(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性タンパク質含有試料中の酸化エチレン系非イオン界面活性剤の定量方法であって、該試料溶液にチオシアン酸アンモニウム・硝酸コバルト試薬（ＣｏＳＣＮ試薬）を添加し、生成したチオシアン酸コバルト錯体を３２０ｎｍの波長における吸光度測定により定量することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
以下の段階を含んでなる請求項１記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
２）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
３）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を３２０ｎｍの波長における吸光度測定により定量する、そして
４）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
【請求項３】
生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させ、該沈殿を除去した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する請求項１記載の方法。
【請求項４】
以下の段階を含んでなる請求項３記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させる、
２）該沈殿を除去した試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
３）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
４）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を３２０ｎｍの波長における吸光度測定により定量する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
【請求項５】
水系有機溶媒がアセトンである請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
沈殿の除去を濾過又は遠心分離により行う請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生理活性タンパク質含有試料にタンパク質分解酵素を添加して生理活性タンパク質を分解した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含んでなる請求項７記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料にタンパク質分解酵素を添加して生理活性タンパク質を分解する、
２）１）で得られる試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
３）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
４）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を３２０ｎｍの波長における吸光度測定により定量する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
【請求項９】
タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫである請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
生理活性タンパク質含有試料に含まれるタンパク質と同濃度のタンパク質を標準液に添加して、標準曲線を作成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含んでなる請求項１０記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
２）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
３）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を３２０ｎｍの波長における吸光度測定により定量する、
４）生理活性タンパク質含有試料に含まれるタンパク質と同濃度のタンパク質を標準液に添加して、標準曲線を作成し、該標準曲線に基づいて試料中のチオシアン酸コバルト錯体量を補正する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
【請求項１２】
酸化エチレン系非イオン界面活性剤がポリソルベート及び／又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ポリソルベートがポリソルベート２０及び／又は８０である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
非水系有機溶媒がジクロロメタンである請求項２、４〜６、８、９、１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＣｏＳＣＮ試薬の添加時に塩を添加して測定する請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
塩が塩化カリウム又は塩化ナトリウムである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
生理活性タンパク質含有試料が濃縮タンパク質製剤である請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
生理活性タンパク質含有試料中のタンパク質が８μｇ/ml以上である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
生理活性タンパク質が造血因子タンパク質である請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
生理活性タンパク質がエリスロポエチンである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
生理活性タンパク質が抗体である請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はタンパク質含有製剤などのタンパク質含有試料中のポリソルベート等の酸化エチレン系非イオン界面活性剤の定量方法に関する。
背景技術
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。これらの製剤は安定性を確保するため、凍結乾燥したタンパク質成分粉末とこれを溶解するための水溶性希釈液とを別途包装し、使用時に溶解する形態で提供されるか、あるいは安定性を向上させるための添加剤を加えたタンパク質溶液製剤の形で提供されている。
このようなタンパク質含有製剤において、タンパク質の容器への吸着防止や安定化を目的として非イオン性の界面活性剤であるポリソルベートが含まれている場合がある。例えば、安定化剤としてポリソルベートを含む顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）製剤が開示されている（特開昭６３−１４６８２６号）。
ポリソルベートは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、脂肪酸エステル種により２０（モノラウレート）、４０（モノパルミテート）、６０（モノステアレート）、８０（モノオレエート）などがあるが、いずれも酸化エチレンが約２０モルからなるポリマーが結合している。ポリソルベート２０を例にとって製造方法を以下に示す。
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すなわち、ソルビトールを分子内脱水してソルビタン（２，６型と１，４型）をつくり、さらにこれをＮａＯＨを触媒としてラウリル酸と反応させ脂肪酸エステルとし、これを酸化エチレン処理して得たものである。ソルビタンモノラウレート１モルに対して約２０モルの酸化エチレンが結合しており、分子は単一の構造ではない。エリスロポエチン（ＥＰＯ）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などのタンパク質を含有する製剤で最も好ましく使用されているのはポリソルベート２０及び８０である。
タンパク質製剤に添加するポリソルベートの添加量は、一般には０．００１〜３％と微量であり、タンパク質製剤の品質管理のためには、このような微量のポリソルベートの確認、定量法を設定する必要がある。また、現在ＥＰＯ製剤に使用されているポリソルベート８０は濃度が低すぎると吸着防止効果が薄れ、逆に濃度が高すぎるとタンパク質の分解を促進することからタンパク質製剤中のポリソルベートの量を正確に測定することが求められている。
ポリソルベートの定量法としては、以下に示す方法が考えられる。
１）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法：ポリ酸化エチレンのアルキルエーテルを１−アンスロイルニトリルを用いて蛍光ラベル化後、逆相カラムにて分析する（Ｍ．Ｋｕｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｏｒｏｍａｔｏｇｒ．，６１：５８１，１９８４）。その他、２２０ｎｍの低波長域で検出し、直接逆相系カラム（ＲＰ−１８）（Ｎ．Ｇａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６０：１１５１，１９８３）又は順相系カラム（Ｎ．Ｇａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４：１１７３，１９８１）で分析する。
２）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法：酸化加水分解して脂肪酸としメチルエステルに変換後分析する（Ｃ．Ｎ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６１：５８１，１９８３）。あるいは臭化水素酸を作用させ、生成した１，２−ジブロモエタンを分析する（田中久ら、水質汚濁研究、７：２９４，１９８４）。
３）Ｗｉｃｋｂｏｌｄ法：泡沫濃縮後ドラーゲンドルフ試薬を加えて沈殿させ、溶解後ピロリジンジチオカルバメートにより電位差測定を行う（Ｒ．Ｗｉｃｋｂｏｌｄ，Ｔｅｎｓｉｄｅ  Ｄｅｔｅｒｇ．，９：１７３，１９７２など）。
４）フレームレス原子吸光法：ポリソルベートとチオシアン酸コバルト−アンモニウムの複合錯体中のコバルトを原子吸光法で分析する（Ａ．Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｉｓｅｉ  Ｋａｇａｋｕ，２９：１２３，１９８３など）。
５）比色法：ポリソルベートの酸化エチレン部分とチオシアン酸コバルト−アンモニウムで形成する複合錯体を吸光度（最大波長）で測定する（Ｒ．Ａ．Ｇｒｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，４２：１８０，１９６５など）。また、同様にチオシアン酸鉄（ＩＩＩ）との錯体を用いる方法（村井省二：分析化学、３３：Ｔ１８，１９８４）や、ポリソルベートにカリウムイオンを配位させ、これとピクリン酸イオンからなるイオン対をジクロロエタンで抽出し比色定量する方法（Ｌ．Ｆａｖｒｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１４：２０１，１９８３）がある。
これらの方法の中で、感度、操作性に優れ、特殊な装置、試薬を必要とせず、さらに最も汎用性があり、日局方のポリソルベート８０の確認試験（第１２改正日本薬局方解説書、Ｂ−６３９（ポリソルベート２０）、Ｄ−８９１（ポリソルベート８０）、広川書店）やＢｒｉｔｉｓｈ  ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｎｉａ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｎｉａ  １９８８，Ｖｏｌ．１，４４９，Ｌｏｎｄｏｎ  Ｈｅｒ  Ｍａｊｅｓｔｙ’ｓ  Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆｆｉｃｅ）のポリソルベート２０の確認試験として記載されているチオシアン酸コバルト錯体を用いる比色定量が薬剤中に含まれるポリソルベートの定量法として優れていると考えられている。すなわち、試料水溶液にチオシアン酸アンモニウム・硝酸コバルト試薬を加えて、さらにクロロホルム、ジクロロメタンなどの有機溶媒を加えて振り混ぜ、有機溶媒層に移行したチオシアン酸コバルト錯体を比色定量する。
しかし、同様の方法でタンパク質を含有する溶液を試験すると、水層と有機溶媒層の間にタンパク質の凝集物が生成する場合があり、このためポリソルベートの抽出率を下げてしまい、その結果正確な定量ができなくなることが問題であった。
そこで、タンパク質を含有する溶液試料においても、これに含まれるポリソルベートを簡便かつ正確に測定する方法が求められている。
発明の開示
本発明者らは、タンパク質含有試料中に含まれるポリソルベートなどの酸化エチレン系非イオン界面活性剤を定量するときに、生成したチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定することにより上記目的を達成できることを発見して本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）生理活性タンパク質含有試料中の酸化エチレン系非イオン界面活性剤の定量方法であって、チオシアン酸アンモニウム・硝酸コバルト試薬（ＣｏＳＣＮ試薬）を用いる比色定量法によって定量することを特徴とする方法。
（２）生理活性タンパク質含有試料中の酸化エチレン系非イオン界面活性剤の定量方法であって、該試料溶液にチオシアン酸アンモニウム・硝酸コバルト試薬（ＣｏＳＣＮ試薬）を添加し、生成したチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量することを特徴とする前記（１）記載の方法。
（３）以下の段階を含んでなる前記（２）記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
２）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
３）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、そして
４）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
（４）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させ、該沈殿を除去した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する前記（２）記載の方法。
（５）以下の段階を含んでなる前記（４）記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させる、
２）該沈殿を除去した試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
３）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
４）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
（６）水系有機溶媒がアセトンである前記（４）又は（５）記載の方法。
（７）沈殿の除去を濾過又は遠心分離により行う前記（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）生理活性タンパク質含有試料にタンパク質分解酵素を添加して生理活性タンパク質を分解した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加することを特徴とする前記（２）記載の方法。
（９）以下の段階を含んでなる前記（８）記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料にタンパク質分解酵素を添加して生理活性タンパク質を分解する、
２）１）で得られる試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
３）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
４）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
（１０）タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫである前記（８）又は（９）記載の方法。
（１１）生理活性タンパク質含有試料に含まれるタンパク質と同濃度のタンパク質を標準液に添加して、標準曲線を作成することを特徴とする前記（１）又は（２）記載の方法。
（１２）以下の段階を含んでなる前記（１１）記載の方法：
１）生理活性タンパク質含有試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
２）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
３）得られる非水系有機溶媒層を取り、チオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、
４）生理活性タンパク質含有試料に含まれるタンパク質と同濃度のタンパク質を標準液に添加して、標準曲線を作成し、該標準曲線に基づいて試料中のチオシアン酸コバルト錯体量を補正する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
（１３）酸化エチレン系非イオン界面活性剤がポリソルベート及び／又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールである前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）ポリソルベートがポリソルベート２０及び／又は８０である前記（１３）記載の方法。
（１５）非水系有機溶媒がジクロロメタンである前記（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）ＣｏＳＣＮ試薬の添加時に塩を添加して測定する前記（２）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）塩が塩化カリウム又は塩化ナトリウムである前記（１６）記載の方法。
（１８）生理活性タンパク質含有試料が濃縮タンパク質製剤である前記（１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）生理活性タンパク質含有試料中のタンパク質が８μｇ／ｍｌ以上である前記（１８）記載の方法。
（２０）生理活性タンパク質が造血因子タンパク質である前記（１）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）生理活性タンパク質がエリスロポエチンである前記（２０）記載の方法。
（２２）生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記（２０）記載の方法。
（２３）生理活性タンパク質が抗体である前記（１）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２４）生理活性タンパク質含有試料に比色定量試薬を添加し、比色定量試薬と生理活性タンパク質含有試料中の添加剤との間で形成される生成物を吸光度測定により定量する、生理活性タンパク質含有試料中の添加剤の定量方法であって、以下のいずれかの工程を含む上記方法：
Ａ）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させ、該沈殿を除去した後の試料に比色定量試薬を添加する、
Ｂ）タンパク質分解酵素を添加して、試料中のタンパク質を分解した後に比色定量試薬を添加する、または
Ｃ）試料中に含まれるのと同種類のタンパク質を同量、標準液中に添加して、標準曲線を作成する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法で測定する酸化エチレン系非イオン界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルなどを含み、ポリソルベート及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールが好ましい。ポリソルベートはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５などを含み、ポリソルベート２０及び／又は８０が好ましい。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールとしては、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）などが挙げられる。
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料中の酸化エチレン系非イオン界面活性剤を比色定量法によって定量する。本発明で好ましい比色定量法には、肉眼による着色観察、分光光度計による測定を含み、好ましくは分光光度計によって吸光度を測定することによって定量する。
本発明の好ましい態様では、生理活性タンパク質含有試料溶液にチオシアン酸アンモニウム・硝酸コバルト試薬（ＣｏＳＣＮ試薬）を添加し、生成したチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量することによって、生理活性タンパク質含有試料中の酸化エチレン系非イオン界面活性剤を定量する。
本発明の好ましい態様では、本発明の方法は以下の段階を含んでなる：
１）生理活性タンパク質含有試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
２）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
３）得られる非水系有機溶媒層を取り、これに含まれるチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、そして
４）チオシアン酸コバルト錯体の量から酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を算出する。
本発明の方法では、まず水溶性の生理活性タンパク質含有試料にチオシアン酸アンモニウム・硝酸コバルト試薬（ＣｏＳＣＮ試薬）を添加する。
ＣｏＳＣＮ試薬は、チオシアン酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＣＮ）と硝酸コバルト（Ｃｏ（ＮＯ３）２／６Ｈ２Ｏ）を水に溶解して調製する。例えば、チオシアン酸アンモニウム１７．４ｇと硝酸コバルト２．８ｇを水に溶解して１００ｍｌとする。
次いで、これに非水系有機溶媒を加えて振とうし、非水系有機溶媒層を取る。ＣｏＳＣＮ試薬と酸化エチレン系非イオン界面活性剤の酸化エチレンとで形成されるチオシアン酸コバルト錯体（青色）は非水系有機溶媒に移行する。非水系有機溶媒の添加量によるチオシアン酸コバルト錯体の非水系有機溶媒層への分配率には変化がなかったので、吸光度測定に好ましい濃度が得られるように非水系有機溶媒の量を適宜設定することができる。
チオシアン酸コバルト錯体の抽出に用いる非水系有機溶媒はジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、トルエン、ベンゼンを含み、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンが好ましく、ジクロロメタンが最も好ましい。これらの有機溶媒は分液ロート中で水を加えて混合分離し、水飽和としたものを用いるのが好ましい。水飽和ジクロロメタンを用いるのが最も好ましい。
非水系有機溶媒による抽出時に塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの塩を添加すると塩析効果により抽出効果を高めることが観察された。塩の添加量は生理活性タンパク質含有試料に対して５％以上、好ましくは１０〜５０％である。
測定は酸化エチレン系非イオン界面活性剤（例えばポリソルベート）標準液を調製して検量線を作成し、同様にチオシアン酸コバルト錯体を測定し、これから生理活性タンパク質含有試料中の酸化エチレン系非イオン界面活性剤の量を定量することにより行うことができる。
本発明の測定原理は、ＣｏＳＣＮ試薬と酸化エチレンとで形成する青色の複合錯体（チオシアン酸コバルト錯体）を非水系有機溶媒層、好ましくはジクロロメタン層に抽出し、これを吸光度測定法で測定する。吸収スペクトルは３２０ｎｍ及び６２０ｎｍ付近に吸収極大を示す。定量はより吸光度の大きい３２０ｎｍ付近の吸光度を測定することにより分光光度計（例えば、ＤＵ６４０：ＢＥＣＫＭＡＮ）で実施できる。
本発明の方法では、生理活性タンパク質の種類などによっては、水層と有機溶媒層の間にタンパク質の凝集体が形成されて、このために酸化エチレン系非イオン界面活性剤の抽出率を下げる場合がある。本発明では、以下のいずれかの方法によりこの問題を解決することができた：
Ａ）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させ、該沈殿を除去した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
Ｂ）タンパク質分解酵素を添加して、試料中のタンパク質を分解した後にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、または
Ｃ）試料中に含まれるのと同種類のタンパク質を同量、標準液中に添加して、標準曲線を作成する。
各態様について以下に詳しく説明するが、以下の説明では酸化エチレン系非イオン界面活性剤としてポリソルベートを用いた態様で説明する。
Ａ）の態様
本発明の好ましい態様では、生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させ、該沈殿を除去した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する。
本発明の好ましい態様では、本発明の方法は以下の段階を含んでなる：
１）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させる、
２）該沈殿を除去する、
３）該沈殿を除去した試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
４）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
５）得られる非水系有機溶媒層を取り、これに含まれるチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、そして
６）チオシアン酸コバルト錯体の量からポリソルベートの量を算出する。
水系有機溶媒はアセトン、エーテル、アルコールであることが好ましく、特にアセトンが好ましい。水系有機溶媒の添加量は、試料１ｍｌに対して１ｍｌ以上が好ましく、さらに好ましくは１．５ｍｌ以上である。さらに、除去した沈殿を１〜５回繰り返し水系有機溶媒で洗浄したポリソルベートを抽出することが好ましい。
水系有機溶媒の添加により形成される生理活性タンパク質の沈殿の除去にあたっては、水系有機溶媒が生理活性タンパク質に結合したポリソルベートを充分に抽出できること、吸光度比が高いこと、操作性がよいこと、誤差が少なく、再現性のよいことなどを基準に沈殿除去法を選択する。濾過法又は遠心分離法が好ましく、遠心分離法がさらに好ましい。
Ｂ）の態様
本発明の別の好ましい態様では、生理活性タンパク質含有試料にタンパク質分解酵素を添加して生理活性タンパク質を分解した後の試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加することを特徴とする。
従って、本発明の好ましい態様では、以下の段階を含んでなる：
１）生理活性タンパク質含有試料にタンパク質分解酵素を添加して生理活性タンパク質を分解する、
２）１）で得られる試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
３）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
４）得られる非水系有機溶媒層を取り、これに含まれるチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量からポリソルベートの量を算出する。
タンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫ、ペプシン、パンクレアチンなどを含み、プロテイナーゼＫであることが好ましい。タンパク質分解酵素の添加量は試料中に含まれるタンパク質の量に依存して適宜決定することができる。
Ｃ）の態様
本発明の別の好ましい態様では、生理活性タンパク質含有試料に含まれるタンパク質と同濃度のタンパク質を標準液に添加して、標準曲線を作成することを特徴とする。
従って、本発明の好ましい態様では、以下の段階を含んでなる：
１）生理活性タンパク質含有試料にＣｏＳＣＮ試薬を添加する、
２）非水系有機溶媒を加えて振とうする、
３）得られる非水系有機溶媒層を取り、これに含まれるチオシアン酸コバルト錯体を吸光度測定により定量する、
４）生理活性タンパク質含有試料に含まれるタンパク質と同濃度のタンパク質を標準液に添加して、標準曲線を作成し、該標準曲線に基づいて、３）により得られた生理活性タンパク質含有試料中のチオシアン酸コバルト錯体量を補正する、そして
５）チオシアン酸コバルト錯体の量からポリソルベートの量を算出する。
本発明の方法は、生理活性タンパク質含有試料が、濃縮タンパク質製剤であるときに好ましく、特に、生理活性タンパク質含有試料中のタンパク質が８μｇ／ｍｌ以上であるときに好ましい。
本発明の方法で測定する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン等の造血因子及びモノクロナール抗体が好ましく、さらに好ましくはＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及びモノクローナル抗体である。
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質としては、特に糖鎖を有するタンパク質が好ましい。糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
生理活性タンパク質が抗体であるときは、抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。あるいは再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：１−６，１９９３）。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
本発明の方法で測定する生理活性タンパク質含有試料には安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を含んでいてもよいが、実質的に含まない方が好ましい。しかし、これらのタンパク質を安定化剤として含んでいる場合であっても、本発明の方法により、特に上述したＣ）の態様を用いることにより、適切にポリソルベートの定量が可能である。すなわち、例えばヒト血清アルブミンを生理活性タンパク質含有試料に安定化剤として含むときには、同濃度のヒト血清アルブミンを標準液に添加して、標準曲線を作成し、該標準曲線に基づいて試料中のチオシアン酸コバルト錯体量を補正することにより、ポリソルベートを正確に定量することができる。
生理活性タンパク質含有試料がタンパク質製剤であるときのｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．５である。しかしながら、ｐＨは含まれるタンパク質により異なり、これらに限定されるものではない。例えばＧ−ＣＳＦの場合には好ましくはｐＨ５〜７であり、さらに好ましくはｐＨ６．０〜６．７であり、さらに好ましいのはｐＨ６．５である。ＥＰＯの場合には好ましくはｐＨ５〜８であり、さらに好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．０である。ｈＰＭ−１抗体の場合には好ましくはｐＨ５．０〜７．５である。
生理活性タンパク質含有試料がタンパク質製剤であるときには、これに含まれるタンパク質の量は、使用するタンパク質、治療すべき疾患の種類、患者の重症度、患者の年齢等に応じて決定できる。一般的には、０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ以上のタンパク質を含む。例えばＥＰＯの場合には、一般には１００〜５０００００ＩＵ／ｍｌ，好ましくは２００〜１０００００ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは７５０〜７２０００ＩＵ／ｍｌである、また、Ｇ−ＣＳＦの場合には一般には１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜８００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌである。抗体の場合には一般に０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１２０ｍｇ／ｍｌである。
本発明はさらに、生理活性タンパク質含有試料に比色定量試薬を添加し、比色定量試薬と生理活性タンパク質含有試料中の添加剤との間で形成される生成物を吸光度測定により定量する、生理活性タンパク質含有試料中の添加剤の定量方法であって、以下のいずれかの工程を含む上記方法を提供する：
Ａ）生理活性タンパク質含有試料に水系有機溶媒を添加して生理活性タンパク質を沈殿させ、該沈殿を除去した後の試料に比色定量試薬を添加する、
Ｂ）タンパク質分解酵素を添加して、試料中のタンパク質を分解した後に比色定量試薬を添加する、または
Ｃ）試料中に含まれるのと同種類のタンパク質を同量、標準液中に添加して、標準曲線を作成する。
本発明の上記方法によって測定できる添加剤には、等張化剤、希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含む。等張化剤としては、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノースなどの糖類；含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
これらの添加剤を既知の比色定量法を用いて、上記Ａ）、Ｂ）又はＣ）のいずれかの工程を含む方法によって定量できる。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
産業上の利用可能性
本発明の方法により、タンパク質を含有する溶液試料においても、これに含まれる酸化エチレン系非イオン界面活性剤を簡便かつ正確に測定することができる。
実施例
ＣｏＳＣＮ溶液
チオシアン酸アンモニウム１７．４ｇ
硝酸コバルト・６水和物２．８ｇ
上記を１００ｍＬの水に溶解する。
実施例１：ｒＧ−ＣＳＦ注射剤中のポリソルベート２０の定量
標準溶液及び試料溶液の調製
ポリソルベート２０標準液：ポリソルベート２０を水に溶解し、２ｍｌ中にポリソルベート２０を０、０．２５、０．５、０．７５、１．０ｍｇ含む液を調製し、これをポリソルベート標準液とする。この２ｍｌをとり、２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液０．０２ｍｌを加えて標準溶液とする。
ｒＧ−ＣＳＦ注射剤試料溶液：ｒＧ−ＣＳＦ注射剤（組換えＧ−ＣＳＦを２５０μｇ含有：中外製薬）５バイアルをとり、それぞれに水０．４ｍｌずつを加えて溶かし、これらの液を合わせて試料溶液とする。なお、ｒＧ−ＣＳＦ注射剤試料溶液には、安定化剤としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が１バイアル当たり約１ｍｇ含まれている。
標準操作
標準溶液又は試料溶液２ｍｌをとり、ＣｏＳＣＮ溶液２ｍｌを加えて３分間振とう（２５０回／分）する。塩化カリウム０．４ｇを加え、さらに水飽和ジクロロメタン５ｍｌを加えて１０分間振とう（２５０回／分）する。３０００ｒｐｍで３０分遠心し、ジクロロメタン層（下層）を取り、吸光度測定法によりＯＤ３２０ｎｍを測定する。
（１）ポリソルベート２０−ＣｏＳＣＮ複合錯体の吸収スペクトル
ポリソルベート２０標準液（０．５ｍｇ／２ｍｌ）、試料溶液又は水（ブランク）について標準操作に準じてＣｏＳＣＮ試薬と混合して得たジクロロメタン層の吸収スペクトル（２５０−７００ｎｍ）を図１に示す。
標準溶液と試料溶液では吸収スペクトルに差異はなく、ともに３２０ｎｍと６２０ｎｍに極大吸収を示した。これらはポリソルベート２０とＣｏＳＣＮによる複合錯体に由来する吸収であり、ブランクではこの波長域に極大吸収を示さない。しかし、ブランクでも３２０ｎｍにわずかな吸収を有する（ＯＤ＜０．１０）。
（２）抽出有機溶媒の検討
ポリソルベート２０標準液（０−１ｍｇ）について標準操作に準じて操作したもの、ジクロロメタンに代えて、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、トルエン、ベンゼンで抽出した試料で吸収スペクトルを測定した。いずれも３２０ｎｍと６２０ｎｍ付近の極大吸収に差異はなく、溶媒種によるスペクトル変化は見られなかった。従って、定量はより吸光度の大きい３２０ｎｍの吸収を用いて行うこととした。
次に、同一のポリソルベート２０標準液から、上記の各溶媒を抽出溶媒として検量線を作成し、各溶媒での複合錯体の検出強度を比較した。なお、これらの溶媒は分液ロート中で水を加えて混合分離し、水飽和として用いた。その結果、ジクロロメタンと１，２−ジクロロエタンは同程度の吸収強度を示し、クロロホルムはその約２／３の強度、トルエン及びベンゼンは１／１０以下の強度を示した。従って、測定強度の点からは、ジクロロメタンと１，２−ジクロロエタンが溶媒として適していると判断された。
有機溶媒、特にハロゲン系有機溶媒はタンパク質と混和するとこれを不可逆的に析出させることが知られている。ｒＧ−ＣＳＦ注射剤にはｒＧ−ＣＳＦの他にもＨＳＡが含まれており、複合錯体を抽出するときにタンパク質が析出して錯体の一部を取り込んでしまう。そこで、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルムの３溶媒で、抽出時のＨＳＡ（５ｍｇ）により取込の影響を調べた。結果を表１に示す。
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回収率の点からはジクロロメタンとクロロホルムが適している。測定強度と回収率の両者からジクロロメタンが抽出溶媒として適切であると判断した。
（３）ＣｏＳＣＮ試薬の添加量
ポリソルベート２０  １ｍｇに対する複合錯体の形成反応に必要なＣｏＳＣＮ試薬量を検討した。その結果、試薬量が２ｍｌ以上において反応が完全に進行し、試薬が過剰となった。ｒＧ−ＣＳＦ注射剤にはポリソルベート２０が０．５ｍｇ含まれていることから、試薬量は２ｍｌで充分であると判断された。
（４）複合錯体の反応時間と検出強度の関係
ポリソルベート２０  ０．５ｍｇとＣｏＳＣＮ試薬との振とうによる反応時間と、生成する複合錯体の検出強度の関係を検討した。その結果、１分以上の振とうで反応は完全に終了することがわかった。そこで、試薬との反応時間は３分に設定した。
（５）複合錯体と試料液量の関係
ポリソルベート２０とＣｏＳＣＮ試薬との複合錯体は、抽出後に定量することから、抽出効率が試薬液量によって異なることが予想される。ポリソルベート２０  ０．５ｍｇを水２，３，４，６ｍｌに溶解した溶液について、同様に操作し、複合錯体の検出強度を比較した結果、図２に示すように、試料溶液の液量によって検出強度が異なった。従って、標準溶液と試料溶液は液量を同一にする必要があり、２ｍｌに統一することとした。
（６）塩析効果
標準溶液（０．５ｍｇ／２ｍｌ）２ｍｌに対する塩化カリウムと塩化ナトリウムの塩析効果を図３に示す。塩化カリウム、塩化ナトリウムのいずれも添加量を増やすとともに吸光度は高くなり、０．４ｇで最大となり、その後０．７以上では分離が悪くなり、再び低下した。塩化カリウムと塩化ナトリウムではほとんど差がなかった。
（７）他の賦形剤（ＨＳＡ、マンニトール、リン酸塩）、ｒＧ−ＣＳＦの混在量と錯体の検出強度の関係
標準溶液（０．５ｍｇ／２ｍｌ）２ｍｌに対するＨＳＡ、マンニトール、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏの混合物）、ｒＧ−ＣＳＦの添加量の影響を検討した。
ＨＳＡは添加量の増加に伴って吸収強度が減少したが、３−１０ｍｇでは一定となり、約２０％吸収強度が減少した。マンニトールは０．５ｇまでの添加量で顕著な影響を認めなかった。リン酸塩は２０ｍｇまでの添加量で影響を認めなかった。ｒＧ−ＣＳＦは２ｍｇまでの添加量で影響を認めなかった。
（８）他の賦形剤（ＨＳＡ、マンニトール、リン酸塩）、ｒＧ−ＣＳＦの試薬との反応とジクロロメタン層への抽出
ｒＧ−ＣＳＦ注射剤５バイアル中に含まれるＨＳＡ５ｍｇ、マンニトール２５０ｍｇ、リン酸塩３２ｍｇ、ｒＧ−ＣＳＦ１．２５ｍｇとＣｏＳＣＮ試薬との反応性及びジクロロメタンへの抽出を調べた結果を表２に示す。
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表２から明らかなように、各ジクロロメタン溶液での吸収強度はブランク値と差異を認めず、これらの賦形剤又はｒＧ−ＣＳＦとＣｏＳＣＮ試薬との反応物は吸収を示さないことを確認した。
（９）試料溶液の除タンパク処理
上記（７）で記載したように、試料中に存在するＨＳＡのために複合錯体の抽出時の回収率が低下する。そこで試料溶液中のタンパク質のみを効果的に除去する方法を検討した。除タンパクは以下の条件を満たす必要がある：
ａ）ポリソルベート２０は処理によって損なわれずに保持される。
ｂ）処理後の試料溶液の組成はＣｏＳＣＮ試薬との反応を妨害しない。
ｃ）錯体の抽出効率を低下しないよう、試料溶液量を増やさない。
ｄ）操作が簡単である。
ｅ）処理により定量値の再現性が低下しない。
これらを考慮し、逆相系固相処理（セップパックＣ１８又はセップパックＣＮによる処理）、限外濾過膜による分離、塩析による除タンパク、エタノール添加によるタンパク質の変性沈殿、トリクロロ酢酸によるタンパク質の沈殿分離などを試みた結果、いずれも効率よくタンパク質のみを除くことができなかった。従って、試料溶液中の除タンパクは行わず、標準溶液中にＨＳＡを添加して、試料溶液と抽出率を揃えることとした。
（１０）複合錯体の検出強度と反応溶液のｐＨの影響
試料溶液と標準溶液にＣｏＳＣＮ試薬を添加した反応溶液のｐＨを実測した結果、試料溶液では約５．８、標準溶液では約５．４（０−１．０ｍｇ／２ｍｌの標準液の範囲で差異を認めない）であった。このｐＨ５．４と５．８の差異で試薬との反応性に影響が生じるかを確認した。
５ｘ１０−３Ｍ濃度のリン酸緩衝液から標準液（０．５ｍｇ／２ｍｌ）をつくり、ＣｏＳＣＮ試薬を加えてｐＨ２．６から６．２の反応溶液について測定した。その結果、ｐＨが５．２以上では吸収強度は一定となり、従って試料溶液と標準溶液のｐＨの差異による反応への影響はないことを確認した。
（１１）複合錯体のジクロロメタンによる抽出率
試料溶液及び標準溶液で反応により生成する複合錯体を、１回の抽出でそれぞれ何％がジクロロメタン層に抽出されるかを求めた。それぞれ３回抽出を繰り返し、各抽出回のジクロロメタン層に抽出される複合錯体の定量値から１回目の抽出により得られる複合錯体の比率を算出した。結果を表３に示す。
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表から明らかなように、標準溶液と試料溶液でともに１回目の抽出で約９２％が抽出され、かつ標準溶液と試料溶液で差異がないことを確認した。
（１２）検量線
ポリソルベート２０標準液（０−１ｍｇ／２ｍｌ）に対して、ＨＳＡを５ｍｇ添加した液（Ｂ）、ＨＳＡ５ｍｇとマンニトール２５０ｍｇを添加した液（Ｃ）、及び何も添加しない液（Ａ）の各標準溶液から検量線を作成した。その結果、いずれもポリソルベート２０を０−１ｍｇの範囲で原点付近を通る良い直線性が得られた。ただし、ＢとＣでは、前述したように複合錯体の抽出回収率が低下するため、Ａに対して吸収強度が約８０％となり、かつＢとＣでは差異がなかった。従って、検量線は試料溶液と複合錯体の抽出率を合わせる目的からＢの条件の検量線を用いることとした。
また、使用する検量線の直線性はｎ＝７で行った結果から、直線回帰係数ｒ≧０．９９のものを用いた。
（１３）定量限界
水を用いたブランク値を測定した結果から、定量限界は約０．０１ｍｇ／バイアルとなった。
（１４）ポリソルベート２０の回収率
ｒＧ−ＣＳＦ注射剤にポリソルベートを１バイアル当たり０．０２−０．１０ｍｇを添加したときの回収率を求めた。回収率はｒＧ−ＣＳＦ注射剤に標準液を添加した試料のポリソルベート２０総量を求め、これより元来ｒＧ−ＣＳＦ注射剤に入っているポリソルベート２０量（０．０９５ｍｇ／バイアル）を差し引くことから算出した。その結果、０．０４ｍｇ／ｍｌ以上のポリソルベート２０添加量では約１００％を示した。よって、試料中のポリソルベート２０は、この定量法により回収率１００％で定量ができると判断した。
（１７）ｒＧ−ＣＳＦ注射剤の実測
ｒＧ−ＣＳＦ注射剤１７ロット（中外製薬：１５ロットについては各５バイアル、２ロットについては各３バイアルを使用）を用いて、ポリソルベート２０の含量を実測した。また、吸収スペクトルを測定した。
その結果、全てのロットにおいて、ポリソルベート２０含量が０．０９５−０．１０８ｍｇ／バイアルとなり、ほぼ表示量（０．１ｍｇ／バイアル）に合致した値を示した。また、複合錯体の吸収スペクトルは、いずれのロットも極大吸収を３１７−３１９ｎｍと６１９−６２２ｎｍに示し、ロット間で差を認めなかった。
実施例２：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）含有試料中のポリソルベート８０の定量（アセトン添加によるｈＰＭ−１の除去）
試料調製
ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）溶液は、ｈＰＭ−１原液（中外製薬）を限外ろか濃縮し、ｈＰＭ−１濃度３３ｍｇ／ｍＬのものを用いた（約１９ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１９０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）。
プラセボ溶液として、１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．６を調製した。
（１）アセトン沈殿法によるポリソルベート８０濃度及びｈＰＭ−１濃度の依存性
ポリソルベート８０（濃度０．００５％又は０．０１％）を含むｈＰＭ−１溶液（濃度２０ｍｇ／ｍｌ又は４０ｍｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを調製した。これらの溶液にアセトン４ｍｌを添加し、２０分振とう後、１０分間遠心分離（３０００ｒｐｍ）して沈殿を除去した。沈殿にさらにアセトン４ｍｌを添加して振とう、遠心分離を行い、これを２回繰り返し、各回で得られた上清をあわせてナス型フラスコに取り、蒸発乾固させた。残留物に水２．５ｍｌを加えて再溶解し、試料溶液として２ｍｌを取った。試料溶液にＣｏＳＣＮ試薬２ｍｌと塩化カリウム０．５ｇを加えて３分振とうし、次にジクロロメタン２ｍｌを添加して１０分振とうした。下層を取り、３２０ｎｍの吸光度を測定した。別途、プラセボ溶液も同様な操作を行って吸光度を測定し、試料溶液とプラセボとの吸光度比を求めた。結果を表４に示す。
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すなわち、ｈＰＭ−１濃度が２０ｍｇ／ｍＬ，４０ｍｇ／ｍＬと高濃度になった時においても、プラセボと比較して回収率が比較的高かった。また、ｈＰＭ−１の濃度にも依存しないことが示唆された。
（２）沈殿除去法の検討
アセトン添加により生成した沈殿をろ過するときに使用する器具として、ろ過面積や器具の表面積の異なる桐山ロートとフィルターホルダーを選択し、実験を行った。その結果を遠心分離法とあわせて以下の表５にまとめた。
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すなわち、ろ過法による沈殿分離においては作業性がよい反面、沈殿物に吸着していると思われるポリソルベート８０が十分に洗えない欠点がある。目詰まりしやすくなる方法であるほど、吸光度比が低下する傾向にある。したがって、ポリソルベート８０の定量法としては適当ではないと判断した。
一方、遠心分離法は試料の移し換えが多く、それゆえ測定時間が長くなる傾向があるが、沈殿物に吸着したと思われるポリソルベート８０を十分抽出することができ、吸光度比もほぼ１００％であり、また測定のばらつきも小さくなることがわかった。
（３）塩析効果の検討
吸光度が低いとＣＶが大きくなりやすいので、誤差の少ない安定した吸光度を得るために塩の添加について検討を行った。
まず、塩化カリウム添加量の最適化を検討するために、０．０１％ポリソルベート８０プラセボ溶液２ｍＬに対し、標準操作法により吸光度を測定したところ、ＫＣｌの添加量が増加するに従い吸光度が増し、０．５ｇ付近から傾きが小さくなった。したがって、ＫＣｌの添加量は、０．５ｇとした。
次に、ＫＣｌを添加したときの再現性を検討した。ｈＰＭ−１、プラセボとも０．０１％ポリソルベート８０溶液２ｍＬを遠心分離法にて調製した溶液２ｍＬを標準操作法により吸光度を測定した。実験はｎ＝５で実施し、２日にわたり行った。本結果について、日内差、日間差を考察した結果を表６に示す。
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プラセボ／ｈＰＭ−１比（％）について見ると、２日とも９８．５７％と９７．１７％と良好である。また、ばらつきに関しても５％程度であり、良好といえる。ＫＣｌの添加により、ばらつきも回収率も上昇したことが分かった。
（４）真度及び併行精度
（１）〜（３）の検討に基づいて設定した試験法により、０．０５％ポリソルベート８０を含むｈＰＭ−１溶液を測定したところ、ポリソルベート８０の回収率は９９．８％、変動係数は７．６％であり、真度、変動係数ともに良好な結果を得た。
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実施例３：ＥＰＯ注射剤中のポリソルベート８０の定量（プロテイナーゼＫによるタンパク質分解）
試料
ＥＰＯ原液、ＥＰＯ溶液製剤（ＥＰＯを７５０ユニット含有）、及びＥＰＯ溶液製剤（ＥＰＯを２４０００ユニット含有）はいずれも中外製薬製を用いた。これらのＥＰＯ製剤はいずれもポリソルベート８０を０．００５％含む。
プロテイナーゼＫ溶液
プロテイナーゼＫ（和光純薬）１００ｍｇをとり、ＴＥ（ｐＨ８．０）（和光純薬）を加え５０ｍｌとし、２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液を調製した。
標準操作
試料溶液２ｍｌをとり、ＣｏＳＣＮ試液２ｍｌを加えて３分間撹拌する。塩化カリウム０．４ｇを加え、更にジクロロメタン（水飽和）１ｍｌを加えて１０分間撹拌する。３０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ジクロロメタン層（下層）を取り、吸光度測定法によりＯＤ３２０±２ｎｍを測定した。
（１）抽出溶媒の選択
ポリソルベート８０の抽出率は抽出溶媒によって異なる。そこで、抽出溶媒にジクロロメタンとクロロホルムを用いて検討した。０．００５％ポリソルベート８０水溶液２ｍｌを試料とし、抽出溶媒層のＯＤ３２０±２ｎｍを標準操作に準じて測定した結果、クロロホルム抽出に比べ、ジクロロメタン抽出の方が高い吸光度を得た。
一方、水を試料として同一操作を行った場合、両溶媒とも特に妨害となるスペクトルは検出されなかった。よって、抽出溶媒は吸光度の高いジクロロメタンとした。
（２）複合錯体の反応とＣｏＳＣＮ試液量の検討
０〜０．０１０％のポリソルベート８０濃度範囲での定量が可能なＣｏＳＣＮ試液量の検討をした。０．０５０％ポリソルベート８０水溶液０．４ｍｌに、水３．６，３．１，２．６，１．６，０．６，０ｍｌと、これらにＣｏＳＣＮ試液を０、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０ｍｌをそれぞれに加え全量を４．０ｍｌとし、標準操作に準じて測定した。その結果、試液量の増加に依存して吸光度は増加し、２ｍｌ以上で反応曲線（吸光度）がほぼ横這いとなった。目的とする定量範囲から、試液量は２ｍｌで十分と判断した。
（３）複合錯体生成反応時間の検討
試料中のポリソルベート８０とＣｏＳＣＮ試液が完全に反応し、複合錯体が生成するまでの反応時間を検討した。０．００５％ポリソルベート８０水溶液２ｍｌを試料とし、反応時間を０、１、２、３、５ｍｉｎとした場合のＯＤ３２０±２ｎｍを標準操作に準じて測定した。いずれも吸光度に大きな差は見られず、反応は速やかに進行するものと思われた。
（４）．ジクロロメタン量の検討
複合錯体の抽出に必要なジクロロメタン量を検討した。０．００５％ポリソルベート８０水溶液２ｍｌを用い、加えるジクロロメタン量を１．０，２．０，３．０ｍｌとした場合のＯＤ３２０±２ｎｍを標準操作に準じて測定した。その結果、ジクロロメタン量を２倍、３倍と増やすことによって、吸光度は約１／２、１／３に減少した。よって、ジクロロメタン量による分配率への影響はほとんどないものと考えられた。
（５）塩析効果の検討
複合錯体をジクロロメタンで抽出する際の塩析効果を検討した。０．００５％ポリソルベート８０水溶液２ｍｌを試料とし、塩化カリウム０．０、０．２、０．４、０．６、０．８ｇを添加した場合のＯＤ３２０±２ｎｍを標準操作に準じて測定した。その結果、塩化カリウムの添加量を増やすと吸光度は高くなり、０．４ｇ以上でほぼ横這いとなった。
（６）除タンパク質法の検討
実施例１に記載したように、試料中にタンパク質が存在する場合、複合錯体の抽出率が低下することが観察された。実際、最も高濃度のＥＰＯ製剤では、ＥＰＯが約４００μｇ／ｍｌ存在するため、複合錯体の抽出率が約７０％に低下した。また、ＥＰＯ製剤は、Ｄｏｓｅ幅が広い（０．８μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ）ため、得られる吸光度も各Ｄｏｓｅにより異なることが予想された。
そこで、試料溶液中のタンパク質（ＥＰＯ）を効果的に除去する必要が生じた。但しこの場合、除タンパク質法は実施例１（９）に記載の条件を満たす必要がある。
これらを考慮し、以下の方法を試みた。
プロテアーゼＫによるタンパク質消化；タンパク質含有量の異なる試料（０．００５％ポリソルベート８０水溶液（ブランク）、ＥＰＯ  ７５０ＩＵ／０．５ｍｌ、ＥＰＯ  ２４０００ＩＵ／０．５ｍｌ）でほぼ同一の吸光度を得、タンパク質による複合錯体の回収率低下は認められなかった。
よって、プロテアーゼＫによるタンパク質消化操作が有効であると考えられた。
（７）タンパク質含量の影響
タンパク質濃度を変化させ、定量への影響を検討した。１５００，４８０００，７２０００  ＩＵ／ｍｌのＥＰＯを含む０．００２５〜０．０１０％ポリソルベート８０水溶液２ｍｌを用い、試験法に従って測定した。その結果、各ポリソルベート８０濃度とも吸光度に差は見られず、タンパク質消化操作を行えば、タンパク質の含有量による定量への影響はないことが確認された。
（８）検量線の直線性
０，０．００１，０．００２５，０．００５，０．００７５，０．０１％のポリソルベート８０標準溶液を試験法に従って測定し、検量線を作成した。その結果、検量線の相関係数は何れもｒ≧０．９９９であり、ほぼ原点を通る直線を示した。
（９）室内再現精度および真度
０．００２５，０．００５０，０．０１００％のポリソルベート８０水溶液を試験法に従って測定した。その結果、０．００２５，０．００５０，０．０１００％ポリソルベート８０水溶液の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、それぞれ４．７，５．２，４．７％であった。また、真度はそれぞれ１０２．７，９９．４，１０１．２％であり、変動係数、真度ともに良好な結果を得た。
先にも述べた通り、５点検量線から得られた相関係数は極めて良好なものであり、精度および真度は確保されると推察された。そこで、０．００５％ポリソルベート８０水溶液を用いた１点検量線により求めた測定値と比較した結果、Ｃ．Ｖ．≦４．６％、真度１００±５．６％の測定結果を与え精度、真度共に問題ないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリソルベート２０標準液（０．５ｍｇ／２ｍｌ）、試料溶液又は水（ブランク）について標準操作に準じてＣｏＳＣＮ試薬と混合して得たジクロロメタン層の吸収スペクトル（２５０−７００ｎｍ）を示す。
図２は、複合錯体の検出強度と試料液量の関係を示すグラフである。
図３は、標準溶液（０．５ｍｇ／２ｍｌ）２ｍｌに対する塩化カリウムと塩化ナトリウムの塩析効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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