(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号１１−１６からなる群より選ばれるアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子；
（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号１７および３３からなる群より選ばれるアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子：
（ｃ）グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号３４−３６からなる群より選ばれるアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子；
（ｄ）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号３７のアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子、
の少なくとも１つを含んでなる各カセットの１以上で適当な宿主微生物を形質転換する工程であって、ただし、遺伝子（ａ）〜（ｄ）の全てが宿主微生物に導入される、工程、
（ii）形質転換された宿主微生物を単糖、オリゴ糖、多糖または１炭素基質よりなる群から選択された少なくとも１つの炭素源の存在下で適当な条件下で培養し、それにより１，３−プロパンジオールを生成する工程、及び
（iii）１，３−プロパンジオールを回収する工程、
を含んでなる組み換え微生物からの１，３−プロパンジオールの生産方法。
【請求項２】
適当な宿主微生物がバクテリア、酵母及び糸状菌よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
適当な宿主微生物がシトロバクター（Citrobacter）、エンテロバクター（Enterobacter）、クロストリジウム（Clostridium）、クレブシエラ（Klebsiella）、エロバクター（Aerobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、ザイゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、ピチア（Pichia）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、デバリオミセス（Debaryomyces）、ムコール（Mucor）、トルロプシス（Torulopsis）、メチロバクター（Methylobacter）、エシェリキア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、バシラス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）及びシュードモナス（Pseudomonas）よりなる属の群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
適当な宿主微生物がエシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ種（Klebsiella sp.）及びサッカロミセス種（Saccharomyces sp.）よりなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
形質転換された宿主微生物が遺伝子ＧＰＤ１及びＧＰＤ２を含んでなる形質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種（Klebsiella sp.）であって、前記遺伝子がそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
炭素源がグルコースである請求項１記載の方法。
【請求項７】
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択され、それらのアミノ酸配列が前記グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項１記載の方法。
【請求項８】
グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配列番号３３及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択され、それらのアミノ酸配列が前記グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項１記載の方法。
【請求項９】
デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３を含んでなり、それらの遺伝子がそれぞれ配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応し、それらのアミノ酸配列が前記活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応し、そのアミノ酸配列が前記１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子；
（２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子；
（３）配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のα−サブユニットをコードする遺伝子；
を含んでなる遺伝子の群、
を含んでなる形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は分子生物学の分野及び所望する化合物の生産のための組み換え生物の使用に関する。より具体的には、本発明は１，３−プロパンジオールの増大生産のために、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）のクローン化された遺伝子の別個または一緒のいずれかの発現を記述する。
発明の背景
１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の製造並びにポリウレタン及び環式化合物の製造に潜在的有用性を有するモノマーである。
１，３−プロパンジオールへの様々な化学経路が知られている。例えば、アクロレインの触媒溶液相水和及びそれに続く還元により、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在下で触媒でエチレンオキシドを１，３−プロパンジオールに転化することができ、またはグリセロールのような炭化水素から、周期表のVIII族からの原子を有する触媒で一酸化炭素及び水素の存在下で反応させることができる。これらの方法により１，３−プロパンジオールを生成することは可能であるが、それらは高価であり且つ環境汚染物質を含有する廃棄物の流れを生じる。
グリセロールの発酵から１，３−プロパンジオールを生成できることは百年以上の間知られている。１，３−プロパンジオールを生産することができるバクテリア株は例えばシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びペロバクター（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）の群に見いだされている。研究された各場合で、グリセロールは２段階の酵素触媒反応順序で１，３−プロパンジオールに転化される。第一段階では、デヒドラターゼがグリセロールの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）及び水への転化を触媒する（式１）。第二段階では、ＮＡＤ+結合（ＮＡＤ+−ｌｉｎｋｅｄ）オキシドレダクターゼにより３−ＨＰが１，３−プロパンジオールに還元される（式２）。
グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ2Ｏ    （式１）
３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ+    （式２）
１，３−プロパンジオールはさらに代謝されず、その結果、培地中に高濃度で蓄積する。全反応は補因子の形態の還元当量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を消費し、それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）に酸化される。
通常、グリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産は、グリセロールを唯一の炭素源として用いて嫌気的条件下で他の外因性還元当量受容体の非存在下で実施される。これらの条件下で、例えば、シトロバクター、クロストリジウム及びクレブシエラの株では、グリセロールの並発経路が動き、それはまずＮＡＤ+（またはＮＡＤＰ+）結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化を伴う（式３）。ＤＨＡはＤＨＡキナーゼによるジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）の後に、生合成のため及び例えば解糖によるＡＴＰ生成を補助するために利用できるようになる。
グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+    （式３）
ＤＨＡ＋ＡＴＰ→ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ    （式４）
１，３−プロパンジオール経路と異なり、この経路は炭素及びエネルギーを細胞に与えることができ、そしてＮＡＤＨを消費するよりむしろ生成する。
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びシトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）では、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機能的に連結した活性をコードする遺伝子はｄｈａレギュロンにより包含される。シトロバクター及びクレブシエラからのｄｈａレギュロンはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で発現されており、そしてグリセロールを１，３−プロパンジオールに転化することが示されている。
グリセロールの製造のための生物学的方法は知られている。グリセロール生産体の圧倒的大多数は酵母であるが、いくつかのバクテリア、他の真菌及び藻類もグリセロールを生産することが知られている。バクテリア及び酵母は両方とも解糖のフルクトース−１，６−ビスリン酸経路を通してグルコースもしくは他の炭水化物を転化するかまたはエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路によりグリセロールを生産し、一方、ある種の藻類は葉緑体中の溶存二酸化炭素もしくは重炭酸塩をカルビン回路の３炭素中間体に転化する。一連の工程で、３炭素中間体のホスホグリセリン酸はグリセルアルデヒド３−リン酸に転化され、それをそのケト異性体ジヒドロキシアセトンリン酸に容易に相互転化することができ、そして最終的にグリセロールに転化される。
特に、バクテリアのバシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びラクトバシラス・リコペルシカ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃａ）はグリセロールを合成し、そしてグリセロール生産は高い外部の塩濃度に対する防護のために耐塩性藻類ドゥナリエラ種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）及びアステロモナス・グラシリス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に見いだされる（Ｂｅｎ−Ａｍｏｔｚ等、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ３８、４９−５２、（１９８２））。同様に、各種浸透圧耐性（ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ）酵母は防護手段としてグリセロールを合成する。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の大部分の株はアルコール発酵中にいくらかのグリセロールを生産し、そして浸透圧ストレスの添加によりこれを生理学的に増やすことができる（Ａｌｂｅｒｔｙｎ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、４１３５−４１４４、（１９９４））。今世紀初期の商業的グリセロール製造は、亜硫酸塩またはアルカリのような「スティアリング（ｓｔｅｅｒｉｎｇ）試薬」が添加されたサッカロミセス培養物の使用により実施された。不活性複合体の形成により、舵取り剤はエタノールへのアセトアルデヒドの転化を阻止または阻害し；従って、過剰の還元当量（ＮＡＤＨ）は還元のためにＤＨＡＰが利用できるかまたはそれに「導かれ」てグリセロールを生成する。この方法は亜硫酸塩による酵母の生育の部分的阻害により制限される。異なる機構で過剰のＮＡＤＨ当量を生じるアルカリの使用によりこの制限をある程度克服することができる。この操作で、アルカリはカニッツァロ不均化を開始して２当量のアセトアルデヒドからエタノールと酢酸を生成する。
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＤＡＲ１、ＧＰＤ１）はサッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）からクローン化され、シークエンスされている（Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６、７０９１−７０９５、（１９９４））。ＤＡＲ１遺伝子はシャトルベクター中にクローン化され、そしてエシェリキア・コリを形質転換するために用いられ、その場合、発現により活性酵素が生産された。Ｗａｎｇ等（上記）はＤＡＲ１が細胞の浸透圧環境により調節されることを認めるが、組み換え生物において１，３−プロパンジオール生産を高めるためにその遺伝子がどのように用いられる可能性があるかを示唆していない。
他のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素が単離されており；例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からｓｎ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがクローン化され、シークエンスされており（Ｌａｒａｓｏｎ等、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０、１１０１、（１９９３））、そしてＡｌｂｅｒｔｙｎ等（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、４１３５（１９９４））はサッカロミセス・セレビシエからのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１のクローニングを教示している。Ｗａｎｇ等（上記）のように、Ａｌｂｅｒｔｙｎ等及びＬａｒａｓｏｎ等はこの遺伝子の調節の浸透圧感受性を認めるが、組み換え生物における１，３−プロパンジオールの生産にその遺伝子がどのように用いられる可能性があるかを示唆していない。
Ｇ３ＰＤＨでのように、グリセロール−３−ホスファターゼがサッカロミセス・セレビシエから単離されており、そのタンパク質はＧＰＰ１及びＧＰＰ２遺伝子によりコードされると同定されている（Ｎｏｒｂｅｃｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、１３８７５、（１９９６））。Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子のように、ＧＰＰ２は浸透圧感受性であるようである。
グリセロール及び１，３−プロパンジオールの両方の生産の生物学的方法は知られているが、全工程を単一の組み換え生物により成し遂げることができることはこれまで一度も示されていない。
化学的方法はエネルギー集約的であり、そして生物学的方法は高価な出発原料のグリセロールを必要とするので、１，３−プロパンジオールの製造に関して上に記述した化学的または生物学的方法はいずれも工業規模生産には十分に適していない。低いエネルギー入力及び安価な出発原料を必要とする方法が求められている。より望ましい方法は所望する１，３−プロパンジオール最終生成物に炭水化物または糖類のような基本的な炭素源を転化する能力を有する微生物を含む。
１，３−プロパンジオールへのグリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の発酵可能な炭素源の単一生物転化が望ましいが、そのような試みには克服すべきかなりの難題があることが実証されている。例えば、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ等（ＥＰ ３７３ ２３０）はシトロバクター・フロインジイ、クロストリジウム・アセトトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）及びクレブシエラ・ニューモニエを初めとする１，３−プロパンジオールの生産のために有用な大部分の株の生育がフルクトースまたはグルコースのような水素供与体の存在により妨げられることを教示している。グリセロールとフルクトースまたはグルコースの同時発酵で１，３−プロパンジオールを生成するラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）及びラクトバシラス・ブフナー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒ）の株は、グリセロールが唯一の炭素源として与えられる場合には生育せず、そして得られる細胞がグルコースまたはフルクトースを代謝できることは示されているが、それらは１，３−プロパンジオールを生成しない（Ｖｅｉｇａ  ＤＡ  Ｃｕｎｈａ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、１０１３（１９９２））。同様に、グリセロール及びアセテートが与えられる場合に１，３−プロパンジオールを生産するイリオバクター・ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）の株は、フルクトース及びグルコースを初めとするグリセロール以外の炭素基質から１，３−プロパンジオールを生成しないことが示されている（Ｓｔｅｉｂ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４０、１３９（１９８４））。最後に、Ｔｏｎｇ等（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３４、１４９（１９９２））はグリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａレギュロンで形質転換された組み換えエシェリキア・コリが外因性グリセロールの非存在下でグルコースまたはキシロースのいずれもから１，３−プロパンジオールを生産しないことを教示している。
グリセロールからの１，３−プロパンジオールの収率を上げる試みが報告されており、その場合、還元当量を与えることができる補助基質、典型的には発酵可能な糖類が工程に含まれる。収率の向上はグリセロール及びグルコースを同時発酵するシトロバクター・フロインジイ及びクレブシェラ・ニューモニエＤＳＭ ４２７０の休止細胞に対して主張されているが（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ等、上記及びＴｒａｎ−Ｄｉｎｈ等、ＤＥ ３７３４ ７６４）；グリセロール及びグルコースを同時発酵するクレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５の増殖細胞には主張されておらず、それらは１，３−プロパンジオールを生成しなかった（Ｉ−Ｔ．Ｔｏｎｇ、Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）−Ｍａｄｉｓｏｎ（１９９２））。増加した収率は組み換えエシェリキア・コリによるグリセロールとグルコースまたはフルクトースの同時発酵に対して報告されているが；しかしながら、グリセロールの非存在下で１，３−プロパンジオールは生産されない（Ｔｏｎｇ等、上記）。これらの系で、単一生物は細胞の維持または増殖のためにエネルギー及び炭素を与えながらＮＡＤＨを生成する供給源として炭水化物を用いる。これらの開示は１，３−プロパンジオールを生産する炭素の流れに糖類が入らないことを示唆する。いずれの場合でもグリセロールの外因性供給源の非存在下で１，３−プロパンジオールは生産されない。従って、文献のウェートから、単一生物による炭水化物源からの１，３−プロパンジオールの生産は可能ではないことが明らかに示唆される。
本発明により解決される問題はグルコースまたは他の糖類のような安価な炭素基質からの単一組み換え生物による１，３−プロパンジオールの生物学的生産である。１，３−プロパンジオールの生物学的生産は２段階の連続反応の基質としてグリセロールを必要とし、その場合、デヒドラターゼ酵素（典型的には補酵素Ｂ12依存性デヒドラターゼ）がグリセロールを中間体の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに転化し、次にそれはＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）依存性オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに転化される。補因子条件の複雑さのために、１，３−プロパンジオールの製造にこの反応順序を利用する工業的方法は全細胞触媒の使用を必要とする。さらに、この方法を経済的に実用的にするために、グリセロールまたはジヒドロキシアセトンより安価な供給原料が必要とされる。グルコース及び他の炭水化物は適当な基質であるが、上に説明したように、それらは１，３−プロパンジオール生成を妨げることが知られている。その結果として、いかなる単一生物もグルコ−スを１，３−プロパンジオールに転化することが示されていない。
出願人等は提示した問題を解決し、そして本発明は単一の組み換え生物を用いて発酵可能な炭素源を直接１，３−プロパンジオールに生物転化することを規定する。グルコースをモデル基質として用い、そして生物転化はあらゆる生存する微生物に適用できる。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を保有する微生物は、グリセロール分解経路により優れた収率及び選択性でグルコース及び他の糖類を１，３−プロパンジオールに転化することができる。さらに、本発明を１）グリセロール、２）ジヒドロキシアセトンまたは３）グリセロールの酸化状態のＣ3化合物（例えば、グリセロール３−リン酸）または４）ジヒドロキシアセトンの酸化状態のＣ3化合物（例えば、ジヒドロキシアセトンリン酸もしくはグリセルアルデヒド３−リン酸）に容易に転化されるあらゆる炭素基質を含むように一般的に適用することができる。
本発明の要約
本発明は
（ｉ）（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子；（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子；（ｃ）デヒドラターゼ活性をコードする遺伝子；及び（ｄ）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする遺伝子の少なくとも１つを含んでなる形質転換カセットで適当な宿主生物を形質転換し、ただし、形質転換カセットが（ａ）−（ｄ）の全てより少ない遺伝子を含んでなる場合には、適当な宿主生物が内因性遺伝子を含んでなり、それにより得られる形質転換された宿主生物が少なくとも１つの各々の遺伝子（ａ）−（ｄ）を含んでなり；
（ii）形質転換された宿主生物を単糖、オリゴ糖、多糖または１炭素基質よりなる群から選択される少なくとも１つの炭素源の存在下で適当な条件下で培養し、それにより１，３−プロパンジオールが生成され；そして
（iii）１，３−プロパンジオールを回収すること
を含んでなる組み換え生物からの１，３−プロパンジオールの生産方法を提供する。
本発明はさらに１，３−プロパンジオールの生産のためにグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、グリセロールデヒドラターゼ及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を発現することができる発現カセットを含んでなる形質転換された宿主を提供する。
本方法に用いる適当な宿主生物はバクテリア、酵母及び糸状菌よりなる群から選択される。より具体的には、適当な宿主生物はシトロバクター、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム、クレブシエラ、エロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシラス、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる属の群から選択される。最も具体的には、適当な宿主生物はエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサッカロミセス種よりなる群から選択される。本方法に用いる特定の形質転換された宿主生物は１）遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴを含んでなる形質転換カセットで形質転換されたサッカロミセス種で、その場合、それらの遺伝子はサッカロミセス種ゲノム中に安定に組込まれる；及び２）遺伝子ＧＰＤ１及びＧＰＰ２を含んでなる形質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種である。
本発明の好ましい炭素源はグルコースである。
本方法はさらに配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択されるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を用い、それらのアミノ酸配列はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法は配列番号３３及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択されるグリセロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、それらのアミノ酸配列はグリセロール−３−ホスファターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールキナーゼ酵素をコードする遺伝子も用い、そのアミノ酸配列はグリセロールキナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法はｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３を含んでなるデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、それらの遺伝子はそれぞれ配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応し、それらのアミノ酸配列はデヒドラターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法は配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、そのアミノ酸配列は１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。
また、本発明は
（ａ）（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子；
（２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子；
（３）配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のαサブユニットをコードする遺伝子；
（４）配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のβサブユニットをコードする遺伝子；
（５）配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のγサブユニットをコードする遺伝子；及び
（６）配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子、
を含んでなる遺伝子の群、（ａ）（１）−（６）のそれぞれのアミノ酸配列は遺伝子（１）−（６）の酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する、並びに
（ｂ）（ａ）の遺伝子の群で形質転換された宿主細胞で、それにより形質転換された宿主細胞が単糖、オリゴ糖及び多糖よりなる群からまたは１炭素基質から選択される少なくとも１つの基質で１，３−プロパンジオールを生産する、
を含んでなる形質転換された宿主細胞も包含する。
生物学的寄託及び配列表の簡単な説明
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有する（エシェリキア・コリ宿主Ｗ１４８５並びにプラスミドｐＤＴ２０及びｐＡＨ４２を含んでなる）形質転換されたエシェリキア・コリＷ２０４２を特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下でＡＴＣＣに１９９６年９月２６日に寄託し、そしてそれをＡＴＣＣ ９８ １８８と称する。
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５を保有するサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００を特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下でＡＴＣＣに１９９６年９月２６日に寄託し、そしてそれをＡＴＣＣ ７４３９２と称する。
「ＡＴＣＣ」は１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５２  Ｕ．Ｓ．Ａ．に位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ国際受託所をさす。名称は寄託したものの受託番号をさす。
出願人等は特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列の標準表示に関する規則（ＯＪ  ＥＰＯ、１２／１９９２への追補番号２中に公開された、ＥＰＯの総裁の決定への付加条件Ｉ及びII）並びに３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５及び付録Ａ及びＢ（ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列を含む出願開示のための条件）と適合する４９配列を提供している。
発明の詳細な説明
本発明は単一の組み換え生物における発酵可能な炭素源からの１，３−プロパンジオールの生物学的生産方法を提供する。本方法はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有する微生物を含む。組み換え微生物を炭素基質と接触させ、そして１，３−プロパンジオールを増殖培地から単離する。
本方法はポリエステル及び他のポリマーの製造に有用な１，３−プロパンジオールモノマーの迅速で安価で且つ環境的に信頼できる供給源を提供する。
以下の定義は請求及び明細書を説明するために用いられる。
「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」という用語はグリセロール分子を生成物の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに異性化または転化することができる酵素活性のポリペプチドをさす。本発明の目的のためには、デヒドラターゼ酵素はそれぞれグリセロール及び１，２−プロパンジオールという好ましい基質を有するグリセロールデヒドラターゼ（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）Ｕ０９７７１、Ｕ３０９０３）及びジオールデヒドラターゼ（ジーンバンク Ｄ４５０７１）を含む。クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５のグリセロールデヒドラターゼは配列番号１、２及び３としてそれぞれ同定される遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３によりコードされる。ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３遺伝子はそれぞれグリセロールデヒドラターゼ酵素のα、β及びγサブユニットをコードする。
「オキシドレダクターゼ」または「１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ」という用語は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼは例えば、ｄｈａＴ遺伝子（ジーンバンク Ｕ０９７７１、Ｕ３０９０３）によりコードされるポリペプチドを含み、それを列番号４として同定する。
「グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」または「Ｇ３ＰＤＨ」という用語はジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。インビボのＧ３ＰＤＨはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはＦＡＤ依存性である可能性がある。この酵素活性の例は以下のものを含み：ＮＡＤＨ依存性酵素（ＥＣ １．１．１．８）はＧＰＤ１（ジーンバンク Ｚ７４０７１ｘ２）またはＧＰＤ２（ジーンバンク Ｚ３５１６９ｘ１）またはＧＰＤ３（ジーンバンク Ｇ９８４１８２）またはＤＡＲ１（ジーンバンク Ｚ７４０７１ｘ２）を初めとするいくつかの遺伝子によりコードされ；ＮＡＤＰＨ依存性酵素（ＥＣ １．１．１．９４）はｇｐｓＡ（ジーンバンク Ｕ３２１６４、Ｇ４６６７４６（ｃｄｓ  １９７９１１−１９６８９２）及びＬ４５２４６）によりコードされ；そしてＦＡＤ依存性酵素（ＥＣ １．１．９９．５）はＧＵＴ２（ジーンバンク Ｚ４７０４７ｘ２３）またはｇｌｐＤ（ジーンバンク Ｇ１４７８３８）またはｇｌｐＡＢＣ（ジーンバンク Ｍ２０９３８）によりコードされる。
「グリセロール−３−ホスファターゼ」または「ｓｎ−グリセロール−３−ホスファターゼ」または「ｄ，ｌ−グリセロールホスファターゼ」または「Ｇ３Ｐホスファターゼ」という用語は、グリセロール−３−リン酸のグリセロールへの転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。Ｇ３Ｐホスファターゼは例えばＧＰＰ１（ジーンバンク Ｚ４７０４７ｘ１２５）またはＧＰＰ２（ジーンバンク Ｕ１８８１３ｘ１１）によりコードされるポリペプチドを含む。
「グリセロールキナーゼ」という用語は、反応条件により、グリセロール−３−リン酸へのグリセロールのまたはグリセロールへのグリセロール−３−リン酸の転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。グリセロールキナーゼは例えばＧＵＴ１（ジーンバンク Ｕ１１５８３ｘ１９）によりコードされるポリペプチドを含む。
「ＧＰＤ１」、「ＤＡＲ１」、「ＯＳＧ１」、「Ｄ２８３０」及び「ＹＤＬ０２２Ｗ」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号５として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「ＧＰＤ２」という用語は細胞質グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号６として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「ＧＵＴ２」及び「ＹＩＬ１５５Ｃ」という用語は互換的に用いられ、そしてミトコンドリアのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号７に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「ＧＰＰ１」、「ＲＨＲ２」及び「ＹＩＬ０５３Ｗ」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−３−ホスファターゼをコードし且つ配列番号８に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「ＧＰＰ２」、「ＨＯＲ２」及び「ＹＥＲ０６２Ｃ」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−３−ホスファターゼをコードし且つ配列番号９に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「ＧＵＴ１」という用語は細胞質グリセロールキナーゼをコードし且つ配列番号１０として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「機能」または「酵素機能」という用語は特定の化学反応を実施するために必要なエネルギーを変えることにおける酵素の触媒活性をさす。適当な条件下で生成物または基質のいずれかの生成を成し遂げることができる平衡の反応にそのような活性を適用することができると理解される。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換可能に用いられる。
「炭素基質」及び「炭素源」という用語は本発明の宿主生物が代謝することができる炭素源、具体的には単糖、オリゴ糖、多糖及び１炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源をさす。
「宿主細胞」または「宿主生物」という用語は外来または異種起源の遺伝子を受け入れること及びそれらの遺伝子を発現して活性のある遺伝子産物を生産することができる微生物をさす。
「外来遺伝子」、「外来ＤＮＡ」、「異種起源の遺伝子」及び「異種起源のＤＮＡ」という用語は、様々な方法により宿主生物内に置かれたある生物に固有の遺伝物質をさす。
「組み換え生物」及び「形質転換された宿主」という用語は異種起源または外来遺伝子で形質転換されているあらゆる生物をさす。本発明の組み換え生物は適当な炭素基質からの１，３−プロパンジオールの製造のためにグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする外来遺伝子を発現する。
「遺伝子」はコーディング領域の前（５’非コーディング）及び後（３’非コーディング）の調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをさす。「天然」及び「野生型」という用語は遺伝子自体の調節配列と共に天然に見いだされるような遺伝子をさす。
「コードする」及び「コーディング」という用語は、転写及び翻訳の機構を通して遺伝子がアミノ酸配列を生成する方法をさす。特定のアミノ酸配列をコードする方法は、コードされるアミノ酸に変化を生じない塩基変異を含むことができるか、または１個もしくはそれより多いアミノ酸を変える可能性があるが、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基変異を含むＤＮＡ配列を含有すると理解される。従って、本発明は特定の例示配列より多くを包含すると理解される。また、得られるタンパク質分子の機能特性を実質的に変えないサイレント変異を生じる配列中の欠失、挿入または置換のような配列に対する改変も意図される。例えば、遺伝暗号の縮重を反映するかまたは与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変が考えられる。従って、疎水性アミノ酸のアミノ酸アラニンのコドンをグリシンのような別のより疎水性が低い残基またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのようなより疎水的な残基をコードするコドンで置換することができる。同様に、グルタミン酸の代わりのアスパラギン酸のような、ある負に荷電した残基の別のものでの置換またはアルギニの代わりのリシンのような、ある正に荷電した残基の別のものでの置換をもたらす変異も生物学的に同等な生成物を生じると予想することができる。また、タンパク質分子のＮ末端及びＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変異もタンパク質の活性を変えないと予想される。ある場合には、実際、タンパク質の生物学的活性に対する改変の影響を調べるために配列の突然変異体を作製することが望ましいことがある。提示した改変の各々は、コードされる生成物の生物学的活性の保持の測定のように、当該技術分野の日常技術の十分に範囲内である。さらに、本発明により包含される配列が本明細書に例示される配列とストリンジェントな条件下（０．１ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃）でハイブリダイスするそれらの能力によっても特定されることを当業者は理解する。
「発現」という用語は遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写及び翻訳をさす。
「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は細胞の主要な代謝の一部ではない遺伝子をしばしば保有し、そして通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外成分をさす。そのような成分は適切な３’非翻訳配列と共にプロモーターフラグメント及び選択した遺伝子産物のＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる独特な構築物に多数のヌクレオチド配列を連結または再結合している、あらゆる起源に由来する１本または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線状または環状の自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい。「形質転換カセット」は外来遺伝子を含有し且つ外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする成分を有する特定のベクターをさす。「発現カセット」は外来遺伝子を含有し且つ外来遺伝子に加えて外来宿主におけるその遺伝子の高められた発現を可能にする成分を有する特定のベクターをさす。
「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は核酸の取込み後の細胞における新しい遺伝子の取得をさす。取得される遺伝子を染色体ＤＮＡ中に組込むかまたは染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換体」という用語は形質転換の産物をさす。
「遺伝的に改変された」という用語は形質転換または突然変異により遺伝物質を変える工程をさす。
組み換え生物の構築：
炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転化の酵素経路をコードする必要な遺伝子を含有する組み換え生物を当該技術分野でよく知られている技術を用いて構築することができる。本発明では、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子をクレブシエラまたはサッカロミセスのような天然の宿主から単離し、そしてエシェリキア・コリＤＨ５α、ＥＣＬ７０７、ＡＡ２００もしくはＷ１４８５；サッカロミセス・セレビシエ株ＹＰＨ５００；またはクレブシエラ・ニューモニエ株ＡＴＣＣ ２５９５５もしくはＥＣＬ２１０６のような宿主株を形質転換するために用いた。
遺伝子の単離
バクテリアゲノムから所望する遺伝子を得る方法は一般的であり、分子生物学の当該技術分野でよく知られている。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適当なゲノムライブラリーを作製することができ、そして所望する遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーニングすることができる。いったん配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．４，６８３，２０２）のような標準的なプライマーによる増幅方法を用いてＤＮＡを増幅して適切なベクターを用いた形質転換のために適当なＤＮＡの量を得ることができる。
あるいはまた、コスミドライブラリーを作製することができ、その場合、ゲノムＤＮＡの大きいセグメント（３５−４５ｋｂ）をベクター中にパッケージングし、適切な宿主を形質転換するために用いることができる。コスミドベクターは大量のＤＮＡを受け入れることができる点で独特である。通常、コスミドベクターは少なくとも１コピーのｃｏｓＤＮＡ配列を有し、それはパッケージング及びそれに続く外来ＤＮＡの環化のために必要である。ｃｏｓ配列に加えてこれらのベクターはＣｏｌＥ１のような複製起点及びアンピシリンまたはネオマイシンに耐性の遺伝子のような薬剤耐性マーカーも含有する。適当なバクテリア宿主の形質転換のためにコスミドベクターを用いる方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）中に詳しく記述されている。
コスミドをクローン化するために典型的には、外来ＤＮＡを単離し、そして適切な制限エンドヌクレアーゼを用いてコスミドベクターのｃｏｓ領域の近くに連結する。次に、直鎖状にした外来ＤＮＡを含有するコスミドベクターをバクテリオファージλのようなＤＮＡパッケージング媒体と反応させる。パッケージング工程中にｃｏｓ部位は切断され、外来ＤＮＡはバクテリアウイルス粒子の頭部中にパッケージングされる。次に、これらの粒子を用いてエシュリキア・コリのような適当な宿主細胞をトランスフェクトする。いったん細胞中に注入されると、外来ＤＮＡはｃｏｓ付着末端の影響で環化する。このようにして、外来ＤＮＡの大きいセグメントを組み換え宿主細胞に導入し、発現させることができる。
グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子の単離及びクローニング
グリセロールを１，３−プロパンジオールに処理することができる遺伝子を保有することが知られているバクテリアの属からゲノムＤＮＡの大きいセグメントをクローン化するために本発明の文脈内ではコスミドベクター及びコスミド形質転換法を用いた。具体的には、クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５からのゲノムＤＮＡを当該技術分野でよく知られている方法により単離し、コスミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ  １中への挿入のために制限酵素Ｓａｕ  ３Ａで消化し、そしてＧｉｇａｐａｃｋIIパッケージング抽出物を用いてパッケージングした。ベクターの構築後にエシュリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ細胞をコスミドＤＮＡで形質転換した。グリセロールの存在下で細胞を生育し、そして１，３−プロパンジオール形成に関して培地を分析することにより、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転化する能力に関して形質転換体をスクリーニングした。
１，３−プロパンジオール陽性の形質転換体のうち２個を分析し、それらのコスミドをｐＫＰ１及びｐＫＰ２と命名した。ＤＮＡシークエンシングによりシトロバクター・フロインジイからのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ｄｈａＢ）に対する大きい相同性が示され、これらの形質転換体がグリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含有することを表した。他の１，３−プロパンジオール陽性の形質転換体を分析し、それらのコスミドをｐＫＰ４及びｐＫＰ５と命名した。ＤＮＡシークエンシングによりこれらのコスミドがジオールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを保有することが示された。
本発明はクレブシエラコスミド内から単離された遺伝子を利用するが、デヒドラターゼ遺伝子の別の起源はシトロバクター、クロストリジウム及びサルモネラを含み、しかしそれらに限定されない。
Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子
本発明は宿主細胞におけるＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼ活性の発現のために適当な遺伝子を提供する。
Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子は知られている。例えば、ＧＰＤ１がサッカロミセスから単離されており、配列番号５で示される塩基配列を有し、配列番号１１に示されるアミノ酸配列をコードする（Ｗａｎｇ等、上記）。同様に、配列番号６に示される塩基配列を有し、配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードするＧＰＤ２によりコードされるＧ３ＰＤＨ活性もサッカロミセスから単離されている（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ等、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７、９５、（１９９５））。
Ｇ３ＰＤＨ活性のポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子が本発明の目的のために適当であり、その場合、その活性はジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転化を触媒することができると考えられる。さらに、遺伝子ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＵＴ２、ｇｐｓＡ、ｇｌｐＤ及びｇｌｐＡＢＣのαサブユニットにそれぞれ相当する配列番号１１、１２、１３、１４、１５及び１６のいずれかにより示されるようなＧ３ＰＤＨのアミノ酸配列をコードするあらゆる遺伝子が本発明において機能的であり、その場合、そのアミノ酸配列は酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含すると考えられる。他の起源から単離されたＧ３ＰＤＨをコードする遺伝子も本発明における使用のために適当であることを当業者は認識する。例えば、原核生物から単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｍ３４３９３、Ｍ２０９３８、Ｌ０６２３１、Ｕ１２５６７、Ｌ４５２４６、Ｌ４５３２３、Ｌ４５３２４、Ｌ４５３２５、Ｕ３２１６４及びＵ３９６８２を含み；真菌から単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｕ３０６２５、Ｕ３０８７６及びＸ５６１６２を含み；昆虫から単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｘ６１２２３及びＸ１４１７９を含み；そして哺乳類起源から単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｕ１２４２４、Ｍ２５５５８及びＸ７８５９３を含む。
Ｇ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、ＧＰＰ２がサッカロミセス・セレビシエから単離されており、配列番号９で示される塩基配列を有し、それは配列番号１７に示されるアミノ酸配列をコードする（Ｎｏｒｂｅｃｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、ｐ１３８７５、１９９６）。
Ｇ３Ｐホスファターゼ活性をコードするあらゆる遺伝子が本発明の目的のために適当であり、その場合、その活性はグリセロール−３−リン酸のグリセロールへの転化を触媒することができると考えられる。さらに、配列番号３３及び１７により示されるようなＧ３Ｐホスファターゼのアミノ酸配列をコードするあらゆる遺伝子が本発明において機能的であり、その場合、そのアミノ酸配列は酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含すると考えられる。他の起源から単離されたＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子も本発明における使用のために適当であることを当業者は認識する。例えば、グリセロールを生じるためのグリセロール−３−リン酸の脱リン酸を１つまたはそれより多い以下の一般的または特異的ホスファターゼで実施することができる：アルカリホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１）［ジーンバンクＭ１９１５９、Ｍ２９６６３、Ｕ０２５５０もしくはＭ３３９６５］；酸性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２）［ジーンバンクＵ５１２１０、Ｕ１９７８９、Ｕ２８６５８もしくはＬ２０５６６］；グリセロール−３−ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．−）［ジーンバンクＺ３８０６０もしくはＵ１８８１３ｘ１１］；グルコース−１−ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１０）［ジーンバンクＭ３３８０７］；グルコース−６−ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．９）［ジーンバンクＵ００４４５］；フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１１）［ジーンバンクＸ１２５４５もしくはＪ０３２０７］またはホスファチジルグリセロリン酸ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２７）［ジーンバンクＭ２３５４６及びＭ２３６２８］。
グリセロールキナーゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、サッカロミセスからのグリセロールキナーゼをコードするＧＵＴ１が単離され、シークエンスされており（Ｐａｖｌｉｋ等、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４、２１、（１９９３））、そしてその塩基配列は配列番号１０により示され、それは配列番号１８に示されるアミノ酸配列をコードする。グリセロールキナーゼは現実にはグリセロールの分解を触媒するが、同じ酵素が適切な反応エネルギー条件下でグリセロール−３−リン酸をグリセロールに転化するようにグリセロールの合成において機能できることを当業者は認識する。グリセロールキナーゼによるグリセロール生成の証拠が存在する。嫌気的または呼吸阻害条件下で、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）はグリセロール−３−Ｐ及びＡＤＰの存在下でグリセロールを生産する。その反応はグリコソームコンパートメント中で起こる（Ｄ．Ｈａｍｍｏｎｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、１５６４６−１５６５４、（１９８５））。
宿主細胞
Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの発現によるグリセロールの組み換え生産のために適当な宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれであってもよく、そして活性のある酵素を発現するそれらの能力によってのみ限定される。好ましい宿主はシトロバクター、エンテロバクター、クロストリジウム、クレブシエラ、エロバクター、ラクトバシラス、アスペルギルス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ザイゴサッカロミセス、ピチア、クルイベロミセル、カンジダ、ハンセヌラ、デバリオミセス、ムコール、トルロプシス、メチロバクター、エシェリキア、サルモネラ、バシラス、ストレプトミセス及びシュードモナスのようなグリセロールまたは１，３−プロパンジオールの生産のために典型的に有用なものである。本発明において最も好ましいものはエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサッカロミセス種である。
アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ12）はグリセロールデヒドラターゼ活性のために必須の補因子である。この補酵素は知られている最も複雑な非ポリマー天然物であり、そのインビボでの合成は約３０の遺伝子の産物を用いて導かれる。補酵素Ｂ12の合成は原核生物において見いだされ、それらのあるものはその化合物をデノボで合成することができ、一方、あるものは部分反応を実施することができる。
例えば、エシェリキア・コリはコリン環構造を作ることができないが、コビナミドのコリノイドへの転化を触媒することができ、そして５’−デオキシアデノシル基を導入することができる。
真核生物は補酵素Ｂ12をデノボで合成することができず、代わりに細胞外環境からビタミンＢ12を輸送し、続いて、細胞の酵素によりその化合物をその化合物の機能形態に転化する。この一連の反応に対して３つの酵素活性が記述されている。
１）アクアコバラミンレダクターゼ（ＥＣ １．６．９９．８）はＣｏ（III）をＣｏ（II）に還元し；
２）コブ（II）アラミン（ｃｏｂ（II）ａｌａｍｉｎ）レダクターゼ（ＥＣ １．６．９９．９）はＣｏ（II）をＣｏ（Ｉ）に還元し；そして
３）コブ（Ｉ）アラミン（ｃｏｂ（Ｉ）ａｌａｍｉｎ）アデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１７）はＡＴＰから５’デオキシアデノシン部分を還元されたコリノイドに移す。この最後の酵素活性はそれら３つのうちで最も特性化されており、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ではｃｏｂＡ、エシェリキア・コリではｂｔｕＲ、そしてシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ではｃｏｂＯによりコードされる。これら３個のコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子はクローン化され、シークエンスされている。コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性はヒト繊維芽細胞及び単離されたラットミトコンドリアで検出されている（Ｆｅｎｔｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９８、２８３−９、（１９８１））。コバルト還元に関与する２つの酵素は十分に特性化されておらず、遺伝子配列は利用できない。ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのアクアコバラミンレダクターゼの報告があり（Ｗａｔａｎａｂｅ等、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０５、４２１−７、（１９９３））、そしてミクロソームのコブ（III）アラミンレダクターゼはラット繊維芽細胞からのミクロソーム及びミトコンドリアの内膜画分に存在する（Ｐｅｚａｃｋａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１５７、１６７−７７、（１９９３））。
ビタミンＢ12を培養培地に補足することは、多くの微生物でグリセロールデヒドラターゼ活性のために補酵素Ｂ12を生産する必要性を満たすことができるが、ある場合には、さらなる触媒活性をインビボで添加または増加しなければならない可能性がある。真核生物における補酵素Ｂ12の高められた合成は特に望ましい可能性がある。コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の公開された配列を与えられれば、この遺伝子のクローニング及び発現を当業者は成し遂げることができる。例えば、グルコースのような炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転化をもたらすために必要な遺伝子に加えてコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するようにサッカロミセスのような酵母を構築することができると考えられる。コバルト還元のための遺伝子のクローニング及び発現は異なる方法を必要とする。これは唯一のＮ2源としてのエタノールアミンでの生育に関するエシェリキア・コリにおける選択に基づくことができる。補酵素Ｂ12の存在下でエタノールアミンアンモニア−リアーゼにより他のＮ2源の非存在下で細胞は生育できる。エシェリキア・コリ細胞がコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼのクローン化された遺伝子及び別の生物からの無作為にクローン化されたＤＮＡを含有する場合、アクアコバラミンの存在下でのエタノールアミンでの生育は高められるはずであり、そして無作為にクローン化されたＤＮＡがアクアコバラミンのアデノシル化を促進するコバルト還元特性をコードするかどうかに関して選択されるはずである。
エシェリキア・コリ及びサッカロミセスに加えて、クレブシエラは特に好ましい宿主である。クレブシエラ・ニューモニエの株は唯一の炭素としてグリセロールで生育すると１，３−プロパンジオールを生産することが知られている。単糖、オリゴ糖、多糖または１炭素基質から１，３−プロパンジオールを生産するようにクレブシエラを遺伝的に改変することができると考えられる。
そのような株を作製するためには、１つまたはそれより多い構成的または誘導性プロモーターの転写制御下で、ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロールへの転化及びグリセロールの１，３−プロパンジオールへの転化を促進する遺伝子を別々または一緒にクレブシエラ宿主に与えることが都合よい。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロール−３−ホスファターゼをそれぞれコードするＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子の導入により、クレブシエラは適切な炭素基質から１，３−プロパンジオールを生産するための遺伝子装置が与えられる。
それらの遺伝子（例えば、Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、ｄｈａＢ及び／またはｄｈａＴ）をクレブシエラ・ニューモニエにおいて複製することができるあらゆるプラスミドベクターで導入してもよく、またはそれらをクレブシエラ・ニューモニエゲノム中に組込んでもよい。例えば、クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５及びクレブシエラ・ニューモニエＥＣＬ ２１０６はテトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに感受性であることが知られており；従って、クレブシエラ・ニューモニエにおいて複製すること及びこれらの抗生物質のいずれかまたは両方に対する耐性をコードすることの両方ができるプラスミドベクターを用いてこれらの遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ中に導入することができる。目的の遺伝子でクレブシエラを形質転換する方法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、そして適切なベクター及び発現技術を初めとする適当なプロトコルをＳａｍｂｒｏｏｋ、上記中に見いだすことができる。
ベクター及び発現カセット
本発明は適当な宿主細胞へのＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼのクローニング、形質転換及び発現のために適当な様々なベクター及び形質転換及び発現カセットを提供する。適当なベクターは用いるバクテリアと適合するものである。適当なベクターは例えばバクテリア、（バクテリオファージＴ７もしくはＭ−１３由来のファージのような）ウイルス、コスミド、酵母または植物から得ることができる。そのようなベクターを獲得及び使用するためのプロトコルは当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−１、２、３巻（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９））。
典型的に、ベクターまたはカセットは関係のある遺伝子の転写及び翻訳を導く配列、選択マーカー及び自律的複製または染色体組込みをさせる配列を含有する。適当なベクターは転写開始制御を保有する遺伝子の５’の領域及び転写の終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’の領域を含んでなる。そのような制御領域は生産宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないと理解されるが、両方の制御領域が形質転換される宿主細胞に相同な遺伝子から得られる場合が最も好ましい。
所望する宿主細胞においてＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子の発現を導くために有用な開始制御領域またはプロモーターは非常に多く、そして当業者によく知られている。（サッカロミセスにおける発現のために有用な）ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ；（ピチアにおける発現のために有用な）ＡＯＸ１；並びに（エシェリキア・コリにおける発現のために有用な）ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰL、λＰR、Ｔ７、ｔａｃ及びｔｒｃを初めとするがそれらに限定されない、これらの遺伝子を導くことができる実質的にあらゆるプロモーターが本発明のために適当である。
終結制御領域も好ましい宿主に固有の各種遺伝子から得ることができる。場合により、終結部位が必要ない可能性があるが、しかしながら、含まれる場合が最も好ましい。
本発明の酵素の有効な発現のために、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、酵素をコードするＤＮＡを選択した発現制御領域に開始コドンを通して機能的に連結する。
１，３−プロパンジオールの生産のための適当な宿主の形質転換及び遺伝子の発現
いったん適当なカセットが構築されると、それらを用いて適切な宿主細胞を形質転換する。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有するカセットを別々または一緒に宿主細胞中に導入することを（例えば、カルシウム−透過性細胞、エレクトロポレーションを用いる）形質転換によるかまたは組み換えファージウイルスを用いるトランスフェクションによるような既知の方法により成し遂げることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上記）。
本発明では、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有するエシェリキア・コリＷ２０４２（ＡＴＣＣ ９８１８８）を作製した。さらに、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５を保有するサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ ７４３９２）を構築した。上記の形質転換されたエシェリキア・コリ及びサッカロミセスは両方とも本発明の好ましい態様を表す。
培地及び炭素基質：
本発明の発酵培地は適当な炭素基質を含まなければならない。適当な基質はグルコース及びフルクトースのような単糖、ラクトースもしくはショ糖のようなオリゴ糖、澱粉もしくはセルロースのような多糖またはそれらの混合物、並びにチーズ乳清透過物、トウモロコシ浸し液（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、テンサイ糖蜜及びオオムギモルトのような継続できる供給原料からの未精製混合物を含むことができるがそれらに限定されない。さらに、炭素基質は重要な生化学中間体への代謝転化が示されている二酸化炭素またはメタノールのような１炭素基質であってもよい。
単一の炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒドまたはホルメート）からのグリセロール生産はメチル栄養（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母（Ｙａｍａｄａ等、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３（２）５４１−５４３、（１９８９））及びバクテリア（Ｈｕｎｔｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４、４１４８−４１５５、（１９８５））で報告されている。これらの生物はメタンからホルメートまでの酸化状態である単一の炭素化合物を同化してグリセロールを生産することができる。炭素同化の経路はリブロース１リン酸、セリンまたはキシルロース−１リン酸を通してであってもよい（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６））。リブロース１リン酸経路はホルメートをリブロース−５−リン酸と縮合して６炭素糖を形成し、それがフルクトースそして最終的に３炭素生成物のグリセルアルデヒド−３−リン酸になることを含む。同様に、セリン経路は１炭素化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸塩を経て解糖系に同化する。
１及び２炭素基質の利用に加えて、メチル栄養生物は代謝活動のためにメチルアミン、グルコサミン及び各種アミノ酸のような多数の他の炭素含有化合物も利用することが知られている。例えば、メチル栄養酵母はトレハロースまたはグリセロールを形成するためにメチルアミンからの炭素を利用することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ等、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［国際シンポジウム］、第７回（１９９３）、４１５−３２．編集者：Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ、Ｄｏｎ  Ｐ．出版社：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）。同様に、カンジダの様々な種はアラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３（５）。４８５−９（１９９０））。従って、本発明に利用する炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含することができ、そして宿主生物の条件によってのみ限定される。
上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが本発明に適していると考えられるが、好ましい炭素基質は単糖、オリゴ糖、多糖及び１炭素基質である。より好ましいものはグルコース、フルクトース、ショ糖のような糖類並びにメタノール及び二酸化炭素のような単一炭素基質である。最も好ましいものはグルコースである。
適切な炭素源に加えて、発酵培地は培養物の増殖及びグリセロール生成のために必要な酵素経路の促進のために適当な、当業者に知られている適当な鉱物、塩、補因子、バッファ−及び他の成分を含まなければならない。Ｃｏ（II）塩及び／またはビタミンＢ12またはその前駆物質に特に注意を払う。
培養条件：
典型的には、細胞を適切な培地中３０℃で増殖させる。本発明における好ましい増殖培地はルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ））（ＬＢ）培地、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｏｒｏｓｅ）（ＳＤ）培地または酵母麦芽エキス（Ｙｅａｓｔ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）（ＹＭ）培地のような一般の商業的に調製される培地である。他の特定または合成の増殖培地を用いてもよく、特定の微生物の増殖のために適切な培地は微生物学または発酵科学の当業者により知られている。また、カタボライト抑制を直接的または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば、サイクリックアデノシン２’：３’−１リン酸またはサイクリックアデノシン２’：５’−１リン酸の使用を反応培地中に含んでもよい。同様に、グリセロール生成の増大を導く酵素活性を調節することが知られている薬剤（例えば、亜硫酸塩、重亜硫酸塩及びアルカリ）の使用を遺伝子操作と共にまたはその代わりとして用いることができる。
発酵のために適当なｐＨの範囲はｐＨ５．０ないしｐＨ９．０の間であり、その場合、ｐＨ６．０ないしｐＨ８．０が初期条件の範囲として好ましい。
好気的または嫌気的条件下で反応を実施することができ、その場合、嫌気的または微好気的条件が好ましい。
バッチ及び連続発酵：
本発明の方法は発酵のバッチ法を用いる。古典的なバッチ発酵は密閉系であり、その場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、そして発酵中に人為的改変を受けない。従って、発酵の開始時に適切な生物または複数の生物を培地に接種し、そして系に何も添加せずに発酵を起こすことができる。しかしながら、典型的には、バッチ発酵は炭素源の添加に関して「バッチ」であり、ｐＨ及び酸素濃度のような因子を制御する試みがしばしばなされる。バッチ系の代謝産物及びバイオマス組成は発酵を停止する時まで絶えず変化する。バッチ内で細胞は静止状態の誘導期を経て高増殖の対数期に、そして最終的に増殖速度が減少するかまたは止まる定常期になる。処理されない場合、定常期の細胞は結局死ぬ。通常、対数期の細胞が最終生成物または中間体の生成の大部分を生じる。
標準的なバッチ系に対する変形はＦｅｄ−バッチ発酵系であり、それも本発明に適当である。典型的なバッチ系のこの変形では、発酵が進むにつれて基質を増加して添加する。Ｆｅｄ−バッチ系はカタボライト抑制が細胞の代謝を抑制しがちである場合及び培地中に制限された量の基質があることが望ましい場合に有用である。Ｆｅｄ−バッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、それ故、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ2のような廃ガスの分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて概算する。バッチ及びＦｅｄ−バッチ発酵は一般的であり、当該技術分野でよく知られており、Ｂｒｏｃｋ、上記中に実施例を見いだすことができる。
また、本方法が連続発酵法に適応できることも考えられる。連続発酵は開放系であり、その場合、特定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に等量のならし培地が処理のために取り出される。通常、連続発酵は培養物を一定の高密度で維持し、その場合、細胞は主として対数期増殖である。
連続発酵は細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの因子またはあらゆる数の因子を調節することができる。例えば、ある方法では炭素源または窒素レベルのような制限的栄養物質を固定した割合で維持し、そして全ての他のパラメーターを調節することができる。他の系では、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変えることができる。連続系は定常状態増殖条件を維持するように努め、従って、取り出される培地による細胞損失を発酵における細胞増殖速度で埋め合わせなければならない。連続発酵法の栄養物質及び増殖因子を調節する方法並びに生成物形成の割合を最大にする技術は工業微生物学の当該技術分野でよく知られており、様々な方法がＢｒｏｃｋ、上記により詳細に記述されている。
バッチ、ｆｅｄ−バッチまたは連続法のいずれかを用いて本発明を実施することができ、発酵のそのあらゆる既知の形態が適当である。さらに、細胞を全細胞触媒として基質上に固定し、１，３−プロパンジオール生成の発酵条件に供することができると考えられる。
１，３−プロパンジオール生成の代替経路：
代表的な酵素経路
グルコースからの１，３−プロパンジオールの生成を以下の一連の工程により成し遂げることができる。この一連のものは当業者に知られている多数の経路の代表である。グルコースは解糖系の酵素により一連の工程でジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）及び３−ホスホグリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に転化される。次に、ＤＨＡＰのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への加水分解及びそれに続く還元、またはＤＨＡＰのグリセロール３リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元及びそれに続く加水分解のいずれかによりグリセロールが形成される。基質に関して特異的または非特異的であることが知られているあらゆる数の細胞性ホスファターゼにより加水分解工程を触媒することができ、またはその活性を組み換えにより宿主中に導入することができる。ＮＡＤ+（またはＮＡＤＰ+）結合宿主酵素により還元工程を触媒することができ、またはその活性を組み換えにより宿主中に導入することができる。ｄｈａレギュロンが式３の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含有することは重要である。
グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ2Ｏ    （式１）
３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ+    （式２）
グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+    （式３）
上に詳細に記述されているようにグリセロールは中間体の３−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）を経て１，３−プロパンジオールに転化される。中間体の３−ＨＰは宿主によりコードすることができるかまたは組み換えにより宿主中に導入することができるデヒドラターゼ酵素によりグリセロールから生成される（式１）。このデヒドラターゼはグリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）またはこの転化を触媒することができるあらゆる他の酵素であってもよい。グリセロールデヒドラターゼはｄｈａレギュロンによりコードされるが、ジオールデヒドラターゼはそうではない。１，３−プロパンジオールはＮＡＤ+（もしくはＮＡＤＰ+）結合宿主酵素により３−ＨＰから生成され（式２）、またはその活性を組み換えにより宿主中に導入することができる。１，３−プロパンジオールの生成のこの最終反応を１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒することができる。
炭素チャネリング（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）に影響を及ぼす突然変異及び形質転換
１，３−プロパンジオール生産経路中に変異を含んでなる様々な突然変異体生物は本発明に有用である。微生物へのトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異（ｔｐｉ−）の導入は炭素チャネリングによる効率を上げるための突然変異の使用の例である。あるいはまた、エタノール（ａｄｈ）またはラクテート（ｌｄｈ）の生成を減少する突然変異は１，３−プロパンジオールの生産に対するＮＡＤＨの利用性を増す。ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｐｇｍ）のようなグリセルアルデヒド−３−リン酸の後の解糖の工程のさらなる突然変異は１，３−プロパンジオール生産経路への炭素の流れを増すために有用である。ＰＥＰの損失を防ぐＰＴＳのようなグルコース輸送をもたらす突然変異も有用となる可能性がある。また、グリセロール異化経路（ｇｌｐ）のような１，３−プロパンジオール生産経路の中間体の代替経路を妨げる突然変異も本発明に有用である。突然変異は酵素活性の活性を弱めるかもしくは上げるように構造遺伝子に対してでもよく、または酵素活性の発現レベルを調節するように調節遺伝子に対してでもよい。
あるいはまた、１，３−プロパンジオール生産の増大のために特定の酵素活性を制御するように形質転換と突然変異を組み合わせることができる。従って、１，３−プロパンジオールの増加した生産をもたらす全細胞触媒の改変を予想することは本発明の範囲内である。
１，３−プロパンジオールの同定及び精製：
発酵培地からの１，３−プロパンジオールの精製法法は当該技術分野で知られている。例えば、反応混合物を有機溶媒での抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに供することにより細胞培地からプロパンジオールを得ることができる（Ｕ．Ｓ．５，３５６，８１２）。この方法のための特に優れた有機溶媒はシクロヘキサンである（Ｕ．Ｓ．５，００８，４７３）。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に培地を供することにより直接１，３−プロパンジオールを同定することができる。本発明に好ましいものはアイソクラチックで０．０１Ｎ硫酸の移動相を用いて分析イオン交換カラムで発酵培地を分析する方法である。
Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの同定及び精製：
タンパク質Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの発現のレベルを酵素アッセイにより測定し、Ｇ３ＰＤＨ活性アッセイはＧ−３−ＰへのＤＨＡＰ転化における補助基質のＮＡＤＨの分光特性による。ＮＡＤＨは固有のＵＶ／可視吸収を有し、その消費を３４０ｎｍで分光光度計で調べることができる。反応で遊離される無機リン酸塩を測定するあらゆる方法によりＧ３Ｐホスファターゼ活性を測定することができる。最も一般的に用いられる検出方法は青色に着色したリンモリブデン酸アンモニウム錯体の可視分光測定を用いた。
実施例
一般法
リン酸化、ライゲーション及び形質転換の方法は当該技術分野でよく知られている。以下の実施例における使用のために適した技術をＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）中に見いだすことができる。
バクテリア培養物の維持及び増殖のために適した材料及び方法は当該技術分野でよく知られてい得る。以下の実施例における使用のために適した技術をＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｅｉｇ及びＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））中またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）中に記述されたように見いだすことができる。他に記載しないかぎり、バクテリア細胞の増殖及び維持のために用いた全ての試薬及び材料をＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
略語の意味は以下のとおりであり：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
酵素アッセイ
無細胞抽出物中のグリセロールデヒドラターゼ活性を１，２−プロパンジオールを基質として用いて測定した。メチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾンとアルデヒドの反応に基づくそのアッセイはＦｏｒａｇｅ及びＦｏｓｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、５６９、２４９（１９７９））により記述されている。同様に記述されているように、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼとも呼ばれれ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼの活性を１，３−プロパンジオール及びＮＡＤ+を基質として用いて溶液中またはスラブゲル中で測定した。Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＬｉｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６９、２０５０（１９８７）。記述されているように（Ｒ．Ｍ．Ｂｅｌｌ及びＪ．Ｅ．Ｃｒｏｎａｎ、Ｊｒ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０；７１５３−８（１９７５））、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消失により、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）活性を分光光度計で測定した。
グリセロール−３−ホスファターゼ、ＧＰＰのアッセイ
ビス−ＴｒｉｓまたはＭＥＳ及びマグネシウムバッファー、ｐＨ６．５中で抽出物を有機リン酸エステル基質とインキュベートすることにより酵素活性のアッセイを実施した。用いた基質は１−α−グリセロールリン酸；ｄ，ｌ−α−グリセロールリン酸であった。アッセイにおける試薬の最終濃度は：バッファー（２０ｍＭビス−Ｔｒｉｓまたは５０ｍＭ ＭＥＳ）；ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）；及び基質（２０ｍＭ）である。サンプル中の全タンパク質が少なく、酸クエンチで目に見える沈殿が生じない場合、サンプルをキュベット中で都合よくアッセイした。この方法は２０ｍＭの基質（５０μＬ、２００ｍＭ）、５０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ６．５バッファーを含有するキュベット中で酵素サンプルをインキュベートすることを含んだ。最終ホスファターゼアッセイ容量は０．５ｍＬであった。酵素を含有するサンプルを反応混合物に添加し；キュベットの中身を混合し、次に、キュベットをＴ＝３７℃で循環する水浴中に酵素サンプル中のホスファターゼ活性が２から０．０２Ｕ／ｍＬまでの範囲であるかどうかにより５ないし１２０分間置いた。酸性モリブデン酸塩試薬（０．４ｍＬ）の添加により酵素反応をクエンチした。Ｆｉｓｋｅ  ＳｕｂｂａＲｏｗ試薬（０．１ｍＬ）及び蒸留水（１．５ｍＬ）を添加した後、溶液を混合し、発色させた。１０分後にサンプルの吸光度をＣａｒｙ ２１９ ＵＶ／可視分光光度計を用いて６６０ｎｍで読み取った。ストック無機リン酸塩溶液（０．６５ｍＭ）を用いて０．０２６から０．１３０μｍｏｌ／ｍＬまでの範囲の最終無機リン酸塩濃度を有する６個の標準液を調製することにより作成した標準曲線に遊離された無機リン酸塩の量を比較した。
１，３−プロパンジオールの単離及び同定
１，３−プロパンジオールへのグリセロールの転化をＨＰＬＣにより調べた。クロマトグラフィーの当業者が利用できる標準技術及び材料を用いて分析を実施した。一つの適当な方法はＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩ検出を用いてＷａｔｅｒｓ  Ｍａｘｉｍａ  ８２０  ＨＰＬＣシステムを利用した。０．５ｍＬ／分の流速で０．０１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を移動相として用いて、５０℃に温度温度された、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１Ｐプレカラム（６ｍｍｘ５０ｍｍ）を備えたｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍｘ３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡから購入した）にサンプルを注入した。定量分析が所望される場合には、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いてサンプルを調製した。典型的に、グリセロール（ＲＩ検出）、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）及びトリメチル酢酸（ＵＶ及びＲＩ検出）の保持時間はそれぞれ２０．６７分、２６．０８分及び３５．０３分であった。
１，３−プロパンジオールの生成をＧＣ／ＭＳにより確かめた。ＧＣ／ＭＳの当業者が利用できる標準技術及び材料を用いて分析を実施した。一つの適当な方法はＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５９７１シリーズ質量選択的検出器及びＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍの長さ、０．２５ｍｍのｉ．ｄ．、０．２５ミクロンフィルムの厚さ）に連結されたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０シリーズIIガスクロマトグラフを利用した。生成された１，３−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを真の１，３−プロパンジオール（ｍ／ｅ：５７、５８）のものに比較した。
ＧＣ／ＭＳの代わりの方法はサンプルの誘導化を含んだ。１．０ｍＬのサンプル（例えば、培養上清）に３０μＬの濃（７０％ ｖ／ｖ）過塩素酸を添加した。混合した後、サンプルを冷凍し、凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥物質に添加し、強く混合し、６５℃で１時間置いた。遠心分離によりサンプルから不溶物を除いた。得られた液体は２相に分配し、上層を分析に用いた。サンプルをＤＢ−５カラム（４８ｍ、０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．、０．２５μｍフィルムの厚さ；Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）でクロマトグラフィーにより分離し、培養上清から得られた１，３−プロパンジオール誘導体の保持時間及び質量スペクトルを真の基準から得られたものに比較した。ＴＭＳで誘導された１，３−プロパンジオールの質量スペクトルは２０５、１７７、１３０及び１１５ ＡＭＵの特性イオンを含有する。
実施例１
１，３−プロパンジオールの発現のためのコスミドＤＮＡでのクローニング及びエシェリキア・コリ宿主細胞の形質転換
培地
１，３−プロパンジオールを製造する能力に関するバクテリア形質転換体のスクリーニングに合成Ｓ１２培地を用いた。Ｓ１２培地は：１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．７ｍＭ ＣａＣｌ2、５０μＭ ＭｎＣｌ2、１μＭ ＦｅＣｌ3、１μＭ ＺｎＣｌ、１．７μＭ ＣｕＳＯ4、２．５μＭ ＣｏＣｌ2、２．４μＭ Ｎａ2ＭｎＯ4及び２μＭチアミン塩酸塩を含む。
増殖及び発酵のために用いた培地Ａは：１０ｍＭ硫酸アンモニウム；５０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．５；５ｍＭ リン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５；２ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．７ｍＭ ＣａＣｌ2；５０μＭ ＭｎＣｌ2；１μＭ ＦｅＣｌ3；１μＭ ＺｎＣｌ；１．７２μＭ ＣｕＳＯ4；２．５３μＭ ＣｏＣｌ2；２．４２μＭ Ｎａ2ＭｎＯ4；２μＭチアミン塩酸塩；０．０１％酵母エキス；０．０１％カザミノ酸；０．８μｇ／ｍＬビタミンＢ12及び５０μｇ／ｍＬアンピシリンからなった。必要な場合、０．２％グリセロールまたは０．２％グリセロール＋０．２％ Ｄ−グルコースのいずれかを培地Ａに補足した。
細胞：
文献でクレブシエラ・エロゲネス（Ｋ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）またはエロバクター・エロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）としても知られているクレブシエラ・ニューモニエＥＣＬ２１０６（Ｒｕｃｈ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１２４、３４８（１９７５））をＥ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から得、実験室培養物として維持した。
クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。
エシェリキア・コリＤＨ５αをＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入し、グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ酵素のいずれかをコードする遺伝子を含有するクレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５から単離されたコスミドＤＮＡで形質転換した。グリセロールデヒドラターゼを含有するコスミドをｐＫＰ１及びｐＫＰ２として同定し、ジオールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドをｐＫＰ４として同定した。形質転換されたＤＨ５αをＤＨ５α−ｐＫＰ１、ＤＨ５α−ｐＫＰ２及びＤＨ５α−ｐＫＰ４として同定した。
エシェリキア・コリＥＣＬ７０７（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３５、１２５５（１９８９））をＥ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から得、クレブシエラ・ニューモニエからのコスミドＤＮＡで同様に形質転換した。これらの形質転換体をグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＥＣＬ７０７−ｐＫＰ１及びＥＣＬ７０７−ｐＫＰ２並びにジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＥＣＬ７０７−ｐＫＰ４として同定した。
ｔｐｉ遺伝子（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６２、３２９（１９７０））に突然変異を含有するエシェリキア・コリＡＡ２００をＥ．Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から購入し、クレブシエラコスミドＤＮＡで形質転換してグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有する組み換え生物ＡＡ２００−ｐＫＰ１及びＡＡ２００−ｐＫＰ２並びにジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＡＡ２００−ｐＫＰ４を得た。
ＤＨ５α：
クレブシエラ・ニューモニエＤＮＡでトランスフェクトした約１，０００コロニーのエシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲを含有する６枚の形質転換プレートを５ｍＬのＬＢ培地で洗浄し、遠心分離した。バクテリアをペレットにし、５ｍｌのＬＢ培地＋グリセロールに再懸濁した。０．２％グリセロール＋４００ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ12＋０．００１％酵母エキス＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＳ１２合成培地を含有する１５ｍＬのチューブにアリコート（５０μＬ）を接種した。培地でチューブを最上部まで満たし、パラフィルムで包み、３０℃でインキュベートした。４８時間後にわずかな濁りが見られた。７８時間及び１３２時間で上記のように生成物区分に関して分析したアリコートは１，３−プロパンジオールに関して陽性であり、後者の時点は増加した量の１，３−プロパンジオールを含有した。
１，３−プロパンジオール生産に関して陽性結果であるバクテリアを単一コロニーを単離するために連続希釈してＬＢ−５０ａｍｐプレートで培養した。４８個の単一コロニーが単離され、それらを再び１，３−プロパンジオールの生産に関して調べた。６個の別個のクローンからコスミドＤＮＡを単離し、エシェリキア・コリ株ＤＨ５α中に形質転換した。形質転換体を再び１，３−プロパンジオールの生産に関して調べた。２個の形質転換体をさらに特性化し、ＤＨ５α−ｐＫＰ１及びＤＨ５α−ｐＫＰ２と称した。
ｐＩＢＩ３１（ＩＢＩ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）中にサブクローン化した、ｐＫＰ１からの１２．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントをシークエンスし、ｐＨＫ２８−２６（配列番号１９）と称した。シークエンシングからグリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａオペロンの関係のあるオープンリーディングフレーム及び調節のために必要な遺伝子の遺伝子座が明らかになった。配列番号１９に関して、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするｄｈａＫのオープンリーディングフレームのフラグメントは塩基１−３９９で見いだされ；グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＤは塩基９８３−２１０７で見いだされ；リプレッサーをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＲは塩基２２０９−４１３４に見いだされ；１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＴは塩基５０１７−６１８０で見いだされ；αサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＢ１は塩基７０４４−８７１１に見いだされ；βサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＢ２は塩基８７２４−９３０８に見いだされ；γサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＢ３は塩基９３１１−９７３６に見いだされ；そして未知の機能のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームｄｈａＢＸは塩基９７４９−１１５７２に見いだされる。
クレブシエラ・ニューモニエからのパッケージングされたコスミドＤＮＡでトランスフェクトしたエシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲの単一コロニーを２００μＬのＳ１５培地（硫酸アンモニウム、１０ｍＭ；リン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、１ｍＭ；ＭＯＰＳ／ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．０、５０ｍＭ；ＭｇＣｌ2、２ｍＭ；ＣａＣｌ2、０．７ｍＭ；ＭｎＣｌ2、５０μＭ；ＦｅＣｌ3、１μＭ；ＺｎＣｌ、１μＭ；ＣｕＳＯ4、１．７２μＭ；ＣｏＣｌ2、２．５３μＭ；Ｎａ2ＭｎＯ4、２．４２μＭ；及びチアミン塩酸塩、２μＭ）＋０．２％グリセロール＋４００ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ12＋０．００１％酵母エキス＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するマイクロタイターウェル中に接種した。マイクロタイターウェルに加えて、ＬＢ−５０ａｍｐを含有するマスタープレートにも接種した。９６時間後に１００μＬを取り出し、０．２ミクロンのナイロン膜フィルターを含有するＲａｉｎｉｎ微量遠心管で遠心分離した。バクテリアは保持され、濾過液をＨＰＬＣ分析のために処理した。約２４０コロニーをスクリーニングした後、１，３−プロパンジオール生産を示す陽性クローンを同定した。３個の陽性クローンを同定し、それらのうち２個はＬＢ−５０ａｍｐで生育し、１個は生育しなかった。ＬＢ−５０ａｍｐで生育した２個の陽性クローンのうちの１個から単離し、そして１，３−プロパンジオールの生産に関して確かめた単一コロニーをｐＫＰ４と称した。ｐＫＰ４を含有するエシェリキア・コリ株からコスミドＤＮＡを単離し、エシェリキア・コリ株ＤＨ５αを形質転換した。ＤＨ５α−ｐＫＰ４と命名した別個の形質転換体を１，３−プロパンジオールの生産に関して確かめた。
ＥＣＬ７０７：
ｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４のいずれかに相当するコスミドクレブシエラ・ニューモニエＤＮＡまたはＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみでエシェリキア・コリ株ＥＣＬ７０７を形質転換し、それぞれ、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ１、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ２、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ４及びＥＣＬ７０７−ｓｃと命名した。ＥＣＬ７０７はＡＴＰ依存性グリセロールキナーゼ、ＮＡＤ+−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ及びホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系のジヒドロキシアセトンの酵素IIをそれぞれコードするｇｌｐＫ、ｇｌｄ及びｐｔｓＤを欠損している。
ＬＢ−５０ａｍｐプレートから単離された、各コスミド形質転換体の２０個の単一コロニー及び５個のＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみ（陰性コントロール）の形質転換体をマスターＬＢ−５０ａｍｐプレートに移した。また、これらの単離体がデヒドラターゼ活性を含有するかどうかを決定するためにグリセロールを１，３−プロパンジオールに転化するそれらの能力に関しても試験した。０．２％グリセロールまたは０．２％グリセロール＋０．２％Ｄ−グルコースのいずれかを補足した２００μＬの培地Ａを含有するマイクロタイタープレートに形質転換体を滅菌したつまようじで移した。３０℃で４８時間インキュベーション後、マイクロタイタープレートウェルの中身を０．４５ミクロンナイロンフィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣでクロマトグラフィーにより分離した。これらの試験の結果を表１に示す。
0004327909.tif 000002
ＡＡ２００：
ｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４のいずれかに相当するコスミドクレブシエラ・ニューモニエＤＮＡまたはＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみでエシェリキア・コリ株ＡＡ２００を形質転換し、それぞれ、ＡＡ２００−ｐＫＰ１、ＡＡ２００−ｐＫＰ２、ＡＡ２００−ｐＫＰ４及びＡＡ２００−ｓｃと命名した。株ＡＡ２００はトリオースリン酸イソメラーゼを欠損している（ｔｐｉ-）。
各コスミド形質転換体の２０個の単一コロニー及び５個の空のベクター形質転換体を単離し、そしてエシェリキア・コリ株ＥＣＬ７０７に対して記述したようにグリセロールを１，３−プロパンジオールに転化するそれらの能力に関して試験した。これらの試験の結果を表２に示す。
0004327909.tif 000003
実施例２
ＤＡＲ１、ＧＰＰ２、ｄｈａＢ及びｄｈａＴを用いた組み換えエシェリキア・コリによる１，３−プロパンジオールへのＤ−グルコースの転化
エシェリキア・コリの形質転換における使用のための汎用発現プラスミドの構築
発現ベクターｐＴａｃＩＱ
エシェリキア・コリ発現ベクター、ｐＴａｃＩＱはｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ等、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３、７７（１９７９））のＥｃｏＲＩ中に挿入されたｌａｃＩｑ遺伝子（Ｆａｒａｂａｕｇｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ２７４、５６７３（１９７８））及びｔａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ等、Ｇｅｎｅ  ２５、１６７（１９８３））を含有する。マルチプルクローニング部位及びターミネーター配列（配列番号２０）がＥｃｏＲＩからＳｐｈＩまでのｐＢＲ３２２配列に置き換わる。
グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ｄｈａＢ１、２、３）のサブクローニング
プライマー（配列番号２１及び２２）を用いてＰＣＲによりｐＨＫ２８−２６からｄｈａＢ３遺伝子のオープンリーディングフレーム（５’末端にＥｃｏＲＩ部位そして３’末端にＸｂａＩ部位を含む）を増幅した。生成物をｐＬｉｔｍｕｓ２９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中にサブクローン化してｄｈａＢ３を含有するプラスミドｐＤＨＡＢ３を作製した。
ｐＨＫ２８−２６からのｄｈａＢオペロンの４個の遺伝子の全コーディング領域を含有する領域を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローン化してプラスミドｐＭ７を作製した。
ｄｈａＢ（１、２、３、４）を含有するプラスミドｐＭ７をＡｐａＩ及びＸｂａＩで消化する（ｄｈａＢ３の一部及びｄｈａＢＸの全部を欠失する）ことによりｄｈａＢＸ遺伝子を除いた。得られた５．９ｋｂのフラグメントを精製し、プラスミドｐＤＨＡＢ３からの３２５ｂｐ ＡｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントと連結して（ｄｈａＢ３遺伝子を元に戻す）ｄｈａＢ（１、２、３）を含有するｐＭ１１を作製した。
プライマー（配列番号２３及び配列番号２４）を用いてＰＣＲによりｐＨＫ２８−２６からｄｈａＢ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（５’末端にＨｉｎｄIII部位及び共通ＲＢＳリボソーム結合部位そして３’末端にＸｂａＩ部位を含む）を増幅した。生成物をｐＬｉｔｍｕｓ２９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．）中にサブクローン化してｄｈａＢ１を含有するプラスミドｐＤＴ１を作製した。
ｄｈａＢ１遺伝子の一部、ｄｈａＢ２遺伝子及びｄｈａＢ３遺伝子を含有するＭ１１からのＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＤＴ１中に挿入してｄｈａＢ発現プラスミド、ｐＤＴ２を作製した。ｐＤＴ２からのｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有するＨｉｎｄIII−ＸｂａＩフラグメントをｐＴａｃＩＱ中に挿入してｐＤＴ３を作製した。
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のサブクローニング
完全な１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）遺伝子を含有する、ｐＨＫ２８−２６のＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ+中にサブクローン化してプラスミドｐＡＨ１を作製した。合成プライマー（配列番号２５と配列番号２６）を用いて鋳型ＤＮＡとしてｐＡＨ１からＰＣＲによりｄｈａＴ遺伝子（５’末端にＸｂａＩ部位そして３’末端にＢａｍＨＩ部位を含む）を増幅した。生成物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にＳｒｆＩ部位でサブクローン化してｄｈａＴを含有するプラスミドｐＡＨ４及びｐＡＨ５を作製した。プラスミドｐＡＨ４はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ中のｌａｃプロモーターからの発現のために正しい向きにｄｈａＴ遺伝子を含有し、そしてｐＡＨ５は反対向きにｄｈａＴ遺伝子を含有する。ｄｈａＴ遺伝子を含有するｐＡＨ４からのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＴａｃＩＱ中に挿入してプラスミドｐＡＨ８を作製した。ＲＢＳ及びｄｈａＴ遺伝子を含有するｐＡＨ８からのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ+中に挿入してｐＡＨ１１を作製した。ＲＢＳ、ｄｈａＴ遺伝子及びターミネーターを含有するｐＡＨ８からのＨｉｎｄIII−ＳａｌＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ+中に挿入してｐＡＨ１２を作製した。
ｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴの発現カセットの構築
標準的な分子生物学方法を用いて上記の個々のｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴサブクローンからｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴの発現カセットを組み立てた。ＲＢＳ、ｄｈａＴ遺伝子及びターミネーターを含有するｐＡＨ８からのＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＤＴ３のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ部位中に挿入してｐＡＨ２３を作製した。ｐＡＨ２３のｄｈａＢ３とｄｈａＴ遺伝子の間のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを除いてｐＡＨ２６を作製した。ｐＤＴ２からのＥｃｏＲＩ部位を含有するＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを用いてｐＡＨ２６のＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを置き換えてｐＡＨ２７を作製した。
ｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）の発現カセットの構築
標準的な分子生物学方法を用いて先に記述した個々のｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴサブクローンからｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）の発現カセットを組み立てた。ｐＤＴ３からのｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有するＳｐｅＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＡＨ１１中にＳｐｅＩ−ＳａｃＩ部位で挿入してｐＡＨ２４を作製した。
エシェリキア・コリにおける増加したグリセロール生産のためのグリセロール３−ホスファターゼのクローニング及び発現
サッカロミセス・セレビシエ染色体Ｖラムダクローン６５９２（ジーンバンク、受託番号Ｕ１８８１３ｘ１１）をＡＴＣＣから購入した。合成プライマー（配列番号２７と配列番号２８）を用いて標的ＤＮＡとしてそのラムダクローンからＰＣＲクローニングによりグリセロール３−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）遺伝子（５’末端にＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＸｂａＩ部位そして３’末端にＳｍａＩ部位を含む）をクローン化した。生成物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にＳｒｆＩ部位でサブクローン化してＧＰＰ２を含有するプラスミドｐＡＨ１５を作製した。プラスミドｐＡＨ１５はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+中のｌａｃプロモーターからの発現のために不活性の向きにＧＰＰ２遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１５からのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+中に挿入してプラスミドｐＡＨ１９を作製した。ｐＡＨ１９はｌａｃプロモーターからの発現のために正しい向きにＧＰＰ２遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＸｂａＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＰＨＯＸ２中に挿入してプラスミドｐＡＨ２１を作製した。
ｄｈａＴ、ｄｈａＢ（１、２、３）及びＧＰＰ２遺伝子の発現のためのプラスミド
制限酵素ＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化したｐＡＨ５中にＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩリンカー（配列番号２９及び３０）を挿入してｐＤＴ１６を作製した。そのリンカーはＸｂａＩ部位を消失させる。次に、ｐＤＴ１６からの１ｋｂ ＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントをｐＡＨ２４中に挿入し、存在するＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントを置き換えてｐＤＴ１８を作製した。
ｐＤＴ１８からのｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）の発現カセットを含有する４．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメント及びｐＡＨ２１からのＧＰＰ２遺伝子を含有する１．０ｋｂ ＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したベクターｐＭＭＢ６６ＥＨ
0004327909.tif 000004
中に挿入してｐＤＴ２０を作製した。
エシェリキア・コリにおけるＤＡＲ１の過剰発現のためのプラスミド
合成プライマー（配列番号４６と配列番号４７）を用いてサッカロミセス・セレビシエゲノムＤＮＡからＰＣＲクローニングによりＤＡＲ１を単離した。成功したＰＣＲクローニングはＤＡＲ１の５’末端にＮｃｏＩ部位を配置し、その場合、ＮｃｏＩ内のＡＴＧはＤＡＲ１の開始メチオニンである。ＤＡＲ１の３’末端では翻訳ターミネーターの後にＢａｍＨＩ部位が導入される。ＰＣＲフラグメントをＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）内の同じ部位中にクローン化してｐＤＡＲ１Ａを得た。
より優れたリボソーム結合部位をＤＡＲ１の５’末端に作製するために、合成プライマー（配列番号４８と配列番号４９）をアニーリングすることにより得られるＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＤＡＲ１ＡのＮｃｏＩ部位中に挿入してｐＡＨ４０を作製した。プラスミドｐＡＨ４０はＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のｔｒｃプロモーターからの発現のために正しい向きに新しいＲＢＳ及びＤＡＲ１遺伝子を含有する。ｐＤＡＲ１ＡからのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び合成プライマー（配列番号３１と配列番号３２）をアニーリングすることにより得られる２組目のＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II−ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位中に挿入してｐＡＨ４１を作製した。構築物ｐＡＨ４１はアンピシリン耐性遺伝子を含有する。ｐＤＡＲ１ＡからのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び合成プライマー（配列番号３１と配列番号３２）をアニーリングすることにより得られる２組目のＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＢＣ−ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位中に挿入してｐＡＨ４２を作製した。構築物ｐＡＨ４２はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
ＤＡＲ１及びＧＰＰ２の発現カセットの構築
標準的な分子生物学方法を用いて上記の個々のＤＡＲ１及びＧＰＰ２サブクローンからＤＡＲ１及びＧＰＰ２の発現カセットを組み立てた。ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４０中に挿入してｐＡＨ４３を作製した。ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４１中に挿入してｐＡＨ４４を作製した。ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からの同じＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４２中にも挿入してｐＡＨ４５を作製した。
エシェリキア・コリ株の構築
エシェリキア・コリＷ１４８５は野生型Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ １２４３５）である。この株をプラスミドｐＤＴ２０及びｐＡＨ４２で形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補足したＬＡ（ルリア寒天、Ｄｉｆｃｏ）で選択した。
グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産
１リットル当たり２２．５ｇのグルコース、６．８５ｇのＫ2ＨＰＯ4、６．３ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇのＮａＨＣＯ3、２．５ｇのＮａＣｌ、８ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン、２．５ｍｇのビタミンＢ12、２．５ｍＬの修正バルチ（Ｂａｌｃｈ’ｓ）微量元素溶液、５０ｍｇのカルベニシリン及び１０ｍｇのクロラムフェニコールを含有し、最終ｐＨ６．８（ＨＣｌ）、次に濾過滅菌した５０ｍＬの培地にエシェリキア・コリＷ１４８５／ｐＤＴ２０／ｐＡＨ４２をプレートから移す。修正バルチ微量元素溶液の組成をＭｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ等、編集、ｐ１５８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４））中に見いだすことができる。３７℃、３００ｒｐｍで６時間インキュベートした後、０．５ｇのグルコース及びＩＰＴＧ（最終濃度＝０．２ｍＭ）を添加し、振盪を１００ｒｐｍに下げた。サンプルをＧＣ／ＭＳにより分析した。２４時間後に、Ｗ１４８５／ｐＤＴ２０／ｐＡＨ４２は１．１ｇ／Ｌのグリセロール及び１９５ｍｇ／ｍＬの１，３−プロパンジオールを生産した。
実施例３
サッカロミセス・セリビシエにおけるｄｈａＢ及びｄｈａＴのクローニング及び発現
複製するエピソーム成分として存在することができる発現プラスミドを４個のｄｈａ遺伝子の各々に対して構築した。全ての発現プラスミドには酵母ＡＤＨ１プロモーターが存在し、１つまたはそれより多い制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するＤＮＡのフラグメントで酵母ＡＤＨ１転写ターミネーターから隔てられている。また、各発現プラスミドはアンピシリンを含有する培地でのエシェリキア・コリにおける選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、エシェリキア・コリにおけるプラスミドの維持のための複製起点及びサッカロミセス・セリビシエにおける維持のための２ミクロン複製起点も含有する。酵母に対して用い、発現プラスミド上に存在する選択栄養マーカーは以下のもの：イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼをコードするＨＩＳ３遺伝子、オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素をコードするＵＲＡ３遺伝子、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸イソメラーゼをコードするＴＲＰ１遺伝子及びβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするＬＥＵ２のいずれかであった。
５’末端にＥｃｏＲＩ部位を含むプライマー（ｄｈａＴ、ｄｈａＢ３、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ１に対してそれぞれ配列番号３８と配列番号３９、配列番号４０と配列番号４１、配列番号４２と配列番号４３及び配列番号４４と配列番号４５）を用いてＰＣＲによりｐＨＫ２８−２６（配列番号１９）からｄｈａＴ、ｄｈａＢ３、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ１のオープンリーディングフレームを増幅した（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０００１％ゼラチン、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、１μＭの各プライマー、１−１０ｎｇの標的ＤＮＡ、２５ユニット／ｍＬ ＡｍｐｌｉｔａｑTM（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ））。ＰＣＲパラメーターは９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分、３５サイクルであった。生成物をｐＨＩＬ−Ｄ４（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）のＥｃｏＲＩ部位中にサブクローン化してｄｈａＴ、ｄｈａＢ３、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ１をそれぞれ含有するプラスミドｐＭＰ１３、ｐＭＰ１４、ｐＭＰ２０及びｐＭＰ１５を作製した。
ｄｈａＢ１発現プラスミドｐＭＣＫ１０の構築
７．８ｋｂの複製プラスミドｐＧＡＤＧＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）をＨｉｎｄIIIで消化し、脱リン酸化し、そしてｐＭＰ１５からのｄｈａＢ１ ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結した。得られたプラスミド（ｐＭＣＫ１０）はＡＤＨ１プロモーターからの転写のために正しい向きのｄｈａＢ１を有し、そしてＬＥＵ２マーカーを含んだ。
ｄｈａＢ２発現プラスミドｐＭＣＫ１７の構築
プラスミドｐＧＡＤＧＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）をＨｉｎｄIIIで消化し、ＨｉｎｄIII−ＸｍｎＩ及びＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩアダプター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）とのライゲーションにより一本鎖末端をＥｃｏＲＩ末端に転化した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ）からのＥｃｏＲＩフラグメント上のカナマイシン耐性遺伝子に連結し、エシェリキア・コリ株ＤＨ５α中に形質転換し、そして２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートで選択することにより正しいＥｃｏＲＩ末端を有するプラスミドの選択を実施した。得られたプラスミド（ｐＧＡＤ／ＫＡＮ２）をＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーターを含む１．８ｋｂのフラグメントを単離した。プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）をＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、１．５ｋｂのＡＤＨ１／ＧＡＬ４フラグメントをＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりｐＧＡＤ／ＫＡＮ２から単離した１．８ｋｂのＡＤＨ１プロモーターフラグメントで置き換えた。得られたベクター（ｐＭＣＫ１１）はＡＤＨ１プロモーター及びターミネーター並びにＴＲＰ１マーカーを有する酵母における複製プラスミドである。プラスミドｐＭＣＫ１１をＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、そしてｐＭＰ２０からのｄｈａＢ２ ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。得られたプラスミド（ｐＭＣＫ１７）はＡＤＨ１プロモーターからの転写のために正しい向きのｄｈａＢ２を有し、そしてＴＲＰ１マーカーを含んだ。
ｄｈａＢ３発現プラスミドｐＭＣＫ３０の構築
プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮａｅＩ及びＰｖｕIIで消化し、１ｋｂのＴＲＰ１遺伝子をこのベクターから除いた。ＴＲＰ１遺伝子をプラスミドｐＲＳ４０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの１．７ｋｂ ＡａｔII／ＮａｅＩフラグメントとして与えられるＵＲＡ３遺伝子で置き換えて中間ベクターｐＭＣＫ３２を得た。ｐＭＣＫ３２上に存在する欠失したＡＤＨ１プロモーターを１．５ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントで取り除き、プラスミドｐＧＡＤ／ＫＡＮ２からの１．８ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上の全長のＡＤＨ１プロモーターで置き換えてベクターｐＭＣＫ２６を得た。ｐＭＣＫ２６上の唯一のＥｃｏＲＩ部位を用いてプラスミドｐＭＰ１４からのｄｈａＢ３を含むＥｃｏＲＩフラグメントを挿入してｐＭＣＫ３０を得た。ｐＭＣＫ３０複製発現プラスミドはＡＤＨ１プロモーターからの発現のための向きのｄｈａＢ３を有し、そしてＵＲＡ３マーカーを含んだ。
ｄｈａＴ発現プラスミドｐＭＣＫ３５の構築
プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮａｅＩ及びＰｖｕIIで消化し、１ｋｂのＴＲＰ１遺伝子をこのベクターから除いた。ＴＲＰ１遺伝子をプラスミドｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＸｍｎＩ／ＮａｅＩフラグメントとして与えられるＨＩＳ３遺伝子で置き換えて中間ベクターｐＭＣＫ３３を得た。ｐＭＣＫ３３上に存在する欠失したＡＤＨ１プロモーターを１．５ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントで取り除き、プラスミドｐＧＡＤ／ＫＡＮ２からの１．８ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上の全長のＡＤＨ１プロモーターで置き換えてベクターｐＭＣＫ３１を得た。ｐＭＣＫ３１上の唯一のＥｃｏＲＩ部位を用いてプラスミドｐＭＰ１３からのｄｈａＴを含むＥｃｏＲＩフラグメントを挿入してｐＭＣＫ３５を得た。ｐＭＣＫ３５複製発現プラスミドはＡＤＨ１プロモーターからの発現のための向きのｄｈａＴを有し、そしてＨＩＳ３マーカーを含んだ。
ｄｈａ発現プラスミドでのサッカロミセス・セレビシエの形質転換
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入したサッカロミセス・セレビシエ株ＹＰＨ５００（ｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−△６３ ｈｉｓ３−△２００ ｌｅｕ２−△１）（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  Ｒ．Ｓ．及びＨｉｅｔｅｒ  Ｐ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２、１９−２７、（１９８９））をＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キット（カタログ番号Ｔ２００１）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いて１−２μｇのプラスミドＤＮＡで形質転換した。１つまたはそれより多い以下のもの：アデニン硫酸（２０ｍｇ／Ｌ）、ウラシル（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン（３０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リシン（３０ｍｇ／Ｌ）を添加して補足最小培地（ＳＭＭ−０．６７％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基（ｂａｓｅ）、２％グルコース）でコロニーを２９℃で３−４日間増殖させた。コロニーを選択プレート上に延ばし、液体培地に接種するために用いた。
ｄｈａ遺伝子に関するサッカロミセス・セレビシエ形質転換体のスクリーニング
ＵＲＡ+、ＨＩＳ+、ＴＲＰ+、ＬＥＵ+形質転換体からの染色体ＤＮＡを各遺伝子に特異的なプライマー（配列番号３８−４５）を用いてＰＣＲにより分析した。４個全てのオープンリーディングフレームの存在が確かめられた。
形質転換されたサッカロミセス・セレビシエにおけるｄｈａＢ及びｄｈａＴ活性の発現
インビトロ酵素アッセイを用いて活性のあるグリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）の存在を示した。さらに、ウェスタンブロット分析により４個全てのオープンリーディングフレームからのタンパク質発現が確かめられた。
プラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５の群で形質転換された株ＹＰＨ５００を０．６７％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、２％グルコース、２０ｍｇ／Ｌアデニン硫酸及び３０ｍｇ／Ｌ Ｌ−リシンを含有する補足最小培地で増殖させた。細胞をホモジナイズし、抽出物をｄｈａＢ活性に関してアッセイした。グリセロールデヒドラターゼには０．１２ユニット／ｍｇタンパク質、そして１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼには０．０２４ユニット／ｍｇタンパク質の比活性が得られた。
実施例４
組み換えサッカロミセス・セレビシエを用いたＤ−グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産
プラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５の群を保有するサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００を最初に２０ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、４０ｍｇ／Ｌのアデニン硫酸及び６０ｍｇ／ＬのＬ−リシンＨＣｌを含有する１．０Ｌの最小培地中でＢｉｏｓｔａｔＢファーメンター（Ｂ  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で増殖させた。増殖の期間中に、さらなる当量の酵母窒素塩基、アデニン及びリシンを添加した。１０％のリン酸及び２ＭのＮａＯＨの添加でｐＨ５．５、３０℃、及び振盪制御により４０％の溶存酸素圧力にファーメンターを制御した。３８時間後に、細胞（ＯＤ600＝５．８ＡＵ）を遠心分離により集め、基本培地（６．７ｇ／Ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、２０ｍｇ／Ｌアデニン硫酸、３０ｍｇ／Ｌ Ｌ−リシンＨＣｌ及び５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）に再懸濁した。
０．５％のグルコース、５μｇ／ｍＬの補酵素Ｂ12及び０、１０、２０または４０ｍＭのクロロキンを補足した４ｍＬの全容量の基本培地中に細胞（ＯＤ600＝２０ＡＵ）を含有する反応混合物を１０ｍＬのクリンプ密封血清ボトル中に光及び酸素の非存在下で（窒素分散）調製し、振盪しながら３０℃でインキュベートした。３０時間後にアリコートを取り出し、ＨＰＬＣにより分析した。結果を表３に示す。
0004327909.tif 000005
実施例５
Ｄ−グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産のための、ｄｈａＢ及びｄｈａＴがゲノム中に組込まれているサッカロミセス・セレビシエ二重形質転換体の使用
実施例５はグルコースからの１，３−プロパンジオールの製造のためのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴでのサッカロミセス・セレビシエの形質転換及び酵母ゲノム中へのそれらの遺伝子の安定な組込みをｐｈｒｏｐｈｅｔｉｃａｌｌｙに示す。
発現カセットの構築
４個の発現カセット（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴ）を酵母のサッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの遺伝子のグルコース誘導性で高レベルの構成的発現のために構築する。これらのカセットは（ｉ）サッカロミセス・セレビシエ株Ｓ２８８Ｃからのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター；（ii）遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３またはｄｈａＴのいずれか；及び（iii）サッカロミセス・セレビシエ株Ｓ２８８ＣからのＰＧＫターミネーターからなる。重複伸長によるＰＣＲに基づく遺伝子スプライシングの技術（Ｈｏｒｔｏｎ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８：５２８−５３５、（１９９０））を用いてＤＮＡ配列を再結合し、各遺伝子の最適発現のために継目なく連結されたこれらのカセットを作製する。酵母発現プラスミドにおいて複数のカセットクローニングができる制限部位を有する適当なベクター（ｐＬＩＴＭＵＳ３９）中にこれらのカセットを別個にクローン化する。
酵母組込みベクターの構築
酵母ゲノム中への発現カセットの組込みをもたらすために用いるベクターを構築する。これらのベクターは以下の成分：（ｉ）発現カセットをサブクローン化するポリクローニング領域；（ii）安定な酵母形質転換体を選択するために用いる独特なマーカー；（iii）酵母を形質転換する前のエシェリキア・コリにおける遺伝子操作を可能にする複製起点及び選択マーカーを含有する。一つの組込みベクターはＵＲＡ３栄養要求性マーカーを含有し（ＹＩｐ３５２ｂ）、もう一つの組込みベクターはＬＹＳ２栄養要求性マーカーを含有する（ｐＫＰ７）。
酵母発現プラスミドの構築
ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ２の発現カセットをＹＩｐ３５２ｂのポリクローニング領域中にサブクローン化し（発現プラスミド＃１）、そしてｄｈａＢ３及びｄｈａＴの発現カセットをｐＫＰ７のポリクローニング領域中にサブクローン化する（発現プラスミド＃２）。
発現プラスミドでの酵母の形質転換
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いてサッカロミセス・セレビシエ（ｕｒａ３、ｌｙｓ２）を発現プラスミド＃１で形質転換し、そしてウラシルを欠いたプレートで形質転換体を選択する。ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ２の発現カセットの組込みを染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により確かめる。選択した形質転換体をＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キットを用いて発現プラスミド＃２で再形質転換し、そしてリシンを欠いたプレートで二重形質転換体を選択する。ｄｈａＢ３及びｄｈａＴの発現カセットの組込みを染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により確かめる。二重形質転換体中の４個全ての発現カセット（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、ｄｈａＴ）の存在を染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により確かめる。
二重に形質転換された酵母からのタンパク質の生産
二重に形質転換された酵母からのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴによりコードされるタンパク質の生産をウェスタンブロット分析により確かめる。
二重に形質転換された酵母からの酵素活性
二重に形質転換された酵母からの活性グリセロールデヒドラターゼ及び活性１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを上の一般法で記述したような酵素アッセイにより確かめる。
二重に形質転換された酵母からの１，３−プロパンジオールの生産
二重に形質転換された酵母におけるグルコースからの１，３−プロパンジオールの生産を本質的に実施例４に記述したように示す。
実施例６
ＤＡＲ１／ＧＰＰ２またはｄｈａＴ／ｄｈａＢ１−３を含有するプラスミドの構築及びクレブシエラ種への形質転換
クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）及びクレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．Ｏｘｙｔｏｃａ）（ＡＴＣＣ ８７２４）は生来アンピシリン（１５０μｇ／ｍＬまで）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬまで）に耐性であるが、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に感受性である。その結果、これら後者２つの抗生物質に対する耐性をコードする複製プラスミドはこれらのクレブシエラ株のクローニングベクターとして潜在的に有用である。中等度コピー数のプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のエレクトロポレーションにより、野生型のクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）、グルコースにより活性化されるクレブシエラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）及びクレブシエラ・オキシトカ（ＡＴＣＣ ８７２４）をうまくテトラサイクリン耐性に形質転換した。以下の方法によりこれを成し遂げた。１０ｍＬの一晩培養物を１ＬのＬＢ（１％（ｗ／ｖ）バクト−トリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、０．５％（ｗ／ｖ）バクト−酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）及び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））中に接種し、培養物を０．５−０．７のＯＤ600まで３７℃でインキュベートした。細胞を氷上で冷やし、４０００ ｘ ｇで１５分間の遠心分離により集め、そして１Ｌのよく冷えた滅菌した１０％グリセロール中に再懸濁した。細胞を遠心分離により繰り返し集め、段階的に５００ｍＬ、２０ｍＬ、そして最後に２ｍＬのよく冷えた滅菌した１０％グリセロール中に再懸濁した。エレクトロポレーションのために、冷やした０．２ｃｍキュベット中で４０μＬの細胞を１−２μＬのＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて２００Ω、２．５ｋＶで４−５ミリ秒間パルスを与えた。１μＬのＳＯＣ培地（２％（ｗ／ｖ）バクト−トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％（ｗ／ｖ）バクト−酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１０μＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＭｇＣｌ2、１０μＭ ＭｇＳＯ4、２．５μＭ ＫＣｌ及び２０μＭグルコース）を細胞に添加し、懸濁液を１７ ｘ １００ｍｍの滅菌したポリプロピレンチューブに移した後、培養物を３７℃、２２５ｒｐｍで１時間インキュベートした。アリコートを示したような選択培地上で培養した。別個のテトラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡの分析からｐＢＲ３２２の典型的な制限エンドヌクレアーゼ消化パターンが示され、ベクターがテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ中３７℃で一晩培養後に安定に維持されたことを示す。従って、クレブシエラ・ニューモニエ及びクレブシエラ・オキシトカ中にＤＡＲ１／ＧＰＰ２及びｄｈａＴ／ｄｈａＢ１−３発現カセットを導入するためにこのベクター並びにアンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールに対する耐性をコードするｐＢＲ３２９（ＡＴＣＣ ３７２６４）のような誘導体を用いることができる。
ＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子をそれらの既知のＤＮＡ配列に基づいて、サッカロミセス・セレビシエゲノムからＰＣＲでの増幅により得ることができる。次に、グルコースを含有する培地中でそれらの遺伝子の発現を導くために用いることができる１つまたはそれより多いプロモーターの制御下でそれらをクレブシエラ・ニューモニエまたはクレブシエラ・オキシトカ中に形質転換する。便宜上、プラスミドｐＡＨ４４のＰｖｕII制限エンドヌクレアーゼでの消化により得られる２．４ｋｂ ＤＮＡフラグメント上にそれらの遺伝子を得、それによりそれらの遺伝子はすでにエシェリキア・コリｌａｃプロモーターの制御下で発現カセット中に配置されている。このＤＮＡフラグメントをＰｖｕIIで消化したｐＢＲ３２９に連結し、そのクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入不活化を生じた。連結されたＤＮＡを用いてエシェリキア・コリＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を形質転換した。形質転換体をテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）に対するそれらの耐性により選択し、そしてクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に対するそれらの感受性に関してスクリーニングした。テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール感受性の形質転換体からのプラスミドＤＮＡの分析により、Ｐlac−ｄａｒ１−ｇｐｐ２発現カセットがｐＢＲ３２９のＰｖｕII部位にいずれかの向きでサブクローン化された予想されるプラスミドの存在が確かめられた。ｐＪＳＰ１Ａ（時計回りの向き）及びｐＪＳＰ１Ｂ（反時計回りの向き）と命名したこれらのプラスミドを記述したようにクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）及びクレブシエラ・オキシトカ（ＡＴＣＣ ８７２４）中にエレクトロポレーションにより別個に形質転換した。形質転換体をテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）に対するそれらの耐性により選択し、そしてクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に対するそれらの感受性に関してスクリーニングした。別個の形質転換体から単離されたプラスミドの制限分析から、予想される消化パターンのみが示され、それらが抗生物質選択で３７℃で安定に維持されることが確かめられた。増殖培地へのＩＰＴＧ（０．２−２．０ｍＭ）の添加によりＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子の発現を高めることができる。
クレブシエラ・ニューモニエのｄｈａＢ（１−３及）びｄｈａＴの４個の遺伝子をそれらの既知のＤＮＡ配列に基づいてクレブシエラ・ニューモニエゲノムからＰＣＲでの増幅により得ることができる。次に、これらの遺伝子をグルコースを含有する培地中でそれらの発現を導くために用いることができる１つまたはそれより多いプロモーターの制御下でクレブシエラ・ニューモニエ中に形質転換する。便宜上、プラスミドｐＡＨ２４のＫｐｎＩ／ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼでの消化により得られる約４．０ｋｂ ＤＮＡフラグメント上にそれらの遺伝子を得、それによりそれらの遺伝子はすでにエシェリキア・コリｌａｃプロモーターの制御下で発現カセット中に配置されている。このＤＮＡフラグメントを同様に消化したｐＢＣ−ＫＳ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に連結し、そしてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換するために用いた。形質転換体をクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に対するそれらの耐性により選択し、そしてＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天上で白色コロニー表現型に関してスクリーニングした。白色コロニー表現型を示すクロラムフェニコール耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡの制限分析により、ｄｈａＴ−ｄｈａＢ（１−３）遺伝子がエシェリキア・コリｌａｃプロモーターの制御下にサブクローン化されたｐＪＳＰ２と命名された予想されるプラスミドの存在が確かめられた。
３Ｇへのグルコースの転化を高めるために、このプラスミドをすでにＰlac−ｄａｒ１−ｇｐｐ２発現カセットを含有するクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）（ｐＪＳＰ１Ａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）（ｐＪＳＰ１Ａ）及びクレブシエラ・オキシトカ（ＡＴＣＣ ８７２４）（ｐＪＳＰ１Ａ）中にエレクトロポレーションにより別個に形質転換した。共形質転換体（ｃｏｔｒａｎｓ ｆｏｒｍａｎｔ）をテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）の両方に対するそれらの耐性により選択した。別個の共形質転換体から単離されたプラスミドの制限分析から、ｐＪＳＰ１Ａ及びｐＪＳＰ２の両方に対して予想される消化パターンが示された。培地へのＩＰＴＧ（０．２−２．０ｍＭ）の添加によりＤＡＲ１、ＧＰＰ２、ｄｈａＢ（１−３）及びｄｈａＴ遺伝子の発現を高めることができる。
実施例７
クレブシエラ・ニューモニエによるグルコースからの１，３−プロパンジオールの生産
両方ともｐＪＳＰ１Ａで形質転換されたクレブシエラ・ニューモニエ株ＥＣＬ ２１０６及び２１０６−４７、並びにｐＪＳＰ１ＡとｐＪＳＰ２で形質転換されたＡＴＣＣ ２５９５５をグルコースからの１，３−プロパンジオールの生産のために様々な条件下（表４参照）で５ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎファーメンター中で増殖させた。株２１０６−４７はＢａｕｅｒ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６、１２９６（１９９０）中に記述されたようにフルオロ酢酸／乳酸選択プレートから得られたＥＣＬ２１０６のフルオロ酢酸耐性の誘導体である。各場合で、用いた培地は５０−１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５、４０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１０μＭ ＣｏＣｌ2、６．５μＭ ＣｕＣｌ2、１００μＭ ＦｅＣｌ3、１８μＭ ＦｅＳＯ4、５μＭ Ｈ3ＢＯ3、５０μＭ ＭｎＣｌ2、０．１μＭ Ｎａ2ＭｎＯ4、２５μＭ ＺｎＣｌ2、０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０−２０ｇ／Ｌグルコースを含有した。さらにグルコースを供給し、残存グルコースを過剰に維持した。温度を３７℃に制御し、そしてｐＨを５Ｎ ＫＯＨまたはＮａＯＨで７，５に制御した。適切な抗生物質をプラスミドの維持のために含み；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を同様に示した濃度で添加した。嫌気発酵には、０．１ｖｖｍの窒素を反応器中に分散させ；ｄＯ整定値が５％である場合は１ｖｖｍの空気を反応器中に分散させ、そして培地にビタミンＢ12を補足した。最終濃度及び全体収率（ｇ／ｇ）を表４に示す。
0004327909.tif 000006
実施例８
ｄａｒ１、ｇｐｐ２、ｄｈａＢ及びｄｈａＴを含有する組み換えクレブシエラ・ニューモニエによる１，３−プロパンジオールへの炭素基質の転化
Ａ．各種クレブシエラ・ニューモニエ組み換え株による１，３−プロパンジオールへのＤ−フルクトースの転化
クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２１０６ ｐＪＳＰ１Ａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２１０６ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２）の単一コロニーを寒天プレートから移し、別個の培養管中で適切な抗生物質剤を含有するルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地中で一晩継代培養した。１リットル当たり：１０ｇのフルクトース；１ｇの酵母エキス；５０ｍｍｏｌｅのリン酸カリウム、ｐＨ７．５；４０ｍｍｏｌｅ（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．０９ｍｍｏｌｅの塩化カルシウム；２．３８ｍｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．８８ｍｇ ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；２７ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ；５ｍｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．３１ｍｇ Ｈ3ＢＯ3；１０ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ；０．０２３ｍｇ Ｎａ2ＭｎＯ4・２Ｈ2Ｏ；３．４ｍｇ ＺｎＣｌ2；０．２ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有するＬＬＭＭ／Ｆとして明示される４５ｍＬの滅菌濾過した最小培地を含む５０ｍＬのフラスコ（？）。単一のプラスミド組み換え体のいずれかを用いる反応には１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン；二重のプラスミド組み換え体のいずれかを用いる反応には１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを培地に添加した。２ｍＬの継代培養物を接種する前に培地に窒素を完全に分散させた。いくつかのフラスコには０．５ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを添加した。フラスコに蓋をし、次に、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋシリーズ２５インキュベーター／振盪機中で３７℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。少なくとも２４時間かまたは大部分の炭素基質が生成物に転化されるまで反応を実施した。サンプルをＨＰＬＣにより分析した。表５に各種クレブシエラ組み換え体によりフルクトースから生産された１，３−プロパンジオールの収率を記述する。
0004327909.tif 000007
Ｂ．クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２）による各種炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転化：
クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２）の冷凍したストック培養物のアリコート（０．１ｍＬ）を２５０ｍＬバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬの種培地に移した。種培地は１リットル当たり；０．１モル ＮａＫ／ＰＯ4バッファー、ｐＨ７．０；３ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4；５ｇグルコース、０．１５ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍＬ １００Ｘ微量元素溶液、２５ｍｇクロラムフェニコール、１０ｍｇテトラサイクリン及び１ｇの酵母エキスを含んだ。１００Ｘ微量元素は１リットル当たり：１０ｇクエン酸、１．５ｇＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２．８ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３９ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３８ｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ及び０．３ｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏを含んだ。得られた溶液をＫＯＨまたはＨ2ＳＯ4のいずれかでｐＨ７．０に滴定した。グルコース、微量元素、抗生物質及び酵母エキスを別個に滅菌した。種接種材料を３５℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。
反応設計は半好気的であった。系はアルミホイル片で部分的に開いたままの１２５ｍＬの密封フラスコ中の１３０ｍＬの反応培地からなった。反応培地は１リットル当たり：３ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4；２０ｇ炭素基質；０．１５モル ＮａＫ／ＰＯ4バッファー、ｐＨ７．５；１ｇ酵母エキス；０．１５ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．５ｍｍｏｌｅ ＩＰＴＧ；１０ｍＬ １００Ｘ微量元素溶液；２５ｍｇクロラムフェニコール；及び１０ｍｇテトラサイクリンを含んだ。得られた溶液をＫＯＨまたはＨ2ＳＯ4でｐＨ７．５に滴定した。炭素源は：Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）；Ｄ−フルクトース（Ｆｒｃ）；Ｄ−ラクトース（Ｌａｃ）；Ｄ−ショ糖（Ｓｕｃ）；Ｄ−マルトース（Ｍａｌ）；及びＤ−マンニトール（Ｍａｎ）であった。混合を高めるために数個のガラスビーズを培地中に含んだ。細胞懸濁液の吸光度がλ600ｎｍで測定した場合に０．１ＡＵで始まるように種接種材料を添加することにより反応を開始した。フラスコを３５℃：２５０ｒｐｍでインキュベートした。２４時間後にＨＰＬＣにより３Ｇ生成を測定した。表６に各種炭素基質から生産された１，３−プロパンジオールの収率を記述する。
0004327909.tif 000008
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）受信人：Ｅ．Ｉ．ＤＵ  ＰＯＮＴ  ＤＥ  ＮＥＭＯＵＲＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＡＮＹ
（Ｂ）通り：１００７  マーケット通り（ＭＡＲＫＥＴ  ＳＴＲＥＥＴ）
（Ｃ）市：ウィルミントン（ＷＩＬＭＩＮＧＴＯＮ）
（Ｄ）州：デラウェア（ＤＥＬＡＷＡＲＥ）
（Ｅ）国：米国（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
（Ｆ）郵便番号：１９８９８
（Ｇ）電話：３０２−８９２−８１１２
（Ｈ）テレファックス：３０２−７７３−０１６４
（Ｉ）テレックス：６７１７３２５
（Ａ）受信人：ＧＥＮＥＮＣＯＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，ＩＮＣ．
（Ｂ）通り：４  ケンブリッジプレイス（ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＰＬＡＣＥ）
１８７０  サウスウィントン通り（ＳＯＵＴＨＷＩＮＴＯＮ  ＲＯＡＤ）
（Ｃ）市：ロチェスター（ＲＯＣＨＥＳＴＥＲ）
（Ｄ）州：ニューヨーク（ＮＥＷ  ＹＯＲＫ）
（Ｅ）国：米国（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
（Ｆ）郵便番号：１４６１８
（ii）発明の名称：１，３−プロパンジオールの組み換え製造方法
（iii）配列の数：４９
（iv）コンピューター可読形態：
（Ａ）媒質型：３．５０  インチ  ディスケット
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウズ９５用マイクロソフト  ワード
（Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフトワード  バージョン７．０Ａ
（ｖ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vi）先行する出願データ：
（Ａ）出願番号：６０／０３０，６０１
（Ｂ）出願日：１９９６年１１月１３日
（vii）弁護士／代理人の情報：
（Ａ）氏名：ＦＬＯＹＤ、ＬＩＮＤＡ  ＡＸＡＭＥＴＨＹ
（Ｂ）登録番号：３３，６９２
（Ｃ）参照／整理番号：ＣＲ−９９８２
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：1668
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＢ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000009
0004327909.tif 000010
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：585
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＢ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000011
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：426
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＢ３
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000012
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：1164
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＴ
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000013
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：1380
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＤ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000014
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：2946
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＤ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000015
0004327909.tif 000016
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：3178
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＵＴ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000017
0004327909.tif 000018
0004327909.tif 000019
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：816
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＰ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000020
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：753
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＰ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000021
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：2520
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＵＴ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000022
0004327909.tif 000023
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：391
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＤ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000024
0004327909.tif 000025
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：384
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＤ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000026
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：614
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＵＴ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000027
0004327909.tif 000028
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：339
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＳＡ
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000029
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：501
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＬＰＤ
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000030
0004327909.tif 000031
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：542
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＬＰＡＢＣ
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000032
0004327909.tif 000033
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：250
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＰ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000034
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：709
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＵＴ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000035
0004327909.tif 000036
0004327909.tif 000037
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：12145
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＰＨＫ２８−２６
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000038
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0004327909.tif 000040
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（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：94
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000045
（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：37
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000046
（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：27
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000047
（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：33
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000048
（２）配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：26
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000049
（２）配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：42
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000050
（２）配列番号２６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：36
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000051
（２）配列番号２７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：51
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000052
（２）配列番号２８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：36
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000053
（２）配列番号２９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：18
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000054
（２）配列番号３０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：18
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000055
（２）配列番号３１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：19
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000056
（２）配列番号３２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：19
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000057
（２）配列番号３３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：271
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＧＰＰ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000058
（２）配列番号３４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：555
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＢ１
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000059
0004327909.tif 000060
（２）配列番号３５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：194
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＢ２
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000061
（２）配列番号３６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：140
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＢ３
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000062
（２）配列番号３７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：387
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＤＨＡＴ
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000063
0004327909.tif 000064
（２）配列番号３８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：27
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000065
（２）配列番号３９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：28
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000066
（２）配列番号４０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：28
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000067
（２）配列番号４１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：27
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000068
（２）配列番号４２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：30
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000069
（２）配列番号４３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：25
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000070
（２）配列番号４４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：30
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000071
（２）配列番号４５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000072
（２）配列番号４６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：34
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000073
（２）配列番号４７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：39
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000074
（２）配列番号４８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：24
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000075
（２）配列番号４９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：24
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：
0004327909.tif 000076