(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板と、Ｈｅｌａ  Ｒｈｏ０細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られる、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞に、被験薬剤を投与し、該細胞のミトコンドリア活性を指標として、ミトコンドリア関連疾患の治療薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項４】
ミトコンドリア関連疾患が、ミトコンドリア病、アルツハイマー性痴呆又はパーキンソン症のうちのいずれかである請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養が可能である新規な細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミトコンドリアは固有のDNA（ミトコンドリアDNA:以下 「mtDNA」ともいう）を持ち、独自の遺伝的発現システムを持つ。しかし、mtDNAには13個のペプチドのみがコードされており、遺伝的発現システムに関する因子を含むほかのすべてのミトコンドリア蛋白質は核遺伝子にコードされている。従って、これまで、ミトコンドリアは、核なしでは維持できないと考えられてきた。従来、ミトコンドリアを肝臓、心筋、骨格筋、脳、血小板などから分離精製する技術が確立していた（非特許文献１〜３を参照） 。ミトコンドリア病、パーキンソン病、アルツハイマー病、Huntington病を含む種々の疾患において、精製されたミトコンドリアを用いて、酵素活性などのミトコンドリア機能が評価されてきた(非特許文献３〜６を参照)。しかし、分離精製されたミトコンドリアは増殖能をもたず培養は不可能であった。
【０００３】
血小板は巨核球から分離し、ミトコンドリアを有するが核を有さない生体内にある特異的細胞である。しかし、血小板は増殖能を持たず生体内で数日間の寿命である。このため、ミトコンドリアの経時的変化を観察するのは不可能であった。
【０００４】
他方、Rho0細胞と表される、mtDNAを持たないヒト細胞株が単離されている(非特許文献７を参照)。Rho0細胞株を、変異mtDNAと融合し、サイトプラスミーを行うことにより、変異mtDNAを持った細胞(サイブリッド細胞)の培養が可能になった。Rho0細胞株と様々なミトコンドリア病の患者由来の除核細胞との融合により得られた細胞株はミトコンドリア疾患の解明に寄与している（非特許文献８〜１０を参照）。しかし、このようなサイブリッド細胞のミトコンドリアは常に核の影響下にあり、培養細胞に薬剤を投与した際のミトコンドリアの変化は核を介してのミトコンドリアへの間接作用による可能性があり、薬剤などのミトコンドリアへの直接作用を評価するのにはこのようなサイブリッド細胞では不十分であった。これらのことから、核がなくミトコンドリア活性を示すミトコンドリアが主体をなす細胞の培養が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】
Stumpf et al. Biochem Med 21, 182-189, 1979.
【非特許文献２】
Hatafi Y et al. A.B.B. 94 148, 1964.
【非特許文献３】
Methods in enzymology IV, 51-59, 1979.
【非特許文献４】
Haas RH, K Nakano et al. Ann Neurol 1995;37:714-722.
【非特許文献５】
Shoffner JM, Brown MD, et al. Genomics 17:171-184,1993.
【非特許文献６】
Grunewald T et al. Ann New York Academy Science 893:203-213,1999.
【非特許文献７】
Maurer I et al. Neurobiology of Aging 21:455-62, 2000.
【非特許文献８】
GuM Cooper JM et al. Ann Neurol 44:177-186, 1998.
【非特許文献９】
Chomyn A, et al. Proc Natl Acad Sci USA 89:4221-4225, 1992.
【非特許文献１０】
Dunbar DR, et al. Hum Mol Genet 5:123-129, 1996.
【非特許文献１１】
Chomyn A, et al. Am J Hum Genet 34:966-974, 1994.
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示し、培養可能な細胞を製造する方法および該方法により得られる細胞を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞と、ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することにより、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を得ることに成功し、発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は上記のようにしてなされたものであり、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞と、ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法。
（２）  核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞が、血小板である（１）に記載の方法。
（３）  ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞が、Hela Rho0細胞である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  （１）〜（３）のいずれかに記載の方法により得られる、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞。
（５）  （４）に記載の細胞に、被験薬剤を投与し、該細胞のミトコンドリア活性を指標として、ミトコンドリア関連疾患の治療薬剤をスクリーニングする方法。
（６）  ミトコンドリア関連疾患が、ミトコンドリア病、アルツハイマー性痴呆又はパーキンソン症のうちのいずれかである（５）に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の細胞の製造方法
本発明の細胞の製造方法は、核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞と、ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法である。以下、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を「ミトコンドリア細胞」ともいう。
本発明の方法に用いられる、核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞は、核及びミトコンドリアDNAを持つ細胞から核を除核して用いてもよく、または、遺伝的に核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞を用いてもよいが、遺伝的に核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞を用いることが好ましい。このような細胞としては、例えば、血小板などが好ましく例示される。
核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞は、細胞中にミトコンドリアDNAを持つ生物から取得することができる。このような生物としては、哺乳動物が好ましく、特にヒトが好ましい。
本発明の方法において、核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞として、事前にインフォームドコンセントを受けたミトコンドリア関連疾患を有する患者から取得された細胞を用いることにより、ミトコンドリア病変変異を有するミトコンドリア細胞を得ることができる。ミトコンドリア関連疾患としては、例えば、リー（Leigh）症候群などのミトコンドリア病、アルツハイマー性疾患、およびパーキンソン症などが挙げられる。
【００１０】
本発明の方法に用いられる、ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞としては、核を持ち、ミトコンドリアDNAを持たない公知のRho0細胞株が例示され、具体的には、Hela Rho0細胞株、繊維芽細胞Rho0細胞株及び骨肉腫細胞Rho0細胞株などが例示され、この中でHela Rho0細胞株が好ましく例示される。なお、ガン細胞由来培養細胞は、生体中のガン組織由来の細胞を培養したものであってよく、また、生体中の正常組織由来の細胞をガン化して得られた樹立細胞株由来の細胞を培養したものであってもよい。
【００１１】
本発明の方法において、細胞融合は、サイブリッドを作製するための通常の細胞融合手法に従って行うことができる。
具体的には、例えば、細胞融合は、ミトコンドリアドナーである核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞に、ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞を加え、エチレングリコール存在下などで細胞融合させる方法などにより行うことができる。
【００１２】
得られたサイブリッド細胞の培養は、通常の細胞培養手段に従って行うことができる。
具体的には、例えば、サイブリッド細胞の培養は、10%ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（D-MEM）中で、37℃で、8% CO2を含む加湿混合気体中で培養を行うことができる。培養は7〜30日間、好ましくは、14〜30日間行うことができる。
サイブリッド細胞は、始め接着形態を示して増殖し、続いて、増殖した細胞は接着細胞に重なるが、過増殖が進むにつれ、重なっている細胞が接着細胞から分離され、培養液中に浮遊する。本明細書における「浮遊細胞」とは、培養液中に浮遊するこれらの細胞を意味する。
浮遊細胞の回収は、培養液の上清を回収することなどにより行うことができる。
【００１３】
（２）本発明のミトコンドリア細胞
上記方法によって得られる、本発明のミトコンドリア細胞は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞である。
本明細書において「核を持たない」とは、好ましくは核構造および核DNAを持たないことを意味する。さらに本明細書において「核を持たない」とは、細胞群中において５％以下、好ましくは３％以下の細胞が核を持つが、残りの細胞が核を持たないことを意味する。
核の有無は、例えば、ヘマトキシリン−エオシン染色などにより確認することができる。また、核、核DNA及びミトコンドリア活性の有無は、例えば、核、核DNA及びミトコンドリア膜電位をそれぞれ特異的に染色する蛍光色素により、各細胞構造を標識し、蛍光顕微鏡下で観察することなどにより確認することができる。各細胞構造の蛍光色素による標識および蛍光顕微鏡による検出は、通常の手法に従って行うことができる。核及び核DNAを標識する蛍光色素としては、例えばSYTO Greenなどが挙げられる。ミトコンドリア膜電位を標識する蛍光色素としては、例えば、MitoTracker、MitoTracker Greenなどが挙げられる。これらの蛍光色素は、例えば、モレキュラープローブ社などから販売されているものを用いることができる。
本明細書において、「ミトコンドリア活性を示す」とは、活性なミトコンドリア膜を標識するMitoTracker、MitoTracker Greenなどの色素で標識される構造を有することを意味する。
【００１４】
本発明のミトコンドリア細胞は、継続的な培養が可能である。培養は通常の細胞培養手段に従って行うことができる。本明細書において、「培養が可能」とは、通常のミトコンドリア細胞の培養に適した培地条件にて細胞を培養した場合に、３ヶ月以上、好ましくは６ヶ月以上、より好ましくは１年以上、培養細胞が増殖維持されることを意味する。
具体的には、例えば、本発明のミトコンドリア細胞の培養は、10%ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（D-MEM）中で、37℃で、8% CO2を含む加湿混合気体中で培養を行うことができる。
【００１５】
なお、本発明において用いられる組織からの細胞の調製、細胞の培養、PCR、PCRプライマーの調製、ミトコンドリア及び核DNAの調製などの方法は、当業者によく知られている通常の遺伝子工学的手法に従って、行うことができる。
【００１６】
（３）本発明のスクリーニング方法
本発明のミトコンドリア細胞は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示し、さらに培養が可能であるため、ミトコンドリア関連疾患の治療薬を開発するためのスクリーニング系として有用である。
具体的に、本発明のミトコンドリア細胞をミトコンドリア関連疾患治療薬のスクリーニング系として、例えば、次のように用いることができる。目的の疾患を有する患者由来の、核を持たず、ミトコンドリアDNAを持つ細胞と、ミトコンドリアDNAを持たないガン細胞由来培養細胞とのサイブリッドから得られた本発明のミトコンドリア細胞を被験細胞群及び対照細胞群にわけ、被験細胞群に試験する治療薬を投与し、その後、被験細胞群、及び、対照細胞群のミトコンドリア膜電位活性などを測定し、各群を比較し、治療薬の効果を検討し、ミトコンドリア関連疾患治療薬をスクリーニングすることができる。このような治療薬の例として、ミトコンドリア病、アルツハイマー性痴呆又はパーキンソン症の治療薬などが好ましく挙げられる。
【００１７】
本発明において、核を持たず、ミトコンドリア活性を示し、さらに培養が可能であるミトコンドリア細胞が開発された。これまで、活性なミトコンドリアを持ち、核を持たないこの種の細胞型については報告がない。
また、この結果は一回の異常な細胞培養によりなされたものではなく、ミトコンドリア細胞は病変変異を有する、あるいは有さないサイブリッドから繰り返し得られているということを強調する。
血小板は核を持たずに活性なミトコンドリアを持つので、親の親である血小板から、いくつかの性質がミトコンドリア細胞に伝えられているかもしれない。しかしながら、親の幹細胞の核DNAは、Hela細胞から由来されているはずである。いくつかの信号がサイトゾル由来のHela核またはミトコンドリアを刺激するかもしれない。このミトコンドリア細胞は、核がどのように消失したか、信号は何か、どのようにミトコンドリアは維持されるかを調べるために非常に有用であろう。さらに、サイブリッドが核のバックグラウンドの影響を除外するものであったように、これらは変異ミトコンドリアの役割を調べるのに適用可能であり得る。
【００１８】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨をこえない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】
mtDNAを持たないHela細胞と、血小板との細胞融合によるサイブリッドおよび該サイブリッド由来の浮遊細胞の作製
ミトコンドリアゲノムDNAの塩基番号9176（T9176C）における病変点突然変異の役割を調べるために、mtDNAを持たないHela細胞と、健常対照およびリー症候群の患者由来の血小板との融合によりサイブリッド細胞株を構築した。
（１）Rho0細胞培養
mtDNAを除去したヒトHela細胞株（mtDNAを持たないRho0細胞）を、10%ウシ胎児血清、50 U/mlペニシリン、50 μg/mlストレプトマイシン、0.2 mMウリジン、2 mMグルタミンおよび1 mMピルビン酸ナトリウムを添加したダルベッコ改変イーグル培地（D-MEM）（ギブコBRL.  米国）中で、３７℃で、8 % CO2を含む加湿混合気体中で培養した。
【００２０】
（２）血小板の精製
ミトコンドリアATPase 6遺伝子のT9176C変異を有する血液サンプルを、リー症候群を示す２人の兄弟、および対照血液サンプルを、２人の健常ボランティアである４５才男性および３０才女性から得た。両ボランティアはこの研究に参加するためにインフォームドコンセントを受けた。兄弟は１８才の女性および１３才の男性であり、彼らの保護者はこの研究に彼らの細胞を使用することに同意した。これらの症例の臨床的詳細は以前に報告されている（Makino M et al. Neuromuscular Dis 8:149-151, 1998 ; Nakano K et al. Japanese Journal of Inherited Metabolic Diseases 15:217, 1999 (abstract) (Japanese)）。
血小板の単離は血液サンプルの取得後、２時間以内に、以前報告されたように行った（Shults CW. et al. Neurology 50:193-195, 1998）。簡単には、以下のようにして行った。2 ml容量の4.5%クエン酸を加えた20 mlの全血を得た。血液を室温で１０分間、200 gで遠心し、上清の２／３中に血小板に富んだ血漿を生成させた。血小板に富んだ血漿を回収し、３０分間、3000 gで再度遠心した。血小板を多く含む沈殿を洗浄し、その後回収した。
【００２１】
（３）血小板融合サイブリッド
血小板融合サイブリッドを、以前報告された方法に従って得た（Ohta S. 細胞工学(Japanese Cell Technology) 5(2):160-165, 1986）。合計で5×107個のRho0細胞を、0.05 %トリプシン-EDTAの添加後回収し、ハンクスバッファーに懸濁した。懸濁物を穏やかに血小板の沈殿に加え、１０分間、200 gで遠心した。沈殿は血小板とRho0細胞の混合物と考えられた。次に、0.2 mlの0.1 %のエチレングリコール（DMSO）を、30秒間２回加え、30秒間室温で休ませた。その後、ウシ胎児血清を含まないD-MEMを4 ml添加し、ゆっくりと沈殿と混合させ、１０分間室温で放置した。混合したバッファーを、10 %ウシ胎児血清（FBS）を含むD-MEM 40 ml中にデカントした。細胞を96ウェル中で培養した。血小板融合サイブリッドの単一クローンのコロニーを各ウェルで、バッファーを３日毎に交換し、培養した。単一クローンの血小板融合サイブリッド細胞株を構築した。
【００２２】
得られたサイブリッド細胞株（５個の対照および４１個のT9176C変異細胞株）を単離した。細胞株１はT9176C変異を有するリー症候群の患者の姉の方から得た。細胞株２はT9176C変異を有するリー症候群の患者の弟の方から得た。細胞株３は対照から得た。サイブリッドは始め接着形態を示して増殖し、続いて、増殖した細胞は接着細胞に重なった。過増殖が進むにつれ、重なっている細胞は接着細胞から分離され、培養液中に浮遊した。サイブリッド細胞株由来の浮遊細胞は回収され、10% FBSを添加した新鮮なD-MEM培地中で、３７℃で、８％ CO2を含む加湿混合気体中で培養が続けられた。上記浮遊細胞は、連続的に約１ヶ月間加速度的に増殖を続け、同じ条件下で１年半増殖を続けた。
【００２３】
【実施例２】
浮遊細胞のDNA解析
浮遊細胞が確かに、血小板とRho0Hela細胞を融合して得られたサイブリッド細胞由来であることを確認した。
（１）DNA解析
ゲノムDNAを、対照およびT9176C変異を有する患者の血小板由来のサイブリッド、およびその誘導体であるミトコンドリア細胞から、通常の方法に従って抽出した。T9176C変異の検出を、以前に示された方法（Makino M et al. Neuromuscular Dis 8:149-151, 1998 ; Thyagarajan D et al. Ann Neurol 38(3):468-72, 1995 ; Campos Y et al. Neurology 49:595-597, 1997）により、ポリメラーゼチェインリアクション制限多型（PCR-RFLP）解析により行った。mtDNA位置9025-9046（フォワード）GGCCACCTACTCATGCACCTAA（配列番号１）および断片の3' 末端から3 bpの9179の位置にＴからＣへのミスマッチを含む9203-9177（リバース）GTGTTGTCGTGCAGGTAGAGGCTTCCT（配列番号２）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、変異を包含するmtDNAの178塩基対（bp）断片を増幅した。mtDNAの塩基番号は、Anderson等の文献（Anderson S. et al. Nature 290:457-465, 1981）に従って決定した。PCRは、94℃、1分；60℃、1分；72℃、1分を35サイクルの反応条件で行った。PCR産物を15 UのScrfIで２４時間、３７℃で消化し、3 %アガロースゲルを電気泳動させ、エチジウムブロマイドで染色した。変異mtDNAにおいて、ミスマッチ含有プライマーは、nt9176のScrfIの制限部位を導入する。したがって、ScrfIは野生型mtDNAを分断せず、178bpの断片が残るのに対し、ScrfIは変異mtDNAを151bp及び27bpの２つの断片に分断する。
【００２４】
T9176C変異を検出するためのPCR-RFLP解析によれば、T9176C変異を有するサイブリッドに由来する浮遊細胞は、図１に示すように変異を有する。他方では、対照血小板融合サイブリッド由来の浮遊細胞は、塩基位置9176における野生型mtDNAを持つ（図１）。浮遊細胞およびそれらのもととなるサイブリッド細胞は、患者および対照の血小板由来のmtDNAを持つことを確認した。
【００２５】
以下図１に示す結果の説明をする。
図１は、新規なミトコンドリア細胞におけるT9176C変異の制限断片長解析の結果を示す。野生型mtDNAが切断されず、178bpであるのに対し、この変異が存在すると178bpの増幅断片はScfIで、151bpと27bpに切断される（27bpの断片はここには示されない）。レーン1-10は、T9176C変異を有する151bp断片を示すが、レーン11はT9176C変異を有さない178bp断片を示す。レーン1-5は、T9176C変異を有するリー症候群患者の姉の血小板由来の細胞株１の標本を示す。レーン6-10は、細胞番号１の弟の血小板由来の細胞株２の標本を示す。レーン11は、細胞株３の標本を示す（対照）。レーンＭは、psi174/Hind IIIのサイズマーカーである。
【００２６】
【実施例３】
浮遊細胞の特徴
浮遊細胞の細胞内構造をヘマトキシリン−エオシン染色により確認した。
浮遊細胞は接着せず、しかしながらゆるく凝集した。顕微鏡下で、細胞表面は粗い膜構造を持っていた（図３−１ｂ）。ヘマトキシリン−エオシン染色されたサイトゾルは同種エオシン色を呈したが、驚くべきことにヘマトキシリン染色はされず、このことは核が存在しないことを示した（図２ａ）。これに対して、もとのサイブリット細胞は、ヘマトキシリンで染色される明らかな核構造を持っていた（図２ｂ）。この結果は、多くの浮遊細胞が核構造及び核DNAを持たないことを示した。
【００２７】
以下図２に示す結果の説明をする。
図２は、浮遊細胞の顕微鏡的特徴を示す。細胞株は株２である（mtDNAのT9176C変異を有するリー症候群患者の弟の血小板由来）。
（ａ）ミトコンドリア細胞は核を欠いている。細胞はヘマトキシリン−エオシンで染色した。倍率は20×（明）。ヘマトキシリン−エオシン染色サイトゾルは同種エオシン色を呈したが、驚くべきことにヘマトキシリン染色は見られなかった。
（ｂ）陽性対照としての、ヘマトキシリン−エオシン染色で核を染色したもとのサイブリッド細胞。倍率は20×（明）。
【００２８】
以下図３に示す結果の説明をする。
図３は、浮遊細胞及びもとのサイブリッドの共焦点顕微鏡解析の結果を示す。
図３−１は、MitoTracker蛍光色素により判定されたミトコンドリア膜活性を含有する野生型浮遊細胞である（倍率60×）。
（ａ）赤い顆粒粒子が細胞中に分散していた。形と大きさはサイブリッドのミトコンドリアと同一であった。
（ｂ）透過顕微鏡検査における浮遊細胞は、膜状表面を示した。
【００２９】
【実施例４】
MitoTracker蛍光色素、MitoTrackerおよびMitoGreen二重染色、ならびに、MitoTrackerおよびSYTO Green二重染色を用いた共焦点測定
浮遊細胞の細胞内構造を共焦点蛍光顕微鏡を用いた蛍光色素染色により、さらに確認した。
（１）共焦点蛍光顕微鏡を用いたMitoTracher、MitoTracher GreenおよびSYTO Green核酸染色
MitoTracher CTX-Rosプローブ（以後、MitoTracherという）（モレキュラープローブ、オレゴン）は、Ｘ−ロザミン由来の脂肪親和性のカチオン色素であり、ミトコンドリア膜活性を測定する際、細胞固定の間もよく維持される、ミトコンドリア選択的染色を表す。MitoTracher Green（モレキュラープローブ、オレゴン）も、ミトコンドリア膜活性を増強することなく、ミトコンドリア選択的である（Ligon LA et al. J Comp Neurol 427:340-350, 2000 ; Hollinshead M et al. J Histochem Cytochem 45:1053-1057, 1997）。SYTO Green（Syto 16）（モレキュラープローブ、オレゴン）は、生細胞中でも核酸染色される蛍光色素である（Frey T. Cytometry 21:265-274）。20 nMのMitoTracker、20 nMのMitoTrackerおよび100 nMのMitoTracker Green、100 nMのMitoTracker Greenおよび1 μMのSYTO Greenをそれぞれ加えたサンプルを１５分間放置した。MitoTrackerによる単染色、MitoTrackerおよびMitoTracker Greenによる二重染色、MitoTrackerおよびSYTO Greenによる二重染色の切片スキャンを、コンピューター補助共焦点蛍光顕微鏡（FluoView FV300、オリンパス、東京）を用いて細胞内構造解析のために得た。
【００３０】
MitoTracker CTX-Ros(以下、MitoTrackerという)は、ミトコンドリア特異的なミトコンドリア膜電位を表す。浮遊細胞をMitoTrackerで染色し、共焦点顕微鏡で観察した結果、図３−１ａに示すように、細胞内に顆粒粒子が分散していた。形や大きさは、サイブリッドのミトコンドリアと同一であった（図３−２ｃ，ｇ）。MitoTracker Green色素はミトコンドリアの膜活性に関わらず、特異的にミトコンドリアを標識する。共焦点蛍光顕微鏡を用いたMitoTrackerおよびMitoTracker Green二重標識は、野生型浮遊細胞および変異型浮遊細胞の両者のMitoTracker（図３−２ａ，ｅ）およびMitoTracker Green（図３−２ｂ，ｆ）による陽性染色を表した。野生型サイブリッドおよび変異型サイブリッド両者におけるミトコンドリアは、核を取り囲んで顆粒状にMitoTracker（図３−２ｃ，ｇ）およびMitoTracker Green（図３−２ｄ，ｈ）により染色された。蛍光色素SYTO Greenは、生細胞中へ膜を浸透して核の核酸を染色する。浮遊細胞およびサイブリッドをMitoTrackerおよびSYTO Green色素の二重色素を用いて共焦点蛍光顕微鏡を用いて標識した結果（図３−３）、野生型浮遊細胞および変異型浮遊細胞のどちらもMitoTrackerで陽性染色されたが（図３−３ａ，ｆ）、SYTO Greenでの陰性染色は陰性であった（図３−３ｂ，ｇ）。一方では、野生型および変異型においてもとのサイブリッドは、MitoTracker（図３−３ｄ、ｉ）およびSYTO Green色素（図３−３ｅ，ｊ）で陽性染色された。
これらの結果は、浮遊細胞の多くはミトコンドリア膜活性を示し、しかし、核構造および核DNAを欠いていることを強く示唆する。したがって、これらの浮遊細胞をミトコンドリア細胞と名付けた。
【００３１】
以下図３に示す結果の説明をする。
図３は、浮遊細胞及びもとのサイブリッドの共焦点顕微鏡解析の結果を示す。
図３−２。サイブリッドのミトコンドリアがそうであるように、野生型および変異型の浮遊細胞はミトコンドリア選択性色素特異的なミトコンドリア膜を有した（倍率100×）。
（ａ，ｅ）両野生型浮遊細胞（ａ）および変異型浮遊細胞（ｅ）は、ミトコンドリア膜活性に特異的なMitoTrackerにより標識された顆粒状の染色を示した。
（ｂ，f）両野生型浮遊細胞（ｂ）および変異型浮遊細胞（ｆ）は、MitoTracker Greenにより標識された顆粒状の染色を示した。
（ｃ，ｄ，ｇ，ｈ）野生型サイブリッドのミトコンドリアは、MitoTracker 色素（ｃ）およびMitoTracker Green（ｄ）標識された、核を取り囲む顆粒状染色を示した。変異型サイブリッドのミトコンドリアもまた、MitoTracker 色素（ｇ）およびMitoTracker Green（ｈ）標識された、核を取り囲む顆粒状染色を示した。
【００３２】
図３−３。野生型浮遊細胞および変異型の浮遊細胞はMitoTrackerおよびSYTO Green色素標識核構造および核DNAを欠く（倍率100×）。
（ａ，ｆ）野生型浮遊細胞（ａ）および変異型（ｆ）は、MitoTrackerにより標識された顆粒状の染色を示した。
（ｂ，ｇ）野生型浮遊細胞（ｂ）および変異型（ｇ）は、SYTO Green標識陰性を示した。
（ｃ，ｈ）透過顕微鏡検査は、野生型（ｃ）および変異型（ｈ）浮遊細胞における粗い膜状表面を示した。
（ｄ，ｉ）野生型サイブリッド（ｄ）および変異型サイブリッド（ｉ）は、MitoTracker色素により標識された核を取り囲む顆粒状の染色を示した。
（ｅ，ｊ）野生型（ｅ）および変異型（ｊ）における核。野生型サイブリッドはSYTO Green標識で染色された。
【００３３】
【実施例５】
SYTO Green およびMitoTrackerを用いたミトコンドリア細胞のフローサイトメトリー
ミトコンドリア細胞集団における核およびミトコンドリアの存在を調べるため、二色フローサイトメトリーを行った。
ミトコンドリア細胞に100 nMのMitoTrackerおよび1 μMのSYTO Greenを添加した後、サンプルを１５分間放置した。サンプルをフローサイトメーター（Epics Elite ESP、ベックマンコールター、米国）で試験した。２色における他のスペクトラムバンドから誘導された擬陽性を無視することについては、MitorackerおよびSYTO Greenの単一標識である陰性対照で確認した。ミトコンドリア細胞またはサイブリッドの全細胞のカウントは、4000-8000周辺であった。
【００３４】
MitoTrackerおよびSYTO Greenで二重染色した、健常対照及びT9176C変異を有するサイブリッドおよび各サイブリッド由来のミトコンドリア細胞のフローサイトメトリーの結果を図４−１に示した。フローサイトメトリーの結果を、SYTO Green およびMitoTrackerの陽性または陰性により、４つの領域に分割した。T9176C変異型ミトコンドリア細胞の97.6%および野生型ミトコンドリア細胞の99.6%がSYTO Green陰性領域に存在した。他方では、T9176C変異型サイブリッドの92.4%および野生型サイブリッドの97.3%がSYTO Green およびMitoTracker陽性領域に存在した。これらの結果は、主なミトコンドリア細胞は核を欠いているが、数％未満の細胞のみが核および核DNAを維持していることを示唆する。
【００３５】
ミトコンドリア膜活性は、MitoTrackerにより、ミトコンドリア細胞およびサイブリッドにおいてT9176C mtDNA変異株および野生型mtDNA株間で比較した（図４−２）。T9176C変異mtDNAを有するミトコンドリア細胞は、野生型mtDNAを持つものよりもミトコンドリア活性がより少なかった。MitoTrackerの強度は変異型ミトコンドリア細胞において、17.4±20.4（標準±標準偏差）であり、野生型において37.8±30.9であった。結果は、サイブリッドにおけるT9176C mtDNA変異株および野生型mtDNA株間の違いに相当した。変異サイブリッドにおいて強度は43.5±79.9であり、野生型において101.6±71.7であった。T9176C変異mtDNAを有するサイブリッドも、野生型mtDNAのものに対して、活性の少ないミトコンドリアを持つ。この結果は、T9176C mtDNA変異は、ミトコンドリア膜活性の減少に、核の存在に関係なく、影響することを示唆する。
【００３６】
以下図４に示す結果の説明をする。
図４は、SYTO Green及びMitoTracker色素染色ミトコンドリア細胞およびもとのサイブリッドにおけるフローサイトメトリーの結果を示す。
（ａ）ミトコンドリア変異型細胞。（ｂ）ミトコンドリア野生型細胞。（ｃ）変異型サイブリッド。（ｄ）野生型サイブリッド。
図４−１。ミトコンドリア細胞は、ミトコンドリア膜活性を保持していたが、核または核ＤＮＡの多くを欠いていた。領域をSYTO Green およびMitoTrackerの陽性、陰性により4つの部分に分けた。陽性または陰性の標準は陰性対照およびサイブリッドの単一染色にしたがって決定した。T9176C変異型ミトコンドリア細胞（ａ）の97.6%および野生型ミトコンドリア細胞（ｂ）の99.6%は、各図の第1および３領域からなるSYTO Green陰性領域に存在した。一方、T9176C変異型サイブリッドの92.4%（ｃ）および野生型サイブリッド（ｄ）の97.3%は、第２領域と表される両SYTO Green およびMitoTracker陽性領域に存在した。
図４−２。T9176C変異型mtDNAを持つミトコンドリア細胞は、Mitotrackerにより評価されたように、野生型およびサイブリッドよりも活性の少ないミトコンドリア膜を表した。
（ａ）左の白抜き曲線が変異型ミトコンドリア細胞の強度である。右の黒塗り曲線が野生型のものである。
（ｂ）左の白抜き曲線が変異型サイブリッドの強度である。右の黒塗り曲線が野生型のものである。
【００３７】
【実施例６】
ミトコンドリア細胞の増殖試験
ミトコンドリア細胞の増殖を検討した。
（１）フローサイトメーターを用いたミトコンドリア細胞のソーティング
サンプルとしてT9176C mtDNA変異型と野生型のそれぞれのミトコンドリア細胞を用いた。対象として野生型mtDNAサイブリッドを用いた。生細胞の核酸に特異的なSyto Green (Syto 16)（モレキュラープローブ、オレゴン）をサンプルに1μM添加し15分間放置して蛍光染色し、フローサイトメーター（Epics ALTRA(商標) HyperSort(商標)、ベックマンコールター、米国）を用いてソーティングした。ミトコンドリア細胞のもととなったサイブリッド細胞の核染色の蛍光強度を基準に同等の蛍光強度を持つものを核DNA量含有群、それ以下のものを核DNA非含有群として、変異型と野生型のミトコンドリア細胞についてソーティングを行った。
【００３８】
（２）細胞数の計測
ソーティングしたミトコンドリア細胞は新鮮な10% FBSを添加したRPMI 1640培地中で8% CO2を含有する加湿混合気体中で37℃で培養した。対象のサイブリッドをSyto Greenへの暴露の後、RPMIの変わりにDMEM培地を用いる以外は上記と同様の条件で培養した。核DNA量含有群と核DNA非含有群とを経時的に（２週間毎）トリパンブルー染色を用いた色素排除試験により細胞数を計測した。
試験の結果、核DNA量含有群と同様、核DNA非含有群も増殖した（図５-１、２）。しかし、核DNA量含有群の増殖速度が核DNA非含有群より速かった（図５-１）。本研究で、ミトコンドリア細胞は細胞群中において核DNA量が非常に少ない状態で増殖可能であること、すなわち、核なしで増殖可能なことが示唆された。
【００３９】
以下に図５に示す結果の説明をする。
図５はミトコンドリア細胞の増殖試験の結果を示す。#3(+)は野生型ミトコンドリア細胞の核DNA量含有群、#3(-)は核非含有群を示す。#２(+)はT9176C変異型ミトコンドリア細胞の核DNA量含有群、#２(-)は核非含有群を示す。各群の細胞数は経時的にトリパンブルー染色で計測した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法および該方法により得られる細胞が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 新規なミトコンドリア細胞におけるT9176C変異の制限断片長解析の結果を示す図（写真）である。
【図２】 浮遊細胞の顕微鏡的特徴を示す図（写真）である。
【図３】 浮遊細胞及びもとのサイブリッドの共焦点顕微鏡解析の結果を示す図（写真）である。
【図４】  SYTO Green及びMitoTracker色素染色ミトコンドリア細胞およびもとのサイブリッドにおけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５】  ミトコンドリア細胞の増殖試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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