(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２に記載の塩基配列を有する請求項２記載のｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号３に記載の塩基配列を有する請求項２記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかの項に記載のｃＤＮＡを含有する複製または発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換された細胞を培養し、培養物から当該蛋白質を採取することからなる請求項１の蛋白質の製造方法。
【請求項８】
請求項１記載の蛋白質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体およびその用途に関する。さらに詳しく言えば、（１）ヒトＬＰＡ受容体、（２）ヒトＬＰＡ受容体蛋白質を用いるヒトＬＰＡ酸様物質、ヒトＬＰＡ拮抗物質、ヒトＬＰＡ受容体に反応するＬＰＡ以外のリン脂質に対する拮抗物質または作動物質のスクリーニング方法、（３）ヒトＬＰＡ受容体を含有するＬＰＡ阻害剤またはヒトＬＰＡ以外のリン脂質に対する阻害剤、（４）ヒトＬＰＡ受容体の製造方法、（５）ヒトＬＰＡ受容体のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、（６）ヒトＬＰＡ受容体をコードするｃＤＮＡ、（７）前記ｃＤＮＡからなる複製または発現ベクター、および（８）前記複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
背景技術
ＬＰＡ受容体はＬＰＡと結合し、細胞内にシグナルを伝え、細胞増殖、血管細胞の脱分化、細胞の増殖抑制など、様々な生理現象を引き起こすことが知られている。従ってヒトＬＰＡ受容体を得ることができればそれ自体を利用して、血管スパズムなどの医薬品、診断薬として応用が期待できるばかりでなく、新しいタイプのＬＰＡ受容体拮抗剤などの医薬品のスクリーニングや評価など幅広く医薬品の開発に利用できることが予想される。ＬＰＡ受容体は複数存在することが知られているが、ある種のＬＰＡ受容体についてはヒト型は未だ単離されておらず、その作用および構造は明確になっていない。
細胞は増殖因子、ホルモン、神経伝達物質などの生理活性物質を受容体を介して認識し、様々に応答する。細胞膜上に存在するＬＰＡ受容体はＬＰＡと結合し、同受容体に共役したＧ蛋白質を介して細胞内にシグナルを伝える。ＬＰＡ受容体に共役し得るＧ蛋白質としてはＧｉ，Ｇｑなどが知られており、同受容体は細胞増殖亢進作用、また逆の増殖抑制作用などの応答に関与するとされる。さらに、Ｇ蛋白質の下流にはＭＡＰ−キナーゼ系が連動しており、ＬＰＡ受容体は多彩なシグナルを伝達することが分かってきた。
ＬＰＡをリガンドとする受容体は既にマウスやアフリカツメガエルから単離されている。例えば、ＴｉｇｙｉらはＬＰＡ受容体をアフリカツメガエルの卵母細胞より最初に得ており、これはＰＳＰ２４型ＬＰＡ受容体と称されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１４３６７−１４３７２，１９９６）。また、マウスより別のタイプのＬＰＡ受容体がクローニングされており、これはｖｚｇ−１と称されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３５，１０７１−１０８３，１９９６）。
ヒト由来ＬＰＡ受容体についてはｖｚｇ−１のホモログであるＥｄｇ−２（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３１，６１９−６２２，１９９７）が報告されているが、ＰＳＰ２４型についてのヒトでの報告はない。
発明の概要
本発明者はアフリカツメガエルの卵母細胞に発現するＰＳＰ２４型ＬＰＡ受容体のヒトでのカウンターパートをクローン化することを目的として鋭意検討を重ねた結果、ヒト由来脳組織からＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体をコードするｃＤＮＡのクローン化および当該ＬＰＡ受容体の全アミノ酸配列の決定に成功した。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対してＢＬＡＳＴＮにより、またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＰにより検索した結果、ＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体をコードする核酸配列と一致する配列はなかった。また、疎水性プロットによる解析から、当該ＬＰＡ受容体のポリペプチドは７回膜貫通領域を持つことが予想された。このことから、当該ポリペプチドは、新規の膜蛋白質であることが判明した。
本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、そのホモログ、フラグメントまたはそのホモログのフラグメントからなる蛋白質、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列またはそのホモログからなるヒトリゾホスファチジン酸（ヒトＬＰＡ）受容体、
（３）前記１または２に記載の蛋白質を用いることを特徴とするヒトＬＰＡ酸様物質、ヒトＬＰＡ拮抗物質、ヒトＬＰＡ受容体に反応するＬＰＡ以外のリン脂質に対する拮抗物質または作動物質のスクリーニング方法、
（４）前記１または２に記載の蛋白質を有効成分として含有するヒトＬＰＡ酸阻害剤、またはヒトＬＰＡ以外のリン脂質に対する阻害剤、
（５）前記１または２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された細胞を培養し、培養物から当該蛋白質を採取することからなるヒトＬＰＡ受容体の製造方法、
（６）前記１または２に記載の蛋白質あるいはその蛋白質の部分配列からなるペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、
（７）前記１または２に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、
（８）配列番号２に記載の塩基配列を有する前記７記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、
（９）配列番号３に記載の塩基配列を有する前記７記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、
（１０）前記６から９のいずれかの項に記載のｃＤＮＡからなる複製または発現ベクター、および
（１１）前記１０記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
詳細な説明
本発明は、実質的に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメントおよびそのホモローグに関する。
本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２で示される塩基配列に関する。
ハイブリダイズするｃＤＮＡには、上記配列の相補配列も含まれる。
ハイブリダイズさせるための条件は、ストリンジェントであることが好ましい。
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される。
さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
配列番号２または３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。
配列番号２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。培養は、本発明のポリペプチドが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行なわれることが好ましい。
本発明のｃＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスｍＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスｍＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
本発明は、本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。
本発明には、本発明のポリペプチド、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１アミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号１中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
本発明のｃＤＮＡには、配列番号１で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
配列番号２で特定されるｃＤＮＡは、本発明のｃＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
配列番号３で示されるｃＤＮＡは、配列番号２で特定されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
配列番号２または３中に示される塩基配列を有するｃＤＮＡの作製は、例えば以下の方法に従って行なわれる。
ヒトＬＰＡ受容体のｃＤＮＡクローニング
一般的にはヒト成人脳組織、ヒト腎組織などからまた、種々のヒト細胞株などよりＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標、ＧＩＢＣＯＢＲＬより販売）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ・プュリィフィケーション・キット（ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（商品名、Ｐｈａｒｍａｃｉａより販売）などを用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製することができる。ガブラーらの方法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３，１９８３）または市販のｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを作製し、必要に応じて長塩基対のものを分別した後、プラスミドベクター（例えばＰＵＣ１９）やλファージベクター（例えば、λｇｔ１１）に導入することができる。
このようにして作製されたｃＤＮＡライブラリーから常法に準じて、標識プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどでスクリーニングし、ＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体の全部またはその一部を含むｃＤＮＡ断片を含むクローンを選別することができる。さらに必要に応じて当該ｃＤＮＡを他のベクターなどに再クローニングすることによりＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体ｃＤＮＡを単離することができる。またこれとは全く別の方法として、上記にてｃＤＮＡを作製し、アフリカツメガエルより単離されたｃＤＮＡ配列をもとにプライマーを作製し、ＰＣＲ法によりＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体ｃＤＮＡの部分長をクローニングし、さらにこれを利用して全長のクローニングを行なうことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製
ヒト成人脳組織よりＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標、ＧＩＢＣＯＢＲＬより販売）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、Ｐｈａｒｍａｃｉａより販売）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
このｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをもとにマラソン・ｃＤＮＡ・アンプリフィケーション（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より販売））によりｃＤＮＡ合成を行なった。
実施例２：ＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体の部分クローニング
アフリカツメガエルの卵母細胞より得られたＬＰＡ受容体（ＰＳＰ２４）の塩基配列の情報に基づいて、センス、アンチセンスそれぞれ１８個ずつのプライマーを作製し、このプライマー間でＰＣＲを行なった。そのうち、あるプライマーの組み合わせでヒトＰＳＰ２４型クローンの部分断片と思われるバンドが増幅された。このＰＣＲに用いたプライマーのセットを以下に示す。
アフリカツメガエルＰＳＰ２４プライマー＃１５：５’−ＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号４）、アフリカツメガエルＰＳＰ２４プライマー＃２１：５’−ＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号５）。
増幅されたｃＤＮＡをアガロース電気泳動で分画後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ｎｏｖａｇｅｎより販売）に連結し、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換してプラスミドを調製した。そして、このＤＮＡの全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対してＢＬＡＳＴＮにより、また決定した塩基配列を翻訳したアミノ酸配列をアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＰにより検索した結果、アフリカツメガエルＰＳＰ２４型ＬＰＡ受容体と相同性を示し、かつ決定したＤＮＡの核酸配列およびアミノ酸配列と一致する配列はなかった。このことからこのＰＣＲ産物は新規の遺伝子の部分長であることが判明した。
実施例３：ヒトＰＳＰ２４型ＬＰＡ受容体の全長クローニング
次にマラソンｃＤＮＡアンプリケーション（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より販売））を用いて全長クローニングを試みた。決定した部分長の塩基配列内に新たにプライマーを作製し（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３）、このプライマーと５’側あるいは３’側のアダプター配列特異的プライマー（ＡＰ１，ＡＰ２）間で５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）および３’−ＲＡＣＥを行なった。そのうち以下のプライマーの組み合わせでヒトＰＳＰ２４型ＬＰＡ受容体クローンの５’部分あるいは３’部分と思われるバンドが増幅された。このＰＣＲに用いたプライマーのセットを以下に示す。
0004280886.tif 000002
Ｒ１プライマー：
５’−ＧＣＣＣＡＴＧＴＣＡＡＴＧＣＴＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号６）、
Ｒ２プライマー：
５’−ＡＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＡＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号７）、
Ｒ３プライマー：
５’−ＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＴＡＴＡＣＣＴＴＣ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号８）、
Ｆ１プライマー：
５’−ＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＣＡ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号９）、
Ｆ２プライマー：
５’−ＣＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＣＴＣ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号１０）、
Ｆ３プライマー：
５’−ＡＣＣＡＡＴＣＣＡＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＣＴＴＡＴＧＴＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号１１）
ＡＰ１プライマー：
５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号１２）：
ＡＰ２プライマー：
５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’（２３ｍｅｒ）（配列番号１３）。
増幅されたｃＤＮＡを部分クローニングと同様の手法でサブクローニングし、全塩基配列を決定し、配列番号３に示す配列を得た。さらにオープンリーディングフレームを決定し、アミノ酸に翻訳して配列番号１に示す配列を得た。核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対してＢＬＡＳＴＮにより、またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＰにより検索した結果、本発明のポリペプチド、ＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体をコードする核酸配列と一致する配列はなかった。このことから、本発明のポリペプチドは新規の膜蛋白質であることが判明した。また同類の７回膜貫通領域を持つ膜蛋白質であるＰＡＦ受容体、ＬＴＢ４受容体などとのホモロジーもなかったことから、本クローンはアフリカツメガエルのＰＳＰ２４ＬＰＡ受容体のヒトでのカウンターパートである可能性が示唆された。
実施例４：全長ｃＤＮＡのクローニングおよび塩基配列の決定
全長ｃＤＮＡのクローニングは配列番号３に示す決定されたＰＳＰ２４型ヒトＬＰＡ受容体の塩基配列をもとにＫｏｚａｃ配列と全翻訳領域を含む様にプライマーを作製し、ＰＣＲ法によりクローニングした。用いたプライマーは次の２種である。
５’側プライマー：
５’−ＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号１４）、
３’側プライマー：
５’−ＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号１５）。
特異的に増幅されたｃＤＮＡを、部分クローニングと同様の手法でサブクローニングし、全塩基配列を決定し、配列番号１に示す配列を得た。さらにオープンリーディングフレームを決定し、全長を単離した。
実施例５：哺乳動物細胞でのタンパク発現
本発明受容体（ヒトＰＳＰ２４型ＬＰＡ受容体）をＣＨＯ細胞に、リポフェクション法を用いて導入し、安定形質発現細胞を取得した。受容体発現を最大にするために、該遺伝子をブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性マーカーを持つベクターに組込み、制限酵素切断により、直鎖状にした後、細胞に導入した。次にブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）（５μｇ／ｍｌ）存在下で培養し、耐性株を限外希釈法により２９個単離した。これらのクローンからＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲにより発現しているクローンのみを選択した。発現が確認されたクローンについて、該遺伝子の全長をプローブとして、ノザンハイブリダイゼーション（Ｎｏｔｈｅｒｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により、発現量の強弱を測定した（図１）。図の右横に示した数字は、サイズマーカーとして用いたリポゾーマルＲＮＡの大きさを示しており、１．９ｋｂ付近に該遺伝子の転写物と考えられるバンドが観察された。左端にコントロールとして親株のＣＨＯ細胞から調製した全ＲＮＡを泳動した。
【配列表】
0004280886.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明ヒトＬＰＡ受容体のＣＨＯ細胞での発現のノザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１】
0004280886.tif 000015