(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有し、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド。
（ａ）作用及び基質特異性：β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖のβ−１，４−ガラクトシド結合をエンド型に加水分解する。
（ｂ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ２〜１０の範囲で安定である。
（ｃ）分子量：４０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）等電点：４．５（等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｅ）至適ｐＨ：５〜６である。
（ｆ）作用最適温度：５０℃である。
【請求項２】
糸状菌由来である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
糸状菌が、アクレモニウム属に属する微生物である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アクレモニウム属に属する微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列１又は複数個の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
糸状菌由来である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
糸状菌が、アクレモニウム属に属する微生物である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
アクレモニウム属に属する微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列１又は複数個の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；あるいは、
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
糸状菌由来である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
糸状菌が、アクレモニウム属に属する微生物である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
アクレモニウム属に属する微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、あるいは、請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物、あるいは、請求項１４に記載の発現ベクターで形質転換された、形質転換細胞。
【請求項１６】
宿主が、大腸菌、酵母、放線菌、又は糸状菌である、請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属、又はピキア属に属する微生物である、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
酵母が、サッカロミセス・セレビジエである、請求項１７に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
糸状菌が、アクレモニウム属、フミコーラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、又はフザリウム属に属する微生物である、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス、フミコーラ・インソレンス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーセイ、又はフザリウム・オキシスポーラスである請求項１９に記載の形質転換細胞。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の形質転換細胞を培養する工程；及び
前記培養工程で得られた形質転換細胞及び／又は培養液から、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを採取する工程
を含む、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法で生産された、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、酵素組成物。
【請求項２４】
セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、又はポリガラクツロン酸リアーゼの少なくとも１つを更に含む、請求項２３に記載の酵素組成物。
【請求項２５】
植物材料処理用の、請求項２３又は２４に記載の酵素組成物。
【請求項２６】
植物材料を、請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは、請求項２３又は２４に記載の酵素組成物で処理することを特徴とする、前記植物材料の加工効率及び／又は利用効率を向上させる方法。
【請求項２７】
動物への投与用の、請求項２３又は２４に記載の酵素組成物。
【請求項２８】
請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは、請求項２３又は２４に記載の酵素組成物を、ガラクタン類と共に、動物（但し、ヒトを除く）に直接摂取させることを特徴とする、動物の消化器官内でガラクトオリゴ糖を遊離させる方法。
【請求項２９】
請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは、請求項２３〜２５又は２７のいずれか一項に記載の酵素組成物を含む、飼料添加物。
【請求項３０】
家禽用の、請求項２９に記載の飼料添加物。
【請求項３１】
家禽用飼料に、請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは、請求項２３〜２５又は２７のいずれか一項に記載の酵素組成物を添加することを特徴とする、家禽の産卵率向上、卵殻強度向上、及び／又は産卵期間延長のための方法。
【請求項３２】
請求項２９又は３０に記載の飼料添加物を含む、飼料。
【請求項３３】
飼料原料に、請求項２９又は３０に記載の飼料添加物を添加する、請求項３３に記載の飼料の調製方法。
【請求項３４】
請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは、請求項２３〜２５又は２７のいずれか一項に記載の酵素組成物を含む、食品加工用及び／又は食品添加用の酵素剤。
【請求項３５】
請求項３４に記載の食品加工用酵素剤を用いる、食品の加工方法。
【請求項３６】
請求項１〜８又は２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは、請求項２３〜２５又は２７のいずれか一項に記載の酵素組成物を用いて、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を分解することを特徴とする、ガラクトビオースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラクタナーゼ活性を有する新規のポリペプチド、すなわち、新規のガラクタナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
柑橘類、馬鈴薯、又はダイズ等の植物由来の繊維に多く含まれるガラクタン類は、β−１，４−ガラクトシド結合を有する主鎖を含む多糖である。これらの多糖を分解する酵素として、β−１，４−ガラクタナーゼ（以下、単に「ガラクタナーゼ」と称することがある）が知られている。これまで、種々の菌〔例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ［「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．３４４５−３４５４（非特許文献１）］、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ［「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９７２年，第３６巻，ｐ．１９４５−１９５４（非特許文献２）］、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ［「カルボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」，（オランダ），エルゼビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９１年，第１６巻，ｐ．１６７−１８７（非特許文献３）］、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ［特表２０００−５０５３０３号公報（特許文献１）］、又はＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ（特表２０００−５０５３０３号公報）等〕の生産するエンド型ガラクタナーゼや、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生産するエキソ型ガラクタナーゼ［特許第２９８９２１７号明細書（特許文献２）］が報告されている。
【０００３】
ガラクタナーゼの各分野への応用例として、飼料分野としては、動物飼料に添加することにより、飼料の消化不良の原因解消［特公昭５５−４０２３８号公報（特許文献３）］、あるいは、飼料転換割合の改良［特表平１１−５１４５２８号公報（特許文献４）］等に利用することが開示されている。ここで、飼料に添加されたガラクタナーゼが家畜消化管において有効に作用するためには、比較的低いｐＨにおいて安定でなければならない。例えば、ブロイラーでは、腺胃や筋胃でのｐＨは２付近まで低下することが知られている［小野寺良次ら著，「畜産栄養学」，（有）川島書店，１９８９年，第７３頁（非特許文献４）］が、このように低いｐＨで安定であるガラクタナーゼはこれまで知られていない。例えば、低ｐＨで安定であることが知られている、特表平６−５０５１５４号公報に記載のガラクタナーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来）でも、ｐＨ２．０では６０％以下に、ｐＨ１．５では２０％まで酵素活性が低下する（室温で１時間処理した場合）。
食品分野では、植物抽出物の濁り安定性向上［特表平１０−５０１４１２号公報（特許文献５）］、あるいは、ワイン又はジュースの加工における脱ペクチン化及び粘度低下［特表平６−５０５１５４号公報（特許文献６）］のために用いることが開示されている。
【０００４】
また、ガラクタナーゼをガラクタン類に作用させてガラクトオリゴ糖を得ることができる。ガラクトオリゴ糖は、整腸作用及びカルシウム吸収促進作用［特開平４−１３４０３１号公報（特許文献７）］等が注目され、骨粗鬆症の予防又は治療［特開平７−２５２１５６号公報（特許文献８）］、炎症性腸疾患の予防又は治療の目的で、食品及び医薬品分野に応用されている。また、下痢若しくは軟便の発生抑制又は体重増加率の向上［特公平２−５７９２０２号公報（特許文献９）］、腸内菌叢改善効果［特開平６−１７８６５４号公報（特許文献１０）］、豚用便秘の予防又は治療［特許第２５７１７０２号明細書（特許文献１１）］、牛乳脂肪率の上昇［特許第２５２５６３８号明細書（特許文献１２）］、体内脂肪の蓄積抑制［特開平６−１７８６５４号公報（特許文献１３）］、卵の品質向上［特許第３１２４４０９号明細書（特許文献１４）］、あるいは、サルモネラ菌の増殖阻害［特開平５−２０８９１２号公報（特許文献１５）］の目的で、飼料分野に応用されている。
【０００５】
ガラクトオリゴ糖の製造方法に関しては、種々の報告がなされている。従来、多く用いられている方法は、乳糖又は乳糖含有物にβ−ガラクトシダーゼ又はガラクタナーゼを作用させ、糖転移により、式：
Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ
（式中、「Ｇａｌ」はガラクトースを表わし、「Ｇｌｃ」はグルコースを表わし、「ｎ」は０以上の整数を表わす）
で表されるガラクトオリゴ糖を得る方法である［特公平２−５３０３３号公報（特許文献１６）、特公平３−５４５５９号公報（特許文献１７）、又は特開平９−１１７２９７号公報（特許文献１８）］。
また、特許第２６１５２３６号明細書（特許文献１９）、特許第２８９４２９２号明細書（特許文献２０）、特許第２８９４２９３号明細書（特許文献２１）、又は特許第２９８９２１７号明細書（特許文献２２）には、オカラ、又はダイズ由来のアラビノガラクタンにガラクタナーゼを作用させて、式：
（Ｇａｌ）ｐ
（式中、「Ｇａｌ」はガラクトースを表わし、「ｐ」は２〜４の整数を表わす）で表されるオリゴ糖を製造する方法が開示されている。しかし、特許第２６１５２３６号明細書又は特許第２８９４２９２号明細書に記載の各方法では、ガラクトトリオース（Ｇａｌ3）及びガラクトテトラオース（Ｇａｌ4）が同程度、主に生成され、特許第２８９４２９３号明細書に記載の方法では、ガラクトトリオース（Ｇａｌ3）が主に生成され、特許第２９８９２１７号明細書に記載の方法では、ガラクトビオース（Ｇａｌ2）の他にガラクトテトラオース（Ｇａｌ4）が生成する。
従って、これまでの方法で製造したガラクトオリゴ糖は、種々のオリゴ糖及び単糖の混合物であることから、結晶化しにくいという難点があった。これに対し、ガラクタナーゼによりガラクトビオースを高濃度に生成することができれば、容易に結晶化することができる可能性がある。
ガラクタナーゼの作用により最終生成物がガラクトース及びガラクトビオースになるとする知見もある［「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．３４４５−３４５４；「カルボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」，（オランダ），エルゼビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９１年，第１５巻，ｐ．４３１−４４４（非特許文献５）；及び「カルボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」，（オランダ），エルゼビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９１年，第１６巻，ｐ．１６７−１８７］が、いずれも長時間反応後の結果であり、より短時間での純度の向上が望まれる。
このような反応特性を有し、しかも、高い比活性を有するガラクタナーゼが待ち望まれていた。
【０００６】
糸状菌の一種であるアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）の生産する酵素に関しては、セルラーゼ、ペクチナーゼ（ポリガラクチュロナーゼ）、及びキシラナーゼに関しては多くの報告がなされており［「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８８年，第５２巻，ｐ．２４９３−２５０１（非特許文献６）；「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８９年，第５３巻，ｐ．３３５９−３３６０（非特許文献７）；「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９０年，第５４巻，ｐ．３０９−３１７（非特許文献８）；及び国際公開ＷＯ９８／３９４２３号パンフレット（特許文献２２）］、これらの酵素が飼料用途やサイレージ用途において有効であることが示されている［特開平４−１１７２４４号公報（特許文献２３）、又は特開平７−２３６４３１号公報（特許文献２４）］。しかしながら、ガラクタナーゼに関しては未だ詳細な報告は無く、前記アクレモニウム・セルロリティカス由来の酵素又は酵素組成物を産業上、更に有効利用するためにも、ガラクタナーゼの詳細な酵素的又はタンパク質的諸性質の解明、及び前記酵素をコードする遺伝子の単離が待ち望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】
特表２０００−５０５３０３号公報
【特許文献２】
特許第２９８９２１７号明細書
【特許文献３】
特公昭５５−４０２３８号公報
【特許文献４】
特表平１１−５１４５２８号公報
【特許文献５】
特表平６−５０５１５４号公報
【特許文献６】
特表平１０−５０１４１２号公報
【特許文献７】
特開平４−１３４０３１号公報
【特許文献８】
特開平７−２５２１５６号公報
【特許文献９】
特公平２−５７９２０２号公報
【特許文献１０】
特開平６−１７８６５４号公報
【特許文献１１】
特許第２５７１７０２号明細書
【特許文献１２】
特許第２５２５６３８号明細書
【特許文献１３】
特開平６−１７８６５４号公報
【特許文献１４】
特許第３１２４４０９号明細書
【特許文献１５】
特開平５−２０８９１２号公報
【特許文献１６】
特公平２−５３０３３号公報
【特許文献１７】
特公平３−５４５５９号公報
【特許文献１８】
特開平９−１１７２９７号公報
【特許文献１９】
特許第２６１５２３６号明細書
【特許文献２０】
特許第２８９４２９２号明細書
【特許文献２１】
特許第２８９４２９３号明細書
【特許文献２２】
国際公開ＷＯ９８／３９４２３号パンフレット
【特許文献２３】
特開平４−１１７２４４号公報
【特許文献２４】
特開平７−２３６４３１号公報
【非特許文献１】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．３４４５−３４５４
【非特許文献２】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９７２年，第３６巻，ｐ．１９４５−１９５４
【非特許文献３】
「カルボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」，（オランダ），エルゼビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９１年，第１６巻，ｐ．１６７−１８７
【非特許文献４】
小野寺良次ら著，「畜産栄養学」，（有）川島書店，１９８９年，第７３頁
【非特許文献５】
「カルボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」，（オランダ），エルゼビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９１年，第１５巻，ｐ．４３１−４４４
【非特許文献６】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８８年，第５２巻，ｐ．２４９３−２５０１
【非特許文献７】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８９年，第５３巻，ｐ．３３５９−３３６０
【非特許文献８】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９０年，第５４巻，ｐ．３０９−３１７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ガラクタナーゼを産業上、有効利用するためには、高い比活性を有する酵素を単離及び精製し、酵素的及び物理的性質を明らかにすることが不可欠である。また、前記酵素の発現増強及び大量生産を可能にするには、前記酵素をコードする遺伝子を単離及び解析することが必要となる。
また、飼料添加用酵素としては、低いｐＨ（好ましくはｐＨ３以下、より好ましくはｐＨ２以下）で安定でなくてはならない。更に、ガラクトビオース製造用酵素としては、ガラクトビオースを高濃度で生成する酵素であることが必要となる。
【０００９】
本発明者らは、このような状況下、アクレモニウム・セルロリティカスの種々の酵素を分画及び精製して鋭意検討したところ、これら酵素群の中からこれまで知られていたガラクタナーゼに比べて顕著に高い比活性を示し、しかも、広いｐＨ範囲で安定である、新規なガラクタナーゼを見出し、前記酵素をコードする遺伝子を単離した。更に、種々の植物材料に対する前記ガラクタナーゼの作用効果を検討したところ、ガラクトビオースを高濃度で生成する酵素であることが判明した。本発明は、このような知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、新規なガラクタナーゼ、前記ガラクタナーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを用いたガラクタナーゼの発現方法、ガラクタナーゼを含む酵素組成物、並びに前記酵素組成物による植物材料の処理方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、下記の理化学的性質（ａ）〜（ｆ）を有し、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドによって解決することができる：
（ａ）作用及び基質特異性：β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖のβ−１，４−ガラクトシド結合をエンド型に加水分解する。
（ｂ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ２〜１０の範囲で安定である。
（ｃ）分子量：４０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）等電点：４．５（等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｅ）至適ｐＨ：５〜６である。
（ｆ）作用最適温度：５０℃である。
【００１１】
また、本発明は、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列１又は複数個の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１２】
また、本発明は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列１又は複数個の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；あるいは、
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド構築物に関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物を含む、発現ベクターに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチド構築物又は発現ベクターで形質転換された、形質転換細胞に関する。
また、本発明は、前記形質転換細胞を培養する工程；及び
前記培養工程で得られた形質転換細胞及び／又は培養液から、前記ポリペプチドを採取する工程
を含む、前記ポリペプチドの製造方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、前記ポリペプチドを含む、酵素組成物に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド又は酵素組成物を含む、飼料添加物に関する。
また、本発明は、前記飼料添加物を含む、飼料に関する。
また、本発明は、飼料原料に、前記飼料添加物を添加する、前記飼料の調製方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド又は酵素組成物を含む、食品加工用及び／又は食品添加用の酵素剤に関する。
また、本発明は、前記食品加工用酵素剤を用いる、食品の加工方法に関する。
更に、本発明は、前記ポリペプチド又は酵素組成物を用いて、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を分解することを特徴とする、ガラクトビオースの製造方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、エンド−β−１，４−ガラクタナーゼ活性を有する。エンド−β−１，４−ガラクタナーゼ活性を示す酵素（すなわち、Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ  ４−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＥＣ３．２．１．８９）とは、具体的には、β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖（例えば、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖）のβ−１，４−ガラクトシド結合をエンド型に加水分解する酵素を意味し、エンド−β−１，４−ガラクタナーゼ、ガラクタナーゼ、又はアラビノガラクタナーゼとも呼ばれる。
【００１６】
ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖とは、主鎖が主にガラクトースからなる多糖又はオリゴ糖の総称であり、側鎖の有無や、側鎖の糖の種類には限定されない。本発明のポリペプチド（すなわち、ガラクタナーゼ）は、β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖、例えば、主鎖にβ−１，４−ガラクトシド結合を有するガラクタン類又はガラクトオリゴ糖に作用する。
主鎖にβ−１，４−ガラクトシド結合を有するガラクタン類としては、側鎖にアラビノース、グルコース、マンノース、キシロース、及び／又はウロン酸等を有するガラクタンがあり、具体的には、例えば、ダイズに含まれるアラビノガラクタンを挙げることができる。
主鎖にβ−１，４−ガラクトシド結合を有するガラクトオリゴ糖としては、例えば、式：
（Ｇａｌ）ｍ
（式中、「Ｇａｌ」はガラクトースを表わし、「ｍ」は２以上の整数を表わす）で表されるガラクトオリゴ糖［例えば、ガラクトビオース（Ｇａｌ2）、ガラクトトリオース（Ｇａｌ3）、又はガラクトテトラオース（Ｇａｌ4）］、式：
（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ
（式中、「Ｇａｌ」はガラクトースを表わし、「Ｇｌｃ」はグルコースを表わし、「ｎ」は２以上の整数を表わす）
で表されるガラクトオリゴ糖、又はアラビノガラクトオリゴ糖などを挙げることができる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、以下の理化学的性質を有し、ガラクタナーゼ活性を有する。
（ａ）作用及び基質特異性
β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖、例えば、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖のβ−１，４−ガラクトシド結合をエンド型で加水分解する。基質としては、主鎖にβ−１，４−ガラクトシド結合を有するガラクタン類又はガラクトオリゴ糖に対して高い活性を示す。
また、ダイズに含まれるアラビノガラクタンは、β−１，４結合からなることが知られているが、本発明のポリペプチドは、ダイズ繊維質に作用し、主にガラクトビオース及びガラクトースを生成する。
（ｂ）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は、約４０，０００である。
（ｃ）等電点
等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による等電点（ｐＩ）は、約４．５である。
（ｄ）至適ｐＨ
ガラクタン分解活性における至適ｐＨは、５〜６、特には５．５である。
（ｅ）至適温度
ガラクタン分解活性における至適温度は、約５０℃である。
（ｆ）安定ｐＨ範囲
室温（２２℃）での５時間処理においては、ｐＨ２〜１０の範囲で安定である。なお、ｐＨ１．５〜２の範囲においても、高い活性を保持している。なお、本明細書において、或るｐＨにおいて「安定である」とは、２２℃で５時間処理した後の残存酵素活性が８０％以上であることを意味する。
（ｇ）温度安定性
ｐＨ５．５での２４時間処理においては、５０℃以下で安定である。
（ｈ）比活性
ガラクタン分解活性における比活性は、約３０００単位／ｍｇタンパク質である。
【００１８】
なお、本明細書において「ガラクタン分解活性」とは、ｐＨ５．５及び３７℃の条件下で、０．５％ルピン（Ｌｕｐｉｎ）由来ガラクタン溶液に酵素を作用させ、この測定系において、１分間に１μｍｏｌの還元ガラクタン末端を生成する酵素量を「１単位」と定義する。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、例えば、糸状菌から得ることができる。前記糸状菌としては、アクレモニウム属に属する微生物が好ましく、アクレモニウム・セルロリティカスがより好ましく、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）又はアクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）が更に好ましい。なお、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）は昭和５８年１月１２日に、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）は昭和５９年１０月１３日に、それぞれ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所］に寄託されたものである。
【００２０】
本発明のポリペプチドを生産する微生物から、本発明のポリペプチドを取得するには、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順に従って調製することができる。
まず、微生物の培養を、それ自体公知の培養方法により実施する。例えば、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）又はアクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）を用いる場合には、例えば、特公昭６０−４３９５４号公報又は特公昭６３−６３１９７号公報に記載の方法に従って培養を行なうことができる。
微生物の培養終了後、得られた培養物を、適当な分離手段（例えば、遠心分離等）により菌体を除去して得られる上清液を、そのまま、本発明のポリペプチドの粗酵素として用いることができる。通常は、更に、前記上清液を、適当な濃縮手段（例えば、限外濾過法など）により濃縮し、所望により防腐剤などを加えて、濃縮酵素として、あるいは、前記濃縮後、適当な粉末化手段（例えば、スプレードライ法）によって粉末酵素として、本発明のポリペプチドを得ることができる。
更に、これらの濃縮酵素又は粉末酵素を、必要に応じて、部分精製又は高度に精製することにより、より純粋な状態で、本発明のポリペプチドを得ることができる。
前記精製方法としては、タンパク質精製のための常法、例えば、硫安などによる塩析法；アルコールなどによる有機溶媒沈殿法；膜分離法；あるいは、イオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、及び／又はゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法などを、単独で、あるいは、適宜組み合わせて用いることができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドには、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列１又は複数個（好ましくは１又は数個）の箇所において、１又は複数個（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；あるいは、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
なお、本明細書において「ガラクタナーゼ活性」とは、β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖、例えば、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖のβ−１，４−ガラクトシド結合をエンド型で加水分解する活性を意味する。
【００２２】
本発明のポリペプチドの１つである、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、３３４個のアミノ酸残基からなるアクレモニウム・セルロリティカス由来の新規ガラクタナーゼである。前記「配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、「配列番号２で表されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目〜３５４番目のアミノ酸配列）からなるポリペプチド」として翻訳された前駆体から、Ｎ末端側のシグナルペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０番目のアミノ酸からなるペプチド）が切断除去された成熟体であると考えられる。
【００２３】
本発明の「配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド」には、例えば、
（ｂ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したアミノ酸配列からなり、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列のＮ末端に、シグナル配列（好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０番目のアミノ酸配列、あるいは、その部分配列であって、しかも、シグナル配列としての機能を有するアミノ酸配列）を付加したアミノ酸配列からなり、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド；あるいは、
（ｂ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列のＮ末端に、シグナル配列を付加したアミノ酸配列において、更に、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したアミノ酸配列からなり、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド
を挙げることができる。
【００２４】
本発明において用いることのできるマーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００２５】
本発明のポリペプチドの起源は、アクレモニウム・セルロリティカスに限定されない。例えば、本発明の機能的等価改変体には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアクレモニウム・セルロリティカスにおける天然の変異体（但し、ガラクタナーゼ活性を有する）が含まれるだけでなく、アクレモニウム・セルロリティカス以外の微生物［例えば、糸状菌（好ましくは、アクレモニウム・セルロリティカスを除く、アクレモニウム属に属する微生物）］由来の天然に存在する機能的等価改変体（但し、ガラクタナーゼ活性を有する）が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチド（但し、ガラクタナーゼ活性を有する）などが含まれる。
【００２６】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列との相同性が、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）により得られた値を意味する。
【００２７】
本発明のポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド」又は「配列番号２で表されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目〜３５４番目のアミノ酸配列）からなるポリペプチド」が好ましい。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、具体的には、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列を含み、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）「機能的改変体」をコードするポリヌクレオチド；あるいは、
（ｅ）「相同ポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド
が含まれる。
【００２９】
また、本発明のポリヌクレオチドには、「配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド」が含まれる。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブとして、標識化した、配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるＤＮＡを有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）に添付のプロトコールに従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、前記プローブを添加し、１５時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行なった後、０．４％ＳＤＳ及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素含有の１×ＳＳＣ（ＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）により４２℃で２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５×ＳＳＣで室温にて１０分間の洗浄を２回行なう条件である。
【００３０】
本発明によるポリヌクレオチドは、例えば、天然由来のものであることもできるし、あるいは、全合成したものであることもできる。更には、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。
本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば、アクレモニウム・セルロリティカス由来の染色体ライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドとしては、「配列番号１で表される塩基配列の６１番目〜１０６５番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド」又は「配列番号１で表される塩基配列（すなわち、配列番号１で表される塩基配列の１番目〜１０６５番目の塩基配列）からなるポリヌクレオチド」が好ましい。
配列番号１で表される塩基配列は、１番目〜３番目のＡＴＧで始まり、１０６３番目〜１０６５番目のＴＧＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６１番目〜６３番目の塩基配列は、３３４残基からなる成熟タンパク質（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１番目〜３５４番目のアミノ酸配列からなるガラクタナーゼ）のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、本発明のポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドがコードする本発明のポリペプチドを発現させるのに必要な塩基配列を含むポリヌクレオチドとを、前記ポリペプチドが発現可能な順序で含む限り、特に限定されるものではない。前記ポリペプチドを発現させるのに必要な塩基配列としては、特に限定されるものではないが、例えば、発現対象であるポリヌクレオチドの上流に配置するプロモーター配列、発現対象であるポリヌクレオチドの下流に配置するターミネーター配列、あるいは、シグナルペプチドをコードする塩基配列などを挙げることができる。
【００３３】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物を含み、しかも、宿主細胞内で複製可能で、かつそのポリヌクレオチドがコードするガラクタナーゼを宿主細胞内で発現可能である限り、特に限定されるものではない。
本発明の発現ベクターは、例えば、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しないＤＮＡ（例えば、プラスミド）を基本に構築することができる。あるいは、本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであることもできる。
本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３４】
本発明の発現ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、本発明のポリヌクレオチドの他に、その発現を制御する塩基配列、あるいは、微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが好ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、あるいは、シグナルペプチドをコードする塩基配列等を挙げることができる。
前記プロモーター配列は、宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。また、前記ターミネーター配列は、宿主細胞において転写終結活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。更に、シグナルペプチドは、宿主細胞において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。  また、前記遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択することができるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子、あるいは、栄養要求性を相補する遺伝子を用いることができる。
【００３５】
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を、本発明のポリヌクレオチド構築物又は発現ベクターで形質転換することにより得ることができる。本発明において用いることのできる宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、又は動物細胞（例えば、哺乳動物細胞又は昆虫細胞）などを用いた系（他のタンパク質との融合タンパク質発現系を含む）を用いることができる。
本発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従って実施することができる。
【００３６】
本発明において宿主として用いる酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等を挙げることができる。
また、宿主として使用する、不完全菌類に属する糸状菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物を挙げることができ、好ましくは、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、又はフザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）等を挙げることができる。
【００３７】
本発明による、本発明ポリペプチドの製造方法では、本発明の形質転換細胞を適当な培地で培養し、得られた形質転換細胞及び／又は培養液から、本発明のポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。
形質転換細胞の培養は、宿主として使用する微生物の培養と本質的に同等の方法により実施することができる。また、形質転換細胞及び／又は培養液から目的のポリペプチドを回収する方法は、この分野で慣用されている方法を用いることができる。
【００３８】
例えば、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスを用いて本発明のポリペプチドを製造する場合には、例えば、特開２００１−１７１８０号公報に記載の方法に準じて実施することができる。
すなわち、アクレモニウム・セルロリティカスにおいて最も高発現しているＣＢＨ（セロビオヒドロラーゼ）１遺伝子のプロモーターの下流に、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を連結した遺伝子発現用の組換えベクターを作製し、このベクターをアクレモニウム・セルロリティカスに導入することにより、前記ポリペプチドを大量に発現させることができる。
【００３９】
本発明の酵素組成物は、本発明のポリペプチドと、酵素組成物に通常用いることのできる担体又は希釈剤とを含む。本発明の酵素組成物は、例えば、本発明のポリペプチドを、酵素組成物に一般的に用いることのできる担体又は希釈剤、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、又はソルビトール等）、界面活性剤、又は防腐剤等とともに混合して製造することができる。
また、本発明における酵素組成物の形状は任意であり、適当な形状、例えば、粉末又は液体状に調製することができる。
【００４０】
本発明の酵素組成物は、本発明のポリペプチドに加え、更に、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、又はポリガラクツロン酸リアーゼの少なくとも１つを含むことができる。本発明のポリペプチド（すなわち、ガラクタナーゼ）以外の酵素を併用することにより、ガラクタナーゼを単独で含む酵素組成物に比べて、植物材料の利用及び／又は加工効率をより一層向上させることが期待できる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖、例えば、ガラクタン類及びガラクトオリゴ糖の分解能に優れており、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を含有する植物材料の加工や利用性向上に適している。すなわち、本発明のポリペプチド又は酵素組成物で、植物材料を処理することにより、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を加水分解することができ、植物材料の加工及び／又は利用効率を向上させることができる。
【００４２】
本発明のポリペプチド又は酵素組成物で処理することのできる植物材料としては、収穫した植物、あるいは、その処理物（例えば、乾燥物、切断物、抽出物、又は精製物など）を挙げることができ、具体的には、例えば、ガラクタン類若しくはガラクトオリゴ糖を含む全ての植物、その切断物、植物組織（例えば、細胞壁又は表皮組織等）、植物組織由来物、細胞内容物、又は抽出成分などを挙げることができる。
より具体的には、飼料分野又は食品分野では、例えば、穀類、豆類、牧草、野菜、果実、いも類、又は樹木などが対象となり、これらを加工した果汁、ピューレ、ペースト、絞り粕、又は抽出粕にも適用することができる。
【００４３】
また、本発明のポリペプチド又は酵素組成物を、ガラクタン類と同時に、あるいは、本発明のポリペプチド又は酵素組成物とガラクタン類とが消化器官内に同時に存在するように、動物（例えば、ヒトを除く動物）に摂取させることにより、前記動物の体内で基質であるガラクタン類を分解し、ガラクトオリゴ糖を生成させることができる。ガラクトオリゴ糖は、腸内菌叢改善効果、整腸作用、及びカルシウム吸収促進作用等が注目されており、食品又は飼料から適量のガラクトオリゴ糖を遊離させることにより、下痢及び／又は軟便を予防することができ、更には、これらの効果により、家畜の成長速度及び／又は飼料転換割合を改良することができる。また、カルシウム吸収促進による骨密度の向上、骨粗鬆症予防及び治療、骨折予防、あるいは、脚弱予防を期待することができる。対象となる動物としては、例えば、ヒト、家畜動物（例えば、牛、豚、馬、鶏、羊、又はヤギ等）、又は愛玩動物（例えば、犬、猫、又はウサギ等）を挙げることができる。
【００４４】
本発明の飼料添加物は、本発明のポリペプチド又は酵素組成物を含む。また、本発明の飼料は、本発明の飼料添加物を含む。
本発明のポリペプチド又は酵素組成物を動物飼料中で用いることにより、飼料中のガラクタン類を分解し、あるいは、酵素組成物中に含まれる種々の酵素との相乗作用により飼料中の繊維質を効率的に分解し、これら飼料中の繊維質の消化能を改善することができる。あるいは、ガラクタン類を分解することにより、あるいは、酵素組成物中に含まれる種々の酵素との相乗作用により、飼料中の繊維質を効率的に分解することができ、従って、飼料作物の細胞内に蓄積されるタンパク質等の利用を促進させることができる。
【００４５】
また、本発明の飼料添加物は、家禽の産卵率及び／又は卵殻強度を向上させることができ、更には、家禽の産卵期間を延長することができる。すなわち、本発明のポリペプチド又は酵素組成物を家禽用飼料に添加することにより、家禽の産卵率及び／又は卵殻強度を向上させることができ、更には、家禽の産卵期間を延長することができる。前記家禽としては、卵を食用とする鳥類、例えば、鶏、うずら、あひる、又はかも等を挙げることができる。
【００４６】
本発明の飼料調製方法では、飼料原料に、本発明の飼料添加物を添加する。前記飼料原料は、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を含む飼料原料である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ダイズ、トウモロコシ、マイロ、コムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ又はシュガービートを挙げることができる。
【００４７】
本発明の食品加工用又は食品添加用の酵素剤は、本発明のポリペプチド又は酵素組成物を含む。本発明の食品加工方法では、食品原料を、本発明の食品加工用酵素剤で処理する。
本発明のポリペプチド又は酵素組成物を食品の加工に用いることにより、例えば、ジュース又はワイン等の収量増加又は芳香改善、果汁の清澄化、色味の改善、醸造における醗酵歩合の向上、あるいは、ジュース又はジャムの粘度調整などの効果が得られる。
本発明の食品加工方法により処理することのできる食品原料は、β−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖（例えば、ガラクタン類若しくはガラクトオリゴ糖、又はペクチン）を含む食品原料である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ダイズ、ジャガイモ、柑橘類、リンゴ、シュガービート、ブドウ、又はベリー類を挙げることができる。
【００４８】
本発明のガラクトビオース製造方法では、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を、本発明のポリペプチド又は酵素組成物で処理する。
本発明のポリペプチドをダイズ繊維質又はルピン由来ガラクタンに作用させると、反応生成物として主にガラクトビオースとガラクトースとを蓄積し、その重量比は約２：１であり、そして、反応後期においてはガラクトトリオース又はガラクトテトラオース等のオリゴ糖はほとんど蓄積されない。更に、本発明のガラクタナーゼは、従来知られているエンド型ガラクタナーゼよりも顕著に高い比活性を示し、効率的にガラクトビオースを製造することが可能である。
ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖を本発明のポリペプチド又は酵素組成物で処理して得られる反応生成物中から、ガラクトビオースを精製するには、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーや活性炭を用いたカラムクロマトグラフィーなどを用いて容易に行なうことが可能である。
【００４９】
本発明のポリペプチド又は酵素組成物の使用方法としては、各利用分野で通常行われる反応条件（例えば、ｐＨ、温度、時間、又は酵素使用量など）を、使用する原料又はガラクタナーゼの種類などに応じて適宜決定することができる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ガラクタナーゼ酵素の精製》
（１）酵素原末の調製
アクレモニウム属微生物由来のガラクタナーゼ原末を得るため、以下の手順に従って微生物の培養を行なった。培地としては、綿実油粕２％、セルロース２％、リン酸水素二カリウム１．２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム０．６％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１６％、硫酸マグネシウム・七水塩０．００１％、及び硫酸銅・五水塩０．００１％（ｐＨ４．０）からなる培地を常法により加熱滅菌したものを用いた。
【００５１】
前記培地５００ｍＬに、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）を接種し、３０℃で４８時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシードとして１５Ｌにスケールアップし、更にスケールアップを続け、最終的に６００Ｌ容タンク中の培養液量を３００Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行なった。
得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライにより粉末化した。この方法で得られたガラクタナーゼ原末は５．０ｋｇであった。
【００５２】
（２）ガラクタナーゼ酵素の精製
実施例１（１）で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として、以下に示した方法で精製した。
始めに、前記上清を、弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ；ファルマシア社製）にトリス−塩酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）で吸着させた後、トリス−塩酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）中にＮａＣｌを各０ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｏｌ／Ｌ、又は０．８ｍｏｌ／Ｌの濃度になるように含有させた各溶液で、ステップワイズ溶出を行ない、ＮａＣｌ濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌの場合に溶出されるガラクタナーゼ活性画分を分取した。
続いて、得られたガラクタナーゼ活性画分を、強塩基性イオン交換クロマトグラフィー［Ｍｏｎｏ  Ｑ（１０／１０）；ファルマシア社製］にトリス−塩酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）で吸着させた後、トリス−塩酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）中にＮａＣｌを０ｍｏｌ／Ｌ〜０．３ｍｏｌ／Ｌの濃度になるように含有させた溶液で、リニアグラジェント溶出を行ない、ガラクタナーゼ活性を示した画分を分取した。
この分取したガラクタナーゼ活性画分を、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５；ファルマシア社製）に０．１ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０）で通過させ、ガラクタナーゼ活性を示した画分を分取することにより、精製ガラクタナーゼ酵素を得た。
【００５３】
【実施例２】
《ガラクタナーゼ酵素の酵素的及びタンパク質的諸性質》
（１）基質特異性及び作用特性
実施例１で得た精製ガラクタナーゼ酵素を、ルピン由来のガラクタン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）に作用させ、反応生成物を経時的に調べた結果、反応初期に２糖以上のオリゴ糖の生成が認められることから、本酵素はエンド機作で作用することが明らかとなった。また、反応後期には、ガラクトースとガラクトビオースとを蓄積するが、単糖のガラクトースよりも２糖のガラクトビオースをより多く蓄積する傾向が見られた。
また、本酵素をダイズ（ダイズに含まれるアラビノガラクタンは、β−１，４結合からなることが知られている）から調製した繊維質に作用させ、反応生成物を経時的に調べた結果、これをエンド機作で加水分解することを確認した。
更に、本酵素は、ガラクトビオースを単糖にする活性がほとんど無く、カラマツ由来のアラビノガラクタン（シグマ社製）には全く作用しなかった。カラマツ由来のアラビノガラクタンはβ−１，３結合からなり、本酵素はβ−１，３結合には作用しないことを確認した。
以上の結果から、本酵素は、エンド−β−１，４−Ｄ−ガラクタナーゼと結論した。
本酵素のガラクタナーゼ活性における比活性は、約３０００単位／ｍｇタンパク質であった。
なお、ガラクタナーゼ活性は、ｐＨ５．５及び３７℃の条件下で、０．５％ルピン由来ガラクタン溶液に酵素を作用させて測定し、１分間に１μｍｏｌの還元ガラクタン末端を生成する酵素量を１単位と定義した。
【００５４】
（２）至適ｐＨ
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素の３７℃における至適ｐＨを、図１に示す。図１において、記号「□」は、酢酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ３．５〜６）を用いた場合の結果を示し、記号「△」は、リン酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６〜８）を用いた場合の結果を示す。
本酵素は、酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液で、ｐＨ５〜６の範囲で最大の活性を示し、ｐＨ３．５〜７において高い活性を有していた。
【００５５】
（３）至適温度
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素の作用最適温度を調べるため、酢酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５）にてガラクタン分解活性を測定した結果を、図２に示す。
至適温度は５０℃であり、４０〜６０℃において高い活性を有していた。また、３５〜６０℃においても比較的高い活性を有していた。
【００５６】
（４）安定ｐＨ範囲
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素の室温（２２℃）で５時間処理した場合のｐＨ安定性を、図３に示す。図３において、記号「◇」は、グリシン−塩酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ１〜３．５）を用いた場合の結果を示し、記号「□」は、酢酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ３．５〜６）を用いた場合の結果を示し、記号「△」は、リン酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６〜８）を用いた場合の結果を示し、記号「○」は、トリス−塩酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８〜９）を用いた場合の結果を示し、記号「×」は、ＣＨＥＳ緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９〜１０）を用いた場合の結果を示す。
本酵素はｐＨ２〜１０の範囲で安定であったが、ｐＨ１．５〜２の範囲においても６０％以上の高い活性を保持していた。
【００５７】
（５）温度安定性
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素のｐＨ５．５で２４時間処理した場合の温度安定性を図４に示す。本酵素は５０℃以下で安定であった。
【００５８】
（６）分子量
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素の分子量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ゲル；テフコ社製）を行なった。
その結果、ガラクタナーゼの分子量は約４０，０００（還元条件下）と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の分子量を、表１に示す。
【００５９】
《表１》
タンパク質                  分子量      
ホスホリラーゼＢ            ９７，４００
血清アルブミン              ６６，２００
オボアルブミン              ４５，０００
カルボニックアンヒドラーゼ  ３１，０００
トリプシンインヒビター      ２１，５００
リゾチーム                  １４，４００  
【００６０】
（７）等電点
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素の等電点（ｐＩ）を決定するために、ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動を行なった。
その結果、ガラクタナーゼの等電点は約４．５と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプル（シグマ社製）の等電点を、表２に示す。
【００６１】
《表２》
タンパク質                      等電点    
トリプシノーゲン                    ９．３０
レンチルレクチン−塩基性バンド      ８．６５
レンチルレクチン−中性バンド        ８．４５
レンチルレクチン−酸性バンド        ８．１５
ウマ・ミオグロビン−塩基性バンド    ７．３５
ウマ・ミオグロビン−酸性バンド      ６．８５
ヒト・カルボニックアンヒドラーゼＢ  ６．５５
ウシ・カルボニックアンヒドラーゼＢ  ５．８０
β−ラクトグロブリンＡ              ５．２０
ダイズ・トリプシンインヒビター      ４．５５
アミログルコシダーゼ                ３．５０  
【００６２】
【実施例３】
《アクレモニウム・セルロリティカス由来ガラクタナーゼ遺伝子の単離》
（１）精製したガラクタナーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素を、電気泳動システム（テフコ社製）と１２％ポリアクリルアミドゲルとを用い、電気泳動［Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）］した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、転写装置（マルチフォーII；ファルマシアバイオテク社製）にて、添付のプロトコールに従い、ポリビニリデンジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰSQ；ミリポア社製）に転写した。この膜をクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、約４０ｋＤａのタンパク質がブロットされている部分を切り出した。Ｎ末端アミノ酸配列の決定は、プロテインシークエンサー（Ｍｏｄｅｌ４９２；パーキンエルマー社製）を用い、添付のプロトコールに従って行なった。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列であることが明らかとなった。
【００６３】
一方、内部アミノ酸配列の決定は、以下のようにして実施した。すなわち、実施例１で精製したガラクタナーゼ酵素を凍結乾燥した後、０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。ガラクタナーゼ酵素に対して１／１００モル量のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し、３７℃にて４８時間反応させた。得られた分解産物を、プレパラティブＨＰＬＣシステム（Ｍｏｄｅｌ１７２μ；ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて、カラムクロマトグラフィー［カラム＝Ｃ１８、カラムサイズ＝２２０ｍｍ×２．１ｍｍ、グラジエント＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び５％アセトニトリル〜０．０８５％ＴＦＡ及び３５％アセトニトリル］を行ない、３種のペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列は、前記プロテインシークエンサーにより決定した。
その結果、内部アミノ酸配列として、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列が明らかとなった。
【００６４】
（２）ゲノムＤＮＡの単離
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）を、（Ｓ）培地（２％ブイヨン、０．５％イーストエキス、及び２％グルコース）で３０℃にて２日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結した後、乳鉢及び乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体から、市販のＤＮＡ調製キット（ＩＳＯＰＬＡＮＴ；ニッポンジーン社製）により、添付のプロトコールに従い、ゲノムＤＮＡを単離した。
【００６５】
（３）ガラクタナーゼのＤＮＡ断片の単離
実施例３（１）で得られたガラクタナーゼ酵素の部分アミノ酸配列に基づいて、１組のプライマーを合成した。具体的には、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２２番目〜２８番目のアミノ酸配列を元に、配列番号７で表される塩基配列からなるセンスプライマーを合成した。また、配列番号６で表されるアミノ酸配列を元に、配列番号８で表される塩基配列からなるアンチセンスプライマーを合成した。
これらのプライマーを用い、実施例３（２）で得られた、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株から単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。ＰＣＲは、５０μＬの反応液中、ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを鋳型とし、１．２５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；宝酒造社製）、添付のバッファー、ｄＮＴＰ混合物、及び１０μｍｏｌ／Ｌの前記プライマーを用いて、９４℃（３分間）で反応させた後、９４℃（１分間）、４２℃（１分間）、及び７２℃（４５秒間）からなるサイクルを３０回繰り返し、更に７２℃（３分間）で反応させることにより実施した。この反応により、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅し、このＤＮＡ断片をｐＴ７  Ｂｌｕｅベクター（ストラタジーン社製）に挿入した。
【００６６】
このようにしてクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、市販のＤＮＡシークエンスキット（ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；パーキンエルマー社製）とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；パーキンエルマー社製）とを用いて、添付のプロトコールに従って行なった。その結果、単離したＤＮＡ断片の塩基配列は、アスペルギルス・アキュリータスのガラクタナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ３４５９９）と相同性を示し、目的とするガラクタナーゼをコードする遺伝子の一部であることが明らかとなった。
【００６７】
（４）ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの作製
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株をセルラーゼ誘導培地［４％セルロース、１％バクトペプトン、０．６％硝酸カリウム、０．２％尿素、０．１６％塩化カリウム、０．１２％硫酸マグネシウム、１．２％リン酸一カリウム、０．００１％硫酸亜鉛、０．００１％硫酸マンガン、及び０．００１％硫酸銅（ｐＨ４．０）］で３２℃にて４日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結した後、乳鉢及び乳棒を用いて磨砕した。磨砕した菌体から、市販のＲＮＡ調製キットＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）により、添付のプロトコールに従い、全ＲＮＡを単離した。更に、全ＲＮＡから、市販のｍＲＮＡ精製キット（ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ファルマシア社製）により、添付のプロトコールに従い、ｍＲＮＡを精製した。
【００６８】
こうして得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；ファルマシア社製）により、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをファージベクター（Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  II；ストラタジーン社製）に挿入した。このようにして作製した組換えファージベクターについて、パッケージングキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ  III  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ；ストラタジーン社製）により、添付のマニュアルに従って、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）パッケージングを行なった。続いて、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成させた。このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーは、５．５×１０5ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）であった。更に、このｃＤＮＡライブラリーを、前記ファージベクター（Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  II）に添付のプロトコールに従い、増幅した。この増幅したｃＤＮＡライブラリー中の組換えファージを、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成させた。
【００６９】
（５）ガラクタナーゼ遺伝子の単離
プラークの形成されたプレート上に、メンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をのせ、プラークを付着させた。このメンブレンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変性し、メンブレンに吸着させた。こうして作製したメンブレンと、実施例３（３）においてＰＣＲにより増幅したガラクタナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用い、市販の標識及び検出システム（ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）により、添付のプロトコールに従って、スクリーニングを行なった。  前記スクリーニングにより選抜した陽性クローンについて、前記ファージベクター（Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  II）に添付のプロトコールに従い、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）へのイン・ビボ切り出し（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を実施した。
【００７０】
プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）中のガラクタナーゼｃＤＮＡの塩基配列の決定は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のマルチクローニングサイト近傍のシークエンス用プライマー、あるいは、解析された塩基配列を元に作製したプライマーを用い、ＤＮＡシークエンスキット（ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；パーキンエルマー社製）と、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；パーキンエルマー社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、行なった。この結果、アクレモニウム・セルロリティカスのガラクタナーゼｃＤＮＡの１１９９ｂｐの塩基配列が得られた。
このｃＤＮＡは、１０６５ｂｐの塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなる１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、３８ｋＤａのタンパク質をコードすることが明らかとなった。前記ＯＲＦから予測されるタンパク質に関して、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）にてホモロジー検索を行なったところ、本ガラクタナーゼは、アスペルギルス・アキュリータスのガラクタナーゼ（Ｌ３４５９９）に最も高い相同性（６８％）を示した。
なお、このようにして得られたガラクタナーゼｃＤＮＡを含むプラスミドベクターｐｇａｌで形質転換された大腸菌（ＪＭ１０９）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年３月５日付けで寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８２４２である。
【００７１】
【実施例４】
《アクレモニウム・セルロリティカス由来ガラクタナーゼ遺伝子の過剰発現》
（１）ガラクタナーゼ遺伝子発現用の組換えベクターの作製
本実施例の工程の概略を図５に示す。
前記実施例３で得られた、ガラクタナーゼｃＤＮＡの挿入されたプラスミドｐｇａｌを鋳型とし、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーとを用いて、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０μＬの反応液中、１．２５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；宝酒造社製）、添付のバッファー、ｄＮＴＰ混合物、２０ｎｇプラスミドＤＮＡ、及び１μｍｏｌ／Ｌの前記プライマーを用いて、９４℃（３分間）で反応させた後、９４℃（３０秒間）、５２℃（３０秒間）、及び７２℃（７５秒間）からなるサイクルを３０回繰り返し、更に７２℃（３分間）で反応させることにより実施した。
こうして得られたＰＣＲ反応液をエタノール沈殿し、ＰＣＲ産物を回収した後、制限酵素ＨｐａＩ及びＳｐｈＩで切断し、これを、デストマイシン耐性カセット（ＤｔＲ）を含むプラスミドｐＣＢＨＥＸ／ＤｔＲ２（特開２００１−１７１８０号公報）のＨｐａＩ部位とＳｐｈＩ部位との間に挿入し、プラスミドｐＧＡＬ−Ｄｔを作製した。
【００７２】
プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ部位を切断し、この切断部位を平滑化した後に再度連結して、ＢａｍＨＩ部位を欠失したプラスミドｐＵＣ１１８を作製した。このプラスミドのＸｂａＩ部位に、プラスミドｐＤＨＢＡＲ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５，１０３６−１０４４，１９９９）から制限酵素ＸｂａＩにより切り出したビアラホス耐性カセットを挿入した。このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、切断部位を平滑化した後に再度連結し、ＢａｍＨＩ部位を欠失したビアラホス耐性カセットを含むプラスミドを作製した。このプラスミドから、制限酵素ＸｂａＩによりビアラホス耐性カセットを切り出し、これを、先に作成したプラスミドｐＧＡＬ−ＤｔのＸｂａＩ部位のデストマイシン耐性カセットと置き換え、タンパク質発現用プラスミドｐＧＡＬ−ｂａｒを作製した。
【００７３】
（２）ガラクタナーゼ遺伝子の宿主への導入
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株を（Ｓ）培地において３０℃で１６時間培養し、３５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより集菌した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（１０ｍｇ／ｍＬキチナーゼ、１０ｍｇ／ｍＬザイモリアーゼ、３０ｍｇ／ｍＬβ−グルクロニダーゼ、及び０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース）に懸濁した。３０℃で６０分〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。脱脂綿によりこの懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍで１０分間遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣバッファー［０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）］で洗浄した。
【００７４】
以上のようにして調製したプロトプラストをＳＵＴＣバッファー１００μＬに懸濁し、これに、実施例４（１）で作成したプラスミドｐＧＡＬ−ｂａｒ溶液１０μｇ（１０μＬ）を加え、氷上に５分間静置した。次に、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液［６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）］４００μＬを加え、氷中に２０分間静置した後、ＳＵＴＣバッファー１０ｍＬを加え、２５００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心分離したプロトプラストをＳＵＴＣバッファー１ｍＬに懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心して、最終的にＳＵＴＣバッファー１００μＬに懸濁した。
以上の処理をしたプロトプラストを、ビアラホス（１０００μｇ／ｍＬ）添加（Ａ）寒天培地［３．９％ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）、及び１７．１％シュークロース］上に、（Ａ）軟寒天培地［１．３％ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）、及び１７．１％シュークロース］と共に重層し、３０℃で５〜９日間培養した後、形成したコロニーを形質転換体とした。
【００７５】
（３）アクレモニウム・セルロリティカス形質転換体におけるガラクタナーゼの発現と酵素活性の測定
ビアラホスに対する耐性度の高い上位４株をセルラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、図６に示すように、ガラクタナーゼ酵素は親株より分泌量が向上していた。
ガラクタナーゼ活性は、実施例２（１）に記載の方法により測定し、培養上清１ｍＬ当りの活性（Ｕ／ｍＬ）として表した。その結果を表３に示す。形質転換体は、親株の約２７倍の比活性を示した。
0004206243.tif 000002
【００７６】
最も比活性の高かった「形質転換体３」株を、実施例１（１）と同様の方法で培養し、「形質転換体３」株の酵素原末（以下、ガラクタナーゼ増強原末と称する）を調製した。
【００７７】
【実施例５】
《イン・ビトロにおけるガラクタナーゼ酵素の鶏飼料への作用》
鶏消化管内でのガラクタナーゼの作用を模擬的に調べるために、実施例１（１）で調製したガラクタナーゼ原末（以下、親株原末と称する）、実施例１（２）で調製した精製ガラクタナーゼ酵素、あるいは、実施例４（３）で調製したガラクタナーゼ増強原末を用いて、ダイズ繊維質、鶏飼料繊維質、及びルピン由来ガラクタンに対する作用を調べた。
ダイズ繊維質及び鶏飼料繊維質は、ダイズ粕（オカラ）及び鶏飼料（全植タイプブロイラー後期用飼料；伊藤忠飼料社製）を、それぞれ、８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶液に懸濁し、５分間煮沸した後、水洗及びエタノール洗し、乾燥させたものを基質として用いた。
反応液は、２０ｍｇ／ｍＬ基質、２５μｇ／ｍＬ酵素原末（親株原末又はガラクタナーゼ増強原末）又は０．５μｇ／ｍＬガラクタナーゼ酵素、及び２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）からなり、３７℃で１時間反応させた後、５分間煮沸して反応を停止させた。反応生成物は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により分析した。
【００７８】
結果を図７に示す。
図７において、試験区１〜３は、基質として、ダイズ繊維質を用いた場合の結果であり、同様に、試験区４〜６は、基質として鶏飼料繊維質を、試験区７〜９は、基質としてガラクタンを、それぞれ用いた場合の結果である。また、試験区１、４、及び７は、酵素として、親株原末を用いた場合の結果であり、同様に、試験区２、５、及び８は、酵素としてガラクタナーゼ増強原末を、試験区３、６、及び９は、酵素としてガラクタナーゼ酵素を、それぞれ用いた場合の結果である。
図７に示すように、いずれの基質からも、ガラクタナーゼ増強原末及びガラクタナーゼ酵素によりガラクトビオース及びガラクトースが生成され、鶏消化管モデルにおいて、前記酵素の作用により鶏飼料からガラクトビオースが生成されることが確認された。
【００７９】
【実施例６】
《ガラクタナーゼ酵素によるガラクトビオースの製造》
（１）ダイズ繊維質の糖組成分析
ガラクタナーゼ酵素によるガラクトビオース製造の基質として用いたダイズ繊維質の糖組成を調べた。ダイズ繊維質を１２ｍｏｌ／Ｌ又は９ｍｏｌ／Ｌ硫酸に懸濁した後、硫酸濃度が０．３６ｍｏｌ／Ｌになるように純水にて希釈した。反応容器内を窒素で置換した後、脱気し、１２１℃で３０分間反応させて加水分解を行なった。反応終了後、炭酸バリウムにて中和し、遠心分離した後、上清をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に供した。
その分析結果を表４に示す。表４において、記号「Ｇｌｃ」は、グルコースであり、記号「Ｇａｌ」は、ガラクトースであり、記号「Ｘｙｌ」は、キシロースであり、記号「Ａｒａ」は、アラビノースであり、記号「ＵＡ」は、ウロン酸である。
【００８０】
0004206243.tif 000003
【００８１】
（２）ガラクトビオースの製造
実施例１（２）で精製したガラクタナーゼ酵素、あるいは、実施例４（３）で調製したガラクタナーゼ増強原末を用いて、ダイズ繊維質、あるいは、ルピン由来ガラクタンに、それぞれ作用させた。反応は、実施例５と同様の方法で行ない、反応停止後の反応液をウルトラフリー−１５遠心式フィルターユニット・バイオマックス−５メンブレン装着ユニット（ミリポア社製）に供してタンパク質を除去した後、ＨＰＬＣにて反応生成物の分析を行なった。
ダイズ繊維質及びルピン由来ガラクタンに対する反応生成物の収率を表５に示す。また、実施例６（１）で調べたダイズ繊維質中のガラクトース残基に対する収率（重量％）を括弧内に示した。表５において、記号「Ｇｌｃ２」は、セロビオースであり、記号「Ｇｌｃ」は、グルコースであり、記号「Ｇｌｃ２」は、ガラクトビオースであり、記号「Ｇａｌ」は、ガラクトースである。
0004206243.tif 000004
【００８２】
表５に示すように、ガラクタナーゼ酵素又はガラクタナーゼ増強原末の作用により、ダイズ繊維質又はルピン由来ガラクタンから遊離される糖は、主にガラクトビオース及びガラクトースであり、その重量比は約２：１であった。また、ダイズ繊維質中のガラクトース残基の大半がガラクトビオースとして遊離されることが明らかとなった。本分析の結果、グルコース及びガラクトース以外の単糖は見出されなかった。
このようにして得られたガラクトビオース及びガラクトースを含む反応液を、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ４０−Ｓ；東ソー社製）により、ガラクトビオースを精製した。精製したガラクトビオースは、ＴＬＣにより単一であることを確認した。
【００８３】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、高い比活性を有するだけでなく、低いｐＨでも安定であり、しかも、ガラクトビオースを高濃度で生成する酵素である。従って、本発明のポリペプチド又は酵素組成物によれば、ガラクタン類又はガラクトオリゴ糖等のβ−１，４−ガラクトシド結合を有する多糖又はオリゴ糖を含む植物材料の消化促進や、その加工又は利用効率の向上が可能であり、食品分野、飼料分野、又は医療分野等の様々な用途での利用が期待される。更に、本発明のポリペプチド又は酵素組成物によれば、ガラクトビオースを高濃度で製造することができる。
【００８４】
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号７〜１０の配列で表される各塩基配列は、合成ＤＮＡ配列である。
【００８５】
【配列表】
0004206243.tif 000005
0004206243.tif 000006
0004206243.tif 000007
0004206243.tif 000008
0004206243.tif 000009
0004206243.tif 000010
0004206243.tif 000011
0004206243.tif 000012
0004206243.tif 000013
0004206243.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドの３７℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図２】本発明のポリペプチドのｐＨ５．５における至適温度を示すグラフである。
【図３】本発明のポリペプチドの２２℃での５時間処理におけるｐＨ安定性を示すグラフである。
【図４】本発明のポリペプチドのｐＨ５．５での２４時間処理における温度安定性を示すグラフである。
【図５】本発明のプラスミドｐＧＡＬ−ｂａｒの作製方法を示す説明図である。
【図６】アクレモニウム・セルロリティカス形質転換体におけるガラクタナーゼの発現を示す電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図７】本発明のポリペプチド酵素又はガラクタナーゼ増強原末による各種基質からの反応生成物を示す薄層クロマトグラフの結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１】
0004206243.tif 000015
【図２】
0004206243.tif 000016
【図３】
0004206243.tif 000017
【図４】
0004206243.tif 000018
【図５】
0004206243.tif 000019
【図６】
0004206243.tif 000020
【図７】
0004206243.tif 000021