(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
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の塩濃度でｖＷＦをカチオン交換体と結合させ、
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の塩濃度で特に高分子ｖＷＦ多量体を含むｖＷＦフラクションを溶出させてｖＷＦを回収することを特徴とするｖＷＦの回収方法。
【請求項２】
ｐＨ５．０から８．５、好ましくはｐＨ６．０から８．０の範囲のｐＨを有する緩衝液中、高分子ｖＷＦ多量体を含有するｖＷＦを含むフラクションを溶出させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
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の範囲の塩濃度で、低分子ｖＷＦ多量体、低い比活性を有するｖＷＦタンパク質分解産物および非特異的な付随タンパク質を除去することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カチオン交換体がスルホプロピル基結合担体またはカルボキシメチル基結合担体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特に、少なくとも６５Ｕ／タンパク質ｍｇの特異的な血小板凝集活性および少なくとも６５Ｕ／タンパク質ｍｇの特異的なコラーゲン結合活性を有する高分子ｖＷＦ多量体を含有するｖＷＦを含むフラクション（群）を回収することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
回収されたｖＷＦを含むフラクション（群）が低分子ｖＷＦ多量体、低い特異的ｖＷＦ活性を有するｖＷＦ断片および混入核酸を含まないことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
血漿、血漿フラクション、クリオ沈降物、組換え細胞培養物の上清または抽出物、またはタンパク質富化溶液から、ｖＷＦを回収することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前精製工程により、該タンパク質富化溶液を得ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アニオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせのようなクロマトグラフィー法によって、該タンパク質富化溶液を得ることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスを不活化または涸渇するために、回収されたｖＷＦを含むフラクション（群）を処理することを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製されたフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の回収方法に関する。
血漿中、ｖＷＦは５−１０ｍｇ／Ｌの濃度で、部分的に因子ＶＩＩＩと非共有結合で複合体を形成して循環している。ｖＷＦは、種々のヒト体細胞中で形成され、その後に放出され循環している糖タンパク質である。このとき、分子量約２２５０００Ｄａ（ｖＷＦモノマー）のポリペプチド鎖から出発し、いくつかの硫黄結合を形成させることにより、分子量約４５００００ＤａのｖＷＦ二量体（初期二量体）が細胞内で合成される。次にｖＷＦ二量体から、硫黄結合による結合の形成により、約２０００００００Ｄａまでの増加した分子量のさらなるｖＷＦのポリマーが形成される。
ｖＷＦを特徴付ける１つの重要な基準は、アガロース電気泳動による多量体構造分析である。特に高分子ｖＷＦポリマーは血液の凝固において本質的に重要であることが想定される。通常、ｖＷＦの機能的活性はリストセチン補因子活性（ｖＷＦ：RistCoF）によって決定される。活性とｖＷＦ抗原濃度との比（ｖＷＦ：Ａｇ）はｖＷＦの純度および特異的効力の特徴として決定される。調製物の比活性はｖＷＦ：Ａｇに対するｖＷＦ：RistCoFの割合の増加に伴って増加する。
ｖＷＦは止血において重要な機能を担っている。これは、補因子として血液の凝固を助ける因子ＶＩＩＩと部分的に複合体を形成して血漿中を循環している。因子ＶＩＩＩはｖＷＦと複合体を形成することによって安定化され、それによりタンパク質分解から保護される。ｖＷＦのさらなる目的は、初期止血に大きく貢献する血小板凝集への関与である。このとき、ｖＷＦは血小板の表面レセプターの糖タンパク質ＩｂおよびＩＩｂ／ＩＩＩａに結合し、血小板を架橋して血小板を凝集させる。初期止血に関してさらに重要なのは、無傷の血管中では、単層の内皮細胞によって血液流から遮断されていて、血液と直接接触しない細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンに対するｖＷＦのアフィニティーである。血管が損傷した場合、損傷部位で内皮細胞層の局所的剥離が生じ、その結果、細胞外マトリックスの成分が血液に直接暴露される。ｖＷＦは、そのコラーゲンに対するアフィニティーによって、損傷した血管の領域において形成された血小板凝集を、暴露された内皮下層細胞（subendothelium）に固定することができる。この結果、まず、傷口が塞がれ、続く血液凝固によりこれがさらに強化される。
フォンビルブラント症候群は機能的フォンビルブラント因子の欠如によって、あるいはフォンビルブラント因子の多量体組成物中の異常スペクトルによって特徴付けられる。因子ＶＩＩＩの安定化の欠如のために、フォンビルブラント症候群によって悩まされている患者は、通常、因子ＶＩＩＩの合成速度は正常であるにもかかわらず、この凝固因子の血漿半減期の大きい減少の結果として、因子ＶＩＩＩの欠如を発現し得る。それゆえ、フォンビルブラント症候群の患者は、血友病Ａ患者の徴候と類似の徴候（表現型（遺伝子発現型）血友病）を示し得る。また、フォンビルブラント症候群に悩まされている患者において、機能的に活性なｖＷＦの欠如は血小板凝集および付着の機能不全を引き起こすことがあり、これは初期止血の欠陥を導き得る。これらのｖＷＦが媒介する手順の機能不全のために、フォンビルブラント症候群に悩まされている患者は出血時間の増加を示す。
したがって、フォンビルブラント症候群の処置のためには、機能的に活性なｖＷＦの欠如と釣り合うだけのｖＷＦ調製物を投与しなければならない。この目的ため、血友病Ａの治療に用いることもできる調製物、例えば因子ＶＩＩＩおよびｖＷＦの複合体を含むクリオ沈降物（クリオプレシピテート）またはそれから調製した因子ＶＩＩＩ濃縮液を用いることができる。しかし、血友病Ａの処置には、より良く精製された、ｖＷＦを含まないか、あるいはほんの微量のｖＷＦを含む因子ＶＩＩＩ：Ｃ濃縮液が常に用いられる。フォンビルブラント症候群に悩まされている患者に対して因子ＶＩＩＩを補うことは必要ではないから、ならびに因子ＶＩＩＩを適用することは患者内で阻害的因子ＶＩＩＩ抗体を誘導する危険性を有するから、フォンビルブラント症候群の処置用には、できるだけ混入因子ＶＩＩＩを含まないｖＷＦ調製物が非常に望ましい。それゆえ、高い比活性を有する純粋かつウイルスに関して安全なフォンビルブラント因子調製物が望まれる。
文献には、ｖＷＦを精製し、回収する種々の方法が開示されている。
ＥＰ ０ ５０３ ９９１には、以下の連続する３つのクロマトグラフィー工程によるヒトクリオ沈降物からのｖＷＦの精製が記載されている：
１）ＴＳＫ−ＤＥＡＥフラクトゲルでのアニオン交換クロマトグラフィーにおいて、０．１５Ｍ ＮａＣｌによってｖＷＦを溶出させ；２）ＴＳＫ−ＤＥＡＥフラクトゲルでのもう１つのアニオン交換クロマトグラフィーにおいて、０．１７Ｍ ＮａＣｌによってｖＷＦを溶出させ；ならびに３）ゼラチンセファロースでのアフィニティークロマトグラフィーにおいて混入したフィブリノーゲンを分離する。ここでは、アミノ酸含有緩衝液およびカルシウムイオン含有緩衝液を用いた。
ＷＯ ８９／１２０６５には、タンパク質をアニオン交換体に結合させ、塩濃度を増加させて段階的に溶出させることによって、血漿ｖＷＦを因子ＶＩＩＩおよびさらなるタンパク質から分離することが記載されている。ｖＷＦ含有フラクションをアニオン交換体で２回目のクロマトグラフ処理に付し、濃縮液として回収した。
ＥＰ ０ ４６９ ９８５には、クリオ沈降物からの血漿ｖＷＦの精製が記載されている。第一工程では、塩濃度２５０ｍＭで因子ＶＩＩＩをアニオン交換体に選択的に結合させ、一方ｖＷＦを上清中に残す。ｖＷＦ含有上清の塩濃度を１００ｍＭ〜１５０ｍＭに下げた後、ｖＷＦを第二アニオン交換体に結合させ、ｐＨ６．６の３００−３５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出させる。ここでは、＜２％の割合の因子ＶＩＩＩを含む、活性少なくとも５０Ｕ／ｍｇを有するｖＷＦを回収している。
ＤＥ ３９ ０４ ３５４には、クリオ沈降物からの血漿ｖＷＦの回収、およびアニオン交換体で因子ＶＩＩＩを選択的に吸着させる一方、ｖＷＦを溶液中に残すことによる因子ＶＩＩＩからのｖＷＦの分離が記載されている。ここでは、１６０Ｕ／ｍＬのｖＷＦを含む溶液を回収している。
ＵＳ ５，００６，６４２には、適当な緩衝液に対して透析することによる、あるいは溶液をさらなるクロマトグラフィー工程において脱塩することによる、ＵＳ ４，３６１，５０９に記載の、ｖＷＦおよび副産物として混入したカオトロピック物質の溶液からのｖＷＦの回収が記載されている。
ＥＰ ０ ３８３ ２３４には、アニオン交換クロマトグラフィーによるｖＷＦ濃縮液の生産方法であって、カルシウムおよびアミノ酸含有緩衝液を加えることによって溶液に含まれる因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を解離させ、ｖＷＦ濃縮液を回収する方法が記載されている。
ＷＯ ９６／１０５８４には、アニオン交換／ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによって、高度に精製された組換えｖＷＦを回収する方法が記載されており、ＥＰ ０ ７０５ ８４６には、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによる組換えｖＷＦの高分子および低分子フラクションの分離が記載されている。
従来、高い比活性を有する精製されたｖＷＦ調製物を回収するためには、いくつかのクロマトグラフィー工程を組み合わせることが必要であった。特に、高分子ｖＷＦ多量体を含む調製物の製造は、これまでヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによってのみ可能であった。しかし、ヘパリンは比較的高価なクロマトグラフィー物質である。
改良された比活性を有する精製されたｖＷＦを回収する方法であって、工業規模で大量生産技術への適用に適した方法を提供することが本発明の目的である。この方法は組換えｖＷＦおよび血漿ｖＷＦ両方の精製に使用可能である。
本発明により、低い塩濃度においてｖＷＦをカチオン交換体に結合させ、段階的フラクション化溶出によって高い比活性を有する、特に高分子ｖＷＦ多量体からなるｖＷＦを回収する組換えｖＷＦの回収方法を提供することでこの目的が達成される。特に、塩濃度を段階的に増加させることによって、まず中塩濃度で、低分子ｖＷＦ多量体、不活性な分解産物および非特異的な付随タンパク質を含むフラクションを分離し、より高い塩濃度で、高い比活性を有する高分子ｖＷＦ多量体を含むフラクションを回収することで、改良された活性および安定性を有するｖＷＦの回収富化が行われる。
酸性等電点（ＩＥＰ＝５．５〜６）およびその結果としての負の正味の電荷のために、通常、弱酸性から塩基性環境で正に帯電しているアニオン交換体によってｖＷＦを精製する。このように、従来は、正に帯電したアニオン交換体によるｖＷＦの精製法が記載されていたため、ｖＷＦのＩＥＰより高いｐＨおよび低い塩濃度で、ｖＷＦがカチオン交換体の負に帯電しているゲルマトリックスに結合し、塩濃度をあげることによってそこから選択的に溶出可能であることは予測できなかった。また、塩濃度
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で段階的に溶出させることによって、特に高分子ｖＷＦ多量体からなるｖＷＦが得られることも予測できなかった。
本発明の方法を用いて、不純な生物学的物質から出発し、実質的に核酸が混入していない精製されたフラクションを得ることも本発明の範囲内に認められた。これにより、非特異的な付随タンパク質に加えて、本方法によってタンパク質調製物から核酸をも除去できる。核酸はその負の電荷のためにアニオン交換体に結合し、塩濃度が増加すると、アニオン交換体から再び解離して、溶出液に入るので、アニオン交換体よる慣用の方法ではこの効果は得られない。
ｖＷＦを精製する場合、ｖＷＦのサイズは５０００００から数百万にわたるため、用いる担体物質中でのｖＷＦ分子の拡散および分配を妨げないような担体物質のみが結果として良好な精製および良好な収量を生むことに特に注意を払わなければならない。カチオン交換体によって高い比活性を有するｖＷＦを精製する本発明の方法を実行する場合、高いローディング容量を有し、扱うのに丈夫であり、明確な溶出プロファイルを有するばかりでなく、工業規模で経済的に用いることができるゲルマトリックスを用いる。これゆえ、本発明の方法は、大量工業規模での精製ｖＷＦの回収用に特に関心を起こさせるものである。
本発明の実施には、すべての既知のカチオン交換体を用いることができ、このカチオン交換体はスルホプロピル基またはカルボキシメチル基を結合した担体を有するのが好ましい。例えば、ＳＰ−セファロースR Fast FlowおよびＣＭ−セファロースR Fast Flow（Pharmacia）、フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３およびフラクトゲルR ＥＭＤ ＣＯＯＨ（Merck）、ＰｏｒｏｓR １０ ＳＰおよびＰｏｒｏｓR １０Ｓ（Perseptive Biosystems）およびToyopearlTM ＳＰ ５５０ＣおよびToyopearlTM ＣＭ−６５０（Ｍ）（TosoHaas）は非常に適していることがわかっている。
フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３およびフラクトゲルR ＥＭＤ ＣＯＯＨ（Merck）のタイプのテンタクル（tentacle）構造を有する多孔性のゲルは精製されたｖＷＦの回収に特に適当であることがわかっている。
緩衝液中の塩濃度
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で、ｖＷＦはカチオン交換体に好ましく吸着する。これゆえ、好ましい吸着緩衝液は５０から２５０ｍＭ、特に１５０−２５０ｍＭの範囲の塩濃度（例えば１５０ｍＭ）を有するものである。緩衝液の塩濃度を段階的に上げることによって、実質的に高分子ｖＷＦ多量体からなるｖＷＦを
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の塩濃度で選択的に溶出させることができる。ｖＷＦ含有溶液に含まれ、ｖＷＦ活性、特にリストセチン補因子活性に関して、低い比活性を有し、コラーゲン結合活性を有し、ならびに特異的な血小板凝集活性を有する低分子ｖＷＦ多量体およびｖＷＦタンパク質分解産物を、
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好ましくは３００ｍＭの塩濃度でカチオン交換体から溶出させ、分離する。
塩として一価または二価の金属イオンを含む緩衝液中でｖＷＦの吸着および脱着を行うことができ、塩としてはＮａＣｌを用いるのが好ましい。
本発明の方法では、カチオン交換体に結合したタンパク質を溶出させるための緩衝液系として、好ましくは緩衝物質、特にグリシン、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液、および塩からなる緩衝溶液を用いる。ここでは、用いる緩衝液はＣａイオンを全く含まないのが好ましい。
溶出緩衝液はｐＨ領域５．０から８．５、好ましくは６．０から８．０を有し得る。
本発明の方法はバッチ法として、あるいはカラムクロマトグラフィーとして行うことができる。
しかし、本発明の方法を行うのに最適なパラメーター、例えば塩濃度、ｐＨおよび温度はそれぞれ用いるカチオン交換体物質に依存する。しかし、個別に用いられるカチオン交換体タイプについて、本方法を実行するために、本発明の範囲内で開示されている条件を最適化することは、当業者の一般的知識の範囲内である。
特に、本発明の方法によって、特に高分子ｖＷＦ多量体からなるｖＷＦを回収し、豊富にする。低い特異性の血小板凝集活性を有する低分子ｖＷＦ多量体およびｖＷＦ断片を選択的に分離し、特に高い活性および特異性を有する高分子ｖＷＦ多量体を含むフラクションを得る。
回収されたｖＷＦフラクション（群）は低分子ｖＷＦ多量体、比活性が低いｖＷＦ断片、因子ＶＩＩＩ複合体、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、非特異的な付随タンパク質および混入核酸を実質的に含まない。
本発明の方法による精製されたｖＷＦの回収には、任意のｖＷＦ含有溶液を出発物質として用いることができる。出発物質は、特に血漿、血漿フラクション、クリオ沈降物または組換え細胞培養物の上清または抽出物のような生物学的物質である。
しかし、ｖＷＦ含有溶液はまた、前精製工程、例えばゲルろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせによって前精製したタンパク質を豊富にした溶液であり得る。これら前処理によって、特に、ｖＷＦを豊富にし、非特異的な付随タンパク質、特に因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩＩ複合体を選択的に分離する。
本発明の方法の特定態様では、アニオン交換体によって豊富にしたｖＷＦ含有フラクションを出発溶液として用いる。
アニオン交換クロマトグラフィーを行うと、アニオン交換クロマトグラフィーの実行方法に依存してｖＷＦは非結合物質としてアニオン交換体を通過するか、あるいはそれに吸着する。したがって、例えば弱酸性環境下、低いイオン強度および塩濃度でｖＷＦおよび因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の両者はアニオン交換体に結合するので、ｖＷＦを血漿フラクションから回収し、豊富にする。次いで、因子ＶＩＩＩ複合体および遊離の複合体形成していない因子ＶＩＩＩは＞３００ｍＭの高塩濃度でのみ脱着するので、１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの中塩濃度で、アニオン交換体からｖＷＦを選択的に溶出させる。
また、因子ＶＩＩＩ複合体はアニオン交換体に結合し、ｖＷＦは溶液中に残る１００ｍＭ〜２００ｍＭの中塩濃度において、ｖＷＦ含有溶液をアニオン交換体で処理し、ｖＷＦに富むフラクションを得ることができる。次いで、塩濃度を増加させることによって結合した因子ＶＩＩＩ複合体をアニオン交換体から回収することができる。
特定の態様では、塩濃度
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の豊富にした溶液中に存在するｖＷＦを（バッチ法で）流出液または溶出液から直接回収し、あるいは上清として回収し、所望によりイオン強度または塩濃度を変えることなしにカチオン交換体に結合させる。しかし、必要ならば、希釈して塩濃度を下げてもよい。
この態様は特に、豊富にしたタンパク質の複雑な再緩衝化、透析などを必要とせずにアニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの単純な組み合わせが可能であるという点で特に有利である。
したがって、最初のクロマトグラフィー工程によって、ｖＷＦを豊富に含むフラクションを得ることができ、続くカチオン交換クロマトグラフィーによって、高分子および低分子ｖＷＦフラクションを精製および分離することができる。しかし、例えばアフィニティー／カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換／アフィニティー／カチオン交換クロマトグラフィーのような他の組み合わせもまた可能であり、高い比活性を有するｖＷＦをさらに豊富にし、選択的に回収することを可能にする。
本発明の上記方法によって、高い比活性を有するｖＷＦは、不純なｖＷＦ含有物質から少なくとも８０倍濃縮される。
原則として、あらゆる生物学的物質に感染性の病原体が混入し得るので、得られたｖＷＦ含有フラクションに対してウイルスを不活化または涸渇するための処理を行い、ウイルスに関して安全な調製物を生産する。この目的のために、先行技術分野に既知のすべての方法、例えば化学的／物理的方法、光活性化物質と光の組み合わせによる不活化、またはろ過による涸渇を用いることができる。特に、確実に脂質包膜ウイルスおよび非脂質包膜ウイルスの両方を不活化できる溶液または固体状態での熱処理は、ウイルスの不活化に適当である。ウイルスの涸渇はナノフィルターでのろ過によって行うのが好ましい。
さらなる側面では、本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによってｖＷＦ含有溶液から得ることができる、高い比活性を有し、特に高分子ｖＷＦ多量体からなる純粋なｖＷＦを含む調製物を提供する。低い純度および低い比活性のｖＷＦを含有する出発物質から出発して、高い比活性を有するｖＷＦを富化し、付随タンパク質、特に因子ＶＩＩＩまたは低分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ複合体を選択的に分離する。これにより、特に、高分子ｖＷＦ多量体からなり、実質的に低分子ｖＷＦ多量体およびｖＷＦ分解産物を含まない精製されたｖＷＦを含む調製物を回収する。
特に本発明の調製物は、ｖＷＦの特異的血小板凝集活性少なくとも６５Ｕ／タンパク質ｍｇおよび特異的コラーゲン結合活性少なくとも６５Ｕ／タンパク質ｍｇを有する。同様に調製物は、実質的に因子ＶＩＩＩを含まず、因子ＶＩＩＩに対するｖＷＦの活性の割合（比率）に基づく因子ＶＩＩＩ含量が＜０．１％である点で特徴付けられる。
また、生成物の純度および低い感染性についてのさらなる基準は、核酸が混入していないことである。したがって、本発明の調製物は実質的に核酸を含まない。ここで「実質的に」とは、２６０／２８０ｎｍの比に基づく核酸含量が
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であることを意味する。しかしまた、例えばＥＰ ０ ７１４ ９８７およびＥＰ ０ ７１４ ９８８に記載されている方法にしたがい、核酸を定量することができる。
出発物質として血漿ｖＷＦまたは組換えｖＷＦを用いて、本発明の調製物を回収および生産する場合、所望により上記記載のウイルスの涸渇または不活化法を行い、感染性粒子を除去する。ウイルスの不活化および／またはウイルスの涸渇は、出発物質から出発し、医薬調製物の生産までの各精製工程の前または後において原則的に可能である。したがって、本発明の調製物はいずれにしてもウイルスに関して安全であろう。
好ましい態様では、本発明の調製物は保存安定形態で存在する。高い比活性を有する精製されたｖＷＦを含む調製物を、溶液用調製物、凍結乾燥物、または急速冷凍状態で提供することができる。本調製物はその純度のために特に安定である。本発明の調製物は−２０℃で少なくとも６月、溶液中４℃で少なくとも４週間および凍結乾燥物として少なくとも１年間安定であることが示されている。各期間内にｖＷＦ活性は最大１０％減少するだけであり、ｖＷＦ多量体の多量体パターンはいかなる実質的な変化をも示さない。
本発明の調製物の製剤化は既知の慣用方法により行うことができる。本発明の調製物中に含まれる精製されたｖＷＦを塩、例えばＮａＣｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物および／またはＣａＣｌ2、およびアミノ酸、例えばグリシンおよびリシンを含み、ｐＨ範囲が６から８の緩衝液と混合し、医薬調製物に製剤化する。
表現型血友病およびｖＷＤの患者の処置用薬物を生産するために本調製物を用いることができる。
以下の実施例および図面によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例示的態様に限定されるべきではない。
図１は、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製前および後のｒｖＷＦの多量体分析を示す；
図２は、ｖＷＦがアニオン交換体に結合する条件下における、アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる精製前および後のクリオ沈降物由来のｖＷＦの多量体分析を示す（実施例２Ａ）
図３は、ｖＷＦがアニオン交換体に結合しない条件下における、アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる精製前および後のクリオ沈降物由来のｖＷＦの多量体分析を示す（実施例２Ｂ）。
実施例１は、カチオン交換クロマトグラフィーによる組換え細胞の培養上清からのｒｖＷＦの精製を記載し；実施例２は、まずアニオン交換クロマトグラフィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィーによる血漿ｖＷＦの精製を記載し；実施例３は、アニオン交換／免疫アフィニティーと、カチオン交換クロマトグラフィーとの組み合わせによる組換えｖＷＦの精製を記載する。
実施例１：
カチオン交換クロマトグラフィーによる組換え細胞の培養上清からのｖＷＦの精製
慣用の培養培地中、組換えＣＨＯ細胞内でｖＷＦを生産した。形質転換細胞の発酵後、培養培地を除去し、遠心によって細胞および細胞断片を除去した。次いで、この溶液を、孔サイズ０．４μｍのフィルターに通し、膜断片のような低分子成分を除いた。
クロマトグラフィーカラム（５０ｍＬ）にカチオン交換体（フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３）を充填し、緩衝液（３０ｍＭ グリシン−ＮａＣｌ−緩衝液）ですすいだ。次いで、カチオン交換カラムに細胞を含まない培養上清を載せ、流出液（フラクション１）中に、交換体に結合しないタンパク質を得た。０．３Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液でカラムをすすぎ、結合した非特異的な付随タンパク質を除去した（フラクション２）。次いで、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液によって、結合したｖＷＦを交換体から脱着させ、溶出液（フラクション３）中に得た。
タンパク質含量、ｖＷＦ抗原含量（ｖＷＦ：Ａｇ）、ｖＷＦ活性（リストセチン補因子活性、ｖＷＦ：RistCoF）についてすべてのフラクションを試験し、ｖＷＦ多量体分析に付した。タンパク質濃度はBradford法（M. Bradford (1976), Anal. Biochem., 72: 248-254）によって測定した。ｖＷＦ含量は市販のＥＬＩＳＡ系（AsserachromR vWF, Boehringer Mannheim）によって測定した。リストセチン補因子活性は一般試験系（v-Willebrand-ReagenzR, Behringwerke）によって測定した。カチオン交換クロマトグラフィーの結果を表１にまとめる。図１はカチオン交換体による精製前および後のｖＷＦ多量体分析を示す。
表１から、出発物質中に存在し、リストセチン補因子活性を有する完全なｖＷＦがカチオン交換体と結合することは明らかである。０．３Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液でカチオン交換カラムをすすぐ（フラクション２）ことによって、測定可能な活性を含まないｖＷＦを除去した。０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出させる（フラクション３）ことによって、ほとんどすべてのリストセチン補因子活性を有するｖＷＦを得る。さらに、培養上清のＤＮＡの記載した涸渇を行う：吸光度２６０ｎｍ／２８０ｎｍは１．２から０．７である。この単一のクロマトグラフィー工程の結果、精製倍率は１０倍であった。
図１は、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製前および後のｖＷＦの多量体分析を示す。図１中、レーンＡは未精製ｒｖＷＦを示し、レーンＢは、流出液中のフラクション１のｖＷＦ多量体を示し；レーンＣはフラクション２（０．３Ｍ ＮａＣｌ溶出液）のｖＷＦ多量体を示し、レーンＤはフラクション３（０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出液）のｖＷＦ多量体を示す。図１から、カチオン交換クロマトグラフィーおよび選択的溶出によって、特に高分子多量体構造を含有するｖＷＦが得られることは明らかである。低分子ｖＷＦ多量体およびｖＷＦ分解産物は、いずれもカチオン交換体と結合しない（フラクション１）か、あるいは０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出（フラクション２）させることによって選択的に分離される。
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実施例２：
アニオン交換体による前精製およびカチオン交換体による血漿ｖＷＦの精製
Ａ．ｖＷＦがアニオン交換体に結合する条件下での結合アニオン交換クロマトグラフィーおよびｖＷＦの選択的溶出
ヒト血漿からのクリオ沈降物をｐＨ６．７の７ｍＭトリス、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭリシンの緩衝液に溶解した。前処理のため、Ａｌ（ＯＨ）3を攪拌しながら加えた。次いで、遠心により沈降物を分離した。
このように前処理したクリオ沈降物を、フラクトゲルR ＥＭＤ−ＴＭＡＥのアニオン交換カラムにアプライした。このカラムを１６０ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液ですすぎ、弱く結合したタンパク質を除去した。まず、緩衝液中の２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出させることによって、交換体からｖＷＦを溶出させた（フラクション１）。次いで、４００ｍＭ ＮａＣｌで溶出を行い、ＦＶＩＩＩ複合体を溶出させた（フラクション２）。クリオ沈降物から出発し、フラクション１は全ｖＷＦ活性の６８％を含んでいたが、全ＦＶＩＩＩ活性のほんの１０％しか含んでいなかった。残りのｖＷＦ活性およびＦＶＩＩＩ活性の８０％はフラクション２に含まれている。
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次いで、ｖＷＦを含有するフラクション１をフラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３のカチオン交換カラムにアプライした。このカラムを１００ｍＭ ＮａＣｌですすぎ、弱く結合したタンパク質を除去した。次いで、２００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション１）、３００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション２）および４００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション３）で段階的に溶出させた。全ｖＷＦ活性の７０％以上が４００ｍＭ ＮａＣｌフラクション中に認められた。ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性は全く認められなかった。この結果を表３にまとめる。
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クリオ沈降物中のｖＷＦの比活性は０．６Ｕ／タンパク質ｍｇであったが、カチオン交換クロマトグラフィーの４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液中では６５Ｕ／ｍＬに達する。特異的コラーゲン結合活性は、クリオ沈降物中の０．７Ｕ／タンパク質ｍｇからカチオン交換クロマトグラフィーの４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液中の６５Ｕ／タンパク質ｍｇに上がった。クリオ沈降物から出発して、ｖＷＦの純度は１００倍増加した。
図２は、組み合わせたアニオン／カチオン交換クロマトグラフィー時のｖＷＦ多量体分析を示す。レーンＡからＥはアニオン交換体による精製を示し、レーンＦからＫはカチオン交換体による精製を示す。図２の各レーンはｖＷＦのｖＷＦ多量体パターンを示し、レーンＡはクリオ沈降物中の、レーンＢはろ過後の、レーンＣは流出液中の、レーンＤは２５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション１、表２）中の、レーンＥは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表２）中の、レーンＦはカチオン交換クロマトグラフィー前の２５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション１、表２）中の、レーンＧは流出液中の、レーンＨは２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション１、表３）中の、レーンＩは３００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表３）中の、そしてレーンＫは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション３、表３）中のパターンを示す。レーンＨおよびＩから、２００ｍＭ ＮａＣｌまたは３００ｍＭ ＮａＣｌで溶出させることによって、低分子ｖＷＦ多量体だけがカチオン交換体から脱着することがわかる。カチオン交換体から４００ｍＭ ＮａＣｌで溶出を行い、レーンＫでは特に高分子ｖＷＦ多量体を含有するｖＷＦを得た。
Ｂ．ｖＷＦがアニオン交換体に結合せず、溶液中に残ったままである条件下でのアニオン交換クロマトグラフィー
ヒト血漿由来のクリオ沈降物をｐＨ６．７の７ｍＭトリス、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭリシン、１２０ｍＭ ＮａＣｌの緩衝液中に溶解した。前処理のため、Ａｌ（ＯＨ）3を攪拌して加えた。次いで、沈降物を遠心して分離した。
このように前処理したクリオ沈降物をフラクトゲルR ＥＭＤ−ＴＭＡＥのカラムにアプライした。このカラムを溶液緩衝液ですすぎ、非結合タンパク質を得た（フラクション１）。このフラクション１はｖＷＦ活性の６０％を含んでいたが、ＦＶＩＩＩ活性は１０％しか含んでいなかった。次いで、４００ｍＭ ＮａＣｌでこのカラムから溶出を行い（フラクション２）、ＦＶＩＩＩ複合体を得た。
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次いで、ｖＷＦを含むフラクション１をカチオン交換カラム（フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３）にアプライした。このカラムを１００ｍＭ ＮａＣｌですすぎ、弱く結合したタンパク質を除去した。次いで、２００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション１）、３００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション２）および４００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション３）を用い、段階的に溶出を行った。４００ｍＭ ＮａＣｌフラクション中にｖＷＦ活性の７０％以上が認められた。因子ＶＩＩＩ抗原およびＦＶＩＩＩ：Ｃ活性は全く認められなかった。この結果を表５にまとめる。
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クリオ沈降物中のｖＷＦの比活性は０．６Ｕ／タンパク質ｍｇであったが、カチオン交換クロマトグラフィーの４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液中では、４７Ｕ／ｍｇに達する。特異的コラーゲン結合活性は、クリオ沈降物中の０．７Ｕ／タンパク質ｍｇからカチオン交換クロマトグラフィーの４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液中の５１Ｕ／タンパク質ｍｇに上がった。クリオ沈降物から出発して、ｖＷＦの純度は８０倍増加した。
図３は、組み合わせたアニオン／カチオン交換クロマトグラフィー時のｖＷＦ多量体分析を表す。レーンａからｃはアニオン交換体による精製を示し、レーンｄからｈはカチオン交換体による精製を示す。図３のレーンａはクリオ沈降物中の、レーンｂは流出液中の、レーンｃは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表４）中の、レーンｄはカチオン交換クロマトグラフィー前の流出液（フラクション１、表４）中の、レーンｅはカチオン交換体の流出液中の、レーンｆは２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション１、表５）中の、レーンｇは３００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表５）中の、レーンｈは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション３、表５）中の、ｖＷＦのｖＷＦ多量体パターンを示す。結果的に、カチオン交換クロマトグラフィーの２００ｍＭ ＮａＣｌ（レーンｆ）および３００ｍＭ ＮａＣｌ（レーンｇ）のそれぞれ、および４００ｍＭ ＮａＣｌ（レーンｈ）を用いて得られたフラクション中にｖＷＦのｖＷＦ多量体構造が示された。４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（レーンｈ）は高分子ｖＷＦ多量体パターンを示し、７０％以上のｖＷＦ活性を含んでいる。
実施例３：
アニオン交換／免疫アフィニティークロマトグラフィーと、カチオン交換クロマトグラフィーとの組み合わせによる組換えｖＷＦの精製（現時点で発明者らが本発明の実施に最良の方法と考えているもの）
通常の培養培地中、組換えＣＨＯ細胞によってｖＷＦを生産した。形質転換細胞の発酵後、培養培地を除去し、遠心して細胞および細胞断片を除去した。次いで、孔サイズ０．４μｍのフィルターを通してこの溶液をろ過し、膜断片のような低分子成分を除去した。
アニオン交換クロマトグラフィー
細胞を含まない培養上清１０００ｍＬを、流速０．７ｃｍ／分のカラム（７．１ｃｍ2×８ｃｍ、アニオン交換体フラクトゲルR ＥＭＤ−ＴＭＡＥ ６５０Ｍ（Merck）５７ｍＬを充填）でろ過した。その前に、２０ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）でゲルを平衡化しておいた。次いで、このカラムを０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。このカラムを２００ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄し、付随する物質および低いRistCoF活性を有するｖＷＦを除去した。次いで、２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の２８０ｍＭ ＮａＣｌによって、ｒｖＷＦを担体から溶出させた。
免疫アフィニティークロマトグラフィー
アニオン交換体工程の２８０ｍＭ ＮａＣｌ溶出液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化しておいた固定化抗体樹脂（カラム寸法：１９．６ｃｍ2×５．６ｃｍ；ゲル床容量：１１０ｍＬ；樹脂マトリックス：セファロースＣＬ２Ｂ；抗体：マウスモノクローナル抗体ＡｖＷ８／２のＦａｂ断片）に流速０．２５５ｃｍ／分で載せた。次いで、０．５％トゥイーン８０を加えた２０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）ですすいだ。１０％スクロースを加えたｐＨ８．０の２０ｍＭグリシン緩衝液でｒｖＷＦを溶出させた。カラム容量の８０％になった後、流速を約２０分の１まで遅くした。
カチオン交換クロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（７．１ｃｍ2×８ｃｍ、フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３ ５７ｍＬで充填）を緩衝液（３０ｍＭ グリシン−ＮａＣｌ緩衝液；ｐＨ５．０）ですすいだ。次いで、カチオン交換体カラムを通して、免疫アフィニティークロマトグラフィーの溶出液をろ過した。３０ｍＭグリシン−ＮａＣｌ緩衝液でカラムを再び洗浄した後、緩衝化０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液でこのカラムをすすぎ、カチオン交換体に結合した付随物質および低い比活性を有するｖＷＦを除去した。次いで、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出させ、交換体カラムからのフラクション３中にｖＷＦを得た。
各クロマトグラフィー工程後、タンパク質濃度、ｒｖＷＦ抗原含量（ｖＷＦ：Ａｇ）およびリストセチン補因子活性（ｖＷＦ：RistCoF）を測定した。
アニオン交換クロマトグラフィーによってｒｖＷＦは２．３倍豊富になったことが認められた。続く免疫アフィニティークロマトグラフィーでは、さらに３．６倍豊富になった。次のカチオン交換クロマトグラフィーにより、ｖＷＦをさらに５．２倍豊富にすることができた。さらに、この工程によって、免疫アフィニティーカラムからの溶出液中に存在する微量のマウス抗体を事実上完全に除去することができた（＜０．０２ｍｇ／１０００Ｕ ｖＷＦ RistCoF活性）。続くカチオン交換クロマトグラフィーによって、低分子ｖＷＦ多量体の分離および高分子多量体構造を有するｖＷＦの豊富化を行い、これによりｖＷＦ：Ａｇ活性に対するｖＷＦ：RistCoFの割合が４倍増加する。
本連続精製手順の種々の工程におけるｒｖＷＦの精製結果を表６に示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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