(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
0004271260.tif 000011
｛式中、
Ｒ１はコレステリル基を表し、
Ｒ２及びＲ３は相互に独立して水素原子又は一般式ＩＩ：
0004271260.tif 000012
［式中、
ｎ及びｍは相互に独立し且つＲ２及びＲ３基間で異なる０〜４の整数を表し、
Ｒ４及びＲ５は相互に独立して水素原子又は式ＩＩＩ：
0004271260.tif 000013
（式中、
ｐ及びｑは相互に独立して０〜４の整数を表し、ｒは０又は１であり、ｒが１のとき、ＸはＮＨ基を表し且つｘは１であるか、又はＸは窒素原子を表し且つｘは２であり、ｐ、ｑ及びｒはＲ４及びＲ５基間で独立して変化し得る）
の基を表す］の基を表し、
Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも一方は水素原子以外のものであり、
Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも一方は水素原子以外のものである｝の化合物またはその塩。
【請求項２】
Ｒ２およびＲ３が相互に独立して水素原子又は一般式ＩＶ：
0004271260.tif 000014
［式中、ｎ、ｍ及びｐは請求項１と同義であり、Ｒ４は水素原子又は式Ｖ：
0004271260.tif 000015
（式中、ｑ及びｒは請求項１と同義である）の基を表し、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは種々のＲ２及びＲ３基間で独立して変化し得る］の基を表すことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記一般式：
[(H2N)2+C-NH-(CH2)3][(H2N)2+C-NH-(CH2)4]-N-COO-R1    VII
[(H2N)2+C-NH-(CH2)2]2-N-(CH2)2-NH-COO-R1    VIII
[(H2N)2+C-(CH2)2]2N-COO-R1    IX
（式中、Ｒ１は請求項１と同義である）の１種により表される化合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
ビスグアニジノスペルミジンコレステロール（ＢＧＳＣ）であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
ビスグアニジノトレンコレステロール（ＢＧＴＣ）であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
化合物がビスグアニジノスペルミジンコレステロール（ＢＧＳＣ）であることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
化合物がビスグアニジノトレンコレステロール（ＢＧＴＣ）であることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
更に核酸を含むことを特徴とする請求項６から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
核酸が治療遺伝子を含むことを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物と、中性脂質と、核酸を含む医薬組成物。
【請求項１４】
化合物がビスグアニジノトレンコレステロール（ＢＧＴＣ）とビスグアニジノスペルミジンコレステロール（ＢＧＳＣ）から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
中性脂質がＤＯＰＥであることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
核酸が治療遺伝子を含むことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
注射用製剤に医薬的に許容可能なビヒクルを含むことを特徴とする請求項６から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
皮膚及び／又は粘膜に施用するのに医薬的に許容可能なビヒクルを含むことを特徴とする請求項６から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明はアミジニウムファミリーに属する新規化合物、特にグアニジニウム、該化合物を含有する医薬組成物及びその使用に関する。
より詳細には、本発明は一般式Ｉ：
0004271260.tif 000002
｛式中、
Ｒ１はコレステロール誘導体又はアルキルアミノ基−ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’及びＲ”は相互に独立して飽和又は不飽和の直鎖又は分枝鎖Ｃ12〜Ｃ22脂肪族基を表す）を表し、
Ｒ２及びＲ３は相互に独立して水素原子又は一般式ＩＩ：
0004271260.tif 000003
［式中、
ｎ及びｍは相互に独立し且つＲ２及びＲ３基間で異なる０〜４の整数を表し、
Ｒ４及びＲ５は相互に独立して水素原子又は式ＩＩＩ：
0004271260.tif 000004
（式中、
ｐ及びｑは相互に独立して０〜４の整数を表し、ｒは０又は１であり、ｒが１のとき、ＸはＮＨ基を表し且つｘは１であるか、又はＸは窒素原子を表し且つｘは２であり、ｐ、ｑ及びｒはＲ４及びＲ５基間で独立して変化し得る）
の基を表す］の基を表し、
Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも一方は水素原子以外のものである｝
の化合物とその塩に関する。
好ましいサブファミリーとしては、特に本発明の範囲では一般式Ｉ中、Ｒ２又はＲ３が相互に独立して水素原子又は式ＩＶ：
0004271260.tif 000005
［式中、ｎ、ｍ及びｐは上記と同義であり、Ｒ４は水素原子又は式Ｖ：
0004271260.tif 000006
（式中、ｑ及びｒは上記と同義である）の基を表し、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは種々のＲ２及びＲ３基間で独立して変化し得る］の基を表す化合物が挙げられる。
これらの一般式（Ｉ）の新規生成物は医薬的に許容可能な非毒性塩の形態をとることができる。これらの非毒性塩は無機酸（塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸又は蓚酸）、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム）又は有機塩基（トリエチルアミン等の第３級アミン、ピペリジン、ベンジルアミン）との塩を含む。
本発明による化合物の例としては、特に下記一般亜式：
0004271260.tif 000007
（式中、Ｒ１は上記と同義である）の化合物を特に挙げることができる。
本発明のグアニジニウム及びアミジニウムの例としては、上記亜式ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸ中、Ｒ１がコレステリル基である化合物を特に挙げることができる。これらの３種の化合物を以下の文中では夫々ＢＧＳＣ（ビスグアニジノスペルミジンコレステロール）、ＢＧＴＣ（ビスグアニジノトレンコレステロール）及びＢＡＤＣ（二塩酸ビスアミジニウムジエチレントリアミンコレステロール）と呼ぶ。
本発明の化合物は非毒性と両親媒性により治療上特に有用である。これらの品質により、前記化合物は核酸の細胞トランスフェクションを想定した核酸の複合体形成に特に使用することができる。従って、これらの化合物は遺伝子治療で有利に使用できる。
化合物ＶＩＩ（ＢＧＳＣ）及びＶＩＩＩ（ＢＧＴＣ）はｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入に特に有利である。これらの２種の化合物はＤＮＡと複合体を形成し、治療しようとする細胞への輸送時にｐＨ変動による分解からＤＮＡを保護する。
従って、本発明は本発明による少なくとも１種の化合物を含有する医薬組成物に関する。本発明の好ましい実施態様において、化合物はビスグアニジノスペルミジンコレステロール（ＢＧＳＣ）であり、別の好ましい態様において化合物はビスグアニジノトレンコレステロール（ＢＧＴＣ）である。
遺伝子治療は発現不足及び／又は異常発現即ち１種以上の核酸の欠損又は過剰発現に関連する遺伝病を治療することを主たる目的とする。クローン化遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞発現によりこの種の遺伝子異常を補う試みがなされている。
今日、この種の遺伝情報の細胞内送達方法として数種の方法が提案されている。実際に利用されている技術の１つは明確に化学的又は生化学的ベクターを利用するものである。これらの合成ベクターはトランスフェクトしようとするＤＮＡを圧縮する機能と、その細胞固定及び細胞膜通過、場合によっては２つの核膜の通過を助長する機能との２つの主機能をもつ。Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）等の正電荷をもつカチオン脂質も提案されている。これらのカチオン脂質は負電荷をもつＤＮＡとリポソーム又は小ベジクルの形態で自発的に相互作用し、細胞膜と融合可能な脂質−ＤＮＡ複合体を形成し、こうしてＤＮＡの細胞内送達を可能にするという利点がある。しかし、特にＤＯＴＭＡの場合には、トランスフェクションレベルの良好な効率は生分解性の不足と細胞に対する毒性に結び付けられる。
ＤＯＴＭＡ以来、所謂「スペーサー」アームを介してアミノ基に結合した親油基というこの構造モデルで他のカチオン脂質も提案されている。これらのうちでは特に親油基として２種の脂肪酸又はコレステロール誘導体を含み、更に場合によりアミノ基として第４級アンモニウム基を含むものを挙げることができる。この分類のカチオン脂質の例としてはＤＯＴＡＰ、ＤＯＢＴ又はＣｈＯＴＢを特に挙げることができる。
本発明の化合物はその化学構造と生分解性に加え、核酸トランスフェクションベクターに必要な要件を明確に満たす。
従って、本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション、特に核酸のベクター輸送のための前記新規化合物の任意使用も目的とする。本発明は特に、少なくとも１種の本発明による化合物に加え、核酸を含む任意の医薬組成物に関する。
本発明の組成物において、少なくとも１種の本発明の化合物に結合した核酸はデオキシリボ核酸でリボ核酸でもよい。また、オリゴヌクレオチド配列でもポリヌクレオチド配列でもよく、天然起源でも人工起源でもよく、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列又は合成もしくは半合成配列が挙げられる。これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルス等の起源であり得る。核酸は治療遺伝子を含むことが好ましい。
従って、本発明の別の目的は、更に核酸を含む医薬組成物を提供することである。好ましくはこの核酸はデオキシリボ核酸又はリボ核酸である。本発明の好ましい実施態様では、核酸は治療遺伝子を含む。
本発明の意味では、治療遺伝子とは特に治療効果をもつタンパク産物をコードする任意の遺伝子を意味する。このようにコードされるタンパク産物はタンパク質、ペプチド等であり得る。このタンパク産物は標的細胞に対して同種であり得る（即ち標的細胞が疾病を示さないときに標的細胞で通常発現される産物）。この場合、タンパク質の発現は例えば、細胞における不十分な発現や、改変による不活性又は低活性のタンパク質の発現を緩和することができ、あるいは前記タンパク質を過剰発現させることができる。治療遺伝子は安定性を増加したり活性を改変するなどした細胞タンパク質の突然変異体をコードするものでもよい。タンパク産物は更に標的細胞に対して異種でもよい。この場合には、発現されるタンパク質は例えば細胞に欠損する活性を補ったり付加したりして細胞が疾病に対抗できるようにし、あるいは免疫応答を刺激することができる。
本発明の意味での治療産物としては、特に酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（ＦＲ９２０３１２０））、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン等、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７））、膵嚢胞性線維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等（ＦＲ９３０４７４５））、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子等の血液凝固に関与する因子をコードする遺伝子、ＤＮＡの修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビン又は他のタンパク質輸送体の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されるアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、代謝酵素（例えばリポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、７αコレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ）、脂質輸送タンパク質（例えばコレステロールエステルの輸送タンパク質及びリン脂質の輸送タンパク質）、ＨＤＬ結合タンパク質、又はＬＤＬ受容体、キロミクロンレムナント受容体及びスカベンジャー受容体等から選択される受容体を挙げることができる。
治療核酸は、標的細胞で発現すると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することができる遺伝子又はアンチセンス配列でもよい。このような配列は例えば特許ＥＰ１４０３０８に記載されている技術に従い、標的細胞で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡに転写され、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。治療遺伝子は標的ＲＮＡを選択的に破壊することが可能なリボザイムをコードする配列を含むものでもよい（ＥＰ３２１２０１）。
上述のように、核酸はヒト又は動物で免疫応答を発生することが可能な抗原ペプチドをコードする１個以上の遺伝子を含むものでもよい。従って、この実施態様によると本発明は特に微生物、ウイルス又は癌に対してヒト又は動物に施用されるワクチン又は免疫治療処置を提供することができる。特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、偽狂犬病ウイルス、シンシチウム形成ウイルス、他のウイルス又は腫瘍（ＥＰ２５９２１２）の特異的抗原ペプチドを挙げることができる。
好ましくは、核酸は更に所望細胞又は臓器で治療遺伝子及び／又は抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列も含む。このような配列としては、これらの配列が感染細胞で機能できるときに該当遺伝子の発現に天然に関与する配列を挙げることができる。（他のタンパク質又は合成タンパク質の発現に関与する）別の起源の配列でもよい。特に、真核細胞又はウイルス遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター配列が挙げられる。また、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化配列、調節配列等を付加してこれらの発現配列を修飾してもよい。また、プロモーターは誘導プロモーターでも抑制プロモーターでもよい。
更に、核酸は合成された治療産物を標的細胞の分泌経路に指向させるシグナル配列も特に治療遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療産物の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。核酸は更に合成された治療産物を細胞の特定区画に指向させるシグナル配列も含んでいてもよい。
本発明に記載するカチオン脂質、特にＢＧＴＣ及びＢＧＳＣはＤＮＡと複合体を形成することができ、該当治療核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ導入用ウイルスベクターに代わる有利な代用品である。グアニジニウム基の化学的性質、特にその高いｐＫａにより、これらのカチオン脂質はｐＨ変動による分解からＤＮＡ分子を保護することができる。実施例に記載する結果によると、これらの化合物は高い効率で多数の細胞型のトランスフェクションを可能にする。トランスフェクション効率は形成される複合体中のカチオン脂質／ＤＮＡ比に特に依存する。トランスフェクションに特に好ましい２種の化合物の比はＤＮＡ上のリン酸基１個につきグアニジニウム基６〜８個に相当する。
カチオン脂質／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率は中性脂質の付加とカチオンリポソームの形成により更に改善することができる。これらのリポソームはカチオン脂質と中性脂質の複合体により形成される。中性脂質はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジーステアロイル、−パルミトイル、−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、それらの１〜３倍Ｎ−メチル化誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（例えば特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴ脂質（例えば特にスフィンゴミエリン）及びアシアロガングリオシド（例えば特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択することができる。
ＤＯＰＥを使用するのが好ましい。
好ましくは、本発明の化合物と中性脂質は１〜５、より好ましくは２〜４の比で存在する。更に、ＤＮＡに対する合計脂質比（本発明の化合物と中性脂質の和）は、正電荷の純比が２〜５となるように選択すると有利である。この比は約３にすると特に有利である。
従って、本発明は本発明による化合物と中性脂質と核酸を含む任意の医薬組成物にも関する。好ましくは、本発明による化合物はＢＧＴＣとＢＧＳＣから選択される。同様に、中性脂質はＤＯＰＥが好ましい。核酸はデオキシリボ核酸でもリボ核酸でもよい。核酸は治療遺伝子を含むものが好ましい。
本発明のアミジニウム誘導体は前記適用以外に、核酸又はタンパク質間の相互作用レベルに介入して例えば遺伝子発現又は酵素活性（ポリメラーゼ、転写酵素等）の調節の所定のプロセスを阻害又は刺激したり、例えば膜プローブ／電極による抽出、除去又は検出のためにアニオン種を選択的に錯化したり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション操作を実施するための実験室試薬として使用する等の用途における利用も考えられる。
従って、本発明は上記のようなアミジニウム誘導体の直接又は医薬組成物の成分としての任意の治療的使用にも関する。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、特に所望臓器のレベルの直接注射に用いる注射用製剤又は局所投与（皮膚及び／又は粘膜）に医薬的に許容可能なビヒクルを更に含む。ビヒクルとしては特に滅菌等張溶液、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的食塩水を加えることにより注射用溶質を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物を挙げることができる。
以下、実施例と図面により本発明を更に詳しく説明するが、以下の実施例及び図面は例示に過ぎず、本発明を制限するものではない。
図面
図１：ＢＧＳＣ及びＢＧＴＣの製造操作プロトコールの模式図。
図２：ＢＡＤＣの製造操作プロトコールの模式図。
図３：脂質化合物／ＤＮＡ比の関数としてのトランスフェクション効率の測定。
図４：合計脂質／ＤＮＡ比の関数としてのトランスフェクション効率の測定。
図５：ＨｅｐＧ２（５Ａ）、ＨｅＬａ（５Ｂ）、ＮＩＨ３Ｔ３（５Ｃ）及び２９３（５Ｄ）細胞のトランスフェクション効率に及ぼす血清効果の測定。陰影付きの棒：血清の存在；陰影なしの棒：血清の不在下で２時間トランスフェクション。
図６：ＢＧＴＣ／ＤＯＰＥリポソームによるｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション後に呼吸器の上皮でレポーター遺伝子の発現を示すマウス気管の凍結切片の写真。（６Ａ）及び（６Ｂ）：上皮表面（６Ａ）及び粘膜下腺（６Ｂ）に局在したトランスフェクトした細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現の検出；（６Ｃ）：抗β−ガラクトシダーゼモノクローナル抗体を使用して免疫ペルオキシダーゼ標識により検出した粘膜下腺でβ−ガラクトシダーゼを発現する細胞；（６Ｄ）：抗ルシフェラーゼポリクローナル抗体を使用して免疫ペルオキシダーゼ標識により検出した粘膜下腺でルシフェラーゼを発現する細胞；（６Ｅ）：免疫ペルオキシダーゼ着色：抗体の不在下で行われた負の調節。
図７：ＤＮＡ／リポソームＢＧＴＣ複合体の静脈内注射によるｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入効率の測定。
図８：ＤＮＡ／リポソームＢＧＴＣ複合体の腹腔内注射によるｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入効率の測定。
Ａ−本発明による誘導体の製造
材料と方法
１．物理的測定
陽子核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲ）はスペクトロメーターＢｒｕｋｅｒ  ＡＣ２００で記録した。化学シフトはＴＭＳを基準としてｐｐｍで表す。
２．シリカクロマトグラフィー
・薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は厚さ０．２ｍｍのＭｅｒｃｋ  シリカゲルプレート上で実施した。
・カラムクロマトグラフィーは粒度０．０４０〜０．０６３ｍｍの６０  Ｍｅｒｃｋシリカゲル上で実施した。
実施例１
グアニジノスペルミジンコレステロールＢＧＳＣの製造
１．ジ−Ｂｏｃカルバメート（１）の製造
クロロギ酸コレステリル（０．９ｇ，２ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（０．２１４ｇ，２ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）溶液を１Ｎ，８Ｎ−Ｂｏｃ２−スペルミジン（０．６９０ｇ，２ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）溶液に加える。５時間還流後、混合物を水洗（２×５０ｍｌ）し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発させる。９５／５  ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨを溶離剤として使用して粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製すると、純カルバメート（１．３ｇ，８６％）が得られる。
1Ｈ  ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3，２００ＭＨｚ）：０．５−２．５（ｍ，コレステリル構造、シグナルＢｏｃ及びスペルミジンからの中心ＣＨ2基），３．１−３．３（ｍ，８Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３７（ｄ，１Ｈ，Ｈ6）。
２．アミノカルバメート（２）の製造
化合物（１）（１．３ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2  ２０ｍｌに溶かし、冷却（氷床）したこの溶液に、新たに蒸留したＣＦ3ＣＯ2Ｈ  ２ｍｌを加え、ＢＯＣ保護基を遊離させる。周囲温度で３時間撹拌後、１Ｎ  ＮａＯＨ  ５０ｍｌを加え、混合物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。有機層を水洗し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発させると、粗アミノカルバメート（２）（０．９４５ｇ，９８％）が得られる。
1Ｈ  ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3，２００ＭＨｚ）：０．５−２．５（ｍ，コレステリル構造及びスペルミジンからの中心基），２．７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｎ−ＣＯ−），３．２５（広幅ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），４．４９（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｈ6）。
３．ＢＧＳＣの合成
粗カルバメート（２）（０．９４ｇ）を８５／１５  ＴＨＦ／ＭｅＯＨ  ３０ｍｌに溶かす。次いで１Ｈ−ピラゾールカルボキサミジン（０．４９５ｇ，３．４ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．４３６，３．４ｍｍｏｌ）を８５／１５  ＴＨＦ／ＭｅＯＨ  ３０ｍｌに加える。周囲温度で１８時間撹拌後、ジエチルエーテル２５０ｍｌをゆっくりと加え、得られた沈殿をデカンテーションにより分離する。粗化合物をジエチルエーテルに３回懸濁し、デカンテーションにより分離すると、純ＧＳＣ（０．５７０ｇ，４７％）が得られる。
1Ｈ  ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯｄ6）２００ＭＨｚ：０．５−２．５（ｍ，コレステリル構造及び中心ＣＨ2），３．１（ｍ，８Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），４．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３（ｄ，１Ｈ，Ｈ6），７．２（広幅ｓ，８Ｈ，ＮＨ2＋），７．８（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）。元素分析：Ｃ37Ｈ67Ｎ7Ｏ2・２ＨＣｌの計算値：Ｃ６２．１５；Ｈ９．６７；Ｎ１３．７１。
元素分析結果：Ｃ６２．２８；Ｈ９．８１；Ｎ１３．１５。
実施例２
グアニジノトレンコレステロールＢＧＴＣの製造
１．アミノカルバメート（５）の製造
クロロギ酸コレステリル（１．８ｇ，４ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）溶液をトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）（１１．６８ｇ，８０ｍｍｏｌ）の飽和ＣＨ2Ｃｌ2（４００ｍｌ）溶液にゆっくりと加える。周囲温度で２時間撹拌後、水洗（３×１００ｍｌ）により不活性アミンを遊離させ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥後、溶媒を蒸発させる。次のように（５）を三塩酸塩として単離する。粗生成物をＭｅＯＨ  １０ｍｌに溶かし、ＨＣｌの飽和メタノール溶液（５ｍｌ）を滴下し、得られた沈殿をデカンテーションにより分離し、純化合物を得るためにＭｅＯＨに３回懸濁し、デカンテーションにより分離する。減圧乾燥後、純三塩酸塩（６）が得られる（１．７１ｇ，６４％）。
1Ｈ  ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3＋εＣＤ3ＯＤ，２００ＭＨｚ）：０．５−２．４（ｍ，コレステリル構造），２．５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＣＯ），２．８（広幅ｓ，４Ｈ，＋ＮＨ−ＣＨ2），３．０６（広幅ｓ，４Ｈ，ＣＨ2ＮＨ3＋），３．２０（ｍ，２Ｈ，＋ＮＨ−ＣＨ2），４．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３α），５．３（ｄ，１Ｈ，Ｈ6）。元素分析：Ｃ34Ｈ62Ｎ4Ｏ2・３ＨＣｌの計算値：Ｃ６１．１０；Ｈ９．８０；Ｎ８．３８。結果：Ｃ６１．２５；Ｈ９．９６；Ｎ８．２２。
２．Ｂ．ＧＴＣの製造
クロロギ酸コレステリル（２．２４ｇ，５ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）溶液をトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）（２９．２ｇ，２００ｍｍｏｌ）の高飽和ＣＨ2Ｃｌ2（２５０ｍｌ）溶液にゆっくりと加える。周囲温度で２時間撹拌後、水洗（３×１００ｍｌ）により不活性アミンを遊離させ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥後、溶媒を蒸発させる。粗生成物（３．２ｇ）を５０／５０  ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）に溶かした後、1Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシイミジン（１．４６５ｇ，１０ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（１．３ｇ，１０ｍｍｏｌ）の混合物に加える。周囲温度で１８時間撹拌後、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をデカンテーションにより分離する。純サンプルを得るために粗化合物をジエチルエーテルに３回懸濁し、デカンテーションにより分離し、減圧乾燥後に生成物（２．１５ｇ，６０％）が得られる。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ6，２００ＭＨｚ）：０．５−２（ｍ，コレステリル構造），２．２（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），２．６（広幅ｓ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），３．０（ｄ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），３．２（広幅ｓ，４Ｈ），４．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３（ｄ，１Ｈ，Ｈ6），７．３（広幅ｓ，８Ｈ，ＮＨ2＋），７．８（広幅ｓ，２Ｈ，ＮＨ）。元素分析：Ｃ36Ｈ66Ｎ8Ｏ2・２ＨＣｌの計算値：Ｃ６０．３９；Ｈ９．５７；Ｎ１５．６５。結果：Ｃ６０．３８；Ｈ９．６７；Ｎ１５．５６。
実施例３
二塩酸ビスアミジニウムＢＡＣＤの製造
１．ジニトリルの製造
クロロギ酸コレステリル（８．９７ｇ，２０ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）溶液をイミノプロピオニトリル（２．４６ｇ，２０ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（２．０２ｇ，２０ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）溶液に滴下する。周囲温度で６時間撹拌後、水洗（２×１００ｍｌ）し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥する。溶媒を蒸発させ、粗生成物（１０．５ｇ）をメタノールから再結晶させる（８．５９ｇ，８０％）。
1Ｈ  ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3，２００ＭＨｚ）：０．５−２．５（ｍ，コレステリル構造），２．７（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ2ＣＮ），３．６２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｎ−），４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３９（ｄ，１Ｈ，Ｈ6）。
２．ジチオアミドの製造
上記のように調製したジニトリル（０．３２４ｇ，６ｍｍｏｌ）とジエチルアミン（０．８８４ｇ，１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍｌ）溶液を５０℃に維持し、これに弱いＨ2Ｓ流を２時間バブリングする。青色溶液を氷上に注下し、こうして得られた沈殿を濾別する。この粗生成物をＣＨ2Ｃｌ2に溶かし、水洗する（２×５０ｍｌ）。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥後に、溶媒を蒸発させ、得られた生成物をメタノールから２回再結晶させる（１．８６ｇ，５１．５％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ6，２００ＭＨｚ）：０．５−２．５（ｍ，コレステリル構造），２．６７（ｔ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），３．５０（ｔ，４Ｈ，Ｓ＝Ｃ−ＣＨ2），４．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｈ6）。
３．二ヨウ化ジチオアミデートの製造
ジチオアミド（０．６０３ｇ，１ｍｍｏｌ）のアセトン（２０ｍｌ）溶液にヨウ化メチル（２ｍｌ）を加え、周囲温度で４８時間放置する。得られた沈殿を濾過する（０．７４１ｇ，８３．５％）。この生成物をそれ以上精製せずに直接使用する。
４．二塩酸ビスアミジニウムＢＡＤＣの製造
上記のように得られた二ヨウ化物（０．７４１ｇ，０．８３ｍｍｏｌ）のイソプロパノール（１０ｍｌ）懸濁液を還流しながらＮＨ3流を２時間バブリングした後、更に４時間加熱還流を続ける。イソプロパノールを蒸発させ、残渣をメタノール（１０ｍｌ）にとる。この溶液を塩基性イオン交換樹脂に通した後、溶離剤に塩酸流を通し、蒸発乾涸させる。こうして得られた二塩酸塩を最少量のエタノール（約５ｍｌ）に溶かす。僅かな不溶分を濾過し、濾液に著しく過剰のジエチルエーテルを加える。得られた粉末を濾過し、乾燥する（３２０ｍｇ，６０％）。イソプロパノールから再結晶させると、分析的に純粋な形態の所期生成物を単離することができる。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ6，２００ＭＨｚ）：０．５−２．６（ｍ，コレステリル構造及び−ＣＨ2−アミジニウム），３．５７（広幅ｓ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），４．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ3α），５．３（ｄ，１Ｈ，Ｈ６），８．６４（広幅ｓ，２Ｈ，ＮＨ2），９．０７（広幅ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１８（広幅ｓ，２Ｈ）。元素分析：Ｃ34Ｈ56Ｎ4Ｏ2・２ＨＣｌの計算値：Ｃ６５．２５；Ｈ９．３２；Ｎ８．９４。結果：Ｃ６５．４０；Ｈ９．８７；Ｎ９．５５。
Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入のための本発明による誘導体の使用
材料と方法
１−以下のトランスフェクション実験は実施例１及び２に記載したプロトコールに従って製造したＢＧＳＣ及びＢＧＴＣを用いて実施する。
２−リポソームの調製
クロロホルム（ＣＨＣｌ3）中のカチオン脂質とＤＯＰＥ（モル比３／２）の混合物を減圧蒸発させ、Ｎ２雰囲気下にｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁する。
最終脂質濃度は１．２ｍｇ／ｍｌである。
混合物を５分間渦形成した後、超音波発生器（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ２２１０）を使用して５分間「超音波処理」し、最終的に＋４℃で２４時間保存して水和する。
得られた分散液を再び５〜１０分間「超音波処理」（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｂｒａｎｓｏｎ  ４５０）し、リポソームを形成する。
遠心分離後、溶液を細孔直径０．２２μのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＳ，Ｍｉｌｌｅｐｏｒｅ）で濾過し、＋４℃で保存する。
レーザー回折装置（Ａｕｔｏｓｉｚｅｒ  ４７００，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりＢＧＳＣ又はＢＧＴＣを含むリポソームの寸法を調べた。この試験は、多モード数値分析で平均直径５０ｎｍに対応する単一ピークを示す。
３−細胞培養
トランスフェクション実験に使用した細胞系の大部分の起源（種及び組織）は表Ｉに示す。
ＨｅＬａ細胞系の細胞（Ｐ  Ｂｒｉａｎｄ，ＩＣＧＭ，パリ）は頸上皮由来ヒト癌に由来する。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｃ  Ｌａｇｒｏｕ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，リール）はマウス繊維芽細胞である。
ＮＢ２Ａ細胞系（Ｃ．Ｇｏｕｇｅｔ，パリ）はマウス神経芽腫に由来する。
ＡｔＴ−２０及びＰＣ１２細胞以外の全細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＧＩＢＣＯ）、１００単位／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ）及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充した変形ダルベッコ培地（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）中で培養した。
ＡｔＴ−２０細胞は１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。
ＰＣ１２細胞は１０％ＦＣＳと５％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。
全細胞は５％ＣＯ2の湿潤大気下でプラスチックびん（Ｆａｌｃｏｎ）に培養保存した。
４−プラスミド
プラスミドｐＲＳＶ−Ｌｕｃ（Ｏ．ＢＥＮＳＡＵＤＥ，ＥＮＳ，パリ）及びｐＲＳＶ−ｎｌｓＬａｃＺは標準技術により大腸菌で増幅し、ＣｓＣｌ勾配上で精製した。プラスミドｐＲＳ−Ｖ−ｎｌｓＬａｃＺ及びプラスミドｐＲＳＶ−Ｌｕｃにおいて大腸菌のＬａｃＺ遺伝子とその核局在シグナル配列及びルシフェラーゼ遺伝子は夫々ＬＴＲ／ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）の転写調節下にある。プラスミドｐＸＬ２７７４はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。
５−ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションプロトコール
トランスフェクションの前日に各ウェル２×１０5個の細胞を接種する（Ｆａｌｃｏｎ６穴プレート）。
各ウェルに異なる細胞系を接種する。
従って、トランスフェクション当日に細胞は半集密になる。
ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ２５０μｌでプラスミドＤＮＡ（５μｇ）と所望量のビスグアニジニウム脂質を各々希釈し、渦形成した。約５分後に２種の溶液を周囲温度で１５分間インキュベートした。次に、無血清培地で洗浄した細胞にトランスフェクション混合物を加える（０．５ｍｌ／ウェル）。３７℃で４〜６時間インキュベーション後、トランスフェクション混合物を取り出さずに血清を含む培地１ｍｌを各ウェルに加える。トランスフェクションから２４時間後に培地を新鮮な培地１ｍｌに交換する。トランスフェクションから２日後に細胞を回収し、ルシフェラーゼの発現を測定する。
対照トランスフェクションは次の市販トランスフェクション剤を使用して実施した。
−リポポリアミンＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（ＪＰ  Ｂｅｈｒ，ストラスブール，フランス）は６〜８のＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）／ＤＮＡイオン電荷最適比でアルコール溶液として使用した。
−Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス）は、中性脂質ＤＯＰＥと、カチオン脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）を含むリポソーム製剤である。
ＤＮＡ／リポソーム複合体は製造業者に推奨されている標準条件で得た。
−リン酸カルシウム沈殿により細胞にトランスフェクトした。（Ｋｅｏｗｎ，Ｗ．Ａ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｒ．Ｓ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１８５，５２７−５３７）。
６−ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施したトランスフェクションのルシフェラーゼ測定
ルシフェラーゼ活性はトランスフェクションから４８時間後にＤｅ  Ｗｅｔら（Ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．，ＤｅＬｕｃａ，Ｍ．，Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．＆  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，７２５−７３７）の方法の変法を使用して測定する。
−培地を除去する。
−冷リン酸緩衝塩類溶液で細胞を洗浄する。
−次に、溶解用緩衝液（２５ｍＭ  三リン酸塩ｐＨ７、８．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオトレイトール、１５％グリセロール及び１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）２５０μｌ中でインキュベートして細胞を溶解させる。
−マイクロ遠心機で遠心分離（１５分、＋４℃）により不溶分を除去後に透明溶解液を得る。
−２５ｍＭ  ＡＴＰ（ｓｉｇｍａ）９μｌと２５ｍＭルシフェリン（ｓｉｇｍａ）２０μｌを加えた溶解用緩衝液１００μｌで細胞抽出物のアリコート（２０μｌ）を希釈する。
−サンプルをルミノメーター（Ｌｕｒｍｅｔ  ＬＢ９５０１  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｎａｓｈｕａ，ＮＨ）に入れ、発光を１０秒間測定する。
精製ホタルルシフェラーゼ（ｓｉｇｍａ）の種々の希釈液を使用することによりＲＬＵ／ルシフェラーゼ曲線を校正した処、曲線の直線部分は１０4〜１０7ＲＬＵ（相対光単位）に相当することが判明した。
タンパク濃度は対照としてウシ血清アルブミンを使用してＢＣＡ（ビシンコニン酸）試験により測定した。
ルシフェラーゼ活性のデータはＲＬＵ／ｍｇタンパク質で表す。
７−マウス気道レベルのｉｎ  ｖｉｖｏ注入プロトコール
使用したマウスはＩｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ（リヨン、フランス）から入手したＯＦ１雄マウス（体重３０ｇ）である。カチオンリポソームＢＧＴＣ／ＤＯＰＥ（モル比３：２）を使用する。トランスフェクション混合物はプラスミドＤＮＡ１０μｇ（水１０μｌ中）、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ溶媒（ｐＨ７．４）中カチオンリポソーム２０μｌ（合計脂質濃度５ｍｇ／ｍｌ）から得る。こうして形成されたＤＮＡ／脂質凝集物は約６の電荷比をもつ。
マウスをペントバルビタールで麻酔後、気管内腔に挿入したカニューレを介して気管内点滴注入によりトランスフェクション混合物（３０μｌ）を気道に注入する。点滴注入から４８時間後にペントバルビタールの過剰投与により動物を殺し、肺と気管を取り出して分析する。
８−Ｘ−ｇａｌ着色
一次培養物における大腸菌β−ガラクトシダーゼの発現を定量するために、細胞に４℃で４％パラホルムアルデヒド溶液を１５分間含浸させた後、色原体β−ガラクトシダーゼ基質のＸ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートする。トランスフェクトした細胞の核の青色着色をルミネセンスにより顕微鏡で定量する。
９−ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクトした気道のレベルのＸ−ｇａｌ細胞の定量
気道のレベルのＸ−ｇａｌ細胞の検出のために、肺と気管を４％パラホルムアルデヒドで１時間処理した後、３０％スクロースを含有するＰＢＳに一晩浸漬し、次いで冷凍用媒体に入れ、液体窒素で冷凍する。次に５μのクリオスタット切片をＸ−ｇａｌ試薬（Ｓｉｇｍａ）と共に一晩インキュベートして着色し、β−ガラクトシダーゼ活性を試験する。
１０−ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクトした気道のレベルのルシフェラーゼの定量
ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性を定量するために、組織フラグメントを溶解用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−リン酸ｐＨ７．８、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１５％グリセロール及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）３０μｌの存在下におき、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｌａｂｏ、ストラスブール、フランス）で約１分間溶解し、氷上で保存する。遠心分離後、溶解液２０μｌを定量に使用する。ルシフェラーゼ活性はＲＬＵ／ｍｇタンパク質として表す。
１１−免疫組織化学分析プロトコール
肺と気管のサンプルの冷凍切片を５μｇ／ｍｌの抗大腸菌β−ガラクトシダーゼマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）又は１：４００希釈ウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に１時間インキュベートする。
大腸菌β−ガラクトシダーゼタンパク質はビオチンで標識したマウス抗Ｉｇ二次抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）とストレプトアビジン−ＰＯＤ結合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して免疫ペルオキシダーゼ着色により定量する。ルシフェラーゼタンパク質は抗ウサギヤギ抗体（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）とウサギペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ系（ＰＡＰ）（Ｄａｋｏ  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）を使用して免疫ペルオキシダーゼ着色により定量する。切片をルミネセンスにより顕微鏡で試験する。抗体なしで負の調節を行う。
実施例４
種々のトランスフェクション剤／ＤＮＡ比でのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
ＢＧＴＣ／ＤＮＡ凝集物を用いて得られるトランスフェクション効率を最適化するために、本願出願人は慣用トランスフェクション法に比較的感受性であることが知られている３種の異なる哺乳動物細胞でＢＧＴＣ／ＤＮＡ比がトランスフェクション率に及ぼす影響を試験した。結果を図３に示す。
即ち、マウス繊維芽細胞３Ｔ３、ヒト上皮細胞ＨｅＬａ及びマウス神経芽腫ＮＢ２Ａを用いてトランスフェクション実験を実施した。これらの実験中に一定量のプラスミドｐＲＳＶ−Ｌｕｃを溶液中の可変量のＢＧＴＣと接触させた。被験比範囲の決定にあたり、本願出願人はＤＮＡ１μｇが負電荷をもつリン酸３ｎｍに等しく、２個のグアニジニウム基のみが凝集物形成及びトランスフェクションの中性ｐＨで正電荷をもつという前提に立った。トランスフェクションから４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定する。ルシフェラーゼの発現はＤＮＡのリン酸基１個につき６（ＨｅＬａ細胞）〜８個（３Ｔ３、ＮＢ２Ａ細胞）のグアニジニウム基を含む凝集物即ち大きい正電荷をもつ凝集物で最大である。
実施例５
種々の細胞型によるｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
カチオン脂質による遺伝子導入は、仲介を必要としないだけでなく、異なる組織及び生物の非常に多種多様の細胞にトランスフェクトできるという点で魅力的なトランスフェクション技術である。トランスフェクション剤としてのＢＧＴＣの効力の範囲を調べるために、異なる起源の数種の細胞系を試験した。結果を下表１に示す。最大効率にするために電荷比は６〜８に選択した。比較のために、リポポリアミンとリン酸カルシウムを使用して同一系の細胞に同様にトランスフェクトした。その結果、ＢＧＴＣは一般にＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍよりも有効であり、リン酸カルシウムよりも２倍有効である。
0004271260.tif 000008
実施例６
中性脂質の存在下のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
化合物ＢＧＳＣはＢＧＴＣよりも水性媒体に溶けにくいので、ＢＧＳＣは中性脂質ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の存在下にリポソームの形態で使用した。配合物はモル比３／２で調製する。ＢＧＴＣを含む第２の調製物も同一条件でＤＯＰＥの存在下に調製した。
６．１−合計脂質／ＤＮＡ比の決定
本願出願人はまず最初にＨｅＬａ細胞でのトランスフェクション実験中に脂質／ＤＮＡ比を決定した。得られた曲線を図４に示す。リポソームＢＧＳＣ／ＤＮＡ比が２．５〜３を中心に１．５〜５であるときに最適トランスフェクションが得られる。グアニジニウム基は中性ｐＨで陽子化されるので、最良の凝集物ＢＧＳＣ−ＤＯＰＥ／ＤＮＡは約３の正電荷をもつ（図４）。
従って、最良のＢＧＳＣ−ＤＯＰＥ／ＤＮＡ比はＢＧＴＣ／ＤＮＡ型の凝集物で得られる比（６〜８）よりも小さい。カチオン脂質の存在下のトランスフェクションはＤＯＰＥの存在とその紡錘生成性質により助長される。
６．２−カチオン脂質による種々の細胞系のトランスフェクション
本願出願人はモル比３／２のカチオン脂質配合物ＢＧＳＣ−ＤＯＰＥ及びＢＧＴＣ−ＤＯＰＥを使用することにより種々の細胞系でトランスフェクション実験を行った。これらの２種の遺伝子導入系で脂質のグアニジニウム／ＤＮＡのリン酸電荷比は約２．５（〜３）である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）によるトランスフェクションを対照として用いる。結果を下表２に示す。
これらの結果から明らかなように、カチオン脂質の形態のグアニジニウム基をもつコレステロールの誘導体はＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎと少なくとも同等にトランスフェクションに有効である。これらの結果は当然、各細胞系毎に最適化することができる。
0004271260.tif 000009
実施例７
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入効率に及ぼす血清タンパク質の存在の効果の検討
カチオン脂質をベースとするトランスフェクション組成物の大部分は血清の存在下で効率が低下する。本実施例は、血清効果に対する本発明の化合物の感受性を試験することを目的とする。
７．１−カチオン脂質配合物
本発明に記載する脂質をエタノールに可溶化させる。
ｉ）ＤＯＰＥの存在下で次のように「リポソーム」溶液を得る。クロロホルムに溶かしたＤＯＰＥ（ＡＶＡＮＴＩ）を脂質のエタノール溶液に３／２のカチオン脂質／ＤＯＰＥモル比で加える。蒸発乾涸後、混合物を水にとり、５０℃に３０分間加熱する。
ｉｉ）ＤＯＰＥ溶液の代わりにクロロホルムを使用する以外は「リポソーム」獲得について記載したプロトコールに従って「ミセル」溶液を得る。
溶液はいずれも１０ｍＭのカチオン脂質濃度に調整する。
７．２−核酸
使用した核酸はプラスミドｐＸＬ２７７４である。
７．３−サイトフェクタント混合物（即時調合調製物）
ＤＮＡを１５０ｍＭ  ＮａＣｌで２０μｇ／ｍｌに希釈し、種々のカチオン脂質配合物を水で４０、８０、１２０及び１６０μＭに希釈する。ＤＮＡ溶液と脂質溶液を徐々に混合し、夫々濃度２、４、６及び８ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡとし、塩濃度は７５ｍＭとする。
７．４−トランスフェクション
細胞を適当な条件で２４穴マイクロプレート（２ｃｍ２／ウェル）で培養し、集密の５０〜７０％で指数増殖期にトランスフェクトする。血清タンパク質を含まない溶媒５００μｌで細胞を２回洗浄し、無血清培地（血清の不在下のトランスフェクション）又は完全培地（血清の存在下のトランスフェクション）で再増殖させ、サイトフェクタント混合物５０μｌ（０．５μｇＤＮＡ／ウェル）を細胞に加える（３ウェル／脂質−ＤＮＡ条件）。
「血清の不在下」で細胞にトランスフェクトする場合には、トランスフェクションから２時間後に適量の血清を増殖培地に補充する。
Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の使用に関する指示に従ってルシフェラーゼの発現を測定することによりトランスフェクション効率を評価する。細胞溶解液中のタンパク質濃度の測定によりサイトフェクタント混合物の毒性を推定する。
７．５−結果（図５）
４種の細胞型（ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ）で得られた結果によると、試験条件では「リポソーム」形態の配合物のほうが「ミセル」形態の配合物よりも有効である。更に、カチオン脂質を含むサイトフェクタント調製物の大部分で観察される結果に反して、「リポソーム」又は「ミセル」」形態のＢＧＴＣで血清の存在に結びつけられる有意な阻害効果は試験トランスフェクション条件では検出されなかった。
実施例８
リポソームＢＧＴＣ／ＤＯＰＥによるマウス気道における導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
このために、カチオンリポソームＢＧＴＣ／ＤＯＰＥを使用した。凝集物ＤＮＡ／リポソームの獲得と投与プロトコールについては、材料と方法の項に記載した通りに実施する。
リポソームＢＧＴＣ／ＤＯＰＥによりプラスミドＬａｃＺを細胞にトランスフェクションしてから４８時間後に処理したマウスの気道の上皮でＸ−ｇａｌ細胞を検出する。結果を図６に示す。
トランスフェクトした細胞の大部分は気管に局在しており、数個のＸ−ｇａｌ細胞のみが第二分岐気道に観察される。この型の分布は他の細胞トランスフェクションで既に報告されている。
本願出願人は更にレポーター遺伝子の産物を同定するために免疫組織化学分析を行った。上皮表面のレベルにトランスフェクトされた細胞は大半が成熟細胞である（図６Ａ）。これらのデータから明らかなように、カチオンリポソームは非増殖性で完全に分化し終えた気道上皮細胞に遺伝子のトランスフェクションを誘導することができる。導入遺伝子の発現は粘膜下腺でも検出される（図６Ｂ）。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体を使用し、トランスフェクトした細胞を免疫標識により検出すると、粘膜下腺と表面上皮でこの発現が確認される（図６Ｃ）。ＢＧＴＣ／ＤＯＰによるｐＲＳＶ−Ｌｕｃのトランスフェクション後にルシフェラーゼタンパク質に対する抗体を使用して免疫ペルオキシダーゼ着色により試験した場合にも、粘膜下腺に導入遺伝子発現が検出される（図６Ｄ）。
陰性対照群は、抗体不在下で実施した（図６Ｅ）。
以上の結果は膵嚢胞性線維症に対する遺伝子治療に特に有用である。実際に、この疾病の治療には、ヒト気管支におけるＣＦＴＲの発現の主要部位である粘膜下腺を標的にすることが必要である。
実施例９
ＢＧＴＣ／ＤＯＰＥのｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション効率の定量
このために、実施例８に記載した条件でリポソームＢＧＴＣ／ＤＯＰＥとプラスミドｐＲＳＶ−Ｌｕｃで処理したマウスの肺と気管をトランスフェクションから４８時間後に取り出し、材料と方法の項に記載したプロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を定量する。
結果を下表３に示す。
0004271260.tif 000010
ルシフェラーゼ活性は気管のホモジネートでは一貫して検出されるが、肺のホモジネートではそうではない。この結果はＸ−ｇａｌに陽性の細胞の分布試験時に得られた上述の結果に一致する。プラスミドＬａｃＺを含む対照では活性を全く検出することができなかったので、ルシフェラーゼの発現は発現プラスミドに直接結びつけられると考えられる。対照としてベクターを用いずにプラスミドのトランスフェクションも実施した。この対照試験ではルシフェラーゼの発現は全く観察されない。
以上の結果は、気道のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子トランスフェクションにリポソームＢＧＴＣ／ＤＯＰＥが有効であることを立証するものである。
実施例１０
静脈内又は腹腔内注射によるｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入
カチオン脂質とＤＮＡの配合物は実施例７に記載した通りである。
１０．１−カチオン脂質の用量効果（図７〜８）
３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グルコースに溶かしたトランスフェクト混合物２００μｌを５週齢ＢａｌｂＣマウスに静脈内（尾静脈）又は腹腔内経路で注射し、トランスフェクションから２４時間後に静脈内注射の場合は肺、腹腔内注射の場合は肝臓と脾臓でルシフェラーゼの発現を調べる。プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  １６９７４９８）を加えた溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１５３Ａ）に臓器を冷却下に取り出し、粉砕機Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＤＩＡＸ６００で均質化する。組織抽出物の１４０００ｇ上清でルシフェラーゼ活性を調べる。
静脈内注射
ＤＮＡ  ５０μｇと「リポソーム」形態の種々の濃度のＢＧＴＣの複合体を各マウスに投与する。検出されたカチオン脂質ｎｍｏｌ／μｇ  ＤＮＡの最適比は９であり（図７）、９００ｎｍｏｌまでのＢＧＴＣを注射しても毒性は全く検出されなかった。
腹腔内注射
各マウスに「リポソーム」形態のＢＧＴＣをＤＮＡ１００μｇと共に注射した。肝臓（図８Ｂ）と脾臓（図８Ａ）のいずれでも最大発現は１．５ｎｍｏｌＢＧＴＣ／μｇ  ＤＮＡで得られる。
１０．２−静脈内注射後の発現動態
３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グルコース中の「リポソーム」ＢＧＴＣ／ＤＮＡ混合物２００μｌ（ＤＮＡ５０μｇ及び９ｎｍｏｌ  ＢＧＴＣ／μｇ  ＤＮＡ）を５週齢ＢａｌｂＣマウスの尾静脈に注射後の時間の関数として７種の臓器におけるルシフェラーゼの発現の生体分布を調べた。結晶化形態で市販されているルシフェラーゼによる校正曲線に従い、各臓器毎に抽出されたルシフェラーゼｐｇとして結果を表す。検出限界はルシフェラーゼ０．５〜１ｐｇに位置する。
試験条件では、最大発現は試験した７種の臓器のうちの６種即ち横隔膜、腓腹筋、心臓、肺、腎臓及び脾臓ではトランスフェクションから２３時間後に得られることが判明した。肝臓レベルでの発現はもっと早いと思われる。最大発現はトランスフェクションから２３時間後に肺レベルで０．５ｎｇの比率で得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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