(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HBV/Bに属するB型肝炎ウイルスにおいて、C46T, A499C, C1029T, T1505C, G1799C, A1838G, T1975G,T1978G, C1993A, C1996T, T2003G, G2029A, G2035T, T2056C, G2059A, T2089G, G2092A,A2100C, C2107T, G2128A, G2160A, C2161T, C2167T, G2171A, A2188G, A2194G, C2198T,A2293C, A2354C, T2443C, T2511G, G2512T, C2657Tのうち、少なくともいずれか一つの位置の相違に基づき、数値の前に記載された塩基である場合には、HBV/BとHBV/Cとの間で遺伝子組換えが起こっているタイプであるB/C組換えを持ち、日本を除くアジアに多く認められ、若年齢者においても肝細胞ガンを発生させて重篤な肝臓疾患を引き起こす危険性がより大きいBaタイプであると区別し、数値の後に記載された塩基である場合には、前記B/C組換えを持たず、日本に多く認められ、危険性がより小さいBjタイプであると区別することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
HBV/Bに属するB型肝炎ウイルスにおいて、 CA1020T, TG1504C, GTA1632C, TG2150C, AW2465T, GK2504Aのうち、少なくともいずれか一つの位置の相違に基づき、数値の前に記載された塩基である場合には、HBV/BとHBV/Cとの間で遺伝子組換えが起こっているタイプであるB/C組換えを持ち、日本を除くアジアに多く認められ、若年齢者においても肝細胞ガンを発生させて重篤な肝臓疾患を引き起こす危険性がより大きいBaタイプであると区別し、数値の後に記載された塩基である場合には、前記B/C組換えを持たず、日本に多く認められ、危険性がより小さいBjタイプであると区別することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
制限断片長多型法を用いてBaタイプ及びBjタイプを区別することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項４】
A1838Gの相違に基づいて、Baタイプ及びBjタイプを区別することを特徴とする請求項３に記載の遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＢ型肝炎ウイルス及び、その検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV)は、約３．２Kbpを備えたDNAウイルスである。現在、世界的に、およそ３億５０００万の人が、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）に感染していると推定されている１（本明細書中においては、参考文献は上付き数字にて番号を示し、その番号が示す文献は、まとめて最後に示す。）。そのうち大多数の感染者は、アジア及びアフリカに住む人々である。これらの感染地域においては、HBV の感染は、HBe坑原（HbeAg）陽性の母親から生まれる赤ん坊への出産前後の時期に成立する。後になって、彼らの生活で、若干のキャリアが肝硬変と終局の肝細胞ガン（ HCC ）に発展し得る慢性の肝炎となる1。
【０００３】
ＨＢＶには、全遺伝子配列における８％以上の相違によって、７つの遺伝子型が区別されており、それらはＡ〜Ｇまでのアルファベットによってネーミングされている2-4。これらの各HBV 遺伝子型は、異なった地理的分布を備えている5,6。すなわち、遺伝子型Ａは、北西ヨーロッパ、北アメリカ、及びアフリカにおいて多数派である一方、遺伝子型Ｂと遺伝子型Ｃとは、アジアにおいて一般的なタイプである。遺伝子型Ｄは、地中海の国々において最も広範囲に拡がった一般的なタイプである。また、遺伝子型Ｇは、東アフリカに限定的なタイプであり、遺伝子型Ｆは、新世界に局地的なタイプである。このうち、最近になって加えられた遺伝子型Ｅについては、いまだ疫学については記述されていない。
【０００４】
HBV遺伝子型は、宿主における病気の兆候について影響を与えるかもしれない。ヨーロッパにおいては、遺伝子型Ｄに比べて遺伝子型Aは、よりいっそう慢性の肝臓病を発症しやすい7。また、アジアにおいては、遺伝子型Ｂに比べて遺伝子型Ｃは、病気を誘発する能力が高いとされている8,9。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、遺伝子型の相違は、慢性Ｂ型肝炎の重症度に対して影響を与える唯一のウイルス由来の因子ではないようである。というのは、同じ遺伝子型のHBVに感染している人が、必ずしも臨床的に同じような症状に至るわけではないからである。このような臨床像の多様性は、アジアの異なった地域でのHBV/B（本明細書中において、「ＨＢＶの遺伝子型Ｘ」（Ｘは、A〜Ｇ）と「HBV/Ｘ」とは、同じ意味を示すものとして使用する。）に感染した人々について最も顕著である。例えば、台湾においては、HBV/Bは若年齢者においても肝細胞ガンを発生させて重篤な肝臓疾患を引き起こす一方、日本においては、対照的に、そのような事象は報告されていない9,10。
【０００６】
また、遺伝子型が異なるHBVゲノムの間で組換えが起こることが知られている。このような組換えは、典型的には、遺伝子型Ｂと遺伝子型Ｃとの間で、同様に遺伝子型Ａと遺伝子型Ｄとの間においても発生すると報告されている11,12。しかし、異なるHBVゲノム間の遺伝子組換えと、疾患等との関連については、詳細な研究がなされているとは言い難く、未だに未知の知見が残されているかも知れなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規なHBV/Bを提供すると共に、その検出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
本発明者は、７０例のHBV/B遺伝子型の全遺伝子について塩基配列を決定し（この明細書中には、そのうち３８例分が含まれている）、それらの塩基配列について系統的に分析した。その結果、HBV/Cとの間の組換えは、プレＣ部位とＣ遺伝子とにおいて特徴的であることが判明した。また、従来には、HBV/Bとして一つのグループに分類されていたウイルス株が、B/C組換えを持つタイプである「Ba」（aは、Asiaを意味する。）と、B/C組換えを持たないタイプである「Bj」（ｊは、Japanを意味する。）とに細分類できることを解明し、本質的には本発明を完成するに至った。
【０００８】
HBV/BaとHBV/Bjとの間の具体的な塩基の相違について、「Baの塩基／塩基位置／Bjの塩基」の順で記述すると、C46T, A499C, C1020T, C1029T, T1504C, T1505C, G1632C, G1799C, A1838G, T1975G, T1978G, C1993A, C1996T, T2003G, G2029A, G2035T, T2056C, G2059A, T2089G, G2092A, A2100C, C2107T, G2128A, T2150C, G2160A, C2161T, C2167T, G2171A, A2188G, A2194G, C2198T, A2293C, A2354C, T2443C, A2465T, G2504A, T2511G, G2512T, C2657T であった。なお、上記の相違は、これ以外に認められた塩基の相違のうち、BaとBjとのほとんど全てについて（９０％以上）相違が認められたものである。さらに詳細な塩基の比較については、図５〜図１０に示す。基本的には、上記のいずれの塩基の相違に基づいても、HVB/BaとHVB/Bjとを区別することができる。
【０００９】
なお、特定位置の塩基の相違を確認するためには、当業者にとって既知の方法、例えばサザンブロット法、ＦＩＳＨ法、ＲＩＧＳ法、ＣＧＨ法、ＬＯＨ法、直接シークエンス法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＭＡＳＡ法、ＡＳＯプローブ法、ＰＣＲ法、ＯＰＡ法、RLPM法等を使用することにより、遺伝子検出を行うことができる。
【００１０】
本発明者は、このうち1838位の相違を利用した制限断片長多型法（restriction length polymorphism (RLPM)）を開発した。すなわち、1838位の塩基は、BaタイプではAであり、BjタイプではGである。このため、後述するように、1838位を含む塩基配列をPCR法によって増幅した後に、所定の制限酵素を利用することで、より確実に両タイプの相違を区別できるものである。こうして、HBV/BとHBV/Cとの間で遺伝子組換えが起こっているか否かのマーカとして、1838位置の多型を利用して制限断片長多型法を開発し、B/C組換えタイプ（本明細書中において、「HBV/BとHBV/Cとの間で組換えが起こっているウイルス」と「B/C組換えタイプ」と称することがある。）又はB/C非組換えタイプを区別することが可能となった。
【００１１】
本発明者の方法の一つは、1834位をCからAに変更したセンスプライマー（例えば、HBVBJ-F ：配列番号５：5’-ATG CAA CTT TTT CAC CTC TGA CTA-3’）を用いる。このセンスプライマーは、核酸位置1814-1837の塩基配列において、1834位をAに変更したものである。他方、1838位を跨いで逆方向から伸長するアンチセンスプライマー（例えば、BJA-RV:配列番号４：5’-TTC TTT ATA MGG GTC AAT GTC CAT G-3’[核酸位置 1924-1901に対応させたもの])を用いる。両プライマーを用いたPCR法によって合成されるDNAプロダクトは、1834位にAを備え、1838位には、A（Baタイプ）またはG（Bjタイプ）を備えている。このため、1838位の塩基の相違によって、Baタイプを鋳型として合成されたDNAプロダクトには、塩基配列ACTAATが、またBjタイプを鋳型として合成されたDNAプロダクトには、塩基配列ACTAGTが含まれている。このうち、ACTAGT(Bjから得られたDNAプロダクト)は、制限酵素Spel1の認識部位である。このため、Bjタイプを鋳型として合成されたDNAプロダクトのみが制限酵素Spel1によって分解されるので、鋳型のタイプを区別できる。
【００１２】
なお、PCRの増幅度合いを増加させたり、アガロースゲル電気泳動でのDNAフラグメント長の区別を明確化するために、２回のPCRを行ってもよい。その場合には、例えば、HBVBJ-F とHBAS - 4V（配列番号３：5’-ATA GGG GCA TTT GGT GGT TCT-3’）とを用いて１回目のPCR法を行った後に、そのPCRプロダクトに対して２回目のPCR法を行う。２回目のPCRには、例えば、センスプライマーHBVBJ-FとアンチセンスプライマーBJA-RVとを用いることができる。なお、PCR用のプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）については、上記の塩基配列の他に様々な位置、及び長さを備えたものを使用することが可能であることは、当業者ならば容易に理解できるであろう。
【００１３】
また、他の制限断片長多型法としては、1837位のAの代わりにGを3’末端として備えたセンスプライマー（例えば、BJA - FV：配列番号２：5’-ATG CAA CTT TTT CAC CTC TGC CTG-3’）を用いる。このセンスプライマーは、核酸位置 1814-1836の塩基配列に、1837位にAに代えてGを備えたものである。他方、1838位を跨いで逆方向から伸長するアンチセンスプライマー（例えば、HBAS - 4V）を用いる。両プライマーを用いたPCR法によって合成されるDNAプロダクトは、1837位にGを備え、1838位には、A（Baタイプ）またはG（Bjタイプ）を備えている。このため、1838位の塩基の相違によって、Baタイプを鋳型として合成されたDNAプロダクトには、塩基配列TGATCAが、またBjタイプを鋳型として合成されたDNAプロダクトには、塩基配列CCTGGが含まれている。このうち、TGATCAは、制限酵素Bcl1の認識部位であり、一方CCTGGは、制限酵素BstN1の認識部位である。このため、BaタイプまたはBjタイプを鋳型として合成されたDNAプロダクトを制限酵素Bcl1またはBstN1によって分解することにより、鋳型のタイプが区別できる。
【００１４】
上記の方法は、BaタイプまたはBjタイプを鋳型として合成されるDNAプロダクトについて、両者のいずれか一方を切断する２種類の制限酵素を用いている。このため、両タイプを区別するために、誤りが少なく、より確実な方法であると言える。
【００１５】
上記の二つの方法は、1838位の相違に基づいて、BaタイプまたはBjタイプを区別する方法であるが、本発明者がこの明細書によって開示する塩基配列を用いれば、別の部位を用いて同様の方法を組み立てることは、当業者ならば容易に可能であろう。例えば、2035位を含む塩基配列には、BaタイプのみにTCCGGAという回文構造があり、この塩基配列は、例えば制限酵素BspE1によって認識される。なお、Bjタイプでは、TCCTGAとなるので、上記の制限酵素BspE1によっては認識されない。このため、制限酵素BspE1の酵素処理を行い、作成されたDNAフラグメントの大きさを確認することにより、鋳型となったHBV/Bタイプを区別することができる。
【００１６】
また、本発明者は、B/C組換えがウイルス学上及び臨床上にどんな影響を与えるかを評価するために、上述の方法を用いて、アジア各国におけるHBV/Bキャリアのウイルスを個々に判別するのに応用した。
【００１８】
第１の発明は、HBV/Bに属するB型肝炎ウイルスにおいて、C46T, A499C, C1029T, T1505C, G1799C, A1838G, T1975G,T1978G, C1993A, C1996T, T2003G, G2029A, G2035T, T2056C, G2059A, T2089G, G2092A,A2100C, C2107T, G2128A, G2160A, C2161T, C2167T, G2171A, A2188G, A2194G, C2198T,A2293C, A2354C, T2443C, T2511G, G2512T, C2657Tのうち、少なくともいずれか一つの位置の相違に基づき、数値の前に記載された塩基である場合には、HBV/BとHBV/Cとの間で遺伝子組換えが起こっているタイプであるB/C組換えを持ち、日本を除くアジアに多く認められ、若年齢者においても肝細胞ガンを発生させて重篤な肝臓疾患を引き起こす危険性がより大きいBaタイプであると区別し、数値の後に記載された塩基である場合には、前記B/C組換えを持たず、日本に多く認められ、危険性がより小さいBjタイプであると区別することを特徴とする遺伝子検出方法である。
第２の発明は、HBV/Bに属するB型肝炎ウイルスにおいて、 CA1020T, TG1504C, GTA1632C, TG2150C, AW2465T, GK2504Aのうち、少なくともいずれか一つの位置の相違に基づき、数値の前に記載された塩基である場合には、HBV/BとHBV/Cとの間で遺伝子組換えが起こっているタイプであるB/C組換えを持ち、日本を除くアジアに多く認められ、若年齢者においても肝細胞ガンを発生させて重篤な肝臓疾患を引き起こす危険性がより大きいBaタイプであると区別し、数値の後に記載された塩基である場合には、前記B/C組換えを持たず、日本に多く認められ、危険性がより小さいBjタイプであると区別することを特徴とする遺伝子検出方法である。
【００１９】
なお、Ｂ型肝炎ウイルスのタイプ（従来のAタイプ〜Ｇタイプ）を判定するためには、従来の血清学的な方法（例えば、抗原抗体反応を利用したエライザ法）の他に、分子生物学的な方法（例えば、DNAシークエンス）を用いることもできる。
【００２０】
第３の発明は、上記発明において、制限断片長多型法を用いてBaタイプ及びBjタイプを区別する遺伝子検出方法である。
第４の発明は、上記発明において、A1838Gの相違に基づいて、Baタイプ及びBjタイプを区別する遺伝子検出方法である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の一実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００２２】
＜実施例１＞HBV/B単離株の完全な塩基配列の決定
各国のキャリアから取り出された３８種類（中国７例、香港３例、日本１９例、台湾４例、タイ３例、ベトナム２例）のHBV/B単離株の完全な塩基配列は、既報の方法13によって決定した。簡単に説明すると、３,２００塩基対と４６２塩基対との二種類のオーバーラップするフラグメントを、ネステッドプライマー（nested primers）を用いたPCR法によって、それぞれ増幅した。ＤＮＡの増幅には、96穴プレートを用い、GeneAMP9600（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Calif.）によって行った。PCR反応物は、3.0%アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外光下で観察した。PCR反応におけるコンタミネーションを回避するために、PCR法を実施する際にネガティブコントロール血清を置いて同様の増幅反応を行った。１２個のオーバーラップするHBV DNAフラグメントをシークエンスキット（Taq Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kit）と蛍光310DNAシークエンサ（Applied Biosystems, Foster City, Calif.）を用いて、ダイデオキシ法によって直接にシークエンスした。
なお、この明細書中で報告された塩基配列データは、DDBJ / EMBL / GenBanK データベースに登録される予定である。
【００２３】
＜実施例２＞ソフトウエアによる解析
HBV塩基配列はクラスターＷソフトウエアによって並べられ21、そのアラインメントは視覚による検査によって確認した。遺伝学的距離は、６個のパラメータを用いる方法（the six-parameter method）によって計算した。また、系統樹は近隣接合法（the neighbor-joining method）14を使って組み立てた。系統樹の信頼性を確認するために、自己サンプリングと再構築とを、国立遺伝研究所（日本国、三島）の ODEN プログラムによって１０００回に渡って実行した15
組換えの有無に関する解析には、ロバートソンらによる方法22に従い、SimPlotプログラムとBootscanning23を用いた。系統学的に有用な部位を決めるために四つのシークエンス（B/C組換えタイプ(Ba)から一つ、組換えの元となったタイプ(Bj及びC)からそれぞれ代表的なものを一つずつ、全く別のタイプ(F)から一つ）を用いた。その結果、２種類のシークエンスは一種類のタイプに属し、残りの２種類のシークエンスは別の種類のタイプに属することが分かった。また、フィッシャーの正規検定を用いてP値を計算した。
【００２４】
＜実施例３−１＞HBV/Cとの組換えを有するHBV/B単離株の検出のための制限断片長多型方法の開発（１）
HBV/Cとの組換えを有するHBV/B単離株では1838位がA（アデニン）であるのに対して、組換えを有さないHBV/B単離株ではG（グアニン）であることを利用して、両者を区別するために制限断片長多型方法を開発した。核酸の抽出は、-80℃に保存しておいた血清100μlから、DNA抽出キット(Genome Science, Tokyo, Japan)を用いて行った。
【００２５】
抽出された核酸は、セミネステッドプライマー（seminested primers）を用いたPCR法による増幅に供した。最初のPCRには、センスプライマー（HBVBJ-F ：配列番号５：5’-ATG CAA CTT TTT CAC CTC TGA CTA-3’ [核酸位置 1814-1837 において、制限酵素Spel1の認識部位の有無により、B/C組換えの有無を確認するために、1834位をCからAに変更したもの]）とアンチセンスプライマー（HBAS - 4V：配列番号３：5’-ATA GGG GCA TTT GGT GGT TCT-3’ [核酸位置 2316-2297に対応させたもの]）とを用いた。また、二回目のPCR は、センスプライマーHBVBJ-Fとアンチセンスプライマー(BJA-RV:配列番号４：5’-TTC TTT ATA MGG GTC AAT GTC CAT G-3’[核酸位置 1924-1901に対応させたもの]) とを用いた。１１０塩基対（bp）の増幅プロダクトの一部（5μg）を、10UのSpel1を用いて37℃の条件で２時間、分解した。それから分解物を3.0%アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色した後、紫外線下で観察した。B/C組換えを有さないHBV/B単離株から増幅された110塩基対のプロダクトは、Spel1の切断によって89bpのラグメントを生じるが、B/C組換えを有するHBV/B単離株からの増幅プロダクトはSpel1によって切断されないのでゲル上で分離された（図１３を参照）。
【００２６】
＜実施例３−２＞HBV/Cとの組換えを有するHBV/B単離株の検出のための制限断片長多型方法の開発（２）
制限断片長多型方法には、様々な方法が考えられる。上記（１）とは異なる制限酵素を用いる方法として、以下のような方法を開発した。なお、核酸の抽出方法については、上記（１）の方法と同様であるため、記載を省略する。
抽出された核酸は、セミネステッドプライマー（seminested primers）を用いたPCR法による増幅に供した。最初のPCRには、センスプライマー（BJA - FV ：配列番号２：5’-ATG CAA CTT TTT CAC CTC TGC CTG-3’ [核酸位置 1814-1837 において、制限酵素BstN1とBcl1との認識部位を作成するためにGを挿入したもの]）とアンチセンスプライマー（HBAS - 4V：配列番号３：5’-ATA GGG GCA TTT GGT GGT TCT-3’ [核酸位置 2316-2297に対応させたもの]）とを用い、二回目のPCR は、センスプライマーBJA-FV（配列番号２）とアンチセンスプライマー(BJA-RV:配列番号４：5’-TTC TTT ATA MGG GTC AAT GTC CAT G-3’[核酸位置 1924-1901に対応させたもの]) とを用いた。
１１０塩基対（bp）の増幅プロダクトの一部（5μg）を、10UのBstN1を用いて60℃、または10UのBcl1を用いて50℃の条件で２時間、分解した。それから分解物を3.0%アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色した後、紫外線下で観察した。B/C組換えを有するHBV/B単離株から増幅された110塩基対のプロダクトは、Bcl1の切断によって87bpのラグメントを生じるが、B/C組換えを有しないHBV/B単離株からの増幅プロダクトはBcl1によって切断されないのでゲル上で分離された（データは示さない）。
また、組換えを有しないHBV/B単離株からの増幅物のみが、BstN1によって分解されて88-bpのフラグメントを生じることも確認された。
【００２７】
＜実施例４＞HBV/Bを含んでいる血清サンプル
アジア各国とアメリカ合衆国におけるキャリアからの２７４例の血清について、プレS2領域プロダクト16,17に対するタイプ毎に異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いたエライザ（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)）キット(HBV GENOTYPE EIA, Institute of Immunology Co., Ltd., Tokyo, Japan)を利用して、HBV遺伝子型を決定した。このpreS2 血清タイプによってHBV/Bが陽性とされた血清サンプルについて、Ｓ遺伝子プロダクトを用いた制限断片長多型法によって、遺伝子型Bに関する検討を行った18。
【００２８】
＜実施例５＞プレC領域およびコアプロモータにおける突然変異の決定
本研究によって、1896位がA（アデニン）であるプレC領域の突然変異（A1896：前述の記載方法とは、異なることに注意するべきである。すなわち、前述の記載方法では、BaとBjとの塩基配列の相違を明らかにするために、「Baタイプの塩基／配列位置／Bjタイプの塩基」と記述したが、単に「塩基／配列位置」と記述することがある。）と、1762位がT（チミン）でありかつ1764位がAであるコアプロモータ領域の突然変異（ T1762 / A1762 ）とが、70例のHBV/B遺伝子型の全塩基配列から確認された（なお、７０例のうち３８例については、本発明者らによってシークエンスされたものであり、残りの３２例については全塩基配列をDNA DATA BANK から抽出されたものである。）。また、74例のHBV/C遺伝子型の全塩基配列は、国際的なＤＮＡデータベース（ DDBJ / EMBL / GenBank ）で検索した。
【００２９】
＜実施例６＞Ｂ/Ｃ組換えの有無によって、HBV/B感染者における臨床上及びウイルス学上の相違があるか否かに関するケーススタディ
90例のHBV/Bキャリアについて、臨床上および血清学上のデータを利用することができた。これら90例のうち46例は、B/C組換えを有するウイルスであった。組換えを有する事例については、その事例の内部で比較され、さらに１９９６年から２００１年の間に名古屋市大学病院の第２内科で診察された遺伝子型Ｃを持つ４７名のHBVキャリアに対しても比較された。
【００３０】
ケーススタディは、ＨＢＶキャリアについて、年齢・性別・アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）値、およびフォローアップ期間中に正常ALT値を示した症状がない保因者と、慢性肝炎・肝硬変・肝細胞ガンのような慢性的な肝疾患が繰り返すことで ALT値を高めた患者（＞40U/L）との間で臨床段階を合わせた状態で行われた。肝臓疾患の診断は、肝機能の関する生化学的検査、超音波診断、コンピュータ断層撮影、および必要とされる場合には小針を用いたバイオプシーによる組織検査によって行われた。彼らは、Ｃ型肝炎ウイルスあるいはヒト免疫不全ウイルスタイプ１に対する感染がないことが確認されていた。
【００３１】
この研究プロトコルについては、１９７５年のヘルシンキ公開文書（the 1975 Declaration in Helsinki）に従って、本研究機関の倫理委員会で承認され、各HBVキャリアからは書面におけるインフォームドコンセントが得られている。
【００３２】
＜実施例７＞統計上の分析
統計上の相違は、それぞれのデータの性格にあわせて適当に、マン・ホイットニーのノンパラメトリックテスト、フィッシャーの正規分布テスト（Fisher's exact probability test）、およびスチューデントのｔ検定によって評価した。相違が、Ｐ値 ＜ ０.０５の場合には、有意であると判断した。
【００３３】
＜結果１＞HBV/Cとの組換えの有無によるHBV/Bの単離
図１には、７０例のHBV/B単離株の全塩基配列と、その他の６種類の遺伝子型（Ａおよび、C〜Ｇ）のHBV単離株の代表的な配列とを比較した系統樹を示した。HBV/Bの塩基配列については、３２例についてはDDBJ / EMBL / GenBank データベースから検索され、残りの３８例についてはこの研究によって決定されたものである。
【００３４】
７０例全てのHBV/B単離株は、全てアジア人キャリアから得られたものであり、それらは各キャリアが出身した地区によって影響を受けている４つの枝に分類された。このうち日本人由来の２９例のHBV/B単離株については、顕著に一つの枝に分類された。図２には、その結果を示した。
【００３５】
HBV/B単離株は、HBV/C単離株を含むクラスターとして、二つのカテゴリーに分類された。このうち、日本人由来の２９の HBV/B単離株の全てはHBV/Cから独立しており、HBV/Cとは別の枝にクラスターを構成した。このクラスターを「Ｂｊ」と言う（後に詳述する）。
これと対照的に、日本とは別のアジア各国から得られた残りの４１例のHBV/B単離株については、HBV/C単離株が属するもう一方の別の枝にクラスターを構成した。このクラスターを「Ｂａ」と言う（後に詳述する）。また、図５〜図１０には、BaとBjとにおける代表的な全塩基配列をそれぞれ５例ずつ示した。
【００３６】
B/Cの組換えの有無に基づいて、上記２種類のうち代表的なHBV/B単離株と遺伝子型Cとの全遺伝子についての遺伝的距離を比較したものを図３に示した。遺伝子型B/C間の組換えは、遺伝子型HBV/Ba単離株において、プレCとコア領域に限定されていた。プレC/C領域においてHBV/Cとの組換えを有するHBV/B単離株と、そのような組換えを有さないHBV/B単離株との間には、塩基多型が認められた。
【００３７】
塩基多型のうちの一例として、B/C組換えを有する４１例の HBV/Bタイプの全ては、1838位にA（アデニン）を持っていた。一方、B/C組換えを有さない29例のHBV/B単離株については、1838位はG（グアニン）であった。この相違に基づいて、HBV/B単離株についてB/C間の組換えを持つものと持たないものとを区別するための制限断片長多型法を開発した（実施例３−１、３−２を参照）。
【００３８】
図3(a)は、標準としたHBV/C単離株(アクセションナンバー：AB014378)との間におけるBj（１０例分）、及びBa（１０例分）間の遺伝的距離を示したものである。BjとBaとは、PreC及びコア(Core)遺伝子領域を除いて、ほぼ同等の距離を示している。PreC/Core領域では、Bjタイプに比べて、Baタイプの方が、よりHBV/Cタイプに近くなっている。組換えの区切りを正確に確認するために、上述のようにSimPlotプログラムとBootscanning解析を行った23。図3(b)には、４例のHBVゲノム（Ba, Bj, C, F）を用いて、B/C組換えの区切り位置を解析した結果を示した。B/C組換えの区切りは、位置情報とカイ二乗最大化法15とによって、およそ1740位と2443位との間であると推定された。４１例のBaタイプに対して、上記の方法によって組換えの区切りを確認したところ、5’側は1740位〜1838位であり、3’側は2443位〜2485位であることが分かった（図11を参照）。Baタイプにおいて、Ｃタイプとの組換えが起こった領域は、PreC領域とコア遺伝子のほとんどをカバーしており、605〜745塩基対に及んでいる。
表１は、この試験において検知されたBj単離株の１８例とBa単離株の２０例とについて、PreC領域とコア遺伝子中における核酸とアミノ酸との平均的なペアをなしたホモロジーを百分率で示したものである。遺伝子領域においては、HBV/Bjタイプは、Bjタイプを除いて、Ａ〜Gタイプのいずれについても、核酸及びアミノ酸配列において、良好なホモロジーを示さなかった。１８例のHBV/Bjタイプは、そのタイプ内においては、核酸配列で96.5％のホモロジーを示し、アミノ酸配列で96.6%のホモロジーを示した。これと対照的に、２０例のHBV/Baタイプは、そのタイプ内（核酸レベルで96.9%、アミノ酸レベルで98.9%のホモロジー）に加えて、Cタイプとの間でも良好なホモロジー（核酸レベルで96.9%、アミノ酸レベルで97.0%のホモロジー）を示した。一方、HBV/Baタイプ（２０例分）とHBV/Bjタイプ（１８例分）とでは、核酸レベルで91.9%、アミノ酸レベルで92.9%のホモロジーしか示さなかった。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
＜結果２＞Ｂ/Ｃの組換えの有無による HBV/Bキャリア個人の比較
Cタイプとの組換えを有するHBV/B単離株の41例全例は1838位がAである一方、組換えを有さないHBV/B単離株の29例全例はGであった（図１２に一例を示した。）。この相違に基づいて、B/Cの組換えの有無を確認するための制限断片長多型法を上述のように開発した。
274例のHBV/Bキャリア（アジア各国（中国、２０；香港、４５；日本、９７；台湾、３２；タイ、３０；ベトナム、３０）と合衆国（全てアジア民族、２０））について、B/C間の組換えがどの程度の頻度で起こっているかを上述した制限断片長多型法によって検出した。結果を図１４に示した。注目すべきことに、日本以外の国における１７７例の HBV/Bキャリアは、全てＢ/Ｃ組換えを持っていた。
【００４１】
また、日本人由来の９７例の HBV/Bキャリアについては、わずか７例（７％）のみがB/C組換えタイプに感染しており、残りの大多数のキャリアは、非組換え型ウイルスに感染していた。このように、B/C組換えの地理的分布が明確に区別できることから、我々は本明細書中において、HBV/B単離株においてB/C組換えを持つものを「Ba」（aは、アジアを意味する。）と、B/C組換えを持たないものを「Bj」（ｊは、日本を意味する。）と称することにした。
1896位がAであって（A1896）、HBe抗原がマイナスの表現型であるプレＣ変異体について、B/C組換えを有するか否かをHBV/B単離株について調査した結果を図４に示した。A1896は、B/C組換えを有するHBV/B単離株（遺伝子型Ba）においては37%（15/41）に確認された。一方、B/C組換えを有さないHBV/B単離株（遺伝子型Bj）では、A1896は72%（21/29）に確認され、両者には有意差が見られた。
【００４２】
また、遺伝子型Cに関するHBV単離株では、A1896は26%（19/74）に見られた。これは、B/C組換えを有するHBV/Bタイプ（Ba）と同等の率であるが、B/C組換えを有さないHBV/Bタイプ（Bj）に比べて有意に少なかった。
【００４３】
コアプロモータにおける二重変異（T1762/A1762）の発生率は、B/C組換えを有するHBV/B(Ba)では１１％（4/41）であり、B/C組換えを有さないHBV/B（Bj）では10%（3/29）であった。両者には、有意差は見られなかった。また、T1762/A1762は、HBV/Cタイプにおいて53%（37/74）に認められ、この発生率はBaまたはBjのいずれのタイプに比べても有意に高かった。
ケースコントロールスタディにおいて、HBV/Bタイプのキャリアのうち、B/C組換えを有するものと有さないものとの間で、臨床上およびウイルス学上の特徴を比較したものを表２に示した。HBV/Ｃに感染しているキャリアをコントロールとした。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
HBe抗原の保有率は、HBV/Bキャリアにおいて、B/C組換えの有無（ＢｊまたはBa）によって相違が見られなかったものの、HBV/Cキャリアに比べると有意に低かった。しかしながら、肝疾患を有するHBV/Bキャリアについては、HBe抗原の保有率は、B/C組換えを有するもの（Ba）は、B/C組換えを有さないもの(Bj)に比べて有意に高かった（55%対33%、P<0.05）。また、BaタイプにおけるHBe抗原の保有率（55%）は、HBV/Cキャリアにおける保有率（60%）と同等であった。B/C組換えを有するHBV/B（Ba）のHBe抗原陽性キャリアの年齢は、B/C組換えを有さないHBV/B（Bj）のHBe抗原陽性キャリアの年齢よりも有意に高齢であった（35.2 + 14.8歳対27.9 + 6.9歳、 P < 0.05）。また、Ｂａタイプの年齢は、HBe抗原陽性のHBV/Cキャリアの年齢(44.4 + 12.5歳)と同等であった。
【００４６】
＜考察＞
本研究の最も顕著な結果は、アジアにおいて一般的なHBV単離株である遺伝子型Bが、二つのサブタイプに分割できたことである。それらサブタイプのうちの一方は、遺伝子型Bと他のタイプとの間で組換えを有しており(HBV/Ba)、他方は、そのような組換えを有していなかった（HBV/Bj）。系統樹解析に依れば、B/Cの組換えは、プレコア領域とC遺伝子とに限定されている（図２を参照）。
【００４７】
遺伝子型Cとの間で組換えを持つHBV/B単離株と、そのような組換えを持たないものとでは、少なくとも1838位の塩基がGかAかの相違が見られた。本発明者は、この相違に基づいて、制限断片長多型法を用いて、HBV/B単離株の区別をすることができた。
【００４８】
驚いたことには、遺伝子型Cとの組換えを持たない「純粋な」遺伝子型BのHBV単離株は日本に限って確認され、しかも97例のHBV/Bキャリアのうち90%が、「純粋な」遺伝子型Bであった。これとは対照的に、中国・香港・台湾・タイ・ベトナムを含むアジア各国由来の１５７例の全てのHBV/B単離株は、B/C組換えを持っていた。また、合衆国由来の２０例のHBV/Bキャリアは、アジア民族であり、彼らはすべてB/C組換えタイプであり、彼らのいずれも日本を起源とするウイルスタイプではなかった。全体的に見ると、遺伝子型Cとの組換えを持たない本来の遺伝子型Bは日本に固有のものであり、他方、遺伝子型Bと遺伝子型Cとの組換えタイプはアジア各国に偏在するようである。これらの排他的な地理的な分布に依れば、遺伝子型Bj（「j」はJapanを意味する）は遺伝子型Cとの組換えを持たないHBV/B単離株であり、遺伝子型Ba（「a」はAsiaを意味する）は遺伝子型Cとの組換えを持つHBV/B単離株であると考えられる。
【００４９】
遺伝子型Bと遺伝子型Cとの間でどのようにして組換えが起こり、その組換えタイプが何故アジア全体の国に均等に分布しないのかについては明確ではない。現在では一般的となったＢ型肝炎ワクチンの接種が行われる前に、他のアジア各国ではHBVキャリアの割合が20%に達する程に地域特有のものであったという事態に対し、日本では１９８６年から受動的および能動的免疫を組み合わせることによって、出産前後のHBVの感染は2%まで抑制されていた。日本に比べてHBVの感染率が高いアジア各国では、HBVの遺伝子型Ｂと遺伝子型Ｃとが共に感染する事態が加速していたのかも知れないし、そこでは組換えタイプのHBV/Bが流行していたのかも知れない。
【００５０】
遺伝子型Cとの組換えを持っている HBV/Bが、複製に有利に働くのか、或いは過去にHBV/BとHBV/Cの両ウイルスに感染したキャリアにおいて、両タイプのウイルスが単独で持続感染するよりも持続感染を継続する点で有利に働くのか否かに関しては明確ではない。しかしながら、B/C組換えを持つHBV/Bが本来の遺伝子型BのHBVを凌いで、HBV/BとHBV/Cとの両ウイルスに二重感染した個人の内部で本来のHBV/Bを引き継いだのは疑いない。
【００５１】
アジアでは、遺伝子型Bと遺伝子型Cとの二つのタイプが、ほぼ全てのHBV感染を占めており、これら二つの遺伝子型が、ひどい肝臓病を誘発する能力において相違があるか否かを比較した。HBV/Cへの感染は、HBV/Bへの感染に比べて、より重篤な肝臓疾患を誘発するという証拠が示されてきている8,19。そのために、遺伝子型Cとの組換えによって、本来のHBV/Bに比べると、より疾患を誘発する能力が高いものとなるという可能性があるだろう。HBe抗原から対応する免疫抗体（抗HBe抗体）へのセロコンバージョンは、HBV/CキャリアよりもHBV/Bキャリアにおいて起こりやすいと言うことは、両ウイルスに罹ったときの肝臓疾患の重篤さの相違に関係するものである8。
【００５２】
上記の事実に関連しそうなものとして、プレC領域においてストップを起こす変異（A1896）は、B/C間の組換えを持たないHBV/B（遺伝子型Bj）に比べて、B/C組換えを持つHBV/B（遺伝子型Ba）に感染した人たちにおいて、有意に少ない率でしか検出されなかった。更に、ケースコントロールスタディにおいては、HBe抗原は、HBV/BjキャリアよりもHBV/Baキャリアにおいて、有意に多く確認された。HBV/BaキャリアにおけるHBe抗原の頻度は、HBV/Cキャリアにおける人口統計および臨床的パラメータに匹敵するものであった。
【００５３】
Ｃ遺伝子の産物に基づいて表出された細胞障害性Ｔ細胞に対するエピトープが、ホスト（キャリア）の免疫系を誘導するように働くことで、細胞表面にそのようなエピトープを持つ肝細胞が破壊され、肝臓に炎症が発生する20。遺伝子型Cとの組換えがHBV/BのプレC領域とC遺伝子とに限定されている限りにおいて、細胞障害性Ｔ細胞に対する推定上のエピトープが、B/C組換えを持つHBV/Ba単離株において予測されている高度の疾患誘発能力のために、HBV/C単離株によってよりいっそう効率的に発現されるのであろう。メカニズムが何であるとしても、日本におけるHBV/B系統よりも、台湾におけるHBV/B系統がより高い疾患誘発能力を示すという研究10は、台湾の遺伝子型Bが遺伝子型Cとの組換えを持つものであることに帰することができそうである。
【００５４】
HBV/Bは、台湾において若年層のキャリアに肝細胞ガンを起こす関連が深いものであるとして確立された10。別の遺伝子型を持つHBVの共感染は、考えられている以上に一般的なことであるということは、ますます明白になって来つつある11,12。HBVの遺伝子型Ａと遺伝子型Ｄとは、ヨーロッパで流行していることから、そこでは両タイプの共感染が発生する傾向がある。また、アジアでは、遺伝子型Ｂと遺伝子型Ｃとの共感染が発生する傾向がある。
【００５５】
米国とヨーロッパにおいては遺伝子型Ａと遺伝子型ＤとのHBV系統が流行していることから、それらの両ウイルスの共感染が、宿主の臨床上の経過及びHBVのウイルス学上に相違を与えるか否かを調査することは価値があるだろう。それまでは、本研究の結果が、遺伝子型Ｂと遺伝子型Ｃとが頻繁であるアジア各国に拡げられるように希望する。
【００５６】
遺伝子型B/C間の組換えを有するか否かによってBaとBjとを容易に見分ける方法は、従来の血清学的方法によってHBV遺伝子型を決定する方法16,17と組み合わせることにより、HBV/Bの異なる遺伝子型が感染して組換えを起こした場合に、臨床上の妥当な評価を容易にすることができるだろう。
【００５７】
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【００５８】
【配列表】
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0004330833.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】  遺伝子型Bを持つ７０例のHBV単離株の全塩基配列と、遺伝子型A、C,D,E,F及びGを持つそれぞれ１５例の単離株の全塩基配列に基づいて構築された系統樹である。自動的に得られた計算値は、各主枝に沿って示されている。水平方向のバーの長さは、各部位毎の塩基置換の割合を示す。アクセションナンバー（Accession numbers）は、スラッシュ（／）の後ろに表示されており、DNAデータベースに保存されている塩基配列のものである。太字で示された単離株は、本研究においてシークエンスされたものである。
【図２】  ７０例のHBV/B単離株と、他の遺伝子型（A, C, D, E, F, G）を持つ単離株とにおいて、プレＣ／Ｃ遺伝子の塩基配列に基づいて構築された系統樹である。アクセションナンバー（Accession numbers）は、スラッシュ（／）の後ろに表示されており、DNAデータベースに保存されている塩基配列のものである。太字で示された単離株は、本研究においてシークエンスされたものである。
【図３】  (a)標準的なHBV/C単離株と、Bj単離株またはBa単離株との遺伝的距離を比較したものである。平均的遺伝子距離は、HBV/C(アクセションナンバー:D23684)との比較で、B/C組換えを持たない遺伝子型Bj（１０例分）と、遺伝子型Ba（１０例分：Thailand 1, Thailand 2, China 1, China 2, Taiwan 1, Taiwan 2, Hong Kong1, Hong Kong2, Vietnam 1及びVietnam 2）との間で全遺伝子に渡ってプロットされている。平均的遺伝子距離は、SimPlotプログラム23を用いて、ウインドウサイズ200bp、ステップサイズ50bpの条件で計算されたものである。
(b)  異なるHBV遺伝子型間における組換えの有無をロバートソンらによる方法22に従い、SimPlotプログラムとBootscanning23を用いて解析した結果である。三つの代表的なHBV遺伝子型（Bjタイプ（Japan9）、Cタイプ（組換え相手のタイプ：アクセションナンバーD23684）、及びFタイプ（組換えに関与していないタイプ：アクセションナンバーX75658）のそれぞれをBaタイプ（Taiwan1）の全遺伝子に渡って、ウインドウサイズ200bp、ステップサイズ50bpの条件で比較した（ギャップ部分を除き、１００回の自動繰り返し、及び近隣接合木解析(neighbour-joining tree analysis)に依った。）。また、グラフ中の縦方向の点線は組換えの区切り点であり、カイ二乗最大化法（核酸位置は、下端部分に矢印で示した。1740位と2443位である。）によって、系統発生学的な情報を考慮して決定した。トポロジー[I]または[II]によって分配された位置情報の数値は、グラフ(b)の下方に示した。
【図４】  遺伝子型Cとの組換えを有するHBV単離株(Ba)と組換えを有さないHBV単離株（Bj）とについて、プレＣ領域(A1896)及びコアプロモータ(T1762/A1764)中の変異の程度をHBV/C単離株と比較した図面である。
【図５】  BaとBjとにおける全塩基配列の比較図（１）である。それぞれのタイプで、代表的なものを５例ずつ掲載した（図６〜図１０において同様である。）。
【図６】  BaとBjとにおける全塩基配列の比較図（２）である。
【図７】  BaとBjとにおける全塩基配列の比較図（３）である。
【図８】  BaとBjとにおける全塩基配列の比較図（４）である。
【図９】  BaとBjとにおける全塩基配列の比較図（５）である。
【図１０】  BaとBjとにおける全塩基配列の比較図（６）である。
【図１１】  遺伝子型C、Ba（組換えを有するもの）、及びBj（組換えを有さないもの）の代表的な単離株について、HBV/BとCとの組換えが起こっている1701位〜2500位の核酸配列を示した図である。
【図１２】  DDBJ/EMBL/GenBankから得られたHBV/B単離株の36例について、PreC領域の核酸配列を比較した図である。Cタイプとの組換えを有するもの(Ba)では1838位はAであり、一方Cタイプとの組換えを有さないもの(Bj)では1838位はGである。
【図１３】  B/C組換えを有するか否かを区別するためのPCR制限断片長多型法の概要を示す図である。組換えを有さないHBV/B単離株から得られた110bpのPCR産物は、制限酵素Spel1の切断反応によって89bpの断片を生ずる。一方、組換えを有さないHBV/B単離株から得られたPCR産物からは断片は生じない。
【図１４】  アジア各国及び米国のアジア人集団における274例のHBV/Bキャリアについて、Cタイプとの組換えを有するか否かを地理的分布で示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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