(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物をアセトバクター(Acetobacter)属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エアロモナス(Aeromonas)属、アルカリジェネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、バシラス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エッシェリッシア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、ハロコッカス(Halococcus)属、クレブシラ(Klebsiella)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ミクロコッカス(micrococcus)属、ミクロポリスポラ(Micropolyspora)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、セラチア(Serratia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、キサントモナス(Xanthomonas)属のいずれかに属する微生物またはその処理物を用い、該α，β−炭素・炭素二重結合を還元してα位がキラルなＳ体化合物を製造することを特徴とするα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【請求項２】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物をシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物またはその処理物を用い、該α，β−炭素・炭素二重結合を還元することを特徴とする請求項１に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【請求項３】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物をバークホルデリア(Burkholderia)属に属する微生物またはその処理物を用い、該α，β−炭素・炭素二重結合を還元することを特徴とする請求項１に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【請求項４】
シュードモナス属に属する微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas sp.SD810)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６７）、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas
sp.SD811)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６８）、またはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas sp.SD812)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６９）である請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）である請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株である請求項３に記載の製造方法。
【請求項７】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物が、下記一般式（１）
【化１】
0004269416.tif 000005
（但し、式中Ｒ1はハロゲン原子を表わし、Ｒ2、Ｒ3は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、Ｒ4はヒドロキシル基、炭素数１乃至３の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または１級乃至３級アミノ基を表わす。）で示される化合物であり、α−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物が下記一般式（２）
【化２】
0004269416.tif 000006
（但し、式中Ｒ1乃至Ｒ4は上記と同じ意味を表わす。）で示される化合物である請求項１乃至６のいずれかに記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【請求項８】
一般式（１）で示される化合物が、α−ハロアクリル酸であり、一般式（２）で示される化合物が絶対配置Ｓのα−ハロプロピオン酸である請求項７に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【請求項９】
ハロゲン原子が臭素原子または塩素原子である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
微生物の処理物が微生物培養物、微生物抽出物、微生物細胞懸濁液または微生物菌体固定物である請求項１乃至９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
生成するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を分解しなくなるような変異を使用する微生物に生じさせ、生成物の蓄積量を高めることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
反応系中にα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物と、使用する微生物が酸化できる化合物を共存させることによって反応継続時間を延長した請求項１乃至１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
使用する微生物が酸化できる化合物が炭素数３乃至６の糖または炭素数２乃至４の有機酸である請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas
sp.SD810)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６７）またはその変異株。
【請求項１５】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas
sp.SD811)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６８）またはその変異株。
【請求項１６】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas
sp.SD812)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６９）またはその変異株。
【請求項１７】
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia
sp.SD816)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）またはその変異株。
【請求項１８】
請求項１４乃至１７のいずれかに記載の微生物の処理物。
【請求項１９】
微生物培養物、微生物抽出物、微生物細胞懸濁液または微生物菌体固定物からなる請求項１８に記載の微生物の処理物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アセトバクター(Acetobacter)属等の特定の属に属する微生物、特に、シュードモナス属またはバークホルデリア属に属する微生物、さらに特にはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas sp.SD810)、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas sp.SD811)、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas sp.SD812)、バークホリデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)等の特定の菌株またはそれらの処理物を用いて、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合に水素添加して、対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法に関する。さらには、新規なシュードモナス属またはバークホルデリア属に属する微生物、特にシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas sp.SD810)、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas sp.SD811)、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas sp.SD812)およびバークホリデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)に関する。
【０００２】
また、本発明は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、この炭素・炭素二重結合に水素添加して、対応するα位についてＳ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法に関する。この新規な方法は、種々の光学活性（α位の絶対配置Ｓ体）な飽和カルボン酸やアミドなどの光学活性カルボニル化合物の製造分野に利用することができる。光学活性なカルボニル化合物は、古典的な化学プロセスでは調製が困難な、価値の高いキラル構築ブロックであり、特に医薬や農薬の原料として有用な物質群である。
【０００３】
【従来の技術】
近年、微生物の炭素・炭素二重結合の還元により様々な化合物、特に光学活性体を製造する方法が注目され、種々のα，β−炭素・炭素二重結合を有しかつα位に置換基を持つカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を微生物的に還元して対応するα位に置換基を持つα，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法が報告されている(H.Simon.et.al.,Hoppe-Seyler's  Z.Physiol.Chem.362,33(1981)、H.Giesel.et.al.,Arch.Microbiol.135,51(1983)、H.G.W.Leuenberger.et.al.,Helv.Chim,Acta.,62,455(1979)、R.Matuno.,et.al.,J.Ferm.Bioeng.,84,195(1997))。しかしながら、たとえば微生物として細菌を用いる方法では、クロストリジウム・クルイベリー(Clostridium kluyveri(DSM-555))、クロストリジウム・エスピー・Ｌａ−１(Clostridium sp. La-1(DSM-1460))などの嫌気性細菌を用いるため、微生物の生育速度が遅く、菌体濃度が上げ難いため反応速度も十分ではなく、経済性、操作性において問題があった。
【０００４】
また、特開昭63-003794号公報に開示されているクロストリジウム・サーモサッカロリティカム(Clostridium theremosaccharolyticum)を用いる方法は、好熱性細菌を用いることによって前記問題を解決しようとしたものであるが、依然嫌気性細菌を用いるため、生育速度、反応速度共十分ではなく、プロセスに水素を用いるなど経済性、安全性の問題を解決するには至っていない。またこの微生物によるプロキラルな、α，β−炭素・炭素二重結合を有しα位に置換基を持つカルボニル化合物の還元で生成されるα位に置換基を持つα，β−飽和カルボニル化合物は絶対配置Ｒ体であり、Ｓ体を製造することはできない。
【０００５】
微生物としてパン酵母を用いα，β−炭素・炭素二重結合を還元するる方法では、還元できる化合物の範囲が広いため汎用性があり、好気性微生物であるため操作性もよく、生成される光学活性体もS体、R体いずれの場合も知られており報告例も最も多いが、酵母は細菌に比して生育が遅く、さらに光学活性な生成物を目的とした還元反応では、光学選択性が十分ではない場合が多く、また、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元反応は知られていない。
【０００６】
以上のように微生物を用いてα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法においては、操作性、経済性、安全性、反応特性などの条件をすべて満たす方法は知られていなかった
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を微生物を用いて還元して対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法において、操作性、経済性、安全性及び反応特性などの条件がすべて満たされ、かつ光学選択性に優れた製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の該炭素・炭素二重結合を還元して対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成する微生物が、驚くべきことに、好気性あるいは通性嫌気性細菌の比較的多くの属に渡って分布していることを土壌からの徹底的なスクリーニングにより見出した。特にシュードモナス属(Pseudomonas)またはバークホルデリア属(Burkholderia)に属する微生物に本活性を有する株が多く存在すること、これらの株の中にはα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を還元して、純度の極めて高いα位の絶対配置Ｓ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成しうるものが存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の事項に関する。
［１］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物をアセトバクター(Acetobacter)属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エアロモナス(Aeromonas)属、アルカリジェネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、バシラス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エッシェリッシア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、ハロコッカス(Halococcus)属、クレブシラ(Klebsiella)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ミクロコッカス(micrococcus)属、ミクロポリスポラ(Micropolyspora)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、セラチア(Serratia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、キサントモナス(Xanthomonas)属のいずれかに属する微生物またはその処理物を用い、該α，β−炭素・炭素二重結合を還元してα位がキラルなＳ体化合物を製造することを特徴とするα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【００１０】
［２］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物をシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物またはその処理物を用い、該α，β−炭素・炭素二重結合を還元することを特徴とする［１］に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
［３］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物をバークホルデリア(Burkholderia)属に属する微生物またはその処理物を用い、該α，β−炭素・炭素二重結合を還元することを特徴とする［１］に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【００１１】
［４］  シュードモナス属に属する微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas sp.SD810)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６７）、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas
sp.SD811)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６８）、またはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas sp.SD812)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６９）である［２］に記載の製造方法。
［５］  バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）である［３］に記載の製造方法。
［６］  バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株である［３］に記載の製造方法。
【００１２】
［７］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物が、下記一般式（１）
【化３】
0004269416.tif 000002
（但し、式中Ｒ1はハロゲン原子を表わし、Ｒ2、Ｒ3は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、Ｒ4はヒドロキシル基、炭素数１乃至３の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または１級乃至３級アミノ基を表わす。）で示される化合物であり、α−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物が下記一般式（２）
【化４】
0004269416.tif 000003
（但し、式中Ｒ1乃至Ｒ4は上記と同じ意味を表わす。）で示される化合物である［１］〜［６］のいずれかに記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【００１３】
［８］  一般式（１）で示される化合物が、α−ハロアクリル酸であり、一般式（２）で示される化合物が絶対配置Ｓのα−ハロプロピオン酸である［７］に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
［９］  ハロゲン原子が臭素原子または塩素原子である［８］に記載の製造方法。
［１０］  微生物の処理物が微生物培養物、微生物抽出物、微生物細胞懸濁液または微生物菌体固定物である［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］  生成するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を分解しなくなるような変異を使用する微生物に生じさせ、生成物の蓄積量を高めることを特徴とする［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］  反応系中にα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物と、使用する微生物が酸化できる化合物を共存させることによって反応継続時間を延長した［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］  使用する微生物が酸化できる化合物が炭素数３乃至６の糖または炭素数２乃至４の有機酸である［１２］に記載の製造方法。
【００１４】
［１４］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas
sp.SD810)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６７）またはその変異株。
［１５］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas
sp.SD811)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６８）またはその変異株。
［１６］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas
sp.SD812)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６９）またはその変異株。
【００１５】
［１７］  α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia
sp.SD816)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）またはその変異株。
［１８］  ［１４］〜［１７］のいずれかに記載の微生物の処理物。
［１９］  微生物培養物、微生物抽出物、微生物細胞懸濁液または微生物菌体固定物からなる［１８］に記載の微生物の処理物。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において使用できる微生物は、アセトバクター(Acetobacter)属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エアロモナス(Aeromonas)属、アルカリジェネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、バシラス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エッシェリッシア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、ハロコッカス(Halococcus)属、クレブシラ(Klebsiella)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ミクロポリスポラ(Micropolyspora)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、セラチア(Serratia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、キサントモナス(Xanthomonas)属のいずれかに属する微生物である。
【００１７】
好適にはシュードモナス属あるいはバークホルデリア属に属する微生物である。α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有する株ならば特に制限はないが、例えば、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株、またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株が好適に用いられる。中でもシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株が特に好適に用いられる。シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株は土壌中から単離されたものであり、各種のカルボニル化合物を分解資化する能力を有している。
【００１８】
また、上記微生物は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有している限り、野生株、変異株、または細胞融合もしくは遺伝子操作により誘導される組み換え体などのいずれの菌株でも用いることができる。たとえば、生成物の分解活性が低下したり欠損した変異株、還元活性が向上した変異株や遺伝子組み換え体、高濃度の基質や生成物に対する耐性が向上した変異株などは、特に好適に用いることができる。
【００１９】
次にその分離・培養の例を示す。
すなわち、通常の細菌に用いられる無機塩培地（例えば、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ２g/l、ＮａＨ2ＰＯ4 １g/l、Ｋ2ＨＰＯ4 １g/l、ＭｇＳＯ4 ０．１g/l、酵母エキス０．５g/l）に、例えば、α−クロロアクリル酸のようなα位にハロゲン原子を置換基として持つα，β−不飽和カルボニル化合物を実質的に唯一の炭素源として２g/l添加した最少培地５mlを試験管に分注し滅菌後、土壌約０．１ｇを添加し、２８℃で振とう培養を行い、１日毎に植え継ぎを行う。本集積培養を６日間繰り返した後、上記最少培地に２０g/lの寒天を添加して平板化した上に塗布し、２８℃で３日間培養し、生成したコロニーを純粋分離すると、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株またはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株を得ることができる。これらシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株およびシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株は、それぞれ生命研菌寄第BP-6767号(FERM  BP-6767)［生命研菌寄第16746号(FERM-16746)から移管］、生命研菌寄第BP-6768号(FERM  BP-6768)［生命研菌寄第16747号(FERM  16747)から移管］および生命研菌寄第BP-6769号(FERM  BP−6769)［生命研菌寄第16748号(FERM  16748)から移管］として生命工業技術研究所に寄託されている。
【００２０】
また、比較的分離源中でのポピュレーションの低い株の分離・培養例を示す。
【００２１】
すなわち、土壌などを分離源とした馴化集積培養によりポピュレーションの低い微生物、資化能力が低い微生物、α−クロロアクリル酸のようなα位にハロゲン原子を置換基として持つα，β−不飽和カルボニル化合物（以降「含ハロゲン化合物」ともいう。）に対する耐性の低い微生物を分離することができる。酵母抽出物（０．５g/l）、硫酸アンモニウム（２g/l）、リン酸二水素ナトリウム（１g/l）、リン酸水素二カリウム（１g/l）、硫酸マグネシウム（０．１g/l）を含む基本培地（一部の高塩濃度を好んで生育する微生物の分離には、前記基本培地に、塩化ナトリウムを１０〜２０％濃度で加えたものを基本培地として用いる）に各種の含ハロゲン化合物０．０１％（本明細書中、特記しない限り「％」は「重量(g)／体積(100ml)ｘ100」を表わす。)を実質的に唯一の、あるいは同濃度のグルコースと共に炭素源として添加した培地１０mlに、採取した土壌１ｇを懸濁し３０℃で振とう培養する。２４時間後培養液上清５mlを取り、上記組成のうち含ハロゲン化合物濃度のみ０．０２％とした新しい培地５mlを加え３０℃で振とう培養する（植え継ぎ１回目）。２４時間後、培養液の上清５mlを取り、培地中の含ハロゲン化合物の濃度を０．０２％から０．１％に上げた培地５mlを加え３０℃で振とう培養する（植え継ぎ２回目）。この作業を２４時間毎にさらに３回繰り返す（植え継ぎ３〜５回目）。６回目の植え継ぎ時に、培養液に加える培地の含ハロゲン化合物の濃度を０．２％に上げ、上清５mlを取り、新しい培地５mlを加え３０℃で振とう培養する。この作業を２４時間毎に６回繰り返し（植え継ぎ６〜１２回目）、６回の各植え継ぎ時に、上記含ハロゲン化合物０．２％を含む培地に２％の寒天を加えて平板培地としたものに培養液上清の一部を塗布し、３０℃で培養し、生じたコロニーを純粋分離すると、たとえば、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を得ることができる。バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株は、生命研菌寄第BP-6770号(FERM  BP−6770)として生命工業技術研究所に寄託されている。
【００２２】
次に、これらの菌株の分類学的試験結果を示す。
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株
形態；
（１）細胞の形および大きさ                      桿菌
０．６−１．０μm×１．２−３．０μm
（２）運動性                                    あり
（３）グラム染色性                              陰性
（４）胞子の有無                                なし
（５）３％ＫＯＨによる溶菌                      陽性
生理学的活性；
（１）アミノペプチダーゼ                        陽性
（２）オキシダーゼ                              陽性
（３）カタラーゼ                                陽性
（４）インドールの生成                          陰性
（５）ＶＰテスト                                陰性
（６）硝酸塩の還元                              陰性
（７）脱窒反応                                  陰性
（８）クエン酸の利用（Simons）                  陽性
（９）ウレアーゼ                                陰性
（１０）フェニルアラニンデアミナーゼ            陰性
（１１）マロン酸の利用                          陽性
（１２）シュクロースからのレバンの生成          陽性
（１３）レシチナーゼ                            陰性
（１４）デンプンの加水分解                      陰性
（１５）ゼラチンの加水分解                      陰性
（１６）カゼインの加水分解                      陰性
（１７）ＤＮＡの加水分解                        陰性
【００２３】
（１８）Tween  ８０の加水分解                   陰性
（１９）エクスリンの加水分解                    陰性
（２０）生育
酸素に対する挙動                              絶対好気性
３７℃での生育                                −
４１℃での生育                                −
ｐH５．６での生育                             ＋
Mac-Conkey-Agar培地での生育                   −
SS-Agar培地での生育                           −
Centrimid-Agarでの生育                        −
（２１）色素の生成
非拡散性                                      陰性
拡散性                                        陰性
蛍光性                                        陰性
ピロシアニン                                  陰性
（２２）ＯＦテスト                              糖を分解しない
（２３）酸の生成
グルコース                                    陰性
フラクトース                                  陽性
キシロース                                    陰性
（２４）ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ）        陰性
（２５）アルギニンジヒドロラーゼ                陰性
（２６）グルコースからのガス生成                陰性
（２７）チロシン分解                            陰性
（２８）生育因子要求性                          なし
（２９）各種炭素化合物の利用性
酢酸                                          ＋
アジピン酸                                    −
【００２４】
カプリン酸                                    ＋
クエン酸                                      ＋
シトラコン酸                                  ＋
グリコール酸                                  ＋
レブリン酸                                    ＋
マレイン酸                                    ＋
マロン酸                                      ＋
メサコン酸                                    ＋
ムコン酸                                      ＋
フェニル酢酸                                  ＋
糖酸                                          ＋
セバシン酸                                    ＋
Ｄ−酒石酸                                    ＋
ｍ−酒石酸                                    ＋
Ｌ−アラビノース                              −
セロビオース                                  −
フラクトース                                  ＋
Ｄ−フコース                                  −
グルコース                                    −
マンノース                                    −
マルトース                                    −
リボース                                      −
ラムノース                                    −
キシロース                                    −
マンニトール                                  −
グルコン酸                                    −
２−ケトグルコン酸                            ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン                      −
【００２５】
トリプタミン                                  −
エタノールアミン                              −
Ｄ−アラニン                                  ＋
Ｌ−オルニチン                                −
Ｌ−セリン                                    −
Ｌ−スレオニン                                −
グルタミン酸                                  ＋
安息香酸                                      ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸                        ＋
サリシン酸ナトリウム                          −
２，３−ブチレングリコール                    −
以上の結果をバージェイの細菌分類書(Bergey's  Manual  of  Systematic  Bacteriology(1986))に基づいて分類すると、本菌株はシュードモナス属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas sp.SD810)と呼ぶことにした。
【００２６】
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株
形態；
（１）細胞の形および大きさ                      桿菌
０．７−０．９μm×１．５−３．０μm
（２）運動性                                    あり
（３）グラム染色性                              陰性
（４）胞子の有無                                なし
（５）３％ＫＯＨによる溶菌                      陽性
生理学的活性；
（１）アミノペプチダーゼ                        陽性
（２）オキシダーゼ                              陽性
【００２７】
（３）カタラーゼ                                陽性
（４）インドールの生成                          陰性
（５）ＶＰテスト                                陰性
（６）硝酸塩の還元                              陰性
（７）脱窒反応                                  陰性
（８）クエン酸の利用（Simons）                  陽性
（９）ウレアーゼ                                陰性
（１０）フェニルアラニンデアミナーゼ            陰性
（１１）マロン酸の利用                          陽性
（１２）シュクロースからのレバンの生成          陰性
（１３）レシチナーゼ                            陰性
（１４）デンプンの加水分解                      陰性
（１５）ゼラチンの加水分解                      陰性
（１６）カゼインの加水分解                      陰性
（１７）ＤＮＡの加水分解                        陰性
（１８）Tween ８０の加水分解                    陽性
（１９）エクスリンの加水分解                    陰性
（２０）生育
酸素に対する挙動                              絶対好気性
３７℃での生育                                −
４１℃での生育                                −
ｐＨ５．６での生育                            ＋
Mac-Conkey-Agar培地での生育                   −
SS-Agar培地での生育                           −
Cetrimid-Agarでの生育                         −
（２１）色素の生成
非拡散性                                      陰性
拡散性                                        陰性
【００２８】
蛍光性                                        陰性
ピロシアニン                                  陰性
（２２）ＯＦテスト                              糖を分解しない
（２３）酸の生成
グルコース                                    陽性
フラクトース                                  陽性
キシロース                                    陽性
（２４）ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ）        陰性
（２５）アルギニンジヒドロラーゼ                陰性
（２６）グルコースからのガス生成                陰性
（２７）チロシン分解                            陰性
（２８）生育因子要求性                          なし
（２９）各種炭素化合物の利用性
酢酸                                          ＋
アジピン酸                                    −
カプリン酸                                    −
クエン酸                                      −
シトラコン酸                                  ＋
グリコール酸                                  ＋
レブリン酸                                    −
マレイン酸                                    ＋
マロン酸                                      ＋
メサコン酸                                    −
ムコン酸                                      ＋
フェニル酢酸                                  ＋
糖酸                                          ＋
セバシン酸                                    −
Ｄ−酒石酸                                    ＋
【００２９】
ｍ−酒石酸                                    −
Ｌ−アラビノース                              ＋
セロビオース                                  −
フラクトース                                  ＋
Ｄ−フコース                                  ＋
グルコース                                    ＋
マンノース                                    −
マルトース                                    −
リボース                                      ＋
ラムノース                                    ＋
キシロース                                    −
マンニトール                                  ＋
グルコン酸                                    −
２−ケトグルコン酸                            ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン                      ＋
トリプタミン                                  −
エタノールアミン                              −
Ｄ−アラニン                                  −
Ｌ−オルニチン                                −
Ｌ−セリン                                    −
Ｌ−スレオニン                                −
グルタミン酸                                  ＋
安息香酸                                      ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸                        ＋
サリシン酸ナトリウム                          −
２，３−ブチレングリコール                    −
以上の結果を同様にバージェイの細菌分類書に基づいて分類すると、本菌株はシュードモナス属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas sp.SD811)と呼ぶことにした。
【００３０】
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株
形態；
（１）細胞の形および大きさ                      桿菌
０．５−０．８μm×１．５−３．０μm
（２）運動性                                    あり
（３）グラム染色性                              陰性
（４）胞子の有無                                なし
（５）３％ＫＯＨによる溶菌                      陽性
生理学的活性；
（１）アミノペプチダーゼ                        陽性
（２）オキシダーゼ                              陽性
（３）カタラーゼ                                陽性
（４）インドールの生成                          陰性
（５）ＶＰテスト                                陰性
（６）硝酸塩の還元                              陰性
（７）脱窒反応                                  陰性
（８）クエン酸の利用（Simons）                  陽性
（９）ウレアーゼ                                陽性
（１０）フェニルアラニンデアミナーゼ            陰性
（１１）マロン酸の利用                          陽性
（１２）シュクロースからのレバンの生成          陰性
（１３）レシチナーゼ                            陰性
（１４）デンプンの加水分解                      陰性
（１５）ゼラチンの加水分解                      陰性
（１６）カゼインの加水分解                      陰性
（１７）ＤＮＡの加水分解                        陰性
【００３１】
（１８）Tween  ８０の加水分解                   陰性
（１９）エクスリンの加水分解                    陰性
（２０）生育
酸素に対する挙動                              絶対好気性
３７℃での生育                                −
４１℃での生育                                −
ｐＨ５．６での生育                            ＋
Mac-Conkey-Agar培地での生育                   −
SS-Agar培地での生育                           −
Cetrimid-Agarでの生育                         −
（２１）色素の生成
非拡散性                                      陽性
拡散性                                        陰性
蛍光性                                        陰性
ピロシアニン                                  陰性
（２２）ＯＦテスト                              糖を分解しない
（２３）酸の生成
グルコース                                    陰性
フラクトース                                  陰性
キシロース                                    陰性
（２４）ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ）        陰性
（２５）アルギニンジヒドロラーゼ                陰性
（２６）グルコースからのガス生成                陰性
（２７）チロシン分解                            陽性
（２８）生育因子要求性                          なし
（２９）各種炭素化合物の利用性
酢酸                                          ＋
アジピン酸                                    ＋
【００３２】
カプリン酸                                    −
クエン酸                                      ＋
シトラコン酸                                  −
グリコール酸                                  ＋
レブリン酸                                    −
マレイン酸                                    ＋
マロン酸                                      ＋
メサコン酸                                    ＋
ムコン酸                                      ＋
フェニル酢酸                                  ＋
糖酸                                          ＋
セバシン酸                                    ＋
Ｄ−酒石酸                                    −
ｍ−酒石酸                                    ＋
Ｌ−アラビノース                              −
セロビオース                                  −
フラクトース                                  −
Ｄ−フコース                                  −
グルコース                                    −
マンノース                                    −
マルトース                                    −
リボース                                      −
ラムノース                                    −
キシロース                                    −
マンニトール                                  −
グルコン酸                                    ＋
２−ケトグルコン酸                            ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン                      −
【００３３】
トリプタミン                                  −
エタノールアミン                              −
Ｄ−アラニン                                  ＋
Ｌ−オルニチン                                −
Ｌ−セリン                                    −
Ｌ−スレオニン                                ＋
グルタミン酸                                  ＋
安息香酸                                      ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸                        ＋
サリシン酸ナトリウム                          −
２，３−ブチレングリコール                    −
以上の結果を同様にバージェイの細菌分類書に基づいて分類すると、本菌株はシュードモナス属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas sp.SD812)と呼ぶことにした。
【００３４】
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株
形態；
（１）細胞の形                                  桿菌
（２）運動性                                    あり
（３）グラム染色性                              陰性
（４）胞子の有無                                なし
（５）鞭毛                                      着生状態不明
生理学的活性；
（１）オキシダーゼ                              陽性
（２）カタラーゼ                                陽性
（３）プロトカテキン酸の開裂                    ortho型
（４）硝酸塩の還元                              陰性
【００３５】
（５）脱窒反応                                  陰性
（６）ＰＨＢの蓄積                              陽性
（７）デンプンの加水分解                        陰性
（８）ゼラチンの加水分解                        陰性
（９）生育
酸素に対する挙動                              絶対好気性
４０℃での生育                                ＋
（１０）色素の生成
集落の色調                                    特徴的集落色素を生成せず
水溶性色素の生成                              陰性
（１１）ＯＦテスト                              糖を分解しない
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ                陰性
（１３）各種炭素化合物の利用性
レブリン酸                                    −
メサコン酸                                    −
Ｄ−酒石酸                                    ＋
リボース                                      ＋
ラムノース                                    ＋
キシロース                                    ＋
トリプタミン                                  −
２，３−ブチレングリコール                    −
（１４）キノン系                                Ｑ−８
（１５）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（mol％）         ６２
以上の結果をバージェイの細菌分類書(Bergey's  Manual  of  Systematic  Bacteriology(1986、1994))に基づいて分類すると、本菌株はバークホルデリア属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)と呼ぶことにした。
【００３６】
本発明において、好適に使用できるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物は、次の一般式（１）で表される。
【化５】
0004269416.tif 000004
式中Ｒ1 はハロゲン原子を表わし、好ましいＲ1 としては塩素原子、臭素原子を挙げることができる。Ｒ2 、Ｒ3 は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または飽和もしくは不飽和含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、好ましいＲ2 、Ｒ3 としては水素原子を挙げることができる。Ｒ4 はヒドロキシル基、炭素数１乃至４の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、１級乃至３級アミノ基を表わし、好ましいＲ4 としてはヒドロキシル基を挙げることができる。
【００３７】
具体的にはα−クロロアクリル酸、α−ブロモアクリル酸、２−クロロ−２−ブテン酸、２−ブロモ−２−ブテン酸、２−クロロ−２−ペンテン酸、２−ブロモ−２−ペンテン酸、それらのメチルエステル、エチルエステルなどが挙げられ、好ましくはα−クロロアクリル酸、α−ブロモアクリル酸である。
【００３８】
本発明の反応方法は、シュードモナス属あるいはバークホルデリア属等に属する微生物、具体例としてはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株等の微生物をα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物に接触させて炭素・炭素二重結合を還元し、対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を得ることにより行われる。
【００３９】
本発明で行なうα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合の還元反応は、前記微生物が持つ還元力が安定に発現する条件下であれば、該微生物の培養液中、前記方法により培養して得た菌体、または前記方法により培養して得た菌体を破砕して得られる無細胞抽出液等の微生物の処理物のいずれを用いても行うことができる。
【００４０】
すなわち培養して得た菌体を用いる場合は、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を培養液に、０．１％〜１０％の濃度、好ましくは０．２％〜２％の濃度になるように連続的または回分的に添加し、培養温度１５℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３０℃で培養し、培養液中に相当するα−ハロ−α,β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。
【００４１】
あるいは、前記方法により培養して得た培養物から遠心分離などの方法で回収した菌体を、適当な溶液、例えば希薄なｐH緩衝溶液のごとき水溶液に懸濁した溶液に、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を、例えば、０．１％〜１０％の濃度になるように連続的または回分的に添加し、反応温度１５℃〜３５℃、好ましくは、２５℃〜３０℃、反応ｐH６．０〜９．０、好ましくは、ｐH６．５〜７．３に調節して反応し、該菌体懸濁液中に相当するα−ハロα，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。前記培養法による培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、基質となるα, β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を、たとえば、０．１％〜１０％の濃度、好ましくは０．２％〜２％の濃度で含み、反応液のｐＨ維持に有効な成分、好ましくは、水性バッファ、たとえばリン酸カリウムもしくはトリス／ＨＣｌを１０mM〜１Mの範囲で含むような反応液に懸濁して、反応温度１５℃〜５０℃、好ましくは２８℃〜３５℃の範囲で反応させ、相当するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の添加時期と速度または回数は、反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択できる。
【００４２】
微生物の処理物を用いる場合は、例えば、前記培養法による培養物を遠心分離に供して回収した菌体を、フレンチプレス等の方法により破壊して得た無細胞抽出液を、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の濃度が、０．１％〜１０％、好ましくは０．２％〜２％であり、反応液のｐＨ維持に有効な成分を１０mM〜１Mの範囲で含むような反応液に添加して、反応温度１５℃〜５０℃、好ましくは２８℃〜３５℃の範囲で反応させ、相当するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。
【００４３】
さらに本発明においては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元する活性の維持に有効な物質、たとえば使用する微生物が酸化することのできる糖や有機酸のごとき化合物、好ましくはグルコースやＬ−乳酸等を、単独で、あるいはα−クロロアクリル酸との混合溶液として反応中、０．１％〜１０％の濃度、好ましくは０．２％〜１％の濃度になるように連続的または回分的に添加しながら反応させることができる。α−クロロアクリル酸とこれら被酸化物質との添加割合は１：１〜２０：１の間で任意に選択できる。この糖や有機酸の添加により反応時間を延長することができる。このことにより、目的生成物であるα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の反応液中の濃度を高くすることができ、生成物を単離収得するのに好ましい。反応は培養中で無い場合は、好気的、嫌気的いずれの環境でも行うことができる。菌体または無細胞抽出液と基質であるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の比率、あるいは基質の添加時期と速度または回数は、反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択できる。
【００４４】
本発明においては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元によって生成したα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物は、使用する微生物にとって代謝中間体であってさらに分解を受ける場合がある。例えば、α−クロロアクリル酸から生成されるα−クロロプロピオン酸は、微生物のいくつかでは比較的速やかに分解される。このような場合は、分解活性を失った変異株を用いるか、ｐＨ値の低下、菌体または無細胞抽出液の加熱処理、又は適切な分解酵素の阻害剤の添加により分解反応を停止させることができる。たとえば、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株は、通常α−クロロアクリル酸からα−クロロプロピオン酸を生成する最適な速度を与える条件では、培養液もしくは反応液中に生成したα−クロロプロピオン酸を速やかに分解するため、対α−クロロアクリル酸からα−クロロプロピオン酸への変換率が低下してしまうが、α−クロロアクリル酸からα−クロロプロピオン酸生成段階の至適反応のｐＨの範囲が、ｐＨ５．０〜７．０であり、α−クロロプロピオン酸の分解段階の至適反応ｐＨの範囲が、ｐＨ７．０〜７．３であり、α−クロロプロピオン酸の分解段階の至適反応ｐＨの範囲が高いので、ｐＨ５．０〜７．０の低いα−クロロプロピオン酸生成段階の至適反応のｐＨの範囲で反応を行うことによりα−クロロプロピオン酸の生成量を増すことができる。また、前記α−クロロプロピオン酸を分解する酵素の一種はヒドロキシルアミンによって効果的に阻害されることが知られているが（Soda K. et. al., J. Biol. Chem. 272,3363-3368,1997)、本発明においても、培養液あるいは反応液に適量のヒドロキシルアミンを添加することにより、分解反応を阻害することができる。
【００４５】
さらに、本発明で用いられる微生物の菌体あるいは無細胞抽出液は、慣用の方法、たとえば、吸着、包括、架橋などの方法により、種々の固定化担体に固定化して用いることができる。担体の種類は特に制限されず、たとえば、セルロースなどの多糖系材料、ポリマー系材料、コラーゲン等のタンパク質系材料などを用いることができる。
【００４６】
本発明で使用するα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、炭素・炭素二重結合を還元することにより、α位について絶対配置Ｓ体の対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造することができる。
【００４７】
本発明に用いる微生物の培養方法は、一般好気性微生物が増殖し得る方法であれば特に制限されないが、培地の炭素源としては、上記微生物が利用可能なものであればいずれも使用でき、たとえば、糖類、酢酸、乳酸、およびこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては、たとえば、硫酸アンモニウムやリン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキスなどの含窒素化合物、およびこれらの混合物を使用できる。
【００４８】
また、培地には、前記成分以外に通常の培養に用いられる栄養源、たとえば、無機塩、微量金属塩、ビタミン類などを適宜、混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、微生物の増殖を促進する因子、培地のｐＨ維持に有効な成分等を添加できる。また、微生物の還元活性を高めるために有効な化合物、たとえば、α−クロロアクリル酸のようなα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を、単独で炭素源として、または複数の炭素源と混合して用いることができる。
【００４９】
本発明に用いる微生物の培養は、ほとんどの好気性あるいは通性嫌気性細菌の培養に用いられる好気的条件下で行うことができる。たとえば、培地のｐＨ５．５〜８．０好ましくはｐＨ６．５〜７．０、培養温度１５℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３０℃の条件で行うことができる。培養時間は、たとえば、１〜１４４時間、好ましくは１２時間〜７２時間である。
【００５０】
本発明で生成したα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物は、常用の溶媒抽出、蒸留といった精製法を用いて、得ることができる。たとえば、α−クロロアクリル酸から生成したα−クロロプロピオン酸は、培養液や反応液から有機溶媒抽出、蒸留等に供することにより得ることができる。また、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、本発明の還元法によって生成するキラルなα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の鏡像異性体の純度は、キラルカラム材料でのＧＣ、ＨＰＬＣあるいは旋光計で決定するのが有利である。
【００５１】
このように、本発明は、好気性あるいは通性嫌気性細菌を用いるため、経済性、操作性、プロセスの安全性に優れたα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して対応する絶対配置Ｓ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を提供するものである。
【００５２】
【実施例】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元活性の検出
酵母抽出物（０．５g/l）、硫酸アンモニウム（２g/l）、リン酸二水素ナトリウム（１g/l）、リン酸水素二カリウム（１g/l）、硫酸マグネシウム（０．１g/l）を含む基本培地（一部の高塩濃度を好んで生育する微生物は、前記基本培地に、塩化ナトリウムを１０〜２０％濃度で加えたものを基本培地として用いた）に、炭素源としてα-クロロアクリル酸またはα−クロロ−α，β−ブテン酸を０．２％添加した培地を用いて、集積培養あるいは馴化集積培養により分離した微生物を３０℃で培養し、培養液中に対応する還元生成物であるα-クロロプロピオン酸、α-クロロ酪酸が出現するかどうかをガスクロマトグラフィーを用いて調べた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、次の条件で分析を行った。
【００５４】
本体；              GC-7A（島津製作所）
カラム；            Thermon−3000／SHINCARBON  A  ２．６mm×２．１m
キャリアガス；      窒素  ５０ml／min．
検出；              FID
カラム温度；        ２００℃（一定）
インジェクション；  ２〜１０マイクロリター、２６０℃
記録；              クロマトコーダー１２（SIC）
上記検出により、複数の微生物の培養液中に、培養開始後速やかに、α−クロロアクリル酸またはα-クロロ-α，β-ブテン酸の消費に伴って、還元生成物であるα−クロロプロピオン酸またはα-クロロ酪酸の位置にピークが出現した。このピークをＧＣ−ＭＳにより分析したところ、標準物質のα−クロロプロピオン酸またはα-クロロ酪酸のマススペクトルと一致したことから、α−クロロプロピオン酸、α-クロロ酪酸であることが証明された。培養物中に還元生成物を生じた微生物の属を同定したところ様々な属の微生物にこの還元活性が認められることが判った。
【００５５】
活性が認められた微生物は、アセトバクター（Acetobacter）属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アシネトバクター（Acinetobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エアロモナス（Aeromonas)属、アルカリジェネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター（Azotobacter)属、バシラス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エッシェリッシア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、ハロコッカス(Halococcus)属、クレブシラ(Klebsiella)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ミクロコッカス(micrococcus)属、ミクロポリスポラ(Micropolyspora)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、セラチア(Serratia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、キサントモナス(Xanthomonas)属に属する好気性あるいは通性嫌気性細菌であった。特に多くの株が認められたのはシュードモナス(Pseudomonas)属であり、還元生成物量が比較的多かったのは、シュードモナス(Pseudomonas)属およびバークホルデリア(Burkholderia)属に属する微生物であった。培養液中に認められた還元生成物はいずれの株でも微少量（０．０１％以下）であったため、以下優良株について生成物蓄積条件の最適化を行った。
【００５６】
実施例２
（１）シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の培養
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を次の培地において培養した(量g/l)：α−クロロアクリル酸（２）、酵母抽出物（０．５）、硫酸アンモニウム（２）、リン酸二水素ナトリウム（１）、リン酸水素二カリウム（１）、硫酸マグネシウム（０．１）。培地の作成は以下のように行った。前記成分のうち、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを除く全成分を９５０mlの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整し、５ｌのフラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、この培地の温度が７０℃程度まで下がった後、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを５０mlの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。さらに酸素を供給したり、ｐＨを調節することなく、この培地に５％予備培養物（ＯＤ６６０nm＝１．１０）を接種し３０℃で株を培養した。
【００５７】
（２）α−クロロアクリル酸培養液におけるα−クロロプロピオン酸の検出
上記のシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のα−クロロアクリル酸を用いた培養において、特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１に示した条件で分析を行った。
【００５８】
上記検出により、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の培養液中には、培養開始後速やかに、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現し、その生産量は最大の時で培養液の約０．０２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約１０％であった。
【００５９】
実施例３
（１）α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−１
上記のシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を、実施例２の方法の１／１０のスケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収した。この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００ｍM（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０mlに懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
【００６０】
反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４ｍｌに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析したところ、反応液中には、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現し、その生産量は最大の時で反応液の約０．０５％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約２５％であった。
【００６１】
（２）α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応からのα−クロロプロピオン酸の単離
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas sp．SD811)を実施例１の方法の１／５スケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して回収した菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液１００mMを含む溶液（ｐＨ７．３に調整）１００mlに懸濁し、２８℃で攪拌して反応させた。反応中、α−クロロアクリル酸が無くなった時点で、さらに反応液の０．２％のα−クロロアクリル酸を添加して、反応を続行した。特定の時点でサンプル０．５mlを採取し、実施例３の方法で生成物を抽出分離し、実施例１の方法でα−クロロプロピオン酸の生産量をモニタリングした。約９時間後、反応液中のα−クロロアクリル酸が検出できなくなった時点で反応を終了し、その反応液の全量を遠心分離に供して菌体を除去した。得られた上清９５mlに２０mlの６ＮＨＣｌを添加し、９５mlの酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水１００mlで洗浄した後、エバポレーターで酢酸エチルを除去して濃縮した。濃縮サンプルを実施例１の方法で分析したところ、微量のα−クロロアクリル酸とα−クロロプロピオン酸が検出され、濃縮サンプルに含まれるα−クロロプロピオン酸は全量で約１００mg、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約２５％であった。
【００６２】
実施例４
（１）α−クロロプロピオン酸のメチル化
光学分割ＧＣカラムによって光学分割を行う場合、未修飾のカルボン酸はカルボキシル基の影響でＧＣカラムでの分離性が悪いことが多いため、三フッ化硼素−メタノール錯塩法により生成物のメチルエステル化を行った。すなわち、α−クロロプロピオン酸３mgにメタノール４mlを添加して混合した後、さらに三フッ化硼素−メタノール錯体１４％メタノール溶液１mlを添加して、攪拌しながら８０℃のオイルバス上で１時間還流した。１時間後、水３０mlを反応液に加え、酢酸エチル１０mlで反応物を抽出した後、酢酸エチルをエバポレーターで留去してサンプル全量を約０．１mlに濃縮した。濃縮サンプルを実施例１の方法のうちカラム温度のみを１２０℃にした条件で分析したところ、α−クロロプロピオン酸メチルエステルの位置にメインピークが一つ見られた。このピークをＧＣ−ＭＳ分析し、α−クロロプロピオン酸メチルエステルであることを確認した。
（２）α−クロロプロピオン酸の光学分割ＧＣ分析
上記の方法によりメチル化したＳ体とＲ体のα−クロロプロピオン酸は、以下の分析条件により、良く分離できた。
【００６３】
本体  ；            GC-１４A（島津製作所）
カラム；            CP-Chirasil-DEX−DEX  CB
０．３２mmI.D.×２５m  ｄｆ＝０．２５mm
（ＧＬサイエンス株式会社）
キャリアガス；      He、０．３８  kg/cm2
検出；              FID  ２７５℃
カラム温度；        ７０℃（一定）
インジェクション；  ０．１〜０．２マイクロリター
split  約１：１００、２５０℃
記録；              クロマトパックC-R6A（島津製作所）
この条件で実施例３の反応液から得たα−クロロプロピオン酸メチルエステルを分析したところ、Ｓ体のα−クロロプロピオン酸メチルエステルの位置にのみピークが見られ、その光学純度は９９％以上であった。
【００６４】
実施例５
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−２
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を、実施例２の方法の１／１０のスケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００mM（ｐＨ５．７）を含む溶液（ｐＨ５．７に調整）２０mlに懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析したところ、反応液中には、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現し、その生産量は最大の時で反応液の約０．０８％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約４１％であった。
【００６５】
実施例６
α−クロロプロピオン酸非分解性変異株の作成
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株およびバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を実施例２の方法の１／２００のスケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、それぞれ生理食塩水で洗浄した。この洗浄菌体を１０〜１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）１mlに再懸濁した菌体懸濁液に、最終濃度が５０〜１００ppmとなるように、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を添加し、室温で２〜２０分間処理した。処理後の菌体懸濁液を遠心分離に供して菌体を回収し、滅菌生理食塩水で洗浄した後、全量をＬ培地（ポリペプトン１０g/l、酵母エキス５g/l、塩化ナトリウム５g/l、ｐＨ７）５mlに植菌して、２８℃で一昼夜振とう培養した。培養終了後の培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、２０％グリセリン溶液に懸濁した後、適当量ずつ等分して凍結し、それぞれ変異株の選択用グリセリン・ストックとした。
【００６６】
実施例７
α−クロロプロピオン酸非分解性変異株の選択
前記変異株の選択用グリセリン・ストックを実施例２の方法で用いた培地５mlに植菌し、２８℃で５時間培養した。濁度が数倍に上昇した時点で、培養液に終濃度１００〜１０００ppmとなる量のペニシリンＧを添加し、２８℃で培養を続行した。５〜１６時間培養後の培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、滅菌生理食塩水で２回洗浄した後、全量をＬ−ブロス５mlに植菌して、２８℃で一昼夜振とう培養した。
【００６７】
実施例２で用いた培地のうち、炭素源であるα−クロロアクリル酸を、等量の乳酸に置き換えた培地に、２％の寒天を添加して平板化したものに、前記培養液を希釈して塗布し、２８℃で培養した。１〜２日後、平板上に形成されたコロニーを、実施例２で用いた培地に２％の寒天を添加して平板化したものにレプリカし、２８℃で１〜２日間培養した。乳酸平板上では生育し、α−クロロアクリル酸平板上では生育しなかった株を、α−クロロプロピオン酸非分解性変異株の候補として分離した。
【００６８】
分離した候補株を、実施例２で用いた培地に、生育可能な炭素源として乳酸を２g/l添加した培地５mlに一白金耳植菌し、２８℃で振とう培養した。この培養液について実施例１の方法によって分析を行ったところ、培養物中に生成したα−クロロプロピオン酸の生産最大量は、候補株によってバラツキがあったが、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の変異株では最大で培養液の約０．１７％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約８５％、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の変異株では最大で培養液の約０．１５％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約７５％であった。これらの株をα−クロロプロピオン酸非分解性変異株として選択した。
【００６９】
実施例８
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−３
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株およびバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、それぞれ実施例７で使用したのと同じ培地で培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００mM（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０mlにそれぞれ懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
【００７０】
反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例２の方法により分析したところ、反応液中には、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現した。その生産量は、α−クロロアクリル酸が反応液から消失した時点で、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の変異株では反応液の約０．１９％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９５％であり、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の変異株ではそれぞれ約０．２％、約１００％であった。いずれの株でも生成したα−クロロプロピオン酸が時間の経過と共に減少することは無かった。このα−クロロプロピオン酸の光学活性を、実施例４の方法に従って分析した結果、共にＳ体であり、その光学純度は９９％以上であった。
【００７１】
実施例９
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−４
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株およびバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、それぞれ実施例２で使用した基本培地に、炭素源としてグルコース０．２％を添加した培地１００mlで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００mM（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０mlにそれぞれ懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
【００７２】
反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析したところ、反応液中には、反応開始初期の数時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現した。その生産量は、α−クロロアクリル酸が反応液から消失した時点で、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の変異株では反応液の約０．１９％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９５％であり、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の変異株ではそれぞれ約０．２％、約１００％であった。
【００７３】
実施例１０
ジャーファーメンターによる培養
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例９で使用した培地を培地成分について５倍濃度とした培地（５×培地、ｐＨ７．０）１００mlで１６時間培養した培養液を、５Ｌのジャーファーメンターに張り込んだ５×培地２Ｌに接種し、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で培養した。培養開始後約１５〜２０時間経過時、初期投入分のグルコースが全て消費されるため、グルコース５〜２０％／硫酸アンモニウム５〜１５％／酵母エキス１〜５％溶液をそれぞれ単独あるいは混合液として、ペリスタック・ポンプにより連続的に追加添加した。この間のグルコース濃度は０．０２〜２％の間に保たれるように添加速度を調節した。培養液ｐＨは２０％アンモニア水溶液により６．３〜７．３の間に保たれるように調節した。この方法によって約３０〜４８時間培養した時のＯＤ６６０nmは約３０〜５０であった。
【００７４】
実施例１１
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−５
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い培養した。培養開始後４８〜７２時間グルコースなどの添加を停止して生育を止めた培養液に、終濃度が約０．２％になるようα−クロロアクリル酸を添加し、培養時と同条件で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、次の条件で液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。
【００７５】
本体；                LC-９A（島津製作所）
カラム；              ODSpak  F-511／４．６mm×２５０mm（Shodex）
溶離液；              アセトニトリル／水＝２／８＋０．１％トリフルオロ酢酸、１ml／分
検出；                SPD-6AV  UV-VIS  Spectrophotometer（島津製作所）、                        ２５６nm
カラム温度；          ２５℃
インジェクション；    Autosampler  Model123（SIC）
２０マイクロリター・サンプルループ付
記録；                クロマトコーダー１２（SIC）
この反応では、反応開始初期の３〜７時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２％になった時点で、α−クロロアクリル酸の濃度が約０．２％になるよう、α−クロロアクリル酸を追加添加した。この作業を実質的にα−クロロアクリル酸の消費が停止するまで繰り返した。反応が実質的に停止した３２時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約１．０〜１．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９７％であった。この蓄積したα−クロロプロピオン酸の光学活性を、実施例４の方法に従って分析した結果、Ｓ体であり、その光学純度は９９％以上であった。
【００７６】
実施例１２
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−６
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁し、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。
【００７７】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２％になった時点で、α−クロロアクリル酸の濃度が０．２％になるよう、α−クロロアクリル酸を追加添加した。この作業を実質的にα−クロロアクリル酸の消費が停止するまで繰り返した。反応が実質的に停止した２８時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約０．８〜１．０％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９８％であった。
【００７８】
実施例１３
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−７
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁した。この菌体懸濁液に５〜１０％のα−クロロアクリル酸溶液をペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加しながら、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。
【００７９】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２〜０．２％の間に、好ましくは０．１％前後となるよう、消費スピードに合わせてα−クロロアクリル酸溶液の添加スピードを調節した。この作業を実質的にα−クロロアクリル酸の消費が停止するまで継続した。反応が実質的に停止した２４時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約０．８〜１．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９５％であった。
【００８０】
実施例１４
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−８
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁した。この菌体懸濁液に５〜１０％のα−クロロアクリル酸溶液をペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加しながら、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。同時に、５〜１０％のグルコース溶液あるいは５〜１０％の乳酸ナトリウム溶液を、単独で、あるいはα−クロロアクリル酸との混合溶液としてペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加した。α−クロロアクリル酸とこれら被酸化物質との割合は１：１〜２０：１の範囲になるように調整した。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。またグルコースを添加した場合はグルコース・アナライザーを用いて、乳酸を添加した場合は乳酸脱水素酵素を用いて濃度を定量した。反応系のｐＨは２０％アンモニア水および２ＮＨＣｌを用いて６．５〜７．３に調整した。
【００８１】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。被酸化物質は反応開始直後から速やかに消費された。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２〜０．２％の間に、好ましくは０．１％前後となるよう、消費スピードに合わせてα−クロロアクリル酸溶液の添加スピードを調節し、同時に被酸化物質濃度が０．４％を越えない範囲で添加量を調節した。この作業を約６０時間まで継続した。本還元反応は被酸化物質の共存により顕著に持続され、約６０時間後も一定速度で進行した。６０時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約２．８〜３．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９９％以上であった。
【００８２】
実施例１５
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−９
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁した。この菌体懸濁液に１０％のα−クロロアクリル酸と１０％のグルコースの混合水溶液をペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加しながら、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。グルコース濃度は遠心して得た反応上清を原液のままグルコースアナライザーに供して定量した。反応系のｐＨは２０％アンモニア水および２ＮＨＣｌを用いて６．５〜７．３に調整した。この反応では、反応開始初期の６〜１２時間のラグタイムの後、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。グルコースは反応開始直後特に速やかに消費されたが、還元活性が安定してからは一定の速度で消費された。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２〜０．２％の間に、好ましくは０．１％前後となるよう、同時にグルコース濃度が０．４％を超えないように留意しながら混合溶液の添加スピードを調節した。この作業を約６０時間まで継続した。本還元反応はグルコースの共存により顕著に持続され、約６０時間後も一定速度で進行した。６０時間後のα−クロロプロピオン酸に対しての変換率約９９％以上であった。
【００８３】
実施例１６
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−１０
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法の１／２のスケールで４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、グルコース０．２％、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）１ｌに懸濁し、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。反応開始後５〜１０時間のラグタイムの終点で、通気を空気から窒素ガスに換え、その後は嫌気的な環境で反応を行った。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。同時にグルコース濃度をグルコース・アナライザーで定量した。反応系のｐＨは２０％アンモニアおよび２ＮＨＣｌを用いて６．５〜７．３に調整した。
【００８４】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２％になった時点で、α−クロロアクリル酸の濃度が０．２％になるよう、またグルコースの濃度が０．１％前後になるようα−クロロアクリル酸あるいはグルコースを追加添加した。この作業を約６０時間まで継続した。本還元反応は被酸化物質の共存により顕著に持続され、約６０時間後も一定速度で進行した。またグルコースの消費は反応系を好気的環境から嫌気的環境に移した直後から激減し、総消費量は好気的環境における反応の約１／１０以下となった。６０時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約２．５〜３．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９９％以上であった。
【００８５】
【発明の効果】
本発明は、好気性細菌あるいは通性嫌気性細菌を用いるため、経済性、操作性、プロセスの安全性に優れたα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して、対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を提供する。さらには、α，β−炭素・炭素二重結合を有するプロキラルなα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して、医農薬等のキラル構築ブロックとして有用な高純度の絶対配置Ｓ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】被酸化物質を添加しない場合と添加した場合のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量の例
【図２】グルコースを添加しない場合と添加した場合のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量の比較の例
【図１】
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【図２】
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