(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多薬剤抵抗性のスタヒロコッカスアウレウス、メチシリン抵抗性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、グループＡ連鎖球菌、多薬剤抵抗性の肺炎球菌およびバンコマイシン抵抗性の腸細菌の殺菌に用いられるものであって、ニシン、サブチリン、エピダ−ミン、ガリダ−ミン、およびペップ５のグル−プから選択される殺菌剤。
【請求項２】
前記殺菌剤はニシンであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の殺菌剤。
【請求項３】
前記殺菌剤は、部位特異的突然変異法により生成された構造的変異体あるいは半合成アナログであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の殺菌剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗生物質抵抗性病原体による感染に帰因する疾病の予防および治療方法に関する。
背景技術
ニシン（ｎｉｓｉｎ）は、バクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）、すなわち食品グレードの微生物によって産生される抗菌性物質であり、ランチバイオティクス（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）（あるいはここではラントシンズ（ｌａｎｔｈｏｃｉｎｓ））と呼ばれ、他に、サブチリン（ｓｕｂｔｉｌｉｎ）、エピダ−ミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）、ガリダ−ミン（ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ）、ペップ５（ｐｅｐ５）、シナマイシン（ｃｉｎｎａｍｙｃｉｎ）、ドゥラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉｎ）、アンコベニン（ａｎｃｏｖｅｎｉｎ）を含む同様な物質のグル−プの一員である。
ニシンは、ランスフィ−ルドの血清学的グル−プＮに属するラクトコッカスラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）によって産生される（マチック（Ｍａｔｔｉｃｋ）、Ａ．Ｔ．Ｒ．およびＡ、ハ−シュ（Ｈｉｒｓｃｈ）、１９４７、Ｌａｎｃｅｔ．２巻、５）。ニシンは、３４アミノ酸残基から構成されるペプチドであり、ランチオニンあるいはβ−メチルランチオニンを形成するチオエ−テル架橋によって交差結合した５個の環構造を有する。これらのチオエ−テルは、セリンあるいはスレオニン残基から形成されるデヒドロ側鎖を有するシステインメルカプト基グループの濃縮の結果であり、ニシン前駆ペプチドの翻訳後の修飾の結果である。
ニシンは、カチオン性界面活性剤として働き、その活性はアニオン性界面活性剤によって中和できること（ラムサイア−（Ｒａｍｓｅｉｅｒ）、Ｈ．Ｒ．１９６０、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３７巻、５７）、分子レベルにおいてニシンは細胞質膜で作用し、ペプチドグリカンの生合成を阻害すること（ライシンガ−（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ）等、１９８０、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２７巻、１８７）が報告されている。植物性細菌に対するニシンの作用は、おそらく、脂質二重層へのペプチドの挿入に続くプラスマ膜の電圧依存性脱分極の結果であり、隣接するニシン分子の相互作用で一時的な穴あるいはチャネルを形成するかもしれない。ニシンの分子の特徴およびその生合成のメカニズムは最近の広範な報告の主題となっている（ユング（Ｊｕｎｇ）、Ｇ．およびＨ．−Ｇ．サ−ル（Ｓａｈｌ）、１９９１、ニシンおよび新しいランチバイオティクス  ＥＳＣＯＭ  サイエンス出版社（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ））。
ニシンにおいては、活性範囲は狭いと考えられており、グラム陽性細菌に対して驚異的な活性があり、グラム陽性細菌に対して増強した活性を示す場合にキレ−ト剤と組合せたときを除いては、一般的にある種のグラム陽性細菌に対してのみ活性がある（ブラックバ−ン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）らに対する米国特許番号５，１３５，９１０；５，２１７，９５０；および５，２６０，２７１）。ニシンは、抗菌の食物防腐剤として使用されており、ＪＥＦＣＡおよび、食物添加物の使用を調整しているＵＳ、ＵＫおよびＥＥＣの国々を含む様々な国の当局者によって安全であると受け入れられている。
発明の開示
本発明の方法では、ニシンおよび他のランチオニン含有バクテリオシン（ラントシン）、および遺伝子工学あるいは半合成化学によって生成したそれらの構造的変異体を使用する。本発明の方法は、数々ある中でも、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の抗生物質抵抗性株に対しての使用が適している。
発明を実施するための最良の形態
細菌感染、とくに病院において生じる感染により、一部で一般に治療に使用されている抗生物質に対して抵抗性の臨床単離物の選択の結果として、治療がより困難になっている。特に、メチシリン抵抗性スタヒロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）およびメチシリン抵抗性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）は、グリコペプチド抗生物質、バンコマイシン、テイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）を除く一般に入手可能な抗生物質のほとんどに対して抵抗性を有するようになっている。バンコマイシンはこれらの感染に対する選択薬剤であるが、バンコマイシンはいつも臨床的に効果があるわけではない（カルシュマ−（Ｋａｒｃｈｍｅｒ）、Ａ．Ｗ．１９９１、内科学会誌（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１１５：７３９）。腸球菌感染は伝統的に治療が困難であり、それは一部で腸球菌が本質的に多くの抗菌剤に抵抗性があるためであり、また一部で他の細菌種に対して一般的には殺菌性である薬剤に対して耐性（殺傷に対して抵抗性がある）があるためである（ム−レイ（Ｍｕｒｒａｙ）、Ｂ．Ｅ．１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｒｅｖ．３：４６）。最近、腸球菌がバンコマイシンに対して抵抗性を取得し、腸球菌のバンコマイシン抵抗性単離物による感染は、特に集中治療室において驚くべき割合で増加している（エモリ（Ｅｍｏｒｉ）、Ｔ．Ｇ．およびＲ．Ｐ．ガイネス（Ｇａｙｎｅｓ）、１９９３、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６：４２８）。腸球菌とブドウ球菌との間の遺伝情報の接合移入は可能であり、バンコマイシン抵抗性の移入は実験室で行われた（ノ−ブル（Ｎｏｂｌｅ）、Ｗ．Ｃ．等、１９９２、ＦＥＭＳ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７２：１９５）。従って、病院で生じた感染の中にバンコマイシン抵抗性ブドウ球菌が出現するのは時間の問題と思われる。地域で生じた感染の中で、連鎖球菌中に出現する抵抗性は、特に肺炎球菌中で懸念されている（ソ−ンスベリ（Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙ）、Ｃ．等、１９９３、医学感染（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１０巻、Ｓｕｐｐｌ．Ｄ：１５；スタットマン（Ｓｔｕｔｍａｎ）、Ｈ．Ｒ．１９９３、医学感染（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１０巻、Ｓｕｐｐｌ．Ｄ：５１）。グル−プＡ連鎖球菌（アノニマス（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ）、１９９４、罹患死亡率週間報告（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔ）４３巻、４０１）およびブドウ球菌（壊死性筋膜炎（ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｆａｓｃｉｉｔｉｓ）や中毒性ショック様症候群のような問題の原因である）の高毒素産生株は治療が困難であり、これにより、しばしば患者が急死する。新しくより効果的でより速く作用する抗菌性剤がこれらの感染に対抗するのに必要であることは明かである。
おもに、ニシンは、抗菌性が要求されバクテリオシンが予備動物モデル実験において効果的であることが示されたある状況下での使用が考えられるかもしれない（マティック、Ａ．Ｔ．Ｒ．およびＡ．ハ−シュ、１９４７、Ｌａｎｃｅｔ．２巻、５；  バビン（Ｂａｖｉｎ）、Ｅ．Ｍ．等、１９５２、Ｌａｎｃｅｔ１巻：１２７；ゴ−ワンス（Ｇｏｗａｎｓ）、Ｊ．Ｌ．等、１９５２、Ｂｒｉｔ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７巻：４３８；  ハ−シュ、Ａ．およびＡ．Ｔ．Ｒ．マティック、１９４９、Ｌａｎｃｅｔ２巻：１９０）が、ニシンはヒトあるいは家畜医学において治療のために開発されたものとしては有効性が不十分であることが判明した。アクタガルディン（ａｃｔａｇａｒｄｉｎｅ）およびメルサシディン（ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ）は、評価されたより新しいランチオニン含有抗菌ペプチドであるが、最近使用されている治療薬と比較してブドウ球菌および腸球菌に対して中位の活性しか有さず（アリオリ（Ａｒｉｏｌｉ）、Ｖ．等  １９７６  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ２９巻：５１１；  ソオマ（Ｓｏｍｍａ）、Ｓ．等  １９７７  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；  バーレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、Ｍ．Ｓ．等  １９９２  Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５巻：６４１）、治療的価値がありそうにもないことが判明している。
しかし、我々はニシンがグラム陽性細菌の病原性株に対して強力な殺菌剤であることを見い出した。特に、ニシンには、多薬剤抵抗性のスタヒロコッカスアウレウスの現代の単離物、メチシリン抵抗性コアグラ−ゼ陰性ブドウ球菌、グル−プＡ連鎖球菌の壊死する株、および多薬剤抵抗性の肺炎球菌に対して殺菌性があることを我々は見い出した。さらに、ニシンは、バンコマイシン抵抗性の腸細菌を含む腸細菌に対して効果的な殺菌剤であることを我々は見い出した。腸細菌は抗菌剤に対して抵抗力があるのは一般的に知られているので、この結果は驚くべきものであり、ニシンは並外れた治療的価値を有している可能性があることを強く示唆している。広い範囲の抗菌剤使用の普及、特に経口で低用量の投与のときには多薬剤抵抗性の病原体の大量の出現を引き起こすことは認められていることであり、ニシンは食物から低量摂取されるので、ニシン抵抗性および他の抗菌剤に交差抵抗性が出現していないことは驚かされている。抗菌性食物防腐剤としての初期のニシンの開発中においては、現代の一連の抗生物質に対して交差抵抗性で選択しないことが判明したが（ホザック（Ｈｏｓｓａｃｋ）、Ｄ．Ｊ．Ｎ．Ａｐｒｉｌ６、１９８８  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  Ｖｏｌ．５３、Ｎｏ．６６；ジバルスキイ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）、Ｗ．Ａｐｒｉｌ  ６、１９８８  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  Ｖｏｌ．５３、Ｎｏ．６６）、長年の統制されていない食品中でのその使用後の現代の多薬剤抵抗性の病原体に対するニシンの活性は現在まで評価されていなかった。
これらの結果は、ニシンだけではなく、サブチリン、エピダ−ミン、ガリダ−ミン、ペップ５、シンナマイシン、ドゥラマイシン、アンコベニン、および遺伝子工学あるいは半合成化学によって生成されたこれらの分子の構造的変異体を含むラントシン抗菌ペプチドのこのクラスの関連した他のメンバ−は、ヒトおよび動物において抗生物質抵抗性細菌によって引き起こされる感染の予防あるいは治療に有効であることを示している。
活性剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）より過剰に血液レベルおよび組織レベルが到達し、従って感染を予防、治療、治癒あるいは緩和するために細菌滴定濃度を減少させるのに効果的であるように、これらのペプチドの効果的な薬剤学的な製剤には、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、あるいは腹腔内（ｉ．ｐ．）ル−トを介した活性剤の非経口投与に適切な単純水性溶液が含まれる。より広い範囲の治療のためにより効果的に供給するために、ラントシン抗菌剤は他の抗菌剤と共に、同時あるいは連続的に投与できることが予想され、これは治療を初める前に特別な診断がない場合に特に有用である。細菌滴定濃度を効果的に減少させるために、約２−２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲で与えることが予想される。また、水性あるいは石油を基にした軟膏、ロ−ション、乳剤あるいはゲルのような皮膚および／あるいは粘膜に局所的に適用するのに適切な薬学的製剤は、抗生物質抵抗性微生物の制御に有効であると予想される。例えば、前鼻孔への適用に適し、ＭＩＣより過剰な活性剤の濃度で、従って細菌滴定濃度を減少させるのに充分なラントシンを基にした局所的な製剤は、患者および健康に不安のある人員におけるＭＲＳＡの増殖を制御し、それによって生命を脅かす可能性がある抗生物質抵抗性の感染を生じる危険が減少するのに特に有効であると期待される。
細菌株
メチシリン抵抗性スタヒロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）およびスタヒロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＭＲＳＥ）は、異なるヨ−ロッパの病院によって提供された臨床単離物であった。一方、高毒素性ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）株とバンコマイシン抵抗性エンテロコッカスフェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）株は米国臨床単離物であった。ＭＲＳＡ、ＭＲＳＥおよびバンコマイシン抵抗性エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の追加の試験検体は米国臨床単離物であった。別々の実験において、４つの異なった国からのＭＲＳＡ株、スペインからのＭＲＳＥ株、６つの異なった国からのペニシリン抵抗性ストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株、および２つのニュ−ヨ−クの病院からのバンコマイシン抵抗性腸球菌を試験した。他の試験した単離物は培養コレクション由来のものである。
最小阻害濃度（ＭＩＣ）
ＭＩＣは、本質的にＮＣＣＬＳ（臨床研究所基準国立委員会、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）ブイヨンマイクロ希釈方法を用いて決定した。ＭＲＳＡとＭＲＳＥの米国臨床単離物およびバンコマイシン抵抗性エンテロコッカスフェシウムを用いた実験では、無添加ミュ−ラ−ヒントンブイヨン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ）を使用した。異なるヨ−ロッパの病院からｎｏＭＲＳＡおよびＭＲＳＥの単離物、ストレプトコッカスピオゲネスおよびバンコマイシン抵抗性エンテロコッカスフェカーリスの米国臨床単離物を用いた実験では、トリプティックソイブイヨン（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）を使用した。後者の実験においては、ニシンがプラスチック微量滴定濃度ウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｗｅｌｌ）に付着するのを防ぐために、希釈液中に０．０２％ウシ血清アルブミン（最終濃度０．０１％）を使用した。
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）
ＭＩＣの測定後、増殖していないウェルをサンプルとし、コロニ−数を数えるためにプレ−トで培養した。ＭＢＣは、最初に接種したうちの９９．９％が接触後２４時間以内に殺傷された最小濃度として定義した。
細菌培養の溶解と迅速な殺菌活性
使用した培養液は、Ｓ．ニューモニエに対しては’Ｃ＋Ｙ’ブイヨンを、ブドウ球菌にはトリプティックソイブイヨンを、腸球菌にはブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）ブイヨンを含んでいた。以下の表に示すように、異なる細菌種を３７℃において、異なる時間、ニシンの固定した異なる濃度でインキュベ−トした。溶解は、ニシンに接触させる前の培養物と比較して６００ｎｍでの光学濃度のパ−セント減少として測定した。さらに、いくつかの実験においては、サンプルを移し、ＭＢＣで上述したように生存数が本質的に数えられた。
マウスｉ．ｐ．感染モデル
スタヒロコッカスアウレウスＮＣＴＣ８３２５を子牛インフュ−ジョンブイヨン中で成長させ、ブロス＋１０％（ｗ／ｖ）ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）細菌学的ムチンで希釈したそれぞれ１０３コロニー形成単位（ＣＦＵ）でマウスに腹腔内感染させた。各グル−プ５匹のマウスが、無処置あるいは、感染後１０分以内に静脈内に１０ｍｇ／ｋｇのニシン投与（尾の静脈からｐＨ５．０に調製した０．５ｍｌの水性溶液を投与）を受けた。死亡あるいは不都合な兆候を記録するために、マウスを４８時間観察した。
実施例１  現代の多薬剤抵抗性病原体に対するニシンのＭＩＣおよびＭＢＣの測定
表１に示すように、ブドウ球菌、腸球菌および連鎖球菌の異なる種類の実験室ＡＴＣＣ株および臨床単離物の両者に対して、ニシンは優れた阻害活性（ＭＩＣ）を示し、一方、グラム陰性細菌（大腸菌およびシュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））は感受性が相当低かった。臨床単離物には、メチシリン抵抗性スタヒロコッカスアウレウス（ＭＲＳＡ）およびスタヒロコッカスエピデルミディス（ＭＲＳＥ）と、ムピロシン抵抗性（ｍｕｐ−ｒ）Ｓ．アウレウスおよびＭＲＳＡと、バンコマイシン抵抗性（ｖａｎ−ｒ）エンテロコッカスフェカーリスおよびエンテロコッカスフェシウムとが含まれていた。試験した全微生物において、ＭＢＣ（２４時間以内に細菌の少なくとも９９．９％を殺傷する濃度）は等しいか、あるいは数例においてはＭＩＣの２倍であったことは、ニシンはこれらの細菌に対して高い殺菌性を有することを示す。ニシンがバンコマイシン抵抗性株を含む腸球菌に対して殺菌性であるという結果は、腸球菌がほとんどの抗菌剤の殺菌活性に対して抵抗性であることから予期しないものである。
実施例２  多薬剤抵抗性の病原体に対するニシンの殺菌活性の測定
多薬剤抵抗性肺炎球菌に加えて、ブドウ球菌および腸球菌の多数の多薬剤抵抗性臨床単離物を２０分から２４０分の範囲の時間で、固定した濃度のニシンに暴露させた追加実験において、実施例１の結果は確認され拡張された。短時間の暴露期間の終わりに、２種類のパラメ−タを測定した。すなわち、細胞生存性（１セットの実験において）および細胞溶解（両方のセットの実験において）である。表２に示すように、ほとんどの単離物は、６００ｎｍでの培養濁度の減少によって測定される５０％より多い溶解を示した。残りの多くの株は測定できるほどの溶解を示したが５０％以下であった。さらに、表２で示すように、ニシンで処理した単離物のサンプルが生存性について評価された。生存数の減少パ−セントが混濁度の減少パ−セントを越えることが観察され、いくつかの単離物においては、混濁度が比較的少しの減少しか示さないにも関わらず生存数が有意に減少していた。従って、これらの細菌に対するニシンの殺菌作用は細胞溶解を必要とせず、むしろ溶解は薬剤に対する細菌の反応において後期の現象であると考えられる。２つの単離物（両者とも短時間の間で低濃度に暴露された肺炎球菌である）以外の全ては、実験における短時間の暴露の間に広範囲に殺傷された。腸球菌単離物の全てに対するニシンの迅速な殺菌作用（４時間以内に９９％以上）は、これらの微生物に対する顕著な結果である。
実施例３  マウスにおける腹腔内スタヒロコッカスアウレウス感染に対するニシンの効果
感染に対するニシンの効果は、マウス感染モデルにおいて検討された。このモデルにおいて、腹腔内感染は感染後１８時間以内に未処置マウスの死亡を引き起こす。表３に示すように、５匹の未処置マススの５匹が死亡したが、一方、１０ｍｇ／ｋｇのニシンを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した５匹の全感染マウスは感染に対して生き残った。この結果は、ニシンは感染治療の可能性を有することを示唆する。
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