(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人産業技術総合研究所における受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１８８３５のハイブリドーマ「Mouse Hybridoma SgF11」。
【請求項２】
請求項１に記載のハイブリドーマ「Mouse Hybridoma SgF11」から産生される、セミノジェリンの精子運動抑制因子に対して結合するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を検体と接触させ、当該接触により生ずる抗原抗体反応シグナルを当該検体中のセミノジェリン又は精液の検出指標として用いることにより、当該検体中のセミノジェリンを検出する、セミノジェリン又は精液の検出方法。
【請求項４】
独立行政法人産業技術総合研究所における受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１８８３５のハイブリドーマ「Mouse Hybridoma SgF11」から産生され、セミノジェリンの精子運動抑制因子に対して結合するモノクローナル抗体を含有する、請求項３に記載のセミノジェリン又は精液の検出方法を行うための、検出用キット。
【請求項５】
独立行政法人産業技術総合研究所における受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１８８３５のハイブリドーマ「Mouse Hybridoma SgF11」から産生され、セミノジェリンの精子運動抑制因子に対して結合する、標識されたモノクローナル抗体を、液体の移動と共に移動可能な態様で担体上に配置して、当該担体上の標識により形成される判定ラインとしてセミノジェリンに対するポリクローナル抗体を固定化した担体を含む、請求項４に記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体、および、これを産生するハイブリドーマ、並びに、このモノクローナル抗体を用いた特定生体成分の検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
セミノジェリンは精嚢特異的な分泌蛋白質であり、52kDa のセミノジェリンＩと、71kDa および糖鎖付加により76kDa で検出されるセミノジェリンIIの、２種類のセミノジェリンが存在することが確認されている。これらセミノジェリンＩとセミノジェリンIIは、Ｃ末端側に位置する機能未確定の繰り返し配列部の長さが異なる以外、アミノ酸の相同性が非常に高いことが知られている。また、セミノジェリン（本明細書中で、セミノジェリンと記載した場合には、特に断わらない限り、セミノジェリンＩとセミノジェリンIIの双方を意味するものとする）は、ヒトとサルにのみに、その存在が確認されている。セミノジェリンは、精液を凝集させる作用が認められており、精液の射出後、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のセリンプロテアーゼ活性により速やかに分解され、精液の液化を引き起こし、精子は運動能を獲得する。
【０００３】
また、現在、セミノジェリンの検出方法として、特開２０００−２８３９８２号公報に記載されている方法が提供されており、この方法は、性犯罪等の犯罪の捜査において、極めて有力な方法である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
セミノジェリンについて、最近、small cell lung carcinoma の細胞株における培養上清、および、small cell lung carcinoma の患者の肺組織の抗セミノジェリン抗体を用いた免疫染色により、腫瘍の存在に関連して、セミノジェリンが発現することが確認された（Rodrigues RG, Panizo-Santos A, Cashel JA, Krutzsch HC, Merino MJ, Roberts DD.  Clin Cancer Res 2001 Apr;7(4):854-60 ）。これは、例えば、血液検体中のセミノジェリンの検出を行うことにより、癌の診断を行い得ることを意味するものである。
【０００５】
血液検体のような、本来的にセミノジェリンが存在すべき精液等以外の検体におけるセミノジェリンの検出は、発現するセミノジェリンが極微量であることが予想される。よって、一層の鋭敏性が必要となるが、特開２０００−２８３９８２号公報に記載されている方法において用いられている、セミノジェリンに対するポリクローナル抗体では、これを用いた検出系の鋭敏性に限界があり、これも、セミノジェリンを指標にした、血液検体等における腫瘍の検出等に対しては、不十分であると考えられる。
【０００６】
また、現在提供されている、セミノジェリンに対するモノクローナル抗体MHS-5 は、セミノジェリンＩの１９８〜２２３番アミノ酸配列部分において、セミノジェリンＩとIIを認識し得る抗体であるが、さらに、異なるセミノジェリンの要素を認識し得るモノクローナル抗体を作出して、モノクローナル抗体で認識され得るセミノジェリンの要素の多様化を実現することが望まれる。
【０００７】
そこで、本発明が解決すべき課題は、セミノジェリンの特定部分を認識する新たなモノクローナル抗体を作出し、これによりセミノジェリンを検出する手段を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題の解決に向けて、セミノジェリンのプロテアーゼの影響を受けにくい最終分解産物であるＳＰＭＩ部分を認識するモノクローナル抗体を作出できれば、これを基とした、極めて鋭敏なセミノジェリンの検出手段を提供可能であると考え、免疫抗原をＳＰＭＩとした、新たなモノクローナル抗体の作出を試みた。
【０００９】
その結果、経時に伴い、精漿が任意に分解する中でも、ＳＰＭＩは、残存する傾向が強いという性質を利用して、十分に液化させた精漿を用いてハイブリドーマをスクリーニングして、ＳＰＭＩに対して結合する、所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを分離することに成功し、さらに、このモノクローナル抗体を用いた、セミノジェリンの鋭敏、かつ、簡便な検出手段を提供するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、第１に、独立行政法人産業技術総合研究所における受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１８８３５のハイブリドーマである「Mouse Hybridoma SgF11」から産生される、セミノジェリンの精子運動抑制因子（ＳＰＭＩ）に対して結合するモノクローナル抗体（以下、本モノクローナル抗体ともいう）を提供する発明であり、第２に、本モノクローナル抗体を産生する、前記ハイブリドーマ（以下、本ハイブリドーマともいう）を提供する発明である。
【００１１】
また、第３に、本モノクローナル抗体を用いてセミノジェリンを検出する、セミノジェリンの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
上述したように、本検出方法は、血液検体等の精液関連検体以外の検体において存在する、極微量のセミノジェリンを検出することが可能である。また、特開２０００−２８３９８２号公報に記載されている方法と同様に、性犯罪等の犯罪の捜査における、精液瘢痕の検出においても、極めて優れた方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本検出方法は、セミノジェリンのＳＰＭＩに対して結合するモノクローナル抗体である、本モノクローナル抗体を用いることを前提とする、セミノジェリンの検出方法である。
【００１３】
Ａ．本モノクローナル抗体について：
本モノクローナル抗体は、セミノジェリンのＳＰＭＩに対して結合するモノクローナル抗体であることから、免疫抗原においては、少なくとも、セミノジェリンのＳＰＭＩが含まれていることが必要である。本モノクローナル抗体と、これを産生するハイブリドーマ（本ハイブリドーマ）を得た具体的な製造工程については、後述する実施例において具体的に記載するが、ここでは、当該製造工程を含めて、本発明者が、本モノクローナル抗体を製造することが可能であった手段を一般的に開示する。
【００１４】
セミノジェリン(Semenogelin) は、もともと、精液を凝固させる蛋白として、１９８７年に、LiIja らによって、精漿中に発見され（LiIja H.,Oldbring J.,Rannevik G and Laurell C.B.,J.Clin.Invest.80:281-285,1987）、ＰＳＡの特異基質としての研究が進む中、１９９２年、その遺伝子が単離され、セミノジェリンＩ，IIの遺伝子の全塩基配列が明らかになった（Ulvsback M.,Lazure C.,LiIja H.,Spurr N.K.,Rao V.V.,Loffler C.,Hansmann I. and Lundwall A.,J.Biol,Chem.267:18080-18084,1992）。セミノジェリンをコードする遺伝子は、ヒト２０番染色体の長腕上に存在し、セミノジェリンＩをコードする遺伝子の塩基数は、４１６４bpで、同アミノ酸数は、４６２aaであり、セミノジェリンIIをコードする遺伝子の塩基数は、８２２４bpで、同アミノ酸数は、５８２aaである。
【００１５】
一方、１９８１年、Gagnonが、精漿中に、精子運動抑制因子（ＳＰＭＩ）の存在を見出し、１９８８年、岩本と共同で、ＳＰＭＩの精漿中からの精製分離に成功した（Iwamoto T. and Gagnon C.J.Androl. 9:377-383,1988）。ＳＰＭＩには、５２kDa の前駆体が存在することが知られていたが、その後の研究から、１９９６年に、Robertによって、前記のＳＰＭＩの前駆体が、セミノジェリンであることが明らかにされた（Martin R. and Gagnon C.,Biol.Reprod.55:813-821,1996 ）。上述のように、セミノジェリンは、精嚢から特異的に分泌される蛋白で、精液が射出される際に、前立腺液等と混合され、主に、ＰＳＡの作用により、速やかに分解を受けるため、精液中には、様々な分解過程におけるセミノジェリンが存在する。そして、その最終産物が、ＳＰＭＩであり、抗セミノジェリン抗体と反応し得る、最小単位の蛋白である。
【００１６】
そこで、本モノクローナル抗体を製造するための免疫抗原は、例えば、ＳＰＭＩのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を用いて、これを発現させて得た組換えＳＰＭＩであってもよいが、天然、または、組換えのセミノジェリンを、十分に分解したセミノジェリン分解物を免疫抗原として用いることが、簡便であり、好適である。
【００１７】
なお、ここで用いるセミノジェリンは、天然に存在するものであってもよいし、遺伝子工学的手段を駆使して製造される組換えタンパク質であってもよいが、ヒトセミノジェリンの入手と精製の容易性を考慮すると、後者の組換えタンパク質を選択することが好ましい。
【００１８】
組換えセミノジェリンの製造は、上述の既知のセミノジェリンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、常法を用いて行うことができる。
すなわち、例えば、ヒトの精嚢のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡライブラリーを調製し、さらにこのｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記の既知のセミノジェリンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により、セミノジェリンをコードする遺伝子を特異的に増幅させることができる。
【００１９】
次いで、このセミノジェリンをコードする遺伝子を、適切な遺伝子発現ベクターに組み込み、この遺伝子発現ベクターに応じた宿主を形質転換し、この形質転換体においてセミノジェリンを発現させることにより、所望の組換えセミノジェリンを得ることができる。
【００２０】
好適には、かかる組換えセミノジェリンを免疫抗原として、本モノクローナル抗体を製造することができる。
なお、免疫抗原として用いるセミノジェリンは、セミノジェリンＩ又は同IIに対する抗体のどちらをも選択することが可能であり、さらに両者を組み合わせて用いることも可能である。
【００２１】
さらに、セミノジェリンに対する抗体を製造するための免疫抗原は、ヒトセミノジェリンの全部又は一部（本発明においては、セミノジェリンの全部は勿論のこと、その一部も、免疫抗原としての「セミノジェリン」の範疇に含まれる）を用いることができる。
【００２２】
本モノクローナル抗体を製造するために、上述の免疫抗原で免疫される動物は、特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等を広く用いることが可能である。
【００２３】
免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
より、具体的には、上記免疫抗原を、所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に、２週間程度毎に、上記手法により数回投与し、免疫を行うことができる。
【００２４】
このようにして、本モノクローナル抗体を製造するための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができる。
本モノクローナル抗体の製造において、この免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
【００２５】
上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495(1975)）等に準じて行うことができる。
【００２６】
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
【００２７】
本ハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
【００２８】
目的とするＳＰＭＩに結合する、本モノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。これらの検索法において、ＳＰＭＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのために、例えば、ＳＰＭＩのアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させて得られる組換えＳＰＭＩを用いることも可能であるが、ＳＰＭＩは、精漿において自ら分解するセミノジェリンの最終分解物であるから、精漿の液化物を用いることが、その簡便性故に好適である。かかる精漿の液化物は、精漿を、室温で、十分な時間、好適には、３〜５日間程度静置することで得ることができる。
【００２９】
このようにして得られるＳＰＭＩに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（本ハイブリドーマ）は、ＳＰＭＩが、セミノジェリンＩとIIに共通する蛋白因子であるので、ＳＰＭＩに結合すると共に、セミノジェリンに対して特異的なモノクローナル抗体（本モノクローナル抗体）である。
【００３０】
本ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
本ハイブリドーマからの本モノクローナル抗体の採取は、本ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、本ハイブリドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
【００３１】
また、前述のようにして得られる、本モノクローナル抗体は、更に、塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。
【００３２】
このようにして得られる本モノクローナル抗体は、ＳＰＭＩに対して結合することで、ＳＰＭＩを認識するモノクローナル抗体であり、かつ、セミノジェリンに対して特異的、すなわち、セミノジェリンに結合して、セミノジェリンを認識し得るモノクローナル抗体である。
【００３３】
また、本モノクローナル抗体を、必要に応じて標識物質で標識して、後述する本検出方法において用いることができる。
かかる標識物質は、その標識物質単独で又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキシダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。
【００３４】
これらの標識物質による、本モノクローナル抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いることができる。
【００３５】
また、本モノクローナル抗体（標識されたものを含む）を、必要に応じて、不溶性担体に固定化して用いることができる。かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。
【００３６】
これらの不溶性担体における、本モノクローナル抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体において既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００３７】
Ｂ．本検出方法の態様について：
本検出方法は、上述したように、本モノクローナル抗体を用いて、セミノジェリンを検出する、セミノジェリンの検出方法であり、典型的には、本モノクローナル抗体と、検体中のセミノジェリンとの反応に基づき、検体中のセミノジェリンを検出する、セミノジェリンの検出方法である。
【００３８】
このような本検出方法の態様としては、例えば、エンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フローサイトメトリーによる解析、ウエスタンブロット法等において、本モノクローナル抗体を用いて、セミノジェリンを検出する態様が挙げられる。
【００３９】
本検出方法の態様のうち、好適な態様は、本検出方法を行う目的により、異なる場合がある。
（１）例えば、本検出方法により、セミノジェリンを検出することにより、腫瘍等の疾病の診断を行う場合、好適な検体が、血漿、血清、全血等の血液検体である。そして、この場合、一般的には、エンザイムイムノアッセイ法が、本検出方法の好適な態様として挙げられる。
【００４０】
エンザイムイムノアッセイ法は、酵素免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。エンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする"heterogeneous enzyme assay"と、このＢ／Ｆ分離を必要としない"homogeneous enzyme assay"とに大別される。本検出方法においては、これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる、前者の"heterogeneous enzyme assay"を選択するのが好適であり、イムノソルベントを用いる、"enzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）" を選択するのが、特に好適である。
【００４１】
ＥＬＩＳＡの、典型的な検出態様として、いわゆるサンドイッチ法による、エンザイムイムノアッセイ法（サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ法：以下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができる。サンドイッチ法は、特に、操作の簡便性、経済上な利便性、とりわけ臨床検査における汎用性を考慮すると、特に好適に検出態様の一つとして挙げられる。
【００４２】
サンドイッチ法を行うに際しては、本モノクローナル抗体が、９６穴マイクロプレートに代表される、多数のウエルを有するマイクロプレートに固定化された、固定化モノクローナル抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素やビオチン等により標識された、セミノジェリンに対するポリクローナル抗体を用いることが好適である。セミノジェリンに対するポリクローナル抗体は、例えば、特開２０００−２８３９８２号公報の段落番号〔００１７〕〜〔００２２〕等に記載されている方法に従い、上記のポリクローナル抗体を製造する際に用いる免疫動物から得られる抗血清として得ることができる。このポリクローナル抗体の標識や固定化は、上記の本モノクローナル抗体の場合と同様に行うことができる。
【００４３】
サンドイッチ法は、少なくとも、下記(a) および(b) の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法である。
(a) 不溶性抗体に、本モノクローナル抗体（第１抗体）を固定化した、固定化モノクローナル抗体に、血液検体等の検体を反応させる工程。
【００４４】
この工程(a) においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体は、固定化した本モノクローナル抗体から除去される。
(b) 固定化した本モノクローナル抗体と、検体中のセミノジェリンとの結合により形成される、抗原抗体複合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素やビオチン等に標識された、セミノジェリンに対するポリクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
【００４５】
この工程(b) においては、反応させた第２抗体における標識物質の種類に応じた標識シグナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。例えば、標識物質として、ビオチンを選択した場合には、アビジンやストレプトアビジンを用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。また、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、その酵素の基質を発色物質と共に添加して、標識シグナルを顕在化させることができる。
【００４６】
このようにして、顕在化させた発色シグナルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定手段を用いて検出することで、検体中のセミノジェリンの検出を行うことができる。
【００４７】
このサンドイッチ法による本検出方法においては、検体中のセミノジェリンの存在の有無を判別するのみならず、検体中のセミノジェリの定量を行うことができる。セミノジェリンの定量は、検体中のセミノジェリン量が、診断対象となる腫瘍等の重篤度等を示す指標になり得るために、非常に重要な要素である。
【００４８】
上記に列挙した方法のうち、セミノジェリン（セミノジェリンＩおよび／またはII：セミノジェリンＩとIIを別々に検出する場合には、第２抗体として、セミノジェリンＩ、または、IIに対して特異的なモノクローナル抗体を用いることで行うことができる）の定量に適した方法として、エンザイムイムノアッセイ法（サンドイッチ法を含む）、および、ラジオイムノアッセイ法を挙げることができる。
【００４９】
このように、本検出方法を行うことで、血液検体等における微量のセミノジェリンを検出して、腫瘍等の診断を行うことができる。
（２）例えば、本検出方法により、セミノジェリンを検出することにより、性犯罪等の犯罪捜査の証拠方法を得ようとする場合には、本検出方法によろセミノジェリンを検出することにより、精液の存在の有無を識別することができる。このような場合の本検出方法は、多くの犯罪証拠資料の中から、個人識別に適した資料を、スクリーニングして確保し得る態様であることが好ましい。このような観点から、本検出方法の態様として、最も好ましい態様の一つとして、エンザイムイムノアッセイ法の一種である、「ドットエライザ法」を挙げることができる。
【００５０】
ドットエライザ法は、精液を検出すべき対象、例えば、被害者の着衣等の特定部分を、適当な緩衝液やイオン交換水等で抽出し、この抽出物に、適切な分別処理を施した被検試料（例えば、抽出液の遠心上清等）を、ＰＶＤＦやニトロセルロース膜等の薄膜に定着させ、これに対して、本モノクローナル抗体を一次抗体として用いたエンザイムイムノアッセイを実施して、上記検出対象から、セミノジェリンを検出することで、精液の存在の有無を識別することができる。
【００５１】
このように、本検出方法は、本モノクローナル抗体を用いることで、セミノジェリンを検出して、精液の有無を判別することが可能であり、外気に触れた後、長時間が経過して、もはや斑痕化した精液をも、容易に検出し得る、犯罪捜査、特に性犯罪捜査において、極めて有用な検出方法である。
【００５２】
なお、本発明においては、本検出方法を簡便に実施するための、本モノクローナル抗体を含む、検出用キットも提供される（以下、本検出用キットともいう）。
【００５３】
本検出用キットにおいては、本モノクローナル抗体（検出するための適切な標識がなされたものを含む）を、必須要素として、その他、被検物の種類や、本検出用キットにより行われる本検出方法の態様に応じた要素を選択的な要素として含ませることができる。
【００５４】
例えば、血液検体等におけるセミノジェリンの検出を行う場合には、本モノクローナル抗体の他に、希釈液、ブロッキング液、セミノジェリンに対するポリクローナル抗体（検出するための適切な標識がなされたものを含む）、発色要素（例えば、発色酵素を結合した二次抗体と、これを発色させるための発色剤）等を、必要に応じて含有させることができる。
【００５５】
また、例えば、犯罪現場における精液の検出を行う場合には、本モノクローナル抗体の他に、抗原抽出用の緩衝液  試料定着要素（例えば、ニトロセルロースやＰＶＤＦ等の試料定着用膜）、希釈液、ブロッキング液（これらは、リン酸緩衝液を基本緩衝液とすることが好適であり、防腐剤を含有することが好適である）、セミノジェリンに対するポリクローナル抗体（検出するための適切な標識がなされたものを含む）、発色要素（例えば、発色酵素を結合した二次抗体と、これを発色させるための発色剤）等を、必要に応じて含有させることができる。
【００５６】
なお、本検出用キットの態様として、例えば、金コロイド、西洋ワサビペルオキシダーゼ等による標識を行った本モノクローナル抗体を、液体の移動と共に移動可能な態様で、ニトロセルロース膜やグラスファイバー等の担体上に配置して、担体上の標識により形成される判定ラインとしてセミノジェリンに対するポリクローナル抗体を固定化した担体を構成中に含む、セミノジェリンの検出用のイムノクロマトキット等として用い得る態様も挙げることができる。
【００５７】
すなわち、本発明は、本モノクローナル抗体を用いて、セミノジェリンを担体上の標識により検出する、検出用のイムノクロマトキットを提供する発明でもある。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、これにより、本発明が限定されるものではない。
モノクローナル抗体の免疫抗原の調製
免疫抗原として使用したヒトセミノジェリンII蛋白質は、聖マリアンナ医科大より作製されたヒトセミノジェリンIIを組込んだバキュロウイルスを用いて（Murakami J, Yoshiike M, Satoh M, Furuichi Y, Iwamoto T.   Int J Mol Med 1998 Dec;2(6):693-700 ）、昆虫細胞HIGH Five に感染させ、組換え体のヒトセミノジェリンIIを得た。この組換えセミノジェリン蛋白質は、分子量、精子運動抑制活性ともに天然のセミノジェリンと同等であることが確認された。この組換えセミノジェリン蛋白質を、Ni-NTAアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、免疫抗原とした。この精製した組換えセミノジェリン蛋白質は、分子量、精子運動抑制活性ともに天然のセミノジェリンと同等であることが確認された。
【００５９】
ハイブリドーマの調製
上述のように精製して得られた、組換えヒトセミノジェリンII（40μｇ）を、アジュバンドと混合し、２週間おき、計４回、BALB/cマウス（雌、日本生物材料センター社）の腹腔に免疫した。尾静脈より血清を採取し、免疫抗原である組換えヒトセミノジェリンIIを用いたＥＬＩＳＡ法により力価を測定し、十分な力価の認められたマウスに、組換えヒトセミノジェリンII（８０μｇ）を、腹腔に最終免疫した。最終免疫４日後のマウスの脾臓細胞１０7 個を、マウスミエローマ細胞（SP2/0-Ag14）１０6 個と混和し、５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１５００、ベーリンガーマンハイム社製）を用いて細胞融合を行った。１５％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）で、９６wellプレートに播き、翌日よりＨＡＴ試薬（シグマ社製）添加して、１週間培養を行った。
【００６０】
各ハイブリドーマにおける培養上清中のヒトセミノジェリンおよびＳＰＭＩに対する抗体の有無は、精製組み換え体ヒトセミノジェリンIIを抗原としたＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。組換えヒトセミノジェリンII（100ng ）のＰＢＳ溶液を、各wellに滴下して、このセミノジェリンを固定化し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで、４℃下、一晩ブロッキングを行い、ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、培養上清１００μl を添加し、室温で２時間反応を行った（一次反応）。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Tween20 を用いて、4000倍希釈パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG 抗体（Zymed laboratories社製）１００μl を添加し、室温で１時間反応（二次反応）を行った。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、０．０１５％過酸化水素を添加した０. ２５mg／mlＯＰＤ溶液１００μl を加え、室温で３０分間反応（基質反応）を行った。反応後、２Ｎ硫酸５０μl を加え反応を停止させ、４９２nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（ラボシステム社）で測定した。測定により、吸光度が１．０以上であったハイブリドーマ培養上清を陽性とした。陽性ハイブリドーマ培養上清について、更に、１万倍希釈（ＰＢＳ）ヒト精漿、および、４日間室温保存し、液化したヒト精漿を使用した上記ＥＬＩＳＡ法で陽性となり、ＰＢＳで１０００倍希釈した健常人血清、および、同唾液に上記ＥＬＩＳＡ法で陰性であるクローンを選別した。クローニングではＨＴ試薬（シグマ社製）と１０％Hybridoma Cloning Factorを添加し、ＲＰＭＩ１６４０培地で、０．３個／wellで３回播き直した（SgF11 クローン）。更に、無血清培地ＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）を、ＲＰＭＩ１６４０培地に等量添加し、ハイブリドーマの増殖後、ＲＰＭＩ１６４０培地にＧＩＴ培地を、１：４〔ＲＰＭＩ：ＧＩＴ（容量比）〕で加え、培養し、ハイブリドーマ増殖後に、ＧＩＴ培地に置き換えた。
【００６１】
SgF11 クローンハイブリドーマ１０6 〜１０7 個を、BALB/cマウスに腹腔注射し〔１週間前にプリステイン（和光純薬社製５００μ）を腹腔注射〕、常法により腹水を採取した。また、ハイブリドーマ培養ＧＩＴ培地からも抗体を得た。
【００６２】
抗体は、遠心分離した腹水上清、および、ＧＩＴ培地、それぞれに、飽和硫安等量を混和し、氷冷下で１時間放置し、４℃下において、１５０００回転で１０分遠心後、沈殿物をＰＢＳに溶解し、ＰＢＳで一昼夜透析を行い、硫安をぬいた。Hitrap Protein G( アマシャムファルマシアバイオテック社製) を用いてキットのプロトコールで精製モノクローナル抗体（SgF11 ）を得た。
【００６３】
モノクローナル抗体（SgF11 ）を、IsoStrip（ロッシュ  ダイアグノスティックス社製) を用い、キットのプロトコールに従い、抗体のアイソタイプを決定した。その結果、モノクローナル抗体（SgF11 ）のアイソタイプは、IgG1κ鎖であった。
【００６４】
精製モノクローナル抗体（SgF11 ）を産生するハイブリドーマを「Mouse Hybridoma SgF11」として、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託を行った（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８３５）。
【００６５】
健常人精漿、体液との反応
モノクローナル抗体（SgF11 ）を用いたウエスタンブロットとＥＬＩＳＡ法により、健常人精漿、４日間室温保存し、液化したヒト精漿、血清、唾液、および、尿との反応を行った。
【００６６】
ウエスタンブロットでは、精漿は、セリンプロテアーゼ活性により分解されるため、約２０〜７０kDa にブロードに反応した。４日間室温保存し、液化したヒト精漿では、約２０kDa の低分子に反応が見られた。健常人血清、唾液、尿では、抗体による反応は認められなかった。
【００６７】
（１）ウエスタンブロット…精漿２μl 、健常人血清、唾液、尿５μl に対して、SDS-PAGEを行い（アトー社製パジェル５２０L)、泳動後、泳動ゲルのニトロセルロース膜への転写を行った、転写膜をＰＢＳ／１％スキムミルク／０．１％Tween20 で、４℃下で、一晩ブロッキングした。ハイブリドーマ培養上清またはＰＢＳ／１％スキムミルク／０．１％Tween20 に、SgF11 抗体１μg/mlを加え、室温で２時間反応後、ＰＢＳ／０．１％Tween20 で、室温下で１０分間３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ／１％スキムミルク／０．１％Tween20 に4000倍希釈パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG 抗体（Zymed laboratories社製）を加え、室温下で１時間反応後、ＰＢＳ／０．１％Tween20 で、室温下で３０分間３回で洗浄後、ケミルミ試薬（NEN ライフサイエンスプロダクト社製）で、１分間反応を行い、Ｘ線フィルムに感光を行い、現像した。ケミルミ試薬反応後、ＤＡＢ試薬（Vevtor Laboratoris社製USA ）に１５分間反応させ、膜上に反応バンドを検出した。
【００６８】
（２）ＥＬＩＳＡ法…固相抗原精漿ＰＢＳ1000〜100 万倍希釈、血清、唾液、尿ＰＢＳ10〜1 万倍希釈を、96well plateの各wellに、50μl ずつ分注し、固相化した（室温２時間以上反応）後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで、４℃下で一晩ブロッキングを行い、ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、培養上清１００μl またはSgF11 抗体を100ng/ml添加し、室温で２時間反応した（一次反応）。反応後、ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Tween20 を用いて、4000倍希釈パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG 抗体（Zymed laboratories社製）１００μl を添加し、室温で１時間反応した（二次反応）。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、０．０１５％過酸化水素を添加した０. ２５mg／mlＯＰＤ溶液１００μl を加え、室温で３０分間反応した（基質反応）。反応後、２Ｎ硫酸５０μを加え反応停止させ、４９２nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（ラボシステム社）で測定した。
【００６９】
大腸菌由来組換えＳＰＭＩのHPLC精製天然セミノジェリンとの結合
大腸菌由来組換えＳＰＭＩ（ニッケルカラム精製）、ＨＰＬＣ精製天然セミノジェリンを、検出対象として用いて、上記ウエスタンブロットとＥＬＩＳＡ法を行った場合も、陽性反応が確認された。
【００７０】
また、▲１▼この組換えＳＰＭＩと、▲２▼ヒト精漿（採取直後）と、▲３▼室温で４日間放置した精漿と、▲４▼３７℃で４日間放置した精漿と、▲５▼健常人血清を検出対象とした、上記ウエスタンブロットを行った結果を、第１図に示す。
【００７１】
第１図に示すように、レーン１の組換えＳＰＭＩ同様のバンドが、レーン２のヒト精漿、レーン３の室温４日間放置精漿、レーン４の３７℃４日間放置精漿に認められたが、レーン５の健常人血清においては、このバンドは認められなかった。
【００７２】
動物精液との反応
上記ウエスタンブロット〔サンプル２μl （ただしサルは精液が固形の為ＰＢＳ／８Ｍ尿素で懸濁した上清を使用した）〕と、上記ＥＬＩＳＡ法（サンプルＰＢＳで10〜100 万倍希釈）で、ヒト精漿、サル（マンドリル）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタの精液を検出対象として用いて、検出反応を行った。その結果、ヒト精漿、サル（マンドリル）精液に陽性反応が認められ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタの精液は、陰性であった。
【００７３】
SgF11 エピトープ解析
AFFINIXQ（水晶発振子マイクロバランス装置）を用いて、ＳＰＭＩを３分割したペプチドを用いたエピトープ解析により、本モノクローナル抗体（SgF11 ）が、ＳＰＭＩである３１〜４７アミノ酸部位に結合することを確認した。
【００７４】
サンドイッチＥＬＩＳＡおよび免疫クロマトグラフィーでのセミノジェリンと精液の検出
ヒトセミノジェリンIIに対するウサギポリクローナル抗体を製造した（SgF11 と同様の方法で抗血清よりIgG 精製）。精製モノクローナル抗体SgF11 を、ＰＢＳで希釈し、96well plateの各wellに、400ng/50μl で、４℃下で一晩固相化を行い、１％ＢＳＡ／０．１Ｍリン酸バッファー(pH7.5) ／０．９％塩化ナトリウムで、室温で２時間ブロッキングを行った。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、１％ＢＳＡ／０．１Ｍリン酸バッファー(pH7.5) ／0.9 ％塩化ナトリウム／０．１％Tween20 で希釈した測定試料を添加、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、１％ＢＳＡ／０．１Ｍリン酸バッファー(pH7.5) ／0.9 ％塩化ナトリウム／０．１％Tween20 で希釈したウサギポリクローナル抗体(1もしくは0.1ug/ml 100ul/well)を加え、室温で２時間反応した。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、１％ＢＳＡ／０．１Ｍリン酸バッファー(pH7.5) ／０．９％塩化ナトリウム／０．１％Tween20 で４０００倍した希釈パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG 抗体（Zymed laboratories社製）１００μl を添加し、室温で１時間反応した。ＰＢＳ／０．１％Tween20 で５回洗浄後、０．０１５％過酸化水素を添加した０. ２５mg／mlＯＰＤ溶液１００μl を加え、室温で３０分間反応させた（基質反応）。反応後、２Ｎ硫酸５０μl を加え、反応を停止させ、４９２nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（ラボシステム社）で測定した。
【００７５】
その結果、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、精漿〔i)採取直後，ii) 室温４日間放置，iii)３７℃４日間放置〕と、ＨＰＬＣ精製天然セミノジェリンの検出が可能であった。また、健常人血清、唾液には反応が認められなかった。さらに、健常人血清で精漿を希釈したサンプルで検出が可能であった。
【００７６】
ここに示した本検出方法では、ＨＰＬＣ精製天然セミノジェリンをスタンダードとした検量線が得られるため、精液や癌患者血清中のセミノジェリンの定量が可能である。
【００７７】
イムノクロマトキット
本モノクローナル抗体（SgF11 ）に対して、常法により、金コロイド標識を施し、この金コロイド標識本モノクローナル抗体（SgF11 ）を、グラスファイバー濾紙を担体として、サンプル注入部の下流に付着させた。一方、金コロイド標識本モノクローナル抗体（SgF11 ）の付着部位のさらに下流を、判定部として、上記のヒトセミノジェリンIIに対するウサギポリクローナル抗体を、常法に従い、固定化して、イムノクロマトキットを作出した。検体中にセミノジェリンが存在すると、サンプル注入部に注入した検体が下流側に移動して、まず、金コロイド標識本モノクローナル抗体付着部位の金コロイド標識本モノクローナル抗体（SgF11 ）と検体中のセミノジェリンが反応して、標識モノクローナル抗体とセミノジェリンの複合体が形成され、これが、さらに下流域の判定部のポリクローナル抗体に捕捉され、判定部において赤紫色の陽性バンドが認められる。一方、検体中にセミノジェリンが存在しない場合には、上流から移動してきた、フリーの金コロイド標識本モノクローナル抗体（SgF11 ）は、判定部においても、ポリクローナル抗体とは結合せず、上記の陽性バンドは現れない。
【００７８】
ヒト精漿の倍数希釈を行い、これを検体として、上記のイムノクロマトキットを用いて、セミノジェリンの検出を行ったところ、原ヒト精漿の１０〜４０００００倍の範囲で、安定した陽性バンドが認められた。また、この最低検出限界（４０００００倍精漿）におけるセミノジェリンの濃度を推定するために、ＨＰＬＣで精製した天然セミノジェリンの希釈液を、上記のイムノクロマトキットに対して適用したところ、５ng/mL が、最低検出濃度として認められた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明により、セミノジェリンの特定部分を認識する新たなモノクローナル抗体が提供され、さらに、これによりセミノジェリンを検出する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えヒトＳＰＭＩとヒト精漿と健常人血清についての、本モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果を表す電気泳動像を示す図面である。
【図１】
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