(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質アレルゲンに由来するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（Ｘ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（Ｙ）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（Ｚ）の群から選ばれた３つの領域からなる単離した組換えペプチドであって、
前記領域がＸＺＹ又はＺＹＸの構成で配置されている単離した組換えペプチド。
【請求項２】
前記領域の前に挿入された蛋白質加水分解部位を含む、請求項１に記載の単離した組換えペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載の組換えペプチド及び製薬上許容し得るキャリアー又は希釈剤を含む蛋白質アレルゲンに対する感受性を治療するための医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
Ｔリンパ球は、免疫応答の特異的及び非特異的なエフェクター機構の両者を媒介し且つ制御することが出来る。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、抗体産生を助け、他のＴ細胞の成長並びに他の免疫細胞例えば単核細胞及び顆粒球等の成長及び分化を調節するサイトカインを分泌する。機能的及び生化学的研究は、細胞性免疫応答の誘発が、抗原提示アクセサリー細胞上で発現されている主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）生成物と結合した外来蛋白質のペプチド断片を認識するＴ細胞上の抗原レセプターに依存することを示した。最近の技術における進歩は、抗原特異的なヒト及びマウス細胞系統並びにクローンをイン・ビトロで効率よく培養することを可能にした。更に、今や、多量の蛋白質抗原若しくはそれらの断片を組換えＤＮＡ技術又は固相ペプチド合成を用いて生産することが可能である。こうして、過去数年間に、幾つかの研究グループが、ＭＨＣと結合してＴ細胞により認識される抗原蛋白質の直鎖状アミノ酸配列（Ｔ細胞エピトープ）を決定することを始めた。
細菌性及びウイルス性の病原体、自己抗原、アレルゲン並びに他の実験用抗原例えば雌鳥卵リゾチーム（ＨＥＬ）、オバルブミン（ＯＶＡ）及びラムダリプレッサー（ｃ１）を含む種々の蛋白質抗原から誘導されたペプチドが、抗原特異的Ｔ細胞を刺激する能力について試験された。ペプチドの広いサイズスペクトルがＴ細胞エピトープとして作用することが報告された。例えば、ＯＶＡのアミノ酸残基３２４〜３３９（Shimonkevitz, R等、J. Immunol., 133:2167（1984））、ＨＥＬのアミノ酸残基７４〜９６（Shastri, N.等、J. Exp. Med. 164:882-896（1986））、及びラムダリプレッサー（ｃ１）のアミノ酸残基１２〜２６（Lai, M.等、J. Immunol., 139:3973-3980（1987））は、全蛋白質活性化したＴ細胞を効率的に引き起こすことが示された。Ｂ型肝炎表面抗原から誘導したペプチド（ＨＢｓＡｇアミノ酸残基１９〜３３）は、最近、組換えＢ型肝炎ワクチンで免疫されたヒト患者の大多数においてＴ細胞応答を刺激することが示された（Schad, V.C.等、Seminars in Immunol., 3:217-224（1991））。主要マイコバクテリウム抗原６５ｋＤ蛋白質も又エピトープマップされた（Lamb, J.R.等、EMBOJ., 6（5）:1245-1249（1987））。Ｔ細胞エピトープは、６５ｋＤ蛋白質のアミノ酸残基１１２〜１３２及び４３７〜４５９からなるペプチド中に同定された。ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発する自己抗原及び多発性硬化症（ＭＳ）における推定抗原も又、ヒト（Ota等、Nature, 346:183-187（1990））及びゲッ歯動物（Zamvil等、Nature 324:258-260（1986））両系においてエピトープマップされた。Ota等は、ＭＳ患者により認識される主要Ｔ細胞エピトープを、ＭＢＰアミノ酸残基８４〜１０２と同定した。ＭＳ患者からのＴ細胞により認識される少数エピトープ（ＭＢＰアミノ酸残基１４３〜１６８、６１〜８２、１２４〜４２及び３１〜５０）も又記載された。Zamvil等は、ＭＢＰアミノ酸残基１〜１１が、感受性のゲッ歯動物系統にＥＡＥを引き起こす主要Ｔ細胞エピトープを含むことを示した。
アレルゲン性蛋白質中に存在するＴ細胞エピトープがつい最近記載された（O’Hehir, R等、Ann. Rev.Immunol., 9:67-95（1991））。室内塵ダニアレルゲンDer p Iから誘導された幾つかのペプチドは、Ｔ細胞反応性であることが示された（Thomas, W.R.等Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin（1989年9月）77-82頁; O’Hehir, R.E. Annual Review Immunology 9: 67-95（1991）;。Stewart, G.A.等Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIVCongress of the European Academy of Allergy andClinical Immunology, Berlin（1989年9月）41-47頁;及びYessel, H.等T Cell Activation in Health and Disease中: Discrimination Between Immunityand Tolerance, Conference 22-26（1990年9月）英国Oxford, Trinity College）。短ブタクサアレルゲンAmb aIアミノ酸残基５４〜６５から誘導されたＴ細胞刺激性ペプチドも又報告された（Rothbard, J.B.等、Cell, 52:515-523（1988））。ライ麦アレルギーの個人から得たＴ細胞クローンのパネルを用いて、Perez等は、Ｔ細胞エピトープが蛋白質アレルゲンLol p Iのアミノ酸残基１９１〜２１０内に含まれることを示した（Perez, M.等J. Biol. Chem., 265（27）:16210-16215（1990））。
発明の要約
本発明は、Ｔ細胞刺激活性を有する単離されたペプチド（レコンビトープ（商標）と呼ぶ）を提供する。この発明のレコンビトープペプチドは、好ましくは、ヒトＴ細胞刺激活性を有する。更に、この発明のレコンビトープペプチドは、好ましくは、同じ又は異なる蛋白質抗原から誘導される少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含み、一層好ましくは、蛋白質抗原に由来する少なくとも１つのＴ細胞エピトープをそれぞれ含む少なくとも２つの領域を含む（各領域は好ましくはヒトＴ細胞刺激活性を有する）。幾つかの場合には、レコンビトープペプチドは、同じ又は異なる蛋白質抗原に由来する３つのかかる領域を含む。ここで用いる場合、レコンビトープペプチドの領域は、少なくとも５アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基を含む。典型的には、レコンビトープペプチドは、１次構造依存性のヒトＴ細胞刺激活性を維持するときに蛋白質抗原の２次及び３次構造と関係する望ましくない特性を除くために、天然の蛋白質抗原中の領域の構成と異なる構成に配置された領域を含む。例えば、これらの領域を同じ蛋白質抗原から誘導し、非隣接的構成に配置し或は非隣接的構成且つ非逐次的順序で配置することが出来る。
この発明のレコンビトープペプチドは、蛋白質アレルゲンから誘導することが出来る。これらのレコンビトープペプチドは、好ましくは、最小免疫グロブリンＥ刺激活性しか有さず且つ、レコンビトープが由来する蛋白質アレルゲンが免疫グロブリンＥに結合するより実質的に低い程度にしか免疫グロブリンＥに結合しない。一層好ましくは、蛋白質アレルゲンに由来するレコンビトープペプチドは、蛋白質アレルゲンに感受性の個人のかなりのパーセンテージ（少なくとも約７５％）において蛋白質アレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥに結合しないか、又はかかる結合が起きてもかかる結合はマスト細胞若しくは好塩基球からの媒介物質、例えばヒスタミン、の放出を生じない。更に、レコンビトープペプチドは、自己抗原、例えば、インシュリン、ミエリン塩基性蛋白質及びアセチルコリンレセプターから誘導することが出来る。これらのレコンビトープペプチドは、好ましくは、自己抗原に感受性の個人の集団のかなりのパーセンテージ（少なくとも約７５％）において自己抗原に特異的な免疫グロブリンと結合しない。更に、蛋白質アレルゲン又は他の蛋白質抗原から誘導したレコンビトープペプチドを、天然の蛋白質の望ましくない特性（例えば、酵素活性）を治療目的のために排除し得るようにデザインすることが出来る。
この発明は又、個人における蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に対する感受性を診断する方法、かかる感受性を治療する方法及び、１種以上のレコンビトープペプチドを含む治療用組成物をも提供する。例えば、個人における少なくとも１種の蛋白質アレルゲン又は他の蛋白質抗原に対する特定の遅延型過敏症及び／又は特定の即時型過敏症を検出する方法を開示する。１つの方法によって、この発明のレコンビトープペプチドを用いて特定の遅延型過敏症の試験を個人に施すことが出来、且つ特定の遅延型過敏症反応が個人において起きる程度を測定することが出来る。他の方法において、少なくとも１つの蛋白質アレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥの存在を個人において測定することが出来、その個人のＴ細胞が蛋白質アレルゲンのＴ細胞エピトープに応答する能力を評価することが出来る。この実施態様において、蛋白質アレルゲン若しくはその一部又は蛋白質アレルゲン若しくはその一部の改変型（各々は、蛋白質アレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥに結合する）を用いる特定の即時型過敏症の試験を個人に施す。更に、蛋白質アレルゲン若しくはその一部の修飾型又は組換えにより製造した蛋白質アレルゲン又は蛋白質アレルゲンから誘導したレコンビトープペプチド（各々は、ヒトＴ細胞刺激活性を有し、蛋白質アレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に結合せず、もし結合がおきても、かかる結合は、アレルゲンに感受性の個人の集団のかなりのパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）においてマスト細胞又は好塩基球からの媒介物質の放出を生じない）を用いる特定の遅延型過敏症の試験を、即時型過敏症試験を施す前に、同時に、又は施した後に、その同じ個人に施す。特定の即時型過敏症反応及び特定の遅延型過敏症反応の両方を示す個人には、蛋白質アレルゲンに対する感受性を低下させると考えられるので、治療上有効量の改変型の蛋白質アレルゲン若しくはその部分、組換えにより製造した蛋白質アレルゲン又は蛋白質アレルゲンから誘導したレコンビトープペプチド及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療用組成物を投与する。
蛋白質抗原から誘導したＴ細胞刺激活性を有するレコンビトープペプチドは又、個人における蛋白質抗原に特異的な免疫グロブリンの存在及びそれらの個人のＴ細胞の蛋白質抗原のＴ細胞エピトープにより刺激される能力を測定する他の方法においても使用することが出来る。１つのかかる方法は、個人から得た第１の血液試料又はその試料の少なくとも一部を、蛋白質抗原、改変型の蛋白質抗原、又は何れかの一部（各々は、蛋白質抗原に特異的な免疫グロブリンに結合する）と合わせることを含む。試料及び抗原を、試料若しくはその一部分中の血液成分例えば免疫グロブリンの結合に適した条件下で、蛋白質抗原、改変した蛋白質抗原又はこれらの抗原の何れかの部分と合わせる。もし結合が起きたら、Ｔ細胞刺激が起きたか否かを測定するために、個人から得た第２の血液試料又は元の試料の第２の部分を、蛋白質抗原、蛋白質抗原の改変型又はその一部から誘導した少なくとも２つの領域を含むレコンビトープペプチド又は組換えにより製造した蛋白質抗原（各々は、Ｔ細胞刺激活性を有し、好ましくは、抗原に感受性の個人の集団かなりのパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）において蛋白質抗原に特異的な免疫グロブリンに結合しない）と合わせる。もしＴ細胞刺激が起きたら、好ましくは、蛋白質抗原に対する感受性を低下させると考えられるので、その個人に、改変型の蛋白質抗原若しくはその一部、組換えにより製造した蛋白質抗原又はレコンビトープペプチド及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療上有効量の治療用組成物を投与する。
個人が感受性である蛋白質抗原が、未知若しくは不明確なエピトープを有するこの発明のレコンビトープペプチドをデザインする方法も又提供する（例えば、蛋白質抗原に対するヒトＴ細胞刺激活性を有する蛋白質抗原の幾つかの若しくはすべてのペプチド領域が、標準Ｔ細胞生物学技術（例えばCurrent Protocols in Immunology, Coligan, J.E.等編、第1巻（1991））によって規定されておらず、或は、蛋白質抗原の正確なヒトＴ細胞エピトープはマッピング技術によって規定されていない）。１つの方法により、アレルゲン又は他の蛋白質抗原の公知の蛋白質構造を検討し、そのアレルゲン若しくは他の抗原を理論的に少なくとも２つの所望の長さのペプチド領域に分割する。理論的にとは、実際に行なうのではなくて、例えば紙上若しくは頭の中での思考過程を意味する。この分割は、任意であってよく、アルゴリズムに従って行なうことが出来、或は、全部又は部分的にＴ細胞刺激活性を有することが公知の蛋白質抗原の領域に基づいてよい。Ｔ細胞刺激活性を有する蛋白質抗原の少しの領域のみが知られているとき又はヒトＴ細胞刺激活性を有する蛋白質抗原のすべての領域が未知であるとき、好ましくは５０％以上、一層好ましくは全蛋白質を所望の長さのペプチド領域に分割する。これらのペプチド領域を、次いで、理論的に配置して少なくとも１つのレコンビトープペプチドを形成し、該ペプチド中においてこれらの領域は非隣接的状態で再配置される。続いて、少なくとも１つの再配置した構成を有するレコンビトープペプチドを生成し、ヒトＴ細胞を刺激するレコンビトープペプチドの能力を測定する。更なる実施態様において、ヒトＴ細胞刺激活性を有することが見出されたレコンビトープペプチドの能力を試験して、アレルゲン若しくは他の抗原に特異的な免疫グロブリンに結合するその能力を測定し、又は他の望ましくない特性（例えば、プロテアーゼ活性）のないことを試験する。
【図面の簡単な説明】
図１は、リーダー配列Ａ（配列番号１及び２）及びＢ（配列番号３及び４）を含むヒトＴ細胞反応性ネコ蛋白質（ＴＲＦＰ）の鎖１の核酸配列及び推定上のアミノ酸配列である。
図２は、リーダー配列（配列番号５及び６）を含むＴＲＦＰの鎖２の核酸配列及び推定上のアミノ酸配列である。
図３は、ネコアレルギーの患者から単離してアフィニティー精製したＴＲＦＰで活性化し、ランク付けしたペプチド応答の総計により分析した、Ｔ細胞の重複ＴＲＦＰペプチドに対する応答を描いたグラフ表示である。
図４は、ＴＲＦＰのペプチドＸ（配列番号７）、ペプチドＹ（配列番号８）、ペプチドＺ（配列番号９）、ペプチドＡ（配列番号１０）、ペプチドＢ（配列番号１１）及びペプチドＣ（配列番号７７）のアミノ酸配列であり、それぞれは少なくとも１つのＴＲＦＰのＴ細胞エピトープを含む。
図５は、複製連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いるレコンビトープペプチドＹＺＸの構築の図式表示である。
図６は、ＰＣＲ技術を用いるレコンビトープペプチドＡＹＺＸＢの構築の図式表示である。
図７は、レコンビトープペプチドＹＺＸの構築で用いたオリゴヌクレオチドＣ（配列番号１２及び１３）、Ｄ（配列番号１４及び１５）、Ｅ（配列番号１６及び１７）、Ｆ（配列番号１８及び１９）、Ｇ（配列番号２０及び２１）、Ｈ（配列番号２２及び２３）及びＩ（配列番号２４及び２５）の並びにレコンビトープペプチドＡＹＺＸＢの構築において用いたオリゴヌクレオチドＪ（配列番号２６及び２７）、Ｋ（配列番号２８及び２９）、Ｌ（配列番号３０及び３１）、Ｍ（配列番号３２及び３３）、Ｎ（配列番号３４及び３５）及びＯ（配列番号３６及び３７）の核酸配列及び推定アミノ酸配列である。
図８は、核酸配列（大腸菌発現コドン使用）及びレコンビトープペプチドＹＺＸ（配列番号３８及び３９）を含む推定上のアミノ酸配列である。トロンビン開裂部位を示す
図９は、ＴＲＦＰから単離したｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ技術を用いるレコンビトープペプチドＹＺＸの構築の図式表示である。
図１０は、レコンビトープペプチドＸＺＹ（配列番号４０〜５１）、ＹＸＺ（配列番号５２〜６３）及びＺＸＹ（配列番号６４〜７１）の構築で用いたプライマーの核酸配列及び推定アミノ酸配列である。
図１１は、レコンビトープペプチドＸＺＹ、ＹＸＺ及びＺＸＹを構築するために用いた個々のプライマーのアミノ酸配列の図解表示である。
図１２は、不明確なＴ細胞エピトープであるホスホリパーゼＡ2から誘導したレコンビトープペプチドの構築の図式表示である。
図１３は、ネコアレルギーの個人から得られたヒトＩｇＥの、レコンビトープペプチドＸＹＺ、ＸＺＹ、ＹＸＺ、ＹＺＸ、ＺＸＹ及びＺＹＸを含む種々の蛋白質試料に対する結合を検出するＳＤＳ／ＰＡＧＥウエスタンイムノブロット分析の結果の表示である。
図１４は、ネコアレルギーの個人から得たヒトＩｇＥの、レコンビトープペプチドＸＹＺ、ＸＺＹ、ＹＸＺ、ＹＺＸ、ＺＸＹ及びＺＹＸを含む種々の蛋白質試料に対する結合を示すＥＬＩＳＡ分析の結果のグラフ表示である。
図１５ａ、１５ｂ及び１５ｃは、３人の患者に由来するイン・ビトロでＴＲＦＰ、レコンビトープペプチドＹＸＺ又はレコンビトープペプチドＹＺＸに対して活性化され、種々のペプチドに対する応答を分析したＴ細胞系統の応答を描いたグラフ表示である。
図１６は、レコンビトープペプチドＹＺＸで免疫してイン・ビトロで応答を分析したマウスＴ細胞のレコンビトープペプチドＹＺＸとの培養に対する応答を、ＩＬ−２産生により測定して描いたグラフ表示である。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｔ細胞増殖の誘発、リンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アネルギー／寛容化等のＴ細胞刺激活性を有するレコンビトープペプチドという単離したペプチドに関する。この発明のレコンビトープは、好ましくは、ヒトＴ細胞刺激活性を有し、蛋白質アレルゲン、自己抗原又は他の蛋白質抗原に対する個人の感受性を診断し及び治療するのに有用である。一般に、この発明の範囲内の好適レコンビトープペプチドは、同じ又は異なる蛋白質アレルゲン又は他の蛋白質抗原に由来する少なくとも２つの領域を含み、各領域は、好ましくは、標準Ｔ細胞生物学技術により測定されるヒトＴ細胞刺激活性を有し、従って、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。例えば、微細マッピング技術により正確なＴ細胞エピトープを測定するために、標準Ｔ細胞生物学技術により規定した少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチド領域は、ペプチド領域のアミノ若しくはカルボキシ末端の何れかにおけるアミノ酸残基の付加若しくは欠失により改変することが出来、改変ペプチドに対するＴ細胞反応性の変化を測定するために試験することが出来る。更に、もし重複領域を共有する２つ以上のペプチド領域が標準Ｔ細胞生物学技術により測定されるヒトＴ細胞刺激活性を有することが見出されるならば、かかるペプチド領域のすべて若しくは一部を含む更なるペプチドを生成することが出来、これらのペプチドを上記の微細マッピング手順によって試験することが出来る。微細マッピングの結果として、Ｔ細胞認識に不可欠なアミノ酸残基を含む１組のヒトＴ細胞エピトープを生成することが出来る。
この発明のレコンビトープペプチドは、かかるレコンビトープペプチドをコードする核酸配列でトランスホームした宿主細胞における組換えＤＮＡ技術により、又は化学合成により、又はある限定的状況においては蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の化学的開裂によって製造することが出来る。組換え技術により製造する場合には、レコンビトープペプチドをコードする核酸でトランスホームした宿主細胞を、その細胞に適した培地中で培養し、レコンビトープペプチドを、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動又は、レコンビトープペプチド、蛋白質アレルゲン若しくは他の抗原（これらからレコンビトープペプチドが誘導される）又はそれらの一部に特異的な抗体を用いる免疫的精製法を含む当業者に公知のペプチド若しくは蛋白質精製のための技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞又は両者から精製することが出来る。従って、この発明の１つの面は、レコンビトープペプチドをコードする核酸配列又は核酸配列の機能的同等物でトランスホームした宿主細胞中で生成されたレコンビトープペプチドを提供する。この発明のレコンビトープペプチドを、レコンビトープペプチドが組換えＤＮＡ技術により生成されたときに実質的に細胞性物質又は培養培地を含まないように、或は、化学合成したとき又は蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の化学的開裂により得たときに化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないように単離する。
蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の少なくとも２つのＴ細胞エピトープ又は少なくとも１つの領域（各領域は、少なくとも２つの蛋白質アレルゲン若しくは他の抗原のＴ細胞エピトープを含む）を含む本発明の好適レコンビトープペプチドを得るために、Ｔ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープを含む領域を、天然におけるアレルゲン若しくは抗原中のＴ細胞エピトープ若しくは領域の構成と異なる構成で配置する。例えば、Ｔ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープを含む領域を非隣接的構成で配置することが出来、好ましくは、同じ蛋白質アレルゲン若しくは他の抗原から導くことが出来る。非隣接的を、エピトープ又は領域が導かれる蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に存在するアミノ酸配列の配置と異なるＴ細胞エピトープ若しくはＴ細胞エピトープを含む領域を構成するアミノ酸の配置として定義する。更に、非隣接的なＴ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープを含む領域を非逐次的順序（例えば、アミノ酸がアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている天然の蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原（それらからＴ細胞エピトープ若しくはＴ細胞エピトープを含む領域が導かれる）のアミノ酸の順序と異なる順序）で配置することが出来る。好適レコンビトープペプチドは、少なくとも１５％、一層好ましくは少なくとも３０％、更に好ましくは少なくとも５０％及び最も好ましくは１００％まで、蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原のＴ細胞エピトープを含む。
蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原のＴ細胞エピトープが未知若しくは不確定な状況（例えば、ヒトＴ細胞刺激活性を有する蛋白質抗原の幾つか若しくはすべてのペプチド領域が標準Ｔ細胞生物学技術により規定されておらず、或は、蛋白質抗原の正確なヒトＴ細胞エピトープが微細マッピング技術により規定されていない）において、レコンビトープペプチドは、公知のアレルゲン若しくは他の抗体の蛋白質構造を検討してそのアレルゲン若しくは抗原を理論的に少なくとも２つの所望の長さのペプチド領域に分割することによって得ることが出来る。例えば、アレルゲン若しくは他の抗原の蛋白質配列を、少なくとも２つの重複しない所望の長さのペプチド領域又は少なくとも２つの重複する所望の長さのペプチド領域に系統的に分割し、及び、理論的に配置して、少なくとも２つの領域が非隣接的に好ましくは非逐次的順序で再配置された少なくとも１つのレコンビトープペプチドを形成することが出来る。このペプチド領域への分割は、任意であり、アルゴリズムに従って行なうことが出来、又はすべて若しくは部分的に少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むことの知られた蛋白質抗原の領域に基づいてよい。
少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原のほんの少しのペプチド領域しか公知でないか、ヒトＴ細胞刺激活性を有する蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原のすべての領域が未知であるときには、好ましくは蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の全蛋白質配列の少なくとも５０％、一層好ましくは蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の全蛋白質配列を１つ以上のレコンビトープペプチドに分割し及び再配置する。レコンビトープペプチドの形成におけるかかる大きいパーセンテージの蛋白質抗原の蛋白質配列の使用の目的は、その結果生じたレコンビトープペプチドが少なくとも１５％、一層好ましくは少なくとも３０％、更に好ましくは少なくとも５０％及び最も好ましくは少なくとも１００％の蛋白質抗原のＴ細胞エピトープを含むようにすることである。勿論、もし少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むことが知られた蛋白質抗原の僅かのペプチド領域しか蛋白質抗原のＴ細胞エピトープの上述のパーセンテージを構成せず、かかるペプチド領域が蛋白質抗原の全蛋白質配列の少なくとも５０％を構成しないならば、レコンビトープペプチドの形成においてかかる大きいパーセンテージの全蛋白質配列を用いる必要はない。この方法によって、レコンビトープペプチドを、次いで、組換え又は合成によって生成することが出来、レコンビトープペプチドのヒトＴ細胞を刺激する能力を測定することが出来る。レコンビトープペプチドが蛋白質アレルゲンから導かれた領域を含むときは、個々のペプチド領域を生成し、どの領域がアレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥに結合し及びかかる領域のどれがマスト細胞若しくは好塩基球からの媒介物質（例えば、ヒスタミン）の放出を引き起こすのかを測定するために試験することが出来る。試験したアレルギー性血清の約１０〜１５％以上において免疫グロブリンＥに結合し及びマスト細胞若しくは好塩基球からの媒介物質の放出を引き起こすことが見出されたこれらのペプチド領域は、好ましくは、レコンビトープペプチドを形成するために配列したペプチド領域に含まれない。
ホスホリパーゼＡ2（ミツバチ毒由来の主要アレルゲン）から誘導されるレコンビトープの構築は、蛋白質抗原の蛋白質構造は公知であるがＴ細胞エピトープは未知若しくは不明確という場合のレコンビトープペプチドの構築の例証的実施例として用いることが出来る。ホスホリパーゼＡ2は、ｃＤＮＡクローニングにより明らかにされたように１３４アミノ酸からなる（Kuchler, K.等Eur. J. Biochem. 184:249-254）。このアミノ酸配列を領域に分割することが出来、それぞれは好ましくは２０〜３５アミノ酸残基を含み、各領域は好ましくは約１０アミノ酸だけ他と重複する（図１２参照）。図１２は領域に分割される蛋白質の全蛋白質配列を示しているが、少なくとも１つの組換えペプチドを形成するのに用いる配列は、全蛋白質配列より実質的に少なくてよい。構築したレコンビトープペプチド中にＴ細胞エピトープを含む可能性を最大にするために、アルゴリズムを用いて予想されるＴ細胞エピトープの存在を保持するように重複領域及び各領域の長さをデザインすることが出来る（Rothbard, J.及びTaylor, W.R. EMBO J. 7:93-100（1988）;Berzofsky, J.A. Philos Trans R. Soc. Lond. 323:535-544（1989））。好ましくは、公知のＨＬＡクラスＩＩ特異的結合特異的アミノ酸残基を用いて、蛋白質アレルゲン内のヒトＴ細胞エピトープが予想され得る。更に、構築されたレコンビトープペプチドがヒトアレルギー性ＩｇＥに結合する見込みを最小にするために、生成したレコンビトープペプチドのアミノ酸配列を、それらの領域をごたまぜにし及び／又はアミノ末端領域若しくはカルボキシ末端領域を分子の反対の端に移すことによって、天然のホスホリパーゼＡ2の構造と異なるようにすることが出来る（即ち、天然蛋白質のアミノ末端に位置するアミノ酸残基をレコンビトープペプチドのカルボキシ末端に位置させることが出来る）。同様の手順を用いて、蛋白質構造は公知であるが未知のＴ細胞エピトープを有する自己抗原例えばグルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、Samama, J.P.及びMallet, J. Journalof Neurochemistry 54:703-705（1990）），インシュリン（Joslin’s Diabetes Mellitus，第12版，編者A.Marble等，Lea及びFebiger, Philadelphia, 67頁（1985））等から導いたレコンビトープペプチドを構築することが出来る。この状況において、ペプチド領域を、自己抗原中の天然の領域の構成と異なる構成で配置して自己抗原の望ましくない特性例えば免疫グロブリン結合活性又は酵素活性を除去する。
アレルゲン若しくは他の抗原から導いた少なくとも２つの領域を含むレコンビトープペプチドを試験してＴ細胞刺激活性（即ち、増殖、リンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アネルギー／寛容化の誘発）を有するレコンビトープペプチドを測定し、従って、該レコンビトープペプチドは少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。例えば、ヒトＴ細胞刺激活性を、蛋白質アレルゲン若しくは蛋白質抗原に感受性の個人（即ち、その蛋白質アレルゲン若しくは蛋白質抗原に対する免疫応答を有する個人）から得たＴ細胞を、その蛋白質アレルゲン若しくは抗原から誘導したレコンビトープペプチドと共に培養し及びレコンビトープペプチドに応答するＴ細胞による増殖の存在を測定することによって試験することが出来る。実施例で詳細に説明するように、レコンビトープペプチドに対するＴ細胞による応答についての刺激指標は、培地のコントロールＣＰＭで割ったレコンビトープペプチドに応答する最大ＣＰＭとして計算することが出来る。この出願において用いる場合、ヒトＴ細胞刺激活性を、刺激指標少なくとも２．０として規定する。刺激指標少なくとも２．０は、免疫治療剤として有用なレコンビトープペプチドを規定する目的について決定的であると考えられる。好適レコンビトープペプチドは、少なくとも２．５の、一層好ましくは少なくとも３．５の、最も好ましくは少なくとも５．０の刺激指標を有する。
更に、蛋白質アレルゲンから導いたこの発明の好適レコンビトープペプチドは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に結合せず又は実質的に、これらのペプチドが導かれた蛋白質アレルゲンがＩｇＥに結合するより低い程度に結合する。標準的免疫療法の主要な紛糾は、全身性の応答例えばアナフィラキシーである。免疫グロブリンＥは、マスト細胞若しくは好塩基球における結合及び抗原のＩｇＥへの架橋及び媒介物質（例えば、ヒスタミン、セロトニン、好酸球走化因子）の放出から生じたアナフィラキシー反応の媒介物質である。従って、アナフィラキシーは、ＩｇＥに結合せず又はもし結合するにしてもかかる結合がマスト細胞若しくは好塩基球からの媒介物質（例えば、ヒスタミン等）の放出を生じないレコンビトープペプチドの利用によって回避することが出来るであろう。更に、最小ＩｇＥ刺激活性を有するレコンビトープペプチドは、特に、治療効果について好ましい。最小ＩｇＥ刺激活性とは、全蛋白質アレルゲンにより刺激されたＩｇＥ生産量及び／又はＩＬ−４生産より少ないＩｇＥ生産をいう。
蛋白質アレルゲンから導かれたこの発明のレコンビトープペプチドは、蛋白質アレルゲンに感受性の個人に投与したときに、そのアレルゲンに対する個人のアレルギー性応答を緩和することが出来る。特に、蛋白質アレルゲンの少なくとも２つのＴ細胞エピトープ若しくは蛋白質アレルゲンから導いた少なくとも２つの領域（各領域は、好ましくは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含むレコンビトープペプチドは、そのアレルゲンに感受性の個人に投与したときに、そのアレルゲンに対する個人のＴ細胞応答を緩和することが出来る。ここで用いる場合、蛋白質アレルゲンに感受性の個人のアレルギー性応答の緩和は、標準的臨床手順で測定した場合の、アレルゲンに対する非応答性又は徴候の減少として規定することが出来る（Varney等、British MedicalJournal 302:265-269（1990）参照）。
ここに説明する仕事の結果として、蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原から導かれ、Ｔ細胞刺激活性を有し若しくは好ましくは少なくとも１つのＴ細胞エピトープをそれぞれ有する２つの領域を含むレコンビトープペプチドを生成した。Ｔ細胞エピトープは、それぞれアレルギー若しくは他の病気の臨床的徴候の原因となる蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に対する免疫応答の開始及び持続に関係すると考えられる。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面で適当なＨＬＡ分子に結合すること及び関連Ｔ細胞亜集団を刺激することによるＴヘルパー細胞のレベルにおける初期事象の引き金を引くと考えられる。これらの事象は、Ｔ細胞の増殖、リンホカインの分泌、局所的炎症反応、その部位への更なる免疫細胞の補充、及び抗体産生へ導くＢ細胞カスケードの活性化へ導く。これらの抗体の１つのイソタイプであるＩｇＥは、基本的に、アレルギー症状の進展に重要であり、その生産は、Ｔヘルパー細胞のレベルにおいて、分泌されたリンホカインの性質によって、初期に事象のカスケードにおいて影響を受ける。Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞レセプターによる認識の基本的要素若しくは最小単位であり、ここにエピトープは、レセプター認識に不可欠なアミノ酸を含み、蛋白質のアミノ酸配列において隣接し及び／又は隣接していなくてよい。Ｔ細胞エピトープは、ここで用いる場合、少なくとも２．０、一層好ましくは少なくとも２．５、更に好ましくは少なくとも３．５、最も好ましくは少なくとも５．０の刺激指標を有する。Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列に似せたアミノ酸配列、及び蛋白質アレルゲンに対するアレルギー性応答を緩和するアミノ酸配列は、この発明の範囲内にある。
患者を蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に由来する本発明のレコンビトープペプチドにさらすと、適当なＴ細胞亜集団を寛容化若しくは無力化して、それらの蛋白質アレルゲン若しくは他の抗原に対する感受性を低下させ、免疫応答を刺激することに関与しなくさせる。更に、蛋白質アレルゲンから導いた本発明のレコンビトープペプチドの投与は、リンホカイン分泌プロフィルを、天然の蛋白質アレルゲン若しくはその一部分にさらすことに匹敵する程に加減することが出来る（例えば、ＩＬ−４の減少及び／又はＩＬ−２の増加を生じる）。更に、レコンビトープペプチドにさらすことは、通常アレルゲンに対する応答に関係するＴ細胞亜集団に影響を与えて、それらのＴ細胞が普通アレルゲンにさらされる部位（例えば、鼻粘膜、皮膚及び肺）から離れてレコンビトープペプチドを治療のために投与した部位に行くようにする。このＴ細胞亜集団の再分配は、個人の免疫系が、普通アレルゲンにさらされる部位において通常の免疫応答を刺激する能力を改善若しくは減じて、アレルギー症状の減少を生じる。
この発明のレコンビトープペプチドは、好ましくは、少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む（例えば、レコンビトープペプチドは、少なくとも約８アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基を含む）。この発明の他のレコンビトープペプチドは、同じ若しくは異なる蛋白質アレルゲン又は他の蛋白質抗原に由来する少なくとも２つの領域を含み、該レコンビトープペプチドはＴ細胞刺激活性を有し、各領域は好ましくはヒトＴ細胞刺激活性を有し、従って、蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。一般に、かかるレコンビトープペプチドの領域の各々は、少なくとも１つの蛋白質アレルゲンの少なくとも約７つのアミノ酸残基を含む。かかるレコンビトープペプチドの各領域は、好ましくは、少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む（例えば、レコンビトープペプチドは、少なくとも約８個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基を含む）。この発明のレコンビトープペプチドは、所望するだけ多くのアミノ酸残基を含むことが出来、好ましくは、蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の少なくとも約７個、一層好ましくは少なくとも約１５個、更に好ましくは少なくとも約３０個、最も好ましくは少なくとも約４０個のアミノ酸残基を含むことが出来る。レコンビトープペプチドの一領域は、好ましくは、４５アミノ酸残基の長さまで、一層好ましくは４０アミノ酸残基の長さまで、最も好ましくは３０アミノ酸残基の長さまでを含み、レコンビトープペプチドの一領域の長さが増大するとペプチド合成が困難となり、その領域とそれが由来した蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原との間のコンホメーションの類似性が維持されるために望ましくない特性が保持されるようになる（例えば、免疫グロブリン結合活性又は酵素活性）。所望であれば、これらの領域のアミノ酸配列を生成し、リンカーで結合して抗原提示細胞によるプロセッシングに対する感受性を増大することが出来る。かかるリンカーは、任意の非エピトープアミノ酸配列又は他の適当な架橋剤若しくは接合剤であってよい。
レコンビトープペプチドを蛋白質アレルゲンから導いたときは、それらは、同じ属（Dermatophagoides属；Felis属；Ambrosia属；Lolium属；Cryptomeria属；Alternaria属；Alder属；Betula属；Quercus属；Olea属；Artemisia属；Plantago属；Parietaria属；Canine属；Blattella属，Apis属；Periplaneta属等）に由来する異なる蛋白質アレルゲンから導かれた少なくとも２つの領域を含むことが出来る。更に、レコンビトープペプチドは、交差反応性の種に由来する少なくとも２つの領域を含むことが出来る（例えば、Dermatophagoides pteronyssinusに由来する領域とDermatophagoides farinaeに由来する領域）。他の実施態様において、これらの領域は、同じ種から導くことが出来る（例えば、Der p Iに由来する領域とDer p IIに由来する領域；Der f Iに由来する領域とDer f IIに由来する領域；Amb a Iに由来する領域とAmb a IIに由来する領域；Lol p Iに由来する領域とLol p IXに由来する領域；Cry j Iに由来する領域とCry j IIに由来する領域）。更に、レコンビトープペプチドは、同じ分類群に由来する異なる蛋白質アレルゲンから導かれる少なくとも２つの領域を含むことが出来る（例えば、Dermatophagoides pteronyssinusの分類群Ｉ蛋白質アレルゲン（即ち、Der p I）に由来する領域とDermatophagoides farinaeの分類群Ｉ蛋白質アレルゲン（即ち、Der f I）に由来する領域）。或は、これらの領域は、同じ科に由来する異なる蛋白質アレルゲンから導くことが出来る（例えば、Amb a I.1、Amb a I.2、Amb a I.3及びAmb aI.4）。Felis domesticusに対する感受性を治療するために特に好適なレコンビトープペプチドは、Felis属から導かれ、ＴＲＦＰのペプチドＸ、Ｙ、Ｚ、Ａ及びＢから選択する領域（各ペプチドは配列番号７〜１１で表され、それらのアミノ酸配列を図４に示す）及びそれらの改変物例えばペプチドＣ（配列番号１２）（ペプチドＡへの１アミノ酸付加であり、図４に示す）を含む。好適レコンビトープペプチドは、ペプチドＹＺＸ及びペプチドＡＹＺＸＢを含む。この出願においては、文字Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ、ペプチドＸ、ペプチドＹ、ペプチドＺ、ペプチドＡ、ペプチドＢ及びペプチドＣのことをいい、これらの文字を合わせて用いるとき（例えば、ＹＺＸ）は、私たちは、ペプチドＹ、ペプチドＺ及びペプチドＸを逐次的順序で含むレコンビトープペプチドをいう（即ち、ＹＺＸとはペプチドＹのアミノ酸配列の次に何ら介在アミノ酸残基を有することなく直接ペプチドＺのアミノ酸配列が続きその次に何ら介在アミノ酸残基を有することなくペプチドＸのアミノ酸配列が続くレコンビトープペプチドをいう）。この発明のレコンビトープペプチド例えばＹＺＸは、レコンビトープペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端に更なるアミノ酸残基を含むことが出来る。
この発明のレコンビトープペプチドは、抗原特異的な免疫応答の増強又は低下が望まれる蛋白質アレルゲン以外の蛋白質抗原から導くことが出来る。例えば、自己免疫疾患の病因論に関係する公知の自己抗原のヒトＴ細胞刺激活性を有する領域又は公知の自己抗原のＴ細胞エピトープを同定し及びレコンビトープペプチドに合わせて自己抗原に対する抗体の応答を減じ、効力を妨げ及び／又は免疫複合体関連の副作用を減じることが出来る。自己抗原のＴ細胞反応性を保存するために、ヒトＴ細胞刺激活性を有する自己抗原の領域を標準Ｔ細胞生物学技術によって規定することが出来るであろうし、或は、所望であれば、正確なＴ細胞エピトープを、微細マッピング技術によって規定することが出来且つ少なくとも２つの領域（各々はヒトＴ細胞刺激活性を有する）を含み、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むレコンビトープペプチドを生成することが出来る。例えば、もしヒトＴ細胞刺激活性を有する３つの領域又は３つのＴ細胞エピトープが自己抗原中でアミノ末端からカルボキシ末端へ逐次的且つ隣接して１、２、３の順序で見出されたならば、各領域又は各Ｔ細胞エピトープを一度ずつ用いる６つの可能なレコンビトープペプチドを生成することが出来るであろう（３つの領域又はＴ細胞エピトープを種々の順序、例えば２１３、３１２、１３２、３２１、１２３、２３１で含む）。これらの６つのレコンビトープペプチドを、Ｔ細胞活性を刺激する能力について試験し及び自己抗原中に存在する望ましくない特性のないこと（例えばレコンビトープペプチドが自己抗体に結合することが出来ないこと）を試験することが出来る。或は、前に説明したように、レコンビトープペプチドは、自己抗原から、どの領域がＴ細胞刺激活性を有するか若しくは正確なＴ細胞エピトープが何であるかを知ることなしに、構築することが出来る。これらのＴ細胞を刺激し且つ望ましくない自己抗原の特性を有しない（例えば、自己抗原に感受性の個人のかなりのパーセンテージにおいて自己抗体に結合しない）レコンビトープペプチドを、免疫療法剤又は診断用薬剤として利用するために選択する。治療用組成物の形態において、このレコンビトープペプチドを、生理的に許容し得るビヒクル中で、アジュバントなしで送達して、レコンビトープペプチドが自己抗原（それからレコンビトープが導かれる）に対する抗原特異的寛容を誘発し及び免疫応答に対する任意の潜在的障害を制御することを可能にする。レコンビトープペプチドの生成において有用な自己抗原には、糖尿病におけるインシュリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（６４Ｋ）、ＰＭ−１及びカルボキシペプチダーゼ；多発性硬化症におけるミエリン塩基性蛋白質；胎児性赤芽球症におけるｒｈ因子；重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプター；グレーブズ病における甲状腺レセプター；グッドパスチャー症候群における基底膜蛋白質；及び甲状腺炎における甲状腺蛋白質がある。例えば、ヒトＴ細胞刺激活性を有するミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）の領域（例えば、ヒトＭＢＰのアミノ酸残基８４〜１０６、一層好ましくは８４〜１０２、更に好ましくは８９〜１０１の全部若しくは一部を含む領域及びヒトＭＢＰのアミノ酸残基１４０〜１７２、一層好ましくは１４３〜１６８の全部若しくは一部を含む領域）は、多発性硬化症を治療するのに用いるためのこの発明のレコンビトープペプチドを構成し得る。
この発明の範囲内のレコンビトープペプチドを個人の蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に対する感受性を治療し又は診断する方法において利用することが出来る。従って、この発明の１つの面は、レコンビトープペプチドと製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤とを含む治療用組成物を提供する。蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に対する個人の感受性を低下させるための本発明の治療用組成物の投与は、公知の技術を用いて実施することが出来る。例えば、レコンビトープペプチドは、適当な希釈剤、キャリアー及び／又はアジュバント（適当であるならば）と組み合わせて投与することが出来る。製薬上許容し得る希釈剤は、塩溶液及び緩衝剤水溶液を含む。製薬上許容し得るキャリアーは、ポリエチレングリコール（Wie等、InternationalArchives of Allergy and Applied Immunology 64:84-99（1981））及びリポソーム（Strejan等、Journal of Neuroimmunology 7:27（1984））を含む。製薬上許容し得るアジュバントはミョウバンを含む。かかる組成物は、一般に、注射（皮下注射、静脈注射等）、経口投与（例えば、カプセル形態）、吸入法、経皮投与又は直腸投与によって投与することが出来る。この発明の治療用組成物を、レコンビトープペプチドが導かれるアレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に感受性の個人に、そのアレルゲン若しくは他の抗原に対する個人の感受性を減じるのに有効な投与量及び期間で投与する。１種類以上の同じ若しくは異なる治療用組成物の治療上有効な量を、アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に感受性の個人に同時に若しくは逐次的に投与することが出来る。これらの治療用組成物の有効量は、個人の感受性の程度、年齢、性別及び個人の体重、並びに個人におけるＴ細胞応答を刺激するペプチドの能力等の因子によって変化するであろう。本発明の更に他の面において、少なくとも２種のレコンビトープペプチドを含む組成物（例えば、少なくとも２種のレコンビトープの物理的混合物）を提供し、各々は、同じ若しくは異なる蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原から導かれる少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。
本発明は又、蛋白質抗原に対する個人の感受性を検出する方法及び蛋白質抗原に特異的な免疫グロブリンの存在及びその抗原に応答する個人のＴ細胞の能力を測定する方法をも提供する。感受性を検出するために、個人から得た血液試料又はその試料の少なくとも一部を、蛋白質抗原、蛋白質抗原の改変型又は何れかの抗原の一部と合わせ、各々は、血液成分を抗原、改変抗原又はそれらの一部で結合するのに適した条件下でその抗原に特異的な免疫グロブリンに結合する。蛋白質抗原、改変抗原若しくはそれらの一部との血液成分の結合が見出された個人から得た第２の血液試料、又は蛋白質抗原、改変抗原若しくはそれらの一部との血液成分の結合が見出された個人からの第１の血液試料の第２の部分を、Ｔ細胞刺激が起きるか否かを測定するために、蛋白質抗原から導いた少なくとも２つの領域を含むレコンビトープペプチド（該レコンビトープペプチドはＴ細胞刺激活性を有する）；又は蛋白質抗原から導いた少なくとも２つの領域を含むレコンビトープペプチド（各領域はヒトＴ細胞刺激活性を有する）；又は蛋白質抗原の改変型若しくはその一部；又は組換えにより生成した蛋白質抗原（各々は、蛋白質抗原に感受性の個人の集団のかなりのパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）において蛋白質抗原に特異的な免疫グロブリンに結合しない）と合わせる。もし蛋白質抗原が蛋白質アレルゲンであるならば、蛋白質アレルゲンの改変型若しくはその一部、組換えにより生成した蛋白質アレルゲン、又は蛋白質アレルゲンに由来するレコンビトープペプチドは、その蛋白質アレルゲンに特異的なＩｇＥに結合せず、或はもしＩｇＥの結合が起きたとしても、かかる結合は、そのアレルゲンに感受性の個人の集団のかなりのパーセンテージにおいてマスト細胞若しくは好塩基球からの媒介物質の放出を生じない。もし個人が、抗原、改変抗原若しくはそれらの一部に対する血液成分の結合を有すること及びレコンビトープペプチド、改変蛋白質抗原若しくはそれらの一部又は組換えにより生成した蛋白質抗原に応答するＴ細胞刺激が見出されたならば、その個人に、レコンビトープペプチド、組換えにより生成した蛋白質抗原又は蛋白質抗原若しくはその一部の改変型及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは稀釈剤を含む治療上有効な量の治療用組成物を投与してその個人の蛋白質抗原に対する感受性を低下させることが出来る。
本発明は又、個人における少なくとも１種の蛋白質アレルゲンに対する特定の遅延型過敏症を検出する方法をも提供する。この方法によって、遅延型過敏症試験（例えば、Immunology（1985）Roitt, I.M., Brostoff, J.,Male, D.K.（編集）, C.V. Mosby Co., Gower MedicalPublishing, London, NY, pp.19.2-19.18:pp22.1-22.10）を、改変型の蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原又はそれらの部分又は組換えにより生成した蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原、又は少なくとも１種の該蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に由来するレコンビトープペプチド（各々は、ヒトＴ細胞刺激活性を有し及び、該蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に感受性の個人のかなりのパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）において蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に特異的な免疫グロブリンに結合しない）を用いて、個人に施す。二量体形態のＴＲＦＰの組換え鎖１は顕著に減少したＩｇＥ結合を有するが、Ｔ細胞反応性を維持する（即ち、組換え二量体鎖１はペプチドＸ及びＹを含み、これら両者は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むことが知られている）こと及び弱アルカリ処理したＴＲＦＰは顕著に減じたＩｇＥ結合を有するが、Ｔ細胞反応性を維持していることが見出された。従って、二量体形態のＴＲＦＰの組換え鎖１又はアルカリ処理したＴＲＦＰを上記の遅延型過敏症試験又は他の診断用アッセイにおいて用いてＴＲＦＰのＴ細胞エピトープに対する個人の感受性を測定し及び／又はＴＲＦＰに対する個人の感受性を低下させるための治療用組成物において用いることが出来る。遅延型過敏症試験を施した後に、特定の遅延型過敏症がその個人において蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原に対して起きる程度（その個人における、その蛋白質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原のＴ細胞エピトープに特異的なＴ細胞の存在を示す）を測定する。
本発明は、更に、個人における少なくとも１種の蛋白質アレルゲンに対する感受性を検出し治療する方法を提供する。少なくとも１種の蛋白質アレルゲンに特異的なＩｇＥの個人における存在及びそれらの個人のＴ細胞の蛋白質アレルゲンのＴ細胞エピトープに応答する能力を、それらの個人に即時型過敏症試験及び遅延型過敏症試験を施すことによって測定することが出来る。これらの個人に即時型過敏症試験（例えば、Immunology（1985）Roitt,I.M, Brostoff.J., Male,D.K.（編集）,C.V.Mosby Co.,Gower Medical Publishing, London, NY, pp.19.2-19.18:pp22.1-22.10を参照）を、蛋白質アレルゲン若しくはその一部、又は蛋白質アレルゲンの改変型若しくはその一部（各々は、アレルゲンに特異的なＩｇＥに結合する）を用いて施す。同じ個人に、即時型過敏症試験を施す前に、同時に、又は続いて遅延型過敏症試験を施す。勿論、もし即時型過敏症試験を遅延型過敏症試験の前に施すならば、遅延型過敏症試験は、特定の即時型過敏症反応を示した個人に対して行なわれる。遅延型過敏症試験は、改変型の蛋白質アレルゲン若しくはその一部、組換えにより生成した蛋白質アレルゲン又は蛋白質アレルゲンから導いたレコンビトープペプチド（各々は、ヒトＴ細胞刺激活性を有し且つ、そのアレルゲンに感受性の個人の集団のかなりのパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）のアレルゲンに特異的なＩｇＥに結合しない）を利用する。これらの特定の即時型過敏症反応及び特定の遅延型過敏症反応の両者を有することが見出された個人には、治療上有効な量の治療用組成物を投与する。この治療用組成物は、改変型の蛋白質若しくはその一部、組換えにより生成した蛋白質アレルゲン、又はレコンビトープペプチド（各々、遅延型過敏症試験で使用）及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは稀釈剤を含む。
溶解度を増加させ、治療若しくは予防効果又は安定性（例えば、生体外での貯蔵寿命及び生体内での蛋白質加水分解による劣化に対する抵抗性）を増大する等の目的のためにレコンビトープペプチドの構造を改変することも又可能である。アミノ酸の置換、欠失又は追加等によりアミノ酸配列を変更して免疫原性を改変し及び／又はアレルギー誘発性を減じた、或は同じ目的のために成分を加えた改変したレコンビトープペプチドを生成することが出来る。例えば、Ｔ細胞エピトープ機能に不可欠なアミノ酸残基を、公知の技術（例えば、各残基の置換及びＴ細胞反応性の存否の測定）を用いて決定することが出来る。それらの不可欠に見える残基を改変することが出来（例えば、その存在がＴ細胞反応性を増大させるように見える他のアミノ酸で置換する）、同様に、Ｔ細胞反応性に必要でない残基も改変することが出来る（例えば、その取り込みがＴ細胞反応性を増大させるが関連ＭＨＣへの結合を減じることのない他のアミノ酸で置換する）。レコンビトープペプチドの改変の他の例は、システイン残基の好ましくはアラニン又はグルタミン酸との置換であり、或はセリン若しくはスレオニンと置換してジスルフィド架橋を介しての二量体形成を最小化することである。安定性及び／又は反応性を増大させるために、レコンビトープペプチドを改変して１つ以上の多形性（自然の対立遺伝子変化により生じる）を、蛋白質アレルゲンのアミノ酸配列に取り込むことも又可能である。更に、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸又は非アミノ酸アナログでの置換又は付加により改変ペプチドを生成することがこの発明の範囲内で出来る。更に、レコンビトープペプチドを、A. Sehonと共同研究者（Wie等、前掲書）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて改変してＰＥＧと結合したペプチドを生成することが出来る。レコンビトープペプチドの改変は又、還元／アルキル化（Tarr:Methods of ProteinMicrocharacterization,J.E.Silver編Humana Press, Clifton, NJ,pp155-194（1986））；アシル化（Tarr:前掲書）；エステル化（Tarr:前掲書）；適当なキャリアーへの化学結合（Mishell及びShiigi編Selected Methods in Cellular Immunology, W H Freeman, San Francisco,CA（1980）；米国特許4,939,239号）；又は温和なホルマリン処理（Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology 41:199-215（1971））を含むことも出来る。
精製を容易にして、レコンビトープペプチドの溶解度を潜在的に増大するために、レポーター基をそのペプチドの主鎖に付加することが出来る。例えば、ポリヒスチジンをレコンビトープペプチドに加えて、不動化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上でレコンビトープペプチドを精製することが出来る（Hochuli, E.等Bio/Technology, 6:1321-1235（1988））。更に、所望であれば、特定のエンドプロテアーゼ開裂部位をレポーター基とレコンビトープペプチドのアミノ酸配列との間に導入して無関係の配列を含まないレコンビトープペプチドの単離を容易にすることが出来る。蛋白質抗原に対する個人の感受性をうまく低下させるためには、レコンビトープペプチドの溶解度を、官能基をそのペプチドに加えるか又は疎水性のＴ細胞エピトープ若しくは疎水性エピトープを含む領域をレコンビトープペプチド中に含まないことによって増大させることが必要であろう。
レコンビトープペプチド内のＴ細胞エピトープの適当な抗原プロセッシングを潜在的に助けるために、標準的なプロテアーゼ感受性部位を、組換えにより又は合成技術により、それぞれ少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む領域と領域の間に存在させることが出来る。例えば、帯電したアミノ酸対例えばＫＫ又はＲＲを、レコンビトープペプチドの組換えによる構築の際に、レコンビトープペプチド内の領域間に導入することが出来る。その結果生成したレコンビトープペプチドは、カテプシン及び／又は他のトリプシン様酵素開裂に感受性となり、１つ以上のＴ細胞エピトープを含むレコンビトープペプチドの部分を生成することが出来る。更に、かかる帯電したアミノ酸残基は、レコンビトープペプチドの溶解度の増大を生じ得る。
レコンビトープペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を用いてレコンビトープペプチドの構造を改変することが出来る。かかる方法はＰＣＲ（Ho等、Gene 77:51-59（1989））又は突然変異遺伝子の全合成（Hostomsky, Z等、Biochem. Biophys. Res. Comm.161:1056-1063（1989））を含んで良い。細菌での発現を増大させるために、前記の方法を他の手順と共に用いて、レコンビトープペプチドをコードするＤＮＡ構築物において真核生物コドンを大腸菌中で優先的に用いられるものに変えることが出来る。
本発明は又、この発明のレコンビトープペプチドをコードする核酸配列をも提供する。この発明の任意の実施態様において用いる核酸配列は、ここで説明するようなｃＤＮＡであってよく、或は、ここに表す配列の全部若しくは一部を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド配列又はそれらの機能的同等物であってよい。かかるオリゴヌクレオチド配列は、公知の技術を用いて、化学的に若しくは機械的に生成することが出来る。オリゴヌクレオチド配列の機能的同等物とは、１）オリゴヌクレオチド配列（又は対応する配列部分）若しくはその断片がハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることの出来る配列、又は２）オリゴヌクレオチド配列に相補的な配列（又は対応する配列部分）及び／又は３）オリゴヌクレオチド配列（又は対応する配列部分）によりコードされる生成物と同じ機能的特性を有する生成物（例えば、蛋白質、ポリペプチド又はペプチド）をコードする配列であるものである。機能的同等物が１つ以上の基準に適合しなければならないかどうかは、その利用によるであろう（例えば、もしそれが単にハイブリダイゼーションのプローブとして用いられるのであれば、第１若しくは第２の基準に適合すれば良く、それを本発明のペプチドを生成するために用いるならば、単に第３の基準に適合しさえすれば良い）。
後述の実施例において説明するように、ヒトＴ細胞反応性ネコ蛋白質（ＴＲＦＰ）の鎖１（配列番号１〜４）及び２（配列番号５〜６）を、組換えにより大腸菌内で発現させて精製した。ＴＲＦＰアミノ酸配列から導いた重複するペプチド領域を用いるＴ細胞エピトープの研究を用いてＴＲＦＰの各鎖中の複数のＴ細胞エピトープを同定した。実施例２において詳細に説明するように、ＤＮＡ構築物を組み立てたが、そこにおいて、それぞれＴＲＦＰの主要ヒトＴ細胞エピトープを少なくとも１つ含む３つの領域（ペプチドＸ、ペプチドＹ、ペプチドＺと呼ぶ）を６通りの可能な組合せで結合して、６つの異なる構成の３つの領域を含むレコンビトープペプチドをコードする６つＤＮＡ構築物を生成した。ペプチドＸが５アミノ酸をそのカルボキシ末端で、ペプチドＹのアミノ末端の５アミノ酸と共有しているので、レコンビトープペプチドＸＹＺ及びＺＸＹは、該５アミノ酸の重複を有しても有さなくても構築することが出来る（ＺＸＹが５アミノ酸の配列の重複を有さずに組み立てられている図１１を参照されたい）。下記の実施例において、これらのレコンビトープペプチドを、５アミノ酸の重複なしで隣接して組み立てた。３領域Ｘ、Ｙ及びＺに加えて、それぞれ少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む他の領域も又、これらのレコンビトープペプチド及び生成した４つ以上の領域（Ｎ！通りの構成、ここにＮ＝領域の数）を有するＤＮＡ構築物に含まれ得る。或は、１つ以上の領域を、ペプチドＸ、ペプチドＹ又はペプチドＺの替わりに、例えば図４に示すように、ペプチドＡ若しくはＢを用いて、例えばレコンビトープペプチドＡＸＹを生成することが出来る。
精製の助けとしてレコンビトープペプチドに付加した外来の配列の開裂及び除去のための詳細なプロトコールを説明する。精製したレコンビトープペプチドを、ヒトのネコアレルギー患者のＩｇＥの結合についてウエスタンブロットにて試験し、ＴＲＦＰの組換えの鎖１及び２のＩｇＥ結合と比較した。ＥＬＩＳＡを行なって、アレルギー性ＩｇＥのレコンビトープペプチドへの結合を天然のＴＲＦＰ、組換え鎖１及び組換え鎖２と比較して試験した。ここに説明する仕事は、本発明のレコンビトープペプチドが、それらのエピトープ構成が一般に天然のＴＲＦＰ蛋白質配列において見出されるものと異なっていてもＴ細胞刺激活性を有するということを示す。更に、レコンビトープペプチドの予防剤としての利用を、マウスを天然ＴＲＦＰ、ＴＲＦＰの組換え鎖１若しくは鎖２又はレコンビトープペプチドを用いる抗原対抗にて低感受性にして示した。
この発明を下記の非制限的実施例により更に説明する。
実施例１  重複ＴＲＦＰペプチドを用いるＴ細胞エピトープ研究
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ネコアレルギーの臨床的徴候を示し、ネコ抽出物を用いた皮膚試験で陽性であったネコアレルギー患者からのヘパリンで凝血防止した血液６０ｍｌをFicoll-Hypaque遠心分離することにより精製した。個人の患者からの１０００万個のＰＢＭＣを５％のプールしたヒトＡＢ血清を含み且つグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＨＥＰＥＳ緩衝液を補った１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Gibco）（完全ＲＰＭＩ１６４０）中で、アフィニティー精製した天然ＴＲＦＰ２０μｇ／ｍｌを存在させて３７℃で７日間培養した。次いで、生存力のある細胞をFicoll-Hypaque遠心分離によって精製し、更に２週間、５単位の組換えヒトＩＬ−２／ｍｌ及び５単位の組換えヒトＩＬ−４／ｍｌを含む完全ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。次いで、この培養から生じた休止Ｔ細胞を、９６ウェルミクロ滴定プレートを用いる第２の増殖アッセイにおいて試験して、図３に示すように、種々のＴＲＦＰペプチド若しくは蛋白質（ＴＲＦＰ抗原）に対するＴ細胞応答を評価した。アッセイ用に、２×１０4の休止Ｔ細胞を完全ＲＰＭＩ１６４０中で、５×１０4の自家ＰＢＭＣ（３５００ラド）を抗原提示細胞として存在させて、各ウェル当り２００μｌの量で種々の濃度のＴＲＦＰ抗原の１つと共に３日間３７℃で培養した。次いで、各ウェルに１μＣｉのトリチウム化チミジンを１６時間与えた。取り込まれたカウントをガラス繊維フィルター上に集めて液体シンチレーション計数処理した。次いで、各ペプチドに対する応答の刺激指標を、培地のコントロールＣＰＭで割った抗原に対する応答の最大ＣＰＭとして計算した。刺激指標２．５をＴ細胞応答陽性であるとみなした。（この出願で用いる場合、ヒトＴ細胞刺激活性を刺激指標少なくとも２．０と定義する。しかしながら、この発明のレコンビトープを生成するのに用いるべきＴ細胞エピトープ若しくは領域の刺激指標は、少なくも２．０、好ましくは少なくとも２．５、一層好ましくは少なくとも３．５、最も好ましくは少なくとも５．０である。）３４のかかる実験の結果の要約を図３に示す。トップ５ペプチドの、各患者由来のＴ細胞系統によるＴＲＦＰの鎖１及び鎖２をカバーするＴＲＦＰペプチドの重複した組に対する応答をランク付けして、最高の陽性応答をａ５、次に高い陽性をａ４等とした。次いで、各ペプチドについて得られたランクの総計を計算したものを図３にヒストグラムで示す。この型の分析は、完全な蛋白質に対するＴ細胞応答におけるＴＲＦＰ分子の異なる領域の相対的重要性を強調する。これらの結果は、この患者のパネルにおけるＴ細胞反応性の主要領域が、Fel-14.2（鎖１、アミノ酸残基２９〜４２）、Fel-3.1（鎖１、アミノ酸残基１８〜３２）、Fel-2（鎖１、アミノ酸残基９〜２５）、Fel-21（鎖１、アミノ酸残基５６〜７０）、Fel-29（鎖１、アミノ酸残基５６〜７０）、Fel-1.2（鎖１、アミノ酸残基１〜１７）、Fel-4（鎖１、アミノ酸残基３７〜５５）、Fel-18（鎖２、アミノ酸残基２３〜４８）、Fel-25（鎖２、アミノ酸残基４９〜６８）、Fel-16（鎖２、アミノ酸残基１〜２２）、Fel 23（鎖１、アミノ酸残基５１〜６６）によって（重要性の順に）取り囲まれていることを示す。次いで、ペプチドの組を、これらの領域をカバー���るようにデザインした。Fel-1.2、Fel-2、Fel-3.1及びFel-14.2の部分は、ペプチドＸ（鎖１、アミノ酸残基７〜３３）を含む。Fel-3.1、Fel-14.2及びFel-4の部分は、ペプチドＹ（鎖１、アミノ酸残基２９〜５５）を含む。Fel-16、Fel-17及びFel-18の部分は、ペプチドＺ（鎖２、アミノ酸残基１４〜３９）を含む。Fel-4、Fel 21及びFel-23の部分は、ペプチドＡを含む。Fel-29の部分は、ペプチドＢを含む。ペプチドＸ、Ｙ、Ｚ、Ａ及びＢを図４に示す。
実施例２  レコンビトープペプチドの構築及び発現
合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応））を利用して、ペプチドＸ、Ｙ及びＺの配列をコードするＤＮＡを構築した。大腸菌内での発現を増大させる目的で、オリゴヌクレオチド中のコドンを、高度に発現される大腸菌蛋白質において優勢なコドンの表から選択した。Sharp, P.M.,等、Nucl. AcidsRes. 16:8207（1988）。レコンビトープペプチドを構築するために用いたオリゴヌクレオチド及びＰＣＲ手順を以下に詳細に説明する。
オリゴヌクレオチドを、大腸菌好適コドンを用いて、図５及び６に表示するようにデザインした。これらのオリゴヌクレオチド（図７に示すＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ及びＯ）（配列番号１２〜３７）をPerkin Elmer/Cetus Gene Ampキットを用いて、２つの別々のＰＣＲ反応（ＰＣＲ＃１及びＰＣＲ＃２、ＰＣＲ＃１はレコンビトープペプチドをコードするＤＮＡ分子の５’部分の合成を、ＰＣＲ＃２はレコンビトープペプチドをコードするＤＮＡ分子の３’部分の合成を生じた）にて増幅した。オリゴヌクレオチド（Ｃ〜Ｉ）を用いて単一ＰＣＲ反応を行なった場合にレコンビトープＹＺＸの適当なＰＣＲ生成に干渉することが見出された配列（ＫＡＬＰＶ（配列番号８のアミノ酸残基１〜５））がペプチドＸ及びペプチドＹの両方に存在するためにこのアプローチを取った。レコンビトープペプチドＡＹＺＸＢの生成において、図６に示すように、ＰＣＲ＃１で用いたオリゴヌクレオチドは、Ｎ、Ｊ、Ｋ及びＣ〜Ｉであり、ＰＣＲ＃２で用いたオリゴヌクレオチドは、Ｃ〜Ｉ及びＬ、Ｍ、Ｏであった。レコンビトープペプチドＹＺＸの生成において、図５に示すように、ＰＣＲ＃１で用いたオリゴヌクレオチドは、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦであり、他方、ＰＣＲ＃２で用いたオリゴヌクレオチドは、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩであった。各反応混合物（１０ｍｇ）は、意図したＹＺＸ構造の５’側半分と３’側半分をそれぞれ生成した（図５）。これらのＰＣＲ混合物を、Ｔａｑポリメラーゼを加えた後に、下記の変性、アニーリング及び重合のサイクルを有するプログラムにかけた：
工程＃    温度                    時間
１        ９４℃                  １分間
２        ５０℃                  １．５分間
３        ７５℃                  ２分間
４        工程１〜３を繰り返す（４回）
５        ９４℃                  １分間
６        ６０℃                  １．５分間
７        ７５℃                  ２分間
８        工程５〜７を繰り返す（２０回）
９        ４℃に維持
ＹＺＸ構造の構築においてＰＣＲ＃１及びＰＣＲ＃２反応が完了した後、それぞれからのアリコート（１０μｇの全反応混合物の１００ｐモル；１／１００容積）を１組の５’及び３’プライマー（１００ｐモルのプライマーＣ及びＩ）を含む第３のＰＣＲ反応混合物に加えた。第３のＰＣＲ反応（ＰＣＲ＃３）を、この第３のＰＣＲ反応混合物を用いて、ＰＣＲ＃１及び＃２について前述したようにして行なった（但し、工程６でのアニーリング温度を６５℃に高めた）。ＰＣＲ＃３の完了は、レコンビトープペプチドＹＺＸをコードするＤＮＡを生成した。ＰＣＲ＃３反応方法は、Horton, R.M.等Gene77:61（1989）に記載されたものと類似している。ＰＣＲ＃３で用いた全反応混合物を２％アガロースゲル上で分画し、ゲルスライスから適当なサイズのバンド（２３０ｂｐ）を泳動溶出して沈殿させた。単離したレコンビトープペプチドＹＺＸをコードするＤＮＡを、過剰の５’及び３’増幅用プライマー（Ｃ及びＩ）を用いて別のＰＣＲ反応にかけた。この最終生成物を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、ベクターｐＥＴｌｌｄに入れて、ファージＴ７ｇｎ１０１ａｃ０融合プロモーターの転写制御下でクローン化した。Studier,F.W.等、Methods in Enzymol.185:60（1990）。
６つの逐次的ヒスチジンをコードするポリリンカー、（ＣＡＣ）６、をフレームを合わせて、レコンビトープペプチドＹＺＸをコードするＤＮＡの５’末端にクローン化した。この６つのヒスチジン（Ｈ6若しくはＨｉｓ６）リーダー配列は、QIAGEN NTA-アガロース（ドイツ国、Dusseldorf在、Diagen社）、Ｎｉ2+キレート支持体を用いる発現したレコンビトープペプチドの精製を可能にした。Hochuli, E.,等、BioTechnology 6：1321（1988）。部位特異的な酵素開裂部位（例えば、トロンビン、因子Ｘa等）をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて、ポリヒスチジンコード配列（Ｈ6）とレコンビトープペプチド主鎖をコードするＤＮＡとの間に挿入することが出来る。レコンビトープペプチドＹＺＸの場合、トロンビン認識部位（ＬＶＰＲＧＳ）（配列番号７２）を挿入した。Uhlen, M.,Moks, T. Methods in Enzymol. 185:129（1990）, Chang, J.-Y. Eur.J.Biochem. 151:217（1985）。
レコンビトープペプチドＹＺＸをコードするＤＮＡを構築するために上述したのと同じ手順を用いて、レコンビトープペプチドＸＹＺ及びＺＹＸをコードするＤＮＡを構築した。更に、他のＴ細胞エピトープを含むペプチドを、存在するレコンビトープ主鎖構造例えばＹＺＸ（その生成は上述した）に追加することが出来、レコンビトープペプチドＡＹＺＸＢの構築の場合等がそれである（図６及び７参照）。或は、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを、存在するレコンビトープ主鎖を利用せずにここに概説する方法を用いて生成することが出来る。レコンビトープペプチドＡＹＺＸＢを生成するために、レコンビトープペプチドＹＺＸの各末端に対する重複領域を有するオリゴヌクレオチドプライマー（Ｊ〜Ｍ）及び５’及び３’増幅用プライマー（Ｎ及びＯ）を生成した（図６に示すように、分子の薄黒くした部分が重複配列である）。ＰＣＲ反応を上述のようにして行なった。その結果生成したＡＹＺＸＢ断片を単離してｐＥＴｌｌＤＨ6ＴＨベクター中にサブクローン化した。
別の手順を用いて、レコンビトープペプチドＸＺＹ、ＹＸＺ及びＺＸＹをコードするＤＮＡを構築した。レコンビトープペプチドＸＺＹ、ＹＸＺ及びＺＸＹをコードする各ＤＮＡ構築物を、レコンビトープペプチドの最もＮ末端側のアミノ酸をコードするコドンにおいて、リーダー配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＥＦ（配列番号７３）（ここに、アミノ酸ＥＦは、配列番号７４で表されるＥｃｏＲＩ制限部位ＧＡＡＴＴＣによりコードされる）をコードするＤＮＡと連結した。３つのレコンビトープペプチドをコードするＤＮＡセグメントを、本質的にHorton等（1989）Gene 77:61-68により記載された連続的ＰＣＲによって組み立てた。ペプチドＸ、Ｙ及びＺ（図４に示す）をコードするＤＮＡセグメントを、Morgenstern等（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88:9690-9694に記載されたFel dＩｃＤＮＡから増幅した。特定の一例としてレコンビトープペプチドＸＺＹコード配列の構築を示す図９に示すように、オリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ配列を用いて合成したが、それは、単に特定のペプチドＸ、Ｙ若しくはＺをコードするＤＮＡセグメントを増幅するだけでなく、隣接するペプチドＸ、Ｙ若しくはＺをコードするＤＮＡセグメントの小セグメント（９〜１８塩基対）を共有結合する。ＰＣＲを、Vent（商標）ポリメラーゼを用いて、New England Biolabの指示に従って、増幅プログラム３０Ｘ［９４℃  １分／６０℃  １分３０秒／７２℃  １分］を用いて行なった。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーを図１０に示す。ＰＣＲ増幅からの個々のレコンビトープペプチドをコードするＤＮＡ断片／リンカーＤＮＡ断片を３％（wt./vol.）NuSieve（FMC）アガロース中の調製用ゲル電気泳動により精製した。これらの個々のＰＣＲ断片を、次いで、第２のＰＣＲ反応において結合して、図９及び１１に示すようなＸＺＹをコードするＤＮＡ構築物を形成した。これらのＰＣＲ断片を結合させるために、初期ＰＣＲ生成物を含む３％NuSieveゲルスライスを７０℃で溶融し、各１μｌを、５’ＲＩ（ＮＨ2末端）及び３’Ｂａｍ（ＣＯＯＨ末端）プライマーを用いるVent（商標）ＰＣＲポリメラーゼ反応に加えた。
発現ベクターｐＥＴｌｌｄ（Studier等、1990）中に存在する制限部位の故に、すべての最５’末端プライマーは、特定のレコンビトープのＮＨ2末端アミノ酸をコードするＤＮＡとフレームを合わせて配列番号７４で表されるＥｃｏＲＩコード部位［ＧＡＡＴＴＣ］を有し、他方、３’末端プライマーの最後は配列番号７５で表されるＢａｍＨＩコード部位［ＧＧＡＴＣＣ］を有した。第２ＰＣＲから生成したレコンビトープペプチドＸＺＹ、ＹＸＺ及びＺＸＹをコードするＤＮＡ構築物を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化して、０．５（wt./vol.）NuSieve（FMC）アガロースゲルを通して電気泳動した。ＤＮＡ構築物を含むゲルスライスを７０℃で溶融して、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したBluescript KSプラスミッド（Stratagene）を用いる連結反応に加えた。この連結物をコンピテントXL-1 Blueバクテリア（Stratagene）中にトランスホームし、挿入物を有する組換えプラスミッドを、Qiatopキット（Diagen GmbH）を用いて単離した後に分析用制限消化によって同定した。挿入物の配列を、Sequenase IIキット（United States Biochemicals）を用いてジデオキシチェーンターミネーション配列分析によって確認した。
正しい核酸配列を有するレコンビトープペプチドＸＺＹ、ＹＸＺ及びＺＸＹ挿入物をコードするＤＮＡ構築物を有するBluescript KSプラスミッドをＥＣｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化し、それらのＤＮＡ構築物を、上述のように、発現ベクターｐＥＴｌｌｄ中に、配列番号７３で表されるＮＨ2末端リーダーＭＧＨＨＨＨＨＨＥＦをコードするＤＮＡとフレームを合わせてサブクローン化するために０．６％SeaPlaqueゲルから単離した。これらの構築物をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴｌｌｄＨｉｓ6Amb a I.1ＨＲ中にサブクローン化した。この連結は、ＤＮＡ構築物の挿入物（この場合、主要ブタクサアレルゲンAmb a I.1のｃＤＮＡ）を交換するのに役立った（Rafnar等（1991）J.Biol.Chem. 226:1229-1236）。ｐＥＴｌｌｄＨｉｓAmb a I.1 ΔＨＲをｐＥＴｌｌｄから２工程で導いた。第１のｐＥＴｌｌｄをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で平滑化し及びそれを自身に連結してｐＥＴｌｌｄΔＨＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を欠くｐＥＴｌｌｄプラスミッド）を創った。次いで、ｐＥＴｌｌｄＨｉｓ6Amb a I.1ΔＨＲを、Ｈ6 Amb a I.1カセットをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として発現ベクターｐＥＴｌｌｄＨｉｓAmb a I.1から切除し、それをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴｌｌｄΔＨＲ中に連結することにより形成した。組換えプラスミッドを、Qiatipキットによる単離の後に分析用制限酵素消化により同定し、陽性のプラスミッドを発現用のコンピテントＢＬ２１［ＤＥ３］バクテリア中にトランスホームした。ＢＬ２１［ＤＥ３］は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下のファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する組換えファージ１溶原ＤＥ３を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子発現は、ＩＰＴＧの添加により誘発され、それは更にｐＥＴベクターＴ７ｇｎ１０１ａｃ０融合プロモーターの３’側にサブクローン化した組換え遺伝子の高レベルの発現へと導く。
ｐＳＥＭ中にサブクローン化した、ＴＲＦＰ成熟鎖１及び２の（Ｈ6）融合物をコードするＰＣＲで誘導したＤＮＡ断片（１９９１年２月２８日出願の米国特許出願第６６２，２７６号）を切り出してｐＥＴｌｌｄ中に連結した。これを、２つの鎖の３’末端のＰｓｔＩ部位にＢｃｌＩリンカーを付け、それらの鎖の５’末端をＮｃｏＩ消化し、及び５’ＮｃｏＩ／３’ＢｃｌＩ断片を５’ＮｃｏＩ／３’ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴｌｌｄ中に挿入することによって達成した。
ＴＲＦＰの組換えペプチド鎖１及び２並びにレコンビトープペプチドＸＹＺ、ＸＺＹ、ＹＺＸ、ＺＹＸ、ＺＸＹ及びＹＸＺを大腸菌内で発現して本質的に以下に概説するように精製した。ｐＥＴｌｌｄ発現ＤＮＡ構築物を有するＢＬ２１ＤＥ３宿主細菌を、２００μｇ／ｍｌアンピシリンを補ったＢＨＩ寒天プレート（３．７％wt./vol.Difco Brain Heart Infusion; １．５％wt./vol.Difco寒天）上に線状接種して３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを２ｍｌの２００μｇ／ｍｌアンピシリン／ＢＨＩ培地（３．７％wt./vol. Difco Brain Heart Infusion）に接種し、３００ｒｐｍにて３７℃で濃濁する（但し、飽和には至らない）まで震盪した。次いで、２ｍｌの培養物を１００ｍｌの２００μｇ／ｍｌアンピシリン／ＢＨＩ培地に加え、３００ｒｐｍで３７℃にて濃濁する（但し、飽和に至らない）まで震盪し、その時点で培養物を、１８ｘ２５０ｍｌ（４．５リットル）の２００μｇ／ｍｌアンピシリン／ＢＨＩ培地に分割して３００ｒｐｍで３７℃にて震盪した。培養のＯＤ595が１．０に達したとき、（Ｈｉｓ）6融合ペプチドとしての組換えペプチドの発現を、ＩＰＴＧを４００μＭに添加して２時間継続することにより誘発した。
細菌を１０，０００×ｇ１５分の遠心分離によって集め、１／５０倍容の６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００ｍＭＮａＰＯ4、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に再懸濁した。組換え鎖１及び２並びにレコンビトープペプチド（組換えペプチド）を、再懸濁した細菌を１時間２５℃で激しく攪拌することにより抽出した。この懸濁液を１５，０００×ｇの遠心分離にかけて、上清を取り出し、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで８．０に調節し、ＮＴＡアガロースカラム（６Ｍ  グアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＰＯ4、１０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）で、溶出物のＯＤ280がバックグラウンドに達するまで平衡化しておく）に加えた。次いで、カラム緩衝液を、８Ｍ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＰＯ4、１０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）に交換した。平衡化の後、８Ｍ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１０ｍＭ  トリス（ｐＨ６．３）中で、溶出物のＯＤ280がバックグラウンドに達するまで、更に厳重な洗浄を行なった。次いで、各組換えペプチドを（Ｈｉｓ6融合物として）、８Ｍ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１０ｍＭ  トリス（ｐＨ４．５）中で溶出し、アリコートを集めてそれらのＯＤ280プロフィルをモニターした。そのペプチドピークを、分析用に、５００容のＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）中に３回透析した。収量は、一般に９０％を超える純度（ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの濃度走査により測定）で、組換えペプチド（Ｈｉｓ6）融合物２〜２５ｍｇ／ｌであった。
上述の組換えペプチド（ＴＲＦＰ鎖１、ＴＲＦＰ鎖２、ＸＹＺ、ＹＺＸ及びＺＹＸ）は、すべて、精製及び発現を助けるために加えられた配列番号７６で表されるＮ末端配列（例えば、ＭＧＨＨＨＨＨＨＬＶＰＲＧＳ−）を有する。この無関係のＮ末端配列は、配列が、ポリヒスチジン配列とレコンビトープ配列との間に挿入された配列番号７２で表されるトロンビン認識部位（ＬＶＰＲＧＳ）を含むので、蛋白質加水分解消化によって除去することが出来る（図８参照。矢印はトロンビン開裂部位を示す）。トロンビンを用いて２つの余分なアミノ酸残基のみの残留無関係配列、即ち、ＴＲＦＰ鎖１及び２並びにレコンビトープペプチドＸＹＺ、ＹＺＸ及びＺＹＸのＮ末端のＧＳを開裂させた（Chang,J.-Y. Eur. Biochem. 151:217-224（1985））。融合蛋白質の効率的開裂は、蛋白質対トロンビンの比１０００対１を２５℃で２時間用いることにより達成することが出来る。レコンビトープペプチドＹＺＸを構築するために用いた開裂及び精製の計画を以下に概説する：
１）レコンビトープペプチドMGHHHHHHLVPRGS-YZX
２）ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中に透析する
３）トロンビン開裂
ペプチド：トロンビン＝１０００：１
２５℃、２時間
４）５Ｍ  グアニジンＨＣＬ中の１００ｍＭ  ジチオスレイトールで還元
３７℃、３０分
５）Ｃ4逆相ＨＰＬＣ、ｐＨ２．０
６）凍結乾燥
分析用逆相ＨＰＬＣをＶＹＤＡＣ２１４ＴＰ５４カラム上で４２ｍｌ床容積にて行なった。そのカラムに３４０μｇのレコンビトープペプチドＹＺＸを載せた。半調製用ＨＰＬＣを、ＶＹＤＡＣ２１４ＴＰ１０２２カラムを用いて９５ｍｌ床容積にて９０ｍｇの蛋白質を載せて行なった。０％から開始して３０％に至る０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル勾配を最初の１０分間続け、その後３０〜４３％アセトニトリル勾配を１５分間続けた。次いで、移動相を４３％アセトニトリルにて１０分間保持した。精製されたレコンビトープペプチドＹＺＸが４３％アセトニトリルにて溶出した。開裂及び精製をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。レコンビトープペプチドＹＺＸの同定及び純度を、Applied Biosystem社、Protein Sequenator Model 477Aを用いる配列分析により決定した。
実施例３  ＩｇＥのＴＲＦＰ蛋白質及びレコンビトープに対する直接結合アッセイ
実施例２で生成したレコンビトープペプチドのウエスタンイムノブロット分析を行なった。すべての蛋白質試料（例えば、ＴＲＦＰ、ＴＲＦＰの組換え鎖１、ＴＲＦＰの組換え鎖２、レコンビトープペプチドＸＹＺ、レコンビトープペプチドＸＺＹ、レコンビトープペプチドＹＸＺ、レコンビトープペプチドＹＺＸ、レコンビトープペプチドＺＸＹ及びレコンビトープペプチドＺＹＸ）のゲル電気泳動用濃度をＢＣＡ法（Pierce Co.）により測定した。すべての蛋白質試料を５μｇ／レーンでゲルに載せた（但し、ＴＲＦＰは１０μｇ／レーン）。蛋白質分離を、１５％アクリルアミドゲル上で行ない、ニトロセルロース紙（Schleicher and Schuell, ０．１ミクロン）上へのトランスファーを、Hoeffer装置中で、Towbin, H., T. Stachlin及びJ.Gordon, PNAS 76:4350（1979）のプロトコールに従って、１．５アンペア１．５時間のエレクトロブロッティングにより行なった。蛋白質をブロット溶液（２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ７．５、０．１７１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５ｍｌ／リットルTween 20）中ですすいだ。次いで、そのブロットをブロック溶液（ブロット溶液中の１％ミルク）中で１時間ブロックした。第１の抗体源として用いた患者＃４１７からの血漿をブロック用溶液で１０％に稀釈して、未使用ニトロセルロース（２ｃｍ×１５ｃｍ）で１．５時間にわたって予備吸収した。調製したヒト血漿を、次いで、一晩、関心ある蛋白質ブロットセクションと共にオービタル震盪機上でインキュベートした。第１の抗体インキュベーションの後、ブロットセクションを、３回洗った（各洗浄は、ブロット溶液中での１５分間のインキュベーションを含む）。ヒトＩｇＥに特異的な第２の抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＥ、KPL Inc.）を、ブロット溶液中で１：２５００に稀釈し、インキュベーションを２時間続けた。続いて、過剰の第２抗体を、ブロット溶液中で１５分ずつ３回インキュベートすることにより除去した。125Ｉでヨウ素化したストレプトアビジン（Amersham）をブロット溶液中で１：２５００に稀釈して、ブロットと共に５０ｍｌのインキュベーション容積中の２μＣｉにて１時間インキュベートした。次いで、ブロットセクションを、廃棄溶液中の検出可能な放射能がバックグラウンドレベルにまで減少するまでブロット溶液で洗浄した。次いで、ブロットセクションをサランラップで包み、クロネックス増強スクリーンを用いて一晩−８０℃でフィルムに露出した。図１３に示したＩｇＥ結合パターンは、アフィニティー精製したＴＲＦＰ（レーン１）、鎖１（分子量６ＫＤ）及び鎖２（分子量１６ＫＤ以上）に対する反応性を示した。組換え鎖１は、強いＩｇＥ結合（レーン２）を示すが、他方、組換え鎖２の反応性は、鎖１に比べて低い（レーン３）。これらのＩｇＥ結合を示すレコンビトープペプチドは、ペプチドＸＹＺ及びＺＸＹである（それぞれ、レーン４及び８）。すべての他のレコンビトープペプチドは、この分析方法によって、ＩｇＥ結合について陰性である。
ＩｇＥのレコンビトープペプチドへの特異的な結合は又、ＥＬＩＳＡアッセイにおいても示された。コーニングアッセイプレート（＃２５８８２−９６）を、１０μｇ／ｍｌの図１４に列挙した各被覆抗体（即ち、ＴＲＦＰ、鎖１（ＴＲＦＰの組換え鎖１）、鎖２（ＴＲＦＰの組換え鎖２）、レコンビトープペプチドＸＹＺ、レコンビトープペプチドＸＺＹ、レコンビトープペプチドＹＸＺ、レコンビトープペプチドＹＺＸ、レコンビトープペプチドＺＸＹ及びレコンビトープペプチドＺＹＸ）で、５０μｌ／ウェルで覆って一晩４℃でインキュベートした。被覆抗原を除去してウェルをウェル当り２００μｌのＰＢＳ中の０．５％ゼラチンで２時間室温でブロックした。患者＃６６９からの血漿をＰＢＳ−Tween 20（０．０５％非イオン性洗浄剤Tween20（ミズーリ州、St.Louis在、Sigma社）を含むＰＢＳ）で連続稀釈し、ウェル当り１００μｌを加えて一晩４℃でインキュベートした（血漿稀釈を二重に試験した）。第２抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＥ、１：１０００、メリーランド州、Gaithersburg在、Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.）を１００μｌ／ウェルで、室温で１時間加えた。この溶液を取り出し、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ、１：１０、０００（アラバマ州、Birmingham在、Southern Biotechnology Associates, Inc.）を１００μｌ／ウェルで１時間室温で加えた（すべてのウェルを、各インキュベーション工程の間に、ＰＢＳ−Tweenで３回洗った）。TMB Membrane Peroxidase Substrateシステム（Kirkegaard & Perry Laboratories）を新たに混合してウェル当り１００μｌずつ加えた。色を２〜５分間展開させた。反応を、ウェル当り１００μｌの１Ｍリン酸の添加により停止させた。プレートを、４５０ｎｍフィルターを付けたMicroplate EL 310 Autoreader（バーモント州、Winooski在、Biotek Instruments）上で読んだ。二重のウェルの吸光度レベルを平均した。ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ化した結果（稀釈の対数対吸光度）を図１４に示す。
この図１４に示すＥＬＩＳＡの結果は、ＴＲＦＰに対するＩｇＥの高レベルの結合並びにＴＲＦＰ鎖１（鎖１）及び鎖２（鎖２）に対する幾分か低い結合を示す。これらの２つの組換え鎖は、この特定の患者のＩｇＥに同等の結合を示している。レコンビトープＺＸＹのみがＩｇＥとの明確な反応性を示しただけである。他のレコンビトープペプチドの結合は、レコンビトープペプチドＸＹＺから僅かにシグナルがあるが、殆どバックグラウンドレベルである。レコンビトープペプチドがＥＬＩＳＡとウエスタンアッセイの両者において等量存在することを示すために、抗ペプチド抗血清を陽性コントロールとして用いたが、それは、すべてのレコンビトープペプチドを有するレーン及びウェルに対して公平に同等のシグナルを与えた。
実施例４  レコンビトープペプチドに対するヒトＴ細胞エピトープの応答
ヒトのネコアレルギー性Ｔ細胞のレコンビトープペプチドに対する応答を試験した。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ネコアレルギーの臨床的症状を示し且つネコ抽出物を用いた皮膚試験陽性のネコアレルギー患者からのヘパリンで凝血防止した末梢血液６０ｍｌをFicoll-Hypaque遠心分離することにより精製した。個々の患者からの１０００万個のＰＢＭＣを、５％のプールしたヒトＡＢ血清を含み且つグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＨＥＰＥＳ緩衝液を補った１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中で、アフィニティー精製した天然ＴＲＦＰを１０μｇ／ｍｌで存在させて或は２５μｇ／ｍｌの精製した未開裂レコンビトープペプチドＹＸＺ又は２５μｇ／ｍｌの精製した開裂済レコンビトープペプチドＹＺＸと共に３７℃で７日間培養した。レコンビトープペプチドＹＺＸを実施例２に説明したようにトロンビンで開裂させた。次いで、生存力のある細胞をFicoll-Hypaque遠心分離により精製し、更に２週間、５単位の組換えヒトＩＬ−２／ｍｌ及び５単位の組換えヒトＩＬ−４／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０／５％ＡＢ血清中で培養した。次いで、休止Ｔ細胞を９６ウェルミクロ滴定プレートを用いる第２の増殖アッセイにおいて試験して種々のＴＲＦＰ蛋白質若しくはペプチド（ＴＲＦＰ抗原）に対するＴ細胞応答を評価した。アッセイ用に、２×１０4の休止Ｔ細胞を、２×１０4の自家エプスタイン−バールウイルスでトランスホームしたＢ細胞（２５，０００ラド）を抗原提示細胞として存在させて、各ウェル当り２００μｌの量で種々の濃度の抗原と共に３日間３７℃で培養した。次いで、各ウェルに１μＣｉのトリチウム化チミジンを１６時間与えた。取り込まれたカウントをガラス繊維フィルター上に集めて液体シンチレーション計数処理にかけた。次いで、各抗原に対する応答の刺激指標を、培地コントロールＣＰＭで割った抗原に対する応答の最大ＣＰＭとして計算した。刺激指標２．５を陽性Ｔ細胞応答とみなした。３つのかかる実験（患者５２２、５１９及び３８６）の結果の要約を図１５ａ、１５ｂ及び１５ｃに示す。図１５ａ及び１５ｂに示した実験と比較して、図１５ｃに示した実験において、ペプチドＸ及びＺの構成アミノ酸を一層似させるために、Fel-1.4（鎖１、アミノ酸残基６〜１７）をFel-1.2（鎖１、アミノ酸残基１〜１７）の代りに用い及びFel-33.3（鎖２、アミノ酸残基２６〜４０）をFel-18（鎖２、アミノ酸残基２３〜４８）の代りに用いた。更に、この実験において、レコンビトープペプチドＹＺＸのＹ−Ｚ接合物（ＴＲＦＰの鎖１からのアミノ酸残基５０〜５５及びＴＲＦＰの鎖２からのアミノ酸残基１４〜１９）から誘導した１つのペプチドとレコンビトープペプチドＹＺＸのＺ−Ｘ接合物（ＴＲＦＰの鎖２からのアミノ酸残基３４〜３９及びＴＲＦＰの鎖１からのアミノ酸残基７〜１２）から誘導される１つのペプチドとを合成し及び試験した。これらの接合ペプチドを、レコンビトープペプチドＹＺＸのこれらの領域がレコンビトープペプチド内に形成されたときに非天然エピトープを生成するか否かを測定するために製造した。
これらの結果は、天然ＴＲＦＰで活性化された患者５２２からのＴ細胞が、天然ＴＲＦＰ、レコンビトープペプチドＹＸＺ、ペプチドＹ、Fel-14.2及びFel-17に対して陽性に応答することを示している。対照的に、レコンビトープＹＸＺで活性化されたＴ細胞は、天然ＴＲＦＰに対してはそれ程よく応答しないが、ＴＲＦＰ分子の、ペプチドＸ、ペプチドＹ、ペプチドＺ、Fel-4、Fel-3.1、Fel-2、Fel-14.2、Fel-17及びFel-18を含む部分に対応する幾つかの合成ペプチドに対しては同程度若しくはより一層よく応答する。患者５１９からのＴ細胞を用いた実験の同様の結果を図１５ｂに示す。この患者からの天然ＴＲＦＰで活性化したＴ細胞は、天然の精製ＴＲＦＰ、レコンビトープペプチドＹＸＺ及びペプチドＹに対して応答する。同じ患者の細胞をレコンビトープペプチドＹＸＺで活性化した場合は、陽性応答は、天然ＴＲＦＰ、レコンビトープペプチドＹＸＺ、ペプチドＸ、ペプチドＹ、ペプチドＺ、Fel-3.1、Fel-4及びFel-17に対して見られた。図１５ｃは、活性化剤として生成した開裂済レコンビトープＹＺＸを含む同様の実験を示す。これらの結果は、天然ＴＲＦＰで活性化された患者３８６からのＴ細胞は、天然ＴＲＦＰ、レコンビトープペプチドＹＺＸ、ペプチドＸ、ペプチドＹ、Fel-3.1及びFel-14.2に対して陽性に応答することを示している。対照的に、レコンビトープペプチドＹＺＸで活性化されたＴ細胞は、天然ＴＲＦＰ、レコンビトープペプチドＹＺＸ、ペプチドＸ、ペプチドＹ、ペプチドＺ、Fel-2、Fel-3.1、Fel-14.2及びFel-17に対して同レベル若しくはそれ以上によく応答する。これらのデータは、少なくともこれらの３人の患者においては、Ｔ細胞が、レコンビトープペプチドとして存在するＴＲＦＰＴ細胞エピトープを効率的に認識することを示している。これらの実験で試験した天然ＴＲＦＰ分子中に存在するエピトープは、何れもＹＸＺレコンビトープペプチドとの関連において破壊されていない。これらの実験におけるレコンビトープペプチドＹＸＺ若しくはＹＺＸのＴＲＦＰエピトープを提供する能力は、天然分子に比べて一層大きいらしい。患者３８６からの結果は、レコンビトープＹＺＸの接合領域（ＹＺ接合ペプチド及びＺＸ接合ペプチド）から導いたペプチドが、レコンビトープペプチド中に存在するときに、Ｔ細胞により認識され、従って、非天然エピトープがこの接合領域に創られたということを示している。
実施例５  マウスＴ細胞のレコンビトープペプチドに対する応答
マウスをレコンビトープＹＺＸで免疫して、ＴＲＦＰ由来のレコンビトープペプチド中に含まれるＴ細胞エピトープがＴ細胞応答を刺激することが出来るかどうかを測定した。このアッセイで、リンパ節細胞の個々のレコンビトープペプチド並びに免疫化抗原に対して応答する能力を測定した。
１０Ｂ６ＣＢＡＦ１マウスを、尾の基部及び腿領域に完全フロイントアジュバント中の１００μｇのレコンビトープペプチドＹＺＸを皮下注射して免疫した。１０日後、免疫したマウスの鼠径節、傍大動脈節及び膝窩節を取り出してプールした。これらのリンパ節を、ステンレス鋼メッシュを通すことにより、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む冷ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。これらの細胞を、１％ＦＢＳを含む冷ＲＰＭＩ１６４０で２回洗って４℃に維持した。
これらのリンパ節細胞を、１０％ＦＢＳ、２５０μｇ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０中に４×１０6細胞／ｍｌでプレートした。これらの細胞を、示したように抗原（即ち、レコンビトープペプチドＹＺＸ、レコンビトープペプチドＺＹＺ、レコンビトープペプチドＸＺＹ、ペプチドＸ、ペプチドＹ、ペプチドＺ、ペプチドＸ、Ｙ及びＺ並びにAmb a I）と共に培養した（図１６）。２４時間後、５０μｌの上清を各培養から取り出し、一晩凍結して生細胞の繰越を排除した。この上清を３７℃に加熱して洗浄した。ＣＴＬＬ−２指示細胞（ＡＴＣＣ＃Ｔ１Ｂ２１４）を加えた（５×１０3細胞／ウェル）。この指示細胞系統は、連続成長のためにＩＬ−２を必要とする。２４時間後、Ｈ3−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加えて更に細胞を４時間インキュベートした。これらのプレートを凍結して解凍し、Tomtec９６ウェル採取機（コネチカット州、Orange在、Tomtec）で採取して、Betaplateベータカウンター（メリーランド州、Gaithersburg在、Pharmacia）にて計数した。
プールしたリンパ節細胞は、ＩＬ−２産生により測定するとき、イン・ビトロで、レコンビトープペプチドＹＺＸとの培養に対してよく応答する（図１６）。培地のバックグラウンドは、平均１５００ｃｐｍだけであった。レコンビトープペプチドＹＺＸに対するＴ細胞の応答は、レコンビトープペプチドを構築するために用いたエピトープを含む個々のペプチド（即ち、ペプチドＸ、Ｙ及びＺ）に対する応答の一つ若しくは組合せから生じ得る。他のレコンビトープペプチド並びに個々のペプチドＸ、Ｙ及びＺをリンパ節細胞と共に培養してＴ細胞の応答を測定した。ペプチドＸ、Ｙ及びＺの各々（成分ペプチド）に対する有意の応答があった。幾つかの他のレコンビトープペプチドＺＹＸ及びＸＺＹに対する強いＴ細胞応答があった。これらのレコンビトープペプチドと同じアミノ末端リーダー配列を有する組換えAmb a I調製物に対する弱いが有意のＴ細胞応答があった。
実施例６  アレルギー疾患の診断へのレコンビトープペプチドの応用
レコンビトープペプチドは、新しい形態の蛋白質アレルゲン若しくは蛋白質抗原に対する感受性の診断として有用であり得る。例えば、この発明の好適レコンビトープペプチドはＩｇＥに結合しないが、蛋白質アレルゲンから導かれるある種のレコンビトープペプチドは、アレルギー患者のＩｇＥに結合することが出来る。これらのレコンビトープペプチドを、皮膚試験においてそのレコンビトープペプチドが導かれる蛋白質アレルゲンに対する個人における特異的な即時型過敏症（ＩＴＨ）の正確なアッセイとして用いることが出来る。ＩＴＨ応答を誘出するアレルゲンは又、レコンビトープペプチドに加えて、組換えで生成したアレルゲン、天然の源から生化学的に精製したアレルゲンであってもよく、必要なことは特異的ＩｇＥ反応性が高いことだけである。ヒトＩｇＥとの反応性を全く又は非常に僅かしか示さないが蛋白質アレルゲンと反応性のＴ細胞エピトープを含むレコンビトープペプチドを用いて、それらのエピトープが導かれるアレルゲンに感受性の個人における遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を誘出することが出来る。ＤＴＨ応答を生じるためのアレルゲン形態は、単離されたレコンビトープペプチド、組換えアレルゲン又は化学的改変した天然若しくは組換えアレルゲンであってよい（例えば、ＫＯＨ処理したＴＲＦＰ）。再び、ＤＴＨを刺激するアレルゲン／抗原の主な要求は、ＩｇＥ結合反応性のないこと、或は、もしかかる結合が起きたとしてもマスト細胞若しくは好塩基球から媒介物質が放出されないことであり及び投与した際に個人においてＴ細胞を刺激する能力である。陽性ＤＴＨは、レコンビトープペプチド内のエピトープに特異的な個人のＴ細胞を指示する。一般に、レコンビトープペプチドは、個々のＴ細胞エピトープを含むペプチドより大きい分子であり、従って、ＤＴＨ試験に有利である。これらのレコンビトープペプチドは大きい分子であるので、それらは、ＤＴＨ皮膚応答に寄与するＴリンパ球及び他の細胞を流入させる皮膚（注射部位）に存在すると考えられる。
皮膚試験の１５〜３０分以内に起きるＩＴＨ反応を、ＤＴＨ反応と組合せて利用することが出来る（ＤＴＨ反応は、４８〜７２時間後に現れる）。それは、これらの２つの異なる型のアレルギー疾患関連反応性についてのアッセイの組合せであり、新規な診断用組成物を表す。レコンビトープペプチドを用いる皮膚試験における皮膚への適用は、１つの応答を他のものに対して誘出する（ＩＴＨ対ＤＴＨ）ために異なる様式を要求することが出来る。例えば、ＩＴＨ反応を個人において、レコンビトープペプチド（この場合においては、ＩｇＥ反応性レコンビトープペプチド）及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む非常に少量の治療用組成物を用いるプリック試験によって誘出することが出来る。ＤＴＨ反応を誘出するために、多量のレコンビトープペプチド（この場合は、非ＩｇＥ反応性レコンビトープペプチド）及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療用組成物は、皮内注射又は尖叉試験形式によって適用する（両者は、ＤＴＨによるＴＢ試験に用いられている）。Immunology（1985）Roitt,I.M.,Brostoff,J.,Male,D.K.（編集）、C.V.Mosby Co.,Gower Medical Publishing, London, NY, pp.19.2-19.18;pp.22.1-22.10.を参照されたい。この発明のレコンビトープペプチドを用いる診断の後に、特定の感受性低下治療に対する個人を。１組の試験においてＩｇＥ反応性及びＴエピトープ反応性を限定することによって選択することが出来る。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：イミュロジク ファーマスーティカル カンパニー インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：レコンビトープペプチド
（iii）配列数：７７
（iv）通信用住所：
（A）宛名人：ラハイブ アンド コックフィールド
（B）通り：ステート ストリート 60、スイート 510
（C）都市：ボストン
（D）州：マサチューセッツ
（E）国：米国
（F）郵便番号：０２１０９
（v）コンピューター読み取り可能形式：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換機
（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩテキスト
（vi）現出願のデータ：
（A）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９２／０８６９４
（B）出願日：１９９２年１０月１６日
（C）分類：
（vii）先願のデータ：
（A）出願番号：ＵＳ  ７７７，８５９
（B）出願日：１９９１年１０月１６日
（C）分類：
（vii）先願のデータ：
（A）出願番号：ＵＳ  ８０７，５２９
（B）出願日：１９９１年１２月１３日
（C）分類：
（viii）代理人／代理業者の情報：
（A）名称：アミ  Ｅ．マンドラゴラス
（B）登録番号：３６，２０７
（C）参照／登録簿番号：027.0 PCT（IMI-015PC）
（ix）電信用情報：
（A）電話：（６１７）２２７−７４００
（B）テレファックス：（６１７）２２７−５９４１
（2）配列番号１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：８．．２８３
（xi）配列（配列番号１）：
0004246794.tif 000002
（2）配列番号２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号２）：
0004246794.tif 000003
（2）配列番号３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：２６．．２８９
（xi）配列（配列番号３）：
0004246794.tif 000004
（2）配列番号４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：８８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号４）：
0004246794.tif 000005
（2）配列番号５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４７６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：８．．３３４
（xi）配列（配列番号５）：
0004246794.tif 000006
（2）配列番号６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１０９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号６）：
0004246794.tif 000007
（2）配列番号７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７）：
0004246794.tif 000008
（2）配列番号８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号８）：
0004246794.tif 000009
（2）配列番号９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号９）：
0004246794.tif 000010
（2）配列番号１０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号１０）：
0004246794.tif 000011
（2）配列番号１１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号１１）：
0004246794.tif 000012
（2）配列番号１２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１０．．２７
（xi）配列（配列番号１２）：
0004246794.tif 000013
（2）配列番号１３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号１３）：
0004246794.tif 000014
（2）配列番号１４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１０．．９０
（xi）配列（配列番号１４）：
0004246794.tif 000015
（2）配列番号１５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号１５）：
0004246794.tif 000016
（2）配列番号１６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列（配列番号１６）：
0004246794.tif 000017
（2）配列番号１７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号１７）：
0004246794.tif 000018
（2）配列番号１８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．４５
（xi）配列（配列番号１８）：
0004246794.tif 000019
（2）配列番号１９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号１９）：
0004246794.tif 000020
（2）配列番号２０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列（配列番号２０）：
0004246794.tif 000021
（2）配列番号２１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号２１）：
0004246794.tif 000022
（2）配列番号２２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：８９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．６３
（xi）配列（配列番号２２）：
0004246794.tif 000023
（2）配列番号２３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号２３）：
0004246794.tif 000024
（2）配列番号２４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列（配列番号２４）：
0004246794.tif 000025
（2）配列番号２５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号２５）：
0004246794.tif 000026
（2）配列番号２６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：９．．４１
（Xi）配列（配列番号２６）：
0004246794.tif 000027
（2）配列番号２７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号２７）：
0004246794.tif 000028
（2）配列番号２８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列（配列番号２８）：
0004246794.tif 000029
（2）配列番号２９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号２９）：
0004246794.tif 000030
（2）配列番号３０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列（配列番号３０）：
0004246794.tif 000031
（2）配列番号３１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号３１）：
0004246794.tif 000032
（2）配列番号３２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．４５
（xi）配列（配列番号３２）：
0004246794.tif 000033
（2）配列番号３３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号３３）：
0004246794.tif 000034
（2）配列番号３４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：９．．２０
（xi）配列（配列番号３４）：
0004246794.tif 000035
（2）配列番号３５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号３５）：
0004246794.tif 000036
（2）配列番号３６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列（配列番号３６）：
0004246794.tif 000037
（2）配列番号３７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号３７）：
0004246794.tif 000038
（2）配列番号３８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．２８８
（xi）配列（配列番号３８）：
0004246794.tif 000039
（2）配列番号３９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列（配列番号３９）：
0004246794.tif 000040
（2）配列番号４０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号４０）：
0004246794.tif 000041
（2）配列番号４１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号４１）：
0004246794.tif 000042
（2）配列番号４２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号４２）：
0004246794.tif 000043
（2）配列番号４３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号４３）：
0004246794.tif 000044
（2）配列番号４４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号４４）：
0004246794.tif 000045
（2）配列番号４５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号４５）：
0004246794.tif 000046
（2）配列番号４６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号４６）：
0004246794.tif 000047
（2）配列番号４７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号４７）：
0004246794.tif 000048
（2）配列番号４８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号４８）：
0004246794.tif 000049
（2）配列番号４９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号４９）：
0004246794.tif 000050
（2）配列番号５０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号５０）：
0004246794.tif 000051
（2）配列番号５１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５１）：
0004246794.tif 000052
（2）配列番号５２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号５２）：
0004246794.tif 000053
（2）配列番号５３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５３）：
0004246794.tif 000054
（2）配列番号５４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号５４）：
0004246794.tif 000055
（2）配列番号５５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５５）：
0004246794.tif 000056
（2）配列番号５６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号５６）：
0004246794.tif 000057
（2）配列番号５７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５７）：
0004246794.tif 000058
（2）配列番号５８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号５８）：
0004246794.tif 000059
（2）配列番号５９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５９）：
0004246794.tif 000060
（2）配列番号６０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号６０）：
0004246794.tif 000061
（2）配列番号６１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号６１）：
0004246794.tif 000062
（2）配列番号６２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号６２）：
0004246794.tif 000063
（2）配列番号６３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号６３）：
0004246794.tif 000064
（2）配列番号６４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号６４）：
0004246794.tif 000065
（2）配列番号６５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号６５）：
0004246794.tif 000066
（2）配列番号６６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号６６）：
0004246794.tif 000067
（2）配列番号６７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号６７）：
0004246794.tif 000068
（2）配列番号６８の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号６８）：
0004246794.tif 000069
（2）配列番号６９の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号６９）：
0004246794.tif 000070
（2）配列番号７０の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列（配列番号７０）：
0004246794.tif 000071
（2）配列番号７１の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７１）：
0004246794.tif 000072
（2）配列番号７２の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７２）：
0004246794.tif 000073
（2）配列番号７３の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７３）：
0004246794.tif 000074
（2）配列番号７４の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７４）：
0004246794.tif 000075
（2）配列番号７５の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７５）：
0004246794.tif 000076
（2）配列番号７６の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７６）：
0004246794.tif 000077
（2）配列番号７７の情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号７７）：
0004246794.tif 000078
【図１】
0004246794.tif 000079
【図２】
0004246794.tif 000080
【図３】
0004246794.tif 000081
【図４】
0004246794.tif 000082
【図５】
0004246794.tif 000083
【図６】
0004246794.tif 000084
【図７】
0004246794.tif 000085
0004246794.tif 000086
【図８】
0004246794.tif 000087
【図９】
0004246794.tif 000088
【図１０】
0004246794.tif 000089
0004246794.tif 000090
【図１１】
0004246794.tif 000091
【図１２】
0004246794.tif 000092
【図１３】
0004246794.tif 000093
【図１４】
0004246794.tif 000094
【図１５ａ】
0004246794.tif 000095
【図１５ｂ】
0004246794.tif 000096
【図１５ｃ】
0004246794.tif 000097
【図１６】
0004246794.tif 000098