(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のＤＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなるＤＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法。
【請求項２】
（１）導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するＰＮＡ断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のＰＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなるＰＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法。
【請求項３】
導電性基板の表面がポリ陽イオンまたは反応性基を有するシランカップリング剤で被覆されており、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片が末端に反応性基を有し、ポリ陽イオンの陽イオンまたはシランカップリング剤の反応性基とＤＮＡ断片の末端の反応性基とが共有結合を形成することにより、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片を導電性基板の表面に固定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行うことを特徴とする請求項１もしくは２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二種類以上の互いに異なる試料に発現している遺伝子のその発現量を検出するために有用なデファレンシャル・ハイブリダイゼーション（differential hybridization）技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や組織における遺伝子発現態様の解析は、種々の状態の細胞や組織からｍＲＮＡを調製し、調製したｍＲＮＡをメンブレン上に固定し、ｍＲＮＡの特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット解析法もしくはドットブロット解析法、または各遺伝子に特異的なプライマ（ＰＣＲ法において、ＤＮＡ合成酵素がＤＮＡの複製開始に必要とする２０塩基程度の短いＤＮＡ断片）を用いるＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写反応とＰＣＲ法を組み合わせた方法）によって行われてきた。一方、生命現象に関わる遺伝子研究の進展により解析に供する遺伝子数が急速に増加し、さらにゲノムプロジェクトの進行に伴って各生物が保持する全遺伝子が明らかになるにつれて、多数の遺伝子の挙動を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイ法は、ゲノム構造が解析された後に必須となるゲノム機能の大量で迅速な解析を可能にする手段として注目されている。この方法では、スライドガラス等の担体上に高密度に整列化しているＤＮＡ断片に対して、標識した核酸断片をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの解析は、その標識方法によって異なるが、蛍光法、ラジオアイソトープ法、電気化学的な方法等によるのが一般的である。電気化学的な方法として、特開平９−２８８０８０号公報に、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ断片が担体上に高密度に整列化してなるもの）および電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いて、試料ＤＮＡ断片を検出する方法が開示されている。
【０００４】
米国特許第５８００９９２号には、二蛍光標識法を用いる遺伝子発現解析の技術が開示されている。この原理は、互いに異なる二つの試料中の特定遺伝子（ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡを転写したｃＤＮＡ）を互いに異なる蛍光物質で標識し、その標識遺伝子を用いてＤＮＡマイクロアレイ上で競合的にハイブリダイゼーションを行い、両者の蛍光を測定し比較することによって、互いに異なる二つの試料中の遺伝子の発現の差を検出するものである。この技術は、同一スポット上で競合するハイブリダイズに係るシグナルを検出するので、相対的比較ができる点で極めて有効である。二蛍光標識法を用いる遺伝子発現解析の技術は、その他多数の文献（P.Brown et al., Nature Genetics Supplement, 21, 1999, 33-37、細胞工学  Vol.18, No.4, 1999, 541-549、および実験医学  Vol.17, No.11, 1999, 1362-1366）にも報告があるが、これらは、何れも蛍光法を用いるものである。しかし、蛍光法では、励起光による褪色が起こりやすいという問題点を有する。この問題点を克服するべく、現在では、蛍光法でこれまで一般的に使用されてきたフルオロセインに代えて、褪色が起こりにくいＣｙ色素が使用されている。しかし、Ｃｙ色素は極めて高価であるという問題点を有し、今後、価格を含めた機器の改善と方法の改良が必要である。
【０００５】
二蛍光標識法ではないが、ＤＮＡマイクロアレイ法の応用例として、ＤＮＡのように負電荷を持たず、かつＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）を模倣した分子であるＰＮＡ（peptide nucleic acid）を用いる方法が知られている。
【０００６】
ＰＮＡは、いわゆるアンチセンス分子の一つとして知られているものである。アンチセンス分子は、遺伝子が発現する際に、一本鎖になるＤＮＡの塩基配列の転写領域もしくはＲＮＡの塩基配列の翻訳領域に高選択的に結合して、その領域の機能を制限するように働く分子であり、遺伝子治療の分野ではアンチセンス医薬品として知られている。ＰＮＡは、核酸と同様にその分子中に核酸塩基を有し、相補的な塩基配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズして二本鎖を形成する（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。ＰＮＡは、機能的には核酸とほとんど変わりないが、その構造は全く異なり、Ｎ−(２−アミノエチル）グリシンを単位とするポリアミドを基本骨格としており、その分子中に糖およびリン酸を含まない。核酸塩基は、ポリアミド骨格に、通常、メチレンカルボニル基を介して結合している。下記に、ＰＮＡの代表的な構造をＤＮＡの構造と共に示す。
【０００７】
【化１】
0004272800.tif 000002
【０００８】
ＰＮＡは、電気的には中性であり、塩の存在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有する機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡと核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのため、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬への応用が期待されている分子である（特表平６−５０９０６３号の明細書）。
【０００９】
特開平１１−３３２５９５号公報には、固相担体表面にＰＮＡ断片をその一端部にて固定してなるＰＮＡマイクロアレイ、およびＰＮＡマイクロアレイを用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰＮＡマイクロアレイは、アビジン−ビオチン法によって、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定チップにＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴シグナルを測定することによって行なわれている。また、ＰＮＡマイクロアレイ、およびラジオアイソトープで標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトープ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上させることができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、互いに異なる二種類以上の試料中にそれぞれ存在する試料核酸断片の量を、ＤＮＡ分析素子を用いて電気化学的に検出する方法を提供することを、その課題とする。本発明は、また、ＤＮＡ分析素子の代わりに、ＰＮＡ分析素子を用いて該試料核酸断片の存在量を電気化学的に検出する方法を提供することをも、その課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
〈ＤＮＡ分析素子を用いる方法〉
本発明は、（１）導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のＤＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなるＤＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法にある。
【００１２】
本発明の、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法の好ましい特徴は以下の通りである。
（イ）導電性基板の表面がポリ陽イオンまたは反応性基を有するシランカップリング剤で被覆されており、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片が末端に反応性基を有し、ポリ陽イオンの陽イオンまたはシランカップリング剤の反応性基とＤＮＡ断片の末端の反応性基とが共有結合を形成することにより、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片を導電性基板の表面に固定する。
（ロ）電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【００１３】
〈ＰＮＡ分析素子を用いる方法〉
本発明は、また、（１）導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するＰＮＡ断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のＰＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなるＰＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法にもある。
【００１４】
本発明の、ＰＮＡ分析素子を用いる検出方法の好ましい特徴では、電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【００１５】
【発明の実施の形態】
図１に、本発明の代表的な検出方法を模式的に示す。互いに異なる試料ａ（１ａ）および試料ｂ（１ｂ）に存在している試料核酸断片（２）を、それぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質（３ａ）、導電性物質（３ｂ）で標識する。そして、導電性物質（３ａ）が結合した試料核酸断片（４ａ）を含む標識試料溶液と導電性物質（３ｂ）が結合した試料核酸断片（４ｂ）を含む標識試料溶液とを混合し、その混合試料溶液をＤＮＡ分析素子（５）上の一つの領域（６）に接触させることにより、ＤＮＡ分析素子上に固定されているＤＮＡ断片（７）と標識試料核酸断片（４ａ）とのハイブリッドＤＮＡ、および該ＤＮＡ断片と標識試料核酸断片（４ｂ）とのハイブリッドＤＮＡを形成させる。
ここで、「ＤＮＡ分析素子」は、導電性基板の表面に多数のＤＮＡ断片がその一端部にて固定されてなる素子を表す。ＤＮＡマイクロアレイが、一般的に、複数のＤＮＡ断片が固定された領域が複数個整列したものを意味するのと異なり、本明細書におけるＤＮＡ分析素子では、図１に示すように該領域の数が複数であっても、あるいは一つであってもよい。
次いで、領域（８）における、導電性物質（３ａ）と導電性基板との間を流れる電流量、および導電性物質（４ａ）と導電性基板との間を流れる電流量を、それぞれ、導電性物質（３ａ）が有する酸化還元電位、導電性物質（４ａ）が有する酸化還元電位にて測定することにより、領域（８）における標識試料核酸断片（４ａ）の存在量と標識試料核酸断片（４ｂ）の存在量との比を検出することができる。領域（８）における存在量比は、試料ａ中の標識前の試料核酸断片の存在量と試料ｂ中の標識前の試料核酸断片の存在量との比を示す。尚、導電性物質（３ａ）が有する酸化還元電位とは、導電性物質（３ａ）で標識された試料核酸断片（４ａ）が示す、極大電流値を与える酸化還元電位の値をいう。
【００１６】
本発明の検出方法では、ＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片と完全な相補性を有する試料核酸断片であって、同一の塩基配列を有する試料核酸断片を対象とする。試料ａおよび試料ｂには、何れも、複数の種類の試料核酸断片が存在していてもよいが、複数の種類の試料核酸断片の内で、特定のＤＮＡ断片と完全相補する試料核酸断片は一種類しか存在しないものとし、その試料核酸断片の塩基配列は完全に同一であることとする。互いに異なる試料は、三種類以上の試料であってもよいが、各試料に存在している試料核酸断片の性質は、上記と同様である。
【００１７】
以下、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法を中心に説明するが、特に断らない限りＰＮＡ分析素子を用いる場合についても同様とする。本明細書において用いる用語を次のように定義する。
「ＰＮＡ断片」には、合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片化したものを含まない。
「ハイブリッドＤＮＡ」とは、ＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と標識試料核酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰＮＡ」とは、ＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片と標識試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「導電性基」とは、一つ以上の結合手を有する導電性物質をいう。試料核酸断片に結合している状態の導電性物質を導電性基とする。
「存在」とは、試料中に試料核酸断片が含まれている状態をいい、遺伝子の発現を含む。
【００１８】
［導電性基板］
導電性基板としては、疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてなる基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板および電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。
電気絶縁性の担体の材質としては、何れも、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
疎水性の導電性基板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく用いることができるが、電極を用いることが特に好ましい。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることがが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
【００１９】
導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてなる基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体の凹凸を軽減することができる。また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体も好ましく用いることができる。
【００２０】
電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置されたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載の、核酸断片が未固定のシリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線導電性基板のように、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであってもよい。
【００２１】
［ＤＮＡ断片］
ＤＮＡ断片としては、導電性基板表面に二本鎖のＤＮＡ断片を固定した後、一方の鎖のみを固定させる処理を施したもの、あるいは固定前に二本鎖のＤＮＡ断片を一本鎖のＤＮＡ断片としたものであることが好ましい。また、ＤＮＡ断片としては、合成オリゴヌクレオチドあるいは導電性基板表面で直接合成して得られたオリゴヌクレオチドであることも好ましい。
【００２２】
二本鎖のＤＮＡ断片を固定させるためには、一般的に、導電性基板表面に該ＤＮＡ断片の固定のための反応性基（反応性基Ｄ1とする。）を導入することが好ましい。反応性基Ｄ1は、導電性基板表面をポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイミンもしくはポリアルキルアミンであることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることが特に好ましい）で被覆処理することによって導入されたものであっても、または反応性基Ｄ1を有するシランカップリング剤を導電性基板表面に接触させることによって導入されたものであることが好ましい。反応性基Ｄ1としては、アミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基もしくは水酸基であることが特に好ましい。アミノ基を有するシランカップリング剤としては、具体的には、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシシランを挙げることができ、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【００２３】
二本鎖のＤＮＡ断片は、ｍＲＮＡに対してＲＴ（reverse transcription）法によって得たｃＤＮＡ断片をベクターに組み込んだもの（ｃＤＮＡのライブラリ）をテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製することが好ましい。
一本鎖のｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅して得られる二本鎖のｃＤＮＡ断片は、一方の鎖がその末端部に反応性基（反応性基Ｄ2とする。）を持ち、かつ他方の鎖が反応性基を持たないものであり、これは、二種類のプライマ（反応性基Ｄ2を５’末端に有するプライマと反応性基を有しないプライマ）を用いて調製することができる。このような反応性基Ｄ2としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。
【００２４】
固定は、ＰＣＲ法によって得られた二本鎖のｃＤＮＡ断片の一方の鎖の末端部（好ましくは、５’末端）に有する反応性基Ｄ2と導電性基板表面に導入された反応性基Ｄ1との共有結合によって行うことが好ましい。反応性基Ｄ1と反応性基Ｄ2との共有結合は、スペーサを介して行ってもよい。ｃＤＮＡ断片の塩基数は、３乃至１０００００の範囲にあることが好ましく、３乃至１００００の範囲にあることがより好ましく、５０乃至１０００の範囲にあることが特に好ましい。導電性基板表面に固定した二本鎖のｃＤＮＡ断片を解離させる変性処理の方法としては、公知の方法を用いることができる。変性処理によって、反応性基Ｄ2を有する鎖が固定される。
また、特願平９−２８８０８０号公報に記載の、導電性基板として、金で蒸着処理されているものやグラシーカーボンが塗布されているものを用いる固定方法も好ましい。
【００２５】
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。ＤＮＡ分析素子が複数の領域を有するものである場合には、導電性基板表面に区画された複数の領域のそれぞれに、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定させることもできるが、その場合、ＤＮＡ断片としては、複数の種類のものを用いることができる。
【００２６】
ＤＮＡ断片の固定は、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散されてなる水性液を導電性基板上に点着して行うことが好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片が固定される。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うこともできる。点着後は、インキュベーションを行ってもよい。インキュベート後、未固定のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。上記のようにして作製したＤＮＡ分析素子の寿命は、通常、数日間乃至数週間の範囲にある。
【００２７】
［ＰＮＡ断片］
本発明で好ましく用いられるＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００２８】
【化２】
0004272800.tif 000003
【００２９】
式中、Ｂ11は、リガンドであって、天然の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩基類似体を表す。Ｂ11は、天然に見出される位置、即ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリンについては、９位において、チミン、ウラシルもしくはシトシンを含むピリミジンについては、１位において結合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が導入された化合物）をいう。また、Ｂ11は、核酸塩基を含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノイル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。
典型的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片への結合親和性を増加させることが知られている（特開平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５）。
さらに、Ｂ11は、ＤＮＡインターカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あるいは放射性標識であってもよい。
Ｂ11は、核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に好ましい。
【００３０】
Ｒ11は、水素原子、もしくは天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ13Ｒ14基、−ＳＨ基、および炭素原子数が１乃至６のアルキル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていてもよい。Ｒ13およびＲ14は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキルチオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしくは水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基は、Ｒ11が結合している炭素原子の水素原子と一緒になって脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【００３１】
Ｌ11は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＲ12−基であることが好ましく、−ＣＯ−基であることが特に好ましい。Ｒ12は、水素原子、炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のアルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい。
【００３２】
ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよびｃは、何れも１であることが好ましい。
【００３３】
本発明で用いるＰＮＡ断片は、下記一般式(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式中、Ｂ11およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ11、ｄを表す。
【００３４】
【化３】
0004272800.tif 000004
【００３５】
ＰＮＡは、ペプチドと同様に液相法や固相法によって合成することができ、合成されたものは市販もされている。ＰＮＡの合成法については、特表平６−５０９０６３号の明細書、米国特許２７５８９８８号の明細書、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1987(1992)、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 9677-9678(1992)などに詳細が記載されている。
【００３６】
［ハイブリダイゼーション］
ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ分析素子に、互いに異なる二種類以上の、標識試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる標識試料溶液を接触させることによって実施する。互いに異なる二種類以上の標識試料溶液は、混合したものを接触させる。混合の割合は、特にその割合を問わないが、通常等量である。
ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後は、洗浄を行い、未反応の標識試料核酸断片を除去することが好ましい。
【００３７】
［標識試料核酸断片］
試料核酸断片としては、生物試料に存在しているｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡを逆転写反応させることによって得られるｃＤＮＡ断片を用いることが好ましい。標識試料核酸断片は、試料核酸断片の一方の末端部（もしくは末端部付近）に導電性物質を結合させることによって調製することができる。その調製方法については、文献（S.Takenaka et al., Analytical Biochemistry, 218, 436-443(1994)）に詳細が記載されている。標識試料核酸断片は、試料核酸断片に、導電性基を結合させたｄＮＴＰを逆転写反応により取り込ませることによって調製することもできる。さらに、試料核酸断片に、アミノアリル基を結合させたｄＮＴＰを逆転写反応により取り込ませて、複数のアミノ基を有するｃＤＮＡ断片に導き、次いで、導電性物質の活性体をこれらのアミノ基と反応させる方法によって、標識試料核酸断片を調製する方法も知られている。この方法は、導電性物質を結合させたｄＮＴＰの取り込み率が低いことに比べ、多数の導電性物質を取り込むことができる点で優れた方法である。上記前者の、導電性基を結合させたｄＮＴＰを取り込ませる方法、およびアミノアリル基を結合させたｄＮＴＰを取り込ませる方法では、何れも、互いに異なる試料核酸断片への取り込み率は同一であることが好ましい。
【００３８】
［導電性物質］
互いに異なる二種類以上の試料中に含まれる試料核酸断片は、それぞれ、互いに異なる導電性物質で標識する。互いに異なる導電性物質とは、試料核酸断片に結合していない状態で導電性物質そのものが与える極大電流値を比較したとき、極大電流値を与える酸化還元電位が互いに異なるような物質をいう。但し、互いに異なる導電性物質であって、その当量（モル）の導電性物質が与える極大電流値は同一の値を示すことが好ましい。極大電流値である必要はないが、極大電流値を与える酸化還元電位を比較することが望ましい。互いに異なる酸化還元電位は、酸化還元電位が何れも０乃至８００ｍＶの範囲にあることが好ましく、互いの酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上であることが好ましい。
【００３９】
導電性物質の具体例を以下に示す。導電性物質としては、有機金属化合物と金属原子を含まないが導電性を有する物質とを挙げることができる。結合手については省略する。
【００４０】
有機金属化合物としては、配位子から中心金属原子の電子供与に加えて、中心金属原子の軌道から配位子の原子の空軌道へ電子がπ結合を通じて供与されるタイプのπ錯体を用いることが好ましい。また、有機金属化合物としては、繰り返し単位どうしが配位結合によって結合している配位高分子も好ましく用いることができる。π錯体は、金属原子に対する配位が、単座配位、二座配位、多座配位もしくは架橋配位の何れの配位によるものであってもよい。π錯体の具体例としては、下記式に示すメタロセン錯体をあげることができる。Ｍは、金属原子を表す。
【００４１】
【化４】
0004272800.tif 000005
【００４２】
上記式で表されるメタロセン錯体の金属原子は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｔｌ、Ｔａ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｗ、Ｖ、ＲｕもしくはＯｓであることが好ましく、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｒｕ、Ｏｓ、ＶもしくはＣｒであることがさらに好ましく、Ｆｅであることが特に好ましい。
【００４３】
π錯体としては、下記式で表されるシクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナントロリン錯体、ビピリジン錯体もしくはトリフェニルホスフィン錯体も好ましく用いることができる。
【００４４】
【化５】
0004272800.tif 000006
【００４５】
【化６】
0004272800.tif 000007
【００４６】
ビピリジン錯体としては、［Ｐｄ（ｂｐｙ）2］2+、［ＣｏＣｌ2（ｂｐｙ）2］+、［Ｆｅ（ｂｐｙ）３］n、もしくは［Ｃｒ（ｂｐｙ）３］nであることが好ましい。但し、ｂｐｙは２，２’−ビピリジンを表し、ｎは、−１乃至３の整数を表わす。トリフェニルホスフィン錯体としては、ＣｏＣＨ3（ＰＰｈ3）3、ＣｏＨ（Ｎ2）（ＰＰｈ3）3、ＲｕＨ2（ＰＰｈ3）4もしくはＲｈＨ（ＰＰｈ3）4であることが好ましい。Ｐｈは、フェニル基を示す。
【００４７】
導電性物質としては、クロロクルオロヘム、クロロフィリド、クロロフィル、ヘム、ビタミンＢ12等のポルフィリン系錯体も好ましく用いることができる。
【００４８】
金属原子を含まない導電性物質としては、下記式で表されるビオロゲン、２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、カテコールアミン等を挙げることができる。但し、ＲA、ＲBは、互いに独立に、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、並びにＮ、ＯおよびＳからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１２の複素環基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。上記のアルキル基、アルコキシ基、アリール基および複素環基は、何れも炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基および炭素原子数が６乃至１０のアリール基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。ＲA、ＲBは、何れも、炭素原子数が１乃至６のアルキル基もしくは炭素原子数が６乃至１２のアリール基であることがさらに好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。
【００４９】
【化７】
0004272800.tif 000008
【００５０】
【化８】
0004272800.tif 000009
【００５１】
導電性物質は、置換基を有していてもよい。特定の構造を持つ導電性物質を主骨格とした場合、酸化還元電位の相違は、その導電性物質が有する置換基の性質に依存することが多い。従って、互いに異なる導電性物質としては、上記の導電性物質を主骨格として、その主骨格に互いに異なる性質の置換基が結合してなるものを用いることが、調製の簡便さの点からも好ましい。上記置換基は、試料核酸断片と結合する際に、結合手となる二価の基を含むものであることが特に好ましい。置換基の数が複数の場合には、その内の一つが結合手となる二価の基を含むものであることが好ましい。
【００５２】
結合手となる二価の基を含む置換基を有する導電性物質の好ましい具体例を下記式（ＩＩＩ）に示す。結合手となる二価の基とは、−Ｘ−、−Ｙ−もしくは−Ｘ−Ｙ−をいう。−Ｘ−および−Ｙ−の内何れか一方は単結合であってもよい。。−Ｘ−の左側に核酸断片が結合する。
【００５３】
【化９】
0004272800.tif 000010
【００５４】
上記式中、Ｘは、試料核酸断片との縮合反応によって形成される基を表す。Ｙは、単結合、置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基、あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基を表す。炭素原子数が１乃至６のアルキレン基としては、メチレン基もしくはエチレン基であることが好ましい。
置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアルキルアミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原子数が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至７のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０のＮ−アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカルボニル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニル基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、並びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン原子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の数が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基については、１乃至１２個であることが好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基については、その数は１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。
【００５５】
フェロセン分子は、−Ｘ−Ｙ−基の結合位置を除く他の位置がさらに置換されていてもよい。置換基としては、カルボン酸基、炭素原子数が２乃至６のジアルキルアミノ基を有する炭素原子数が８乃至１２のジアルキルアミノアルキレン基、および−ＣＯＮＨ−炭素原子数が１乃至６のアルキレン基−炭素原子数が２乃至６のジアルキルアミノ基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。置換基の数は、フェロセン一分子について１乃至９個であることが好ましく、１個であることが特に好ましい。フェロセン一分子が有する置換基の種類は複数であってもよい。
【００５６】
二つの、互いに異なる上記式（ＩＩＩ）で表される導電性物質の特に好ましい組み合わせとしては、Ｙが単結合を表す導電性基とＹがメチレン基を表す導電性基との組み合わせを挙げることができる。Ｙを変化させずに、導電性基の何れか一方のフェロセン分子に電子吸引性基あるいは電子供与性基を置換させてもよい。
【００５７】
［標識量の検出］
電流量の測定は、導電性基板と導電性物質との間を流れる電流量が測定できる方法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリックボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグラフィ、ポテンショスタット等を用いることが好ましい。カウンタ電極とハイブリッドＤＮＡが固定された導電性電極を電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成させ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定することが特に好ましい。
【００５８】
本発明の検出方法では、上述の通り、互いに異なる二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量（数）比を求めることができる。互いに異なる二種類の試料の例としては、正常細胞と異常細胞との組み合わせ、あるいは特定の菌体の野生株と変異株との組み合わせを挙げることができる。具体的には、ＤＮＡ分析素子上のＤＮＡ断片が、例えば、フィブロネクチン産生に関与する遺伝子に相補性を有する塩基配列を持つものであれば、正常細胞に発現しているフィブロネクチン産生に関与する遺伝子と胃がん由来の株細胞ＮＵＧＣ３に発現している該遺伝子とについて、それらの量比を求めることができる。また、分析素子上のＤＮＡ断片の種類を変えることによって、例えば、正常細胞と慢性骨髄性白血病由来の株細胞Ｋ５６２とにそれぞれ発現しているフィブロネクチン産生に関与する遺伝子の量比を求めることもできる。さらに、ＤＮＡ分析素子上の複数の領域のそれぞれに互いに異なる種類のＤＮＡ断片を固定しておけば、互いに異なる試料中にそれぞれ発現している複数の種類の遺伝子について、同時に、各遺伝子の発現量比の解析を行うこともできる。
【００５９】
【実施例】
［実施例１］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、Ｃ末端にメルカプトヘキシル基を導入した１００ピコモル／１μＬのチミンの２０量体を含む水溶液２μＬを滴下し、室温で１時間放置することによってＤＮＡ分析素子を作製した。
（２）標識試料ＤＮＡ断片の調製
文献（Takenaka et al., Analytical Biochemistry, 218, 436-443(1994)）に記載された方法に従って、下記式で順に表される、酸化還元電位が互いに異なる二種類のフェロセン標識オリゴヌクレオチド、Ｆ１−Ａ20およびＦ２−Ａ20を調製した。Ａはアデニンを示す。
【００６０】
【化１０】
0004272800.tif 000011
【００６１】
【化１１】
0004272800.tif 000012
【００６２】
（３）試料ＤＮＡ断片の検出
（イ）Ｆ１−Ａ20の検出
前記（１）で得たＤＮＡ分析素子の表面に、８０ピコモルのフェロセン標識オリゴヌクレオチドＦ１−Ａ20を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを滴下し、２５℃にて３０分間インキュベートした。次いで、分析素子表面を純水にて洗浄し、未反応のＦ１−Ａ20を除去した。３８℃にて、０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液に、純水で洗浄後の分析素子を浸漬し、印加電圧が１００乃至７００ｍＶの範囲にて、デファレンシャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、４６０ｍＶにおいてＦ１−Ａ20に由来する応答電流が認められ、その電流値は６．０μＡであった（図２の１）。
（ロ）Ｆ２−Ａ20の検出
Ｆ１−Ａ20の代わりにＦ２−Ａ20を用いる以外は上記（イ）と同様にしてデファレンシャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、２６０ｍＶの印加電圧においてＦ２−Ａ20に由来する応答電流が認められ、その電流値は６．０μＡであった（図２の２）。
【００６３】
［参考例］
チミンの２０量体の代わりにアデニンの２０量体を用いる以外は実施例１の（１）と同様にしてＤＮＡ分析素子を作製し、そのＤＮＡ分析素子を使用する以外は、実施例１の（３）と同様にして、Ｆ１−Ａ20およびＦ２−Ａ20についてそれぞれデファレンシャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、何れの場合にも応答電流は認められなかった。
【００６４】
［実施例２］ＤＮＡ分析素子上のＤＮＡ断片に相補的な試料ＤＮＡ断片の試料中の存在量比の確認
試料ＤＮＡ断片として、４０ピコモルのＦ１−Ａ20と４０ピコモルのＦ２−Ａ20とからなる混合物を含むトリス緩衝液を用いる以外は、実施例１と同様にして、印加電圧４６０ｍＶおよび２６０ｍＶにおける応答電流をそれぞれ測定した（図３）。また、Ｆ１−Ａ20のモル数が０、２０、６０および８０ピコモルの場合についても、それぞれ、混合物の総モル数が８０ピコモルとなるように調製した混合物を用いて、印加電圧４６０ｍＶおよび２６０ｍＶにおける応答電流を測定した（図３）。図３の−黒塗り四角−は、印加電圧４６０ｍＶにおける応答電流を、−黒塗り丸−は、印加電圧２６０ｍＶにおける応答電流をそれぞれ表す。
【００６５】
図３より、２６０ｍＶにおけるピーク電流値と４６０ｍＶにおけるピーク電流値との比は、試料に含まれるＦ２−Ａ20の濃度とＦ１−Ａ20の濃度との比に対応することが分かる。
【００６６】
［実施例３］ＰＮＡ分析素子上のＰＮＡ断片に相補的な試料ＤＮＡ断片の試料中の存在量比の確認
（１）ＰＮＡ分析素子の作製
下記式で表されるペプチド核酸：ＰＮＡ−Ｈ2Ｎ−Ｌｙｓ−Ｔ10−Ｈ（以下「ＰＮＡ−Ｔ10」という。）を、文献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1897(1992)および同114, 9677-9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔは、チミンを表し、式の左端がＰＮＡのＣ末端、右端がＰＮＡのＮ末端をそれぞれ表す。
【００６７】
【化１２】
0004272800.tif 000013
【００６８】
表面にメルカプト基を有する面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られる、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極に、１００ピコモル／１μＬのチミンの１０量体であるＰＮＡ−Ｔ10の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時間放置してＰＮＡ修飾電極を作製した。
（２）試料ＤＮＡ断片の検出
ＤＮＡ分析素子を用いる代わりに上記（１）で作製したＰＮＡ分析素子を用いる以外は実施例２と同様の操作を行って、Ｆ１−Ａ20とＦ２−Ａ20とからなる混合物の応答電流を測定した。図４の−黒塗り四角−は、印加電圧４６０ｍＶにおける応答電流を、−黒塗り丸−は、印加電圧２６０ｍＶにおける応答電流をそれぞれ表す。
【００６９】
図４より、ＰＮＡ分析素子を用いても、ＤＮＡ分析素子を用いた場合と同様な結果が認められた。また、ＤＮＡ分析素子と比べると、さらに感度よく検出できることが分かる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の検出方法は、互いに異なる二種類以上の試料中における試料核酸断片の存在量の差を検出する二蛍光標識法に対して、標識を導電性物質に変えた初めての電気化学的な方法である。本発明の検出方法は、従来の二蛍光標識法と比較して、迅速・簡便であり、感度が高く、コストが低い。また、試料核酸断片として、試料中に発現しているｍＲＮＡあるいはそのｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡを用いれば、互いに異なる試料中の、特定のタンパク質の産生に関与する遺伝子の発現の差を求めることもできる。ＤＮＡ分析素子をＰＮＡ分析素子に代えても、上記と同様な検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子の発現解析の代表的な方法を示す模式図である。
【図２】実施例１における、印加電圧と応答電流との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２にける、混合試料中のＦ１−Ａ20の割合と応答電流との関係を示すグラフである。
【図４】実施例３にける、混合試料中のＦ１−Ａ20の割合と応答電流との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１ａ  試料ａ
１ｂ  試料ｂ
２  試料ａから得られた試料核酸断片あるいは試料ｂから得られた試料核酸断片
３ａ  導電性物質ａ
３ｂ  導電性物質ｂ
４ａ  導電性物質ａが結合した試料核酸断片
４ｂ  導電性物質ｂが結合した試料核酸断片
５  ＤＮＡ分析素子
６  ＤＮＡ分析素子上の一領域
７  ＤＮＡ分析素子上の一領域に固定されている、試料核酸断片に相補性を有するＤＮＡ断片
８  ＤＮＡ分析素子上の一領域におけるハイブリッドＤＮＡ
【図１】
0004272800.tif 000014
【図２】
0004272800.tif 000015
【図３】
0004272800.tif 000016
【図４】
0004272800.tif 000017