(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
AOP-1をコードする核酸若しくはAOP-1のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたAOP-1の機能を有するポリペプチドをコードする核酸を有効成分として含有する、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全から選ばれるAOP-1遺伝子又はAOP-1の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬。
【請求項２】
AOP-1遺伝子の発現量又はAOP-1の産生量を指標として測定する手段を含む、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全から選ばれるAOP-1遺伝子又はAOP-1の発現減少を伴う疾患の診断剤又は診断キット。
【請求項３】
合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を、（１）AOP-1遺伝子の転写制御領域及びAOP-1遺伝子若しくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させ、AOP-1遺伝子又はレポーター遺伝子の発現量を検出すること、又は（２）AOP-1又はAOP-1の標的分子と接触させ、AOP-1又はAOP-1の標的分子の量を検出して、AOP-1遺伝子の発現を増強する物質、AOP-1の産生を増強する物質及びAOP-1の機能を増強する物質からなる群から選ばれる少なくとも１つを得ることを含む、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全から選択されるAOP-1遺伝子又はAOP-1の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
AOP-1遺伝子の転写制御領域をレポーター遺伝子の翻訳領域の上流又は下流に連結した発現ベクターを構築後、適当な宿主細胞に導入して培養し、当該培養細胞に合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を添加し、一定時間後にレポーター遺伝子の発現量又はレポータータンパク質の産生量の変化を検出することを含む請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質をAOP-1又はAOP-1の標的分子と接触させ、当該物質と結合した又は結合しなかったAOP-1又はAOP-1の標的分子の量を検出することを含む請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
AOP-1又はAOP-1の標的分子を支持体に固定化し、当該固定化したAOP-1又はAOP-1の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とAOP-1又はAOP-1の標的分子を添加し、結合した又は結合しなかったAOP-1又はAOP-1の標的分子の量を検出することを含む請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を支持体に固定化し、当該固定化した物質にAOP-1又はAOP-1の標的分子を添加し、結合した又は結合しなかったAOP-1又はAOP-1の標的分子の量を検出することを含む請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を、AOP-1又はAOP-1の標的分子と接触させ、AOP-1の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去機能を測定して、AOP-1の機能を増強する物質を得ることを含む、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全から選択されるAOP-1遺伝子又はAOP-1の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
AOP-1又はAOP-1の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とAOP-1又はAOP-1の標的分子を添加し、AOP-1の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去能を測定することを含む請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
AOP-1又はAOP-1の標的分子を支持体に固定化し、当該固定化したAOP-1又はAOP-1の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とAOP-1又はAOP-1の標的分子を添加し、AOP-1の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去機能を測定することを含む請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を支持体に固定化し、当該固定化した物質にAOP-1又はAOP-1の標的分子を添加し、AOP-1の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去機能を測定することを含む請求項８記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、疾患の予防方法、治療方法又は診断方法、疾患の予防薬又は治療薬、製剤の有効成分に係る物質のスクリーニング方法、非ヒト形質転換動物、及び形質転換組織等に関する。
背景技術
多くの疾患においては、病態の進展に伴い、組織細胞に代償的変化が発生し、一時的なバランス状態となる。さらなる病態悪化の過程で代償機構が破綻し細胞機能低下さらには細胞死が起こる。この細胞脱落により、疾患の治癒はより困難となり、予後の不良、再発を招くこととなる。特に心臓をはじめ、脳、腎臓等、自己再生不能臓器における疾患治療では細胞の壊死脱落を抑制することが重要な治療方針である。
（１）心疾患
ア．心不全：  心不全は、心筋収縮力の低下により心臓が各臓器へ十分量の血液を拍出できない状態と定義される。心不全に至る前段階として、心臓は全身の血行を正常に保つ目的で代償的リモデリングを行う。この時期には、心筋細胞が持続的に肥大伸展化し、心拍出圧を高く保つと同時に心拍出量を維持するが、同時に心組織内の線維化が進行し、収縮細胞に対する負荷が増加する。心筋細胞に対する負荷と、肥大化による代償とのバランスが限界を迎えた時、心機能が破綻し心不全となる。心不全状態の心筋細胞では、収縮力が低下することが知られている（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９７  Ｖｏｌ．２７３（１Ｐｔ２），Ｈ１８３−９１）。これまでの慢性心不全治療では心不全状態つまり患者が正常な日常生活に支障をきたした時点から、心筋収縮力を増加させるジギタリス製剤やキサンチン製剤等の強心剤が使用された。しかし、これらの薬剤は心筋エネルギーの過剰消費により、長期投与においては細胞死を促進させ、生存率を悪化させることが明らかにされた。最近では、代償リモデリング期で亢進している交感神経系やレニンアンジオテンシン系による心臓への過剰な負荷を軽減させるβ遮断剤やＡＣＥ阻害剤による治療が主流になってきている。しかし、心筋細胞の肥大化の防止を作用メカニズムに持つこれらの薬剤は、すでに心不全状態に陥った患者の治療には有効とは言えず、慢性心不全の予防剤的側面が強い。また、これら薬剤の発売後も依然として慢性心不全患者の長期生存率が改善されない事実は、これら薬剤の作用メカニズムの限界を示唆している。よって、代償期破綻後、慢性心不全期におけるＱｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ、生存率両面の改善をもたらす、新たな慢性心不全治療薬の開発が急務である。代償期から不全期への移行に伴い起こる破綻機構の本質的原因である、細胞死、細胞機能低下を治療する新たな治療薬の開発が望まれる。
イ．虚血性心疾患：  虚血性心疾患は、狭心症や心筋梗塞症を含む冠血管性血流不良を特徴とする疾患群である。例えば、狭心症は安静狭心症と労作性狭心症に分類される。現在重症患者では外科的治療が施され、物理的血管拡張後のステント留置等が行われる。比較的軽症の患者に対しては、発作時の治療剤として、硝酸薬、ニトログリセリン、ニコランジル等の血管拡張剤が用いられる。また、コレステロール低下剤や、抗血液凝固剤等が、梗塞予防の目的で処方される。このように急性期治療や、血行改善を目的とした治療方法は確立されつつある。そもそも発作は、無症状期の慢性的虚血による傷害蓄積が、心筋適応能を減少させることに起因すると考えられる。しかし、現在この点に対する治療方法は未確立である。また、狭心症から、重症心筋梗塞へ移行する患者も多く、狭心症の発症から大規模虚血に対する予防治療を行うことが望ましいが、これに関する適した治療方法も見出されていない。
（２）神経変性疾患
神経変性疾患は、神経細胞の変性を特徴とする一群の疾患であり、具体的には脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、頭部外傷、ハンチントン舞踏病、脳血管性痴呆、運動神経変性症、ビンスワンガー病等の白質傷害等が挙げられる。脳梗塞、脳血管性痴呆、頭部外傷、アルツハイマー病、運動神経変性症、パーキンソン氏病等で共通して、神経伝達物質であるグルタミン酸が、細胞外で過剰に濃度上昇することが判明している。（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０００  Ｖｏｌ．１２（８），２７３５−４５）（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９４  Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６４２（１−２），１１７−１２２）（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ  Ｓｕｐｐｌ．２０００  Ｖｏｌ．７６，４３７−８；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２００１  Ｖｏｌ．２９９（１−２），３７−４０；Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｖｏｌ．６３（５），３７７−８７；Ｄｒｕｇｓ  Ａｇｉｎｇ  ２００１  Ｖｏｌ．１８（１０），７１７−２４）。この過剰なグルタミン酸は神経細胞表面のＧｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＭＤＡ受容体）を刺激し、神経の過剰興奮を誘導する。この過剰な神経興奮により細胞内イオン環境の破綻が誘導され、細胞死が起こるとする説が有力である。現在脳梗塞治療剤としては、抗血小板薬、血栓溶解剤が用いられているが、血流の再開、維持を目的としたものであり、神経細胞自体に対する保護作用を有する治療方法は未だ確立されていない。試験段階の治療薬として、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、グルタミン酸放出抑制剤、活性酸素消去剤が開発中であるが、有効性は未確認である。アルツハイマー病の治療に関しては、最近コリンエステラーゼ阻害剤が唯一治療剤として認められたが、細胞間情報伝達を増強することによる学習機能改善がメカニズムであり、神経細胞死を直接抑制するものではない。一連の神経変性疾患に対する有効な治療方法として、神経細胞保護を作用機序とする治療薬の開発が望まれている。
（３）リウマチ
リウマチのうち特に慢性関節リウマチは、関節滑膜の連続的増殖を特徴とする慢性的関節炎であり、その原因は自己免疫作用に基づくと言われる。老化、遺伝的素因に加え、生活環境的因子が複合的に危険因子を形成し、感染症を初めとする何らかの関節炎症を発端として、自己抗原に対する免疫感作が生じると考えられている。進行した慢性関節リウマチでは、軟骨破壊、骨破壊と同時に、軟骨芽細胞死、骨芽細胞死が報告されている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９９  Ｖｏｌ．４２（７），１５２８−３７；Ｚ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２０００  Ｖｏｌ．５９，Ｓｕｐｐｌ．１，１０−２０）。軟骨芽細胞、骨芽細胞の死によって疾患は不可逆的な段階に入るものと考えられる。現在は、ステロイド、非ステロイド製剤による、免疫抑制作用を基とする治療が行われるが、その治療効果は持続的でなく、根治的でない。そこで、関節、骨芽細胞、軟骨芽細胞保護をメカニズムとする新しい治療剤の開発が望まれている。
（４）腎疾患
腎疾患のうち特に慢性腎不全は、腎臓内の糸球体、尿細管の傷害を特徴とする疾患であり、具体的には、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、ループス腎症等が挙げられる。血液中の老廃物をろ過する機能を有する糸球体と、尿からの再吸収をその機能とする尿細管における機能異常が発生する原因として、高血糖による糖化蛋白による細胞傷害、高血圧による血行不良による細胞傷害、自己免疫性の慢性腎炎が挙げられる。現在慢性腎不全に対する有効な治療方法は見出されておらず、ループス腎炎を初めとする炎症を主体とする場合にはステロイド系、非ステロイド系抗炎症剤が、高血圧性腎不全の場合は降圧剤が対処療法として適用される。現在、糸球体構成細胞、尿細管構成細胞に直接作用し保護する薬剤が望まれている。
（５）肝疾患
肝疾患は、ウイルス性、アルコール過剰摂取、薬剤性などの肝炎を経て、肝硬変、肝不全へと至る。治療法には、対症療法として、ウルソデスオキシコール酸、グリチルリチン製剤、漢方療法等がある。ウイルス性肝炎の場合、原因療法としてインターフェロン療法があるが、副作用も強く、治療効果も不完全である。肝臓は再生可能臓器であるが、そもそも肝不全は、肝硬変を初め肝機能が再生不能な状態に陥ることであるから、再生能力を超えるストレスが慢性的に加わることが原因の疾患であると言える。よって、肝細胞を保護することが、肝不全予防効果があることは明らかである。しかし現在、副作用の少ない有効な治療方法は見出されていない。
一方、ＡＯＰ−１遺伝子は、マウス赤白血病細胞をＤＭＳＯにより分化誘導させた場合に発現量が増加する因子として同定された（Ｇｅｎｅ  １９８９  Ｖｏｌ．８０，３３７−３４３：当初の呼称はＭＥＲ−５であったが、後にＡＯＰ−１と改名された）。その後ＡＯＰ−１タンパク質はｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎファミリーに属することが判明し、Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  ３（ＰＲｘ３）と文献記述されることが一般化した（以下、本明細書ではＡＯＰ−１タンパク質をＡＯＰ−１と記載する）。Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙは、精製蛋白質を用いた生化学的解析より、ｔｈｉｏｌ基特異的な抗酸化活性を有する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４  Ｖｏｌ．９１，７０１７−７０２１）ことを特徴とする一群の蛋白質であり、原核生物からヒトを含む高等生物に広く保存されている。また、最近ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎを用いた解析から、ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎには過酸化亜硝酸（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ）を除去する能力があることが見出された（Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  ｖｏｌ．４０７，Ｎｏ．１４，２１１）。Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙの中でもＡＯＰ−１はミトコンドリアに局在することで、他のｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎとは異なる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３００）。抗酸化蛋白として広く知られるｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）やｃａｔａｌａｓｅが、抗酸化活性発現にｔｈｉｏｌ基を要求しないことや、過酸化亜硝酸を除去できないこと等から、ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙはＳＯＤ，ｃａｔａｌａｓｅとは生理機能面でも異なることが予見される。最近細胞質に存在するｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  １型及び、２型の生理機能として、培養甲状腺細胞における過酸化水素傷害に対する保護作用が見出されたが（Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００  Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．２４，１８２６６−１８２７０）、ミトコンドリアに局在するＡＯＰ−１（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  ３型）の生理機能は見出されていない。また、ＡＯＰ−１を含むｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙは、未だにいかなる疾患との直接的関連性も示されていない。
本発明は、ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患、例えば、心疾患（慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患等）、神経変性疾患（脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、頭部外傷、ハンチントン舞踏病、脳血管性痴呆、運動神経変性症、ビンスワンガー病等）、リウマチ（慢性関節リウマチ等）、腎疾患（腎不全等）、肝疾患（肝炎、肝硬変、肝不全等）の予防方法、治療方法又は診断方法、当該疾患の予防薬又は治療薬、当該製剤の有効成分に係る物質のスクリーニング方法、ＡＯＰ−１遺伝子を発現抑制又は欠失する非ヒト形質転換動物、及び形質転換組織等を提供しようとするものである。
発明の開示
本発明は以下の事項に係るものである。
（１）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の予防又は治療方法において、▲１▼ＡＯＰ−１をコードする核酸、若しくはＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸を導入すること、▲２▼ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質若しくはＡＯＰ−１の機能を増強する物質を投与すること、又は▲３▼ＡＯＰ−１タンパク質若しくはＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドを投与すること、からなる当該予防又は治療方法。なお、ＡＯＰ−１遺伝子とは、通常、ＡＯＰ−１をコードする核酸配列（エクソン配列）とその間にある核酸配列（イントロン配列）、さらにＡＯＰ−１遺伝子の転写を制御する核酸配列を含むことを意味するが、本発明において、特に明示されている場合を除き、ＡＯＰ−１遺伝子とはＡＯＰ−１ｍＲＮＡを意味する。
（２）ＡＯＰ−１遺伝子に係る核酸又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸を患部組織に導入することからなる上記（１）記載の予防又は治療方法。
（３）ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質を投与することからなる上記（１）記載の予防又は治療方法。
（４）ＡＯＰ−１の産生を増強する物質を投与することからなる上記（１）記載の予防又は治療方法。
（５）ＡＯＰ−１の産生を増強する作用を有する物質が、ＡＯＰ−１遺伝子に係る核酸又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸である上記（４）記載の予防又は治療方法。
（６）ＡＯＰ−１の機能を増強する物質を投与することからなる上記（１）記載の予防又は治療方法。
（７）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（１）乃至（６）記載の予防又は治療方法。
（８）▲１▼ＡＯＰ−１をコードする核酸若しくはＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、▲２▼ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質若しくはＡＯＰ−１の機能を増強する物質、又は▲３▼ＡＯＰ−１タンパク質若しくはＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチド、を有効成分として含有するＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬。
（９）ＡＯＰ−１遺伝子に係る核酸又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸を有効成分として含有する上記（８）記載の予防薬又は治療薬。
（１０）ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質を有効成分として含有する上記（８）記載の予防薬又は治療薬。
（１１）ＡＯＰ−１の産生を増強する物質を有効成分として含有する上記（８）記載の予防薬又は治療薬。
（１２）ＡＯＰ−１の産生を増強する作用を有する物質が、ＡＯＰ−１をコードする核酸又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸である上記（１１）記載の予防薬又は治療薬。
（１３）ＡＯＰ−１の機能を増強する物質を有効成分として含有する上記（８）記載の予防薬又は治療薬。
（１４）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（８）乃至（１３）記載の予防薬又は治療薬。
（１５）ＡＯＰ−１遺伝子の発現量又はＡＯＰ−１の産生量を測定し、当該発現量又は産生量を指標として診断することからなるＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の診断方法。
（１６）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（１５）記載の診断方法。
（１７）ＡＯＰ−１遺伝子の発現量又はＡＯＰ−１の産生量を指標として測定する手段を含むＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の診断剤又は診断キット。
（１８）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（１７）記載の診断剤又は診断キット。
（１９）ＡＯＰ−１の産生を抑制、ＡＯＰ−１遺伝子の発現を抑制又はＡＯＰ−１遺伝子を欠失することによりＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の疾患モデルとして使用できる非ヒト形質転換動物。
（２０）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（１９）記載の非ヒト形質転換動物。
（２１）ＡＯＰ−１の産生を抑制、ＡＯＰ−１遺伝子を発現抑制又はＡＯＰ−１遺伝子を欠失することによりＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の組織モデル又は細胞モデルとして使用できる形質転換組織又は形質転換細胞。
（２２）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（２０）記載の形質転換組織又は形質転換細胞。
（２３）上記（１８）乃至（２１）記載の非ヒト形質転換動物、形質転換組織又は形質転換細胞に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を投与又は添加し、ＡＯＰ−１遺伝子の発現量またはＡＯＰ−１の産生量を検出することを含む、ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質及びＡＯＰ−１の機能を増強する物質からなる群から選ばれる少なくとも１つをスクリーニングする方法。
（２４）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を、▲１▼ＡＯＰ−１遺伝子の転写制御領域及びＡＯＰ−１遺伝子若しくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させ、ＡＯＰ−１遺伝子又はレポーター遺伝子の発現量を検出すること、又は▲２▼ＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子と接触させ、ＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子の量を検出すること、を含むＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質及びＡＯＰ−１の機能を増強する物質からなる群から選ばれる少なくとも１つをスクリーニングする方法。
（２５）ＡＯＰ−１遺伝子の転写制御領域をレポーター遺伝子の翻訳領域の上流又は下流に連結した発現ベクターを構築後、適当な宿主細胞に導入して培養し、当該培養細胞に合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を添加し、一定時間後にレポーター遺伝子の発現量又はレポータータンパク質の産生量の変化を検出することを含む上記（２４）記載のスクリーニング方法。
（２６）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質をＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子と接触させ、当該物質と結合した又は結合しなかったＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子の量を検出することを含む上記（２５）記載のスクリーニング方法。
（２７）ＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を支持体に固定化し、当該固定化したＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を添加し、結合した又は結合しなかったＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子の量を検出することを含む上記（２４）記載のスクリーニング方法。
（２８）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を支持体に固定化し、当該固定化した物質にＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を添加し、結合した又は結合しなかったＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子の量を検出することを含む上記（２４）記載のスクリーニング方法。
（２９）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を、ＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子と接触させ、ＡＯＰ−１の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去機能を測定することを含むＡＯＰ−１の機能を増強する物質のスクリーニング方法。
（３０）ＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を添加し、ＡＯＰ−１の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去能を測定することを含む上記（２９）記載のスクリーニング方法。
（３１）ＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を支持体に固定化し、当該固定化したＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を添加し、ＡＯＰ−１の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去機能を測定することを含む上記（２９）記載のスクリーニング方法。
（３２）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を支持体に固定化し、当該固定化した物質にＡＯＰ−１又はＡＯＰ−１の標的分子を添加し、ＡＯＰ−１の抗酸化又は過酸化亜硝酸消去機能を測定することを含む上記（２９）記載のスクリーニング方法。
（３３）▲１▼ＡＯＰ−１遺伝子に係る核酸若しくはＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、▲２▼ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質若しくはＡＯＰ−１の機能を増強する物質、又は▲３▼ＡＯＰ−１タンパク質若しくはＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドの、ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬の製造のための使用。
（３４）ＡＯＰ−１遺伝子に係る核酸又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸を有効成分として含有する上記（３３）記載の使用。
（３５）ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質を有効成分として含有する上記（３３）記載の使用。
（３６）ＡＯＰ−１の産生を増強する作用を有する物質が、ＡＯＰ−１をコードする核酸又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸である上記（３５）記載の使用。
（３７）ＡＯＰ−１の産生を増強する物質を有効成分として含有する上記（３３）記載の使用。
（３８）ＡＯＰ−１の機能を増強する物質を有効成分として含有する上記（３３）記載の使用。
（３９）ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性関節リウマチ、神経変性疾患、肝疾患又は腎不全である上記（３３）乃至（３８）記載の使用。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、「ＡＯＰ−１の機能」とは、心臓・心筋細胞代謝活性化作用、心臓・心筋細胞機能保護作用及び心臓・心筋細胞死抑制作用、神経細胞活性化作用、神経細胞死抑制作用、腎機能保護作用に代表される、臓器、細胞の活性化・保護作用をいう。従って、本発明において「ＡＯＰ−１の機能を有する」とは、臓器、細胞の活性化・保護作用を有することをいう。「ＡＯＰ−１の機能を有する」かどうかの判定は、（６）スクリーニング方法の項及び実施例で後述する種々の方法を用いて行うことができる。
本発明において、心疾患とは、心不全（慢性心不全、虚血性心不全、糖尿病性心不全等を含む）、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞等を含む）等を意味する。本発明において、神経変性疾患とは、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、頭部外傷、ハンチントン舞踏病、脳血管性痴呆、運動神経変性症、ビンスワンガー病等を意味する。本発明において、リウマチには、慢性関節リウマチ等を含む。本発明において、腎疾患とは、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、ループス腎症等の腎不全等を意味する。本発明において、肝疾患とは、肝炎（ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、薬剤性肝炎を含む）、肝硬変、肝不全等を意味する。
発明者らは、心疾患、神経変性疾患、リウマチ、腎疾患、肝疾患の共通現象である細胞機能低下、細胞死を誘導する共通原因を見出すため、一連の実験を行った。
（１）心疾患
先ず、慢性心不全における代償期の破綻の原因を究明するため、心肥大から慢性心不全の進行に伴う、組織における各種のタンパク質の発現変化を測定した。組織抽出液中の蛋白質混合液を水可溶性画分と界面活性剤可溶性画分の粗画分に分離し、それぞれを２次元電気泳動によって解析した。慢性心不全の病態モデルとして大動脈狭窄ラット（心臓圧負荷モデル）、動静脈シャントラット（心臓容量負荷モデル）、遺伝的高血圧症ラット（ＳＨＲ）、ダール食塩感受性ラットを用いて比較解析を行った。多くのモデルで共通して代償期の破綻とともに発現量の変化する蛋白質を検索し、普遍的な慢性心不全関連蛋白質群を得た。その中の１つであるＡＯＰ−１タンパク質が、代償期の破綻とともに発現減少していることを見出した。
慢性心不全の進行に伴う当該蛋白質の変化が、遺伝子発現レベルにおいて調節を受けたことによるかどうか調査するために、遺伝子発現解析を実施した。その結果、検討したすべてのモデルで当該遺伝子の発現抑制が見られたことから、慢性心不全の進行にともなうＡＯＰ−１の減少は、遺伝子発現調節を受けた結果であることが示された。また、虚血性慢性心不全モデルである心筋梗塞後心不全ラットを用いて遺伝子発現解析を行ったところ、当該遺伝子の発現抑制が見られた。よって、多種多様な原因による慢性心不全において普遍的にＡＯＰ−１遺伝子の発現低下、さらにはＡＯＰ−１が減少することが示された。さらに、２型ＰｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎであるＴｈｉｏｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ（ＴＳＡ）の遺伝子発現変化と、抗酸化活性機能において共通性のあるＣｕＺｎ−ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ），Ｍｎ−ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（Ｍｎ−ＳＯＤ），ｃａｔａｌａｓｅの遺伝子発現解析を行ったところ、ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ，Ｍｎ−ＳＯＤ，ｃａｔａｌａｓｅは遺伝子発現量に変化が無いことが判明した。よって、ＡＯＰ−１は、ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎファミリー、代表的抗酸化蛋白の中で、特徴的に心不全期への移行に伴い発現減少することが判明した。これは、ＡＯＰ−１遺伝子が他の抗酸化蛋白質とは異なる遺伝子調節を受けることを示す。
次に、ＡＯＰ−１が、心臓機能の改善もしくは増悪化に対して何らかの作用を持つかどうか検証を行った。まず、ラットＡＯＰ−１遺伝子の全長遺伝子を単離し、適当な発現ベクターを構築した後、ＡＯＰ−１遺伝子をラット培養心筋細胞へ導入した。培養細胞を無酸素にて培養した無酸素処理、無酸素培養後再酸素化しさらに一定期間培養を行った再酸素化処理、通常酸素濃度下で培養した無処理、の各実験条件においてＡＯＰ−１遺伝子導入群と、強制的な遺伝子発現、蛋白質生産による影響を加味し無害無益な遺伝子である大腸菌β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子を導入したコントロール群とで比較解析を行った。比較方法１として生存細胞数の確認、比較方法２として生存細胞中で自律拍動を示す細胞数の確認、比較方法３としてＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８３  Ｖｏｌ．６５，５５−６３）により生存細胞数と細胞代謝活性の確認を行った。以上３点の比較検討を行った結果、コントロール群に対してＡＯＰ−１遺伝子導入群は、生存細胞数が無酸素処理、再酸素化処理で有意に上昇し、同時に自律拍動能を持つ細胞数も有意に増加した。またＭＴＴ法では、コントロール群に対してＡＯＰ−１遺伝子導入群は、無酸素処理，再酸素化処理、無処理において高値を示し、障害時の生存生細胞数の増加と、障害、正常時での代謝活性の亢進を示した。つまり、無酸素傷害、再酸素化傷害に対して、ＡＯＰ−１は細胞生存率、細胞機能維持の両面で高い有効性を示すことが判明した。さらに我々は、ＡＯＰ−１遺伝子の相補鎖を発現するようにデザインした、アンチセンスＡＯＰ−１発現アデノウイルスベクター（アンチセンスＡＯＰ−１ベクター）を構築した。一般に、この種のベクターから発現されたｍＲＮＡは内在性ＡＯＰ−１遺伝子から発現したｍＲＮＡと相補的に結合し、蛋白質への翻訳を阻害すると報告されている（Ｇｅｎｅ  １９９０  Ｖｏｌ．９１，２６１−２６５）。我々は、アンチセンスＡＯＰ−１ベクター、ＡＯＰ−１発現ベクター、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現ベクターを心筋細胞に導入し、未導入細胞と共に３日間培養を行った。それぞれに対し、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを行ったところ、アンチセンスＡＯＰ−１ベクターを導入したもので色素生成が抑制され、巨視的に生存細胞数の減少が観察された。つまり、アンチセンスＡＯＰ−１ベクターによって内在性ＡＯＰ−１の発現が抑制されたことが、細胞の生存に対して悪影響を及ぼしていることが判明した。さらに、ＡＯＰ−１，ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤの細胞保護作用における有効性を直接比較検証するため、それぞれを強制発現できるアデノウイルスベクターの構築を行った。このベクターにてラット心筋細胞にそれぞれの蛋白質を増強し、以下のストレスに対する耐性を解析した。その結果、過酸化水素、Ｈｙｐｏｘｉａ，高グルコースストレスにおいて、ＡＯＰ−１が最も有効な細胞保護作用を示した。これにより、細胞維持機構においてＡＯＰ−１が、特に重要な役割を担うことが示唆された。また、高グルコース障害における細胞保護作用が見出されたことは、糖尿病性心疾患（糖尿病に起因する心不全及び虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞等））に対するＡＯＰ−１の有効性を示唆する。
以上は、各種心疾患におけるＡＯＰ−１の減少が、代償機構破綻（病態悪化）の一主原因をなすことを示す。
特に注目すべき点は、ＡＯＰ−１が再酸素化における活性酸素傷害のみならず、無酸素状態における各種傷害つまり、エネルギー枯渇傷害と細胞内酸性化傷害をも保護できたことであり、さらには通常酸素濃度下における培養で細胞代謝機能を活性化したことである。即ち、ＡＯＰ−１の細胞機能保護作用及び細胞死抑制作用は、単に抗酸化作用のみならず、細胞代謝活性化作用（ミトコンドリア活性化作用）を含む新たな機能に基づいてもたらされることが強く示唆された。
さらに我々は、ＡＯＰ−１が生体内で保護作用を発現するかどうか検証する目的でＡＯＰ−１遺伝子を心臓内に導入し、以下の解析を行った。遺伝子を導入後、蛋白質の発現を待ち、心臓をすばやく摘出し灌流装置に接続した。心臓を血液と同等量のガスを含んだ溶液で灌流することで摘出による傷害を抑え、生体内と同等の条件下で心臓機能を保持することに努めた。この心臓を虚血状態にする目的で一時的に灌流を停止し、また再酸素化することによる影響を調べる目的で再灌流を行った。ＡＯＰ−１を強制発現させた心臓は、陰性対照である遺伝子導入操作のみを行った心臓（Ｓｈａｍ）に対して、虚血時の虚血性心硬直が有意に延長され、さらに再灌流時の機能回復が有意に良好であること、さらには有意な再灌流時細胞壊死抑制作用が見られることが判明した。虚血硬直は、心筋細胞ＡＴＰ枯渇と良く相関することが示されている（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９６，Ｖｏｌ．２８，１０４５−１０５７）。ＡＯＰ−１が虚血から虚血硬直までの時間を延長したことは、培養心筋細胞にて我々が見出したＡＯＰ−１のミトコンドリア活性化作用がｉｎ  ｖｉｖｏ心においても機能していることを示す。この結果から、ＡＯＰ−１は培養細胞のみならず、生体内においても、抗酸化作用に加え、新規のミトコンドリア活性化作用を介して、虚血傷害、再灌流傷害を共に保護することが示された。以上から、ＡＯＰ−１遺伝子の導入、ＡＯＰ−１の発現増強剤、ＡＯＰ−１機能増強剤は、虚血性心不全、虚血性心疾患の有効な治療方法であることが示された。虚血性心不全、虚血性心疾患のみならず慢性心不全においても、心肥大に起因する心筋組織内血行不全が報告されていることから（Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｊ．１９９５  Ｖｏｌ．１０（３），１５１−１５７）、虚血、虚血再灌流は、慢性心不全病態に普遍的な傷害要因であると考えられる。故に、当該蛋白質を慢性心不全もしくは慢性心不全兆候を示す病態の心臓に補充することは、心筋細胞死を保護すると同時に、心臓拍出機能を維持させる慢性心不全に対する有効な治療方法と予想される。
（２）心臓以外の疾患形成部位
次に、ＡＯＰ−１の機能が心臓以外の臓器においても、疾患形成に対して原因であるかどうかを調査する目的で、他の疾患臓器における遺伝子発現解析を行った。結果、腎炎モデルにおける腎臓、神経変性疾患モデルにおける脳、および感染性肝炎（Ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ）における肝臓においてもＡＯＰ−１の発現が低下することが判明した。よって、ＡＯＰ−１の発現低下が、多くの疾患における普遍的病態形成・悪化に対する一因であることが強く示唆された。また、心不全モデルだけでなく、神経変性疾患モデルの脳組織においてもＣｕＺｎ−ＳＯＤ，ｃａｔａｌａｓｅ遺伝子に発現変化が見られなかったのに対しＡＯＰ−１遺伝子は発現低下を示した。よって、心臓以外の臓器疾患においてもＡＯＰ−１遺伝子の発現は、他の抗酸化蛋白質とは異なる調節を受けることが示された。
ア．神経変性疾患
脳梗塞、脳血管性痴呆、頭部外傷、アルツハイマー病、運動神経変性症、パーキンソン氏病等では、細胞外グルタミン酸濃度の上昇によりＧｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＭＤＡレセプター）の過剰な活性化が生じる（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０００  Ｖｏｌ．１２（８），２７３５−４５；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９４  Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６４２（１−２），１１７−１２２；Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ  Ｓｕｐｐｌ．２０００  Ｖｏｌ．７６，４３７−８；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２００１  Ｖｏｌ．２９９（１−２），３７−４０；Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｖｏｌ．６３（５），３７７−８７；Ｄｒｕｇｓ  Ａｇｉｎｇ  ２００１  Ｖｏｌ．１８（１０），７１７−２４）。ＮＭＤＡレセプターの活性化を受けた細胞は、そのカルシウムチャネルを開口させ、細胞内へのカルシウム流入を起こす。過剰なＮＭＤＡレセプターの活性化は、細胞にカルシウム過負荷状態をもたらす。このカルシウム過負荷によって神経細胞がアポトーシスもしくは、ネクローシスを起こし、神経機能障害が不可逆的なものとなる。先に示したようにＡＯＰ−１は脳神経変性疾患において発現が低下するため、心疾患と同様にＡＯＰ−１を補充することが有効である可能性がある。実際にＡＯＰ−１が培養ニューロンにおけるグルタミン酸傷害を保護しうるか検証したところ、ＡＯＰ−１遺伝子導入細胞は、有意に細胞死が抑制された。さらに、無負荷状態においては、神経突起の伸展を促進しニューロンの機能であるネットワーク形成を活性化することが判明した。よって、ＡＯＰ−１は神経細胞において、カルシウム過負荷に対する細胞保護作用、ならびに神経細胞活性化作用という高い有用性を示すことが判明した。
神経変性疾患動物モデルにおける有効性を確認するために、イボテン酸における脳障害モデルに対する解析を行った。イボテン酸は、ＮＭＤＡ受容体の作動薬であり、細胞内カルシウム過剰流入を惹起し、神経細胞死を誘発する。脳の海馬にＡＯＰ−１発現遺伝子を導入し、ＡＯＰ−１の発現を誘導した後、同部位にイボテン酸を注入した。２日後脳を摘出し神経細胞を観察した。ＡＯＰ−１遺伝子を導入していないものを対照群として比較解析すると、明らかにＡＯＰ−１遺伝子を導入した脳では、神経細胞死が抑制されていた。また、グリア細胞の増殖・浸潤を定量的に解析したところ、対照群に比べて優位な抑制が見られた。グリア細胞の増殖・浸潤は神経細胞死の量に相関することが示されているため（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０００  Ｖｏｌ．１００９，１０５−１１１；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１，Ｖｏｌ．５６５，３１２−３２０）、この結果はＡＯＰ−１遺伝子の導入により、神経細胞が保護されたことを示している。よって、ＡＯＰ−１は組織内の神経細胞に対しても保護作用を有することが判明した。よってＡＯＰ−１を補充することは、脳梗塞、脳血管性痴呆、頭部外傷、アルツハイマー病、運動神経変性症、パーキンソン氏病等の神経変性疾患に対し有効であると考えられる。
イ．腎疾患
先に示したようにＡＯＰ−１は腎不全モデルにおいて発現が低下するため、心疾患、神経変性疾患と同様に、ＡＯＰ−１を補充することが有効である可能性がある。実際に慢性腎不全に対するＡＯＰ−１遺伝子の有効性を確認するため、Ｔｈｙ−１腎炎モデルに対する解析を行った。Ｔｈｙ−１腎炎モデルとは、腎糸球体細胞であるメサンギウム細胞に特異的に発現するＴｈｙ−１  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（Ｔｈｙ−１）蛋白に対する抗体を注入することでＴｈｙ−１に対する自己免疫感作を行う物であり、自己免疫作用によって、メサンギウム細胞の細胞死と、続いて尿細管の傷害が発生するものである。一般にＴｈｙ−１腎炎モデルは炎症を主体とする腎不全モデルと考えられている。Ｔｈｙ−１抗体と同時にＡＯＰ−１遺伝子を注入し、経時的に血中尿素窒素を指標として腎機能を測定した。ＡＯＰ−１非導入群を対象として比較解析した結果、ＡＯＰ−１遺伝子導入群では有意に腎機能低下が抑制された。よって、ＡＯＰ−１は慢性腎不全に対し有効であると考えられる。
ウ、肝疾患
肝疾患は、ウイルス性、アルコール過剰摂取、薬剤性などの肝炎を経て、肝硬変、肝不全へと至る。肝臓は再生可能臓器であるが、そもそも肝不全は、肝硬変を初め肝機能が再生不能な状態に陥ることであるから、再生能力を超えるストレスが慢性的に加わることが原因の疾患であると言える。よって、肝細胞を保護することが、肝不全予防効果があることは明らかである。先に示したようにＡＯＰ−１は肝炎モデルにおいて発現が低下するため、心疾患、神経変性疾患、腎疾患と同様に、ＡＯＰ−１を補充することが有効である可能性が示唆された。
エ、リウマチ
リウマチでは、免疫細胞へと分化し、増殖した滑膜由来細胞、関節へ浸潤した末梢血中の炎症細胞が、軟骨・骨破壊を誘導することによって関節を不可逆的に破壊する。最近、過酸化亜硝酸等のストレスにより、軟骨芽細胞がアポトーシスすることにより軟骨再生ができなくなることが分かってきた（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  １９９９  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．７，１５２８−１５３７；Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｖｏｌ．４９（８），３６１４−２１）。心疾患、神経変性疾患、腎不全、肝不全の解析結果から、細胞の生死に関わるストレス状態ではＡＯＰ−１の発現が低下すると考えられる。よって、リウマチ病態における軟骨芽細胞や骨芽細胞ではＡＯＰ−１の発現が低下していると予想される。アポトーシスの細胞内カスケードにはミトコンドリアが深く関与する。また、ミトコンドリアの機能低下がアポトーシスの直接的引き金にもなる（総説：最新医学１９９９年５４巻４号）。我々の解析から、ＡＯＰ−１が様々な細胞、組織に対する保護作用を有することを見出している。軟骨芽細胞や骨芽細胞にＡＯＰ−１を補充することは、ミトコンドリア機能を保護、活性化し、軟骨芽細胞死や骨芽細胞死を抑制すると考えられる。これにより、軟骨・骨の再生能力を維持させることが可能となる。
以上により、我々は、新たなＡＯＰ−１機能として、心筋細胞代謝活性化作用、心筋細胞機能保護作用及び心筋細胞死抑制作用、神経細胞活性化作用、神経細胞死抑制作用に代表される、細胞保護・活性化作用を見出した。さらに我々は、ＡＯＰ−１の補充が、慢性心不全、虚血性心不全、虚血性心疾患、慢性腎不全、神経変性疾患、リウマチをはじめとするＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の治療に対して有効であること見出し、本発明を完成した。
なお、本発明においてＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患とは、患部組織（例えば、心不全であれば心臓、脳であれば神経細胞、リウマチであれば関節等）において、ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現低下を呈する細胞を含有することを意味する。また、ＡＯＰ−１の量が減ずるとは、細胞内のＡＯＰ−１機能が減少したことと同義である故、遺伝的変異によってＡＯＰ−１の機能が低下した疾患も本発明の範疇に含まれる。
本発明に係るＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬の有効成分として使用できる物質には以下の（１）乃至（４）に係る物質を挙げることができる。
（１）ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する作用を有する物質
ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する作用を有する物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよいが、そのような物質としては、例えばＡＯＰ−１遺伝子のプロモーターやエンハンサー領域に作用しＡＯＰ−１遺伝子のｍＲＮＡへの転写を増強する作用を持つ物質、又は細胞中の転写因子等を介して同様の作用を示す物質（例えば、転写因子やｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒに結合し、ＤＮＡや他の転写因子、ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒへの結合を促進する物質、若しくは転写抑制因子やｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒに結合し、ＤＮＡや他の転写因子、ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒへの結合を抑制する物質等）が挙げられる。
（２）ＡＯＰ−１の産生を増強する作用を有する物質
ＡＯＰ−１の産生を増強する作用を持つ物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよいが、そのような物質としては、例えばＡＯＰ−１をコードする核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ：配列番号１乃至３）又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）が挙げられる。さらに、ＡＯＰ−１をコードする核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ：配列番号１乃至３）の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドをコードする核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）も含む。例えば、標準的な方法としては、文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているように、６ｘＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１０ｍｇ／ｍｌ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡの溶液中で６８℃でハイブリダイゼーションを行ってハイブリダイズする核酸を含む。このような核酸はＡＯＰ−１をコードする核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ：配列番号１乃至３）と９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性を有するものが好ましい。また、これらをウイルス改変ベクター等他の生物遺伝子中に挿入した物質も同様である。例えば、ウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター、又は化学合成リポソーム、ウイルスエンベロープ、若しくはウイルスエンベロープと合成リポソームの複合体等に、宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）等、の下流にＡＯＰ−１遺伝子を組み込んだ核酸配列を組み込んだものを挙げることができる。
また、ＴＮＦ−αの場合、転写後ｍＲＮＡの安定性によってＴＮＦ−α産生が調節されており、ＨｕＲ蛋白質の結合により安定化されることが知られているが、同様に、ＡＯＰ−１ｍＲＮＡと結合する物質若しくは蛋白質あるいは核酸で、ＡＯＰ−１ｍＲＮＡの分解を阻害する物質若しくは、翻訳の効率を上昇させる活性を有する物質も挙げることができる。
（３）ＡＯＰ−１の機能を増強する作用を有する物質
ＡＯＰ−１は、活性部位システイン残基の酸化還元を酵素的に可逆化することによって酸化並びに過酸化亜硝酸活性を消去する。ＡＯＰ−１の機能を増強する物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよいが、そのような物質としては、例えばこの活性化部位システイン残基に結合し、酸化還元サイクルを促進させる物質や、ＡＯＰ−１の活性部位以外に結合しアロステリック効果によって活性部位の酸化還元サイクルを促進させる物質を挙げることができる。また、ＡＯＰ−１とＡＯＰ−１が作用するＡＯＰ−１標的分子（例えば、受容体）の結合や細胞内でのシグナル伝達を促進し、ＡＯＰ−１のもつ活性を亢進する物質が挙げられる。例えば、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎタンパク質はＡＯＰ−１に結合し、生化学的な抗酸化活性を上昇させることが分かっている。このようなＡＯＰ−１機能を増強させる蛋白質それ自体又は遺伝子の導入、化学合成物質等による誘導を介して、間接的にＡＯＰ−１の機能を増強することで、有効性を発揮する物質が挙げられる。また、ＡＯＰ−１を特異的に分解するプロテアーゼの活性阻害物質等も含まれる。
（４）ＡＯＰ−１タンパク質及びＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチド
本発明では、ＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１の発現減少を伴う疾患の予防薬又は治療薬の有効成分としてＡＯＰ−１タンパク質自体又はＡＯＰ−１のアミノ酸配列中のアミノ酸が１つ以上付加、欠失、置換されたＡＯＰ−１の機能を有するポリペプチドを使用することもできる。
（５）製剤
上記のような物質を有効成分として含有する製剤は、通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
本発明に係る医薬組成物の有効成分は、遊離型であっても、その医薬的に許容し得る塩であってもよい。無機酸との塩としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられ、あるいは有機酸との塩としては、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、クエン酸等との酸付加塩として用いることができる。塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態であってもよい。
有効成分は、公知の薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等と、適宜混和することにより製造することができ、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等としてもちいることができる。錠剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチンのような結合剤、コーンスターチのような潤滑剤等を用いることができ、また糖衣又は易溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよい。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としてはブドウ糖などを含む等張液などがあげられ、ポリエチレングリコールのような適当な溶解補助剤などと併用してもよい。また、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤などと配合してもよい。有効成分がペプチドの場合、経口投与では消化管内で分解を受けるため、この投与方法は一般的には効果的ではないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分であるペプチドをリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は座剤、点鼻スプレー、舌下錠といった形態で投与することができる。
また、遺伝子治療に用いる場合にはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター、又は化学合成リポソーム、ウイルスエンベロープ、若しくはウイルスエンベロープと合成リポソームの複合体等公知の遺伝子治療に適した媒体に、宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）等、の下流にＡＯＰ−１遺伝子又はＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質若しくはＡＯＰ−１の機能を増強する物質に係る核酸を組み込んだものを用いることができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度及び投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は０．１〜１０００ｍｇ程度であり、これを１ないし数回に分けて投与すればよい。
（６）スクリーニング方法
本願発明に係る予防薬又は治療薬の有効成分として用いうる物質のスクリーニング法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
ＡＯＰ−１遺伝子の発現増強又はＡＯＰ−１の産生を増強する物質のスクリーニングに用いるＡＯＰ−１遺伝子若しくはＡＯＰ−１又はそれらの誘導体は、何れの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＡＯＰ−１遺伝子：配列番号１、ＡＯＰ−１：配列番号４）、ラット（ＡＯＰ−１遺伝子：配列番号２、ＡＯＰ−１：配列番号５）、マウス（ＡＯＰ−１遺伝子：配列番号３、ＡＯＰ−１：配列番号６）等哺乳動物由来のものが挙げられる。これらのうち、ヒトに対する予防薬又は治療薬の研究、開発に利用する上ではヒト由来のものを用いることが好ましい。また、動物モデル、即ち、ＡＯＰ−１遺伝子を発現抑制又は欠失したことによる慢性心不全症状等を有する非ヒト形質転換動物を用いた研究、開発の必要性からは、例えばマウス、ラット等の動物由来のものを用いることが好ましい。但し、動物モデルを用いて薬剤スクリーニングを行う場合には、ヒト由来のものを用いることが望ましい。
ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質、又はＡＯＰ−１の機能を増強する物質のスクリーニング方法においては、レポーター遺伝子を利用した方法が一般に利用されている。レポーター遺伝子としては例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ルシフェラーゼなどが利用できる。ＡＯＰ−１遺伝子の発現を増強する物質は、例えば、ＡＯＰ−１遺伝子の転写制御領域（プロモーター、エンハンサー領域等）をレポーター遺伝子の翻訳領域の上流又は下流に連結した発現ベクターを構築し、適当な培養細胞等に導入し、その培養細胞に試料である物質（当該物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよい）を添加して、一定時間後にレポーター遺伝子の発現量、またはレポータータンパク質の量を測定することによりスクリーニングすることができる。ＡＯＰ−１遺伝子の転写制御領域（プロモーター、エンハンサー領域等）は市販の遺伝子（ｇｅｎｏｍｉｃ）ライブラリーから、ＡＯＰ−１ｃＤＮＡの断片をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行うことなどにより得ることができる。レポータータンパク質の量は酵素活性として測定することでもよいし、タンパク質の発現量として抗体などを用いて測定することでもよい。
また、ＡＯＰ−１の産生を増強する物質には、ＡＯＰ−１配列を含むＤＮＡまたは、ＲＮＡが含まれ、これをリポソームや、ウイルス改変ベクターに組み込むことでも同様の効果を得る事が出来る。
ＡＯＰ−１の機能を増強する物質のスクリーニング方法としては、精製ＡＯＰ−１、または細胞溶解液、望ましくはミトコンドリア画分に対し、過酸化水素、チオール基をもつ還元剤（例えばｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、酵素活性測定が可能なモニター酵素の４種類を混合し、一定時間後のモニター酵素活性を測定することで行うことが挙げられる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９４  Ｖｏｌ．１９９，Ｎｏ．１，１９９−２０６；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６  Ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．２６，１５３１５−１５３２１）。また、過酸化亜硝酸（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ：例えば、酸性化亜硝酸塩と過酸化水素の混合によって得られる）の場合、精製ＡＯＰ−１、または細胞溶解液、望ましくはミトコンドリア画分に対し、過酸化亜硝酸と酵素活性測定が可能なモニター酵素又は過酸化亜硝酸によって修飾される物質（例えばＤＮＡ）の３種類を混合し、一定時間後のモニター酵素活性又は物質の修飾量を測定することで行うことができる（Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  Ｖｏｌ．４０７，Ｎｏ．１４，２１１−２１５）。即ち、ラジカル傷害によって、モニター酵素が失活することに対するＡＯＰ−１の保護活性を測定することによりＡＯＰ−１の機能を増強する物質をスクリーニングすることができる。
（７）診断方法、診断剤及び診断キット
ＡＯＰ−１遺伝子は、その発現量が種々の疾患において疾患の悪化とともに減少することが本発明者らにより明らかにされた。患者のバイオプシーサンプルを用いて、ＡＯＰ−１遺伝子の発現量を測定することにより、慢性心不全の増悪化の程度を知ることができる。例えば、患者のバイオプシーサンプル１００ｍｇからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理を行った後に、ｃＤＮＡ合成を行い、適当なプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりＡＯＰ−１遺伝子を増幅し、ゲル電気泳動によってＡＯＰ−１に相当するバンドの濃さを判定するなどの方法により、ＡＯＰ−１遺伝子の発現量を測定することができる。ＡＯＰ−１遺伝子発現の定量は、この方法に限らず、例えば実施例３に記載の方法やノーザンハイブリダイゼーション法、ｃＤＮＡアレイ法などをはじめＲＮＡ，ＤＮＡの定量法であればどのような方法も利用できる。
また、本発明によりＡＯＰ−１遺伝子が種々の疾患の改善因子であることが示されたことにより、ＡＯＰ−１遺伝子及びその制御領域に何らかの変異が存在することによりＡＯＰ−１の機能が低下したり、遺伝子発現量が減少したりする場合には、その変異を持つ個体は、慢性心不全等の疾患になり易い、あるいは、増悪化しやすい傾向を持つことが容易に考えられる。そこで、これらの遺伝子上の変異を試験することで、リスクファクターの診断が可能となる。遺伝子上の変異を知る方法としては、例えば、患者の血液サンプルから定法に従ってＤＮＡを分離し、実施例１−５に記載の方法により、その塩基配列を決定し、正常な配列と比較することにより行うことができる。また、一旦変異と慢性心不全の関係が明確になれば、その変異のみを検出するＤＮＡチップ法、ＳＳＣＰ法などが利用できる。
また、慢性心不全患者を伴う疾患に羅漢した患者のバイオプシーサンプルを用いて、心筋細胞内ＡＯＰ−１の濃度を測定することにより、慢性心不全もしくは、上記疾患の増悪化の程度を知ることができる。測定方法としては、例えば、ＡＯＰ−１に対する抗体を利用したＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ法、ＨＰＬＣやマススペクトロメトリーによる定量法などが利用できる。この際、ＡＯＰ−１は完全な形である必要はなく、測定可能であれば断片化したものでも良い。
更に、本発明は上記の測定手段等を用いたＡＯＰ−１遺伝子の発現量又はＡＯＰ−１の産生量を測定する手段を含む慢性心不全の診断剤又は診断キットを包含する。
（８）ＡＯＰ−１遺伝子導入形質転換動物及び形質転換ヒト細胞または組織等
本願発明に係る物質の同定は上記（６）スクリーニング方法に記載したが、ＡＯＰ−１の発現を抑制したことによる、慢性心不全症状等を有する非ヒト形質転換動物を利用して行う事も可能である。宿主動物たる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギなどの小動物のほか、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの大動物も対象となり、遺伝子を発現し、機能や生理作用を確認しうる動物であればどのような動物でも良い。遺伝子発現を抑制することは、ＡＯＰ−１転写調節領域に変異若しくは欠失等を導入することにより可能であるが、遺伝子発現を抑制するのであれば如何なる方法を用いても良い。また、ＡＯＰ−１の産生抑制は、ＡＯＰ−１ｍＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ又はＲＮＡを導入もしくは、当該相補配列をコードする遺伝子を導入して得られるが、ＡＯＰ−１の産生を抑制できれば如何なる方法を用いても良い。また、遺伝子欠失の方法としては、胎性幹細胞を用いたノックアウトマウス技術が挙げられるが、遺伝子の発現を抑制するシステムであればどのようなシステムを用いても良い。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例
実施例１：蛋白質２次元電気泳動法によるＡＯＰ−１の検索
１−１．慢性心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
Ａ．ダール慢性心不全モデルラット
ダールラットはＳｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットにおいて、８％の高食塩含有食を負荷し、継代交配を行うことにより、３代で高血圧易発性の食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）と、高血圧を生じない食塩抵抗性ラット（Ｄａｈｌ−Ｒ）とに分離されたものである。Ｄａｈｌ−Ｓラットについては京都大学の木原らの研究により、６週齢より８％の高食塩含有食を負荷することにより、代償性左室肥大を呈した後、収縮不全を伴う左室拡大、すなわち非代償性慢性心不全へと移行し、肺鬱血により死亡することが示されている（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｕｏｌ．１９９４  Ｖｏｌ．２６７，Ｈ２４７１−２４８２）。本モデルはモデルの作製に特殊な手法を必要とせず、短期間で慢性心不全を発症させることができ、また、一個体において代償肥大期と非代償慢性心不全期に明瞭に区分でき、ヒトの高血圧性慢性心不全と発症過程が類似している。
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）および慢性心不全期（１４週齢）に左心室を採取した。
Ｂ．腹部大動脈狭窄ラット（圧負荷モデル：圧負荷によるラット心肥大モデル：ＡＯＢ）の作製及び左心室サンプルの採取
実験にはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の９週齢雄性ラットを用いた。ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によりラットを麻酔し、腹臥位に固定して開腹後、腹部大動脈を露出させ、左右の腎動脈間の部分を剥離した。２１Ｇ注射針を大動脈に沿わせ、左右の腎動脈間で大動脈とともに絹糸で結紮し、その後注射針を引き抜くことにより、大動脈狭窄を行った。本モデルにおいてはこのような腹部大動脈狭窄により収縮期血圧が上昇し、心臓の後負荷が増大して、左心室の肥大が生じる。偽手術［Ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（Ｓｈａｍ）］群には腹部大動脈の剥離のみを施した。
動脈の狭窄により収縮期血圧は手術後３ヶ月目、１７ヶ月目においてそれぞれ２３２ｍｍＨｇ，１８８ｍＨｇと通常より高い値を示した。３ヶ月目で、心重量／体重比の有意な上昇を認め、さらに、１７ヶ月目のラットは３ヶ月目に比べ心機能の指標であるＦｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ（ＦＳ）が５２％から２６％に低下した。よって狭窄手術後３ヶ月目を代償性肥大期、１７ヶ月目を非代償慢性心不全期とし、それぞれの左心室ならびに偽手術群の左心室を採取した。
Ｃ．腹部動静脈シャントラット（容量負荷モデル：容量負荷によるラット心肥大モデル：ＡＣＳ）の作製及び左心室サンプルの採取
実験にはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の９週齢雄性ラットを用いた。ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によりラットを麻酔し、腹臥位に固定して開腹後、腹部大動静脈を露出させ、大動脈の腎動脈分岐部及び大腿動脈分岐部において、それぞれクランプで血流を停止した。止血した部位で大動脈内に１８Ｇ注射針を挿入し、大静脈へと貫通させ、動静脈シャントを作製した。注射針を引き抜き、動脈部の傷口を手術用接着剤で塞ぎ、クランプをはずした。シャント部で静脈内に動脈血が流入するのを確認した後、閉腹した。本モデルにおいてはこのような腹部大動静脈シャントの形成により、静脈圧が上昇し、心臓の前負荷が増大して、右心房、右心室、左心房、左心室の順に負荷が加わり肥大が生じる。さらに、静脈系のコンプライアンスが低いため血液が貯流し、肺うっ血を呈する。偽手術［Ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（Ｓｈａｍ）］群には腹部大動静脈の剥離のみを施した。
術後、３ヶ月、１１ヶ月において、心エコーによる心機能測定を行った後、解剖、心重量ならびに解剖所見を確認した。手術後３ヶ月目にくらべ１１ヶ月目のラットではヘマトクリット値が低下すると共に全例で肺水腫が生じており、容量負荷が進行したものと思われた。また右心系の心重量／体重比や肺重量／体重比が増加し、右心室から肺にかけての鬱血が示唆された。ＦＳは５７％から３１％に低下した。したがってシャント手術後３ヶ月目を代償期、１１ヶ月目を非代償慢性心不全期と判断し、それぞれの左心室ならびに偽手術群の左心室を採取した。
Ｄ．自然発症高血圧ラット（圧負荷モデル）の作製及び左心室サンプルの採取
自然発症高血圧ラットとして知られているＳＨＲラットを飼育し、経時的に血圧、心エコー測定を行った。３ヶ月齢のＳＨＲは血圧および心重量／体重比が通常より高く、高血圧による心肥大を呈していた。１９ヶ月齢では、立毛、うずくまりなどの外見に加え、ＦＳは５６％から３２％に低下、収縮期血圧も低下し慢性心不全を呈した。さらに、胸水、浮腫などの症状が見られた。それぞれ解剖によって左心室を採取した。
Ｅ．心筋梗塞後心不全モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取）
体重１８０ｇ−２００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用いて冠動脈の結紮を行った。結紮後４週後、心機能の測定、心臓摘出後、心肺重量（左右心室、肺）の測定を行った。心機能では、拡張末期圧、最大収縮期圧の測定を行った。拡張末期圧は心不全の悪化に伴い上昇するが、今回のモデルでは、ｓｈａｍ群に対しＶｅｈｉｃｌｅ群では３．１倍の上昇が見られた。最大収縮期圧はｓｈａｍ群に対しＶｅｈｉｃｌｅ群では２９％低下した。右心室重量と体重の比は、心肥大に伴い上昇するが、今回のモデルではｓｈａｍ群に対しＶｅｈｉｃｌｅ群で２．２倍の上昇が見られた。肺重量は心機能の低下に伴いうっ血のため上昇するが、今回のモデルでは、ｓｈａｍ群に対しＶｅｈｉｃｌｅ群で２．３倍の上昇が見られた。よって、本モデルは、心筋梗塞後の心肥大による代償期を経て心不全に至る典型的な心不全モデルであると思われる。
解剖によって左心室非梗塞領域を採取した。
１−２．蛋白質サンプルの作製
ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  １／４量に対し、１ｍｌのｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を添加した。Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて組織を破壊した後さらに、超音波処理を施した。遠心操作で上清を得、可溶性の蛋白画分とした。沈殿を同ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した後、沈殿と同体積のｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ２（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １＋２％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を加え再混合して遠心後の上清を膜蛋白質・膜相互作用蛋白画分とした。
１−３．蛋白質の定量
蛋白中のペプチド結合が銅の二価イオンをキレートし、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＡ）と反応して紫色を呈する現象を利用したＢＣＡ法を簡便化したＰｉｅｒｃｅ社製の蛋白質定量キットを用いて行った。標準蛋白にはキット付属の牛血清アルブミンを用いた。
１−４．二次元電気泳動
Ａ．一次元電気泳動
１２５〜７５０μｇ相当の蛋白質をサンプルバッファー（８Ｍ  Ｕｒｅａ，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０ｍＭ  ＤＴＴ，Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ微量）に懸濁し、これをもって乾燥ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．社製Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ）を膨潤させた。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．社製Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩを用い、製造者の標準操作方法にて泳動を行った。泳動後は−２０℃にて１週間を限度に保存し、随時二次元電気泳動に供した。
Ｂ．二次元電気泳動
上記ゲルを平行化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，６Ｍ  Ｕｒｅａ，３０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％  ＳＤＳ）を用いて前処理した後、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ上に設置した。これをＢｉｏｒａｄ社製の電気泳動装置を用いて泳動した。泳動後直ちに蛋白をゲル中に固定化すると同時に銀染色法を用いて染色し、二次元電気泳動像を得た。
１−５  蛋白発現比較解析
同一サンプルに対して最低２回の電気泳動を行い、群内の最低２個体に関して発現変化に再現性のある蛋白をそれぞれのモデルでピックアップした。それらのピックアップされた蛋白の中で、多くのモデルで共通して変化する因子を慢性心不全関連蛋白質と位置づけた。その中で後述の実施例１−６によってＡＯＰ−１と同定された蛋白質スポットを数値化したグラフを図１に示した。図１において、Ｄａｈｌ、ＡＯＢ、ＡＣＳ、ＳＨＲは、それぞれ上述した１−１．Ａ．からＤ．で作製した慢性心不全病態モデルラットをいう。
１−６  蛋白質の同定
Ａ．目的蛋白質のｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌからの回収
ゲル片を適当なバッファーで洗いＳＤＳを除いた。ゲル内にｔｒｙｐｓｉｎ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を浸透させ、ゲル中で目的蛋白質を消化することにより断片化し、ゲル網目から溶出させた。
Ｂ．質量分析によるＡＯＰ−１の同定
上記Ａにて得られた目的蛋白質の断片群を混合物のままＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製質量分析機（エレクトロスプレーイオン化法／飛行型質量分析機）を用いて解析し、目的蛋白質断片群の質量情報を得た。さらに一部の断片にヘリウムガスを照射しペプチド結合の開裂を行うことによって、蛋白質断片の内部配列Ｎ末［Ｈ（Ｉ／Ｌ）ＳＶＮＤＬ］Ｃ末と質量情報（親イオン分子量１２０６．６、娘イオン１０６９．４８１，９５６．４２８，８６９．４１８，７７０．３７９，６５６．３３６，５４１．３２４，４２８．２４４）を得た。これらの情報を基に、インターネット上で公開されている遺伝子配列データベースに対して検索を行いＡＯＰ−１を同定した（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ２０１０８：配列番号６）。
実施例２：ＡＯＰ−１遺伝子の発現解析
実施例１−１−Ａ〜Ｄに記載の方法にて得た左心室をサンプルとして用いた。
総ＲＮＡは各左心室よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法に従って調製し、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡそれぞれ１μｇより反応液５０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子の発現解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ定量システムにより定量した。ＡＯＰ−１検出用のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブはプライマーデザインソフトウェアＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いてｍｏｕｓｅ  ＡＯＰ−１ｃＤＮＡの塩基配列を基に設計した。フォワードプライマー５’ＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣＣＣＡ３’（配列番号：７）、リバースプライマー５’ＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡ３’（配列番号：８）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧ３’（配列番号：９）。
リアルタイムＰＣＲ定量反応は上記ｃＤＮＡ１μｌを鋳型として反応液４０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて説明書に記載の方法に従って行った。同様の方法によりＧＡＰＤＨの発現量を解析し、内部標準として用いた。ＧＡＰＤＨフォワードプライマー５’ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ３’（配列番号：２４）、リバースプライマー５’ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣ３’（配列番号：２５）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣ３’（配列番号：２６）。ＧＡＰＤＨは、構成的蛋白質のひとつであり、内部標準として用いることは一般的である。解析結果は図２に示した。その結果すべてのモデルにおいて慢性心不全病態の進行に伴いＡＯＰ−１遺伝子の発現低下が見られた。
実施例３：ＴＳＡ（ＰＲｘ２），ＣｕＺｎ−ＳＯＤ，Ｍｎ−ＳＯＤ，Ｃａｔａｌａｓｅ遺伝子の発現解析
実施例１−１，Ｅに記載の方法にて得た左心室をサンプルとして用いた。
総ＲＮＡは各左心室よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法に従って調製し、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡそれぞれ１μｇより反応液５０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子の発現解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ定量システムにより定量した。検出用のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブはプライマーデザインソフトウェアＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いてｒａｔ  ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ，Ｍｎ−ＳＯＤ，ｃａｔａｌａｓｅ  ｃＤＮＡの塩基配列を基に設計した。ｒａｔ  ＴＳＡフォワードプライマー５’ＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＡＣＴ３’（配列番号：１０）、リバースプライマー５’ＣＣＴＧＴＡＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴ３’（配列番号：１１）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＡＧＣＴＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＧＴＴＧＡＡ３’（配列番号：１２）。ＣｕＺｎ−ＳＯＤフォワードプライマー５’ＧＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＣＡＴＧ３’（配列番号：１３）、リバースプライマー５’ＧＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡ３’（配列番号：１４）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＣＴＧ３’（配列番号：１５）。ｃａｔａｌａｓｅフォワードプライマー５’ＡＣＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣ３’（配列番号：１６）、リバースプライマー５’ＡＧＧＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣ３’（配列番号：１７）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡ３’（配列番号：１８）。Ｍｎ−ＳＯＤフォワードプライマー５’ＴＴＡＣＡＧＡＴＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣ３’（配列番号：２１）、リバースプライマー５’ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＡＡＧＧＣＣＴ３’（配列番号：２２）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＡＡＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡ３’（配列番号：２３）。
リアルタイムＰＣＲ定量反応は上記ｃＤＮＡ１μｌを鋳型として反応液４０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて説明書に記載の方法に従って行った。同様の方法によりＧＡＰＤＨの発現量を解析し、内部標準として用いた。解析結果は図３に示した。その結果ｓｈａｍ群に対してＶｅｈｉｃｌｅ群でＡＯＰ−１遺伝子の有意な発現低下が見られたのに対し（ｐ＝０．０５）、ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ，Ｍｎ−ＳＯＤ，Ｃａｔａｌａｓｅでは遺伝子発現変化は見られなかった。
実施例４：ラットＡＯＰ−１ｃＤＮＡのクローニング
４−１  ｒａｔ  ＡＯＰ−１ＰＣＲ断片のクローニング
実施例２にて作成したｃＤＮＡを鋳型として用い、フォワードプライマー５’ＡＡＣＣＧＣＧＧＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＣＴＣＴ３’（配列番号：１９）、リバースプライマー５’ＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧ３’（配列番号：２０）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物をＰＣＲ  ＩＩベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングした。
４−２  塩基配列の決定
塩基配列は、ＴＨＥＲＭＯ  ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭＩＩ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて自動ＤＮＡ配列読み取り装置モデル３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋのデーターバンクに照会した結果、クローンの１つ（ｐＦＨ１）がラットＡＯＰ−１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１０６９４４：配列番号２）と一致する遺伝子であることが判明した。
実施例５：ＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターの構築
５−１  コスミドの構築
アデノウイルス改変ベクターの構築は、宝酒造株式会社製Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔを用いて行った。実施例３にて構築したｐＦＨ１からＡＯＰ−１遺伝子を含むＳａｃＩＩ，ＮｈｅＩ断片を切り出し、ｐＱＢＩ２５（宝酒造株式会社製）にクローニングした。後にＮｈｅＩ，ＢａｍＨＩでＧＦＰ遺伝子を欠失させることにより、ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＡＯＰ−１遺伝子、その下流に牛Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ由来のｐｏｌｙＡシグナルを持ったＡＯＰ−１発現ユニットを構築した。この発現ユニットをＢｇｌＩＩ，ＤｒａＩＩＩを用いて切り出し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて末端を平滑化し、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ付属のコスミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ  ｓｉｔｅにクローニングした。
５−２．２９３細胞を用いたＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターの作製と増幅
上記のコスミドとＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ付属のＤＮＡ−ＴＰＣを２９３細胞（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。２９３細胞内で、ＡＯＰ−１ｃｏｓｍｉｄと、ＤＮＡ−ＴＰＣが相同組換えを起こし、ＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターが構築され、２９３細胞が恒常的に発現するＥ１蛋白の働きを借り、ウイルスとして増殖する。なお、作成したＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターはＥ１遺伝子を欠失しており、人為的にＥ１遺伝子を構成的に発現するよう形質転換された細胞内（例えば２９３細胞）でしか増殖することが出来ない。
５−３．ＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターのタイターチェック
実施例４−２にて構築されたＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターのタイターチェックは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ付属のマニュアル記載の方法に順じて行った。
実施例６：ラット培養心筋細胞の作製とＡＯＰ−１遺伝子導入
生後１乃至３日目の新生児ラットをエーテル麻酔し、ｄｅｃａｐｉｔａｔｉｏｎ後心臓を摘出した。心室を単離し、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ｗａｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）消化によって細胞を分散させた。Ｐｅｒｃｏｌｌ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて密度勾配遠心を行い、心筋細胞と、非心筋細胞を分取した。牛胎仔血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）を終濃度１０％で混合した日研生物医学研究所社製Ｄ−ＭＥＭ（ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を用いて、分取した心筋細胞を培養した。実施例５にて作製したＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターを１．６×１０２（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で１時間感染させた後、培地にて２回洗浄した。２４時間培養後、実施例７に供した。
実施例７：遺伝子導入細胞に対する無酸素培養、再酸素化ストレス応答解析
実施例５と同様の方法にて作製したβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現アデノウイルス改変ベクターを用いて、実施例６と同様の方法にて作製したβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ強制発現細胞を作製した。これを遺伝子導入系にて無害無益蛋白質を強制発現させた比較対照群に位置づけ、以下の実験に加えた。実施例６にて作製したＡＯＰ−１強制発現細胞とコントロール細胞を、無酸素培養系に２４時間、その後大気酸素濃度、５％炭酸ガス濃度での通常培養系に戻し（再酸素化）７２時間培養を行った。また、同時に通常酸素濃度で、２４時間培養を行った通常酸素濃度対照群も作製した。通常酸素下で培養した細胞、無酸素培養後、再酸素化培養後の細胞をそれぞれサンプリングし、顕微鏡下で観察を行った。生存する細胞数、自律に拍動する細胞数を測定し統計処理した。その後、ミトコンドリア呼吸鎖に属するｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ系が、ＭＴＴ試薬（ナカライテスク社製）を還元することを利用した、細胞生存率、細胞代謝活性測定試薬を用いて解析を行った。
その結果、通常酸素濃度下で培養したＡＯＰ−１導入群、コントロール群間では、細胞生存率に差が無かったのに対して、無酸素条件下２４時間培養後、再酸素化培養後の細胞生存率は、ＡＯＰ−１遺伝子導入群で有意な増加を示した（図４）。また、無酸素条件下２４時間培養後、再酸素化培養後の細胞自律拍動率は、ＡＯＰ−１遺伝子導入群で有意な増加を示した（図５）。さらに、ＭＴＴを用いた実験においても、無酸素条件下２４時間培養後、再酸素化培養後において、ＡＯＰ−１遺伝子導入群で有意にＭＴＴ分解活性の上昇が観察された（図６）。特に、通常酸素濃度下における培養つまり無傷害状態で細胞代謝機能を活性化したこと（図６）より、ＡＯＰ−１はミトコンドリア機能を向上させる可能性が示唆された。
一般に、酸素欠乏状態における細胞内では、好気的エネルギー産生系から、嫌気的エネルギー産生系への切り替えが起こり、クエン酸の蓄積等による細胞内酸性化傷害、嫌気的エネルギー産生系が好気的エネルギー産生系に対して非効率であるために、細胞内エネルギーの枯渇傷害が発生すると考えられている。また、再酸素化時には、ミトコンドリアにおいて活性酸素種が発生することが示されており、蛋白質、ＤＮＡ、細胞膜リン脂質等の酸化を経て細胞に傷害を与える。本実施例における結果から、ＡＯＰ−１は心筋細胞におけるこれらの傷害を除去し、細胞の正常な機能を維持する活性を有することが明らかとなった。
虚血性慢性心不全（心筋梗塞後慢性心不全）のみならず慢性心不全においても、心機能の低下、心肥大に起因する、心筋細胞に対する血流不足（虚血）が報告されていることから、当該蛋白質を慢性心不全状態の心筋細胞に補充することにより、心筋細胞を保護し、さらに拍出機能を維持させることにより、慢性心不全治療薬となる。
実施例８：アンチセンスＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターの構築
実施例５で用いたＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＡＯＰ−１遺伝子、その下流に牛Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ由来のｐｏｌｙＡシグナルを持ったＡＯＰ−１発現ユニットから、ＡＯＰ−１遺伝子を切り出し、切り出した両方のフラグメントをＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて末端を平滑化し、再びｌｉｇａｔｉｏｎした。ＡＯＰ−１のクローニングされた方向を配列解読によって確認した。この発現ユニットをＢｇｌＩＩ，ＤｒａＩＩＩを用いて切り出し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて末端を平滑化し、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ付属のコスミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ  ｓｉｔｅにクローニングした。これを用い、実施例５と同様にウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒアンチセンスＡＯＰ−１ｃｏｓｍｉｄ）を作製した。
実施例９：培養心筋細胞に対するアンチセンスＡＯＰ−１遺伝子強制発現の影響  実施例６と同様の方法にて、アンチセンスＡＯＰ−１、ＡＯＰ−１、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ強制発現細胞を作製した。未導入細胞と共に、上記遺伝子導入細胞を７２時間培養を行った後、ミトコンドリア呼吸鎖に属するｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ系が、ＭＴＴ試薬（ナカライテスク社製）を還元することを利用した、細胞生存率、細胞代謝活性測定試薬を用いて解析を行った。すると、アンチセンスＡＯＰ−１導入細胞群でのみ有意に、ＭＴＴ試薬分解物の生成が抑制されていた（図７）。顕微鏡下で観察を行った結果、アンチセンスＡＯＰ−１群では、有意に生存細胞数の減少が見られた。よって、アンチセンスＡＯＰ−１の強制発現は、培養心筋細胞の生存に不利に作用することが判明した。
実施例１０：その他病態モデルの作製
Ａ．腎炎モデルの作製
８週齢のＷｉｓｔａｒ系雌性ラットを用いた。エーテル麻酔下で左腎臓を摘出した。その１時間後にａｎｔｉ−Ｔｈｙ−１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１−２２−３），５００μｇ／ｒａｔを静脈内投与することによって腎炎を惹起した（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｊｐｎ．３６：１１９１，１９８６）。腎炎惹起後経時的（１日、４日、７日、１４日、２８日後）に腎臓を摘出した。
Ｂ．ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ（感染性肝炎）モデルの作製
１５０−３００ｇの同週齢ラット３匹に対し、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  １０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、２時間後肝臓を摘出した。
Ｃ．脳障害モデルの作製
ｓｌｃ  ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（１１ｗ）をネンブタール麻酔下に脳定位固定装置に固定し、頭蓋骨露出後、ブレグマ、ラムダの水平を確認し、ブレグマより後方４．５ｍｍ、側方２．７ｍｍに直径約０．５ｍｍ程度の穴を開けた。マイクロシリンジを用いて、ブレグマより深さ３．０ｍｍの部位にイボテン酸０．６μｇを注入した。７２時間後切片用サンプルを回収し、遺伝子発現解析に供した。イボテン酸はグルタミン酸アナログであり、ＮＭＤＡレセプターに特異性を持たせた化合物である。よって、イボテン酸による神経細胞傷害は、上述したグルタミン酸傷害の２つの主要なメカニズムの内、ＮＭＤＡレセプターの過剰興奮を介する神経細胞傷害を起こすものである。
実施例１１：その他病態モデルでのＡＯＰ−１並びにその他の遺伝子の発現解析
総ＲＮＡは上記実施例１０で得られた各臓器の組織よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法に従って調製し、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡそれぞれ１μｇより反応液５０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子の発現解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ定量システムにより定量した。ＡＯＰ−１並びにその他の遺伝子検出用のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブはプライマーデザインソフトウェアＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いてｍｏｕｓｅ  ＡＯＰ−１ｃＤＮＡの塩基配列を基に設計した。ＡＯＰ−１フォワードプライマー（配列番号：７）、リバースプライマー（配列番号：８）、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：９）。ＴＳＡフォワードプライマー（配列番号：１０）、リバースプライマー（配列番号：１１）、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１２）。ＣｕＺｎ−ＳＯＤフォワードプライマー（配列番号：１３）、リバースプライマー（配列番号：１４）、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１５）。ｃａｔａｌａｓｅフォワードプライマー（配列番号：１６）、リバースプライマー（配列番号：１７）、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１８）。Ｍｎ−ＳＯＤフォワードプライマー（配列番号：１９）、リバースプライマー（配列番号：２０）、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：２１）。
リアルタイムＰＣＲ定量反応は上記ｃＤＮＡ１μｌを鋳型として反応液４０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて説明書に記載の方法に従って行った。同様の方法によりＧＡＰＤＨの発現量を解析し、内部標準として用いた。解析結果は（図８ａ：腎炎モデル、８ｂ：脳障害モデル及び図９：感染性肝炎モデル）に示した。その結果各疾患モデルの疾患臓器において病態の進行に伴いＡＯＰ−１遺伝子の発現低下が見られた。
実施例１２：胎仔ラット由来培養神経細胞の作製
Ｗｉｓｔａｒ系妊娠１８〜２０日目ラットをエーテル麻酔した後、開腹した。子宮より胎児を取り出し、さらに胎仔から脳を取り出し氷冷ＨＢＳＳ（組織培養用ハンクス液「ニッスイ」▲２▼（日水製薬社）９．８ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３０．３５ｇ／ｌを作製し濾過滅菌）中に保存した。直ちに実体顕微鏡下で大脳を分離し、蛋白質分解酵素ｐａｐａｉｎ（ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）にて細胞を分散させた。馬血清を終濃度１０％で混合した日研生物医学研究所社製Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を用いて、分取した神経細胞を培養した。培養開始後、４日目上記血清含培地を加え、さらに３日間培養を行った。合計７日間培養後、ＡＯＰ−１もしくはβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅアデノウイルスベクターによる遺伝子導入を行った。遺伝子導入後４８時間培養し、グルタミン酸傷害、無血清化等の刺激を行った。
実施例１３：ＡＯＰ−１の培養神経細胞におけるグルタミン酸傷害保護作用の検出
実施例１２にて作製した培養神経細胞に対し、実施例６と同様の方法にてＡＯＰ−１遺伝子の導入を行った。実施例７と同様にβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを強制発現させた群を比較対照に位置づけ、以下の実験に用いた。終濃度０，１００，５００μＭ、でｇｌｕｔａｍａｔｅを加え４８時間培養した後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙに供した。ｇｌｕｔａｍａｔｅを加えなかった、それぞれの遺伝子導入群のＭＴＴ値で、ｇｌｕｔａｍａｔｅ傷害群を割り返したものを神経細胞保護率としてグラフ化した（図１０）。なお、図１０中の、ＭＫ−８０１は、（＋）−ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｈｅｐｔｅｎｅｉｍｉｎｅであり、ＮＭＤＡレセプターのアンタゴニストであり、神経培養細胞をグルタミン酸傷害から守ることが示されている（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９３  Ｖｏｌ．２４８（４）３０３−３１２）。図で示したように、ＡＯＰ−１導入群はＭＫ−８０１非添加群において、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ導入群に比較して培養神経細胞保護傾向を示した。さらに、ＭＫ−８０１添加群においては、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ導入群に比較して有意に培養神経細胞保護作用を示したので、ＡＯＰ−１はＭＫ−８０１の保護作用に対し相加作用を持つことが示された。神経細胞におけるグルタミン酸傷害には、前述のＮＭＤＡレセプターを介するカルシウム過負荷と、ｃｙｓｔｉｎｅ，ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒの活性化を介する細胞内ｃｙｓｔｉｎｅ枯渇傷害（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２  Ｖｏｌ．４８（４）９０６−９１４）の二つが見出されている。上記の結果から、ＡＯＰ−１は上記二つの傷害に対する保護作用を併せ持つと考えられる。
実施例１４：ＡＯＰ−１の培養神経細胞神経突起伸展促進作用の検出
実施例１２にてグルタミン酸未添加の細胞（１０％ＦＢＳ群）、グルタミン酸添加（１０％ＦＢＳ群＋１００μＭ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ群）無血清化（０％ＦＢＳ群）、を写真撮影した（図１１）。
各種刺激存在下で常にＡＯＰ−１導入群で神経突起伸展促進、保護作用が観察された。
実施例１５：ＡＯＰ−１，ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤの培養心筋細胞に対する保護作用の比較
実施例４に記載の方法でｒａｔ  ＴＳＡを取得し、配列確認を行った（配列番号２７）。配列番号２８は、配列番号２７から翻訳される蛋白質配列を表す。また、ＣｕＺｎ−ＳＯＤは文献（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ  １９９０  Ｖｏｌ．２０：２６９（１）８９−９２）に記載されたｈｕｍａｎ  ＣｕＺｎ−ＳＯＤ遺伝子（配列番号２９）を含むプラスミド（ｐＹＳＯ２００）を著者から入手し用いた。配列番号３０は、配列番号２９から翻訳される蛋白質配列を表す。各種遺伝子に対し実施例５に記載した方法を用いて、ＴＳＡ発現アデノウイルス改変ベクター、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ発現にアデノウイルス改変ベクターを作製した。また、実施例６記載の方法を用いて作製した培養心筋細胞に、同じく実施例６記載の方法を用いて遺伝子導入を行った。ストレス耐性に関する解析は以下のように行った。
▲１▼無酸素条件培養（Ｈｙｐｏｘｉａ）における細胞生存率
遺伝子導入後２４時間培養した細胞を無酸素条件に暴露しさらに２４時間培養を行った。細胞生存率を実施例７記載のＭＴＴ法を用いて測定した。ＡＯＰ−１，ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ遺伝子を導入した細胞は、対照（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ導入細胞）に対しそれぞれ有意（ｐ＜０．０１）な生存率増加作用を示した。ＡＯＰ−１遺伝子を導入した細胞はＴＳＡを導入した細胞に対し有意に生存率が増加し、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ導入細胞に対して生存率が増加傾向を示した（図１２ａ）。
▲２▼過酸化水素暴露による細胞生存率
遺伝子導入後２４時間培養した細胞を０．１，１ｍＭ過酸化水素に暴露しさらに２４時間培養を行った。細胞生存率を実施例７記載のＭＴＴ法を用いて測定した。ＡＯＰ−１遺伝子を導入した細胞は、有意（Ｐ＜０．０５）に対照に対し有意に細胞生存率が増加した。しかし、ＴＳＡ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ導入群では、細胞生存率改善傾向は示したが、統計的に有意（ｐ＜０．０５）ではなかった（図１２ｂ）。
▲３▼高グルコース培養条件による細胞生存率
遺伝子導入後２４時間培養した細胞を３０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（通常濃度の６倍程度）に暴露しさらに２４時間培養を行った。細胞生存率を実施例７記載のＭＴＴ法を用いて測定した。ＡＯＰ−１遺伝子を導入した細胞は、対照に対し有意（Ｐ＜０．０５）に細胞生存率が増加した。しかし、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ導入群では、細胞生存率改善傾向は示したが、統計的に有意な差ではなかった。
また、ＴＳＡ遺伝子導入細胞では、対照に対し生存率に差が無かった（図１２ｃ）。高グルコース培地培養は糖尿病時高血糖状態に近似すると考えられ、ＡＯＰ−１はこれに纏わる合併症にも効果があると考えられる。
実施例１６：ＡＯＰ−１の心臓保護作用
ラット心臓にＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターの感染を行った。同時に希釈液（生理食塩水）を用いて感染操作のみを行ったＳｈａｍ群を作製した。感染方法は文献（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１  Ｖｏｌ．１０４  １４２４−１４２９）に準じた。導入後４−５日動物を飼育した後ランゲンドルフ虚血再灌流実験に供した。ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ・Ｎａ（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で麻酔し、尾静脈よりｈｅｐａｒｉｎ（５００Ｕ／ｋｇ）を投与した。開胸後、心臓を肺とともに摘出し、大動脈にカニューレを挿入後、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ法（７０ｍｍＨｇ定圧灌流）で灌流した。圧トランスデューサーに接続したラテックスバルーンを左心耳から左心室内へ挿入し、左心室圧を測定した。左室拡張末期圧が約５ｍｍＨｇになるようにバルーン内に水を充填させた。灌流液はｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｍＭ：ＮａＣｌ１１８，ＫＣｌ４．７，ＣａＣｌ２１．２５，ＭｇＳＯ４１．２，ＫＨ２ＰＯ４１．２，ＮａＨＣＯ３２５．０，ｇｌｕｃｏｓｅ１１．０）を用いた。右心房をペースメーカーにより約２８０ｂｐｍでペーシングし心拍数を一定に保った。
灌流液を３５分間停止させることで虚血を施し、その後、灌流を３０分間再開させることで虚血再灌流障害を作製した。虚血前および再灌流３０分後に左心室圧を測定し、心機能回復率を求めた。また、虚血開始から虚血硬直を生ずるまでの時間を調べた。虚血硬直は、心筋細胞ＡＴＰ枯渇と良く相関することが示されている（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９６，Ｖｏｌ．２８，１０４５−１０５７）。さらに、心灌流液中に放出されるＬａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）活性を測定（再灌流後１〜３０分）することで、心筋細胞壊死量を比較した。
ＡＯＰ−１を強制発現させた心臓は、遺伝子導入操作のみを行ったＳｈａｍ群の心臓に対して、再灌流時の機能回復が有意に良好であることが判明した（図１３ａ）。また、虚血から虚血硬直に至る時間を計測したところ、ＡＯＰ−１を強制発現させた心臓は、対照群（Ｓｈａｍ群）に対し有意に延長効果を示した（図１３ｂ）。これは、ＡＯＰ−１が虚血時心筋細胞内のＡＴＰ減少を抑制したことを示す。また、虚血再灌流後、心灌流液中に放出されるＬＤＨ活性量を測定したところ、ＡＯＰ−１群では、対照群に対し有意にＬＤＨ放出を抑制した（図１３ｃ）。ＬＤＨの放出は、細胞傷害、細胞壊死に相関するマーカー蛋白質として一般的である（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１，Ｖｏｌ．２８０，Ｈ２３１３−２３２０）。よって、ＡＯＰ−１は再灌流時の細胞壊死を抑制したと考えられる。上記の結果から、ＡＯＰ−１は培養細胞のみならず、生体内においても、抗酸化作用に加え、新規のミトコンドリア活性化作用を介して、虚血傷害、再灌流傷害を共に保護することが判明した。
実施例１７：ＡＯＰ−１の脳保護作用
実施例１０−ｃにより脳障害モデルを作製する手法を用いて、ＡＯＰ−１発現アデノウイルス改変ベクターを脳海馬内に８．５×１０６ＰＦＵ注入した。その７２時間後、同一部位にイボテン酸を実施例１０−ｃと同様に注入した。対照群としてβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子導入群を作製し、同様にイボテン酸処理を施した。７２時間後組織切片用サンプルを回収し、１２日後ｐｅｒｉｆｅｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｈｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ（ＰＴＢＢＳ）解析用のサンプル回収を行った。ＰＴＢＢＳ解析とは、ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｈｉｎｅに対する結合性を指標とした、グリア細胞の増殖・遊走の定量的解析方法である。これは、神経細胞死によりグリア細胞が活性化し遊走増殖する、いわゆるグリオーシスを測定する方法として一般的である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０００  Ｖｏｌ．１００９  １０５−１１１，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１  Ｖｏｌ．５６５  ３１２−３２０）。切片用のサンプルを用い、凍結切片法にて厚さ１０μｍの切片を作成し、神経細胞特異的染色方法であるニッスル染色に供した。ＰＴＢＢＳ解析用のサンプルは、密閉式組織破砕器にて海馬を破壊し、組織溶解液を作製した。蛋白質濃度を実施例１−３記載の方法で求めた。トリチウム標識したｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｈｉｎｅを組織溶解液に混合し、３７℃で１時間結合反応を行った。この後、蛋白質とそれに結合したトリチウム標識ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｈｉｎｅをガラス繊維フィルターにトラップし、結合しなかったトリチウム標識ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｈｉｎｅを洗浄除去した。上記ガラス繊維フィルターの放射能を定量した。ＰＴＢＢＳ解析では、対照群（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現群）に対し、ＡＯＰ−１遺伝子導入群は、有意にグリア細胞の増殖・遊走を抑制した（図１４ａ）。また、組織切片を神経細胞を特異的に染色すると、対照群に対してＡＯＰ−１遺伝子導入群では定性的に神経細胞が保護されていることが分かった（図１４ｂ）。上記解析により、ＡＯＰ−１は脳神経細胞を保護する効果をもつことが判明した。
実施例１８：ＡＯＰ−１の腎保護作用
Ｗｉｓｔｅｒ  ｒａｔ雌  ７週齢を片腎摘し、Ｔｈｙ−１抗体の注入を行った。Ｔｈｙ−１抗体注入直後、一部の動物にはＡＯＰ−１または、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを強制発現するアデノウイルスベクターの静脈内注入を行った。さらにアデノウイルスベクターの感染を１週間毎、合計３回行った。Ｔｈｙ−１感作後、３日、７日、１４日、２８日に血液サンプルを回収し、血中尿素窒素量（ＢＵＮ）の解析を行った。２８日後組織回収を行い、糖タンパク染色法であるＰＡＳ染色による組織像を得た。組織像解析の結果ＡＯＰ−１遺伝子導入群における１個体でＴｈｙ−１腎炎における他の個体所見と比較して人為的な病因を見出し、かつＤａｙ７のＢＵＮ解析の結果を棄却検定（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）にて解析した場合においても棄却されたので、解析から除外した。
図１５ａに血中ＢＵＮ量の変化を経時的に表示した。Ｄａｙ７においては、ｓｈａｍ群（Ｔｈｙ−１腎炎非惹起、非遺伝子導入群）とＶｅｈｉｃｌｅ群（Ｔｈｙ−１腎炎惹起、非遺伝子導入群）の間に有意差があったが、他の全ての時期においてＶｅｈｉｃｌｅ群、ｓｈａｍ群間に有意差は見られなかった。Ｄａｙ７の結果に注目した（図１５ｂ）ところ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に対し、ＡＯＰ−１遺伝子導入群の間に有意な保護作用を見出した。また、ＡＯＰ−１導入群はＳｈａｍ群に対して有意な差を認めなかった。図１５ｃに典型的な組織像を示した。Ｖｅｈｉｃｌｅ導入群では、四角で囲んだ部位において広範囲な尿細管の萎縮像が見られ、正常尿細管がほとんど存在しないのに対し、Ｓｈａｍ群では全く傷害が見られない。ＡＯＰ−１導入群でも四角で囲んだ部位において尿細管の萎縮が見られるが、その範囲はＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて限局されたもので、正常な尿細管が圧倒的に多いことが注目される。丸で囲んだ部位は糸球体を示す。Ｓｈａｍ群とＶｅｈｉｃｌｅ群を比較すると、色素沈着（濃い紫色の部分：＊印）が広範囲に見出される。ＡＯＰ−１導入群とＶｅｈｉｃｌｅ群を比較すると、この色素沈着がＡＯＰ−１群では少ない。この色素沈着は腎メサンギウム細胞の増殖を示す。メサンギウム細胞は糸球体傷害に伴い見出されることが示されており（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２  Ｖｏｌ．６６  ４８５−４９７）、また、過剰なメサンギウム細胞の増殖が糸球体硬化による機能障害を誘導することも示されている（Ｋｉｄｎｅｙｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １９９５  Ｖｏｌ．４８  １１１−１１７）。よって色素沈着の抑制すなわちメサンギウム細胞の増殖抑制は、ＡＯＰ−１が腎機能を保護した結果と考えられる。以上の結果から、ＡＯＰ−１に腎障害を抑制する能力があることが判明した。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、各慢性心不全病態モデルラットにおけるＡＯＰ−１蛋白質の心肥大期および心不全期での発現変化を示す。
図２は、各慢性心不全病態モデルラットにおけるＡＯＰ−１遺伝子の心肥大期および心不全期での発現変化を示す。
図３は、心筋梗塞後慢性心不全モデルラットにおけるＡＯＰ−１、ＴＳＡ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤおよびＣａｔａｌａｓｅ遺伝子の発現変化を示す。
図４は、ＡＯＰ−１遺伝子強制発現が細胞生存率に及ぼす影響を示す。
図５は、ＡＯＰ−１遺伝子強制発現が細胞自立拍動率に及ぼす影響を示す。
図６は、ＡＯＰ−１遺伝子強制発現がＭＴＴ分解活性に及ぼす影響を示す。
図７は、アンチセンスＡＯＰ−１遺伝子強制発現が培養心筋細胞に及ぼす影響を示す。
図８は、８ａ：腎炎モデルにおける炎症惹起７日目におけるＡＯＰ−１遺伝子の発現量を正常コントロールと比較したものである。８ｂ：イボテン酸微量注入による神経変性疾患モデルにおけるＡＯＰ−１，Ｃａｔａｌａｓｅ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ遺伝子の発現量を正常コントロールと比較したものである。
図９は、感染性肝炎モデルにおけるＡＯＰ−１遺伝子の発現量を正常コントロールと比較したものである。
図１０は、ＡＯＰ−１遺伝子強制発現が培養神経細胞グルタミン酸傷害に及ぼす保護作用を示す。
図１１は、ＡＯＰ−１遺伝子強制発現が培養神経細胞に及ぼす神経突起伸展促進・保護作用を示す。
図１２は、図１２ａは、ＡＯＰ−１，ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤをそれぞれ遺伝子導入した細胞の無酸素条件における培養（Ｈｙｐｏｘｉａ）における生存率を示し、図１２ｂは、ＡＯＰ−１，ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤをそれぞれ遺伝子導入した細胞の過酸化水素暴露条件における生存率を示し、図１２ｃは、ＡＯＰ−１，ＴＳＡ，ＣｕＺｎ−ＳＯＤをそれぞれ遺伝子導入した細胞の高グルコース培養条件における生存率を示す。
図１３は、図１３ａは、ＡＯＰ−１の虚血再灌流における心機能保護作用を示し、図１３ｂは、ＡＯＰ−１の虚血再灌流における虚血硬直抑制作用を示し、図１３ｃは、ＡＯＰ−１の虚血再灌流における心筋壊死の抑制作用を示す。
図１４は、図１４ａは、ＡＯＰ−１が神経細胞を保護した結果、ＰＴＢＢＳの量が減少した結果を示し、図１４ｂは、ＡＯＰ−１が神経細胞を保護したために、対照に比べ生存する神経細胞が増加したことを示す。図１４ｂ中の矢印は対照群における障害部位と、ＡＯＰ−１遺伝子導入群における同一部位を表す。
図１５は、図１５ａは、血中尿素窒素量の経時変化を各群について示し、図１５ｂは、炎症惹起後７日目ＡＯＰ−１が血中尿素窒素量の上昇を抑制したことを示し、図１５ｃは、炎症惹起後２８日目の腎臓組織像であって、ＡＯＰ−１が尿細管、糸球体を保護したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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