(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコバクテリア細胞を含有する喀痰試料から、核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害する物質の量を減少させる方法であって、
（ａ）ミコバクテリア細胞を溶解させる前に、（ｉ）該物質を可溶化し、且つ（ii）該ミコバクテリア細胞から核酸を放出させず、かつ、（ｉｉｉ）カオトロピック試薬である試薬に該ミコバクテリア細胞を接触させる工程と、
（ｂ）該試薬から該ミコバクテリア細胞を分離する工程と
を含んでなる方法。
【請求項２】
試薬は、ＮａＩ、ＮａＣｌＯ４ 、ＫＩ、ＮａＳＣＮ、ＫＳＣＮ、イソチオシアン酸グアニジン、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウムおよび尿素から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カオトロピック試薬が、イソチオシアン酸グアニジンである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
塩基性ｐＨの溶液中にイソチオシアン酸グアニジンが存在する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨが、９．０である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イソチオシアン酸グアニジンの濃度は６Ｍである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
分離が、洗浄および遠心分離による請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）の前に、細胞がペレット化される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の分野は、広く核酸ハイブリダイゼーションに関する。さらに詳細には、本発明は、試料中の核酸ハイブリダーゼーションを阻害する物質の減少に関する。このようなハイブリダイゼーションには、目的とする核酸の存在および／または量を決定するための核酸プローブハイブリダイゼーション、および核酸増幅過程を開始するための核酸プライマーハイブリダイゼーションが含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）、核酸配列を基本とする増幅（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）などの核酸増幅過程を使用して、試料中に存在するコピー数が少ない、目的とする特定の核酸配列（標的配列）のコピーが多数作製される。しかし、このような試料中によくみられる多くの物質は、増幅過程を開始するためのプライマーのハイブリダイゼーションを阻害するため、核酸増幅過程の阻害を引き起こす。同様に、このような物質は、未増幅標的核酸の検出に使用される直接核酸プローブハイブリダーゼーション反応を阻害する。
【０００３】
このような核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の例は、血液試料中によくみられ、ＰＣＲを阻害するヘムおよびヘマチンから誘導されるポルフィリン化合物である（PCR Technology, Stockton Press, Henry A. Erlich, Ed. pp 33-34, 1989)。浸透による溶解、及び、核片と細胞片のペレット化を用いるプロトコルが、これらの阻害物質の量を減らすために使用されてきた。
唾液試料もＰＣＲ阻害物質を含むと報告されている。 Ochert et al., PCR Methods and Applications 3, 365-368 (1994)。阻害物質は同定されなかったが、唾液試料をマイクロ波で長時間加熱したり煮沸したりすると、ＰＣＲ阻害が完全に排除されることが確認された。
【０００４】
Frickhofen and Young, J, Virol, Methods 35, 65-72 (1991)には、血清試料を７０℃で４５秒間加熱すると、ウイルス核酸配列のＰＣＲ増幅が改善すると報告されている。この改善は、ＰＣＲ過程を阻害すると考えられるアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ペプスタチンなどの血清酵素の熱不活化に起因すると理論づけられている。
ウイルス核酸配列の増幅に先立ってＰＣＲ阻害物質を血清から除外する他の方法は、Zeldis et al., J. Clin. Invest. 84, 1503-1508 (1989)により示されている。この方法には、ウイルスを抗体被覆微粒子に吸着させること、微粒子を洗浄すること、ＰＣＲを阻害すると考えられる残りのタンパク質をプロテイナーゼＫで破壊することが含まれる。
【０００５】
羊水中、胎児血清中、新生児血清中および脳脊髄液中のトレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）をＰＣＲで検出しようとして、ＰＣＲ阻害化合物を除去するために異なる４つの方法を試みた。 Grimprel et al., J. Clin. Microbiol. 29, 1711-1718 (1991)。簡単に記述すると、ＰＣＲ阻害化合物を除去するための４つの方法は、（１）試験管内の試料を沸騰している水浴中に１０分間入れ、氷で冷却し、遠心分離する煮沸法、（２）試料に滅菌リン酸緩衝食塩水を加え、一連の遠心分離に供し、ペレットを再懸濁して１０分間煮沸し、その後氷で冷却する低スピン分離法、（３）１ＭのＮａＣｌ、１ＮのＮａＯＨおよび０．１％ＳＤＳ中で試料を１．５分間煮沸し、０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコールによる一連の抽出に供し、イソプロピルアルコールで沈殿させるアルカリ溶解抽出法、（４）試料を上述の（２）に記載の通りに低スピン分離に供し、続いて１０分間煮沸し、フェノール−クロロホルム抽出を１回行った後、冷無水エタノールで沈殿させた。著者の報告によれば、これらの方法は使用した試料のタイプによって成功が異なる。
【０００６】
糞便試料では、逆転写酵素−ＰＣＲ過程を阻害する可能性がある小粒子および可溶性物質のかなりの量がポリエチレングリコール沈殿により除去されることが確認された。Jiang et al., J. Clin. Microbiol. 30, 2529-2534 (1992)。沈殿後、フェノール−クロロホルム抽出とともに、陽イオン洗浄剤である臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を高塩濃度で使用して、抽出過程を実施しした。
Wilde et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1300-1307 (1990)により、ＰＣＲ阻害物質を糞便試料から除去する別の方法が報告されている。糞便試料からロタウイルス核酸を検出するためにＰＣＲを使用する前に、一連の急速洗浄工程中および溶出工程中にクロマトグラフィーセルロース繊維粉末（ＣＦ１１粉末）を使用してロタウイルスＲＮＡを精製する工程を付加して抽出過程を一部変更した。
【０００７】
ＰＣＲを使用して尿中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出する試験を実施するとき、尿素がＰＣＲを阻害することが確認された。 Khan et al., J. Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991) 。この参考文献には、単純透析または超遠心分離によって尿中の尿素のＰＣＲ阻害作用が効果的に除去されることが報告されている。
Buffone et al., Clin. Chem. 37, 1945-1949 (1991)には、ＣＭＶ核酸を検出する前にＰＣＲ阻害物質を尿から除去する別の方法が報告されている。この過程は、ＣＭＶからの核酸放出後に行われ、増幅用核酸の回収前に、タンパク質および他の物質を選択的に溶出することができるように、細かいガラスビーズを使用して核酸を吸着させる。
【０００８】
上述の参考文献から明白なように、核酸増幅阻害に関する出版物は、そのほとんどがＰＣＲに関連している。しかし、これらのＰＣＲを阻害する同物質、ならびに、タンパク質物質、ＥＤＴＡ、ヒトＤＮＡおよび鉄などの臨床試料によくみられる他の多くの物質は、ＳＤＡおよび他の核酸増幅過程も阻害することが確認されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
これらの核酸ハイブリダイゼーション阻害物質を減少または除去するための方法は、そのほとんどが、試料処理方法論を加えなければならない、かなり時間のかかる複雑な工程を含む。比較的厳しい処理工程または条件を使用し、及び／または他の物質から標的核酸を分離することが必要な方法に伴う別の問題は、一部の標的核酸配列が喪失することである。核酸増幅過程は非常に少数のオリジナル標的から標的配列（アンプリコン）のコピーを多数作製する能力を有するが、より多数のオリジナル標的が試料中に存在すれば、増幅効率および検出能力が改善される。抗酸性バチルス属（ａｃｉｄ  ｆａｓｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ；ＡＦＢ）スミア陰性結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）試料など、検出することが特に難しい試料を処理するとき、検出能力が高いことは非常に重要であろう。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
核酸ハイブリダイゼーションを阻害する物質が試料中に存在することに関連した問題に対処するために、したがって、標的核酸配列のより効率のよい増幅および検出改良を実現するために、本発明は、増幅すべき核酸を含有する試料中の細胞溶解前に、細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触させ、その後、細胞を試薬と分離させることによって、試料中の阻害物質の量を減少させる方法を提供する。
【００１１】
本発明で使用するのに有用な試薬の例としては、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック試薬などがある。また、細胞と試薬との分離は、一般にその試薬が溶解できる溶液を用いた洗浄工程および遠心分離工程によって行われる。
添付の図とともに以下の詳細な説明を読むと、本発明の様々な目的、長所および斬新な特徴を容易に理解できるであろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】
上述の通り、本発明は、ハイブリダイゼーション過程に供せられる核酸を含む細胞を含有する試料から、核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害する物質の量を減少させる方法に関する。本方法では、核酸を含有する細胞が試料中に残存するように、試料中の細胞を溶解する前に、このような物質を可溶化し且つ細胞から核酸を放出させない試薬を試料と接触させる。次に、このような細胞を試薬とから分離させる。
上述の従来の技術の章の記載から明白なように、他者が阻害物質を除去するために試行した方法のいくつかは複雑であったため、本方法の結果は特に意外であった。また、カオトロピック塩類は細胞の可溶化や溶解に特に有用であることが教示されている米国特許第５，４８２，８３４号などの様々な参考文献から明白なように、本発明の方法に使用される試薬は、一般に細胞壁溶解や可溶化によって細胞から核酸を放出させるのに有用であると当業者により考えられていた。
【００１３】
Hubbard et al., Experimental & Applied Acarology 19, 473-478 (1995), Boom et al., J. Clin. Microbiol. 28 495-503 (1990), Reek et al., BioTechniques 19, 282-285 (1995), Chungue et al. J. Med. Virol. 40, 142-145 (1993)およびShah et al., J. Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995) などの参考文献には、チオシアン酸グアニジウム（ＧｕＳＣＮ）など、カオトロピック試薬の細胞壁溶解特性も報告されている。同様に、Delacourt et al., J. Pediatrics 126, 703-710 (1995), Lee and Choi, J. Micorobiol. & Biotechnol. 5, 181-187 (1995), Cano et al., J. Food Protection 58, 614-620 (1995), Bartolome et al, J. Hepatol. 17, s90-s93 (1993), Rajagopaian et al., Lett. Applied Microbiol. 21, 14-17 (1995) およびShieh et al. J.Virol. Methods 54, 51-66 (1995)などの参考文献に教示されているように、ＧｕＳＣＮなどのカオトロピック試薬や洗浄剤は、細胞からの核酸の抽出に広く使用されてきた。それゆえ、細胞溶解前に試料中の細胞をこのような試薬と接触させて核酸ハイブリダイゼーション阻害物質を除去することを特徴とする本発明の迅速且つ簡単な方法は、当該分野で使用されている他の方法を考慮すると意外であった。
【００１４】
また、本発明の方法の長所の１つは、試料中の細胞からの標的核酸の初期収率を上昇させることができることである。核酸増幅過程は非常に少数の初期標的から標的配列の多くのコピー（アンプリコン）を作製することができるが、できる限り多い初期標的物を用いて増幅過程を開始することは有益である。細胞溶解に後続する核酸ハイブリダイゼーション阻害物質配列を除去する他の方法は、核酸を溶解物中の他の物質と分離することに基づいているため、悪名が高いほど非能率的である。それゆえ、多くの初期標的は回収されない。本方法では、細胞溶解の前に阻害物質が除去され、その後の分離を必要とせず、初期標的のよりよい収率が達成される。
【００１５】
本発明の方法に供することが可能な試料には喀痰試料、血液試料、尿試料、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）試料などの実質的にすべてのヒト臨床試料および獣医学臨床試料、水試料、空気試料および土壌試料などの環境試料、および食物試料などが含まれる。本発明の方法に供することが可能な試料は、増幅過程開始のための直接プローブハイブリダイゼーションやプライマーハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション過程に供せられる標的核酸配列を含む細胞の含有が疑わしい。
【００１６】
核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害し、且つ一般にこのような試料中でみられる物質としては、ヒト試料中のタンパク質材料およびヒトＤＮＡや獣医学試料中の動物ＤＮＡなどがある。上述の従来技術の章で検討した通り、これらの物質はＳＤＡ、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなどの核酸増幅過程を阻害することが知られている。
本発明の方法の第一のステップでは、阻害物質が溶解でき、且つ細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触させる。この接触は、標的核酸を放出させるための細胞溶解前の何時でも行うことが可能である。しかし、細胞をこのような試薬と接触させる好ましい時期は、試料を幾らか操作して、細胞の位置を集中させたり細胞をペレット化した後である。一般に、このような集中は遠心分離の結果であるが、濾過や選択的吸着に起因することもある。
【００１７】
このように細胞を集中させると、細胞の位置が限定されているため、試薬はより確実に細胞と接触し、試薬をより効率よく使用することが可能になる。細胞と試薬との接触は、好ましくは細胞の比較的短時間の洗浄である。一般に、細胞と試薬の接触は、約５分間までである。
多くの試薬が本発明の方法に有用である。このような有用な試薬の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、Ｃｈａｐｓ、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、尿素など、当業者に周知のカオトロピック試薬や洗浄剤などがある。当該分野で通常の熟練者は、このような試薬の２つの主たる特徴、すなわち、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の可溶化の程度および細胞から核酸が放出されないことに向けられた通常行われるスクリーニングアッセイを実施することによって、本発明の方法に有用な他の試薬を確認することができ、成功がかなり期待される。
【００１８】
簡単に記述すると、試薬を細胞と接触させ、その細胞を遠心分離し、通常行われるスクリーニングアッセイで細胞に共通な標的核酸配列の増幅反応を上清に実施した。標的配列が増幅される場合、試薬は細胞から核酸を放出させるため、この試薬は本発明の方法で使用するための要件を満たさないが、標的配列の増幅がみられず、内部コントロール配列が増幅すれば、この試薬は本発明の方法に有用と考えられる。次に、細胞から核酸を放出させない試薬を既知の核酸ハイブリダイゼーション阻害物質と接触させ、通常行われるスクリーニングアッセイで阻害物質の可溶化の程度を迅速に測定する。阻害物質を可溶化する試薬は、本発明の方法に有用である。
本発明の方法に使用される試薬の濃度および量は、本方法に供する試料の種類によって異なる。本発明の方法に使用するのに適したカオトロピック試薬および洗浄剤の濃度の例を下表１に示す。
【００１９】
【表１】
0004271273.tif 000002
【００２０】
一般に、本発明の方法に使用される試薬の体積は、少なくとも試料の体積と等しい。さらに詳細には、試薬と試料の体積：体積比は、約１：１から約５：１である。また、一般に、試薬が塩性溶液として調製されることが望ましく、個々の試薬の最も好ましいｐＨは、たとえば、本願明細書の実施例３に記載の実験に基づいた通常行われるスクリーニングアッセイで測定され、ｐＨ９．０での６．０Ｍイソチオシアン酸グアニジン溶液は、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の量を減少させるのに特に有益であった。本願明細書の実施例３に記載の実験に基づいた同じタイプの通常のスクリーニングアッセイを使用して、個々の試薬の最適濃度（モル濃度）も決定することが可能である。また、一般に、試料は、室温で試料と接触させる。
試薬を試料の細胞と接触させるとき、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質は、試薬により可溶化されるため、このような細胞壁からの物質を洗浄する。適当な試薬は細胞から核酸を放出させないため、試薬を細胞と分離したときの標的核酸の喪失は問題ではない。
【００２１】
しかし、本発明の方法で使用される試薬は、核酸ハイブリダイゼーション過程に悪影響を及ぼす可能性があり、それゆえ、その後、このような薬剤を細胞から分離する。このような分離は、試薬が溶解できる緩衝液を使用して、あるいは使用せずに、濾過または洗浄および遠心分離など、適当な手段で遂行することが可能である。好ましくは、このような緩衝液は、阻害物質の除去ならびに細胞溶解前の試薬の除去を確実に行うために使用される。それゆえ、このような細胞を溶解するとき、標的核酸は、標的核酸が供せられるハイブリダイゼーション過程を阻害する物質の最小量を含む環境にある。
【００２２】
現在、様々な方法を使用してハイブリダイゼーション試料中または増幅用試料中で標的核酸が調製される。たとえば、ミコバクテリウム核酸配列を増幅するために処理が行われる喀痰試料は、一般に、ＮＡＬＣ／ＮａＯＨ過程に供せられる。本発明の方法は、ＮＡＬＣ／ＮａＯＨペレットを選択的に可溶化してこのような試料の凝集を減少させるため、このようなＮＡＬＣ／ＮａＯＨ過程に供せられるミコバクテリウム試料を用いる場合に特に有用である。同様に、他種の臨床試料は他の周知の標準方法に供せられ、たとえば、血液や尿など、多量の試料は遠心分離に供せられる。本発明の方法は、標的核酸を含有する細胞の溶解前にこの方法が実行されるという条件で、標準法の前、標準法の一部、または標準法の後で使用することが可能である。
【００２３】
本発明の方法は、定量的結合および結合表面からの標的核酸の放出を必要とせず、それゆえ、核酸に基づくハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイに従来使用されている量より多い試料を使用することが可能である。このより多い試料を使用できることは、アッセイの初期段階により多くの標的核酸が存在するため、アッセイの感度が高くなる。阻害物質を可溶化するが、標的核酸や細胞壁を同時に可溶化しない試薬の選択性は、以下に記載する実施例で明白なように、本発明の方法の結果に貢献する試薬の特徴の１つである。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は、本願明細書に記載の発明の具体的な実施態様を例示するものである。熟練者には明白なように、様々な変化および修正が可能であり、それらも本発明の範囲内と考えられる。
【００２５】
実施例１
対照試料処理方法と本発明の方法との比較
この実施例の目的は、本発明の方法が臨床試料から核酸増幅阻害の量を減少させるかどうか、したがって対照標準試料処理方法と比較して、よりよい標的検出値を生じるかどうかを決定することである。
【００２６】
材料
試料処理試薬
・過塩素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）
・チオシアン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）
・チオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｏｓｍｏｓｉｓ  ＤＩｓｔｉｌｌｅｄ（「ＲＯＤＩ」）Ｈ2 Ｏ
・ＭｙｃｏＰｒｅｐ（ＢＢＬ）
・ＭＡＣ／ＴＢ試料希釈剤
・リン酸緩衝液（ＢＢＬ）
・ジルコニウムビーズ含有カプセル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
・臨床喀痰試料、試料番号７８５、６５７、６３４、８５４９、８８９４、１３８８３、８３９６、１３８６７、１４６
・Ｍ．ａｖｉｕｍ複合体（「ＭＡＣ」）ミコバクテリウム細胞
【００２７】
増幅試薬
・ＲＯＤＩＨ2 Ｏ
・５００ｍＭのＫＰＯ4 
・５０×ＰＢＡ
・５０×ｄＣＡＧ
・５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ
・１００ｍＭのＤＴＴ
・５０％トレハロース
・１Ｕ／μｌのＵＤＧ
・１９２ｍＭのマグネシウム
・５０×ｄＵ
・５Ｕ／μｌのＵＤＩ
・Ｂｓｔ、１２０Ｕ／μｌ
・Ｂｓｏ  ＢＩ、１６０Ｕ／μｌ
・内部増幅対照（「ＩＡＣ」）  １０3 
・５５％グリセロール
・ＤＭＳＯ
・ヒト胎盤ＤＮＡ
・消泡剤
・標的希釈剤
【００２８】
検出試薬
・Ｍ．ｔｂ．ハイブリダイゼーション混合物
・ＭＡＣプローブ
・ハイブリダイゼーション希釈剤
・ＩＡＣハイブリダイゼーション混合物
・システム液
・洗浄液
・検定装置（「ＡＤ」）
・ＬＵＭＩＰＨＯＳ  ５３０
・２．０ｍｌのＬａｂｃｒａｆｔTM試験管
・ＭＡＣアッセイキャリブレーター
・アッセイキャリブレーター
【００２９】
手順：
蒸留水中、２ＭのＮａＣｌＯ4 を調製した。蒸留水中、３ＭのＮａＳＣＮを調製した。蒸留水中、４ＭのＧｕＳＣＮを調製した。この３種のカオトロピック試薬溶液を２．０ｍＬ  ＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１０本に１．０ｍｌ／試験管で分注した。ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌのアリコートを２．０ｍＬのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管に分注した。
臨床喀痰試料１０本を室温で解凍した。喀痰試料体積と等量のＭｙｃｏＰｒｅｐ緩衝液を加え、試料を攪拌し、室温で１５分間維持した。
各試料にリン酸緩衝液を加えて、各試料の総量を５０ｍｌに調整した。試料を攪拌し、３，０００相対遠心力（ＲＦＣ）で２０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、リン酸緩衝液２．０ｍｌを各試料に加えて攪拌した。このようにして得られた試料に、７５粒子／ｍｌのＭＡＣ細胞をスパイクした。
各試料の５００μｌのアリコートを、記載の４種の洗浄緩衝液（上述の試料緩衝液、２ＭのＮａＣｌＯ4 、３ＭのＮａＳＣＮ、および４ＭのＧｕＳＣＮ、１．０ｍｌ）すべてに分注した。試料を攪拌し、１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌでペレットを再懸濁した後、１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。再び上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌでペレットを再懸濁した後、１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。
【００３０】
ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験管に挿入し、各ペレットをＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液４００μｌで再懸濁した。試料を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あらゆるミコバクテリウム生物体を非感染性にさせた。５．０ｍ／ｓ、４５秒間に設定したＳａｖａｎｔ  ＣｅｌｌＰｒｅｐTM装置に試料試験管を充填して実行し、核酸を他の細胞成分から分離させた。以下の通り、ＭＡＣ／ＴＢ増幅および検出システムで試料をさらに処理した。
公開された欧州特許出願第０６８４３１５号に記載の通りに、２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、１００μｇ／ｍＬのアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．５ｍＭのｄＵＴＰ、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ、および１．４ｍＭの２’デオキシシチジン５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）（α−チオｄＣＴＰ）、１２％グリセロール、６．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５μＭの増幅プライマー、０．０５μＭのバンパープライマー、５０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、１２．５単位のＢｓｔポリメラーゼ、６０単位のＢｓｏＢＩ１、１単位ウラシル−Ｎ−グリコシレート（ＵＮＧ）および２単位のウラシル−Ｎ−グリコシレートインヒビター（Ｕｇｉ）を含む反応混合物で好熱性ＳＤＡを実施した。
【００３１】
酵素を加えて増幅反応を開始する前に、試料を２分間沸騰させた。次に試料を４１℃で２分間インキュベートし、ＵＮＧを加えてあらゆる含有アンプリコンを分解した。ＵＮＧとともに３０分間インキュベートした後、試料を５２℃に５分間移した。酵素混合物（Ｂｓｔポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ、Ｕｇｉおよびグリセロール）を加え、増幅を５２℃で３０分間続行させた。５分間沸騰させて反応を停止させた。
C.A. Spargo ら（1993. Molec. Cell. Probes 7, 395-404）により記載されている通りに、化学ルミネッセントアッセイで増幅産物を検出した。Ｍ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ用アルカリホスファターゼ標識検出プローブ、Ｍ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ用ビオチニル化捕捉プローブおよび試料を、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃で５０分間インキュベートした。ウェルを厳密度の高い緩衝液で３回洗浄した。ＬＵＭＩＰＨＯＳ（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を加え、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。照度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）でルミネセンスを検出し、相対光単位（ＲＬＵ）を記録した。
【００３２】
結果
結果を試料１０検体のＭ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣの平均値として下表に示し、あわせて図１にグラフとして示す。
【００３３】
【表２】
0004271273.tif 000003
＊両洗浄方法は、陽性のＭ．ｔｂ．値と同じ試料であり、臨床現場での診断間違いの可能性を示す。
【００３４】
結論
実施例のデータから、統計学的に、洗浄条件のいずれでもＩＡＣ値に差がないことがわかるが、すべての試薬条件で平均値が対照洗浄手順より高値であることは興味深い。統計学的に、４ＭのＧｕＳＣＮ条件では、他の３条件よりも高い特異的なＭＡＣ  ＲＬＵ値を示すことがデータからわかる。このことから、本明細書で実行される本発明の方法は、ミクロバクテリウムを損傷せず、それどころか、４ＭのＧｕＳＣＮの場合には、ＭＡＣ生物体の回復、ひいては標的ＤＮＡの回復を改善することがわかる。
【００３５】
実施例２
核酸増幅阻害用臨床試料のスクリーニング
この実施例の目的は、核酸増幅阻害用臨床試料をスクリーンングすることであった。
材料
試料処理試薬
・ＭｙｃｏＰｒｅｐ試薬
・ＢＢＬリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
・ＴＢ／ＭＡＣ試料希釈剤
・Ｎ．Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈのスミア陰性、培養陰性喀痰、試料番号８２０７、１５１４、１３４７２、１４１９９、１３８４７、３６７５、６４０１、４６９１、１３５４５、１３７１１、９９３９、１２２２７、１２２２８、１２１６１、８４０６、７８２、１３５４７、１３４４８、１３５０６、１３３１９、１３４２０、２４３、１０３
・ジルコニウムビーズ含有カプセル
【００３６】
増幅試薬
実施例１と同じもの、およびＩＮ２プラスミド対照
アッセイ試薬
実施例１と同じ
【００３７】
手順：
臨床喀痰試料２３検体を室温で解凍した。処理した喀痰試料はどれも、体積が７．５〜１２ｍｌの範囲になるように、１２ｍｌ以上の喀痰を分離管に分配した。喀痰試料体積と等量のＭｙｃｏＰｒｅｐ試薬を喀痰試料に加えた。試料を攪拌し、室温に１５分間維持した。各喀痰溶液の体積をリン酸緩衝液で５０ｍｌに調節した。
この溶液を３，０００ＲＣＦで２０分間遠心分離した。各試料ペレットから上清を傾瀉し、リン酸緩衝液２．０ｍｌを各試験管に加えた。試料を２．０ｍｌＬａｂＣｒａｆｔR 試験管に５００μｌずつ等分した。各タイプの試料１本を室温で維持し、残りの試料を−７０℃で保存した。
【００３８】
ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１ｍｌを、室温で維持した各試料に加えた。試料を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に加え、その試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験管に加え、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液４００μｌを各試験管に分注した。試験管を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あらゆるミコバクテリウム生物体を非感染性にさせた。５．０ｍ／ｓ、４５秒間の設定を使用して、Ｓａｖａｎｔ  ＣｅｌｌＰｒｅｐTM装置で試験管を揺り動かした。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実施例１に記載の検出手順を使用した好熱性鎖置換（ｔＳＤＡ）を使用して、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
結果：
結果を下表に示す。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
結論
ＭＡＣ／ＴＢシステムでアッセイした臨床試料２３検体のうち、９検体は、ＩＡＣ値が１０ＲＬＵ未満であり、臨床試料による増幅／検出反応の重大な阻害を示した。「標準」試料洗浄条件下で生じたこれらの阻害標本を、以下の実施例に示す通り、さらに処理した。
【００４１】
実施例３
カオトロピック試薬溶液のｐＨおよびモル濃度調節
この実施例の目的は、より多くの阻害物質を臨床サンプルから除去できるように、ＧｕＳＣＮ洗浄液のｐＨおよびモル濃度を調節することができるかどうかを決定することであった。
材料
試料処理試薬
・実施例２の陰性ＮＡＬＣペレット試料番号６４０１、８４０６、７８２、１３４４８、１３５０６
・イソチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ
・ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液
・ジルコニウムビーズ含有カプセル
・５００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰＯ4 ）
・５ＮのＮａＯＨ  Ｒｉｃｃａ
・Ｍ．ｔｂ．ミコバクテリウム細胞
増幅試薬
実施例１と同じ。
アッセイ試薬
実施例１と同じ。
手順
試料７８２を１．０ｍｌ、試料６４０１、８４０６、１３４４８および１３５０６を５００μｌずつ、２ｍｌのポリプロピレン製試験管に分注することにより陰性のＮＡＬＣ阻害プールを作製した。２００粒子／ｍｌでＭ．ｔｂ．生物体を阻害プールにスパイクした（７．５粒子／最終ｔＳＤＡ反応）。作製したＧｕＳＣＮ溶液を下表に示す。ｐＨ７．０およびｐＨ９．０の溶液は、５ＮのＮａＯＨで指示されたｐＨに調製した。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
各ＧｕＳＣＮ溶液を１．０ｍｌ／試験管で２．０ｍｌのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１本に分注した。スパイクした陰性ＮＡＬＣ阻害プールを、ＧｕＳＣＮが入っている各試験管に５００μｌ／試験管で分注した。
試験管を短時間攪拌し、この試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、この試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注した。この試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験管に挿入した。
ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液を４００μｌ／試験管で各試験管に傾瀉した。試験管を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分間加熱した。５．０ｍ／ｓ、４５秒間の設定を使用して、Ｓａｖａｎｔ  ＣｅｌｌＰｒｅｐTM装置で試験管を揺り動かした。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実施例１に記載の検出手順を使用したｔＳＤＡを使用して、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
【００４４】
結果：
結果を下表に示し、あわせて図２にグラフとしてで示す。
【００４５】
【表５】
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注：Ｍ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ値は、５回反復した増幅／検出試料の平均値である。
【００４６】
結論：
６．０Ｍ、ｐＨ９．０のＧｕＳＣＮ条件で、非特異的ＭＡＣ値を生じることなく、他の条件よりも統計学的にすぐれたＭ．ｔｂ．ＲＬＵ値およびＩＡＣ  ＲＬＵ値が得られた。これは、６．０Ｍ、ｐＨ９．０のＧｕＳＣＮ溶液を使用すると、ミコバクテリウムから標的核酸が放出されずに、より多量の核酸ハイブリダイゼーション阻害物質が除去されることを示すものである。
【００４７】
実施例４
Ｍ．ｔｂ．スパイクした陰性臨床試料を使用したＧｕＳＣＮ（６Ｍ、ｐＨ９．０）洗浄
この実施例の目的は、Ｍ．ｔｂ．をスパイクして、６ＭのＧｕＳＣＮ（ｐＨ９．０）溶液で洗浄した臨床試料は、望ましくない核酸ハイブリダイゼーション阻害物質を除去し、特異的Ｍ．ｔｂ．ＤＮＡ標的の増幅および検出が可能かどうかを決定することであった。
材料
試料処理試薬
・陰性ＮＡＬＣペレット試料番号８２０７、１５１４、１３４７２、１４１９９、１３８４７、３６７５、６４０１、４６９１、１３５４５、１３７１１、９９３９、１２２２７、１２２２８、１２１６１、８４０６、７８２、１３５４７、１３４４８、１３５０６、１３３１９、１３４２０、２４３、１０３
・イソチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ
・ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液
・ジルコニウムビーズ含有カプセル
・５００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰＯ4 ）
・５ＮのＮａＯＨ  Ｒｉｃｃａ
【００４８】
増幅試薬
実施例１と同じ。
アッセイ試薬
実施例１と同じ。
【００４９】
手順：
２００ｍＭのＫＰＯ4 で６ＭのＧｕＳＣＮ溶液を調製し、実施例３と同様に、５ＮのＮａＯＨでｐＨ９．０に調整した。実施例２の材料のセクションの各臨床試料５００μｌに、Ｍ．ｔｂ．生物体を２００粒子／ｍｌ（７．５粒子／増幅反応）でスパイクした。これらの実施例２の試料の一部は核酸ハイブリダイゼーションを阻害した。ＭＡＣ／ＴＢ緩衝液５００μｌに、Ｍ．ｔｂ．を２００粒子／ｍｌでスパイクし、これを標識「試料処理対照」とした。
ＧｕＳＣＮ溶液１．０ｍｌを２．０ｍｌのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１本に分注し、この試験管を標識「ＧｕＳＣＮ陰性対照」とした。６Ｍ、ｐＨ９．０のＧｕＳＣＮ溶液１ｍｌを各臨床試料試験管に分注した。
この試験管を攪拌し、１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、この試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、この試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニウムカプセルを各試験管に加えた。ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液を各試験管に４００μｌ／試験管で加えた。上述の実施例に記載の通りに、この試験管を加熱し、揺り動かした。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実施例１に記載の検出手順を使用したｔＳＤＡを使用して、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
【００５０】
結果：
結果を、各処理試料の３回の増幅繰り返しの平均値として下表に示し、あわせて図３にグラフとして示す。
【００５１】
【表６】
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【００５２】
結論
２３のＩＡＣ値は、１０ＲＬＵより大きい許容できるｔＳＤＡ値を示し、増幅反応は阻害されなかったことがわかる。さらに、各試料の８８．２：１未満というバックグラウンド特異的ＲＬＵ比から明白なように、スパイクされたあらゆる試料で７．５粒子／増幅反応のＭ．ｔｂ．が検出された。実施例２では、ＧｕＳＣＮ洗浄液を使用しない臨床試料のうち５検体は、１０ＲＬＵ未満の阻害的ＩＡＣ値を示した。実施例で実行される本発明の方法で、ほぼすべての試料での改善（実施例２で低シグナル発生により阻害的であることが証明される試料も）が達成された。
本発明は、ある程度特異的に記述されているが、本発明の範囲から逸脱することなく当該技術で通常の熟練者に明白な修正を行うことが可能である。本発明の様々な特徴を請求の範囲に記述されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】対照標準試料方法と比較して、本発明の方法が臨床試料から核酸増幅阻害の量を減少させるかどうかを決定するために実施した実験結果を示すグラフ図である。
【図２】本発明の方法に使用される個々の試薬の最適ｐＨおよびの濃度値を決定するために実施した実験結果を示すグラフ図である。
【図３】臨床試料から核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の量を減少させる上で、本発明の方法の有効性を表す実験の結果を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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