(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（i）〜（iii）：
（i）ＯｓｐＡから成る単離、精製されたボレリア ブルグドルフェリ抗原（Borrelia burgdorfera antigen）またはこの抗原を発現するベクターと、
（ii）ボレリア ブルグドルフェリ抗原以外の哺乳動物病原の追加の抗原と、
（iii）任意成分としての、薬学的または獣医学的に許容される担体と、
から成り、
上記の追加の抗原がイヌジステンパー抗原、アデノウィルス抗原、コロナウィルス抗原、パラインフルエンザ抗原およびパルボウィルス抗原の組合せであることを特徴とする免疫組成物。
【請求項２】
上記の（i）が単離、精製されたボレリア ブルグドルフェリＯｓｐＡ抗原である請求項１に記載の免疫組成物。
【請求項３】
単離、精製されたボレリア ブルグドルフェリＯｓｐＡ抗原がリピド化されたＯｓｐＡである請求項２に記載の免疫組成物。
【請求項４】
免疫強化アジュバントを含まない請求項３に記載の免疫組成物。
【請求項５】
上記の（i）が単離、精製されたボレリア ブルグドルフェリＯｓｐＡ抗原を発現するベクターである請求項１に記載の免疫組成物。
【請求項６】
上記の（ii）が上記の追加の抗原を発現するベクターである請求項1に記載の免疫組成物。
【請求項７】
上記の（ii）がボレリア ブルグドルフェリ抗原以外の病原からの追加の抗原である請求項1に記載の免疫組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物をヒトを除く哺乳動物に投与することを特徴とする、ライム病（Lyme Disease）およびボレリア ブルグドルフェリ抗原（Borrelia burgdorfera antigen）以外の哺乳動物病原に対して免疫応答を導き出す方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物をイヌまたは子犬に投与する、イヌまたは子犬に免疫応答を導き出す方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物をウマに投与する、ウマに免疫応答を導き出す方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物をネコに投与する、ネコに免疫応答を導き出す方法。
【請求項１２】
免疫強化アジュバントをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本明細書では米国特許第5,582,990号、第5,523,089号、国際特許出願第PCT/US95/07665, PCT/US92/08972, WO93/08306, PCT/US95/07665, WO93/08299, PCT/US92/08697, PCT/US95/07709, WO95/35119、WO90/04411号を参照する。本願明細書では上記文献または請求の範囲の前に記載の「参照文献」リストの全体または一部が引用される。これらの内容は本願明細書の一部を成す。
発明の技術分野
本発明はライム病（Lyme Disease）（ボレリア ブルグドルフェラ抗原、Borrelia burgdorfera antigen）に対する組成物に関するものであり、特に、コンビネーション組成物（combination composition、以下、組み合せ組成物という）と、その製造方法およびその使用、特に動物医薬としての使用に関するものである。
本発明組成物は上記Borrelia burgdorferi抗原または抗原群の他に、他の病原、例えばイヌ、ネコまたはウマの病原、例えば狂犬病ウィルス、イヌジステンパーウィルス、アデノウィルス、冠ウィルス、パラインフルエンザ、パルボウィルス、ネコ白血病ウィルス、ネコヘルペスウィルス、ウマインフルエンザウィルス、ウマヘルペスウィルス等の少なくとも一つの抗原を含むことができる。
本発明組成物はホストに投与したときにライム病（Borrelia burgdorferi）に対する免疫応答を誘発すると同時に、組成中の他の抗原に対しても免疫応答を誘発するのが好ましい。本発明組成はウマおよびイヌを含む動物のライム病（Borrelia burgdorferi）に対して長期免疫（反応）によって動物を保護し、免疫応答を引き出す。本発明組み合せ組成物には「効能干渉（efficiency interference）」の問題はない。
本発明は上記組成物の製造方法に関するものでもある。
本発明はさらに、必要に応じて動物または細胞培養から単離した上記組成物が産生する抗体に関するものであり、この抗体はライム病（Borrelia burgdorferi抗原）の抗原あるいは他の抗原または病原の検出、検査またはアッセイ用診断キットを製造する上で有用である。
発明の背景
ライム病はダニのイクソデリチナスコンプレックス（Ixodes ricinus complex）を介して伝染する多重疾患（multisystem）である。このライム（Lyme）病の病因はスピロヘータのBorrelia burgdorferi sensulatoであり、これは現在米国で節足動物が運ぶ最も普通な疾患であり、中部欧州の流行病である（Barbour達1993）。
ライム病は初期の段階で抗生物質療法を行えば根治可能であるが、進行を放置しておくと、心臓、神経および関節に異常が生じる。
ライム疾患の人間用ワクチンの開発は開発途上にある。この種のワクチン開発の現在の主要な候補物質分子はBorrelia burgdorferiの外部表面リポ蛋白質「OspA」である。組換え型のOspAリポ蛋白質「rOspA」を感染性Borrelia burgdorferiをハツカネズミに抗原投与した時に防御免疫応答するということは知られている（Fikrig達1990；Erdile達1993；USSN/08373455）。OspAは現在米国で皮下投与ワクチンとしてヒトでの試験が行われている（ケラー達1994）。上記の特許出願第WO93/08299およびPCT/US92/08697には、組換え型OspA（rOspA）ワクチン、特にリピド化されたrOspAと、OSpAをコードするDNAの発現方法と、リピド化されたrOspAの単離方法とが記載されている。
上記の米国特許第5,582,990号、第5,523,089号および国際出願第WO90/04411号には、OspAをコードするDNAと、rOspAおよびそのリピド化形OspAのアミノ酸配列、rOspAおよびそのリピド化形合成OspA、OspAまたは合成OspAを含む組成物およびこの組成物の使用方法が記載されている。上記の他の出願には、他のBorrelia抗原または他のOspsをコードするDNAあるいはOspAまたは他のOspsの有用な断片をコードするDNA、そのアミノ酸配列、その断片または他のOspsを含む組成物およびこの組成物の使用方法が記載されている。本発明で用いられるOspA、他のBorrelia抗原またはOspsおよびその断片は、Borrellia burgdorferiに関して上記で引用した米国特許第5,582,990号および第5,523,089号、国際特許第US92/08697に記載のDNAから生産することができる。本発明で有用なDNAおよび抗原に関してはMolecular Microbiology（1989）、3（4）、479-486も参照することができる。
この分野の一つ問題は、家畜がダニに咬まれてBorrelia burgdorferiに感染することにある。例えばイヌやウマがダニに刺されてライム病に感染しても、飼い主はそれになかなか気が付かない。すなわち、イヌやウマは毛に包まれているため、ダニ刺傷に起因する円形の跡を検知するのが難しく、イヌやウマは関節潰瘍等の病状をはっきりと訴えず、動物の感染に起因する疾患の微妙な症状が分からない飼い主もいる。更に、人間に伝染する危険もある。
この分野の別の問題点はワクチン接種計画である。特に、家畜に予防注射をする場合には多重抗原を１回の「カクテル」投与で済ませるか、多価組成物にして獣医の訪問回数を減らすか、注射回数を減らすのが好ましい。しかし、ライム病結合物、「カクテル」、多価ワクチン、免疫組成物または免疫原組成物、特に、Borrelia burgdorferi抗原を他の抗原と組み合わせた組成物、特にイヌ用組成物は現在のところ入手不可能か、知られていない。
更に別の問題は多価組成物に関する「効能干渉」の問題、すなわち、複合組成物の場合に一つまたは複数の抗原がダメになって、その効能を維持または発揮できないという問題である。これは、他の抗原の存在によって、投与された時に免疫学的応答、抗原性応答、抗体またはホスト（例えばイヌ）の保護応答を刺激する抗原上に干渉が起こるためと信じられている。例えば、他の抗原と組み合わせた狂犬病抗原は、イヌに投与した時にその組成中の他の抗原による免疫学的、抗原性、抗体または保護薬応答の刺激作用と干渉するか、干渉を受ける。特に、狂犬病抗原やレプトスピラ抗原のような抗原は、他の抗原と一緒に投与すると、その抗原によって引き起こされる応答と干渉する。事実、Leptcspira抗原はOspAの邪魔をする。ネコのような他のホストの場合には組合せワクチンが知られている。多分、「効能干渉」はイヌ生物系に独特なものか、現在知られている抗原によるイヌ生物系での反応またはそれとの組み合わせに問題があるものと考えられるが、この理論に縛られるものではない。
理論は別として、ライム病と他の抗原性とを組み合わせた組成物、特にイヌ用の組成物で、効能干渉を示さないものは出願人の知る限り存在しない。そのため、ライム病組み合せ組成物、特にイヌ用のライム病組み合わせ組成物が求められている。
効能干渉で示さないライム病と他の抗原との組成物、特にイヌ用のライム病組み合せ組成物ができるということは驚くべきことであり、全く予想し得ない非自明なことである。すなわち、現在の知識およびイヌでの効能干渉問題から、「抗原組成物」を単に組み合わせても、有用な組み合わせにはならず、「カクテル」組成物を製造することもできない。
このイヌ用ライム病抗原カクテル組成物がイヌを長期間保護し、母子免疫で子イヌをライム病から保護できればさらに有利である。母子免疫は新生児が出生および／または授乳期に母親から得る免疫性である。この免疫性は誕生から所定期間後には失われ、病原菌の危険に曝されるということは知られている。また、新生児中に母性の抗体が存在していると抗原組成物、例えばワクチンを投与したときに新生児が保護応答を獲得することができないということも知られている。すなわち、抗原またはワクチン組成物の投与が得られる前に、新生児は免疫が無いか、ほど無い期間すなわち新生児が罹患する危険のある期間に入るということを意味している。この母子免疫に関しては1994年8月16日出願の米国特許第5,338,683号を参照されたい。その内容は本願明細書の一部を成す。
従って、別のワクチン接種計画が望ましい。
効能干渉の無いイヌ用組み合せ「カクテル」組成物としえ使用でき、さらに、それを他の宿主（例えばウマ、ネコ等）用の組成物として使用でき、イヌを長期間保護ができ、母子免疫があっても子イヌを保護できるような組換え型Borrelia burgdorferi抗原が得られたとしたら、それは驚くべきことであり、全く予想できないことである。
特に、Borrelia burgdorferi抗原、例えば上記のOspAを含む組み合せ組成物を哺乳動物の宿主、特にライム病の危険に曝されるイヌ、ネコ、ウマ等のペットや家畜動物に投与するということは従来技術では信じられないことであり、全く示唆もされなかったことである。
発明の目的および要約
ライム病（Borrelia burgdorferi）用の一価ワクチン（Lyと表記）の免疫がイヌにおいて安全かつ有効であるということはセロコンバージョン率とBorrelia burgdorferi感染に対する保護効果の両方で確認されている。
研究の結果、OspAを10μg/ml含むライムワクチン（WO93/08299、米国特許第5,582,990および第5,523,089号（これらは本願明細書の一部を成す）に従って製造したもの）によって、イヌをダニによる抗原投与から十分に保護できるということは、スピロヘータの増殖が減ることと、臨末的症状がなくなることの両方で確認されている。しかも、ワクチン接種から6ヵ月後に抗原が入った場合でも、ワクチン誘導免疫性は大きい。一価ワクチンは例外的に安全であり、ライム病の臨床的徴候を示すイヌもOspAワクチンを高い投与量で繰り返し予防注射することで疾患の悪化を示さなくなる。
しかし、安全かつ有効なライム組み合せワクチンを提供することは従来技術をさらに大きく前進させるものではあり、イヌの他の抗原と一緒に投与したときにOspAワクチンが免疫干渉を示さないということは大きな前進である。これまでの結果では、皮下接種を一定間隔で行うことによって大きなセロコンバージョンが見られている。この接種により生じる抗体のレベルは一価のワクチンを接種したイヌで観測されたものと類似し、Borrelia刺傷感染を用いた抗原投与に対して長期間保護できるようなレベルである。
Borrelia burgdorferiにはウマも自然感染するという証拠があるので、ウマでBorrelia burqdorferi抗原を十分に産生できるライムワクチン、例えばウマのOspA、抗体が得られればそれはさらに大きな前進である。
本発明の目的は、組み合せBorrelia burgdorferi、例えばOspA、ワクチンまたは免疫組成物または抗原組成物、特に、イヌ、ウマ、その他の家畜に保護を誘発する組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、組成中の抗原による効能干渉が小さい組み合せライム病ワクチン、免疫組成物または抗原性組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、イヌ、ウマ、その他の家畜に投与した時に血清学的応答、免疫組成物または抗原性組成物を生じるライム病ワクチンを提供することにある。
本発明は、単離、精製されたBorrelia burgdorferi抗原と、哺乳動物のBorrelia burgdorferi以外の少なくとも一つの追加の病原抗原と、必要に応じて用いられる薬学または獣医学で許容される担体とで構成される免疫学的抗原性またはワクチン組成物を提供する。この組成物の単離、精製されたBorrelia burgdorferi抗原は単離、精製されたOspAにすることができる。この組成物において、単離、精製されたOspAは、実質的にリポポリサッカリドおよび他の細菌蛋白を実質的に含まない単離、精製されたリピド化された組換え型OspAにすることができる。この組成物は免疫原増強アジュバントをなしで用いることができる。
この組成物では追加の抗原をイヌの病原抗原、ウマの病原抗原およびネコの病原抗原で構成されるグループの中から選択することができる。好ましい組成物では追加の抗原はイヌの病原またはウマの病原の抗原である。この追加の抗原は狂犬病ウィルス抗原、イヌジステンパー抗原、アデノウィルス抗原、コロナウィルス抗原、パラインフルエンザ抗原、パルボウィルス抗原およびこれらの混合物で構成される群の中から選択することができる。
本発明の好ましい組成物の実施例では、追加の抗原は狂犬病ウィルス抗原であるか、イヌジステンパー抗原、アデノウィルス抗原、コロナウィルス抗原、パラインフルエンザ抗原およびパルボウィルス抗原から成る。この追加の抗原は変性または弱毒化された生ウィルス、例えば弱毒化されたCDV、CAV2のようなCAV、コロナウィルス、パラインフルエンザウィルスおよび／またはパルボウィルスにすることができる。
本発明はさらに、上記組成物を投与することによってライム病および哺乳動物のBorrelia burgdorferi以外の病原に罹る危険のある哺乳類に免疫応答を導き出す方法にある。哺乳類はウマであることができ、追加の抗原はウマの病原にすることができる。哺乳類はイヌまたは子イヌであることができ、追加の抗原はイヌの病原にすることができる。
本発明はさらに、単離、精製されたBorrelia burgdorferi OspAを含む組成物をウマに投与してBorrelia burgdorferiに対してウマの免疫応答を導き出す方法を提供する。
本発明はさらに、単離、精製されたBorrelia burgdorferi OspAを含む組成物をイヌに投与してBorrelia burgdorferiに対してイヌまたは子の免疫応答を導き出す方法を提供する。
これらの方法で使うOspAはリポポリサッカリドおよび他の細菌蛋白を実質的に含まない単離、精製されたリピド化組換え型OspAにすることができる。これらの方法でも組成物は免疫原性を強化するアジュバントはなしにすることができる。
本発明はさらに、上記組成物の製造方法にある、この方法は追加の抗原を凍結乾燥の形で製造し、Borrelia burgdorferi抗原を液体の形で作り、追加の抗原をBorrelia burgdorferi抗原で再水和することから成る。
上記Borrelia burgdorferi OspAは、全長の野性型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質をコードし且つ組換え型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を作る遺伝子を含むプラスミドを用いて宿主微生物を変換し、この宿主生物の溶菌液から非変質条件下にリポポリサッカリドおよび他の細菌蛋白を実質的に含まない組換え型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を精製することで得られられる。
本発明で利用可能な単離されたリポ蛋白質は、例えばlipidationを保持したリポポリサッカリドおよび他の細菌蛋白を実質的に含まない精製された組換え型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質である。
この精製された組換え型Borrelia burgdorteri OspAリポ蛋白質は、全長の野性型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質をコードし且つ組換え型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を作る遺伝子を含むプラスミドを用いて宿主微生物を変換し、この宿主生物の溶菌液から非変質条件下に精製して、リポポリサッカリドおよび他の細菌蛋白を実質的に含まない、宿主生物の哺乳動物宿主に投与したときに哺乳動物宿主に免疫原となるリピド化状態の組換え型Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を得られる。
組換え型Borrelia burgdorferi OspAの精製は下記工程で行うことができる：
１）宿主生物の細胞を溶解して溶解細胞を得る、
２）Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を細菌性のものとその他の蛋白とに選択的に溶解でき且つV35℃から40℃の温和な条件下で界面活性剤相を相分離可能な界面活性剤を用いて溶解細胞を処理して処理済みの溶解細胞を得る
３）処理済みの溶解細胞を溶解したBorrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を含む界面活性剤相と、細菌性の他の蛋白および細胞残基を含む水相とに分離し、
４）界面活性剤相を固形および水相から分離し、
５）Borrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質以外の蛋白がクロマトグラフィ・カラムと結合するような条件下で、界面活性剤相をクロマトグラフィ・カラムと接触させ、
６）結合した蛋白を含まないBorrelia burgdorferi OspAリポ蛋白質を含む通過流を第一クロマトグラフィ・カラムから回収する。
組換え型Borrelia burgdorferi OspAの精製は界面活性剤相をクロマトグラフィ・カラムと約7.5のpHで接触することで行うことができる。
上記OspAは、全長の野性型Borrelia opsa OspA遺伝子によってコードされる単離、精製された組換え型OspAリポ蛋白質を生産するプロセスを用いて得ることもできる。この方法は、
1）宿主微生物の細胞を溶解し、
2）細菌性の他の蛋白に優先してBorrelia OspAリポ蛋白質を選択的に可溶化でき且つ温和な条件下に界面活性剤相を分離できるような界面活性剤で溶解した細胞を処理し、
3）Borrelia OspAリポ蛋白質を含む界面活性剤相と、細菌性の他の蛋白を含む水相と、細胞残基を含む固相とを分離し、
4）固相および水相から界面活性剤相を分離し、
5）OspA遺伝子を含んでいるプラスミドを用いて変形する宿主生物からのBorrelia OspAリポ蛋白質の遂行している誘起する、
6）以下の方法でBorrelia OspAリポ蛋白質およびリポポリサッカリド以外の蛋白を含まない界面活性剤相を精製する：
（a）界面活性剤相をBorrelia OspAリポ蛋白質以外の蛋白が結合する第１のクロマトグラフィ・カラムと接触クさせ、
（b）結合した蛋白を含まないBorrelia OspAリポ蛋白質の通過流を第１のクロマトグラフィ・カラムから回収し、
（c）第１のクロマトグラフィ・カラムから通過流を、Borrelia OspAリポ蛋白質が優先的に結合し且つ残存した汚染蛋白質およびリポポリサッカリドは通過させるような第2のクロマトグラフィ・カラムと接触させ、
（d）結合したBorrelia OspAリポ蛋白質が溶出する条件下で、第2のクロマトグラフィ・カラムを溶出剤と接触させて、
（e）第2のクロマトグラフィからBorrelia OspAを含む溶出剤を回収する。
このプロセスでは、通過流と第2のクロマトグラフィとの接触はpHで約5.7で行うことができ、第2のクロマトグラフィ・カラムの結合したOspAリポ蛋白質と溶出剤との接触はpH約5.7までで行われ、結合したBorrelia OspAリポ蛋白質を溶出するのにはそれ以上で行うのが効果的である。
このプロセスでは、界面活性剤相と第１のクロマトグラフィ・カラムとの接触を約7.5のpHで行い、通過流と第2のクロマトグラフィ・カラムでとの接触を約4.2のpHで行い、第2のクロマトグラフィ・カラムと溶出剤との接触を約5.7のpHで行うこともできる。
本発明のさらに他の対象は、上記組成物および方法で得られる抗体にある。
本発明組成物および方法には、重大な効能干渉が見られないということは驚くべきことである。
上記の組成物、方法およびプロセスに用いら上記以外のあるいはOspAと同時またはその代わりに使用可能なBorrelia抗原は、「関連出願」として上記した出願および文献に記載されている。これらに記載の他の抗原およびその製造方法も参照のこと。
本発明の上記以外の目的および具体化は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
以下の詳細な説明で引用する添付図面は本明細書の一部を成す。
図1は、B. burgdorferiのB-31、ACAlおよびIp90のOspA遺伝子全長をpET9a発現ベクターにクローン化するのに用いられるPCRオリゴヌクレオチドの図。
図2は、OspA遺伝子全長をpET9a発現ベクターに挿入し、T7 φ10プロモータのコントロール下にOspA遺伝子を置いて、B31遺伝子からpOA9、pOAlOからACAl遺伝子、Ip90遺伝子からpOAlO遺伝子を形成するためのクローン化計画図。
図3は、プラスミドpOAlの予想制限地図。
図4は、全ての予測部位が存在するということを示す、プラスミドpOAlの各種規制変異消化物結果を示す図（M＝マーカー（Hae IIIで消化されたφX 174DNA;B＝Bam HI; E＝Eco RI; H＝Hind III; N＝Nde I）。
図5は、Borrelia burgdorferiのB-31、ACAlおよびIp90のOspA遺伝子全長をpCMBl発現ベクターにクローン化する時にに用いるPCRヌクレオチドを示す図。
図6は、OspA遺伝子全長をpCMBl発現ベクターに挿入して、OspA遺伝子をTrcプロモータのコントロール下に置き、B31遺伝子からpOA7、ACAl遺伝子からpOA8、Ip90遺伝子からpOASを形成するためのクローン化計画図。
図7A、7B、7Cは、pOAl（図7A）を含む2つの宿主株と、pOAS（図7B）およびpOAG（図7C）を含む宿主株のOspAのITPGによる誘導時間の経過を示す図。
図8A、8B、8Cは、本発明の一実施例で大腸菌から完全長の組換え型OspAを産生、精製する際の、細胞発育段階、細胞溶解段階、洗浄抽出段階および精製段階をそれぞれ示すフロー図。
図9はプラスミドpCr4BlおよびpCMB2の生産法を示す図。
発明の詳細な説明
既に述べたように、本発明はイヌ、子イヌ、ネコ、ウマのような家畜、ペット用のためにBorreiia burgdorferi antigenを含む組成物を提供する。この組成物は「カクテル」または多価性組成物であるのが好ましい。すなわち、この組成物は「他の」の抗原または病原を追加として含むのが好ましい。
Borrelia burgdorferi抗原は上記抗原のエピトープにすることができ、この抗原はOspAであるのが好ましい。このOspAは大腸菌のような組換え型の発現産物であるのが好ましい。OspAはリピド化されたものが好ましく、従って、リピド化された組換え型OspAであるのが好ましい。
Borrelia burgdorferi抗原、例えばOspAは任意の方法で得られられる。例えば、Borrelia burgdorferi培養液から単離できる。組換え型のリピド化されたOspAは米国特許第5,582,990号および第5,523,089号およびWO93／08299に開示の方法を用いて得られる。これらの内容は本願明細書の一部をなす。本発明の実施に有用なBorreiLia burgdorfferi抗原およびその製造方法については上記の「関連出願」およびそこに引用された文書を参照されたい。
本発明組成物、例えば免疫組成物生物、抗原性組成物生物または多価ワクチン、「カクテル」または組み合わせ組成物は経腸管、経皮、経筋肉、経皮で投与することができる。この投与で全身の免疫応答が得られる。
本発明の抗原性、免疫学的あるかワクチンのBorreiia burgdorferi抗原組成物は周知方法および製薬および家畜分野の当業者に標準的な方法で製造することができる。本発明組成物は加齢、性、体重、種類、患者の状態および径路等の因子を考慮して医師または家畜の当業者に周知の技術で投与することができる。Borrelia burgdorferi抗原は単独で投与できるが、「他の」抗原または「他の」免疫学的、抗原性またはワクチン組成物と一諸に「カクテル」として、または組み合わせ組成物として、同時または順次投与することができる。この「他の」抗原または「他の」免疫学的、抗原性またはワクチン組成物はその抗原のエピトープまたはその抗原の重要なエピトープを含む組成物にすることができる。
この「他の」組成物には家畜またはペットの病原、例えばイヌ、ネコ、ウマ等の動物の単離および／または精製された抗原、例えば狂犬病の抗原、例えば狂犬病グリコプロテインG、イヌジステンパーウィルス抗原、イヌの病原の抗原、例えばCDV HAおよび／またはFグリコプロテイン、イヌのアデノウィルス2型抗原、イヌコロナウィルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウィルス抗原、レプトスピラカニコライクテロハモロハギ（Canicola-Icterohaemorrhagiae）バクテリア抗原、これらの抗原の組み合わせ、ネコの病原、例えばネコ白血病ウィルス抗原、ネコ免疫不全ウイルス抗原、狂犬病、ネコヘルペスウィルス抗原またはこれらの抗原を任意に組み合わせた抗原または抗原、ウマの病原、例えばウマインフルエンザおよび／またはウマヘルペスウィルスおよび／または狂犬病抗原のような任意の抗原、病原が含まれる。
これらの「他の」抗原は上記抗原の発現物からの組換え型、例えばインヴィトロのポックスウィルスまたは他のベクター系にすることができ、また、「他の」組成物生物は組換え型、例えば抗原をインビボで発現するポックスウィルスまたはポックスウィルスにすることができる。
本発明のOspAまたはそのエピトープまたは本発明で用いる「他の」抗原またはそのエピトープを発現するベクターまたは組換え型は下記の特許および文献に記載の製造方法と類似の方法で調整することができる：米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、Paoletti）の「ポックスウイルス・ベクターのワクチン接種用途：アップデート」（PNAS USA 93：11349-11353、1996年10月、Mossの″Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,″PNAS USA 93:11341-11348, October 1996, Smith et al.,米国特許第4,745,051号（組換え型かん状ウイルス）、Richardson, C.D.編, Methods in Molecular Biology 39,″Baculovirus Expression Protocols″、1995 Humana Press Inc., Smith et al.,″Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector,″Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock達、「Strong and Regulated Expression of Escherichia Coli B-Galactosidase in Insect CellsInfected with Baculovirus vector、1984年3月, Molecular and Cellular Biology、第4巻、No.3、p. 399-406；EPA 0 370 573、第1986年10月16日に出願の米国特許出願第920,197号、EP特許公表265,785番、米国特許第4,769,331号（組換えヘルペスウィルス）、Roizman,″The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vevtors,″PNAS USA 93:11307-11312, October 1996, Andreansky et al.,″The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,″PNAS USA 93:11313-11318, October 1996, Robertson et al.″Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes,″PNAS USA 93:11334-11340, October 1996, Frolov et al.,″Alphavirus-based expression vectors:Strategy and applications,″PNAS USA 93:11371-11377, October 1996, Kitson et al., J. Viral. 65, 3068-3075, 1991;米国特許第5,591,439号、第5,552,143号、Grunhaus et al., 1992,″Adenovirus as cloning vectors,″Seminars in Virology（Vol. 3）p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 429-434, PCT WO91/11525, Felgner et al.（1994）, J. BiolL. Chem. 269,2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 and McClements et al.,″Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease,″PNAS USA 93:11414-11420, October 1996, and U.S. Patents Nos 5,591,639, 5,589,466, and 5,580,859 relating to DNA expression vectors。
成分および投与量および方法（同時投与または順次投与）は加齢、性、生物種、患者の特殊条件、投与経路等の因子を考慮して決定できる。この点に関しては、イヌ、ネコ、ウマの病原とこれらの抗原を発現する組換え体およびこの組換え体を含む組成物を開示した米国特許第5,503,834号、第5,529,780号、第5,482,713号、第5,494,807号と、イヌのヘルペスウィルス抗原および組換え体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列とそ使用に関する1995年3月29日に出願の米国特許出願第08/413118号、ポックスウィルス、イヌジステンパーウィルス（CDV）組換え体および組成物とこの組換え体の使用方法を開示した1994年4月6日に出願の米国出願第08/224657号、1995年4月5日に出願の米国出願第08/416616号；獣医用のイヌアデノウィルス組換え体を含む形質発現カセット、促進因子および組換え体を開示した1996年7月3日に出願の米国特許出願第08/675556号；ネコの免疫不全ウイルス・エピトープを発現する組換え体を含む1996年11月14日に出願の米国特許出願第第08/746668号；ポックスウィルス組換え体−組み合せ組成物を含む狂犬病組成物とその使用に関する1995年6月7日に出願の米国特許出願第08/486969号も参照される。これらの特許および出願は本明細諸の一部をなす。特に、これらの出願に開示された組換え体、発現産物および核酸コードは、本発明の「カクテル」、多価または組み合わせ組成物、その投与、またはその組換え体で使用することができる。
製品の例としては、イヌジステンパー−アデノウィルス2型―コロナウィルス−パラインフルエンザ−パルボウィルスXL、変形Live Virus（Product Code 1491.21）がある。この製品にBorrelia burgdorfferi抗原、例えばOspAを組み合わせて単一パッケージとした組成ものにするか、獣医師の一回の訪問時にOACPiPXLとBorrelia burgdorferi抗原の両方を適当なホスト哺乳類、例えばイヌに投与するのが極め好ましい。
本発明組成物の実施例は鼻音、肛門、経膣、経胃等の経体腔、経口投与用の液体製剤、シロップまたはエリキシル等の懸濁投与、腸管外、皮下、皮内、筋肉内、静脈投与（注射可能な投与法）、例えば滅菌懸濁液またはエマルションが含まれる。この組成物では抗原を適切な担体、希釈液または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩液、グルコースまたはその他と混合して製剤にすることができる。組成物を凍結乾燥することもできる。組成物は投与経路と所望する製剤に依って、湿潤剤または乳化剤のような助剤、pH緩衝剤、アジュバント、ゲル化剤、添加物、防腐剤、香料、着色剤、粘度改良剤などを含むことができる。本願明細書では過度の実験なしで適切な製法を調製するために標準テキスト、例えば″REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE″、第17の版、1985を引用する。適切な供与量は実施例に基づいて決めることができる。Borrelia burgdorferi抗原の典型的なイヌへの供与量は５〜25のμg/ml、例えば13μg/ml OspAにすることができ、Borrelia burgdorferi抗原の典型的なウマへの供与量は15〜150μg/供与、例えば100のμg/供与OspA単独、30μｇ/供与OspA単独卯、または他の抗原、例えば狂犬病（ImrabはBorrelia burgdorfferi抗原と組み合わせることができる市販の狂犬病ワクチン）と組み合わせた場合には30μｇ/供与OspAにすることができる。
既に述べたように、一般に、抗原組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物は所望の応答を引き出すためにアジュバントと所定量の抗原を含むことができる。用途によっては明礬（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。サポニンとその精製された成分Quil A, フレウンド（Freund’s）完全アジュバント、その他のアジュバントは獣医用途で用いられる。リピド化された組換えOspAはアジュバントを加えずに保護応答を引き出すことができる。化学製法、例えばムラミルジペプチド、Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147:410-415（1991）（この内容は本発明の一部をなす）に記載のモノフォスフォリルリピドＡのようなホスホリピド共役物、法Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744（1992）（この内容は本発明の一部をなす）に記載のプロテオリポソーム内への蛋白のカプセル化、Novasome（登録商標）脂肪小胞（Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH）のような脂肪小胞への蛋白のカプセル化を用いることができる。
本発明組成は、腸管外（筋肉、皮内、皮下）投与または体腔投与、例えば経舌（すなわち、経口）、経胃、径肛門、膣内のような投与によって免疫化するために、単一製剤の形に包装することができる。効果的な供与量と組成経路は組成物の種類と、過度の実験を必要としないLD50、その他のスクリーニング法によって決定される。一般に供与量は数マイクログラムから数百マイクログラムで変えることができ、例えば各抗原の５〜500μｇにすることができる。他の適切な担体または希釈液は水または滅菌したまたはしない緩衝された塩類溶液にすることができる。抗原を凍結乾燥し、投与時点で再懸濁して溶液にすることができる。
担体は複数の徐放システムにすることもできる。コントロルされた放出速度を有する組成物を製剤する場合には合成ポリマーが有用である。その初期の例は1ミクロン以下の直径（ナノ粒子）を有する球を形成するメタクリル酸メチル重合体（Kreuter, J., MicrocaDsules and Nanoparticles in Medicine and PharmacoloQv, M. Donbrow（Ed）. CRC Press, p. 125-148.）がある。
マイクロカプセル化はコントロルされた放出速度を与えるためにマイクロカプセル化された医薬品の注射用に開発された。マイクロカプセル化では各ポリマーの選抜には多くの因子が関与する。ポリマー合成およびマイクロカプセル化プロセスの再現性、マイクロカプセル化材料のコストおよびプロセス、毒性の観点、必要な徐放速度、ポリマーおよび抗原の物理化学的相溶性等の全ての因子を考慮しなければならない。有用なポリマーの例としてはポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルトエステルおよびポリアミド、特に生体分解性のものが挙げられる。
最近の抗原用に医薬品として広く選択される担体はポリアクリル酸エステル（d,1-ラクチド-co-グリコリド）（PLGA）である。これは縫合、骨板およびその他の一時的人工補填物で毒性を示さない生体分解性のポリエステルとして医療で古くから使われている。ペプチドと抗原とを含む多くの医薬品がこのPLGAミクロ莢膜中に配合されている。PLGAを用いた場合の抗原の徐放性に関するデータは例えばEldridge, J.H., et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146:59-66.によってチェックされている。直径が１〜10ミクロンへのPLGAに抗原を封入することで懸著なアジュバント効果を示している。このPLGAマイクロカプセル化プロセスは油中水型乳剤の相分離を用いる。必要な化合物を水溶液として調製し、PLGAは適切な有機溶媒（例えば塩化メチレンと酢酸エチル）に溶かす。これらの2つの非相溶性の溶液を高速拌して共乳化する。水滴のまわりにポリマーが沈降して初期マイクロカプセルを形成するようになってから、ポリマーに対する非溶媒を加える。マイクロカプセルを回収し、試薬（ポリビニールアルコール（PVA）、ゼラチン、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン（PVP）、メチルセルロース）の1つで安定させ、溶剤を真空乾燥または液液抽出で除去する。
組み合せ組成物中の抗原の働きを遅らせることが要求されるときには上記のマイクロカプセル化、遅延放出系、カプセル化法が使用できる。
本発明非組成物は注射以外の他の投与法、例えば固体含有液体、固形物、液体、ゲル（「ゲルカプセル」を含む）にすることができる。
本発明組成物は動物で免疫応答を刺激するために直接用いることができる。この免疫応答は抗体応答にすることができる。この抗体から当業者に周知の穂法でモノクローナル抗体が調製できる。このモノクローナル抗体は特定の抗原の有無を決定するために、周知の抗体結合アッセイ、診断キットまたは検査で使用することができる。このモノクローナル抗体を免疫吸着クロマトグラフィで使用して抗原を回収または単離することもできる。
モノクローナル抗体の生産方法およびモノクローナル抗体の使用方法は当業者に周知である。さらに、診断方法、キット、検査またはアッセイで用いることができ、免疫吸着クロマトグラフィまたは免疫沈降による材料回収で使用することができる。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞によって生じる免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は単一の抗原決定基と反応して従来の血清から得られる抗体よりも大きな特異性を示す。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることによって、所望の特異性、結合活性およびアイソタイプで各個人の抗体を選択することが可能になる。ハイブリドーマ細胞株は化学的に全く同じ抗体を定常的かつ安価に提供する供給源であり、この抗体の製法は簡単に標準化できる。モノクローナル抗体の生産方法は周知であり、例えば1989年4月1日発行のKoprowski、H.達の米国特許第4,196,265号に記載されている。好ましいの特許の内容は本願明細書の一部をなす。
モノクローナル抗体の使用法は公知である。その診断での使用法の一例は1983年3月8日のDavid, G. and Greene, H.の米国特許第4,376,110号に記載されている。この特許の内容は本願明細書の一部をなす。モノクローナル抗体は免疫吸着クロマトグラフィによって材料を回収するのに用いられる。例えばMilstein, C. 1980, Scientific American 243:66, 70を暗礁。この内容は本願明細書の一部をなす。
本発明組成物は上記の多くの利用法がある。その他の用途も本発明の具体化に入る。
本発明の理解とその多くの利点は例として挙げる以下の実施例から明らかになろう。
実施例
実施例1
組換え型OspAの製造
組換え型OspAを米国特許第5,523,089号および第5,582,990号、WO93/08299、PCT/U592/08697およびrdile達1993に記載の方法で作った。
B. burgdorfferi B31（上記WO90/04411に記載、Ｎ末端領域：配列番号1、c-終末領域：配列番号2、配列の残りはWO90/04411に記載）のクローン化ospA遺伝子を鋳型として使用した（pTRH44；Howe et al., 1986, Infection and Immunity, 54:207-212,″Howe et al. 1986″）。また、図1に示すように、野性型ospA遺伝子全体を増幅するために特別に設計されたオリゴヌクレオチドプライマ（PET-IN［Col］（配列番号第3）およびPET-273C［C03］（配列番号4）をポリメラーゼ鎖反応（PCR）で用いた。
同様に、B. burgdorferi株ACAlおよび1p90（Johnsson et al., 1992, Infect. Immun. 60:1845-1853に記載、ACAlの末端および1p90では配列番号1；ACAlのＣ末端領域；配列番号5：1p90のＣ末端領域：配列番号6）のクローンされたospA遺伝子をオリゴヌクレオチドプライマー対（a）OspN2（配列番号7）を用いたPCR反応で使用した。また、図１に示すようにBZl（配列番号第8）および（b）OspN2（配列番号7）およびpK4（配列番号9）をそれぞれN-およびＣ末端端で該当する増幅された断片を形成するために用いた。
オリゴヌクレオチドプライマを用いて所望の標的核酸配列を増幅するための基本的な法は一般に公知であり、米国特許第4,683,202号および第4,800,159号に記載されている。これらの特許の内容は本明細書の一部をなす。
得られた断片をプラスミドベクターpET9のNdeIおよびＢａｍHI部位にクローン化して、図2に示すように、ospA遺伝子をT7プロモータおよびバクテリオファージT7からの効率的な翻訳イニシエーション信号のの制御下に置いた。pET9およびpLysSプラスミド、クローン化するための細菌性宿主、培養培地およびＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン化された遺伝子を直接発現する方法は上記米国特許第4,952,496号に記載されている。この特許の内容は本明細書の一部をなす。本発明ではT7プロモータ系がの好ましい発現系であるが、宿主生物と相溶性のある他の発現系を用いて完全長のospA遺伝子を発現することもできる。
pET9発現ベクターは選択マーカとしてbla遺伝子よりｋａｎ遺伝子を有するので、pET9発現ベクターを用いた。従って、細胞発育ではアンピシリンを使わなかった。従って、免疫原のampicilloyl/OspA標的蛋白複合体は形成されない。この共役はペニシリンアレルギーの主要な抗原決定基であると思われ、免疫学的な検討を複雑にする。
得られたプラスミドはB. burgdorteriのB31、ACAlおよびIp90株からのospA遺伝子を含み、それぞれpOAl、pOA9およびpOAlOよばれる。ＯpOAlプラスミドはDunn et al., 1990, Protein Expression and Purification, 1:159-168に記載のpET9-preOspAプラスミドとほぼ同一であるが、2CR反応のために使われるオリゴヌクレオチドは違っている。
図3はプラスミドpOAlの予測された制限地図、図4はプラスミドpOAlの各種制限消化の結果を示し、全ての予測された部位が存在することを証明している。
プラスミドpOAl、pOA9およびpOAlOは蛋白生産のために大腸菌株、好ましくは前記米国特許第4,952,496号に記載のT7発現大腸菌株へ移した。特に、この株は上記の大腸菌の発現株BL21（DE3）（pLysS）または大腸菌株HM5174（DE3）（pLysS）にすることができる。変換宿主を増殖させ、イソプロピル―β-D-チオガラクトオサイド（isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）で蛋白を生産させた。IPTG添加後、プラスミドpOAlからのOspAを精細させる工程は図7Aに示してある。pOA9およびpOAlOを使用した場合もpOAlと全く同じ結果が得られられた。プラスミドpOAlからのOspA蛋白の合成は約1時間で終わる。蛋白は大腸菌に対してわずかに毒性を示すが、蛋白生産量は約10mg/L培養細胞で、許容量であった。
上記プラスミドpOAl、pOA9およびpOAlOの準備とT7プロモータを用いた大腸菌でのOspAリポ蛋白質の発現のほかに、完全長B31、ACAlおよび1p90 ospA遺伝子を含むプラスミドを異なるプロモータの下で作り、リポ蛋白質を発現させた。この場合、プラスミドpOASおよびpOA6はB31株からのospAのPCR-増殖断片をプラスミド発現ベクタpCMBlおよびpCMB2のNcolおよびBarnHI部位へクローン化して作られた。断片プラスミドpOA7およびpOA8はACAl株（pOA7）からのOspAのPCR-増殖断片の、そして、1p90株（pOAB）からのPCR-増幅された断片を発現ベクターpCMBlのNcolおよびBarnHI部位にクローン化して製造された（pOAS、pOA7およびpOABのための図6を参照）。
図5に示すように、B. burgdorferiのB31株、ACAlおよびIp90のクローン化されたospA遺伝子はオリゴヌクレオチドプライマ対（a）PK3（配列番号10）およびC03（配列番号3）、（b）PK3（配列番号10）およびBZl（配列番号8）および（c）PK3（配列番号10）およびPK4（配列番号9）をそれぞれの遺伝子のN-およびＣ−末端端でＰCR反応を用いて増幅して該当する増幅された断片を形成する。
プラスミドpCMBlおよびpCMB2は、プラスミドpTrc99a（Pharmacia Catalog番号27-5007-01）およびカナマイシン耐性遺伝子（Pharmacia Catalog番号27-4897-01）を消化し、得られた断片（図9）を単離することで得られる。プラスミドpTrc99a、4197bpは多回クローニングサイトの隣りに強いプロモータを含み、その後に強い転写終結信号（rrnB）が続く。標的遺伝子の発現は宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼを利用し、各種の大腸菌株が使用できる。発現はベクターに含まれるラクトース・サプレッサー遺伝子（laclq）によって厳密に管理される。ラクトースレプレッサたんぱくはインデューサIPTGがない場合に標的遺伝子の転写を阻害する。カナマイシン耐性遺伝子は線形２重鎖の1282bp ＤＮＡの断片で、制限酵素部位から側面に位置したトランスポゾンTn903からの遺伝子を含み、カナマイシンおよびネオマイシンことが耐性を与える酵素アミノグリコシド3’-燐酸トランスフォラーゼをコードする。
5.5kbのpCMBlはカナマイシン耐性遺伝子を含み、その転写はTrcプロモータが始まるのと同じ方向である。pCMB2は反対方向を向いたカナマイシン耐性遺伝子を含み、その転写は耐性遺伝子の転写およびTrcプロモータ制御下での上記遺伝子の転写が収束転写となる。ＳｍaＩ、HindlilおよびBamHi+NcoIを用いたpCMBlおよびpCMB2の制限酵素消化物は予測される正確な大きさ断片を示した。
プラスミドpOASおよびpOA6は大腸菌またはその他の適切な微生物、好ましくはDH5crコンピテント菌の発現株に転換した。転換した宿主を増殖し、蛋白をIPTGで生産させた。pOA5（図7B）を用いた生産時間はpOAl（図7A）の場合と類似しており、POA6（図7C）で生産されるOspAレベルは数倍低かった。POA7およびPOA8を使用して得られられた結果はpOASと全く同じであった。
組換え型完全長OspAの生産および精製段階は図8A〜図8Cに図示してある。ここで用いられているプロセス条件についは実施例で説明する。
細胞成長階段および蛋白生産段階（図8A）に続いて細胞を凍結-解凍で細胞溶解する。溶菌液中に存在する他の細菌蛋白よりOspA蛋白の可溶化を優先する選択性のある界面活性剤で溶菌液を処理した。三重陽子X-114が31のキロダルトン蛋白を選択的に可溶化するとわかった。そして、それはイムノブロッティングを用いてOspAであることを示した。トリトンX-114の使用で31キロダルトンの蛋白（免疫ブロットでOspAであることが示されている）が選択的に可溶化されることがわかっている。
本発明がこのトリトンX-114の使用に制限されるものではなく、上記の温和な条件下で上記と同様なOspAに対して選択的溶解性と相分離特性とを示す他の材料にすることができる。
選択的界面活性剤の添加に続いて、混合液を温和な温度上昇速度で加熱して溶液が懸濁し、相分離が起こる約35℃〜40℃にする。
懸濁した混合液を遠心分離すると混合液は三相すなわち、少なくとも50%がOspA蛋白で、それに少量（約5つのwt%）の細菌蛋白を含む界面活性剤相と、細菌蛋白の残部を含む水相と、細胞残基を含む固形ペレットに分離する。界面活性剤相を水相および固形ペレットから分離する。
OspAの選択的界面活性剤処理と界面活性剤相の分離の後に、OspAを細菌蛋白から実質的に完全分離する処理を行う。すなわち、界面活性剤相中に残って存在する残留物細菌蛋白からOspAを最終的に精製する。
蛋白の最終的な精製は細菌蛋白と結合し、OspAとは結合しない選択クロマトグラフィ・カラム、特にDEAE-Sephacel、DEAE-Sepharoseまたはこれらと均等な他のクロマトグラフィ材料で行われる。界面活性剤相をカラムに供給し、精製された全OspA蛋白を含む通過流（貫通流）を回収する。全ての細菌蛋白を含む結合画分は界面活性剤相中にある。
Ｓ-Sepharoseまたはそれと均等なクロマトカラムを使用した次の精製にによって、汚染蛋白質を含まない通過流を発熱原性のリポサッカロイド（LPS）を実質的に含まないものにする。これはリムルス属変形細胞溶菌液（LAL）を含まないことで示される。この高度に精製されたOspA溶液は凍結乾燥でき、さらに処理することもできる。
すなわち、上記のようにして製造されたプラスミドpOAlを大腸菌株BL21（DE3）（pLysS）（pOAl）およびHMS174（DE3）（pLysS）（pOAl）を変換させるために用いた。変換された大腸菌を25μg/mlのクロラムフェニコールと25μg/mlの硫酸カナマイシンとを含むＬＢ培地に1リットルの培地当たり12mlの率で接種した。培地はフラスコ・シェーカ中で37℃で一晩培養した。
翌朝、一晩培養した10mlの培地を25μg/mlの硫酸カナマイシンを含むＬＢ培地1リットルに移し、培地をフラスコ・シェーカ中で37℃でOD=0.6になるまで約3時間培養した（OD=1.5まで成長可能であるが）。
最終濃度が0.5ｍＭになるまで培地にイソプロピルチオガラクトサイド（IPTG）を加え、培地を37℃で更に2時間培養した。この培養期間の終わりに、培地を約4℃まで冷却し、10分間の10000×gで遠心分離した。
上澄は捨て、細胞ペレットは1/10体積のPBSに再懸濁した。細胞懸濁液を液体窒素で凍結し、必要な場合には-70℃で無期限保存できる。
凝固した細胞懸濁液は細胞が溶解するように室温（約20℃〜25℃）に加熱して細胞を解凍した。解凍された材料にＤＮａｓｅＩを添加して1μg/mlの濃度にし、混合液を30分間室温で培養する。それによって材料の粘度が低下する。
培養された材料は氷上で10℃の温度に冷やし、トリトンX-114の10wt%原液を加えて、最終濃度を0.3〜1wt%にした。混合液は20分間の氷上に保たれた。次に、冷やした混合液を約37℃まで加熱し、10分間のその温度を保持した。
相分離が起こり、溶液が混濁するようになったら、混濁した混合液を10分間の20℃で12,000×gで遠心分離して混合液を下側の界面活性剤相と、上側の透明な水相と、固形ペレットとに分離する。界面活性剤相をペレットを乱さずに他の2つの相から分離し、40℃に冷却した。冷却された界面活性剤相に緩衝液A（すなわち、50mMトリス、pH7.5、2mM EDTAおよび10mM NaCl）をて最初の体積の1/3に戻した。得られた溶液は凍結保存して以下で説明するプロセシンまで保存きる、または直ちに使用できる。
1ml/10の容積の界面活性剤相中にDEAE-Sepharose CL-GBカラムヲ調整し、2容積の緩衝液C（すなわち、50mMトリスpH7.5、2mM EDTA、1Ｍ NaCl、0.3wt%トリトンX-100）で洗い、次いで4容積の緩衝液B（すなわち、50mMトリスpH7.5、2mM EDTA、0.3wt%トリトンX-100）で洗った。
界面活性剤相をカラム上に供給し、OspAを含む通過流を回収した。カラムを1容積の緩衝液B洗い、その通過流を回収した。両方の通過流を合せたものが精製されたOspAの水溶液である。これを凍結乾燥して貯蔵する。
カラムは再使用のために2容積の緩衝液Cで溶出して細菌蛋白を除去する。
DEAE-Sepharoseカラムからの通過流の最終的な精製はＳ-Sepharose Fast Flowのクロマトグラフィを用いて行う。DEAE-Sepharoseカラムからの通過流に最初に0.1Mクエン酸を添加してpH4.2の酸性化する。
Ｓ-Sepharose Fast Flowカラムに緩衝液Cを通し、クエン酸でpH4.2に調節した。
高度に精製されたOspAはクエン酸でpH5.7に調節され、緩衝液Cを用いてカラムから溶出した。溶出液は、2Mトリス塩基を添加して直ちにpH7.5に戻す。
2回のクロマトグラフィ分離で得られられた高度に精製されたOspAの水溶液はCoomassie着色ゲルを用いて分析され、極めて純度の高いOspAを含むことが確証された。2回目のクロマトグラフィ分離で得られた生産物の純度は第1回目のクロマトグラフィ分離で得られたものより高く、エンドトキシンのレベルは非常に低かった。
プラスミドpOASおよびpOA6は上記のようにして製造され、大腸菌株DE5aを変換させるために用いた。実施例1で用いた蛋白発現手順を繰り返した。pOA5を用いたOspAリポ蛋白質の時間経過発現はpOAlで観測されたものと同じであり、pOA6を用いたOspA発現はpOA5（図7Bおよび7C）を用いた場合より低いことがわかる。OspA蛋白の精製はpOAS発現細胞のみで続く。
このようにTrc発現系で生じるB31 OspAリポ蛋白質は実施例1に記載の方法と全く同じ手順で精製したが、収穫後に細胞ペレットに0.1mg/mlのリソチームを加え、凍結前に細胞を30分間室温で懸濁された点が相違する。
DEAE-Sepharoseカラムからの通過流は極めて精製されたOspAリポ蛋白質を含んでいる。
プラスミドpOAl（pETプロモータ）およびpOAS（TRCプロモータ）の生産手順は上記と同じで、B. burgdorferiのアジア株（1p90）のクローン化されたospA遺伝子からその遺伝子を含むプラスミドpOA8（Trcプロモータ）およびpOAlO（pETプロモータ）を形成した。これらのプラスミドに制限消化を実行した。全ての予測された部位が存在することを示した。
B. burgdorferiのヨーロッパの株（ACAl）のクローン化されたospA遺伝子でその遺伝子を含むプラスミドpOA7（Trcプロモータ）およびpOA9（pETプロモータ）を上記手順も繰り返して形成した。制限消化をこれらのプラスミドに行った結果、全ての予測された部位が存在することを示した。
pOA9およびpOAlO発現株の増殖および誘導はpOAl株と同じに行い、pOA7およびpOA8発現株の増殖および誘導はpOA5株と同じに行った。
これらの操作を用いて得られられるACAlおよび1p90 OspAリポ蛋白質は上記のB31（pOAl）OspAリポ蛋白質と同様に精製した。OspAリポ蛋白質を含んだDEAE-Sepharoseカラムの通過流は極めて精製された形であった。
以下の実施例の製剤では上記方法で製造されたリピド化された組換え型B31 OspAが用いられるが、上記以外の他の株からの組換え型OspA、特にヨーロッパまたはアジアの家畜用の組換え型OspAを使用することもできる。
実施例2
組換え型OspAによるイヌ保護
Appel et al., 1993, J. Infect. Dis. 167:651-64に繰り返し述べられているように、イヌはライム病（Borreiia burgdorferi）に罹り易く、イヌから人間への伝染の可能もある。この点でライム病に対してイヌに予防注射をすることは望ましいことである。
初期効能の研究
コノ研究には14匹のイヌを使った。4匹に低濃度のバクテリン（107）を予防注射し、4匹には高濃度バクテリン（109）を予防注射し、4匹はアジバンドを加えたOspA製剤を予防注射し、2匹は対照にした。イヌへの抗原投与はダニの自然感染で行った。予防注射されたイヌは全て感染から完全に守られ、抗B. burgdorferi、抗OspA、ELISA抗体、増殖抑制抗体を示したが、2匹の対照は感染した。
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Ixodes darninniは抗原投与の1週間前にウェストチェスター郡（ニューヨーク）の樹木帯域でホワイトフラグをドラッグして回収した。この領域で回収したダニの60%以上が通常感染していることがわかった。
ダニをステージおよび性でソートし、使用時まで98%相対湿度中に維持した。抗原投与時に15匹の成熟雌および7匹の成体雄の左脇側にプラスチック帽を配置して吸血できるようにし、弾性材料テープで1週間間放置した。この時間はダニが吸血するのに十分な時間である。
サンプルコレクション
皮膚生検（抗原投与後、1月、2月および3月目にダニ付着の部位から4mmパンチで生体検査）し、Borreiia burgdorferiを培養した。血液サンプルはDO（最初の日）から毎週隔週に抗原投与（D42）まで回収し、さらに剖検まで回収した。血清抗体は下記の方法でテストした。剖検は約100日間（抗原投与後の97〜109日）行った。材料が左右筋、前部筋肉、後部筋肉、肘および肩部にからおよび筋肉および関節莢膜を回収し、Borrelia burgdorferiを培養した。
培養方法
サンプルをBSKII培地に接地し、BSKIIを含むチューブに接種した。このチューブを34℃で6週間間培養した。各チューブからのサンプルを毎週採り、B. burgdorferlの存在を証明するために暗視野鏡検でスクリーニングした。B. burgdorferiが観測された場合にはポジとした。
血清学的方法
RMエリサ：
これは間接エリサである。抗原をフランスのダニから単離されたB. burgdorferi株Bb212で超音波処理した。コンジュゲートはヤギ抗イヌ免疫グロブリンGである。基質はテトラメチルベンジジン（TMB）である。力価は血清サンプルの1/100の希釈物で450ナノメートルと620ナノメートルでのO.D.の差で表した。
コーネル・エリサ：
この検査は上記のAppel達に記載の方法で実行される。これは間接ELISAである。抗原はウェストチェスター郡から回収されたI. damminiから単離された低継代のB. burgdorferiの溶菌液である。コンジュゲートおよび基質は上記と同じものである。力価は動的ELISA単位として表記した。
OspAエリサ：
この間接ELISAはプレート抗原としてrOspAを用いて実行した。コンジュゲートはアルカリホスファターゼ・ヤギ抗イヌ免疫グロブリンGである。基質はsigna104ホスファターゼ基質（NA 0200）である。力価は405ナノメートルで0.1を超えるO.D.を与える最も高い希釈度のlog10で表した。
成長阻害アッセイ：
このアッセイはSADZIENE & al.（J. Infect. Dis. 1993, 167:165-172）に記載の方法で実行した。漿液をフレッシュなモルモット補体の2つの溶血性単位の存在下で62-66時間、B. burgdorferi微生物で連続的に培養した。この間にスピロヘータが存在するウエルのBSKII細胞増殖培養液のフェノールレッド変色指示薬はピンクから黄色へ変る。この点から両側へ3つ目のウエルを暗視野鏡検を用いて調べ、生菌が90%に減少した希釈度を確認する。力価はこの希釈度のlog10で表した。
結果：
皮膚の生体組織検査：
結果は表2に示した。対照のイヌは全てのサンプルでポジであることがわかる。予防注射した12匹のイヌではポジのサンプルはなかった。
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解剖検査−培養結果：
結果は表3に示してある。２匹の対照イヌは両側の側面の各種器官からポジの培養液が得られた。その単離率は右側より左側（抗原投与側面）が多いとはいえない。
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RMエリサ：
結果は表4に示されている。OspAワクチンまたはバクテリンをしたものはワクチン接種後のは大抵、1回の注射後に力価が増加し、第2回ワクチン接種から追加抗原刺激効果が目立つ。予防注射したイヌは抗原投与に対して安定であるが、対照のイヌは2ヵ月から力価が増加した。
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コーネル・エリサ：
結果は表5に示してある。パターン抗体の増加はRM ELISAで得られられるものとほとんど同一である。全てワクチンは1回の注射後に力価が大きい増加し、第2回目のワクチン接種後に追加抗原刺激がでる。抗原投与後、力価は安定したままである。対照は3月間、力価が漸進的に増加する。
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OspAエリサ：
結果は表6に示してある。両方のバクテリンは抗OspA抗体と類似のレベルを誘発する。OspAワクチンは大きな定型抗体応答を誘発する。パターンは全細胞溶菌液EOLISAに類似し、1回の注射後に力価が増加し、2回目の注射でブースター効果が見られる。
成長阻害：
結果は表6に示してある。バクテリンおよびOspAワクチンは予防注射した全てのイヌのB. burgdorferi阻害抗体を高レベルに誘発した。
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抗原投与：
使用した抗原投与法は他に開示のB. burgdorferiの注射針投与法を基礎とする抗原投与法より多くの利点を有している。すなわち、
1）抗原投与ベクターおよび径路が自然の状況を模倣する。
2）感染を皮膚生体組織検査を用いてインビボで追跡できる。
さらに、抗原投与（アメリカ起源のダニ）は2つのバクテリン（フランス株）の異形とみなすことができる。
臨床徴候無しが少ないが、上記Appel et al.,に記載のように、この加齢のイヌの全てに予想されることである。
これらの条件下での結果、すなわち：対照は全て感染し、予防注射した12匹は感染しないトイウ結論は、高濃度および低濃度の両方のバクテリンとOspAワクチンは完全にイヌを抗原投与から保護したことを証明している。
血清学：
3つのワクチンは使用した全ての方法で類似の結果を与えた。すなわち、１回の注射後に力価が増加し、第2回目の射出で追加抗原刺激効果が現れる。このことから、抗原産生のために使った株および発現が相違し、結果に差があるが、使用した2つの溶菌液ELISA（RM ELISA（コーネルELISA）の間には高い相関関係があることを示している（図3）（r2=0.86、F==935、α=0.001）。
ワクチン接種で誘発される抗体に注意することも重要である：
1）B. burgdorferiの主要な外膜蛋白のOspAと強く反応する。
2）B. burgdorferiの成長を強く抑制する。
結論
B. burgdorferiの死んだ細胞を低供与量（107）または高供与量（109）で含んだバクテリンは自然径路（ダニに曝す）の抗原投与に対してイヌを完全に保護した。OspAにアジバンドを加えたワクチンも同じ結果。全てのワクチンは類似した大きなOspAリポ蛋白質を認識し、B. burgdorfferiの増殖を抑制する抗体価を増加させる。
免疫の持続期間の研究：
33匹のビーグル犬を2つのグループに分けた。最初のグループ（20匹のイヌ）は3週間または4週間の間隔で単価ワクチンを2SC供与量で与えた（10μｇ/実施例1で製造したOspA組換え型B31投与量）。第2のグループは未処置だった（13匹のイヌ）。全てのイヌは第2回目のワクチン接種後５〜6ヵ月目にダニニによって抗原投与された。抗体レベルはELISAを用いて定期的に求めた。ワクチン効能はスピロヘータ再単離（reisolation）によって抗原投与後1ヵ月と2ヵ月に確認した。さよに、イヌのイヌライム病（LD）の臨床的徴候をモニターした。
まとめ：
安全性：ワクチンの注射後に不利な局所反応または一般反応は見られなかった。
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一価のLy OspAワクチン：
１）イヌLDに対する保護を誘導することがスピロヘータ再単離と臨床徴候によって確認される。
２）この保護応答はワクチン接種後少なくとも5月続く。
３）自然の抗原投与後のスピロヘータ感染症に対する保護（90%）と臨床徴候。
動物：
Ridglan Farms（Mount Horeb, WI）から33匹のビーグル犬の子イヌ（雄雌両方、9〜10週目、ライムおよびレプトスピラ・ワクチンに対してはネガ）を入手し、子イヌをランダムに2つのグループに分け、予防注射をした。
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ワクチン製法：
OspA単価ワクチン（Lyで表示）は実施例1に記載の方法で精製したB31 OspA蛋白株の濃縮株を薄めて使用した。株の濃度は465μｇ  OspA/mlであった。Lymeワクチンは濃縮株を蒸留水に希釈して10μg/mlの濃度のOspAに薄め、一回用および多数回用の小びん（1mlおよび10ml）にワクチンを分けた。ワクチンは完全に滅菌検査した。
ワクチン接種のプロトコル：
イヌには皮下注射で3週間毎（グループ1）または4週間毎（グループ2）にワクチン（1ml/投与）を2回投与した。呼吸困難、痒みおよび水腫を含むアナフィラキシー徴候があるかないかを注射後15分後に観察した。さらに、接種の後１時連続的に観察し、その後は各注射後14日間規則的に観測した。腫脹、痛覚、そして注射部位をひっかく徴候をモニターした。第2回目の注射前、一回目のワクチン接種部位は腫脹および圧痛のために震えていた。
血清学：
各ワクチン接種前と、その後毎月毎に血液を採って力価を求めた。OspA力価はELISAを用いて決定した。
抗原投与：
全てのイヌはダニを用いた自然感染によってAppel達の抗原投与手順に従って、B. burgdorferiを抗原投与した。抗原投与と最後のワクチン接種との間の期間はグループ1では24週間、グループ２では21週間であった。ダニはAppel達の手順に従ってN.Y.州、ウェストチェスターのライム病流行地域から集められた。このダニのBorreila burgdorferi感染率は60%であった。
皮膚生体組織検査とスピロヘータ再単離：
抗原投与後の1ヵ月および2ヵ月後に全てのイヌを生体検査した。ダニ付着部位のまわりの皮膚を剃り、Betadine外科スクラブで押し、皮内注射で2%のリドカインで麻酔をし、Baker Skin Punch.を用いてpunch-biopsiedした。皮膚サンプルは培地（熱で不活化したウサギ血清と抗生物質とを含むでBSK培地）を含んだチューブに入れ、実験室へ輸送した。チューブに追加の培地を補い、カンテラ・ジャーに入れた。このジャーは６週間間培養された。暗視野顕微鏡を使用して毎週チューブ中のスピロヘータの存在を調べた。サンプルがネガティブとみなされる前に少なくとも10の部分を40Xのレンズで調べた。
臨床徴候および症状：
この疾患は変化しやすいため、イヌライム病（LD）の臨床徴候は感染後には予想されなかったので、ワクチン効能を主として皮膚生体組織検査サンプルからのBorreiia burgdorferiスピロヘータの再単離で評価することにした。しかし、全てのイヌのLD外観的徴候をモニターし、痛み、びっこ、運動失調症、欝状態、食欲低下をモニターした。Borrelia burgdorfferiに自然感染したイヌの約10%が臨床徴候を示した。
結果：
ワクチンの安全性：
予防注射した全てのイヌは最初のワクチン接種後の15分と各ワクチン接種後の2週間に副作用（アナフィラキシーを含む）がモニターされた。ライムの単価ワクチンの注射後には副作用は見られなかった。さらに、腫脹、痛覚、圧痛または痒みは注射部位でワクチン接種後2週期間の間は分からない。
抗体価（表7を参照）：
OspAに対する抗体をエリサを用いて求めた。表7はELISA値の一覧を示す。ダニ抗原投与の時点で単価ワクチン（10μｇのOspA）で予防注射された大部分のイヌは大きいOspA抗体価を示した。1匹のイヌ  FAS＜はOspAに対する大きい抗体応答を取得するのに失敗した。
スピロヘータ再単離（表7を参照）：
全てのイヌニ対して皮膚の生検を抗原投与後1月目と2ヵ月目に行った。生検サンプルは6週間培養してスピロヘータ再単離を検査した。12匹の対照イヌの中で7匹から最初の生検でスピロヘータが再単離された（58%）。一つのサンプルは汚染のために培養5週間以後消失したので、記録はない。第2回目の生体組織検査日には13匹の対照イヌからの全てのサンプルがスピロヘータに対してポジであった（100%）。
結果は、一価ライムワクチン（HVTおよびDXT）を予防注射した2匹のイヌのみがスピロヘータに対してポジであった（再単離率10%）。
イヌライム病の臨床徴候（表6、7を参照）：
抗原投与後5月後に、13匹のワクチン処理なしの対照（39%）の中の5匹がLDに起因するエピソード（episode）を示した。2匹のイヌ（HXTおよびJCT）は倍数エピソードを示した。ワクチン処理をした20匹のイヌの中の1匹（5.0%）もびっこの単一のエピソードを経験した。
討論：
このワクチンの効能は、スピロヘータ播種および臨床徴候を短期間で免疫試験の期間中に阻止するワクチン能力によって確認された。イヌのLDは臨床面な外観に現れない（Levy and Magnarelli, 1992, JAVMA, 200: 344-347）ので、臨床徴候以外に、皮膚生検からのスピロヘータの再単離によって評価して、スピロヘータ増殖を防ぐワクチン効能を実験的能力に基づいて求めた。スピロヘータ再単離がワクチンの効能を評価するパラメータノ中で最も重要なものであり、一定のものである。ワクチン接種を減すか、播種を無くした場合には動物は臨床徴候を示さない。上記のように、Lyワクチンはスピロヘータの増殖を短期間の効能試験で90%以上を保護することが示された。この免疫性（DOI）研究の期間中にワクチン接種の後5〜6ヵ月に抗原投与したイヌは2匹からだけスピロヘータが再単離された（10%）のに対して、未処置の対照イヌは第2回目の生検期日には100%がスピロヘータに対してポジであった。
さらに、感染から生じる臨床的徴候をイヌでモニターした。各イヌのワクチン接種状態を開示しないで動物の専門家が目視観測した。上記の短期効能研究では、イヌライム病（LD）の代表的兆候、主としてびっこは未処置の対照の25%以上で観察されたが、予防注射をしたものではその兆候はなかった。このＤＯＩ研究で、6匹のイヌの中の5匹がこの種の徴候を示したが、ワクチン処理しない対照が5匹（39%）、予防注射をしたイヌは1匹であった（5%）。最初のびっこのエピソード（挿間状態）は抗原投与後約2ヵ月であった、それ以来、未処置のイヌ（JRTとIAT）の２匹は再発性のエピソードを示した。
予防注射した1匹（HPS）では、抗原投与の後約2ヵ月後に正面右足に腫脹と軽度なびっこが報告された。この動物はスピロヘータ単離ではポジでなかったが、、そのイヌの腹からの培養物をびっこエピソードを考えて調べた。このエピソードがイヌLDの結果でなく、他の原因（外傷、その他）に起因した可能はあるが、検査をできるだけストリンジェンにするために、臨床徴候の一覧ではこのイヌをポジと記載した。
抗体価の結果は、少なくとも2回希釈したサンプル採取前と抗原投与後の力価の差から分かるように、単価ワクチンを予防注射したイヌ（FAS）の中の1匹以外の全てがワクチン接種の後にセロコンバートしたことを示した。このセロコンバージョン率は95%であった。抗原投与時に予防注射した2匹（FASとHVT）以外の全てが有意の力価を示した。3匹の対照（HXT、JBTとJIT）は抗原投与前の細説で低レベルの抗体が報告されたが、対照イヌはOspA抗体レベルの増加を示さなかった。
Ly単価ワクチンの安全性はこの実験結果からも示される。有害反応はワクチン接種の時点および各注射後の2週間において見られなかった。10μｇのOspA/投与量は全ての子イヌに許容できる量であった。本発明のワクチンはアジュバントを含まないので、大部分のアジュバントを含むワクチン接種で見られるわずかな一過性の肉芽腫性の応答形質も本発明では見られなかった。
結論：
10μｇOspA/投与の単価ワクチンは、
１）９〜10週目の子イヌにも安全であり，
２）抗原性が強く、95%のレシピエントでセロコンバージョンを誘発し、
３）対照のイヌはダニ抗原投与後に100%がスピロヘータ感染症を示し、39%が臨床徴候を示すのに対して、予防注射したイヌはワクチン接種後スピロヘータ感染に対する保護免疫応答を引き出し（90%）、５〜6ヵ月間の臨床徴候がない。
この実施例も、本発明ワクチンが全ライム病に対して保護薬であることを証明している。
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抗原投与後１、２、３月後に全てのイヌを生検した（acc Malariais and Meihods）。皮膚サンプルをBSK培地（抗生物質と10％のウサギ血清を供給）で6週間培養し、暗視顕微鏡で毎週チューブを検査し、サンプルがネガと考えられるまで少なくともフィールド調査した。＊このサンプルは汚染のため廃棄した。
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実施例3
効能干渉がない組み合せ組成物物の製剤
本実施例はBorrelia burgdorferi抗原OspAと、イヌジステンパー、アデノウィルス型2、コロナウィルス・パラインフルエンザ、パルボウィルスと間には干渉がないことを証明するものである。
略号
成分 略記号
イヌジステンパーウィルス、
Rockborn（CDVR）、または、
Onderstepoort（CDV〜）                             D
イヌのアデノウィルス型2（CAV2）                    A
イヌコロナウィルス（MLV（CCVL））                  C
イヌのパラインフルエンザ2型（Cpi）                 Pi
イヌパルボウィルス（CPVXL）                        PXL
これらの成分は改良型ライブウィルスから調製された（Rhone Merieux, Inc., Athens, Georgia, U.S.A.から入手可能）。このワクチンは下記の製剤である。
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このワクチンは以下の2つの分離した成分として調製される：
第一成分はイヌジステンパー、アデノウィルス2型、コロナウィルス、パラインフルエンザ、パルボウィルスxL、改良型ライブウィルス、DACPiPXLで、1つの小びんに凍結乾燥されており、アジュバントは含んでいない。
第二成分はBorreila burgdorferi B31外側表層膜プロテインＡ（OspA）から施例1に記載の組換技術による生産した。（Lyと表記）またはOspA。
第2の成分は凍結乾燥されたワクチン成分を接種前に再水和するために用いられる液体成分である。OspA成分はアジュバントを含んでいない。
凍結乾燥されたワクチンDACPIPXLでウィルス同一性、力価、滅菌性、マイコプラズマおよび安全性をテストした。凍結乾燥ケークを13μg/mlのOspAを含むLyで再水和した。OspAワクチンは滅菌性をテストした。
凍結乾燥成分を希釈する前のOspAワクチン成分に免疫干渉がないことはCode of Federal Regulations, 9 C.F.R. 113.35.のガイドラインに従ったインビトロ獣医テストで証明した。
OspAへ希釈される凍結乾燥ウイルス成分に免疫干渉がないことは、組み合せワクチン（DACPiPXL+OspA）を投与したイヌと、OspAのみを投与したイヌの血清学的力価を比較することで求めた（実施例2を参照）。
DACPIPXL+OspAの組み合わせは既に大規模な効能検定を経ている２つのワクチンの組み合わせであるので、凍結乾燥されたウイルスの成分がライム病に対してOspA画分と、またその逆に、干渉しないことを証明することを少数のイヌへの抗原投与で証明した。
20匹のイヌを加齢、品種、性に従って無作為に集め、10匹のイヌにはDACPiPXL+OspA組み合わせワクチンを投与し、5匹のイヌにはOspAのみを投与し（実施例２と同じ）、5匹のイヌは未処置の対照とした。
イヌには下記予定で、皮下（SC）に3週間隔でワクチン（1ml/イヌ）を2回投与した。
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イヌはワクチン接種前（日0と21）と、抗原投与日（35日）と、各生検前にサンプル採取した。OspAに対する特異抗体はエリサ検査で検出した。OspAまたはDACPiPXL-＋OspAを接種したイヌで抗OspAが検出された。
ワクチン接種後直ちにアナフィラキシーを含む全てのイヌの副作用を観測した。さらに、動物専門家によって毎日イヌを観察して発熱、食欲低下、おう吐物または無気力を含む局所作用および全身症状をモニターした。第2回目の注射前に前回のワクチン接種部位の肉芽腫発生を含む異常な反応を触診した。副作用は観測されなかった。
第2回目のワクチン接種後に、全てのイヌにダニによってBorreila burgciorferlを自然感染させた（実施例2を参照）。
皮膚パンチ生検は1月、2月および3ヵ月目の抗原投与後にイヌから得た生検材料で行った。材料を培養し、実施例2に記載のプロトコルに従ってスピロヘータ再単離を調べた。
OspAに希釈する前の凍結乾燥ウイルス成分からなる組み合せワクチンに免疫干渉がないとは未処置の対照と、ワクチン投与したイヌとでスピロヘータ再単離率を比較して確認した。
OspA成分が組み合せライムワクチン中で凍結乾燥ウイルス成分に影響を及ぼさないことを示すために殺ウイルス性の検定を行った。全てのウイルスの成分はLyで再水和したものと、ウイルス成分を無菌水に水和したものとの力価を比較した。
インビボおよびインビトロ結果の解釈：
組み合せワクチンの効能は、血清学力価およびスピロヘータ再単離によってインビボで求め、殺ウイルス性の検定によってインビトロで決定した。組み合せワクチン（DACPIPXL+Ly）を投与したイヌのOspA抗体レベルとスピロヘータ再単離の結果を、Ly単独を投与したイヌおよび未処置の対照のレベルと比較した。
組み合せワクチンは以下の理由で有効である考えらる：
（1）組合せのワクチンの抗体レベルは一価のLyワクチンを投与したイヌのレベルと同様である。ワクチン投与したものの抗体レベルは未処置の対照のレベルよりはるかに高い。
（2）スピロヘータ再単離に対してワクチン投与されたイヌは100%ネガであったが、未処置の対照は80%（4/5）がスピロヘータにポジであった。
（3）凍結乾燥ウイルスケークをLy希釈液に再水和したウィルスの力価は無菌水に比べてロスがない。
結果は表9に示してある。
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実施例4
ウマでのOsｐAワクチンの効能
この研究には10匹のウマを用いた。それら番号は74、75、76、77、93、95、96、97、98、99である。
単価ワクチン（Lyと表記、100μｇ/投与OspA、30μｇ/投与）は実施例1に記載の組換技術で作成した（B31）。この組み合せワクチン（狂犬病/Lyと表記）はlmrab（Rhone Merieux, Inc., Athens, Georgia）＋実施例1の方法（B31）で作られた30μｇg/mlのB31 OspAからなる。
全てのウマに筋肉内経路で以下のプロトコルに従って2週間隔（IM）で2回ワクチンを投与した：
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各ワクチン接種前と第2回ワクチン接種後1、2、3週間後にウマからサンプルを採取した。血清学的結果はエリサによって決定した（ウマ抗血清で修正）。OspA血清学の結果から、組合せでワクチン投与したウマで狂犬病抗体価を決定した。
各ワクチン接種後の1時間30分間、全てのウマのアナフィラキシーの徴候を観測した。初期の目視観測期間に続いて、第2回ワクチン接種前にワクチン接種部位の局所反応（腫瘍、その他）の外観検査をした。さらに、各ウマのワクチン反作用（発熱、欝状態、食欲低下、その他）を外観から毎日観測した。ワクチン接種後1週間毎日目視観測したが、副作用は観測されなかった。ワクチンの効能はワクチン投与したウマの抗OspA抗体のレベルをサンプル採取前のレベルと比較して評価した。
結果は表10に示してある。この結果はウマが一価または多価のOspAワクチンによってライム病から守られることを示し、多価ワクチンには免疫効能干渉が観測されないことを示している。
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実施例5
イヌのライム：その安全性、効能およびライム組み合せワクチンの無干渉
この実施例はライム組み合せワクチン（recDACPiPXL＋OSpA）の安全性、効能および無干渉性を確認するものである。
34匹のビーグル犬をランダムに2つのグループ（22匹はワクチン投与、12匹は対照）に分けた。組み合せワクチン（recDACPiPXL＋OspA）は皮下に2回ワクチン投与した。対照にはrecDACPiPXLウイルス成分のみをワクチン投与した。第2回のワクチン接種後7週間後に全てのイヌにダニの自然感染によって抗体投与した。イヌのOspA抗体力価はエリサ血清学によってを定期的にテストした。Borrelia burgdorferi抗原投与に対するワクチンの効能を確かめるために、イヌを生体検査し、皮膚サンプルの培養でスピロヘータ再単離を調べた。さらに、OspA希釈がウイルスワクチン成分に有害な効果を与えないことを確認するために、干渉試験と殺ウイルス性アッセイを行った。
１）安全性：注射後、局所または全身に副作用は全く無かった。
２）効能の概要：
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従って、ライム組み合わせワクチン（recDACPiPXL＋OspA）は：
１）8〜10週の子イヌに安全である。
２）抗原性強く、ワクチン投与したイヌは100%OspAセロコンバージョンを誘発する。
３）ダニの自然抗原投与後に、ワクチン投与者をスピロヘータ感染症から保護する。
４）インビトロな殺ウイルス性アッセイおよびインビボな干渉検定なないという結果から、凍結乾燥されたワクチン成分に対する干渉はない。
略号
ワクチンの成分
Borrelia burgdorferiからの外部表面蛋白Ａ（OspA）（前の実施例を参照）
イヌジステンパーウィルス；カルノラポックス・ベクター（recCDV）  D
イヌのアデノウィルス型2（CAV2）                                 A
イヌパラインフルエンザウィルス（Cpi）                           Pi
イヌパルボウィルス（PXL）                                       PXL
イヌコロナウィルス（CCV）                                       C
ライム病に対してイヌを保護し且つイヌのその他の病原に対しも同時に保護するこの組み合せワクチンは獣医に感染症予防における一つの重要な可能性を与えるものである。
この研究は、本発明の組み合せワクチンが安全で、効能良く、干渉がないことを示すために実施されたものである。本発明の組み合せワクチンはOspA希釈液（OspAと表記）と、凍結乾燥ウイルス（組換えイヌジステンパーウィルス、アデノウィルス2型、コロナウィルス、パラインフルエンザ、パルボウィルス（recDACPiPXL））のケークとで構成される。
材料と方法
動物：
Ridglan Farms（Mount Horeb, WI）から入手した34匹のビーグル犬の子イヌ（雌雄両方、加齢8週間、Lyme（Borrelia burgdorferi）およびレプトスピラ抗体に対してのネガ）をランダムに2つのグループに分け、以下のワクチン投与をした：
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ワクチンの製法：
実施例1のOspAワクチンを得た。凍結乾燥ウイルス成分は予め使用許諾されたシリーズから得た。凍結乾燥ケークは以下の力価であった：
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ワクチン・プロトコル：
イヌに皮下注射で3週間間隔でワクチン（1ml/イヌ）を2回投与した。注射後の15分間、動悸、痒み、水腫を含むアナフィラキシー徴候をモニターした。さらに、ワクチン接種後の最初の一時間と、各注射後14日間、動物管理人よってイヌを毎日連続的に観測した。モニターした徴候は腫脹、痛覚、注射部位をひっかくことである。第2回目の注射前に第１回目のワクチン接種部位の腫脹と圧痛を触診した。
血清学：
血清学用に各ワクチン接種前と、その後毎月血液を採った。OspA力価はエリサて求めた。
無干渉のテスト：
組み合せワクチンのウイルス成分をOpsAで希釈した時に干渉が無いことを示すために、血清中和力価を求め、グループI（recDACPiPXL＋OspAを投与）のGMTをグループII（recDACPiPXLのみを投与）の力価と比較した。
インビトロでの殺ウイルス性検査：
組み合せワクチンをOspAで希釈した時にウイルス成分が力価を低下させないいことを証明するために、殺ウイルス性検定をインビトロで9 CFR guidelines（113.35）に従って実施した。
ダニによる抗原投与
ウイルス成分が組み合せワクチンのOspA成分によって引き出される保護を妨げないことを確認するために、ワクチン接種後7日目に全てのイヌにB. burgdorfferiを抗原投与した。この抗原投与は自然に用いられる、ライム病流行地域で集めたダニを感染させて行った。これらのダニのBorrelia burgdorferi感染率は60%である。
皮膚生検とスピロヘータ再単離：
抗原投与後1月および2月後に全てのイヌを生体検査した。ダニ付着の部位のまわりの皮膚を剃り、Betadine外科のスクラブを準備し、2%リドカインを皮内に注射して麻酔し、ベーカー皮膚パンチを用いて生検した。皮膚サンプルを培地（熱で不活性化させたウサギ血清と抗生物質を含むBSK培地）を収容したチューブに入れ、そのチューブを実験室へ送った。チューブに追加の培地を補い、キャンドル・ジャーに入れた。このジャーで6週間培養した。暗視野顕微鏡を用いて毎週チューブ中のスピロヘータの存在を調べた。サンプルがネガとみなされまで少なくとも10のフィールドを40Xの対物レンズで調べた。
ワクチン安全性：
ワクチン投与した全てのイヌを、ワクチン接種後の最初の15分間と各ワクチン接種後の14日間、P1によって副作用（アナフィラキシーを含む）を動物管理人がモニターした。ライム組み合せワクチン接種後に副作用は見られなかった。また、注射部位での腫脹、痛覚、圧痛または痒みはワクチン接種後2週間後でも見られなかった。
OspA抗体価（表12を参照）
OspAへの抗体はエリサによって決定した。血液を日0（予めサンプル採取する；最初のワクチン接種の投与前）；日14（第2回ワクチン接種の前）；日42（抗原投与前）；そして毎月採取した。
表12はエリサ値の一覧を示す。OspA抗体レベルが少なくとも4倍増加することから、最初のワクチン接種後に21匹のワクチンイヌの中で12匹がセロコンバート（57.1%）したを示す。recDACPiPXL単独をワクチン投与した22匹の全てイヌ（100%）が第2回のワクチン接種後の2週間後にOspAにセロコンバートした。抗原投与したイヌの大多数（19/22=86.4%）は抗原投与前に有意なOspA抗体を示した。これにら対して、対照（recDACPiPXLのみをワクチン投与）ではOspA抗原に血清学的に応答しなかった。
両方のグループでダニ抗原投与の後に抗体はごくわずか上昇した。人間では感染後期にならないとOspA抗体は発現されないが、それと同じことが自然感染の場合にはイヌでもいえる。
無干渉の検査（表13を参照）
接種後で日0（最初のワクチン接種前）と日35にのイヌから血清を得た。組み合せワクチンのウイルス抗原の血清中和力価を各イヌに対して両方の日に求めた。recDACPiPXLのみをワクチン投与したグループに対して幾何平均力価（GMT）と標準偏差（SD）を計算し、ライム組み合せワクチン（recDACPiPXL＋OspA）を接種したグループのGMTと比較した。
この研究で用いた子イヌはライムまたはレプトスピラ・ワクチンに対してネガであったが、特定の病原菌からフリーな条件下ではなかった。従って、ワクチンの凍結乾燥された成分のウイルス成分に対して予めサンプル採取した0日に力価を示した。ワクチン接種後に予想した通り全ての成分の力価は上昇した。
各力価の比較（有意とみなされるp<0.05で、student’t検定を用いて分析した）から、recDACPiPXL＋OspAをワクチン投与したイヌの力価を中和する血清の力価とrecDACPiPXLを単独で投与した場合の力価には相違が無かった。従って、ワクチンのウイルス成分はOspA希釈によって有意な干渉を受けない。
インビトロでの殺ウイルス性テスト（表14を参照）：
OspAで希釈した再水和ウイルスのワクチンの各成分の価を、ワクチンを無菌水で再水和したときの力価とインビトロの殺ウイルス性テストで比較した。この力価の比較から、ライム組み合せワクチンの各ウイルス成分の変動は容範囲内にあることが示された（力価の差のlogが0.5未満）。
スピロヘータ再単離（表15を参照）：
全てのイヌに対して抗原投与後1ヵ月および2ヵ月目に皮膚生検を実行した。生検物は6週間培養され、スピロヘータ再単離を調べた。結果は組み合わせライムワクチン（XBY）を投与したイヌはスピロヘータにポジ（4.5%）であり、この犬は最初の生検日だけポジであり、recDACPiPXL＋OspAをワクチン投与した22匹のイヌで第2回生検後にスピロヘータにポジなイヌはいなかった（0%）。
抗原投与後1ヵ月に12匹の対照イヌの中の3匹から取り出した生検サンプルでスピロヘータが再単離され（25%）た。対照の中の9匹は第2回生検でもポジであった（75%）。
病原のスピロヘータBorrelia burgdorferiによって生じるライム病（LD）は現在の人間の最も普通の咬まれて発症する疾患である。また、獣医が報告する感染のイヌLDは増加している。
Borrelia burgdorfferi（OspAと表記）の主たる外側表面蛋白の1つが有力な免疫原であり、それが動物のスピロヘータ感染症に対する保護を与えることは公知である。組換技術によって充分な量供給される精製されたOspA蛋白が人間のワクチン用に現在臨床試験中である。
イヌを免疫化してライム病を防き、それと同時にイヌの他の病原に対しても保護する本発明の組み合せワクチンは、感染症予防法として獣医に重要なツールを提供するものである。
本実施例の目的はこの組み合せワクチンの効能、安全性、無干渉性を示すことにある。組換えイヌジステンパーウィルス、アデノウィルス2型、コロナウィルス、パラインフルエンザ、パルボウィルスを含んだ凍結乾燥ウイルスケークを含むワクチン（recDACPiPXLと表記）をOspA希釈液で再水和する。この組み合せワクチン（recDACPiPXL＋OspA）を22匹の子イヌに投与した。一方、12匹の対照には凍結乾燥されたウイルス（recDACPiPXL）のケークを無菌水で再水和したワクチンを投与した。全ての子イヌは、3週間間隔で2回のワクチン終車し、その後にダニ感染でBorrelia burgdorferi抗体投与した。
この実施例ではこの自然のダニ抗原投与モデルを用いた。以下の抗原投与では全てのイヌが抗原投与後に1回および2回目の生体検査され、スピロヘータ再単離のために培養された。結果は、ライム組み合せワクチンを投与した子イヌのうちの1匹だけが一時的にスピロヘータ再単離にポジであったが、第2回の生検ではこのイヌおよび組み合せワクチンでワクチン投与した全ての他の子イヌがスピロヘータに対してネガであった、これに対してrecDACPiPXLのみを投与したイヌの75%から第2回生検日にスピロヘータが再単離された。
OspA抗体結果は全てのイヌで示された。組み合せワクチン（recDACPiPXL＋OspA）をワクチン投与した子イヌは全て、2回の注射を受けた後にセロコンバートを示した。一方、凍結乾燥ウイルス成分のみをワクチン投与した対照はどれもOspA抗体レベルの増加を示さなかった。
生検によって感染を示す対照動物のOspA力価はダニ抗原投与後でも実質的に上昇しなかった。人間ではライム病初期にはOspA抗体が存在しないことが知られているが、この研究結果から、そのことはイヌの感染の場合の症例でも同じであるいことが示された。
この研究によってOspA組み合せワクチンの安全性はさらに示された。ワクチン接種時点でまたは各注射後の2週間後でも、全身または局所の副作用は見られなかった。
本発明のライム組み合せワクチン（recDACPiPｘＬ＋OsｐA）は、
１）8〜10週齢の子イヌに安全でえる。
２）抗原性が強く、ワクチン投与されたイヌの100%にOspAセロコンバージョンを誘発する。
３）スピロヘータ再単離でしょうめいされるように、にスピロヘータ感染症と自然のダニ抗原投与後の播種に対してワクチン投与者を保護する。
４）インビボ干渉テストおよびインビトロでの殺ウイルス性アッセイの結果で証明されるように、凍結乾燥ウイルスのワクチン成分との干渉はない。
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以上、本発明の好しい実施例を詳細に説明したが、本発明は上記の説明および実施例に限定されるものではなく、請求の範囲を逸脱しない限り種々変更することができ、本発明は請求の範囲によってのみ限定されるということは理解できよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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