(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド・プローブ。
【請求項４】
配列番号：２で示される塩基配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項５】
配列番号：２で示される塩基配列の少なくとも３０の連続するヌクレオチド配列を含んでいる請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項６】
請求項３から請求項５に記載のヌクレオチド・プローブを用いるＭＦＨ腫瘍診断剤。
【請求項７】
請求項３から請求項５に記載のヌクレオチド・プローブを用いるＭＦＨ腫瘍診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、8p23.1での増幅の共通する領域から、蛋白結合分子の特徴である高く保存されたロイシン縦列反復領域を含んでいる新規の遺伝子を単離した。該遺伝子は、ATP/GTP結合部位、３つのロイシン−ジッパー・ドメイン、及びロイシン−リッチ縦列反復有しており、それら全てが、細胞サイクルに関連した蛋白間の相互作用に対して重要な構造叉は機能的な構成要素である。かかる遺伝子のｃＤＮＡ解析などによって、ＭＦＨ(malignant fibrous histiocytomas:線維性組織球腫)についての診断、治療、かかる治療のための新しい治療薬の開発などを行い得る新規な遺伝子（MASL1遺伝子）、該遺伝子を保有するｃＤＮＡ、その発現産物（MASL1蛋白質）、これらを利用した医薬組成物及び遺伝子診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＦＨは成人に見られる最も一般的な軟組織肉腫である(Enzinger, F.M.and Weiss, S.W., malignant fibrohistocyttic tumors: Soft Tissue Tumors. CV Mosby:  St.louis, pp.351-380 (1995))。近年のＷＨＯのクラス分類では、MFHは「多形性紡錘細胞肉腫：plemorphic spindle-cell sarcoma」として定義されて、通常成人に生じ、未だ分化の明瞭な細胞株は示されていない(Weiss,S.W.,Histological Typing of Soft Tissue Tumors,Springer-Verlag:Berlin (1994))。組織学的には、ＭＦＨは、線維芽細胞、組織球細胞、及び奇型細胞の混成された不均一な肉腫のグループと定義されており、その間質はしばしば様々な量の炎症細胞、コラーゲン、及び粘液様の物質から成り立っている。腫瘍が線維芽細胞、組織球細胞又は未分化間葉細胞を起源とするかどうかは知られていない。ＭＦＨの４つの組織学的なサブ・タイプのうち、花むしろ状の多形性と奇型のサブ・タイプがもっとも一般的であり、一方、巨大細胞叉は炎症のサブ・タイプはまれにしか見られない。ＭＦＨの核型の異常は通常、複雑な数的異常か構造異常を示す構造的な再配列を持つ複合体である。ＭＦＨに対して特異的な染色体異常は今までは特定されていない。しかしながら、このタイプの腫瘍においてしばしば見られる染色体の染色体末端部の融合、同定不能な環状染色体、二動原体の染色体は、また、同様に、遺伝子増幅の染色体変化として二重微小染色体や均一染色体領域が出現する(LeDoussal,V., et al., Cancer, 77,1823-1830 (1992): Pezzi, M.E., et al., Cancer, 69, 2098-2103 (1992))。軟組織における腫瘍の発生に対して潜在的な病因として重要な役割を果たす幾つかの知られている癌原遺伝子がＭＦＨの関与のために研究されている：それは、ＳＡＳ遺伝子(SAS:the sarcoma-amplified-sequence gene)、ＭＤＭ２遺伝子(the murine double-minute 2 gene: MDM2)のヒト・ホモログ、サイクリン依存性キナーゼ４(cycline-dependent kinase 4: CDK4)、C/EBPをコードする遺伝子相同蛋白(CHOP)などである。前記した全ての遺伝子が染色体12q13-15にマップされており、ＣＨＯＰを除く全てが、試験したＭＦＨの３分の１以上において増幅されている(Nilbert,M., et al., Cancer Genet. Cytogenet., 83, 32-36(1995))。
【０００３】
腫瘍抑制遺伝子ＴＰ53(17q13)叉はＲＢ1(13q14)に影響を与える変異がＭＦＨ腫瘍においてもおよそ３分の１に報告されている(Wadayama, B., et al., Br.J.Cancer,68,1134-1139 (1993): Wunder, J.S., et al., J. Natl. Cancer Inst., 83,194-200 (1991))。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、このタイプの腫瘍の発達及び/叉は進展に影響するかもしれないゲノムの変異を探究するためにＣＧＨによって１９例のＭＦＨ腫瘍を解析した。本発明者らは異なった染色体の幾つかの領域を含む欠失と増加を合わせて、明瞭な高いレベルの増幅が６つの局座、染色体座位4q12-21、8p21-pter、8q24.1-qter、9q12-13、12p11.2-pter、及び15q11.2-15にあることを見出した。これらの領域の各々が、ＭＦＨの腫瘍の成立に関与する１又はそれ以上の潜在的な癌原遺伝子を含んでいるかもしれない。そのような遺伝子の特定に向けての第一段階として、本発明者らは、その分子の構造を詳細に特徴づけるために８ｐアンプリコンに焦点を当てた。8p23.1での増幅の共通する領域から、本発明者らは、蛋白結合分子の特徴である高く保存されたロイシン縦列反復領域を含んでいるＭＡＳＬ１と命名された新規の遺伝子を単離した。本発明は、かかる知見を基礎として完成されたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、まず第１に、以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む遺伝子：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号：２を持っているポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の相同性を持っているポリヌクレオチド、
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドに対する相補鎖であるポリヌクレオチド。
【０００６】
本発明によれば、第２に以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子：
（ａ）配列番号：２で示される塩基配列又はそれらの相補鎖、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０００７】
本発明によれば、第３に配列番号：２で示される塩基配列である遺伝子、又は配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子及びその遺伝子発現産物、遺伝子を有する組換え体発現ベクター、並びに該組換え体発現ベクターを有する宿主細胞、またはMASL1蛋白質を発現するクローン化ｃＤＮＡ及びその断片、その誘導体及びその相同物。
【０００８】
さらに本発明によれば、第４に、配列番号：２で示される塩基配列の少なくとも１５又は３０の連続するヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチド、または。
【０００９】
本発明によれば、第５に、配列番号：２で示される塩基配列に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドが少なくとも１５又は３０の連続するヌクレオチド配列を用いて作成される配列を含んでいる前記アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びこれらのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する遺伝子治療剤。
【００１０】
さらに本発明によれば、第６に配列番号：２で示される塩基配列からなるＤＮＡプローブ、またはそれらのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号：２で示される塩基配列の少なくとも１５又は３０の連続するヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドプローブ及びこれらのオリゴヌクレオチドプローブを用いる診断剤並びに診断用キットを提供することが出来る。
【００１１】
本発明によれば、第７に以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質であるMASL1蛋白質：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つMASL1活性を有する蛋白質。
【００１２】
さらに本発明によれば、第８にMASL１遺伝子又は遺伝子発現産物を用いる相互作用物のスクリーニング方法。
【００１３】
更に本発明の遺伝子の相同物であって、ヒト、イヌ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ及びネコから選ばれる哺乳動物の遺伝子相同物、本発明の遺伝子の発現産物に結合性を有する抗体及び該抗体を癌の診断に用いる診断方法および該抗体を有効成分とする癌治療剤が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、このタイプの腫瘍の発達及び/叉は進展に影響するかもしれないゲノムの変異を探究するためにＣＧＨ(Comparative genomic hybridization:比較ゲノムのハイブリダゼーション)によって１９例のＭＦＨ腫瘍を研究し、ＭＦＨ患者の染色体上において発現する新たな関連遺伝子の探索についての研究結果として完成されたものである。
【００１５】
即ち、１９例のＭＦＨ腫瘍の研究から異なった染色体の幾つかの領域を含む欠失と増加を合わせて、明瞭な高いレベルの増幅が６つの局座染色体座位、4q12-21、8p21-pter、8q24.1-qter、9q12-13、12p11.2-pter、及び15q11.2-15にあることを見出した。本発明者らは、その分子の構造を詳細に特徴づけるために８ｐアンプリコンに焦点を当てて、8p23.1での増幅の共通する領域から、本発明者らは、蛋白結合分子の特徴である高く保存されたロイシン縦列反復領域を含んでいるＭＡＳＬ１と命名された新規の遺伝子を単離した。
【００１６】
本発明のＭＡＳＬ１遺伝子は、ＭＦＨ患者のサンプルからＣＧＨによって染色体８の短腕上において高いレベルの増幅が見られた患者サンプルからの全ゲノムＤＮＡを用いて逆染色体ＦＩＳＨを行い増幅物のバンドを8p23.1に限局させた後、サザンブロット分析により、増幅した領域内のゲノム断片を特定した。次いでサザンブロット分析により、高い増幅コピー数を持つＥＳＴ、ＧＥＮ−０２４Ｈ１０をプローブとして、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを単離し、塩基配列を決定することにより、その配列が決定されたものである。
【００１７】
本発明MASL1遺伝子は、配列番号：１で示される１０５２アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを有する遺伝子として特定される。
【００１８】
本発明MASL1遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の計算された分子量は１１６８９０Ｄ（１１７ｋＤ）である。
【００１９】
本発明MASL1遺伝子がコードするアミノ酸配列は、ロイシン−リッチ縦列反復領域を有しており、またＭＡＳＬ１の反復配列は酵母アデニレート・シクラーゼに生じている遺伝子配列に大変類似しており、更にＭＡＳＬ１の推定アミノ酸配列は、ＡＬＳ(Kobe, B., and Deisenhofer, J., Trends Biochem. Sci., 19, 415-421 (1994))と高い相同性を有していた。
【００２０】
上記のとおり、本発明により提供される新規なMASL1遺伝子のその推定産物の基本構造は、ATP/GTP結合部位、３つのロイシン−ジッパー・ドメイン、及びロイシン−リッチ縦列反復を明らかにし、それら構造の全てが、細胞の増殖や分化、アポトーシスさらにＤＮＡ合成などにサイクルに関連した蛋白間の相互作用に対して重要な構造叉は機能的な構成要素であるので、MASL１蛋白と結合すると予測できる分子、さらにはMASL１蛋白の結合によって細胞の増殖や分化、さらに複合蛋白分子の機能などの生体機能の調節に影響を与えると考えられる。
【００２１】
また、後述するようにＭＡＳＬ１の過剰発現がMFHに関しては癌遺伝子に属するものであると考えられる。
【００２２】
かかる本発明遺伝子の提供によれば、各細胞での細胞の増殖、分化、アポトーシスを調節する作用により、該作用に関与する疾患、例えば悪性腫瘍などの病態解明や診断、治療などが可能である。
【００２３】
本発明MASL1遺伝子の全部叉は一部は、これらを利用する発現産物に結合する抗体の製造、並びに抗体を用いる診断に利用できる。
【００２４】
更に本発明遺伝子の提供によれば、遺伝子配列のアンチセンス断片、これらの発現産物の利用によれば、上記疾患の形成を抑制することもできる。
【００２５】
本発明MASL1遺伝子の全部叉は一部をプローブとして利用でき、該利用により、癌の診断並びに診断用キットの一部として利用することができる。さらに腫瘍においてMASL１遺伝子の遺伝子増幅・発現亢進は、癌の診断ばかりでなく、癌の悪性度の判定にも利用可能である。
【００２６】
本発明MASL1遺伝子又はその発現産物を用いるMASL１蛋白相互作用物のスクリーニングに利用することも出来る。
【００２７】
尚、本発明によって提供されるMASL1遺伝子の一例は、ヒト癌細胞起源のものであり、その利用によれば、ヒトを含む各種哺乳動物の相同遺伝子も提供できる。また、本発明遺伝子の利用によれば、本発明遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のＣ末端側と結合する遺伝子の同定を行うこともできる。
【００２８】
以下、本発明DNA分子(MASL1遺伝子)につき詳述する。
【００２９】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３０】
また、本発明において遺伝子(DNA）とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子(DNA）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００３１】
本発明MASL1遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示されるクローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。
【００３２】
このクローンが有する遺伝子は、配列表中、配列番号：１に示される１０５２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードする３１５９ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配列番号：２に示される塩基配列を示す）を有する。陽性クローンからｃＤＮＡ配列の一方向配列から上記３１５９ｂｐの単一のオープン・リーディング・フレームを含む６２４２ｂｐ転写体を確認した。転写の開始(「コザックのルール」)の為のコンセンサス配列がよく保存されていることから、転写の為の開始コドンは、ヌクレオチド番号の４１７−４１９番目であることが考えられた。
【００３３】
なお、全長ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号：３に示すとおり６３４５ヌクレオチドである。
【００３４】
また、本発明MASL1遺伝子のＰＳＯＲＴプログラム(Nakai, K. and Kanehisa, M.A., Genomics, 14,897-911 (1992) )は、アミノ酸配列中央(486-502残基)において一つの疎水性の領域を示した、しかしながら、疎水性プロット(Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., 157, 105-132  (1982))では疎水性領域を予測しなかった。１つのＡＴＰ／ＧＴＰ結合サイト・モチーフ「Ａ」([AG]-X(4)-G-K-[ST])が416−423残基で見出された。ロイシン残基が「ロイシン・ジッパー」として知られている構造的なモチーフを形成することが出来る各7つのアミノ酸として反復していた(Landschulz,W.H., et al., Science, 240, 1759-1764  (1988))。
【００３５】
推定された遺伝子産物は３つのロイシン−ジッパー領域を含んでいるようで(68-89残基、102-123残基、及び962-983残基)、４つのロイシン残基を持つ各々は、７つのアミノ酸の繰り返しを持って一定の間隔を空けていた。
【００３６】
本発明のDNA分子としては、例えば配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するMASL1遺伝子を挙げることができるが、特にこれに限定されることなく、当該MASL1遺伝子の相同物も包含される。
【００３７】
ここで「MASL1遺伝子の相同物」とは、本発明MASL1遺伝子（又はその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性、及び上記したようなその生物学的機能の類似性によりひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、MASL1遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。
【００３８】
具体的には、配列番号：１で示される特定のアミノ酸配列において、一定の改変を有する蛋白質であって、且つ該特定のアミノ酸配列を有するMASL1蛋白質と同様の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００３９】
尚、上記アミノ酸配列における相同性は、Genome Net：ゲノム・ネットを使用するＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994))において、通常、アミノ酸配列の全体で約４５％以上、好ましくは約５０％以上であることができる。
【００４０】
また、上記相同性は、ロイシン−リッチ反復モチーフ領域におけるそれが約３５％以上、好ましくは約４５％以上のいずれか少なくとも一つを満たしていることが望ましい。
【００４１】
即ち、本発明MASL1遺伝子には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列において１又は数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含むDNA分子もまた包含される。
【００４２】
ここで、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそれらの位置などは、改変された蛋白質が、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（MASL1蛋白）と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されない。本発明において「MASL1活性」とは配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質が有する活性並びに機能を意味し、具体的には、細胞の増殖、分化、アポトーシスを調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節すると予想される機能を指す。
【００４３】
上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明のヒトMASL1又はヒトMASL1遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。本発明の遺伝子（ヒトMASL1遺伝子）には、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。
【００４４】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００４５】
本発明遺伝子の具体的態様としては、配列番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。この塩基配列中のコーディング領域は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００４６】
また、本発明DNA分子は、前記のとおり、配列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
【００４７】
上記相同性は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は配列番号：２に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％、更に最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
【００４８】
かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で配列番号：２に示される塩基配列中、２３６１−３８５８の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することもできる。
【００４９】
本発明遺伝子は、本発明により開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００５０】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００５１】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００５２】
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００５３】
具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【００５４】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００５５】
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものも含まれる、或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来る。
【００５６】
本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
【００５７】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
【００５８】
また、上記で得られる本発明遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００５９】
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
【００６０】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕及びその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
【００６１】
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００６２】
このように、本発明の遺伝子には、本発明にかかるMASL1遺伝子を検出するための特異プライマー及び／又は特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含される。
【００６３】
当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規定することできる。ここで、ストリンジェントな条件としては、プライマー又はプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。
【００６４】
本発明のMASL1遺伝子によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物（MASL1蛋白）又はこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００６５】
従って本発明は、本発明遺伝子によってコードされるMASL1蛋白質などの蛋白質を始め、該蛋白質の製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して上記本発明蛋白質を製造する方法などをも提供するものである。
【００６６】
本発明蛋白質の具体的態様としては、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するMASL1蛋白質を挙げることができるが、本発明蛋白質には、該MASL1蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記MASL1活性を有する蛋白質を挙げることができる。具体的には、前記MASL1遺伝子の相同物（アレル体を含むMASL1同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることができる。
【００６７】
また、本発明MASL1蛋白質の相同物には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のMASL1蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどのげっ歯類動物の蛋白質も包含される。
【００６８】
本発明の蛋白質は、本発明により提供されるMASL1遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。
【００６９】
該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行なわれる。
【００７０】
上記宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含まれるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００７１】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００７２】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMingen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００７３】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen社）なとが包含される。
【００７４】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００７５】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。
【００７６】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００７７】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００７８】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００７９】
かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００８０】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００８１】
尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号：２に示されるMASL1遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【００８２】
また、MASL1遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法により行うことができる。
【００８３】
本発明蛋白質は、また、配列番号：１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００８４】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよい。
【００８５】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などを例示できる。
【００８６】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなど及びこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００８７】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【００８８】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【００８９】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【００９０】
かくして得られる本発明蛋白質は、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【００９１】
本発明MASL1蛋白質は、その特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクローナル抗体を取得することができる。
【００９２】
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００９３】
かくして得られる抗体は、例えばMASL1蛋白の精製及びその免疫学的手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。より具体的には、本発明遺伝子の増幅および発現亢進が癌細胞において確認されていることから、該抗体を用いて癌の診断叉は、癌の悪性度の判定に利用することが出来る。
【００９４】
更に、MASL1に結合する抗体を有効成分とする癌の治療剤として利用することができる。
【００９５】
従って、本発明MASL１蛋白質に結合する抗体は、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。従って、本発明は本発明蛋白質を有効成分とする医薬組成物をも提供するものである。
【００９６】
該医薬組成物において有効成分とする蛋白質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びナプシレートなどが例示される。
【００９７】
上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
【００９８】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００９９】
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１００】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独で又は界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１０１】
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１０２】
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類など及びそれらの誘導体などを使用できる。
【０１０３】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１０４】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１０５】
上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【０１０６】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１０７】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１０８】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１０９】
本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１１０】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１１１】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１１２】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１１３】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【０１１４】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１１５】
非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。  滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１１６】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１１７】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト及びオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【０１１８】
経鼻又は舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１１９】
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１２０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１２１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
【０１２２】
また、本発明は、本発明MASL1遺伝子の発現する細胞において、細胞内のmＲＮＡに対して相補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、ＭＡＳＬ１遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬の提供による癌の遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えばMASL1遺伝子を有する癌細胞本来のｍＲＮＡと結合させるか、或いはＤＮＡ二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害することによって、標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。そのためには遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
かかるMASL1遺伝子の発現機能を抑制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞における新生物の増殖を抑制することができる。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することができる。
【０１２３】
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた癌遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これを癌細胞に感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の抗腫瘍効果を得ることが出来る。
【０１２４】
このようにMASL1遺伝子を有する細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入してMASL1蛋白の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは対応するMASL1遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該ＭＡＳＬ１遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子を使用することもできる。
【０１２５】
かかる組換え及び染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したMASL1 のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該アンチセンス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書及びＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１及び／又はｐＲＳＶＬなど）又はｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１２６】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１２７】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮及び胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼ、サイトチトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
【０１２８】
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１又は６、ロイクリンなどを例示できる。
【０１２９】
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン、チロシンヒドロキシラーゼ膵臓ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
【０１３０】
なおアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＭＡＳＬ１遺伝子配列に対応する相補配列全部又は一部）は、本発明のMASL1遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【０１３１】
かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、MASL1 でアンチセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態で癌の抑制ないしは癌転移の抑制のための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
【０１３２】
遺伝子治療においては、上記のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の腫瘍部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の腫瘍細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的腫瘍細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【０１３３】
本発明の遺伝子治療方法は、前述するアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両方の方法を包含する。
【０１３４】
またMASL1 をアンチセンス・オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
【０１３５】
後述する、本発明MASL1 に対応する配列のアンチセンス・オリゴヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクター及び該ベクターによりヒトMASL1 がアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に癌をその利用対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、癌以外にも遺伝性疾患、ＡＩＤＳのようなウイルス疾患の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
【０１３６】
また、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、癌細胞や腫瘍組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。
【０１３７】
上記遺伝子治療におけるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法及び非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１３８】
ウイルス的導入方法としては、例えば、MASL1 がアンチセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr virus）ベクターなどがあげられる。
【０１３９】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato,K.,et al.,J.Biol.Chem.,266,22071-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87,9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wolff,J.A.,et al.,Science,247,1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotechnol.,11,202 (1993); Miller,et al.,FASEB J.,9,190 (1995)〕などを使用することができる。
【０１４０】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al.,J.Biol.Chem.,266,14338 (1991); Ferkol,et al.,FASEB J.,7,1081-1091 (1993)〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,87,3410 (1990)〕などが含まれる。
【０１４１】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的及び物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化及びエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１４２】
以下、具体的な本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞又は標的組織へのアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法について述べる。
【０１４３】
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeats)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージングシグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 に対応する全アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【０１４４】
所望のMASL1 をアンチセンス・オリゴヌクレオチド組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が発現する。
【０１４５】
尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat.,23,747 (1995)〕を採用することもできる。
【０１４６】
なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。
【０１４７】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Immunol., 158,39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguchi,Y.,et al., Blood, 84,2946-2953 (1994)〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12,28-34 (1994)〕及びケナーら〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91,6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。
【０１４８】
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１及び／又はＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド、即ち本発明MASL1 、アンチセンス・オリゴヌクレオチドそのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）及びアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のMASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチドを包含する本発明遺伝子治療用ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【０１４９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質のＲｅｐをコードしている。
【０１５０】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
【０１５１】
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫、高田賢蔵、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【０１５２】
本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエプスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【０１５３】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【０１５４】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【０１５５】
上記膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res.,159,399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【０１５６】
以下、該膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似ウイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞又は組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％(モル比）コレステロールとレシチン及び陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【０１５７】
また、別のリポソームを用いてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al.,B.B.R.C.,196,1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することも可能である。
【０１５８】
プラスミド包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholine）及びＤＯＰＥ（dioleoyl phosphatidylethanolamine）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μgの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１５９】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μg、リポソーム脂質量として３０nmolになるように包埋し、これを２μlのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１６０】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義されている。しかしながら、本発明における遺伝子治療とは、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞にMASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチドの癌抑制アンチセンスＤＮＡとして特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することによって癌を始めとする各種疾患の治療のみならず、更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含むものとする。
【０１６１】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１６２】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするMASL1 をアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適である。
【０１６３】
第２法は、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を直接患者の体内や腫瘍組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
【０１６４】
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきアンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するベクターを加える。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、2500回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣＲや、例えば所望の対象が酵素活性であればその活性の程度を測定することにより、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効果を確認する。
【０１６５】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
【０１６６】
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０8細胞に対して１×１０3ｃｆｕから１×１０8ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１６７】
上記第１法の別法として、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へアンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を導入する方法を採用することもできる。
【０１６８】
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、或いは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 アンチセンス・オリゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、或は膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際してアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１６９】
本発明遺伝子治療法において、特に癌や悪性腫瘍を対象とする場合は、患者から癌細胞を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする癌細胞に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in vivo測定)し、次いで放射線処理を施行し、患者腫瘍内または傍腫瘍に接種する癌治療法を一例として挙げることができる。
【０１７０】
本発明はまた、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター又は目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（MASL1 なアンチセンス・オリゴヌクレオチドど）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物又は医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１７１】
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１７２】
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記したMASL1蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１７３】
例えば、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１７４】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１７５】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１７６】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１７７】
一般には、医薬製剤としての所望アンチセンス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０3ｐｆｕから１×１０15ｐｆｕ程度とするのがよい。
【０１７８】
また所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、１×１０4細胞／bodyから１×１０15細胞／body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１７９】
該製剤は１日に１回又は数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質又はこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１８０】
本発明に従う遺伝子治療を癌の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来の癌化学療法、放射線療法、免疫療法などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
【０１８１】
本発明によれば、細胞の腫瘍形成を促すMASL1遺伝子の存在を検出するために、血液又は血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、MASL1の感受性遺伝子が存在する否かについて分析することが可能である。また、本発明によれば細胞叉は組織における新生物、悪性の前駆障害への進行、または予後指標としての存在を検出するためには、障害を有する生物学的な試料を調製し、MASL1の新生物遺伝子が存在するか否かについて分析できる。この方法を用いることにより細胞又は組織における新生物、悪性の前駆障害への進行、または予後指標としての存在を検出することが可能となり、これらの診断、例えば癌の診断並びに癌治療効果の判定並びに予後の予測が可能となる。
【０１８２】
該検出方法は、例えば、予め腫瘍を有する患者サンプルから得られたMASL1遺伝子に関する情報を基に、該ＤＮＡ断片を作成し、ＭＡＳＬ１遺伝子のスクリーニング及び／又はその増幅に用いられるように設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したＭＡＳＬ１の全部叉は一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまずＭＡＳＬ１と同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該MASL1配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動又はドットブロッティングで調製してもよい。
【０１８３】
前記スクリーニング方法としては、特にＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、MASL1断片をプライマーとして用いる方法であればとくに制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用されるＰＣＲ変法(榊佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可能である。
【０１８４】
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus:ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマー又はアンチセンスプライマー)の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的又は間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブ及びリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミング又はキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
【０１８５】
検出のために用いるＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
【０１８６】
また、本発明の測定方法は、試料中のMASL1遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【０１８７】
故に本発明は上記MASL1 ＤＮＡ断片を含有することを特徴とするMASL1の検出用試薬キットが提供される。
【０１８８】
該試薬キットは、少なくとも配列番号：２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部又は全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）が含まれていてもよい。
【０１８９】
標識剤としては、放射性同位元素又は蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【０１９０】
更に本発明は、前記測定方法を用いる癌の診断方法及び該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
【０１９１】
また、前記方法を用いることにより、被検試料中から得られたMASL1配列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、野生型MASL1と相同性の高い相同物である新たなMASL1遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。
【０１９２】
従って、本発明はかかる測定と被検試料中のMASL1 ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒトMASL1遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【０１９３】
また、本発明の配列番号：１で示されるヒトMASL1遺伝子でコードされる蛋白質、又は該配列番号：１において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、又はこれらの断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対する抗体を合成することによって、野生型MASL1及び／又は変異MASL1の測定が可能となる。
【０１９４】
従って、本発明は、野生型MASL1及び／又は変異MASL1の抗体測定法、抗原測定法を提供するものである。該測定法によって新生物状態の障害の程度、或いは悪性腫瘍の悪性度を野生型MASL1ポリペプチドの変化に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるMASL1配列分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリクローナル又はモノクローナル抗体)を用いて、MASL1蛋白質中の相違、又はMASL1蛋白質の有無を検出することができる。本発明の測定法の具体的な例示としては、MASL1抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からMASL1蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロット又はイムノブロット上でMASL1蛋白質と反応することができる。また、MASL1抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフィン又は凍結組織切片中のMASL1蛋白質を検出することができる。抗体産生技術及び精製する技術は当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
【０１９５】
野生型MASL1又はその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体及び／又は、ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、及び免疫酵素法(ＩＥＭＡ)が含まれる。
【０１９６】
また、本発明は、MASL1蛋白に対するMASL1結合活性を有する細胞膜画分又は細胞表面上に存在するMASL1レセプターをも提供することが可能である。該MASL1レセプターの取得は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識したMASL1蛋白をコンジュゲートさせ、MASL1結合反応物を抽出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定することによって達成され、該MASL1レセプター蛋白の取得並びに配列決定は、この分野の当業者には容易に達成できる。
【０１９７】
また本発明は、MASL1レセプター蛋白質又はその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリーニングする技術に用いることによって、化合物(MASL1レセプター反応物：化合物は低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原、又は抗体など言う)をスクリーニングすることに利用可能である。好ましくは、MASL1レセプターを利用する。かかるスクリーニング試験に用いるMASL1レセプターポリペプチド又はその断片は、固体支持体に付着するか、又は細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。
【０１９８】
薬剤スクリーニングの一例としては、例えば、MASL1蛋白質又はその断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物又は真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用することができる。また遊離の又は固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもできる。より具体的には、MASL1レセプター蛋白質又はその断片と、試験する物質との間の複合体の形成を測定し、MASL1レセプター蛋白質又はその断片とMASL1蛋白質又はその断片との間の複合体の形成が試験する物質によって阻害される程度を検出することによって化合物をスクリーニングすることが可能である。
【０１９９】
かくして、本発明は、当該分野で既知の方法によって、かかる物質とMASL1レセプター蛋白質又はその断片とを接触させ、次いで、該物質とMASL1レセプター蛋白質又はその断片との間の複合体の存在、又はMASL1レセプター蛋白質又はその断片とリガンドとの間の複合体の存在について測定することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、MASL1レセプター活性を測定して、かかる物質がMASL1レセプターを阻害でき、かくして上記定義されたMASL1の活性、例えば細胞増殖や分化を調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節できるかどうか判断する。かかる競合結合アッセイにおいて、より具体的には、MASL1レセプター蛋白質又はその断片を標識する。遊離のMASL1レセプター蛋白質又はその断片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（複合体未形成）標識の量は、各々、試験される因子のMASL1レセプターに対する結合又はMASL1レセプター：MASL1蛋白質結合の阻害の尺度となる。MASL1蛋白質の小さなペプチド(ペプチド疑似体)をこのように分析し、MASL1レセプター阻害活性を有するものを測定できる。
【０２００】
本発明において、薬剤スクリーニングのための他の方法は、MASL1レセプター蛋白質に対して適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリーニング法であって、該略すると、多数の異なるペプチド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験化合物をMASL1レセプター蛋白質と反応させ、洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合MASL1レセプター蛋白質を検出する方法も例示できる（ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精製されたMASL1レセプターは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、MASL1レセプター蛋白質を固相上に固定することができる。さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも目的とし、MASL1レセプター蛋白質又はその断片に対する結合性につき、MASL1レセプター蛋白質に特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競合によって、MASL1レセプター蛋白質の１又はそれ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可能である。
【０２０１】
また、薬剤スクリーニングに関し、さらなる方法としては、非機能性MASL1遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物が例えば、細胞増殖や分化を調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段として、MASL1レセプターの生物活性を測定することも可能である。
【０２０２】
また本発明によれば、より活性又は安定した形態のMASL1蛋白質誘導体又は例えば、イン・ビボ(in vivo)でMASL1蛋白質の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性な蛋白質又は構造アナログ、例えばMASL1アゴニスト、MASL1アンタゴニスト、MASL1インヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばMASL1と他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリング又は、これらの組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
【０２０３】
また上記より活性叉は安定した形態のMASL1蛋白質誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なMASL1誘導体を設計することができる。
【０２０４】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０２０５】
かくして、改善されたMASL1活性もしくは安定性又はMASL1活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２０６】
クローン化MASL1配列によって、十分な量のMASL1蛋白質を入手して、Ｘ線結晶学のような分析研究をも行うことができる。さらに、本発明の配列番号：１に示されるアミノ酸配列よりなるMASL1蛋白質の提供により、Ｘ線結晶学に代えるか又はこれに加えて、コンピューターモデリング技術に適応可能である。
【０２０７】
また本発明によれば、MASL1遺伝子含有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することによってMASL1遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なMASL1活性に影響を与えるかどうか、即ちMASL1遺伝子産物、並びに改変MASL1遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
【０２０８】
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989))。
【０２０９】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)に、本発明のヒト野生型MASL1遺伝子及び変異MASL1遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたMASL1活性もしくは安定性又はMASL1活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２１０】
【発明の効果】
本発明によれば、細胞の増殖、分化、アポトーシスを調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節する作用を有する新規なMASL1遺伝子が提供される。本発明遺伝子は、ＡＬＳと類似性を有し、このため、解析されたこれらの関連遺伝子の機能と各種疾患との係わりについての研究に利用でき、各種疾患への遺伝子診断並びに該遺伝子の発現産物に対する抗体やアンチセンスによる医薬用途への応用研究に用いることが可能である。また、本発明遺伝子の利用によれば、各種組織での該遺伝子の発現状況が調べられ、生体内におけるその機能を解析することが可能となる。
【０２１１】
また、該遺伝子によれば、該遺伝子がコードするMASL1蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供によれば、MASL1蛋白質活性やMASL1蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
【０２１２】
またMASL1蛋白質は、MASL1遺伝子及びその産物が関与する疾患（例えば、細胞の増殖、分化、アポトーシス調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節する作用に関連する各種疾患など、特に癌）の病態解明や診断、治療などに有用である。
【０２１３】
本発明によれば、更にMASL1アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該MASL1 がアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞及び該ベクター又は細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提供される。
【０２１４】
本発明によれば、更に各種癌細胞の成長抑制作用を有し、該作用による各種癌の疾患及び病態の処置などに使用されるMASL1 をアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はＭＡＳＬ１に結合性を有する抗体を有効成分とする医薬も提供することができる。
【０２１５】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
実施例１
１．材料及び方法
１）初期のＭＦＨ腫瘍
19例の全てのケースは、新らたに診断された未治療患者からの初期腫瘍組織を外科切除時に集められた。凍結サンプルからのＤＮＡは標準的方法に従い抽出した。
【０２１６】
ＣＧＨのために(Kallioniemi, O.P., et al., Science, 258, 818-821 (1992))、腫瘍の標本から単離されたＤＮＡサンプルをスペクトラム−グリーン−dUTP(Spectrum-green-dUTP:Vysis社製)で直接標識した、そして正常のＤＮＡはニックトランスレーションを使用するテキサス・レッド−dUTP(Texas red-dUTP:デュポン社製)で標識した。
【０２１７】
標識された腫瘍と正常のＤＮＡ(各180ng)は、10μlのハイブリダゼーション溶液(50％ホルムアミド、10％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ)の中に15μgの正常Ｃｏｔ−１ＤＮＡ(ギブコ−ＢＲＬ社製)と供に７０℃で５分間変性させ、次いで正常(リンパ球)分裂中期の伸長に適応した。
【０２１８】
ハイブリダゼーション条件とシグナルの検出は、引用される文献に従って実施した（森俊樹、有山洋二、阿部達生監修、稲澤譲治編、臨床FISHプロトコール、細胞工学別冊、１７９−１８４（１９９７））。
【０２１９】
３色蛍光イメージ(DAPI, Spectrum-greeen and Texas-red fluoresence)は、エピフルオレッセンス(表面蛍光)・マイクロスコープ(epifluoresence microscope:ニコン社製)、冷却充電連結装置 (cooled charge-coupled device: CCD)カメラ(フォトメトリックス:Photometrics社製)を使用し、各分裂中期の伸長から収集した。ＤＮＡ配列のコピー数の相対的な変化をデジタル式イメージ分析システム(Ｑｕｉｐｓ-ＸＬソフトウェア; Vysis, Inc.社製)を用いて分析した。蛍光比が１．５を超えたとき、その染色体領域が高いレベルの増幅があると考えられた。動原体近傍と全Ｙ染色体近傍の異質染色質領域は、分析対象から外した。
【０２２０】
ＣＧＨ分析結果、試験した１９の腫瘍のうち１６がゲノムの不均衡を呈した。重複の極小領域の下方表出が3p25-pter(2ケース;11％)、10p12-pter (2ケース;11％)、13q21 (2ケース;11％)、及び18q22-qter (2ケース;11％)上に観察された、重複の極小領域の上方表出が4q12-13(7ケース;39％)、5p15.3-pter (5ケース;28％)、8q24.1-qter (4ケース;22％)、6p12-21(3ケース;18％)及び12p12-pter (3ケース;18％)上に観察さられた。ＤＮＡの高いレベルの増幅が１つの腫瘍の各々において6つの異なった局座において確認された：4q12-21、8p21-pter、8q24.1-qter、9q12-13、12p11.2-pter、及び15q11.2-15。また、染色体８の短腕上において高いレベルの増幅が、腫瘍No.1においてみられた。
２）前期染色体上の逆染色ＦＩＳＨ(Reverse-painting FISH)
ＣＧＨ研究において、腫瘍No.1の高いレベルの増幅された8p21-23における領域を更に絞るために、本発明者らは、プローブとして腫瘍No.1からの全ゲノムＤＮＡを用いて前期染色体を伸長させるために逆染色ＦＩＳＨを実施した(RevFISH: Joos, S., et al. , Hum. Genet., 90, 584-589 (1993))。伸長した前期染色体は、稲沢らの方法に従い培養したリンパ球から調製した(Inazawa, J., et al., Cytogenet. Cell Genet., 65, 130-135 (1994))。
【０２２１】
その結果、このＭＦＨ腫瘍に対するアンプリコンのＦＩＳＨシグナルが細胞遺伝学的にバンド8p23.1にアンプリコンを限局させた。
３）サザン・ブロット分析及び８ｐアンプリコンの広さの決定
サザン・ハイブリダゼーションは、8p21-23で増幅した領域内のゲノム断片を特定するためにサンブロックらの標準的なプロトコールに従い実施した(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press:NY.(1989))。
【０２２２】
この試験に用いたプローブは以下のＥＳＴs(expressed-sequence tags)又はＳＴＳｓ(sequence-tagged sites)を含む７つのコスミドであった：0757C03(GEN-131E06)、0600H06(GEN-003G09)、cos.024H10(GEN-024H10)、cos.505G01(GEN-505G01)、0155D08(GEN-001B12)、cos.D8S1819(D8S1819)、及びcos.D8S550(D8S550)。それらの染色体の局在に関するＥＳＴｓとデータは、ＧＥＮＯＴＫヒトｃＤＮＡデータベース(http://genotk.genome.ad.jp)から得られた。
【０２２３】
次いでＥｃｏＲＩ消化した腫瘍ＤＮＡとヒト胎盤ＤＮＡを0.8％アガロース・ゲルにおいて電気泳動し、ナイロン膜(BIODYNE社製)に転写した。各プローブをランダム・プライマーを用いて［α-32ＰｄＣＴＰ］で標識し、そしてプレ・ハイブリダイズしたフィルターにハイブリダイズした。本発明者らは、ＢＡＳ1000イメージ・アナライザー(フジ社製)でシグナルを分析し、増幅の程度を計算した。次いで−80℃で一晩オートラジオグラフィーのためにフィルターを露光させた。
【０２２４】
サザン・ブロットの結果、１５のＭＦＨにおけるこれらの局座の各々の増幅の状態から、増幅されたＤＮＡがより小さく重複している領域は、D8S1819とD8S550の間であった。この領域は、２つの腫瘍No.1及とNo.4(13％)において増幅されたGEN-024H10とGEN-505G01の２つのＥＳＴを含んでいた。しかしながら、高いコピー数増幅を持つ腫瘍No.1のみが8p21-pterでＣＧＨによって検出されている。増幅されたＤＮＡ対正常ＤＮＡのハイブリダゼーション・シグナルの比較に基づいて行った。
【０２２５】
コピー数は、それぞれ腫瘍No.1においてGEN-024H10とGEN-505G01の増幅は約8倍と4倍であった、そして腫瘍No.4においては各々約6倍と3倍のＤＮＡ増幅であった。
４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとＤＮＡ配列決定
本発明者らは、イシカワらのプロトコールに従って(Ishikawa, S., et al., DNA Res., 4, 35-43 (1997))、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとＤＮＡ配列決定を行った。
【０２２６】
即ち、プローブとしてGEN-024H10を用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー(10 x 106プラーク:ストラタジーン社製)をスクリーニングし、次いで３７７ＡＢＩ自動シークエンサー(パーキン−エルマー社製)を用いて陽性クローンのＤＮＡ配列を決定した。
【０２２７】
その結果、１０個の陽性クローンからｃＤＮＡ配列の一方向配列が３１５９ｂｐの単一のオープン・リーディング・フレームを含む６２４２ｂｐ転写体を確認した。転写の開始(「コザックのルール」)の為のコンセンサス配列がよく保存されていることから、転写の為の開始コドンは、ヌクレオチド番号の４１７−４１９番目であることが考えられた。
【０２２８】
配列番号１に遺伝子産物の推定された１０５２アミノ酸配列を示す。
【０２２９】
新規蛋白の構造分析は、蛋白位置測定部位の予測のためのＰＳＯＲＴプログラム(Nakai, K. and Kanehisa, M.A., Genomics, 14,897-911 (1992) )は、アミノ酸配列中央(486-502残基)において一つの疎水性の領域を示した、しかしながら、疎水性プロット(Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., 157, 105-132  (1982))では疎水性領域を予測しなかった。１つのＡＴＰ／ＧＴＰ結合サイト・モチーフ「Ａ」([AG]-X(4)-G-K-[ST])が416−423残基で見出された。ロイシン残基が「ロイシン・ジッパー」として知られている構造的なモチーフを形成することが出来る各7つのアミノ酸として反復していた(Landschulz,W.H., et al., Science,240,1759-1764 (1988))。
【０２３０】
推定された遺伝子産物は３つのロイシン−ジッパー領域を含んでいるようで(68-89残基、102-123残基、及び962-983残基)、４つのロイシン残基を持つ各々は、７つのアミノ酸の繰り返しを持って一定の間隔を空けていた。
【０２３１】
ＦＡＳＴＡプログラム(Genome Net:ゲノムネット)を使用するホモロジー検索によると、推定された蛋白が、ＡＬＳ(acid-labile subunit protein: 酸不安定サブユニット蛋白)、インシュリン成長因子のＩＧＦ-I、ＩＧＦ-II及びＩＧＦ-結合蛋白-3(IGFBP3)の3要素からなる複合体の構成要素に対して類似していることを明らかにした(Baxter, R.C., et al., J.Biol. Chem.,264, 11843-11848 (1989))。ＡＬＳは、保存されたロイシン−リッチの反復したモチーフを持つ蛋白のファミリーに属する(Kobe, B., and Deisenhofer, J., Trends Biochem. Sci., 19, 415-421 (1994))。
【０２３２】
新しい蛋白の11のロイシン−リッチ縦列反復(各23残基)を並べたとき、一部の残基が高く保存され、以下に続くコンセンサス配列が推論することが出来ることが明白である：Ｐ−Ｘ−Ｘ−α−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−α−Ｘ−Ｘ−α  (Xは全てのアミノ酸、αは脂肪族のアミノ酸：Ｌ、Ｉ又はＶを示す)。
【０２３３】
推定されたＭＡＳＬ１産物の基本構造は、この蛋白にとって重要な機能を提言する幾つかの特徴と予期せぬ配列相同性を示した。著しい特徴は、23アミノ酸の11のロイシン−リッチ縦列反復の存在であった。このモチーフは最初の残基として通常プロリンを含んでいて、幾つかの位置においてロイシンが繰り返されて、18番目の残基としてアスパラギンを含んでいる。
【０２３４】
このパターンの高く保存された特徴は、ロイシン−リッチ反復領域が構造的な保全及び／又はそれらを含む蛋白の機能を維持するために重要であることを指摘している。
【０２３５】
このモチーフを含んでいる公知の蛋白の機能が蛋白−蛋白相互作用に関連しているので(Tan, F., et al., J. Biol. Chem., 265, 13-19 (1990): Delhanty, P and Baxter, R.C. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 227, 897-902(1996))、このモチーフは結合に係わっているかもしれない。
【０２３６】
ＭＡＳＬ１の反復配列は、酵母アデニレート・シクラーゼに生じている遺伝子に大変類似している(Kataoka, T. et al., Cell, 43, 493-505 (1985))。該酵母アデニレート・シクラーゼ酵素はＲＡＳによって活性化され、酵母の細胞周期のＧ１期への移行を調節する(Thevelein, J.M., Mol.Microbiol., 5, 1301-1307 (1991))。この保存されたモチーフの保有は、ＭＡＳＬ1蛋白がヒトにおいてシグナル伝達と細胞の増殖、分化、アポトーシスの調整において重要な役割を演ずると推測される。
【０２３７】
更に、ＭＡＳＬ1の推定されたアミノ酸配列はＡＬＳと35.9％の相同性を生じている。ＩＧＦｓとＩＧＦＢＰとの3つからなる複合体において、ＡＬＳは、循環しているＩＧＦの生物利用率を調整することにおいて中心的な役割を持っている(Delhanty, P.J. and  Baxter,Ｒ.Ｃ., Prog. Growth Factor Res., 6,141−149(1995) )。ＡＬＳは血清においてのみＩＧＦＢＰ−３に結合する；この３つの複合体において成長因子は明らかに毛細管のバリアーを通過することは出来ない(Binoux, M. and Hossenlopp, P., Endocrinol. Metab., 67, 509-514(1988) )。
【０２３８】
しかしながら、他の循環している分子に対してレセプターとして作用することが出来る(Hook, M. et al., Annu. Rev. Biochem., 53, 847-869 (1984) )、細胞に関連したグリコサミノグリカンとＡＬＳがと相互作用をしたとき、2成分の複合体における成長因子が毛細管バリアーを通過することが出来るように3つの複合体から簡単に分離する。組織中の循環からＩＧＦｓの通過は、この特異的な分離メカニズムに依存するかもしれない(Baxter, R.C., Biochem. J.,271,773-777(1990))。それ故に、もしＭＡＳＬ1がＡＬＳに対する構造類似物であり、ＩＧＦＢＰ−３に類似の蛋白に結合するならば、細胞の増殖、分化、アポトーシスを調節するかもしれない。
【０２３９】
本発明者らは、新規な遺伝子をＭＡＳＬ１(MFH-amplified sequences with leucine-rich tandem repeats)と命名した。
５）ノーザンブロット分析によるＭＡＳＬ１の発現
１６の異なる正常ヒト組織(クローンテック社製)の一つから各レーン2μｇのポリ(A)＋ＲＮＡを含んでいるノーザンブロットを製品の説明書に従いＭＡＳＬ１の2361-3858番目のヌクレオチドに対応するランダム・プライムド32Ｐ標識プローブでハイブリダイズさせた。ブロットを0.1 ｘＳＳＣ/ 0.1％ＳＤＳ、50℃の条件で洗浄し、シグナルをＢＡＳ1000イメージ・アナライザー(フジ社製)で分析した。
【０２４０】
種々のヒト組織においてＭＡＳＬ１の発現のレベルを特定するためにノーザンブロット分析を行った。その結果６．６ｋｂの転写体が普遍的に発現していた。
６）ＲＴ−ＰＣＲ分析
MFH腫瘍と正常組織におけるＭＡＳＬ１転写体の発現レベルを比較する為に定量的な発現試験をＲＴ−ＰＣＲによって実施した。
【０２４１】
全ＲＮＡは製品の使用説明書に従いＴＲＩzol(ギブコ−ＢＲＬ社製)を用いてＭＦＨ腫瘍の凍結サンプルから得た。Superscript II(ギブコ−ＢＲＬ社製)を持つ全ＲＮＡの0.2μgから産生したｃＤＮＡを各ＰＣＲのための鋳型として用いた。全反応は、GeneAmp ＰＣＲシステム9600(パーキン−エルマー社製)で、94℃で2分間の最初の変性に続いて、94℃で30秒、58℃で30秒、及び72℃で30秒を１サイクルとして25サイクル反応させた。
【０２４２】
各ＲＮＡ鋳型の完全性を全てのサンプルにおいて類似のシグナルを示すβ−アクチンの増幅を通じて調製した。
【０２４３】
ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下に示される：
ＭＡＳＬ１：  ５’−ＧＣＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＣＡＧ−３’及び
５’−ＡＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣ−３’
β−アクチン：５’−ＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴ−３’
５’−ＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＴ−３’
ＲＴ−ＰＣＲ産物は3.0％ＧＴＧアガロース・ゲルを通して電気泳動にかけ、ナイロン膜上にサザン−ブロットし、次いでGEN-024Ｈ10の内部オリゴヌクレオチドの５’−ＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧ−３’を［γ-32ＰｄＡＴＰ］で標識し、ハイブリダイズさせた。
【０２４４】
その結果、この遺伝子は、腫瘍No.1においてだけでなく、腫瘍No.3、4、5、6、7、9及び11においても過剰発現していた。
【０２４５】
ＭＡＳＬ１の発現は、ＣＧＨ分析において8p21-23で高いレベルの増幅が明らかとなった腫瘍のみの、腫瘍No.1において約１０倍上昇していた。
【０２４６】
本発明者らのＲＴ−ＰＣＲによる量的な遺伝子発現試験によると、ＭＡＳＬ1の発現が腫瘍No.1とNo.4において有意に上昇した、そしてこれらの両者は、この局座でＤＮＡの明瞭な増幅が見られた。その結果は、例えそれらの一つのみがＣＧＨによって8p23.1で高いレベルの増幅が見られたとしても、ＭＡＳＬ１の過剰発現がＲＴ−ＰＣＲによって試験した腫瘍の57％(8/14)に見られたという事実において、ＤＮＡ増幅がＭＡＳＬ１のアップ・レギュレーションに導くことが出来るメカニズムの一つであると強く提言できる。ＭＡＳＬ1の推定されたアミノ酸構造と合わせて、データは、この遺伝子の調節不良は、ＭＦＨに対して重要な病原性因子であることを指摘していると思われる。
【０２４７】
【配列表】
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