(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節炎の予防薬または治療薬。
【請求項２】
FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の医薬。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である請求項２記載の医薬。
【請求項４】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）である請求項３記載の医薬。
【請求項５】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型相補性決定領域（complementarity determining region ; CDR）移植抗体である請求項３記載の医薬。
【請求項６】
ヒト型キメラ抗体が、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体の抗体重鎖可変領域（VH）および抗体軽鎖可変領域（VL）、ならびにヒト抗体の抗体重鎖定常領域（CH）および抗体軽鎖定常領域（CL）からなるヒト型キメラ抗体である請求項５記載の医薬。
【請求項７】
ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である請求項６記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）VLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
【請求項８】
ヒト型キメラ抗体が、形質転換体KM3034（FERM BP-7836）が生産するヒト型キメラ抗体である請求項７記載の医薬。
【請求項９】
ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRならびにヒト抗体のCHおよびCLを含むヒト型CDR移植抗体である請求項５記載の医薬。
【請求項１０】
ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDR、ヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク領域（FR）、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型CDR移植抗体である請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である請求項９または10記載の医薬。
（ａ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【請求項１２】
ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である請求項９または10記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、1４番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【請求項１３】
ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である請求項９または10記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
【請求項１４】
ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である請求項13記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号21で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号44で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号50で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【請求項１５】
ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である請求項９または10記載の医薬。
（ａ）形質転換体KM8037（FERM BP-8084）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｂ）形質転換体KM8035（FERM BP-8082）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｃ）形質転換体KM8036（FERM BP-8083）が生産するヒト型CDR移植抗体
【請求項１６】
抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、１本鎖抗体（scFv）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（diabody）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項３記載の医薬。
【請求項１７】
FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節破壊抑制剤。
【請求項１８】
FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する軟骨保護剤。
【請求項１９】
FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する滑膜増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗FGF-8抗体を有効成分として含有する、関節炎の予防薬または治療薬、関節破壊抑制剤、軟骨保護剤、滑膜増殖抑制剤および関節炎の診断薬、ならびに該抗体を用いる関節炎の判定方法に関する。
【０００２】
高齢者社会において関節症状を訴える人は確実に増加している。関節疾患の代表的な変形性関節症、あるいは関節リウマチといった疾患の早期診断やスクリーニング、あるいは患者の予後判定を的確に行うことは大変重要であり、その治療が多くの高齢者の生活の質を高めることになるが、未だに十分な診断や治療方法が確立していない。
【０００３】
関節軟骨は、関節の可動面を覆う少数の軟骨細胞と豊富な細胞外マトリックスに富んだ組織で、血管や神経は分布しておらず、主として関節内面を覆う滑膜から産生される滑液から栄養補給を受けている。また、無血管であるだけでなく、血管網に富む周囲組織からの血管の侵入に対して強い抵抗性を示す。軟骨細胞は、細胞外マトリックス合成、分解の両面を複雑に制御し、細胞外マトリックスの恒常性の維持に中心的役割を担っている。サイトカイン、成長因子などの化学的因子や荷重負荷などの力学的因子は軟骨細胞に作用し、細胞外マトリックス合成、分解の両者のバランスを変えることにより、細胞外マトリックス代謝に影響する。
【０００４】
変形性関節症は、加齢や機械的ストレスが原因となって、関節軟骨表面の崩壊と、これに伴う関節辺縁の新たな軟骨の増殖、関節の変形、適合性の破綻をきたし、さらに関節滑膜の炎症へと進行する。変形性関節炎は、関節の軟骨の遅行変性で、しばしば痛みと機能喪失とを特徴とする単関節炎疾患である（Manek M. J. and Lane N. E., Am. Fam. Physician, 61, 1795-1804, 2000）。
関節リウマチでは、免疫異常や感染症が原因となって、滑膜に炎症性細胞が浸潤し、さらに、血管新生に伴って滑膜線維芽細胞の増殖が亢進して、パンヌスと呼ばれる炎症性滑膜肉芽組織が形成される。パンヌスが形成されると、骨や軟骨の破壊が進み、関節に不可逆的な障害がもたらされる。骨や軟骨が破壊される過程では、多量に存在するコラーゲンやプロテオグリカンなどの種々の細胞外マトリックスが分解される。
【０００５】
変形性関節症あるいは関節リウマチなどの関節症において、滑膜炎症および細胞外マトリックスの破壊が関節軟骨の機能喪失へつながってゆく。
変形性関節症と関節リウマチは、病因論的に全く異なる疾患であるが、関節軟骨破壊機構において多くの共通点を有する。関節滑液および滑膜・軟骨などの関節局所で多種類のマトリックスメタロプロテアーゼが産生・分泌され、関節局所にマトリックスメタロプロテアーゼが過剰に検出される。マトリックスメタロプロテアーゼは多種類の細胞外マトリックスを分解するため、このことが関節破壊の一因となっている。これらの産生は、炎症滑膜、マクロファージ、好中球のみならず軟骨細胞からも産生されるが、その産生は同じ関節局所において産生分泌される種々のサイトカイン、活性酸素、一酸化窒素、プロスタグランジン、成長因子等により調節されている。これらは滑膜細胞、軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテアーゼの産生を誘導して、細胞外マトリックスの分解を促進することも報告されている。
【０００６】
これらの報告から、変形性関節症や関節リウマチのほか、自己抗体の出現と免疫複合体の組織沈着による炎症性組織傷害が認められる原因不明の疾患で、関節症状が高率に出現する全身性エリテマトーデス、強直性関節炎、乾癬症患者に合併する滑膜増殖を伴い骨破壊にまで至る乾癬性関節炎、椎間板の細胞外マトリックスの破壊が認められる椎間板疾患、急性結晶性滑膜炎（痛風、偽痛風）といった関節炎疾患（広畑和志ら編  リウマチ学  同文書院  1989年）において、滑膜の増殖や軟骨破壊を抑制することにより治療することが可能と考えられる。
【０００７】
従来、関節リウマチの薬物療法は、主に関節の疼痛および炎症を軽減するために、種々の非ステロイド性抗炎症薬、プレドニゾロン等のステロイド剤やメトトレキサートをはじめとする抗リウマチ薬が使われている（治療，78, 3553-3558, 南山堂，1996）。変形性関節症においては、疼痛および炎症の除去のために、種々の非ステロイド性抗炎症薬や鎮痛剤や、関節注入剤ヒアルロン酸製剤等の投与が行われてきた。軟骨破壊を抑制するヒアルロン酸は軟骨保護剤として使われている（Creamer P., J. Rheum., 20, 1461-1464, 1993、Arthritis Rheum., 43, 1905-1915, 2000）。また、理学療法や、骨切り術、人工関節置換術等の手術療法も行われている。全身性エリテマトーデスでは非ステロイド性抗炎症薬やプレドニゾロン等のステロイド剤、強直性関節炎には非ステロイド性抗炎症薬や抗リウマチ薬であるスルファサラジン、乾癬症患者に合併する滑膜増殖を伴い骨破壊にまで至る乾癬性関節炎では非ステロイド性抗炎症薬、抗リウマチ薬やステロイドの関節内注入、椎間板の細胞外マトリックスの破壊が認められる椎間板疾患では非ステロイド性抗炎症薬や鎮痛薬、急性結晶性滑膜炎では非ステロイド性抗炎症薬やコルヒチン等が使われている（広畑和志ら編  リウマチ学  同文書院  1989年）が、このような薬物療法は対症療法で、関節破壊を十分に抑制することは困難であった。
【０００８】
現在、関節リウマチの治療では、関節の破壊を少しでも予防しようとする積極的な治療法の選択が受け入れられつつあり、なるべく早い段階で関節リウマチと診断して、メトトレキサートをはじめとする抗リウマチ薬を、いかに適切に選択していくかがポイントとなっているが、十分な診断法はまだない。
【０００９】
生体内に存在する様々な成長因子の一種である線維芽細胞増殖因子（以下、FGFと略す）は、血管内皮細胞に作用するヘパリン結合性増殖因子として知られている。また、ＦＧＦファミリーには19種類以上あり、FGF-2（basic FGF）やFGF-1（acidic FGF）等が古くから知られている。FGF受容体は現在までに７種類見出されており、チロシンキナーゼを細胞内領域にコードしている。
【００１０】
FGF-8は、アンドロジェン誘導増殖因子（AIGF）として、性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株SC-3（Nakamura N. et al., J. Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987）の培養上清中より単離された因子で、アンドロジェン刺激により誘導産生され、オートクライン的にSC-3細胞を増殖させる増殖因子である（Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992）。FGF-8は、前立腺癌の細胞や繊維芽細胞の増殖を促進させることが報告されている（Tanaka A. et al., FEBS Lett., 363, 226-230, 1995）。FGF-8はFGFレセプター−2IIIc、FGFレセプター−3IIIc、FGFレセプター−4の３種のレセプターに結合することが報告されている（Ornitz D. M. et al., J. Biol. Chem., 271, 15292-15297, 1996）。また、FGFの作用にはシンデカンなどの膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合が不可欠である。ヘパラン硫酸との結合はＦＧＦを安定的に局所に蓄積するためにも必要である。炎症などの組織改変の状況ではヘパラン硫酸が分解されることにより、細胞外マトリックスからFGFが遊離して、その活性を発揮すると考えられている。      軟骨中にはFGF-2のような強い血管新生因子が含有されている（Satoh H. et al., J. Biol. Chem., 273, 12307-12315, 1998）。また関節炎では滑膜細胞、軟骨細胞および侵入した炎症細胞が著しく高レベルのFGF-1やFGF-2を合成し（Sano H. et al., J. Cell Biol., 110, 1417-1426, 1990、Remmers E. F., Growth factors, 2, 179-188, 1990）、リウマチ患者の関節液中のFGF-2濃度は、関節症状と相関する（Manabe N. et al., Rheumatology, 38, 714-720, 1999）。FGF-2は変形性関節症における骨棘形成に関与している（Uchino M. et al., Clin. Orthop., 377, 119-125, 2000）。これらの報告はFGF-1やFGF-2が関節炎に関与することを示している。
【００１１】
FGF-8ノックアウトマウスを用いた報告では、FGF-8が関節の発生段階に発現している（Haraguchi R. et al., Development, 127, 2471-2479, 2000；Lewandoski M. et al., Nat. Genet., 26, 460-463, 2000）とされるが、FGF-8の関節炎への関与は知られていない。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の目的は、関節炎の予防薬または治療薬、関節破壊抑制剤、軟骨保護剤、滑膜増殖抑制剤および関節炎の診断薬、ならびに関節炎の判定方法を提供することにある。
【００１３】
本発明は以下の（１）〜（51）を提供する。
（１）FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節炎の予防薬または治療薬。
【００１４】
（２）FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする（１）記載の医薬。
（３）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である（２）記載の医薬。
【００１５】
（４）ハイブリドーマが、ハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）である（３）記載の医薬。
（５）ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型相補性決定領域（CDR）移植抗体である（３）記載の医薬。
【００１６】
（６）ヒト型キメラ抗体が、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体の抗体重鎖可変領域（VH）および抗体軽鎖可変領域（VL）、ならびにヒト抗体の抗体重鎖定常領域（CH）および抗体軽鎖定常領域（CL）からなるヒト型キメラ抗体である（５）記載の医薬。
【００１７】
（７）ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である（６）記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）VLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（８）ヒト型キメラ抗体が形質転換体KM3034（FERM BP-7836）が生産するヒト型キメラ抗体である（７）記載の医薬。
【００１８】
（９）ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRならびにヒト抗体のCHおよびCLを含むヒト型CDR移植抗体である（５）記載の医薬。
（10）ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDR、ヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク領域（FR）、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型CDR移植抗体である（９）記載の医薬。
【００１９】
（11）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（９）または（10）記載の医薬。
（ａ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００２０】
（12）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（９）または（10）記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００２１】
（13）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（９）または（10）記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００２２】
（14）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（13）記載の医薬。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号21で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号44で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号50で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００２３】
（15）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（９）または（10）記載の医薬。
（ａ）形質転換体KM8037（FERM BP-8084）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｂ）形質転換体KM8035（FERM BP-8082）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｃ）形質転換体KM8036（FERM BP-8083）が生産するヒト型CDR移植抗体
（16）抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、１本鎖抗体（scFv）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（diabody）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（３）記載の医薬。
【００２４】
（17）FGF-8に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する関節炎の診断薬。
（18）FGF-8に特異的に結合する抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする（17）記載の診断薬。
（19）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である（18）記載の診断薬。
【００２５】
（20）ハイブリドーマが、ハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）である（19）記載の診断薬。
（21）ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型CDR移植抗体である（19）記載の診断薬。
【００２６】
（22）ヒト型キメラ抗体が、FGF-8に特異的に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVL、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型キメラ抗体である（21）記載の診断薬。
（23）ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である（22）記載の診断薬。
【００２７】
（ａ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）VLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（24）ヒト型キメラ抗体が形質転換体KM3034（FERM BP-7836）が生産するヒト型キメラ抗体である（23）記載の診断薬。
【００２８】
（25）ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRならびにヒト抗体のCHおよびCLを含むヒト型CDR移植抗体である（21）記載の診断薬。
（26）ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDR、ヒト抗体のVHおよびVLのFR、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型CDR移植抗体である（25）記載の診断薬。
【００２９】
（27）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（25）または（26）記載の診断薬。
（ａ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００３０】
（28）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（25）または（26）記載の診断薬。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００３１】
（29）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（25）または（26）記載の診断薬。
（ａ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００３２】
（30）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（29）記載の診断薬。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号21で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号44で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号50で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００３３】
（31）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（25）または（26）記載の診断薬。
（ａ）形質転換体KM8037（FERM BP-8084）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｂ）形質転換体KM8035（FERM BP-8082）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｃ）形質転換体KM8036（FERM BP-8083）が生産するヒト型CDR移植抗体
（32）抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、１本鎖抗体
（scFv）、２量体化Ｖ領域断片（diabody）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（19）記載の診断薬。
【００３４】
（33）FGF-8に特異的に結合する抗体を用いて試料中のFGF-8を検出および／または定量することを特徴とする関節炎の判定方法。
（34）FGF-8に特異的に結合する抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする（33）記載の判定方法。
【００３５】
（35）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である（34）記載の判定方法。
（36）ハイブリドーマが、ハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）である（35）記載の判定方法。
【００３６】
（37）ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型CDR移植抗体である（35）記載の判定方法。
（38）ヒト型キメラ抗体が、FGF-8に特異的に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVL、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型キメラ抗体である（37）記載の判定方法。
【００３７】
（39）ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である（38）記載の判定方法。
（ａ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）VLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）VHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（40）ヒト型キメラ抗体が形質転換体KM3034（FERM BP-7836）が生産するヒト型キメラ抗体である（39）記載の判定方法。
【００３８】
（41）ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRならびにヒト抗体のCHおよびCLを含むヒト型CDR移植抗体である（37）記載の判定方法。
（42）ヒト型CDR移植抗体が、FGF-8に特異的に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDR、ヒト抗体のVHおよびVLのFR、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型CDR移植抗体である（41）記載の判定方法。
【００３９】
（43）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（41）または（42）記載の判定方法。
（ａ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHのCDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号10、11および12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００４０】
（44）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（41）または（42）記載の判定方法。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００４１】
（45）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（41）または（42）記載の判定方法。
（ａ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００４２】
（46）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（45）記載の判定方法。
（ａ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号21で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｂ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号44で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
（ｃ）VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号50で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体
【００４３】
（47）ヒト型CDR移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型CDR移植抗体である（41）または（42）記載の判定方法。
（ａ）形質転換体KM8037（FERM BP-8084）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｂ）形質転換体KM8035（FERM BP-8082）が生産するヒト型CDR移植抗体
（ｃ）形質転換体KM8036（FERM BP-8083）が生産するヒト型CDR移植抗体
（48）抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、１本鎖抗体（scFv）、２量体化Ｖ領域断片（diabody）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（35）記載の判定方法。
【００４４】
（49）FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節破壊抑制剤。
（50）FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する軟骨保護剤。
（51）FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する滑膜増殖抑制剤。
【００４５】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬に用いられる抗体は、FGF-8に特異的に結合し、かつFGF-8の活性を阻害する抗体（以下、抗FGF-8中和抗体とも称する）であればいかなるものでもよく、例えば、FGF-8に対して中和活性を有する抗体および該抗体断片などがあげられる。
【００４６】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬に用いられる抗FGF-8中和抗体は、FGF-8に特異的に結合する抗体（以下、抗FGF-8抗体とも称する）の中から、FGF-8の活性を阻害する能力を有する抗体を選択することにより得ることができる。FGF-8の活性としては、FGF-8が有する生物活性であればいかなるものであってもよいが、具体的には、マウス乳癌細胞株SC-3（Nakamura N. et al., J Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987）、マウス線維芽細胞株NIH/3T3（ATCC番号: CRL-1658）、もしくはヒト前立腺癌細胞株LNCaP（ATCC番号: CRL-1740）の増殖を促進する活性、滑膜細胞の増殖を促進する活性、軟骨細胞の細胞外マトリックスの分解を促進する活性、軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生を促進する活性をあげることができる。
【００４７】
抗FGF-8抗体は、公知の手段（Harlow E. and Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、以下、アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアルと記す）を用いて製造することができる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用される抗FGF-8中和抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。
【００４８】
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、ヒト化抗体およびこれらの抗体の抗体断片をあげることができる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用される、ハイブリドーマにより生産される抗FGF-8中和モノクローナル抗体は、具体的には以下に述べる方法によって製造することができる。
【００４９】
すなわち、FGF-8蛋白質を抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性をもつ形質細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマを培養するか、あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水よりFGF-8に特異的に結合する抗体を分離、精製する。得られた抗体の中から、FGF-8の活性を阻害する抗体を選択する。このような抗FGF-8中和モノクローナル抗体として、特開平9-271391に記載されているマウスIgG1サブクラスに属するハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）が生産するモノクローナル抗体KM1334があげられる。
【００５０】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト化抗体としては、上記の抗FGF-8中和モノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものがあげられる。該抗体においては、抗原性が低く、血中半減期の延長されたものが、予防薬または治療薬として好ましい。
【００５１】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（complementarity determining region; 以下、CDRと略記する。）移植抗体を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、可変領域をＶ領域、重鎖可変領域をVHと称す）および軽鎖Ｖ領域（以下、VLと称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域をＣ領域、重鎖定常領域をCHと称す）およびヒト抗体の軽鎖Ｃ領域（以下、CLと称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００５２】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト型キメラ抗体は、抗FGF-8中和モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより得られる該抗体のH鎖およびL鎖をコードするcDNAから、VHおよびVLをコードするDNAを取得し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
【００５３】
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（hIg）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、hIgGクラスに属するγ1、γ2、γ3、γ4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５４】
FGF-8に特異的に結合しFGF-8の活性を阻害するヒト型キメラ抗体（以下、抗FGF-8中和キメラ抗体とも称する）としては、FGF-8に特異的に結合しFGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLとヒト抗体のCHおよびCLからなる抗FGF-8中和キメラ抗体、好ましくはVHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、VLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、およびVHが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体があげられる。具体的には、抗体のVHが配列番号５記載のアミノ酸配列、CHがヒトγ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のVLが配列番号６記載のアミノ酸配列、CLがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型キメラ抗体KM3034およびKM3334があげられる。
【００５５】
ヒト型キメラ抗体KM3034を生産する形質転換体KM3034は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成13年12月26日付けでFERM BP-7836として寄託されている。
【００５６】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト抗体に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRをヒト以外の動物の抗体のCDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのCDR配列で任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードするDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
【００５７】
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、さらにhIgGクラスに属するγ1、γ2、γ3、γ4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５８】
FGF-8に特異的に結合しFGF-8の活性を阻害するヒト型CDR移植抗体（以下、抗FGF-8中和CDR移植抗体とも称する）としては、FGF-8に特異的に結合しFGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRならびにヒト抗体のCHおよびCLを含むヒト型CDR移植抗体、FGF-8に特異的に結合し、FGF-8の活性を阻害するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDR、ヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク領域（以下、FRと略す）、ならびにヒト抗体のCHおよびCLからなるヒト型CDR移植抗体があげられる。好ましくは、(a) VHのCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(b) VLのCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列番号10、11、12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(c) VHのCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLのCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列番号10、11、12で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体があげられ、より好ましくは(a) VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(b) VLが配列番号19で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(c) VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体があげられる。さらに好ましくは(a) VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(b) VLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(c) VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArgおよび95番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のIle、３番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeuおよび92番目のTyrから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体があげられる。具体的には、(a) VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(b) VLが配列番号19、21、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、(c) VHが配列番号18または20で示されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号19、21、、42、43、44、45、46、47、50または51で示されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体があげられ、好ましくは(a) VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、VLが21で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体、(b) VHが配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、VLが44で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体、(c) VHが配列番号18で示されるアミノ���配列を含み、VLが50で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型CDR移植抗体があげられる。このようなヒト型CDR移植抗体として、VHが配列番号18記載のアミノ酸配列、CHがヒトγ1サブクラスのアミノ酸配列からなり、VLが配列番号21記載のアミノ酸配列、CLがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型CDR移植抗体HV0LV6、HV0LV6/CHO、VHが配列番号18記載のアミノ酸配列、CHがヒトγ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、VLが配列番号44記載のアミノ酸配列、CLがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型CDR移植抗体HV0LV3-1/CHO、VHが配列番号18記載のアミノ酸配列、CHがヒトγ1サブクラスのアミノ酸配列からなり、VLが配列番号50記載のアミノ酸配列、CLがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型CDR移植抗体HV0LV4-3/CHOがあげられる。
【００５９】
ヒト型CDR移植抗体HV0LV6を生産する形質転換体KM8037は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成14年６月20日付けでFERM BP-8084として、ヒト型CDR移植抗体HV0LV3-1を生産する形質転換体KM8036は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成14年６月20日付けでFERM BP-8083として、ヒト型CDR移植抗体HV0LV4-3を生産する形質転換体KM8035は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成14年６月20日付けでFERM BP-8082として、それぞれ寄託されている。
【００６０】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用される抗FGF-8中和抗体には抗体断片も含まれる。抗体断片は、FGF-8に特異的に結合しFGF-8の活性を阻害する抗体断片であるFab（fragment of antigen bindingの略）、F(ab')2、Fab'、一本鎖抗体(single chain Fv; 以下、scFvと称す)、２量体化Ｖ領域断片（diabody）、ジスルフィド安定化抗体(disulfide stabilized Fv; 以下、dsFvと称す)およびCDRを含むペプチドを含有する。
【００６１】
Fabは、IgGのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
【００６２】
F(ab')2は、IgGのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００６３】
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
scFvは、一本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、VH−P−VLないしはVL−P−VHポリペプチドである。本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるscFvに含まれるVHおよびVLは、抗FGF-8中和モノクローナル抗体であればいかなるものでもよい。
diabodyは、抗原結合特異性の同じまたは異なるscFvが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対するそれぞれ特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００６４】
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法（Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるdsFvに含まれるVHあるいはVLは、抗FGF-8中和モノクローナル抗体であればいかなるものでもよい。
【００６５】
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるCDRを含むペプチドは、抗FGF-8中和抗体のVHまたはVLのCDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
【００６６】
以下に、本発明で使用される抗FGF-8中和抗体の具体的な作製方法と活性評価方法、該抗体を含有する関節炎の予防薬または治療薬、抗FGF-8抗体を含有する関節炎の診断薬、抗FGF-8抗体を用いた関節炎の判定方法について説明する。
【００６７】
１．抗FGF-8中和抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）の作製方法
（１）抗原の調製
抗FGF-8中和抗体を作製するために必要な抗原としては、FGF-8を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはFGF-8蛋白質、該蛋白質の部分断片、該蛋白質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドなどがあげられる。
【００６８】
FGF-8蛋白質および該蛋白質の部分断片は、FGF-8をコードする全長あるいはその部分断片DNA（Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992、Tanaka A. et al., FEBS Lett., 363, 226-230, 1996）を適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組み換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより得られたFGF-8発現細胞を、適当な培地中で培養することにより細胞内あるいは培養上清中にそのままあるいは融合蛋白質として生産することができる。また、FGF-8蛋白質の部分配列を有するペプチドは、ペプチド合成機を用いて調製することができる。
【００６９】
FGF-8をコードする全長あるいはその部分断片DNAは、FGF-8を発現しているSC-3等の細胞から調製したcDNAを鋳型にした、ポリメラーゼ連鎖反応〔Polymerase Chain Reaction、以下PCRと記す；Sambrook J. et al., Molecular Cloning 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001（以下、「モレキュラー・クローニング  第３版」と記す）、Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-2001（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと記す）〕により調製することができる。
【００７０】
宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれば、いずれでもよい。細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のエシェリヒア属、バチルス属等の細菌が例示される。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が例示される。動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞等が例示される。昆虫細胞としては、Sf9、Sf21〔ファーミンジェン（Farmingen)社製〕、High Five〔インビトロジェン（Invitrogen）社製〕等が例示される。
【００７１】
FGF-8をコードする全長あるいはその部分断片DNAを導入するベクターとしては、該DNAを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるものであればいかなるベクターでも用いることができる。
細菌、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合配列、FGF-8をコードする全長あるいはその部分断片DNA、転写終結配列、場合によってはプロモーターの制御配列より構成されているのが好ましいが、例えば、市販のpGEX-2T〔アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences）社製〕、pET17b〔ノバジェン（Novagen）社製〕などが例示される。
【００７２】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Cohen S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110-2114, 1972）、プロトプラスト法（特開昭63-248394）等、いずれの方法も用いられる。
【００７３】
酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）等が用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法（Becker D. M. and Guarente L., Methods. Enzymol., 194, 182-187, 1991）、スフェロプラスト法（Hinnen A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933, 1978）、酢酸リチウム法（Ito H. et al., J. Bacteriol., 153, 163-168, 1983）等、いずれの方法も用いられる。
【００７４】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pAGE107（特開平3-22979；Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）、pAGE103（Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310, 1987）等が用いられる。
【００７５】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、サイトメガロウィルス（CMV）のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40あるいはメタロチオネインのプロモーター等があげられる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
【００７６】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法（Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法（Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987）等、いずれの方法も用いられる。
【００７７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、O' Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, 1994等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。すなわち、以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得たのち、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質発現昆虫細胞を取得する。
【００７８】
遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393（共にファーミンジェン社製）、pBlueBac4.5（インビトロジェン社製）等が用いられる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus）などが用いられる。
【００７９】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法（Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987）等が用いられる。
【００８０】
また、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットなどを用いて組み換えバキュロウィルスを作製したのち、前述したSf9、Sf21あるいはHigh Five等の昆虫細胞に該組み換えウィルスを感染させることにより蛋白質を生産させることもできる（Bio/Technology, 6, 47, 1988）。
【００８１】
遺伝子の発現方法としては、FGF-8蛋白質だけを細胞内に発現させる以外に、分泌生産、融合蛋白質発現等が開発されており、いずれの方法も用いることができる。例えば、モレキュラー・クローニング  第３版に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００８２】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にFGF-8蛋白質を生成蓄積させ、該培養物からFGF-8蛋白質を採取することにより、FGF-8蛋白質の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として製造することができる。
形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００８３】
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい（モレキュラー・クローニング  第３版）。培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、15〜40℃で16〜96時間行う。培養期間中、pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI 1640培地、イーグル（Eagle）のMEM培地またはこれら培地にウシ胎児血清（以下、FBSと略す）等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常５％CO2存在下、35〜37℃で３〜７日間行い、培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８５】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf900IISFM（インビトロジェン社製）、EX-CELL400、EX-CELL405〔いずれもJRHバイオサイエンシズ（JRH Biosciences）社製〕等が用いられる。培養は、25〜30℃で１〜４日間行い、培養中は必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８６】
上記において、動物細胞および昆虫細胞の培養において可能であれば、FGF-8の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質の精製を容易にするため、血清無添加の培地を用いることが好ましい。
FGF-8の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として宿主細胞内に蓄積された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離し、水系緩衝液にけん濁後、超音波法、フレンチプレス法などにより細胞を破砕し、その遠心分離上清に該蛋白質を回収する。
【００８７】
さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタンパク質変性剤で可溶化後、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、タンパク質の立体構造を形成させることができる。
【００８８】
FGF-8蛋白質の全長または部分断片、あるいはこれらの蛋白質の融合蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清中に発現蛋白質を回収することができる。
単離精製については、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈殿、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。
【００８９】
FGF-8のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドは、Fmoc（フルオレニルメチルオキシカルボニル）法、tBoc（t-ブチルオキシカルボニル）法等の化学合成法によって製造することができる。また、アドバンスド・ケムテック（Advanced ChemTech）社、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社、プロテイン・テクノロジーズ（Protein Technologies）社、島津製作所等のペプチド合成機を用いても製造することができる。
【００９０】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記で得られた該蛋白質を抗原として動物を免疫する。免疫する方法としては、動物の皮下、静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、抗原性の高いキャリアタンパク質を抗原に結合させて投与する、あるいは適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。
【００９１】
キャリアタンパク質としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin）、ウシ血清アルブミン、ウシチログロブリン等があげられ、アジュバンドとしては、フロイントの完全アジュバント(Complete Freund's Adjuvant)、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物があげられる。
【００９２】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間毎に３〜10回行う。抗原の投与量は動物１匹当たり50〜100μｇが好ましい。各投与後、３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、該血清の抗原との特異的な結合性について、下記に示すような酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法  第３版  医学書院  1987年、アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Chapter 14）、Goding J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1996（以下、モノクローナル・アンチボディーズと略す）〕などで確認する。
【００９３】
酵素免疫測定法は以下のようにして行うことができる。
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などをプレートにコートし免疫動物より採取した血清を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。反応後、第二抗体を標識した物質に応じた検出反応を行い、抗体価を測定する。
【００９４】
第二抗体とは、第一抗体を認識できる抗体を、パーオキシダーゼ等の酵素やビオチン等で標識したものである。具体的には、免疫動物にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
そして、該血清が十分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、抗体産生細胞の供給源とする。
【００９５】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫動物より公知の方法（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に準じて抗体産生細胞を摘出し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該ポリクローナル抗体がFGF-8の活性を阻害する中和活性を有しているかどうかは下記の１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで調べることができる。
【００９６】
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗体産生細胞は、抗原投与された非ヒト哺乳動物脾細胞、リンパ節、末梢血などから採取する。
【００９７】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（Kohler G and Milstein C, Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976）、SP2/0-Ag14（Shulman M. et al., Nature, 276, 269-270, 1978）、P3-X63-Ag8653（Kearney J. F. et al., J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979）、P3-X63-Ag8（Kohler G and Milstein C, Nature, 256, 495-497, 1975）など、イン・ビトロ（in vitro）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に従い、細胞融合時までに２×107個以上の細胞数を確保する。
【００９８】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体の選択
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−1000（PEG-1000）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはMEM培地またはPBS（1.83g/L Na2HPO4、0.21g/L KH2PO4、7.65g/L NaCl、pH7.2）などを用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、HAT培地〔正常培地（1.5mmol/Lグルタミン、50μmol/L 2-メルカプトエタノール、10μg/mLゲンタマイシンおよび10％ FBSを加えたRPMI 1640培地）に100μmol/Lヒポキサンチン、15μmol/Lチミジンおよび0.4μmol/Lアミノプテリンを加えた培地〕を用いる。
【００９９】
培養後、培養上清の一部をとり、下記の酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをFGF-8と特異的に結合するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０１００】
酵素免疫測定法は１．（２）に記載したのと同様に行うが、第一抗体として、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の方法で得られる精製抗体を用いる。
モノクローナル抗体とFGF-8との特異的な結合は表面プラズモン共鳴（Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991）によっても評価できる。
【０１０１】
抗FGF-8モノクローナル抗体の具体例としては、特開平9-271391に記載されているマウスIgG1サブクラスに属するハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）が生産するモノクローナル抗体KM1334があげられる。
【０１０２】
上記で選択されたハイブリドーマが生産する抗FGF-8モノクローナル抗体がFGF-8の活性を阻害できるか否かを、ターゲット細胞にマウス乳癌細胞株SC-3（Nakamura N. et al., J Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987）、マウス線維芽細胞株NIH/3T3（ATCC番号: CRL-165８）、もしくはヒト前立腺癌細胞株LNCaP（ATCC番号: CRL-1740）を用いた増殖阻害アッセイにて調べる。方法としては、ターゲット細胞をFGF-8（１〜100ng/mL）あるいはテストステロンを含む培地にて培養する際、培養上清もしくは下記２．（５）にしたがって精製した抗FGF-8モノクローナル抗体の最終濃度が0.001〜100μg/mLになるように段階希釈して培地中に添加する。24〜72時間培養後、MTT〔3-(4,5-ジメチル-2-チアゾル-2-イル）-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド〕溶液、セルカウンティングキットもしくはWST-1キットなどを用いて生細胞数を測定する。抗FGF-8モノクローナル抗体を添加しない場合に比べて抗FGF-8モノクローナル抗体の濃度依存的に生細胞数が減少する場合に、該抗FGF-8モノクローナル抗体はFGF-8の活性を阻害する抗FGF-8中和抗体であることが確認できる。
【０１０３】
また、ボルトン-ハンター法（Bolton A. E. and Hunter W. M., Biochem. J., 133, 529-539, 1973）などで125Ｉ標識したFGF-8の上記の細胞株への結合測定系を用いて、抗FGF-8モノクローナル抗体のFGF-8の細胞表面上の受容体への結合阻害活性を測定することができる。
上記のモノクローナル抗体KM1334は、FGF-8の活性を阻害する活性を有する抗FGF-8中和抗体であり、関節炎の予防薬または治療薬として好ましい。
【０１０４】
（５）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはプリスタン（Pristane、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）0.5mLを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を腹腔内投与して腹水癌化させた腹水から、分離、精製することにより調製できる。
【０１０５】
モノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、40〜50％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、DEAE-セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて行う方法があげられる。この方法により、IgGあるいはIgM画分を回収し、精製モノクローナル抗体を取得することができる。
【０１０６】
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、モノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法あるいは280nmでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、ヒトでは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4があげられるが、特にマウスIgG3、IgG2a、ヒトIgG1タイプは、補体依存性細胞傷害活性および抗体依存性細胞傷害活性を有し、治療への応用上、有用である。
【０１０７】
２．抗FGF-8中和ヒト化抗体の作製方法
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣ領域であるCHおよびCLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築することができる。
【０１０８】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のCHおよびCLであることができ、例えば、ヒト抗体γ1サブクラスのCH、γ4サブクラスのCH、およびκクラスのCL等があげられる。ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAとしてはエキソンとイントロンより成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を組込み、発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０１０９】
例えば、pAGE107（特開平3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）、pAGE103（Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310, 1987）、pHSG274（Brady G. et al., Gene, 27, 223-232, 1984）、pKCR（O'Hare K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527-1531, 1981）、pSG1βd2-4（Miyaji H. et al., Cytotechnology, 4, 173-180, 1990）等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー（Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310, 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRプロモーターとエンハンサー（Kuwana Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960-968, 1987）、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason J. O. et al., Cell, 41, 479-487, 1985）とエンハンサー（Gillies S. D. et al., Cell, 33, 717-728, 1983）等があげられる。
【０１１０】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、pKANTEX93（WO97/10354）、pEE18（Bentley K. J. et al., Hybridoma, 17, 559-567, 1998）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【０１１１】
（２）ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLをコードするDNAの取得
ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体、例えば、マウス抗FGF-8中和モノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするDNAは以下のようにして取得する。
【０１１２】
マウス抗FGF-8中和モノクローナル抗体を産生する細胞、例えば、マウスFGF-8中和抗体産生ハイブリドーマ等よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびVLをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。
組換えファージあるいは組換えプラスミド上のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。
【０１１３】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。ハイブリドーマから全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Okayama H. et al., Methods Enzymol., 154, 3-28, 1987）、また、全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング  第３版）などがあげられる。また、ハイブリドーマからmRNAを調製するキットとしては、ファストトラック（FastTrack）mRNA単離キット（インビトロジェン社製）、クイックプレップ（QuickPrep）mRNA精製キット（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）などがあげられる。
【０１１４】
cDNAの合成およびcDNAライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング  第３版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）、あるいは市販のキット、例えば、cDNA合成用スーパースクリプト・チョイス・システム（SuperScript Choice System for cDNA Synthesis、インビトロジェン社製）やZAP-cDNA合成キット〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕、タイムセーバー（TimeSaver）cDNA合成キット（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いる方法などがあげられる。
【０１１５】
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(+)（ストラタジーン社製）、λZAP II（ストラタジーン社製）、λgt10（ストラタジーン社製）、λgt11（ストラタジーン社製）、Lambda BlueMid（Clontech社製）、λExCell（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、pcD2（Okayama H. and Berg P., Mol. Cell. Biol., 3, 280-289, 1983）およびpUC18（Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33, 103-119, 1985）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
【０１１６】
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-Blue MRF'（ストラタジーン社製）、C600（Appleyard R. K. Genetics, 39, 440-452, 1954）、Y1088（Young R. A. and Davis R., Science, 222, 778-782, 1983）、Y1090（Young R. A. and Davis R., Science, 222, 778-782, 1983）、NM522（Gough J. A. and Murray N. E., J. Mol. Biol., 166, 1-19, 1983）、K802（Wood W. B., J. Mol. Biol., 16, 118-133, 1966）およびJM105（Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33, 103-119, 1985）などが用いられる。
【０１１７】
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLをコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング  第３版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーを鋳型として、PCRによりVHおよびVLをコードするcDNAを調製することもできる。
【０１１８】
上記方法により選択されたcDNAの塩基配列は、適当なベクターにクローニングされた該cDNAを用いてジデオキシ法（Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977）に基く反応を行い、ABI377（アプライドバイオシステムズ社製）等のDNAシークエンサーを用いて解析することで決定することができる。
【０１１９】
（３）ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の解析とCDRのアミノ酸配列の同定
２．（２）で取得し、決定したcDNAの塩基配列から該cDNAがコードするVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991、以下、「シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト」と記す。）と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。
【０１２０】
さらに、任意のデータベース、例えばSWISS-PROTやPIR-Protein等に対して、BLAST（Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）など相同性検索プログラムを用いて、得られたVHおよびVLの完全なアミノ酸配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
抗体の抗原結合部位を形成するVH及びVLは、配列の比較的保存された４個のFRとそれらを連結する配列の変化に富んだ３個のCDR（CDR1、CDR2、CDR3）から成っている（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。そしてVHおよびVLの各CDRのアミノ酸配列は、既知の抗体のＶ領域のアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより同定することができる
【０１２１】
（４）抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターの構築
２．（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLをコードするDNAを挿入し、抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLをコードするDNAを有するプラスミドを鋳型として、抗体のVHおよびVLを、適当な制限酵素の認識配列とＶ領域をコードする塩基配列よりなる5'末端側と3'末端側のプライマーを用いてPCR法により増幅し、それぞれの増幅産物をpBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、２．（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを取得する。得られたプラスミドより、抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードするDNAを単離し、２．（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１２３】
（５）抗FGF-8中和CDR移植抗体のＶ領域をコードするDNAの構築
抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするDNAは、以下の様にして構築することができる。まず、ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）などがあげられるが、それらの中でも、十分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を作製するためには、ヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性、好ましくは60％以上の相同性を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
【０１２４】
次に、選択したヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗FGF-8中和抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮して塩基配列に変換し、抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、100〜150塩基の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから、VH、VLとも４本の合成DNAを設計することが好ましい。また、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、２．（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。PCR反応後、増幅産物をpBluescript SK(-)（ストラタジーン社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、２．（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望の抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
【０１２５】
（６）抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに、移植しただけでは、その抗原結合活性はもとのヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている（Tempest P. R. et al., Bio/technology, 9, 266-271, 1991）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLでは、CDRのみならず、FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がCDRの移植に伴い、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型CDR移植抗体では、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やCDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（Tempest P. R. et al., Bio/technology, 9, 266-271, 1991）。ヒト型CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Bernstein F. C. et al., J. Mol. Biol., 112, 535-542, 1977）あるいはコンピューターモデリング（Tempest P. R. et al., Protein Engineering, 7, 1501-1507, 1994）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
【０１２６】
ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成DNAをプライマーとして用いてPCR法を行うことにより、達成できる。PCR後の増幅産物について２．（２）に記載の方法により、その塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認して、目的の変異が導入されたDNAを含むベクター（以下、アミノ酸配列改変ベクターと称す）を取得する。
【０１２７】
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、20〜35塩基からなる変異導入プライマーを用いたPCR変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするDNA配列を含む20〜35塩基からなるセンス変異プライマー及びアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきVHおよびVLのアミノ酸配列をコードするDNAを含むプラスミドを鋳型として２段階のPCRを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたDNAを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
【０１２８】
（７）抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターの構築
２．（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAの上流に、２．（５）および（６）で構築した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするDNAを挿入し、抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、２．（５）および（６）で抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、２．（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAの上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。
【０１２９】
（８）ヒト化抗体の一過性発現および活性評価
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、２．（４）記載の抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクター、２．（７）に記載の抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、COS-7細胞（ATCC番号: CRL-1651）が一般に用いられる（Warr G. W. et al., Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283, 1990）。COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法（Warr G. W. et al., Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1990）、リポフェクション法（Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987）などがあげられる。
【０１３０】
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、第一抗体として培養上清を、第二抗体として標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた１．（２）に記載の酵素免疫測定法などにより測定できる。また、FGF-8の活性を阻害する中和活性を保持しているかどうかを１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで確認することができる。
【０１３１】
（９）ヒト化抗体の安定発現および活性評価
２．（４）記載の抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターまたは２．（７）に記載の抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（特開平2-257891; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）等があげられる。
【０１３２】
抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターまたは抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（ATCC番号: CRL-1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC番号: CRL-1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと略す）遺伝子が欠損したCHO細胞であるCHO/DG44細胞（Urlaub G. and Chasin L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 1980）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC番号: CRL-1662、以下、YB2/0細胞と称す）等があげられる。
【０１３３】
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換体は、G418（G418 sulfate；シグマ−アルドリッチ社製）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる（Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994）。動物細胞培養用培地としては、RPMI 1640培地（日水製薬社製）、GIT培地（日本製薬社製）、EX-CELL302培地（JRHバイオサイエンシズ社製）、IMDM培地（インビトロジェン社製）、ハイブリドーマ−SFM培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にFBSなどの各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換体を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は前記１．（４）に記載のELISAなどにより測定できる。また、形質転換体は、DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる（Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994）。
【０１３４】
ヒト化抗体は、形質転換体の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル, chapter 8; モノクローナル・アンチボディーズ）。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE；laemmli U. K., Nature, 227, 680-685, 1970）やウエスタンブロッティング法（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル, chapter 12; モノクローナル・アンチボディーズ）等で測定する。
【０１３５】
精製したヒト化抗体の抗原結合活性は、第一抗体として精製ヒト化抗体を、第二抗体として標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた前記１．（２）に記載の酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴（Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991）などにより測定できる。また、FGF-8の活性を阻害する中和活性を保持しているかどうかを１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで確認することができる。
【０１３６】
３．抗体断片の作製
抗体断片は、１．および２．に記載の抗FGF-8中和モノクローナル抗体、抗FGF-8中和ヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
【０１３７】
（１）Fabの作製
Fabは、抗FGF-8中和抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するIgGサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、IgG分子やFc断片と分離し、均一なFabとして回収することができる（モノクローナル・アンチボディーズ）。プロテインＡ結合性を持たないIgGサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（モノクローナル・アンチボディーズ）。また、Fabは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶ領域をコードするDNAを、Fab発現用ベクターにクローニングし、Fab発現ベクターを作製することができる。Fab発現用ベクターとしては、Fab用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pIT106（Better M. et al., Science, 240, 1041-1043, 1988）などがあげられる。Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にFabを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFabとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったFabが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なFabを精製することができる（Borrebeck K., Antibody Engineering: A Practical Guide, Oxford University Press, 1991）。
【０１３８】
（２）F(ab')2の作製
F(ab')2は、抗FGF-8中和抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Fabと同様の精製操作により、均一なF(ab')2として回収することができる（モノクローナル・アンチボディーズ）。      また、３．（３）に記載のFab'をN,N'-o-フェニレンジマレイミドやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、5、5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）で処理し、ジスルフィド結合させる方法によっても作製することができる（McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996）。
【０１３９】
（３）Fab'の作製
Fab'は、３．（２）に記載のF(ab')2をジチオスレイトール等の還元剤で処理して得ることができる。また、Fab'は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶ領域をコードするDNAを、Fab'発現用ベクターにクローニングし、Fab'発現ベクターを作製することができる。Fab'発現用ベクターとしては、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶ領域をコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pAK19（Carter P. et al., Bio/technology, 10, 163-167, 1992）などがあげられる。Fab'発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にFab'を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFab'とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なFab'を精製することができる（McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996）。
【０１４０】
（４）scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のVHおよびVLをコードするDNAを、12残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするDNAを介して連結し、scFvをコードするDNAを作製する。ポリペプチドリンカーは、その付加がVH、VLの抗原への結合に対して妨害しないように最適化することが重要で、例えばPantolianoらにより示されたもの（Pantoliano M. W. et al., Biochemistry, 30, 10117-10125, 1991）あるいはそれを改変したものを用いることができる。
【０１４１】
作製したDNAをscFv発現用ベクターにクローニングし、scFv発現ベクターを作製することができる。scFv発現用ベクターとしては、scFvのDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。
【０１４２】
例えば、pCANTAB5E（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、Phfa（Lah M. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 5, 48-56, 1994）などがあげられる。scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にscFvがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にscFvを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるscFvとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なscFvを精製することができる（McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996）。
【０１４３】
（５）diabodyの作製
diabodyは、上記のscFvを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜10残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のVHおよびVLを用いた場合には、２価のdiabodyを、２種類の抗体のVHおよびVLを用いた場合は、２特異性を有するdiabodyを作製することができる（Le Gall F. et al., FEBS Lett., 453, 164-168, 1999、Courage C. et al., Int. J. Cancer, 77, 763-768, 1998）。
【０１４４】
（６）dsFvの作製
dsFvは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。まず、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のVHおよびVLをコードするDNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたDNAを作製する。アミノ酸残基のシステイン残基への改変は２．（６）のPCRを用いた変異導入法により行うことができる。作製した各DNAをdsFv発現用ベクターにクローニングし、VHおよびVLの発現ベクターを作製することができる。dsFv発現用ベクターとしては、dsFv用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pULI9（Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994）などがあげられる。VHおよびVLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にVHおよびVLを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からVHおよびVLを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、ジスルフィド結合を形成させ、活性のあるdsFvとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる（Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994）。
【０１４５】
（７）CDRを含むペプチドの作製
CDRを含むペプチドは、Fmoc法あるいはtBoc法等の化学合成法によって作製することができる。また、CDRを含むペプチドをコードするDNAを作製し、作製したDNAを適当な発現用ベクターにクローニングし、CDRペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、CDRを含むペプチドをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pLEX（インビトロジェン社製）、pAX4a+〔モビテック（MoBiTec）社製〕などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズム層にCDRを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズム層からCDRを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる（Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994）。
【０１４６】
（８）活性の評価
上記の抗体断片の抗原結合活性は抗体断片を第一抗体として用いた前記１．（２）に記載の酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴（Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991）などにより測定できる。また、FGF-8の活性を阻害する中和活性を保持しているかどうかを１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで確認することができる。
【０１４７】
４．本発明の予防薬および治療薬
抗FGF-8中和抗体は、滑膜や軟骨の細胞および組織上のFGF-8と結合し、FGF-8により誘導される軟骨の細胞外マトリックスの分解を抑制し、軟骨の破壊を抑制する能力を有するため、軟骨保護剤となる。また、該抗体はFGF-8により誘導される滑膜細胞の増殖を抑制する能力を有するため、滑膜細胞の増殖抑制剤となる。関節の破壊は、軟骨の破壊や滑膜細胞の増殖を伴うので、該抗体は滑膜細胞の増殖および軟骨の破壊を抑制することにより関節の破壊の抑制剤となる。関節炎は関節の破壊を伴う疾患であるので、該抗体は関節の破壊を抑制することにより関節炎の治療薬および予防薬となる。関節炎としては変形性関節症や関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性関節炎、乾癬性関節炎、椎間板疾患、急性結晶性滑膜炎（痛風、偽痛風を含む）などがあげられる。
【０１４８】
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体と比較して、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において高い効果を示し、かつ免疫原性が低く、その効果が長期に渡り持続することが期待されるので、予防薬および治療薬として好ましい。
【０１４９】
抗FGF-8中和抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１５０】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、関節内、および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは関節内および静脈内投与をあげることができる。
【０１５１】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
【０１５２】
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０１５３】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１５４】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０１５５】
また、噴霧剤は該抗体またはペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体またはペプチドを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体またはペプチドおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１５６】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり10μｇ／ｋｇ〜20ｍｇ／ｋｇである。
抗FGF-8中和抗体が軟骨の細胞外マトリックスの分解を抑制すること、および滑膜細胞の増殖を抑制することは、以下（１）および（２）に示すイン・ビトロでのアッセイ系を用いて確認できる。また、関節炎の治療薬および予防薬になることは、以下（３）に示す関節炎病態モデル動物に該抗体を投与し、その関節炎症状を軽減できるかどうかによっても評価できる。
【０１５７】
（１）FGF-8による軟骨破壊に対する阻害活性
軟骨の破壊は、軟骨細胞や軟骨器官を用いた軟骨の細胞外マトリックスの分解、軟骨細胞および滑膜細胞からの破壊因子の産生の増加を指標としたアッセイにより、軟骨破壊の進展による軟骨下骨の破壊は、骨吸収量を指標としたアッセイによりそれぞれ評価できる。
【０１５８】
（ａ）軟骨の細胞外マトリックスの分解
軟骨破壊作用は、初代培養したウサギ関節軟骨細胞を、FGF-8存在下で抗FGF-8中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、培養後にプレートに残存する細胞外マトリックスの量を測定することにより評価できる。細胞外マトリックスの量はパパイン処理により遊離してきたグリコサミノグリカンの量として測定する。FGF-8により誘導される細胞外マトリックスの減少が、抗FGF-8中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。
【０１５９】
軟骨破壊作用は、Priceらの方法 （Price J. S. et al., Arthritis Rheum., 42, 137-147, 1999）に従って初代培養したウシ鼻中隔軟骨器官を、FGF-8存在下で抗FGF-8中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、培養し、培養後の軟骨器官中の細胞外マトリックスの量を測定することによっても評価できる。FGF-8により誘導される細胞外マトリックスの減少が、抗FGF-8中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。細胞外マトリックスの量は、培養後の器官をパパイン処理し、遊離してきたグリコサミノグリカンの量を、ジメチルメチレンブルー法（Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161, 103-108, 1987）にて測定するかまたは、コラーゲンの量を東京衛生年報，36, 277, 1985に従いヒドロキシプロリン濃度として測定することにより測定できる。
【０１６０】
（ｂ）軟骨破壊に関与する因子の産生
軟骨破壊に関与する因子としては、プロスタグランジンE2、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、一酸化窒素をあげることができる。ウサギ関節軟骨細胞またはウサギ滑膜細胞をFGF-8存在下で抗FGF-8中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、これらの因子の該細胞からの産生量として、培養上清のプロスタグランジンＥ2、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３あるいは一酸化窒素を測定する。FGF-8により促進されるプロスタグランジンＥ2、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３あるいは一酸化窒素の産生が、抗FGF-8中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。
【０１６１】
プロスタグランジンＥ2は、プロスタグランジンＥ2  ＥＩＡシステム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）により、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３は、ウサギマトリックスメタロプロテイナーゼ―３ＥＬＩＳＡシステム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）により、一酸化窒素はGriess試薬を用いる方法（Green L. C. et al., Anal. Biochem. 126, 131-138 1982）により測定することができる。
【０１６２】
（ｃ）骨吸収
骨吸収は、Kusanoらの方法（Kusano K., et al., Endocrinology, 139, 1338-1345, 1998）に従って、マウス頭蓋冠をFGF-8存在下で抗FGF-8中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、培養上清中のカルシウム濃度あるいはヒドロキシプロリン濃度を測定することにより評価できる。FGF-8により促進される骨吸収が、抗FGF-8中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。培養上清中のカルシウム濃度は、カルシウムＣ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定できる。また培養上清中のヒドロキシプロリン濃度は、東京衛生年報，36, 277, 1985に従い測定できる。
【０１６３】
（２）滑膜細胞の増殖抑制作用
滑膜細胞の増殖は、ヒトやウサギの滑膜細胞をFGF-8存在下で抗FGF-8中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、[3H]チミジン取り込み量の測定により評価できる。FGF-8により促進される[3H]チミジン取り込み量が、抗FGF-8中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は滑膜細胞の増殖抑制作用を有すると考えられる。
【０１６４】
（３）関節炎病態モデル動物を用いたイン・ビボでの評価
下記の関節炎病態モデル動物を用いて、FGF-8あるいは抗FGF-8中和抗体の関節破壊に対する効果を評価できる。関節炎病態モデル動物に抗FGF-8中和抗体を投与し、該モデル動物の関節炎の症状が軽減する場合に関節炎の治療薬や予防薬として用いることができると考えられる。
【０１６５】
関節リウマチに類似した病態を示すモデル動物として、主として足関節に関節炎が自然発症するMRL-lpr/lprマウス（Hang L. et al., J. Exp. Med., 155, 1690-1701, 1982、日本チャールス・リバーより購入可能）、結核死菌を免疫して誘導されるラット・アジュバント関節炎モデル（Pearson CM. et al., Arth. Rheum., 5, 654-658, 1962、Taurog J. D. et al., Cell. Immunol., 75, 271-282, 1983、Bendele A. et al., J. Rheumatol., 26, 1225-1229, 1999）、関節に多いII型コラーゲンをアジュバントとともに免疫して発症させるマウス・コラーゲン関節炎モデル（Stuart J. M. et al., Annu. Rev. Immunol., 2, 199-218, 1984、Kamada H. et al., Jpn. J. Pharmacol., 70, 169-175, 1996）などをあげることができる。これらのモデル動物は関節リウマチと類似した病態を示し、関節炎治療薬の評価に広く用いられている。
【０１６６】
ラット・アジュバント関節炎モデルを用いる場合は、アジュバント処置足（急性炎症に続いて慢性炎症が起こる二相性の炎症反応が起こる）およびアジュバント非処置足（感作１週間頃から慢性炎症が起こる）それぞれについて、経時的に後肢足蹠浮腫容積を測定する。また左右後肢の軟Ｘ線撮影を行い、骨破壊および関節の変形について評価する。また、尿中のグリコサミノグリカン量を測定することにより、全身における軟骨破壊について、尿中のデオキシピリジノリン量またはヒドロキシプロリン量を測定することにより、全身における骨破壊について、それぞれ評価する。尿中のグリコサミノグリカン量は、ジメチルメチレンブルー法（Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161, 103-108, 1987）により、尿中のデオキシピリジノリン量は、オステオリンクス「DPD」（住友製薬社製）を用いて、尿中のヒドロキシプロリン量は池田らの方法（池田眞悟ら, 東京衛研年報. 36 277-282, 1985）に従って、それぞれ測定できる。さらに、全身の炎症反応の指標として血清中ムコ蛋白濃度をアスプロ−GP（大塚製薬）を用いて、血清中の一酸化窒素濃度をTraceyらの方法（Tracey W. R., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 272, 1011-1015, 1995）に従いそれぞれ測定する。
【０１６７】
マウス・コラーゲン関節炎モデルを用いる場合は体重と全肢の関節炎スコアの経時変化、血清中抗コラーゲン抗体価を測定する。さらに解剖後、関節部の病理組織学的検討を行う。関節炎スコアは一肢０から４点、全肢最高16点のスコアリングによって評価する。スコアの基準は、０：正常、１：弱い紅斑を認める、２：弱い腫脹と紅斑を認める、３：強い腫脹と紅斑を認め、触知により温感を認める、４：手指の変形を伴う著明な腫脹を認めるとする。
【０１６８】
変形性関節症モデルとして、イヌ、ウサギなどの大動物を用い膝半月の切除や靭帯の切離によって関節に動揺性を生ぜしめ、慢性的な関節の変性を発生させるモデル（以下、実験的変形性関節症モデルと称する）が多く用いられている（伊藤隆太，新薬開発のための動物モデル利用集成，変形性関節症，Ｒ＆Ｄプランニング，１９８５年、Guingamp C. et al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997、van der Kraan P. M. et al., Am. J. Pathol., 135, 1001-1014, 1989）。また、ラットの膝関節内にモノヨード酢酸を注入することにより、関節軟骨の細胞外マトリックスであるグリコサミノグリカンの遊離を促進し、関節破壊を惹起するラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルも変形性関節症モデルとしてあげられる。
【０１６９】
ウサギ膝関節半月板部分切除による実験的変形性関節症モデルは、Colomboらの方法（Colombo C. et al., Arthritis Rheum., 26, 875-886, 1983）および菊地らの方法（菊地寿幸ら，関節外科，15, 92-98, 1966）により作製できる。
ラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルは、Guingampらの方法（Guingamp C. et al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997）に基き、ラットの膝関節内にモノヨード酢酸を注入して作製できる。
【０１７０】
これらの変形性関節症モデル動物は一定期間後に膝関節膝蓋骨を摘出し、パパイン処理し、グリコサミノグリカンの量をジメチルメチレンブルー法（Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161, 103-108, 1987）にて測定することにより関節破壊（細胞外マトリックスの分解）を評価する。また、膝関節の病理組織学的検討を行う。
【０１７１】
抗FGF-8中和抗体をモデル動物に投与する際の剤型および投与経路としては、対象となるモデル動物の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。
例えば、それらをそのまま、または他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤等と共に、モデル動物に対して、経口的または非経口的（腹腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮下投与など）に投与することができる。
【０１７２】
抗FGF-8中和抗体の配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、モデル動物の具体的症状、モデル動物の体重などに応じて個別に決定され、特に限定されないが、投与量として、１日当たり概ね1μg/kg〜100mg/kg程度を、投与間隔として１日１回程度でも可能であり、１日２〜４回、またはそれ以上の回数に分けて投与することもできる。また、例えば点滴などにより連続的に投与することも可能である。関節などの局所に投与する場合には、１個所に概ね1pgから100mgを投与する。
【０１７３】
５．本発明の診断薬
FGF-8は関節における滑膜細胞の増殖、軟骨の細胞外マトリックスの破壊を誘導する。上述した抗FGF-8抗体は、FGF-8と特異的に結合し、FGF-8を検出および定量できるので、関節炎の診断薬として用いることができる。診断できる関節炎としては、上記４．に記載した疾患があげられる。FGF-8の検出および定量は、下記６．に示す方法により行うことができる。
【０１７４】
本発明の診断薬に使用される抗FGF-8抗体としては、FGF-8に特異的に結合する抗体であればいかなるものでもよく、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、ヒト化抗体およびこれらの抗体の抗体断片をあげることができる。
【０１７５】
本発明の診断薬で使用される、抗FGF-8抗体は、上記の抗FGF-8中和抗体の製造法と同様にして製造することができるが、FGF-8の活性を阻害することを要しない。抗FGF-8中和抗体を、本発明の診断薬として使用される抗FGF-8抗体として用いることもできる。本発明の診断薬に用いられる抗FGF-8抗体の具体例としては、ハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）が生産するモノクローナル抗体KM1334、形質転換体KM3034（FERM BP-7836）が生産するヒト型キメラ抗体KM3034、形質転換体KM3334が生産するヒト型キメラ抗体KM3334、形質転換体KM8037（FERM BP-8084）が生産するヒト型CDR移植抗体HV0LV6、形質転換体KM8034が生産するヒト型CDR移植抗体HV0LV6／CHO、形質転換体KM8036（FERM BP-8083）が生産するヒト型CDR移植抗体HV0LV3-1/CHOおよび形質転換体KM8035（FERM BP-8082）が生産するヒト型CDR移植抗体HV0LV4-3/CHOがあげられる。
【０１７６】
抗FGF-8抗体を含有する診断薬は、下記６．に示すような判定方法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出用試薬としては、抗FGF-8抗体を認識する標識された二次抗体、標識に対応した基質等の通常の免疫学的検出法に用いられる試薬があげられる。
【０１７７】
６．本発明の関節炎の判定方法
本発明の判定方法で判定される関節炎としては、上記４．に記載した疾患があげられる。これらの疾患の患者の関節では、健常者と比較して、滑膜細胞の増殖、軟骨の細胞外マトリックスの破壊を誘導する活性をもつFGF-8の量が増加していると考えられる。
【０１７８】
本発明の関節炎の判定方法としては、例えば、バイオプシー等で被験者より採取した関節の滑膜や軟骨の細胞または組織切片、および該細胞または組織より調製した細胞抽出液、滑液等を用いて、細胞あるいは組織に存在するFGF-8を下記に述べるように、免疫学的に検出および／または定量する方法があげられる。
【０１７９】
FGF-8に対する抗体を用いて関節に発現したFGF-8を免疫学的に検出および／または定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ELISA）、放射性物質標識免疫抗体法（RIA）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチELISA法（富山朔二および安東民衛，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック，1987年、日本生化学会，続生化学実験講座５，免疫生化学研究法，東京化学同人，1986年）などを用いることができる。
【０１８０】
蛍光抗体法は、文献（モノクローナル・アンチボディーズ、富山朔二および安東民衛，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック，1987年）等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的には、分離した関節の細胞あるいは組織などに、抗FGF-8抗体を反応させ、さらにフルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）あるいはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【０１８１】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、分離した関節の細胞あるいは組織、滑液などに、抗FGF-8抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、酵素反応により発色する基質を加えて反応させ、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【０１８２】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）は、分離した関節の細胞あるいは組織、滑液などに、抗FGF-8抗体を反応させ、さらに放射性同位体標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで放射能を測定する方法である。
【０１８３】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法は、分離した関節の細胞あるいは組織などに、抗FGF-8抗体を反応させ、さらにFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素等で標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させ、酵素標識の場合は酵素反応により発色する基質を加えて反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法であり、文献（モノクローナル・アンチボディーズ、富山朔二および安東民衛，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック，1987年）等に記載された方法を用いて行うことができる。
【０１８４】
ウェスタンブロッティングは、分離した関節の細胞あるいは組織、それらの破砕液、滑液などをSDSを含むサンプル用緩衝液に溶解させてSDS-PAGEを行なったのち、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写し、抗FGF-8抗体を反応させ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、酵素反応により発色あるいは化学発光する基質を加えて反応させ、バンドとして検出する方法である。
【０１８５】
免疫沈降法は、分離した関節の細胞あるいは組織の破砕液、滑液とビーズ等に固定化した抗FGF-8抗体を反応させ、遠心等によりビーズを単離した後、ビーズをSDSを含むサンプル用緩衝液で処理して、溶解させたFGF-8をウェスタンブロッティング等により検出する方法である。
【０１８６】
サンドイッチELISAはエピトープがそれぞれ異なる２種類の抗FGF-8抗体を用いた酵素免疫測定法の一種である。一方の抗FGF-8抗体をプレート上に固定し、分離した関節の細胞あるいは組織、それらの破砕液、滑液を反応させた後、プレート上の抗FGF-8抗体に結合したFGF-8にさらにもう一方の抗FGF-8抗体を反応させる。ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、酵素反応により発色する基質を加えて反応させ、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【０１８７】
第1図  ウサギ軟骨細胞のFGF-8による細胞外マトリックスの分解作用を示す図である。縦軸は細胞外マトリックス中に残ったグリコサミノグリカンの量を、横軸はFGF-8の濃度（ng/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、***はP＜0.001（無刺激群対比、Dunnett検定）を表す。
【０１８８】
第2図  ウサギ軟骨細胞のFGF-8による細胞外マトリックスの分解に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸は細胞外マトリックス中に残ったグリコサミノグリカンの量を、横軸はKM1334の濃度（μg/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（無刺激群対比、Studentのt-検定）を表し、**はP＜0.01、***はP＜0.001（０群対比、Dunnett検定）を表す。
【０１８９】
第3図  ウサギ軟骨細胞のFGF-8によるマトリックスメタロプロテイナーゼ-3産生の促進と抗FGF-8中和抗体KM1334による阻害作用を示す図である。縦軸は培養液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の量（ng/ウェル）を、横軸はKM1334の濃度（μg/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、##はP＜0.01（無刺激群対比、Aspin-Welch検定）を表し、***はP＜0.001（０群対比、Dunnett検定）を表す。
【０１９０】
第4図  ウサギ滑膜細胞のFGF-8による増殖の促進作用を示す図である。縦軸はウサギ滑膜細胞に取り込まれた[3H]チミジンの放射活性を、横軸はFGF-8の濃度（ng/mＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、*はP＜0.05（無刺激群対比、Steel検定）を表す。
【０１９１】
第5図  ウサギ滑膜細胞のFGF-8による増殖の促進に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸はウサギ滑膜細胞に取り込まれた[3H]チミジンの放射活性を、横軸はKM1334の濃度（μg/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（無刺激群対比、Studentのt-検定）を表し、***はP＜0.001（０群対比、Dunnett検定）を表す。
【０１９２】
第6図  ヒト滑膜細胞のFGF-8による増殖の促進作用を示す図である。縦軸はヒト滑膜細胞に取り込まれた[3H]チミジンの放射活性を、横軸はFGF-8の濃度（ng/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、***はP＜0.001（無刺激群対比、Dunnett検定）を表す。
【０１９３】
第7図  ヒト滑膜細胞のFGF-8による増殖の促進に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸はヒト滑膜細胞に取り込まれた[3H]チミジンの放射活性を、横軸はKM1334の濃度（μg/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（無刺激群対比、Aspin-Welch検定）を表し、*はP＜0.05（０群対比、Steel検定）を表す。
【０１９４】
第8図  FGF-8の注入による関節の細胞外マトリックスの分解を示す図である。縦軸は関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度（μg/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、**はP＜0.01（生理食塩液注入群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０１９５】
第9図  FGF-8の注入による関節の膝蓋骨の破壊を示す図である。縦軸は膝蓋骨重量（mg）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、*はP＜0.05（生理食塩液注入群対比、Studentのt-検定）を表す。
第10図  コラーゲン関節炎発症マウスにおける関節炎スコアの経時変化に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸は関節炎スコアを、横軸はコラーゲン初回感作日からの経過日数を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、*はP＜0.05（生理食塩液投与群対比、Wilcoxon順位和検定）を表し、#はP＜0.05（溶媒投与群対比、Wilcoxon順位和検定）を表す。
【０１９６】
第11図  アジュバント関節炎発症ラットにおけるアジュバント非処置足の足容積増加に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸は足容積（mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（未処置群対比、Aspin-Welch検定）を表し、**はP＜0.01（生理食塩液投与群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０１９７】
第12図  アジュバント関節炎発症ラットにおけるアジュバント非処置足の足容積増加に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸は足容積（mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（未処置群対比、Aspin-Welch検定）を表し、***はP＜0.001（溶媒投与群対比、Studentのt-検定）を表し、††はP＜0.01、†††はP＜0.001（溶媒投与群対比、Aspin-Welch検定）を表す。
【０１９８】
第13図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のグルコサミノグリカン量上昇に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸はグルコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度比（μg/mg）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（未処置群対比、Aspin-Welch検定）を表し、**はP＜0.01(生理食塩液投与群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０１９９】
第14図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のグルコサミノグリカン量上昇に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸はグルコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度比（μg/mg）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、##はP＜0.01（未処置群対比、Aspin-Welch検定）を表し、*はP＜0.05（溶媒投与群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０２００】
第15図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のデオキシピリジノリン量上昇に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸はデオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度比（nmol/mmol）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（未処置群対比、Aspin-Welch検定）を表し、*はP＜0.05（生理食塩液投与群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０２０１】
第16図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のデオキシピリジノリン量上昇に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸はデオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度比（nmol/mmol）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（未処置群対比、Studentのt-検定）を表し、**はP＜0.01（溶媒投与群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０２０２】
第17図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のヒドロキシプロリン量上昇に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸はヒドロキシプロリン濃度／クレアチニン濃度比（μg/mg）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、###はP＜0.001（未処置群対比、Studentのt-検定）を表す。
【０２０３】
第18図  モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルラットにおける関節軟骨破壊に対する抗FGF-8中和抗体KM1334の阻害作用を示す図である。縦軸は関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度（μg/mL）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、##はP＜0.01（偽手術群対比、Aspin-Welch検定）を表し、*はP＜0.05（生理食塩液投与群対比、Aspin-Welch検定）を表す。
【０２０４】
第19図  プラスミドpKM1334CH-H5の造成工程を示した図である。
第20図  プラスミドpKM1334CH-L4の造成工程を示した図である。
第21図  プラスミドpKANTEX1334の造成工程を示した図である。
【０２０５】
第22図  抗FGF-8中和マウス抗体KM1334、抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034およびKM3334のマウス乳癌細胞株SC-3細胞のFGF-8依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸がFGF-8のみを添加した場合の増殖を100％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がKM1334、□がKM3034、△がKM3334、×が陰性対照であるKM2760の活性を示す。
【０２０６】
第23図  プラスミドpKM1334HV0の造成工程を示した図である。
第24図  プラスミドpKANTEX1334HV0LV0の造成工程を示した図である。
第25図  抗FGF-8中和キメラ抗体KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV0、HV0LV6、HV6LV6のFGF-8に対する結合活性をELISAにより測定した結果を示した図である。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が結合活性（OD415）を示す。△がKM3334、○がHV0LV0、□がHV0LV6、×がHV6LV6の活性を示す。
【０２０７】
第26図  抗FGF-8中和キメラ抗体KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV0、HV0LV6、HV6LV6のFGF-8に対する結合活性をBIAcore 2000により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（RU）を示す。
【０２０８】
第27図  プラスミドpKM1334LV3-1の造成工程を示した図である。
第28図  プラスミドpKM1334LV4-2の造成工程を示した図である。
第29図  プラスミドpKM1334LV3-2の造成工程を示した図である。
【０２０９】
第30図  抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034、抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV0/CHO、HV0LV6/CHO、HV0LV4-1/CHO、HV0LV4-2/CHO、HV0LV3-1/CHO、HV0LV3-2/CHO、HV0LV2-1/CHO、HV0LV2-2/CHOのFGF-8に対する結合活性をBIAcore 2000により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（RU）を示す。
【０２１０】
第31図  抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034、抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV6/CHO、HV0LV4-1/CHO、HV0LV3-1/CHO、HV0LV2-1/CHOのマウス乳癌細胞株SC-3細胞のFGF-8依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸がFGF-8のみを添加した場合の増殖を100％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がKM3034、●がHV0LV6/CHO、◇がHV0LV4-1/CHO、△がHV0LV3-1/CHO、□がHV0LV2-1/CHO、×が陰性対照であるKM2760の活性を示す。
【０２１１】
第32図  プラスミドpKM1334LV3-3の造成工程を示した図である。
第33図  抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034、抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV6/CHO、HV0LV3-1/CHO、HV0LV4-3/CHO、HV0LV3-3/CHOのFGF-8に対する結合活性をBIAcore 2000により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（RU）を示す。
【０２１２】
第34図  抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034、抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV6/CHO、HV0LV3-1/CHO、HV0LV4-3/CHO、HV0LV3-3/CHOのマウス乳癌細胞株SC-3細胞のFGF-8依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸がFGF-8のみを添加した場合の増殖を100％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がKM3034、●がHV0LV6/CHO、△がHV0LV3-1/CHO、▲がHV0LV4-3/CHO、■がHV0LV3-3/CHO、×が陰性対照であるKM2760の活性を示す。
以下に、本発明の実施例および参考例を示す。
【実施例１】
【０２１３】
ウサギ軟骨細胞のFGF-8による細胞外マトリックスの分解と抗体による阻害
ウサギ関節軟骨細胞は、３週齢の雌性ニュージーランドホワイト種ウサギの両膝および肩より田村らの方法（Tamura T. et al., Eur. J. Pharmacol., 419, 269-274, 2001）に従って分離培養した。すなわち両膝関節および両肩関節を摘出し、骨端軟骨を採取した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、軟骨を細切し、0.4w/v％アクチナーゼＥを含む10vol％FBS添加DMEM（以下、FBSを含むDMEMをFBS/DMEMと記す）中で37℃で１時間、さらに0.025w/v％コラゲナーゼＰを含む10vol％FBS/DMEM中で37℃、５〜６時間処理することにより軟骨細胞を軟骨組織から分離し、採取した。採取した軟骨細胞を10vol％FBS/DMEMに懸濁し、100,000個/mLになるように調製した。この軟骨細胞を含む培養液を24ウェルプレートの各ウェルに１mLずつ播種して５％CO2−95％air気相下、37℃にて培養した。軟骨細胞がコンフルエントに達した後、培養液を0.5vol％FBS/DMEMに置換し24時間培養した。培養液を除去し、0.5vol％FBS/DMEM（無刺激群）、またはFGF-8〔１、10または100ng/mL；ペプロテック（Peprotech）社製〕を含む0.5vol％FBS/DMEMを１ｍＬ添加して48時間培養した。抗FGF-8中和抗体の作用を検討する際は、FGF-8（100ng/mL）を含む0.5vol%FBS/DMEM（０群）、またはFGF-8（100ng/mL）と抗FGF-8中和抗体KM1334（1、3または10μg/mL）とを含む0.5vol％FBS/DMEMを1mL添加して48時間培養した。培養液を除去し、プレートに残った細胞外マトリックス中のグリコサミノグリカンの量をジメチルメチレンブルー（DMMB）法（Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161103-108, 1987）にて測定した。すなわち、５mmol/L L-システイン塩酸塩一水和物を加えて活性化した保存用パパイン緩衝液（0.1mol/L酢酸ナトリウム、50mmol/L EDTA、pH5.8）に最終濃度が20μg/mLになるようにパパイン（シグマ−アルドリッチ社製）を加え、この液を上記の軟骨細胞を培養したプレートの各ウェルに1mLずつ添加し、60℃で一晩消化した。この消化液75μLに塩酸グアニジン緩衝液（2.88mol/L塩酸グアニジン、50mmol/L酢酸ナトリウム、pH6.8）25μLとDMMB溶液200μLを添加し、530/590nmの吸光度を測定した。スタンダードとして使用したコンドロイチン硫酸（クジラ軟骨由来、生化学工業社製）の吸光度から各サンプルのグリコサミノグリカンの濃度を算出した。実験は各条件とも３例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
【０２１４】
その結果を第1図および第2図に示す。FGF-8は100ng/mLの濃度で細胞外マトリックス中のグリコサミノグリカン残存量を有意に低下させた（第1図）。
このことは、FGF-8が軟骨の細胞外マトリックスの分解を促進する作用を有することを示している。また、抗FGF-8中和抗体KM1334はFGF-8による軟骨の細胞外マトリックスの分解促進を3μg/mL以上の抗体濃度で有意に抑制した（第2図）。したがって、抗FGF-8中和抗体の投与により、関節炎における細胞外マトリックスの分解を抑制することができる。
【実施例２】
【０２１５】
FGF-8によるウサギ軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生の促進と抗体による阻害
ウサギ関節軟骨細胞は、実施例１に記載の方法に従って分離培養した。軟骨細胞がコンフルエントに達した後、培養液を0.5vol％FBS/DMEMに置換し24時間培養した。培養液を除去し、0.5vol％FBS/DMEM（無刺激群）、FGF-8（100ng/mL）を含む0.5vol％FBS/DMEM（０群）または、FGF-8（100ng/mL）と抗FGF-8中和抗体KM1334（1、3または10μg/mL）とを含む0.5vol％FBS/DMEMを1mL添加して48時間培養した。48時間後、培養液を回収し、培養液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ-3濃度をウサギマトリックスメタロプロテイナーゼ-3 ELISAシステム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて測定した。実験は各条件とも３例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
【０２１６】
その結果を第3図に示す。FGF-8は100ng/mLの濃度で軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の産生を有意に増加させた（無刺激群対0群、P＝0.0079）。このことは、FGF-8が軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の産生誘導を介して細胞外マトリックスの分解を促進する作用を有することを示している。また、抗FGF-8中和抗体KM1334は、FGF-8による軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の産生を1μg/mL以上の抗体濃度から有意に抑制した。抗FGF-8中和抗体KM1334の1、3または10μg/mLでの抑制率は、それぞれ72、74、100％であった。したがって、抗FGF-8中和抗体の投与により、軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の産生が抑制され、関節炎における細胞外マトリックスの分解を抑制することができる。
【実施例３】
【０２１７】
ウサギ滑膜細胞のFGF-8による増殖の促進と抗体による阻害
ウサギ滑膜細胞はHamiltonらの方法（Hamilton J. A. and Slywka J., J. Immunol. 126, 851-855, 1981）に準じて採取した。分離した滑膜細胞を10vol％FBSを含むRPMI 1640培地（以下、FBSを含むRPMI 1640培地をFBS/RPMI 1640と記す）中に懸濁し、10,000個ずつ96ウェルの培養プレートに播種した。24時間培養後、各ウェルの培養液を除去し、0.2vol％FBS/RPMI 1640（無刺激群）、またはFGF-8（１、10または100ng/mL）を含む0.2vol％FBS/RPMI 1640を200μL添加した。抗FGF-8中和抗体の作用を検討する際は、FGF-8（100ng/mL）を含む0.2vol％FBS/RPMI 1640（0群）、またはFGF-8（100ng/mL）と抗FGF-8中和抗体KM1334（0.1、0.3、1、3または10μg/mL）とを含む0.2vol％FBS/RPMI 1640を各ウェルに200μL添加した。48時間培養後、1ウェルあたり9.25kBqの[3H]チミジンを添加した。さらに24時間培養し、細胞内に取り込まれた[3H]チミジンの放射活性を液体シンチレーションカウンター（1205ベータープレート、パーキンエルマーライフサイエンスジャパン社製）を用いて測定した。実験は各条件とも６例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
【０２１８】
その結果を第4図および第5図に示す。FGF-8は100ng/mLの濃度でウサギ滑膜細胞への[3H]チミジンの取り込みを有意に促進した（第4図）。このことはFGF-8がウサギ滑膜細胞の増殖を促進する作用を有していることを示している。また、抗FGF-8中和抗体KM1334は、このFGF-8依存性の[3H]チミジンの取り込みの促進を0.3μg/mLの抗体濃度から有意に抑制した（第5図）。したがって、抗FGF-8中和抗体の投与により、関節炎における滑膜の増殖を抑制することができる。
【実施例４】
【０２１９】
ヒト滑膜細胞のFGF-8による増殖の促進と抗体による阻害
関節リウマチ患者由来のヒト滑膜細胞（東洋紡より購入）を用いて、実施例３と同様の実験を行った。FGF-8の濃度は10、100または500ng/mLで行い、抗FGF-8中和抗体KM1334と共存させるFGF-8の濃度は500ng/mLにした。実験は各条件とも６例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
【０２２０】
その結果を第6図および第7図に示す。FGF-8は500ng/mLの濃度でヒト滑膜細胞への[3H]チミジンの取り込みを有意に促進した（第6図）。このことはFGF-8がヒト滑膜細胞の増殖を促進する作用を有していることを示している。また、抗FGF-8中和抗体KM1334はこのFGF-8依存性の[3H]チミジンの取り込みの促進を１μg/mLの抗体濃度から有意に抑制した（第7図）。したがって、抗FGF-8中和抗体の投与により、関節炎における滑膜の増殖を抑制することができる。
【実施例５】
【０２２１】
抗FGF-8抗体を使用した滑膜の染色
ヒト関節リウマチ患者より摘出した滑膜から、文献の方法（Tanaka A. et al, Cancer Res. 58, 2053-2056, 1998）に従いパラフィン切片を作製し、抗FGF-8抗体KM1334を用いて組織免疫染色を行った。その結果、ヒト関節リウマチ滑膜４例中３例の滑膜細胞でFGF-8が陽性であった。したがって、FGF-8はヒト滑膜に存在することが確認された。また、抗FGF-8抗体を用いてヒト関節リウマチの滑膜細胞を検出することにより、ヒト関節リウマチの判定が可能なことが示された。
【実施例６】
【０２２２】
FGF-8の関節内注入による関節炎の誘導
FGF-8を用いて、Sprague-Dawley系ラット（雄性、7週齢、日本チャールス・リバー社）に、以下のようにして関節炎様症状を誘発した。最終濃度が１mg/mLとなるように生理食塩液（大塚製薬工場社製）を用いて調製したFGF-8を、ラット膝関節内に50μL注入した。また、生理食塩液を膝関節内に50μL注入した群を設けた。一群は3匹とした。FGF-8または生理食塩液注入3日後に、Yamadaらの方法（Yamada A. et al., Inflamm. Res., 49, 144-146, 2000）に従い、膝関節包内を0.38w/v％クエン酸ナトリウム含有の生理食塩液30μLで洗浄し、洗浄液を回収した。この操作を10回繰り返し、300μLの関節洗浄液を回収した。関節洗浄液中のグリコサミノグリカン量を実施例１に記載のDMMB法にて測定した。また、膝関節の膝蓋骨を取り出し、実施例１に記載の方法で軟骨部分をパパインで消化し、硬骨の重量を測定した。
【０２２３】
その結果を第8図および第9図に示す。第8図は関節洗浄液中のグリコサミノグリカンの濃度を示す。FGF-8の注入により、関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度は、生理食塩液注入群の1.9倍に上昇した（P=0.0034）。このことは、FGF-8の注入により関節軟骨の細胞外マトリックス分解が亢進することを示している。第9図はパパイン消化後の膝蓋骨重量を示す。FGF-8の注入により、膝蓋骨の重量は、生理食塩液注入群の40％に低下した（P=0.0454）。このことは、FGF-8の注入により、膝蓋骨の破壊が亢進することを示している。したがって、FGF-8は、生体において関節破壊を誘導し、関節炎様の症状を引き起こすことが示された。
【実施例７】
【０２２４】
マウス・コラーゲン関節炎モデルでの評価
マウス・コラーゲン関節炎モデルは、DBA/1J系マウス（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー社）を用いて、鎌田らの方法（Kamada H. et al., Jpn. J. Pharmacol., 70, 169-175, 1996）に準じ、以下のようにして作製した。
【０２２５】
ウシ軟骨由来II型コラーゲン溶液（コラーゲン技術研修会社製）をフロイント完全アジュバント（ヤトロン社製）と氷冷下で混和してエマルジョンを形成させ、II型コラーゲンの最終濃度が1.5mg/mLとなるように調製したものを、マウスの尾根部皮内に100μL注射して感作し、さらに21日後に同様の操作で追加免疫を行った。一群は10匹とした。KM1334投与群には、抗FGF-8中和抗体KM1334を生理食塩液（大塚製薬工場社製）で最終濃度2mg/mLとなるように溶解し、上記マウス・コラーゲン関節炎モデルの初回感作から21、25、28、32、35および39日目に1日1回各個体に200μL腹腔内投与した。また生理食塩液投与群には、抗FGF-8中和抗体KM1334溶液の代わりに生理食塩液のみを腹腔内投与した。また陽性コントロールとして、ジクロフェナック投与群には、非ステロイド性抗炎症薬であるジクロフェナックナトリウム（シグマ−アルドリッチ社製）を0.5w/v％メチルセルロース溶液に最終濃度0.3mg/mLとなるように溶解し、上記マウス・コラーゲン関節炎モデルの初回感作21日目から25日目、28日目から32日目、および35日目から39日目に、1日1回、体重100gあたり1mL経口投与した。また、溶媒投与群として0.5w/v％メチルセルロース溶液のみを同様に経口投与した。さらに未処置群をおき、これらにはコラーゲン感作および薬物投与を行なわなかった。コラーゲン関節炎における全肢浮腫の経時変化は、一肢０から４点、全肢合計最高16点のスコアリングによって評価した。スコアの基準は、０: 正常、１: 弱い紅斑を認める、２: 弱い腫脹と紅斑を認める、３: 強い腫脹と紅斑を認め、触知により温感を認める、４: 手指の変形を伴う著明な腫脹を認める、とした。
【０２２６】
その結果を第10図に示す。抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、42日目で34％（P＝0.0204）の有意な関節炎スコアの抑制が認められ、その抑制の程度は陽性コントロールのジクロフェナック投与群と同程度であった（第10図）。このことは、抗FGF-8中和抗体の投与により、関節炎を抑制することができることを示している。
【実施例８】
【０２２７】
ラット・アジュバント関節炎モデルでの評価
ラット・アジュバント関節炎モデルは、Lewis系ラット（雌性、8週齢、日本チャールス・リバー社）を用いて、Pearsonらの方法（Pearson CM. et al., Arth. Rheum., 5, 654-658, 1962）に準じ、以下のようにして作製した。
【０２２８】
Mycobacterium butyricum（ディフコ社製）を、最終濃度が6mg/mLとなるように流動パラフィン（和光純薬工業社製）に懸濁し、高圧蒸気滅菌したものを、ラットの右側足蹠部皮内に100μL注射して感作した。一群は8〜10匹とした。KM1334投与群には、抗FGF-8中和抗体KM1334を生理食塩液で最終濃度2mg/mLとなるように溶解し、上記ラット・アジュバント関節炎モデルの感作日、ならびに感作から3、7、10、14、および17日目に1日1回各個体に体重100gあたり0.5mLを腹腔内投与した。また生理食塩液投与群には、抗FGF-8中和抗体KM1334溶液の代わりに生理食塩液のみを腹腔内投与した。また陽性コントロールとして、ジクロフェナック投与群には、抗炎症薬のジクロフェナックナトリウムを0.5w/v％メチルセルロース溶液に最終濃度0.3mg/mLとなるように溶解し、アジュバント感作日から4日目、7から11、14から18日目に、1日1回、体重100gあたり1mL経口投与した。メソトレキセート投与群には、代謝拮抗薬である注射用メソトレキセートa50mg（日本ワイスレダリー社製）を0.5w/v％メチルセルロース溶液に最終濃度0.01mg/mLとなるように溶解し、ジクロフェナック投与群と同様に投与した。プレドニゾロン投与群には、ステロイド薬であるプレドニゾロン（シグマ−アルドリッチ社製）を0.5w/v％メチルセルロース溶液に最終濃度0.3mg/mLとなるように懸濁し、ジクロフェナック投与群と同様に投与した。また溶媒投与群として0.5w/v％メチルセルロース溶液のみを同様に経口投与した。さらに未処置群をおき、これらにはMycobacterium butyricum感作および薬物投与を行わなかった。アジュバント処置足および非処置足の容積は、ラット後肢足浮腫測定装置（TK-101、ユニコム社製）を用いて経時的に測定した。
【０２２９】
感作日より21日目の測定結果を第11図ならびに第12図に示す。抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、アジュバント非処置足において、69％（P＝0.0010）の有意な足容積増加の抑制が見られた（第11図）。ジクロフェナック投与群では45％（P＜0.0001）、メソトレキセート投与群では90％（P＜0.0001）、プレドニゾロン投与群では51％（P＝0.0029）の有意な足容積増加の抑制が見られた（第12図）。すなわち、抗FGF-8中和抗体KM1334は、ジクロフェナックナトリウムやプレドニゾロンを上回る浮腫抑制作用を示した。
【０２３０】
感作から20日目より21日目までの24時間蓄尿を用いて、尿中のグリコサミノグリカン、デオキシピリジノリン、ヒドロキシプロリン、およびクレアチニン量を測定した。尿中のグリコサミノグリカン量は、実施例１に記載のDMMB法にて測定した。尿中のヒドロキシプロリン量は、池田らの方法（池田眞悟ら, 東京衛研年報. 36 277-282, 1985）に従って測定した。すなわち、尿0.8mLにアミノ酸分析用塩酸（関東化学社製）0.8mL添加し、110℃で15時間加水分解した。加水分解した試料0.5mLに1.2mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を2mL添加して中和した。中和処理した試料0.5mLにイソプロパノールを１mL添加し、Oxidant溶液を1mL添加してよく攪拌し、５分間室温に静置した。Oxidant溶液は、酢酸ナトリウム三水和物5.7g、クエン酸三ナトリウム二水和物3.75g、クエン酸一水和物0.602gを蒸留水約50mLに溶解し、イソプロパノール38.5mL加え、さらに蒸留水を加えて100mLとした酢酸クエン酸緩衝液と、蒸留水を用いて調製した7w/v％クロラミンＴ溶液（p-トルエンスルホンクロロアミドナトリウム三水和物、和光純薬工業社製）を使用時に4:1の割合で良く混和したものである。その後Ehrlich試薬を1mL添加してよく攪拌し、恒温器にて60℃、20分間加温した。Ehrlich試薬は、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬工業社製）17.6gを過塩素酸（関東化学社製）20.9mLに溶解し、イソプロパノールを加えて100mLとしたものである。加温後、流水で冷却し、562nmの吸光度を測定した。L-ヒドロキシプロリン（和光純薬工業社製）の吸光度から作成した検量線を用いて、各サンプルのヒドロキシプロリン濃度を算出した。尿中のデオキシピリジノリン量は、オステオリンクス「DPD」（住友製薬社製）を用いて測定した。尿中クレアチニン量は、クレアチニン−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。個体間の尿濃度の差を補正するため、各個体毎にグリコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度、デオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度、あるいはヒドロキシプロリン濃度／クレアチニン濃度の比を算出し、それぞれの指標とした。
【０２３１】
その結果を第13図から第17図に示す。尿中のグリコサミノグリカン量は、生理食塩液投与群において、未処置群の2.2倍に上昇した（P＜0.0001）（第13図）。このことは、関節炎の進展に伴い、軟骨破壊が亢進することを示している。抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、尿中グリコサミノグリカン量の上昇に対し、73％（P＝0.0064）の有意な抑制が見られた（第13図）。メソトレキセート投与群では、79％（P＝0.0465）の有意な尿中グリコサミノグリカン量上昇の抑制が見られた。有意ではないが、ジクロフェナック投与群では40％、プレドニゾロン投与群では18％の尿中グリコサミノグリカン量の低下が認められた（第14図）。すなわち、抗FGF-8中和抗体KM1334は、メソトレキセートと同程度の軟骨破壊抑制作用を示した。
【０２３２】
尿中のデオキシピリジノリン量は、生理食塩液投与群において、未処置群の1.8倍に上昇した（P＜0.0001）（第15図）。このことは、関節炎の進展に伴い、骨破壊が亢進することを示している。抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、尿中デオキシピリジノリン量の上昇に対し、41％（P＝0.0185）の有意な抑制が見られた。ジクロフェナック投与群では、88％（P＝0.0016）の有意な尿中デオキシピリジノリン量上昇の抑制が見られた。有意ではないが、メソトレキセート投与群では34％、プレドニゾロン投与群では38％の尿中デオキシピリジノリン量の低下が認められた（第16図）。すなわち、抗FGF-8中和抗体KM1334は、メソトレキセートやプレドニゾロンを上回る骨破壊抑制作用を示した。
【０２３３】
尿中のヒドロキシプロリン量は、生理食塩液投与群において、未処置群の1.8倍に上昇した（P＝0.0002）（第17図）。このことは、関節炎の進展に伴い、骨破壊が亢進することを示している。抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、尿中ヒドロキシプロリン量の上昇に対し、有意ではないが48％の低下が見られた。
【０２３４】
感作から21日目にアジュバント非処置足を脛骨骨幹部で切断して採取し、10vol％リン酸緩衝ホルマリン溶液で固定した。その後、軟X線発生装置SOFRON SRO-M50（ソフロン社製）を用いて、29kV、4mA、2分間の条件下で軟X線写真を撮影した。実体顕微鏡を用いて写真を観察し、骨破壊をスコアリングした。スコアリングは、踵骨（一辺を１部位とし、合計５部位）の骨びらんの有無を観察し、びらんあり１点、なし０点として、一肢最高５点で行った。
【０２３５】
その結果を第１表ならびに第２表に示す。値は平均値±標準誤差を意味し、*はP＜0.05、**はP＜0.01、***はP＜0.001（溶媒投与群対比、Wilcoxon順位和検定）を表す。
【０２３６】
0004246069.tif 000002
0004246069.tif 000003
【０２３７】
抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、有意ではないが、骨破壊スコアの27％低下が見られたが、（第１表）。ジクロフェナック投与群では33％（P＝0.0362）、メソトレキセート投与群では80％（P＝0.0006）、プレドニゾロン投与群では61％（P＝0.0032）骨破壊スコアの低下が認められた（第２表）。すなわち、抗FGF-8中和抗体KM1334は、ジクロフェナックナトリウムと同程度の骨破壊スコアの低下を示した。
【０２３８】
ホルマリン固定したアジュバント非処置足のパラフィン切片を作製した。ヘマトキシリン／エオシン染色し、脛骨から中足骨にかけての骨、関節および関節周囲領域を組織病理学的に評価した。関節周囲組織あるいは関節腔への血漿漏出を、一肢０から４点のスコアリングにより評価した。スコアの基準は、０: 変化なし、１: 極軽度の変化を認める、２: 軽度の変化を認める、３: 中等度の変化を認める、４: 重度の変化を認める、とした。
その結果を第３表に示す。値は平均値±標準誤差を意味し、*はP＜0.05、**はP＜0.01（生理食塩液投与群対比、Wilcoxon順位和検定）を表す。
【０２３９】
0004246069.tif 000004
【０２４０】
抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、関節周囲組織への血漿漏出の41％低下（P＝0.0022）、ならびに関節腔への血球および血漿漏出の41％低下（P＝0.0156）が見られた（第３表）。したがって、抗FGF-8中和抗体の投与により、関節炎における浮腫形成と、軟骨ならびに骨破壊を抑制することができる。
【実施例９】
【０２４１】
ラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルでの評価
ラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルは、Sprague-Dawley系ラット（雄性、7週齢、日本チャールス・リバー社）を用いて、Guingampらの方法 （Guingamp C. et al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997）に準じて、以下のようにして作製した。
【０２４２】
最終濃度が10mg/mLとなるように生理食塩液を用いて調製したモノヨード酢酸（シグマ−アルドリッチ社製）を、ラットの右膝関節内に25μL注入した。一群は10匹とした。KM1334投与群には、抗FGF-8中和抗体KM1334を生理食塩液（大塚製薬工場社製）で最終濃度4mg/mLとなるように溶解し、モノヨード酢酸注入時に１回、体重100gあたり0.5mLを腹腔内投与した。また生理食塩液群には、抗体溶液の代わりに生理食塩液のみを腹腔内投与した。さらに偽手術群をおき、これらには生理食塩液を膝関節内に注入し、薬物投与は行わなかった。モノヨード酢酸注入３日後に、実施例６に記載の方法に従い、関節洗浄液を回収した。関節洗浄液中のグリコサミノグリカン量を実施例１に記載のDMMB法にて測定した。
【０２４３】
その結果を第18図に示す。モノヨード酢酸の注入により、関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度は、偽手術群の1.6倍に上昇した（P＝0.0014）。このことは、モノヨード酢酸注入により、関節軟骨の細胞外マトリックス分解が亢進することを示している。このモノヨード酢酸注入による関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度の上昇に対し、抗FGF-8中和抗体KM1334投与群では、42％（P＝0.0188）の有意な抑制が見られた。したがって、抗FGF-8中和抗体の投与により、関節炎における関節軟骨の破壊を抑制することができる。
（参考例１）
【０２４４】
抗FGF-8中和キメラ抗体の生産
１．マウスの抗FGF-8中和抗体のＶ領域をコードするcDNAの単離と解析
（１）マウスの抗FGF-8中和抗体生産ハイブリドーマ細胞からのmRNAの調製
マウスの抗FGF-8中和抗体を生産するハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451、特開平9-271391）の1×107細胞より、mRNAの調製キットであるファストトラックmRNA単離キット（インビトロジェン社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、mRNAを約8μｇ調製した。
【０２４５】
（２）抗FGF-8中和マウス抗体のH鎖およびL鎖cDNAライブラリーの作製
上記（１）で取得したKM1334のmRNAの5μgから、タイムセーバーcDNA合成キット（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にEcoRI-NotIアダプターを有するcDNAを合成した。続いて、λZAPIIクローニング・キット（ストラタジーン社製）を用いてcDNAライブラリーを作製した。まず、cDNA全量を20μLの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、IgGクラスの抗体のH鎖に対応する約1.5kbのcDNA断片とκクラスのL鎖に対応する約1.0kbのcDNA断片をそれぞれ約0.1μg回収した。次に、各々の約1.5kbのcDNA断片0.1μgおよび約1.0kbのcDNA断片0.1μgと、制限酵素EcoRIで消化後仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化したλZAPIIベクター1μgとを、添付の使用説明書に従い連結した。
【０２４６】
連結後の各々の反応液のうち4μlをGigapack II Packaging Extracts Gold（ストラタジーン社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、適当量を大腸菌株XL1-Blue（ストラタジーン社製）に感染させて、KM1334のH鎖cDNAライブラリーおよびL鎖cDNAライブラリーとしてそれぞれ約8.1×104個と、5.5×104個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法（モレキュラー・クローニング  第３版）に従い、ナイロンメンブレン上に固定した。
【０２４７】
（３）抗FGF-8中和マウス抗体のH鎖およびL鎖cDNAのクローニング
上記（２）で作製したKM1334のH鎖cDNAライブラリーおよびL鎖cDNAライブリーのナイロンメンブレンを、ECL直接核酸標識検出システム（ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems、アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のC領域のcDNA〔H鎖はマウスCγ1 cDNAを含むDNA断片（French D. L. et al.,J. Immunol., 146, 2010-2016, 1991）、L鎖はマウスCκ cDNAを含むDNA断片（Hieter P. A. et al., Cell, 22, 197-207, 1980）をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをH鎖、L鎖各10クローン取得した。次に、λZAPIIクローニング・キット（ストラタジーン社製）の使用説明書に従い、イン・ビボ・エクシジョン（in vivo excision）により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるcDNAの塩基配列を、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２（Big Dye Terminator Kit Ver.2、アプライド・バイオシステムズ社製）およびDNAシークエンサーを用いて決定した。その結果、cDNAの5'末端に開始コドンと推定されるATG配列が存在する完全長の機能的なH鎖cDNAを含むプラスミドpKM1334H7-1およびL鎖cDNAを含むプラスミドpKM1334L7-1を得た。
【０２４８】
（４）抗FGF-8中和マウス抗体のV領域のアミノ酸配列の解析
配列番号１にプラスミドpKM1334H7-1に含まれていたVHの全塩基配列、配列番号２に推定された全アミノ酸配列、配列番号３にプラスミドpKM1334L7-1に含まれていたVLの全塩基配列、配列番号４に推定された全アミノ酸配列をそれぞれ示す。既知のマウス抗体の配列データ（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）との比較および精製した抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ-10（島津製作所製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果との比較から、単離した各々のcDNAは分泌シグナル配列を含む抗FGF-8中和マウス抗体KM1334をコードする完全長cDNAであり、H鎖については配列番号２に記載のアミノ酸配列の１から19番目が、L鎖については配列番号４に記載のアミノ酸配列の１から19番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。なお、分泌シグナル配列を除いたVHおよびVLのアミノ酸配列を配列番号５および配列番号６にそれぞれ示した。
【０２４９】
次に、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVHおよびVLのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてGCGパッケージ〔バージョン９．１、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group）社製〕を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース〔PIR-Protein (Release 56.0)〕をBLAST（Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）により検索した。その結果、H鎖、L鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVHおよびVLは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
【０２５０】
また、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVHおよびVLのCDRを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVHのCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号7、8および9に、VLのCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号10、11および12に示した。
【０２５１】
２．抗FGF-8中和キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）抗FGF-8中和キメラ抗体のVHをコードするDNAを含むプラスミドpKM1334CH-H5の構築
参考例１の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334H7-1の50ngを鋳型とし、配列番号13、14に記載の塩基配列をそれぞれ有する合成DNA〔ジェンセット（GENSET）社製〕をプライマーとして終濃度0.3μmol/Lとなるように加え、KODプラス・ポリメラーゼ（東洋紡績社製）に添付の使用説明書に従い、全量50μLでまず94℃で2分間加熱した後、94℃15秒間、57℃30秒間、68℃1分間の条件で30サイクルのPCRを行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.48kbのEcoRI断片（5’末端側がEcoRI、3’末端側は平滑末端）を約0.3μg回収した。
【０２５２】
次に、プラスミドpBluescript SK(-)の3μgに、10単位の制限酵素EcoRI及び10単位の制限酵素EcoRV（宝酒造社製）を37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kbのEcoRI-EcoRV断片を約2μg回収した。
【０２５３】
次に、上記で得られたVHをコードするDNAのEcoRI断片0.1μgとプラスミドpBluescript SK(-)由来のEcoRI-EcoRV断片0.1μgとを全量10μlの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイ（Ligation High、東洋紡績社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、第19図に示した抗FGF-8中和キメラ抗体のVHをコードするDNAを含むプラスミドpKM1334CH-H5を得た。
【０２５４】
（２）抗FGF-8中和キメラ抗体のVLをコードするDNAを含むプラスミドの構築
参考例１の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334L7-1の50ngを鋳型とし、配列番号15、16に記載の塩基配列をそれぞれ有する合成DNA（ジェンセット社製)をプライマーとして終濃度0.3μmol/Lとなるように加え、KODプラス・ポリメラーゼに添付の使用説明書に従い、全量50μLでまず94℃で2分間加熱した後、94℃15秒間、57℃30秒間、68℃1分間の条件で30サイクルのPCR反応を行った。    該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、10単位の制限酵素EcoRIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.45kbのEcoRI断片（5’末端側がEcoRI、3’末端側は平滑末端）を約0.3μg回収した。
【０２５５】
次に、上記で得られたVLをコードするDNAのEcoRI断片0.1μgとプラスミドpBluescript SK(-)由来のEcoRI-EcoRV断片0.1μgを全量10μlの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、第20図に示した抗FGF-8中和キメラ抗体のVLをコードするDNAを含むプラスミドpKM1334CH-L4を得た。
【０２５６】
（３）抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334の構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と参考例１の２．（１）および（２）で得られたプラスミドpKM1334CH-H5およびpKM1334CH-L4を用いて抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334を以下の様にして構築した。
【０２５７】
参考例１の２．（１）で得られたプラスミドpKM1334CH-H5の3μgに、10単位の制限酵素NotI〔ニュー・イングランド・バイオラブイズ（New England Biolabs）社製〕及び10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を添加して37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.48kbのNotI-ApaI断片を約0.2μg回収した。
【０２５８】
次に、ヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の3μgに、10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）および10単位の制限酵素NotIを添加して37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約12.8kbのApaI-NotI断片を約2μg回収した。
【０２５９】
次に、上記で得られたプラスミドpKM1334CH-H5由来のNotI-ApaI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX93由来のNotI-ApaI断片0.1μgとを全量10μLの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、第21図に示したプラスミドpKANTEX1334Hを得た。
【０２６０】
次に、参考例１の２．（２）で得られたプラスミドpKM1334CH-L4の3μgに、10単位の制限酵素EcoRI及び10単位の制限酵素BsiWI（ニュー・イングランド・バイオラブイズ社製）を添加して37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.45kbのEcoRI-BsiWI断片を約0.2μg回収した。
【０２６１】
次に、上記で得られたプラスミドpKANTEX1334Hの3μgに、10単位の制限酵素EcoRIおよび制限酵素BsiWIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.30kbのEcoRI-BsiWI断片を約2μg回収した。
【０２６２】
次に、上記で得られたプラスミドpKM1334CH-L4由来のEcoRI-BsiWI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1334H由来のEcoRI-BsiWI断片0.1μgとを全量10μLの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、第21図に示したプラスミドpKANTEX1334を得た。
【０２６３】
得られたプラスミドpKANTEX1334の400ngを用い、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２およびDNAシークエンサーを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、目的のDNAがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
【０２６４】
（４）抗FGF-8中和キメラ抗体のCHO/DG44細胞を用いた安定発現
上記参考例１の２．（３）で得られた抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334を用いて、DHFR遺伝子欠損CHO細胞であるCHO/DG44細胞（Urlaub G. and Chasin L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980）を宿主とした抗FGF-8中和キメラ抗体の発現を以下の様にして行った。
【０２６５】
プラスミドpKANTEX1334の10μgを1.6×106細胞のCHO/DG44細胞へエレクトロポレーション法（Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）により導入後、10〜30mLのIMDM−1×HTサプルメント−dFBS(10)〔透析FBS（以下dFBSと略す)を10％と1×HTサプルメント（インビトロジェン社製）とを含むIMDM培地（インビトロジェン社製）〕に懸濁し、96ウェルマイクロタイタープレート（旭テクノグラス社製）に100μL/ウェルずつ分注した。5％CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、培養液を培地IMDM-dFBS(10)〔HTサプルメントを含まずに10％ dFBSを含むIMDM培地〕と交換してさらに１〜２週間培養した。耐性コロニーが出現しコンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗FGF-8中和キメラ抗体の抗原結合活性を下記の参考例１の２．（６）に示すELISAにより測定した。
【０２６６】
培養上清中に抗FGF-8中和キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については24ウェルプレートに播種し、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、dhfrの阻害剤であるメソトレキセート（シグマ−アルドリッチ社製、以下MTXと略す）を50 nmol/L含むIMDM-dFBS(10)で2週間培養した。更にMTX濃度を200 nmol/L、500 nmol/Lと高くし、それぞれの段階で2週間ずつ培養を行い、500 nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗FGF-8中和キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２．（６）に示すELISAにより測定した。最終的に、500 nmol/LのMTXを含むIMDM-dFBS(10)培地で増殖可能かつ、抗FGF-8中和キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗FGF-8中和キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンをKM3034と命名した。なお、KM3034は平成13年12月26日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にFERM BP-7836として寄託されている。
【０２６８】
(５) 抗FGF-8中和キメラ抗体のYB2/0細胞を用いた安定発現
上記参考例1の2項（3）で得られた抗FGF-8中和キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334を用いて抗FGF-8中和キメラ抗体のラットミエローマYB2/0細胞 (ATCC No. CRL-1662)での発現を以下の様にして行った。
【０２６９】
プラスミドpKANTEX1334の10μgを4×106細胞のYB2/0細胞へエレクトロポレーション法により導入後、40mLのハイブリドーマ-SFM−FBS(5)〔5％FBS（PAAラボラトリーズ社製）を含むハイブリドーマ-SFM培地（インビトロジェン社製）〕に懸濁し、96ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に200μL/ウェルずつ分注した。5％CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を1mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗FGF-8中和キメラ抗体の抗原結合活性を参考例1の２．（６）に示すELISAにより測定した。
【０２７０】
培養上清中に抗FGF-8中和キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、1mg/mL G418および50nmol/L MTXを含むハイブリドーマ-SFM−FBS(5)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート〔グライナー（Greiner）社製〕に1mLずつ分注した。5％CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗FGF-8中和キメラ抗体の抗原結合活性を参考例1の２．（６）に示すELISAにより測定した。
【０２７１】
培養上清中に抗FGF-8中和キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を上昇させ、終濃度が1mg/mL のG418、200nmol/LのMTXを含むハイブリドーマ-SFM-FBS(5) 培地で増殖可能かつ、抗FGF-8中和キメラ抗体を高発現する形質転換株5-Dを得た。得られた形質転換株について、限界希釈法によるクローン化を行い、抗FGF-8中和キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞株を得た。得られた形質転換細胞株をKM3334と命名した。
【０２７２】
（６）ELISAによる、抗体のFGF-8部分ペプチドに対する結合活性の測定
抗FGF-8抗体が反応し得るヒトFGF-8の部分ペプチドとして、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334（特開平9-271391）の抗原ペプチドと同じ配列である配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。配列番号17は、ヒトFGF-8のアミノ酸配列の23〜46番目の配列のＣ末端に、コンジュゲート作製のためにシステイン残基を付加した配列である。以下、このペプチドを化合物１と呼ぶ。ELISAに用いるため、以下の方法で牛血清アルブミン（ナカライテスク社製、以下、BSAと略す）とのコンジュゲート（以下、BSA-化合物１と呼ぶ）を作製した。すなわち、10mgのBSAを含むPBS 900μLに、100μLの25mg/mL SMCC〔4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カルボキシリックアシッドN-ヒドロキシサクシンイミドエステル、シグマ−アルドリッチ社製〕のDMSO溶液を攪拌しながら滴下し、30分間ゆっくりと攪拌した。25mLのPBSで平衡化したゲルろ過カラム（NAP-10カラム）に反応液1mLを載せ、1.5mLのPBSで溶出させた溶出液をBSA-SMCC溶液とした。各画分のBSA濃度は280nmの吸光度で測定した。次に、1.0 mgの化合物１に200μL DMSOを加え、次いで800μL PBSを加えて完全に溶解させた後、前述のBSA-SMCC溶液 （BSA換算2.5mg）を攪拌下で添加して室温で3時間ゆっくり攪拌した。反応液をPBSに対して4℃、一晩透析し、最終濃度0.05％となるようにアジ化ナトリウムを添加した後、孔径0.22μmフィルターでろ過した溶液をBSA-化合物１溶液とした。
【０２７３】
96ウェルのELISA用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したBSA-化合物１溶液を0.5〜1.0μg/mLの濃度で50μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1％BSAを含むPBS（以下、BSA-PBSと呼ぶ）を100μL/ウェルずつ加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを0.05%Tweenを含むPBS（以下、Tween-PBSと呼ぶ）で洗浄後、形質転換株の培養上清あるいは精製抗体を50μL/ウェルずつ加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween-PBSで洗浄後、BSA-PBSで3000〜6000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG (H&L)抗体溶液〔アメリカン・クォーレックス（American Qualex）社製〕を二次抗体溶液として、50μL/ウェルずつ加え、室温で1時間反応させた。反応後の各ウェルを、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液〔0.55gの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウムを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に30％過酸化水素水を1μL/mLの割合で添加した溶液〕を50μL/ウェルずつ加えて発色反応させ、5分後に5％SDS溶液を50μL/ウェルずつ加えて反応を停止した。その後、415nmの吸光度を測定した。
【０２７４】
３．抗FGF-8中和キメラ抗体の精製
（１）CHO/DG44細胞由来の発現細胞の培養及び抗体の精製
参考例1の２．（４）で得られた抗FGF-8中和キメラ抗体を発現する形質転換細胞株KM3034を500nmol/L MTXを含むIMDM-dFBS(10)培地に1〜2×105細胞/mLとなるように懸濁し、175cm2フラスコ（グライナー社製）に40mLずつ分注した。5％CO2インキュベーター内で37℃で5〜7日間培養し、コンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、20mLのPBSにて細胞を洗浄した。PBSを除去し、40mLのEX-CELL 301培地（JRHバイオサイエンシズ社製）を加え、5％CO2インキュベーター内で37℃にて7〜14日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりプロセップ-A〔Prosep-A、ミリポア社製〕カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗FGF-8中和キメラ抗体を精製した。得られた抗FGF-8中和キメラ抗体はKM3034と名付けた。
【０２７５】
（２）YB2/0細胞由来の発現細胞の培養及び抗体の精製
参考例1の２．（５）で得られた抗FGF-8中和キメラ抗体を発現する形質転換細胞株KM3334を、175cm2フラスコで、200nmol/L MTXおよび5％ダイゴGF21（和光純薬社製）を含むハイブリドーマ-SFM培地を用いて、5％CO2インキュベーター内で37℃にて培養した。8〜10日間培養して回収した培養上清より、プロセップ-Aカラムを用いて、添付の説明書に従い、抗FGF-8中和キメラ抗体を精製した。得られた抗FGF-8中和キメラ抗体はKM3334と名付けた。
【０２７６】
４．精製した抗FGF-8中和キメラ抗体の解析
参考例１の３．で得られた各種動物細胞で発現、精製した２種類の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034およびKM3334の各4μgを公知の方法（Nature, 227,680, 1970）に従ってSDS-電気泳動にかけ、分子量及び精製度を解析した。精製した各抗FGF-8中和キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約150Kdの単一のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のH鎖及びL鎖のcDNAの塩基配列から推定される分子量（H鎖：約49Kd、L鎖：約23Kd、分子全体：約144Kd）とほぼ一致し、更に、IgG型の抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のS-S結合が切断され、分子量約50KdのH鎖と約25KdのL鎖にそれぞれ分解されるという報告（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）と一致し、これにより抗FGF-8中和キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０２７７】
５．精製した抗FGF-8中和キメラ抗体の中和活性評価
精製した抗FGF-8中和キメラ抗体のFGF-8中和活性の評価は、以下に示すマウス乳癌細胞株SC-3のFGF-8依存性増殖の抑制効果（Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992）により測定した。即ち、活性炭処理をしたFBSを2％の濃度で含むDMEM:Ham's F12 (1:1)培地〔DMEM培地とHam's F12培地（インビトロジェン社製）とを1:1の割合で混合した培地〕に、SC-3細胞を3.0×104 細胞/mLの濃度でに懸濁し、150μL（4.5×103 細胞）/ウェルずつ96ウェルプレートに播種した。5％CO2インキュベーター内で37℃、18時間培養後、100μL/ウェルの試験培地を用いて培地交換した。試験培地は、50ng/mLのFGF-8（R&D社製）及び各希釈濃度の抗FGF-8中和キメラ抗体を、BSAを0.1%で含むDMEM:Ham's F12 (1:1)培地に溶解することにより作製した。また、陰性対照の抗体としてWO01/64754に記載のヒトケモカインCCR4に対するキメラ抗体KM2760を用いた。5％CO2インキュベーター内で37℃、48時間培養後、新たに調製した試験培地と交換し、さらに48時間培養した。WST-1試薬（ロシュ社製）を10μL/ウェルずつ添加し、軽く攪拌して5％CO2インキュベーター内で37℃、1時間培養後、吸光度（OD450/650）を測定した。第22図において、横軸は添加した抗体濃度、縦軸は50ng/mLのFGF-8のみの添加時の増殖に対する相対増殖（％）を示す。50ng/mLのFGF-8のみの添加時の増殖に対する相対増殖（％）は下記の式により算出された。
（式）FGF-8添加時の増殖に対する相対増殖（％）
＝｛（FGF-8及び抗体添加時の吸光度−FGF-8及び抗体未添加時の吸光度）/
（FGF-8のみ添加時の吸光度−FGF-8及び抗体未添加時の吸光度）}×100
【０２７８】
第22図に示したように、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334、抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034およびKM3334は、いずれも同等のSC-3細胞増殖阻害活性を示し、キメラ抗体化による中和活性の低下は認められなかった。
（参考例２）
【０２７９】
抗FGF-8中和CDR移植抗体の作製
１．抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするDNAの構築
（１）抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
まず、抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１の１項（４）で同定した抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVHのCDRのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のVHをそのアミノ酸配列の相同性から3種類のサブグループ（HSG I〜III）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列を設計することとした。より活性の高い抗FGF-8中和CDR移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のVHの3種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、KM1334のVHのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を選択した。
第４表には、相同性の検索結果を示した。第４表に示した様に、KM1334のVH領域のFRのアミノ酸配列はサブグループIと最も高い相同性を有していた。
【０２８０】
第  ４  表
ヒト抗体のVHの各サブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列と
KM1334のVHのFRのアミノ酸配列との相同性
HSG I  HSG II  HSG III
79.3%   51.7%   59.8%
以上の結果から、ヒト抗体のVHのサブグループIの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVHのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号18に記載の抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0を設計した。
【０２８１】
次に、抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１の１．（４）で同定した抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVLのCDRのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVLのFRのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のVLをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（HSG I〜IV）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。そこでVHの場合と同様にして、ヒト抗体のVLの４種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、KM1334のVLのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を選択した。
第５表には、相同性の検索結果を示した。第５表に示した様に、KM1334のVLのFRのアミノ酸配列はサブグループIIと最も高い相同性を有していた。
【０２８２】
第  ５  表
ヒト抗体のVLの各サブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列と
KM1334のVLのFRのアミノ酸配列との相同性
HSG I  HSG II  HSG III  HSG IV
66.3%   83.8%   66.2%   73.8%
以上の結果から、ヒト抗体のVLのサブグループIIの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号19に記載の抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV.0を設計した。
【０２８３】
上記で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0およびVLのアミノ酸配列LV.0は、選択したヒト抗体のFRのアミノ酸配列に抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のCDRのアミノ酸配列のみを移植した配列である。多くの場合、ヒト型CDR移植抗体では、マウス抗体のCDRのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまう。それを回避するため、ヒト抗体とマウス抗体とのFRアミノ酸配列を比較し、異なっているFRのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をCDRのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本参考例においても、結合活性に影響を与えると考えられるFRのアミノ酸残基を同定することを検討した。
【０２８４】
まず、上記で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0およびVLのアミノ酸配列LV.0よりなる抗体V領域（HV0LV0）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアAbM〔オックスフォード・モレキュラー（Oxford Molecular）社製〕を、三次元構造の表示についてはソフトウェアPro-Explore（オックスフォード・モレキュラー社製）あるいはRasMol〔グラクソ（Glaxo）社製〕を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のV領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、HV0LV0のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列において、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334と異なっているアミノ酸残基について順次、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334の相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列からなる改変体のV領域三次元構造モデルを同様にして構築し、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334、HV0LV0および改変体のV領域の三次元構造を比較した。その結果、HV0LV0のFRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、HV.0において12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、68番目のVal、70番目のIle、74番目のThr、76番目のThr、82番目のGlu、84番目のSer、87番目のArg、95番目のTyrを、LV.0において2番目のIle、3番目のVal、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeu、92番目のTyrを選択し、アミノ酸を改変することとした。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも1つ以上をマウス抗体KM1334に見られるアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLを以下のように設計した。
【０２８５】
具体的には、VHとしては、12番目のLys、13番目のLys、40番目のAla、41番目のPro、48番目のMet、95番目のTyrの6残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるAla、Arg、Arg、Ser、Ile、Pheに改変した配列番号20に記載のアミノ酸配列HV.6を設計した。VLとしては、2番目のIle、14番目のThr、15番目のPro、50番目のGln、51番目のLeu、92番目のTyrの6残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるVal、Ser、Leu、Lys、Val、Pheに改変した配列番号21に記載のアミノ酸配列LV.6を設計した。
【０２８６】
（２）抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHをコードするDNAの構築
参考例２の１項（１）で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0をコードするDNAをPCRを用いて以下の様にして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のH鎖の分泌シグナル配列（配列番号２の１〜19番目のアミノ酸配列）を繋げた。次に、得られたアミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体V領域のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を設計した。この塩基配列の5'末端と3'末端にヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含む配列を付加し、さらに5'末端にM13プライマーRV（宝酒造社製）の配列、3'末端にM13プライマーM4（宝酒造社製）の配列と相補的な配列を付加した。設計した塩基配列（配列番号22）を5'末端側から141塩基ずつ、末端の20塩基が重複する様に４つに区切り、それぞれの配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、センス鎖、アンチセンス鎖に相当する、配列番号23〜26に示す配列からなる４本のDNAを化学合成した（ジェンセット社製）。
【０２８７】
KODポリメラーゼに添付の使用説明書に従い、0.1μmol/Lの各合成DNA、0.5μmol/LのM13プライマーRV、0.5μmol/LのM13プライマーM4および2.5単位のKODポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いて全量50μＬのPCR反応液を調製し、PCRを行った。反応条件は、94℃で5分間加熱した後、94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間のサイクルを25サイクル行い、さらに74℃で5分間加熱した。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、10単位の制限酵素EcoRIおよび10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社製）を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.47kbのEcoRI-SpeI断片を約0.3μg回収した。
【０２８８】
次に、3μgのプラスミドpBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）に、10単位の制限酵素EcoRIおよび10単位の制限酵素SpeIを37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kbのEcoRI-SpeI断片を約2.9μg回収した。
【０２８９】
次に、上記で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHをコードするPCR産物のEcoRI-SpeI断片0.1μgとプラスミドpBluescript II SK(-)のEcoRI-SpeI断片0.1μgとを全量10μLの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２およびDNAシークエンサーを用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第23図に示したプラスミドpKM1334HV0を得た。
【０２９０】
また、参考例２の１．（１）で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.6をコードするDNAを、上記HV.0をコードするDNAと同様にして設計し（配列番号27）、配列番号28〜31に示す配列からなる４本の合成DNA（ジェンセット社製）を用いて、上記と同様にしてPCRにより構築した。pKM1334HV0と同様の過程をとり、HV.6をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334HV6を得た。
【０２９１】
（３）抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLをコードするDNAの構築
参考例２の１．（１）で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV.0をコードするDNAをHV.0をコードするDNAと同様にして設計した（配列番号32）。ただし、合成DNAの設計の際、分泌シグナル配列としては、抗FGF-8中和マウス抗体KM1334のL鎖の分泌シグナル配列（配列番号４の１〜19番目のアミノ酸配列）を用いた。HV.0をコードするDNAと同様にして、それぞれ配列番号33から36の配列からなる4本の合成DNA（ジェンセット社製）を用いたPCRにより、LV.0をコードするDNAを構築した。pKM1334HV0と同様の過程をとり、LV.0をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV0を得た。
【０２９２】
また、参考例２の１．（１）で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV.6をコードするDNAをLV.0をコードするDNAと同様にして設計し（配列番号37）、それぞれ配列番号38から41の配列からなる4本の合成DNA（ジェンセット社製）を用いて上記と同様にしてPCRにより構築した。pKM1334HV0と同様の過程をとり、LV.6をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV6を得た。
【０２９３】
２．抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と参考例２の１．（２）および（３）で得られたプラスミドpKM1334HV0およびpKM1334LV0とを用いて抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターpKANTEX1334HV0LV0を以下の様にして構築した。
【０２９４】
参考例２の１．（２）で得られたプラスミドpKM1334HV0の3μgに、10単位の制限酵素ApaI及び10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.47kbのApaI-NotI断片を約0.3μg回収した。
【０２９５】
次に、ヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の3μgに、10単位の制限酵素ApaI及び10単位の制限酵素NotIを37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約12.8kbのApaI-NotI断片を約2μg回収した。
次に、上記で得られたpKM1334HV0由来のNotI-ApaI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX93由来のNotI-ApaI断片0.1μgとを全量10μLの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、第24図に示したプラスミドpKANTEX1334HV0を得た。
【０２９６】
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV0の3μgに、10単位の制限酵素EcoRI及び10単位の制限酵素BsiWIを37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.45kbのEcoRI-BsiWI断片を約0.3μg回収した。
【０２９７】
次に、上記で得られたプラスミドpKANTEX1334HV0の3μgに、10単位の制限酵素EcoRI及び制限酵素BsiWIを37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.30kbのEcoRI-BsiWI断片を約2μg回収した。
次に、上記で得られたpKM1334LV0由来のEcoRI-BsiWI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1334HV0由来のEcoRI-BsiWI断片0.1μgとを全量10μLの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、第24図に示した発現ベクターpKANTEX1334HV0LV0を得た。
【０２９８】
得られたプラスミドの400ngに対して、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２およびDNAシークエンサーを用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のDNAがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
また、参考例２の１．（２）で得られたプラスミドpKM1334HV0および参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV6を用いて上記と同様の方法により、発現ベクターpKANTEX1334HV0LV6を構築した。
また、参考例２の１．（２）で得られたプラスミドpKM1334HV6および参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV6を用いて上記と同様の方法により、発現ベクターpKANTEX1334HV6LV6を構築した。
【０２９９】
３．抗FGF-8中和CDR移植抗体のYB2/0細胞を用いた安定発現
参考例２の２．で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターpKANTEX1334HV0LV0、pKANTEX1334HV0LV6、pKANTEX1334HV6LV6をそれぞれ用いて各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のYB2/0細胞での安定発現を上記参考例１の２．（５）に記載の方法に従い、行った。
【０３００】
４．抗FGF-8中和CDR移植抗体の精製
参考例２の３．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体を発現するYB2/0細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗FGF-8中和CDR移植抗体の精製を上記参考例１の３．（２）に記載の方法に従い、行った。
pKANTEX1334HV0LV0を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV0、pKANTEX1334HV0LV6を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV6、pKANTEX1334HV6LV6を導入した形質転換株由来の抗体をHV6LV6とそれぞれ名付けた。
【０３０１】
５．精製した抗FGF-8中和CDR移植抗体の解析
参考例２の４．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のSDS-PAGEを上記参考例１の４．に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０３０２】
６．ELISAによる、抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性の測定
参考例２の４．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性は、上記参考例１の２．（６）に記載のELISAにより測定した。陽性対照として、参考例１の３．（２）で得られたYB2/0細胞由来の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3334を用いた。その結果を第25図に示した。第25図に示したように、いずれの抗FGF-8中和CDR移植抗体も、KM3334と同等のFGF-8結合活性を示し、CDR移植化による明らかな結合活性の低下は認められなかった。
【０３０３】
7．抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性の測定
参考例２の４．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性をより詳細に検討するため、BIAcore 2000〔ビアコア（BIACORE）社製〕を用いて各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性を以下のようにして測定、比較した。陽性対照として、参考例１の３．（２）で得られたYB2/0細胞由来の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3334を用いた。
【０３０４】
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはHBS-EP（ビアコア社製）を使用した。まず、センサーチップCM5（ビアコア社製）をセットし、10mmol/L酢酸緩衝液（pH4.0）を用いて31.25μg/mLに溶解したFGF-8（R & D社製）をアミンカップリング法によりセンサーチップ表面に固定化した。共鳴シグナル（RU）を指標とした固定化量は4498RUであった。
【０３０５】
FGF-8固定化フローセルに20μL/分の流速で、各種抗体溶液を60μL添加し、その後、3分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、20μLの10mmol/L Glycine-塩酸溶液（pH1.5）を2回連続してフローセルに添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（50-0.068μg/mL）の抗体溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。各々の抗体のセンサーグラムは、陰性対照としてGD3に対するキメラ抗体KM871（Shitara K. et al., Cancer Immunol. Immunother., 36, 373-380, 1993）を用いて得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。第26図に50μg/mLの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合〔共鳴シグナル（RU）〕の高さを比較することにより、行った。その結果、第26図に示したように、キメラ抗体KM3334が最も高い結合反応を示し、CDR移植抗体HV0LV6は、KM3334と同等の高い結合反応を示した。一方、CDR移植抗体HV0LV0およびHV6LV6は、KM3334およびHV0LV6と比較して若干低い結合反応を示した。以上の結果は、ELISAでは認められなかった抗体間の結合活性の比較がBIAcore 2000を用いることにより可能であること、そして、VLのFRの6アミノ酸残基の改変により、CDR移植抗体の結合活性がキメラ抗体と同等レベルに回復することを示している。また、VHのFRの6アミノ酸残基については、結合活性の回復に対する効果は認められなかった。
【０３０６】
キメラ抗体KM3334と同等の高い結合反応を示したYB2/0細胞由来のCDR移植抗体HV0LV6をKM8037と命名し、また、KM8037を高発現するYB2/0細胞由来の形質転換細胞株も同様にKM8037と命名した。なお、形質転換細胞株KM8037は平成14年6月20日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にFERM BP-8084として寄託されている。
（参考例３）
【０３０７】
より免疫原性の低い抗FGF-8中和CDR移植抗体の作製（１）
参考例２の結果より、VLのFRにマウス抗体KM1334由来の6アミノ酸残基の改変を有する抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV6は、キメラ抗体と同等の結合活性を示すことが明らかとなった。そこで、さらにこれら6残基の活性回復に対する効果を検討し、充分な活性を有し、かつマウス抗体由来のアミノ酸残基の少ない、より免疫原性の低下が期待される抗FGF-8中和CDR移植抗体の作製を以下のようにして行った。
【０３０９】
１．VLのアミノ酸配列の設計
上記の6アミノ酸残基について、以下のような改変を有する6種類のVLのアミノ酸配列を設計した。いずれもLV.0のアミノ酸残基からの改変を示した。
LV.4-1では、2番目のIle、50番目のGln、51番目のLeu、92番目のTyrの4残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるVal、Lys、Val、Pheに改変した。
【０３１０】
LV.4-2では、2番目のIle、14番目のThr、15番目のPro、92番目のTyrの4残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるVal、Ser、Leu、Pheに改変した。
LV.3-1では、2番目のIle、51番目のLeu、92番目のTyrの3残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるVal、Val、Pheに改変した。
【０３１１】
LV.3-2では、14番目のThr、15番目のPro、92番目のTyrの3残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるSer、Leu、Pheに改変した。
LV.2-1では、51番目のLeu、92番目のTyrの2残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるVal、Pheに改変した。
【０３１２】
LV.2-2では、2番目のIle、92番目のTyrの2残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるVal、Pheに改変した。
LV.4-1、LV.4-2、LV.3-1、LV.3-2、LV.2-1、LV.2-2のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号42〜47に示した。
【０３１３】
２．VLをコードするDNAの構築
参考例３の１．で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体の各種VLのアミノ酸配列をコードするDNAは以下のようにして構築した。
（1）LV.4-1をコードするDNAの構築
LV.4-1をコードするDNAは、それぞれ配列番号38、34、40、41の配列からなる4本の合成DNA（ジェンセット社製）を用いて参考例２の１．（３）に記載の方法に従い、構築した。その結果、LV.4-1をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV4-1を得た。
【０３１４】
（2）LV.3-1をコードするDNAの構築
参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV6の50ngを鋳型とし、M13プライマーRVおよび配列番号48の塩基配列からなる合成DNA（ジェンセット社製）をプライマーとして終濃度0.3μmol/Lとなるように加え、KODポリメラーゼに添付の使用説明書に従い、全量50μLでまず94℃で2分間加熱した後、94℃で15秒間、50℃で30秒間、68℃で1分間の条件のサイクルで35サイクルのPCRを行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）および10単位の制限酵素SpeIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.22kbのKpnI-SpeI断片を約0.3μg回収した。
【０３１５】
次に、参考例３の２．（１）で得られたプラスミドpKM1334LV4-1の3μgを10単位の制限酵素KpnIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.21kbのKpnI断片を約0.2μg回収した。
さらに、3μgのプラスミドpBluescript II SK(-)に、10単位の制限酵素KpnIおよび10単位の制限酵素SpeIを37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kbのKpnI-SpeI断片を約2μg回収した。
【０３１６】
上記で得られたVL DNAのKpnI-SpeI断片0.1μg、プラスミドpKM1334LV4-1由来のKpnI断片0.1μg、およびプラスミドpBluescript II SK(-)由来のKpnI-SpeI断片0.1μgを全量10μlの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、第27図に示したLV.3-1をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV3-1を得た。
【０３１７】
（３）LV.2-1をコードするDNAの構築
プラスミドpKM1334LV4-1の代わりに参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV0を用いる以外は、参考例３の２．（１）に記載の方法と同様の方法で、LV.2-1をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV2-1を得た。
【０３１８】
（４）LV.2-2をコードするDNAの構築
プライマーとして配列番号48に記載の合成DNAの代わりに配列番号49に記載の合成DNAを用いる以外は、参考例３の２．（１）に記載の方法と同様の方法で、LV.2-2をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV2-2を得た。
【０３１９】
（５）LV.4-2をコードするDNAの構築
参考例３の２．（４）で得られたプラスミドpKM1334LV2-2の3μgを10単位の制限酵素KpnIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.16kbのKpnI断片を約2μg回収した。
【０３２０】
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV6の3μgを10単位の制限酵素KpnIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.21kbのKpnI断片を約0.2μg回収した。
上記で得られたプラスミドpKM1334LV2-2由来のKpnI断片0.1μgとプラスミドpKM1334LV6由来のKpnI断片0.1μgとを全量10μlの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、第28図に示したLV.4-2をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV4-2を得た。
【０３２１】
（6）LV.3-2をコードするDNAの構築
参考例３の２．（５）で得られたプラスミドpKM1334LV4-2の3μgに、10単位の制限酵素Tth111I（宝酒造社製）およびXmnI（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）を37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.24kbのTth111I-XmnI断片を約2μg回収した。
【０３２２】
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV0の3μgに、10単位の制限酵素Tth111IおよびXmnIを37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.11kbのTth111I-XmnI断片を約1μg回収した。
【０３２３】
上記で得られたプラスミドpKM1334LV4-2由来のTth111I-XmnI断片0.1μgとプラスミドpKM1334LV0由来のTth111I-XmnI断片0.1μgとを全量10μlの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、第29図に示したLV.3-2をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV3-2を得た。
【０３２４】
3．抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターの構築
参考例２の２．で得られた発現ベクターpKANTEX1334HV0LV6のVLをコードするDNAを含むEcoRI-BsiWI断片を参考例３の２．で構築した各種VLをコードするDNAを含むEcoRI-BsiWI断片で置換することにより、各種VLをコードするDNAを有する抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを構築した。具体的には、pKANTEX1334HV0LV4-1、pKANTEX1334HV0LV4-2、pKANTEX1334HV0LV3-1、pKANTEX1334HV0LV3-2、pKANTEX1334HV0LV2-1、pKANTEX1334HV0LV2-2の6種類を構築した。
【０３２５】
4．抗FGF-8中和CDR移植抗体のCHO/DG44細胞を用いた安定発現
参考例２の２．で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターpKANTEX1334HV0LV0およびpKANTEX1334HV0LV6、参考例３の３．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを用いて各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のCHO/DG44細胞での安定発現を上記参考例１の２．（４）に記載の方法に従い、行った。
【０３２６】
5．抗FGF-8中和CDR移植抗体の精製
参考例３の4項で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体を発現するCHO/DG44細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗FGF-8中和CDR移植抗体の精製を上記参考例１の３．（１）に記載の方法に従い、行った。pKANTEX1334HV0LV0を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV0/CHO、pKANTEX1334HV0LV6を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV6/CHO、pKANTEX1334HV0LV4-1を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV4-1/CHO、pKANTEX1334HV0LV4-2を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV4-2/CHO、pKANTEX1334HV0LV3-1を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV3-1/CHO、pKANTEX1334HV0LV3-2を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV3-2/CHO、pKANTEX1334HV0LV2-1を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV2-1/CHO、pKANTEX1334HV0LV2-2を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV2-2/CHOと名付けた。
【０３２７】
６．精製した抗FGF-8中和CDR移植抗体の解析
参考例３の５．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のSDS-PAGEを上記参考例１の４．に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０３２８】
７．BIAcoreバイオセンサーによる、抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性の測定
参考例３の５．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性をより詳細に検討するため、BIAcore 2000を用いて各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性を、FGF-8の部分ペプチドである化合物１のＣ末端をビオチン標識したものを用いて、以下のようにして測定、比較した。陽性対照として、参考例１の３．（１）で得られたCHO/DG44細胞由来の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034を用いた。
【０３２９】
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはHBS-EPを使用した。まず、センサーチップSA（ビアコア社製）をセットし、5μL/minの流速で0.05μg/mLに調製したC末端ビオチン標識化合物１を5μL添加した。その後、5μLの10mmol/L グリシン-塩酸溶液（pH1.5）を２回連続して添加し、チップ表面を洗浄した。FGF-8ペプチドの固定化量は35RUであった。
【０３３０】
FGF-8ペプチド固定化フローセルに20μL/分の流速で、各種抗体溶液を60μL添加し、その後、3分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、20μLの10mmol/Lグリシン-塩酸溶液（pH1.5）を２回連続して添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（50-1.85μg/mL）の抗体溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。各々の抗体のセンサーグラムは、陰性対照としてGD3に対するキメラ抗体KM871を用いて得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。
【０３３１】
第30図に16.7μg/mLの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合〔共鳴シグナル（RU）〕の高さを比較することにより、行った。
【０３３２】
その結果、第30図に示したように、キメラ抗体KM3034およびHV0LV6/CHOが最も高い結合反応を示し、次いで、HV0LV3-1/CHO、HV0LV4-1/CHO、HV0LV2-1/CHOが高い結合反応を示した。一方、HV0LV3-2/CHO、HV0LV2-2/CHO、HV0LV4-2は、低い結合反応を示し、HV0LV0/CHOは、最も低い結合反応を示した。これらの結果は、参考例２の７．に記載のYB2/0細胞由来の抗FGF-8中和CDR移植抗体を用いた結果と一致していた。
【０３３４】
８．抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する中和活性の測定
参考例3の7項においてFGF-8に対する高い結合反応が確認された4種類の抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0HV0LV6/CHO、HV0LV3-1/CHO、HV0LV4-1/CHO、HV0LV2-1/CHOのFGF-8中和活性の評価を参考例2の5項に記載の方法に従って、行った。陽性対照として、参考例1の3項（1）で得られたCHO/DG44細胞由来の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034を、陰性対照として、WO01/64754に記載のヒトケモカインCCR4に対するキメラ抗体KM2760を用いた。その結果を第31図に示した。第31図に示したように、HV0LV6/CHOは、キメラ抗体KM3034と同等のFGF-8中和活性を示し、次いで、HV0LV3-1/CHOが高いFGF-8中和活性を示した。HV0LV4-1/CHOは、HV0LV3-1/CHOに比べて若干低いFGF-8中和活性を示し、HV0LV2-1/CHOの中和活性が最も低かった。FGF-8中和活性の強さと、BIAcoreによる結合反応の強さとの間には相関が認められた。
（参考例４）
【０３３５】
より免疫原性の低い抗FGF-8中和CDR移植抗体の作製（２）
参考例３の結果より、LV6の6アミノ酸残基の改変のうち、51番目の改変は活性回復に必須であることが明らかとなった。また、2番目の改変は、単独の改変では、活性回復に対する効果は小さいが51番目の改変との組合せにより、協調的に活性回復に寄与することが示唆された。14番目、15番目の改変についても、51番目の改変との組合せにより、協調的に活性回復に寄与することが示唆された。一方、50番目の改変の効果は小さいことが示唆された。そこで、2番目の改変と14番目、15番目の改変のどちらがより活性回復に対する効果が高いかを検討するため、また、92番目の改変の効果を検討するため、抗FGF-8中和CDR移植抗体の作製を再検討した。
【０３３６】
１．VLのアミノ酸配列の再設計
以下のような改変を有する２種類のVLのアミノ酸配列を設計した。いずれもLV.0のアミノ酸残基からの改変を示した。
LV.4-3では、14番目のThr、15番目のPro、51番目のLeu、92番目のTyrの4残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるSer、Leu、Val、Pheに改変した。
【０３３７】
LV.3-3では、14番目のThr、15番目のPro、51番目のLeuの3残基をそれぞれマウス抗体KM1334に見られるアミノ酸残基であるSer、Leu、Valに改変した。
LV.4-3のアミノ酸配列を配列番号50に、LV.3-3のアミノ酸配列を配列番号51にそれぞれ示した。
【０３３８】
２．VLをコードするDNAの構築
参考例４の１．で設計した抗FGF-8中和CDR移植抗体の各種VLのアミノ酸配列をコードするDNAは以下のようにして構築した。
（１）LV.4-3をコードするDNAの構築
参考例３の２．（５）に記載の方法に従い、構築した。ただし、プラスミドpKM1334LV2-2の代わりに参考例３の２．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV2-1を用い、プラスミドpKM1334LV6の代わりに参考例３の２．（６）で得られたプラスミドpKM1334LV3-2を用いた。その結果、LV.4-3をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV4-3を得た。
【０３３９】
（２）LV.3-3をコードするDNAの構築
参考例４の２．（１）で得られたプラスミドpKM1334LV4-3の3μgを10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）及び10単位の制限酵素SpeIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.23kbのBamHI-SpeI断片を約2.5μg回収した。
【０３４０】
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドpKM1334LV0の3μgを10単位の制限酵素BamHI及び10単位の制限酵素SpeIを用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.13kbのBamHI-SpeI断片を約0.15μg回収した。
【０３４１】
上記で得られたプラスミドpKM1334LV4-3由来のBamHI-SpeI断片0.1μgとプラスミドpKM1334LV0由来のBamHI-SpeI断片0.1μgを全量10μlの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、第32図に示したLV.3-3をコードするDNAを含むプラスミドpKM1334LV3-3を得た。
【０３４２】
３．抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターの構築
参考例２の２．で得られた発現ベクターpKANTEX1334HV0LV6のVLをコードするDNAを含むEcoRI-BsiWI断片を参考例４の２．で構築した各種VLをコードするDNAを含むEcoRI-BsiWI断片で置換することにより、各種VLをコードするDNAを有する抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを構築した。具体的には、pKANTEX1334HV0LV4-3、pKANTEX1334HV0LV3-3の2種類を構築した。
【０３４３】
４．抗FGF-8中和CDR移植抗体のCHO/DG44細胞を用いた安定発現
参考例４の３．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体発現ベクターを用いて各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のCHO/DG44細胞での安定発現を上記参考例１の２．（４）に記載の方法に従い、行った。
【０３４４】
5．抗FGF-8中和CDR移植抗体の精製
参考例４の４．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体を発現するCHO/DG44細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗FGF-8中和CDR移植抗体の精製を上記参考例１の３．（１）に記載の方法に従い、行った。pKANTEX1334HV0LV4-3を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV4-3/CHO、pKANTEX1334HV0LV3-3を導入した形質転換株由来の抗体をHV0LV3-3/CHOと名付けた。
【０３４５】
６．精製した抗FGF-8中和CDR移植抗体の解析
参考例４の５．で得られた各種抗FGF-8中和CDR移植抗体のSDS-PAGEを上記参考例１の４．に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０３４６】
７．抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する結合活性の測定
参考例３の５．で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV6/CHOおよびHV0LV3-1/CHO、参考例４の５．で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV4-3/CHOおよびHV0LV3-3/CHOのFGF-8に対する結合活性を参考例３の７．に記載の方法に従い、測定した。陽性対照として、参考例１の３．（１）で得られたCHO/DG44細胞由来の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034を用いた。
【０３４７】
第33図に16.7μg/mLの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合〔共鳴シグナル（RU）〕の高さを比較することにより、行った。その結果、第33図に示したように、キメラ抗体KM3034が最も高い結合反応を示し、HV0LV4-3/CHOは、HV0LV3-1/CHOよりも高く、HV0LV6/CHOと同等の結合反応を示した。HV0LV3-3/CHOの結合反応は、HV0LV3-1よりも低かった。以上の結果より、結合反応の高さに関しては、2番目の改変よりも、14番目、15番目の改変の方がより協調的に働くこと、また、92番目の改変は、活性の回復に必須であることが示唆された。
【０３４８】
８．抗FGF-8中和CDR移植抗体のFGF-8に対する中和活性の測定
参考例３の５．で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV6/CHOおよびHV0LV3-1/CHO、参考例４の５．で得られた抗FGF-8中和CDR移植抗体HV0LV4-3/CHOおよびHV0LV3-3/CHOのFGF-8中和活性の評価を参考例２の５．に記載の方法に従って、行った。陽性対照として、参考例１の３．（１）で得られたCHO/DG44細胞由来の抗FGF-8中和キメラ抗体KM3034を、陰性対照として、WO01/64754に記載のヒトケモカインCCR4に対するキメラ抗体KM2760を用いた。その結果を第34図に示した。第34図に示したように、HV0LV6/CHOおよびHV0LV3-1/CHOは、キメラ抗体KM3034と同等のFGF-8中和活性を示した。一方、HV0LV4-3/CHOおよびHV0LV3-3/CHOは、同等の中和活性を示し、その活性はキメラ抗体KM3034に比べて1/2程度であった。HV0LV3-1/CHOとHV0LV4-3/CHOの中和活性は、BIAcoreでの結合反応の高さと相関せず、2番目のアミノ酸残基と14番目、15番目のアミノ酸残基は、FGF-8に対する結合活性と細胞に対するFGF-8中和活性において独立した影響を与えることが示唆された。
【０３４９】
以上の各種評価結果より、キメラ抗体KM3034と同等の高い結合反応およびFGF-8中和活性を示したCHO/DG44細胞由来のCDR移植抗体HV0LV6/CHOをKM8034と命名し、また、KM8034を高発現するCHO/DG44細胞由来の形質転換細胞クローンも同様にKM8034と命名した。また、KM8034と同等の高い結合反応を示したCHO/DG44細胞由来のCDR移植抗体HV0LV4-3/CHOをKM8035と命名し、また、KM8035を高発現するCHO/DG44細胞由来の形質転換細胞株も同様にKM8035と命名した。KM8035のVLのアミノ酸配列LV.4-3を配列番号38に示した。なお、形質転換細胞株KM8035は平成14年6月20日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にFERM BP-8082として寄託されている。また、KM8034と同等の高いFGF-8中和活性を示したCHO/DG44細胞由来のCDR移植抗体HV0LV3-1/CHOをKM8036と命名し、また、KM8036を高発現するCHO/DG44細胞由来の形質転換細胞株も同様にKM8036と命名した。KM8036のVLのアミノ酸配列LV.3-1を配列番号39に示した。なお、形質転換細胞株KM8036は平成14年6月20日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にFERM BP-8083として寄託されている。
【０３５０】
抗FGF-8中和CDR移植抗体KM8034は、キメラ抗体KM3034と同等の高い結合反応およびFGF-8中和活性を示し、かつ、ヒトにおける免疫原性がキメラ抗体よりも低下することから、キメラ抗体よりも高い治療効果が期待される。抗FGF-8中和CDR移植抗体KM8036およびKM8035では、KM8034に比べて、結合活性およびFGF-8中和活性が若干低下する可能性があるが、それぞれマウス抗体KM1334に由来するV領域FRのアミノ酸残基が3残基および4残基となることから、KM8034よりもさらに免疫原性が低下することが期待される。
【０３５６】
【産業上の利用可能性】
本発明により、抗FGF-8中和抗体を有効成分として含有する、関節炎の予防薬または治療薬、軟骨保護剤、関節破壊抑制剤、滑膜増殖抑制剤、および抗FGF-8抗体を有効成分として含有する関節炎の診断薬ならびに該抗体を用いた関節炎の判定方法が提供される。
【０３５７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号13−KM1334のVHの増幅のためのプライマー
配列番号14−KM1334のVHの増幅のためのプライマー
配列番号15−KM1334のVLの増幅のためのプライマー
配列番号16−KM1334のVLの増幅のためのプライマー
配列番号17−Ｃ末にシステイン残基を付加したヒトFGF-8のペプチド（23〜46番目のアミノ酸残基）
配列番号18−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列、HV.0
配列番号19−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.0
配列番号20−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列、HV.6
配列番号21−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.6
配列番号22−HV.0をコードするDNA
配列番号23−HV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号24−HV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号25−HV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号26−HV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号27−HV.6をコードするDNA
配列番号28−HV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号29−HV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号30−HV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号31−HV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号32−LV.0をコードするDNA
配列番号33−LV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号34−LV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号35−LV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号36−LV.0をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号37−LV.6をコードするDNA
配列番号38−LV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号39−LV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号40−LV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号41−LV.6をコードするDNAの構築のためのの合成DNA
配列番号42−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.4-1
配列番号43−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.4-2
配列番号44−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.3-1
配列番号45−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.3-2
配列番号46−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.2-1
配列番号47−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.2-2
配列番号48−LV.3-1をコードするDNAの構築のためののプライマー
配列番号49−LV.2-2をコードするDNAの構築のためののプライマー
配列番号50−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.4-3
配列番号51−設計された抗FGF-8中和CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列、LV.3-3
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８による細胞外マトリックスの分解作用を示す図である。縦軸は細胞外マトリックス中に残ったグリコサミノグリカンの量を、横軸はＦＧＦ−８の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第２図  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８による細胞外マトリックスの分解に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は細胞外マトリックス中に残ったグリコサミノグリカンの量を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１（０群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第３図  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８によるマトリックスメタロプロテイナーゼ−３産生の促進と抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４による阻害作用を示す図である。縦軸は培養液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の量（ｎｇ／ウェル）を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃はＰ＜０．０１（無刺激群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１（０群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第４図  ウサギ滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進作用を示す図である。縦軸はウサギ滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＦＧＦ−８の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５（無刺激群対比、Ｓｔｅｅｌ検定）を表す。
第５図  ウサギ滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はウサギ滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１（０群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第６図  ヒト滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進作用を示す図である。縦軸はヒト滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＦＧＦ−８の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第７図  ヒト滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はヒト滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（０群対比、Ｓｔｅｅｌ検定）を表す。
第８図  ＦＧＦ−８の注入による関節の細胞外マトリックスの分解を示す図である。縦軸は関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液注入群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第９図  ＦＧＦ−８の注入による関節の膝蓋骨の破壊を示す図である。縦軸は膝蓋骨重量（ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液注入群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１０図  コラーゲン関節炎発症マウスにおける関節炎スコアの経時変化に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は関節炎スコアを、横軸はコラーゲン初回感作日からの経過日数を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液投与群対比、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を表し、＃はＰ＜０．０５（溶媒投与群対比、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を表す。
第１１図  アジュバント関節炎発症ラットにおけるアジュバント非処置足の足容積増加に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は足容積（ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１２図  アジュバント関節炎発症ラットにおけるアジュバント非処置足の足容積増加に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸は足容積（ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１（溶媒投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、††はＰ＜０．０１、†††はＰ＜０．００１（溶媒投与群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表す。
第１３図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のグルコサミノグリカン量上昇に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はグルコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度比（μｇ／ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１４図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のグルコサミノグリカン量上昇に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸はグルコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度比（μｇ／ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃はＰ＜０．０１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（溶媒投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１５図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のデオキシピリジノリン量上昇に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はデオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度比（ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１６図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のデオキシピリジノリン量上昇に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸はデオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度比（ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１（溶媒投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１７図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のヒドロキシプロリン量上昇に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はヒドロキシプロリン濃度／クレアチニン濃度比（μｇ／ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１８図  モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルラットにおける関節軟骨破壊に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃はＰ＜０．０１（偽手術群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液投与群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表す。
第１９図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５の造成工程を示した図である。
第２０図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４の造成工程を示した図である。
第２１図  プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の造成工程を示した図である。
第２２図  抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４のマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ１３３４、□がＫＭ３０３４、△がＫＭ３３３４、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
第２３図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０の造成工程を示した図である。
第２４図  プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第２５図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３３３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ６のＦＧＦ−８に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）を示す。△がＫＭ３３３４、○がＨＶ０ＬＶ０、□がＨＶ０ＬＶ６、×がＨＶ６ＬＶ６の活性を示す。
第２６図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３３３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ６のＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第２７図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−１の造成工程を示した図である。
第２８図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２の造成工程を示した図である。
第２９図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２の造成工程を示した図である。
第３０図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第３１図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯのマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ３０３４、●がＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、◇がＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、△がＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、□がＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
第３２図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−３の造成工程を示した図である。
第３３図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第３４図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ３０３４、●がＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、△がＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、▲がＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、■がＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯ、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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