(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の酵素学的性質を有するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７６（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６３）由来のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）及びペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、ジガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応pH：pH８付近（トリス−塩酸緩衝液）及びpH９．５付近（グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）に極大値を有する。
（３）最適反応温度：約５５℃（０．４ｍＭ塩化カルシウムを含むグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、pH９．５）
（４）pH安定性：pH６〜１２（３０℃、６０分間処理）
（５）耐熱性：約５５℃まで安定（１ｍＭ塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、pH７．０、１５分間処理）
（６）分子量：約１１００００（ＳＤＳ電気泳動法）
（７）等電点：pH４．６付近（等電点電気泳動法）
（８）界面活性剤耐性：界面活性剤（０．１％）に対し安定である。
【請求項２】
請求項１記載のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを生産するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７６（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６３）。
【請求項３】
請求項２記載の微生物を培養し、培養物から請求項１記載の酵素を採取するアルカリエキソポリガラクツロナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤等に有用なアルカリエキソポリガラクツロナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペクチン質を分解する酵素にはポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ等が知られている。食品工業分野ではこれらの酵素を有効に利用し、果汁、ワイン等の清澄化、柑橘類ジュースの搾汁率の向上、果汁残渣から可溶性成分の回収、みかん果皮の剥皮等に応用している。特に食品工業分野においては一般的に作用pHの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが使用されるが、事実、従来公知のポリガラクツロナーゼの最適反応pHは殆どが酸性側に存在している。
【０００３】
一方、ジャム、ケチャップ、ジュースなどのペクチン質含量の高い食物の衣服についた食べこぼしや染み汚れの除去にポリガラクツロナーゼを衣料洗剤用酵素として利用しようとする試みもあり、例えば、特開昭６０−２２６５９９号公報、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９８／０６８０９号等が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
衣料用洗剤や他の洗浄剤等にポリガラクツロナーゼを用いる場合には、酵素が中性からアルカリ性領域で作用すること、洗浄剤の成分である界面活性剤等に対し安定であることが必要である。
現在までに唯一知られているアルカリポリガラクツロナーゼ（特公昭４８−６５５７号公報）は好アルカリ性バチルスＰ−４−Ｎ株が生産し、アルカリ性領域で作用するエンド型の酵素である。最適反応pHは１０付近にあるが、pH５から７では最大活性の２０％以下の相対活性を示すにすぎず広範囲で作用させるためには、他の中酸性酵素との併用が必要である。また、最適反応pHの高いフザリウム属及びセレノモナス属由来のポリガラクツロナーゼが知られているが双方の酵素とも最適反応pHを７付近に有するエキソポリガラクツロナーゼである（Maceira et al., FEMS Microbiol.Lett.,154,37-43,1997、Heinrichova et al.J.Appl.Bacteriol.,66,169-174,1989）。
【０００５】
従って本発明の目的は、アルカリ性領域に最適反応pHを有し、界面活性剤に対し安定なアルカリエキソポリガラクツロナーゼを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素の中から、pH９．５付近に最適反応pHを有し、且つ広いpH範囲においても作用する界面活性剤耐性のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するアルカリエキソポリガラクツロナーゼ、それを生産する微生物及びその製造法を提供するものである。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）及びペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、ジガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応pH：pH８付近（トリス−塩酸緩衝液）及びpH９．５付近（グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）に極大値を有する。
（３）最適反応温度：約５５℃まで安定（０．４ｍＭ塩化カルシウムを含むグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、pH９．５）
（４）pH安定性：pH６〜１２（３０℃、６０分間処理）
（５）耐熱性：約５５℃（１ｍＭ塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、pH７．０、１５分間処理）
（６）分子量：約１１００００（ＳＤＳ電気泳動法）
（７）等電点：pH４．６付近（等電点電気泳動法）
（８）界面活性剤耐性：界面活性剤（０．１％）に対し安定である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、例えばアルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造できる。かかる生産菌としては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ５７６株が挙げられる。
【０００９】
Ａ形態学的性質
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．４〜０．６×３．０〜４．０μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）：楕円形、０．４〜１．０×１．０〜１．６μｍ、準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：不定（ＣＶＴ寒天培地には生育せず）
（ｆ）抗酸性：陰性
（ｇ）肉汁寒天培地上での生育：乳白色、全縁のコロニーを形成、生育はやや不良
【００１０】
（Ｂ）生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元（培地２）：＋
（ｂ）脱窒反応（培地２）：−
（ｃ）ＭＲテスト（培地３）：−
（ｄ）ＶＰテスト（培地３）：−
（ｅ）インドール生成（培地４）：−
（ｆ）硫化水素の生成（培地５）：−
（ｇ）デンプン加水分解（培地６）：＋
（ｈ）ゼラチン加水分解（培地７）：＋
（ｉ）カゼイン加水分解（培地８）：＋
（ｊ）クエン酸の利用（培地９）：−
（ｋ）無機窒素の利用（培地１０）：−
（ｌ）ウレアーゼ（培地１１）：−
（ｍ）オキシダーゼ（培地１２）：＋
（ｎ）カタラーゼ：＋
（ｏ）リトマスミルク（培地１３）：アルカリ性化
（ｐ）生育温度範囲（培地１４）：１７〜４６℃
（ｑ）生育pH範囲（培地１５）：pH６〜１０
（ｒ）嫌気条件下での生育（培地１６）：生育
（ｓ）ＯＦテスト（培地１７）：−
（ｔ）グルコースからのガス産生（培地１８）：−
（ｕ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１９）：７％で生育
（ｖ）糖からの酸生成（培地２０）：以下の糖類からの酸生成は認められなかった。リボース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、シュークロース、グルコース、マンニトール、マンノース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、ラフィノース、サリシン、ソルボース、メリビオース、可溶性デンプン
【００１１】
培地１：ニュートリエントアガー（ディフコ）
培地２：ニュートリエントブロス（ディフコ）、硝酸カリウム０．１重量％
培地３：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、リン酸１水素カリウム０．５重量％、グルコース（別滅菌）０．５重量％
培地４：ＳＩＭ培地（日水製薬）、コバック試薬
培地５：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）
培地６：ニュートリエントアガー、可溶性デンプン１．０重量％
培地７：ニュートリエントアガー、ゼラチン１．０重量％
培地８：ニュートリエントアガー、カゼイン１．０重量％
培地９：Simmons培地（栄研化学）
培地１０：酵母エキス０．０５重量％、硫酸ナトリウム０．１重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、グルコース（別滅菌）１．０重量％、硝酸ナトリウム０．２５重量％又は塩化アンモニウム０．１６重量％
培地１１：尿素培地（栄研化学）
培地１２：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）
培地１３：バクトリトマスミルク（ディフコ）
培地１４：ＳＣＤ培地（日本製薬）
培地１５：ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、塩酸を別滅菌後に添加し、pHを調整
培地１６：アナエロビックアガー（ディフコ）
培地１７：ＯＦ基礎培地（ディフコ）
培地１８：ニュートリエントブロス、グルコース（別滅菌）１．０重量％
培地１９：ＳＣＤ培地、塩化ナトリウム２〜１０重量％
培地２０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、塩化カリウム０．０２重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、酵母エキス０．０２重量％、寒天１．５重量％、ブロモクレゾールパープル０．０００６重量％、糖類（別滅菌）１．０重量％
【００１２】
以上、ＫＳＭ−Ｐ５７６株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス  サーキュランスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス  サーキュランスとは一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ５７６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５６３）として寄託した。
【００１３】
ＫＳＭ−Ｐ５７６株等のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。使用する炭素源、窒素源には特に制限は無く資化しうる炭素源、例えばペクチン、ペクチン酸、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコース、シュークロース、マルトース等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられる。その他リン酸塩、金属塩、有機無機微量栄養源を適宜添加することができる。培地のpHは、本発明の酵素生産に適したpHに炭酸ナトリウム等を用いて調整すれば良い。
【００１４】
得られた培養液中からのアルカリエキソポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、例えば塩析法、溶剤沈殿法、限外濃縮等により目的酵素を濃縮することができる。塩析法の例として硫酸アンモニウム（３０〜９０％飽和画分）、溶剤沈殿の例として冷アセトン（５０％以上）等の条件下において酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、セファデックスＧ−１０等を用いるゲル濾過、限外濾過等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
かくして得られる本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼの一例であるバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ５７６株由来のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、以下のような性質を有する。尚、酵素活性の測定は以下のように行った。
【００１５】
［標準酵素活性測定法］
試験管に０．２ｍＬの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）、０．１ｍＬの４ｍＭ塩化カルシウム、０．２ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ  １４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整）、０．４ｍＬの脱イオン水を添加し、３０℃で５分間恒温した。これに０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液（希釈は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で行った）を加え２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００１６】
（１）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン（２８、６７、９３％）を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。本酵素はポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２）に対し最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ；ｌｏｔ１１２Ｈ３７８０、フルカ；ｌｏｔ５３９９８）を用いた場合、その反応速度は最大活性のそれぞれ８５％、７５％程度であった。エステル化度２８％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９２）では約４０％、エステル化度６７％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９３）に対して約３％の分解活性を示した。エステル化度９３％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ１２５Ｈ０１２３）に対しては、殆ど分解活性を示さなかった。
【００１７】
（２）基質の分解様式
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）、０．２％ポリガラクツロン酸、０．２ｍＭ塩化カルシウムからなる反応液に０．０５Ｕの本酵素を添加し、全量０．２５ｍＬとした。３０℃、３０分間反応させた液を薄層クロマトプレート(kiesel gel ６０：メルク社）に約１０μＬスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５：２：３（ｖ／ｖ）の溶媒系にて展開を行った。反応物の検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用い、プレートに噴霧後、１００℃、１０分間乾燥器中で発色させた。その結果、反応生成物としてジガラクツロン酸のみが検出され、本酵素はエキソ型のアルカリポリガラクツロナーゼと判断された。
【００１８】
（３）最適反応pH
１００ｍＭ酢酸緩衝液（pH４〜６）、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（pH６〜８）、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１０．５）を用いて最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH８のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示し、pH９．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中においても活性の極大値を示した（図１）。
【００１９】
（４）最適反応温度
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）中、３０℃〜７５℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は５５℃付近に最適反応温度を示し、６０℃においても最大活性の９０％以上の活性を示した。また、塩化カルシウムを反応系に添加しない場合において最適反応温度は５０℃付近へシフトするとともに、カルシウム添加系の最大活性値に比べて約７０％の活性を示した（図２）。
【００２０】
（５）安定pH範囲
酢酸緩衝液（pH４〜６）、ＭＯＰＳ緩衝液（pH６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム酸緩衝液（pH９〜１１）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１１〜１２．８）の各緩衝液（５０ｍＭ）中に酵素を加え、３０℃、６０分間恒温した後、残存活性を測定した。その結果、処理前の本酵素活性を１００％とした場合、pH５〜１２の範囲で８０％以上の残存活性を示した（図３）。尚、各処理において１ｍＭの塩化カルシウムを添加した場合、塩化カルシウムを添加しない系と安定性には差が認められなかった。
【００２１】
（６）耐熱性
１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）中に酵素を添加し、３０℃〜７０℃の各温度で１５分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において５５℃まで安定であった。また、塩化カルシウムを添加しない場合、４５℃付近まで安定であった（図４）。
【００２２】
（７）分子量（ＳＤＳ電気泳動法）
ＳＤＳ処理（１００℃、３分間）した酵素液について１２．５％アクリルアミドゲルを用いＳＤＳ電気泳動を行った。標準タンパク質としてミオシン（２０００００）、β−ガラクトシダーゼ（１１６２５０）、ホスホリラーゼｂ（９７４００）、血清アルブミン（６６２００）、卵白アルブミン（４５０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１０００）を用い、それぞれの移動度と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約１１００００と推定された。
【００２３】
（８）等電点
ＰＡＧ−Ｐｌａｔｅ（ファルマシア；pH３．５〜９．５）を用いて本酵素の等電点電気泳動を行った。泳動後、クマーシーブリリアントブルーＧ２５０によりタンパク質を染色した。標準タンパク質（バイオラッド）の等電点と移動度から得た検量線より本酵素の等電点を求めたところ、pH４．２付近であると決定された。
【００２４】
（９）界面活性剤の影響
各種界面活性剤を０．１％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素の活性を測定した。その結果、０．１％という高濃度の各界面活性剤の存在下においても本酵素は、対照に比べ７０％以上の活性を発現しうることが判った（表１）。
【００２５】
【表１】
0004382951.tif 000002
【００２６】
（１０）キレート剤の影響
本酵素を１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（pH６．０）中にて３０℃、１５分間処理した後の残存活性を標準活性測定法により測定した。その結果、対照（ＥＤＴＡを添加していない系）に比べ約９０％の活性が残存していた。さらに別の実験系として５ｍＭ  ＥＤＴＡを直接反応系に添加し、３０℃、２０分間の反応を行った。その結果、相対活性として約９０％の活性値を示した。以上の結果から、本酵素はキレート剤に対し、極めて安定な酵素であることが明らかになった。
このように本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、最適反応pHをpH８並びにpH９．５付近に有し、ジガラクツロン酸生成型の新規な酵素である。
【００２７】
【実施例】
実施例１  アルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、２０分間熱処理し、下記の組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜７日間静置培養し、菌の生育後、０．２％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１％塩化ナトリウム、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）、０．８％寒天から成る軟寒天を重層し、３７℃で１時間恒温した。コロニー周辺にポリガラクツロン酸の分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラクツロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でアルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌としてバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ５７６株を得た。
【００２８】
【表２】
0004382951.tif 000003
【００２９】
実施例２  バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ５７６株によるアルカリエキソポリガラクツロナーゼの生産
上述のスクリーニングにより得られたバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ５７６株の培養は、５００ｍＬ容坂口フラスコに５０ｍＬの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン、２％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸１水素カリウム、０．００５％硫酸マンガン、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８）であった。上記条件下においてポリガラクツロン酸分解酵素の生産性は７４０Ｕ／Ｌであった。
【００３０】
実施例３  アルカリエキソポリガラクツロナーゼの精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ５７６株の培養液を遠心分離（９０００×ｇ、２０分間、４℃）し上清液（１．５Ｌ）を得た。これを限外濾過用モジュール（ＡＣＰ１３０００：旭化成）により濃縮、脱塩を行った（２６０ｍＬ）。得られた濃縮液は２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたSuper Qトヨパールカラム（２．５×５０ｃｍ：東ソー）に添着した。約８００ｍＬの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた後、０から０．２５Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液（１Ｌずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。０．１５Ｍの塩化カリウム濃度付近にポリガラクツロナーゼ活性が溶出された。また、併産されるペクチン酸リアーゼは０．２Ｍ以上の塩化カリウム濃度で溶出されたため双方の酵素を分離することが可能となった。そこでポリガラクツロナーゼ活性画分を集め（３００ｍＬ）、限外濾過（ＰＭ１０メンブレン：アミコン）により濃縮、脱塩を行った。この液を脱イオン水にて１０倍に希釈し、予め２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH９）にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−バイオゲルＡカラム（２．５×１２ｃｍ：バイオラッド）へ添着した。カラムを平衡化緩衝液にて洗浄した後、吸着タンパク質を０から０．１Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（３００ｍＬずつ）により濃度勾配溶出を行った。アルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性は５０ｍＭ塩化カリウム濃度付近に溶出され、この画分を集め、限外濾過により濃縮を行った。次にこの濃縮液を予め２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（pH６）にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−バイオゲルＡカラム（２．５×１０ｃｍ：バイオラッド）へ添着した。カラムを平衡化緩衝液にて洗浄した後、吸着タンパク質を０〜０．１Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（２００ｍＬずつ）、次いで０．１〜０．２５Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（２００ｍＬずつ）により濃度勾配溶出を行った。アルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性は０．１５Ｍ塩化カリウム濃度付近に溶出され、この画分を集め、限外濾過により濃縮を行った。得られた濃縮液を予め２ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（pH６）にて平衡化しておいたヒドロキシアパタイトカラム（２．５×７ｃｍ：バイオラッド）に添着した。カラムを平衡化緩衝液にて洗浄した後、吸着タンパク質を１０〜１００ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍＬずつ）、次いで１００〜２５０ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍＬずつ）により濃度勾配溶出を行った。アルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性は１８０ｍＭ（Ｆｒ．Ａ）並びに２３０ｍＭ（Ｆｒ．Ｂ）リン酸緩衝液濃度付近にそれぞれ溶出された。それぞれの画分を集め限外濾過により濃縮を行った。２つの活性画分は電気泳動的な挙動は全く同じであったが、Ｆｒ．Ａの比活性はＦｒ．Ｂの約１．５倍であった。
上記精製操作により得られたアルカリエキソポリガラクツロナーゼ画分（Ｆｒ．Ａ）は、前述の酵素学的性質を示した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、pH８並びにpH９．５付近に最適反応pHを有し、界面活性剤耐性の新規酵素であり衣料用他、洗浄剤用酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図２】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図４】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１】
0004382951.tif 000004
【図２】
0004382951.tif 000005
【図３】
0004382951.tif 000006
【図４】
0004382951.tif 000007