(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互にアフィニティーを有する２つのポリペプチドを含有してなる融合ポリペプチドであって、一方のポリペプチドがインターロイキン−６ファミリーのサイトカインであり、他方のポリペプチドが該サイトカインに対応したサイトカインレセプターであり、該２つのポリペプチドはポリペプチドリンカーを介して互いに結合してなる、融合ポリペプチド。
【請求項２】
該レセプターが該サイトカインに結合するサブユニットの型で存在することを特徴とする、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
該サイトカインが該サイトカインレセプターに結合するサブユニットの型で存在することを特徴とする、請求項１または２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
該サイトカインレセプターがＩＬ−６レセプターであり、該サイトカインがＩＬ−６であることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
該サイトカインレセプターがＣＮＴＦレセプターであり、該サイトカインがＣＮＴＦであることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。
【請求項８】
請求項７記載の発現プラスミドを含む形質転換体。
【請求項９】
蛋白質間の相互作用に影響を及ぼすための、請求項１〜５いずれか記載の融合ポリペプチドおよび請求項６記載のＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、蛋白質間の相互作用に影響を及ぼすのに適するコンジュゲート、かかるコンジュゲートをコードするＤＮＡおよびかかるコンジュゲートの使用に関する。
生物で起こる多くのプロセスは、蛋白質間の相互作用に基づいている。かかる相互作用の例は、レセプターとそれに結合するリガンドにおいて見出される。しかしながら、蛋白質の相互作用は不均衡であることが多い。これは、相互作用に関与する個々の蛋白質が修飾され、同様に関与する他の蛋白質に対するアフィニティーが変化するという事実による。相互作用に関与する個々の蛋白質が欠けてもよい。これは、例えば、インターロイキン−６（ＩＬ−６）に応答しない細胞の場合において見出される。かかる細胞は、不完全なインターロイキン−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）を有する、即ち、このレセプターは、単に細胞内シグナル誘因サブユニットｇｐ１３０のみを包含するが細胞外ＩＬ−６結合サブユニットを包含しない。
蛋白質間の不均衡な相互作用を改善するために多くの試みがなされてきた。例えば、これは、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）と可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）（１２８０ｎｇ／ｍｌ）の投与による不完全なインターロイキン−６レセプターの場合に試みられる。しかしながら、ｓＩＬ−６Ｒは、真核細胞に由来する場合のみ生物学的に活性であり、それから得られる収量は、１〜６ｍｇ  ｓＩＬ−６Ｒ／ｌの範囲であるので、ｓＩＬ−６Ｒの提供は高価で時間がかかる。したがって、前記投与は、不完全なインターロイキン−６レセプターの場合における不均衡な相互作用を持続的に改善するには好適な手段ではない。
したがって、本発明の目的は、特に、不完全なインターロイキン−６レセプターの場合において、蛋白質間の不均衡な相互作用が改善されうる製品を提供することにある。
本発明によれば、これは、請求の範囲に規定された主題により達成される。
したがって、本発明の主題は、相互にアフィニティーを有するポリペプチドであって、リンカーを介して互いに結合している２つのポリペプチドを含有するコンジュゲートに関する。
「相互にアフィニティーを有するポリペプチド」という用語は、互いにアフィニティーを有するいかなる種類、起源および長さのポリペプチドにも関する。２つのかかるポリペプチドが本発明のコンジュゲートに存在する。これらのポリペプチドの一方はレセプターであってもよく、他方は該レセプターに結合するリガンドであってもよい。該レセプターは、該リガンドに結合可能なそのサブユニットおよびそれの機能的部分それぞれの型で存在してもよい。同様に、該リガンドは、該レセプターに結合可能なそのサブユニットおよびそれの機能的部分それぞれの型で存在してもよい。該レセプターは、サイトカインレセプター、具体的には、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子またはインターロイキンに対するレセプターであることが好ましい。レセプターは、インターロイキン−６レセプターまたはＣＮＴＦレセプターであることが特に好ましい。同様のことは、リガンドにも相応じて適用される。該リガンドは、サイトカイン、具体的には、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子またはインターロイキンであることが好ましい。リガンドは、インターロイキン−６ファミリーのメンバー、具体的には、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦ、ＯＳＭ、ＬＩＦまたはＣＴ−１であることが特に好ましい。レセプターとリガンドは、野生型の配列または１個もしくは数個のヌクレオチドがそれとは異なる配列からなってもよい。結論として、レセプターとリガンドは、改良されたおよび／または新規な性質を有してもよい。例えば、改良された性質は、レセプターとリガンド間の結合が改良されるという事実により表わされてもよい。例えば、新規な性質は、リガンドがレセプターに結合した後に反応する蛋白質に関して、改変された挙動を示すという事実により表されてもよい。例えば、ＩＬ−６は、ＩＬ−６レセプターとより強固に結合するがｇｐ１３０蛋白質をもはや活性化できないという効果に合わせて改変されてもよい。かかる場合において、ＩＬ−６は、図３の配列またはその断片からなることが好ましい。野生型のレセプターとリガンドの配列のそれぞれの改変においてなされた前述のことは、相互の結合に関与する他のサブユニットおよびその機能的部分に相応じて適用する。
「リンカー」という用語は、ポリペプチドを結合するのに適するいかなる種類のリンカーにも当てはまる。かかるリンカーの例としては、ＤＰＤＰＢ等の二官能性の化学架橋剤である。さらに、該リンカーは、両ポリペプチドにより形成されたジスルフィドブリッジであってもよい。また、該リンカーは、ポリペプチドであってもよい。
好ましい態様において、前記コンジュゲートは、融合ポリペプチドである。それは、相互にアフィニティーを有し、互いに融合している２つのポリペプチドを含有してもよく、リンカーは、２つのポリペプチドにより形成されたジスルフィドブリッジに相当してもよい。該リンカーは、２つの他のポリペプチドを互いに結合するポリペプチドであることが好ましい。後者の融合ポリペプチドの例を図１および２に示す。これらの融合ポリペプチドは、ヒトｓＩＬ−６Ｒポリペプチド、即ち、インターロイキン−６レセプターの細胞外サブユニットとヒトＩＬ−６ポリペプチドとを含有し、該ポリペプチドは、異なるポリペプチドリンカーを介して互いに結合している。これらの融合ポリペプチドを、Ｈ−ＩＬ−６と称する。また、ｓＩＬ−６ＲポリペプチドのＰｒｏ１１４からＡｌａ３２３までのアミノ酸のみを含有するＨ−ＩＬ−６の改変体も提供される。さらに、ｓＩＬ−６Ｒポリペプチドの１１３位から３２３位までのアミノ酸とＩＬ−６ポリペプチドの２９位から２１２位のアミノ酸とを含有するＨ−ＩＬ−６の改変体が提供される。また、ＩＬ−６ポリペプチドが図３の配列からなる融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６が提供される。この融合ポリペプチドのｓＩＬ−６Ｒポリペプチドは、ｓＩＬ−６Ｒポリペプチドの全長の配列およびアミノ酸１１３（１１４）位から３２３位の間の配列をそれぞれ含有する。その他にも、両ポリペプチドがポリペプチドリンカーを介して互いに結合しているヒトＣＮＴＦレセプターの細胞外サブユニットとヒトＣＮＴＦとを含有する融合ポリペプチドが提供される。
本発明のさらなる主題は、前記融合ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。該ＤＮＡは、相互にアフィニティーを有する両ポリペプチドがポリペプチドリンカーを介して互いに結合している融合ポリペプチドをコードすることが好ましい。後者のＤＮＡの例を図１に示す。このＤＮＡは、１９９６年２月２７日にＤＳＭ  １０５４９のもとに、ＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）［ドイツタイプ  コレクション  オブ  マイクロオーガニズム  アンド  セル  カルチャーズ］にＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６として寄託された。
本発明のＤＮＡは、ベクターおよび発現ベクター中にそれぞれ存在することができる。当業者は、その例に精通している。大腸菌の発現ベクターの場合、これらは、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂおよびｐＱＥ−８である。酵母における発現に対しては、例えば、ｐＹ１００、Ｙｃｐａｄ１およびピヒア  パストリス（Pichia pastoris）用のベクターが挙げられ、後者が好ましく、一方、必要に応じて生体内または生体外に存在する動物細胞における発現に対しては、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＣＥＶ４およびｐＣＤＭ８が示され、後者が好ましい。昆虫細胞における発現に対しては、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａが特に好ましい。当業者であれば、ｓＩＬ−６Ｒ配列を含む本発明のＤＮＡの発現に関して、真核細胞における発現を可能にするベクターを使用することが有利であるということを斟酌するであろう。
しかしながら、当業者は、発現ベクターに存在する前記ＤＮＡを発現させるために適する細胞に精通している。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９、酵母株サッカロミセス  セレビシエおよびピヒア  パストリスを含み、後者が好ましく、動物細胞Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａおよびＣＯＳを含み、後者が好ましく、ならびに昆虫細胞ｓｆ９が含まれる。
当業者は、本発明のＤＮＡを発現ベクターに挿入する方法を知っている。また、当業者は、細胞の形質転換および細胞のトランスフェクションのそれぞれ、次いで、それらを培養する条件を知っている。当業者は、本発明のＤＮＡにより発現される融合ポリペプチドを単離および精製する方法にも精通している。
本発明のさらなる主題は、前記融合ポリペプチドに対する抗体に関する。かかる抗体は、常法により調製することができる。該抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナルそれぞれであってもよい。該抗体の調製のためには動物、具体的には、ポリクローナル抗体のためにはウサギまたはニワトリ、モノクローナル抗体のためにはマウスを前記融合ポリペプチドで免疫することが好ましい。動物のさらなる「ブースター」は、同じ融合ポリペプチドで行なうことができる。次いで、ポリクローナル抗体が動物の血清および卵黄それぞれから得られる。モノクローナル抗体の調製のためには、動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。
本発明により、蛋白質間の相互作用に影響を及ぼすことが可能である。これは、本発明のコンジュゲートを投与したり、本発明のＤＮＡを遺伝子治療に使用することによりなされうる。特に、不完全なインターロイキン−６レセプターの場合において、不均衡な相互作用を改善することができる。本発明は、経費上有効な様式で使用できるという点が顕著である。これは、特に、不完全なインターロイキン−６レセプターの場合において不均衡な相互作用に影響を及ぼすために本発明のコンジュゲートを投与する際に証明される。
さらに、本発明は、幹細胞、特にヒト幹細胞のエクス・ビボでの拡張に適する。これに関して、軟寒天中の幹細胞のコロニーをより多く得ることは、個々のＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒ成分での能力よりも本発明のコンジュゲートＨ−ＩＬ−６により可能であることが特に注目に値する。したがって、本発明は、血液細胞の形成の十分計算された影響力に重要な貢献もする。
また、ＩＬ−６ポリペプチドとして図３の配列を含有する融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６により、本発明はＩＬ−６レセプターアンタゴニストとして好適な生成物も提供する。かかる生成物は、治療上非常に重要である。
本発明の実施は、本発明の抗体により制御することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６のアミノ酸（ＤＮＡ）配列を示す。制限酵素ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）、シグナルペプチド（ＭＬＡＶＧＣＡＬＬＡＡＬＬＡＡＰＧＡＡ）およびリンカー（ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥ）に関する配列を示す。該リンカーは、ヒトｓＩＬ−６ＲのＣＯＯＨ末端をヒトＩＬ−６のＮＨ2末端と連結する。
図２は、本発明の融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６のアミノ酸（ＤＮＡ）配列を示す。制限酵素Ｓａｌｌ（ＧＴＣＧＡＣ）、シグナルペプチド（ＭＬＡＶＧＣＡＬＬＡＡＬＬＡＡＰＧＡＡ）およびリンカー（ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥ）に関する配列を示す。該リンカーは、ヒトｓＩＬ−６ＲのＣＯＯＨ末端をヒトＩＬ−６のＮＨ2末端と連結する。
図３は、本発明の融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６に存在するＩＬ−６ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図４は、本発明の融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６の拡張とコロニー形成能を示す。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例１：本発明のＤＮＡの調製
図１のＤＮＡを調製した。この目的のために、ヒトＩＬ−６Ｒ  ｃＤＮＡ（スクールティンク（Schooltink）ら、Biochem．J．（1991）277，659-664）を使用した。このｃＤＮＡを、制限部位ＸｈｏＩを介して発現プラスミドｐＣＤＭ８にクローニングした（ミュルベルク（Mullberg）ら、Eur．J．Immunol．（1993）23，473-480）。プライマー（１）（ｐＣＤＭ８  ５’プライマー：５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’）およびプライマー（２）（ｓＩＬ−６Ｒ  ３’プライマー：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡ３’）を用いて通常の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｓＩＬ−６Ｒ断片を生成した。制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｈｏＩでの切断後、この断片を開裂させたプラスミドｐＣＤＭ８にクローニングした。プラスミドｐＣＤＭ８−ｓＩＬ−６Ｒが生成した。その後、また、ＸｈｏＩを用いて発現プラスミドｐＣＤＭ８にクローニングされたＩＬ−６  ｃＤＮＡで、第２のＰＣＲ反応を行なった。プライマー（３）（ＩＬ−６−５’プライマー：５’ＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡ３’）およびプライマー（４）（ｐＣＤＭ８  ３’プライマー：５’ＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴ３’）を使用した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、プラスミドｐＣＤＭ８−ｓＩＬ−６Ｒにクローニングした。プラスミドｐＣＤＭ８−ｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６が生成した。その後、２つのオリゴヌクレオチド：プライマー（５）（５’ＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧ３’）およびプライマー（６）（５’ＴＣＧＡＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣ３’）からなる合成リンカーを調製した。標準的方法に従って、オリゴヌクレオチド（５）および（６）を組み合わせて二本鎖にした後、制限酵素ＸｈｏＩにより消化したプラスミドｐＣＤＭ８−ｓＩＬ−Ｒ−ＩＬ−６にクローニングした。プラスミドｐＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６が生成した。
実施例２：本発明のＤＮＡの調製
図２のＤＮＡを調製した。この目的のために、実施例１に記載の工程を行なった。しかしながら、以下のプライマー：プライマー（５）（５’ＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧ３’）およびプライマー（６）（５’ＴＣＧＡＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣ３’）をプライマー（５）および（６）として使用した。プラスミドｐＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６−（２）が得られた。
実施例３：本発明の融合ポリペプチドの発現
ＣＯＳ−７細胞を、実施例１のｐＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６および実施例２のｐＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６（２）それぞれでエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。１０7個のＣＯＳ−７細胞を、９６０μＦおよび２３０Ｖでジーンパルサー（Bio-Rad）により２０μｇのプラスミドでエレクトロポレーションした。トランスフェクション後４８時間で、該細胞を［35Ｓ］システイン／メチオニンを用いて４時間、代謝的に放射性標識し、放射性標識されていないアミノ酸で２時間インキュベートした。細胞溶解液由来の上清と細胞上清を、抗ＩＬ−６抗体を用いて標準法（ミュルベルクら、Eur．J．Immunol．（1993）23，473-480）に従って免疫沈降させ、ＳＤＳゲル電気泳動後のオートラジオグラフィーにより可視化した。トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、抗ＩＬ−６抗体により認識され、トランスフェクトしない細胞により生成されない７０〜７５ｋＤａの蛋白質を分泌した。
トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の上清を、ＳＤＳゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに転写して抗ＩＬ−６抗体で検出した。また、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、抗ＩＬ−６抗体により認識される７０〜７５ｋＤａの蛋白質を発現した。
トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の上清を、ＩＬ−６用の市販のＥＬＩＳＡ（ＣＬＢ、アムステルダム、オランダ）およびｓＩＬ−６Ｒ用の市販のＥＬＩＳＡ（Seromed、ギーセン、独国）により調べた。Ｈ−ＩＬ−６は、両ＥＬＩＳＡにより検出された。細胞上清中のＨ−ＩＬ−６の濃度は、約１μｇ／ｍｌであった。
実施例４：本発明の融合ポリペプチドによるハプトグロビン発現の刺激
ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６およびＨｅｐＧ２−ＰＤＩを使用した。
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８０６５）は、ＩＬ−６により刺激されてハプトグロビンを発現するが、ｓＩＬ−６Ｒでは発現しない。
ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞は、ＨｅｐＧ２細胞のヒトＩＬ−６発現プラスミドでの安定なトランスフェクションにより得られた。ＩＬ−６の発現のため、これらの細胞は、内在性のＩＬ−６Ｒをダウンレギュレートし、よってＩＬ−６Ｒを発現しない。ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞は、ＩＬ−６により刺激されてハプトグロビンを発現しないが、ｓＩＬ−６Ｒでは発現する。
ＨｅｐＧ２−ＰＤＩ細胞は、ＨｅｐＧ２細胞のヒトＩＬ−６発現プラスミドでの安定なトランスフェクションにより得られた。この目的のために、発現したＩＬ−６蛋白質は、小胞体（ＥＲ）に対するＣＯＯＨ末端保持シグナルを含むように、ＩＬ−６ｃＤＮＡを含んでいた。結論として、これらの細胞は、ＥＲ中で、発現したＩＬ−６のみならず、ＩＬ−６Ｒも保持した。ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞に比べて、ＨｅｐＧ２−ＰＤＩ細胞は、ＩＬ−６を分泌せず、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの組合せにより刺激されてハプトグロビンを発現できるのみである。
前記肝がん細胞株を、９６ウエルの細胞培養プレート中で標準条件下で培養した（ローズ−ジョン（Rose-John）ら、J．Biol．Chem．268（1993），22084-22091）。該細胞を、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６、ＩＬ−６＋ｓＩＬ−６Ｒ、ならびにｐＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６、ｐＣＤＭ８−Ｈ−ＩＬ−６（２）およびｐＣＤＭ８それぞれで１８時間トランスフェクトした実施例３のＣＯＳ−７細胞に由来する細胞上清それぞれで刺激した。細胞上清を回収し、該上清中のハプトグロビン濃度をＥＬＩＳＡにより決定した（表１を参照のこと）。
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本発明の融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６は、細胞におけるハプトグロビンの発現を刺激すること、即ち、蛋白質間の相互作用に影響を及ぼすことが可能であることが示された。
実施例５：本発明の融合ポリペプチドによるヒトＣＤ３４+細胞の拡張とコロニーの形成
ヒト骨髄および幹細胞がＧ−ＣＳＦの注射により動員された患者の血液それぞれから、表面マーカーＣＤ３４を発現する細胞を単離した。これらの細胞の６０００個を細胞培養容器中の３ｍｌの培地に播種した。２週間後、サイトカインＳＣＦ、ＩＬ−３およびＨ−ＩＬ−６（本発明の融合ポリペプチド）ならびにＳＣＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−６との該細胞のインキュベーションが強い増殖を引き起こすことがわかった。得られた細胞の１０００個を新しい細胞培養容器に播種した。標準化されたコロニー誘導実験において２週間後、ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＨ−ＩＬ−６で処理した細胞は、ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−６で処理した細胞よりも約３倍多いコロニーを形成可能であった。
この結果は、本発明の融合ポリペプチドＨ−ＩＬ−６により刺激された細胞は、ＩＬ−６により刺激された細胞よりも高いコロニー形成能を有することを示す（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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