(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を有する酵素製剤であって、当該製剤が以下の：
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ）  配列番号２と少なくとも９５％同一性を示し、かつエンド-１，４-β-グルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は
ｃ）  配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、かつエンド-１，４-β-グルカナーゼ活性を有するポリペプチド
を含み、ここで当該ａ）、ｂ）、又はｃ）のポリペプチドが、85℃を超える温度において最適活性を有する、前記製剤。
【請求項２】
前記酵素が、９０℃で最適活性を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記酵素製剤が、ジクチオグロムス属に属する株から得ることができる、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
５．５と１１の間のｐＨにおいて活性を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
７０℃及びｐＨ１０におけるカルボキシメチルセルロースに対する活性（ＣＭＣアッセイ）が、７０℃及び最適ｐＨにおける活性の５０％より高い活性を示す、請求項１に記載のエンドグルカナーゼ活性を有する酵素製剤。
【請求項６】
前記比活性は、６０％より高い、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記酵素製剤が、ジクチオグロムス属に属する株から得ることができる、請求項５又は６に記載の製剤。
【請求項８】
エンドグルカナーゼ活性を有し、かつ、８５℃を超える温度において最適活性を有する酵素をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、当該ＤＮＡが、
ａ）配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド、又は
ｂ）配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む、前記ＤＮＡ構築物。
【請求項９】
前記ＤＮＡが、ジクチオブロムス属に属する株からのＤＮＡライブラリーから単離され、又はそれに基づき製造される、請求項８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、エシェリキア・コリ（Escherichia coli），ＤＳＭ １１２０１から単離される、請求項８又は９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）をコードするＤＮＡをさらに含み、当該セルロース結合性ドメインと、当該ＤＮＡ構築物のＤＮＡによりコードされた酵素の酵素コア（触媒活性ドメイン）が作用可能な状態で連結されている、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含む組換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物又は請求項１３に記載の組換え発現ベクターを含む細胞。
【請求項１５】
原核生物細胞、特にバクテリア細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、バチルス・サブチリス、バチルス・レンタス、バチルス・リクエファシエンス、及びバチルス・リケニフォルミスから成る群から選ばれるバチルスの株に属する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、アスペルギルス、フザリウム、及びトリコデルマ属から成る群から選ばれる糸状菌の株に属する、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、ジクチオグロムス種ＤＳＭ  ６２６２の株に属する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、サッカロミセスの株に属する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
エンドグルカナーゼ活性を有し、かつ８５℃を超える温度において最適活性を有する酵素の製法であって、当該方法がその酵素の製造を許容する条件下、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の細胞を培養し、そして当該培養物からその酵素を回収することを含む、前記製法。
【請求項２１】
エンドグルカナーゼ活性を有する単離された酵素であって、当該酵素が、（ｉ）同種不純物を含まず、そして（ｉｉ）請求項２０に記載の方法により製造されている、前記酵素。
【請求項２２】
エンドグルカナーゼ活性を有し、かつ、８５℃を超える温度において最適活性を有する酵素であって、その酵素が、
ａ）請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物によりコードされ、又は
ｂ）請求項２０に記載の方法により製造される、
前記酵素。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載の酵素に富む、酵素製剤。
【請求項２４】
マンナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、ペクチン・アセチル・エステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチン・リアーゼ、ペクテート・リアーゼ、ペクチン・メチルエステラーゼ、エンドグルカナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスブルタミナーゼから成る群から選ばれた１以上の酵素をさらに含む、請求項１〜７、及び２３の中のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  ＤＳＭ  １１２０１株の単離された実質的に純粋な生物学的培養物。
【請求項２６】
セルロース繊維又は布ふくの特性を改良するための又はデニムのストーン・ウォッシュ外観を提供するための繊維産業における；又は工業的洗浄プロセスにおける；又は加熱押出しポリマー材料中での；又はバイオマスから糖への変換における；又はアルコールの製造における；又は飼料製造において使用される、例えば穀類の事前消化のための；又はインスタント・コーヒーの製造又は同様の抽出プロセスにおける、請求項２１又は２２に記載の酵素又は請求項１〜７、２３、及び２４のいずれか１項に記載の酵素製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、高温においてセルロース分解活性を有する酵素、特にエンドグルカナーゼに；セルロース分解活性を有する酵素をコードするクローン化DNA配列に；そのような酵素をコードする遺伝子の提供方法に；その酵素の製法に；セルロース分解活性を有する酵素を含む酵素製剤に；そして多数の工業用途のための上記酵素及び酵素製剤の使用に関する。
本発明の背景
セルラーゼ又はセルロース分解酵素は、セルロースの加水分解に関係する酵素である。生来のセルロースの加水分解においては、関係するセルラーゼ酵素の３つの主要なタイプ、すなわち、セロビオヒドロラーゼ（１，４−ベータ−Ｄ−グルカン・セロビオヒドロラーゼ、EC 3.2.1.91）、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.4）、及びベータ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）が在ることが知られている。
特に、エンドグルカナーゼ（EC No.3.2.1.4）は、上述の工業用途のためのヒドロラーゼの興味深い群を構成する。エンドグルカナーゼは、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシ・メチル・セルロース及びヒドロキシ・エチル・セルロース）、リケニン中の１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合、混合ベータ−１，３グルカン、例えば、穀類ベータ−Ｄ−グルカン又はキシログルカンその他の植物材料であってセルロース性部分を含むものの中のベータ−１，４結合のエンド加水分解を触媒する。正式名は、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノ・ヒドロラーゼであるが、その略号、エンドグルカナーゼを本明細書中で使用する。
0004327255.tif 000002
を参照することができる。
セルラーゼは、菌類（fungi）、放線菌類（actinomycetes）、ミクソバクテリア（myxobacteria）、及び真のバクテリアを含む多数の微生物のみならず植物により合成される。特に、多種多様な特異性をもつエンドグルカナーゼが同定されてきた。多くのバクテリアのエンドグルカナーゼが記載されてきた（Henrissat，B．and Bairoch，A．（1993）Biochem J．293: 781-788; Gilbert，H.J．and Hazlewood，G.P．（1993）J.Gen.Microbiol．139: 187-194）。クロストリジウム（Clostridia）亜門は、生理学的にひじょうに異なる属を含む嫌気性バクテリアのひじょうに多様な群である。従来、クロストリジウムは、内胞子形成性嫌気性バクテリアの全てを含む１の属であると考えられていた。しかしながら、分子分類学の道具、例えば16S rDNA配列決定の導入は、上記属が属をはるかに超えるレベルまで異質であるということを明らかにした。その上、非胞子形成性嫌気性を有するさまざまな属が、クロストリジウム内に分類され、それは、上位分類群、すなわち、亜門と判明した。これは、上記生物についての高く多様な生息環境に符号する。亜門クロストリジウムは、例えば、ひじょうに広い範囲の最適成長温度をもつ種を含む。
ジクチオグロムス属（genus Dictyoglomus）は、クロストリジウム亜門内に系統発生学的に位置する極好熱性嫌気性バクテリアを含む。ジクチオグロムス種は、クロストリジウム亜門内の最も好熱性の生物の中にある。16S rDNA系統発生樹の中で、ジクチオグロムスは、最も近い親類として、他の好熱性属、例えば、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、サーモアナエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）、及びシントロフォモナス（Syntrophomonas）と共に発生する。しかしながら、ジクチオグロムスは、深い枝を形成し、ジクチオグロムスが実際には別個の属として考えられるべきことを確信させる。
ジクチオグロムス種Ｂ１株は、パルプマス冷却タンク、すなわち、人工の好熱性環境からの、スラッジ及びパルプ・サンプルから単離された。この生物のキシラナーゼは、（約90℃の）最適温度に関して記載されている。この株のキシラナーゼ生産は、発酵の最適化のために試験に供されてきた。ジクチオグロムス属の種からのエンドグルカナーゼの存在は、全く報告されなかった。クロストリジウム門（the phylum clostridia）の中では、その中のいくつかの種から、２〜３が好熱性であるところのセルラーゼが記載されている。あるケースにおいては、エンドグルカナーゼの熱安定性が測定されており、最もよく研究された種の中の１は、80℃まで安定性であることが証明されているクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）である。サーモアナエロバクター・セルリティカス（Thermoanaerobacter cellulyticus）は、80℃までの安定性をもつ少なくとも２つのエンドグルカナーゼを生産する。
Hudson et al.（1991）The cellulase activity of an extreme thermophile，Appl.Microbiol.Biotechnol．35: 270-273; Mathrani and Ahring（1991）Isolation and characterization of strictly xylan-degrading Dictyoglomus from man-made thermophilic environment，Arch.Microbiol．157: 13-17; Adamsen et al.（1995）Optimization of extracellular xylanase production by Dictyoglomus sp B1 in continuous-culture，Appl.Microbiol.Biotechnol．44: 327-332; Maidak et al.（1994）The Ribosomal Database Project，Nuc.Acids Res．22: 3485-3487; Honda et al.（1987）Cloning and expression in E．coli of a Thermoanaerobacter cellulyticus gene encoding for heatstable beta-glucanase，Appl.Microbiol.Biotechnol．25: 480-483; Honda et al.（1988）Isolation of a new cellulase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in E．coli，Appl.Microbiol.Biotechnol．29: 264-268を参照することができる。
セルロース分解酵素のひじょうに重要な産業用途は、例えば、洗剤組成物又は布ふく軟化組成物中の成分としての、セルロース繊維又は布ふくの処理のための、及びセルロース含有布ふく、特にデニムの“ストーン−ウォッシュ”外観を得るための、使用であり、そしてこのような処理のためのいくつかの方法が、例えば、GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564、及びEP-A-0 435 876，WO 91／17243，WO 91／10732，WO 91／17244，PCT／DK95／000108及びPCT／DK95／00132中に示唆されている。セルロース分解酵素の他の重要な産業用途は、例えば、排水を改善するための又は再生紙のインク抜きのための、製紙パルプの処理のための使用である。
セルラーゼはセルロース結合性ドメイン（CBD）をもつことも又はもたないこともできるということも知られている。CBDは、セルロース含有繊維への上記酵素の結合を強化し、そしてその酵素の触媒活性部分の効果を高める。
高温におけるエルラーゼ、好ましくはエンドグルカナーゼの活性が所望される用途に使用されることができる経済的に実行可能なセルラーゼ酵素製剤を提供する必要性が在る。
本発明の目的は、高温条件において実質的なセルロース分解活性を有し、そして産業用途、例えば、製紙パルプ処理、繊維処理、洗濯プロセス、抽出プロセス又は動物飼料において、改良された性能を有する、新規の酵素製剤又は組換え酵素を提供することである。
本発明の要約
本発明者らは、今般、ひじょうに広いpH範囲において極めて高い温度においてセルロース分解活性を示す酵素をコードするジクチオグロムス（Dictyoglomus）属のバクテリアからのDNA配列をクローニング及び特徴付けし、それにより、所望の特性をもつ１成分セルロース分解酵素製剤を製造することを可能にすることに成功した。
従って、第１の側面においては、本発明は、85℃を超える、好ましくは90℃を超える、より好ましくは95℃を超える、特に100℃を超える温度において最適活性を持つエンドグルカナーゼ活性を有する酵素製剤に関する。
その第２の側面においては、本発明は、７０℃及び最適ｐＨにおける活性の５０％、好ましくは５５％、より好ましくは６０％、より好ましくは６５％、特に７０％より高い７０℃及びｐＨ１０におけるカルボキシ・メチル・セルロースに対するエンドグルカナーゼ活性（ＣＭＣアッセイ）を有する酸素製剤に関する。その第３の側面においては、本発明は、エンドグルカナーゼ活性及び85℃を超える、好ましくは90℃を超える、より好ましくは100℃を超える、最適活性を有する酵素をコードするDNA配列を含むDNA構築物であって、そのDNA配列が：
ａ）大腸菌（Escherichia coli）DSM 11201内のプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列、又は
ｂ）大腸菌（Escherichia coli）DSM 11201内のプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列のアナログ、であって、
ｉ）Escherichia coli DSM 11201内のプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列に、相同であり、好ましくは、少なくとも60％相同であるか、又は
ii）Escherichia coli DSM 11201内のプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列と同じオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズし、又は
iii）Escherichia coli DSM 11201内のプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列を含むDNA配列によりコードされたペプチドに、相同であり、好ましくは少なくとも60％相同であるポリペプチドをコードするか、又は
iv）Escherichia coli DSM 11201内のプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列によりコードされた精製されたエンドグルカナーゼに対して生じた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする、
ものを含む、前記DNA構築物に関する。
その第４、第５及び第６の側面においては、本発明は、本発明のクローン化されたDNA配列を宿す発現ベクター、上記クローン化DNA配列又は上記発現ベクターを含む細胞、及びセルロース分解活性を示す酵素の製法であって、上記酵素の製造を許容する条件下で上記細胞を培養し、そして上記培養物から上記酵素を回収することを含む、前記製法を提供する。
さらに他の側面においては、本発明は、セルロース分解活性を示す単離酵素であって、（ｉ）同種不純物を含まず、そして（ii）上記酵素が上記方法により製造されることを特徴とするものを、提供する。
本発明は、さらに、本発明のDNA構築物によりコードされている、セルロース分解活性を有する単離酵素、好ましくはエンドグルカナーゼに関する。さらに、本発明は、産業用途のための、例えば、セルロース性繊維又は布ふくの特性を改良するための又はデニムのストーン−ウォッシュ外観を提供するための繊維産業における；又は工業的洗浄プロセスにおける；又は加熱押出しされたポリマー材料における；又は糖へのバイオマスの変換における；又はアルコールの製造における；又は飼料製造において使用される例えば、穀粒の事前消化のための；又はインスタント・コーヒーの製造又は同様の抽出プロセスにおける、上記酵素又は本発明の酵素製剤の使用に関する。
本発明は、セルラーゼ・コーディングDNA配列を宿すEscherichia coli株DSM 11201、又はこのE．coli株のいずれかの突然変異体の単離された実質的に純粋な生物学的培養物にも関する。
本発明の詳細な説明
本文脈中、用語“20の天然アミノ酸残基”は、タンパク質中に通常在り、かつ、アラニン（Ala又はＡ）、バリン（Val又はＶ）、ロイシン（Leu又はＬ）、イソロイシン（Ile又はＩ）、プロリン（Pro又はＰ）、フェニルアラニン（Phe又はＦ）、トリプトファン（Trp又はＷ）、メチオニン（Met又はＭ）、グリシン（Gly又はＧ）、セリン（Ser又はＳ）、トレオニン（Thr又はＴ）、システイン（Cys又はＣ）、チロシン（Tyr又はＹ）、アスパラギン（Asn又はＮ）、グルタミン（Gln又はＱ）、アスパラギン酸（Asp又はＤ）、グルタミン酸（Glu又はＥ）、リジン（Lys又はＫ）、アルギニン（Arg又はＲ）、及びヒスチジン（His又はＨ）として従来知られている20のアミノ酸残基を表す。
本発明の酵素及び酵素製剤は、広いpH範囲にわたり活性であり、好ましくは、約４〜11の、好ましくは約5.5〜約10の間のpHにおいて活性である。
好ましい態様においては、本発明の酵素又は酵素製剤は、グラム陽性バクテリア門に属する株、より好ましくは、クロストリジウム亜門に属する株、さらにより好ましくは、ジクチオグロムス属、特にジクチオグロムス種の種DSM 6262に属する株から得られることができるか又はそれらに内因性である。
本文脈中、部分的であるか全体であるかに拘らず、表現“クローン化DNA配列”は、その天然の位置から、それが再生されるであろうところの異なる部位まで、DNAのセグメントを移すための遺伝子操作において使用される標準的なクローニング手順によりクローン化されたDNA配列をいう。上記クローニング方法は、所望のDNAセグメントの切除及び単離、ベクター分子内へのDNAの片の挿入、及び上記DNAセグメントのマルチ・コピー又はクローンが複製されるであろうところの細胞内への組換えベクターの導入を含む。
本発明の“クローン化DNA配列”は、“DNA構築物”又は“単離DNA配列”とも言われる。
DNA配列は、ゲノム、cDNA、又は合成起源又はそれらのいずれかの組合せ物であることができる。
Escherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドpSJ1678中にクローン化されたDNA配列の一部及び／又は本発明のアナログDNA配列をコードするセルラーゼは、ジクチログロムス属のバクテリアの株、好ましくは、ジクチオグロムス、DSM 6262株であって、セルラーゼ、好ましくはエンドグルカナーゼ活性を有する酵素を生産するもの、又は以下にさらに説明する他の又は関連の生物から、クローン化されることができる。
あるいは、上記アナログ配列は、Escherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドから得られることができるDNA配列、例えばそのサブ−配列に基づき、そして／又は上記DNA配列によりコードされたセルラーゼの他のアミノ酸配列を生じないが、上記酵素の製造を意図される宿主生物のコドンの用い方に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列（すなわち、本発明のセルラーゼの変異体）を生じることができるヌクレオチド置換の導入により、構築されることができる。
ヌクレオチド置換を行うとき、アミノ酸変更は、好ましくは、僅かな性質を有するもの、すなわち、そのタンパク質の酵素活性又は折れ畳みに有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換；典型的には１〜約30アミノ酸の、小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシ−末端、例えば、アミノ末端メチオニン残基、約20〜25残基までの小さなリンカー・ペプチド、又は精製を容易にする小さな伸長、例えば、ポリ−ヒスチジン領域、抗原性エピトープ又は結合性ドメイン、伸長である。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小さなアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の群内にある。ヌクレオチド置換の一般的説明については、例えば、Ford et al.,（1991），Protein Expression and Purification 2，95-107を参照のこと。
上記のような置換がその分子の働きに対して決定的でない領域の外で行われることができ、そして未だ活性なポリペプチドをもたらすことができるということは、当業者にとって明らかであろう。本発明のクローン化されたDNA配列の活性に不可欠であり、そしてそれ故好ましくは置換を受けていないアミノ酸は、本分野において知られた手順、例えば、部位指定突然変異誘発又はアラニン走査（alanine-scanning）突然変異誘発に従って同定されることができる（例えば、Cunningham and Wells，（1989），Science 244，1081-1085を参照のこと。）。後者の技術においては、突然変異は、その分子内のそれぞれの残基において導入され、そして得られた突然変異体分子は、その分子の活性に決定的であるアミノ酸残基を同定するために生物学的（すなわち、セルロース分解）活性についてテストされる。基質−酵素相互作用部位も、核磁気共鳴分析、結晶学（crystallography）又は光親和性標識付けの如き技術により測定されるような、結晶構造の分析により測定されることができる（例えば、de Vos et al.,（1992），Science 255，306-312; Smith et al.,（1992），J.Mol.Biol．244，899-904; Wlodaver et al.,（1992），FEBS Lett．309，59-64を参照のこと）。
本発明のDNA構築物のDNA配列によりコードされるエンドグルカナーゼは、コードされた酵素の不可欠な部分として存在するセルロース結合性ドメイン（CBD）を含むことができ、又は他の起源からのCBDは、エンドヌクレアーゼ内に導されることができ、こうして酵素ハイブリッドが作製される。この文脈中、用語“セルロース−結合性ドメイン”は、Peter Tomme et al.“Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties”in“Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”，John N.Saddler and Michael H.Penner（Eds.），ACS Symposium Series，No.618，1996により定義されるように理解されることを意図される。この定義は、120のセルロース結合性ドメインを10のファミリー（Ｉ−Ｘ）に分類し、そしてCBDsがさまざまな酵素、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチル・エステラーゼ及びキチナーゼ（chitinases）中に在るということを証明している。CBDsは、藻類（algae）、例えば、紅藻（red algae）ポルフィラ・パープレア（Porphyra purpurea）内に、非加水分解性多糖類結合性タンパク質としても存在している（Tomme et al.，参照  前掲書中）。しかしながら、CBDsのほとんどは、セルラーゼ及びキシラナーゼ由来であり、CBDsは、タンパク質のＮ及びＣ末端に在り、又は内部にある。酵素ハイブリッドは、本分野において知られており（例えば、WO 90／00609及びWO 95／16782を参照のこと）、そしてエンドヌクレアーゼをコードするDNA配列に、リンカーにより又はなしで、ライゲートされたセルロース結合性ドメインをコードするDNAの断片を少なくとも含むDNA構築物を宿主細胞内に形質転換し、そしてその融合された遺伝子を発現するようにその宿主細胞を培養することにより製造される。酵素ハイブリッドは、以下の式：
CBD−MR−X
｛式中、CBDは、少なくともセルロース結合性ドメインに対応するアミノ酸配列のＮ−末端領域又はＣ−末端領域であり；MRは、中央領域（リンカー）であり、そして結合、又は好ましくは約２〜約100炭素原子、より好ましくは２〜40炭素原子を有する短い連結基であり；又は好ましくは、約２〜約100アミノ酸、より好ましくは２〜40アミノ酸であり；そしてＸは、本発明のDNA配列によりコードされたポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端領域である。｝により示されることができる。
本発明のDNA配列は、例えば、Sambrook et al.,（1989），Molecular Cloning: A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor，NYにより記載されるような、標準的な方法を使用して、Escherichia coli DSM 11201株からクローン化されることができる。
本発明のDNA配列は、以下の、
−着目のエンドグルカナーゼを製造することを期待された、いずれかの生物、例えば、ジクチログロムス（Dictyoglomus）からのDNAライブラリーを、好適なベクター内で、クローニングし、
−上記ベクターを用いて、好適な宿主細胞を形質転換させ、
−DNAライブラリー内のクローンによりコードされた着目のいずれかの酵素を発現させるために好適な条件下で上記宿主細胞を培養し、
−上記クローンにより製造される酵素のいずれかのセルロース分解活性を測定することにより陽性クローンをスクリーニングし、そして
−上記クローンから酵素コーディングDNAを単離する、ことを含むいずれかの一般的方法によりクローン化されることもできる。
あるいは、本発明のセルラーゼをコーディングするDNAは、周知の手順に従って、便利には、Escherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドから得られることができるDNA配列に基づき調製された合成オリゴヌクレオチド・プローブの使用により、好適な源、例えば、以下に述べる生物の中のいずれかからクローン化されることができる。
DNA配列のホモロジー
先に言及したDNA配列のホモロジーは、第２の配列から第１の配列の誘導を示す２つの配列の間の同一性の程度として測定される。ホモロジーは、本分野において知られたコンピューター・プログラム、例えば、GCGプログラム・パッケージにおいて提供されたGAP（Needleman，S.B．and Wunsch，C.D.,（1970），Journal of Molecular Biology，48，443-453）により、好適には測定されることができる。DNA配列比較のための以下の設定を用いたGAPを使用して：5.0のGAP創製ペナルティー及び0.3のGAP伸長ペナルティー、（部分的）DNA配列は、Escherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するDNA配列と、少なくとも60％の、好ましくは、少なくとも75％の、より好ましくは、少なくとも80％の、より好ましくは少なくとも90％の、より好ましくは少なくとも95％の、より好ましくは少なくとも97％の同一性の程度を示す。
ハイブリダイゼーション
上記のハイブリダイゼーションは、アナログ（部分的）DNA配列が、以下に詳しく説明するある程度の条件下でEscherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分に対応するオリゴヌクレオチド・プローブに、ハイブリダイズするということを示すことを意図される。
ヌクレオチド・プローブと相同DNA又はRNA配列の間のハイブリダイゼーションを測定するために好適な条件は、10分間５×SSC（標準生理食塩水クエン酸塩）中でハイブリダイズさせるためのDNA断片又はRNAを含有するフィルターの事前浸漬、及び５×SSC（Sambrook et al．1989）、５×Danhardt’s溶液（Sambrook et al．1989）、0.5％SDS及び100μｇ／mlの変性音波処理サケ精子DNA（Sambrook et al．1989）の溶液中での上記フィルターの事前ハイブリダイゼーション、その後の、約45℃で12時間の、ランダム−プライムされた（Feinberg，A.P．and Vogelstein，B.（1983）Anal.Biochem．132: 6-13）、32P-dCTP−標識付けされた（比活性＞１×109cpm／μｇ）プローブを含む同一溶液中でのハイブリダイゼーションを含む。次に、このフィルターを、好ましくは、55℃以下で、より好ましくは60℃以下で、より好ましくは65℃以下で、さらにより好ましくは70℃以下で、特に好ましくは75℃以下で、２×SSC、0.5％SDS中30分間、２回洗浄する。
上記条件下で上記オリゴヌクレオチド・プローブがハイブリダイズするところの分子を、Ｘ−線フィルムを使用して検出する。
アミノ酸配列に対するホモロジー
上記のポリペプチド・ホモロジーを、第２の配列からの第１の配列の誘導を示す２つの配列の間の同一性の程度として測定する。ホモロジーは、本分野において知られたコンピューター・プログラム、例えば、GCGプログラム・パッケージにおいて提供されたGAP（Needleman，S.B．and Wunsch，C.D.,（1970），Journal of Molecular Biology，48，443-453）により、好適には測定されることができる。ポリペプチド配列比較のための以下の設定を用いたGAPを使用して：3.0のGAP創製ペナルティー及び0.1のGAP伸長ペナルティー、アナログ（部分的）DNA配列によりコードされるポリペプチドは、Escherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分によりコードされるポリペプチドと、少なくとも60％の、好ましくは、少なくとも80％の、好ましくは、少なくとも85％の、より好ましくは少なくとも90％の、より好ましくは少なくとも95％の、より好ましくは少なくとも97％の同一性の程度を示す。
免疫学的交差反応性
免疫学的交差反応性の測定において使用されるべき抗体は、精製されたセルロース分解酵素の使用により製造されることができる。より特に、本発明のエンドグルカナーゼに対する抗血清は、N.Axelsen et al．in: A Manual of Quantitive Immunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，Chapter 23、又はA.Johnstone and R.Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982（より特にp.27-31）により記載される手順に従って、ウサギ（又は他のげっ歯類）を免疫化することにより作られることができる。精製された免疫グロブリンは、例えば、塩沈（（NH4）2SO4）、その後の透析及び例えば、DEAE-Sephadex上のイオン交換クロマトグラフィーにより、上記抗血清から得られることができる。タンパク質の免疫化学的特徴は、Outcherlony２重拡散分析（O.Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology（D.M.Weir，Ed.），Blackwell Scientific Publications，1967，pp.655-706）により、交差免疫電気泳動（N.Axelsen et al.，前掲、Chapter 3 and 4）により、又はロケット免疫電気泳動（N.Axelsen et al.，Chapter 2）により、行われることができる。
微生物源
以下に適用される分類法は、Maidak et al．1996（The Ribosomal Database Project.Nucl.Acids Res．24: 82-85）に従うものである。
特定の源との関係で本明細書中に使用するとき、用語“から得られる”又は“から得られることができる”とは、その酵素が、その特定の源により、又はその源からの遺伝子がその中に挿入されているところの細胞により、製造され、又は製造されることができるということを意味する。
現在、本発明のセルラーゼは、バクテリア、特にグラム陽性バクテリア、好ましくはクロストリジウム亜門、特にジクチログロムス（Dictyoglomus）属の株から得られることができると考えられている。
好ましい態様においては、本発明のセルラーゼは、ジクチオグロムス、DSM 6262株から得られる。
現在、本発明の酵素に相同な酵素をコードするDNA配列は、他のバクテリア株、特に、ジクチオグロムス属に属する株から得られることができると考えられている。
本発明のセルラーゼがそれから得られることができるところのジクチオグロムス種の株の単離は、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，DSM 6262から公に入手可能である。
さらに、本発明のエンドグルカナーゼをコードするDNA配列を含むプラスミドpSJ1678は、受託番号DSM 11201の下、1996年10月11日に、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Federal Republic of Germanyに、特許手続の目的のために、微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、本発明者らにより寄託された大腸菌（Escherichia coli）の株に形質転換されている。
組換え発現ベクター
本発明の酵素をコードする
本発明の酵素をコードするDNA構築物を含む組換えベクターは、便利には、組換えDNA手順に供されることができるいずれかのベクターであることができ、そしてベクターの選択は、しばしば、それがその中に導入されるであろう宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律複製性ベクター、すなわち、染色体外存在物として存在するベクターであってその複製が染色体の複製から独立しているもの、例えば、プラスミドであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとき、その宿主細胞のゲノム内に部分的に又は全体として組み込まれ、そしてそれがその中に組み込まれているところの染色体と共に複製されるものであることができる。
ベクターは、好ましくは、本発明の酵素をコードするDNA配列が、そのDNAの転写のために必要な追加のセグメントに作用可能な状態で連結されているような発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミド又はウイルスDNAから得られ、又は両方の要素を含むこともできる。用語“作用可能な状態で連結された”とは、上記セグメントが、それらの意図された目的をもって協力して働くように、例えば、転写がプロモーター内で開始され、そしてその酵素をコードするDNA配列を通って進行するように、それらのセグメントが配置されていることを示す。
プロモーターは、選ばれた宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であることができ、そしてその宿主細胞にとって同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子から得られることができる。
バクテリア宿主細胞内での使用のために好適なプロモーターの例は、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のマルトース生成（maltogenic）アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）アルファ−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）アルファ−アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はラムダ・ファージＰR又はＰLプロモーター又は大腸菌（E．coli）lac，trp又はtacプロモーターを含む。
本発明の酵素をコードするDNA配列は、必要により、好適なターミネーターに作用可能な状態で接続されることもできる。
本発明の組換えベクターは、それらベクターが着目の宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列をさらに含むことができる。
ベクターは、選択マーカー、例えば、その生成物が宿主における欠陥を補足するような遺伝子、又はカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラマイシン、スペクチノマイシンその他のような抗生物質に対する耐性又は重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含むこともできる。
本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に向けるために、（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）分泌シグナル配列が組換えベクター内に提供されることができる。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠内で酵素をコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般に、その酵素をコードするDNA配列に対し５′に位置する。分泌シグナル配列は、通常、酵素と会合されるもの又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであることができる。
本酵素をコードするDNA配列、プロモーター、そして場合により、ターミネーター、及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲートするために使用され、又は好適なPCR増幅スキームにより上記配列をアセンブルするために、そして複製又は組み込みのために必要な情報を含む好適なベクター内にそれらを挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al.，引用書中、を参照のこと。）。
宿主細胞
宿主細胞内に導入された本酵素をコードするDNA配列は、着目の宿主に同種又は異種のいずれかであることができる。天然の宿主細胞にとって同種である、すなわち、天然において宿主細胞により製造される場合、それは、典型的には、その天然の環境におけるよりも、他のプロモーター配列に、又は可能な場合、他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に、作用可能な状態で接続されるであろう。用語“同種（homologous）”は、着目の宿主生物に対し生来の酵素をコードするDNA配列を含むことを意図される。用語“異種（heterologous）”は、天然の宿主細胞により発現されないDNA配列を含むことを意図される。従って、DNA配列は、他の生物からのものであることができ、又は合成配列であることができる。
本発明のDNA構築物又は組換えベクターがその中に導入されるところの宿主細胞は、本酵素を製造することができるいずれかの細胞であることができ、バクテリア、酵母、菌類（fungi）及び高等真核細胞を含む。好ましい宿主細胞は、原核、古細菌（archaeal）及び糸状菌の細胞を含む。
培養の間、本発明の酵素を製造することができる菌類宿主細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、フザリウム（Fusarium）及びトリコデルマ（Trichoderma）に属する株、より特にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、フザリウム・グラミネララム（Fusarium graminerarum）及びトリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）種に属する株である。
培養の間、本発明の酵素を製造することができるバクテリア宿主細胞の例は、グラム陽性バクテリア、例えば、バチルスの株、例えば、バチルス・サブチリス（B．subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）、バチルス・レンタス（B．lentus）、バチルス・ブレビス（B．brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（B．stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（B．alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B．amyloliquefaciens）、バチルス・リクエファシエンス（B．liquefaciens）、バチルス・コアギュランス（B．coagulans）、バチルス・サーキュランス（B．circulans）、バチルス・ラウタス（B．lautus）、バチルス・メガセリウム（B．megatherium）又はバチルス・チューリンゲンシス（B．thuringiensis）の株、又はストレプトミセス（Streptomyces）の株、例えば、ストレプトミセス・リビダンス（S．lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（S．murinus）の株、又はグラム陰性バクテリア、例えば、大腸菌（Escherichia coli）である。上記バクテリアの形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られたやり方でコンピテント細胞を使用することにより、行われることができる（Sambrook et al.，前掲  参照）。
バクテリア、例えば大腸菌（E．coli）内で酵素を発現させるとき、その酵素は、細胞質内に、典型的には（封入体として知られる）不溶性顆粒として保持されることができ、又はバクテリア分泌配列により細胞周辺腔に向けられることができる。前者の場合には、細胞が溶解され、そして顆粒が回収され、そして変性され、その後、その酵素は、変性剤を希釈することにより再び折り畳まれる。後者の場合には、酵素は、細胞周辺腔の内容物を放出させるために、例えば、音波処理又は浸透圧ショックにより、細胞を破壊し、そしてその酵素を回収することにより、細胞周辺腔から回収されることができる。
グラム陽性バクテリア、例えば、バチルス又はストレプトミセス株内で酵素を発現させるとき、その酵素は、細胞質内に保持されることができ、又はバクテリア分泌配列による細胞外培地に向けられることができる。後者の場合には、酵素は、以下に記載するように、培地から回収されることができる。
セルロース分解酵素の製法
本発明は、本発明に係る単離酵素の製法であって、上記酵素をコードするDNA配列で形質転換されている好適な宿主細胞を、上記酵素の製造を許容する条件下で培養し、そして得られた酵素を上記培地から回収する、前記製法を提供する。
本明細書中に定義するように、単離されたポリペプチド（例えば、酵素）は、他のポリペプチドを本質的に含まない、例えば、SDS-PAGEにより測定されるとき、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％の純度、さらにより好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の純度、そしてさらに最も好ましくは約95％純度であるポリペプチドである。
用語“単離されたポリペプチド”は、“精製されたポリペプチド”とも言われることができる。
上記酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターが異種宿主細胞内に形質転換されるとき、本発明の酵素の異種組換え製造を可能にすることができる。
それにより、相同不純物を含まないことを特徴とする、高く精製された又は単一成分のセルロース分解組成物を作ることができる。
上記文脈中、本発明の酵素がそれから元々得られるところの同種細胞から生じるいずれかの不純物（例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。
本発明においては、同種宿主細胞は、ジクチオグロムス種（Dictyoglomus sp.）の株であることができる。
形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、着目の宿主細胞を培養するために好適ないずれかの慣用の培地であることができる。発現されたセルロース分解酵素は便利には上記培地中に分泌されることができ、そして、遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムにより培地のタンパク質成分を沈殿させ、その後、クロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィーその他を含む、周知の手順により、培地から回収されることができる。
酵素製剤
そしてさらなる側面においては、本発明は、上記のようなセルロース分解活性を示す酵素を含む酵素製剤に関する。
本発明の酵素製剤は、本発明のセルラーゼに加えて、１以上の他の酵素タイプ、例えば、ヘミ−セルラーゼ、例えば、キシラナーゼ、及びマンナーゼ、他のセルラーゼ又はエンド−グルカナーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、又はアミラーゼを含む。
本酵素製剤は、本分野において知られた方法に従って製造されることができ、そして液体又は乾燥組成物の形態にあることができる。例えば、本酵素組成物は、粒状物又は微粒状物（microgranulate）の形態にあることができる。本組成物中に含まれるべき酵素は、本分野に知られた方法に従って安定化されることができる。
熱安定性セルラーゼは、多くの異なる産業及び用途において潜在的な用途をもつ。本発明の酵素製剤の好ましい用途の例を以下に与える。本発明の酵素製剤の投与量、及び本製剤が使用されるところの他の条件は、本分野に知られた方法に基づいて決定されることができる。
本発明に係る酵素製剤は、以下の目的の中の少なくとも１にとって有用であることができる。
用途
繊維産業においては、セルラーゼは、変更された特性、例えば、減少されたピリング（pilling）傾向、毛羽（fuzz）の除去、より柔軟な布ふく（fabric）、より良好な手ざわり又は見た目の効果をもつ布ふくをもたらす繊維の表面処理を得るために、綿その他のセルロース性材料の処理のために使用される。特に、セルラーゼは、デニムの“ストーン−ウォッシュ”外観を作り出すために使用される。高温におけるセルラーゼの使用は、デニムと非デニムの、綿／セルロース布ふくの両者の新たな外観を創り出すことを可能にする。熱安定性セルラーゼは、以前には不可能であった布ふくの高温処理に含まれることができ、新たな外観を創り出す可能性を与える80℃以上の、又はひじょうに低い液化を用いた蒸気条件下でのセルラーゼ洗浄が可能である。
工業的洗浄プロセスにおける熱安定性セルラーゼの使用は、除去されるべき不所望の材料がセルロースの問題に基づくとき、より容易な洗浄プロセスを作ることを可能にする。例は、食品／飼料産業における限外濾過膜、パイプその他の洗浄である。
セルロース充填物を含む熱押出しされたプラスチック及びポリマー材料中の熱安定性セルラーゼの取り込みは、天然の上記材料のより高い分解性をもたらすであろう。
リグノセルロース材料は、市の廃棄物においてひじょうに優勢である紙及び農林業廃棄物の大きな部分を構造する。この廃棄物は、典型的には焼却されるが、これは、エネルギーの点で、資源の大いなる無駄である。例えば、燃料として使用するためのアルコールを作り出すために発酵されることができる糖に、上記バイオマスを変換させるための有効かつ経済的なプロセスの開発する研究に多大な仕事が割り当てられてきた。糖へのリグノセルロースの変換のための提案されたプロセスは、セルラーゼの使用を含むが、ひじょうに高い投与量が必要であり、このことが、経済的な点から工業的に大きな規模において、上記プロセスを非現実的なものにしている。液化特性をもつ熱安定性セルラーゼの使用は、このような生物変換プロセスをより現実的なものにする。高温における処理は、多くの植物材料中での細胞壁構造に孔を開け、そしてそのセルロースが、酵素の攻撃のためにより接近することができるようにする。
異なる種類の穀粒からのアルコールの工業的生産においては、伝統的なプロセスは、80〜100℃付近の温度におけるアルファ・アミラーゼによる液化を含む。この段階におけるセルラーゼの含有は、発酵可能な糖の収率を増加させるであろう。このセルロースの事前液化は、事前液化なしよりも高い加水分解率のために、以下のプロセスにおける伝統的なセルラーゼの含有を現実的なものにもするであろう。
飼料生産のための、穀粒：ライ麦、大麦、メイズ等の事前消化は、動物内での飼料の消化率を増加させるための、熱安定性セルラーゼの他の潜在的な使用である。
インスタント・コーヒーの製造のためのコーヒー抽出は、一連のパーコレーション・カラム内で85〜105℃の温度において行われる。水は、最もよく抽出されたセルから新鮮なコーヒーでちょうど満たされたセルまで逆行する。新鮮なコーヒーの入ったセルのための運転温度は、約100℃である。この点における好熱性セルラーゼの含有は、カラムの能力を増加させるであろう。なぜなら、細胞壁構造に孔が開くとき、可溶性材料がより容易に放出されるからである。
天然植物源からの油又は芳香／香味の抽出のための他の伝統的な高温プロセスにおけるセルラーゼの含有は、コーヒー抽出に関するものと同じ方法で能力又は収率を増加させる。例は、水性高温プロセスであるパーム油又はパーム核油の抽出である。
材料及び方法
寄託された生物：
ジクチオグロムス種DSM 6262（Dictyoglomus sp．DSM 6262）は、本発明のセルラーゼ・コーディングDNA配列を含む。
クローニング・ベクターpSJ1678内に、本発明のセルロース分解酵素をコードするDNA配列を含むプラスミドを含有するEscherichia coli DSM 11201。
他の株：
0004327255.tif 000003
アルファ−アセトラクテート・デカルボキシラーゼをコードするもの、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）からのエキソエンザイム。J.Bacteriol.，172，4315-4321）を、供給者により記載されたように、BIO-RADからのGene PulserTMエレクトロポレーターを用いるエレクトロポレーションのために調製し、そしてそれにより形質転換した。
プラスミド：（引用により本明細書中に取り込む）WO 94／19454として公表された国際出願中に開示された。pSJ1678。
一般的分子生物学的方法：
DNA操作及び形質転換を、分子生物学の標準的な方法（Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning: A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY; Ausubel，F.M．et al.（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，1995; Harwood，C.R.，and Cutting，S.M.（eds.）“Molecular Biological Methods for Bacillus”．John Wiley and Sons，1990）を使用して行われた。
DNA操作のための酵素を、供給者の指示書に従って使用した。
本発明のセルロース分解酵素をコードするDNA配列の単離
本発明のエンドグルカナーゼをコードするDNA配列を、本分野において知られた方法（Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning: A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY）によるプラスミドDNAの抽出により、寄託された生物E．coli，DSM 11201から得ることができる。
エンドグルカナーゼ遺伝子のクローニング
ゲノムDNA調製：
ジクチオグロムス種の株DSM 6262を、以下に記載するような培地上で70℃で２日間、１ｌのガラス・フラスコ内で培養した。
株DSM 6262のための厳しい嫌気培地の組成：
1.0ｇ NH4Cl、0.1ｇ NaCl、0.1ｇ MgCl2、0.05ｇ CaCl2、0.4ｇ  K2HPO4・3H2O、0.75ｇ酵母エキス、4.0ｇ Beechキシラン（Lenzing）、0.5mgレザズリン（Resazurin）、1.0mlの微量金属、1.0mlビタミン溶液、3.0ｇ NaHCO3、１ｌまでのH2O。
微量金属溶液：
2.0ｇ FeCl2・4H2O、0.05ｇ ZnCl2、0.05ｇ MnCl2、0.05ｇ AlCl3、0.05ｇ NiCl2、0.1ｇ Na2SeO3・5H2O、0.05ｇ H3BO3、0.03ｇ CuCl2、0.05ｇ （NH4）6Mo7O24・4H2O、0.05ｇ CoCl2・6H2O、0.5ｇ EDTA、1.0ml濃HCl、１ｌまでの水。
Ｎ2／CO2（４：１）の下、洗浄し、そしてボトル当り10mlを小分けする。Ｏ2−不透過性のゴム栓で栓をし、そして20分間140℃でオートクレーブにかけた。フィルター滅菌された嫌気溶液からの0.1ml DSMビタミン溶液#141及び0.2mlの、オートクレーブされた保存溶液からの2.5ｇ／ｌ  Na2S・9H2Oを、滅菌嫌気シリンジ技術による接種直前に、添加する。
細胞を収穫し、そしてゲノムDNAを、Pitcher et al.により記載された方法（Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.（1989），Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate.Lett.Appl.Microbiol．8: 151-156）により単離した。
ゲノム・ライブラリー構築物：
ゲノムDNAを、制限酵素Sau3Aで部分消化し、そして0.7％アガロース・ゲル上の電気泳動によりサイズ分画した。２〜７kbのサイズの断片を、DEAE−セルロース紙上の電気泳動により単離した（Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P.（1981）A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels.Anal.Biochem.，112，295-298）。
単離されたDNA断片を、BamHＩ消化pSJ1678プラスミドDNAにライゲートし、そしてこのライゲーション混合物をE．coli SJ2を形質転換するために使用した。
細胞を、0.1％CMC（ナトリウム−カルボキシ−メチル−セルロース、Aqualon，France）及び９μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上にプレートして、500〜1000c.f.u.／プレートを与え、そして37℃で一夜インキュベートした。
活性による陽性クローンの同定：
インキュベーション後、上記クローンを、１セットのLB＋CAM寒天プレート上にレプリカ・プレートし、そして次に約20時間37℃でさらにインキュベートした。適当なバッファーpH７に0.1％CMC、１％HSBアガロースを含む重層を、上記レプリカ・プレート上に注ぎ、そして65℃で約20時間インキュベートした。エンドグルカナーゼの陽性クローンを、Congo Red（SIGMA，USA）の0.1％水性溶液による染色、その後の２Ｍ NaCl中での洗浄により同定した。エンドグルカナーゼ陽性クローンが存在した位置に、黄色っぽい光輪（halos）が現れた。
酵素−陽性コロニーからの細胞を、寒天上での単一コロニーの単離のために広げ、そして酵素産生単一コロニーを、同定されたエンドグルカナーゼ産生コロニーの各々について選択した。
陽性コロニーの特徴付け：
再塗抹プレートから、エンドグルカナーゼ陽性コロニーを、単一コロニーとして得て、そしてプラスミドを抽出した。表現型を、E．coli SJ2の形質転換により確認し、そしてプラスミドを制限消化により特徴付けた。
培地
TY及びLB寒天（Ausubel，F.M．et al.（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”．John Wiley and Sons，1995中に記載されたもの）。
ハイブリダイゼーション条件（本発明のDNA構築物の特性ii）の評価において使用されるべきもの）：
ヌクレオチド・プローブと相同DNA又はRNA配列の間のハイブリダイゼーションを測定するために好適な条件は、10分間、５×SSC（標準生理食塩水クエン酸塩）中でのハイブリダイズさせるための、DNA断片又はRNAを含有するフィルターの事前浸潤、及び５×SSC（Sambrook et al．1989）、５×Denhardt’s溶液（Sambrook et al．1989）、0.5％SDS及び100μｇ／mlの変性音波処理サケ精子DNA（Sambrook et al．1989）の溶液中での上記フィルターの事前ハイブリダイゼーション、その後の約４５℃での12時間のランダム−プライムされ（Feinberg，A.P．and Vogelstein，B.（1983）Anal.Biochem．132: 6-13）、そして32P-dCTP−標識された（比活性＞１×109cpm／μｇ）プローブを含有する同一溶液中でのハイブリダイゼーションを含む。次に、上記フィルターを、好ましくは、55℃以下で、より好ましくは60℃以下で、より好ましくは65℃以下で、さらにより好ましくは70℃以下で、特に75℃以下で、２×SSC、0.5％SDS中で30分間２回洗浄する。
上記ハイブリダイゼーション中で使用すべきヌクレオチド・プローブは、Escherichia coli DSM 11201内に存在するプラスミドから得られることができるDNA配列のエンドグルカナーゼ・コーディング部分である。
免疫学的交差反応性：
免疫学的交差反応性の測定において使用されるべき抗体は、精製されたエンドグルカナーゼの使用により調製されることができる。より特に、本発明のエンドグルカナーゼに対する抗血清を、N.Axelsen et al．in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Black-well Scientific Publications，1973，Chapter 23、又はA.Johnstone and R.Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982（より特にpp.27-31）により記載された手順に従って、ウサギ（又は他のげっ歯類）を免疫化することにより、作ることができる。精製された免疫グロブリンを、例えば、塩沈（（NH4）2SO4）、その後の、透析及び、例えばDEAE-Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、上記抗血清から得ることができる。タンパク質の免疫化学的特徴付けを、オクテルロニー２重拡散分析（O.Ouchterlory in: Handbook of Experimental Immunology（D.M.Weir，Ed.），Blackwell Scientific Publications，1967，pp.655-706）、交差免疫電気泳動（N.Axelsen et al.，前掲、３章と４章）、又はロケット免疫電気泳動（N.Axelsen et al.，２章）のいずれかにより、行うことができる。
以下の非限定的実施例は、本発明を説明する。
実施例１
ジクチオグロムス種DSM 6262からのエンドグルカナーゼのクローニング及び発現
ジクチオグロムス種DSM 6262からのライブラリーを、材料及び方法中に記載したように、E．coli内で構築し、そしてスクリーニングした。単離された１の陽性形質転換体は、本発明のセルロース分解酵素をコードするDNA配列を含むプラスミドpSJ1678を含有するDSM 11201であった。
この単離されたE．coliクローンを、0.1％  AZCLベータ−グルカン、AZCLキシログルカン、AZCL HEセルロース、AZCLキシラン、AZCLクルドラン（curdlan）又はAZCLガラクトマンナンを含有するLB＋CAM寒天プレート上で同時にテストした。上記プレートを、約48時間37℃でインキュベートし、その後65℃でのインキュベーションを行った。酵素活性を、上記コロニーの周囲の青色の光輪により同定した。上記クローンは、AZCLベータ−グルカン、AZCLキシログルカン、及びAZCL HEセルロース上で陽性で存在した。
E．coliクローンDSM 11201からの酵素溶液の調製
DSM 11201を、以下の組成（１リッター当り）：トリプトン32ｇ、酵母エキス20ｇ、NaCl ５ｇ、CMC ５ｇ、pH 7.2〜7.3（１Ｍ NaOHで調整）をもつ200mlのSuperブロス培地を含む振とうフラスコ内のプレカルチャーとして接種した。121℃で20分間オートクレーブにかけた。滅菌後、６mg／mlの最終濃度までクロラムフェニコールを添加した。
振とうフラスコを、16時間37℃、280rpmで回転振とう機上でインキュベートした。１mlの上記培養物を、200mlのSuperブロス培地を含む100の振とうフラスコに接種し、そして16〜18時間280rpm、37℃でインキュベートした。20リッターのE．coli培養物を3000rpmで遠心分離し、そして800mlの50mM Tris−マレイン酸塩バッファー中にそのペレットを再懸濁させた。上記細胞を、Rannie高圧実験室ホモジェナイザーを用いて800barで破砕した。１時間、10,000rpmで遠心分離し、そして清澄な上清を回収した。
実施例２
ジクチオグロムス種DSM 6262からクローン化されたエンドグルカナーゼの精製及び特徴付け
600mlのE．coli細胞抽出物を５分間70℃で加熱処理し、その後20分間5000rpmで遠心分離した。上清を、WhatmanフィルターＤを通して濾過し、そして全部で200mlを、１ml当り11CMCUの活性をもって得た（CMCUの測定については、以下を見よ）。
この溶液を、0.05Ｍ酢酸ナトリウム・バッファーpH 5.0で平衡化したS-Sepharoseカラム上に通過させた。結合したエンドグルカナーゼを、0.5Ｍ塩化ナトリウムで溶離させ、そして全部で300mlの容量を、２CMCU／mlをもって得た。この溶液をpH 9.0に調整し、そして10kDのカット・オフをもつ膜を用いたAmicon限外濾過セル上で20mMエタノールアミン・バッファーpH 9.0で平衡化した。その後、導電率が約250マイクロＳ／cmのとき、上記溶液を、同一バッファーで平衡化されたQ-Sepharoseカラムに適用する。エンドグルカナーゼは、結合するであろうし、そして塩化ナトリウム・グラジエントを使用して溶離されることができる。最初の実験におけるかなり高い導電率のために、我々は、65CMCU／mlをもつほんの２mlを得た。
最終的に、上記溶液を濃縮し、そして0.1Ｍ酢酸ナトリウムpH 6.0中のサイズ・カラムSuperdex 200に適用し、そして純粋なエンドグルカナーゼを、22mlの容量において溶出し、これを6kDのカット・オフをもつ膜を用いたAmicon限外濾過セルを使用して濃縮した。１ml当り40CMCUをもつ１mlを得た。このサンプルは、30kDのMW及び6.5のpIをもつSDS-PAGEにおける単一バンドを示した。このタンパク質をエレクトロブロットし、そして、Applied Biosystems model 473Aシーケンサーを使用したＮ末端配列決定に供した。このタンパク質シーケンサーを、その製造者の指示書に従って走らせ、そして以下の配列を得た：
0004327255.tif 000004
純粋なエンドグルカナーゼは、ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−セロビオシド（Sigma）、CMC、HEセルロース（Megazyme）、及び酸膨潤セルロースに対する活性を有する。
１CMCU単位は、標準条件下、１分当り1mmolのグルコースに等価な量を放出する酵素量として定義される。
標準条件：70℃におけるCMCアッセイ
上記酵素を、0.1Ｍバルビツール酸ナトリウム・バッファーpH 8.5中の0.75％CMC（Herculesからの７Ｌ）溶液中20分間インキュベートする。インキュベーション後、還元性末端基における増加を、PHBAH（SIGMA H-988253H7704（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）））を使用して測定し、そしてグルコース標準を用いて、１分当りのグルコース等価末端基の形成を計算する。（Lever，M.（1972）A new reaction for colometric determination of carbohydrates．Anal.Biochem．vol 47，page 273-279）。
エンドグルカナーゼは、70℃及びpH 8.5で137CMCU／mgタンパク質を示した（Ａ280当り50CMCU）。
エンドグルカナーゼの温度活性特性
エンドグルカナーゼを、異なる温度においてpH 8.5でCMCUアッセイにおいてインキュベートし、そして20分間のインキュベーション後の活性を上記のように測定した。90℃を超えるインキュベーションは行わなかった。この温度で得られた還元糖の量は最高であり、そしてより低い温度における比活性の計算のために使用した。
温度          比活性
90℃           100％
80℃            76％
70℃            40％
60℃            26％
50℃            14％
40℃             7％
pH活性特性
エンドグルカナーゼを、4.5〜11のpH間隔において異なるバッファーを使用して70℃におけるCMCUアッセイにおいてインキュベートし、そして20分間のインキュベーション後の活性を上記のように測定した。
バッファー：pH 4.5，5.0及び5.5; 0.1Ｍ  Na−アセテート
pH 6.0; 0.1Ｍ Na-MES
pH6.5，7.0及び7.5; 0.1Ｍ Na-MOPS
pH 8.0及び8.5; 0.1Ｍ EPPS
pH 9.0，9.5，10.0，10.5及び11.0; 0.1Ｍ  Na−グリシン。
50％を超える比活性を、pH 5.5〜11の間隔において得た。
ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−セロビオシド・アッセイ
PNPU単位は、標準条件下、ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−セロビオシド（Sigma）から１分当り１ミリモルのｐ−ニトロフェノールを放出する酵素量として定義される。
方法：生成物ｐ−ニトロフェノールの定常状態の速度式の、直接的検出。それは黄色を与え、405nmで検出される。この活性は、吸光度の増加として計測され、その曲線の直線部分が、勾配（AU／秒）を決定するために使用される。この活性は、ホスフェート・バッファーpH 7.5中ｐ−ニトロフェノールの吸光度を使用して計算される：１cmキュベット内の吸光度、405nmにおいて0.018（420nmにおいて0.014）をもつ１mM。
アッセイ条件：
0.1Ｍ  Na−ホスフェート・バッファー、pH 7.5中10mM  ｐ−NP−ベータ−Ｄ−セロビオシド475ml
25mlの酵素溶液
手順：
上記計測を、0.75mlキュベット、１cm幅内で70℃にサーモスタットで制御されたHP 8452A Diode Array分光光度計上で行う。
405nmにおける吸光度を、各々20秒間の計測を用いて300秒で計測する。
エンドグルカナーゼは、70℃及びpH 7.5においてＡ280当り170PNPUを示した。
酸膨潤セルロース
PASC保存溶液を、氷冷アセトン及びリン酸を使用して以下の方法で調製した。５グラムのセルロース（Avicel▲Ｒ▼）を水で水和させ、そして150mlの氷冷85％オルト−リン酸を添加した。この混合物を、１時間ゆっくりと撹拌しながら氷浴内に入れた。次に、100mlの氷冷アセトンを撹拌しながら添加した。このスラリーを、パイレックス焼結ディスク番号３を備えたブフナー・フィルターに移し、そして次に100mlの氷冷アセトンで３回洗浄し、そして各洗浄後吸引して、できるだけ乾燥させた。このPASCを脱イオン水と混合して、300mlの全容量とし、（Ultra Turraxホモジェナイザーを使用して）均質までブレンドし、そして（１ケ月まで）冷蔵庫内に保存した。
バッファーによる基質の平衡化：20グラムのリン酸膨潤セルロースPASC保存溶液を、5000rpmで20分間遠心分離し、上清を、移し；沈殿を30mlのバッファー中に再懸濁させ、そして5000rpmで20分間遠心分離し、そして上清を移し、そして沈殿をバッファー中に再懸濁させて、全部で60ｇにし、これは、５ｇセルロース／リッターの基質濃度に相当する。
pH 8.5の測定のためのバッファー：0.1Ｍバルビタール。
手順：
１．酵素サンプルの希釈
酵素溶液は、基質と同じバッファー中で希釈する。
２．酵素反応
バッファー溶液中の基質を、80℃で５分間、事前に加熱する（２ml）。
次に、酵素溶液（希釈されたもの）0.5mlを、添加し、そして５秒間混合する。酵素ブランクを、酵素溶液前に停止試薬を添加することにより得る。80℃で20分間インキュベートする。この反応を、0.5mlの２％NaOH溶液を添加し、そして５秒間混合することにより停止させる。
上記サンプルを、5000rpmで20分間遠心分離する。１mlの上清を、0.5mlのPHBAH試薬と混合し、そして10分間沸騰させる。上記試験管を、氷水浴内で冷却する。
３．還元末端基の測定
410nmにおける吸光度を、分光光度計を使用して計測する。標準的なグルコース曲線を、同一バッファー中、５，10，15、及び25mg／ｌのグルコース濃度を使用して、そして沸騰前にPHBAH試薬を添加することにより得た。還元グルコース当量の放出を、この標準曲線を使用して計算する。
ｋcatとＫmの測定：
酸膨潤セルロースに対する触媒活性を、異なる基質濃度を用いたpH 8.5及び80℃における標準条件下上記のようなアッセイを使用して測定した。速度定数を、ミカエリス−メンテン速度式コンピューター・プログラムGrafitを使用して計算した。エンドグルカナーゼのアミノ酸組成に基づき、そのモル吸光係数は、85630と測定された。従って、以下のデータを得た：
ｋcat＝77／秒
Ｋm＝2.5グラム  酸膨潤セルロース／リッター
実施例３
バチルス・サブチリスにおける熱安定性エンドグルカナーゼの発現
ジクチログロムス種DSM 6262からクローン化された熱安定性エンドグルカナーゼをコードする発現プラスミドを宿す、以下に記載するバチルス・サブチリス株は、受託番号DSM 11903の下、1997年12月16日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Federal Republic of Germanyに特許手続を目的として、微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って本発明らにより寄託された。
材料：
株
0004327255.tif 000005
製造者により推奨されるようにBio-Rad GenePulserTMを使用して調製及び形質転換されたエレクトロコンピテント細胞。
B．subtilis A164。この株は、B．subtilis ATCC 6051aの誘導体であり、胞子形成欠陥であり、かつ、破壊されたapr及びnpr遺伝子をもつ。上記破壊は、本質的に、（Eds．A.L.Sonenshein，J.A.Hoch and Richard Losick（1993）Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria，American Society for microbiology，p.618）中に記載されたように行われた。コンピテント細胞を、Yasbin，R.E.，Wilson，G.A．and Young，F.E.（1975）Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells．J.Bacteriol，121: 296-304により記載されたように、調製し、そして形質転換させた。
プラスミド
pUB110：（McKenzie，T.，Hoshiro，T.，Tanaka，T．and Sueoka，N．The nucleotide sequence of pUB110: some salient features in relation to replication and its regulation Plasmid 15（2），93-103（1986））及び（McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T．and Sueoka，N．Correction．A revision of the nucleotide sequence and functional map of pUB110 Plasmid 17（1），83-85（1987））中に記載されたプラスミド。
pMUTIN-4-MCS：プラスミドは、Laboratoire de Genetique Microbienne，Institut National de la Recherche Agronomique，78352 Jouy en Josas-CEDEX，Franceから得られることができる。
培地
LB寒天（Ausubel，F.M．et al.（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”．John Wiley and Sons，1995中に記載されたもの）。
LBPGは、0.5％グルコース及び0.05Ｍリン酸カリウム、pH 7.0を補ったLB寒天である。
AZCL-HE−セルロースを１％までLBPG−寒天に添加する。AZCL-HE−セルロースは、Megazyme，Australiaからのものである。
BPX培地は、WO 91／09129として公表された国際公開中に記載されている。
方法：
上記プラスミドを構築し、そしてそのクローンを本質的に以下のように確立した：
pMUTIN4MCSは、ハイブリッド・プロモーターSPAC（Yansura et al．（1984）Use of E．coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis，PNAS，Vol 81，pp.439-443）及びそのプロモーターの転写制御下のlacZ遺伝子を有するE．coliプラスミドである。さらに、上記プラスミドは、バチルス種のpenPプロモーターの制御下にlacI遺伝子を含む。従って、B．subtilis内に在るとき、lacIは発現され、そしてSPACプロモーター−オペレーターのオペレーターに結合するであろうし、そしてこれは、下流の配列の転写を阻害するであろう。上記プロモーターは、Yansura et al.中のものと同じである、しかしながら、そのオペレーターは、完全なパリンドロームに修飾されていた。そのプロモーター−オペレーター領域の直下流のHindIII部位は、他の遺伝子、すなわち、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子の挿入により、lacZ遺伝子を破壊することを可能にした。このようにして、SPACプロモーターオペレーターの制御下のエンドグルカナーゼの発現を放置した。
E．coliプラスミドpMUTIN4MCS内では、リボゾーム結合部位（RBS）と、クローニング目的のためのSacII部位をもつシグナル・ペプチドが、HindIII−SacＩ断片としてクローン化された。こうして、以下のリボソーム結合部位とシグナル・ペプチド・コーディングDNA配列を確立した：
HindIII
0004327255.tif 000006
イタリック体で書かれたものは、タンパク質の成熟部分をコードする他のDNA配列に融合されたとき、それを、バチルス種の細胞の外部に向けるであろうバチルス種のシグナル・ペプチドをコードするDNA配列である。
上記の配列は、pMUTIN4MCSのHindIII部位、その直後のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）RBS、及び人工的に導入されたSacII部位で終るバチルス種のシグナル・ペプチドをコードするDNA配列をコードし、その後、NotＩ及びSacＩ制限部位が続く。このプラスミドは、エレクトロポレーション、及び100μｇ／mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上でのプレーティング、及び一夜37℃での細胞のインキュベーションによりE．coli SJ2内で確立された。得られたプラスミドを、pMUTIN4−シグナルSacII−NotＩと命名した。
熱安定性エンドグルカナーゼ遺伝子を、SacII−EagＩ消化PCR断片としてクローン化した。
このPCR断片を、Boehringer MannheimからHiFi Expand PCRキットを使用して得て、そして反応を、製造者により推奨されるように行った。このDNA断片を、プラスミドpDSM11201から増幅した。熱安定性エンドグルカナーゼ遺伝子は、ジクチオグロムス種DSM 6262から元々クローン化されたものであり、そして上記エンドグルカナーゼ遺伝子をもつプラスミドを宿すE．coliクローン（DSM 11201）として寄託された。使用した２つのPCRプライマーは、以下のものであった：
0004327255.tif 000007
上記PCR断片とpMUTIN4−シグナルSacII−NotＩを、SacII−EagＩで消化し、一緒にライゲートし、そしてエレクトロポレーション、及び100μｇ／mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上でのプレーティング、及び一夜37℃での細胞のインキュベーションによりE．coli SJ2を形質転換させるために使用した。SJ2内で得られたプラスミドをpMB447Aと命名した。
（SacII−Not／EagＩ部位内で）上記のものからのシグナル・ペプチドと融合して、上記エンドグルカナーゼ遺伝子をクローン化した後、以下のオープン・リーディング・フレーム：
0004327255.tif 000008
と誘導タンパク質：
0004327255.tif 000009
が、SPACプロモーター−オペレーターの転写制御下で得られた。
バチルス・サブチリス内でpMB447Aを増幅することができるように、このE．coliプラスミドを、pUB110（B．subtilis内で増幅することができるプラスミド）の誘導体に融合した：pUB110のNciＩ部位内に、SacＩとNotＩ部位が、ポリリンカーを使用して導入され、そして、得られた挿入物は、以下の配列をもっていた：
0004327255.tif 000010
２つのNci部位は下線を引かれ、これらの間には、SacＩとEagＩ（NotＩ）部位が在る。
このプラスミドを、次にSacＩ及びEagＩ消化し、そしてSacＩEagＩ消化されたpMB447Aにライゲートし、そしてこのライゲーションを、バチルス・サブチリスA164を形質転換させるために使用した。クローンを樹立し、そしてLBPG-10 Kana AZCL-HE−セルロース・プレート上で一夜培養した。翌日、上記プレートを５時間70℃でインキュベートし、そして青色の光輪の出現は、熱安定性エンドグルカナーゼの陽性発現を示した。
クローンMB505（DSM 11903）から単離されたプラスミドDNAを分析した後、そのプラスミドが組換えを経験しており、そして得られたプラスミドが12.5kbの予想されたプラスミド・サイズよりも小さかったということが明らかになった。従って、このプラスミドは、E．coliプラスミドpMUTIN4シグナルSacII−NotＩの大部分を失っており、凡そ5.5kbのサイズのプラスミドをもたらしたようであった。
得られたプラスミドは、以下の本質的な特徴をもっていた：
DSM 11903のプラスミド上にコードされたエンドグルカナーゼは、IPTGを添加する必要性を伴わずに陽性に発現され、そしてそのプラスミドは、１０μｇ／mlのカナマイシンに対する耐性が付与された。
MB505は、２つのバッフルと100mlのBPX培地の入った500mlの振とうフラスコ内で、300rpm、37℃で５日間、培養された。
精製及び特徴付け：
クローンMB505を含むバチルスからの振とうフラスコ培養液5000mlを、受容し、そしてこの培養液を、それを70℃まで加熱することにより熱処理し、そして撹拌しながら５分間この温度で保った。次に、それを冷却し、そして20分間9000rpmで遠心分離した。清澄上清4000mlであって１ml当り2.4CMCUを含むものを得た。
CMCUを、70℃及びpH 8.5で測定した。
6000CMCUを、50mM MesバッファーpH 6.2中で平衡化したDEAE A-50 Sephadex 3000mlに適用した。結合されなかった材料は、全部で5700CMCUを含んでいた。
この非結合材料を、20mMエタノールアミン・バッファーpH 9.5で平衡化したQ-Sepharoseカラム1000mlに適用した。この結合された酵素をNaClグラジエントを使用して溶出させた。
部分的に精製された生成物を、6kDaのカット−オフ値をもつ膜を用いたアミコン限外濾過細胞を使用して濃縮した。
この濃縮された画分を、40％プロピレングリコールと配合した。
１ml当り9.7CMCUの濃度をもつ全部で250ml（全部で2425CMCU）を得て、そして適用試験のために使用した。
免疫学的方法：
（実施例２からの）ジクチオグロムスからの高精製セルラーゼを、抗血清の製造のために使用した。
上記免疫化手順を、ウサギを使用してDAKOにおいて行った。各ウサギを、100μｌのアジュバントと混合された100μｌのセルラーゼ（１ml当り0.4mgタンパク質）で免疫化した。各ウサギを、１週間の間隔をもって15回免疫感作させた。このウサギの血清を集め、そしてそのガンマグロブリンを上記血清から精製した。
Manciniプレートは、例えば、25mlの１％アガロース・ゲル（15×10cm）は、50μｌガンマグロブリン（A280＝106.5）を含み、そして４mmウェルを含む。この中で、10μｌサンプルが適用され、そして加湿チャンバー内で室温において１日間インキュベートされる。
上記プレートを、数回0.95NaCl水中で洗浄し、そして標準的な手順に従ってクマシー・ブルーで染色した。
以下の直径を、それぞれ、高精製ジクチオグロムス・セルラーゼ又は配合された部分精製されたMB505のいずれかから得た：
高精製ジクチオグロムス・セルラーぜ：
40CMCUは直径11.5mmを与えた。
20CMCUは直径9.5mmを与えた。
10CMCUは直径７mmを与えた。
配合されたMB505：
10CMCUは直径８mmを与えた。
他の科の12のセルラーゼ（例えば、菌類属トリコダーマ（Trichoderma）、フミコーラ（Humicola）、アスペルギルス（Aspergillus）からのもの）は、上記条件下で免疫沈殿物を形成しなかった。
実施例４
90℃におけるジクチオグロムス・セルラーゼの生物学的研磨（biopolishing）
実験
材料及び装置：
装置：Mathis Pad−スチーム・レンジ、タイプ：PSA-HTF
布ふく：漂白されたインターロックされた編みの綿布ふく（Test fabrics Inc.）：N.O.白、100％綿、スタイル460。この布ふくを20×30cm（各約12.5ｇ）の片に切断した。
酵素：ジクチオグロムス（Dictyoglomus）、バッチMB505、9.7CMC U／ml
バッファー：15mMホスフェート・バッファーpH 6.0
15mMホスフェート・バッファーpH 8.1
パジング（Padding）手順：
布ふく布きれ（Fabric swatches）を、少なくとも24時間、標準的AATCC（American Association of Textile Chemists and Colourists）気候調節室（65±２％相対湿度及び70±３°Ｆ温度）内で馴らした。それらを計量した。
酵素溶液を酵素をバッファーと混合することから作った。このpHを調整し、そして溶液中の酵素活性を、以下の表１中に示した。布きれを、45秒未満の間酵素溶液中に浸漬し、そして次にパジングした。パジング後、布きれを計量し、そしてMathisスチーマー内に直ちに吊した。布ふく布きれの湿度の拾い上げ（wet pickup）として示される布ふく上の溶液のパーセンテージをも、表１中に示す：
0004327255.tif 000011
スチーマー内での生物研磨：
布ふく布きれを以下の条件にあるスチーマー内で処理した：
温  度  ：90℃
時  間  ：90分間
相対湿度：100％
全ての布きれを移し、そして少なくとも５分間、脱イオン水中で濯いだ。それらを風乾し、そして次に評価前少なくとも24時間、AATCC気候調節室内で馴らした。
評価：
強度の損失：布ふく布きれを、ASTM D3786-87に従ってMullen Burstテスター・モデルＣ上で計測した。このデータは、少なくとも８つの計測値の平均である。ピリング特性（Pilling note）：500回転におけるMatindale Pilling Testerを使用してASTM D 4970-89に従って計測した。布ふく上のピリングを、等級１〜５に視覚的に評価する。ここで、１はひじょうに重いピリングであり、そして５はピリングがない。データは、少なくとも２つの計測値の平均である。
結果及び結論：
結果を以下に要約し、そしてデータを表２と３に示す。
１．酵素濃度が上昇すると、ピリング特性が増加する（表３）。
２．ジクチオグロムスのセルラーゼは、pH 6.0よりもpH 8.1においてより良好なピリング特性を与える（表３）。
３．存在条件下、生物研磨は、pH 6.0において僅かな布ふく強度の損失（５％未満）を与えたが、pH 8.1においては強度の損失は全く検出されなかった。
ジクチオブロムスのセルラーゼによる綿布ふくの生物研磨は、上記試験における条件下、布ふくピリング耐性を有意に改善すると結論付けることができる。好ましい条件、例えば、約８のpHにおいては、良好なピリング耐性が、検出可能な強度損失を伴わずに得られた。
0004327255.tif 000012
0004327255.tif 000013
配列表
（２）配列番号：１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：867塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：DNA（genomic）
（xi）配列番号：１：
0004327255.tif 000014
（２）配列番号：２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：288アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：タンパク質
（xi）配列番号：２：
0004327255.tif 000015
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