(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチドSP310 (SEQ ID NO:41)をコードするDNA配列を含む分離されたDNA分子。
【請求項２】
310mut1 (SEQ ID NO:42)、310mut2 (SEQ ID NO:43)、310mut3 (SEQ ID NO:44)、310mut4 (SEQ ID NO:45)、310mut5 (SEQ ID NO:46)、310mut6 (SEQ ID NO:47)、310mut7 (SEQ ID NO:48)、310mut8 (SEQ ID NO:49)、310mut10 (SEQ ID NO:51)、310mut11 (SEQ ID NO:52)、310mutA (SEQ ID NO:53)、310mutB (SEQ ID NO:54)、310mutC (SEQ ID NO:55)、310mutA1 (SEQ ID NO:56)、310mutB1 (SEQ ID NO:57)、310mutD2 (SEQ ID NO:58)、310mutD7 (SEQ ID NO:59)、310mutE2 (SEQ ID NO:60)、310mutE11 (SEQ ID NO:61)及び310mutF2 (SEQ ID NO:62)からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードするDNA配列を含む分離されたDNA分子。
【請求項３】
請求項１又は２による分離されたDNA分子のDNA配列を含む組換えプラスミド。
【請求項４】
シグナルペプチドと所望の遺伝子産物との融合物をコードするDNA配列に操作可能に結合した調節プロモーターをさらに含む請求項３によるプラスミド。
【請求項５】
調節プロモーターがP170である請求項４によるプラスミド。
【請求項６】
請求項１又は２による分離されたDNA分子のDNA配列を含む組換え細菌。
【請求項７】
DNA配列が所望の遺伝子産物を発現する遺伝子に操作可能に結合しており、それにより該遺伝子産物が分泌される請求項６による細菌。
【請求項８】
乳酸菌である請求項６又は７による細菌。
【請求項９】
所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を、請求項６〜８のいずれか１項による組換え細菌からなる宿主生物に挿入し、そして遺伝子産物を発現させることからなる所望の遺伝子産物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は細菌発現系の分野に関し、特に組み換え宿主細胞における同種又は異種遺伝子産物の分泌レベルを向上させる手段に関する。具体的には、乳酸菌中の分泌シグナルをコードする配列を同定して分離する手段及びラクトコッカス種から分離された新規なシグナルペプチド、ならびに効率を向上させたそのようなシグナルペプチドの変異体が提供される。
【０００２】
技術的背景及び従来技術
一般に乳酸菌と称され、ラクトコッカス・ラクティス等のラクトコッカス種、ラクトバシラス種、ストレプトコッカス種、リューコノストク種及びオエノコッカス(Oenococcus)種を含むグラム陽性細菌群は、食品及び飼料の製造において、例えばバター、チーズ及びヨーグルト等の発酵乳製品を製造する際の酪農スターター培養物として一般的に使用される。ラクトコッカス・ラクティスは広範囲におよぶ発酵乳製品の製造に使用されるグラム陽性細菌の典型的な一例である。
【０００３】
さらに、乳酸菌は現在、医薬的に活性な生成物又は酵素のような異種及び同種遺伝子産物を製造するための組み換え宿主細胞として使用されている。新興しつつあるエル.ラクティスの産業的応用のなかでも、本発明者らによる最近の研究は、ワクチン、治療薬又は酵素としての可能性のある異種タンパク質の製造に集中している。使用した発現系は強力な調節プロモーターを含み、組み換えリューコノストク・メゼンテロイデスのβ-ガラクトシダーゼ LacLMの高レベルでの製造が可能である(Madsenら、1999)。
異種タンパク質を製造するための細胞工場としての微生物の開発に伴い、改良遺伝子発現のための多数の遺伝子ツールが確立されている。これらは強力なプロモーター、高コピー数ベクター、最適化されたコドンの使用及び改良生産株を含む。これらの使用は結果として、製造レベルを増加させている。
【０００４】
これらの最適化されたツールを使用すると、異種タンパク質の培養上精への分泌が制限的な段階を示すことがある。したがって、タンパク質分泌の分子認識もまた、応用研究の主題として浮上しつつある。組み換えによって製造されたタンパク質の下流プロセッシングを促進するためには、一般にこのタンパク質の分泌が要求される。異種遺伝子産物の効率的な分泌を達成するためには、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって認識されうる有効なシグナルペプチドをコードする遺伝子と操作可能に結合している構造物を使用することが必要である。
細菌における分泌工程には、mRNAの翻訳直後に起こる事象、すなわちその次に起こる未完成の折りたたまれていない(unfolded)ポリペプチド鎖中のシグナルペプチド（SP）のSec組織による認識、及び細胞膜を介した転位時のシグナルペプチドによる開裂が含まれる。
【０００５】
Sec依存経路は、最も研究されたタンパク質搬出系である。このメカニズムを介して搬出されたすべてのタンパク質は実質的にSPを必要とすることが知られているが、SPの構造が細胞中の分泌機構の異なる成分とどのように相互作用するのかははっきりとわかっていない。大腸菌及び植物の間で維持されているSec依存経路の最近の特性づけでは、タンパク質は多数の異なる経路を介して搬出されるということが明示されている(Settles及びMartienssen、1998；Stephens 1998)。これに関与する機構は通常、搬出されたタンパク質に配列モチーフ(sequence motifs)が存在することを必要とする。
SPは、Sec依存分泌タンパク質中に存在するN-末端の延長部分である。典型的なSPの構造には、3つの異なる領域：(i)プラスに帯電した多数のアミノ酸、リジン及びアルギニンを含むN末端領域；(ii)疎水性中心核及び；(iii)シグナルペプチダーゼによって認識される配列モチーフを含む親水性C末端が含まれる(von Heijne 1990)。構造的には類似しているにもかかわらず、異なるSP間には大きな配列の違いが見られる。この違いは近年、分泌タンパク質の特異的標的に関連づけられた(Martoglio及びDobberstein、1998)。
【０００６】
大腸菌での分泌の研究では、効率的なプロセッシングに対するSPの疎水性核領域の影響が証明された。きわめて疎水性の核領域を有するSPは、マイナスに帯電した改変N末端領域が使用されていても、高率輸送を持続させる(Izard ら、1996)。PhoAは、この細菌における詳細な分泌研究のためのモデルタンパク質として使用されてきた。へリックス破壊残基(Gly又はPro)除去による影響は、増加した疎水性によって相殺することができる(Izardら、1995)。競合実験では、2個の同一SPがN末端からPhoAまで配置され、いずれかのSPを使用する率はそのうちの1個のSPの疎水性における弱い増加に依存することが証明された(Chenら、1996)。また、アミノ末端での減少したマイナス電荷が結果として輸送経路の全体的な親和性を低下させたことが証明された(Izardら、1996)。
【０００７】
多くの細胞外タンパク質の特性づけにより、グラム陽性及びグラム陰性の原核細胞及び真核細胞を含む異なる微生物からのアミノ酸配列中のシグナルペプチド開裂部位の存在及び位置を予測する方法の開発が可能になった(Nielsenら、1997)。この方法には、いくつかの人工神経回路網の組み合わせに基づいた開裂部位の予測及びシグナルペプチド／非シグナルペプチド予測が含まれる。この方法を使用することにより、生体内でSP誘導体を構築及び試験する前にSP誘導体の設計及び分析を事前に行うことができる。
【０００８】
分泌の対象とされるタンパク質は、N末端にシグナル配列又はシグナルペプチド(SP)を含む。SPは、細胞膜を介した転座時に、細胞の分泌機構の一成分であるリーダー又はシグナルペプチダーゼによって認識され、開裂される(Martoglio及びDobberstein、1998)。通常、SPはグラム陽性細菌中ではアミノ酸(aa)で25から35個以上の大きさである。SPは配列相同性を共有しないが、しばしば1個以上の塩基性aaを含むアミノ末端、7個以上のaaの疎水性中心核及びシグナルペプチダーゼによって認識されるモチーフを含む親水性カルボキシ末端から構成される(Martoglio及びDobberstein、1998)。エル.ラクティスから入手することができるSPの調査では、分泌される主な乳酸球菌（lactococcal）タンパク質であるUsp45からSPを使用することが提案されている(van Asseldonkら、1990)。このSPはエル.ラクティス中の幾つかの異種タンパク質の分泌で機能しうると報告されている(van Asseldonkら、1993)。
【０００９】
エル.ラクティス中のSPを同定するための従来法は、プロモーターを持たないレポーター遺伝子を有するベクター中のゲノムライブラリーの構築に従っていた。通常、グラム陽性細菌での研究は、グラム陰性細菌中でSPを同定するための証明された機能性を有するレポーター遺伝子の使用を伴う。これらのレポーターはBlaM、大腸菌β-ラクタマーゼを含む(Sibakovら、1991; Perez-Martinezら、1992)。エル.ラクティスのSPを同定するためのBlaMの使用は、エル.ラクティスにおける直接スクリーニングの可能性の限界を暗示した。これはコドン使用及びBlaMのタンパク質折りたたみ要件の違いによるものと考えられた(Pouquetら、1998)。したがって、グラム陽性細菌ゲノムライブラリーの最初のスクリーニングが大腸菌及び後にエル.ラクティス中で試験された陽性クローンにおいて現在まで行われており(Sibakovら、1991; Perez-Martinezら、1992)、このために最初の宿主での機能性を選択するための冗長かつ多大な労働力を要する工程が強いられていた。より適切な分泌レポーターであるバシラス・リヘニフォルミスからの細胞外β-アミラーゼもまた、乳酸球菌SPのスクリーニングに使用されているが、同様のスクリーニング方法に基づいている(Perez-Martinezら、1992)。これらの方法は、タイプIのSPを分離しているだけである。また、同定された配列の機能性のいくつかは、ベクター中の複数のクローニング部位に由来するアミノ酸残基の存在によるものであった。これらのアミノ酸は、この種のSPのC末端領域についての要件と一致した(Perez-Martinezら、1992)。
【００１０】
しかしながら、特定の目的のためには、特定の宿主細胞において適当又は特定の遺伝子産物を分泌するのに適当なSPを選択するために、広範囲に及ぶSPを処理することが望ましい。したがって、本発明の主要な目的は、乳酸菌細胞を含む広範な宿主細胞中において機能的なシグナルペプチドをコードする乳酸菌ヌクレオチド配列を直接的に分離するための簡便な方法を提供することである。この方法は別の種における中間スクリーニング工程を必要としない。本発明のさらなる目的は、細菌染色体においてSPをコードする配列を同定し、その位置をつきとめることを可能にする、この方法において有用な転位因子を提供することである。この新規な方法を使用することにより、いくつかの新規な乳酸球菌SPが同定され、分離され、突然変異形成によって改良された。
【００１１】
発明の要約
したがって、本発明は第一の観点において、乳酸菌中でシグナルペプチド（SP）をコードするDNA配列を同定するためのトランスポゾン誘導体を構築する方法に関する。この方法は、(i)プロモーターを持たないプロモーターレポーター遺伝子及びリボソーム結合部位(RBS)からなる配列を左方末端(LR)と右方末端(RR)との間に含むトランスポゾンからなるDNA分子を選択する工程、(ii)前記DNA分子からLRとプロモーターを持たないレポーター遺伝子の間に位置する領域を削除し、転位能及びRBSを保持する修飾DNA分子を得る工程、(iii)得られた修飾DNA分子のLRとプロモーターを持たないレポーター遺伝子との間に位置する残存領域に、ユニーク制限部位を挿入する工程、及び(iv)前記のユニーク制限部位に、分泌レポーター分子をコードするDNA配列であって、SPをコードする配列を含まないDNA配列を挿入する工程からなる。このようにして得られたトランスポゾン誘導体は、分泌レポーター分子とともにフレーム中に停止コドンを持たないため、転位時にLRの上流からの翻訳融合を可能にする。
【００１２】
別の観点において、乳酸菌中でシグナルペプチド（SP）をコードするDNA配列を同定するためのトランスポゾン誘導体が提供される。この分子は以下の要素：(i)プロモーターを持たないプロモーターレポーター遺伝子及びリボソーム結合部位からなる配列を左方末端(LR)と右方末端(RR)との間に含むトランスポゾン要素からなり、プロモーターレポーター遺伝子の上流領域に停止コドンを持たないDNA分子、(ii)分泌レポーター分子をコードするDNA配列であって、SPをコードする配列を含まないDNA配列から構成される。
さらに別の観点において、本発明は乳酸菌中でシグナルペプチド(SP)をコードするDNA配列を同定する方法に関する。この方法は、(i)乳酸菌を上記に定義したトランスポゾン誘導体で形質転換する工程、及び(ii)形質転換された乳酸菌から、プロモーターを持たないプロモーターレポーター遺伝子が発現され、分泌レポーター分子をコードするDNA配列の遺伝子産物が分泌されている細胞を選択する工程からなる。
【００１３】
また別の観点において、ここに定義したトランスポゾン誘導体の少なくとも一部及び乳酸菌中で機能的なシグナルペプチド（SP）をコードするDNA配列からなる分離されたDNA分子、ならびに以下に記載するSP10、SP13、SP307、SP310及びSP330、及びシグナルペプチド機能性を保持しているいずれの前記シグナルペプチドの誘導体からなる群より選択される分子に由来するシグナルペプチドをコードするための分離されたDNA配列が提供される。このような誘導体は、相当する野生型SPと比較して向上した分泌効率を有することが見いだされた。
本発明のさらなる観点では、トランスポゾン誘導体の少なくとも一部からなる分離されたDNA分子又は本発明の分離されたDNA配列からなる組み換えプラスミド；本発明のDNA配列からなる組み換え細菌；及び所望の遺伝子産物の製造におけるそのような細菌の使用が包含される。
【００１４】
発明の詳細な開示
本発明の主な目的は、乳酸菌のゲノム内において、SPをコードする配列の直接同定、すなわち中間的な細菌種を用いない同定を可能にする新規な転位因子を提供することである。このような因子は、乳酸菌中でシグナルペプチド（SP）をコードするDNA配列を同定するためのトランスポゾン誘導体を構築する上記方法によって提供される。
この方法の第一の工程において、プロモーターを持たないプロモーターレポーター遺伝子及びリボソーム結合部位(RBS)からなる配列を左方末端(LR)と右方末端(RR)との間に含むトランスポゾンからなるDNA分子が選択される。本文において、そのような有用なDNA分子のひとつとしては、Tn917トランスポゾン又はその誘導体からなるDNA分子がある。特に有用であるTn917誘導体は、Tn917トランスポゾンに加え、プロモーターを持たないlacZ遺伝子及びリボソーム結合部位(RBS)からなるプラスミドpLTV1である。
【００１５】
選択された塩基性で転位可能なDNA分子から、LRとプロモーターを持たないレポーター遺伝子との間に位置する領域を削除し、転位能及びRBSを保持する修飾DNA分子を得る。次いで、LRとプロモーターを持たないレポーター遺伝子との間に位置する残存領域に、ユニーク制限部位を挿入し、このユニーク制限部位に、分泌レポーター分子をコードするDNA配列であって、SPをコードする配列を含まないDNA配列を挿入する。
LRとプロモーターを持たないレポーター遺伝子との間に位置する領域を削除することにより、得られたトランスポゾン誘導体は分泌レポーター分子とともにフレーム中に停止コドンを持たず、転位時にLRの上流からの翻訳融合を可能にする。
【００１６】
エル.ラクティス及びその他の乳酸菌種中で使用可能な分泌レポーターのうち、エル.ラクティスにおいて分泌レポーターとして有用であることが証明された(Poquetら、1998)天然細胞外タンパク質であるスタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ(Nuc)を含むヌクレアーゼをコードする遺伝子が、現在好ましい。タンパク質は細胞内では不活性であり、その構造は極めて簡素(ジスルフィド結合を持たないモノマー)であるため、NucはSPのスクリーニングに適している。また、nuc遺伝子中でコドンを使用することは乳酸球菌の高レベル発現において適切である。分泌検出のためのプレートアッセイは非毒性であり、レプリカ培養の必要はない。
【００１７】
別の観点において、本発明は乳酸菌中でシグナルペプチド(SP)をコードするDNA配列を同定するための上記方法において有用な新規のトランスポゾン誘導体分子を提供する。このような分子は、プロモーターを持たないプロモーターレポーター遺伝子及びリボソーム結合部位からなる配列を左方末端(LR)と右方末端(RR)との間に含むトランスポゾン要素からなるDNA分子の形となる第一の要素からなる。有用なプロモーターレポーター遺伝子の一例としてlacZ遺伝子がある。
この第一の要素の重要な特徴は、プロモーターレポーター遺伝子の上流領域において、DNA分子が下記の第二の要素である分泌レポーター分子とともにフレーム中に停止コドンを持たないことである。これは、トランスポゾン誘導体の転位時において、LRの上流からの翻訳融合の発現を可能にする。
【００１８】
トランスポゾン誘導体分子は、第二の要素として、分泌レポーター分子をコードするDNA配列を含む。このDNA配列はSPをコードする配列を含まない。現在好ましい実施態様では、分泌レポーター遺伝子はスタフィロコッカス・アウレウスに由来するnuc遺伝子のようなヌクレアーゼをコードする遺伝子である。
有用な実施態様において、トランスポゾン誘導体はpLTV1を含むTn917又はその誘導体に由来する。本発明において特に好ましいトランスポゾン誘導体は、pTnNucである。その構造及び機能は、以下の実施例において詳細に記載する。上記第一及び第二の要素に加えて、トランスポゾン誘導体は、例えば抗生物質耐性遺伝子又は必須栄養成分に対する栄養要求性を与える突然変異のような選択マーカーをさらに含んでもよい。
【００１９】
本発明の主要な目的は、乳酸菌中においてシグナルペプチド（SP）をコードするDNA配列を同定する方法を提供することである。この方法は、乳酸菌を上記トランスポゾン誘導体で形質転換する工程と、形質転換された乳酸菌から、プロモーターを持たないプロモーターレポーター遺伝子が発現され、分泌レポーター分子をコードするDNA配列の遺伝子産物が分泌されている細胞を選択する工程からなる。
プロモーターレポーター遺伝子の発現が、転位因子が乳酸菌細胞遺伝子内に細胞染色体中のプロモーターに操作可能に結合する位置で組み込まれたことを示す指標であることは認識されるだろう。プロモーターレポーター遺伝子と分泌レポーター遺伝子の融合生成物を示唆する培地でプロモーターを持たないレポーター遺伝子と分泌レポーター遺伝子を発現させるための同時スクリーニングにより、機能性SPをコードする配列からなるクローンの直接同定が可能になる。
【００２０】
本発明によれば、上記において機能性SPの供給源として使用される乳酸菌は、一般に乳酸菌と称される細菌群に属するいずれの種であってもよい。この群はラクトコッカス・ラクティス等のラクトコッカス種、例としてラクトバシラス・アシドフィルス及びラクトバシラス・プランタルム(plantarum)を含むラクトバシラス種、リューコノストク・メゼンテロイデス等のリューコノストク種、オエノコッカス種及びストレプトコッカス種を含む。
好ましい実施態様において、トランスポゾン誘導体は任意に、又はある程度任意に転位される。
上記方法を用いて機能性SPをコードする配列からなるクローンが同定されると、そのような配列はヌクレオチド配列を分離するための従来技術によって分離することができる。必要ならば、分離されたそのような配列は、所望の遺伝子産物の分泌を向上又は最適化する目的で、同種又は異種に挿入することができる。
【００２１】
したがって、本発明はさらに別の観点において、上記に定義したトランスポゾン誘導体の少なくとも一部と、乳酸菌中で機能的なシグナルペプチド（SP)をコードするDNA配列とからなる分離されたDNA分子に関する。有用な実施態様において、そのようなDNA分子はシグナルペプチダーゼI認識配列又はシグナルペプチダーゼII認識配列からなるシグナルペプチドをコードする配列からなる。本文において適当なDNA分子としては、シグナルペプチドをコードするDNA配列が以下の実施例に記載するSP10、SP307、SP310及びSP330からなる群より選択されるクローン及びその突然変異体に由来している分子が含まれる。
【００２２】
遺伝子産物をコードする遺伝子を、天然に存在するSPをコードする配列の突然変異体に操作可能に結合することにより、所望の遺伝子産物の分泌効率を増加させることが可能であることがわかっている。そのような突然変異体は、UV照射又は化学的突然変異誘発物質を使用する突然変異誘発等の従来の突然変異誘発技術によって製造することができる。しかしながら、部位特異的突然変異誘発が好都合であり、機能特性が向上したSP突然変異体を製造するための有効な手段であることが見出されている。このような突然変異誘発は、結果として1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を生じてもよい。以下の実施例において、そのような突然変異SPの範囲を記載する。そのうちのいくつかは対応する野生型SPよりも高い分泌効率を示す。これらの突然変異体としては、ここにそれぞれ具体的に310mut1、310mut2、310mut3、310mut4、310mut5、310mut6、310mut7、310mut8、310mut10、310mut11、310mutA、310mutB、310mutC、310mutA1、310mutB1、310mutD2、310mutD7、310mutE2、310mutE11及び310mutF2と称される突然変異体が含まれる。
【００２３】
本発明はまた、ここに記載するSP10、SP13、SP307、SP310及びSP330、ならびにシグナルペプチド機能性を保持するいずれの前記シグナルペプチドの誘導体からなる群より選択される分子に由来し、シグナルペプチドをコードする分離されたDNA配列を提供する。上記突然変異体のいずれかに由来するDNA配列はここに含まれる。また、本発明のトランスポゾン誘導体の少なくとも一部からなる分離されたDNA分子又は上記の分離されたDNA配列からなる組み換えプラスミドが提供される。このようなプラスミドは、ここに記載するΔ10::Nuc、Δ13::Nuc、Δ307::Nuc及びΔ310::Nucからなる群より選択される組み換えプラスミドを含む。有用な実施態様において、本発明の組み換えプラスミドは分泌レポーター遺伝子に操作可能に結合する調節可能プロモーターからなる。プロモーター活性の調節は、成長温度、pH、成長段階及び宿主細胞の成長中に生じる培地の栄養成分変化等の、プラスミドを担持する宿主細胞の成長条件要因によってもたらされることが好ましい。本文において、ひとつの有用なプロモーターとしては以下に記載するP170プロモーターがある。
【００２４】
さらに別の観点において、本発明はSP10、SP13、SP310及びSP330、ならびにSP活性を保持するこれらSPのいずれの誘導体からなる群より選択される分子に由来し、シグナルペプチドをコードするDNA配列からなる組み換え細菌に関する。このような細菌において、このDNA配列は所望の遺伝子産物を発現する遺伝子に操作可能に結合することが好ましく、これによって遺伝子産物が分泌される。このような組み換え細菌は、所望の遺伝子産物の製造において宿主細胞として使用されるいずれかのグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌である。グラム陽性細菌の典型的な例としては、乳酸菌種、バシラス種及びストレプトマイセス種が含まれる。グラム陰性細菌の典型的な例としては大腸菌が挙げられる。
【００２５】
本発明を、以下の非制限的な実施例及び以下の図面において説明する。
図1Aは、エル.ラクティス中の分泌レポーターツールであるpTnNucの構築を示す。TnNucの構築の詳細は、実施例１に記載する。プラスミドは一定の比例で描いておらず、関連のある特徴だけを示している。制限部位： A: AatII; B: BsmI; E: EcoRV; N: NsiI; R: RsrII; S: SmaI。pPRAプラスミドはtet遺伝子のコード領域(塗りつぶしていない矢印tet)からlacZ遺伝子(縞をつけた矢印lacZ)までに及ぶpLTV1からの3.1 EcoRVフラグメントを含み、Tn917の左方反復（left repeat）を含む(塗りつぶした四角形LR)。このフラグメント(塗りつぶしていない四角形LTV1)及びLRの位置(塗りつぶした四角形LR)は、明確にするためにpPRAプラスミド中に記載する。LRとlacZとの間の欠失領域は、pPRA4B中の塗りつぶされていない三角形として記載する。
図1Bは、pLTV1中のTn917誘導体の欠失分析に使用されるnt位置の詳細及び転位における異なるpPRA5誘導体の機能性を示す。
【００２６】
図2に、選択されたエル.ラクティスのSP分泌効率分析を要約する。PRA157株(レーン1)、PRA158株(レーン2)及びPRA159株(レーン3)の濃縮(20倍)上清を16%トリシンゲル上に流し、クマシーで染色した。ロードした容量は、100 μl (PRA157及びPRA158)又は50 μl (PRA159)の培養上清からの全タンパク質含有量を表す。分子量マーカーの移動は、kDa単位で左側に示す。NucAの位置及び対応する全長タンパク質(Δ13::Nuc、Δ307::Nuc及びΔ310::Nuc)を右側に示す。Δ13::Nucと移動を同じくする弱いバンドは、エル.ラクティスからの主要な分泌タンパク質Usp45に対応するすべての株に存在する(van Asseldonkら、1990)。
【００２７】
図3は、SP310及びヌクレアーゼ分泌のための部位特異的突然変異誘発の概要である。SignalPを用いた野生型SP310(SP310)の分析から得られたプロフィルを上に示す。C、S及びY点は、SPの同定のためのSignalPに使用した3つのパラメーターである。矢印は、残基Ala34からAla35の間に示唆される主要なプロセッシング部位を示す。配列交代には下線を付す。
【００２８】
図4は、改変SP310を含むエル.ラクティス株中に分泌されたヌクレアーゼ収量を示す。一晩培養した培養物からの上清を、TCA沈澱によって約50倍に濃縮した。0.5 mlの培養上清に相当する容量を14% SDS PAGE (Novex)上に流した。レーン1：PRA76株(Usp45SP-Nuc)；レーン2：PRA159株(SP310配列からの60 aaを有するもとの構造は成熟Nucに融合)；レーン3：PRA162株(SP310の35 aaだけがNucに融合)；レーン4：PRA164株(310mut2-Nuc)；レーン5：PRA170株(310mutB-Nuc)；レーン6：PRA250株(310mut6-Nuc)；分子量マーカーの移動は、kDa単位で左側に表す。
【００２９】
実施例1
TnNucの開発及びラクトコッカス・ラクティス中の新規な分泌シグナルの分離におけるその使用
略語：aa：アミノ酸；  B.：バシラス；  bp：塩基対；  E.：大腸菌；Em：エリスロマイシン；  L.：ラクトコッカス；  LR：左方反復；  nuc：ヌクレアーゼコード遺伝子；  Nuc：ヌクレアーゼタンパク質；  nt：ヌクレオチド；  S.：スタフィロコッカス；  SP：シグナルペプチド又は分泌シグナル；  St.：ストレプトコッカス
【００３０】
1.1. 要約
TnNucと称され、スタフィロコッカス・アウレウスヌクレアーゼ遺伝子(nuc)を分泌レポーターとして含む新規のTn917トランスポゾン誘導体の構築を記載する。TnNucのエル.ラクティス染色体への転位は、nuc遺伝子とともにフレーム内での融合物の生成を可能にする。TnNucはまた、ライブラリーから関連のあるクローン、すなわちTnNucをエル.ラクティス染色体上の機能遺伝子に転位することによって生じるLac+表現型を有するクローンを同定するために使用するレポーターであるlacZを含む。転位因子の左方反復の上流フランキング領域に機能性シグナル配列が存在することは、結果として感受性プレートアッセイを用いたヌクレアーゼ活性の検出をもたらす。TnNucはエル.ラクティスからの新規な分泌シグナルの同定に使用された。同定された配列は、シグナルペプチダーゼI認識配列又はペプチダーゼII認識配列のいずれかを含む公知及び未知の乳酸球菌分泌タンパク質を含んでいた。ある場合において、同定された遺伝子は貫膜タンパク質をコードする。同定された配列は、pH及び成長段階依存プロモーターP170の制御下でプラスミド中に位置するとき、機能性を調査するために使用した(Madsenら、1999)。すべての場合において、恒成分培養槽中にP170を導入している間にヌクレアーゼの共同作用分泌が見られた。
【００３１】
1.2. 原料及び方法
(i) 株及び成長条件
適当であれば100 μg/mlのアンピシリン又は200 μg/mlのエリスロマイシン(Em)で補足したLB中、37℃で成長させた大腸菌K-12株DH10B (Grantら、1990)を、クローニング、プラスミドDNAの救出及びプラスミドDNAの増殖のために使用した。ラクトコッカス・ラクティス  クレモリス(cremoris) 株MG1614(Gasson 1983)を、トランスポゾン挿入の構築、スクリーニング、トランスポゾン挿入の分析及び挿入部位に近接するDNAのプラスミド救出をともなう実験において使用した。エル.ラクティス亜種のクレモリス株MG1614(Gasson 1983)を、分離した転座シグナルの分析に使用した。エル.ラクティス株は、適当であれば1 μg/mlのエリスロマイシンで補足したGM17又はArgM17(Israelsenら、1995)中(GM17Em又はArgM17Em)で、30℃で成長させた。発酵槽実験では、合成培地3 x SAIV (Jensen及びHammer、1993)を使用し、pHはKOHを用いて維持した。
細菌の形質転換は、大腸菌(Sambrookら、1989)及びエル.ラクティス(Holo及びNes 1989)についてそれぞれ公表されている手順に基づき、エレクトロポレーションで行った。
【００３２】
(ii) プラスミド及びTnNucの構築
Tn917-LTV1の欠失誘導体の構築及び分析のための方法(Camilliら、1990)を図1に示す。lacZ遺伝子の3'末端からtet遺伝子のコード領域まで(位置12208から15335)に及ぶpLTV1からの3.1 kb EcoRVフラグメントを、EcoRVで消化したpBluescript SK- (Stratagene)にサブクローンし、pPRA2を生じさせた。pPRA2からのプラスミドDNAを、プライマーPSS1b(5'-CGATGAATGC CGGACCGAAT TGATACACTA ATGCTTTTAT ATAGGG-3'(SEQ ID NO:1)、BsmI(下線部)及びRsrII(イタリック体)の各制限部位を含む；pLTV1中、位置13374から13348)及びプライマーPSS14(5'L-GTGTAGTCGG TTTATGCAGC-3'L(SEQ ID NO:2); lacZ 遺伝子中、位置12672から12691)を用いたPCRのテンプレートとして使用した。増幅した720bpのフラグメントをBsmI及びAatII(図1のpPRA2中の3,1 kb pLTV1フラグメント中のユニーク部位)で消化し、BsmI及びAatIIで消化したpPRA2にクローンし、pPRA3を生じさせた。4つの異なるPCR生成物(2A〜2Dと称する)を、pPRA2 DNAをテンプレートとして用いて増幅させた。PCRは、プライマーPSS3(5'-CACACATACC AATACATGC-3' (SEQ ID NO:3); pLTV1中、位置14391-14373、図1参照)を、ユニークRsrII部位(イタリック体)を含む以下のプライマー：(i) 2AにはプライマーPSS4 (5'-GCATCGGTCC GTAGGCGCTC GGGACCCC-3' (SEQ ID NO:4), pLTV1中、位置13665から13647); (ii)2BにはプライマーPSS6 (5'-GCATCGGTCC GTTCTTATCG ATACAAATTC CTCG-3' (SEQ ID NO:5), pLTV1中、位置13648 から13626); (iii)2CにはプライマーPSS8 (5'-GCATCGGTCC GAAATTTTTA AATCTATTTC TTATC-3' (SEQ ID NO:6), pLTV1中、位置13633 から13608) 及び(iv)2DにはプライマーPSS10 (5'-GCATCGGTCC GTAAATGTAC AAAATAACAG CGAAAT-3' (SEQ ID NO:7), pLTV1中、位置13613から13589)と組み合わせて用いることにより行った。
【００３３】
フラグメント2A〜2Dは、RsrII及びNsiI (pLTV1からの 3.1 kb EcoRV フラグメント中のユニークNsiI部位、図1参照)で消化し、同様に消化されたpPRA3にクローンし、pPRA4A〜pPRA4Dをそれぞれ生じさせる。pPRA4A〜pPRA4DはEcoRVで消化し、2.8-2.9 kbインサートをEcoRVで消化したpLTV1にクローンして、もとの3.1 kbフラグメントを置換する。その結果、プラスミドpPRA5A〜pPRA5Dが生じた(図1)。
pPRA5Bを、TnNucを構築するために選択した。DNAテンプレートとしてpBS::Nuc (Le Loirら、1997)を用い、プライマーPSSnuc1 (5'-GCATCGGACC GTCACAAACA GATAACGGCG-3' (SEQ ID NO:8)、RswrII部位はイタリック体)及びプライマーPSSnuc2 (GCATCGGTCC GCATTATTGA CCTGAATCAG-3' (SEQ ID NO:9)、RsrII部位はイタリック体)を用いて、531 bpのフラグメントを得た。RsrIIを用いた消化と、同様に処理したpPRA5Bへの連結を続けて行い、pTnNucを生じさせる。nucフラグメントは、NucB型のタンパク質をコードする(Poquetら、1998)。
【００３４】
トランスポゾン挿入は、Tn917誘導体を担持するベクターでエル.ラクティスを形質転換し、これらをエリスロマイシン選択で成長させることによって行った。形質転換体のプレートは、Israelsenら(1995)に記載のようにX-galプレートでレプリカ培養し、次いでLacZ+-クローンのヌクレアーゼプレート(Nuc)アッセイするか、又は形質転換した高密度のエル.ラクティスをそれぞれ1 μg/mlのEmで補足した200 mlのSGM17寒天を入れた140 mmのペトリ皿で培養することによってトランスポゾン挿入のライブラリーを形成した。プレートは30℃で4日間インキュベートし、コロニーをGM17Em及び17%グリセロールに再懸濁することによってクローンをプールした。構築したライブラリーを少量のアリコートで凍結した。その後、アリコートをGM17Em又はArgM17Emのいずれかでc. 500 cfu/プレートの密度で培養した。次いで、Nucアッセイをコロニーで行い、Nuc分泌クローンを同定した。
【００３５】
プラスミド上で分離したSPの機能性を分析するために、pAMJ206を使用した。pAMJ206は、pAK80(Israelsenら、1995)からリボソーム結合部位(RBS)の上流に位置するエル.ラクティス調節プロモーターP170(Madsenら、1999)を含む。ユニークなBglII及びSalI部位は、RBSのすぐ下流に好都合に位置する。プライマーNuc1及びNuc2(それぞれ 5'-GGAAGATCTT CACAAACAGA TAACGGC-3' (SEQ ID NO:10) 及び5'-ACG-CGTCGAC GAATTCGATC TAAAATTAT AAAAGTGCC-3' (SEQ ID NO:11)、制限部位はイタリック体)を用いて、pBS:Nuc(Le Loirら、1997)からPCRフラグメントを得、BglII及びSalIで消化し、pAMJ206に連結し、pΔSPNucを生じさせた。このプラスミドは以下のプラスミドpPRA157、pPRA158及びpPRA159の構築に使用した。pPRA157において、PCRフラグメントを、プライマーPSScluA-A及びPSScluA-B (それぞれ 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA AAAACATTGA GAGACCAGTTACTTG-3' (SEQ ID NO:12)及び5'-GCATAGATCT ACTCCAACTA TCACCTGTTG CATTTGCTC-3' (SEQ ID NO:13), 制限部位SmaI及びBglIIはイタリック体、発現ベクターpAMJ203からの配列は下線付き、cluA遺伝子ATG開始コドンは小文字で表す)を用いてエル.ラクティスMG1614の染色体DNAから増幅させた。このフラグメントは、cluA遺伝子の開始コドンから下流の位置1200 bpに及ぶ。この位置では、TnNucの挿入がクローンSP13において確認された。このフラグメントをSmaI-BglIIで消化したpΔSPNucにクローンし、SP13で製造されたタンパク質と比較してaaが2個しか違わない(Arg-Ser、クローニング部位に由来)フレーム内融合タンパク質)CluA::Nucを生じさせた。
【００３６】
それぞれpΔSPNucにおけるクローンSP307(プライマーPSS307-A, 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAT AAATCAAAAA TTATTGCTTT CTCTGC-3' (SEQ ID NO:14)及びPSS307-B, 5'-GCATAGATCT ATCAATGGAA TTAACATCAG CTGCCATGC-3' (SEQ ID BO15)を用いて増幅されたフラグメント、SmaI及びBglII部位はイタリック体)及びSP310(プライマーPSS310-A, 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAA TTTATAAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:16) 及びPSS310-B, 5'-GCATAGATCT GTTATCATTA AAATCACTCC GATTAAGAG-3' (SEQ ID NO:17)を用いて増幅されたフラグメント、SmaI及びBglII部位はイタリック体)へのTnNuc挿入によって不活性化された遺伝子の最初の120 bpのコード領域に対応するPCRフラグメントのクローニング以外は、pPRA158及びpPRA159の構築を同様に行った。
【００３７】
さらに、Usp45からのSP(プライマーUsp1(5'-TAGTAGGATC CCGGGTCTAG ATTAGGGTAA CTTTGAAAGG ATATTCCTCatgAAAAAAAA GATTATCTCAGC-3' (SEQ ID NO:18)、SmaI部位はイタリック体、usp45 ATG開始コドンは小文字)及びUsp2(5'-ACGCGTCGAC CTGCAGAGAT CTTGTGTCAG CGTAAACACC-3' (SEQ ID NO:19)、 BglII部位はイタリック体、を用いて増幅させたSPUsp)を含むN-末端29 aaを含むPCRフラグメントを、SmaI-BglIで消化したpΔSPNucにクローンすることにより、AMJ627株を構築した。すべてのプラスミド構築は、関連領域をシーケンシングすることによって確認した。
【００３８】
(iii) ヌクレアーゼアッセイ
プレート上でのヌクレアーゼアッセイは、Lachicaら(1971)に記載のコロニーオーバーレイ法で、以下を変更して行った：0,1％の超音波処理したニシンの精子DNAと40 μMのCaCl2をオーバーレイに使用し、1％寒天培地の代わりに0.6％アガロースを用いた。コロニーは、0,3％のグルコースを含むGM17Em、ArgM17Em又はLBEmプレートで成長させた。オーバーレイを凝固させた後、プレートを37℃で30分から6時間インキュベートした。ヌクレアーゼ分泌コロニーは、青緑色のバックグラウンドにおいて明るいオレンジ色の領域として現れた。
【００３９】
(iv) Tn917及び誘導体を用いた挿入突然変異誘発
トランスポゾン挿入実験を、Tn917誘導体を担持するベクターでエル.ラクティスを形質転換し、これらをエリスロマイシン選択で成長させることによって行った。最初の形質転換体はIsraelsenら(1995)に記載のようにX-galプレートでレプリカ培養し、次いでLacZ+-クローンのヌクレアーゼアッセイを行った。又は、形質転換した高密度のエル.ラクティスをそれぞれ1 μg/mlのEmで補足した200 mlのSGM17を入れた140 mmのペトリ皿で培養することによって、トランスポゾン挿入のライブラリーを形成した。プレートを30℃で4日間インキュベートし、GM17Em及び17%グリセロールにコロニーを再懸濁することによってクローンをプールした。構築したライブラリーを少量のアリコートで凍結した。その後アリコートを解凍し、Emで補足したGM17又はArgM17のいずれかでc. 500 cfu/プレートの密度で培養した。その後プレートアッセイをコロニーで行い、ヌクレアーゼを分泌するクローンを同定した。
【００４０】
(v) パルス領域ゲル電気泳動
組み込まれたトランスポゾンを有するエル.ラクティスクローンからのSmaI消化染色体DNAのPFGEを記載のように(Israelsen及びHansen, 1993)行い、TnNucのランダム分布を分析した。
(vi) プラスミド救出
組み込まれたTnnucトランスポゾンのフランキング領域からのDNAを以下のように特性づけた：トランスポゾンLRにフランキングしているDNA領域については、染色体DNA(2 μg)をEcoRIで消化し、分子内連結のために大容量(200 μl)で再連結し、大腸菌 DH10Bに形質転換した。RRに近接するDNA領域については、再連結及び大腸菌 DH10Bの形質転換の前に、染色体DNAをMluI又はBsiWIのいずれかで消化させた。
【００４１】
(vii) タンパク質の特性づけ
代替の培養上清を、フェノール-エーテル法(Sauveら、1995)を用いて20〜30倍に濃縮した。製造業者に従い、試料を16%トリシンゲル(Novex)上に流した。ゲルをコロイド状クマシー染色キット(Novex)を用いて一晩染色した。分子サイズを評価するためにマーク12ワイドレンジスタンダード（Mark 12 Wide Range Standard）を使用した。
(viii) DNAのシーケンシングとコンピュータ分析
プラスミド構築及び救出プラスミドDNAを、Thermo Sequenase蛍光標識プライマーサイクルシーケンシングキット(Amersham)、Cy5標識プライマー及びALF高速DNAシーケンサー(Pharmacia Biotech)を用いてシーケンシングした。DNA配列データは、Genetics Computer Group, Inc.のウィスコンシンパッケージを用いて分析した。存在しうる分泌シグナルは、SignalP WWWサーバー(Nielsenら、1997)を用いて分析した。
(ix) 発酵
発酵実験は、1リットルの培地を入れ、30℃で稼動し、pHを5.2以上に維持するように設定されたベンチトップ発酵槽(Applikon)を用いて行った。
【００４２】
1.3. 結果
(i) ラクトコッカス・ラクティス中のTn917の転位に必要な最小領域の同定
pLTV1に含まれるTn917誘導体の転位は、エル.ラクティス中の調節プロモーターの研究中に証明された(Israelsenら、1995)。この誘導体は、トランスポゾン左方末端のプロモーターを持たないlacZ遺伝子及びバシラス・サチリスのspoVG遺伝子に由来するリボソーム結合部位を含む。SpoVG::lacZ配列はTn917の末端から、この挿入が転位を破壊しない位置に278 bp挿入される(Youngman、1987)。エル.ラクティスからの分泌シグナルを同定するためのトランスポゾンを主体とするスクリーニングツールを開発するためには、転位時に分泌されたタンパク質をエンコードする遺伝子とのフレーム内融合の形成を可能にするために、分泌タンパク質をエンコードするレポーター遺伝子をこの要素の左方末端に挿入しなければならない。これには、Tn917の左方末端からの距離が短いことと、レポーター遺伝子とのフレーム内融合を妨げる停止コドンを回避することが要求される。プラスミドpPRA5A〜pPRA5Dは、それぞれTn917のLRからspoVG::lacZのすぐ上流の領域までの範囲内(pPRA5A)又はその近傍(pPRA5B〜pPRA5D)に及ぶ小さな欠失を含むpLTV1の誘導体として構築された(図1)。ユニークRsrII部位は、欠失時にすべての誘導体に導入された。エル.ラクティスMG1614は、pLTV1及びpPRA5A〜Dを用いて形質転換された。形質転換体は、GM17Emプレートでレプリカ培養を4回繰り返して成長させた。多数の初期形質転換体が、レプリカ培養中に成長を止めた。これらは次のプレート成長中に失われる不完全な遊離複製プラスミドを含む分離菌に相当すると思われ、Em感受性に変化する。安定なEm耐性クローンはTn917誘導体のエル.ラクティス染色体への転位を意味するが、トランスポゾンを担持するプラスミドの組み込みの可能性は、クローンの分画において排除できない(Israelsenら、1995)。エル.ラクティスMG1614のpLTV1、pPRA5B、pPRA5C及びpPRA5Dを用いた形質転換は、同様の安定形質転換体出現率を生じた。しかしながら、pPRA5Aを用いた場合では安定な形質転換体は得られなかった。pPRA5A中のTn917誘導体は、要素のLRの部分的な欠失を含む。この構造特性を変更することは、エル.ラクティス中で確認された転位の欠落の要因となることがある。要素の境界を定めるためにはこの領域での配列の完全性が必要であり、高度の配列相同性がTn917のようなTn3関連要素において確認される(Sherratら、1989)。
【００４３】
エル.ラクティスMG1614では、pLTV1を用いた形質転換の結果、X-galを含むプレート上の安定なEm耐性クローン中で15％の青色コロニーが生じた(Israelsenら、1995)。青色コロニーは、エル.ラクティス染色体中のプロモーター下流でのTn917の転位に起因する。pPRA5B、pPRA5C又はpPRA5Dでは、pLTV1に比較して青色コロニー出現率の顕著な相違は見られず(データ記載せず)、これらの誘導体がエル.ラクティス中で機能性であることを示している。
pPRA5Bは最大の欠失を含み、機能性を保持しているため、分泌レポーターであるエス.アウレウスnuc遺伝子のクローンを作るために選択した。
【００４４】
(ii) エル.ラクティス中のシグナルペプチドを同定するためのツールであるTnNucの構築
SP下流に完全なnucコード領域を含むPCRフラグメント(2.2項参照)を、pPRA5BのユニークRsrII部位にクローンし、pTnNucを生じさせた(図1)。この構築において、nuc遺伝子とフレームに入る停止コドンが回避されるので、LR上流からの翻訳融合が可能となる。TnNucと名づけられた新しいトランスポゾンを、エル.ラクティスMG1614中に突然変異体集団を構築するために使用した。TnNucは、本来のlacZコード領域とリボソーム結合部位を保持する。TnNucのこの追加的な特徴は表現型特性(Lac+)を提供し、遺伝子の機能性に関係なく、転位時にLRの上流の配列からのプロモーター活性の存在を示す。このように、青色コロニーに対する最初のスクリーニングにより、真の転位が発生し、TnNucへの転写が生じるエル.ラクティスクローンが同定される。これらにおいて、クローンの割合は、分泌タンパク質をエンコードする遺伝子の5' 末端に近接するTnNucを含むと思われる。
【００４５】
(iii) TnNuc要素集団の構築及びスクリーニング
2個の独立したエル.ラクティスMG1614形質転換実験を、pTnNucを用いて行った。機能性シグナルペプチドの同定には、活性プロモーターと分泌タンパク質をエンコードする遺伝子の両方が必要なため、最初のスクリーニングではlacZの発現をもたらす転位事象に焦点をおき、正確な方位でプロモーターとの融合を生じない組み込み事象は考慮しなかった。最初の実験において、147個のLac+クローンを分離し、プレートオーバーレイアッセイを用いてヌクレアーゼ分泌アッセイを行った。X-galプレートで濃青色コロニーを形成した多数のクローンは、プレート上で弱いNuc活性を示した。これらのクローンは、強力に発現した遺伝子へのTnNucの転位を表していた。プレート上の低レベルのNucは、制限された細胞溶解及び非実際的な分泌の結果であったかもしれない。弱いLac+表現型と低レベルのNucを同時に示した12個のクローンが、真性のNuc分泌が予想されたため、次の分析のために選択された。
【００４６】
2番目の実験型では、改良法が考案された。この方法は、上記の複雑かつ順次的なスクリーニングを低減し、また制限的なプロモーター活性のために最初の要素のレプリカ培養中に失われ、その結果X-galプレート上に白色コロニーを生じさせるクローンを取り戻すことを可能にする。この方法では、最初の形質転換体がSGM15Emプレートで培養され、4日間インキュベートされる。この長いインキュベートは、真性かつ安定なEm耐性要素を選択するためのものである。コロニーはプールされ、約104個の独立した転位体を含むライブラリーとして蓄積される。続いてライブラリーの分析を、プレート上でNucアッセイを用いることによって行った。次いでNuc+クローンをLacZ活性について試験した。得られた108個のNuc+クローンのうち、(i)強いNuc+表現型、又は(ii)弱いNuc+と弱いLac+表現型のいずれかを示す20個のクローンを次の分析のために選択した。後者のクローンは、機能性L. lactis遺伝子へのTnNuc共適合を含んでいると推定された。
【００４７】
エル.ラクティス染色体中のTnNuc分布を調査するために、49個の独立したLacZ+クローンからのSmaI消化染色体DNAにおいてPFGEを行った。エル.ラクティス染色体において、TnNucの存在はTnNuc配列に含まれる2個の隣接するSmaI部位を導入する(図1)。したがって、1個のSmaIフラグメントのエル.ラクティスMG1363のPFGEプロフィルからの消失及び2個の新規なSmaIバンドの存在が、TnNucの存在を証明している。試験したクローンのうち、35個が最大600 kbのSmaI染色体フラグメントにおいてTnNucの存在を示した。この出現率(71%)は、以前に報告された同様のTn917系であるTV32のエル.ラクティスMG1614中の同じ染色体領域への転位出現率(60%)と一致する(Israelsen及びHansen、1993)。2個のクローンはそれぞれ、310 kbのSmaI染色体フラグメントにおいて1又は2個のTnNucコピーを有する。TnNucの280 kb、140 kb及び120 kb SmaI染色体フラグメントへの転位が、それぞれ3個、2個及び2個のクローンについて確認された。残りの6個のクローンについては、PFGEプロフィルに明白な変化は検出されなかった。TnNucは小さいほうのSmaIフラグメントのうちの１個に挿入されるものと仮定される。なぜなら、PFGEで使用する条件下ではこれらのフラグメントについて大きさの変化が検出されないからである(Israelsen 及びHansen、1993)。これらの結果により、エル.ラクティス中にTnNuc転位がある程度ランダムに分布していることが確認された。
【００４８】
(iv) 分泌タンパク質をコードするエル.ラクティス遺伝子の配列分析
陽性Nuc+/Lac+表現型を示す得られた32個すべてのクローンを、プラスミド救出実験に使用し、TnNuc転位の影響をうける遺伝子の特性づけを行った。2つの場合において、大腸菌中のプラスミド救出は形質転換体をまったく産出せず、対応するクローンはそれ以上分析しなかった。TnNucのLRをフランキングする染色体DNA(300〜400 bp)を、救出したプラスミドにシークエンスした。2つの場合において、得られた配列はpTnNucに相当した。pTnNucの転位ではなく、組み込みがこれらエル.ラクティスクローン中で発生した可能性がある。残りの28個のクローンについては、エル.ラクティス染色体からの配列がTnNucのLR近傍で同定され、真性の転位が起こったことを示している。DNA分析により、TnNuc挿入のすぐ上流の配列に、10個のクローンにおいてnuc遺伝子とフレームに入る停止コドンが存在することがわかった。残りの18個のクローンのうち、cluA遺伝子中のSP13及びSP36がTnNuc挿入を含んでいた。CluAは、乳酸球菌結合での供与菌と受容菌との間の細胞凝集に係わる貫膜タンパク質である(Godonら、1994)。CluAは、シグナルペプチダーゼIの対象となる実に典型的なシグナルペプチドを有する(表 1)。同一遺伝子内の5つの異なる位置にTnNuc挿入を含む９個のクローンが同定された。この遺伝子は、シグナルペプチドを含む推定上のタンパク質をエンコードする。この群の代表的なクローンであるSP310は、強いNuc活性及び低いLacZ活性を示し、分泌されたNucに係わる有効なシグナルペプチド配列を示している。
【００４９】
【表１】
0004271396.tif 000002
【００５０】
1 同一位置にTnNuc挿入を有する独立したクローンの数を示す。目的遺伝子内の異なる位置の数はカッコ内に示す。
2 Nuc活性はオーバーレイアッセイを使用したプレートで評価した(2.3項参照)。
3 LacZ活性はX-galを含むプレートで評価した。
4 SignalP神経回路網を用いたシグナルペプチド分析(Nielsenら、1997); I:タイプIシグナルペプチド; II: タイプIIシグナルペプチド(リポタンパク質)。
5 以前に分離されたトランスポゾン要素PA243(Israelsenら、1995)においてよりも分断された同一の遺伝子。
6 ストレプトコッカス・ミュータンスdexB、細胞外デンプンの代謝に係わるエキソグリコシラーゼをエンコードする(Whitingら、1993)。
7 ストレプトコッカス・エクイリシムス(equilisimus)からのヒアルロナンシンセターゼ(HAS) (Ashbaughら、1998)。
8 大腸菌からのカチオン輸送タンパク質との相同性。
ND: 関連遺伝子の5'末端に利用できない配列。
【００５１】
クローンSP10は、pLTV1を用いた調節乳酸球菌プロモーターの研究において以前に同定されたthrオペロン(Madsenら、1996)近傍の染色体位置にTnNuc挿入を含んでいた。SP10は、同一位置のpLTV1要素であるPA234について報告されたように(Madsenら、1996)、強いプロモーター活性(LacZ)を示した。エンコードされたタンパク質は、推定のシグナルペプチドを含んでいた(表 1)。
クローンSP307はレンサ球菌ヒアルロナーゼシンターゼ(HAS)の相同体をエンコードする遺伝子内にTnNuc挿入を含んでおり、カプセル合成に関与していた(Ashbaughら、1998)。リポタンパク質シグナルペプチド(von Hejne, 1989))は、エンコードされたタンパク質のN末端に存在する(表 1)。
【００５２】
クローンSP11及びSP25の分析により、分裂した遺伝子のATG開始コドンからそれぞれ103及び49 bpの2つの異なる位置でのTnNuc挿入が明らかになった。SP25については、短い配列はSPを一致させるほど十分に長くない。しかしながら、Nuc及びLacZ活性間の好ましい比率は、SP11及びSP25の両方から確認された(表 1)。確認されたヌクレアーゼ活性は、Nuc融合タンパク質の部分的なプロセッシング及び分泌によるものかもしれない。あるいは、不活性遺伝子が分泌機構又は細胞膜の成分に係わっており、分泌増加又はタンパク質結合を導くとも考えられる。
2個のクローンSP240及びSP330において、SPは目的遺伝子において同定されなかった。SP240については、データベース検索によりエスティ.ミュータンスdexB遺伝子との重要な相同性が確認された。dexBは細胞外デンプンの分解に関与するエキソグリコシラーゼをエンコードする(Whitingら、1993)。興味深いことに、DexBにはSPが発見されない(表 1)。SP240及びSP330において確認されたNuc分泌の根底に存在する機構はいまだ不明である。
最後に、膜タンパク質をエンコードする遺伝子は、クローンSP323の挿入対象であった。推定タンパク質は、大腸菌のMg2+輸送体との相同性を示した(表 1)。
【００５３】
(v) エル.ラクティス中のマルチコピープラスミドの選択された分泌シグナルの機能分析
公知の遺伝子からの配列(SP13)と、これまで知られていなかった遺伝子からの配列(SP10、SP307及びSP310)を表し、シグナルペプチダーゼI又はIIによって認識されるSPに属する４個のSPを、次の分析のために選択した。野生型バックグラウンドにおいてTnNucで同定された融合パートナーの分泌効率を分析するために、プラスミド構築を行い、最小領域(すなわち対応するATG開始コドンに最も近い挿入位置、2.2項参照)のクローンを作成した。予備的な結果では、最初の60-150 aaを含むN末端CluA領域を担持するCluA-Nucタンパク質融合は検出可能な量の分泌Nucを産出しなかったことが分かった(データ記載せず)。したがって、ここで同定されたcluAの5'末端に最も近いTnNuc挿入位置に対応するCluAのN末端 400aaを含む領域を、比較のために使用した(SP13)。
【００５４】
その他すべてのSPについては、タンパク質の60 aa N末端領域(SP10、SP307及びSP310)が、Nucとのタンパク質融合物(以降それぞれΔ10::Nuc、Δ13::Nuc、Δ307::Nuc及びΔ310::Nucと称する)として導入され、PRA156株(Δ10::Nuc)、PRA157株(Δ13::Nuc)、PRA158株(Δ307::Nuc)及びPRA159株(Δ310::Nuc)が生じた。この研究において使用したNucフラグメントは、NucB型タンパク質に相当する。この型をさらに19〜21 aaの短い形のNucAに加工する(Pouquetら、1998)。PRA156〜PRA159株は調節発現のためのpH及び成長段階依存プロモーターP170を含む(Madsenら、1999)。P170による発現は、成長培地がpH〜6.5に維持されているとき、静止期に移行する間に起こる。上記株を用いて発酵槽実験を行い、最大製造レベルが得られた静止期の開始時に試料を取り出した(Madsenら、1999)。最初の測定ではPRA156の培養上清においてバックグラウンドNuc活性レベルだけが現れた。このため、この株はこれ以上分析しなかった。
【００５５】
PRA157、PRA158及びPRA159からの濃縮培養上清を、SDS-PAGEを行うために使用した。記載のように、NucAの分泌は3個の株すべてにおいて確認された(レーン1-3での19-kDaのバンド、図2)。全長融合タンパク質に相当する大きさのその他のバンドはPRA157(42-kDaのバンド)及びPRA158(22-kDaのバンド；図2)において同定された。PRA159株において、同様の大きさの2個の付加生成物(約23kDa)が検出された。これはSP310中のSPの代替プロセッシング部位を示唆している。この可能性は、最初のMetから位置27及び34で、SignalP ( HYPERLINK "http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP" http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalPで入手可能、データ記載せず)を用いた最初のaa配列の２個の推定上のプロセッシング部位の同定によって支持された。全般的に、分泌効率はPRA159(Δ310::Nuc)で最高、PRA157(ΔCluA::Nuc)で最低であった。試料はNuc活性の測定に使用した(表 2)。
【００５６】
比較として、AMJ627株を使用した。AMJ627は上記と同様の構造を有し、Nucと融合したUsp45からの完全なSP(SPUsp::Nuc; 2.2項参照)を含む。得られた値は、Usp45からのSPの分泌効率を確証した。PRA159で使用したSP(Δ310::Nuc)は67 mg/LのNuc、つまりSPUspに対して約60％を分泌した。活性レベルはPRA158(31%)及びPRA157(6%)では低かった。
【００５７】
【表２】
0004271396.tif 000003
【００５８】
実施例2
ラクトコッカス・ラクティスからのシグナルペプチドSP310の分子特性づけ及び分子工学
2.1 要約
実施例1において同定されたシグナルペプチド（SP）のうち、SP310は最高レベルの分泌を示した。しかしながら、得られたレベルは、主要な分泌乳酸球菌タンパク質であるUsp45のシグナルペプチド(SPUSP)を用いて得られたレベルよりも低かった。本実施例では、分泌レベルを高め、エル.ラクティスでのSec依存分泌の必要条件を調べることを目的とした、SP310における部位特異的突然変異誘発の方法について記載する。分析した突然変異体のうちのひとつであるSP310mut2は、SPUSPと同様の分泌レベルを示し、発酵槽で150 mg/L以上のスタフィロコッカス・アウレウスヌクレアーゼ(Nuc)を産出した。これは、野生型SP310配列に対して45％の向上を意味する。突然変異体におけるNuc分泌分析は、エル.ラクティスにおける有効な分泌のための必要条件のいくつかを確立することを可能にした。エル.ラクティスのSec依存分泌経路についての共通の特性は、大腸菌について報告された特性とは異なる。
【００５９】
2.2. 原料及び方法
(i) 株及び成長条件
適当であれば100 μg/mlのアンピシリン又は200 μg/mlのエリスロマイシン(Em)で補足したLB又はTB中、37℃で成長させた大腸菌K-12株DH10Bを、クローニング、プラスミドDNAの救出及びプラスミドDNAの増殖のために使用した。ラクトコッカス・ラクティス  クレモリスMG1363株 (Gasson 1983)をSPの分析に使用した。エル.ラクティス株は30℃で、適当であれば1 μg/mlのエリスロマイシンで補足したGM17(GM17Em又はArgM17Em)で成長させた(Israelsenら、1995)。発酵槽実験では、合成培地SAIV(Jensen及びHammer、1993)を使用し、pHはHCl又はNaOHを用いて維持した。細菌の形質転換は、大腸菌(Sambrookら、1989)及びエル.ラクティス(Holo及びNes 1989)についてそれぞれ公表されている手順に基づき、エレクトロポレーションで行った。
【００６０】
(ii) SP310の部位特異的突然変異誘発及びプラスミドの構築
プライマーPSS310-A (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAA TTTAATAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:20)、SmaI部位はイタリック体)及びPSS310-B0 (5'-CTATTGGTTT GATTACGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NO:21)、BglII部位はイタリック体)を、野生型SP310配列(以下SP310と称する)を増幅するために使用した。テンプレートとしてはpPRA159 DNAを用いた。増幅したフラグメントはSmaI及びBglIIで消化し、アガロースゲルから精製し、クローンした。
【００６１】
310mut1の構築については、PSS310-A及びPSS310-B1 (5'-GGTTCTATTG GTTCGATTAC GTCGGCTTTC TAGATACG-3' (SEQ ID NO:22)、BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き)を使用した。PSS310-A及びPSS310-B2 (5'-GTTATAGTAG TTAGGTTCTA CGAGTT---- --CGTCGGCTTTCTAGATACG-3' (SEQ ID NO:23)、BglII部位はイタリック体、変異は下線付き、欠失は線で表示)を使用して310mut2を得た。
310mut3は、PSS310-A及びPSS310-B3(5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT----- -TAGGGT---TTGTGACGAG TTCGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:24), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を使用して製造した。
310mut4は、PSS310-A及びPSS310-B4 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT----- -TAGGTT--- TTGGTTTGAT TACGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:25), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて構築した。
【００６２】
310mut5は、PSS310-A及びSS310-B5 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT----- -TAGGTT--- TTGGTTCGAT TACGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:26), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて得た。
310mut6は、プライマーPSS310-A及びPSS310-B6 (5'-GTTATAGTAG TTAGGTTCTA CGAGTT---- --CGTCTATG ATCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:27), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて構築した。
310mut7は、プライマーPSS310-A及びPSS310-B2ΔQ (5'-GTTATAGTAG TTAG---CTA CGAGTT---- --CGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:28), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて得た。
【００６３】
310mut8は、プライマーPSS310-A及びPSS310-B2ΔD (5'-GTTATAGTAG TTAGGTT--- CGAGTT---- --CGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:29), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて製造した。
310mut10は、プライマーPSS310-A及びPSS310-B21F (5'-CGTTATCGGT GCAAATAAAA AAACTATAAA CATTCAAAAA AATGTTATAG TAGTTAGGTT CTACGAGTT- -----CGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NO:30), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて構築した。
310mut11は、プライマーPSS310-A及びPSS310-B22F (5'-CGTTATCGGT GCAAATAAAA AAACTATAAA CATAAAAAAA AATGTTATAG TAGTTAGGTT CTACGAGTT - -----CGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NO:31), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)を用いて得た。
310mutAを構築するために、プライマーPSS310-AA (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAAA AAGAGTTGCA ATAGCCTTGT TTATTGCTTT GATATTTGTA CTTTTTTTTC TTATATCATC-3' (SEQ ID NO:32), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、突然変異は下線付き)及びPSS310-B0を使用した。
【００６４】
310mutBは、プライマーPSS310-AB (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGGG TAACTTTGAAA GGATATTCCTC atgAAATTTA ATAAAAAAAG AGTTCTTATA CTTTTGTTTA TTCTTTTGAT ATTTGTACTT TTTTTTCTTA TATCATC-3' (SEQ ID NO:33), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、突然変異は下線付き)及びPSS310-B0を用いて得た。310mutCは、プライマーPSS310-AC (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAAA AAGACTTTTG CTTTTGCTTT TGCTTTTGCT TTTACTTCTT TTG-3' (SEQ ID NO:34), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、突然変異は下線付き)及びPSS310-BC (5'-GAAAATGAAG AAAACGAAAA CGAATATAGT AGTTAGGTTC TATTGGTTTG ATTACGTCGG CTTTCTAGAT ACG-3' (SEQ ID NO:35), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き)を用いて得た。
【００６５】
310mutA1は、プライマーPSS310-AA及びPSS310-B1 (5'-GGTTCTATTG GTTCGATTAC GTCGGCTTTC TAGATACG-3' (SEQ ID NO:36), BglII部位はイタリック体、突然変異は下線付き)を用いて構築した。
310mutB1は、プライマーPSS310-AB (5'- CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAA AAAGAGTTCT TATACTTTTG TTTATTCTTT TGATATTTGT ACTTTTTTTT CTTATATCAT C-3' (SEQ ID NO:37), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、突然変異は下線付き)及びPSS310-B1を用いて得た。
310mutD2の構築は、プライマーPSS310-AΔF(5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA ---AATAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:38), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、突然変異は下線付き、欠失は線で表示)及びPSS310-B2を用いて行った。
【００６６】
310mutD7は、プライマーPSS310-AΔF及びPSS310-B2ΔQを用いて構築した。310mut E2はプライマーPSS310-AΔN (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA TTT---AAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:39), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、欠失は線で表示)及びPSS310-B2を用いて得た。
310mutE11の構築は、プライマーPSS310-AΔF及びPSS310-B22Fを用いて行った。
310mutF2は、プライマーPSS310-AK (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA TTTAAAAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:40), SmaI部位はイタリック体、ATG開始コドンは小文字、突然変異は下線付き)及びPSS310-B2を用いて構築した。
【００６７】
すべての場合において、クローンを、エレクトロポレーションによって大腸菌に導入した。310配列中の突然変異の存在は、Thermo Sequenase蛍光標識プライマーサイクル配列キット(Amersham)、Cy5標識プライマー及びALF高速DNAシーケンサー(Pharmacia Biotech)を用いて両方の鎖をシーケンシングして確認した。その後、プラスミドDNAをエル.ラクティスMG1363に導入した。
【００６８】
(iii) タンパク質分析及びSDS-PAGE
培養上清を、フェノール-エーテル法(Sauveら、1995)を用いて20〜30倍に濃縮した。試料を製造業者に従って16%トリシンゲル(Novex)に流した。ゲルは、コロイド状クマシー染色キット(Novex)を用いて一晩染色した。マーク12ワイドレンジスタンダード (Novex)を用いて分子サイズを評価した。
(iv) タンパク質配列分析
SP310の誘導体を HYPERLINK "http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.html" http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.htmlで入手可能なSignalP WWWサーバー(Nielsenら、1997)を用いて分析し、これらのSPとしての適性を予測した。
(v) 発酵
発酵実験は1リットルの培地を入れ、30℃で稼動し、pHを5.2以上に維持するように設定されたベンチトップ発酵槽(Applikon)を用いて行った。
【００６９】
2.3. 結果
(i) エル.ラクティスでの分泌効率分析のための実験設定
実施例1では、nuc遺伝子を含むTn917誘導体を用いた挿入突然変異誘発によって多数の新規なSPを構築した。これらのうち、次の研究のためにSP310を選択した。なぜならその使用によって、SP310-nuc遺伝子融合の発現がマルチコピープラスミド上のプロモーターP170によって発生したときに、最高収量のヌクレアーゼ(Nuc)分泌が生じるからである。主要な分泌乳酸球菌タンパク質であるUsp45からのSP(SPUSP)と比較して、SP310を用いて得られたNuc分泌収量はきわめて低かった。
【００７０】
SP310の分泌レベルを高め、Nucの分泌を高めつつ突然変異体を容易に同定するために、GM17で一晩培養した培養物からの培養上清中のNucレベルを、発酵槽中のSAIV培地での成長で得られたレベルと比較した。記載のように、位置+1(Ala+1、プロセッシングされたタンパク質のN末端 aa)にAlaを含む最小のSP 35 aa野生型配列の使用により、5,67 mg/LのNuc分泌レベルが得られた。これはGM17で一晩成長させた後にSPUSP(PRA76株)を用いて確認されたレベルの約78％である(表 3)。分泌されたNucの全体の値は発酵槽にて得られたNucレベルよりも低かったが、SP310の相対効率はSPUSPと比べて同桁、すなわち58%以上であった(それぞれ106対182 mg/L)。したがって、SP310突然変異体の最初のスクリーニングについては、GM17で一晩成長させた培養物の上清中でNuc分泌を測定することにした。
【００７１】
全体としては、発酵槽と比較して、GM17の一晩培養物ではNuc分泌全量で約20倍の減少が得られた。これは主にP170プロモーターの調節が異なることと、一様でない生理条件及び使用した媒体による。SP310については、GM17培養上清では5,67 mg/L、発酵槽では106 mg/Lが測定された。GM17培養物の結果を表3に要約する。
【００７２】
【表３】
0004271396.tif 000004
【００７３】
(ii) エル.ラクティスSP310シグナル配列の部位特異的突然変異誘発
最初のSP310 aa 配列の初期分析を、SignalPを用いて行った。有効な細菌SPは位置-3、-1及び+1にAlaを示す。SP310の配列は比較的まれなaaであるThrを位置-3に含む(Thr-3)。記載のように、Thr-3残基のAla-3との置換(310mut1株において)はNuc分泌を著しく増加させた(表 3)。SP310のC末端領域(図3)が普通よりも長く、通常はグラム陽性SPのこの領域には存在しない残基を多数(位置-10から -2; Ser-9, Ser-10, Asn-5, Gln-4, Gln-7, Asp-6及びThr-3)含むことは明らかであった。Thr-3及びAsn-2の欠失及びAsn-5のAla-3との置換は、したがって310mut2に組み込まれた。この突然変異体は位置-3、-1及び+1にAlaを保持する(図3)。310mut2におけるNuc分泌分析では、野生型SP310と比較して24％までの増加を示し、GM17で成長させた一晩培養物での310mut1で確認されたレベルについても増加を示した(表 3)。これらの結果から、C末端領域が短くなることとAla残基が開裂部位で維持されることによってエル.ラクティスでのNuc分泌が相当に向上することが確認された。
【００７４】
グラム陽性細菌からのSPのSignalPを用いた分析では、変化しやすい（turn favoring）aa (例えばGly又はPro)が疎水性核とC末端領域の間の位置にしばしば見つかることが予想された。SP310では、2個のSer残基(Ser-10及びSer-9)がこの領域に存在する。我々は、これら2個の残基とAsp-6を欠く突然変異体を構築した(310mut4)。これらの変更により、SP310と比較してNucレベルが相当に減少した(表 3)。これは、SP310のC末端領域にSer及び／又はAspが存在していることがエル.ラクティスにおける有効な分泌のための必要条件であることを示唆している。Ala残基を位置-3(310mut5の)に組み込むための310mut4での1回の置換は、分泌効率に影響を与えなかった(表 3)。これは、これら残基のきわめて重要な役割を顕著に示している。しかしながら、Asn-2、Gln-4をこれらの位置でより頻繁に見つかるaa (Gln-2及びThr-4)に置換することと、310mut3でGln-6をPro-6に置換することにより、SP310と比較して高レベルであるが、310mut2よりは低いレベルの分泌が生じた。Proもまた、2個の主要な細胞外エル.ラクティスタンパク質であるPrtP及びUsp45のSPのこの領域で発見され(下記表 4)、310mut3で得られた結果がこの aaの分泌における役割を支持している。興味深いことに、重複Serもまた、近年SPが同定された別のエル.ラクティス細胞外タンパク質であるExp2のこの領域に存在する(Poquetら、1998)。
【００７５】
【表４】
0004271396.tif 000005
【００７６】
Gln-7(310mut7株)又はAsp-6(310mut8株)のいずれかを除去することによってC末端領域を短くすることを意図した付加的変化の分析では、分泌が著しく減少した(表 3)。長さの変化又はC末端領域での電荷変化が分泌効率減少に係わっているのかどうかはいまだ不明である。
成熟タンパク質のN末端残基もまた、分泌機構による効果的なプロセッシングにおいて重要である可能性がある。エル.ラクティスのUsp45及びExp2において、Asp及びThrがプロセッシングされたタンパク質の最初の2個のaaである(表 4)。したがって、SP中に310mut2の配列を保存しつつ、この2個のaaを位置+1及び+2に含む突然変異体を調べた。記載のように、この突然変異体310mut6は310mut2と比較してやや少ない量のNucを分泌したが、得られたレベルはSP310よりも高かった(表 3)。
【００７７】
エル.ラクティスでの分泌における疎水性核の役割を調べるために一連の突然変異体を構築し、特性付けを行った。大腸菌では、疎水性核は分泌において不可欠な役割を果たすとみられ、この領域で疎水性を増加させてN末端又はプロセッシング領域のいずれかでの欠損を補償する(REF)。したがって、Ala-20のみの置換(310mut10で)、又はそれとSer-15 (310mut11株)のPheとの置換との組み合わせを分析した。記載のように、分泌効率の減少と導入されたPhの数との間に相関性が確認された。310mut11株におけるNuc分泌は310mut2中よりもきわめて低く、SP310よりもやや低かった(表 3)。
【００７８】
大腸菌では、疎水性領域でのLeuの存在もまた、分泌を向上させるものであると証明されている。したがって、SP310に存在するLeu-19に加え、3、6又は14個のLeu残基を含む一連の突然変異体を構築した。310mutA、310mutB及び310mutCにおいて、C末端領域で野生型配列を維持しつつ、Leuを疎水性領域の異なる位置に導入した(表 3)。310mutAではかなりの効率減少(SP310と比較して46%)が見られ、さらに低い収量が310mutB(41%)及び310mutC(35%)で得られた。これは、Leu量が増加していくと分泌レベルが徐々に減少することを示している。Alaが位置-3 (310mut1のC末端領域に対応)に組み込まれた改変310mutA及び310mutBを調査した。これらの突然変異体のうちのひとつ310mutA1では、分泌レベルはやや高く(SP310と比較して63%)、プロセッシング領域で保護されたAla位置が、エル.ラクティスの疎水性核中の適度に過剰なLeuの存在を部分的に相殺することを示している。しかしながら、6個のLeuが存在するとき(310mutB1株)、得られた収量は310mutBとほぼ同等であり、Ala-3の存在によって疎水性核中の高いLeu含有量を相殺することができないことを示している(表 3)。
【００７９】
分泌におけるN末端領域の影響を調べるために、一連の突然変異体を構築した。ここでは、310mut2(又は310mut7)のC末端領域を使用し、Phe又はAsnをN末端領域から除去して全体のプラス電荷を増加させた。310mutD2では、Phe-33の除去によって、SP310より高く、310mut2より低い分泌レベルが生じた(表 3)。310mut7のC末端領域を使用すると、さらに低い収量が得られた。これはより短いか又はより極性のN末端領域を有するSPにおいてGln-7の欠落が減衰することをさらに証拠づける。Asn-32の除去(310mutE2株)により、310mut2と同等の最大分泌レベルが生じ(表 3)、効率に対するこの残基の最小の役割を示唆している。310mut11の疎水性及びC末端領域が310mutE11株の310mutD2のN末端領域と結合したときには大幅な減少が見られ、分泌中の全体の行動における疎水性核の主要な役割が強く確認された(表 3)。310mutF2株では、Asn-32をLysに置換することによってN末端領域を変更し、正味のプラス荷電を増加させた。この変更は分析したすべての突然変異体において最も低いNuc分泌レベルを生じた(表 3)。したがって、SP310のN末端領域の正味の電荷はエル.ラクティスにおける効果的な分泌について可能な最大量を表す。
【００８０】
(ii) SP310及び選択された突然変異体を用いたNucのプロセッシング及び分泌
AMJ627、PRA159及び突然変異体PRA164、310mutB及び310mutBの一晩培養物からの上清をSDS-PAGEで分析した。AMJ627では、主要な45 kDaのUsp45タンパク質に加えて、プロセッシングしたNucタンパク質に相当する大きさの強いバンドが確認された(図4、レーン1)。PRA159については、遺伝子融合は全長SP310及びプロセッシングされたタンパク質のN末端に対応する25個のコドンを含む(実施例1)。25 aaのN末端延長部分を有する全長Nucについて予想された大きさである主要な19 kDのバンドが確認された。この調製物でのマイナーバンドは、次の融合タンパク質の全長Nucへのプロセッシングに対応しているかもしれない(16 kDaのバンドが検出された；図4、レーン2)。PRA164株では、2個の主要なNucバンドの存在が、SignalPを用いた配列分析によって示唆される別のプロセッシング部位を支持している(図3)。1個のNucバンドがPRA164、310mutB及び310mut6において検出され、1個のプロセッシング部位が3個の突然変異体において使用されることを示している。Nucの相対量は、これらの株において測定された活性レベルと一致した(表 3)。
【００８１】
(iii)発酵槽中のNuc分泌分析
上記のように、エル.ラクティスのP170依存発現系を用いた製造レベルは、発酵槽中で合成培地で制御成長させている間は、濃GM17培地で成長させた一晩培養物で得られたレベルと比較して、少なくとも20倍は高い。したがって、野生型SP310及び最大分泌効率(310mut2)、中程度の分泌効率(310mut6)又は低い分泌効率(310mutB)を示す3個の突然変異体を、AMJ627(SPUSP)と比較して使用した。記載のように、310mut2は150 mg/L以上のNucを生じ、SP310に対して45％の向上を示した(下記表 5)。310mut6については、得られた値は好ましい結果であった(SP310に対して25％向上)。310mutBはSP310を用いて分泌された量の50％を生じ、GM17での最初のスクリーニングの結果と類似していた。興味深いことに、発酵槽での310mut2の収量はSPUSPに匹敵するものであり、後者によって分泌されたNuc量の85％に達していた。
【００８２】
【表５】
0004271396.tif 000006
【００８３】
参考文献
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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