(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＩ）
0004269333.tif 000009
（ただし、Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒは低級アルキル基を表す。）
で示される化合物を、水に可溶なエーテル系溶媒と水の混合溶媒中、酸で加水分解した後、所望により塩に変換することを特徴とする、一般式（Ｉ）
0004269333.tif 000010
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示されるハロゲノフェニルピルビン酸またはその塩の製法。
【請求項２】
一般式（ＩＩＩ）
0004269333.tif 000011
（ただし、Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒは低級アルキル基を表す。）
で示される化合物を、水酸化アルカリ金属で加水分解して、一般式（ＩＩ）
0004269333.tif 000012
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される化合物またはその塩を製した後、水に可溶なエーテル系溶媒と水の混合溶媒中、酸で加水分解し、さらに所望により塩に変換することを特徴とする、一般式（Ｉ）
0004269333.tif 000013
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示されるハロゲノフェニルピルビン酸またはその塩の製法。
【請求項３】
一般式（ＩＶ）
0004269333.tif 000014
（ただし、Ｘはハロゲン原子をあらわす。）
で示される化合物と、一般式（ＶＩ）
0004269333.tif 000015
（ただし、Rは低級アルキル基を表す。）
で示される化合物を縮合させ、一般式（ＩＩＩ）
0004269333.tif 000016
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される化合物を製した後、該化合物を水酸化アルカリ金属で加水分解して、一般式（ＩＩ）
0004269333.tif 000017
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される化合物またはその塩を製し、次いで水に可溶なエーテル系溶媒と水の混合溶媒中、酸で加水分解し、さらに所望により塩に変換することを特徴とする、一般式（Ｉ）
0004269333.tif 000018
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示されるハロゲノフェニルピルビン酸またはその塩の製法。
【請求項４】
請求項１，２または３記載の方法で一般式（Ｉ）
0004269333.tif 000019
（ただし、Ｘはハロゲン原子を表す。）
で示されるハロゲノフェニルピルビン酸またはその塩を得た後、宿主微生物中に他属の微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドを含有せしめた組換微生物またはその微生物の処理物をアミノ供与体の存在下に作用させ、さらに所望により塩とすることを特徴とする、一般式（Ｖ）
0004269333.tif 000020
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される光学活性ハロゲノフェニルアラニンまたはその塩の製法。
【請求項５】
宿主微生物中に他属の微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドを含有せしめた組換微生物が、パラコッカス属に属する微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドをエシェリシア・コリである宿主微生物中に含有せしめた組換微生物である、請求項４記載の製法。
【請求項６】
パラコッカス属に属する微生物由来のトランスアミナーゼが、パラコッカス・デニトリフィカンス由来トランスアミナーゼである、請求項５記載の製法。
【請求項７】
パラコッカス属に属する微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドが、パラコッカス・デニトリフィカンスの染色体由来のDNAを制限酵素Sau3AIで消化して得られるフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラスミドpLG339の制限酵素BamHI切断部位に組み込み、得られたプラスミドを更に制限酵素EcoRVおよびSalIで消化して得られるフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラスミドpUC18の制限酵素SmaIおよびSalI切断部位に組み込んでなるハイブリッドプラスミドであるか、該ハイブリッドプラスミドからパラコッカス・デニトリフィカンスの染色体由来のＤＮＡ断片中の、遺伝子源本来のプロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域を欠失させたハイブリッドプラスミドである、請求項５記載の製法。
【請求項８】
Ｘが臭素原子またはヨウ素原子である請求項１〜７のいずれか１項に記載の製法。
【請求項９】
Ｘが臭素原子である請求項８に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はハロゲノフェニルピルビン酸の工業的に有利な、改良された製造方法に関する。また、本発明は、光学活性なハロゲノフェニルアラニンの改良された製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
フェニルピルビン酸などのα−ケト酸は有機合成化学上のみならず生化学上きわめて重要な化合物であり、近年バイオテクノロジーの進歩と共に、食品添加剤及び農医薬に使用されるα−アミノ酸の出発原料として重要な位置を占めるに至っている。特に、ハロゲノフェニルピルビン酸は、農医薬の合成に使用されるハロゲノフェニルアラニンの原料として、近年富にその重要性を増している。
【０００３】
ハロゲノフェニルピルビン酸を製造する方法としては、５−（置換アリーリデン）ヒダントインを加水分解する方法（特開昭６１−２２０４２号公報）のほか、４−（ハロゲン置換ベンジリデン）−５−オキサゾロン化合物をアセトン−水で加水分解し、次いで得られる２−（アセチルアミノ）−３−（ハロゲノフェニル）プロペン酸を塩酸中で加水分解する方法が知られている（マツムラら、Enzymatic Synthesis of Fluorine-containing Amino acids（Kukhar'等編集、Fluorine-containing Amino Acids: Synthesis and Properties 、２４５ページ、John Wiley & Sons発行、1995年））。しかし、この方法に記載されているアセトン−水での加水分解および塩酸での加水分解は、反応が遅く、また、低収率（２０％程度）であるという欠点があった。このため、工業的・経済的により有利な製法が望まれていた。
【０００４】
また、ハロゲノフェニルピルビン酸から光学活性ハロゲノフェニルアラニンを合成する方法については、微生物由来のトランスアミナーゼを利用する方法が、前記マツムラらの文献、および、内田ら、有機合成化学協会誌、４６巻、９７７ページ（１９８８年）に記載されている。この内田らの文献では、ハロゲノフェニルピルビン酸から光学活性ハロゲノフェニルアラニンを合成するトランスアミナーゼを産生する微生物として、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、アルカリゲネス属に属する微生物を挙げ、なかでもアルカリゲネス・フェカリスが好ましい旨記載している。しかし、この反応は速度が遅く、５０％以上の収率で合成するには長時間の反応が必要である。例えば、アルカリゲネス・フェカリス由来のトランスアミナーゼを用いた反応では、２０時間後でも、ブロモフェニルピルビン酸５０ｍＭからブロモフェニルアラニン１０ｍＭが生成するにすぎない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はハロゲノフェニルピルビン酸の改良合成方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、かくして得られたハロゲン置換フェニルピルビン酸から光学活性なハロゲノフェニルアラニンを効率よく得るための製法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来技術にみられる欠点を是正し、高収率でハロゲノフェニルピルビン酸を経済的に、また工業的に有利に製造する方法を開発するために鋭意検討した結果、４−（ハロゲノベンジリデン）−５−オキサゾロン化合物を水酸化アルカリ金属で加水分解し、得られた２−（低級アルカノイルアミノ）−３−（ハロゲノフェニル）プロペン酸を、水に可溶なエーテル系溶媒と水との混合溶媒中で加水分解することにより、前記の目的が達成されることを見出した。
【０００７】
また本発明者らはそのようにして得られたハロゲノフェニルピルビン酸を、宿主微生物中に他属の微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドを含有せしめた組換微生物が産生するトランスアミナーゼで処理することにより、高収率で光学活性ハロゲノフェニルアラニンが得られることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明によれば一般式（ＩＩＩ）
【０００９】
【化１３】
0004269333.tif 000002
【００１０】
（ただし、Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒは低級アルキル基を表す。）
で示される４−（ハロゲノベンジリデン）−５−オキサゾロン化合物を水酸化アルカリ金属で加水分解して、一般式（ＩＩ）
【００１１】
【化１４】
0004269333.tif 000003
【００１２】
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される２−（低級アルカノイルアミノ）−３−（ハロゲノフェニル）プロペン酸化合物またはその塩を製し、次いで水に可溶なエーテル系溶媒と水の混合溶媒中、酸で加水分解し、さらに所望により塩に変換することにより、一般式（Ｉ）
【００１３】
【化１５】
0004269333.tif 000004
【００１４】
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示されるハロゲノフェニルピルビン酸またはその塩を製造することができる。
【００１５】
さらに本発明によれば、前記のごとくして得られたハロゲノフェニルピルビン酸（Ｉ）またはその塩に、宿主微生物中に他属の微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドを含有せしめた組換微生物または該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下作用させることにより、一般式（Ｖ）
【００１６】
【化１６】
0004269333.tif 000005
【００１７】
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される光学活性ハロゲノフェニルアラニンまたはその塩を製造することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の製法についてさらに詳細に説明する。
【００１９】
なお、本発明の製造方法において、反応に用いる化合物は反応に支障のない限り、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、たとえば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩などの金属塩、たとえばエチルアミン塩、グアニジン塩、アンモニウム塩などの塩基との塩などの塩の形で用いられてもよい。反応に用いる化合物が遊離体で得られた場合は常法によりその塩に変換し、又反応に用いる化合物が塩で得られた場合はその塩を常法により遊離体に変換することができる。
【００２０】
また本発明において、「ハロゲン原子」としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等、これら原子をいずれも好適に用いることができるが、臭素原子およびヨウ素原子がより好ましく、臭素原子が最も好ましい。
【００２１】
さらに本発明において、「低級アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味し、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。好ましくは、炭素数１〜４のアルキル基をいい、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基がその具体例として挙げられる。さらに好ましくは炭素数１または２のアルキル基（すなわち、メチル基またはエチル基）であり、とりわけメチル基が好ましい。
【００２２】
さらにまた本発明において、「低級アルカノイル」とは、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルカノイル基を意味し、具体的にはアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基などが挙げられる。好ましくは、炭素数２〜５のアルカノイル基であり、さらに好ましくはアセチル基またはプロピオニル基であり、とりわけアセチル基が好ましい。
【００２３】
本発明によれば、まず、４−（ハロゲノベンジリデン）−５−オキサゾロン化合物（ＩＩＩ）を水酸化アルカリ金属で加水分解することにより、２−（低級アルカノイルアミノ）−３−（ハロゲノフェニル）プロペン酸化合物（ＩＩ）を製する。
【００２４】
水酸化アルカリ金属は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどであり、その効果に違いはないが、水酸化ナトリウムが安価であり、工業的に好ましい。
【００２５】
水酸化アルカリ金属の使用量は、化合物（ＩＩＩ）に対し、１モル当量〜３モル当量の範囲であるが、１．１モル当量〜２モル当量の範囲が好ましく、とりわけ、１．５モル当量使用するのが良い。
【００２６】
反応は、通常、室温で実施する。このため、加熱が必要な従来方法と比較して温和な条件で反応が進行し、工業的に好ましい。なお、必要により、冷却下または加熱下に実施することもできる。
【００２７】
溶媒としては、通常、水を用いるが、反応に影響を与えない他の有機溶媒、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、メタノール、エタノールなどのアルコール類などを用いることも可能である。また、これら有機溶媒と水の混合溶媒を用いることも可能である。
【００２８】
なお、水酸化アルカリ金属で加水分解した後、酸を用いて後処理を行うことにより、カルボン酸である化合物（ＩＩ）が得られるが、所望により酸で処理することなく、アルカリ金属塩として得ることも可能である。化合物（ＩＩ）のアルカリ金属塩は、常法により単離・精製することができる。また、アルカリ金属塩を次工程に使用することもできる。
【００２９】
次いで、２−（低級アルカノイルアミノ）−３−（ハロゲノフェニル）プロペン酸化合物（ＩＩ）またはその塩を酸で加水分解し、さらに所望により塩に変換することによりハロゲノフェニルピルビン酸（Ｉ）またはその塩を製造する。
【００３０】
酸としては、通常、塩化水素、臭化水素などのハロゲン化水素を用いるが、硝酸、硫酸など、ハロゲン化水素以外の鉱酸を用いることもできる。
【００３１】
溶媒としては水に可溶なエーテル系溶媒および水との混合溶媒を用いる。水に可溶なエーテル系溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどが好しい。エーテル系溶媒は、反応の促進と収率の向上に関係し、エーテル系溶媒の量が少なければ反応の進行が遅く、必然的に長時間の反応が必要となる。反応時間が長くなると、生成したハロゲノフェニルピルビン酸の分解が起こり、収率が低下するので好ましくない。水と該エーテル系溶媒の比率は、水：エーテル系溶媒＝１０：１〜１：１０の範囲で行われるが、とりわけ、水：エーテル系溶媒＝５：１で行うことが好ましい。
【００３２】
反応は、室温から加熱下に実施することができるが、５０〜１５０℃の範囲で実施するのが好ましく、特に１００℃付近で行うのが良い。さらに本反応は、常圧下でも、加圧下でも実施することができる。
【００３３】
ハロゲノフェニルピルビン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩などのアミン塩などがあるが、これら塩への変換および単離・精製は常法により実施することができる。
【００３４】
さらに本発明によれば、前記のごとくして得られたハロゲノフェニルピルビン酸またはその塩に、宿主微生物中に他属の微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドを含有せしめた組換微生物または微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下作用させ、さらに所望によりその塩とすることにより、一般式（Ｖ）
【００３５】
【化１７】
0004269333.tif 000006
【００３６】
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示される光学活性ハロゲノフェニルアラニンまたはその塩を製造することができる。
【００３７】
トランスアミナーゼは、アミノ供与体の存在下にハロゲノフェニルピルビン酸（Ｉ）からハロゲノフェニルアラニン（Ｖ）を生成するものであればよく、芳香族アミノ酸・トランスアミナーゼ（すなわち、Aromatic-amino-acid aminotransferase）、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ（すなわちphenylalanine aminotransferase）がその例としてあげられる。
【００３８】
トランスアミナーゼをコードするDNAの供給源となる微生物としては、トランスアミナーゼを産生する能力を有する微生物であればとくに限定されず、その例としてパラコッカス属(Paracoccus)に属する微生物を挙げることができ、パラコッカス・デニトリフィカンスIFO12442(Paracoccus denitrificans IFO12442)等を好適に使用することができる。
【００３９】
トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとしては、例えばパラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の中のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする翻訳領域を用いることができる。
【００４０】
パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、例えば、文献（タカギら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、第112−119頁、1991年）記載の方法と同様に、ショットガンクローニングによりパラコッカス属微生物から以下のようにして単離することができる。
【００４１】
まずパラコッカス属微生物から染色体ＤＮＡを調製する。これを適当な制限酵素で処理（Sau3AIによる部分切断等）した後、適当なベクタープラスミドのプロモータ下流（ｐＬＧ３３９のＢａｍＨＩ切断部位、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト等）に連結する。ついで、得られた組換えプラスミドを用いて、宿主大腸菌を形質転換する。
【００４２】
形質転換株を培養し、得られた菌体を用いて、トランスアミナーゼ活性を測定することにより、組換えプラスミド上に目的遺伝子が含まれていることを確認することができる。トランスアミナーゼ活性は、フェニルピルビン酸、２−オキソ−４−フェニル酪酸などを基質とし、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などをアミノ供与体として含む反応溶液中、微生物菌体を酵素源として添加し、公知の方法により測定できる。
【００４３】
また、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、既知の塩基配列情報を利用して、取得することもできる。
【００４４】
例えば、オウエらの文献（J. Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997年）には、パラコッカス・デニトリフィカンス  ＩＦＯ１２４４２から単離したフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子を含む染色体断片の塩基配列及び当該フェニルアラニン・トランスアミナーゼのアミノ酸配列が開示されている。
【００４５】
開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼーション法などを適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子を取得できる。
【００４６】
ＤＮＡライブラリーは、パラコッカス属微生物の染色体ＤＮＡを用い、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年）に記載の方法により調製できる。
【００４７】
かくして単離されたパラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の塩基配列を決定し、翻訳領域を同定できる。この翻訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出して、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとして用いることができる。
【００４８】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡは、自然界に存在するフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を用いることもできるが、その一部の塩基配列を改変したものであってもよい。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、塩基配列を改変する際は、通常、コードするアミノ酸配列に変更が生じないように設計される。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、化学合成したＤＮＡの連結、ＤＮＡの断片化と結合、部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）（Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662〜5666頁、1984年）等を組み合わせることによって取得できる。
【００４９】
トランスアミナーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクタープラスミド中のプロモータ下流に連結することにより、トランスアミナーゼを発現するためのプラスミド（以下、トランスアミナーゼ発現プラスミドと称する）を得ることができる。
【００５０】
ベクタープラスミドは、宿主微生物中で複製可能なプラスミドであれば特に限定されない。宿主微生物として大腸菌（エシェリシア・コリ）を用いる場合、このようなベクタープラスミドとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製)、ｐＬＧ３３９（Gene、第１８巻、第３３５頁、１９８２年、ATCC37131）、ｐＵＣ１８（Gene、第３３巻、第１０３頁、１９８５年、ATCC37253）等が挙げられる。このうち、ｐＵＣ１８がとりわけ好ましい。
【００５１】
トランスアミナーゼ発現プラスミドにおいて、トランスアミナーゼをコードするＤＮＡはプロモータの下流に機能的に連結され、トランスアミナーゼは該プロモータの調節の下に発現することが好ましい。
【００５２】
プロモータは、宿主微生物中で機能し得るプロモータであればよく、特に限定されない。このようなプロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター（大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター）が挙げられる。
【００５３】
プロモータとトランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列は、トランスアミナーゼをコードするＤＮＡの制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化、断片化したＤＮＡの結合、化学合成したリンカーＤＮＡの連結、部位特異的変異導入法、ＰＣＲ法等を適宜組合わせることによって構築することができる。
【００５４】
トランスアミナーゼ発現プラスミドを、通常の形質転換法により宿主微生物に導入することにより、組換え微生物を取得できる。このような宿主微生物は特に限定されないが、エシェリシア・コリを好適に使用することができ、具体的には、エシェリシア・コリＤＨ５株、エシェリシア・コリＪＭ１０９株、エシェリシア・コリＨＢ１０１株（Journal of molecular biology、第４１巻、第４５９頁、１９６９年、ATCC33694）、エシェリシア・コリＪＭ１０５株（蛋白質・核酸・酵素、第２９巻、第２９４頁、１９８１年）等を挙げることができる。このうち、エシェリシア・コリＨＢ１０１株が好ましい。
【００５５】
かくして得られる組換微生物（形質転換体）を本発明に使用することができるが、パラコッカス属に属する微生物由来のトランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドをエシェリシア・コリである宿主微生物中に含有せしめた組換微生物を使用することが好ましい。とくに、パラコッカス・デニトリフィカンス由来トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換プラスミドをエシェリシア・コリに含有せしめた組換微生物がより好ましい。
【００５６】
具体的には、特開平１−１５３０８４号公報に記載された、パラコッカス・デニトリフィカンスの染色体由来のDNAを制限酵素Sau3AIで消化して得られるフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラスミドpLG339の制限酵素BamHI切断部位に組み込み、得られたハイブリッドプラスミドを更に制限酵素EcoRVおよびSalIで消化して得られるフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラスミドpUC18の制限酵素SmaIおよびSalI切断部位に組み込んでなるハイブリッドプラスミド（pPAP142）をエシェリシア・コリHB101株に含有せしめた微生物を使用することが好ましい。
【００５７】
また、特開２０００−２７０８８２号公報に記載された、パラコッカス・デニトリフィカンスの染色体由来のＤＮＡ断片中の、遺伝子源本来のプロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域をpPAP142から欠失させ、大腸菌でのトランスアミナーゼの発現に必要な領域のみを残したハイブリッドプラスミドpPAP243を、エシェリシア・コリＨＢ１０１株に導入した形質転換株HB101(pPAP243)を使用することが好ましい。
【００５８】
プラスミドpPAP243は、pPAP142中のトランスアミナーゼ翻訳域Ｎ末端側（１７７ｂｐ）とその上流非翻訳域の一部（９５ｂｐ）を含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製）のＥｃｏＲＶ切断部位に挿入し、得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、得られたＤＮＡ断片をpPAP142のＥｃｏＲＩ切断部位に組み込むことにより得られる。
【００５９】
本発明の製法においては、特開２０００−２７０８８２号公報に記載された、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のトランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ２４３をエシェリシア・コリＨＢ１０１株に含有せしめた形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）がとりわけ好ましい。
【００６０】
酵素反応に用いる微生物（生菌体、培養物等）及びそれらの処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、培養上清、菌体破砕物、菌体自己消化物、菌体抽出物等）は、トランスアミナーゼ活性を有するものであればよく、その形態は特に限定されない。
【００６１】
微生物の培養は常法により行うことができる。例えば、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地のpHを5.0〜9.0に調整し、これに微生物を接種したのち10〜45℃、好ましくは28〜37℃で、好気的に培養すればよい。トランスアミナーゼがｌａｃプロモータの制御下に発現するよう構築されている場合には、培地中にラクトース、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドなどの酵素誘導物質を添加することが、トランスアミナーゼ発現を高めるために望ましい。
【００６２】
微生物の培養液から遠心分離またはろ過等により生菌体を得ることができる。また、生菌体を生理食塩水等で洗浄することにより洗浄菌体を得ることができ、生菌体や洗浄菌体等を凍結乾燥またはアセトン乾燥することにより乾燥菌体を得ることができる。また、生菌体、洗浄菌体等を種々の物理化学的方法（例えば、超音波、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、アルミナ破壊、溶菌酵素、界面活性剤または有機溶媒等で処理）で処理することにより、菌体の破砕物を得ることができ、これら菌体や細胞の破砕物からろ過または遠心分離などにより固形物を除去することによって菌体の抽出物を得ることができる。
【００６３】
また、触媒の経済的使用の点から、得られた酵素、菌体抽出物等を、適当な固体支持体に固定化し、反復して使用可能な固定化酵素としてバイオリアクター用に調整してもよい。そのような酵素の固定化方法は当該技術分野で既知である。
【００６４】
基質とするハロゲノフェニルピルビン酸およびアミノ供与体は、遊離の形でも塩の形でも反応系に供することができる。
【００６５】
アミノ供与体としては、例えばＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸が挙げられ、Ｌ−アスパラギン酸が好ましい。アミノ供与体は、ハロゲノフェニルピルビン酸１モルに対して通常１〜３モル、とりわけ１．３〜１．５モル使用するのが好ましい。
【００６６】
酵素反応は、トランスアミナーゼの安定性を考慮して４０℃未満で行うのが好ましいが、とりわけ28〜37℃で実施するのが好ましく、また、そのpHは７〜９となるよう調整するのが好ましい。また、上記酵素反応に際しては、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム等の界面活性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度になるよう添加しておくことにより酵素反応を促進させることもできる。
【００６７】
反応液中に生成した目的ハロゲノフェニルアラニンの分離精製は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独で、或いは組合せることにより、容易に行うことができる。
【００６８】
なお、原料化合物である４−（ハロゲノベンジリデン）−５−オキサゾロン化合物（ＩＩＩ）は、一般式（ＩＶ）
【００６９】
【化１８】
0004269333.tif 000007
【００７０】
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示されるハロゲノベンズアルデヒドと、一般式（ＶＩ）
【００７１】
【化１９】
0004269333.tif 000008
【００７２】
（ただし、記号は前記と同一意味を有する。）
で示されるＮ−低級アルカノイルグリシンを縮合させることにより得られる。化合物（ＩＶ）と化合物（ＶＩ）との縮合反応は、常法により、例えば、塩基と脱水剤の存在下に、適当な溶媒中もしくは無溶媒で実施される。塩基としては、酢酸ナトリウムを好適に用いることができる。脱水剤としては、無水酢酸を好適に用いることができる。無水酢酸を適当量使用する場合、例えば、化合物（ＩＶ）に対して無水酢酸を２モル当量以上使用する場合には、特に溶媒を使用する必要がない。もし溶媒を使用するのであれば、反応に影響を与えない溶媒であれば特に制限がない。本反応は、室温から加熱下、好ましくは、１００〜１５０℃で実施する。
【００７３】
【実施例】
実施例１
（１）２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３８２ｍｌに参考例１で得られた４−（４−ブロモベンジリデン）−２−メチル−５−オキサゾロン１３８．３ｇを加え、室温で４時間撹拌した。水で希釈した後、ノライトを加え、室温で一晩放置した。不溶物をろ過した後、ろ液を酢酸エチルで洗浄した。濃塩酸でろ液を酸性にし、氷冷した。析出した結晶をろ取し、水洗後、送風乾燥して２−（アセチルアミノ）−３−（４−ブロモフェニル）プロペン酸１３３．６ｇを得た。融点：２２１−２２２℃
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて純度を測定したところ、純度は８９％であり、収率は８１％と計算された。
ＨＰＬＣ条件
カラム：CHIRALCEL OJ（ダイセル化学工業社製）、溶出溶媒：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９２／８／０．５、流速：1.0 ml／分、温度：４０℃、検出：２５４ｎｍ。
【００７４】
（２）２−（アセチルアミノ）−３−（４−ブロモフェニル）プロペン酸４０．０ｇ、２Ｎ塩酸８００ｍｌ、ジオキサン１６０ｍｌの混合物を、１００℃で４時間撹拌した。放冷後、液量を半分程度まで濃縮し、氷冷した。析出した結晶をろ取し、水洗後、送風乾燥し、（４−ブロモフェニル）ピルビン酸３２．７ｇを得た。融点：１７９−１８１℃
前記ＨＰＬＣ条件で純度を測定したところ、純度８８％であり、収率は９５％と計算された。
【００７５】
実施例２
生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０３％カラリンを含む培地（ｐＨ７．０））１００ｍｌに、大腸菌形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）を１白金耳植種し、３７℃で２４時間培養した。この培養液を８０００×ｇで遠心分離して、上清液を除去した。沈殿した菌体に対して最初の培養液量になるように精製水を加え、酵素溶液とした。こうして得られた酵素溶液７００ｍｌに実施例１で得られた（４−ブロモフェニル）ピルビン酸９．６４ｇ、Ｌ−アスパラギン酸モノナトリウム塩１水和物９．０９ｇを加え、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．６に調整し、３０℃で撹拌して酵素反応を行った。反応開始後、２時間後まで３０分間隔で、（４−ブロモフェニル）ピルビン酸２．８９ｇとＬ−アスパラギン酸モノナトリウム塩１水和物２．７３ｇを添加した。その際、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．６に調整した。次いで、５時間後まで1時間間隔で（４−ブロモフェニル）ピルビン酸２．８９ｇとＬ−アスパラギン酸モノナトリウム塩１水和物２．７３ｇを添加した（２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．６に調整）。反応開始後７時間目に酵素溶液２００ｍｌを添加し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．６に調整して、２１時間撹拌した。後記HPLC条件（１）にて測定したところ、反応液中のＬ−４−ブロモフェニルアラニンへの転換率は９２．２％であった。反応終了後、３０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて塩基性とした後、８０００×ｇで遠心分離して、上清液を採取した。上清液に濃塩酸を加えて弱酸性とした後、液量がおよそ１／８〜１／９になるまで減圧濃縮した。５０℃に加熱後、冷却し、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を洗浄、乾燥して、Ｌ−４−ブロモフェニルアラニン２０．５ｇを得た。融点：２１３−２１４℃。後記ＨＰＬＣ条件（２）にて、光学純度を測定したところ、光学純度は１００％であった。
ＨＰＬＣ条件（１）
カラム：Nucleocil 10C18 (MACHEREY-NAGEL社製）、溶出溶媒：４０mM KH2PO4-H3PO4 (pH 2.5)／アセトニトリル＝９／１，流速：1.0 ml／分、温度：５０℃、検出：２５４ｎｍ。
ＨＰＬＣ条件（２）
カラム：Crownpak CR(+) (4.0×250mm)（ダイセル化学工業製）、溶出溶媒：HClO4 (pH2.0) ／メタノール=85／15、流速：0.4 ｍｌ／分、温度：２５℃、検出：２５４ｎｍ
参考例１
４−ブロモベンズアルデヒド１１０ｇ、Ｎ−アセチルグリシン６９．６ｇ、酢酸ナトリウム３６ｇ、無水酢酸１５１．７ｇを８０−１００℃で溶解した後、１４０℃で１時間撹拌した。一晩室温で放置し、析出結晶をろ取し、水洗、乾燥して、４−（４−ブロモベンジリデン）−２−メチル−５−オキサゾロン１４０．４ｇを得た。
【００７６】
参考例２
（１）発現プラスミドｐＰＡＰ１４２の調製
タカギらの文献（Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、112-119頁、1991年）または特開平１−１５３０８４号公報記載の方法に従って、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans IFO12442）の染色体ＤＮＡからトランスアミナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、これを含む組換え発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を得た。
ｐＰＡＰ１４２は、トランスアミナーゼ遺伝子を含むパラコッカス・デニトリフィカンス染色体ＤＮＡ断片（約２．２ｋｂ）が、ベクタープラスミドｐＵＣ１８のｌａｃプロモータ下流に連結されている。この染色体ＤＮＡ断片中、トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の上流には、パラコッカス・デニトリフィカンス由来の、プロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域が存在する。
【００７７】
（２）発現プラスミドｐＰＡＰ２４３の調製
前記(１)で得たプラスミドｐＰＡＰ１４２から、パラコッカス・デニトリフィカンス由来の、プロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域を欠失させたプラスミドを、特開２０００−２７０８８２号公報記載の方法に従って構築した。まず、ｐＰＡＰ１４２を鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）により、ｐＰＡＰ１４２中のトランスアミナーゼ翻訳域Ｎ末端側（１７７ｂｐ）とその上流非翻訳域の一部（９５ｂｐ）を含む断片を増幅した。PCRのためのプライマーとしては、合成オリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーに用いた。センスプライマーの配列は、上流非翻訳域部分配列のＮ末側を一部改変してＫｐｎＩ認識部位が生成されるように設計した。また、アンチセンスプライマーの配列は、トランスアミナーゼ翻訳域中の部分配列に基づいて設計した。ＰＣＲは、5μｌ（0.09μｇ）のプラスミドpPAP142、各4μＭのプライマー、1.0単位のＤＮＡポリメラーゼ、5μｌの10倍緩衝液、各5μｌ（2mM）のデオキシＮＴＰおよび30.5μｌの水からなる混合液を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の工程を、３０回繰り返して行った。反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＰＣＲ産物のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）をゲル中から回収した。得られたＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製）のＥｃｏＲＶで切断部位に挿入し、プラスミドｐＢＳＫ１を得た。プラスミドｐＢＳＫ１をさらにＥｃｏＲＩで切断し、得られた約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＰＡＰ１４２のＥｃｏＲＩ切断断片（約３８００ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ遺伝子の３’末端側を含む）と連結して、組換え発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を得た。
【００７８】
(３)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の取得
前項(２)で得た発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を、常法によりエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株に導入し、形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）を得た。
【００７９】
【発明の効果】
本発明の製法は、従来法におけるハロゲノフェニルピルビン酸の低収率および長時間の反応が必要という欠点を解消するもので、工業的に有利な方法である。
【００８０】
また、本発明のトランスアミノ化法により、比較的短時間で収率良く光学活性ハロゲノフェニルアラニンを得ることができる。