(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチンを輸送する能力を有するタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチンを輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法。
【請求項２】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチンを輸送する能力を有するタンパク質を用いたカルニチンの取り込み実験系に物質を添加することを特徴とする、前記タンパク質のカルニチン輸送能を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
ａ）前記タンパク質を発現している細胞を調製する工程、
ｂ）前記細胞を用いたカルニチンの取り込み実験系に前記物質を添加する工程、及び
ｃ）前記細胞へのカルニチンの取込量を測定する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は精巣及び精巣上体におけるカルニチン及びその類似物質のナトリウム依存的な輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
背景技術
カルニチンは、生体のあらゆる臓器における脂肪酸のベータ酸化において重要な役割を果たしている。あらゆる臓器の細胞はそのエネルギー源であるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を脂肪酸のベータ酸化によりミトコンドリア内で産生している。脂肪酸のアシル基はカルニチンの作用によりミトコンドリア内に輸送され、アシルＣｏ−Ａに変換された後、ベータ酸化を受け、ＡＴＰを産生する。カルニチンは多くは食物由来であり、一部は肝臓、脳で生合成されるが、多くの細胞はカルニチンを細胞外より取り込む必要があり、カルニチン特異的な輸送体が細胞膜に存在することがこれまでの生理学的な研究から予測されてきた。
各種細胞のカルニチンの取り込みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。しかし従来の手法では、細胞膜を介したカルニチン輸送系について詳細に解析することは困難であり、トランスポーターそのものを単離して解析することが望まれてきた。
カルニチントランスポーターとして、ラットＣＴ１（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第２５１巻、５８６−５９１頁、１９９８年）が単離されている。ＣＴ１のヒトにおける相同遺伝子としてｈＯＣＴＮ２（Ｔａｍａｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７３巻、２０３７８−２０３８２頁、１９９８年）が報告されている。これらは全身の臓器に広く分布し、各種細胞のカルニチン取り込みに寄与している。また腎臓にも発現し、カルニチンを尿細管腔より再吸収する機能をはたしている。
これまでの研究で、精巣及び精巣上体のカルニチンの濃度は生体内で最も高く、種によっては血中濃度の２０００倍にも達することが明らかにされた。精巣上体管腔は精子の栄養及び成熟を司る器官であることから、カルニチンと精子機能の関連が注目されてきた。
精巣で産生された精子は、その段階では未成熟であり、運動性もきわめて低く、そのままでは受精能力を有さないことが明らかになっている。精巣を離れた精子は精巣上体に移行し、様々な修飾をうけ、成熟する。また精子の受精能にはその鞭毛運動が不可欠であり、そのために膨大なエネルギーを要する。このエネルギー源となるＡＴＰ産生のためにカルニチンが大量に要求されると考えるのは合目的的である。
実際にヒトの精液中カルニチン濃度と精子の数及び運動能の正の相関を示す研究も報告されている。また臨床医学において、特発性不妊症患者にカルニチンを投与したところ、妊娠の確率が上昇したとの報告もされている。
このように、精巣及び精巣上体に特異的なカルニチン輸送は、精子の成熟及び受精能力に関して重要な役割を担っていると考えられ、摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。これらの研究により能動的カルニチン輸送系が存在することは示されていたが、その分子的実体は不明であった。
本発明者の一部らは、以前に腎臓、肝臓、脳、胎盤などにおける薬物輸送において中心的な役割を果たしている有機アニオントランスポーターＯＡＴ１（ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７２巻，１８５２６−１８５２９頁、１９９７年）、ＯＡＴ２（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ，第４２９巻、１７９−１８２頁、１９９８年）、ＯＡＴ３（Ｋｕｓｕｈａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７４巻、１３６７５−１３６８０頁、１９９９年）、及びＯＡＴ４（Ｃｈａ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７５巻、４５０７−４５１２頁、２０００年）を単離し報告してきた。ＯＡＴファミリーに属するこれらのトランスポーターは化学構造の異なる多くの有機アニオンを輸送することの出来るトランスポーターであり、種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。
更に近年、有機カチオンを認識するＯＣＴ（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）ファミリーも同定されている。カルニチンは正電荷及び負電荷の両者を併せ持つ有機イオンであり、カルニチントランスポーターは分子進化の観点からＯＡＴファミリーとＯＣＴファミリーの中間に位置することが予想される。
これらの事実から、本発明者らは、精巣及び精巣上体に特異的なカルニチントランスポーターが有機イオントランスポーターファミリーに属するものであることを予測した。
発明の開示
本発明の目的は、精巣及び精巣上体におけるカルニチン輸送に関与する新規なカルニチントランスポーター遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドであるカルニチントランスポーターを同定し、提供することにある。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、（１）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質に関する。
また、本発明は、（２）上記タンパク質をコードする遺伝子に関する。
更に、本発明は、（３）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡ、又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる遺伝子に関する。
更にまた、本発明は、（４）上記遺伝子若しくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターに関する。
また、本発明は、（５）上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
更に、本発明は、（６）配列番号：１に記載された塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチドに関する。
更にまた、本発明は、（７）上記ヌクレオチドを含んでなる、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブに関する。
また、本発明は、（８）上記ヌクレオチドを用いて、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させる方法に関する。
更に、本発明は、（９）上記（１）に記載のタンパク質に対する抗体に関する。
更にまた、本発明は、（１０）上記（１）に記載のタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法に関する。
また、本発明は、（１１）上記（１）に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整する方法に関する。
更に、本発明は、（１２）上記（１）に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整する方法に関する。
更にまた、本発明は、（１３）上記（１）に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整する方法に関する。
また、本発明は、（１４）上記（１）に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いはすでに細胞に存在する該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出及び調整する方法に関する。
即ち、本発明者らは既に述べたように、４つの有機アニオントランスポーターＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３及びＯＡＴ４を先に単離した。これらは相互に４０％前後のアミノ酸配列の相同性を有している。これらの配列をもとに、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースを検索し、ＯＡＴ１，２，３及び４と相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片を同定し、このｃＤＮＡ断片を用いて、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーよりこれまでに報告のない新規クローン（ＣＴ２）を同定し本発明を完成するに到った。
本発明のカルニチントランスポーターＣＴ２は、Ｌ−カルニチン及びその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送する能力を有し、他のＯＡＴやＯＣＴファミリーに属する薬物トランスポーターと比較して、狭い範囲の基質選択性を有するトランスポーターである。
本発明のタンパク質としては、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない程度であればよく、その数としては、通常１〜約１１０個、好ましくは１〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、〜７５％、好ましくは〜９０％のアミノ酸配列の相同性を有する。
本発明の遺伝子としては、配列番号：１に記載された塩基配列を有するＤＮＡからなるもののほか、例えば、配列番号：１に記載された塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
本発明のカルニチントランスポーター遺伝子、並びに本発明のタンパク質は、適当な哺乳動物の臓器、組織、若しくは培養細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジースクリーニング及びＰＣＲスクリーニングなどにより好適に実施できる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ちＣＴ２のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたｃＤＮＡがカルニチントランスポーターのｃＤＮＡであること、即ちｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物がカルニチントランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。
得られたＣＴ２ｃＤＮＡから調製したｃＲＮＡを卵母細胞に導入して発現させ、カルニチンを細胞内に輸送する（取り込む）能力を、カルニチンを基質とする通常の取り込み実験（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第２５１巻、５８６−５９１頁、１９９８年）により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。
また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、ＣＴ２の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、ＣＴ２の特性、例えば、ＣＴ２が時間依存性の輸送を行っているという特性や、ＣＴ２のナトリウム依存性、基質選択性、ｐＨ依存性などを調べることができる。
得られたＣＴ２遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号：１）に示された塩基配列、若しくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することが出来る。
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊」に記載の方法により調製することができる。或いは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。
ＣＴ２遺伝子のヒトゲノム上における構造を得るには、得られたＣＴ２遺伝子のｃＤＮＡを用いて、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、得られたクローンを解析する。或いは公開されているヒトゲノム解析結果の情報をもとにホモロジー検索プログラムを用いてこれを探索してもよい。
本発明のカルニチントランスポーター（ＣＴ２）は、例えば、カルニチントランスポーターをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術により生産することができる。例えば、カルニチントランスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクター、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等に組み込み、得られた組み換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を用いることが望ましい。
例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現させる場合には、カルニチントランスポーターをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、プラスミドベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換して、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞、マウス由来近位尿細管Ｓ１、同Ｓ２、同Ｓ３細胞等の細胞株が挙げられる。
カルニチントランスポーターＣＴ２をコードするｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１に記載された塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることが出来るほか、前記のｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設計することが望ましい。設計した塩基配列をもつＤＮＡはＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位変異導入法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）「Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ第１８巻、５６６２−５６６６頁、１９８４年」等により実施できる。
本発明のカルニチントランスポーター遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド（オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド）は、カルニチントランスポーター遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、カルニチントランスポーターの発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、やリボザイム、デコイとして使用することもできる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１に記載された塩基配列の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上或いは３０塩基以上の配列を用いても良い。
また、本発明のカルニチントランスポーターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、カルニチントランスポーター検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のカルニチントランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（たとえば、ラットやウサギ）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
本発明のタンパク質を用いることにより、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出することが出来る。
また、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整することが出来る。
更に、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン等）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整することが出来る。
更にまた、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン等）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整することが出来る。
また、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質（例えば、アンドロゲン等のホルモン等）或いは機能抑制物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド等）を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いは既に細胞に存在する該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出又は調整することが出来る。
実施例
以下、実施例により本説明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊」に記載の方法により行うか、又は市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従ってこれを使用した。
実施例１  精巣及び精巣上体特異的カルニチントランスポーター（ＣＴ２）ｃＤＮＡの単離とその解析
先に本発明者の一部らが単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、及びＣＴ１の塩基配列情報をもとに、公開されているＥＳＴデータベースを探索した。この結果、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、及びＣＴ１と相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片ＡＡ７７８５９８を得た。
ＡＡ７７８５９８を３２Ｐでラベルしたプローブを用いて、既に構築してあったヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５０℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、５０℃で０．１×ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）／０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、３×デンハード液、０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ  ＭＥＳ、０．０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ（シグマ社製、発泡防止剤）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。λＺｉｐＬｏｘ中に単離されたクローンはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ法によりプラスミドベクターｐＺＬ１に更にサブクローン化した。この結果、カルニチン輸送活性を持つ新規ｃＤＮＡ（ＣＴ２ｃＤＮＡ）が得られた。
上記により得られたｃＤＮＡ（ＣＴ２ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定は、特異的プライマーを用いて、自動シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）によりおこなった（配列番号：１に記載）。
次いで、ＣＴ２ｃＤＮＡを含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７２巻、１８５２６−１８５２９頁、１９９７年参照）。
得られたｃＲＮＡを、既に報告されている方法（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７２巻、１８５２６−１８５２９頁、１９９７年）に従い、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識されたＬ−カルニチンによる取り込み実験を行った。この結果、第１図Ａに示すようにＣＴ２を発現させた卵母細胞は３Ｈ−Ｌ−カルニチンの取り込みを示すことが判明した。これに対して代表的な有機アニオンである１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）及び有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）の取り込みは認められなかった。
以下に、本発明のＣＴ２について、輸送機能解析、基質選択性の検討、遺伝子発現の解析、遺伝子がコードするタンパク質の精巣及び精巣上体における免疫組織学的検討、並びにＣＴ２遺伝子のヒトゲノムにおける構造解析を行った結果を順を追って記す。
（１）ＣＴ２のカルニチン輸送の時間依存性試験をおこなった。
この結果、第１図Ｂに示すようにＣＴ２を発現させた卵母細胞は３Ｈ−Ｌ−カルニチンの取り込みの時間依存性を示した。このことから、ＣＴ２は単にカルニチンと結合するだけではなく、細胞内に輸送するトランスポーターであることが示された。
（２）ＣＴ２のカルニチン輸送のミカエリス−メンテン動力学試験をおこなった。
種々の濃度のカルニチンのＣＴ２による取り込み量の変化を調べることにより、カルニチンのＣＴ２による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたカルニチンの取り込み実験は、ＣＴ２ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。この結果（第２図Ａ）、Ｌ−カルニチンの取り込みのＫｍ値は約２０．３μＭであった。
（３）Ｌ−カルニチンの異性体であるＤ−カルニチンがＣＴ２によるＬ−カルニチン輸送に与える影響を検討した。
第２図Ｂに示すように、Ｄ−カルニチンは濃度依存的にＣＴ２によるＬ−カルニチン輸送を阻害した。Ｋｉ値は約３０．１μＭであった。
（４）ＣＴ２のカルニチン輸送におけるナトリウム依存性を検討した。
細胞外ナトリウムをリチウム及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミンに置換した場合、ＣＴ２を介したカルニチンの輸送は減少し、ＣＴ２が細胞外ナトリウム依存性のカルニチントランスポーターであることが明らかになった（第３図Ａ）。ただし細胞外ナトリウムをリチウム及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミンに置換した場合でも取り込みは完全には減少せず、部分的細胞外ナトリウムに依存することが明らかになった。
（５）ＣＴ２のカルニチン輸送におけるｐＨ依存性を検討した。
第３図Ｂに示すように、細胞外のｐＨをより酸性にしたところ、ＣＴ２のカルニチン輸送は減少した。
（６）ＣＴ２の基質選択性をさらに検討するために、ＣＴ２ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−カルニチンの取り込み実験系において、系へ各種カルニチン類似物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。
３Ｈ−カルニチンの取り込み実験は、ＣＴ２ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。５μＭ、及び５０μＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、５０ｎＭ  ３Ｈ−カルニチンの取り込みを測定した。その結果、種々のカルニチン類似物質（Ｄ−カルニチン、アセチルＬ−カルニチン、アセチルＤＬ−カルニチン、オクタノイルＬ−カルニチン、ベタインなど）はＣＴ２による３Ｈ−カルニチンの輸送を有意に阻害した（第４図）。一方、パラアミノ馬尿酸やテトラエチルアンモニウムのようなアニオン性物質及びカチオン性物質は阻害作用を示さなかった（第４図）。以上の結果から、ＣＴ２はカルニチン及びカルニチン類似物質の特異的なトランスポーターであることが判明した。
（７）ヒトの各組織におけるＣＴ２遺伝子の発現（ノーザンブロッティング）の解析を行った。
ＣＴ２ｃＤＮＡの全長を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出したＲＮＡをブロッティングしたフィルター（クロンテック社製）のハイブリダイゼーションをおこなった。ＣＴ２ｃＤＮＡ全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイブリダイセーションを行い、フィルターを６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで洗浄した。ノーザンブロットの結果（第５図）、精巣のみにおいて、強いバンドが検出された。
（８）ＣＴ２の遺伝子がコードするタンパク質の精巣及び精巣上体における免疫組織学的検討を行った。
ＣＴ２タンパク質のカルボキシル末端の１４アミノ酸残基からなるポリペプチドを合成し、これをウサギに免疫することにより、抗血清を得た。ヒト精巣のパラフィン切片を脱パラフィン化したのち、３％過酸化水素水で処理することにより内因性のペルオキシダーゼを不活性化した。切片をアフィニティー精製したポリクローナル抗ＣＴ２抗体（１次抗体）で２４時間インキュベートし、次にペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体で反応させた。最後にペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジンを加えることにより、茶褐色の沈殿の得られた場所を光学顕微鏡で観察した。第６図に示す通り、精巣ではセルトリ細胞の細胞質内に、精巣上体では上皮細胞の管腔側に有意な染色がみられた（第６図中、矢頭はＣＴ２発現部位を示す。）。従って、ＣＴ２は精巣においてセルトリ細胞内にカルニチンを供給し、また精巣上体管腔内に血中よりカルニチンを輸送するトランスポーターである。
（９）ＣＴ２遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した。
ホモロジー検索プログラムを利用して公開されているヒトゲノム解析結果の情報を探索したところ、ＣＴ２遺伝子のエクソン・イントロン構造が明らかになった。第７図に示すように、ＣＴ２遺伝子は１０のエクソンからなり、開始コドンは第２エクソンに存在した。
産業上の利用可能性
本発明のカルニチンを選択的に輸送する精巣及び精巣上体特異的カルニチントランスポーター及びその遺伝子は当該トランスポーターの発現箇所でのカルニチン及びカルニチン類似物質の輸送のインビトロでの検討や、それを基にしたそれら化合物の生殖器官内の動態の予測を可能とする。カルニチンは精子の運動能及び受精能に必須なエネルギー産生に必須の因子であり、当該トランスポーターの発明は将来特発性男性不妊症の病因解明に寄与するものと考えられる。さらに、当該トランスポーターの発現を変調する制御因子を解明することにより、カルニチン輸送能を変調させる方法、精子受精能を変調させる方法の開発に利用できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒトＣＴ２遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験の結果（Ａ）と時間依存性（Ｂ）を示す図である。
第２図は、ヒトＣＴ２遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込みのミカエリス−メンテン動力学試験の結果（Ａ）とＣＴ２によるＬ−カルニチン輸送においてＤ−カルニチンの阻害効果を調べた結果（Ｂ）を示す図である。
第３図は、ヒトＣＴ２遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験において、添加する塩の影響を調べた結果（Ａ）とｐＨの影響を調べた結果（Ｂ）を示す図である。
第４図は、ヒトＣＴ２遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験において、系へのカルニチン類似物質添加の影響を調べた結果を示す図である。
第５図は、ヒトの各臓器組織におけるＣＴ２遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す図面に代わる写真である。
第６図は、精巣及び精巣上体におけるＣＴ２タンパク質の発現を免疫組織学的に解析した結果を示す図面に代わる写真である。
第７図は、ＣＴ２遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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