(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号２の位置31−494 に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
ii）配列番号２の位置31−494 に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるポリペプチド；
iii ）１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ｉ）に記載のポリペプチドから誘導され、但し配列番号２に関する位置377 及び383 におけるアルギニンは保存されているポリペプチド；あるいは
iv）配列番号１のヌクレオチド91〜ヌクレオチド1395に示されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドに対して高緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
であるペクチン酸リアーゼ。
【請求項２】
ａ）配列番号１のヌクレオチド91〜ヌクレオチド1395に示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
ｃ）配列番号１のヌクレオチド91〜ヌクレオチド1395に示されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドに対して高緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
及び
ｄ）上記ａ）の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択されたペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがDNA である、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
（ａ）ペクチンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号１のヌクレオチド91〜ヌクレオチド1395に示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドに対して高緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び
（ｂ）ペクチンリアーゼ活性を有し、そして配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 のアミノ酸残基に対して少なくとも90％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
から成る群から選択されたDNA セグメント；並びに
転写ターミネーター；
を含んで成る発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターが導入されている、DNA セグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項６】
ａ）ペクチンリアーゼ活性を有し、そして配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；並びに
ｂ）ペクチンリアーゼ活性を有し、そして配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 のアミノ酸に対し少なくとも90％同一であるポリペプチド分子；
から成る群から選択されたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１又は６に記載のポリペプチドを含んで成る酵素調製物。
【請求項８】
ペクチン分解活性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、請求項４記載の発現ベクターを導入されている細胞又は請求項５に記載の細胞を培養し、それにより、前記細胞がDNA セグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そして前期ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項９】
（ｉ）同種不純物を有さず、そして（ii）請求項８記載の方法により生成される、ペクチン分解活性を有する単離された酵素。
【請求項１０】
プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビノシダーゼ、マンナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のペクチン酸リアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はそれらの混合物から成る群から選択された１又は複数の酵素をさらに含んで成る請求項７記載の酵素調製物。
【請求項１１】
請求項７もしくは10記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素、及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
【請求項１２】
請求項７もしくは10記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素を含む清浄溶液により硬質表面を処理することを含んで成る、硬質表面を清浄にするための方法。
【請求項１３】
布の機械処理のための方法であって、請求項７もしくは10記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素を含む洗浄溶液により、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、布を処理することを含んで成る方法。
【請求項１４】
有効量の請求項７もしくは10に記載の酵素調製物、又は有効量の請求項１に記載の酵素により処理することを含んで成る、セルロース繊維、糸、織布又は不織布の性質を改良するための方法。
【請求項１５】
前記酵素調製物又は酵素が精練作業段階に使用される請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
有効量の請求項７もしくは10記載の酵素調製物、又は有効量の請求項１に記載の酵素により処理することを含んで成る、植物材料を分解又は変性するための方法。
【請求項１７】
前記植物材料が、浸水工程にゆだねられる、再循環された故紙、機械的紙製造パルプ又は繊維である請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
有効量の請求項７もしくは10記載の酵素調製物、又は有効量の請求項１に記載の酵素を、従来の動物飼料成分に、動物飼料添加剤として添加する、動物飼料を製造するための方法。
【請求項１９】
ワイン又はジュースを、有効量の請求項７もしくは10記載の酵素調製物、又は有効量の請求項１に記載の酵素により処理する、ワイン又はジュースを加工するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペクチン分解酵素調製物；好ましくは微生物ペクチン分解酵素、より具体的には、中性及びアルカリ性pH範囲においてそれらの主要酵素活性としてペクチン分解活性を示す微生物酵素、特にバチルス・リケニホルミスに起因するクローン化されたペクチン分解酵素；及び繊維及びセルロース繊維加工産業へのそのような酵素の使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
ペクチンポリマーは、植物細胞壁の重要な構造成分である。ペクチンは、交互のホモガラクツロナン（平滑領域）（smooth region ）及びラムノガラクツロナン（毛状領域）（hairy region）から構成される主鎖を有するヘテロ多糖である。平滑領域は、１，４−連結されたα−D −ガラクツロン酸の線状ポリマーである。ガラクツロン酸残基は、通常、非ランダム態様で、種々の程度、カルボキシル基上でメチル−エステル化され得、そしてポリガラクツロン酸のブロックが完全にメチル−エステル化される。
【０００３】
ペクチナーゼは、それらの選択的基質、高度にメチル−エステル化されたペクチン又は低度にメチル−エステル化されたペクチン及びポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、並びにそれらの反応機構、すなわちβ−脱離又は加水分解、に従って分類され得る。ペクチナーゼは、主に内部−作用し、すなわちオリゴマーの混合物を付与するために鎖内のランダム部位でポリマーを切断することができ、又はそれらは外部−作用し、すなわちポリマーの一端から攻撃し、そしてモノマー又はダイマーを生成する。
【０００４】
ペクチンの平滑領域に対して作用するいくつかのペクチナーゼ活性が、酵素命名法（1992）により提供される酵素、たとえばペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10 ）、ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15 ）、エクソ−ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67 ）、エクソ−ポリガラクツロン酸リアーゼ（EC 4.2.2.9）及びエクソ−ポリ−α−ガラクツロノシダーゼ（EC 3.2.1.82 ）の分類に包含される。
【０００５】
ペクチン酸リアーゼは、異なった細菌の属、たとえばエルウイニア（Erwinia ）、シュードモナス（Pseudomonas ）、クレビシエラ（Klebsiella）、及びキサントモナス（Xanthomonas ）からクローン化されて来た。また、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）(Nasser など. (1993) FEBS 335: 319-326) 及びバチルスsp. YA-14(Kim など. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 947-949) からのペクチン酸リアーゼが記載されている。
【０００６】
バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）(Dace and Vaughn (1971) J. Bucteriol. 108: 166-174) 、バチルス、ポリミクサ(Bacillus polymyxa）(Nagel and Vaughn (1961) Arch. Biochem. Biophs. 93: 344-352)、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）(Karbassi and Vaughn (1980) Can. J. Microbiol. 26: 377-384) 、バチルスsp. (Hasegawa and Nagel (1966) J. Food Sci. 31: 838-845)及びバチルスsp. RK9 (Kelly and Fogarty (1978) Can. J. Microbiol. 24: 1164-1172) により生成される、pH 8〜10の範囲で最大活性を有するペクチン酸リアーゼの精製が報告されているが、しかしながら、それらの文献はそれらの生物からの遺伝子をコードするペクチン酸リアーゼのクローニングについての見出さなかった。記載されるすべてのペクチン酸リアーゼは、最大活性のために二価のカチオンを必要とし、カルシウムイオンが最も刺激的である。
【０００７】
WO98/45393号は、土壌に対する著しい洗浄力を有するプロトペクチナーゼを含む洗浄組成物を開示する。
一般的に、ペクチナーゼ生成生物は、広範囲のペクチン分解又は変性酵素を示す。しばしば、微生物はまた、セルラーゼ及び/ 又はヘミセルラーゼを生成し、そしてそのような微生物からの複数の多成分酵素調製物は種々の適用のために最適化することは困難であり、それらは有害な効果を有する酵素さえ含む。従って、たとえば洗剤又は異なった産業工程において所望する効果のみを示すペクチン分解酵素を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
発明の要約：
本発明者は、今や、バチルス属の細菌株、より具体的にはバチルス・リケニホルミス株に内因性（endogeneous ）である、いくつかのペクチン分解酵素、特にアルカリペクチン分解酵素を見出しており、そしてそのような酵素をコードするDNA の同定に成功している。
【０００９】
従って、第１の観点においては、本発明は、バチルス・リケニホルミス又は高度に関連性のバチルス種の株に由来するか又はそれらに内因性のペクチン分解酵素から実質的に成る酵素調製物に関し、ここで前記酵素は好ましくは、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10 ）又はポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15 ）である。
【００１０】
本発明の２種のペクチン酸リアーゼのDNA 配列がそれぞれ配列番号３および７として記載する配列に列挙されており、そして推定されるアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号４及び８として記載する配列に列挙されている。それらの新規酵素は、Enzyme Class EC 4.2.2.2 における酵素命名法に従って分類されるであろう。しかしながら、本発明の酵素はまた、EC 4.2.2.2に属する酵素に従来帰属するといわれているペクチン酸及びポリガラクツロニドに対する活性の他に、（エステル化されていてもよい）ペクチンに対する触媒活性も示す。
【００１１】
本発明のペクチンリナーゼのDNA 配列は番号１として記載する配列に列挙され、そして推定されるアミノ酸配列が配列番号２として記載する配列に列挙される。この新規酵素は、酵素命名法に従って酵素クラス EC 4.2.2.10と分類されるであろう。
本発明のポリガラクツロナーゼのDNA 配列は、配列番号５として記載する配列に列挙され、そして推定されるアミノ酸配列が配列番号６として記載する配列に列挙される。この新規酵素は、酵素命名法に従って酵素クラス EC 3.2.1.15と分類されるであろう。
【００１２】
従って、第２の観点においては、本発明は、
i)バチルス・リケニホルミスATCC14580 により生成されるポリペプチド；
ii) 配列番号８の位置28−341 に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
iii)前記ポリペプチドと少なくとも45％相同であるi)又はii) に定義されるポリペプチドの類似体；
iv) １又は複数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチドから誘導され、但し位置233 及び238 におけるアルギニンは保存され、そして前記誘導されたポリペプチドが前記ポルペプチドと少なくとも42％相同であるポリペプチド；あるいは
v)精製された形の前記ポリペプチドに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
であるペクチン酸リアーゼに関する。
【００１３】
１つの観点においては、本発明は、
（a ）ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号７のヌクレオチド82〜ヌクレオチド1026に示されるヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（b ）上記（a ）の種相同体；
（c ）配列番号８のアミノ酸残基28〜アミノ酸残基341 のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（d ）上記(a), (b)又は(c) に対して相補的な分子；並びに
(e)上記(a), (b), (c) 又は(d) の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１４】
アミノ酸配列（配列番号８）により表される本発明のペクチン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド分子（DNA 配列）を含んで成るプラスミドpSJ1678 は、E.コリの株中に形質転換され、この株は寄託番号DSM11789として、1997年９月25日に、Deutsche Sammlung von Mikroorgamismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germanyに、特許手続のための微生物の寄託の国際認識に基づいて、ブダペスト条件に従って本発明者により寄託されている。
【００１５】
第３の観点においては、本発明は、
i)バチルス・リケニホルミスATCC14580 により生成されるポリペプチド；
ii) 配列番号４の位置28−221 に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
iii)前記ポリペプチドと少なくとも60％相同であるi)又はii) に定義されるポリペプチドの類似体；
iv)１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチドから誘導され、但し位置133 及び155 におけるリシン及び位置158 におけるアルギニンは保存され、そして前記誘導されたポリペプチドが配列番号4 の位置60−158 と少なくとも66％相同であるポリペプチド；あるいは
v)精製された形の前記ポリペプチドに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
であるペクチン酸リアーゼに関する。
【００１６】
1 つの観点において、本発明は、
（a ）ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号３のヌクレオチド82〜ヌクレオチド666 に示されるヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（b ）上記（a ）の種相同体；
（c ）ペクチン酸リアーゼ活性を有し、そして配列番号４のアミノ酸残基28〜アミノ酸残基221 のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（d ）上記(a), (b)又は(c) に対して相補的な分子；並びに
(e)上記(a), (b), (c) 又は(d) の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１７】
第４の観点においては、本発明は、
i)バチルス・リケニホルミスATCC14580 により生成されるポリペプチド；
ii) 配列番号２の位置31−494 に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
iii)前記ポリペプチドと少なくとも60％相同であるi)又はii) に定義されるポリペプチドの類似体；
iv) １又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチドから誘導され、但し配列番号２に関する位置377 及び383 におけるアルギニンは保存され、そして前記誘導されたポリペプチドが前記ポルペプチドと少なくとも60％相同であるポリペプチド；あるいは
v)精製された形の前記ポリペプチドに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
であるペクチン酸リアーゼに関する。
【００１８】
1 つの観点において、本発明は、
（a ）ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号１のヌクレオチド91〜ヌクレオチド1485に示されるヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（b ）上記（a ）の種相同体；
（c ）ペクチン酸リアーゼ活性を有し、そして配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（d ）上記(a), (b)又は(c) に対して相補的な分子；並びに
(e)上記(a), (b), (c) 又は(d) の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１９】
アミノ酸配列（配列番号２）により表されるような本発明のペクチン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド分子（DNA 配列）を含んで成るプラスミドpSJ1678 は、E.コリの株中に形質転換され、この株は、寄託番号DSM12031として、1998年２月23日に、Deutsche Sammlung von Mikroorgamismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germanyに、特許手続のための微生物の寄託の国際認識に基づいて、ブダペスト条件に従って本発明者により寄託されている。
【００２０】
第５の観点においては、本発明は、
i)バチルス・リケニホルミスATCC14580 により生成されるポリペプチド；
ii) 配列番号６の位置1 −415 に示されるアミン酸配列を含んで成るポリペプチド；あるいは
iii)前記ポリペプチドと少なくとも60％相同であり、１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチドから誘導され、又は精製された形の前記ポリペプチドに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体と免疫学的に反応性であるi)又はii) に定義されるポリペプチドの類似体；
であるポリガラクツロナーゼに関する。
【００２１】
1 つの観点において、本発明は、
（a ）ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号５のヌクレオチド１〜ヌクレオチド1248に示されるヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（b ）上記（a ）の種相同体；
（c ）ペクチン酸リアーゼ活性を有し、そして配列番号６のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基415 のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（d ）上記(a), (b)又は(c) に対して相補的な分子；並びに
(e)上記(a), (b), (c) 又は(d) の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２２】
アミノ酸配列（配列番号６）により表されるような本発明のペクチン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド分子（DNA 配列）を含んで成るプラスミドpSJ1678 は、E.コリの株中に形質転換され、そしてこの株は、寄託番号DSM12030として、1998年２月23日に、Deutsche Sammlung von Mikroorgamismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germanyに、特許手続のための微生物の寄託の国際認識に基づいて、ブダペスト条件に従って本発明者により寄託されている。
【００２３】
本発明の他の観点においては、次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
(a) ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号7 のヌクレオチド82〜ヌクレオチド1026に示される又は配列番号３のヌクレオチド82〜ヌクレオチド666 に示されるヌクレオチド配列を含んで成る; 又はペクチンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号１のヌクレオチド91〜ヌクレオチド1485に示されるヌクレオチド配列を含んで成る；又はポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号５のヌクレオチド１〜ヌクレオチド1248に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、ポリヌクレオチド分子；(b) 上記(a) の種相同体；(c) アミノ酸残基28〜アミノ酸残基341 の配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸残基28〜アミノ酸残基221 のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし；又は配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 のアミノ酸残基に対して少なくとも70％同一であるペクチンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし; 又は配列番号６のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基415 のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；又は(d) 上記(a), (b), もしくは (c)の縮重ヌクレオチド配列から成る群から選択されたDNA セグメント；並びに
転写ターミネーター；
を含んで成る発現ベクターが提供される。
【００２４】
本発明のさらにもう１つの観点においては、上記開示されるような発現ベクターが導入されている培養された細胞が提供され、ここで前期細胞はDNA セグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。
本発明のさらなる観点は、
（a ）配列番号８のアミノ酸残基28〜アミノ酸残基341 に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基28〜アミノ酸残基221 に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子；並びに
（c ）上記（a ）又は（ｂ）の種相同体；
から成る群から選択されたペクチン酸リアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。
【００２５】
本発明のもう１つの観点は、
（a ）配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基494 に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子；及び
（ｂ）上記（a ）の種相同体；
から成る群から選択されたペクチンリアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。
本発明のもう１つの観点は、
（a ）配列番号６のアミノ酸残基1 〜アミノ酸残基415 に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子；及び
（ｂ）上記（a ）の種相同体；
から成る群から選択されたポリガラクツロナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。
【００２６】
本発明のもう１つの観点においては、本発明の精製されたポリペプチド及び他のポリペプチドを含んで成る組成物が提供される。
本発明のもう1 つの観点においては、上記に開示されるような発現ベクターが導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞がDNA セグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そしてポリペプチドを回収することを含んで成る本発明のポリペプチドを製造するための方法が提供される。
【００２７】
本発明の新規酵素は、セルロース材料、特にセルロース含有繊維、糸、織布又は不織布の処理、機械的紙製造パルプ又は再循環された故紙の処理、及び繊維の浸水のために有用である。前記処理は、被服製造又は布製造のための材料中へのセルロース材料の加工の間、たとえば湯通し又は精練段階において；又はそのような布又は被服の産業的又は家庭用洗濯の間、行われる。
従って、さらなる観点においては、本発明は、実質的なペクチン分解活性を有する酵素を含んで成る洗剤組成物；及びセルロース含有繊維、糸、織布又は不織布の処理のためへの本発明の酵素の使用に関する。
【００２８】
本発明の酵素は、セルロース材料の調製における酵素的精練工程への使用のために、たとえば続く染料操作における正しい応答のために非常に有用である。さらに、新規酵素を含んで成る洗剤組成物が、洗濯物上に存在する土壌又はしみ、特にガラクタン又はアラビノガラクタン含有食品、植物及び同様のものに起因する土壌及びスポットを除去し、又は漂白することができると思われる。新規酵素を含んで成る洗剤組成物による処理がセルロース材料への一定の土壌の結合を妨げることができると思われる。本発明の酵素はまた、清浄の必要な硬質表面から一定の土壌又はしみを除去し、又はその除去を助ける効果を有する硬質表面清浄組成物における成分としても有用である。
【００２９】
定義：
本発明をさらに詳細に論じる前に、次の用語をまず定義しよう。
用語“オルト体（ortholog）”（又は“種相同体”）（species homolog ）とは、異なった種からの類似するポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する１つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
用語“パラ体（paralog ）”とは、所定の種からの異なったポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有するある種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
【００３０】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結された対象ポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又は環状DNA 分子を示す。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含することができ、そして任意には、１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、および同様のものを含むことができる。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNA に由来し、又は両要素を含むことができる。
【００３１】
本発明の発現ベクターは、組換えDNA 方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製と無関係である。染色体外実存体として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【００３２】
用語“組換え発現される”又は“組換え的に発現される”とは、ポリペプチド又はタンパク質の発現に関して本明細書において使用される場合、当業界における標準的定義に従って定義される。タンパク質の組換え的発現は一般的に、上記に記載されるような発現ベクターを用いることによって行われる。
【００３３】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、そのポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から取り出されており、そして従って他の外来の又は不所望のコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成系内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノムクローンを含むそれらの分子である。
【００３４】
本発明の単離されたDNA 分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さないが、しかし天然に存在する5 ’及び3 ’側の非翻訳領域、たとえばプロモーター及びターミネーターは含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（たとえば、Dynan and Tijan, Nature 319: 774-78, 1985 を参照のこと）。用語“単離されたポリヌクレオチド”とは他方では、“クローン化されたポリヌクレオチド”とも称することができる。
【００３５】
タンパク質/ ポリペプチドに適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の同種性タンパク質（すなわち“同種性不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。40％よりも高い純粋な形、より好ましくは60％よりも高い純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
【００３６】
さらにより好ましくは、SDS −PAGEにより決定される場合、高度に精製された形、すなわち80％以上、より好ましくは95％以上、及びさらにより好ましくは99％以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
用語“単離されたタンパク質/ ポリペプチド”とは、他方では、“精製されたタンパク質/ ポリペプチド”とも呼ばれ得る。
用語“同種性不純物”とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる同種細胞に起因するいずれかの不純物（たとえば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド）を意味する。
【００３７】
用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び/ 又はポリペプチドが特定源により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味する。
用語“〜に内因性”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、あるポリペプチドが、生来の遺伝子、すなわちその源の細胞中に組換え的に挿入されたものでない遺伝子の源の存在のために、その特定の源により生成されることを意味する。
【００３８】
用語“作用可能に連結された”とは、DNA セグメントに言及する場合、そのセグメントが、それらの意図された目的に関して機能するよう、たとえば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを意味する。
用語“ポリヌクレオチド”とは、5 ’から3 ’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドはRNA 及びDNA を包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
【００３９】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、対照配列に比較して、相補的な塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチドを示す。たとえば、配列5 ’ ATGCACGGG 3’は、5 ’ CCCGTGCAC 3’に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU 及びGAC トリプレットはそれぞれ、Asp をコードする）。
【００４０】
用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA 配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5 ’非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうとは限らない。
用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA 配列を示す。大きなペプチドは、通常、分泌経路を通して移動する間、分泌ペプチドを除去するために分解される。
【００４１】
用語“ペクチン”は、高い程度又は低い程度にエステル化されていてもよい、ペクチン酸、ポリガラクツロン酸及びペクチンを示す。
用語“ペクチン分解酵素”又は“ペクチナーゼ”とは、当業者において定義されるペクチナーゼ酵素を示し、ここでペクチナーゼはペクチン物質、主のポリ（１, ４−α−D −ガラクツロニド）及びその誘導体のグリコシド連鎖を分解する酵素グループである（Sakai など., 1993 ）。
【００４２】
好ましくは、本発明のペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸とも呼ばれるペクチン酸中のα−１, ４−グリコシド連鎖のトランスエリミネーション（transelimination）によるランダム分解を触媒するペクチナーゼ酵素、たとえばペクチン酸リアーゼとしても知られており、ポリ（１, ４−α−D −ガラクツロニド）リアーゼとしても知られている、酵素クラス・ポリガラクツロン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）(PGL) であるペクチナーゼである。
【００４３】
また、ペクチン酸中のα−１, ４−グリコシド連鎖のランダム加水分解を触媒するペクチナーゼ酵素、たとえばエンド−PGとしても知られている酵素クラス・ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15 ）(PG)が好ましい。また、ペクチナーゼ酵素、たとえばペクチンのα−１, ４−ガラクシド連鎖のランダム分解を触媒するペクチンリアーゼとしても知られており、ポリ（メトキシガラクツロニド）リアーゼとしても知られている、エンド−PMGLとして知られているポリメチルガラクツロン酸リアーゼ（EC 4.2.2.10 ）が好ましい。
【００４４】
発明の特定の記載：
他の関連する配列を得るために本発明の配列の使用し方：
本発明のペクチン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に関連する、本明細書において開示される配列情報は、他の相同ペクチン酸リアーゼを同定するための手段として使用され得る。たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR ）は、種々の微生物源から、特に異なったバチルス種の他の相同ペクチン酸リアーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。
【００４５】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中位の緊縮条件下で、それぞれ配列番号1, 3, 5 又は７の類似する大きさの領域、又はそれらに対して相補的な配列にハイブリダイズするであろう。
【００４６】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の位置91−1485、配列番号３の位置82−1248、配列番号５の位置１−1248又は配列番号７の位置82−1026に示されるいずれかの十分な配列（ポリペプチドの成熟部分をコードする）を含んで成る変性された二本鎖DNA 、又は少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下で、少なくとも約100 個の長さの塩基対を有する、それぞれ配列番号1, 3, 5 又は７の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対してハイブリダイズするであろう。
【００４７】
ヌクレオチドプローブと相同DNA 又はRNA 配列の間の、中位又は高い緊縮下でのハイブリダイゼーションを決定するための適切な実験条件は、５×SSC （塩化ナトリウム/ クエン酸ナトリウム、Sambrookなど., 1989 ）において、ハイブリダイズするDNA フラグメント又はRNA を含むフィルターの10分間のプレソーキング、及び５×SSC 、５×Denhardtの溶液（Sambrookなど., 1989 ）、0.5 ％SDS 及び100 μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA （Sambrookなど., 1989 ）の溶液中でのフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、10ng/ml の濃度のランダム−プライムされた（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13）、32P −dCTP−ラベルされた（１×109cpm/ μg よりも高い比活性）プローブを含む同じ溶液における約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを含む。
【００４８】
次に、フィルターは、２×SSC, 0.5％SDS により、少なくとも60℃（中位の緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（中位の/ 高い緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも70℃（高い緊縮性）、及びさらにより好ましくは少なくとも75℃（非常に高い緊縮性）で、30分間、2 度洗浄される。
【００４９】
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X −線フィルムを用いて検出される。
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA 及びRNA を包含する。DNA 及びRNA を単離するための方法は、当業界において良く知られている。注目の遺伝子をコードするDNA 及びRNA は、当業界において知られている方法により、Gene Banks及びDNA ライブラリーにおいてクローン化され得る。
【００５０】
次に、本発明のペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、そして、たとえばハイブリダイゼーション又はPCR により単離される。
本発明はさらに、異なった細菌株からの対応するポリペプチド及びポリヌクレオチド（オルト体又はパラ体）を提供する。バチルスの種を包含する、グラム−陽性好アルカリ性菌株からのペクチン分解ポリペプチドは、特に興味あるものである。
【００５１】
本発明のペクチン分解活性を示すポリペプチドの種相同体は、従来のクローニング技法と組合せて、本発明より提供される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。たとえば、DNA は、タンパク質を発現する細胞型から得られる染色体DNA を用いて、クローン化され得る。適切なDNA 源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次にライブラリーが、陽性細胞系の染色体DNA から調製される。
【００５２】
次に、本発明のペクチン分解活性を有するポリペプチドをコードするDNA が、種々の方法により、たとえば開示された配列の基づいて、完全な又は部分的DNA 又は１又は複数の変性プローブによりプローブすることによって単離され得る。DNA はまた、ポリメラーゼ鎖反応（PCR ）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202 号）を用いて、又は本明細書に開示される配列からの企画されたプライマーを用いてクローン化され得る。
【００５３】
さらなる方法においては、DNA ライブラリーは、宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトするために使用され得、そして注目のDNA の発現が、材料及び方法、及び例に記載のようにして、バチルス・リケニホルミス（ATCC14580 ）からクローン化され、発現され、そして精製された、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ又はポリガラクツロナーゼに対して生ぜしめられた抗体（モノクローナル又はポリクローナル）により、又はペクチン分解活性を有するポリペプチドに関連する活性試験により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離に適用され得る。
【００５４】
E.コリDSM11789, E.コリDSM12030, E.コリDSM12031に存在するプラスミドpSJ1678 中にクローン化されるDNA 配列及び/ 又は本発明の類似DNA 配列の部分をコードするポリペプチドは、ペクチン分解活性を有する酵素を生成する、細菌種バチルス・リケニホルミス、好ましくは菌株ACTC14580 、又は本明細書に記載されるような他の又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５５】
あるいは、類似配列は、E.コリDSM11789、E.コリDSM12030又はE.コリDSM12031に存在するプラスミドから得られるDNA 配列、たとえばその副配列に基づいて、及び/ 又は前記DNA 配列によりコードされるペクチン分解酵素のもう1 つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の製造のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列（すなわち本発明のペクチン分解酵素の変異体）を生ぜしめ得るヌクレオチド置換の導入により構成され得る。
本明細書に開示される配列情報に基づいて、本発明のペクチナーゼをコードし、そしてそれぞれ配列番号1, 3, 5 又は７に示されるDNA 配列を含んで成る十分な長さのDNA 配列がクローン化され得る。
【００５６】
クローニングは、当業界において知らされる標準の方法により、たとえば、
バチルス株からゲノムライブラリーを調製し；
適切な基材プレート上にそのようなライブラリーをプレートし；
それぞれ、配列番号1, 3, 5 又は７に基づくプローブを用いての標準のハイブリダイゼーション技法により、本発明のポリヌクレオチド配列を含んで成るクローンを同定し；又は
それぞれ、配列番号1, 3, 5 又は７からの配列情報に基づくプライマーを用いてのInverse PCR 法により、前記バチルス・リケニホルミスATCC14580 ゲノムライブラリーからのクローンを同定することによって行われる。Inverse PCR に関するさらなる詳細に関しては、M. J. MCPherson など. ( “PCR A Practical Approach”, Information Press Ltd, Oxford England)を参照のこと。
【００５７】
本明細書に開示される配列情報（配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 及び8 ）に基づいて、本発明の相同ペクチナーゼをコードする相同ポリヌクレオチド配列を、関連する微生物からのゲノムライブラリーを用いて、特にバチルス属、たとえばバチルス・スブチリス（Bacillus subutilis）の他の株からのゲノムライブラリーから、類似する方法により単離することは、当業者にとって日常の作業である。
【００５８】
あるいは、本発明のペクチン分解酵素をコードするDNA は、よく知られている方法に従って、適切な源、たとえば下記に言及される生物のいずれかから、E.コリDSM11789, E.コリDSM12030又はE.コリDSM12031に存在するプラスミドから得られるDNA 配列に基づいて調製された合成オリゴヌクレオチドプローブの使用により、便利にクローン化され得る。
【００５９】
従って、本発明のポリヌクレオチド分子は、E.コリDSM11789, E.コリDSM12030又はE.コリDSM12031から単離され得、ここで上記のようなクローニングにより得られるプラスミドは寄託されている。また、本発明は、それぞれ、E.コリDSM11789, E.コリDSM12030及びE.コリDSM12031の単離された、実質的に純粋な生物学的培養物にも関する。
【００６０】
ポリペプチド：
配列番号４のアミノ酸番号28−221 の配列は、成熟ペクチン酸リアーゼ配列であり；位置１−27はプロ配列である。配列番号８のアミノ酸番号28−341 の配列は成熟ペクチン酸リアーゼ配列であり；位置1 −27はプロ配列である。配列番号２のアミノ酸番号31−494 の配列は成熟ペクチンリアーゼ配列であり；位置1 −30はプロ配列である。配列番号６のアミノ酸番号1 −415 の配列は、成熟ポリガラクツロナーゼ配列である。
【００６１】
本発明はまた、それぞれ配列番号2, 4, 6 及び8 のポリペプチドに対して実質的に相同であるペクチン分解ポリペプチド、及びそれらの種相同体（パラ体又はオルト体）を提供する。用語“実質的に相同である”とは、それぞれ配列番号2, 4, 6 及び8 に示される配列、又はそれらのオルト体又はパラ体に対して、少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは少なくとも85％、及びさらにより好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために、本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、それぞれ配列番号2, 4, 6 及び8 に示される配列、又はそのオルト体又はパラ体に対して、少なくとも95％及び最も好ましくは98％又はより以上に同一であろう。
【００６２】
％配列同一性は、従来の方法、すなわち当業者において知られているコンピュタープログラムパッケージプログラム、たとえば引用により本明細書に組込まれる、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453 において開示されるようなGCG プログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）に提供されるGAP により決定される。GAP は、ポリペプチド配列比較のために次の設定を用いて使用される：3.0 のGAP 創造ペナルティー及び0.1 のGAP 延長ペナルティー。
【００６３】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、DNA 配列比較に関して次の設定でのGAP を用いて類似する方法により決定される：5.0 のGAP 創造ペナルティー及び0.3 のGAP 延長ペナルティー。
本発明は、他の微生物のアミノ酸ペクチナーゼ配列に対して相同性を有するポリペプチド配列をコードするバチルス・リケニホルミス株から得られるいくつかの新規ポリヌクレオチド配列の発現に一部、基づかれている。
【００６４】
新規バチルス・リケニホルミスペクチナーゼは次のように命名されている：
I ：ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）
II：ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）
III ：ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10 ）
IV：ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15 ）
本発明の新規ペクチナーゼポリペプチド配列は、代表的な調査配列、特に既知のペクチナーゼのアミノ酸配列をバチルス・リケニホルミス配列データベースにたずねて、ペクチナーゼに対する相同配列を同定することによって、最初に同定された。
【００６５】
本明細書においてさらに詳細に記載されるように従来の％配列同一プログラムを用いて、最も接近した従来技術の既知ペクチナーゼに対する、付随する配列番号２(I), 4(I), 6(IV), 8(II))のアミノ酸配列のアミノ酸配列同一性が下記の表１，２及び３に示される。
【００６６】
第１表：
ペクチン酸リアーゼ（I ）についてのアミノ酸配列間の相同性：
本発明のペクチン酸リアーゼ（I ）に対して最も相同なペクチン分解タンパク質は、WO98/45393として公開された国際出願に見られるB.sp. 株KSM-P15 の配列番号：１であり、これは成熟タンパク質配列番号４に対して58.8％相同である。
第２表：
ペクチン酸リアーゼ（II）についてのアミノ酸配列間の相同性：
類似性について使用される配列は、下記スキームに列挙される位置を有するTREMBLREL からのタンパク質配列である。
II：本発明のアミノ酸配列（配列番号８）
B ：o08454. sp# 細菌アミコラタsp. (Amycolata sp.) ペクチン酸リアーゼ
C ：q00893. Sp# 細菌グロメレラ・シンギュレート（Glomerella cingulate）
【００６７】
【表１】
0004246385.tif 000002
【００６８】
第３表：
ペクチンリアーゼ（III ）についてのアミノ酸配列間の相同性：
本発明のペクチンリアーゼに対して最も相同なペクチンリアーゼタンパク質は、バチル・スブチリスペクチンリアーゼO34819及びバチルス・スブチリスペクチンリアーゼP94449であり、両タンパク質配列はTREMBLデータベース（EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS）に見出される。それらは、タンパク質配列（配列番号２）に対して55％及び56％相同である。
【００６９】
第４表：
ポリガラクツロナーゼについてのアミノ酸配列間の相同性：
類似性について使用される配列は、下記スキームに列挙される位置を有するSWISSPROT からのタンパク質配列である。
IV：本発明のアミノ酸配列（配列番号６）
B ：p27644. swissprot#細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス
C ：p20041. Swissprot#細菌ブルコルデリア・ソラナセアラム（Burkholdaria solanacearum ）
【００７０】
【表２】
0004246385.tif 000003
【００７１】
本発明の酵素調製物は好ましくは、微生物、好ましくは細菌、原始生物又は菌類、特に細菌、たとえばバチルス、好ましくは種バチルス・リケニホルミス及びすべての種が、好ましくは、整列された16S rDNA配列に基づいてバチルス・リケニホルミスに対して少なくとも99％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択され得る好アルカリ性バチルス株に属する細菌に由来する。
【００７２】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に対して実質的に影響を与えない他の置換であるマイナーな性質のもの；典型的には、１〜約30個の少数のアミノ酸の欠失；および短いアミノ−又はカルボキシル−末端延長、たとえば、アミノ酸−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、たとえばポリ−ヒスチジン路、プロテインA の延長である（Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991）。一般的には、Fordなど., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991 (引用により本明細書に組込まれる) を参照のこと。親和性標識をコードするDNA は、商業的供給者（たとえば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA ）から入手できる。
【００７３】
【表３】
0004246385.tif 000004
【００７４】
20個の標準のアミノ酸の他に、非標準的アミノ酸（たとえば、４−ヒドロキシプロリン、６−N −メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“非天然アミノ酸”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして/ 又は標準的アミノ酸の側鎖とは異なるそれらの側鎖に化学構造を有する。非天然アミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン並びに３, ３−ジメチルプロリンを包含する。
【００７５】
本発明のペクチン酸リアーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子中のどの残基にでも導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して必須であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、ペクチン分解活性）について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996を参照のこと。
【００７６】
酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。たとえば、de Vosなど., Science 255: 306-312, 1992; Smithなど., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。
【００７７】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/ 又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、たとえばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989), WO95/17413 号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数位置の同時ランダム化、又は組換え/ 異なった突然変異のシャフリング（WO95/17413号、WO95/22625号）、続いての機能的ポリペプチドについての選択、及び次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドの配列決定のための方法を開示する。
【００７８】
使用され得る他の方法は、ファージ表示（たとえば、Lowmanなど., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner など.,アメリカ特許第5,223,409 号；Huse, WIPO Publication WO92/06204 号）及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshireなど., Gene 46: 145, 1986; Nerなど., DNA 7: 127, 1988 ）を包含する。
【００７９】
上記に開示されるような突然変異誘発/ シャフリング方法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA 分子は、宿主細胞から回収され、そして近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、注目のポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の迅速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
【００８０】
上記で論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の残基31〜494 （成熟タンパク質）、配列番号４の残基28〜221 、配列番号６の残基１〜415 及び配列番号8 の残基28〜341 に対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質のペクチン分解活性を保持する種々のポリペプチドを同定し、そして/ 又は調製することができる。
【００８１】
本発明は、１つの観点においては、配列番号２の位置31−419 のアミノ酸配列、又は1 又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、又は付加により、それらから誘導されるアミノ酸配列（この後、突然変異として言及される）を有するペクチンリアーゼ酵素に関し、但し前記ペクチンリアーゼは不活性化されず、そして前記突然変異は配列番号２の377 位置でアルギニン及び383 位置でアルギニンを保存する。
【００８２】
突然変異の程度は特に制限されないが、但し上記377 及び383 位置におけるアルギニンは保存される。配列番号２のアミノ酸31〜375 に対応する部分配列に基づいて計算される場合、好ましくは、56％又はそれよりも高い相同性が、生来又は親ペクチンリアーゼ酵素の前記のような突然変異体間に存在する。より好ましくは、相同性は、70％又はそれ以上、特に80％又はそれ以上である。
【００８３】
さらに、本発明は、１つの観点においては、配列番号４の位置28−221 のアミノ酸配列、あるいは1 又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、又は付加によりそれらから誘導されるアミノ酸配列（この後、突然変異として言及される）を有するペクチン酸リアーゼ酵素に関し、但し前記ペクチンリアーゼは不活性化されず、そして前記突然変異は配列番号４の133 及び155 位置のリシン及び158 位置のアルギニンを保存する。
【００８４】
また、突然変異の程度は特に制限されないが、但し上記K133,K155 及びR158は保存される。配列番号４のアミノ酸位置60−158 に対応する部分配列に基づいて計算される場合、好ましくは、66％又はそれよりも高い相同性が、生来又は親ペクチンリアーゼ酵素の前記のような突然変異体間に存在する。より好ましくは、相同性は、70％又はそれ以上、特に80％又はそれ以上である。
【００８５】
さらに、本発明は、１つの観点においては、配列番号８の位置28−341 のアミノ酸配列、あるいは1 又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加によりそれらから誘導されるアミノ酸配列（この後、突然変異として言及される）を有するペクチン酸リアーゼ酵素に関し、但し前記ペクチンリアーゼは不活性化されず、そして前記突然変異は配列番号８の233 及び238 位置（R233及びR238）のアルギニンを保存する。
【００８６】
また、突然変異の程度は特に制限されないが、但し上記R233及びR238は保存される。配列番号８の成熟配列に基づいて計算される場合、好ましくは、42％又はそれよりも高い相同性が、生来又は親ペクチンリアーゼ酵素の前記のような突然変異体間に存在する。より好ましくは、相同性は、50％又はそれ以上、さらにより好ましくは、60％以上、特に70％又はそれ以上、特に80％又はそれ以上である。
【００８７】
本発明のペクチン分解酵素は、触媒活性ドメインを含んで成る酵素コアの他にさらに、セルロース結合ドメイン（CBD ）を含んで成り、前記酵素のセルロース結合ドメイン及び酵素コア（触媒活性ドメイン）は作用可能に連結される。そのセルロース結合ドメイン（CBD ）はコードされた酵素の内部部分として存在することができ、又は他の起源からのCBD がペクチン分解酵素中に導入され、従って酵素ハイブリッドを創造し得る。
【００８８】
この場合、用語“セルロース−結合ドメイン”とは、Peter Tomme など.,“Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties” in “Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”, John N, Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No.618, 1996により定義されるとおりであるものとして理解されるべきである。この定義は、120 よりも多くのセルロース−結合ドメインを10種のファミリー（I 〜X ）に分類し、そしてCBD が種々の酵素、たとえばセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼに見出されることを示す。
【００８９】
DBD はまた、藻類、たとえば赤藻類ポルフィラ・パーピュレア（Porphyra purpurea ）において、非加水分解性多糖−結合タンパク質として見出されている（Tomme など.,前記を参照のこと）。しかしながら、CBD のほとんどは、セルラーゼ及びキシラナーゼからのものであり、CBD はタンパク質のN 及びC 末端で見出され、又は内部に存在する。
【００９０】
酵素ハイブリッドは当業界において知られており（たとえば、WO90/00609号及びWO95/16782号を参照のこと）、そしてペクチン分解酵素をコードするDNA 配列に、リンカーを伴って又は伴わないで、連結されるセルロース−結合ドメインをコードするDNA のフラグメントを少なくとも含んで成るDNA 構造体を用いて、宿主細胞を形質転換し、そして融合された遺伝子を発現するために宿主細胞を増殖することによって製造され得る。
【００９１】
酵素ハイブリッドは、次の式：
CBD −MR−X
により記載され、ここで前記CBD は少なくともセルロース−結合ドメインに対応するアミノ酸配列のN −末端又はC −末端領域であり；MRは中間領域（リンカー）であり、そして結合、又は好ましくは、約２〜約100 個の炭素原子、より好ましくは２〜40個の炭素原子の短い結合基であり得；又は好ましくは約２〜約100 個のアミノ酸、より好ましくは２〜40個のアミノ酸であり得；そしてX は本発明のペクチン分解酵素のN −末端又はC −末端の領域である。
【００９２】
好ましくは、本発明の酵素は、少なくとも８、より好ましくは少なくとも8.5 、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも9.5 、より好ましくは少なくとも10、さらにより好ましくは少なくとも10.5、特に少なくとも11のpHでその最大の触媒活性を有し；そして好ましくは、酵素の最大活性は、少なくとも50℃、より好ましくは少なくとも55℃の温度で得られる。
【００９３】
タンパク質の製造：
十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において製造され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNA により形質転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。細菌細胞、特に、グラム−陽性生物の培養された細胞が好ましい。
【００９４】
バチルス属からの次のグラム−陽性細胞が特に好ましい：バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、バチルス・レンタス（Bacillus lenntus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシ（Bacillus clausii）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus ）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）、又は特に、バチルス・リケニホルミス。ATCC14580 は、バチルスリケニホルミスのタイプ株である。
【００９５】
クローン化された分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNA を導入するための技法は、次の文献に開示されている：Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubelなど. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987;及びBacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheimなど., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C. ( それらは引用により本明細書中に組込まれる) 。
【００９６】
一般的に、本発明のペクチン酸リアーゼをコードするDNA 配列は、一般的に発現プロモーター内に転写プロモーター及びターミネーターを含む、その発現のために必要とされる他の遺伝子要素に作用可能に連結される。前記ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むが、但し当業者は、一定のシステム内において、選択マーカーが別々のベクター上に提供され得、そして外因性DNA の複製が宿主ゲノムへの組み込みにより提供され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常のことである。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして商業的供給者から入手できる。
【００９７】
宿主細胞の分泌経路中にポリペプチドを向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列はポリペプチドの配列であり得、又は他の分泌されたタンパク質に起因し、又は新たに合成され得る。多くの適切な分泌シグナル配列が当業界において知られており、そして特に、バチルス宿主細胞における分泌のための適切な分泌シグナル配列のさらなる記載については、次の文献を参照のこと：Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheimなど., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.;及びCutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus ”, John Wiley and Sons, 1990 。
【００９８】
分泌シグナル配列は、DNA 配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は、通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列の５’側に位置し、但しあるシグナル配列は興味のDNA 配列の他の場所に位置することができる（たとえば、Welch など.,アメリカ特許第5,037,743 号；Holland など.,アメリカ特許第5,143,830 号を参照のこと）。
【００９９】
形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養物、及び選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。定義された培地及び複合培地を包含する種々の適切な培地が、当業界において知られており、そして一般には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要な場合、成長因子のような成分を含むことができる。薬物選択、又は発現ベクター上に担持され、又は宿主細胞中に同時にトランスフェクトされた選択マーカーにより補充される必須栄養物における栄養不足により、増殖培地は、外因的に付加されたDNA を含む細胞を選択するであろう。
【０１００】
本発明のポリペプチドはまた、バチルス属に属する野生型株、好ましくはバチルス・リケニホルミス種及びすべての種において、整列された16S rDNA配列に基づいて、バチルス・リケニホルミスに対して少なくとも99％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択され得る株を発酵することによっても生成され得る。特定の及び非常に好ましい例は、バチルス・リケニホルミスATCC14580 である。
さらに、本発明のポリペプチドは、上記菌株に由来する変異株又は変異体を発酵することによって生成され得る。そのような変異体は、従来の技法の使用及びより高いペクチナーゼ活性を付与する変異体についての選択により得られる。
【０１０１】
発酵は、他の必須栄養物と共に炭素及び窒素源を含む栄養培地における好気性条件下での菌株の培養により行われ得、ここで前記培地は知られている技術の原理に従って構成される。培地は複合富化培地又は最少培地であり得る。窒素源は、無機及び/ 又は有機性質の物であり得る。適切な無機窒素源は、硝酸塩及びアンモニウム塩である。有機窒素源の中で、非常に多くの窒素源が発酵において規則的に使用される。
【０１０２】
例としては、大豆ミール、カゼイン、トウモロコシ、トウモロコシ蒸留酒、酵母抽出物、尿及びアルブミンを列挙することができる。適切な炭素源は、炭水化物又は炭水化物含有材料である。好ましい栄養培地は、炭素源として高いか又は低い程度、エステル化される、ペクチン酸、ポリガラクツロン酸及び/ 又はペクチン、及び/ 又はペクチナーゼ生成のインデューサーを含む。他方では、培地は、ペクチンに富んでいる材料、たとえば大豆ミール、リンゴ果肉又はカンキツ類の皮を含む。
【０１０３】
本発明のバチルス種は好アルカリ性であるので、培養は好ましくは、アルカリpH値、たとえば少なくともpH8 、又は少なくともpH9 で行われ、これは、増殖培地の殺菌の後、適切な緩衝液、たとえば炭酸ナトリウム、又は炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの混合物の添加により得られる。
野生型株又は変異体の適切な培地における発酵は、培養物ブイヨン１ｌ当たり少なくとも0.5g又は2gのペクチナーゼタンパク質の収量をもたらすことができる。
【０１０４】
タンパク質の単離：
発現された野生型又は組換えポリペプチドが分泌される場合、そのポリペプチドは増殖培地から精製され得る。好ましくは、発現宿主細胞は、ポリペプチドの精製の前、培地から除かれる（たとえば、遠心分離による）。
発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、宿主細胞は好ましくは、破壊され、そしてポリペプチドは、そのような精製技法の第１段階である水性“抽出物”中に開放される。好ましくは、発現宿主細胞は、細胞破壊の前、培地から除去される（たとえば遠心分離による）。
【０１０５】
細胞破壊は、従来の技法たとえばリゾチーム消化により、又は細胞に高圧力を付与することにより行われ得る。そのような細胞破壊技法のさらなる説明のためには、Robert K. Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlag を参照のこと。
発現された組換えポリペプチド（又はキメラポリペプチド）が分泌されても又はされなくても、それは、分別及び/ 又は従来の精製方法を用いて、精製され得る。
【０１０６】
硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出が、サンプルの分別のために使用され得る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なアニオン交換媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ及び同様のものを含む。PEI, DEAE, QAE及びQ 誘導体が好ましく、そしてDEA Fast-Flow セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ ）が特に好ましい。
【０１０７】
典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチル、又はオクチル基により誘導体化されたそれらの媒体、たとえばフェニル−セファロース（Pharmacia ）、Toyopearl ブチル650 （Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−セファロース（Pharmacia ）及び同様のもの；又はポリアクリル酸樹脂、たとえばAmberchrom CG71 (Toso Haas) 及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材のビーズ樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂、及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。
【０１０８】
それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び/ 又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基により変性され得。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、N −ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体が、良く知られており、そして当業界において広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。
特定方法の選択は、日常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。たとえば、Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988 を参照のこと。
【０１０９】
本発明のポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され得る。本発明のポリペプチドは、モノマー又はマルチマー；グリコシル化された又はグリコシル化されていない；ペギル化され（pegylated ）又はペギル化されず；そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくてもよい。
従って、さらなる観点においては、本発明はまた、本発明の酵素調製物を生成するための方法にも関し、ここで前記方法は、ペクチン酸リアーゼを生成することができる微生物を前記酵素の生成を可能にする条件下で培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んで成る。
【０１１０】
培養は、従来の発酵技法、たとえばペクチン酸リアーゼ酵素の生成を誘発する増殖培地に対して十分な確保するために撹拌しながら、振盪フラスコ又は発酵器においての培養を用いて実施され得る。増殖培地は、従来のN −源、たとえばペプトン、酵母抽出物又はカザミノ酸、低められた量の従来のC −源、たとえばデキストロース又はスクロース、及びインデューサー、たとえばペクチン酸又はペクチン、又は複合植物基質、たとえば穀類ふすま（たとえば小麦ふすま又は米穀）を含むことができる。
【０１１１】
回収は、従来の技法、たとえばバイオマス及び上清液の遠心分離又は濾過による分離、上清液の回収、又は興味ある酵素が細胞内に存在する場合、細胞の破壊、たぶん続いて、ヨーロッパ特許第0406314 号に記載されるようなさらなる精製、又はWO97/15660号に記載のような結晶化により実施され得る。
さらにもう1 つの観点においては、本発明は、上記に記載される性質を有し、そして相同不純物を有さず、そして従来の組換え技法を用いて生成される、単離されたペクチン分解酵素に関する。
【０１１２】
トランスジェニック植物：
本発明はまた、本発明のペクチン分解酵素を回収できる量で発現し、そして生成するために、前記酵素をコードするDNA により形質転換された、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞にも関する。酵素は植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換え酵素を含む植物又は植物部分自体が使用され得る。
トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物の例は、草、たとえば湿地帯を好む草（イチゴツナギ属の草、イネ科）、飼草、たとえばウシノケグサ・トボシガラ、ドクムギ、温帯性草、たとえばヌカボ、及び穀草類、たとえば小麦、カラスムギ、ライ麦、大麦、イネ、モロコシ及びトウモロコシである。
【０１１３】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、たとえばハウチワマメ、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、豆及び大豆、並びにアブラナ科（ブラシカセアエ科（Brassicaceae））、たとえばカリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis Thaliana）である。
植物部の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子、及び塊根である。現在、また特定の植物組織、たとえばクロロプラスト、アポプラスト（apoplast）、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、及び細胞質が植物部分であると思われる。さらに、いずれの植物細胞でも、その組織起源が何であろうと、植物部分であると見なされる。
また、そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫も、本発明の範囲内に包含される。
【０１１４】
本発明の酵素を発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、本発明の酵素をコードする１又は複数の発現構造体を植物宿主ゲノム中に組み込み、そしてその得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞に生長せしめることによって構成される。
【０１１５】
便利には、発現構造体は、本発明の酵素をコードする遺伝子を、選択された植物又は植物部分において前期遺伝子の発現のために必要とされる適切な調節配列と共に作用可能に関連して含んでなるDNA 構造体である。さらに、発現構造体は、その発現構造体が組み込まれている宿主細胞を同定するために有用である選択マーカー、及び問題の植物中への前期構造体の導入のために必要なDNA 配列を含むことができる（後者は、使用されるDNA 導入方法に依存する）。
【０１１６】
調節配列、たとえばプロモーター及びターミネーター配列、及び任意には、シグナル又はトランジットの選択は、酵素がいつ、どこで及びいかにして、発現されることを所望されるかに基づいて、決定される。たとえば、本発明の酵素をコードする遺伝子の発現は、構成的又は誘導的であり、又は進行的、段階的又は組織特異的であり、そして遺伝子生成物は特定の組織又は植物部分、たとえば種子又は葉に標的化され得る。調節配列は、たとえばTague など., Plant Phys., 86: 506, 1988 により記載されている。
【０１１７】
構成的発現のためには、35S −CaMVプロモーターが使用され得る（Franckなど., 1980, Cell 21:285-294）。器官−特異的プロモーターは、貯蔵組織たとえば種子、ジャガイモ塊茎、及び果物（Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275-303）、又は代謝組織、たとえば分裂組織（Ito など., 1994, Plant Mol. 24: 863-878 ）からのプロモーター、又は種子特異的プロモーター、たとえばイネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Wuなど., Plant and Cell Physiology Vol.34, No.39, No.8, pp.885-889 (1998) ）、
【０１１８】
Conrad U. など, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No.6, pp.708-711 (1998) により記載されるビシア・ファバ（Vicia faba）からのレグミンB ４及び未知の種子タンパク質遺伝子からのビシア・ファバプロモーター、種子油本体のタンパク質からのプロモーター（Chenなど., Plant and Cell Physiology Vol.39, No.9, pp.935-941 (1998)）、ブラシカ・ナパス（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質napAプロモーター、又はたとえばWO91/14772号に記載のような当業界において知られているいずれか他の種子特異的プロモーターであり得る。
【０１１９】
さらに、プロモーターは、葉特異的プロモーター、たとえば株又はトマトからのrbcsプロモーター（Kyozuka など., Plant Physiology Vol.102, No.3, pp.991-1000 (1993) ）、コレラウィルスあでのメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol.26, No.1, pp.85-93 (1994)）、又はイネからのaldP遺伝子プロモーター（Kagayaなど., Molecular and General Genetics Vol.248, No.6, pp.668-674 (1995)）、又は創傷誘発性プロモーター、たとえばジャガイモpin ２プロモーター（Xuなど., Plant Molecular Biology Vol.22, No.4, pp.573-588 (1993)）であり得る。
【０１２０】
プロモーターエンハンサー要素は、植物における、酵素のより高い発現を達成するために使用され得る。たとえば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと酵素をコードするヌクレオチド配列との間に配置されるイントロンであり得る。たとえば、Xuなど、前記は、発現を増強するためにイネアクチン１遺伝子の第１イントロンの使用を開示する。
選択マーカー遺伝子、及び発現構造体のいずれかの他の部分は、当業界において入手できるものから選択され得る。
【０１２１】
DNA 構造体は、当業界において知られている従来の技法、たとえばアグロバクテリウム−介在性形質転換、ウィルス−介在性形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、バイオリスティク形質転換、及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノム中に組込まれる（Gasserなど., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/tech. 8,535,1990; Shimamotoなど., Natune, 338, 274, 1989 ）。
【０１２２】
好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは、トランスジェニック双子葉植物を生成するための好ましい方法（Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38を参照のこと）であるが、しかしながら、それはまた、他の形質転換方法が一般的に、それらの植物のためには好ましいけれども、単子葉植物を形質転換するためにも使用され得る。
【０１２３】
現在、トランスジェニック単子葉植物を生成するための好ましい方法は、胚カルス又は成長する胚の粒子衝撃法（形質転換性DNA により被覆された微小金又はタングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil など., 1992, Bio/Technology 10: 667-674 ）。単子葉植物の形質転換のための他の方法は、Omirulleh B,など., Plant Molecular Biology Vol. 21, No.3, pp.415-428 (1993) により記載されるように、プロトプラスト形質転換に基づかれている。
形質転換に続いて、発現構造体を組み込んでいる形質転換体が、当業界においてよく知られている方法に従って、選択され、そして完全な植物に再生される。
【０１２４】
酵素調製物：
本明細書において、用語“酵素調製物”とは、微生物の単一種から、たぶん単離され、そして精製された従来の酵素発酵生成物（そのような調製物は通常、多くの異なった酵素活性を含んで成る）；又は単一生成酵素、好ましくは細菌又は菌類種から従来の組換え技法を用いることによって誘導された酵素の混合物（前記酵素は、発酵され、そしてたぶん単離され、そして別々に精製されており、そして異なった種、好ましくは菌類又は細菌種に起因する）；又は組換えペクチン分解酵素の発現のための宿主細胞として作用するが、しかし他の酵素、たとえば他のペクチン分解酵素、プロテアーゼ又はセルラーゼを同時に生成する微生物の発酵生成物（微生物の天然に存在する発酵生成物、すなわちその対応する天然に存在する微生物により従来通りに生成される酵素複合体である）のいずれかを意味する。
【０１２５】
本発明のペクチン分解酵素調製物はさらに、下記から成る群から選択された１又は複数の酵素を含んで成ることができる：プロテアーゼ、セルラーゼ（エンド−β−１, ４−グルカナーゼ）、β−グルカナーゼ（エンド−β−１, ３（４）−グルカナーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナーゼ、キシログルナナ−ゼ、キシラナーゼ、
【０１２６】
ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物。好ましい態様においては、調製物中の1 又は複数の、又はすべての酵素は、組換え技法を用いて生成され、すなわち酵素は所望する酵素ブレンドにより酵素調製物を形成するために、他の酵素と共に混合される単一成分酵素である。
【０１２７】
免疫学的交差反応性：
免疫学的交差反応性の決定に使用されるべきポリクローナル抗体（所定の酵素タンパク質に対して単特異的である）は、生成されたペクチン分解酵素の使用により調整され得る。より具体的には、本発明のペクチン分解酵素に対する抗血清が、N. Axelsenなど., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, 又はA. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (より詳しくは、p.27-31)に記載される方法に従って、ウサギ（又は他のゲッ歯動物）を免疫化することによって生ぜしめられ得る。
【０１２８】
精製された免疫グロブリンは、たとえば塩沈殿（(NH4)2 SO4）、続いて透析、及びDEAE−Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得られる。タンパク質の免疫化学特徴化が、Outcherlony 二重拡散分析（O. Ouchterlony, Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publication, 1967, pp.655-706 ）、架橋された免疫電気泳動（N. Axelsenなど.,前記, Chapters 3 and 4) 、又はロケット免疫電気泳動（N. Axelsenなど., Chapter 2）のいずれかにより行われ得る。
【０１２９】
洗剤又は洗浄産業への使用：
さらなる観点においては、本発明は、本発明のペクチン分解酵素又は酵素調製物を含んで成る洗剤組成物、本発明のペクチン分解酵素又は酵素調製物を含む洗浄溶液により、機械洗浄の洗浄サイクルの間、布を処理することを含んで成る、布の機械処理のための方法、及び卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去性能を提供する本発明のペクチン分解酵素又は酵素調製物を含んで成る清浄組成物、たとえば洗濯、硬質表面クリーナー、個人用洗浄及び経口/ 歯用組成物に関する。
【０１３０】
論理に拘束されるわけではないが、本発明のマンナナ−ゼは、ガラクトマンナンを含む土壌又はしみを効果的に分解し、又は加水分解することができ、そして従って、そのような土壌又はしみを含んで成る洗濯物を清浄することができると思われる。
本発明の清浄組成物は、少なくとも１つの追加の洗剤成分を含むべきである。それらの追加の成分の正確な性質、及びその導入のレベルは、組成物の物理形、及びそれが使用される洗浄操作の性質に依存するであろう。
【０１３１】
本発明の洗浄組成物は好ましくは、選択された界面活性剤、他の酵素ビルダー及び/ 又は漂白系から選択された洗浄成分をさらに含んで成る。
本発明の洗浄組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状、錠剤、スプレー、発泡体、粉末又は粒質物であり得る。粒状組成物はまた、“圧縮”形でも存在することができ、そして液体組成物はまた、“濃縮された”形でも存在することができる。
【０１３２】
本発明の組成物は、手動及び機械皿洗い組成物、手動及び機械洗濯洗剤組成物、たとえば洗濯用添加剤組成物、及び染色された布のソーキング及び/ 又は前処理への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄操作への使用のための組成物として配合され得る。そのようなカルボヒドラーゼを含む組成物はまた、衛生用製品、コンタクトレンズ清浄剤、及び健康及び美容ケアー製品、たとえば経口/ 歯用ケアー及び身辺用洗浄組成物としても配合され得る。
【０１３３】
手動皿洗い方法のための組成物として配合される場合、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤、及び好ましくは、有機ポリマー化合物、石鹸水増強剤、第II族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ及び追加の酵素から選択された他の洗剤化合物を含む。
【０１３４】
洗濯機洗浄方法への使用のために適切な組成物として配合される場合、本発明の組成物は好ましくは、界面活性剤及びビルダー化合物の両者、及びさらに、好ましくは、有機ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、石鹸水の泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁及び抗−再沈殿剤、及び腐食防止剤から選択された１又は複数の洗剤成分を含む。洗濯組成物はまた、追加の洗剤成分として軟化剤も含むことができる。カルボヒドラーゼを含むそのような組成物は、洗濯洗剤組成物として配合される場合、布の清浄、しみの除去、白色度の維持、軟化、発色、染料移行の阻害、及び消毒を提供することができる。
【０１３５】
本発明の組成物はまた、固体又は液体形で、洗剤添加剤製品としても使用され得る。そのような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補充し、又は高めることが意図され、そして清浄工程のいずれの段階ででも添加され得る。
必要とされる場合、洗濯洗剤組成物の密度は、20℃で測定される組成物１ｌ当たり400 〜1200g 、好ましくは500 〜950gの範囲である。
【０１３６】
本明細書における組成物の“圧縮”形は、密度により、及び組成物に関しては、無機充填剤塩の量により最良に影響され；無機充填剤塩は、粉末形での洗剤組成物の従来の成分であり；従来の洗剤組成物においては、充填剤塩は、実質的な量で、典型的には、合計組成物の17〜35重量％で存在する。圧縮組成物においては、充填剤塩は、合計組成物の15重量％を越えない量で、好ましくは10重量％を越えない量で、最も好ましくは５重量％を越えない量で存在する。
【０１３７】
無機充填剤塩は、本発明の組成物に存在する場合、アルカリ及びアルカリ土類金属の硫酸塩及び塩化物塩から選択される。好ましい充填剤塩は、硫酸ナトリウムである。
本発明の液体洗剤組成物は、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤中の水含有率は、洗剤組成物中、40重量％以下、より好ましくは30重量％以下、最も好ましくは20重量％以下である。
【０１３８】
本明細書において使用するための適切な特定の洗剤化合物は、引用により本明細書中に組込まれるWO97/01629号に記載されるような特定の化合物から成る群から選択される。
マンナナ−ゼは、本発明の洗浄組成物中に、好ましくは、0.0001〜２重量％、より好ましくは0.0005〜0.5 重量％、最も好ましくは0.001 〜0.1 重量％のレベルで、純粋な酵素形で導入され得る。
【０１３９】
本発明において使用できるセルラーゼは、細菌又は菌類セルラーゼを含む。好ましくは、それらは、５〜12のpH最適値及び50CEVU/mg （セルラーゼ粘度単位）以上の比活性を有するであろう。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第4,435,307 号、J61078384 号及びWO96/02653号に開示されており、それらの特許はそれぞれ、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens ）、トリコダーマ（Trichoderma ）、チエラビア（Thielavia ）及びスポロトリカム（Sporotrichum）から生成される菌類セルラーゼを開示する。EP739982号は、新規バチルス種から単離されたセルラーゼを記載する。適切なセルラーゼはまた、GB−A −2075028 号；GB−A −2095275 号；DE−OS−2247832 号及びWO95/26398号にも開示される。
【０１４０】
そのようなセルラーゼの例は、ヒューミコラ・インソレンスの株（Humicola grisea var. thermgidea ）、特に株ヒューミコラ・インソレンスDSM1800 により生成されるセルラーゼである。他の適切なセルラーゼは、約50kDの分子量、5.5 の等電点を有し、そして415 個のアミノ酸を含むヒューミコラ・インソレンス起源のセルラーゼ；及びヒューミコラ・インソレンス、DSM1800 に由来する約43kDのエンド−β−１, ４−グルカナーゼであり；好ましいセルラーゼはPCT 特許出願WO91/17243号に開示されるアミノ酸配列を有する。
【０１４１】
また、適切なセルラーゼは、WO94/21801号に記載されるトリコダーマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum ）からのBGIII セルラーゼである。特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、WO96/29397号、EP−A −0495257 号、WO91/17243号、WO91/17244号及びWO91/21801号に記載されるセルラーゼである。布の保護及び/ 又は洗浄性質についての他の適切なセルラーゼは、WO96/34092号、WO96/17994号およびWO95/24471号に記載される。
【０１４２】
前記セルラーゼは通常、洗剤組成物の0.0001〜２重量％の純粋な酵素のレベルで洗剤組成物に導入される。
本発明のための好ましいセルラーゼは、アルカリセルラーゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも25％、より好ましくは少なくとも40％の活性を有する酵素である。より好ましいセルラーゼは、７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有する酵素である。好ましいアルカリセルラーゼは、Carezyme（商標）としてNovo Nordisk A/Sから市販されるセルラーゼである。
【０１４３】
アミラーゼ（α及び/ 又はβ）は、炭水化物基材のしみの除去のために含まれ得る。1994年２月３日に公開されたWO94/02597号、Novo Nordisk A/Dは、変異体アミラーゼを組込む清浄組成物を記載する。また、1995年４月20日に公開されたWO95/10630号、Novo Nordisk A/Sも参照のこと。清浄組成物への使用のための既知の他のアミラーゼは、α−及びβ−アミラーゼの両者を包含する。
【０１４４】
α−アミラーゼは当業界において知られており、そして次の特許に開示されるものを包含する：アメリカ特許第5,003,257 号；EP252,666 号；WO91/00353号；FR2,676,456 号；EP285,123 号；EP525,610 号；EP368,341 号；及びイギリス特許出願第1,296,839 号（Novo）。他の適切なアミラーゼは、1994年８月１８日に公開されたWO94/18314号及び1994年２月22日に公開されたWO96/05295（Genencor）に記載される安定性−増強されたアミラーゼ、及び1995年４月に公開されたWO95/10603号に公開される、Novo Nordisk A/Sから入手できる特許における、追加の修飾を有するアミラーゼ変異体である。また適切なアミラーゼは、EP277216号及びWO96/23873号（すべては、Novo Nordiskによる）に記載される。
【０１４５】
市販のα−アミラーゼ生成物の例は、GenencorからのPurafect OX AM（商標）、及びTermamyl（商標）、Ban （商標）、Fuugamyl（商標）、及びDuramyl （商標）（すべては、Novo Nordisk A/S Denmarkから入手できる）である。WO95/26397号は、他の適切なアミラーゼ、すなわちPhadebas（商標）α−アミラーゼ活性アッセイにより測定される場合、25℃〜55℃の温度範囲、及び８〜10の範囲のpH値で、Termamyl（商標）の比活性よりも少なくとも25％高い比活性を有することによって特徴づけられるα−アミラーゼを記載する。WO96/23873号（Novo Nordisk）に記載される上記酵素の変異体が適切である。活性レベルに関して、改良された性質、及び熱安定性及びより高い活性レベルの組み合わせを有するほかのデンプン分解酵素が、WO95/35382号に記載される。
【０１４６】
本発明のための好ましいアミラーゼは、商標Termamyl, Duramyl 及びMaxamyl として市販さえているアミラーゼ、及び/ 又はWO96/23873号において配列番号２として開示される、高められた熱安定性を示すα−アミラーゼ変異体である。
特定の用途のための好ましいアミラーゼは、アルカリアミラーゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも40％の酵素活性を有する酸素である。より好ましいアミラーゼは、７〜12に範囲のpHでそれらの最大活性を有する酵素である。
【０１４７】
デンプン分解酵素は、組成物の0.0001〜２重量％好ましくは0.00018 〜0.06重量％、より好ましくは0.00024 〜0.048 重量％の純粋の酵素レベルで、本発明の洗剤組成物に組込まれる。
用語キシログルカナーゼは、Vincken and Voragen at Wageningen University [vincken など. (1994) Plant Physiol., 104, 99-107] により記載される酵素ファミリーを包含し、そしてHayashi など. (1989) Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 139-168 に記載されようなキシログルカンを分解できる。
【０１４８】
Vincken などは、トリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）から精製されたキシログルカナーゼ（エンド−IV−グルカナーゼ）による、単離されたリンゴ細胞壁のセルラーゼからのキシログルカン被膜の除去を示した。この酵素は、細胞壁−埋封されたセルロースの酵素分解を増強し、そしてペクチン酵素と共同して作用する。Gist−Brcades からのRapidase LIQ＋は、キシログルカナーゼ活性を含む。
【０１４９】
このキシログルカナーゼは、好ましくは、組成物の0.0001〜２重量％、より好ましくは0.0005〜0.5 重量％、最も好ましくは0.001 〜0.1 重量％の純粋な酵素レベルで、本発明の清浄組成物中に導入される。
特定用途のための好ましいキシログルカナーゼは、アルカリキシログルカナーゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは40％の酵素活性を有する酵素である。より好ましいキシログルカナーゼは、７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有する酵素である。
【０１５０】
上記酵素は、いずれか適切な起源のもの、たとえば植物、動物、細菌、菌類及び酵母起源のものであり得る。起源はさらに、中温性又は高温性（extremphilic）（好冷性、向冷性、好熱性、好圧性、好アルカリ性、好酸性、好ハロゲン性、等）であり得る。それらの酵素の精製された又は精製されない形が使用され得る。
【０１５１】
現在、本発明の清浄組成物において野生型酵素の性能効率を最適化するためにタンパク質又は遺伝子工学技法を通してそれらの酵素を修飾することは、通常の実施である。たとえば、変異体は、そのような組成物中の通常遭遇する成分に対する酵素の適合性が高められるように企画され得る。他方では、変異体は、酵素変異体の最適pH、漂白剤又はキレート剤安定性、触媒活性及び同様のものが特定の清浄用途に適合するよう調整され得る。
【０１５２】
特に、漂白剤安定性の場合、酸化に対して敏感なアミノ酸に対して、及び表面適合性のための表面の電荷に対して注意が払われるべきである。そのような酵素の等電点はいくつかの荷電されたアミノ酸の置換により修飾され、たとえば等電点の上昇はアニオン性界面活性剤との適合性の改良を助けることができる。酵素の安定性は、キレート剤安定性を高めるために、たとえば追加の塩架橋及び強い金属結合部位の創造によりさらに高められ得る。
【０１５３】
繊維及びセルロース繊維加工産業への使用：
本発明のペクチン分解酵素は、繊維の生物調製のために、又は繊維の清浄のために、洗剤と組合せて、単独で又は他の炭水化物分解酵素（たとえば、アラビナナーゼ、キシログルカナーゼ、マンナナーゼ）と組合して使用され得る。綿繊維は、ペクチンを含む一次細胞壁層及び主にセルラーゼを含む二次層から成る。綿調製又は綿精錬下で、一次細胞壁の部分が除去されるであろう。本発明は、一次細胞壁の除去により、綿精錬の間、又は残留ペクチン物質を除去し、そして紡繊の灰色化を防げるために綿の清浄の間の助けに関する。
【０１５４】
本明細書においては、用語“セルロース材料”とは、繊維、縫われ及び縫われていない布、たとえば編物、織物、デニム、糸及びタオル（綿から製造される）、綿ブレンド、又は天然又は人工的セルロース系誘導物（たとえば、キシラン−含有セルロース繊維、たとえば木材パルプに起因する）、又はそれらのブレンドを意味する。
【０１５５】
ブレンドの例は、綿又はレーヨン/ ビスコースと１又は複数の類似する材料、たとえば毛、合成繊維（たとえば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有繊維（たとえば、レーヨン/ ビスコース、ラミー、大麻、亜麻/ リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、ライオセル（lyocell ））のブレンドである。
【０１５６】
本発明の酵素又は調製物は、大麻、亜麻又はリネンからの繊維の前処理又は浸水のためにセルロース繊維加工産業において有用である。
綿繊維に関して、紡織産業のためのセルロース材料の被服製造のために容易な材料への加工は、次のいくつかの段階を包含する：繊維の糸への紡糸；糸からの織物又は編物の構成、及び続く調製、染色及び最終操作。織物製品は、一連の縦糸間に横糸を織り込むことによって構成され；糸は２種の異なったタイプのものである。編物製品は、１本の連続した長さの糸から絡み合いのループの網状構造を形成することによって構成される。セルロース繊維はまた、不織布のためにも使用され得る。
【０１５７】
調製工程は、染色操作における適切な応答のための紡織を提供する。調製に包含される副段階は次の工程である：
a.たとえばスターチのようなポリマーサイズ剤を用いてのサイズ剤除去（織布製品に関しては）；CMC 又はPVA が、縦糸の速度を早めるために、織り込む前に添加され、この材料は、追加の加工の前に除去されるべきであり；
【０１５８】
b.精練；この目的は、綿繊維から非セルロース材料、特に表皮（主に、蜜蝋から成る）及び一次細胞壁（主に、ペクチン、タンパク質及びキシログリカンから成る）を除去することである。適切な蜜蝋の除去は、良好な染色を得るための目安である高い湿潤性を得るために必要である。一次細胞壁、特にペクチンの除去は、蜜蝋の除去を改良し、そしてより均等に染色を確実にする。されに、これは、漂白工程における白色度を改良する。精練に使用される主要化学物質は、70g/kg綿までの高濃縮及び80〜90℃の高温での水酸化ナトリウムであり；
【０１５９】
c.漂白；通常、精練に続いて、十分に漂白された（白色）布を得、又は染料の明瞭な色相を確保するために、酸化剤として過酸化水素を用いての漂白が伴う。
精練/ 漂白工程を組みさわされた１つの段階がまた、産業において使用される。調製工程は布の状態においては、最も日常的に使用されるが、精練、漂白及び染色操作はまた、繊維又は糸段階で用いられ得る。
【０１６０】
加工手段は、バッチ又は連続的であり得、そして布は開放した一定幅又はロープ形で液体加工流により接触される。連続操作は一般的に、含浸機を使用し、加熱された保圧チャンバーに適用され、それにより、布の重量当たりほぼ等しい重量の化学物質が布に適用され、続いて、化学反応が起こる。次に、洗浄セクションが、次の加工段階のための布を用意する。バッチ加工は一般的に、１つの加工バッチにおいて行われ、それにより、布は、化学薬品浴において、その重量の約８〜15倍の薬品と接触せしめられる。
【０１６１】
一定の反応期間の後、化学薬品が排液され、布がすすがれ、そして次に、化学薬品が適用される。断続的パッド−バッチ加工は、含浸機を用い、それにより、布の重量当たりほぼ等しい重量の化学薬品浴が布に適用され、続いて冷パッド−バッチの場合、１又は複数の日を要する保圧期間が伴う。
【０１６２】
織物は、編織布構成の一般的な形である。織り込み工程は、摩擦からそれを保護するために縦糸の“サイジング”(sizing)を要する。スターチ、ポリビニルアルコール（PVA ）、カルボキシメチルセルロース、蜜蝋及びアクリル酸結合剤が、利用性及び費用のために、使用される典型的なサイジング化学薬品の例である。サイズ剤は、織物を調製する最初の段階として、織り込み工程の後に除去されるべきである。ロープ又は開放した一定幅の形でのサイジングされた布は、デサイジング(desizing)剤を含む処理液体と接触せしめられる。
【０１６３】
使用されるデサイジング剤は、除去されるべきサイズ剤の型に依存する。PVA サイズ剤に関しては、熱湯又は酸化剤工程がしばしば使用される。綿布のための最も通常のサイズ剤は、スターチに基づかれている。従って、最もしばしばには、織られた綿布は、熱湯、スターチを加水分解するための酵素α−アミラーゼ、及び湿潤剤又は界面活性剤の組み合わせによりデサイジングされる。セルロース材料は、デサイジングを行うために十分に長い“保持期間”、デサイジング化学薬品と共に静置される。
【０１６４】
保持期間は、加工レジメの型及び温度に依存し、そして15分〜２時間であり、多くの場合、数日である。典型的には、デサイジング化学薬品は、一般的に、約15℃〜約55℃の範囲である含浸機に適用される。次に布が、デサイジング剤の活性を高めるために、十分な熱、通常約55℃〜約100 ℃の熱を付与する装置、たとえば“J −ボックス”において維持される。化学薬品、たとえば除去されるサイジング剤が、保持期間の終結の後、布から洗浄される。
【０１６５】
高い白色度又は良好な湿潤性及び得られる染色性を確保するために、サイジング薬品及び他の適用される化学薬品は十分に除去されるべきである。一般に、効果的なサイジングは、次の調製工程、すなわち精練及び漂白に対して決定的に重要なものであると思われる。
【０１６６】
精練工程は、綿に天然において見出される多くの非セルロース化合物を除去する。天然の非セルロース不純物の他に、精練は、汚れ、土壌、及び製造工程で導入された残留する材料、たとえば紡糸、コーン形成又はスラッシング滑剤を除去することができる。精練工程は、水酸化ナトリウム、又は関連する苛性アルカリ化剤、たとえば炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、又はそれらの混合物を用いる。一般的な、アルカリ安定性界面活性剤が、疎水性化合物の溶解性を高めるために、及び/ 又は布上へのそれらの再付着化を妨げるために、工程に添加される。
【０１６７】
処理は、一般的に、精練剤のpH13〜14の強アルカリ性溶液を用いて、80℃〜100 ℃の高温で行われる。化学工程の非特異的性質のために、不純物のみならず、セルロース自体が攻撃され、強度又は他の所望する布の性質の損傷を導く。セルロース布の軟度は、残留する天然綿の蜜蝋の機能である。高温での強アルカリ精練工程の非特異的性質は、所望する天然綿滑剤と製造工程において導入される滑剤との間を区別することはできない。さらに、従来の精練工程は、それらの工程からの高アルカリ性流出液のために環境問題を引き起こす。精練段階は、漂白のための最適な応答のための布を調製する。不適切に精練された布は、続く漂白段階において高いレベルの漂白用化学薬品を必要とするであろう。
【０１６８】
漂白段階は、天然の綿色素を脱色し、そしてジンニング、カーディング又は精練の間、完全には除去されなかったいずれかの残留する天然の木性綿のごみ成分を除去する。今日使用するための主要工程は、アルカリ過酸化水素漂白である。多くの場合、特に、非常に高い白色度が必要とされない場合、漂白は精練と組み合わされ得る。
下記例においては、精練段階が本発明のペクチン酸リアーゼ又はペクチン酸リアーゼ調製物、約50℃〜80℃の温度、及び約７〜11のpH（従って、苛性アルカリ剤を置換し又は補充する）を用いて行われ得ることが示されている。最適化された酵素工程は、高いペクチン除去性及び十分な湿潤性を確保する。
【０１６９】
植物材料の分解又は変性：
本発明の酵素調製物は好ましくは、本発明の酵素の高い植物細胞壁分解活性のために、植物細胞壁又は植物壁に起因するいずれかのペクチン含有材料の分解又は変性のための剤として使用される。
本発明のペクチン分解酵素は、油に富んでいる植物材料からの油の、大豆からの同様の大豆油の、オリーブからのオリーブ油の、又はナタネ種子からのナタネ油の又はヒマワリからのヒマワリ油の抽出を改良するために、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、および/ 又はヘミセルラーゼのような他の酵素と共に、又は単独で使用され得る。
【０１７０】
本発明のペクチン分解酵素は、植物細胞材料の成分の分解のために使用され得る。糖又はスターチに富んでいる植物材料の相当な商業的興味ある成分（たとえば、テンサイからスクロール、又はジャガイモからスターチ）及び商業的に興味が低い成分（たとえば、パルプ又は外皮画分）への分離が、特に興味あるものである。また、タンパク質に富んでいるか又は油に富んでいる収穫物の価値あるタンパク質及び油、及び不価値の外皮画分への分離が特に興味あるものである。分離工程は、当業界において知られている方法の使用により実施され得る。
【０１７１】
本発明のペクチン分解酵素はまた、収率を高めるために果実又は野菜ジュースの調製にも、及びたとえばワイン又はジュース製造からの種々の植物細胞壁−由来の材料又は廃棄材料、又は農業残留物、たとえば植物外皮、豆類の外皮、テンサイ果肉、オリーブ果肉、ジャガイモ果肉、及び同様のものの酵素加水分解にも使用され得る。
植物材料は、異なった種類の加工を改良し、カンキツ類からのペクチンの精製のような、ガラクタン以外の成分の精製又は抽出を促進し、供給価値を改良し、水結合能力を低め、廃水プラントにおける分解性を改良し、エンシレージへの植物材料の転換性を改良するために分解され得る。
【０１７２】
本発明の酵素調製物により、加工された果物又は野菜のコンシステンシー及び外観を調節することが可能である。コンシステンシー及び外観は、加工のために使用される酵素の実際の組み合わせ；すなわち本発明のペクチン酸リアーゼが組み合わされる酵素の特異性の生成物であることが示されている。たとえばリンゴ、ナシ、又はベリーからの透明なジュース；たとえばリンゴ、ナシ、ベリー、柑橘類又はトマトからの曇り安定性ジュース；及びたとえばニンジン及びトマトからのピューレの製造が、例として包含される。
【０１７３】
本発明のペクチン分解酵素は、植物細胞壁由来の材料の粘度を改良するために使用され得る。たとえば、前記ペクチン分解酵素は、ガラクタンを含む供給物の粘度を低めるために、及び粘性ガラクタン含有材料の加工を促進するために使用され得る。粘度の低下は、ガラクタン含有植物材料を、本発明の酵素調製物により、ガラクタン含有材料の十分な又は部分的分解のために適切な条件下で処理することによって得られる。
【０１７４】
本発明のペクチン分解酵素は、たとえば植物繊維からのペクチン物質の除去のために他の酵素と組合して使用され得る。この除去は、たとえば紡織繊維又は他のセルロース材料の製造において必須である。このためには、植物繊維材料は、適切な量の本発明のペクチン分解酵素により、植物繊維材料に関連するペクチン物質の十分な又は部分的分解を得るための適切な条件下で処理される。
【０１７５】
動物飼料添加剤：
本発明のペクチン分解酵素は、動物飼料の改良のために使用され得、そしてインビトロ（飼料の成分を変性することによって）又はインビボのいずれかで、それらの効果を付与することができる。ペクチン分解酵素は特に、多量のアラビノガラクタン又はガラクタンを含む動物供給組成物、たとえば大豆、ナタネ種子、ルピナス、等からの植物材料を含む飼料への添加のために適合化される。
【０１７６】
飼料に添加される場合、ペクチン分解酵素は、植物細胞壁材料のインビボ分解を有意に改良し、それにより、動物による植物材料の良好な利用性が達成される。それにより、動物の成長速度及び/ 又は飼料転換比（すなわち、体重の上昇に対する摂取された飼料の重量）が改良される。たとえば、摂取できるガラクタンが、β−ガラクトシダーゼと組合して、ペクチン酸リアーゼにより、動物により摂取でき、そして従って、飼料の利用できるエネルギーに寄与するガラクトース又はガラクトオリゴマーに分解される。
【０１７７】
また、ガラクタンの分解によりペクチン酸リアーゼが、非炭水化物飼料構成成分、たとえばタンパク質、脂肪及び鉱物の消化能力及び摂取を改良することができる。
さらなる記載のために、PCT/DK96/00443号及びそこにおける実施例が言及される。
【０１７８】
ワイン及びジュースの加工：
本発明の酵素又は酵素調製物は、野菜又は果物ジュース、特にリンゴ又はナシジュースにおける脱ペクチン化及び粘度低下のために使用され得る。これは、果物又は野菜ジュースを、本発明の酵素調製物により、果物又は野菜ジュースに含まれるペクチン−含有材料を分解するのに効果的な量で処理することによって達成され得る。
【０１７９】
酵素又は酵素調製物、マッシュ（飼料）の抽出性又は分解性を改良するために果物及び野菜からのマッシュの処理に使用され得る。たとえば、酵素調製物は、ジュース製造のためにリンゴ及びナシからのマッシュの処理に、及びワイン製造のためにブドウのマッシュ処理に使用され得る。
【０１８０】
ペクチン分解酵素の触媒活性の測定：
粘度アッセイAPSU：
APSU単位：APSU単位アッセイは、カルシウムを添加しないで、基質ポリガラクツロン酸を用いての粘度測定である。
基質の５％ポリガラクツロン酸のナトリウム塩（Sigma P-1879）を、0.1Mのグリシン緩衝液（pH10）に溶解する。その基質４mlを、40℃で５分間プレインキュベートする。酵素を添加し（250 μl の体積で）、そして最大速度でミキサー上で10秒間、混合し、次にそれを40℃で20分間インキュベートする。標準曲線のために、５APSU/ml 〜100APSU/mlの範囲の酵素濃度の希釈溶液の二重決定を、10〜60APSU/ml 間の最少４種の濃度に伴って実施する。粘度を、Sofraser, 45700 Villemandeur, FranceからのMIVI600 を用いて測定する。粘度を、10秒後、mVとして測定する。
【０１８１】
APSU単位の計算のために、上記のような酵素標準希釈度を標準曲線を得るために使用した：
0004246385.tif 000005
【０１８２】
プラトーと共に1 つの相指数減衰を有する非直線適合性を用いてのGrafPad Prism プログラムを、計算のために使用した。プラトーの＋範囲は、酵素を用いないで得られたmVである。プラトーは、100APSU 以上のmVであり、そして両例における粘度の半分への低下が、1.5APSU の標準誤差を伴って、12APSU単位であることが見出された。
【０１８３】
リアーゼアッセイ（235nm での）：
β−脱離の測定のために、235nm での吸光度の上昇を測定するアッセイを、0.1Mのグリシン緩衝液（pH10）に溶解された基質0.1 ％ポリガラクツロン酸のナトリウム塩（Sigma P-1879）を用いて実施した。触媒速度の計算のために、１分当たり235 単位での5.2 吸光度の上昇性は、１μモルの不飽和生成物の形成に対応する（Nasuna and Starr (1966) J. Biol. Chem. Vol 241 P.5298-5306; 及びBartling, Wegner and Olsen (1995) Microbiology Vol. 141 P.873-881 ）。
【０１８４】
235nm での吸光度の連続した測定を伴って、温度調節されたキュベットホルダーにおけるHP二極管アレー分光光度計上での１cmの光路を有する0.5ml のキュベットを用いての定常状態条件。定常状態のために、少なくとも200 秒間の直線上昇が、その速度の計算のために使用された。それがμモル/ 分での生成物の形成への転換のために使用された。
【０１８５】
寒天アッセイ：
ペクチン酸リアーゼ活性を、0.7 ％（w/v ）のポリガラクツロン酸ナトリウム（Sigma P 1879）を含む寒天プレート（たとえば、LB寒天）に穴開けされた４mmの穴に試験溶液を適用することによって測定することができる。次に、プレートを、特定温度（たとえば、75℃）で６時間インキュベートする。
【０１８６】
次に、プレートを、（i ）1MのCaCl2 に0.5 時間、又は（ii）１％の混合されたアルキルトリメチルアンモニウムBr（MTAB, Sigma M-7635）に１時間、インキュベートする。それらの両工程は、寒天内のポリガラクツロン酸塩の沈殿を引き起こす。ペクチン酸リアーゼ活性が、沈殿されたポリガラクツロン酸塩のバックグラウンド内の透明な領域の出現により検出され得る。このアッセイの感度を、ペクチン酸リアーゼの標準調製物の希釈溶液を用いて検量する。
【０１８７】
エンドポイン分析−ペクチン酸リアーゼについての235nm でのトランス位脱離（高カルシウム方法：最終インキュベーション混合物において１mMのカルシウム）：
この方法においては、基質および酵素を37℃で20分間インキュベートし、続いて、二重結合の形式の235nm での測定を行う。最終的に、分解速度を、トランス単位によるモル消衰係数に基づいて計算する。
【０１８８】
方法：
0.5ml の酵素希釈溶液と0.5ml の２＊基質溶液との混合。
基質：Sigma P-1879ロット77H3784 からのポリガラクツロン酸；
緩衝液２×：0.1Mのグリシン（pH10）＋2.0mモルのCaCl2 ；
停止試薬：0.02M のH3PO4 ；
インキュベーションの温度：37℃；
反応時間：20分；
トランスエリミネーションの消衰係数：0.0052μモル/cm 。
イオン不含有水に0.5 〜5APSU/mlまで希釈された酵素。
【０１８９】
２重反復試験での主要値：0.5ml 。２×緩衝液中、２％（w/v ）の基質溶液を、0.5ml の希釈された酵素と共に混合する。両者を37℃で水浴上で５分間プレインキュベートする。20分間インキュベートする。５mlの停止試薬および混合物を用いて停止する。ブランク混合物酵素及び停止試薬を最初に、そして次に、基質をすべて同じ体積で添加する。
【０１９０】
酵素：0.5ml
基質：0.5ml
停止試薬：5 ｍｌ
合計体積：6ml
１cmのキュベットにおける235nm での吸光度の測定。
0.0052μモル/cm の消衰係数を用いての１分当たりのトランス位脱離の形成の計算。
計算：[ （主要値＋主要値）/2−ブランク]0.0052 ＊6 ＊2 ＊酵素希釈度/20 分/1000ml ＝μモル/ 分。
【０１９１】
エンドポイント分析−pH9.0 でのペクチンリアーゼについての235nm でのトランスエリミネーション：
この方法は、エンドポイント分析−ペクチン酸リアーゼについての235nm でのイランス位脱離（高カルシウム方法）について上記の通りにして、但し下記基質及び緩衝液を用いて実施される：
基質：Sigma P −9561ロット125HO123からのCitrusからエステル化されたペク
チン
緩衝液２×：0.1Mの硼酸塩、pH9.0, 5mMのEDTA溶液
【０１９２】
材料及び方法：
菌株：
バチルス・リケニホルミスATCC14580
バチルス・スブチリスPL2306
この株は、既知のバチルス・スブチリスセルラーゼ遺伝子の転写単位を破壊されているapr 及びnpr 遺伝子（Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaarc, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of ald B, Which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis, J. Bacteriol., 172, 4315-4321）を有するバチルス・スブチリスDN1885であり、これはセルラーゼ陰性細胞をもたらす。
【０１９３】
この破壊は、（eds. A. L. Sonenshein, J. A. Hoch and Richard Losick (1993) Bacillus suhtillis and other Gram-Positive Bacteria, American Society Microbiology, p.618 ）に実質的に記載のようにして行った。
コンピテント細胞を、Yasbin, R. E., Wilson, G. A. and Young, F. E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for elective induction of prophage in competent cells, J. Bacteriol. 121: 296-304により記載のようにして、調製し、そして形質転換した。
【０１９４】
プラスミド：
pMOL944 :
このプラスミドは、プラスミドをバチルス・ スブチリスにおいて増殖可能にする要素、カナマイシン耐性遺伝子を実質的に含み、そしてバチルス・ リケニホルミスATCC14580 のamyL遺伝子からクローン化された強いプロモーター及びシグナルペプチドを有するpUB110誘導体である。シグナルベプチドは、シグナルペプチドとの融合においてタンパク質の成熟部分をコードするDNA をクローン化するのを便利にするSacII 部位を含む。これは、細胞の外部方向に向けられるプレ−タンパク質の発現をもたらす。
このプラスミドは、下記に手短に説明される従来の遺伝子工学技法により構成された。
【０１９５】
pMOL944 の構成：
pUB110プラスミド（Mckenzie, T.など., 1986, Plasmid 15: 93-103 ）を、ユニーク制限酵素NciIにより消化した。プラスミドpDN1981 (P. L. Jorgensenなど., 1990, Gene, 96, p37-42)上にコードされたamylプロモーターから増幅されたPCR フラグメントを、NciIにより消化し、そしてNciIにより消化されたpUB に挿入し、プラスミドpSJ2624 を得た。
【０１９６】
使用される２種のPCR プライマーは次の配列を有する：
# LWN5494: 5’-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3 ’
# LWN5495: 5’-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCA
AGAAGAT-3’
プライマー#LWN5494は、プラスミドにNotI部位を挿入する。
【０１９７】
次に、プラスミドpSJ2624 を、SacI及びNotIにより消化し、そしてpDN1981 上にコードされたamyLプロモーターに基づいて増幅された新たなPCR フラグメントを、SacI及びNotIにより消化し、そしてこのDNA フラグメントを、SacI−NotI消化されたpSJ2624 に挿入し、プラスミドpSJ2670 を得た。
このクローニングは、第１のamyLプロモータークローニングを、同じプロモーターにより置換するが、しかし反対の方向にである。
【０１９８】
PCR 増幅のために使用される２種のプライマーは、次の配列を有する：
# LWN5938: 5’-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGA
AGAT-3 ’
# LWN5939: 5’-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3’
【０１９９】
プラスミドpSJ2670 を、制限酵素PstI及びBclIにより消化し、そしてアルカリアミラーゼSP722 （引用により本明細書に組み込まれるWO95/26397号として公開された国際特許出願に開示される）をコードするクローン化されたDNA 配列から増幅されたPCR フラグメントをPstI及びBclIにより消化し、そして挿入し、プラスミドpMOL944 を得た。
【０２００】
PCR 増幅のために使用される２種のプライマーは次の配列を有する：
# LWN7864: 5’-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3’
# LWN7901: 5’-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3’
プライマー#LWN7901は、プラスミドにおけるSacII 部位を挿入する。
【０２０１】
一般的分子生物学的方法：
特にことわらない限り、DNA 操作及び形質転換は、分子生物学の標準的方法を用いて行われた（Sambrookなど.(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY;  Ausubel, F. M.など. (eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”. John Wiley and sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.)“Molecular Biological Methods for Bacillus ”. John Wiley and Sons, 1990 ）。
DNA 操作のための酵素は、供給者の規格に従って使用された（たとえば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等は、New England Biolabs, Inc. から入手できる）。
【０２０２】
培地：
TY: Ausubel, F. M.など. (eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and sons, 1995 に記載される通りである。
LB寒天：Ausubel, F. M.など. (eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and sons, 1995 に記載される通りである。
EPX 培地：EPO506780 号（WO91/09129号）に記載される。
次の例は、本発明を例示する。
【０２０３】
例１．バチルス・リケニホルミスからのペクチン酸リアーゼ（II）のクローニン
グ、発現、精製及び特徴づけ：
ゲノムDNA の調製：
株バチルス・リケニホルミスATCC14580 を、ATCC（American Type Culture Collection, USA ）により特定さえるような液体培地において増殖せしめた。37℃及び300rpmでの18時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、そしてゲノムDNA を、Pitcher など. (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989), Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156) により記載される方法により単離した。
【０２０４】
本発明のDNA 配列をコードするペクチン酸リアーゼII（上記参照のこと；アミノ酸配列、配列番号８により表される）を、次の２種のオリゴヌクレオチドから成るPCR プライマー組みを用いてPCR 増幅した：
【化１】
0004246385.tif 000006
制限部位SacII 及びNotII は下線が引かれている。
上記のようにしてバチルス・リケニホルミスATCC14580 から単離された染色体DNA を、製造業者の説明書に従って、Amplitaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)を用いてのPCR 反応において鋳型として使用した。PCR 反応を、200 μM の個々のdNTP, 2.5 単位のAmlitaq ポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）及び100pモルの個々のプライマーを含むPCR 緩衝液（10mMのトリス−HCl, pH8.3, 50mMのKcl, 1.5mMのMgCl2, 0.01 ％（w/v ）のゼラチン）において設定した。
【０２０５】
RCR 反応を、DNA 熱サイクラー（Landgraf, Germany ）を用いて行った。94℃での１分間の１回のインキュベーションに続いて、30回のPCR サイクルを、94℃で30秒間の変性、60℃で１分間のアニーリング、及び72℃で２分間の延長のサイクルプロフィールを用いて実施した。増幅生成物の５μl アリコートを、0.7 ％アガロースゲル（NuSieve, FMC）において、電気泳動により分析した。1.0kb のサイズのDNA フラグメント出現は、遺伝子セグメントの正しい増幅を示した。
【０２０６】
PCR フラグメントのサブクローニング：
上記のようにして生成されたPCR 生成物の45μl のアリコートを製造業者の説明書に従って、QIAquick PCR精製キット（Qiagen, USA ）を用いて精製した。精製されたDNA を、50μM のトリス−HCl （pH8.5 ）に溶出し、５μg のpMOL944 及び25μl の精製されたPCR フラグメントをSacII 及びNotIにより消化し、0.8 ％の低ゲル化温度アガロース（Seaplaque GTG, FMC）ゲルにおいて電気泳動し、相当するフラグメントをゲルから切り出し、そして製造業者の説明書に従って、QIAquick Gel抽出キット（Qiagen, USA ）を用いて精製した。
【０２０７】
次に、単離されたPCR  DNAフラグメントを、SacII −NotIにより消化されそして精製されたpMOL944 に連結した。連結は、0.5 μg の個々のDNA フラグメント、１単位のT4 DNAリガーゼ及びT4リガーゼ緩衝液（Boehringer Mannheim, Germany）を用いて、16℃で一晩行われた。
【０２０８】
連結混合物を用いて、コンピテントバチルス・スブチリスPL2306を形質転換した。形質転換された細胞を、LBPG−10μg/mlのカナマイシンプレート上にプレートした。37℃で18時間のインキュベーションの後、いくつかのクローンを新鮮な寒天プレート上に再画線培養し、そしてまた、10μg/mlのカナマイシンを含む溶液TY培養物において増殖せしめ、そして37℃で一晩インキュベートした。次の日、1ml の細胞を、バチルス・スブチリスプラスミド調製物についての製造業者の推薦に従って、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep キット#27106を用いて細胞からプラスミドを単離するために使用した。このプラスミドDNA を、DNA 配列決定のための鋳型として使用した。
【０２０９】
ペクチン酸リアーゼ遺伝子を含むクローンを保持し、このクローンをMB541 と命名した。
ペクチン酸リアーゼの成熟部分に対応するDNA を、Taq デオキシ−末端サイクル配列決定キット（Perkin−Elmer, USA）、蛍光ラベルされたターミネーター及びプライマーとしての適切なオリゴヌクレオチドを用いて、プライマーウォーキングによるDNA 配列決定により特徴づけた。
【０２１０】
配列データの分析を、Devereuxなど. (1984) Nucleic Acids Res. 12. 387-395 に従って行った。クローン化されたDNA 配列を、バチルス・スブチリスにおいて発現し、そして上清液に出現するタンパク質は、配列番号８に示される成熟タンパク質に対応した。
【０２１１】
精製：
MB541 を、500ml の２個の、バッフルを付した振盪フラスコにおいて、10μg/mlのカナマイシンを含有する25×200ml のBPX 培地において37℃及び300rpmで５日間、増殖せしめ、それにより、3500mlの培養液を得た。pHを、酢酸を用いて5.0 に調整し、そして100ml のカチオン剤（C521）及び200ml のアニオン剤（A130）を、凝集のために、撹拌しながら添加した。凝集した材料を、10000rpmで30分間、6 ℃で、Sorval RC 3B遠心分離機を用いての遠心分離により分離した。得られる上清液合計体積は3600mlであり、１ml当たり370APSU を含んでいた。
【０２１２】
上清液を、Whatman ガラスフィルターGF/D及びC を用いて透明にし、そして最終的に、10kDa のカットオフを有するフィルトロンUF膜上で濃縮した。2000mlの合計体積を、pH8.5 に調節した。50g のDEAE A-50 Sephadex (Pharmacia)を2000mlの50mMのトリス（pH8.5 ）中で膨潤せしめた。過剰の緩衝液を捨て、そして透明な濃縮された酸素溶液を15分間、スラリーと混合した。酵素をイオン交換材料から、ブフナー漏斗上での吸引により分離した。得られる溶液を、10kDa のカットオフを有するフィルトロン上で、800ml の最終体積に濃縮した。
【０２１３】
高度に精製されたペクチン酸リアーゼを得るために、S −セファロースカチオン交換クロマトグラフィーを用いての最終段階を行った。950APSU/ml（上記参照のこと）の溶液50mlを、酢酸を用いてpH5.0 に調節した。それを、50m モルの酢酸ナトリウム（pH5.0 ）の緩衝液により平衡化されたS −Sepharose （Pharacia）を含む50mlのカラムに適用した。結合されたペクチン酸リアーゼを、0.5Mの塩化ナトリウムのグラジエントを用いて溶出した。
【０２１４】
特性決定：
純粋な酵素は、SDS −PAGEにおける35kDa の単一バンド及び約6.1 の等電点をもたらした。
タンパク質濃度を、57750 のモル消衰係数を用いて決定した（配列から推定されるアミノ酸組成に基づく）。
解裂の形成を検出するアッセイを用いて、235nm で測定され得る二重結合の形成により、次のデータを得た：
１．（条件：pH10；グリシン緩衝液；カルシウムは存在しない；基質としてポリガラクツロン酸Sigma P-1879）: 1 μモル/ 分/mg 。
２．（条件：pH10；グリシン緩衝液；カルシウムは存在しない；基質としてDE35（35％のエステル化されたペクチン）：４μモル/ 分/mg 。
【０２１５】
純粋な酵素を、pH8.0 （20mMのトリス、pH8.0 ）で、及びpH10.0（20mMのグリシン、pH10）でEDTAに対して透析し、そして酵素をCircular二色性により分析し、EDTAを伴っても及びそれを伴わないでもスペクトルの差異は見出されなかった。
４個のサンプルの示差走査熱量法DSC は、酵素が、pH8.0 で最も安定し、そしてトリスpH8.0 において75℃のおよびEDTAに対する透析の後に約70℃の溶解温度を有することを示した。pH10で、酵素は、EDTAを伴って及びそれを伴わないでも、55℃で溶解した。
【０２１６】
ペクチン酸リアーゼの触媒活性は、基質と共にインキュベーションする間、EDTAの存在により阻害されるが、しかしEDTAにより透析された酵素は、基質と共にインキュベーションする間EDTAが排除されている場合では、活性的であった。２価のカチオン、たとえばFe2+, Li2+, Mg2+, Cu2+, Mn2+は、触媒活性に対して効果を有さない。
異なるpH値でのβ−トランスエリミネーション活性（nmでのリアーゼアッセイを用いての）を、次の緩衝液を用いて40℃で定常状態カイネティックスとして決定した：
【０２１７】
pH6.0 ：Na−NES 0.1M；
pH6.5, 7.0及び7.5 ：Na−MOPS 0.1M;
pH8.0 及び8.5 ：トリス  0.1M；
pH9.0, 9.5, 10.0, 及び10.5：Naグリシン  0.1M；
pH11-11.5 ：炭酸ナトリウム  0.1M；
MES ；SIGMA #M-8250 からの(2[N−モルホリン] エタンスルホン酸) ；
MOPS：SIGMA  #M-1254からの(3−[N−モルホリン] プロパンスルホン酸) ；
トリス：Merck No. 1.08382 からの；
グリシン：MERCK からの及び炭酸ナトリウム：MERCK No.6392 からの。
【０２１８】
比活性（比率）を、最適活性の％として計算し、次の結果を得た：
0004246385.tif 000007
【０２１９】
相応して、異なる温度（pH10で）での比活性が見出された：
0004246385.tif 000008
【０２２０】
洗剤における活性：緩衝液の代わりに市販の洗剤、及びポリガラクツロン酸ナトリウム塩（Sigma P-1879）と共に40℃で20分間のインキュベーション、続いて、還元糖の測定を用いた場合、酵素はヨーロッパ市販の粉末洗剤Ariel Futur においては活性であり、44％の相対活性を有し、US Tide の市販の粉末に関しては51％の相対活性を有し、そしてUS Tide の市販の液体洗剤に関しては30％の相対活性を有した（これらの相対活性は、グリシン緩衝液において測定された活性に対してである）。洗剤濃度は、ヨーロッパ条件下で18度のGerman硬度及びUS条件下で９度の硬度を有する水道水のために推薦される通りである。
【０２２１】
免疫学的性質：デンマークの会社DAKOで、ウサギポリクローナル単一特異的血清を、従来の技法を用いて、高度に精製されたペクチン酸リアーゼに対して生じさせた。血清は、本発明のペクチン酸リアーゼにより、アガロースゲル中で良好な単一の沈殿物を形成し、そしてNordisk A/S からのPulpzyme HC バッチno. CKF0054 又はバッチno. CKN00009のようなバチルス・リケニホルミス粗生成物に対して唯一の沈殿を形成した。
【０２２２】
例２．バチルス・リケニホルミスからのペクチン酸リアーゼ（I ）のクローニン
グ、発現、精製及び特徴化：
ゲノムDNA 調製：
ATCC14580 株を、ATCC（American Type Culture Collection, USA ）により特定されるように、液体培地３において増殖せしめた。37℃及び300rpmでの18時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、そしてゲノムDNA を、Pitcher など. [Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J; Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate; Lett. Appl. Microbiol.1989, 8: 151-156] に記載される方法により単離した。
【０２２３】
本発明の配列の定義：
配列は、次の２種のプライマーにより定義され、このプライマーは次に本発明のペクチン酸リアーゼの完全な読み取り枠の増幅のためのPCR 反応に使用され得る：
【化２】
0004246385.tif 000009
クローニング目的のための制限部位は下線が引かれている。
【０２２４】
完全な読み取り枠を、例１に記載のようにして実施されるPCR において、上記プライマーを用いて、クローン化することができる。0.7kb サイズのDNA フラグメントの出現は、遺伝子のセグメントの適切な増幅を示す。このDNA フラグメントを、E.コリ、B.スブチリス又は他のものにおけるクローニングのために適切ないずれかのベクターにクローン化することができる。フラグメントは、PstI−NotIフラグメントとしてクローン化される。PCR フラグメント又はクローン化されたフラグメントに対するDNA 配列決定を行った場合、出現するDNA 配列の読み取り枠が配列番号３で示される。
【０２２５】
バチルス・サブチリスにおけるペクチン酸リアーゼのサブクローニング及び発
現：
本発明のDNA 配列（配列番号３）をコードするペクチン酸リアーゼを、次の２種のオリゴヌクレオチドから成るPCR プライマーを用いてPCR 増幅した：
【化３】
0004246385.tif 000010
制限部位PstI及びNotIが下線が引かれている。
【０２２６】
上記のようにしてバチルス・リケニホルミスから単離された染色体DNA を、例１に記載のようにして行われるPCR 反応において鋳型として使用した。0.6kb のサイズのDNA フラグメントの出現は、遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。
PCR フラグメントのサブクローニングを、例１に記載のようにして行い、但し精製されたPCR フラグメントをPstI及びNotIにより消化した。いくつかのクローンを、一晩の培養液からプラスミドDNA を単離することによって分析した。
【０２２７】
１つのそのような陽性クローンを、上記で使用されたような寒天プレート上で数回、再画線培養し、このクローンMB750 を、37℃でTY−10μg/mlのカナマイシンにおいて一晩増殖し、そして次の日、１mlの細胞を、バチルス・スブチリスプラスミド調製についての製造業者の推薦に従って、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106を用いて、細胞からプラスミドを単離するために使用した。このDNA を配列決定し、そしてペクチン酸リアーゼの成熟部分に対応するDNA 配列、すなわち付随する配列番号３の位置85−666bp に対応するDNA 配列を示した。誘導されたタンパク質配列は、配列番号４に列挙される。
【０２２８】
発酵及び精製
上記のようにして得られたクローンMB750 を、500ml の２個の、バッフルを有する振盪フラスコにおいて、10μg/mlのカナマイシンを含む200ml のBPX 培地中で、37℃及び300rpmで５日間、増殖せしめた。
【０２２９】
凝集を、カチオン性凝集剤C521（10％溶液）及びアニオン剤A130の0.1 ％溶液を用いて行った：pH6.0 での発酵培地1300mlに、20mlのA130（0.1 ％）と同時に、10mlのC521（10％）を、室温で撹拌しながら添加した。凝集された材料を、10,000rpm でのSorval RC 3B遠心分離機を用いての30分間の遠心分離により分離した。液体を、10kDa の分子量カットオフを有するフィルトロン限外濾過を用いて、200ml に濃縮した。この生成物を、40％グリセロールによる安定化の後、適用試験のために使用した（バッチ#9845 は、１ml当たり193 Trans Units 又は１ml当たり1.97mgの活性ペクチン酸リアーゼを含む）。
【０２３０】
高度に精製された酸素を、25mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、pH5.5 で、カチオン性クロマトグラフィーS −セファロースカラムを用いて得、酸素をNaClグラジエントを用いて溶出し、最終精製段階は0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液において実施されるSuperdex 200カラム上でのサイズクロマトグラフィー処理であった。
【０２３１】
特性決定：
純粋な酵素は、22kDa のMW及び6.2 のpIを有する。
pH10での至適温度（相対活性）は、40℃である。
相対活性は、40℃の温度で、pH9.5 〜10.5間で、50％よりも高い。
pH6.0 での酵素のDSC は、61℃の変性(unfolding) 温度を与えた。
精製されたペクチン酸リアーゼのN −末端は、次の配列を有する：AEVVHKTIV （アミノ酸配列配列番号４の位置29で始まる）。
この酵素は、多糖リアーゼのファミリー３に属する。
【０２３２】
例３．バチルス・リケニホルミスからのペクチンリアーゼ（III ）のクローニン
グ、発現、精製及び特徴化：バチルス・リケニホルミス  ペクチンリアー
ゼをコードする遺伝子のクローニング：
バチルス・サブチリスにおけるバチルス・リケニホルミスペクチンリアーゼの
サブクローニング及び発現：
本発明のDNA 配列番号１をコードするペクチンリアーゼを、次の２種のオリゴヌクレオチドから成るPCR プライマー組を用いてPCR 増幅した：
【化４】
0004246385.tif 000011
制限部位PstI及びNotIは、下線が引かれている。
上記のようにしてバチルス・リケニホルミスから単離された染色体DNA を、例１に記載のようにして実施されるPCR 反応において鋳型として使用した。約1.5kb のサイズのDNA フラグメントの出現は、遺伝子生成物の適切な増幅を示した。
【０２３３】
PCR フラグメントのサブクローニング：
サブクローニングを、例１に記載のようにして行い、但し精製されたPCR フラグメントをPstI及びNotIにより消化した。いくつかのクローンを、一晩の培養液からプラスミドDNA を単離することによって分析した。
１つのそのような陽性クローンを、上記で使用されたような寒天プレート上で数回、再画線培養し、このクローンをMB588 と命名した。そのクローンMB588 を、37℃でTY−10μg/mlのカナマイシンにおいて一晩増殖させ、そして次の日、１mlの細胞を、バチルス・スブチリスのプラスミドの調製についての製造業者の推薦に従って、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106を用いて、細胞からプラスミドを単離するために使用した。このDNA を配列決定し、そしてペクチン酸リアーゼの成熟部分に対応し、及び付随するタンパク質配列（配列番号２）でのタンパク質配列に対応するDNA 配列を示した。
【０２３４】
発酵及び精製：
上記のようにして得られたクローンMB588 を、500ml の２個の、バッフルを有する振盪フラスコにおいて、10μg/mlのカナマイシンを含む25×200ml のBPX 培地中で、37℃及び300rpmで５日間、増殖せしめた。
凝集を、カチオン性凝集剤C521（10％溶液）及びアニオン剤A130の0.1 ％溶液を用いて行った：pH6.0 での発酵培地2000mlに、40mlのA130（0.1 ％）と同時に、20mlのC521（10％）を、室温で撹拌しながら添加した。凝集された材料を、10,000rpm でのSorval RC 3B遠心分離機を用いての30分間の遠心分離により分離した。上清液を、Whatman ガラスフィルター番号F を用いて透明にした。
【０２３５】
液体を、10kDa のMWカットオフを有するフィルトロン限界濾過を用いて、300ml に濃縮し、これは2,260,000Transユニットのペクチンを含む。濾液を、酢酸を用いてpH5.5 に調節し、そして50mMの酢酸ナトリウム（pH5.5 ）により平衡化されたS −セファロースカラムに適用した。結合されたペクチンリアーゼを、NaClグラジエントを用いて、純粋なタンパク質として溶出した。
【０２３６】
特性決定：
純粋の酵素は、55kDa のMW及び9.3 のpIを有する。
比活性は、40℃の温度で、pH8.5 〜9.3 の間で、50％よりも高い（ペクチンは9.3 以上で安定エステル化されない）。
この酵素は、多糖リアーゼのファミリーに属する。
【０２３７】
例４．ペクチン酸リアーゼとCBD との間での融合タンパク質の構成及び発現：
クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）株YSからのCipB遺伝子のCBD コードDNA 配列（Poole D M; Morag E; Lamed R; Bayer EA; Hazlewood GP; Gilbert HJ (1992) Identification of the cellulose-binding domain of cellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, No.2-3 pp.181-186）を、次の２種のオリゴヌクレオチドから成るPCR プライマー組を用いて、PCR 増幅した；
【０２３８】
【化５】
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制限部位SalI及びNotIは下線が引かれている。
【０２３９】
CBD をコードする染色体DNA を、Poole D M; Morag E; Lamed R; Bayer EA; Hazlewood GP; Gilbert HJ (1992) Identification of the cellulose-binding domain of cellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, No.2-3 pp.181-186に記載のようにして得ることができる。CBD をコードするDNA サンプルを、例１に記載のようにして実施されるPCR 反応において鋳型として使用した。約0.5kb のサイズのDNA フラグメントの出現は、遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。
【０２４０】
PCR フラグメントのサブクローニング：
サブクローニングを、例１に記載のようにして行い、但し精製されたPCR フラグメントをSalI及びNotIにより消化した。いくつかのクローンを、一晩の培養液からプラスミドDNA を単離することによって分析した。
１つのそのような陽性クローンを、上記で使用されたような寒天プレート上で数回、再画線培養し、このクローンをMB914 と命名した。そのクローンMB914 を、37℃でTY−10μg/mlのカナマイシンにおいて一晩増殖し、そして次の日、１mlの細胞を、バチルス・スブチリスのプラスミドの調製についての製造業者の推薦に従って、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106を用いて、細胞からプラスミドを単離するために使用した。このDNA を配列決定し、そして配列番号９及び付随するタンパク質配列（配列番号10）で表されるようなペクチン酸リアーゼ−リンカーcbd の融合タンパク質に対応するDNA 配列を示した。
【０２４１】
ペクチン酸リアーゼ−cbd 融合タンパク質の発現及び検出：
MB941 を、37℃及び250rpmで、TY−培地において20時間インキュベートした。１mlの細胞フリー上清液を、Millipure H2O において、200 μl の10％ Avicel （Merck, Darmstadt, Germany ）と共に混合した。その混合物を、0 ℃で0.5 時間、インキュベートした。Avicelへのペクチン酸リアーゼ−リンカーCBD 融合タンパク質のこの結合の後、結合されたタンパク質を有するAvicelを、5000g で５分間、回転せしめた。
【０２４２】
ペレットを、100 μl のSDS −PAGE緩衝液に再懸濁し、95℃で５分間、煮沸し、5000g で５分間、回転せしめ、そして25μl を、４〜20％のLaemmli Tris-Glycine, SDS-PAGE NOVEXゲル（Novex, USA）上に負荷した。サンプルを、製造業者により推薦されるようにして、Xcell(商標）Mini-Cell (NOVEX, USA)において電気泳動し、続いて、クーマシーにより染色し、脱色し、そして乾燥することを包含するゲルのすべての続く操作は、製造業者により記載されるようにして実施された。
約55kDa のタンパク質バンドの出現は、プラスミドpMB914上にコードされるペクチン酸リアーゼ−リンカーCBD 融合のバチルス・ サブチリスにおける発現を示した。
【０２４３】
例５．セルロース材料のペクチン酸リアーゼ処理：
ペクチン除去及び湿潤性に対する温度の効果：
典型的なセルロース材料を示す、100 ％綿の綾織物のデサイズされた試験布#428U を、9APSU/g 布で投与される、例１のバチルス・リケニホルミスペクチン酸リアーゼを含んで成る酵素水溶液により、pH９及び15：１の液体比で処理した。処理時間は２時間であり、そして温度は35〜75℃であった。布を、酵素処理の後、十分にすすぎ、乾燥せしめ、そして次に、Ruthenium Red により染色した。染料の摂取を、分光光度計により測定し、そしてそれは繊維上の残留ペクチンの目安である。残留ペクチンの％を、100 ％の残留ペクチンとしての出発材料の染料摂取、及び０％としての十分に化学的に精練され、そして漂白された布の染料摂取を用いて計算した。結果は、第６表に示される。さらに、湿潤性（落下試験−布により吸収されるようになる水の落下についての時間（秒）の測定）を測定し、そして酵素を有さない対照と比較した。結果は第７表に示される。
【表４】
0004246385.tif 000013
【表５】
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上昇する温度の有益な効果が両応答に基づいて、明らかに見出される。
【０２４４】
例６．セルロース材料のペクチン酸リアーゼ処理：
ペクチン除去に対するpHの効果：
典型的なセルロース材料を代表する100 ％綿の綾織物のデサイズされた試験布#428U を、例１のバチルス・リケニホルミスペクチン酸リアーゼを含んで成る酵素水溶液により、15：１の液体比で9APSU/g 布の使用量で処理した。処理時間は２時間であり、そして温度は55℃であった。PHは、8 〜11であった。布を、酵素処理の後、十分にすすぎ、乾燥せしめ、そして次に、Ruthenium Red により染色した。染料の摂取を、分光光度計により測定し、そしてそれは繊維上の残留ペクチンの目安である。残留ペクチンの％を、100 ％の残留ペクチンとしての出発材料の染料摂取、及び０％としての十分に化学的に精練され、そして漂白された布の染料摂取を用いて計算した。結果は、第８表に示される。
【０２４５】
【表６】
0004246385.tif 000015
最適pHは、約9.5 であることが見出されるが、しかし良好な活性は、非常に広いアルカリ性範囲で示される。
【０２４６】
例７．洗剤への本発明の酵素の使用：
例１に記載のようにして得られた、精製された酵素（バッチ9751）は、従来の市販の液体洗剤を用いてのミニ洗浄試験において、１ppm のレベルで試験される場合、改良された清浄性能を示した。試験を、従来の北アメリカ洗浄条件下で行った。
【０２４７】
例８．バナナ染色された綿編織に対するカルボヒドラーゼの効果：
方法：
３本のバナナを網に通し、そしてUltra Turraxにおいて、水40mlと共に均質化した。Style 400 綿（Testfabrics, Inc. ）を、溶液にソークし、２本のロール間で絞り、そして一晩乾燥せしめた。
染色された綿編織を、ヨーロッパ洗浄条件下で、市販の液体洗剤Ariel Futur Liquidにより洗浄し、そしてその洗剤に、例１のペクチン酸リアーゼを、それぞれ0.1ppm、0.2ppm、1ppm及び10ppm 添加された洗剤により洗浄した。試験は反復された。
【０２４８】
結果：
Ariel 液体：バナナ染色の除去率％（100 ％は染色の完全な除去である）。
【表７】
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【０２４９】
文献：
Lever, M. (1972) A new reaction for colormetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 47, 273-279。
N. C. Carpita and D. M. Gibeaut (1993) The Plant Journal 3: 1-30。
Diderichgen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis, J. Bacteriol. 172: 4315-4321 。
Sakai など., Pectin, Pectinase and Protopectinase: Production, Properties and Applications, pp213-294 in: Advances in Applied Microbiology Vol: 39, 1993。
【０２５０】
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【配列表】
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