(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チーズの製造方法であって、以下の：
a）チーズにおけるオイリングオフ効果を低減及び／又はチーズ産生量を増加するのに十分な量において、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される精製ホスホリパーゼによりチーズ・ミルク又はチーズ・ミルクの画分を処理し；及び
b）上記チーズ・ミルクからチーズを製造する、
ステップを含み、ここでステップa）がステップb）の前及び／又はステップb）中に行われる方法。
【請求項２】
前記ホスホリパーゼにより処理された前記チーズ・ミルク又は前記チーズ・ミルク画分が、１又は複数のクリーム、バター又はバターミルクを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼによって処理される前記チーズ・ミルク又は前記チーズ・ミルク画分が乳脂肪を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップa）のミルクがステップb）の前に乾燥されない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップa）の処理が前記チーズ・ミルクの画分に関して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップa）の処理が前記チーズ・ミルクに関して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記チーズを食品に加工するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ホスホリパーゼがホスホリパーゼＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ１又はホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）の後に、前記ホスホリパーゼ酵素蛋白質含量を除去又は低減するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）の後に、前記ホスホリパーゼを不活性化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で製造されるチーズ。
【請求項１３】
前記食品が、ピザ、インスタント食品、トースト、ハンバーガー、ラザニア、ドレッシング、ソース、粉チーズ、チーズの調味料、及びプロセスチーズからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は酵素処理したチーズ・ミルクからのチーズの製造方法及び食品の成分としての前記方法により得られたチーズの使用に関する。本発明はミルク組成物中の脂肪の安定化方法にも関する。
【０００２】
本発明の背景
チーズ製品において、脂肪相の状態はチーズの特性に重要である。上記脂肪相は製造及び熟成中の安定性だけでなく、それ自体が食べられる又は調理済みレトルト食品、例えばピザ、トースト又はハンバーガーに使用される最終的なチーズとしても特に重要である。
【０００３】
また、チーズ製品の前記オイリング・オフ特性は1つの重要な品質パラメーターである。オイリング・オフとは貯蔵及び融解において遊離の油を形成する傾向のことである。過度のオイリング・オフは、チーズが、例えばピザ及び関連した食品に使用されている加熱した製品に最も頻繁に関連した欠点である（例えばKindstedt J.S; Rippe J.K. 1990, J Dairy Sci. 73: 867-873 を参照のこと）。食べ物の脂肪レベルの増加に関心のある消費者にとって、この欠点を管理／除去することはますます重要になる。製品中の遊離の油／脂肪は高い脂肪含有量であると理解され、そして一般的に好ましくないものである。
【０００４】
他の食品において前記脂肪相は機械による乳化、例えば均質化によってしばしば安定させられる。この技術は一般的にチーズの製造には使用できない、なぜなら前記チーズ・ミルクの均質化はチーズ・ミルクの凝固特性及びそこから製造したチーズの味に加えて産生にもおもわしくない影響をもつためである。
【０００５】
GB1,525,929においてジアシル・グリセロホスファチドをホスホリパーゼAの作用にかけることで得たモノアシル・グリセロ−ホスファチドを用いる安定した油／水エマルジョンの調製が既知のものとして開示されている。GB1,525,929は油／水エマルジョン調製のためのホスホリパーゼA処理したホスホリポタンパク質含有物質の使用、例えばソース、ドレッシング、及びマヨネーズが挙げられる油／水エマルジョンのためのエマルジョン安定化剤としてのホスホリパーゼ処理した物質の使用についてさらに記載する。チーズはGB1,525,929に開示されていない。
【０００６】
ホスホリパーゼ活性として開示されたいわゆるレシチナーゼ活性はミルク中の細菌の汚染物質として報告され、加えてチーズ製造への上記ミルクの使用が報告された：「J.J Owens, Observations on lecithinases from milk contaminants, Process Biochemistry,vol.13 no.1,1978,page10-18」及び「J.J Owens, Lecithinase Positive Bacteria in Milk, Process Biochemistry,vol.13, page13-15,1978」。
【０００７】
US4,861,610はモノアシル・グリセロ−リン脂質、脂肪、水、及び溶融した食塩がチーズに加えられる食品材料中に取り込まれるためのチーズ製品、すなわちプロセスチーズの調製方法を開示する。前記方法は脂肪の添加前にチーズ（とりわけモノ・アシル・グリセロ−リン脂質と混合されている前記チーズ）を溶かすための加熱処理を含む。次に前記チーズ製品をミキサーにより乳化させる。US4,861,610はホスホリパーゼによるミルクの処理及び前記酵素処理したミルクからのチーズの生産について開示していない。
【０００８】
チーズ生産のための改善した方法、特にチーズ中の脂肪の安定性を改善する方法の必要性がある。
【０００９】
発明の概要
本発明はチーズ製造方法であって、以下の：
a）ホスホリパーゼによるチーズ・ミルク又は上記チーズ・ミルクの画分の処理；及び
b）上記チーズ・ミルクからのチーズの製造、
のステップを含み、ここでステップa）がステップb）の前及び／又はステップb）と同時に行われる方法を提供する。
【００１０】
チーズの特性を改善するための方法が提供される；特にチーズ及びチーズ・ミルクの脂肪の安定性は本発明によりを改善される。本発明はチーズ・ミルクの酵素処理が上述のホスホリパーゼ処理したチーズ・ミルクから製造したチーズの加熱処理中の安定性を著しく高めることを発見した。本発明の方法によってチーズ製造における産生量の増加もまた提供される。
【００１１】
本発明はチーズ製品の生産におけるホスホリパーゼの使用にさらに関し、ここでの前記ホスホリパーゼ処理は前記チーズ・ミルク又はその画分にチーズ製造の前及び／又はその間に行われる。本発明は得ることのできるチーズ、特に本明細書に記載したいずれかの方法によって得たチーズにも関する。
【００１２】
本発明の詳細な開示
本発明はチーズ製造方法にであって、以下の：
a）ホスホリパーゼによるチーズ・ミルク又はチーズ・ミルクの画分の処理；及び
b）ステップa）の酵素処理したチーズ・ミルクからのチーズの製造、
のステップを含み、ここでステップa）がステップb）の前及び／又はステップb）と同時に行われる方法に関する。
【００１３】
したがって、本発明の方法のステップa）及びb）は同時に行われうる。すなわち、チーズ・ミルク中のホスホリパーゼは凝固物を形成するミルク凝固剤とちょうど同時に反応するということである。
【００１４】
チーズ・ミルク及びチーズ製造
本文脈において、用語「チーズ（cheese）」はあらゆる種類のチーズでありうる、そして、例えばナチュラル・チーズ、チーズ類似物、プロセスチーズを含みうる。前記チーズは本技術分野で知られた適当な方法のいずれか、例えばレンネットによるチーズ・ミルクの酵素的凝固によって又は食品グレードの酸又は乳酸細菌の増殖により産生される酸によるチーズ・ミルクの酸凝固によって得ることができる。1つの態様において、本発明の方法によって生産されたチーズはレンネット凝乳のチーズである。よって、1つの態様において、前記チーズはレンネットによって生産される。本発明の方法のステップb）において前記チーズ・ミルクは一般に行われているチーズ製造の方法に晒されうる。レンネットは市販されており、例えばネイチュレン（Naturen）（商標）（動物性レンネット）、キ−マックス（Chy-max）（商標）（発酵により製造したキモシン）、ミクロラント（Microlant）（商標）（発酵により製造した細菌性凝固剤）、はすべてデンマークのChr-Hansen A/Sからのものである）。
【００１５】
プロセスチーズはナチュラル・チーズ又はチーズ類似物から加温及び乳化塩（例えばリン酸塩及びクエン酸塩）を含んでいるチーズの乳化によって生産されうる、そして香辛料／調味料もまた含みうる。1つの態様において、本発明の方法の前記チーズ製品はプロセスチーズではない。
【００１６】
チーズ類似物については、製品の一部が非ミルク成分、例えば植物油であるところのチーズのような製品であると理解される。チーズ類似物のほかの例はチーズ成分である。本発明の方法は製品の一部として製品が脂肪（例えばクリームのような乳脂肪）を含んでいる限りチーズ類似物の製造に応用できる。
【００１７】
本発明の方法によって製造された前記チーズはあらゆる種類のチーズ、例えばカンペジーノ（Campesino）、チェスター（Chester）、ダンボー（Danbo）、ドラバント（Drabant）、エレガード（Herregard）、マンチェゴ（Manchego）、プロボローネ（Provolone）、セント・ポーリン（Saint Paulin）、ソフト・チーズ（Soft cheese）、スベキア（Svecia）、タレージョ（Taleggio）、ホワイト・チーズ（White cheese）はチーズ凝乳のレンネット凝固によって製造したレンネット凝乳のチーズを包含し；熟成したチーズ、例えばチェダー（Cheddar）、コルビー（Colby）、エダム（Edam）、ムンステール（Muenster）、グリエール（Gryere）、エメンタール（Emmenthal）、カマンベール（Camembert）、パルメザン（Parmesan）、及びロマノ（Romano）；フレッシュ・チーズ、例えばモッツアレラ（Mozzarella）及びフエタ（Feta）；並びに酸凝固させたチーズ、例えばクリーム・チーズ（cream cheese）、ヌーシャテル（Neufchatel）、クワルク（Quarg）、カッテージ・チーズ（Cottage Cheese）、及びクエソ・ブランコ（Queso Blanco）；並びにパスタ・フィラタ・チーズ（pasta filata cheese）を含む。1つの態様は本発明の方法によるピザ・チーズの製造に関する。
【００１８】
チーズ生産においてミルク中のカゼインの凝固は2つの方法により行われうる：いわゆるレンネット凝乳のチーズ及び酸凝乳のチーズである。チーズ製造において凝乳のこれら2つのタイプはチーズ・タイプの2つの主要な群を形成する。非熟成の酸凝乳チーズは酸性化若しくは酸と加熱の組合せを介したミルク、クリーム又は乳清の凝固によって製造されたさまざまなチーズをいい、そしてそれは一旦、熟成によらない製造が完了すれば、直ちに消費される。非熟成の酸凝乳チーズは、凝固がカゼインの等電点付近で一般的に起こる、すなわち例えば高温ではpH4.6又はそれより高い値、例えばリコッタの場合pH6.0で80℃が用いられるので、凝固がpH値6.4〜6.6でのレンネットの働きによって一般的に引き起こされるレンネット凝乳チーズの種類（例えばカンバーベール、チェダー、エメンタール）とは一般的に異なる。本発明の好ましい態様において前記チーズはレンネット凝乳チーズのクラスに属する。さらなる態様において前記用語のチーズは非熟成の酸凝乳チーズを包含する酸凝乳チーズをも包む。
【００１９】
モッツアレラはいわゆるパスタ・フィラタ・チーズ又は伸ばした凝乳のメンバーであり、モッツアレラチーズは熱湯中での非熟成凝乳への独特のプラスティサイジング（plasticizing）及びニーディング（kneading）の処理によって一般的に区別され、それらの処理は最終的なチーズにその特徴的な線維状構造並びに融解及び伸展特性を与える、例えばポール S.カインドステッド著「モッツアレラとピザチーズ」、チーズ：化学的性質、物理的性質、及び微生物学的性質、第2巻：主要なチーズグループ、第2版、337〜341ページ、チャップマン・アンド・ホール社を参照のこと。本明細書に用いたピザ・チーズはピザに好適なチーズを包含し、しかもそれらは一般にパスタ・フィラタ／伸ばした凝乳チーズである。1つの態様において、本発明の方法はパスタ・フィラタ・チーズ、例えばモッツアレラの生産のための加熱／伸展処理をさらに含む。
【００２０】
本発明の方法により処理されるチーズ・ミルクは次のミルク画分：スキムミルク、クリーム、全乳、甘性又は酸性化バターの製造に由来するバターミルク、乳清タンパク質の凝縮物、及びバター又はバター油の1つ以上を含みうる。本発明の方法によりホスホリパーゼ処理されるチーズ・ミルクは生乳をも含みうる。
【００２１】
本発明のさらなる態様において、ホスホリパーゼ処理されるチーズ・ミルクは、乾燥したミルク画分、例えば全乳粉末、スキムミルク粉末、カゼイン、カゼイン塩、全ての乳タンパク質若しくはバターミルク粉末又はそれらのいずれかの組合せからすべて又は一部が調製される。
【００２２】
用語「チーズ・ミルク（cheese milk）」は、特に本発明の方法のステップb）において、ミルクを成分とした製品であり、それからチーズが調製される。よって、本発明の方法において前記チーズは全体が又は一部に限ってホスホリパーゼ処理されたミルクを成分とした製品（「前記チーズ・ミルク」）から製造されるうる。もし以下の2つの用語が異なった意味をもつことが文脈からはっきりしていなければ、本明細書で用いた用語「前記チーズ・ミルク」は用語「チーズ・ミルクの画分（fraction of the cheese milk）」を包含しうる。
【００２３】
本発明の文脈中の用語「前記チーズ・ミルクの画分」は、特に本発明の方法のステップa）において、本発明の酵素的な処理される前記チーズ・ミルクの画分を意味する。「チーズ・ミルクの画分」は、ここに定義したミルク画分、すなわち例えばスキムミルク、クリーム、全乳、甘性又は酸性化バターの製造に由来するバターミルク、乳清タンパク質の凝縮物、及びバター又はバター油を1つ以上含みうる。前記バターは、例えば融解した形状にて存在しうる。処理されるチーズ・ミルクの画分は生乳及び本明細書にすでに記載した乾燥したミルク画分から同様に調製されうるものもさらに含みうる。本発明の文脈中の用語「チーズ・ミルクの画分」は、1つ以上の処理されるチーズ・ミルクの成分を意味する。ステップa）においてチーズ・ミルクの画分がホスホリパーゼ処理される場合にはステップa）はステップb）中ではなくその前に行われる。チーズ・ミルクの画分の酵素的処理の後、前記画分はステップb）にて1つ以上のミルク画分と混ぜ合わせられ、そこからチーズが調整されるところのチーズ・ミルクを作成する。
【００２４】
ステップa)における酵素処理はチーズ・ミルクの画分に行われうるか又はチーズ・ミルクのようなものに行われうる。よって本発明の応用の範囲内は、以下の：ステップｉ）ホスホリパーゼによるチーズ・ミルクの画分の処理；ステップii）ステップｉ）の処理した画分からのチーズ・ミルクの調製；及びステップiii ）ステップii）のチーズ・ミルクからのチーズの製造のステップを含むチーズ製造方法である。ステップiii ）においてチーズの成分となるチーズ・ミルクを提供するためにステップii）におけるステップｉ）の前記酵素処理したチーズ・ミルクの画分が（1つの）非ホスホリパーゼ及び／又は（1つの）ホスホリパーゼ処理したチーズ・ミルク画分（群）と混ぜ合わせられうることもまた考慮される。ステップｉ）はステップa）に対応し；そしてステップiii ）は本明細書中に用いたステップb）に対応する。
【００２５】
好ましい態様において、酵素処理されたチーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分はクリームを含む又はクリームから成る。さらなる態様において、酵素処理されたチーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分はバターを含む又はバターから成る。いっそうさらなる態様において、酵素処理されたチーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分はバターミルクを含む又はバターミルクから成る。1つの態様において、ステップa）の前記酵素処理したミルクはステップb）の前に乾燥されない。さらなる態様において、本発明の方法はチーズの総脂肪含有量を下げるための特定のステップ、例えば食品中の脂質含有量を下げるための方法に関するEP531 104 A2に開示した方法を包含しない。
【００２６】
異なる動物種由来のミルクはチーズの製造に使用されうる。したがって、「ミルク」は、例えば乳牛、ヒツジ、ヤギ、バッファロー又はラクダを搾乳することによって得られた乳状の分泌物でありうる。
【００２７】
チーズ製造のためのミルクはいくつかの生乳成分の一部又は全ての除去及び／又は上記成分の補足的な量をそこに添加することによって望ましい組成に標準化されうる。これは牛乳加工所に到着したときの生乳のクリームとスキムミルクへの分離によって行われうる。よって、チーズ・ミルクは望まれたチーズ・ミルクの最終的な組成を得るための生乳の分画及び前記画分の再混合によって従来法で行われるのと同様に調製されうる。前記分離は連続的な遠心分離によってとても低い脂肪含有量（すなわち例えば＜0.5％）をもつスキムミルク画分及び例えば＞35％の脂肪をもつクリームの誘導をもたらしうる。前記「チーズ・ミルク」はクリームとスキムミルクの混合によって構成されうる。好ましい態様においてホスホリパーゼにより処理される前記チーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分はチーズに由来しない。
【００２８】
前記チーズ・ミルク画分を含んでいるホスホリパーゼにより処理される前記チーズ・ミルクはリン脂質、例えばレシチンを含む。チーズ・ミルクは本発明の方法によって製造されるチーズに適当と思われるいくらかの総脂肪含有量、例えば（乾燥物の）約25％の脂肪、乾燥物の10〜50％の範囲内の脂肪、約0.06％がリン脂質、総脂肪含有量の0.02〜5％（W/W）がリン脂質でありうる。
【００２９】
従来のステップはチーズ・ミルク中に安全な低い細菌数をとりえた。前記スキムミルクを低温殺菌しないことが一般的に好まれた、なぜならチーズ・ミルク中の熱変性したタンパク質は前記ミルクの凝固におもわしくない影響をもたらし、そして前記チーズの熟成を遅くするからである。スキムミルク画分の細菌数は他の技術、例えば精密ろ過法又はバクトフューゲイションによって減少させられうる。前記クリームは前記製品中の低い細菌数とするために低温殺菌されうる。
【００３０】
本発明の方法はステップa）とステップb）の間に前記処理したチーズ・ミルク又は前記チーズ・ミルク画分を加熱処理にかけるステップc）をさらに含みうる。1つの態様において、本発明の方法は以下の：ステップｉ）ホスホリパーゼによるチーズ・ミルクの画分（例えばクリーム）の処理；ステップii）ステップｉ）の酵素処理した画分を加熱処理にかけること；ステップiii ）ステップii）のミルク画分と（1つの）非酵素処理及び／又は（1つの）ホスホリパーゼ処理したミルク画分（群）との混合によりチーズの成分となるチーズ・ミルクを得ること；そしてステップiv）ステップiii ）のチーズ・ミルクからのチーズの製造のステップを含み、ここでのステップｉ）はステップa）に対応し；そしてステップiv）は本明細書中に用いたステップb）に対応している。したがって、本発明の方法の1つの態様において、本明細書に記載のチーズミルク画分はクリームであり、クリームをステップa）とステップb）の間に低温殺菌にかけるステップをさらに含みうる。
【００３１】
本発明の方法において前記チーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分は、例えばダニッシュ・ブルー・チーズの製造においてチーズ製造の前に均質化の工程されうる。前記均質化はホスホリパーゼによる処理前及び／又は処理後に適用されうる。しかしながら、他の態様においてステップb）の前記チーズ・ミルクはチーズ製造前の均質化の工程をおこなわれることはない。
【００３２】
酵素による処理
本発明の方法における酵素による処理はチーズ・ミルク又は前記チーズ・ミルクの画分中にホスホリパーゼを分散させ、そして適当な保持時間と適当な温度において前記酵素反応起こすことによって行われうる。ホスホリパーゼによる前記処理は本技術分野で周知の原理に従って選択された酵素に適合するよう選ばれた条件において実施されうる。前記酵素による処理は前記チーズ・ミルクの乳脂肪画分がホスホリパーゼにより処理されるところの処理である。
【００３３】
前記酵素による処理はいずれかの好適なpHにおいて行われうる、例えば2〜10の範囲で、pH4〜9又は5〜7において、pH5.5〜7.0を使うことが好ましいであろう。
【００３４】
本発明の方法は3〜7℃での冷蔵の間、例えば2〜48時間の範囲で少なくとも2時間又は5〜24時間の範囲で少なくとも5時間のチーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分のホスホリパーゼ処理として行われうる。もし前記ホスホリパーゼが30〜45℃（例えば、少なくとも5分間、少なくとも10分間又は少なくとも30分間、5〜60分間）の凝固条件においても反応できるならば、前記方法は例えばステップb）のチーズ作製工程中でもまた行われうる。さらには、チーズ・ミルクの凝固前に前記ホスホリパーゼがミルク画分、例えばクリームにおいてホスホリパーゼにとっての最適条件の温度にて、例えば47〜80℃又は50〜80℃、例えば45〜80℃にて、例えば10〜180分間の範囲の少なくとも10分間、少なくとも30分間、反応できたならば、前記方法は行われうる。
【００３５】
場合によっては、前記酵素による処理の後前記ホスホリパーゼ酵素タンパク質は除去／低減される及び／又は前記酵素は失活させられる。
【００３６】
好適な酵素投与量は脂肪含有量の0.01〜1％（W/W）の範囲が一般的であろう、例えば0.1〜1.0％、特に0.2％（W/W）は脂肪100gあたり2000IUに相当する。1IU（国際単位）は標準条件のもとで1分間あたり1マイクロ・モルの遊離脂肪酸を産生する酵素の量として定義される、標準条件：卵黄基質（およそ0.4％ホスホリパーゼ）、pH8、40℃、6mM Ca++、アッセイ法AF280はノボ・ノルディスクA/Sの請求を満たし、そしてそれは本実施例に記載される。前記酵素投与量は処理したチーズ・ミルクの脂肪含有量の重量あたりの酵素重量に基づく、例えば本実施例中で説明したクリームがそうである。あるいは、前記酵素投与量は本明細書中に記載の他のアッセイにより決定されうる。
【００３７】
前記酵素による処理はバッチ式、例えば撹拌しているタンクにおいて又は連続的でありうる、例えば一組の撹拌したタンク反応器にて行われうる。
【００３８】
1つの態様において、前記ホスホリパーゼは前記クリーム画分に添加され、45〜80℃の範囲内の温度にて前記クリーム画分のそれぞれのホスホリパーゼ処理を実行する。さらなる態様において、前記ホスホリパーゼは、例えば32〜36℃にてチーズ・レンネットの直前又はそれと同時に添加される。
【００３９】
本発明の方法において使用される酵素：
本発明の方法において使用した酵素はホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、及びホスホリパーゼBを包含する。本発明の方法において前記ホスホリパーゼ処理は1つ以上のホスホリパーゼ、例えば2つ以上のホスホリパーゼ、タイプAとBの両者；A1とA2の両者；A1とBの両者；A2とBの両者；による処理又は同じタイプの2つの異なるホスホリパーゼによる処理を制限なく包含する2つのホスホリパーゼによって提供されうる。包含したホスホリパーゼもまた1つのタイプのホスホリパーゼ、例えばA1、A2又はBによる処理である。
【００４０】
リン脂質、例えばレシチン又はホスファチジルコリンは外側（sn-1）と内側（sn-2）の位置が2つの脂肪酸によってエステル化され、そして第3位の位置がリン酸によってエステル化されたグリセロールから成る；前記リン酸はアミノ−アルコールに順にエステル化されうる。ホスホリパーゼはリン脂質の加水分解に関与する酵素である。1つの脂肪のアシル基（sn-1とsn-2の位置において、それぞれに）を加水分解しリゾリン脂質を作り出すホスホリパーゼA1及びホスホリパーゼA2；そしてリゾリン脂質の残った脂肪のアシル基を加水分解するリゾホスホリパーゼ（ホスホリパーゼB）を含めてホスホリパーゼ活性のいくつかのタイプは区別できる。よって、本発明はリン脂質の1つ及び／又は両方の脂肪のアシル基を加水分解する能力をもつ酵素の使用に関する。
【００４１】
ホスホリパーゼA1は標準酵素のEC分類に従いEC3.1.1.32として定義される。
【００４２】
公式名称：ホスホリパーゼA1
触媒した反応：
ホスファチジルコリン+H(2)O <>
2−アシルグリセロホスホコリン+1つの脂肪酸の陰イオン
所見：
ec3.1.1.4に比べより幅広い特異性をもつ。
【００４３】
ホスホリパーゼA2は標準酵素のEC分類に従いEC3.1.1.4として定義される。
【００４４】
公式名称：ホスホリパーゼA2
別名：ホスファチジルコリン2−アシルヒドロラーゼ
レシチナーゼa；ホスファチダーゼ；ホスファチドリパーゼ
触媒した反応：
ホスファチジルコリン+h(2)O <>
1−アシルグリセロホスホコリン+1つの脂肪酸の陰イオン
所見：ホスファチジルエタノールアミン、コリン・プラスマロゲン、及びホスファチドにも作用し、第2位に結合した脂肪酸を遊離する。
【００４５】
本発明の酵素に関連して本明細書に用いた用語「ホスホリパーゼA」はホスホリパーゼA1及び／又はホスホリパーゼA2活性をもつ酵素の包含を意味する。
【００４６】
「ホスホリパーゼB」：ホスホリパーゼBは標準酵素のEC分類に従いEC3.1.1.5として定義される。
【００４７】
公式名称：リゾホスホリパーゼ
別名：レシチナーゼb；リゾレシチナーゼ；ホスホリパーゼb；又はplb
触媒した反応：
2−リゾホスファチジルコリン+h(2)O <>グリセロホスホコリン+1つの脂肪酸の陰イオン
本発明の酵素に関連して本明細書に用いた用語「ホスホリパーゼ」は本明細書に定義したリン脂質に対する酵素活性をもつ酵素の包含を意味する。本明細書に用いる用語ホスホリパーゼはホスホリパーゼ活性、例えばホスホリパーゼA（A1又はA2）又はホスホリパーゼB活性を持つ酵素を包含する。前記ホスホリパーゼ活性は同様に他の活性を持つ酵素、例えばホスホリパーゼ活性をもつリパーゼによって提供されうる。前記ホスホリパーゼ活性は、例えばホスホリパーゼの付随的な活性をもつリパーゼからでありうる。本発明の他の態様において前記ホスホリパーゼ酵素活性は本来ホスホリパーゼ活性しかもたず、そして前記ホスホリパーゼ酵素活性が付随的な活性ではないところの酵素によって提供される。本発明の1つの態様において、前記ホスホリパーゼはWO98/26057に定義されたホスホリパーゼの付随的な活性をもつリパーゼではない。
【００４８】
前記ホスホリパーゼはあらゆる起源、例えば動物起源（例えば哺乳動物）の膵臓から（例えばウシ又はブタ膵臓）又はヘビ毒若しくはハチ毒からでありうる。あるいは、前記ホスホリパーゼは微生物起源、例えば糸状菌、酵母又は細菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus）、A.ニガー（niger）；ディクティオステリウム（Dictyostelium）、D.ディスコイデウム（discoideum）；ムコール（Mucor）、M.ジャバニクス（javanicus）、M.ムセド（mucedo）、M.ズブチリシウス（subtilissimus）；ニューロスポラ（Neurospora）、N.クラッサ（crassa）；リゾムコール（Rhizomucor）、R.プシルス（pusillus）；リゾープス（Rhizopus）、R.アリザス（arrhizus）、R.ジャポニクス（japonicus）、R.ストロニファ（stolonifer）；スクレロティニア（Sclerotinia）、S.リバティアナ（libertiana）；トリコフィトン（Trichophyton）、T.ラブラム（rubrum）；フェッツェリニア（Whetzelinia）、W.スクレロチオラム（sclerotiorum）；バチルス（Bacillus）、B.メガテリウム（megaterium）、B.ズブチリス（subtilis）；シトロバクター（Citrobacter）、C.フレアンディ（freundii）；エンテロバクター（Enterobacter）、E.エロゲンス（aerogenes）、E.クロアカエ（cloacae）；エドワードシエラ（Edwardsiella）、E.ターダ（tarda）；エルビニア（Erwinia）、E.ハービコラ（herbicola）；エッシェリシア（Escherichia）、E.コリ（coli）；クレブジエラ（Klebsiella）、K.ニューモニア（pneumoniae）；プロテウス（Proteus）、P.ブルガリス（vulgaris）；プロビデニシア（Providencia）、P.スチュアーティ（stuartii）；サルモネラ（Salmonella）、S.タイフィムリウム（typhimurium）；セラチア（Serratia）、S.リクエファシエン（liquefasciens）、S.マーセッセン（marcescens）；シゲラ（Shigella）、S.フレキシネリア（flexneri）；ストレプトマイセス（Streptomyces）、S.ビオレスオルバー（violeceoruber）；エルジニア（Yersinia）、Y.エンテロコリティカ（enterocolitica）といった属又は種からでありうる。よって、前記ホスホリパーゼは菌類、例えばピレノミセテス（Pyrenomycetes）綱、フザリウム（Fusarium）属、F.カルモラム（culmorum）、F.ヘテロスポラム（heterosporum）、F.ソラニ（solani）又はF.オキシスポラム（oxysporum）株からでありうる。前記ホスホリパーゼはアルペルギルス属の糸状菌株、例えばアルペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アルペルギルス・ファチダス（Aspergillus foetidus）、アルペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アルペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアルペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）株からでもありうる。好ましいホスホリパーゼはフザリウムの菌株、特にF.オキシスポラム、例えばWO98/26057に記載のDSM2627株に、とりわけWO98/26057の請求項36に記載のSEQ ID NO.2から抽出されうる。さらなる態様において、前記ホスホリパーゼはPCT/DK/00664（ノボ・ノルディスクA/S、デンマーク）に記載のホスホリパーゼである。
【００４９】
本発明の方法において使用されるホスホリパーゼは本明細書に挙げたいずれかの起源から抽出されうるか又は得ることができる。前記用語「抽出した」はこの文脈において天然に存在するところの生物から分離されうる前記酵素を意味する、すなわち前記酵素のアミノ酸配列の同一性は天然の酵素と全く一致する。前記用語「抽出した」は前記酵素が宿主生物中にて組換えによって製造されうることを意味し、前記組換え型の製造された酵素は天然酵素と全く一致の同一性か又は改変されたアミノ酸配列のいずれかをもつ、例えば欠失された、挿入された、及び／又は置換された1つ以上のアミノ酸をもつ、すなわち組換えにより製造された酵素は突然変異及び／又は天然のアミノ酸配列の断片である。天然酵素の意味の中には天然の変異体が包含される。さらには、前記用語「抽出した」は、例えばペプチド合成によって合成的に製造した酵素を包含する。前記用語「抽出した」は、例えばグリコシル化、リン酸エステル化などによってインビボかインビトロのいずれかで改変された酵素もまた包含する。前記用語「得ることができる」はこの文脈において前記酵素が天然の酵素と全く一致するアミノ酸配列を持つことを意味する。前記用語は酵素が天然に存在ところの生物から分離される酵素又は酵素が同じ若しくは異なるタイプの生物中に組換えによって発現されるところの酵素である場合又は酵素が、例えばペプチド合成によって合成的に製造された場合、生物から分離される酵素を包含する。組換えによって製造した酵素との関連で前記用語「得ることができる」及び「抽出した」は前記酵素の同一性の関し、そして前記酵素が組換えによって製造されるところの宿主生物の同一性に関しない。
【００５０】
したがって、前記ホスホリパーゼはいずれかの好適な技術の使用によって微生物から獲得されうる。例えばホスホリパーゼ酵素配合物は好適な微生物の発酵、そしてそれに続いて起こる本技術分野において知られた方法による発酵した培地又は微生物からのホスホリパーゼ配合物の分離によって得られうる。前記ホスホリパーゼは組換えDNA技術の使用によってもまた得られうる。上記方法は当該ホスホリパーゼをエンコードするDNA配列を含む組換えDNAベクターによって形質転換された宿主細胞の培養を一般的に含む、そしてここで前記DNA配列は、前記酵素の発現をさせ、さらに前記培養から前記酵素を回収する条件下において培養液中への前記ホスホリパーゼの発現が可能な適切な発現シグナルと機能を果たすように連結されている。前記DNA配列は前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれうる。前記DNA配列はゲノム起源、cDNA起源、若しくは合成起源又はそれらのいずれかの組合せからでありえ、本技術分野で知られた方法に従って分離又は合成されうる。
【００５１】
好適なホスホリパーゼは市販している。実際的な使用のための前記酵素の典型的な例として、膵臓由来ホスホリパーゼA2、例えばレシターゼ（商標）（ノボ・ノルディスクA/S製造）が好んで用いられる。
【００５２】
さらなる態様において、本発明の方法におけるホスホリパーゼの起源はチーズ製造に使用したスターター微生物による、例えばラクトバチルス（Lactobacillus）を包含する乳酸菌によるホスホリパーゼの過剰発現による酵素の発現からである。あるいは、チーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分の処理は前記ホスホリパーゼの添加によって、場合によっては本明細書に記載のスターター培養から提供されたホスホリパーゼと合同して行われる。
【００５３】
好ましい態様において、前記ホスホリパーゼは微生物的なミルク汚染物質からは得られない。したがって、本発明の方法において前記ホスホリパーゼ酵素処理はミルク又はミルク画分中に存在する、少なくとも主要なタンパク質ではない微生物的なミルク汚染物質により発現したホスホリパーゼの酵素作用により提供されない。前記微生物的なミルク汚染物質はバチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・セレウスの変種ミコイデス（mycoides）、シュードモナス（Pseudomonas）種、エンテロバクター・リキファシアンス（Enterobacter liquifacians）（クレブジアラ・シオアカエ（Klebsialla cioacae））、アルカリグネス・ビスコラクティス（Alcalignes viscolactis）、コリネフォルム（Corynefrom）桿状体から成る1つ以上の群でありうる。1つの態様において、前記ホスホリパーゼはそれらの汚染物質から得られない。さらなる態様において前記ホスホリパーゼは「J.J Owens,ミルク汚染物質由来のレシチナーゼの観察、Process Biochemistry,vol.13 no.1,1978,page10-18」及び「J.J Owens,ミルク中のレクチナーゼ陽性細菌、Process Biochemistry,vol.13,page13-15,1978」に開示された酵素と一致しない。
【００５４】
本発明の方法において、前記ホスホリパーゼ処理はチーズ・ミルク又は／及びチーズ・ミルク画分と精製されたホスホリパーゼの接触によって成されうる。本明細書に用いた用語「精製した（purified）」はホスホリパーゼ酵素タンパク質が抽出された生物の成分から分離するホスホリパーゼ酵素タンパク質を包含する。本明細書に用いた用語「精製した」はホスホリパーゼ酵素タンパク質が得られた天然の生物の成分から分離するホスホリパーゼ酵素タンパク質をも包含し、これはまた「本質的に純粋（essentially pure）」なホスホリパーゼと称され、そして天然に存在するホスホリパーゼであり、さらに、例えば1つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入によって遺伝子的に改変されていないホスホリパーゼにとりわけ相当しうる。
【００５５】
したがって、前記ホスホリパーゼは、すなわち微量の他のタンパク質しか存在していないまでに精製されうる。「他のタンパク質（other proteins）」の発現は特に他の酵素に関する。本明細書に用いた用語「精製した」は他の成分の除去、特に他のタンパク質、さらに最も特に前記ホスホリパーゼの起源の細胞中に存在するほかの酵素にも関する。前記ホスホリパーゼは、例えば前記ホスホリパーゼが製造されるところの生物、例えば組換えによりホスホリパーゼを製造した宿主生物の他の組成物から分離される「物質的に純粋（substantially pure）」でありうる。好ましくは前記酵素は少なくとも純度75％（W/W）、より好ましくは少なくとも純度80％、85％、90％又はさらに少なくとも純度95％である。さらなるより好ましい態様において前記ホスホリパーゼは少なくとも純度98％の酵素タンパク質の配合物である。他の態様において前記ホスホリパーゼはミルク中に天然に存在しないホスホリパーゼである。
【００５６】
用語ホスホリパーゼは酵素の作用活性に必要であろう、前記反応系中に天然に存在するかもしれない又はしないかもしれない補助化合物、例えば適当な受容体又は補助因子をすべて包含する。前記ホスホリパーゼは懸案への使用に適合したあらゆる形態、例えば乾燥粉末又は顆粒、非発塵性の顆粒、液体、安定性液体又は保護された酵素でありうる。顆粒は、例えばUS4,106,991及びUS4,661,452に開示のごとく製造され、さらに本技術分野で知られた方法により場合によっては被覆されうる。液体の酵素配合物は、例えば安定剤、例えば糖、糖アルコール又は他のポリオール、乳酸又は確立された方法に従って他の有機酸の添加によって安定しうる。保護酵素はEP238,216に開示された方法に従って調製されうる。
【００５７】
本発明の方法によってチーズのレシチン含有量は少なくとも5％、例えば少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、例えばステップa）での酵素による処理のない方法により作られた同種のチーズと比較して5〜95％の範囲で減らされうる。
【００５８】
牛乳においてレシチンはミルク中のリン脂質の95％以上を一般的に構成するのに対しリゾレシチンはリン脂質のおよそ1％である。リン脂質は牛乳中の総脂質の1％未満に一般的に相当するが、それらは主に乳脂肪球の膜に存在しており特に重要な役割を演じる。本発明の方法によってステップb）のチーズ中のレシチン含有量はチーズ中のリン脂質の総含有量の90％未満、例えば80％未満、60％未満又は50％未満でありうる。本発明の他の態様においてチーズ中のリゾレシチン含有量はチーズ中のリン脂質の総含有量の少なくとも5％、例えば少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、例えば5〜99％の範囲、5〜90％の範囲、10〜90％の範囲又は30〜90％若しくは40〜80％の範囲にて構成する。レシチン又はリゾレシチン含有量は本分野の技術者によって知られるいずれかの方法、例えばHPLCにより計測されうる。
【００５９】
好ましい態様において製造したチーズ中のレシチンのリゾレシチンに対する相対量はホスホリパーゼによるチーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分の処理によるレシチンのリゾレシチンへの変換によって提供される。チーズ中の脂肪含有量は一般的に65％（W/W）、例えば10〜60％の範囲である。
【００６０】
本発明は本発明の方法におけるホスホリパーゼの使用に関する。したがって、1つ態様はチーズ・ミルク又はチーズ・ミルク画分へのホスホリパーゼの添加及びチーズを作るためのチーズ・ミルクの処理を含む、チーズ製品の生産におけるホスホリパーゼの使用に関する。したがって、チーズ・ミルク又はその画分へのホスホリパーゼ処理がチーズ製造の前及び／又はその間に行われるところのチーズ製品の生産におけるホスホリパーゼの使用が本発明の範囲内にある。
【００６１】
本発明は本発明の方法によって製造したチーズのピザ、レトルト食品、プロセスチーズ又は他の食品の成分としての使用にさらに関する。したがって、本発明の方法に従って製造したチーズはプロセスチーズ、ピザ、ハンバーガー、トースト、ソース、ドレッシング、粉チーズ又はチーズの調味料のようなさらに加工した食品に使用されうる。
【００６２】
さらなる態様において本発明の方法はステップb）のチーズを加熱処理、例えば150〜350℃の範囲にかけるステップをさらに含みうる。
【００６３】
本発明は本発明の方法によって得ることができる、特に得たチーズにも関する。
【００６４】
好ましい態様において本発明はチーズ中の脂肪の安定性を向上するための方法に関し、前記方法は本明細書に記載したとおりである。1つの態様において本発明の方法によって生産されたチーズは脂肪／油の低下した拡散、例えば少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも40％の「油の」直径の減少、例えば20〜800％の範囲の、20〜600％の範囲の「油の」直径の減少がある；「油の」直径は本明細書の実施例1又は2に定義したとおり計測されている。
【００６５】
1つの態様において本発明はチーズの産生を増加、例えばチーズ製品中のチーズ脂肪産生又は／及びチーズタンパク質産生を増加させるための本発明の方法に関する。したがって、本発明によってチーズのより高い産生及び本発明の方法により製造されたチーズの脂肪相のよりよい安定性を導くチーズ生産方法が提供される。よって、1つの態様はチーズの安定性の向上及び／又はチーズ製造における産生の増加のための本発明の方法に関する。本発明の方法による脂肪産生の増加は少なくとも0.5％、例えば0.5〜10％の範囲、0.5％〜5％の範囲でありえ、例えば実施例3に記載した「差引計算による脂肪」のとおり計測されうる。
【００６６】
本発明のさらなる側面
本発明はミルク組成物の脂肪の安定化のための、ホスホリパーゼの群から選ばれた酵素によるミルク又はミルク画分の処理を含む方法を提供しうる。本発明はミルク組成物のエマルジョン安定性がホスホリパーゼを用いたミルク組成物の処理によって向上させることができることを確認した。よって、本発明はミルク組成物の脂肪エマルジョンの安定化のための、ホスホリパーゼの群から選ばれた酵素によるミルク又はミルク画分の処理を含む方法にも関する。前記方法は本明細書に記載した方法のステップa）として行われうる。
【００６７】
本発明によって向上した、特に向上した脂肪安定性を持っているUHTクリームの製造方法もまた提供される。前記方法は：ステップa）ホスホリパーゼでのクリームの処理；及びステップb）ステップa）のホスホリパーゼ処理したクリームのUHT処理にかけるステップを含み、ここでステップa）はステップb）の前に行われるUHTクリーム製造方法である。最後に、本発明はUHTクリームの生産におけるホスホリパーゼの使用に関する。
【００６８】
本発明によって以下の：ステップa）ホスホリパーゼでのミルク組成物（例えばクリーム）の処理；及びステップb）酵素処理したミルク組成物からのクリーム・リカーの製造のステップを含むクリーム・リカー製造方法もまた提供される。本発明は得ることができる又は本発明の上記方法から得たクリーム・リカーにさらに関する。最後に、本発明はクリーム・リカーの生産におけるホスホリパーゼの使用に関する。
【００６９】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するがこれら実施例は保護の範囲を何ら限定するものではない。
【００７０】
実施例
ホスホリパーゼ活性の決定：
ホスホリパーゼ活性の測定は以下に記載した原理に従ってなしうる。この方法において卵黄がレシチンに富んだ基質として用いられた。
【００７１】
原理：pHスタットによる滴定。リン脂質を含む均質化した卵黄をpHスタットを使ってpH8.0そして40℃にてカルシウム及びデオキシコール酸ナトリウム存在下においてホスホリパーゼにより加水分解する。遊離した脂肪酸を0.1N水酸化ナトリウムにより滴定し、そして基準量を時間との相関関係として観察する。1ホスホリパーゼ単位を標準条件下で1マイクロ等量の遊離脂肪酸を産生する酵素量として定義する。
【００７２】
試薬：
0.016Mデオキシコール酸ナトリウム（C24H39NaO4）、0.32M塩化カルシウム、0.01N塩化水素、0.1N水酸化ナトリウム。
【００７３】
基質：1つの卵黄を水100mlに加え、そして分散装置を使って均質化する。均質な基質を二重のガーゼを通してろ過する。0.32M塩化カルシウム5mlを加え前記ろ液を安定させる。
【００７４】
滴定混合物：基質が100mlであれば0.016Mデオキシコール酸ナトリウム50mlと混ぜる。
【００７５】
あるいは、以下のアッセイはDK99/00664（ノボ・ノルディスクA/S、デンマーク）：「ホスホリパーゼ活性（PHLU）」、「ホスホリパーゼ活性（LEU）」、「ホスホリパーゼ単層アッセイ」、「プレート・アッセイ1」、「プレート・アッセイ2」に記載の又はWO98/26057（ノボ・ノルディスクA/S）：「NEFA-C試験」に記載のホスホリパーゼ活性の質的又は量的決定のために使用されうる。
【００７６】
実施例1  チーズ製造のためのクリームのホスホリパーゼ処理
この実施例ではクリームをチーズ・ミルクを調製するためにスキムミルクと合わせる前にホスホリパーゼによって処理した。
【００７７】
未加工の成分
チーズ・クリームの組成：
スキムミルク            0.1％脂肪  1820ml
クリーム                38.0％脂肪  180ml
バターミルク（スターター培養を含む） 50ml
CaCl2                                 0.4g
酵素：
1）レンネット（アスパラギン酸酸性のリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のプロテアーゼ−EC3.4.23.6）、投与量：0.107g
2）レシターゼ（商標）（膵臓由来ホスホリパーゼA2、ノボ・ノルディスクA/Sより入手可能）、（脂肪に基づいた）投与量：0.2％（W/W）
チーズ製造
方法：クリームをホスホリパーゼ（レシターゼ（商標）、ノボ・ノルディスクA/S（デンマーク）が製造、投与量：0.2％（W/W脂肪含有量に基づく））を使って50℃の水浴中で30分間前記混合物をインキュベートすることによってそれぞれ処理した。処理したクリームをスキムミルクと混合し総脂肪含量が混合物の3.5％（W/W）となった、そして33〜35℃の水浴中に置いた。CaCl2を2リットルのチーズ・ミルクに加え、さらにスターター培養（例えばバターミルク）を加えた、そして前記混合物を5〜10分間撹拌した。前記ミルクを撹拌せずに30分間放置した。その次に、レンネット（アスパラギン酸酸性のリゾムコール・ミエヘイのプロテアーゼ）を加え、前記ミルクを1分間撹拌した。続いて、凝固点を明らかに（約12分）し、そして前記ミルクを切断の前に約25〜26分間静置した。
【００７８】
凝固点（凝固時間）はレンネットの添加から最初の凝集の表れまでに経過した時間であり、そしてミルク中の黒い棒の動きによって決定される、例えば凝固点とは前記棒の上に最初に確認できるカゼインの沈殿が観察される時点である。
【００７９】
実際のカッティング・タイムを次の試験をすることによって定義した：凝固スティックによってチーズの表面に小さな切れ目を入れ、スティックを前記切れ目の下に置きそして前方に動かした、チーズが2つの鋭いへりをもって分かれたとき、そして乳清が2つのへりの間に集まればそのときチーズが切断の準備ができた。
【００８０】
チーズを泡立て器を使って静かに撹拌し粉々に砕いた、そして2分間放置した。2分後、チーズを時々10〜15分間撹拌し凝乳から乳清を分離した。安定したように見える乳清と凝乳をろ布を包むざるに移した。乳清をろ布を通して1〜2時間排出した。0.6kgのおもりをチーズの上に置きさらに乳清を除いた、そしてその後チーズを室温で一晩保存した。
【００８１】
結果：チーズ製造のデータ（凝固時間、切断時間、乳清の量、乳清中のタンパク質、及びチーズの量）を表1に表す。
【００８２】
チーズの融解
方法：融解の前にチーズを高さ約2.5cmそして直径約8cmの断片に切った。チーズ・サンプルを250℃以上で8分間加熱した。加熱後のチーズの直径を2つの直径の平均として計測した。
【００８３】
結果：下記表1を参照のこと。
【００８４】
脂肪／油の拡散
方法：拡散試験を行う前にチーズを高さ約2.5cmそして直径約8cmの断片に切った。チーズ・サンプルを200℃以上で3分間加熱した後脂肪／油の拡散を計測した。加熱後にろ紙−ワットマン（商標）40−上に拡散した液体の直径を4つの直径の平均として計測した。
【００８５】
結果：下記表1を参照のこと。
【００８６】
実施例1において得たサンプルの計測値を表1に表す。
【００８７】
試行を異なるバッチのミルク／未加工の成分を用いたクリームであるところの2セットの試行として行った。1つのセットは列1及び2である。第2のセットは列3、4、及び5である。
【００８８】
【表１】
0004271872.tif 000002
【００８９】
結果の表より（「チーズの融解」及び表1の最下部に表わされた「脂肪／油の拡散」参照のこと）クリームの最初のホスホリパーゼ処理を伴って作ったチーズは加熱処理中のチーズの安定性が向上することは疑いなく明らかである。これはホスホリパーゼで処理されたチーズ・ミルクのためのクリームの場合に、より小さいことが加熱後のサンプルの平均直径の計測値からわかる。さらにはろ紙上の油の拡散はホスホリパーゼでクリームを処理した場合に減少する。
【００９０】
前記結果は本発明の方法により加熱処理中のチーズの安定性向上を得ることが可能であることを証明する。
【００９１】
実施例2  チーズへの安定化効果の試験のためのクリームのホスホリパーゼ処理
方法：クリーム（200g）を以下の：
1．投与量0％
2．投与量0.2％  （＝クリームの0.0725％）
3．投与量1.0％  （＝クリームの0.36％）
の3つの異なる投与量のレシターゼ（商標）10L（ノボ・ノルディスクA/S、デンマーク）とともに50℃で15分間インキュベートした（投与量は概算した脂肪＝36％に基づいた）。インキュベートの後前記クリームを5℃に冷やした。前記クリームを標準化された方法（フィリップス・ミキサー5段変速、最初の2分間は速度4にて、そして残りの時間は速度5にて動かす）において泡立てた。泡立てたクリーム100gを漏斗に入れ、そして室温にて1時間静置ドリッピングさせた。
【００９２】
サンプルと結果：
サンプル1を7分25秒間泡立てた。約300mlのクリーム。漏斗での1時間後のドリッピングの量＝2.5ml。
【００９３】
サンプル2を20分間泡立てた、そして泡のない形成物を得た。サンプルはほんの少しかたくなり、そして明るい黄色になった。
【００９４】
サンプル3を15分間泡立てた、そして泡のない形成物を得た。サンプルはほんの少しかたくになり、そして明るい黄色になった。
【００９５】
泡立つ能力はレシターゼ（商標）処理によって破壊された。クリームにおける泡の形成は脂肪球の崩壊及び泡を形成する継続的な脂肪相の形成に基づいている。本発明の方法に一致して上記結果はレシターゼ（商標）処理はクリーム中の脂肪の乳化及び安定性を向上させることを表す。
【００９６】
実施例3  モッツアレラ・チーズ製造のためのクリームのホスホリパーゼ処理  この実施例においてクリームをチーズ・ミルクを製造するためにスキムミルクと混ぜ合わせられる前にホスホリパーゼにより処理した。
【００９７】
未加工の成分
チーズ・ミルクの組成：
低温殺菌したスキムミルク 0.83％脂肪      13.63L
クリーム                 30％脂肪         1.37L
CaCl2                                     0.4g/2kgクリーム
スターター培養LH100及びロードス島の食品由来のTA061（乳酸菌）（ローディア社、マディソン群、ウイスコンシン州、アメリカ）
酵素：
1）レンネット（アスパラギン酸酸性のリゾムコール・ミエヘイのプロテアーゼ−EC3.4.23.6）、投与量w50KRU/g（KRU法はノボ・ノルディスクA/Sから入手可能：0.60g
2）レシターゼ（商標）（膵臓由来ホスホリパーゼA2、ノボ・ノルディスクA/Sより入手可能）、（脂肪に基づいた）投与量：0.2％（W/W）
チーズ製造
方法：クリームをホスホリパーゼ（レシターゼ（商標）、ノボ・ノルディスクA/S（デンマーク）が製造、投与量：0.2％（W/W脂肪含有量に基づく））を使ってCaCl2とともに50℃の水浴中で30分間前記混合物をインキュベートすることによってそれぞれ処理した。処理したクリームをスキムミルクと混合し総脂肪含量が3.5％となった、そして15Lのチーズ・バット（GEAリキッド・プロセッシング社（ハダスレベージ36、6000コレング、デンマーク）から入手可能な2×15Lバットをもつチーズ装置を使用）に置いた。前記ミルクを34.4℃に平衡化し、そしてスターター培養を加えた、そして混合物をレンネット添加前に4〜5分間静かに撹拌した。その次に、レンネット（アスパラギン酸酸性のリゾムコール・ミエヘイのプロテアーゼ）を加え、前記ミルクを3分間撹拌した。続いて、前記ミルクを切断の前に約35分間静置した。
【００９８】
実際のカッティング・タイムを次の試験をすることによって定義した：凝固スティックによってチーズの表面に小さな切れ目を入れた−次にスティックを上記切れ目の下に置きそして前方に動かした時にチーズが2つの鋭いへりをもって分かれ、そして乳清が2つのへりの間に集まればよい。切断を1/2インチ・ナイフにより行った。
【００９９】
次に前記切断した凝乳を41.1℃に加熱した（約30分処理する）。次にチーズを凝乳のpHがpH5.90達するまで静かに撹拌し、その後乳清を抜き、5cmマットに積み重ねた。pHが5.25に達してから凝乳を1.5インチ角に切断し、そして冷たい水道水に15分間浸す。水道水を排水した後凝乳を計量する。さいの目に切った凝乳にNaCl（チーズ・ミルク重量の0.2％）を固形で3回に分けて添加した。次に前記凝乳をツイン・スクリュー・ストレッチャー（ステンレス・ファブリケイティング社（コロンバス、ウイスコンシン州、アメリカ）から入手可能なスプリーム・マイクロ・ミキシング・マシーン）によって63℃で9rmpにて伸展し、この後伸展した凝乳を7℃の水中に30分間置き、そして7℃の塩水（23％NaCl）中にもう90分間置いた。
【０１００】
チーズ製造のデータ（チーズ中のタンパク質はデュマ燃焼法（LECO）により計測し、水分はCEM自動揮発性コンピューター、モデルAVC-80（CEM社、マシューズ、NC、28108）によって計測し、そして脂肪は差引計算による）を表2にまとめる。
【０１０１】
結果：下記表2を参照のこと。
【０１０２】
脂肪／油の拡散
方法：脂肪／油の拡散を90℃以上5分間加熱したチーズ・サンプルにて試験した。拡散試験を行う前にチーズをサンプルの均一性を得るためにオステライザー（商標）ミキサーにてすり砕いた。続いて2.0グラムを金属の輪（2cm）で成型し、ワットマン（商標）＃4ろ紙の中央に置いた。油状になったものを油の輪に囲まれた面積とチーズの円の差によって定量した（3連の定量）。結果：下記の表2を参照のこと。
【０１０３】
融解性
方法：スクイーズ−フロー流量計、Ak, M.M., and Gunasekaran. 1995. J. Texture Stud. 26:695-711参照のこと。
条件： 0.1mm/秒のクロスヘッド・スピードのステイブル・マイクロ・システム、TA-XT2構造解析器。円筒形のサンプル（直径25mm、高さ15mm）を50℃の水浴中に5分間置き、温度と平衡を保たせた。
【０１０４】
P-リパーゼ処理したサンプルの融解性はそれらのそれぞれの対照よりもほんのわずか低かった。
【０１０５】
実施例3において得られたサンプルの計測値を表2に表した。
【０１０６】
試験を異なるバッチのミルク／未加工の成分を用いたクリームであるところの2セットの試験として行った。
【０１０７】
【表２】
0004271872.tif 000003
【０１０８】
結果の表2からクリームの最初のホスホリパーゼ処理を伴って作ったモッツアレラチーズは、モッツアレラチーズの重要な品質条件であるオイリング・オフが著しく抑えられる。前記結果は本発明の方法により加熱処理中のチーズの安定性向上の獲得が可能であるということを証明する。さらにホスホリパーゼは、おそらく工程中の脂肪の損失が減少したことが原因となってチーズ中の脂肪含有量を増加させることがわかる。よって、ホスホリパーゼによる最初の処理はチーズ製品の生産増を導く。