(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体を作成する方法であって、糖のケトン誘導体又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において、ＶκドメインとＣＨ１ドメインより構成されるグループから選択されるドメインに１つ又はそれ以上のＮ−グリコシル化部位を有する抗体をコードするベクターによりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップを含み、前記糖のケトン誘導体又は糖前駆体のケトン誘導体が、レブリノイル基を有する糖又はレブリノイル基を有する糖前駆体であり、前記グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体を前記細胞が産生する方法。
【請求項２】
前記抗体が１つ以上のグリコシル化部位を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が単鎖抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
結果的に生じる抗体を抗原結合抗体断片の中に断片化して入れ、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗原結合抗体断片を作成するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記断片がＦ（ａｂ'）２断片である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
レブリノイル基を有する糖又はレブリノイル基を有する生合成糖前駆体がＮ−レブリノイルマンノースアミン又はＮ−レブリノイルフコースである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグループから選択されたケトン反応基を含む薬剤と結果的に生じた抗体とを反応させるステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって製造される抗体。
【請求項９】
グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体を作成する方法であって、糖のケトン誘導体又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において、ＨＣＮ１、ＨＣＮ５及びＶκのうちいずれかのＮ−グリコシル化部位を有する抗体をコードするベクターによりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップを含み、前記糖のケトン誘導体又は糖前駆体のケトン誘導体が、レブリノイル基を有する糖又はレブリノイル基を有する糖前駆体であり、前記グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体を前記細胞が産生する方法。
【請求項１０】
結果的に生じる抗体を抗原結合抗体断片の中に断片化して入れ、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗原結合抗体断片を作成するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって製造される抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
1.  発明の技術分野
本発明は、特定部位に反応性ケトン基を有するように修飾されたグリコシル化抗体と抗体断片に関する。ケトン反応基を有するこれらの「景色化された（landscaped）」抗体と抗体断片は臨床上の適用に有用であり、また in vivoでの標的部位にその薬剤をデリバリーするのに使用されるリンカー、ペプチド、オリゴ糖あるいは他の薬剤と共役することができる。
【０００２】
2.  関連先行技術の記載
抗体免疫共役体は現代医療で広く使用されている。薬剤とキレート剤を含む様々な診断と治療のための化合物のモノクローナル抗体（mabs）に対する効果的な共役を可能にする化学的方法がよく報告されている。しかし、こうした方法の大半はチロシン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの一定のアミノ酸残基に無作為に付着することに依存している。腫瘍を有するマウスで有意な抗腫瘍活性を示したBR-96-DOX 16771 と LL2-シュードモナス菌体外毒素免疫共役体は、そうした残基で共役により構築された抗体免疫共役体の実施例である。しかし、これらの共役は極端な化学的な条件下で作成され（非生理学的なpH、温度、溶媒、他）、共役は部位-特異的ではないため、結果的に生じる免疫共役体は縮小ならびに異種抗原結合特性を示すことがある。
【０００３】
Rodwellら、Proc. Nat'l Acad. Sci., 83: 2632 (1986) は、放射性核種共役の都合のよい化学的処理として、CH2ドメイン (Asn297) においてAsnにリンクされている炭水化物 (CHO) を使用するモノクローナル抗体 (mAbs) の部位特異的共有結合修飾を報告している。この方法により形成された131I共役体では、マウスにおけるin vivoでの標的効率の改善がみられた異種結合特性が示されている。中間キャリアとして可溶性アミノ-デキストランを使用して、メソトレキセート（MTX）、フルオロウリジンあるいはドキソルビシン（DOX）などの治療薬剤はCH2付加炭水化物の一部分で共役された。これについては、例えば、米国特許第4,699,784号を参照されたい。だが、Asn297関連CHOは2つの隣接CH2ドメイン間に形成される内腔に位置しているため、立体障害がこの部位での共役の効率を妨害することが予想される。さらに、臨床上の使用に多くの場合好適であるF(ab')2、Fab'、Fabなどの抗体断片は、Fc部分と関連炭水化物の一部分を欠く。したがって、これらの種はこの方法では共役することができない。
【０００４】
本明細書の記載の一部としてその全体を引用するHansenらの米国特許第5,443,953号とLeungらの米国特許仮出願第60/013,709号は、抗体のVkとCH1（HCN1及びHCN5部位）ドメインにおける複数のグリコシル化部位の導入を述べている。これらのすべての部位におけるキレートの付着は、結果的に生じる抗体の免疫反応性に影響を及ぼすことはなく、これについては、Leungら、J.Immunol. 154：5919(1995)を参照すると分かるが、これらの炭水化物を薬剤又はキレート剤に対する理想的な部位特異的な共役部位に仕立てられる。しかし、これらの炭水化物において共役するためには、反応性アルデヒド基を生成するよう、リボース環を化学的に酸化させなければならない。このように形成されたアルデヒド基はシッフ塩基によりキレート剤又は薬剤のアミノ基に共有的に結合することができる。各炭素に付着しているヒドロキシル基を伴うC-C結合のみが、2つのアルデヒド基を形成するように過ヨウ素酸酸化することができるため、最大限度数のこれらの反応性部位がオリゴ糖の構造とリンケージによって書き取られる。
【０００５】
例えば、2つの抗体、hLL2HCN1とhLL2HCN5由来のCH1付加炭水化物の組成と配列は蛍光団援用炭水化物電気泳動法（FACE）16411により測定されてきた。これについては、Quら、Glycobiol. 7(6)：803-09(1997)を参照されたい。hLL2HCN1-炭水化物の構造的なプロフィールからは、オリゴ糖鎖における約2〜4の六炭糖環が過ヨウ素酸酸化に有用であることが明らかにされた。したがって、平均で8〜16のアルデヒド基最大のものを、各hLL2HCN1 F(ab')2断片の炭水化物側鎖から生成することができる。HCN1の平均サイズよりも大きい3〜4単糖残基であるhLL2HCN5炭水化物の平均サイズに関しては、hLL2HCN5の最大限度達成可能なアルデヒド基の数はさらに大きくなることが予想される。温和な化学的な条件下では、DTPAの1.6と3分子のみが、おそらくこれら条件下での六炭糖環の不十分な酸化のために、それぞれhLL2HCN1とhLL2HCN5部位のF(ab')2に共役していた。さらに多くのアルデヒド基を生成するのにより厳しい条件を使用することができるが、そうした条件下では抗体の三次元構造が変わり、また抗体の免疫反応性が損なわれることがある。
【０００６】
Brumeanuら、J.Immuno.Meth. 183：185-97(1995)は、ガラクトースオキシダーゼ（GAO）により脱シアル酸化免疫グロブリン(Igs)の末端ガラクトース(Gal)残基を酸化することによりC-6アルデヒドが生成された、その酵素的手順によって、炭水化物の一部分にペプチドを結合させることを報告している。ペプチドの付着はその後、温和な還元でシッフ塩基の同時安定化により達成される。この共役は生理学的な条件下で起こり、また、ガラクトース等価の推定数と一致するIg当たりで結合するペプチドの平均数に関して特異的であり、また効率的である。しかし、この方法は非常に数多くの時間を消費するステップを必要とし、また、事前標的化に関しては、in vivoでの共役に採用することはできない。
【０００７】
したがって、癌や感染症の診断ならびに治療などの臨床上の適用に有用な免疫共役体を形成するため、特異的な部位で共役することができる抗体と抗体断片にが要望されていた。共役が特定部位で起こり、また、抗体又は抗体断片の特異的結合を干渉しない抗体及び抗体断片作成法が要望されていた。
【０００８】
発明の要約
したがって、本発明の目的の1つは、免疫反応性免疫共役体を産生するために、特異的な部位で容易に共役することができる抗体と抗体断片を提供することであり、抗体と抗体断片を含む免疫共役体を提供することである。
【０００９】
本発明の目的の1つはまた、特異的な部位で共役が起こり、また抗体又は抗体断片の特異的結合を干渉しない抗体及び抗体断片を作成する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の目的の1つはまた、免疫反応性免疫共役体を産生するために、特異的な部位で、容易に共役することができる抗体又は抗体断片を使用して、あるいはこうした抗体又は抗体断片を含む免疫共役体を使用して、in vivoでの標的部位に活性のある薬剤を向ける方法を提供することである。
【００１１】
これらの、また他の目的を達成するにあたって、本発明の1つの形態は、糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において1つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体をコードするベクターによりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップを含む、また、抗体断片の場合は、結果的に生じる抗体を断片化して抗原結合抗体断片の中に入れるステップを含む、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を作成する方法を提供する。
【００１２】
もう1つの実施形態により、本発明は、糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地の中で1つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体を含むベクターによりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップと、結果的に生じる抗体を断片化して抗原結合抗体断片の中に入れるステップと、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグループから選択されたケトン反応基を含む薬剤と抗体とを反応させるステップとを含む、グリコシル化部位により薬剤に共役するグリコシル化抗体を含む免疫共役体を作成する方法を提供する。
【００１３】
もう1つの実施形態では、本発明は、糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において、1つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体を含むベクターによりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップと、結果的に生じる抗体を抗原結合抗体断片の中に断片化して入れるステップと、またヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグループから選択されたケトン反応基を含む薬剤と抗体断片とを反応させるステップとを含む、グリコシル化部位により薬剤に共役するグリコシル化抗原結合抗体断片を含む免疫共役体を作成する方法を提供する。
【００１４】
他の実施形態により、本発明は、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片と、グリコシル化部位により薬剤に共役するグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を含む免疫共役体を提供する。
【００１５】
他の実施形態により、本発明は、in vivoでの標的部位を標的として活性のある薬剤を向ける方法を提供する。1つの実施形態により、本方法はグリコシル化部位により活性のある薬剤に共役されるグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を含む免疫共役体を投与するステップを含む。もう1つの実施形態により、本方法はグリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を投与するステップと、抗体又は抗体断片が標的部位に局在することを可能にするステップとを含む。任意には、非局在抗体又は抗体断片を血液循環から取り除く除去薬剤を投与するステップを含む。また、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグループから選択されるケトン反応基を含む活性のある薬剤を投与するステップを含み、それによって活性のある薬剤は事前標的化されている抗体又は抗体断片による共役を介して標的部位に局在する。
【００１６】
本発明のこれらの、また他の目的と形態は、本出願書に含められている教示内容に鑑み、当業者には明らかであろう。
【００１７】
発明の好適な実施の形態の詳細な説明
本発明は、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するように景色化されるグリコシル化抗体と抗体断片を提供する。「反応性ケトン基」が意味しているものは、生理学的条件下でヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラキシルアミノ、チオセミカルバジド基と反応するケトン基である。こうした反応性ケトン基は自然発生するタンパク質と糖タンパク質には存在せず、また臨床上の適用に有用である、リンカー、ペプチド、オリゴ糖や他の薬剤などのケトン反応性を有する一部分を含む薬剤取り付けのための効率的な分子ハンドルとして役に立てることができる。
【００１８】
本発明はまた、共役がグリコシル化部位で起こり、また抗体又は抗体断片の特異的結合を干渉しない、抗体又は抗体断片免疫共役体を作成する、簡単で、効率的な方法を提供する。景色化された抗体と抗体断片と免疫共役体を使用するin vivoでの方法もまた提供される。
【００１９】
Mahalら、Science 276：1125（1997）は、オリゴ糖生合成経路はL-レブリノイルマンノースアミン（ManLev）由来の代謝シアル酸基により細胞表面関連末端シアル酸残基を置換するのに使用することができ、その結果、反応性ケトン残基により充填された細胞表面形成を生じることを報告している。Mahalらは、分子ハンドルとしてこれら細胞表面ケトンを使用し、アシルヒドラゾンの形成により生理学的条件下でビオチンアミドカプロイルヒドラジドにそれらを化学選択的に結合した。ビオチン結合細胞は、リチンA鎖アビジン共役が加えられて、殺傷された。
【００２０】
Mahalらは、形質転換された細胞がシアル酸と、もう1つの糖であるフコースの両方を多く含む抗原基を過剰発現するので、またいくつかの腫瘍部位がヒドラジド-ケトン相互作用をさらに可能にするpH（pH 5）を有するので、腫瘍細胞のin vivoでの修飾は、その後に、ヒドラジド又は同様の反応基にリンクされる細胞毒性の薬剤の投与により補われるが、癌や他の疾病を治療するための新しい治療適用の様式になることも考えられる。しかし、Mahalらはこの方法が有しているかもしれない、ケトンにより景色化された臓器に対して有害効果の可能性については書いていないし、また、血液循環におけるケトン反応性細胞毒性薬剤と自然発生ケトンとアルデヒドの一部分の間で起こうる反応効果についても書いていない。
【００２１】
本発明者は、オリゴ糖生合成経路が抗体のN-グリコシル化部位に反応性ケトン基を導入するのに使用することができ、また、景色化された、こうしたケトン含有抗体（又はこれら抗体の抗原結合断片）は、in vitro又はin vivoのいずれでも、免疫反応性免疫共役体を形成するためにケトン反応性薬剤と反応することができることを発見した。
【００２２】
本発明の景色化抗体と抗体断片は以下の一般的な手順により作成される。N-結合されたグリコシル化部位は遺伝子工学的な処理により抗体の一定の位置に導入される。トランスフェクションされた抗体を発現させる安定したクローンは、糖のケトン誘導体（N-レブリノイルフコースなど）又は糖前駆体（N-レブリノイルマンノースアミン（ManLev）など）で補足された培養培地において増殖され、N-グリコシル化部位にある反応性ケトン基を含む抗体に結果的になる。ManLevの場合、生合成経路は、グリコシル化部位で抗体の中に組み込まれるレブリノイルシアル酸にManLevを変換する。N-レブリノイルフコースの場合、N-レブリノイルフコース自体がグリコシル化部位で抗体の中に組み込まれる。
【００２３】
景色化F(ab)、F(ab')、F(ab')2断片を含めた景色化抗原結合抗体断片は、公知の手順により抗原結合抗体断片の中に景色化抗体を断片化して入れることによって、作成される。
【００２４】
本発明により、単鎖抗体もまた、例えば、Vκ領域に存在するグリコシル化部位を使用して、景色化することができる。以下に続く議論では、単鎖抗体が抗体の代わりに使用できることが理解されて然るべきである。
【００２５】
すべての抗体が糖タンパク質であるが、抗体の炭水化物の大半は、CH2ドメインの中のAsn297でN-結合されている。ヒト、マウスにおける、またハイブリドーマ由来のFc-関連炭水化物の高いパーセンテージは不完全に処理されており、構造タイプ（複合-又は高いマンノース-タイプ）、外部分岐でのSia、Gal及び/又はGlcNAc残基の分量、コアフコシル化において様々である。Fc-関連炭水化物の12〜15％のみがシアル酸化される。自然発生Fc-関連炭水化物により抗体を景色化することは、したがって、実際的ではない。
【００２６】
その代わりに、1つ又はそれ以上のN-グリコシル化部位を有するように遺伝子工学的に処理された抗体は、本発明による景色化に関しては好適である。こうした抗体は公知の手順により作成することができる。その内容が全体として本明細書の記載の一部として引用される米国仮出願第60/013,709号は、適当な複数のグリコシル化抗体を記述している。抗体のVκドメインにおける位置18〜20（Vκ-N）と、抗体のCH1ドメインにおける位置162〜164（HCN1）で導入されたN-結合グリコシル化部位は、1つの部位が1つの抗体に導入される場合に、効率的にグリコシル化されることが示された。同様の効率的なグリコシル化が、これらの部位の1つ以上を含むように遺伝子工学的に処理された抗体から考えられる。したがって、これらの部位の1つ又はそれ以上を含むように遺伝子工学的に処理された抗体は、本発明において有用である。
【００２７】
抗体hLL2HCN1とhLL2HCN5は、N-グリコシル化部位を含むように遺伝子工学的に処理された抗体の実施例である。これについては、その内容が全体として本出願に記載されている同時係属米国出願第08/690,102号を参照されたい。これらの抗体の遺伝子工学的に処理された炭水化物は、CH1ドメインの表面上に位置し、相対的に均質であり、すべてがコア-フコシル化され、複合タイプであり、強くシアル酸化されている。hLL2をコードするVHとVκ領域が、関心の対象である他の抗体のそうした領域により置換される抗体もまた、本発明により有用となる。この置換は、例えば、簡単な切り取りとペースト手順により成し遂げることができ、連続的に酵素対Xhol/HindIIIとXbal/BamHlをそれぞれ使用することができる。Vκ-N部位を含むVκ領域は、同様のアプローチを使用して挿入することができる。これについてはまた、以下に述べられている実施例を参照されたい。
【００２８】
上述された3つのグリコシル化部位の1つ、あるいはVκ-N/HCN1と Vκ-N/HCN5あるいはHCN1/HCN5の組み合わせた部位の2つ、あるいはすべての3つの部位を伴う、遺伝子工学的に処理された抗体などの異なるグリコシル化変異体を含む抗体は遺伝子工学的に処理することができる。それらはF(ab')2、Fab'又はFab断片において使用することができるので、これらの部位には利点がある。IgGを使用する場合は、CH2付加炭水化物が4番目に可能性のある部位として景色化のために役に立たせることができる。当業者には公知の手順により、付加的なグリコシル化部位が同定され、またVκ、VH、CH1、CH2、CH3、Cκドメインで遺伝子工学的に処理することができる。
【００２９】
糖又は糖前駆体のケトン誘導体の存在下で抗体産生細胞を増殖することにより、生合成過程によるN-グリコシル化部位に反応性ケトン基が効率的に導入される。糖及び糖前駆体のケトン誘導体は、グリコシル化抗体にケトン基を導入するために、単独で、又は組み合わせて使用することができる。任意には、クローンによる抗体産生レベルは培養培地にメソトレキセートを加えることによって増加させることができる。
【００３０】
細胞培養培地において糖又は糖前駆体のケトン誘導体の濃度は、抗体の中に導入されるケトン基の数を最適化するために制御することができる。回転瓶培養法、流加培養法又は連続還流バイオリアクターなどの抗体培養に関しては、培地が糖又は糖前駆体のケトン誘導体で補足されているかぎりは、いずれかの方法で増殖することができる。
【００３１】
これらの景色化抗体又は抗体断片を含む免疫共役体は、生理学的条件下でヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミノ又はチオセミカルバジド基などのケトン反応基を含む薬剤と、景色化抗体又は抗体断片を反応させることにより作成される。薬剤は、例えば、リンカー、キレート剤又は診断もしくは治療薬剤でありうる。いずれかのリンカー、キレート剤あるいは診断もしくは治療用薬剤は、それがケトン反応基を有しているかぎりは、使用することができる。景色化抗体又は抗体断片は1つの反応性ケトン基を含み、各ケトン基は薬剤に共役することができ、抗体又は抗体断片当たりの複数の薬剤の一部分を含む免疫共役体に結果的になる。
【００３２】
本発明により景色化抗体又は抗体断片に共役することができる薬剤の実施例には、リンカー、キレート剤、キレート化金属、ペプチド、オリゴ糖、ビオチンアミドカプロイルヒドラジド、診断用マーカー、薬剤（例えば、メソトレキセート、フルオロウリジン、ドキソルビシン）、毒素（リチンA鎖など）画像ラジオアイソトープ、治療用ラジオアイソトープが含まれる。
【００３３】
本発明により景色化抗体に共役することができるリガンド含有ペプチドの実施例には、DTPAを有するペプチド、DOTAを有するペプチド、アシルヒドラジドAc-KdDdKd（TscGC）DdKd-NH（CH2）4CH（NH2）CONH-NH2とAc-KdDdKd（TsdGC）DdKd-NH（CH2）4H（NH2）CONH-NH2、ヒドラジンH2N-NH-CH2-CO-Dd-Kd（TscGC）-Dd-Kd-NH2が含まれるが、そこではKdとDdはD-アミノ酸D-リシンとD-アスパラギン酸をそれぞれ表している。またTscGCがリガンドである場合は、すなわち、
【化５】
0004301730.tif 000002
また、TsdGCがリガンドである場合は、すなわち、
【化６】
0004301730.tif 000003
が含まれる。
【００３４】
DTPA-とDOTA-含有ペプチドは111Inと90Yによりキレート化するのに適している。だが、沸騰などの極端な条件がTc-99mとRe-188をキレート化する場合には必要となる。これについては、例えば、米国特許第5,175,343号、第5,120,526号、第5,242,679号を参照されたい。これらの極端な条件は共役抗体又は抗体断片を減成させるであろう。対照的に、アシルヒドラジドとヒドラジンペプチドの場合は、Tc-99mとRe-188をより容易にキレート化する。例えば、TscGCリガンドは室温で標識化することが示されている。これらのペプチドのリガンドは、診断用画像アイソトープTc99mにより、安定したTc(V)オキソ複合体を形成する。
【００３５】
これらペプチドのヒドラジンは景色化抗体と抗体断片に対してヒドラゾン連鎖をケトンにより形成するのに使用される。親水性アミノ酸は、抗体に対して遊離チオール含有ペプチドを共役する間にジスルフィド交換又は混合ジスルフィド形成が行われるように、そのペプチドを十分に親水性なものにする。驚くべきことに、ヒドラジンペプチドは、アシルヒドラジドペプチドよりもさらに安定した抗体共役を形成し、一方、アシルヒドラジドペプチド抗体共役は24時間後に標識化ペプチド喪失を示した。これについては、以下の実施例8で論議される。
【００３６】
ペプチドのDアミノ酸は、注射後金属複合ペプチドの代謝を最小化する。したがって、タンパク質が減成されることがあれば、親水性金属含有ペプチドは代謝されないことになる。さらに、そのペプチドが親水性であるため、細胞から逃れ出る標識化ペプチドは急速に腎臓から排出されることになる。
【００３７】
抗原エピトープはまた、景色化抗体又は抗体断片に共役することができる。例えば、-（CH2）n-リンカーを介してヒドラジド基に共有的にリンクされるα-Galエピトープを含有するオリゴ糖を使用することができる。こうしたエピトープと共役した腫瘍特異的抗体又は抗体断片は自然抗-Gal抗体を介する免疫応答を誘発する。これについては、その内容が全体として参考に値するとして本出願書に記載されている米国仮出願第60/037,908号を参照されたい。
【００３８】
景色抗体は回収され、少なくとも3つの異なる方法で共役させることができる。
【００３９】
1.  培養後、抗体は標準的なタンパク質A親和性カラム手順により精製される。ケトンで景色化された精製抗体はヒドラジド又はヒドラジン基などのケトン反応基を含む薬剤と混合させる。急速なヒドラジドケトン反応は、部位特異的方法でアシル-ヒドラゾンを介して遺伝子工学的に処理された炭水化物において共有的にリンクされる抗体共役を形成する結果となる。
【００４０】
2.  培養後、培地はケトン反応基を含む薬剤を過剰負荷される。過剰ヒドラジドはいずれかの組み込まれていない糖、景色化細胞糖タンパク質又は糖脂質を中和化し、景色化抗体と共役される。末端培養から生じる酸性環境は、例えば、ヒドラジドとケトンの間の反応を促進する（pH 7.3〜7.6でよりもpH 5での方が10倍早く起こる）。複合抗体はタンパク質Aカラムを使用して精製される。
【００４１】
3.  培養後、景色化抗体が洗浄されカラムから溶離される前に、その抗体はタンパク質Aに結合され、薬剤により直接反応を起こす。
【００４２】
以下の反応式は、ヒドラジド含有分子と、ケトン景色化抗体又は抗体断片との間の反応を図示している。
【化７】
0004301730.tif 000004
ここでは、Rはヒドラジド含有薬剤を表しており、またグリコシル化Abはグリコシル化抗体又は抗体断片を表している。
【００４３】
本発明の1つの実施形態により、ケトン反応基はアスパラギン酸のヒドラジド誘導体を含む。以下の反応式は、このタイプの薬剤と、ケトン景色化抗体又は抗体断片の間の反応を図示している。
【化８】
0004301730.tif 000005
Rはヒドラジド含有薬剤を表し、またグリコシル化Abはグリコシル化抗体又は抗体断片を表す。反応は、他のアシルヒドラジド-ケトン反応と同じ条件下で起こるであろう。例えば、約pH 5は利点があるが、しかし、反応はpHは約7.3〜7.6にまで上昇した値で進行するであろう。この反応は急速に反応し、また結果的に生じる共役は、シアノホウ酸ヒドリドナトリウム還元などの個別の安定化ステップを行わないで安定すると考えられる。
【００４４】
臨床上関心の対象となっている腫瘍、病原体、他の分子に特異的な抗体と抗体断片は、本発明により景色化し、またウイルス、細菌、寄生虫感染を含む癌又はその他の病理の診断及び治療などの臨床上の適用に使用することができる。景色化抗体は、ケトン反応基を含む診断又は治療用薬剤に直接共役し、又はケトン反応基を含むキレート剤により診断もしくは治療用薬剤に共役することができる。結果的に生じる免疫共役体は、癌又は他の病理学的状態の診断もしくは治療を成し遂げるために、標準的な免疫診断又は免疫治療手順により、in vivoに投与することができる。
【００４５】
代替的には、臨床上の関心の対象となっている腫瘍、病原体、その他の分子に特異的な景色化抗体又は抗体断片は、事前標的化方法に使用することができる。本発明による事前標的化方法の1つの実施例では、景色化抗体又は抗体断片が投与されて、腫瘍又は病変などの標的部位に局在することを可能にする。その後、ケトン反応基を含む診断又は治療用薬剤（あるいは、ケトン反応基を含むキレート化薬剤によってキレート化された診断又は治療用薬剤）が投与される。この薬剤は局在化した景色化抗体又は抗体断片と反応し、それによって標的部位に診断又は治療用薬剤をデリバリーする。ケトン反応薬剤はまた、ケトン基を含む循環分子と反応するが、Mahalらの方法にあったように、これら分子が細胞表面結合ではないため、いずれかのこうした反応は問題となる副作用を産生することは予想されない。
【００４６】
本発明のもう1つの事前標的化方法により、血液循環から非局在化抗体を除去するために、除去薬剤が景色化抗体が標的部位に局在化した後に（また診断又は治療薬剤が投与される前に）投与される。好都合なことに、抗イディオタイプ抗体などの除去薬剤は、景色化抗体に対して抗イディオタイプ的である。全体として参考に値するとしてその内容が本出願書に記載されている、米国出願第08/486,166号と第08/731,107号は、本発明による有用な、抗イディオタイプ的除去薬剤を記述している。
【００４７】
本発明の実施形態はさらに、詳細に本発明の実施の形態を示す以下の実施例により説明される。これらの実施例は本発明の具体的な形態を説明しており、その範囲を制限するものではない。
【００４８】
実施例1.ヒト化抗体における自然発生N-結合炭水化物の遺伝子工学的再処理
Vκ FRI領域の潜在的なAsn-結合グリコシル化部位はLL2と称せられる抗B細胞モノクローナル抗体において同定された。この部位はコンピュータモデリング研究によって予測されていたように、グリコシル化と付着CHOに対して使用されるべきものであることが確認され、抗原結合部位（ABS）からは離れて位置決めされた。このV-付加CHOへのキレート剤、DTPA、又はDTPA誘導体の共役は、結果生じる共役体の免疫反応性に対して何らかの悪影響を有することは観察されなかったが、一方、リシン残基に匹敵する数のキレート剤の無作為な共役は免疫反応性における実質的な減少という結果になった。これについては、以下にある表1を参照されたい。普遍的な共役部位として、とくにFcドメインの抗体断片欠失に対して役に立つこのV-付加CHOの能力は、LL2グリコシル化部位がhMN14のVドメインの対応する領域に移植されたときに示され、また遺伝子工学的に再処理されたmAbの中にあるその移植部位は、グリコシル化されていることを示した。この部位のグリコシル化も遺伝子工学的に再処理されたCHOへのキレート取付けもmAbの結果的に生じた免疫反応に影響を与えることは観察されなかった。研究された全CHO共役体は効率的に111Inと90Yにより標識化された。
【００４９】
【表１】
0004301730.tif 000006
【００５０】
実施例2.  hLL2のCH1ドメインにおけるN-結合CHOsの設計と遺伝子工学的処理
新規なCHOの一部分を遺伝子工学的に処理するために、グリコシル化受容体配列、Asn-X-Ser/Thrが部位特異的突然変異誘発によりhLL2のCκとCH1ドメインに導入された。トリペプチド配列がタンパク質におけるN-結合グリコシル化を指示するために必要であるが、効率的なグリコシル化は適切に位置決めされた受容体でのみ起こる。部位は次のように設計された。すなわち、効率的なグリコシル化に適当な位置を同定するために、（1）他の抗体の定常ドメインで自然な状態でみつかり、（2）コンピュータモデリングにより同定されていたように表面位置で、あるいは（3）CκとCH1ドメインに沿って「均等に」分散する、無作為に選択された部位である。合計で、5つのCH1部位（HCN1〜5）と5つのCκ部位（KCN1〜5）が設計され、また遺伝子工学的に処理された。
【００５１】
表2には、hLL2のCH1とCκドメインにおけるN-グリカン受容体の位置と配列を示す。部位を指示された突然変異誘発はトリペプチド受容体配列（太字）を生成するのに使用された。hLL2のCH1（H鎖）とCκ（L鎖）ドメインの部分的なペプチド配列が示され、また、遺伝子工学的に処理された潜在的なAsn-結合グリコシル化部位（HCN1〜HCN5とKVN1〜KCN5）の間の位置関係を示すために配列と構造相同性により並べられた。β-鎖配列（C〜F）は箱の中に押し込められている。残基はKabatのシステムにより番号が付けられた。すなわち、以前に不連続に番号付けられた重鎖残基はアステリスク（*）で示され、また残基は左から右に、156、162、171、182、203、205とそれぞれ番号が付けられた。
【００５２】
【表２】
0004301730.tif 000007
【００５３】
KCN5を除くすべてのケースで、最終的な三次構造で可能な摂動に関しては、1つの潜在的なグリコシル化部位になるように、ただ1つのアミノ酸置換のみを必要とする配列を注意深く選択することにより最小限度のものにされた。KCN5の場合は、配列Asn-Val-Ser（166〜168）を形成するように2つのアミノ酸残基が変えられた。これらの部位は、コンピュータモデリング分析により評価されているように、「埋め込まれている」、あるいは2つの並列したドメインの間のインターフェイスにあるようにはみえなかった。
【００５４】
これらの遺伝子工学的に処理された部位は効率的にグリコシル化されたかどうかを調べるために、抗体突然変異体は安定的にトランスフェクションされた細胞から精製され、また還元条件下でSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分析された。遺伝子工学的に処理された部位でのグリコシル化のために、遅めの速度で移動させた突然変異体抗体hLL2HCN1〜5の重鎖は、そのCH1ドメインには何らの潜在的なグリコシル化部位も含んではいない親抗体hLL2の重鎖と比較された。分子サイズに逆比例している、SDS-PAGEでのペプチドの相対移動速度から、異なる部位でのグリコシル化の程度がHCN5＞HCN1＞HCN3＞HCN2＞HCN4となっており、hLL2HCN5とhLL2HCN1が2つの最も高度にグリコシル化された抗体であることが推定された。対照的に、突然変異体hLL2KCN1〜5の軽鎖における移動遅延がないことから、これらCκ関連部位はグリコシル化されていなかったという結論につながった。
【００５５】
すべてのヒトIgGsはAsn297でCH2ドメインでは自然にグリコシル化されるので、SDS-PAGEでみられる突然変異体抗体とhLL2との間のサイズの差異は、培養条件における変化の結果として、遺伝子工学的に処理された部位でよりも、Asn297で示されたグリコシル化による差異であると考えられる可能があった。hLL2HCN1、hLL2HCN5、hLL2のF(ab')2断片がSDS-PAGE分析のために作成されたとき、抗体間のサイズの差異は、Fc部分の欠失であり、また付加されたオリゴ糖であるFd断片（VH-CH1）と実際に関連していたことが確かめられた。したがって、SDS-PAGEでみられた突然変異体抗体とhLL2の間のサイズの差異は、Asn297で示されたグリコシル化の差異のせいではなかった。
【００５６】
これらのCH1付加オリゴ糖のサイズを定量的に評価するために、hLL2、hLL2HCN1（Asn162でのグリコシル化部位；トリペプチド受容体NGS）とhLL2HCN5（Asn198でのグリコシル化部位；トリペプチド受容体NGT）が作成され、質量分析計による分析（Mass consortium社製、カリフォルニア州サンディエゴ市）にかけられた。hLL2、hLL2HCN1、hLL2HCN5のF(ab')2断片の質量分析計により測定された分子質量は、それぞれ99,471、102,884、104,345であった。CH2付加CHOを含むFc部分は除外されたので、非グリコシル化hLL2のF(ab')2断片とグリコシル化突然変異体との間の質量差は、遺伝子工学的に処理されたCH1負荷CHOsを表すはずである。したがって、HCN1-とHCN5-付加CHOsの分子サイズはそれぞれ、およそ3,400と4,900ダルトンであると算出された。平均単糖残基の分子量が240であるとして、我々は、HCN5-付加CHOには、HCN1部位に付着しているものよりも3つから4つさらに多くの単糖残基が含まれていたと推定した。これは遺伝子工学的に処理されたCHOsの詳細な構造分析により確認された。
【００５７】
実施例3.  HCN1とHCN5部位に関連するCHOsの構造決定
糖タンパク質から複合オリゴ糖を放出し、分離し、定量化し、配列決定することを含め、FACEを使用して、HCN1-とHCN5-付加CHOsの構造が決定された。N-結合オリゴ糖は、PNGアーゼF加水分解によりhLL2HCN1又はhLL2HCN5から放出され、精製され、またその後、遊離還元末端で蛍光団8-アミノナフタリン-1,3,6-三スルホン酸（ANTS）で標識化された。ANTSの1つの分子が、オリゴ糖の1つの分子に付着するため、異なるCHO種の相対量を高濃度ポリアクリルアミドゲルの中で分画後正確に測定することができる。これについては、Quら、Glycoviol. 7(6)：803-09(1997)を参照されたい。
【００５８】
オリゴ糖の異種集団がhLL2HCN1とhLL2HCN5のF(ab')2断片から放出された。HCN5オリゴ糖のプロフィールはHCN1のそれとは非常に異なる。例えば、N1-bは最も豊富な種であり、HCN1部位由来の全標識化オリゴ糖の55％を数えたが、構造的にはN1-bと同じであったN5-b1は標識化HCN5オリゴ糖の20％未満を数えるのみであった。
【００５９】
HCN1-とHCN5-付加CHOsの間の構造的な類似と差異を調べ、また比較するために、我々は個々のANTS-標識化された種を配列決定し、位相幾何学的構造を解明した。配列決定された全HCN1-とHCN5-CHO種は、コア-フコシル化され、複合タイプであり、すべての分岐が完全に伸長され、GalとGlcNAc残基を含んでいるのが発見された。これは、部位（HCN1とHCN5）は抗体上の曝露位置にあるはずであるという点では、我々が目標としているものに合致している。
【００６０】
HCN1とHCN5部位の両方がグリコシル化に効率的に利用される。HCN1上のCHOsは独占的に二分岐（100％）であり、HCN5上のCHOは大半が三分岐(60％)である。有意に、HCN1-とHCN2-CHOsの60と90％にものぼるものがそれぞれシアル酸化されたものであった。シアル酸化されたそれらのうち、Sia残基は二分岐かないしは三分岐構造かのいずれかのすべての外部分岐で同定することができる。したがって、これらの遺伝子工学的に処理されたCHOsは抗体景色化の豊富な潜在的部位を提供する。付加的には、すべてのHCN1-とHCN5-CHO種には五糖コアに付着したフコース残基が含まれるという事実から、遺伝子工学的に処理されたCHOsの中に生合成的にN-レブリノイルフコース（FucLev）を組み込むことにより、ケトンハンドルをIgGの表面上に部位特異的に導入することができることが示される。
【００６１】
実施例4.  複数のグリコシル化部位を運ぶ抗体の生成
Leungら、J.Immunol. 154：5919(1995)に説明されているPCR方法を使用して、Vκ-N（NVT）グリコシル化部位は、公知のDNA配列により、抗体のVκ-ドメインに導入される。Sculptor IVMシステム（Amersham社製、イリノイ州アーリントンハイツ市）を使用して、部位指示された突然変異誘発により単一CH1ドメインの中にHCN1（NSS）とHCN5(NGT)部位の両方を遺伝子工学的に処理して入れられる。手短に言うと、ヒトIgG1［CH1イントロン-ヒンジ-イントロン-CH2-イントロン-CH3］をコードするゲノムDNAのセグメントは、重鎖発現ベクターhLL2pdHLからスプライシングされた。これについては、Losmanら、Cancer Supp.(1997)印刷中を参照されたい。酵素対HindIII/Eaglを使用。2 kb断片はその後pBlueScript SKベクター（Strategene社製、カリフォルニア州ラジョラ市）の対応するクローニング部位の中に結合された。オリゴヌクレオチドHCN1（5'-GTG TCG TGG AAC TCA AGC GCT CTG ACC AGC GGC-3'）は、CH1ドメインにG164S（Kabatの番号付けにより番号が付けられた）置換を導入するのに使用される。成功した突然変異はDNA配列決定により確認される。鋳型としてCH1にHCN1突然変異を含む重鎖断片を使用して、第2の突然変異が、オリゴヌクレオチドHCN5（5'-G CCC TCC AGC AGC AAC GGT ACC CAG ACC TAC ATC TGC-3'）をL198N置換に使用して導入される。所定位置にHCN1とHCN5部位の両方が存在するかどうかはDNA配列決定により確認される。突然変異を起こしたヒトIgG1重鎖ゲノム配列を含むHindIII/EagI断片は、hLL2pdHL2の対応する位置に結合させて戻される。結果的に生じるベクターはhLL2pdHL2（HCN1/5）と称される。
【００６２】
実施例5.  景色化グリコシル化抗体
発現ベクターhLL2pdHL2(HCN1/5)は、標準的な手順を使用してSP2/0の中にトランスフェクションされる。これについては、例えば、Leungら、Int. J. Cancer 60：534 (1995) を参照されたい。トランスフェクションされた抗体を産生するクローンはELISA測定法によって同定される。これらのクローンによる抗体産生のレベルは培養培地でのメソトレキセートの増加濃度により増幅することによって促進される。これについては、Leungら、Tumor Target. 2：184（96）（1996）；Losmanら、Tumor Target. 2：155(41)(1996)を参照されたい。
【００６３】
高いレベルの抗体を発現する安定したクローンが、ManLevの約5mMにより補足された培養培地で増殖される。結果的には、生合成経路によりグリコシル化部位に反応性ケトン基を形成する。
【００６４】
実施例6．  キレート剤に対する景色化抗体の共役
グリコシル化突然変異体抗体であるhLL2HCN1とhLL2HCN5は、親抗体の結合親和性と比較して、ELISA測定法ではWNに対する同等の結合親和性を示した。CHO共役に対して特異的な温和な化学的条件下で、DTPAの平均1.6と2.97の分子がそれぞれ、hLL2HCN1とhLL2HCN5の各F(ab')2断片に組み込まれた。両方の共役は111In組込みに対して高い効率を示した（hLL2HCN1に対して92％、hLL2HCN5に対して91％）。グリコシル化突然変異体断片のDTPA共役前後で免疫反応性における有意な変化は観察されなかった。HCN5-付加CHOは、HCN5部位に組み込まれたDTPA分子のほぼ2倍であったHCN1付加CHOに比較した場合、キレート共役に関してはさらにアクセス可能であるようにみえた。これは、HCN5部位に付着したCHOsがHCN1部位のCHOsよりも大きかったという発見と一致する。
【００６５】
【表３】
0004301730.tif 000008
【００６６】
実施例7．大きな薬剤分子に対する景色化抗体の共役
景色化ケトン基により、大きな薬剤複合体であるDOX-デキストランの抗体への部位特異的付着効果もまた研究された。DOX-デキストラン複合体は、18 kDaアミノ-デキストラン高分子上に平均10 DOX分子を化学的に組込むことにより生成された。
【００６７】
抗体結合部位にその位置が物理的に近位であることで、除外又は修飾の結果、その免疫反応性を変えてしまう可能性がある大半のV領域関連CHOsとは対照的に、コンピュータモデリング研究では、マウスのLL2のVκドメインの自然発生CHOを抗体結合部位から遠位に位置決めしている。これは、そのVκ-付加CHOが適度に修飾され、DTPAなどの小さなキレートと共役されたときには、LL2の抗原結合親和性は強化されなかったという事実と一致する。しかし、DOX用のキャリアとしてアミノ-デキストランを使用してLL2 のF(ab')2当たりの 5.1 DOX分子の組込み率が細胞結合とELISA測定法により評価され、免疫反応性の60％に近い減少という結果になり、いわゆる遠位のCHOsであっても大きな薬剤複合体との共役のための抗体結合部位に近すぎることが明らかになった。
【００６８】
hLL2HCN1とhLL2HCN5の遺伝子工学的に処理されたCHOsは、抗体結合部位から離れているという利点を有しており、また重要なことだが、V領域からは分離している球状構造（CH1ドメイン）の中にある。したがって、これらCHOsは、大きな組成物に共役される場合には、抗体結合部位にはより少ししか干渉しておらず、またそのため、免疫反応性における減少が少ないことを示している。同じ条件下でhLL2HCN1のF(ab')2に対するDOX-デキストランの共役は、6.8のDOX-組込み率という結果を生じているが、これに結合親和性における比較的に少ない有害な効果（30%減少）を伴う。DOX分子の同様の数（7.1）がhLL2HCN5のF(ab')2に対して共役した場合、結果的には免疫複合体は95%の抗原結合親和性を保持していた。これらの結果は遺伝子工学的に処理されたCHOsと抗体結合部位の間の空間的な関係を示しており、またHCN1-CHOはCβ-鎖の中央セクションにつなぎ止められ、抗体結合部位に向かって傾いており、一方、HCN5-CHOはCH1ドメインを形成するβ-バレルの底部ループにある先端に位置しており、また抗体結合部位からは離れてある角度をもって方向付けられていることを示す、コンピュータモデルの結果と一致していた。
【００６９】
【表４】
0004301730.tif 000009
【００７０】
実施例8.  景色化抗体又は抗体断片を含む二価ペプチド
抗体又は抗体断片への連鎖のためのグリシルヒドラジンリンカーと、金属結合リガンド基を含む二価ペプチドであるIMP-155が設計された。ペプチドはまた、いくつかの親水性Dアミノ酸を含む。IMP-155といくつかの類似体は最新式Chemtech 348複数ペプチド合成装置上での標準Fmocをベースとしたペプチド合成により合成された。精製IMP-155の分子量はMH+808であることが質量分析計（ESMS）により測定されたが、これは算出されていた値と同じであった。
【００７１】
予備的な共役実験では、我々は、グリシルヒドラジンリンカーとアシルヒドラジドリンカーを共役と安定性について比較し、アシルヒドラジドは不安定であることが判明した。24時間室温でpH 7.3にて精製アシルヒドラジド共役を加温放置した後、付着したペプチドの約20〜40％が抗体から放出された。対照的に、グリシルヒドラジンリンカーは、同じ貯蔵条件下での分解がほとんどなかった（＜3％）を示した。したがって、グリシルヒドラジンはIMP-155の合成のためにリンカーとして選択された。
【００７２】
IMP-155の構造は、
H2N-NH-CH2-CO-Dd-Kd-(TscGC)-Dd-Kd-NH2であり、そこではKdとDdがそれぞれD-アミノ酸D-リシンとD-アスパラギン酸を表し、またTscGCは、
【化９】
0004301730.tif 000010
であり、
IMP-155は室温で2時間酢酸緩衝液生理食塩水の中でpH 5.3にて1：100ペプチド：抗体のモル比で精製景色化抗体又は抗体断片に共役される。複合抗体又は抗体断片は、非結合過剰ペプチドを除去するため、セファデックスG 50-80ゲルスピンカラムにより2度精製される。
【００７３】
実施例9.  活性のある薬剤に共役される景色化抗体に関する直接標的化
臨床上関心の対象になっている腫瘍、病原体あるいは他の部位（総称的に「標的部位」と称せられる）に特異的な景色化抗体又は抗体断片はケトン反応基を含む診断又は治療用薬剤などの活性のある薬剤にin vitroで共役される。結果的に生じる共役（共役体）は患者に注射され、抗体又は抗体断片によって特異的な結合を介して標的部位に局在する。
【００７４】
実施例10.  反応性ケトン基を運ぶ景色化抗体に関する事前標的化
標的部位に特異的な景色化抗体又は抗体断片は患者に直接注射される。抗体が標的部位に標的化された後、また任意には、非結合抗体が、ケトン反応基を含む除去薬剤により血液循環から除去された後、活性のある薬剤（例えば、診断又は治療用薬剤）が投与される。この活性のある薬剤は、標的-結合-景色化抗体と反応し、それによって活性のある薬剤を標的部位にデリバリーする。
【００７５】
本発明の方法と構成に対して、様々な修飾と変更を作成することができることは当業者には明らかであろう。したがって、それらの修飾と変更が請求項記載の発明と同等なものの範囲内で実施される場合には、本発明は本発明のその修正と変更を包含する。