(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルクホルデリア  エスピー（Burkholderia sp.）ＭＢ−１１と命名され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９４９として受託された微生物から生産され、配列表の配列番号１（Ｎ末端フラグメント）および配列番号２(中間部フラグメント）で表されるアミノ酸配列を含む、次の（１）〜（８）の酵素学的性質を有するカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１。
（１）基質特異性
カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンに対しても作用する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ
少なくともｐＨ２〜６で作用し、最適ｐＨは約３〜４である。ｐＨ５において最大活性値の２０〜３０％、ｐＨ２．５において最大活性値の１０〜２０％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性
４℃、１２時間の処理条件でｐＨ３〜８の範囲で安定である。
（４）作用温度及び最適温度
少なくとも１０〜８０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃で最適温度における活性の約５５〜６５％、３０℃で最適温度における活性の約２０〜３０％、７０℃で最適温度における活性の約６０〜７０％、８０℃で最適温度における活性の約３０〜４０％の活性を保持する。
（５）温度安定性
ｐＨ５．８ 、１０分間の処理条件で少なくとも約５０〜６０℃まで安定である。
（６）分子量
１０ ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの推定分子量は、約３６，０００である。
（７）等電点
４．２である。
（８）阻害剤
ペプスタチン、ジアゾアセチルノルロイシンメチルエステルおよび1、2-エポキシ-3-(p-ニトロフェノキシ)プロパンによっては阻害されない。
【請求項２】
ブルクホルデリア  エスピー（Burkholderia sp.）ＭＢ−１１と命名され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９４９として受託された請求項１記載のカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１を生産する微生物。
【請求項３】
請求項２記載の微生物を培地に培養し、その培養物から請求項１に記載のカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１を採取することを特徴とするカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なカルボキシルプロテアーゼ、それを生産する微生物および前記カルボキシルプロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を利用した好気的発酵処理による有機性廃棄物の堆肥化、特に、微生物を利用した好気的発酵処理は、ランニングコストが低廉で、エネルギー消費量の少ない省資源的な方法であるばかりでなく、発酵処理物を堆肥として土壌に還元することができる。
しかし、微生物を利用した好気的発酵処理法は、有機物の分解反応の主体である微生物が活発に生育可能な環境条件下でのみ機能し得る。したがって、不適当な環境条件下においては、環境条件の調整が必要になる。発酵処理過程で関与する微生物の多くは、中性から弱アルカリ性に生育の至適pHを持ち、酸性環境下では、その増殖活性が低下し、pH４−５以下では、全く増殖を示さなくなる（廃棄物学会論文誌、４巻、３５頁、１９９３年）。このため発酵処理過程で、pHの低下が生じると分解反応速度が低下し、処理過程の大幅な遅延や停止を引き起こすことが知られている（衛生工学研究論文集、２０巻、１７５頁、１９８４年）。こうした酸性物質を中和するために、有機物処理装置に測定器を用いて発酵物質のpHを測定する機構や、pH値が適正範囲を外れた場合に消石灰などのアルカリ剤を投入する機構が既に提案されている（特開昭５５−１１３６８８号公報、特開平１−１４５３８８号公報）。しかし、処理装置にpHを測定する機構やアルカリ剤を投入する機構を搭載すると、装置が煩雑になりコストも高くなり、特に装置が小規模であるバイオ式生ゴミ処理装置による個別分散処理に適用することは難しい。また固相反応系である発酵処理物の正確なpH測定は困難であり、アルカリ剤の供給が不足すれば効果が得られないばかりか、過剰のアルカリ剤の供給によりpHが上昇し過ぎて逆に微生物の活性低下を引き起こすなどの問題があった。
また、有機物処理装置の発酵槽内に、水素イオン濃度を中性から弱アルカリ性に保つpH調整剤および有機物を分解する微生物を固定した水分調整剤を充填することで、有機物を高速発酵させる方法が提案されている（特開平７−３０３８７１号公報）。しかしこの水分調節剤は作成に１週間以上の日数を要し、製造コストが高くなるという問題があった。
有機性廃棄物の発酵処理過程で、pHを低下させる要因は、有機酸の蓄積であるが、逆にpHを高める要因はアンモニアの発生である。良好な発酵処理が進行すると、タンパク質の分解によって生じたアンモニアは、水に溶解し水酸化アンモニウムとなりpHを上昇させる。ある程度pHが上昇すると、アンモニアがアンモニアガスとして揮散するため発酵に障害を与えるほどpHが上昇することはない。したがって酸性環境下においても十分にタンパク質を分解し、pHを上昇できるシステムの実現、特にそれに適する酵素更に好ましくは微生物の提供が求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、低pH域でも高性能のタンパク質分解能をもち、直接的ではないにしろアンモニアを生じせしめて、コンポストの低pH環境を改善することができる酵素、かかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当該微生物を用いたカルボキシルプロテアーゼの製造法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らの研究途上、偶然にも発酵処理物のpHが４．５付近まで低下しているにもかかわらず活発な分解反応が継続するといった特異的現象を見いだした。そこで、この発酵処理物から微生物を分離したところ、従来の微生物、例えば、Pseudomonas sp.101（Oda et al. Biochimica et Biophysica Acta、９２３巻、４６３頁、１９８７年。Oda et al.  J. Biol. Chem.、２６９巻、２６５１８頁、１９９４年）、またはXanthomonas sp.（Oda et al. Agric. Biol. Chem.、５１巻、３０７３頁、１９８７年。Oda et al J. Biochem.、１２０巻、５６４頁、１９９６年)とは異なる微生物とその微生物の産する新規カルボキシルプロテアーゼを見出し本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち本発明は、ブルクホルデリア  エスピー（Burkholderia sp.）ＭＢ−11と命名され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９４９として受託された微生物から生産され、配列表の配列番号１（Ｎ末端フラグメント）および配列番号２(中間部フラグメント）で表されるアミノ酸配列を含み、次の（１）〜(８)の酵素学的性質を有するカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１を提供するものである。
（１）基質特異性
カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンに対しても作用する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ
少なくともｐＨ２〜６で作用し、最適ｐＨは約３〜４である。ｐＨ５において最大活性値の２０〜３０％、ｐＨ２．５において最大活性値の１０〜２０％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性
４℃、１２時間の処理条件でｐＨ３〜８の範囲で安定である。
（４）作用温度及び最適温度
少なくとも１０〜８０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃で最適温度における活性の約５５〜６５％、３０℃で最適温度における活性の約２０〜３０％、７０℃で最適温度における活性の約６０〜７０％、８０℃で最適温度における活性の約３０〜４０％の活性を保持する。
（５）温度安定性
ｐＨ５．８、１０分間の処理条件で少なくとも約５０〜６０℃まで安定である。
（６）分子量
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの推定分子量は、約３６，０００である。
（７）等電点
４．２である。
（８）阻害剤
ペプスタチン、ジアゾアセチルノルロイシンメチルエステルおよび1、2-エポキシ-3-(p-ニトロフェノキシ)プロパンによっては阻害されない。
また本発明は、ブルクホルデリア  エスピー（Burkholderia sp.）ＭＢ−11と命名され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９４９として受託された前記のカルボキシルプロテアーゼＭＢ11を生産する微生物を提供するものである。
さらに本発明は、前記の微生物を培地に培養し、その培養物から上記のカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１を採取することを特徴とするカルボキシルプロテアーゼＭＢ１１の製造法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ11は、例えばブルクホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）ＭＢ11を培養し、その培養物から採取することにより製造される。
【０００７】
ブルクホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）ＭＢ11の分類学的性質を以下に示す。
(a)顕微鏡的観察結果
０．5〜０．８μm ×１．５〜３．０μm の桿菌であり、鞭毛を有し、運動性がある。胞子の形成は認められない。
(b)グラム染色性：−、
(c)3%KOHによる溶菌：＋
(d)アミノペプチダーゼ活性：＋
(e)胞子形成能：−、
(f)運動性：＋、
(g)カタラーゼ活性：＋、
(h)オキシダーゼ活性：−、
(i)アルコールデヒドロゲナーゼ活性：−、
(j)ウレアーゼ活性：−、
(k)ゼラチンの加水分解：−、
(l)硝酸からの亜硝酸の生成：＋、
(m)脱窒：− (n.g.)
(n)糖等の利用性：
グルコース：＋
クエン酸塩類の利用：＋、
アラビノース：−、
イノシトール：−
Adonit：＋
α‐amylamin：＋＋
m‐hydroxybenzoat：＋
2、3‐ブチレングリコール：＋
ciraconat：＋＋
トリプタミン：＋
lavulinat：＋
(o)41℃での生育：＋
【０００８】
以上の菌学的性質に関する検討に基づき、ドイツDSMZ社の同定により、本菌株は、ブルクホルデリア属の一種ブルクホルデリア セパシア 又は ブルクホルデリア ピロシニアに類似した性質を有する菌種であると判断された。しかし本菌株は、耐酸性を示し、さらにカルボキシルプロテアーゼを産出するといった、ブルクホルデリア属としては特異的な性質を有していた。そこで、本菌株をブルクホルデリア  エスピー  ＭＢ11と命名し、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９４９として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。受託証を添付する。
【０００９】
上記の菌株を用いて、本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ11を得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養することで これを得ることができる。
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及びタンパク質を適当量含有せしめておくことが望ましいが、タンパク質以外の窒素源を与えると、微生物は生育できるが本発明の酵素の生産は低下する。
この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、その例としては、炭素源として例えばグルコースや有機酸（例えばクエン酸等）が挙げられるが各種のスターチが最も好適である。またタンパク質源としては、カゼイン、大豆粉、肉エキス等の有機窒素源が有効である。ただし、低分子量のペプチドやアミノ酸が豊富に存在する窒素源を供給すると、本発明の酵素の生産は著しく低下する。
また、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
このような培地として、例えば、ACS培地（スターチ１％、カゼイン０．３％、NaCl ０．２％、MgSO4・7H2O ０．００５％、CaCO３ ０．００２％、FeSO4・7H2O ０．００１％、KH2PO4 ０．３％、pH４．５）は、特に好適に用いることができる。
培養温度は、30℃前後が好ましく、培養初発pHは4.5が好ましい。この条件下において通常３〜５日間で培養は完了する。
【００１０】
かくして得られた培養液の中から目的の酵素であるカルボキシルプロテアーゼＭＢ11を採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行えばこれを得ることができる。即ち、培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。この粗酵素液を、更に、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。なお、好適な酵素の精製方法は以下の通りである。即ち、適宜濃縮を繰り返しながら、例えばpH5.8に調節した粗酵素液を陽イオン交換クロマトグラフィに付し、さらにゲル濾過を必要に応じ繰り返すことができる。
【００１１】
本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ11の酵素学的諸性質について以下に説明する。
（酵素活性測定法）
ヘモグロビン１.33％を含むMcllvaine緩衝液（Mcllvaine、J.Biol.Chem.、49巻、183頁、1921年、酸成分：0.1Mクエン酸、塩基成分：0.2M Na2HPO4）(pH3.0）375μlを37℃とし、これに125μlの酵素液を加え37℃、10分間反応させる。反応停止液（０．４４Ｍトリクロロ酢酸）0.5mlを加え、３０℃、２０分間静置する。次に遠心分離（1000Ｇ ５分間）し、上清の0.5mlについて、さらに0.44M炭酸ナトリウム2.5mlを加え、1N Folin‐Ciocalteu試薬（シグマ社製）0.5mLを加え、37℃で20分間静置後、660nmの吸光度を測定する。上記反応条件下において、１分間に反応液の１mlあたり１μｇのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
（酵素学的性質）
（１）作用及び基質特異性：  タンパク質及びペプチド、例えばカゼイン、ヘモグロビン、アルブミン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タンパクなどを分解する。とくにカゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンに対して作用する。
Mcllvaine緩衝液(pH3.5）中に最終濃度１．０％となるように、一連のサンプルを加え、３７℃で１０分間反応を行い、活性を測定した。ヘモグロビンは、シグマ社製、Bovineを、カゼインは和光純薬工業社製、ハマルステン氏法を用いた。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ（図１）：  少なくともｐＨ２〜６で作用し、最適ｐＨは約３〜４である。pH５において最大活性値の２０〜３０％、pH2.5において最大活性値の10〜20％の活性を保持する。
Mcllvaine緩衝液(pH2‐8)およびClark‐Lubs緩衝液（Clark, Lubs、J.Bact、2巻、191頁、1917年（酸成分0.2M HCl、塩基成分0.2M KCl)(pH1‐2）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビンを加え、３７℃で１０分間反応を行い、各pHにおける活性を測定した。
（３）ｐＨ安定性（図２）：  ４℃、１２時間の処理ではｐＨ３〜８範囲で安定である。
Mcllvaine緩衝液(pH2‐8)およびClark‐Lubs緩衝液 (pH1‐2）中に本酵素を加え、４℃で１２時間放置した。ヘモグロビンを基質として、残存活性をpH３．５、３７℃の条件下で測定した。
（４）作用温度及び最適温度（図３）：  少なくとも１０〜８０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。40℃ で最適温度における活性の約５５〜６５ ％、30℃で最適温度における活性の約 20 〜３０ ％、７0℃ で最適温度における活性の約６０〜７0％、80℃で最適温度における活性の約 ３０〜４０ ％ の活性を保持する。
Mcllvaine緩衝液(pH3.5)中に最終濃度１．０％となるように、ヘモグロビンを加え、各温度で10分間反応を行い、活性を測定した。
（５）温度安定性（図４）：  ｐＨ５．８、１０分間の処理条件では、少なくとも約５０〜６０℃まで安定である。
本酵素を２０ｍＭクエン酸緩衝液中で、各温度で10分間放置した後氷冷した。ヘモグロビンを基質として、残存活性をpH３．５、３７℃の条件下で１０分間反応させ測定した。
（６）分子量（図５）：    Parfect Protein Markers (Novagen社製  150,000、100,000、75,000、50,000、35,000、25,000、15,000)を分子量マーカーとした10％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、本酵素の分子量は、約３６，０００である。
（７）等電点：  等電点は４．２である。
ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法により測定した。ｐＩマーカーとして、低pIキャリブレーションキット（pI 2.5‐6.5）(ファルマシア社製）を使用した。
（８）阻害剤の影響（図６）：  ペプスタチン、ＤＡＮ（ジアゾアセチルノルロイシンメチルエステル）、ＥＰＮＰ（1、2‐エポキシ‐3‐(p‐ニトロフェノキシ)プロパン）によっては阻害されない。
ブタペプシン(シグマ社製）を対照区として、カルボキシルプロテアーゼに特異的な阻害剤に対する感受性を測定した。
［ペプスタチン］  Mcllvaine緩衝液(pH4.0)に本酵素を最終濃度１０（μｇ／ｍｌ）となるように添加し、各濃度のペプスタチンを３７℃で１０分間作用させた。作用後、ヘモグロビンを基質として、残存活性をpH３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応させ測定した。
［ＤＡＮ］  Mcllvaine緩衝液(pH5.0)に本酵素、３０ｍＭＣｕＳＯ４、６０ｍＭ ＤＡＮを添加し、３７℃で０−６０分間作用させた。作用時の最終濃度は、酵素：５７（μｇ／ｍｌ）、Ｃｕ２＋：２．２０ｍＭ、ＤＡＮ ２．６５ｍＭとした。作用後、ヘモグロビンを基質として、残存活性をpH３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応させ測定した。
［ＥＰＮＰ］  Mcllvaine緩衝液(pH4.0)に本酵素を５７（μｇ／ｍｌ）となるように添加し、ＥＰＮＰを１０ｍｇ／ｍｌ添加し、３０℃で０−７６．５時間反応させた。反応後、ヘモグロビンを基質として、残存活性をpH３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応させ測定した。
【００１２】
このように、本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ11は、過去の報告に無い新規酵素である。本酵素は、前述のPseudomonas sp.101が産生する酵素と類似しているものの、その分子量、至適ｐＨ、等電点に差異を認めることができる新規な酵素である。
本発明の微生物は、タンパク質の一連の資化過程をへて、最終的に脱アミノ化反応により、アンモニアを生じることにより、これが結果として生育環境のｐＨを上昇させる。
本発明のカルボキシプロテアーゼＭＢ１１は、有機性廃棄物の醗酵処理工程の他に、酸性洗浄剤への配合によりタンパク質汚れの除去、あるいは酸性食料品の製造ライン洗浄剤としても有効に利用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
先ず、一次スクリーニングとして、酸性培地（ＳＰＹＮ培地）による選択培養により耐酸性微生物の分離を行った。
［ＳＰＹＮ培地］  （J. Gen. Appl. Microbiol. 41巻、175頁、１９９５年）
Soluble Starch : 1%、Pepton : 0.1%、Yeast extract : 0.01%、Nutrient broth : 0.05%、KNO3 : 0.2%、NaCl : 0.2%、MgSO4 7H20 : 0.005%、CaCl2 2H2O : 0.002%、FeSO4 7H2O : 0.001%、(pH: 4.5)
発酵処理物をＳＰＹＮ液体培地に添加し、３０℃で好気的培養を行い、培養１−７日後に適時ＳＰＹＮ寒天培地を用いて発生した菌株を分離した。得られた菌株は、ＳＰＹＮ寒天培地により画線培養を繰り返し純化した。
次に、プロテアーゼ活性の有無による二次スクリーニングを行った。プロテアーゼ活性を有する菌株をＡＣＳ寒天培地上で培養すると、コロニーの周辺に透明帯（ハロ）が形成される。この性質を指標とし、タンパク質資化性微生物の分離を行った。
得られた分離株について、カルボキシルプロテアーゼ活性を定量したところ、該酵素活性を有していた。このようにして、本発明のブルクホルデリア  エスピー  ＭＢ11株を選抜した。
【００１４】
実施例２
次に実施例１で得られたブルクホルデリア  エスピー  ＭＢ11株のカルボキシルプロテアーゼの産生、およびタンパク質の分解にともなうpHを改善する効果について検証した。ＡＣＳ培地により本菌株を３０℃で５日間培養し、菌体の生育、培地のｐＨ、およびプロテアーゼ活性を測定した。
［菌体の生育測定法］菌体の生育は、ＡＴＰ濃度を測定しその指標とした。ＡＴＰ濃度の測定は、ＡＴＰ測定用試薬キット  ルシフェールＬＵ（キッコーマン（株）社製）を使用した。
菌体の生育（図７）、培地中に分泌されたプロテアーゼ活性（図８）、および培地のｐＨ値の経時変化（図９）を図に示した。本菌株は、その生長にともない盛んにプロテアーゼを産生していることが分かる。また菌体の生育によってプロテアーゼが産生されるとともに培地のｐＨ値が中性付近にまで増加している。培地中のプロテアーゼ活性とｐＨ値の関係をみると、プロテアーゼが産生されタンパク質の分解が進行すると、結果として明らかにｐＨ値が中性側にシフトしており、本発明の目的に合致していることが示された。
【００１５】
実施例３
実施例１で得られたブルクホルデリア  エスピー  ＭＢ−１１株をＡＣＳ液体培地（ｐＨ４．５）に接種し、３０℃で７２時間培養した。培養後、遠心により菌体を除去した上清に２０ｍＭのクエン酸を添加し、ｐＨを５．８に調整した。本粗酵素液を、予め２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したDEAE‐Sepharose CL‐6B(ファルマシア社製、カラム径１．８ｃｍ×長さ２３．５ｃｍ）に添加し、０−０．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた（図10）。プロテアーゼ活性の高い画分を分取し、コロジオンバック(Sartorius社製)によって濃縮した。濃縮液を、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したSephadex G‐75(ファルマシア社製、カラム径３．３ｃｍ×長さ７１ｃｍ）に添加し、同一の緩衝液により溶出した。活性画分を分取し、コロジオンバック(Sartorius社製)によって濃縮した。濃縮液を予め同じ緩衝液で平衡化したBio‐Gel P‐100（バイオ ラッド社製、カラム径１．７ｃｍ×長さ８１ｃｍ）に添加し、同一の緩衝液により溶出し活性画分を分取した(図11)。以上の操作により、電気泳動的に単一のバンドを示す酵素標品を得た(図５)。この結果、本酵素は約９倍まで精製された。精製の各段階を（図12)の精製表にまとめた。この中で注目されるのは、ＡＣＳ培地を培養基として得られた粗酵素液の比活性は、１４７（Ｕ／ｍｇ）と極めて高い値を示しており、この培地が本酵素の生産に適した培地であるという点である。このため本培地の使用は、本酵素の精製を比較的容易に行うことを可能にした。
プロテインシークエンサー（Applied Biocystems 477A）により本酵素のアミノ酸配列を決定した結果、本酵素は次のＮ末端フラグメントおよび中間部フラグメントを含むタンパク質であることが分かった。また酵素学性質は図13の通りであった。
【００１６】
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【００１７】
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【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、低pH域でも高性能のタンパク質分解能をもち、直接的ではないにしろアンモニアを生じせしめて、コンポストの低pH環境を改善することができる、酵素並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当該微生物を用いたカルボキシルプロテアーゼの製造法が提供される。
【００１９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の作用pH 及び 最適pHを示す図である。
【図２】本発明の酵素のpH安定性を示す図である。
【図３】本発明の酵素の作用温度 及び 最適温度を示す図である。
【図４】本発明の酵素の温度安定性を示す図である。
【図５】本発明の酵素のSDS‐PAGEおよび分子量の算出を示す図である。
【図６】本発明の酵素に与える阻害剤の影響を示す図である。
【図７】本発明の微生物の生育を示す図である。
【図８】本発明の微生物の産出する酵素のプロテアーゼ活性を示す図である。
【図９】本発明の微生物の培地に与えるpH調整能を示す図である。
【図１０】本発明の酵素の精製過程（DEAE‐Sepharose CL‐6Bによるイオン交換クロマトグラム）を示す図である。
【図１１】本発明の酵素の精製過程（Sephadex G‐75によるゲル濾過クロマトグラム）を示す図である。
【図１２】本発明の酵素の一連の精製過程をまとめた図である。
【図１３】本発明の酵素の酵素学的性質（他の微生物起源のカルボキシルプロテアーゼとの比較）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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