(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された下記の化学式（１）で表わされる融合ペプチド（Tat-human type-Ｉcollagen DP）:
【化１】
0004231674.tif 000012
前記式（１）中[  ]Tatで表わされるペプチドは、配列番号６のペプチドであり、
前記式（１）で[  ]collagen DPで表わされるペプチドは、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、または配列番号４のペプチドである。
【請求項２】
請求項１に記載の融合ペプチドを製造する方法であって、該方法が固相ペプチド合成法である融合ペプチドの製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の融合ペプチドを製造する方法であって、該方法が遺伝子組換え技術を利用した生物学的方法である融合ペプチドの製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の融合ペプチドを有効成分として含む皮膚シワ改善化粧品組成物。
【請求項５】
前記請求項１に記載の融合ペプチドを０．０００００１乃至５．０重量％含むことを特徴とする、請求項４に記載の皮膚シワ改善化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチド（transactivator of transcription peptide）が結合された融合ペプチド、及びこれを含む皮膚シワ改善化粧品組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲン（collagen）は哺乳類の全蛋白質の２５％程度を占める細胞外基質（ECM;extra-cellular matrix）の主要構成成分である。コラーゲンの異常な合成または分解は、皮膚老化、特に皮膚のシワ形成に非常に深く関与している。コラーゲンＩ型は、皮膚、骨などにおいて細胞外基質の主要構成成分であり、また、コラーゲンを合成する細胞内で細胞内コラーゲン合成を自ら調節するという報告がある（Wiestner, M. et al. (1979) J. Biol. Chem. 254, 10482〜10484, Paglia, L. M. et al. (1979) Biochemistry 18, 5030〜5034）。ヒトコラーゲンＩ型（human  α１（I）procollagen）C−末端の一部をなすペプチドをヒトの繊維芽細胞（human fibroblast）に添加すると、コラーゲンＩ型（collagenＩ）、コラーゲンIII形とフィブロネクチン（fibronectin）の合成が強化される[▲１▼ K. Katayama et al.(1991), Biochemistry, 30, 7097, ▲２▼ K. Katayama et al.(1993), J. Biol. Chem. 268(14), 9941, ▲３▼ Aycock, R.S. et. al.(1986), J.Biol. Chem. 261, 14355]。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトコラーゲンＩ型の一部が繊維芽細胞に導入されれば、コラーゲンの合成増進によって、細胞の成長と細胞外基質の生成を促進させるという報告に基づき、ヒトコラーゲンＩ型から誘導されたペプチドがシワの改善に効果があると予想され、多様なペプチドが合成されスクリーニングされた。その結果、特にヒトコラーゲンＩ型のアミノ酸配列のうち１８２〜２１６、１９７〜２４１配列のペプチドがコラーゲン合成によるシワ改善に効果あることが明らかになった（PCT/FR９９/０２１７８、WO  ００/１５１８８号）。しかし、このペプチドは水溶性であり、皮膚吸収性が微弱であるため、皮膚シワ改善効果を大きく期待し難いという短所を有しており、外皮から吸収され易く、生体内でのシワ改善効果が増強された新たな皮膚シワ改善剤の開発が急務であった。
【０００４】
このようなペプチドシワ改善剤の皮膚吸収を増加させるための一つの方法として、ペプチドの末端にパルミチン酸などの長鎖の脂肪酸をグラフトしてペプチドの脂溶性を増加させる方法（フランス特許出願第２７８８０５８号、PCT公開公報WO  ００/４０６１１号）が開示されたが、その吸収増大効果は大きく改善された水準のものではなかった。
【０００５】
したがって、皮膚に刺激がなく、外皮からの吸収性が増加して、安定性が向上し、及び生体内でのシワ改善効果が増強された新たな皮膚シワ改善剤に対する研究と開発が必要であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記従来技術の問題点を解決するために、本発明は、非刺激性で、外皮と内皮に穏やかに、しかも安全に浸透して皮膚疾患の誘発をせず、優れたコラーゲン及びヒアルロン酸合成の促進による皮膚シワ改善効果を持続的に有する、ヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチドを提供することを目的とする。
【０００７】
本発明の他の目的は、ヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチドの製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は細胞浸透性が優れており、コラーゲン及びヒアルロン酸の合成、シワ改善効果及びその効果の持続性に優れた、ヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチドを有効性分として含む皮膚シワ改善化粧品組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明はヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドにＴａｔペプチドが結合された下記の化学式（１）で表わされる融合ペプチド（Tat-human type-Ｉcollagen DP）を提供する。
【０００９】
【化２】
0004231674.tif 000002
【００１０】
前記式（１）で[  ]Tatで表わされるペプチドは、配列番号６のペプチドであり、前記式（１）で[  ]collagen DPで表わされるペプチドは、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、または配列番号４のペプチドである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明はヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された下記の化学式（１）で表示される融合ペプチド（Tat-human type-Ｉcollage DP）を提供する。
【００１２】
【化３】
0004231674.tif 000003
【００１３】
前記式（１）で、[  ]Tatで表わされるペプチドは、自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドであって、（  ）nはアミノ酸配列を示し、R1はグルタミン、リジン、アルギニン、及びグリシンの側鎖からなる群より１種以上選択され、nは４乃至１２範囲の整数である。
前記式（１）で、[  ]collagen DPで表わされるペプチドは、ヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドであって、配列番号１に示したヒトコラーゲンＩ型のアミノ酸１８２番から２４６番よりなるペプチドのうちアミノ酸２１２番から２１６番のペプチドを含む連続的な５乃至３５個のアミノ酸からなるペプチドであり、好ましくは配列番号２に現れたペプチドを含む８乃至１５個のペプチドであり、さらに好ましくは配列番号２のペプチド（m=５）、配列番号３のペプチド（m=７）、または配列番号４のペプチド（m=１１）であり、R2はペプチドを構成するアミノ酸の側鎖を含んでなり、mは５乃至３５の整数である。
【００１４】
前記ヒトコラーゲンＩ型のアミノ酸配列１８２番から２４６番よりなるペプチドの配列は下記の通りであり、この配列はまた配列番号１に示される。
N-Ala-Glu-Gly-Asn-Ser-Arg-Phe-Thr-Tyr-Ser-Val-Thr-Val-Asp-Gly-Cys-Thr-Ser-His-Thr-Gly-Ala-Trp-Gly-Lys-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Ser-Arg-Leu-Pro-Ile-Ile-Asp-Val-Ala-Pro-Leu-Asp-Val-Gly-Ala-Pro-Asp-Gln-Glu-Phe-Gly-Phe-Asp-Val-Gly-Pro-Val-Cys-Phe-Leu-C
前記ヒトコラーゲンＩ型のC−末端のアミノ酸配列２１２乃至２１６番までの配列は下記の通りであり、この配列はまた配列番号２に示される。
【００１５】
Lys-Thr-Thr-Lys-Ser
本発明に用いられたヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチド（human type-Ｉcollagen DP）は下記の化学式（２）で表示される:
【００１６】
【化４】
0004231674.tif 000004
【００１７】
ヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドは配列番号１に示したヒトコラーゲンＩ型のアミノ酸配列１８２番から２４６番よりなるペプチドのうち、アミノ酸配列２１２番から２１６番のペプチドを含む連続的な５乃至３５個のアミノ酸からなるペプチドである（m=５〜３５）。好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列のうち２１２番から２１６番のペプチドを含む連続的な８乃至１５個のアミノ酸からなるペプチドであり、さらに好ましくは配列番号２のペプチド（m=５）、配列番号３のペプチド（m=７）、または配列番号４のペプチド（m=１０）であることが望ましい。
【００１８】
より具体的には、配列番号２番に表わされたペプチドの全部であるか、アミノ酸２１１番から２１７番である配列番号３のペプチド（human type-Ｉcollagen DP21１−217、Tyr-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Ser）、またはアミノ酸２１０番から２１９番である配列番号４のペプチド（human type-Ｉcollagen DP 210-219,
Val-Ile-Tyr-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Ser-Arg-Leu）である。
【００１９】
最近、多様な人体の疾患が細胞蛋白質の異常な活性に起因するという事実により、これら蛋白質の活性を調節することによって致命的な人体疾患を治療することができる物質の開発が全世界的な関心の的となっている。しかし、ペプチドと蛋白質は他の化合物に比べて生理作用に対する選択的な効能が非常に優れているが、細胞内部に直接導入することが難しいという短所があり、効果的な薬物送達手段として実用化することは現実的には難しい。
【００２０】
前記のような問題を解決するために、最近は重要な生理活性を有する様々な生体機能蛋白質を細胞内に効率的に浸透させる蛋白質浸透技術（protein penetration technology）が利用されている。それにより、人体疾患治療に必要な物質を直接的かつ効率的に導入または吸収させることができるようになった。このような蛋白質浸透技術においては、自己浸透（self-penetration）信号を有する人間免疫不全ウイルス（HIV : Human Immunodeficiency Virus type-１）が有する蛋白質の一種であるＴａｔペプチドが用いられ、該Ｔａｔペプチドが自発的に細胞膜を通過して容易に細胞内に浸透及び移動する特性を利用する手法が代表的である。このような機能は、Ｔａｔペプチド配列の中間部位である蛋白質形質導入部位（protein transduction domain）特性により表れるものであるが、まだその正確なメカニズム（mechanism）は知られていない（Frankel, A.D. and Pabo, C.O.(1998) Cell 55, 1189-1193. Green, M. and Loewenstein, P. M.(1998) Cell 55, 1179-1188. Ma, M. and Nath, A.(1997) J. Virol. 71, 2495-2499. Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B.(1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017.）。
【００２１】
本発明者らは前記のようなＴａｔペプチドの浸透特性に注目して研究した結果、ヒトコラーゲンＩ型C−末端から誘導されたペプチドのような所望の皮膚活性成分を自己浸透信号を有するＴａｔペプチドに化学的に共有結合させることによって得られる融合ペプチドが、皮膚細胞に直接的で効率的に浸透することを発見し、これに基づいて本発明を完成した。
【００２２】
本明細書で用いられた自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドとは、Ｔａｔペプチドそれ自体またはそれから誘導されたペプチドを言い、前記Ｔａｔペプチドまたはそれから誘導されたペプチドとはそれ自体またはそれと結合した物質と共同して細胞浸透能を有するペプチドのことを言う。
この細胞浸透能とは、具体的には、HIV（human immunodeficiency virus）Type-１のＴａｔペプチドの主要特徴の一つとして蛋白質全体のうちN−末端の領域におけるアミノ酸配列部位が浸透しようとする細胞の脂質膜（lipid barrier）を開ける信号を持っているということであり、その配列は下記の通りで、この配列はまた配列番号５に示される。
【００２３】
Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln−Arg-Arg-Arg（またはRKKRRQRRR）
自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドの構成アミノ酸は２０個のアミノ酸の中でリジン（リジン、以下、LysまたはKとする）、アルギニン（arginine、以下、ArgまたはRとする）、グルタミン（glutamine、以下、GlnまたはQとする）等は全て構造的にアミノ基とカルボキシル基を有しているために、アルコールとの反応によってカルボキシル基とエステル化反応でヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドと結合させることができる。本発明の代表的な自己細胞浸透性Ｔａｔペプチド（n=９）としては配列番号５のＴａｔペプチド（Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln−Arg-Arg-ArgまたはRKKRRQRRR）、配列番号６のＴａｔペプチド（Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysまたはKKKKKKKKK）、配列番号７のペプチド（Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-ArgまたはRRRRRRRRR）などがあり、これらはヒトコラーゲンＩ型DPと縮合反応して化学的に結合することができる。
【００２４】
前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドは下記の化学式（３）で表示される:
【００２５】
【化５】
0004231674.tif 000005
【００２６】
前記R1はグルタミン（glutamine:Gln）、リジン（lysine:Lys）、アルギニン（arginine:Arg）、及びグリシン（glycine:Gly）の側鎖からなる群より選択された１種以上の置換基であり、前記Ｔａｔペプチドは４個乃至１２個のアミノ酸からなるペプチドであり、さらに好ましくはリジン及びアルギニンからなる群より選択された１種以上のアミノ酸からなるペプチドである。また、前記化学式（３）の中でnは４乃至１２の整数であり、さらに好ましくは８乃至１０であり、最も好ましくはｎが９である。
【００２７】
本発明は自己細胞浸透性ＴａｔペプチドにヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドを結合させた融合ペプチド（Tat-human type-Ｉcollagen DP）を製造する方法を提供する。
さらに詳しくは、本発明のTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの製造は下記のような方法で製造できる。
【００２８】
第一の方法は、遺伝子組換え発現ベクターを利用する生物学的方法である。
（a）HIV-１Tat遺伝子が含まれている発現ベクターであるpSVC２１から自己浸透信号領域を有するN−末端部位（N−terminal）を６個のヒスチジンタグ（６ His tag）が含まれた蛋白質発現ベクター（expression vector）であるpETベクターに、PCR（polymer chain reaction）技法を利用してHIV-１のTat遺伝子をクローニング（cloning）し、融合蛋白質の形態に発現させることができるベクターを製造する段階、そして
（b）前記pET-Tat発現ベクターを利用して大腸菌内において遺伝子組換えHis-Tat-human type-Ｉコラーゲンペプチドの形態で大量発現させた後、純粋分離精製する段階
を含むTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの製造方法である。
【００２９】
第二の方法は、（a）Tat-human type-Ｉコラーゲン発現ベクターに目標蛋白質（target protein）、例えば、カタラーゼ（catalase）またはスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）などを挿入してHis-Tat-human type-Ｉコラーゲン融合蛋白質に大量発現して純粋分離精製する段階を含むTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの製造方法である。
【００３０】
第三の方法は、ペプチド合成用有機合成装置を利用して純粋なTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドを合成する方法である。この製造法はMerrifieldの固相ペプチド合成法であり（J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154(1963)）、ABI社のペプチド合成装置（Model 431A）を利用してグルタミン（Gln）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、及びグリシン（Gly）からなる群より１種以上選択したアミノ酸を有するＴａｔペプチドを含むTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドを、C−末端とN−末端の反応性を有するアミノ酸モノマーを縮合反応させてを合成した。
【００３１】
固相合成は、適当なレジンにα−アミノ基が保護されたアミノ酸をカルボキシル末端からカップリング（coupling）させることから始まる。この時、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をヒドロキシメチルレジンやクロロメチルレジンに結合させる。α−アミノ基を保護するグループとしてはFmoc（９-fluorenyl methoxycarbonyl）やBoc（t-butyloxycarbonyl）を使用し、Fmocで保護されたアミノ酸はABI社やPharmacia社あるいはCalbiochem社のものを購入した。アミノ酸側鎖に反応性があるアミノ酸には、例えばArg側鎖のアミノ基や、Gly、Lys、Glnの反応性側鎖はトリチル（Trt）、４−メトキシ−２，３，トリメチルベンゼンスルフォニル（Mrt）、ｔ−ブチル（t-Bu）のような適当なグループで保護されたFmoc−アミノ酸を含んでいる。ペプチド合成は固体状支持体レジンについているペプチドチェーンのアミノ末端に順次にα−アミノ基が保護されたアミノ酸を活性化した後カップリングさせ、合成が終わればレジンからペプチドを切断して、保護グループはトリフルオロ酢酸（TPA）のような試薬で除去する。ペプチドはTFA溶液からろ過や遠心分離またはジエチルエーテルで抽出して分離し、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）や他の方法で精製することができる。
【００３２】
本発明の製造方法によって製造された前記化学式（１）で表示されるTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドは化学的な安定性があり、コラーゲン及びヒアルロン酸合成による皮膚シワ改善効果とその持続性、及び安全性が優れている皮膚シワ改善剤として用いることができる。これに関する詳細な活性評価は実施例で記述する。
【００３３】
本発明は前記化学式（１）で表示される化合物を含有する皮膚シワ改善化粧品組成物を提供する。
本発明による組成物は化学式（１）で表示される化合物を０．０００００１乃至５．０重量％を含有する。０．０００００１重量％未満量を含む場合には実質的なシワ改善効果を期待し難く、５．０重量％を超える場合には製品形状及び製品の安定性によくない影響を与える可能性がある。
【００３４】
本発明が適用できる化粧品の形状には特に制限がなく、通常の化粧品の形状にすることができる。例えば、本組成物は皮膚外用軟膏や、スキンローション、ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、パック、エマルジョン、油性ゲルなどの形状で製造できる。ここで、皮膚外用軟膏は化学式（１）で表示される化合物の有効性分以外にワセリン５０．０乃至９７．０重量％、及びポリオキシエチレンオレイルエーテルホスフェート０．１乃至５．０重量％を含有し、スキンローションはプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類１．０乃至１０．０重量％、及びポリエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油などの界面活性剤０．０５乃至２．０重量％を含有して製造される。ローション及び栄養クリームは化学式（１）で表示される化合物の有効性分以外にスクアレン、ワセリン、オクチルドデカノールのようなオイル類５．０乃至２０．０重量％、及びセタノール、ステアリルアルコール、パラフィンなどのワックス成分３．０乃至１５．０重量％を含有しており、エッセンスはグリセリン、プロピレングリコールなど多価アルコール類５．０乃至３０．０重量％を含有する。マッサージクリームは化学式（１）で表示される化合物の有効性分以外に流動パラフィン、ワセリン、イソノニルイソノナノエートなどのオイルを３０．０乃至７０．０重量％含有して製造され、パックはポリビニルアルコールを５．０乃至２０．０重量％含有するピールオフ（peel off）タイプパックにまたは一般乳剤化粧品にカオリン、タルク、酸化亜鉛、二酸化チタンなどの顔料が５．０乃至３０．０重量％含まれている洗い流しタイプのパックとして製造される。
【００３５】
一方、本発明の前記化学式（１）で表示される化合物を含有する皮膚シワ改善化粧品組成物は、一般皮膚化粧品に配合される普通の成分、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを必要なだけ適量配合することが可能である。
本発明の化合物の生理活性を確認するために経皮吸収実験、皮膚刺激性実験、コラーゲン及びヒアルロン酸合成増大効果、及びシワ改善効果の測定を行った結果、本発明の化合物は優れた経皮吸収力を有し、コラーゲン及びヒアルロン酸合成能増大効果、シワ改善効果などの実験で優れた効果があることが立証された。したがって、本発明の化合物はその活性度と非刺激性、皮膚吸収力が優れたシワ改善効果持続性に起因して化粧品のクリーム、ローション、ゲルなどの全ての形態で添加して使用することができる。
【００３６】
以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、次の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、本発明が次の実施例に限られるわけではない。
【００３７】
【実施例】
【００３８】
【実施例１】
＜Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチド（KKKKKKKKKKTTKS）の製造＞
（１）Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの製造
本発明に用いられたTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドはKKKKKKKKKKTTKS配列を有する１４個のアミノ酸からなるペプチドであり、その合成はペプチド自動合成装置（Applied Biosystems Model 431A）を利用して固相ペプチド合成法で合成した。０．２５mmolのパラヒドロキシメチルフェニルオキシメチルポリスチレン（HMP）レジンを標準反応容器（３８mL）に入れて、合成するべきペプチドのカルボキシ末端のFmoc−アミノ酸を入れて合成を始めた。１mmolのFmoc−アミノ酸が入っているカートリッジをカルボキシル末端アミノ酸からアミノ酸末端のアミノ酸まで配列順にガイドウエイに配列する。次いでカートリッジの金属製蓋を除去して最初と最後にはアミノ酸が入っていない空カートリッジを置いた。
【００３９】
ABI社で開発した標準スケールFmocカップリングプロトコルによってペプチド合成前にパラメーターを設定し、自動合成メニューによって合成した（ABI User's Manual. Jan, 1992参照）。標準スケールFmocを使用する時は、脱保護（deprotection）をN−メチルピロリドン（NMP）で希釈した２０％ピペリジンを使用して２１分間行い、NMPで９分間洗浄してカップリングを７１分間実施した。カップリングには１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（HOBt）を使用し、NMPで７分間洗浄した。
【００４０】
（２）Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの分離及び精製
合成が完了した後、Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドはトリフルオロ酢酸（TFA）を使用しABI社マニュアル（Introduction to Cleavage Techniques、P6-19(1990)）を参考として固体支持体から分離した。具体的には、合成が終了したペプチドが結合したレジンを、丸底フラスコに入れて冷凍した後、結晶フェノール０．７５g、１，２−エタンジチオール（EDT）０．２５mL、チオアニソール０．５mL、蒸溜水０．５mL、及びTFA１０mLを入れてふたを閉じて室温で１〜２時間反応させた。
【００４１】
反応が終わった後、レジンと反応液を焼結(sintered）ガラス漏斗を通じて低真空でろ過してレジンとペプチド溶液を分離した。フラスコとガラス漏斗を５〜１０mLのジクロロメタン（DCM）で洗い、この溶液をペプチド溶液と混合し、さらに５０mL以上の冷ジエチルエーテルを添加してペプチドの沈殿物を得た。この沈殿物を、低真空下において漏斗でろ過し、漏斗上に集められた沈殿物を乾燥した後、３０％酢酸に溶かして凍結乾燥した。このようにして得られたペプチドをHPLC（High Performance Liquid Chromatography）で精製した。この時、カラムはC18分析カラム（Pharmacia）を用い、緩衝溶液Aには１０％アセトニトリル+０．０５％TFAを使用して平衡化させ、８０％アセトニトリル+０．０５％TFAを使用した緩衝溶液Bによりペプチドを溶出した。その結果、高純度に精製されたペプチドが得られ、その合成収率は３０±５％程度であった。
【００４２】
【実施例２】
＜コラーゲン合成効果試験＞
前記実施例１で製造されたTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの皮膚老化抑制剤としての有用性を測定するために、従来からコラーゲン合成効果に優れた物質として知られているアスコルビン酸と比較実験した。
【００４３】
この試験では２４個のウェル（well）を有するプレート（plate）に、同一数のヒト繊維芽細胞（human fibroblast）を２４時間培養した後、１０-4から１０-7の濃度（w％/mL）の上記試料をそれに加えた。２時間後、トリチウムが導入されたプロリンをそれに加えて２４時間培養した後、培養培地を利用して繊維芽細胞が新しく合成、分泌したコラーゲンの量をトリチウムが導入されたプロリンのcpm（counting per minute）を測定してcsp（コラーゲン敏感蛋白質:collagenous sensitive protein）の量を計算し、これを利用してコラーゲン合成効果を測定比較した（参考文献:▲１▼David F. W. and Wilson Harvey, Analytical Biochemistry(1979); 96, 220〜224, ▲２▼Atsushi Hatamochi, Masashi Ono, Hiroaki Ueki, and Masayoshi Namba., J.Invest Dermatol.(1991) 96, 473〜477）。
【００４４】
実験の結果、本発明に用いられた前記化学式（１）で表示される化合物は、５５％の増加率を示し、コラーゲン合成の増進効果を有していることが分かった。
【００４５】
【実施例３】
＜シワ改善効果測定＞
前記実施例１で製造されたTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドのシワ改善効果を測定するために、３０代の女性２９名に目の周囲のシワ部分に本発明の前記化学式（１）で表示される化合物を含む水中油型乳化物と、その化合物を含まない対照群を各々３ケ月間、１日一回ずつ塗布するようにした。その後、シワ改善状態を肉眼で観察して改善なし、多少改善、中程度の改善、相当な改善の４段階で判定した。
【００４６】
その結果、本発明に用いられた化学式（１）で表示される化合物が目の周囲のシワ皮膚で シワ改善効果を示したことから、本発明の化学式（１）で表示される化合物を皮膚に塗布外用剤として用いた時、シワを緩和、改善することが確認された。
【００４７】
【実施例４】
＜経皮吸収（皮膚細胞内浸透）実験＞
前記化学式（１）で表示される化合物の皮膚細胞内浸透を通常、経皮吸収と言うので本明細書では以下、この語を使用する。経皮吸収実験は、化学式（１）で表示される化合物を使用して実験した。（参考文献:LehmanPA, Slattery JT, Franz TJ. Percutaneous absorption of retinoids: Influence of vehicle, light exposure, and dose, J. Invest Dermatol., 91;56-61, 1998）。
【００４８】
具体的には、生後８週齢の雌性無毛マウスの背部位皮膚を１．７ｃｍ2の大きさで切り取り、前記融合ペプチドを塗布した後、経皮吸収測定器（Franz cell）を利用して２４時間後受容器（receptor）溶液とマウスの背部位皮膚に吸収された物質を抽出して高速液体クロマトグラフィ（HPLC）とマス液体クロマトグラフィ（LC mass）で定量分析して、化学式（１）で表示される本発明の化合物が経皮吸収された量を定量した。実験の結果、本発明に用いられた化学式（１）で表示される化合物の経皮吸収率が優れていることが分かった。
【００４９】
【実施例５】
＜Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドのアレルギーテスト（LLNA）＞
化粧品原料としての化学式（１）で表示される化合物に対する安全性実験としては運搬媒介物としてエタノールを使用する実験法を用いた[参考文献:Kimber I(1990): Identification of contact allergens using the murine local lymph node assay, J. Appl. Toxicol. 10(3); 173-180]。老化防止用化粧品原料として用いられている対照群原料と前記化学式（１）で表示される化合物を、各々０．５％、１．０％溶液として用いた。つまり、マウス（Balb/c）の両耳に５０μLずつ３日間塗った後、マウスから耳のリンパ節（auricular lymph node）を分離した。リンパ節を単一細胞状態にした後、放射性同位元素で標識した[3H]−メチルチミジン（[3H]-methylthymidine）を添加して２４時間培養した後、β-シンチレーション計数器（Beckman LS 6000TA、USA）を利用して細胞の増幅度（dpm、disintegrations per minute）を測定した結果、本発明に用いられた化学式（１）で表示される化合物は対照群に比べて低いアレルギー誘発可能性を示した。
【００５０】
【実施例６】
＜Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの皮膚刺激性試験＞
前記化学式（１）で表示される化合物の皮膚刺激性試験のために、モルモット（Guinea Pig）を利用した貼布試験（patch test）を行った[参考文献:▲１▼Draize, J.H.(1959): Dermal toxicity. Assoc. Food and Drug officials, US. Appraisal of the safety of chemicals in Food, Drugs and Cosmetics., pp46-59, Texas State Dept. of Health, Austin, Texas, ▲２▼Federal Register(1973): Method of testing primary irritant substances 38(187) : pp1500-1541]。試料は前記化学式（１）で表示される化合物を多様な濃度で水中油型乳化物に調製して試験した。
【００５１】
まず、試料塗布部位であるモルモット背部位の毛を除去した。その除去による皮膚刺激を最少化するために２４時間環境適応をした後、試料塗布部位を設定（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）し、試料とガーゼをそれに当てて試料の蒸発及び損失を防止するために固形材質の薄紙でその塗布部位を密封した後、弾力性のある包帯で４８時間固定した。密封された貼布物を除去した後、２時間、２４時間（貼布後、５０時間、７２時間）後の刺激程度を判定して刺激指数（PII:primary cutaneous irritation index）と刺激度として表１に示した。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
前記表１により、本発明に用いられた化学式（１）で表示される化合物は、皮膚に刺激を与えず安全であることが確認できた。
【００５４】
【実施例７】
＜Tat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチドの細胞毒性試験＞
化粧品に用いられる原料としての安全性を検証するために化学式（１）で表示される化合物を用い、V７９-４細胞（チャイニーズハムスター、肺組織繊維芽細胞の連続細胞株）を培養してMTT試験[参考文献:Mossman T.(1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth & survival: application to proliferation & cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63]を行って毒性を試験した。その結果、化学式（１）で表示される化合物は、０．１の濃度（％、w/v）以上では非常に弱い毒性を示す傾向があったが、０．０１以下の濃度（％、w/v）ではほとんど毒性を示さないことが分かった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明はヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに自己浸透信号を有する自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合されたTat-human type-Ｉcollagen DP融合ペプチド、そしてこれを含む皮膚シワ改善剤を提供するものである。本発明のシワ改善剤は自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドの存在によって、既存のヒトコラーゲンＩ型のC−末端から誘導されたペプチドに比べて皮膚に対する吸収性が優れていて非刺激性であり、優れたコラーゲン及びヒアルロン酸の合成促進の効果、それによるシワ改善効果及びその効果の持続性を有する長所がある。
【００５６】
【配列表】
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