(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された組換えキメラヘテロ多量体接着体であって、
ＥｒｂＢ２レセプターモノマーの膜貫通ドメインを欠く細胞外ドメイン、および第１の異種多量体化ドメインを含む、第１のアミノ酸配列；
ＥｒｂＢ３レセプターモノマーの膜貫通ドメインを欠く細胞外ドメインまたはＥｒｂＢ４レセプターモノマーの膜貫通ドメインを欠く細胞外ドメイン、および第２の異種多量体化ドメインを含む、さらなるアミノ酸配列；
を含み、
ここで、該第１のアミノ酸配列の多量体化ドメインおよび該さらなるアミノ酸配列の多量体化ドメインがそれぞれ、免疫グロブリン定常領域またはそのフラグメントを含み；
ここで、該第１のアミノ酸配列の細胞外ドメインおよび該さらなるアミノ酸配列の細胞外ドメインが、該第１のアミノ酸配列の多量体化ドメインと該さらなるアミノ酸配列の多量体化ドメインとの相互作用によって互いに結合して、ＥｒｂＢ３モノマーもしくはＥｒｂＢ４モノマーまたはホモダイマーＥｒｂＢ３レセプターもしくはホモダイマーＥｒｂＢ４レセプターと比較して１０-1から１０6倍のニューレグリンに対する親和性を有するキメラヘテロ多量体接着体の結合ドメインを形成し：そして、
ここで、該キメラヘテロ多量体接着体が水溶液中で可溶性である、
組換えキメラヘテロ多量体接着体。
【請求項２】
前記さらなるアミノ酸配列の細胞外ドメインが：
（ｉ）ＥｒｂＢ３レセプターモノマーに由来し、そしてここで、前記キメラヘテロ多量体接着体がＥｒｂＢ２−ＩｇＧ／ＥｒｂＢ３−ＩｇＧ接着体であるか、または
（ｉｉ）ＥｒｂＢ４レセプターモノマーに由来し、そしてここで、前記キメラヘテロ多量体接着体がＥｒｂＢ２−ＩｇＧ／ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ接着体である、
かのいずれかである、請求項１に記載の単離された組換えキメラヘテロ多量体接着体。
【請求項３】
前記キメラヘテロ多量体接着体が前記ニューレグリンのアンタゴニストである、請求項１から請求項２のうちのいずれか１項に記載のキメラヘテロ多量体接着体。
【請求項４】
請求項１から請求項３のうちのいずれか１項に記載のキメラヘテロ多量体接着体のアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
【請求項５】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項４または請求項５に記載の核酸、あるいは請求項６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
ニューレグリンを含むサンプル中でキメラヘテロ多量体接着体−ニューレグリン複合体を形成させる方法であって：
請求項１から３のうちのいずれか１項に記載のキメラヘテロ多量体と該サンプルとを、該ニューレグリンが該キメラヘテロ多量体接着体に結合して、該キメラヘテロ多量体接着体−ニューレグリン複合体を形成する条件下で接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記複合体が、天然に存在するヘテロ多量体へのニューレグリンの結合を阻害し、
そしてここで、前記サンプルが哺乳動物由来であり、そして組織、流体、および体液からなる群から選択される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
天然に存在するＥｒｂＢヘテロ多量体レセプターの活性化を阻害するための組成物であって：
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載のキメラヘテロ多量体接着体
を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１から３のうちのいずれか１項に記載のキメラヘテロ多量体接着体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本出願は一般に、ヘテロ多量体レセプターの細胞外結合ドメインを含むキメラヘテロ多量体接着体に関する。このヘテロ多量体接着体は、天然のレセプターのリガンドに結合する。本発明はさらに、ヘテロ接着体に対する抗体、接着体を作成する方法、ならびにヘテロ接着体および抗体を使用する方法に関する。
発明の背景
細胞の増殖および分化を調製するシグナルの伝達は、種々の細胞タンパク質のリン酸化によって一部調節される。タンパク質チロシンキナーゼは、このプロセセスを触媒する酵素である。レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、細胞内基質のリガンド刺激性チロシンリン酸化を介して細胞増殖を指向すると考えられている。
一回貫通型レセプターチロシンキナーゼのErbBファミリーは、４つのメンバーからなる:上皮成長因子レセプター（EGFR）、ErbB2（HER2/neu）、ErbB3（HER3）、およびErbB4（HER4）。EGFRに結合しそしてそれを活性化する多数のリガンド（全ては異なる遺伝子産物である）が同定されている（Groenenら、1994に概説される）。対照的に、単一のニューレグリン遺伝子が多数のタンパク質のイソ型をコードし、これはmRNAのオルタナティブスプライシングによって生じる（Lemke,G.（1996）mol.Cell.Neurosci.7:247-262に概説される）。ErbB3（Carraway,K.L.ら（1994）J.Biol.Chem.269:14303-14306）またはErbB4（Plowman,G.D.ら（1993）Nature 366:473-475）は、ニューレグリンのレセプターとして作用し得る。これらのレセプターおよびリガンドは、正常な細胞の増殖および分化において重要な役割を果たす。
成長因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼのクラスＩサブファミリーは、erbB1遺伝子によってコードされる170kDaの上皮成長因子レセプター（EGFR）を含む。erbB1は、ヒト悪性腫瘍において原因となると考えられている。特に、この遺伝子の増大した発現が、より侵襲性の乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、および胃ガンにおいて観察されている（Modjtahedi,H.およびDean,C.（1994）Int.J.Oncol.4:277-296）。
クラスＩサブファミリーの第２のメンバーであるp185neuは、化学的に処理されたラットの線維芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として最初に同定された。neu遺伝子（erbB2およびHER2とも呼ばれる）は、185kDaのレセプタータンパク質チロシンキナーゼをコードする。ヒトHER2遺伝子の増幅および／または過剰発現は、乳ガンおよび卵巣ガンにおける乏しい予後と関連する（Slamon,D.J.ら、Science 235:177-182（1987）;およびSlamonら、Science 244:707-712（1989））。HER2の過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、および膀胱のガンを含む他のガンと関連している。従って、米国特許第4,968,603号においてSlamonらは、腫瘍細胞でのHER2遺伝子の増幅または過剰発現を決定するための種々の診断アッセイを記載し、そして請求しているSlamonらは、腫瘍細胞中でのHER2オンコジーンの複数の遺伝子コピーの存在が、疾患初期の腫瘍部位を超えてより広がるようであること、およびそれゆえ、そうでなければこの疾患が他の診断因子によって示され得るよりも侵襲的な処置を必要とし得ることを発見した。Slamonらは、リンパ節の状態の決定とともにHER2遺伝子増幅試験が、非常に改善された予後の有用性を提供すると結論づけた。
erbB3またはHER3と呼ばれるさらなる関連する遺伝子がまた記載されている。米国特許第5,183,884号;Krausら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9193-9197（1989）;EP特許出願第444,961 A1号;およびKrausら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2900-2904（1993）を参照のこと。Krausら（1989）は、顕著に上昇したレベルのerbB3 mRNAが特定のヒト腫瘍細胞株に存在することを発見し、このことは、erbB3がerbB1およびerbB2と同様にヒト悪性腫瘍において役割を果たし得ることを示す。Krausら（1993）はまた、キメラEGFR/ErbB3レセプターのErbB3触媒ドメインのEGF依存性活性化が、トランスフェクトされたNIH-3T3細胞中での増殖応答を生じたことを示した。さらに、これらの研究者らは、いくつかのヒト乳房腫瘍細胞系統が定常状態のErbB3チロシンリン酸化の有意な上昇を示すことを実証し、このことはさらに、このレセプターがヒト悪性腫瘍において役割を果たし得ることを示す。ガンにおけるerbB3の役割は、他によって研究されている。これが、乳ガン（Lemoineら、Br.J.Cancer 66:1116-1121（1992））、消化管のガン（Pollerら、J.Pathol.168:275-280（1992）、Rajkumerら、J.Pathol.170:271-278（1993）、およびSanidasら、Int.J.Cancer 54:935-940（1993））、ならびに膵臓ガン（Lemoineら、J.Pathol.168:269-273（1992）、およびFriessら、Clinical Cancer Research 1:1413-1420（1995））で過剰発現されることが見出されている。
ErbB3は、それが内因性のチロシンキナーゼ活性をほとんど有さないまたは全く有さない点で、ErbBレセプターファミリーの中で独特である（Guyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8132-8136（1994）およびKimら、J.Biol.Chem.269:24747-55（1994））。ErbB3がErbB2と同時に発現される場合、活性なシグナル化複合体が形成され、そしてErbB2に対する抗体がこの複合体を破壊し得る（Sliwkowskiら、J.Biol.Chem.,269（20）:14661-14665（1994））。さらに、ヘレグリン（HRG）に対するErbB3の親和性は、ErbB2と同時に発現された場合により高い親和性状態い増大される。Leviら、Journal of Neuroscience 15:1329-1340（1995）;Morrisseyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1431-1435（1995）;Lewis,G.D.ら、Cancer Res.,56:1457-1465（1996）;Pinkas-Kramarski,R.ら、（1996）EMBO J.15:2452-2467;Beerli,R.ら（1995）Mol.Cell.Biol.15:6496-6505;およびインビボのErbB2-ErbB3タンパク質複合体に関しては、Karunagaran,D.ら、（1996）EMBO J.15:254-264もまた参照のこと。
成長因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼのクラスＩサブファミリーは、HER4/ErbB4レセプターを含むようにさらに拡大されている。EP特許出願第599,274号;Plowmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1746-1750（1993）;およびPlowmanら、Nature 366:473-475（1993）を参照のこと。Plowmanらは、増大したHER4の発現が、乳腺ガンを含む上皮起源の特定のガンに密接に関連することを見出した。ヒトの新生物性状態（特に、乳ガン）の検出のための診断方法（これは、HER4の発現を評価する）が、EP特許出願第599,274号に記載されている。
HER2オンコジーンの活性化因子の探索は、ヘレグリンポリペプチドのファミリーの発見を導いた。これらのタンパク質は、Lee,J.およびWood,W.I.（1993）Genomics 16:790-791によってヒト第８染色体のショートアームにマップされた単一の遺伝子のオルタナティブスプライシングによって生じるようである。
Holmesらは、ヘレグリン-α（HRG-α）、ヘレグリン-β1（HRG-β1）、ヘレグリン-β2（HRG-β2）、ヘレグリン-β2-様（HRG-β2-様）、およびヘレグリン-β3（HRG-β3）と呼ばれる、HER2レセプターのポリペプチド活性化因子のファミリーを単離し、そしてクローン化した。Holmes,W.E.ら、Science 256:1205-1210（1992）;WO 92/20798;および米国特許第5,367,060号を参照のこと。45kDaのポリペプチドであるHRG-αが、MDA-MB-231ヒト乳ガン細胞株の馴化培地から精製された。これらの研究者らは、MCF7乳房腫瘍細胞におけるHER2レセプターのチロシンリン酸化を活性化する精製したヘレグリンポリペプチドの能力を示した。さらに、SK-BR-3細胞でのヘレグリンポリペプチドの有糸分裂活性化（これは、高レベルのHER2レセプターを発現する）を示した。EGFファミリーに属する他の成長因子と同様に、可溶性HRGポリペプチドは、膜結合前駆体（pro-HRGと呼ばれる）に由来するようであり、これは、タンパク質分解的にプロセシングされて45kDaの可溶性形態を遊離する。これらのpro-HRGはＮ末端のシグナルペプチドを欠いている。
ヘレグリンは最初の213アミノ酸残基において実質的に同一であるが、これらは、それらのＣ末端部分で異なる２つの変異体EGF様ドメインに基づいて２つの主要な型（αおよびβ）に分類される。それにも関わらず、これらのEGF様ドメインは、それらに含まれる６つのシステイン残基のスプライシングにおいて同一である。アミノ酸配列の比較に基づいて、Holmesらは、EGF様ドメイン内の第１のシステインと第６のシステインとの間で、HRGがヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF）に対しては45％類似であり、アンフィレグリン（AR）に対して35％同一であり、TGF-αに対して32％同一であり、そしてEGFに対して27％同一であることを見出した。
44kDaのneu分化因子（NDF）（これは、ヒトHRGのラット等価物である）が、Pelesら、Cell,69:205-216（1992）;およびWenら、Cell,69:559-572（1992）によって最初に記載された。HRGポリペプチドと同様に、NDFは、免疫グロブリン（Ig）相同性ドメイン、続くEGF様ドメインを有し、そしてＮ末端シグナルペプチドを欠いている。続いて、Wenら、Mol.Cell.Biol.,14（3）:1909-1919（1994）は、NDFのファミリーを拡大するために「完全（exhaustive）クローニング」を行った。この実験は、６つの異なる線維芽細胞のpro-NDFを明らかにした。Holmesらの名称を採用して、NDFをEGF様ドメインの配列に基づいてαポリペプチドまたはβポリペプチドのいずれかとして分類する。イソ型１から４は、可変の膜ストレッチ（EGF様ドメインと膜貫通ドメインとの間）に基づいて特徴付けられる。また、イソ型ａ、ｂ、およびｃは、可変の長さの細胞質ドメインを有することが記載されている。これらの研究者らは、異なるNDFイソ型は、オルタナティブスプライシングによって作成され、そして異なる組織特異的機能を行うと結論づけた。NDFに関しては、EP第505 148号;WO 93/22424;およびWO 94/28133号もまた参照のこと。
ヘレグリンポリペプチドがHER2レセプターを活性化するそれらの能力にもとづいて最初に同定された（Holmesら、前出を参照のこと）が、これは、neuを発現する特定の卵巣細胞およびneuでトランスフェクトされた線維芽細胞がNDFに結合または架橋しないだけではなく、それらがチロシンリン酸化を受けるためにNDFに応答もしないことを発見した（Pelesら、EMBO J.12:961-971（1993））。このことは、完全なヘレグリン応答性を付与するために別の細胞成分が必要であることを示した。Carrawayらは、続いて、125I-rHRGβ1177-244がウシerbB3で安定にトランスフェクトされたNIH-3T3線維芽細胞に結合するが、トランスフェクトされていない親細胞には結合しないことを示した。従って、これらは、ErbB3がHRGのレセプターであり、そして両方のレセプターを発現する細胞内での、内因性のチロシン残基のリン酸化およびErbB2レセプターのリン酸化を媒介すると結論づける。Carrawayら、J.Biol.Chem.269（19）:14303-14306（1994）。Sliwkowskiら、J.Biol.Chem.269（20）:14661-14665（1994）は、HER2およびHER3の両方でトランスフェクトした細胞がより高い親和性を示すが、HER3のみでトランスフェクトした細胞がヘレグリンに対して低い親和性を示すことを見出した。
この観察は、Kokaiら、Cell 58:287-292（1989）;Sternら、EMBO J.7:995-1001（1988）;およびKingら、4:13-18（1989）に以前に記載された「レセプターのクロストーク」に関連する。これらの研究者は、EGFのEGFRへの結合がEGFRキナーゼドメインの活性化およびp185HER2の交差リン酸化を生じることを見出した。このことは、リガンド誘導性レセプターヘテロダイマー、およびヘテロダイマー内でのレセプターの付随する交差リン酸化の結果であると考えられる（Wadaら、Cell 61:1339-1347（1990））。
Plowmanおよび彼の共同研究者らは、p180HER4/p185HER2の活性化を同様に研究した。彼らは、ヒトＴリンパ球中でp185HER2のみ、p180HER4のみ、または２つのレセプターをともに発現させ、そしてヘレグリンがp180HER4のチロシンリン酸化を刺激し得るが、両方のレセプターを発現する細胞でのp185HER2のリン酸化だけは刺激し得ないことを示した。Plowmanら、Nature 336:473-475（1993）。従って、ヘレグリンは、いくつかのレセプターと相互作用し得るEGF成長因子ファミリーのメンバーの一例である（CarrawayおよびCantley,Cell 78:5-8（1994））。さらに、β-セルリン（cellulin）リガンドは、EGFレセプターおよびHER4に結合するが、HER3には結合しないことが示されている（Riese II,D.J.ら、（1996）Oncogene 12:345-353）。
ヘレグリンの生物学的役割は、いくつかのグループによって調べられている。例えば、Fallsら（Cell 72:801-815（1993））は、ARIAが筋管の分化において役割を担っており、すなわち、運動性のニューロンのシナプス後の筋細胞において神経伝達物質レセプターの合成および濃度に影響を与えることを見出した。CorfasおよびFischbachは、ARIAがニワトリの筋肉のナトリウムチャンネルの数を増大させることを示した。CorfasおよびFischbach、J.Neuroscience,13:（5）:2118-2125（1993）。GGFIIがサブコンフルエントな休止ヒト筋芽細胞の有糸分裂促進物質であること、およびGGFIIの持続的な存在下でのクローン化ヒト筋芽細胞の分化が分化の６日後に大量の筋管を生じることが示されている（Sklarら、J.Cell Biochem.,Abst.W462,18D,540（1994））。1994年11月24日に刊行されたWO 94/26298もまた参照のこと。
Holmesら（前出）は、HRGが哺乳動物細胞株（例えば、SK-BR-3およびMCF-7）に有糸分裂促進効果を発揮することを見出した。Schwann細胞に対するGGFの有糸分裂促進活性もまた、報告されている。例えば、Brockesら、J.Biol.Chem.255（18）:8374-8377（1980）;LemkeおよびBrockes、J.Neurosci.4:75-83（1984）;Brockesら、J.Neuroscience 4:（1）:75-83（1984）Brockesら、Ann.Neurol.20（3）:317-322（1986）;Brockes、J.Methods in Enzym.,147:217-225（1987）およびMarchionniら（前出）を参照のこと。Schwann細胞は、ニューロンの軸索の周辺を覆うミエリンを提供し、それにより個々の神経繊維を形成する。従って、Schwann細胞は、末梢神経の発達、機能、および再生において重要な役割を果たす。治療的見地からこの密接な関係は、Leviら、J.Neuroscience 14（3）:1309-1319（1994）によって提言されている。Laviらは、損傷した脊髄の領域に移植され得る、ヒトSchwann細胞を含む細胞の補綴物の構築のための可能性を議論している。エキソビボでSchwann細胞を培養する方法が記載されている。WO 94/00140およびLiら、J.Neuroscience 16（6）:2012-2019（1996）を参照のこと。
Pinkas-Kramarskiらは、NDFが、胎ウシならびに成体のラットの脳およびラットの脳の初代培養物中で胚のニューロンおよびグリア細胞で発現されるようであることを見出し、そしてそれが星状膠細胞の生存および成熟因子として作用し得ることを示唆した（Pinkas-Kramarskiら、PNAS,USA 91:9387-9391（1994））。MayerおよびBrichmeier,PNAS,USA 91:1064-1068（1994）は、マウスの胚形成の間および周産期の動物におけるヘレグリンの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションおよびRNase保護実験を使用して分析した。これらの著者らは、これらの分子の発現に基づいて、ヘレグリンがインビボで間葉性因子およびニューロン様因子として作用すると結論づけた。また、彼らの知見は、上皮細胞の発生においてヘレグリンが機能することを意味する。同様に、DanilenkoらAbstract 3101,FASEB 8（4-5）:A535（1994）は、NDFとHER2レセプターとの相互作用が損傷の修復の間の上皮の移動および分化を指向させることにおいて重要であることを見出した。
ErbBファミリーのメンバーの相互作用がインビトロおよびインビボで調べられている。リガンドと他のErbBファミリーのメンバーとの相互作用の結果としてのErbB2のトランス活性化は共通であり、そして生理学的に重要な事象である（Dougall,W.C.ら、（1993）J.Cell.Biochem.53:61-73;Earp,H.S.ら、（1995）Breast Cancer Res.Treatment 35:115-132）。ErbB2とErbB3との同時発現は、高親和性ヘレグリン（HRB）結合部位の形成を導く（Sliwkowski,M.Xら、（1994）J.Biol.Chem.269:14661-14665）。ErbB2は、HRGに対するErbB3の親和性を調節し、そしてErbB3-HRG複合体に対してチロシンキナーゼ活性を提供するようである。なぜなら、ErbB3は、内因性のチロシンキナーゼ活性を欠いている機能不全シグナルレセプターであるからである（Guy,P.M.ら、（1994）PNAS USA 91:8132-8136）。生理化学的研究は、インビトロでErbB2およびErbB3のECDの会合を示さなかった（Horanら、J.Biol.Chem.270:24604-24608（1995））。さらに、可溶性HER3へのneu分化因子（NDF）の結合は、可溶性HER2の存在によって増強されなかった。
発明の要旨
本発明は、ヘテロ多量体レセプターモノマーの細胞外ドメインを含む可溶性のキメラヘテロ多量体が、レセプターリガンドに結合するという驚くべき発見に関する。本発明はさらに、キメラヘテロ多量体を作成する方法、それらをレセプターリガンドアンタゴニストとして使用する方法、レセプターリガンドのアンタゴニストまたはアゴニストとして機能するキメラヘテロ多量体に対する抗体、およびリガンド−レセプター相互作用に関連する疾患状態を処置する方法に関する。
１つの局面において、本発明は、天然のヘテロ多量体レセプターの第１のモノマーの第１のアミノ酸配列（この配列は、キメラモノマーを形成し、そして細胞外ドメイン（ECD）またはそのリガンド結合フラグメントを含む）および多量体化ドメインを含むキメラヘテロ多量体を含む。ここで、ECDは、多量体化ドメインに融合される。本発明のキメラヘテロ接着体はさらに、天然のヘテロ多量体レセプターのさらなるモノマーの細胞外ドメインおよび多量体化ドメインを含む、さらなるキメラモノマーを形成するさらなるアミノ酸配列を含む。本発明のこの局面に従って、天然のヘテロ多量体レセプターの第１およびさらなるモノマーの細胞外ドメインは、細胞中で会合して、リガンドの結合の際に活性化される天然のヘテロ多量体レセプターを形成する。そしてここで、可溶性のキメラヘテロ接着体は、天然のレセプターのモノマーまたは天然のレセプターのホモダイマーと比較して、リガンドに対して10-1から106倍の親和性を有する。本発明の好ましい実施態様において、キメラヘテロ多量体接着体は、水溶性接着体である。
本発明の１つの実施態様において、キメラヘテロ多量体接着体は、天然のヘテロ多量体レセプターの細胞外ドメインに結合する、リガンドのアンタゴニストである。
本発明の別の実施態様において、第１のアミノ酸配列の多量体化ドメインは、各さらなるアミノ酸配列の多量体化ドメインと相互作用し得てヘテロ多量体を形成し得る。
本発明のなお別の実施態様において、キメラヘテロ多量体接着体は、免疫グロブリン領域（好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、およびIgF由来のような免疫グロブリン定常領域）を含む多量体化ドメインを含む。
本発明のなお別の実施態様において、キメラヘテロ接着体は、安定なタンパク質−タンパク質相互作用を形成し得る多量体化ドメインを含む。このようなタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン（または多量体化ドメイン）として、ロイシンジッパー、裂け目を含むアミノ酸配列に相補的な隆起を含むアミノ酸配列、疎水性ドメイン、親水性ドメイン、およびさらなるアミノ酸配列の多量体化ドメインと分子内ジスルフィド結合を形成するように反応し得る遊離のチオール部分を含むアミノ酸配列が挙げられる。
本発明のさらなる実施態様は、ErbB2レセプターモノマーの細胞外ドメインを含む第１のアミノ酸配列、ErbB3レセプターモノマーの細胞外ドメインを含むさらなるアミノ酸配列、ならびに第１のアミノ酸およびさらなるアミノ酸の多量体化ドメインがそれぞれ、免疫グロブリン定常領域を含む、キメラヘテロ多量体接着体である。この多量体化ドメインは、第１のアミノ酸配列とさらなるアミノ酸配列との間の安定なタンパク質−タンパク質相互作用の形成を提供する。このキメラヘテロ多量体接着体の好ましいリガンドは、リガンド、ヘレグリンである。
本発明のさらなる実施態様は、ErbB2レセプターモノマーの細胞外ドメインを含む第１のアミノ酸配列、ErbB4レセプターモノマーの細胞外ドメインを含むさらなるアミノ酸配列、ならびに第１のアミノ酸およびさらなるアミノ酸の多量体化ドメインがそれぞれ、免疫グロブリン定常領域を含む、キメラヘテロ多量体接着体である。この多量体化ドメインは、第１のアミノ酸配列とさらなるアミノ酸配列との間の安定なタンパク質−タンパク質相互作用の形成を提供する。このキメラヘテロ多量体接着体の好ましいリガンドは、リガンド、ヘレグリンである。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸配列を含む。
他の実施態様において、本発明は、例えば、ErbB2-IgG、ErbB3-IgG、またはErbB4-IgGのようなヘテロ多量体接着体のモノマーのキメラのアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。例えば、核酸分子は、以下からなる群から選択され得る:（ａ）免疫グロブリン定常領域のような多量体化ドメインをコードする核酸配列に同じ転写の位相で（in phase）および転写の方向で共有結合され、そして直接転写された天然のヘテロ多量体レセプターのモノマーの細胞外ドメイン（すなわち、リガンド結合ドメインまたはその結合フラグメント）のヌクレオチド配列を含む核酸;および（ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲内で（ａ）の配列に対応する核酸。単離された核酸分子は必要に応じて、それに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。
単離された核酸はまた、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療のために使用され得る。本発明のこの実施態様は、本発明の核酸、核酸を含むベクター、または核酸を含む細胞を、哺乳動物への投与を含み、その結果、コードされるキメラ接着体は哺乳動物中で発現され、そしてそのリガンドのアンタゴニストとしての作用する。例えば、哺乳動物中で発現されたErbB2/3-IgGは、ErbB2/3レセプター付近のヘレグリンの局在濃度を低下させ、そしてその表面でレセプターを有する細胞の増殖を阻害するために有用である。好ましくは、発現されたErbB2/3-IgGは、ガンのような細胞増殖性疾患を処置するために使用され、そこでそのレセプターに結合するヘレグリンをアンタゴナイズすることによって細胞の増殖を阻害する。
本発明の１つの実施態様において、キメラアミノ酸の単離された核酸配列は、ErbB2レセプター由来の細胞外ドメインまたはその結合フラグメントをコードする。そしてここで、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含む。
本発明のなお別の実施態様において、キメラアミノ酸配列の単離された核酸配列は、ErbB3レセプターECD由来の細胞外ドメインまたはその結合フラグメントをコードする。そしてここで、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含む。
本発明の別の実施態様において、キメラアミノ酸配列の単離された核酸配列は、ErbB4レセプターECD由来の細胞外ドメインまたはその結合フラグメントをコードする。そしてここで、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含む。
本発明の別の実施態様は、核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
なお別の実施態様において、本発明は、本発明の単離された核酸を含むベクターを含む。例えば、本発明は、核酸分子を含むベクター（例えば、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結された核酸分子を含む発現ベクター）;核酸分子を含む宿主細胞;およびErbB-IgGのようなキメラヘテロ多量体接着体をコードする核酸分子を使用して接着体を効果的に産生する方法であって、宿主細胞を培養する工程、および細胞培養物から接着体を回収する工程を包含する方法を提供する。関連する実施態様において、核酸を使用して接着体を効果的に産生する方法は、異なるキメラ接着体をコードする複数の核酸配列を導入する工程、およびキメラ接着体の混合物を発現させる工程を包含する。例えば、ErbB2-IgGをコードする核酸およびErbB3-IgGをコードする核酸が宿主細胞に導入され、発現され、そしてホモダイマーとヘテロダイマーの混合物が細胞から、または培養培地から単離される。
本発明の１つの実施態様は、本発明の核酸を含む宿主細胞を含む。好ましくは、宿主細胞は、核酸を発現し得、この発現は、本発明のキメラヘテロ接着体の翻訳および産生を含む。本発明の実施態様は、ヘテロ接着体のキメラモノマーを含み、そして発現する宿主細胞を含む。一方、本発明の別の宿主細胞において、ヘテロ接着体のさらなるキメラモノマーが発現される。あるいは、この実施態様は、単一の宿主細胞中での１つ以上のキメラモノマーの発現を含む。
本発明の好ましい実施態様において、宿主細胞は、本発明の可溶性のキメラヘテロ多量体の第１のアミノ酸配列をコードする第１の単離された核酸配列（ここで、細胞外ドメインは、ErbB2レセプター由来であり、そして多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含む）;および本発明の可溶性のキメラヘテロ多量体のさらなるアミノ酸配列をコードする第２の単離された核酸配列（ここで、細胞外ドメインはErbB3レセプター由来であり、そして多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含む）を含む。
本発明の別の好ましい実施態様において、宿主細胞は、本発明の可溶性のキメラヘテロ多量体の第１のアミノ酸配列をコードする第１の単離された核酸配列（ここで、細胞外ドメインはErbB2レセプター由来であり、そして多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域を含む）;および本発明の可溶性のキメラヘテロ多量体のさらなるアミノ酸配列をコードする第２の単離された核酸配列（ここで、細胞外ドメインはErbB4レセプター由来であり、そして多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含む）を含む。
本発明の別の局面は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体に対するアンタゴニスト抗体を含む。ここでこの抗体は、天然のヘテロ多量体レセプターに結合し、そしてその活性を阻害する。
本発明の別の局面は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体に対するアゴニスト抗体を含む。ここでこの抗体は、天然にヘテロ多量体レセプターに結合し、そしてそれを活性化する。本発明の好ましい実施態様において、アゴニスト抗体は、天然のリガンドの10-1から106倍の活性で天然のヘテロ多量体レセプターを活性化し得る。
中でもキメラヘテロ多量体-特異的抗体が、ヘテロ多量体レセプターを含むことが予想されるサンプルと抗体（必要に応じて標識される）とを接触させる工程、および結合が生じた場合にそれを検出する工程を包含するヘテロ多量体レセプターを検出するための方法において使用され得る。抗体はまた、ヘテロ多量体レセプターを含む混合物を抗体に結合された固相上を通過させる工程、およびヘテロ多量体レセプターを含む画分を回収する工程を包含するヘテロ多量体レセプターを精製するための方法において使用され得る。好ましくは、本発明の１つの実施態様において、ヘテロ多量体レセプターは、ErbB2/ErbB4であり、そしてキメラヘテロ多量体接着体はErbB2-IgG/ErbB4-IgGである。別の好ましい実施態様において、ヘテロ多量体レセプターはErbB2/ErbB3であり、そしてキメラヘテロ多量体接着体は、ErbB2-IgG/ErbB3-IgGである。
なお別の局面において、本発明は、リガンドを含むサンプル中でキメラヘテロ多量体接着体−リガンド複合体を形成する方法を含む。本発明の方法は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体とサンプルとを、リガンドがヘテロ多量体に結合してキメラヘテロダイマー接着体−リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程を包含する。
本発明の１つの実施態様において、キメラヘテロ多量体接着体−リガンド複合体は、天然のヘテロ多量体レセプターへのリガンドの結合を阻害する。好ましくは、サンプルは、哺乳動物組織、または哺乳動物の液体（例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、および尿を含むがこれらに限定されない体液）である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
別の局面において、本発明は、天然のヘテロ多量体レセプターの活性化を阻害する方法に関する。この方法は以下の工程を包含する:１）本発明のキメラヘテロ多量体接着体と、天然のヘテロ多量体レセプターを含むサンプルおよびレセプターとを接触させる工程;２）キメラヘテロ多量体接着体をリガンドとともにインキュベートして複合体を形成させ、その結果リガンドによって天然のヘテロ多量体レセプターの活性化を阻害する工程。
天然のヘテロ多量体レセプターに結合するリガンドを阻害する方法の別の実施態様において、天然のヘテロ多量体レセプターはErbBであり、そして可溶性のキメラヘテロ多量体はErbB2およびErbB3の細胞外ドメインを含む。
天然のヘテロ多量体レセプターに結合するリガンドを阻害する方法の別の実施態様において、天然のヘテロ多量体レセプターはErbBであり、そして、可溶性のキメラヘテロ多量体はErbB2およびErbB4の細胞外ドメインを含む。
本発明の別の実施態様は、天然のヘテロ多量体レセプターに結合するリガンドを阻害する方法である。ここで、レセプターの活性化が阻害される。この方法は、本発明のアンタゴニスト抗体と天然のヘテロ多量体レセプターとを接触させて、アンタゴニスト抗体−ヘテロ多量体レセプター複合体を接触させてアンタゴニスト抗体−ヘテロ多量体レセプター複合体を形成させる工程を包含し、ここで、レセプターの活性化が阻害される。
別の局面において、本発明は、本発明のアゴニスト抗体と天然のヘテロ多量体レセプターとを接触させて、アゴニスト抗体−ヘテロ多量体レセプター複合体を形成する工程を包含する、天然のヘテロ多量体レセプターを活性化する方法に関する。ここで、レセプターは活性化される。
本発明のなお別の局面において、本発明は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体の治療有効用量をそれを必要とする哺乳動物に投与する工程を包含する、疾患状態の処置のための方法に関する。本発明の実施態様は、疾患が、リガンドへのヘテロ接着体の結合を競合することによるような、リガンドと天然のヘテロ多量体レセプターとの間の接触を阻害することによって処置可能である疾患状態を含む。
本発明の１つの実施態様において、キメラヘテロ多量体接着体は、ErbB2/ErbB3-Igヘテロ接着体である。別の実施態様において、キメラヘテロ多量体は、ErbB2/ErbB4-Igヘテロ接着体である。
本発明は、キメラヘテロ多量体接着体を含む組成物を含む。接着体を含むこの組成物は、好ましくは滅菌である。組成物が水溶液である場合、好ましくは接着体は可溶性である。組成物が凍結乾燥された粉末である場合、好ましくは粉末は適切な溶媒中で再構成可能である。
本発明の別の実施態様において、処置方法は、目的のヘテロ多量体レセプターモノマーの細胞外ドメインを使用してそれぞれ調製されたキメラモノマーを含むキメラヘテロ多量体接着体を投与する工程を包含する。細胞外ドメインは、好ましくは、以下のヘテロ多量体レセプターから選択される:Axl、Rse、上皮成長因子（EGF）レセプター、肝細胞成長因子（HGF）レセプター、IL-2レセプター、c-mer、A1-1、EPH、TrkA、TrkB、TrkC、TNF、IL-10、CRF2-4、RXR、RON、AChRα/δ、TRα/RXRα、Trα/DR4、Trα/MHC-TRE、TRα/ME、Trα/F2、KDR/FLT-1、FLT/VEGF、VEGF121/165、Arnt/Ahr、CGA/CGB、EGFR/p185-neu、プロラクチンレセプター（PRL）、Ｔ細胞レセプター（TCR）、線維芽細胞成長因子（FGF）、およびCakレセプター（Kishimoto,T.ら（1994）Cell 76:253-262;Kendall,R.L.ら（1996）Biochem Biophys.Res.Comm.226:324-328;Chang,W.-P.およびClevenger,C.V.（1996）PNAS USA 93:5947-5952;Lala,D.S.ら（1996）Nature 383:450-453;Collesi,C.ら（1996）Mol.Cell.Biol.16:5518-5526;Tzahar,E.ら（1996）Mol.Cell.Biol.16:5276-5287;Shtrom,S.S.およびHall,Z.W.（1996）J.Biol.Chem.271:25506-25514;Nagaya,T.ら（1996）Biochem.Biophys.Res.Comm.226:426-430;Dendall,R.L.ら（1996）Biochem.Biophys.Res.Comm.226:324-328;Kainu,T.ら（1995）Neuroreport 6:2557-2560;Yoo,S.H.およびLewis,M.S.（1996）J.Biol.Chem.271:17041-17046;Murali,R.ら（1996）PNAS USA 93:6252-6257;Dietrich J.ら（1996）J.Cell Biol.132:299-310;Tanahashi,T.ら（1996）J.Biol.Chem 271:8221-8227;およびPerez,J.L.ら（1996）Oncogene 12:1469-1477））。細胞外ドメインは、より好ましくは、以下から選択されるレセプターに由来する:IL-6/gp130、IL-11/gp130白血病抑制因子（LIF）/gp130、カルジオトロフィン-1/gp130（CT-1）、IL-11/gp130、繊毛状の神経向性因子CNTF/gp130、オンコスタチンＭ（OSM）/gp130、インターフェロンγ、およびインターフェロンα、β（Kishimoto,T.ら（1994）,前出、Taga,T.（1996）J.Neurochem.67:1-10;Pennica,D.ら（1995）J.Biol.Chem.270:10915-10922;Marsters,S.A.（1995）PNAS USA 92:5401-5405;およびWollert,K.C.ら（1996）J.Biol.Chem.271:9353-9545）。最も好ましくは、細胞外ドメインは、レセプターのErbBファミリーから選択される。
処置の方法の実施態様は、疾患状態、または免疫学的傷害、ガン、および神経学的障害のような状態を含む。
ヘテロ接着体がErbB2/ErbB3-IgまたはErbB2/ErbB4-Igヘテロ接着体である実施態様において、処置の方法は、炎症性の疾患、ガン、神経芽細胞腫および末梢神経学のような神経学的障害、心臓肥大のような心臓障害からなる群から選択される。
本発明はさらに、治療的に有効な量のキメラヘテロ多量体接着体（例えば、ErbB2/3-IgGまたはErbB2/4-IgG）を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物を処置するための方法を提供する。例えば、哺乳動物は、神経学的障害または細胞増殖性疾患を罹患し得る。哺乳動物は、HRGレベル／生物学的活性における（例えば、ガンにおける）減少から恩恵を受け得る動物である。
別の局面において、本発明は、薬学的組成物を含む。本発明の１つの実施態様において、薬学的組成物は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体を含み、このヘテロ接着体１）は、ECDまたは天然のヘテロ多量体レセプターのECDの結合フラグメントを含み、そして２）は、天然のヘテロ多量体レセプターのECDと結合するリガンドのアンタゴニストである。
本発明の別の実施態様において、薬学的組成物は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体に対する抗体を含み、この抗ヘテロ接着体抗体１）は、ECDまたは天然のヘテロ多量体レセプターのECDの結合フラグメントを含み、そして２）は、天然のヘテロ多量体レセプターのECDに結合し、そして天然のヘテロ多量体レセプターのECDと結合するリガンドのアンタゴニストである。
本発明のなお別の実施態様において、薬学的組成物は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体に対する抗体を含み、この抗ヘテロ接着体抗体１）は、ECDまたは天然のヘテロ多量体レセプターのECDの結合フラグメントを含み、そして２）は、天然のヘテロ多量体レセプターのECDに結合し、そして天然のヘテロ多量体レセプターのECDと結合するリガンドのアゴニストである。
さらに別の局面において、本発明は、容器、容器上のラベル、および容器内に含まれる組成物を含有する製品を含む。本発明の１つの実施態様において、組成物は、本発明のキメラヘテロ多量体接着体組成物を含み、このヘテロ接着体は、リガンドのアンタゴニストである。組成物は、リガンドの天然のヘテロ多量体レセプターへの結合をアンタゴナイズするために有効であり、そして容器上のラベルは、組成物がリガンドの天然のヘテロ多量体レセプターへの結合をアンタゴナイズするために使用され得ることを示す。好ましい実施態様において、キメラヘテロ多量体接着体は、ErbB2/ErbB3-IgまたはErbB2/ErbB4-Igからなる群より選択される。
製品の別の実施態様において、組成物は、抗キメラヘテロ多量体接着体抗体を含み、この抗体は、リガンドのアンタゴニストである。組成物は、リガンドの天然のヘテロ多量体レセプターへの結合をアンタゴナイズするために有効であり、そして容器上のラベルは、組成物がリガンドの天然のヘテロ多量体レセプターへの結合をアンタゴナイズするために使用され得ることを示す。好ましい実施態様において、抗キメラヘテロ多量体接着体抗体は、ErbB2/ErbB3-IgまたはErbB2/ErbB4-Igからなる群より選択されるキメラヘテロ接着体に対して惹起される抗体である。
製品のさらに別の実施態様において、組成物は、抗キメラヘテロ多量体接着体抗体を含み、この抗体は、リガンドのアゴニストである。組成物は、リガンドの天然のヘテロ多量体レセプターを活性化するために有効であり、そして容器上のラベルは、組成物が天然のヘテロ多量体レセプターを活性化するために使用され得ることを示す。好ましい実施態様において、抗キメラヘテロ多量体接着体抗体は、ErbB2/ErbB3-IgまたはErbB2/ErbB4-Igからなる群より選択されるキメラヘテロ接着体に対して惹起される抗体である。
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を考慮して当業者に明白である。
【図面の簡単な説明】
図１は、キメラホモダイマーおよびヘテロダイマーのErbBファミリーの図である。キメラの細胞外ドメイン（ECD）および免疫グロブリン領域（Fc）が示される。細胞外ドメインは、天然のヘテロ多量体レセプター由来であり、そして組換え手段によって多量体化ドメインである免疫グロブリン領域に融合される。
図２は、キメラ免疫接着体の結合分析を示すグラフプロットである。ホモダイマーErbB3-IgGおよびErbB4-IgGは、125I-HRGに特異的に結合し得た。ここで、識別可能な結合は、ErbB2-IgG構築物で検出されなかった。
図3A〜3Dは、各キメラヘテロ接着体ErbB2/3-IgG、ErbB2/4-IgG、およびErbB3/4-IgGについての125I-ヘレグリン結合研究のグラフ結果である。図3Aに示されるように、高親和性HRG結合部位が、ErbB3/4-IgGではなく、ErbB2-含有ヘテロダイマーで検出され得た。
図4Aおよび4Bは、抗ErbB2モノクローナル抗体（2C4）結合研究のグラフ結果であり、ここでキメラErbBホモダイマーの結合活性は、2C4の存在下でのキメラErbBヘテロダイマーの結合活性と比較される。
図５は、ErbB-IgGタンパク質の、乳ガン細胞株MCF7におけるHRG依存性チミジン取り込みを阻害する能力を示す棒グラフである。種々の濃度の、異なるErbB-IgGタンパク質を１nMのrHRGと共にインキュベートし、次いでMVF7細胞の血清を枯渇させた単層培養物に添加した。DNA合成を測定するために、細胞を3H-チミジンで標識した。HRG結合し得るレセプター融合体は、用量に関連する様式で、HRG媒介分裂促進応答を阻害した。ヘテロダイマーのIgG、ErbB3/2-IgG、およびErbB4/2-IgGは、それらの対応するホモダイマー融合タンパク質より有効であった。
図６は、ErbB2と、ErbB3またはErbB4との相互作用についての可能性のあるモデル（「接触」モデル（左）および「立体配置」モデル（右））を示す図である。
詳細な説明
本発明のキメラヘテロ多量体接着体、それらを作製する方法、およびそれらの使用が記載される前に、本発明が、このような化合物および方法が当然変化し得るように、記載される特定の接着体またはプロセスに限定されないことが理解されるべきである。本明細書中において使用される術語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、限定することを意図されないこともまた理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の請求の範囲によってのみ限定されるからである。
Ｉ.定義
一般に、以下の語または語句は、説明、実施例、およびクレームにおいて使用される場合、指示された定義を有する。
他に指示されない限り用語「ErbB」は、本明細書中で使用される場合、任意の１つ以上の哺乳動物のErbBレセプター（すなわち、ErbB1または上皮性成長因子（EGF）レセプター;ErbB2またはHER2レセプター;ErbB3またはHER3レセプター;ErbB4またはHER4レセプター;および将来同定されるべきこのクラスＩのチロシンキナーゼファミリーの任意の他のメンバー）をいい、そして「erbB」は、これらのレセプターをコードする哺乳動物のerbB遺伝子をいう。
「HRG」（または「ヘレグリン」）は、本明細書中において天然の配列のHRG（米国特許出願第60/021,640,PR1043号、前出）の少なくとも１つの生物学的特性（以下に定義されるような）を有する任意のポリペプチド配列であると定義される。この定義は、天然のHRG供給源（例えば、ヒトMDA-MB-175細胞）から、または別の供給源（例えば、別の動物種）から単離されたポリペプチドだけでなく、組換えまたは合成方法によって調製されるポリペプチドもまた含む。それはまた、機能的な誘導体、対立遺伝子変異体、天然に存在するイソ型、およびその類似体を含む変異体形態を含む。ときにHRGは、哺乳動物から単離された内因性HRGポリペプチドをいう「天然のHRG」である。HRGはまた、それが天然のHRG（例えば、ヒトHRG）と同じアミノ酸配列を有するならば、「天然の配列のHRG」であり得る。しかし、「天然の配列のHRG」は、組換えまたは合成手段によって生成されるポリペプチドを含む。「成熟HRG」は、可溶性であるか、または細胞から放出される（すなわち、アミノ酸末端配列を欠いている）分泌されたHRGである。HRG「イソ型」は、HRGのＮ末端ドメインの少なくとも一部を含む、天然に存在するポリペプチドである。
本明細書中において使用される用語「免疫接着体」は、細胞表面レセプターの細胞外ドメイン（接着体部分）のようなタンパク質の結合ドメインを、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と結合している抗体様分子をいう。免疫接着体は、ヒト抗体の多くの有用な化学的および生物学的特性を有し得る。免疫接着体は、適切なヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常ドメイン（Fc）配列に結合された望ましい特異性を有してヒトタンパク質配列から構築され得、目的の結合特異性は、全体的なヒト成分を用いて達成され得る。そのような免疫接着体は、患者に対して最小に免疫原性であり、そして慢性的な使用または繰り返しの使用について安全である。
文献において報告される免疫接着体は、以下の融合体を含む:Ｔ細胞レセプター（Gascoigneら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2936-2940（1987））;CD4（Caponら、Nature 337:525-531（1989）;Trauneckerら、Nature 339:68-70（1989）;Zettmeisslら、DNA Cell Biol.USA 9:347-353（1990）;およびByrnら、Nature 344:667-670（1990））;L-セレクチンレセプターまたはホーミングレセプター（Watsonら、J.Cell.Biol.110:2221-2229（1990）;およびWatsonら、Nature 349:164-167（1991））;CD44（Aruffoら、Cell 61:1303-1313（1990））;CD28およびB7（Linsleyら、J.Exp.Med.173:721-730（1991））;CTLA-4（Lisleyら、J.Exp.Med.174:561-569（1991））;CD22（Stamenkovicら、Cell 66:1133-1144（1991））;TNFレセプター（Ashkenaziら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539（1991）;Lesslauerら、Eur.J.Immunol.27:2883-2886（1991）;およびPeppelら、J.Exp.Med.174:1483-1489（1991））;NPレセプター（Bennettら、J.Biol.Chem.266:23060-23067（1991））;インターフェロンγレセプター（Kurschnerら、J.Biol.Chem.267:9354-9360（1992））;4-1BB（Chalupnyら、PNAS USA 89:10360-10364（1992））、ならびにIgEレセプターα（RidgwayおよびGorman,J.Cell.Biol.115,Abstract No.1448（1991））。
治療的使用について記載されたホモ多量体免疫接着体の例は、HIVの細胞表面CD4への結合をブロックするためのCD4-IgG免疫接着体を含む。CD4-IgGを、分娩の直前に妊娠中の女性に投与したPhase I臨床試験から得たデータは、この免疫接着体が、HIVの母胎-胎児転移の防止において有用であり得ることを示唆する。Ashkenaziら、Intern.Rev.Immunol.10:219-227（1993）。腫瘍壊死因子（TNF）に結合する免疫接着体もまた、開発されている。TNFは、敗血性ショックの主要な媒介物であることが示されている前炎症誘発性サイトカインである。敗血性ショックのマウスモデルに基づいて、TNFレセプター免疫接着体は、敗血性ショックを処置することにおける臨床的な使用のための候補としての見込みを示した（Ashkenazi,Aら（1991）PNAS USA 88:10535-10539）。免疫接着体はまた、非治療的使用を有する。例えば、L-セレクチンレセプター免疫接着体は、末梢リンパ節の高内皮細静脈（HEV）の組織化学的染色のための試薬として使用された。この試薬はまた、L-セレクチンリガンドを単離し、そして特徴づけるために使用された（Ashkenaziら、前出）。
免疫接着体構造の２つの腕が異なる特異性を有するならば、免疫接着体は、二重特異的抗体との類似によって「二重特異的免疫接着体」と呼ばれる。Dietschら、J.Immunol.Methods 162:123（1993）は、接着体分子、E-セレクチン、およびP-セレクチンの細胞外ドメインと組み合わせるこのような二重特異的免疫接着体を記載し、この各セレクチンは、天然において異なる細胞型において発現される。結合研究は、そのように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、それが誘導された一次特異的免疫接着体と比較して、骨髄細胞株に結合する増強した能力を有することを示した。
用語「ヘテロ接着体」は、表現「キメラヘテロ多量体接着体」と交換可能に使用され、そしてキメラ分子の複合体（アミノ酸配列）をいい、ここで各キメラ分子は、各ヘテロ多量体レセプターモノマーの細胞外ドメインのような生物学的に活性な部分を、多量体化ドメインに組み合わせる。「多量体化ドメイン」は、ヘテロ多量体複合体内におけるキメラ分子の安定な相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラヘテロ多量体のキメラ分子間の分子内ジスルフィド結合を形成する遊離のチオールを介して相互作用し得る。多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含み得る。本発明において有用な可能性のある多量体化ドメインは、米国特許出願第07/440,625,P565P1号（本明細書中で参考として援用される）に見出され、ここでハイブリッド免疫グロブリンが記載される。さらに、多量体化領域は、立体的な相互作用が、安定な相互作用を促進するだけでなく、さらにモノマーの混合物由来のホモダイマーにわたるヘテロダイマーの形成をも促進するように、操作され得る。例えば、米国特許出願第08/399,106,P0927号（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと、ここで「空洞中の隆起（protuberance-into-cavity）」ストラテジーは、ヘテロオリゴマー形成のための第１のペプチドおよび第２のペプチドの間の界面について開示される。「隆起」は、小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）を有する第１のポリペプチドの界面と置き換えることによって構築される。隆起と等しいかまたは類似のサイズの代償的な「空洞」は、必要に応じて第２のポリペプチドの界面上に、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって作製される。免疫グロブリン配列は、必ずではないが、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のサブタイプ、IgA、IgE、IgD、またはIgMだが、好ましくはIgG1またはIgG3から得られ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープタグ」は、「タグポリペプチド」に融合される全キメラヘテロ接着体を含むキメラポリペプチド、またはそのフラグメントをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するに十分な残基を有し、さらにそれがキメラヘテロ接着体の活性を妨害しないように十分短い。タグポリペプチドは、好ましくはそれに対する抗体が、他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に少なくとも６のアミノ酸残基、そして通常少なくとも約８〜50の間のアミノ酸残基（好ましくは約９〜30の間の残基）を有する。本発明の１つの実施態様は、エピトープタグに結合されたキメラヘテロ接着体を含み、そのタグは、サンプル内の接着体を検出するか、またはサンプルから接着体を回収するために使用される。
「単離されたキメラヘテロ多量体接着体」、「高度に精製したキメラヘテロ多量体接着体」、および「実質的に同質なキメラヘテロ多量体接着体」は、交換可能に使用され、そして供給源から精製されたか、または組換えもしくは合成方法によって調製され、そしてクロマトグラフ技術または他の精製技術（例えば、Coomassieブルー、または好ましくは銀染色を用いる非還元または還元条件下でのSDS-PAGE）によって同質の他のペプチドまたはタンパク質を十分に含まない接着体を意味する。本明細書中で同質性は、他の供給源のタンパク質での約５％より少ないコンタミネーションを意味する。本明細書中（下記）に開示されるように、本発明のErbB2/3-IgGまたはErbB2/4-IgGキメラヘテロ接着体は、ホモダイマーと比較して実質的に高い親和性で結合するので、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの混合物の使用はまた、本発明の有用な実施態様であると考えられる。用語「キメラヘテロ多量体接着体」、「キメラヘテロ接着体」、および「CHA」は、本明細書中で交換可能に使用される。
「生物学的特性」は、「キメラヘテロ多量体接着体」と組み合わせて用いられる場合、リガンドに結合する能力、および天然のレセプターに結合するリガンドのアンタゴニストとしての機能を意味する。「生物学的特性」は、「キメラヘテロ多量体接着体に対する抗体」と組み合わせて用いられる場合、抗体がリガンドのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用するように、接着体においてコードされる細胞外ドメインまたは天然のヘテロ多量体レセプターの細胞外ドメインと結合する能力を意味する。
「生物学的活性」は、ErbBヘテロ接着体のようなキメラヘテロ接着体と組み合わせて用いられる場合、以下によるヘレグリンレセプター活性化のアンタゴニストとして機能すること（例えば、ErbB2、ErbB3、および／またはErbB4レセプターの活性化をアンタゴナイズ化すること）を含む:細胞膜関連ヘレグリンまたは分泌されたヘレグリンに結合すること;それらの表面上でのErbBレセプターを発現する細胞の成長の阻害;これらのレセプターを発現する細胞（例えば、SK-BR-3細胞、Schwann細胞、肝細胞、グリア芽腫細胞、上皮細胞（例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、膵臓、結腸、および直腸における細胞）、筋細胞、星状細胞、および／または稀突起膠細胞）の分化および／または増殖の阻害;レセプター結合（例えば、ErbB2/3、ErbB2/4、ErbB3、および／またはErbB4レセプターへの結合）の阻害;分裂促進活性の阻害;神経筋接合部でのアセチルコリンレセプターの合成を阻害すること;ならびにニューロン、および筋肉、神経、または腺性細胞間のシナプス接合部の形成を阻害すること。
「生物学的活性」は、アゴニスト抗ErbBヘテロ接着体抗体のようなアゴニストキメラヘテロ接着体抗体と組み合わせて用いられる場合、以下のアゴニストとして機能することを含む:ヘレグリンレセプターの活性化（例えば、ErbB2、ErbB3、および／またはErbB4レセプターの活性化）;レセプター結合および活性化（例えば、ErbB2/3、ErbB2/4、ErbB3、および／またはErbB4レセプターへの結合）;それらの表面上でErbBレセプターを発現する細胞の成長を促進すること;これらのレセプターを発現する細胞（例えば、SK-BR-3細胞、Schwann細胞、肝細胞、グリア芽腫細胞、上皮細胞（例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、膵臓、結腸、および直腸における細胞）、筋細胞、星状細胞、および／または稀突起膠細胞）の分化および／または増殖を促進すること;分裂促進活性を促進すること;神経筋接合部でのアセチルコリンレセプター合成を促進すること;ならびにニューロン、および筋肉、神経、または腺性細胞間のシナプス接合部の形成を促進すること。
キメラヘテロ多量体接着体に関する「パーセントアミノ酸配列同一性」は、必要であるなら最大のパーセント配列同一性を達成するように配列を並べ、そしてギャップを導入することの後、天然のヘテロ多量体レセプターのモノマーの細胞外ドメイン配列における残基と同一の候補細胞外ドメイン配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義され、そして配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない。Ｎ末端、Ｃ末端、または接着体配列中での内部伸長、欠失、または挿入は、配列同一性または相同性に影響を及ぼすように解釈される。
用語「疾患状態」は、細胞もしくは体機能系もしくは器官の損傷、休止、または障害が起こる細胞または全哺乳動物の生理学的状態いう。
用語「ガン」および「ガン性」は、代表的には調節されない細胞増殖によって特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態をいうか、またはそれを描写する。ガンの例は、ガン、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない。このようなガンのよリ具体的な例は、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃ガン、膵臓ガン、グリア芽細胞腫および神経繊維腫症のようなグリア細胞ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝細胞腫、乳ガン、大腸ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、腎ガン、前立腺ガン、産卵口ガン、甲状腺ガン、肝ガン、および種々の型の頭部および頸部ガンを含む。ErbB-Igヘテロ接着体における本発明のキメラヘテロ接着体、処置されるべきガンは、好ましくはErbBレセプター発現細胞のガン性増殖（例えば、乳房、卵巣、前立腺、膵臓、および結腸細胞のガン性増殖）である。
用語「炎症性障害」は、物理学的、化学的、または生物学的薬剤によって引き起こされる傷害または異常な刺激に応答して、発症した血管および隣接した組織において生じる、以下を含む細胞学的および組織学的反応の動的な複合からなる基本的な病理学的プロセスをいう:１）局所的反応および生じる形態学的変化、２）傷害性物質の破壊または除去、３）修復および治癒につながる応答。それらは、本発明によって処置できる炎症性傷害であり、ここで炎症はサイトカイン誘導障害（例えば、インターロイキンおよび白血病阻害性因子サイトカインと関連するもの）と関連する。そのような障害は、血小板新生、マクロファージ増殖および分化、造血性前駆体の増殖などにおける異常性を含む。
用語「神経学的障害」は、代表的には神経細胞の増殖、分化、または細胞のシグナル伝達によって特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態をいうか、またはそれを描写する。神経学的障害の例は、神経繊維腫症および末梢神経病理を含むが、これらに限定されない。
用語「心臓の障害」は、代表的には心臓細胞の増殖および分化によって特徴づけられる、哺乳動物における生理状態をいうか、またはそれを描写する。心臓障害の例は、心臓肥大および心不全（うっ血性心不全、心筋梗塞、および不整脈を含む）を含むが、これらに限定されない。「心不全」は、心臓が、組織の代謝の要求のために必要とされる速度で血液を汲み出さない、心臓機能の異常性をいう。
「疾患状態を決定すること」は、患者の生存の可能性、ならびに新生物性疾患（特に、乳房、卵巣、腹、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、および膀胱ガン）の再発する時間を決定する行為をいう。特に、本発明の抗体（本発明のキメラヘテロ接着体を惹起し、そして細胞外ドメインと相互作用し得る）は、ガンを罹患している患者から採取したガン性組織におけるヘテロ多量体レセプター（例えば、ErbB2、ErbB3、またはErbB4だが、通常はErbB2）の過剰発現を定量するために使用され得る。これはまた「ガンを罹患している患者について処置の適切な治療を決定すること」として言及され得る。例えば、ErbB2過剰発現、または増加した量のErbB2/3もしくはErbB2/4細胞表面レセプターを有することによって特徴づけられるそれらの患者は、他の診断因子によって指摘され得る他よりも積極的な処置（例えば、化学療法または放射線療法の高用量）を必要とし得る。この段階は、広範な管内のガンを含むインサイチュでの高いグレードの管ガンを罹患している患者を診断することを含む。例えば、Disisら、Cancer Research,54:16-20（1994）を参照のこと。
用語「サンプル」は、患者由来の組織、体液、または細胞をいう。通常、組織または細胞は、患者から採取されるが、インビボでの診断もまた意図される。固形腫瘍の場合、組織サンプルは、外科的に除去された腫瘍から採取され得、そして従来技術によって試験するために調製され得る。リンパ腫および白血病の場合、リンパ球、白血病性細胞、またはリンパ組織が得られ、そして適切に調製される。患者の他のサンプル（尿、涙、血清、脳脊髄液、糞便、痰、細胞抽出物など）はまた、特定の腫瘍について有用である。
表現「標識した」は、本明細書中で用いられる場合、検出可能な化合物または組成物に、直接的または間接的に結合される分子（例えば、ErbB2/3-IgGのようなキメラヘテロ接着体）をいう。標識は、それ自身によって検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）か、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得る。
「固相」によって、目的の試薬（例えば、ErbB2/3-IgG、ErbB2/4-IgG、またはその抗体）が接着し得る非水性マトリックスが意味される。本明細書中に含まれる固相の例は、ガラス（例えば、制御孔ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコンから部分的または全体的に形成されるものを含む。特定の実施態様において、文脈に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを含み得;他において、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフカラム）である。この用語はまた、米国特許第4,275,149号に記載のもののような分散した粒子の不連続な固相を含む。
語句「ErbBレセプターを活性化すること」は、ErbBレセプターの細胞内キナーゼドメインが、チロシン残基をリン酸化することを引き起こすという働きをいう。一般に、これは、ErbB2/3-Igに惹起される抗体の結合を含み、その抗体は１つ以上のこれらのレセプターのキナーゼドメインを活性化し、そしてそれによって１つ以上のレセプターにおけるチロシン残基のリン酸化および／またはさらなる基質ポリペプチド（単数または複数）におけるチロシン残基のリン酸化を生じる２つ以上のErbBレセプターのレセプター複合体（例えば、ErbB2/ErbB3またはErbB2/ErbB4複合体）に結合することによって、ヘレグリンのアゴニストとして作用するその能力について試験される。ErbBレセプターのリン酸化は、下記のチロシンリン酸化アッセイを用いて定量され得る。語句「ErbBレセプターを阻害すること」は、キメラErbBヘテロ接着体またはそれに対して惹起されるアンタゴニスト抗体のアンタゴニスト特性をいい、それは、ErbBレセプターに結合される場合、レセプターの活性化を妨げる（すなわち、キナーゼ機能を阻害する）。
表現「細胞の生存を減少すること」は、インビトロまたはインビボのいずれかで、キメラErbB-IgG（または、それに惹起されるアンタゴニスト抗体）に曝露されていない未処置の細胞に比較して、細胞の生存期間を減少させるという作用をいう。表現「減少した細胞の増殖」は、未処置の細胞と比較してインビトロまたはインビボのいずれかでキメラErbB-IgGに曝露された集団における細胞の数における減少をいう。
表現「細胞の生存を増加する」または「増大された細胞増殖」は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、未処理の細胞と比較して、本発明のキメラErbB-IgGに対して惹起されたアゴニスト抗体に曝された集団での、細胞の増加した存在または増加した細胞数をいう。細胞培養物中の細胞集団の増加または減少は、アゴニスト抗ErbB-IgG抗体への曝露の前または後に、細胞数を計数することによって検出され得る。増殖の程度は、コンフルエンシーの程度の顕微鏡試験によって定量され得る。細胞増殖はまた、細胞による3H-チミジンの取り込みによって、定量され得る。
「細胞分裂を促進すること」によって、最初の細胞とは異なる１つ以上の特性または機能の獲得または所有の程度を増大する作用が意味される（すなわち、細胞特殊化）。これは、細胞表現型の変化をスクリーニングする（例えば、細胞での形態学的変化を同定する）ことによって、検出され得る。細胞の分裂を促進することはまた、本明細書中では、例えば、成熟細胞に関連する特有タンパク質が合成される細胞成熟をいう。
「グリア細胞」は、中枢神経系および末梢神経系由来であり、そして乏希突起神経膠細胞、星状細胞、上衣細胞、または小膠細胞、ならびに神経節の随伴細胞および末梢神経繊維の周辺の神経鞘細胞から選択され得る。
「筋細胞」は、骨格、心臓、または平滑筋組織細胞を包含する。この用語は、分裂してより特殊化された筋細胞（例えば、筋原細胞）を形成する細胞を包含する。
「単離された核酸」は、通常、天然の供給源に関連づけられている少なくとも１つの供給源核酸を含まないDNAまたはRNAであり、そして好ましくは、任意の他の哺乳動物RNAまたはDNAを実質的に含まない。語句「通常関連づけられている少なくとも１つの供給源核酸を含まない」は、核酸が、供給源細胞または天然の細胞に存在するが、異なる染色体配置に存在するか、そうでなければ、通常は供給源細胞に認められない核酸配列に隣接して存在する場合を包含する。単離された核酸は、生物学的に活性なキメラヘテロ多量体接着体をコードするRNAまたはDNAであり、この各々の細胞外ドメインは、それが由来する天然のレセプターのモノマー細胞外ドメインと少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、なおさらに好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは90％、そして最も好ましくは95％の配列同一性を共有する。
「ストリンジェントな条件」は、（a）洗浄について低イオン強度および高温度（例えば、50℃での0.015MのNaCl/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のNaDodSO4（SDS）を使用するか、または（b）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドのような変性剤（例えば、42℃での、0.1％のウシ血清アルブミン／0.1％のフィコール／0.1％のポリビニルピロリドン／750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウムを含むpH6.5の50mMのリン酸ナトリウム緩衝液を含有する、50％（vol/vol）ホルムアミド）を使用する条件である。別の例は、42℃での、50％ホルムアミド、5×SSC（0.75ＭのNaCl、0.075Ｍのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト（Denhardt）溶液、超音波処理したサケ精子DNA（50μg/mL）、0.1％のSDS、および10％のデキストラン硫酸の使用であり、42℃での0.2×SSCおよび0.1％のSDS中での洗浄を伴う。
「適度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）に記載され、そして上記の記載よりよりも低いストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％SDS）の使用を含む。適度にストリンジェントな条件の例は、20％のホルムアミド、5×SSC（150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％のデキストラン硫酸、および20mg/mLの変性した剪断サケ精子DNAを含有する溶液中での、37℃で一晩のインキュベーション、その後の約37〜50℃での1×SSC中でのフィルター洗浄のような条件である。当業者は、温度、イオン強度などを調節するための方法、必要であればプローブの長さなどのようなファクターを適合させるための方法を認識している。表現「コントロール配列」は、特定宿主生物での作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列をいう。原核生物に適切なコントロール配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーターポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチド分泌に関与するプレタンパク質として発現されるときは、ポリペプチドのDNAに作動可能に連結される;それが配列の転写に影響するときには、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に作動可能に連結される;または、それが翻訳を促進するように配置されるときには、リボソーム結合部位がコード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されるDNA配列が連続的であり、そして分泌リーダーの場合には、連続しリーディング層（reading phase）に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、連続されるべきではない。連結は、従来の制限部位での連結によって完了される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実施方法に従って使用される。
HRG「アンタゴニスト」は、HRGエフェクター機能を妨げるか、または妨害する分子（例えば、HRGによるErbBレセプターの結合および／または活性化を妨げるかまたは妨害する分子）である。このような分子は、例えば、本明細書中に開示されているチロシンリン酸化アッセイでのHRGによるErbBレセプターの活性化を競合的に阻害するそれらの能力についてスクリーニングされ得る。好ましいアンタゴニストは、他のヘレグリンポリペプチドとErbBレセプター（単数または複数）との相互作用を実質的に妨害しないものである。HRGアンタゴニストの例は、本発明のErbB2/3-IgまたはErbB2/4-Igキメラヘテロ接着体に対する中和抗体を含む。
用語「抗体」は最も広義に使用され、そして特に、単一の抗キメラヘテロ接着体（例えば、抗ErbB2/3-IgGまたは抗ErbB2/4-IgG）モノクローナル抗体、およびポリエピトープ特異性を有する抗キメラヘテロ接着体抗体成分（中和および非中和抗体を含む）を含む。本明細書中での目的の抗体は、先の背景技術の章に記載されているような、他のヘテロ多量体レセプターと有意に交差反応しないものであり、従って、ErbB2/3またはErbB2/4のようなヘテロ多量体レセプターに「特異的に結合する」ものである。このような実施態様では、抗体の非ErbBレセプターへの結合の程度は、例えば、放射免疫沈降法（RIA）によって測定される場合は、10％未満である。
本明細書中で使用されているように、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体のことであり、すなわち、その集団に含まれる個別の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異体を除いて同一である。モノクローナルは高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。さらに典型的に異なる決定基（エピトープ）を指向される異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製に比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。
本明細書中でモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、定常ドメインを有する抗キメラヘテロ接着体抗体（例えば、「ヒト化」抗体）の可変（超可変を含む）ドメイン、または重鎖を有する軽鎖、または別の種由来の鎖を有する１つの種由来の鎖、または、起源の種または免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスの名称に関係なく異種タンパク質を有する融合体、ならびに抗体フラグメント（例えば、Fab、F（ab）2およびFv）をスプライシングすることによって産生される、ハイブリッド抗体および組み換え抗体を含む（例えば、米国特許第4,816,567号、ならびにMageおよびLamoyiのMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications,79-97頁（Marcel Dekker,Inc.）,New York（1987）を参照のこと）。
従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特性を示し、そして任意の実施方法による抗体の産生を要求するようには構築されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein,Nature 256:495（1975）に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成され得るか、または組み換えDNA法によって作成され得る（米国特許第4,816,567号）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554（1990）に記載されている技術を用いて作成されたファージライブラリーから単離され得る。
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を有するそのフラグメント（例えば、Fv、Fab、Fab’、F（ab）2または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定基領域（CDR）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のCDR由来の残基によって置換されていヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒトFR残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてだけではなく、移入されたCDRまたはFR配列にも認められない残基を含み得る。これらの改変は、さらに抗体能力を改良および最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、代表的には２つの実質的に全ての可変領域を含み、そのCDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、FR残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリコンセンサス配列の残基である。ヒト化抗体はまた必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む。
「中和抗体」によって、天然の配列HRGのエフクター機能をブロックするかまたは有意に低下させ得る、本明細書中で定義されているような抗体分子が意味される。例えば、中和抗体は、本明細書中に記載されているチロシンリン酸化アッセイでErbBレセプターを活性化するHRGの能力を阻害するかまたは低下させ得る。中和抗体はまた、本明細書中に開示されている細胞増殖アッセイで、HRGの融資分裂促進活性をブロックし得る。
「処置」は、治療的処置および予防または防御処置の両方をいう。治療の必要なものには、すでに障害を有するもの、ならびに障害を有する傾向にあるもの、または障害が予防されるべきものを含む。
処置の目的について「哺乳動物」は、ヒトを含む、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような家畜動物および酪農動物、ならびに動物園の動物、スポーツ動物、またはペット動物のような、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、本発明では哺乳動物はヒトである。
「薬学的に受容可能な」キャリア、賦形剤、または安定剤は、それに曝される細胞または哺乳動物に対して使用される投与量および濃度で、毒性ではないものである。しばしば、生理学的に受容可能なキャリアは、水性のpH緩衝溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例は、リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸のような抗酸化剤;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストランを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成カウンターイオン;および／またはTweenTM、ポリエチレングリコール（PEG）、およびPluronicsTM、ポリエチレングリコール（PEG）、およびPluronicsTMのような非イオン性界面活性剤を包含する。
II.発明の実施の形態
１.キメラヘテロ多量体接着体の産生
本発明のキメラヘテロ接着体は、好ましくは、宿主細胞での発現およびそれからの単離によって産生される。一般に宿主細胞は、本発明の核酸で形質転換される。好ましくは核酸は、発現ベクターに組み込まれる。本明細書中でのベクターのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、E.coli、Bacillus、Pseudomonas、および他の細菌株）、酵母、および他の真核微生物、およびより高度な真核生物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞および他の哺乳動物細胞）である。細胞はまた生存している動物中（例えば、ウシ、ヤギ、またはヒツジ中）に存在し得る。昆虫細胞もまた使用され得る。クローニングおよび発現の方法論は当該分野で周知である。
ErbB2-IgG、ErbB3-IgG、および／またはErbB4-IgGのようなキメラヘテロ多量体の発現を得るために、発現ベクターが形質転換またはトランスフェクションによって宿主細胞へ導入され、得られた組み換え宿主細胞は従来の栄養培地中で培養され、プロモーターを誘導するか、組み換え細胞を選択するか、またはErbB-IgG DNAを増幅するために適切に改変される。一般に、インビトロでの哺乳動物細胞の培養の生産性を最大にするための基本原理、プロトコール、および実施技術は、Mammlian Cell Biotechnolgy:a Practical Approach,M.Butler編（IRL Press,1991）に見出され得る。
用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、本明細書中では互換的に使用され、細胞へのDNA導入のプロセスをいう。形質転換またはトランスフェクション後に、本発明の核酸が宿主細胞のゲノムへ組み込まれ得るか、または染色体外エレメントとして存在し得る。原核生物細胞または実質的に細胞壁構築物を含む細胞が宿主として使用される場合、DNAでの細胞のトランスフェクションの好ましい方法は、Cohen,S.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,69:2110-2114（1972）に記載されている、カルシウム処理法、または、Chungら、Nuc.Acids.Res.16:3580（1988）のポリエチレグリコール法である。宿主細胞として酵母が使用される場合、トランスフェクションは、一般に、Hinnen,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:1929-1933（1978）によって教示されているように、ポリエチレングリコールを使用して達成される。しかし、哺乳動物細胞が宿主として使用されるときは、一般に、トランスフェクションは、Grahamら、Virology 52:546（1978）,Gormanら、DNA and Protein Eng.Tech 2:3-10（1990）のリン酸カルシウム沈降法によって実施される。しかし、核酸注入、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合のような、原核生物または真核生物細胞へのDNA導入のための他の公知方法もまた、本発明での使用に適している。
ErbB2/3-IgまたはErbB2/4-Igのようなキメラヘテロ接着体をコードするDNAの哺乳動物細胞での一過発現のため提供される発現ベクターが、本発明に特に有用である。一般に、一過性の発現は、宿主細胞で効率的に複製され得る発現ベクターの使用を包含し、その結果、宿主細胞は、発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルに合成する。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性の発現系は、クローン化DNAによってコードされるポリペプチドの従来のポジティブ同定、ならびに、所望の生物学的または生理学的特性についてこのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
キメラヘテロ接着体は、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それはまた宿主細胞溶解物から回収される。第一の工程として、特定の破片（宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって回収され;必要に応じて、タンパク質が、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮され得、その後、以下から選択される１つ以上の精製手順によって、他の不純物からキメラヘテロ接着体が分離される:イムノアフィニティーカラムでの分画;イオン交換カラムでの分画;硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降;逆相HPLC;シリカでのクロマトグラフィー;ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー;カチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー;等電点クロマトフィー;SDS-PAGE;および、ゲル濾過。
ErbB-IgGのようなエピトープタッグキメラヘテロ多量体の調製は、融合ポリペプチドを吸着させるためのエピトープに対する抗体を含有するイムノアフィニティーカラムを使用して精製を促進する。ウサギポリクローナル抗ErbBカラムのようなイムノアフィニティーカラムが、それをErbB免疫エピトープへ結合することによって、ErbB-IgGを吸着さるために使用され得る。
キメラヘテロ接着体に含まれる天然の配列の細胞外ドメインのアミノ酸配列の変異体が、天然の細胞外ドメインのDNA配列への適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または、所望のキメラヘテロ接着体モノマーポリペプチドのインビトロ合成によって調製される。このような変異体は、例えば、キメラヘテロ接着体のアミノ酸配列中の残基の欠損形態、または挿入もしくは置換を包含する。
上記記載のような天然の配列でのバリエーションは、任意の技術、ならびに米国特許第5,364,934号に記載されている保存および非保存的変異についてのガイドラインを用いて作成され得る。特に表１、ここで変更、付加または欠損についてのアミノ酸の選択についてのガイダンスのためのこの表の考察を参照のこと。
天然の配列の細胞外ドメイン（例えば、ErbB由来）のアミノ酸の変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定されないが、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列の変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発、PCR変異誘発、および天然の配列ErbB2、-3、および／または-4のより初期に調製された変異バージョンまたは非変異バージョンのカセット変異誘発による調製を含む。
キメラアミノ酸配列の好ましい型は、多量体化ドメイン（免疫グロブリン定常領域など）のような異種ポリペプチドに連結された、ErbBモノマー由来のような細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。このような配列は、組み換えDNA技術を使用して構築され得る。あるいは、異種ポリペプチドは、ヘテロ二官能性架橋剤の使用のような、当該分野で周知の技術によって細胞外ドメインポリペプチドへ共有結合され得る。カップリング剤の例は、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオール）プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートHCl）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）アルデヒド（例えば、グルタールアルデヒド）、bis-アジド化合物（例えば、ビス-（p-アジドベンゾール）ヘキサンジアミン）、bis-ジアゾニウム誘導体（例えば、bis-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（tolyene）2,6-ジイソシアネート）、およびbis-活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を包含する。
１つの実施態様において、キメラヘテロ接着体ポリペプチドは、キメラヘテロ接着体のモノマーと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を有する。キメラヘテロ接着体のこのようなエピトープタグ化形態は、その存在がタグポリペプチドに対して標識された抗体を使用して検出され得るので有用である。また、エピトープタグの供給は、キメラヘテロ接着体を、抗タグ抗体を使用するアフィニティー精製により容易に精製されることを可能にする。タグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該分野で周知である。例として、flu HAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5（Fieldら、Mol.Cell.Biol.8:2159-2165（1988））;c-mycタッグおよびそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7、および9E10抗体（Evanら、Molecular and Cellular Biology 5（12）:3610-3616（1985））;および、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグおよびその抗体（Paborskyら、Protein Engineering 3（6）:547-553（1990））が挙げられる。
本発明のキメラヘテロ接着体を調製する場合、天然のヘテロ多量体レセプターの細胞外ドメインをコードする核酸が、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸へＣ末端を融合される。しかし、Ｎ末端融合体もまた可能である。代表的には、このような融合体は、コードされるキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的な活性ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを保持している。融合体はまた定常ドメインのFc部分のＣ末端、重鎖のCH1のすぐＮ末端、または軽鎖の対応する領域に対して作成される。得られたDNA融合構築物は、適切な宿主細胞中で発現される。
キメラ多量体の共有修飾の別の型は、多量体のモノマーポリペプチドの、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー）の１つへの連結を含む。キメラ多量体はまた、例えば、コアセルベーション法または界面多量体法（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタシレート）マイクロカプセル）によって、コロイド薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中で、調製されたマイクロカプセルに封入され得る。このような技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences,第16編、Oslo,A.編（1980）に開示されている。
一般に、本発明のErbBキメラ多量体は、任意の１つ以上の以下の特性を有する:（a）ヘレグリンのような、ニューレグリンへの結合のために、天然ヘテロ多量体レセプターと競合する能力;（b）ErbB2-IgG/ErbB3-IgGおよび／またはErbB2-IgG/ErbB4-IgG複合体を形成する能力;および、（c）天然ヘテロ多量体レセプターの活性化を、ヘレグリンを天然レセプターの環境から枯渇させることによって、阻害する能力であって、そのことによって、ErbB2およびErbB3レセプターおよび／またはErbB2およびErbB4レセプターを発現する細胞の増殖を阻害する。
特性（a）をスクリーニングするために、キメラErbB多量体接着体のγ-ヘレグリンへ結合する能力が、容易にインビトロで測定され得る。例えば、これらのレセプターの免疫接着体型は産生され得（下記を参照のこと）、そしてErbB2/3-IgまたはErbB2/4-Igヘテロ免疫接着体は固体相（例えば、ヤギ抗ヒト抗体でコートされたアッセイプレートに）に固定され得る。次に、HRGの固定化免疫接着体への結合能力が、例えば、他のヘレグリン分子による競合置換を測定することによって、測定され得る。さらなる詳細については、下記の実施例に記載されている125I-HRG結合アッセイを参照のこと。
特性（c）については、実施例に記載されている、MCF7細胞を用いるチロシンリン酸化アッセイが、ErbBレセプターの活性化についてのスクリーニング手段を提供する。本発明の別の実施態様では、第WO 95/14930号に記載されているKIRA-ELISAが、ErbBレセプターの活性化を阻害するErbBキメラヘテロ接着体の能力を、定性的および定量的に測定するために使用され得る。
ErbB2/3-IgまたはErbB2/4-Igのようなキメラヘテロ接着体の、ErbB2およびErbB3レセプターならびに／またはErbB2およびErbB4レセプターを発現する細胞の増殖を促進する能力は、細胞培養で容易に測定され得る。この実験に有用な細胞は、ATCCから入手可能なMCF7およびSK-BR-3細胞およびSchwann細胞を包含する（例えば、Liら、J.Neuroscience 16（6）:2012-2019（1996）を参照のこと）。これらの腫瘍細胞系は、細胞培養プレートにプレートされ、そしてそれに付着され得る。ErbBキメラヘテロ接着体の存在または非存在で、HRGリガンドが添加される。単層が洗浄され、クリスタルバイオレットで染色／固定され得る。従って、細胞増殖または増殖阻害が、記載のように定量され得る。
本発明が有用なキメラヘテロ接着体の調製に適用され得る他のヘテロ多量体レセプターは、以下を包含する:Ax1、Rse、表皮増殖因子（EGF）レセプター、肝細胞増殖因子（HGF）レセプター、IL-2、c-mer、Al-1、EPH、TrkA、TrkB、TrkC、TNF、IL-10、CRF2-4、RXR、RON、AChRα/δ、TRα/RXRα、Trα/DR4、Trα/MHC-TRE、Trα/ME、Trα/F2、KDR/FLT-1、FLT/VEGF、VEGF121/165、Arnt/Ahr、CGA/CGB、EGFR/p185-neu、プロラクチンレセプター（PRL）、T細胞レセプター（TCR）、線維芽増殖因子（FGF）、Cakレセプター、IL-6/gp130、IL-11/gp130白血病阻害因子（LIF）/gp130、カルジオトロフィン-1/gp130（CT-1）、IL-11/gp130、繊毛向神経因子CNTF/gp130、オンコスタチンM（OSM）/gp130、インターフェロンγ、およびインターフェロンα、β。
本発明のキメラヘテロ接着体は、天然に存在するヘテロ多量体レセプターの細胞外ドメインを含み、そこで、レセプターモノマーのECD（または、そのリガンド結合フラグメント）は、上記のように多量体化ドメインに融合される。ヘテロ接着体のキメラモノマーは、多量体化ドメインを介して安定に結合し、キメラヘテロ接着体を形成した。本発明のヘテロ接着体は、ECDが得られ、そしてリガンドのアンタゴニストとして有用である、天然レセプターのリガンドを結合する。このようなアンタゴニストは、リガンド結合および天然ヘテロ多量体レセプターの活性化の結果としての疾病状態を処置するのに有用である。
２.治療組成物および方法
治療組成物としての本発明のキメラヘテロ接着体の使用は、本発明の実施態様である。全般的に本明細書に開示されているその使用は、一般的にキメラヘテロ接着体の使用のガイダンスとして提供されている。ErbBキメラヘテロ接着体は、さらなるガイダンスの例として開示されている。
HRGは、中枢（脳および脊髄）、末梢（交感、副交感、知覚、および腸壁ニューロン）、および運動ニューロンを含む、インビボでのニューロンの発達、維持、および／または再生を促進する。従って、抗ErbB-Ig抗体アゴニストのようなHRGアゴニストは、ヒトのような哺乳動物の神経系に影響する、種々の「神経学的疾患または異常」の診断および／または治療のための方法に使用され得る。本発明のこの実施態様に従って、ErbBキメラヘテロ接着体に対して誘起されたアゴニスト抗体は、ErbBレセプターと交差反応し、そしてErbBレセプターを活性化する。
このような疾患または障害は、神経系が、例えば、外傷、手術、発作、虚血、感染、代謝疾患、栄養不足、悪性腫瘍、または毒性因子によって損傷された患者において、引き起こされ得る。その因子は、ニューロンの生存、増殖、または分化を促進するように設計される。例えば、抗ErbBキメラヘテロ接着体アゴニスト抗体は、外傷または手術によって損傷された運動ニューロンの生存または増殖を促進するために使用され得る。それはまた、筋萎縮側索硬化症（Lou Gehrig病）、ベル麻痺、および脊椎筋萎縮または麻痺を含む種々の症状のような、運動ニューロン障害を処置するために使用され得る。アゴニスト抗体は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチングトン舞踏病、ダウン症候群、神経聾、およびメニエル病のような、ヒト「神経変性障害」を処置するために使用され得る。
さらに、抗ErbBキメラヘテロ接着体アゴニスト抗体は、神経病、特に末梢神経病を処置するために使用され得る。「末梢神経障害」とは、最も頻繁には、運動、知覚、知覚運動、または自立神経機能障害の単独または組み合わせとして出現する、末梢神経系に影響を与える障害をいう。末梢神経障害によって示される広範な形態学は、特有の原因から等しい広範な数の原因まで、それぞれ起因され得る。例えば、末梢神経障害は、一般的に後天的であり得るか、全身性疾患から生じ得るか、または毒性薬剤に誘導され得る。例には、限定されないが、末端知覚神経障害、または消化管の減退した能動性もしくは膀胱弛緩のような自立神経障害が包含される。全身性疾患に関連する神経障害の例は、ポリオ後症候群を含み;遺伝性神経障害の例は、シャルコー（Chercot-Marie-Tooth）病、レフサム病、無βリポタンパク質血症、タンジール病、クラッペ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病、およびデジェリン-ソッタ症候群を含み;そして毒性薬剤により引き起こされる神経障害の例は、化学治療剤での処置により引き起こされる神経障害を含む。
本発明の抗ErbBキメラヘテロ接着体アゴニスト抗体はまた、筋細胞およびそれらに影響する医学的症状を処置するために使用され得る。例えば、HRGは、哺乳動物における筋組織の病理生理学的症状、例えば、骨格筋疾患（例えば、筋病またはジストロフィー）、心筋障害（心房不整脈、心筋病、虚血損傷、先天性疾患、または心臓外傷のような）、または平滑筋障害（例えば、動脈硬化症、脈管病変、または先天性脈管疾患）の処置;筋肉損傷の処置;筋細胞萎縮の減少;哺乳動物での筋細胞の生存、増殖、および／または再生の増加;高血圧症の処置;および／または（重症性筋無力症または頻脈患者でのような）不十分な機能性アセチルコリンレセプターを有する筋細胞の処置に使用され得る。
抗ErbBキメラヘテロ接着体アゴニスト抗体は、細胞表面膜でのイオンチャンネル形成を誘導するため、および／または個体でのシナプス接続形成を促進するために、使用され得る。HRGはまた、メモリーエンハンサーとして有用であり得、そしてニコチンに対する「必要性」を消去し得る。
抗ErbBキメラヘテロ接着体アゴニスト抗体は、ErbBレセプター、特にErbB2レセプターを産生する組織の修復および／または再生を促進するために使用され得る。例えば、抗ErbBキメラヘテロ接着体アゴニスト抗体は、皮膚創傷;消化管疾患;バーレット食道;嚢胞性または非嚢胞性末期腎疾患;および、炎症性腸疾患の処置に使用され得る。同様に、この分子は、ヒト消化管、呼吸気道、生殖管、または尿管における再上皮形成を促進するために使用され得る。
ErbB-Igキメラヘテロ接着体のようなHRGアンタゴニストによる哺乳動物の処置、特に過剰レベルのHRGが存在する、および／またはHRGによるErbBレセプターの過剰な活性化が哺乳動物で生じる場所に望まれ得る。例示的なHRGアンタゴニストによって処置される症状または障害は、初期または悪性の腫瘍（例えば、腎臓、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸、前立腺、膵臓、肺（ling）、外陰、甲状腺、肝ガン;肉腫;膠芽腫;ならびに種々の頭部および頚部腫瘍）;白血病およびリンパ腺悪性腫瘍;ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部、ならびにその他の小腺、マクロファージ、上皮、間質、および胞胚腔障害のようなその他の障害;炎症、脈管形成、および免疫学的障害;乾癬、および瘢痕組織形成を包含する。HRGアンタゴニストはまた、腫瘍細胞の免疫応答に対する耐性を逆にするため、病理学的脈管形成を阻害するため、および免疫系を刺激するために使用され得る。
本発明のなおさらなる実施態様では、HRGアンタゴニストとしての抗ErbBキメラヘテロ接着体が、HRGの過剰産生および／またはHRGによる過剰なErbBレセプターの活性化によって特徴付られる神経学的疾患または障害に罹患した患者に投与され得る。抗ErbBキメラヘテロ接着体アンタゴニスト抗体は、手術後に生じ得るような知覚神経の迷走性再生の予防、または、知覚神経の選択的剥離（例えば、慢性痛症候群の処置）で使用され得る。
核酸（必要に応じて、ベクターに含有された）をインビボおよびエキソビボで患者の細胞に導入するための主要な２つのアプローチが存在する。インビボ送達には、核酸は、通常キメラヘテロ接着体が必要とされる部位で、直接患者に注入される。エキソビボ処置には、患者の細胞が取り出され、核酸はこれらの単離された細胞へ導入され、そして改変された細胞は直接患者へ投与されるか、または例えば、患者へ移植される多孔性膜内にカプセル化されて投与されるかのいずれかである（例えば、米国特許第4,892,538号および第5,283,187号を参照のこと）。
生細胞への核酸導入のために可能な種々の技術が存在する。その技術は、核酸が、意図される宿主細胞において、インビトロまたはインビボで培養された細胞へ移入されるかどうかに依存して変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸移入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を包含する。遺伝子のエキソビボ送達のために一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
現在の好ましいインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスI型ウイルス、またはアデノ随伴ウイルスのような）、および脂質ベースシステム（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPE、およびDC-Cholである）でのトランスフェクションを包含する。いくつかの状況では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどのような、標的細胞を標的とする因子を有する核酸供給源を提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、特定の細胞型に指向性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環中に内部移行を行うタンパク質に対する抗体、および細胞内極在化を標的し、細胞内半減期を促進するタンパク質の、標的および／または取り込みの促進のために使用され得る。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら、J.Biol.Chem.262:4429-4432（1987）;および、Wangnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414（1990）に記載されている。現在既知の遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルの論評は、Andersonら、Science 256:808-813（1992）を参照のこと。第WO 93/25673号およびそこに援用されている参考文献もまた参照のこと。
キメラヘテロ接着体またはそれに対して誘起された抗体の治療処方物は、所望の程度の純度を有するヘテロ接着体または抗体を、必要に応じて、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と混合し（Reminogton’s Pharmaceutical Science,第16版、Osol.,A.編（1980））、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、貯蔵のために調製される。薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量または濃度で受容者に対して非毒性であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量（約10残基未満）ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成カウンターイオン;および／またはTweenTM、PluronicsTM、またはポリエチレングリコール（PEG）のような、非イオン性界面活性剤を包含する。
インビボ投与に使用されるキメラヘテロ接着体または抗キメラヘテロ接着体抗体は、無菌性でなければならない。これは、特に凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。処方剤は通例、凍結乾燥された形態または溶液で貯蔵される。
治療キメラヘテロ接着体または抗キメラヘテロアドヘイシン抗体組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈溶液バッグ、または皮下注射針による刺突が可能なスットパーを有するバイアル）に配置される。
キメラ接着体または抗体投与経路は、既知の方法、例えば、静脈、腹腔内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、もしくは病巣内経路により、または下記に示されている徐放システムによる注射または注入による。ヘテロ接着体または抗体は、注入またはボーラス注射によって、継続投与される。
徐放調製物の適切な例は、タンパク質を含む疎水性固体ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、このマトリックスは、形成品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例は、ポリエステル、ヒロドゲル（例えば、Langerら、J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277（1981）、およびLanger,Chem.Tech.,12:98-105（1982）に記載されているような、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、欧州特許第58,481号）、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー（Sidmanら、Biopolymers,22:547-556（1983））、非分解性エチレン-酢酸ビニル（Langerら、前出）、Lupron DepotTM（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成されてた注入可能な微粒子）のような、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、およびポリ-D-（-）-3-ヒドロキシブチル酪酸（欧州特許第133,988号）を包含する。
徐放キメラヘテロ接着体もしくはアゴニストまたはアンタゴニスト抗ヘテロ接着体抗体組成物はまた、リポソーム封入薬剤を含む。HRGを含有するリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される:DE 3,218,121;Epsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692（1985）;Hwangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034（1980）;EP第52,322号;EP第36,676号;EP第88,046号;EP第143,949号;EP第142,641号;日本国特許出願第83-118008号;米国特許第4,485,045および第4,544,545号;ならびに、EP第102,324号。通常、リポソームは、脂質含有が約30mol%を超えるコレステロールである、小さな（約200〜800オングストローム）単ラメラ型であり、選択される割合は、最適治療に対して調整される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含有する脂質組成物を用いた逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、決められた孔の大きさのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。化学治療剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてリポソーム内に含有される。Gabizonら、J.National Cancer Inst.81（19）:1484（1989）を参照のこと。
本発明のErbB-Igキメラヘテロ接着体は、HRGリガンドに結合して隔離するために使用され得（そのことによって、細胞でのErbB活性化（activatin）を阻害する）、ガンのような患者での細胞増殖異常を阻害する。
本明細書に開示されているように、ErbB2/3-IgまたはErbB2/4-Igヘレグリンアンタゴニストまたはアンタゴニストとしての抗ErbB-Ig抗体で処置されるべきガン患者はまた、放射線治療を受け得る。あるいはまたはさらに、化学治療剤が、患者に投与され得る。このような化学治療剤の調製および投与計画は、製造者の説明書に従い、または当業者によって実験的に決定されるように使用され得る。このような化学療法の調製または投与計画はまた、Chemotherapy Service編、M.C.Perry,WilliamおよびWilkins.Baltimore,MD（1992）に記載される。化学治療剤は、アンタゴニストの投与に先行または後続し得るか、またはそれらと同時に与えられ得る。ガンの徴候には、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、または血管内皮因子（VEGF）に結合する抗体のような、腫瘍関連抗原に対するかまたは抗原性因子に対する抗体を投与することも望まれ得る。あるいはまたはさらに、１つ以上のサイトカインが患者へ同時に投与され得る。
治療に使用されるべきアンタゴニストの有効量は、例えば、治療目標、投与経路、および患者の症状に基づく。従って、治療専門家には、最大治療効果を得るために必要とされるように、投与量の力価決定および投与経路の改変が必要である。典型的な投与量は、約1μg/kg患者体重から100mg/kgまでの範囲、好ましくは約10μg/kgから10mg/kgの範囲であるべきである。典型的に、臨床医は、上記に記載の障害の治療に望まれる効果に達成すように、投与量が到達されるまで、アンタゴニストを投与する。
３.非治療法
HRGアゴニスト抗ErbB2/3-Ig抗体または抗erbB2/4-Ig抗体は、エキソビボにて（グリアおよび筋細胞のような）細胞を増殖するために使用され得る。細胞特異因子、例えば、Schwann細胞特異マーカーであるP75NGFRの単離のために、細胞培養でこのような細胞集団を有することが望ましい。このような因子は、診断手段として有用であるか、またはP75NGFRの場合には、診断使用のための抗体を産生するための抗原として使用され得る。さらに、哺乳動物患者への移植用（例えば、末梢神経損傷の修復の補助、および多重自己移植の代替として、中断された中枢軸索の再生に影響するための試みにおける損傷した脊髄の領域内へ）の細胞補綴物としての使用のための哺乳動物細胞の集団（例えば、Schwann細胞）を有することはまた有利である。
本発明のインビトロ方法に従って、ErbBレセプターを含む細胞が提供され、そして細胞培養培地に入れられる。適切な組織培養培地は、当業者に周知であり、最少必須培地（MEM）、RPMI-1640、およびダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含むが、これらに限定されない。これらの組織培養培地は、Sigma Chemical Company（St.Louis,MO）およびGIBCO（Grand Island,NY）から商業的に入手可能である。次いで、細胞は、細胞が有効量のアゴニスト抗体の存在下で生存および増殖したままであるのに十分な条件下で、細胞培養培地中で培養される。細胞は、血餅、寒天、または液体培養での培養を含む、種々の方法で培養され得る。
抗ErbB-Ig抗体は、erbB（例えば、erbB2）過剰発現および／または増幅によって特徴づけられるガンの診断で使用され得、ここで、ErbBレセプターと交差反応する抗キメラヘテロ接着体抗体が、使用される。このような診断アッセイ（単数または複数）は、リンパ節の状態、原発性腫瘍の大きさ、組織学的程度、エストロゲンまたはプロゲステロン状態、腫瘍DNA含有量（倍数性）、または細胞増殖（S期画分）を決定することのような、その他の診断／予後の評価と組み合わせて使用され得る。Mussら,New Eng.J.Med.,330（18）:1260-1266（1994）を参照のこと。
本明細書中に定義されているようなサンプルは、例えば、患者の原発性病巣から得られた組織サンプルである。ホルマリン固定、パラフィン包埋ブロックが調製される。Mussら（前出）およびPressら、Cancer Research 54:2771-2777（1994）を参照のこと。組織切片（例えば、4μM）が、公知の技術によって調製される。次いで、組織切片に結合する、抗ErbB2/3-Igまたは抗erbB2/4-Ig抗体の程度が定量される。
一般的に、キメラヘテロ接着体または抗キメラヘテロ接着体抗体は、直接または間接的のいずれかで、検出可能な標識によって標識される。多数の標識が入手可能であり、一般的に以下の区分に分類され得る:
（a）35S、14C、125I、3H、および131Iのような、放射性同位体。γ-HRGまたは抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology,Coligenら編、Wiley Publishers、第１巻および第２巻に記載されている技術を用いて、放射性同位体によって標識され得、そして放射活性がシンチレーションカウンティングを用いて測定され得る。
（b）希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、Lissamine、フィコエリトリン、およびTexas Redのような蛍光標識が、入手可能である。蛍光標識は、例えば、Current Protocols in Immunology（前出）に開示されている技術を用いて、キメラヘテロ接着体または抗体に結合され得る。蛍光は、フルオリメーター（Dynatech）を用いて定量され得る。
（c）種々の酵素-基質標識が入手可能であり、米国特許第4,275,149号は、これらのいくつかの総説を提供する。一般的に、酵素は、種々の技術を用いて測定され得る発色性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光光度的に測定され得る基質の色の変化を触媒し得る。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量するための方法は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起され、次いで、（例えば、Dynatech ML3000化学ルミノメーターを用いて）測定され得るか、または蛍光アクセプターへエネルギーを提供する電光を放ち得る。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジンジオン（2,3-dihydrophthalazinediones）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロサイクリックオキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどを包含する。酵素のタンパク質への結合の技術は、O’Sullivanら、Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay、Methods in Enzym.（J.LangoneおよびH.Van Vunakis編）、Academic Press,New York,73:147-166（1981）に記載される。
酵素-基質組み合わせの例は、例えば、（a）基質としての過酸化水素との西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）、ここで、過酸化水素は、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（OPD）または3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジンヒドロクロライド（TMB））を酸化する;（b）発色基質としてのパラニトロフェニルリン酸とのアルカリホスファターゼ（AP）;および、（c）発色基質（例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼとのβ-D-ラガクトシダーゼ（β-D-Gal）を包含する。
多数のその他の酵素-基質組み合わせが、当業者に入手可能である。これらの一般的な総説は、米国特許第4,275,149号および第4,318,980号を参照のこと。
必要に応じて、標識は、キメラヘテロ接着体または抗CHA抗体と間接的に結合される。当業者は、これに到達するための種々の方法を承知している。例えば、CHAまたは抗CHA抗体は、ビオチンと結合され得、上記の３つの区分の標識のいずれかが、アビジンと結合され得るか、または逆も可能である。ビオチンは、選択的にアビジンに結合し、従って、標識は、CHAまたは抗CHA抗体と、間接的様式で結合され得る。ビオチン-アビジン結合に関する技術の総説については、Current Protocols in Immunology（前出）を参照のこと。あるいは、標識のCHAまたは抗CHA抗体との間接的結合を達成するために、CHAまたは抗CHA抗体は、小さなハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合され、上記の異なる型の標識の１つが、抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）と結合される。従って、標識のCHAまたは抗CHA抗体との間接結合が、達成され得る。
本発明の別の実施態様において、CHAまたは抗CHA抗体は、標識される必要がなく、その存在は、標識抗CHAまたは抗抗体抗体（例えば、HRPOと結合された）を用いて検出され得る。
好ましい実施態様において、HRGまたは抗体は、基質（例えば、テトラメチルベンズイミジン（TMB）またはオルトフェニレンジアミン（OPD））の色の変化を触媒する酵素標識によって、標識される。従って、放射活性材料の使用は避けられる。試薬の色の変化は、適切な波長（例えば、650nmの参照波長での、TMBについては450nm、およびOPDについては490nm）で、分光学的に測定され得る。
HRGのようなリガンドを発現し得ると考えられる細胞を、標識ErbB CHAに曝し、細胞培養培地の染色強度が測定される。通常、インビトロ分析が意図されるが、検出部分に結合された標識ErbB CHAを用いるインビボ診断もまた実施され得る。例えば、米国特許第4,938,948号を参照のこと。
CHAまたは抗CHA抗体はまた、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、またはラジオレセプターアッセイにおいて、アフィニティー精製法（例えば、HRG、またはErbB3もしくはErbB4レセプターのようなErbBレセプターに対して）において、および放射ヨウ素、酵素、蛍光剤（fluorophore）、スピン標識などで標識される場合、競合型レセプター結合アッセイにおいて、有用である。従って、CHAは、診断使用についての抗CHA抗体の産生のための免疫原として有用である。
４.抗キメラヘテロ接着体抗体およびその使用
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のような、抗体を産生する技術は、当該分野で周知である。一般的に、ポリクローナル抗体は、CHAまたはそのフラグメント（必要に応じて、免疫されるべき種において免疫原性である異種タンパク質と結合された）を用いて、動物を免疫して惹起される。CHAに対して指向されるモノクローナル抗体は、培養での抑制細胞株による、抗体分子の産生を提供する任意の方法によって、産生され得る。モノクローナル抗体を調製するため適切な方法の例は、Kohlerら、Nature 256:495-497（1975）の最初のハイブリドーマ法およびヒトB細胞ハイブリドーマ法、Kozbor,J.Immunol.133:3001（1984）;BrodeurらのMonoclonal Antibody Production Techniques and Applicaton,51-63頁（Marcel Dekker,Inc.,New York,1987）;および、Boernerら、J.Immunol.147:86-95（1991）を、包含する。
本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の方法によって（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得る、オリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離され、シーケンシングされる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、DNAは、発現ベクター内に入れられ、次いで、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない、E.coli細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、またはミエローマ細胞のような宿主細胞へトランスフェクトされ、組み換え宿主細胞でモノクローナル抗体の合成を得る。
DNAはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインに対するコーディング配列を相同ネズミ配列と置換することによって（Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851（1984））、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコーディング配列の免疫グロブリンコーディング配列の全体または一部に共有結合することによって、修飾され得る。その様式で、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は、本明細書中で抗CHAモノクローナル抗体の結合特異性を有するように、調製される。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からのアミノ酸に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入（import）」残基と呼ばれ、典型的に、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、基本的に、Winterおよび共同研究者の方法（Jonesら、Nature 321:522-525（1986）;Riechmannら、Nature 332:323-327（1988）;および、Verhoeyenら、Science 239:1534-1536（1988））後に、ヒト抗体の対応配列に対する齧歯類CDRまたはCDR配列を置換することによって、実施され得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第4,816,567号）であり、実質的にインタクトでないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応配列によって置換された。実際、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのCDR残基、およびおそらくいくつかのFR残基が、齧歯類抗体のアナログからの残基によって置換される、ヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用されるべきヒト可変ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるのに非常に重要である。「ベストフィット」法と呼ばれるように、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類に非常に近いヒト配列が、ヒト化抗体に対するヒトフレームワーク（FR）として受け入れられる（Simsら、J.Immunol,151:2296（1993）;ならびに、ChothiaおよびLesk,J.Mol.Biol.196:901（1987））。その他の方法は、軽鎖または重鎖の特定サブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列由来である特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に対して使用される（Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285（1992）;および、Prestaら、J.Immunol..151:2623（1993））。
抗原およびその他の好ましい生物学的特性に対する高親和性を保持してヒト化されることが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体が、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の関連ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンフォメーション構造を図解して示すコンピュタープログラムが入手可能である。これらの図示の調査は、候補免疫グロブリン配列の機能化において残基の同様の役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原へ結合する能力の分析を可能にする。この方法において、標的抗原（単数または複数）への増加された親和性のような、所望の抗体特性が達成され得るように、FR残基が選択され、そしてコンセンサス配列および移入配列から組み合わされる。一般的に、CDR残基は、直接的および非常に実質的に抗原結合に関連する。
ヒト抗体を産生する代替法に従って、免疫に際して、内在生免疫グロブリン産生の存在しないヒト抗体の全レパートリーの産生を可能にするトランスジェニック動物（例えば、マウス）が入手可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスでの抗体重鎖接続領域（JH）遺伝子のホモ接合欠損は、内在生抗体産生の完全な阻害をもたらす。このような生殖系列変異体マウスでのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子配列の導入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551（1993）;Jakobvitsら、Nature 362:255-258（1993）;および、Bruggermannら、Year in Immuno.7:33（1993）を参照のこと。
あるいは、ファージ表示技術（McCaffertyら、Nature 348:552-553（1990））は、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（V）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生するために、使用され得る。この技術に従って、抗体Vドメイン遺伝子は、M13またはfdのような、繊維状バクテリオファージの主要または低量のコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子表面の機能性抗体フラグメントとして提示される。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づいた選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。従って、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示は、種々のフォーマットで行われ得る。それらの総説については、例えば、Johnson,Kevin S.およびChiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571（1993）を参照のこと。V-遺伝子セグメントの数種の供給源が、ファージ提示に使用され得る。Clacksonら、Nature,352:624-628（1991）は、免疫マウスの脾臓由来のV遺伝子の小さなランダム組み合わせライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様な配列を単離した。非免疫ヒトドナーからのV遺伝子のレパートリーが構築され得、そして多様な一連の抗原（自己抗原を含む）に対する抗体が、Marksら、J.Mol.Biol.222:581-597（1991）、またはGriffithら、EMBO J.12:725-734（1993）によって記載された技術に本質的に従って、単離され得る。
二重特異抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。本願の場合には、結合特異性の１方は、CHA（好ましくはCHAのECD）に対するものであり、他方は、任意のその他の抗原である。二重特異抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、F（ab’）2二重特異抗体）として調製され得る。以下に記載される手順は、二重特異体の調製、および本発明のCHA多量体化ドメインの調製に有用である。
二重特異抗体の作製方法は当該分野で公知である。全長の二重特異抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に基づき、ここで、２つの鎖は、異なる特異性を有する（Millsteinら、Nature 305:537-539（1983））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、10の異なる抗体分子（その１つのみが適切な二重特異構造を有する）の可能な混合物を産生する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって実施される、適切な分子の精製は、より扱いにくく、産物収量は少ない。同様の手順が、第WO 93/08829号およびTrauneckerら、EMBO J.,10:3655-3659（1991）に開示されている。
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体の可変ドメイン（抗体-抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。その融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであり、ヒンジ、CH2、およびCH3領域の少なくとも一部を含む。融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を有する第一重鎖定常領域（CH1）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAが、別の発現ベクターへ挿入され、適切な宿主生物へ共トランスフェクトされる。これは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適収量を提供するときの実施態様で、３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率を調整するのに、大きな柔軟性を提供する。しかし、等しい比率で少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらすか、または、その比率が特に重要でない場合に、１つの発現ベクターに、ポリペプチド鎖の２つまたは３つ全てをコードする配列を挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい実施態様では、二重特異抗体は、一方のアームに第一結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対（第二結合特異性を提供する）から構成される。二重特異分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法を提供するので、この非対称構造は、所望でない免疫グロブリン鎖組み合わせから、所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見い出された。このアプローチは、第WO 94/04690号に開示されている。二重特異抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology,121:210（1986）を参照のこと。
別のアプローチに従って、抗体分子対間の境界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にするように設計され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を有する。この方法では、第一抗体分子の境界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換される。大きな側鎖（単数または複数）と同一または類似の大きさの埋め合せ（compensatory）「空洞（cavities）」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって、第二の抗体分子の界面に作製される。これは、ホモダイマーのような他の所望でない最終産物に対して、ヘテロダイマーの収量を増加するためのメカニズムを提供する。
二重特異抗体には、架橋された抗体または「ヘテロ複合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の一方が、アビジンに結合され得、他方はビオチンに結合され得る。このような抗体は、例えば、望まれていない細胞に対して免疫系細胞を標的化するために（米国特許第4,676,980号）、およびHIV感染の処置のために（第WO 91/00360号）提供された。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野で周知であり、そして多数の架橋技術とともに、米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異抗体を産生するためにの技術はまた、文献に記載されている。例えば、二重特異抗体が、化学結合を用いて調製され得る。Brennanら、Science 229:81（1985）は、インタクトな抗体がタンパク質分解によって切断されて、F（ab’）2フラグメントを産生する手順を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯体化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で低減されて、隣位のジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を妨害する。次に、産生されたFab’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（TNB）誘導体に転換される。Fab’-TNB誘導体の１つは、次いでメルカプトエチルアミンによる還元によってFab’-チオールに再度転換され、そして等モル量の他方のFab’-TNB誘導体と混合されて、二重特異抗体を形成する。産生された二重特異抗体は、酵素の選択固定化のための試薬として使用され得る。
最近の進歩により、E,coliからのFab’-SHフラグメントの直接回収が容易になった。このフラグメントは化学的に結合されて、二重特異抗体を形成し得る。Shalabyら、J.Exp.Med.,175:217-225（1992）は、完全ヒト化二重特異抗体F（ab’）2分子の産生を記載する。各Fab’フラグメントは、E.coliから個別に分泌され、そして指向されたインビトロ特異化学結合に供されて、二重特異抗体を形成する。このように形成された二重特異抗体は、erbBおよび正常ヒトT細胞を過剰発現する細胞へ結合し得、そしてヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発し得る。
組み換え細胞培養から直接に二重特異抗体フラグメントを作製し、そして単離する種々の技術もまた記載されている。例えば、二重特異抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelnyら、J.Immunol.148（5）:1547-1553（1992）。FosおよびJunタンパク質からのロイシンジッパーは、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のFab’部分に連結された。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生に利用され得る。Hollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448（1993）によって記載された「ダイアボディー（diabody）」技術は、二重特異抗体フラグメントを作製するための代替メカニズムを提供している。フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。従って、１つのフラグメントのVHおよびVLドメインは、別のフラグメントの相補的VLおよびVHドメインと対形成することを強いられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv（sFv）ダイマーの使用による、二重特異抗体フラグメントを作製するための別の方法はまた、報告されている。Gruberら、J.Immunol.152:5368（1994）を参照のこと。
２より多い価数の抗体が考慮される。例えば、三重特異抗体が調製され得る。Tuttら、J.Immunol.147:60（1991）。
中和抗体を製造するために、抗体は、上記記載のこれらの分子を産生するための技術によって、調製され得る。好ましい中和抗体は、CHAの細胞外ドメインに特異的であり、天然ヘテロ多量体レセプターの細胞外ドメインと交差反応するが、その他のレセプターとは交差反応しない。パネル抗体の産生後に、抗体を、目的の基準に到達した分子（すなわち、インビトロまたはインビボのいずれかで、天然ヘテロ多量体レセプターの生物学的活性を中和し得るもの）を同定するためのスクリーニング工程に供する。例えば、上記記載の任意１つ以上のアッセイで、ErbB-Ig CHAのErbB活性を阻害する能力が、評価され得る。ErbBレセプターへ結合または活性化するHRGの能力、および/または細胞でのHRGマイトジェン活性をブロックするそれらのCHAまたは抗CHA抗体が、CHAまたはCHA抗体を中和するものとして選択され得る。
抗体は、CHAについて上に記載された様式と同様の様式で、細胞傷害性因子または酵素（例えば、プロドラッグ-活性化酵素）へ結合され得る。さらに、抗体は、上記のように、特に抗体が診断アッセイで使用される場合に標識され得る。
５.診断キットおよび製造物品
本発明は、便宜上、少なくとも２つの型の診断アッセイ（すなわち、例えば、抗ErbB-Ig抗体を用いてガンを検出するための、および、例えば、ErbB-Igを用いてサンプル中のHRGの存在を検出するための）を提供するので、これらのアッセイ用の試薬は、テストされるサンプルと組み合わされるキット、すなわち、詰合された試薬の組み合わせで、提供され得る。キットの成分は、通常は予め決定された比率で提供される。従って、キットは、適切な標識に直接または間接に標識された、CHAまたは抗CHA抗体を含み得る。検出ラベルが酵素であるとき、キットは、基質および酵素に要求されるコファクター（例えば、検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定剤、緩衝液などのような、その他の添加物が包含され得る。種々の試薬の相対量は、実質的にアッセイの感度を最適化する、試薬溶液の濃度を提供するために広く変化し得る。特に、試薬は、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得、溶解に際して、適当な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む。キットはまた、バイオアッセイを実施するための説明書を適切に含む。
本発明の別の実施態様では、上記記載の障害を治療するために有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器およびラベルを包含する。適切な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、およびテストチューブを包含する。容器は、ガラスまたはプラスティックのような、種々の材料から成形され得る。容器は、症状を処置するのに有効である組成物を保持し、滅菌取り出し口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺し得るストッパーを有する、静脈溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性因子は、CHAまたはそのHRGアンタゴニスト抗CHA抗体である。容器上のまたはそれに付随するラベルは、組成物が、選択される症状の処置に使用されることを示す。製造物品はさらに、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液のような、薬学的に受容可能な緩衝液を含む、第二容器を包含する。さらに、それは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための説明書を伴うパッケージ挿入物を含む、商業的および使用者の立場から望まれるその他の材料を包含する。
実施例
以下の実施例は、例示手段として、そして限定手段としてではなく、提供される。実施例は、当業者に、本発明の化合物、組成物、および方法を、いかに調製し使用するかの完全開示および記載を提供するために提供されていて、発明者が本発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用されている数字に関して正確さを確実にするための努力がなされている（例えば、量、温度など）が、いくらかの実験誤差および偏差は考慮されるべきである。その他に示されていない限り、部分は重量部、温度は摂氏度、および圧力は大気圧またはその付近である。明細書中の全ての引用の開示は、本明細書中で参考として特別に援用される。
実施例１:材料および方法
この実施例は、本発明のErbB2-IgG、ErbB3-IgG、およびErbB4-IgGキメラアミノ酸配列、ならびに得られたキメラヘテロ多量体の構築、単離、および生物学的特性を記載する。
試薬:HRGβ1(177-244)のEGF様ドメインを、E.coliで発現し、精製し、以前に記載のように放射ヨウ素化した（Sliwkowski,M.ら、J.Biol.Chem.269:14661-14665（1994））。チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現された、全長rHRGβ1を、ウエスタンブロット分析に使用した。抗ErbB2モノクローナル抗体2C4および4D5は、他に記載されている（Fendlyら、Cancer Research 50:1550-1558（1990））。
ErbB2-、ErbB3-、およびErbB4-免疫接着体:単一Mlu I部位を、免疫グロブリンのヒンジドメインをコードする領域で、ヒトIgG重鎖を発現するプラスミド（pDR、J.RidgewayおよびP.Carter,Genentech,Inc.からの寄贈）へ操作した。Mlu I部位をまた、これらのレセプターのECD/TM連結部位をコードする領域で、ErbB発現プラスミドのセットへ操作した。全変異誘発を、Kunkel法（Kunkel,T.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:488（1985））によって、実施した。Mlu I部位を使用して、適切なErbB-IgG融合構築物を作成した。種々のEbB-IgGキメラ体の融合連結部位は、ErbB2に対してはE646ErbB2-（TR）-DKTH224VH;ErbB3に対してはL636ErbB3-（TR）-DKTH224VH;ErbB4に対してはG640ErbB4-（TR）-DKTH224VHであり、ErbBポリペプチドのアミノ酸番号は、Plowmanらに記載されている（Plowman,G.D.ら、（1993a）PNAS USA 90:1746-1750）。保存されたTR配列は、Mlu I部位由来である。融合構築物の調製に使用されたFc領域配列は、Ellison,J.W.ら（Ellison,J.W.ら（1982）NAR 10:4071-4079）に認められる。最終発現構築物は、真核発現がCMVプロモーターによって誘導される、pRK型プラスミド骨格に存在した（Gormanら、DNA Prot.Eng.Tech.2:3-10（1990））。
インビトロ実験用のタンパク質を得るために、付着HEK-293細胞（ATCC No.CRL-1573）を、標準的なリン酸カルシウム法を用いて、適切な発現プラスミドでトランスフェクトした（Gormanら、前出、およびHuangら、Nucleic Acids Res.18:937-947（1990）。血清含有培地を、トランスフェクションの15時間後に、血清を含まない培地と交換し、トランスフェクト細胞を5-7日間インキュベートした。得られた馴化培地を回収し、プロテインAカラム（1mL Pharmacia HiTrapTM）に通した。精製されたIgG融合体を、1M Tris pH9.0を含有するチューブ中に、0.1Mクエン酸（pH4.2）で溶出した。次に、溶出タンパク質を、PBSに対して透析し、Centri-prep-30フィルター（Amicon）を用いて濃縮した。グリセロールを添加して25%最終濃度にし、その材料を-20℃で保存した。材料濃度は、Fc-ELISAによって測定した。
125I-HRG結合アッセイ:結合アッセイは、Nunc分離（breakapart）免疫モジュールプレートで実施した。プレートウエルを、50mM炭酸緩衝液（pH9.6）中の5μg/mlヤギ-抗ヒト抗体（Boehringer Mannheim）100μlで、４℃で一晩コートした。プレートを、200μl洗浄緩衝液（PBS/0.05% Tween-20TM）で２回すすいだ後に、100μl 1%BSA/PBSと室温にて30分間の短時間インキュベーションを行った。緩衝液を除去し、そして各ウエルを1% BSA/PBS中の100μl IgG融合タンパク質とともに、１時間激しく左右に回転させながらインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回すすぎ、そして種々の量の冷コンペティター、γ-HRGおよび125I-HRGβ1を加え、2〜3時間激しく左右に回転させながら、室温にてインベートして、競合結合を実施した。ウエルを洗浄緩衝液で迅速に３回すすぎ、排出して、そして各ウエルを100 Series Iso Dataγ-カウンターで計数した。スキャッチャード分析を、修飾リガンドプログラムを用いて実施した（Munson,P.およびRobard,D.（1980）Analytical Biochemistry 107:220-239）。
3Ｈ-チミジン取り込みアッセイ:トリチウム化チミジン取り込みアッセイを、96ウェルフォーマットで実施した。MCF7-7細胞を、50:50 F12/DMEM（高グルコース）0.1%ウシ胎児血清（100mL）中10,000細胞／ウェルでプレートした。細胞を３時間放置し、その後、ErbB-IgG融合タンパク質および／またはヘレグリンをウェルに添加（最終容量200mL）し、そしてそのプレートを、37℃の組織培養インキュベーター中で15時間インキュベートした。トリチウム化チミジン（1/20希釈トリチウム化チミジンストックの20mL:Amersham TRA 120 B363,1mCi/mL）をウェルに加え、そしてプレートをさらに３時間インキュベートした。次に、トリチウム化材料を、Packard Filtermate 196ハーベスターを用いて、GF/Cユニフィルター（96ウェルフォーマット）上に回収した。フィルターを、Packard Topcout装置を用いて計数した。
実施例２:ErbB3-IgGタンパク質およびErbB4-IgGタンパク質はHRGを結合する
上記に記載のように、ヒトIgGの定常ドメインへ融合されたErbBレセプターの細胞外ドメイン（ECD）の真核生物発現を可能にする、一連のプラスミド構築物を調製した。図１に示されているように、これらのレセプター-IgG構築物は、ジスルフィド連結ダイマーとして溶液中に存在する。ErbB2、ErbB3、およびErbB4に対するホモダイマーIgGレセプターをHEK-293細胞において個々に発現し、得られた分泌レセプター融合タンパク質をプロテインAでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Chenら（Chen,X.ら（1996）J.Biol.Chem.271:7620-7629）は、ホモダイマーErbB3-およびErbB4-免疫接着体（immunoadhesin）の同様の構築物を報告し、これらは、レセプター-特異モノクローナル抗体の産生のための免疫原として使用した。キメラ免疫接着体タンパク質の結合分析を、マイクロタイタープレートフォーマットを使用して、実施した（実施例１を参照のこと）。図２に示されているように、ホモダイマーErbB3-IgGおよびErbB4-IgGは、125I-HRGを特異的に結合し得、一方、識別し得る結合は、ErbB2-IgG構築物で検出されなかった。ErbB3-IgGへのHRG結合のScatchard分析は、9.3±2.9nMのＫdを有する単一の親和性結合部位を示した。昆虫細胞で発現された界面活性剤可溶化ErbB3（Carrawayら、1994）、COS7細胞で発現されたErbB3（Sliwkowskiら、（1994）前出）、およびK562細胞で発現されたErbB3に対する結合定数は、0.8〜1.9nMの間の範囲であった。ホモダイマーErbB3-IgGは、ErbB3の一価可溶性ECDを使用した分析で、Horanら（Horanら（1995）J.Biol.Chem.270:24604-24608）によって最近報告された、26nMの値より高い、HRGに対する親和定数を有する。これらのデータは、ErbB3のHRG結合部位の最適コンフォメーションが、脂質二重層によって安定化され得ることを示唆する。インタクトなレセプターに比較した結合親和性のより大きな減少もまた、EGFレセプターの可溶性型について報告された（Brown,P.M.ら、（1994）Eur.J.Biochem.225:223-233;および、Zhou,M.ら、（1993）Biochemistry 32:8193-8198）。ErbB4-IgGについて測定された親和定数は、5.0±0.8nMであった。この値は、COS7細胞で発現された全長ErbB4について1.5nMの、Tzaharらによって報告された値（Tzahar,E.ら、（1994）J.Biol.Chem.269:25226-25233）の近くに一致する。
ニューレグリンは、オルタナティブRNAスプライシングから生じるタンパク質ファミリーであるが、レセプター結合は、全ての活性なイソタイプに存在するEGF様モチーフによって媒介される。ErbB3またはErbB4のECDを含むキメラホモダイマー免疫接着体は、これらのタンパク質のEGF様ドメインが存在するならば、ニューレグリンファミリーの複数の型を結合した。これらのホモダイマーに結合するヘレグリン変異体は、rHRGβ11-244、rHRGβ144-244、チオレドキシン-HRGβ144-244、およびチオレドキシン-γHRG、rHRGα1-239を含んでいた。
実施例３:ErbB2がErbB3またはErbB4と存在する場合、ヘテロダイマーErbB-IgG融合タンパク質は高親和性HRG結合部位を形成する
ヘテロダイマー型のレセプター-IgG構築物が、異なるレセプターをコードする２つの発現プラスミドを同じ細胞へ同時トランスフェクトすることによって、産生された（実施例１を参照のこと）。得られた分泌形態のレセプター-IgGは、ホモダイマーの２つの型および推定されたヘテロダイマーの混合物である。３つの異なる同時トランスフェクションを実施して、以下のErbB混合物を産生した:ErbB2/3-IgG、ErbB2/4-IgG、およびErbB3/4-IgG。次に、混合物のそれぞれについての結合親和性を測定した。図３Aに示されているように、高親和性HRG結合部位は、ErbB2含有ヘテロダイマーで検出され得たが、ErbB3/4-IgGでは検出され得なかった。これらのデータのScatchardプロットは、ErbB2含有ヘテロダイマー混合物に対する曲線（図3Bおよび3C）であり、これは異なる２つの型の結合部位の存在を示唆する（Munson,P.およびRobard,D.（1980）Analytical Biochem.107:220-239）。Ｋd0.013nMを、高親和性結合部位に対して測定し、一方、低親和性結合部位は12nMのＫdを有した。高親和性結合定数は、ErbB3が、高レベルのErbB2を含有する細胞で発現される場合（Carrawayら、（1994）前出）、または高親和性HRG結合部位が、高ErbB3バックグラウンドでの結合データの２部位フィットから測定される場合（Sliwkowskiら、（1994）前出）に測定された値と一致する。ErbB2/4-IgG（図3C）もまた、ErbB4-IgGホモダイマーと比較した場合、同様の親和性シフトを示した。ErbB2/4-IgGについて測定された親和定数は、0.017nMであった。再度２部位フィットを使用して、5nMの低親和結性合部位Ｋdが決定された。この値は、ErbB4-IgGホモダイマーについて測定されたＫdと近くで一致する。対照的に、ErbB3/ErbB4-IgGタンパク質（図3D）は、高親和性部位を示さなかったが、その代わりに、６nMのＫdが測定され、これはErbB3-IgGおよびErbB4-IgGホモダイマーについて認められたものと匹敵した。高親和性リガンド結合部位の形成は、ErbB2 ECDのErbBファミリーの別のメンバーのECDとの同時発現に相関し、このことは、ErbB2が、高親和性部位の形成に必要とされることを示唆する。ErbB-IgG融合タンパク質についての結合定数のまとめを、表１に示す。ヘテロダイマーErbB2/3-IgGまたはErbB2/4-IgGタンパク質について形成された高親和性結合部位は、対応するホモダイマー種に対するものより300〜700倍高かった。
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ErbB2が、高親和性結合部位の形成に寄与したという仮説をさらにテストするために、抗ErbB2 ECD抗体がErbB免疫接着体への高親和性結合を阻害する効果を試験した。結合反応は、ErbB2 ECDに特異的である抗体の2C4の存在下で、実施した（Lewis,G.D.ら、（1996）Cancer Res.56:1457-1465;Sliwkowskiら、（1994）前出）。図4Aに示されているように、2C4モノクローナル抗体の添加は、ErbB2/ErbB3-IgGヘテロダイマーに対するHRG結合への著しい阻害効果を有したが、対応するErbB3-IgGホモダイマーに対しては阻害効果は有さなかった。同様に、抗ErbB2モノクローナル抗体もまた、ErbB2/ErbB4-IgGヘテロダイマーへのHRG結合に影響したが（図4B）、対応するErbB4-IgGホモダイマーには影響しなかった。これらのデータは、ErbB2のECDと、ErbB3またはErbB4のいずれかのECDとの物理的相互作用が、可溶性レセプターシステムでの高親和性成長因子結合部位の形成をもたらすことを示す。
実施例４:ErbB-IgG融合タンパク質はHRGの生物学的効果を阻害する
HRG処置に際して、多数の異なる細胞型が増殖応答を受けることが知られている。ErbB-IgGタンパク質がHRG依存性チミジン取り込みを阻害する能力を、乳ガン細胞株、MCF7でテストした（Lewisら、（1996）前出）。種々の濃度の個別ErbB-IgGタンパク質を、1nM rHRGとインキュベートし、次に、MCF7細胞の血清枯渇単層培養物へ添加した（実施例１を参照のこと）。24時間のインキュベーション後に、次に、細胞を、DNA合成を測定するために、3Ｈ-チミジンで標識した。図５に示されるように、HRGに結合し得る全レセプター融合体は、用量相関様式で、HRG媒介マイトジェン応答を阻害した。ヘテロダイマーIgG、ErbB3/2-IgG、およびErbB4/2-IgGは、その対応するホモダイマー融合タンパク質より、より強力であった。
考察
ErbB2の細胞外ドメインはHRGのErbB3およびErbB4への結合を調節する
免疫接着体は、インビトロ分析に多数の利点を提供する（総説については、Chamow,S.M.およびAshkenazi,A.（1996）Trends in Biotechnology 14:54-60を参照のこと）。高親和性ヘレグリン結合部位の産生をもたらす、レセプターのErbBファミリーの推定インビボヘテロダイマー化を模倣するようであるのは、IgG融合物のダイマー化能力である。HRG結合分析は、ErbB2を含むヘテロダイマー混合物、すなわち、ErbB2/ErbB3-IgGおよびErbB2/ErbB4-IgGが、ErbB3-IgGもしくはErbB4-IgGホモダイマーまたはErbB3/ErbB4-IgGヘテロダイマーについて認められるのよりも300倍を超えて大きい高い親和性を有するヘレグリン結合部位を産生することを実証した。ErbB3/ErbB4-IgGヘテロダイマーに存在する低親和性HRG結合部位は、高親和性ヘレグリン結合部位の作製は、任意の異なる２つのErbB-IgGの組み合わせによってでは作製され得ず、むしろErbB2-IgG含有混合物に特異的であることを示唆する。この高親和性結合部位を作製するためのErbB2の要件についてのさらなる証拠は、ErbB2に対するモノクローナル抗体によって決定された（Lewisら、（1996）前出;Sliwkowskiら、（1994）前出）。結合研究が、これらの抗体の存在下で、ErbB2含有ヘテロダイマーによって実施された場合、HRG結合親和性の有意な減少が観察された。
HRG-ErbB3-ErbB2複合体の形成は、正常レベルのこれらのレセプターを発現する細胞株で、連続的に生じる。詳細には、HRGはErbB3に結合し、次に、ErbB2がこのHRG占有レセプターへ補充される。複合体の形成は、リガンドの解離速度の減少をもたらし、高親和性結合部位を形成する（Karunagaran,D.ら、（1996）EMBO J.15:254-264）。ところで、高親和性複合体の形成はまた、ダイマー化モチーフが存在するならば、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの非存在下で、可溶性レセプターシステムに生じることが報告された。対照的に、Horanら（Horan,T.ら、（1995）J.Biol.Chem.270:24604-24608）は、ErbB2-ECDの添加で、ErbB3-ECDへのHRG結合の明白な増加はないことを報告した。それらの知見に一致して、単一のトランスフェクト細胞より産生されたホモダイマーErbB-IgGが混合され、ヘレグリン結合についてテストされた場合、同様の結果が得られる。ErbB3-IgGまたはErbB4-IgGのホモダイマーと混合されたErbB2-IgGホモダイマーの得られた混合物は、ErbB3-IgGまたはErbB4-IgG単独より大きなリガンド親和性を全く示さなかった。従って、Fc成分によって供給されたダイマー化モチーフは、高親和性リガンド結合部位の形成において重要な特徴である。さらに、ヒンジ領域の可撓性もまた、これらのレセプター-リガンド結合相互作用を促進するのを補助し得る。なんら理論に限定されることなく、細胞膜にはめ込まれたインタクトなレセプターに関しては、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインのような、その他のモチーフもまた、ErbB2を含むヘテロ-オリゴマー複合体の安定化に寄与し得る。
オリゴマーヘレグリン-レセプターシグナリング複合体でのErbB2の役割
リガンド誘導レセプターオリゴマー化は、単一膜貫通通過レセプターに対する共通のパラダイムである（Ullrich,A.およびSchlessinger,J.（1990）Cell 61:203-212;および、Wells,J.A.（1994）Curr.Opin.Cell Biol.6:163-173）。ErbB3またはErbB4のいずれかとErbB2とから構成される、可溶性キメラヘテロダイマーの本明細書中の知見に基づいて、このようなキメラヘテロダイマーは、高親和性結合状態の形成に十分であることが結論される。これらのデータ（図６）に一致する２つの可能なモデルが提案される。「接触」モデルは、部位１がErbB3またはErbB4に存在し、部位２がErbB2によって与えられることを除いては、成長ホルモンおよびそのレセプターについて開発されたものに類似する（Wells,J.A.（1996）PNAS USA 93:1-6）。このモデルは、部位１へのHRG結合に対する親和性が、ErbB3またはErbB4ホモダイマーについて測定されたものと同様であることを予測する。次に、ErbB2が、ErbB3-HRG複合体またはErbB4-HRG複合体へ補充され、ErbB3（または、ErbB4）結合HRGに接触する。ErbB3-HRG-ErbB2複合体の形成は、HRGの解離を減少させ、より高い親和性結合状態をつくる。あるいは、「コンフォメーション」モデルは、ErbB2は、HRGとErbB3またはErbB4との相互作用を調節するが、HRGとErbB2との間の接触は生じないと仮定する。このモデルでは、ErbB2とErbB3またはErbB4との相互作用は、これらのレセプターのコンフォメーションを変え、高親和性結合状態をつくる。
ErbB3およびErbB2を発現する細胞での放射標識HRGによる化学架橋技術（Holmes,W.E.ら、（1992）Science 256:1205-1210;Sliwkowskiら、（1994）前出）を用いて、分子の大きさが約190kDaおよび500kDaより大きなタンパク質に対応する架橋結合複合体が観察された。これらの結果は、レセプター複合体のオリゴマー構造が、複数コピーのErbB3およびErbB2を含有し得ることを示唆する。さらに、ErbB3は、本質的なチロシンキナーゼ活性を欠如するので（Guyら、（1994）前出）、この仮説は、ErbB2およびErbB3の両方に対して観察される、チロシンリン酸化のリガンド依存性増加についての説明を提供する。例えば、２コピーのErbB3および２コピーのErbB2を含有する複合体は、ErbB3のリン酸化を可能にし、第二のErbB2レセプターのトランスリン酸化も可能にする。TNFレセプターホモダイマー免疫接着体（Ashkenazi,A.ら、（1991）PNAS USA 88:10535-10539）は、細胞表面TNFレセプターがトリマーである、TNFレセプターシステムを模倣するようである（Banner,D.W.ら、（1993）Cell 73-431-445）。
ErbB3およびErbB4のErbB2調節の生物学的関係
ErbB2が発見されたので、ErbB2と単独で相互作用して活性化するリガンドが存在しなければならないと思われた。多数の候補タンパク質が、ErbB2に対する推定リガンドとして発表されたが（Hynes,N.E.およびStern,D.F.（1994）Biochem.Biophys.Acta 1198:165-184に総説される）、この基準を満たす分子レベルで特徴づけられたタンパク質はなかった。その他の研究は、ErbB2が、EGFおよびヘレグリンレセプター複合体の両方で、多面的役割を果たすようであることを示唆した（Earpら、（1995）前出;Karunagaranら、（1996）前出）。これらの複合体でのErbB2の機能は、リガンド結合ドメインの親和性を変えること、非常に強力なチロシンキナーゼ成分に寄与すること、ならびにリン酸化により種々のシグナル伝達経路の活性化および増幅を提供するチロシン残基を提供することを含む。ErbB2のヘレグリン活性化は、神経-筋接合点（Altiok,N.ら、（1995）EMBO J.14:4258-4266;Chu,G.C.ら、（1995）Neuron 14:329-339;および、Jo,S.A.ら、（1995）Nature 373:158-161）、および神経-Schwann細胞接合点（Dong,Z.ら、（1995）Neuron 15:585-596;Marchionni,M.A.ら、（1993）Nature 362:312-318;およびMorrissey,T.K.ら、（1995）PNAS USA 92:1431-1435）で生理学的に関連する。ヒト腫瘍細胞株を用いる細胞培養実験では、数件の報告は、ErbB2とErbB3またはErbB4のいずれかとの相互作用を排除することが、下流シグナリング、ならびに増殖のような次の生物学的応答を減少させることを示した（Karunagaranら、（1996）前出;Lewisら、（1996）前出;Pinkas-Kramarski,R.ら、（1996）EMBO J.15:2452-2467）。永久的な「オルファン（orphan）」レセプターとしてのErbB2の概念（Lonardoら、1990）は、さらに、ErbB2およびニューレグリンのノックアウトの表現型についての最近の報告によって支持された。両方の場合において、いずれかの変異についてホモ接合性であるマウスは、ほぼE10.5で胚致死であった（Lee,K.-F.ら、（1995）Nature 378:394-398;ならびにMeyer,D.およびBirchmeier,C.（1995）Nature 378:386-390）。各場合において、肺は心室柱化の欠如という同様の心臓表現型のために死亡した。両胚はまた、著しく類似する、後脳の奇形を有した。これらの観察はさらに、ErbB2がHRGシグナルリングを伝達するのに重要であることを示唆する。正常な生物学的環境下で、ErbB2の唯一の機能は、これらのレセプター複合体の共通メンバーとして、HRGおよびEGFリガンド応答を媒介することのようである。
本発明は、現在好ましい実施態様を参照して記載されてきたが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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