(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列の９５番目から１７５番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列の１３３番目から１７５番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列の１５１番目から１７５番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｂ細胞特異的受容体の一員である新規なＴＲＡＦ３結合性タンパク質に関する。本発明はまた、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該遺伝子を有する形質転換体、該タンパク質を認識する抗体、該タンパク質を利用した医薬のスクリーニング法、並びに該タンパク質を利用した診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的作用はある刺激に対する反応によって制御されている。即ち、多くのサイトカインは受容体に結合し、細胞内反応を引き起こす。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、ＴＮＦ受容体を経て作用し、感染およびショックの誘導および炎症性疾患に対する保護などの生物学的過程を調節する。ＴＮＦはＴＮＦ−リガンドスーパーファミリーに属し、そのリガンドであるＴＮＦ受容体スーパーファミリーとともに作用する。リガンドとしては、ＴＮＦ−α、リンホトキシン（ＬＴ）−α、ＬＴ−β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＯＸ４０Ｌおよび神経栄養因子（ＮＧＦ）などが知られている。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーとしては、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＴＮＦ受容体関連因子、Ｆａｓ抗原、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、低親和性ｐ７５およびＮＧＦ受容体などが知られている。数種のＴＮＦ受容体ファミリーの機能はすでに解明されており、例えば、Ｆａｓ抗原や低親和性ＮＧＦ受容体とそれらのリガンドは、プログラムされた細胞死に関係し、ＣＤ４０リガンドはＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化に関与する。
【０００３】
生理学的過程の一つであるプログラムされた細胞死は正常な発育および多細胞生物の恒常性にとって必須であり、アポトーシスの混乱は癌、神経変性疾患、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むヒトの疾患の病因に関与している。Ｆａｓの活性化はデスドメイン含有アダプター分子であるＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１がＦａｓの細胞内ドメインに結合し、これが次にプロアポトーシスプロテアーゼであるカスペース８を活性化し、最終的にアポトーシスを実行する。一方、ＴＮＦＲ−１は主にＮＦ−κＢを活性化することにより一連の広範な生物学的活性のシグナルを伝達する。ＴＮＦＲ−１はデスドメインを含むＴＲＡＤＤとＴＮＦＲ−１の細胞内ドメインで結合し、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、およびＲＩＰなど多数のシグナル伝達分子との会合を通じて、アポトーシスとＮＦ−κＢ活性化との両方のシグナルを伝達する。このようにＴＮＦファミリーリガンドとＴＮＦファミリー受容体の作用は多様であり、多くの生物学的プロセスに影響を与えるため、これらの受容体、リガンドおよびそれらに関するシグナル伝達分子を同定して解析することは疾患の治療法を確立する上で重要である。
【０００４】
ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの下流シグナル伝達因子として最初に発見されたタンパク質ファミリーである［Rothe,M.他、(1994) Cell 78, 681-692; Hu, H.M.,他、(1994) J.Biol.Chem. 269, 30069-30072;及びCheng, G.,他、(1995) Science 267, 1494-1498］。現在までに、ＴＲＡＦファミリーとしては６種の因子が同定されている［Rothe,M.他、(1994) Cell 78, 681-692; Hu, H.M.,他、(1994) J.Biol.Chem. 269, 30069-30072; Cheng, G.,他、(1995) Science 267, 1494-1498; Cao, Z.,他、(1996) Nature (London) 383, 443-446; Mosialos, G.,他、(1995) Cell 80, 389-399; Sato, T.,他、(1995) FEBS Lett. 358, 113-118; Regnier,C.H.,他、(1995) J.Biol.Chem. 270, 25715-25721; Ishida,T.K., 他、(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 9437-9442; Nakano, H.,他、(1996) J.Biol.Chem. 271, 14661-14664;及びIshida,T.K., 他、(1996) J.Biol.Chem. 271, 28745-28748］。ＴＲＡＦ１−６は何れも、コイルドコイルのＴＲＡＦ−Ｎドメインを有し、Ｃ末端のＴＲＡＦ−Ｃドメインが保存されている。［Cao, Z.,他、(1996) Nature (London) 383, 443-446］。ＴＲＡＦ−Ｃドメインは、ＴＲＡＦタンパク質間の相互作用、ならびに該タンパク質とＴＮＦＲスーパーファミリーの因子との結合を仲介する［Cheng, G.,他、(1995) Science 267, 1494-1498; Takeuchi, M., 他、 (1996) J.Biol.Chem. 271, 19935-19942;及びHsu, H., 他、(1996) Cell 84, 299-308］。
【０００５】
ＴＲＡＦ３は、Ｂ細胞表面マーカーであるＣＤ４０およびエプスタイン−バーウイルス潜在性膜タンパク質であるＬＭＰ−１の細胞質ドメインに結合した分子として最初に同定された［Mosialos, G.,他、(1995) Cell 80, 389-399; Sato, T.,他、(1995) FEBS Lett. 358, 113-118; Hu, H.M.,他、(1994) J.Biol.Chem. 269, 30069-30072; 及びCheng, G., 他、(1995) Science 267, 1494-1498］。また、ＴＲＡＦ３は、リンフォトキシンβ受容体などのＴＮＦＲファミリーの他の因子の細胞質末端部分と相互作用することが示された［Force, W.R., 他、(1997) J.Biol.Chem. 272, 30835-30840］。ＴＲＡＦ３を含むＴＲＡＦファミリータンパク質は、触媒活性を欠損すると思われる細胞質タンパク質であり、一般にアダプタータンパク質として働くと考えられている。これに関連して、ＴＲＡＦ３はＮＩＫ、ＡＳＫおよびＴＡＮＫなどの他のシグナル伝達分子と相互作用することが判明している［Song, H.Y., 他、(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 9792-9796; Nishitoh, H., 他、(1995) Mol.Cell 2, 389-395; 及びRegnier,C.H., 他、(1997) Cell 90, 373-383］。しかしながら、ＴＲＡＦ３がシグナル伝達を仲介する機構は完全には解明されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＴＲＡＦ３に結合するシグナル伝達分子を同定することを解決すべき課題とした。本発明はまた、ＴＲＡＦ３に結合するシグナル伝達分子をコードする遺伝子をクローニングし、その遺伝子の構造と機能を解明することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、ＴＲＡＦ３に結合するシグナル伝達分子をコードする遺伝子を利用して新規な医薬または診断方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、酵母を用いてタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングを実施した。このスクリーニングは、ヒト由来Ｓｏｓ（ｈＳｏｓ）蛋白質を細胞膜にリクルートさせることによって酵母ＲＡＳシグナル伝達経路を活性化させ、酵母ｃｄｃ２５遺伝子欠損を相補させることを利用するものである。本発明者らは、ＷＥＨＩ２３１細胞由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーおよびｈＳｏｓに融合した完全長ＴＲＡＦ３を用いる上記スクリーニング法により、新規なＴＲＡＦ３結合タンパク質（以下、Ｔ３ＢＰとも称する）を同定し、さらにこのＴ３ＢＰタンパク質の構造と機能を解明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または挿入したアミノ酸配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するアミノ酸配列；または、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するアミノ酸配列：
【０００９】
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
さらに本発明によれば、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００１０】
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子を含むベクターが提供される。
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子または本発明のベクターを有する形質転換体が提供される。
さらに本発明によれば、本発明の形質転換体を用いることを特徴とする、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質の製造方法が提供される。
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質を認識する抗体が提供される。
【００１１】
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質または抗体を用いて、該タンパク質または抗体の機能を促進または抑制する物質をスクリーニングする方法が提供される。好ましくは、本発明のタンパク質または抗体の機能を促進または抑制する物質は、ＴＲＡＦ３を介した細胞内シグナル伝達を促進または抑制する物質である。
さらに本発明によれば、本発明のスクリーニング方法により得られる、本発明のタンパク質の機能を促進または抑制する物質が提供される。
さらに本発明によれば、上記物質を有効成分として含む医薬が提供される。本発明の医薬は、好ましくは、ＴＲＡＦ３を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の予防または治療のために使用される。
さらに本発明によれば、生体由来成分における本発明のタンパク質のレベルを測定することを含む、ＴＲＡＦ３を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の診断方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質及び遺伝子
本発明は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質、並びにそれをコードする遺伝子に関する。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または挿入したアミノ酸配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するアミノ酸配列；または、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するアミノ酸配列：
【００１３】
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００１４】
上記した「配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１５】
上記した「配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００１６】
上記した「配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００１７】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、DNAをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989. 以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
上記した「ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有する」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同程度またはそれ以上の親和性でＴＲＡＦ３と結合することができ、それによってＴＲＡＦ３が仲介する細胞内シグナル伝達に関与できることを言う。
【００２０】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１および配列番号２に記載した塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてマウスなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。
マウスの由来のｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞、器官または組織から作製することが好ましい。当該遺伝子を発現している細胞の具体例としてはＷＥＨＩ２３１細胞などが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００２１】
ＰＣＲ法により配列番号２に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得することもできる。マウスの染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２２】
上記したブローブまたはプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００２３】
本明細書中上記した、（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
【００２４】
例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
本明細書中上記した、（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２６】
次に、本発明のタンパク質の入手・製造方法について説明する。本発明のタンパク質の入手・製造方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００２７】
天然由来のタンパク質を入手する場合には、該タンパク質を発現している細胞または組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質を入手する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機（例えば、桑和貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米国Perkin−Elmer社製)、ファルマシアバイオテク(スウェーデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等）を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。
【００２８】
本発明のタンパク質を組み換えタンパク質として産生するには、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号２に記載の塩基配列）を有するＤＮＡまたはその変異体または相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を製造することができる。発現ベクターおよび形質転換体の作成およびそれを用いた組み換えタンパク質の産生については本明細書中後記する。
【００２９】
なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造または入手することができる。
【００３０】
例えば、配列番号２に記載の塩基配列またはその一部を有するＤＮＡプローブとしてマウスまたはマウス以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。或いはＤＮＡ配列データベースのホモロジー検索から対応ｃＤＮＡ配列を取得し、ＰＣＲ等で調製することもできる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３１】
（２）本発明の遺伝子を有するベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用することができる。ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、目的に応じて選ぶことができる。
クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものが好ましく、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nuclelc Acids Research, 17, 9494(1989)〕、Lambda ZAP II(ストラタジーン社製)、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49(1985)〕、λTriplEx(クローンテック社製)、λExCell(ファルマシア社製)、pT7T318U(ファルマシア社製)、pcD2〔Mo1. Cen. Bio1., 3, 280 (1983)〕、pMW218(和光純薬社製)、pUC118(宝酒造社製)、pEG400〔J.Bac., 172, 2392 (1990)〕、pQE-30 (QIAGEN社製)等をあげることができる。
【００３２】
発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものを使用する。また、発現ベクターとしては、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。
【００３３】
細菌を宿主細胞として用いる場合は、本発明の遺伝子を発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記DNAおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３４】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescrlptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００３５】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００３６】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcDNAI/AmP(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００３７】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができる。
【００３８】
（３）本発明の遺伝子を有する形質転換体
本発明のＴＲＡＦ３に対する結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記した組み換えベクター（好ましくは発現ベクター）を宿主に導入することにより作製することができる。
細菌の宿主細胞の具体例としては、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospiri11um属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属等に属する微生物をあげることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００３９】
酵母宿主の具体例としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４０】
動物細胞宿主としては、ナマルバ細胞、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等を挙げることができる。動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００４１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４２】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４３】
（４）本発明の形質転換体を用いた組み換えタンパク質の製造
本発明においては、上記のようにして作製した本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養し、培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物より本発明のタンパク質を採取することにより組み換えタンパク質を単離することができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中、pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４４】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5%C02存在下等の条件下で1〜7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＭＳ培地、Ｒ２Ｐ培地等、その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、１５〜３５℃等の条件下で１〜２１日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４７】
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００４８】
（５）本発明のタンパク質を認識する抗体
本発明によりＴＲＡＦ３結合性タンパク質が同定されたことにより、該タンパク質を認識する抗体を作製することができる。このような抗体の作製は、当該タンパク質またはＴＲＡＦ３の動態の解明などの研究において有用である。本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、その作製は定法により行なうことができる。
【００４９】
例えば、本発明のタンパク質を認識するポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質を抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。抗原投与は、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等に応じてアジュバントを使用しない場合もある。
【００５０】
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、該哺乳動物の血清をサンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたら、例えば１００μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なう。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のタンパク質を認識するポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。
【００５１】
本発明のタンパク質を認識するモノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
【００５２】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明のタンパク質との懸濁液もしくは乳化液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合してハイブリドーマを作製することができる。
【００５３】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。さらに必要に応じて、本発明のタンパク質を用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことにより、本発明のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
【００５４】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体を用いて本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質を免疫測定するための方法としては、例えば酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等を挙げることができる。
【００５６】
また、上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
さらに、上記した抗体の標識抗体も本発明の範囲内である。即ち、上記のようにして作製した本発明の抗体は標識して使用することができる。抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に公知である。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素標識、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光標識、コロイド金属および着色ラテックスなどの呈色物質による標識、ビオチンなどのアフィニティー標識、あるいは125Ｉなどの同位体標識などを挙げることができる。本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法または間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知の方法により行うことができる。
【００５７】
（６）本発明のタンパク質を用いたスクリーニング法
本発明はさらに、本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質またはその抗体を用いて、該タンパク質または抗体の機能を促進または抑制する物質をスクリーニングする方法にも関する。当該スクリーニング方法により、好ましくは、ＴＲＡＦ３を介した細胞内シグナル伝達を促進または抑制する物質が選択される。このようなスクリーニング系は、例えば以下の通り構築することができる。
【００５８】
本発明の遺伝子を有する発現ベクターを構築し、この発現ベクターをＴＲＡＦ３を発現する適当な宿主に導入する。得られる形質転換体においてはＴＲＡＦ３と本発明のタンパク質の両方が発現し、両者の相互作用を介して、適切なリガンドの存在下においては細胞内シグナル伝達が進行する。
上記のように構築したスクリーニング系に被験物質を添加することができる。被験物質を添加した場合に細胞内シグナル伝達の進行が阻害されれば、その被験物質は、本発明のタンパク質とＴＲＡＦ３との相互作用を阻害する物質（即ち、本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質の機能を抑制する物質）の候補物質として選択することができる。反対に、被験物質を添加した場合に細胞内シグナル伝達が活性化されれば、その被験物質は、本発明のタンパク質とＴＲＡＦ３との相互作用を活性化する物質（本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質の機能を促進する物質）の候補物質として選択することができる。
【００５９】
上記スクリーニング系で使用することができる発現ベクター、宿主細胞などは当業者であれば適宜選択することができ、本明細書中上記したものを使用してもよい。
被験物質としては任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００６０】
（７）本発明の医薬
ＴＮＦリガンドファミリーは細胞毒性、抗ウイルス活性、免疫調節活性および数種の遺伝子の転写制御を含む多数の細胞反応を誘導する最も多面的なサイトカインの一つとして知られている。ＴＮＦリガンドに対する細胞の応答は正常な生理学的反応のみならず、アポトーシスの増強またはアポトーシスの阻害にも関係する。アポトーシス調節の異常は多数の病因となる。細胞増加に関連する疾患またはアポトーシスの阻害に関する疾患としては、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、炎症、移植片対宿主疾患、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶などが挙げられ、アポトーシスの増強に関連する疾患には、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、骨髄形成異常症候群、虚血性損傷、トキシン誘導性肝疾患、敗血症ショック、悪液質および食欲不振などが挙げられる。
【００６１】
本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーには属さないものの、ＴＲＡＦ３に結合することからＴＮＦ受容体／リガンドスーパーファミリーが関与する慢性および急性炎症、関節炎、敗血症、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リューマチ、炎症性腸疾患、乾癬）、移植拒絶反応、移植片対宿主病、感染症、卒中、虚血、急性呼吸器疾患症候群、再狭窄、脳損傷、ＡＩＤＳ、骨疾患、癌（例えば、リンパ球増殖性疾患）、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病およびその他の疾患へ関与するものと考えられる。
【００６２】
従って、上記したスクリーニング法により得られる、本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質の機能を促進または抑制する物質は、このような疾患の治療および／または予防のための医薬として有用である。
即ち、本発明は、上記したスクリーニング法により得られる本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質の機能を促進または抑制する物質を有効成分として含む医薬にも関する。本発明の医薬は、例えば、ＴＲＡＦ３を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の予防または治療のために使用することができる。
【００６３】
本発明の医薬は一般的には、本発明のＴＲＡＦ３結合性タンパク質の機能を促進または抑制する物質を有効成分として含み、さらに製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００６４】
本発明の医薬の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。
本発明の医薬の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
本発明の医薬の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．００１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０００μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００μｇ／ｋｇ体重／日である。
【００６５】
（８）本発明のタンパク質のレベルを測定することによる疾患の診断方法
本発明はさらに、生体由来成分における本発明のタンパク質のレベルを測定することを含む、ＴＲＡＦ３を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の診断方法に関する。
上記した通り、本発明のタンパク質は、アポトーシス増強またはアポトーシス阻害に関係する様々な疾患に関与している可能性がある。従って、生体内における本発明のタンパク質の活性またはその量を測定することにより、ＴＲＡＦ３を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患を診断することが可能になる。
【００６６】
本発明のタンパク質のレベルの測定は、当業者に公知の常法に従って行うことができ、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いる免疫学的方法で行ってもよいし、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定することによって行ってもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【００６７】
【実施例】
（Ａ）材料および方法
Ａ−１．酵母を用いたタンパク質-タンパク質相互作用のスクリーニング
完全長ＴＲＡＦ３をコードするＤＮＡを、CytoTrap(登録商標)ツーハイブリッド系（Stratagene, La Jolla. CA）においてベイト（bait）として使用した。この系で使用した酵母ｃｄｃ２５Ｈ株（ｃｄｃ２５遺伝子の温度感受性突然変異株）は以下に示す遺伝子型を有する：ＭＡＴα  ｕｒａ３、ｌｙｓ２、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｈｉｓ２００、ａｄｅ１０１、ｃｄｃ２５−２、ＧＡＬ＋。ミリスチル化シグナル配列とＷＥＨＩ２３１細胞由来のｃＤＮＡ断片とのハイブリッドタンパク質のライブラリーを、プラスミドｐＭｒｙ中で構築した。製造業者の推奨通り、変更を加えずにスクリーニングを実施した。
【００６８】
簡単に説明すると、上記酵母株を、適切な添加物質を補充したＹＰＡＤ培地もしくはBurkholderの最少培地（ＢＭＭ）中２５℃で増殖させ［Sato, T.,他、(1995) FEBS Lett. 358, 113-118］、酢酸リチウム法で形質転換した。その酵母形質転換体をＢＭＭ／ガラクトースプレート上で２５℃にて２日間増殖させ、続いて３７℃で増殖させた。ＴＲＡＦ３と相互作用を有するミリスチル化タンパク質を発現していると考えられる３７℃で増殖したコロニーを拾い、３７℃におけるＢＭＭ／グルコースプレートおよびＢＭＭ／ガラクトースプレート上での増殖について試験した。３７℃でガラクトース依存性増殖（ｐＭｙｒに組み込まれたｃＤＮＡの発現はガラクトースに依存）を示すクローンからライブラリープラスミド（ｃＤＮＡが組み込まれたｐＭｒｙ）を単離し、プラスミドｐＳｏｓ／ＴＲＡＦ３もしくは陰性対照としてｐＳｏｓ／コラゲナーゼを用いてｃｄｃ２５Ｈ細胞に再度形質転換した。ｐＳｏｓ／ＴＲＡＦ３の存在下でのみｃｄｃ２５Ｈ表現型を抑制するプラスミドの配列を決定した。ＤＮＡの配列決定は、Applied Biosystems自動ＤＮＡシーケンサー、ABI PRISM 310遺伝子解析機（Foster, CA）で行った。
【００６９】
Ａ−２．ノーザンブロットハイブリダイゼーション
マウス組織（Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎ  Ｃｒｊ）から酸性グアニジンフェノールクロロホルム法により調製した１０μｇの全ＲＮＡを、ホルムアルデヒド含有１％アガロースゲル上で分離し、２０×ＳＳＣ中でHybond（登録商標）-N+（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）にトランスファーし、そしてＵＶ架橋（Stratagene）により固定化した。ハイブリダイゼーションプローブは、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Amersham Pharmacia）によりランダムプライム法で放射標識したゲル精製ＤＮＡ断片から作製した。ブロットを、５×ＳＳＣ、５×デンハルトの溶液、０．１％  ＳＤＳ、５０％脱イオン化ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、該ブロットを室温にて２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、続いて６５℃にて０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて洗浄した。該ブロットを乾燥し、ＢＡＳ２５００（Fuji Ltd., Tokyo. Japan）を使用して分析した。
【００７０】
Ａ−３．発現プラスミドの構築およびトランスフェクション
Ｔ３ＢＰ発現構築物を作製するために、マウスＴ３ＢＰの適切な領域をＰＣＲで増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を利用してpcDNA 3.1 (-) myc his version B（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ／Ｔ３ＢＰを得た。Ｔ３ＢＰを、Ｃ末端に標識したＭＹＣ融合タンパク質として発現させた。
ＥＧＦＰ標識Ｔ３ＢＰ発現プラスミドの構築のために、完全長コード領域をＰＣＲで増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を利用してｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Clontech, California, CA）にライゲートしてｐＥＧＦＰ／Ｔ３ＢＰを得た。
ＦＬＡＧ標識マウスＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３をコードする哺乳動物発現ベクターをＰＣＲに基づく方法で作製した。
全ての発現構築物は、ABI PRISM 310遺伝子解析機を使用して配列決定した。
【００７１】
Ａ−４．細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎臓由来２９３細胞は、１０％仔ウシ血清（HyClone, Logan, UT）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（GIBCO-BRL, Grand Island, NY）を含有するイーグルの最少必須培地中で維持した。ＷＥＨＩ２３１細胞は、１０％仔ウシ血清（HyClone）、５．５×ｌ０5Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（GIBCO-BRL）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。２９３細胞を、１０ｃｍ培養皿中に細胞１０6個／皿の濃度で接種し、２〜３日間培養した。続いて該細胞を、市販溶液（Eppendorf-5 Prime, Inc., Boulder, CO）を使用した標準リン酸カルシウム共沈法を用いてトランスフェクトした。
【００７２】
Ａ−５．ＧＳＴプルダウンアッセイ
ＧＳＴプルダウンアッセイのために、ＧＳＴ融合タンパク質を、ＩＰＴＧ誘導後、ｐＧＥＸベクター（Amersham Pharmacia）を使用して大腸菌（ＢＬＲ）で発現させ、グルタチオンビーズ（Amersham Pharmacia）で精製した。ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６を２９３細胞中で発現させた。細胞溶解物は、Ｅ１Ａバッファー（50mM HEPES［pH7.6］、250mM NaCl、0.1％ NP-40および5mM EDTA）を溶解剤として使用することにより、トランスフェクション細胞から調製した。該細胞溶解物を透明にして、グルタチオンビーズ上に固定化した２μｇのＧＳＴもしくはＧＳＴ融合タンパク質と共にインキュベートした。そのグルタチオンビーズをＥ１Ａバッファーで十分に洗浄した。サンプルを１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ブロッキング後、該膜を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体で処理し、強化型化学発光プロトコール（ＥＣＬ，Amersham Pharmacia）に従って、５，０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Bio-Rad）を用いて免疫反応性タンパク質を検出した。ＴＲＡＦ３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳，３５−Ｓメチオニン標識はＴ７リンク転写・翻訳システム（Amersham Pharmacia）に従い、検出はフルオログラフィーにて行った。
【００７３】
Ａ−６．免疫沈降アッセイ
上記細胞を５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中でプレートから剥がし、同緩衝液を用いて３回洗浄した。該細胞を１ｍｌのＥ１Ａ緩衝液中に４℃にて１０分間溶解させた。その細胞溶解物を遠心分離し、上清を細胞抽出物として使用した。該細胞抽出物を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体、抗ＭＹＣ  ９Ｅ１０抗体もしくは対照抗体と共に４℃にて２時間インキュベートし、続いてプロテインＧセファロースＦＦ（Amersham Pharmacia）による処理を行った。このセファロースビーズをＥ１Ａ緩衝液で十分に洗浄した。サンプルを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、上述のように免疫反応性タンパク質を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体もしくは抗ＭＹＣ  ９Ｅ１０抗体を用いて検出した。
【００７４】
Ａ−７．蛍光顕微鏡法
カバーガラス上で培養したＨＥＫ２９３細胞を、種々の構築物を用いてトランスフェクションした。２４時間後に、細胞を３．７％ホルマリンを含有するＰＢＳ中で室温にて１０分間固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温にて５分間、ＰＢＳ中０．２％Triton X-100で処理した。スキムミルクでブロッキングした後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体もしくは抗ＭＹＣ  ９Ｅ１０抗体（Sigma）などの各種一次抗体と一緒に、続いてＣｙ５結合二次抗体（Jackson ImmunoReseach Laboratories, Inc.）と一緒に細胞をインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、スライドガラス上にのせた。
蛍光をCarl Zeiss LSM510共焦点レーザー走査型顕微鏡（Oberkochen, Germany）を使用して可視化した。
【００７５】
Ａ−８．Ｆアクチンの定量化
Ｆアクチン含量測定を既報の通り実施した［Mizuno., 他、(1998) J.Pharm.Pharmacol. 50, 645-648］。簡単に説明すると、リン酸カルシウム法により、１２ウエルプレート上で培養した２９３細胞を指示した量のＴ３ＢＰ発現プラスミドを用いて一時的にトランスフェクションした。トランスフェクトされた全ＤＮＡ（２μｇ）は、空のベクターに担持することにより一定に維持した。２４時間後に、そのトランスフェクション細胞をＰＢＳ中で３．７％ホルマリンを用いて３７℃にて１０分間固定した。ＰＢＳ中０．２％Triton X-100を用いて室温で１０分間透過した後、細胞をＰＢＳ中１０Ｕ／ｍｌのローダミン-ファロイジン(MolecurProbe)で室温にて１時間染色した。ＰＢＳで十分に洗浄した後、結合したＦＩＴＣ-ファロイジンをメタノールを用いて氷上で１時間抽出した。その蛍光強度を、分光計F-3010（Hitachi Ltd., Tokyo, Japan）を使用して４８８ｎｍの励起波長および５１０nmの発光波長で測定した。結果を、対照トランスフェクト細胞の蛍光強度の比から算出した相対蛍光強度として表した。
【００７６】
（Ｂ）結果
Ｂ−１．Ｔ３ＢＰをコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＴＲＡＦ３と直接結合するタンパク質を同定するために、酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用に基づくスクリーニングを実施した。サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)ｃｄｃ２５Ｈ株は、ｃｄｃ２５遺伝子に温度感受性点突然変異が含まれているため、宿主の増殖は３７℃では阻害されるが、許容温度（２５℃）では正常である。ｃｄｃ２５遺伝子は、ＲＡＳと結合して活性化することにより細胞増殖を導くグアニルヌクレオチド変換因子をコードしている。本実施例で使用した系は、ｃｄｃ２５欠陥を相補し、酵母ＲＡＳシグナル伝達経路を活性化するヒト由来Ｓｏｓの能力を利用している；ｈＳｏｓ融合タンパク質（ｈＳｏｓ−ＴＲＡＦ３）が発現して、それがタンパク質−タンパク質相互作用を介して形質膜に局在化すると、ｃｄｃ２５Ｈ株は３７℃においても増殖する。
【００７７】
プラスミドｐＳｏｓ／ＴＲＡＦ３を含む酵母を、ミリスチル化シグナルに融合して形質膜に局在化するＷＥＨＩ２３１細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて形質転換した。約２×１０5個の形質転換体を、ＢＭＭ／ガラクトースプレート上２５℃で２日間増殖させ、次に３７℃のインキュベーターに移した。３７℃で増殖したコロニーを拾い、３７℃におけるＢＭＭ／グルコースプレートおよびＢＭＭ／ガラクトースプレート上での増殖について試験した。ライブラリープラスミドを、３７℃においてガラクトース依存性増殖を示すクローンから単離し、ｐＳｏｓ／ＴＲＡＦ３もしくは陰性対照としてｐＳｏｓ／コラゲナーゼを用いてｃｄｃ２５Ｈ細胞に再度形質転換後、ｐＳｏｓ／ＴＲＡＦ３の存在下においてのみｃｄｃ２５Ｈ表現型を抑制する９個のｃＤＮＡを得た。これらのうちの１つであるクローン３は新規タンパク質の一部をコードしていた。
【００７８】
クローン３中に挿入されている完全長ｃＤＮＡを単離するために、部分ｃＤＮＡをプローブとして使用してＷＥＨＩ２３１細胞由来のｐＭｒｙｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを得た。陽性クローンのＤＮＡ配列決定により、推定分子量１８，８４６ダルトンを有する１７５アミノ酸のタンパク質をコードすると予測されるオープンリーディングフレームの存在が明らかになった（図１Ａ、配列表の配列番号１及び配列番号２）。この新規タンパク質をＴ３ＢＰと称する。
【００７９】
図１Ａは、全長Ｔ３ＢＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列を示す。クローン３によりコードされる配列には下線を付してある。網掛けのボックスは推定膜貫通ドメインを示す。
【００８０】
ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラムを利用したデータベース検索により、Ｔ３ＢＰｃＤＮＡが、マウス白血病およびリンパ腫における、体細胞により獲得されたプロウイルスのフランキング配列として報告された配列（ＡＦ１９３１６１）を含むことが判明した。また、ヒトＢ細胞成熟因子（ＢＣＭＡ）がＴ３ＢＰに対し有意な配列類似性を有し、Ｔ３ＢＰに対して２８％の同一性および４２％の類似性を有していた。Ｔｍｐｒｅｄプログラムを用いて作製したヒドロパシープロットにより、Ｔ３ＢＰが推定膜貫通領域（アミノ酸７７−９７）を有することが示唆された。ＰＲＯＳＩＴＥ解析によって、Ｎ−グリコシル化部位（アミノ酸２３−２６）およびＮ−ミリストイル化部位（アミノ酸８１−８６）が同定された。ＰＳＯＲＴ解析によって、このタンパク質がＩ型膜タンパク質立体構造を有し、形質膜に位置すると推測された。
【００８１】
Ｔ３ＢＰの発現パターンを、６種の組織およびＷＥＨＩ２３１細胞を用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションにより調べた。結果を図１Ｂに示す。図１Ｂでは、ブロットを２００ｂのＴ３ＢＰｃＤＮＡプローブを用いてバイブリダイズした。リボソームＲＮＡの位置を左側に示す。
図１Ｂに示すように、Ｔ３ＢＰ遺伝子はＷＥＨＩ２３１細胞中に約２ｋｂのｍＲＮＡを示した。しかしながら、Ｔ３ＢＰｍＲＮＡは試験した他のマウス組織では検出されなかった。
【００８２】
Ｂ−２．ＴＲＡＦ３と特異的に相互作用するＴ３ＢＰ
酵母でのアッセイで観察されたＴＲＡＦ３とＴ３ＢＰとの相互作用を確認するために、クローン３およびクローン１０をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、ＴＲＡＦ２もしくはＴＲＡＦ３に対する結合をＧＳＴプルダウンアッセイで試験した。ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ２もしくはＴＲＡＦ３を過剰発現する２９３細胞の細胞溶解物を、ＧＳＴ−クローン３、ＧＳＴ−クローン１０もしくはＧＳＴ単独と一緒にインキュベートし、ＧＳＴ融合タンパク質に結合したＴＲＡＦを、グルタチオン−セファロースで沈降させた。該ＴＲＡＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いたイムノブロッティングで検出した。該細胞溶解物におけるＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦの発現レベルもまた、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いたイムノブロッティングでモニターした。結果を図２Ａに示す。
【００８３】
図２Ａで示すように、ＧＳＴ−クローン３は、ＴＲＡＦ２よりもＴＲＡＦ３に優先的に結合する。一方、ＧＳＴ−クローン１０はＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３に対して同様に相互作用する。クローン１０の配列解析により、このクローンが、ＴＲＡＦ結合ドメインのコンセンサス配列（ＰＸＱＸＴ／Ｓ、アミノ酸５８３−５８７）を含む、ｍｎｂプロテインキナーゼ相同体ｍｐ８６（Ｄｙｒｋ；ＭＭＵ５８４９７、アミノ酸２８４−７６３）の一部をコードすることが判明した。しかし、クローン３にはこの配列を含まない。
さらにクローン３と他のＴＲＡＦファミリー（ＴＲＡＦ５，６）との結合特異性を比較するため、同様にＧＳＴプルダウンアッセイを行ったところ、図２Ｂに示すように、ＧＳＴ−Ｔ３ＢＰ（クローン３）は他のＴＲＡＦに比較してＴＲＡＦ３と一番強く結合した。
【００８４】
ＴＲＡＦ３とＴ３ＢＰとの相互作用を、哺乳動物細胞における共免疫沈降アッセイにより分析した。結果を図２Ｃに示す。先ず、２９３細胞を、ＭＹＣ標識Ｔ３ＢＰ（Ｃ末端ＭＹＣエピトープ標識を含む完全長Ｔ３ＢＰ）およびＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３をコードする発現ベクターを用いて一時的にトランスフェクションした。細胞抽出物を調製し、抗ＭＹＣ  ９Ｅ１０抗体、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体）、または対照のマウスＩｇＧを用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った。共沈するＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ３またはＭＹＣ−Ｔ３ＢＰを、それぞれ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（図２Ｃの上部）または抗ＭＹＣ  ９Ｅ１０抗体（図２Ｃの下部）を用いたイムノブロッティング分析で検出した。該細胞溶解物におけるＴ３ＢＰおよびＴＲＡＦ３の発現レベルも、それぞれ抗ＭＹＣ  ９Ｅ１０抗体または抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いたイムノブロッティングで測定した。図２Ｃには、Ｔ３ＢＰおよびＴＲＡＦ３の位置を示す。ＩｇのＨ鎖およびＬ鎖の位置も示した。
【００８５】
図２Ｃ下図に示す通り、抗ＭＹＣ抗体は、ＭＹＣ標識Ｔ３ＢＰ発現プラスミドによるトランスフェクション細胞溶解物中にアミノ酸配列から推定されたものより大きい（３５−５０ｋＤａ）複数のバンドを特異的に認識したが、対照抗体の場合には認識しなかった。ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３によって沈降されるＴ３ＢＰが約４０ｋＤａの位置に検出され（下図）、逆にＭＹＣ標識Ｔ３ＢＰによって沈降されるＴＲＡＦ３が約６４ｋＤａの位置に検出された（上図）。
【００８６】
Ｂ−３．ＴＲＡＦ３中のＴ３ＢＰ結合ドメインのマッピング
Ｔ３ＢＰとの結合に関与するＴＲＡＦ３の領域を決定するために、ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３の種々のトランケーション突然変異体を２９３細胞中で発現させ、ＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。先ず、２９３細胞を、ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３トランケーション突然変異体を用いて一時的にトランスフェクトした。細胞抽出物を調製し、ＧＳＴ−クローン３もしくはＧＳＴ単独と共にインキュベートした。ＧＳＴ融合タンパク質に結合したＴＲＡＦを、グルタチオン−セファロースにより沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いたイムノブロッティングで検出した。細胞溶解物におけるＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３トランケーション突然変異体の発現レベルを抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いたイムノブロッティングで監視した。結果を図３Ａに示す。図３Ａから分かるように、ＴＲＡＦ３のＴＲＡＦドメインがＴ３ＢＰと相互作用するために必要であることが判明した。
これを確認するために、ｈＳｏｓに融合させたＴＲＡＦ３トランケーション突然変異体を作製し、酵母でのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイにおいてＴ３ＢＰとの相互作用について試験した。具体的には、酵母細胞ｃｄｃ２５Ｈを指示した構築物を用いてトランスフェクトし、上述の方法と同様に増殖についてアッセイした。許容温度以上で増殖したコロニーは陽性であり、許容温度以上では増殖できないコロニーは陰性である（図３Ｂ）。このアッセイによって、ＴＲＡＦＣドメインがＴ３ＢＰ結合に重要であることが示唆された。図３Ｃは、マウスＴＲＡＦ３の一次構造の概略を示す。
【００８７】
Ｂ−４．Ｔ３ＢＰ中のＴＲＡＦ３結合ドメインのマッピング
ＴＲＡＦ３との結合に関与するＴ３ＢＰの領域を決定するため、Ｔ３ＢＰの種々のトランケーション突然変異体をＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌で発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳，３５Ｓ−メチオニン標識したＴＲＡＦ３と共にインキュベーションした。ＧＳＴ融合蛋白質に結合したＴ３ＢＰをグルタチオンセファロースにより沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しフルオログラフィーにて検出した。図４Ａに示すように、Ｔ３ＢＰの１５１番目以降のアミノ酸を含むＣ末端部分がＴＲＡＦ３との相互作用に必要であることが判明した。さらにＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３を２９３細胞中で発現させ、ＧＳＴ及びＧＳＴ融合Ｔ３ＢＰトランケーション突然変異体による２９３細胞溶解物のＧＳＴプルダウンアッセイを実施したところ、図４Ｂに示すように抗ＦＲＡＧ  Ｍ２抗体で検出される結合パターンは図４Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳産物による結合試験と完全に一致した。図４ＣはＴ３Ｂ  Ｐの一次構造とそのＴＲＡＦ３結合領域を示す（ＴＭは膜貫通領域）。
【００８８】
Ｂ−５．Ｔ３ＢＰの細胞分布
Ｔ３ＢＰの機能について調べるために、その細胞小器官局在化を蛍光顕微鏡法により調べた。カバーガラス上で培養した２９３細胞を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（対照プラスミド；左側）もしくはｐＥＧＦＰ／Ｔ３ＢＰ（ＥＧＦＰ標識Ｔ３ＢＰ発現プラスミド；右側）を用いて一時的にトランスフェクションした。２４時間後に細胞を３．７％ホルマリン中で固定した。次にＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて画像化した。結果を図５Ａに示す。
【００８９】
図５Ａに示すように、ＥＧＦＰ標識Ｔ３ＢＰの発現により形態の変化が誘導された。ＥＧＦＰ標識Ｔ３ＢＰ発現細胞においては、細胞形状が接着性になり、細胞表面から多くのスパイクが発達した。ＥＧＦＰ融合Ｔ３ＢＰの大部分の蛍光が細胞表面およびスパイクにおいて観察された。この観察結果はＰＳＯＲＴによる予測と一致するものである。
【００９０】
次に、ＴＲＡＦ３細胞分布に及ぼすＴ３ＢＰ発現の影響を試験した。カバーガラス上で培養した２９３細胞を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２およびｐＣＲ／ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ３（図５Ｂ−ａ，ｂ，ｃ）、またはｐＥＧＦＰ／Ｔ３ＢＰおよびｐＣＲ／ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ３（図５Ｂ−ｄ，ｅ，ｆ）を用いてトランスフェクトした。２日後に細胞を３．７％ホルマリン中で固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した。ブロッキング後、間接免疫蛍光分析を行った。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を一次抗体として使用し、続いてＣｙ５−結合二次抗体処理を行った。ＥＧＦＰおよびＣｙ５からの蛍光を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて画像化した。上部；ＥＧＦＰの蛍光画像、中央；Ｃｙ５結合二次抗体の蛍光画像、下部；合併した画像。バーは５０μｍ。
【００９１】
図５Ｂ−ｂから分かるように、ＥＧＦＰおよびＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３を共発現する細胞において、ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３が核の周辺において可視化された（図５Ｂ−ｂ）。ＥＧＦＰ標識Ｔ３ＢＰおよびＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３を共発現する細胞においては、ＥＧＦＰ標識Ｔ３ＢＰが局在化していた細胞表面およびスパイクにおいて、ＦＬＡＧ標識ＴＲＡＦ３が観察された（図５Ｂ−ｅ）。
【００９２】
Ｂ−６．細胞性Ｆアクチン含量に及ぼすＴ３ＢＰの影響
細胞性Ｆアクチンに及ぼすＴ３ＢＰの影響を調べるために、ｐｃＤＮＡ／Ｔ３ＢＰでトランスフェクションした細胞におけるＦアクチンの細胞含量を測定した。１２ウエルプレート上で培養した２９３細胞を、指示した量のｐｃＤＮＡ／Ｔ３ＢＰを用いてトランスフェクトした。２４時間後に、上述の方法と同様にＦＩＴＣ−ファロイジンを用いてＦアクチンレベルを測定した。
結果を図６Ａに示す。図６Ａから分かるように、Ｔ３ＢＰによって濃度依存的に細胞性Ｆアクチン含量が増大した。
【００９３】
Ｔ３ＢＰによって細胞性Ｆアクチン含量が増大することを確認するために、ＭＹＣ標識Ｔ３ＢＰを発現する細胞中におけるＦアクチンの細胞分布を観察した（図６Ｂ）。具体的には、カバーガラス上で培養した２９３細胞を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２およびｐｃＤＮＡ（図６Ｂ−ａ）、またはｐＥＧＦＰ−Ｎ２およびｐｃＤＮＡ／ＭＹＣ−Ｔ３ＢＰ（図６Ｂ−ｂ）を用いてトランスフェクションした。２４時間後に細胞を３．７％ホルマリン中で固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した。ブロッキング後、細胞をローダミン−ファロイジンで染色した。ＥＧＦＰからの蛍光（緑色）およびローダミンからの蛍光（赤色）を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて画像化した。バーは５０μｍ。
図６Ｂ−ｂから分かるように、ＭＹＣ標識Ｔ３ＢＰ発現によって細胞形状の変化が引き起こされ、Ｔ３ＢＰにより誘導されたスパイクはローダミン−ファロイジンにより染色された。
【００９４】
（Ｃ）結論
本実施例では、酵母でのタンパク質−タンパク質相互作用に基づくスクリーニングにより新規なＴＲＡＦ３結合タンパク質Ｔ３ＢＰが同定された。Ｔ３ＢＰとＴＲＡＦ３との結合は、ＧＳＴプルダウンアッセイおよび共免疫沈降アッセイにより確認した（図２Ｃ）。さらにＴ３ＢＰとＴＲＡＦ３は、両方のタンパク質を共発現する細胞中に共局在していた（図５Ｂ）。Ｔ３ＢＰは、ＴＲＡＦファミリーの中でＴＲＡＦ３と優先的に相互作用した。最近の報告によれば、ＴＲＡＦファミリーの唯一の因子と特異的に相互作用するＴＲＡＦ結合タンパク質が明らかになった［Gamper, C., 他、(2000) Mol.Immunol. 37, 73-84; Ling, L., 他、(2000) J.Biol.Chem. 275, 23852-23860; 及びLing, L., 他、(2000) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97, 9567-9572］。ＭＩＰ−Ｔ３はＴＲＡＦ３特異的ＴＲＡＦ結合タンパク質として同定され、そしてＭＩＰ−Ｔ３が微小管に結合しＴＲＡＦ３を微小管に集めることによって、ＴＲＡＦ３が微小管に結合する（Ling, L., 他、(2000) J.Biol.Chem. 275, 23852-23860）。ヌクレオポリンもまたＴＲＡＦ３特異的ＴＲＡＦ結合タンパク質として同定された（Gamper, C., 他、(2000) Mol.Immunol. 37, 73-84）。ＴＲＡＦは特にシグナル伝達カスケードにおいて過剰にまたは特異的に働くと考えられるので、ＴＲＡＦファミリーの単一の因子に特異的なＴＲＡＦ結合タンパク質の同定および解析は個々のＴＲＡＦタンパク質の役割の多様性から見て重要である。
【００９５】
Ｔ３ＢＰは、１７番目の因子としてＴＮＦＲスーパーファミリーに属するヒトＢＣＭＡに対して有意な配列類似性を有する［Madry C., 他、(2000) Int.Immunol. 10, 1693-1702］。興味深いことに、Ｔ３ＢＰの発現は、ＢＣＭＡの場合と同様にＢ細胞系統の特定の段階に限定され［Laabi, Y., 他、(1992) EMBO J. 11, 3897-3904;及びLaabi, Y., 他、(1994) Nucleic Acid Res. 22, 1147-1154］、細胞表面に分布する可能性がある（図１Ｂおよび図５Ｂ）。これ以外にも、Ｔ３ＢＰ遺伝子がマウス白血病およびリンパ腫におけるマウス白血病レトロウイルスの挿入によって破壊されることが報告されている［Hansen, G.M., 他、(2000) Genome Res. 10, 237-43］。以上から、Ｔ３ＢＰはＢ細胞分化において細胞表面受容体として重要な役割を果たしていると考えられる。しかし、Ｔ３ＢＰは推定細胞外領域にシステインリッチ領域をもたないため腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーには属さない。
本発明によって明らかとなった新規ＴＲＡＦ３結合蛋白質は、最近報告されたＢＡＦＦ［ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子：B cell activation factor from the TNF family (BAFF) ］の特異的な受容体［Thompson, J.S., 他、（2001）Science 293, 2108-2111］と一致した。ＢＡＦＦはＢ細胞の増殖に関係し[Schneider, P., 他、(1999) J. Exp. Med. 189, 1747-1756]、ＢＡＦＦを高発現させたマウスは成熟Ｂ細胞の過形成や全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus)の症状を呈することから、自己反応性Ｂ細胞の増殖による自己免疫疾患への関連が示唆されている［Mackay, F., 他、(1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710, Batten, M., 他、J. Exp. Med. (2000)192, 1453-1466]。従って、ＢＡＦＦを介したＢ細胞増殖の細胞内情報伝達系に対しＴＲＡＦ３は重要な機能を有しているものと推定され、ＢＡＦＦとＴＲＡＦ３結合性Ｂ細胞特異受容体との相互作用の調節のみならず、ＴＲＡＦ３結合性Ｂ細胞特異受容体とＴＲＡＦ３間の相互作用の調節による自己免疫疾患に対する治療薬の開発が期待される。
【００９６】
【発明の効果】
本発明により、ＴＲＡＦ３に結合する新規なシグナル伝達分子が同定された。また、本発明によりＴＲＡＦ３に結合するシグナル伝達分子をコードする遺伝子がクローニングされた。本発明で同定された新規タンパク質を利用することにより新規な医薬を開発したり、疾患の診断方法を提供することが可能になる。
【００９７】
【配列表】
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【００９９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、Ｔ３ＢＰの推定アミノ酸配列、図１ＢはＴ３ＢＰ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。
【図２】図２Ａは、ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−クローン３，ＧＳＴ−クローン１０）のＴＲＡＦ２，ＴＲＡＦ３に対する結合特性のＧＳＴプルダウンアッセイによる分析結果を示す。
【図３】図２Ｂは、ＧＳＴ−Ｔ３ＢＰのＴＲＡＦ２，ＴＲＡＦ３，ＴＲＡＦ５，ＴＲＡＦ６に対する結合特性のＧＳＴプルダウンアッセイによる分析結果を示す。
【図４】図２Ｃは、ＴＲＡＦ３とＴ３ＢＰとの相互作用の免疫沈降アッセイによる分析結果を示す。
【図５】図３Ａ及び図３Ｂは、ＴＲＡＦ３中のＴ３ＢＰ結合領域のマッピングの結果を示す。
図３Ｃは、マウスＴＲＡＦ３の一次構造の概略を示す。
【図６】図４Ａは、ＧＳＴ融合Ｔ３ＢＰトランケーション突然変異体のＴＲＡＦ３に対する結合特性のin vitroアッセイによる分析結果を示す。
図４Ｂは、ＧＳＴ融合Ｔ３ＢＰトランケーション突然変異体のＴＲＡＦ３に対する結合特性のＧＳＴプルダウンアッセイによる分析結果を示す。
図４ＣはＴ３ＢＰの一次構造とそのＴＲＡＦ３結合領域を示す。
【図７】図５Ａは、Ｔ３ＢＰの発現による細胞の形態変化を示す。
図５Ｂは、ＴＲＡＦ３の細胞分布に及ぼすＴ３ＢＰ発現の影響を示す。
【図８】図６Ａは、Ｔ３ＢＰによる細胞性Ｆアクチン含量の増大を示す。
図６Ｂは、Ｔ３ＢＰを発現する細胞中におけるＦアクチンの細胞分布を観察した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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