(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性条件下でキレート化剤とコラーゲン質組織を接触させ、続いて、酸と接触させ、続いて、緩衝化塩溶液と接触させ、この後、水を用いてすすぎ工程を行う化学的清浄処理により得られる生体再造形可能チューブ状補綴であって、
チューブに形成された、小腸の粘膜下層由来の加工組織マトリックスの単一層を含み、該加工組織マトリックスは本質的に略９３乾燥重量％の無細胞テロペプチドコラーゲンと、略５乾燥重量％以下の糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非コラーゲン状タンパク質、並びにＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸とで成り、本質的には細胞および細胞破片を含まないことを特徴とする生体再造形可能チューブ状補綴。
【請求項２】
単一層の両端部が重なり、チューブ周囲の少なくとも５％である結合領域を形成することを特徴とする請求項１記載の生体再造形可能チューブ状補綴。
【請求項３】
結合領域がＥＤＣで架橋された請求項２記載の生体再造形可能チューブ状補綴。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組織工学の分野にある。本発明は動物源に由来する洗浄された組織物質から調製された生物工学作成移植片補綴に指向される。本発明の生物工学作成移植片補綴は、加工された組織マトリックスの細胞適合性、強度および生体再造形性を保持する方法を用いて調製される。生物工学作成移植片補綴は移植、修復にまたは哺乳動物宿主における用途で使用される。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
組織工学の分野は、正常および病理学的哺乳動物組織において構造および機能の関係を理解するために工学の方法をライフサイエンスの原理と組み合わせる。組織工学の目標は組織機能を回復、維持および改良するための生物学的代替の開発および最終的適用である。
【０００３】
コラーゲンは身体における主要な構造蛋白質であって、全身体蛋白質のほぼ３分の１を構成する。それは、皮膚、腱、骨および歯の有機物質のほとんどを含み、ほとんどの他の身体構造において繊維状封入体として起こる。コラーゲンの特性のいくつかはその高い引張強度；そのイオン交換能力；部分的には螺旋構造による可能な抗原決定基のマスキングによるその低い抗原性；およびその低い展延性、半透性および可溶性である。さらに、コラーゲンは細胞接着のための天然物質である。これらの特性および他の特性はコラーゲンを、移植可能な生物学的代替物および生体再造形可能補綴の組織工学および製造のために適した物質とする。
【０００４】
外植哺乳動物組織からコラーゲン質組織および組織構造を得る方法および組織から補綴を構築する方法は、外科的修復のためまたは組織もしくは器官置換のために広く調査されてきた。哺乳動物組織を置換または修復するのに首尾よく用いることができる補綴を開発するのは依然として研究者の継続的目標である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
腸粘膜下組織のごとき生物学的に由来するコラーゲン質材料は組織修復または置換で用いるために多くの研究者によって提案されてきた。生体補綴適用のためのラミネートを形成するのに用いることができる腸コラーゲン（ＩＣＬ）の単一無細胞層を生成させるための近位ブタ空腸の機械的および化学的加工方法が開示されている。該加工は天然コラーゲン構造を維持しつつ細胞および細胞夾雑物を除去する。加工された組織マトリックスの得られたシートは、所望の仕様を持つ多層積層構築体を製造するのに使用される。本発明者らは、軟組織修復のための積層パッチの効果ならびに血管移植片としてのチューブ化ＩＣＬの使用を調べた。この材料は必要な物理的支持体を提供し、周囲の天然組織に一体化し、宿主細胞が侵入するようになることができる。イン・ビボでの再造形は機械的一体化を許さない。弾性率、縫合保持およびＵＴＳのごときインプラントの保有かつ機能的特性は、ＩＣＬ層の数および架橋条件を変化させることによって具体的要件に対して操作することができる重要なパラメーターである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、哺乳動物宿主に移植されると、修復、増加または置換身体部分または組織構造として働くことができ、宿主細胞による再造形と同時におこる制御された生分解を受けるであろう組織作成補綴に指向される。かくして本発明の補綴は、置換組織として用いると二重の特性を有する。まず、それは代替身体部分として機能し、第２に、代替身体部分として依然として機能しつつ、それは宿主細胞の内方成長のための再造形鋳型として機能する。これを行うためには、本発明の補綴材料は、それ自体またもう１つの加工された組織マトリックスに結合されて患者に対する移植のための補綴を形成することができる哺乳動物由来コラーゲン質組織から開発された加工組織マトリックスである。
【０００７】
本発明は、洗浄された組織材料から組織作成補綴を作成する方法に指向され、ここに、該方法は補綴の生体再造形性を維持しつつ層を一緒に結合するのに接着剤、縫合またはステープルを必要としない。用語「加工組織マトリックス」および「加工組織材料」は動物源、好ましくは哺乳動物から獲得され、随伴組織から機械的に清浄され、細胞、細胞夾雑物から化学的に清浄され、非コラーゲン質細胞外マトリックス成分が実質的になくされた天然の通常の細胞組織を意味する。加工組織マトリックスは、非コラーゲン質成分が実質的になくて、その天然マトリックス構造、強度および形状の多くを維持する。本発明の生体作成移植片を構成するための好ましい組成物は、限定されるものではないが、腸、大腿筋膜、心膜、硬膜、およびコラーゲン質組織マトリックスを含む他の平坦または平面構造組織を含めたコラーゲンを含む動物組織である。これらの組織マトリックスの平面構造はそれらが本発明の生体作成移植片を調製するように容易に清浄、操作および組み立てることができるようにする。同一の平坦シート構造およびマトリックス組成を持つ他の適当なコラーゲン質組織源は他の動物源において当業者によって同定され得る。
【０００８】
本発明の生体作成移植片を調製するためのより好ましい組成物は小腸の粘膜下膜に由来する腸コラーゲンである。小腸についての適当な源はヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヤギまたはウマのごとき哺乳動物生物であるが、ブタの小腸は好ましい源である。
【０００９】
本発明の補綴を調製するための最も好ましい組成物は、ブタ小腸の粘膜下膜に由来する加工腸コラーゲン層である。加工腸コラーゲン層を得るには、ブタの小腸を収集し、伴う腸管膜組織を腸から大いに切開する。粘膜下膜は、好ましくは、対向ローラーの間で原料腸材料を機械的に圧搾して筋肉層（筋肉膜）および粘膜（粘膜）を除去することによって小腸の他の層から分離しまたは脱ラミネートする。小腸の粘膜下膜は周囲の組織よりも硬くてしっかりしており、ローラーは粘膜下組織からのより柔らかい成分を圧搾する。後記する実施例においては、Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーンを用いてブタ小腸から粘膜下膜を機械的に収集し、次いで、化学的に清浄して清浄組織マトリックスを得る。この機械的かつ化学的に清浄された腸コラーゲン層を本明細書中では「ＩＣＬ」と言う。
【００１０】
加工されたＩＣＬは実質的に無細胞テロペプチドコラーゲン（約９３乾燥重量％）であり、約５乾燥重量％未満の糖蛋白質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非コラーゲン質蛋白質およびＤＮＡおよびＲＮＡのごとき核酸を含み、細胞および細胞夾雑物は実質的にない。加工ＩＣＬはそのマトリックス構造およびその強度の多くを保持する。重要なことには、組織マトリックスの成体再造形性は部分的には清浄プロセスによって保持される。というのは、それはコラーゲンの生体再造形性に悪影響を与えるであろう結合洗剤残渣がないからである。加えて、コラーゲン分子はそのテロペプチド領域を保持した。というのは該組織は洗剤プロセスの間に酵素での処理を受けないからである。
【００１１】
補綴デバイスのコラーゲン層は、ＩＣＬの２以上の層のごとき同一コラーゲン材料、またはＩＣＬの１以上の層および大腿筋膜の１以上の層のごとき異なるコラーゲン材料に由来するものでよい。
【００１２】
加工組織マトリックスは生物工学形成移植片補綴の製造に先立って物理的または化学的に処理または改質することができる。シェーピング、延伸および緩和によるコンディショニング、または洗浄組織マトリックスの穴あけのごとき物理的改質ならびに結合成長因子、選択された細胞外マトリックス成分、遺伝物質、および生体再造形に影響するであろう他の剤のごとき化学的修飾を行うことができ、身体部分の修復を処理し、改質しまたは置き換える。
【００１３】
ＩＣＬは本発明の生体作成移植片補綴の生産用の最も好ましい出発材料であるので、後記する方法はＩＣＬを含む生体作成移植片補綴を生産するのに好ましい方法である。
【００１４】
最も好ましい具体例において、ブタ小腸の粘膜下膜は、本発明の生体作成移植片補綴のための出発材料として利用される。ブタの小腸を収集し、その随伴する組織を除去し、次いで、機械的作用および水を用いる洗浄の組合せを用いて粘膜下膜から脂肪、筋肉および粘膜層を強制的に除去する腸清浄マシーンを用いて機械的に清浄される。機械的作用は、小腸がそれらの間で処理されると粘膜下膜からの連続層を圧縮し、該層を除く一連のローラーとして記載することができる。小腸の粘膜下膜は周囲の組織よりも比較的硬くてしっかりしており、ローラーは粘膜下組織から柔軟成分を圧搾する。マシーン清浄の結果は、腸の粘膜下層のみが残るものであった。
【００１５】
機械的に清浄した後、化学的清浄処理を使用して、細胞およびマトリックス成分を除去し、好ましくは室温にて無菌条件下で行う。次いで、腸をルーメンの長さ方向に切断し、次いで、ほぼ１５ｃｍ2シートセクションに切断される。材料を秤量し、腸材料に対する溶液の約１００：１ｖ／ｖの比率にて容器に入れる。国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／４９９６９（その開示をここに一体化させる）に開示された方法のごとき最も好ましい化学的清浄処理において、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加によって、アルカリ性条件下で、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）のごときキレート化剤とコラーゲン質組織を接触させ、続いて、酸と接触させ、ここに該酸は塩、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する塩酸（ＨＣｌ）を含有し、続いて、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０  ｍＭリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）のごとき緩衝化塩溶液と接触させ、最後に水を用いるすすぎ工程を行う。
【００１６】
各処理工程は、好ましくは、回転または震盪プラットフォームを用いて行う。すすいだ後、次いで、水を各容器から除去し、ＩＣＬを滅菌吸収剤タオルを用いて過剰の水でにじませる。この時点で、ＩＣＬを−８０℃にて、滅菌リン酸緩衝液中で４℃にて凍結貯蔵するか、あるいは、補綴の製造で用いるまで乾燥することができる。もし乾燥貯蔵すべきならば、ＩＣＬシートを平坦プレート、好ましくは剛直なポリカーボネートシートのごときプレートまたは膜のような表面上で平坦化させ、材料のアブルミナル側からのいずれのリンパ系タグもスカルペルを用いて除去し、雰囲気室温および湿度にて層流フード中でＩＣＬシートを乾燥させる。
【００１７】
ＩＣＬは、その意図した用途に最終的には応じて補綴の形状にて補綴として使用されるべき種々のタイプの構築体を製造するのに使用することができる平面シート構造である。本発明の補綴を形成するには、加工マトリックス材料の生体再造形性を保持する方法を用いて構築体を製造しなければならないが、また置換組織としてその性能においてその強度および構造特徴を維持することもできる。加工組織マトリックスシートは、もう１つのシートと接触するように層とされ、あるいはチューブとされ、それ自体にまかれる。接触の面積は層が接触する結合領域である。結合領域は、患者の細胞が補綴に住み着いて引き続いてそれを生体再造形して新しい組織を形成するまで、臨床的移植において取り扱われる間およびおよび最初の治癒相の間において縫合および延伸に耐えることができなければならない。導管またはダクトとして使用する場合、特に全身血流の収縮期および弛緩期圧力下で血管移植片として使用する場合、結合領域はそれが含有するまたは通過する物質の圧力に耐えることができなければならない。
【００１８】
好ましい具体例において、本発明の補綴デバイスは加工組織マトリックスの単一の一般に矩形シートから形成されたチューブ状構築体である。加工組織マトリックスは、１つのエッジが対向エッジに適合し重複するように圧延される。重複は結合領域として働く。本明細書中で用いる「結合領域」は、層を相互にその上に置き、自己ラミネーションおよび化学的結合によって十分に一緒に保持されるように処理された同一または異なる加工組織マトリックスの２以上の層の間の接触の領域を意味する。
【００１９】
例えば、ＩＣＬの多層シート構築体を用いて、心膜パッチまたはヘルニア修復デバイスのごとき体壁構造を修復し、チューブ状構築体を用いて、血管系または消化系管構造のごとき導管として働くチューブ状器官を修復することができ、あるいは神経再生をガイドするためのニューロン成長チューブとして使用することができる。また、本発明の補綴は組織バルキングおよび増加のために移植することができる。ＩＣＬの多数の層をバルキングまたは強度表示のために構築体に一体化させることができる。移植に先立ち、層をさらにコラーゲンまたは他の細胞外マトリックス成分、ヒアルロン酸、またはヘパリン、成長因子、ペプチドまたは培養細胞で処理しまたはコートすることができる。
【００２０】
好ましい具体例において、ＩＣＬシートをチューブ状補綴に形成する。ＩＣＬチューブは種々の直径、長さおよび層の数にて製造することができ、その使用のための適用に応じて他の成分を配合することもできる。チューブ状ＩＣＬ構築体は血管移植片として用いることができる。この適用では、移植片は密な継ぎ目を形成する結合領域として作用するための少なくとも５％重複を持つ少なくとも１つの層を含み、管腔表面を好ましくはヘパリンまたは血栓を予防する剤で処理する。血栓を予防する他の手段は血管構築体を製造する分野で公知である。もう１つの血管適用において、チューブ状ＩＣＬ構築体は、静脈自己移植片を身体内に移植し、移植された静脈のための外部支持体が望ましい場合に、外部ステントとして用いることができる。もう１つの血管適用において、チューブ状ＩＣＬ構築体は金属ステント上に形成されたステントのためのカバーを供する。移植すると、ＩＣＬは、ステント用の平滑保護カバリングを供して、配置の間に宿主組織に対するさらなる損傷を妨げることによって受容者に益する。また、チューブ状ＩＣＬ補綴を用いて、胃腸管セクション、尿道、ダクト等のごとき他の通常にチューブ状の構造を修復しまたは置き換えることもできる。また、細胞外マトリックス成分、成長因子または培養細胞を充填した神経成長チューブを製造した場合、それは神経系修復で使用することもできる。
【００２１】
チューブ状構築体を形成するには、形成された構築体の直径を決定するであろう直径測定でマンドレルを選択する。マンドレルは好ましくは断面が円筒または卵型であり、ガラス、ステンレス鋼または非反応性の医療グレードの組成物で作成される。マンドレルは直線、曲線、角度をつけたものであってよく、それは分岐または分岐点、あるいは多数のこれらの性質を有することができる。形成されるべきチューブ状構築体で意図した層の数は、ＩＣＬがマンドレルの回りまたはそれ自体にわたって巻かれる回数の数に対応する。ＩＣＬを巻くことができる回数の数は加工ＩＣＬシートの幅に依存する。２層チューブ状構築体では、シートの幅は少なくとも２回マンドレルの周りにシートを巻くのに十分でなければならない。該幅は、マンドレルの周りにシートを必要な回数の数及び結合領域として作用する重複部としての更なるパーセンテージ、即ち結合領域として作用し密な継ぎ目を形成するためのマンドレル周囲の約５％ないし約２０％だけ巻くのに十分であるのが好ましい。同様に、マンドレルの長さは、その上で見いだすことができるチューブの長さを指令するであろう。マンドレル上で構築体を扱う容易性のために、形成される構築体ではなくマンドレルが取り扱われる場合に接触されるように、マンドレルは構築体の長さよりも長くあるべきである。
【００２２】
ＩＣＬはその天然チューブ状状態に由来する面性を有する。ＩＣＬは２つの対向表面を有する：腸ルーメンに面する粘膜表面および腸間膜および血管系のごとき、それに付着した外部腸組織を従前有した漿膜。これらの表面は補綴の手術後性能に影響し得る特徴を有するが、増強されたデバイス性能につきてこ入れされ得ることが判明した。血管移植片におけるごとき使用のためのチューブ状構築体の形成において、材料の粘膜表面は、形成された場合に、チューブ状移植片の管腔表面であるのが好ましい。粘膜表面を血流に接触させることは、利点を有する。というのは、それが患者に移植された場合に、移植片の閉塞を妨げるのが好ましいいくつかの非血栓形成性特性を有するからである。他のチューブ状構築体において、完全な構築体におけるＩＣＬの表面の向きは、意図した用途および血栓形成性または接着が許容されるかまたはされないかに依存する。
【００２３】
マンドレルには、スリーブ形態である、非反応性で、医療グレードの品質の、弾性ゴムもしくはラテックス材料のカバーリングを設けるのが好ましい。チューブ状ＩＣＬ構築体はマンドレル表面に直接形成することができるが、該スリーブは形成されたチューブをマンドレルから取り出すのを容易とし、ＩＣＬ上の残物に接着したり、それと反応したりそれを残したりしない。形成された構築体を取り出すには、スリーブは、それと共にマンドレルからの構築体を運ぶにはマンドレルの一端から引っ張ることができる。加工されたＩＣＬはスリーブに軽く接着しているに過ぎず、かつ他のＩＣＬ層により接着している故に、ＩＣＬチューブの製造は容易とされる。というのは、チューブ化構築体は、該構築体を延ばしたりまたはそれに圧力を加えたり、あるいはそれに損傷を与える危険性なくしてマンドレルから取り出すことができるからである。最も好ましい具体例において、スリーブはＫＲＡＴＯＮ8（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、非常に安定な飽和中央ブロックを持つスチレン−エチレン／ブチレン−スチレンコポリマーよりなる熱可塑性ゴムを含む。
【００２４】
説明の簡単のために、４ｍｍ直径および１０％重複を持つ２層チューブ状構築体が約４ｍｍ直径を有するマンドレル上に形成されるものとする。マンドレルには、該マンドレルの長さとほぼ同等の長さであって、その上に形成されるべき構築体よりも長いＫＲＡＴＯＮ8スリーブが設けられる。ＩＣＬのシートは、幅の寸法が約２８ｍｍであって、長さの寸法が構築体の所望の長さに依存して変化し得るように整えられる。層流キャビネットの滅菌場において、次いで、ＩＣＬを以下のプロセスによってコラーゲンチューブに形成する。該ＩＣＬは１つのエッジに沿って湿らせ、スリーブ被覆マンドレルと整列させ、ＩＣＬの接着性質をてこ入れし、それをスリーブ被覆マンドレルの長さに沿って「舗装」し、所定の位置にて少なくとも１０分以上乾燥する。次いで、舗装したＩＣＬを水和させ、マンドレルの回りに巻き、次いで、１１０％重複のために、１回転＋周囲の１０％だけそれ自体の回りに巻いて、結合領域として働かせ、密な継目を供する。形成された構築体の管腔としてのＩＣＬの粘膜側を持つチューブ状構築体を得るには、ＩＣＬの粘膜側を１つのエッジに沿って湿らせ、マンドレル上に舗装し、ＩＣＬの粘膜側がマンドレルに面するように巻く。
【００２５】
単一層チューブ状構築体の形成には、ＩＣＬは、マンドレルの周りに完全に一回と構築体の周囲の約５％と等しい結合領域を供するための重複として、少なくとも５％の更なる回転だけ巻くことができなければならない。２層構築体では、ＩＣＬは、重複として、少なくとも２回および好ましくはさらに５％ないし２０％回転だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。この２層巻はＩＣＬ表面の間に１００％の結合領域を提供する一方、重複のための更なるパーセンテージにより密で不浸透性の継ぎ目を保証している。３層構築体では、ＩＣＬは、重複として少なくとも３回および好ましくはさらに５％ないし２０％回転だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。意図した適用によって要求される移植片の仕様に応じて、構築体はいずれかの数の層にて調製することができる。典型的には、チューブ状構築体は、重複の程度を変化させて、１０層以下、好ましくは２ないし６層、より好ましくは２または３層有するであろう。巻いた後、あらゆる気泡、折れ、および皺を材料の下方から、および層の間から取り除く。
【００２６】
ＩＣＬは、手動で、またはマンドレルの下方またはＩＣＬの層の間に生じ得る気泡または水泡または皺を張りそれを延ばすのを助ける装置の助けで圧延することができる。該装置は、マンドレルがそれがＩＣＬを巻くように回転するにつれてその長さに沿って接触できる表面を有する。
【００２７】
次いで、スリーブ被覆マンドレル上に巻いた配置である間に、それを脱水することによって、巻いたＩＣＬの層を一体に結合する。理論に拘束されるつもりはないが、脱水は、マトリックス中の繊維の間の空間から水を除去すると、コラーゲン繊維のごとき細胞外マトリックス成分を一緒に層に入れる。脱水は空気中、真空中、またはアセトンまたはエチルアルコールもしくはイソプロピルアルコールのごときアルコールによるごとき化学的な方法によって行うことができる。脱水は室内湿度、通常は約１０％Ｒｈないし約２０％Ｒｈ以下；または約１０重量％ないし２０重量％水分まで行うことができる。脱水は、雰囲気室温、ほぼ２０℃および室内湿度にて、少なくとも約１時間ないし２４時間まで、ＩＣＬ層を層流キャビネットの対向する気流まで入れるような角度にマンドレルを置くことによって容易に行うことができる。この時点において、次いで、巻かれた脱水ＩＣＬ構築体をスリーブを介してマンドレルから引き離し、あるいはさらに加工のために放置することができる。構築体は、それを再脱水剤を含有する室温容器に移すことによって、少なくとも約１０ないし約１５分間水性溶液、好ましくは水中で再脱水して、層を分離または脱ラミネートすることなくそれを再脱水することができる。
【００２８】
次いで、構築体を、架橋剤、好ましくはＩＣＬ材料の生体再造形性を保持する化学架橋剤と接触させることによってそれを一緒に架橋する。前記したごとく、脱水は、ラップのそれらの層を一緒に架橋するために隣接ＩＣＬ層の細胞外マトリックス成分を一緒にして、成分間に化学結合を形成し、かくして、層を一緒に結合させる。別法として、少なくとも約１０ないし約１５分間脱水剤を含有する室温容器にそれを移して、それを分離または脱ラミネートすることなく層を再脱水脱するすることにより水性溶液、好ましくは水と接触させることによる架橋の前に構築体を再脱水することができる。結合された補綴デバイスを架橋することは、デバイスに強度および持続性を供して取り扱い特性を改良する。リボースおよび糖、酸化剤および脱水加熱（ＤＨＴ）方法のごとき種々のタイプの架橋剤が当該分野で知られていおり、使用可能である。好ましい架橋剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。もう１つの好ましい方法において、Ｓｔａｒｏｓ，  Ｊ．  Ｖ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１，  ３９５０−３９５５，１９８２によって記載されているごとく、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをＥＤＣ架橋剤に添加する。化学架橋剤に加えて、フィブリン−ベースの膠のごとき他の手段またはポリウレタン、酢酸ビニルまたはポリエポキシのごとき医療グレードの接着剤によって層を一体に結合することができる。最も好ましい方法において、ＥＤＣを、好ましくは約０．１ｍＭないし約１００ｍＭの間、より好ましくは約１．０ｍＭないし約１０ｍＭの間、最も好ましくは約１．０ｍＭの濃度にて水に可溶化させる。水以外に、リン酸緩衝化セーラインまたは（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）緩衝液を用いてＥＤＣを溶解させることができる。加えて、他の剤をアセトンのごとき溶液に添加することができるか、あるいはアルコールを水中に９９％まで添加して架橋をより均一かつ効果的にすることができる。ＥＤＣ架橋溶液は、ＥＤＣが経時的にその活性を失うので使用直前に調製する。架橋剤をＩＣＬに接触させるためには、水和し結合したＩＣＬ構築体を狭いパンのごとき容器に移し、架橋剤を温和に該パンにデカントして、ＩＣＬ層が被覆されかつ自由浮遊し、ＩＣＬ構築体の層の下方およびその中に気泡が存在しないことを確実とする。パンを覆い、ＩＣＬの層を約４ないし約２４±２時間の間架橋させ、しかる後、架橋溶液をデカントし、捨てる。
【００２９】
それをすすぎ剤と接触させることによって構築体を該パンですすいで、残存する架橋剤を除去する。好ましいすすぎ剤は水または他の水性溶液である。好ましくは、化学的結合した構築体を等容量の滅菌水と各すすぎにつき約５分間３回接触させることによって十分なすすぎが達成される。もし構築体がマンドレルから取り出されていなければ、それを、マンドレルからスリーブを引くことによってこの時点で取り出すことができる。次いで、構築体を乾燥させ、乾燥すれば、単にそれを自由端の１つだけ引くことによって、構築体の管腔からスリーブを取り出すことができる。
【００３０】
構築体を血管移植片として使用する具体例において、形成されたチューブの管腔にヘパリンを適用することによって構築体を非血栓形成性とする。ヘパリンは種々のよく知られた技術によって補綴に適用することができる。説明のため、ヘパリンは以下の３つの方法で補綴に適用することができるとする。まず、垂直に管腔を充填し、または補綴を溶液中に浸漬し、次いで、それを風乾することによって、ベンザルコニウムヘパリン（ＢＡ−Ｈｅｐ）イソプロピルアルコール溶液を補綴に適用する。この手法はコラーゲンをイオン結合したＢＡ−Ｈｅｐ複合体で処理する。第２に、ＥＤＣを用いて、ヘパリンを活性化し、次いで、ヘパリンをコラーゲン繊維に共有結合させることができる。第３に、ＥＤＣを用いて、コラーゲンを活性化し、次いで、プロタミンをコラーゲンに共有結合させ、次いで、イオン結合したヘパリンを補綴に共有結合させることができる。多くの他のコーティング、結合および付着手法が当該分野でよく知られており、これも使用することができよう。
【００３１】
次いで、医療デバイス滅菌の分野で知られた手段を用いて構築体を末端滅菌する。滅菌のための好ましい方法は、ここにその開示を一体化させる、米国特許第５，４６０，９６２号に従って、十分量の１０Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で中和した滅菌０．１％過酢酸（ＰＡ）処理と構築体を接触させることによる。汚染除去は、１Ｌ  Ｎａｇｌｅ容器のごときシェーカープラットフォーム上の容器中にて約１８±２時間行う。次いで、３倍容量の滅菌水と各すずきにて１０分間接触させることによって構築体をすすぐ。
【００３２】
また、本発明の構築体はガンマ線照射を用いて滅菌することもできる。構築体を、ガンマ線照射に適した材料で作成された容器に充填し、真空シーラーを用いてシールし、これを２５．０および３５．０ｋＧｙの間のガンマ線のためにハーメチィックバッグに入れた。ガンマ線照射は、劇的ではないが、有意にヤング率および収縮温度を低下させる。ガンマ線照射後の機械的特性は、適用の範囲で使用するのに依然として十分であり、ガンマ線は滅菌する好ましい手段である。というのは、それは移植可能医療デバイスの分野で広く使用されるからである。
【００３３】
さらにもう１つの好ましい具体例において、ＩＣＬを組織修復もしくは置換用の構築体に再形成した後、それには細胞が棲みいてＩＣＬおよび培養細胞の結合層を含む細胞組織構築体を形成することができる。細胞組織構築体を形成して、それらが修復または置換しようとする器官を模倣することができる。
【００３４】
組織をほぐすことによって、または外植体方法によって細胞培養を哺乳動物組織源から確立する。一次培養を確立し、それから当該バンクの一部を解凍し、接種し、および継代培養して細胞数を拡大するマスター細胞バンクで低温保存する。無細胞ＩＣＬ構築体に細胞を棲みつかせるためには、構築体を培養皿もしくはフラスコに入れ、懸濁された細胞を含有する培地への浸漬によって接触させる。コラーゲンは細胞接着のための天然物質であるので、細胞はＩＣＬ構築体に結合し、構築体のコラーゲン質マトリックス上でおよびそれに増殖する。
【００３５】
本発明で使用される好ましい細胞タイプは腸間膜に由来する。より好ましい細胞タイプは繊維芽細胞、間質細胞、および他の支持結合組織細胞、またはヒト皮膚繊維芽細胞である。ヒト繊維芽細胞は、限定されるものではないが、新生児雄包皮、真皮、腱、肺、臍帯、軟骨、尿道、角膜間質、口腔粘膜および腸を含めた多数の源に由来し得る。ヒト細胞は限定されるものではないが、繊維芽細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞および腸間膜起源の他の結合組織細胞を含むことができる。組織構築体の生産で使用されるマトリックス−生産細胞の起源は、本発明の培養方法を用いた後に似せたりまたは模倣すべき組織タイプに由来するのが好ましいがそれが必要というのではない。例えば、多層シート構築体を繊維芽細胞と共に培養して、骨格筋構築体のために生きた結合組織を作った；または筋芽細胞を形成する。１を超える細胞タイプを用いてＩＣＬ構築体に棲みつかせることができ、例えば、チューブ状構築体をまず平滑筋細胞と共に培養し、次いで、第１の細胞タイプが棲みついた構築体の管腔を第２の細胞タイプとしての血管内皮細胞と共に培養して細胞血管置換デバイスを形成する。同様に、平滑筋細胞を第１の細胞タイプとして、次いで、尿内皮細胞を第２の細胞タイプとして用いて、尿膀胱壁パッチ補綴を同様に多層ＩＣＬシート構築体上に調製する。細胞ドナーは発生および年齢で変化し得る。細胞は胚、新生児または成体を含めた他の個体のドナー組織に由来し得る。腸間膜幹細胞のごとき胚先祖細胞を本発明で用い、それを誘導して分化させ所望の組織に発育させることができる。
【００３６】
ヒト細胞は本発明で用いるのに好ましいが、本発明の方法で用いるべき細胞はヒト源からの細胞に限定されない。限定されるものではないが、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジおよびネズミ源を含めた他の哺乳動物種からの細胞を用いることができる。加えて、自然発生的に、化学的にまたはウイルスによりトランスフェクトされた遺伝子工学作成細胞を本発明で用いることもできる。１を超える細胞タイプを取り込む具体例では、正常および遺伝的に修飾したもしくはトランスフェクトした細胞の混合物を用いることができ、２以上の種または組織源の細胞の混合物を用いることができ、あるいは双方を用いることができる。
【００３７】
組換えまたは遺伝子工学作成細胞を細胞マトリックス構築体の生産で用いて、増大したレベルの天然細胞産物または治療剤での治療を必要とする患者のための薬物送達移植片として作用する組織構築体を創製することができる。患者に存在する条件により生物学的に、化学的にまたは熱的に信号が発せられた場合、連続的な時間または必要に応じて、移植片組換え細胞産物、成長因子、ホルモン、ペプチド、または蛋白質を介して細胞を生産し、患者に送達することができる。  また、細胞を遺伝子工学により作成して、「正常」であるが高レベルで発現されるか、あるいは改良された創傷治癒、促進されたもしくは指向された血管新生、または最小化された瘢痕またはケロイド形成に治療的に有利である細胞外マトリックスおよび生細胞を含む移植片デバイスを作成するためにいくつかの方法で修飾された蛋白質または異なるタイプの細胞外マトリックス成分を発現させることもできる。これらの手法は一般的に当該分野で公知であり、出典明示して本明細書の一部とみなすＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）に記載されている。結合したＩＣＬ層から形成された無細胞構築体から形成された細胞組織構築体の生産のためにすべての前記したタイプの細胞を本発明で用いることができる。
【００３８】
チューブ状補綴を用いて、例えば、血管系、食道、気管、腸、およびＦａｌｌｏｐｉｕｓに起因するチューブのごときチューブ状器官の断面を置き換えることができる。これらの器官は外方表面および内方管腔表面を持つ基本的チューブ状形状を有する。平坦シートは器官支持体で用いて、例えば、膀胱または子宮のごとき器官のための三角布としてシートを用いることによって脱したおよび過剰運動性器官を支持することもできる。加えて、平坦シートおよびチューブ状構築体は一緒に形成して複合構築体を形成させ、心臓または静脈弁を置き換えまたは増加させることができる。
【００３９】
本発明の生物工学移植片補綴を用いて、宿主組織で損傷したまたは病気となった身体構造を修復し置き換えることができる。代替身体一部または支持体として機能させつつ、補綴は、宿主細胞の内方増殖のための生体再造形可能マトリックス足場としても機能する。本明細書で用いる「生体再造形」とは、宿主細胞または酵素による移植補綴のマトリックス成分の生分解、再形成および置換の速度とほぼ等しい速度で宿主細胞の内方増殖による構造コラーゲンの生産、血管形成および細胞再集団形成を意味するように使用される。移植片補綴は、宿主によって全ての、または実質的に全ての宿主組織に再造形されつつその構造特徴を保持し、それ自体はそれが修復し置き換える組織のアナログとして機能する。
【００４０】
組織マトリックス補綴の収縮温度（℃）はマトリックス架橋の程度のインジケーターである。収縮温度が高ければ、材料はより架橋している。非架橋ＩＬＣは約６８±０．３℃の収縮温度を有する。好ましい具体例においては、ＥＤＣ架橋補綴は約６８±０．３±ないし約７５±１℃の間の収縮温度を有するべきである。
【００４１】
機械的特性は、補綴が生体再造形の間にクリープに抵抗し、加えて、柔軟であって縫合可能であるように機械的一体性を含む。用語「柔軟」は臨床使用の容易性のための良好な取り扱い特性を意味する。
【００４２】
用語「縫合可能」とは、層の機械的特性が、針および縫合材料が補綴の天然組織のセクションへの縫合への時点で補綴材料を通過することを可能とする縫合保持（吻合として知られたプロセス）を意味する。縫合の間、かかる補綴は縫合によりそれに適用された引張力の結果として裂けてはならず、また縫合が結ばれる場合に裂けてはならない。補綴の縫合性、すなわち、縫合されつつ裂けに抵抗する補綴の能力は、補綴材料の固有の機械的強度、移植片の厚み、縫合に適用された引張力、および結びが引かれて閉じられる速度に関連する。１００ｍＭ  ＥＤＣおよび５０％アセトン中で架橋した高度に架橋した平坦６層補綴のための縫合保持は少なくとも約６．５Ｎである。水中の１ｍＭ  ＥＤＣ中で架橋した２層チューブ状補綴のための縫合保持は約３．９Ｎ±０．９Ｎである。好ましいより低い縫合保持強度は架橋した平坦２層補綴については約２Ｎである；縫合する場合に外科医が引っ張る強度は約１．８Ｎである。
【００４３】
本明細書で用いる「非−クリーピング」は、補綴が移植後に正常限界を越えて伸びたり、広がったり、拡大されたりしないように補綴の生物機械的特性が持続性を付与することを意味する。後記するごとく、本発明の移植された補綴の全ストレッチは許容される限界内にある。本発明の補綴は、生分解および再造形による移植された材料の機械的強度の喪失よりも速い速度で宿主細胞による構造コラーゲンの置換による移植後細胞生体再造形の機能としてストレッチングに対する抵抗性を獲得する。
【００４４】
層とされ、かつ結合されているにもかかわらず、本発明の加工された組織材料は「半透性」である。半透性は再造形のため、あるいは生体再造形性、細胞内方増殖、接着予防または促進、または血流に永久するであろう剤および成分の沈積のために宿主細胞の内方増殖を可能とする。補綴の「非多孔性」性質は補綴の移植によって保持されることを意図する流体の通過を防止する。逆に、もし多孔性または開口性質が補綴の適用に必要であれば孔を補綴中に形成することができる。
【００４５】
また、本発明の補綴の機械的一体性は垂らすまたは折り畳まれるその能力、ならびに補綴を切断または整えて構築体のエッジを脱ラミネートまたはほぐすことなく清浄エッジを得る能力にある。
【００４６】
以下の実施例は本発明の実施をよく説明するために掲げ、本発明の範囲を断じて限定するものと解釈されるべきではない。その組成、形状および厚みにおけるデバイス切形は構築体のための最終適用に応じて選択されるべきであることが理解されよう。当業者ならば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に記載した方法に種々の修飾をなすことができるのを理解するであろう。
【００４７】
【実施例】
実施例１：機械的に清浄されたブタ小腸の化学的清浄
機械的作用および水を用いる洗浄の組合せを用いて粘膜下層から脂肪、筋肉および粘膜層を強制的に取り出すＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーン（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ）を用い、ブタの小腸を収穫し、機械的にストリップした。機械的作用は、無傷小腸をその間に走行させると粘膜下層からの連続層を圧縮しそれをストリップする一連のローラーとして記載することができる。小腸の粘膜下層は周囲の層よりも比較的硬くしっかりしておりローラーはより柔らかい成分を粘膜下組織から圧搾する。機械清浄の結果は、腸の粘膜下層のみが残るものであった。該手法の残りは無菌下かつ室温にて行った。化学溶液はすべて室温で用いた。次いで、腸を管腔の長さにそって切断し、次いで１５ｃｍセクションに切断した。材料を秤量し、小腸に対する溶液の約１００：１ｖ／ｖの比率にて容器に入れた。
【００４８】
Ａ．腸を含有する各容器に０．２２μｍ（ミクロン）濾過滅菌下１００  ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）／１０  ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、容器を約２００ｒｐｍにて約１８時間シェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＥＤＴＡ／ＮａＯＨを各ボトルから取り出した。
【００４９】
Ｂ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）／１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、約２００ｒｐｍにて約６ないし８時間の間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＨＣｌ／ＮａＣｌ溶液を各容器から取り出した。
【００５０】
Ｃ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０  ｍＭリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、２００ｒｐｍにてほぼ１８時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液を各容器から取り出した。
【００５１】
Ｄ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１０ｍＭ  ＰＢＳのほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、２００ｒｐｍにて約２時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、次いで、リン酸緩衝化セーラインを各容器から取り出した。
【００５２】
Ｅ．最後に、次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した水を添加した。次いで、約２００ｒｐｍにて約１時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、次いで、水を各容器から取り出した。
【００５３】
組織学的分析のために加工ＩＬＣ試料を切断し固定した。ヘモトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＭａｓｓｏｎ三色染色を対照および処理組織双方の断面および長手方向面試料で行った。加工ＩＬＣ試料は細胞および細胞球雑物がないように見え、他方、対照試料は正常かつ予測されたごとくに非常に細胞が見えた。
【００５４】
実施例２：コラーゲン質組織についての他の正常処理の比較実験
Ｋｅｍｐに対する米国特許第５，４６０，９６２号に記載されたコラーゲン質組織を消毒し滅菌する他の方法を、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１５８にＣｏｏｋらによって記載された同様の方法と比較した。非緩衝化過酢酸方法に加えてＫｅｍｐからの実施例１、２、および３を行った。
【００５５】
小腸を四匹の大きなブタから収穫した。腸を獲得し、外方腸間膜層をストリップし、腸に水を満たした。
【００５６】
実験は７つの条件を含むものであった：
条件Ａは国際ＰＣＴ出願ＷＯ０９８／２２１５８におけるＣｏｏｋらの実施例１の開示に従って行った。条件Ｂは、腸材料を開示された化学処理を使用する前に機械的に清浄した点でＡの変形である。条件Ｃ、ＤおよびＥはＫｅｍｐに対する米国特許第５，４６０，９６２号における実施例１、２および３の方法に従って行った。すべての条件において、材料に対する溶液の１０−対−１比率を用いた、すなわち、１００ｇの組織材料を１Ｌの溶液で処理する。
【００５７】
Ａ．４つの腸の各々からの材料を、５％エタノール中の０．２％過酢酸（ｐＨ２．５６）の１リットル溶液を含有する別々のボトル（ｎ＝５）に入れ、シェーカープラットフォーム上で震盪させた。震盪の２時間後、条件ＡはＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーン上で機械的に清浄した。
【００５８】
他の６つの条件ＢないしＧについては、化学的処理に先立ってＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーンを用いて腸を機械的に清浄した。機械的清浄後、４つの腸からの代表的なピースを化学処理用の溶液を含有するボトルに入れた。ボトルをプラットフォーム上で１８±２時間震盪した。残りの６つの条件ＢないしＧは以下の通りであった：
Ｂ．５％エタノール中の０．２％過酢酸の１リットル溶液（ｐＨ２．５６）（ｎ＝５）。
【００５９】
Ｃ．リン酸緩衝化セーライン中の０．１％過酢酸の１リットル溶液（ｐＨ７．２）（ｎ＝３）。
【００６０】
Ｄ．０．１％過酢酸および１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の１リットル溶液（ｐＨ７．２）（ｎ＝３）。
【００６１】
Ｅ．０．１％過酢酸および１Ｍ  ＮａＣｌの１リットル溶液（ｐＨ２．９）（ｎ＝３）。
【００６２】
Ｆ．実施例１で前記した「化学清浄」溶液の１リットル（ｎ＝４）。
【００６３】
Ｇ．ｐＨ７．０に緩衝化された、脱イオン水中の０．１％過酢酸の１リットル溶液（ｎ＝２）。
【００６４】
化学的および機械的処理、すべての条件を合計４回濾過滅菌精製水ですすいだ。機械的および化学的に処理した材料はＭａｙｅｒヘマトキシリンで細胞夾雑物を調べるのに大いに染色された。形態学的評価はヘマトキシリンおよびエオシン、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム、およびアリザリンレッド染色技術。種々の処理からの組織学的結果は、条件Ａの方法は化学的処理後にＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ上の粘膜層を取り出すのが非常に困難な場合に材料を生じさせることを示す。該材料は１０−１２回過剰にＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇを通さなければならなかった。該材料は一見して非常に膨潤し、材料の表面上および血管系においてかなり大量の細胞夾雑物を有した。条件Ｂの方法も非常に膨潤し、材料の表面上および血管系においてかなり多量の細胞夾雑部を示した。条件ＣおよびＤの方法は血管系中に最小細胞夾雑物を有する非膨潤材料を生じた。条件Ｅはわずかに膨潤し、血管系に最小の細胞夾雑物を含有する材料を生じた。
【００６５】
ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて清浄組織中に含有される残存ＤＮＡ／ＲＮＡを定量した。結果を表１にまとめる。
【００６６】
【表１】
0004341049.tif 000002
【００６７】
形態学的分析はＤＮＡ／ＲＮＡ定量と相関して、条件ＡおよびＢの清浄方法の結果、高度に細胞的なままであって結果として残存ＤＮＡを含有するコラーゲン質組織マトリックスが得られることを示す。Ｋｅｍｐの清浄方法はコラーゲン質組織マトリックスからの細胞および細胞夾雑物の除去でかなり効果的である。最後に、Ａｂｒａｈａｍらに対する国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／４９９６９に記載され、前記実施例１に概説した条件Ｆの化学的清浄方法はすべての細胞および細胞夾雑物ならびにそのＤＮＡ／ＲＮＡをこれらの方法により検出できないレベルまで除去する。
【００６８】
実施例３：ＩＣＬチユーブ構築体を作成する方法
層流キャビネットの滅菌分野において、ＩＣＬを以下のプロセスによってＩＣＬコラーゲンチューブに形成した。ＩＣＬの漿膜表面からリンパ系タグをトリムした。ＩＣＬを滅菌吸収剤タオルでにじませて過剰の水を材料から吸収し、次いで、多孔性ポリカーボネートシート上に広げ、層流キャビネットの気流中で乾燥した。一端乾燥すると、ほぼ１０％重複した２層移植片用にＩＣＬを２８．５ｍｍ×１０ｃｍピースに切断した。チューブの形成においてＩＣＬを支持するために、約４ｍｍの直径を持つ円筒ステンレス鋼マンドレルを、ＫＲＡＴＯＮ8（マンドレルからの形成されたコラーゲンチューブの取り出しを容易とし、ＩＣＬに接着せずまたはそれと反応しない弾性スリーブ材料）で被覆した。次いで、ＩＣＬの長いエッジを滅菌水で示され、マンドレルに接着させ、約１５分間乾燥させて「フラッグ」を形成させた。一旦接着すると、ＩＣＬを、マンドレルの周りおよびそれ自体にわたり一回完全に圧延した。ローリングが完了した後、気泡、折り畳みおよびしわを材料の下方および層の間から延ばした。構築体を層流キャビネットの気流中におき、室温（ほぼ２０℃）にてキャビネット中で約１時間で乾燥させた。
【００６９】
チューブ当たり約５０ｍＬ架橋溶液の容量で、水中の架橋した１  ｍＭ  ＥＤＣまたは１０ｍＭ  ＥＤＣ／２５％アセトンｖ／ｖいずれかの化学的架橋溶液を架橋直前に調製し；ＥＤＣは経時的に活性を喪失するであろう。次いで、水和したＩＣＬチューブをいずれかの架橋剤を含有する２つの円筒容器のいずれかに移した。容器を覆い、ヒュームフード中に約１８±２時間置き、しかる後、架橋溶液をデカントし、捨てた。次いで、ＩＣＬをすすぎ当たり約５分間、滅菌水で３回すすいだ。
【００７０】
次いで、Ｋｒａｔｏｎスリーブを引っ張ってマンドレルから一端を離すことによって、架橋ＩＣＬチューブをマンドレルから取り出した。一端取り出せば、Ｋｒａｔｏｎを含有するＩＣＬチューブをフード中で１時間乾燥させた。一旦乾燥すれば、単にそれを一端から引っ張ることによって、スリーブをＩＣＬチューブの管腔から除去した。
【００７１】
その開示を引用して全体を一体化させる共通した所有された米国特許第５，４６０，９６２号に記載された方法に従って、ＩＣＬチューブをほぼｐＨ７．０の０．１％過酢酸中で一晩滅菌した。次いで、ＩＣＬチューブをすすぎ当たり約５分間、滅菌水で３回すすいで滅菌溶液を除去した。次いで、過酢酸滅菌ＩＣＬコラーゲンチューブを層流フード中で乾燥し、次いで、移植まで滅菌１５ｍＬコニカルチューブ中に充填した。
【００７２】
実施例４：ＩＣＬチューブ補綴の機械的テスト
２０％重複にてマンドレルの回りに巻かれ、水中の１ｍＭ  ＥＤＣで架橋されたＩＬＣの単一シートから形成された２層ＩＣＬチューブ状構築体の種々の機械的特性を測定した。「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ」，  ＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ，  １９９３年８月に従って、  縫合保持、破裂、多孔度合い（遺漏／一体的水透過性）、およびコンプライアンステストを行った。縫合保持、破裂およびコンプライアンス分析はＴｅｓｔＳｔａｒ−ＳＸソフトウェアを備えたサーボヒドローリックＭＴＳテストシステムを用いて行った。結果を表２に示す。
【００７３】
略言すれば、縫合保持は一定速度で移植片のエッジから２．０ｍｍ引かれる縫合よりなるものである。縫合が移植片を通じて裂かれた場合のピーク力を測定した。得られた平均測定値は必要な限界を超え、構築体が臨床における医師の縫合圧力に耐えることができることを示す。
【００７４】
破裂テストにおいて、移植片が破裂するまで１分間隔で圧力を２．０ｐｓｉで増分にて移植片に適用した。参照のために、収縮期圧力は正常血圧のヒトにおいてほぼ１２０ｍｍＨｇ  （１６．０  ｋＰａ）である。テストによって得られた破裂強度は、構築体が収縮期圧力の約７．７５倍に圧力を維持することを示し、かくして、構築体が血管適用のために移植でき厳格な血液循環に耐えることができることを示す。
【００７５】
コンプライアンステストでは、移植片を順次８０および１２０ｍｍＨｇとした。次いで、イメージ分析ソフトウェアを用いて各圧力にて移植片の直径を測定し、（Ｄ120−Ｄ80）／（Ｄ80×４０  ｍｍＨｇ）×１００％としてコンプライアンスを計算した。ウサギ頸動脈のコンプライアンスはほぼ０．０７％／ｍｍＨｇ，  ヒト動脈は約０．０６％／ｍｍＨｇであってヒト静脈は約０．０２％／ｍｍＨｇであり、これは構築体が血管移植片として働くのに必要なコンプライアンスを呈することを示す。
【００７６】
多孔度を測定するには、１２０ｍｍＨｇの静水圧下のＰＢＳを移植片に適用する。７２時間にわたって移植片を透過したＰＢＳの容量を時間および移植片の表面積に正規化し、多孔度を測定した。
【００７７】
収縮温度を用いてコラーゲン質材料における架橋の程度をモニターする。移植片がより架橋すれば、より多いエネルギーが必要となり、かくしてより高い収縮温度が必要となる。示唆走査熱量計を用いて熱的に制御された条件下で試料へのおよび試料からの熱流を測定した。収縮温度は温度−エネルギープロットにおける変性ピークの開始温度と定義した。
【００７８】
縫合保持は２Ｎを十分に超え、縫合が約１．８Ｎである場合の患者：外科医の引張力における補綴の縫合を示唆した。７回の収縮期圧力にわたる破裂強度。コンプライアンスはヒト動脈および静脈の範囲にある。ＩＣＬチューブの多孔度は織った移植片と比べて低い：ＩＣＬチューブはプレクロッティングを必要としない。収縮温度、コラーゲン変性温度の尺度は非架橋ＩＣＬのそれに近く、低い量の架橋を示す。２層ＩＣＬ構築体の機械的および物理的特徴の種々のテストからの結果の要約を表２に掲げる。
【００７９】
【表２】
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【００８０】
実施例５：チューブ状ＩＣＬ補綴を用いるステントカバーリング
ＩＣＬチューブは金属−合金ステントまたは血管内デバイスのための保護カバーリングとして用いることができる。金属ステントを被覆するには、ＩＣＬシートを調製して、ステント用の１層カバーリングのための１０５％巻を供した。
【００８１】
水和した状態の機械的および化学的に化合したＩＣＬを平坦化し、リンパ系タグをＩＣＬの漿膜側から切断した。ＩＣＬを平坦なポリカーボネート上に置き、粘膜側は上方に面し、空気に暴露した。乾燥した後、１００ｍｍ長さを有する４ｍｍ直径ステントにつき、ＩＣＬをルーメンに鉛直に２８ｍｍおよびルーメンに平行に１００ｍｍに切断した。該ステントをマンドレル上に滑らせ、その長さに沿って脱イオン水で湿らせた。ＩＣＬの漿膜表面をステントルーメンに面するようにするため、ＩＣＬシートの漿膜側の１つの長いエッジを金属ステントを持つステンレス鋼マンドレルに適用して、マンドレル上のそれおよびステントを「舗装」し、ほぼ１０−１５分乾燥した。一旦接着させると、次いで、ＩＣＬを滅菌水で湿らせ、マンドレルおよびステント上で、次いでそれ自体上で圧延した。次いで、形成されたＩＣＬ被覆ステントおよびマンドレルを層流風土の気流中にて乾燥した。一旦乾燥すると、ＩＣＬ被覆ステントおよびマンドレルをステントの端部の回りの過剰ＩＣＬを取り除き、マンドレルに結合したＩＣＬをマンドレルからはがした。ＩＣＬ被覆ステントをマンドレルから取り出し、ステンレス鋼マンドレル上のＩＣＬチューブ、ステントを包むＩＣＬチューブを架橋させた。結合したＩＣＬをステントに架橋させるために、それらを２５％アセトン中の１０ｍＭ  ＥＤＣの架橋剤に約１８±２時間浸漬させた。架橋後、ＩＣＬ被覆ステントを３回の１００ｍＬ容量の滅菌水中ですすいで、架橋剤からの残渣および架橋反応からの副産物を除去した。得られたデバイスは４ｍｍ直径の１００長金属−合金血管ステントであり、ＥＤＣで架橋した５％結合領域を持つＩＣＬの単一層カバーリングを有する。被覆ステントを出荷のために滅菌テストチューブに充填した。
【００８２】
前記した発明は明瞭性および理解の目的で説明および例を挙げて幾分詳細に記載したが、添付の請求の範囲の範囲内である種の変形および修飾を増すことができるのは当業者に明白であろう。