(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＰＨＯＲ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はその相補鎖を含む、組み換え核酸。
【請求項２】
前記ＰＨＯＲ−１ポリペプチドの産生をもたらす調節配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むよう修飾された、単離された宿主細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞を培養する工程を含み、それによってＰＨＯＲ−１ポリペプチドが産生される、ＰＨＯＲ−１ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項５】
ＰＨＯＲ−１ポリペプチドを回収する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸によってコードされる、ＰＨＯＲ−１ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のＰＨＯＲ−１ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体又はそのフラグメントであって、検出可能なマーカー及び/又は毒素又は治療薬剤に結合していてもよい、前記抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントであり、単鎖型であってもよい、請求項７に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を産生するためのベクター。
【請求項１０】
以下の工程を包含する、前立腺の試験組織におけるガンの存在の有無を決定する方法：
（ａ）前立腺組織の試験サンプルにおける請求項１に記載の核酸によってコードされるＰＨＯＲ−１タンパク質又は請求項１に記載の核酸によって産生されるＰＨＯＲ−１ ｍＲＮＡのレベルを決定する工程；
（ｂ）ガンの存在しない対応する前立腺組織におけるタンパク質又はｍＲＮＡのレベル値を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で提供されたレベルに対して工程（ａ）で決定されたタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを比較する工程であって、
それにより、（ｂ）と比較した（ａ）のレベルが大きい場合は該試験組織にガンが存在することを示し、（ｂ）と比較した（ａ）のレベルが大きくない場合は該試験組織にガンが存在しないことを示す、前記方法。
【請求項１１】
ＰＨＯＲ−１タンパク質のレベルが、サンプルをＰＨＯＲ−１タンパク質と特異的に結合する媒介物（agent）に接触させる工程、及び該サンプルに対する該媒介物の結合のレベルを検出する工程、を含む方法によって決定される、請求項１０に記載の方法であって、該媒介物が抗体又はそのフラグメントである、前記方法。
【請求項１２】
以下の工程を包含する、請求項６に記載のタンパク質の活性を減少させる薬剤を同定する方法：
第一の細胞サンプルと第二の細胞サンプルを提供する段階であって、各々の細胞サンプルが該タンパク質を発現する工程；
第一のサンプルを候補化合物に接触させ、
該候補化合物に対する第一のサンプルにおけるタンパク質の活性を測定する工程；
該候補化合物と接触していない、第二のサンプルにおけるタンパク質の活性を測定する工程；
第一のサンプルと第二のサンプルにおいて測定されたタンパク質の活性を比較する工程；
それによって、第二のサンプルと比較した第一のサンプルにおけるタンパク質の活性の減少により、該化合物が該タンパク質の活性を減少させる薬剤として同定される、前記方法。
【請求項１３】
活性が、チロシンのリン酸化、細胞質ｃＡＭＰの蓄積、又はコロニー増殖の刺激を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項７又は８に記載の抗体ならびにそのフラグメント、及び生理学的に受容可能なキャリアを含有する、前立腺ガンの処置のための薬学的組成物。
【請求項１５】
抗体又はそのフラグメントが細胞に対して毒性の治療薬に結合している、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
細胞に対して毒性の治療薬が放射性同位体、化学療法剤及び毒素からなる群から選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
放射性同位体が１３１Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、及び２１２Ｂｉからなる群から選択され、化学療法剤がタキソール、アクチノマイシン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ゲロニン、及びカリヒマイシンからなる群から選択され、毒素がジフテリア毒素、エノマイシン、フェノマイシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、ミトゲリン、モデシンＡ鎖、及びα−サルシンからなる群から選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９９年１０月５日に出願された、米国特許仮出願番号第６０／１５７，９０２号（その全体の内容が本明細書中で参考として援用される）の特典を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、ＰＨＯＲ−１と呼ばれる新規の遺伝子およびそのコードされるタンパク質、ならびに診断および治療方法、ならびにＰＨＯＲ−１を発現する種々の癌（特に、前立腺癌）の管理において有用である組成物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
癌は、冠状動脈の疾患に次ぐ、ヒトの第２の死亡原因である。世界中で、数百万のヒトが、毎年癌で死亡している。米国のみで、癌は、毎年５０万をゆうに越えるヒトの死亡原因であり、１４０万人が毎年新たに診断されている。心臓疾患による死亡は有意に減少しているが、一般的には癌による死亡は増大している。２１世紀の始めには、癌は第１の死亡原因になると予想される。
【０００４】
世界中で、いくつかの癌は、主だった死亡原因として突出している。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による死亡の主な原因を示す。これらおよび実質的に全ての他の癌腫は、共通する致死的な特徴を共有する。ごくわずかな例外をともなうが、癌腫による転移性の疾患は致命的である。さらに、当初は生存している初期の癌腫を有するこのような癌の患者についてもなお、共通する実験は、彼らの生存性が劇的に変更されることを示した。多くの癌患者は、再発の可能性または処置の失敗の自覚による強烈な不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の身体の衰弱を経験する。多くの癌患者は、再発を経験する。
【０００５】
世界中で、前立腺癌は、男性における４番目の最も一般的な癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、これは、最も一般的な男性の癌であり、そして男性の癌による死亡の第２の原因である。米国のみで、４０，０００人をゆうに超える男性が、唯一肺癌に次いで、毎年この疾患によって死亡する。これらの数の程度にもかかわらず、転移性の前立腺癌についての有効な処置はなお存在していない。外科手術による前立腺切除、放射線治療、ホルモン切除治療、および化学療法が、主な処置の形態でありつづけている。残念なことに、これらの処置は多くについては不十分であり、そしてしばしば、所望されない結果を付随する。
【０００６】
診断の最前線においては、初期段階の局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺の腫瘍マーカーが存在していないことが、この疾患の管理における有意な限界を残している。血清のＰＳＡアッセイが非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的な有用性は、いくつかの重要な局面を欠いていると広範に認識されている。
【０００７】
前立腺癌のさらなる特異的なマーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の種々の段階を要約し得る前立腺癌の異種移植片の作成によって改善されている。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中の生存した継代を有する前立腺癌の異種移植片であり、そしてアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行および転移性の病巣の発達を含む、疾患の進行を模倣する能力を示す（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。より最近同定された前立腺癌のマーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７２５２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１７３５）、およびＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５２３）が挙げられる。
【０００８】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ、およびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーが前立腺癌の診断および処置についての努力を促進したが、診断および治療をさらに改善するための、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的の同定が必要とされている。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＰＨＯＲ−１と呼ばれる、前立腺癌においてアップレギュレートされる、新規の前立腺特異的Ｇタンパク質結合レセプターに関する。ＰＨＯＲ−１の発現は、前立腺に大きく制限されており、そして前立腺の腫瘍において顕著にアップレギュレートされる。適合する正常な前立腺／進行した前立腺癌の患者に由来する腫瘍サンプル中でのＰＨＯＲ−１の発現は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方の検出方法を使用して、腫瘍組織中で高い程度にアップレギュレートされた発現を示し、このことは、ＰＨＯＲ−１が前立腺癌の検出のための有用なマーカーであることを示唆している。正常なサンプル／他のヒトの癌患者に由来する腫瘍サンプルの分析は、腎臓、子宮、頚部、胃、および直腸の癌などにおけるＰＨＯＲ−１の発現のアップレギュレーションを実証する。さらに、ＰＨＯＲ−１の発現は、コロニーの増殖を誘導し、そしてｃＡＭＰおよびチロシンのリン酸化を、腫瘍形成および形質転換における機能的な役割を示す様式で調節し、これによって癌の治療の有利な標的を提供する。
【００１０】
ＰＨＯＲ−１の構造は、３１７個のアミノ酸のタンパク質配列にまたがる７個の推定の膜貫通ドメインを含む。ＰＨＯＲ−１は、細胞表面で発現され、細胞膜の外部に発現されるＮ末端を有する。ＰＨＯＲ−１タンパク質は、嗅覚の上皮およびニューロン中で発現される嗅覚のレセプターの大きなファミリーと相同である。ＰＨＯＲ−１は、他のＧタンパク質結合レセプターと一致する機能的な活性を示し、このことは、ＰＨＯＲ−１が細胞の機能、増殖、および形質転換の調節において重要な役割を果たすことを示唆している。
【００１１】
前立腺癌および他のＰＨＯＲ−１を発現する癌の処置のための多数の可能性のあるアプローチが、本明細書中に記載される。このレセプターの細胞表面での方向性およびＧタンパク質結合の性質は、ＰＨＯＲ−１およびその機能を標的化する分子、ならびにＰＨＯＲ−１レセプターを通じて作用する他のタンパク質、因子、およびリガンドを標的化する分子を使用する多数の治療アプローチを示す。これらの治療アプローチとして、抗ＰＨＯＲ−１抗体を用いる抗体治療、低分子治療、およびワクチン治療が挙げられる。さらに、前立腺癌におけるそのアップレギュレートされた発現に注目すると、ＰＨＯＲ−１は、前立腺癌についての診断、病期の診断、および／または前立腺癌のマーカーとして有用であり、そして同様に、このレセプターを発現する他の癌についてのマーカーであり得る。
【００１２】
本発明は、ＰＨＯＲ−１遺伝子、ｍＲＮＡ、および／またはコード配列の全てまたは一部に対応するかまたはそれらに対して相補的であるポリヌクレオチド（好ましくは、以下を含む単離された形態：ＰＨＯＲ−１タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連する分子、ＰＨＯＲ−１遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列もしくはそれらの一部に対して相補的であるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＰＨＯＲ−１遺伝子、ｍＲＮＡに対して、もしくはＰＨＯＲ−１をコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）を提供する。ＰＨＯＲ−１をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段もまた、提供される。ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを含有している組換えのＤＮＡ分子、このような分子で形質転換されたかまたは形質導入された細胞、およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の発現のための宿主ベクター系もまた、提供される。
【００１３】
本発明はさらに、ＰＨＯＲ−１タンパク質およびそのポリペプチドフラグメント、ならびにＰＨＯＲ−１タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに対して結合する抗体を提供する。本発明の抗体として、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全なヒト抗体、検出可能なマーカーで標識された抗体、および放射性核種、毒素、または他の治療用組成物に対して結合させられた抗体が挙げられる。
【００１４】
本発明はさらに、種々の生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在を検出するための方法、ならびにＰＨＯＲ−１を発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明はさらに、種々の治療用組成物およびストラテジーを提供し、これは特に、前立腺、腎臓、頚部、子宮、直腸、および胃の癌を処置するための、抗体、ワクチン、および低分子治療を含む。
【００１５】
本発明はさらに、ＰＨＯＲ−１の生物学的活性を調節する分子を同定する方法を提供する。この方法は、分子をＰＨＯＲ−１を発現する細胞と接触させる工程、分子の存在下および非存在下でＰＨＯＲ−１の生物学的活性をアッセイする工程、ならびにＰＨＯＲ−１の生物学的活性が分子の存在によって変更されるかどうかを決定する工程を包含する。ＰＨＯＲ−１の生物学的活性における変更は、ＰＨＯＲ−１の生物学的活性を調節する分子の指標である。好ましくは、この方法においてアッセイされるＰＨＯＲ−１の生物学的活性は、チロシンのリン酸化、細胞質性のｃＡＭＰの蓄積、またはコロニーの増殖の刺激を含む。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＰＨＯＲ−１と呼ばれる、前立腺ガンにおいてアップレギュレートされる新規の前立腺特異的Ｇタンパク質結合レセプターを提供する。ＰＨＯＲ−１は、前立腺において独占的に発現されるようであり、そして前立腺の腫瘍において顕著にアップレギュレートされる。適合する正常な前立腺／進行した前立腺ガンの患者に由来する腫瘍サンプル中でのＰＨＯＲ−１の発現は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方の検出方法を使用して、腫瘍組織中で高い程度にアップレギュレートされた発現を示し、このことは、ＰＨＯＲ−１が前立腺ガンの検出のための有用なマーカーであることを示唆している。さらに、ＰＨＯＲ−１の発現は、コロニーの成長、チロシンのリン酸化、およびｃＡＭＰの調節を、腫瘍形成および形質転換における機能的な役割を示す様式で誘導し、これによってガンの治療の有利な標的を提供する。
【００１７】
ＰＨＯＲ−１タンパク質は、嗅覚の上皮およびニューロン中で発現される嗅覚のレセプターの多くのファミリーに対して相同である。このレセプターの細胞表面での方向性およびＧタンパク質結合の性質は、ＰＨＯＲ−１およびその機能を標的化する分子を使用する多数の治療アプローチを示す。これらの治療アプローチとして、抗ＰＨＯＲ−１抗体を用いる抗体治療、低分子治療、およびワクチン治療が挙げられる。さらに、前立腺ガンにおけるそのアップレギュレートされた発現に注目すると、ＰＨＯＲ−１は、前立腺ガンについての診断、病期の診断、および／または前立腺ガンの予後マーカーとして有用であり、そして同様に、このレセプターを発現する他のガンについてのマーカーとして役に立ち得る。
【００１８】
他に特に定義されていない限りは、本明細書中で使用される当該分野の全ての用語、記号、および他の科学的な専門用語は、本発明が関係している当業者によって一般的に理解されている意味を有するように意図される。いくつかの場合においては、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中で定義され、そして本明細書中でのこのような定義の包含は、当該分野で一般的に理解されている意味を超える実質的な差異を示すようには決して解釈されないはずである。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｎｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｅｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論）は、一般的に十分に理解されており、そして当業者によって従来の方法論を使用して一般的に使用される。適切である場合には、商業的に入手可能なキットおよび試薬の使用を含む手順が、一般的には、製造業者によって定義されるプロトコールおよび／またはそうでなければ他に記載されているパラメーターに従って行われる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合は、用語「進行した前立腺ガン」、「局所的に進行した前立腺ガン」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺の莢膜を通じて拡大した前立腺ガンを意味し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）システムのもとでのステージＣの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムのもとでのステージＣ１Ｃ２の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移（ｔｕｍｏｒ、ｎｏｄｅ、ｎｅｔａｓｔａｓｉｓ））システムのもとでのステージＴ３〜Ｔ４およびＮ＋の疾患を含むように意味される。一般的には、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した（器官に限定された）前立腺ガンを有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性またはしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定され得る。局所的に進行した前立腺ガンは、現在は、腫瘍が前立腺の莢膜に侵入または浸潤するか、外科的な縁に伸びるか、あるいは精子の小包に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合は、用語「転移性の前立腺ガン」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺ガンを意味し、そしてＡＵＡシステムのもとでのステージＤの疾患、およびＴＮＭシステムのもとでのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むように意味される。局所的に進行した前立腺ガンの症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン（アンドロゲンの切除）治療が、好ましい処置態様である。転移性の前立腺ガンを有している患者は、最終的には、処置の開始の１２〜１８ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症し、そしてこれらの患者のほぼ半分がその後６ヶ月以内に死亡する。前立腺ガンの転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺ガンの骨転移は、どちらかといえば、骨溶解よりもむしろ骨芽細胞について特徴的である（すなわち、正味の骨の形成を生じる）。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺ガンは、代表的には、開放性のまたは腹腔鏡による骨盤のリンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および／あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多形性の形態（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態）を意味し、そしてＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含むように意味される。
【００２２】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１０個のアミノ酸のポリマーを意味する。明細書を通じて、アミノ酸についての標準的な３文字または１文字の表記が、使用される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドの状況で使用される「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション）をいうように意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄のための温度は５５℃以上であり、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が最も好ましい。
【００２４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性させられたＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにし、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００２５】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得る：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、４２℃）；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有している０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄が続く。
【００２６】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９によって記載されているように同定され得、そして上記に記載されているハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントの条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの変性させられた剪断されたサケの精子のＤＮＡを含有している溶液中で３７℃での一晩のインキュベーション、続く１×ＳＳＣ中での約３７℃〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの因子に順応させることが必要とされる場合には、温度、イオン強度などを調節するための方法を認識する。
【００２７】
アミノ酸配列の比較の状況においては、用語「同一性」は、同一である同じ比較位置のアミノ酸残基の割合を表すように使用される。また、この状況においては、用語「相同性」は、当該分野で一般的に理解されているように、ＢＬＡＳＴ分析の保存的アミノ酸の基準を使用して、同一または類似のいずれかである、同じ比較位置でのアミノ酸残基の割合を表すように使用される。例えば、％同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって作成され得る。このような基準のもとで保存的であると考えられるアミノ酸の置換に関するさらなる詳細が、以下に提供される。
【００２８】
さらなる定義は、以下のサブセクションを通じて提供される。
【００２９】
（ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチド）
本発明の１つの局面は、ＰＨＯＲ−１遺伝子の全てまたは一部に対応するかまたはそれに対して相補的であるポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、および／またはコード配列（好ましくは、単離された形態）（ＰＨＯＲ−１タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ならびに関連する分子、ＰＨＯＲ−１遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはそれらの一部に対して相補的であるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＰＨＯＲ−１遺伝子、ｍＲＮＡに対して、またはＰＨＯＲ−１をコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（まとめて、「ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチド」と呼ばれる）を提供する。本明細書中で使用される場合は、ＰＨＯＲ−１遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で詳細に記載されるＰＨＯＲ−１遺伝子およびタンパク質、ならびに他のＰＨＯＲ−１タンパク質に対応する遺伝子およびタンパク質、ならびに上記の構造的に同様の変異体を含むように意味される。このような他のＰＨＯＲ−１タンパク質および変異体は、一般的には、ＰＨＯＲ−１コード配列に対して高度に相同であるコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性を共有している、および少なくとも約６０％のアミノ酸相同性（ＢＬＡＳＴ基準を使用する）を共有している、より好ましくは、７０％以上の相同性（ＢＬＡＳＴ基準を使用する）を共有している、コード配列を有する。
【００３０】
ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドの１つの実施形態は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示される配列を有しているＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドである。ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドは、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるヒトのＰＨＯＲ−１のヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドであって、ここでＴはまたＵでもあり得る、ポリヌクレオチド；ＰＨＯＲ−１タンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチド；上記の配列に相補的である配列；または上記の任意の配列のポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、ヌクレオチド残基番号１３３からヌクレオチド残基番号１０８３まで、またはヌクレオチド残基番号３８８からヌクレオチド残基番号１０６２までに示される配列を有しているポリヌクレオチドを含む。ここで、ＴはまたＵでもあり得る。別の実施形態は、ＰＨＯＲ−１ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。その配列は、登録番号ＰＴＡ−３１２として１９９９年７月２日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されたプラスミドｐ１０１Ｐ３Ａ１１中に含まれるｃＤＮＡによってコードされる。別の実施形態は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるヒトのＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡまたはそのポリヌクレオチドフラグメントに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書中で開示される本発明の典型的な実施形態は、タンパク質およびそのフラグメントをコードする配列のような、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡ配列の特異的な部分をコードするＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は以下を含む：図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸１から約アミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸２０から約アミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸３０から約アミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸４０から約アミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸５０から約アミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸６０から約アミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸７０から約アミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸８０から約アミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸９０から約アミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。この概要に従って、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質のアミノ酸１００〜３１７のアミノ酸配列の一部をコードするポリヌクレオチド（少なくとも１０個のアミノ酸）が、本発明の典型的な実施形態である。ＰＨＯＲ−１タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドもまた、意図される。例えば、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質の約アミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）から約アミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）までをコードするポリヌクレオチドが、当該分野で周知の種々の技術によって作製され得る。
【００３２】
本明細書中に開示される本発明のさらなる説明的な実施形態として、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列中に含まれる１つ以上の生物学的なモチーフをコードするＰＨＯＲ−１のポリヌクレオチドフラグメントが挙げられる。１つの実施形態においては、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、図２に示されるような、ＨＰＲＡＪ７０またはＲＡ１ｃに対して相同性を示す、ＰＨＯＲ−１の１つ以上の領域をコードし得る。本発明の別の実施形態においては、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上のＧＰＣＲ記号配列または嗅覚レセプター記号配列をコードし得る。本発明のなお別の実施形態においては、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上のＰＨＯＲ−１オルタナティブスプライシング変異体について特有である配列をコードし得る。本発明の別の実施形態においては、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の一部（例えば、ヌクレオチド残基番号３８８からヌクレオチド残基番号１０６２、ヌクレオチド残基番号１５９からヌクレオチド残基番号７３３、ヌクレオチド残基番号８５４からヌクレオチド残基番号３１３６、ヌクレオチド残基番号１３３からヌクレオチド残基番号１０８３）を含み得る。
【００３３】
上記の段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特異的な使用を有する。ＰＨＯＲ−１が前立腺および他のガンにおいて過剰発現されることが示されているので、これらのポリヌクレオチドは、正常な組織対ガン性の組織中でのＰＨＯＲ−１遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代表的には、ＰＨＯＲ−１タンパク質の特異的な領域をコードするポリヌクレオチドは、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物の特異的な領域（例えば、膜貫通ドメインを含有している領域）中の摂動（例えば、欠失、導入、点変異など）の存在を評価するために使用され得る。例示的なアッセイとして、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび一本鎖の立体構造多形性（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられる。これらの両方ともが、タンパク質中のこれらの領域を試験するために、特異的なタンパク質の領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。一本鎖のヌクレオチドの多形性を検出するために配列を分析するためのアッセイおよび方法もまた、利用可能である（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６（２）：２２３−２３６）。
【００３４】
本明細書中に開示される本発明の他の特異的に意図される実施形態は、モルホリノアンチセンス分子を含有している、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに別の骨格に基づくかもしくは別の塩基を含有している核酸分子である。これらは、天然の供給源に由来するかまたは合成されるかには関係しない。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡまたは他の分子であり得る。これらは、ホスホロチオエート誘導体のようなペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子を含み、塩基対依存性の様式でＤＮＡまたはＲＮＡに対して特異的に結合する。当業者は、ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドおよび本明細書中に開示されているポリヌクレオチド配列を使用して核酸分子のこれらのクラスを容易に得ることができる。
【００３５】
アンチセンス技術は、細胞内に配置された標的のポリヌクレオチドに結合する外因性のオリゴヌクレオチドの投与を必要とする。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドがそれらの細胞内標的（例えば、ＰＨＯＲ−１）に対して相補的であるという事実をいう。例えば、ＪａｃｋＣｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  １：１〜５（１９９８）を参照のこと。本発明のＰＨＯＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドヌクレオチドは、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体を含む。これは、増強されたガン細胞の増殖阻害作用を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電アナログであり、ここでは、リン酸基の非架橋酸素原子が、イオウ原子で置き換えられる。本発明のＳ−オリゴは、イオウ輸送試薬である、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキサイドでの対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）を参照のこと。その開示は本明細書中で参考として完全に引用されている。本発明のさらなるＰＨＯＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１６９−１７５を参照のこと）。
【００３６】
本発明のＰＨＯＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、最初の１００個のＮ末端のコドンまたは最後の１００個のＣ末端のコドンに対して相補的でありそしてそれに対して安定にハイブリダイズするか、あるいはＰＨＯＲ−１ゲノムまたは対応するｍＲＮＡのＡＴＧ開始部位と重複している、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に対して相補的であるオリゴヌクレオチドの使用は、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡに対する選択的なハイブリダイゼーションを可能にし、そしてプロテインキナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡに対してはそうではない。好ましくは、本発明のＰＨＯＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡに対してハイブリダイズする配列を有しているアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、ＰＨＯＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＨＯＲ−１の最初の１０個のＮ末端のコドンおよび最後の１０個のＣ末端のコドン中の領域に対して相補的である３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、ＰＨＯＲ−１の発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される。Ｌ．Ａ．Ｃｏｕｔｕｒｅ  ＆  Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５１０−５１５（１９９６）。
【００３７】
本発明のこの局面のさらに特異的な実施形態は、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特異的な部分の特異的な増幅を可能にするプライマーおよびプライマーの対、ならびに本発明の核酸分子またはその任意の部分に対して選択的または特異的にハイブリダイズするプローブを含む。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター、または酵素のような）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中のＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドの存在を検出するため、およびＰＨＯＲ−１タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用され得る。
【００３８】
このようなブローブの例として、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるヒトのＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を含有しているポリペプチドが挙げられる。ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーの対の例はまた、以下の実施例に記載される。当業者によって理解されるように、多数の種々のプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そしてＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡを増幅および／または検出するために有効に使用され得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドは、それが、ＰＨＯＲ−１遺伝子以外の遺伝子に対応するかもしくはそれら対して相補的である混入しているポリヌクレオチド、またはＰＨＯＲ−１遺伝子産物もしくはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入しているポリヌクレオチドから、実質的に分離されている場合に、「単離されている」といわれる。当業者は、単離されたＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを得るための核酸の単離手順を容易に使用し得る。
【００４０】
本発明のＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない種々の目的のために有用である：ＰＨＯＲ−１遺伝子（単数または複数）、ｍＲＮＡ（単数または複数）、もしくはそれらのフラグメントの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしてのそれらの使用；前立腺ガンおよび他のガンの診断および／または予後のための試薬としてのそれらの使用；特に前立腺細胞中へのカルシウムの侵入を阻害する分子を同定するためのツールとしてのそれらの使用；ＰＨＯＲ−１ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としてのそれらの使用；ＰＨＯＲ−１遺伝子（単数または複数）の発現および／またはＰＨＯＲ−１の転写物（単数または複数）の翻訳を調節または阻害するためのツールとしてのそれらの使用；ならびに治療薬としてのそれらの使用。
【００４１】
（ＰＨＯＲ−１の分子的特徴および生物学的特徴）
以下の実施例においてさらに記載されるように、ＰＨＯＲ−１遺伝子およびタンパク質は、種々の方法で特徴付けられている。例えば、ヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列の分析が、ＰＨＯＲ−１配列中の保存された構造エレメント、トポロジーの特徴、翻訳後修飾、および関連する可能性のある分子を同定するために行われた。ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、およびＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの発現のノーザンブロット分析が、種々のＰＨＯＲ−１メッセージを発現している正常な組織およびガン性の組織の範囲を確立するために行われた。実験によってトランスフェクトされた細胞のＰＨＯＲ−１タンパク質の発現のウェスタンブロットおよび蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析が、細胞表面局在化を決定するために行われた。ＰＨＯＲ−１は、８．７のｐＩおよび３５．２ｋＤの計算された分子量を有する。
【００４２】
ＰＨＯＲ−１は、進行した前立腺腫瘍および局在化した前立腺の腫瘍において高レベルで発現される、前立腺特異的Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）である。ＰＨＯＲ−１タンパク質の配列は、７個の可能な膜貫通ドメインを明らかにし、そして嗅覚に関係しているＧＰＣＲに対して相同性を有する（Ｒａｍｉｎｇら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：３５３；Ｍａｌｎｉｃら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９６：７１３）。脳内で発現される、Ｒａ１ｃとして公知であるラットの嗅覚レセプター（Ｒａｍｉｎｇら、１９９８、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ６：１４１）は、ＰＨＯＲ−１に対して最も高い程度の相同性を有する配列を有する。ＰＨＯＲ−１は、２９９残基の重複においてＲＡｃ１に対して５９．９％同一である。おそらくＲＡ１ｃのヒトのホモログであるＨＰＲＡＪ７０もまた、ＰＨＯＲ−１に対して同様の程度の相同性を示す（２９８の残基の重複にわたってＨＰＲＡＪ７０に対して５９．４％の同一性）。ＨＰＲＡＪ７０タンパク質は、前立腺特異的ＧＰＣＲであることが報告されている（米国特許第５７５６３０９号、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９６／３９４３５号）。ＰＨＯＲ−１、ＨＰＲＡＪ７０、およびＲＡ１ｃのアミノ酸配列のアラインメントが図１Ｂに提供される。
【００４３】
脳の嗅覚レセプターとのＰＨＯＲ−１の相同性によって、嗅覚レセプター−１の前立腺ホモログ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＰＨＯＲ−１））という命名が導かれた。このレセプターファミリーのメンバーであるタンパク質は、細胞外アミノ末端、３個のさらなる細胞外ループ、３個の細胞内ループ、および細胞内カルボキシル末端を示す。ＰＨＯＲ−１の第２の細胞外領域は、残基９０で可能性のあるＮグリコシル化部位（ＮＳＴＴ）を示し、このことは、このタンパク質がグリコシル化され得ることを示唆している。ＧＰＣＲは、ポリペプチドホルモンまたは低分子によって刺激される７回膜貫通レセプターである。それらのシグナルは、三量体のグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を通じて、エフェクター酵素またはイオンチャンネルに伝達される（Ｓｉｍｏｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８０２）。
【００４４】
最近、ＧＰＣＲはまた、チロシンキナーゼの有糸分裂促進シグナル伝達経路に関連することも、示されている（Ｌｕｔｔｒｅｌｌら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６５５；Ｌｕｔｔｒｅｌｌら、１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７）。ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）によって媒介されるリン酸化によって調節される。ＧＰＣＲキナーゼ自体は、ＧＰＣＲによって間接的に活性化される（Ｐｉｔｃｈｅｒら、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６５３）。嗅覚のＧＰＣＲは、それらのシグナルを、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成することによってアデニル酸シクラーゼおよびホスホリパーゼＣ経路を通じてｃＭＰ経路を活性化することによって、伝達する（Ｂｒｅｅｒ、１９９３、Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １７９：９７；Ｂｒｕｃｈ，１９９６、Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１３：４５１）。ｃＡＭＰの生成は、プロテインキナーゼＡの活性化を導く。ＩＰ３は細胞内カルシウムの増大を生じ、一方ＤＡＧはプロテインキナーゼＣを活性化する。
【００４５】
以下の実施例においてより詳細に議論されるように、ＰＨＯＲ−１は、ＰＨＯＲ−１を発現するようにベクターでトランスフェクトされた細胞の挙動によって示されるように、ＧＰＣＲの機能的な特徴を示す。ＰＨＯＲ−１の発現は、５５ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化および１３０ｋＤａタンパク質の脱リン酸化を誘導し、そしてマイトジェン活性化プロテインキナーゼであるＥｒｋのリン酸化をもまた誘導する。ＰＨＯＲ−１の発現は、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞によるウシ胎児血清（ＦＢＳ）に応答した、ｃＡＭＰの蓄積によって示されるように、細胞質性のｃＡＭＰ濃度を調節する。さらに、ＰＨＯＲ−１の発現は、軟寒天中でのコロニーの増殖を刺激する。
【００４６】
ＰＨＯＲ−１の発現は、本質的には、正常な成体のヒトの組織において前立腺特異的であり（図５〜７）、正常な卵巣においてはＲＴ−ＰＣＴによって検出可能な非常に低いレベルの発現を有し、そして心臓組織においてはＲＮＡのドットブロットによって検出可能な非常に低いレベルの発現を有する。前立腺ガンにおいては、ＰＨＯＲ−１は、ＳＣＩＤマウス中で継代された腫瘍異種移植片中、そして進行した前立腺ガンの患者から生検された腫瘍サンプルで発現される（図５〜７）。進行した前立腺ガンの患者、ならびに腎臓、子宮、子宮頸部、胃、および直腸のガンを有する患者から採取した、腫瘍組織対隣接している正常組織の対応する組におけるＰＨＯＲ−１の発現の比較は、大部分の患者において非常に高レベルの過剰発現を示し（図８〜１０）、このことは、腫瘍組織中での高いレベルのアップレギュレーションを示す。
【００４７】
（ＰＨＯＲ−１をコードする核酸分子の単離）
本明細書中に記載されているＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡ配列は、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物（単数または複数）をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにＰＨＯＲ−１遺伝子産物のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物の選択的スプライシングされたイソ型、対立遺伝子改変体、および変異形態の単離を可能にする。ＰＨＯＲ−１遺伝子をコードする全長のｃＤＮＡを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，９９５）。例えば、λファージクローニング方法論が、商業的に利用可能なクローニング系（例えば、λＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して便利に使用され得る。ＰＨＯＲ−１遺伝子のｃＤＮＡを含有しているファージクローンが、標識されたＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントでプローブすることによって同定され得る。例えば、１つの実施形態においては、ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡ（図１Ａ〜Ｄ；配列番号１）またはその一部が合成され得、そしてＰＨＯＲ−１遺伝子と重複しかつそれに対応する全長のｃＤＮＡを回収するためのプローブとして使用され得る。ＰＨＯＲ−１遺伝子自体が、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌の人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母の人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、ＰＨＯＲ−１  ＤＮＡプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって単離され得る。
【００４８】
（組換えＤＮＡ分子および宿主ベクター系）
本発明はまた、ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを含有している組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）、ならびにそのような組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子で形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合は、組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、インビトロで分子操作に供されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。このような分子を作製するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと）。
【００４９】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中に、ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを含有している組換えＤＮＡ分子を含有している、宿主ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例として、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスに感染可能な細胞（例えば、Ｓｆ９細胞））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例として、種々の前立腺ガン細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５、ＬＡＰＣ−４、ＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺ガン細胞株）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多数の哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、ＰＨＯＲ−１のコード配列を含有しているポリヌクレオチドが、日常的に使用されそして当該分野で広範に公知の任意の多数の宿主ベクター系を使用して、ＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントを作製するために使用され得る。
【００５０】
ＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な宿主ベクター系が、利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（前出）を参照のこと。哺乳動物での発現に好ましいベクターとして以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｅｎｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）。これらの発現ベクターを使用して、ＰＨＯＲ−１は好ましくは、いくつかの前立腺ガンおよび非前立腺細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、３Ｔ３、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、およびＴｓｕＰｒ１を含む）中で発現され得る。本発明の宿主ベクター系は、ＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントの産生に有用である。このような宿主ベクター系は、ＰＨＯＲ−１およびＰＨＯＲ−１変異の機能的な特性を研究するために使用され得る。
【００５１】
ＰＨＯＲ−１遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそのフラグメントは、以下を含むがこれらに限定されない、種々の用途を有する：抗体を生成すること、ならびにＰＨＯＲ−１遺伝子産物に結合するリガンドおよび他の試薬および細胞構成成分を同定するための方法における使用。ＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断アッセイおよび予想アッセイ、画像化方法論（特に、ガンの画像化を含む）、およびＰＨＯＲ−１タンパク質の発現によって特徴付けられるヒトのガン（前立腺ガンを含むがこれに限定されない）の管理における治療方法において有用であり得る。ＰＨＯＲ−１タンパク質の検出に有用な種々の免疫学的アッセイが、意図される。これは、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学的方法などを含むが、これらに限定されない。このような抗体は標識され得、そして前立腺細胞を検出し得る免疫学的な画像化試薬として使用され得る（例えば、放射性シンチグラフィー画像化方法において）。ＰＨＯＲ−１タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、ガンのワクチンを作製することにおいても特に有用であり得る。
【００５２】
（ＰＨＯＲ−１タンパク質）
本発明の別の局面は、ＰＨＯＲ−１タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のＰＨＯＲ−１タンパク質は、本明細書中で特に同定されるもの、ならびに、以下に概説される方法に従って過度の実験を行うことなく単離／生成されそして特徴付けられ得る程度の、対立遺伝子改変体、保存的置換改変体、およびホモログを含む。種々のＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントの一部を組合せた融合タンパク質、ならびにＰＨＯＲ−１タンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質もまた、含まれる。このようなＰＨＯＲ−１タンパク質は、まとめて、ＰＨＯＲ−１タンパク質、本発明のタンパク質、またはＰＨＯＲ−１と呼ばれる。本明細書中で使用される場合は、用語「ＰＨＯＲ−１ポリペプチド」は、少なくとも１０アミノ酸の、好ましくは少なくとも１５アミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたはＰＨＯＲ−１タンパク質をいう。
【００５３】
ＰＨＯＲ−１タンパク質の特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｄに示されるヒトのＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列（配列番号２）（その中に示されているアミノ酸残基番号１からおよそアミノ酸残基番号３１７まで）を有しているポリペプチドを含む。ＰＨＯＲ−１タンパク質の別の特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｄに示されるヒトのＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列（配列番号２）（その中に示されているおよそアミノ酸残基番号８６からおよそアミノ酸残基番号３１０まで）を有しているポリペプチドを含む。ＰＨＯＲ−１フラグメントの特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１のタンパク質配列のアミノ酸１〜１４（ＭＶＤＰＮＧＮＥＳＳＡＴＹＦ；配列番号８）、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１のタンパク質配列のアミノ酸２６２〜２７４（ＶＨＲＦＳＫＲＲＤＳＰＬＰ；配列番号９）、およびＰＨＯＲ−１の細胞外部分（配列番号２のアミノ酸１〜２８、８６〜９９、１５９〜２０２、および２６２〜２７２）を含む群より選択されるペプチドを含む。他の特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に同定される膜貫通ドメインの一方または両方を含む。
【００５４】
一般的には、天然に存在しているヒトのＰＨＯＲ−１の対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的な同一性および相同性を共有する（例えば、９０％以上の同一性）。代表的には、ＰＨＯＲ−１タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるＰＨＯＲ−１配列中に保存的なアミノ酸置換を含むか、またはＰＨＯＲ−１ホモログ中の対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。ＰＨＯＲ−１対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定のＰＨＯＲ−１アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、その配列からの極端な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮挿入、またはフレームシフト）をさらに含む、タンパク質である。
【００５５】
保存的なアミノ酸の置換は、しばしば、そのタンパク質の立体構造または機能のいずれをも変更することなく、タンパク質中で行われ得る。このような変化は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）の任意のものによりこれらの疎水性アミノ酸の他の任意のものを置換すること；グルタミン酸（Ｅ）に代えてのアスパラギン酸（Ｄ）での置換およびその逆；アスパラギン（Ｎ）に代えてのグルタミン（Ｑ）での置換およびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）に代えてのセリン（Ｓ）での置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えられ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）がそうであり得るように、しばしば、互換可能であり得る。メチオニン（Ｍ）（これは、比較的疎水性である）は、頻繁にロイシンおよびイソロイシンと互換可能であり得、そしてしばしばバリンと互換可能であり得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）はしばしば、アミノ酸残基の重要な特性がその変化でありそしてこれらの２つのアミノ酸残基の異なるｐＫ’が重要ではない位置において、互換可能である。なお他の変化が、特定の環境下では「保存的である」と考えられ得る。
【００５６】
ＰＨＯＲ−１タンパク質（改変体を含む）は、図１Ａ〜Ｄのアミノ酸配列（配列番号２）を有しているＰＨＯＲ−１タンパク質と共通している少なくとも１つのエピトープを含む。その結果、ＰＨＯＲ−１タンパク質または改変体に対して特異的に結合する抗体もまた、図１Ａ〜Ｄのアミノ酸配列（配列番号２）を有しているＨＰＯＲ−１タンパク質に対して特異的に結合する。１つのクラスのＰＨＯＲ−１タンパク質改変体は、図１Ａ〜Ｄのアミノ酸配列（配列番号２）と９０％以上の同一性を共有する。ＰＨＯＲ−１タンパク質改変体のより特定のクラスは、図４に同定されるような細胞外ドメインを含む。好ましいＰＨＯＲ−１タンパク質改変体は、本明細書中に記載されるＧＰＣＲ機能の１つ以上を示し得る。これは例えば、細胞質性のｃＡＭＰ濃度、およびチロシンのリン酸化を調節する能力、ならびにコロニーの増殖を刺激する能力を含む。
【００５７】
ＰＨＯＲ−１タンパク質は、多くの形態（好ましくは、単離された形態）で具体化され得る。本明細書中で使用される場合は、タンパク質は、物理的、機械的、または化学的方法が、通常はそのタンパク質と会合している細胞構成成分からＰＨＯＲ−１タンパク質を取り出すために使用される場合に、「単離される」といわれる。当業者は、単離されたＰＨＯＲ−１タンパク質を得るための標準的な精製方法を容易に使用し得る。精製されたＰＨＯＲ−１タンパク質分子は、抗体または他のリガンドに対するＰＨＯＲ−１の結合を損なう他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される使用に依存する。ＰＨＯＲ−１タンパク質の実施形態は、精製されたＰＨＯＲ−１タンパク質および機能的であり可溶性であるＰＨＯＲ−１タンパク質を含む。１つの形態においては、このような機能的であり可溶性であるＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドに結合する能力を保持している。
【００５８】
本発明はまた、ＰＨＯＲ−１アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含有しているＰＨＯＲ−１ポリペプチド（例えば、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列（配列番号２）の一部に対応するポリペプチド）を提供する。本発明のこのようなポリペプチドは、ＰＨＯＲ−１タンパク質の特性（例えば、ＰＨＯＲ−１タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の生成を誘発する能力）を示す。
【００５９】
本明細書中に開示される本発明の実施形態として、アミノ酸の挿入、欠失、および置換を有しているポリペプチドのような、広範な種々の当該分野で受容されるＰＨＯＲ−１の改変体を含む。ＰＨＯＲ−１改変体は、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発のような、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６））または他の公知の技術が、ＰＨＯＲ−１改変体ＤＮＡを産生するためにクローン化されたＤＮＡに対して行われ得る。スキャニングアミノ酸分析もまた、連続している配列にそって１つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。中でも、好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミン酸として、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的には、この群の中で好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素の後の側鎖を排除し、そして改変体の主鎖の立体構造を変更する可能性が少ないからである。アラニンはまた、典型的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、アラニンは、埋没した部位および露出した部位の両方において頻繁に見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６））。アラニン置換が十分な量の改変体を生じない場合には、等配電子のアミノ酸が使用され得る。
【００６０】
上記に議論されるように、請求される発明の実施形態として、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）の３１７個未満のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施例として、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１からおよそアミノ酸１０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸２０からおよそアミノ酸３０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ酸４０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸４０からおよそアミノ酸５０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸５０からおよそアミノ酸６０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄ）に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸６０からおよそアミノ酸７０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸７０からおよそアミノ酸８０からなるポリペプチド、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸８０からおよそアミノ酸９０からなるポリペプチド、および図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸９０からおよそアミノ酸１００からなるポリペプチドなどが挙げられる。この概要に従って、ＰＨＯＲ−１タンパク質のアミノ酸１００〜３１７のアミノ酸配列の一部をからなるポリペプチドが、本発明の典型的な実施形態である。ＰＨＯＲ−１タンパク質のより大きな部分をからなるポリペプチドもまた、意図される。例えば、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１タンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）からおよそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）からなるポリペプチドが、当該分野で周知の種々の技術によって作製され得る。
【００６１】
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態として、図１Ａ〜Ｄに示されるＰＨＯＲ−１ポリペプチド配列（配列番号２）中に含まれる生物学的なモチーフの１つ以上のアミノ酸残基を含有しているをＰＨＯＲ−１ポリペプチドが挙げられる。１つの実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＨＰＲＡＪ７０および／またはＲＡ１ｃに対して相同性を示す、ＰＨＯＲ−１の領域の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＰＨＯＲ−１  Ｎ−グリコシル化部位（例えば、ＮＥＳＳ（配列番号１０）（残基７〜１０（配列番号２に示される最初のアミノ酸残基からの番号））、ＮＬＴＩ（配列番号１１）（残基４４から４７）および／またはＮＳＴＴ（残基９０〜９３）（配列番号１２）の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＲＲＤＳ（残基２６８から２７１）（配列番号１３）のような、ＰＨＯＲ−１  ｃＡＭＰのリン酸化部位の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＫＲ（残基２６６から２６８）のような、ＰＨＯＲ−１プロテインキナーゼＣリン酸化部位の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＰＨＯＲ−１カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、ＳＬＨＥ（残基５６から５９）（配列番号１４）、ＳＧＩＤ（残基６９から７２）（配列番号１５）、および／またはＳＧＭＥ（残基１１０から１１３）（配列番号１６））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化部位（例えば、ＧＮＥＳＳＡ（残基６〜１１）（配列番号１７）、ＧＬＥＥＡＱ（残基２１〜２６）（配列番号１８）、ＧＭＥＳＴＶ（残基１１１〜１１６）（配列番号１９）、および／またはＧＴＣＶＳＨ（残基２４０から２４５（配列番号２０））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＧＰＣＲ記号配列（例えば、配列番号２のアミノ酸残基１１２〜１２８）の１つ以上および／または嗅覚レセプター記号配列（例えば、配列番号２のアミノ酸残基６１〜８２および／または２３９から２５４）の１つ以上を含み得る。これらの発明の関連する実施形態は、上記に議論される種々のモチーフの組合せを含有しているポリペプチドを含み、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフ内または介在している配列内のいずれかに挿入、欠失、または置換を含まない。
【００６２】
ＰＨＯＲ−１ポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒトのＰＨＯＲ−１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、標準的なペプチド合成技術を使用して、または当該分野で周知の化学的な切断方法を使用して、生成され得る。あるいは、組換え方法が、ＰＨＯＲ−１タンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を作製するために使用され得る。これに関して、本明細書中に記載されるＰＨＯＲ−１をコードする核酸分子は、ＰＨＯＲ−１タンパク質の定義されるフラグメントを作製するための手段を提供する。ＰＨＯＲ−１ポリペプチドは、ドメイン特異的抗体（例えば、ＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）を作製しそして特徴付けることにおいて、ＰＨＯＲ−１またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞性因子を同定することにおいて、そしてガンのワクチンを含むがこれに限定されない種々の治療の状況において、特に有用である。特に興味深い構造を含有しているＰＨＯＲ−１ポリペプチドが推定され得、そして／または以下を含む当該分野で周知の種々の分析技術：例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ、もしくはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を使用して、または免疫原性に基づいて、同定され得る。このような構造を含有しているフラグメントは、サブユニット特異的抗ＰＨＯＲ−１抗体を作製すること、またはＰＨＯＲ−１に結合する細胞性因子を同定することにおいて、特に有用である。
【００６３】
以下の実施例に記載されている特定の実施形態においては、ＰＨＯＲ−１の分泌された形態は、Ｃ末端の６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを有しているＰＨＯＲ−１をコードするＣＭＶによって駆動される発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中で簡便に発現され得る。培養培地中に分泌されたＨＩＳタグ化ＰＨＯＲ−１は、ニッケルカラムおよび標準的な技術を使用して精製され得る。あるいは、ＡＰタグ系が使用され得る。ＰＨＯＲ−１の発現のための種々の構築物が、以下の実施例に記載される。
【００６４】
共有結合改変のようなＰＨＯＲ−１の改変が、本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の１つの型として、ＰＨＯＲ−１の選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応し得る有機誘導試薬との、ＰＨＯＲ−１ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内に含まれるＰＨＯＲ−１ポリペプチドの共有結合改変の別の型は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変更することを含む。「天然のグリコシル化パターンを変更すること」は、天然の配列のＰＨＯＲ−１中に見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させること（根本的なグリコシル化部位を除去することか、または化学的および／もしくは酵素的な手段によってグリコシル化を欠失させることのいずれかによる）、ならびに／あるいは、天然の配列のＰＨＯＲ−１中には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味するように、本明細書中の目的のために意図される。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および特性を変化させることを含む、天然のタンパク質のグリコシル化における定性的な変化を含む。ＰＨＯＲ−１の共有結合改変の別の型は、種々の非タンパク質性のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つに対して、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号；同第４，３１０，１４４号、同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載される様式で、ＰＨＯＲ−１ポリペプチドを連結することを含む。
【００６５】
本発明のＰＨＯＲ−１はまた、別の、異種のポリペプチドまたはアミノ酸の配列に対して融合されたＰＨＯＲ−１を含む、キメラ分子を形成するように改変され得る。１つの実施形態においては、このようなキメラ分子は、ポリヒスチジンエピトープタグとのＰＨＯＲ−１の融合体を含む。これは、固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。エピトープタグは、一般的には、ＰＨＯＲ−１のアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。別の実施形態においては、キメラ分子は、イムノグロブリンまたはイムノグロブリンの特定の領域との、ＰＨＯＲ−１の融合体を含み得る。２価の形態のキメラ分子（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも呼ばれる）については、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ＰＨＯＲ−１ポリペプチドの可溶性の（膜貫通ドメインを欠失させられたかまたは不活化された）形態の置換を含む。特に好ましい実施形態においては、イムノグロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子の、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日に発行された、米国特許第５，４２８，１３０号をもまた参照のこと。
【００６６】
（ＰＨＯＲ−１抗体）
本発明の別の局面は、ＰＨＯＲ−１タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、ＰＨＯＲ−１タンパク質に対して選択的に結合し、そして非ＰＨＯＲ−１タンパク質およびポリペプチドに対しては結合しない（または弱く結合する）。特に意図される抗ＰＨＯＲ−１抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つ以上の相補性決定領域を含有しているフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合は、抗体フラグメントは、その標的（すなわち、抗原結合領域）に対して結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。
【００６７】
いくつかの適用については、特定のＰＨＯＲ−１タンパク質および／または特定の構造ドメイン中のエピトープと特異的に反応する抗体を作製することが所望され得る。例えば、ガンの治療および診断用の画像化の目的に有用である好ましい抗体は、ガン細胞中で発現されるＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞外領域中のエピトープと反応する抗体である。このような抗体は、本明細書中に記載されているＰＨＯＲ−１タンパク質を使用して作製され得るか、または免疫原としてその推定される細胞外ドメインに由来するペプチドを使用して作製され得る。これに関して、図１に示されるＰＨＯＲ−１タンパク質配列を参照して、膜貫通ドメインに対してアミノ末端の配列の領域が選択され得、そして細胞外特異的ＰＨＯＲ−１抗体を惹起および選択するための適切な免疫原およびスクリーニング試薬を設計するために使用され得る。
【００６８】
本発明のＰＨＯＲ−１抗体は、特に、前立腺ガンの治療ストラテジー、診断および予後アッセイ、ならびに画像化方法論において有用であり得る。同様に、このような抗体は、他のガンの処置、診断、および／または予後において、ＰＨＯＲ−１がまた他の型のガンにおいて発現されるかまたは過剰発現される範囲で、有用であり得る。本発明は、ＰＨＯＲ−１、ならびに変異体ＰＨＯＲ−１タンパク質およびポリペプチドの検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、一般的には、ＰＨＯＲ−１または変異体ＰＨＯＲ−１タンパク質を認識し得そして結合し得る１つ以上のＰＨＯＲ−１抗体を含み、そして適切である場合には、以下を含むがこれらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイの形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）など。さらに、以下を含むがこれらに限定されない、前立腺ガンを検出し得る免疫学的な画像化方法が本発明によって提供される：標識されたＰＨＯＲ−１抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化方法。このようなアッセイは、前立腺ガン（特に、進行した前立腺ガン）の検出、モニタリング、および予後において臨床的に使用され得る。
【００６９】
ＰＨＯＲ−１抗体はまた、ＰＨＯＲ−１および変異体ＰＨＯＲ−１タンパク質およびポリペプチドを精製するため、ならびにＰＨＯＲ−１ホモログおよび関連する分子を単離するための方法においても使用され得る。例えば、１つの実施形態においては、ＰＨＯＲ−１タンパク質を精製する方法は、固体のマトリックスに対して結合されているＰＨＯＲ−１抗体を、ＰＨＯＲ−１を含有している溶解物または他の溶液とともに、ＰＨＯＲ−１抗体がＰＨＯＲ−１に結合することが可能である条件下でインキュベートする工程；固体のマトリックスを不純物を排除するために洗浄する工程；および結合した抗体からＰＨＯＲ−１を溶出させる工程を包含する。本発明のＰＨＯＲ−１抗体の他の用途として、ＰＨＯＲ−１タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
【００７０】
ＰＨＯＲ−１抗体はまた、例えば、ＰＨＯＲ−１タンパク質の生物学的活性を調節もしくは阻害すること、またはＰＨＯＲ−１タンパク質を発現するガン細胞を標的化しそして崩壊させることによって、治療的にも使用され得る。前立腺ガンおよび他のガンの抗体治療は、以下の別のセクションにより詳細に記載される。
【００７１】
抗体の調製のための種々の方法は、当該分野で周知である。例えば、抗体は、ＰＨＯＲ−１タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを、単離された形態または免疫結合させられた形態で使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫化することによって調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９））。タンパク質免疫原の例として、組換えのＰＨＯＲ−１（バキュロウイルス系、哺乳動物系などにおいて発現される）、ＰＨＯＲ−１細胞外ドメイン、ＡＰ−タグ化ＰＨＯＲ−１などが挙げられる。さらに、ＰＨＯＲ−１の融合タンパク質（例えば、ＰＨＯＲ−１の、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯ、またはＭｙｃＨｉｓとの融合体（下記の実施例を参照のこと））もまた、使用され得る。
【００７２】
特定の実施形態においては、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）のアミノ酸配列のオープンリーディングフレームの全てまたはほとんどを含有しているＧＳＴ融合タンパク質が産生され得、そして適切な抗体を作製するための免疫原として使用され得る。ＰＨＯＲ−１を発現するかまたは過剰発現する細胞もまた、免疫化のために使用され得る。同様に、ＰＨＯＲ−１を発現するように操作された任意の細胞が、使用され得る。このようなストラテジーは、増強させられた内因性のＰＨＯＲ−１を認識する能力を有するモノクローナル抗体の産生を生じ得る。別の有用な免疫原は、ヒツジの赤血球の原形質膜に連結されたＰＨＯＲ−１ペプチドを含む。
【００７３】
図１Ａ〜Ｄ（図２）に示されるＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列は、抗体を作製するためのＰＨＯＲ−１タンパク質の特異的な領域を選択するために使用され得る。例えば、ＰＨＯＲ−１アミノ酸配列の疎水性および親水性分析が、ＰＨＯＲ−１構造中の親水性領域を同定するために使用され得る。免疫原性の構造を示すＰＨＯＲ−１タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインが、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ、またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を使用して容易に同定され得る。ＨＬＡ−Ａ２に結合すると推定されるＰＨＯＲ−１のペプチドが、抗体の生成のために選択され得る。以下の実施例で議論されるように、免疫原性は、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列（配列番号２）のアミノ酸１〜１４（ＭＶＤＰＮＧＮＥＳＳＡＴＹＦ；配列番号８）、アミノ酸２６２〜２７４（ＶＨＲＦＳＫＲＲＤＳＰＬＰ；配列番号９）およびアミノ酸８６〜３１０を用いて、実証されている。これらは、それぞれ、ウサギおよびマウスを使用してポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するために使用された。このＢ細胞の応答（抗体の産生）は、ＰＨＯＲ−１の免疫原性部分によって誘発される最初のＴ細胞応答の結果である。
【００７４】
免疫原としての使用のため、およびＢＳＡ、ＫＬＨ、または他のキャリアタンパク質のようなキャリアを有するタンパク質の免疫原性結合体を調製するために、タンパク質またはポリペプチドを調製するための方法が、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体が、使用され得る；他の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬによって供給されるような架橋剤が有効であり得る。ＰＨＯＲ−１免疫原の投与は、一般的には、適切な期間にわたる注射によって、そして一般的に当該分野で理解されている適切なアジュバントの使用を伴って行われる。免疫化スケジュールの間に、抗体の力価が、抗体の形成の適切性を決定するために行われ得る。
【００７５】
ＰＨＯＲ−１モノクローナル抗体が好ましく、そして当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望されるモノクローナル抗体を分泌する不死化された細胞株が、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または一般的に公知であるＢ細胞を産生するように不死化する改変を使用して、調製され得る。所望された抗体を分泌する不死化された細胞株は、抗原がＰＨＯＲ−１タンパク質またはＰＨＯＲ−１フラグメントであるイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望される抗体を分泌する適切な不死化された細胞培養物が同定された場合には、細胞は増殖させられ得、そしてインビトロの培養物からまたは腹水液からのいずれかで抗体が産生され得る。
【００７６】
抗体またはフラグメントはまた、組換え手段による現在の技術を使用しても産生され得る。ＰＨＯＲ−１タンパク質の所望される領域に対して特異的に結合する領域もまた、複数の種起源のキメラまたはＣＤＲ接木（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況において産生され得る。ヒト化またはヒトＰＨＯＲ−１抗体もまた産生され得、そして治療の状況における使用に好ましい。１つ以上のヒト以外の抗体のＣＤＲを対応する非ヒト抗体の配列で置きかえることによるマウスおよび他のヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６をもまた参照のこと。完全なヒトのモノクローナル抗体を産生するための方法として、ファージディスプレイおよびトランスジェニック動物技術が挙げられる（概要については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５−５３９を参照のこと）。
【００７７】
完全なヒトのＰＨＯＲ−１モノクローナル抗体は、大きなヒトＩｇ遺伝子組合せライブラリーを使用するクローニング技術（すなわち、ファージディスプレイ）を使用して作製され得る（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｒｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５〜６４頁（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｉｄ、６５〜８２頁）。完全なヒトのＰＨＯＲ−１モノクローナル抗体もまた、以下に記載されているように、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る：１９９７年１２月３日に公開された、ＰＣＴ特許出願番号第ＷＯ９８／２４８９３号、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４をもまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術を用いて必要とされるインビトロでの操作を回避し、そして高い親和性の確実なヒト抗体を効率よく産生する。
【００７８】
ＰＨＯＲ−１抗体のＰＨＯＲ−１タンパク質との反応性は、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含む多数の周知の手段によって、適切である場合には、ＰＨＯＲ−１タンパク質、ペプチド、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞またはその抽出物を使用して、確立され得る。
【００７９】
本発明のＰＨＯＲ−１抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第２の分子（例えば、細胞毒素または他の治療薬）に対して結合させられ得、そしてＰＨＯＲ−１ポジティブ細胞に対して第２の分子を標的化するために使用され得る（Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ、ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ら編、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２６２４−２６３６）。細胞毒性の試薬の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリヒマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅ）。適切な検出マーカーとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位元素、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤、または酵素。抗体はまた、プロドラッグをその活性な形態に転換し得る、抗ガンプロドラッグ活性化酵素に結合させられ得る。例えば、米国特許第４，９７５，２８７号を参照のこと。
【００８０】
さらに、２つ以上のＰＨＯＲ−１エピトープについての特異的な二重特異的抗体が、当該分野で一般的に公知の方法を使用して作製され得る。さらに、抗体エフェクター機能が、ガン細胞に対するＰＨＯＲ−１抗体の治療効果を増強するために改変され得る。例えば、システイン残基が、Ｆｃ領域中に操作され得、それによって鎖間ジスルフィド結合の形成およびホモ二量体の生成を可能にし、これはインターナライゼーション、ＡＤＣＣ、および／または補体によって媒介される細胞の殺傷のための能力を増強させ得る（例えば、Ｃａｒｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５；Ｓｈｏｐｅｓ，１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと）。ホモ二量体抗体はまた、当該分野で公知の架橋技術によって作製され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５を参照のこと）。
【００８１】
（ＰＨＯＲ−１トランスジェニック動物）
ＰＨＯＲ−１またはその改変された形態をコードする核酸もまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」のいずれか動物を作製するために使用され得る。次いでこれは、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、トランスジーンを含む細胞を有している動物である。トランスジーンは、動物または動物の祖先に、出産前（例えば、胚の段階）に導入された。トランスジーンは、それからトランスジェニック動物が生じる細胞のゲノム中に組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態においては、ＰＨＯＲ−１をコードするｃＤＮＡは、ＰＨＯＲ−１をコードするＤＮＡを発現する細胞を含有しているトランスジェニック動物を作製するために使用される確立された技術およびゲノム配列に従って、ＰＨＯＲ−１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。
【００８２】
トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で一般的であり、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを伴うＰＨＯＲ−１トランスジーンの取り込みのために標的化される。胚の段階で動物の生殖系に導入されたＰＨＯＲ−１をコードするトランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物は、ＰＨＯＲ−１をコードするＤＮＡの増大させられた発現の効果を試験するために使用され得る。このような動物は、保護形態（例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態）を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面に従うと、動物は試薬で処置され、そして、トランスジーンを保有している未処置の動物と比較して病理学的状態の減少した指標が、病理学的状態についての可能性のある治療的な介入を示す。
【００８３】
あるいは、ＰＨＯＲ−１の非ヒトホモログが、ＰＨＯＲ−１「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る。これは、ＰＨＯＲ−１をコードする内因性の遺伝子と、動物の胚性の細胞中に導入された変更されたＰＨＯＲ−１をコードするゲノムＤＮＡとの間での相同組換えの結果としての、欠損しているかまたは変更されたＰＨＯＲ−１をコードする遺伝子を有する。例えば、ＰＨＯＲ−１をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従ってＰＨＲＯ−１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ＰＨＯＲ−１をコードするゲノムＤＮＡの一部が、欠失させられ得るか、または、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子のような別の遺伝子と置き換えられ得る。
【００８４】
代表的には、変更されていない隣接しているＤＮＡ（５’および３’末端の両方）の数キロ塩基がベクター中に含まれる（相同組換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。ベクターは、胚性の幹細胞株中に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、１９９２、Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞中に注入されて、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７、１１３〜１５２頁を参照のこと）。
【００８５】
次いで、キメラ胚が、適切な擬似妊娠させた雌性の里親動物中に移植され得、そして胚は「ノックアウト」動物を作製するための期間が与えられ得る。それらの生殖細胞中に相同組み返されたＤＮＡを保有している子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして動物の全ての細胞が相同組み返されたＤＮＡを含む動物を繁殖させるために使用される。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御するそれらの能力、およびＰＨＯＲ−１ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態のそれらの発症について、特徴付けられ得る。
【００８６】
（ＰＨＯＲ−１の検出のための方法）
本発明の別の局面は、ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドおよびＰＨＯＲ−１タンパク質およびそれらの変異体を検出するための方法、ならびにＰＨＯＲ−１を発現する細胞を同定するための方法に関する。高度に組織に限定されたＰＨＯＲ−１の発現パターンは、この分子が、転移性の疾患についての診断マーカーとして作用し得ることを示唆する。この状況においては、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物の状態は、進行した段階の疾患についての罹患性、進行速度、および／または腫瘍の積極性を含む種々の因子を推定するために有用な情報を提供し得る。以下に詳細に議論されるように、患者のサンプル中のＰＨＯＲ−１遺伝子産物の状態は、免疫組織化学的分析、種々のノーザンブロッティング技術（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小解剖サンプル）、ウェスタンブロット分析、および組織アレイ分析を含む、当該分野で周知の種々のプロトコールによって分析され得る。
【００８７】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、前立腺組織、腎臓組織、子宮組織、頚部の標本、胃組織、直腸組織、骨組織、リンパ系組織、および他の組織、尿、精液、血液、または血清、細胞調製物など）中のＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能なＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドとして、例えば、ＰＨＯＲ−１遺伝子またはそのフラグメント、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡ、オルタナティブスプライシング変異体ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡ、およびＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを含有している組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられる。ＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを増幅するため、および／またはＰＨＯＲ−１の存在を検出するための多数の方法が当該分野で周知であり、そして本発明のこの局面の実施において使用され得る。
【００８８】
１つの実施形態においては、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを産生すること；その中のＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡを増幅するためのセンスおよびアンチセンスプライマーとしてＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを使用してそのように産生されたｃＤＮＡを増幅すること；ならびに増幅されたＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。必要に応じて、増幅されたＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡの配列が決定され得る。別の実施形態においては、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１遺伝子を検出する方法は、最初に、サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること；その中のＰＨＯＲ−１遺伝子を増幅するためのセンスおよびアンチセンスプライマーとしてＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドを使用して単離されたゲノムを増幅すること；ならびに増幅されたＰＨＯＲ−１遺伝子の存在を検出することを含む。多数の適切なセンスおよびアンチセンスプローブの組合せが、ＰＨＯＲ−１（図１Ａ〜Ｄ、配列番号１）について提供されるヌクレオチド配列から設計され得、そしてこの目的のために使用され得る。
【００８９】
本発明はまた、他の生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺、および他の組織、尿、細胞調製物など）の組織中のＰＨＯＲ−１タンパク質の存在を検出するためのアッセイ、ならびにＰＨＯＲ−１を発現する細胞の検出のための細胞学的アッセイを提供する。ＰＨＯＲ−１タンパク質を検出するための方法もまた周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学的分析、ウェスタンブロット分析、分子および細胞結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、１つの実施形態においては、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１タンパク質の存在を検出する方法は、最初に、サンプルをＰＨＯＲ−１抗体、そのＰＨＯＲ−１反応性フラグメント、またはＰＨＯＲ−１抗体の抗原結合領域を含有している組換えタンパク質と接触させる工程；次いで、それに対するサンプル中のＰＨＯＲ−１タンパク質の結合を検出する工程を包含する。
【００９０】
ＰＨＯＲ−１を発現する細胞を同定するための方法もまた、提供される。１つの実施形態においては、ＰＨＯＲ−１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中のＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの存在を検出することを含む。細胞中の特定のｍＲＮＡの検出のための方法は周知であり、そして例えば、相補的なＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識されたＰＨＯＲ−１リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、および関連する技術）ならびに種々の核酸増幅アッセイ（例えば、ＰＨＯＲ−１について特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型の検出方法（例えば、分岐したＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど））が挙げられる。あるいは、ＰＨＯＲ−１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中のまたは細胞によって分泌されるＰＨＯＲ−１タンパク質の存在を検出することを含む。タンパク質の検出のための種々の方法が当該分野で周知であり、そしてＰＨＯＲ−１タンパク質およびＰＨＯＲ−１を発現する細胞の検出のために使用され得る。
【００９１】
ＰＨＯＲ−１の発現分析もまた、ＰＨＯＲ−１遺伝子の発現を調節する試薬を同定および評価するためのツールとして有用であり得る。例えば、ＰＨＯＲ−１の発現は、正常な前立腺、ならびに前立腺、腎臓、子宮、頚部、胃、および直腸のガンに限定され、そしてＰＨＯＲ−１はまた、他のガンにおいても発現され得る。ガン細胞中でのＰＨＯＲ−１の発現または過剰発現を阻害し得る分子または生物学的な試薬の同定は、治療的な価値があり得る。このような試薬は、ＲＴ−ＰＣＴ、核酸のハイブリダイゼーション、または抗体結合によってＰＨＯＲ−１の発現を定量するスクリーニングを使用することによって同定され得る。
【００９２】
（ＰＨＯＲ−１およびその産物の状態のモニタリング）
個体中のＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成の可能性についての情報を提供し得る。例えば、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡが、前立腺、腎臓、子宮、頚部、胃、および直腸のガンにおいてこのように高度に発現されるが、ほとんどの正常な細胞中ではそうではないので、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質の相対的なレベルを評価するアッセイが、ＰＨＯＲ−１の脱調節に関連する疾患（例えば、ガン）を診断するために使用され得、そして適切な治療の選択を定義することにおいて有用な予後の情報を提供し得る。同様に、生物学的サンプル中でのＰＨＯＲ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価するアッセイもまた、この状況において使用され得る。
【００９３】
ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡが、前立腺ガンにおいてこのように高度に発現され、そしてほとんどの正常な組織においてはそうではないという知見は、この遺伝子が脱調節された細胞の増殖に関連し、そして従って、当業者がＰＨＯＲ−１の脱調節に関連する疾患を有していると疑われる個体に由来する生物学的サンプルを評価するために使用し得る標的としてこの遺伝子およびその産物を同定する証拠を提供する。別の例においては、ＰＨＯＲ−１の発現が通常は前立腺に限定されているので、当業者はまた、転移の指標としてＰＨＯＲ−１の発現を検出するために、他の組織から採取した生物学的サンプルを評価し得る。この状況においては、ＰＨＯＲ−１遺伝子およびその産物の発現の状態の評価は、組織サンプルの疾患の可能性についての情報を得るために使用され得る。この状況における用語「発現の状態」は、遺伝子およびその産物の発現、機能、および調節（例えば、ｍＲＮＡの発現のレベル）、発現される遺伝子産物の完全性（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）、ならびにこれらの分子に対する転写および翻訳の改変に関係している種々の因子を広範にいうように使用される。
【００９４】
ＰＨＯＲ−１の発現の状態は、特定の疾患の段階、進行、および／または腫瘍の積極性についての罹患性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、ＰＨＯＲ−１の発現の状態を決定するため、ならびにＰＨＯＲ−１を発現するガン（例えば、前立腺ガン、乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、骨のガン、結腸ガン、膵臓ガン、精巣ガン、頚ガン、および卵巣ガンのようなガン）を診断するための、方法およびアッセイを提供する。患者のサンプル中のＰＨＯＲ−１の発現の状態は、多数の当該分野で周知の手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルについてのＲＴ−ＰＣＲ分析、臨床的なサンプルおよび細胞株についてのウェスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析を含むが、これらに限定されない）によって分析され得る。ＰＨＯＲ−１遺伝子および遺伝子産物の発現の状態を評価するための代表的なプロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｓ  ２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）、および１８（ＰＣＲ分析）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５に見出され得る。
【００９５】
１つの局面においては、本発明は、脱調節された細胞の増殖に関連する疾患（例えば、過形成またはガン）を有していると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＰＨＯＲ−１遺伝子産物の状態を決定すること、次いで、対応する正常なサンプル中のＰＨＯＲ−１遺伝子産物の状態に対して、そのように決定された状態を比較することによる、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して試験サンプル中の異常なＰＨＯＲ−遺伝子産物の存在は、個体の細胞内での脱調製された細胞の増殖の存在の指標を提供する。
【００９６】
別の局面においては、本発明は、個体におけるガンの存在を決定することにおいて有用であるアッセイを提供する。これは、対応する正常な細胞または組織中での発現レベルと比較して、試験細胞または組織サンプル中でのＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増大を検出することを含む。ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの存在は、例えば、結腸、肺、前立腺、膵臓、膀胱、乳房、卵巣、頚部、精巣、頭部、および首、脳、胃、骨などを含むがこれらに限定されない組織サンプル中で評価され得る。任意のこれらの組織における有意なＰＨＯＲ−１の発現の存在は、これらのガンの出現、存在、および／または重篤度、あるいは別の組織に起源するガンの転移を示すために有用であり得る。なぜなら、対応する正常な組織はＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡを発現しないか、またはそれをより低いレベルで発現するからである。
【００９７】
関連する実施形態においては、ＰＨＯＲ−１の発現の状態は、核酸のレベルよりもむしろタンパク質のレベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＰＨＯＲ−１タンパク質のレベルを決定すること、および対応する正常なサンプル中で発現されるＰＨＯＲ−１のレベルに対してこのように決定されたレベルを比較することを含む。１つの実施形態においては、ＰＨＯＲ−１タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学的方法を使用して評価される。ＰＨＯＲ−１抗体またはＰＨＯＲ−１タンパク質の発現を検出し得る結合パートナーは、この目的のための当該分野で周知の種々のアッセイ形式において使用され得る。
【００９８】
他の関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動が、増殖の脱調節された表現型に関連している多数のタンパク質において観察されるので、有用である（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９））。この状況においては、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物の核酸またはアミノ酸配列の大きさおよび構造が、本明細書中で議論される、ノーザン、サザン、ウェスタン、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定プロトコールによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動を観察するための他の方法（例えば、一本鎖の立体構造多形性分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９５２，１７０号を参照のこと）。
【００９９】
別の実施態様においては、当業者は、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１遺伝子のメチル化の状態を試験し得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧ島の異常な脱メチル化および／過剰なメチル化は、しばしば、不死化された細胞および形質転換された細胞において生じ、そして種々の遺伝子の変更された発現を生じ得る。例えば、ｐｉ−クラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるが、９０％より多くの前立腺のガン腫においては発現されないタンパク質）は、この遺伝子の転写を永続的にサイレントにさせるようであり、そして最も頻繁には前立腺のガン腫におけるゲノムの変更が検出される（Ｄｅ  Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９））。さらに、この変更は、高いグレードの前立腺の表皮内新生物（ＰＩＮ）の少なくとも７０％の症例において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．、１９９８、７：５３１−５３６）。
【０１００】
別の例においては、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺ガンの２５〜５０％において発現される）の発現が、リンパ芽球細胞においてデオキシアザシチジンによって誘導され、このことは、腫瘍の発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（６）：９０３−９０８）。この状況においては、遺伝子のメチル化の状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、当業者は、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、ＣｐＧ島の全体的なメチル化の状態を評価するために、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を利用し得る。
【０１０１】
さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧ島中に存在するＣｐＧ部位の全てのメチル化の状態を迅速にプロフィール化し得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これは、メチル化されていない全てのシトシンをウラシルに転換する）によるＤＮＡの最初の改変、続くメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡについて特異的なプライマーを使用する増幅を含む。メチル化の干渉を含むプロトコールもまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｓ  １２、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５に見出され得る。
【０１０２】
別の関連する実施態様においては、本発明は、個体中でのガンの存在を決定することにおいて有用なアッセイを提供する。これは、対応する正常な細胞または組織中での発現のレベルと比較して、試験細胞または組織サンプル中で発現されるＰＨＯＲ−１の選択的スプライシング改変体における有意な変化を検出することを含む。ＰＨＯＲ−１の選択的スプライシング改変体をモニタリングすることは有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシングにおける変化は、ガンの進行へと導く一連の事象における工程の１つとして示唆されるからである（例えば、Ｃａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５（２５０：３０５９〜３０６５（１９９７）を参照のこと）。
【０１０３】
遺伝子の増幅は、ＰＨＯＲ−１の状態を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子の増幅は、例えば、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーション（本明細書中に提供される配列に基づいて適切に標識されたプローブを使用する）によって直接、サンプル中で測定され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識し得る抗体が、使用され得る。抗体は、次いで、標識され得、そして二重鎖が表面に結合させられるアッセイが行われ得、その結果、表面上での二重鎖の形成に際して、この二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
【０１０４】
上記に議論される組織に加えて、末梢血が、前立腺ガンを含むがこれに限定されないガン細胞の存在について、ＰＨＯＲ−１の発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲを使用して簡便にアッセイされ得る。ＲＴ−ＰＣＴで増幅可能なＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの存在は、ガンの存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、現在は、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用のために評価されている。前立腺ガンの分野においては、これらは、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。ＲＴ−ＰＣＴアッセイが、当該分野で周知である。
【０１０５】
本発明の関連する局面は、個体におけるガン発症に対する罹患性を推定することに関する。１つの実施態様においてはガンに対する罹患性を推定するための方法は、組織サンプル中のＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質を検出することを含み、その存在はガンに対する罹患性を示す。ここでは、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの発現の存在の程度は、罹患性の程度に比例的する。特定の実施態様においては、前立腺組織中でのＰＨＯＲ−１の存在が試験され、サンプル中のＰＨＯＲ−１の存在は、前立腺ガンの罹患性（または前立腺腫瘍の発生または存在）の指標を提供する。密接に関連する実施態様においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を同定するために、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、サンプル中のＰＨＯＲ−１遺伝子産物中の１つ以上の摂動の存在は、ガンの罹患性の指標（または腫瘍の発生もしくは存在）を提供する。
【０１０６】
本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍の攻撃性を測定するための方法に関する。１つの実施態様においては、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞によって発現されるＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質のレベルを決定すること、同じ個体から採取された対応する正常な組織または正常な組織の参照サンプル中で発現されたＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質のレベルに対して、そのように決定されたレベルを比較することを含む。ここでは、正常なサンプルに対して比較した、腫瘍サンプル中でのＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質の発現の程度は、攻撃性の程度を示す。特定の実施態様においては、前立腺腫瘍の攻撃性は、ＰＨＯＲ−１が腫瘍細胞中で発現される程度を決定することによって評価される。より高い発現レベルは、より攻撃性のある腫瘍であることを示す。密接に関連する実施態様においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、１つ以上の摂動の存在は、より攻撃性の高い腫瘍を示す。
【０１０７】
本発明のなお別の関連する局面は、経時的に個体中の悪性腫瘍の進行を観察するための方法に関する。１つの実施態様においては、経時的に個体中の悪性腫瘍の進行を観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞によって発現されるＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質のレベルを決定すること、同じ個体から種々の時点で採取された等価な組織サンプル中で発現されるＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質のレベルに対して、そのように決定されたレベルを比較することを含む。ここでは、経時的な腫瘍サンプル中のＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰＨＯＲ−１タンパク質の発現の程度は、ガンの進行についての情報を提供する。特定の実施態様においては、ガンの進行は、腫瘍細胞中のＰＨＯＲ−１の発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、より高い発現レベルは、ガンの進行を示す。密接に関連する実施態様においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中のＰＨＯＲ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、１つ以上の摂動の存在は、ガンの進行を示す。
【０１０８】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後および診断プロトコールの任意の１つと組合せられ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施態様は、ＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の発現（またはＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の摂動）と、組織サンプルの状態を診断および予後する手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況においては、悪性腫瘍に関連する広範な種々の因子（例えば、悪性腫瘍に関連する別の遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＭの発現を含む））、ならびに全体的な細胞学的観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｔｓｅｉｎ，１９９５、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５、Ｆｅｂ；２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８−２４を参照のこと）が利用され得る。ＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の発現（またはＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物中の摂動）と、悪性腫瘍に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法は、例えば、一致する特定の因子のセットまたは集まりの存在が、組織サンプルの状態を診断および予後するための基準の情報を提供するので、有用である。
【０１０９】
代表的な実施態様においては、ＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の発現（またはＰＨＯＲ−１遺伝子およびＰＨＯＲ−１遺伝子産物の摂動）と、悪性腫瘍に関連する因子との間での一致を観察するための方法は、組織サンプル中のＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出すること、ならびにＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡまたはタンパク質と、ＰＳＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現との間での一致を観察することを伴う。特定の実施態様においては、前立腺組織中でのＰＨＯＲ−１およびＰＳＡのｍＲＮＡの発現が試験される。好ましい実施態様においては、サンプル中のＰＨＯＲ−１とＰＳＡのｍＲＮＡの過剰発現の一致は、前立腺ガンの指標、前立腺ガンの罹患性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在を提供する。
【０１１０】
ＰＨＯＲ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が本明細書中に記載され、そして当該分野で周知の標準的な核酸およびタンパク質の検出および定量技術を使用する。ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法として、標識されたＰＨＯＲ−１リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、およびＰＨＯＲ−１ポリヌクレオチドプローブを使用する関連技術、ＰＨＯＲ−１について特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、および他の増幅型の検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施態様においては、以下の実施例に記載されるように、半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの発現を検出しそして定量するために使用され得る。ＰＨＯＲ−１を増幅し得るかなり多数のプライマーが、この目的のために試用され得、これには、本明細書中で詳細に記載される種々のプライマーのセットが挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施態様においては、野生型のＰＨＯＲ−１タンパク質と特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
【０１１１】
（ＰＨＯＲ−１と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示されるＰＨＯＲ−１タンパク質配列は、当業者が、ＰＨＯＲ−１と相互作用するタンパク質、低分子、および他の試薬、ならびに種々の当該分野で受容されているプロトコールの任意の１つを通じてＰＨＯＲ−１によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、当業者は、種々のいわゆる相互作用捕捉システム（「ツーハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）の１つを利用し得る。このようなシステムにおいては、相互作用する分子が、転写因子を再構成し、レポーター遺伝子の発現を指向し、次いでその発現がアッセイされる。代表的なシステムは、真核生物の転写活性化因子の再構成を通じてインビボでのタンパク質−タンパク質の相互作用を同定し、そしてこれは、例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５２３号、同第５，８４６，７２２号、および同第６，００４，７４６号に開示されている。
【０１１２】
あるいは、当業者は、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列と相互作用する分子を、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定し得る。このような方法においては、ＰＨＯＲ−１のような選択されたレセプター分子に結合するペプチドが、アミノ酸のランダムなまたは制御されたコレクションをコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。ライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。従って、広範な種々の用途を有しているペプチド（例えば、治療薬または診断薬）が、期待されるリガンドまたはレセプター分子の構造についてのいかなる以前の情報をも用いることなく、同定され得る。ＰＨＯＲ−１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７３３，７３１号に開示されている。ＧＰＣＲと相互作用するかまたはその機能を変更する分子を同定するための例示的なアッセイが、Ｍｏｏｎら、１９９９、ＰＮＡＳ  ９６（２５）：１４６０５−１４６１０；Ｂｒｅｅｒら、１９９８、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５５：１７５−１８１；およびＳｉｎｎｅｔｔ−Ｓｍｉｔｈら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（３９）：３０６４４−３０６５２に記載されている。
【０１１３】
あるいは、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞株が、ＰＨＯＲ−１によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用され得る。この可能性は、他の研究者によって示されているように、免疫沈降技術を使用して試験され得る（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９、２６１：６４６−５１）。代表的には、ＰＨＯＲ−１タンパク質は、抗ＰＨＯＲ−１抗体を使用して、ＰＨＯＲ−１を発現する前立腺ガン細胞株から免疫沈降させられ得る。あるいは、Ｈｉｓ−タグに対する抗体が、ＰＨＯＲ−１を発現するように操作された細胞株中で使用され得る（上記のベクター）。免疫沈降させられた複合体は、ウェスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質の微小配列決定、銀染色、および二次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の会合について試験され得る。
【０１１４】
ＰＨＯＲ−１と相互作用する低分子は、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施態様を通じて同定され得る。例えば、リン酸化および脱リン酸化、二次メッセンジャーのシグナル伝達、および腫瘍形成を媒介するＰＨＯＲ−１の能力を妨害する分子を含む、ＧＰＣＲの機能を妨害する低分子が同定され得る。代表的な方法は、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号に議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示的な実施態様においては、次いで、ハイブリッドのリガンドが、第１および第２の発現ベクターを含む細胞中に順に導入される。それぞれの発現ベクターは、転写モジュールのコード配列に連結された標的のタンパク質をコードする、ハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。細胞はさらに、レポーター遺伝子を含む。その発現は、互いに第１および第２のハイブリッドタンパク質の近位に条件付けられる。発現は、ハイブリッドのリガンドが両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合にのみ、生じる事象である。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が同定される。
【０１１５】
本発明の代表的な実施態様は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１アミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法から構成される。この方法は、分子の集団をＰＨＯＲ−１アミノ酸配列と接触させる工程、相互作用を容易にする条件下で分子の集団がＰＨＯＲ−１アミノ酸配列と相互作用することを可能にする工程、ＰＨＯＲ−１アミノ酸配列と相互作用した分子の存在を決定する工程、次いでＰＨＯＲ−１アミノ酸配列とは相互作用していない分子を、ＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列と相互作用した分子から分離する工程を包含する。特定の実施態様においては、この方法はさらに、ＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施態様においては、ＰＨＯＲ−１アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触させられる。
【０１１６】
（治療方法および組成物）
前立腺ガンタンパク質としてのＰＨＯＲ−１の同定は、前立腺ガンの処置のための多数の治療アプローチへの道を開く。上記に議論されているように、ＰＨＯＲ−１はＧ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）であり、そしてその発現は、コロニーの増殖を誘導し、そしてｃＡＭＰおよびチロシンのリン酸化を調節する。さらに、ＰＨＯＲ−１は、治療のために標的化され得る細胞表面のエピトープを示す。
【０１１７】
ＰＨＯＲ−１の発現プロフィールは、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡの面影を有し、これらは、黒色腫および他のガンにおいてアップレギュレートされる組織特異的遺伝子である（Ｖａｎ  ｄｅｎ  ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２７：８１−８６、１９９７）。それらのガンにおける組織特異的発現および高い発現レベルに起因して、これらの分子は、ガンのワクチンのための標的として現在研究されている（Ｄｕｒｒａｎｔ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ８：７２７−７３３、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：９２７−９７６、１９９７）。ＰＨＯＲ−１の発現パターンは、それが同様に前立腺ガンについてのガンのワクチンアプローチのための理想的な標的であるという証拠を提供する。なぜなら、その発現は、ほとんどの正常な組織中では検出されないからである。ＧＰＣＲとしてのその構造的な特徴もまた、ＰＨＯＲ−１が低分子の標的、ならびに抗体に基づく治療ストラテジーのための標的であり得るという証拠を提供する。治療ストラテジーは、分子のＧＰＣＲ機能を阻害するか、またはＰＨＯＲ−１分子自体を標的化するように設計され得る。
【０１１８】
従って、ＰＨＯＲ−１の細胞外部分を標的化するか、またはＰＨＯＲ−１タンパク質の活性を阻害することを目的とする治療アプローチが、前立腺ガンおよびＰＨＯＲ−１を発現する他のガンを罹患している患者について有用であると予想される。ＰＨＯＲ−１タンパク質の活性を阻害することを目的とする治療アプローチは、一般的に２つのクラスに分けられる。１つのクラスは、ＰＨＯＲ−１タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、ＰＨＯＲ−１遺伝子の転写またはＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
【０１１９】
（抗体に基づく治療の細胞表面の標的としてのＰＨＯＲ−１）
ＰＨＯＲ−１の細胞表面での発現は、この分子が抗体に基づく治療ストラテジーについての魅力的な標的であることを示す。ＰＨＯＲ−１がガン細胞上で発現され、そしてほとんどの正常な細胞上では発現されないので、ＰＨＯＲ−１免疫反応性組成物の全身的な投与は、標的ではない器官および組織への免疫治療分子の結合によって引き起こされる毒性、非特異性、および／または非標的効果を伴わずに、良好な感受性を示すことが予想される。ＰＨＯＲ−１の細胞外ドメインと特異的に反応する抗体は、毒素もしくは治療薬との結合体として、または細胞の増殖もしくは機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、ＰＨＯＲ−１を発現するガンを全身的に処置するために有用であり得る。
【０１２０】
ＰＨＯＲ−１抗体は、抗体がガン細胞上のＰＨＯＲ−１に結合し、そして細胞および腫瘍の崩壊を媒介し、そして／または細胞もしくは腫瘍の増殖を阻害するように、患者中に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体によって媒介される細胞の溶解、抗体依存性の細胞性の細胞傷害性、ＰＨＯＲ−１の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞の分化を調節すること、腫瘍の血管形成因子のプロフィールを変更すること、ならびに／またはアポトーシスを誘導することによることを含み得る。ＰＨＯＲ−１抗体は、毒性の試薬または治療薬に結合させられ得、そしてＰＨＯＲ−１を保有している腫瘍細胞に対して直接毒性の試薬または治療薬を送達するために使用され得る。毒性の試薬の例として、カリヒマイシン（ｃａｌｃｈｅｍｉｃｉｎ）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、イットリウム、ビスマス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
抗ＰＨＯＲ−１抗体を使用するガンの免疫治療は、以下を含むがこれらに限定されない他の型のガンの処置において良好に使用されている種々のアプローチから生成される教示に従い得る：結腸ガン（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４３７−２４４４）、胃ガン（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１−５８９）、結腸直腸ガン（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１６０−６１６６）；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４３９８−４４０３）、および乳ガン（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素に対する裸の抗体の結合化（例えば、抗ＣＤ２０抗体に対する１３１Ｉの結合化（例えば、Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が挙げられるが、一方、他のアプローチは、抗体および他の治療薬の同時の投与（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ＴＭ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））を含む。前立腺ガンの処置については、例えば、ＰＨＯＲ−１抗体は、照射、化学療法、またはホルモンの除去と組合せて、投与され得る。
【０１２２】
ＰＨＯＲ−１抗体治療は、全てのステージのガンについて有用であり得るが、抗体治療は、進行したかまたは転移性のガンにおいて特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いる処置は、以前に１回以上の化学療法を受けた患者について示され得、一方、本発明の抗体治療と化学療法または照射のレジメンとの組合せが、化学療法による処置を受けていない患者について好ましくあり得る。さらに、抗体治療は、付随する化学療法の減少した投与量の使用を可能にし得、特に、化学療法薬の毒性に寛容ではない患者について、非常に良好である。
【０１２３】
いくつかのガン患者については、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的な評価、定量的なＰＨＯＲ−１の画像化、またはＰＨＯＲ−１の発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、ＰＨＯＲ−１の発現の存在およびその発現のレベルを評価することが所望され得る。腫瘍の生検または外科的な標本の免疫組織化学的な分析が、この目的のために好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【０１２４】
前立腺および他のガンを処置することにおいて有用である抗ＰＨＯＲ−１モノクローナル抗体として、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得るもの、および直接細胞傷害性であり得るものが挙げられる。これに関して、抗−ＰＨＯＲ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体によって媒介される細胞の細胞傷害性または抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の機能（これらの両方ともが、エフェクター細胞のＦｃレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、イムノグロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする）のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗ＰＨＯＲ−１  ｍＡｂが、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性のｍＡｂが作用し得る可能性のある機構として、細胞の増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗−ＰＨＯＲ−１  ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体によって媒介される細胞の溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロでのアッセイを使用して、当該分野で一般的に公知であるように評価され得る。
【０１２５】
マウスもしくは他の非ヒトモノクローナル抗体、またはヒト／マウスのキメラｍＡｂの使用は、いくつかの患者において、中程度〜強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの例においては、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効率を生じる。最も重篤な例においては、このような免疫応答は、腎不全を生じ得る可能性のある免疫複合体の多量の形成を導き得る、従って、本発明の治療方法の実施において使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトまたはヒト化されたもののいずれかであり、そして高い親和性で標的のＰＨＯＲ−１抗原に対して特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは抗原性を示さないものである。
【０１２６】
本発明の治療方法は、単一の抗ＰＨＯＲ−１  ｍＡｂの、ならびに種々のｍＡｂの組合せまたは混合物の投与を意図する。このようなｍＡｂの混合物は、それらが種々のエピトープを標的化し、種々のエフェクター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能に依存するｍＡｂと細胞傷害性のｍＡｂとを直接結合するｍＡｂを含む限りにおいて、特定の利点を有し得る。組合せ中のこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗ＰＨＯＲ−１  ｍＡｂの投与は、以下を含むがこれらに限定されない他の治療薬と組合せられ得る：種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）。抗ＰＨＯＲ−１  ｍＡｂは、それらの「裸の」形態または結合していない形態で投与され得るか、あるいはそれらに対して結合体化した治療薬を有し得る。
【０１２７】
抗ＰＨＯＲ−１抗体処方物は、腫瘍部位へ抗体を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的には、静脈内注射（ＩＶ）（代表的には、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量）のような受容可能な投与経路を通じる、抗ＰＨＯＲ−１抗体調製物の繰り返しの投与を含む。１週間あたりで１０〜５００ｍｇの範囲のｍＡｂの用量が、有効であり得、そして十分に寛容化され得る。
【０１２８】
転移性の乳ガンの処置におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｍＡｂでの臨床試験に基づいて、約４ｍｇ／ｋｇ患者体重のＩＶの最初の負荷用量、続く約２ｍｇ／ｋｇＩＶの抗ＰＨＯＲ−１  ｍＡｂ調製物の毎週の用量が、受容可能な用量レジメンを示し得る。好ましくは、最初の負荷用量は、９０分以上の注入として投与される。期間維持用量は、最初の用量が十分に寛容化される場合は、３０分以上の注入として投与され得る。しかし、当業者によって理解されるように、種々の因子が、特定の症例における理想的な投与レジメンに影響を与える。このような因子として、例えば、結合親和性および使用されるＡｂまたはｍＡｂの半減期、患者におけるＰＨＯＲ−１の発現の程度、循環している破棄された（ｓｈｅｄ）ＰＨＯＲ−１抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組合せて使用される化学療法剤の影響が挙げられ得る。
【０１２９】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために、血清中の循環している破棄されたＰＨＯＲ−１抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され得、そして他のパラメーター（例えば、前立腺ガン治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて良好である計測治療に有用であり得る。
【０１３０】
（ＰＨＯＲ−１タンパク質機能の阻害）
本発明は、ＰＨＯＲ−１のその結合パートナーまたはリガンドに対する結合を阻害する種々の方法および組成物、またはＰＨＯＲ−１機能を阻害するための他のタンパク質（単数または複数）および方法とのその組合せを含む。ＰＨＯＲ−１のＮ末端を標的化する分子（例えば、以下の実施例に記載される抗体）は、それらがおそらく、ＰＨＯＲ−１上のリガンド結合部位を標的化するので、タンパク質機能を阻害するために特に魅力的である。
【０１３１】
（組換えタンパク質でのＰＨＯＲ−１の阻害）
１つのアプローチにおいては、ＰＨＯＲ−１に結合し得、それによってＰＨＯＲ−１がその結合パートナー（単数または複数）に対して会合／結合すること、または他のタンパク質（単数または複数）と会合することを妨げ得る、組換え分子が、ＰＨＯＲ−１機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、ＰＨＯＲ−１特異的抗体分子の反応性の部分（単数または複数）を含み得る。特定の実施態様においては、ＰＨＯＲ−１結合パートナーのＰＨＯＲ−１結合ドメインが、ヒトのＩｇＧ（例えば、ヒトのＩｇＧ１）のＦｃ部分に対して連結された２つのＰＨＯＲ−１リガンド結合ドメインを含有している二量体の融合タンパク質中に操作され得る。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体の融合タンパク質は、可溶性の形態で、ＰＨＯＲ−１の発現に関連しているガン（前立腺、乳房、膀胱、肺、骨、結腸、膵臓、精巣、頚、および卵巣のガンを含むがこれらに限定されない）を罹患している患者に対して投与され得る。ここでは、二量体の融合タンパク質はＰＨＯＲ−１に特異的に結合し、それによって結合パートナーとのＰＨＯＲ−１の相互作用をブロックする。このような二量体の融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して多量体のタンパク質へと結合させられ得る。
【０１３２】
（細胞内抗体を用いるＰＨＯＲ−１の阻害）
別のアプローチにおいては、ＰＨＯＲ−１に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、遺伝子導入技術を通じてＰＨＯＲ−１を発現する細胞中に導入され得る。ここでは、コードされる単鎖の抗ＰＨＯＲ−１抗体は、細胞内で発現され、ＰＨＯＲ−１タンパク質に結合し、そしてそれによってその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体はまた、「イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」としても公知であり、細胞内の特定の部分に対して特異的に標的化され得、それによって処置の阻害活性が集められる場所にわたって制御を提供する。この技術は、当該分野で良好に適用されている（概要については、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻）。イントラボディーは、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７−３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１−２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：３３２−３３７を参照のこと。
【０１３３】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドによって連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体が、軽鎖の定常領域に対して連結された単鎖の可変領域フラグメントとして発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、所望される細胞内部分に対して発現されたイントラボディーを正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えのポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に対して標的化されたイントラボディーは、リーダーペプチドを、そして必要に応じて、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフのようなＣ末端のＥＲ保持シグナルを取り込むように操作され得る。核内で活性を発揮するように意図されたイントラボディーは、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分は、血漿膜の細胞質ゾル側にイントラボディーを鎖でつなぐように、イントラボディーに対して連結され得る。イントラボディーはまた、細胞質ゾル中で機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾルのイントラボディーは、細胞質ゾル中の因子を隔離するために使用され得、それによってそれらを、それらの天然の細胞性の目的地に対して輸送されることから妨げる。
【０１３４】
１つの実施態様においては、ＰＨＯＲ−１イントラボディーは、特定のＰＨＯＲ−１ドメインに対して特異的に結合するように設計される。例えば、ＰＨＯＲ−１タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾルのイントラボディーは、ＰＨＯＲ−１に関連する分子が核に対する接近を得ることを防止するために使用され得、それによって、それが核内で任意の生物学的活性を発揮することを防止する。
【０１３５】
このような特定の腫瘍細胞について特異的なイントラボディーの発現を指向するために、イントラボディーの転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置され得る。前立腺について特異的なイントラボディーの発現を標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０１３６】
（ＰＨＯＲ−１の転写または翻訳の阻害）
別のクラスの治療アプローチにおいては、本発明は、ＰＨＯＲ−１遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、タンパク質へのＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【０１３７】
１つのアプローチにおいては、ＰＨＯＲ−１遺伝子の転写を阻害する方法は、ＰＨＯＲ−１遺伝子をＰＨＯＲ−１アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。別のアプローチにおいては、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、アンチセンスポリヌクレオチドとＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡを接触させることを含む。別のアプローチにおいては、ＰＨＯＲ−１特異的リボザイムが、ＰＨＯＲ−１メッセージを切断するために使用され得、それによって翻訳が阻害される。このようなアンチセンスおよびリボザイムに基づく方法はまた、ＰＨＯＲ−１遺伝子の調節領域（例えば、ＰＨＯＲ−１プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント）に対して指向され得る。同様に、ＰＨＯＲ−１遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質が、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用され得る。上記の方法において有用である種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンスおよびリボザイム分子の使用は当該分野で周知である。
【０１３８】
ＰＨＯＲ−１転写活性を妨害することを通じてＰＨＯＲ−１の転写を阻害する他の因子もまた、ＰＨＯＲ−１を発現するガンの処置のために有用であり得る。同様に、ＰＨＯＲ−１のプロセシングを妨害し得る因子が、ＰＨＯＲ−１を発現するガンの処置に有用であり得る。このような因子を利用するガンの処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【０１３９】
（治療ストラテジーについての一般的な考察）
遺伝子導入および遺伝子治療技術が、ＰＨＯＲ−１を合成する腫瘍細胞に対して治療用のポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディーをコードするポリヌクレオチド、および他のＰＨＯＲ−１阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが当該分野で公知である。ＰＨＯＲ−１アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＨＯＲ−１の転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して腫瘍細胞を標的化するために送達させられ得る。
【０１４０】
上記の治療アプローチは、広範の種々の化学療法または放射線治療レジメの任意の１つと組合せられ得る。これらの治療アプローチもまた、化学療法の減少した投与量および／またはより少ない頻度の投与の使用を、特に、化学療法剤の毒性を十分に寛容化しない患者において可能にし得る。
【０１４１】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、イントラボディー）の抗腫瘍活性、またはこのような組成物の組合せが、種々のインビトロおよびインビボでのアッセイシステムを使用して評価され得る。治療能力を評価するためのインビトロでのアッセイとして、細胞増殖アッセイ、軟らかい寒天アッセイ、および腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療組成物が結合パートナーに対するＰＨＯＲ−１の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０１４２】
インビボでは、ＰＨＯＲ−１治療組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種の前立腺ガンのモデル（ここでは、ヒトの前立腺ガン細胞の移植片または継代された異種移植片組織が、免疫和解された動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）中に導入される）が、前立腺ガンに対する関係において適切であり、そして記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２−４０８）。例えば、１９９８年４月２３日に公開された、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９８／１６６２８号、Ｓａｗｙｅｒｓらは、初代の腫瘍の発達、微小な転移、および後期の疾患の特徴である骨芽細胞の転移の形成を要約し得るヒトの前立腺ガンの種々の異種移植片モデルを記載している。効率は、腫瘍形成、腫瘍の退行、または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例をもまた参照のこと。
【０１４３】
インビボでのアッセイにおいては、アポトーシスの促進のクオリファイもまた、可能性のある治療組成物を評価することにおいて有用であり得る。１つの実施態様においては、治療組成物で処置された生存しているマウスに由来する異種移植片が、アポトーシス性の病巣の存在について試験され、そして処置されていないコントロールの異種移植片を保有しているマウスに対して比較される。アポトーシス性の病巣が処置されたマウスの腫瘍中で見出される程度は、組成物の治療効率の指標を提供する。
【０１４４】
上記の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望される送達方法のための適切なキャリアを含有している薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとして、治療組成物とともに混合された場合に、治療組成物の抗腫瘍機能を保持し、そして患者の免疫システムと反応しない任意の材料が挙げられる。例として、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水、静菌水などのような、任意の多数の標準的な薬学的キャリアなどが挙げられるがこれらに限定されない（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
【０１４５】
治療用処方物は可溶化され得、そして、腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正常位などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物として、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水、および／または０．９％の注射のための滅菌の塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含有しているポリビニルクロライドもしくはポリエチレンバッグ中に稀釈された溶液中の治療用組成物が挙げられる。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥させられ得、そして滅菌の散剤として、好ましくは、減圧下で保存され、次いで、注射の前に、例えば、ベンジルアルコール保存料を含有している静菌水中でまたは滅菌水中で再構成され得る。
【０１４６】
以下の方法を使用するガンの処置のための投与量および投与プロトコールは、方法および標的のガンによって変化し、そして、当該分野で示されている多数の他の因子に一般に依存する。
【０１４７】
（ガンのワクチン）
本発明はさらに、ＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントからなるガンのワクチン、ならびにＤＮＡに基づくワクチンを提供する。前立腺および腫瘍に制限されたＰＨＯＲ−１の発現に関して、ＰＨＯＲ−１のガンワクチンは、標的以外の組織に対して非特異的な影響を生じることなく、ＰＨＯＲ−１を発現するガンを特異的に予防しそして／または処置することにおいて有効であると予想される。抗ガン治療における使用のための体液によっておよび細胞によって媒介される免疫性を作成するためのワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトのＰＳＭＡおよびげっ歯類のＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺ガンにおいて使用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１３７）。このような方法は、ＰＨＯＲ−１タンパク質もしくはそのフラグメント、またはＰＨＯＲ−１をコードする核酸分子、およびＰＨＯＲ−１免疫原を発現し得そしてＰＨＯＲ−１免疫原を適切に提示し得る組換えベクターを使用することによって、容易に行われ得る。
【０１４８】
例えば、ウイルス遺伝子送達システムは、ＰＨＯＲ−１をコードする核酸分子を送達するために使用され得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達システムとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達システムもまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に（例えば、筋肉内で）導入されるＰＨＯＲ−１タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＮＤＡを使用することによって使用され得る。１つの実施態様においては、全長のヒトのＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡが使用され得る。
【０１４９】
１つの実施態様においては、ＰＨＯＲ−１ガンワクチンは、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＰＨＯＲ−１のアミノ酸配列内の免疫原性ペプチドの同定に基づく。以下の実施例においてさらに議論されるように、ＰＨＯＲ−１の特異的な部分が、ＴおよびＢ細胞応答を誘導することが示されている。ＰＨＯＲ−１（図１Ａ〜Ｄ；配列番号２）のアミノ酸８６から３１０を含有しているＧＳＴ融合タンパク質は、モノクローナル抗体の産生のためにマウス中で免疫応答を作成するために使用されている。この同じＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質、ならびにＰＨＯＲ−１のアミノ酸１〜１４（ＭＶＤＰＮＧＮＥＳＳＡＴＹＦ；配列番号８）および２６２〜２７４（ＶＨＲＦＳＫＲＲＤＳＰＬＰ；配列番号９）に対応する２つのペプチドが、ポリクローナル抗体の産生のためにウサギ中で免疫応答を作成するために使用されている。従って、ＰＨＯＲ−１のこれらの特異的部分、およびこれらの部分をコードするポリヌクレオチドが、ガンワクチンの産生のために選択され得る。
【０１５０】
別の実施態様においては、特異的細胞毒性のＴリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするＰＨＯＲ−１核酸分子が使用され得る、ＣＴＬエピトープは、特定されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＰＨＯＲ−１タンパク質中のペプチドを同定するための、特異的なアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して決定され得る。１つの適切なアルゴリズムは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で利用可能な、ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子の溝、および特に、ＨＬＡ−Ａ２中の特異的なペプチド配列の結合に基づく（Ｆａｌｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６；Ｈｕｎｔら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３；Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７；Ｐａｒｋｅｒら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５）。ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２ならびにクラスＩ分子に対する推定される結合のための完全なタンパク質配列に由来する、８マー、９マー、および１０マーのペプチドの位置決定およびランキングを可能にする。ほとんどのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドが９マーであり、好ましくは、２位にロイシン、そして９位にバリンまたはロイシンを含有する（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７）。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ−Ａ２の発現の安定化によって評価され得る（Ｘｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら、１９９８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８）。特異的なペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのＣＤ８＋  ＣＴＬの刺激によってインビトロで評価され得る（Ｘｕｅら；Ｐｅｓｈｗａら、前出）。
【０１５１】
種々のエキソビボのストラテジーもまた、使用され得る。１つのアプローチは、患者の免疫システムに対してＰＨＯＲ−１抗原を提示するための樹状細胞の使用を含む。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７同時刺激因子、ならびにＩＬ−１２を発現し、そして従って、高度に特殊化された抗原提示細胞である。前立腺ガンにおいては、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスされた自己由来の樹状細胞が、前立腺ガンの患者の免疫システムを刺激するためのＰｈａｓｅ  Ｉの臨床試験において使用される（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９：３７１−３８０）。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の状況においてＴ細胞に対してＰＨＯＲ−１ペプチドを提示するために使用され得る。１つの実施態様においては、自己由来の樹状細胞が、ＭＨＣ分子に結合し得るＰＨＯＲ−１ペプチドでパルスされる。別の実施態様においては、樹状細胞が、完全なＰＨＯＲ−１タンパク質でパルスされる。なお別の実施態様は、以下のような当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用して樹状細胞中のＰＨＯＲ−１遺伝子の過剰発現を操作することを含む：アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、および腫瘍に由来するＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２）。ＰＨＯＲ−１を発現する細胞もまた、ＧＭ−ＣＳＦのような免疫調節因子を発現するように操作され得、そして免疫化試薬として使用され得る。
【０１５２】
抗イディオタイプ抗ＰＨＯＲ−１抗体もまた、ＰＨＯＲ−１タンパク質を発現する細胞に対して免疫応答を誘導するためのワクチンつとして、抗ガン治療において使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は当該分野で周知であり、そしてＰＨＯＲ−１タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＰＨＯＲ−１抗体を作成するように容易に適合させられ得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、ガンのワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１５３】
遺伝子による免疫化方法が、ＰＨＯＲ−１を発現するガン細胞に対して指向された予防的または治療的な体液性および細胞性の免疫応答を作成するために使用され得る。ＰＨＯＲ−１タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡ、および適切な調節配列を含有している構築物が、個体の筋肉または皮膚中に直接注射され得る。その結果、筋肉または皮膚の細胞は、構築物を取りこみ、そしてコードされるＰＨＯＲ−１タンパク質／免疫原を発現する。ＰＨＯＲ−１タンパク質免疫原の発現は、前立腺および他のＰＨＯＲ−１を発現するガンに対する予防的または治療的な体液性および細胞性の免疫の作成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的な遺伝子による免疫化技術が、使用され得る（概説については、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
【０１５４】
（キット）
上記に記載されているかまたは示唆されている診断用および治療用の適用における使用については、キットがまた本発明によって提供される。このようなキットは、閉じられた制限の中に、１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブなど）を受容させられる仕切られたキャリア手段を含み得る。それぞれの容器手段は、この方法において使用される別々のエレメントの１つを含有している。例えば、１つの容器手段は、検出可能な標識であるかまたは検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれＰＨＯＲ−１タンパク質またはＰＨＯＲ−１遺伝子またはメッセージについて特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが標的の核酸を検出するために核酸のハイブリダイゼーションを利用する場合には、キットはまた、標的の核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（単数または複数）を含有している容器、および／あるいはレポーター手段（例えば、レポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位元素標識）に対して結合させられたビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン））を含有している容器を有し得る。
【０１５５】
本発明のキットは、代表的には、上記に記載されている容器、および商業的にそして使用者の視点から所望される材料（緩衝液、稀釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用のための説明書を有するパッケージ挿入物を含む）を含有している１つ以上の他の容器を含む。組成物が特異的な治療または非治療的な適用のために使用されることを示す標識は、容器上に存在し得、そしてまた、上記に記載されているようなインビボまたはインビトロでのいずれかの使用のための指針を示し得る。
【０１５６】
ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡは、プラスミドｐ１０１Ｐ３Ａ１１としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、１９９９年７月２日にブダペスト条約に基づいて寄託され、そして登録番号Ｎ．ＰＴＡ−３１２を与えられている。
【０１５７】
（実施例）
本発明の種々の局面がさらに記載され、そして以下のいくつかの実施例の方法によって説明される。これらの全てが、本発明の範囲を制限するようには意図されない。
【０１５８】
（実施例１：ＰＨＯＲ−１遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨによって生成された単離物）
（材料および方法）
（ＬＡＣＰ異種移植片：）
ＬＡＣＰ異種移植片を、Ｄｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓ（ＵＣＬＡ）から入手し、そして記載されているように作成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：４０２−４０８；Ｃｒａｆｔら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５０３０−５０３６）。アンドロゲン依存性および非依存性のＬＡＣＰ−４異種移植片（それぞれ、ＬＡＰＣ−４  ＡＤおよびＡＩ）ならびにＬＡＰＣ−９異種移植片（それぞれ、ＬＡＰＣ−９  ＡＤおよびＡＩ）を、インタクトな雄性のＳＣＩＤマウスまたは去勢した雄性中でそれぞれ増殖させ、そしてレシピエントの雄性においてかなりの量の小さい組織として継代した。ＬＡＰＣ−４  ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍から誘導し、そしてＬＡＰＣ−９  ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ腫瘍から誘導した。ＡＩ異種移植片を作成するために、ＬＡＰＣ  ＡＤ腫瘍を保有している雄性のマウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間維持した。ＬＡＰＣ腫瘍の再増殖後、腫瘍を回収し、そして去勢した雄性または雌性のＳＣＩＤマウス中に移した。
【０１５９】
（細胞株：）
ヒトの細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして１０％のウシの胎児の血清を有しているＤＭＥＭ中で維持した。
【０１６０】
（ＲＮＡの単離：）
腫瘍組織および細胞株を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０８個の細胞を使用して、全ＲＮＡを単離するためにホモジナイズした。ポリＡ  ＲＮＡを、ＱｕｉａｇｅｎのＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｍｉｄｉキットを使用して全ＲＮＡから精製した。全ｍＲＮＡを、分光光度分析（Ｏ．Ｄ．２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０１６１】
（オリゴヌクレオチド：）
以下のＨＰＬＣ精製したオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６２】
ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー）（配列番号２１）：
５’ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴ３０３’
アダプター１（それぞれ、配列番号２２および配列番号２３）：
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧ３’
３’ＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴＡＧ５’
アダプター２（それぞれ、配列番号２４および配列番号２５）：
５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧ３’
３’ＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧ５’
ＰＣＲプライマー１（配列番号２６）：
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’
ネストプライマー（ＮＰ）１（配列番号２７）：
５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＡ３’
ネストプライマー（ＮＰ）２（配列番号２８）：
５’ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＡ３’
（抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション：）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を、アンドロゲン非依存性のガンと比較して、アンドロゲン依存性の前立腺ガンにおいてアップレギュレートされ得る遺伝子に対応しているｃＤＮＡを同定するために使用した。
【０１６３】
去勢の１４日後のＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片（テスター）、およびＬＡＰＣ−４ＡＤ異種移植片（ドライバー）に対応している二本鎖のｃＤＮＡを、上記に記載するように、異種移植片組織から単離した２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔおよび１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮをプライマーとして使用して、合成した。第１鎖および第２鎖の合成を、キットの使用者のマニュアルプロトコール（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．ＰＴ１１１７−１、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｋ１８０４−１）に記載されているように行った。得られたｃＤＮＡを、ＤｐｎＩＩで３時間、３７℃で消化した。消化したｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿させた。
【０１６４】
ドライバーｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４  ＡＤ）を、ヒトの良性の前立腺の過形成（ＢＰＨ）、ヒトの細胞株ＨｅＬａ、２９３、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ２０５、およびマウスの肝臓に由来する消化したｃＤＮＡの混合物との、ＤｐｎＩＩで消化したＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ｃＤＮＡの１：１での混合によって作成した。
【０１６５】
テスターｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４  ＡＤ，去勢の１４日後）を、去勢の１４日後に１μｌのＤｐｎ  ＩＩで消化したＬＡＰＣ−４  ＡＤのｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を、５μｌの水中に稀釈することによって生成した。次いで、稀釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μｌ）に対して、別々の連結反応において、１０μｌの全容量中で１６℃で一晩、４００ｕのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して連結させた。連結を、１μｌの０．２ＭのＥＤＴＡおよび７２℃で５分間の加熱を用いて停止させた。
【０１６６】
最初のハイブリダイゼーションを、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｇ（２０ｎｇ）のアダプター１およびアダプター２を連結させたテスターｃＤＮＡを含有している２つのそれぞれのチューブに添加することによって行った。４μｌの最終容量中で、サンプルにミネラルオイルを重層し、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラー中で９８℃で１．５分間変性させ、次いで６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌの新しい変性ドライバーｃＤＮＡとともに混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第２回目のハイブリダイゼーションを、２０ｍＭの２００μｌのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ中に稀釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で保存した。
【０１６７】
（ＳＳＨによって生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応によって得られた遺伝子フラグメントを増幅するために、２回のＰＣＲ増幅を行った。最初のＰＣＲ反応においては、１μｌの稀釈した最終のハイブリダイゼーション混合物を、２５μｌの最終容量中の１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡポリメラーゼＭｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に対して、添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を使用して行った：７５℃で５分間、９４℃で２５秒間、次いで２７サイクルの、９４℃で１０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で１．５分間。５個の別々の最初のＰＣＲ反応を、それぞれの実験について行った。生成物をプールし、そして水で１：１０に稀釈した。第２回目のＰＣＲ反応については、プールしそして稀釈した最初のＰＣＲ反応物を、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことをのぞいて、ＰＣＲ１について使用したものと同じ反応混合物に対して添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの、９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を使用して行った。ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル電気始動を使用して分析した。
【０１６８】
ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１中に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、青色／白色選択およびアンピシリン選択に供した。白色のコロニーを採取し、そして９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養物中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、１ｍｌの細菌培養物について、ＰＣＲ１の条件、ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を使用して行った。ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル電気始動を使用して分析した。
【０１６９】
細菌クローンを、９６ウェル形式で２０％のグリセロール中に保存した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ、およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０１７０】
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析：）
第１鎖のｃＤＮＡを、１μｇのｍＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングを用いて、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを使用して作製した。製造業者のプロトコールを使用し得、そしてこのプロトコールは、逆転写酵素を用いた４２℃で５０分間のインキュベーション、続く２０分間の３７℃でのＲＮａｓｅ  Ｈ処理を含んだ。反応の完了後、容量を、較正の前に水を用いて２００μｌに増大させた。１６個の異なる正常なヒトの組織に由来する第１鎖のｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
【０１７１】
複数の組織に由来する第１鎖のｃＤＮＡの較正を、β−アクチンを増幅するためのプライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号２９）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号３０）を使用することによって、行った。第１鎖のｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭのプライマー、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）、および１×Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有している全容量５０μｌ中で増幅させた。５μｌのＰＣＲ反応物を、１８、２０、および２２サイクルで取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動に使用した。ＰＣＲを、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して、以下の条件下で行った：最初の変性は、９４℃で１５秒間、続いて、１８、２０、および２２サイクルの、９４℃で１５秒、６５℃で２分、７２℃で５秒。７２℃での最後の伸張を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβ−アクチンバンドのバンド強度を、目視検査によって比較した。第１鎖のｃＤＮＡについての稀釈係数を、２２回のＰＣＲサイクルの後の全ての組織中で等量のβ−アクチンのバンド強度を生じるように計算した。３回の較正が、２２回のＰＣＲサイクルの後に全ての組織中で等しいバンド強度を達成するために必要であった。
【０１７２】
ＰＨＯＲ−１遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの較正した第１鎖のｃＤＮＡを、以下のプライマーの対を使用する２５、３０、および３５サイクルの増幅を使用するＰＣＲによって分析した。これらのプライマーは、（ＭＩＴ；詳細については、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕを参照のこと）の補助によって設計した（それぞれ、配列番号３１および配列番号３２）：
１０１Ｐ３Ａ１１．１  ＡＴＣＣＴＧＡＣＴＡＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧ
１０１Ｐ３Ａ１１．２  ＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＡＧＧＡ
半定量的な発現分析を、明るいバンド強度を生じるサイクル数でのＰＣＲ産物を比較することによって達成した。
【０１７３】
（結果）
いくつかのＳＳＨ実験を、材料および方法（上記）に記載するように行い、そして多数の候補の遺伝子フラグメントクローンの単離を導いた。全ての候補のクローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体についての情報を提供するため、および異なる発現について特定の遺伝子を分析するための指針を補助するために、主要な一般的な遺伝子およびＥＳＴデータベース中の全ての配列に対する相同性分析に供した。一般的には、任意の検索されるデータベース中のいずれの公知の配列遺伝子フラグメントに対しても相同性を有さず、従って、新規の遺伝子を提示すると考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現される配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析による異なる発現の分析に供した。
【０１７４】
約４２７ｂｐを含有しているＳＳＨクローンの１つは、全ての公知の遺伝子に対して相同性を示さず、そして１０１Ｐ３Ａ１１と命名された。このクローンは、図１Ａに示すＰＨＯＲ−１をコードする全長のｃＤＮＡフラグメントを示す（実施例２をもまた参照のこと）。１０１Ｐ３Ａ１１  ＳＳＨフラグメントの配列を、図３に示す。
【０１７５】
最初のＲＴ−ＰＣＲ分析（図５Ａ〜Ｂ）は、前立腺、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ、去勢後３日のＬＡＰＣ−４  ＡＤおよび去勢後１４日のＬＡＰＣ−４  ＡＤのみにおいて１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示したが、ＬＡＰＣ−４  ＡＩにおいては発現を示さなかった。より低い発現が、卵巣において検出された。
【０１７６】
（実施例２：全長のＰＨＯＲ−１をコードするｃＤＮＡの単離）
３１３６ｂｐの全長のｃＤＮＡ（ＧＴＨ１０）を、前立腺ライブラリーから単離し、これによって、３１７アミノ酸のＯＲＦを明らかにした（図１Ａ〜Ｄ）。タンパク質配列は、７個の膜貫通ドメインを明らかにし、そしてこれは嗅覚に関係しているＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）に対して相同性を有する（Ｒａｍｉｎｇら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：３５３；Ｍａｌｎｉｃら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９６：７１３）。１０１Ｐ３Ａ１１に対して最も相同である配列は、ＲＡ１ｃとして公知の脳中で発現されるラットの嗅覚レセプターである（Ｒａｍｉｎｇら、１９９８、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ６：１４１）。これは、２９９の残基の重複でＲＡ１ｃと５９．９％同一である。ＲＡ１ｃのヒトホモログはおそらく、ＨＰＲＡＪ７０であり、これは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｉｅｎｃｅｓ（第ＵＳ５７５６３０９号、第ＷＯ９６／３９４３５号）によって同定された前立腺特異的ＧＰＣＲである。１０１Ｐ３Ａ１１と共に両方の遺伝子のアラインメントを図２に示す。全長の１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡは、２９８の残基の重複でＨＰＲＡＪ７０に対して５９．４％同一であるアミノ酸配列をコードする。脳の嗅覚レセプターとの１０１Ｐ３Ａ１１の相同性は、本発明者らがこの遺伝子を嗅覚レセプター−１の前立腺ホモログ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＰＨＯＲ−１））と命名することを導いた。このレセプターのファミリーのメンバーであるタンパク質は、細胞外アミノ末端、３個のさらなる細胞外ループ、３個の細胞内ループ、および細胞内カルボキシル末端を示す。ＰＨＯＲ−１の第２の細胞外領域は、残基９０（ＮＳＴ）で１つの可能性のあるＮグリコシル化部位を示し、このことは、このタンパク質がグリコシル化され得ることを示唆している。
【０１７７】
全長のＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡ（ｐ１０１Ｐ３Ａ１１、クローンＧＴＨ１０）を、１９９９年７月２日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、そして登録番号ＰＴＡ−３１２が与えられた。
【０１７８】
（実施例３：  ＰＨＯＲ−１遺伝子の発現分析）
正常ヒト組織中でのＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡの発現を、最初に、全部で１６個の異なる正常ヒト組織を含有している、２つの複数の組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のノーザンブロッティングによって、プローブとして標識した１０１Ｐ３Ａ１１  ＳＳＨフラグメント（実施例１）を使用して、分析した。ＲＮＡサンプルを、β−アクチンプローブを用いて定量的に較正した。この分析の結果を図６Ａ〜Ｃに示す。３．５ｋｂの転写物の発現を、正常な前立腺中でのみ検出した。
【０１７９】
正常組織中でのＰＨＯＲ−１の発現を、前立腺中でのみＰＨＯＲ−１の強力な発現を示した、７６個の異なるサンプル（主に正常組織、ならびに数個のガン細胞株を示す）を含有している複数の組織のＲＮＡドットブロットを使用してさらに分析した（図７）。有意により低い発現が、心臓組織中で検出される。
【０１８０】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲを、患者に由来するガンを含む種々の組織中でのＰＨＯＲ−１の発現を分析するために使用し得る。第１鎖のｃＤＮＡを、１μｇのｍＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマーを用いて、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを使用して作製した。製造業者のプロトコールを使用し得、そしてこのプロトコールは、逆転写酵素を用いた４２℃で５０分間のインキュベーション、続く２０分間の３７℃でのＲＮａｓｅ  Ｈ処理を含む。反応の完了後、容量を、較正の前に水を用いて２００μｌに増大させた。第１鎖のｃＤＮＡを、目的の種々の組織から調製する。較正を、アクチンおよびＧＡＰに対するプライマーを使用するＰＣＲによって行うことができる。半定量的なＰＣＲを、ＰＨＯＲ−１に対するプライマーを使用して行う。
【０１８１】
（実施例４：前立腺ガンの異種移植片および患者のサンプル中でのＰＨＯＲ−１の発現）
（前立腺ガンの異種移植片および臨床的な標本のノーザン分析）
前立腺ガン組織中でのＰＨＯＲ−１の発現を分析するために、ノーザンブロッティングを、ＬＡＰＣ異種移植片に由来するＲＮＡおよび前立腺ガンのサンプルのパネルに由来するＲＮＡについて、それらの適合する正常な隣接している前立腺組織とともに行った。結果は、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ、およびＬＡＰＣ−９  ＡＩ中での高いレベルのＰＨＯＲ−１の発現を示す。より低い発現が、正常な前立腺中で検出され、そしてＬＡＰＣ−４  ＡＩ中では発現は見られない（図８）。前立腺ガンの患者に由来する臨床的な標本の４個の正常／腫瘍の適合する対の分析は、全ての患者のサンプル中でＰＨＯＲ−１の発現を示した（図８）。興味深いことに、４個の適合する対のうちの３個において、ＰＨＯＲ−１の発現は、適合する正常な隣接している組織と比較して腫瘍サンプル中で５〜２０倍高かった。これらの結果は、前立腺特異的ＰＨＯＲ−１がガンにおいてアップレギュレートされ、そして前立腺ガンの病因において機能的な役割を有し得ることを示唆する。
【０１８２】
（適合する腫瘍／正常な患者のサンプルのノーザン分析およびドットブロット分析）
ノーザン分析およびドットブロット分析は、前立腺ガンの腫瘍の隣接している正常な組織と比較した場合に、１０個の前立腺ガンの腫瘍のうちの８個において（Ｇｌｅａｓｏｎスコア６から９）、ＰＨＯＲ−１のアップレギュレーションを示した（図９Ａ〜Ｂ）。患者に由来する増幅したｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を使用するドットブロットは、３／３の前立腺ガンの患者、６／１４の腎臓ガンの患者，２／８の子宮ガンの患者、１／１の頚ガンの患者、３／８の胃ガンの患者、および７／７の直腸ガンの患者において、ＰＨＯＲ−１のアップレギュレーションを示す（図１０）。
【０１８３】
（ＲＮＡインサイチュ）
アンチセンスＰＨＯＲ−１リボプローブを使用するＲＮＡインサイチュ分析は、正常な前立腺（４／４）、ＰＩＮ（１／１）、および前立腺ガン（６／６）の患者において、有意な腺状の上皮および基底細胞の発現を示した。ＰＨＯＲ−１センスリボプローブは、わずかな染色から全く染色なしまでを有した。ＰＩＮおよび前立腺ガンにおけるＲＮＡのインサイチュ染色を、図１１Ａ〜Ｂにッ示す。ガン細胞中での染色強度は、一般的には、正常な腺において観察される染色強度よりも高かった（図１２Ａ〜Ｂ）。ＲＮＡのインサイチュの結果はまた、前立腺組織中で観察される発現が、腺上皮、基底細胞、およびガン細胞中であることを実証する。
【０１８４】
（実施例５：細菌細胞中での組換えＰＨＯＲ−１タンパク質の発現）
（ｐＧＥＸ構築物）
細菌細胞中でＰＨＯＲ−１を発現させるために、ＰＨＯＲ−１の一部を、ｐＧＥＸ−２ＴまたはｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ）中にクローニングすることによって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に対して融合させた。全ての構築物を、Ｃ末端の６個のヒスチジンエピトープを有するかまたは有さないで、Ｎ末端に融合したＧＳＴとともに組換えのＰＨＯＲ−１タンパク質配列を生じるように作製した。６個のヒスチジンエピトープタグを、ＯＲＦの３’末端でクローニングプライマーにヒスチジンコドンを付加することによって、作製した。トロンビンまたはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位によって、ＰＨＯＲ−１またはｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−６Ｐ−１構築物のぞれぞれからのＧＳＴタグの切断を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。以下のＰＨＯＲ−１のフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中にクローン化した：
アミノ酸１２８から２３８
アミノ酸１８８から３１７
アミノ酸１００から２９５。
【０１８５】
以下のＰＨＯＲ−１のフラグメントを、ｐＧＥＸ−２Ｔ中にクローン化した：
アミノ酸８６から３１０。
【０１８６】
ＰＨＯＲ−１タンパク質の以下の領域に及ぶさらなる構築物を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中に作製し得る：
アミノ酸１から１２８
アミノ酸１から１８８
アミノ酸１から３１７
アミノ酸５２から２３８。
【０１８７】
（ｐＭＡＬ構築物）
細菌細胞中でＰＨＯＲ−１を発現させるために、ＰＨＯＲ−１の一部を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子に対して、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）中にクローニングすることによって融合させた。全ての構築物を、Ｎ末端に融合させたＭＢＰおよびＣ末端に６個のヒスチジンエピトープを有する組換えＰＨＯＲ−１タンパク質配列を生じるように作製した。６個のヒスチジンエピトープタグを、３’クローニングプライマーに対してヒスチジンコドンを付加することによって作製した。第Ｘａ因子認識部位によって、ＰＨＯＲ−１からのＧＳＴタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２ＸおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクターを、それぞれ、細胞質または細胞質周辺中の組換えタンパク質を発現するように最適化する。細胞質周辺での発現は、ジスルフィド結合を伴うタンパク質の折り畳みを増強する。ＰＨＯＲ−１のアミノ酸８６から３１０を、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ中にクローン化した。
【０１８８】
ＰＨＯＲ−１タンパク質の以下の領域に及ぶさらなる構築物を、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ中に作製し得る：
アミノ酸１から１２８
アミノ酸１から１８８
アミノ酸１から３１７
アミノ酸５２から２３８
アミノ酸１００から２９５
アミノ酸１２８から２３８
アミノ酸１８８から３１７。
【０１８９】
（実施例６：哺乳動物システム中での組換えＰＨＯＲ−１タンパク質の発現）  （ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯ構築物）
哺乳動物の細胞中でＰＨＯＲ−１を発現させるために、９５１ｂｐのＰＨＯＲ−１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（ｃａｔ＃ｋ８６４−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローン化した。タンパク質の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＰ１６３翻訳エンハンサーから駆動される。組換えタンパク質は、Ｎ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭおよび６個のヒスチジンエピトープを有する。組換えタンパク質のＣ末端は、終止コドンの前にベクター配列によって生じる２８個のアミノ酸の融合を有する。ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯベクターはまた、エピソームの複製のためのＳＶ４０起点およびラージＴ抗原を発現する細胞株中での単純なベクターレスキューとともに、ｍＲＮＡの安定性を増強するために、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０１９０】
（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物）
哺乳動物細胞中でＰＨＯＲ−１を発現させるために、９５１ｂｐのＰＨＯＲ−１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローン化した。タンパク質の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、Ｃ末端に融合されたｍｙｃおよび６個のヒスチジンを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、エピソームの複製のためのＳＶ４０起点およびラージＴ抗原を発現する細胞株中での単純なベクターレスキューとともに、ｍＲＮＡの安定性を増強するために、ウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０１９１】
（ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物）
哺乳動物細胞中でＰＨＯＲ−１を発現させるために、そして蛍光を使用する組換えタンパク質の検出を可能にするために、９５１ｂｐのＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中にクローン化した。タンパク質の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、Ｃ末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有し、これによって非侵襲性のインビボでの検出および細胞の生物学の研究を容易にする。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、エピソームの複製のためのＳＶ４０起点およびラージＴ抗原を発現する細胞株中での単純なベクターレスキューとともに、ｍＲＮＡの安定性を増強するために、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０１９２】
ＰＨＯＲ−１タンパク質の全長にまたがるＮ末端にＧＦＰ融合を有するさらなる構築物を、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ中で作製し得る。
【０１９３】
（ｐＳＲａ構築物）
構成的にＰＨＯＲ−１を発現する哺乳動物細胞株を作製するために、９５１ｂｐのＰＨＯＲ−１  ＯＲＦをｐＳＲα構築物中にクローン化し、そして安定な細胞株を作製した。両栄養性およびエコトロピックなレトロウイルスを、ｐＳＲα構築物の２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株中へのトランスフェクション、またはｐＳＲαとヘルパープラスミド（j−）の２９３細胞中への同時トランスフェクションによって、それぞれ作製する。レトロウイルスは、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために使用し得、それによってクローン化した遺伝子であるＰＨＯＲ−１の宿主細胞株中への組込みを生じる。タンパク質の発現は、長末端反復（ＬＴＲ）から駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。抗ＦＬＡＧ抗体を使用する検出を可能にするためにＣ末端にＦＬＡＧタグを融合させたさらなるｐＳＲα構築物を作製した。ＦＬＡＧ配列（５’ｇａｔ  ｔａｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｇａｔ  ａａｇ  ３’）（配列番号３３）をＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに付加した。
【０１９４】
Ｎ末端およびＣ末端の両方のＧＦＰ、ならびに全長のＰＨＯＲ−１タンパク質のｍｙｃ／６  ＨＩＳ融合タンパク質を生じるさらなるｐＳＲα構築物を構築し得る。
【０１９５】
（実施例７：バキュロウイルス系での組換えＰＨＯＲ−１の産生）
バキュロウイルス発現系で組換えＰＨＯＲ−１タンパク質を作製するために、ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡを、バキュロウイルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ  ４．５  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化する。これは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する。詳細には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−−ＰＨＯＲ−１を、組換え体のバキュロウイルスを作製するために、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞中に、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに同時トランスフェクトする（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から回収し、そしてプラークアッセイによって精製する。
【０１９６】
次いで、組換え体のＰＨＯＲ−１タンパク質を、精製したバキュロウイルスでのＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染によって作製する。組換えＰＨＯＲ−１タンパク質を、抗ＰＨＯＲ−１抗体を使用して検出し得る。ＰＨＯＲ−１タンパク質を精製し得、そして種々の細胞に基づくアッセイにおいて、またはＰＨＯＲ−１について特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用し得る。
【０１９７】
（実施例８：ＰＨＯＲ−１に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）
３個の免疫原を、ＰＨＯＲ−１に特異的に結合する抗体試薬を作製するために誘導した。２個の抗原は、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列のアミノ酸１〜１４（ＭＶＤＰＮＧＮＥＳＳＡＴＹＦ；配列番号８）およびアミノ酸２６２〜２７４（ＶＨＲＦＳＫＲＲＤＳＰＬＰ；配列番号９）をコードするペプチドであった。これらのペプチドは、それぞれ、ＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞外Ｎ末端およびＰＨＯＲ−１タンパク質の推定の６番目と７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ループをコードすると推定される。これはリガンド結合部位と予想される。第３の免疫原が、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列のアミノ酸８６〜３１０を含有しているグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質であった。この融合タンパク質を、以下のプライマー（それぞれ、配列番号３４および配列番号３５）を用いて、ＰＨＯＲ−１のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド３８８〜１０６２のＰＣＲによって媒介される増幅によって作製した：
【０１９８】
【化１】
0004272376.tif 000002
得られた生成物を、ｐＧＥＸ−２Ｔ  ＧＳＴ融合ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位中にクローン化した。組換えのＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質を、グルタチオンセファロース親和性クロマトグラフィーによって、誘導した細菌から精製した。
【０１９９】
上記の抗原に加えて、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列の他の領域をコードする他のペプチドおよび細菌およびバキュロウイルスによって産生されたタンパク質を、ＰＨＯＲ−１特異的抗体試薬を作製するために使用し得る。このような試薬は、ＰＨＯＲ−１機能を調節し得るＰＨＯＲ−１タンパク質（例えば、リガンド結合をブロックする抗体）の領域を指向し得る。このような試薬は、ＰＨＯＲ−１タンパク質の機能およびシグナル伝達経路を解明するために使用され得る。
【０２００】
（ポリクローナル抗体の作製）
ＰＨＯＲ−１に対するポリクローナル血清を作製するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対して結合させた精製したＧＳＴ−融合タンパク質およびペプチドを、以下のように個体のウサギを免疫化するために使用した。ウサギを、２００μｇの融合タンパク質または完全フロイントアジュバント中で混合したＫＬＨ−ペプチド抗原を用いて免疫化した。次いで、ウサギに、不完全フロイントアジュバント中の２００μｇの免疫原を用いて２週間ごとに注射した。試験採血を、それぞれの免疫化の約７〜１０日後に行った。それぞれのペプチド抗血清の力価は、それぞれの免疫原に対してＥＬＩＳＡによって決定した場合には、少なくとも１×１０５であった。ＧＳＴ−融合血清の力価は、少なくとも１×１０６であった。
【０２０１】
ペプチド抗血清を、Ａｆｆｉｇｅｌマトリックス（ＢｉｏＲａｄ）に対して共有結合させたそれぞれのペプチドから構成したアフィニティーカラム内を血清を通過させることによって、アフィニティー精製した。ＧＳＴ−融合体に対して惹起させた血清を、ＧＳＴアフィニティーカラム内を通過させることによって、ＧＳＴ反応性の抗体の除去によって最初に半精製した。次いで、ＰＨＯＲ−１特異的抗体を、ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１アフィニティーカラム内を通過させることによって単離する。あるいは、ＰＨＯＲ−１特異的抗血清を、同じアミノ酸をコードするマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって単離し得る。ＰＨＯＲ−１配列のＮ末端ペプチドで免疫化したウサギに由来するアフィニティー精製した血清は、ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞溶解物からＰＨＯＲ−１タンパク質を免疫沈降させ（図１３Ａ〜Ｂ）、そしてトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー分析によってＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での発現を検出する（図１４Ａ〜Ｂ）。
【０２０２】
（マウスのモノクローナル抗体の作製）
ＰＨＯＲ−１に対するｍＡｂを作製するために、Ｂａｌｂ  Ｃマウスを、２００μｇの完全フロイントアジュバント中に混合したＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質を用いて腹腔内で免疫化した。次いで、引き続いて、マウスを、フロイント不完全アジュバント中に混合した２００μｇの抗原を用いて２〜４週間ごとに免疫化した。３回の免疫化後には、これらのマウスに由来する試験採血の力価は、ＥＬＩＳＡによって決定した場合には、少なくとも１．２×１０６であり、そしてＧＳＴ融合体中に存在する同じアミノ酸をコードするＭＢＰ融合タンパク質を使用するウェスタンブロッティングによって示されるように、ＰＨＯＲ−１アミノ酸配列を特異的に認識した（図１５）。ＬＮＣａＰ細胞およびＬＡＰＣ９異種移植片細胞のフローサイトメトリー分析は、それらの同種の予備免疫血清と比較して免疫化したマウスの血液の組合せを用いて染色した場合に、蛍光のシフトを示し、このことは、ＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での検出を実証する（図１６Ａ〜Ｂ）。
【０２０３】
一旦、適切な反応性および特異性が、ＥＬＩＳＡ，ウエスタンブロッティング、およびフローサイトメトリー分析によって決定した場合に得られると、次いで、融合体およびハイブリドーマの作製を、当該分野で周知の確立された手順を用いて行う（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。
【０２０４】
別の抗原および免疫化ストラテジーもまた、ＰＨＯＲ−１タンパク質の種々の領域に対して特異的反応性および特異性を有するｍＡｂを作製するために使用し得る。このような抗原として、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列の種々の領域をコードする、さらなるペプチド、および細菌またはバキュロウイルスにって産生された組換えタンパク質が挙げられ得る。細胞に基づく免疫化ストラテジーをもまた使用し得る。ここでは、ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡがＮＨＩ３Ｔ３マウス繊維芽細胞または３００．１９マウスＢ細胞のような細胞中で過剰発現され、そして全細胞またはこれらの細胞に由来する膜調製物が免疫原として使用される。
【０２０５】
（実施例９：ＰＨＯＲ−１タンパク質の発現の特徴付け）
２９３Ｔ細胞を、発現プラスミドｐＣＤＮＡ４  ＨＩＳ／ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一過性にトランスフェクトした。ｐＣＤＮＡ４  ＨＩＳ／ＭＡＸ中では、ＰＨＯＲ−１ｃＤＮＡが、アミノ末端で、２つのエピトープタグ、Ｅｘｐｒｅｓｓ、およびＨｉｓＧに融合されている。空のベクターコントロールおよびＰＨＯＲ−１でトランスフェクトした細胞を、Ｎ末端のＥｘｐｒｅｓｓエピトープを特異的に認識するｍＡｂでか、またはＰＨＯＲ−１配列のＮ末端の１４個のアミノ酸に対して指向されたウサギのｐＡｂで染色した。図１３Ａおよび図１４Ａ〜Ｂに示すように、ＰＨＯＲ−１でトランスフェクトした細胞は、抗Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍＡｂおよびｐＡｂの両方を用いたコントロール細胞と比較して、特異的な蛍光のシフトを示す。このシフトは、ＰＨＯＲ−１が原形質膜の外側に暴露されたＮ末端を伴って細胞の表面で発現されることを示す。これは、公知のＧタンパク質結合レセプターのトポロジーと一致する。これらの細胞によるＰＨＯＲ−１の発現をさらに、免疫組織化学によって確認した（次の実施例を参照のこと）。
【０２０６】
トランスフェクトした細胞に由来するエピトープタグ化ＰＨＯＲ−１タンパク質の免疫沈降およびウェスタン分析は、アミノ酸配列から推定したＰＨＯＲ−１タンパク質の推定分子量に一致する３７ｋＤの免疫反応性のバンドを示す（図１３Ｂ）。さらに、高分子量の免疫反応性のスメアが、ＰＨＯＲ−１でトランスフェクトした細胞中で見られ、これは、７回膜貫通ドメインの疎水性相互作用によって媒介されるタンパク質の、ＳＤＳおよび熱不溶性の凝集物を示し得る。
【０２０７】
ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１タンパク質で免疫化したマウスに由来する血清を、内因性のＰＨＯＲ−１タンパク質の発現を試験するために使用した。ＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ９前立腺ガン細胞（これらの両方が、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡを発現する）は、免疫前血清と比較して免疫血清で染色した場合に、蛍光シフトを示し、このことは、これらの細胞の集団中でのＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での発現を実証する（図１６）。さらに、次の実施例は、正常な前立腺、前立腺ガン、および前立腺ガン細胞株中でのＰＨＯＲ−１の内因性の発現を検出するためのこの血清の使用を実証する。
【０２０８】
ＰＨＯＲ−１の発現を、無細胞インビトロでの翻訳によって評価した。コントロールｃＤＮＡおよびＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡを、製造業者の推奨（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って、ウサギの網状赤血球溶解物を使用してインビトロで翻訳した。無細胞インビトロでのアッセイの結果を、図１７に示し、そしてＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡが３８〜４２ｋＤａのタンパク質に翻訳されることを実証する。これは、ＰＨＯＲ−１の計算される分子量に対応する。
【０２０９】
（実施例１０：正常な前立腺、前立腺ガン、および前立腺ガン細胞株中でのＰＨＯＲ−１の免疫組織化学的検出）
（方法）
ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織のブロックを、４ミクロンに切片化し、そして正に荷電させたＣａｐｉｌｌａｒｙ  Ｇａｐ顕微鏡スライド（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上に配置した。キシレン中での脱蝋、続くアルコール系列による水和の後、組織の切片を、クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）の存在下で２０分間、蒸し器の中で前処理し、続いて抗体反応を最適化するために、１０分間のプロテイナーゼＫ（１：４０）インキュベーションした。５分間の冷却後、スライドを、ビオチン−ストラプトアビジン−ペルオキシダーゼ技術を使用して免疫染色した。簡潔には、スライドを、５分間、ブロッキング血清（正常なヤギ）、続いて、２μｌ／ｍｌの抗ＰＨＯＲ−１ウサギモノクローナル一次抗体（２５分）、ビオチニル化した二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ（２５分）、内因性ペルオキシダーゼブロッキング（３×１．５分）、およびペルオキシダーゼ酵素に結合させたストレプトアビジン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）（１０分）中でインキュベートした。各インキュベーションとインキュベーションとの間に切片を緩衝液中でリンスした。ＤＡＢ−ジアミノベンジジンクロモゲン（ＱｕａｌＴｅｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｂｓ）を、反応を進行させるために使用した−これによって、茶色の沈殿を生じた。引き続きスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、そしてカバースライドをかけた。
【０２１０】
（結果）
ＰＨＯＲ−１タンパク質の内因性発現が、抗ＰＨＯＲ−１（ＰＥＰＴＩＤＥ１：アミノ酸１〜１４）、ウサギのポリクローナル抗体（図１８Ａ〜Ｆ）の免疫組織化学的分析において実証される。前立腺ガンでの染色は、正常な前立腺において観察される染色よりも多かった。染色は、正常な前立腺の内腔の上皮内の先端に局在化される（図１８Ｅおよび１８Ｆ）。前立腺ガンで観察される染色はまた、中程度の段階のガンについては低く先端に局在化され（図１８Ｂおよび１８Ｃ）、そしてより進行した前立腺ガンの細胞の全てにわたって局在化される（図１８Ａ）。前立腺ガン細胞株ＬＮＣａＰもまた、ほとんど全ての細胞において同様の染色を示す（図１８Ｄおよび１９Ｆ）。
【０２１１】
抗ＰＨＯＲ−１（ＰＥＰＴＩＤＥ１）ウサギポリクローナル抗体の特異性を、図１９Ａ〜Ｆにしめす。エピソームのｐｃＤＮＡ４  ＨＩＳ／ＭＡＸ構築物からＰＨＯＲ−１タンパク質を発現する操作された細胞株２９３Ｔ−ＰＨＯＲ−１（図１９Ｂ）、および組み込まれたｐＳＲα構築物からＰＨＯＲ−１を安定に発現するＰＣ３−ＰＨＯＲ−１細胞株（図１９Ｄ）は両方とも、もとの操作されていない細胞株中には存在しない特異的な茶色の染色を示す（それぞれ、図１９Ａおよび１９Ｃ）。２９３Ｔ−ＰＨＯＲ−１細胞株中での染色（図１９Ｂ）は、細胞のサブセットにおいて非常に強力であり、これは、ＣＭＶプロモーターからのＰＨＯＲ−１の発現を駆動するｐｃＤＮＡ４  ＨＩＳ／ＭＡＸ構築物での一過性トランスフェクションによって予想されることである。しかし、細胞株ＰＣ３−ＰＨＯＲ−１（図１９Ｄ）中での染色は、安定な細胞株中で予想されるように、観察した全ての細胞中に存在する。
【０２１２】
これらのデータは、抗ＰＨＯＲ−１（ＰＥＰＴＩＤＥ１）ウサギポリクローナル抗体がＰＨＯＲ−１タンパク質を特異的に認識することを示す。さらに、ＰＣ３−ＰＨＯＲ−１中で観察される染色（図１９Ｄ）は、前立腺ガン細胞株ＬＮＣａＰ（図１９Ｆ）および前立腺ガン（図１９Ｅ）において見られる染色パターンおよび強度と非常に似ている。
【０２１３】
（実施例１１：ＰＨＯＲ−１によるチロシンおよびＥｒＫのリン酸化の変化）  ｐＳＲαレトロウイルスベクター中のｎｅｏまたはＰＨＯＲ−１のいずれかを安定に発現するＰＣ３細胞を、１％のＦＢＳ中で一晩増殖させた。次いで、細胞を、未処理のままにしたか、または１０％のＦＢＳで３分間処理した。細胞を溶解させ、そして抗ホスホチロシン（ＵＢＩ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）（図２０Ａ）、または抗ホスホロ−ＥｒＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ｍＡｂ（図２０Ｂ）を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。抗Ｇｒｂ２  ｍＡｂ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のオーバーレイは、等しいタンパク質の充填を示す（図２０Ｃ）。図２０Ｄにおいて、ＰＨＯＲ−１の発現を、ノーザンブロッティングによって評価した（ＰＣ３−ＰＨＯＲ−１細胞によるＰＨＯＲ−１の発現の免疫組織化学的実証については、図１９Ｄもまた参照のこと）。ＲＮＡを、コントロールのＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＨＯＲ−１で安定に形質導入したＰＣ３細胞から抽出し、そしてＲＮＡのブロットをＰＨＯＲ−１プローブ（クローンＧＴＨ１０のＸｂａ−Ｅｃｏｒ１フラグメント）を使用してハイブリダイズした。ＬＡＰＣ４異種移植片に由来するＲＮＡを、ポジティブコントロールとして使用した（図２０Ｅ）。結果は、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡが、レトロウイルスで形質導入されたＰＣ３−ＰＨＯＲ−１細胞中で発現されるが、コントロール細胞中では発現されないこと、そして一旦発現されると、ＰＨＯＲ−１はＰＣ３細胞のリン酸化のパターンを変化させることを示す。
【０２１４】
チロシンのリン酸化は、細胞表面から核へのシグナル伝達事象において重要な役割を果たす。さらに、チロシンのリン酸化は、ＧＰＣＲを介して生じることが示されており（Ｌｉｅｂｍａｎｎ  Ｃ，Ｂｏｈｍｅｒ  ＦＤ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，７：９１１およびＭａｕｄｓｌｅｙ  Ｓ．Ｐｉｅｒｃｅ  ＫＬ、Ｚａｍａｈ  ＡＭ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＷＥ，Ａｈｎ  Ｓ，Ｄａａｋａ  Ｙ，Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  ＲＪ，Ｌｕｔｔｒｅｌｌ  ＬＭ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：９５７２）、そしてＧＰＣＲの効果に寄与するシグナル伝達カスケードの活性化を生じることが示されている。これらの結果（図２０Ａ〜Ｂに示される）は、ＰＨＯＲ−１がＰＣ３細胞中で発現された場合に、それが５５ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化および１３０ｋＤＡのタンパク質の脱リン酸化を誘導することを示す。さらに、ＰＨＯＲ−１の発現は、Ｅｒｋのリン酸化、有糸分裂促進物質とのタンパク質の会合、および形質転換において２〜３倍の増大を誘導し（Ｇｒｅｕｌｉｃｈ  Ｈ，Ｅｒｉｋｓｏｎ  ＲＬ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：１３２８０）、このことは、ＰＨＯＲ−１がＥｒｋカスケードを活性化することを示す。
【０２１５】
（実施例１２：ＰＨＯＲ−１はｃＡＭＰの細胞質濃度を調節する）
親の細胞およびＰＨＯＲ−１を発現する細胞を、ｃＡＭＰの細胞質での蓄積を誘導するそれらの能力について比較した。２９３Ｔ細胞を、空のｐｃＤＮＡ４  ＨＩＳ  ＭＡＸベクターまたはｐｃＤＮＡ４  ＨＩＳ  ＭＡＸ  ＰＨＯＲ−１でトランスフェクトした。細胞を、１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で一晩飢餓させ、そして培地のみ、または１０％のＦＢＳの存在下でインキュベートした。細胞を溶解させ、そしてｃＡＭＰ含有量について、製造業者の推奨（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ  Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＩ）に従って酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）によって分析した。結果を表１に示し、そしてこれはＰＨＯＲ−１の発現がＦＢＳに応答してｃＡＭＰ濃度を変化させることを示す。
【０２１６】
【表１】
0004272376.tif 000003
嗅覚のレセプターを含む、全ての特徴付けたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰ経路を活性化することによって機能する。リガンドの非存在下では、ＧＰＣＲは通常は、不活性な状態である。リガンドの結合または過剰発現の際に、ＧＰＣＲは活性な立体構造を獲得し、そしてＧタンパク質と複合体を形成する。この相互作用は、Ｇタンパク質サブユニットの解離およびアデニル酸シクラーゼの活性化を生じ、これによってｃＡＭＰの蓄積を生じる（Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ  Ｌ，Ｃｅｌｌ  １９９２、７１：１０６９）。ｃＡＭＰの増強された産生は、ＧＰＣＲの効果を媒介するいくつかの下流のシグナル伝達経路の活性化を生じる。２９３Ｔ細胞中でのＰＨＯＲ−１の発現がＦＢＳに応答してｃＡＭＰの蓄積を可能にするこの実施例における実証は、これらの条件下でＰＨＯＲ−１がＧＰＣＲとして機能することを示す。
【０２１７】
さらに、ｃＡＭＰ含有量を、それらのアンドロゲン依存性およびＰＨＯＲ−１の発現において異なる、２つの前立腺ガンの異種移植片について決定した。ＬＡＰＣ４ＡＤは、図２０Ｅに示すノーザンブロットによって証明されるように、強力なＰＨＯＲ−１発現を示すアンドロゲン依存性の前立腺ガンの異種移植片である。上記の表にも示すこれらの細胞のｃＡＭＰ含有量は、ＬＡＰＣ４ＡＩ細胞の含有量よりも有意に低かった。ＬＡＰＣ４ＡＩ細胞は、アンドロゲン非依存性でありそしてＰＨＯＲ−１を発現しない。
【０２１８】
（実施例１３：ＰＨＯＲ−１は軟寒天中でコロニーの増殖を誘導する）
ＰＨＯＲ−１を安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、軟寒天中でコロニーを形成するそれらの能力について分析した。ｎｅｏまたは活性化Ｒａｓを安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして、それぞれ使用した。実験を、２連で行った。アッセイを、細胞のプレーティングの４週間後に評価した。結果を、図２１および表２に示す。
【０２１９】
【表２】
0004272376.tif 000004
コロニーの計数は、ＰＨＯＲ−１がｎｅｏコントロールと比較してコロニーの形成において３倍の増大を誘導することを示す。この有意な増大は、２つの別々の実験において観察された。これらの結果は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＰＨＯＲ−１の発現が、強力なオンコジーンであるＲａｓによる５倍の増大と比較して、コロニーの形成において３〜４倍の増大を誘導することを示し、このことは、ＰＨＯＲ−１が有意な形質転換能力を有することを示唆している。
【０２２０】
（実施例１４：ＰＨＯＲ−１遺伝子の染色体マッピング）
ＰＨＯＲ−１の染色体配置を、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４放射線照射ハイブリッドパネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：２２）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  Ａ１）を使用して決定した。以下のＰＣＲプライマーを、ＰＨＯＲ−１を配置するために使用した（それぞれ、配列番号３１および配列番号３２）：
【０２２１】
【化２】
0004272376.tif 000005
９３放射線照射ハイブリッドパネルＤＮＡについての得られたマッピングベクターは以下であった：
【０２２２】
【化３】
0004272376.tif 000006
このベクター、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌでのマッピングプログラムによって、１１ｐ１５．５で、染色体１１のテロメアにＰＨＯＲ−１を配置した。
【０２２３】
ヒトのＰＨＯＲ−１遺伝子が染色体１１ｐ１５．５にマップするので、ＰＨＯＲ−１タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドを使用して、種々の癌に関連しているとして同定されている染色体１１バンドｐ１５．５上の細胞遺伝学異常を特徴付けし得る。詳細には、１１ｐ１５．５中の種々の染色体の異常が、多数の異なる癌においてしばしば細胞遺伝学の異常として同定されている（例えば、Ｌａｉら、２０００、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６（８）：３１７２−６；ＯｙａおよびＳｃｈｕｌｚ、２０００、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８３（５）：６２６−３１；Ｓｖａｒｅｎら、２０００年９月１２日、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）。結果として、ＰＨＯＲ−１タンパク質の特異的な領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性腫瘍の表現型に寄与し得る染色体１１のこの領域における細胞遺伝学異常の以前の可能性のある特異的な性質よりも、より正確に、描写するために使用され得る新規のツールを提供する。この状況においては、これらのポリヌクレオチドは、より微妙でありあまり一般的ではない染色体異常を同定するために染色体のスクリーニングの感受性を拡大することへの当業者の要求を満たす（例えば、Ｅｖａｎｓら、１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７１（４）：１０５５−１０５７を参照のこと）。
【０２２４】
（実施例１５：可能性のあるシグナル伝達経路の同定）
ＰＨＯＲ−１が細胞中の公知のシグナル伝達経路を直接または間接的に活性化するかどうかを決定するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に基づく転写レポーターアッセイを、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞中で行う。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する公知の転写因子についてのコンセンサスな結合部位を含む。レポーターおよびそれらの会合する転写因子の例、シグナル伝達経路、および活性化の刺激を以下に列挙する。
【０２２５】
１．ＮＦｋＢ−ｌｕｃ、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
ＰＨＯＲ−１によって媒介される効果を、ｍＲＮＡの発現を示す細胞中でアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質によって媒介されるトランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。ルシフェラーゼ活性（相対的な転写活性の指標）を、ルシフェリン基質との細胞の抽出物のインキュベーションによって測定し、そして反応物の発光を、ルミノメーター中でモニターする。
【０２２６】
（実施例１６：ＰＨＯＲ−１の機能のインビトロでのアッセイ）
前立腺ガン中でのＰＨＯＲ−１の発現は、この遺伝子が腫瘍の進行および／または腫瘍の開始において機能的な役割を有するという証拠を提供する。レセプターとしてのＰＨＯＲ−１の機能が、増殖シグナルを活性化することに関係することは可能である。ＰＨＯＲ−１機能を、インビトロでのアプローチを使用して哺乳動物細胞中で評価し得る。哺乳動物での発現のために、ＰＨＯＲ−１を多数の適切なベクター（ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇおよびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）を含む）中にクローン化し得る。このような発現ベクターを使用して、ＰＨＯＲ−１を、いくつかの細胞株（ＰＣ−３、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、および２９３Ｔを含む）中で発現させ得る。ＰＨＯＲ−１の発現を、抗ＰＨＯＲ−１抗体およびノーザンブロット分析を使用してモニターし得る。
【０２２７】
ＰＨＯＲ−１を発現する哺乳動物細胞株を、いくつかのインビトロおよびインビボのアッセイ（組織培養物中での細胞の増殖、アポトーシスのシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウス中での腫瘍の形成、および膜侵襲培養システム（ＭＩＣＳ：Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：４４９−４５７）を使用するインビトロでの侵襲を含む）において試験し得る。ＰＨＯＲ−１細胞の表現型を、ＰＨＯＲ−１を発現しない細胞の表現型に対して比較する。
【０２２８】
ＰＨＯＲ−１を発現する細胞株をまた、マトリゲルでコーティングした有孔性の膜チャンバー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じる細胞の通過を測定することによって、侵襲性および移動の特性の変化についてアッセイし得る。膜を通じる反対側への細胞の通過を、蛍光アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃４２８）を使用して、指示細胞を充填したｃａｌｃｅｉｎ−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、モニターする。分析した細胞株は、親、およびＰＨＯＲ−１を過剰発現するＰＣ３細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、およびＬＮＣａＰ細胞を含む。ＰＨＯＲ−１を発現する細胞が化学誘引特性を有するかどうかを決定するために、指示細胞を、コントロール培地に対して比較して、ＰＨＯＲ−１の馴化培地の勾配に対する有孔性の膜を通した通過をモニターする。このアッセイをまた、候補の癌治療組成物によるＰＨＯＲ−１によって誘導される影響の特異的な中和の定性および定量のために使用し得る。
【０２２９】
ＰＨＯＲ−１の機能を、上記に記載する種々の機能的なアッセイ（例えば、増殖、侵襲、および移動）と組合せて、アンチセンスＲＮＡ技術を使用して評価し得る。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞中に導入し得、それによってＰＨＯＲ−１の発現を妨害し得る。コントロールおよびアンチセンスを含有している細胞を、増殖能力、侵襲能力、移動能力、アポトーシス能力、および転写能力について分析し得る。ＰＨＯＲ−１の発現の、局所的および全身的な効果の損失を評価し得る。
【０２３０】
（実施例１７：ＰＨＯＲ−１の腫瘍増殖の促進についてのインビボでのアッセイ）
ＰＨＯＲ−１タンパク質の腫瘍細胞の増殖に対する効果を、腫瘍を保有しているマウス中での遺伝子の過剰発現によってインビボで評価し得る。例えば、ＳＣＩＤマウスを、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたはＰＨＯＲ−１を含有している、ＰＣ細胞３、ＴＳＵＰＲ１細胞、またはＤＵ１４５細胞のいずれかの１×１０６を用いて、いずれかの側腹部に皮下注射し得る。少なくとも２つのストラテジーを使用し得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された、第ＵＫ  ２，２１１，５０４号）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類の肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＳＶ４０のようなウイルスのゲノムから、または異種の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、またはイムノグロブリンプロモーター）（そのようなプロモーターが宿主細胞システムと適合性である限りは）から得られる構成的なプロモーターのようなプロモーターの調節下での、構成的なＰＨＯＲ−１の発現、ならびに（２）誘導可能なベクターシステム（例えば、エジクソン、ｔｅｔなど）（そのようなプロモーターが宿主細胞システムと適合性である限りは）の制御下での調節された発現。次いで、腫瘍の容量を、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞がより速い速度で増殖するかどうか、およびＰＨＯＲ−１を発現する細胞によって産生された腫瘍が、変更された積極性（例えば、増強された転移性、血管形成、化学療法剤に対する減少した応答性）の特徴を示すかどうかを決定するために、明確な腫瘍の出現時点およびその後に経時的にモニターし得る。さらに、マウスに、ＰＨＯＲ−１が、前立腺中での局所的な増殖、または細胞が転移する（特に、肺、リンパ節、および骨髄に対して）能力に対して影響を有するかどうかを決定するために、正常位で同じ細胞の１×１０５を用いて移植し得る。
【０２３１】
このアッセイはまた、例えば、ＰＨＯＲ−１イントラボディー、ＰＨＯＲ−１アンチセンス分子、およびリボザイムのような候補の治療用組成物のＰＨＯＲ−１阻害効果を決定するために有用である。
【０２３２】
（実施例１８：ＰＨＯＲ−１ファミリーのメンバーの遺伝子のクローニング）  ＰＨＯＲ−１は、嗅上皮およびニューロン中で発現される嗅覚のレセプターの大きなファにリーに対して相同である。ＰＨＯＲ−１と相同であるさらなる遺伝子を同定する試みにおいては、ＰＨＯＲ−１のタンパク質配列を、公のＥＳＴ（発現配列タグ）データベース（ｄＢｅｓｔ）中のファミリーのメンバーを同定するための電子的なプローブとして使用した。ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の「ｔｂｌａｓｔｎ」機能を使用して、ｄＢｅｓｔデータベースを、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列を用いて問い合わせした。この分析によって、１つの新規のファミリーのメンバーを明らかにした（図２２）。ＥＳＴ、ＡＩ１３８２１３を、ヒトの胎盤のライブラリーから単離し、そしてこれは、ＰＨＯＲ−１のカルボキシル末端領域に相同である。これは、９５個のアミノ酸の重複にわたってＰＨＯＲ−１と４９．５％の同一性を示す。この新規のファミリーのメンバーを、前立腺および前立腺癌のサンプル中での発現について分析し、そしてヒトのｃＤＮＡライブラリーからクローン化する。
【０２３３】
新規のファミリーのメンバーを発見するための別のアプローチは、遺伝子中の保存された領域中の縮重オリゴヌクレオチドを設計することである（Ｒａｍｉｎｇら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：３５３）。これらを、次いで、新規のＧＰＣＲファミリーのメンバーを単離するために、前立腺または前立腺癌に由来する第１鎖のｃＤＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲ反応において使用し得る。ＲＴ−ＰＣＲを使用してＰＨＯＲ−１のファミリーのメンバーを単離するために、以下の保存された領域をオリゴヌクレオチドの設計のために選択した：ＳＬＨＥＰＭＹ（ａ．ａ．５６〜６２；配列番号３６）、ＡＭＡＦＤＲＹ（ａ．ａ．１１９〜１２５；配列番号３７）、ＹＶＡＩＣＨＰ（ａ．ａ．１２５〜１３１；配列番号３８）、ＫＡＦＧＴＣＶ（ａ．ａ．２３７〜２４３；配列番号３９）、およびＧＶＫＴＫＥＩ（ａ．ａ．２９４〜３００；配列番号４０）。使用した縮重オリゴヌクレオチドは以下である：
【０２３４】
【化４】
0004272376.tif 000007
ここで、（Ａ）はアデニンを示し、（Ｃ）はシトシン、（Ｇ）はグアニン、（Ｔ）はチミン、（Ｒ）はアデニンまたはグアニン、（Ｙ）はシトシンまたはチミン、（Ｓ）はシトシンまたはグアニン、（Ｄ）はアデニンまたはグアニンまたはチミン、（Ｈ）はアデニンまたはシトシンまたはチミン、（Ｎ）はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンを示す。
【０２３５】
以下のプライマーの組合せを、第１鎖のｃＤＮＡに由来するファミリーのメンバーを増幅するために、使用する：１Ａ〜１Ｄおよび３Ｂのプール；１Ａ〜１Ｄおよび４Ａのプール；１Ａ〜１Ｄおよび５Ａのプール；２Ａ＋２Ｂおよび４Ａのプール；２Ａ＋２Ｂおよび５Ａのプール；３Ａおよび４Ａ；３Ａおよび５Ａ。得られたＰＣＲ産物を、次いで、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結し、そして続いて、ＤＨ５  Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換する。寒天上での青色／白色選択およびアンピシリン選択の後、白色のアンピシリン耐性コロニーを、プラスミドの精製およびｃＤＮＡ挿入物の配列決定のために、液体培養物中で拡大させた。これらのクローンによる配列を、ＰＨＯＲ−１の配列に対して比較し、そして利用可能な公のデータベースおよび個人的なデータベースに対して問い合わせした。新規のＰＨＯＲ−１ファミリーのメンバーを示す配列を、さらなる分析および全長のクローニングのために選出する。
【０２３６】
本出願を通じて、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、それらの全体において本明細書中で参考として本明細書によって援用される。
【０２３７】
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によっては範囲を限定されない。実施形態は、本発明の個々の局面の単なる説明として意図され、そして機能的に同等な任意のものが、本発明の範囲内にある。本明細書中に記載されるものに加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、上記の記載および教示から当業者に明らかになり、そして本発明の範囲内に入ることが同様に意図される。このような改変および他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神を逸脱することなく実施され得る。
【表３】
0004272376.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜１Ｄは、ヒトのＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡ（クローンＧＴＨ１０）のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）である。推定の開始メチオニンは太字で示される。配列は、Ｋｏｚａｋ配列を示す第２のメチオニン（ＡＴＧ  ＡＴＧ  Ｇ）の周辺の配列とともに、開始部位の２つの隣接しているメチオニンを示す。７個の推定の膜貫通ドメインが四角で囲まれる。
【図２】  図２は、ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．７プログラム（ＢＣＭ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒ）を使用した、ヒトのＰＨＯＲ−１のＨＰＲＡＪ７０（配列番号４）およびＲＡ１ｃ（配列番号３）とのアミノ酸配列のアラインメントである。推定の膜貫通ドメインは太字で示されるか、または四角で囲まれる。四角で囲まれたドメインは、ＨＰＡＲＪ７０およびＲＡ１ｃに対する相同性によって同定された。太字のドメインは、ウェブツールであるＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／〜ｍｉｔａｋｕ／ａｄｖ  ｓｏｓｕｉ／ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）を使用して同定された。
【図３】  図３は、ＰＨＯＲ−１遺伝子に対応するＳＳＨに由来するフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号５）である。
【図４】  図４は、膜貫通ＰＨＯＲ−１タンパク質の全体的なトポロジーの模式図である。
【図５Ａ】  図５Ａは、前立腺および前立腺癌の異種移植片に制限されたヒトＰＨＯＲ−１の発現を示す、半定量的なＲＴ−ＰＣＲ発現分析である。以下が示される：脳（レーン１）、正常な前立腺（レーン２）、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ（レーン３）、去勢の３日後のＬＡＰＣ−４  ＡＤ（レーン４）、去勢の１４日後のＬＡＰＣ−４  ＡＤ（レーン５）、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ（レーン６）、ＨｅＬａ細胞（レーン７）、およびネガティブコントロール（レーン８）。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、前立腺に制限されたヒトＰＨＯＲ−１の発現を示す半定量的なＲＴ−ＰＣＲ発現分析である。以下が示される：結腸（レーン１）、卵巣（レーン２）、白血球（レーン３）、正常な前立腺（レーン４）、小腸（レーン５）、脾臓（レーン６）、精巣（レーン７）、および胸腺（レーン８）。
【図６】  図６Ａ〜６Ｃは、ＰＨＯＲ−１発現のノーザンブロット分析の結果を示し、これは、正常な前立腺および前立腺癌の異種移植片に制限された発現を実証する。図６Ａは、心臓（レーン１）、脳（レーン２）、胎盤（レーン３）、肺（レーン４）、肝臓（レーン５）、骨格筋（レーン６）、腎臓（レーン７）、および膵臓（レーン８）中のＰＨＯＲ−１のノーザンブロット分析である。図６Ｂは、脾臓（レーン１）、胸腺（レーン２）、正常な前立腺（レーン３）、精巣（レーン４）、卵巣（レーン５）、小腸（レーン６）、結腸（レーン７）、および白血球（レーン８）中のＰＨＯＲ−１のノーザンブロット分析である。図６Ｃは、正常な前立腺（レーン１）、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ（レーン２）、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ（レーン３）、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ（レーン４）、およびＬＡＰＣ−９  ＡＩ（レーン５）中のＰＨＯＲ−１のノーザンブロット分析である。
【図７】  図７は、前立腺に対して独占的である発現を示す、ヒトの組織に由来する７６個の種々のサンプル中でのＰＨＯＲ−１発現のｍＲＮＡドットブロット分析である。位置は、以下の組織を示す：Ａ１  全脳；Ａ２  小脳、左；Ａ３  黒質；Ａ４  心臓；Ａ５  食道；Ａ６  結腸、横断面；Ａ７  腎臓；Ａ８  肺；Ａ９  肝臓；Ａ１０  ＨＬ６０、白血病；Ａ１１  胎児の脳；Ｂ１  大脳皮質；Ｂ２  小脳、右；Ｂ３  中隔側坐核（ａｃｃｕｍｂｅｎｓ  ｎｕｃｌｅｕｓ）；Ｂ４  大動脈；Ｂ５  胃；Ｂ６  結腸、下行；Ｂ７  骨格筋；Ｂ８  胎盤；Ｂ９  膵臓；Ｂ１０  ＨｅＬａ、Ｓ３；Ｂ１１  胎児の心臓；Ｃ１  前頭葉；Ｃ２  脳梁；Ｃ３  視床；Ｃ４心房、左；Ｃ５  十二指腸；Ｃ６  直腸；Ｃ７  脾臓；Ｃ８  膀胱；Ｃ９  副腎；Ｃ１０  Ｋ５６２、白血病；Ｃ１１  胎児の腎臓；Ｄ１  頭頂葉；Ｄ２  扁桃腺；Ｄ３  脳下垂体；Ｄ４  心房、右；Ｄ５  空腸；Ｄ６  −−；Ｄ７  胸腺；Ｄ８  子宮；Ｄ９  甲状腺；Ｄ１０  ＭＯＬＴ−４、白血病；Ｄ１１  胎児の肝臓；Ｅ１  後頭葉；Ｅ２  尾状核；Ｅ３  脊髄；Ｅ４  心室、左；Ｅ５  回腸；Ｅ６  −−；Ｅ７  白血球；Ｅ８  前立腺；Ｅ９  唾液腺；Ｅ１０  ＲＡＪＩ、リンパ腫；Ｅ１１  胎児の脾臓；Ｆ１  側頭葉；Ｆ２  海馬；Ｆ３  −−；Ｆ４  心室、右；Ｆ５  回盲腸；Ｆ６  −−；Ｆ７  リンパ節；Ｆ８  精巣；Ｆ９  乳腺；Ｆ１０  ＤＡＵＤＩ、リンパ腫；Ｆ１１  胎児の胸腺；Ｇ１  側中心回；Ｇ２  延髄；Ｇ３  −−；Ｇ４  心室間の隔壁；Ｇ５  中垂；Ｇ６  −−；Ｇ７  骨髄；Ｇ８  卵巣；Ｇ９  −−；Ｇ１０  ＳＷ４８０、結腸癌；Ｇ１１  胎児の肺；Ｈ１  脳橋；Ｈ２  硬膜；Ｈ３  −−；Ｈ４  心臓の尖；Ｈ５  結腸  上行性；Ｈ６  −−；Ｈ７  気道；Ｈ８  −−；Ｈ９  −−；Ｈ１０  Ａ５４９、肺癌；Ｈ１１  −−。
【図８Ａ】  図８Ａは、ヒトの前立腺癌の異種移植片中でのＰＨＯＲ−１の発現のノーザンブロット分析である。これは、前立腺癌の腫瘍中でのＰＨＯＲ−１の高レベルな過剰発現を示す。正常な前立腺（レーン１）：ＬＡＣＰ−４  ＡＤ（レーン２）；ＬＡＰＣ−４  ＡＩ（レーン３）；ＬＡＣＰ−９  ＡＤ（レーン４）；ＬＡＣＰ−９  ＡＩ（レーン５）。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、ヒトの患者の生検サンプル中でのＰＨＯＲ−１の発現のノーザンブロット分析である。これは、前立腺の腫瘍中でのＰＨＯＲ−１の高レベルな過剰発現を示す。正常な前立腺（レーン６）；患者１、正常な近隣組織（レーン７）；患者１、Ｇｌｅａｓｏｎ  ７腫瘍（レーン８）；患者２、正常な近隣組織（レーン９）；患者２、Ｇｌｅａｓｏｎ  ９腫瘍（レーン１０）；患者３、正常な近隣組織（レーン１１）；患者３、Ｇｌｅａｓｏｎ  ７腫瘍（レーン１２）；患者４、正常な近隣組織（レーン１３）；患者４、Ｇｌｅａｓｏｎ  ７腫瘍（レーン１４）。
【図９Ａ】  図９Ａは、前立腺癌におけるＰＨＯＲ−１の発現である。これは、７個のうちの５個（または図９Ｂと組合せた場合には、１０個のうちの８個）の腫瘍の標本のノーザンブロット分析によるアップレギュレーションを示す。以下の腫瘍型についての適合する腫瘍（Ｔ）および正常な（Ｎ）患者のサンプルが示される：Ｇｌｅａｓｏｎ  ７（レーン対１）；Ｇｌｅａｓｏｎ  ９（レーン対２）；Ｇｌｅａｓｏｎ  ７（レーン対３〜５）；Ｇｌｅａｓｏｎ  ６（レーン対６〜７）；Ｂは、良性の前立腺の過形成（ＢＰＨ）を示す；Ｎは、さらなる正常な標本を示す。
【図９Ｂ】  図９Ｂは、前立腺癌におけるＰＨＯＲ−１の発現である。これは、３個の腫瘍標本のうちの３個（図９Ａと組合せた場合には、１０個のうちの８個）のノーザンブロット分析によるアップレギュレーションを示す。以下の腫瘍型についての適合する腫瘍（Ｔ）および正常な（Ｎ）患者のサンプルが示される：Ｇｌｅａｓｏｎ  ７（点の対８）；Ｇｌｅａｓｏｎ  ８（点の対９）；Ｇｌｅａｓｏｎ  ７（点の対１０）。
【図１０】  図１０は、患者に由来する増幅されたｃＤＮＡを使用して、腫瘍のＲＮＡ（Ｔ）および正常なＲＮＡ（Ｎ）の適合するサンプルのドットブロット分析によって実証された、ヒトの癌におけるＰＨＯＲ−１の発現である。ＰＨＯＲ−１の発現のアップレギュレーションが、３人の前立腺癌の患者のうちの３人において、１４人の腎臓癌の患者のうちの６人において、８人の子宮癌の患者のうちの２人において、８人の胃癌の患者のうちの３人において、そして７人の直腸癌の患者のうちの７人において、見られた。
【図１１Ａ】  図１１Ａは、アンチセンスＰＨＯＲ−１リボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる、前立腺の上皮内新生物（ＰＩＮ）中でのＰＨＯＲ−１の発現を示す顕微鏡写真である。
【図１１Ｂ】  図１１Ｂは、アンチセンスＰＨＯＲ−１リボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる、前立腺癌組織中でのＰＨＯＲ−１の発現を示す顕微鏡写真である。
【図１２Ａ】  図１２Ａは、アンチセンスＰＨＯＲ−１リボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる、前立腺癌中でのＰＨＯＲ−１の発現を示す顕微鏡写真である。正常な前立腺（図１２Ｂ）と比較した発現のアップレギュレーションに注目する。
【図１２Ｂ】  図１２Ｂは、アンチセンスＰＨＯＲ−１リボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる、正常な前立腺中でのＰＨＯＲ−１の発現を示す顕微鏡写真である。
【図１３Ａ】  図１３Ａは、ＰＨＯＲ−１−２９３Ｔ細胞中でのＰＨＯＲ−１タンパク質の発現および検出である。２９３Ｔ細胞は、１０μｇの、ｐＣＤＮＡ４  ＨＩＳ  ＭＡＸ  ＰＨＯＲ−１プラスミド（これは、ＥｘｐｒｅｓｓエピトープおよびＰＨＯＲ−１配列のＮ末端に融合されたＨＩＳタグを含む）またはベクターコントロールのいずれかで一時的にトランスフェクトされ、そしてフローサイトメトリーによってＰＨＯＲ−１タンパク質の発現についてアッセイされた。ＰＨＯＲ−１タンパク質のフローサイトメトリーによる検出のために、ＰＨＯＲ−１ＯＲ−１でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞およびベクターコントロールでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞がトランスフェクションの２日後に回収され、そして１０μｇ／ｍｌの抗Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、続いて抗マウスＦＩＴＣ結合体で染色され、次いでＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで分析された。コントロールでトランスフェクトされた細胞の集団（実線）およびＰＨＯＲ−１でトランスフェクトされた細胞の集団（点線）の代表的な蛍光プロフィールが矢印で示される。これらの結果は、トランスフェクトされた細胞中でのＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での発現および認識を示す。
【図１３Ｂ】  図１３Ｂは、ＰＨＯＲ−１−２９３Ｔ細胞中でのＰＨＯＲ−１タンパク質の発現および検出である。２９３Ｔ細胞は、図１３Ａに記載されるようにトランスフェクトされ、そして免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロッティングによってＰＨＯＲ−１タンパク質の発現についてアッセイされた。免疫沈降およびウェスタンアッセイのために、ＰＨＯＲ−１およびベクターコントロール細胞が回収され、そして免疫沈降のためにはＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、２μｇのロイペプチン、および２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）中に、または全細胞溶解物（ＷＣＬ）のウェスタン分析のためには２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンル緩衝液中のいずれかに溶解させられた。ＲＩＰＡ溶解物は、プロテインＧアガロースビーズを用いて予め洗浄され、次いで４μｇの親和性精製されたＰＨＯＲ−１抗ペプチドウサギｐＡｂおよびプロテインＧアガロースビーズを用いて免疫沈降される。全細胞溶解物（ＷＣＬ）中に存在する免疫沈降させられたＰＨＯＲ−１タンパク質（ＩＰ）およびＰＨＯＲ−１タンパク質は、抗Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍＡｂ、続くヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体を用いるウェスタン分析によって検出され、そして増強させられた化学発光およびオートラジオグラム用フィルムへの暴露によって可視化させられた。矢印は、抗Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍＡｂによって検出された推定される３７ｋＤのＰＨＯＲ−１エピトープタグ化タンパク質を示す。高分子量のスメアもまた、ＰＨＯＲ−１でトランスフェクトされた細胞中で検出されたが、コントロール細胞中では検出されなかった。これは、疎水性膜貫通領域の会合によって誘導されたＰＨＯＲ−１タンパク質の凝集を示し得る。これらの結果は、トランスフェクトされた細胞中でのＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での発現および認識を示す。
【図１４Ａ】  図１４Ａは、ＰＨＯＲ−１特異的ポリクローナル抗体によるＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での発現のフローサイトメトリーによる検出である。ＰＨＯＲ−１配列のアミノ酸１−１４に対して惹起された親和性によって精製した抗ＰＨＯＲ−１ペプチドｐＡｂが、一過性トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中で発現されるエピトープタグ化ＰＨＯＲ−１タンパク質を検出するために使用された。２９３Ｔ細胞は、ベクターコントロールまたはｐＣＤＮＡ４  ＨＩＳ−ＭＡＸ  ＰＨＯＲ−１プラスミド（１０μｇ）のいずれかでトランスフェクトされ、そして２日後に回収された。細胞は、次いで、１０μｇの抗Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍＡｂ、続いて抗マウスＦＩＴＣ結合２次Ａｂで染色され、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで分析された。コントロールでトランスフェクトされた細胞の集団（実線）およびＰＨＯＲ−１でトランスフェクトされた細胞の集団（点線）の代表的な蛍光プロフィールが矢印で示される。
【図１４Ｂ】  図１４Ｂは、ＰＨＯＲ−１特異的ポリクローナル抗体によるＰＨＯＲ−１タンパク質の細胞表面での発現のフローサイトメトリーによる分析である。ＰＨＯＲ−１配列のアミノ酸１−１４に対して惹起された親和性によって精製した抗ＰＨＯＲ−１ペプチドｐＡｂが、一過性トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中で発現されるエピトープタグ化ＰＨＯＲ−１タンパク質を検出するために使用された。２９３Ｔ細胞は、ベクターコントロールまたはｐＣＤＮＡ４  ＨＩＳ−ＭＡＸ  ＰＨＯＲ−１プラスミド（１０μｇ）のいずれかでトランスフェクトされ、そして２日後に回収された。細胞は、次いで、親和性によって精製されたウサギ抗ＰＨＯＲ−１  ｐＡｂ、続いて抗ウサギＦＩＴＣ結合２次Ａｂで染色され、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで分析された。コントロールでトランスフェクトされた細胞の集団（実線）およびＰＨＯＲ−１でトランスフェクトされた細胞の集団（点線）の代表的な蛍光プロフィールが矢印で示される。
【図１５】  図１５は、ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１抗原を用いて免疫化したマウスに由来する血清のＰＨＯＲ−１特異的反応性である。Ｂａｌｂ  Ｃマウスが、ＰＨＯＲ−１タンパク質配列のアミノ酸８６から３１０をコードするグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質で免疫化された。ＰＨＯＲ−１タンパク質配列に対する免疫化されたマウスの特異的反応性が、標的抗原として同じアミノ酸をコードするマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質を使用するウェスタンブロッティングによって決定された。代表的な試験採血の１：５００希釈が、精製されたＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１タンパク質（２μｇ＝約１００ｎｇの融合タンパク質）および誘導された細菌の溶解物の種々の量のブロットをプローブするために使用された。ＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１タンパク質の特異的な認識が示され、これは、免疫化されたマウスの血清中のＰＨＯＲ−１特異的抗体を示す。
【図１６Ａ】  図１６Ａは、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞上でのＰＨＯＲ−１の細胞表面での発現の検出である。ＬＮＣａＰ細胞が、ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１で免疫化したマウスに由来する血清、またはマウスの予備免疫血清、続く抗マウスＦＩＴＣ結合体化抗マウス二次抗体で免疫化されたマウスに由来する血清の組合せのいずれかの、１：２００稀釈を用いて染色された。染色された細胞は、次いで、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで分析された。予備免疫血清（実線）またはＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１で免疫化された血清（点線）のいずれかで染色された細胞の集団の代表的な蛍光プロフィールが矢印で示される。これらの結果は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞中での内因性の細胞の表面でのＰＨＯＲ−１の発現の認識を示す。
【図１６Ｂ】  図１６Ｂは、ＬＡＰＣ９腫瘍細胞上でのＰＨＯＲ−１の細胞表面での発現の検出である。ＬＡＣＰ９  ＳＣＩＤマウスの異種移植片から調製されたＬＡＣＰ９腫瘍細胞が、ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１で免疫化したマウスに由来する血清、またはマウスの予備免疫血清、続く抗マウスＦＩＴＣ結合抗マウス二次抗体で免疫化したマウスに由来する血清の組合せのいずれかの、１：２００稀釈を用いて染色された。染色された細胞は、次いで、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで分析された。予備免疫血清（実線）またはＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１で免疫化された血清（点線）のいずれかで染色された細胞の集団の代表的な蛍光プロフィールが矢印で示される。これらの結果は、ＬＡＰＣ９前立腺癌細胞中での内因性の細胞の表面でのＰＨＯＲ−１の発現の認識を示す。
【図１７】  図１７では、ＰＨＯＲ−１の発現が細胞を含まないインビトロでの翻訳によって評価された。コントロールｃＤＮＡおよびＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡが、ウサギの網状赤血球溶解物を使用してインビトロで翻訳された。細胞を含まないインビトロでの翻訳アッセイは、ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡが３８から４２ｋＤａのタンパク質に翻訳され、これがＰＨＯＲ−１の計算された分子量に対応することを示す。
【図１８Ａ】  図１８Ａは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された前立腺癌組織上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ｂ】  図１８Ｂは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ｃ】  図１８Ｃは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された前立腺癌組織上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ｄ】  図１８Ｄは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された正常な前立腺上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ｅ】  図１８Ｅは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された前立腺ガン組織上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ｆ】  図１８Ｆは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された正常な前立腺上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１９Ａ】  図１９Ａは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された２９３Ｔ細胞上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１９Ｂ】  図１９Ｂは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された、ＰＨＯＲ−１を発現するように操作された２９３Ｔ細胞上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１９Ｃ】  図１９Ｃは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋されたＰＣ３細胞上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１９Ｄ】  図１９Ｄは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された、ＰＨＯＲ−１を発現するように操作されたＰＣ３細胞上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１９Ｅ】  図１９Ｅは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋された前立腺ガン組織上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図１９Ｆ】  図１９Ｆは、ホルマリンで固定され、そしてパラフィンで包埋されたＬＮＣａＰ細胞上での、抗ＰＨＯＲ−１（ペプチド１；アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的分析を示す顕微鏡写真である。
【図２０Ａ】  図２０Ａは、ＰＨＯＲ−１によるチロシンのリン酸化の変化のウェスタン分析である。ｎｅｏまたはｐＳＲαレトロウイルスベクター中のＰＮＯＲ−１のいずれかを安定に発現するＰＣ３細胞が、１％のＦＢＳ中で一晩増殖させられた。次いで、細胞は、未処理のまま放置されたか、または１０％のＦＢＳで３分間処理された。細胞は溶解させられ、そして抗ホスホチロシン（ＵＢＩ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）を用いたウェスタンブロッティングによって分析された。
【図２０Ｂ】  図２０Ｂは、ＰＨＯＲ−１によるＥｒｋのリン酸化の変化のウェスタン分析である。ｎｅｏまたはｐＳＲαレトロウイルスベクター中のＰＮＯＲ−１のいずれかを安定に発現するＰＣ３細胞が、図１９Ａについて記載されているように処理された。細胞は溶解させられ、そして抗ホスホ−ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ｍＡｂを用いたウェスタンブロッティングによって分析された。
【図２０Ｃ】  図２０Ｃでは、図１９Ａ〜Ｂについて記載されたように調製された細胞がまた、Ｇｒｂ２についてプローブされた。抗Ｇｒｂ２  ｍＡｂ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）オーバーレイ方式は、等量のタンパク質の充填を示す。
【図２０Ｄ】  図２０Ｄは、ＰＣ３−ｎｅｏおよびＰＣ３−ＰＨＯＲ−１細胞のノーザン分析である。図１９Ａ〜Ｃにおいて上記に記載されたＰＣ３細胞は、ノーザンブロッティングによってＰＨＯＲ−１の発現について評価された。ＲＮＡがコントロールＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＨＯＲ−１で安定に形質導入されたＰＣ３細胞から抽出され、そしてＲＮＡのブロットがＰＨＯＲ−１プローブ（クローンＧＴＨ１０のＸｂａ−Ｅｃｏｒ１フラグメント）を使用してハイブリダイズされた。ＬＡＰＣ４異種移植片に由来するＲＮＡが、ポジティブコントロールとして使用された（図２０を参照のこと）。結果は、ＰＨＯＲ−１  ｍＲＮＡは、レトロウイルスで形質導入されたＰＣ３−ＰＨＯＲ−１細胞中で発現されるが、コントロール細胞中では発現されないことを示す。
【図２０Ｅ】  図２０Ｅは、ＬＡＰＣ４異種移植片中でのＰＨＯＲ−１の発現を示すノーザンブロットである。強力な発現が、アンドロゲン依存性（ＡＤ）のＬＡＰＣ４中で観察されたが、アンドロゲン非依存性（ＡＩ）のＬＡＰＣ４中では観察されなかった。
【図２１Ａ】  図２１Ａでは、ＰＨＯＲ−１を安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞が、軟らかい寒天中でコロニーを形成するそれらの能力について分析された。ｎｅｏを安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞が、ネガティブコントロールとして使用された。実験は２連で行われた。アッセイは、細胞のプレーティングの４週間後に評価された。
【図２１Ｂ】  図２１Ｂでは、ＰＨＯＲ−１を安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞が、軟らかい寒天中でコロニーを形成するそれらの能力について分析された。実験は２連で行われた。アッセイは、細胞のプレーティングの４週間後に評価された。コロニー数は、ＰＨＯＲ−１がｎｅｏコトロールと比較してコロニーの形成において３倍の増大を誘導することを示す（図２１Ａ）。この有意な増大は、２つの別々の実験において観察されている。結果は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中でのＰＨＯＲ−１の発現が、強力な腫瘍形成遺伝子であるＲａｓによる５倍の増大（図２１Ｃを参照のこと）と比較して、３〜４倍のコロニーの形成を誘導することを示し、このことは、ＰＨＯＲ−１が有意な形質転換能力を有することを示唆している。
【図２１Ｃ】  図２１Ｃでは、ＰＨＯＲ−１を安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞が、軟らかい寒天中でコロニーを形成するそれらの能力について分析された（図２１Ｂ）。活性化されたＲａｓを安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞が、ポジティブコントロールとして使用された。実験は２連で行われた。アッセイは、細胞のプレーティングの４週間後に評価された。
【図２２】  図２２は、ＰＨＯＲ−１ファミリーのメンバーである、ＡＩ１３８２１８のヌクレオチド配列（配列番号６）および推定のＯＲＦのアミノ酸配列（配列番号７）である。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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