(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなるトコトリエノールを有効成分とする細菌感染症の予防治療剤。
【請求項２】
ヒトを除く動物にα−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなるトコトリエノールを投与することからなる細菌感染症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、１種以上のトコトリエノールを有効成分とする、種々の免疫不全症に対して有効な、新規な免疫機能改善剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】
近年、免疫学の進歩が急速であり、種々の疾患が免疫機能不全に起因しているものと考えられている。例えば、癌、細菌感染症、喘息、関節リウマチ、自己免疫疾患などが免疫機能不全に起因している疾患として挙げられる。
感染症は、単に病原菌の侵入のみによる単純性感染症に加えて、各種重篤な基礎疾患を伴う複雑性感染症の増加が深刻な問題となってきている。例えば癌に伴う感染症は臨床上最も煩わしい問題である。癌を担うことによって、全身性、局所的な抵抗力低下を招き、易感染状態下では二次感染症を合併、続発する。癌に伴う感染は、初期においては呼吸器感染、尿路感染、胎道感染、皮膚感染が多く、末期においては、肺炎、敗血症が多い。この腫瘍に伴う感染症併発の機序については、次のような過程が一般的である。
【０００３】
すなわち、白血病、悪性リンパ腫、癌の進展に伴い、正常な組織、細胞の障害、特にリンパ系細胞や、顆粒球細胞機能の低下を来すので、易感染性となり、感染症を併発すると考えられている。このような場合、抗生剤投与による根治効果が乏しく、反復感染、菌交代症、難治感染に至ることが多い。従って、従来の抗生剤、化学療法剤のみでは根治がほとんど期待できず、生体防御機能の改善なくしては治療不可能であり、生体の防御機能を高める薬剤の開発が望まれていた。一方、家畜・家禽などの動物の細菌感染に対しては、抗生物質がその中心的存在となっており、事実、各種の抗生物質の登場によって病原細菌による重篤な感染症は減少している。しかし、畜産界では抗生剤の乱用から、畜水産物中の残留・耐性菌の増加、菌交代症などを引き起こし、社会問題となっている。すなわち、宿主は感染防御能が著しく低下し、感染症に対する修復機能も傷害されているため、感染症は治りにくく再感染しやすい状態を作っている。さらに、自発性感染症（日和見感染症）が家畜の生産性を低下させ、その損失は大きい。
【０００４】
【本発明が解決しようとする問題点】
上記のような状況から、宿主の免疫能の活性を高め、生体の防御機能を高める必要があった。
【０００５】
【従来技術】
Anim.Sci.,68,4303-4309,1990 には、牛のブルセラ症に対するワクチン接種後に、ビタミンＥ(トコフェロール)およびセレンの補充が、いくつかの免疫パラメーターに効果があったことが記載されている。
J.Nutr.,124,2024-2032,1994 には、ネズミAIDSになったマウスの栄養状態および免疫反応が、ビタミンＥの補充により正常化したことが記載されている。
しかしながら、これら従来技術はトコフェロールに関するものであり、トコトリエノールに関するものではない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の実状に鑑み、免疫機能を正常化し、生体の防御機能を高める薬剤について永年鋭意研究してきたが、意外にも、１種以上のトコトリエノールがヒトおよび動物の免疫機能不全による疾患の予防・治療剤、特にヒトおよび動物の感染症に対する防御剤として有効であることを見出し、本発明を完成したものである。
すなわち本発明化合物は、ヒトおよび動物の免疫機能を正常化し、感染抵抗性を高める作用を有するので、ヒトおよび動物の免疫機能不全による疾患の予防・治療剤、各種感染症に対する防御剤として有用である。
本発明にかかるトコトリエノールは、次の化学式で表される１種以上である。
【０００７】
【化１】
0004271742.tif 000002
【０００８】
それぞれのトコトリエノールは、例えばパーム油のような植物油から抽出するか、あるいは化学的に合成して得ることができる。
本発明におけるトコトリエノールは単一の異性体には限定されず、混合物も含まれ、その混合比も限定されない。
本発明は、癌、感染症、喘息、関節リウマチ、自己免疫疾患、敗血症、肺炎、風邪症候群、下痢、髄膜炎あるいは他のウィルス性感染症のような、種々の免疫不全症あるいは感染症に対する予防・改善・改良・軽減あるいは治療に有用である。
また本発明にかかる組成物を、食品添加物、補助栄養食品あるいは機能性食品の成分として用いられる場合には、常法に従って、任意の濃度になるよう添加することができる。
【０００９】
次に本発明組成物を医薬品として前記疾患に利用する際には、経口または非経口的に投与することができる。非経口的には、一般的に静脈内投与のような注射剤型として投与される。
投与量は、年齢、性別、体重、患者の感受性、投与方法、投与の時期、間隔および特性、配薬および剤型、有効成分の種類等によって大きく異なり限定されない。通常は一種以上のトコトリエノールを、成人１日あたり0.1mg〜5000mg、好ましくは0.5mg〜3000mg、より好ましくは1mg〜2000mgを、普通は分一ないし分四投与する。
【００１０】
例えば注射剤、座剤、舌下錠、錠剤、カプセル剤等の製剤化にあたっては、常法に従って行うことができる。すなわち、注射剤の製造においては、有効成分を混合し、必要に応じてpH調整剤、緩衝液、縣濁剤、溶解剤、安定化剤、等張化剤、防腐剤などを加え、常法により製剤化することができる。この際に、必要に応じて凍結乾燥製剤とすることも、常法により可能である。縣濁剤として具体的には、例えばメチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、粉末トラガント、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。溶解剤として具体的には、例えば水添ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴールおよびヒマシ油脂肪酸エチルエステルを挙げることができる。安定化剤として具体的には、例えば亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムおよびエーテル等を挙げることができる。防腐剤として具体的には、例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾールおよびクロロクレゾール等を挙げることができる。
【００１１】
【発明の効果】
d-α-トコフェロールまたはトコトリエノール混合物によるラット免疫機能に対する効果
【００１２】
(1) 使用化合物
d-α-トコフェロールは、タマ生化学株式会社(山梨県)から購入した。
下記成分からなるトコトリエノール混合物を、ライオン株式会社(東京都)より提供を受けた。
──────────────────
d-α-トコトリエノール  28.3%
d-β-トコトリエノール   4.8%
d-γ-トコトリエノール  50.0%
d-δ-トコトリエノール  15.9%
──────────────────
【００１３】
酵素抗体免疫検定(ELISA法)に用いるツイン80は、和光純薬株式会社(大阪府)から購入した。
0.05%ツイン80含有PBS(TPBS)をELISAプレート洗浄液として使用した。
ブロッキング溶液(商標名;ブロック・エース)は、雪印乳業株式会社(札幌)から購入し、超純水で4倍に希釈した溶液を使用して、ELISAプレートのブロッキングに用いた。
サンプルおよび抗体の希釈には、超純水で10倍に希釈した溶液を使用した。固相抗体希釈溶液には、50mM-NaHCO3-Na2CO3(pH9.6)を用いた。
【００１４】
固相抗体は、抗ラットマウスモノクローナル抗体(α鎖特異的)をZymed社(サンフランシスコ、カルフォルニア、米国)から、ヤギ抗ラットIgE(ε鎖特異的)をBethyl社(MO、テキサス、米国)から、アフィニティ精製ヤギ抗ラットIgG F(ab')2断片およびアフィニティ精製ヤギ抗ラットIgM F(ab')2断片(μ鎖特異的)をCappel社(West Chester、ペンシルバニア、米国)から購入して用いた。これらの固相抗体は、50mM-NaHCO3-Na2CO3(pH9.6)を用いて1000倍に希釈して用いた。
【００１５】
酵素標識抗体は、ペルオキシダーゼ(POD)標識マウス抗ラットIgAおよびビオチン標識マウス抗ラットIgEをZymed社から、POD標識アビジンをDaco社(Glostrup、デンマーク)から、POD標識アフィニティ精製ヤギ抗ラットIgG F(ab')2断片およびPOD標識アフィニティ精製ヤギ抗ラットIgM F(ab')2断片をCappel社から購入した。IgAおよびIgMの酵素標識抗体は1000倍希釈液、IgGおよびビオチン抗体は2000倍希釈、アビジン抗体は5000倍希釈液を用いた。これら抗体の希釈には、ブロック・エースの4倍希釈液を用いた。
【００１６】
発色基質溶液は、0.006%-H2O2／0.2M-クエン酸緩衝溶液(pH4.0)：超純水：6mg/ml 2,2'-アニソ-ビス(3-エチルベンゾニン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)溶液＝10:9:1で混合して用いた。反応停止溶液には、1.5%-シュウ酸溶液を用いた。ELISA用プレートは、Nunc社から購入した。また吸光度測定には、Tosoh MRP-A4iマイクロプレート分光光度計を用いた。
【００１７】
(2) 実験動物
4週齢Sprague-Dawley系雄ラットをセアック吉富から購入した用いた。予備摂食用には、NMFをオリエンタル酵母株式会社から購入して用いた。食餌脂肪はリノール油脂株式会社製ベニバナ油を用い、ケルセチンはナカライテスク株式会社から購入して用いた。
【００１８】
(3) 摂食
Sprague-DawleyラットにNMFを与え、１週間予備飼育を行い、その後ラットを10匹ずつ4群に分け、それぞれ異なる組成のAIN-93調製食餌を与えた。食餌組成は重量％でカゼイン20、サフラワー油10、ビタミンミックス1.0、ミネラルミックス3.5、Choline bitartarate 0.25、L-リジン0.3、セルロース5、コーンスターチ36.8、糊化コーンスターチ13.2およびシュークロース10とした。これを対照食とし、他の3群にはそれぞれd-α-トコフェロール、トコトリエノール混合物、およびケルセチンを0.1%添加し、添加分はコーンスターチを差し引いた食餌を与えた。
【００１９】
(4) 効力検定
予備飼育終了後、3週間の摂食実験を行い、屠殺当日にラットの尾静脈から採血し、エーテル麻酔により屠殺した。得られ静脈血を10,000×Gで20分間遠心分離して血清を回収し、-30℃で凍結保存して、血清中の抗体価を酵素抗体(ELISA)法により測定した。
屠殺後、脾臓および腸間膜リンパ節(MLN)を採取した。RPMI1640培地を入れたディッシュに脾臓あるいはMLNを移し、付着した脂肪を除去した後、スライドガラスで組織を擦り潰した。この細胞縣濁液を350×gで5分間遠心し、得られた細胞ペレットをROMI1640培地に再縣濁した。この洗浄操作を3回繰り返し、細胞縣濁液を4mlのLSM上に静かに重層し1,000×gで30分間遠心してリンパ球バンドを回収した。このリンパ球画分を、RPMI1640培地に縣濁し、3回上記の洗浄操作を行った後、10%FBS含有RPMI1640培地に縣濁した。細胞数は血球測定板により測定し、2×106細胞/mlに調整して培養に供した。
このリンパ球縣濁液を細胞培養用24穴プレートに1ml添加し、5%CO2通気下で、24もしくは48時間、37℃で培養した。培養終了後、培養液をマイクロチューブに回収し、400×gで5分間遠心して培養上清を回収し、-30℃で凍結保存して抗体量の測定に供した。
【００２０】
(5) 結果
結果を、表1-3に示した(平均±標準誤差)。
各表において、異なる記号間、すなわち"aとb"または"bとa"は、統計学的に有意な差(p<0.05)があることを示し、部分的に異なる記号間、すなわち"aとab"または"abとa"は、統計学的に差(p<0.1)があることを示す。
【００２１】
0004271742.tif 000003
【００２２】
0004271742.tif 000004
【００２３】
0004271742.tif 000005
【００２４】
表1-3から、トコトリエノールが優れた免疫機能改善作用あるいは増強作用を有しており、種々の免疫不全症あるいは感染症に対して予防・改善・改良・軽減あるいは治療に有用であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  食餌による血清免疫グロブリン濃度に対する効果を示した図である。（平均±標準誤差）
【図２】  食餌によるMLNリンパ球の免疫グロブリン産生への効果を示した図である。（平均±標準誤差）
【図３】  食餌による脾臓リンパ球の免疫グロブリン産生への効果を示した図である。（平均±標準誤差）
【図１】
0004271742.tif 000006
【図２】
0004271742.tif 000007
【図３】
0004271742.tif 000008