(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のＩｉタンパク質をコードする第二のｍＲＮＡ分子に相補性である第一のｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含んで成る発現可能な逆向きの遺伝子構築物であって、第一のｍＲＮＡ分子が、第二のｍＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションしてそれにより第二のｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する能力を有し、かつ第一のｍＲＮＡ分子が、翻訳開始部位から少なくとも第二エクソンの一部までを含む第二のｍＲＮＡ分子と相補性である、ことを特徴とする構築物。
【請求項２】
ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項１記載の発現可能な逆向きの遺伝子構築物。
【請求項３】
第一のｍＲＮＡ分子が、Ｉｉコーディング配列の長さ全体に沿って第二のｍＲＮＡ分子と相補性である、請求項２記載の発現可能な逆向きの遺伝子構築物。
【請求項４】
第一のｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列が配列番号４を含んで成る、請求項１記載の発現可能な逆向きの遺伝子構築物。
【請求項５】
発現可能な逆向きの遺伝子構築物を含むＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞であって、該発現可能な逆向きの遺伝子構築物が、哺乳類のＩｉタンパク質をコードする第二のｍＲＮＡ分子に相補性である第一のｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含んで成り、第一のｍＲＮＡ分子が、第二のｍＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションしてそれにより第二のｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する能力を有し、かつ第一のｍＲＮＡ分子が、翻訳開始部位から少なくとも第二エクソンの一部までを含む第二のｍＲＮＡ分子と相補性である、ことを特徴とするＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項６】
クラスII陽性の抗原提示細胞が悪性細胞である、請求項５記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項７】
悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫および黒色細胞腫の分類から成る群から選択される、請求項６記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項８】
抗原性の腫瘍関連ペプチドがＭＨＣクラスIIタンパク質と組み合わさって細胞表面上に呈示される、請求項６記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項９】
ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求５記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項１０】
第一のｍＲＮＡ分子が、Ｉｉコーディング配列の長さ全体に沿って第二のｍＲＮＡ分子と相補性である、請求項５記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項１１】
第一のｍＲＮＡ分子が第二のｍＲＮＡ分子の一部に相補性であり、第一のｍＲＮＡ分子が、翻訳開始部位から少なくとも第二エクソンの一部までを含む第二のｍＲＮＡ分子と相補性である、請求項５記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項１２】
第一のｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子が配列番号４のＤＮＡ分子を含んで成る、請求項５記載のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞。
【請求項１３】
ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞の表面上にＭＨＣクラスIIタンパク質と組み合わさった自己決定基ペプチドの呈示をもたらす方法であって、
ａ）ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞を提供すること；そして
ｂ）ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞に、発現可能な逆向きの遺伝子構築物であって、哺乳類のＩｉタンパク質をコードする第二のｍＲＮＡ分子に相補性である第一のｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含み、かつ第一のｍＲＮＡ分子が、第二のｍＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションする能力を有することにより第二のｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するものであり、第一のｍＲＮＡ分子が、翻訳開始部位から少なくとも第二エクソンの一部までを含む第二のｍＲＮＡ分子と相補性を有する、前記遺伝子構築物を導入する
ことを含んで成る方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第一のｍＲＮＡ分子が、Ｉｉコーディング配列の長さ全体に沿って第二のｍＲＮＡ分子と相補性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
第一のｍＲＮＡ分子が第二のｍＲＮＡ分子の一部分に相補性であり、その部分がＩｉコーディング配列の完全な長さ未満を含んで成る請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
第一のｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子が配列番号４のＤＮＡ分子を含んで成る、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
ａ）ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞を提供すること；
ｂ）ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞に、発現可能な逆向きの遺伝子構築物であって、哺乳類のＩｉタンパク質をコードする第二のｍＲＮＡ分子に相補性である第一のｍＲＮＡ分子が、第二のｍＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションする能力を有することにより第二のｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するものであり、第一のｍＲＮＡ分子が、翻訳開始部位から少なくとも第二エクソンの一部までを含む第二のｍＲＮＡ分子と相補性を有する、前記遺伝子構築物を導入すること、
ｃ）段階ｂ）のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞を可溶化すること；
ｄ）ＭＨＣクラスII分子を免疫精製すること；そして
ｅ）段階ｄ）のＭＨＣクラスII分子から酸処理により自己決定基ペプチドを溶出すること、
を含んで成る自己決定基ペプチドの単離方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
特定の抗原に対する免疫応答はＴリンパ球によるそれらの抗原のペプチド断片の認識により調節される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）内では、プロセシングされた抗原のペプチド断片が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の抗原ペプチド結合部位に結合されたようになる。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、その後、ヘルパーもしくは細胞毒性Ｔリンパ球上のＴ細胞レセプターにより（外来ペプチドおよび提示するＭＨＣ分子の隣接する表面の双方の）認識のために細胞表面に輸送される。
２つのクラスのＭＨＣ分子が同定されている。クラスＩのＭＨＣ分子は、クラスＩのＭＨＣ分子のほぼ合成時に、小胞体において感染性ウイルスのような内因的に合成されたタンパク質からペプチドを受領する。ＭＨＣクラスＩの複合体化されたペプチドはＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔリンパ球に提示され、これはその後活性化されたようになり、そしてそれらのウイルスを発現する細胞を直接殺し得る。しかしながら、ＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位は、インバリアント鎖タンパク質（Ｉｉ）によりほぼ合成時に封鎖される。それらのＭＨＣクラスII−Ｉｉタンパク質複合体は後ゴルジ区画(post-Golgi compartment)に輸送され、そこでＩｉがタンパク質分解により遊離され、また、特定の抗原ペプチドがＭＨＣクラスII分子に結合される。それらの抗原ペプチドは、通常、非特異的エンドサイトーシスを介するかもしくは抗原提示細胞上の特定の細胞表面レセプターとの相互作用によるかのいずれかでインターナリゼーションされている外因性抗原に由来する。例えば、Ｂリンパ球上の表面免疫グロブリンは無傷のタンパク質抗原を認識する。抗原がその後インターナリゼーションされ、分解され、そして抗原提示細胞のＭＨＣクラスII分子に結合される。それらの抗原ペプチド−ＭＨＣクラスII分子複合体は、抗原提示細胞の表面上で再発現され、そしてＣＤ４陽性のヘルパーＴリンパ球により認識される。ヘルパーＴリンパ球はその後、物理的接触およびサイトカインの放出を介して細胞毒性Ｔリンパ球もしくはＢリンパ球を助ける。
抗原ペプチドのＭＨＣクラスII分子への結合はインバリアント鎖によりいくつかの方法で調節される。インバリアント鎖は小胞体におけるそれらの合成時にＭＨＣクラスII分子に結合する。Ｉｉは、ＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位への外因性抗原ペプチドの装填と協調された段階としてのタンパク質分解性の切断により、ＭＨＣクラスII分子から後ゴルジ区画に遊離される（ダイバタ（Daibata）ら、Molecular Immunology 31: 255-260(1994)；シュー(Xu)ら、Molecular Immunology 31: 723-731(1994)）。Ｉｉタンパク質は、細胞質で得られかつ小胞体に輸送される内因性抗原ペプチドの提示を防止する。これらの内因的に得られた抗原ペプチドはＭＨＣクラスII分子に結合し得ない。なぜなら、Ｉｉ鎖は、それらが、外因性の抗原性ペプチドの装填が起こる特定の後ゴルジ区画に到達するまでＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位を封鎖するからである。その区画において、Ｉｉのタンパク質分解性の分解／遊離は、特異的に選択された外因性抗原からの抗原ペプチドでのＭＨＣクラスII分子の装填と協調された過程で起こる。
通常の条件下では、（自己免疫疾患に潜在的につながる自己決定基をもつ）内因性ペプチドはＭＨＣクラスII分子に結合されない。なぜなら、Ｉｉタンパク質は常に新生ＭＨＣクラスII分子と同時に合成されるからである。かように、ＭＨＣクラスII分子中の自己決定基ペプチド（抗原提示細胞（その表面上にそのペプチドが最終的に提示される）内で合成およびプロセシングの双方が行われるペプチド）との複合体は、身体の免疫監視系により決して見られたことがない。免疫寛容は、従って、こうした決定基に対しては現在われない。Ｉｉタンパク質の発現が、自己免疫疾患に罹りやすいある細胞型においてその後阻害される場合は、こうした内因性の自己決定基はＭＨＣクラスII分子により提示されるようになるとみられ、それらの内因性抗原に対する自己免疫応答を開始する。悪性細胞におけるこうした効果を操作することにより、内因性腫瘍抗原に対して生じる「自己免疫応答」は、それらの腫瘍細胞の増殖の制限もしくは排除のいずれかにおいて治療上有用である。
増大されたＭＨＣクラスII発現の治療効果がＭＨＣクラスII陰性の細胞において実証されている（クレメンツ(Clements)ら、Immunol．149: 2391-2396（1992）；バスカー(Baskar)ら、Cell．Immunol．155: 123-133（1994）；およびバスカー(Baskar)ら、J．Exp．Med．181: 619-629（1995））。それらの研究において、ＭＨＣクラスII陰性のマウス肉腫へのＭＨＣクラスII分子の遺伝子のトランスフェクションは、ＭＨＣクラスII陽性のしかしＩｉ陰性の腫瘍細胞株を生じた。ＭＨＣ適合性宿主へのこれらの細胞の注入は親腫瘍の遅延された増殖につながった。肉腫細胞株へのＭＨＣクラスII遺伝子と一緒のＩｉタンパク質の遺伝子のコトランスフェクションは、ＭＨＣクラスII遺伝子の腫瘍治療効果を阻害した。なぜなら、Ｉｉ鎖が内因性腫瘍抗原の提示を封鎖したからである。
発明の要約
一局面において、本発明は、発現可能な逆向きの遺伝子構築物、および、ＩｉのｍＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションしてそれによりＩｉのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する能力を特徴とするオリゴヌクレオチドに関する。これらの組成物は一般にＩｉ発現の阻害剤と称される。ＩｉのｍＲＮＡに対し作用することにより、これらの阻害剤は、処理された細胞においてＩｉタンパク質の発現を約90％まで低下させる。Ｉｉの発現の低下は、免疫系により別の方法で決して確認されていないであろう、内因性の、Ｔ細胞に提示された抗原決定基でのＭＨＣクラスII分子の装填を可能にする。
別の局面において、本発明は、Ｉｉ発現の阻害剤を含有するＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞に関する。とりわけ重要なクラスのＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞は、悪性のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞（例えば、白血病、リンパ腫および黒色細胞腫）である。
本発明はまた、ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞の表面上でのＭＨＣクラスIIタンパク質と組み合わさって自己決定基ペプチドの呈示をもたらす方法にも関する。こうした方法において、Ｉｉ合成の特異的阻害剤がＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞に導入される。特異的阻害剤は、直接もしくは間接的に、ＩｉをコードするｍＲＮＡとの二本鎖分子(duplex molecule)の形成により機能する。二本鎖分子の形成は翻訳レベルでＩｉ合成を阻害するよう機能する。
本発明の他の局面は、ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞における悪性腫瘍の処置のための治療法、および、ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞から単離される自己決定基ペプチドを包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）およびＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）の構築で使用されたクローニング戦略の図解的表示である。
発明の詳細な記述
本発明は、Ｉｉの発現が細胞において特異的かつ効率的に阻害され得る、そしてこうした阻害が治療計画において活用され得るという発見を基礎とする。上で検討されたように、ＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位は、ＭＨＣクラスIIの合成時点においてＩｉ結合により封鎖される。クラスIIのＭＨＣ−Ｉｉ複合体は後ゴルジ区画に輸送され、そこでＩｉがタンパク質分解により遊離され、そして（通常はインターナリゼーションされた外因性抗原からの）特異的抗原ペプチドがＭＨＣクラスII分子に結合される。こうして、Ｉｉタンパク質は、細胞質で得られそして小胞体に輸送される内因性抗原ペプチドの提示を防止する。通常、これらの内因性に得られる抗原ペプチドはＭＨＣクラスII分子に結合し得ない。なぜなら、Ｉｉ鎖は、それらが後ゴルジ区画に輸送されるまで、ＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位を封鎖するからである。
本明細書に開示されるように、Ｉｉ発現を阻害することにより、今や、内因的に合成されたタンパク質からのペプチドでＭＨＣクラスII分子を装填することが可能である。内因性に合成されたタンパク質からの抗原ペプチドでＭＨＣクラスII分子を装填する能力は、個人の自身の免疫系による破壊のために個人の不要な細胞（例えば悪性細胞）の標的とすることを可能にする。
本発明の方法および組成物は一般に哺乳類の系に応用可能である。Ｉｉタンパク質をコードするｃＤＮＡは多様な哺乳類の系から単離されたｍＲＮＡから生じられており、また、その核酸配列が決定されている（シンガー(Singer)ら、EMBO J．3: 873-877（1984）；シュトゥルビン(Strubin，M.)ら、EMBO J．3: 869-872（1984）；ヘンケス(Henkes，W.)ら、Nucl．Acids Res．16: 11822（1988））。Ｉｉをコードする哺乳類の遺伝子は高度に保存されていることが決定されている。例えば、マウスおよびヒトのＩｉをコードするｃＤＮＡ配列はおよそ85％相同であることが決定されている。マウスとラットの配列との間の保存の程度は90％より大きい（ヘンケス(Henkes，W.)ら、Nucl．Acids Res．16: 11822（1988））。
一局面において、本発明は発現可能な逆向きの遺伝子構築物に関する。逆向きの遺伝子構築物は発現可能なＤＮＡ構築物であり、その発現は野生型ＩｉをコードするｍＲＮＡ分子に相補性であるｍＲＮＡ分子を生じる。Ｉｉを産生する細胞において同時発現される場合、発現された逆向きの遺伝子構築物のｍＲＮＡ産物はＩｉをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションし得、それにより二本鎖構造を形成する。この二本鎖構造の形成はＩｉをコードするｍＲＮＡの翻訳に対する阻害効果を有する。この二本鎖形成の正味の効果は細胞におけるＩｉタンパク質レベルの低下である。細胞中の低下されたＩｉのレベルは、ＭＨＣクラスIIを内因的に合成された抗原からの抗原ペプチドで装填することを可能にする。
好ましくは、逆向きの遺伝子構築物は、その中でこの逆向きの遺伝子構築物が発現されることができる細胞型に対応する生物体からのＩｉをコードするｃＤＮＡを使用して合成される。上に示されたように、ＩｉをコードするヒトのｃＤＮＡ配列が公表されている。哺乳類のＩｉ遺伝子間の高程度の保存に照らして、実際上いかなる目的の哺乳類の系からのｃＤＮＡライブラリーも、対応するＩｉ遺伝子を単離するために（例えば起源がヒトもしくはマウスの）Ｉｉのプローブでスクリーニングされ得る。
逆向きの遺伝子構築物の構築における使用のための発現ベクターの背景の選択はその中で発現が所望される細胞型により影響される。大きな多様性の適切なベクターが入手可能であり、また、当業者は過度の実験の必要なしに多くの入手可能なもののなかから適切なベクターを選択することが可能であるとみられる。同様に、効率的な発現に必要とされる調節シグナルは、その中で発現が所望される細胞型に基づいて選択される。こうした調節シグナルの必要条件は当該技術分野で公知であり、かつ、こうしたシグナルの制限されない供給源が一般に既知である。
逆向きの遺伝子構築物は、ＩｉのｃＤＮＡ断片を、野生型の向きに比較してプロモーターに関して逆の向きで発現ベクターに導入することにより作成される。ｍＲＮＡは相補的分子にハイブリダイゼーションするその能力を妨害し得る複雑な二次構造をとることが知られているという事実に照らせば、完全長の逆向きの遺伝子構築物（すなわち、その長さ全体に沿ってＩｉをコードするｍＲＮＡに相補性であるｍＲＮＡ分子をコードする逆向きの遺伝子構築物）が常に最も効率的な設計であるわけではない。Ｉｉ阻害のためのより効率的な構築物を開発するためには、逆向きの遺伝子構築物に導入される場合にＩｉ合成の阻害において有効である完全長未満のｃＤＮＡ断片を同定するために慣例の実験を実施することがしばしば必要である。
完全長未満の構築物の設計において、ＩｉをコードするｍＲＮＡの機能的に重要な領域を同定すること、そして、この逆向きの遺伝子構築物によりコードされるｍＲＮＡが機能的に重要な領域に相補性であるように逆向きの遺伝子構築物を設計することがしばしば望ましい。例えば、機能的に重要な領域は、ｍＲＮＡのリボソーム認識に関与する領域、翻訳開始部位、ｍＲＮＡのスプライス部位、およびポリアデニル化に必要とされる翻訳終止コドンの３’の領域を包含する。
真核生物細胞においては、ｍＲＮＡとの最初のリボソームの連動(engagement)の機構は原核生物における機構と異なる。真核生物においては、翻訳開始点として使用されるのは一般に最も５’のＭｅｔを指定するコドンである。真核生物のｍＲＮＡの５’端は、５’−５’ピロリン酸結合における第一の修飾されないヌクレオチドに結合されたメチル化グアニル酸残基を含む修飾端（しばしば５’キャップと称される）を有する。実験は、例えば、５’キャップを欠くｍＲＮＡが効率的に翻訳されないことを実証している。従って、真核生物における翻訳の開始は、ＡＵＧコドンを取り巻くコンセンサス配列の位置が続く５’キャップの認識を必要とするようである。近くのタンパク質コーディング配列のリボソーム認識のためのコンセンサス配列は「５’−ＡＣＣＡＵＧＧ−」である。
一次転写物内のスプライス部位の位置は、（一次転写物をコードする）ゲノムＤＮＡ配列を（プロセシングされた転写物から生じられる）対応するｃＤＮＡ配列と比較することにより決定され得る。こうした比較で同定される不連続点はイントロン／エクソンの境界を定める(mark)。こうした境界の研究は、イントロン／エクソンの境界での中程度に保存された短いコンセンサス配列、および３’スプライス部位のすぐ上流のピリミジン豊富な領域についての性向を示している。加えて、普遍的に保存されるヌクレオチドが、最初の２個（ＧＵ）および最後の２個（ＡＧ）のイントロン位置に見出される。
ポリアデニル化は、ポリ（Ａ）シグナルすなわちＡＡＵＡＡＡ、およびポリＡ付加部位から下流の約30ヌクレオチドを必要とする。ポリアデニル化はｍＲＮＡを安定化し、それにより細胞内でのその半減期を延長する。
以下に続く例証の節に記述される実験において、マウス細胞でのＩｉ発現の阻害のための逆向きの遺伝子構築物が設計されかつ試験された。マウスＩｉタンパク質は215アミノ酸残基から成る（シンガー(Singer)ら、EMBO J．3: 873-877（1984））。かように、この分子をコードする完全長のｃＤＮＡは645塩基対のコーディング配列から成る。
以下に続く実施例において、１個の完全長の逆向きの遺伝子構築物、および１個の完全長未満の逆向きの遺伝子構築物が設計されかつ試験された。より具体的には、ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）逆向きの遺伝子構築物はマウスｍＩｉのｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＥＸＶ−ｍＩｉ３１からのEcoRI断片を含有する（ミラー(Miller)とジャーメイン(Germain)、J．Experi．Med．164: 1478-1489（1986））。この構築物は完全なマウスＩｉのｃＤＮＡのコーディング配列を逆の向きで含有する。マウスＡ２０細胞（キム(Kim)ら、J．Immunol．122: 549-554（1979））で発現される場合、完全長の逆向きの遺伝子構築物ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）は、実施された２回の試験でＩｉ発現を39.5％および71.9％阻害すると決定された。
完全長未満の構築物すなわちＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）を、上流の５’非翻訳配列の47ヌクレオチドおよびＩｉコーディング配列の最初の97ヌクレオチドを含有するＩｉのｃＤＮＡ断片を生じるようにＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）をSalIおよびSacIで酵素切断することにより生じさせた。マウスＡ２０細胞で発現された場合、完全長未満の逆向きの遺伝子構築物ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）は、実施された２回の試験でＩｉ発現を89.3％および95.3％阻害すると決定された。
前で検討されたように、翻訳を阻害する逆向きの遺伝子構築物を使用する内因性タンパク質の発現の阻害の効率は、大きな程度、その内因性タンパク質をコードするｍＲＮＡの二次構造に依存性である。本明細書に記述される実験は、Ｉｉタンパク質が逆向きの遺伝子構築物による発現の阻害をとりわけ受けやすいことを示す。この結論は、完全長の逆向きの遺伝子構築物でさえＩｉ発現を有意に阻害する能力を表したという事実を基礎とする。さらに、逆向きの遺伝子構築物の短くされた改変体はより高い阻害さえ生じた。この実験的作業は、哺乳類のＩｉ遺伝子の間の既知の高程度の保存と一緒になって、ヒトの系を包含する他の哺乳類の系での逆向きの遺伝子構築物の活性の妥当な予測物となると考えられ得る。
逆向きの遺伝子構築物に加え、ＩｉのｍＲＮＡの機能的に重要な領域もしくはその近くで特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドが、翻訳レベルでＩｉ発現を阻害するのに使用され得る（例えば、ヘレネ(Helene)とトゥールメ(Toulme)、Biochimica et Biophysica Acta 1049: 99-125、（1990）；およびエグチ(Eguchi)、Annu．Rev．Biochem．60: 631-652、（1991）を参照）。ＩｉのｍＲＮＡの多様な機能的に重要な領域がこの様式で標的にされ得る。
例えば、翻訳開始部位、および／もしくはリボソーム認識に関して重要な上流領域に相補性のオリゴヌクレオチドが、翻訳を阻害するのに使用され得る。同様に、スプライシングおよびポリアデニル化に関して重要な特定の配列に相補性のオリゴヌクレオチドが、翻訳レベルでＩｉ発現を阻害するのに使用され得る。
以下に続く例証の節で検討されるように、Ａ２０細胞を、配列番号１〜３に開示されるオリゴヌクレオチドを含む混合物の存在下に96穴マイクロプレート中（穴あたり細胞105個）でインキュベーションした。この混合物中の90μMの各オリゴヌクレオチドの濃度で、Ｉｉ発現が約66％阻害されると決定された。配列番号1に指定されるオリゴヌクレオチドは、翻訳開始に関して重要であると考えられるＩｉのｍＲＮＡの領域に相補性である。配列番号２に指定されるオリゴヌクレオチドは、イントロンのスプライシングに関して重要であると考えられるＩｉのｍＲＮＡの領域に相補性である。最後に、配列番号３に指定されるオリゴヌクレオチドはポリアデニル化に関して重要であると考えられるＩｉのｍＲＮＡの領域に相補性である。
前に論考されたように、抗原ペプチドのＭＨＣクラスII分子との結合はインバリアント鎖によりいくつかの方法で調節される。インバリアント鎖は小胞体におけるそれらの合成の時点でＭＨＣクラスII分子に結合する。Ｉｉは、ＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位における外因性抗原ペプチドの装填との協調された段階としてのタンパク質分解性の切断により、ＭＨＣクラスII分子から後ゴルジ区画中に遊離される。Ｉｉタンパク質は、細胞質で得られそして小胞体に輸送される内因性抗原ペプチドの提示を予防する。これらの内因性に得られる抗原ペプチドはＭＨＣクラスII分子に結合し得ない。なぜなら、Ｉｉ鎖は、それらが外因性抗原ペプチドの装填が起こる特定の後ゴルジ区画に到達するまでＭＨＣクラスII分子の抗原ペプチド結合部位を封鎖するからである。その区画において、Ｉｉのタンパク質分解性の分解／遊離が、特異的に選択された外因性抗原からの抗原ペプチドでのＭＨＣクラスII分子の装填と協調された過程で起こる（ダイバタ(Daibata)ら、Molecular Immunology 31: 255-260（1994）；およびシュー(Xu)ら、Molecular Immunology 31: 723-731（1994））。
目的の細胞におけるＩｉの発現を阻害することにより、内因性の自己決定基はＭＨＣクラスII分子に装填し得、そしてＭＨＣクラスII分子により細胞表面上に提示されるようになり得る。このシナリオは内因性自己決定基ペプチドに対する免疫応答の刺激をもたらす。悪性細胞におけるこの効果を工作することは、内因性腫瘍抗原に対する「自己免疫応答」をもたらす。こうした応答は腫瘍細胞の成長を制限するもしくは排除するかのいずれかにおいて治療上有用である。
疾患の治療のためアンチセンス構築物を使用する他の方法と比較してのこの治療法の重要な価値は、開示された組成物の一時的もしくは随時の使用が腫瘍特異的もしくは腫瘍に関連する決定基に対する免疫系の刺激(priming)につながるということである。こうした刺激事象の後、免疫系は、付加的なアンチセンス治療の非存在下に腫瘍を拒絶することが可能である。対照的に、疾患（例えばＨＩＶのようなウイルス性疾患）の制御のためのアンチセンス治療薬の最新の応用においては、アンチセンス治療薬の中断に際してウイルスが盛り返す。検討されているように、免疫応答の抗腫瘍刺激の誘導は、アンチセンス薬物のインビボもしくはエクスビボの応用で遂行され得る。
下述される実験において、上述された型の逆向きの遺伝子構築物を含有するかもしくは含有しないかのいずれかの悪性のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示マウスＡ２０細胞を使用してマウスに接種した。下の表２はＡ２０細胞を接種されたマウスの生存パーセントを示す。これらの実験は、逆向きの遺伝子構築物ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）をもつＡ２０細胞を接種されたマウスは、外因性プラスミドをもたないＡ２０細胞、もしくはＲＳＶ．５ベクター（ヒグロマイシン抵抗性を与える）のみをもつがしかしＩｉ挿入物を欠くＡ２０細胞を接種されたマウスより生存可能性の本質的に大きな率を表したことを実証した。
かように、別の局面において、本発明はＩｉ合成の阻害剤を含有するＭＨＣクラスII陽性の細胞に関する。こうした細胞は、例えば、悪性腫瘍（例えば白血病、リンパ腫もしくは黒色細胞腫）に悩まされている個人が治療のため選択される治療計画において有用である。悪性のＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞を個人から単離する。これらの処置は免疫療法の一般的プロトコールに従う（クレメンツ(Clements)ら、Immunol．149: 2391-2396（1992）；バスカー(Baskar)ら、Cell．Immunol．155: 123-133（1994）；バスカー(Baskar)ら、J．Exp．Med．181: 619-629（1995）；ハーゼイ(Hersey)、Drugs 47: 373（1994）；およびパラドール(Paradoll)、Immunol．Today 14: 310（1993））。Ｉｉ発現の阻害剤を細胞に導入し、そして細胞を培養する。上で検討したように、こうした阻害剤は逆向きの遺伝子構築物およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。Ｉｉが阻害されるため、（悪性腫瘍特異的抗原を包含する）内因性に産生された抗原が培養された細胞の表面上に表示される。培養された細胞を、その後、悪性腫瘍で悩んでいる個人に再注入する。好ましくは、再注入に先立ち、細胞を（例えば放射処理により）増殖封鎖する。再注入された細胞はその個人の自身の免疫系を刺激して悪性細胞に指向された応答を装備する。この戦略を使用することにより、個人の免疫系は、悪性細胞に特異的に指向された自己免疫応答を装備するように刺激される。
治療されるべき個人から単離された悪性細胞の使用に加え、Ｉｉ合成の阻害剤はまた、樹立悪性細胞株もしくは新鮮な悪性組織の外稙片に導入され得る。この様式で処理された細胞は上述された型の治療法に関してもまた有用でありうる。
別の局面において、Ｉｉ阻害産物の同定およびＩｉタンパク質の発現を修飾するためのそれらの使用法の特定化は、自己免疫疾患の制御のための新規の治療および診断処置につながる。特定の例は、自己免疫疾患関連の自己決定基を同定するための本発明の産物および方法の使用である。ＭＨＣクラスII陽性細胞のＩｉアンチセンス処理は、ＭＨＣクラスII分子に対する自己決定基の拡大されたレパートリーおよび／もしくは高められた量の結合につながる。それらのＴ細胞に提示された疾患を誘導するペプチドは、例えば上述された組成物を使用して、Ｉｉ発現が阻害されている細胞からの免疫精製されたＭＨＣクラスII分子から溶出され得る。それらの自己決定基（そのいくつかは腫瘍特異的決定基である）の発見は、疾患特異的免疫療法の開発の第一段階である。こうした自己決定基ペプチドを考えれば、新規治療法を開発することは慣例の実験の問題である。
別の局面において、本発明は、個人における所望されない細胞の排除につながり得る内因性抗原提示の増強に関する。本発明のこの局面は、本来の細胞内性タンパク質と抗原的に区別できる非本来の細胞内性タンパク質の存在を特徴とするいかなる細胞の排除にも適用され得る。前に論考されたように、悪性細胞はこの分類の範囲内にある。なぜなら、それらは、例えばそれらの本来の細胞性対照物と抗原的に区別できる癌遺伝子産物を含有するからである。上で検討された悪性細胞に加え、他の非悪性細胞（例えばウイルスに感染した細胞）が、Ｉｉ発現の阻害により排除され得る。この態様において、Ｉｉ合成の阻害剤でのエクスビボ療法が使用され得る。あるいは、個人における組織特異的発現に適する発現ベクターが、逆向きの遺伝子構築物の個人の細胞への導入に有用でありうる。組織特異的調節シグナルがこうした治療法に必要な発現の改良を提供し得る。
例えば、Ｉｉアンチセンス構築物で処理されたウイルスに感染した細胞は、それらの感染した細胞の破壊、および／もしくはウイルス感染に対する免疫グロブリン媒介性の応答を調節するヘルパーＴ細胞の敷衍につながる、ウイルス決定基の高められたＭＨＣクラスII提示を有し得る。この点について、ウイルスに感染した細胞の一部のみが、Ｉｉアンチセンス構築物でエクスビボで処理されそして患者に再注入される必要がある。とりわけ、Ｉｉが部分的に大きく過剰発現されて抗ＥＢＶ免疫応答を抑制することが実証されている正常Ｂ細胞のエプスタイン−バールウイルス感染の場合、こうした処理は抗ＥＢＶ免疫応答を高めるのに有効であるとみられる。同様に、活性化に際してＭＨＣクラスII抗原を発現し得る、ＨＩＶに感染したＣＤ４＋Ｔリンパ球の場合、抗ＨＩＶ免疫応答は抗Ｉｉ構築物でのそれらの細胞の処理により高められうる。
本発明は病原性の自己免疫応答の治療においてもまた応用を見出している。より具体的には、自己免疫疾患の周期のある相の間の内因性抗原提示の増強が、病原性の自己免疫応答をダウンレギュレーションするために刺激される。例えば、関節炎のある動物モデル（例えばラットアジュバント関節炎）において、疾患の攻撃的発症の初期相の後、病原性過程を開始した同一の抗原決定基に対して指向されたサプレッサーＴリンパ球が、その後、それらの免疫応答を抑制することができることが立証されている。疾患過程のダウンレギュレーションのその第二相（臨床的に緩解の表示としてみられる）の間、Ｉｉアンチセンス構築物と接触された細胞における内因性自己抗原の提示の増強が疾患をダウンレギュレーションすることができる。さらに、共刺激(co-stimulatory)シグナルを欠く細胞（例えば、Ｂ７を持たない、もしくはそこでのＢ７の発現がＢ７アンチセンス構築物での処理により抑制される細胞）のＩｉアンチセンス構築物処理がアネルギー応答につながることができる。
実務において、細胞（例えばリンパ球）の集団を、まず、標準的技術を使用して個人から単離する。その細胞の集団を、その後、前に論考されたように、Ｉｉ合成の阻害剤でエクスビボで処理する。その個人をその後、緩解の兆候についてモニターする。（予め定義された臨床兆候および症状により決定されるような）緩解の表示が観察される場合、Ｉｉ合成の阻害剤で処理された細胞を個人に再注入する。
本発明の別の局面において、組織特異的プロモーターの制御下のＩｉ遺伝子の遺伝子挿入によるＩｉタンパク質の増大された発現が、それらの組織を伴う自己免疫疾患の抑制に適用され得る。個人の細胞へのＩｉの導入に適切なベクターは文献で特徴づけられる。例えば、インスリンプロモーターの制御下のＩｉ遺伝子の挿入は、糖尿病で破壊されるβ細胞でのＩｉの高められた発現につながることができる。加えて、サイログロブリンプロモーターの制御下のＩｉ遺伝子の挿入は、いくつかの形態の甲状腺炎で破壊される甲状腺小胞細胞でのＩｉの高められた発現につながることができる。自己免疫疾患の予防におけるこうした構築物の機構は、ＭＨＣクラスIIのαおよびβ鎖の増大された発現がＩｉタンパク質の付随する増大された発現なしに見出されうる細胞活性化事象、例えばウイルス感染の間のＩｉの増大された構成発現の当然の結果となると考えられる。Ｉｉタンパク質によるＭＨＣクラスII抗原結合部位の「保護」なしに、自己抗原の高められた提示が起こる。この治療概念は、自己決定基の提示を高めるためのＩｉアンチセンス構築物の応用の概念的鏡像である。
実施例
実施例１：逆向きの遺伝子構築物の設計および合成
図１に示されるように、マウスＩｉ（ｍＩｉ）遺伝子を含有するプラスミドｐｃＥＸＶ−ｍＩｉ３１（ミラー(Miller)とジャーメイン(Germain)、J．Experi．Mid．164: 1478-1489（1986））を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで酵素切断してｍＩｉ遺伝子を遊離した。精製の後、ｍＩｉ遺伝子を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン(Stratagene)）のEcoRI切断部位にクローニングした。ｍＩｉ遺伝子の向きを、BglI制限エンドヌクレアーゼでのその酵素切断のパターンの分析により決定した。図１に示されるSalIに向かう転写の方向に志向されたｍＩｉ遺伝子を含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｍＩｉ構築物を選択した。
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｍＩｉ構築物と、その後、制限エンドヌクレアーゼSalIおよびBamHIで酵素切断してｍＩｉ遺伝子を含有する断片を遊離した。この断片を、SalIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで酵素切断されていたＲＳＶ．５発現ベクター（ロング(Long)、Hum．Immunol．31: 229-235（1991））にサブクローニングした。ＲＳＶ．５ベクターはヒグロマイシン抵抗性遺伝子もまた含有し、そして従ってヒグロマイシンで選択し得た。逆向きの(reversed)ｍＩｉ遺伝子全体を含有する生じるＲＳＶ．５−ｍＩｉアンチセンス構築物をＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）と呼称した。
ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）構築物を、制限エンドヌクレアーゼSalIおよびSacIでさらに酵素切断した。これらの酵素での切断は、５’非翻訳領域からの47ヌクレオチドおよびコーディング配列の最初の94ヌクレオチドを含むＩｉをコードする断片を生じる。ゲル電気泳動による大きな断片の精製の後、Ｉｉ断片をクレノウＤＮＡポリメラーゼＩで処理してSalIおよびSacI端を満たし、それにより平滑端を創製した。平滑端をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。Ｉｉ構造遺伝子の最初の94ヌクレオチドおよび上流配列の47ヌクレオチドを逆転された向きで含有する、生じるｍＩｉアンチセンスプラスミドをＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）と命名した。
ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）およびＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）の構築の戦略を図１に図解する。ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）のプロモーターにより動かされる(driven)ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）およびＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）のアンチセンスプラスミド構築物は、相補性であるアンチセンスＲＮＡを転写し得、そして従ってＩｉのｍＲＮＡを不活性化するためにＩｉのｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし得る。ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）のＩｉのｃＤＮＡ挿入物の配列を配列番号４に提示する。
実施例２：トランスフェクションされた細胞株の発生
Ａ２０細胞（キム(Kim)ら、J．Immunol．122: 549-554（1979））（15×106個）を、血清を含まない予め加温されたＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ（Gibco））で２回洗浄し、そして0.5mlのＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。15μgのプラスミドＤＮＡ（ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）もしくはＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）のいずれか）を細胞懸濁物と混合した。この混合物を、300V、0.5mlあたり625μFで、電気穿孔器での電気穿孔にかけた。細胞懸濁液を室温で10分間インキュベーションした。細胞をその後、10％ウシ胎児血清を含む10mlのＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、そして24穴マイクロタイタープレート中で24時間培養した。抗生物質ヒグロマイシン（１mlあたり800μg）をその後選択のため添加した。１mlあたり800μgのヒグロマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を、コロニーが見えるまで２日ごとに交換した。Ｉｉタンパク質の発現の抑制を、抗マウスＩｉモノクローナル抗体Ｉｎ．１（コッホ(Koch，N．)ら、Nature 299: 644-645（1982））で細胞内染色することにより検査した。このアッセイにおいては、細胞を顕微鏡スライドガラスに塗り、風乾し、アセトン中で固定し、そしてラット抗マウスＩｉモノクローナル抗体と40分間インキュベーションした。スライドガラスをリン酸ナトリウム緩衝生理的食塩水溶液で２回洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗ラットＩｇ（Ｈ，Ｌ）抗体とインキュベーションした。
実施例３：トランスフェクションされた細胞におけるＩｉの発現
Ａ２０細胞（Ａ２０）、ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）で安定にトランスフェクションされたＡ２０細胞（Ａ２０（Ｒ））およびＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）で安定にトランスフェクションされたＡ２０細胞（Ａ２０（ＳＳ））におけるＩｉタンパク質の発現を、Ｉｎ．１モノクローナル抗体で同定された内因性Ｉｉタンパク質についての細胞内免疫蛍光染色することにより定量した。染色された細胞のスライドガラスを、その後、定量的蛍光画像走査顕微鏡法により検査した。各試験スライドガラスは、陽性対照としてのＡ２０細胞のウェルからのスライドガラスを伴った。逆向きの遺伝子構築物をもつ細胞におけるＩｉ発現の阻害を観察した。逆向きの遺伝子構築物をもつ細胞株におけるＩｉ発現の阻害を、陽性対照のパーセントとして表現した。ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）プラスミドでの安定なトランスフェクションは、表１に示されるような２回の試験においてＩｉ合成の39.5％および71.9％の阻害をもたらした。ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）プラスミドでの２回の試験において、Ｉｉタンパク質発現の89.3％および95.3％の抑制が表１に示されるように観察された。また表１に示されるように、この効果はＭＨＣクラスIIタンパク質の発現に対する有意の影響なしに観察された。この表において、（Ｒ１）および（Ｒ２）、（ＳＳ１）および（ＳＳ２）は、それぞれＲＳＶ．５−ｍＩｉ（Ｒ）およびＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）プラスミドでのトランスフェクションからの別個の細胞株である。
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実施例４：トラスフェクションされた細胞を接種されたマウスの生存
マウスを、腫瘍細胞の接種１週前に、マウスあたり0.5mlのプリスタンで刺激した(prime)。各マウスに、以下すなわちＡ２０細胞（プラスミドをもたない）（表２でＡ２０と呼称される）、もしくはＡ２０（ｈｙｇｒｏ）細胞（ＲＳＶ．５プラスミドのみを含有する）（表２でＡ２０（ｈｙｇｒｏ）と呼称される）、もしくはＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）プラスミドをもつＡ２０細胞（表２で「Ａ２０（ＳＳ）」と呼称される）の３×106個を腹腔内に注入した。３種の型の細胞株のそれぞれを接種されたマウスの生存を測定した。Ａ２０細胞を接種されたマウスの生存はＡ２０（ｈｙｇｒｏ）細胞を受領するマウスと有意に異ならなかった。ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）プラスミドをもつＡ２０細胞を受領するマウスは、Ａ２０細胞もしくはヒグロマイシン抵抗性プラスミドで安定にトランスフェクションされたＡ２０細胞のいずれかを接種されたマウスより有意に長く生存した（表２）。例えば、第22日では、ＲＳＶ．５−ｍＩｉ（ＳＳ）プラスミドをもつＡ２０細胞を受領するマウスの100％が、Ａ２０細胞のみ、もしくはＲＳＶ．５プラスミドのみを含有するＡ２０細胞を受領するマウスについて観察された40％のみの生存に比較して、生存した。
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実施例５：アンチセンスオリゴヌクレオチドでのＩｉ発現の阻害
Ａ２０細胞（105個）を、オリゴヌクレオチド１（配列番号１）、２（配列番号２）および３（配列番号３）の混合物の存在下に100μlの培地中で96穴マイクロプレート中で37℃で2.5時間インキュベーションした。より具体的には、各オリゴヌクレオチド10、30もしくは90μMを含むオリゴヌクレオチドの３種の混合物を試験した。前に挙げられたように：配列番号１に指定されるオリゴヌクレオチドは翻訳開始に関して重要であると考えられるＩｉのｍＲＮＡの領域に相補性であり；配列番号２に指定されるオリゴヌクレオチドはイントロンのスプライシングに関して重要であると考えられるＩｉのｍＲＮＡの領域に相補性であり；そして配列番号３に指定されるオリゴヌクレオチドはポリアデニル化に関して重要であると考えられるＩｉのｍＲＮＡの領域に相補性である。
培地を除去して、そして100μlの標識培地（メチオニンなし）および50μCiの［35Ｓ］メチオニンを、同一の濃度のオリゴヌクレオチド１、２、３および３の存在下にさらに2.5時間添加した。細胞を収穫し、そしてリン酸緩衝生理的食塩水溶液で洗浄しそして溶解した。細胞ライセートを抗マウスＩｉモノクローナル抗体Ｉｎ．１で免疫沈降した。免疫沈降物の放射活性を計数した。オリゴヌクレオチド１、２および３のそれぞれの90μMの濃度で、Ｉｉ発現は、放射活性計数により決定されるように約66％阻害された。10μMおよび30μMの混合物濃度は影響を有しなかった。試験された濃度での個々のオリゴヌクレオチドの使用もまた、観察された影響を有しなかった。
配列表
（1）一般的情報：
（１）発明者：アンチジェン  エクスプレス  インク
（ii）発明の名称：Ii合成の阻害
（iii）配列の数：4
（iv）連絡先の住所：
（A）名宛人：ケヴィン  Ｍ．ファレル  Ｐ．Ｃ．
（B）通り：私書箱 999
（C）都市名：ヨーク  ハーバー
（D）州名：メーン
（E）国名：米国
（F）郵便番号：03911
（v）コンピューターで読み取り可能な形式：
（A）媒体の型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC 互換機
（C）オペーレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン  リリース #1.0，バージョン #1.25
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）申請日：
（C）分類：
（vii）以前の出願データ：
（A）出願番号：08/661,627
（B）申請日：1996年6月11日
（C）分類：
（viii）代理人の情報：
（A）名称：ファレル,ケヴィン Ｍ．
（B）登録番号：35,505
（C）参照／文書番号：REH-9501 WO
（ix）遠隔化通信の情報：
（A）電話：（207）363-0558
（B）ファックス：（207）363-0528
（2）配列番号1の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24 塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号1
0004341725.tif 000004
（2）配列番号2の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22 塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号2
0004341725.tif 000005
（2）配列番号3の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：23 塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA
（xi）配列:配列番号3
0004341725.tif 000006
（2）配列番号4の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：141 塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA
（xi）配列:配列番号4
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【図１】
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