(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス毒素または破傷風毒素についてのアッセイであって以下の工程：
(a)テスト化合物を、基質および抗体と結合させる工程、ここで、
（ｉ）該基質は該アッセイの固相成分に付着しており、該基質は、配列番号８−１１に示される、VAMP、SNAP-25およびシンタキシンから選択される完全なペプチドまたはそのフラグメントから選択され、該毒素に対する切断部位を有し、毒素により切断される場合に生産物を形成するものであり；
(ii)該抗体は該生産物には結合するが、該基質には結合しない、
工程；
および、
(b)該生産物に結合した抗体の存在をテストする工程、ここで該生産物は固相アッセイ成分に付着する、工程、を包含する、アッセイ。
【請求項２】
前記毒素が、ボツリヌス毒素である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
以下のアッセイ成分(a)および(b)を利用する、請求項１〜２のいずれかに記載のアッセイであって：
(a)固相に連結されたペプチド、ここで該ペプチドは切断生産物を生じるために前記毒素により切断され得、
(b)該切断生産物には結合するが該ペプチドには結合しない抗体、そしてここで該アッセイは以下の工程：
(i)該毒素を含み得るまたは該毒素から構成され得るテスト化合物を、アッセイ混合物を形成するために該固相ペプチドと結合させる工程、
(ii)該アッセイ混合物を該抗体と連続してまたは同時に結合させる工程、および
(iii)該抗体と該切断生産物との間に任意のコンジュゲートが形成されているかどうかを連続してまたは同時に決定する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項４】
請求項３に記載のアッセイであって、ここで前記工程(i)が亜鉛化合物の存在下で行われる、アッセイ。
【請求項５】
請求項１に記載のアッセイであって、以下の工程：
(i)前記テスト化合物をVAMP、SNAP-25、シンタキシン、およびそのフラグメントから選択されるペプチドを含有する固相と結合させる工程、
(ii)該固相から該テスト化合物を洗浄する工程、
(iii)該固相と、毒素により切断されたペプチドと選択的に結合するように適合された抗体とを結合させる工程、
(iv)該抗体と切断されたペプチドとのコンジュゲートを検出する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイであって、ここで前記抗体が、配列番号1〜7から選択されるペプチドに選択的に結合するように適合される、アッセイ。
【請求項７】
請求項１に記載のアッセイであって、以下の工程：
(i)固定化ペプチドを含有するアッセイプレートにテスト溶液を加える工程であって、該ペプチドはVAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラグメントから選択される、工程、
(ii)該アッセイプレートをインキュベートする工程、
(iii)該プレートを緩衝液で洗浄する工程、
(iv)抗体溶液を該プレートに加える工程であって、該溶液は、(1)C-末端が配列番号1、3、および5から選択されるペプチド、ならびに(2)N-末端が配列番号2、4、および6から選択されるペプチド、から選択されるペプチドに選択的に結合するように適合される抗体を含有する、工程、
(v)該アッセイプレートをインキュベートする工程、
(vi)該プレートを緩衝液で洗浄する工程、
(vii)該アッセイプレート上の抗体の存在を測定する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項８】
請求項７に記載のアッセイであって、ここで前記抗体は酵素に連結され、そして前記プレート上の抗体の存在が、酵素基質を加えることおよび該基質の検出可能な生産物への転換を測定することにより測定される、アッセイ。
【請求項９】
請求項８に記載のアッセイであって、前記検出可能な生産物が発色し、そして選択された波長での吸光度により測定される、アッセイ。
【請求項１０】
前記テスト化合物中に存在する不活性毒素を活性毒素に転換する工程を包含する、請求項１〜９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１１】
プロテアーゼを前記テスト化合物に加える工程を包含する、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記一次抗体に特異的なおよび酵素に連結されたさらなる抗体を用いて抗体-ペプチドコンジュゲートを検出する工程を包含する、請求項１〜１１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１３】
VAMP、SNAP-25、およびシンタキシンから選択されるペプチドには結合しないが、配列番号1〜7から選択されるペプチドの１つの前記毒素による切断生産物に結合することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載のアッセイにおいて使用するための抗体。
【請求項１４】
以下の式の抗原に結合するように適合される、請求項１３に記載の抗体であって：
P-Q-X
ここで、Xは配列番号1〜7から選択されるペプチドであり、P-Qに一端で共有結合される、ならびにここで、P-Qは、Pがキャリアタンパク質であり、Qがアミノ酸またはペプチドXをキャリアPに付着するように適合されるアミノ酸配列であるキャリアである、抗体。
【請求項１５】
毒素アッセイキットであって、(1)固相に固定化された、配列番号８−１１に示される、VAMP、SNAP-25、シンタキシンまたはそれらのフラグメントから選択されるペプチド、(2)(a)酵素に連結されるかまたは酵素を含む請求項１３〜１４のいずれかに記載の抗体、あるいは(b)請求項１３〜１４のいずれかに記載の一次抗体、および該一次抗体に結合するように適合され、そして酵素に連結されるかまたは酵素を含む二次抗体、ならびに(3)該酵素の基質、を含む、毒素アッセイキット。
【請求項１６】
請求項１５に記載の毒素アッセイキットであって、前記固相がアッセイプレート、アッセイウェル、ニトロセルロースメンブレン、ビーズ、ディップスティック、および溶出カラムの成分から選択される、毒素アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
本発明はペプチダーゼ活性を有する毒素、特にボツリヌス神経毒素および破傷風毒素のアッセイに関する。本発明はまた、アッセイにおいて有用な抗体およびアッセイにおいて有用な固相ペプチドに関する。
ボツリヌス神経毒素は、構造的に類似するが抗原的に異なるタンパク質神経毒素ファミリーであり、末梢神経系において作用し、神経筋伝達をブロックする。これらの神経毒はマイクログラムのオーダーのヒトの致死量できわめて強力であり、希ではあるがしばしば致死の疾患、ボツリヌス中毒に進展する。ボツリヌス神経毒についてのアッセイは現在、食品産業および薬品産業の両方において用いられている。食品産業はボツリヌス神経毒についてのアッセイを用いて新しい食品パッケージの方法が適切であることを確認し、食品の安全性を保証する。ボツリヌス毒素の臨床用途が増加するのに伴い、薬品産業は生産物処方および品質管理の両方のためにこれらの毒素についての正確なアッセイを必要とする。
マウス致死テストを用いる食糧中ボツリヌス毒素についてのアッセイが知られている。過去10年にわたって、多くのイムノアッセイ法が多くの場合に適用されているマウステストの代わりにすることを目的として開発されてきたが、このマウステストが長年にわたり産業標準であった。
そのようなアッセイの１つで、サンプル中に存在する毒素に結合する抗体が付着したプレートまたはカラムへテストサンプルを添加することにより操作が行われる。さらなる抗体は、代表的には、結合した毒素を検出するために用いられる。これらの酵素連結イムノアッセイ（ELISA）は、１つのボツリヌス毒素タイプに特異的であり、２時間未満で迅速に行われ得る利点を有する。しかし、ELISAはいくつかの欠点を有する：
(a)  毒素の生物活性を測定しない、
(b)  活性毒素と不活性毒素との間の区別ができない、および
(c)  抗原多様性のため、いくつかの毒素はこれらのアッセイにより検出されず、それゆえに偽陰性を与える。
ボツリヌス神経毒は、その軽サブユニット内に高特異性亜鉛-エンドペプチダーゼ活性を有することが最近示された。神経毒タイプによって、これらは神経伝達物質の放出物に含まれる小タンパク質を神経細胞内で切断するように作用する。ボツリヌスタイプAおよびE毒素はタンパク質SNAP-25を切断する。ボツリヌスタイプB、D、F、およびG、ならびに破傷風毒素は、小胞関連膜タンパク質（VAMP；シナプトブレビン（synaptobrevin）ともいう）を切断する。ボツリヌスタイプC毒素は、タンパク質シンタキシン（syntaxin）を切断する。
さらなる毒素アッセイの開発において、種々の手法がエンドペプチダーゼ活性の評価を目的として工夫された。液体クロマトグラフィ手法が公知であり、これらは、ペプチド生産物の分析およびそれに続く評価に基づく。これらの手法は時間がかかり、高価であり、そして自動化には容易には適さない。分光光度法を用いることも公知であり、これらには適切な発色ペプチド試薬の開発が必要である。このような方法はエンドペプチダーゼについての連続的で正確なアッセイを提供する。しかし、分光光度法は酵素の比較的純粋な調製物が必要であり、粗製のまたは粒状のサンプルでのエンドペプチダーゼ活性の評価には通常適切ではない。
これらの努力にもかかわらず、現在、ボツリヌス神経毒の生物活性についての唯一の便利なアッセイであること、そしてFDAが認可した唯一のアッセイであることが、マウス致死テストを残している。このテストは多くの欠点を有する：
(a)  高価であり、多くの実験動物を用いる、
(b)  特異的な抗血清を用いる毒素中和テストと並行して行なわないと非特異的である、および
(c)  大量の動物群を用いることなしではあまり正確ではない。
本発明は、新規の試薬を用いる、毒素に対する新規のアッセイ系を記載する。このアッセイは、これらの毒素についての現在のインビトロアッセイの多くの欠点を克服するまたは少なくとも軽減することを目的とする。
従って、本発明の最初の局面は次の工程を含む毒素アッセイを提供する：
(a)  テスト化合物を、(i)毒素に対する切断部位を有する基質、および(ii)切断基質には結合するが非切断基質には結合しない抗体と、結合させる工程、および
(b)  該切断基質に結合した抗体の存在についてテストする工程。
これは、このアッセイが活性毒素と不活性毒素とを区別し得る（不活性毒素は低減した活性を有するかまたは活性を有さないため）という利点を有する。また、同群の毒素間の抗原多様性はアッセイの操作にあまり影響しない。なぜなら測定されるのは毒素活性（基質を切断する能力）であり、毒素の正確な抗原構造ではないためである。
本発明の実施態様の利用において、テスト化合物に存在する毒素による基質の切断は、アッセイ抗体に認識されて結合される生産物を生じ、この抗体は非切断基質には結合しない。毒素は２つの生産物（１つは抗体に結合する）を生じるような単一の位置で基質を切断することが好ましい。
本発明の他の実施態様では、基質は毒素に対する切断部位を含むペプチドまたはタンパク質であり、基質の切断はN-およびC末端を有する新たなペプチドを生じる。抗体はこれらの新たに形成されたペプチドの１つに結合する。本発明の特定のアッセイは、ボツリヌス毒素または破傷風毒素のアッセイについてであり、これらの毒素のうち１つの何らかの量がテスト化合物に存在するのかどうかを測定する。この特定のアッセイにおいて、本発明の基質はボツリヌス毒素または破傷風毒素のエンドペプチダーゼ活性により切断されるペプチドまたはタンパク質である。このアッセイの利点は、該アッセイが活性毒素と非活性毒素とを区別することである。なぜなら、該アッセイは、サンプル中に存在するペプチダーゼ活性を測定するためである。
本発明のアッセイのさらなる実施態様は次を含む：
(i)  VAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラグメントから選択されるペプチドを含む固相と、テスト化合物とを結合させる工程、
(ii)  固相からテスト化合物を洗浄する工程、
(iii)  該固相と、毒素により切断されたペプチドに選択的に結合するのに適合する抗体とを結合させる工程、および
(iv)  該抗体と、切断されたペプチドとのコンジュゲートを検出する工程。
好ましくは、該抗体は配列番号1-7から選択されるペプチドに選択的に結合するのに適合する。
本アッセイの他の実施態様は次を含む：
(i)  固定化したペプチドを含むアッセイプレートにテスト溶液を添加する工程であって、該ペプチドがVAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラグメントから選択される、工程、
(ii)  該アッセイプレートをインキュベートする工程、
(iii)該プレートを緩衝液で洗浄する工程、
(iv)  抗体溶液を該プレートに加える工程であって、該溶液が、(1)そのC末端が配列番号1、3、および5から選択されるペプチドならびに(2)そのN末端が配列番号2、4、および6から選択されるペプチドから選択されるペプチドに選択的に結合するのに適合する抗体を含む、工程、
(v)  アッセイプレートをインキュベートする工程、
(vi)  プレートを緩衝液で洗浄する工程、ならびに
(vii)  アッセイプレート上の抗体の存在を測定する工程。
(ii)および(v)の工程において、適切なインキュベートの期間は35-39℃で20分から３時間である。
使用に際しては、抗体は酵素に結合され得、プレート上の抗体は、基質を加え、そして検出可能な（例えば有色の）生産物への転換を観察することにより測定され得る。
本発明のアッセイが調査中の化合物中の活性毒素を検出することは、すでに記載した。いくつかの毒素、とりわけボツリヌス毒素は不活性構造でも存在し、それ自体はアッセイにより同定されない。本アッセイのさらなる実施態様は、不活性毒素を活性毒素に転換するテスト化合物の前処理を含む。これは例えばトリプシンのようなプロテアーゼにより達成される。
アッセイにおいては、固相に付着した基質を用いることがさらに好ましい。例えば、アッセイの固相へ共有結合している（例えば、末端システイン残基を介して共有結合されている）基質を用いることが好ましい。
このように本発明のアッセイ手法は代表的には、ボツリヌス神経毒素および破傷風毒素のような多くの特定の毒素に適用し得る固相マイクロタイターベースのアッセイを示す。分光光度アッセイに比較して、本発明の手法は容易に自動化され得、毒素エンドペプチダーゼの非常に粗製のまたは粒状の調製物にも適用し得る。この手法はまた比較的高価ではなく、使用しやすい。
切断基質に結合した抗体の検出については、抗体がマーカー分子または酵素に連結されることは随意である。一例では、マーカーは従来の、そして周知の技法を用いて検出され得る西洋ワサビペルオキシダーゼである。
本発明の詳細な実施態様では、ボツリヌス毒素用の合成ペプチド基質（毒素の標的である細胞内タンパク質の配列に由来する）を調製し、アッセイ系（次の手法による）における固相エンドペプチダーゼ基質成分として用いる：
工程１−ボツリヌス毒素を含むテスト溶液を固相エンドペプチダーゼ基質とインキュベートする。その結果、毒素タイプに依存する配列の特定のポイントでのペプチドの切断を生じる（これは図１に例示する）。
工程２−抗ペプチド抗体試薬とインキュベートする。この抗体試薬は、固相ペプチドの新たに切断されたNまたはC末端の１つに特異的であり、完全なペプチドを認識しない。抗体試薬はペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素マーカーに共有結合される。新たに切断されたペプチドのN末端に対しておよびC末端に対してそれぞれ結合する２つの異なる抗体を存在させることがさらに随意である。
工程３−酵素マーカー用の基質とのインキュベーション、または一般に入手可能な技法によるさらなる増幅。
この後者の実施態様のアッセイは２つの主要な成分を有することが見られる。
第一の成分は、アッセイされる毒素エンドペプチダーゼにより切断されたタンパク質またはペプチドを含み、あるいは該タンパク質またはペプチドから構成される、エンドペプチダーゼ基質成分である。これは代表的には、アッセイの固相成分へ取り込まれる。
エンドペプチダーゼ基質成分は、例えばエンドペプチダーゼのタンパク質標的（例えば、シンタキシン、VAMP、またはSNAP-25）または毒素エンドペプチダーゼにより切断されるこれらのタンパク質のフラグメントであり得る。あるいは、このエンドペプチダーゼ基質成分は、他のタンパク質に連結した上記のものを含む融合タンパク質であり得る。
固相は、エンドペプチダーゼ基質成分を固定化するために用いられ得るELISAプレート、ビーズ、ディップスティック、または他のマトリックスであり得る。固相成分はまた、ニトロセルロースメンブレンまたはウエスタンブロッティング技法で用いられるような同等物であり得る。
第二の成分は抗体成分であり、これは毒素エンドペプチダーゼによるエンドペプチダーゼ基質成分の切断後に得られた、新たに生じたN末端ペプチドまたは新たに生じたC末端ペプチドのいずれかの配列を示す短ポリペプチド（代表的には、6−8アミノ酸残基長）に対して惹起された抗体である。この抗体は、エンドペプチダーゼ基質成分を認識しないが、代わりに切断されたペプチド生産物のみを認識するという特性を有する。
この抗体は酵素、あるいは放射活性または蛍光マーカーに連結され得る。あるいは、この抗体は遊離のタンパク質およびアッセイ手法で用いられる二次抗体であり得る。抗体はさらにメークアップ（make up）におけるポリクローナルまたはモノクローナル、抗体フラグメント、あるいは他のタンパク質に融合または連結された抗体または抗体フラグメントであり得る。
本発明の第二の局面では、次の特性により特徴付けられた第一の局面のアッセイで用られる抗体が提供される：
(a)  抗体は毒素エンドペプチダーゼによる基質の切断生産物であるペプチドに結合する、および
(b)  抗体は非切断基質には結合しない。
第二の局面の実施態様では、抗体は基質には結合せず、キャリア分子に共有結合または他の方法で結合する。基質は、本発明の第一の局面に従って毒素により切断可能であるペプチド、さらに好ましくは神経細胞ペプチドが好ましい。このペプチドは好ましくは、シンタキシン、VAMP、およびSNAP-25から選択される。
ペプチド基質は、限られた数の切断生産物を生じるように限られた数の位置で、そして好ましくは２ヶ所、またはより好ましくは１ヶ所の位置で毒素エンドペプチダーゼにより切断されること、ならびにこの抗体はこれらの生産物の１つに選択的に結合することがさらに好ましい。
本発明の好ましい実施態様では、抗体は次のペプチド配列の１つを認識する：
0004246259.tif 000002
さらに、好ましい抗体は、次の場合には、上記の配列1−7のうちの１つを認識しない。つまり、その配列が完全な非切断ペプチドの一部であり、そしてその配列が上記に示される遊離のNまたはC末端を含まない場合には、認識しない。
本発明の第二の局面に従い毒素アッセイに用いられる抗体は、例えば次の手法により調製される：
−毒素により切断され、切断生産物を生じるペプチドを同定する工程、
−動物、例えばウサギを該切断生産物で免疫する工程、
−その動物由来の切断生産物に対する抗体を単離する工程、および
−抗体が該ペプチドに交差反応しないことをチェックする工程。
本発明の他の局面は、抗体（毒素アッセイに用いるための抗体）を得る方法であり、該方法は、毒素により切断されて切断生産物となる高分子を同定する工程、切断生産物の１つに対して動物を免疫する工程、上記切断生産物の１つに対して結合する抗体を単離する工程、および抗体が該高分子と交差反応しないことをチェックする工程を包含する。この方法の実施態様は次を含む：
(i)  毒素により切断される高分子を同定し、それにより少なくとも第一および第二の切断生産物を形成する工程、
(ii)  切断生産物の選択された１つで動物を免疫する工程、
(iii)  選択された切断生産物に結合する抗体を動物から単離する工程、および、
(iv)  該抗体が該高分子に結合しないことをチェックする工程。
この高分子は好ましくはペプチドまたはタンパク質である。このペプチドまたはタンパク質は２つのフラグメントに切断されることが特に好ましい。
この方法は、驚くべき有利な特性（特に、毒素についてのアッセイを行うための）を有する抗体の産生を可能にする。重要な特性は短くなった切断生産物に対する結合アフィニティであり、このことにより完全な非切断高分子に対するいかなる重要なアフィニティによっても汚染されることなくこの生産物に結合し得る。
他の実施態様では、この方法は次を含む：
(i)  毒素により切断され、それにより少なくとも第一のおよび第二の切断生産物を形成するペプチドまたはタンパク質を同定する工程、
(ii)  (1)第一の切断生産物の末端フラグメント、(2)第一の切断生産物の合成フラグメント、(3)(1)のアナログ、および(4)(1)-(3)のいずれかに連結するキャリア分子、から選択される抗原で動物を免疫する工程、
(iii)  該第一の切断生産物に結合する抗体を該動物から単離する工程。
多くのキャリア分子は当該技術分野で公知であり、好ましいキャリアはキーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、およびオボアルブミンを含む。
さらなる局面では、本発明は毒素アッセイの固相に付着したペプチド基質である毒素アッセイ成分を提供し、そのペプチド基質は毒素エンドペプチダーゼによる切断の標的となる。好ましくは、このペプチドは完全なペプチドおよび次のもののフラグメントから選択される：
１．VAMP、
２．SNAP-25、
３．シンタギシン。
このアッセイで用いるための特に好ましい標的ペプチド配列は、下記に例示した配列番号8-11から選択される。
0004246259.tif 000003
本発明のさらに好ましいペプチドは、配列番号1−7から選択される配列を含むペプチドである。
本アッセイの固相ペプチドは安定であり、そして便利で有効な毒素アッセイを提供するテストキットに取り込むのに適切である。
本発明のアッセイはまた、本発明の第二の局面による抗体を含む固相を用いて行われ得ることは当業者である読者により認識される。この手順で、このアッセイは毒素を含み得るテスト化合物と毒素基質とを結合することにより行い得る。次いでこの混合物は固相抗体と結合し、その後、固相抗体に結合した切断ペプチドの存在が検出される。本発明の実施態様では、抗体に結合した切断ペプチドは放射標識ペプチドまたはさらなるペプチド特異的抗体を用いて検出される。従って、本発明の第四の局面は毒素アッセイで用いる固相抗体を提供し、該抗体は本発明の第二の局面による結合特性を有する。
従って本発明のアッセイ手法は、種々の特性を包含する：
(i)ポリペプチド配列（例えばXXXXN）に対する抗体の産生。このポリペプチド配列は、アミノ酸Nが遊離である場合にのみ認識され、同じ配列が長いペプチド（例えば、XXXXNXXXX）を構成する場合は認識されない。長いペプチドに反応性を示さない適切な抗体が惹起され得ることは驚くべきことである。
(ii)  毒素エンドペプチダーゼについての迅速な固相アッセイにおける、そのような抗体の特性の利用。ボツリヌスまたは破傷風神経毒素アッセイの例では、生産物はこれらの毒素の亜鉛-エンドペプチダーゼ活性を利用する。
(iii)  固相アッセイ成分として、神経細胞ペプチドのような毒素標的分子を用いるアッセイ。
(iv)  固相アッセイ成分として(i)に記載された抗体を用いるアッセイ。
本発明の特性は、切断ペプチドを検出するために用いる抗体が非切断ペプチドに結合しないことである；明らかに、このような結合は擬陽性を生じ、アッセイの正確さをそこなうためである。抗体が完全なペプチドと交差反応しないことを決定する便利な手段は、２つのプレートを用いて抗体をスクリーニングすることである。第一のプレートは固相に付着した完全なペプチドを含む。第二のプレートは固相に付着した切断ペプチドを含み、切断ペプチドの遊離末端は、例えば配列番号1−7またはアッセイ抗体により認識される他の配列である。
スクリーニング中の抗体を両方のプレートに添加し、一定期間インキュベートし、次いでプレートを洗浄し、続いて結合抗体の存在についてテストする。適切な抗体（すなわち交差反応しない抗体）は、第二プレート上に大きなシグナルを生じ（これは、結合抗体の存在を示す）、第一プレート上に弱いシグナルを生じる（好ましくは実質的にシグナルを生じない）。
多くの潜在アッセイ抗体がテストされる場合には、切断ペプチドについて、完全なペプチドよりも高い選択性をもって抗体が選択されるように、シグナル（第二プレートの結果）とノイズ（第一プレートの結果）との比率を比較することが直接的である。本発明の実施態様では、この比率は少なくとも10:1であり、好ましくは少なくとも20:1、そしてより好ましくは少なくとも50:1である。特に好ましい比率は100:1またはそれより高く、これは完全なペプチドに対するアフィニティより少なくとも２オーダー程度大きい切断ペプチドに対するアフィニティを反映する。
本発明は、毒素（例えばボツリヌス神経毒、破傷風毒素）の生物活性を従来のELISA系の感度に比較し得る感度で測定するアッセイを提供する点で有利である。発明者は、アッセイがボツリヌスAおよびB毒素の場合には、１mlあたり１ngより少ない毒素を検出し得ることを観察した。多くの作業者に、毒素の正確な定量が危険評価における使用に非常にのぞまれている。また偽陰性は、アッセイが毒素エンドペプチダーゼ活性の直接測定であるため、起こらないようである。発明者の観察によれば、血清および他のサンプルにおけるアッセイのノイズレベルが従来のイムノアッセイ系において得られ得るノイズレベルより有意に低い。発明者は現在まで、ボツリヌスB毒素についてのアッセイで偽陰性または擬陽性を有さず、そしてノイズレベルは血清を含む毒素サンプルにおいて、従来のELISAで得られ得るノイズレベルより低かった。さらに、ペプチド固相アッセイ成分は非常に長い保存期間において安定である。
記載された本発明のアッセイおよびアッセイ成分は毒素に対して特に高感度であり、毒素について、ELISAに比較し得る感度および改善された感度を有すると発明者により見い出された。本発明のさらなる利点は、さらなる特異的抗体がアッセイでの使用のために同定された場合、より高感度になる可能性を有することである。この状況をELISAのそれと比較すると、これは毒素に対する抗体のアフィニティに依存する。高アフィニティ抗体を単離する広範な仕事により、このアフィニティはすでに至適であるため、ELISAの感度においてはほとんど増加は期待されない。
次に続く図によって例示された本発明の多くの実施例がある：
図１は、ボツリヌス毒素アッセイの模式図を示す；
図２−４は、実施例１のボツリヌス毒素アッセイを用いて達成した結果を示す；
図５−６は、実施例１のボツリヌス毒素アッセイがさらに改良され、シグナル増幅および実施例２に記載された毒素活性化手法によりさらに高感度になる結果を示す；
ならびに
図７は、実施例４のボツリヌス毒素アッセイを用いて達成された結果を示す。
実施例１．ボツリヌスタイプB神経毒（BoNT/B）についてのアッセイ。
ボツリヌスタイプBアッセイ用に、VAMPイソ体-1の配列を示すペプチド、60-94残基（配列番号９、C-末端システイン残基付）を用いた：
0004246259.tif 000004
マイクロタイターアッセイプレートを次のように調製した：上記のペプチドを、1mM EDTAを含有する0.05M リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5中10μgml-1の最終濃度に希釈し、Sulphydryl Binding Plate（Coster）に加えた（100μ/ウェル）。１時間、室温でインキュベートした後、ペプチド溶液を除去し、そしてプレートを３回リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）pH7.4で洗浄した（洗浄のこの段階では界面活性剤は使用しない）。次いでプレートのあらゆる残存結合部位を0.1% Tween 20および5%ウシ胎児血清を含有するPBS緩衝液の添加（100μl/ウェル）によりブロックした。次いで、プレートを１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートし、その後ブロッキング溶液を除去した。
Clostridium botulinum タイプB神経毒のアッセイ：毒素溶液を10mMジチオトレイトール（または、毒素のエンドペプチダーゼ活性に対して還元状態を提供するための同等の試薬）を含むアッセイ緩衝液（例えば、10μM ZnCl2および1%ウシ胎児血清を含有する0.05M Hepes緩衝液、pH7.4）で希釈し、ペプチドコートマイクロタイタープレートに加えた（100μl/ウェル）。次いでプレートを１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートする。図１に記載のようにBoNT/Bがペプチドを切断するこの期間の後、プレートを、３回、0.1% Tween 20を含有するPBSで洗浄した。
次いで、新たに切断されたペプチドに特異的な抗体を加えた。アッセイのこの実施例では、抗体は以下のVAMP（配列番号１、C-末端システイン付）の切断配列に特異的である：
0004246259.tif 000005
抗体（0.1% Tween 20および5%ウシ胎児血清を含むPBS緩衝液で希釈）を加え（100μl/ウェル）、１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートする。次いで、プレートを、３回、0.1% Tween 20を含有するPBSで洗浄した。
抗体がペルオキシダーゼに結合される場合、適切なペルオキシダーゼ基質がこの段階で加えられ、発色し、アッセイの結果を提供する。
別の方法では抗体は遊離型であり、この場合市販の二次抗体の添加が必要である。例えば、抗ペプチド抗体がモルモットにおいて惹起される場合、二次抗体は抗モルモットペルオキシダーゼコンジュゲートである。二次抗体コンジュゲート（0.1% Tween 20および5%ウシ胎児血清を含有するPBS緩衝液で希釈した）を添加し（100μl/ウェル）、１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートする。二次抗体を洗い流した後（0.1% Tween 20を含有するPBSで、３回）、適切なペルオキシダーゼ基質がこの段階で添加され得、発色され得、アッセイの結果を提供し得る。
図２は、上記の２つの抗体検出系を用いるBoNT/Bの代表的なアッセイの結果を例示する。データは、アッセイにおける２つの異なるVAMPペプチドの固相ペプチドとしての使用を例示する。BoNT/Bの切断部位付近のこれらのペプチドの配列は２つのヒトVAMPのイソ体を示す。
0004246259.tif 000006
データは、バックグラウンドをこえる0.3吸光単位の任意のカットオフ点で、これらのアッセイにおけるBoNT/Bの検出感度が、固相としてVAMP-1ペプチドを用いて約1ng/ml、固相としてVAMP-2ペプチドを用いて5ng/mlであったことを示す。
図３は、BoNT/Bについてのアッセイ系の特性を例示する。(1)BoNT/F、(2)破傷風毒素、および(3)BoNT/BプラスEDTAについて、ゼロ吸光度を記録した。これらのデータは、BoNT/Bを検出するために設計されたアッセイが、密接に関連するボツリヌスタイプFおよび破傷風毒素の存在下で擬陽性の結果を与えないことを示す。このデータはまた、EDTA（これは金属イオンキレート剤である）の存在下でBoNT/Bで行ったアッセイにおいてシグナルが得られなかったことを示す。後者の結果は、アッセイが、BoNT/Bの亜鉛-メタロプロテアーゼ活性に依存することを例示する。
図４は、単一の抗体（すなわち、抗ペプチド抗体を直接ペルオキシダーゼに結合させる）および２重抗体（すなわち、遊離の抗ペプチド抗体を抗種ペルオキシダーゼコンジュゲートと結合させて用いる）検出系の両方を用いる、BoNT/Bによる固相ペプチド切断のアッセイ動力学を例示する。BoNT/Bの濃度を、100ng/mlに固定して、アッセイシグナルを種々の時間で測定した。データは、２重抗体アッセイ系がより迅速で好感度な、BoNT/Bによる固相ペプチド切断を測定する手段を提供することを示す。
実施例２．ボツリヌス神経毒についてのアッセイの増幅および増強
実施例１に記載のようなボツリヌス毒素についてのアッセイを、より高感度を提供するために、さらに増強し得る多くの方法がある：
(a)  ELASTTM（Dupont）系のような市販の増幅系を用いるアッセイシグナルの更なる増幅。
(b)  アッセイ前の神経毒の限定されるトリプシン処理。全てのボツリヌス神経毒は、細菌において一本鎖ポリペプチドとして産生され、これは次いで活性な２本鎖型の毒素を与える特異的な細菌プロテアーゼにより続いて活性化される。いくつかの場合では、特にボツリヌス神経毒タイプBおよびEの場合、毒素は十分には活性化されず、そして不活性神経毒を100%まで含み得る。これらの不活性な１本鎖型の毒素は、毒素のエンドペプチダーゼ活性を弱く発現するかまたは全く発現しない。ボツリヌス神経毒の限定されるトリプシン処理は、１本鎖毒素型を２本鎖の活性毒素型に転換する。従って、１本鎖毒素の一部を含むボツリヌス神経毒タイプでは、トリプシン処理の結果、神経毒のエンドペプチダーゼ活性および特異的毒性における両方の増加を生じる。
図５は、ELAST系のような増幅系が、実施例１に記載のような代表的なアッセイに適用される場合、BoNT/Bについてのアッセイの感度における増加を例示する。このデータは、バックグラウンドを超える0.3吸光単位の任意のカットオフ点での非増幅アッセイにおけるBoNT/Bの検出感度が、約1ng/mlであり、一方増幅アッセイ系における感度は0.1ng/mlに近い感度を与え、ほぼ10倍高かったことを示す。
この結果は、本発明のアッセイが、改良された感度を提供するために市販の増幅系と組み合わせて容易に用いられ得ることを示す。
図６は、神経毒アッセイの感度におけるBoNT/Bの限定されるトリプシン処理の効果を例示する。BoNT/Bサンプル（1mg/ml）をトリプシン（2.5μg/mlの終濃度）で、30分間、37℃で処理し、反応を5〜10モル過剰のトリプシンインヒビターを用いて停止させた。図６は、増幅型および非増幅型のアッセイの両方について（図を参照のこと）、トリプシン処理の効果が、BoNT/Bについてのアッセイ系の感度を増加したことを示す。
BoNT/Bについてのアッセイのための別の戦略は、固相ペプチド基質と切断配列に対する特異的抗体との異なる組合せを用いて行われる。本アッセイのこの局面では、固相VAMPペプチドはN-末端システイン残基（配列番号９、N-末端システイン付）により付着される：
0004246259.tif 000007
本発明のこの実施態様における切断配列に対する特異的抗体は、以下の切断されたVAMPに対して惹起される：
0004246259.tif 000008
実施例３．破傷風毒素についてのアッセイ
破傷風毒素はタンパク質VAMPをBoNT/Bのそれと同じ部位で切断する。しかし２つの毒素のエンドペプチダーゼ活性の特異性は、切断に必要な最小限のペプチド基質サイズにおいて異なる。BoNT/Bは、至適な切断のために30〜35残基長のペプチド基質を必要とするが、破傷風毒素については、50残基長を超えるペプチド基質が必要である。
従って、破傷風毒素切断アッセイは、固相ペプチドがヒトVAMP-1、イソ体-1、33〜94残基（配列番号８）のペプチドであること以外は、BoNT/Bについての方法と同一の方法で行われる。BoNT/Bについて記載された本発明の実施例は、破傷風毒素に対して、等しく適用可能である。
実施例４．ボツリヌスタイプA毒素（BoNT/A）についてのアッセイ
ボツリヌスタイプA神経毒アッセイについて、マイクロタイタープレートを、タンパク質SNAP-25（アミノ酸137〜206）から得られた配列を示す以下のペプチドでコートする（10μl/ml）。
0004246259.tif 000009
毒素テスト溶液を、10μM ZnCl2を含有する0.05M HEPES pH7.2で緩衝化し、次いで10mM 2-メルカプトエタノールを加え、そしてプレートを37℃で１時間インキュベートする。
次いで、洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗ペプチド抗体とインキュベートする。抗体は、以下のSNAP-25の切断配列のいずれかに特異的である：
0004246259.tif 000010
インキュベーション後、過剰のペプチドを洗浄により取り除き、次いでペルオキシダーゼ基質を加えて発色させる。
図７は、BoNT/Aについての代表的なアッセイの結果を示す。このアッセイ系では、固相ペプチドは上記のSNAP-25（137〜206）であり、SNAP-25の切断配列に特異的な抗血清と組み合わせて用いた：
0004246259.tif 000011
アッセイプロトコルは、実施例１でBoNT/Bについて記載されたようである。アッセイは約1ng/mlの濃度でBoNT/Aを検出した（バックグラウンドをこえる0.3単位の任意の吸光度カットオフ点を用いる）。
実施例１に記載された増幅系はまた、BoNT/Aについてのアッセイにも適用され得る。
実施例５．ボツリヌスタイプE毒素のアッセイ
ボツリヌスタイプE神経毒アッセイについて、マイクロタイタープレートを、タンパク質SNAP-25（アミノ酸137〜206）から得られた配列を示す以下のペプチドでコートする（10μg/ml）。
0004246259.tif 000012
次いで、10μM ZnCl2および10mM 2-メルカプトエタノールを含有する0.05M HEPES pH7.2で緩衝化した毒素テスト溶液を加え、そしてプレートを37℃で１時間インキュベートした。
次いで洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ペプチド抗体とインキュベートする。抗体は以下のSNAP-25の切断配列のいずれかに特異的である：
0004246259.tif 000013
インキュベーション後、過剰のペプチドを洗浄により取り除き、次いでペルオキシダーゼ基質を加えて発色させる。
実施例６．マイクロタイタープレートおよび他のアッセイ固相の調製および使用
マイクロタイタープレートまたはディプスティックを、多くの異なる方法により調製する：
(a)  マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝化生理食塩水pH7.4（または水）中10または20μg/mlの濃度で、「エンドペプチダーゼペプチド基質」でコートし（100μl/ウェル）、４℃で一晩インキュベートする。
(b)  「エンドペプチダーゼペプチド基質」を、１方の端でシステイン残基を有するように生成させる。システイン残基が付加されるペプチドの端は、アッセイに用いる抗体の特異性により決定される。特異的抗体により認識されるペプチド切断生産物（アッセイの過程の間形成される）はまた、その遠位の末端にシステイン残基を含まなければならない。「エンドペプチダーゼペプチド基質」を、最終濃度10μgml-1に、1mM EDTAを含有する0.05M リン酸ナトリウム緩衝液pH6.5中で希釈し、そしてSulphydryl Binding Plate（Costar）に加える（100μl/ウェル）。１時間、室温でのインキュベーション後、ペプチド溶液を取り除き、プレートをリン酸緩衝化生理食塩水pH7.4で３回洗浄する（洗浄のこの段階では界面活性剤は用いない）。
(c)  「エンドペプチダーゼペプチド基質」のシステイン含有誘導体（上記）を、キャリアタンパク質（例えば、マレイミド活性化BSA）に連結させる。キャリアタンパク質は市販されている（Pierce Warriner,U.K.）。次いで上記(a)に記載のマイクロタイタープレートに結合させる。
(d)  「エンドペプチダーゼペプチド基質」をニトロセルロースメンブレンのような別の固相に結合させ、そしてこの手法は標準ウエスタンブロッティング技法において規定された手法と同様に用いられる。切断アッセイはいくつかの様式で行われ得る：
(i)  ペプチド基質をニトロセルロースメンブレン上で切断する。
(ii)  ペプチドは溶液中のボツリヌス毒素により切断され、次いで生産物はニトロセルロースメンブレンに結合する。
(iii)  ボツリヌス/破傷風毒素標的タンパク質を、毒素により細胞内（またはインビボで）で切断し得、細胞抽出物をSDSゲル電気泳動により分離し、次いで切断ペプチド生産物を、ウエスタンブロッティングによりニトロセルロースに転写させる。
次いでプレートを0.1% Tween 20を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、次いでPBS中5%のウシ胎児血清溶液（またはPBS中1%BSAあるいはPBS中粉ミルクのような他のブロッキングカクテル）でブロックする（ポリスチレンへのタンパク質のさらなる結合をさけるため）。
この状態のプレートは数ヶ月（または数年）凍結保存するのに適している。
アッセイを行うために、毒素のテスト溶液を、10μM ZnCl2および20mM 2-ジチオトレイトールを含む0.25M Hepes pH7.4緩衝液で緩衝化し（毒素溶液：緩衝液の割合が4:1）、次いでマイクロタイタープレートに加え、37℃で１時間インキュベートする。次いで毒素テスト溶液をPBS/tweenで洗浄し、次いで抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを加える。（抗体は切断生産物の１つの開放末端に特異的であり、そしてそのバッチに依存してあらかじめ決定された希釈物で加える）。１時間、37℃でのインキュベーション後、抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートをプレートからPBS/tweemで洗い流し、次いでペルオキシダーゼ基質を加えて発色させる。
実施例７．特異的抗体産生の方法
抗体が惹起されるペプチドを、問題の反対側の端にシステイン残基を有するように合成する。実施例１では、合成された２つのペプチドは以下の通りである。
0004246259.tif 000014
次いでペプチドを、キャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミン）に、システイン残基を介して連結させる。これは、供給者により詳細に説明されるように、マレイミド活性化キャリアタンパク質（Pierce Warriner,U.K.から市販されている）とペプチドを混合することにより達成される。
次いでコンジュゲートペプチドをアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）の存在下で動物（例えば、モルモットまたはウサギ）に注入する。１つの免疫スケジュールは、0、4、および8週の時点で50μgのペプチドタンパク質を動物に与えることである；次いで10週後、動物を採血する。
血清中の抗体は血清由来のIgGを精製するための公表された方法のいずれかにより精製される。抗ペプチド特異的抗体は、必要に応じて、クロマトグラフィー媒体上に固定化した免疫ペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製される（Pierce Warriner, U.K.から市販されているキットおよび方法）。
所望の結合特徴を有する抗体を、実施例６に記載のように評価する。アッセイは、毒素の不在下では発色せず、1μg/mlの所望の毒素の存在下で強く発色すべきである。
実施例８．アッセイの定量
アッセイは毒素標準を組み込むことにより定量的に作製される。種々の濃度の毒素により産生された発色をマイクロタイタープレート読みとり装置により測定し、そして未知のサンプルにおける毒素濃度が評価され得る標準曲線を作成する。
従って、本発明は、新規のおよび有効な毒素アッセイを提供し、アッセイにおいて使用する新規の試薬を提供する。アッセイは、現存するアッセイ（例えばマウス致死テストを用いるアッセイ）に比べて高価ではなく、産業適用に適している。アッセイおよびその試薬のさらなる利点は上記に示した。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：
(A)名称：マイクロバイオロジカル  リサーチ  オーソリティー
(B)番地：センター  フォー  アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  リサーチ（CAMR）
(C)市：ポートン  ダウン，サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：エスピー4  0ジェイシー
(A)名称：ショーン，クリフォード  チャールズ
(B)番地：44  オークウッド  グローブ
(C)市：アルダーバリー，サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：エスピー5 3ビーエヌ
(A)名称：ハリス，バッサム
(B)番地：3  エイボン  テラス
(C)市：サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：エスピー2 7ビーティー
(A)名称：ジェイムズ，ベンジャミン，アーサー，フレデリック
(B)番地：22  プライオリー  クローズ
(C)市：アルダーバリー，サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：エスピー5 3ティーイー
(A)名称：クイン，コンラド，パドライグ
(B)番地：36  エスティー  フランシス  ロード
(C)市：サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：エスピー1 3キューエス
(ii)発明の名称：毒素アッセイ
(iii)配列数：11
(iv)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン  リリース #1.0，バージョン #1.30（EPO）
(vi)先願データ：
(A)出願番号：GB 9411138.2
(B)出願日：1994年6月30日
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号１：
0004246259.tif 000015
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号２：
0004246259.tif 000016
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号３：
0004246259.tif 000017
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号４：
0004246259.tif 000018
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号５：
0004246259.tif 000019
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号６：
0004246259.tif 000020
(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号７：
0004246259.tif 000021
(2)配列番号８の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：62アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号８：
0004246259.tif 000022
(2)配列番号９の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号９：
0004246259.tif 000023
(2)配列番号10の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：70アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号10：
0004246259.tif 000024
(2)配列番号11の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号11：
0004246259.tif 000025
【図１】
0004246259.tif 000026
【図２】
0004246259.tif 000027
【図３】
0004246259.tif 000028
【図４】
0004246259.tif 000029
【図５】
0004246259.tif 000030
【図６】
0004246259.tif 000031
【図７】
0004246259.tif 000032