(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記コード配列がSEQ ID NO:１に示すものである、請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】
SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、0.25Ｍ Na2HPO4、pH7.2、6.5％SDS、10％デキストランスルフェート中、65℃、一夜のハイブリダイゼーション及び0.1×SSC、0.1％SDS中、60℃での洗浄を含んで成るストリンジェント条件下で請求項３記載の核酸とハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項５】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29及びSEQ ID NO:42に示すものから選ばれるポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の核酸分子。
【請求項６】
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33及びSEQ ID NO:41に示すヌクレオチド配列から選ばれるコード配列を含む、請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
前記コード配列が、SEQ ID NO:23に示す配列を有する分子内に含まれるSEQ ID NO:24に示すものである、請求項６記載の核酸分子。
【請求項８】
SEQ ID NO:４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項９】
SEQ ID NO:３に示すアミノ酸配列を含む請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:３、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29及びSEQ ID NO:42に示すものから選ばれるポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項８又は９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
SYFHLFPPPPSPCTDSS（SEQ ID NO:403），
VDGRQNIKRAKDDGT（SEQ ID NO:404），
EVLFTTGLIRPVALVVDN（SEQ ID NO:405）及び
IQGHLDFVMDILVFHS（SEQ ID NO:406）
から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項９又は10記載のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１２】
SEQ ID NO:３に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基25〜1385のLRP5細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項９又は10記載のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１３】
SEQ ID NO:３に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基1409〜1615のLRP5細胞質ドメインを含む、請求項９又は10記載のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１４】
請求項８〜10のいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法であって、それをコードする核酸からの当該ポリペプチドの発現を含む組換え方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの単離及び／又は精製を更に含む、請求項14記載の組換え方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドを少なくとも一種の追加成分を含む組成物へと処方することを更に含む、請求項14又は15記載の組換え方法。
【請求項１７】
請求項８〜10のいずれか１項記載のポリペプチド及び薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項１８】
請求項11〜13のいずれか１項記載のフラグメントの製造方法であって、それをコードする核酸からの当該フラグメントの発現を含む方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドの単離及び／又は精製を更に含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドを少なくとも一種の追加の成分を含む組成物に処方することを更に含む、請求項18又は19記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか１項記載の核酸分子と薬理学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項２２】
請求項８〜10のいずれか１項記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項２３】
SYFHLFPPPPSPCTDSS（SEQ ID NO:403），
VDGRQNIKRAKDDGT（SEQ ID NO:404），
EVLFTTGLIRPVALVVDN（SEQ ID NO:405）及び
IQGHLDFVMDILVFHS（SEQ ID NO:406）
から選ばれるアミノ酸配列に結合する請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
請求項22又は23記載の抗体及び薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項２５】
LRP5活性のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、ここで当該活性は（1）LRP5ポリペプチドのLDL結合及びその取り込み、並びに（2）トリグリセリド及びリポタンパク質レベルのLRP5ポリペプチドの調節からなる群から選ばれ、当該方法は：
a）SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.403，SEQ ID NO.404，SEQ ID NO.405又はSEQ ID NO.406に示すアミノ酸配列を含んでなる組換LRP5ポリペプチドを用意し；
b）前記LRP5ポリペプチド及び試験物質を接触させ；そして
c）前記試験物質により前記LRP5ポリペプチドの活性を試験し；そして
d）前記試験物質による前記LRP5ポリペプチドの活性を試験物質抜きでの前記LRP5ポリペプチドの活性と比較し、ここで当該活性の差は前記試験物質がLRP5活性を調節することを示唆する；
工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はLDL−レセプターファミリーの構成員であることを特徴とし、且つ１型糖尿病としても知られるインスリン依存性真性糖尿病（「IDDM」）に対する感受性に関与するいくつかの対立形質の指標となる遺伝子の同定に関連し、且つそれを基礎とする核酸、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、診断又は予後の方法、並びにその他の方法に関する。
より詳しくは、本発明はここではじめて明らかにされ、且つLDLレセプターファミリーの構成員として同定されたコードポリペプチドの特徴に基づく、本発明者が「LDL−レセプター関連タンパク質−５（LRP5）」と命名した遺伝子のクローニング及び特性決定を基礎とする。更に、LRP5がIDDM感受性遺伝子IDDM４であるとの示唆を供する実験的証拠を本明細書に含ませる。
発明の背景
グルコースホメオスタシスの調節不全である糖尿病は人口の約６％に影響を及ぼしている。ヨーロッパ系人口の0.4％までに影響を及ぼしている最も深刻な形態、１型糖尿病はインスリン産生性の膵臓のβ細胞の自己免疫崩壊により発症し、その発症ピーク年齢は12才である。β細胞崩壊は不可逆的であり、そして注射によるインスリン代替にかかわらず、患者は早期死亡、腎不全及び盲目を患う（Bach, 1994；Tisch and McDevitt, 1996）。従って、遺伝的研究の主たる狙いは１型糖尿病にかかり易い遺伝子の同定及び病気のメカニズムを理解し、且つβ細胞の総合的崩壊及びその病気を予測及び予防するためにこの情報を利用することにある。
１型糖尿病の遺伝の態様は単純なメンデルパターンには従わず、そして感受性ゲノタイプと病気の発症との一致は、一卵性双子の30〜70％の一致により示される通り、100％をはるかに下まわる（Matsuda and Kazuya, 1994；Kyvikら、1995）。糖尿病は協奏作用し合ういくつかの遺伝子又はポリジーンにより発症し、そのことは個々の遺伝子の同定及び単離を極めて困難なものとする。
主要IDDM座は染色体6p21上の主要組織適合性複合体（MHC）によりコードされる（IDDM１）。この遺伝子座での家族性分類度λS＝2.5であり、ここでλS＝期待Ｐ〔同祖的（IBD）座にあるゼロ対立形質の共有〕／実測Ｐ〔ゼロ対立形質IBDの共有〕であり（Risch 1987；Todd, 1994）、そして染色体11p15上の第２座IDDM２、インスリンミニサテトライトではλS＝1.25である（Bellら、1984；Thomsonら、1989；Owerbachら、1990；Julierら、1991；Bainら、1992；Spielmanら、1993；Daviesら、1994；Bennettら、1995）。これらの座は機能的候補としてのその状況に基づき小ケースコントロール連合研究によりまず検出され、それは更なるケースコントロール、連合及び連鎖研究によりその後確認された。
しかしながら、これら２つの座は家族内で観察される全ての病気分類を司ることはできず（λS＝15）、それは患者の兄弟の危険率と集団有病率との比（６％／0.4％）から推定される（Risch, 1990）。我々は、病気遺伝子に連結したマーカーが冒されている兄弟において過剰の対立形質共有同祖性を示すであろという事実を利用し、１型糖尿病に対する感受性を引き起こすその他の遺伝子座の同定を期待して位置決定クローニング戦略を開始した（Penrose, 1953；Risch, 1990；Holmans, 1993）。
96組の英国人兄弟家計における289のマイクロサテライトマーカーを利用する連鎖についての一次ゲノム幅スキャンは更に18の遺伝子座に対する連鎖の証拠を示した（Daviesら、1994）。これらの遺伝子座のうちの２つの連鎖の確認は更に２組の家族群（102組の英国人家族及び84組の米国人家族）、即ち染色体11q13上のIDDM４（MLS 1.3，Ｐ＝0.003，FGF3）及び染色体６ｑ上のIDDM５（MLS 1.8，ESR）の分析により達成された。IDDM４において最も有意義な連鎖はHLAにおいて１又は０の対立形質IBDを共有する家族のサブセットにおいて得られた（MLS＝2.8；Ｐ＝0.001；λS＝1.2）（Daviesら、1994）。この連鎖は251組の冒された兄弟を利用し、全ての兄弟においてＰ＝0.0008を得たHashimotoら（1994）によっても観察された。これらの結果を組合せると、596組の家族により、IDDM４の実体的な裏付けが供された（Ｐ＝1.5×10-6）（Todd and Farrall, 1996, Luoら、1996）。
発明の簡単な説明
本発明ははじめてLDL−レセプターファミリーの新規の構成員をコードする遺伝子をここで開示し、それらを「LRP5」と称する（以前は「LRP−３」）。更に、遺伝子がIDDM感受性遺伝子座IDDM４であることを示す証拠、その同定単離が主たる科学的突破である。
ここ10年、集団において比較的稀である単一遺伝子又はモノ遺伝子病に関する多くの遺伝子は家族間内での連鎖分析により位置決めされ、そして遺伝子の同定を可能にするよう十分に小さい領域にまで局在化された。後者のサブ局在化及び微細なマッピングは単一遺伝子の稀な病気において実施でき、なぜなら家族間内での組換は何ら疑いなく最小間隔の境界を規定するからである。対照的に、一般的な病気、例えば糖尿病又はぜん息においては、病的突然変異の存在は常に病気の発症と一致するわけではない：一般的な障害の病気感受性突然変異は病気の発症のおそれを供し、そしてこのおそれは通常100％をはるかに下まわる。従って、一般的な病気における感受性遺伝子を家族間内での組換事象を利用して局在化することは、数万組の家族が遺伝子座の微細なマッピングのために得られない限り、できないものである。このサイズの収集は現実的でないため、研究者は連合マッピングの利用を考え、それはその家族が由来する集団の歴史の際の歴史的組換事象を頼りとする。
連合マッピングは稀な単一遺伝子形質の多数の例において利用され、そして特に遺伝的に隔離された集団、例えばフィンランドにおいて病的突然変異をマッピングするために利用されている。にもかかわらず、連合マッピングは直接的な連鎖マッピングとは根本的に相違し、なぜなら２種類のマーカー又はマーカーと病的突然変異との間での連合度が染色体の物理的距離に比例したとしても、この関係はマーカーの対立形質頻度、集団の歴史及び年齢なら並びに病的遺伝子座にある突然変異の数に依存することを理由に予測できないからである。稀で高度に浸透性な単一遺伝子病にとって、通常、集団の中の一つの始祖染色体が研究の対象とすることで、生存家族間内での標準組換事象により規定できるほどに小さい間隔に位置決めすることが比較的可能となる。一の主要始祖染色体があるモノ遺伝子病におけるこの方法の解像度は確実に２cM未満であり、そして一定の例においては、その解像度は100kbのDNAにまで下がる（Hastbackaら（1994）Cell 78, 1-20）。
協奏して作用する多数の遺伝子又はポリジーンにより発症する１型糖尿病のような一般的な病気においては、病的対立形質の集団頻度は非常に高く、おそらくは50％を超えることがあり、そして複数の始祖染色体があるようであり、その全てが危険性を供するが、病気の発症を100％確実とするわけではない。連合マッピングは予測できないパラメーターに依存し、そして始祖染色体の数は複数であり、そして一般に一般集団においてよくあるため、ポリジーンを微細にマッピングする作業は現在争点の一つとなっており、そして多くは連鎖及び連合マッピングの併合を用いる系統的な遺伝子アプローチの全ての可能性に疑いを抱いている。最近、Risch and Marakandisが複雑な病気における連合マッピングの可能性のいくつかの数学的背景を供しているが（Science 273 1516-1517, 1996）、彼らは多数の始祖染色体の効果は考慮に入れていない。
このような不確実性の結果、ゲノタイピングのためには、極端に大規模な数の糖尿病家族を、特定領域に広がる大量のマーカーと共に必要とし、複数のピークを有しうる連鎖不均衡曲線が供される。問題は、どのピークが病因学的突然変異を示しているか、及びどのようにして我々はこれを確立できるかにある。我々の知るところ、図３，４，19及び20に示すこの連鎖不均衡及びハプロタイプ連合マップは全ての遺伝子座についての全ての複雑なポリジーン病についての最初のものである。この種の曲線は十分に確立されたIDDM１／MHC座についてさえも論文でいままでに発表されていない。これとの関連で、ここに記載の研究は全体的に新規であり、そしてポリジーン遺伝子学への研究の最先端にある。
【図面の簡単な説明】
図１は染色体11q13上のIDDM４のおよその位置決めを示す。HLA１：０のサブグループにおける最大傾向IBDの多点連鎖マップは150組の家族において共有されている。FGF3及びDIIS1883での2.3のMLS（λS＝1.19）が得られた（Daviesら（1994）Nature 371：130-36）。
図２は染色体11q13上のDIIS987−ガラニン領域の物理マップを示す。その間隔をpacs，bacs及びコスミドの中にクローニングし、そして各マーカー間の物理距離を決定するために一連の制限酵素を利用して制限マッピングした。
図３はIDDM４領域での一点連鎖不均衡曲線を示す。1289組の家族をTDTにより分析し、ピークはH0570POLYAにあった：Ｐ＝0.001。ｘ軸：物理距離をkbで表示；ｙ軸：TDT x2統計（tdf）。
図４は４集団（英国、米国、サルジニア及びノルウェー）由来の1289組の家族による三点回転連鎖不均衡曲線を示す。各多形性においての対立形質頻度の変動効果を最小にするため、TDTデーターを３つの連なるマーカーにおいて取得し、そして３つの平均として表示する。ｘ軸：物理距離をkbで表示；ｙ軸：TDT x2統計。
図５（ａ）はLPR5アイソフォーム１cDNAのDNA配列を示す（SEQ ID NO:1）。
図５（ｂ）はLPR5 cDNAの中に存在する最長オープンリーディングフレームのDNA配列を示す（SEQ ID NO:2）。
図５（ｃ）は図５のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳（標準の１文字コード）である（SEQ ID NO:3）。
図５（ｄ）は図５（ｂ）に含まれているオープンリーディングフレーム（SEQ ID NO:2）によりコードされるLPR5アイソフォーム１のモチーフ（SEQ ID NO:3）である。記号：下線付き残基１〜24はタンパク質の輸送及び切断のためのシグナルを含み、▼はイントロン／エキソン境界の位置を示し、★はレセプターの提案細胞外部分の推定Ｎ連結グリコシル化部位を示す。EGF結合モチーフは灰白色で影付けをし、LDL−レセプターリガンドモチーフには濃いめの灰色で影付けをした。スペーサー領域はYWTDモチーフに対して高度な類似性を有する下線付きの４個のアミノ酸により表示する。推定トランスメンブラン横断ドメインには濃い線分で下線付けした。細胞質ドメインにおいて影付けした領域（1409から最後）はエンドサイトシスに関与しうる。
図５（ｅ）は成熟LPR5タンパク質のアミノ酸配列である（SEQ ID NO:4）。
図５（ｆ）は上部線分上（SEQ ID NO:5）のヒトアイソフォーム１cDNA配列の５’末端（図５（ａ）（SEQ ID NO:1））の最初の432個のヌクレオチドのヌクレオチド配列と下部線分上（SEQ ID NO:6）のマウスLrp5 cDNA配列の５’末端（図16（ａ）（SEQ ID NO:35））の最初の493個のヌクレオチドとの対比を示す。この対比はGCGアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を用いて実施した。
図５（ｇ）はヒトLRP5アイソフォーム１の最初の550個のアミノ酸（SEQ ID NO:7）とマウスLrp5の最初の533個のアミノ酸（SEQ ID NO:8）とのGCGアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を利用する対比を示す。
図６（ａ）はLRP5モチーフのアミノ酸配列を示す（SEQ ID NO:9〜22）。プログラムCrossmatch（ワシントン大学のPhil Green博士から入手）を用いてLRP1の中に存在するモチーフとLRP5アミノ酸配列との対比を行った。各LRP5モチーフについての最良の対合を示す。各モチーフに関し、最上線分はLRP5アイソフォーム１アミノ酸配列であり、中央線分は２つのモチーフ間で同一なアミノ酸であり、最下線分は最良対合LRP1モチーフのアミノ酸配列である。特に注目すべきなのはEGF−前駆体及びLDL−レセプターリガンド結合モチーフの双方の目印である保存システイン（ｃ）残基である（SEQ ID NO:9〜22）。
図６（ｂ）はLDL−レセプター及びLRP5のモチーフ構造を示す。LDL−レセプターリガンド結合モチーフは灰白色枠で示し、EGF様モチーフは濃灰色枠で示す。推定トランスメンブランドメインは黒色枠で示す。
図７はLRP5遺伝子構造を示す。ゲノムDNAの連続断片のDNA配列は濃い線分で示し、そして表示のスケールに従う。マーカーDIIS1917（UT5620）、H0570POLYA，L3001CA，DIIS1337及びDIIS970の位置を表示する。エキソンは小さな黒色枠で示し、その番号又はアルファベット名を下に示し、エキソンのサイズはスケール通りではない。
図８は様々なLRP5遺伝子アイソフォームを示す。LRP5遺伝子の択一的にスプライスされた５’末端を、択一的にスプライスされた形態各々のアイソフォーム番号と共に表示する。灰白色の矢印は翻訳の開始を示し、それはアイソフォーム１ではエキソン６にあり、アイソフォーム３のエキソン１の上流にあることがあり、そしてアイソフォーム２，４，５及び６のエキソン６にある。22のコアエキソン（Ａ〜Ｖ）は枠で示す。
図９はコンティング57のSNPマップである。多形性はBAC 14−１−15のDNA配列とコスミドE0 864及びB0 7185との対比により同定した。対応の表６は、多形性の部位を含むPCRアンプリコン、単一ヌクレオチド多形性（SNP）の種類、その位置及び任意的に変更している制限部位を示す。線分は多形性の相対位置及びそれを検出するために用いたアンプリコンと共に連続ゲノムDNAを示す。大きくて細長い三角形は推定エキソン部位を示す。マーカーH0570POLYAを示す。
図10はコンティグ58のSNPマップを示す。多形性はBAC 14−１−15のDNA配列とコスミドB07185との対比により同定した。対応の表６は多形性部位を含むPCRアンプリコン、単一ヌクレオチド多形性（SNP）の種類、その位置及び任意的に変更されている制限部位を示す。線分は連続ゲノムDNAを、多形性の相対位置及びそれを検出するために用いたアンプリコンと共に示す。線分の最先端にある大きくて細長い三角形はLRP5のエキソンＡを示す。
図11（ａ）はアイソフォーム２cDNAのDNA配列を示す（SEQ ID NO:23）。
図11（ｂ）はアイソフォーム２の最長オープンリーディングフレームを示す（更にはアイソフォーム４，５，６）（SEQ ID NO:24）。
図11（ｃ）は図12（ｂ）のオープンリーディングフレームによりコードされるアイソフォーム２のアミノ酸配列を示す（更には、アイソフォーム４，５，６）（SEQ ID NO:25）。
図12（ａ）はアイソフォーム３cDNAのDNA配列を示す（SEQ ID NO:26）。
図12（ｂ）はGRAILにより得られた配列及びアイソフォーム３の推定伸長部を示す（SEQ ID NO:27）。
図12（ｃ）はアイソフォーム３の推定オープンリーディングフレームを示す（SEQ ID NO:28）。
図12（ｄ）はアイソフォーム３のアミノ酸配列を示す（SEQ ID NO:29）。
図12（ｅ）はアイソフォーム３のGRAIL推定プロモーター配列を示す（SEQ ID NO:30）。
図13はアイソフォーム２をコードするオープンリーディングフレーム（図11（ｂ））を含むアイソフォーム４cDNAのDNA配列を示す（SEQ ID NO:31）。
図14はアイソフォーム２をコードするオープンリーディングフレーム（図11（ｂ））を含むcDNAアイソフォーム５の中に存在するDNA配列を示す（SEQ ID NO:32）。
図15はアイソフォーム２をコードするオープンリーディングフレーム（図11（ｂ））を含むアイソフォーム６のDNA配列を示す（SEQ ID NO:33）。
図15（ｂ）はアイソフォーム６と一体化したGRAIL推定プロモーター配列を示す（SEQ ID NO:34）。
図16（ａ）はマウスLrp5 cDNAの一部のDNA配列を示す（SEQ ID NO:35）。
図16（ｂ）はマウスクローンの５’伸長部のDNA配列を示す（SEQ ID NO:36）。
図16（ｃ）はマウスLrp5のオープンリーディングフレームの一部のDNA配列を示す（SEQ ID NO:37）。
図16（ｄ）はマウスLrp5の一部をコードするオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を示す（SEQ ID NO:8）。
図17（ａ）はエキソンＡ〜ＶのDNA配列を示す（SEQ ID NO:38）。
図17（ｂ）は図17（ａ）の中に含まれているオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を示す（SEQ ID NO:39）。
図18（ａ）は全長マウスLrp5 cDNAのヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO:40）。
図18（ｂ）はマウスLrp5 cDNAの中に存在する最長オープンリーディングフレームについてのヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO:41）。
図18（ｃ）は図18（ｂ）中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳（１文字コード）を示す（SEQ ID NO:42）。
図18（ｄ）はヒトLRP5タンパク質アミノ酸配列とマウスLrp5タンパク質プログラムとのGCGアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を利用するアラインメントを示す（SEQ ID NO:3，42）。
図18（ｅ）は成熟ヒトLRP5タンパク質のアミノ酸配列と成熟マウスLRP5プログラムとのGCGアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group， Madison, WI）を利用するアラインメントを示す（SEQ ID NO:43，44）。
図19はIDDM４領域間でのハプロタイプの模式図を示す。３種類のハプロタイプを示す。ハプロタイプＡはIDDMに対して防御性であり、一方ハプロタイプＢ及びＣはIDDMに対して感受性／非防御性である。
図20はIDDM４領域間での単一ヌクレオチド多形性（SNP）ハプロタイプの模式図を示す。ハプロタイプＡは防御性であり、一方ハプロタイプＢ，Ｃ，Ｄ及びＥは感受性／非防御性である。４通りの感受性ハプロタイプについて同祖的（IBD）である25kbの最小領域を示す。SNPの表示、例えば57−３は表６並びに図９及び10に示す。
LRP5遺伝子構造
同定された遺伝子はＡ−Ｖと命名する22のエキソンを含み、それは成熟LRP5タンパク質のほとんどをコードする。この22のエキソンはLRP5遺伝子転写体の4961個のヌクレオチドを占め（図５（ａ）（SEQ ID NO:1））、そして約110kbのゲノムDNAの中に位置する。これらのエキソンを含むゲノムDNAは遺伝子マーカーL3001CAの下流から始まり、そして遺伝子マーカーDIIS1137, 141ca ５及びDIIS970を含む（図７）。LRP5転写体のいくつかの５’末端が同定された。特に注目すべきなのはプラスマ膜を横断するタンパク質輸送のためのシグナルペプチド配列（分泌リーダーペプチド）をコードする５’末端を有するアイソフォーム１である。以下に論ずる通り、LRP5タンパク質は大きな細胞外ドメインを含むようであり、従ってこのタンパク質はシグナル配列を有するものと期待される。エキソン６と称するシグナル配列をコードするエキソンは遺伝子マーカーH0570POYLA付近にある。このエキソンはエキソンＡの35kb上流にあり、それ故LRP5遺伝子を含んで成るゲノムDNAを少なくとも160kb伸長する。
５’未満の択一的なスプライシングにより生ずるLRP5遺伝子のいくつかの追加のアイソフォームがPCRにより同定された（図８）。これらの追加のアイソフォームの機能的な関連性は明確でない。これらのLRP5転写体のうちの２つは遺伝子マーカーDIIS1917（UT5620）の上流に位置し、且つLRP5遺伝子を約180kbのゲノムDNAにまで広げるエキソン１を含む。アイソフォーム３と称する転写体はエキソンＡへと直接スプライシングされる。リーディングフレームは５’末端で解放となっており、それ故エキソン１の上流のエキソンの中に存在する追加のコード情報について潜在的である。他方、この領域に結合したオープンリーディングフレームの全てを含むようにエキソン１をセントロメア伸長することはアイソフォーム３についてのオープンリーディングフレームを生み出す。
エキソン１を含む第二の転写体はエキソン５も含み、それは遺伝子マーカーH0570POYLA付近に位置する。このアイソフォーム、アイソフォーム２についてのオープンリーディングフレームはエキソン13で始まり、それ故最初の100個のアミノ酸における任意の推定分泌リーダーペプチドを欠くトランケーションLRP5タンパク質をコードする。３つの更なる転写体があり、各々はエキソンＢで始まるオープンリーディングフレームと、遺伝子マーカーL3001CA付近の５’末端を有する。
LRP5の発現プロフィール
ノーザンブロット分析はLRP5遺伝子の主要mRNA転写体が約５〜5.5kbであり、そして肝臓、膵臓、前立腺及び胎盤の中で最も高度に発現されることを示す。発現は骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、卵巣、肺、小腸及び結腸でも検出される。５kbより大きい及び小さいささいなバンドが検出され、そして択一的なスプライシング事象又は近縁なファミリー構成員を表わしうる。
LRP5はLDL−レセプターファミリーの構成員
IDDM４遺伝子座において同定された遺伝子lrp5はLDL−レセプターファミリーの構成員である。このタンパク質のファミリーはいくつかの異なる特性、リガンド結合に関与するシステインリッチモチーフを含む大きな細胞外ドメイン、単一のトランスメンブラン横断ドメイン及び「NPXY」（SEQ ID NO:45）内在化モチーフを有する（Krieger and Her2（1994）Ann. Rev. Biochem. 63：601-637）。このファミリーの構成員の機能的な役割はレセプター媒介エンドサイト−シスのメカニズムによるそのリガンドの浄化にある。これはこのファミリーの最も高度に特性決定された構成員LDL−レセプターにより例示され、それは血漿からのLDLコレステロールの浄化を司る（Goldsteinら、（1985）Ann. Rev. Cell Biol. 1：1-39）。
LRP5はアルファー２−マクログロブリンレセプターとしても知られるLDL−レセプター関連タンパク質（LRP）に最も近縁する。アイソフォーム１のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳はLRP5タンパク質を生み出す。LRP5タンパク質とヒトLRP1とのアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を利用する対比はヒトLRP1タンパク質のアミノ酸1236〜2934の領域に対して55％の総合的アミノ酸類似性及び34％の同一性を示した。このORFのDNAはGAPにより示される通り、LRP1コードDNAと45％同一である。若干低いが有意なレベルの類似性が、LRP2及びgp330とも呼ばれるメガリンレセプター（Saitoら、（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91：9725-9729）並びにドロソフィラ・ビテロゲニン（Drosophilla vitellogenin）レセプター（Schonboumら（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. 92：1485-1489）との間でも認められる。類似性は、LDL−レセプター（Suedhofら、（1985）Science 228：815-822）及びVLDLレセプター（Okaら（1994）Genomics 20：298-300）等のLDL−レセプターファミリーのその他の構成員との間でも観察される。LRP5におけるEGF様モチーフの存在に基づき、類似性はLDL−レセプターファミリーの構成員ではないEGF前駆体及びニドゲン前駆体との間でも観察される。
LRP5の特性及びモチーフ
LRP5のＮ末端部分はシグナル配列切断部位についての潜在性を有するようである。シグナル配列はプラスマ膜を横断輸送されるタンパク質において往々にして見い出せる（von Heijne（1994）Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23：167-192）。更に、LDL−レセプターファミリーのその他の構成員はタンパク質輸送のためのシグナル配列を含む。
シグナル配列切断部位の存在はヒトLRP5と我々が得たマウスcDNA配列との対比によりまず同定される。我々が得た1711ヌクレオチドの最初のマウス部分cDNA配列（図16（ａ）（SEQ ID NO:35））はヒトLRP5 cDNAに対して約1500ヌクレオチド部分にわたり87％同一性であり、それ故ヒトLRP5のマウスオルソログ（Lrp5）のようである。マウスcDNAのこのクローニング部分は533個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む（図16（ｃ）（SEQ ID NO:37））。開始コドンは−３（プリン）及び＋４（Ｇヌクレオチド）位置の双方において効率的な翻訳のための共通ヌクレオチドを有する（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7：563-574）。マウスLrp5のこの部分の500個のアミノ酸（図５（ｇ）及び図16（ｄ）（SEQ ID NO:8））はヒトLRP5と96％同一性であり、これがLrp5のマウスオルソログである仮説を更に裏付けする。
有意義なことに、マウスcDNAの最初の200個のヌクレオチドは以下に論ずるアイソフォーム２〜６の中に存在する５’伸長部とほとんど類似性がない。対照的に、この配列はアイソフォーム１の５’末端を含んで成るエキソン６のヒト配列と75％同一である。かくして、タンパク質輸送のためのシグナルペプチドをコードするアイソフォーム１はLRP5の最も生物学的に関連する形態を示す。
重要なことに、ヒトLRP5及びマウスLrp5オープンリーディングフレームの双方はタンパク質輸送のための真核系シグナル配列として作用する潜在能力を有するペプチドをコードする（von Heijne 1994 Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23：167-192）。GCG分析パッケージ（Genetics Computer Group, Madison WI）の中のSigCleaveプログラムを利用することにより決定されるシグナル配列についての最高点はヒトLRP5の残基25及びマウスLrp5の残基29で始まる成熟ペプチドを構築する（図５（ｄ）及び（ｇ））。利用できうる更なる部位はアミノ酸残基22，23，23，26，27，28，30又は32で始まるヒトLRP5の成熟ペプチドを供する。マウスLrp5の追加の切断部位はアミノ酸残基31，32，33又は38で始まる成熟ペプチドをもたらす（図５（ｇ）（SEQ ID NO:8））。成熟ヒトLRP5タンパク質は図５（ｅ）（SEQ ID NO:4）に示す。
LRP5のその他の択一的なアイソフォームはコードタンパク質のＮ末端付近のシグナル配列を欠いている。これらの追加のアイソフォームの機能的関連性は知られておらず、しかしながらシグナル配列を欠くいくつかの輸送タンパク質があり、そしてシグナルペプチドとは独立のメカニズムにより輸送される（Higgins, C.F.（1992）Ann. Rev. Cell Biol. 8：67-113）。かくして、これらのアイソフォームの推定細胞外ドメインはプラスマ膜を横断移動することが可能である。
LDL−レセプターファミリーの構成員の細胞外ドメインは約40個のアミノ酸領域内に６個のシステイン残基を含む多数のモチーフを含む（Krieger and Herz（1994）Ann. Rec. Biochem. 63：601-637）。このようなシステインリッチモチーフのいくつかのクラスはシステイン残基の間隔及びモチーフ内のその他の保存アミノ酸の種類に基づいて規定される。このLDL−レセプターリガンド結合（クラスＡ）モチーフは高度に保存されたSDE配列を含むモチーフのＣ末端部分の中の酸性残基のクラスターにより区別される。リガンド結合におけるこの酸性残基の重要性は突然変異誘発研究により実証される（Russellら（1989）J. Biol. Chem. 264：21682-21688）。３つのLDL−レセプターリガンド結合モチーフがLRP5タンパク質の中に見い出せる（図６（ａ）（SEQ ID NO:9〜22））。EGF様（クラスＢ）モチーフはLDL−レセプターリガンド結合モチーフの中に存在する酸性残基のクラスターを欠く。更に、システイン残基の間隔は、LDL−レセプターリガンド結合モチーフと比べ、EGF様モチーフ間において相違する。LRP5タンパク質は４つのEGF前駆体（Ｂ．２）モチーフを含み、それは第一と第二システイン残基との間にNGGCSモチーフの特性を有する（図６（ａ）（SEQ ID NO:9〜22））。
LDLレセプターファミリーの構成員のサイズ及び細胞外ドメイン内のシステインリッチ反復配列の数は大幅に変動する。LRP1は4544個のアミノ酸の大型タンパク質であり、そして31個のLDL−レセプターリガンド結合モチーフ（クラスＡ）及び22のEGF様モチーフ（クラスＢ）を含む（Herzら、（1988）EMBO 7：4119-4127）。同様にメガリンレセプターLRP2は4660個のアミノ酸のタンパク質であり、そして36のLDL−レセプターリガンド結合モチーフ及び17のEGF様モチーフから成る（Saitoら、（1994）PNAS 91：9725-9729）。対照的に、LDLレセプターは７つのLDL−リガンド結合モチーフ及び３つのEGF様モチーフを含む879個のアミノ酸の比較的小さなタンパク質である。この成熟LRP5タンパク質の推定サイズ1591アミノ酸はLRP1とLDLレセプターとの中間体である。前述の通り、LRP5タンパク質は４つのEGF様モチーフ及び３つのLDL−リガンド結合モチーフを含む。LRP1及びLRP2において極めて顕著な多重モチーフユニットはこれらのタンパク質の多重リポタンパク質及びタンパク質リガンドに結合する能力を担うものと考えられる（Krieger and Herz（1994）Ann. Rec. Biochem. 63：601-637）。
LDL−レセプターリガンド結合及びEGF様モチーフの互いとの配置はLDLレセプターLRP1及びLRP2の双方において類似する。これらのタンパク質の各々において、多重LDL−リガンド結合モチーフを一緒のグループとなり、それに少なくとも一のEGF様モチーフが後続する（Herzら（1988）EMBO 7：4119-4127, 1988）。対照的に、LRP5タンパク質において、EGF様モチーフは３つのLDL−リガンド結合モチーフの群を先行する（図６（ｂ））。LRP5に固有な追加の特性はLRP5におけるLDL−リガンド結合モチーフに推定トランスメンブランドメインが続くことにある。これらのモチーフの異なる配置はLDL−レセプター関連タンパク質ファミリー内の新たなサブファミリーの構成員としてLRP5を規定しうる。
LRP5はタンパク質のＮ末端においてのタンパク質輸送のためのシグナルペプチドを有する。シグナルペプチド切断はEGF前駆体スペーサードメインのアミノ酸31−297で始まる成熟LRP5タンパク質を生み出す（アミノ酸残基の番号はLRP5前駆体を基礎とする）。EGF前駆体スペーサードメインは５つの約50個のアミノ酸の反復配列から成り、それぞれ特徴的な配列モチーフTyr-Trp-Thr-Asp（YWTD）（SEQ ID NO:46）を含む。アミノ酸339−602，643−903及び944−1214の３つの追加のスペーサードメインがある。各スペーサードメインにはアミノ酸297−338（egf1），603−642（egf2），904−943（egf3）及び1215−1255（egf4）のEGF反復配列が続く。これらEGF反復配列は６つの保存システイン残基を含み、そして特徴としてAsn-Gly-Gly-Cys（NGGC）（SEQ ID NO:47）モチーフを有するＢ．２クラスに入る（Herzら、1988, EMBO J. 7：4119-27）（図６（ａ）（SEQ ID NO:9〜22））。EGF前駆体スペーサードメイン及びEGF反復配列として規定される単独ユニットはLRP5の中で４回反復している。最後のEGF反復配列はアミノ酸1257−1295（ldlr１）、1296−1333（ldlr２）及び1334−1372（ldlr３）の３つの連続LDLR反復配列に隣接する。このようなLDLR反復配列は保存システイン残基並びにモチーフSer-Asp-Glu（SDE）を特徴として有する（図６（ａ）（SEQ ID NO:9〜22））。LDLR反復配列を1386−1408の23個のアミノ酸の推定トランスメンブラン横断ドメインから隔離する13個のアミノ酸がある。LRP5の推定の細胞外ドメインはアミノ酸残基93，138，446，499，705及び878にＮ連結グリコシル化のための６つの潜在部位を有する（図５（ｄ）（SEQ ID NO:3））。
LRP5の細胞内ドメインは207個のアミノ酸から成り、それはこのファミリーのほとんどの構成員よりも長いが、LRP2とはサイズが似ている（Saitoら（1994）PNAS 91：9725-9727）。それはLDL−レセプターファミリーとの類似性は示さなく、またどのその他の既知のタンパク質とも似ていない。LRP5のサイトプラズマドメインは16％のプロリン及び15％のセリン残基から成る（図５（ｄ）（SEQ ID NO:3））。LDL−レセプターファミリーのほとんどの構成員は、被覆ピットによるエンドサイト−シスに関与するサイトプラズマドメイン内の保存NPXYモチーフを含む（Chenら（1990）J. Biol. Chem. 265：3116-3123）。突然変異誘発研究はエンドサイト−シス過程の成分による認識のための臨界残基がチロシン残基であることを示した（Davisら、（1987）Cell 45：15-24）。チロシン残基のフェニルアラニン又はトリプトファンによる置換は寛容され、かくしてこの残基についての最小要件は芳香族アミノ酸であるようである（Davisら（1987）Cell 45：15-24）。構造的研究はNP残基の臨界機能が芳香族残基を供するベーターターンの供与にあることを示唆する（Bansal and Gierasch（1991）Cell 67：1195-1201）。
LRP5のサイトプラズマドメインはNPXYモチーフを含まないが、推定のターン領域に属するいくつかの芳香族残基がLRP5サイトプラズマドメインの中にあり（図５（ｄ）（SEQ ID NO:3））、それ故エンドサイト−シスの促進に関与しうる。特に、配列VPLY（SEQ ID NO:48）モチーフの中にあるチロシン1473はプロリン及びチロシンを共通モチーフと比べ適正な位置において有する。NPXYモチーフはいくつかのタンパク質におけるエンドサイト−シスに関与するが、それは絶対的要件ではなく、なぜならNPXYモチーフを欠くタンパク質、例えばトランスフェリンレセプターの如き被覆ピットによるエンドサイト−シスを受けるタンパク質が存在するからである（Chenら（1990）J. Biol. Chem. 265：3116-3123）。いずれにせよ、我々はこのタンパク質の一次機能がそのリガンドのレセプター媒介エンドサイト−シスであると期待する。
LRP5の潜在的役割
LDL−レセプターファミリーの構成員の多重リガンドに結合する能力はLRP5が１又は複数のリガンドに結合するように機能しうることを示唆する。更に、このファミリーのその他の構成員と似たようにして、一旦結合すると、LRP5レセプター・リガンド複合体はエンドサイト−シスされ、細胞外環境からのリガンドの浄化をもたらす。LRP5リガンドの種類は脂質、タンパク質、タンパク質複合体又はリポタンパク質であってよく、そして様々な機能を保有しうる。LDL−レセプターファミリーの最も近縁な構成員LRP1の生理学的機能は未確定であるが、それは多数の生化学的活性を保有する。LRP1はアルファー２マクログロブリンと結合する。アルファー２マクログロブリンは様々なプロティナーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼ及び血漿カリクレインの「おとり」リガンドを含む血漿複合体である（Jensen（1989）J. Biol. Chem. 20：11539-11542）。このプロティナーゼが一旦結合し、そして「おとり」を酵素的に切断すると、アルファー２マクログロブリンはコンホメーション変化を受け、そしてプロティナーゼを「捕促」する。プロティナーゼ：アルファー２マクログロブリン複合体はLRPにより迅速に浄化される。このメカニズムは様々な生物学的機能、例えば抗原プロセシング及びプロティナーゼ分泌を媒介する潜在能力を有するプロティナーゼを排除する（Stricklandら（1990）J. Biol. Chem. 265：17401-17404）。この機能の重要性はLrp1ノックアウトマウスの胎児期死亡により証明される（Zeeら（1994）Genomics 23：256-259）。
抗原提示は、病気感受性を供与するMHCハプロタイプの枢軸的役割により証明される通り、IDDMの発症における重要な要素である（Tisch and McDivitt（1996）Cell 85：291-297）。LRP1による分析により、LRP5は抗原提示において機能することがあり、この場合この遺伝子内の多形性は１型糖尿病患者の自己免疫性の展開に影響を及ぼしうる。
アルファー２マクログロブリン複合体はサイトカイン及び成長因子、例えばベーターインターロイキン−１、インターロイキン２、インターロイキン６、ベーター形質転換成長因子及び繊維芽細胞成長因子にも結合する（Moestrup and Gliemann（1991）J. Biol. Chem. 266：14011-14017）。かくして、アルファー２マクログロブリンレセプターはサイトカイン及び成長因子の浄化に機能する能力を有する。免疫及び炎症反応を媒介するサイトカインの機能は十分に確立されている。例えば、インターロイキン−２遺伝子は１型糖尿病の動物モデル（Dennyら（1977）Diabetes 46：695-700）である非肥満性糖尿病マウスにおけるIdd3遺伝子座の強力な候補遺伝子である。もしLRP5がアルファー２マクログロブリン又は関連の複合体に結合するなら、それはサイトカイン浄化を媒介することにより免疫応答において機能し得る。例えば、IDDMの標的組織である膵臓の中で発現するLRP5は病気において進行する炎症性浸潤（インスリン炎）からのサイトカインの浄化において機能しうる。LRP5がサイトカインを浄化する能力を低下させるLRP5における多形性は個体のIDDMを発症する感受性を高める。更に、サイトカインを浄化するLRP5の能力を強める多形性を有する個体はIDDMの発症から保護されうる。逆に、一定のサイトカインはその他のサイトカインと対向し、それ故LRP5による所定の有益なサイトカインの除去は病気感受性を供与し得、その結果LRP5活性を弱める多形性は病気の発症からの予防を供与し得る。
遊離脂肪酸（FFA）の増加は動物のインスリン分泌を低下させることが示されている（Bodenら（1997）Diabetes 46：3-10）。更に、LDL−レセプターのリガンドであるApoEは酸化防止活性に結びつき（Miyata and Smith（1996）Nature Genet. 14：55-61）、そして酸化的損傷は１型糖尿病における膵臓β細胞崩壊における中心的な病理メカニズムである（Bac（1994）Endocrin. Rev. 15：516-542）。かくして、LRP5がApoE及び関連のリポタンパク質に結合する能力の改変は膵臓β細胞における酸化的損傷に対する感受性に影響を及ぼしうる。LRP5の形態のβ−細胞へのトランスフェクションは自己免疫及び移植における免疫系による損傷に対するβ細胞の抵抗を助長しうる。
FFAの存在下でのキロミクロン残渣に結合してエンドサイト−シスする脂質分解刺激型レセプター（LSR）と称する薬理因子が発表されている（Mannら（1995）Biochemistry 34：10421-10431）。LRP5遺伝子産物の一つの考えられる役割は、それがこの活性を司ることにある。
LRPファミリーのその他の構成員はメガリン及びgp330としても知られるLRP2であり、このタンパク質はラットの腎臓の自己免疫疾患であるHymann腎臓に関与する（Saitoら(1994）PNAS 91：9725-9729）。Heymann腎炎は糸球体腎炎のモデルであり、そしてHeymann腎炎抗原としても知られるアルファー２マクログロブリンレセプター関連タンパク質に対する自己抗体の展開を特徴とする。Heymann腎炎抗原はLRP2に結合する（Stricklandら（1991）J. Biol. Chem. 266：13364-13369）。LRP2はこの病気においてこの病原性タンパク質の浄化により機能しうる。似たような状況において、LRP5の機能が、IDDM患者がそれに対する自己抗体を生産した膵臓の中のタンパク質に結合して浄化しうることでありうる。他方、LRP5自体はIDDM患者の自己抗原でありうる。
LRP1は一定の細菌毒素（Krieger and Herz（1994）Ann. Rev. Biochem. 63：601-637）及びヒトリノウィルス（Hoferら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91：1839-42）にとってのレセプターとして同定されている。ウィルス感染症はIDDMに対する個体の感受性を改変することが可能である（Epstein（1994）N. Eng. J. Med. 331：1428-1436）。もし所定のウィルスが細胞への侵入の態様としてLRP5を利用するなら、LRP5における多形性は個体の１型糖尿病に対する感受性を改変しうる。
LRP5の改変はその他の病気の病原性に関与しうる。LRP1はリポタンパク質、例えばapoE及びＣ−アポリボタンパク質に結合する。リポタンパク質、例えばapoE及びapoBのLDLレセプターによる浄化がその主たる役割であり、LDLレセプターの突然変異は高コレステロール血症を招く（Chenら、（1990）J. Biol. Chem. 265：3116-3123）。従って、当該タンパク質のリポタンパク質を排除する能力を降下させるLRP5の突然変異はコレステロールの高揚をもたらしうる。LRP5の変異は深刻な死因である糖尿病における巨大血管合併症の発症にかかり易くしうる。２型糖尿病において、膵臓病はアミロイドの沈着を特徴とする。アミロイド沈着は膵臓β細胞の機能を低下しうる。LRP5は半島アミロイドの代謝において機能でき、そして２型糖尿病及び１型糖尿病に対する感受性に影響を及ぼす。アルツハイマー病におけるApoEの役割はタンパク質、例えばLRP1、そして可能としてはLRP5がこの病気の病原に寄与する潜在能力を有することを示唆する。
骨粗しょう症−偽膠腫症候群の発症に関与する遺伝子における多形性はLRP5をコードする遺伝子を含む染色体11の３−cM領域へとマッピングされている（Gongら（1996）Am. J. Hum. Genet. 59：146-151）。この病気の病理メカニズムはわかっていないが、硝子体網膜における異常血管成長を有する患者の調節機能に関与するものと信じられている。繊維芽細胞増殖因子、即ち脈管形成の媒介因子の浄化におけるLRP5の潜在的機能及びこの遺伝子の染色体位置はそれがこの病気に一役買っているものと示唆しうる。この提唱の機能は糖尿病における網膜障害の発症にも結びつきうる。
LRP5遺伝子における多形性
LRP5遺伝子のエキソンは多形性についてスキャニングされている。IDDM患者において同定されたLRP5におけるアミノ酸を変化させる複数の多形性がある（表５）。特に注目されるのはＣからＴの変換であり、それは３つの保存LDLレセプターリガンド結合モチーフの一つにおいてAlaコドンをValへと変化させる。上記の多形性に加えて、ＣからＴへの変換がAsn709についてのコドンにて同定され（コードアミノ酸には影響なく）、そして３つの多形性がエキソンに隣接するイントロン配列において同定された。更なるセットの多形性が実験的に誘導されたcDNA配列とゲノムDNA配列との対比により同定された（表５）。このような多形性の一部は、IDDMとのその関連性を決定するため、多数のIDDM患者及びコントロール個体において分析されるであろう。
多数の（約30の）単一ヌクレオチド多形性（SNP）が重複BACのゲノムDNA配列及び遺伝子マーカーポリＡを囲むコスミドクローンにおいて同定された。このような多形性を含む連続ゲノム配列はコンティグ57（図９）（それはエキソン１及び５を遺伝子マーカーポリＡ及びDIIS1917（UT5620）と共に含む）並びにコンティング58（図10）（それは遺伝子マーカーL3001ca及びエキソンＡの一部を含む）と称する。
追加の実験的証拠
１型糖尿病に関与する同祖的な領域がLRP5遺伝子の５’部分において同定された。SNP及びマイクロサテライトマーカーからのデーターを組合せることにより、我々は感受性ハプロタイプにおける同祖的領域を同定し、その最小領域はLRP5の推定調節領域及び第一エキソンを含む25kbから成る。これはLRP5が糖尿病のおそれの遺伝子である遺伝子的証拠を強化する。従って、LRP5に影響を及ぼす治療は１型糖尿病の予防及び治療において有用でありうる。
マウスにおけるLRP5の過剰発現はLRP5がリポタンパク質の代謝に影響を及ぼす証拠を供する。LRP5によるトリグリセリドの調節の統計学的に有意義な証拠が得られた。かくして、LRP5に影響を及ぼす治療は心臓血管病及び血清トリグリセリドが上昇する症状の処置において有用でありうる。
血清コレステロールが正常値より高いときにLRP5がそれを降下させる示唆的証拠が得られた。LRP5が超低密度リポタンパク質粒子と相互作用し、そして血清中のそのレベルを降下させる能力についての証拠もある。従って、LRP−５に影響を及ぼす治療は心臓血管病及び血清コレステロールが上昇する症状の処置において有用でありうる。
生化学的研究はLRP5が低密度リポタンパク質（LDL）粒子の取り込みにおいて機能する能力を有することを示唆する。かくして、LRP5に影響を及ぼす治療はLDLレベルが上昇する心臓血管病の処置において有用でありうる。
マウスにおけるLRP5の過剰発現は血清アルカリホスファターゼの低下の統計学的に有意義な証拠を供する。血清アルカリホスファターゼの低下はLRP5が免疫反応の調節において機能することを一致する。これはLRP5が１型糖尿病の病原性に関与する証拠を供する。従って、LRP5に影響を及ぼす治療は自己免疫疾患の処置において有用でありうる。
LRP5の細胞局在はそれが特定のサブタイプ、即ちファゴサイト−シスマクロファージ、成熟組織マクロファージにおいて発現されることを示唆する。論文からの証拠はこのクラスのマクロファージが自己免疫疾患に関与することを示唆し、自己免疫疾患及び１型糖尿病におけるLRP5の機能を裏付けする。従って、LRP5に影響を及ぼす治療は自己免疫疾患の処置において有用でありうる。
ヒト及びマウスLRP5の双方についての全長cDNAが得られた。LRP5に対して特異的な抗体が開発された。これらの試薬はLRP5の生物学的機能を更に分析するための手段を供する。
LRP5の実際の作用態様並びにIDDM及びその他の病気への関与に関係なく、本明細書に記載の実験研究は本発明の観点及び態様を開示する実際の用途を確立及び裏付けする。
本発明の一の観点に従うと、図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）、図５（ｄ）（SEQ ID NO:3）又は図５（ｅ）（SEQ ID NO:4）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）のアミノ酸配列は図５（ｅ）（SEQ ID NO:4）のそれ及びシグナル配列を含む。
このコード配列は図５（ａ）（SEQ ID NO:1）又は図５（ｂ）（SEQ ID NO:2）に含まれているものであってよく、又は示している配列の突然変異体、変異体、誘導体もしくは対立形質でありうる。この配列は示しているものとは、１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失及び置換のうちの一つ又は複数の変化により相違しうる。ヌクレオチド配列の変更は遺伝子コードによる決定に従い、タンパク質レベルでのアミノ酸変化をもたらしうるか、又はもたらさないことがある。
かくして、本発明に係る核酸は図５（ａ）（SEQ ID NO:1）又は図５（ｂ）（SEQ ID NO:2）に示す配列とは異なる配列を含みうるが、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがある。図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示すアミノ酸配列は1615個の残基から成る。
他方、このコードポリペプチドは図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示すアミノ酸配列とは１又は複数のアミノ酸残基により相違するアミノ酸配列を含んで成りうる。図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示す配列のアミノ酸配列突然変異体、変異体、誘導体又は対立形質であるポリペプチドをコードする核酸を本発明により更に提供する。かかるポリペプチドは以下に論述する。かかるポリペプチドをコードする核酸はヌクレオチド配列及び／又はコードアミノ酸レベルにおいて、図５（ａ）（SEQ ID NO:1）に示すコード配列及び／又は図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示すアミノ酸配列と約60％超の相同性、約70％超の相同性、約80％超の相同性、約90％超の相同性、又は約95％超の相同性を示しうる。アミノ酸「相同性」に関して、これは類似性（アミノ酸類似性の確立された原理に従い、例えばアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を利用する決定に従い）又は同一性を意味すると理解されうるであろう。GAPはNeedleman and Wunschアルゴリズムを利用し、２つの完全配列をアライニングし、対合の数を最大にし、そしてギャップの数を最小にする。一般に、デフォルトパラメーターを使用し、ギャップ構築ペナルティーは12、そしてギャップ伸長ペナルティーは４とする。本明細書における「相同性」なる用語の使用は、例えば適当な条件下で組換するほどに十分に類似であることのみを２本のヌクレオチド配列に要する「相同組換」の如き用語の標準的使用を確保するため、対比する配列間の任意の必然的な進化的関係を包含しない。本発明に係る核酸によりコードされうる本発明に係るポリペプチドの更なる論述は以下にする。
本発明はストリンジェント条件下で本明細書に開示する任意の１又は複数の特異的な配列とハイブリダイズする核酸にまで及ぶ。適当な条件には、例えば、約80〜90％同一である配列の検出のため、例えばヒトプローブによるマウスLRP5の検出のため、又はその逆のため、0.25ＭのNa2HPO4，pH7.2，6.5％のSDS，10％の硫酸デキストランの中での42℃で一夜のハイブリダイゼーション、0.1×のSSC，0.1％のSDSの中での55℃での最終洗浄である。約90％超同一である配列の検出のためには、適当な条件には0.25ＭのNa2HPO4，pH7.2，6.5％のSDS，10％の硫酸デキストランの中での65℃で一夜のハイブリダイゼーション、及び0.1×のSSC，0.1％のSDSの中での60℃での最終洗浄が挙げられる。
コード配列は図５（ａ）（アイソフォーム１）（SEQ ID NO:1）又は図５（ｂ）（SEQ ID NO:2）に示す配列を有する核酸分子内に含まれることがあり、そしてアイソフォーム１の全長ポリペプチド（図５（ｃ）（SEQ ID NO:3））をコードしうる。これらの配列の突然変異体、変異体、誘導体及び対立形質は先の段落及び以下の開示に記載のものと似た意味で本発明の範囲に含まれる。
様々な観点及び態様において本発明により更に検出されるのは図17（ｂ）（SEQ ID NO:39）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子である。この配列は図５（ｅ）（SEQ ID NO:4）に示すアミノ酸配列の実体的部分を構成する。図17（ｂ）（SEQ ID NO:39）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は図17（ｂ）（SEQ ID NO:39）に示すコード配列、又は本発明の観点及び態様についての本明細書に記載のものと似たような観点での対立形質、変異体、突然変異体もしくは誘導体に示すコード配列を含みうる。
本発明の様々な観点に従うと、LRP5ポリペプチド及び遺伝子の様々なアイソフォームも提供する。図５の遺伝子はアイソフォーム１として知られる。本発明に含まれるのは図11（ｃ）に示すポリペプチド（アイソフォーム２）（SEQ ID NO:25）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子である。このコード配列は図11（ｂ）（SEQ ID NO:24）に示すもの（これは図11（ａ）に示す配列（アイソフォーム２）（SEQ ID NO:23）又は図12（ａ）に示す配列（アイソフォーム３）（SEQ ID NO:26）を有する分子の中に含まれうる）、図13（アイソフォーム４）（SEQ ID NO:31）、図14（アイソフォーム５）（SEQ ID NO:32）及び図15（アイソフォーム６）（SEQ ID NO:33）でありうる。これらの配列の突然変異体、誘導体、変異体及び対立形質も開示の通り、本発明により提供する。
本発明に係る更なる核酸分子には図５（ａ）（SEQ ID NO:1）、図12（ｂ）（SEQ ID NO:27）、図12（ｅ）（SEQ ID NO:30）、図15（ｂ）（SEQ ID NO:34）、図16（ａ）（SEQ ID NO:35）及び図16（ｂ）（SEQ ID NO:36）のいずれかのヌクレオチド配列、並びに図５（ａ）（SEQ ID NO:1）、図11（ｂ）（SEQ ID NO:24）、図12（ｃ）（SEQ ID NO:28）又は図16（ｃ）（SEQ ID NO:37）によりコードされるアミノ酸をコードする核酸を、これらの配列の突然変異体、対立形質、変異体及び誘導体と共に含む。更に含まれるのは図18（ｃ）（SEQ ID NO:42）のアミノ酸配列をコードする核酸分子、特に図18（ｂ）（SEQ ID NO:41）に示すコード配列を含むものである。
本発明に係る特定の対立形質は表５又は表６に示す変異を有する配列を有する。１又は複数のこれらの配列はIDDM又はその他の病気に対する感受性に関係しうる。IDDM又はその他の病気に関係する本発明に係る配列における変化は本発明の態様に従って好適でありうる。スクリーニング、例えば診断又は予後目的のための関与を以下に説明する。
一般に、本発明に係る核酸は単離体として、単離及び／又は精製形態で、又は天然に一体化した物質を含まず又は実質的に含まず、例えばヒトゲノム中のその遺伝子に隣接する核酸を含まず又は実質的に含まずに提供されるが、ただし発現のために１又は複数の調節配列は可能としてはそれから除かれる。核酸は完全又は部分合成したものでよく、そしてゲノムDNA，cDNA又はRNAが含まれうる。ここに示すコード配列はDNA配列である。本発明に係る核酸がRNAを含むなら、示している配列についての言及はＵがＴを置換するRNA均等物についての言及を包括する。
核酸は複製ベクターの一部として供与してよく、そしてまた本発明は上記の核酸を含むベクター、特に任意の発現ベクターであってそれからコードポリペプチドが適当な条件下で発現されるもの、及び任意のかかるベクター又は核酸を含む宿主細胞を提供する。ここでいう発現ベクターは注目のポリペプチドをコードする核酸及びポリペプチドの発現のための適当な調節配列を、in vitro発現系、例えば網状赤血球リゼート、又はin vivo系、例えば真核細胞、例えばCOS又はCHO細胞、又は原核細胞、例えばＥ．コリ（E.coli）の中で含む核酸分子である。これは以下に更に説明する。
本発明に従って提供される核酸配列は試験サンプル中の注目の（且つ本発明に係る）核酸を同定するために有用である。本発明は注目の核酸を得る方法を提供し、この方法は図５（ａ），11（ａ），11（ｂ），12（ａ），12（ｂ），12（ｃ），12（ｅ），13，14，15，15（ｂ），16（ａ），16（ｂ）及び16（ｃ）のいずれかに示す配列又は相補性配列を有するプローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションには一般に有効なハイブリダイゼーションの同定及びそのプローブにハイブリダイズした核酸の単離が続き、それは１又は複数のPCR工程が含まれうる。通常、これらの図のいずれかに示す完全配列を有するプローブを使用する必要はないであろう。短めのフラグメント、特に保存モチーフをコードする配列（図５（ｃ，ｄ）及び図６（ａ）（SEQ ID NO:9〜22））を有するフラグメントを使用してよい。
本発明に係る核酸はいずれかの図に示す核酸配列の１又は複数のフラグメント、特に比較的稀な配列のフラグメントとハイブリダイズするように、コドン用法又は統計学的分析を基礎にデザインした１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを利用して得ることが可能である。いずれかの図に示す核酸配列のフラグメントにハイブリダイズするようにデザインしたプライマーは、標的核酸のクローニングされたクローニングベクター中の配列にハイブリダイズするようにデザインされた１又は複数のオリゴヌクレオチドと一緒に利用するか、又はライブラリー中のcDNAがオリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションされており、そしてPCRを示している配列とハイブリダイズするプライマー及びこのオリゴヌクレオチドリンカーとハイブリダイズするプライマーを用いて実施するいわゆる「RACE」（cDNA末端の迅速増幅）に利用してよい。
かかるオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、並びに全長配列（及び突然変異体、対立形質、変異体及び誘導体）は対立形質、突然変異体及び変異体の存在について核酸を含む試験サンプルをスクリーニングする、以下に詳細の診断及び／又は予後用途においても有用である。
１又は複数の細胞（例えばヒト）から単離及び／又は精製した核酸又は細胞から単離及び／又は精製した核酸に由来するライブラリー（例えば細胞から単離したmRNAから誘導したcDNAライブラリー）を選択ハイブリダイゼーションのための条件下でプロービングする及び／又は特定の核酸増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応にかける（例えば、「PCR protcolos；A Guide to Methods and Applications」lnnisら編、1990, Academic Press, New York, Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51：263（1987）, Ehrlich（編）PCR technology, Stockton Press, NY, 1989及びEhrlichら、Science, 252：1643-1650（1991）を参照のこと）。PCRは鋳型核酸の変性（二本鎖なら）、プライマーの標的へのアニーリング及び重合の段階を含んで成る。増幅反応においてプロービングした又は鋳型として使用した核酸はゲノムDNA，cDNA又はRNAであってよい。その他の特異的な核酸増幅技術には標準の置換活性化、QBレプリカーゼシステム、修復連鎖反応、リガーゼ連鎖反応及びライゲーション活性化転写が含まれる。便宜上、及び一般に好適とされるため、PCRなる語はその他の核酸増幅技術が当業者により適用される場合に本明細書において利用する。何らかのことわりのない限り、PCRについての言及は当業界における任意の適当な核酸増幅反応の利用を包括するものと解すべきである。
クローニングの場合において、全長コード配列を構築するために１又は複数の遺伝子フラグメントをライゲーションする必要がありうる。また、全長コード核酸分子が得られない場合、全長分子の一部を代表する小さめの分子が全長クローンを得るために利用されうる。インサートは部分cDNAクローンから調製してよく、そしてcDNAライブラリーをスクリーニングするために利用されうる。単離した全長クローンを発現ベクターの中にサブクローニングし、そして活性を例えばリポータープラスミドを有する適当な宿主細胞への形質導入によりアッセイできうる。
方法は標的核酸に対する１又は複数（例えば２本）のプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションを含みうる。核酸が二本鎖DNAのとき、ハイブリダイゼーションには一般に一本鎖DNAを生成する変性が先行する。ハイブリダイゼーションはPCR手順の一部であってよく、又はPCRを包含しないプロービング手順の一部であってよい。例示手順はPCRと低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションとの組合せであろう。当業者にとって有用な多くのものから選定したスクリーニング手順を有効なハイブリダイゼーション事象及び単離されたハイブリダイズした核酸を同定するために用いる。
標的核酸（例えばDNA）に対するプローブの結合は当業者の処理において任意の様々な技術を利用して測定できうる。例えば、プローブは放射能、蛍光又は酵素ラベルされていてよい。プローブラベリングを利用しないその他の方法は制限フラグメント長多形性の検査、PCRを利用する増幅、RN’ase切断及び対立形質特異的オリゴヌクレオチドプロービングをを含む。プロービングは標準のサザンブロッティング技術は利用しなくてよい。例えば、DNAを細胞から抽出し、そして様々な制限酵素で消化してよい。次いで制限フラグメントをアガロースゲル上での電気泳動により分離し、次いで変性させ、そしてニトロセルロースフィルターに転写する。ラベルしたプローブをフィルター上のDNAフラグメントにハイブリダイズさせ、そして結合を決定してよい。プロービング用のDNAが細胞からのRNA調製品から調製し得る。
予備実験は低ストリンジェンシー条件下で様々なプローブを制限酵素で消化したDNAのサザンブロットにハイブリダイゼーションさせることにより実施してよい。適当な条件は、大量のハイブリダイゼーションフラグメントが得られ、しかもバックグランドハイブリダイゼーションが低いときに達成されるであろう。このような条件を利用し、核酸ライブラリー、例えば発現配列の代表であるcDNAライブラリーを探索してよい。当業者はオリゴヌクレオチド長及び塩基組成、温度等の如き要因を考慮して、選択ハイブリダイゼーションのための所望のストリンジェンシーの適当な条件を採用することが十分に可能である。アミノ酸配列情報を基礎に、遺伝子コードの縮重、並びに適宜、候補核酸が由来する生物のコドン用法を考慮に入れ、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをデザインすることができうる。核酸増幅において利用するオリゴヌクレオチドは約10個以下のコドン（例えば、６，７又は８個）を有してよく、即ち長さ約30以下のヌクレオチドである（例えば18，21又は24）。汎用の特異的プライマーは長さにおいて14ヌクレオチド以上、しかしながら18〜20である必要はない。当業者はPCRの如きプロセスを利用するためのプライマーのデザインにおいて熟知している。オリゴヌクレオチドプライマーを合成するための様々な技術、例えばホスホトリエステル及びホスホジエステル合成法が当業界において公知である。
プローブ又はPCRプライマーのデザインにおいて利用するのに適当な好適なアミノ酸配列はLRP5の中に存在するモチーフをコードする（完全、実質的又は部分的に）保存された配列を含みうる（図５（ｄ））。
本発明の更なる観点は本発明に係る核酸を提示する任意の図面に示すヌクレオチド配列又は相補配列、特に核酸を獲得及び／又はスクリーニングする方法において利用するためのもののオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドフラグメントを提供する。いくつかの好適なオリゴヌクレオチドは表２（SEQ ID NO:49〜54）、表４（SEQ ID NO:83〜317）、表７、表８（SEQ ID NO:318〜333）もしくは表９に示す配列（SEQ ID NO:49〜74，334〜402）、又は１もしくは複数個のヌクレオチドの追加、置換、挿入もしくは欠失により示しているいずれかの配列と相違するが、好ましくは本発明に係る核酸と選択的にハイブリダイズする能力の喪失していない。即ち、所定のいずれかの配列とのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似度が十分に高い配列を有する。
いくつかの好適な態様において、示している任意の配列のフラグメント又はIDDMもしくはその他の病気に対する感受性に関わる任意の対立形質である本発明に係るオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも約10ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも約15ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも約20ヌクレオチドである。かかるフラグメント自体個別に本発明の観点を代表する。フラグメント及びその他のオリゴヌクレオチドは論じたプライマー又はプローブとして利用し得るが、IDDM又はその他の病気感受性を示唆する配列の試験サンプルの中での存在の決定に関する方法においても構築されうる（例えばPCRにより）。
診断及び／又は予後との関係、例えばIDDM又はその他の病気に対する感受性を決定するうえでの核酸の利用を包括する方法、並びにIDDM又はその他の病気感受性を示唆する配列の存在を決定するのに関連するその他の方法を以下に論ずる。
本発明に係るオリゴヌクレオチドの更なる態様は本明細書に記載の核酸に基づくアンチ−センスオリゴヌクレオチド配列である。アンチ−センスオリゴヌクレオチドは核酸、プレーmRNA又は成熟がmRNAの相補性配列にハイブリダイズし、所定のDNA配列によりコードされるポリペプチド（天然ポリペプチド又はその突然変異形態のいずれか）の生産を妨害し、その結果その発現を抑制又は一緒に阻止するようにデザインされうる。アンチ−センス技術はコード配列、遺伝子のコントロール配列、例えば５’隣接配列を標的とし、これによりアンチセンスオリゴヌクレオチドはコントロール配列を妨害しうるように利用することができる。アンチ−センスオリゴヌクレオチドはDNAもしくはRNAであってよく、そして長さ約14〜23ヌクレオチド、特に約15〜18ヌクレオチドであってよい。アンチセンス配列の構築及びその利用はPeyman and Ulman, Chemical Reviews, 90：543-584（1990）及びCrooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32：329-376（1992）に記載されている。
本発明に係る核酸は遺伝子治療、例えばIDDM又はその他の病気の予防又は治癒（完全又は部分的）を狙いとする個体の処置において利用し得る。これは病気の１又は複数の症状を緩和しうる。これは以下に論ずる。
本発明に係る核酸、例えば全長コード配列又はオリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーはキットの一部として、例えば内容物が外部環境から保護されている適当な容器、例えばバイヤルの中で供与されうる。このキットは核酸の例えばPCR及び／又は試験サンプル中の注目の核酸の存在を決定するための方法における使用のための仕様書を含んでよい。核酸がPCRにおける利用を意図するキットは反応のために必要とされる１又は複数のその他の試薬、例えばポリメラーゼ、ヌクレオシド、バッファー溶液等を含みうる。核酸はラベルしてよい。注目の核酸の有無を決定するうえで利用するキットは当該方法の実施のための１又は複数の物品及び／又は試薬、例えば試験サンプル自体を用意するための手段、例えば細胞を頬腔から取り除くためのスワブ、又は血液サンプルを抜き取るためのシリンジ（かかる部材は一般に滅菌されている）を含みうる。
更なる観点に従うと、本発明はLRP5遺伝子プロモーターを含む核酸分子を提供する。
別の観点において、本発明はプロモーターを含む核酸分子を提供し、このプロモーターは図12（ｅ）（SEQ ID NO:30）又は図15（ｂ）に示すヌクレオチドの配列を含む。このプロモーターは遺伝子発現を促進させるのに足りる図12（ｅ）（SEQ ID NO:30）又は図15（ｂ）（SEQ ID NO:34）に示す配列の１又は複数のフラグメントを含んで成りうる。このプロモーターはヒト染色体内のLRP5遺伝子の５’側のヌクレオチド配列、又はその他の種、例えばマウスにおける均等配列を含んで成る又は本質的にそれから成る。
当該図面に開示の任意の配列はゲノムLRP5遺伝子を含むゲノムライブラリーからのプロモーターの同定及び単離において利用するためのプローブを構築するのに利用されうる。かかるプロービングのための技術及び条件は当業界において公知であり、そして本明細書において論じる。組織及び／又は発育調節を司る最小要素又はモチーフを見つけるため、制限酵素又はヌクレアーゼを核酸分子の消化のために用い、次いで適当なアッセイ（例えばリポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼを用い）で必要な配列を決定する。本発明の好適な方法はプロモーター活性のために必要な図12（ｅ）（SEQ ID NO:30）又は図15（ｂ）（SEQ ID NO:34）に示す最小ヌクレオチド配列を有する核酸単離体を提供する。
前述の通り、プロモーターは発現の発育及び／又は組織特異的調節コントロールを供与する１又は複数の配列モチーフ又は要素を含んで成りうる。その他の調節配列、例えば適当な発現系における突然変異もしくは消化アッセイにより、又は例えばオンラインデーターベースをサーチングするためにコンピューターを用いての有用な情報との配列対比により同定される配列を含ませてよい。
「プロモーター」とは、下流に作用可能式に連結されたDNAの転写が開始されうる（即ち、二本鎖DNAのセンス鎖上で３’方向）ヌクレオチド配列を意味する。
「作用可能式に連結」とは、適当に配置され、そして転写がプロモーターから開始するように配向されて同じ核酸分子の一部として連結されていることを意味する。プロモーターに作用可能式に連結されたDNAはプロモーターの「転写開始調節下」にある。
本発明はここに提供するプロモーター配列のヌクレオチド付加、挿入、置換又は欠失により対立形質、突然変異体、変異体又は誘導体であるヌクレオチド配列を有するプロモーターに及ぶ。提供する配列との配列相同性の好適なレベルは本発明に係るコード核酸及びポリペプチドについての上記のものと類似していることがある。ヌクレオチド配列に改変を設けるための核酸の系統的又はランダム突然変異誘発は当業者に公知の任意の技術を利用して実施することができうる。本発明に係るプロモーター配列への１又は複数の改変はプロモーター活性を増強もしくは低下させることがあり、又はプロモーター活性を調節する物質の効果の程度を増強もしくは低下させることがある。
「プロモーター活性」は転写を開始する能力を意味するために用いている。プロモーター活性のレベルは例えばこのプロモーターからの転写により生成されるmRNAの量の評価により、又はこのプロモーターからの転写により生成されるmRNAの翻訳により生成されるタンパク質生成物の量の評価により定量可能である。発現系の中に存在する特異的なmRNAの量は例えばmRNAにハイブリダイズでき、且つラベルされた、又はポリメラーゼ連鎖反応の如き特異的な増幅反応において利用し得る特異的なオリゴヌクレオチドを利用して決定し得る。リポーター遺伝子の利用はタンパク質の生成を参照することによるプロモーター活性の決定を助長する。
本発明により更に提供するのは異種遺伝子、例えばコード配列に作用可能式に連結されたLRP5プロモーター領域又はプロモーター転写できるそのフラグメント、突然変異体、対立形質、誘導体もしくは変異体を含んで成る核酸構築体である。「異種」又は「外生」遺伝子は一般にLRP5の改変形態ではない。一般に、この遺伝子は、発現を経て検出でき、そして好ましくは定量できうるペプチド又はポリペプチド生成物へと翻訳されうるmRNAへと転写されうる。コード生成物が発現を経てアッセイされうる遺伝子を「リポーター遺伝子」、即ち、プロモーター活性に基づく「リポートする」遺伝子という。
リポーター遺伝子は好ましくは検出可能なシグナル、好ましくは目で検出可能なシグナル、例えば有色生成物を生成する反応を触媒する酵素をコードする。β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼ等、多くの例が知られる。β−ガラクトシダーゼ活性は基質に基づく青色の発色によりアッセイでき、このアッセイは目によるか、又は吸収を測定するスペクトル光度計の利用による。例えばルシフェラーゼ活性の結果生成される蛍光は光度計を利用して定量できうる。例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを利用しながら放射能アッセイを利用してよく、それは非放射能アッセイにおいても利用されうる。リポーター遺伝子からの発現に由来する遺伝子生成物の存在及び／又は量はその生成物に結合できる分子、例えば抗体又はそのフラグメントを利用して決定できうる。結合分子は任意の標準技術を利用して直接又は間接的にラベルできうる。
当業者は可能なリポーター遺伝子の多重度及び遺伝子活性を決定するために利用し得るアッセイ技術に十分に気がつくものである。任意の適当なリポーター／アッセイを利用してよく、そして本発明にとって特定の選択は必要でなく、又は制限はないことが理解される。
プロモーター（本明細書に開示）及び異種遺伝子（リポーター）を含んで成る核酸構築体はプロモーターの活性を調節できる物質についてのスクリーニングにおいて採用し得る。治療目的のため、例えばIDDM又はその他の病気の処置のため、プロモーターの発現を上昇調節できる物質が期待される。プロモーターの活性を調節する物質の能力についてのスクリーニング方法は、本明細書に開示する核酸構築体を含む発現系、例えば宿主細胞を試験又は候補物質と接触させ、そして異種遺伝子の発現を決定することを含んで成りうる。
試験物質の存在下での発現のレベルを試験物質の非存在下での発現のレベルと比較することができうる。試験物質の存在下での発現における相違は遺伝子発現を調節する物質の能力を示唆する。本明細書に開示するプロモーターに連結されていない別の遺伝子の発現と比較した異種遺伝子の発現の上昇はプロモーターの調節のためのこの物質の特異性を示唆する。
プロモーター構築体はゲノムの中に組込まれたリポーター構築体を含む安定な細胞系を作り出すため、前述の任意の技術を利用して細胞系の中に導入してよい。これらの細胞を増殖させ、そして試験化合物を様々な時間インキュベーションする。細胞を96穴プレートの中で増殖させ、大量の化合物の分析を促進する。次いで細胞を洗い、そしてリポーター遺伝子発現を分析する。いくつかのリポーター、例えばルシフェラーゼに関しては、細胞を溶解させてから分析する。
かくして、本発明はプロモーター活性の調節因子として核酸分子を利用して同定した物質のみならず、本明細書における開示に従い、かかる物質を含んで成る薬理組成物、医薬品、薬剤又はその組成物、例えばIDDM又はその他の病気の処置（これは予防処置を含みうる）におけるLRP5発現を増強するための患者へのかかる組成物の投与を含んで成る方法、例えばIDDM又はその他の病気の処置におけるLRP5発現を増強するための投与用組成物の製造におけるかかる物質の利用、並びにかかる物質と薬理学的に許容される賦形剤、ビヒクル又は担体及び任意的にその他の成分とを混合することを含んで成る薬理組成物の製造の方法等の様々な観点に及ぶ。
本発明の更なる観点は図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示すアミノ酸配列であって、単離及び／又は精製形態にあり、それが天然で一体化している物質、例えばその他のポリペプチド又は例えば図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示すアミノ酸配列以外のヒトポリペプチドを含まない又は実質的に含まず、又は（例えば原核細胞における発現により生成されるなら）天然のグリコシル化を欠く、例えば非グリコシル化のものを提供する。本発明に係る更なるポリペプチドは図11（ｃ）（SEQ ID NO:25）に示すポリペプチドにおいて示すもの、12（ｄ）に示すもの、及び図16（ｄ）（SEQ ID NO:8）に示す部分ポリペプチドから選ばれるアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列変異体、対立形質、誘導体又は変異体であるポリペプチドも本発明により提供する。変異体、対立形質、誘導体又は突然変異体であるポリペプチドは当該図面に示すものとは１又は複数のアミノ酸の付加、置換、欠失及び挿入のうちの１又は複数により相違する。好適なかかるポリペプチドはLRP5機能、即ち、下記の特性のうちの１又は複数を有する：配列を当該図面に示すポリペプチドと反応性な抗体との免疫学的交差反応性；そのアミノ酸配列を当該図面に示しているポリペプチドを有するポリペプチドの共有（例えば２種類のポリペプチド間の免疫学的交差反応により決定）；その配列を当該図面に示しているポリペプチドに対して生起させた抗体により阻害される生物活性；血清トリグリセリドを降下させる能力；血清コレステロールを降下させる能力；超低密度リポタンパク質粒子と相互作用する及び／又はその血清レベルを降下させる能力；血清アルカリホスファターゼレベルに影響を及ぼす能力。配列の変更はLRP5タンパク質の性質及び／又は活性レベル及び／又は安定性を変更しうる。
当該図面に示すアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体、対立形質、誘導体又は突然変異体であるポリペプチドは示している配列と約35％超、約40％超、約50％超、約60％超、約70％超、約80％超、約90％超又は約95％超の配列同一性を共有する。この配列は関連の図面に示すアミノ酸配列と約60％超の類似性、約70％超の類似性、約80％超の類似性、又は約90％超の類似性を共有しうる。アミノ酸類似性は一般に前述のアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）又はAltschulら（1990）J. Mol. Biol. 215：403-10のTBLASTNプログラムを参照して規定される。類似性は「保存変更」、即ち、一の疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの別の残基による置換、一の極性残基の別のものによる置換、例えばアルギニンのリジン、グルタミン酸のアスパラギン酸、又はグルタミンのアスパラギンによる置換を可能にする。特定のアミノ酸配列変異体は当該図面に示すものとは１個のアミノ酸、２，３，４，５〜10，10〜20，20〜30，30〜50，50〜100，100〜150又は150個超のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により相違しうる。
配列対比は本明細書に示す関連配列の全長にわたって行ってよく、又はより好ましくは約20，25，30，33，40，50，67，133，167，200，233，267，300，333，400，450，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600以上の連続配列、又はより多くのアミノ酸もしくはヌクレオチドトリプレットにわたって行ってよく、ケース毎に関連のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と対比させる。
本発明は更に本発明のポリペプチドの活性部分、フラグメント、誘導体及び機能性擬似体も含む。ポリペプチドの「活性部分」は当該全長ポリペプチドよりは短いが、生物活性、例えばリガンドに対する結合、エンドサイト−シスへの関与から選ばれる生物活性を保持するペプチドを意味する。かくして、LRP5ポリペプチドの活性部分は、一の態様において、トランスメンブランドメイン、及びエンドサイト−シスに関与するサイトプラズマテールの部分を含む。かかる活性フラグメントは、例えば別のリガンドに対する結合部分を含む融合タンパク質の一部として含まれうる。別の態様において、LDLとEGFモチーフとの組合せを分子の中に含ませ、異なる結合特異性を分子に授けることができうる。
ポリペプチドの「フラグメント」は一般に少なくとも約５個の連続アミノ酸、往々にして少なくとも約７個の連続アミノ酸、典型的には少なくとも約９個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約13個の連続アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも約20〜30又はそれより多くの連続アミノ酸のアミノ酸残基鎖を意味する。LRP5ポリペプチド配列のフラグメントはアミノ酸配列の一部に対する抗体を生起させるために有用な抗原決定基又はエピトープを含みうる。ポリペプチド内のペプチドモチーフを発見及び精製するためにアラニンスキャンが一般に利用され、これは各残基のアミノ酸アラニンによる順番通りの系統的置換、それに生物活性の評価が続く。
LRP5の好適なフラグメントは下記のアミノ酸配列のいずれかを有するものが含まれる：
0004271735.tif 000002
これは例えば抗体を生起又は単離するために利用されうる。変異及び誘導ペプチド、これらの配列のいずれかとは１又は複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換により異なるアミノ酸配列を有するペプチドも本発明により提供されるが、但し一般にこの変異体又は誘導ペプチドはその配列を示すペプチドのいずれかと結合する抗体又はその他の特異的結合性構成員と結合することを条件とする。示しているペプチドの変異体又は突然変異体であるペプチドは特異的結合性構成員、例えば抗体又はその抗原結合性フラグメントに対する結合について表示のペプチドと競合しうる。
ポリペプチドの「誘導体」又はそのフラグメントは当該タンパク質のアミノ酸配列を、例えばそのタンパク質をコードする核酸の操作により又はそのタンパク質自体の改変により変えることによって修飾されたポリペプチドを含む。天然アミノ酸配列のかかる誘導体は１又は複数個のアミノ酸の挿入、付加、欠失又は置換のうちの一つ又は複数を包括し得、それは野生型ポリペプチドの生物活性の品質が基本的に変わっていないことがある。本発明の範囲に更に包括されるのは提供するLRP5ポリペプチドの活性フラグメントの機能性擬似体である（対立形質、突然変異体、誘導体及び変異体を含む）。「機能性擬似体」なる語は関連のアミノ酸配列の活性部分を含まないことのある物質を意味し、そしておそらくは完全なペプチドではなく、しかしながら天然のLRP5ポリペプチドの生物活性を定性的観点で保持するものである。候補擬似体のデザイン及びスクリーニングを以下に詳細する。
本発明の好適な態様の代表的なアミノ酸配列変異体の配列を表５及び表６に示す。試験サンプル中の１又は複数のこれらの配列の存在についてのスクリーニングは、例えば後述の通りIDDM又はその他の病気感受性を決定するうえでの診断及び／又は予後用途を有する。
本明細書にその配列情報を供するポリペプチドのその他のフラグメントを、例えば機能性ドメインとの関連で、本発明の観点として提供する。一のかかる機能性ドメインは推定細胞外ドメインであり、従って本発明に係るポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列を図５（ｅ）（SEQ ID NO:4）又は図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）に示すポリペプチドの細胞外ドメインを含みうる。これは図５（ｃ）（SEQ ID NO:3）の前駆体配列のアミノ酸1385にまで及ぶ。その他の有用なLRP5ドメインは細胞質ドメインであり、図５（ｄ）（SEQ ID NO:3）にその207個のアミノ酸を示す。これはタンパク質をエンドサイト−シス経路を経るように照準付けするのに利用されうる。
本発明に係るポリペプチドは例えばコード核酸からの発現（これについては以下参照）による生産後に単離及び／又は精製されうる（例えば抗体を利用して）。かくして、ポリペプチドはそれが天然に一体化している夾雑物（もしそれが天然ポリペプチドなら）を含まない又は実質的に含まないで提供されうる。ポリペプチドはその他のポリペプチドを含まない又は実質的に含まないで提供されうる。本発明に係るポリペプチドは化学合成により完全に又は部分的に作製されうる。単離及び／又は精製されたポリペプチドは組成物の処方において利用してよく、その組成物は少なくとも一種の更なる成分を含んでよく、例えば薬理学的に許容される賦形剤、ビヒクル又は担体を含む薬理組成物である。本発明に係るポリペプチドを含む組成物は後述の通り予防及び／又は治療的処置において利用できうる。
本発明に係るポリペプチド、ペプチドフラグメント、対立形質、突然変異体、誘導体又は変異体は特異的な抗体を得るうえでの免疫原等として利用されうる。抗体は診断スクリーニング及び治療的観点でのポリペプチド及びペプチドの精製及びその他の操作において有用である。これを以下に論ずる。
本発明に係るポリペプチドは、その活性又は機能、例えばリガンドに対する結合、エンドサイト−シスにおける関与、細胞内区画から細胞表層への移動、細胞表層から細胞内区画への移動に影響を及ぼす又は調節する分子のスクリーニングにおいて利用されうる。かかる分子はLRP5のリガンド結合性部分、LRP5の細胞質部分、又はLRP5を含む小胞の細胞表層を中心とする移動に関与するような１又は複数のアクセサリー分子と相互作用し得、そして治療的（可能としては予防的）観点において有用でありうる。
新たな薬剤の同定に結びつく薬理研究は、最先化合物が見つかる前又は見つかった後でさえも、非常に大量の数の候補物質のスクリーニングを包括しうることが周知である。これは薬理研究を非常に高額且つ時間のかかるものとする一つの要因である。IDDM又はその他の病気を処置又は予防するうえで潜在的に有用な物質をスクリーニングするためのかかる手段は本発明に係るポリペプチドにより提供される。ポリペプチドの調節因子として同定された物質はIDDM及びその他の病気に対する戦闘力の進歩を示し、なぜならこれらはin vivo用途のための治療方法のデザイン及び調査の基礎を担うからである。更に、これらは本明細書において論ずるLRP5の機能的用途により、数多くの症状、例えば自己免疫疾患、例えば糸球体腎炎、エンドサイト−シス及び／又は抗原提示の崩壊の関与する病気及び障害、サイトカイン浄化及び／又は炎症の関与する病気及び障害、ウィルス感染症、病原性細菌毒素汚染、遊離脂肪酸の上昇又は高コレステロール血症、２型糖尿病、骨粗しょう症及びアルツハイマー病のいずれかにおいて有用でありうる。本明細書に記載の通り、LRP5、そのフラグメント及び本発明に係る核酸はこのような病気及び障害のいずれかを打倒するうえでも有用でありうる。
ポリペプチドの活性を調節する物質のスクリーニングのための方法は、１又は複数の試験物質を当該ポリペプチドと適当な反応媒体の中で接触させ、処置ポリペプチドの活性を試験し、そしてその活性を１又は複数の試験物質で処理していない同等の反応媒体中の当該ポリペプチドの活性と比較することを含みうる。処理及び未処理ポリペプチド間の活性の差は関連の１又は複数の試験物質の調節作用の指標となる。
組合せライブラリー技術（Schultz, JS（1996）Biotechnol. Prog. 12:729-743）は、ポリペプチドの活性を調節する能力に関して潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する有効な方法を提供する。活性の調節のためにスクリーニングされる前に、またはそれと同様に、被験物質は、例えば酵母菌ツーハイブリッド系でポリペプチドと相互作用する能力に関してスクリーニングされ得る（これはポリペプチドと被験物質の両方がコード化核酸から酵母菌中で発現され得ることを必要とする）。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力に関して物質を試験する前の粗スクリーンとして用いられる。
ポリペプチド活性を調節するかまたはそれに影響を及ぼす物質の同定後、物質はさらに検査され得る。さらに、それは薬物、製剤組成物または医薬品のような組成物の調製に、即ち製造または処方において製造されおよび／または用いられる。これらは個体に投与され得る。
したがって、本発明は、本明細書中に開示したことと合致して、ポリペプチド活性のモジュレーターとして同定される物質に対してだけでなく、このような物質を包含する製剤組成物、薬物、医薬品またはその他の組成物、例えばＩＤＤＭまたはその他の疾患を治療する（予防的治療を含み得る）ためのこのような組成物の患者への投与を包含する方法、例えばＩＤＤＭまたはその他の疾患を治療するために投与するための組成物の製造におけるこのような物質の使用、そしてこのような物質を製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体、および任意にその他の成分と混ぜ合わせることを包含する製剤組成物の製造方法に対する種々の局面にわたる。
ペプチドまたはプロモーター機能のモジュレーターとして用いる同定された物質は、天然のペプチドまたは非ペプチドであり得る。非ペプチド「小分子」は、しばしば、多数のin vivo製薬用途のために選ばれる。したがって、本物質の擬似物質または擬物質（特にペプチドである場合には）は、製薬的使用のために設計され得る。既知の製薬的活性化合物に対する擬似物質の設計は、「先行」化合物を基礎にした製剤の開発への既知のアプローチである。これは、活性化合物が合成するのが難しいかまたは経費が掛かる場合に、あるいはそれが特定の投与方法に適していない、例えばペプチドが、消化管中のプロテアーゼにより迅速に分解される傾向があるので、経口組成物用の活性剤としては十分に適しているわけではない場合に、望ましい。擬似物質の設計、合成および試験を用いて、標的特性に関して多数の分子の無作為スクリーニングをせずに済ませ得る。
所定の標的特性を有する化合物からの擬似物質の設計に一般に採用されるいくつかの工程がある。第一に、標的特性を確定する場合に決定的および／または重要である化合物の特定の部分が確定される。ペプチドの場合には、これはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変えることにより、例えば各残基を順次置換することによりなされ得る。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「薬物団」として知られている。
薬物団が見出されれば、一連の供給源、例えば分光器的技術、Ｘ線回析データおよびＮＭＲからのデータを用いて、その物理的特性、例えば化学量論、結合、サイズおよび／または電荷により、その構造はモデル化される。コンピューター分析、類似点マッピング（これは、原子間の結合というよりむしろ、薬物団の電荷および／または容積を模する）およびその他の技術がこのモデリング法に用い得る。
このアプローチの変法では、配位子およびその結合相手の三次元構造が模される。これは、配位子および／または結合相手が結合における配座を変えて、モデルにこれを考慮した擬似物質の設計を可能にする場合に特に有用であり得る。
次に、薬物団に擬似する化学基がその上にグラフトされ得る鋳型分子が選択される。鋳型分子およびそこにグラフトされる化学基は、擬似物質が容易に合成され、薬理学的に許容可能であると考えられ、そしてin vivoで分解せず、その一方で先行化合物の生物学的活性を保持するように選択されるのが便利である。このアプローチにより見出される単数または複数の擬似物質は次に、それらが標的特性を有するか否か、またはどの程度それらがそれを示すかを見るためにスクリーニングされ得る。さらなる最適化または修飾がなされて、in vivoまたは臨床検査用の１つ又はそれ以上の最終擬似物質に達し得る。
本明細書中に開示したようなスクリーニング方法を用いて得るＬＲＰ５ポリペプチドまたはプロモーター活性を調節する能力を有すると同定された物質の擬似物質は、本発明の範囲内に含まれる。ポリペプチド、ペプチドまたは本発明のポリペプチドの活性を調節し得る物質は、例えば外部環境からその内容物を保護する適切な容器中に密封されて、キット中に提供され得る。このようなキットは、使用説明書を含有し得る。
本発明のポリペプチドの便利な製造方法は、発現系中で核酸を用いることにより、それをコードする核酸を発現することである。したがって、本発明はポリペプチド（開示されるような）の製造方法であって、ポリペプチドをコードする核酸（一般的に本発明の核酸）からの発現を含む方法も包含する。これは、ポリペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にする適切な条件下で、このようなベクターを含有する培養中で宿主細胞を増殖させることにより成し遂げるのが便利である。ポリペプチドは、網状赤血球溶解産物のようなin vitro系でも発現され得る。
種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、真核細胞、例えば哺乳類および酵母菌、ならびにバキュウロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当業界で利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ハムスター新生仔腎細胞、ＣＯＳ細胞およびその他多数が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。適切な配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な場合にはその他の配列を含有する適切なベクターが選択または構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、適切な場合には例えば「ファージ」またはファージミドであり得る。さらに詳しくは、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: ２nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照していただきたい。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多数の既知の技術およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
したがって、本発明のさらなる局面は、本明細書中に開示したような核酸を含有する宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に統合され得る。統合は、標準技法にしたがって、ゲノムとの組換えを促す配列の含入により促進され得る。核酸は、細胞ないの染色体外ベクター上に存在し得る。
さらに別の局面は、核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。（特にin vitro導入に関して）一般的に「形質転換」と呼ばれ得るがしかしこれに限定されない導入は、任意の利用可能な技術を用い得る。真核細胞に関しては、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたはその他のウイルス、例えばワクシニア、または昆虫細胞に関してはバキュウロウイルスを用いる形質導入が挙げられる。細菌細胞に関しては、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。
抗生物質耐性または感受性遺伝子のようなマーカー遺伝子は、当業界で周知のように、当該核酸を含有するクローンを同定する場合に用い得る。
導入後は、コード化ポリペプチドが産生されるように、遺伝子の発現のための条件下で、例えば宿主細胞（実際に形質転換され得るが、しかし形質転換細胞の子孫であると考えられるほうが多い）を培養することにより核酸からの発現が引き起こされるかまたは可能になる。適切なシグナルリーダーペプチドと結合してポリペプチドが発現されると、それは細胞から培地中に分泌され得る。発現による産生後、ポリペプチドは宿主細胞および／または培地から単離および／または精製されて、臨機応変に、その後、例えば１つ又はそれ以上の付加的成分を含み得る組成物、例えば１つ又はそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体（例えば下記参照）を含む製剤組成物の処方において、望ましい場合には用い得る。
核酸の導入は、下記のように、遺伝子療法の方法により、in vivoで起こり得る。例えば細胞または細胞の先祖への核酸の導入、および／または細胞または祖先に内因性の遺伝子変化（導入または変化は、in vivoまたはex vivoで起こり得る）の結果として、本発明の核酸を含有する宿主細胞は、動物、特にヒトまたは非ヒトであり得る哺乳類、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたはその他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマであるか、あるいは鳥類、例えば鶏である生物体内に（例えば体細胞中に）包含され得る。このような細胞を包含する遺伝的修飾またはトランスジェニックな動物またはトリも、本発明のさらなる局面として提供される。
したがって、種々のさらに別の局面において、本発明は、そのゲノム内にヒトＬＲＰ５導入遺伝子を有する非ヒト動物を提供する。導入遺伝子は、本明細書中で同定されたアイソフォームのいずれか、あるいは開示されるようなその突然変異体、誘導体、対立形質または変異体の配列を有し得る。好ましい一実施態様では、異種ヒトＬＲＰ５配列は内因性動物配列を置換する。その他の好ましい実施態様では、ヒトＬＲＰ５配列の１つ又はそれ以上のコピーが動物ゲノムに付加される。
好ましくは、動物は齧歯類であり、最も好ましくはマウスまたはラットである。
これは治療目的を有し得る（遺伝子療法は以下で考察される）。突然変異体、生物体の細胞内の対立形質または変異体配列の存在は、特に相同内因性配列の代わりである場合には、ＬＲＰ５遺伝子、あるいはin vitroでコード化ポリペプチドおよび／またはプロモーターの活性を調節するか、そうでなければ治療的効力を有することが示されている物質の役割を試験するかおよび／または研究する場合のモデルとして生物を用いることを可能にし得る。ＬＲＰ５欠損に関する動物モデルは、動物生殖細胞系中への突然変異の導入のための標準技術を用いて構築し得る。このアプローチの一例では、マウスを用いて、ＬＲＰ５遺伝子内に挿入突然変異を保有するベクターが胚幹細胞中にトランスフェクトし得る。選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏＲを、突然変異体遺伝子が内因性野生型相同体に取って代わったクローンの選択を促すために含有し得る。このようなクローンは、サザーンブロットハイブリダイゼーションにより同定されるかまたはさらに検査し得る。次に、クローンを展開し、細胞をマウス未分化胚芽細胞段階の胚中に注入する。注入細胞がマウスの発生に寄与したマウスを、サザーンブロッティングにより同定し得る。これらのキメラマウスを次に交配して、生殖細胞系における突然変異のコピーを１つ保有するマウスを産生し得る。これらのヘテロ接合体突然変異動物を次に交配して、ホモ接合的に遺伝子の突然変異を保有するマウスを産生し得る。ヘＬＲＰ５遺伝子におけるヘテロ接合突然変異を有するマウスは、ＩＤＤＭまたはその他の疾患を発症する危険性のある生殖細胞系における突然変異化した遺伝子のコピー１つを有するヒト個体に適したモデルであり得る。
動物モデルは、本明細書の別の箇所で考察される種々の疾患のいずれかにも有用である。
導入遺伝子によりコードされるポリペプチドの産生に有用なものの変わりに、またはそれと同様に、宿主細胞は、大量の核酸を精製するために当該核酸に取って代わるための核酸工場として用い得る。当該核酸の多数のコピーは、周知のように、増幅可能遺伝子、例えばジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）に結合される場合に、細胞内に製造され得る。当該核酸で形質転換された、または核酸が導入された宿主細胞に由来するものを、適切な条件下で、例えば発酵器中で培養し、培養から採取して、核酸を精製するためのプロセッシングを施し得る。精製後、核酸あるいは１つ又はそれ以上のその断片を、所望により、例えば本明細書中の別の箇所で考察されるように、診断または予後検定において用い得る。
新規のＬＲＰ−５ポリペプチドアイソフォーム、ならびに突然変異体、対立形質、変異体および誘導体の提示は、最初の間は、これらの分子を特異的に結合し得る抗体の産生を可能にする。
したがって、本発明のさらに別の局面は、その配列が本明細書中の図で示されるポリペプチドと特異的に結合し得る抗体を提供する。このような抗体は、それが結合し得るポリペプチドとそれが全くまたは実質的に全く結合親和性を有さない（例えば、約１０００ｘより低い結合親和性）その他のヒトポリペプチドとの間で区別され得る存在であるという意味で特異的であり得る。特異的抗体は、多の分子上には存在しないかまたは許容可能でない分子上のエピトープを結合する。本発明の抗体は、野生型ポリペプチドに対して特異的であり得る。本発明の抗体は、下記で考察されるような診断および予後方法に有用であるように、その分子と野生型ポリペプチドとの間のような特定の突然変異体、変異体、対立形質または誘導体ポリペプチドに対して特異的であり得る。抗体は、例えばコード核酸からの組換え体発現による産生後にそれらが結合する単数または複数のポリペプチドを精製する場合にも有用である。
本発明の好ましい抗体は、その他のポリペプチドおよび／または血清無含有成分を結合し得るような夾雑物を含有しない存在であるという意味で、単離され得る。ポリクローナル抗体が本発明の範囲内であるけれども、モノクローナル抗体はいくつかの目的には好ましい。
抗体は、当業界において標準である技術を用いて得られる。抗体産生方法としては、タンパク質またはその断片による哺乳類（例えばマウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）の免疫感作が挙げられる。抗体は、当業界で既知の種々の技法のいずれかを用いて免疫感作動物から得られ、好ましくは、抗体の当該抗原との結合を用いてスクリーニングし得る。例えば、ウエスタンブロッティング法または免疫沈降法を用い得る（Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82）。動物からの抗体および／または抗体産生細胞の単離は、動物の屠殺工程を伴い得る。
動物をペプチドで免疫感作することに代わるものまたは補うものとして、タンパク質に特異的な抗体が、例えばそれらの表面上に機能性免疫グロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いて、発現化イムノグロブリン可変ドメインの組換え的産生ライブラリーから得られ得る（例えば、ＷＯ９２／０１０４７参照）。ライブラリは、いずれのタンパク質（または断片）でも免疫感作されていない生物体から得られる配列から構築される自然のものであり得るか、あるいは当該抗原に曝露された生物体から得られる配列を用いて構築されたものであり得る。
動物を免疫感作する場合におよび／または抗ＬＲＰ５抗体を単離する場合に用いるのに適したペプチドとしては、以下のアミノ酸配列のいずれかが挙げられる：
ＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）
ＶＤＧＲＱＮＩＫＲＡＫＤＤＧＴ（SEQ ID NO:404）
ＥＶＬＦＴＴＧＬＩＲＰＶＡＬＶＶＤＮ（SEQ ID NO:405）
ＩＱＧＨＬＤＦＶＭＤＩＬＶＦＨＳ（SEQ ID NO:406）。
本発明の抗体は、多数の方法で修飾され得る。実際、「抗体」という用語は、必要な特異性を伴う結合ドメインを有するあらゆる結合物質を網羅するものと解釈されるべきである。したがって、本発明は、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物および相同物、例えばその形状が抗原またはエピトープを結合し得る抗体の形状を模する単数または複数の合成分子を網羅する。
抗原またはその他の結合相手を結合し得る抗体断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片；ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片；単離ＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。一本鎖Ｆｖ断片も含まれる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝子突然変異またはその他の変化を蒙り得る。モノクローナル抗体は組換えＤＮＡ技術の技法を施されて、その他の抗体または元の抗体の特異性を保持するキメラ分子を産生し得る、ということは、さらに、当業者に理解される。このような技法は、イムノグロブリン可変領域または定常部に対する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、異なるイムノグロブリンの定常部＋枠組み構造領域をコードするＤＮＡの導入を包含し得る（例えば、欧州特許出願第１８４１８７号、英国特許出願第２１８８６３８号、または欧州特許出願第０２３９４００号参照）。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願第０１２０６９４号および欧州特許出願第０１２５０２３号に記載されている。
所望の結合特性を有する抗体を産生し得るハイブリドーマは、抗体（抗体断片を含む）をコードし、それらを発現し得る核酸を含有する真核または原核生物の宿主細胞と同様に、本発明の範囲内である。本発明は、抗体が産生され、そして好ましくは分泌される条件下で抗体を産生し得る細胞を増殖することを包含する抗体の産生方法も提供する。
試料における抗体の反応性は、適切な手段により確定し得る。個々のレポーター分子によるタッグ付は１つの可能性である。レポーター分子は、直接または間接的に検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを生成し得る。レポーター分子の連鎖は、直接的であるかまたは例えばペプチド結合を介して間接的、共有的であるか、あるいは非共有的であり得る。ペプチド結合を介しての連鎖は抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果として存在し得る。
有望な一方式は、分光的に単離される吸光または発光特性を有する各抗体の個々の蛍光色素、リンまたはレーザー染料との共有結合によるものである。適切な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドが挙げられる。適切な色原体染料には、ジアミノベンジジンが含まれる。
その他のレポーターとしては、視覚的に観察され、電子工学的に検出され、またはその他の方法で記録される検出可能なシグナルを直接または間接的に生じ得る、着色性、磁性または常磁性の、そして生物学的または化学的に活性な作用物質であるラテックスビーズのような高分子コロイド粒子または粒状物質が挙げられる。これらの分子は、例えば色を発色または変色する、あるいは電気的特性の変化を生じる反応を触媒する酵素であり得る。エネルギーー状態間の電子遷移が特徴的スペクトル吸光または発光を生じるように、それらは分子的に励起可能である。それらは、バイオセンサーと一緒に用いられる化学的実体を含み得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリ性ホスファターゼ検出系が用いられる。
結合の確定方式は本発明の特徴の一つではなく、当業者は彼等の好みおよび一般的知識によって適切な方式を選択し得る。本発明の抗体の特定の実施態様としては、少なくとも１０-7Ｍの親和性で、以下のペプチドの１つに結合および／または特異的に結合し得る抗体が挙げられる：
ＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）
ＶＤＧＲＱＮＩＫＲＡＫＤＤＧＴ（SEQ ID NO:404）
ＥＶＬＦＴＴＧＬＩＲＰＶＡＬＶＶＤＮ（SEQ ID NO:405）
ＩＱＧＨＬＤＦＶＭＤＩＬＶＦＨＳ（SEQ ID NO:406）。
本発明の抗体は、例えば、考察されたような細胞または細胞溶解物を含有する被験試料中のポリペプチドの存在に関してスクリーニングするのに用い得るし、そして、例えばそのためのコード核酸からの発現によるポリペプチドの産生後に本発明のポリペプチドを精製および／または単離するのに用い得る。抗体は、それらが結合し、したがってポリペプチドが個体における有害作用を有する場合には治療的状況（予防を含み得る）で有用であり得る。
抗体は、例えば被験試料中の特定の物質の存在を確定する場合に抗体を用いるための仕様書を含み得るキットで提供され得る。標識分子、緩衝液、溶出液などのような、１つ又はそれ以上のその他の試薬が含まれ得る。試薬は、外部環境からそれらを保護する容器、例えば密封容器内に提供され得る。
ＬＲＰ５遺伝子の同定、ならびにＩＤＤＭおよびその他の疾患とのその関連は、本発明の局面のための方向を固めて、ＩＤＤＭまたはその他の疾患と特異的に関連した変異体形態の遺伝子、特に対立遺伝子または変異体の被験試料中の存在または非存在を確立するための、前記で開示し、考察したような物質および方法の使用を提供する。これは、ＩＤＤＭまたはその他の疾患に対する個体の疾病素質を診断するためのものである。それは、ＩＤＤＭ４遺伝子と関連しているような疾患を有する患者のＩＤＤＭを診断するためのものである。
これは、適切な治療的および／または予防的処置の計画立案を可能にし、最も有益であると思われるものを標的にすることにより治療の合理化を可能にする。
変異体形態の遺伝子は、（表５または表６に示したような）遺伝子機能を崩壊し得るまたはし得ない、野生型配列と比較した場合の１つ又はそれ以上のヌクレオチドの１つ又はそれ以上の挿入、欠失、置換および／または付加を含有し得る。核酸レベルでの差は、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列の差に必ずしも反映されない。しかしながら、遺伝子における突然変異またはその他の差は、フレームシフトまたは停止コドンを生じ得るし、これは（もしあれば）産生されるポリペプチドの性質、あるいはコード化ポリペプチドに対する点突然変異または大きい突然変異的変化、例えば１つ又はそれ以上のアミノ酸またはペプチド中の領域の挿入、欠失、置換および／または付加に重得な影響を及ぼし得る。プロモーター配列またはその他の調節領域における突然変異は、遺伝子からの発現を防止または低減し、あるいはｍＲＮＡ転写体のプロセッシングまたは安定性に影響し得る。例えば、配列変化は、ｍＲＮＡの代替的スプライシングに影響を及ぼし得る。考察したように、代替的スプライシングに起因する種々のＬＲＰ５アイソフォームは、本発明により提供される。
特定の核酸配列、例えば表５または表６に示した変化を含めた本明細書中の任意の図面に示した配列、あるいはその突然変異体、変異体または対立形質の被験試料中の存在または非存在を確定するための種々の方法が存在する。
試験は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡを含有する調製物に関して実施し得る。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの試験は、イントロン配列の非存在により核酸の複雑度が低減されるという利点を有するが、しかし調製物の製造に余分の時間と労力を有するという不利益を生じ得る。ＲＮＡは、ＲＮアーゼの広範な出現のために、ＤＮＡより操作がより難しい。被験試料中の核酸をシーケンシングし、その配列が本明細書中の図面のいずれかに示した配列と比較して、差が存在するか否かを確定し得る。その場合、差を（例えば、表５または表６に示したような）既知の感受性対立遺伝子と比較して、被験核酸が１つ又はそれ以上の所定の変異を含有するか否かを確定し得るし、あるいはＩＤＤＭまたはその他の疾患との関連に関して差が検査され得る。
被験試料中の全核酸、あるいは全ＬＲＰ５遺伝子をさえシーケンシングすることは一般的に時間または労力効率的であるため、１つ又はそれ以上のプライマー対を用いたＰＣＲのような特定の増幅反応を用いて、核酸中の当該領域、例えばＬＲＰ５遺伝子、あるいはＩＤＤＭまたはその他の疾患感受性に関連した多型性が起こる特定の領域を増幅し得る。次に増幅核酸を前記のようにシーケンシングし、および／または他のいずれかの方法で試験して、特定の特徴の存在または非存在を確定し得る。試験用核酸は、細胞から取り出した核酸から、または制限酵素消化および電気泳動のような種々のその他の技法を用いてライブラリ中で調製し得る。
核酸は、変異体または対立遺伝子特異性プローブを用いてスクリーニングし得る。このようなプローブは、配列中で、ＬＲＰ５遺伝子の領域、あるいはＩＤＤＭまたはその他の疾患感受性に関連することが知られている配列変化を含有するその補体に対応する。適切なストリンジェンシー条件下で、核酸を試験するためのこのようなプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、被験核酸中の配列変化の存在を示す。有効なスクリーニングのために、１つより多いプローブを同一被験試料に関して用い得る。
対立形質または変異体特異的オリゴヌクレオチドを同様にＰＣＲに用いて、被験試料中に存在する場合には特定の配列を特異的に増幅し得る。ＰＣＲバンドが遺伝子変異体を含有するか否かの査定は、当業者には浴知られている多数の方法で実施し得る。ＰＣＲ生成物は、例えば変性ポリアクリルアミドＤＮＡシーケンシングゲル上で、選定中の遺伝子変異体に結びつけられる特異的バンドを伴う多型性を示し得る方法で処理し得る。
配列変異体／突然変異に関してＤＮＡ断片をスクリーニングするために、ＳＳＣＰヘテロ二重型分析を用い得る。それは一般的に、遺伝子の放射能標識化１００〜３００ｂｐ断片を増幅し、これらの生成物を希釈して、９５℃で変性することを包含する。断片を、ＤＮＡが一本鎖形態を保持するように、氷上で急冷する。これらの一本鎖断片をアクリルアミドベースのゲルを通して移動させる。配列組成の差は、一本鎖分子にこのゲルマトリックス中で異なる配座を採用させて、それらの動きを野生型断片とは異なるようにし、したがってＸ線フィルムにゲルを曝露した場合に対照断片に対して分析される断片での突然変異の検出を可能にする。移動性／配座の変化を示す断片をゲルから直ちに切り出して、突然変異に関して直ちにシーケンシングし得る。
ＰＣＲ生成物のシーケンシングは、イソプロパノールによる沈降、ＴａｇＦＳ＋染料ターミネーターシーケンシングキットを用いた再懸濁およびシーケンシングを包含し得る。延長生成物をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー上で電気泳動処理して、シーケンスナビゲーターソフトウエアを用いてデータを分析し得る。
さらに考え得るシーケンシングアプローチは、コンセンサスKozak開始配列およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマーで断片が増幅されるＰＴＴ検定を用いる。これらの余分の配列を、それらが分析されている断片の元のコード配列とともに枠内に存在するように、５’プライマーに組み入れられる。これらのＰＣＲ生成物を共役転写／翻訳系に導入する。この反応は、断片からのＲＮＡの産生およびこのＲＮＡのタンパク質断片への翻訳を可能にする。対照からのＰＣＲ生成物は、分析中の断片のサイズに対して野生型サイズのタンパク質生成物を作る。分析されるＰＣＲ生成物がフレームシフトまたはナンセンス突然変異を有する場合、検定は、対照に対して切頭型タンパク質を生じる。切頭型生成物のサイズは突然変異の位置に関連し、この患者からの遺伝子の相対的領域をシーケンシングして切頭型突然変異を同定し得る。
被験試料中の変異体配列の存在を探すための代替物または補体は、例えば適切な特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、正常配列の存在を探すためである。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの使用は、前記により詳細に考察されている。
本発明の実施態様の対立遺伝子または変異体特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、表４（SEQ ID NO:83〜317）、表７（SEQ ID NO:240〜317）または表８（SEQ ID NO:318〜333）に示したものから選択し得る。
プローブおよび被験核酸間のハイブリダイゼーションとその後の不適正の検出によるアプローチを用い得る。適切な条件（温度、ｐＨ等）下で、オリゴヌクレオチドプローブを、全く相補的であるというわけではない配列とハイブリダイズする。２つの分子間の塩基対合の程度は、不適正であってもそれらがアニーリングするのに十分である。２つのアニーリング核酸分子間の不適正の存在を検出するための種々のアプローチが当業界で周知である。
例えば、ＲＮアーゼＡは、不適正の部位で切断する。切断は、関連の単数または複数のプローブがアニーリングされた被験核酸を電気泳動処理し、そして全長プローブ／被験ハイブリッドより小さい分子（即ちより高い電気泳動移動性を有する分子）を探すことにより、検出し得る。
したがって、ＩＤＤＭまたはその他の疾患感受性と関連した突然変異が起きることが知られている正常ＬＲＰ５遺伝子（センスまたはアンチセンス鎖）の領域の配列（例えば、表５および表６参照）を有するオリゴヌクレオチドプローブをアニーリングして、核酸、および確定された不適正の存在または非存在を試験し得る。不適正の存在の検出は、ＩＤＤＭまたはその他の疾患感受性に関連した突然変異の被験核酸中での存在を示し得る。他方、ＩＤＤＭまたはその他の疾患感受性に関連した突然変異を含めた遺伝子の領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブをアニーリングして、核酸、および確定された不適正の存在または非存在を試験し得る。不適正の存在は、被験試料中の核酸が正常配列を有することを示し得る（不適正の非存在は、被験核酸が突然変異を有することを示す）。どちらかの場合に、遺伝子の異なる領域に対する一群のプローブを用い得る。
核酸分子中の配列の差の存在は、例えば、１つ又はそれ以上の制限酵素を用いて核酸の試料を切断した場合に生成される制限パターンを、例えば表５または表６に示した変化を含有するような本明細書中の図面に示した正常遺伝子、あるいは変異体または対立遺伝子を含有する試料を同一の単数または複数の酵素で消化して得られるパターンと比較するＤＮＡフィンガープリント法のような制限酵素消化の手段により検出し得る。
プロモーターまたはその他の調節配列中の病変の存在または非存在は、転写によるｍＲＮＡ産生のレベル、またはｍＲＮＡからの転写による翻訳によるポリペプチド産生のレベルを確定することによっても査定し得る。プロモーター活性の確定は、前記に考察されている。
核酸の被験試料は、例えば細胞あるいは生物組織または流体、尿、唾液、糞、頬スワブ、生検または好ましくは血液から核酸を抽出することにより、もしくは羊膜、胎盤または胎児それ自体からの出生前試験のために提供される。
本明細書中の図面のいずれかに示したアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列突然変異体、変異体または対立遺伝子を有するポリペプチドのような特定のポリペプチドの被験試料中の存在または非存在を確定するための種々の方法がある。
試料は、本明細書中の図面に示したポリペプチドの１つ又はそれ以上の特定の変異体に特異的な抗体（または抗体の混合物）のような特異的結合成員に対する結合相手の存在に関して試験され得る。試料は、本明細書中の図面に示したポリペプチドに特異的な抗体（または抗体の混合物）のような特異的結合成員に対する結合相手の存在に関して試験され得る。このような場合、試料は、例えば考察されたようなレポーター系を用いて結合が確定される前に、特異的結合のための適切な条件下で、特異的結合成員、例えば抗体と接触させることにより試験され得る。抗体のパネルを用いる場合、各々の結合が確定され得るように、各抗体に関して異なるレポーター標識が用いられる。
抗体のような特異的結合成員を用いて、被験試料からその欠五黄相手ポリペプチドを単離および／または精製して、ポリペプチドの配列および／または生物学的分析を可能にし、その配列が本明細書中に開示されたポリペプチドの配列および／または特性をそれが有するか、あるいはそれが突然変異体または変異体形態であるかを確定し得る。アミノ酸配列は、自動シーケンシング機を用いる業界ではルーチンである。
１つ又はそれ以上のポリペプチドを含有する被験試料は、例えば組織または細胞、例えば唾液、糞、または好ましくは血液からの粗製または一部精製細胞または細胞溶解物調製物として、あるいは羊膜、胎盤または胎児それ自体から出生前試験のために提供され得る。
個体に与えられるものがポリペプチドであろうと、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または本発明の製薬上有用なその他の化合物であろうと、投与は、好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」（場合次第で、予防は治療と考えられ得る）であって、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際量、ならびに投与の速度および経時的経過は、治療されているものの性質および重症度による。治療の処方箋、例えば投与量の決定等は、開業医およびその他の医師が責任を負う。
組成物は、治療条件によって、単独でまたはその他の治療と組合せて、同時にまたは順次問うよされ得る。
本発明の、そして本発明にしたがって用いるための製剤組成物は、活性成分の他に、製薬上許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知のその他の物質を含み得る。このような物質は非毒性でなければ成らず、そして活性成分の効力を妨害すべきでない。担体またはその他の物質の的確な性質は投与経路によっており、これは経口投与、あるいは例えば皮内、皮下または静脈内注射による投与であり得る。
経口投与のための製剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを含み得る。液体製剤組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物または植物油、鉱油あるいは合成油を含む。生理的食塩溶液、デキストロースまたはその他の糖類溶液、あるいはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが含まれ得る。
静脈内、皮膚または皮下注射、あるいは罹患部位での注射のためには、活性成分は、発熱物質無含有で、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水性溶液の形態である。関連当業者は、例えば等張ビヒクルを用いて適切な溶液、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、または乳酸化リンガー注射液を調製し得る。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／またはその他の添加剤を、必要な場合は、含入し得る。
標的化療法を用いて、抗体または細胞特異的配位子のような標的系の使用により、一定の種類の細胞により特異的に活性成分を供給し得る。標的化は、以下の種々の理由から望ましい：例えば、薬剤が許容可能でないほど有毒である場合、あるいはそうでなければ非常に高い投与量を要する場合、そうでなければ標的細胞を入れることができない場合。
薬剤を直接投与する代わりに、それは、細胞に導入されたコード遺伝子からの発現により標的細胞中で、例えばウイルスベクター中で産生され得る（下記参照）。ベクターは、治療される特定の細胞に対して標的化され得るか、またはそれは標的細胞により多少選択的にスイッチオンされる調節素子を含有し得る。ウイルスベクターは、特異的結合分子、例えば糖、糖脂質またはタンパク質、例えば抗体またはその結合断片を用いて標的化され得る。核酸は、ポリリシンを介してタンパク質配位子（例えば抗体またはその結合断片）に連結することにより標的化され、配位子は標的細胞の表面上に存在する受容体に特異的である。
薬剤は、治療される細胞中で産生されるかまたはそれに対して標的かされる活性化剤による活性形態への転換のために、前駆体形態で投与され得る。この型のアプローチは、時としてＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られている：前者は細胞特異的抗体との結合により細胞に対して活性化剤を標的化することを包含し、一方後者はウイルスベクター中でのコードＤＮＡからの発現によりベクター中での活性化剤、例えば酵素を産生することを包含する（例えば欧州特許出願第４１５７３１号およびＷＯ９０／０７９３６参照）。
例えば真正生物学的活性ＬＲＰ５ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする本発明の核酸は、活性ポリペプチドを合成できない、またはそれを正常レベルで合成できない患者を治療するための遺伝子療法の方法に用い、それによりＩＤＤＭおよび／または１つ又はそれ以上のその他の疾患の１つ又はそれ以上の症状を治療しおよび／または予防する目的で野生型により提供される効果を提供し得る。
ウイルスベクターのようなベクターは、広範な種々の異なる標的細胞中に遺伝子を導入するために用いられてきた。典型的には、ベクターは、望ましいポリペプチドの発現からの有用な治療的または予防的効果を提供するのに十分な割合の細胞でトランスフェクションが起こり得るように、標的細胞に曝露される。トランスフェクト化核酸は、標的細胞の各々のゲノム中に恒久的に組み入れられて、長期持続性効果を提供し得るし、あるいは治療は定期的に反復されねばならない。
種々のベクターは、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターとともに、当業界で公知である（例えば米国特許第５，２５２，４７９号およびＷＯ９３／０７２８２参照）。特に、多数のウイルス、例えばアデノウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、例えばＨＳＶおよびＥＢＶ、ならびにレトロウイルス、例えばテナガザル白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、モロニーネズミ白血病ウイルス、そしてネズミ乳腺癌ウイルスが遺伝子導入ベクターとして用いられてきた。従来技術における多数の遺伝子療法プロトコールは、無能化ネズミレトロウイルスを用いた。
無能化ウイルスベクターは、汗腺性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子が発現されるヘルパー細胞株中で産生される。ヘルパー細胞株は、一般に、ウイルスゲノムを包装し、核酸を含有しないビリオンを産生するメカニズムにより認識される配列を欠いている。無傷パッケージングシグナルを供給される遺伝子またはその他の配列（例えばＬＲＰ５ペペまたはその断片をコードする）とともに含有するウイルスベクターは、ヘルパー細胞内で感染性ビリオン粒子中に包装され、これは次に遺伝子供給のために用いられる。
細胞中に核酸を導入するその他の既知の方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム同時沈降、機械的技法、例えばマイクロインジェクション、リポソームにより媒介される導入、ならびに直接ＤＮＡ摂取および受容体介在性ＤＮＡ導入が挙げられる。リポソームは、細胞への供給のためにＲＮＡ、ＤＮＡおよびビリオンを封入し得る。ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンのような因子が存在することにより、リポソームの組成物が特定の細胞または組織の標的に向くように作り上げられる。リポソームはリン脂質を含み、そして脂質およびステロイドを含み得るし、このような成分の各々の組成は変え得る。リポソームの標的化は、特異的結合対成員、例えば抗体またはその結合断片、糖または糖脂質を用いてもなし遂げ得る。
ポリペプチドをコードする核酸またはその活性部分を用いる遺伝子療法の目的は、野生型ポリペプチドのレベルが存在しないか低減化量でしか存在しない細胞中での核酸の発現生成物の量を増大することである。このような処置は、ＩＤＤＭ４感受性対立遺伝子を、したがって疾病に対する疾病素質を有することがスクリーニングまたは試験により知られている個体の治療において特に、治療的または予防的であり得る。
同様の技法は、遺伝子発現のアンチセンス調節に、例えば突然変異体形態の遺伝子が発現される細胞に対するアンチセンス核酸分子の標的化に用いられ、その目的は突然変異体遺伝子生成物の産生を低減することである。遺伝子の特異的ダウンレギュレーションへのその他のアプローチは周知であり、その例としては、例えば特定の核酸配列を切断するよう意図されたリボザイムの使用が挙げられる。リボザイムは核酸分子、実際には、限定配列で一本鎖ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡであり、それらの特異性は工学処理され得る。ハンマーヘッドリボザイムは、それらが約１１〜１８塩基長の塩基配列を認識し、したがって約４塩基長の配列を認識するテトラヒメナ型のリボザイムより大きい特異性を有するために好ましいが、しかし後者の型のリボザイムはある種の環境では有用である。リボザイムの使用に関する参考文献としては、Marschall, et al. Cellular and Molecular Neurobiology, 1994, 14（5）:523; Hasselhoff, Nature 334:585（1988）およびCech, J. Amer. Med. Assn.,260:3030（1988）が挙げられる。
前記ですでに説明済みの添付の図面ならびに実験例を参照しながら、本発明の局面をここで説明するが、例はそれらに限定されない。さらなる局面および実施態様は、当業者には明らかである。本明細書中に言及した文献はすべて、参照により本明細書中に含まれる。
実施例１
ＬＲＰ５のクローニング
前記のように、ＩＤＤＭ疾病素質に関する１８の考え得る遺伝子座のうちの２つに対する連鎖の確証を、２組の家族（１０２の英国家族および８４の米国家族）、即ち染色体１１ｑ１３上のＩＤＤＭ４（ＭＬＳ  １．３、ＦＧＦ３でＰ＝０．０１）と染色体６ｑ上のＩＤＤＭ５（ＭＬＳ  １．８、ＥＳＲでＰ＝０．００３）の分析により成し遂げた。ＩＤＤＭ４では、最も有意の連鎖は、ＨＬＡで１または０個の対立形質ＩＢＤを共有する家族の小集団で得られた（ＭＬＳ＝２．８；Ｐ＝０．０００２；１ｓ＝１．２）（Davies et al., 1994）。この連鎖は、Hashimoto等（１９９４）も２５１の同胞対を用いて得ており、全同胞対でＰ＝０．０００８であった。これらの結果を併合すると、５９６家族で、ＩＤＤＭ４に関する実質的支持が示されている（Ｐ＝１．５ｘ１０-6）（Todd and Farrall, 1996; Luo et al., 1996）。
ＦＧＦ３領域におけるその他のマーカーを用いた多点分析は、ＦＧＦ３およびＤ１１Ｓ１８８３で２．３のＭＬＳを生じ（１ｓ＝１．１９）、そしてマーカーＤ１１Ｓ９０３およびＤ１１Ｓ５２７に側面を接する２７ｃＭ領域に対する間隔を描いた（図１）。
多点連鎖分析は、数千の多様な家族を利用できない限り、小領域に遺伝子を限局できない。代わりに、疾患遺伝子を含有する間隔を２ｃＭ未満または２Ｍ塩基に狭め得る希少単一遺伝子疾患に関して関連マッピングを用いた。しかし、この方法は予測可能性が低く、共通疾患に関するポリジーンの位置を定めるために従来用いられなかった。連合マッピングを用いてＩＤＤＭ２／ＩＮＳポリジーンの位置をつきとめたが、しかしこれは機能的に候補となりそうな多型／遺伝子の選択により、非常に小さい領域（＜３０ｋｂ）に制限された。ＩＤＤＭ４領域を２ｃＭ未満に描くために、連鎖不均衡（ＬＤ）または連合試験を実施した。理論では、始祖突然変異に非常に近い特定の対立形質の連合は、その始祖から下降した集団で検出される。伝達不均衡試験（ＴＤＴ、Spielman et al., 1993）は、親からのマーカー遺伝子座から影響を受けた子への対立形質の伝達の５０％からの偏差を査定することにより、連合を測定する。連合の検出は、いくつかの始祖染色体の存在が連合を検出するパワーを低減する可能性を低減するために、できるだけ均質であるべき試験される各集団の祖先の系統によっている。
ＩＤＤＭ４連鎖間隔ＬＤにまたがるマーカーの分析は、５５４家族におけるＤ１１Ｓ１９１７（ＵＴ５６２０）で検出された（Ｐ＝０．０１）。約５００ｋｂを包含するこの領域の物理的地図は、ｐａｃ、ｂａｃおよびコスミドコンティグを構築することにより成し遂げられた（図２）。アガロースにより分解され、サザーンブロット処理された制限酵素消化クローンでのマーカーのハイブリダイゼーションにより、その領域を物理的にマッピングした。４つの異なる集団（英国、米国、サルジニアおよびノルウェー）からの１２８９家族内で、さらなるマイクロサテライト（ともに発表済み。マイクロサテライト奪回によりクローンから単離されたもの）を分析した。ＬＤグラフを構築した。ピークはＨ０５７０ＰＯＬＹＡで、Ｐ＝０．００１であり、マーカーＤ１１Ｓ９８７および１８０１８ＡＣと側面を接した（図３）。多形マーカーで検出されるＬＤは、対立形質頻度の影響を受け、突然変異が１型糖尿病に対する感受性を生じようとどうしようと、ＬＤにおける対立形質が防御性または中性染色体上のものと同一の対立形質である染色体上に生じる。分析されているマーカーが感受性および防御性遺伝子型を有するＬＤにおける同一対立形質を有する場合、これらは単一点分析により検出されないままで、互いに効果を相殺し、疾病遺伝子座を有するＬＤに関する証拠をほとんどまたは全く示さない。これから生じる本方法の予測不可能性は、前記ですでに述べている。
各マーカーを用いて得られる情報を最大にするために、３点回転ＬＤ曲線を、ＩＤＤＭ４マーカーを用いて作製した（図４）。この場合、伝達パーセンテージ（％Ｔ）は、マーカーおよびその２つのすぐ側面のマーカーから算出し、それらから平均を出して、変動対立形質頻度の作用を最小にした。これはＨ０５７０ＰＯＬＹＡでピークを生じ、Ｐ＝０．０４であったが、このことは、ＩＤＤＭ４突然変異が間隔Ｅ０８６４ＣＡ〜Ｄ１１Ｓ１３３７（７５ｋｂ）にあると思われることを示す。
１型糖尿病との関連を示すこの７５ｋｂ間隔の同定により、疾患関連ハプロタイプを同定した。これらは、糖尿病突然変異または突然変異ＩＤＤＭ４が生じた元の始祖染色体に由来する。１型糖尿病に対する感受性を引き起こす突然変異を同定するために、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）およびハプロタイプを基礎にした厳密な連鎖不均衡曲線を構築する。ＳＮＰは、マイクロサテライト分析から同定された特異的ハプロタイプを有する個体をシーケンシングすることにより同定する：１型糖尿病に感受性のホモ接合型、１型糖尿病に防御性のホモ接合型、および対照。これらのＳＮＰのうちの１つは病因性突然変異ＩＤＤＭ４であり、あるいは原発性疾患遺伝子座と非常に強い連鎖不均衡性であり、したがって厳密な極性のピークに存在し得る。クロスマッチ分析は、この方法によるＩＤＤＭ２突然変異の位置限局化により示されるように、ＳＮＰ候補の数をさらに低減する（Bennett et al., 1995; Bennett and Todd, 1996）。これは、候補ＳＮＰ対立形質の連合または伝達が異なるハプロタイプバックグラウンドで試験され得るように、主要感受性または防御性ハプロタイプからの対立形質の異なる整列を有する別個のハロタイプまたは始祖染色体の同定を必要とする。遺伝子機能または調節に及ぼす作用に関して、突然変異候補を査定し得る。
異なる集団において、異なるＩＤＤＭ４突然変異が同一遺伝子に生じた可能性がある。ＩＤＤＭ４に関する、そして同一遺伝子に群集する突然変異候補を同定するために異なる集団からの数名の無関係な個体からのいくつかの推定上の始祖染色体または疾病関連ハプロタイプを、我々はシーケンシングする。
ＤＮＡ突然変異または多形性に関する広範な調査を実施するために、全領域および関連領域と側面を接する領域をシーケンシングした（７５ｋｂコア領域および１２５ｋｂの側面に位置するＤＮＡ）。ＤＮＡ配列は、遺伝子同定を促し、ｃＤＮＡ選択のような遺伝子同定またはＤＮＡシーケンシングおよび相同マウスゲノムＤＮＡの比較分析による遺伝子同定のその他の方法と相補的である。
この領域内の考え得るコード配列を同定したい場合には、種々の戦略：シーケンシング、推定エキソンおよびプロモーターのコンピューター予測、ならびにｃＤＮＡ選択を用いて、この間隔内の全遺伝子を同定する可能性を増大しようとした。
ショットガンシーケンシングのためのライブラリの構築
コスミド、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、またはＰＡＣ（Ｐ１人工染色体）から、ＤＮＡを調製した。ベクターを含有する細胞を、適切な抗生物質を補充したLuria-Bertani（ＬＢ）寒天平板上に画線した。単一コロニーを用いて、適切な抗生物質を補充し、３７℃で一夜増殖させた２００ｍｌのＬＢ培地に接種した。遠心分離により細胞をペレット化し、ＱＩＡＧＥＮ（Chatsworth, CA）ＴｉＰ５００Ｍａｘｉプラスミド／コスミド精製プロトコールに以下の修正を加えて、プラスミドＤＮＡを調製した：１００ｍｌの培養からの細胞を各Ｔｉｐ５００カラム用に用い、溶離緩衝液のＮａＣｌ濃度を０．２５Ｍから１．７Ｍに増大し、溶離緩衝液を６５℃に加熱した。
精製ＢＡＣおよびＰＡＣ  ＤＮＡをＮｏｔ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化した後、BioRadＣＨＥＦマッパーシステム（Richmond, CA）を用いて、パルスフィールドゲル電気泳動処理を施した。消化ＤＮＡを、０．５ｘトリスホウ酸塩ＥＤＴＡ（１０ｘストック溶液、Fisher, Pittsburg, PA）を用いて調製した１％低融解温度アガロース（BioRad, Richmond, CA）ゲル中で一夜電気泳動処理した。時間および電圧の切り換えのために、ＣＨＥＦマッパー自動計算デフォルト値設定を用いた。電気泳動処理後、ゲルを臭化エチジウム（Sigma, St. Louis, MO）で染色し、紫外線トランスイルミネーターで可視化した。挿入バンド（単数または複数）をゲルから切り取った。メーカーの使用説明書にしたがってβアガラーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）消化によりゲルスライスから、ＤＮＡを溶離した。ＤＮＡおよび消化アガロースを含有する溶液を２ｍｌの容量中の５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５ｍＭのＭｇＣｌ2および２５％グリセロールに移して、ＡＥＲＯ−ＭＩＳＴネビュライザー（CIS-US, Bedford, MA）に入れた。ネビュライザーを窒素ガス供給源に取り付形質転換、ＤＮＡを、１０ｐｓｉで３０秒間、無作為に剪断した。剪断ＤＮＡをエタノール沈降させて、ＴＥ（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。緑豆ヌクレアーゼ（Promega, Madison, WI）を用いて３０℃で３０分間処理し、その後フェノール／クロロホルム抽出し、４０ｕＭのｄＮＴＰの存在下で、１６℃でマルチコア緩衝液（Promega, Madison, WI）中のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（GIBCO/BRL,Gaithersburg, MD）で処理して、末端を平滑にした。ＤＮＡ断片のサブクローニングを促進するために、ＢｓｔＸ  Ｉアダプター（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Promega, Madison, WI）を用いて１４℃で一夜、断片に結紮した。メーカーの使用説明書にしたがって、ｃＤＮＡサイジングカラム（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD））を用いたカラムクロマトグラフィーにより、アダプターおよび５００ｂｐ未満のＤＮＡ断片を除去した。１ｋｂより大きいＤＮＡを含有する分画をプールし、エタノール沈降により濃縮した。ＢｓｔＸＩアダプターを含有するＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ  ＩＩ（Invitrogen, Carlsbad, CA）からのＢｓｔＸ  Ｉ部位をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Stratagene, La Jolla, CA）のＢｓｓＨ  ＩＩ部位にサブクローニングすることにより構築されたｐＳＨＯＴ  ＩＩのＢｓｔＸ  Ｉ部位に結紮した。ＢｓｔＸ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化してｐＳＨＯＴ  ＩＩを調製し、アガロースゲル電気泳動で精製した。以下のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（BioRad, Richmond, CA）プロトコールにより、アガロースからゲル精製ベクターＤＮＡを抽出した。ベクターのそれ自体との結紮を低減するために、消化ベクターを仔ウシ腸ホスファターゼ（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD）で処理した。ＤＮＡ断片とクローニングベクターとの結紮反応物を、超コンピーチントＸＬ−２Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene, La Jolla, CA）中で形質転換して、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ寒天平板上に載せた。個々のコロニーを、アンピシリンを補充した１００ｕｌ／ウエルのＬＢブロスを含入する９６ウエルプレート中に摘み入れて、３７℃で一夜増殖させた。約２５ｕｌの滅菌グリセロールを各ウエルに付加し、培養を−８０℃で保存した。
プラスミドＤＮＡの調製
手動で、または９６ウエルからの５ｍｌのブロスを含入する９６本の試験管に接種するようプログラムされたTecan Genesisi RSP 150ロボット（Tecan AG, Hombrechtikon, Switzerland）を用いて、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した５ｍｌのＬＢブロスを接種するために、グリセロールストックを用いた。培養を、曝気を提供するために振盪しながら３７℃で一夜増殖させた。細菌細胞を遠心分離によりペレット化し、上清をデカントして、細胞ペレットを−２０℃で保存した。Qiawell Ultraプロトコールにしたがって、QIAGEN Bio Robot 9600（QIAGEN, Chatsworth, CA）を用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。挿入物の頻度およびサイズを試験するために、プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ  ＩＩで消化した。制限エンドヌクレアーゼ生成物のサイズをアガロースゲル電気泳動により検査した結果、平均挿入物サイズは１〜２ｋｂであった。
ショットガンクローンのＤＮＡ配列分析
ＡｍｐｌｉＴａｇ  ＤＮＡポリーメラーゼ、ＦＳを用いるＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ染料ターミネーターサイクルシーケンシング即時反応キット（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を思いて、ＤＮＡ配列分析を実施した。ＤＮＡ配列分析は、Ｍ１３前方および逆プフイマーを用いて実施した。Perkin-Elmer 9600での増幅後、延長生成物を精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７自動シーケンサー（Perkin Elmer, Norwalk, CT）で分析した。検査されるＤＮＡ  １ｋｂ当たり約１２〜１５のシーケンシング反応を実施し、例えば１００ｋｂのＰＡＣ挿入物に対して１５００反応を実施した。
ＤＮＡ配列のアッセンブリー
ＤＮＡ配列アッセンブリーのために、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐを用いた。このプログラムはPhil Green博士により開発され、ワシントン大学（Seattle, WA）から認可された。Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐは以下のプログラムから成る：塩基呼出のためのＰｈｒｅｄ、配列アッセンブリーのためのＰｈｒａｐ、配列比較のためのクロスマッチ、データの可視化のためのＣｏｎｓｅｄおよびＰｈｒａｐｖｉｅｗ、ならびにそれぞれの配列をスクリーニングするためのＲｅｐａｔｍａｓｋｅｒ。クロスマッチによりベクターおよび大腸菌ＤＮＡ配列を同定し、ＤＮＡ配列アッセンブリー工程から除去した。ＤＮＡ配列アッセンブリーは、デフォルトＰｈｒａｐパラメーターを用いるSUN Enterprise 4000サーバーランニングSolaris 2.51オペレーティングシステム（Sun Microsystems Inc., Mountain View, CA）上に存在した。ＣｏｎｓｅｄおよびＰｈｒａｐｖｉｅｗを用いて、配列アッセンブリーをさらに分析した。
アッセンブリー化ＤＮＡ配列の生物情報分析
アッセンブリー化ＤＮＡ配列が当該領域の５〜６倍の適用範囲に近づいたときに、プログラムＧＲＡＩＬ（ApoCom, Oak Ridge）のエキソンおよびプロモーター予測能力を用いて遺伝子同定に役立てた。ＡｐｏＣｏｍ  ＧＲＡＩＬは、Lockheed Martin Energy Research CorporationおよびApoCom Client Tool for Genomics（ACTG）TMによりApoCom Inc．に認可されたDepartment of Energy開発GRAIL Gene Characterization Softwareの商業バージョンである。
アッセンブリーの種々の段階のＤＮＡ配列を、デフォルトパラメーターに関してＢＬＡＳＴ算法（S.F. Altschul, et al.,（1990）J. Mol. Biol. 215, 403-410）を用いて、GenBankデータベース（主体）中のＤＮＡ配列に対して問いただした。ＤＮＡの大型連続配列を調べる場合、哺乳類のそれぞれの要素のデータベースとのクロスマッチによる同定後、それぞれの要素を遮蔽した。ＢＬＡＳＴ分析後、Guochun Xie博士（Merck Research Lab）が著した分析者プログラムにより結果を収集した。分析者は、１０-6より大きいＰ値の類似性を有する各々のＤＮＡ配列に関するデータベースから、以下の情報を提供した；配列の注釈名、それが得られたデータベース、類似性の領域の長さおよびパーセント同一性、ならびに疑問物と主体との類似性の所在。
ＢＬＡＳＴ分析は、我々が得たＤＮＡ配列とデータベース中に存在する多数のヒトＥＳＴ配列との間の１００ｂｐより大きい長さに亘る高度の類似性（９０〜１００％同一）を同定した。これらのヒトＥＳＴ配列は、受入番号：Ｒ７３３２２、Ｒ５０６２７、Ｆ０７０１６で表される群に集まった。概して、各ＥＳＴ集団は単一遺伝子を表すと推測される。４２４のヌクレオチドのＲ７３３２２集団中のＤＮＡ配列は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（GenBank受入番号Ｘ１３９１６）およびＬＤＬ受容体族のいくつかのその他の成員をコードする遺伝子に対するより低いが、しかし有意の程度のＤＮＡ配列類似性を有した。したがって、ＥＳＴ  Ｒ７３３２２と高度に類似した配列はＬＤＬ受容体族の成員をコードすると結論された。
各ＥＳＴ集団の成員を、プログラムSequencher（Perkin Elmer, Norwalk CT）を用いて組み立てた。データベースから抽出されるＥＳＴ配列データの精度を増大するために、ショットガンシーケンシングから得られるゲノムＤＮＡ配列からの関連クロマトグラムトレースファイルをアッセンブリーに含めた。修正ＥＳＴ配列を、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴＸにより再分析した。受入番号Ｒ５０６２７で表されるＥＳＴ集団３に関して、編集したＥＳＴアッセンブリーの分析は、この集団がＬＤＬ受容体族の成員に類似することを明示した。この結果は、これら２つのＥＳＴ集団が同一遺伝子の成分であるという可能性を示唆した。
実験的に得られたｃＤＮＡ配列を、プログラムSequencher（Perkin Elmer, Norwalk CT）を用いて組み立てた。ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を、エキソンの所在の迅速且つ高感度の検出を可能にするプログラムCrossmatchを用いて比較した。次に、プログラムGeneWorks（Intelligenetics Inc., Campbell CA）を用いることによりゲノムおよびｃＤＮＡ配列を手動で比較して、イントロン／エキソン境界の同定を成し遂げた。
ノーザンブロット分析
プライマー２５６Ｆおよび６２２Ｒ（表２）を用いて、胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからの３６６ｂｐのＰＣＲ生成物を増幅した。この生成物をアガロースゲル上で精製し、ＤＮＡを抽出して、ｐＣＲ２．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）中でサブクローニングした。３６６ｂｐプローブを、５０〜１００ｕＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（DuPont/NEN, Boston, MA）の存在下で、Amersham Rediprimeキット（Arlington Heights, IL）を用いた無作為プライミングにより標識した。非混入ヌクレオチドを、ProbeQuant G-50回転カラム（Pharmacia/Biotech, Piscataway, NJ）を用いて除去した。迅速ハイブリダイゼーション緩衝液（Clontech, Palo Alto, CA）中の１ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌより高い濃度の放射能標識化プローブを、ヒト多組織ノーザンＩおよびＩＩ（Clontech, Palo Alto, CA）とともに、６５℃で一夜インキュベートした。ブロットを２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２０ｘＳＳＣおよび２０％ＳＤＳストック溶液（Fisher, Pittsburg, PA）から調製）中で、室温で２回の１５分インキュベーション、そしてその後の室温で１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の１５分インキュベーション、ならびに６０℃で０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の３０分インキュベーションにより、ブロットを洗浄した。ブロットのオートラジオグラフィー処理を実施して、放射能標識化プローブと特異的にハイブリダイズしたバンドを可視化した。
プローブは、胎盤、肝臓、膵臓および前立腺で最も高度に発現される約５〜５．５ｋｂのｍＲＮＡ転写体とハイブリダイズした。それは、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、卵巣、小腸および結腸では中間レベルで発現される。メッセージは、脳、精巣および白血球では低レベルで発現される。転写体が高度に発現される組織、例えば肝臓および膵臓では、７ｋｂおよび１．３ｋｂの付加的バンドが観察される。
全長ｃＤＮＡの単離
ＰＣＲベースの技法を用いて、ＥＳＴに高度に類似した領域およびエキソン予測ソフトウエア（ＧＲＡＩＬ）により同定される領域を延長した。用いた一技法は、低減複雑度ｃＤＮＡ分析（ＲＣＣＡ）と呼ばれるｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）に関する変法であり、同様の手法は、Munroe et al.（1995）PNAE 92:2209-2213およびWilfinger et al.（1997）BioTechniques 22:481-486により報告されている。この技術は、約２０，０００ｃＤＮＡクローンのプールであるＰＣＲ鋳型によっており、これは鋳型の複雑度を低減し、より長いＰＣＲ延長の可能性を増大する。ｃＤＮＡを延長するために用いられた第二の技法は、遺伝子の一部である可能性を有するゲノム配列、例えばＥＳＴに非常によく似た配列と、ＧＲＡＩＬにより同定される配列で同定される領域間のＰＣＲである。これらのＰＣＲ反応は、SuperScript選択系（Gibco/BRL, Gaithersburg, MD）を用いて約５ｕｇのｍＲＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）から調製されるｃＤＮＡで実施された。一次鎖ｃＤＮＡ合成は、反応当たり１ｕｇのオリゴ（ｄＴ）12-18プライマーおよび２５ｕｇの無作為ヘキサマーを用いて下準備された。二次鎖ｃＤＮＡ合成は、メーカーの使用説明書にしたがって実施した。
ＥＳＴ集団１に関連した付加的エキソンの同定
プライマー２５６Ｆおよび６２２Ｒを用いて３６６ｂｐＰＣＲ生成物を増幅することにより、ウエル当たり２０，０００クローンの９６ウエルのヒト胎児脳プラスミドライブラリを走査した。反応ミックスは、４ｕｌのプラスミドＤＮＡ（０．２ｎｇ／ｍｌ）、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１０％スクロース、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１％テトラジン、２００ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇの各プライマー、および０．１ｕｌのTag Gold（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）で構成された。総反応容量１１ｕｌを９５℃で１２分間、その後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間のサイクルを３２回、インキュベートした。約２０ウエルが、ＰＣＲ分析により正しい３６６ｂｐ断片を含有することが判明した。５‘および３’ＲＡＣＥを、その後、ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを含有するいくつかの陽性ウエルで実施した。挿入物の配向が分からないため、ベクター特異的プライマー、ＰＢＳ  ５４３ＲおよびＰＢＳ  ８７３Ｆをともに、遺伝子特異的プライマー１１７Ｆおよび５１８Ｒと組合せて用いた。ＰＣＲ増幅条件は、１ｘTaKaRa緩衝液ＬＡ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５００ｍＭのｄＮＴＰ、０．２ｕｌのTaKaRaＬＡタッグポリメラーゼ（PanVera, Madison WI）、１００ｕｇの各プライマー、および５ｕｌのプラスミドライブラリー（０．２ｎｇ／ｍｌ）で構成された。総反応容量２０ｍｌで、熱サイクル条件を以下に示す：９２℃で３０秒、その後９２℃で３０秒、６０℃で１分間、そして６８℃で１０分間。初期ＰＣＲ増幅後、入れ子式ベクタープライマーＰＢＳ  ５７８ＲおよびＰＢＳ  ８３８Ｆ、ならびに種々の遺伝子特的プライマー（２５６Ｆ、３４３Ｆ、６２３Ｒおよび６５７Ｒ）を用いて、入れ子式または半入れ子式ＰＣＲ反応を実施した。標準プロトコールを用いて、ＱＩＡＧＥＮ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製回転カラムを用いて、非混入化ｄＮＴＰおよびプライマーから、ＰＣＲ生成物を分離し、３０ｕｌの水中に再懸濁した。入れ子式および半入れ子式ＰＣＲに関する増幅条件は初期ＰＣＲ増幅と同一であったが、但し、３ｕｌの精製ＰＣＲ断片を鋳型として用い、循環条件は２０回だけであった。このＰＣＲ増幅から得られた生成物を１％アガロースゲル上で分析し、切り取った断片を、ＱＩＡＧＥＮ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ回転カラムを用いて精製し、ＡＢＩ染料ターミネーターシーケンシングキットを用いてシーケンシングした。標準プロトコールにしたがって、ＡＢＩ  ３７７シーケンサーで生成物を分析した。
ＥＳＴ集団１〜３のつながり
前記のように、各ＥＳＴ集団は単一遺伝子を表し、あるいはＥＳＴ集団は同一遺伝子の一部分であり得る、と考えられる。これら２つの可能性を区別するために、プライマーは、ＥＳＴ受入番号Ｆ０７０１６（集団２、２７２ヌクレオチドを含有）およびＲ５０６２７（集団３、１１７７ヌクレオチドを含有）で表される領域における２つの多のＥＳＴ集団に対して指示された。ＰＣＲ反応において、集団１（１１７Ｆおよび４９９Ｆ）からのプライマーをＥＳＴ集団３（４０３４Ｒ）と対にした。メーカーにより供給された反応緩衝液中のTaKaRa LA Tagポリメラーゼ（Panvera, Madison, WI）を用いて、０．３２ｍＭのｄＮＴＰ、プライマーおよび約３０ｎｇのリンパ節ｃＤＮＡを付加して、５０ｕｌの反応を実施した。ＰＣＲ生成物を、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして７２℃で４分間の周期を３５回繰り返して増幅した。生成物を１％アガロースゲル上で電気泳動処理して、２．５および３ｋｂのバンドを切り取り、ｐＣＲ２．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）中でサブクローニングして、ＤＮＡ配列分析のためにプラスミドＤＮＡを調製した。
ＥＳＴ集団１（６３８Ｆ）およびＥＳＴ集団３（４１７３Ｒ）においてプライマーにより精製された前記の一次反応物を、ＥＳＴ集団１（６３８Ｆ）およびＥＳＴ集団２（３５５６Ｒ）からのプライマーとの反応のための鋳型として利用した。この半入れ子式ＰＣＲ反応は、前段落に記載したTaKaRa LA Tagポリメラーゼを用いて実施した。約２ｋｂの生成物を生成し、ＤＮＡ配列分析のためにサブクローニングした。これらのＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列結果ののアッセンブリーは、ＥＳＴ集団１〜３が同一遺伝子の一部であり、この遺伝子により産生されるｍＲＮＡ転写体中で、互いに対するそれらの配向を確定されることを示した。
ＰＣＲ反応は、ＥＳＴ集団２と３の間でも実施された。５０６１Ｒ（集団３）と組合せて、プライマー２５１９Ｆ、３０１１Ｆまたは３１５４Ｆ（集団２）とともに、TaKaRa LA Tagポリメラーゼ（Panvera, Madison, WI）を用いた肝臓ｃＤＮＡからの増幅を、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３分間の周期を３５回、実行した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、サブクローニングして、ＤＮＡ配列を確定した。これらのＰＣＲ生成物すべての末端のＤＮＡ配列分析はほとんどのｃＤＮＡ配列をもたらしたが、しかしながら、両鎖の完全ＤＮＡ配列を提供するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮＡシーケンシングのために用いた（図５（ａ）（SEQ ID NO:1））。
５‘末端の延長
ＲＣＣＡ分析を用いて、前記のような内部遺伝子特異的プライマーを用いることにより５‘を延長した多数のクローンを得た。いくつかのクローン延長が単離されたが、しかしながら分析したクローンのほとんどがエキソンＡ内で停止した。あるクローンはエキソンＡの５’末端を過ぎて延長されたが、しかしその配列はゲノムＤＮＡと連続しており、一団の証拠はエキソンＡの５‘末端でイントロン／エキソン境界を示すために、この延長は非プロセッシング化イントロン配列の結果であると考えられる。二次クローンｈ１０は、この点を過ぎて延長したが、しかしゲノムＤＮＡ配列とは異なった。これは、元の胎児脳ｃＤＮＡライブラリーに存在したキメラクローンを表すと結論づけられた。
アイソフォーム１の５‘末端の同定
前記のように、ＲＣＣＡ実験からの結果は、エキソンＡの５‘末端で終結する多数の別々のクローンを生じた。これは、ヒトＬＲＰ５遺伝子が逆転写酵素が転写の難しさを有する領域を含有することを示唆した。この問題を回避するためには、ＤＮＡ配列内容物の微妙な差がある領域を転写する酵素の能力を変え得るため、ＬＲＰ５のマウスオルトログを単離することを決定した。マウス遺伝子の５’部分を単離する可能性を増大するために、前記の、そしてエキソンＡおよびＢに由来する３６６ヌクレオチドのヒトプローブを用いた。
Clontech（Palo Alto, CA）から購入したマウス肝臓ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。メーカーの使用説明書にしたがって、SuperScript Choice系（Gibco/BRL Gaithersburg, MD）をもちいてｃＤＮＡを調製した。リン酸化Ｂｓｔ  ＸＩアダプター（Invitrogen, San Diego, CA）を約２ｕｇのマウス肝臓ｃＤＮＡに結紮した。結紮ミックスを希釈し、ｃＤＮＡサイジングカラム（Gibco/BRL Gaithersburg, MD）上でサイズ分別した。カラムからの小滴を収集し、カラムからの溶離容量を、ショットガンライブラリーの構築に関して前記したように確定した。Ｂｓｔ  ＸＩリンカーによるサイズ分別化ｃＤＮＡを、前記のようにベクターｐＳＨＯＴ  ＩＩに結紮し、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔ  ＸＩで切断して、ゲル精製し、そして仔ウシ腸ホスファターゼ（Gibco/BRL Gaithersburg, MD）を用いて脱リン酸化した。約１０〜２０ｎｇのｃＤＮＡおよび約１００ｎｇのベクターを含有する結紮物を１４℃で一夜インキュベートした。結紮物を超コンピーテントＸＬ−２Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene, La Jolla, CA）中で形質転換した。形質転換細胞を、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン（Sigma, St. Louis, MO）を補充したLuriaブロス寒天平板上で、約３０，０００コロニー／平板の密度で、２０個の１３３ｍｍコロニー／プラークスクリーンフィルター（Dupont/NEN, Boston,MA）に広げた。コロニーを一夜増殖させた後、レプリカを２つのフィルター上で２回、平板化した。レプリカフィルターを、コロニーが目に見えるようになるまで３７℃で数時間増殖させて、確立された手法（Maniatis, Fritsch and Sambrook, 1982）にしたがってコロニーのin-situハイブリダイゼーションのために加工処理した。Stratalinker（Stratagene, La Jolla, CA）を用いてＤＮＡをフィルタに架橋させた。５０％ホルムアミドを含有する１ｘハイブリダイゼーション緩衝液（Gibco/BRL Gaithersburg, MD）中の１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌより大きい値のプローブを用いて、４２℃で一夜、フィルタをハイブリダイズした。プライマー５１２Ｆおよび８７８Ｒを用いて、ヒトＬＲＰ５ｃＤＮＡに由来するＰＣＲ生成物からプローブを生成した。このプローブを、５０〜１００ｕＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（DuPont/NEN, Boston, MA）の存在下で、Amersham Rediprimeキット（Arlington Heights, IL）を用いて無作為プライミング標識し、ProbeQuant G-50回転カラム（Pharmacia/Biotech, Piscataway, NJ）を用いて精製した。フィルターを０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４２℃で洗浄した。オートラジオグラフィー処理後、ハイブリダイゼーション陽性コロニーを含有する個々の領域をマスターフィルターから切り取って、０．５ｍｌのLuriaブロス＋２０％グリセロール中に入れた。各陽性物を約５０〜２００コロニー／１００ｍｍプレートの密度で再平板化して、前記のようにハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。単一コロニーを単離し、ＤＮＡ配列分析のためにプラスミドＤＮＡを調製した。
３つのコロニーをマウスｃＤＮＡライブラリーから単離した。このクローンのアッセンブリー化配列（図１６（ａ）（SEQ ID NO:35））は、ヒトＬＲＰ５遺伝子と高度の類似性（約１７００ヌクレオチド部分にわたって、８７％同一）を有し、したがってＬＲＰ５のマウスオルトログを表すと考えられる。我々が初期に得たマウスＬＲＰ５の部分の５００個のアミノ酸（図１６（ｄ）（SEQ ID NO:8））は、ヒトＬＲＰ５と９６％同一である。有意には、これらのクローンのうちの２つがエキソンＡに対応する領域の５‘である配列を有し、クローン１９ａは付加的２００ｂｐを含有し、クローン９ａは付加的１８０ｂｐを含有した（図１６（ｂ）（SEQ ID NO:36））。付加的２００ｂｐは、ｂｐ１１２で開始する開放読み取り枠を含有する（図１６（ｃ）（SEQ ID NO:37））。開始コドンは、−３（プリン）および＋４（Ｇヌクレオチド）一の両方での翻訳の有効な開始のためのコンセンサスヌクレオチドを有する（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7:563-574）。この開放読み取り枠は、タンパク質輸送のための真核細胞シグナル配列として作用する能力を有するペプチドをコードする（von Heijne, 1994, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23:167-192）。ＧＣＧ分析パッケージ（Genetics Computer Group, Madison WI）においてSigCleaveプログラムを用いて確定した場合のシグナル配列に関する最高スコアは、アイソフォーム１の残基２９で開始する成熟ペプチドを生成する。利用され得る付加的部位は、アミノ酸残基３１（エキソンＡによりコードされる一次アミノ酸）またはアミノ酸残基３２、３３または３８で開始する成熟ペプチドを産生する。
全長マウスＬｒｐ３  ｃＤＮＡの分子クローニング
核酸ハイブリダイゼーションにより単離されたマウスｃＤＮＡクローンは、１．７ｋｂの長さのＬｒｐ３  ｃＤＮＡの５‘末端を含有する（図１６（ａ）（SEQ ID NO:35））。これは、ヒトｃＤＮＡ配列と比較した場合、全長ｃＤＮＡの約３分の１を占める。マウスＬｒＰ３  ｃＤＮＡの残りは、ＰＣＲを用いて単離され、マウス肝臓ｃＤＮＡからの生成物を増幅した。ＰＣＲプライマー（表９（SEQ ID NO:49〜74，334〜402））は、マウスＬｒｐ３遺伝子を含有するマウスゲノムクローンＢＡＣ  ５３−ｄ−８および１３１−ｐ−１５の配列スキミングにより同定されるＤＮＡ配列を基礎にして設計した。１１ｑ１３とシンテニーであるマウス染色体１９に対するFISH分析により、ＢＡＣ  ５３−ｄ−８をマッピングした。これらのクローンの配列スキミングは、ヒトＬＲＰ５のコード領域ならびに３’非翻訳領域に対応するＤＮＡ配列を同定した。この戦略は、１６１４アミノ酸（図１８（ｃ）（SEQ ID NO:40））のタンパク質をコードする４８４２ヌクレオチド（図１８（ｂ）（SEQ ID NO:41））の開放読み取り枠を含有する５０５９ヌクレオチド（図１８（ａ）（SEQ ID NO:42））のマウスｃＤＮＡ配列の確定をもたらした。推定上のＡＴＧは、翻訳の開始のために有望な配列状況で存在する（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7:563-574）。
ヒトおよびマウスＬＲＰ５の比較
ヒトおよびマウスＬＲＰ５のｃＤＮＡ配列は、８７％の同一性を示す。ヒトＬＲＰ５  ｃＤＮＡの開放読み取り枠は、マウスＬｒｐ３によりコードされる１６１４アミノ酸タンパク質（SEQ ID NO:42）と９４％同一である１６１５アミノ酸のタンパク質をコードする（図１８（ｄ）（SEQ ID NO:3））。長さの差は、マウスＬｒｐ３シグナルペプチド配列中の１個のアミノ酸の欠失によるものである。シグナルペプチド配列は高度に保存されず、ヒトとマウスとの間の同一性は５０％未満である。推定上のシグナル配列切断部位の所在は、ヒトではアミノ酸残基２５、マウスではアミノ酸残基２９である。これらの部位での切断は、それぞれ１５９１および１５８６アミノ酸の成熟ヒトおよびマウスタンパク質をもたらし、これらは９５％同一である（図１８（ｅ）（SEQ ID NO:43，44））。高度の全配列類似性は、同定配列がＬＲＰ５遺伝子のオルトログであることを強く主張する。この仮説は、ゲノムサザーン実験の結果によりさらに支持される（データは示されていない）。
アイソフォーム１に関するヒトシグナルペプチドエキソンの同定
シグナルペプチドをコードするヒトエキソンを、ＰＣＲにより肝臓ｃＤＮＡから単離した。前方プライマー１Ｆ（SEQ ID NO:51）（表９）を、Tag Gold（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用い、３、５または７％ＤＭＳＯを補充したＰＣＲ反応において、以下の逆プライマー：２１８Ｒ、２６５Ｒ、３１８Ｒおよび３６１Ｒ（SEQ ID NO:50，52，53，54）の１つと組合せて用いた。生成物を、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分間の周期４０回で、増幅した。生成物をアガロースゲル上で分析し、予測サイズのバンドを含有する反応物のいくつかを、ＤＮＡ配列分析のために選択し、ｐＣＲ２．１（Invitorgen, San Diego, CA）中にサブクローニングした。
エキソン２（エキソンＡとしても知られている）の１３９ヌクレオチド上流の得られたＤＮＡ配列は、翻訳の有効な開始のための状況で存在するＡＴＧ：−３位置のアデニン（Ａ）残基および＋４位置のグアニン（Ｇ）残基を含有する（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7:563-574）。
このＡＴＧに関する開放読み取り枠は、１６１５アミノ酸残基のポリペプチド（図５（ｃ）（SEQ ID NO:3））をコードする４８５４ヌクレオチド（図５（ｂ）（SEQ ID NO:2））の間存続する。
イニシエーターＡＴＧコドンの後ろの配列は、タンパク質輸送のためのシグナルとして作用する能力を有するペプチドをコードする。ＧＣＧ分析パッケージ（Genetics Computer Group, Madison WI）においてSigCleaveプログラムにより示されるシグナル配列（１５．３）に関する最高スコアは、アミノ酸残基２５で開始する成熟ペプチド（図５（ｄ、ｅ））を生成する。成熟ＬＲＰ５タンパク質を産生するために利用され得る付加的推定切断部位は、残基２３、２４、２６、２７、２８、３０および３２（エキソンＡによりコードされる一次アミノ酸）に関して予測される。
シグナルペプチドエキソンを含有し、それと側面を接するゲノムＤＮＡ配列の確定
シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列と同一のゲノムＤＮＡ配列を含有する領域は、コンティグ５７および５８として知られている連続ゲノムＤＮＡ配列の２つのストレッチ間のギャップに存在した。このギャップを閉じるために、ワシントン大学（Seattle, WA）のPhil Green博士から認可されたプログラムＰｈｒａｐｖｉｅｗによる分析にしたがって、このギャップにかかるよう確定されたショットガンライブラリーから、４つのクローンを選択した。これらのクローンの直接ＤＮＡシーケンシングは、うまくいかなかった。即ち、高ＧＣ含量は、周期シーケンシングの効率を有意に低減した。この問題を回避するために、７−デアザ−ｄＧＴＰ（Phamacia, Phamacia Biotech, Piscataway, NJ）を組み入れることにより、ＰＣＲ生成物を生成した。これらの反応のための条件は、Klentaq Advantage-GCポリメラーゼキット（Clontech, Palo Alto, CA）の修正で構成された。２００ｕＭの７−デアザ−ｄＧＴＰとの反応ミックスを補充することにより、標準反応プロトコールを修正した。挿入物を、Ｍ１３前方および逆プライマーを用いて、９２℃で３０秒、６０℃で１分間、６８℃で５分間の周期を３２回で増幅した。生成物をQiaquickゲル抽出キット（Qiagen Inc., Santa Clareta, CA）を用いてゲル精製し、前記と同様にシーケンシングした。その結果生じた配列のアッセンブリーはギャップを閉鎖し、約７８，０００ｂｐのゲノムＤＮＡの連続配列を生成した。
アイソフォーム２および３の延長
ソフトウエアパッケージＧＲＡＩＬ（前記）は、ゲノムＤＮＡ配列からエキソンおよびプロモーター配列を予測する。ＧＲＡＩＬにより同定される一領域は、元々Ｇ１と呼ばれ、その後エキソン１と命名された、エキソンＡの起始の約５５ｋｂ上流にあるエキソンである（図１２（ｃ）（SEQ ID NO:28））。Ｇ１  １ｆ〜３ｆと呼ばれる３つのプライマーは、この配列を基礎にして設計された。このエキソンは、ＧＲＡＩＬも、エキソン配列のすぐ上流のプロモーターを予測するため（図１２（ｅ））、特に興味深かった。さらに、Ｇ１における開放読み取り枠は、真核生物シグナル配列の特徴を有するペプチドをコードした。
Ｇ１予測エキソンがＬＰＲ５遺伝子の一部であるか否かを確定するために、TaqaraＲＮＡ  ＰＣＲキット（Panvera, Madison WI）を用いて、逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲを実施した。ヒト肝臓ｍＲＮＡ（５０ｎｇ）を、１０ｕｌの逆転写酵素反応のための鋳型として用いた。ＬＲＰ５特異的プライマー（６２２Ｒ、３６１Ｒまたは３１８Ｒ）のうちの１つを用いた逆転写酵素反応を、６０℃で３０分間、その後９９℃で５分間インキュベートした後、試料を氷上に置いた。表２に示した前方プライマー（Ｇ１  １ｆ、２ｆまたは３ｆ）のうちの１つをＰＣＲ増幅のための試薬とともに付加し、反応物を、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分間の周期を３０回で、増幅した。この一次ＰＣＲ反応物を次に水中で１：２に希釈し、１ｕｌの反応物を、入れ子式プライマーを用いた二次２０ｕｌ反応物に用いた。２回目の増幅のための反応条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分間の周期を３０回であった。生成物をアガロースゲル上で分離して、切り取った。精製断片をｐＣＲ２．１（Invitorgen, San Diego, CA）中にサブクローニングし、プラスミドＤＮＡを調製して、ＤＮＡ配列を確定した。
これらの生成物のＤＮＡ配列は、Ｇ１（エキソン１）がＬＲＰ５転写体の少なくとも一部に存在することを示した。２つの異なるアイソフォームを同定した。本実験で同定された最初のアイソフォーム２（図１１（ａ）（SEQ ID NO:23））は、エキソン１、その後、我々がエキソン５という名称を与えたエキソンで構成された。このスプライス変異体は、エキソンＢヌクレオチド４０２（図１１（ａ））で開始する開放読み取り枠を有し、この位置でのイニシエーターメチオニンは、翻訳開始のためのコンセンサス配列と一致しない（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7:563-574）。第二の考え得るイニシエーターメチオニンはヌクレオチド４５３に存在し、このコドンは翻訳開始脳有効な開始に関する状況で存在する（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7:563-574）。アイソフォーム２に関する最長の潜在的開放読み取り枠（図１１（ｃ））は、アミノ酸１５３に真核生物シグナル配列を含有するスプライス変異体をコードする。このスプライス変異体により生成される成熟ペプチドは最初の５つのスペーサードメインおよび一次ＥＧＦ様モチーフの一部を欠いている。
第二のアイソフォーム（アイソフォーム３）は、エキソン１と、その後のエキソンＡから成る（図１２（ａ））。エキソン１がアイソフォーム２の最初のエキソンであるか否かは分からない。しがしながら、Ｇ１の上流のＧＲＡＩＬ予測プロモーターの位置は、エキソン１が最初のエキソンである可能性を示唆する。さらに、ＧＲＡＩＬにより仮定された５’イントロン／エキソン境界を過ぎてのギル開放読み取り枠が存在する（図１２（ｂ））。したがって、この延長開放読み取り枠がＬＲＰ５転写体に組み入れられる可能性を、我々は調べた。その結果生じた開放読み取り枠（図１２（ｃ））は、１６３９アミノ酸タンパク質（図１２（ｄ））をコードする。イニシエーターメチオニンコドンは、有効な翻訳に重要であると考えられるいずれのコンセンサスヌクレオチドも含有しない（Kozak, M. 1996, Mamalian Genome 7:563-574）。予測タンパク質は予測真核生物シグナル配列を最初の１００アミノ酸内に含有しない。あるいは、イニシエーターメチオニンコドンおよび／または潜在的シグナル配列を提供するエキソン１の上流の付加的エキソンが存在し得る。
ｌｒｐ５の５’末端のＲＡＣＥ延長：アイソフォーム４および５
ＲＡＣＥは、ｃＤＮＡ末端の分析のための確立されたプロトコールである。Clontech（Palo Alto, CA）から購入したMarathonＲＡＣＥ鋳型を用いて、この手法を実施した。これは、胎児脳および乳房組織からのClontech“Marathon”ｃＤＮＡを用いて、使用説明書にしたがって実施した。２つの「入れ子式」ＰＣＲ増幅を、Gibco-BRL（Gaithersburg, MD）からのELONGASE長ＰＣＲ酵素ミックス＆緩衝液を用いて実施した。
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第１回ＰＣＲは、２ｕｌのMarathon胎盤ｃＤＮＡ鋳型と、各々１０ｐｍｏｌのプライマーＬ２１７およびＡＰ１を用いた。熱循環は：９４℃で３０秒、６８℃で６分間の周期を５回；９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で４分間の周期を５回；９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で４分間の周期を３０回であった。この反応物の１／２０希釈液からの１ｕｌをＤＮＡ鋳型として二次ＰＣＲ反応に付加した。このＰＣＲ反応は、入れ子式プライマーＬ１２０およびＡＰ２を用いる点で、一次ＰＣＲ反応と異なった。約１６００ｂｐおよび３００ｂｐの２つの生成物が観察され、ｐＣＲ２．１（Invitorgen, San Diego, CA）中にクローニングした。これらのクローンのＤＮＡ配列は、それらがエキソンＡの配列のスプライシングにより生成されたことを示した。より大きい１．６ｋｂ断片（図１３（SEQ ID NO:31））は、エキソンＡの上流の約４３６５ヌクレオチドの領域を同定し、１５５５塩基対に関してゲノムＤＮＡと連続しているように見えた。３００ｂｐ断片により同定される配列は、エキソンＡの上流の約５６４８ヌクレオチドであった（図１４（SEQ ID NO:32））。この配列は、Ａｌｕ反復との類似性を有した。３００ｂｐ断片により同定される領域は、１．６ｋｂ断片により同定される領域の内部であった。４および５と呼ばれるこれらのアイソフォームに関する開放読み取り枠は、アイソフォーム２に関して前記したのと同一である（図１１（ｂ））。
アイソフォーム６の延長
ＧＲＡＩＬ（前記）分析を用いて、遺伝子に関して考え得るプロモーター領域を予測した。プライマーは、ＧＲＡＩＬにより限定されるアイソフォーム６プロモーター配列（図１５（ｂ））に設計され、エキソンＡから約４ｋｂ中心である。この領域は、ＧＲＡＩＬプロモーター−１（Ｇｐ−１）と呼ばれた。
ＰＣＲプライマーＧｐ  １ｆ（表２）（SEQ ID NO:78）を、メーカー（Perkin Elmer, Norwalk, CT）により供給された反応緩衝液中のポリメラーゼＴａｑ  Ｇｏｌｄを用いてプライマー５７４ｒおよび５９９ｒとともに、ＰＣＲ反応に用いた。反応条件は、９５℃で１２分、その後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の周期を３５回で、約１０ｎｇの肝臓ｃＤＮＡ／反応物２０ｕｌを用いた。一次反応物を水で２０倍に希釈し、プライマーＧｐ  １ｆを４７４ｒまたは５２１ｒと組合せて用いて、第２回目のＰＣＲを実行した。生成物を２％アガロースゲル上で分析し、約２２０〜４００ｂｐのバンドをｐＣＲ２．１（Invitorgen, San Diego, CA）中にサブクローニングし、ＤＮＡ配列分析により分析したアイソフォーム４中に存在する開放読み取り枠は、前記でアイソフォーム２に関して記載したのと同一である（図１１（ｂ））。
マイクロサテライト奪回
各クローンを制限し、特異的バブルリンカー上で結紮して、各クローンから小ベクターライブラリを作製した（Munroe, D.J. et al.,（1994）Genomics 19, 506）。リンカーに特異的なプライマー（Ｎｏｔ  １−Ａ）と反復モチーフ（ＡＣ）１１Ｎ（ここで、ＮはＡではない）との間で、６５℃のアニーリング温度で、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、前記のようなＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ染料ターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いてシーケンシングした。この配列から、プライマーを設計し、これをＮｏｔ  １−ＡプライマーとともにＰＣＲに用いた。これもシーケンシングし、プライマーが反復モチーフと側面を接するように二次ＰＣＲプライマーを設計して（表８）（SEQ ID NO:318〜333）、遺伝子型化に用いた。
突然変異走査
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を、シーケンシングスキャニングアプローチを用いて１型糖尿病患者において同定した（表５）。
プライマーを設計して、当該の特異的領域（即ち、ＬＲＰ５エキソン、以前に同定されたＳＮＰまたはＧＲＡＩＬ予測エキソンを含入する領域）を含入する約５００〜８００ｂｐの長さのをゲノム断片を特異的に増幅した。蛍光染料プライマーシーケンシングを促すために、前方および逆プライマー対を、それぞれＭ１３Universalプライマー（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’）（SEQ ID NO:409）および修飾Ｍ１３逆プライマー（5’-GCTATGACCATGATTACGCC-3’）（SEQ ID NO:410）に対応する配列で尾端を付けた。前記のようにプライマー組を用いて賛成されたＰＣＲ生成物を、Perkin-Elmerの１０ｘＰＣＲ緩衝液、２００ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ｕｌのTaq Gold（Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA）、５０ｎｇの患者ＤＮＡおよび２０ｐｍｏｌ／ｍｌの前方および逆プライマーから成る５０ｕｌの反応物中で増幅した。循環条件は、９５℃で１２分間；９５℃で３０秒、５７℃で３０秒および６８℃で２分間の周期を３５回、その後７２℃で６分間延長し、４℃を保持した。
これらの反応により単一ＤＮＡ断片が産生するように、条件を最適化した。ＰＣＲ生成物を次に、Qiagenロボット（Qiagen Inc., Santa Clarita, CA）上でQiaQuickストリップまたはQiaQuick  ９６ウエルプレートを用いてシーケンシングのために精製した。この精製工程は、非混入プライマーおよびヌクレオチドを除去する。
直接BODIPY染料プライマーサイクルシーケンシングは、ＰＣＲ生成物を分析するために用いられる方法であった（Metzker et al.,（1996）Science 271, 1420-1422）。Tecanロボット（Tecan, Research Triangle Park, NC）は、標準染料プライマーシーケンシングプロトコール（ABI Dye Primer Cycle Sequencing with AmpliTaq DNA Polymerase FS, Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA）を用いてシーケンシング反応を実施した。反応は、以下の循環条件を用いて、ＤＮＡエンジン熱循環器（M.J.Research Inc., Watertown, MA）で実施した：９５℃で４秒、５５℃で１０秒、および７０℃で６０秒の周期を１５回；その後、９５℃で４秒および７０℃で６０秒の周期を１５回。循環後、試料をプールし、沈降させて、ドライダウンした。試料を３ｕｌの充填緩衝液中に再懸濁し、２ｍｌをＡＢＩ  ３７７自動ＤＮＡシーケンサー上を移動させた。
ＳＮＰが一旦同定されると、スキャニング技法を用いて、１型糖尿病族の疾病と遺伝子との連合の確定に役立てるためのマーカーとしてのそれらの情報性を評価する。我々は制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を用いて、制限エンドヌクレアーゼ部位を変ＬＳＮＰを査定している。さらに、強制ＲＦＬＰ  ＰＣＲ（Li and Hood（1995）Genomics 26, 199-206; Haliassos et al.,（1989）Nuc. Acids Res. 17, 2437-2448: Wu et al.,（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2757-2760）を用いて、制限エンドヌクレアーゼ部位を変えないＳＮＰを評価している。蛍光ベースのCleavase（ＣＦＬＰ）（Life Technologies, Gathersburg, MD）およびResolvase（Avitech Diagnostics, Malven, PA）検定を開発することにより、遺伝子座の大型領域を走査することも試みている。
ＩＤＤＭ４でのハプロタイプ分析
ハプロタイプマッピング（または同一性家系マッピング）を連合マッピングとともに用いて、始祖集団における同一性家系（ＩＢＤ）の領域を同定した。この場合、始祖集団中の罹患個体（のうちのあるものは）は突然変異だけでなく、疾病遺伝子座周囲の非常に大きいゲノムハプロタイプ（したがってＤＮＡの同一片）をも共有する。組換え体ハプロタイプを利用して、突然変異を含有する領域を描き得る。これらの方法を用いて、劣性形質障害：ウィルソン病、バッテン病、ヒルシュスプルング病および遺伝性ヘモクロマトーシスの遺伝子がマッピングされてきた（Tanzi, R.et al.,（1993）Nature Genet 5, 344-350; The International Batten Disease Consortium.（1995）Cell 82, 949-957; Puffenberger, E., et al.,（1994）Hum Mol Genet 3, 1217-1225;およびFeder, J., et al,（1996）Nature Genet 13, 399-408）。同様に、１型糖尿病では、ＩＤＤＭ１に関して、特定のコーカサス人とアフリカ人オリジンのハプロタイプとの間の比較ＭＨＣハプロタイプマッピングが、この障害に対する感受性遺伝子座としてＨＬＡ−ＤＱＡ１およびＨＬＡ−ＤＱＢ１の療法を同定した（Todd, J. et al.（1989）Nature 338, 587-589;およびTodd, J. et al.（1987）Nature 329, 599-604）。
染色体１１ｑ１３では、しばしば予期したよりも多くが伝達され、したがって病因遺伝子座に高感受性対立遺伝子を含有するハプロタイプ間のＩＢＤの領域を同定するために、ハプロタイプ分析は、連合分析と一緒に着手された。これに対比して、防御性ハプロタイプは、しばしば予期したよりも少なく伝達され、病因遺伝子座に異なる（防御的）対立形質を含有する。対立形質の予測伝達の偏差に関する証拠は、２つの多型マーカーＤ１１Ｓ１９１７およびＨ０５７０ＰＯＬＹＡを用いて示された。英国、米国、ノルウェー、サルジニア、ルーマニア、フィンランド、イタリアおよびデンマークからの２０４２の１型糖尿病家族では、Ｄ１１Ｓ１９１７−Ｈ０５７０ＰＯＬＹＡハプロタイプ３−２の罹患子孫への伝達は陰性（４６％）で、罹患および非罹患伝達間の不均質性の２ｘ２検定では、Ｘ2＝２３、ｄｆ＝１、ｐ＜１．５ｘ１０-6で、これは防御性ハプロタイプであるという良好な証拠を提供した。これに対比して、２−３ハプロタイプは非罹患子孫より罹患子孫により多く伝達され（％Ｔ＝５１．３；２ｘ２偶発性検定；Ｘ2＝５．５、ｄｆ＝１、ｐ＜０．０２）、このことは、これが高感受性（またはおそらくは中性の）染色体であったことを示す。１型糖尿病に罹りやすいと思われるさらに別のまれなハプロタイプが同定されている（Ｄ１１Ｓ１９１７−Ｈ０５７０ＰＯＬＹＡ、３−３、罹患％Ｔ＝６２．４、２ｘ２偶発性検定、罹患対非罹患；カイ2＝６．７、ｄｆ＝１、ｐ＜０．００９）。したがって、この領域における関連の分析は、非罹患子孫と比較した場合に罹患子孫に有意に低く伝達されるときは、１型糖尿病に対して防御性の対立形質を含有するハプロタイプに関する証拠と、１型糖尿病に及ぼす中性または高感受性作用を有する２つの非防御性ハプロタイプに関する証拠を生じた。このハプロタイプ分析を広げて１４の側面を接するマイクロサテライトマーカー、２５５ｃａ５、Ｄ１１Ｓ９８７、２５５ｃａ６、２５５ｃａ３、Ｄ１１Ｓ１２９６、Ｅ０８６４ＣＡ、ＴＡＡ、Ｌ３００１ＣＡ、Ｄ１１Ｓ１３３７、１４ＬＣＡ５、Ｄ１１Ｓ４１７８、Ｄ１１Ｓ９７０、１４ＬＣＡ１、１８０１８、ならびに単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）５８−１、エキソンＥ（イントロン性、８ｂｐのエキソン６の３’）およびエキソンＲ（Ａｌａ1330、エキソン１８）（図１９）は、糖尿病個体におけるこの間隔内の高度保存性ハプロタイプを明示した。別個の防御性ハプロタイプ（Ａ）（Ｄ１１Ｓ１９１７−Ｈ０５７０ＰＯＬＹＡでの３−２ハプロタイプを包含する）、ならびに別個の高感受性ハプロタイプ（Ｂ）（Ｄ１１Ｓ１９１７−Ｈ０５７０ＰＯＬＹＡでの２−３ハプロタイプを包含する）も同定されている。高感受性ハプロタイプは、マーカーＤ１１Ｓ１３３７の３’である防御性ハプロタイプを有するＩＢＤであり、これは、１型糖尿病にある役割を演じる病因変異体が同一領域内に存在せず、ＬＲＰ−５遺伝子のエキソンＥの５’に局在することを示す。防御性ハプロタイプと高感受性ハプロタイプとの間のＩＢＤであるこの領域は、罹患子孫への伝達への偏差が検出されなかったので、着手中の関連分析を防止する。極高感受性ハプロタイプ（Ｃ）（Ｄ１１Ｓ１９１７−Ｈ０５７０ＰＯＬＹＡで３−３）も同定され得る。その領域で付加的マーカーを用いるハプロタイプ分析は、この極高感受性ハプロタイプがＵＴ５６２０と１４Ｌ１５ＣＡとの間の高感受性ハプロタイプと同一であり、おそらくは病因変異体はＵＴ５６２０とエキソンＥとの間（約１００ｋｂ）に局在することを明示する。したがって、高感受性および極高感受性ハプロタイプは１型糖尿病に及ぼす高感受性作用を付与する１つの対立形質（または別々の複数の対立形質）を保有し得るが、一方防御性ハプロタイプはＩＤＤＭに対して防御性である対立形質を含有する。ＬＲＰ５遺伝子の５’領域はこの間隔内に存在し、ＬＲＰ５ｉ電子およびエキソン１〜６の５’調節領域を包含する。
イタリア人およびサルジニア人のハプロタイプの分析から、さらに別の２つの高感受性ハプロタイプが明らかになった。イタリア人家族のハプロタイプ１−３のＤ１１Ｓ１９１７−Ｈ０５７０ＰＯＬＹＡでは、６３％Ｔ、２ｘ２罹患対非罹患  ｐ＝０．０３（ハプロタイプＤ）であった。サルジニア人家族のハプロタイプ１−２のＨ０５７０ＰＯＬＹＡ−Ｌ３００１では、５８％Ｔ、２ｘ２罹患対非罹患  ｐ＝０．０５（ハプロタイプＥ）であった。
前記の５つのハプロタイプを含有する試料を、ＩＢＤの領域を調べるために、ＩＤＤＭ４領域からのＳＮＰを用いて遺伝子型分類した（図Ｂ）。これらのＳＮＰは、ＵＴ５６２０および１４Ｌ１５ＣＡ間の高感受性ハプロタイプＢおよびＣの間のＩＢＤの領域を確証した。それは、マーカーＤ１１Ｓ１３３７の３’の防御性および感受性ハプロタイプＡおよびＢ間のＩＢＤの領域も確証したが、但し、病因性変異体は、この領域では含まれない。ＳＮＰ分析は、ＵＴ５６２０およびＴＡＡ間、防御性ハプロタイプＡ（２５ｋｂ領域）とは異なる感受性ハプロタイプＢ、Ｃ、ＤおよびＥ間のＩＢＤの潜在的領域も明らかにした。マーカーＨ０５７０ＰＯＬＹＡはこの間隔内に存在し、他の感受性ハプロタイプと比較して、ハプロタイプＥにおいては同一でない。これは、おそらくは、この多形での突然変異によるものであるか、あるいはそれはこの領域内の境界を描き、病因性変異体はこのマーカーの５’または３’である。この間隔内での付加的ＳＮＰのさらなる分析が必要である。
したがって、ＩＤＤＭ４領域内でのハプロタイプマッピングは、ＬＲＰ５遺伝子の５’領域における１００ｋｂの感受性ハプロタイプＢおよびＣ間のＩＢＤの領域を同定した。ＳＮＰハプロタイプマッピングは、この遺伝子；推定プロモーター、およびマウスシンテニー領域と相同性の領域（表１２）、ならびにＬＲＰ５のエキソン１に関して考え得る調節配列を含むＬＲＰ５の５’領域を包含する２５ｋｂ間隔におそらくはこれをさらに描いた。
ＬＲＰ５を含有するアデノウイルスベクターの構築
全長ヒトＬＲＰ５遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有するアデノウイルストランスファーベクターｐｄｅｌＥｌｓｐ１Ａ−ＣＭＶ−ｂＧＨＰＡ中でクローニングして、ｐｄｅｈｌｒｐ３を作製した。このベクターを用いて、５’ＩＴＲに向けられる宇するのＥ１領域中に挿入されるＬＲＰ５遺伝子を含有するアデノウイルスを構築した。この長さのｃＤＮＡを収容するために、Ｅ３領域は、ｐＢＨＧ１０に関して記載された（Bett et al.,1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806）ように、ウイルスから完全に欠失された。同一戦略を用いて、全長マウスＬｒｐ５遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを構築した。
Ｈｉｓタッグおよび翻訳停止シグナルが推定上のトランスメンブラン横断メインに取って代わるマウスＬｒｐ５の可溶性バージョンを構築した（表９に列挙したプライマー）（SEQ ID NO:49〜74，334〜402）。これは、当然、ＬｒＰ５の細胞外ドメインの分泌をもたらし、Ｌｒｐ５の推定配位子結合ドメインの生化学的特性を促進する。同様に、ヒトＬＲＰ５の可溶性バージョンは、表９に示したプライマー（SEQ ID NO:49〜74，334〜402）を用いて構築し得る。細胞外ドメインは、前駆体（未熟）タンパク質配列のアミノ酸１３８５に移動する。
ＬＲＰ５リガンドの同定
ＬＲＰ５はＬＤＬを結合し、そして保有する能力を示す（下記参照）が、しかしこの活性は高レベルではない。したがって、ＬＲＰ５は付加的配位子（単数または複数）を結合する能力を有すると思われる。ＬＲＰ５配位子を同定するために、ヒトＬＲＰ５の最初の１３９９アミノ酸から成る細胞外ドメイン、またはマウスＬｒｐ５の対応する領域を精製する。多数の発現系が用いられるが、これらの例としては、ショウジョウバエＳ２細胞、酵母菌および大腸菌におけるプラスミドベースの系、ならびに哺乳類細胞およびＳＦ９昆虫細胞におけるウイルスベースの系が挙げられる。ヒスチジンタッグを用いて、ニッケルカラム（Novagen, Madison WI）上でＬＲＰ５を精製する。種々の樹脂をカラムクロマトグラフィーに用いて、可溶性ＬＲＰ５をさらに濃厚化し得る。ＬＲＰ５は固体支持体、例えばニッケルカラムに取り付けられる。血清分画、尿分画または組織抽出物からの分画からの配位子を含有する溶液を、ＬＲＰ５カラム上で分別する。イミジゾールを用いて、ニッケルカラムから配位子を溶離する。ＬＲＰ５に結合した配位子（単数または複数）の性質を、ゲル電気泳動、アミノ酸配列、アミノ酸組成、ガスクロマトグラフィーおよび質量分光光度計で特性化する。
精製ＬＲＰ５をＢｉａＣｏｒｅ２０００（BiaCore, Uppsula Sweden）チップに取り付形質転換、ＬＲＰ５と結合する配位子が被験溶液中に存在するか否かを確定する。ＬＲＰ５に対する配位子が同定されれば、ＬＲＰ５チップを用いてＬＲＰ５配位子相互作用の動力学が特性化される。
ＬＲＰ５の可溶性バージョンを含有するアデノウイルスベクターを用いて動物を感染させ、配位子／ＬＲＰ５複合体の血清または肝臓抽出物からの単離は、ヒスチジンタッグおよびＬＲＰ５のこの部分に対して向けられる抗体の使用により促される。
ＬＲＰ５ウイルスによる動物の治療
広範囲の種が、導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターで治療され得る。マウスは、多数の遺伝子変更系統、即ちノックアウトマウス、トランスジェニックマウスおよび近交系マウスが利用可能であるために、実験を実施するのに好ましい種である。しかしながら、適切な場合には、より大きい動物、例えばラットまたはウサギを用い得る。１型糖尿病の発症を修飾するＬＲＰ５の能力を試験するための好ましい動物モデルは、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスである。リポタンパク質代謝におけるＬＲＰ５に関する潜在的役割の実験のための好ましい動物モデルは、ＬＤＬ受容体族の成員、例えばＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）が分解された、あるいはリポタンパク質代謝に関与する遺伝子、例えばＡｐｏ−Ｅが破壊されたマウスである。
アデノウイルスは、１ｘ１０9プラーク形成単位をマウスの尾静脈に注入することにより投与する。従来の研究に基づいて、この形態の治療は、相対的に高頻度で肝細胞の感染を引き起こす。３つの異なるアデノウイルス処置物を調製した：１）挿入物を含有しないアデノウイルス（陰性対照）、２）ヒトＬＤＬＲを含有するアデノウイルス（陽性対照）および３）ヒトＬＲＰ５を含有するアデノウイルス。これらのウイルスの各々を用いて、５匹のＣ５７野生型と５匹のＣ５７ＬＤＬＲノックアウトマウスを感染させた。ウイルスの注入の８日前に、前処理採血して、処置前の血清化学値を検査した。動物にウイルスを注入した。ウイルス投与後５日目に、二回目の採血をして、リポタンパク質分別のために血清を採集するため、動物を安楽死させた。さらに、in-situ分析、免疫組織化学および組織病理学所見のために組織を採取した。
実験中は、動物は標準明／暗周期に保持し、通常の餌を与えた。血清採取前は動物を絶食させた。ある種の実験条件では、動物に高脂肪食を与えるのが望ましいこともある。
標準臨床血清化学検定を実施して、血清トリグリセリド、総コレステロール、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、尿素窒素、およびクレアチニン値を確定した。血液検査を実施して、循環白血球、好中球、％リンパ球、単球および好酸球、赤血球、血小板、ヘモグロビンならびに％ヘマトクリットのレベルを調べた。
血清リポタンパク質を、Superose 6 FPLCサイジングカラムを用いて、Gerdes等（Clin. Chim. Acta 205:1-9（1992））が記載した手法を多少変更して、分別してサイズ別に分類し、Gerdesの手法から得られた最も有意の差異は、カラムを１つだけ用いた値であった。カラム分画を収集し、コレステロールおよびトリグリセリドに関して分析した。「曲線下面積」を、各リポタンパク質種に関して算出した。密度で限定された等級の各々に対応する近似ピーク分画は、ＶＬＤＬに関しては、分画２４、ＬＤＬに関しては分画３６そしてＨＤＬに関しては分画５１である。
ＬＲＰ５過剰発現は血清トリグリセリドおよびリポタンパク質に影響を及ぼす血清化学データの統計分析は、対照ウイルスに対して、ウイルスを含有するＬＲＰ５で処置した動物におけるトリグリセリドレベルでは、３０％の低減（Ｐ値＝０．０２５）が認められた（表１０）。トリグリセリドにおけるこの低減は、野生型およびＫＯマウスの療法で、同様のレベルで起きた。比較すると、ＬＤＬＲウイルスは血清トリグリセリドを、対照ウイルスに対して約５５％低減した。この結果は、ＬＲＰ５が血清トリグリセリドレベルを調節する能力を有することを示す。
血清リポタンパク質プロフィールは、ＶＬＤＬ粒子種が、ＬＲＰ５ウイルスで処置した野生型マウスにおいて低減されたことを示した。分析した試料の数は統計分析に十分ではなかったが、しかしこの結果は血清トリグリセリドで観察された低減と一致する。これらの結果は、ＬＲＰ５が脂質の豊富な粒子と結合しそして内在化して、血清トリグリセリドおよびＶＬＤＬ粒子の低減を引き起こす能力を有することを示唆する。したがって、ＬＲＰ５による、あるいはＬＲＰ５の発現を増大する、またはＬＲＰ５の生物学的活性を贈さいする治療薬による処置は、トリグリセリド値を増大する疾患、例えば２型糖尿病および肥満症の患者において脂質が豊富な粒子およびトリグリセリドを低減するのに有用である。
統計的有意は認められなかったけれども、ＬＤＬ受容体の崩壊（ノックアウト）のために高レベルの血清コレステロール（約２２０ｍｇ／ｄＬ）を有するマウスにおけるＬＲＰ５処置の結果としての血清コレステロールレベルの低減傾向（２８％、ｐ＝０．０７３）が観察された（表１０）。ＬＲＰ５処置が血清コレステロールを上昇する逆傾向（３０％、ｐ＝０．０８）は、相対的に低レベルの血清コレステロール（約７０ｍｇ／ｄＬ）を有する野生型マウスにおいては観察されなかった。これらのデータ組での小処置群（ｎ＝４）はこれらの解釈を制限し、このことはさらなる実験が必要であることを示している。しかし、それでもこれらの結果は、コレステロールが上昇した状態では、ＬＲＰ５の活性の増大が血清コレステロール値を低減し得る、ということを示す。したがって、ＬＲＰ５による、あるいはＬＲＰ５の発現またはＬＲＰ５の生物学的活性を増大する治療薬を用いた処置は、高コレステロール血症患者のコレステロールを低減するのに有用である。
ＬＲＰ５過剰発現は血清アルカリ性ホスファターゼレベルに影響を及ぼし得る胆管閉塞の結果、血清アルカリ性ホスファターゼレベルは劇的に、例えば２０倍に増大し得る（Jaffe, M.S.およびMcVan, B.,1997,Davis’s laboratory and diagnostic test handbook, pub. F.A. Davis Philadelphia, PA）。しかしながら、３倍増までの低レベルのアルカリ性ホスファターゼは、肝臓における感染性作用因子、例えばアデノウイルスに反応して起こる炎症反応に起因する。対照ウイルスで処置した動物では、アルカリ性ホスファターゼの約２倍の増加が認められた。これに対比して、ＬＲＰ５ウイルスで処置した動物のアルカリ性ホスファターゼレベルでは、わずかの増大しか認められなかった。対照に対して、アルカリ性ホスファターゼレベルは、ＬＲＰ５処置動物では４９％低減した（ｐ値＝０．００１）（表１０）。
アルカリ性ホスファターゼレベルの増大は、アデノウイルス感染レベルの結果であり、したがってＬＲＰ５ウイルスで処置した動物における低減に対して考え得る説明は、単に、この処置群における低ウイルスによるということであり得る。ウイルス感染レベルの指標は、肝臓酵素であるアスパラギンアミノトランスフェラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼが血清中に出現することである。これらの酵素は通常は細胞の細胞質中に見出され、細胞損傷が起こると血清中で増大する（Jaffe, M.S.およびMcVan, B., 1997, Davis’s laboratory and diagnostic test handbook, pub. F.A. Davis Philadelphia, PA）。したがって、これらの酵素は、アデノウイルス感染の結果である毒性レベルに関するマーカーとして役立つ。これらの酵素は、感染前は通常は低レベルで、ウイルスを摂取していない動物中に存在する。重要なことは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼのレベルはＬＲＰ５ウイルスを投与された動物では高いことであり、このことは、これらの動物が対照ウイルスを投与された動物より多くの細胞損傷を有し、したがってより広範な感染を有することを示している（表１１）。したがって、アルカリ性ホスファターゼレベルの低減は単に低ＬＲＰ５ウイルスが投与されたためであるとは考えられない。第二に考え得る説明は、ＬＲＰ５がアデノウイルス感染に起因する炎症反応の性質を修正するというものである。炎症反応を調節する場合に考え得るＬＲＰ５の役割は、遺伝子データと一致し、このことはこの遺伝子が１型糖尿病の発症に対する危険性に関連があることを示している。慢性インスリン炎または炎症は１型糖尿病の臨床的開始の前駆症状であり、したがってＬＲＰ５処置、あるいはＬＲＰ５の転写を増大する治療薬による処置は、１型糖尿病の防止に有用であり得る。１型糖尿病は自己免疫疾患であり、したがってＬＲＰ５による、あるいはＬＲＰ５の発現またはＬＲＰ５の生物学的活性を増大する治療薬による処置は、その他の自己免疫疾患の治療に有用であり得る。
細胞系でのＬＲＰ５の発現
異種プロモーターの制御下でのＬＲＰ５の過剰発現は、ＬＲＰ５を含有するアデノウイルスによる感染、あるいはＬＲＰ５を含有するプラスミドベクターによるトランスフェクションによって成し遂げ得る。プラスミドベクターによるトランスフェクションは、導入遺伝子の一過性のまたは安定した発現をもたらし得る。
内因性ＬＤＬ受容体は、ＬＤＬ受容体族の他の成員によるＬＤＬの取込みを検出する能力を低減する。ＬＤＬ受容体の非存在下でのリポタンパク質取込みを調べるために、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）ヒト患者からの一次細胞株を用いた。これらのＦＨ細胞株は、いかなる内因性ＬＤＬ受容体も欠いている。ＦＨ繊維芽細胞を、５００プラーク形成単位／細胞のＭＯＩで、３７℃で２４時間感染させた。感染後、細胞を４０μｇ／ｍｌの125 Ｉ−ＬＤＬとともに３７℃でインキュベートした。４時間後、細胞を洗浄し、ＬＤＬの取込みを測定した。ＬＤＬ取込みレベルの適度（約６０％）の増大が観察された。比較すると、ＬＤＬ受容体を含有するアデノウイルスによるＦＨ細胞の感染は、ＬＤＬ取込みの２０倍の増大をもたらした（ｐ＜０．０００１、ｎ＝３）。ＬＲＰ５により媒介されるこの適度レベルの活性が統計的に有意であっ多価否かを確定するために、２４の個々のウエルをＬＲＰ５ウイルスに感染させて、分析した。この実験の統計的分析は、ＬＤＬ取込みの増大が高度に有意であったことを示した（ｐ＜０．０００１）。したがって、ＬＲＰ５はＬＤＬ取込みを媒介し得る。しかしながら、ＬＤＬ受容体に対して、適度レベルの活性を基礎にして、ＬＲＰ５の一次活性はＬＤＬの取込みを媒介するためであるとは思えない。
ＬＤＬ受容体またはＬＤＬ受容体族のその他の成員を欠いた別の細胞株が存在する。ＰＥＡ−１３細胞株（ＡＴＣＣ２２１６−ＣＲＬ）は、ＬＲＰ１受容体を欠く。ＬＤＬ受容体を欠いた突然変異体ＣＨＯ細胞は、KingsleyとKrieger（Proceedings National Academy Sciences USA（1984）81:5454）により記載されている。ｌｄ１Ａ７として知られているこの細胞株は、組換えＬＲＰ５を発現する安定トランスフェクタント細胞株の作製に特に有用である。
抗ＬＲＰ５抗体
ウエスタンブロット分析
ヒトＬＲＰ５  ＭＡＰペプチド：
ＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）
ＶＤＧＲＱＮＩＫＲＡＫＤＤＧＴ（SEQ ID NO:404）
ＥＶＬＦＴＴＧＬＩＲＰＶＡＬＶＶＤＮ（SEQ ID NO:405）
ＩＱＧＨＬＤＦＶＭＤＩＬＶＦＨＳ（SEQ ID NO:406）
で免疫感作したウサギで調製した抗血清を、ウエスタンブロット分析により評価した。
ＣＯＳ細胞を、ヒトＬＲＰ５  ｃＤＮＡを含有するアデノウイルスで感染させた。感染後３日目に、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（１００ｕｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２ｕｇ／ｍｌ）およびペプスタチンＡ（１ｕｇ／ｍｌ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（Gibco/BRL Gathersburg, MD）中に掻き取ることにより、細胞を採集した。低速回転により細胞をペレット化し、プロテアーゼ阻害剤を含有するリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁して、Dounce均質化により溶解した。１０００ｒｐｍの低速回転で、Beckman J-9ローター中で５分間回転して、核を除去した。上清を収集し、１００，０００ｘｇの高速で３時間、遠心分離して、膜をペレット化した。膜をＳＤＳ−試料緩衝液（Novex, San Diego CA）中に再懸濁した。
１０％トリス−グリシンアクリルアミドゲル（Novex, San Diego CA）上で電気泳動処理して、膜タンパク質を分別した。分別タンパク質を、メーカーの使用説明書にしたがって、ＰＶＤＦ紙（Novex, San Diego CA）に移した。標準ウエスタンブロット分析を膜上で実施したが、一次抗体は粗製抗血清の１：２００希釈液であり、二次抗体は抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ複合体（Amersham, Arlington Heights, IL）の１：３０００希釈液であった。ＥＣＬ試薬（Amersham, Arlington Heights, IL）を用いて、血清中に存在する抗体により認識されるタンパク質を可視化した。
ペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）で免疫感作したウサギからの血清により、約１７０〜１８０ｋＤのバンドを検出した。このバンドは、ヒトＬＲＰ５を含有するアデノウイルスに感染させた細胞において検出されただけで、対照ウイルスに感染させた細胞中には存在しなかった。さらに、この１７０ｋＤバンドの検出は、０．１ｕｇ／ｍｌのペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）を含有するが、０．１ｕｇ／ｍｌのペプチドＶＤＧＲＱＮＩＫＲＡＫＤＤＧＴ（SEQ ID NO:404）は含有しない血清の１：５００希釈液を予備吸着させることにより遮断された。したがって、ペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）に対して向けられる抗体により検出される約１７０ｋＤのこのタンパク質バンドは、ヒトＬＲＰ５である。成熟ヒトＬＲＰ５タンパク質の予測サイズは、１７６ｋＤである。
ペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）で免疫感作したウサギからの抗血清を、ＭＡＰペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）を共有結合させたAffigel 10カラム（BioRad, Hercules CA）を用いてアフィニティー精製した。これは、ＬＲＰ５に対してより大きい特異性を有する抗血清を生じた。
ペプチドＩＱＧＨＬＤＦＶＭＤＩＬＶＦＨＳ（SEQ ID NO:406）で免疫感作したウサギからの抗血清は、ウイルスを含有するＬＲＰ５に感染させた細胞中には存在するが、対照ウイルスに感染させた細胞中には存在しないヤク１７０ｋＤのバンドを検出し得る。この抗体は、ＬＲＰ５の推定上の細胞外ドメイン中に存在するペプチドを認識し、したがってＬＲＰ５の可溶性バージョンの検出に有用である。しかしながら、ペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）で免疫感作したウサギからの抗血清に対して、この抗血清を用いた場合には、より大きいバックグラウンドが観察される。
ＬＲＰ５は組織マクロファージ中で発現される
ＬＲＰ５ペプチドＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰＳＰＣＴＤＳＳ（SEQ ID NO:403）に対する粗製およびアフィニティー精製抗血清を、ヒト肝臓における免疫細胞化学試験に用いた。抗体は、肝臓中のタップファー細胞と呼ばれる、ＬＲＰ５に対して陽性に、そして成熟組織食細胞を認識するマーカーＲＦＤ７（Harlan Bioproducts, Indianapolis IN）に対して陽性に、そしてＭＨＣクラスＩＩマーカーであるＲＦＤ１（Harlan Bioproducts, Indianapolis IN）に対しては陰性に染色される組織マクロファージを認識した。この染色パターン（ＲＦＤ１−ＲＦＤ７＋）は、マクロファージの亜集団、エフェクター食細胞を同定する。この種のマクロファージは、自己免疫疾患に関するモデルにおける疾患である実験的自己免疫神経炎の進行に関与していた（Jung, S. et al., 1993, J Neurol Sci 119:195-202）。食細胞組織マクロファージにおける発現は、免疫応答の炎症性成分を調節する場合のＬＲＰ３に関する役割を支持する。この結果は、ＬＲＰ５ウイルスで処置した動物におけるアルカリ性ホスファターゼレベルで観察された差ならびに遺伝子データに基づいて提案された役割と一致し、このことはＬＲＰ５が糖尿病の危険性を有する遺伝子であることを示す。
ＬＲＰ５遺伝子の付加的保存領域の確定
マウスＢＡＣクローン１３１−ｐ−１５および５３−ｄ−８から調製されたショットガンライブラリーの高スループットＤＮＡシーケンシングを用いて、マウスおよびヒト間に保存されるＬＲＰ５遺伝子の領域を同定した。この領域を同定するために、非アッセンブリー化配列またはアッセンブリー化コンティグであるマウスゲノムＤＮＡを、ヒトゲノムＤＮＡのアッセンブリーに対して比較した。比較はＢＬＡＳＴ算法を用いて実行し、カットオフは８０％であった。この分析はＬＲＰ５遺伝子の大多数のエキソンの同定を成し、遺伝子の他の位置の保存配列の多数のパッチを同定した（表１２）。
推定ＡＴＧの上流４．３ｋｂおよび１６８ｂｐに位置するヒトおよびマウス間に保存された配列が存在する。これらの配列は、ｍＲＮＡ転写体またはプロモーター素子の５’非翻訳配列を表し得る。
３６ｋｂの推定上の最初のイントロン内に、ある程度のＤＮＡ配列保存を示す１２のパッチが存在する。これらの領域、例えば４１７０７−４１９０３のいくつかは、非常に広範で、ＬＲＰ５遺伝子のエキソンに関して観察されるものと同様に、高度の配列保存を有する。これらの領域は転写されるとは思われないため、これらの保存領域は、ＬＲＰ５遺伝子の転写またはＬＲＰｓｍＲＮＡ転写体のプロセッシングを調節する場合にある役割を演じると思われる。それらの役割の的確な性質に無関係に、これらの新規に同定された領域は、配列多型がＬＲＰ５の生物学的活性に影響を及ぼし得る領域を示す。
ＬＲＰ５の最初の２つのエキソンを含有するＢＡＣクローン１３１−ｐ−１５を、広範に、即ち約６ｘ適用範囲でシーケンシングした。ＢＡＣクローン５３−ｄ−８は、エキソンＤからエキソンＶまでの配列適用範囲を含有するが、しかしながらこのクローンの配列適用範囲は約１ｘに過ぎなかった（スキムシーケンシング）。マウスＢＡＣ５３−ｄ−８のスキムシーケンシングにより、７６％のエキソンが検出されたが、しかしながらいくつかの場合には、エキソンの一部分だけがマウス配列データ中に存在した。エキソンの他に、ヒト配列によるある程度の配列保存を示したＢＡＣ５３−ｄ−８配列中には３つのパッチが認められた（表１２）。これらはすべて、エキソンＤとＥの間の大型の２０ｋｂイントロンに局在した。これらの配列は、この大型イントロンのプロセッシングに重要な領域を表し、したがってこれらの配列における多型は、ＬＲＰ５の発現レベルに影響を及ぼし得る。
代替的スプライシング化ＬＲＰ５  ｍＲＮＡ転写体の相対的豊富さの確定
いくつかの技法を用いて、ＬＲＰ５の異なる代替的スプライシング化アイソフォームの相対的豊富さを確定し得る。
特定の転写体から得られるプローブのノーザンブロット分析を用いて、特定の転写体の豊富さを調べる。より高感度の技法、例えばＲＮアーゼ防御検定を実施する。市販キット（Ambion, Inc., Austin TX）からの試薬を用いて、プローブを調製する．［α］３２Ｐ−ＵＴＰで放射能標識したプローブとハイブリダイズする転写体の相対的豊富さを、元のそして変性アクリルアミドゲル（Novex Inc., San Diego, CA）により分析する。確立された手法（Sambrook et al.,（1989）Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Press, NY）にしたがって、転写体の５’部分から得られる逆プライマーを用いて、プライマー延長検定を実施する。
ＬＲＰ５遺伝子のその他の種同族体の単離
ヒトＬＲＰ５配列から設計されたＰＣＲプライマーを用いて、当該種のｃＤＮＡから得られた遺伝子の一部を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる種、例えばラット、イヌからのＬＲＰ５遺伝子を単離する。低コドン縮重を有するアミノ酸、例えばＭｅｔおよびＴｒｐをコードする領域を選択することにより、３２〜１２８倍縮重を示す１７−２０ヌクレオチドのプライマーを設計して、縮重ＰＣＲを実施する。これらのプライマーを選択する場合、タンパク質中に保存される領域、例えば図６ｂに示したモチーフに対して選択が示される。ＰＣＲ生成物をＤＮＡ配列分析により分析して、ヒトＬＲＰ５に対するそれらの類似性を確証する。正しい生成物を用いて、高ストリンジェンシーでのコロニーまたはプラークハイブリダイゼーションにより、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。あるいは、ヒトＬＲＰ５遺伝子から直接得られるプローブを利用して、低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションにより、ＬＲＰ５のｃＤＮＡ配列を、異なる種から単離する。ｃＤＮＡライブラリーを、前記のように生成する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【図５（ｄ）】
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【図５（ｅ）】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１１（ｃ）】
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【図１２（ａ）】
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【図１２（ｂ）】
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【図１２（ｃ）】
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【図１２（ｄ）】
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【図１２（ｅ）】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５（ａ）】
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【図１５（ｂ）】
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【図１６（ａ）】
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【図１６（ｂ）】
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【図１６（ｃ）】
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【図１６（ｄ）】
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【図１７（ａ）】
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【図１７（ｂ）】
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【図１８（ａ）】
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【図１８（ｂ）】
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【図１８（ｃ）】
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【図１８（ｄ）】
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【図１８（ｅ）】
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【図１９】
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【図２０】
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