(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体を有し、前記固定支持体上に離散的に２次元配列させた化学修飾部が設けられ、前記固定支持体が、炭素系材料からなる固定層と、前記固定層を支持する支持体とからなる、ポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、
前記固定層を離散的に２次元配列し、前記固定層の表面を化学修飾することを特徴とするポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項２】
前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をエッチングにより選択的に除去することを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項３】
前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をレーザ加工により選択的に除去することを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用な、ポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
基体上にＤＮＡ等のポリヌクレオチドの微小スポットが固定されたものをマイクロアレイと呼ぶが、図７に示すように、従来のマイクロアレイ１は、あらかじめ調製しておいたＰＣＲ増幅したＤＮＡの微小スポット２００を基体１０の固定支持体１００表面に２次元配列し、固定化している（例えば、特許文献１参照）。また、固定支持体１００は、スライドガラスまたはシリコンなどの平面基板からなり、図８に示すようにその表面にはＤＮＡが固定化できるようにPoly-L-lysine等の高分子層３００が塗布形成されている。
【０００３】
しかし、スライドガラスまたはシリコンなどの平面基板表面にPoly-L-lysine等の高分子層３００を塗布形成してＤＮＡを固定化する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成過程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題がある。そこで、ＤＮＡを安定に固定するために、図９のようにダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなる固定支持体１０１の表面を官能基で化学修飾しているものがある。（例えば、特許文献２参照）。図９において、１０１は固定支持体、３０１は化学修飾部、２００はＤＮＡの微小スポットである。
【０００４】
以上のような高分子層を形成した基体や化学修飾された基体に、スポッティング装置を用いて、ＤＮＡの微小スポットを高密度で配列させる。スポッティング装置は、ペン先のような形状をしたスポットピンを持ち、吸引したＤＮＡを基体に接触してスポッティングする方式や、インクジェット式のスポットピンを持ち、基体に非接触でＤＮＡをスポッティングする方式がある。
【０００５】
一般的なマイクロアレイの大きさは２５ｍｍ×７６ｍｍであり、これにスポット径１００〜３００μｍ、スポットピッチ２００μｍ程度でスポッティング装置によりＤＮＡを配列している。
【０００６】
これら従来のマイクロアレイを用いて遺伝子解析する方法は以下のとおりである（例えば、特許文献３参照）。まず、既知の異なる多数のポリヌクレオチド、例えば標本ＤＮＡを２次元配列したマイクロアレイを作成する。つぎに、第１の蛍光色素で標識された健常者の細胞から取り出した検体ＤＮＡを前記マイクロアレイ上の標本ＤＮＡとハイブリタイズさせる。その後、所定の溶液で前記マイクロアレイを洗浄すると、マイクロアレイ上の標本ＤＮＡとハイブリタイズされなかった検体ＤＮＡは除去され、ハイブリタイズされた検体ＤＮＡだけが標本ＤＮＡの各微小スポット部に残る。蛍光分析装置を用いて、第１の蛍光色素を励起する波長の第１の励起レーザを走査しながらこのマイクロアレイ上の各微小スポットに照射する。すると検体ＤＮＡの残った部分のみ、第１の蛍光色素から蛍光を発する。この蛍光強度を検出し、標識信号を得る。
【０００７】
上記と同様の処理を、第２の蛍光色素で標識された遺伝子疾患を有する患者の細胞から取り出した検体ＤＮＡに関しても行い、第２の励起レーザの照射により発生した蛍光の検出結果を表す標識信号を得る。健常者の検体ＤＮＡから得られた標識信号と患者の検体ＤＮＡから得られた標識信号との比から、特異的な微小スポットを求めることにより、患者に特異なＤＮＡが何であるかを解析することができる。
【０００８】
図１０に従来の蛍光分析装置を示す。４０１は第１の励起レーザを出力する第１のレーザ光源、４０２は第２の励起レーザを出力する第２のレーザ光源である。この第１のレーザ光源４０１および第２のレーザ光源４０２から発せられた励起光は反射ミラー４０３、第１のダイクロイックミラー４０４、プリズム４０５を通過後、第１のスキャナミラー４０６、および第２のスキャナミラー４０７で走査され、レンズ４０８を通過してマイクロアレイ１上のポリヌクレオチドの微小スポットを照射する。前記第１または第２の励起レーザの照射によりポリヌクレオチドの微小スポットから発生した蛍光を、レンズ４０８、第２のスキャナミラー４０７、第１のスキャナミラー４０６、プリズム４０５、フィルタ４０９、ピンホール４１０を通過させて、第２のダイクロイックミラー４１１で波長分離後、第１のフォトマルチメータ４１２または第２のフォトマルチメータ４１３に入射させ検出する構成になっている。
【０００９】
【特許文献１】
特表平１０−５０３８４１号公報
【００１０】
【特許文献２】
特開２００１−１３９５３２号公報
【００１１】
【特許文献３】
特開平２００１−０７４６５８号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のマイクロアレイおよびポリヌクレオチドを固定化するための基体では、各微小スポットの形状ばらつきや各微小スポット間距離のばらつきがあり、遺伝子解析プロセスの中で後工程となる測定・解析工程での不具合や測定精度が低くなるという問題があった。また、各微小スポットの形状ばらつきや各微小スポット間距離のばらつきによって、各微小スポットの大きさや、微小スポット間距離が制限され、マイクロアレイの高密度化が図れないといった問題点があった。
【００１３】
また、従来のマイクロアレイおよびポリヌクレオチドを固定化するための基体では、その固定支持体の外形公差が０．３ｍｍほどある。したがって、固定支持体に対する化学修飾部の２次元配列位置が、基体毎に図１１（ｂ）のようにオフセットしたり、図１１（ｃ）のように傾いたりする。さらに、この化学修飾部に固定化したポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列も、マイクロアレイ毎にオフセットしたり、傾いたりする。そのため、マイクロアレイを蛍光分析装置で測定する際、励起レーザが微小スポットの配列位置からずれて走査することがあり、マイクロアレイごとに測定結果のばらつきが生じるという問題があった。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、ポリヌクレオチドの微小スポット形状を均一にするとともに微小スポットを均一配列させることにより、高精度の遺伝子解析ができるとともに、より高密度にポリヌクレオチドの微小スポットを配列でき、より多くの遺伝子解析を一度におこなうことができるポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を提供することにある。
【００１５】
また、本発明の別の目的は、マイクロアレイの蛍光分析において励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射でき、蛍光分析による測定精度が低下しないようにすることができるポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を提供することにある。
【００１６】
【００１７】
【００１８】
【００１９】
【００２０】
【００２１】
【００２２】
【００２３】
【００２４】
【００２５】
【００２６】
【００２７】
【００２８】
【００２９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体を有し、前記固定支持体上に離散的に２次元配列させた化学修飾部が設けられ、前記固定支持体が、炭素系材料からなる固定層と、前記固定層を支持する支持体とからなる、ポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、前記固定層を離散的に２次元配列し、前記固定層の表面を化学修飾することを特徴とするものである。
【００３０】
このようにするため、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去し、残った固定層上を化学修飾することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を持つポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造できる。
【００３１】
また、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をエッチングにより選択的に除去することを特徴とするものである。
【００３２】
このようにエッチングを用いることで、エッチングの際に用いるマスクにしたがって固定層を微細に２次元配列することができる。
【００３３】
また、請求項３記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をレーザ加工により選択的に除去することを特徴とするものである。
【００３４】
このようにレーザ加工を用いることで、マスクを用いずに固定層を微細に２次元配列することができるので、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なる他種のマイクロアレイを容易に作成することができる。また、固定層はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、レーザによって容易に選択除去できる。
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的実施例を図に基づいて説明する。
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
（第１実施例）
図１は第２実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。図２は第２実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。図において、１０２は固定層、１０３は支持体、３０１は化学修飾部である。
本実施例において、固定支持体は、固定層１０２とこれを支持する支持体１０３とから構成されている。固定層１０２は図５のように微小エリアに分かれ、各微小エリアは離散的に２次元配列されている。化学修飾部３０１は、この２次元配列された固定層１０２の上に設けられている。
【００４４】
本実施例の基体１０の製造方法としては、図３に示すように、まず支持体１０３の表面全体に固定層１０２を形成した（ステップ１）。ついで、固定層１０２が図２のように離散的に配列するように、固定層１０２を選択的に除去した（ステップ２）。さらに、固定層１０２上に化学修飾を施した（ステップ３）。ステップ１では、２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラスまたはシリコン製の支持体１０３上に、メタンガス（ＣＨ４）を原料にプラズマＣＶＤを用いて厚さ０．２μｍのダイヤモンドライクカーボンを形成した。ステップ２では、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法を用いて加工をおこなった。使用したマスク形状に応じて、１２５μｍピッチで２次元配列されたφ５０μｍの固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。ステップ３では、第１実施例のステップ１と同等の化学修飾処理をおこなった。
【００４５】
図４は、本実施例で作製した基体１０にＤＮＡをスポッティングして固定して得られたマイクロアレイ１の断面図である。図において、２００はＤＮＡの微小スポットである。このマイクロアレイ１に対して相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。その結果、高密度で実装した１０万個のＤＮＡについて、解析することができた。数千個程度の解析しかできなかった従来のマイクロアレイに比べて、大幅に高密度化が達成できた。
【００４６】
（第２実施例）
第３実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、第２実施例の図３のステップ２において、レーザを用いて加工をおこなって作製したものである。
用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定層１０２表面でφ７５μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて１２５μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。その結果、１２５μｍピッチで２次元配列されたφ５０μｍの固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。ステップ３では、第１実施例のステップ３と同等の化学修飾処理をおこなった。
【００４７】
第１実施例と同様に、本実施例の基体にＤＮＡをスポッティングし、相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。その結果、第２実施例と同様に、高密度で実装した１０万個のＤＮＡについて、解析することができた。数千個程度の解析しかできなかった従来のマイクロアレイに比べて、第１実施例と同様に大幅に高密度化が達成できた。
【００４８】
（第３実施例）
図５は第４実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。同図に示すように、本実施例の基体には、その端部に化学修飾部３０１の２次元配列位置を示す位置決めマーク５０１〜５０３を設けている。位置決めマーク５０１は化学修飾部３０１の２次元配列のＸ軸方向の開始点、位置決めマーク５０２はＸ軸方向の終了点、位置決めマーク５０３はＹ軸方向の開始点を示している。そのほかの構成は、第１，第２実施例の基体と同様であり、本実施例の基体も、ガラスまたはシリコン製の支持体１０３と、支持体１０３上に離散的に２次元配列されたダイヤモンドライクカーボンからなる固定層２０２と、固定層２０２上に設けられた化学修飾部３０１とを備えている。
【００４９】
この基体の製造装置は、２次元方向に走査可能な加工用レーザを備えている。
加工用レーザとしては、ＹＡＧレーザやＹＡＧレーザの高調波（ＳＨＧ，ＴＨＧ，ＦＨＧ）レーザなどが利用できる。また、半導体レーザを用いることも可能である。２次元方向に走査する手段として、２軸ステージや、２つのスキャナミラーや、ステージとスキャナミラーの組み合わせなどを用いることができる。
【００５０】
基体の製造方法としては、まず支持体１０３表面全体に固定層１０２を形成した（ステップ１）。ついで、固定層１０２が図２のように離散的に配列するように、加工用レーザによって固定層１０２を選択的に除去した（ステップ２）。つづいて、固定層１０２の２次元配列のＸ軸方向の開始点を示す位置決めマーク５０１、Ｘ軸方向の終了点を示す位置決めマーク５０２、およびＹ軸方向の開始点示す位置決めマーク５０３を加工用レーザによってマークした（ステップ３）。
さらに、固定層１０２上に化学修飾を施した（ステップ４）。
【００５１】
ステップ１では、２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラスまたはシリコン製の支持体１０３上に、メタンガス（ＣＨ４）を原料にプラズマＣＶＤを用いて厚さ０．２μｍのダイヤモンドライクカーボンを形成した。
【００５２】
ステップ２で用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定層１０２表面でφ７５μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて１２５μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。その結果、１２５μｍピッチで２次元配列された５０μｍ角の固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。
【００５３】
ステップ３では、ステップ２の状態から支持体１０３の位置を動かさず、加工用レーザの走査位置指令だけをコントロールしてマークした。その際、位置決めマークの線幅が細くなるように、レーザの集光径が固定層１０２表面でφ１０μｍになるように集光後、マークした。ステップ２とステップ３の順序は逆であってもかまわない。
【００５４】
ステップ４では、ステップ３の支持体を取り出し、特許文献１を参考に、化学修飾をおこなった。
【００５５】
作製した基体に、あらかじめ調製しておいた標本ＤＮＡをスポッティング装置によって固定し、１０万個のＤＮＡ微小スポットを持つマイクロアレイを作製した。その後、蛍光標識した検体ＤＮＡとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。
【００５６】
蛍光分析の方法としては、図６に示すように、まず励起用レーザを基体の端部に走査・照射して、その反射光の変化をフォトマルチメータで検出することにより、位置決めマークの位置を特定した（ステップ１）。ついで、位置決めマークの位置をもとに、ポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置座標を演算した（ステップ２）。その後、微小スポットの２次元配列位置座標をもとに、励起用レーザ光の走査方向を補正してマイクロアレイに照射した（ステップ３）。
【００５７】
従来の位置決めマークを設けていないマイクロアレイと、本発明の位置決めマークを設けたマイクロアレイとを比較するため、それぞれ同一検体ＤＮＡについて２０枚のマイクロアレイを用いて蛍光分析をおこなった。その結果、本発明の位置決めマークを設けたマイクロアレイでは、測定のばらつきが１／５に抑えられた。
【００５８】
なお、上記各実施例では、サンプルとしてＤＮＡを使用したが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡの他のポリヌクレオチドを使用しても同様の効果が得られた。
【００５９】
また、本実施例においては、レーザにより位置決めマークを施したが、同時にバーコードや２次元コードのような識別コードを基体端部に形成することも可能である。
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【発明の効果】
以上述べたように、請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、固定層のある部分のみ化学修飾されるので、離散的に２次元配列された化学修飾部を設けることができる。
【００６７】
また、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、エッチングを用いるため、エッチングの際に用いるマスクの寸法精度にしたがって固定層を微細に２次元配列することができる。
【００６８】
また、請求項３記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、レーザ加工を用いるため、固定層を微細に２次元配列することができる。
【００６９】
【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図２】  本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図３】  本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を示す模式図である。
【図４】  本発明の第２実施例を示すマイクロアレイの断面図である。
【図５】  本発明の第４実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図６】  本発明のマイクロアレイの蛍光分析方法を示す模式図である。
【図７】  従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図８】  従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図９】  従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図１０】  従来の蛍光分析装置の模式図である。
【図１１】  従来のマイクロアレイの問題点を示す模式図である。
【符号の説明】
１  マイクロアレイ
１０  ポリヌクレオチドを固定化するための基体
１００  スライドガラスまたはシリコンからなる固定支持体
１０１  ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定支持体
１０２  ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定層
１０３  ガラスまたはシリコン製の支持体
２００  ＤＮＡの微小スポット
３００  Poly-L-lysine等の高分子層
３０１  化学修飾部
４０１  第１の励起レーザを出力する第１のレーザ光源
４０２  第２の励起レーザを出力する第２のレーザ光源
４０３  反射ミラー
４０４  第１のダイクロイックミラー
４０５  プリズム
４０６  第１のスキャナミラ−
４０７  第２のスキャナミラー
４０８  レンズ
４０９  フィルタ
４１０  ピンホール
４１１  第２のダイクロイックミラー
４１２  第１のフォトマルチメータ
４１３  第２のフォトマルチメータ
５０１〜５０３  位置決めマーク
【図１】
0004296479.tif 000002
【図２】
0004296479.tif 000003
【図３】
0004296479.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0004296479.tif 000010
【図１０】
0004296479.tif 000011
【図１１】
0004296479.tif 000012