(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ・マルトーサ形質転換体での遺伝子発現誘導用の、配列番号２で示されるＤＮＡからなるプロモーター。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターを含む、キャンディダ・マルトーサ用の発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項４】
宿主がキャンディダ・マルトーサである、請求項３に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャンディダ属酵母由来の新規プロモーターに関する。より詳しくは、キャンディダ属酵母において、培養条件や培地条件等の誘導条件に依存することなく構成的に、かつ翻訳レベルにおいて高効率に有用遺伝子を発現できるプロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え技術の発展に伴い、微生物を用いた有用蛋白質並びに有用化学品等の生産が行われてきた。まず、原核生物である大腸菌や枯草菌を用いた遺伝子組換え系の開発が積極的に進められ、特に大腸菌の宿主・ベクター系を用いた様々な有用物質の生産が行われている。しかし、大腸菌において生産される蛋白質は菌体内で不溶性穎粒を形成することがあり、また、真核生物に特徴的な糖鎖付加を行うことができない等の問題もあった。
【０００３】
これに対して、真核生物である酵母を宿主とした系の開発が進められた。酵母は古くから醸造や製パンに利用されてきたほか、飼料用として生産された経験もあり、高い安全性が保証されている。また、生産される蛋白質に糖鎖付加を行うことが可能であることも、原核生物とは区別される特徴である。例えば、遺伝学的知見が豊富なサッカロマイセス・セレビジェの他、シワニオマイセス属、クルイベロマイセス属、ピキア属、ハンセヌラ属、ヤロウィア属、キャンディダ属において、宿主・ベクター系が開発されている（Nonconventional Yeasts in Biotechno1ogy，Klaus Wolf著，Springer出版）。
【０００４】
これらの酵母の中には、直鎖炭化水素鎖（ｎ−アルカン）を唯一の炭素源として生育できるもの（「ｎ−アルカン資化性酵母」という）がある。キャンディダ属のキャンディダ・マルトーサ（Candida ma1tosa）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等や、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula po1ymorpha）、ヤロウィア・リボリティカ（Yarrowia 1ipo1ytica）等である。これらの酵母はｎ−アルカンの末端を酸化する酸化酵素系をもち、酸化によって生じた長鎖カルボン酸を、ペルオキシソームのβ酸化系でＴＣＡサイクルの基質となるアセチル−ＣｏＡにまで分解し、エネルギー源として利用することができる。
【０００５】
ｎ−アルカン資化性酵母は直鎖炭化水素を炭素源として生育するばかりでなく、通常の酵母の生育を阻害する疎水性物質に耐性であり、疎水性化学物質の変換による有用物質の生産・反応の場を提供する宿主として有望である。したがって、このような酵母における異種遺伝子発現系を作製することによって、有害な副産物を生み出さず、エネルギーを浪費しない、新たな有用化学物質生産系を構築することができる。
【０００６】
ｎ−アルカン資化性酵母のうちキャンディダ・マルトーサにおいて、異種遺伝子発現系の構築が積極的に行われてきた。M.Kawamuraらはキャンディダ・マルトーサより高効率形質転換の原因領域（Transformationability=以下ＴＲＡと略す）を見出した（M, Kawamura, et a1., Gene, vol.24, 157, （1983））。この領域には、キャンディダ・マルトーサにおいて自立的複製に関わる配列（Autonomously rep1icating sequence:以下ＡＲＳと略す）およびセントロメア配列（以下ＣＥＮと略す）が含まれることが判った。現在までに、ＴＲＡ全領域を有する低コピーベクターと導入遺伝子高発現が期待できるＣＥＮ領域を除いた高コピーベクターが開発されている（M. Ohkuma, et al., Mo1. Gen. Genet., vol.249, 447, （1995））。
【０００７】
ところで、キャンディダ・マルトーサにおける遺伝子発現のためには同酵母内で機能するプロモーターが必要であり、複数のプロモーターが利用可能になっている。キャンディダ・マルトーサはｎ−アルカン酸化系の酵素をアルカンの存在下に高生産する。特に、アルカンの初発酸化を行うチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子（ＡＬＫと略す）は強く誘導され（M. Ohokuma, et a1., ＤＮＡ and Ce11 Biology, vol.14, 163,（1995））、またβ酸化系の酵素をコードする遺伝子の転写も誘導される（Y. Masuda, et al., Gene, vol.167, 157,（1995））。ＡＬＫ遺伝子群のうちＡＬＫ１遺伝子のプロモーターは、ｎ−アルカンによって最も強く誘導され、遺伝子発現に利用することができる。一方、脂肪酸存在下ではＡＬＫ２やＡＬＫ５遺伝子のプロモーターが適している。
【０００８】
解糖系の酵素として知られているホスホグリセリン酸キナーゼ（以下ＰＧＫと略す）のプロモーターは、グルコースの存在下で強力な遺伝子発現を誘導することが知られている。キャンディダ・マルトーサのＰＧＫプロモーターが、Y. Masudaらによってクローニングされた（Y. Masuda, et a1., Curr. Genet., vol.25,412,（1994））。更に、ガラクトース存在下において強力な遺伝子発現誘導活性を有する、ＧＡＬプロモーターもクローニングされた（S. M. Park, et a1., Yeast, vol.13, 21（1997））。このようにしてクローニングされたＡＬＫプロモーター、ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬプロモーターは、キャンディダ・マルトーサにおける遺伝子発現に利用することができる。
【０００９】
しかしながら、ＡＬＫプロモーターはブドウ糖などを炭素源とした場合にはほとんど機能せず、またＰＧＫプロモーターは脂肪酸やｎ−アルカンを炭素源とした場合にほとんど機能しない。このため、キャンディダ・マルトーサにおける有用物質の生産において、当該物質の生産に適した炭素源は必ずしも強力な遺伝子発現に適したものとはいえない。更にＧＡＬプロモーターはガラクトースを炭素源としたときにのみ誘導されるため、高価なガラクトースを利用しなければならない点で工業的生産には適さないといえる。
【００１０】
そこで、キャンディダ・マルトーサを用いた高効率な有用物質の生産のために、炭素源の種類による制限を受けず、かつ前記プロモーターよりも強力に遺伝子発現できる新規プロモーターが望まれていた。
最近、キャンディダ・マルトーサのＧＣＮ４遺伝子（以下Ｃ−ＧＣＮ４と略す）がクローニングされた（高久等、平成12年度分子生物学会年会）。該遺伝子は、既にサッカロマイセス・セレビジェにおいてアミノ酸生合成系の遺伝子発現調節に密接に関係していることが知られている（A. G. Hinnebusch, E. W. Jones et al., 編, The Molecular and Ce11ular Bio1ogy of the Yeast Saccharomyces, vo1.2, 317, Co1d Spring Harbor Laboratory Press）。
【００１１】
サッカロマイセス・セレビジェのＧＣＮ４遺伝子（以下Ｓ−ＧＣＮ４と略す）は5'非翻訳領域が長く、同領域内に４つの上流オープンリーディングフレーム（以下ｕＯＲＦと略す）を有している。Ｓ−ＧＣＮ４遺伝子発現は、栄養源が豊富な培養条件では抑制され、アミノ酸飢餓のような培養条件下で誘導される。このような遺伝子発現誘導は、翻訳活性の増強によるものである。
【００１２】
また、Ｓ−ＧＣＮ４遺伝子の5'非翻訳領域内にある、４つのｕＯＲＦの翻訳開始コドンに変異を導入することにより、栄養源が豊富な培養条件下においても該遺伝子の翻訳活性が上昇することが知られている（G. Thireos et a1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.81, 5096（1984）, P. P. Muellereta1., Cell, vol.45, 201（1986））。このことから、前述の変異導入をされたＳ−ＧＣＮ４プロモーターを用いた遺伝子発現は、炭素源の違いによる影響を受けないと考えられる。
【００１３】
一方、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（以下３−ＡＴと略する）を培地に添加することにより、Ｓ−ＧＣＮ４プロモーターを利用した遺伝子発現系の構築も行われている（A. Mimran, et a1., Biotechniques, vol.28, 552,（2000）、W000/52181）。この系は、前述の変異導入されたＳ−ＧＣＮ４プロモーターと同程度の遺伝子発現を行うことができる。そこで、サッカロマイセス・セレビジェを宿主として、この系を利用したヒト血清アルブミンの生産が検討された。しかしながら、ヒト血清アルブミンの生産性はO.5mg/Lと非常に低く、かつ本生産系では培地にヒスチジン合成系阻害剤である３−ＡＴの添加が必要なため、工業的生産への応用は困難と考えられた。
【００１４】
したがって、Ｓ−ＧＣＮ４は変異導入により遺伝子翻訳活性が上昇するにも関わらず、サッカロマイセス・セレビジェにおける有用物質生産用プロモーターとして有用とは考えられていなかった。
キャンディダ属酵母は、サッカロマイセス・セレビジェとは異なり有性世代が知られておらず、多くは２倍体ゲノムを有している。また、その遺伝暗号読みとりに異常があることも報告されている。キャンディダ・シリンドラッセ（Candida cy1indraceae）（Y. Kawaguchi,et al., Nature, vol.341, 164（1989））やキャンディダ・マルトーサ（H. Sugiyama, et a1., Yeast, vol11, 43（1995））は通常ロイシンコドンをコードするＣＵＧコドンをセリンとして読むことが報告されている。このように、キャンディダ属酵母はサッカロマイセス・セレビジェとは大きく異なる性質を有しているといえる。
【００１５】
高久らによってクローニングされた前述のＣ−ＧＣＮ４は、Ｓ−ＧＣＮ４とは異なり、３種類のｕＯＲＦを含有する。こうしたＧＣＮ４遺伝子の構造の違い、並びに前述したキャンディダ属酵母の特殊性のため、サッカロマイセス・セレビジェで認められるＧＣＮ４遺伝子への変異導入による翻訳活性の上昇が、キャンディダ属酵母でも認められるかどうかは不明である。そればかりか、Ｃ−ＧＣＮ４が、Ｓ−ＧＣＮ４と同様に物質生産に要求される強力なプロモーター活性を有するとも考えられていなかった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵母において、炭素源の種類に関わらず、強力な遺伝子発現が可能なプロモーターを提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、キャンディダ・マルトーサＧＣＮ４遺伝子の5'非翻訳領域に存在する３種類の翻訳開始コドンに変異を導入することにより、そのプロモーター活性が上昇することを見出し、本発明を完成させた。該変異導入ＧＣＮプロモーターは、ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬプロモーターに比べて極めて高いプロモーター活性を示した。しかも、そのプロモーター活性は炭素源によって影響を受けないことが考えられた。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の(1)〜(13)を提供するものである。
(1) キャンディダ属酵母由来のＧＣＮ４遺伝子上の転写開始点と構造遺伝子の間に存在する少なくとも１つの翻訳開始コドンに変異を導入して得られる、改変されたＧＣＮ４プロモーター。
(2) キャンディダ属酵母由来のＧＣＮ４遺伝子上の転写開始点と構造遺伝子の間に存在する全ての翻訳開始コドンに変異を導入して得られる、改変されたＧＣＮ４プロモーター。
【００１９】
(3) キャンディダ属酵母由来のＧＣＮ４遺伝子が、キャンディダ・マルトーサ由来のＧＣＮ４遺伝子である、上記(1)または(2)記載のプロモーター。
(4) 前記ＧＣＮ４遺伝子が以下の(a)または(b)のＤＮＡからなる、上記(3)記載のプロモーター。
(a) 配列番号１で示されるＤＮＡ
(b) 配列番号１で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＣＮ４遺伝子活性を有するＤＮＡ
【００２０】
(5) 前記ＧＣＮ４遺伝子が配列番号１で示されるＤＮＡからなる、上記(3)記載のプロモーター。
(6) 配列番号２で示される塩基配列を含む、上記(1)〜(5)のいずれか１に記載のプロモーター。
(7) 前記プロモーターが、変異導入により野性型ＧＣＮ４プロモーターよりも、タンパクの発現量において５０倍以上向上していることを特徴とする、上記(1)〜(6)のいずれか１に記載のプロモーター。
【００２１】
(8) 以下の(a)または(b)のＤＮＡからなるプロモーター。
(a) 配列番号２で示されるＤＮＡ
(b) 配列番号２で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるＤＮＡからなるプロモーターと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡ
(9) 上記(1)〜(8)のいずれか１に記載のプロモーターを含む、発現ベクター。
【００２２】
(10) 上記(9)記載の発現ベクターを含む形質転換体。
(11) 宿主がキャンディダ属に属する酵母である、上記(10)記載の形質転換体。
(12) キャンディダ属酵母由来のＧＣＮ４遺伝子上の転写開始点と構造遺伝子の間に存在する少なくとも１つの翻訳開始コドンに変異を導入することにより、プロモーター活性が向上されたＧＣＮ４プロモーターの作製方法。
(13) キャンディダ属酵母由来のＧＣＮ４遺伝子上の、転写開始点と構造遺伝子の間に存在する少なくとも１つの翻訳開始コドンに変異を導入することにより、該遺伝子のプロモーター活性を向上させる方法。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．改変されたＧＣＮ４プロモーターの構築
(1) ＧＣＮ４遺伝子
本発明にかかる「ＧＣＮ４遺伝子」は、アミノ酸生合成系(少なくとも１２の異なるアミノ酸生合成経路ネットワーク)を調節する遺伝子群に対し、該遺伝子群の転写活性因子をコードする遺伝子であって、サッカロマイセス属やキャンディダ属等の酵母に見出されている。
【００２４】
本発明において、前記ＧＣＮ４遺伝子は、キャンディダ属酵母由来のものであれば、いずれの種由来のＧＣＮ遺伝子であってもよい。かかるキャンディダ属酵母としては、たとえば、キャンディダ・マルトーサ（Candida ma1tosa）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等が挙げられるが、特にキャンディダ・マルトーサが好ましい。
【００２５】
本発明にかかるＧＣＮ４遺伝子の好適な例として、該キャンディダ・マルトーサ由来のＣ−ＧＣＮ４遺伝子を挙げることができる。該遺伝子の構造の概略を図１に示す。該遺伝子は、例えば配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡからなる。但し、配列番号１で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、ＧＣＮ４遺伝子活性を有する限り、前記ＧＣＮ４遺伝子に含まれるものとする。ここで、ＧＣＮ４活性とは、アミノ酸合成の調節に関与する遺伝子群について、当該遺伝子群の転写を活性化する機能を意味する。また、ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が10mM〜300mM、温度が25℃〜70℃、好ましくはナトリウム濃度が50mM〜100mM、温度が42℃〜55℃の条件をいう。
【００２６】
図１に示すよう、キャンディダ・マルトーサ由来のＣ−ＧＣＮ４遺伝子の転写開始点から翻訳開始点までの上流域には、ＧＣＮ４遺伝子発現を制御するＧＣＮ４プロモーター領域とペプチドをコードする３つの上流オープンリーディングフレーム（以下ｕＯＲＦと略す）が存在する。前記Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子上のそれぞれの位置は、配列番号１において、プロモーター領域が626〜1482番目、構造遺伝子領域が1483〜2427番目、ｕＯＲＦ１が1154〜1165番目、ｕＯＲＦ２が1289〜1300番目、ｕＯＲＦ３が1324〜1350番目の塩基領域と考えられている。なお、上記プロモーター領域は学術的に定められたものではなく、プロモーター活性を示し、本発明においてプロモーターとして利用可能な領域である。
【００２７】
(2) 改変されたＧＣＮ４プロモーター
本発明にかかる「改変されたＧＣＮ４プロモーター」は、前記キャンディダ属酵母由来のＧＣＮ４遺伝子上の転写開始点と構造遺伝子の間に存在する少なくとも１つの翻訳開始コドンＡＴＧに変異を導入することにより得られる。
すなわち、本発明の「改変されたＧＣＮ４プロモーター」とは、変異導入により野性型ＧＣＮ４プロモーターに比較してプロモーター活性が向上されたＧＣＮ４プロモーターである。該プロモーター活性の向上は、野性型ＧＣＮ４プロモーターに比較して、タンパクの発現量において５０倍以上であることが好ましく、特に８０倍以上であることが好ましい。ここで、「野性型ＧＣＮ４プロモーター」とは変異を導入しない天然のＧＣＮ４プロモーターを意味する。また、「変異」とは塩基の置換、欠失または付加を意味する。置換、欠失または付加される塩基の数は、標的ｕＯＲＦを破壊できる限り特に限定されない。変異導入される翻訳開始コドンの数も特に限定されないが、ＧＣＮ４遺伝子上に存在する全ての翻訳開始コドンに対して行われることが望ましい。
【００２８】
前記変異導入によりプロモーター活性が向上する理由は明らかではないが、ｕＯＲＦの翻訳開始コドンＡＴＧに変異を導入することにより翻訳活性が上昇したためではないかと思われた。
なお、本発明の改変されたＧＣＮ４プロモーターは、プロモーター活性を有する領域にかかる遺伝子を意味するもので、その作製において使用される破壊されたｕＯＲＦを含むＧＣＮ４遺伝子上の全領域を意味するものではない。
【００２９】
(3) ＧＣＮ４遺伝子への変異導入
前記したＧＣＮ４遺伝子への変異導入は、公知の方法に基づき、例えば変異導入用プライマーとＰＣＲ法を組み合わせて行える。該変異導入用プライマーは、公知の方法に基づいて、標的遺伝子断片を特異的に増幅しうる１５〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドを設計し、これに目的とする変異（塩基置換、挿入または削除）を導入して作製すればよい。複数の変異導入は、標的遺伝子を部分的にＰＣＲ増幅し、得られた増幅断片を適当な制限酵素で切断・連結することにより達成される。
【００３０】
ＰＣＲによる増幅条件は、標的遺伝子断片が増幅できる限り、どのような条件を用いても良い。また、使用するＤＮＡポリメラーゼは、増幅遺伝子断片の3'側にＡ（アデニン）を付加しないタイプのポリメラーゼを利用することが好ましい。該ＤＡＮポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO社製）等が挙げられる。
【００３１】
本発明の好適な態様として、キャンディダ・マルトーサのＧＣＮ４遺伝子の、３つのｕＯＲＦ（以下、遺伝子5'上流よりそれぞれｕＯＲＦ１、ｕＯＲＦ２、ｕＯＲＦ３と称する）の全ての翻訳開始コドンＡＴＧへの変異導入する方法を以下に説明する。
【００３２】
まず、プライマーORF31-FP（配列番号３）およびORF31-RP（配列番号５）を用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子（配列番号１）を鋳型にＰＣＲ反応を行い、ＯＲＦ３に変異が導入された増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ３１を作製する。同様に、別なプライマーペアORF32-RP（配列番号４）およびORF32-FP（配列番号６）を用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ３２を作製する。
【００３３】
次いで、前記ｕＯＲＦ３１とｕＯＲＦ３２を、それぞれ制限酵素SpeIで切断し、切断断片をＤＮＡリガーゼによって連結する。連結されたＤＮＡ断片を鋳型に、さらに前述のORF31-FP（配列番号３）およびORF32-RP（配列番号４）プライマー用いてＰＣＲ反応を実施し、増幅ＤＮＡ断片ｍ−ｕＯＲＦ３を作製する。
【００３４】
さらに、前記ｍ−ｕＯＲＦ３を鋳型に、ORF32-RP（配列番号４）とORF23−FP（配列番号７）プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ２３を作製する。また、ORF31-FP（配列番号３）とORF21-RP (配列番号８）プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ２１を作製する。作製したｕＯＲＦ２１とｕＯＲＦ２３は、それぞれ制限酵素MunIで切断し、切断断片をＤＮＡリガーゼによって連結する。
【００３５】
こうして連結されたｕＯＲＦ２１とｕＯＲＦ２３から構成されるＤＮＡ断片を鋳型に、ORF32-RP（配列番号４）とORF13-FP（配列番号９）プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ１３を作製する。また、ORF31-FP（配列番号３）およびORF11-RP（配列番号10）プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ１１を作製する。作製したｕＯＲＦ１１とｕＯＲＦ１３をそれぞれ制限酵素Spel,XbaIで切断し、切断断片をＤＮＡリガーゼによって連結する。
【００３６】
こうして連結されたｕＯＲＦ１１とｕＯＲＦ１３から構成されるＤＮＡ断片を鋳型に、ORF31-FP（配列番号３）とORF32-RP（配列番号４）プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子の３つのｕＯＲＦの翻訳開始コドン全てに変異が導入された増幅ＤＮＡ断片ｍ−ＯＲＦ１，２，３を作製することができる。
【００３７】
ｍ−ＯＲＦ１，２，３はＣ−ＧＣＮ４遺伝子のコーディング領域の9アミノ酸を含んでいるが、プロモーター機能を有する限り、翻訳開始コドンに変異が導入されたｕＯＲＦ３の3'下流であればどの領域を本発明のプロモーターとして利用しても良い。また、変異が導入されたｕＯＲＦ１の5'上流側は、プロモーター機能を有する限り、どの領域を本発明のプロモーターとして利用しても良い。
【００３８】
こうして得られた、本発明のプロモーター配列の好適な例を配列番号２に示す。
配列番号２で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡも、それが配列番号２で示されるＤＮＡからなる遺伝子と同等のプロモーター活性を有する限り、本発明のプロモーターに含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が10mM〜300mM、温度が25℃〜70℃、好ましくはナトリウム濃度が50mM〜100mM、温度が42℃〜55℃の条件をいう。なお、配列番号２で示されるＤＮＡからなる遺伝子のプロモーター活性は、後述する実施例２の表１に示されている。
【００３９】
２．プロモーター機能の解析
(1) 解析方法
ｕＯＲＦの翻訳開始コドンに変異が導入された新規プロモーターの機能解析は、該プロモーターによって転写されるｍＲＮＡや該ｍＲＮＡから翻訳される遺伝子産物を定量することにより行うことができる。特に、プロモーターの下流にβガラクトシダーゼ遺伝子や酸性フォスファターゼ遺伝子のような酵素活性を測定できる、いわゆるレポーター遺伝子を連結することによって行うことが好ましい。
前記解析方法の好適な例として、酵母クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces 1actis）由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpPL1を利用した解析方法（M. Ohkuma, et a1., Biosci. Biotech. Biochem., vol.59, 1328,（1995））を挙げることができる（図2）。
【００４０】
(2) ベクターの構築
まず、pPL1を制限酵素SalIとSmaIで切断し、ｍ−ｕＯＲＦ１，２，３を制限酵素Sa1Iで切断する。これらのＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼによって連結し、pPL-CGCN4u0RFl,2,3を構築する。pPL-CGCN4u0RFl,2,3は、本発明のプロモーターの下流にβガラクトシダーゼ遺伝子を含む発現ベクターである。
【００４１】
(3) 形質転換体の作製
次いで、公知の方法にしたがい、前記プラスミドによりキャンディダ・マルトーサを形質転換する。例えば、カルシウム法（E. M. Lederberg, et a1., J. Bacterio1., vol.119, 1072（1974））やエレクトロポレーション法（Currnt Protoco1s in Molecular Biology, １巻, 1.8.4項、1994年）等を用いることができる。また、Fast TrackTM-Yeast Transformation KitSM（GenoTechnology）のような市販の形質転換キットを利用することもできる。
【００４２】
前記形質転換体の宿主としては、例えば、キャンディダ・マルトーサCMT101（his5::HIS5, ade1, ura3::URA3）を好適に用いることができる。CMT101はキャンディダ・マルトーサCHAU1（his5, ade1, ura3/ura3）（M. Ohkuma, et a1., Curr. Genet., vol.23, 205,（1993））のヒスチジン並びにウラシル要求性を、HIS5,Ura3遺伝子を形質転換することにより解除して作製されたものである。
【００４３】
(4) プロモーター活性
得られた、pPL-CGCN4u0RFl,2,3のキャンディダ・マルトーサ形質転換体を用いて新規プロモーターの機能解析を実施する。形質転換体の培養は、同形質転換体が資化できる炭素源を用いて行い、菌体内に発現されるβガラクトシダーゼ活性を測定する。該測定は、例えば、Y. Masudaらの方法（Y. Masuda, et a1., Curr. Genet., vol.25, 412,（1994））によって行うことができる。
【００４４】
３．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、本発明の改変されたＧＣＮ４プロモーターとその下流域に発現させたい遺伝子を機能しうる態様で含むベクターである。該ベクターは、たとえば前項(2)に記載したように、プラスミド等の適当なベクターを用いて構築することができる。なお、機能しうる態様とは、発現させたい遺伝子に対し、本発明のプロモーターがプロモーター活性を発揮し得る態様を意味する。
【００４５】
４．形質転換体
本発明の形質転換体は、前記ベクターを用いて宿主を形質転換することにより得られる。形質転換の方法は、前項(3)に記載したように、カルシウム法、エレクトロポレーション法など公知の方法を用いればよい。該形質転換体は、例えば薬剤耐性や栄養要求性を指標として選択することができる。
本発明の形質転換体の宿主は、本発明のプロモーターが有効に機能しうる宿主であれば特に限定されないが、キャンディダ属酵母が好ましく、特にキャンディダ・マルトーサが最も好ましい。本発明の形質転換体は酵母を宿主とするため、安全性が高く、糖鎖付加機能も有する。しかも、高いプロモーター活性を有する本発明のプロモーターを含むため、高効率な遺伝子発現が可能となる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、こ
れら実施例によりその技術範囲を限定されるものではない。
実施例１：新規プロモーターの構築
新規プロモーターの構築は、変異導入用プライマーとＰＣＲにより実施した。
ＰＣＲはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いて、98℃2分を1サイクル、98℃15秒−46℃2秒−74℃30秒を30サイクル、74℃1分にて実施した。
【００４７】
まず、ｕＯＲＦ３の翻訳開始コドンに変異を導入した。ORF31-FP（配列番号３）およびORF31-RP（配列番号５）プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子（配列番号１）を鋳型にＰＣＲ反応を実施し、目的遺伝子断片ｕＯＲＦ３１を作製した。同様に、ORF32-RP（配列番号４）およびORF32-FP（配列番号６）プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ３２を作製した。
【００４８】
次いで、前記ｕＯＲＦ３１とｕＯＲＦ３２を、それぞれ制限酵素SpeIで切断し、切断断片をＤＮＡリガーゼによって連結する。連結されたＤＮＡ断片を鋳型に、さらに前述のORF31-FP（配列番号３）およびORF32-RP（配列番号４）プライマー用いてＰＣＲ反応を行い、ｕＯＲＦ３の翻訳開始コドンＡＴＧがＡＧＴに置換された増幅ＤＮＡ断片ｍ−ｕＯＲＦ３を作製した。
【００４９】
さらに、ｕＯＲＦ１およびｕＯＲＦ２に変異導入を行った。前記ｍ−ｕＯＲＦ３を鋳型に、ORF32-RP（配列番号４）とORF23−FP（配列番号７）プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ２３を作製した。また、ORF31-FP（配列番号３）とORF21-RP(配列番号８)プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ２１を作製した。作製したｕＯＲＦ２１とｕＯＲＦ２３は、それぞれ制限酵素MunIで切断し、切断断片をＤＮＡリガーゼによって連結した。
【００５０】
こうして連結されたｕＯＲＦ２１とｕＯＲＦ２３から構成されるＤＮＡ断片を鋳型に、ORF32-RP（配列番号４）とORF13-FP（配列番号９）プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ１３を作製する。また、ORF31-FP（配列番号３）およびORF11-RP（配列番号10）プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片ｕＯＲＦ１１を作製する。作製したｕＯＲＦ１１とｕＯＲＦ１３をそれぞれ制限酵素Spel,XbaIで切断し、切断断片をＤＮＡリガーゼによって連結する。
【００５１】
こうして連結されたｕＯＲＦ１１とｕＯＲＦ１３から構成されるＤＮＡ断片を鋳型に、ORF31-FP（配列番号３）とORF32-RP（配列番号４）プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子の３つのｕＯＲＦの翻訳開始コドン全てに変異が導入された増幅ＤＮＡ断片ｍ−ｕＯＲＦ１，２，３（配列番号２）を作製することができた。該断片では、ｕＯＲＦ１の翻訳開始コドンＡＴＧはＡＧＡ,ｕＯＲＦ２の翻訳開始コドンＡＴＧはＣＡＡ、ｕＯＲＦ３の翻訳開始コドンＡＴＧはＡＧＴに変換されている。
【００５２】
実施例２：プロモーター機能の解析
実施例１で構築した新規プロモーターであるｍ−ｕＯＲＦ１,２,３（配列番号２）の機能を、酵母クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpPL1を利用することによって解析した（M. Ohkuma, et al., Biosci. Biotech. Biochem., vol.59, 1328,（1995））（図2）
【００５３】
1) ｍ−ｕＯＲＦ１,２,３のプロモーター機能
まず、pPL1を制限酵素Sa1IとSmaIで切断し、前記ｍ−ｕＯＲＦ１,２,３を制限酵素Sa1Iで切断した。これらのＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼによって連結し、その結果としてpPL-CGCN4uORFl,2,3を構築した。次に、該プラスミドをキャンディダ・マルトーサCMT1O1（his5::HIS5, ade1, ura3::URA3）に、酢酸リチウム法を用いて形質転換した（M. Takagi, et a1., J. Bacterio1ogy, vo1.167, 551,（1986））。CMT101はキャンディダ・マルトーサCHAU1（his5,ade1,ura3/ura3）（M. Ohkuma, et a1., Curr, Genet., vol.23, 205,（1993））のヒスチジン並びにウラシル要求性を、HIS5, Ura3遺伝子を形質転換することにより解除して作成した。このようにして、pPL-CGCN4uORFl,2,3のキャンディダ・マルトーサ形質転換体を取得した。
【００５４】
形質転換体の培養は、SD培地（Difco社製 Yeast Nitrogen Base w/o amino acid 0.17%、硫酸アンモニウム O.5% およびブドウ糖2%）を用いて、30℃にて実施した。該培養液を10mlのSD培地に3%濃度で植菌し、5時間の培養後、菌体内に発現されるβガラクトシダーゼ活性をY. Masudaらの方法（Y. Masuda, et al., Curr. Genet., vol.25, 412,（1994））によって測定した。
【００５５】
2) 野性型プロモーターとの比較
対照として、変異を導入していない変異を導入していないＣ−ＧＣＮ４プロモーターをpPL1に挿入したpPL1-CGCN4を作製し、該ベクターによる形質転換体のβガラクトシダーゼを測定した。なお、PPL1-CGCN4は次のようにして作成した。まず、ORF31-FP（配列番号３）およびORF31-RP（配列番号５）プライマーを用いて、Ｃ−ＧＣＮ４遺伝子を鋳型にＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素Sa1Iにて切断し、制限酵素Sa1IとSmalによって切断されたpPL1とＤＮＡリガーゼを用いて連結し、pPL1-CGCN4を得た。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
なお、参考としてＧＡＬプロモーター、ＰＧＫプロモーターをそれぞれＣＥＮとＡＲＳを有する単コピーベクターに挿入したときのプロモーター活性を、公知の文献に基づき表２にまとめた。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
3) 結果
変異導入されたＧＣＮ４プロモーターは、変異を導入しないプロモーターに比べて、タンパクの発現量において100倍近いプロモーター活性を示した。また、その活性は公知のＧＡＬプロモーターやＰＧＫプロモーターよりもはるかに高いものであった。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、キャンディダ属酵母において、培養条件や培地条件等の誘導条件に依存することなく構成的に、かつ翻訳レベルにおいて高効率に有用遺伝子を発現できるプロモーターが提供される。
【００６１】
【配列表】
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【００６２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：キャンディダ・マルトーサ由来ＧＣＮ４遺伝子
配列番号２：改変されたキャンディダ・マルトーサ由来ＧＣＮ４プロモーター
配列番号３〜１０：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、キャンディダ・マルトーサＣ−ＧＣＮ４遺伝子の構造の概略を示す。
【図２】図２は、酵母クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を利用したプラスミドpPL1の構造の概略を示す。
【図１】
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【図２】
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