(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードし、そして
（ａ）配列番号１１、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列の内の１つ、
（ｂ）配列番号１２、配列番号１４の内の１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列と６８℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの１時間の洗浄後にハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
を含んでなるＤＮＡ配列を有する単離された核酸。
【請求項２】
請求項１に記載される配列の内の少なくとも一つのコピーを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載されるＤＮＡ配列、あるいは請求項２に記載されるベクターを用いて形質転換されている細胞。
【請求項４】
請求項３に記載される細胞、あるいはこの種類の細胞からの抽出物を糖の産生のために用いる、トレハロースおよび／またはパラチノースの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いる、非齲蝕性の糖、特にトレハルロースおよび／またはパラチノースの調製のための改良方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非齲蝕性の糖置換体であるパラチノース（イソマルツロース）およびトレハルロースは、固定化細菌性細胞（例えば、プロタミノバクター  ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）、エルウィニア  ラポンティキ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）、セルラティア  プリムティカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）を用いる酵素的転移によりスクロースから大量に産生される。これは二糖類であるスクロースの２つの単糖単位間に存在するα１→β２グリコシド結合が、パラチノースにおけるα１→６結合およびトレハルロースにおけるα１→α１結合へと異性化されることを伴なう。２つの非齲蝕性二糖類を生じるためのスクロースの転移は、スクロースムターゼとも称される細菌性酵素スクロースイソメラーゼによる触媒作用を用いて行われる。使用する生物体に依存して、この反応は所望の非齲蝕性二糖類パラチノースおよびトレハルロース以外にも、所定の比率における所望されない単糖類（グルコースおよび／またはフルクトース）を含む産物混合物をもたらす。これらの単糖類含有物は工業的には重要な問題となっており、その理由はそれらを除去するために手の込んだ精製処理（通常は分別結晶法）が必要であるためである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の基となる一つの目的は、スクロースのトレハルロールおよび／またはパラチノースへの異性化の際に単糖類の形成をできる限り抑制することであった。本発明の基となる他の目的は、既知の生物体が産生するものと比較してより高い収率においてパラチノースおよび／またはトレハルロースを産生する生物体を提供することであった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
これらの目的を達成するために、組換えＤＮＡ分子、組換えＤＮＡ分子で形質転換させた生物体、組換え蛋白質、および特にパラチノースおよび／またはトレハルロースである非齲蝕性の糖の調製のための改良方法を提供する。
【０００５】
本発明は、スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードし、そして
（ａ）適切である場合にはシグナルペプチドコーディング領域を伴わない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３で示されるヌクレオチド配列の内の一つ、
（ｂ）遺伝コードの縮重の範囲内に含まれる、（ａ）からの配列に対応するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
を含んでなるＤＮＡ配列に関する。
【０００６】
本発明の文脈においては、用語「スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質」は、スクロースを、スクロース中のグルコースとフルクトースとの間のα１→β２グリコシド結合の、２つの単糖単位の間の他のグリコシド結合、特にα１→６結合および／またはα１→α１結合への転化により他の二糖類へと異性化することが可能である蛋白質を意図している。したがって用語「スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質」は、具体的にはスクロースをパラチノースおよび／またはトレハルロースへと異性化することが可能な蛋白質に関することが好ましい。そのうえ、スクロースの異性化により形成される全ての二糖類におけるパラチノースとトレハルロースとの比率は≧２％であることが好ましく、特に≧２０％であることが好ましく、そして≧５０％であることが最も好ましい。
【０００７】
配列番号１において示されるヌクレオチド配列は、微生物プロタミノバクタールブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）（ＣＢＳ  ５４７，７７）からの完全なスクロースイソメラーゼをコードしており、これはシグナルペプチド領域を含む。配列番号２において示されるヌクレオチド配列は微生物エルウィニア  ラポンティキ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）（ＮＣＰＰＢ  １５７８）からのスクロースイソメラーゼのＮ−末端分画をコードしており、これはシグナルペプチドを含む。配列番号３において示されるヌクレオチド配列は、エンテロバクター  スピシーズ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ ｓｐｅｃ．）ＳＺ６２株からのスクロースイソメラーゼのある分画をコードしている。
【０００８】
配列番号１におけるシグナルペプチドをコードする領域はヌクレオチド１−９９までの範囲に広がっている。配列番号２におけるシグナルペプチドをコードする領域はヌクレオチド１−１０８までの範囲に広がっている。本発明に従うＤＮＡ配列はシグナルペプチドをコードする領域を含まない配列番号１および配列番号２において示されるヌクレオチド配列をも含むが、その理由は、シグナルペプチドは一般的に特別な細胞区画内（例えば、外膜と内膜との間の周辺腔内、外膜内、もしくは内膜内）における成熟蛋白質の正確な局在化、あるいは細胞外輸送のためのみに必要であるに過ぎず、そのような酵素活性のために必要であるのではないからである。したがって本発明は成熟蛋白質（シグナルペプチドを伴わない）をもコードし、そして異種のシグナル配列、特に例えばｄｉｅ  Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８５）、ｐ．２５６においてＥ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ、Ｅｉｎｅ  Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、において記載されるような原核生物のシグナル配列に操作的に連結させてある配列を含む。
【０００９】
配列番号９のヌクレオチド配列は、プロタミノバクター  ルブルムからのイソメラーゼの変異体をコードしている。配列番号１１のヌクレオチド配列は、単離ＳＺ  ６２株からの完全なイソメラーゼをコードしている。配列番号１３のヌクレオチド配列は、ＭＸ−４５株（ＦＥＲＭ  １１８０８またはＦＥＲＭ  ＢＰ３６１９）からのイソメラーゼの大部分をコードしている。
【００１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３において示されるヌクレオチド配列、ならびに遺伝コードの縮重の範囲内に含まれるこれらの配列の内の一つに対応するヌクレオチド配列以外にも、もしある配列がスクロースを異性化することが可能な蛋白質をコードしているとしたら、本発明はそれらの配列の内の一つとハイブリッド形成するＤＮＡ配列をも含む。本発明に従う用語「ハイブリッド形成」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、１．１０１−１．１０４）におけるように用いる。本発明に従うと、ハイブリッド形成は、１時間の１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５５℃、好ましくは６２℃、および特に好ましくは６８℃での洗浄、特に１時間の０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５５℃、好ましくは６２℃、および特に好ましくは６８℃での洗浄の後に依然として陽性のハイブリッド形成シグナルが観察される場合に用いられる用語である。配列番号１もしくは配列番号２において示されるヌクレオチド配列の内の一つ、あるいは遺伝コードの縮重の範囲内に含まれるそれらの配列に対応するヌクレオチド配列と、このような洗浄条件下においてハイブリッド形成するヌクレオチド配列は、本発明に従うヌクレオチド配列である。
【００１１】
本発明に従うＤＮＡ配列は、
（ａ）適切である場合にはシグナルペプチドをコードする領域を伴わない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３で示されるヌクレオチド配列の内の一つ、あるいは
（ｂ）（ａ）からの配列と少なくとも７０％相同であるヌクレオチド配列、
を有することが好ましい。
【００１２】
本発明に従うＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３で示されるヌクレオチド配列の保存部分領域に対して少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列をも有することが好ましい。これらの保存部分領域は具体的には、配列番号１において示されるヌクレオチド配列中のヌクレオチド１３９−１８６、ヌクレオチド２５６−３１２、ヌクレオチド３２８−３６０、ヌクレオチド３７９−４２０、および／またはヌクレオチド４２４−４４４である。
【００１３】
特に好ましい態様においては、本発明に従うＤＮＡ配列は、配列番号１において示されるヌクレオチド配列の、
（ａ）ヌクレオチド１３９−１５５、および／または
（ｂ）ヌクレオチド６２５−６４４
の部分領域に対して少なくとも８０％相同である、特に少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を有する。
【００１４】
先の配列領域から得られるオリゴヌクレオチドは、プロタミノバクター  ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）（ＣＢＳ  ５４７，７７）、エルウィニア  ラポンティキ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）（ＮＣＰＰＢ  １５７８）、分離菌ＳＺ６２、およびシュードモナス  メソアキドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５（ＦＥＲＭ  １１８０８）を例とする多大な数のテスト微生物のゲノムＤＮＡからのイソメラーゼ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして適切であることが判明している。
【００１５】
以下に示されるオリゴヌクレオチド（括弧内に示される塩基は二者択一のものとして存在することができる）は適切である場合には混合物の形態をとっており、これらのオリゴヌクレオチドをこの目的のために用いることが特に好ましく、それらは、
オリゴヌクレオチドＩ（１７ヌクレオチド）
５′−ＴＧＧＴＧＧＡＡ（Ａ，Ｇ）ＧＡ（Ｇ，Ａ）ＧＣＴＧＴ−３′
オリゴヌクレオチドＩＩ（２０ヌクレオチド）
５′−ＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧ（Ｇ，Ａ）ＴＣＣＧＧＣＴＧ−３′
オリゴヌクレオチドＩは配列番号１のヌクレオチド１３９−１５５から得られ、そしてオリゴヌクレオチドＩＩは配列番号１のヌクレオチド６２５−６４４に対して相補的な配列から得られる。本発明に従うＤＮＡ配列の相同部分領域と、オリゴヌクレオチドＩおよびオリゴヌクレオチドＩＩと称される配列との間の相違は、各場合において２ヌクレオチドを上回らないことが好ましく、そして各場合において１ヌクレオチドを上回らないことが特に好ましい。
【００１６】
本発明の他の特に好ましい態様においては、ＤＡＮ配列は、配列番号１において示されるヌクレオチド配列の、
（ａ）ヌクレオチド９９５−１０１３、および／または
（ｂ）ヌクレオチド１０７８−１０９４
の部分領域に対して少なくとも８０％相同性、特に少なくとも９０％相同性を有する。
【００１７】
先の配列領域から得られるオリゴヌクレオチドは、プロタミノバクター  ルブルム、エルウィニア  ラポンティキからのスクロースイソメラーゼ遺伝子とハイブリッド形成する。
【００１８】
本発明の他の特に好ましい態様においては、ＤＡＮ配列は、配列番号１において示されるヌクレオチド配列の、
（ａ）ヌクレオチド９９５−１０１３、および／または
（ｂ）ヌクレオチド１０７８−１０９４
の部分領域に対して少なくとも８０％相同性、特に少なくとも９０％相同性を有する。
【００１９】
本発明に従うヌクレオチド配列は、具体的にはプロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セルラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、レウコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびクレブシエルラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）という属の微生物から取得することができる。このような微生物の具体的な例は、プロタミノバクター  ルブルム（ＣＢＳ  ５４７，７７）、エルウィニア  ラポンティキ（ＮＣＰＰＢ  １５７８）、セルラティア  プリムティカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）（ＡＴＣＣ  １５９２８）、セルラティア  マルケスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ＮＣＩＢ  ８２８５）、レウコノストック  メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５２１ｆ（ＡＴＣＣ  １０８３０ａ）、シュードモナス  メソアキドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５（ＦＥＲＭ  １１８０８もしくはＦＥＲＭ  ＢＰ−３６１９）、アグロバクテリウム  ラディオバクテル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＸ−２３２（ＦＥＲＭ  １２３９７もしくはＦＥＲＭ  ＢＰ−３６２０）、およびクレブシエルラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の亜種、およびエンテロバクター  スピシーズ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ ｓｐｅｃ．）である。本発明に従うヌクレオチド配列は、関連する微生物のゲノムから、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３の保存領域の内の一つもしくは複数からのオリゴヌクレオチドを用いて、増幅および／またはハイブリッド形成の標準的な技術により、単純な様式において単離することができ、そして特性決定することができる。本発明に従うヌクレオチド配列はオリゴヌクレオチドＩおよびＩＩを用いて、関連する生物体のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により取得することが好ましい。関連するスクロースイソメラーゼ遺伝子の部分断片はこのような方式において取得し、そして次には関連する微生物の遺伝子ライブラリーから完全な遺伝子を単離するためのハイブリッド形成プローブとして使用することができる。別法では、特定の生物体から遺伝子ライブラリーを作製し、そしてオリゴヌクレオチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、および／またはＩＶを用いてこの遺伝子ライブラリーを直接スクリーニングすることによりこのヌクレオチド配列を取得することができる。
【００２０】
本発明はさらに本発明に従うＤＮＡ配列の少なくとも一つのコピーを含むベクターに関する。このベクターは原核生物もしくは真核生物ベクターのいずれかのものであることができ、このベクター上では本発明に従うＤＮＡ配列が発現シグナル（プロモーター、オペレーター、エンハンサーなど）の調節下にあることが好ましい。原核生物ベクターの例は、バクテリオファージ（一例は、バクテリオファージλである）を例とするもののような染色体ベクター、ならびにプラスミドを例とするもののような染色体外ベクターであり、環状プラスミドベクターが特に好ましい。適切な原核生物ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前述、第１−４章において記載されている。
【００２１】
本発明に従うベクターの特に好ましい例はプラスミドｐＨＷＳ  ８８であり、これは調節可能なｔａｃプロモーターの調節下においてプロタミノバクター  ルブルム（配列番号１において示される配列を伴う）からのスクロースイソメラーゼ遺伝子を宿している。このプラスミドｐＨＷＳ  ８８を、受託番号ＤＳＭ  ８８２４の基に１９９３年１２月１６日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、ブダペスト条約の規定に従って寄託した。
【００２２】
本発明の他の好ましい態様においては、本発明に従うベクターは、宿主細胞当たり１０を下回るコピー数、特に好ましくは１から２までのコピー数で宿主細胞内に存在するプラスミドである。一方でこの種のベクターの例は、バクテリオファージλもしくはＦプラスミドを例とするもののような染色体ベクターである。スクロースイソメラーゼ遺伝子を含むＦプラスミドは、一例ではスクロースイソメラーゼ遺伝子を含むトランスポゾンでのＦプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株の形質転換、ならびにそのトランスポゾンがＦプラスミド内に取り込まれている組換え細胞についての後続の選択を行うことにより調製することができる。この種の組換えトランスポゾンの一例はトランスポゾンＴｎ  １７２１  Ｔｅｔを含むプラスミドｐＨＷＳ  １１８であり、そしてこれは先に記載のプラスミドｐＨＷＳ  ８８からのスクロースイソメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をトランスポゾンｐＪＯＥ  １０５（ＤＳＭ  ８８２５）内にクローニングさせることにより調製した。
【００２３】
他方、本発明に従うベクターは真核生物ベクターであることもでき、その例はイーストベクター（例えばＹＩｐ、ＹＥｐなど）、もしくはより高等な細胞に適するベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイスル性ベクター、植物性ベクター）である。これらの種類のベクターは分子生物学の領域における当業者に知られているため、その詳細をここに記載する必要なはい。これに関連しては、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上述、第１６章を引用されたい。
【００２４】
本発明はさらに、本発明に従うＤＮＡ配列もしくは本発明に従うベクターを用いて形質転換させる細胞に関する。ある態様においてはこの細胞は原核生物細胞、好ましくはグラム陰性原核生物細胞、特に好ましくは腸内細菌細胞である。そのうえ例えば大腸菌のようにそれ自体スクロースイソメラーゼ遺伝子を全く含まない細胞を使用することも可能である一方で、他方では、スクロースイソメラーゼ遺伝子の源として先に記載される微生物を例とする、それ自体染色体上にそのような遺伝子を既に含む細胞を使用することも可能である。適切な原核生物細胞の好ましい例は、大腸菌、プロタミノバクター  ルブルム、もしくはエルウィニア  ラポンティキ細胞である。外因性核酸配列を用いる原核生物細胞の形質転換は分子生物学の領域における当業者には知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上述、第１−４章を参照せよ）。
【００２５】
しかしながら本発明の他の態様においては、本発明に従う細胞は、例えば真菌類細胞（例えばイースト）、動物もしくは植物細胞であることもできる。外因性核酸配列を用いる真核生物の形質転換もしくはトランスフェクションのための方法は同様に分子生物学の領域における当業者に知られており、そしてその詳細をここに説明する必要はない（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上述、第１６章を参照せよ）。
【００２６】
本発明は、本発明に従うＤＮＡ配列によりコード化される、先に記載されるスクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質にも関する。この蛋白質は、
（ａ）適切である場合にはシグナルペプチド領域を含まない、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４において示されるアミノ酸配列の内の一つ、あるいは
（ｂ）（ａ）からの配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、
を含むことが好ましい。
【００２７】
配列番号４において示されるアミノ酸配列は、プロタミノバクター  ルブルムからの完全なスクロースイソメラーゼを含む。シグナルペプチドはアミノ酸１−３３の範囲内に広がっている。成熟蛋白質はアミノ酸３４において開始する。配列番号５において示されるアミノ酸配列は、エルウィニア  ラポンティキからのスクロースイソメラーゼのＮ−末端分画を含む。シグナルペプチドはアミノ酸１−３６の範囲内に広がっている。成熟蛋白質はアミノ酸３７において開始する。配列番号６において示されるアミノ酸配列は、微生物ＳＺ  ６２からのスクロースイソメラーゼの一部分を含む。図１は、Ｐ．  ルブルム、Ｅ．  ラポンティキ、およびＳＺ  ６２からのイソメラーゼのアミノ酸配列の比較である。
【００２８】
配列番号１０のアミノ酸配列はプロタミノバクター  ルブルムからのイソメラーゼの変異体を包含する。配列番号１２のアミノ酸配列は、ＳＺ  ６２からの完全なイソメラーゼを包含する。この酵素は３７℃で高い活性を有しておりそして単糖類は極めて少量産生されるにすぎない。配列番号１４のアミノ酸配列はＭＸ−４５からのイソメラーゼの大部分を包含する。この酵素は、約８５％のトレハルロース及び１３％のパラチノースを生産した。
【００２９】
本発明に従う蛋白質は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４において示されるアミノ酸配列からの保存部分領域、特に配列番号４において示されるアミノ酸配列の
（ａ）アミノ酸５１−１４９、
（ｂ）アミノ酸１６８−１８１、
（ｃ）アミノ酸１９９−２５０、
（ｄ）アミノ酸３５１−３８７、および／または
（ｅ）アミノ酸３９０−４２０、
からの部分領域に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
【００３０】
先に記載のＤＮＡ配列、ベクター、形質転換させた細胞、および蛋白質により、追加的な酵素活性を妨害することなく単純な様式においてスクロースイソメラーゼ活性を提供することが可能である。
【００３１】
一方でこの目的のために、宿主生物体からの抽出物の構成成分として、あるいは単離および精製された形態において、組換えＤＮＡ技術によりスクロースイソメラーゼを取得することが可能である（例えば、大腸菌内における発現により）。この、好ましくは精製および単離されているスクロースイソメラーゼ酵素を、酵素反応器内におけるスクロースの反応によるトレハルロースおよび／またはパラチノースを例とするもののような非齲蝕性の糖の工業的産生のために、例えば固定化形態において使用することができる。酵素の固定化は当業者に知られており、そして詳細をここに記載する必要はない。
【００３２】
他方で、スクロースからの非齲蝕性の糖の産生は、好ましくは固定化形態である完全な微生物内においても実施することができる。先に記載のスクロースイソメラーゼ遺伝子の、パラチノースおよび／またはトレハルロース代謝の低下していないかもしくは低下している（つまり、先に記載の糖類を分解することが有意に不可能である生物体内）生物体内へのクローニングにより、外因性ＤＮＡの導入に起因し、極微量の単糖類の形成のみを伴う状態で非齲蝕性二糖類を産生することが可能な、新規の生物体を作製することができる。したがって、スクロースイソメラーゼ遺伝子の導入に適するものは、パラチノースおよび／またはトレハルロースを利用することができない生物体（例えば、大腸菌、バチルス属、イースト）である一方で、他方では、原理的にはパラチノースおよび／またはトレハルロースを利用することが可能ではあろうが、非特異的突然変異もしくは特異的突然変異のためにパラチノースおよび／またはトレハルロースの代謝が低下している生物体である。
【００３３】
用語「パラチノースおよび／またはトレハルロースの代謝の低下」は本発明の目的については、関連する生物体のすべての細胞がＣ源としてスクロースを利用する際に非齲蝕性二糖類を産生するが、後者の二糖類を、例えばそれらを単糖類に分解することによる代謝においてわずかな範囲においてのみ利用することができるに過ぎないことを意味する。この生物体は１５−６５℃、特に２５−５５℃における非齲蝕性二糖類および単糖類の分解産物の総量に基づいて、好ましくは２．５％を下回る、特に好ましくは２％を下回る、最も好ましくは１％を下回る総グルコース  および  フルクトースを産生する。
【００３４】
したがって本発明はさらに、スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含み、そして先に特定されるようにパラチノースおよび／またはトレハルロース代謝が低下している細胞に関する。この種の細胞はより大きな比率の非齲蝕性二糖類、トレハルロースおよび／またはパラチノースを産生し、そして妨害性副産物であるグルコースおよびフルクトースの産生量が低下している。
【００３５】
本発明のある態様においては、パラチノースおよび／またはトレハルロースの細胞内分解の原因となっているインベルターゼおよび／またはパラチナーゼ遺伝子の発現の部分的もしくは完全な阻害により、パラチノースおよび／またはトレハルロースの代謝を低減させることが可能である。遺伝子発現のこのような阻害は、例えば部位特異的突然変異誘発および／または関連する遺伝子の欠損により実施することができる。配列番号７において示されるパラチナーゼ遺伝子または配列番号１５において示されるパラチノースヒドロラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異は、一例では相同染色体組換えに適し、そして突然変異を起こしているパラチナーゼ遺伝子を宿すベクターの導入、ならびにこのような組換えを生じている生物体の選択により実施することができる。遺伝子組換えによる選択の原理は、ｄｉｅ  Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（１９８５）、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｐｐ．３２０  ｅｔ  ｓｅｑ．におけるＥ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ、Ｅｉｎｅ  Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇにおいて説明されている。
【００３６】
さらに、パラチノースおよび／またはトレハルロース代謝が低下している本発明に従う生物体を、適切な出発生物体からの非特異的突然変異誘発、ならびにパラチナーゼ欠損突然変異体についての選択により取得することが可能である。この種類のパラチナーゼ欠損突然変異体のある例は、プロタミノバクター  ルブルム株ＳＺＺ  １３であり、これを受託番号ＤＳＭ  ９１２１の基に１９９４年３月２９日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、ブダペスト条約の規定に従って寄託した。この微生物は、Ｐ．ルブルムの野生型細胞のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンでの非特異的突然変異誘発により調製し、そしてこの微生物が非齲蝕性の糖であるトレハルロースおよびパラチノースをもはやグルコースおよびフルクトースへと開裂しない点において識別される。このような突然変異体の選択は、例えばＭａｃＣｏｎｋｅｙのパラチノース培地、もしくは単一のＣ源としてパラチノースもしくはグルコースを添加してある最小塩培地を使用することにより実施することができる。ＭａｃＣｏｎｋｅｙのパラチノース培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡからのＭａｃＣｏｎｋｅｙＡｇａｒ  Ｂａｓｅ（４０ｇ／Ｌ）および２０ｇ／Ｌのパラチノース）上で白色を呈する、あるいは単一のＣ源としてグルコースを添加してある最小塩培地上において生育するが、単一のＣ源としてパラチノースを添加してある対応する培地上ではそのようにはならない突然変異体を、パラチナーゼ欠損突然変異体として同定した。
【００３７】
さらに本発明は、スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む供与生物体からの遺伝子ライブラリーを適切な宿主生物体内に作製し、この遺伝子ライブラリーのクローンを調査し、そしてスクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸を含むクローンを単離する、スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードする核酸を単離するための方法に関する。この方法において単離され、そしてスクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸を、次には非齲蝕性の糖の新規の産生生物体を提供する目的で、先に記載される細胞内への導入のために使用することができる。
【００３８】
この方法においては、選択される宿主生物体はパラチノース代謝についてそれ自体の機能遺伝子、特に機能的なパラチナーゼおよび／またはインベルターゼ遺伝子を有さない生物体であることが好ましい。好ましい宿主生物体は大腸菌である。パラチノース産生性クローンの特徴決定を容易にするためには、遺伝子ライブラリー中のクローンを調査するに当たり、スクロース開裂性クローン、ならびにそのクローン中に含まれそして受容生物体から生じるＤＮＡ配列を単離し、そしてこれを、ガラクトースを利用せずかつ遺伝子ライブラリー中のクローンのためのスクリーニング株として用いられる大腸菌内に形質転換させることが可能である。
【００３９】
他方では、スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードするＤＮＡ配列についての遺伝子ライブラリー中のクローンの調査を、プロタミノバクター  ルブルム、エルウィニア  ラポンティキ、および分離菌ＳＺ６２からのスクロースイソメラーゼ遺伝子をコードする、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３から得られる核酸プローブを使用して実施することも可能である。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＩおよびＩＩを用いるＰＣＲ反応により取得されるＤＮＡ断片、あるいはオリゴヌクレオチドＩＩＩおよび／またはＩＶを、プローブとして使用することが特に好ましい。
【００４０】
本発明はさらに、非齲蝕性の糖、特にトレハルロースおよび／またはパラチノースの産生方法に関し、この方法は、
（ａ）単離形態における、スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質、
（ｂ）スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列、あるいはこのＤＮＡ配列の少なくとも一つのコピーを含むベクターで形質転換させた生物体、
（ｃ）スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含み、そしてパラチノースおよび／またはトレハルロース代謝が低下している生物体、および／または
（ｄ）そのような細胞もしくはそのような生物体からの抽出物、
を、糖類の産生のために使用することを含んでなる。
【００４１】
この方法は一般的に、適切な培地中の蛋白質、生物体、もしくは抽出物を、スクロースが少なくとも部分的にスクロースイソメラーゼにより非齲蝕性二糖類へと転化されるような条件下においてスクロースと接触させることにより実施する。その次に、非齲蝕性二糖類をその培地もしくは生物体から取得し、そして既知の様式において精製する。
【００４２】
この方法の好ましい態様においては、生物体、蛋白質、もしくは抽出物を固定化形態において使用する。蛋白質（純粋形態、もしくは抽出物におけるもの）は、適切な担体に対して、反応性側鎖基（例えば、ＮＨ2基）のカップリングにより固定化することが好ましい。細胞の固定化は、例えばアルギン酸ナトリウム／塩化カルシウム溶液中で実施する。細胞および蛋白質の固定化に適切な方法の総説は、例えば、Ｉ．Ｃｈｉｂａｔａ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９７９）において与えられている。
【００４３】
スクロースイソメラーゼ遺伝子で形質転換させた細胞の利用に際して、細胞中の遺伝子コピー数を増加させること、および／または強力なプロモーターとの組み合わせで発現速度を増大させることにより、既知の生物体と比較して非齲蝕性の糖の産生速度を増加させることが可能である。そしてスクロースイソメラーゼ遺伝子を用いて、非齲蝕性の糖を利用することが不可能であるかあるいは限られた程度までのみそれらを利用することが可能であるに過ぎない細胞を形質転換させることにより、形質転換細胞を産生することが可能であり、そしてその形質転換細胞を用いることで、非齲蝕性の糖、特にパラチノースおよび／またはトレハルロースを、副産物がほとんどない状態もしくはわずかな副産物を生じるだけの状態で取得することが可能となる。
【００４４】
既に機能的なスクロースイソメラーゼ遺伝子を含み、パラチノースおよび／またはトレハルロースの代謝が減少している微生物を利用する際には、外因性スクロースイソメラーゼ遺伝子での形質転換は必須ではないものの、しかしこれを実施して収率を改善させることができる。
【００４５】
最後に、本発明は、パラチナーゼ活性またはパラチノースヒドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードし、そして
（ａ）配列番号７または配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列、
（ｂ）遺伝コードの縮重の範囲内に含まれる、（ａ）からの配列に対応するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
を含んでなるＤＮＡ配列にも関する。
【００４６】
本発明はさらに、先に記載のＤＮＡ配列の少なくとも一つのコピーを含むベクター、ならびに先に記載のＤＮＡ配列もしくはベクターで形質転換させた細胞に関する。本発明は同様に、先に示されるＤＮＡ配列によりコード化され、そして配列番号８または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を好ましくは有する、パラチナーゼ活性を有する蛋白質を含む。
【００４７】
Ｐ．ルブルムに由来する配列番号８において示されるパラチナーゼは、それが、既知の酵素により開裂されないスクロース異性体、特にパラチノースを開裂するという点において既知のスクロース開裂性酵素とは異なる。
【００４８】
配列番号１６において示されるアミノ酸配列は、ＭＸ−４５由来のパラチノースヒドロラーゼを含み、パラチノースを開裂しフルクトースとグルコースを形成する。この酵素をコードする遺伝子は配列番号１５で示され、そしてＭＸ−４５のゲノム中、配列番号１３で示されるイソメラーゼ遺伝子の５′側に存在する。
【００４９】
本発明は以下に列挙される配列によりさらに詳しく記載される。
【００５０】
配列番号１は、プロタミノバクター  ルブルムからのスクロースイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。シグナルペプチドをコードする配列はヌクレオチドＮｏ．９９で停止している。
【００５１】
配列番号２は、エルウィニア  ラポンティキからのスクロースイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列のＮ−末端分画を示す。シグナルペプチドをコードする配列はヌクレオチドＮｏ．１０８で停止している。
【００５２】
配列番号３は、分離菌ＳＺ  ６２からのスクロースイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列のある分画を示す。
【００５３】
配列番号４は、プロタミノバクター  ルブルムからのスクロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号５は、エルウィニア  ラポンティキからのスクロースイソメラーゼのアミノ酸配列のＮ−末端分画を示す。
【００５５】
配列番号６は、分離菌ＳＺ  ６２からのスクロースイソメラーゼのアミノ酸配列のある分画を示す。
【００５６】
配列番号７は、プロタミノバクター  ルブルムからのパラチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００５７】
配列番号８は、プロタミノバクター  ルブルムからのパラチナーゼのアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号９は、プロタミノバクター  ルブルムからのスクロースイソメラーゼ遺伝子の変異体のヌクレオチド配列を示す。
【００５９】
配列番号１０は、その対応するアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号１１は、ＳＺ  ６２からのスクロースイソメラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を示す。
【００６１】
配列番号１２は、その対応するアミノ酸配列を示す。
【００６２】
配列番号１３は、シュードモナス  メソアキドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）（ＭＸ−４５）からのスクロースイソメラーゼ遺伝子の大部分を示す。
【００６３】
配列番号１４は、その対応するアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号１５は、シュードモナスメソアキドフィラ（ＭＸ−４５）からのパラチノースヒドロラーゼ遺伝子を示す。
【００６５】
配列番号１６は、その対応するアミノ酸配列を示す。
【００６６】
以下に示す実施例は、本発明をさらに詳しく説明するために掲載する。
【００６７】
【実施例】
実施例１
プロタミノバクター  ルブルムからのスクロースイソメラーゼ遺伝子の単離
生物体プロタミノバクター  ルブルム（ＣＢＳ  ５７４，７７）からの完全なＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａ  Ｉで部分的に消化させた。約１０ｋＢｐのサイズを有する断片のコレクションは、ゲル電気泳動による分画化の後の溶出により得られる断片混合物から取得し、そしてこれをラムダーＥＭＢＬ４ベクター誘導体λ  ＲＥＳＩＩ（Ｊ．  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ、Ｇｅｎｅ  １２３（１９９３）、６３−６８）の既にＢａｍＨＩで開環させてある誘導体内に連結させた。遺伝子ライブラリーは、先に記載の引用に従い、大腸菌のトランスフェクション、ならびにファージのプラスミド内への形質転換により作製した。この遺伝子ライブラリー中のカナマイシン耐性コロニーのスクリーニングは、ハイブリッド形成により、成熟イソメラーゼのＮ末端の配列から得られる放射ラベル化オリゴヌクレオチドＳ２１４を用いて実施した。
【００６８】
Ｓ２１４：  ５′−ＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣ−３′
Ｔ    Ａ    Ａ                Ａ    Ａ
それに続き、適切な培養の後に、陽性反応を示すコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。制限地図を作製した後に、この方法において取得したプラスミドｐＫＡＴ  ０１からの適切なサブフラグメントの配列決定を行い、そしてこのようにしてイソメラーゼをコードするＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号１において示される）を取得した。この配列から得られるアミノ酸配列は、配列決定（エドマン分解）により得られる成熟イソメラーゼのペプチド配列に完全に対応する。ＳａｃＩについての開裂部位はこのイソメラーゼ遺伝子の非コーディング３’領域内に存在し、そしてＨｉｎｄＩＩＩについての開裂部位は非コーディング５’領域内に存在する。このことにより、当該酵素で予め開裂させてあるベクターｐＵＣＢＭ  ２１（ベクターｐＵＣ  １２から得られる、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内への完全なイソメラーゼ遺伝子のサブクローン化が可能になる。得られるプラスミドはｐＨＷＳ  ３４．２と称し、そしてこのプラスミドはこれを宿している大腸菌細胞にスクロースイソメラーゼを合成する能力を付与する。
【００６９】
Ｐ．ルブルムからのスクロースイソメラーゼ遺伝子の変異体は配列番号９のヌクレオチド配列を有する。
【００７０】
実施例２
大腸菌内におけるＰ．ルブルムからのスクロースイソメラーゼのクローニングおよび発現
１．  プラスミドｐＨＷＳ８８の調製
スクロースイソメラーゼ遺伝子の非コーディング領域を、配列
５′−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＡ−３′
を有するオリゴヌクレオチドＳ４３４を用いてプラスミドｐＨＷＳ  ３４．２から削除し、そして同時にＥｃｏＲＩ開裂部位（ＣＧＡＡＴＴＣ）を導入した。この方法において得られるイソメラーゼ遺伝子誘導体をＢｓｔＥ  ＩＩで処理し、そして突出しているＢｓｔＥ  ＩＩ末端をＳ１ヌクレアーゼの消化により切り落とし、そして続いてＥｃｏＲＩでの消化を実施した。この方法により処理したイソメラーゼ遺伝子を、予めＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで予備処理してあるベクターｐＢＴａｃＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内にクローン化させた。得られるベクターｐＨＷＳ  ８８（ＤＭＳ  ８８２４）は、ＡＴＧ開始コドンの前の先行するＥｃｏＲＩ制限部位、ならびにＳ１−切端ＢｓｔＥ  ＩＩ開裂部位までに及ぶイソメラーゼ遺伝子の３’領域を有する修飾化イソメラーゼ遺伝子を含む。ＩＰＴＧで誘導をかける際、このベクターは、このプラスミドを宿している細胞にイソメラーゼを産生する能力およびアンピシリン（５０から１００μｇ／ｍｌまで）に対する耐性を付与する。イソメラーゼを産生させるのに用いるのが好ましいのは、ｌａｃレプレッサーを過剰産生する大腸菌宿主細胞である。
【００７１】
２．プラスミドｐＨＷＳ１１８：：Ｔｎ１７２１Ｔｅｔの調製
スクロースムターゼのための遺伝子カセットをトランスポゾン内に取り込ませた。
【００７２】
これは、ｔａｃプロモーターの調節下にスクロースムターゼ遺伝子を宿すプラスミドｐＨＷＳ８８からのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を、トランスポゾンＴｎ  １７２１が存在しているプラスミドｐＪＯＥ１０５内にクローン化させることにより実施する。このプラスミドｐＪＯＥ１０５は、ブダペスト条約の規定に従い、受託番号ＤＳＭ  ８８２５の基に、ＤＳＭに、１９９３年１２月１６日に寄託した。得られるプラスミドｐＨＷＳ１１８においてはスクロースムターゼ遺伝子は調節可能なｔａｃプロモーターの調節下に置かれており、このプラスミドを使用してＦ’プラスミドを含む大腸菌株を形質転換させた。図２はｐＨＷＳ８８およびｐＪＯＥ  １０５からのｐＨＷＳ  １１８の調製のためのクローニングチャートを示す。
【００７３】
スクロースムターゼ遺伝子を含む大腸菌のトランス接合体を図３のチャートにおいて記載されるように調製した。この目的のために、まず最初にＦ’プラスミドにより媒介されるＬａｃ＋表現型を保持するＦ’含有性大腸菌株ＣＳＨ３６（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２）、ｐ．１８）を、ナリジキシン酸に対する耐性を示す大腸菌株ＪＭ１０８と交雑させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上述ｐ．Ａ９−Ａ１３）。ラクトース、プロリン、およびナリジキシン酸を添加してある最小培地上での選択によりＦ’−Ｌａｃ含有性トランス接合体を取得した。これを、ｔａｃプロモーターによるスクロースムターゼ遺伝子の調節を可能にさせる目的で、ＩｑプラスミドＦＤＸ５００（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ８５（１９８９）、１０９−１１４）で追加的に形質転換させた。
【００７４】
この方法で調製したトランス接合体を、スクロースムターゼ遺伝子を宿すトランスポゾンプラスミドｐＨＷＳ１１８で形質転換させた。トランス接合体の選択のために、ストレプトマイシン耐性大腸菌株ＨＢ１０１（ＢｏｙｅｒおよびＲｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４１（１９６９）、４５９−４７２）内への交雑を実施した。トランスポゾンにより媒介されるテトラサイクリン耐性の転移は、接合もしくは動態化が不可能であるプラスミドｐｐＨＷＳ１１８からの修飾化Ｔｎ１７２１Ｔｅｔの、接合が可能であるＦ’プラスミドへの転位の後にのみ可能になる。ＨＢ１０１内の修飾化トランスポゾンを有するＦ’プラスミドの伝達体は、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンを含むＬＢプレート上で選択し、そしてアンピシリンおよびナリジキシン酸のプレートで再テストした。
【００７５】
３．  大腸菌におけるスクロースイソメラーゼの発現
このようなＦ’プラスミド含有性大腸菌による酵素産生を調査したところ、この大腸菌はスクロースムターゼ蛋白質を産生することが可能であることが示された。追加的なＬａｃレプレッサープラスミド（例えば、Ｋ１／１もしくはＫ１／１０）を全く宿さないＦ’プラスミド含有性ＨＢ１０１細胞は、誘導物質であるイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を使用した場合とそうでない場合とで、同一の量のスクロースムターゼ蛋白質を産生した。３つのトランス接合体Ｋ１／１、Ｋ１／１０、およびＫ１／４の産生率を以下の表１に示す。
【００７６】
0004301529.tif 000002
スクロースムターゼ蛋白質の産生中には大腸菌細胞の正常な生育を観察することが可能であった。
【００７７】
スクロースムターゼ遺伝子をレプレッサーコード化プラスミドｐＦＤＸ５００（トランス接合体Ｋ１／４を参照せよ）の存在下におけるＦ’プラスミド内へ導入することにより、誘導物質ＩＰＴＧで酵素産生を調節することが可能になった。ＩＰＴＧなしの状態では酵素活性は測定しなかったものの、４時間の誘導の後には約１．６Ｕ／ｍｇのスクロースムターゼ蛋白質の産生が観察可能であった。
【００７８】
細胞成長についての不利な効果は観察されなかった。プラスミド含有性大腸菌は、４時間の誘導後には約３ＯＤ600の密度に達した。
【００７９】
最高で１．６Ｕ／ｍｇのスクロースムターゼ活性が、形質転換させた大腸菌内において測定された。合成作業はＰ．ルブルムのものと比較可能である。ＳＤＳゲル電気泳動による産生酵素の分析により、不活性蛋白質凝集物の証拠は得られていない。スクロースムターゼ蛋白質のバンドはクーマシー染色ではかすかに可視化できるに過ぎず、そしてウエスタンブロットにおいてのみ明確に検出された。大腸菌内のスクロースムターゼの産生においては、蛋白質バンドの強度と測定される酵素活性とを相関させることが可能であった。
【００８０】
実施例３
エルウィニア  ラポンティキからのスクロースイソメラーゼ遺伝子の単離
遺伝子ライブラリーは、実施例１において記載されるものと同一の方法において、エルウィニア  ラポンティキ（ＮＣＰＰＢ  １５７８）からの完全なＤＮＡの制限開裂により作製した。
【００８１】
0004301529.tif 000003
とのプライマー混合物を使用してＰＣＲ増幅を行ったところ、あるＤＮＡ断片が得られ、このＤＮＡ断片を用いるとハイブリッド形成によってムターゼ遺伝子を含むコロニーの同定が可能になる。
【００８２】
この方法において、エルウィニアのイソメラーゼ遺伝子の１３０５ヌクレオチ分の長さの断片を含む陽性クローンｐＳＳＴ２０２３を見いだした。この断片のヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【００８３】
プロタミノバクター遺伝子との配列比較により、シグナルペプチド領域を含む完全な遺伝子分画については７７．７％の相同性および７８％の類似性が、そしてアミノ酸レベルにおいては８３．４％の相同性および８３．４％の類似性が認められた。
【００８４】
配列の差異は主にシグナルペプチド領域に濃縮されている。この理由のために、比較に関しては、シグナルペプチドを伴わない、実際のムターゼ活性を担っている酵素コード化領域のみを考慮すべきである。これらの観点から、ヌクレオチドレベルにおける相同性もしくは類似性は７９％となっている。この分画におけるアミノ酸配列の比較（図１）により８７．９％の相同アミノ酸が示されている。エルウィニアのムターゼにおける３９８のアミノ酸の内の３４９がプロタミノバクターにおけるものと同一である。４８の交換されているアミノ酸の内の２５は高い類似性を示し、そのためＡＡレベルにおける総合的な類似性は９４％となっている。ＡＡ交換は主にアミノ酸１４１と１９８との間の領域に濃縮されている。この領域の手前には、５６の保存アミノ酸の配列が存在する。他の分画も特に高い保存性を示す（図１を参照せよ）。
【００８５】
これらのデータにより、これまでにクローン化および配列決定を行った分画については、エルウィニアとプロタミノバクターとからの２つのムターゼには相対的に広域にわたる保存性が存在することが示される。
【００８６】
エルウィニアからのクローン化ムターゼ遺伝子の同定
エルウィニアのゲノムＤＮＡとの再ハイブリッド形成実験のために選択されたプローブは、ｐＳＳＴ２０２３からの約５００ｂｐのサイズのＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ断片であった。ジゴキシゲニンでのラベル化の後にこの断片を、高緊縮性（６８℃）を利用するエルウィニアＤＮＡとのハイブリッド形成に使用した。ＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩで切断した完全なエルウィニアＤＮＡは、予測される約５００ｂｐのサイズの明確なハイブリッド形成シグナルを示した。ＳｓｐＩのみで切断したエルウィニアＤＮＡは約２ｋｂのハイブリッド形成シグナルを示した。
【００８７】
エルウィニアのゲノムＤＮＡとのｐＳＳＴ２０２３の再ハイブリッド形成が成功したことより、ｐＳＳＴ２０２３内にクローン化されたムターゼ領域はエルウィニア  ラポンティキから生じるものであることを立証することが可能であった。
【００８８】
エルウィニアのムターゼのＣ−末端部分断片のクローニング
今日までにクローン化されているエルウィニアのムターゼ遺伝子のＮ−末端部分断片は１．３ｋｂのサイズであり、そして配列番号２において示されるヌクレオチド配列を有している。完全なエルウィニア遺伝子は実質的には既知のプロタミノバクターの遺伝子（１．８ｋｂ）とサイズにおいて相同であると仮定することができるために、約５００ｂｐの分画がエルウィニア遺伝子のＣ−末端領域から失われていることがわかる。
【００８９】
完全なエルウィニアＤＮＡからの、約２ｋｂのサイズのＳｓｐＩ断片を、エルウィニアのＣ−末端のクローニングのために選択した。サザンブロットにおいては、この断片は、ｐＳＳＴ２０２３からのジゴキシゲニンラベル化ＤＮＡを用いた場合に明確なシグナルを示した。この２ｋｂのＳｓｐＩ断片は３’端の約５００ｂｐがｐＳＳｔ２０２３において既にクローン化されている領域と重複している。このサイズは、約５００ｂｐの消失遺伝子分画の完全なクローニングのためには十分であるはずである。ｐＳＳＴ２０２３からのジゴキシゲニンラベル化断片プローブＳｓｐＩ／ＥｃｏｒＩは探索するクローンの同定に適している。
【００９０】
実施例４
プロタミノバクターのパラチナーゼ欠損突然変異体の調製
プロタミノバクター  ルブルム（ＣＢＳ  ５４７，７７）の細胞を、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．、（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１２５−１７９（１９７２）により改変されているＡｄｅｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎ．１８（１９６５）、７８８）の方法により、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで突然変異を起こさせた。パラチナーゼ欠損突然変異体は、２０ｇ／Ｌのパラチノースを添加し、濾過により滅菌させたＭａｃＣｏｎｋｅｙのパラチノース培地（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）の４０ｇ／Ｌのもの、あるいは最小塩培地（リットル当たり、１０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、４．５ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのチアミン、２ｇのパラチノースもしくはグルコース、２５ｍｇのカナマイシン、および１５ｇのアガロース、ｐＨ７．２）を使用して選択した。ＭａｃＣｏｎｋｅｙのパラチノース培地上で白色を呈するか、あるいはパラチノースを添加してある同一の培地の場合とは対照的にグルコースを添加してある最小塩培地上で生育する突然変異体を、パラチナーゼ欠損突然変異体として同定する。野生型ものとは対照的に、パラチノースをグルコースとフルクトースとに開裂する酵素活性（パラチナーゼ活性）は、これらの突然変異体からの細胞抽出物においては検出できない。
【００９１】
培養開始後４時間から１１時間までに過渡的にのみパラチノースを検出することが可能である野生型細胞とは対照的に、単一のＣ源として０．２％のスクロースを添加してある最小塩培地内においてこれらの細胞の培養を行うと、検出可能なパラチノース（イソマルツロース）の蓄積が継続的に存在する。同一の培地中で一晩培養させた培養物は、野生型細胞の場合にはパラチノースを含まないが、この方法において調製された（図４を参照せよ）突然変異体ＳＺＺ  １３（ＤＭＳ  ９１２１）の場合においては＞０．０８％のパラチノースを含む。
【００９２】
実施例５
微生物細胞の固定化
砂糖工場からの８ｋｇの濃縮液（ｊｕｉｃｅ）、２ｋｇのコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、０．１ｋｇの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、および８９．９ｋｇの蒸留水、ｐＨ７．２からなる滅菌栄養素培養基の内の１０ｍＬ分を使用して、適切な株の継代培養物から細胞をすすぎ落とす。この懸濁液を、震盪装置内に入れてある先の組成の栄養素溶液２００ｍＬを含む１Ｌフラスコ内での予備培養のための接種材料として使用する。２９℃における３０時間のインキュベーション時間の後、１０本のフラスコを（総含有量２Ｌ）を使用して３０Ｌ用の小発酵器内に入れてある先の組成物の栄養素溶液１８Ｌを接種し、そして発酵を２９℃、および分当たり２０Ｌの空気を導入させながら３５０ｒｐｍの撹拌速度において実施する。
【００９３】
ｍｌ当たり５×１０9の生物体を上回る生物体計測数が達成された後に発酵を停止させ、そして細胞を遠心により発酵溶液から回収する。その後細胞を２％の濃度のアルギン酸ナトリウム溶液内に懸濁させ、そして２％濃度の塩化カルシウム溶液にこの懸濁液を滴下により添加することにより固定化する。得られる固定化物ビーズを水で洗浄し、そしてこれを数週間＋４℃に保存することができる。
【００９４】
パラチナーゼ欠損突然変位体ＳＺＺ  １３（ＤＳＭ  ９１２１）の細胞は、既知の微生物プロタミノバクター  ルブルム（ＣＢＳ  ５４７，７７）およびエルウィニア  ラポンティキ（ＮＣＰＰＢ  １５７８）からの比較可能な細胞のものと比較して、それらの産物組成に関してより良い触媒特性を示す。
【００９５】
ＳＺＺ  １３の全細胞および未精製抽出物、ならびに先のように調製したアルギン酸ナトリウム中のＳＺＺ  １３の固定化物は、活性アッセイにおける産物組成に関してはその値が増大していた。実際の活性アッセイの前に、この固定化物を０．１モル／Ｌのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５で膨潤させた。
【００９６】
２５℃における活性測定値により、突然変位体ＳＺＺ  １３を使用する場合にはフルクトースおよびグルコースは見いだされない一方で、Ｐ．ルブルムの野生型細胞では２．６％のフルクトースおよびグルコース（単糖類および二糖類の総量に基づく）が全細胞内において見いだされ、そして１２．０％が未精製抽出物中において見いだされた。Ｅ．ラポンティキの場合においては、４％のグルコースおよびフルクトースが全細胞内において、そして４１％が未精製抽出物中において見いだされた。
【００９７】
実施例６
他の微生物からのスクロースイソメラーゼ遺伝子の単離
分離菌ＳＺ６２（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ ｓｐｅｃ．）、シュードモナス  メソアキドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）（ＭＸ−４５）からの、あるいは他の微生物からのゲノムＤＮＡの部分消化、ならびに得られる断片の適切な大腸菌ベクター内への挿入、ならびに形質転換により遺伝子ライブラリーが得られ、この遺伝子ライブラリーの各クローンは２および１５ｋｂの間の受容生物体のゲノム分画を含む。
【００９８】
これらのプラスミドを宿し、そしてコロニーが示す赤色を呈するこれらの大腸菌細胞を、ＭａｃＣｏｎｋｅｙのパラチノース培地上でのプレート培養により選択する。これらの細胞内に含まれるプラスミドＤＮＡを、単一のＣ源としてのガラクトース上で生育することが不可能である大腸菌突然変位体（例えばＥＤ８６５４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上述、ページＡ９−Ａ１３）内へと転移させる。
【００９９】
この形質転換細胞株により、受容生物体のＤＮＡから先に記載するように調製してある遺伝子ライブラリー内のパラチノース産生体を同定することが可能である。
【０１００】
検索されるパラチノース産生性クローンを同定するために、遺伝子ライブラリーの細胞を単離し、そしてガラクトースおよびスクロースを含む最小塩培地上で培養する。同一の培地を含むプレート上におけるレプリカ平板法の後に、トルエン蒸気に露出させることにより細胞を殺した。次にはスクリーニング株の細胞を、遺伝子ライブラリーのコロニーにかぶせるように、Ｃ源を添加していない最小塩ソフトアガロース中に菌叢として広げ、そしてインキュベーションを行う。スクリーニング株の細胞の有意な生育は、パラチノースを産生している遺伝子ライブラリー中の細胞の位置においてのみ観察される。イソメラーゼの含有量は、レプリカ対照の細胞をテストする際に明らかになる。
【０１０１】
この方法において同定されるこれらの大腸菌クローンは、培地中の単一なＣ源としてのパラチノース上では生育することができず、全細胞もしくは細胞抽出物についてのテストにおいてはスクロースを開裂する能力を全く示さないが、これらの条件および培地にスクロースを添加していない状態における培養に際してはパラチノースを産生する。
【０１０２】
別法では、イソメラーゼクローンも、実施例３の処理法により調製されるＰＣＲ断片を使用して同定することができる。
【０１０３】
受容生物体からの固定化ＤＮＡとのフィルター上でのハイブリッド形成のためのプローブとしてこの方法において同定された大腸菌クローンからのプラスミドＤＮＡの利用により、イソメラーゼ遺伝子を宿す遺伝子領域を検出することが可能になり、そして特別に作製されたこのような遺伝子領域を入手することができるようになっている。
【０１０４】
配列番号３において示されるヌクレオチド配列（この配列から得られるアミノ酸配列は配列番号６において示されている）はこの方法において同定した。同一の方法においてシュードモナス  メソアキドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５（ＦＥＲＭ  １１８０８）のＤＮＡからのイソメラーゼクローンを見いだした。
【０１０５】
ＳＺ  ６２からのスクロースイソメラーゼの完全なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号１１及び１２に示されている。ＭＸ−４５からのスクロースイソメラーゼのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の大部分は、配列番号１３及び１４に示されている。
【０１０６】
実施例７
パラチナーゼ遺伝子のクローニング
実施例１において調製したプロタミノバクター  ルブルムの遺伝子ライブラリーを、単離されたパラチナーゼのＮ−末端の配列から得られ、そして配列
ＣＡ（Ｇ，Ａ）ＴＴ（Ｃ，Ｔ）ＧＧ（Ｔ，Ｃ）ＴＡ（Ｃ，Ｔ）ＧＧ−３′
を有する放射ラベル化オリゴヌクレオチド混合物Ｓ４３３を用いてスクリーニングした。
【０１０７】
陽性クローンを発見し、そしてｐＫＡＴ  ２０３と称するあるプラスミドをそのクローンから単離した。
【０１０８】
プラスミドｐＫＡＴ  ２０３を宿している大腸菌細胞はパラチノースを代謝することが可能である。パラチノースの、活性アッセイにおいて検出可能であるグルコースとフルクトースとへの開裂により、「パラチノース」の存在が示唆される。
【０１０９】
プライマーとしてのオリゴヌクレオチドＳ４３３を用いてｐＫＡＴ２０３のＤＮＡの配列を決定することにより、翻訳後にＮ−末端アミノ酸として我々に知られているアミノ酸配列のデータへと読み取られる可能性のあるＤＮＡ配列を取得することが可能である。読み取り枠を、次に行う配列決定段階において取得した。
【０１１０】
「パラチナーゼ」遺伝子の配列の決定
さらに詳しい「パラチナーゼ」遺伝子の配列決定のために、プラスミドｐＫＡＴ  ２０３からの部分断片を制限地図に基づいて選択し、そしてＭ１３ファージ系内にサブクローン化し、そして一本鎖ファージＤＮＡの配列決定を、万能プライマー
５′−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３′
を使用して実施した。
【０１１１】
重複する領域を考慮に入れて個々の断片について得られるＤＮＡ配列データを組み合わせることにより、「パラチナーゼ」についての１３６０塩基対の連続的な読み取り枠を決定することが可能になる（配列番号７）。
【０１１２】
このＤＮＡ配列をアミノ酸データへと翻訳することにより、４５３のアミノ酸（配列番号８）およびそこから演繹することができる約５０，０００Ｄａの分子量を有する蛋白質が明らかにされている。これは、ＳＤＳゲルにおいて約４８，０００Ｄａ上にバンドを有する蛋白質分画を「パラチナーゼ」活性の濃縮により取得することができるという所見に矛盾しない。天然のゲルにおいては、パラチノース開裂性活性は約１５０，０００Ｄａのサイズのバンドから得られた。
【０１１３】
他の既知の蛋白質との相同性の比較
遺伝子バンク（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ社）において保存してあるデータとの、このＤＮＡ配列から得られるアミノ酸配列の比較により、大腸菌（ＭｅｌＡ）からのメリビアーゼとの相同性が明らかにされた（２つの部分における相同性は３２％）。
【０１１４】
実施例８
Ｐ．メソアキドフィラ  ＭＸ−４５からのパラチノースヒドロラーゼ遺伝子のクローニング
実施例６において調製したＰ．メソアキドフィラＭＸ−４５の遺伝子ライブラリーから配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子を得た。この遺伝子は配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。この蛋白質はパラチノースヒドロラーゼであり、パラチノースを開裂してフルクトースとグルコースを生成する反応を触媒する。
【０１１５】
本発明の主な特徴または態様は以下のとおりである。
【０１１６】
１．  スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードし、そして
（ａ）適切である場合にはシグナルペプチドコーディング領域を伴わない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３で示されるヌクレオチド配列の内の一つ、
（ｂ）遺伝コードの縮重の範囲内に含まれる、（ａ）からの配列に対応するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
を含んでなるＤＮＡ配列。
【０１１７】
２．  以下に示す、
（ａ）適切である場合にはシグナルペプチドをコードする領域を伴わない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３で示されるヌクレオチド配列の内の一つ、あるいは
（ｂ）少なくとも７０％が（ａ）からの配列に相同であるヌクレオチド配列、を含んでなる、上記１に記載のＤＮＡ配列。
【０１１８】
３．  配列番号１において示されるヌクレオチド配列の内の、
（ａ）ヌクレオチド１３９−１５５、および／または
（ｂ）ヌクレオチド６２５−６４４、
の部分領域に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を有する、上記１、もしくは２に記載のＤＮＡ配列。
【０１１９】
４．  配列番号１において示されるヌクレオチド配列の内の、
（ｃ）ヌクレオチド９５５−１０１３、および／または
（ｂ）ヌクレオチド１０７８−１０９４、
の部分領域に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を有する、上記１−３に記載のＤＮＡ配列。
【０１２０】
５．  上記１から４までの内のいずれかに記載されるＤＮＡ配列の内の少なくとも一つのコピーを含むベクター。
【０１２１】
６．  原核生物ベクターであるベクター。
【０１２２】
７．  環状プラスミドである、上記５もしくは６に記載のベクター。
【０１２３】
８．  １０を下回るコピー数で宿主細胞内に存在する、上記６もしくは７に記載のベクター。
【０１２４】
９．  調節可能なプロモータの調節下においてスクロースイソメラーゼ遺伝子を含む、上記７もしくは８に記載のベクター。
【０１２５】
１０．プラスミドｐＨＷＳ  ８８（ＤＳＭ  ８８２４）。
【０１２６】
１１．上記１から４までの内のいずれかにおいて記載されるＤＮＡ配列、あるいは上記５から１０までの内のいずれかにおいて記載されるベクターを用いて形質転換させてある細胞。
【０１２７】
１２．原核生物細胞である、上記１１に記載の細胞。
【０１２８】
１３．グラム陰性原核生物細胞である、上記１２に記載の細胞。
【０１２９】
１４．腸内細菌細胞である、上記１２に記載の細胞。
【０１３０】
１５．大腸菌、プロタミノバクター  ルブルム、もしくはエルウィニア  ラポンティキ細胞である、上記１２に記載の細胞。
【０１３１】
１６．上記１から４までの内のいずれかに記載されるＤＮＡ配列によりコード化される、スクロースイソメラーゼ活性を有する蛋白質。
【０１３２】
１７．以下に示す、
（ａ）適切である場合にはシグナルペプチド領域を伴わない、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４で示されるアミノ酸配列の内の一つ、あるいは
（ｂ）少なくとも８０％が（ａ）からの配列と相同であるアミノ酸配列、
を含んでなる、上記１６に記載の蛋白質。
【０１３３】
１８．配列番号４において示されるアミノ酸配列の内の、
（ａ）アミノ酸５１−１４９、
（ｂ）アミノ酸１６８−１８１、
（ｃ）アミノ酸１９９−２５０、
（ｄ）アミノ酸３５１−３８７、および／または
（ｅ）アミノ酸３９０−４２０、
からの部分領域に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有する、上記１６もしくは１７に記載の蛋白質。
【０１３４】
１９．スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードするＤＮＡ配列を少なくとも一つは含み、そしてパラチノースおよび／またはトレハルロースの代謝が減少している細胞。
【０１３５】
２０．インベルターゼおよび／またはパラチナーゼ遺伝子の発現の部分的もしくは完全な阻害によりパラチノースおよび／またはトレハルロースの代謝が低下している、上記１９に記載の細胞。
【０１３６】
２１．プロタミノバクター  ルブルム突然変位体ＳＺＺ  １３（ＤＳＭ  ９１２１）。
【０１３７】
２２．スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む供与体生物体からの遺伝子ライブラリーを適切な宿主生物体内に作製し、この遺伝子ライブラリーのクローンを調査し、そしてスクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードする核酸を含むクローンを単離する、スクロースイソメラーゼ活性を伴う蛋白質をコードする核酸を単離するための方法。
【０１３８】
２３．大腸菌を宿主生物体として使用する、上記２２に記載の方法。
【０１３９】
２４．遺伝子ライブラリーのクローンの調査に当たって、スクロース開裂性クローン、ならびにそのクローンに含まれ、そして受容生物体から生じるＤＮＡ配列を単離し、そしてそれを、ガラクトースを利用せず、そしてその遺伝子ライブラリー中のクローンのためのスクリーニング株として使用する大腸菌株内において形質転換させる、上記２２に記載の方法。
【０１４０】
２５．遺伝子ライブラリー中のクローンの調査を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３から得られる核酸プローブを使用して実施する、上記２２もしくは２３に記載の方法。
【０１４１】
２６．プライマーとして、
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とのオリゴヌクレオチド混合物を使用して受容生物体からのＤＮＡのＰＣＲ増幅により予め取得されているＤＮＡ断片を核酸プローブとして使用する、上記２５に記載の方法。
【０１４２】
２７．上記１６から１８までの内のいずれかに記載される蛋白質、上記１１から１５まで、もしくは上記１９から２１までの内のいずれかに記載される生物体、あるいはこの種類の生物体からの抽出物を糖類の産生に用いる、非齲蝕性の糖、特にトレハルロースおよび／またはパラチノースの産生のための方法。
【０１４３】
２８．生物体、抽出物、もしくは蛋白質を固定化形態において使用する、上記２３に記載の方法。
【０１４４】
２９．非齲蝕性の糖、特にトレハルロースおよび／またはパラチノースの産生のための、上記１６から１８までの内のいずれかに記載の蛋白質、あるいは上記１１から１５まで、もしくは上記１９から２１までの内のいずれかに記載の生物体の利用。
【０１４５】
３０．パラチナーゼおよび／またはトレハルラーゼ活性を有する蛋白質をコードし、そして
（ａ）配列番号７もしくは配列番号１５で示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）遺伝コードの縮重の範囲内に含まれる、（ａ）からの配列に対応するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
を含むＤＮＡ配列。
【０１４６】
３１．上記３０に記載されるＤＮＡ配列の少なくとも一つのコピーを含むベクター。
【０１４７】
３２．上記３０に記載のＤＮＡ配列もしくは上記３１に記載のベクターを用いて形質転換させてある細胞。
【０１４８】
３３．上記３０に記載のＤＮＡ配列によりコード化される、パラチナーゼおよび／またはトレハルラーゼ活性を有する蛋白質。
【０１４９】
３４．配列番号８もしくは配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有する、上記３３に記載の蛋白質。
【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
【表４】
0004301529.tif 000008
【０１５４】
【表５】
0004301529.tif 000009
【０１５５】
【表６】
0004301529.tif 000010
【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
【表８】
0004301529.tif 000012
【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
【表１１】
0004301529.tif 000015
【０１６１】
【表１２】
0004301529.tif 000016
【０１６２】
【表１３】
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【０１６３】
【表１４】
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【０１６４】
【表１５】
0004301529.tif 000019
【０１６５】
【表１６】
0004301529.tif 000020
【０１６６】
【表１７】
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【０１６７】
【表１８】
0004301529.tif 000022
【０１６８】
【表１９】
0004301529.tif 000023
【０１６９】
【表２０】
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【０１７０】
【表２１】
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【０１７１】
【表２２】
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【０１７２】
【表２３】
0004301529.tif 000027
【０１７３】
【表２４】
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【０１７４】
【表２５】
0004301529.tif 000029
【０１７５】
【表２６】
0004301529.tif 000030
【０１７６】
【表２７】
0004301529.tif 000031
【０１７７】
【表２８】
0004301529.tif 000032
【０１７８】
【表２９】
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【０１７９】
【表３０】
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【０１８０】
【表３１】
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【０１８１】
【表３２】
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【０１８２】
【表３３】
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【０１８３】
【表３４】
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【０１８４】
【表３５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プロタミノバクター  ルブルム、エルウィニア  ラポンティキ、および分離菌ＺＥ  ６２からのスクロースイソメラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】トランスポゾンＴｎ  １７２１上にスクロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＷＳ  １１８の調製のためのクローニングチャートを示す。
【図３】Ｆプラスミドのスクロースイソメラーゼ遺伝子を含む大腸菌トランス接合体の調製のためのチャートを示す。
【図４】Ｐ．ルブルム野生型細胞およびＰ．  ルブルム突然変位体ＳＺＺ  １３の細胞により産生される糖類間の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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