(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を、以下の工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清と反応させ、前記対象菌株の前記特異的抗血清に対する反応性を指標として前記対象菌株を工程（ａ）で選択した菌株と共通の血清型を持つ菌株に分類することを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株の分類方法。
（ａ）ヘリコバクター・ピロリに属する任意の菌株を以下より２以上選択する工程
ヘリコバクター・ピロリ217B株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０４９）
ヘリコバクター・ピロリ218A株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０５０）
ヘリコバクター・ピロリ220B株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０５１）
（ｂ）工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させ、生じる凝集を除去して、工程（ａ）で選択した菌株以外の全ての菌株に対する抗体を除去する工程
【請求項２】
前記対象菌株をプロテアーゼ処理した後、前記特異的抗血清と反応させることを特徴とする、請求項１記載の分類方法。
【請求項３】
前記特異的抗血清に含まれる抗体を担体に感作した後、前記対象菌株を前記担体と反応させ、前記対象菌株の前記担体に対する反応性を指標として前記対象菌株を分類することを特徴とする、請求項１または２記載の分類方法。
【請求項４】
前記担体がラテックス粒子であることを特徴とする請求項３記載の分類方法。
【請求項５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清。
（ａ）ヘリコバクター・ピロリに属する任意の菌株を以下より２以上選択する工程
ヘリコバクター・ピロリ217B株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０４９）
ヘリコバクター・ピロリ218A株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０５０）
ヘリコバクター・ピロリ220B株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０５１）
（ｂ）工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させ、生じる凝集を除去して、工程（ａ）で選択した菌株以外の全ての菌株に対する抗体を除去する工程
【請求項６】
請求項５記載の特異的抗血清を含むヘリコバクター・ピロリに属する菌株の分類用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株の血清学的分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の研究の結果、ヘリコバクター・ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎の主な原因であることが明らかになりつつある。また、ヘリコバクター・ピロリと胃がんとの関連性も注目されている。
ヘリコバクター・ピロリとこれらの疾患との関連性を明らかにするためには、ヘリコバクター・ピロリの病原株を探索する必要があり、病原株を探索する際には、その一つの指標としてヘリコバクター・ピロリに属する菌株を分類することが必要となる。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリに属する菌株を分類する方法としては、ゲノムＤＮＡの塩基配列の相違に基づき分類する方法や、サイトトキシン（空胞化細胞毒，VacA）を産生するもの（Ｉ型菌）とサイトトキシンを産生しないもの（II型菌）とに分類する方法が知られている。
【０００４】
しかし、ゲノムＤＮＡの塩基配列の相違に基づき分類する方法では、多くの経費、労力、時間及び機器が必要であるとともに、分類が細分化されすぎるという問題点があり、実用的とは言えない。また、サイトトキシンの産生の有無により分類する方法では、Ｉ型菌かII型菌かの２種類にしか分類することができない。そこで、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株を簡易かつ精度よく分類できる方法の開発が緊急の課題となっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株を簡易かつ精度よく分類できる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）又はGTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてＰＣＲを行った結果、増幅断片長の多型が各菌株ごとに相違することを明らかにし（図１）、この増幅断片長の多型によりヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株を特定できることを見出した。
【０００７】
そして、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株を用いて以下の抗血清▲１▼〜▲３▼を作製することに成功した。
▲１▼  ヘリコバクター・ピロリ217B株を免疫原として調製した抗血清とヘリコバクター・ピロリ218A株及び220B株とを反応させ、生じた凝集を除去することにより得られる抗血清
▲２▼  ヘリコバクター・ピロリ218A株を免疫原として調製した抗血清とヘリコバクター・ピロリ217B株及び220B株とを反応させ、生じた凝集を除去することにより得られる抗血清
▲３▼  ヘリコバクター・ピロリ220B株を免疫原として調製した抗血清とヘリコバクター・ピロリ217B株及び218A株とを反応させ、生じた凝集を除去することにより得られる抗血清
【０００８】
そして、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を上記抗血清▲１▼〜▲３▼と反応させ、抗原抗体反応による凝集形成の程度、すなわち、対象菌株と上記抗血清▲１▼〜▲３▼との反応性を指標とすることによりヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を分類できることを見出した。
【０００９】
また、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を培養すると、菌体同士が付着して塊を形成する場合があり、この塊を対象菌株と上記抗血清▲１▼〜▲３▼との抗原抗体反応により形成される凝集と見間違う危険性があることを見出した。そして、本発明者らは、対象菌株と上記抗血清▲１▼〜▲３▼とを反応させる前に対象菌株を予めトリプシンやブタ膵臓エキス等のプロテアーゼにより処理し、塊を形成していた対象菌株を均一の浮遊液とすることにより、上記危険性を回避できることを見出し、これによって対象菌株をより一層精度よく分類できることを見出した。
【００１０】
さらに、本発明者らは、上記抗血清▲１▼〜▲３▼から単離した抗体を担体に感作し、該担体を対象菌株に反応させた場合には、対象菌株を予めプロテアーゼ処理しなくとも、また対象菌株が少量であっても、対象菌株の担体に対する反応性を精度よく判別できる点で有利であり、特に担体としてラテックス粒子（例えば、ポリスチレンラテックス粒子）を用いた場合には、対象菌株と担体との反応により生じる凝集像が明瞭となり、対象菌株の担体に対する反応性を容易かつ精度よく判別できる点でさらに有利であることを見出した。
【００１１】
これらの知見に基づいて本発明は完成されるに至った。
すなわち、本発明は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を、以下の工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清と反応させ、前記対象菌株の前記特異的抗血清に対する反応性を指標として前記対象菌株を分類することを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株の分類方法である。
（ａ）ヘリコバクター・ピロリに属する任意の菌株を２以上選択する工程
（ｂ）工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させ、生じる凝集を除去する工程
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のヘリコバクター・ピロリに属する菌株の分類方法は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を、以下の工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清と反応させ、前記対象菌株の前記特異的抗血清に対する反応性を指標として前記対象菌株を分類することを特徴とする。
（ａ）ヘリコバクター・ピロリに属する任意の菌株を２以上選択する工程
（ｂ）工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させ、生じる凝集を除去する工程
【００１３】
本発明において、「ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株」とは、分類の対象であるヘリコバクター・ピロリに属する菌株を意味する。ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株は、ヘリコバクター・ピロリに属する限り、いかなる菌株を使用してもよい。例えば、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎等の患者から単離したヘリコバクター・ピロリに属する菌株を対象菌株として使用することができる。また、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株は、生菌及び死菌のいずれであってもよい。例えば、ホルマリン等によって処理した死菌を対象菌株として使用することができる。
【００１４】
ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株は、工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清と反応させる前に予めプロテアーゼ処理しておくことが望ましい。ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株は菌体同士の付着により塊を形成する場合があり、この塊を対象菌株と特異的抗血清との抗原抗体反応による凝集と見間違う危険性がある。そこで、対象菌株を予めプロテアーゼ処理しておけば、対象菌株の菌体同士の付着を防止できるので、上記危険性を回避でき、対象菌株の特異的抗血清に対する反応性を指標としてより一層精度よく対象菌株を分類することができる。
【００１５】
ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を予めプロテアーゼ処理する場合、使用するプロテアーゼは、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の菌体同士の付着を防止できる限り、いかなるプロテアーゼであってもよいが、トリプシン、ブタ膵臓エキス等を使用するのが好ましい。
プロテアーゼの使用量は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の菌体同士の付着を防止できる限り特に限定されず、対象菌株の細胞濃度やプロテアーゼの種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、プロテアーゼとしてトリプシンを使用する場合には、対象菌株109〜1010cells/mlに対して5%トリプシン0.1〜0.4ml、好ましくは0.2〜0.3mlを使用することができる。また、プロテアーゼとしてブタ膵臓エキスを使用する場合には、対象菌株109〜1010cells/mlに対してブタ膵臓エキス0.1〜0.4ml、好ましくは0.2〜0.3mlを使用することができる。
【００１６】
プロテアーゼ処理する際の温度は、使用するプロテアーゼの種類等に応じて適宜選択し得るが、通常、30〜37℃である。
プロテアーゼ処理する時間は、対象菌株の細胞濃度やプロテアーゼの量等に応じて適宜選択し得るが、通常、0.5〜2時間であり、好ましくは1時間である。
プロテアーゼ処理する際のpHは、使用するプロテアーゼの種類等に応じて適宜選択し得るが、通常、8.0〜8.5であり、好ましくは8.0である。
【００１７】
ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株と反応させる特異的抗血清は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）により作製される。
（ａ）ヘリコバクター・ピロリに属する任意の菌株を２以上選択する工程
（ｂ）工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させ、生じる凝集を除去する工程
【００１８】
以下、各工程ごとに説明する。
工程（ａ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する任意の菌株を２以上選択する工程である。
工程（ａ）で選択する菌株は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株である限り、いかなる菌株であってもよい。ヘリコバクター・ピロリに属する菌株としては、例えば、以下の菌株（Ｉ）〜（ＩＩＩ）、菌株（ｉ）〜（ｉｉｉ）、並びにヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株を例示できる。なお、ヘリコバクター・ピロリ217B株、ヘリコバクター・ピロリ218A株及びヘリコバクター・ピロリ220B株は、各々、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17049、FERM P-17050及びFERM P-17051として寄託されている（寄託日：平成10年11月11日）。
【００１９】
菌株（Ｉ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株であって、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、450bp、480bp、970bp、1100bp、1500bp及び1650bpの断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、450bp、500bp、550bp、750bp、780bp及び1200bpの断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、470bp、550bp及び2200bpの断片が増幅されるような菌株である。
【００２０】
菌株（ＩＩ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株であって、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、480bp、970bp、1500bp及び1800bpの断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、380bp、450bp、500bp、570bp、790bp及び810bpの断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、470bp、540bp、950bp及び1150bpの断片が増幅されるような菌株である。
【００２１】
菌株（ＩＩＩ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株であって、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、1150bp及び1600bpの断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、380bp、480bp及び780bpの断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、480bp、680bp及び880bpの断片が増幅されるような菌株である。
【００２２】
菌株（ｉ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株であって、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン１に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン６に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン１１に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅されるような菌株である。
【００２３】
菌株（ｉｉ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株であって、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン２に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン７に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン１２に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅されるような菌株である。
【００２４】
菌株（ｉｉｉ）は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株であって、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン４に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン９に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅され、
その菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合には、図１のレーン１４に示す電気泳動パターンを示す断片が増幅されるような菌株である。
なお、プライマーとして用いるGGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）及びGTAGACCCGT（配列番号３）はランダムプライマーとして設計されたＤＮＡである（Designed DNA to act as a random primer）。
【００２５】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製する工程である。
抗血清の調製は、工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原とし、常法に従って行うことができる。例えば、工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれブタ膵臓エキス処理した後、ホルマリン処理して不活化する。不活性化した各菌株をPBSに浮遊し、濃度を0.5〜1mg/ml、好ましくは1mg/mlに調製して、免疫原とする。免疫原をウサギの耳静脈等に、２〜５日間隔で４〜８回、好ましくは６回接種し、最終免疫から１〜２週間後、好ましくは１週間後に採血する。この際、免疫原を接種する動物としては、ウサギの他に、例えば、ヤギ、モルモット、ラット等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類を使用することができる。採取した血液を遠心分離（例えば、3000rpmで15分間）し、血清を得る。得られた血清を56℃で、30分間加熱し、非働化する。以上のようにして、工程（ａ）で選択した菌株をそれぞれ免疫原として抗血清を調製することができる。
【００２６】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させ、生じる凝集を除去する工程である。
工程（ｂ）で調製した抗血清をそれぞれ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、免疫原である菌株以外の全ての菌株と反応させる際、反応温度は例えば30〜37℃とすることができ、反応時間は例えば１〜２時間とすることができる。
【００２７】
生じる凝集の除去は、常法に従って行うことができる。例えば、3000〜12000rpmで15〜30分間遠心分離することにより凝集を除去することができる。
工程（ｃ）より、工程（ｂ）で免疫原とした菌株に反応し、かつ、工程（ａ）で選択した菌株のうち、工程（ｂ）で免疫原とした菌株以外の菌株には反応しない特異的抗血清が得られる。
【００２８】
例えば、工程（ａ）で選択する菌株が上記菌株（Ｉ）〜（ＩＩＩ）である場合には、菌株（Ｉ）に反応し、かつ菌株（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）には反応しない特異的抗血清、菌株（ＩＩ）に反応し、かつ菌株（Ｉ）及び（ＩＩＩ）には反応しない特異的抗血清、並びに、菌株（ＩＩＩ）に反応し、かつ菌株（Ｉ）及び（ＩＩ）には反応しない特異的抗血清が得られる。
また、工程（ａ）で選択する菌株が上記菌株（ｉ）〜（ｉｉｉ）である場合には、菌株（ｉ）に反応し、かつ菌株（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）には反応しない特異的抗血清、菌株（ｉｉ）に反応し、かつ菌株（ｉ）及び（ｉｉｉ）には反応しない特異的抗血清、並びに、菌株（ｉｉｉ）に反応し、かつ菌株（ｉ）及び（ｉｉ）には反応しない特異的抗血清が得られる。
【００２９】
また、工程（ａ）で選択した菌株が上記ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株である場合には、217B株に反応し、かつ218A株及び220B株には反応しない特異的抗血清、218A株に反応し、かつ217B株及び220B株には反応しない特異的抗血清、並びに、220B株に反応し、かつ217B株及び218A株には反応しない特異的抗血清が得られる。
工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清はそのまま対象菌株と反応させてもよいが、特異的抗血清に含まれる抗体を担体に感作した後、該担体を対象菌株と反応させてもよい。
【００３０】
特異的抗血清に含まれる抗体は、常法に従って特異的抗血清から単離できる。例えば、特異的抗血清を硫安塩析した後、ゲルろ過することにより、特異的抗血清から該特異的抗血清に含まれる抗体を単離できる。ゲルろ過には、例えばSephadex G25等を使用することができる。特異的抗体から単離された抗体には不純物が含まれていてもよいが、不純物はできるだけ少ない方が好ましい。
特異的抗血清から単離された抗体を担体に感作させた場合、対象菌株を予めプロテアーゼ処理しなくても、また対象菌株が少量であっても、対象菌株の担体に対する反応性を容易かつ精度よく判別できる点で有利である。
【００３１】
特異的抗血清を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン-ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子を使用する場合には、特別な処理をしなくても容易に抗体を担体に感作できるとともに、対象菌株と担体の反応により生じる凝集像が明瞭となり、対象菌株の担体に対する反応性を容易かつ精度よく判別できる点でさらに有利である。
【００３２】
特異的抗血清から単離された抗体を担体に感作する方法は、特に限定されない。例えば、特異的抗血清から単離された抗体を担体に物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例えば、特異的抗血清から単離された抗体と担体とを混和した後、30〜37℃で1〜2時間加温振盪することにより、抗体を担体に感作させることができる。担体に感作する抗体の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定することができる。
抗体を担体に感作した後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。
【００３３】
工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清及び該特異的抗血清に含まれる抗体を感作した担体は、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株の分類用試薬とすることができる。分類用試薬とする場合、工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清及び該特異的抗血清に含まれる抗体を感作した担体は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株と反応させる時まで媒体分散液として保持しておくのが好ましい。この際、媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用することができる。工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清及び該特異的抗血清に含まれる抗体に感作した担体の含有量は、通常、媒体分散液に対して0.2〜0.5重量％とすることができるが、0.25〜0.3重量％とするのが好ましい。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。
【００３４】
ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の分類は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を、工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清と反応させ、対象菌株の特異的抗血清に対する反応性を指標として行う。また、工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清に含まれる抗体を担体に感作した後、該担体を対象菌株と反応させる場合には、対象菌株の該担体に対する反応性を指標として対象菌株の分類を行う。
【００３５】
ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の分類は、対象菌株の上記特異的抗血清、抗体又は担体に対する反応性を指標とする限り、いかなる態様をもとり得る。
例えば、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を特異的抗血清と反応させ、凝集の有無又はその程度によって対象菌株と特異的抗血清との反応性を判別し、その判別結果に基づいてヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を分類することができる。この際、上述のように、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を予めプロテアーゼ処理しておくと、対象菌株と特異的抗血清との反応により生じる凝集の有無及びその程度を精度よく判別することができる。
より具体的には、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の特異的抗血清に対する反応性を指標として、以下のように対象菌株を分類することができる。
【００３６】
すなわち、工程（ａ）で選択する菌株が上記菌株（Ｉ）〜（ＩＩＩ）である場合には、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を、以下のグループ１〜４：
グループ１：菌株（Ｉ）に反応し、かつ菌株（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）には反応しない特異的抗血清（以下「特異的抗血清Ａ」という）にのみ反応するグループ、
グループ２：菌株（ＩＩ）に反応し、かつ菌株（Ｉ）及び（ＩＩＩ）には反応しない特異的抗血清（以下「特異的抗血清Ｂ」という）にのみ反応するグループ、
グループ３：菌株（ＩＩＩ）に反応し、かつ菌株（Ｉ）及び（ＩＩ）には反応しない特異的抗血清（以下「特異的抗血清Ｃ」という）にのみ反応するグループ、
グループ４：特異的抗血清Ａ、Ｂ及びＣのいずれにも反応しないグループ
に分類することができる。
工程（ａ）で選択する菌株が上記菌株（ｉ）〜（ｉｉｉ）、又はヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株である場合にも、上記と同様にして、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を分類することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
〔実施例１〕ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株、219A株、220B株及び11637株の特性決定
ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株、219A株、220B株及び11637株の各ゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）又はGTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、「PCR」という）を行い、その増幅断片長の多型により各菌株の特性を決定した。すなわち、RAPD（Randam amplified polymorphic DNA）解析により、各菌株のゲノムDNA間の多型を検出した。なお、ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株は、各々、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−17049、FERM P‐17050及びFERM P−17051として寄託されている（寄託日：平成10年11月11日）。
【００３８】
RAPD解析は、Ready-To-Go RAPD Analysis Kit（Pharmacia Biotech社製）を用いて次のように行った。RAPD Analysis Beadsの入ったエッペンドルフチューブに鋳型となる各菌株のゲノムＤＮＡ25ng及び各プライマー25pmolを加え、容量が25μlとなるように滅菌水を加えた。サーマルサイクラーGene Amp PCR System 9600及び2400（Perkin Elmer社製）を用いて以下の条件でPCRを行った。
【００３９】
【表１】
0004315513.tif 000002
【００４０】
バッファーとしてTAE（40mM Tris-acetate（pH8.0）；1mM EDTA）を用い、15cm×15cmのゲルプレートに2%アガロースを作製し、PCR反応液10μlに泳動用色素（30%グリセロール；0.125%ブロモフェノールブルー）を２μl加えたものを、上記アガロースゲルのサンプルスロットに注入し、電圧150Ｖで３時間電気泳動した。電気泳動後、アガロースゲルを１mg/mlエチジウムブロマイドを含むTAEバッファーで染色し、トランスイルミネーター上でＤＮＡのバンドを撮影した。
【００４１】
その結果を、図１に示す。
図１中、レーン１、６及び１１は、各々、217B株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合、レーン２、７及び１２は、各々、218A株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合、レーン３、８及び１３は、各々、219A株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合、レーン４、９及び１４は、各々、220B株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合、レーン５、１０及び１５は、各々、11637株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合の結果を示す。
【００４２】
図１に示すように、ヘリコバクター・ピロリ217B株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合であって、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとした場合には、450bp、480bp、970bp、1100bp、1500bp及び1650bpの断片が増幅され、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとした場合には、450bp、500bp、550bp、750bp、780bp及び1200bpの断片が増幅され、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合には、470bp、550bp及び2200bpの断片が増幅された。
【００４３】
また、ヘリコバクター・ピロリ218A株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合であって、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとした場合には、480bp、970bp、1500bp及び1800bpの断片が増幅され、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとした場合には、380bp、450bp、500bp、570bp、790bp及び810bpの断片が増幅され、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合には、470bp、540bp、950bp及び1150bpの断片が増幅された。
【００４４】
また、ヘリコバクター・ピロリ219A株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合であって、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとした場合には、450bp、950bp、1050bp、1100bp、1500bp及び1650bpの断片が増幅され、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとした場合には、500bp、520bp、800bp、1150bp及び1500bpの断片が増幅され、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合には、470bp、550bp、600bp、800bp、900bp及び1800bpの断片が増幅された。
【００４５】
また、ヘリコバクター・ピロリ220B株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合であって、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとした場合には、1150bp及び1600bpの断片が増幅され、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとした場合には、380bp、480bp及び780bpの断片が増幅され、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合には、480bp、680bp及び880bpの断片が増幅された。
【００４６】
また、ヘリコバクター・ピロリ11637株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合であって、GGTGCGGGAA（配列番号１）をプライマーとした場合には、420bp、1000bp、1250bp及び1650bpの断片が増幅され、GTTTCGCTCC（配列番号２）をプライマーとした場合には、480bp、520bp、700bp、780bp、1150bp及び1700bpの断片が増幅され、GTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとした場合には、480bp、550bp、680bp及び1050bpの断片が増幅された。
以上の結果より、各菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、GGTGCGGGAA（配列番号１）、GTTTCGCTCC（配列番号２）又はGTAGACCCGT（配列番号３）をプライマーとしたPCRにより増幅される断片長の多型により、各菌株を特定できることが判明した。
【００４７】
〔実施例２〕  特異的抗血清の調製
ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株をブタ膵臓エキスで処理した後、ホルマリンで不活性化し、各菌体濃度が１mg/mlになるようにPBSで調整し、免疫原とした。
上記免疫抗原0.5〜３mlをウサギの耳静脈に３日間隔で６回接種した。最終免疫から１週間後に採血し、得られた血液を3000rpmで15分間遠心分離して血清を得た。得られた血清を56℃で30分間加熱することにより非働化した。以下、ヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株を免疫原として得られた血清を、各々、抗血清α、抗血清β及び抗血清γと呼ぶ。
【００４８】
スライドグラスをガラス鉛筆で６分画に分け、各分画に抗血清α、β又はγを１滴（約30μl）滴下した。上記のようにブタ膵臓エキスで処理したヘリコバクター・ピロリ217B株、218A株及び220B株を各分画に10μlずつ加えた。スライドガラスを前後左右に揺り動かし、抗血清とヘリコバクター・ピロリとを反応させ、１分間以内に菌体の凝集が見られるか否かを判別した。
その結果を以下の表２に示す。なお、表２中、「＋」は弱陽性を意味し、「＋＋」は中陽性を意味し、「＋＋＋」は強陽性を意味する。
【００４９】
【表２】
0004315513.tif 000003
【００５０】
表２に示すように、抗血清α、β及びγは、各々、217B株、218A株及び220B株とよく反応したが、抗血清αは220B株ともわずかに反応し、抗血清βは220B株ともわずかに反応し、抗血清γは217B株及び218A株ともわずかに反応した。
そこで、抗血清αに220B株の菌体を加え、37℃で２時間反応させた後、8000rpmで30分間遠心分離し、沈殿した菌体を除いて血清を得た。得られた血清が、220B株と反応しなくなったことを上記と同様のスライド凝集試験によって確認した。
【００５１】
これによって、217B株に反応し、かつ218A株及び220B株には反応しない抗血清α（以下、「特異的抗血清α」という）が得られた。
抗血清β及びγに関しても上記と同様の手法を施し、218A株に反応し、かつ217B株及び220B株には反応しない抗血清β（以下、「特異的抗血清β」という）、並びに220B株に反応し、かつ217B株及び218A株には反応しない抗血清γ（以下、「特異的抗血清γ」という）が得られた。
【００５２】
〔実施例３〕特異的抗血清α〜γを用いた分類
実施例１で特性決定したヘリコバクター・ピロリ219A株及び11637株の特異的抗血清α〜γに対する反応性をスライド凝集反応により調べ、ヘリコバクター・ピロリ219A株及び11637株の分類を試みた。なお、ヘリコバクター・ピロリ219A株及び11637株を特異的抗血清α〜γと反応させる前に、ヘリコバクター・ピロリ219A株及び11637株をブタ膵臓エキスで処理しておいた。
その結果、ヘリコバクター・ピロリ219A株は、特異的抗血清αにのみ反応し、特異的抗血清β及びγには反応しなかった。
【００５３】
また、ヘリコバクター・ピロリ11637株は、特異的抗血清βにのみ反応し、特異的抗血清α及びβには反応しなかった。
以上の結果より、ヘリコバクター・ピロリ219A株は、特異的抗血清αにのみ反応するグループに分類され、ヘリコバクター・ピロリ11637株は、特異的抗血清βにのみ反応するグループに分類されることが判明した。すなわち、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の特異的抗血清α〜γに対する反応性を指標として該対象菌株を分類できることが判明した。
【００５４】
実施例１で示したように、ヘリコバクター・ピロリ217B株と219A株とは遺伝子型が異なる菌株であり、またヘリコバクター・ピロリ218A株と11637株とは遺伝子型が異なる菌株である。しかし、上記結果により、遺伝子型の異なる菌株であっても、特異的抗血清を用いて分類する場合には、同一のグループに分類されることが判明した。
【００５５】
〔実施例４〕特異的抗血清α〜γに含まれる抗体を感作したラテックス粒子を用いた分類
特異的抗血清α〜γをそれぞれ硫安塩析した後、Sephadex G25を用いたゲルろ過に供し、特異的抗血清α〜γに含まれる抗体をそれぞれ精製抗体として得た。精製抗体の濃度が約1mg/mlとなるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（pH7.2）で調整し、精製抗体含有ＰＢＳを作製した。この精製抗体含有ＰＢＳと、ポリスチレンラテックス粒子（PROLABO社製）（粒径0.3μm）約1mg/mlを含有するＰＢＳとを１：１（v/v）で混合し、37℃の温浴槽で１時間加温振盪した。
【００５６】
次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）約5mg/mlを含有するＰＢＳを1/10容量加えて、ポリスチレンラテックス粒子の未感作部分をブロッキングした。
この混合液を12000rpmで15分間遠心分離した後、上清を除去し、ＢＳＡ約0.1mg/mlを含有するＰＢＳを加えてさらに遠心分離した。
遠心分離後、上清を除去し、精製抗体を感作したポリスチレンラテックス粒子の最終濃度が0.5mg/mlとなるように、ＢＳＡ約0.5mg/mlを含有するグリシン緩衝液を加え分散させた。この分散液を分類用試薬として、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株（20株）の分類に使用した。分類の対象としたヘリコバクター・ピロリに属する菌株（20株）は、胃疾患者の胃から分離培養して得たものである。なお、以下では、特異的抗血清αに由来する分類用試薬を「分類用試薬α」、特異的抗血清βに由来する分類用試薬を「分類用試薬β」、特異的抗血清γに由来する分類用試薬を「分類用試薬γ」という。
【００５７】
ヘリコバクター・ピロリに属する菌株（20株）の分類用試薬α〜γに対する反応性を上記と同様にしてスライド凝集反応により調べ、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株（20株）の分類を試みた。
その結果、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株（20株）のうち、分類用試薬αにのみ反応した菌株数は８であり、分類用試薬βにのみ反応した菌株数は７であり、分類用試薬γにのみ反応した菌株数は４であり、いずれの分類用試薬にも反応しなかった菌株数は１であった。
【００５８】
以上の結果より、ヘリコバクター・ピロリに属する菌株（20株）のうち、８菌株は分類用試薬αにのみ反応するグループに、７菌株は分類用試薬βにのみ反応するグループに、４菌株は分類用試薬γにのみ反応するグループに、残る１菌株は分類用試薬α〜γのいずれにも反応しないグループに分類できることが判明した。すなわち、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株の分類用試薬α〜γに対する反応性を指標として該対象菌株を分類できることが判明した。
【００５９】
【発明の効果】
本発明では、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株を、工程（ａ）〜（ｃ）により作製される特異的抗血清又は該特異的抗血清に含まれる抗体を感作した担体と反応させ、対象菌株の上記特異的抗血清、抗体又は担体に対する反応性を指標とすることにより、対象菌株を簡易かつ精度よく分類することができる。この際、対象菌株と上記特異的抗血清又は担体とを反応させる前に、対象菌株を予めプロテアーゼ処理しておくと、抗原抗体反応による凝集の有無及びその程度をより精度よく判別できるので、分類の精度がさらに向上する。特に、特異的抗血清に含まれる抗体を感作した担体を使用する場合には、対象菌株を予めプロテアーゼ処理しなくても、また対象菌株が少量であっても、対象菌株の担体に対する反応性を容易かつ精度よく判別できる点で有利であり、特に担体としてラテックス粒子を用いる場合には、対象菌株と担体との反応により生じる凝集像が明瞭となり、対象菌株の担体に対する反応性を容易に判別できる点でさらに有利である。
【００６０】
【配列表】
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0004315513.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】  PCRにより得られた増幅断片の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１】
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