(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１発光物質（flu）が少なくともルミネセンス強度についてパラメーターに感応性であり、第２発光物質（ref）が少なくともルミネセンス強度および減衰時間についてパラメーターに非感応性である、少なくとも２つの異なる発光物質（flu、ref）を利用する、サンプルの生物学的、化学的または物理的パラメーターの蛍光測定方法であって、発光物質（flu、ref）が異なる減衰時間を有し、得られるルミネセンス応答の時間的挙動または位相挙動を使用して、該パラメーターの測定のための参照値（R）を作成することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
第１発光物質（flu）が少なくともルミネセンス強度についてパラメーターに感応性であり、第２発光物質（ref）が少なくともルミネセンス強度および減衰時間についてパラメーターに非感応性である、少なくとも２つの異なる発光物質（flu、ref）を利用する、サンプルの生物学的、化学的または物理的パラメーターの光学測定方法、特に発光測定方法であって、発光物質（flu、ref）が異なる減衰時間を示し、両方の発光物質のルミネセンス応答の時間的挙動または位相挙動を単一の検出器によって測定し、該測定した時間的挙動または位相挙動により、両方の発光物質の総強度には無関係な参照値を得、該参照値を利用してパラメーターを測定する、上記方法。
【請求項３】
第２発光物質（ref）の減衰時間が第１発光物質（flu）のものよりも長いことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発光物質（flu、ref）の励起および／または発光スペクトルが互いに重複していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
発光物質（flu、ref）を単一の光源によって共同して励起することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
発光物質（flu、ref）が同時に励起される、特に同時に励起が開始され、かつ／または同持続時間励起されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
得られる共同ルミネセンス応答の合計シグナル（Ages）から基準値を決定することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
両方の発光物質の合計シグナル（ges）の位相の位相シフト（Φm）を参照値（R）として使用することを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
参照値として、時間経過中での両方の強度Ｉ１およびＩ２の比率が利用され、Ｉ１は光源がオンである間の両方の発光物質（flu、ref）による発光の測定強度を意味し、Ｉ２は光源を消した後のリファレンス染料（ref）による発光の測定強度を意味することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
長寿命の発光物質（ref）を含有する粒子の表面に短寿命の発光物質（flu）を固定化し、別の担体を使わずにサンプルにこの粒子を加えることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中で測定される化学的パラメーターが、pH値、カリウム、カルシウム、硝酸、塩化物および各種の重金属などの各種のイオン性化合物の濃度、若しくはCO2およびNH3などの気体成分の濃度、またはレドックス電位であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
測定される生物学的パラメーターが蛍光染料で標識した抗体または抗原の濃度であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
第１発光物質（flu）が少なくともルミネセンス強度についてパラメーターに感応性であり、第２発光物質（ref）が少なくともルミネセンス強度および減衰時間についてパラメーターに非感応性である、少なくとも２つの異なる発光物質（flu、ref）が含まれたセンサー手段を含む、サンプルの生物学的、化学的または物理的パラメーターの蛍光測定のための装置であって、発光物質（flu、ref）が異なる減衰時間を有し、その結果得られるルミネセンス応答の時間的挙動または位相挙動を使用して、該パラメーターの測定のための参照値（R）を作成することを特徴とする、上記装置。
【請求項１４】
第１発光物質（flu）が少なくともルミネセンス強度についてパラメーターに感応性であり、第２発光物質（ref）が少なくともルミネセンス強度および減衰時間についてパラメーターに非感応性である、少なくとも２つの異なる発光物質（flu、ref）を提示するセンサー手段を含む、サンプルの生物学的、化学的または物理的パラメーターの光学測定、特に発光測定のための装置であって、発光物質（flu、ref）が異なる減衰時間を示し、両方の発光物質のルミネセンス応答の時間的挙動または位相挙動を単一の検出器によって測定し、該測定した時間的挙動または位相挙動により、両方の発光物質の総強度には無関係な参照値を得、該参照値を利用してパラメーターを測定する、上記装置。
【請求項１５】
第２発光物質（ref）の減衰時間が第１発光物質（flu）のものよりも長いことを特徴とする、請求項１３または１４に記載の装置。
【請求項１６】
発光物質（flu、ref）の励起および／または発光スペクトルが互いに重複していることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
発光物質（flu、ref）を共同して励起するための単一の光源を有することを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
装置が、得られる共同ルミネセンス応答の合計シグナル（ges）からパラメーター測定値および基準値を決定するためのものであることを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
装置が、両方の発光物質の合計シグナル（ges）の位相の位相シフト（Φm）に基づいて参照値を決定するためのものであることを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
装置が、時間経過中での両方の強度Ｉ１およびＩ２の比率として参照値を決定するためのものであり、Ｉ１は光源がオンである間の両方の発光物質（flu、ref）による発光の測定強度を意味し、Ｉ２は光源を消した後のリファレンス染料（ref）による発光の測定強度を意味することを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
長寿命の発光物質（ref）を含有する粒子の表面に短寿命の発光物質（flu）が固定されていることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の装置。
【請求項２２】
長寿命の発光物質（ref）が中心原子としてのRu、Re、Os、Rh、Ir、またはPtとαジイミンリガンドとを有する発光遷移金属錯体からなる群に属することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の装置。
【請求項２３】
短寿命の発光物質（flu）がpH感応性の発光指示物質であることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
短寿命の発光物質（flu）がキレート形成性の発光指示物質であることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、第１発光物質（flu）が少なくともルミネセンス強度についてパラメーターに感応性であり、第２発光物質（ref）が少なくともルミネセンス強度および減衰時間についてパラメーターに非感応性である、少なくとも２つの異なる発光物質を利用する、サンプルの生物学的、化学的または物理的パラメーターの蛍光測定のための方法、ならびに分光光度計とともに使用するための装置に関する。
【０００２】
本発明は特に、光センサーを使用する化学的パラメーターの光学的検出の、位相シフトおよび時間分解測定に基づいた、新規な原理に関する。使用する変調周波数は0.5〜5 MHzであり、低コストの光学半導体構成要素を使用して検出することができる。
【０００３】
文献および光センサーでの実経験で知られているように、ルミネセンス測定においては、測定変数として強度の代わりに減衰時間を測定することが確かに実用上有利である。例えば、光学システムのゆらぎは減衰時間をほとんどまたは全く妨害しない。光源の強度および光検出器の感度の変化、または曲がったファイバーによるシグナルの損失若しくはセンサーの幾何学的構造の変化によるシグナル強度に対する影響のいずれも、この測定シグナルには何ら影響しない。これは、強度の測定に問題を生じると考えられる、サンプルの未確定の光学的性質（濁度、固有の着色、または屈折率など）にも当てはまる。
さらに、多くの場合、測定されるシグナルは感応性層中の指示物質の濃度に大きく依存する。この理由のため、わずかな程度の光分解または浸出(leaching)はあまり重大ではない。
【０００４】
減衰時間によって化学的パラメーターをモニターするため、多数の測定原理が文献中で提案されてきた。最も頻繁に使用される方法の１つは、動的ルミネセンス消失、すなわち、アナライトによるルミネセンス指示物質の励起状態の無放射失活である。この手法は分子状酸素の光学的検出ならびにハロゲン化物および重金属イオンの検出のために使用される（1）。
【０００５】
別の失活方法では１個の指示物質分子中の光誘発性電子転移（短縮してPETと称される）が利用される。この例においては、ルミネセンス指示物質は各種の形態で含まれており、その中の１種（すなわち酸型または金属イオンが結合したもの）のみが強いルミネセンスおよび長寿命の特徴を有する。その他の形態（すなわち塩基型または金属イオンが結合していないもの）では、その指示物質は自由電子対を有し、これが放射を伴わないで励起状態を失活させることができる。その結果、減衰時間およびルミネセンス量子効率の両方が減少することとなる。この原理は光学的pH測定、または光学的イオンセンサー技術について使用することができる（2）。
【０００６】
提案された減衰時間の別の測定方法は、ある種のpH指示物質がプロトン付加および脱プロトン状態について、異なるルミネセンス強度、および一定であるが異なる減衰時間を表出するという効果を利用する。こうした指示物質として例えばセミナフトフルオレセインの誘導体が含まれる。こうした例においては、酸および塩基型のルミネセンスが同時にモニターされる。（pH依存性の）対応する２つの強度の比率は測定が可能な平均の減衰時間を与えることになる（3）。この方法の前提条件は指示物質の両形態がルミネセンス性であること、ならびにそれらの吸収および放出スペクトルが有意に重複していることである。
【０００７】
上記引用の測定原理の大部分においては、測定する減衰時間は一般に2,3ナノ 秒の範囲にあることに注意が必要である。しかし、ナノ秒の低い数字領域での減衰時間の正確な測定には、非常に高速の回路機構および高変調周波数ばかりでなく、高速光源および検出器が要求されるので、高価な装置が必要となる。この理由によって、このタイプのセンサーについて、近い将来に、光放出ダイオードおよび光ダイオードなどの光学的半導体構成要素を利用する低コストの装置はおそらく開発されないものと見られる。しかし、光センサーを広範囲の適用例で使用しようとするならば、安価な装置が不可欠である。この理由によって、測定範囲がマイクロ秒、またはさらにミリ秒の領域にある減衰時間センサーは、考慮すべき関心事である。これまでは、こうしたセンサーはほとんど光学的酸素測定のためのみに開発されて、実用化されており、ここでは数ミリ秒までの減衰時間を有する指示物質が使用されている。
【０００８】
新しい長寿命減衰時間センサーを開発するための最近の手法は、その光物理的特性がアナライトによって影響されない発光ドナー分子から、そのアナライトに感応性の、アクセプターと称される染料指示物質への、無放射エネルギー転移を使用するものである。対応するアナライトの濃度に応じて、アクセプターの吸収スペクトルはドナーの放射スペクトルの変化範囲に重複しなければならない。好適なルミネセンスドナーは中心原子としてルテニウム(II)、ルテニウム(Ｉ)、またはオスミウムおよびイリジウムを有する遷移金属錯体である。これらの化合物は長寿命（数100ナノ秒〜2,3マイクロ秒）および高量子収量の特徴を有する。この新しい手法は最初にLakowiczによって提案され、最近光学的pHセンサーに使用されている。原理的には、同様の様式で、こうしたオプトード(optode)をpCO2、NH3およびイオンの検出のために使用することもできる（4、5）。
【０００９】
こうしたセンサーの実用に伴って発生する重大な問題の１つは、エネルギー転移の比率、したがって測定し得る平均減衰時間がマトリックス中のドナーおよびアクセプターの距離および位置関係ばかりでなく、アクセプターの濃度にも少なからず依存することである。その結果、マトリックス中の指示物質の分布および距離の変化がセンサーの特性の変化を導くことになる。特に、マトリックスの膨潤は重大な問題を形成する。
【００１０】
センサーに対する酸素の影響によって別の問題が発生する。使用する長寿命ドナーのルミネセンスは酸素によってその後消失することが多いので、酸素濃度を測定に含めて、測定シグナルを補正する必要がある。その上、このプロセス中に膜中に反応性の一重項酸素が生成し、これは固定化された指示物質の光分解を加速するので、保存時および長期間の安定性の両方を低下させる。その結果、減衰時間測定法の定評ある利点の１つが失われる。
【００１１】
上記のタイプの装置の１つが米国特許第5,102,625号に開示されている。これ は２つの発光物質の強度を２つに別れた測定チャネルによって別々に測定するものである。パラメーターのモニターのための最終的シグナルとして、この２つの発光物質の強度の比率を使用する。ルミネセンスの減衰時間は測定に含まれない。この２つの発光物質は異なるスペクトル領域を持っている。
【００１２】
高測定精度および測定操作の比較的な単純性を兼ね備えた、サンプルのパラメーターの蛍光測定による決定のための方法および装置を提案することが本発明の１つの目的である。
この目的を達成するため、特許請求の範囲の請求項１の特徴を有する方法および請求項２１の特徴を有する装置を提案する。
【００１３】
本発明は時間分解法および位相変調技法を使用する、各種の化学的、物理的および生物学的パラメーターの蛍光測定による決定を可能にする新しい測定原理について記載する。本発明は長寿命の発光物質を添加混合することによって、文献中に記載された大部分の蛍光センサーの強度シグナルの有効な基準化を可能にする。この目的のため、２つの異なる発光物質をセンサー中に共固定化する。（少なくとも数100ナノ秒の）一定の長寿命の減衰時間を有する１つの発光物質シグナルおよび１つの短寿命蛍光シグナルから合計シグナルを誘導する。長寿命のルミネセンスのパラメーターはアナライトによって影響を受けないが、共固定化された短寿命の発光物質の強度は対応するアナライトの濃度とともに変化する。位相変調技法によって得られた位相シフトΦmは２つの個々の発光物質の部分的強度の比率にもっぱら依存するので 、このパラメーターはそのパラメーターに感応性な発光物質の強度を直接反映する。したがって本発明は第２の光源または第２の光検出器を必要としないで、発蛍光団のシグナル強度を内部で基準化する、新しい方法に関する。２つの発光物質の分布が製造中に一定に維持されるならば、Φmはモニターされる物理的または化学的パラメーターにもっぱら依存し、一方光電システムの変更、ファイバー光学での損失およびサンプルの光学的性質の変更はこのシグナルに対して何ら影響しない。
【００１４】
好ましくは、両発光物質は同範囲の波長の光を吸収し、これによって１つの光源でルミネセンスに励起することができるようにする。発光スペクトルは好ましくは同一のスペクトル領域とする。例えば、両発光物質を波長が450 nmの青光で励起し、発光物質の１つは520 nmの緑光を、そしてもう一方は600 nmの赤光を放出することは、それでも両シグナルとも１つの同一の検出器で測定することができるので、可能である。しかし、発光スペクトルが互いにかなり異なっている２つの発光物質のルミネセンスを同時に測定することも可能である。
【００１５】
記載する測定方法は、長寿命発光物質がアナライトに特異的な応答を表出する必要はなく、単に短寿命発光物質によって変調される、一定の長期減衰時間を有するバックグラウンドシグナルの担体としてのみ作用するという利点を有する。この理由によって、文献に記載されたりん光化合物の多数がこの目的のために好適である。
【００１６】
長寿命発光物質はサンプル、アナライトまたは蛍光指示物質と相互作用する必要はなく、したがってすべてのサンプル成分に不活性になるように固定化することができ、予測し得る化学的パラメーターによるどんな潜在的妨害も排除される。
【００１７】
以下は実施例によるさらに詳細な本発明の説明である。
アナライトに不活性で、長い減衰時間を有する、好適な発光物質として、以下のものが含まれる：
- 中心原子としてルテニウム(II)、レニウム(I)、またはオスミウムおよびイリジウム、ならびにジイミンリガンドを有する遷移金属錯体；
- 中心原子としてプラチナ、パラジウム、ルテチウムまたはスズを有するりん光ポルフィリン；
- ユウロピウム、ジスプロシウムまたはテルビウムなどの希土類のりん光錯体；
- ルビー、Cr-YAG、アレキサンドライトなどのりん光結晶、またはフルオロゲルマニウム酸マグネシウムなどのりん光混合酸化物。
好適な短寿命蛍光物質として、励起および発光スペクトルが上記の長寿命発光物質のスペクトルと重複し、蛍光強度がモニターするパラメーターに依存するすべての染料が含まれる。
【００１８】
発光物質の可能な組合せ、またはルミノフォア(luminophore)／フルオロフォア(fluorophore)の例は以下のものである：
ルテニウム(II)-(トリス4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)／HPTS
ルテニウム(II)-(トリス4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)／フルオレセイン
ルテニウム(II)-(トリス4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)／ローダミンB
ルテニウム(II)-(トリス4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)／ローダミンB-オクタデシルエステル
ルテニウム(II)-(トリス4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)／ ヘキサデシルアクリジンオレンジ
ユウロピウム(III)-トリス-テオニル-トリフルオロメチルアセトネート／ヒドロキシメチルクマリン
プラチナ(II)-テトラフェニルポルフィリン／ローダミンB-オクタデシルエステル
プラチナ(II)-テトラフェニルポルフィリン／ローダミンB
プラチナ(II)-テトラフェニルポルフィリン／ナフトフルオレセイン
プラチナ(II)-テトラフェニルポルフィリン／スルホローダミン101
プラチナ(II)-オクタエチルポルフィリン／エオシン
プラチナ(II)-オクタエチルポルフィリン／チオニン
プラチナ(II)-オクタエチルケトポルフィリン／Nileブルー
CR(III)-YAG／Nileブルー
Cr(III)-YAG／ナフトフルオレセイン
【００１９】
長寿命発光物質は以下の各種の方法でセンサー内に組み込まれる（図６）：
- アナライト感応性層中に発光物質を直接溶解する（図６、実施例３）；
- センサー層のためのプライマーとして作用するポリマー中に組み入れる（図６、実施例１）；
- 感応性層中にマイクロまたはナノ粒子として分散しているポリマー中に組み入れる（図６、実施例２）；
- ゾル-ゲルガラス中にルミネセンス染料を組み入れた後、焼結し、微粉砕し 、そしてそのガラスをセンサー層中に分散させる（図６、実施例２）；
- 感応性層中に分散させた微粉砕蛍りん光体を利用する（図６、実施例２）；
- センサーフォイルの外側を被覆して、サンプルとの接触を回避する（図６、実施例４）；
- ポリマー層中に分散させるかサンプル中に直接分布させるかのいずれかのルミネセンス粒子の表面に蛍光指示物質を共有結合または静電結合させる；
- 蛍光指示物質が溶質として含まれているサンプル中に粒子を分散させる。
【００２０】
位相変調技法をkHzの範囲の周波数で使用する場合は、このタイプのセンサーでは平均位相シフト以外を取得することは不可能であることに注意することが重要である。両減衰時間成分に分離することは原理的には可能であるが、高周波数が必要なため、相当程度の装置稼働費用を要することになる。２つの共固定化した指示物質の減衰時間に大きな差異があることから、１励起光パルスを供給する時間分解測定は、励起パルスが停止した後のルミネセンスシグナルの減衰特性のみに関係するので、有用なパラメーターを産生するのに失敗することが多い。なぜならば、短寿命成分はあまりにも早く減衰するので、かなりの費用をかけないと検出できないからである。
【００２１】
さらに、励起パルス中と減衰期間中に分けてシグナル強度の時間分解測定を実施し、２つのシグナルの比率Rを算出することが可能である。図４に示すように、この比率は２つのルミネセンス成分の強度の比率Rのみに依存し、シグナルの総強度には完全に無関係である。
【００２２】
ルミネセンスシグナルの平均位相シフトを決定するために、位相変調技法を使用することもできる。測定用周波数を発光物質の減衰時間に適応させるが、これは0.5〜100 kHzである。以下に示すように、式(1)は測定された位相角Φmが２つのシグナル強度の比率のみに依存し、絶対シグナルレベルには依存せず、したがって短寿命蛍光成分の強度の基準化が可能であることを意味している。
【００２３】
条件１：
シグナルの相加重ね合わせ（添字 ref＝基準シグナル、添字 flu＝蛍光シグナル、添字 m＝測定値）
【式１】
0004272347.tif 000002
【００２４】
条件２：
長い方の減衰時間は短い方の減衰時間よりもはるかに大きい。
【式２】
0004272347.tif 000003
変調周波数をτrefにとって最適なものに選択する場合、すなわち、
【式３】
0004272347.tif 000004
の場合、
Φfluについては、
【式４】
0004272347.tif 000005
となる。
上記の前提の結果、角Φfluについては、
【式５】
0004272347.tif 000006
となる。
【００２５】
条件３：
長い方の減衰時間を表出する染料の減衰時間は対象とする測定について一定である：
【式６】
0004272347.tif 000007
これによって相加等式が以下のように単純化される：
【式７】
0004272347.tif 000008
上の第１式を第２式で割ると、その結果：
【式８】
0004272347.tif 000009
となる。
【００２６】
これにより、振幅比に対してcotΦmをプロットすると、測定した位相角Φmのコタンジェントと２つの発光物質の振幅比R（すなわち強度の比率）間の直線関係が示される（図２参照）。
２つのシグナル強度を別に測定する必要がなく、cotΦmが強度の比率を表す。
【００２７】
主要な利点は次のとおりである：
- 新しいセンサーの製造における、合成および最適化のコストが低い。
- 長寿命の発光物質を単に添加混合するだけで、減衰時間測定のために以前最適化した蛍光センサーを容易に転換できる。
- 各種アナライトのための一連のセンサーについて、１つの長寿命発光物質をそのまま使用することができる。したがって、同一の光電システムによって異なるセンサーを評価することができる。
- 検量線の形状は２つの強度の比率にのみ依存するので、添加する発光物質の量を変更することによって、各センサーの感度の範囲を簡単に最適化することができる。
- 励起および発光の両方についてのスペクトルウィンドウの最適な選択によって、同一の目的を達成することができる。
- 気体に対して非透過性の物質中に指示物質を組み入れることによって、酸素に対する長寿命ルミネセンスの交差感応性を除外することができる。
- りん光固体またはガラスに包埋した発光物質を使用するならば、サンプル中の化学的ルミネセンスパラメーターによるシグナルに対するあらゆる影響が完全に排除される。
- 酸素はルミネセンスを消光することができないので、膜内には反応性一重項酸素は産生されない。その結果、光分解が減少し、センサーの安定性が改善されるはずである。
- 長寿命発光物質のガラスマトリックス内への組み入れまたは固体としてのそれは完全に浸出を防止する。さらに、その光安定性は格別強い。
- アナライトによる長寿命発光物質の励起状態の失活に基づく測定原理（PET効果、動的消光、またはエネルギー転移）においては、平均減衰時間の減少は常にシグナル強度の減少を伴い、これはシグナル-ノイズ比を悪化させるが、本件のタイプのセンサーでは、減衰時間の減少とともにシグナル強度が上昇する。その結果、シグナル-ノイズ比は全測定範囲にわたって、有意に改善されることになる。
【００２８】
これらのセンサーの特性は２つの指示物質のシグナル成分の比率のみに依存するので、以下の条件に合致しなければならない：
1)  ２つの指示物質のいずれもが測定中に浸出してはならない。
2)  ２つの指示物質が測定中に異なる光分解速度を表示してはならない。
3)  ２つの指示物質の濃度比率が膜の加工製造中に一定に維持されなければならない。
4)  長寿命の発光物質の減衰時間が常に一定でなければならない。
多くのセンサーについて、これらの条件は容易に満足される。
【００２９】
この原理に基づく光センサーの例として以下のものがある：
（pHセンサー）
- 第４級アンモニウム基を有するセルロース上に吸着され、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(PHEMA)ヒドロゲル中に組み込まれたHPTS。
- ゾル-ゲル中のRu(phen)3Cl2（焼結し、粉砕し、ヒドロゲル中に分散）。
（図５は周波数 80 kHzでの位相シフトとして測定した、このセンサーの検量 線を示す）
【００３０】
（pHセンサー）
-Ru(phen)3Cl2（焼結し、粉砕し、ヒドロゲル中に分散）が組み込まれているゾル-ゲル粒子に共有結合したアミノフルオレセイン。
【００３１】
（CO2センサー）
- バッファーとしてテトラオクチルアンモニウムヒドロキシドを含む、エチルセルロース中に溶解したHPTS-CTA3イオン対（6参照）。
- センサーフォイルの外部被覆剤としてPVC中のRu(4,7-diph-1,10-phen)。
【００３２】
（NH3センサー）
- NPOEを含むPVC中に溶解したローダミンB（7参照）。
-センサーフォイルの外部被覆剤としてPVC中のPt(II)-テトラ-ペンタフルオ ロフェニル-ポルフィリン。
【００３３】
（カリウムセンサー）
- 可塑剤を含むPVC中に溶解した親油性化したNileブルー（8参照）。
- 外部被覆剤としてPVC中のPt(II)-オクタエチルケトポルフィリン。
【００３４】
このように、本発明は光センサーを使用した、サンプルの化学的、生物学的または物理学的パラメーターの光学的モニターを可能にする。センサーは共固定化された形態の２つのルミネセンス指示物質を含み、その１つはバックグラウンドルミネセンスシグナルの担体として作用し、長いルミネセンス寿命（好ましくは少なくとも100ナノ秒から数ミリ秒までの範囲）の特徴を有し、その強度および減衰時間はモニターするパラメーターの影響を受けない。第２の指示物質はこれより短い寿命、好ましくは数ナノ秒の範囲、の蛍光を表示し、これは長寿命ルミネセンスシグナルに重なり、その強度はモニターするパラメーターの関数である。位相変調技法または時間分解測定法を使用して、２つの個々のルミネセンス強度成分の比率を表示するものである、参照値を測定する。この参照値はルミネセンスシグナルの合計強度には無関係で、これによって短寿命のアナライト依存性蛍光成分を基準化することが可能になる。
【００３５】
（参照文献）
0004272347.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】  蛍光指示物質および基準発光物質の強度間の関係に対する測定位相角Φmの依存性を示す；Ａは強い蛍光シグナル、Ｂは弱い蛍光シグナルのものである。使用する表示は、flu＝変動性蛍光シグナル、ref＝一定基準シグナル、ges＝測定した合計シグナル、である。
【図２】  測定位相角Φmまたはそのcot(Φm)および２つの発光物質の振幅の比率R間について算出した関係を示す。
【図３】  好適な一対の蛍光指示物質および基準発光物質のスペクトル特性を示す。斜線部分はルミネセンスシグナルの励起および放出光の測定に最適なスペクトルウィンドウを示す。
【図４】  励起パルス中（I1）およびルミネセンス減衰中（I2）のシグナル強度の比率の時間分解測定を示す。この比率Rはモニターされる化学的パラメーターのみの関数 であるので、総合シグナル振幅には無関係である。
【図５】  実施例1にしたがうpHセンサーのpH検量線を示す。別量のHPTS（Ａ：低HPTS； Ｂ：高HPTS）について、変調周波数 80 kHzでの位相シフトとして測定した。光源として青色LEDを使用し、検出器としてホトダイオードを使用した。
【図６】  光センサー中の、化学的に感応性な短寿命の発光物質（Ａ）および不活性な長寿命の発光物質（Ｂ）の４種の可能な組合せを示す。
【図１】
0004272347.tif 000011
【図２】
0004272347.tif 000012
【図３】
0004272347.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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