(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者の免疫機能のレベルを増加させる方法において用いられる薬剤の調製におけるIL-2のある量の使用方法であって、
該量が該患者におけるヘルパー／インデューサーT細胞機能のレベルを増加させるのに十分であり、且つ
投与のそれぞれが５日間の期間にわたって行われ、投与とその次の投与とは８週間の期間をあけて行われる、断続的に行われる一連の投与において、該患者に該IL-2が投与される、使用方法。
【請求項２】
IL-2の量が患者におけるCD4数を増加させるのに十分である、請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
IL-2の量が患者におけるIL-2レセプターの発現を増加させるのに十分である、請求項１記載の使用方法。
【請求項４】
薬剤が皮下投与のための薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１記載の使用方法。
【請求項５】
ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者の免疫機能のレベルを増加させるための、薬学的に許容される担体中にIL-2を含む液体調製物であって、投与のそれぞれが、５日間の期間にわたって行われ、投与とその次の投与とは８週間の期間をあけて行われるように、断続的に行われる一連の投与において、該患者の免疫機能のレベルを増加させるのに十分な量で、ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者に投与するための、前記調製物。
【請求項６】
1.8〜24MU/日の用量で患者に投与するための、請求項５記載の調製物。
【請求項７】
持続的注入によって投与するための、請求項５記載の調製物。
【請求項８】
皮下注射によって投与するための、請求項５記載の調製物。
【請求項９】
皮下投与のための薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項８記載の調製物。
【請求項１０】
IL-2を含む調製物の投与の前にまたは同時に、患者に治療剤が投与され、該治療剤が特定の疾患状態を標的とする、請求項５記載の調製物。
【請求項１１】
治療剤がヒト免疫不全ウイルス感染症を標的とする、請求項１０記載の調製物。
【請求項１２】
治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項１０記載の調製物。
【請求項１３】
治療剤がジドブジン、ddI、またはインターフェロンαを含む、請求項１２記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
本発明に関する研究は、「国立衛生研究所（National Institutes of Health）」の「アレルギーおよび感染症国立研究所（National Institute of Allergy and Infectious Disease:NIAID）」から、契約番号NO1-AI-05058のもとに、一部合衆国基金の支援を受けている。
発明の背景
本発明は、患者に断続的にインターロイキン−２（IL-2）を投与することにより、患者の免疫系を活性化する方法に関する。このようなIL-2の投与は、例えば抗レトロウイルス、抗菌、または抗真菌療法などの、患者の状態の療法に適したその他の療法と任意に組み合わされうる。本発明は、同じ患者にレトロウイルスベクターを投与することによるインサイチュー（in situ）リンパ球形質転換を促進するために、患者に対してIL-2を使用することを必要とする遺伝子療法の手法にも関する。
従来の、免疫活性化および回復の試みは、骨髄移植またはリンパ球転移（H.C.Lane et al.,Ann.Internal Med.113:512-19（1990））、イムチオール（immuthiol）（J.M.Lang et al.,Lancet 24:702-06（1988））またはイソプリノシン（isoprinosine）（C.Pedersen et al.,N.Engl.J.Med.322:1757-63（1990））のような免疫モジュレート剤、インターフェロンα（IFN-α）（H.C.Lane et al.,Ann.Intern.Med.112:805-11（1990））またはIL-2のような組換え体サイトカインを利用している。［H.C.Lane et al.,J.Biol.Response Mod.3,512-16（1984）;D.H.Schwartz et al.,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.4,11-23（1991）;P.Mazza et al.,Euro.J.Haematol.49:1-6（1992）;H.W.Murray et al.,Am.J.Med.93:234（1992）;H.Teppler et al.,J.Infect.Dis.167:291-98（1993）;P.Volberding et al.,AIDS Res.Hum.Retroviruses 3:115-24（1987）］これらの研究は、ごくわずかな、または一時的な免疫系回復をもたらした。
一般的な生物学的反応修飾体、そして特にIL-2の使用は、臨床研究の活発な領域である。インターロイキン−２は、TおよびBリンパ球両方の活性化および増殖と分化の誘導（K.A.Smith,Science 140:1169-76（1988））を含む、数多くの免疫モジュレート効果を持つT細胞由来のリンホカインである。外因的なIL-2は、インビトロ（in vitro）で、減退した天然キラー細胞の活性およびAIDS患者の末梢血単核細胞のサイトメガロウイルス特異的細胞毒性（A.H.Rook et al.,J.Clin.Invest.72:398-403（1983））を増加させ、そしてAIDS患者からのリンパ球によるIFN-γ産生を増加させる（H.W.Murray et al.,loc.cit.76:1959-64（1985））ことが示されている。
高用量注入により投与されるIL-2は、腎細胞癌および黒色腫の治療に用いられる（J.Nat’l Cancer Inst.85（8）:622-32（1993））。例えば、24時間にわたる連続的な36ミリオン国際単位（MU）の投与は、癌の治療に用いられている。（18MUは、約1mgのタンパク質と等しい。）「Lancet 340:241（1992）」を参照のこと。しかしながら、IL-2の高用量の使用は一般的に患者の耐量を超えており、そのような高レベルでは副作用がより顕著になる。
その他の研究者は、HIV感染を含むその他の疾患の治療におけるIL-2を評価している。連続的な療法におけるIL-2の低用量の使用は、「Yarchoan et al.,米国特許第5,026,687号」により明らかにされている。より特異的には、ヤコアン（Yarchoan）らは、3ケ月間、1日につき25,000から100万国際単位（U）の投与量で連続的に投与するIL-2と組み合わせて、抗レトロウイルス剤ddIを使用することを教示している。ヤコアンらは、組み合わせddI/IL-2法には「有益な結果」が伴うであろうと予測したが、彼らはこれらの結果をIL-2自体によるものであるとはしなかった。さらに、この低レベルの用量は初期にCD4レベルを上昇させることが示されているが、これらの上昇は、実際には一時的であり、治療の完了後6ヶ月以内にCD4レベルは基線に戻ってしまう。
多くの研究者が、HIVを活性化する潜在力のために、IL-2の使用はHIV感染患者には禁忌であるとの感を有している。持続的な反応を引き起こす、または長期的な有益な結果をもたらすIL-2によるHIVの治療法は開示されていない。
活性化されて活発にDNAを合成する細胞は、遺伝子導入療法の影響を受けやすい。現在の遺伝子治療法は、複雑なインビトロ（in vitro）の形質転換を必要とする。より特異的には、細胞は患者から取り出され、インビトロで活性化されて、細胞株の樹立に用いられ、そうしてインビトロで遺伝子を形質転換された細胞株は患者に再び移植される。この操作には多額の費用がかかり、そして細胞の活性化、形質転換、および発現のための患者への細胞の移植という各ステップにおける失敗の可能性のためにその成功は限定されたものである。
インビボ（in vivo）の遺伝子導入を行うためにレトロウイルスベクターを使用する試みは、限定されたものであった。レトロウイルスは、活発にDNAを合成している標的細胞にのみ安定に取り込まれる。この取り込みは、レトロウイルス遺伝子発現の前に起こらなければならない。いかなる時点においても活発にDNAを合成している細胞は一部のみであるため、このインビボの遺伝子導入法はほとんど成功例がない。
従って、抗ウイルス、抗菌、抗真菌療法と併用できる、患者の免疫系を強化する手段が必要とされているのは明らかである。
発明の要約
このように、IL-2を用いて免疫系を活性化し、しかも従来のIL-2療法に関連する顕著な副作用が避けられるような方法を提供するのが本発明の目的である。
また、IL-2の使用により、HIV感染を含む広範囲の種類の疾患を治療するための方法を提供することも本発明の目的である。
さらに、IL-2の投与により免疫系を活性化された患者のための、遺伝子治療に関する、レトロウイルスベクターを介したインサイチューの形質転換の方法を提供することもまた本発明の目的である。
これらおよびその他の目的を達成するために、本発明の一つの面として、免疫不全により特徴づけられる疾患の治療法において使用する、製剤中のある量のIL-2の使用を提供している。ここで、
（A）IL-2の量は、そのような不全を患う患者の、ヘルパー／インデューサーT細胞機能のレベルを増加させるのに十分な量であり、
（B）患者には、各注入を1日から2週間の期間連続して行い、連続注入は少なくとも4週間隔てる、一連の断続的な注入法によりIL-2を投与する。
T細胞機能の増加は、例えば患者のCD4 T細胞機能の増加または患者のIL-2レセプターの発現の増加等により測定できる。
本発明のもう一つの面として、IL-2の投与のための物の組み合わせが提供されている。この組み合わせは、
（i）患者に注入する溶液を保持するのに適した容器、（ii）薬学的に許容される担体中に約1.8から約24MUの用量のIL-2を含む液剤、および（iii）免疫不全または感染症を患う患者に、約5日間にわたり投与量の連続注入を行うような、患者へ製剤を注入するための説明書を含む。
好ましい態様として、組み合わせはさらに、ある特定の疾患を標的とする療法をその注入の前にまたは同時に患者に施すことを指示する説明書も含む。より好ましい態様として、その説明書は、ジドブジン（zidovudine）投与のような抗レトロウイルス療法を指示する。
本発明のさらにもう一つの面として、IL-2およびレトロウイルスベクターの投与のための物の組み合わせを提供している。この組み合わせは、（i）患者に注入する溶液を保持するのに適した容器、（ii）薬学的に許容される担体中に約1.8から約24MUの用量のIL-2を含む液剤、および（iii）患者に対して、患者の免疫系を活性化するような製剤を注入し、そしてリンパ球のインサイチュー形質転換を起こすレトロウイルスベクターを投与するための説明書を含む。組成物は、IL-2注入の4日目から7日目のような、IL-2注入期間中の適当な時点で投与する。
本発明のさらなる目的および利点は、一部は以下の記述中にあり、そして一部は記述から明らかであるかまたは本発明の実施により理解されるであろう。目的および利点は、添付の請求の範囲において特定した使用および組み合わせにより実現し入手することができる。
【図面の簡単な説明】
図１Ａおよび図１Ｂは、一年の断続的IL-2療法の間の、患者１および３の、CD4細胞数および破傷風毒素とポークウィードマイトーゲン（pokeweed mitogen:PWM）に対する幼若化反応の変化を示している。
図２Ａは、一年のIL-2療法の間の、患者２のリンパ球表面のIL-2レセプター（CD25）の発現およびヒト白血球抗原-D関連（HLA-DR）の発現の変化を示している。
図２Ｂは、IL-2療法の前と、週48（5回目のIL-2投与の5週間後）に得た患者２の凍結細胞について決定したIL-2レセプターとHLA-DR発現の二色蛍光活性化セルソーター（FACS）分析を示している。
図３は、患者２、３、４、６および８の、IL-2療法中のウイルスマーカーの変化を示している。
図４は、5日間連続のIL-2療法を受けた患者のインビボで起こるDNA合成レベルを示している。
図５は、抗レトロウイルス療法のみを受けた患者（Ｂ群）、または抗レトロウイルス療法および断続的IL-2療法を受けた患者（Ａ群）のT細胞の変化を示している。
図６は、断続的IL-2療法を受けた特発性CD4リンパ球欠損の患者のT細胞数の変化を示している。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫不全の患者を含む患者の免疫機能レベルを増加させる方法において用いられる製剤中のある量のIL-2の使用を提供する。免疫機能の増加は、典型的に、ヘルパー／インデューサーT細胞機能の増加として現れる。より特異的には、免疫機能の増加には、例えばCD4数の増加、リンパ球機能の回復、および／またはIL-2レセプター（IL-2r）の発現の増加を含む。
本発明におけるIL-2剤の使用は、関連の免疫反応においてIL-2が機能しているような疾患に対して有効である。標的疾患には例えば、細菌感染のように細胞性免疫反応が患者の特異的な免疫の主要な機構であるような、患者の病原菌による感染が含まれる。「アバス（Abbas）ら、細胞および分子免疫学（CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY）309-10（W.B.サンダーズ（Saunders）社、フィラデルフィア（1991）」を参照のこと。本発明が治療に適用される特異的な疾患を例示すると、HIV感染、および例えば結核およびクリプトコックス（cryprococcul）症など真菌感染のようなマイコバクテリウム感染などの、T細胞免疫の減少により特徴づけられるその他の疾患があげられる。本発明はまた、AIDS患者に起こる日和見感染のような、免疫系の減退した患者に起こる二次感染の治療にも用いられる。
AIDS患者の治療におけるIL-2の治療的使用における従来の試みはほとんどが不成功であったが、本発明に従ったIL-2の治療的使用はHIV感染患者に最大のT細胞活性化とT細胞増加を引き起こし、いかなる患者においても質的に類似の効果をもつであろう。本発明は、IL-2注入終了後4ヶ月後まで持続する、CD4数の持続的改善および抗原やマイトーゲンを排除するT細胞反応の回復により示されるように、少なくとも部分的にはHIV感染患者の免疫機能回復を促進する。CD4レベルは健常な患者にみられるレベル（800-1200細胞/mm3）またはそれ以上にまで回復、持続し、これは免疫系の回復がIL-2療法の結果であるということを示している。
本発明は、長期間にわたり断続的に投与される、複数回の連続的なIL-2注入を利用する。IL-2は、中枢系すなわち首から、または末梢例えば腕から連続注入により投与される。有利な点として、連続的なIL-2注入は末梢から投与されうる。対照的に、従来開示されている低用量IL-2療法は、患者にとってより不快である中枢系注入を必要とする。さらに、我々は断続的なIL-2の皮下投与でも類似の結果が得られると期待する。
本発明の特徴であるIL-2の用量は、１ミリオン国際単位（MU）/日から24MU/日までの範囲である。これらの投与量は、以前にAIDSの治療に用いられていた用量より多いが、癌の治療に用いられていた用量よりは少ない。好ましい態様として、IL-2は、およそ6から18ミリオン国際単位（MU）/日までの間の用量で、8週間ごとに、5日にわたり連続的な静脈注射により投与される。患者には、本療法の2回目から4回目の後に、IL-2レセプター発現の初期的な増加がみられている。18MU/日の用量が好ましいが、この高レベルのIL-2が耐量を越えている患者がいる可能性があるため、6-12MU/日の用量でも有益に使用されうる。
本発明においては、IL-2剤は断続的に投与される。特異的には、IL-2剤は1日から2週間の期間連続的に投与される。1日以下の注入期間では有効性がなく、2週間以上の注入期間ではそれより短い期間を上回る利点がみられないようである。実験によると免疫系の活性化はIL-2注入の約5日目に最大になるため、約1週間の注入期間が好ましい。
連続注入を隔てる期間は、4週間から6ヶ月または1年にまで変化させうる。4週間より近い注入では、近すぎて断続的な療法の有効性が生じず、患者にとって利益がない。4週間より近い注入では、本発明の用量は耐量を越えている。IL-2療法に関連する副作用、そして連続注入療法のためには入院の必要があることを考慮すると、注入を隔てる期間は長い方が好ましい。例えば、IL-2は、6週間、8週間、12週間、または6ヶ月ごとに投与でき、有益な結果がみられるであろう。一年かそれ以上まで長く隔てられた療法も、持続的な有益な結果を示すと期待される。
注入間の最適な期間は決定されておらず、おそらく患者により様々である。当業者であれば、慣習的な医学的経験により本発明のプロトコルを修飾し、特定の患者に対して最大の結果を得ることが可能であろう。例えば、ある実験においては、患者は5日間上記の用量のIL-2の連続注入を受け、8週間IL-2は投与されず、それから再び5日間連続的にIL-2を投与された。このサイクルを繰り返し、患者はIL-2投与を3-7回受けた。
本発明の断続的IL-2療法は、IL-2注入サイクルを無期限に繰り返す一生の治療法を構成しうる。一旦、本方法により患者の免疫系が回復されたことが、CD4数が正常なレベルかそれ以上に持続することにより証明されれば、その後の注入は段々間隔を拡げて投与することができると考えられる。例えば、初めは8週間ごとに注入を受けていた患者は、その後6ヶ月ごと次には1年ごとに注入を受け、依然としてCD4数の上昇を保ちうる。
IL-2の断続的な投与は、T細胞株またはクローンの樹立または発現に必要な、間隔をおいた刺激サイクルを変化させるインビトロの方法（M.Kimoto＆G.G.Fathman,J.Exp.Med.152:759-70（1980））に類似している。IL-2はまた、HIV感染におけるCD4減退において役割を果たす、HIVエンベロープを介したプログラム細胞死を変化させることにより、T細胞の生存を延長させることも可能である。D.I.Cohen et al.,Science 156:542-45（1992）;H.Groux et al.,J.Exp.Med.175:331-40（1992）さらに、IL-2はTh1とTh2リンパ球の均衡を変化させ、それによりHIV感染において起こることが最近示されたTh1細胞の相対的な欠損（H.C.Lane et al.,N.Engl.J.Med.（1984）;M.Clerici et al.,J.Clin.Invest.91:759-65（1993））を回復することにも役立つであろう。
本研究は、免疫系が比較的無傷であるHIV感染患者の治療に焦点を当てている。治療に対する患者の反応の程度は、患者に残っている免疫系のレベルと直接関係がある、または患者のウイルスレベルと逆の関係があることが示されている。残存する免疫系の程度は、患者のT4またはCD4の数により測定されうる。約150細胞/mm3以上のT4またはCD4数を持つ患者は、本発明の治療法によく反応することが見いだされている。患者のウイルスレベルは、ウイルス力価により測定されうる。約1:81の比で希釈した血漿がウイルスを増殖させうる場合、その患者には抗レトロウイルス療法を併用しない直接の治療は薦められない。
ウイルスレベルのあまりに高い患者は、ウイルス負荷を低下させるddI、AZT、またはその他の抗レトロウイルス薬でまず治療することができる。または、抗ウイルス療法をIL-2療法と同時に投与し、免疫系が衰えそしてウイルス負荷の高い患者に断続的IL-2療法による利益を与えることができる。
IL-2療法を受けているAIDS患者に抗レトロウイルス療法を投与するもう一つの理由は、HIVは活性化された細胞内で複製しやすいため、IL-2療法を受けているHIV患者のウイルス負荷が増加するということに主に関連する。ウイルス負荷の増加効果の可能性を最小限にするため、IL-2療法は好ましくは抗レトロウイルス療法と組み合わせられる。このような抗レトロウイルス療法には、例えば、AZT、AZTとddI、またはインターフェロンアルファの投与が含まれる。抗レトロウイルス療法は、IL-2療法開始の前に始められ、断続的IL-2療法の間中続けることができる。患者が併用して抗レトロウイルス療法を受けた場合、ウイルス複製の増加はIL-2の注入前後の短い期間だけにみられる。この場合、例えばU-90152（アップジョン（Upjohn）社）、PMEA（ギリード（Gilead）社）、およびCD4-PE（アップジョン社）などの強力な薬剤を、ウイルスの耐性株を発達させることなしに短期間のみ断続的に使用できる。
本発明の断続的IL-2療法をHIV感染以外の疾患の治療に用いる場合、その疾患を標的とした療法をさらにIL-2療法と併用させることもできる。例えば、抗菌剤は細菌感染の治療に、抗真菌剤は真菌感染の治療に用いられる。抗レトロウイルス療法に関して上に述べたように、このような治療は本発明のIL-2治療の前にまたは同時に使用されうる。
本発明におけるIL-2療法により達成された成果は、多くのパラメーターにより測定されうる。本発明のIL-2剤は、細胞のヘルパー／インデューサーT細胞機能を増強させる。ヘルパーT細胞は、様々なTエフェクター細胞を活性化し、IL-2およびIL-2レセプターの産生を増加させることを含む、抗原に対する細胞性反応を引き起こす。「J.Kuby,IMMUNOLOGY17-18（W.H.Freeman and Co.,New York 1992）」を参照のこと。本発明による療法を受けている患者にみられるIL-2レセプターの増加は、そのようなヘルパー／インデューサーT細胞機能の上昇と一致する。
実験によると、HIV感染患者において、末梢血リンパ球の反応性をリンパ球幼弱化形質転換およびIL-2産生により測定すると、始めに抗原、それからアロ抗原を排除できなくなり、そして最終的に免疫不全がひどくなるとフィトヘマグルチニンやポークウイードマイトーゲンのようなマイトーゲンを排除できなくなる（M.T.Lotze et al.,Cancer 58:2754-2772（1986）;H.C.Lane et al.,New England J.Med.313:79-84（1985）;M.Clerici et al.,J.Clin.Invest.91:759-65（1993）。アロ抗原およびマイトーゲンに対する反応性の低下は、組織培地中のCD4とCD8細胞の相対的な数の変化により少なくとも一部は説明されるが、この可溶性抗原に対する反応性の欠損は、精製CD4細胞の実験においてもみられる（H.C.Lane et al.,New England J.Med.313:79-84（1985））。実際、HIV感染に関する初期の免疫不全の一つは、この抗原を排除する反応能の欠損であり、正常なCD4数を持つ患者によく存在する（H.C.Lane et al.,New England J.Med.313:79-84（1985））。
断続的IL-2療法がインビトロでリンパ球機能を回復する能力を測定した。表2および図１に示したように、本発明の断続的IL-2療法は、そのおそらく欠損の逆の順序で幼弱化反応の改善に関する。
HIV患者においてみられるもう一つの現象は、ヒト白血球抗原-D関連（HLA-DR）陽性リンパ球が健常者の対照と比較して割合が増加していることである（A.Landay et al.,AIDS 4:479-497（1990）;J.V.Giorgi et al.,Clin.Immunol.Immunopathol 52:10-18（1989））。このことは、活性化され、おそらくは最終的に分化する、末梢血中のリンパ球の割合の増加を示している。このHLA-DRの増加は、CD8陽性細胞に主にみられ、悪い兆候かもしれない（D.P.Sites et al.,Clin.Immunol.Immunopathol 38:161-177（1986））。すべての患者でHLA陽性リンパ球のパーセントが治療前には上昇していた。
図２および表２に示したように、本発明の断続的IL-2療法により、HLA-DR陽性細胞の割合が減少する。このHLA-DR陽性細胞の減少は、HIVにおけるCD8リンパ球の活性化を制御する恒常性機構の異常の改善をIL-2が誘導したことを意味する。このレベルの低下は、IL-2療法終了後1ないし2ヶ月後にもみとめられる。
CD4陽性細胞、およびCD4とCD8両方に陽性な細胞のIL-2レセプターのレベルは、断続的IL-2療法中に増加した。このIL-2レセプターの正の制御は、IL-2の薬学的効果と類似しており、CD4は増加するがCD8は増加しない患者がいる一方、両方が増加する患者もいることの理由を説明しうる。IL-2レセプター発現細胞の増加もまた、幼弱化反応の改善の一つの理由となっているかもしれない。なぜならこのような反応は主に非反応性の細胞の補給に依存しており、そしてこのような細胞はIL-2レセプターを発現しているなら、主に活性化細胞から分泌されるIL-2に、より容易に反応しうるからである。
我々の観察は、CD4、CD8、HLA-DR、またはIL-2レセプター陽性細胞に変化がみられなかった、低用量の組換え体IL-2またはポリエチレングリコール（PEG）IL-2を連続的に投与した他の報告（H.Teppler et al.,J.Infect.Dis.167:291-298（1993）;H.Teppler et al.,J.Exp.Med.177:483-492（1993））とは異なっている。さらに、低用量のIL-2ではナチュラルキラー（NK）活性が増加することが示されているが（H.Teppler et al.,J.Infect.Dis.167:291-298（1993）;M.A.Caligiuri et al.,J.Clin Invest.91:123-132（1993））、我々はIL-2療法後のNKまたはLAK活性において、一致する変化を認められなかった（データは示していない）。
本発明のもう一つの面として、物の組み合わせが免疫不全または感染疾患を患う患者への投与のために提供されている。組み合わせは、患者に注入する溶液を保持するのに適した容器及び、約1.8から約24MUまでの用量でIL-2を薬学的に許容される担体中に含む液剤から成る。受容する患者に投与しうるような成分を「薬学的に許容される担体」と呼ぶ。無菌的なリン酸緩衝生理食塩水が、薬学的に許容される担体の一例である。その他の好適な担体は、当業者によく知られている。例えば、「アンセル（Ansel）ら、薬学的投与形態および薬物送達システム（PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS）、第5版（リーアンドフェビガー社（Lea＆Febiger 1990）」および「ゲナロ（Gennaro）編,レミングトンの薬学の科学（REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES）、第18版（マック出版社（Mack Publishing Company 1990）」を参照のこと。
物の組み合わせはさらに、約5日間にわたる連続注入により患者へIL-2剤の投与を指示する説明書を含む。この説明書はさらに、特定の疾患を標的とした療法を、注入の前または同時に患者に施すことを指示する。疾患の例としては、HIV感染、結核のようなマイコバクテリア感染、およびクリプトコックス症のような真菌感染がある。例えば、療法にはジドブジン投与のような抗レトロウイルス療法がある。
本発明のさらにもう一つの面として、IL-2療法中に免疫系の活性化状態を利用するための物の組み合わせが提供されている。本発明の態様として、組み合わせは、患者に注入する溶液を保持するのに適した容器、約1.8から約24MUまでの間の用量でIL-2を薬学的に許容される担体中に含む液剤、およびIL-2製剤の注入および、リンパ球のインサイチュー形質転換を起こすレトロウイルスベクターの投与を指示する説明書を含む。患者から細胞を取り出し、インビトロで形質転換し、患者に戻すという従来の当業者の遺伝子治療法と対照的に、本発明の組み合わせでは、患者に直接レトロウイルスベクターを投与し、インサイチューで起こる細胞の形質転換を起こすことができる。
本発明のこの態様においては、免疫系はまず上記のようなIL-2投与により活性化される。IL-2は、細胞の活性化およびDNAの合成を誘導し、その細胞をレトロウイルスベクターによる形質転換に対してより感受性にする。それから遺伝子工学によるレトロウイルスベクターを直接患者に投与する。このベクターは、患者自身の細胞のDNAに取り込まれ、次に投与された遺伝子が発現する。細胞をHIVのようなウイルスに対して耐性にする、または細胞がウイルスを攻撃できるようにするレトロウイルスベクターを、本方法により患者の系に導入することができる。プラスミドDNAもまた、レトロウイルスベクターの代わりに用いることができ、類似の効果および結果がみられる。
本方法は、細胞がベクターによる形質転換に対して最も感受性があるときに患者に投与する場合が最も効果的である。このような感受性は、DNA合成が最大になる期間に起こり、それは通常IL-2が投与されている期間中にみられる。
図４は、上記の投与量で5日間連続的にIL-2注入を受けた7人の患者のインビボで起こるDNA合成のレベルを示している。データの点はIL-2療法の前（PRE）、IL-2注入0日目（D/0）、IL-2注入5日目（D/5）、そして追跡調査（F/U）にとった。各ピークは、注入5日目のDNA合成のレベルに対応する。IL-2注入の5日目にみられるこの強力なインビボT細胞活性化は、患者に直接レトロウイルスベクターを投与することによりT細胞形質転換を起こすのに好適な期間であることのしるしである。
本発明は、本発明の特異的な因子を説明する以下の実施例を参照することにより、さらに解説されるが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
免疫不全患者の免疫系に対する断続的なIL-2投与効果の研究を行った。実験は、「アレルギーおよび感染症の国民協会（NIAID）」の組織審査会議（institutional review board）により承認され、すべての患者が実験の危険性の説明を受けた後に書面でインフォームドコンセントを提出した。
CD4数が200細胞/mm3以上で日和見感染を併発していなければ、HIV感染患者が登録に好適であった。CD4数のカットオフ値は、この群が免疫機能不全が重症である患者より免疫モジュレーターに対して反応しやすいことを示す初期の研究に基づいて選択した。
IL-2がHIV複製の強化を引き起こしうるという理由により、抗レトロウイルス療法、主にジドブジン（AZT）を実験の間中投与した。始めの評価は完全な変遷、物理学的試験、血液学的および化学的特徴、尿分析、免疫学的特徴、p24抗原レベルを含み、そして何人かの患者には血漿ウイルスの力価（Dewar et al.,Acq.Immune Def.Syndromes,5:822-828（1992）;R.Davey,Jr.et al.,P.N.A.S.,USA,in press）、または分岐DNA（bDNA）検定を用いた粒子関連血漿HIV RNAの定量（C.A.Pachl et al.,Abstract #1247,32nd INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,Oct.1992;M.S.Urdea et al.,NUCLEIC ACID RESEARCH SYMPOSIUM SERIES No.24,pages 197-200（Oxford University Press 1991））を行った。実験室における評価は、少なくとも1ケ月間繰り返した。
実施例1.初期毒性試験
天然および組換え体のIL-2を3から8週間、12MU/日までの投与量で患者に連続的に投与した。
これらのIL-2用量は耐えうるものであり、CD4数の一時的な増加がみられた（H.C.Lane et al.,J.Biol.Response Mod.3:512-516（1984））。この連続的IL-2療法の最後に得た骨髄生検により、療法前のサンプルと比較して相対的なリンパ球増加が示された。このことは、IL-2の効果は単に末梢血へのリンパ球の再分配だけではないことを示している。
実施例2.用量増加試験
用量増加試験では、1.8ミリオン国際単位（MU）/日から24MU/日の範囲の用量で、23人の患者に21日間または5日間組換え体IL-2（rIL-2;Chiron）を連続的に注入した。すべての患者は、最初のIL-2投与の少なくとも6週間前にジドブジン（100-200mg 5idまたはq4h）投与を始めた。
ジドブジンと組み合わせて21日間投与した場合、組換え体IL-2の最大耐量は12MU/日であり、ジドブジンと組み合わせて5日間投与した場合は18MU/日であった。用量に依存する毒性は、以前に示された組換え体IL-2治療単独に関するものに類似しており（J.P.Siegel et al.,J.Clin.Oncol.9:694-704（1991）;M.T.Lotze et al.,Cancer 58:2754-2772（1986））、肝臓および腎臓の機能障害、血小板減少症、好中球減少症、呼吸障害症そして重症のインフルエンザ様症候群を含む。
この相の間にCD4数に一時的な変化がみられるが、免疫パラメーターに一定の長期的変化はみられない（データは示していない）。p24抗原レベルまたは末梢血単核細胞からのHIVを培養する能力には変化がみられない。
実施例3.断続的IL-2療法
断続的IL-2療法のいくつかの投与実験を行った。連続注入による入院患者を基本に、始めは18MU/日の用量で8週間ごとに8人の患者（6人の男性と2人の女性）に組換え体IL-2を5日間投与した。組換え体IL-2は、中枢系静注または末梢静注により投与した。末梢注入を用いる場合は、組換え体IL-2は0.1％のアルブミンを含む水（D5W）中5％のデキストロースに入れた。ジドブジン（100mg bid）を同時に投与した。2人の患者には、実験の終わり付近にジダノシン療法（200mg bid）も用いた。
用いられたIL-2の用量は、一般に耐えうるものであり、癌療法に典型的に用いられる高用量の方法よりも毒性は低かった。しかしながら、主に発熱および重いインフルエンザ様症候群により、6人の患者では12または6MU/日に用量を減少させる必要があった。代謝異常、肝臓および腎臓機能不全、甲状腺機能不全、血小板減少症、および貧血を含む他の毒性がみられたが、それは穏やかなもので用量依存性ではなかった。
いくつかのパラメーターを結果の評価に用いた。IL-2治療のいくつかの投与方法による、リンパ球のサブ集団（CD4パーセントおよび数、CD8数、CD4：CD8比、リンパ球数、CD3数）の変化を測定した。CD3（T細胞）、CD4（ヘルパー−インデユーサーT細胞）、CD8（サプレッサー−細胞毒性T細胞）に対するモノクローナル抗体を用いたすでに記述されている技術により、フィコール−ヒパーグ（Ficoll-Hypague）により分離した末梢血単核細胞に対してフローサイトメトリーを行った（H.C.Lane et al.,Am.J.Med.78:417-422（1985））。用いた値は、3つの実験前値（Pre-IL-2）の平均およびもっとも最近のIL-2投与の4および8週間後に得られた2つの値の平均を表す。これらの結果は、表１に示した。ほとんどの患者について4週間値は8週間値より高い傾向がある。
8人の患者のうち6人はCD4数および／またはパーセントが一定の持続的な25％以上の増加を示した（表１および図１）。最も劇的な増加は、治療前の20％および458細胞/mm3（3つの値の平均）から、組換え体IL-2の6回の投与完了後の1年後の57％および2130細胞/mm3（2つの値の平均値）へというものである（図１Ａ）。
CD8数の変化はもっと多様であり、そしてCD4数の変化とは必ずしも一致しない。4人の患者は、主にCD4細胞の増加によりCD4：CD8比において増加（>25％）を示した（表１）。
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療法中止後24時間以内に測定した、組換え体IL-2療法の末梢血CD4数に対する即効性の効果は、数週間後に測定した長期的な効果よりはるかに劇的であった。2000細胞/mm3以上の最大CD4数は共通にみられたが、これらの増加は一時的であり（データは示していない）、おそらく再分配現象を反映している。
免疫学的パラメーターの変化もまた測定した。断続的IL-2療法がインビトロのリンパ球機能を回復する能力を評価するため、抗原やマイトーゲンに対する幼弱化反応を測定した。増殖試験は、1:800希釈のPWMまたは3μ/mlの破傷風毒素を6日間用いて、以前に記述されている破傷風毒素とポークウィードマイトーゲンが誘導するリンパ球の幼弱化トランスフォーメーション試験に従って行った（H.C.Lane et al.,Am.J.Med.78:417-22（1985））。用いた値は、3つの実験前値（Pre-IL-2）の平均と最も最近のIL-2投与の4および8週間後に得られた2つの値の平均を表す。結果は、表２に取り込まれた［3H］チミジンの正味のＣＰＭとして示した。ＩＬ−２レセプター（IL-2r）およびヒト白血球抗原-D関連（HLA-DR）発現について陽性な細胞のパーセントを、CD25（p55 IL-2レセプター）およびHLA-DRに対するモノクローナル抗体を用いて、単色蛍光活性化セルソーター（FACS）分析により決定した。FACS分析は、リンパ球のゲート制御である。これらの結果も表２に示した。
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表２および図１に示したように、IL-2療法は、おそらく欠損の逆の順序で幼弱化反応の改善に関する。このように、PWMに対する反応性を欠損しているか微弱である5人の患者のうち4人（80％）は、実験中に活発な一定の反応を示し、破傷風毒素抗原の排除に非反応性7人のうち2人（29％）は、一定の反応をするようになった。
HLA-DR陽性のリンパ球のパーセントは、8人の患者全員で実験前より上昇した（20％以上）（表２）。興味深いことに、IL-2療法の間、IL-2完了の1または2ヶ月後に測定したHLA-DR陽性の細胞の割合が、5/8の患者で減少した（初期値の25％以上）（表２および図２）。同時に、IL-2レセプター（IL-2r）（p55）陽性細胞の割合が、すべての患者で連続的に増加した（表２および図２）。一人の患者では、この増加は最小で（患者５、表２）、この患者にはCD4数または幼弱化反応にほとんど改善の証拠がみられなかった。この同じ患者は、HLA-DR陽性細胞の割合においても最小の減少しか示さなかった。
3人の患者における二色FACS分析によると、実験前にはCD8陽性細胞は主要なHLA-DR陽性集団であり、そしてこのマーカーの減少の主要な原因であった（図２Ｂ）。患者１および患者２（図２Ｂ）では、IL-2療法の間に増加したIL-2レセプター（IL-2r）はほとんどすべてCD4陽性細胞においてであったが、患者３は、CD4およびCD8細胞両方においてIL-2ｒの増加を示した。このIL-2ｒの正の制御は、IL-2の薬学的効果と類似しており、それにより患者１および２はCD4では増加したがCD8では増加せず、患者３は両方で増加した理由が説明されうる。
図１−３は、個々の患者の付加的な結果を示している。
図１は、患者１および３の、一年の断続的IL-2療法の間のCD4細胞数、および破傷風毒素とPWMに対する幼弱化反応の変化を示している。矢印は、始めは18MUの用量で、24時間にわたる連続的IL-2注入の5日間ごとの開始を示している。示した値は、各IL-2投与の４または8週間後に得られた結果を表し、週8のサンプルは、次回のIL-2投与の開始の直前に取り出した。
図１Ａは、CD4細胞が顕著に増加し、そして両方の刺激に対するリンパ球の幼弱化形質転換が持続的に改善した患者１の結果を示している。最後のデータの点は、IL-2の6回目の投与の15週間後（週59）であり、その点において患者のCD4数は1500細胞/mm3以上を維持している。
図１Ｂは、PWMに対するリンパ球幼弱化形質転換は改善されたが破傷風毒素に対しては改善されなかった、患者３の結果を示している。彼のCD4数は、6回目のIL-2投与後までは安定したままでその時点から増加した。週38に、この患者の抗レトロウイルス療法にジダノシンを加えた。
図２Ａは、一年のIL-2療法間の患者２のリンパ球細胞表面におけるIL-2レセプター（CD25）およびHLA-DRの発現の変化を示している。示した結果は、IL-2投与の4および8週間後に得られたサンプルについて、表２で述べたモノクローナル抗体を用いた単色FACS分析により得られたものである。HLA-DR陽性細胞の割合の持続的な低下は、2回目のIL-2投与の後に始まった。IL-2レセプター陽性細胞の割合は、4回目のIL-2投与後に実質的に増加した。
図２Ｂは、IL-2療法前と週48（5回目のIL-2投与の5週間後）に得た患者２の凍結細胞についての、IL-2レセプター（IL-2ｒ）およびHLA-DRの発現を二色FACS分析により示している。示されているように、この患者のIL-2ｒの増加はすべてCD4細胞上の発現の増加によるもので、HLA-DR発現の減少は、主にCD8細胞上の発現の減少によるものであった。CD3＋/IL-2r＋細胞の正常値は4.4±1.5％であり、CD3＋/HLA-DR＋細胞については8.7±2.9％である。
図３は、患者２、３、４、６、および８のIL-2療法間のウイルスマーカーの変化を示している。各IL-2投与の4および8週間後に得たサンプル、および5日間の各IL-2投与開始の5日後または6日後（矢印）に得たサンプルについての結果を示している。p24抗原レベルは免疫複合体解離試験（クールター社Coulter Corporation、フロリダ州、ハイアレア）により、粒子関連HIV RNAレベルはbDNA信号増幅試験［カイロン社（Chiron Corporation）、カリフォルニア州、エメリービル（Emeryville）］を用いて凍結サンプルについて測定した。（C.A.Pachl et al.,Abstract 1247,32nd INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,Oct.1992;M.S.Urdea et al.,NUCLEIC ACID RESEARCH SYMPOSIUM,Series 24,Oxford University Press,pages 1927-200（1991））
簡単に述べると、ウイルスを卓上マイクロ遠心分離機（Heraeus Contifugeモデル17RS、ローター3753；23,500xg、1時間）により血漿から集める。得られたウイルスのペレットを、pol遺伝子配列に相補的な標的プローブを含む220μｌのプロテアーゼK/リチウムラウリルスルホン酸緩衝液で溶解し、96穴プレートのマイクロウエルに移した。53度で一晩インキュベートする間に、RNA標的を特異的捕獲プローブを介してマイクロウエルの表面に捕獲させた。ウエルを洗浄し、続いて分岐DNA増幅剤とハイブリッド形成させ（30分）、それからアルカリホスファターゼ標識プローブとハイブリッド形成させた（15分）。最後に、化学蛍光基質であるジオキセタンを各ウエルに加え、酵素により引き起こされる発光を蛍光測定器で測定した。HIV RNAの量（RNA相当量/ml血漿として）は、標準曲線との比較を基に計算した。信号は、標品中に存在するウイルスRNAの量に直接比例した。すべてのサンプルがすべての時点で使用できるわけではなかった。
図３Ａは、IL-2療法中にp24抗原血症に有意な変化がみられなかったことを示している。図３Ｂは、粒子関連血漿HIV RNAがIL-2療法直後（矢印）に一時的に増加し、それから基線に戻る傾向があることを示している。すべての患者が実験の間中、ジドブジン投与を受けた。患者３の週38でのジダノシンの付加は、血漿粒子関連RNAレベルの実質的で持続的な減少に関連するものであった。
連続的にp24抗原レベル（図３Ａ）またはウイルス血症（データは示していない。））を測定することにより評価したところ、複数回のIL-2療法の間に末梢血全体のウイルス負荷に一定の変化はみられなかった。一年の治療の間にp24抗原レベルにおいて、一人の患者は段階的な減少を示し、二人は段階的な増加を示した。他の５人の患者は、p24抗原血症に対して常に陰性のままであった。
p24抗原レベルは血漿のウイルス負荷における急性の変化に対して感受性はないようなので、HIV RNAを定量する最近開発された分岐DNA試験を用いて、6人の患者の凍結血漿について試験した（図３Ｂ）。「C.A.Pachl et al.,前述;M.S.Urdea et al.,前述」を参照のこと。ほとんどの患者で、IL-2投与の終了直後に粒子関連HIV RNAに一定の増加が認められた。この増加は、p24抗原レベルの増加に関連しておらず、ほとんどいつも一時的であり、1および2ヶ月後の追跡調査では基線に戻る。このウイルスRNAの一時的な増加の医学的重要性は現在においては不確実であるが、リンパ球の活性化後のHIVの放出を表しているようである。または、それはリンパ節またはその他の部位から血液へのウイルスの再分配を表しているのかもしれない（G.Pantaleo et al.,Nature 36:365-71（1993））。
要約すると、6人の患者はIL-2療法によりCD4数および／またはパーセントにおいて持続的な増加を示し、一人の患者では、一年の治療の間に458細胞/mm3から2130細胞/mm3への増加を示した。CD4細胞数の増加に加えて、CD4機能の測定においても改善がみられた。当初非反応性であった5人の患者のうち4人は、ポークウイードマイトーゲンに対する幼若化反応を回復し、当初非反応性であった7人の患者のうち2人は、破傷風毒素に対する反応性を回復した。このように、本発明によるIL-2療法は、HLA-DRを発現しているリンパ球の割合を減少させ、p55 IL-2レセプター陽性のCD4リンパ球の割合を増加させる。p24抗原とウイルス血症の試験ではHIV負荷に変化は検出されなかったが、各注入の終わりにおける新しい、感受性の高い分岐DNA検定により血漿HIV RNAに一時的ではあるが一定の増加が検出された。
患者は3から7回のIL-2投与を受け、26から60週までの範囲の追跡調査を受けた。いずれの患者も実験の間AIDSの顕著な特徴である日和見感染にかからなかった。従って、本発明によるIL-2の使用は、HIV感染の特徴である深刻な免疫学的異常、特にCD4細胞欠損を回復させた。
さらに別の実験で、断続的IL-2療法が免疫系を強化するということが証明された。進行中の実験の目的は、HIV感染患者における断続的IL-2療法の効果を調べることである。実験の始めに、31人の患者が抗レトロウイルス療法と断続的IL-2療法の投与に選出され（Ａ群）、29人の患者が抗レトロウイルス療法のみの投与に選出された（Ｂ群）。この実験においては、患者は約8週間ごとに連続的注入によりIL-2を投与される。IL-2の用量は、3から5日間で、24時間に6から18MUまでの範囲である。図５は、継続中の実験から得られるであろうデータの約3分の1を示している。図５に示したように、IL-2療法を受けた患者ではT細胞数が増加しているが、IL-2療法を受けなかった患者ではT細胞数が減少している。
別の実験で、200以上のCD4数を持つ27患者の集団が、抗レトロウイルス療法と共に約8週間ごとにIL-2の連続注入を受けた。IL-2の用量は、3または5日間で、24時間に6から18MUまでの範囲である。IL-2療法の6ヶ月後、19人の患者（70％）で25％以上CD4数が増加し、16人の患者（59％）で50％以上CD4数が増加し、そして9人の患者（33％）で100％以上CD4数増加した。
特発性CD4リンパ球欠損症の患者においても研究を行った。患者は、24時間当たり6から18MUまでという範囲の濃度で連続IL-2注入を約１ヶ月受けた。図６は、T細胞数がIL-2療法の間に増加したことを示している。
結論として、臨床実験により免疫機能の増幅においてIL-2療法が有効であることの証拠が提供された。
実施例4.組み合わせIL-2／遺伝子療法
インターロイキン−２は、6日間、6-18MU/日の用量で連続注入により投与される。IL-2注入の5日目に、患者に複製能を欠いた両種性レトロウイルス、または細胞をHIV感染に抵抗性にするような遺伝子を含むプラスミドDNAを静脈注射により投与する。細胞の活性化状態のため（図４）、レトロウイルスまたはプラスミドの遺伝情報は細胞の遺伝情報に組み込まれ、細胞をHIV感染に対して抵抗性にする。
この方法は、特異的な抗原レセプターの遺伝情報を含む組換え体レトロウイルスまたはプラスミドを利用することにより、免疫系の抗原特異的レパートリーを拡大するためにも用いられうる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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