(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，２３，２５及び２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％同一である配列を有する、480nm〜680nmの範囲の最大蛍光波長を有する蛍光タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項２】
以下の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、480nm〜660nmの範囲の最大蛍光波長を有する蛍光タンパク質をコードする、単離された核酸もしくはその模倣物：
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，２３，２５及び２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはその相補配列を有する、核酸。
【請求項３】
ベクターおよび核酸を含む、構築物であって、該核酸が480nm〜660nmの範囲に最大蛍光波長を有する蛍光タンパク質をコードし、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，２３，２５及び２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有する、構築物。
【請求項４】
以下を含む発現カセット：
(a)発現宿主において機能する転写開始領域；
(b)請求項1〜３記載の核酸からなる群より選択される核酸；および
(c)該発現宿主において機能する転写終結領域。
【請求項５】
染色体外エレメントの一部として、または発現カセットの宿主細胞への導入の結果、宿主細胞ゲノムに組込まれた、請求項４記載の発現カセットを含む、細胞またはその子孫。
【請求項６】
アントゾアン色素および／または蛍光タンパク質を作製する方法であって、以下の段階を含む方法：
請求項５記載の細胞を増殖させ、これにより該タンパク質が発現される段階；および、
他のタンパク質を実質的に含まない該タンパク質を単離する段階。
【請求項７】
請求項1〜３からなる群より選択される核酸にコードされたタンパク質。
【請求項８】
請求項７記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項９】
請求項1〜３のいずれか1項記載の核酸からなる群より選択される導入遺伝子を含む、トランスジェニック細胞またはその子孫。
【請求項１０】
請求項1〜３のいずれか1項記載の核酸からなる群より選択される導入遺伝子を含む、ヒトを除くトランスジェニック生物。
【請求項１１】
請求項1〜３記載のいずれか1項記載の核酸および該核酸の使用に関する使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法(35USC)第119条(e)項に従い、本出願は、2000年10月12日に出願された米国特許仮出願第60/240,018号の出願日；および、2001年7月16日に出願された米国特許出願第60/306,131号の出願日の優先権を請求するものであり；これら出願の開示は本明細書に参照として組入れられる。
【０００２】
発明の背景
標識付け（labeling）は、対象となるタンパク質、細胞、または関心対象の生物に印を付ける手段であり、多くの生化学的、分子生物学的、および医学的な診断の応用に重要な役割を果たす。放射性標識、色素標識、蛍光標識、化学発光標識などを含む多種多様な標識が現在まで開発されてきた一方で、新たな標識の開発には引き続き関心が寄せられている。なかでも色素タンパク質および／または蛍光タンパク質の標識を含む新たなタンパク質の標識の開発に特に関心が寄せられている。
【０００３】
発明の概要
蛍光変異体スチコダクチリダエン(Stichodactylidaen)色素タンパク質におよび、これにコードされたポリペプチド組成物を含む、大きく赤側にシフトされたタンパク質をコードする核酸組成物が提供される。関心対象のタンパク質は、有色のおよび／または蛍光のタンパク質であり、この特徴は、このタンパク質の2個以上の残基の相互作用から生じる。また、非凝集性変異体および野生型と比べ改変された重合特性を伴う変異体を含む前述の特異的タンパク質と、実質的に類似したまたはその変異体である、タンパク質も関心対象となる。さらに、核酸断片およびこれにコードされたペプチドおよび、本タンパク質に対する抗体ならびにトランスジェニック細胞および生物も提供される。本タンパク質および核酸の組成物は、様々な異なる適用における用途が見いだされている。最後に、例えば本核酸組成物を含む、このような適用において使用するためのキットが提供される。
【０００４】
定義
本発明に従って、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術の知見を用いることができる。これらの技術は文献で詳しく説明されている。例えば以下の文献を参照されたい：マニアティス（Maniatis）、フリッツ（Fritsch）およびサンブルック（Sambrook）、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」（1982）；「DNAクローニング：実践的アプローチ（DNA Cloning A Practical Approach）」、第I巻および第II巻（D.N. Glover編、1985）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（M.J. Gait編、1984）；「核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」（B.D. HamesおよびS.J. Higgins編（1985））；「転写および翻訳（Transcription and Translation）」（B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、（1984））；「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）」（R.I. Freshney編、（1986））；「固定化された細胞および酵素（Immobilized Cells and Enzymes）」（IRL Press、（1986））；B. Perbal、「分子クローニングの実践的手引書（A Practical Guide To Molecular Cloning）」（1984）。
【０００５】
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコン（replicon）であり、ベクターに別のDNAセグメント(segment)を結合させて、結合させたセグメントを複製させることが可能である。
【０００６】
「DNA分子」は、1本鎖状または2本鎖らせん状である、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合体（polymeric form）を意味する。この用語は分子の1次構造および2次構造のみを意味し、任意の特定の3次構造に制限しない。したがって、この用語は特に線状（linear）DNA分子（例えば制限酵素切断断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体にみられる2本鎖DNAを含む。
【０００７】
DNAの「コード配列」は、適切な調節配列の制御下において、インビボでポリペプチドに転写されて翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端側に位置する開始コドンと、3'（カルボキシル）末端に位置する翻訳停止コドンで決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のmRNAに由来するcDNA、真核生物（例えば哺乳類）のゲノムDNA配列、および合成DNA配列を含むことができるがこれらに限定されない。ポリアデニル化のシグナルおよび転写終結配列は、コード配列に対して3'側に位置する場合がある。
【０００８】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、2本の核酸鎖が結合して、反対側の核酸鎖の残基間の水素結合によって安定化された逆平行2重鎖（duplex）を形成する過程を意味する。
【０００９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は短い（長さが100塩基未満）の核酸分子を意味する。
【００１０】
本明細書で用いる「DNA調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター（terminator）およびその類似物などの、宿主細胞におけるコード配列の発現に備えるまたは調節する、転写および翻訳の制御配列である。
【００１１】
「プロモーター配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼを結合させ、下流（3'方向）にあるコード配列の転写を開始することが可能な、DNA調節領域である。本発明を定義するため、プロモーター配列は3'末端では転写開始部位に接し、上流（5'方向）に向かって伸び、バックグ回に対して検出可能なレベルで転写を開始する必要最小限の塩基または配列を含む。プロモーター配列内には、RNAポリメラーゼの結合を担う転写開始部位ならびにタンパク質結合領域がある。真核生物のプロモーターは、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むことが多いが、常に含むわけではない。誘導可能なプロモーターを含む様々なプロモーターを用いて、本発明の様々なベクターを駆動することができる。
【００１２】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は細菌の酵素を意味し、いずれも2本鎖DNAを特定のヌクレオチド配列またはその近傍で切断する。
【００１３】
細胞は、外因性または異種のDNAを細胞内に導入すると、これらのDNAにより「形質転換」または「トランスフェクト」される。形質転換用のDNAは、細胞のゲノム中に（共有結合を介して）組み込まれる場合もあれば組み込まれない場合もある。例えば真核生物、酵母、および哺乳動物の細胞では、形質転換用のDNAはプラスミドなどのエピソーム要素として維持される場合がある。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞では、形質転換用DNAが染色体上に組み込まれて、染色体の複製に伴って娘細胞に受け継がれる。このような安定性は、真核細胞が形質転換用DNAを含む娘細胞の集団からなる細胞系列またはコロニーを確立する能力によって明らかにされる。「クローン」とは、有糸分裂により1個の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系列」とは、インビトロで数世代にわたって安定に成長可能な初代細胞のクローンである。
【００１４】
DNA構築物の「異種」領域は、自然界に存在するより大きな分子と関連せずに見出されるより大きなDNA分子中に存在する、同定可能なDNAセグメントである。したがって、異種領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常、供給源の生物のゲノム中では哺乳類のゲノムDNAに隣接しないDNAに隣接する。別の例では、異種DNAは2種の異なる供給源に由来する遺伝子の一部分がまとめられた融合タンパク質産物を作製する構築物中における、コード配列を含む。対立遺伝子の変異または天然に起こる変異事象は、本明細書で定義するような異種DNA領域を生じない。
【００１５】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」は異種プロモーターまたはエンハンサー配列に結合するコード配列を意味し、その構築物を組織または細胞に導入することで、レポーター遺伝子の産物を容易かつ定量的にアッセイすることができる。
【００１６】
本明細書に記載したアミノ酸は「L型」異性体であることが好ましい。アミノ酸配列は1文字表記法で記載する（A：アラニン；C：システイン；D：アスパラギン酸；E：グルタミン酸；F：フェニルアラニン；G：グリシン；H：ヒスチジン；I：イソロイシン：K：リシン；L：ロイシン；M：メチオニン；N：アスパラギン；P：プロリン；Q：グルタミン；R：アルギニン；S：セリン；T：スレオニン；V：バリン；W：トリプトファン；Y：チロシン；X：任意の残基）。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する結合相手をもたない状態のアミノ基を意味する。COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する結合相手をもたない状態のカルボキシ基を意味する。標準的なポリペプチドの命名法は、J. Biol. Chem.、243（1969）、3552〜59に準拠する。
【００１７】
「免疫学的に活性のある」という用語は、天然、組換え型、または合成の色素/蛍光タンパク質、またはそれらの任意のオリゴペプチドがもつ、適切な動物または細胞で特異的な免疫応答を誘導して、特定の抗体と結合する能力を意味する。本明細書で用いる「抗原性アミノ酸配列」は、単独または担体分子と結合したアミノ酸配列を意味し、哺乳類で抗体応答を誘発することができる。抗体が抗原に結合する文脈における「特異的な結合」という用語は、当技術分野で十分に理解される用語であり、他の無関係の抗原ではなく抗体が生成された対象の抗原への、抗体の結合を意味する。
【００１８】
本明細書で用いる「単離された」という用語は、天然に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞を記述するために用いられる。
【００１９】
具体的態様の説明
スチコダクチリダエン蛍光変異体を含む、大きく赤側シフトされた蛍光タンパク質をコードする核酸組成物に加え、これにコードされたポリペプチド組成物が提供される。関心対象のタンパク質は、有色のおよび／または蛍光のタンパク質であり、この特徴は、このタンパク質の2個以上の残基の相互作用から生じる。同じく関心があるのは、非凝集性変異体および野生型と比べ改変された重合特性を伴う変異体を含む前述の特異的タンパク質と、実質的に類似したまたはその変異体である、タンパク質である。さらに、核酸の断片およびこれにコードされたペプチドおよび、本タンパク質に対する抗体ならびにトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物も提供される。本タンパク質および核酸の組成物は、様々な異なる適用における用途が見いだされている。最後に、例えば本核酸組成物を含む、このような適用において使用するためのキットが提供される。
【００２０】
本発明をさらに説明する前に、特定の態様の変更は添付された特許請求の範囲内でなされ、この範囲内にあるため、本発明が以下に説明する発明の特定の態様に制限されないことは理解されるべきである。また使用する専門用語は特定の態様を説明することを目的とするものであって、限定的であるように意図されるものではないことも理解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は添付した特許請求の範囲により設定される。
【００２１】
本明細書および添付した特許請求の範囲では、単数形の「一つの（a、an）」および「その（the）」は、文中で特に断らない限り複数形を含む。特に明記した部分を除いて本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味をもつ。
【００２２】
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限値と下限値の間で、文脈で明確に示さない限りは下限値の最小自然数(unit)の10倍までの中間値(intervening value)の各々、ならびにいずれか他の表示値(stated value)またはその表示された範囲内の中間値が、本発明に包含されていると理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、このより小さい範囲に独立して含まれ、かつ表示された範囲内のいずれか具体的に除外された限界に従い、本発明に包含される。表示された範囲がこれらの一方または両方の限界を含む場合は、これらの含まれた限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００２３】
特に規定しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものと同様または同等のあらゆる方法、装置および材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここで説明する。
【００２４】
本明細書において言及された全ての刊行物は、本明細書で説明された発明に関連して使用されるそれらの刊行物において説明された細胞株、ベクター、方法論および他の発明の構成要素を説明および開示の目的で、本明細書に参照として組入れられている。
【００２５】
さらなる本発明の説明において、本核酸組成物が最初に説明され、次に本タンパク質組成物、抗体組成物およびトランスジェニック細胞／生物が考察される。次に本タンパク質の用途が見いだされている代表的方法について検証がなされる。
【００２６】
核酸組成物
先に要約したように、本発明は、大きく赤側にシフトした蛍光タンパク質をコードする核酸組成物を提供し、このタンパク質は、その大きく赤側にシフトした蛍光変異体を含むスチコダクチリダエン色素タンパク質の蛍光変異体および、これらのタンパク質の断片およびホモログを含む。色素タンパク質および／または蛍光タンパク質は、有色の、すなわち着色されたタンパク質を意味し、ここにおいてこのタンパク質は、蛍光であってもなくてもよく、例えば、照射時に低、中または高の蛍光発光を示してもよい。いずれかの事象において、関心対象の本タンパク質は、有色特性（すなわち色素特性および／または蛍光特性）がそのタンパク質の2個以上の残基の相互作用から生じ、このタンパク質の単一の残基（より詳細に述べると単一の残基の単一の側鎖）からは生じないようなものである。このように、本発明の蛍光タンパク質は、本来備わっている蛍光体(fluor)、すなわちトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンのように、それ自身により作用する残基からのみ蛍光発光を示すタンパク質は含まない。このように、本発明の蛍光タンパク質は、その蛍光発光が先に特定化した単独の残基以外であるタンパク質の構造の一部から生じるような、例えばそれが2個以上の残基の相互作用から生じるような、蛍光タンパク質である。
【００２７】
核酸組成物は、本発明の色素／蛍光ポリペプチド、例えばスチコダクチリダエン色素／蛍光タンパク質遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを有するDNAの配列を含む組成物を意味し、かつ適当な条件下で本発明に従いタンパク質として発現されることが可能である。この用語には、本発明の核酸と相同で、実質的に類似または同一である核酸も包含されている。従って本発明は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子およびそのコード配列ならびに、それらのホモログを提供する。本核酸は、それらの自然環境以外において存在し、例としてこれらは、それらの自然環境、例えばそれらが得られる生物から単離され、濃厚な量などとして存在する。
【００２８】
多くの態様において、本発明の野生型の天然の核酸配列は、スチコダクチリダエンファミリー種の一員に由来し、ある態様において、ヘテラクチス(Heteractis)属に由来する。特に関心対象となる種は、センジュイソギンチャク(ヘテラクチス・マグニフィカ(Heteractis magnifica))、ヘテラクチス・マル(Heteractis malu)、ヘテラクチス・クリスパ(Heteractis crispa)、ヘテラクチス・アウロラ(Heteractis aurora)、ヘテラクチス種などを含み、多くの態様において、これらの野生型核酸はヘテラクチス・クリスパに由来している。
【００２９】
関心対象の具体的核酸は、本明細書においてhcFP640またはhcCP(hcCP)として識別された、ヘテラクチス・クリスパの野生型色素タンパク質をコードするものである。このタンパク質のアイソフォームは2種同定されており、すなわち基本アイソフォームおよび第二アイソフォームである。基本アイソフォームは、図1に示したアミノ酸配列を有し、配列番号：2として同定されている。第二のアイソフォームは、図2に示したアミノ酸配列を有し、配列番号：4として同定されている。hcFP640(hcCP)基本アイソフォームの野生型cDNAコード配列は、配列番号：1に提供され、図1に示されている。hcFP640(hcCP)第二アイソフォームの野生型cDNAコード配列は、配列番号：3に提供され、図2に示されている。
【００３０】
前記野生型色素タンパク質の特異的蛍光変異体タンパク質をコードする核酸も提供されている。特に関心対象となるのは、本明細書においてmutC148S、mut44-9(hcFRFP)(HcRed)；mutFP10-cr1(hcFRFP-2)(HcRed-2A)、mut hc-44、mut hc-4、mut hc-41およびmut-44-6として識別された変異体蛍光タンパク質をコードする核酸である。
【００３１】
上記の特定の核酸組成物に加えて、上記配列の相同体も対象となる。本核酸の相同体に関しては、相同遺伝子の供給源は植物および動物の任意の種であってもよく、またはその相同体はまったくの合成配列でもよい。ある態様においては、相同体間の配列類似性は少なくとも約20％であり、ときには少なくとも約25％であり、30％、35％、40％、50％、60％、70％またはそれ以上の場合があり、75％、80％、85％、90％および95％またはそれ以上を含む場合もある。配列類似性は、保存モチーフ、コード領域、隣接領域などの、より長い配列の亜集団の場合がある標準配列を元に計算される。標準配列の長さは通常少なくとも約18ヌクレオチドであり、より一般的には少なくとも約30ヌクレオチドであり、比較されている全配列に伸張しうる。配列解析に用いるアルゴリズムは当技術分野で公知であり、例えばBLASTはアルチュール（Altschul）ら（1990）、J. Mol. Biol. 215：403〜10（デフォルトの設定、例えばパラメータとしてw=4やT=17を使用する）に記載されている。本明細書に記載した配列は、データベースの検索において関連性および相同性のある核酸を認識する必須の配列である。ある態様において特に関心対象となるのは、添付の配列表および添付の図面に記載された特定の核酸と実質的に同じ長さの核酸である。実質的に同じ長さであるとは、長さの任意の差が約20個％を超えず、一般的には約10個％を超えず、さらに一般的には約5個％を超えないことを意味し；これらの任意の配列に対して、核酸の全長にわたって少なくとも約90％、一般的には約95％、さらに一般的には少なくとも約99％以上の配列同一性を有することを意味する。多くの態様においては、このような核酸は本明細書の一部に含まれる図面および配列表の特定の核酸配列と実質的に同様（すなわち同じ）か、または同一である。実質的に同様であるとは、配列同一性が一般的には少なくとも約60％、一般的には少なくとも約75％、また多くの場合少なくとも約80％、85％、90％、さらには95％であることを意味する。
【００３２】
前述の核酸にコードされたタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のために前述の核酸とは配列が異なる核酸も提供される。
【００３３】
ストリンジェントな条件下で前述の核酸にハイブリダイズする核酸も提供される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、50℃以上および0.1xSSC(15mM塩化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム)でのハイブリダイゼーションである。別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、溶液：50％ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハルト溶液、10％硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断したサケ精子DNA中で42℃で一晩インキュベーションし、引き続きフィルターを、0.1xSSCを用い約65℃で洗浄する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも前記の代表的条件と同程度にストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件であり、その条件が、前述の具体的なストリンジェント条件に対し、少なくとも約80％のストリンジェンシー、典型的には少なくとも約90％のストリンジェンシーである場合に、少なくともストリンジェントであるとみなされる。別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知であり、さらに本発明のこの特定の態様の核酸を同定するためにも使用することができる。
【００３４】
本発明のタンパク質の変異体をコードする核酸も提供される。変異体核酸は、当該技術分野において慣習的である周知の技術を用い、ランダム突然変異誘発または標的突然変異誘発により作成することができる。一部の態様において、ホモログまたは変異体をコードする核酸にコードされた色素タンパク質または蛍光タンパク質は、野生型蛍光タンパク質と同じ蛍光特性を有する。別の態様において、ホモログまたは変異体核酸は、本明細書により詳細に説明したように、変更されたスペクトル特性を伴う、色素-または蛍光タンパク質をコードする。
【００３５】
特に関心対象となる変異体のひとつの範疇は、非凝集性の変異体である。多くの態様において、天然のタンパク質または変異体の非凝集性の変異体を作出するのに十分な方法で、例えば変化を逆行または中和するようなN-末端残基の側鎖に出現する変化を改変する、改変するN-末端の変異により非凝集性の変異体は、野生型配列と異なり、ここで特定のタンパク質は、その開示が本明細書に参照として組入れられている米国特許出願第60/270,983号に開示されたアッセイを用い、非凝集性であると決定された場合、非凝集性であると見なされる。
【００３６】
別の特に関心対象の変異体の範疇は、改変されたオリゴマー形成変異体である。変異体は、そのオリゴマー形成特性が野生型タンパク質と比べて異なる場合に、改変されたオリゴマー形成変異体であると見なされる。例えば、特定の変異体が野生型よりもより多いまたはより少ない程度にオリゴマー形成するならば、これはオリゴマー形成変異体とみなされる。特に関心対象となるのは、生理的(例えば細胞内)条件下でオリゴマー形成しない、すなわち単量体であるか、あるいは、例えば細胞内条件下で二量体もしくは三量体であるようなような野生型のそれよりもより少ない程度にオリゴマー形成する、オリゴマー形成変異体である。
【００３７】
本発明の核酸は、cDNAもしくはゲノムDNA、またはそれらの断片であってもよい。ある態様においては、本発明の核酸は特異的な蛍光タンパク質およびポリペプチドコードする一つまたは複数の読み枠、ならびにイントロンと同様に、発現の調節にかかわり、コード領域を超えてさらにどちらの方向でもありうる約20 kbまでの5'側および3'側に隣接する非コードヌクレオチド配列を含む。対象となる核酸は、染色体外に維持するため、または宿主ゲノムに組み込むために、適切なベクターに導入されることが可能であり、これについてはより詳しく後述する。
【００３８】
本明細書で用いる「cDNA」という用語は、天然の成熟型mRNA種（species）に見出される配列要素の配置を共有する、すべての核酸を含める（配列要素とはエキソンならびに5'側および3'側にある非コード領域である）。通常mRNA種は連続したエキソンを有し、介在するイントロンが存在する場合は、核のRNAスプライシングにより除去されて、タンパク質をコードする連続した読み枠が作製される。
【００３９】
関心対象のゲノム配列は、開始コドンと停止コドンの間に存在し、表に記載した配列で定義される核酸を含み、通常は天然の染色体上に存在するすべてのイントロンを含む。これはさらに、成熟型mRNAに見出される5'側または3'側の非翻訳領域を含む場合がある。またさらに、プロモーターやエンハンサーなどで約1 kbまたはそれ以上である場合がある、転写領域の5'端または3'端のいずれかにおいて隣接するゲノムDNAの特異的な転写および翻訳の調節配列を含む場合もある。ゲノムDNAを100 kbpまたはそれ未満の断片として単離することが可能であり、隣接する染色体配列を実質的に含まない場合がある。3'端もしくは5'端にある、コード領域に隣接するゲノムDNA、またはイントロン中に見出される調節配列は、組織および段階に特異的である適切な発現に必要な配列を含む。
【００４０】
本発明の核酸組成物は、本タンパク質のすべてまたは一部をコードしうる。2本鎖または1本鎖の標準的な断片は、DNA配列から従来の方法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成したり、制限酵素で切断したり、PCRで増幅するなどして得られる。多くの場合DNA断片は少なくとも15ヌクレオチドであり、一般的には少なくとも約18ヌクレオチドまたは25ヌクレオチドであり、少なくとも約50ヌクレオチドの場合もある。一部の態様においては、対象となる核酸分子の長さは、約100ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、約400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド、約700ヌクレオチド、または約720ヌクレオチドである。対象となる核酸は、対象となるタンパク質の断片または完全長のタンパク質をコードする場合がある。例えば、対象となる核酸は、約25アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸、約125アミノ酸、約150アミノ酸、約200アミノ酸、約210アミノ酸、約220アミノ酸、約230アミノ酸、または約240アミノ酸、全タンパク質までのポリペプチドをコードしうる。
【００４１】
対象となる核酸は、実質的に純粋な状態で、一般的には完全な染色体とは別物として単離され、得られる。一般的には、このDNAは本発明の核酸またはその断片を含まない他の核酸配列を実質的に含まない状態で得られ、通常は少なくとも約50％、一般的には少なくとも約90％の純度であり、また典型的には「組換え型である」、すなわち、天然の染色体上では通常は結合していない一つまたは複数のヌクレオチドに隣接する。
【００４２】
対象となるポリヌクレオチド、対応するcDNA、完全長の遺伝子、および対象ポリヌクレオチドの構築物が提供される。これらの分子は当技術分野で公知であるいくつかの異なるプロトコルによって合成的に作製することができる。適切なポリヌクレオチド構築物は、例えばサムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」第2版、（1989）Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NYに記載された標準的な組換えDNA技術、および米国HHSの国立予防衛生研究所（NIH）の組換えDNA研究に関する指針に記載された現行の規制に基づいて精製されることができる。
【００４３】
また、第2のタンパク質、例えば分解配列（degradation sequence）やシグナルペプチドなどに融合させた、対象タンパク質の融合タンパク質またはその断片をコードする核酸も提供される。融合タンパク質には、対象のポリペプチド、またはその断片、および対象ポリペプチドのN末端および/またはC末端においてインフレームで（in-frame）融合させた、スチコダクチリダエンでないポリペプチド（「融合相手」）が含まれうる。融合相手には、融合相手に特異的な抗体に結合可能なポリペプチド（例えばエピトープタグ）；抗体またはその結合断片；触媒機能を提供して細胞応答を誘導するポリペプチド；リガンドもしくは受容体、またはそれらの模倣物などが含まれるがこれらに限定されない。このような融合タンパク質では、融合相手は一般に天然の状態では融合タンパク質の対象アンソゾアン部分に結合せず、典型的にはアンソゾアンタンパク質またはそれらの誘導体/断片ではない、すなわちアンソゾアン種には見出されない。
【００４４】
ベクターに挿入した本核酸からなる構築物もまた提供される。このような構築物は、増殖やタンパク質産生などを含む、いくつかの異なる応用に使用することができる。プラスミドを含む、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを調製して使用することができる。ベクターの選択は、増殖が望ましい細胞の種類、および増殖の目的に応じて行う。あるベクターは、大量の所望のDNA配列の増幅および作製に有用である。培養中の細胞における発現に適したベクターもある。また、動物全体またはの、細胞における伝達および発現に適したベクターもある。適切なベクターの選択法は当技術分野で公知である。このようなベクターの多くは市販されている。構築物を調製する際には、ポリヌクレオチドの一部または全体を一般的にはベクター中の切断済みの制限酵素部位にDNAリガーゼで結合させることで、ベクター中に挿入する。あるいは所望のヌクレオチド配列を、相同組換えによりインビボで挿入することができる。これは通常、相同性のある領域を、所望のヌクレオチド配列に隣接させてベクターに結合させることによってなされる。相同性のある領域は、オリゴヌクレオチドの連結によって、または、例えば相同性のある領域と所望のヌクレオチド配列部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって添加する。
【００４５】
また、他の応用の中でも、対象タンパク質の合成で使用される、発現カセットまたは発現系も提供される。発現に関しては、本発明のポリヌクレオチドにコードされた遺伝子産物は、例えば細菌、酵母、両生類、および哺乳類の系を含む任意の簡便な発現系で発現される。適切なベクターおよび宿主細胞は米国特許第5,654,173号に記載されている。発現ベクター中では、対象ポリヌクレオチドを、所望の発現特性が適切に得られるように調節配列に連結する。このような調節配列には、プロモーター（センス鎖の5'端またはアンチセンス鎖の3'端に結合される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが含まれうる。プロモーターは、調節型または構成型（constitutive）でありうる。状況によっては、組織特異的なプロモーターまたは発生段階に特異的なプロモーターなどの条件的に活性であるプロモーターを使用することが望ましい場合がある。これらは、ベクターへの連結に関して上述した手法を用いて、所望のヌクレオチド配列に連結させる。当技術分野で公知の任意の手法を用いることができる。言い換えると、発現ベクターは誘導型または構成型の転写および翻訳の開始領域を提供し、コード領域は転写開始領域ならびに転写および翻訳の終結領域の転写制御下で使用可能なように連結される。このような制御領域は、本核酸が得られる対象種に対して天然でありうるか、または外因性の供給源に由来しうる。
【００４６】
発現ベクターには一般に、プロモーター配列の近傍に好都合な制限酵素切断部位があり、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入が可能となる。発現宿主内で作用する選択マーカーが存在しうる。発現ベクターは特に、上述したように融合タンパク質の産生に使用されうる。
【００４７】
転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含むように発現カセットを調製することができる。特に関心対象であるのは、一般的には長さが少なくとも約8アミノ酸であり、より一般的には長さが少なくとも約15アミノ酸であり、約25アミノ酸さらに遺伝子の読み枠の完全長までである、機能性エピトープまたは領域の発現を可能とする、配列の使用である。DNAを導入後、この構築物を含む細胞を選択マーカーによって選択し、細胞を増殖させた後に発現に使用する。
【００４８】
上述の発現系は、発現の目的に応じて従来の方法で原核生物または真核生物で使用することができる。タンパク質を大規模に産生させる場合は、大腸菌、枯草菌、分裂酵母などの単細胞生物、バキュロウイルスベクターを組み合わせた昆虫細胞、または脊椎動物などの高等生物の細胞、例えばCOS 7細胞、HEK293、CHO、アフリカツメガエル（Xenopus）の卵母細胞などを発現宿主細胞として使用することができる。状況によっては、真核細胞で遺伝子を発現させることが望ましく、この場合、発現させるタンパク質は、天然の折りたたみ（folding）および翻訳後修飾による恩典を得る。小ペプチドを研究室で合成することもできる。完全なタンパク質配列の亜集団であるポリペプチドを、機能上重要なタンパク質の一部分を同定して調査するために使用することができる。
【００４９】
対象となる特異的な発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳類細胞に由来する発現系が含まれる。これら各分類の代表的な系を以下に提供する：
【００５０】
細菌
細菌を用いた発現系は以下の文献で説明されたものを含む：チャン（Chang）ら、Nature（1978）275：615；ゴーデル（Goeddel）ら、Nature（1979）281：544；ゴーデルら、Nucleic Acids Res.（1980）8：4057；欧州特許第0 036,776号；米国特許第4,551,433号；デボア（DeBoer）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1983）80：21〜25；およびシーベンリスト（Siebenlist）ら、Cell（1980）20：269。
【００５１】
酵母
酵母を用いた発現系は以下の文献に記載されたものを含む：ヒネン（Hinnen）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1978）75：1929；イトウ（Ito）ら、J. Bacteriol.（1983）153：163；カーツ（Kurtz）ら、Mol. Cell Biol.（1986）6：142；クンゼ（Kunze）ら、J. Basic Microbial.（1985）25：141；グリーソン（Gleeson）ら、J. Gen. Microbial.（1986）132：3459；ローゲンカンプ（Roggenkamp）ら、Mol. Gen. Genet.（1986）202：302；ダス（Das）ら、J. Bacteriol.（1984）158：1165；デ・ルーベンコート（De Louvencourt）ら、J. Bacterial.（1983）154：737；ファン・デン・バーグ（Van den Berg）ら、Bio/Technology （1990）8：135；クンゼ（Kunze）ら、J. Basic Microbial.（1985）25：141；クレッグ（Cregg）ら、Mol. Cell. Biol. （1985）5：3376；米国特許第4,837,148号および第4,929,555号；ビーチ（Beach）およびナース（Nurse）、Nature（1981）300：706；ダビドウ（Davidow）ら、Curr. Genet.（1985）10：380；ガイジャーディン（Gaillardin）ら、Curr. Genet.（1985）10：49；バランス（Ballance）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.（1983） 112：284〜289；ティルバーン（Tilburn）ら、Gene（1983）26：205〜221；イェルトン（Yelton）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1984）81：1470〜1474；ケリー（Kelly）およびハインズ（Hynes）、EMBO J.（1985）4：475〜479；欧州特許第0 244,234号；および国際公開公報第91/00357号。
【００５２】
昆虫細胞
昆虫における異種遺伝子の発現は以下の文献に記載されたようになされる：米国特許第4,745,051号；フリーセン（Friesen）ら、「バキュロウイルス遺伝子発現の調節（The Regulation of Baculovirus Gene Expression）」「バキュロウイルスの分子生物学（The Molecular Biology Of Baculoviruses）」（1986）（W. Doerfler編））；欧州特許第0 127,839号；欧州特許第0 155,476号；およびブラク（Vlak）ら、J. Gen. Virol.（1988）69：765〜776；ミラー（Miller）ら、Ann. Rev. Microbiol.（1988）42：177；カーボネル（Carbonell）ら、Gene（1988）73：409；マエダ（Maeda）ら、Nature（1985）315：592〜594；レバック-ベルヘイデン（Lebacq-Verheyden）ら、Mol.Cell.Biol.（1988）8：3129；スミス（Smith）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1985）82：8844；ミヤジマ（Miyajima）ら、Gene（1987）58：273；およびマーティン（Martin）ら、DNA（1988）7：99。数多くのバキュロウイルス株および異型ならびに宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞は、ルコウ（Luckow）ら、Bio/Technology（1988）6：47〜55、ミラー（Miller）ら、Generic Engineering（1986）8：277〜279、およびマエダ（Maeda）ら、Nature（1985）315：592〜594に記載されている。
【００５３】
哺乳類細胞
哺乳類における発現は以下の文献に記載されるようになされる：ディケマ（Dijkema）ら、EMBO J.（1985）4：761、ゴルマン（Gorman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1982）79：6777、ボシャート（Boshart）ら、Cell （1985）41：521、および米国特許第4,399,216号。哺乳類における発現の他の特徴は、以下の文献に記載されるように促進される：ハム（Ham）およびウォレス（Wallace）、Meth. Enz.（1979）58：44、バーンズ（Barnes）およびサトウ（Sato）、Anal. Biochem.（1980）102：255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、および米国再発行特許第30,985号。
【００５４】
上述の任意の宿主細胞、または他の適切な宿主細胞または生物を用いて本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および/または発現させた際に、結果として得られる複製された核酸、RNA、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の産物として本発明の範囲内にある。このような産物は当技術分野で公知の任意の適切な方法で回収される。
【００５５】
選択されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子を同定すると、その発現を該遺伝子が天然に存在する細胞内で制御することができる。例えば細胞の内因性遺伝子は、細胞ゲノムの、細胞内における遺伝子発現を少なくとも増強するのに十分な位置に挿入した外因性調節配列で調節することができる。調節配列は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,641,670号および第5,733,761号に記載された相同組換えを介してゲノムに組み込まれるように設計することが可能であり、または参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/15650号に記載された非相同組換えを介してゲノムに組み込まれるように設計することができる。したがって、コードする核酸そのものを操作しない代わりに、上述の本明細書に組み入れられる特許文書に記載されているように、所望のタンパク質をコードする遺伝子を既に含む細胞のゲノムへ調節配列を組み込むことによって対象タンパク質を産生する段階も本発明に含まれる。
【００５６】
対象となる核酸の相同体も提供する。相同体は多数の任意の方法で同定される。提供されたcDNA断片を、関心対象の標的生物から回収したcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができ、ストリンジェンシーの低い条件を使用する。このプローブは一つの大きな断片であっても、一つまたは複数の短い縮重プライマーであってもよい。配列が類似した核酸は、ストリンジェンシーの低い条件（例えば50℃で6×SSC（0.9 Mの塩化ナトリウム/0.09 Mのクエン酸ナトリウム））でハイブリダイゼーションを行って検出し、1×SSC（0.15 Mの塩化ナトリウム/0.015 Mのクエン酸ナトリウム）中で55℃で洗浄した場合に結合状態が維持される。配列同一性は、例えば50℃またはそれ以上および0.1×SSC（15 mMの塩化ナトリウム/1.5 mMのクエン酸ナトリウム）のストリンジェンシーの高い条件でハイブリダイゼーションを行うことで決定することができる。提供された配列（例えば対立遺伝子異型や遺伝学的に変化させた遺伝子など）と実質的に同一な領域を有する核酸は、ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件で提供された配列と結合する。プローブ、特にDNA配列の標識プローブを用いることで相同遺伝子または関連遺伝子を単離することができる。
【００５７】
また、対象となるゲノム配列のプロモーター配列も関心対象である。5'隣接領域の配列をエンハンサー結合配列を含み、例えば対象タンパク質遺伝子を発現させる細胞/組織における発現を調節可能とする、プロモーター要素に使用することができる。
【００５８】
断片がPCRやハイブリダイゼーションによるスクリーニング用のプローブなどとして有用な本核酸の短いDNA断片も提供される。より長いDNA断片（100ヌクレオチドを超えるもの）は、上の項に記載したように、コードされたポリペプチドの産生に有用である。幾何級数的PCRのような幾何級数的な増幅反応にはプライマー対を使用する。プライマー配列の正確な組成は本発明に重要ではないが、多くの応用でプライマーは、当技術分野で公知であるようにストリンジェンシーの高い条件で対象配列とハイブリッドを形成する。少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100ヌクレオチドの増幅産物を生成するプライマー対を選択することが好ましい。プライマー配列の選択に用いられるアルゴリズムは一般的に知られており、市販のソフトウェアパッケージを利用することができる。増幅用プライマーはDNAの相補鎖とハイブリッドを形成し、互いの方向にプライムする（prime）。
【００５９】
DNAはまた、生物試料中の遺伝子発現を同定する際に使用することもできる。細胞を対象に、ゲノムDNAまたはmRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在に関して細胞を調査する方法は文献に詳しく記載されている。手短に説明すると、DNAまたはRNAを細胞試料から単離する。逆転写酵素を用いてmRNAをRT-PCRで増幅し、相補的なDNA鎖を形成させた後に、対象DNA配列に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行う。またmRNA試料をゲル電気泳動法で分離し、適切な支持体（例えばニトロセルロースやナイロンなど）に移した後に、対象DNAの断片をプローブとして調査した。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法、および固体チップ上に整列させたDNAプローブに対するハイブリダイゼーションなどの他の手法を使用することもできる。対象配列とハイブリッドを形成したmRNAを検出することにより、試料中におけるアンソゾアンタンパク質の遺伝子発現が示される。
【００６０】
隣接するプロモーター領域およびコード領域を含む本核酸に、当技術分野で公知のさまざまな方法で変異を導入することで、プロモーター強度、コードタンパク質配列、コードタンパク質の性質（コードタンパク質の蛍光の性質を含む）などにおける、目標とした変化を導入することができる。このような変異をもつDNA配列またはタンパク質産物は通常、本明細書に記載される配列と実質的に同様であり、例えば、それぞれ少なくとも1個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なり、かつ少なくとも2個（ただし約10個のヌクレオチドまたはアミノ酸を超えない）が異なる場合がある。配列の変化は、置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせの場合がある。欠失にはさらに、領域またはエキソン（例えば10、20、50、75、150、またはそれ以上のアミノ酸残基）の欠失などの大規模な変化が含まれうる。クローン化した遺伝子のインビトロにおける変異導入法は公知である。部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）のプロトコルの例は以下の文献に記載されている：グスタン（Gustin）ら（1993）、Biotechniques 14：22；バラニー（Barany）（1985）、Gene 37：111〜23；コリチェリ（Colicelli）ら、（1985）Mol. Gen. Genet. 199：537〜9；およびプレンキ（Prentki）ら、（1984）、Gene 29：303〜13。部位特異的変異導入法は、以下の文献に記載されている：サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、CSH Press 1989、pp. 15.3〜15.108；ワイナー（Weiner）ら、（1993）、Gene 126：35〜41；セイヤーズ（Sayers）ら、（1992）、Biotechniques 13：592〜6；ジョーンズ（Jones）およびウィニストーファー（Winistorfer）（1992）、Biotechniques 12：528〜30；バートン（Barton）ら、（1990）、Nucleic Acids Res. 18：7349〜55；マロッティ（Marotti）およびトミック（Tomich）、（1989）、Gene Anal. Tech. 6：67〜70；およびチュー（Zhu）、（1989）、Anal. Biochem. 177：120〜4。このような変異型核酸の誘導体は、特定の色素/蛍光タンパク質の構造-機能関係を検討するために、または、機能または調節に影響を及ぼすタンパク質の性質を変化させるために使用することができる。
【００６１】
多くの態様の中で特に関心対象となるのは、色素タンパク質（任意の蛍光である場合ほとんど持っていない色素タンパク質）に変異を導入して蛍光変異体とする段階に用いられる、下記の特異的な変異プロトコルである。このプロトコルでは、候補タンパク質の配列を、マッツ（Matz）らによって報告されたプロトコル「非生体発光性のアンソゾアン種由来の蛍光タンパク質（Fluolescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species）」、Nature Biotechnology（1999年10月）17：969〜973）にしたがってオワンクラゲ（Aequorea victoria）の野生型GFPのアミノ酸とともに整列させる。整列させた色素タンパク質の148位の残基を同定した後に、それを例えば部位特異的変異導入法でセリンに変える。こうすることで野生型色素タンパク質の蛍光変異体が得られる。これについては下記のmut C148Sを参照されたい。
【００６２】
本核酸がヒト化された変形も関心対象となる。本明細書で使用する「ヒト化された（humanized）」という用語は、ヒト細胞におけるタンパク質発現用のコドンを最適化させるために、核酸配列を対象になされる変更を意味する（Yangら、Nucleic Acids Research 24（1996）、4592〜4593）。また、タンパク質のヒト化について記載した米国特許第5,795,737号も参照されたい、この開示は本明細書に参照として組み込まれる。
【００６３】
タンパク質／ポリペプチド組成物
本発明により、スチコダクチリダエン蛍光タンパク質(その野生型非蛍光性色素タンパク質前駆体の他に)およびその変異体を含む、大きく赤側にシフトした蛍光タンパク質、ならびにそれらに関連したポリペプチド組成物も提供される。本タンパク質は色素タンパク質であるので、これらは有色のタンパク質であり、これは蛍光、低蛍光または非蛍光であってもよい。本明細書において使用される用語色素タンパク質および蛍光タンパク質は、Renillaルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ類は含まず、例えば白色光または特定波長の光(または狭い波長バンド)などの光が照射された場合に、着色したまたは有色のおよび／もしくは蛍光発光するいずれかのタンパク質を意味する。本明細書において使用される用語ポリペプチド組成物は、完全長タンパク質および、その一部または断片の両方を意味する。この用語には、天然のタンパク質の変種も含まれ、ここでこのような変種は、以下に詳述するように、天然のタンパク質、および天然のタンパク質の変異体と相同または実質的に類似している。本ポリペプチドは、その自然の環境以外に存在する。
【００６４】
蛍光発光を示している本タンパク質に関して、ひとつの光波長で励起し、その後別の波長で光を発光することができるような手段により、本タンパク質の励起スペクトルは、典型的には約450nm〜650nm、一般には約550nm〜600nm、およびより一般的には約570nm〜600nmの範囲であり、一方本タンパク質の発光スペクトルは、典型的には約480nm〜680nm、一般には約580nm〜660nm、およびより一般的には約590nm〜650nmであり、ならびにある特定のこれらの態様においては、約620nm〜680nm、一般には約630nm〜670nmおよびより一般的には約635nm〜665nmの範囲である。
【００６５】
本発明のある種の大きく赤側にシフトした蛍光変異体の野生型前駆体であるスチコダクチリダエン色素タンパク質も提供され、これらの色素タンパク質は、最大吸収範囲を約450nm〜650nm、一般には約550nm〜600nm、およびより一般的には約565nm〜585nmに有する。
【００６６】
本タンパク質は、典型的にはアミノ酸残基の長さが約200個〜300個、一般には約220個〜250個の範囲であり、概して分子量は約20kDa〜35kDa、一般には約25kDa〜30kDaの範囲である。
【００６７】
ある態様においては本タンパク質は明るい。明るいとは、色素タンパク質およびその蛍光変異体が一般的な方法（例えば視覚的スクリーニング法、分光光度法、分光蛍光法、蛍光顕微鏡、FACS装置など）で検出可能であることを意味する。特定の蛍光タンパク質の蛍光輝度は、その量子収量に最大吸光係数を乗じた値によって決定される。色素タンパク質の輝度は、その最大吸光係数で表すことができる。
【００６８】
ある態様においては、対象となるタンパク質は、宿主細胞内で発現させると速やかに折りたたまれる。速やかに折りたたまれるとは、タンパク質がその3次構造をとり、短時間のうちに色素または蛍光の性質を獲得することを意味する。これらの態様においては、タンパク質は、一般的に約3日を超えない時間で、一般的にある態様において、タンパク質は、例えば、温度範囲30〜40℃(例えば37℃)の生理的温度条件下で成熟する。
【００６９】
本発明の特異的および代表的野生型スチコダクチリダエン色素タンパク質は、野生型ヘテラクチス・クリスパ色素タンパク質である。このタンパク質の基本アイソフォームは、図1に示したようなアミノ酸配列を有し、配列番号：2として同定される。この野生型タンパク質の第二のアイソフォームは、図2に示したようなアミノ酸配列を有し、配列番号：4として同定される。これらの代表的特異的蛍光変異体は、mutC148S、mut44-9(hcFRFP)(HcRed)；mutFP10-cr1(hcFRFP-2)(HcRed-2A)、mut hc-44、mut hc-4、mut hc-41およびmut-44-6である。
は約2日で、またさらに一般的には約1日を超えない時間で折りたたまれる。
【００７０】
本明細書に記載の本発明の特定のアミノ酸配列（すなわち配列番号：02〜18）とは配列が異なる、相同体およびタンパク質（またはそれらの断片）が提供される。相同体とは、MegAlign、DNAstar（1998）clustalアルゴリズム（ヒギンス（D.G. Higgins）およびシャープ（P.M. Sharp）、「マイクロコンピューター上における、迅速かつ高感度の複数配列整列（Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer）」（1989）CABIOS、5：151〜153（使用パラメータはktuple 1、gap penalty 3、window 5、およびdiagonals saved 5である）に記載されている）を用いて決定される、本発明のタンパク質に対して少なくとも約10％、一般的には約20％、またさらに一般的には少なくとも約30％、また多くの態様においては少なくとも約35％、一般的には少なくとも約40％、またさらに一般的には約60％のアミノ酸配列の同一性を有する、タンパク質を意味する。多くの態様においては、関心対象である相同体には極めて高い配列同一性がある（例えば65％、70％、75％、80％、85％、90％、またはそれ以上）。
【００７１】
また、野生型タンパク質と実質的に同一なタンパク質も提供される。実質的に同一であるとは、タンパク質のアミノ酸配列と野生型のタンパク質の配列との同一性が少なくとも約60％、一般的には少なくとも約65％、またさらに一般的には少なくとも約70％であることを意味する。場合によってはこの同一性はさらに高くなる（例えば75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上）。
【００７２】
多くの態様においては、対象となる相同体には上述の特定の配列に構造的特徴がある。このような構造的な特徴にはβカンフォールド（β-can fold）が含まれる。
【００７３】
上述した天然のタンパク質の変異体であるタンパク質もまた提供される。変異体は、野生型（例えば天然の）タンパク質の生物学的特性を保持している場合があり、または野生型のタンパク質とは異なる生物学的特性をもつ場合がある。対象タンパク質の「生物学的特性」という用語には、吸収極大、放射極大、最大吸光係数、輝度（例えば野生型タンパク質またはオワンクラゲ（A. victoria）の緑色蛍光タンパク質などの他の標準的なタンパク質と比較する）などのスペクトル特性；インビボおよび/またはインビトロにおける安定性（例えば半減期）などが含まれるがこれらに限定されない。変異体には、1アミノ酸残基の変化、1残基または複数の残基のアミノ酸の欠失、N末端の切断、C末端の切断、挿入などが含まれる。
【００７４】
変異体は、分子生物学の標準的な手法（例えば無作為変異導入法や標的変異導入法）で作製することができる。本明細書ではいくつかの変異体が提供される。実施例で代表例を示すことで、また標準的な手法を用いることで、当業者であれば多種多様な付加的な変異体を容易に作製して、生物学的特性が変化したか否かを調べることができる。例えば蛍光強度は、分光光度計を用いてさまざまな励起波長で測定することができる。
【００７５】
天然のタンパク質である本発明のタンパク質は、天然の環境以外で存在する（例えば天然の環境から分離される）。ある態様においては、対象タンパク質は天然の環境と比較して対象タンパク質が濃縮されている組成物中に存在する。例えば精製されたタンパク質が提供される。精製されたとは、タンパク質が非スチコダクチリダエンの色素/蛍光タンパク質に由来するタンパク質を実質的に含まない組成物中に存在することを意味する。実質的に含まないとは、組成物の90％未満、一般的には60％未満、またさらに一般的には50％未満が非アンソゾアン由来の色素タンパク質またはその変異体で構成されることを意味する。本発明のタンパク質はまた、単離された状態で存在する場合もある。単離された状態とは、該当するタンパク質が他のタンパク質および他の天然の生物学的分子（オリゴ糖、ポリヌクレオチド、およびそれらの断片など）を実質的に含まないことを意味する。この場合の「実質的に含まない」とは、単離された状態のタンパク質を含む組成物中の70％未満、一般的には60％未満、またさらに一般的には50％未満が、他の何らかの天然の生物学的分子であることを意味する。ある態様においては、このようなタンパク質は実質的に純粋な状態で存在する。実質的に純粋な状態とは、少なくとも95％、一般的には少なくとも97％、またさらに一般的には少なくとも99％の純度であることを意味する。
【００７６】
天然のタンパク質に加えて、天然のタンパク質とは異なるポリペプチド（例えば上述の変異型タンパク質）が提供される。通常このようなポリペプチドは、アンソゾアンタンパク質をコードする遺伝子の読み枠（ORF）にコードされたアミノ酸配列を含む。これには、完全長のタンパク質およびその断片、特に生物学的に活性のある断片、および/または機能領域に対応する断片が含まれるほか、対象ポリペプチドと他のタンパク質またはその一部分との融合体が含まれる。対象断片の長さは、典型的には少なくとも約10アミノ酸であり、一般的には少なくとも約50アミノ酸であり、また長くて300アミノ酸またはそれ以上となる場合もあるが一般的には約1000アミノ酸を超えない。この場合、断片は対象タンパク質と同一のアミノ酸を少なくとも約10アミノ酸、一般的には少なくとも約15アミノ酸、また多くの態様においては少なくとも約50アミノ酸の長さで有する。いくつかの態様においては、対象ポリペプチドの長さは約25アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸、約125アミノ酸、約150アミノ酸、約200アミノ酸、約210アミノ酸、約220アミノ酸、約230アミノ酸、または約240アミノ酸であり、最長でタンパク質全体となる。いくつかの態様においては、タンパク質断片は野生型タンパク質の生物学的特性のすべてまたは実質的にすべてを保持する。
【００７７】
本タンパク質およびポリペプチドは天然の供給源から得られるほか、合成によって得られる。例えば野生型のタンパク質は、タンパク質を発現する生物の供給源（例えば上述した特定のアンソゾアン種）に由来する場合がある。また、本タンパク質は合成方法（例えば組換え遺伝子、または対象タンパク質をコードする配列をコードする核酸を上述した適切な宿主で発現させる）を用いて産生してもよい。任意の簡便なタンパク質精製法を使用することができる。適切なタンパク質精製法は、「タンパク質精製の手引書（Guide to Protein Purification）」（Deuthser編）（Academic Press、1990）に記載されている。例えば溶解物は、元の供給源から調製してHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーなどで精製することができる。
【００７８】
抗体の組成
対象蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体も提供する。適切な抗体は、対象タンパク質のすべてまたは一部を含むペプチドで宿主動物を免疫化することで得られる。適切な宿主には、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが含まれる。タンパク質の免疫原の起源は通常、アンソゾアン種である。宿主動物は一般に、免疫原とは異なる種である（例えばマウスなど）。
【００７９】
免疫原は、完全なタンパク質、またはその断片および誘導体を含む場合がある。好ましい免疫原はタンパク質のすべてまたは一部を含む。これらの残基は元の標的タンパク質にみられる翻訳後調節を含む。免疫原は当技術分野で公知のさまざまな方法（例えば従来の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現やアンソゾアン種の分離など）で作られる。
【００８０】
ポリクローナル抗体の調製の第1工程は標的タンパク質による宿主動物の免疫化である。標的タンパク質は実質的に純粋な状態のもので、含まれる混入物は約1％未満であることが好ましい。免疫原は完全な標的タンパク質、その断片または誘導体を含む場合がある。宿主動物の免疫応答を昂進させるために、標的タンパク質をアジュバントと結合させる場合がある。適切なアジュバントには、ミョウバン、デキストラン、硫酸塩、高分子量の重合体陰イオン、油水エマルジョン（例えばフロインドアジュバントやフロインド完全アジュバントなど）が含まれる。標的タンパク質を合成担体タンパク質または合成抗原に結合させることもできる。さまざまな宿主を免疫化してポリクローナル抗体を産生させることができる。このような宿主には、ウサギ、モルモット、齧歯類（例えばマウスやラット）、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。標的タンパク質を一般的には、初期量で宿主の皮膚内に投与したあとに、1回または複数回（一般的には少なくとも2回）の追加投与を行う。免疫化後に宿主の血液を採取して血清と血液細胞を分ける。結果として得られた抗血清中に含まれるIgを、アンモニウム塩による分画法やDEAEクロマトグラフィーなどの既知の方法でさらに分画することができる。
【００８１】
モノクローナル抗体は従来の手法で作製する。通常、免疫化した宿主動物の脾臓および/またはリンパ節が血漿細胞の供給源となる。血漿細胞を骨髄腫細胞と融合させて不死化させてハイブリドーマ細胞を得る。個々のハイブリドーマの培養上清を、標準的な方法でスクリーニングして所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを同定する。ヒトのタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生させるのに適切な動物には、マウス、ラット、ハムスターなどが含まれる。マウスのタンパク質に対する抗体を産生させる場合は、このような動物は通常ハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、ハイブリドーマ細胞の上清または腹水から従来の手法（例えば不溶性の支持体やタンパク質Aセファロースなどに結合させたタンパク質を用いる親和性クロマトグラフィー）で精製することができる。
【００８２】
抗体は、通常の多量体構造ではなく1本鎖として産生させることができる。1本鎖の抗体についてはジョスト（Jost）ら（1994） J.B.C. 269：26267〜73および他の文献に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を、小分子量の中性アミノ酸（グリシンおよび/またはセリンを含む）の少なくとも4アミノ酸をコードするスペーサーに連結する。この融合物にコードされるタンパク質には、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能性の可変領域を集合させることができる。
【００８３】
ある態様においてはヒト化された抗体も対象となる。抗体をヒト化する方法は当技術分野で公知である。ヒト化抗体は、トランスジェニックのヒト免疫グロブリンの定常領域遺伝子を有する動物の産物の場合がある（例えば国際公開公報第90/10077号および第90/04036号を参照）。また対象となる抗体は、組換えDNA技術でCH1、CH2、CH3、ヒンジ領域、および/またはフレームワーク（framework）領域を、対応するヒト配列で置換することで作製することができる（国際公開公報第92/02190号を参照）。
【００８４】
IgのcDNAをキメラ免疫グロブリン遺伝子の構築に使用することは当技術分野で公知である（Liuら（1987）P.N.A.S. 84：3439および（1987）J. Immunol. 139：3521）。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞からmRNAを単離してcDNA作製に用いる。対象となるcDNAは、特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応で増幅させることができる（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号）。またはライブラリーを作製してスクリーニングを行って対象配列を単離する。次に抗体の可変領域をコードするDNA配列をヒトの定常領域配列と融合させる。ヒトの定常領域遺伝子の配列については、カバト（Kabat）ら（1991）、Sequences of Proteins of Immunological Interest、N.I.H 出版番号91-3242号に記載されている。ヒトのC領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプを選択する際には、補体結合などの所望のエフェクター機能や抗体依存性の細胞障害活性を参考とする。好ましいアイソタイプはIgG1、IgG3、およびIgG4である。ヒトの軽鎖の定常領域、κ鎖またはλ鎖のいずれかを使用することができる。次にキメラのヒト化抗体を従来の方法で発現させる。
【００８５】
Fv、F(ab')2、およびFabなどの抗体断片は、完全なタンパク質を例えばタンパク質分解酵素または化学的な切断法で切断することで調製することができる。または先端が切断された（truncated）遺伝子を設計する。例えばF(ab')2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1領域およびヒンジ領域をコードするDNA配列と、それに続く翻訳停止コドンを含み、先端の切れた分子を作る。
【００８６】
H領域およびL J領域の共通（consensus）配列は、有用な制限酵素切断部位をJ領域に導入して、続いてV領域セグメントをヒトのC領域セグメントに連結させるためのプライマーとしてのオリゴヌクレオチドを設計する際に用いられる。C領域のcDNAは、部位特異的変異導入法でヒトの配列中の同様の位置に制限酵素切断部位を導入して修飾することができる。
【００８７】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来のエピソームなどが含まれる。有用なベクターは、機能が損なわれていないヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードし、任意のVH配列またはVL配列を容易に挿入して発現させることができるような適切な制限酵素切断部位を備えたベクターである。このようなベクターでは通常、挿入されたJ領域中のスプライス供与体部位と、ヒトのC領域の手前にあるスプライス受容体部位間でスプライシングが起こるほか、ヒトのCHエキソン内で起こるスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある本来の染色体部位上で起こる。結果として生じるキメラ抗体は、レトロウイルスのLTR、例えばSV-40の初期プロモーター（Okayamaら（1983）Mol. Cell. Bio. 3：280）、ラウス肉腫ウイルスのLTR（Gormanら、（1982）、P.N.A.S. 79：6777）、およびモロニーマウス白血病ウイルスのLTR（Grosschedlら、（1985）Cell 41：885）、天然のIgプロモーターなどの任意の強力なプロモーターに連結することができる。
【００８８】
トランスジェニック
対象となる核酸を使用して、トランスジェニックの非ヒト植物または動物を作製することができるほか、または細胞系列内で部位特異的な遺伝子修飾を導入することができる。本発明のトランスジェニック細胞には、導入遺伝子として存在する、本発明の一つまたは複数の核酸が含まれる。この定義には、導入遺伝子を含むように形質転換された親細胞およびその子孫が含まれる。多くの態様におけるトランスジェニック細胞は、本発明の核酸を通常含まない細胞である。トランスジェニック細胞が天然の状態で本核酸を含む態様においては、この核酸は細胞内において天然の位置とは異なる場所に存在する。すなわち細胞ゲノム上の天然とは異なる場所に組み込まれる。トランスジェニック動物は相同組換えを介して作製することができる。この場合、内在性の座位は変化する。あるいは核酸構築物は、ゲノム上に無作為に組み込まれる。安定に組み込まれるベクターには、プラスミド、レトロウイルス、および他の動物のウイルス、YACなどがある。
【００８９】
本発明のトランスジェニック生物は、内因性遺伝子の発現を消失させはしないにせよ少なくとも低下させた、内因性遺伝子をノックアウトした細胞および多細胞生物（例えば植物および動物）を含む。対象となるトランスジェニック生物はまた、タンパク質またはその異型が、通常は発現しないか、および/または細胞または組織内に通常みられるレベルとは異なるレベルで発現する細胞または組織で発現する、例えば植物および動物などの細胞および多細胞生物も含む。
【００９０】
相同組換えに用いるDNA構築物は、本発明の遺伝子の少なくとも一部を含む。この遺伝子には所望の遺伝的修飾があり、標的座位に対して相同な領域が含まれる。無作為に組み込ませるためのDNA構築物は組換えに関与する相同領域を含む必要がない。陽性または陰性の選択に用いるマーカーを含むことは有用である。相同組換えを介した標的遺伝子修飾を有する細胞を作製する方法は当技術分野で公知である。動物細胞をトランスフェクトするさまざまな手法は、キーオン（Keown）ら（1990）、Meth. Enzymol. 185：527〜537に記載されている。
【００９１】
胚幹細胞（ES細胞）を得るためには、ES細胞系列を使用するか、または宿主（例えばマウス、ラット、モルモットなど）から新鮮な状態で胚細胞を得る。このような細胞を適切な線維芽細胞支持細胞層で生育させるか、または白血病抑制因子（LIF）の存在下で生育させる。ES細胞または胚細胞を形質転換する際は、それらをトランスジェニック動物を作製するために使用する場合がある。形質転換後に細胞を適切な培地中の支持細胞層にプレーティングする。構築物を含む細胞を選択培地を用いて検出することができる。コロニーが生育するために十分な時間が経過した後に、構築物の相同組換えまたは組込みが起きたか否かについてコロニーを選抜して検討する。次に陽性を示すコロニーを用いて胚の操作および胚盤胞への注入を行う。胚盤胞は4週齢〜6週齢の過排卵状態の雌から回収する。ES細胞をトリプシン処理して細胞を修飾し、胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後に胚盤胞を偽妊娠状態の雌の個々の子宮角に戻す。次にこれらの雌が妊娠満期になるのを待ち、生まれた子孫を対象に構築物の有無についてスクリーニングを行う。胚盤胞の異なる表現型と、遺伝学的に修飾した細胞が提供されることで、キメラの子孫を容易に検出することができる。
【００９２】
キメラ動物を対象に、修飾遺伝子の有無についてスクリーニングを行い、また修飾を有する雄ならびに雌を交配させてホモ接合の子孫を得る。遺伝子修飾が原因で発生のある時点で致死となる場合は、組織または器官は、同種の（allogeneic）移植片または類遺伝子性の（congenic）移植片もしくは移植体、またはインビトロ培養で維持することができる。トランスジェニック動物は実験用動物や家畜などのヒト以外の哺乳類とすることができる。トランスジェニック動物は、機能に関する研究や薬剤スクリーニングなどに使用することができる。トランスジェニック動物の用途の代表例には後述する動物が含まれる。
【００９３】
トランスジェニック植物を同様の方法で作製することができる。トランスジェニック植物の細胞および植物体を調製する方法は、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第5,767,367号；第5,750,870号；第5,739,409号；第5,689,049号；第5,689,045号；第5,674,731号；第5,656,466号；第5,633,155号；第5,629,470号；第5,595,896号；第5,576,198号；第5,538,879号；第5,484,956号に記載されている。トランスジェニック植物を作製する方法は「植物生化学および分子生物学（Plant Biochemistry and Molecular Biology）」（LeaおよびLeegood編、John WileyおよびSons）（1993）の275〜295ページでも概説されている。手短に言えば、植物種の性質に応じて適切な植物の細胞または組織を回収する。したがって状況によってはプロトプラストを単離する。プロトプラストは多種多様な植物組織（例えば葉、胚軸、根など）から単離することができる。プロトプラストを単離する際には、細胞壁を除くために、回収した細胞をセルラーゼとともにインキュベートする。詳細なインキュベーションの条件は、細胞を回収する供給源である植物および/または組織の種類に応じて変わる。結果として得られたプロトプラストを次に、ふるいにかけて遠心して細胞片から分離する。プロトプラストを使う代わりに、体細胞を含む胚形成外植片を用いてトランスジェニック宿主を調製することができる。細胞または組織を回収した後に関心対象の外因性DNAを植物細胞に導入する。この際、多種多様な導入法を用いることができる。単離されたプロトプラストを対象に、DNAを介した遺伝子導入プロトコルによる導入を行う。導入法は以下を含む：プロトプラストを裸のDNA（例えば多価陽イオン（PEGまたはPLOなど）の存在下で、関心対象の外因性コード配列を含むプラスミド）とともにインキュベートする；また、対象となる外因性配列を含む裸のDNAの存在下でプロトプラストの電気泳動を行う。次に、外因性DNAを取り込むことに成功したプロトプラストを選択してカルスに成長させ、最終的には、適切な量および比率の促進因子（例えばオーキシンおよびサイトカイン）と接触させてトランスジェニックの植物体に生育させる。胚形成の外移植片の場合は、標的となる体細胞に外来DNAを簡便に導入する際に、粒子加速法すなわち「遺伝子銃（gene-gun）」プロトコルを用いる。次いで、結果として得られた外移植片をキメラ植物体に生育させ、交配してトランスジェニックの子孫を得る。上記の裸のDNAを用いる方法以外の、トランスジェニック植物の別の簡便な作製法がアグロバクテリウムを介した形質転換法である。アグロバクテリウムを介した形質転換法では、外来DNAを含む融合体（co-integrative）ベクターまたはバイナリー（binary）ベクターを調製して、それを適切なアグロバクテリウム株（例えばA. tumefaciens）に導入する。結果として得られた細菌を次に、調製済みのプロトプラストまたは組織移植片（例えば葉のディスク）とともにインキュベートしてカルスを生じさせる。次にカルスを選択条件で生育させ、選択して培地中で根および茎頂の生育を誘導させることで最終的にトランスジェニック植物を得る。
【００９４】
有用性
対象となる色素タンパク質およびその蛍光変異体は多種多様な応用で使用される。応用は、対象タンパク質が色素タンパク質かまたは蛍光タンパク質かのいずれかによって必然的に変わる。個々の種類のタンパク質の代表的な用途を以下に説明する。記載した用途はあくまで代表的なものであり、対象タンパク質の用途を以下の記述に制限する意図はない。
【００９５】
色素タンパク質
本発明で対象となる色素タンパク質は多種多様な応用で使用される。対象となる一つの応用は、対象タンパク質を、特定の組成物に色を付けたりまたは色素を加えることができる着色剤として使用することである。ある態様において特に関心対象であるのは毒性のない色素タンパク質である。対象となる色素タンパク質は多種多様な組成物に取り込ませることができる。代表的な組成物には、食品成分、医薬品、化粧品、生物（例えば動物や植物）などがある。着色剤または色素として使用する場合は、十分量の色素タンパク質を組成物に取り込ませて、所望の色または色素を付ける。色素タンパク質は、任意の簡便なプロトコルを用いて組成物に取り込ませることができる。使用する特定のプロトコルは、少なくとも部分的には着色対象組成物の性質に必然的に依存する。使用するプロトコルには、混合（blending）、拡散（diffusion）、摩擦（friction）、吹きつけ（spraying）、注入（injection）、入れ墨（tattooing）など含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
色素タンパク質はまた、分析物の検出アッセイ法（例えば対象となる生物学的分析物のアッセイ法）の標識としても使用される。例えば色素タンパク質は、分析物に特異的な抗体またはその結合断片とともに付加物に取り込まれたあとに、複合試料中で、対象分析物のイムノアッセイ法で用いられる。この手順は参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第4,302,536号に記載されている。抗体またはその結合断片ではなく、対象色素タンパク質またはその色素生産性断片を、対象分析物または他の部分に特異的に結合するリガンド、成長因子、ホルモンなどと結合させることができる。これらは当業者には容易に理解される。
【００９７】
さらに別の態様においては、対象色素タンパク質は、組換えDNAの応用（例えば上述のトランスジェニックの細胞および生物の作製）で選択マーカーとして使用できる。したがって、成功または不成功のプロトコルのいずれかに対する、選択マーカーとして対象色素タンパク質の発現を利用するために、特定のトランスジェニック作製プロトコルを作ることができる。したがって、特定の工程で産生されたトランスジェニック生物の表現型における対象色素タンパク質の色の外観は、特定の生物が対象導入遺伝子を良好に保持する（多くの場合は生物において導入遺伝子を発現するように組み込まれる）ことを示すために使用することができる。選択マーカーとして使用する場合は、対象色素タンパク質をコードする核酸を、遺伝子導入体の作製過程（既に詳述）で使用することができる。対象タンパク質を選択マーカーとして用いる対象となる特定のトランスジェニック生物には、トランスジェニックの植物、動物、細菌、真菌などが含まれる。
【００９８】
さらに別の態様においては、本発明の色素タンパク質（および蛍光タンパク質）は、国際公開公報第00/46233号に記載されたタンパク質の使用法と同様に、選択フィルターなどとして日焼け止め剤に使用される。
【００９９】
蛍光タンパク質
本発明の対象となる蛍光タンパク質（ならびに上記の本発明の他の組成物）は、多種多様な応用で使用される。応用には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。対象となる最初の応用では、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）への応用で対象タンパク質を使用する。この応用では、対象タンパク質は、第2の蛍光タンパク質または色素（例えばMatzら、Nature Biotechnology（1999年10月）17：969〜973に記載された蛍光タンパク質）、オワンクラゲ（Aequoria victoria）の緑色蛍光タンパク質またはその蛍光変異体（例えば参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号に記載）、他の蛍光色素（例えばクマリンおよびその誘導体（例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン）、ボディピー（Bodipy） FLなどのボディピー色素、カスケードブルー、フルオレセイン、およびその誘導体（例えばフルオレセインイソチオシアナート）、オレゴングリーン、ローダミン色素（例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およびエリトロシン）、シアニド色素（例えばCy3およびCy5）、ランタノイドイオンの大環状キレート（例えば量子色素など）、化学発光色素（例えばルシフェラーゼ、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,746号；第5,700,673号；第5,674,713号；第5,618,722号；第5,418,155号；第5,330,906号；第5,229,285号；第5,221,623号；第5,182,202号に記載されたものを含む））と組み合わせて供与体および/または受容体としてはたらく。使用される可能性のある対象蛍光タンパク質を使用するFRETアッセイ法の特定の例は、以下の例を含むがこれらに限定されない：タンパク質-タンパク質相互作用の検出（例として、多種多様な事象に対するバイオセンサーとしてはたらく、哺乳類のツーハイブリッド（two-hybrid）系、転写因子の二量体化、膜タンパク質の多量体化、多タンパク質複合体の形成など。この場合、ペプチドまたはタンパク質は、対象蛍光タンパク質および連結用のペプチドまたはタンパク質を含むFRET蛍光コンビネーションと共有結合するし、例としてタンパク質分解酵素に特異的な基質、例としてカスパーゼによる切断では、FRETを上昇または下降させるシグナル受けて立体構造の変化を受けるリンカー、例としてPKA調節領域（cAMPセンサー）、リン酸化（例えばリンカー内にリン酸化部位があるか、またはリンカーに別のタンパク質のリン酸化/脱リン酸化された領域に対する結合特異性があるか、またはリンカーにCa2+結合領域がある）。対象タンパク質を使用する代表的な蛍光共鳴エネルギー移動すなわちFRETの応用は、以下のものを含むがこれらに限定されない：米国特許第6,008,373号；第5,998,146号；第5,981,200号；第5,945,526号；第5,945,283号；第5,911,952号；第5,869,255号；第5,866,336号；第5,863,727号；第5,728,528号；第5,707,804号；第5,688,648号；第5,439,797号、これらは参照として開示が本明細書に組み入れられる）。
【０１００】
対象蛍光タンパク質はまた、原核生物および真核生物の細胞におけるバイオセンサー（例えばCa2+イオンインジケーター、pHインジケーター、リン酸化インジケーター、他のイオン（例えばマグネシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、およびハロゲン）のインジケーター）として使用される。例えば、Caイオンを検出する際は、EFハンドモチーフを含むタンパク質がCa2+の結合を受けて細胞質から膜へ移動することが知られている。このようなタンパク質は、同タンパク質の他の領域との疎水性相互作用により分子の奥に埋め込まれたミリストイル基を含む。Ca2+が結合すると立体構造が変化してミリストイル基が露出し、脂質二重膜への挿入に利用される（「Ca2+-ミリストイルスイッチ」と呼ばれる）。タンパク質を含むこのようなEFハンドが蛍光タンパク質（FP）と融合すると、共焦点顕微鏡で細胞質から形質膜への移動を追跡することで細胞内Ca2+のインジケーターとすることができる。この系における用途に適したEFハンドをもつタンパク質にはリカバリン（1-3）、カルシニューリンB、トロポニンC、ヴィシニン（visinin）、ニューロカルシン、カルモジュリン、パルブアルブミンなどがあるがこれらに限定されない。pHについては、ヒサクトフィリン（hisactophilin）を基にした系を用いることができる。ヒサクトフィリンはミリストイル化されたヒスチジンに富むタンパク質であり、粘菌（Dictyostelium）に存在することが知られている。ヒサクトフィリンとアクチンおよび酸性脂質への結合は、細胞質のpH変動の範囲内で明確にpH依存性を示す。生細胞の膜への結合は、ヒサクトフィリンとアクチンフィラメントの相互作用に優先すると考えられる。pHが6.5の場合はそれらは形質膜および核に存在する。これとは対照的にpH 7.5では細胞質空間全体に均等に分布する。このような分布の変化は可逆的であり、分子表面上にループ状に露出したヒスチジンクラスターの影響を受ける。細胞質のpH変動の範囲内における細胞内分布の復帰は、ヒスチジン残基のpKが6.5であることと矛盾しない。このような細胞内分布は、タンパク質のミリストイル化とは無関係である。FP（蛍光タンパク質）をヒサクトフィリンに融合させることで、融合タンパク質の細胞内分布を、レーザースキャニング、共焦点顕微鏡、または標準的な蛍光顕微鏡で追跡することができる。定量的な蛍光分析は、細胞全体を対象としたラインスキャン（レーザースキャニングを用いた共焦点顕微鏡）、または他の電子データの分析（例えばメタモルフ（metamorph）ソフトウェア（Universal Imaging Corp）を用いて、細胞集団を対象に集めたデータを平均化する）を実施することで行われる。細胞質から形質膜に向かう実質的にpH依存性のヒサクトフィリン-FPの再分布は1分〜2分内に完了して5分〜10分後には定常状態となる。逆反応は同様の時間尺度で起きる。したがって同様の様式ではたらくヒサクトフィリン-蛍光タンパク質の融合タンパク質は、生きている哺乳類細胞の細胞質のpH変化を同時進行で追跡するために使用することができる。このような方法は、高いスループットの応用（例えば成長因子受容体（例えば上皮または血小板由来成長因子）の活性化、化学走性刺激/細胞移動の結果としての細胞内pH変化の検出、2次メッセンジャーとしての細胞内pH変化の検出、pHを操作する実���における細胞内pHのモニタリングなど）で使用される。PKC活性を検出する際には、レポーター系は、MARCKS（ミリストイル化されたアラニンに富むCキナーゼの基質）と呼ばれる分子がPKCの基質であるという事実を利用する。これは、ミリストイル化および静電的相互作用を介して負に帯電した形質膜に結合する正に帯電したアミノ酸（ED領域）の連続により形質膜に固定される。PKCが活性化されるとED領域はPKCによってリン酸化されることで負に帯電するようになり、静電気的な反発の結果としてMARCKSは形質膜から細胞質へ移動する（「ミリストイル静電的スイッチ」と呼ばれる）。ミリストイル化モチーフからMARCKSのED領域までのMARCKSのN末端を本発明の蛍光タンパク質と融合させると、上述したPKC活性の検出系となる。PKCによりリン酸化されると、融合タンパク質は形質膜から細胞質へ移動する。この移動は、標準的な蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡（例えばセロミックス（Cellomics）技術または他の高コンテントスクリーニング系（High Content Screening System）（例えばUniversal Imaging Corp./Becton Dickinson）を使用）で追跡できる。上述のレポーター系は、高コンテントスクリーニング（例えばPKC阻害剤のスクリーニング）に応用できるほか、この情報伝達経路を干渉すると考えられる試薬に対する多くのスクリーニング条件におけるPKC活性のインジケーターとして使用することができる。蛍光タンパク質をバイオセンサーとして使用する方法は、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第972,638号；第5,824,485号、および第5,650,135号に記載された方法（ならびに本明細書で引用した方法）も含む。
【０１０１】
対象蛍光タンパク質はまた、顕微鏡画像および電気的分析を用いた、蛍光レポーティング基を発現する細胞アレイ（array）の自動スクリーニングが関与する応用においても使用される。スクリーニングは、薬剤探索や機能ゲノム科学分野で利用することができる。この場合、例えば対象タンパク質を全細胞のマーカーとして使用して、多細胞の再編成および移動（例えば内皮細胞による多細胞性細管の形成（血管形成）、フルオロブロックインサート系（Fluoroblok Insert System）（Becton Dickinson Co.）を介した細胞移動、創傷治癒、神経突起伸長など）の変化を検出する。この場合、タンパク質はペプチド（例えば標的配列）に融合するマーカーとして使用され、例えば細胞内活動のインジケーターとしての細胞内局在の変化を可能とするタンパク質である。細胞内活動の例を以下に挙げる：キナーゼなどの情報伝達、タンパク質キナーゼC、タンパク質キナーゼA、転写因子NF-κB、およびNFATなどの刺激を受けた結果の転写因子のトランスロケーション；細胞周期にかかわるタンパク質（サイクリンA、サイクリンB1、およびサイクリンE）；タンパク質分解酵素による切断とそれに続く切断後基質であるリン脂質の、高コンテントスクリーニングの手段としての小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、核、核小体、形質膜、ヒストン、エンドソーム、リソソーム、微小管、アクチンなどの細胞内構造のマーカーを伴う移動；他の蛍光融合タンパク質と、細胞内蛍光融合タンパク質/ペプチドの運動を示すインジケーターとして、またはマーカー単独としてのこれらの局在化マーカーとの共存など。対象蛍光タンパク質を使用する細胞アレイの自動スクリーニングを含む応用例は、参照として本明細書に含まれる米国特許第5,989,835号と同様に、国際公開公報第00/17624号；国際公開公報第00/26408号、国際公開公報第00/17643号、および国際公開公報第00/03246号を含む。
【０１０２】
対象蛍光タンパク質は高いスループットのスクリーニングアッセイ法でも使用される。対象蛍光タンパク質は半減期が24時間を上回る安定なタンパク質である。また、半減期がより短く、薬剤探索の転写レポーターとして使用可能な対象蛍光タンパク質の不安定化変形も提供する。例えば本発明のタンパク質を、半減期の短いタンパク質に由来するタンパク質分解シグナル配列と推定される配列（例えばマウスのオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子のPEST配列やマウスのサイクリンB1破壊ボックスおよびユビキチンなど）と融合させることができる。不安定化させたタンパク質およびベクターを産生するために用いることができるこれらの不安定化させたタンパク質およびベクターの記載は米国特許第6,130,313号を参照されたく、この開示は本明細書に参照として組み入れられる。情報伝達経路で作用するプロモーターを、薬剤スクリーニングを目的とした対象蛍光タンパク質の不安定化された変形（例えばAP1、NFAT、NF-κB、Smad、STAT、p53、E2F、Rb、myc、CRE、ER、GR、およびTREなど）を用いて検出することができる。
【０１０３】
対象タンパク質を2次メッセンジャー検出因子（detector）として使用することができる。この場合、例えば対象タンパク質を特定の領域（例えばPKC-γのCa結合領域、PKC-γのDAG結合領域、SH2領域およびSH3領域など）に融合させる。
【０１０４】
分泌型の対象タンパク質は例えば、分泌型のリーディング（leading）配列を対象タンパク質に融合させて、最終的に多種多様な応用で使用可能な分泌型の対象タンパク質を構築することで調製することができる。
【０１０５】
対象タンパク質はまた、蛍光活性化細胞選別における応用に使用される。この応用では、対象蛍光タンパク質を細胞集団に印を付ける標識として使用し、標識細胞集団を次に当技術分野で公知の蛍光活性化細胞選別装置で選別する。FACS法は、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第5,968,738号および第5,804,387号に記載されている。
【０１０６】
対象タンパク質はまた、動物（例えばトランスジェニック動物）用のインビボにおけるマーカーとしても使用される。例えば対象タンパク質の発現を組織特異的なプロモーターで駆動することができる。このような方法は他の応用における遺伝子治療の研究、例えば導入遺伝子の発現効率の試験で使用される。対象タンパク質のこの種の応用を説明するトランスジェニック動物における蛍光タンパク質の代表的な応用は、参照として開示が本明細書に組み入れられる国際公開公報第00/02997号に記載されている。
【０１０７】
対象タンパク質の他の応用例は以下を含む：細胞または動物への注入後のマーカーおよび、定量的測定の較正時に使用するマーカー（蛍光およびタンパク質）；細胞の生死をモニタリングする酸素バイオセンサー装置におけるマーカーまたはレポーター；動物、ペット、おもちゃ、食品などのマーカーまたは標識。
【０１０８】
対象蛍光タンパク質はタンパク質分解酵素切断アッセイ法にも使用される。例えば、対象タンパク質を用いて、切断不活性化蛍光アッセイ法を開発することができる。この場合、対象タンパク質を、タンパク質の蛍光特性を無効とすることなく、タンパク質分解酵素に特異的な切断配列を含むように作製する。活性化したタンパク質分解酵素により蛍光タンパク質が破壊されると、機能性発色団が破壊されるために蛍光は急激に減少すると思われる。あるいは対象タンパク質を用いて、切断により活性化される蛍光を開発することができる。この場合、対象タンパク質を発色団の極めて近位または内部に付加的なスペーサー配列を含むように作製する。このような異型の蛍光活性は、機能性発色団の一部がスペーサーで分断されることから有意に低下すると思われる。スペーサーの両側には、2か所の同一なタンパク質分解酵素特異的切断部位が置かれる。活性化されたタンパク質分解酵素によって切断されると、スペーサーが切断されて、蛍光タンパク質の2つの残存する「サブユニット（subunit）」が再集合して機能性の蛍光タンパク質を生じると考えられる。上述の応用の両種類とも、多種多様な型のタンパク質分解酵素（例えばカスパーゼなど）を対象としたアッセイ法で開発できると考えられる。
【０１０９】
対象タンパク質はまた、生物学的な膜内のリン脂質組成物を決定するアッセイ法に使用することもできる。例えば、特定のリン脂質を結合させて、生物学的な膜におけるリン脂質分布のパターンの局在/可視化を可能とし、さらに特定のリン脂質小領域における膜タンパク質の共存を可能とする対象タンパク質の融合タンパク質（または対象タンパク質の共有結合または非共有結合による修飾の他の任意の種類）は、対象タンパク質を用いて達成することができる。例えばGRP1のPH領域は、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）に対しては高い親和性を示すが、PIP2には親和性を示さない。したがって、GRP1のPH領域と対象タンパク質との融合タンパク質を構築することで、生物学的な膜上にPIP3に富む領域を特異的に標識することができる。
【０１１０】
対象タンパク質のさらに別の応用は、蛍光タンパク質の加齢を伴う、一つの蛍光色素を別の蛍光色素（例えば緑色から赤色）へ切り替える蛍光タイマーを用いて遺伝子発現（例えば発生関連遺伝子の発現、細胞周期に依存する遺伝子の発現、慨日リズムに特異的な遺伝子の発現など）の活性化/非活性化を判定することである。
【０１１１】
上述した本発明の抗体は、対象タンパク質と他の蛍光タンパク質の区別を含むいくつかの応用でも使用される。
【０１１２】
キット
本発明では、一つまたは複数の上述の応用を実施する際に使用されるキットも提供する。この場合、本キットは、通常は本タンパク質（例えば対象タンパク質のコード領域を含むベクターを含む構築物）を作製する要素を含む。本キットの部品は通常、適切な保存用溶媒（例えば緩衝液）中に、典型的には適切な容器内に存在する。対象キットには提供されるタンパク質に対する抗体が存在する場合もある。ある態様においては、キットは複数の異なるベクターを含み、各ベクターは対象タンパク質をコードする。この場合ベクターは、異なる環境および/または異なる条件で発現するように設計される。例えばベクターが、哺乳類細胞における強力な発現プロモーターを含む場合は構成的に発現する。このほかに使用者が任意のプロモーターを挿入して意図した発現を行うことができる、マルチクローニングサイトがあってプロモーターのないベクターを含む場合もある。
【０１１３】
前述の成分に加え、本キットはさらに、本方法を実施するための使用説明書を含む。これらの使用説明書は、様々な形で本キット内に存在することができ、その1個または複数個がキット内に存在することができる。これらの指示が存在するひとつの形は、キットの包装内、添付文書中などの、適当な媒体または基体上にプリントされた情報として、例えばその上に情報が印刷された1枚または数枚の紙としてである。さらに別の手段は、例えばディスケット、CDなどそれらに情報が記録されたコンピュータで読み取り可能な媒体である。さらに別の存在し得る手段は、遠隔地から情報にアクセスするためにインターネットを介して使用可能なウェブサイトのアドレスである。いずれか都合の良い手段が、これらのキット中に存在することができる。
【０１１４】
以下に挙げる実施例は、説明を目的として提供するものであって、制限する意図はない。
【０１１５】
実施例
I.  hcFP640(hcCP)の特徴決定
野生型色素タンパク質hcFP640(hcCP)の基本および第二のアイソフォームの核酸配列および推定アミノ酸配列を、各々、図1および図2に示した。第一の基本アイソフォーム野生型hcFP640(hcCP)の吸収スペクトルを、Matzらの論文に記されたプロトコール(Nature Biotech.、17:969-973(1999))を用いて測定し、図3に示した。この色素タンパク質の別の態様を図17に示した。
【０１１６】
II.  変異体
A.  mutC148Sの作製
配列番号：2の本色素タンパク質をMatzらの論文(前掲)に記されたプロトコールに従いGFPと並置した場合に、残基148(GFPを基に番号付け)は、Ser残基の代わりにCys残基で占領されていることが同定され、Ser148は、Matzらの論文(前記参照)に明らかにされたタンパク質由来の蛍光アンソゾア(Anthozoa)の全てに存在している。部位特異的された突然変異誘発を、148位にSerを含む色素タンパク質の点変異体を作出するために使用した。突然変異誘発は、重複伸長法(Ho, S.N.、Hunt, H.D.、Horton, R.M.、Pullen, J.K.、Pease, L.R.、「ポリメラーゼ連鎖反応を使用する重複伸長による部位特異的突然変異誘発(Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction)」、Gene、77:51-59(1989))により行った。簡単に述べると、2種類の各FPコード領域を重複している断片を増幅した。「フォワードクローニング」プライマー(5'-acatggatccgctggtttgttgaaaga)(配列番号：19)および「リバース突然変異誘発」プライマー(5'-acctcagtgcttggctcccat)(配列番号：20)を用い5'-末端断片を増幅し、「フォワード突然変異誘発」プライマー(5'-atgggagccaagcactgaggt)(配列番号：21)および「リバースクローニング」プライマー(5'-tgacaagcttctggtgtcactgggaacaatca)(配列番号：22)を用い3'-末端断片を増幅した。PCRは、25μl(最終容量)中に100μMの各dNTP、0.2μMの各プライマーおよび1ngのプラスミドDNAを含む、製造業者の1x緩衝液中のAdvantage(商標)2 Polymerase Mix(CLONTECH社)を用い行った。サイクリングパラメータは、以下のように設定した：95℃で10秒、65℃で30秒、72℃で30秒。PTC-200 MJリサーチサーモサイクラー（Research Thermocycler）を用い、20サイクルを完了した。野生型タンパク質をコードするプラスミドを除去するために、5'-断片および3'-断片を、1xTAE緩衝液中で2％低-融点アガロースゲルから切り出した。DNA溶液を排出する(drain)ために、これらのゲル片に3回の凍結-解凍サイクルを施した。その後、5'-断片および3'-断片を一緒にし、以下のように、完全長cDNAを得た。等量の5'-断片溶液、3'-断片溶液、ならびにAdvantage 2 Polymerase Mix、緩衝液およびdNTPを含有する3xPCR混合液を一緒に混合し、95℃で20秒、65℃で30分、72℃で30秒を、2〜3サイクル実施した。その後この反応液を、10倍希釈し、この希釈した試料1μlをPCRの鋳型としてフォワードクローニングプライマーおよびリバースクローニングプライマーとともに用いた(前述のように5'-断片および3'-断片の増幅のため)。結果として、標的置換を伴う完全長コード領域を含む、クローニングの準備が整った(ready-for-cloning)断片を作出した。この単独置換は、野生型タンパク質と比べ赤蛍光の量子収量(quantum yield)が劇的に増大した。その後、初代蛍光変異体(Ser148)のランダム突然変異誘発により、より明るい変異体、すなわち44-9(hcFRFP)(HcRed)を作出した。
【０１１７】
B.  蛍光変異体の特徴決定
1.  mutC148S
mutC148Sの核酸配列および推定アミノ酸配列を、各々、図4の配列番号：5および配列番号：6に示した。mutC148Sの吸収スペクトルは、前記プロトコールを用いて測定し、図3に示した。mutC148Sの励起および放射スペクトルを、Matzらの論文(Nature Biotech.、17:969-973(1999))に記されたプロトコールを用いて測定し、これを図5に示した。この変異体の別の態様は、図15の配列番号：23および配列番号：24に示した。
【０１１８】
2. mut44-9(hcFRFP)(HcRed)
mut44-9(hcFRFP)(HcRed)は、以下のように、野生型色素タンパク質と異なる(番号付けは、Matzらの論文(前掲)に説明されたプロトコールに従い、GFPに関して行った)：A5S；T39A；C148S；L181H；P208L；K211E(自己番号付けを用い、この変異体は以下のように野生型と異なる：A2S、T36A、C143S、L173H、P2O1L、K204E)。
【０１１９】
mut44-9の核酸配列および推定アミノ酸配列は、各々、図6の配列番号：7および配列番号：8に示した。mut44-9の励起および放射スペクトルは、Matzらの論文(Nature Biotech.、17:969-973(1999))に記されたプロトコールを用いて測定し、図7に示した。
【０１２０】
3.  mut44-6(クリスパ44-6)
この変異体は、野生型に対し以下の6種のアミノ酸置換を有する：A2S、T36A、A65E、C143S、L173H、P201L。(GFP番号付け、例えばMatzらの論文(前掲)参照)(自己番号付け)。この変異体のアミノ酸配列は、図8(配列番号：10)に示し、その結果の核酸コード配列は、図8(配列番号：9)に示した。mut44-6の励起および放射スペクトルは、Matzらの論文(Nature Biotech.、17:969-973(1999))に記されたプロトコールを用いて測定し、図9に示した。この変異体の別の態様は、44.6について、図16(配列番号：25および26)に示した。
【０１２１】
4.  FP10-cr1(hcFRFP-2)(HcRed-2A)
FP10-cr1は、1(3)個の置換を導入することにより、変異体「44-9」を基に作出した−L126(122)H(R176(168)H、E211(204)K)。野生型タンパク質と比較すると、FP10-cr1は、以下の置換を保持した：Matzらの論文(前掲)において説明されたGFP番号付けに従い、A5S、T39A、L126H、C148S、L181H、R176H；P208L：自己番号付けに従い、A2S、T36A、L122H、C143S、R168H、L173H、P201L。
【０１２２】
アミノ酸配列(配列番号：12)およびその結果の核酸コード配列(配列番号：11)は、図10に示した(この変異体の別の態様の配列も示した、すなわち配列番号：13および14)。
【０１２３】
この変異体は、他のNFPと共に優れた多重化(multiplexing)用途を供する大きく赤側-シフトした波長を有する。mut44-6の励起および放射スペクトルは、Matzらの論文(Nature Biotech.、17:969-973(1999))に記されたプロトコールを用いて測定し、図11に示した。
【０１２４】
この変異体は、以下により詳細に説明されるように、生理的条件下において、四量体とは対照的に、二量体を形成することが認められている。
【０１２５】
5.  hc-4
野生型タンパク質との比較において、hc-4は、以下の置換を有する：Matzらの論文(前掲)に説明されたGFP番号付けに従い、A5S、C148S、P208L。
【０１２６】
この変異体は、その親C148S変異体に似たスペクトルの特徴を有するが、温度感受性ではなく、大腸菌において37℃で一晩増殖した後に最大の明るさに到達する。
【０１２７】
6.  hc-44
野生型タンパク質との比較において、hc-44は、以下の置換を有する：Matzらの論文(前掲)に説明されたGFP番号付けに従い、A5S、T39A、C148S、L181H、P208L。
【０１２８】
この変異体は、hc-4よりも3倍明るく、645nmにピークがあるわずかにより大きく赤側へシフトした蛍光を示した。
【０１２９】
7.  hc-41
野生型タンパク質との比較において、hc-41は、以下の置換を有する：Matzらの論文(前掲)に説明されたGFP番号付けに従い、A5S、T39A、L126H、C148S、L181H、P208L、K211E。
【０１３０】
この変異体は、野生型四量体タンパク質の二量体変異体である。L126H変異は、この変異体に二量体の表現型を特異的に付与すると考えられている。
【０１３１】
III.  特異的変異体の特徴決定
A.  Mut44-9(hcFRFP)(HcRed)
蛍光顕微鏡下でのdrFP583およびhcFRFP HcRed(HcRed)を発現している大腸菌コロニーの当量(equivalent)の比較は、drFP583のオレンジ色およびHcRedの真の赤色の間の顕著な差異を明らかにしている。加えてHcRedは、drFP583よりも迅速に成熟し、このことは大腸菌で一晩発現した後の前者のタンパク質を含むコロニーにより示されたより明るい蛍光により確認される。しかし成熟drFP583の最終的蛍光強度は、HcRedのものよりもかなり高い(約5倍)ことは注意しなければならない。
【０１３２】
HcRedは、そのスペクトル特性(最大励起は592nm、最大放射は645nm)により、600nm色素-レーザーによるFACS分析に適している。drFP583でトランスフェクトしたHEK293細胞は、488nmアルゴンイオンレーザー(PEチャネル)により容易に検出されたが、600nm色素レーザーでは検出されなかった。対照的に、HcRedでトランスフェクトした細胞は、488nmで励起した場合には蛍光を示さず、600nmレーザー(TxRedおよびAPCチャネル)により明確に可視化された。本発明者らのデータは、変異体HcRedを、多色フローサイトメトリー用途においてさらに大きく赤側の色に使用することができることを示した。
【０１３３】
B.  オリゴマー形成試験
本発明者らは、EGFP(増強された緑色蛍光タンパク質)およびdrFP583を各々単量体および四量体標準として用い、ゲルろ過分析により、ある種の前述の新規蛍光タンパク質の重合状態を試験した。野生型色素タンパク質hcCP(hc-41と示す)の二量体変異体を検出し、これはEGFPとdrFP583の間を移動した。このタンパク質は、8個のアミノ酸置換を含み、具体的には、A5S、S43G、E65A、L126H、K141E、C148S、R186KおよびP208L(前述)である。これらの置換の中で、ただひとつの置換L126Hが、このタンパク質の重合状態の修飾に寄与しており、その理由はこの位置のIle残基は、drFP583における四量体化境界面(tetrametric interface)の形成に参画するからである。hc-41は相対的に青側にシフトされた蛍光を有する(放射Imax＝625nm)ので、本発明者らは、HcRedにL126H変異を導入した。得られた変異体は、HcRed-2と称した。ゲルろ過分析は、このタンパク質の二量体の性質を明らかにした。HcRed-2のランダム突然変異誘発の後、2個の追加のアミノ酸置換、具体的には、R176HおよびE211K(GFP番号付けに従う)を含む、より明るい二量体変種HcRed-2A(同じく先にcr-1と称す)を生じた。HcRed-2Aのスペクトルおよび成熟特性は、HcRedのものと類似していた。大腸菌で発現したHcRed-2Aは、一晩の増殖時にほぼ完全に成熟し、かつ最大励起および放射を各々、590および640nmに示した。ある態様において、二量体HcRed-2は、機能性融合タンパク質構築に関して四量体drFP583よりもより適している。
【０１３４】
C.  融合構築物
Cr-44-9-タンデム(連結した二量体)、およびCr-449-タンデム-アクチン融合体を構築した。Cr-44-9タンデム融合タンパク質のアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、配列番号：15および配列番号：16として図12に示した。Cr-44-9タンデム-アクチン融合タンパク質のアミノ酸およびコードするヌクレオチド配列は、配列番号：17および配列番号：18として図13に示した。前記構築物は、哺乳類細胞において発現し、コードされた蛍光タンパク質が検出可能であった。
【０１３５】
D.  図14のAからFは、Cr-449(C、D)、DsRed(E、F)でトランスフェクトした、または偽トランスフェクト(A、B)したHEK293細胞の、トランスフェクション後48時間のフローサイトメトリー分析の結果を示している。488nmレーザーを、パネルA、C、Eにおいて用い、および600nmレーザーをパネルB、D、Fにおいて使用した。等高線(contour)プロット(輪郭の5％可能性)を示した。死滅細胞は、分析から除外した。Vanford FACS装置のための標準補償(standard compensation)およびフィルターセットを使用した。
【０１３６】
IV.  要約
【表１】
スペクトルのプロフィール
0004330338.tif 000002
＊相対輝度は、発光オワンクラゲ(A. victoria)GFPと同じ値で割り、量子収量を掛けた減衰係数である。
【０１３７】
前述の考察および結果から、本発明は重要な新規色素タンパク質および蛍光タンパク質ならびにこれらをコードする核酸を提供することは明白である。本発明により提供される特に重要な利点は、大きく赤側にシフトした蛍光タンパク質である。本タンパク質および核酸は、様々な異なる用途における使用が見いだされた。従って本発明は当該技術分野に重大な貢献を成している。
【０１３８】
本明細書において引用された刊行物および特許出願は全て、各々個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として組入れられることが指摘されているように、本明細書に参照として組入れられている。あらゆる刊行物の引用は、出願日に先立ち明らかにされたものについてであり、本発明が、先行する発明によりこのような刊行物の日付に先立ち権利を付与されないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１３９】
前記発明は、理解を明確にする目的で例証および実施例により一部詳細に説明されているが、当業者には本発明の内容を考慮し、添付された特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱しない限りは、ある種の変更および修飾を行うことができることは容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  基本アイソフォームhcFP640(hcCP)cDNAの野生型配列およびそれにコードされた色素タンパク質を提供する。
【図２】  第二のアイソフォームhcFP640(hcCP)cDNAの野生型配列およびそれにコードされた色素タンパク質を提供する。
【図３】  hcFP640(hcCP)およびC148S変異体タンパク質の吸収スペクトルのグラフを提供する。
【図４】  C148S変異体の核酸配列およびそれにコードされた蛍光タンパク質を提供する。
【図５】  C148S変異体タンパク質の吸収、励起および放射スペクトルのグラフを提供する。
【図６】  44-9(hcFRFP)(HcRed)変異体の核酸配列およびそれにコードされた蛍光タンパク質を提供する。
【図７】  44-9変異体タンパク質の吸収、励起および放射スペクトルのグラフを提供する。
【図８】  本明細書で説明した変異体44-6のアミノ酸配列およびヌクレオチドコード配列を提供する。
【図９】  44-6変異体タンパク質の励起および放射スペクトルのグラフを提供する。
【図１０】  変異体FP1O-cr1(hcFRFP-2)(HcRed-2A)のアミノ酸および核酸配列を提供する。
【図１１】  cr-1タンパク質の励起および放射スペクトルのグラフを提供する。
【図１２】  Cr-449-タンデム融合タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１３】  本発明のCr-449-タンデム-アクチン融合タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１４】  上記実験の項に報告されたフローサイトメトリー分析の結果を提供する。
【図１５】  別の態様のC148Sのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を提供する。
【図１６】  別の態様の44-6のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を提供する。
【図１７】  別の態様の基本アイソフォームhcCPのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を提供する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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