(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４でコードされるタンパク質の少なくとも一つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、グリシントランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードする外因性核酸を含有する鳥類細胞。
【請求項２】
外因性核酸が哺乳動物のものである請求項１記載の鳥類細胞。
【請求項３】
哺乳動物がヒトまたはラットである請求項２記載の鳥類細胞。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４でコードされるタンパク質の少なくとも一つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、グリシントランスポーターとしての機能を有するタンパク質がグリシントランスポーター−１（ＧｌｙＴ−１）またはグリシントランスポーター−２（ＧｌｙＴ−２）である請求項２記載の鳥類細胞。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４でコードされるタンパク質の少なくとも一つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、グリシントランスポーターとしての機能を有するタンパク質がヒトＧｌｙＴ−１である請求項２記載の鳥類細胞。
【請求項６】
グリシン輸送のエンハンサーまたはインヒビターである作用物質を分析またはスクリーニングする方法であって、第一および第二鳥類細胞を別々に培養し、その際第一および第二鳥類細胞は同じ系統のものであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４でコードされるタンパク質の少なくとも一つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、グリシントランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードする外因性核酸を含有するものであり、第一鳥類細胞を作用物質と接触させ、第一鳥類細胞へのグリシン輸送の増強または抑制を、作用物質と接触させなかった第二鳥類細胞へのグリシン輸送と比較してスクリーニングする
諸段階を含んでなる方法。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４でコードされるタンパク質の少なくとも一つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、グリシントランスポーターとしての機能を有するタンパク質がＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２である請求項６記載の方法。
【請求項８】
外因性核酸がＧｌｙＴ−１をコードする請求項７記載の方法。
【請求項９】
外因性核酸がＧｌｙＴ−２をコードする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
第一および第二鳥類細胞がＱＴ−６細胞である請求項６記載の方法。
【請求項１１】
鳥類細胞がＱＴ−６細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
作用物質がＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２のエンハンサーまたはインヒビターであるが、両方のエンハンサーまたはインヒビターではない請求項７記載の方法。
【請求項１３】
作用物質がＧｌｙＴ−１およびＧｌｙＴ−２のエンハンサーまたはインヒビターである請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は薬剤発見分野のものであり、より詳細に述べるならば、神経系におけるグリシン仲介性神経伝達に影響を与える薬剤に関するものである。
シナプス伝達は、シナプス前およびシナプス後ニューロンにおけるかなりの特殊化構造系列に関係する細胞間コミュニケーションの複雑な形である。高親和性神経伝達物質のトランスポーターはそのような成分の一つであり、シナプス前末端に位置し、グリア細胞を取り巻いている（カナー（Ｋａｎｎｅｒ）およびシュルディナー（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ）、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、１０３２ページ、１９８７）。トランスポーターは神経伝達物質をシナプスから隔離し、それによってシナプス中の神経伝達物質の濃度並びにその持続時間を調節する。それは同時にシナプス伝達の大きさにも影響を与える。さらにトランスポーターは、伝達物質が近隣シナプスへ広がるのを阻止することによって、シナプス伝達の適合性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を維持する。最後に、放出された伝達物質をシナプス前末端に隔離することによって、トランスポーターは伝達物質の再利用を可能にする。
神経伝達物質輸送は細胞外ナトリウムおよび経膜的電圧差に依存する；例えば発作時のような強い神経線維活性興奮（ｆｉｒｉｎｇ）の状態では、トランスポーターはカルシウム非依存性、非エキソサイトーシス的やり方で逆方向にはたらくことができ、神経伝達物質を放出する（アットウェル（Ａｔｔｗｅｌｌ）ら、神経線維（Ｎｅｕｒｏｎ、１１巻、４０１−４０７ページ（１９９３））。神経伝達物質トランスポーターの薬理学的調節はこうしてシナプス活性の調節手段となり、それは神経精神障害の有用な治療法を提供する。
アミノ酸グリシンは哺乳動物神経系における重要な神経伝達物質であり、抑制−並びに興奮シナプス両方に機能する。神経系とは神経系の中枢部分も末梢部分も含める。グリシンのこのような明白な機能は２種類の受容体によって仲介され、それらの各々は異なる種類のグリシントランスポーターと結合する。グリシンの抑制作用は、けいれん性アルカロイドであるストリキニンに敏感で、そのため“ストリキニン感受性”と呼ばれているグリシン受容体によって仲介される。このような受容体は、グリシンがその受容体に結合すると開く固有の塩化物チャンネルを含んでいる。塩化物伝導性が高まることによって活動電位の興奮閾値は増加する。ストリキニン感受性グリシン受容体は主として脊髄および脳幹に見いだされ、したがってこのような受容体の活性を高める薬理的作用物質はこれらの領域における抑制的神経伝達を高める。
グリシンは、中枢神経系の主な興奮性神経伝達物質であるグルタメートの作用を調節することによって興奮性伝達に機能する。ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびアッシャー（Ａｓｃｈｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ、３２５巻、５２９−５３１ページ（１９８７）；フレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）ら、グリシン伝達（オッタソン（Ｏｔｔｅｒｓｏｎ）およびストーム−マチセン（Ｓｔｏｒｍ−Ｍａｔｈｉｓｅｎ）編、１９９０）１９３−２１９ページ、を参照されたい。特にグリシンは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体と呼ばれるグルタメート受容体クラスにおいて必須の補助的アゴニストである。ＮＭＤＡ受容体の活性化はナトリウムおよびカルシウム伝導性を高め、それはニューロンを脱分極し、それによって活動電位を興奮させやすくする。ＮＭＤＡ受容体は脳全体に広く分布し、脳皮質および海馬構成体には特に高密度にある。
分子クローニングは、哺乳動物脳に、ＧｌｙＴ−１およびＧｌｙＴ−２と呼ばれる２種類のグリシントランスポーターが存在することを明かにした。ＧｌｙＴ−１は主として前脳に見いだされ、その分布はグルタメート作動性経路およびＮＭＤＡ受容体のそれに対応する（スミスら、Ｎｅｕｒｏｎ、８巻、９２７−９３５（１９９２））。分子クローニングはさらに、ＧｌｙＴ−１の少なくとも３種類の変種、すなわちＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂおよびＧｌｙＴ−１ｃが存在することも明かにした（キム（Ｋｉｍ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４５巻、６０８−６１７ページ（１９９４））；その各々は脳および末梢組織に特異的分布を示す。これらの変種は異なるスプライシングおよびエクソン使用によって生じ、それらのＮ−末端領域が異なる。これに対して、ＧｌｙＴ−２は主として脳幹および脊髄に見いだされ、その分布はストリキニン感受性グリシン受容体のそれと密接に対応する（リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８巻、２２８０２−２２８０８ページ（１９９３）；ジャスキー（Ｊｕｒｓｋｙ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４巻、１０２６−１０３３ページ（１９９５））。これらのデータは、シナプス中グリシン濃度の調節によって、ＧｌｙＴ−１およびＧｌｙＴ−２は選択的にＮＭＤＡ受容体およびストリキニン感受性グリシン受容体それぞれの活性に影響を与える、という意見と一致する。
ＧｌｙＴ−１およびＧｌｙＴ−２の配列比較の結果、これらのグリシントランスポーターがナトリウム依存性神経伝達物質トランスポーターの比較的広いファミリー（例えばγ−アミノ−ｎ−酪酸（ＧＡＢＡ）に特異的なトランスポーターなどを含める）のメンバーであることが明かになった。ウール（Ｕｈｌ）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻、２６５−２６８ページ（１９９２）；クラーク（Ｃｌａｒｋ）およびアマラ（Ａｍａｒａ）、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、１５巻、３２３−３３２ページ（１９９３）。全体的に、これらのトランスポーターの各々は、主として疎水性アミノ酸を含む１２の推定的経膜的ドメインを含む。リプマン−ピアソン（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ）ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、ラットＧｌｙＴ−１ａまたはラットＧｌｙＴ−１ｂをラットＧｌｙＴ−２と比較すると、５１％アミノ酸配列が同一であり、５５％核酸配列が同一であることが判明した。しかしヒトＧｌｙＴ−１ｃは１６アミノ酸長さの断片であり、そのアミノ酸配列はラットＧｌｙＴ−２のそれらと１００％同一である；この領域の対応する核酸配列（それは４８ヌクレオチドの長さである）は２つのトランスポーターの間で７８−８５％が同一である。約２６０アミノ酸というさらに長い直線コースはヒトＧｌｙＴ−１ｃとラットＧｌｙＴ−２との間で５３％アミノ酸配列の同一性を示す；この領域（７８０ヌクレオチド長さ）の対応するヌクレオチド配列は２つのトランスポーターの間で約６６％の配列同一性を示す。
グリシントランスポーターを抑制または活性化する化合物は受容体機能を変化させ、種々の疾患状態に治療的効果を与えることが期待される。例えばＧｌｙＴ−２の抑制を用いて、シナプスのグリシン濃度を高めることによってストリキニン感受性グリシン受容体を有するニューロンの活性を低下させ、それによって、これらの受容体によって仲介させることが判明している脊髄におけるペイン関連（すなわち痛み刺激（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ））情報伝達を減少させる（ヤクシュ（Ｙａｋｓｈ）、ペイン、１１１−１２３ページ、１９８９）。その上、脊髄のストリキニン感受性グリシン受容体による抑制的グリシン作動性伝達を高めて筋肉過剰反応を減らすことができる。これは筋収縮増加に関係する疾患または症状、例えばけいれん、ミオクローヌスおよびてんかんなどの治療に有用である（トルオング（Ｔｒｕｏｎｇ）ら、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、３巻、７７−８７ページ（１９８８）；ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）、ＦＡＳＥＢＪ．４巻、２７６７−２７７４ページ（１９９０））。グリシン受容体の調節によって治療できるけいれんは、てんかん、卒中、頭部外傷、多発性硬化症、脊髄損傷、ジストニー、およびその他の神経の病的症状および損傷に関連するものである。
ＮＭＤＡ受容体は記憶および学習に密接に関係する（リソン（Ｒｉｓｏｎ）およびスタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．１９巻、５３３−５５２ページ（１９９５）；ダニツ（Ｄａｎｙｃｚ）ら、Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６巻、４５５−４７４ページ（１９９５））；さらに、ＮＭＤＡ−仲介性神経伝達の機能低下は、精神分裂病の基礎となるか、またはその病気に寄与するようにみえる。（オルニー（Ｏｌｎｅｙ）およびファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、５２巻、９９８−１００７ページ（１９９６））。こうして、ＧｌｙＴ−１を阻止し、それによってＮＭＤＡ受容体のグリシン活性化を増加する作用物質を新規の抗精神病薬および抗痴呆薬として用い、また認識過程が障害された疾患、例えば注意力減退疾患および器質性脳障害などの治療に用いることができる。逆に、ＮＭＤＡ受容体の過剰活性化は、多数の病的状態、特に、卒中に関係する神経細胞死、および多分、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、多発梗塞性痴呆、ＡＩＤＳ痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、または、神経細胞死が起きているその他の状態、例えば卒中および頭部外傷などに関係づけられる。コイル（Ｃｏｙｌｅ）およびパットファルケン（Ｐｕｔｔｆａｒｃｋｅｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２巻、６８９−６９５ページ（１９９３）；リプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）およびローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３０巻、６１３−６２２ページ（１９９３）；チョイ（Ｃｈｏｉ）、Ｎｅｕｒｏｎ、１巻、６２３−６３４ページ（１９８８）。こうして、Ｇｌｙ−１Ｔ活性を高める薬物学的作用物質はＮＭＤＡ受容体のグリシン活性化の低下をおこし、その効果を利用してこれらの、およびそれに関連する疾患状態を治療することができる。同様に、ＮＭＤＡ受容体上のグリシン部位を直接ブロックする薬剤を用いてこれらの、およびそれに関連する疾患状態を治療することができる。
上記の薬物学的作用物質を確認する方法および材料が必要である。特に、グリシン輸送を調節しまたはグリシン受容体と相互作用する薬物学的作用物質を確認するための薬剤スクリーニング法が１種類または複数種類必要である。
発明の簡単な概要
本発明は、グリシンの細胞内外への輸送を調節する作用物質、またはグリシン受容体と相互作用する作用物質を確認する材料および方法に関する。そのような材料は、そのなかにグリシントランスポーターをトランスフェクトした細胞類を含める。その方法は、そのような細胞を操作して、作用物質が与えられたグリシントランスポーターに関してグリシンの取り込みまたは流出を阻止または刺激することが確認できるものである。
好適実施態様において、本発明はグリシントランスポーターをコードする外因性核酸を含む非哺乳動物細胞に関係する。このような実施態様は、遺伝的に異なるバックグラウンドにおける或る哺乳動物トランスポーターの活性の特異的証明を可能にする。本発明の非哺乳動物細胞は、鳥類、真菌、昆虫、および爬虫類からなる群から選択される；鳥類の細胞が最も好適である。本発明の外因性核酸は哺乳動物のものであるのが好ましい；より好適には外因性核酸はヒトまたはラットのものである。認められるように、本発明の非哺乳動物細胞は、グリシントランスポーター−１（ＧｌｙＴ−１）またはグリシントランスポーター−２（ＧｌｙＴ−２）であるグリシントランスポーターを含める。ここでＧｌｙＴ−１は好適にはＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂ、またはＧｌｙＴ−１ｃである。好適にはグリシントランスポーターはＧｌｙＴ−１である；この場合外因性核酸はＳＥＱ  ＩＤ（配列記号）  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなる群から選択されるのが好ましい。また別の実施態様において、グリシントランスポーターはＧｌｙＴ−２である；この場合外因性核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であるのが好ましい。本発明の非哺乳動物細胞は好適にはウズラ線維芽細胞であり、最も好適にはＱＴ−６細胞である。
本発明のその他の好適実施態様はペイン、筋肉活動亢進、神経細胞死、精神分裂病、記憶または認識障害、または神経系異常または−状態と関連するその他の疾患または状態を治療する方法であって、第一および第二の非哺乳動物細胞を別々に培養することを含む方法に関係する。この場合第一および第二の非哺乳動物細胞は同じ系統のものであり、グリシントランスポーターをコードする外因性核酸を含み、第一の非哺乳動物細胞を作用物質と接触させ、第一非哺乳動物細胞へのグリシン輸送が、その化合物と接触していない第二の非哺乳動物細胞へのグリシン輸送に比べて増加しているかまたは阻止されたかをスクリーニングする。上記の神経系疾患または状態は、けいれん、筋肉けいれん、ミオクローヌス、てんかん、卒中、頭部外傷、多発性硬化症、脊髄損傷、ジストニア、アルツハイマー病、多発硬化性痴呆、ＡＩＤＳ痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される。好適には、本発明の範囲で用いられるグリシントランスポーターはＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２であり、ここでＧｌｙＴ−１は好適にはＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂ、またはＧｌｙＴ−１ｃである。本発明のまた別の好適実施態様は、ＧｌｙＴ−１をコードする外因性核酸、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む外因性核酸などを含んでなる第一および第二非哺乳動物細胞を含める。或いは、本発明の第一および第二非哺乳動物細胞は、ＧｌｙＴ−２をコードする外因性核酸、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む外因性核酸などを含む。好適実施態様において、本発明の非哺乳動物細胞はＱＴ−６細胞である。もう一つの好適実施態様において、本発明の方法によって見いだされた薬はＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２、またはＧｌｙＴ−１およびＧｌｙＴ−２両方のエンハンサーまたはインヒビターである。
図の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、ＱＴ−６細胞におけるグリシントランスポーターの不均一な発現結果をあらわすグラフである。
図２Ａおよび２Ｂは、グリシン部位拮抗物質によるＭＫ−８０１結合の減少（図２Ａ）およびグリシン部位アゴニストによるＭＫ−８０１結合の強化（図２Ｂ）をそれぞれ示すグラフである。
図３は、一次神経細胞培養物におけるＮＭＤＡ受容体仲介性カルシウム取り込みを示す棒グラフである。
詳細な説明
本発明は細胞内外へのグリシン輸送を調節する作用物質またはグリシン受容体と相互作用する作用物質を確認するための材料および方法にも向けられる。
特に、このようなグリシン輸送は、グリシントランスポーター  タイプ１（ＧｌｙＴ−１）またはグリシントランスポーター  タイプ２（ＧｌｙＴ−２）の作用によって仲介され、または生起する。ＧｌｙＴ−１は５’末端が異なる少なくとも３種類のイソ型として表現されることが判明した；よって、ここに用いられる“ＧｌｙＴ−１”とは、ＧｌｙＴ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＧｌｙＴ−１ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＧｌｙＴ−１ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、および配列および転写オリジンが似ているその他のこの種のバリアント（Ｖａｒｉａｎｔｓ）を指す、ただし、これらに制限されるものではない。例えば、ＧｌｙＴ−１ａはＧｌｙＴ−１ｂおよびＧｌｙＴ−１ｃ以外の異なるプロモーターから転写される；しかし、３種類すべてのイソ型は異なるスプライシングおよびエクソン使用によって異なる。アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１５巻、２５２４−２５３２ページ（１９９５）；キム（Ｋｉｍ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５巻、６０８−６１７（１９９４）。こうして、本発明の範囲で用いられる好適グリシントランスポーターとして考慮されるその他のこの種のバリアントは、異なるスプライシングおよびエクソン使用によって異なるその他のイソ型である。
グリシントランスポーター遺伝子およびそれらそれぞれの遺伝子産物は、グリシンのシナプス間隙からシナプス前−神経終末またはグリア細胞への再取り込みを起こし、それによってグリシン作用を終わらせる。不適切にコントロールされたグリシン受容体活性に関連する、またはグリシン受容体活性を調節する治療薬で治療できる神経学的疾患または状態としては、けいれん（ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ、４巻、２７６７−２７７４ページ（１９９０））および“痛みの実感”（ヤクシュ（Ｙａｋｓｈ）、Ｐａｉｎ、３７巻、１１１−１２３ページ（１９８９）がある）。それに加えてグリシンはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体と相互作用する。それは学習および記憶障害および幾つかの臨床的状態、例えばてんかん、アルツハイマー病およびその他の認識関連性疾患および精神分裂病に関係づけられている。リソン（Ｒｉｓｏｎ）およびスタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．１９巻、５３３−５５２ページ（１９９５）；デニツ（Ｄａｎｙｓｚ）ら、Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６巻、４５５−４７４ページ（１９９５）を参照されたい。
ＧｌｙＴ−１仲介性グリシン輸送を阻止する化合物はＮＭＤＡ受容体のグリシン濃度を高める。この受容体は特に前脳部に存在する。この濃度増加はＮＭＤＡ受容体の活性を高め、それによって精神分裂病を寛解し、認識機能を高める。或いは、ＮＭＤＡ受容体のグリシン受容体成分に直接相互作用する化合物は、ＧｌｙＴ−１活性の阻止または増加それぞれによって細胞外グリシン利用性を増加または減少させるのと同じかまたは同様な効果を有する。例えばピッケネン（Ｐｉｔｋ  ｎｅｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５３巻、１２５−１２９ページ（１９９４）；ティールス（Ｔｈｉｅｌｓ）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、４６巻、５０１−５０９ページ（１９９２）；およびクレッチュマー（Ｋｒｅｔｓｈｍｅｒ）およびシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６巻、１５６１−１５６９ページ（１９９６）を参照されたい。ＧｌｙＴ−２仲介性グリシン輸送を阻止する化合物は主として脳幹および脊髄に位置する受容体のグリシン濃度を高める。これらの部位ではグリシンはシナプス伝達のインヒビターとして働いている。これらの化合物はてんかん、ペインおよびけいれん、およびその他のこの種の状態に有効である。例えばベッカー、同上、およびヤクシュ、同上、を参照されたい。
よって、グリシントランスポーターを増強または阻止する作用物質、またはＮＭＤＡ受容体のグリシン受容体部分を抑制または活性化する作用物質の同定は、このような神経学的状態および−異常の治療に有用な薬剤の開発のために重要である。本発明はこのようなスクリーニングのために適した材料および方法を提供する。特に、ＧｌｙＴ−１（好適にはＧｌｙＴ−１ａ、−１ｂまたは−１ｃ）、およびＧｌｙＴ−２  ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに挿入し、それによって適切なホストがそれぞれＧｌｙＴ−１、好適にはＧｌｙＴ−１ａ、−１ｂ、または−１ｃ、およびＧｌｙＴ−２でトランスフォームされるとき、グリシントランスポーター  ポリペプチドが合成され、それぞれのグリシントランスポーターを生成する。このようなトランスフォームド細胞は、構造的または誘導的にＧｌｙＴ  ＤＮＡを発現する安定系を形成し、それによってグリシントランスポーターを発現する。或いは、その他のこのような細胞はＧｌｙＴ  ＤＮＡおよびタンパク質の一過性発現を示すかも知れない。候補となった作用物質が本発明に関してここに開示されたようなグリシン輸送増強−または抑制特性を有するかどうかを決めるスクリーニングアッセイのためには、このようなトランスフェクテド細胞のいずれかを、一緒に、または別々に用いる。それに加えて、ＮＭＤＡ受容体およびグリシントランスポーターを含む適切な一次神経細胞培養物を本発明の範囲内で用いて、化合物類について、グリシントランスポーター、ＮＭＤＡ受容体のグリシン受容体部分、またはその両方の活性化または抑制能力を試験する。このような試験には、ＮＭＤＡ受容体を含む適切なソース、例えば脳組織などからの膜を用いる結合アッセイの形もある。
適切な発現ベクターとしてはｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）、Ｚａｐ発現ベクター（ストラタゲン  クローニング  システム、ラジョラ、ＣＡ；以後は“ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）”とする）、ｐＢｋ／ＣＭＶまたはｐＢｋ−ＲＳＶベクター（ストラタゲン）、ＬａｃＳｗｉｔｃｈ（ストラタゲン）、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭネオ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））などがある。適切な発現ベクターは、適切なホスト細胞、好適には非哺乳動物ホスト細胞、すなわち真核細胞、真菌、または原核細胞など、におけるＧｌｙＴ  ＤＮＡの発現を促進することができる。このような好適ホスト細胞は鳥類、真菌、昆虫および爬虫類細胞を含めるが、これらに制限するものではない。好適ホスト細胞は鳥類、真菌および昆虫細胞である。最も好適なホスト細胞は鳥類の細胞である。好適鳥類細胞としては、ウズラ、ヒナドリおよび七面鳥の細胞がある；より好適なのはウズラの細胞である。このような細胞のなかで最も好適なのはウズラ線維芽細胞、例えば、特にＱＴ−６である。
上記の発現ベクターの一つに挿入されるＧｌｙＴ  ＤＮＡは、グリシントランスポーターをコードする適したいかなるＤＮＡでもよい。好適には、ＧｌｙＴ  ＤＮＡは適した動物、例えば鳥および哺乳動物などから得られる；ただしこれらに制限されるものではない。好適哺乳動物はヒト、マウス、ラット、雌牛、ブタ、などである；より好適にはＧｌｙＴ  ＤＮＡはヒトまたはラットから得られる；最も好適には、ＧｌｙＴ  ＤＮＡはヒトから得られる。一実施態様において、ＧｌｙＴ  ＤＮＡは、ＧｌｙＴ  １に関しては好適にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、ＧｌｙＴ−２に関してはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる。グリシントランスポーター  タイプ１活性をコードするその他の適したすべてのＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の等価代替物である。同様に、グリシントランスポーター  タイプ２活性をコードする他の適したすべてのＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の等価代替物である。
その他の実施態様において、本発明の範囲で用いられるＧｌｙＴ  ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４によってコードされるタンパク質の少なくとも一つと同じアミノ酸配列を少なくとも約４５％有するタンパク質、より好適には少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好適には少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、さらになおより好適には少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする。ここで考慮される配列同一性測定値は、保存的アミノ酸置換を同一として数える。この際保存的置換とは、コードされているタンパク質のアミノ酸の交換をおこす置換である。これらのアミノ酸は非常に似た物理化学的特性を有し、または相同タンパク質において置換することが実験的に知られている。核酸レベルでは、ヌクレオチドの交換が起きることがあるが、遺伝暗号の末梢重複の結果、コードされている（遺伝暗号化された）タンパク質配列に対するその効果は中性である。これはアミノ酸レベルにおけるよりも、核酸レベルでの配列変化がより大きいことを説明する。
このような交換可能アミノ酸は次の群の一つに分類される。ここではアミノ酸は当業者には公知のそれぞれの三文字コードであらわされている：
１．小さい脂肪族性、無極性またはわずかに極性を有する残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；
２．極性を有し、負に帯電した残基およびそれらのアミド類：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；
３．極性を有し、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；
４．大きい脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
相同タンパク質配列に関する研究から得られた実験的証拠に基づく保存的置換の好適リストは次のものである：
0004246797.tif 000002
選択する置換のタイプは好適には（だが制限するものではない）以下に記載されるような、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸置換の頻度分析に基づくものである：例えばシュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）らによって開発された分析法（“タンパク質構造の原理”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９７８；チョウ（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）によって開発された構造形成ポテンシャルの分析に関するもの、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻、２１１ページ（１９７４）並びにＡｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７巻、４５−１４９ページ（１９７８）；およびアイゼンベルグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）らによって開発された、タンパク質中の疎水性パターンの分析、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、１４０−１４４ページ（１９８４）；カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１５７巻、１０５−１３２ページ（１９８１）、およびゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５巻、３２１−３５３ページ（１９８６）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４によってコードされる各タンパク質と全体的に約４５％より少ない同一性を示すタンパク質をコードするＧｌｙＴ  ＤＮＡｓは、にもかかわらず、関連核酸がＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２またはそれらの実質的部分をコードする遺伝子に特異的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む範囲では、ＧｌｙＴ  ＤＮＡとされる。“実質的部分”という用語は、含まれる部分が、グリシントランスポーター核酸配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ１、２、３または４（ただしこれに制限されるものではない）など、によってコードされるタンパク質の対応セグメントと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を示すペプチド配列をコードする最低約５０のヌクレオチドの連続セグメントを含むことを意図する；より好適には、実質的部分はグリシントランスポーター核酸配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１、２、３、または４（ただしこれらに制限されるものではない）などによってコードされるタンパク質の対応セグメントと最低約７０％のアミノ酸配列同一性を示すペプチド配列をコードする少なくとも約５００のヌクレオチドの連続セグメントを含む；より好適には、実質的部分は、グリシントランスポーター核酸配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１、２、３、または４など（ただしこれらに制限されるものではない）によってコードされるタンパク質の対応セグメントと最低約６０％のアミノ酸配列同一性を示すペプチド配列をコードする少なくとも約１０００のヌクレオチドの連続セグメントを含む。
本発明の範囲に用いられるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４の１つ、またはそれらの実質的部分に関する核酸の特定の配列同一性が、一部には、ここに開示される薬剤発見法に用いることのできる発明の遺伝子構成物、ベクター、およびトランスフォームド  ホストの作成に用いるＧｌｙＴ  ＤＮＡの一実施態様を決める。よって、本発明の範囲で用いられる核酸の配列を決定し、さもなければ適した分析を行って、その配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、または４の配列の１つと比較する。
配列同一性パーセントを決定する多くの方法が当業者に知られている。一つの好適方法は、配列比較をするためのＧＡＰコンピュータープログラムのバージョン６．０を用いることである。そのプログラムはウィスコンシン大学遺伝学研究コンピューターグループから入手でき、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）の配列法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻、４４３ページ、１９７０）の、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の改良法（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻、４８２ページ、１９８１）を利用する。もう一つの利用可能の方法は、ＦＡＳＴＡコンピュータープログラムを用いるものである（ピアソンおよびリプマン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４−２４４８ページ（１９８８））。
上に認められるように、本発明はＧｌｙＴ  ＤＮＡをトランスフェクトした細胞に関する。このＧｌｙＴ  ＤＮＡは、グリシントランスポーター特性がそのトランスフェクテド細胞によって発現するように、グリシントランスポーターをコードするあらゆる適切なＤＮＡである。一実施態様において、そのようなＧｌｙＴ  ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４の少なくとも１つに、またはそれに相補的である配列に相同である；この実施態様の好適ＧｌｙＴ  ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４の少なくとも１つに関して最低約４５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。本発明の範囲に用いられるより好適なＧｌｙＴ  ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４、これに相補的な核酸、および実質上等価の核酸からなる群から選択される核酸を含む。上に定義したこのような関連ＧｌｙＴ  ＤＮＡｓはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４の１つ、またはそれらの実質的部分を用いて分離され、分子生物学の種々の一般的方法、例えばハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、またはグリシン輸送活性を有する生物から誘導されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、またはそのような生物から誘導されるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに関する操作など（ただしこれらに制限されるものではない）、のいずれかにプローブとして用いられる。
“実質上等価”な核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−４の１つから、１つ以上の置換、欠失、または付加によって変化する配列を有する核酸であって、その変化の影響によって、２つの核酸の間に好ましくない機能的不同性がおきないような核酸である。言い換えれば、実質上等価の配列から生ずるポリペプチドはＧｌｙＴ遺伝子産物に特徴的な活性を有する。アミノ酸レベルでの配列の差は、単一のアミノ酸置換、欠失、または挿入から、多数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入までの範囲のアミノ酸の差を含めると理解される。その場合生成ポリペプチドは、グリシントランスポーターの機能性が保存されているという点で、まだＧｌｙＴタンパク質に関連するものとして認識される。
神経系の異常または状態に関連する疾患または症状を治療するための作用物質の分析−またはスクリーニング法は第一および第二非哺乳動物細胞を別々に培養することを含む。その際第一および第二非哺乳動物細胞は同じ種属であることが好ましく、その種属の同じ系統であるのがより好ましい。そして本明細書に説明するようなグリシントランスポーターをコードする外因性核酸を含める；ここでグリシントランスポーターは好適にはＧｌｙＴ−１かＧｌｙＴ−２であり、ＧｌｙＴ−１はＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂ、またはＧｌｙＴ−１ｃであるのが好ましい。その薬剤を用いて治療する神経系異常または状態は、けいれん、ミオクローヌス、筋肉けいれん、ペイン、筋肉過剰活動、てんかん、卒中、頭部外傷、神経細胞死、認識または記憶障害、多発性硬化症、脊髄損傷、ジストニア、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、注意力欠乏疾患、器質性脳症候群、および精神分裂病を含める、ただし、これらに制限されるものではない。この方法において、第一の非哺乳動物細胞を適切に標識したグリシンの存在下で作用物質、好適にはペプチドまたは有機化合物のような化合物、またはこれを含んでなる組成物または混合物、と接触させる。このような標識グリシンには、例えば放射性同位元素、例えば3Ｈまたは14Ｃなどが挿入されている。その後、接触させた第一非哺乳動物細胞について、化合物と接触させなかった第二の非哺乳動物細胞（すなわち対照細胞）へのグリシン輸送に比較して、第一の非哺乳動物細胞へのグリシン輸送が増加したか抑制されたかを試験する。このような分析またはスクリーニングは好適には検出、学習、発見、決定、同定または確認の諸活動を含む。
上記試験の終わりに、細胞内標識グリシンの量が、作用物質非接触非哺乳動物細胞に比し、作用物質接触非哺乳動物細胞の方がより大きい場合は、グリシントランスポーター取り込みのエンハンサーである；逆に、もしも細胞内標識グリシンの量が作用物質非接触非哺乳動物細胞の方が大きければ、作用物質はグリシントランスポーターのインヒビターである。試験した第一細胞と対照第二細胞との間のグリシン取り込みの差は、少なくとも約２のファクターであるのが好ましい。より好適には、その差は少なくとも約５のファクターである；最も好適にはその差は少なくとも約１桁以上である。
本発明の方法を用いて確認される作用物質はＧｌｙＴ１、すなわち好適にはＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂ、またはＧｌｙＴ−１ｃ、或いはＧｌｙＴ−２、或いはそれらの組み合わせ、に特異的である。同じ化合物がどのグリシントランスポーターに関してもインヒビターまたはエンハンサーであるのが好ましい、だが他のグリシントランスポーターに関しては中性または逆の効果をもっていてもよい。好適作用物質は、或るグリシントランスポーターを特異的に高めまたは抑制し、他のグリシントランスポーターには、前記グリシントランスポーターに対する効果に比較して、中性または無視し得る効果を有する。本発明のトランスフェクテド細胞で試験したとき、好適には、或るグリシントランスポーターに対し、第二のグリシントランスポーターに対するよりも特異的である作用物質は、第二のグリシントランスポーターに対するその（作用物質の−−訳者）効果に比し、第一グリシントランスポーターによって仲介されるグリシン取り込みの抑制−または活性化能力は少なくとも１桁は大きい。
より好適な作用物質は、或るグリシントランスポーターと他のグリシントランスポーターとの間で最低２桁の大きさの差を有する。
作用物質は次のものを含めるいかなる適した化合物、材料、組成物、混合物、または化学物質でもよい；２ないし約２５アミノ酸長さのポリペプチド、好適には２ないし約１０、より好適には２ないし約５アミノ酸長さのポリペプチド（ただしこれらに制限されるものではない）。本発明の範囲内のその他の適した作用物質は、分子量約１００ダルトンないし約５０００ダルトンの小さい有機化合物を含める、そしてアルキル、アリール、アルケン、アルキン、およびその他の適切な基（ヘテロ原子を含んでいても含まなくてもよい）を含んでなる。このような有機化合物は単純な砂糖、アミノ−またはイミノ酸類、核酸、ステロイドなどを含める炭水化物類でよい。ここで作用物質として試験した化学物質は当業者には公知の、または化学合成のための一般的手段を用いて作ることができる。適切な作用物質は上記のまたはその他の神経系異常または状態の治療のための薬剤として有用であるのが好ましい。
ここに記載の方法を用いて、グリシントランスポーターを増強しまたは抑制する、またはＮＭＤＡ受容体のグリシン受容体部分を抑制または活性化することが確認された作用物質は、下記の式であらわされる化合物または薬物学的に容認されるその塩類を含める：
0004246797.tif 000003
上記式中、
（１）  Ｘは窒素または炭素；
（２）  Ａｒ1はアリール、ヘテロアリール、アリールアルキルであり、ここでアルキルはＣ１ないしＣ２であり、またはアルキルがＣ１ないしＣ２であるヘテロアリールアルキルであり、Ａｒ2はアリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールアルキル、ここでアルキルはＣ１ないしＣ２であり、アルキルがＣ１ないしＣ２であるヘテロアリールアルキル、アリールメトキシ、ヘテロアリールメトキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールメチルチオ、ヘテロアリールメチルチオ、または、Ａｒ−Ｎ（Ｒ6*）−かＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6）−メトキシのどちらか、ここでＲ6およびＲ6*は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで、Ａｒはアリールまたはヘテロアリールであり、
（ａ）Ｘが窒素であるときはＡｒ2はアリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールメトキシ、ヘテロアリールメトキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールメチルチオ、ヘテロアリールメチルチオ、Ａｒ−Ｎ（Ｒ6）−またはＡｒ−ＣＨ2−（Ｎ（Ｒ6*））−ではなく、
（ｂ）Ａｒ1またはＡｒ2のアリールはフェニルまたはナフチルであり、
（ｃ）Ａｒ1またはＡｒ2のヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、または６員環に融合した６員環を含んでなり、ヘテロアリールは芳香族で、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択されたヘテロ原子を含み、環の残りの原子は炭素であり、
（ｄ）Ａｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールが一緒になって、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基をもつことができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（ここで各アルキルは独立的にＣ１ないしＣ６である）、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル（水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ（独立的に３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、または、アリールまたはヘテロアリール環状構造上の隣接位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシまたはエチレンジオキシであって、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換され得るメチレンジオキシまたはエチレンジオキシからなる群から選択される６個までの置換基で置換されてもよい；
（ｉ）ここでＡｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールのこのような置換基は、結合してＡｒ1とＡｒ2との間の第二の橋を形成することができる：すなわち（１）（Ｃ１−Ｃ２）アルキルまたはアルケニル；それらは独立的に１個以上の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できる、（２）硫黄、（３）酸素、（４）アミノ、ここで水素は１個の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（５）カルボニル、（６）−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−、ここで水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（７）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、（８）−ＣＨ2−Ｏ−、ここで水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（９）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ24）−、ここでＲ24は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（１０）−ＣＨ2−ＮＨ−、ここで水素を３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（１１）−ＣＨ＝Ｎ−、ここで水素を（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、
またはＡｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘトロアリールは一重結合によって直接結合することができる；
（３）  Ｒ25は（ａ）直鎖（Ｃ１−Ｃ４）脂肪族基、（ｂ）＝Ｎ−Ｏ−（Ｒ26）であり、この際Ｒ26はエチレンまたはプロピレンであり、釣り合っていない二重結合がＸに結合しており（Ｘが炭素であるとき）、または、Ｘが炭素で、Ａｒ2がＡｒ−Ｎ（Ｒ6）−でもＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）でもないとき（ｃ）−Ｏ−Ｒ8または−Ｓ−Ｒ8*であり、上記式中Ｒ8またはＲ8*は（Ｃ２−Ｃ３）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ３）アルケニレンで、ＯまたはＳがＸに結合している、
（ｉ）ここで、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイルオキシまたはオキソ置換基が、窒素または酸素に結合している炭素と結合していない、という条件で、Ｒ25は１個までのヒドロキシ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシまたは１個までの（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、１個までのオキソ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデンで置換され得る；
（ｉｉ）Ｒ25のアルキルまたはアルキリデン置換基が結合して３ないし７員環を形成することができ；
（ｉｉｉ）Ｘが窒素である場合、Ｘは一重結合でＲ25に結合し、Ｒ25をＮに結合させているＲ25の末端炭素が飽和している；
（４）  Ｒ2は、（ａ）Ｘが窒素であるときは、存在しない、Ｒ2は、（ｂ）水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、シアノ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、アミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ここで各アルキルは独立的にＣ１−Ｃ６、またはＡｒ9、ここでＡｒ9は独立的にＡｒ1のために定義されたものであり、（ｃ）Ｒ25が−Ｏ−Ｒ8でない場合には、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモまたは（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシを含んでなり、（ｄ）Ｒ25からの隣接炭素または窒素と二重結合を形成する；
（５）  Ｒ3は（ａ）水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはフェニルまたはフェニルアルキルであり、ここでアルキルはＣ１−Ｃ６であり、これらどちらのフェニルも、Ａｒ1またはＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールについて上で定義した同じ置換基３個までで置換することができる、（ｂ）Ｒ3は−ＣＨ（Ｒ9）−Ｒ10であり、ここでＲ9はＲ4と同じであり、Ｒ10はＲ5と同じであり、または（ｃ）Ｚ（Ａｒ3）（Ａｒ4）（Ｒ11）−Ｒ11−Ｒ12であり、ここでＲ12はＮに結合し、Ｚは独立的にＸと同じものであり、Ａｒ3は独立的にＡｒ1と同じであり、Ａｒ4は独立的にＡｒ2と同じであり、Ｒ11は独立的にＲ2と同じであり、Ｒ12は独立的にＲ25と同じである；
（６）  Ｒ4およびＲ4*は独立的に水素、または３ないし７員環を完成するように結合できる（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、またはＲ4およびＲ4*の一つが（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキルでもよい；そして
（７）  Ｒ5は（ＣＯ）ＮＲ13Ｒ14、（ＣＯ）ＯＲ15、（ＣＯ）ＳＲ16、（ＳＯ2）ＮＲ17Ｒ18、（ＰＯ）（ＯＲ19）（ＯＲ20）またはＣＮである、ここでＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19およびＲ20は独立的に水素、（Ｃ３−Ｃ８）を組み込むことができる（Ｃ１−Ｃ８）アルキル（ここでＲ15の酸素またはＲ16の硫黄に結合した炭素は二次的枝分かれをもつに過ぎない）、（Ｃ２−Ｃ６）ヒドロキシアルキル、アミノアルキル（ここでアルキルはＣ２−Ｃ６で、アミノは２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ６である）、アルキルがＣ１ないしＣ６であるヘテロアリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールで置換できる、
（ａ）ここでアリールはフェニルまたはナフチルで、ヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、または６員環に融合した６員環であり、ヘテロアリールは芳香族で、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択されたヘテロ原子を含み、環の残りの原子は炭素であり、
（ｂ）アリール、ヘテロアリール、アリールまたはアリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルのヘテロアリールは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基をもつことができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミン、ジアルキルアミン（ここで各アルキルは独立的にＣ１ないしＣ６である）、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルでＮ−置換することができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ（独立的に３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、または、アリールまたはヘテロアリール環状構造上の隣接位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシまたはエチレンジオキシであって、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換され得るメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ、からなる群から選択される３個までの置換基で置換することができる
（ｃ）Ｒ13およびＲ14は一緒に窒素とともに５ないし７員環を形成することができる。その環は、酸素および硫黄から選択される１個のヘテロ原子を付加的に含むことができる。
上のように同定されたその他の適した作用物質は、下記の式であらわされる作用物質または薬物学的に容認されるその塩類を含める；
0004246797.tif 000004
上記式中、
（１）  Ｘは窒素または炭素であり；
（２）  Ａｒ1はアリール、ヘテロアリール、アリールアルキル（ここでアルキルはＣ１ないしＣ２である）またはヘテロアリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ２）であり、Ａｒ2はアリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールアルキル（ここでアルキルはＣ１ないしＣ２である）、ヘテロアリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ２）、アリールメトキシ、ヘテロアリールメトキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールメチルチオ、ヘテロアリールメチルチオ、またはＡｒ−Ｎ（Ｒ6）−またはＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）−のどちらかであり、ここでＲ6およびＲ6*は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルでＡｒはアリールまたはヘテロアリールでよい、
（ａ）ここでＸが窒素であるとき、Ａｒ2はアリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールメトキシ、ヘテロアリールメトキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールメチルチオ、ヘテロアリールメチルチオ、Ａｒ−Ｎ（Ｒ6）−またはＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）−であり、
（ｂ）Ａｒ1またはＡｒ2のアリールはフェニルまたはナフチルであり、
（ｃ）Ａｒ1またはＡｒ2のヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、または６員環に融合した６員環を含んでなり、ヘテロアリールは芳香族で、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択されたヘテロ原子を含み、環の残りの原子は炭素であり、
（ｄ）Ａｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールは一緒に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基をもつことができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（ここで各アルキルは独立的にＣ１ないしＣ６である）、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル（水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ（水素を独立的に３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、または、アリールまたはヘテロアリール環状構造上の隣接位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシまたはエチレンジオキシであって、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換され得るメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ、からなる群から選択される６個までの置換基で置換されていてもよい；
（ｉ）ここでＡｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールのこのような置換基は、結合してＡｒ1とＡｒ2との間の第二の橋を形成することができる：すなわち（１）（Ｃ１−Ｃ２）アルキルまたはアルケニル；それらは独立的に１個以上の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できる、（２）硫黄、（３）酸素、（４）アミノ、この際水素は１個の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（５）カルボニル、（６）−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−、ここで水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（７）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、（８）−ＣＨ2−Ｏ−、この際水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（９）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ24）−、この際Ｒ24は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、（１０）−ＣＨ2−ＮＨ−、ここで水素を３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、（１１）−ＣＨ＝Ｎ−、この際水素を（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、
またはＡｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘトロアリールは一重結合によって直接結合することができる；
（３）  Ｒ1は（ａ）直鎖（Ｃ２−Ｃ４）脂肪族基、（ｂ）Ｘが炭素であるときは、＝Ｎ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）−（この際釣り合っていない二重結合がＸに結合している）、または、（ｃ）Ｘが炭素で、Ａｒ2がＡｒ−Ｎ（Ｒ6）−でもＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）でもないときは、−Ｏ−Ｒ8または−Ｓ−Ｒ8*であり、上記式中Ｒ8またはＲ8*は（Ｃ２−Ｃ３）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ３）アルケニレンで、ＯまたはＳはＸに結合している、
（ｉ）ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイルオキシまたはオキソ置換基が、窒素または酸素に結合している炭素には結合していない、という条件で、Ｒ1は１個までのヒドロキシ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシまたは１個までの（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシで、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで、１個までのオキシ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデンで置換できる、
（ｉｉ）Ｒ1のアルキルまたはアルキリデン置換基は３ないし７員環を形成するように結合することができる、
（ｉｉｉ）Ｘが窒素である場合、Ｘは一重結合によってＲ1に結合し、Ｒ1をＮに結合させているＲ1の末端炭素は飽和している；
（４）  Ｒ2は、（ａ）Ｘが窒素であるときは、存在しない、Ｒ2は、（ｂ）水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、シアノ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、アミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニル、この際各アルキルは独立的にＣ１−Ｃ６であり、（ｃ）Ｒ1が−Ｏ−Ｒ8、または−Ｓ−Ｒ8*−でない場合には、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモまたは（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシを含んでなり、（ｄ）Ｒ1からの隣接炭素または窒素と二重結合を形成する；
（５）  この際Ｑは、図示したＲ5を担うｔｅｒｔ．窒素およびｔｅｒｔ．炭素と一緒になって環Ｃを形成し、ここで環Ｃは３ないし８員環、３ないし６員スピロ環で置換された３ないし８員環、または５ないし６員環と融合した３ないし８員環で、この際図示した第四窒素のない融合環は芳香族またはヘテロ芳香環であり、環Ｃの各成分環には酸素、硫黄または窒素（図示された窒素を含める）および残りの炭素から選択される２個までのヘテロ原子がある、この場合飽和環では環状窒素原子は他の環状ヘテロ原子から少なくとも２個の介在炭素原子だけは離れている、
（ａ）環Ｃの炭素および窒素環状原子は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、オキソ、ヒドロキシカルボニル、アルール（このアルールはＡｒ1のところで定義したものである）またはヘテロアルール（このヘテロアルールはＡｒ1のところで定義したものである）から選択される３個までの置換基で置換することができる；この際アルキリデン、ヒドロキシカルボニルまたはオキソで置換される環状原子は炭素であるという条件がある、そしてさらに、ヒドロキシまたはアルコキシで置換される環状原子は他の環状ヘテロ原子から少なくとも２個の介在炭素原子だけ離れていることも条件である、そして
（ｂ）Ｑは環Ｃの定義を十分に満足する；
（６）  Ｒ5は（ＣＯ）ＮＲ13Ｒ14、（ＣＯ）ＯＲ15、（ＣＯ）ＳＲ16、（ＳＯ2）ＮＲ17Ｒ18、（ＰＯ）（ＯＲ19）（ＯＲ20）またはＣＮである、ここでＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19およびＲ20は独立的に水素、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルを組み込むことができる（Ｃ１−Ｃ８）アルキル（ここでＲ15の酸素またはＲ16の硫黄に結合した炭素は二次的枝分かれを有するに過ぎない）、（Ｃ２−Ｃ６）ヒドロキシアルキル、アミノアルキル（ここでアルキルはＣ２ないしＣ６で、アミノは２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できる）、アリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ６である）、アルキルがＣ１ないしＣ６であるヘテロアリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールである、
（ａ）ここでアリールはフェニルまたはナフチルで、ヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、または６員環に融合した６員環であり、ヘテロアリールは芳香族で、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択されるヘテロ原子を含み、環の残りの原子は炭素であり、
（ｂ）アリール、ヘテロアリール、アリールまたはアリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルのヘテロアリールはフルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基をもつことができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミン、ジアルキルアミン（ここで各アルキルは独立的にＣ１ないしＣ６である）、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルでＮ−置換することができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ（水素を３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、または、アリールまたはヘテロアリール環状構造上の隣接位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシまたはエチレンジオキシであって、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換され得るメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ、からなる群から選択される３個までの置換基で置換することができる、
（ｃ）Ｒ13およびＲ14は、それらが結合している窒素と共に５ないし７員環を形成することができる。その５−７員環は、酸素および硫黄から選択されるもう１個のヘテロ原子を含むことができる。
上のように決めたその他の適切な作用物質は次のものを含める：
作用物質は下記の式ＩまたはＩＩであらわされる化合物または薬物学的に容認されるその塩類であって；
0004246797.tif 000005
（１）  Ｘは窒素または炭素であり；
（２）  Ａｒ1はアリール、ヘテロアリール、アリールアルキル（ここでアルキルはＣ１ないしＣ２である）またはヘテロアリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ２）であり、Ａｒ2はアリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールアルキル（ここでアルキルはＣ１ないしＣ２である）、ヘテロアリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ２）、アリールメトキシ、ヘテロアリールメトキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールメチルチオ、ヘテロアリールメチルチオ、またはＡｒ−Ｎ（Ｒ6）−またはＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）−のどちらかであり、ここでＲ6およびＲ6*は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルでＡｒはアリールまたはヘテロアリールでよい、
（ａ）ここでＸが窒素であるとき、Ａｒ2はアリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールメトキシ、ヘテロアリールメトキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールメチルチオ、ヘテロアリールメチルチオ、Ａｒ−Ｎ（Ｒ6）−またはＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）−であり、
（ｂ）Ａｒ1またはＡｒ2のアリールはフェニルまたはナフチルであり、
（ｃ）Ａｒ1またはＡｒ2のヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、または６員環に融合した６員環を含んでなり、ヘテロアリールは芳香族で、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択されたヘテロ原子を含み、環の残りの原子は炭素であり、
（ｄ）Ａｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールは一緒に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基をもつことができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（ここで各アルキルは独立的にＣ１ないしＣ６である）、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル（水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ（水素を独立的に３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、または、アリールまたはヘテロアリール環状構造上の隣接位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシまたはエチレンジオキシであって、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換され得るメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ、からなる群から選択される６個までの置換基で置換されていてもよい；
（ｉ）ここでＡｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘテロアリールの、このような置換基は、結合してＡｒ1とＡｒ2との間に次のような第二の橋を形成することができる；（１）（Ｃ１−Ｃ２）アルキルまたはアルケニル（それらは独立的に１個以上の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できる）、（２）硫黄、（３）酸素、（４）アミノ（ここで水素は１個の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されてもよい）、（５）カルボニル、（６）−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−（ここで水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、（７）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、（８）−ＣＨ2−Ｏ−（ここでは水素を２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、（９）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ24）−、この際Ｒ24は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、（１０）−ＣＨ2−ＮＨ−（ここでは水素を３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、（１１）−ＣＨ＝Ｎ−（ここでは水素を（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、
またはＡｒ1およびＡｒ2のアリールまたはヘトロアリールは一重結合によって直接結合することができる；
（３）  Ｒ1は次のものを含む：（ａ）一重結合または二重結合、（ｂ）直鎖（Ｃ１−Ｃ３）脂肪族基、（ｃ）Ｘが炭素のときは＝Ｎ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）−（ここでは釣り合っていない二重結合がＸに結合している）、または（ｄ）Ｘが炭素で、Ａｒ2がＡｒ−Ｎ（Ｒ6）−でもＡｒ−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ6*）でもないときは、−Ｏ−Ｒ8または−Ｓ−Ｒ8*、上記式中Ｒ8またはＲ8*は一重結合、（Ｃ１−Ｃ３）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ３）アルケニレンで、ＯまたはＳはＸに結合している、
（ｉ）ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイルオキシまたはオキソ置換基が、窒素または酸素に結合している炭素には結合していない、という条件で、Ｒ1は１個までのヒドロキシ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシまたは１個までの（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシで置換でき、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、１個までのオキシ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデンで置換できる、
（ｉｉ）Ｒ1のアルキルまたはアルキリデン置換基は３ないし７員環を形成するように結合することができる、
（ｉｉｉ）Ｘが窒素である場合、Ｘは一重結合によってＲ1に結合し、Ｒ1をＮに結合させているＲ1の末端炭素は飽和している；
（４）  Ｒ2は、（ａ）Ｘが窒素であるときは、存在しない、Ｒ2は、（ｂ）水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、シアノ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、アミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニル（この際各アルキルは独立的にＣ１−Ｃ６である）、（ｃ）Ｒ1が−Ｏ−Ｒ8でない場合には、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモまたは（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシを含んでなり、（ｄ）Ｒ1からの隣接炭素または窒素と二重結合を形成する；
（５）  Ｒ3は一重結合または（Ｃ１−Ｃ２）アルキルまたはアルケニル；
（６）  Ｒ18は一重結合または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたはアルケニル；
（７）  環Ｄは３ないし８員環、３ないし６員スピロ環で置換された３ないし８員環、または５ないし６員環と融合した３ないし８員環であり、図示するｔｅｒｔ．窒素が欠けている融合環は芳香族またはヘテロ芳香族であってもよい。環Ｄの各成分環には、酸素、硫黄、または窒素（図示した窒素を含める）から選択される２個までのヘテロ原子および残りの炭素がある、この際環状原子は第四窒素を含まないという条件がある、そしてさらに、飽和環では環状窒素原子は他の環状ヘテロ原子から少なくとも２個の介在炭素原子だけ離れていることも条件である、
（ａ）環Ｄの炭素および窒素環状原子は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、オキソ、ヒドロキシカルボニル、アリール（ここでアリールはＡｒ1のために定義したものである）またはヘテロアリール（ここでヘテロアリールはＡｒ1のために定義したものである）から選択される３個までの置換基で置換することができる。ただしアルキリデン、ヒドロキシカルボニルまたはオキソで置換された環状原子は炭素であることが条件であり、さらにヒドロキシまたはアルコキシで置換された環状原子はその他の環状ヘテロ原子から少なくとも２個の介在炭素原子だけ離れていることも条件である、
（ｂ）そして、Ｇは環Ｄの定義を満足するために要求されるものである；
（８）  環Ｅは、３ないし８員環、３ないし６員スピロ環で置換された３ないし８員環、または５ないし６員環と融合した３ないし８員環であり、図示するｔｅｒｔ．窒素が欠けている融合環は芳香族またはヘテロ芳香族であってもよい。環Ｅの各成分環には、酸素、硫黄、または窒素（図示した窒素を含める）から選択される２個までのヘテロ原子および残りの炭素がある、この際環状原子は第四窒素を含まないという条件がある、そしてさらに、飽和環では環状窒素原子は他の環状ヘテロ原子から少なくとも２個の介在炭素原子だけ離れていることも条件である、
（ａ）環Ｅの炭素および窒素環状原子は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、オキソ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、アリール（ここでアリールはＡｒ1のために定義したものである）またはヘテロアリール（ここでヘテロアリールはＡｒ1のために定義したものである）から選択される３個までの置換基で置換することができる。ただしアルキリデン、ヒドロキシカルボニルまたはオキソで置換された環状原子は炭素であることが条件であり、さらにヒドロキシまたはアルコキシで置換された環状原子はその他の環状ヘテロ原子から少なくとも２個の介在炭素原子だけ離れていることも条件である、
（ｂ）そして、Ｇ*は環Ｅの定義を満足するために要求されるものである；
（９）  Ｒ19は（ａ）Ｒ1、Ｒ3またはＧと二重結合を形成し、（ｂ）水素であり、（ｃ）（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたはアルキレンであり、または（ｄ）融合環に組み入れられている；
（１０）  Ｒ4およびＲ4*は独立的に水素または、３ないし７員環を完成するように結合できる（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、或いはＲ4およびＲ4*の１つが（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキルでもよい；
（１１）  Ｒ5は（ＣＯ）ＮＲ13Ｒ14、（ＣＯ）ＯＲ15、（ＣＯ）ＳＲ16、（ＳＯ2）ＮＲ17Ｒ18、（ＰＯ）（ＯＲ21）（ＯＲ20）またはＣＮである、ここでＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ21およびＲ20は独立的に水素、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルを組み込むことができる（Ｃ１−Ｃ８）アルキル（ここでＲ15の酸素またはＲ16の硫黄に結合した炭素は二次的枝分かれをもつに過ぎない）、（Ｃ２−Ｃ６）ヒドロキシアルキル、アミノアルキル（ここでアルキルはＣ２ないしＣ６で、アミノは２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できる）、アリールアルキル（アルキルはＣ１ないしＣ６である）、アルキルがＣ１ないしＣ６であるヘテロアリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールである、
（ａ）ここでアリールはフェニルまたはナフチルで、ヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、または６員環に融合した６員環であり、ヘテロアリールは芳香族で、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択されるヘテロ原子を含み、環の残りの原子は炭素であり、
（ｂ）アリール、ヘテロアリール、アリールまたはアリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルのヘテロアリールは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基をもつことができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミン、ジアルキルアミン（ここで各アルキルは独立的にＣ１ないしＣ６である）、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル（２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルでＮ−置換することができる）、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ（３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる）、または、アリールまたはヘテロアリール環状構造上の隣接位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシまたはエチレンジオキシであって、２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できるメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ、からなる群から選択される３個までの置換基で置換することができる、
（ｃ）Ｒ13およびＲ14は、窒素と共に５ないし７員環を形成することができる。その５−７員環は、酸素および硫黄から選択されるもう１個のヘテロ原子を含むことができる。
ＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２仲介性輸送を阻止する若干の化合物もＮＭＤＡ受容体上のグリシン結合部位に結合する。このような結合は結合アッセイによって確認できる、例えば放射標識グリシンを、神経細胞または脳組織から調製できるようなＮＭＤＡ受容体標本と接触させておく。例えばグリムウッド（Ｇｒｉｍｗｏｏｄ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１巻、９２３−９３０ページ（１９９２）を参照されたい。より詳細に述べるならば、このようなＮＭＤＡ受容体は適切な動物の選択された脳組織から膜フラクションを分離することによって調製できる。適切な脳組織としてはどの哺乳動物からでも分離される皮質および海馬がある（ただしこれに制限されるものではない）。一般的方法、例えばホモゲニゼーションおよび遠心分離法などを用いて、これらから膜フラクションを作ることができる。このような膜にあるＮＭＤＡ受容体をマイルドな洗剤、例えば約０．１％ないし約０．５％サポニンなどを用いて処理して内因性グリシンまたはグルタメートを除去する。このようなアッセイに用いるグリシンを適切な同位元素、例えば14Ｃまたは3Ｈで放射標識する。
それから非特異的結合による定量放射能を、放射標識グリシンの総合的（すなわち特異的および非特異的）結合による定量放射能から差し引くことによって、放射標識グリシンの特異的結合を決める。非特異的結合による放射能は、放射標識グリシン、および１００倍過剰の非放射標識グリシン、または“コールド”グリシンと接触させたＮＭＤＡ受容体含有膜フラクションによる放射能量を定量することによって決定される。放射標識グリシンの総合的結合による放射能は、非放射標識グリシンのないところでＮＭＤＡ受容体に結合した放射標識量を測定することによって決定される。例えばジクロロキヌレン酸またはＬ−６８９，５６０などのアミノ酸の標識類似体を用いて、ＮＭＤＡ受容体上のグリシン部位に結合を測定することができる。グリムウッドら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９巻、９２３−９３０ページ（１９９２）を参照されたい。
或る化合物の、ＮＭＤＡ受容体上グリシン部位への結合を測定するもう一つの方法は、その化合物が［3Ｈ］ＭＫ−８０１のＮＭＤＡ受容体への結合を変える能力を測定することである。ＭＫ−８０１はグリシンとは異なる部位でＮＭＤＡ受容体に結合するが、グリシンまたはその他のリガンドのグリシン部位への結合はＭＫ−８０１の結合をアロステリック的に変えることができる。この技術の利点は、これによってＮＭＤＡ受容体グリシン結合部位においてアゴニスト活性を有する化合物と拮抗活性を有する化合物とを区別できることである。特に、このアッセイでアゴニスト活性を有する化合物はＭＫ−８０１結合を高める；逆に、拮抗活性を有する化合物はＭＫ−８０１結合を阻止する。スターナー（Ｓｔｅｒｎｅｒ）およびカリガロ（Ｃａｌｌｉｇａｒｏ）、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ．２１巻、３５１ページ（１９９５）；カリガロら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６０巻、２２９７−２３０３ページ（１９９３）。
本発明によって確認された化合物効果を測定するために用いられるイオン−フラックス  アッセイは、ＮＭＤＡ受容体を通過するカルシウムフラックスを増強または抑制する能力に関係する。この試験は、膜結合ＮＭＤＡ受容体およびグリシントランスポーターを含む適切な細胞培養物で行われる。このような細胞は一般的に神経細胞を含め、脳などの中枢神経系の神経細胞、それから誘導される細胞系、および誘導またはトランスフェクトされてＮＭＤＡ受容体を発現するその他のあらゆる細胞を含める。このような試験に用いられるカルシウムは一般に45Ｃａ同位元素である、ただしその他のカルシウム測定法、例えばカルシウム結合蛍光法なども用いることができる。しかしカルシウムをモニターし、本発明の化合物の個別的添加の結果としてカルシウムフラックスは増強または阻止される。この系の利点は、それによりＮＭＤＡ受容体上のグリシン部位およびグリシントランスポーターと接触する化合物の、ＮＭＤＡ受容体機能に与える正味効果をモニターできることである。
ＮＭＤＡ受容体アゴニストでもあるＧｌｙＴ−１インヒビターは、グリシントランスポーターの阻止によるＮＭＤＡ受容体発現シナプスにおけるグリシン濃度を高めるのに加えて直接ＮＭＤＡ受容体活性も高めることによって、精神分裂病を寛解し、認識力を高めるようにはたらく。ＮＭＤＡ受容体拮抗物質でもあるグリシントランスポーターインヒビターは、にもかかわらず、もしもグリシン輸送抑制によるグリシン増加がＮＭＤＡ拮抗性を上回るならば、精神分裂病における効果おける認識力改善効果を保持することができる。ＮＭＤＡ受容体拮抗物質活性がグリシントランスポーターの阻止による増加した細胞外グリシンの効果を上回る場合、これらの化合物は、卒中後、または神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ痴呆、ハンチントン病、などの結果として起きる細胞損傷および細胞死を制限するのに有用である。例えばチョイ、同上、コイルおよびパットファルケン（Ｐｕｔｔｆａｒｃｋｅｎ）同上；リプトンおよびローゼンベルグ、同上；ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ（１９９６年５月１３日）、４１−４７ページ；リーソン（Ｌｅｅｓｏｎ）、神経科学のための薬剤計画、Ａ．Ｐ．コジコウスキー（Ａｌａｎ  Ｐ．Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ）編集、１９９３）、３３９−３８３ページ。
上に述べたように、本発明の化合物は多数の薬理作用を有する。これらの化合物の相対的有効性は下記を含める多数の方法で評価することができる：
１．ＧｌｙＴ−１およびＧｌｙＴ−２トランスポーターによって仲介される活性を比較する。この試験は、（ａ）ＧｌｙＴ−１トランスポーターに対してより活性で、したがって精神分裂病、を治療または阻止し、認識力を増加し、記憶を高めるのにより有用であり、または（ｂ）ＧｌｙＴ−２トランスポーターに対してより活性で、したがっててんかん、ペインまたはけいれんを治療または抑制するのにより有用である化合物を決定する。
２．ＮＭＤＡ受容体結合を試験する。この試験は、この部位に十分な結合があるかどうか、拮抗活性かまたはアゴニスト活性か、を確認して、このような結合の薬理学的効果のその後の試験の正当性を保証する。
３．一次神経組織培養におけるカルシウムフラックスを増加または減少させる化合物の活性を試験する。カルシウムフラックスを増加する試験化合物は（ａ）ＮＭＤＡ受容体において拮抗活性をほとんどまたは全くもたず、ＧｌｙＴ−１トランスポーター阻止によるグリシン活性の強化に影響を与えるはずがないか、または（ｂ）もしもＮＭＤＡ受容体との直接的相互作用をほとんどもたないＧｌｙＴ−１インヒビターと比較して顕著な増加が認められるならば、その化合物は受容体アゴニストであるか、どちらかである。上記のどちらの場合でも、試験により精神分裂病の治療または阻止、認識力増加または記憶増加の効果が確認される。これに対して、カルシウムフラックスを減少させる試験化合物は、グリシン輸送の阻止によりグリシン活性を増加させるその化合物のいかなる活性よりも、受容体拮抗活性が上回る、という正味効果を有する。この場合、試験により、卒中後、またはその他の虚血性状態後に起きる細胞損傷および細胞死を制限または阻止し、または神経変性疾患による細胞損傷を制限または阻止する活性が確認される。
下記の実施例は本発明をさらに詳しく説明するが、もちろん決してその範囲を制限するものではない。
実施例１
この実施例はＱＴ−６細胞を増殖させトランスフェクトするために用いる方法および材料を明らかにする。
ＱＴ−６細胞はアメリカ培養コレクション（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７０８）から入手した。ＱＴ−６を増殖させる完全ＱＴ−６培地は、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ；以後“シグマ”とする）に１０％塩酸トリプトース；５％ウシ胎児血清（シグマ）；１％ペニシリン−ストレプトマイシン（シグマ）；および１％滅菌ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；シグマ）を補充したものである。ＱＴ−６細胞の増殖またはトランスフェクションのために必要なその他の溶液は次のものである：
ＤＮＡ／ＤＥＡＥ ミックス：  ＴＢＳ  ４５０μｌ、ＤＥＡＥ  デキストラン（シグマ）  ４５０μｌ、およびＴＥ中ＤＮＡ（４μｇ）１００μｌ、ここでＤＮＡは適した発現ベクター中のＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂ、ＧｌｙＴ−１ｃ、またはＧｌｙＴ−２を含む。
用いたＤＮＡは以下で定義されるものであった。
ＰＢＳ：１ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む標準燐酸緩衝液、ｐＨ７．４。０．２μフィルターで滅菌。
ＴＢＳ：溶液Ｂ  １ｍｌ、溶液Ａ  １０ｍｌ；蒸留Ｈ2Ｏで１００ｍｌとする；濾過滅菌し、４℃で保存する。
ＴＥ：０．０１Ｍ  トリス、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。
ＤＥＡＥ  デキストラン：シグマ、＃Ｄ−９８８５。ＴＢＳ中０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）ＤＥＡＥ  デキストランからなる保存溶液を作った。この保存溶液を濾過滅菌し、１ｍｌ部分づつ凍結した。
クロロキン：シグマ、＃Ｃ−６６２８。Ｈ2Ｏ中１００ｍＭクロロキンからなる保存溶液を作った。この保存溶液を濾過滅菌し、０．５ｍｌ部分づつ凍結保存した。
溶液Ａ（１０Ｘ）：
ＮａＣｌ                ８．００ｇ
ＫＣｌ                  ０．３８ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4            ０．２０ｇ
トリス塩基              ３．００ｇ
この溶液をＨＣｌでｐＨ７．５に調節し、蒸留Ｈ2Ｏで１００．０ｍｌとし、濾過滅菌し、室温で保存した。
溶液Ｂ（１００Ｘ）
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  １．５ｇ
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  １．０ｇ
溶液を蒸留Ｈ2Ｏで１００ｍｌとし、濾過滅菌した；それから溶液を室温で保存した。
ＨＢＳＳ：  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2・Ｈ2Ｏ；ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する。
使用した標準増殖および継代法は次のようである：細胞を２２５ｍｌフラスコ中で増殖させた。継代のために、細胞を温ＨＢＳＳ（各洗浄ごとに５ｍｌ）で２回洗った。０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液２ｍｌを加え、培養物を渦巻き状に回し、それからトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を速やかに吸引した。培養物を約２分間（細胞が離昇するまで）インキュベートし、それからＱＴ−６培地１０ｍｌを加え、フラスコを渦巻き状に回したりフラスコの底をたたいたりしてさらに細胞を（固着場所から）移動させた。細胞を取り出し、１５ｍｌの円錐管に移し、１０００×ｇで１０分間遠心分離し、ＱＴ−６培地１０ｍｌに再懸濁した。サンプルを取り、計数し、細胞をさらに１×１０5細胞／ｍｌまでＱＴ−６培地で希釈し、継代細胞の各２２５ｍｌフラスコにその培地６５ｍｌを加えた。
トランスフェクションは次のように調製したｃＤＮＡを用いて行った：
使用したラットＧｌｙＴ−２（ｒＧｌｙＴ−２）クローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタゲン）にＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローン化されるｒＧｌｙＴ−２の全配列を含む（リウら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻、２２８０２−２２８０８ページ（１９９３））。ＧｌｙＴ−２をその後ｐＲｃ／ＲＳＶベクターに次のようにサブクローンした：ｒＧｌｙＴ−２配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］のヌクレオチド２０８−７０２に相当するＡＰＣＲ断片を、５’プライマーとしてオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ  ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］を用い、３’プライマーとしてオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧ  ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］を用いることによって、増幅した。これは、翻訳出発部位の直ぐ上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を作り出した。３’末端にＫｐｎＩ部位を含むこの断片を、ＧｌｙＴ−２のコーディング配列の残りを含むＫｐｎＩ−ＰｖｕＩＩ断片と共に、あらかじめＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋に三部分連結でクローン化した。このクローンからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片をその後ｐＲｃ／ＲＳＶベクターにサブクローンした。生成した構成物はｐＲｃ／ＲＳＶ発現ベクターにｒＧｌｙＴ−２核酸のヌクレオチド２０８−２７２０［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］を含んでいた。
使用したヒトＧｌｙＴ−１ａ（ｈＧｌｙＴ−１ａ）クローンは、キム（Ｋｉｍ）らがＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５巻、６０８−６１７ページ、１９９４、に報告したように、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片としてｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡ）にクローン化したｈＧｌｙＴ−１ａの配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］ヌクレオチド位置１８３から２１０８を含む。このｃＤＮＡの遺伝暗号をもつＧｌｙＴ−１ａは実際にラットからのＧｌｙＴ−１ａ配列の最初の１７ヌクレオチド（最初の６アミノ酸に相当する）を含んでいた。ヒトＧｌｙＴ−１ａの配列がこの領域で異なるかどうかを調べるために、ｈＧｌｙＴ−１ａの５’領域、ヌクレオチド１から２１２までをギプコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）（ガイザースバーグ、ＭＤ）から提供された５’ＲＡＣＥシステムを用いてｃＤＮＡ末端の急速増幅によって得た。その遺伝子に特異的なプライマー：５’ＣＣＡＣＡＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＣＣＧ  ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］（これはｈＧｌｙＴ−１ａ配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］のヌクレオチド５５８−５３９に相当する）を用いてヒト脳ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成をプライムした、そして遺伝子特異的プライマー：５’ＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣ  ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］（ｈＧｌｙＴ−１ａ配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］のヌクレオチド４５４−４３１に相当する）を用いてＰＣＲ増幅を行った。ＧｌｙＴ−１ａのこの５’領域の配列決定の結果、コーディング配列の最初の１７ヌクレオチドはヒトおよびラットＧｌｙＴ−１ａでは同じであることが確認された。
使用したヒトＧｌｙＴ−１ｂ（ｈＧｌｙＴ−１ｂ）クローンは、キムらが報告したように（同上）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片としてｐＲｃ／ＣＭＶベクターにクローン化されたヒトＧｌｙＴ−１ｂ配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］、ヌクレオチド位置２１３から２２７４までを含む。
使用したヒトＧｌｙＴ−１ｃ（ｈＧｌｙＴ−１ｃ）クローンは、キムらが報告したように（同上）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片としてｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インビトロゲン）にクローン化されたヒトＧｌｙＴ−１ｃ配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３］、ヌクレオチド位置２１３から２３３６までを含む。このクローンからのｈＧｌｙＴ−１ｃのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片をその後ｐＲｃ／ＲＳＶベクターにサブクローンした。トランスフェクション実験をＧｌｙＴ−１ｃで、ｐＲｃ／ＲＳＶおよびｐＲｃ／ＣＭＶ発現ベクター両方において行った。
トランスフェクションのために次の４日間操作を用いた：
１日目、ＱＴ−６細胞を１００ｍｍ皿において完全ＱＴ−６培地１０ｍｌ中１×１０6の細胞密度で培養した。
２日目、培地を吸引し、細胞をＰＢＳ１０ｍｌで、その後ＴＢＳ１０ｍｌで洗った。ＴＢＳを吸引し、その後ＤＥＡＥ／ＤＮＡミックス１ｍｌをそのプレートに加えた。そのプレートをフード内で５分おきに渦巻き状に回した。３０分後、ＱＴ−６培地中８０μＭクロロキン８ｍｌを加え、培養物を３７℃、５％ＣＯ2で２．５時間インキュベートした。培地をその後吸引し、細胞を完全ＱＴ−６培地で２回洗い、それから完全ＱＴ−６培地１００ｍｌを加え、細胞をインキュベーターに戻した。
３日目、細胞を上記のようにトリプシン／ＥＤＴＡで取り出し、９６ウェルアッセイプレートのウェルに、各ウェルに約２×１０5細胞を入れた。
４日目、グリシン輸送を実施例２に記載のように分析試験した。
実施例２
この実施例はトランスフェクテド培養細胞によるグリシン取り込みを測定する方法を説明する。
実施例１によって増殖させた一過性ＧｌｙＴトランスフェクテド細胞または対照（“模擬”）細胞をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液（ＨＢＳ）で３回洗った。模擬細胞は、トランスフェクション操作においていかなるｃＤＮＡも排除したことを除き、ＧｌｙＴ−トランスフェクテド細胞と正確に同じように処理された。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、その後５０ｎＭ［3Ｈ］グリシン（１７．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および、（ａ）潜在的競合物質なし、（ｂ）１０ｍＭ非放射性グリシン、または（ｃ）或る濃度の候補薬剤、のいずれかを含む溶液を加えた。候補薬剤の濃度範囲を用いて、効果５０％をもたらす候補薬剤の濃度を計算するデータを作った（例えば、ＩＣ50、これはグリシン取り込みを５０％阻止する薬剤濃度である）。細胞をさらに２０分間３７℃でインキュベートし、その後、細胞を吸引し、氷冷ＨＢＳで３回洗った。細胞を収穫し、シンチラントをその細胞に加え、細胞を３０分間振とうし、細胞の放射能をシンチレーションカウンターを用いて計数した。行ったアッセイによって、データを、候補薬剤と接触させた細胞および接触させなかった細胞との間で比較し、またＧｌｙＴ−１活性を有する細胞とＧｌｙＴ−２活性を有する細胞との間で比較した。
陽性対照の結果を図１Ａおよび１Ｂの棒グラフに示す、ここでは［3Ｈ］グリシン取り込みが、模擬、ＧｌｙＴ−１ａ、ＧｌｙＴ−１ｂ、ＧｌｙＴ−１ｃ、およびＧｌｙＴ−２トランスフォームド細胞について示されている。陽性対照の結果は３回行われた代表的実験の平均値±ＳＥＭとして示される。グリシントランスポーターのどれで形質転換した細胞培養物もすべて、非トランスフェクテド対照細胞に比し、グリシン輸送活性の有意な増加を証明した。
実施例３
この実施例は実施例２の方法の応用、およびＧｌｙＴ−１またはＧｌｙＴ−２トランスポーターを互いに他と比べて選択的に調節する薬剤類の確認を示すものである。
下記の薬剤類について、上記実施例１および２の操作によって、ＧｌｙＴ−１ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３］またはＧｌｙＴ−２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］を含むｐＲｃ／ＣＭＶでトランスフェクトしたＱＴ−６細胞、そしてＧｌｙＴ−１ｃまたはＧｌｙＴ−２の一過性発現を示したＱＴ−６細胞それぞれにおけるグリシン輸送の阻止または増強を試験した。
0004246797.tif 000006
0004246797.tif 000007
これらの化合物で得られたデータは次の表のようである：
0004246797.tif 000008
よって、化合物ＺＡ、ＺＢ、ＺＣ、ＺＤ、およびＺＥの各々は、ＧｌｙＴ−２に比べてＧｌｙＴ−１ｃに選択的であり、一方化合物ＺＦは逆の選択性を示す。
実施例４
この実施例は、化合物と、ＮＭＤＡ受容体上のグリシン部位との相互作用を測定するための結合アッセイを説明する。
［3Ｈ］グリシンとＮＭＤＡ−グリシン部位との直接結合は、グリムウッドら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４１巻、９２３−９３０ページ（１９９２）；ヨネダら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２巻、１０２−１１２ページ（１９９４）の方法によって行われた。
結合試験用の膜の調製は、一連の標準法の使用を必要とした。特に記載がない限り、組織およびホモジネートは氷上に保持し、遠心分離は４℃で行った。ホモジナイゼーションは組織／ホモジネートの温度上昇の発生を最小にするように行われた。膜の調製は下記の段階を含んでなる：
１．４匹のラットを殺し、断頭する；皮質および海馬を取り出す。
２．組織を２０容量の０．３２Ｍスクロース／５ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ７．４）中で、ガラス／テフロン  ホモジナイザーの２０ストロークによってホモジナイずする。
３．組織を１０００×ｇで１０分間遠心分離する。上澄液を取って置く。ペレットを少量の緩衝液中に再懸濁し、再びホモジナイズする。ホモジナイズしたペレットを遠心分離し、その上澄液を前の上澄液と合一する。
４．合一した上澄液を４０，０００×ｇで３０分間遠心分離する。上澄液を棄てる。
５．ペレットを２０容量の５ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ７．４）に再懸濁する。その懸濁液を氷上で１時間撹拌する。懸濁液を４００００×ｇで３０分間遠心分離する。上澄液を棄て、ペレットを少なくとも２４時間凍結する。
６．段階５からのペレットを、０．１％サポニン（ｗ／ｖ；シグマ  ケミカル社、セントルイス）を含むトリス−アセテート緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌとする。２０分間氷上に放置する。その懸濁液を４０，０００×ｇで３０分間遠心分離する。ペレットをサポニン不含有緩衝液に再懸濁し、再び遠心分離する。そのペレットを濃度１０ｍｇ／ｍｌになるようにトリス−アセテート緩衝液に再懸濁し、部分に分けて凍結する。
７．３日目に、膜の一部を取り、氷上で融解する。その懸濁液を１０ｍｌトリス−アセテート緩衝液で希釈し、４０，０００×ｇで３０分間遠心分離する。洗浄段階をさらに２回繰り返し、全部で３回洗浄する。最終的ペレットを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにグリシン不含有トリス−アセテート緩衝液に再懸濁する。
結合試験は、約１５０μｇの膜タンパク質と０．５ｍｌ容量中５０ｎＭ［3Ｈ］グリシンとを含むエッペンドルフ管で行った。薬剤をアッセイ緩衝液（５０ｎＭトリス−アセテート、ｐＨ７．４）またはＤＭＳＯに溶解した（最終濃度０．１％）。膜を氷上で３０分間インキュベートし、ワットマンＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルターによる濾過または遠心分離（１８０００×ｇ、２０分間）によって、結合した放射性リガンドを遊離放射性リガンドから分離した。フィルターを速やかに、氷冷５ｍＭトリス−アセテート緩衝液で洗った。フィルターを乾燥し、シンチレーション管に置き、計数した。ペレットをデオキシコレート／ＮａＯＨ（０．１Ｎ）溶液中で一晩溶解し、中和し、放射能をシンチレーション計数によって測定した。
ＮＭＤＡ−グリシン部位に関する第二の結合試験は［3Ｈ］ジクロロキヌレン酸（ＤＣＫＡ）および上記のように調製した膜を用いた。ヨネダら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６０巻、６３４−６４５ページ（１９９３）を参照されたい。結合アッセイは、グリシン部位を標識するために［3Ｈ］ＤＣＫＡを用いたことを除き、上の［3Ｈ］グリシンに関して記載した通りに行った。［3Ｈ］ＤＣＫＡの最終的濃度は１０ｎＭであった、そしてアッセイを氷上で１０分間行った。
ＮＭＤＡ−グリシン部位のために用いる第三の結合試験は、［3Ｈ］ＭＫ−８０１（ジゾシルピン；パルマーおよびバーンズ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２巻、１８７−１９６ページ（１９９４））の結合を測定することによって、その部位に対するリガンド類の親和性を間接的に評価する方法を用いた。その試験のための膜類の調製は上と同じである。結合アッセイは拮抗物質とアゴニストとを別々に検出することを可能にした。
第三の結合試験は、次のように拮抗物質を確認するために行われた：膜１００μｇを９６ウェルプレートのウェルに加えた。このときグルタメート（１０μＭ）およびグリシン（２００ｎＭ）および種々の濃度の被検リガンドも一緒に加えた。アッセイは２．５ｎＭ［3Ｈ］ＭＫ−８０１（２３．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（これはＮＭＤＡ受容体と関連するイオンチャンネルに結合する）の添加によって開始された。アッセイの最終的容量は２００μｌであった。アッセイは室温で１時間行われた。ＴＯＭＴＥＣ収穫器を用いて結合放射能を遊離放射能から濾過により分離した。拮抗物質活性は、被検リガンドの濃度増加につれてＮＭＤＡ受容体に結合する放射能濃度が減少することによって示された。この試験の陽性対照の結果は図２Ａのグラフに描かれている、ここで種々濃度のグリシン部位結合物質Ｌ−６８９，５６０の効果（ｘ軸上のＬ−６８９，５６０のモル濃度のｌｏｇとしてあらわされる）は生起した［3Ｈ］ＭＫ−８０１結合に関して示される；それはｙ軸の１分間あたりのカウント数としてあらわされている。約５０％効果をおこす拮抗物質濃度は約５×１０−7Ｍであった。
第三の結合試験は、グリシン濃度が２ｎＭだったことを除き、上と同じ試験を行うことによってアゴニストを確認するために行われた。アゴニスト活性は、被検リガンドの濃度増加につれてＮＭＤＡ受容体と結合する放射能が増加することによって示された。この試験の陽性対照の結果は図２Ｂのグラフに示される；ここではグリシンの種々濃度（ｘ軸、グリシンのモル濃度のｌｏｇ）の効果が、１分間あたりのカウント数（ｙ軸）であらわされる生起した［3Ｈ］ＭＫ−８０１結合に関して示されている。約５０％効果を起こすアゴニスト（ここではグリシンそのもの）の濃度は約１０−6Ｍであった。
実施例５
この実施例は一次神経細胞におけるカルシウムフラックス（ＮＭＤＡ受容体活性化の指標である）を測定するためのプロトコルを説明する。
カルシウムフラックス測定は一次神経細胞培養物中で行われる。それは無菌解剖装置、顕微鏡および指定の培地を必要とする標準的方法および技術を用いて妊娠ラットから切り離されたラット胎児皮質から調製される。使用したプロトコルはルー（Ｌｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、６２８９−６２９３ページ（１９９１）から採用したものであった。
指定の培地はあらかじめ下記の処方にしたがって作られる：
0004246797.tif 000009
切除を開始する前に、組織培養プレートをポリリジンで処理し（１００μｇ／ｍｌ、少なくとも３０分間、３７℃）、蒸留水で洗った。また、２組の滅菌した粗製解剖器具（鋏およびピンセット）および数組のより繊細な解剖器具をオートクレーヴにかけた。１対の鋏およびピンセットを７０％アルコールを入れた滅菌ビーカーに入れ、解剖台上に置いた。冷燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を有するペトリ皿を解剖場所の近くの氷上に置いた。
妊娠ラット（Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ、スコットデール、ＰＡ、から到着したときにＥ１５またはＥ１６、解剖時にはＥ１７または１８）を、意識がなくなるまでＣＯ2／乾燥氷室に置いた。そのラットを取り出し、支持台にピンで止め、解剖領域に綿棒で７０％アルコールを塗布し、皮膚を切り、関心とする領域から除去した。第二の鋏を用いて切り開き、洋膜中の出産前子ラットを取り出した。洋膜の繊維束（ｓｔｒｉｎｇ）を冷ＰＢＳに入れ、無菌フードに移した。
出産前子ラットを洋膜から取り出し、断頭した。頭蓋を除去し、脳を注意深く取り出し、冷ＰＢＳを含むきれいなペトリ皿に入れた。この時点で、解剖顕微鏡で進めることが必要であった。脳を、皮質がプレートに接触するように返し、解剖器具と皮質との間の組織（線状体およびその他の脳部分）をえぐり取った。海馬および嗅覚球を皮質から切り離した。それからその組織をひっくりかえし、ピンセットで髄膜を除去した。残る組織（皮質）を指示された培地を含む小ペトリ皿に入れた。
組織を解剖用メスで切り刻み、火で仕上げたガラスピペットでつき砕いた。細切し、つき砕かれた組織を滅菌プラスチックチューブに移し、細い口をもつガラスピペットでつき砕いた。細胞を適切な計数チェンバーで数えた。２４ウェル−プレートにおいて、指示培地５００μｌを入れた１ウェルに約２００，０００細胞をプレーティングした。グリア細胞増殖を阻止するために、培養物に１００μＭ５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦＤＵＲ、シグマ（Ｆ−０５０３））または５０μＭウリジン（シグマ（Ｕ−３００３））、そして５０μＭ  ＦＤＵＲを加えた。
標準カルシウムフラックス  アッセイのための皮質培養物を２４ウェル−プレートを用いて上記の指示培地中で７日間増殖させ、培地の半分を交換することによって、血清含有培地（ＭＥＭ中、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、０．６％グルコース）を１回供給した。培養物はｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間インキュベーションした後に用いた。培養物をＨＣＳＳ（すなわち、ＨＰＬＣ水中に１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１５ｍＭグルコースを含み、ＮａＯＨ（これもＨＰＬＣ水で作った）によってｐＨ７．４に調節したＨＥＰＥＳ緩衝対照塩溶液）で３回すすいだ。３回目の洗浄において、培養物を３７℃で２０ないし３０分間インキュベーとした。
45Ｃａ++（１．５×１０6ｄｐｍ／ｍｌ）および試験のための薬剤またはコントロールを含む溶液をＨＣＳＳで調製した。上記45Ｃａ++溶液を加える直前に、培養物をＨＣＳＳで２回洗い、２５０μｌの45Ｃａ++溶液を各ウェルに、１プレートに一度にに加えた。培養物を室温で１０分間インキュベートし、ＨＣＳＳで３回すすぎ、各ウェルに１ｍｌのシンチレーション液を加え、その後少なくとも１５分間振とうした。保有放射能をシンチレーションカウンターで計数した。
標準カルシウムフラックス実験の結果を図３に示す。一次神経皮質細胞培養物を上記のようにＮＭＤＡ（５００μＭ）の存在下で、またはＮＭＤＡ（５００μＭ）および拮抗物質Ｌ６８９，５６０（５０μＭ）の存在下でインキュベートした。図３の棒グラフで示されるデータは、45Ｃａ++の蓄積を示している。データは代表的実験（３回づつ行われた）の平均値±ＳＥＭであり、反復しても同様な結果を与えた。よって、その結果は、ＮＭＤＡが45Ｃａ+-の蓄積を起こすこと、およびこの効果がグリシン部位拮抗物質Ｌ−６８９，５６０によってブロックされることを証明した。
実施例６
この実施例は、非哺乳動物細胞におけるグリシントランスポーターの発現を哺乳動物細胞と比較した比較研究を示す。
この比較研究は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１；ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１；またはＬＭ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１、２）と比較した、非哺乳動物細胞（ＱＴ−６；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０７８、またはスタインバッハ（Ｊ．Ｈ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ）、麻酔科、ワシントン大学医学部、セントルイス、ＭＯ）におけるグリシン輸送の効率の評価を含める。この場合、以下に説明するトランスフェクションのＤＥＡＥデキストラン−または燐酸カルシウム法かどちらかを用いて、グリシントランスポーターｃＤＮＡを上記ホストの各々にトランスフェクトした。使用したグリシントランスポーターｃＤＮＡはヒトグリシントランスポーター１ｃ（“ｈＧｌｙＴ１ｃ”；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ；３）またはラットグリシントランスポーター２（“ｒＧｌｙＴ２”；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ；４）であった。これらをトランスフェクション実験前に、実施例１で既述したように、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）またはｐＲｃ／ＲＳＶ（インビトロゲン）にそれぞれ挿入した。
培地および増殖条件：この比較研究ではすべての被検細胞に次の３種類の試薬を用いた：
・ハンクス−バランス塩溶液（ＨＢＳＳ；実施例１に示される）、以下のものを除いて、化学物質はこのＨＢＳＳ試薬には含まれない：ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、およびＮａＨＣＯ3。ＨＢＳＳ試薬はＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（カタログ番号１４１８０−０２０）から購入した。これは１０倍濃縮物である。１０×ＨＢＳＳ試薬を滅菌水で１×に希釈し、その後冷蔵庫に保存した。
・トリプシン／ＥＤＴＡ、０．０５％トリプシンと０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡからなり、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから購入した（カタログ番号２５３００−０６２）。
・トリプシン（０．２５％）、２．５％トリプシンの保存溶液をＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（カタログ番号１５０９０−０４６）から購入し、希釈剤として１×ＨＢＳＳを用いて１×トリプシン溶液（０．２５％）を作った。
トリプシンの１×溶液を−２０℃で４０ｍｌ部分づつ保存した。上記の細胞を増殖させるためには異なる培地及び増殖条件が必要であった、その異なる培地及び増殖条件を以下に記す；
・ＱＴ−６細胞に関して：ＱＴ−６細胞を培養するために用いる培地（“ＱＴ−６培地”）は毎週新たに作った。それらは下記を含んでいた：（１）５００ｍｌの培地１９９（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１１５０−０５９）；（２）６０ｍｌの燐酸トリプトース（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１８０５０−０２１）；（３）３０ｍｌのウシ胎児血清（ＪＲＨ１２１０３７８Ｐ）；（４）；６ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１５０７０−０１４）；（５）６ｍｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；滅菌）（シグマ、カタログ番号Ｄ２６５０）。
ＱＴ−６細胞を増殖させるために用いる培地は次のものである：ＱＴ−６細胞を上記のＱＴ−６培地に５％ＣＯ2および３７°で湿気のある大気中で培養した。週に２回、比較的高い細胞密度（１×１０5細胞／ｍｌ以上）で次のように継代培養した：（１）各２２５ｃｍ2フラスコのＱＴ−６細胞を温（３７°）ＨＢＳＳで２回洗った（各洗浄に５ｍｌ）；（２）トリプシン／ＥＤＴＡ  ２ｍｌを各フラスコに加え、フラスコを渦巻き状に回した。（３）トリプシン／ＥＤＴＡを２分後に吸引した；（４）それから細胞のフラスコを３７°で１０分間インキュベートし、その後培地１０ｍｌを加え、フラスコを渦巻き状に回したりフラスコの底をたたいたりして細胞を移動させた；（５）離れた細胞をその後すりつぶし、５０ｍｌ円錐管に加えた；（６）細胞を血球計で計数し、それから１×１０5細胞／ｍｌに希釈した；そして（７）各２２５ｃｍ2フラスコに希釈した細胞６５ｍｌを満たした。
・ＣＨＯ−Ｋ１細胞に関して：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養に用いる培地（“ＣＨＯ培地”）は次のものを含んでいた：（１）５００ｍｌ  ＨＡＭＳ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  カタログ番号２１０１６−０１９）；（２）６０ｍｌ  ＦＢＳ（ＪＲＨカタログ番号１２１０３７８Ｐ）；；（３）６ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１５０７０−０１４）。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養に用いる方法は次のようであった：ＣＨＯ−Ｋ１細胞を５％ＣＯ2および３７°、湿気のある大気中で、２２５ｍｌフラスコ中の上記ＣＨＯ培地に培養した。そして次の方法を用いて週に２回継代培養した：（１）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の各２２５ｃｍ2フラスコを温（３７°）ＨＢＳＳ（各洗浄に５ｍｌづつ）で２回洗った；（２）０．２５％トリプシン２ｍｌを各フラスコに加え、フラスコを渦巻き状に回した；（３）２分後トリプシンを吸引した；（４）その後各フラスコを１０−１５分間インキュベートした；（５）各フラスコを観察し、細胞が上昇するときを確認し、その後新鮮培地１０ｍｌを加え、フラスコをたたいて細胞を移動させた；（６）細胞懸濁液を新鮮なフラスコ培地に１：１５の比（ＣＨＯ培地５６ｍｌに対し４ｍｌ）で加えた。
・ＣＯＳ−７細胞に関して：ＣＯＳ−７細胞の培養に用いる培地（“ＣＯＳ培地”）は次のものを含んでいた：（１）５００ｍｌ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  カタログ番号１１９６０−１０）；（２）６０ｍｌ  ＦＢＳ（ＪＲＨカタログ番号１２１０３７）；（３）６ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１５０７０−０１４）。
ＣＯＳ−７細胞の培養に用いる方法は上でＣＨＯ−Ｋ１細胞に関して開示したものと同じである、ただしＣＯＳ−７細胞は週に１回、１：５の比（ＣＯＳ培地４８ｍｌに対し懸濁液１２ｍｌ）で継代培養し、湿気のある１０％ＣＯ2大気中で３７°に保持する。
・ＬＭ細胞に関して：ＬＭ細胞の培養に用いる培地（“ＬＭ培地”）は次のものを含んでいた：（１）５００ｍｌ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１１９６０−１０）；（２）６０ｍｌ  ＦＢＳ（ＪＲＨカタログ番号１２１０３７８ｐ）；（３）６ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１５０７０−０１４）；（４）６ｍｌ  Ｌ−グルタミン溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号２５０３０−０８１）。
ＬＭ細胞の培養に用いる方法は上にＣＨＯ−Ｋ１細胞に関して開示したものと同様であった、ただしＬＭ細胞を１：１０の比（ＬＭ培地５４ｍｌに対し６ｍｌ）で週に２回継代培養し、湿気のある１０％ＣＯ2大気中で３７°に保持する。
トランスフェクション法：上記のように培養した細胞をトランスフェクトし、個々のグリシントランスポーターの特性を研究した；よって、各トランスポーターをコードするｃＤＮＡを個々に適切なホスト細胞系に上記のようにトランスフェクトした。使用するトランスフェクト法並びにトランスフェクトされる特定の核酸によって細胞は実際的範囲で異なる結果を有することがわかっているため、各細胞とトランスフェクトＤＮＡとの組み合わせは２種類のトランスフェクション法、すなわち以下に記載するＤＥＡＥデキストランおよび燐酸カルシウムに関して試験した；
・ＤＥＡＥデキストラン  トランスフェクション：ＤＥＡＥデキストランによる細胞のトランスフェクションは細胞皿上で細胞密度５０ないし７５％で、完全培地中で下記の材料および方法を用いて行われた：
・溶液“Ａ”
ＮａＣｌ                ８．００ｇ
ＫＣｌ                  ０．３８ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4            ０．２０ｇ
トリス塩基              ３．００ｇ
ＨＣｌでｐＨ７．５に調節する。
蒸留水Ｈ2Ｏで１００．０ｍｌとする。濾過滅菌；室温で保存する。
・溶液“Ｂ”
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  １．５ｇ
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  １．０ｇ
蒸留水Ｈ2Ｏで１００ｍｌとする。濾過滅菌；室温で保存。
・ＴＢＳ＋：１００×Ｃａ2+／Ｍｇ2+溶液“Ｂ”１ｍｌ、および塩溶液“Ａ”１０ｍｌを加え、蒸留水Ｈ2Ｏで１００ｍｌとする。
濾過滅菌し、４℃で保存する。
・ＤＥＡＥ溶液：組織培養級Ｈ2Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ
（シグマ、Ｄ−９８８５）；濾過滅菌、１０ｍｌ部分づつ−２０℃で保存する。
・クロロキン溶液：組織培養級Ｈ2Ｏ中１００ｍＭクロロキン
（シグマ、Ｃ６６２８）；濾過滅菌し、１ｍｌ部分づつ−２０℃で保存する。
・滅菌ＤＮＡ：適切な発現ベクター中の関心とするＤＮＡ、１μｇ／μｌ。
ＤＥＡＥデキストラン  トランスフェクション法の１日目には、翌日のトランスフェクションのために細胞を次のようにプレートした：完全培地１０ｍｌおよび２×１０6細胞を１０ｃｍ2皿に加えた。
２日目、細胞を次のようにトランスフェクトした：
１．ＴＢＳ＋および完全培地を水浴で温めた。
２．ＤＥＡＥ混合物を一皿ベースで作った：（ａ）１．９ｍｌ  ＴＢＳ＋に１０μｇＤＮＡを加え、よく混合した；（ｂ）１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥデキストラン１００μｌを加え、よく混合した。
３．各フラスコを１０ｍｌＴＢＳ＋で２回洗った。
４．皿の残留ＴＢＳ＋を１０ｍｌピペットで取った。
５．ＤＥＡＥ混合物を加えた、２ｍｌ／皿。
６．さらを室温で３０分間インキュベートした。
７．８ｍｌ完全培地および１０μｌ１００ｍＭクロロキンを加えた。
８．皿を３７℃で２−２．５時間インキュベートした。
９．培地を１０ｍｌ完全培地に取り換え、インキュベーターに戻した。
３日目、皿に次のように再プレートし、アッセイに用いた：
１．培地を各皿から除去し、細胞をＨＢＳＳで１回洗った。
２．各皿に１ｍｌトリプシン／ＥＤＴＡを加え、皿を全方向に傾け、溶液が底部表面全体を覆うようにする。トリプシン／ＥＤＴＡを吸引した。洗った細胞を室温で約５分間放置した。フラスコを軽くたたいて細胞を移動させた。
３．完全培地５ｍｌを各皿に加え、細胞を集めた。
４．細胞を血球計を用いて数えた。その細胞を９６ウェル−ディッシュあたり３×１０6細胞の密度でプレートした。プレーティング中、皿をときどきかき混ぜた。
４日目、トランスフェクテド細胞を下記のように分析試験した。
・燐酸カルシウム  トランスフェクション：燐酸カルシウムによる細胞のトランスフェクションは、完全培地中５０ないし７５％細胞密度の細胞皿上で下記の材料および方法を用いて行われた；
・２×ＢＳＳ（５０ｍＭ  ＢＥＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；２８０ｍＭ  ＮａＣｌ；および１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4）、を室温で１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．９５ないし６．９８に調節した；０．４５ｍｍニトロセルロースフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過滅菌した；部分に分け、−２０℃で保存した。
・２．５Ｍ  ＣａＣｌ2（滅菌溶液、４°で保存）
・滅菌ＤＮＡ：適切な発現ベクター中、関心とするＤＮＡ、１μｇ／μｌ。燐酸カルシウム−トランスフェクション法の１日目、細胞を、翌日のトランスフェクションのためにプレートする。それは完全培地１０ｍｌと２×１０6細胞を１０ｃｍ2皿に一緒に入れることからなる。
２日目、細胞を次のようにトランスフェクトした：
１．トランスフェクションの約１時間前に、細胞に一皿あたり培地９ｍｌを再供給した（ＱＴ−６細胞の場合は燐酸トリプトースを省いた）。
２．トランスフェクションのために１０μｇのｃＤＮＡを０．４５ｍｌのＨ2Ｏに加えた。２．５ＭＣａＣｌ2溶液５０μｌを加えた。その混合物に２×ＢＳＳ溶液５００μｌを加え、直ちに渦状に回して混合し、それから室温で２０分間静置した（これを以後は“ＤＮＡミックス”と呼ぶ）。微細な沈殿が生成した。
３．ＤＮＡミックスを細胞に滴下し、プレートを渦巻き状に回し、それから一晩インキュベーターに戻した。一般的に、３％ＣＯ2インキュベーターを用いた。
３日目、細胞を次のように再プレートし、分析試験した。
１．細胞を朝チェックした。それらは全般的に少し縮んだようにみえた。沈殿が見られた。細胞に完全培地を再供給し、日常的インキュベーション条件に戻した。
２．４時間後、細胞を培地から取り出し、ＨＢＳＳで１回洗った。
３．１ｍｌトリプシン／ＥＤＴＡを各皿に加え、その皿を全方向に傾けて、溶液が底部表面全体を覆うようにした。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を吸引した。細胞を室温で約５分間放置した。各フラスコをおだやかにたたいて細胞を移動させた。
４．完全培地５ｍｌを各皿に加え、細胞を集めた。
５．血球計を用いて細胞を数えた。あらかじめポリーリジン（シグマ）でコーティングした９６ウェルプレートに、各ウェルあたり約３０，０００細胞の密度で細胞をプレートした。プレーティング中その細胞をしばしばかき混ぜた。
４日目、トランスフェクテド細胞を以下に示すように分析試験した。
グリシン輸送の測定：次の材料を用いて、上で生成したトランスフェクテド細胞への［3Ｈ］グリシンの取り込みを、非トランスフェクテド細胞におけるそれと比較して測定した：
0004246797.tif 000010
・［3Ｈ］−グリシン、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入、カタログ番号ＴＲＫ７１（１ｍＣｉ／ｍｌ、１８．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
・グリシン、シグマか社ら購入。
グリシン輸送の測定法：グリシン取り込み試験の前日、９６−ウェル  プレートに３ないし６００万個の細胞をプレートした、すなわち約３０，０００ないし６０，０００細胞／ウェルの密度である。ウェルはあらかじめポリーリジン（シグマ）でコーティングしておいた。グリシン取り込み実験の日に、下記の段階を行った：
１．細胞をＨＢＳで洗った（ＨＢＳ＋グルコースはあらかじめ３７℃に温めてある）。
２．ＨＢＳ＋グルコース９０μｌをウェルに加えた、それをその後３７℃で１０分間インキュベートした。
３．１０ｍＭ非標識グリシンを含む、または含まない５０ｎＭ［3Ｈ］グリシンを、必要に応じて種々濃度の競合薬剤を加えて、各ウェルに加えた。
４．細胞をその後２０分間３７℃でインキュベートした。
５．ウェルを吸引し、氷冷ＨＢＳで３回洗った。
６．シンチラントを加え、ウェルを３０分間振とうし、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＬＳＣで計数すした。
グリシン輸送データの分析：生成データを次のように定義した：
１．“総輸送”は、非標識グリシンを含まず、５０ｎＭ［3Ｈ］グリシンを含む培地でインキュベートした細胞に関連する放射能（“ｃｐｍ”）を意味する。
２．“非特異的輸送”は、５０ｎＭ［3Ｈ］グリシンと１０ｍＭ非標識グリシンの存在下でインキュベートした細胞に関連する放射能（“ｃｐｍ”）を意味する。
３．“特異的輸送”は総輸送から非特異的輸送を引いたものを意味する。
データは、市販のタンパク質アッセイ  キット（Ｐｉｅｒｃｅ社からのＢＣＡキット（カタログ番号２３２２５））を用いて測定したアッセイ−ウェル中に存在する総タンパク質に関して標準化された。本明細書でデータは特異的ｃｐｍ／ｍｇタンパク質としてあらわされる。
データをさらに処理して、“ｆｏｌｄ  ｓｕｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ”を決定した、すなわち擬似トランスフェクテド細胞を用いた結果を基にしてトランスフェクテド細胞のグリシン取り込みに関連する放射能を得るために必要な倍数を決定した；その処理データは下表に示される。“擬似”トランスフェクテド細胞を作るには、グリシントランスポーターｃＤＮＡでなく、“無関係な”ｃＤＮＡ（すなわち、グリシン輸送に影響しないもの）をホスト細胞にトランスフェクトした；この目的のためにＣＤ８をコードするｃＤＮＡを日常的に用いた。
0004246797.tif 000011
上に認められるように、結果は、ｆｏｌｄ  ｓｕｔｉｍｕｌａｔｉｏｎとしてあらわした特異的取り込みを擬似トランスフェクテド細胞と比較して示す。シンボル“ＮＤ”は、上記の実験が行われなかったことを示す。
あらゆる場合に、トランスフェクテド哺乳動物細胞はトランスフェクテド非哺乳動物細胞よりも非効率であった。その若干の比較は、四分の一ないし二分の一の効率という大きい差を示し、請求の方法が驚くべきプラスの特性を有することを示した。例えば、ＤＥＡＥデキストラン  トランスフェクション法を用いてトランスフェクトしたｈＧｌｙＴ１ｃの発現は、ＱＴ−６トランスフェクテド細胞を用いた場合にはＣＯＳ−７トランスフェクテド細胞に比較して約２０％ないし約１００％もより効率的であった；そしてＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクテド細胞に比較すると約３００％ないし約１５００％もより効率的であった。
本発明を好適実施態様に力点を置いて説明したとはいえ、好適組成物および方法における変更は可能であり、本発明を本明細書に詳細に記載されたものとは異なって実施し得ることは、熟練せる当業者には自明である。よって、本発明は配列リストにしたがう、請求によって決定される本発明の精神および範囲内に含まれるすべての変更を含むものである。
配列表
配列番号:1
配列の長さ: 2136
配列の型: 核酸
鎖の数: 二本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000012
配列番号:2
配列の長さ: 2202
配列の型: 核酸
鎖の数: 二本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000013
配列番号:3
配列の長さ: 2364
配列の型: 核酸
鎖の数: 二本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000014
0004246797.tif 000015
配列番号:4
配列の長さ: 2817
配列の型: 核酸
鎖の数: 二本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000016
0004246797.tif 000017
配列番号:5
配列の長さ: 28
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000018
配列番号:6
配列の長さ: 29
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000019
配列番号:7
配列の長さ: 20
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000020
配列番号:8
配列の長さ: 24
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直線状
配列
0004246797.tif 000021
【図１Ａ】
0004246797.tif 000022
【図１Ｂ】
0004246797.tif 000023
【図２Ａ】
0004246797.tif 000024
【図２Ｂ】
0004246797.tif 000025
【図３】
0004246797.tif 000026