(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡試料をレーザ切断する方法において、
ａ）対象物支持体（１０）を切断すべき試料（１２）と共に、少なくとも１つの対物レンズ（６）を有する顕微鏡（１）に取り付け、
ｂ）試料（１２）の切断すべき領域を対物レンズ（６）により検出し、
ｃ）切断ラインを前記領域の周囲に設定し、
ｄ）レーザビーム錐体が細くなるようレーザビームの直径を減少させるように絞りをかけたレーザビーム（４ｂ）を絞り（１８）によって形成し、対物レンズ（６）により形成されるレーザアパーチャ（３６）が対物レンズ（６）自体の対物レンズアパーチャ（３４）より小さくなるようにし、
ｅ）試料（１２）を設定された切断ラインに沿って切断する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
切断ラインの設定を、モニタ（２６）に表示された試料（１２）の画像において実行し、このとき試料（１２）の切断すべき領域をマウスポインタによってなぞる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カメラ（２４）が設けられており、
該カメラを介してレーザ（４）の切断過程をコントロールおよび監視する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
最適の切断に必要な絞り（１８）を表から求め、絞り（１８）をユーザにより手動で調整する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
画像評価装置を備える計算器（２２）が顕微鏡（１）と接続されており、例えばレーザ強度、レーザビームの焦点位置、および絞り（１８）のような、個々のシステムパラメータの大きさを自動的に最適値に調整する、請求項３記載の方法。
【請求項６】
最適の切断に必要な絞り（１８）を計算器（２２）によって、記憶されたテーブルから求め、絞りの調整を自動的に計算器（２２）によってモータ（２０）を介して行う、請求項５記載の方法。
【請求項７】
顕微鏡試料をレーザ切断するための装置であって、
当該装置は、
ａ）切断すべき試料（１２）を観察するための少なくとも１つの対物レンズ（６）を備える顕微鏡（１）を有し、対物レンズ（６）は光軸（１４）および対物レンズアパーチャを規定し、
ｂ）レーザビーム（４ａ）を形成するレーザ（４）を有し、
ｃ）さらにレーザビーム（４ａ）を対物レンズ（６）に入力結合する少なくとも１つの光学系（１６）を有する形式の装置において、
レーザビーム錐体が細くなるようレーザビームの直径を減少させるように絞りをかけたレーザビーム（４ｂ）を形成する絞り（１８）が設けられており、
対物レンズ（６）により形成されるレーザアパーチャ（３６）は対物レンズ（６）自体の対物レンズアパーチャ（３４）よりも小さいこと、
レーザ（４）の切断過程を監視するカメラ（２４）が設けられていること、
前記カメラ（２４）で撮像された画像の画像評価装置を備える計算器（２２）が顕微鏡（１）と接続されていること、
最適の切断に必要な絞り（１８）は前記計算器（２２）によって、記憶されたテーブルから求められ、絞り（１８）の調整は自動的に前記計算器（２２）により実行されること、
を特徴とする装置。
【請求項８】
レーザビーム（４ａ）の直径の大きさは可変絞り（１８）を介して変更可能である、請求項７記載の装置。
【請求項９】
試料（１２）を照明する照明システム（３）が設けられている、請求項７記載の装置。
【請求項１０】
該照明システム（３）は試料（１２）を透過照明する、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
光学系（１６）は少なくとも１つの二色分光器からなる、請求項７記載の装置。
【請求項１２】
前記計算器（２２）を介してシステムパラメータの大きさが調整される、請求項７記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡試料のレーザ切断方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、顕微鏡試料のレーザ切断装置に関し、ここでこの装置は切断すべき試料を観察するための少なくとも１つの対物レンズと、レーザビームを形成するレーザと、レーザを対物レンズに入力結合する、少なくとも１つの光学系とを有し、前記対物レンズは光軸と対物レンズアパーチャを定める。
【０００３】
【従来の技術】
例えばガンなどの病気は長い間、組織試料を生体組織検査し、不自然な細胞を識別することにより同定されている。被検細胞は手動または機械的に顕微解剖することにより、または他の面倒な方法によって分離される。
【０００４】
ドイツ公開公報ＤＥ１９６１６２１６．５にはこのような方法、いわゆるレーザ圧カタパルト法（Laser Pressure Catapulting（ＬＰＣ）法）が記載されている。ここでは透明の対象物支持体上に載置された試料からレーザによって試料部分(片)が切断され、取り出される。切断された試料部分を全体試料から取り出すことは、この方法では、導入されたレーザプロセスにより行われる。この目的のために、その内側表面に接着剤の塗布された捕獲（つかみ取り）装置が支持アームによって、切断された試料部分上へ案内される。続いてこの試料部分は、適切な出力の平面状のレーザ照射に曝される。このレーザ照射により、切断された試料部分は全体試料から上方へ投げ出（放出）される。このようにして取り出された試料部分は、接着剤の塗布された捕獲装置の内側表面により捕獲され、さらに実行される検査部へ供給することができる。試料部分を投げ出すために使用されるレーザパルスは組織を損傷することもある。さらに切断プロセスのため、切断ラインから切り取られた試料粒子が被検すべき試料領域に堆積することがある。この問題はとりわけ倒立顕微鏡を使用した場合に発生する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
実際に公知のシステムでは、レーザの切断品質がレーザ強度の変化およびフォーカス位置によって調整される。レーザ光束の使用されるアパーチャは、この公知のシステムでは対物レンズアパーチャによって決められ、この対物レンズアパーチャは最大画像品質のためにはできるだけ大きくなければならない。すでに上に述べたように、切断品質を一定に保つことは従来の装置ないし方法では非常に困難である。切断の品質は一方ではプレパラートのフォーカス位置とプレパラートの厚さに依存し、他方ではレーザ強度に依存する。これらをユーザによって変化させ、切断品質を最適にしなければならない。
【０００６】
従来技術から出発して本発明の第１の課題は、顕微鏡試料のレーザ切断装置を改善し、近似的に一定の切断品質が広い試料スペクトルに対して保証されるように構成することである。
【０００７】
本発明のさらなる（第２の）課題は、顕微鏡プレパラートのレーザ切断方法を提供することであり、この方法によって広い試料スペクトルに対して近似的に一定に留まる切断品質を可能にすることである。
【０００８】
【課題の解決手段】
第１の課題を解決するために、本発明の第１の視点により、顕微鏡試料をレーザ切断するための装置であって、
ａ）切断すべき試料を観察するための少なくとも１つの対物レンズを備える顕微鏡を有し、対物レンズは光軸および対物レンズアパーチャを規定し、
ｂ）レーザビームを形成するレーザを有し、
ｃ）さらにレーザビームを対物レンズに入力結合する少なくとも１つの光学系を有する形式の装置を提供する。この装置において、
レーザ光錐体が細くなるようレーザビームの直径を減少させるように絞りをかけたレーザビームを形成する絞りが設けられており、
対物レンズにより形成されるレーザアパーチャは対物レンズ自体の対物レンズアパーチャよりも小さいことを特徴とする（形態１・第１基本構成）。
（形態２）  上記の装置において、レーザビームの直径の大きさは可変絞りを介して変更可能であることが好ましい。
（形態３）  上記の装置において、試料を照明する照明システムが設けられていることが好ましい。
（形態４）  上記の装置において、該照明システムは試料を透過照明することが好ましい。
（形態５）  上記の装置において、光学系は少なくとも１つの二色分光器からなることが好ましい。
（形態６）  上記の装置において、レーザの切断過程をコントロールおよび監視するカメラが設けられていることが好ましい。
（形態７）  上記の装置において、最適の切断に必要な絞りは表から求められ、絞りはユーザにより手動で調整されることが好ましい。
（形態８）  上記の装置において、画像評価装置を備える計算器が顕微鏡と接続されており、
例えばレーザ強度、レーザビームの焦点位置、および絞りのような、個々のシステムパラメータの大きさが調整されることが好ましい。
（形態９）  上記の装置において、最適の切断に必要な絞りは計算器によって、記憶されたテーブルから求められ、絞りの調整は自動的に計算器により実行されることが好ましい。
【０００９】
第２の課題を解決するために、本発明の第２の視点により、顕微鏡試料をレーザ切断する方法を提供する。この方法は、次のステップ：
ａ）切断すべき試料を備える対象物支持体を、少なくとも１つの対物レンズを含む顕微鏡に取り付けるステップ；
ｂ）試料の切断すべき領域を対物レンズにより検出するステップ；
ｃ）前記領域の周囲に切断ラインを設定するステップ；
ｄ）レーザ光錐体が細くなるようレーザビームの直径を減少させるよう絞りをかけたレーザビームを絞りによって形成し、対物レンズにより形成されるレーザアパーチャが対物レンズの対物レンズアパーチャ自体より小さくなるようにするステップ；
ｅ）試料を設定した切断ラインに沿って切断するステップ
を含むことを特徴とする（形態１０・第２基本構成）。
（形態１１）  上記の方法において、切断ラインの設定を、モニタに表示された試料の画像において実行し、このとき試料の切断すべき領域をマウスポインタによってなぞることが好ましい。
（形態１２）  上記の方法において、カメラが設けられており、
該カメラを介してレーザの切断過程をコントロールおよび監視することが好ましい。
（形態１３）  上記の方法において、最適の切断に必要な絞りを表から求め、絞りをユーザにより手動で調整することが好ましい。
（形態１４）  上記の方法において、画像評価装置を備える計算器が顕微鏡と接続されており、例えばレーザ強度、レーザビームの焦点位置、および絞りのような、個々のシステムパラメータの大きさを自動的に最適値に調整することが好ましい。
（形態１５）  上記の方法において、最適の切断に必要な絞りを計算器によって、記憶されたテーブルから求め、絞りの調整を自動的に計算器によってモータを介して行うことが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の利点は、レーザアパーチャを減少することによりレーザ光錐体が細くなることである。このことは、被写界深度の拡大につながる。レーザ光の被写界深度が比較的に大きくなることにより、焦点精度に対する要求が低下し、従って同形の細い切断チャネルが得られる。
【００１１】
本発明の装置の構成での利点は、切断過程時に対物レンズアパーチャの大きさが維持されることである。このことによりいつでも、試料を完全な対物レンズアパーチャにより観察することができる。従って試料面の最適の設定と、試料判定のための最大画像品質が保証される。ディテールの豊富な結像を得るため、および試料の領域を所期のように選択するためには、対物レンズアパーチャは約０．８までが必要である。このことはもちろん被写界深度の減少につながり、従って所期のように試料の種々異なる面に固定することができる。しかしレーザビームによる切断に対しては、被写界深度の減少は望ましいことではない。本発明は、比較的大きな対物レンズアパーチャを絞りをかけたレーザビームと調和させ、対物レンズにより形成されるレーザアパーチャを対物レンズ自体のアパーチャよりも小さくする。対物レンズは、開口部の大きさが変化しなければ、観察と試料の切断に同時に使用することができる。
【００１２】
実際の実施形態によれば、光学系は二色分光器を有しており、この二色分光器はレーザ光を反射し、対物レンズに入力結合する。そしてこの二色分光器は同時に観察ビーム路の光を接眼レンズまたはカメラへと通過させる。
【００１３】
レーザ光をとりわけ切断品質に関してコントロールできるようにするため、本発明より、レーザ切断を時間的に同時に画像形成システム、例えばカメラを介してコントロール可能とすることが提案される。画像評価の際に、試料（プレパラート）がレーザ照射の際に完全に分離されなかったか、または切断幾何形状が不十分であることが検出されると、レーザ切断をこのように時間的に同時にコントロールすることの応答として、個々のシステムパラメータ、例えばレーザ強度および／またはレーザビームの焦点位置および／またはレーザビーム中の絞りの大きさを、計算器を介して調整することができる。この時間的に同時のコントロールによって全体切断時間が、品質を改善しながら短縮される。
【００１４】
本発明のさらなる特徴および利点は、所属図面の以下の説明から明らかとなる。図面には、顕微鏡試料をレーザ切断するための本発明の実施例の装置が例として概略的に示されている。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は専ら発明の理解を助けるためのものであり、本発明を図示の態様に限定することは意図していない。
【００１５】
【実施例】
図１に示された顕微鏡試料をレーザ切断するための装置は顕微鏡１を有し、顕微鏡には対象物支持体１０を収容するための作業台２が設けられている。探査すべきないし切断すべき試料１２は対象物支持体１０上に取り付けられている。さらに照明システム２並びにレーザ４が設けられており、レーザは試料１２を切断するのに使用されるレーザビーム４ａを形成する。
【００１６】
図示の顕微鏡１は、照明システム３が作業台２と試料１２の下方の顕微鏡架台５に配置された顕微鏡である。顕微鏡１の対物レンズ６は作業台２と試料１２の上方に配置されている。対物レンズ６は光軸１４を規定し、この光軸には同様に照明システム３も配置されている。しかしレーザ切断はもちろん、倒立顕微鏡によっても実行することができる。倒立顕微鏡では、照明システム３が作業台２の上方に配置され、少なくとも１つの対物レンズ６は作業台２の下方に配置される。
【００１７】
図１に開示された実施例では、照明システム３から放射された光がコンデンサレンズ７を介して下方から、作業台２に配置された対象物支持体１０および試料１２に向けられる。試料１２を通過した光は顕微鏡１の対物レンズ６に達する。顕微鏡１内で光は、図示しないレンズおよびミラーを介して顕微鏡１の少なくとも１つの接眼レンズ８に案内され、この接眼レンズを通して操作者は作業台２に配置された試料を観察することができる。
【００１８】
顕微鏡１の架台５には、光学系１６が対物レンズ６の光軸内に設けられている。光学系１６は例えば二色分光器とすることができる。さらに光学系１６が複数の光学的構成部材からなることも考えられる。これはレーザ４が複数の個所（角）で偏向しなければならない場合である。さらにレーザビーム４ａには絞り１８が設けられており、この絞りによりレーザビームの直径を相応のようにして制限することができる。絞り１８は例えば固定絞りとして構成することができる。この場合、複数の固定絞りが相応の仕方で例えばリボルバーディスクに配置されており、所要の絞り１８をビーム路に挿入することができる。この方法は操作者により手動で、または電動的に実行することができる。図１に示された実施形態で絞り１８は可変絞り、例えばアイリス絞りとして構成されており、その口径はモータ２０を介して制御される。モータ２０は計算器２２から、所要の絞り口径を調整するために必要な制御信号を受け取る。
【００１９】
顕微鏡１にはさらにカメラ２４が設けられており、このカメラは切断すべき試料１２の画像を撮像（記録）する。この画像はモニタ２６に表示することができ、モニタは計算器２２と接続されている。計算器２２，カメラ２４およびモニタ２６からなるシステムは、レーザ４による切断過程を観察し、監視するために使用することができる。さらにモニタ２６上では試料１２の切断すべき領域をマウスポインタによってなぞることができる。このようにして標識付けられた切断ラインに沿ってレーザ４による切断過程が実行される。
【００２０】
図２は、切断すべき試料１２の領域におけるビーム路を示す。レーザ４から到来するレーザビーム４ａは、絞り１８によってその直径が制限（規定）される。絞り１８を通過すると絞られたレーザビーム４ａは対応して比較的小さな直径を以て出射する。レーザビーム４ｂは、二色分光器として構成された光学系１６に当たり、これにより対物レンズ６を通って切断すべき試料１２に向けられる。対物レンズは図２では概略的に１つのレンズによって示されている。対象物支持体１０に取り付けられた試料１２はコンデンサレンズ７を介して照明される。対物レンズ６は結像ビーム路６ａを形成し、この結像ビーム路は絞り１８を通過した後のレーザビーム４ｂよりも大きな幅を有している。
【００２１】
図３は、絞られたレーザビーム４ｂの利点を明瞭にする図であり、レーザビーム４ｂは結像ビーム路６ａないしは絞りをかけられていないレーザビームよりも細い。結像ビーム路は対物レンズ開口部３２全体を満たしており、この対物レンズ開口部によって最大可能なビーム横断面が設定される。試料１２は厚さ３０を有しており、この厚さは使用される対物レンズ６の被写界深度よりも大きいことがある。ユーザは試料１２の種々異なるレベル（面）にフォーカスし、さらなる探査のために関連個所を見出すことができる。
【００２２】
試料１２が絞りをかけられていないレーザビームにより切断される場合、その横断面は対物レンズ６の対物レンズ開口部３２に相応し、対物レンズ６により最大レーザアパーチャが形成される。この最大レーザアパーチャは対象物アパーチャ３４に等しい。形成された最大レーザアパーチャにより、試料１２には幅３４ａの最大切断チャネル３４ｂが形成される。
【００２３】
しかし試料１２が本発明により絞られたレーザビーム４ｂによって切断される場合、対物レンズ６によって低減されたレーザアパーチャ３６が形成され、このレーザアパーチャ３６は試料１２に、幅３６ａの低減された切断チャネル（溝）を形成する。切断に使用されるレーザビームの直径が小さければ、それだけ切断過程をより精密に実行することができる。
【００２４】
絞り１８を、レーザビーム横断面の制限のため光学系１６の前方かつ観察ビーム路外に配置することによって、試料１２を観察するための対物レンズ６の被写界深度が切断過程中、調整されたレーザアパーチャに依存しないで一定に留まることが保証される。このことにより画像品質は切断過程時でも一定に留まる。
【００２５】
切断品質をさらに最適化するためには、レーザビーム４ａを制限する絞り１８を切断すべき試料１２の厚さ３０に適合することが必要である。第１の手段は、最適の切断に必要な絞り１８を（図示しない）表（テーブル）から求め、絞りはユーザにより手動で調整することである。
【００２６】
さらなる実施例では、最適の切断に必要な絞り１８を計算器２２により、記憶されたテーブル（図示せず）から求めることができる。この場合、絞り１８の調整は自動的に計算器２２によって行われる。このために計算器２２から相応の信号がモータ２０に送出され、モータは絞り１８の調整を実行する。
【００２７】
最適の切断のためにさらなる手段は、画像評価システム（図示せず）を有する計算器２２を顕微鏡１に接続し、個々のシステムパラメータ、例えばレーザ強度、レーザビームの焦点位置および絞り１８の大きさを自動的に最適値に調整することである。調整は自動的に、切断過程中でも変更することができ、これにより試料１２の厚さが変化することを考慮できる。
【００２８】
本発明を実施例に基づいて説明した。しかし当業者であれば、請求項の保護範囲を逸脱することなしに変更および改善を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  顕微鏡試料をレーザ切断するための装置の概略的側面図。
【図２】  切断すべき試料の領域中のビーム路。
【図３】  レーザビームのアパーチャに依存する切断幅の概略図。
【符号の説明】
１  顕微鏡
２  作業台
３  照明システム
４  レーザ
４ａ  レーザビーム
４ｂ  絞りをかけたレーザビーム
５  顕微鏡架台
６  対物レンズ
６ａ  結像ビーム路
７  コンデンサレンズ
８  接眼レンズ
１０  対象物支持体
１２  試料
１４  光軸
１６  光学系
１８  絞り
２０  モータ
２２  計算器
２４  カメラ
２６  モニタ
３０  試料の厚さ
３２  対物レンズ開口部
３４  対物レンズアパーチャ
３４ａ  最大切断チャネルの幅
３４ｂ  最大切断チャネル
３６  レーザアパーチャ
３６ａ  低減された切断チャネルの幅
３６ｂ  低減された切断チャネル
【図１】
0004236844.tif 000002
【図２】
0004236844.tif 000003
【図３】
0004236844.tif 000004