(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液であって、
１５重量％超え４０重量％までの濃度を有する第４級アンモニウム化合物と、
少なくとも１の溶解性向上剤と、ここで、前記溶解性向上剤の少なくとも１つは１０重量％を超え７０重量％までの濃度のプロピレングリコールであり、
溶液の残存重量を補填するための水と、を備え、
前記第４級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウムであり、
前記第４級アンモニウム化合物溶液は、ホモジナイズドされた溶液であることを特徴とする濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項２】
前記溶解性向上剤は、さらにアルコール若しくはポリグリコールを含むことを特徴とする請求項１に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項３】
前記溶解性向上剤は、１価アルコール、２価アルコール、３価アルコール、ポリエチレングリコール及びこれらの組合せからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項４】
前記１価アルコールは脂肪族アルコールであり、前記２価アルコールはグリコール若しくはその誘導体であり、前記３価アルコールはグリセロール及びその誘導体である、
ことを特徴とする請求項３に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項５】
前記第４級アンモニウム化合物は、１５重量％から２５重量％までの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項６】
前記溶解性向上剤は、１０重量％から６０重量％までの濃度で存在することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項７】
前記溶解性向上剤は５０重量％から６０重量％までの範囲の濃度で存在する、
ことを特徴とする請求項１に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項８】
前記溶解性向上剤は５５重量％から６０重量％までの範囲の濃度で存在し、前記溶液は、さらに５重量％までの水を含む、
ことを特徴とする請求項７に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項９】
前記第４級アンモニウム化合物は４０重量％の濃度で存在し、前記溶解性向上剤は５７重量％の濃度で存在し、前記水は３重量％で存在する、
ことを特徴とする請求項８に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項１０】
前記第４級アンモニウム化合物は４０重量％の濃度で存在し、前記プロピレングリコールは５０重量％の濃度で存在する、
ことを特徴とする請求項１に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項１１】
前記第４級アンモニウム化合物は２０重量％の濃度で存在し、前記プロピレングリコールは５０重量％の濃度で存在する、
ことを特徴とする請求項１に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項１２】
前記溶解性向上剤は、エチルアルコールとプロピレングリコールとの組合せであることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項１３】
前記アルコールはグリセロールであり、２０重量％の濃度で存在する、
ことを特徴とする請求項２に記載の濃縮された第４級アンモニウム化合物溶液。
【請求項１４】
（ａ）１５重量％を超え４０重量％までの濃度を有する第４級アンモニウム化合物と、少なくとも１は１０重量％を超え７０重量％までの濃度のプロピレングリコールである、少なくとも１の溶解性向上剤と、溶液の残存重量を補填するための水と、を含む濃縮された溶液を供給し、
（ｂ）濃縮された溶液を希釈して希釈操作溶液を形成し、
（ｃ）前記希釈操作溶液を食品に塗布する、
ことを特徴とし、
前記第４級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウムであり、前記溶液は均一溶液であることを特徴とする、食品の微生物の増殖抑制方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）ステップでは、水で濃縮された溶液を希釈して希釈操作溶液を形成し、微生物増殖を阻害する有効量の前記塩化セチルピリジニウムを有する希釈操作溶液となることを特徴とする請求項１４に記載の食品の微生物の増殖抑制方法。
【請求項１６】
前記（ｂ）ステップでは、水で濃縮された溶液を希釈して希釈操作溶液を形成し、０．０１％から１％までの範囲の濃度を有する前記塩化セチルピリジニウムを有する希釈操作溶液となることを特徴とする請求項１４に記載の食品の微生物の増殖抑制方法。
【請求項１７】
前記（ｃ）ステップでは、前記希釈操作溶液を食品に少なくとも１秒の何分の一塗布することを特徴とする請求項１４に記載の食品の微生物の増殖抑制方法。
【請求項１８】
前記（ｃ）ステップでは、前記希釈操作溶液を食品に塗布する使用時間を０．１秒から５秒とすることを特徴とする請求項１４に記載の食品の微生物の増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、１９９７年４月１４日に出願された継続中の米国出願番号０８／８４０，２８８の一部継続出願であり、この米国出願番号０８／８４０，２８８は、１９９６年４月１２日に出願され、米国特許番号第５，８５５，９４０号である米国出願番号０８／６３１，５７８の一部継続出願であり、両者の全体を参照することによりここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、濃縮された抗細菌性の第４級アンモニウム化合物（quaternary ammonium compound，ＱＡＣ）を有する溶液に関する。本発明のＱＡＣ濃縮物は、一般的に安全であると認可された（generally recognized as safe，ＧＲＡＳ）化合物を利用して、エマルジョンではない、ＱＡＣの純粋な溶液を形成する。このＱＡＣ濃縮溶液は、少なくとも１の溶解性向上剤と組み合わせて調製され、産業的な食品加工若しくは家庭における食品加工及び食品加工に関連する表面に用いられる有用な最終濃度まで希釈するための溶液を調製する際に有益である。
【０００３】
本発明は、一般に、濃縮された抗細菌性のＱＡＣと、少なくとも１つの溶解性向上剤を具備し、家庭及び産業的環境において食品と接触する表面と同様に、食品中（及び食品上）の幅広い範囲も微生物の増殖を予防する方法で使用するのに適した溶液に関する。より詳細には、本発明は、濃縮された抗細菌性のＱＡＣと、少なくとも１つの溶解性向上剤を含み、食品中（及び食品上）の広域スペクトルの微生物の増殖を妨げる方法で使用するのに適した溶液に関する。例えば、鳥肉、牛肉、豚肉、羊肉、鹿肉、及びその他の食用肉製品のような肉製品、例えば、魚、甲殻類のような海産物、果物、野菜、乳製品、ペットフード若しくはスナック、豚の耳、生皮及び乾燥肉を含み得る動物の肉、皮膚及び部分から調製されたもの、と接触させることにより、食品の外観、構造及び品質に有害な影響を及ぼすことなく、本発明の水溶液処理方法を利用して任意のその他食品が処理可能である。さらに詳細には、本発明は、微生物の付着の阻害、除去、及び／又は、食品上の微生物の増殖を予防するための方法での使用に適した濃縮された抗細菌性のＱＡＣを有する溶液に関する。特に、抗細菌性のＱＡＣを有する溶液の使用は、食品媒介性の汚染を引き起こす可能性のある微生物に及ぼすＱＡＣの影響に関連する。さらに特別には、これらの微生物は、ブドウ球菌類、連鎖球菌類、カンピロバクター属、アルコバクター属、リステリア属、アエロモナス属、バチルス属、サルモネラ菌類、非毒生産性エシェリキア属、Ｏ１５７：Ｈ７のような病原性毒生産性エシェリキア属からの微生物を含む。さらに特別には、本発明は、任意の手段による、希釈されたＱＡＣを食品に使用する改良された処理方法に関するが、好ましくは、希釈されたＱＡＣを食品にスプレー若しくは噴霧して、これらの製品上における広域スペクトルの細菌の増殖を予防することを含み、この場合、ＱＡＣの使用時間は、少なくとも１秒の１／１０程度に短い可能性がある。希釈ＱＡＣのこの短い使用時間は、商業的若しくは産業的定着（setting）には特に有用である。
【従来の技術】
【０００４】
細菌汚染による食品由来の病気を防ぐことが、食品加工業界、規制部局及び消費者にとって重要な関心事である。合衆国農業省の食品安全検査サービス（ＦＳＩＳ，Food Safety & Inspection Service）からの最近の報告（連邦登録、１９９５年２月３日）は、食品由来の病気のうち２百万以上の症例が毎年合衆国において細菌汚染により引き起こされ、１０億ドル以上の関連費用を伴うと推定している。食品媒介性の細菌汚染は、加工施設に入る前と、加工環境での交差汚染（cross-contamination）による両方で発生する。ＦＳＩＳは、新しいＨＡＣＣＰ（Hazard Analysis and Critical Controll Point）要求を設定して、食品媒介性の病原体の発生及び数を低減している。これらの規制は、食品加工者により満たされなければならない。この細菌の低減を達成する手段は、加工者の裁量に任されているが、ＦＳＩＳは、抗細菌性の処理がＨＡＣＣＰ計画の重要な構成要素であることを期待している。濃縮されたＱＡＣの溶液から調製される水溶性の組成物（formulation）を採用する本発明の処理方法は、ＨＡＣＣＰの要求を満たすのに有用である。
【０００５】
細菌汚染の完全にない製品を提供する彼らの努力において、鳥肉及び獣肉加工者は、食品として意図されている鳥肉及び獣肉の組織に強力に接着又は付着する微生物を除去する際に大きな困難に直面している。汚染微生物が食品の表面に付着していない場合には、それらは容易に洗い落とされ得る。しかしながら、強く付着するに至った微生物は、水洗によっても除去することができず、化学的若しくは物理的手段による除去に対しても極めて抵抗力がある。
【０００６】
肉製品中の微生物を低減させるために、塩素、二酸化塩素、オゾン、過酸化水素、乳酸、炭酸ナトリウム、燐酸三ナトリウム、及び電気刺激の使用のようにいくつかの化学的及び物理的方法が提案されてきた。通常、これらの方法は、細菌汚染の低減に際して限定された効果しか示さず、肉製品の物理的外観に影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
サルモネラ菌ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）汚染は、鳥肉加工業界にとって特別な関心事である。何故なら、この微生物がしばしば生きた鳥に存在するからである。鳥肉加工者は、鳥肉組織に付着若しくは接着するサルモネラ菌ティフィムリウムのような微生物を除去する際に、大きな困難を有している。死体のサルモネラ菌ティフィムリウム汚染を排除し、死体間での交差汚染を最小限にするために、種々の化学的及び物理的アプローチが、鳥肉加工中に使用することを提案されている。サルモネラ菌ティフィムリウムを抑制するために、鳥肉加工時に燐酸三ナトリウム（ＴＳＰ）が利用されているが、研究は、サルモネラ菌に対するＴＳＰの効力に関して矛盾する結果を報告している。その水溶性の結果として、ＴＳＰは、鳥肉から洗い落とされる可能性があり、そのため、微生物の付着を阻害できない。
【０００８】
ここで、参照することによりここに組み込まれる米国特許第５，３６６，９８３号は、効果的な量のＱＡＣ水溶液で処理することにより、肉製品のサルモネラ菌汚染を除去し若しくは予防する方法を開示する。特に、アルキルピリジニウムのような第４級アンモニウム陽イオン界面活性剤、とりわけ塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）及び臭化セチルピリジニウム（ＣＰＢ）が、鳥肉からサルモネラ菌ティフィムリウムを除去するのに効果的であった。しかしながら、この特許は、ＱＡＣがサルモネラ菌より広域の任意の他の属の食品汚染微生物に対する抗細菌性スペクトルを有することを開示していない。さらに、この処理方法は、肉以外の食品に効果的であることを提案してはいない。加えて、非常に短いＱＡＣの使用時間が利用可能であり、未だ効果的な抗細菌性処理を提供することを提案していない。本発明において開示するように、希釈ＱＡＣ溶液を調製するのに特に有用である濃縮されたＱＡＣの溶液の提案もしていない。
【０００９】
食品物質は、その蛋白質含有量、多孔性、親油性、表面ｐＨ、透水性、表面積及び表面実効電荷によって、化学的及び物理的に異なる。食品の多孔性は、バクテリアの隔離において重要であり得る一方で、食品物質上の強固で非浸透性の外皮が食品のバクテリア汚染を低減し得る。食品間のこれらの化学的及び物理的相異の全ては、１つの抗細菌性剤の肉製品に関する成功が、果物、野菜、海産物、乳製品及びペットフード若しくはスナックのようなその他の食品に関しても成功することを示唆するかどうかを予測することを困難にする。
【００１０】
例えば、ＱＡＣ，ＣＰＣは、蛋白質と結合することが知られているが、ＣＰＣの食品に及ぼす抗細菌性効力は、大部分が蛋白質結合によるものであったとすれば、非蛋白質性の果物や野菜を処理する本方法は、成功するとは期待されなかったであろう。
【００１１】
サルモネラ菌以外の病原性及び腐敗性のバクテリアにより引き起こされる食品由来の病気が、ますます食品加工者にとって問題になっている。それらが同定された食品とともに、これらのバクテリアのリストが表１に示される。
表１  病原性及び腐敗性バクテリアの発生
【表１】
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【００１２】
表に掲載されたこれらの汚染微生物の中で、その毒性、引き起こされる疾患の重症度及び関連する死亡率のため、エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７は特に関心がある。エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７は、血液凝固異常、腎不全（溶血性尿毒症症候群）及び死に至る強力な「シガ類似の」（shiga-like）毒素を生成する。その急性疾患からの快復が完全であるとしても、溶血性尿毒症症候群に感染した人の１５乃至３０％は、慢性腎疾患の徴候を有するであろう。エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の汚染に関連する危険性は、抗生物質に対する報告された抵抗力により倍加される。１９９３年には、食品由来の病気のうち８，０００乃至１６，０００の症例が、エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７により引き起こされ、２億乃至５億ドルの推定費用を伴った。
【００１３】
別の毒性食品汚染物、リステリア属モノサイトゲネスは、肉、野菜及び種々の乳製品中で発見されており、敗血症、髄膜炎及び播種性膿瘍を引き起こす可能性がある。リステリア属モノサイトゲネスは、冷凍下でも増殖する能力のある耐寒性微生物である。１９９３年には、食品由来の病気のうち約１，７００の症例がリステリア属モノサイトゲネスにより引き起こされ、１億乃至２億ドルの推定費用を伴った。
【００１４】
食品業界において関心のある別の微生物は、食品及び肉加工業界において腐敗を引き起こし、これらの製品の貯蔵寿命を減少させるアエロモナス属ヒドロフィアである。
【００１５】
広域スペクトルのグラム陽性、グラム陰性、好気性、条件的な嫌気性、及び微好気性微生物に対する広範囲の食品において、汚染を防ぎ且つ除去するのに効果的な殺微生物性化合物は、現在のところ知られていない。本発明者らは、ＱＡＣが、広範囲の食品に付着するに至ったときに食品由来の病気を引き起こす広域スペクトルの異なる微生物に対して、効果的であると判定した。広域スペクトルの病原性微生物のこの感度は、予測することができなかった。
【００１６】
ある微生物の特定の抗細菌剤に対する感度は、他の微生物の同一の抗細菌剤に対する感度を予測するものではない。防腐剤若しくは殺菌剤は活性を有する連続的なスペクトルを有するが、異なる微生物の相対的な感染性（susceptibilities）は考慮されなければならないと考えられている。例えば、殺菌剤であるヘキサクロロフェンは、グラム陽性の微生物に対して主として効果的であり、陽イオン防腐剤は、胞子形成生物に対しては効果的ではない。プセドモナス属セパチア（Pseudomonas cepacia）のような所定のグラム陰性微生物は、薬物である塩化ベンザルコニウムの溶液中で増殖することが知られている。その他のバクテリアは７０％エタノール中で増殖可能なことが知られている（Harvey, S.C., Antimicrobial Drugs in Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１８版, Mack Publishing Co., 頁１１６３乃至１２４１，１９９０年）。
【００１７】
食品処理に関して、リステリア属は、サルモネラ菌若しくはエシェリキア属コウライよりもＴＳＰの作用に対してより抵抗力があると報告されている（Somers, E.B.ら, Int. J. Food Microbiol., 第２２巻：頁２６９乃至２７６，１９９４年）。さらに、ＴＳＰがサルモネラ菌の増殖を阻害する際には、この生物を脱離させる際よりも全く効果的ではないことが示される（Breenら, J. Food Science, 第６０巻：頁１９９１乃至１９９６，１９９５年）。同様に、ＴＳＰは鶏の死体のエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の数を減少させるが、この微生物の他の鶏に対する交差汚染を阻害するには有効でない。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＱＡＣが液中の懸濁液におけるエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７に対して有効であり、食品に付着した場合に、このバクテリアの数を減少させ、同様に、このバクテリアの食品に対する付着を阻害するのにも効果的であることを示す。エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７は、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、スルフィソキサゾール（Kimら, J. Infect. Dis., 第１７０巻：頁１６０６乃至１６０９，１９９４年）、及びオキシテトラサイクリン（Ciosekら, Med. Weter., 第４０巻：頁３３５，３３８，１９８４年））のような広域スペクトル抗細菌剤に対する抵抗力を示す一方で、これらの同一の抗細菌剤がエシェリキア属コウライの通常の非毒生産性株に対して非常に活性があることが報告されている。
【００１９】
明らかに、抗細菌剤若しくは殺生物剤の特定の微生物に対する効果を、異なる微生物に対するその有効性に基づいて予測することはできない。特定の微生物に対する抗細菌剤の効果において役割を果たす可能性のある、細菌特性のように、考慮すべき多くの要因が存在する。これらの特性は以下のものを含み得るがこれらに限定されない。（１）付着した微生物の所定の種による糖衣（glycocalyx）形成の程度、（２）グラム陰性バクテリア中の脂肪多糖質（lipopolysaccharide-）及びリン脂質（phosopholipid-）含有細胞包膜（cell envelope)の存在、（３）ほとんどの腸のバクテリア及びプセドモナス菌（Pseudomonas）におけるようなリポ蛋白質（lipoprotein）の存在、（４）例えば、エシェリキア属コウライ及びサルモネラ菌における、ポーリン（porin）蛋白質チャネルの存在（Fultonら, Structure in Medical Microbiology, 第３版，頁３７乃至５４，１９９１年）である。
【００２０】
家庭、レストラン若しくは施設の食品調製と同様に、食品加工業界は、多数の異なる食品、及び／又は、食品及び食物からの果汁若しくは液体が接触する表面で、広範囲の汚染微生物の増殖を予防するのにより効果的な製品及びプロセスを必要としている。このことは、食品の表面に付着する微生物に対して特に真実である。食品媒介性の病原性微生物により引き起こされる病気の数の増大の結果として、現在、食品加工業界は、より広域スペクトルの微生物を除去し、予防するため、特に食品汚染の結果、重大な人間の疾病を引き起こすことが知られている毒生産性エシェリキア属、即ち、エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７のような、病原性微生物に対して、より効果的なプロセスを必要としている。本発明は、濃縮されたＱＡＣ溶液及び少なくとも１つの溶解性向上剤を有する組成物と、液体中及び食品及びその調製に関連する表面と同様に食品中の微生物の増殖を抑制する方法と、を提供する。本発明の方法は、感染した食品からの交差汚染を防止し、食品から付着した微生物を除去し、微生物の食品への付着を阻害し、及び、食品に付着したままである微生物の増殖を予防するのが、重要な目的である。さらに、本発明の方法は、容易に、食品加工プラントに使用するために採用され得る。
【００２１】
さらに、本発明は、少なくとも１つの溶解性向上剤若しくは溶媒と組み合わせた濃縮されたＱＡＣを含有する溶液を有する組成物を提供する。本発明のこの濃縮されたＱＡＣ溶液は、食品及び、食品が調製される動物の肉体を含む食品加工及び調製に関連する表面の処理用に、希釈された組成のＱＡＣが調製可能な貯蔵溶液を提供する。例えば、乳牛の乳首は、搾乳前に、安全な牛乳及び乳製品の加工を確実にするために、濃縮されたＱＡＣ溶液の希釈溶液で処理可能である。さらに、ＱＡＣの希釈溶液は、ここで述べた成分と共に、若しくは手及び身体を洗うのに有用であることが知られている他の成分と組み合わせて、人間及びペットの手及び身体を洗うのに有用であり得る。濃縮されたＱＡＣ溶液は、本発明の方法において使用するために、希釈作業溶液を調製するのに有用である。本発明の組成物は、より濃縮された組成のＱＡＣを調製することを許容する溶解性向上成分を含有する。
【００２２】
米国特許第５，４０５，６０４号は、濃縮された口腔リンス液、その使用方法及び口腔リンス液の製造方法を開示する。口腔リンス液は、本質的に約０．０５％から約１０．０％までのＱＡＣからなるオイルインウォーター（oil-in-water）エマルジョンの形態の濃縮された組成物から構成される。香料油用キャリアとして作用する溶媒が約３０％から８５％であり、ここで、溶媒は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物であり、香料油及び水は、約０．２％から約９．０％である。本発明の組成物は、１０％以上のＱＡＣを含み、エマルジョンではなく本当に均質な溶液であり、且つ、香料油を含有しないことにより、口腔リンス液組成物とは異なる。
【００２３】
ＷＯ９８／０３０６６号は、抗細菌性組成物、調製方法及び使用方法を開示する。この組成物は、以下のサブ成分ａ）及びｂ）から構成される。ａ）約５０乃至９９．９重量％の炭素数１乃至４（Ｃ１−Ｃ４）の置換，非置換モノカルボキシル酸、ｂ）約０．１乃至５０重量％の殺微生物性若しくは微生物安定性の陽イオン有機窒素化合物である。本発明の組成物は、それが溶解性向上剤を含み、ＷＯ９８／０３０６６号が含まない点において、ＷＯ９８／０３０６６号の組成物とは異なる。本発明は、それがモノカルボキシル酸のような有機酸を含まない、特にＷＯ９８／０３０６６号の主要成分である置換若しくは非置換のＣ１−Ｃ４のモノカルボキシル酸を含まない点において、ＷＯ９８／０３０６６号と異なる。ＷＯ９８／０３０６６号の開示は、組成物を含有する抗細菌性の非置換Ｃ１−Ｃ４のモノカルボキシル酸のサルモネラ菌に対する効果が、陽イオン有機窒素化合物の添加により向上し得ることを記載する。陽イオン殺微生物性窒素化合物は、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル酸により損傷された微生物において、その効果をより発揮することができるということがこの発明の理論である。この発明の組成物は、さらに、本発明の組成物中には存在しない、「アンキャト」（"ancat"）若しくは「キャタン」（"catan"）化合物を形成する陽イオン有機窒素化合物と混合する追加的な有機酸を含有することができる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明の濃縮されたＱＡＣ溶液は、容易に希釈されて溶液となり、食品及び、動物から得られた食品である場合には生きている若しくは死んだ動物の部分を含む食品に関連する表面と接触する、濃縮された抗細菌性溶液を提供する。本発明の濃縮されたＱＡＣ溶液は、ＱＡＣ及び少なくとも１の溶解性向上剤を有する。好ましくは、ＱＡＣは、約１０重量％を超える濃度である。濃縮された溶液は、希釈されて、希釈された溶解性向上剤と共に水溶液中で増殖阻害に効果的な量の希釈されたＱＡＣを提供する。本発明のＱＡＣは、広域スペクトルの病原性及び腐敗性の微生物の増殖を阻害するのに有効である。ＱＡＣ、特に塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）が、広範囲の食品上の広域スペクトルの微生物の増殖を予防するのに、とりわけ効果的である。
【００２５】
本発明は、食品上の広域スペクトルの微生物の増殖を予防するために、細菌の増殖を阻害するのに効果的な量のＱＡＣを食品と接触させることを備える食品上の微生物の増殖を予防する方法を提供し、ここで、当該化合物の食品上への使用時間は、少なくとも１秒の何分の一である。食品上の微生物の増殖の予防は、摂取前に、人間若しくは動物の疾病若しくは食品の腐敗を引き起こす可能性のある生存可能な微生物が全くないか、又は該微生物を最少数に維持する食品を提供することを意図されている。食品上の微生物の増殖の予防は、以下の機構を含むことを意図されているが、これらに限定されない。（１）食品から付着微生物を除去すること、（２）微生物の食品への付着を阻害すること、（３）食品上の微生物を殺すか不活性化すること、（４）食品上には付着していないが、例えば、冷却タンクのように、加工中に食品に関連する液体中に存在するもの、若しくは、食事の調製に関連する表面に存在するもの、カウンター上部、まな板及び流し台、及び食事の調製及び食品の衛生のために使用される機器のような表面に残存する液体中に存在する、これらの微生物を殺すか不活性化すること、である。
【００２６】
本発明の範囲内に含まれることを意図された微生物は、ＱＡＣに対する感受性がある微生物であり、より詳細には、ブドウ球菌類、連鎖球菌、カンピロバクター属、アルコバクター属、リステリア属、アエロモナス属、バチルス属、サルモネラ菌類、非毒生産性エシェリキア属、病原性毒生産性エシェリキア属からの微生物であり、さらに、人間及び動物消費用食品の細菌の食品媒介性汚染を引き起こす可能性のあるその他の食品媒介性の微生物である。
【００２７】
ＱＡＣに対する感受性のある、追加的に意図された微生物は、コウジカビ属フラバム（flavum）、アオカビ属クリソゲナム（chrysogenum）のような真菌類、及び体内寄生性アメーバ類ヒストリティカ（histolytica）のような寄生体である。
【００２８】
本発明は、家庭及び施設の食事調製と同様に、食品加工業界において重要な用途を有する。ＱＡＣは、容易に利用可能で、本発明の方法を実行する費用は、現行の抗細菌性プロセスと比較して、高価ではない。例えば、ＴＳＰを使用する現行の処理とは異なり、ＱＡＣの使用は、食品の外観、色、味若しくは構造を変更しない。ＱＡＣの濃度範囲は、食品上の広域スペクトルの細菌の増殖を抑制するのに効果的である。ＱＡＣは、突然変異誘因のためのエームズ分析（Ames assay）により試験されている。本発明の好ましいＱＡＣである、ＣＰＣは、エームズ分析により、非突然変異誘発性であることが示された。さらに、ＣＰＣは、一日に２０ｍｇの量まで経口摂取されるセパコール（Cepacol，登録商標）錠剤のような、経口摂取用に調製された製品で人間の使用に対して既に承認されている。
【００２９】
本発明は、また、食品にＱＡＣを接触させる改善された方法に向けられ、ここで、ＱＡＣの食品に対する使用時間は少なくとも１秒の何分の一の間であり、約０．１秒から約５秒までの範囲の時間であり得る。約１乃至２秒の範囲もまた使用可能である。ＱＡＣの使用時間が、食品上の微生物の増殖を有意に防止する結果となるのに十分な時間であることが重要である。
【００３０】
本発明は、また、食品上に当該化合物をスプレー若しくは噴霧することにより、食品にＱＡＣを接触させる改善された方法を含む。当該スプレー若しくは噴霧方法は、水中で希釈されたＱＡＣ溶液を使用して、若しくは、少なくとも１の溶解性向上剤と構成されたＱＡＣを有する新たな濃縮された組成物若しくは水中で希釈される濃縮されたＱＡＣ組成物を用いて、実行可能である。濃縮物の直接スプレー若しくは噴霧は、濃縮物中のＱＡＣの分率が食品に関する使用に対して承認されている場合には、可能であり得る。
【００３１】
本発明は、スプレー、噴霧、浸積、浸透を含む、任意の直接手段により、ＱＡＣ溶液を食品に接触させる任意の方法を包含することが意図されている。しかし、本発明は、また、濃縮され若しくは希釈されたＱＡＣ溶液を、装置に若しくは、食品加工に若しくは、食品が、加工、調製、貯蔵及び／又は梱包中に接触する食品調製表面に、使用するような間接手段によって、ＱＡＣ溶液を食品に接触させることを含むことも意図されている。
【００３２】
さらに、本発明の方法は、オプションとして、処理前に食品上の微生物の存在を判定するために、食品をＱＡＣに接触させるに先立って、判定ステップを含むこともできる。微生物の存在を迅速に判定する任意の従来の方法が判定ステップとして利用可能であり、例えば、ＰＣＲ及び免疫学的検定（immunoassays）を含む。
【００３３】
さらに、本発明の方法は、オプションとして、ＱＡＣに接触後に、食品の表面におけるＱＡＣの存在を判定するステップを含む。この判定は、接触ステップ若しくは数回の洗浄ステップの直後に実行される。例えば、ＱＡＣは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に適した形態で食品の組織から抽出される。この方法は、食品組織からのエタノール抽出、及び、これに引き続く、さもなければ、ＨＰＬＣ分析を妨害するであろう母相中のその他の化合物からＱＡＣを選択的に分離する弱陽イオン性交換カラムを使用した固相抽出を含む。ＱＡＣ残さ分の定量のためのＨＰＬＣ分析は、逆相シアノカラムを採用し、内部標準としてＱＡＣ類似化合物を使用する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明は、広範囲の食品及びこれらの食品を加工・調製に関連した表面における広域スペクトルの食品媒介性の細菌汚染を低減するための処理するのに、ＱＡＣが効果的であるとの判断に基づく。本発明は、また、広範囲の食品媒介性の病原性微生物を除去し、殺し、不活性化し及びこれらの病原性微生物が食品に付着するのを阻害するのに、ＱＡＣが有効であるという発見に基づく。これらの微生物は、以下の属に属するバクテリアを含むが、これらに限定されない。即ち、サルモネラ菌類（Salmonella）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、アルコバクター属（Arcobacter）、リステリア属（Listeria）、アエロモナス属（Aeromonas）、バチルス属（Bacillus）、非毒生産性エシェリキア属（non-toxin-producing Escherichia）及びエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７のように、有毒な毒生産性エシェリキア属株（virulent toxin-producing Escherichia strains）、コウジカビ属フラバス（Aspergillus flavus）、アオカビ属クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）のような真菌類（fungi）、及び体内寄生性アメーバ類ヒストリティカ（Entamoeba histolytica）のような寄生体（parasites）である。
【００３５】
本発明の組成物は、水溶液中に有効量のＱＡＣを含む。特に、本発明の濃縮されたＱＡＣ溶液は、産業用途での使用には理想的な抗細菌性溶液を提供し、ここで、希釈されたＱＡＣ溶液の大部分は、食品加工用に必要とされる。本発明の濃縮された溶液は、最小限の数の成分として、ＧＲＡＳ（一般的に安全であると認可されている）成分及び溶解性向上剤を含む。
【００３６】
本発明の濃縮されたＱＡＣ溶液は、希釈されたＱＡＣ溶液の調製に際して多くの利点を提供する。大量のＱＡＣ粒子が少なくとも１の溶解性向上剤を含む水溶性溶媒中に溶解する。ＱＡＣは、溶液から沈殿するので、水だけの中でＱＡＣの濃縮された溶液を調製することは難しい。実際に、約５乃至約１０％以上のＱＡＣを得ることは難しく、所定の条件下では、溶解性向上剤の助けなしに溶液の温度により、溶液中で１％以上のＱＡＣを得ることも難しい。しかし、本発明者らは、アルコール若しくはポリグリコールのような少なくとも１の溶解性向上剤又は溶媒と組み合わせて調製される場合には、濃縮されたＱＡＣの溶液が調製可能であると判定した。ＱＡＣは陽イオン界面活性剤として知られ、それ自体、ＱＡＣ水溶液の調製により、大量の泡が発生する。しかしながら、１０％を超え、もしくは１５％を超える濃度を有するＱＡＣと少なくとも１の溶解性向上剤を含む濃縮されたＱＡＣ溶液が希釈されたＱＡＣ溶液を調製するために利用されるときには、通常、ＱＡＣ水溶液の調製時に発生する多量の泡は、大幅に低減される。最少の泡生成は、濃縮物の調製の際に発生し、一旦調製されると、濃縮物は泡形成を示さない。さらに、濃縮物は、最小限の撹拌で、そのため、最小限の泡形成で希釈される。この濃縮されたＱＡＣが、冷たい温度に曝されると、濃縮されたＱＡＣ溶液は、沈殿に抵抗する。冷凍される場合には、少なくとも１の溶解性向上剤と共に濃縮されたＱＡＣは、解凍時に溶液状態になる。ＱＡＣの沈殿が出荷若しくは大気温度での貯蔵若しくは冷凍後に残っている場合には、そのときには、沈殿が消失するまで溶液の温度を上昇させる。大きなコンテナ若しくはドラム中の大量のＱＡＣの濃縮物は、必要な場合には、ドラム加温機上で加温される。さらに、ＱＡＣの希釈水溶液と比較して、適当な水混和性有機溶媒のような、高濃度の少なくとも１の溶解性向上剤の組み合わされて、濃縮されたＱＡＣ溶液は、腐敗若しくは限定された貯蔵寿命という最小限のリスクを有する。さらに、濃縮されたＱＡＣ溶液は、ＱＡＣ粉塵に対する吸引暴露を除外することにより、エンドユーザの安全性を向上させる。ＱＡＣ粉塵の吸引は、ＱＡＣ粒子を取り扱う間、肺、目、喉、鼻及び皮膚の炎症を引き起こす可能性があるので、特に大量に扱われるときには、問題である。濃縮されたＱＡＣ溶液は、ＱＡＣ溶液の産業的使用中に輸送されるべき若しくは貯蔵されるべき溶液の容積及び重量を減少させる。さらに、最も重要なことは、食品への使用のために希釈されたＱＡＣ溶液を調製するために、濃縮されたＱＡＣ溶液が水中で希釈されるときに、希釈された濃縮物溶液が、非常に良好な抗細菌性効力を示す。
【００３７】
本発明は、特に、約１０重量％を超える濃度を有する第４級アンモニウム化合物及び、少なくとも１の溶解性向上剤を含む濃縮されたＱＡＣ溶液に向けられる。溶解性向上剤は、水溶液中のＱＡＣ粒子の溶解性を向上させる任意の水混和性有機溶媒であり、それは、結果として１０重量％を超える濃度の溶液を形成する。１０グラムのＱＡＣを秤量し、水が液体の重量を９０グラムまでにするのに必要である場合には、秤量したＱＡＣを、少なくとも１の溶解性向上剤及び水を含む９０グラムの液体中に溶解させることにより、１０重量％溶液が作成される。本発明の濃縮されたＱＡＣ溶液は、約１０重量％より高い濃度で溶液中にＱＡＣを含み、より好ましくは、約１５重量％を超える濃度である。濃縮されたＱＡＣ溶液は、約１０重量％を超え、若しくは約１５重量％を超え約６０重量％までの範囲の濃度で溶液中にＱＡＣを含む。約６０重量％を超える濃度のＱＡＣは、濃縮されたＱＡＣにおいて使用可能ではあるが、それが有用である上限は、この分率（若しくは重量）のＱＡＣ及び濃縮された溶液を調製するために使用される溶解性向上剤の間の相互作用により支配される。特定の溶解性向上剤若しくはこれらの溶解性向上剤の組合せは、６０％より高いＱＡＣが濃縮された処方（フォーミュレーション）に帰着し得る。食品を処理するため、希釈組成物を調製する前に、全てのＱＡＣ粒子を溶解させ、それを溶液状態にすることが重要である。好ましくは、ＱＡＣは、約１０重量％を超え、若しくは約１５重量％を超え約５０重量％までの濃度で存在し、より好ましくは、約１０重量％若しくは約１５重量％を超え約４０重量％までの濃度で存在する。しかし、約１０重量％を超え約３０重量％までの範囲のＱＡＣ濃度、若しくは、約１５重量％と約２５重量％との間、及び約２０重量％のこの範囲内の濃度もまた、本濃縮溶液中で有用である。
【００３８】
本発明のＱＡＣ濃度は、ｐｐｍ若しくは重量％のいずれかとしての濃度で記述され、ここで、１００，０００ｐｐｍは１０重量％に等しい。ここでの実施例では、ＣＰＣを利用し、濃度を示すためにｐｐｍ若しくは％の両者を使用する。
【００３９】
溶解性向上剤もしくはこれらの溶解性向上剤の組合せ、及び、必要であれば、溶液の残存重量を補填するための水は、重量で１００％になるように加えられる。溶解性向上剤は、約１０重量％を超える濃度でＱＡＣを溶解させる任意の相溶性の溶解性向上剤であることが本発明により意図されているが、アルコールは好ましい溶解性向上剤である。さらに、ポリエチレングリコールのようなポリグリコールは、有用な溶解性向上剤である。本発明は、１以上のこれらの溶解性向上剤を使用することを企図している。より好ましくは、アルコールは、１価アルコール、２価アルコール、３価アルコール及びこれらの組合せからなる群から選択される。これらのタイプのアルコールのうちの任意の１つは、所望の重量％の溶解性向上剤を得るために、単独で、若しくは、１以上の他のタイプのアルコールと組み合わせて使用可能である。１価アルコールが使用される場合には、このタイプのアルコールは、好ましくは脂肪族アルコールであり、より好ましくはエチルアルコールである。２価アルコールが使用される場合には、グリコール若しくはその誘導体が好ましい。グリコールの中で、プロピレングリコールが最も好ましく、任意の数の供給者から利用可能である。ＣＰＣのような、高濃度のＱＡＣの溶解性向上剤として、プロピレングリコールは、他のアルコールに対して利点を提供する。グリセロール及びその誘導体のような３価アルコールもまた、本濃縮されたＣＰＣ溶液中の溶解性向上剤として有用である。アルコールの選択は、接触する食品に依存し、ＱＡＣの食品への接触の前後の処理ステップと互換性があるように選択される。ポリグリコールが溶解性向上剤として使用される場合には、ポリエチレングリコールが好ましく、特に、６００以下の平均分子量を有する低分子量のものが公知であり、プロピレングリコールと類似の特性を有する。
【００４０】
エチルアルコールが溶解性向上剤として使用される場合には、それは約４９重量％までの濃度で存在する。約０．５重量％から約４９重量％までの範囲のエチルアルコール、約１０重量％から約４０重量％までの範囲、約１５重量％から約３０重量％までの範囲、及び約２０％でこの範囲内のエチルアルコールが本発明で有用である。
【００４１】
濃縮されたＱＡＣ溶液は、約７０重量％までの濃度のアルコールのような、少なくとも１の溶解性向上剤を含有する。より好ましくは、アルコールは、約６０重量％までの濃度で存在し、約１０重量％から約６０重量％までの範囲であり得る。溶解性向上剤の濃度は、溶液中に溶解されるべきものであるＱＡＣの重量％に依存して変化するのと同様に、濃縮されたＱＡＣ溶液及びその希釈物の特定の意図された使用に依存する。
【００４２】
好ましくは、濃縮されたＱＡＣ溶液は、約４０重量％の濃度のＱＡＣ、及び、残りの重量％を補填する水と共に、約５０重量％から約６０重量％までの範囲の濃度のアルコールを含む。この溶液において好ましいアルコールは、プロピレングリコールである。より好ましくは、濃縮されたＱＡＣは、約４０重量％の濃度のＱＡＣ、約５５乃至約６０重量％の範囲の濃度の少なくとも１のアルコール、及び、約５重量％存在する水を含む。最も好ましい濃縮されたＱＡＣ溶液は、約４０重量％の濃度のＱＡＣ、及び約５７重量％の濃度のアルコール、及び、約３重量％存在する水を含む。再度、この溶液において好ましいアルコールは、プロピレングリコールである。
【００４３】
しかしながら、約４０重量％の濃度のＱＡＣ、及び約５０重量％までの、好ましくは約５０重量％の濃度の少なくとも１のアルコールを含む濃縮されたＱＡＣ溶液もまた、有用である。この濃縮された水溶液において、溶解性向上剤は、エチルアルコール及びプロピレングリコールのようなアルコールの組合せであり得る。しかし、グリセロールもまた、単独で、若しくは、他のアルコール又はポリグリコールと組み合わせて、溶解性向上剤として有用である。グリセロールは、約２０重量％を含むこの値までの濃度でこの目的に有用であり、また、約０．５重量％から約１０重量％までの範囲の濃度、さらにこの範囲内で約１％の濃度で有用である。グリセロールは、プロピレングリコールがＱＡＣを溶解させるために選択するアルコールでない方法で有用である。さらに、有用な濃縮されたＱＡＣ溶液は、約２０重量％の濃度のＱＡＣ、エチルアルコールとプロピレングリコールの組合せのような、約５０重量％の濃度の少なくとも１のアルコールを含み、ここで、好ましくは、各アルコールは約２５重量％で存在する。
【００４４】
本濃縮されたＱＡＣ溶液中で有用なＱＡＣは、アルキルピリジニウム、テトラアルキルアンモニウム、及びアルキル脂肪環式アンモニウム塩からなる群から選択される。
【００４５】
アルキルピリジニウムは、構造式（I）により表される。
【化１】
0004272834.tif 000003
ここで、ｎは９〜２１、Ｘはハロゲン化物である。
【００４６】
テトラアルキルアンモニウムは、構造式（II）により表される。
【化２】
0004272834.tif 000004
ここで、ｎは９〜２１、ＲはＣＨ３及びＣ２Ｈ５からなる群から選択され、Ｘはハロゲン化物である。
【００４７】
アルキル脂肪環式アンモニウム塩は、構造式（III）により表される。
【化３】
0004272834.tif 000005
ここで、ｎは９〜２１であり、Ｚは４乃至５であり、ＲはＣＨ３及びＣ２Ｈ５からなる群から選択され、Ｘはハロゲン化物である。
【００４８】
種々のＱＡＣは、それらの全てが陽イオン表面活性化剤、即ち、界面活性剤であり、微生物の付着を阻害するのと同様に、種々の食品から付着した微生物を除去する有効性に関して評価される。調査されたＱＡＣのうちで、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）が最も効果的であり、以下に述べる実施例で使用されるが、本発明の意義の範囲内においてＱＡＣの使用をＣＰＣに限定することを意図したものではない。何故なら、ＱＡＣの他のメンバもまた、食品媒介性の病原性微生物に対する類似の特性を有するからである。長い側鎖に１２から１６の炭素を有するＱＡＣは、最大の抗細菌性活性を有する。好ましいＱＡＣである、ＣＰＣは、長い側鎖に１６の炭素を有する。
【００４９】
本発明は、さらに、少なくとも溶解性向上剤と、所望の重量％のＣＰＣを得るために必要であれば、水とを含有する濃縮されたＱＡＣ溶液の希釈を含み、並びに食品上での生物の増殖若しくは付着を防止するために、この希釈されたＱＡＣ溶液を食品に接触させることを含む。希釈されたＱＡＣ溶液は、約１重量％までの濃度のＱＡＣを含む。この重量％は、合衆国農業省による食品を処理すべき考慮の下で、ＱＡＣの現状での許容可能な濃度である。特定の食品に残存するＱＡＣの量は、処理される異なるタイプの食品及び使用する方法と共に変化する。本発明で記載する濃縮されたＱＡＣ溶液は、約０．０１％から約１％まで（この値を含む）の範囲のＱＡＣを有する希釈溶液を得るために、水で希釈されるが、処理される食品及び用いられる使用方法に応じて、増加若しくは減少され得る。以前に述べたように重量対重量基準に基づいて調製された濃縮されたＱＡＣ溶液は、容積対容積の希釈により所望の処理ＱＡＣ濃度を得るために希釈される。例えば、４０％の濃縮されたＱＡＣ溶液は、２．５ミリリットルのＱＡＣ濃縮物を９７．５ミリリットルの水で希釈することにより、１％のＱＡＣに希釈される。調製が容易なために、食品処理プラントにおいては、この容積対容積の希釈が望ましい。しかしながら、重量対重量の希釈もまた、希釈ＱＡＣ溶液を調製するために使用可能であり、ここで、４０重量％のＱＡＣ溶液の２．５グラムを９７．５グラムの水と混合して１％のＱＡＣ溶液を得る。濃縮された溶液中におけるＱＡＣの希釈は、また、該濃縮された溶液中にある溶解性向上剤の希釈という結果になる。希釈されたＱＡＣ濃縮溶液は、スプレー、噴霧、浸積により、食品に接触させるために有用であり、さらに、接触装置若しくは、食品加工または、加工、調製、貯蔵、及び／又は、梱包中に食品に接触する調製表面のような間接的接触を含む、ＱＡＣ溶液を食品に接触させるために適した任意の他の接触方法によっても、有用である。ＱＡＣ溶液の使用時間が短かい程、特に、産業的及び商業的食品加工目的に対してより好ましい。
【００５０】
スプレー若しくは噴霧プロセスにおいて、食品へのＱＡＣの使用時間が少なくとも約０．１秒程度まで短く低減され得る一方で、食品媒介性の微生物に対して、このプロセスの産業的使用における大きな改良点であり、商業的な利点であるが、なお微生物の付着を十分に阻害するという判定に、本発明は、さらに基づいている。噴霧若しくはスプレー使用プロセスは、食品への希釈ＱＡＣ溶液の使用時間が２０秒程度まで短くなることを許容するが、より好ましくは、約１０秒以下であり、さらに好ましくは約５秒以下である。最も好ましい範囲の食品に関するＱＡＣの使用時間は、約０．１秒から約５秒であり、その範囲内で、約０．１秒から約２秒もまた、有用であり、好ましい範囲は、０．５秒から約２秒である。本発明は、物理的に可能な限り、希釈ＱＡＣ溶液の短い使用時間を企図し、その一方で、なお、食品上若しくは食品が接触する液体中及び表面の微生物を阻害する結果となることが理解されるべきである。そのため、２０秒未満の異なる時間間隔が本発明により企図される。
【００５１】
それが短い使用時間を許容することができる限り、ＱＡＣを食品と接触させる任意の方法が本発明の方法において有用である。食品へのスプレー若しくは噴霧を提供するキャビネットを利用する方法は、本発明において有用である。食品加工プラントにおける加工ライン上のそのようなキャビネットでの使用のための機械類が、使用時間を最小限まで低減するために採用可能であり、その一方で、なお、食品に関する効果的な抗細菌性効果を得る。これらの短い使用時間の全ては、即ち、２０秒未満、及び０．１秒程度の短さは、これらの食品上の生存可能な食品媒介性の微生物を有意に低減する。さらに、非常に僅かな量のＱＡＣ希釈溶液がスプレー若しくは噴霧処理のために必要であり、例えば、食品１ポンド当たり約１オンス程度の僅かな希釈ＱＡＣ溶液が効果的な処理のために有用である。
【００５２】
鳥肉の加工プラントにおける短いＱＡＣ使用時間を有する本方法は、冷水の冷却浴中で浸積された、冷却後の鶏肉を処理するために有用である。鶏肉は、冷却浴から取り除かれ、本発明の希釈されたＱＡＣで、約２０秒未満、好ましくは１０秒未満、さらに好ましくは５秒未満、最も好ましくは約２秒未満、０．１秒程度の短い使用時間でさえ、処理される。処理された鶏肉は、引き続いて、更なる洗浄若しくはすすぎなしに、梱包される。しかしながら、当該方法は、オプションとして、必要と考えられる場合には、梱包する前に、少なくとも１回の洗浄ステップを含み得る。オプションの洗浄ステップは、食品を水でスプレー若しくは噴霧し、若しくは、コンテナ若しくは水タンク中に食品を浸積することを含み得る。
【００５３】
本発明の上述した観点は、図１乃至５を参照して所定の実施例とともに、以下に詳細に説明される。
【００５４】
以下に記載される実施例は、その好ましい実施形態における本発明をさらに図解するために役立ち、本発明を限定することを意図されてはいない。これらの実施例では、当該方法で処理する食品として、鳥肉、牛肉、ナマズ、ブロッコリー及び葡萄を使用するが、当該処理方法により悪影響を受けないであろう他の食品の処理も、本発明に包含されることを意図されている。
【００５５】
（実施例）
以下の実施例で使用される微生物は、以下のとおりである。ブドウ球菌アウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ  ２９２１３，カンピロバクター属ジェジュニ（Campylobacter jejuni）ＡＴＴＣ  ２９４２８，エシェリキア属コウライ（Escherichia coli）（非毒生産株）ＡＴＣＣ２５９２２，エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７（毒生産株）ＡＴＣＣ  ４３８９５，アルコバクター属ブツレリ（Arcobacter butzleri）ＡＴＣＣ  ４９６１６，リステリア属モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ＡＴＣＣ  ４９５９４，アエロモナス属ヒドロフィア（Aeromonas hydrophila）ＡＴＣＣ  ４９１４０，バチルス属セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ  ４９０６３，サルモネラ菌ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）ＡＴＣＣ  １４０２８及びＮＣＴＣ  １２０２３，並びにコウジカビ属フラバス（Asperigillus flavus）及びアオカビ属クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）の商業的に利用可能な培養菌である。
【００５６】
（実施例１）懸濁培養中の第４級アンモニウム化合物の殺菌活性（肉製品に付着していない）
第４級アンモニウム化合物の最少阻害濃度（minimum inhibitory concentration,ＭＩＣ）
１９８７年の臨床研究室標準の国家委員会（National Committee for Clinical Laboratory Standards）により確立されたマクロダイリューション（macrodilution）法を用いて、ミューラーヒントン（Mueller Hinton）培養液（broth）（ＢＢＬ微生物システム）において、ＱＡＣに関する最少阻害濃度（ＭＩＣ）が決定された。ブドウ球菌アウレウス、エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７、リステリア属モノサイトゲネス及びサルモネラ菌ティフィムリウムに対して、３７℃で１６時間の培養（インキュベーション、incubation）により、実験が行われた。アエロモナス属ヒドロフィア及びバチルス属セレウスの培養は、３０℃で実行された。ＭＩＣは、目に見える濁り度のない最低希釈により決定された。表２は、上記実験からのデータを示す。
表２  最少阻害濃度（ＭＩＣ）
【表２】
0004272834.tif 000006
【００５７】
第４級アンモニウム化合物の最少殺菌濃度（minimum bactericidal concentration,ＭＩＣ）
カンピロバクター属ジェジュニ及びアルコバクター属ブツレリに対するＱＡＣの最少殺菌濃度（minimum bactericidal concentration,ＭＢＣ）は、１９８７年の臨床研究室標準の国家委員会により確立されたマクロダイリューション法を用いて、ミューラーヒントン培養液（ＢＢＬ微生物システム）において、決定された。実験は、３７℃で４８時間の微好気性インキュベーションにより行われた。各希釈（物）の部分標本（aliquot）は、寒天中にポアプレートされ（pourplated）、３７℃で４８時間、微好気性条件で培養された。ＭＢＣは、増殖のない最低希釈として決定された。表３は、上記実験からのデータを示す。
表３  最少殺菌濃度（ＭＢＣ）
【表３】
0004272834.tif 000007
【００５８】
ＭＩＣ及びＭＢＣデータは、ＣＰＣが広範囲の微生物に対して効果的であることを示す。
【００５９】
プランクトン細胞における第４級アンモニウム化合物の活性
トリプチケースソイ（tripticase soy）培養液中における各エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の１６時間培養物は、遠心（分離）された（１５，０００回転／分、１０分、４℃）。上澄み液の除去後に、ペレットは、１０ｍｌの０．０４モルの燐酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ，ｐＨ７．０）で洗浄され、ＰＰＢ中に懸濁され、１乃至２×１０９細胞／ｍｌの最終懸濁液が得られた。部分標本（１．０ｍｌ）は、遠心（分離）され（１４，０００回転／分、３分）、上澄み液は除去された。各ペレットは、試験組成物（ＣＰＣ）の種々の濃度（１００乃至１，０００μｇ／ｍｌ）の水溶液１ｍｌ若しくは１．０ｍｌのＰＰＢのいずれかに懸濁され、３０秒撹拌され（vortexed）、２５℃で１分インキュベートされ、遠心（分離）された（１４，０００回転／分、３分）。上澄み液の除去後に、各ペレットは、０．５ｍｌのＰＰＢ中に懸濁された。各サンプルからの細胞は、複製した０．０５ｍｌの部分標本及びトリプチケースソイ寒天上での標準の逐次希釈手法を用いて計数され、平均コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌとしてデータが記録された。
【００６０】
上記実験の結果は、懸濁液中で生存しているエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の完全な減少が、試験した全てのＣＰＣ濃度（１００，２５０，５００及び１０００μｇ／ｍｌ）で達成されたことを示す。この実験の結果は、肉の産業的加工におけるエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の交差汚染を予防するために特に重要である。上述したように、毒生産性エシェリキア属コウライの株は、多くの広域スペクトルの抗細菌性剤に対する抵抗力を示す。これらの結果は、食品をＱＡＣで処理することが汚染された肉片が汚染されていない他の肉片を汚染することを防止するであろう証拠を提供する。何故なら、ＱＡＣは、交差汚染の原因となる伝播剤である液体中の生物を殺すからである。
【００６１】
（実施例２）鶏の皮膚に付着した生存バクテリアの低減に関する第４級アンモニウム化合物の効果
鶏のすねから切除し、電子源から４５ＫＧｙの線量の照射により滅菌された鶏の皮膚（２．５×２．５ｃｍ）が、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに表皮側を上にして配置された。各皮膚片は、５ｍｌの燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）でのみ処理されるバックグランド対照群を除いて、６乃至８×１０３ＣＦＵ／ｍｌのバクテリアを含有する５ｍｌの０．００８モルのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で接種された。該プレートは、インキュベートされ（３０分、３５℃）、各皮膚片はリンスされ（５ｍｌのＰＢＳで２回）、緩く結合している（付着していない）微生物を除去した。各接種された皮膚は、ＣＰＣを含む５ｍｌのＰＢＳで処理された。３片の皮膚が、該皮膚が５ｍｌのＰＢＳのみで処理される１つ（濃度ゼロ）を含むＣＰＣの各濃度に対して使用された。該プレートは、２５℃で３０分間の振とう（１００ｒｐｍ）とともにインキュベートされた。インキュベート後に、各皮膚片は、（５ｍｌのＰＢＳで）リンスされ、８０ｍｌの塩水若しくは１％のペプトンを含有する無菌プラスチック袋に配置され、実験用ブレンダー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００，Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて２分間ホモジナイズされた。このホモジェネート（１ｍｌ）の３つの部分標本は、ポアプレートされ、インキュベートされた（３７℃、１８乃至２４時間）。バクテリアコロニーが計数され、希釈に関して修正され、ＣＦＵ／皮膚として報告された。
【００６２】
これらの研究は、５０乃至１０００ｐｐｍの濃度のＣＰＣで処理した後で、生存しているバクテリア（サルモネラ菌ティフィムリウム、ブドウ球菌アウレウス、カンピロバクター属ジェジュニ、エシェリキア属コウライ（非毒生産株）及びエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７）の減少を示す。８，０００ｐｐｍまでの高濃度のＣＰＣがエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７に対して試験され、付着したバクテリアの数を０．１％以下まで低減することが見出された。これらの研究は、鶏の皮膚上でこれらの５つのバクテリアの増殖を有意に阻害することを示す。
【００６３】
（実施例３）鶏の皮膚へのバクテリア付着の阻害に関する第４級アンモニウム化合物の効果
鶏のすねから切除し、電子源から４５ＫＧｙの線量の照射により滅菌された鶏の皮膚（２．５×２．５ｃｍ）が、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに表皮側を上にして配置された。各皮膚片は、ＣＰＣを含有する５ｍｌの０．００８モルの燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で接種された。３片の皮膚が、該皮膚が５ｍｌのＰＢＳのみで処理される１つ（濃度ゼロ）を含む試験化合物の各濃度に対して使用された。該プレートは、振とう（１００ｒｐｍ）とともに２５℃で種々の時間（１分若しくは１０分）インキュベートされた。このインキュベーション溶液は、吸引により除去され、当該皮膚は、リンスされ（５ｍｌのＰＢＳ）、次いで、６乃至８×１０３ＣＦＵ／ｍｌのバクテリアを含有する５ｍｌのＰＢＳで３５℃で３０分インキュベートされた。インキュベーション後、緩く結合した（付着していない）微生物を除去するために、各皮膚片は、リンスされ（５ｍｌのＰＢＳで２回）、８０ｍｌの塩水若しくは１％のペプトンを含有する無菌プラスチック袋に配置され、実験用ブレンダー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００，Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇａｌａｎｄ）を用いて２分間ホモジナイズされた。このホモジェネート（１ｍｌ）の３つの部分標本は、ポアプレートされ、インキュベートされた（３７℃、１８乃至２４時間）。バクテリアコロニーが計数され、希釈に関して修正され、ＣＦＵ／皮膚として報告された。
【００６４】
これらの研究は、５０乃至１０００ｐｐｍの濃度のＣＰＣで処理した後で、鶏の皮膚へのバクテリアの付着（サルモネラ菌ティフィムリウム、ブドウ球菌アウレウス、カンピロバクター属ジェジュニ、エシェリキア属コウライ（非毒生産株）及びエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７）の阻害を示す。これらの研究のデータから、ＣＰＣで鶏の皮膚を予備処理することは、これらの微生物が鶏の皮膚に付着することを有意に阻害することを示す。
【００６５】
僅か１分間だけＣＰＣで鶏の皮膚を処理することにより、結果として、５００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍで、サルモネラ菌ティフィムリウムの付着を有意に阻害する。肉製品とのこの短い接触時間は、以前に有効であると報告されていたものより短い接触時間を用いることを支持する。通常、冷却タンク浸積は６０分間までは可能であるが、ここで示されたデータは、結果的に、なお、生存微生物の数を有意に減少させる、より短い接触若しくは浸積時間が、使用可能であることを支持する。本発明のＣＰＣ接触ステップは、概ね、２０秒から約６０分間実行可能である。本発明は、また、１０分未満のこの範囲内で、約２０秒から約９分の範囲で、約２０秒から約５分の範囲で、並びに約２０秒から約９０秒の範囲で、有用な接触時間を開示する。
【００６６】
（実施例４）牛肉脇腹肉ステーキに付着した生存バクテリアの減少に関する第４級アンモニウム化合物の効果
牛肉脇腹肉の正方形組織（２．５×２．５ｃｍ）は約０．５ｃｍ厚さであり、電子源から４５ＫＧｙの線量の照射により滅菌され、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに配置された。各組織片は、５ｍｌのＰＢＳでのみ処理されるバックグランド対照群を除いて、６乃至８×１０３ＣＦＵ／ｍｌのバクテリアを含有する５ｍｌの０．００８モルの燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で接種された。該プレートは、インキュベートされ（３０分、３５℃）、各皮膚片はリンスされ（５ｍｌのＰＢＳで２回）、緩く結合している（付着していない）微生物を除去した。各接種された正方形片は、ＣＰＣを含む５ｍｌのＰＢＳで処理された。３片の組織が、該正方形片が５ｍｌのＰＢＳのみで処理される１つ（濃度ゼロ）を含む試験化合物の各濃度に対して使用された。該プレートは、振とう（１００ｒｐｍ）とともに２５℃で３０分間インキュベートされた。インキュベート後に、各正方形片は、（５ｍｌのＰＢＳで）リンスされ、５０ｍｌの１％ペプトンを含有する無菌プラスチック袋に配置され、実験用ブレンダー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００，Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて２分間ホモジナイズされた。このホモジェネート（１ｍｌ）の３つの部分標本は、ポアプレートされ、インキュベートされた（３７℃、１８乃至２４時間）。バクテリアコロニーが計数され、希釈に関して修正され、ＣＦＵ／正方形片として報告された。
【００６７】
この研究の結果は、牛肉の脇腹肉の組織上での５０乃至１０００ｐｐｍの濃度のＣＰＣでの処理後に、５００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍのＣＰＣで付着したバクテリアの６２乃至６４％を減少させると共に、生存しているエシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の低減を示す。
【００６８】
（実施例５）牛肉の脇腹肉の組織へのバクテリ付着の阻害に関する第４級アンモニウム化合物の効果
牛肉脇腹肉の正方形組織（２．５×２．５ｃｍ）は約０．５ｃｍ厚さであり、電子源から４５ＫＧｙの線量の照射により滅菌され、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに配置された。各組織片は、ＣＰＣを含有する５ｍｌの０．００８モルの燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で処理された。３片の牛肉組織が、該正方形片が５ｍｌのＰＢＳのみで処理される１つ（濃度ゼロ）を含む試験化合物の各濃度に対して使用された。該プレートは、振とう（１００ｒｐｍ）とともに２５℃で１０分インキュベートされた。このインキュベーション溶液は、吸引により除去され、当該正方形片は、リンスされ（５ｍｌのＰＢＳ）、次いで、６乃至８×１０３ＣＦＵ／ｍｌのバクテリアを含有する５ｍｌのＰＢＳで３５℃で３０分インキュベートされた。インキュベーション後、緩く結合した（付着していない）微生物を除去するために、各皮膚片は、リンスされ（５ｍｌのＰＢＳで２回）、５０ｍｌの１％ペプトンを含有する無菌プラスチック袋に配置され、実験用ブレンダー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００，Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇａｌａｎｄ）を用いて２分間ホモジナイズされた。このホモジェネート（１ｍｌ）の３つの部分標本は、ポアプレートされ、インキュベートされた（３７℃、１８乃至２４時間）。バクテリアコロニーが計数され、希釈に関して修正され、ＣＦＵ／皮膚として報告された。
【００６９】
この研究の結果は、１０００ｐｐｍのＣＰＣ濃度で当該牛肉に付着したバクテリアの数を７６％減少させると共に、５０乃至１０００ｐｐｍのＣＰＣでの処理後に、エシェリキア属コウライＯ１５７：Ｈ７の付着の阻害を示す。図１は、高濃度のＣＰＣ及び同一の実験手順を用いた別々の試験結果を示す。２０００ｐｐｍのＣＰＣで、牛肉に付着したバクテリアは完全に抑制された。
【００７０】
（実施例６）０．１％塩化セチルピリジニウムでの予備冷却鳥肉へのスプレー
スプレー試験チャンバは、鳥肉加工パイロットプラント内で使用するために設計され、建設された。スプレー試験システムは、試験チャンバ、スプレー水貯蔵タンク、圧力ポンプ、フィルタ、圧力調整器、４つの側部に配置された８つのノズルを有するプラスチック製スプレーチャンバ、及び使用した水回収器から構成されていた。前面及び背面のスプレー用の各パイプ上に３つのノズルがあった。１つのノズルは、上部スプレー用に使用され、別の１つは底部スプレー用に使用された。チャンバ寸法は、好ましくは、３×３×３フィートである。高圧力ブースターポンプを用いて、圧力は、０乃至１４０ｐｓｉの間で調製可能であった。スプレーノズルと鶏の死体との間の距離は、１２乃至１５インチであった。上部ノズルは、鶏の死体の内部にスプレーするために使用された。平形−円錐形（flat-cone）スプレーノズル（１／８ＴＫ−ＳＳ１，Ｓｐｒａｙｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏ．社）が使用された。
【００７１】
貯蔵タンク内のスプレー溶液は、ポンプで圧力調整器まで輸送され、次いで、チャンバ内のノズルを介してスプレーされた。スプレーチャンバ内では、ステンレス鋼製ノズル及びパイプからなる数個のスプレー層が設置され、チャンバは化学ドリフト（drift）を抑制するためにプラスチックシートで覆われた。シャックルがチャンバ内に鶏の死体を吊すために使用された。
【００７２】
予備冷却された鶏の死体は、地元の鳥肉加工プラントから得られた。それらは、内蔵除去ラインの端部から引き取られ、研究室まで運搬され、即座に試験のために使用された。この処理プラントと研究室との間で経過した時間は、３０分未満であった。鶏の死体の温度は、３２乃至３７℃の範囲であった。
【００７３】
鶏の死体は、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌで１ｍｌのサルモネラ菌ティフィムリウムをスプレーすることにより接種された。この接種された鶏の死体は、３０ｐｓｉ，２２℃で５秒間水道水を噴霧することによりリンスして、緩く付着したサルモネラ菌細胞が洗い落とされた。その後、各死体は、スプレーチャンバに吊され、試験化合物の１つがスプレーされた。スプレー後に、各鶏の死体は、２０秒間水道水でリンスされた。この鶏の死体は、次いで、自動振とう器のプラスチック袋中の緩衝されたペプトン水で洗浄され、生物分析用のサンプルを得た。鶏の皮膚の色は、ＱＡＣのような試験化合物で処理された鳥を未処理の鳥と比較することにより、目視検査された。
【００７４】
１０００ｐｐｍの濃度のＣＰＣは、異なるスプレー圧力及び継続時間で使用された。スプレー水の温度は、室温の２２℃に設定された。圧力は、３０，５０及び１２０ｐｓｉに、継続時間は、３０及び９０秒に設定された。各試験が３回繰り返された。鶏の死体上のサルモネラ菌ティフィムリウムの減少は、試験化合物が噴霧された群、水が噴霧された群、何も噴霧されなかった群の間で比較された。
【００７５】
スプレー処理後、各死体は、１ｍｌの緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）で１分間、機械的に振とうされ、次いで、洗浄水は回収された。サンプルは、希釈され、富化され（enriched）、ＸＬＴ寒天若しくはＰｅｔｒｉｆｉｌｍ（３Ｍ，Ｉｎｃ．社；Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，総好気菌計数プレート用）上に配置され、３７℃で１８乃至２４時間インキュベートされた。次いで、コロニー形成単位が計数された。付着したバクテリアの数は、最尤数手法（most-probable-number method）を用いて算出された。サルモネラ菌及び総好気菌計数は、洗浄水サンプルを用いて、各死体について実行された。分散分析が実験データを解析して、処理群と対照（参照）との間の有意な差を判別するために使用された（ＳＡＳ／ＳＴＡＴ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．社，Ｃａｒｙ，ＮＣ  １９９３年）。
【００７６】
この実験の結果は、３０，５０及び１２０ｐｓｉで１０００ｐｐｍのＣＰＣ溶液を３０及び９０秒スプレーすることが、鶏の死体上のサルモネラ菌の数を有意に減少させることを示す。このデータは、０．１％のＣＰＣ濃度で３０乃至１２０ｐｓｉの圧力範囲において、３０秒乃至９０秒の間スプレーされるときに、スプレー法が、鶏の標準浸透法若しくは浸積法に対して可能性のある代替方法であることを示す。食品媒介性の微生物の有意な減少となる最も効果的なプロセスを得るために、スプレー圧力を３０乃至１２０ｐｓｉ若しくはさらに大きい圧力の開示された範囲内で変化させ、及び、スプレー時間を変化させて、より低い濃度のＣＰＣを使用することも可能であろう。スプレー法は、産業プロセスにおいて使用するのに有利であろう。何故なら、多くの鶏の死体は、短い時間、自動的にスプレーされて、なお、病原性バクテリアの数を有意に減少させる結果となり得るからである。
【００７７】
（実施例７）鶏の皮膚上のサルモネラ菌ティフィムリウムに関する第４級アンモニウム化合物の効果の有効濃度及び時間の研究
鶏の皮膚上で生存可能なサルモネラ菌ティフィムリウムの阻害及び低減に関するＣＰＣの効果が検討された。試験溶液は、０．００８モル、ｐＨ７．２の燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の体積比５％のグリセリン中に種々の濃度のＣＰＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含んでいた。この溶液は、適当な量のＣＰＣをグリセリン−ＰＢＳ混合物の中に溶解させることにより調製された。新鮮に冷凍され、加工されていない鶏のすねから皮膚の正方形片（２．５×２．５ｃｍ）が、４５ＫＧｙの線量の放射（Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの線形加速器からの電子ビーム）により滅菌された。サルモネラ菌ティフィムリウムの起源は、ＡＴＣＣ株１４０２８番若しくはＮＣＴＣ株１２０２３番であった。トリプティックソイ（tryptic soy）寒天（ＴＳＡ，ＤＩＦＣＯ社，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）上で、全てのコロニー計数が実行された。接種物調製は、以下のように実行された。５０ｍｌのトリプティックソイ培養液を含有するフラスコが、単一コロニーからのサルモネラ菌ティフィムリウムを接種され、次いで、振とうしながら（１５０ｒｐｍ）３７℃で一晩インキュベートされた。当該培養液の１ｍｌの部分標本が、９ｍｌのＰＢＳで（４８００ｒｐｍ，１０分）２回洗浄された。ペレットは、ＰＢＳ中に再懸濁されて、１乃至２×１０６ＣＦＵ／ｍｌの最終細胞濃度（４２０ｎｍの分光測定による）を得た。
【００７８】
鶏の皮膚は、すねから切除されて、表皮を上にして、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに配置された。皮膚片は、５ｍｌのＰＢＳでのみ処理されるバックグランド対照群を除いて、１乃至２×１０６ＣＦＵ／ｍｌのサルモネラ菌を含有する５ｍｌのＰＢＳを接種された。皮膚片を有する培養プレートは、インキュベートされ（３０分、３５℃）、次いで、インキュベーション溶液は、吸引により除去された。接種された皮膚は、５ｍｌの試験溶液で処理された。３片の皮膚からなる組は、該皮膚が体積比でＰＢＳ（濃度ゼロ）中に５％グリセリン溶液５ｍｌのみで処理される１つの組を含む試験溶液の各濃度に対して使用された。該プレートは、２５℃で１，３及び１０分間の振とう（１００ｒｐｍ）とともにインキュベートされた。インキュベート後に、各正方形片は、吸引しながら（５ｍｌのＰＢＳで）リンスされ、５０ｍｌの０．１％ペプトン（ｗ／ｖ）を含有する無菌プラスチック袋に配置され、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００実験用ブレンダー（Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて２分間ホモジナイズされた。当該袋の角部は、無菌的に切断され、全内容物が無菌遠心チューブに移送され、それは、次いで、１０分間（１２，０００ｒｐｍ，２０℃）回転された。ペレットは、５ｍｌの０．１％（ｗ／ｖ）のペプトン／水に再懸濁された。適当な希釈物の１ｍｌがＴＳＡ寒天上に２つ複製してポアプレートされ、次いで、３７℃で２４時間インキュベートされ、コロニーが計数された後で、希釈に関して修正され、ＣＦＵ／皮膚として報告された。その結果は、サルモネラ菌の減少が、ＣＰＣ濃度及び暴露時間の両者に依存していたことを示す。３分程度の短い接触時間で４０００ｐｐｍ及び８０００ｐｐｍのＣＰＣ溶液で処理することにより、約５ｌｏｇ１０の汚染除去が達成された。
【００７９】
皮膚正方形片は、表皮を上にして、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに配置された。皮膚片は、５ｍｌの試験溶液で処理された。３片の皮膚からなる複数の組が、当該皮膚がＰＢＳ中に体積比で５％のグリセリン溶液（濃度ゼロ）５ｍｌでのみ処理された１組を含む、試験溶液の各濃度に対して使用された。皮膚片を有する培養プレートは、振とう（１００ｒｐｍ）と共に、２５℃で１，３及び１０分間インキュベートされた。このインキュベート溶液は、吸引により除去され、皮膚は、リンスされ（５ｍｌのＰＢＳ）、次いで、１乃至２×１０６ＣＦＵ／ｍｌのサルモネラ菌ティフィムリウムを含有する５ｍｌのＰＢＳでインキュベートされた（３０分、３５℃）。インキュベーション後、各皮膚片は、吸引しながらリンスされ（５ｍｌのＰＢＳ）、５０ｍｌの０．１％（ｗ／ｖ）ペプトンを含む滅菌プラスチック製袋に配置され、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００実験用ブレンダーを用いて２分間ホモジナイズされた。ホモジェネート（１ｍｌ）の３つの部分標本は、ＴＳＡ寒天上にポアプレートされ、３７℃で２４時間インキュベートされ、次いで、コロニーが計数され、希釈に関して修正され、ｌｏｇ１０ＣＦＵ／皮膚として報告された。その結果は、ＣＰＣでの予備処理によるサルモネラ菌汚染の予防は、また、濃度及び時間依存性を示したことを示唆する。最も顕著な効果は、１０分間の予備処理時間に対して観察され、この場合、４．９ｌｏｇ１０のサルモネラ菌付着の阻害が、８，０００ｐｐｍの濃度で示された。交差汚染の予防は、食品加工において最も重要であるので、この結果は重要である。
【００８０】
対照に関するｌｏｇ１０ＣＦＵ／皮膚の値は、４．６１から５．０３の範囲内であった。処理サンプルと対照との間の差は、ニューマンケウルス多重範囲解析（Newman-Keuls multiple range analysis）に従うＡＮＯＶＡを用いて解析され、統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【００８１】
別のスプレー実験では、５，０００ｐｐｍのＣＰＣ溶液を鶏の死体に９０秒スプレーした後で、３．３ｌｏｇ１０のサルモネラ菌の減少が得られた。
【００８２】
（実施例８）鶏の皮膚に付着した生存リステリア属モノサイトゲネスの減少に関する第４級アンモニウム化合物の効果
リステリア属モノサイトゲネスが、鶏の皮膚に接種するために使用され、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ４００中で使用されたプラスチック製袋中の培地が０．１％ペプトンを含有していた以外は、実施例２のステップに従った。２０００ｐｐｍ若しくはこれ以上のＣＰＣ濃度において、４ｌｏｇ１０以上のリステリア属モノサイトゲネスの減少があった。
【００８３】
（実施例９）鶏の皮膚に付着した生存リステリア属モノサイトゲネスの付着の阻害に関する第４級アンモニウム化合物の効果
リステリア属モノサイトゲネスが、鶏の皮膚に接種するために使用され、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ４００中で使用されたプラスチック製袋中の培地が０．１％ペプトンを含有していた以外は、実施例３のステップに従った。この研究の結果は、５０ｐｐｍで付着したバクテリアの８２％の減少、１００ｐｐｍで９２％の減少、５００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍで１００％の減少を示す。
【００８４】
（実施例１０）ナマズ、黒葡萄及びブロッコリーに付着した生存サルモネラ菌ティフィムリウムの減少に関する第４級アンモニウム化合物の効果
ナマズ、黒葡萄及びブロッコリー上で生存しているサルモネラ菌ティフィムリウムの減少に関するＣＰＣの効果が検討された。試験溶液は、０．００８モル、ｐＨ７．２の燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の体積比で５％のグリセリン中に種々の濃度のＣＰＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む。この溶液は、グリセリン−ＰＢＳ混合物中に適当な量のＣＰＣを溶解させることにより調製された。
【００８５】
食品サンプルは、小さい無傷の黒葡萄、ブロッコリーの花房、及び、新鮮に凍結された未処理のナマズから切除されたナマズの皮膚の正方形片（２．５×２．５ｃｍ）であった。果物及び野菜は、地元の食料品店から購入され、魚は、地元のナマズ供給者から冷凍して出荷された。サルモネラ菌ティフィムリウムの起源は、ＡＴＣＣ株１４０２８番若しくはＮＣＴＣ株１２０２３番であった。
【００８６】
全てのコロニー計数は、サルモネラ菌選択性ＸＬＤ寒天（ＤＩＦＣＯ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）プレートを使用して実行された。さらに、ナマズの実験においては、総好気性コロニーの計数が、非選択性培地である、トリプティックソイ（triptic soy）寒天（ＴＳＡ：ＤＩＦＣＯ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を使用して実行された。サルモネラ菌の貯蔵は、ＴＳＡ上であった。
【００８７】
サルモネラ菌ティフィムリウムに関する接種物調製は、上記実施例７で述べたように実行された。食品サンプルは、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに配置された。次いで、サンプルは、５ｍｌのＰＢＳでのみ処理されるバックグランド対照群を除いて、１乃至２×１０６ＣＦＵ／ｍｌのサルモネラ菌ティフィムリウムを含有する５ｍｌのＰＢＳを接種された。食品サンプルを有する培養プレートは、インキュベートされ（３０分、３５℃）、次いで、インキュベート溶液は吸引により除去された。接種されたサンプルは、５ｍｌの試験溶液で処理された。３つの食品サンプルからなる複数の組は、当該食品サンプルがＰＢＳ中に体積比で５％のグリセリン溶液（濃度ゼロ）５ｍｌでのみ処理された１組を含む、試験溶液の各濃度に対して使用された。該プレートは、振とう（１００ｒｐｍ）と共に、２５℃で３分間インキュベートされた。インキュベーション後、各食品サンプルが調製され、上記実施例７で述べたように、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００実験用ブレンダーで使用するプラスチック製袋に配置された。この袋の角部は、無菌的に切断され、全内容物が無菌遠心チューブまで移送され、当該チューブは、次いで、１０分間回転した（１２，０００ｒｐｍ，２０℃）。ペレットは、５ｍｌの０．１％（ｗ／ｖ）ペプトン／水中で再懸濁された。１ｍｌの適当な希釈物が、葡萄及びブロッコリーの実験に対して、ＸＬＤ寒天にポアプレートされ、２個複製されたナマズに対しては、ＸＬＤ及びＴＳＡ寒天にポアプレートされた。３７℃で２４時間のインキュベーション後、コロニーが計数され、希釈に関して修正され、ナマズに関してはＣＦＵ／皮膚として、他の食品サンプルに関しては、ＣＦＵ／グラムとして報告された。これらの実験結果は、図２乃至５に示されている。図２は、非選択性培地上での全好気性バクテリアの計数を示し、一方、図３は、サルモネラ菌のみの計数を示す。
【００８８】
（実施例１１）鶏全体に生存しているバクテリアの減少に関する第４級アンモニウム化合物のスプレー効果
商業的スプレー機を使用して鶏の死体全体にＱＡＣをスプレーすることが、生存バクテリアの減少に及ぼす効果を、これらの実験で試験した。バクテリアの接種された溶液は、以下のようにして作成された。エシェリキア属コウライは、脳心臓注入培養液（ＢＨＩ，brain heart infusion broth）中で２０乃至２４時間増殖され、次いで、０．５ｍｌのエシェリキア属コウライ培養物を５００ｍｌの生理食塩水（ＰＳＳ，physiological saline solution）に加えることにより、１：１０００の濃度まで希釈された。サルモネラ菌ティフィムリウムは、ＢＨＩ中で２０乃至２４時間増殖され、次いで、０．１ｍｌのサルモネラ菌ティフィムリウム培養物を５００ｍｌの生理食塩水（ＰＳＳ）に加えることにより、１：５０００の濃度まで希釈された。ＣＰＣ処理溶液は、５，０００ｐｐｍの濃度まで調製された。予備冷却した鶏の死体は、各試験に対して、地元の鳥肉加工プラントから得られた。この死体は、シャックルラインに配置され、１ｍｌのバクテリア接種溶液が死体の胸部にスプレーされ、１ｍｌが背中にスプレーされた。このバクテリアは、室温で３０分間付着することが許容された。付着後、死体はシャックルライン上で水道水により２０秒間リンスされた。この死体は、１０の群に分割された。各実験に対して、５，０００ｐｐｍのＣＰＣをスプレーされた１０羽の鶏からなる１つの群と、水道水のみをスプレーされた１０羽の鶏からなる１つの群とが存在した。サルモネラ菌ティフィムリウム試験では、スプレーの効果を評価するために、接種後にスプレーされなかった１つの群があった。
【００８９】
全てのバクテリアに関して、死体の１つの群は、３５カップの水道水を用いて６０ｐｓｉで２０秒間Ｊｏｈｎｓｏｎ（商標）洗浄機で処理された。リンス後、死体は、９０秒間セット（set）することが許容され、次いで、８０ｐｓｉで２０秒間２０カップの水道水でリンスされた。このリンスサイクルは、２回若しくは３回繰り返された。各リンス間隔は、また、９０秒であった。死体の別の群は、Ｊｏｈｎｓｏｎ（商標）洗浄機内で、６０ｐｓｉで２０秒間、５，０００ｐｐｍのＣＰＣで処理され、次いで、９０秒間セットすることを許容され、その後、８０ｐｓｉで２０秒間２０カップの水道水でリンスされた。このリンスサイクルは、２回若しくは３回繰り返された。
【００９０】
処理後に、死体は、プラスチック製袋に配置され、１００ｍｌの０．１％緩衝ペプトン水（ＢＰＷ，buffered peptone water）が各袋に加えられた。この袋は、機械的に振とうされ、リンス液は最尤数（ＭＰＮ，most probable number）手法用に回収された。Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）が、また、総好気性プレート計数（ＴＰＣ，total aerobic plate counts）を評価するために採用された。既に存在している（接種されていない）カンピロバクター属ジェジュニは、ＭＰＮ手法により、エシェリキア属コウライはＰｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）により、数えられた。
【００９１】
以下に示す結果は、ＣＰＣ処理が、カンピロバクター属ジェジュニ、エシェリキア属コウライ及びサルモネラ菌ティフィムリウムの数を減少させるのに効果的であった。サルモネラ菌ティフィムリウムの実験に関する洗浄水は、試験され、洗浄水中のＣＰＣが１ｌｏｇだけサルモネラ菌を減少させることが見出された。このため、サルモネラ菌に関する以下の殺菌データは、１ｌｏｇだけ差し引くことができる。
【表４】
0004272834.tif 000008
【表５】
0004272834.tif 000009
【００９２】
（実施例１２）食品媒介性の真菌に関する第４級アンモニウム化合物の効果
この研究は、食品媒介性の真菌に関するＣＰＣの効果を試験した。コウジカビ属フラバス及び青カビ属クリソゲナムの傾斜培養（slant culture）が、ジャガイモブドウ糖寒天（ＰＤＡ，potato dextrose agar）プレート上にすじを付けられた（streaked）。接種後３０分若しくは接種後２４時間（及び室温でのインキュベーション後）に、２つの円形フィルター（直径７ｍｍ）が各プレートの表面に載置された。２００ｐｐｍ，１０００ｐｐｍ，５０００ｐｐｍ及び２５，０００ｐｐｍのＣＰＣ溶液若しくは蒸留され且つ脱イオン化された（ＤＤ，distilled and deionized）水が該フィルターに、フィルター当たり１０μｌ加えられた。全てのプレートは、蓋側を上にして、室温で４８時間インキュベートされた。阻害円（inhibition rings）の直径が測定された。以下に示す結果は、ＣＰＣが食品媒介性の真菌類に対して効果的であることを示している。
【表６】
0004272834.tif 000010
【表７】
0004272834.tif 000011
【００９３】
ＣＰＣは、試験した食品媒介性の真菌類に対して効果的である。
【００９４】
（実施例１３）短い使用時間を用いた鶏の死体に関する第４級アンモニウム化合物の効果
商業的ブロイラー加工施設内で行われた２つの試験では、ＣＰＣ（４０％）、プロピレングリコール（５７％）及び水（３％）を含み、全成分が重量対重量基準である、Ｃｅｃｕｒｅ（商標）組成物（０．２乃至０．５％のＣＰＣ）が、冷却後の鶏の死体を処理するために使用された。これらの研究においては、最終リンスキャビネット若しくは、等級分け及び梱包前で、浸透冷却後に、ＣＰＣ組成物の使用のために配置された「フィーカル破損（fecal failure）」キャビネットは、ＣＰＣ組成物の使用のために改良された。キャビネットの改良は、ノズルを変更して死体当たりの唯一の少ない容積の組成物（１乃至６オンス）を許容し、死体上へのスプレーパターンを改良して最大表面積を全部カバーすることを許容することを含んでいた。さらに、キャビネットの長さは、延長され、キャビネット排気機構が装備された。濃縮されたＣｅｃｕｒｅ（商標）組成物は、死体へ直接使用する地点において、正しい使用濃度まで希釈されるか、若しくは、希釈され、使用前に大きな容器に保持されるかのいずれかである。希釈Ｃｅｃｕｒｅ（商標）溶液は、各死体に対して、約１．５秒間使用された。この溶液の温度は、室温であり、若しくは、貯蔵条件に応じて、若干上下した。
【００９５】
希釈Ｃｅｃｕｒｅ（商標）による死体の処理後に、当該死体は、微生物学的サンプリングに先立って、概ね３分間ドリップすることを許容された。４００ｍＬの緩衝ペプトン水中での全死体リンス手法を用いて、死体がサンプルされた。カンピロバクター属、サルモネラ菌、非毒生産性エシェリキア属コウライ、及び全生物を評価する好気性プレート計数に関して、サンプルが評価された。対照死体は、また、これらの同一の生物に関して評価されたが、これらの死体は、改良されたフィーカル破損キャビネットの直前で、捕集された。両者の試験においては、カンピロバクター属、エシェリキア属コウライ、及び好気性（全好気性バクテリア）プレートは、９９％を超えるだけ、有意に低減された。両者の試験では、サルモネラ菌の発生は、１０％未満まで有意に低減される一方で、対照死体のサルモネラ菌の発生速度は、ある場合においては、６０％を超えていた。
【００９６】
上記教示に照らして、開示された発明に対して種々の改良が可能であるため、本発明の好ましい実施形態の前述した記載は、図解目的のために示されたものであり、発明を実施例中で使用された特定の組成物に限定することを意味するものではない。本発明は、ＱＡＣが、以前に知られていたよりも、広域スペクトルの食品媒介性の微生物汚染によるバクテリア汚染を抑制し、低減するという発見に基づく。濃縮されたＱＡＣのフォーミュレーションは、食品加工プラント内での大規模な使用に関して多くの利点を提供する。本発明は、添付のクレームにより定義される本発明の精神及び範囲内に含められる可能性のある、代替物、改良物及び均等物を包含することを意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＣＰＣでの処理後の牛肉の脇腹肉組織に対するエシェリキア菌コウライＯ１５７：Ｈ７の付着の阻害を示す棒グラフである。
【図２】  図２は、非選択性培地上で５％グリセリン水溶液中のＣＰＣで処理した後のナマズの皮膚上に生存している微生物の減少を示す棒グラフである。
【図３】  図３は、選択性培地上で５％グリセリン水溶液中のＣＰＣで処理した後のナマズの皮膚上に生存しているサルモネラ菌ティフィムリウムの減少を示す棒グラフである。
【図４】  図４は、５％グリセリン水溶液中のＣＰＣで処理した後の黒葡萄上に生存しているサルモネラ菌ティフィムリウムの減少を示す棒グラフである。
【図５】  図５は、５％グリセリン水溶液中のＣＰＣで処理した後のブロッコリー上に生存しているサルモネラ菌ティフィムリウムの減少を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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