(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピペット装置と、ピペット・プレートを乗せるための熱サイクル器とを使用してＰＣＲ法を自動的に実施する装置であって、該ピペット装置（２７、２８）がサンプル物質および／または化学薬品をピペット注入するためのピペット・アーム（１３）を備える装置において、
該ピペット装置と該熱サイクル器とを空間的に分離した作業ステーションとして構成し、かつ装置の作業面（２）上に配置し、そして
作業面（２）の実質的に全域にわたってピペット・プレートを移動させるためのハンドリング装置が設けられており、該ピペット・プレートはサンプル物質または化学薬品を有する反応槽を備え、該反応槽は前記作業ステーションから離れて構成されており、かつ装置（１）は該槽を自動的に開閉するためのカバー作動アーム（１４）を備えており、
該ハンドリング装置および該ピペット・アーム（１３）はロボット・アーム（８）上に配置され、該ロボット・アーム（８）がレール（７）の長手方向に移動するように配置されており、該レール（７）は、作業面（２）に対して上方において平行であるように、水平に配置されており、該ピペット・アーム（１３）およびハンドリング・アーム（１５）はそれぞれ、垂直におよび該ロボット・アーム（８）の長手方向に移動するように、ロボット・アーム（８）上に配置されていることを特徴とする装置。
【請求項２】
該装置(１)がピペット・アーム（１３）、ハンドリング・アーム（１５）および該熱サイクル器（３５〜３８）を作動させる制御装置を備えており、該制御装置をマルチタスク・コントローラとして構成したことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
該ピペット・アーム（１３）は、その下端に、細管（２１）を介して少なくとも１つのポンプ（２２、２３）に接続するピペット・チップを受け入れることができ、
精巧な定量ポンプ（２２）および該精巧な定量ポンプ（２２）よりも高い流速を有するポンプ（２３）は共に再使用可能なピペット・チップを洗浄するために該ピペット・チップに接続されており、
該装置（１）が、使い捨てピペット・チップ用のピペット・チップ・マガジン（３２）および使い捨てピペット・チップを取り外すピペット・チップ・スイーパ（３３）を備えている
ことを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
該ピペット・アーム（１３）、該カバー作動アーム（１４）および該ハンドリング・アーム（１５）を、垂直におよび該ロボット・アーム（８）の長手方向に移動する垂直に配列されたアームとして構成したことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
該装置(１)が、サンプル物質または化学薬品を含む槽またはこのような槽が構成されたピペット・プレートの中間貯蔵用のスタッカ（２９）を備えていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記熱サイクル器が、ベースボディ（３６）、およびタンク（３５）を閉じるためのカバー（３７）からなるタンクを備えており、該タンク（３５）を自動開閉する位置制御器を設けたことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
使い捨てピペット・チップがピペット・アーム（１３）に配置されているかどうかを調べるために、自由に突き出た導電性ポインタ（３４）を設け、これを感知手段に接続したことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の装置を作動させる方法において、
ピペット操作中、ピペット・チップを、個々の反応槽中の液の面よりも上方に少し離して保持することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項に記載の装置を作動させる方法において、
２つの異なる用法を同時に実施し、該制御装置が、ピペット操作および該熱サイクル器内でのインキュベーションの開始をそれらが実質的に同時に終了するように自動的に規定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、化学的または生物学的方法の自動実施装置に関し、具体的には、サンプル物質および／または化学薬品をピペット注入するためのピペット・アームを備えるピペット装置ならびに熱サイクル器(Thermocycler)を含む、核酸配列の決定および増幅のための装置に関する。
【０００２】
ＵＳ５，４４３，７９１には、いくつかの作業ステーションを備える化学的または生物学的方法の実施装置が開示されている。作業ステーションは、熱サイクル器、能動的に冷却された酵素貯蔵ステーション、洗浄ステーション、試薬貯蔵ステーション、ＤＮＡサンプル・ステーションなどである。この公知の装置では、作業面に平行な平面内をピペット・チップ(Pipettierspitze)が移動し、液移送が実施される。この装置の反応槽は、熱サイクル器内に配置された金属製ブロックに設けたくぼんだ空洞として構成される。まず、熱サイクル器内に位置する反応槽の１つに個々の試薬をピペットから滴下し、次いで温度プロフィール(Temperaturprofil)を受けさせる。この反応槽は、別の反応を実施するためには、清浄化する必要がある。清浄化が不十分な場合には、その後の反応が汚染されてしまう。このことは、ＰＣＲ法などの非常に敏感な方法では極めて重大な欠点である。この欠点の他に、反応槽が、金属ブロックに設けたくぼんだ空洞として構成され、試薬と直接的に接触することも欠点である。金属表面を残留物の全くない清浄な状態にすることが合理的な費用ではできない場合があり、その場合には、金属表面自体が別の汚染源となる。
【０００３】
熱サイクル器を使用することによって、所定の温度プロフィールを実現化することができる。具体的には熱サイクル器は、核酸配列を決定および増幅する遺伝子技術で使用されている。このような方法が、例えばＥＰ２００３６２Ｂ１、ＥＰ２５８０１７Ｂ１、ＥＰ２０１１８４Ｂ１に記載されている。
【０００４】
カバーでサンプル槽を閉じるシステムが、ＤＥ４４１２２８６Ａ１から知られている。このシステムは、ラッチ機構によってカバーをつかみ移動させる反応槽開閉手段を備える。
【０００５】
本発明の目的は、前述の装置を改良して、化学的または生物学的方法の自動実施に、具体的には核酸配列の決定および増幅のための無汚染自動実施に適した装置とすることにある。
【０００６】
この目的は、特許請求の範囲請求項１に記載した特徴を有する装置によって達成される。従属請求項には有利な態様を記載した。
【０００７】
本発明は、ピペット装置と熱サイクル器が空間的に分離された作業ステーションとして構成されること、およびサンプル物質または化学薬品を含み、前記作業ステーションから離れて構成された少なくとも１つのサンプル槽を移動させるハンドリング・アームを備えることを特徴とする。
【０００８】
ピペット装置と熱サイクル器を空間的に分離し、前記作業ステーションとは独立に構成された反応槽を備え、これによって反応槽が、個々の作業ステーションの間をハンドリング・アームによって移動することによって、複雑な化学的および生物学的方法の高処理量の完全自動実施が可能となる。これは、反応槽が、ピペット装置内と熱サイクル器内とに同時に置かれ、装置の複雑な清浄化手順を必要としないためである。これによって、全く異なる試薬およびサンプル物質を用いる複雑な方法を、実際上同時におよび／または逐次的に完全自動実施することが可能となる。
【０００９】
したがって本発明に基づく装置によって、複雑な化学的および生物学的方法、より具体的には核酸配列の決定および増幅を汚染を生じることなく完全自動実施することが可能となり、これによって作業手順が単純となり、手順の正確さおよび安全性が大幅に向上する。
【００１０】
マルチタスク・コントローラを含む請求項３に記載の実施形態では、さまざまなサンプル物質や、適用作業等のロボット・ハンドリングを可能にし、同時に、研究者が個々のプロセス段階を監視およびチェックする必要を排除する。その結果、最も複雑な方法プロファイルであっても、場所などの間違いに起因する誤りの危険なしに最小限の空間環境で実施することができる。
【００１１】
本発明に基づく装置の他の好ましい実施形態では、蓋によってサンプル槽を自動開閉する手段を設ける。自動化装置では通常、サンプル槽をワックスまたはオイルの薄膜で閉じている。化学的または生物学的反応を手動で実施するには、サンプル槽をこのように閉じることが一般的である。自動操作において開放可能に槽に固定された蓋を利用することは、ワックスまたはオイルの被膜を使用する従来の方法に比べて顕著な利点を有する。すなわち、試薬および／またはサンプル物質を満たし、カバーで閉めた槽を再び開いて、追加の試薬およびサンプル物質を添加することができる。試薬およびサンプル物質は、反応槽の液面のわずかに上方に保持されたピペット・チップを用いて反応槽に導入され、そのため、ピペット・チップと反応槽内の試薬およびサンプル物質が接触せず、したがって試薬およびサンプル物質を一方の反応槽から他方の反応槽へと移送させることによって相互間の汚染を確実に防ぐことができる。
【００１２】
従来法で反応槽を封止するには、ピペット操作時にピペット・チップをワックスまたはオイルの薄膜に突き刺し、反応槽中の液に浸す必要がある。ピペット・チップを、別の反応槽、例えば同じ物質に適用するためには、ピペット・チップを清浄化するか、または取り換える必要がある。このことは、化学的および生物学的反応を手動で実施する際に普通に行われていることであるが、このままでは、これらの反応を完全自動実施化するのに必要な時間および費用が増大する。
【００１３】
反応槽内に含まれる液体または反応槽自体に動きが生じたとき、あるいは加熱段階中に熱サイクル器内で沸騰が遅れて生じた場合、オイルまたはワックスの薄膜では、液体が反応槽から漏れてしまい、隣接した反応槽が例えば液体の飛散(schwappt)により汚染するのを確実に防ぐことはできない。
【００１４】
この他にも、ワックスで封止する方法には、冷却されて低温（例えば１４℃）になったときにワックスが凝固し、それ以降の処理を妨げてしまうという欠点がある。
次に、添付図面を参照して本発明の一例を詳細に説明する。
【００１５】
図１に、２つの正面縁３ならびに前方および後方に長手方向の縁４を有する長方形の作業面２を備える本発明に基づく装置１を示す。作業面２の後方の長手方向の縁４には後壁６が配置される。後壁６の上縁部には、作業面２の後方の長手方向の縁４と平行に走る水平レール７が配置される。レール７にはロボット・アーム８が装着され、レールの縦方向（２重矢印９、Ｘ方向）に移動する。
【００１６】
ロボット・アーム８は、作業面２の正面縁３と平行に、真っ直ぐに撓まないように配置され、したがって後壁６から垂直に延びる。ロボット・アーム８の外面は、２つの縦壁１０および自由端にあって上から見てＵ字形に配置された正面壁１１によって画定される。２つの縦壁１０の間には、縦壁から間隔を置いてレール１２が配置される。レール１２には、３本のＺアーム１３〜１５が装着され、レールの縦方向（Ｙ方向）に移動する。３本のＺアーム１３〜１５は、レール１２と縦側壁１０の間のすき間１６を通って垂直に延びる。２本のＺアーム１３、１４は、左側のすき間１６の中に配置され、第３のＺアーム１５は右側のすき間１６の中に配置される。
【００１７】
ロボット・アーム８は電力の供給を受け、レール７に沿った方向（Ｘ方向）に移動し、Ｚアーム１３〜１５は、レール１２に沿った方向（Ｙ方向）およびレール１２と垂直な方向（Ｚ方向）に移動する。そのため、Ｚアーム１３〜１５は、作業面２の上方の領域（Ｘ方向、Ｙ方向）を実質的に完全にカバーし、高さ（Ｚ方向）の調整が可能である。
【００１８】
Ｚアーム１３は、ピペット・チップ２０（概略的に示す）を装着するための部品をその下端に備える。Ｚアーム１３を以後、ピペット・アーム１３と呼ぶ。ピペット・チップは、細管２１を介して２つのポンプ２２、２３に接続される。ポンプ２２は、微量配給（１μｌ）を正確に実施するためのシリンジ・ポンプであり、一方、第２のポンプ２３は、シリンジ・ポンプ２２よりも処理量の大きな（例えば＞１００ｍｌ／分）洗浄ポンプで、ピペット・チップ２０の洗浄に使用される。
【００１９】
Ｚアーム１４は、ＤＥ４４１２２８６Ａ１およびＥＰ７３４７６９Ａ１から知られているような、槽についての自動開閉手段２５をその下端に備える。Ｚアーム１４を以後、カバー作動アーム１４と呼ぶ。手段２５は、ラッチ機構によって蓋を持ち上げたり放したりすることができる。
【００２０】
汚染の危険があるときには、サンプル物質および化学薬品を含むそれぞれの槽にカバーをかぶせる。カバーは、カバー作動アーム１４によって自動的に取り外したり、再びかぶせたりすることができる。閉じることができるこれらの槽は具体的にはＰＣＲ法で使用される。配列決定では汚染の危険は少ないので、このような閉じることのできる槽を配列決定で利用することは必ずしも必要ではない。
【００２１】
第３のＺアーム１５を以後、ハンドリング・アーム１５と呼ぶ。ハンドリング・アーム１５は、フォーク・リフト・トラックの動作と同じようにピペット・プレート（図示せず）を持ち上げ、移動し、所定の位置に戻すフォーク状の保持手段２６をその下端に備える。ピペット・プレートには、長方形の格子模様に配列され、それぞれをカバーで閉じることができる複数のサンプル槽が形成されている。必要に応じてピペット・プレートをハンドリング・アーム１５を用いて作業面２の上に置くことができる。
【００２２】
作業面２の上には、サンプル・マウント２７および２つのピペット・マウント２８が配置される。サンプル・マウント２７とピペット・マウント２８は全く同一に構成された取付具であって、これらの上にピペット・プレートが置かれる。ピペット・プレートを取付具２７、２８の上に置くことによって、ピペット・プレートが作業面２に対して正確に位置決めされ、そのため、ピペット・プレート上に構成されたそれぞれの槽の位置が正確に画定され、これによってロボット・アーム８、より具体的にはピペット・アーム１３およびカバー作動アーム１４がそれぞれの槽の位置を正確に検出することができるようになる。ピペット・マウント２８は、ピペット操作が実施されるピペット・ステーションを画定する。
【００２３】
マウント２７、２８は、ピペット・プレートを載せるのを容易にするために作業面２の前方の長手方向の縁４のところに配置される。マウント２７、２８の傍らには、何枚かの、例えば５〜１０枚のピペット・プレートを収容する小型のバッファ貯蔵および取出し(Zwischenspeichern)システムとして構成されたスタッカ２９が配置される。
【００２４】
作業面２の後部には、化学薬品リザーバ３０、洗浄ステーション３１、使い捨てピペット・チップを収めるピペット・チップ・マガジン３２、および使い捨てピペット・チップを取り外すピペット・チップ・スイーパ３３が配置される。使い捨てピペット・チップは、ピペット・チップマガジン３２の中に縦に配置され、そのためピペット・アーム１３は、その下端をマガジンの中に下げるだけで使い捨てピペット・チップをピックアップすることができる。使用後は、ピペット・チップ・スイーパ３３によって取り外される。
【００２５】
ピペット・チップ・スイーパの上には水平に突き出た柔軟な導電性材料のポインタ３４が配置される。使用する使い捨てピペット・チップは、例えば含黒鉛プラスチックなどの導電材料から製作される。
【００２６】
新しい使い捨てピペット・チップをピックアップした後、ピペット・アーム１３に隣接した側のピペット・チップの端部を、ポインタ３４に接触させるか、またはこれに近づける。ポインタ３４は、キャパシタンスを感知する感知手段に接続されており、この手段の結果に基づいて、システムは、使い捨てピペット・チップがピペット装置に取り付けられているのかどうか、あるいは使い捨てピペット・チップのピックアップが正常に実施されなかったのかどうかを「知る」ことができる。したがってポインタと感知手段を用いて、新しい使い捨てピペット・チップのピックアップを確認することができる。この確認手段の大きな利点は、従来の確認手法で知られているのとは違い、使い捨てピペット・チップの先端を別の物体に接触させる必要がなく、使い捨てピペット・チップのピックアップの確認を汚染を全く生じることなく実施できることである。
【００２７】
再使用可能なピペットを使用するときには、それぞれのピペット操作の間に必要に応じてピペットを洗浄ステーション３１に挿入し、洗浄ポンプ２３を用い水で十分に洗い流して清浄する。
【００２８】
化学薬品リザーバ３０には、上部が開放された、さまざまな化学薬品を保持した複数の槽が配置される。化学薬品リザーバ３０にある槽は、カバー作動アーム１４によって取り外したり再びかぶせたりすることができるカバーで閉じてもよい。
【００２９】
本発明によれば、熱サイクル器・タンク３５が作業面２の上に配置される。熱サイクル器・タンク３５は、上部が開放されているがカバー３７で閉じることができる本体３６から成る。カバー３７は、ヒンジ３８によってベースボディ３６に固定されており、モータ（図示せず）によってヒンジ３８に沿って回転するようになっており、熱サイクル器・タンク３５を自動開閉する。熱サイクル器・タンク３５の内部には、その内部を特定の温度に調節するための加熱冷却部品が配置されている。加熱冷却部品によって特定の温度プロフィールを実現することも可能である。加熱冷却部品には、排熱と給熱の両方の能力を有するペルティエ素子を使用することが好ましい。このような熱サイクル器の温度範囲は一般に−５℃〜１２０℃であり、温度は、２℃／ｓ〜５℃／ｓの加熱／冷却速度で変化する。
【００３０】
本発明に基づく装置は、Ｚアーム１３から１６を有するロボット・アーム８の運動を制御し、ポンプ２２、２３、内蔵熱サイクル器などの個々の機能部品を制御する中央コントローラを備える。このコントローラは、後壁６の内部に配置される。しかしこのコントローラは、別個のハウジング内に収容してもよいし、または別個のコンピュータで代替してもよい。コントローラは、プロセッサ制御の装置であり、いくつかの制御動作を同時に実施し監視することができるマルチタスク・コントローラとして構成することが好ましい。
【００３１】
コントローラは、コンピュータとのインタフェースを備えている。コンピュータには、個々の適用作業、サンプル管理、化学薬品および熱サイクル器・プログラムのデータを含むいくつかのデータ・ベースが記憶される。すべてのユーザは、分析または処理対象のサンプルを挿入し、適用作業の種類（配列決定、増幅など）を入力し、選択した適用作業に対して化学薬品およびサイクル器プログラムが規定されていない場合には、これら（化学薬品、サイクル器プログラム）を選択し、サンプル・マウント２７にサンプルを置くだけでよい。
【００３２】
次いで本発明に基づく装置が、サンプル物質および化学薬品を含む槽をカバー作動アーム１４を用いて開き、サンプル物質の一部を、ピペット・マウント２８の上に配置されたピペット・プレートの反応槽の中へ移し、サンプル物質を、化学薬品リザーバ３０からの対応する化学薬品と接触させる。試薬およびサンプル物質がある反応槽から別の反応槽に移ることを防ぐため、ピペット操作時にはピペット・チップを反応槽の液面よりも上に保持することが好ましい。こうすることによって、ピペット操作と操作の間にピペット・チップを清浄化する必要がなくなり、操作が迅速になるので、同じ物質をピペット・プレートのいくつかの反応槽に適用するときに特に有利である。
【００３３】
ピペット操作をした後、ハンドリング・アーム１５を用いてピペット・プレートを熱サイクル器・タンク３５の中に直接に挿入するか、またはスタッカ２９に一時的に貯蔵し、後の適当な時点で熱サイクル器・タンク３５に移動させる。
【００３４】
熱サイクル器・タンク３５内でサンプルを特定の温度プロフィールにさらしている間に、他のサンプル物質を別のサンプルにピペット注入して他の適用作業を実施することができる。
【００３５】
次に図２に、本発明に基づくＤＮＡサンプル増幅装置の単純で代表的な適用操作の流れ図を示す。この適用操作では、ＤＮＡサンプルを増幅し、次いで特定の配列のところで分割し、電気泳動分析に供する。
【００３６】
この目的のため、研究者は、コンピュータのメニュー表示から、サンプル物質、増幅に適した所定の酵素混合物、増幅したＤＮＡサンプルを特定の配列のところで分割する別の所定の酵素混合物、および電気泳動分析用のゲルおよび緩衝液を選択する。
【００３７】
次いでコンピュータは、規定されたサンプル物質および試薬によって定まるいわゆるピペット操作スクリプト(Scripte)および熱サイクル器・スクリプト(Pipette.scrおよびCycler.scr)を自動的に生成する。これらのスクリプトには、ピペット・プレートを移動させる移送命令およびカバーを開閉する命令を含む、反応槽への充填およびインキュベーションに必要な全ての制御命令が含まれる。熱サイクル器・スクリプトにはさらに、熱サイクル器で実施する温度プロフィールを含む。温度プロフィールは、必要があれば手動で修正することができる。
【００３８】
第１の作業段階Ｓ１の間に、ピペット・スクリプトを実施する。その結果、ピペット・プレートの槽には選択したサンプル物質および試薬が満たされ、ピペット・プレートが熱サイクル器に供給される。
【００３９】
第２段階Ｓ２では、熱サイクル器内に温度プロフィールが与えられ、公知のＰＣＲ法に基づいてＤＮＡが増幅される。増幅手順完了後、ピペット・プレートはピペット・マウントに移される。
【００４０】
段階Ｓ３では、別のピペット・スクリプトが実施され、反応槽が所定の制限酵素混合物を受け取る。次いで、ピペット・プレートは熱サイクル器に再移送され、挿入される。
【００４１】
次の段階Ｓ４では、ＤＮＡサンプルを、例えば制限酵素が特に活性な３７℃の温度で２時間処理して、配列特異的に分配する。その後、温度を一時的に例えば９５℃に高め、制限酵素を失活させる。ＤＮＡサンプルの分割の完了した後、ピペット・プレートは、一方のピペット・マウント２８に戻される。
【００４２】
段階Ｓ５では、電気泳動分析のためのゲルおよび緩衝液が反応槽に添加される。
調整済みのＤＮＡ配列と共にピペット・プレートは、研究者らによって取り出されるか、またはスタッカ２９で自動的に緩衝液で処理される。
【００４３】
次に図３に、本発明に基づく装置を用いる完全自動実施可能な他の方法の流れ図を示す。この方法は、例えば特許ＥＰ４３８５１２Ｂ１（＝ＵＳ５７６６８４７）に記載のようにＤＮＡ部分の多形の長さを求めるのに役立つ。
この構成では、サンプル物質が完全な細胞を含み、この細胞は、段階Ｓ１１およびＳ１２においてプロテイナーゼＫを用いて溶解される。
【００４４】
段階Ｓ１３では、ランダム・プライマー混合物（プライマー伸長プロトコル（ＰＥＰ）が添加され、段階Ｓ１４では、ＰＣＲ法に基づいて増幅される。
その後、段階Ｓ１５で、何種類かのプライマーと酵素の混合物が添加されて、ＤＮＡ配列の単純なまたは隠蔽された単純な反複、（ＳＴＲ：短いタンデム・リピート）が検出され、その後、対応するＰＣＲ法が実施される（段階Ｓ１６）。
【００４５】
図２および図３に示した方法または適用手順は、本発明に基づく装置で実施することができる豊富な応用例のうちの２例に過ぎないことに留意されたい。これらの適用業務のいくつかは、コントローラに事前にプログラム化されている。しかし研究者は、任意のピペット・スクリプトおよび熱サイクル器・スクリプトを有する自分独自の応用を組み立てることもできる。任意にこれらの方法を複雑にすることができ、例えばＤＮＡにＲＮＡをかぶせる操作(Umschreiben)を含めることができるが、本発明によればこれらの方法も完全に自動実施することができる。
【００４６】
研究者が個々の段階を監視する必要なしに、さまざまな適用作業を同時におよび／または逐次的に完全自動的に実施することができる。熱サイクル器で１つの作業を実施している間に、ピペット装置で別の作業を実施することも可能である。そのため制御装置は、一般により迅速に実施されるピペット操作プロセスを、熱サイクル器で実施中のインキュベーションと同時に終了するように開始させる追加の機能を備えている。ピペット操作プロセス中に調製された混合物は、時間を置かずに熱サイクル器に添加され、これによって望ましくない反応が回避される。
【００４７】
本発明によって、複雑な化学的および／または生物学的方法、特にＰＣＲ法の完全自動処理を可能にする方法が生み出され、使用する方法の種類にさいて最大限の柔軟性が達成できる。これによって、最も複雑な方法形態であっても、場所などの間違いに起因する誤りが起る危険性なしに最小限の空間環境で実施することができる。最も複雑な化学的および／または生物学的方法を、より具体的には核酸配列の決定および増幅を高効率および高スループットで完全自動実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に基づく装置の一実施例の概略透視図である。
【図２】  代表的な一適用例の流れ図である。
【図３】  他の代表的な適用例の流れ図である。
【図１】
0004272351.tif 000002
【図２】
0004272351.tif 000003
【図３】
0004272351.tif 000004