(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト供与動物から非ヒト受容動物に器官を異種移植する方法であって、前記受容動物は供与動物組織に対して免疫寛容とされており、
ａ）  非ヒト受容動物から第１の細胞集団を集め、ここで前記第１の細胞集団はリンパ球始原細胞を含み、非ヒト代理動物からの組織に対して特異的に細胞毒性を有する細胞の少なくとも一部を前記第１の細胞集団から除去し；
ｂ）  前記第１の細胞集団を前記代理動物に投与し、前記代理動物は免疫欠失状態にあり；
ｃ）  前記代理動物において免疫反応性状態（immune competence）を発達させ；
ｄ）  前記免疫反応性代理動物から第２の細胞集団を集め、前記第２の細胞集団は免疫抑制成分を含み、前記免疫抑制成分は前記代理動物の組織に対する前記受容動物の免疫応答を特異的に抑制し；
ｅ）  前記第２の細胞集団を前記受容動物に注入し；
ｆ）  前記代理動物と免疫原的に同一の非ヒト供与動物から器官を切除し；そして
ｇ）  前記器官を前記異種移植非ヒト受容動物に移植する；
の各工程を含む方法。
【請求項２】
細胞集団が、サプレッサーＴ細胞、ヴィトー細胞、非ヒト調節Ｔ細胞、抗イディオタイプ抗体を産生する細胞、および抗イディオタイプ抗体からなる群より選択される免疫抑制成分を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記代理動物が前記供与動物と同一の個体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記代理動物および前記受容動物が異なる種からのものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記代理動物が前記供与動物と同一の個体である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記代理動物および前記供与動物が異なる動物個体である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記代理動物が、前記供与動物の両方の遺伝的親に由来するリンパ球をも含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記器官が細胞懸濁物であり、前記代理動物が前記遺伝的親の１より多い子孫に由来する細胞を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記代理動物が生まれたときに前記供与動物が成熟している、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記供与動物および前記代理動物が異なる個体であり、前記器官が細胞集団であり、そして前記細胞集団が、前記受容動物に移植する前に前記代理動物中で培養することにより拡大される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記器官が、膵島細胞および肝細胞からなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記器官が骨髄である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
受容動物による、供与動物から移植された器官の免疫拒絶を抑制するためのキットであって、代理動物から得た細胞集団を含む免疫抑制組成物を含み、前記代理動物は前記受容動物に由来するリンパ球を含むキメラ動物であり、前記細胞集団は前記供与動物に対する前記受容動物の免疫応答を特異的に抑制する免疫抑制成分を含み、前記免疫抑制組成物は前記受容動物に注入するのに適当なものであることを特徴とするキット。
【請求項１４】
前記免疫抑制組成物が、前記代理動物の免疫反応性細胞を実質的に含まない、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
受容動物に器官を移植するためのキットであって、前記受容動物とは異なる種から切除した身体器官、および前記切除された器官を前記受容動物に移植するのに適当な状態に保存するのに十分な量の灌流溶液を含み、前記器官の複数のレジデント細胞は前記受容動物と同一の個体からの細胞であり、前記レジデント細胞は内皮細胞、単球、樹状細胞、およびリンパ球様細胞から選択され、前記身体器官は前記受容動物に移植するのに適当なものであることを特徴とするキット。
【請求項１６】
前記複数のレジデント細胞が前記受容動物の細胞と同系である、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
切除器官とは同系ではない受容動物に移植するための請求項１５記載の切除器官を製造する方法であって、
ａ）  前記受容動物からの細胞集団を非ヒト代理動物に投与し、前記代理動物は免疫欠失状態にあり、前記第１の細胞集団はリンパ球始原細胞を含み；
ｂ）  前記代理動物において免疫反応性状態を発達させ；
ｃ）  前記免疫反応性代理動物から器官を切除し、前記器官は前記受容動物に由来する少なくとも複数の細胞とともに集団化（ｐｏｐｕｌａｔｅｄ）されており；そして
ｄ）  前記切除器官が前記受容動物に移植するのに適当な条件において保存されるように前記器官を灌流溶液に入れる；
の各工程を含む方法。
【請求項１８】
前記代理動物に前記細胞集団を投与する前に、前記代理動物からの組織に特異的に細胞毒性を有する細胞の少なくとも一部が前記細胞集団から除去されている、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
切除器官とは同系ではない受容動物に移植するための切除器官を製造する方法であって、
ａ）  前記受容動物からの細胞集団を非ヒト代理動物に投与し、前記代理動物は免疫欠失状態にあり、前記細胞集団はリンパ球始原細胞を含み；
ｂ）  前記代理動物において免疫反応性状態を発達させ；
ｃ）  前記免疫反応性代理動物から器官を切除し、前記器官は前記受容動物に由来する少なくとも複数の細胞とともに集団化されており；そして
ｄ）  前記切除された器官が前記受容動物に移植するのに適当な条件において保存されるように前記器官を灌流溶液に入れる；
の各工程を含む方法。
【請求項２０】
前記代理動物に前記細胞集団を投与する前に、前記代理動物からの組織に特異的に細胞毒性を有する細胞の少なくとも一部が前記細胞集団から除去されている、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
受容動物の複数の兄弟または親に由来するリンパ球が、免疫欠失状態にある前記代理動物に前記細胞集団と実質的に同時に投与され、前記複数の兄弟または親が前記受容動物の複数の組織型を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記受容動物が重症の熱傷を有するヒトであり、前記代理動物が非ヒト哺乳動物であり、かつ前記器官が前記受容動物の熱傷領域に適用するための前記非ヒト哺乳動物からの皮膚の移植片であり、前記皮膚の少なくとも複数のレジデント細胞が前記患者と同一の種に由来する細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞集団が、前記受容動物に移植する前に前記代理動物中で培養することにより拡大されている、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記器官が膵島細胞および肝細胞からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
劇症肝炎を有する非ヒト患者の補充治療法であって、肝壊死が継続する間周期的に、前記患者に請求項２４記載の方法により製造された肝細胞を移植することを含む方法。
【請求項２６】
前記器官が骨髄である、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
受容動物非ヒトの、非ヒト哺乳動物の移植可能な器官に対する特異的免疫応答を抑制する方法であって、非ヒト哺乳動物の器官の移植の前に、非ヒト哺乳動物の器官に対する受容動物非ヒトの免疫応答を特異的に抑制する免疫抑制成分を含む細胞集団を受容動物非ヒトに投与することを含み、細胞集団は非ヒト代理哺乳動物から得たものであり、非ヒト代理哺乳動物は、非ヒト哺乳動物からの細胞に対する非ヒトの免疫応答を特異的に抑制する免疫抑制成分を含むキメラ動物であり、免疫抑制成分は以下の工程を含む方法によって受容動物非ヒトに由来するものであり：
（ａ）非ヒト受容哺乳動物から第１の細胞集団を集め、前記第１の細胞集団はリンパ球始原細胞を含むが、非ヒト代理哺乳動物からの組織に対して特異的に細胞毒性を有する細胞が減少しており；
（ｂ）前記第１の細胞集団を前記非ヒト代理哺乳動物に投与し、前記非ヒト代理哺乳動物は免疫欠失状態にあり；
（ｃ）前記非ヒト代理哺乳動物において免疫反応性状態（immune competence）を発達させ；および
（ｄ）前記免疫反応性非ヒト代理哺乳動物から第２の細胞集団を集め、前記第２の細胞集団は免疫抑制成分を含み、前記免疫抑制成分は前記代理哺乳動物の組織に対する前記受容哺乳動物の免疫応答を特異的に抑制し、
このことにより器官に対する受容動物非ヒトの免疫応答を減少させる、ことを含む方法。
【請求項２８】
細胞集団が、非ヒトサプレッサーＴ細胞、非ヒトヴィトー細胞、非ヒト調節Ｔ細胞、および抗イディオタイプ抗体を産生する非ヒト細胞からなる群より選択される免疫抑制成分を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
免疫抑制成分が、代理哺乳動物が免疫不全状態にあるときに代理動物に導入された受容動物非ヒトの造血細胞に由来する非ヒトリンパ球であり、代理哺乳動物が免疫反応性状態に達した後に代理哺乳動物から免疫抑制成分が集められる、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
非ヒト代理哺乳動物が、霊長類、偶蹄類または食肉類である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
非ヒト代理哺乳動物が霊長類またはブタである、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
非ヒト代理哺乳動物が齧歯類またはウサギであり、移植可能な器官が細胞懸濁物である、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
受容動物ヒトに移植するのに適当な、切除された非ヒト器官を製造する方法であって、
ａ）  前記受容動物から得られたヒト細胞集団を非ヒト供与哺乳動物に投与し、前記哺乳動物は免疫欠失状態にあり、ここで前記ヒト細胞集団はリンパ球始原細胞を含み；
ｂ）  非ヒト哺乳動物において免疫反応性状態を発達させ；
ｃ）  免疫反応性非ヒト哺乳動物から器官を切除し、器官はヒト細胞集団に由来する少なくとも複数の細胞とともに集団化されており；そして
ｄ）  切除された器官が受容動物ヒトに移植するのに適当な状態において保存されるように、器官を灌流溶液中に入れる；
の各工程を含む方法。
【請求項３４】
非ヒト哺乳動物が霊長類、偶蹄類または食肉類である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
非ヒト代理哺乳動物が霊長類またはブタである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
免疫欠失状態にある非ヒト哺乳動物が哺乳動物胎児である、請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明の分野は、臓器および組織の移植、更に詳しくは、代理動物における調節細胞の生産および受容者において移植臓器に対する免疫寛容性を生じることができる因子並びに引き続きの受容者に対する代理動物からの異種移植片の移植に関する。本発明は、更に、臓器移植受容者からの細胞と一緒に再集団化される（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅｄ）移植用臓器を代理動物中で生産し、抗原差異、したがって拒絶の危険を少なくする方法に関する。
関連技術の論評
正常な免疫系は、「自己」と異物とを特異的に区別することができ、異物として感染性物質がある。自己と異物を区別する能力は、提示された抗原を自己として、すなわち胎児の抗原として認識するように胎児の免疫系の発達をプログラム化する場合、胎児発生の際に自然に備わる。免疫寛容にはいくつかの機序が原因となっていて、抑制、負の選択およびアネルギーがある。抑制とは、自己抗原に対して反応性であるリンパ球の阻害を意味する。負の選択とは、自己抗原と反応することができる免疫クローンの発生の防止を意味する。アネルギーとは、自己を認識するが自己抗原に反応して増殖または機能することができない細胞を意味する。
サプレッサーおよび調節Ｔ細胞は、自己反応性リンパ系細胞の増殖を、通常、可溶性因子の分泌によって阻止する。自己反応性前駆Ｔ細胞による認識によって、自己反応性細胞は抑制される。抗体およびＴ細胞受容体のネットワークは、自己反応性抗体およびＴ細胞受容体の反応性成分に対して反応する能力を生じることができ、抗体およびＴ細胞受容体のネットワークは抗イディオタイプネットワークとしても知られる。ヴィトー細胞は、自己抗原を発現するＴ細胞である。
臓器移植に関係した主な問題は、免疫拒絶および許容しうる提供者の不足である。提供者が一卵性双生児でなければ、受容者の免疫系は移植片を異物とみなし、受容者免疫系は移植片を拒絶しようとする。免疫抑制は長期にわたって拒絶を延期しうるが、免疫抑制は受容者を感染および悪性疾患の危険にさらす。長期にわたる免疫抑制が要求されるにもかかわらず、大部分の臓器および組織移植は、命を救い且つ生活の質を向上させるのに成功している。成功した移植組織リストとしては、腎臓、心臓、肺、肝臓、角膜、膵臓、ランゲルハンス島、腸管、脳組織、肝臓、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、皮膚および骨がある。組織の組合わせも移植されており、例えば、心臓−肺移植、膵臓−腎臓移植および膵臓−腎臓−腸管移植がある。
上記臓器および組織移植の相対的成功のために、ヒト臓器提供者は著しく不足している。例えば、米国では毎年ほぼ９，５００例の腎臓移植が行なわれているが、毎年約４０，０００人の米国人が末期腎臓病を発症し、これら４０，０００人の米国人が臓器移植の恩恵を受けることができると考えられる。別の種からの移植として本明細書中で定義の異種移植は、移植可能な臓器および組織の不足を解消できると考えられるが、拒絶の危険は、同種の非同一提供者からの移植として本明細書中で定義の同種異系移植の場合よりも更に大きいと考えられる。
ヒト臓器提供者の深刻な不足のために、移植受容者は、時々、短期間の生命維持のための異種移植を受けており、短期異種移植をブリッジ移植とも称する。異種移植片のブリッジ移植を用いることにより、適当なヒト提供者を捜し出すまでに更に時間が与えられる。
新規の移植片に対する免疫寛容は、移植片受容者において骨髄移植を用いて誘導されてきた。患者の免疫系を高用量化学療法および／または全身照射によって破壊する。次に、自己の骨髄を、患者が移植片または対応する移植片抗原に暴露されるのと同時に患者に注入する。患者の免疫系が再構成されるにつれて、その免疫系は、患者自身の抗原と一緒に移植片抗原を自己として認識する。その方法は子供にも大人にも用いることができるが、該方法は免疫系が患者において再集団化され且つ再構成される間長期にわたって患者を免疫不全にさらす。したがって、患者は感染および悪性疾患の著しい危険にさらされる。積極的化学療法および／照射は、更に、多数の患者臓器および組織、例えば、肺、肝臓および腸管に対して毒性でありうる。
胎児および新生児期間は、患者に対する危険が少ない状態で新規の抗原に対して寛容を生じさせる好機の一つの窓口を与える。胎児または新生児、すなわち新産児が、別の種からの組織を含む外来抗原に暴露された場合、成熟後の胎児または新生児は、後になって特異的に寛容性であり且つ免疫抑制を伴うことなく外来抗原の元の源に由来する移植片を許容することができる。したがって、ヒト胎児は、可能な提供者からの抗原に暴露され且つ可能な提供者からの移植片を出生後に受容することができる。
提供者はヒトに限定されない、すなわち、他の種が上記方法で暴露されるヒト胎児のための提供者として役立ちうる。例えば、ある種の先天的心臓病および血液病は、心エコー検査法または羊水穿刺を用いて誕生前に診断することができる。左心室症候群のヒト胎児は、ある特定の提供者ヒヒからのヒヒ細胞の子宮内注入を受容することができる。誕生後、その乳児は上記方法を用いて該特定の提供者ヒヒから移植によって心臓を受容するであろう。移植された心臓を受容した乳児は、免疫抑制を必要としない。上記方法は基本的な免疫学の原理の的確な適用を示しているが、該方法は、誕生後、患者にとって好機の出生前または新生児期の窓が閉ざされたずっと後に認識されたまたは診断された病気に悩む大多数の患者の移植要求に取り組むことはできない。
移植片拒絶の抑制について種々の方法が研究されてきており、遺伝子治療；骨髄置換または他の方法によってヒト胎児に行なわれる移植；および各種薬剤による免疫抑制がある。他の研究は、新生児および出生後受容者における外来組織の導入による同種異系移植片および異種移植片の移植に対する免疫寛容の誘導に集中している。当該技術は、ヒトＴ細胞成長因子（ｈＴＣＧＦ）をインキュベートし且つ採取するために、非ヒト動物の最初の発達段階中に非ヒト動物中にヒト細胞を注入することを開示しており、更に、当該技術は、骨髄移植またはキメラを生じる胎児幹細胞による移植免疫寛容の誘導を開示している。この方法は全て、免疫寛容が移植臓器受容者中で誘導される。
スアイモト（Ｓｕａｉｍｏｔｏ）による米国特許第４，６２４，９１７号明細書は、ヒトＴ細胞成長因子（ｈＴＣＧＦ）を生産することができるヒト細胞を非ヒト温血動物中に注入することによってｈＴＣＧＦを製造する方法を開示しており、該動物は、好ましくは未成熟段階にある動物、すなわち、卵、胚、胎児または新生児若しくは乳児動物である。動物の発育は、注入されたヒト細胞を後にｈＴＣＧＦを採取するために発育させ且つ再生産させる。
ボイス（Ｂｏｙｓｅ）らによる米国特許第５，００４，６８１号明細書は、新生児または胎児血液から造血幹細胞および前駆細胞を得ることを示している。得られた細胞は、造血系または免疫再構成および遺伝子治療において後で用いるために凍結保存される。ツカモト（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ）らによる米国特許第５，０６１，６２０号明細書は、ほぼ均一の量でヒト造血幹細胞を単離する方法を示している。
日本アブストラクト第１２６５１９号は、実際のまたは人工的子宮環境、正常細胞インキュベーターまたは細胞増殖プロモーターを用いる老人または病人の同様の遺伝子および細胞質を有する幼若細胞の培養を示している。培養された幼若細胞を、老人または病人の体の一部分に後で用いる。日本アブストラクト第６３−１７０３２２号は、後に移植して発育した細胞にするための単一起原細胞の培養を示している。日本アブストラクト第１−１３２５２８号は、ヒト免疫グロブリンＧ１タンパク質を移植前の受容者に注射することによるＩｇＧ１の免疫抑制性の使用を開示している。日本アブストラクト第６３−３９８２０号は、老齢の受容者への幼若細胞の移植の際の免疫抑制剤の使用を示している。
Ｈ．オーキンクロス・ジュニア（Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｊｒ．）、「異種移植。総説（Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，４６巻，１９８８年７月１日，１〜２０頁は、異種間移植に行なわれた方法を論及している。特に、オーキンクロスは、一生の内の新生児または胚段階において受容者に提供者抗原を導入することによる受容者における同種異系移植および異種移植に対する新生児期寛容の誘導を開示している。オーキンクロスは、Ｔリンパ球の成熟時に外来抗原を提示して細胞が外来抗原を自己とみなすことを可能にする原理を用い、それによって異種決定因子に対して応答性の細胞の機能を展開させないかまたは機能を抑制することによって寛容性誘導を達成することを考えている。
Ｒ．Ｅ．ビリングハム（Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ）ら、「異種細胞の能動的に獲得された寛容性（Ａｃｔｉｖｅｌｙ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｃｅｌｌｓ）」ＮＡＴＵＲＥ，１７２巻，１９５３年１０月３日，６０３〜６０６頁は、胎児期中の最初の異種組織提示によって寛容性を開始する「能動的に獲得された寛容性」を論及しており、後に移植された移植片に対する拒絶は無効にされるかまたは低下する。Ｍ．シモンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）、「免疫寛容の人工的生産。異種細胞に対する誘導された寛容性およびウイルスに対する誘導された感受性（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｖｉｒｕｓ）」ＮＡＴＵＲＥ，１７４巻，１９５５年４月３０日，７６３〜７６４頁は、トリ胚中に異種の細胞を注射することによる異種抗原（異なる種からの）に対する新生児寛容性を実証している。それにより、提供者に対する天然抗体の力価は有意に低下した。
Ｒ．Ｄ．オーウェン（Ｏｗｅｎ）、「ウシ双生児間の血管吻合の免疫遺伝学的結果（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎａｓｔｏｍｏｓｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｗｉｎｓ）」ＳＣＩＥＮＣＥ，１０２巻，１９４９年，４００〜４０１頁は、似ていないウシ同腹子間の寛容性が、同腹子間の胎盤中血管連結による胎児発生の際の血液交換のためであるということを示唆している。Ｊ．Ｗ．ストレイライン（Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ）、「Ｈ−２同種異系抗原の新生児期寛容性。移植片受容獲得『旧式』法（Ｎｅｏｎａｔａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｈ−２  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｐｒｏｃｕｒｉｎｇ  ｇｒａｆｔ  ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｔｈｅ  ‘ｏｌｄ−ｆａｓｈｉｏｎｅｄ’  ｗａｙ）」ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，５２巻，１９９１年７月，１〜１０頁は、新生児期寛容性の機序を論及している。同種異系ネズミ系統の組合わせに応じて、これは負の選択、アネルギーまたは抑制によることがある。
Ａ．Ｗ．フレーク（Ｆｌａｋｅ）ら、「子宮内幹細胞移植（Ｉｎ  Ｕｔｅｒｏ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ，１９巻，１９９１年，１０６１〜４頁は、出生後同種内および異種間移植のための胎盤特異的寛容誘導を含む造血幹細胞（ＨＳＣ）の子宮内移植の将来性を論及している。
Ｅ．Ｄ．ザンジャニ（Ｚａｎｊａｎｉ）ら、「子宮内移植後のヒツジにおけるヒト造血幹細胞の植込みおよび長期間発現（Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕｔｅｒｏ）」Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．，８９巻，１９９２年４月，１１７８〜１１８８頁は、ヒト胎児提供者からの造血幹細胞をヒツジ胎児へ移植することによるヒツジにおける寛容性の誘導を論及ししている。更に、著者らは、異種胎児中の提供者造血を促進するための組換えヒトＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子の使用を示している。彼等は、造血幹細胞を後の使用のために胎児中で「ヒトＨＳＣの蓄積」として貯蔵し且つ増大させることができることを示唆している。彼等は、ヒト免疫グロブリンが子宮内でも生産されうることを示唆している。Ｅ．Ｄ．ザンジャニら、「胎児造血幹細胞の子宮内移植によるヒツジおよび非ヒト霊長類における造血系キメラ現象（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ  ｎａｄ  Ｎｏｎｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｂｙ  Ｉｎ  Ｕｔｅｒｏ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」，ＢＬＯＯＤ  ＣＥＬＬＳ，１７巻，１９９１年，３４９〜３６３頁は、長期間安定な造血系キメラ現象を引き起こす無関係の胎児動物に対する胎児幹細胞の移植を開示している。
Ｅ．Ｆ．スロアー（Ｓｒｏｕｒ）ら、「分別された成人骨髄細胞を妊娠初期に子宮内移植されたヒツジにおける持続したヒト造血（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  Ｉｎ  Ｕｔｅｒｏ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｅａｒｌｙ  Ｇｅｓｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ）」，ＢＬＯＯＤ，７９巻，６号，１９９２年，１４０４〜１２頁は、ＨＳＣ移植に理想的な宿主を表わす胎児の概念、並びに造血系前駆細胞および幹細胞に富むヒト細胞を移植してキメラを生じる概念を示している。前述の論文（ザジャニら）と同様、ヒト胎児の治療のための症状発現前の研究としての研究が記載されている。ヒト胎児は、子宮内で同種異系細胞を受容すると考えられる。Ｃ．エゼル（Ｅｚｚｅｌｌ）、「ヒツジキメラはヒト血液細胞を作る（Ｓｈｅｅｐ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｍａｋｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）」，ＳＣＩＥＮＣＥ  ＮＥＷＳ，１４１巻，１９９２年３月２１日，１８２頁は、スロアーの研究（上記）を論評し、そして子宮内で診断することができ、したがって細胞の子宮内注入によって治療することができるヒトの遺伝的血液疾患を挙げている。
Ｍ．タバソリ（Ｔａｖａｓｓｏｌｉ）ら、「インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子とのプレインキュベーションによる移植された骨髄細胞の移植効率の増大（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ａｎｄ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）」，ＢＬＯＯＤ，７７巻，１９９１年４月，１５９９〜１６０６頁は、ネズミ骨髄細胞とＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦとのプレインキュベーションが、照射された同系宿主におけるそれ以後の植込みを増大させたことを実証している。Ｂ．Ｗ．ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）ら、「造血系キメラアカゲザルの免疫学的評価（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙｓ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ．ＰＲＯＣ．，２３巻，１９９１年２月，８４１〜３頁は、胎児肝からの胎児アカゲザル造血系細胞を誤対合アカゲザル胎児に注射後のＴ細胞成熟および機能を評価している。
Ｔ．Ｍ．クロンブルホルム（Ｃｒｏｍｂｌｅｈｏｌｍｅ）ら、「胎児細胞の移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」，ＡＭ．Ｊ．ＯＢＳＴＥＴ．ＧＹＮＥＣＯＬ，１６４巻，１９９１年１月，２１８〜２３０頁は、胎児組織提供者および胎児組織受容者の使用についての当該技術を論評している。該論評は、患者が胎児である場合に骨髄注入によって治療しうる多数のヒト先天的血液病を挙げている。胎児組織は供与用に用いることもでき、例えば、真性糖尿病の治療のための膵島細胞およびパーキンソン病の治療のためのドパミン作動性ニューロンがある。この文献は、移植前の胎児組織の修飾に関する提案は行なっていない。Ｃ．Ｇ．グロス（Ｇｒｏｔｈ）ら、「ブタ胎児膵臓を移植された糖尿病患者における異種移植片機能の根拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｆｅｔａｌ  ｐａｎｃｒｅａｓ）」ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ．ＰＲＯＣ．，２４巻，１９９２年６月，９７２〜９７３頁は、糖尿病患者に胎児ブタからの膵島細胞を移植した。該島は移植前に修飾されなかった。
ヒトＳＣＩＤマウスキメラに関する当該技術は、ヒトリンパ球がＳＣＩＤマウス中で分化しうるし且つ該マウスに対して寛容になりうることを示している。ヒトＳＣＩＤマウスキメラ技術は、マウスに対する寛容性が負の選択およびおそらくはアネルギーによるが、抑制によるのではないことを示している。
モシア（Ｍｏｓｉｅｒ）ら、「重症複合型免疫不全のマウスに対する機能的ヒト免疫系の伝達（Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」，ＮＡＴＵＲＥ，３３５巻，１９８８年，２５６〜２５９頁は、ＳＣＩＤマウス中の末梢血からのヒトリンパ系細胞の増加および分化を論及している。Ｄ．Ｅ．モシア、「ヒトリンパ系細胞を異種移植された免疫欠損マウス。ヒト免疫生物学および感染症のインビボ研究のための新規モデル（Ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ：Ｎｅｗ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」，Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，１０巻，１９９０年，１８５〜１９１頁およびＤ．Ｅ．モシア、「重症免疫欠損マウスに対するヒトリンパ系細胞の養子免疫伝達。正常なヒト免疫機能、自己免疫、リンパ腫形成およびエイズ（ＡＩＤＳ）のためのモデル（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｓｅｖｅｒｅｌｙ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ：Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ＡＩＤＳ）」，ＡＤＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，５０巻，１９９１年，３０３〜３２５頁は、エイズの研究、感染症に対する免疫反応およびヒト免疫系に対する薬剤の作用などのこれらのモデルの可能な用途を論評している。
Ｊ．Ｍ．マクーン（ＭｃＣｕｎｅ）ら、「ＳＣＩＤ−ｈｕマウス。ヒト血液リンパ系分化および機能の分析用ネズミモデル（Ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ：Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」，ＳＣＩＥＮＣＥ，２４１巻，１９８８年，１６３２〜１６９頁は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト胎児胸腺、リンパ節または胎児肝造血幹細胞の移植並びにヒトリンパ球および免疫グロブリンの分化を示している。Ｒ．ナミカワ（Ｎａｍｉｋａｗａ）ら、「ＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおける長期間ヒト造血（Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ）」，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１７２巻，１９９０年１０月，１０５５〜１０６３頁は、対宿主性移植片病を発症させることなくヒト造血系およびリンパ系細胞の長期間生存をもたらすＳＣＩＤマウスにおけるヒト胎児胸腺および肝臓の同時移植を開示している。
Ｂ．ポールト（Ｐｅａｕｌｔ）ら、「ＣＤ３４＋前駆細胞を用いるＳＣＩＤマウスにおけるヒト胎児胸腺のリンパ系再構成（Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｔｈｙｍｕｓ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３４＋Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）」，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１７４巻，１９９１年１１月，１２８３〜１２８６頁は、ヒト造血幹細胞の注入がヒト細胞を含むＳＣＩＤマウスにおいてヒト胸腺フラグメントの再集団化をもたらすことを示している。Ｊ．Ｆ．クロウカ（Ｋｒｏｗｋａ）ら、「ＳＣＩＤ−ｈｕマウス中のヒトＴ細胞は、表現型に関して正常であり且つ機能的に受容能力がある（Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ  ａｒｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，１４６巻，１９９１年６月，３７５１〜３７５６頁は、未成熟ヒト細胞が、ヒト胸腺および肝臓の胎児移植を受容するＳＣＩＤマウス中の成熟Ｔ細胞の集団に成熟することを示している。Ｂ．Ａ．Ｅ．ヴァンデカークホーヴェ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）ら、「ＳＣＩＤ−ｈｕマウスの末梢Ｔ細胞区分のクローン分析（Ｃｌｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ）」，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，１４６巻，１９９１年６月，４１７３〜４１７９頁は、胎児胸腺および肝臓フラグメントから、多クローン性および同種異系反応性Ｔ細胞受容体を有するが自己反応性Ｔ細胞受容体を持たない成熟Ｔ細胞へのヒトリンパ球の成熟を示している。
Ｈ．カネシマ（Ｋａｎｅｓｈｉｍａ）ら、「今日のＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Ｔｏｄａｙ′ｓ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ）」，ＮＡＴＵＲＥ，３４８巻，１９９０年１２月，５６１〜５６２頁、Ｊ．Ｍ．マクーンら、「ＳＣＩＤ−ｈｕマウス。現状および可能な用途（Ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＴＯＰＩＣＳ  ＩＮ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，１５２巻，１９８９年，１８３〜１９３頁、Ｊ．Ｍ．マクーン、「免疫系モデルとしてのＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ  Ｍｉｃｅ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌｓ）」，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＯＰＩＮＩＯＮ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３巻，１９９１年，２２４〜２２９頁およびＪ．Ｍ．マクーン、「ＳＣＩＤ−ｈｕマウス。ヒト血液リンパ系分化および機能の分析用小動物モデル（Ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ：ａ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」，ＢＯＮＥ  ＭＡＲＲＯＷ  ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，９巻（補遺１），１９９２年，７４〜７６頁は、ヒト免疫生物学の研究、例えば、エイズおよび抗ＨＩＶ薬、造血並びに免疫反応の研究におけるＳＣＩＤ−ｈｕモデルおよび可能な用途を論評している。
Ｗ．フプス（Ｈｕｐｐｅｓ）ら、「正常および免疫欠損マウスにおける急性ヒト対マウス対宿主性移植片病（Ａｃｕｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ｖｓ．Ｍｏｕｓｅ  Ｇｒａｆｔ−ｖｓ．−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ）」，ＥＵＲ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，２２巻，１９９２年，１９７〜２０６頁は、ヒト末梢リンパ球が、天然抗体が除去されているならば、人工的に免疫抑制されているかまたは遺伝的に免疫欠損しているマウス、例えば、ＳＣＩＤマウス中で生存しうることを示している。しかしながら、多量のリンパ球の植込みは、重症対宿主性移植片病（ヒト対マウス）に関係した。
Ｍ．タリ・レーマン（Ｔａｒｙ−Ｌｅｈｍａｎｎ）およびＡ．サクソン（Ｓａｘｏｎ）、「インビボでアネルギー状態にあるヒト成熟Ｔ細胞は、ヒト末梢血によって再構成されたＳＣＩＤマウスにおいて優勢である（Ｈｕｍａｎ  Ｍａｔｕｒｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  Ａｎｅｒｇｉｃ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｐｒｅｖａｉｌ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  Ｍｉｃｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ）」，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１７５巻，１９９２年２月，５０３〜５１６頁は、ヒト細胞は成熟してα／βＴ細胞受容体を有する記憶Ｔ細胞になるが、該細胞はアネルギー状態にあり且つ抗ＣＤ３抗体によって刺激されないことを示している。アネルギーは可逆的であった。Ｔ．チェルニング（Ｔｓｃｈｅｒｎｉｎｇ）ら、「重症混合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおけるＣＤ３＋  Ｔ細胞。Ｖ．ＳＣＩＤマウス中に植込まれた同種異系Ｔ細胞は、宿主拒絶および天然サプレッサー細胞活性の不存在にもかかわらず対宿主性移植片病を引き起こさない（ＣＤ３＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）ｍｉｃｅ．Ｖ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ＳＣＩＤ  Ｍｉｃｅ  ｄｏ  ｎｏｔ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｓｐｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ｖｅｔｏ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）」，ＳＣＡＮＤ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，３４巻，１９９１年，７９５〜８０１頁は、ＳＣＩＤマウス中に植込まれた同種異系ネズミリンパ球のＳＣＩＤマウスに対する寛容性は、宿主ヴィトー細胞によるのではないしまたは天然サプレッサー細胞によるのでもないことを示している。Ｍ−Ｇ．ロンカロロ（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ）およびＢ．ヴァンデカークホーヴェ、「胎児幹細胞移植後の寛容性を研究するためのモデルとしてのＳＣＩＤ−ｈｕマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｉｃｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  Ｆｅｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」，ＢＯＮＥ  ＭＡＲＲＯＷ  ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，９巻（補遺１），１９９２年２月，８３〜８４頁およびＢ．Ａ．Ｅ．ヴァンデカークホーヴェら、「ヒト造血系細胞および胸腺上皮細胞は、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス胸腺における異なる機序によって寛容性を誘導する（Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｖｉａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＣＩＤ−ｈｕ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔｈｙｍｕｓ）」，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１７５巻，１９９２年４月，１０３３〜１０４３頁は、一方の提供者からの胎児胸腺および別の提供者からの胎児肝造血系細胞を用いてＳＣＩＤ−ｈｕキメラを製造している。二人の提供者に由来するリンパ球は互いに寛容である。肝提供者に対する寛容性は負の選択により、胸腺提供者に対する寛容性は負の選択を必要としなかったがおそらくはアネルギーによった。最も��著に、混合実験は、免疫寛容が抑制によるのではなかったことを示している。
Ｙ．Ｊ．ゼン（Ｚｅｎｇ）ら、「完全な異種間キメラ（ＷＦラット→Ｂ１０マウス）における提供者特異的膵島異種移植片の長期間生存（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  Ｆｕｌｌｙ  Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ（ＷＦ  Ｒａｔ  →  Ｂ１０  Ｍｏｕｓｅ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，５３巻，１９９２年２月，２７７〜２８３頁は、致死照射によって処理されたマウスおよびラット骨髄細胞が、ラットからの膵島細胞に対して後になって寛容性であったし且つそれを許容したことを示している。Ｓ．Ｔ．イルドスタド（Ｉｌｄｓｔａｄ）ら、「交雑種移植寛容性。ラット骨髄由来細胞は、異種間抗原（マウス＋ラット→マウス）に対して寛容なキメラにおけるマウスＴ細胞受容体Ｖβの負の選択のリガンドの一因となりうる（Ｃｒｏｓｓ−Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：Ｒａｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖ  Ｂｅｔａ  ｉｎ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ  Ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｔｏ  Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（Ｍｏｕｓｅ  ＋  Ｒａｔ  →  Ｍｏｕｓｅ）」，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１７５巻，１９９２年１月，１４７〜１５５頁は、マウスに致死照射し且つラットおよびネズミ骨髄の混合物を移植した場合、そのキメラは対応するラットおよびネズミ組織適合性抗原に対して寛容であるということを開示している。寛容性は負の選択による。Ａ．Ｍ．ポセルト（Ｐｏｓｓｅｌｔ）ら、「胸腺内島移植による提供者特異的不応答性の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」，ＳＣＩＥＮＣＥ，１９９１年，１２９３〜６頁は、抗リンパ球血清による処置後の胸腺中へ提供者島を注射することによる同種異系ラットにおける膵島に対する寛容性の発現を実証している。寛容性は、抑制によるよりもむしろ負の選択によると実証されている。
Ｋ．ハマノ（Ｈａｍａｎｏ）ら、「ラットにおける対宿主性移植片反応および心臓同種異系移植生存に対する提供者血液の胸腺内注射の効果（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｈｏｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ａｌｌｏｇｒａｆｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ）」，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，６９巻，１９９１年，１８５〜１８９頁は、造血系およびリンパ系細胞の提供者が宿主系統細胞の胸腺内注射を予め受けた場合の低下した対宿主性移植片反応を実証した。提供者は免疫反応性細胞全部を与え且つ宿主は標的臓器を与えたので、この実験は、臓器受容者の胸腺中に臓器提供者細胞を注射することと同等てある。実際に、それは、心臓移植受容者の胸腺中に心臓提供者細胞を注射後の心臓移植拒絶のモデルとして記載された。宿主の免疫反応性細胞は致死照射によって死滅したので、リンパ球提供者における寛容の機序は無関係である。負の選択またはアネルギーのみによる寛容は、宿主並びにサプレッサー細胞に対して伝達されうる。
Ｇ．Ｍ．ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、「内皮の宿主再集団化（Ｈｏｓｔ  Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ．ＰＲＯＣ．，３巻，１９７１年３月，８６９〜７２頁は、大動脈移植片の内皮細胞が、受容者内皮細胞によって２〜４か月で置き換えられることを開示している。骨髄キメラにおいて、提供者由来細胞による骨髄中の内皮細胞の部分的再集団化があった。Ｒ．Ｐ．ゲイル（Ｇａｌｅ）ら、「ヒトの肝マクロファージ（クッパー細胞）の骨髄起原（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ（Ｋｕｐｆｆｅｒ  Ｃｅｌｌｓ）ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）」，ＳＣＩＥＮＣＥ，２０１巻，１９７８年９月，９３７〜９３８頁は、同種異系骨髄受容者の肝臓中のクッパー細胞が提供者細胞と置き換えられることを示している。
当該技術は、移植臓器片が臓器移植受容者中の受容者細胞と一緒に部分的に再集団化されうることおよび骨髄受容者の骨髄血管内皮が提供者細胞と一緒に部分的に再集団化することを実証している。
Ｄ．シェファー（Ｓｈａｆｅｒ）ら、「小腸移植の研究。抗リンパ球血清による提供者前処理による同種異系移植片機能の保存を伴う対宿主性移植片病の予防（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｂｏｗｅｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｇｒａｆｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｒｕｍ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，４５巻，１９８８年２月，２６２〜２６９頁およびＤ．シェファーら、「多クローン性および単クローン性抗リンパ球血清による小腸移植後の対宿主性移植片病の予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｂｏｗｅｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｒｕｍ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，５２巻は、腸からのリンパ球によるＧｖＨＤが、腸移植後の主要な問題であることを示している。彼等は、移植時または移植前に提供者を抗リンパ球血清（ＡＬＳ、多クローン性かまたは単クローン性）で処置することによってＧｖＨＤを予防しうることを開示している。その有効性は、付着した腸間膜リンパ節におけるリンパ球の減少と相関する。移植片は、臓器移植受容者細胞と一緒にｅｘ  ｖｉｖｏで再集団化されない。ＡＬＳによる処置が、内皮、マクロファージ、樹枝状細胞、プラズマ細胞等を含む拒絶の細胞標的を除去するのではない。腸移植からのＧｖＨＤの危険は減少するが、移植片はなお拒絶の危険があるし、更に、免疫欠損の状態であり且つ感染の危険がある。著者らは、「臨床移植におけるその使用は時期または作戦上の拘束によって制限されうる・・・」と注記している。
Ｇ．Ｅ．シェファーら、「レトロウイルス媒介遺伝子伝達によるネズミ骨髄造血系細胞におけるブタクラスＩＩ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｗｉｎｅ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８巻，１９９１年１１月，９７６０〜９７６４頁およびＤ．Ｗ．エメリー（Ｅｍｅｒｙ）ら、「組換えレトロウイルスを導入されたブタ骨髄細胞における同種異系クラスＩＩ  ｃＤＮＡの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  Ｓｗｉｎｅ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）」，ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ．ＰＲＯＣ．，２４巻，１９９２年４月，４６８〜４６９頁は、同種内および異種間寛容が、形質転換工学処理によって達成されうるし且つブタクラスＩＩ  ＭＨＣ抗原の遺伝コードをネズミ骨髄造血前駆細胞中におよび同種異系ブタ細胞中に挿入しうることを示唆している。臓器提供者に対する寛容性は、提供者ＭＨＣ抗原遺伝子を受容者造血幹細胞中に挿入し且つ修飾された幹細胞を用いて受容者に自己骨髄移植を行なうことによって臓器受容者において誘導されると考えられる。著者らは、移植臓器中の臓器提供者細胞を遺伝的に修飾された細胞に置き換えることは提案していない。
関連技術は、更に、提供者動物から臓器移植受容者へ移植片を移植する前に、臓器提供者動物において移植免疫寛容を誘導するためのプロトコルを開示していない。先行技術は、採取のためのおよび臓器移植受容者に戻すための臓器移植提供者中の免疫寛容の原因である抗原特異的サプレッサー細胞、ヴィトー細胞、抗イディオタイプ抗体を生産する細胞または抗イディオタイプ抗体の生産および増大を示唆してはいない。
発明の目的
本発明の目的は、臓器移植受容者において抗原に対する免疫寛容を誘導する目的のための、サプレッサー細胞、ヴィトー細胞、Ｂ７および関連表面分子を欠く抗原提示細胞、抗イディオタイプ抗体を生産する細胞並びに抗イディオタイプ抗体を含む抗原特異的調節細胞および因子の源を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、第三者として代理動物を用いる、臓器提供者に対する免疫寛容の原因であるサプレッサー細胞、ヴィトー細胞、Ｂ７および関連表面分子を欠く抗原提示細胞、抗イディオタイプ抗体を生産する細胞並びに抗イディオタイプ抗体を含む調節細胞を生じる方法である。
本発明のもう一つの目的は、制限されないが内皮細胞、樹枝状細胞、マクロファージ、リンパ球およびプラズマ細胞がある臓器受容者細胞と一緒に再集団化された臓器異種移植片の生産である。もう一つの目的は、代理動物として胎児動物または骨髄移植の受容者を用いる、代理動物中において臓器受容者細胞と一緒に再集団化される臓器異種移植片の生産法である。
これらのおよび他の目的は、本発明の下記の実施態様の一つまたはそれ以上によって達成される。
発明の概要
本発明は、一つの実施態様において、提供者動物と同系ではない受容者動物に対して提供者動物から臓器を移植する方法であって、該受容者動物に対して、提供者動物の組織に対する受容者動物の特異的免疫応答を減少させるのに十分な量の免疫抑制部分を含む細胞集団を投与し、該細胞集団は受容者動物に由来するリンパ球を含むキメラ動物である代理動物から得られ、そして引き続き提供者動物からの臓器を受容者動物に対して移植し、それによって受容者動物の臓器に対する免疫応答を減少させることを含む上記方法を提供する。
もう一つの実施態様において、本発明は、提供者動物から受容者動物に対する臓器の異種移植の方法であって、受容者から第一細胞集団を採取し、該第一細胞集団はリンパ球前駆細胞を含むが、代理動物からの組織に対して特異的に細胞障害性である減少した数の細胞であり、代理動物が免疫不全の状態にある場合、該第一細胞集団を代理動物に対して投与し、代理動物を免疫受容能力のある状態にさせ、免疫受容能力のある代理動物から第二細胞集団を採取し、該第二細胞集団は、代理動物の組織に対する受容者の免疫応答を特異的に抑制する免疫調節部分を含み、該第二細胞集団を受容者に注入し、抗原に関して代理動物と同一である提供者動物から臓器を切除し、そして切除された臓器を異種移植受容者に移植することによって受容者が提供者組織に対して免疫寛容にされている上記方法を提供する。
もう一つの実施態様において、本発明は、提供者動物から移植された臓器の受容動物による免疫拒絶を抑制するためのキットであって、受容者動物に由来するリンパ球を含むキメラ動物である代理動物から得られた細胞集団を含む免疫抑制性組成物を含み、該細胞集団は、提供者動物の組織に対する受容者動物の免疫応答を特異的に抑制する免疫抑制性部分を含み、該細胞集団は受容者動物中へ注射するのに適当な媒質中に懸濁されている上記キットを提供する。
更にもう一つの実施態様において、本発明は、受容者動物とは異なる種から切除された生体臓器および該切除された臓器を受容者動物中への移植に適当な条件において保存するのに十分な量の灌流溶液を含む受容者動物中への臓器移植のためのキットであって、該臓器が、受容者と同じ種からの細胞である内皮細胞、単球、樹枝状細胞および上皮細胞から選択される少なくとも複数の常在性細胞を含む上記キットを提供する。
本発明は、本明細書中において具体化され且つ大まかに記載されたように、一部分は、異種移植片代理動物において目的の異種移植臓器受容者からリンパ造血系細胞を区別することによって異種移植片に対して免疫寛容を生じさせる。目的の異種移植片受容者は、典型的に、臓器移植を必要としているヒト患者である。異種移植片代理動物は、好ましくは、別の種の胎児哺乳動物である。「ヒト」または「臓器移植受容者」調節細胞および因子は、キメラ動物中で生産され且つ増加されて、臓器移植受容者に対して抗原特異的免疫寛容を与えることができる。成熟したリンパ球および因子を代理動物から採取し、そして異種移植片代理動物からの臓器移植または組織移植と一緒に、目的の異種移植片受容者に再注入する。臓器移植受容者において寛容調節細胞および因子を誘導する代わりに、ヒト調節細胞および因子を目的の臓器移植受容者とは無関係な代理動物において生産させる。
好ましい実施態様において、多数の代理動物に、目的の臓器移植受容者からのリンパ造血系細胞を注入する。最良の代理動物を、細胞および因子によって与えられた免疫寛容の程度を基準として選択した後、最良の代理動物を寛容細胞および因子並びに臓器移植片の源として用いる。
リンパ球前駆体を含む造血系およびリンパ系細胞を移植臓器移植片受容者から入手し、そして代理動物が胎児などの初期免疫欠損状態にある場合、代理動物中で培養する。代理動物胎児を発育させた場合、細胞は代理動物の組織に対して免疫寛容になる。培養されたリンパ球および因子を発育した代理動物から採取し、そして目的の移植臓器移植片受容者に注入して戻す。次に、臓器などの代用組織を発育した代理動物から摘出し且つ臓器受容者に移植する。
樹枝状細胞、マクロファージ、リンパ球およびプラズマ細胞並びに内皮細胞を含む臓器受容者からの細胞と移植片との再構成は、目的の臓器移植片受容者とは無関係に引き起こされる変更を伴って記載される。
本発明は、目的の移植臓器受容者からの細胞と一緒に臓器を再集団化させることによって拒絶されることが少ない臓器移植片を提供する。受容者による代用臓器移植片の許容は、目的の臓器移植片受容者からの細胞による臓器移植片の置換および再集団化によって増加する。
本発明の追加の目的および利点は、以下の説明に一部分は記載されるが、一部分はその説明から当業者に明らかである。本発明の目的および利点は、更に、請求の範囲において特に指摘された手段および組合わせによって実現され且つ達成されうる。
【図面の簡単な説明】
図１は、胎児状態の代理動物に対する臓器受容者からのリンパ系細胞の導入を示すフローチャートによって本発明の一つの実施態様を図示し、ここにおいて該代理動物は、寛容誘導性免疫抑制性部分および移植臓器の両方の源として後で役立つ。
図２は、本発明のもう一つの実施態様を図示するフローチャートであり、ここにおいて、代理動物中で生産された寛容誘導性細胞および因子は、臓器受容者において第三者提供者からの移植された臓器に対する寛容性を誘導する。
図３は、本発明の更にもう一つの実施態様を図示するフローチャートであり、ここにおいて、寛容誘導性細胞および因子の生産は、臓器受容者に対して導入するために代理動物からリンパ系細胞を取出す前に、代理動物中に臓器受容者からの新鮮なリンパ球および因子を注射することによって促進される。
図４は、ヒト細胞と２頭のブタの一方からの細胞との二方向混合リンパ球反応を示す。細胞が、ヒト「患者」および子宮内において患者細胞と一緒に注入されたキメラブタ由来である場合、リンパ球の免疫刺激は起こらないが、患者細胞かまたはキメラブタ細胞を無関係のブタまたはヒトそれぞれからの細胞に暴露した場合、刺激は引き起こされる。
図５は、抑制として表示された二方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の結果を示す。更に、子宮内で暴露されたヒト「患者」からの細胞とキメラブタからの細胞との二方向ＭＬＲは抑制されるが（一方向反応に相対して８７％）、どちらかの細胞と、無関係のブタまたはヒトそれぞれの細胞との二方向ＭＬＲ反応は刺激される。
図６は、キメラブタリンパ球が、１：１００の希釈度でもＭＬＲを抑制することを示す。
図７は、ヒトリンパ球に対する子宮内暴露された同腹の子ブタ全部からのリンパ球の抑制活性を示す。結果は、同腹の子どうしの変化を示し、最大レベルの免疫抑制を与える個々のキメラブタを選択するスクリーニングの利点が示される。
図８は、免疫寛容のインビボ試験によってキメラ代理動物における抑制性細胞の存在を実証する。新鮮なマウスリンパ球を用いるキメララットの刺激は、該ラットにおいて多数のマウス細胞の増加を引き起こす。キメララットにおける免疫寛容は、該ラット免疫系による拒絶も、新たに導入されたマウスリンパ球による対宿主性移植片反応をも抑制する。
好ましい実施態様の詳細な説明
臓器移植片とは、本明細書中において、移植される固形臓器または組織を意味すると定義される。
臓器移植片受容者とは、本明細書中において、臓器移植片の最終受容者であるためのヒトなどの動物を意味すると定義される。
代理動物とは、本明細書中において、臓器受容者造血系細胞を有するための代理動物を意味すると定義され、リンパ球は該代理動物中で発育する。代理動物はキメラ、すなわち、臓器移植片受容者細胞を植込まれたまたは注入された動物である。これらの細胞および得られた因子は、引き続き臓器受容者に戻すための代理動物の組織に対して免疫寛容を生じる。代理動物は、更に、臓器移植片を提供することができる。代理動物は、常に、受容者と遺伝的に同一ではないことを意味する同種異系であり、そして通常、受容者とは異なる種を意味する異種である。
本明細書中で用いられるリンパ球前駆細胞とは、完全に分化してないリンパ球として定義される。これらのリンパ球前駆細胞は、種々の細胞から成る細胞集団に含まれていてよい。リンパ球前駆細胞を含む細胞集団は、以下の細胞種、すなわち、造血幹細胞、前胸腺細胞、初期胸腺細胞、プレＢ細胞および初期Ｂ細胞の１種類またはそれ以上を含むと考えられる。好ましくは、この集団は、抗原反応性記憶Ｔ細胞、抗原反応性記憶Ｂ細胞およびプラズマ細胞を除外すると考えられる。リンパ球前駆細胞と、ＴおよびＢ細胞の分化におけるそれらの役割についての論及は更に、本明細書中に援用されるＰ．Ｗ．キンカード（Ｋｉｎｃａｄｅ）およびＪ．Ｍ．ジンブル（Ｇｉｍｂｌｅ）、「Ｂリンパ球（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」，Ｗ．Ｅ．ポール（Ｐａｕｌ）監修のＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ラヴェン・プレス・リミテッド（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．），ニューヨーク，１９８９年，４１〜６７頁中、およびＪ．スプレント（Ｓｐｒｅｎｔ）、「Ｔリンパ球および胸腺（Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｈｙｍｕｓ）」，Ｗ．Ｅ．ポール監修のＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ラヴェン・プレス・リミテッド，ニューヨーク，１９８９年，６９〜９３頁中で見出される。
抗原は、Ｒｏｓｅｎ  Ｆ．Ｓ．ら編集の「免疫の辞典（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８９）」，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＫ，ｐ．１３において、「免疫応答を誘発でき、対応する抗体またはＴ細胞リセプターと特異的に反応できる物質である。一つの抗原が多くの抗原決定基を有することができる。」と定義されている。本明細書における「抗原として理想的な物質」とは、同じ抗原決定基を有しそして同じ抗体及びＴ細胞リセプターと反応するものである。本明細書における「抗原的に似た物質」とは、抗原決定基の多くを共有し、そして同じ抗体及びＴ細胞リセプターの多くと反応するものである。
本明細書における免疫応答とは、抗原−誘発性の、該抗原に対して特異的なＴおよび／またはＢリンパ球の増殖を含む。
本明細書における免疫抑制成分（Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｍｏｉｅｔｙ）とは、選択された抗原に対する免疫応答を特異的に阻害するが、他の抗原に対する応答を阻害しない分子または細胞をいう。免疫抑制成分の例には、抗イディオタイプ抗体、及びサプレーサー細胞、ヴィトー細胞及びＢ７を表面に発現しない抗原提示細胞のような免疫調節細胞、または関連分子が含まれる1。
（注1  Ｂ７は、活性化Ｂ細胞、活性化モノサイト、及び樹枝状細胞のような抗原提示細胞により発現されるＴ細胞表面抗原ＣＤ２８に対するリガンドである。Ｂ７を発現する細胞上のＭＨＣクラスII分子による抗原提示は、適切なＴ細胞増殖及びサイトカイン生産を誘発するが、Ｂ７／ＣＤ２８結合の不存在下でのＭＨＣクラスII分子による抗原提示は、該抗原に対する寛容を引き起こす。Ｇｉｍｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，７月，１９９３，ｐｐ．６５８６−６５９０。）
本明細書における免疫能力がある（コンピテンス）とは、、抗原的に区別される分子、細胞もしくは組織に対する正常の免疫応答を開始する能力と定義されるが、しかし、免疫コンピテントな動物は、該動物と抗原的に似た分子、細胞または組織のような寛容原性の成分に対しては、低い応答しか示さない。免疫コンピテンスの例は、同種異系提供者からの皮膚移植片を迅速に拒絶するが（典型的には６〜１２日）、しかし同系のまたはオートロガスな移植片は無制限に許容する能力である。
本明細書における免疫欠損とは、正常な成熟動物の免疫応答と比較して、分子、細胞または組織のような抗原成分に対する免疫反応が損なわれていることであると定義される。免疫欠損の例は、正常宿主による迅速な拒絶と比較して、無関係な提供個体からの新たな皮膚移植片を長期間受容する動物である。寛容動物は寛容の誘発に用いた成分と類似または同一の特定の分子、細胞または組織に対して免疫応答の現象を示すが、第三者の無関係な抗原に対しては正常に反応する。現在のところ、免疫欠損動物の例は胎児動物及び全身への致死的照射動物である。胎児動物は、免疫システムが未熟なので臓器受容個体からの細胞のような抗原を拒絶することができない。全身への致死的照射を受けた動物は、照射により免疫システムが破壊されているため免疫欠損であり、臓器受容個体からの細胞のような抗原を拒絶することができない。
本明細書における感染因子とは、臓器移植片または細胞の受容個体へ感染し、組織破壊を生じる因子である。感染因子は、一般に病原体であり、代理動物から集めた細胞集団のような生物学的サンプル中に存在する。感染因子は、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生生物、マイコプラズマ、及び微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄａｅ）を含むが、これらに限定されない。
代理寛容形成（Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）
代理寛容形成とは、意図する臓器移植個体の体外において、代理動物に対して特異的に寛容なリンパ球及び可溶性因子を製造することを意味する。代理寛容形成を実施するため、代理動物中で寛容性リンパ球及び因子を発生させる。例えば、胎児ブタのような代理動物中に、臓器移植（例えば腎臓の）を要求するヒトの臓器移植受容者からのヒト細胞（リンパ球及び適当な抗原提示細胞（ＡＰＣ））を注入する。このヒト細胞は、やがてブタ抗原に対して寛容になる。その後、当該ブタからのこのヒトリンパ球及び因子を、臓器移植受容者に移植し戻し、さらにブタ腎臓の移植を行う。
代替的に、予定提供者からのリンパ球及びＡＰＣを、臓器受容予定者からの類似の細胞と混合し、第三者代理胎児動物体内で培養し、寛容の発生を導く環境内で成人提供者に対する寛容の発生を生じさせる。たとえば、子供に腎臓を提供しようと願う親については、臓器移植片受容小児は、ハプロタイブ抗原の相違のために通常は移植片を拒絶するので、通常は拒絶反応を防止するために相当の免疫抑制が必要である。しかしながら、本発明の代理寛容形成を用いれば、ドナーである親のリンパ球及びＡＰＣを、臓器移植受容小児からの同様の細胞集団と混合し、この混合リンパ球及びＡＰＣを第三者である胎児代理動物、たとえば胎児ブタ内に輸血移植する。胎児ブタ体内で培養されると、予定された臓器移植受容者、すなわち上記例でいう小児、は提供者、すなわち親の抗原に対して寛容になる。この代理動物から臓器移植受容者のリンパ球及び因子を取り出して分離した後、そしてこの分離した臓器移植受容者のリンパ球及び因子を臓器移植受容者である小児内へ移植して戻した後、臓器移植受容者の小児は提供者である親からの腎臓を、拒絶反応の危険性の有意な減少をもって、すなわち免疫抑制療法の必要性の低下をもって受け入れる。
代理寛容形成の鍵は、臓器受容者のリンパ球及び因子の集団中に、提供者動物組織に対する免疫寛容を誘発させることであり、この免疫寛容の誘発は代理動物中で生じる。臓器移植受容者内でヒト調節細胞及び因子を誘導する代わりに、調節細胞及び因子は、予定の臓器移植受容者の体外の代理動物中で製造される。代理動物中で分化する臓器移植受容者の細胞は臓器受容者の抗原を保有するので分化した細胞及び因子は臓器移植受容者及び代理動物臓器の両方に対して免疫寛容になる。臓器移植受容者の調節細胞及び因子は、製造され増やされて、臓器移植受容者内で抗原特異的免疫寛容を誘発する能力を有する寛容形成組成物を提供する。この組成物は調節細胞及び因子を含む細胞集団であり、サプレッサーＴ細胞及び関連サプレッサー細胞、ヴィトー細胞、Ｂ細胞の亜集団、表面抗−イディオタイプ免疫グロブリンを有するＢ細胞の選択された集団、循環抗−イディオタイプ免疫グロブリン及び選択された免疫グロブリンを含みうる。
製造及び増殖、収穫、定量の提供に加え、及び免疫抑制成分、抗原特異的調節細胞及び免疫寛容に関係する血清因子（サプレッサーＴ細胞及び関連サプレッサー因子、ヴィトー細胞、表面抗−イディオタイプ免疫グロブリンを有する選択されたＢ細胞の集団、及び循環抗−イディオタイプ免疫グロブリンを含むがこれらに限定はされない）の使用に加え、本発明は、臓器移植受容者内への導入に先立って抗原特異的免疫寛容に関係する調節細胞及び因子を測定する方法、ならびに実際の移植の前に寛容の程度をテストする機会を提供する。本発明はまた、臓器を予定の移植臓器受容者からの内皮細胞、単核球細胞及び白血球と、または臓器受容者と同じ種の動物からの細胞と一緒にすることにより、移植のために修飾した臓器及び組織の製造及びモニターも含む。調節細胞及び因子ならびに修飾された臓器移植片の使用は、拒絶反応の防止に要求される免疫抑制を有意に低下させながら、異種移植を含む臓器移植片の長期生存を可能にする。
本発明は提供者の遺伝コードを含むトランスジェニック細胞を用いる骨髄移植とは、臓器移植片に対する寛容は移植前に代理動物中で生じこのため致死的化学療法及び照射ならびに骨髄移植が不要である点で、異なっている。加えて、提供者抗原をコードするトランスジェニック細胞の使用は、本発明とは二つの点で有意に異なる。第一に、トランスジェニック細胞の使用は移植の後に再集団化（リポピュレーション）を生じるが、本発明では移植の前に生じる。第二に、トランスジェニック細胞の使用は臓器を提供者及び受容者の抗原の両方を含む細胞と再集団化させるが、本発明では移植片を臓器移植受容者の抗原のみ含む細胞と再集団化させる。
新生児の寛容の概念は当業者によく知られているが、現在までに示唆されている新生児寛容の臨床的応用は、ヒトの胎児または新生児への臓器及び組織の移植のみである。本発明は新生児の環境を使用して、サプレッサー細胞及びヴィトー細胞ならびに因子をプログラムし、発生の後期の受容者（成人臓器受容者でさえも）にたいする臓器移植を可能にする。
臓器移植受容者に直接寛容を誘発する試みに代えて、「代理寛容形成」と本明細書中で呼ぶ方法により、代理動物体内で産生させた免疫調節成分により、臓器移植受容者の免疫システム内に寛容を誘発することにより、非同一の臓器片の受容を促進する。この方法は、他の提供者の組織または細胞もまた代理動物内に存在させれば、当該他の臓器提供者の細胞に対する寛容を臓器移植受容者の細胞に誘発することも可能である。代理動物または臓器提供者の抗原に対する免疫応答をブロックするためのサプレッサー細胞及び調節細胞及び因子を、該代理動物中で培養し、増やし、そして採取する。臓器受容者にサプレッサー細胞または調節細胞及び因子を移植した後、該受容者は代理動物または提供者からの臓器移植片を受け入れ、拒絶の危険が有意に少なくそして免疫抑制の必要性も有意に小さい。
免疫寛容を発生させるための代理動物の使用は、そのような方法を臓器移植受容者に対して行ったなら非現実的または非倫理的であると考えられる方法を実施するための柔軟性を提供する。たとえば、移植を受ける予定の受容者が成人であるとしても、代理動物として胎児動物を使用することが可能である。キセノグラフト（異種移植）の場合、内交の同系ストレーンの使用は、免疫抑制成分の供給源として他の個体を用いて一つの個体からの臓器に対する寛容の発生を可能にするであろう。複数の代理動物を使用し、最高の寛容を提供した代理動物を選択して寛容細胞及び因子を採取することもできる。代理キメラは、臓器受容者の新鮮なリンパ球でチャレンジすることもできる、すなわち、代理キメラを臓器受容者の新たなリンパ球の注入に再度曝して、この方法で該キメラの免疫システムによる臓器受容者のリンパ球に対する調節を試験できる。臓器移植片受容者細胞が代理動物組織に対する臓器移植受容者細胞の反応を抑制出来ない場合、その代理動物はＧｖＨＤを生じる。他方、臓器移植受容者からの寛容細胞及び因子を有する代理動物は、新鮮なリンパ球がＧｖＨＤを生じることを防止する。実際、このようなチャレンジはキメラ内での関係細胞及び因子を増やすであろう。最後に、モニターアッセイによって代理動物のいずれもが寛容リンパ球及び因子を生じていないことを示した場合、引き続く臓器移植片の移植は延期または中止すべきである。こうして臓器移植受容者は拒絶される臓器移植片に伴う発病及び死亡から救済される。
代理動物の選択
新生児寛容の原理は種々の動物種で広く観察されている。免疫系発達前の胎児への造血細胞の注入は、対宿主移植片病を生じることなくキメラを生じる。この宿主は注入された細胞に対して寛容であり、そして注入された細胞は宿主に対して寛容である。この現象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、サル、マウス、ラット及びニワトリで観察されている（Ｏｗｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０２：２００，１９４５；Ｚａｎｊａｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９：１１７８−８８，１９９２；Ｄｕｎｃａｎら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．，２３：８４１−３，１９９１；Ｈａｓｅｋ，Ｃｅｓｋ．Ｂｉｏｌ．，２：２６５−７０，１９５３）。免疫寛容を発生させる胎児期間はこれら文献記載の方法を用いて容易に確立できる。サプレッサー細胞の発生は、本明細書の各所の記載を用いて容易にアッセイできる。
多くの動物を代理動物として用いることが可能で、各動物が選択された用途に利点を提供する。好ましい動物は哺乳類であり、哺乳類綱の主要な３９目中の５目はヒト臓器受容者のための代理動物として特に適するようである；霊長類、偶蹄類、食肉類、齧歯類、及び兎形目。
ヒト以外の霊長類は臓器機能の観点から、代理寛容形成の為に最も適する動物である。タンパク質類のアミノ酸配列はヒトとの相同性が典型的には９０〜９８％である。肝臓及び心臓のような臓器は、ヒトに移植した場合、十分に機能する。霊長類はヒトと調和性であり、すなわち通常はヒト受容者は霊長類の組織に対して予め形成された抗体を有しない。
キツネザルのような下等霊長類は妊娠期間が短く（１３２〜１３４日）、高等霊長類（チンパンジーやゴリラ）はほぼヒトと同じ（２６７日）妊娠期間を有する。子宮内注入は、単一細胞または組織片（たとえば肝細胞またはランゲルハンス氏島）の移植に有用であり、これを移植のために胎児または新生児から収穫できる。しかしながら、固形臓器（心臓、腎臓、等）については、生長期間が長期になるから代理動物での寛容誘発を骨髄移植で行うほうがより実際的である。
偶蹄類は、趾を有する有蹄類でもよく、何種かの家畜動物、たとえばブタ、ヒツジ、ヤギ及びウシを含む。いくつかのメンバーの臓器又はタンパク質はヒトにおいて機能を有し及び有用であることが証明されているか、または移植に用いることが提案されている。たとえば、ブタ及びウシのインシュリン、ブタの皮膚、ヒツジの心臓等が治療用途に用いられまたは提案されている。
この目の間では、妊娠期間は異なる。ブタでは１１４日である。ヒツジは１４５日である。ウシは２８２日の妊娠期間を有する。本明細書に記載するとおり、ヒトリンパ球を胎児ブタ体内で培養すると、当該患者からの新鮮なリンパ球の当該ブタに対する反応を抑制する抗原特異的抑制細胞が誘発された。ヒトリンパ球はまた胎児ヒツジ体内で培養され、安定なキメラを導いた。寛容のメカニズムはヒト−ヒツジキメラでは解明されていないが、ヒトリンパ球は抑制細胞になる能力をもつＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に分化した。ウシは、代理寛容形成のために有用である可能性がある特徴を提供する。全部の同腹児の胎盤血は共有されている。したがって、仔牛の一つに注入されたヒト細胞は同腹児全部に寛容をもたらすはずである。その体が大きいため、ウシは糖尿病患者に移植するために他の動物よりも多くの膵臓の島を提供できる。ヒトの膵臓から収穫される膵臓の島の数が限られていることは、島細胞のヒト同種移植のための使用を制限する大きなファクターである。
食肉類は、イヌ、ネコ等を含み、代理寛容形成に有利な可能性があるいくつかの利点を有する。多くの食肉類の妊娠期間は短く（ネコは約６５日、イヌは約６３日）そして新生児は比較的十分に発達している。イヌ及びネコの免疫システムはヒトのそれに非常に類似している。実際、ネコの免疫不全ウイルスモデルはＡＩＤＳの研究に利用できる数少ない動物モデルの一つである。イヌにおいても、骨髄移植の後、抑制細胞が認められている。
ネコ及びイヌは、骨髄、肺、腸及び骨移植を含めて、移植のための大型動物モデルとして一般に使用されている（Ｌａｄｉｇｅｓら，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，４０：１１−１５，１９９０；Ｈｅｎｒｙら，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，４６：１７１４−２０，１９８５）。ヒトのランゲルハンス氏島及び肝細胞はイヌで良好に機能することが示されている（Ｃａｌａｆｉｏｒｅ，Ａｓａｉｏｊ，３８：３４７，１９９２；Ｐｅｔｒｕｚｚｏら，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．，４：２００−４，１９９１；Ｓｕｓｓｍａｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６：６０−６５，１９９２）。したがって、イヌのランゲルハンス氏島及び肝細胞は同様にヒト受容者において機能すると期待される。
齧歯類は、ラット、マウス等を含み、妊娠期間が短く成熟までの成長が迅速であるため代理寛容形成に有用である可能性がある。たとえば、ラットは妊娠期間がわずか２１日であり、６週間で成長する。齧歯類の免疫システムは誕生時には非常に未熟であるため、子宮内注射の代わりに誕生から２４時間以内に細胞を注射して寛容を誘発することが可能である。
齧歯類は、妊娠期間及び成長までの期間が短いため、新規ストレインやトランスジェニック動物を製造するために特に有用である。これらの利点は代理寛容形成に用いることが可能である。たとえば、ＳＣＩＤマウスを用いて、ヒトリンパ球の培養及び分化をさせることが可能である。ヒト細胞ラインはヌードマウス内で培養できる。ヒトインシュリンを生産するトランスジェニックマウスまたは培養ヒト細胞を有するマウスを用いて、それらの細胞に寛容なリンパ球を製造することは、多数の新生児マウスにヒト臓器受容者のリンパ球を注入すれば、数週間以内にできる。
兎形目は、家兎及び野うさぎを含むが、一次は齧歯類の一部と考えられていたが、最近別の目に分けられた。これらは齧歯類と同様に非常に短い妊娠期間及び成長期間を有する。したがって、こられの動物も、ヒトリンパ球の変異に適し且つ機能的な臓器または組織を提供するトランスジェニック系統を含めて、新系統の動物を製造するために有用であろう。これらの動物の体型が齧歯類より大きいことも、より優れた代理動物の候補である理由になる。
理想的な代理動物の種は、予定される臓器移植受容動物と系統発生論的に近いものである。また、予定の移植片の生理学が該移植片に置き換えられる臓器移植受容体の臓器または組織の生理学に似ている必要がある。好ましくは、臓器移植受容体は代理動物と調和性であり、すなわち、臓器移植受容体は代理動物に対する天然の抗体を有すべきでない。上記の定義を考慮すると、ヒトの移植のための臓器及び組織を提供するために最も適当な非ヒト動物は、非ヒト類人猿である。ヒトの移植のための臓器及び組織を提供するために適する非調和性動物には、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等が含まれる。
さらなる考慮が代理寛容形成のための動物種の選定に影響する。移植された移植片は、臓器移植受容者体内の相当する器官とほぼ同じ大きさでなければならない。寛容を胎児体内で誘発させるとすると、できるだけ早急にヒトに対する適当な移植片を提供するためには、その代理動物は比較的短い妊娠期間のものでなければならず、そしてまた該代理動物は誕生後迅速に成長するものでなければならない。そのため、上記さらなる考慮の点では、ブタは霊長類より適当な代理動物である、なぜなら、ブタは妊娠期間がわずか１１４日であり、そして４月齢で典型的には５９kg以上に成長するからである。しかしながら、骨髄移植の後に寛容を誘発させ、もしくは第三者動物の器官に対する寛容を生じさせるために代理動物を用いるのであれば、非ヒト霊長類が代理動物としてブタよりも優れる。
代理寛容形成によれば、遺伝子操作の必要なしに異種移植が可能であるが、遺伝子操作による修飾で本発明の方法を有意に促進および簡素化できる。大型動物における遺伝子操作は、ヒツジ、ウシ及びブタを含めて、よく行われている。遺伝子操作分野の専門家によく知られている技術を用いて、代理寛容形成を補助する遺伝子修飾を行うことができる。遺伝子的に修飾した動物を代理動物として使用することも本発明の技術思想の範囲内である。
可能な遺伝子修飾は二つのカテゴリーに分類できる：すなわち、代理寛容形成の方法を補足もしくは助長するような修飾、及び受容体の病気状態により適合させるために行う移植臓器の機能修飾である。
リンパ球の成長因子は一般に種に対して非特異的であるが、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦのような骨髄球及び単核球（すなわち顆粒球、マクロファージ及び樹状突起細胞）の成長因子は典型的には種特異性である。これらの補助（アクセサリー）細胞は、リンパ球の感作のために重要である。したがって、遺伝子操作されて臓器受容者のミエロイド及びモノサイト細胞のための成長因子を生産する代理動物は、相当するリンパ球の分化を促進すると期待される。
ブタによる代理寛容形成の初期研究において、ヒトリンパ球は容易にＣＤ４＋リンパ球に分化するが、ＣＤ８＋リンパ球へは稀にしか分化しないことが観察された。ＣＤ４＋リンパ球への分化にはクラスII抗原が必要だが、ＣＤ８＋リンパ球への分化にはクラスＩ  ＭＨＣ抗原が必要である。ブタのクラスII抗原はヒトの抗原と十分な相同性を有してＣＤ４＋細胞の分化をおこすようである。他方、クラスＩ抗原は、ヒトの対応抗原と十分に相同ではない。ＣＤ８＋細胞の分化を促進するためには、共通のクラスＩ抗原（たとえばＡ２）を相当するプロモーター遺伝子と一緒に代理動物（たとえばブタ）の卵子に挿入し、この卵子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精させることができる。その子孫のホモ接合性のものを繁殖させて増やし、代理寛容形成に用いることができる。
代理寛容形成は異種移植をより容易にするので、そのことも代理動物または代理動物の組織の遺伝子修飾を正当化する。修飾は薬理学的に重要なヒトタンパク質の分泌をもたらすことができ、該動物を感染にたいしてより耐性とし、該動物の成長を助けることもできる。たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼの生産量を高めたブタの系統は、アルコール性肝臓疾患のために行う肝移植のために有用であろう。同様に、膵臓の島内でヒトのインシュリンを多く生産するブタは、タイプＩまたはタイプIIの真正糖尿病の移植治療のための組織供給源として有用であろう。ヒトエリスロポエチンを多量に生産するブタは、腎臓損傷及び貧血の患者への腎臓移植のために有用であろう。ベータアドレナリンリセプターの数を増加させることにより、より強力な異種移植心臓を製造かのうであろう（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗｓ，１４５：３０３，１９９４）。当業者にとって、多くの他の変更により特定の病気のために移植する臓器を強化することは自明である。
代理動物を用いる寛容誘発方法
本発明は、代理動物からの臓器移植片に対する臓器移植受容者の寛容を誘発する方法も含む。寛容は、臓器移植受容者のリンパ球及び因子が、発生中の代理動物体内に存在する間に誘発され、そして寛容になったリンパ球及び因子は、臓器受容者体内に戻されて該臓器受容者による移植臓器片の拒絶を防止する。広く言えば、この方法は、臓器移植受容者からの複数の細胞を得、そして該細胞を胎児代理動物体内で培養して培養細胞を生じさせる工程からなる。このようにして、培養細胞が胎児代理動物の臓器に対して特異的に寛容になるようプログラムされる。この胎児代理動物を発生させて、免疫能力を有する個体にする。次に、この代理動物から培養細胞を取り出し、臓器移植受容者体内に注入する。次にこの代理動物から臓器移植片を取り出し、臓器移植受容者に移植する。
より具体的には、本発明は、臓器移植受容者内に寛容を誘発するために用いるための、免疫寛容リンパ球及び可溶性因子を含む免疫調節成分（免疫抑制成分）を含む細胞集団を提供する。臓器移植受容者内の臓器移植片に対する寛容を誘発するためのこのリンパ球及び因子の形成は、代理動物が発生により免疫能力を獲得する際に発生中の代理動物体内で受容者のリンパ球及び因子が発生する間に寛容が誘発されることにより生じる。受容者のリンパ球が免疫能力をもつ代理動物から受容者に戻されると、臓器移植受容者による移植臓器片の拒絶の可能性を減少させる。本発明の理解を助けるため、特定の態様を図面のフローチャートを用いて説明する。
図１は、本発明の一態様をフローチャートで説明するもので、リンパ球１１０は臓器受容者１９０からのものであり、該リンパ球は細胞毒性細胞及び因子の数が減少した細胞集団１２０を生じさせるように処理され、該細胞集団は一匹もしくはそれ以上の胎児代理動物１３０に注射される。続いて、臓器受容者の細胞を含む新生児代理動物１４０を誕生させ、免疫能力を有するキメラ代理動物１５０に生育させる。新生児１４０及び成熟１５０のキメラ代理動物は、好ましくはキメリズム、ＧｖＨＤの欠如、及び寛容について試験し、適する動物を選択する。キメラ代理動物からのリンパ球１６０は、寛容誘発性の細胞及び因子１７０を含み、これらは臓器受容者１９０に注射されて、該受容者１９０に代理動物１５０からその後移植される臓器１８０に対する寛容を誘発させる。
図２は、寛容を、臓器提供者である第三者に対する代理動物中で誘発させる、本発明の他の態様の説明である。臓器提供者２８５及び臓器受容者２９０の両者からのリンパ球始原細胞の混合集団を処理して、細胞毒性細胞及び細胞毒性因子が除かれた細胞集団２２０を製造する。この細胞集団２２０を一またはそれ以上の胎児代理動物２３０に導入する。キメラ代理動物２４０を誕生させそして免疫能力を持つ代理動物２５０に発育させる。新生児２４０及び成熟２５０のキメラ代理動物は、好ましくは臓器移植受容者細胞とのキメリズム及びこれら細胞の臓器移植片提供者２８５に対する寛容について、試験する。免疫能力を有するリンパ球細胞２６０は、免疫抑制成分２７０を有し、これらは臓器受容者２９０に戻されて、後に受容者２９０に移植されるべき第三者の器官２８０に対する寛容を誘発する。
図３は本発明のさらに別の観点を説明するもので、ここでは、細胞集団（臓器移植受容予定者３９０のリンパ始原細胞３１０に由来するもので、細胞毒性細胞３２０を減少させたもの）を、胎児代理動物３３０に投与し、この代理動物を免疫能力を有する個体３５０に発育させ、臓器受容予定者からの新鮮な細胞サンプルを一またはそれ以上の選択された代理動物３５０に投与する。第二の細胞集団３４５の投与は、代理動物中の免疫抑制細胞フラクションをさらに増大させ、該代理動物から後に得られるリンパ球３６０サンプル中の免疫抑制細胞及び因子３７０の量を多くする。細胞３４５の注入は、該キメラ代理動物内の免疫抑制成分の能力の試験にもなる。
一つの態様において、本発明は臓器移植受容者からのサンプルとして、多数の細胞、通常は末梢血細胞もしくは骨髄細胞を得、そして好ましくは該サンプルを処理して成熟Ｔ細胞を除去することからなる。処理されたサンプルは、免疫リンパ球、未成熟Ｔ細胞、幹細胞、造血細胞、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）について富化させてもよい。サンプル（好ましくは富化させたもの）を、代理動物が免疫欠損状態（たとえば発生における胎児段階）のうちに、該代理動物に注入する。好ましくは、サンプルは複数の代理動物に注入する。サンプルはリンパ始原細胞を含んでおり、これらは受容者の発達中のＴ細胞として複数の胎児代理動物中で培養される。
この複数の胎児代理動物は、発達した免疫能力を有する代理動物に発育する。代理動物が発育するにつれ、受容者のＴ細胞及びリンパ始原細胞から発達する受容者のリンパ球は、臓器移植受容者の抗原及び代理動物組織の抗原の両者に対して特異的な寛容をもつようにプログラムされる。発育した複数の代理動物各々から血液サンプルを採取し、臓器受容者（たとえばヒト）の細胞との移植適合性の程度を調べるため、及び各血液サンプル中のリンパ球の成熟の程度を調べるための試験を行う。発育した複数の代理動物の各皮膚サンプルの生検を行って、該皮膚サンプルについてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行ってもよい。
臓器移植受容者の細胞及び発育した複数の代理動物内の各細胞を、免疫寛容性、特に未処理の臓器受容者細胞の提供者抗原に対する反応を調節する能力について、試験する。臓器受容者のリンパ球は、発育した複数の代理動物の各々から得られ、通常は各代理動物の脾臓、血液またはリンパ組織から得られる。リンパ球を試験して、臓器提供者（すなわち代理動物提供者または第三者提供者）から以前に得られた（または臓器提供者と抗原的に同一の）照射された細胞に対する、新鮮な臓器移植受容者のリンパ球による増殖反応の抑制を調べる。免疫抑制（寛容）の試験工程の結果に応じて、複数の発育した代理動物内から、臓器受容者に対して免疫寛容な個体を選択する。
この方法は、好ましくは、選択された各代理動物内で、新たなリンパ球の移植により誘発されるＧｖＨＤを試験して、プログラムされたリンパ球により与えられる寛容の程度を調べることも含む。たとえば、新鮮なリンパ球を臓器移植受容者から取り出し、選択された各代理動物に注入する。代理動物中に入れた臓器受容者のリンパ球及び因子が代理動物の組織に寛容であり、新鮮な臓器受容者細胞の代理動物に対する免疫反応が抑制されるなら、新たに注入された臓器受容者リンパ球によるＧｖＨＤは抑制される。そのように新鮮な受容者のリンパ球を注入することは、適する代理動物内において、ヒトＴ細胞、ヴィトー細胞及び抗イディオタイプ抗体の集団の増大ももたらす。ＧｖＨＤの試験の後、そして代理動物が生産した受容者のリンパ球を受容者体内に注入してもどす前に、本発明の方法は先に選んだ適する代理動物から、免疫抑制成分の好ましい供給源及び所望により移植臓器の好ましい供給源として用いるに最適な代理動物を選択することを含んでもよい。
提供者に対する受容者の免疫反応を抑制する受容者の細胞が移植された、キメラ代理動物を突き止めたならば、該代理動物から受容者に対する細胞の養子移植を行う。代理動物から臓器移植受容者へ受容者リンパ球を注入して戻す工程の前に、本発明の方法は、臓器移植受容者の天然抗体を除去することにより（たとえば、プラズマ透析及び脾摘出）、および／または臓器移植片の超急性拒絶反応を阻止するために可溶性の補体リセプターを注入することにより、臓器移植の準備をする工程を含んでもよい。
ヒトリンパ球を臓器移植受容者に注入して戻した後、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、発育した代理動物組織の抗原に対する臓器移植受容者の寛容の程度を確認する工程を含んでもよい。代理動物の抗原に対する臓器移植受容者の特異的免疫寛容は、本明細書に記載したようなアッセイを用いて確認可能である。代理動物から細胞の注入後に得られた新鮮な臓器移植受容者のリンパ球が、一つまたはそれ以上の生育した代理動物の細胞の増殖反応を抑制するか調べ；そして抑制が最も大きいことを基準として最適の代理動物を選択する。更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、代理動物の細胞に対する臓器移植受容者の免疫寛容を確認する。
代理動物または可能な提供動物のプールから、異種移植受容者のために移植片を得るために、最適の選択を行う。異種移植受容者は移植の準備として、発育した代理動物に対する天然抗体を除去することにより移植を可能にしてもよい。移植臓器（好ましくは最適供給源と決定された発育した代理動物から得られる）を次いで臓器移植受容者に移植する。
本明細書に記載する代理寛容形成は、三つの基本的な相または成分を含んでいる：
１．臓器移植受容者のリンパ球及びＡＰＣを少なくとも一つの代理動物に、通常は複数の代理動物に移入する；
２．代理動物体内での寛容の発生をモニターし、最適の代理動物を選択し；そして
３．前記最適の代理動物から臓器移植受容者へ、寛容リンパ球及び因子を養子的に移入し、及び通常は対応する臓器移植を行う。これら三つの相を詳細に説明する。
代理動物への臓器受容者細胞の移入
最初の要件は臓器移植受容者のリンパ球及びＡＰＣを複数の代理動物に注入により移植する、好ましい態様においては、臓器受容者のリンパ球及びＡＰＣは、胎児代理動物に注入することである。造血幹細胞、骨髄または血液を、胎児動物の腹腔内または胸腺に注入するが、注入は代理動物の妊娠期間の最初のトリメスター（１／３）の終期または第二トリメスターの間に行うのが適当である。好ましくは、骨髄または血液は反応性Ｔ細胞を部分的に枯渇させたものである。
代替方法は、代理動物に骨髄移植を行うことを含む。代理動物に致死量の全身照射を行うか、または高用量の化学療法を施して、代理動物の免疫システムを破壊する。臓器受容者のリンパ球及びＡＰＣは、好ましくはＴ細胞の部分枯渇処理または造血幹細胞の富化を施しておく。この処理もしくは富化したリンパ球及びＡＰＣを次に代理動物に注入する。
注入物から臓器受容者のＴ細胞の数を減少させることは、代理動物に致死的な移植片対宿主病を避け、または臓器提供者の細胞に対する拒絶を避けるために、いずれのアプローチでも必要であろう。最も好ましくは、注入物中には十分なＴ細胞を回復させもしくは残存させて、移植に対する抵抗に打ち勝つようにする必要がある。一般に、元のＴ細胞数の約２５％ないし５０％で十分であろう。好ましくは、注入物は、代理動物の体重１kg当たり（kg b.w.）約０．１ないし４×１０8個のＴ細胞、最も好ましくは約１ないし２×１０8個のＴ細胞／kg b.w.を含有する。
胎児動物においては、臓器受容者からのまたは臓器提供者及び受容者の各々からの少なくとも約１×１０8の有核細胞／kg b.w.または１×１０2の幹細胞／kg b.w.を投与すべきであり、そして好ましくはこの細胞数の１０ないし１００倍を胎児に投与すべきである。照射した代理動物においては（骨髄移植ＢＭＴにおける場合）、臓器受容者からの１×１０8の有核細胞／kg b.w.または１×１０2幹細胞／kg b.w.を注入すべきであり、そして好ましくは、この数の１０ないし１００倍の細胞ならびに代理動物の造血細胞の全体の約１０％を構成する混合物を代理動物に投与すべきである。第三者ＢＭＴにおいては、臓器提供者及び臓器受容者の両方からの１×１０8の有核細胞／kg b.w.または１×１０2幹細胞／kg b.w.を注入すべきであり、そして好ましくは、この数の１０ないし１００倍の細胞ならびに代理動物の造血細胞の全体の約１０％を構成する混合物を代理動物に投与すべきである。
代理動物体内の臓器受容者細胞の増殖及び分化は、代理動物への注入前に、該臓器受容者細胞を成長因子中でインキュベートすることにより、適当に増強できる。たとえば、細胞を組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、成長ホルモンまたはインシュリン様成長因子と共にインキュベートすることができる。細胞はこれらの因子の混合物とインキュベートしてもよい。細胞はヒト胎児胸腺のような胎児組織から得られる因子または生産物とともにインキュベートしてもよい。別の方法として、選択した成長因子または阻害因子をキメラ代理動物に投与してもよく、その際、選択した成長因子は臓器受容者に対して種特異的なもので、阻害因子は代理動物に対して種選択性のものである。
最初の要件の主要なゴールは、胎児代理動物への子宮内誘発による又は骨髄移植個体である代理動物による、臓器移植受容者の免疫システムを代理動物の抗原（または臓器提供者の抗原）に対する寛容を生じるために必要な抗原特異的調節細胞及び因子の誘発である。抗原特異的調節細胞及び因子は、臓器提供者の細胞に対して分化した臓器移植受容者のリンパ球及び因子が反応することを阻害または禁止することを可能にするためのものである。したがって、抗原特異的寛容の誘発は、サプレッサーＴ細胞または調節Ｔ細胞及び関連因子、ヴィトー細胞、エンハンスメントファクター及び抗イディオタイプ抗体の発生を助長する。
抗原特異的寛容の誘発を達成するためには、ＧｖＨＤの出現なしに、代理動物内における臓器移植受容者のリンパ球及び抗原提示細胞の長期生存を図る必要がある。
下記の受容者は本発明の好ましい態様を説明するものであり、臓器移植受容者はヒトの臓器移植予定者であり、代理動物は胎児ブタである。
実施例１
４５０mlユニットの末梢血液を器官移植片受容者から除く。または１ユニットの骨髄（20ml）を吸引除去することができる。濾過した後、得られた細胞を遠心し、細胞の最上層（バフィコート）を得る。バフィコートはリンパ球および抗原提示細胞を含んでいる。赤血球細胞および死んだ細胞を除くため、細胞をフィコール-ヒパークを使って遠心する。代理動物中の致死的なGvHDを防ぐために、Ｔ細胞を懸濁液中から部分的に枯渇させる。これはT.M.クロンブレホーム、M.R.ハリソン、E.ザンジャニ，J.Pcd.Surg，25:885-892，1990、で議論されているように、ウサギの抗ヒトＴ細胞抗体および仔ウサギの補体を用いて行う。または、細胞の一部を、CD4およびCD8に対するビオチン化抗体とともにインキュベートした後に、アビジン結合ビーズ（CellPro，Inc.）からなる細胞分離カラムに通す。移植の成功を高めるために、好ましくは器官移植片受理者由来の付加的なＴ細胞を懸濁液に戻し、Ｔ細胞の最初の数の25%-50%、または0.1から4×108Ｔ細胞/kgになるまで加える。その懸濁液を、抗原提示細胞を含む造血細胞の増殖を高めるために、ヒトの組換え体IL-3およびGM-CSFとともにインキュベートする。その懸濁液を、組換え体ヒトIL-7因子、およびソマトメジンＣとしても知られるインシュリン様増殖因子Ｉを含む、始原Ｔ細胞および胸腺細胞の増殖を高める付加的な増殖因子を用いてＴ細胞を生ずるようにインキュベートする。
正中線切開は妊娠第一期または第二期に時期を調節して妊娠させた雌豚で行い、一般に第二期は３８から７６日に起こる。好ましくは切開は４２から５４日の間に為される。子宮は外側に向けられる。超音波による案内で、処理した細胞を同定した胎児の豚の腹壁腔に注入する。注入した細胞の数は、胎児の推定体重のキログラム当たり1×108から1×1010の核細胞にするのが好ましい。所望により、注入された胎児の豚を標識するために放射線不透過性染料が懸濁液中に含まれる。
生後２ヶ月までの間は、代理動物はキメラ化、GvHD、および、器官移植片受容者細胞および代理動物の抗原への寛容をモニターされる。代理動物の中から最良または最適な代理の豚を選択し、その最良の代理の豚から器官移植片受容者細胞および因子を集める。
実施例２
代理の胎児の中で器官移植片受容者細胞を培養するのが実行不能であったり、うまくいかないような場合には、代わりに細胞を代理動物の骨髄およびリンパ組織を多量投与の化学療法または全身照射によって抹殺した後に、その代理動物の中で培養することができる。骨髄移植はより高い程度のキメラ化、およびおそらくより短い待ち時間であるという利点を含んでいる。骨髄移植は短い懐胎期間または急な発育を必要としないので、骨髄移植はヒト以外の霊長類を含む他の代理の種に容易に用いることができる。骨髄移植の欠点としては、より大量の器官移植片受容者細胞を必要とすることが含まれ、その結果、一定量の器官移植片受容者細胞としてより少ない処理可能な代理動物しか生じない。そのため、最良または最適な代理動物の選択のため、より少ない代理動物しか生じない。
血液または骨髄を器官移植片受容者から先に記載した方法により集め、処理した後、生後３ヶ月に満たない代理の子豚は、全身照射；例えば分画投与で137Cs源から1000R、または多量投与の化学療法；例えば200mg/kgのシクロホスファミドおよび16mg/kgのブスルファン、によって処理する。照射または化学療法の完了から１日後、器官移植片受容者由来の処理した細胞を2×108から2×1010細胞/kgの量で代理の豚に静脈注射で注入する。所望により、器官移植片受容者細胞を照射または化学療法に先だって回収した豚の細胞と、器官移植片受容者細胞が代理動物の細胞に対して１：１から１０：１の割合で混合する。器官移植片受容者の骨髄の代理動物への移植に続いて、代理動物をシクロスポリン、FK506、ラパマイシン、シクロホスファミド等を含む、GvHDを防ぐための免疫抑制剤の短く連続した少量投与で処理する。寛容の発達はソマトメジンＣとしても知られているインシュリン様増殖因子Ｉを含む、後薬剤増殖因子で高められる。サプレッサー細胞および因子を含むキメラ化、寛容、およびGvHDの欠失は以前に記載されたようにモニターする。一般に骨髄移植後１から６ヶ月だが、抗原特異的寛容が確立したとき、適した代理動物を選択する。器官移植片受容者細胞を回収し、器官移植片受容者に戻す。器官移植片受容者内での寛容を確認後、代理動物の器官移植片を除き、器官移植片受容者に移植する。
実施例３
ヒトを代理動物として利用することは実用的でも道徳的でもないが、ヒト以外の代理動物を、器官移植片受容者由来の細胞同様、予定される第三者のヒトの提供者由来の骨髄、リンパ球および抗原提示細胞を培養し、インキュベートするのに利用することができ、それによって、器官提供者の細胞および器官受容者の細胞が、次に代理動物由来の培養した器官移植片受容者のリンパ球および因子を器官移植片受容者に戻す前に、相互の寛容を発達することができる。これの後に提供者の器官が移植されるであろう。
予定された器官移植片受容者および未同定の提供者由来の血液または骨髄を回収し、先に記載したように処理する。器官移植片受容者および器官提供者由来の細胞は、器官移植片受容者細胞が提供者細胞に対して１：１から１０：１の割合で混合し、混合した細胞は胎児の代理動物に注入するか、または代理動物の細胞と混合して化学療法または全身照射した後に代理動物に注入する。その後、代理動物の、器官移植片受容者細胞のキメラ化、および器官移植片受容者細胞および因子の第三者の器官提供者の抗原に対する寛容をモニターする。代理動物に対するGvHDは器官移植片受容者の細胞と第三者の器官提供者の抗原との寛容の発達には無関係である。
実施例４
代理の器官提供者のすべての兄弟姉妹に対する免疫寛容は、器官受容者のリンパ球前駆細胞に加えて、可能な器官提供者の母親および父親由来の白血球を代理動物に注入することによって達成される。兄弟姉妹はどちらかの親から派生した組織適合抗原を発現するので、両親に対する寛容は同様に兄弟姉妹のいずれに対する寛容も供給する。一例として、注入時にはそれぞれの親豚由来の1×107から1×1010リンパ球/kg体重を、器官受容者由来の1×107から1×1010リンパ球/kg体重と一緒に胎児の豚に注入する。注入を受けた代理動物に対する器官受容者細胞、他の親の細胞、または移植細胞対宿主病の拒絶を防ぐように、所望により親の細胞を照射する（500から4000rad、最適には1500rad）か、またはＴ細胞の数を減らす。次に、注入された代理動物が同じ親をもつならばその一腹の子の他のメンバーから、または同じ両親から以前に産まれた子から、またはその両親が注入された代理動物と無関係ならばその代理動物に無関係な一腹の子のメンバーから移植器官を使用する。
すべての両親の抗原に対する寛容の誘導により、二つの実用的な利点が供給される。最初にこれによって一腹の子由来の組織を貯蔵することが可能になる。例えば、糖尿病治療のためのランゲルハンス島の移植の成功の鍵を握る主要な要素は、典型的に非常に僅かなランゲルハンス島しか一人の提供者から回収できないことである。しかしながら一腹の子のすべてに対する寛容が確立されると、多くの、またはすべての子由来のランゲルハンス島を貯蔵することができ、これによって、移植の成功に十分なランゲルハンス島を供給し、患者をインシュリン非依存性にすることができる。
第二に、すべての両親の抗原に対する寛容によって、成熟した代理器官提供者の以前に産まれた一腹の子から器官を移植することができる。代理動物が器官提供者であるという発明の具体案では、代理動物が、腎臓または心臓のような異種移植片が器官受容者にとって十分大きいほど十分に成熟するまで移植を遅らせるに違いない。豚では、寛容成立期に両親の抗原を用いることによって、待つ期間を６または７ヶ月からちょうど２または３ヶ月に減らすことができる。
同様に、おそらく霊長類も代理動物または提供者として利用することができるだろう。代理動物が器官提供者であるという具体案では、ヒト以外の霊長類は成熟に多くの年月を要し、そのため、それを非実用的にしている。しかしながら両親の抗原に対する寛容を誘導することによって、待つ期間を数カ月に減らすことが可能であろう。例えば、成熟したヒヒの母方および父方の親由来の細胞は器官受容者の細胞と一緒に胎児の豚に注入することができる。その豚の誕生後、サプレッサー細胞および因子を豚から回収し、器官受容者に移す。それから、親のヒヒの成熟した子供たち由来の器官は器官受容者に移植することが可能である。
両親の細胞を注入することでF1世代に寛容を誘導することによって、動物の近交系を用いるよりも実用的な利点がいくつか提供される。異系交配動物は一般に近交系動物よりも強壮である。豚の近交系も存在するが、ヒト以外の霊長類のような高等動物の近交系は存在しない。
一個体以上からのリンパ球前駆細胞（例えば、提供者および受容者、提供者の両親、または受容者の種の多くの組織の型を示す動物の組み合わせ、に由来するリンパ球前駆細胞）が代理動物に注入されるところでは、様々な個体に由来するリンパ球前駆体細胞の集団は実質的に同時発生的に注入されるはずである。このような状況においては、代理動物がまだ免疫不全の状態である間に注入のすべてが行われるならば注入物は実質的に同時発生的であればよいが、典型的には様々な前駆体細胞集団が実質的に連続的な注入において連続的に注入されるか、またはその細胞達が注入前に一緒に混合され、このように同時に注入される。
代理動物の発育をモニターすること
代理動物の寛容成立の第二の要素には、代理動物内でのキメラ化および寛容のモニター、および多くの代理動物の中から最良または最適な代理動物の選択が含まれる。胎児の培養または骨髄移植に続いて、代理動物はキメラ化の確立のためにモニターされる；すなわち、器官提供者抗原に対するリンパ球細胞および因子の寛容同様、代理動物内での器官移植片受容者由来のリンパ球細胞および因子の増加および成熟がモニターされる。寛容的なリンパ球および因子を供給したり、最も適した因子を供給したりするための最良または最適な代理動物のキメラを選択するのに利用される分析は、当業者に容易に明らかであろう。後に述べられている分析の中から分析を選択することができる。
モニターには代理動物内でのキメラ化の度合いの定量が含まれる；すなわち、代理動物内での器官受容者細胞の相対数、および器官受容者細胞の代理動物の抗原に対する寛容のモニター。キメラ化はフローサイトメトリー、および代理動物および器官受容者の種に特異的な抗体を用いて容易に分かる。例えば代理動物が豚ならば、豚のリンパ球およびヒトのリンパ球の相対数を調べるため、豚の血液および骨髄が検索されるだろう。抗体には、豚のCD45、CD2、CD3、CD8、および豚の表面イムノグロブリン同様、ヒトのCD45、CD2、CD3、CD5、CD7、CD19、HLA-DR、HLA-ABC、CD45RO、CD45RA、CD4、CD8、CD34、およびCD31に対するモノクローナル抗体が含まれる。キメラ化の度合いはまた、胸腺、脾臓、およびリンパ節を含むリンパ組織で定量する。好ましい具体案では、本発明の方法には器官移植片として利用できる器官内でのキメラ化の度合いの決定が含まれる。これらの研究には、ヒトのファクターVIII、樹状細胞、CD45、CD4、CD8、CD2、CD5、HLA-DR、およびHLA-ABCに対する抗体を用いた生検組織の免疫アルカリホスファターゼ染色のような免疫組織化学を含んでいる。
代理動物内で培養された器官受容者細胞の代理動物器官および組織に対する免疫寛容は、様々な方法でモニターできる。免疫寛容をモニターする一つの方法は、移植予定の代理動物の組織の生検、および受容者細胞による拒絶反応の証拠としての代理動物組織の特徴付けを含む。皮膚、肝臓、および腸のような代理動物の他の組織もまたGvHDの証拠として調べられる。モニターの別の方法には寛容の試験管内テストがあり、試験管内テストには混合リンパ球培養（ＭＬＣ）およびサプレッサー細胞分析が含まれる。そのような試験管内テストでは、培養リンパ球は、照射された代理動物または器官提供者の刺激細胞に対して新鮮な器官受容者の応答細胞のＭＬＣに加えられる。いくつかの異種移植のペアでは、限られた増殖を示し、このため、前細胞傷害性Ｔリンパ球での減少を確立するためには希釈分析が必要である。モニターの付加的な方法として、フローサイトメトリーの利用、およびサプレッサー細胞としての表現型を用いてリンパ球の相対的な定量を提供する免疫組織化学の研究がある；例えば、CD31に対する抗体が使用できる。器官移植片受容者細胞はまた、代理動物または器官提供者の抗原に応答するリンパ球に対応したＴ細胞受容体の再編成の減少をモニターすることもできる。
寛容の発達のために代理動物を利用することによって、免疫寛容を査定する新しい生化学的定量法の機会が提供される。生化学的定量法として代理動物を用いることの利点には、代理動物から受容者への器官移植片の移植に先立って、代理動物内での免疫寛容の度合いの査定がある。キメラの代理動物に器官移植片受容者から新鮮なリンパ球を移植し、もしもそのキメラ動物が本当に寛容であるならば、制御細胞および因子は、新鮮なリンパ球が予定された移植片受容者のGvHDまたは免疫拒絶を引き起こすのを防止する。代理動物を用いる上記の生化学的定量法は、”免疫の挑戦”として注目される。その挑戦に続いて、慣例的にGvHDによって傷害を受けた組織に生化学的定量が行われる。寛容の発達のモニターの他に、その挑戦によって制御細胞の増大を活性化する程のさらなる利益がもたらされる；例えば、付加的なサプレッサーＴ細胞の発達が活性化される。
代理動物もまた器官移植片の元であるならば、キメラ化の分析および細胞懸濁液中でのキメラ化の測定は代理動物で行う。キメラ動物の生後-1から120ヶ月（好ましくは０から４ヶ月）、または骨髄移植後1から120ヶ月（好ましくは１から７ヶ月）に血液および骨髄の標本を代理動物から回収する。好ましくは、標本の豚皮脂を単離し、細胞を器官移植片受容者の種のCD45に特異的な抗体で染色する。キメラ化の度合いは分析的なフローサイトメトリーを用いて定量する。Ｔ細胞の成熟の証拠を、一方が陽性の細胞にはCD4およびCD8の二重標識フローサイトメトリー、およびCD3の発現を利用して確立する。サプレッサー細胞としての表現型をもつＴ細胞は、CD31および所望によりLeu15に対する抗体で定量する。Ｂリンパ球の成熟はCD19およびCD21で分析し、マクロファージはCD14およびCD11bに対する抗体で分析する。最良または最適の代理動物にはリンパ節の生検の細胞懸濁液をつくることによって、および脾臓の細針吸引物をつくることによって付加的な研究がおこなえる。所望により、キメラ化は細胞遺伝学および制限断片長多型（RFLP）を用いて細胞懸濁液で査定できる。
キメラ化を確立し、GvHDおよび移植組織に対する免疫応答を防ぐために、代理動物組織への免疫病理がおこなわれる。皮膚、肝臓、腸、気管支粘膜、胸腺、リンパ節、脾臓、および/または予定された移植片由来の他の組織の生検に免疫病理学的研究がなされる。これらの標的組織は染色され、GvHDまたは器官移植片受容者対代理動物の傷害を示す細胞傷害が見積もられる。
器官移植片受容者の種の細胞のサブグループに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学によりリンパ節、脾臓、および胸腺の生検でキメラ化を確立できる。一般に、成熟Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を同定するために、CD45、CD4、CD8、CD3、CD19、CD21、CD31、パーフォリン、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-ABC、CD14、CD11b、およびCD1に対するマウスのモノクローナル抗体が通常用いられる。CD1はまた、胸腺の樹状細胞および皮膚のランゲルハンス細胞も同定する。器官移植片受容者の種のファクターVIIIに対する抗体は、典型的に器官移植片受容者の細胞で内皮細胞の再構成を同定する。組織切片は典型的には一次抗体とともにインキュベートし；洗浄し；二次抗体；例えば、ビオチン化したウマの抗マウスイムノグロブリンとともにインキュベートし；アビジン-ビオチン複合体分析を用いて現像する。免疫蛍光染色は器官移植片受容者の種のイムノグロブリン、または器官移植片受容者または代理動物の種の補体の付着物に対しておこなう。
異種移植片に対する寛容の検査が通常行われる。例えば、寛容の試験管内検査がおこなわれ、混合リンパ球反応およびサプレッサー細胞分析によって確立される。末梢血、脾臓、およびリンパ節は、代理動物から回収された照射された刺激細胞に対するワンウェイMLCで調べる。増殖は典型的には、６日後にトリチウム標識したチミジンの取り込みで分析する。寛容の度合いは、代理動物の刺激細胞に対して新鮮な器官移植片受容者のリンパ球のMLCと比較した増殖の減少に比例する。異種移植のMLCはしばしば同種免疫応答よりも弱いが、標的に対する傷害性リンパ球前リンパ球の数は同等である。そのために制限する希釈分析は代理動物の抗原に対する前傷害性細胞（ＣＴＬ）の数を証明するのに用いられる。寛容した器官移植片受容者の細胞は、新鮮な器官移植片受容者の細胞に比べて、前ＣＴＬが減少する。
代理動物の抗原への応答を制御し、特異的に阻害するためのリンパ球および血漿因子の存在は、傷害性細胞の減少よりも重要である。サプレッサー細胞分析は、典型的には、代理動物から得られた器官移植片受容者の細胞が、先に記載したように新鮮な器官移植片受容者の細胞対照射された代理動物の刺激細胞のMLCを阻害する相対的な能力を調べるのに用いられる。例えば、代理動物のキメラから得られ、抗体および補体の方法によって代理動物の細胞を枯渇させたリンパ球は、MLCに加えられ、増殖の減少が測定される。制御細胞の絶対数はサプレッサー細胞分析に対しての限定希釈法を用いて測定される。代わりに、代理動物が器官移植片の元であるならば、抑制は、新鮮な受容者のリンパ球とキメラの代理動物の細胞とのツーウェイのMLCで観察される増殖と受容者対キメラの代理動物細胞およびキメラの代理動物対受容者の細胞のワンウェイのMLCの総数の比較により査定できる。
同様に補体を減じたキメラ由来の血清を、ＭＬＣ反応を効率的に減衰させる可溶性因子が存在することを確認するためにＭＬＣに添加する。代理動物の血清および器官移植片受容者の細胞の適合試験を、器官移植片受容者の細胞の破壊によって生じる減少を除外するために遂行する。
拒絶を防ぐための器官移植片受容者のリンパ細胞および因子の能力は、また、組織の外植測定（explant assay）を使用して試験する。典型的な測定では、意図した移植片のバイオプシーを、代理動物からとってきて、１ｍｍのスライスに切断し、組織培養する。３日目のＭＬＣ由来のリンパ細胞を、１−２日間組織断片とともに共培養する。それから断片について、拒絶の形跡を組織学的に評価する。または、添加するリンパ細胞を放射ラベルし、オートラジオグラフィーを使用して、標識を付けたリンパ細胞の取り込みを、標本切片中のラベルされた細胞の数を数えることによって決定した。新鮮な器官移植片受容者のリンパ細胞対代理動物の刺激細胞のＭＬＣおよび代理動物のリンパ細胞対代理動物の刺激細胞のＭＬＣを含むコントロールの測定を、実施する。サプレッサー試験では、代理動物キメラ由来の血清因子または制御細胞をＭＬＣに添加する。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける寛容試験は、代理動物中での寛容の発達を利用し、および代理動物キメラ中における免疫寛容のテストをする通常の測定法を使用して実施される。寛容に付いてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、代理動物キメラを比較する基準を提供し、また、さらに広く寛容に関与する制御細胞および因子についての意義を提供する。
代理動物の出生後または骨髄移植後（通常１から４ヵ月）、代理動物の血液および骨髄を、好適にはキメラ性について調べ、および代理動物の組織に対する免疫反応を除外するためにバイオプシーを行なう。典型的には、代理動物の体重１ｋｇに対して２Ｘ１０8から２Ｘ１０10個のリンパ細胞量であるの新鮮な末梢血液リンパ細胞を、代理動物キメラ中に静脈注射する。全ての末梢血液リンパ細胞の数および器官受容者の細胞とのキメラの程度は、１時間後に決定する。５日から１４日後に、代理動物は再び、ＧｖＨＤおよび意図した移植組織片に対する免疫反応の形跡をみるためにバイオオプシーを行い、すべてのリンパ細胞の数およびキメラ性を再び決定する。チャレンジテストが成功していたら、代理動物はＧｖＨＤまたは移植損傷の形跡は示さない。代理動物は、末梢血液の器官移植片受容者のリンパ細胞の数が増大している。
上述の手法は、意図する移植組織片が代理動物のものである場合に適用できる。代理動物が移植片の源である場合には、キメラ性についての測定は、一般に胎児中に確立された代理動物キメラは骨髄移植から作製した代理動物キメラと同様である。一方、意図する器官移植片受容者および第３の器官供与者由来のリンパ細胞およびＡＰＣを、混合して代理動物中で培養し、それからキメラ性および寛容を評価するのに異なる手法が必要となる。代理動物が器官移植片受容者および第３の器官供与者間の寛容を発達させるのに使用される場合には、胎児で確立された代理動物キメラの測定法は、骨髄移植によって生じた代理動物キメラの測定法とは異なる。
典型的に、器官移植片受容者の免疫体系を培養している代理動物および将来の第３の器官供与者の抗原間のキメラ性および寛容を決定する。未来の器官移植片供与者の細胞および器官移植片受容者の細胞を混ぜて、第３の代理動物中に培養した場合、代理動物が胎児でも骨髄移植後でも、代理動物に対する器官移植片受容者の細胞の反応は、ほとんど関連がない。器官供与者および器官移植片供与者が同一種の場合は、２つの細胞集団は、通常、分化する。
将来の器官移植片供与者および器官移植片受容者の性が異なる場合には、男性および女性の細胞の相対的な数は、細胞の遠心してスライドグラス上に載せた細胞について蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して確立する。リンパ細胞集合（サブセット）の成熟については、細胞を遠心して二重にラベルを施した免疫組織学を使用して決定される。従って、ＣＤ３，ＣＤ４またはＣＤ８陽性の将来の器官移植片供与者または受容者に基づく男性または女性細胞の相対数を、決定する。
または、将来の器官移植片供与者および器官移植片受容者のＭＨＣの相違が検出可能であれば、個々のＭＨＣマーカーに対する抗体および特異的な抗原を使用して、二重にラベルしたフローサイトメトリーまたは免疫組織学を、キメラ性および成熟の相対的な程度を決定するのに使用される。
混合リンパ細胞反応は、放射線処理した新鮮な器官移植片供与者の刺激細胞に対する器官移植片受容者のリンパ細胞の反応（代理動物および将来の器官移植片供与者の細胞の放血）を試験する。代理動物および器官移植片供与者の細胞は、抗体および補体法または抗体及び免疫的磁気ビーズを使用して細胞懸濁液より放血する。新鮮な器官移植片受容者の細胞および代理動物中で培養している器官移植片受容者の細胞を制限希釈測定アッセイすることにより、細胞傷害性の前駆体細胞を確実に減少させていることを確認する。
サプレッサー細胞およびサプレッサー因子測定により、キメラの器官移植片受容者の細胞による、新鮮な代理動物の刺激細胞に対する、新鮮な器官移植片受容者のリンパ細胞によるＭＬＣの阻害を試験する。
遂行された測定および試験により、代理動物に対する寛容の確立と同様に将来の器官移植片供与者および器官移植片受容者の細胞の両方の存在が示されれば、免疫チャレンジテストを実施する。典型的な免疫チャレンジテストにおいては、新鮮な器官移植片受容者の細胞が代理動物中に注入される。１時間後に、代理動物の血液を、器官移植片受容者の細胞型および器官移植片供与者の細胞型の全細胞数を数えることによって試験する。５日から１４日後、代理動物の血液を再び器官移植片受容者の細胞型および器官移植片供与者の細胞型の全細胞数を数えることによって試験する。試験が成功であれば、器官移植片受容者の細胞および代理動物の細胞は両方保持されるが、器官移植片受容者の細胞型の全細胞数は増加している。寛容に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験により、器官移植片受容者の細胞は器官供与者の抗原に対して寛容であることが示される。
寛容因子の転移
第３の要件は、器官移植片受容者の細胞および因子を代理動物から得、そして好適には任意にキメラおよび代理動物の抗原に対する器官移植片受容者の細胞の寛容に基づき最適な代理動物を選択した後で、寛容を提供するリンパ細胞および因子を濃縮する。リンパ細胞および可溶性因子は、血液、血清、骨髄、脾臓、リンパ節、および／または他のリンパ組織を含めて代理動物から単離する。骨髄、脾臓、リンパ節、および／または血清を、選択した代理動物から無菌的に取り出す。リンパ組織は、通常リンパ細胞の懸濁液を作製するのに金網のメッシュを通す。好適には、混合懸濁液を遠心し、バフィコート（軟層）を保存する。
キメラ代理動物からリンパ細胞を得た後、リンパ細胞を含む細胞集団は、好適には患者に移植する前に器官受容者の細胞を濃縮しておく。細胞および因子の集団の豊富化は、抗体および補体法、磁気ビーズに付着した抗体、または親和性カラムを使用して成し遂げられるが、代理動物細胞のほとんどを除去することによって器官移植片受容者の細胞および因子を有意に濃縮する。器官移植片受容者の細胞がキメラのうちの少量の成分である場合には、器官移植片受容者のリンパ細胞に対する抗体および免疫磁気ビーズを使用して正に選択することも可能である。あるいは、器官移植片受容者のリンパ細胞を保持した免疫吸着カラムが使用可能である。代理動物の細胞は通過する一方で、受容者の細胞はカラムに保持される。続いて、器官移植片受容者の細胞は、カラムから溶出される。
濃縮は、ブタＣＤ４５のような代理動物リンパ細胞に特異的な抗体、および代理動物リンパ細胞を破壊する補体を付加することによって遂行される。あるいは、細胞懸濁液を代理動物リンパ細胞に対する抗体および免疫磁気ビーズで処理する。それから、代理動物細胞に付着したビーズを、磁気によって除去する。抗代理動物ＣＤ４５抗体が付着した吸着カラムもまた、代理動物細胞を除去できる。代理動物細胞が器官移植片受容者の細胞と、例えば細胞密度のような物理的な特性において異なる場合には、代理動物細胞はエルトリエーターによる遠心によって分離できる。
しかし、もっと簡単な分離法は、遺伝学的に処理した代理動物を使用してなされる。代理動物の細胞は、細胞培養液中にて定められた不都合を持つように遺伝的に修飾することが可能である。そうすれば、代理動物の細胞は、短い培養時間後に抑圧される。例えば、一般に使用されるマーカー遺伝子であるチミジンキナーゼ（ＫＴ）を、ブタ卵中に注すると、ＫＴ＋の系統のブタが生まれる。ＫＴ＋細胞は、抗生物質のガンサイクローバーに感受性である。ヒト細胞はＫＴを生産しないので、ガンサイクローバーに耐性である。キメラ細胞を遺伝的に修飾した代理動物から得たときに、それらをガンサイクローバー存在下にて培養する。薬剤は、代理動物の細胞を殺すが、器官受容者の細胞は殺さないので、サプレッサー細胞を含む器官受容者の細胞混合物が濃縮される。
それから、濃縮した免疫的な寛容を伝達するのに関わるリンパ細胞および因子を、器官移植片受容者中に注入する。最低限の細胞数が注入には必要で、その細胞数は典型的に、免疫が欠陥した代理動物中に注入した数と同数である。好適には、器官移植片受容者の体重１ｋｇに付き５Ｘ１０8から５Ｘ１０10個の範囲の器官移植片受容者の細胞が、回収および濃縮によって得られる。得られたリンパ細胞および因子を評価するのに、上述した免疫寛容のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を使用できる。
器官移植片受容者の調製が、移植に対する寛容を獲得するために濃縮したリンパ細胞および因子の注入に先だって必要である。移植に対する抵抗性耐性の問題もまた存在し、これは遺伝的に変換した細胞で処理した器官移植片受容者中で解決される。リンパ細胞および因子が抗原的に器官移植片受容者と同等であっても、リンパ細胞および因子は注入した部位に局所的に植え込まれただけで終わるかもしれない。局所的な移植は、致死量に近い量の化学療法、全リンパ細胞に放射線をあてたりまたは全身に放射線を当てたりすることによって克服される。
状況によっては、器官移植片受容者は、代理動物から得た器官移植片受容者の細胞を転移する前に処理が必要であり、処理には代理動物由来の培養した細胞による器官移植片受容者への再移植を可能にする治療（例えば、化学療法または致死量に近い放射線照射）を含む。代理動物および器官移植片受容者が不和であれば、即ち、器官移植片受容者が代理動物組織に対する抗体を本来保持していれば、代理動物組織に対する過敏な拒絶を防ぐためにさらなる治療が必要である。プラズマフェレシス（血漿搬出法）、脾臓切除術、コブラ毒因子、および／または可溶性補体受容体が、さらなる治療に使用される。これらのさらなる治療は、一般に移植時に受容者中に循環している因子に直接向けられる；代理動物から器官移植片受容者に戻された細胞および因子は、後にこれらの因子の同様の発達を阻害するかも知れない。
ヒトは、不和な動物細胞の表面タンパク質上に発現しているオリゴサッカライドおよび脂質と反応する循環している天然の抗体を高濃度にもっている。代理動物への寛容が生じることによって、受容者による代理動物器官の細胞レベルの拒絶を防ぐけれども、予め存在する抗体は器官移植に先だって受容者から除去されている必要がある。最近、遺伝的手法が、器官移植により適した動物を作製するために適用されている。
例えば、ヒト崩壊活性化因子（human decay activating factor:ＤＡＦ）は、多数の遺伝子処理したブタによって生産されている。ブタ卵の中にヒトＤＡＦを挿入すると、予め存在する抗体に対してより耐性のある多数の動物が得られる。これは、天然の抗体の結合およびヒト補体の活性化によって引き起こされる異種移植器官の破壊を減少する。
不和な動物細胞上のオリゴサッカライドの発達に関与するアルファガラクトシルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を、不和な動物は生産するけれども、ヒト、尾なしサルおよび旧世界サルは、この酵素を有意な量生産できない。この欠陥は、ＡＧＴに関するＤＮＡ中の変異によるものと信じられている（ガリリ、ＳＰＲＩＮＧＥＲ  ＳＥＭＩＮ．ＩＭＭＵＮＯＰＡＴＨＯＬ．，１５：１５５−７１，１９９３）。機能しないＡＧＴを含むブタのような動物の系統は、相同組換えを使用してブタのＡＧＴ遺伝子または相当するプロモーター遺伝子中に非機能コード領域を挿入して作製された（ワトソン，ら．，”組換えＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク，１９９２，ｐｐ．２５５−７２）。代理動物細胞中におけるこの変換は、器官受容者の免疫体系は器官中で感染細胞と作用して保護することから、器官受容者に補体阻害剤を投与するよりも好ましい。代理動物として、補体阻害因子を持つように遺伝的に修飾したブタまたは他の動物を使用することによって、プラズマフェレシス（血漿搬出法）、ｅｘ  ｖｉｖｏでの潅流、またはコブラ毒因子のような補体を阻害する薬剤の必要性は、有意に減少する。
代理動物から器官移植片受容者への寛容のあるリンパ細胞および因子の養子転移に続いて、器官受容者から得た一連の血液について、上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に類似したｉｎ  ｖｉｖｏの方法を使用して、代理動物組織に対する寛容に付いて評価する。器官移植片受容者が有為な寛容を示さなければ、他の代理動物由来の細胞を含むリンパ細胞および因子のさらなる転移が行なわれる。一方、十分な寛容が確立されていれば、器官移植片受容者は、標準的な移植の手法を使用して代理動物器官または組織を受け取る。
器官移植片受容者由来の末梢血液リンパ細胞は、器官供与細胞に対する寛容についてＭＬＣ試験によってテストする。代理動物が移植の源で、器官移植片受容者は代理動物に対して不和であれば、好適には器官移植片受容者は本来の抗体の存在に付いて調べられる。器官移植片受容者が血清学的に代理動物と反応すれば、器官移植片受容者は通常さらなる処置が必要となる；例えば、プラズマフェレシス（血漿搬出法）および脾臓除去術または過敏な拒絶を防ぐための可溶性補体受容体。長期に渡って安定なキメラが不和の組合せ中で作られるため、サプレッサー細胞としての、代理動物のリンパ細胞および因子は、さらなる天然抗体の産生を妨げる。
器官移植
器官移植片受容者中で一度寛容が確立されれば、代理動物または供与者由来の移植片を、器官移植片受容者中に移植する。代理動物が寛容を誘導する細胞が発達するためのインキュベーターとしてのみ使用されるならば、未来の第３の器官供与者由来の移植片を得て、移植する。代理動物が移植の源である場合には、移植片の移植は、代理動物から器官移植片受容者に行なわれる。外科の移植技術は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、シモン，ら．，”移植”Ｓｃｈｗａｒｚ中、ら．，１９８９，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ編集、ＭａｃＧｒａｗ−ＨＩｌｌ，ニューヨーク，ＰＰ．３８７−４５８参照）。器官移植片受容者は、当該技術分野における通常の手法に従って、器官移植片の拒絶についての証拠を調べるが、免疫を抑制する治療の必要性は、当該技術分野における既知の方法と比較して有意に減少する。
代理動物が、例えば腎臓のように、２つかそれ以上の器官移植片を持つ場合には、代理動物は最初の移植片がなくなってもバックアップとして生かしておく。同様にさらなる代理動物のキメラを単一しかない臓器の移植のため、例えば心臓移植、のバックアップとして生かしておいてもよく、またはさらなる代理動物のキメラを免疫寛容の失敗に備えて用意しておいてもよい。
本明細書中に記載したような代理寛容の原理に従った移植は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、腸、すい臓、すい臓小島、網膜、角膜、骨、脾臓、胸腺、骨髄、唾液腺、神経組織、副腎、および筋を含む多様な固形組織器官への拒絶の発生を有意に減少させる。例えば、通常老齢にみられる視力の低下の原因は、網膜色素上皮細胞の減少に伴う黄斑の減少である。代理動物に対する患者の寛容を誘導した後、代理動物の網膜を、患者中に拒絶の危険性が減少した移植を行なうことが可能である。
代理動物中のリンパ細胞および細胞懸濁液の共培養
代理動物の寛容が生じる原理は、また、骨髄移植（ＢＭＴ）またはすい臓のランゲルハンス島のインシュリンを生産する細胞のような、基本的に細胞懸濁液として移植される器官の移植を促進するために使用可能である。
免疫機能が未発達の胎児の環境によって、新たに誘導される抗原に対する寛容が作られる。注入したリンパ細胞はまた、他の注入細胞を含む、存在する抗原に対する寛容を発達させる。胎児の環境は、また、細胞懸濁液の増殖を可能にする。器官受容者のリンパ細胞と器官受容者の種由来の細胞懸濁液を共培養することによって、単一の過程で一連の移植用に十分な細胞懸濁液を提供し、およびこれらの細胞に対する寛容を誘導することが可能になる。
例えば、流産したヒト胎児（妊娠期間は１０から１４週）から得たすい臓小島を、１型糖尿病メリタスの患者から得たリンパ細胞と共にブタ胎児の腹部に注入する。誕生と同時に、ヒトのリンパ細胞を回収し、濃縮し、ヒト小島に対する寛容を試験する。これらの細胞を、患者中に注入する。その後すぐに、増殖したヒト小島を回収し患者中に移植する。胎児の小島の増殖は、相当な数のヒト小島を提供する。ヒト小島細胞と共に共培養した患者のリンパ細胞は、遺伝的に異なるヒト小島に対する患者の免疫寛容を誘導する。
同様に、ヒト胎児肝臓細胞の懸濁液を、胎児ブタ中に患者のリンパ細胞と共に共培養する。超音波の案内の下、肝臓細胞をブタ胎児の肝臓の主要血管中に注入する。その後、このブタは、部分的にヒト肝臓細胞を持つ肝臓移植片を提供する。修飾していないブタの肝臓の利点は、抗原性の減少および代謝がよいことを含む。
細胞懸濁液は、また、代理寛容形成の過程で寛容の発達を促進する。例えば、ヒト胸腺上皮細胞の注入によって、正の選択およびＣＤ８＋リンパ細胞の分化が促進される。胸腺上皮は、流産した胎児または培養した細胞系列から提供することが可能である。
遺伝的に異なる骨髄の移植（ＢＭＴ）
骨髄は新生可能な組織であるため、ヒト骨髄供与者が潜在的に不足となることはない。しかし、移植片対宿主病は、いまだＢＭＴの効果を制限する主要なめんどうな問題である。代理寛容形成は、供与者の免疫体系を受容者の体外で受容者に対して寛容になることを可能にする。ＧＶＨＤの危険性を減少させるに加えて、代理寛容形成は、多くの移植および最適な代理動物の選択を可能にし、成熟した免疫体系の移植を可能にし、そして癌および選択した伝染病の薬剤に対する免疫を可能にする。
供与者および受容者由来の骨髄細胞は、胎児のブタのような代理動物中に一緒に注入する。その後、代理動物は、供与細胞による移植および混合リンパ細胞測定による受容者の寛容について調べる。それから、供与細胞を最適な代理動物から回収して、適切な調製後に骨髄受容者中に注入する。
免疫抑制組成物
本発明はまた、別の態様で、組織移植提供者と組織移植受容者の組織や細胞に対する免疫反応を抑制でき、組織移植受容者へ注入するよう作られた免疫抑制物を含む組成物を提供する。望ましくは、その組成物は、サプレッサーT細胞、抗イディオタイプ抗体を産生する細胞、ヴィトー細胞、および/またはB7または同様の分子に欠損のある抗原提示細胞のような免疫抑制物を含む細胞集団であるべきだ。そのような細胞は、ここで示したように代理動物が免疫不全状態にあり、結果的に代理動物と受容者の組織に免疫寛容であるような免疫機能を獲得するよう時期に、受容者のリンパ球前駆細胞を含む細胞集団を代理動物に投与することによって代理動物から得られる。細胞集団はまた、細胞に加えて抗イディオタイプ抗体のような循環性因子を含む。
代理動物から得た細胞は、好ましくは組織受容細胞のポジティブな選択または代理動物の細胞や組織提供細胞を除くネガティブな選択を行い組織受容細胞のために強化する。ポジティブな選択では、組織移植受容細胞に特異的な抗体を含む磁気ビーズまたは吸収カラムを用いる。希望の細胞がビーズやカラムに吸着した後、望ましくない細胞を排除する溶媒でビーズやカラムを洗う。希望の細胞は冷やした溶媒やEDTAで溶出する。ネガティブな選択では、望ましくない細胞に特異的な抗体を付けられた磁気ビーズや吸着カラムを用いる。希望の細胞は、ビーズを除いた後に集めた非吸着画分またはカラムから流れでた非吸着画分中に濃縮される。また、抗体および補体は望ましくない細胞を溶解するのに用いられる。望ましくは、濃縮された細胞集団は代理動物の細胞を”実質的に含まない”、つまり代理動物の細胞数は70%減っている、さらに望ましくは80%、もっとも望むべきは95%減少している。
調節細胞の拡張は、混合リンパ球培養物の培地をin vitroで用いてなされる。混合リンパ球培養物（MLC）は、リンパ球の培地と組織移植受容者と同種の2つ以上の同種異系の提供者の抗原提示細胞集団からなる。細胞は、標準MLC法を用いて細胞培地で一緒に培養される。培養上清は18から48時間後に除かれ、代理動物から得られた細胞に加えられる。同様の効果は、この培地中に存在する純粋な、または合成された因子を用いて得られる。
収穫して、調製した細胞は、後の使用や離れた施設へ輸送するために標準低温保存法を用いて、牛胎児血清とDMSOとともに、-85度以下に管理して凍らせておく。解凍した細胞は寛容性細胞と自己調節細胞、因子、および腫瘍、ウイルス、組織移植受容者を通過できる感染性薬剤をテストされる。望ましくは組成物の免疫抑制物は、ここで参考文献で取り入られている、ヴェンカテラマン（Venkateraman）ら、J.Lab.Clin.Med.,20:453-458（1992）で考察されているようにリンパ球の低温保存で用いられる方法にしたがい受容者に導入されるように作られている。注入用の細胞の作製は当該技術分野の範囲内に含まれる。
受容細胞との組織移植の再集団化
代理動物の寛容化の別の結果は、組織受容細胞、特に内皮細胞、単球とその関連細胞、その他の白血球と再集合した組織の産生である。内皮細胞、単球とその関連細胞、その他の白血球は拒否反応の標的となるので、代理動物の細胞を組織受容者の細胞と再集合した組織で置き換えることによって、組織はより組織移植受容者に似てくることになり、組織の移植は、組織受容者による拒否反応をより受けなくなる。
免疫成分をもつ移植組織や器官（例えば肺や腸）は普通、提供者の白血球が排除される期間と受容細胞が移植組織を再構築する期間の間、免疫不全の状態が続く。しかし、代理動物内で受容細胞と再集合した移植組織は移植時には免疫反応できる。提供者のリンパ球が受容者の組織や器官を攻撃する結果のGvHDの危険性を減少させることもまた達成されている。受容細胞と再集合した組織は、それらの器官内の近傍の細胞が免疫反応細胞と同一であるから、拒否反応の危険性が減少している。本発明は、受容者の外の、別の動物内でおきる提供者の器官の再集合を提供する。これは、多様な器官を産し、最適の動物を選択しすること、成人受容者のために動物胎児を用いること、ヒト組織移植受容者内で行う場合には実行できない、あるいは非倫理的な技術の使用からなり、受容者内で再集合を行うより多くの利点をもつ。本発明はまた、移植組織を組織移植受容者に移植する前に再集合させ、器官提供者の細胞が移植後、排除され受容者細胞で置き換えられる場合に生じる局部的な免疫不全を防ぐ点で異なる。
ヒト組織や器官の提供者の深刻な不足のために、移植候補者は短い期間の生命維持のためブリッジ移植と言われる異種移植を受け、適当な提供者を待つ時間を得る。ヒト細胞と再集合した異種移植片は、異種移植片中の移植された細胞が組織受容者と異なる場合は同種異系拒否反応を受けやすいが、ヒト細胞と再集合した移植片は変化させていない移植片より受け入れられやすい。代理動物の寛容化の時期にヒト細胞と再集合した移植片は、免疫不全代理動物へ注入した細胞の元と遺伝学的に異なる（同種異系）ヒト受容者へのブリッジ移植として利用できる。
組織移植受容者細胞と再集合した移植片のex vivoでの産生のために、移植拒否反応の主な細胞性の標的は、内皮細胞、単球、樹状突起細胞、および上皮細胞を含む。内皮に対する反応は、心臓、肺、肝臓、皮膚、および腎臓移植の場合特にそうだが、血栓症、梗塞、および移植の非可逆的な破壊となる。単球とその関連細胞および樹状突起細胞に対する免疫反応は、酵素やサイトカインが殺されたマクロファージから放出された時、近傍のむかんけいの細胞の損傷が生じる。単球、マクロファージ、および樹状突起細胞はまた、APCとファゴサイト細胞であるので、単球、マクロファージ、および樹状突起細胞は感染に対する主要な免疫的防御をなし、単球、マクロファージ、および樹状突起細胞の損失は、移植を、特に肺と腸の移植の場合、適切な感染を受けやすくする。
腸は普通消化器官と言われる。しかし、腸管はまた、体内で最も大きリンパ球器官でもある。内在のリンパ球が組織移植受容者を攻撃する結果生じるGvHDは、腸の移植後の主な問題を提供する。内在のリンパ球が組織移植受容者を攻撃する結果生じるGvHDはまた、肝臓移植の後にも報告があり、肺移植の場合にも潜在的に問題となる。
移植の内在細胞を組織移植受容者細胞で置き換えるなら、上に記載の免疫反応の問題は避けられる。組織を組織移植受容者へ移植した後は、内在の免疫機能をもつ細胞は、主に組織移植受容者に反応しない組織移植受容者細胞からなる。
これらの組織に存在するリンパ球は、通常、感染体に対する局所的な防御をつかさどっている。しかし、移植後は、免疫拒絶や免疫抑制成分のせいで、生体防御作用を持つリンパ球は減少する。したがって、これらの組織が臓器受容の細胞と再構成されるまでは、これらの組織は、非常に感染しやすい状態にある。
移植臓器が免疫拒絶に合う危険性が高いため、受容動物において、受容細胞の移植臓器内での再集団化｛repopulation｝は、困難となっている。移植臓器の受容体は移植臓器の影響を受けるので、通常、移植臓器の受容体は強い免疫抑制を受けて、免疫拒絶が遅れるかあるいは妨げられる。このため、受容細胞の移植臓器内での増殖過程は非常に遅くなる。しかし、移植臓器の再集団化が、代理動物内で起こった場合には、代理動物が免疫不全の危険性を請け負うことになり、臓器受容体は、既に臓器受容体自身の細胞を導入した移植体を受け取ることになる。これにより、免疫拒絶、感染、GvHDの危険が減少する。
臓器受容体自身の細胞を混在させた移植臓器は、上で述べた代理動物の免疫寛容化の副産物である。しかし、最適な再集団化の目標は、免疫寛容の導入とは幾分異なっており、それゆえ、臓器の再集団化の最適な方法は、免疫寛容の導入法とは異なっている。抗原特異的サプレッサー細胞及び抑制細胞と抑制成分の産出は、あまり重要ではない。最適な再集団化における主要な目的は、移植臓器受容体の細胞が移植臓器に最大限に導入されること、そして、代理動物のレジデント細胞を減少させることである。
したがって、最適な再集団化には、子宮内での導入よりも、骨髄移植が望ましい。化学療法と放射療法のいずれかあるいは両方は、代理動物の内皮細胞の増殖を特異的に阻害し、もともと存在しているリンパ球とマクロファージを駆逐する。
骨髄移植は、移植臓器受容体細胞と代理体の細胞間の、移植体対受容動物の反応を制御するという点で、潜在的に有利である。移植臓器受容体の内皮細胞と単核白血球の導入は、適切な増殖因子の投与によって、さらに促進される。例えば、内皮細胞増殖因子は、移植臓器受容体の内皮細胞の導入の促進に、また、GM-CSFは単核白血球の導入に使用できるであろう。
マーカー遺伝子KT（チミジンキナーゼ）を持つトランスジェニック代理体もまた、移植臓器内での臓器受容体細胞の再集団化を促進するために、使用できるであろう。内皮細胞や樹状細胞のような細胞集団の導入を促進するためには、移植臓器受容体の細胞が導入される余地を作り出すという点で、レジデント細胞を選択的に殺傷することは有利であろう。例えば、マーカー遺伝子KTが細胞接着分子のELAMやP-CAMのプロモーターと連鎖している場合、KT+のブタが産出できるであろう。この場合、KTは、内皮細胞のような細胞集団で選択的に発現されるであろう。対応するブタ胎児には、ヒトのリンパ球を導入する。生後、キメラ動物はgancyclovirで処理される。これにより、代理体の内皮細胞は選択的に殺傷され、臓器受容体由来のKT細胞に入れ換えられるであろう。
移植臓器受容体細胞の導入の検出には、代理キメラ動物からの、免疫組織化学的なバイオプシーが最適である。組織片は、移植臓器受容体の内皮細胞または白血球に特異的な抗体、あるいは代理体の内皮細胞や白血球に特異的な抗体を用いて染色される。例えば、移植臓器受容体の内皮細胞に特異的な抗体としては、human factor VIIIがあげられ、また、白血球に特異的な抗体としては、human CD45があげられる。次に、移植臓器受容体と代理体の相対的細胞数を測定する。
普遍的な供与代理動物
代理体の臓器へ導入される移植臓器の受容体は、移植臓器受容体細胞と混在した移植臓器の、最初の供与体となる。しかし、代理キメラ動物もまた、ブリッジ移植（bridge transplant）として、他の患者には有効であろう。代理体の免疫寛容に伴う、潜在的に不利な点のひとつは、臓器が簡単には入手できない点である。通常、２〜７ヵ月の待ち時間が要求される。これは、急性肝炎や、肝不全、重症の心筋梗塞等、緊急な臓器移植を要する場合には、実用的ではないだろう。
免疫寛容なリンパ球や臓器を緊急に供給するためには、代理動物が、複数種の臓器受容動物からの白血球とキメラ化される必要がある。例えば、ブタの胎児に、最も一般的な組織対応成分を発現する、複数種のヒトリンパ球を導入できるであろう。この結果生じるキメラブタは、サプレッサー細胞を有し、このサプレッサー細胞は、クラスI、またはIIのHLA抗原を臓器受容体と共有するヒトリンパ球と、キメラブタに存在する他のいかなるヒト抗原との反応をも抑制すると期待される。これらのキメラブタ由来の移植臓器は、移植臓器受容動物（ヒト）の細胞と部分的に再集団化していると期待される。これにより、ブタ細胞に対する、自然抗原と細胞反応による、免疫拒絶の危険が削減される。
急性肝炎に対するブリッジ臓器移植としての肝臓移植
重症の肝不全を伴う急性肝炎は、患者の生存のためには、肝臓移植を緊急に要する。ヒトの肝臓提供者が現れるまでの一時的代用として、ブタの肝臓移植が行われてきた。例えば、最近、肝不全の被臓器移植患者が、ブタの肝臓に４時間連結された。そして、非常に短期間ではあるにせよ、このブリッジ臓器移植によって、ヒト肝臓移植の供与者を探し出すまでに、２４時間の猶予が生じた。しかし、このような外来の移植臓器は数時間以上は生存できない。あらかじめ異なるヒト細胞を導入したブタの肝臓は、処理していないブタの肝臓よりも、長時間生存できるであろう。外来移植体（exograft）は、やがては異なるヒト細胞に対するアレルギー反応により拒絶されるとはいえ、当発明を用いれば、ヒト細胞を混在させた外来移植体は、そうでない外来移植体よりも長期間の生存できるであろう。
皮膚移植
ブタの皮膚移植は重症の火傷の処置に頻繁に用いられる。しかし、これらは通常数日間で脱離し、組織移植よりは応急処置として使用される。前述の処理をした、ブタのような代理動物由来の皮膚は、より容易に移植可能で、より長時間の恩恵を、患者に授けることができる。ほとんどの患者が皮膚移植を緊急に要するため、特定の免疫寛容を持つサプレッサー細胞を、免疫不全の代理動物に導入することは通常不可能であるが、あらかじめ異なるヒト細胞と混在させてあるブタの皮膚のほうが、未処理のブタの皮膚よりは望ましい。リンパ球と皮膚は、複数種の細胞を導入した代理動物からも、供給可能である。また、免疫寛容の導入は、天庖瘡（pemphigus vulgaris）のような慢性の皮膚病にも有用である。
代用動物から摘出された移植臓器を、遠隔地の施設に輸送するためには、ischemicな変化を避けるため、灌流と輸送媒体への保存が必要である。キメラ動物から摘出された臓器は、通常、被臓器移植患者への臓器移植に先がけて、標準的な生体臓器移植の手順に従い、マニトールとヘパリンの溶液に灌流される。これにより、代理動物の循環細胞が取り除け、抗原の不一致が減少する。再構成された移植臓器は、移植臓器から代理動物の細胞を取り除くため、代理動物に特異的な抗体と補体で灌流される。必要に応じて、移植臓器をさらに処理する必要があるかもしれない。たとえば、膵島は臓器供与体の膵臓から摘出されなければならない。移植肝臓はischemic変化を遅らせるため、WU溶液で灌流されなければならない。
上記の説明の通り、当発明は、ブリッジ移植あるいは永久移植として、内生あるいは外来の臓器移植のための臓器を提供する。この場合、移植臓器は臓器受容体の細胞集団と混在され、その後の臓器移植に備え、あるいは予備として保存される。臓器移植の前段階の臓器保存は容易である。当発明にしたがって摘出された臓器は、例えば、灌流によって循環する供与体の細胞を取り除いたり、抗体と補体と共に灌流を行って供与体の細胞を殺傷する等の処理により、臓器中に存在する供与体の細胞を減少させる処置を行うことが望ましい。
例
この発明をより完全に理解するために、実験例を下記に記してある。これらの実験例は、この文書で明らかにされた、代理体の免疫寛容の本質を示すものである。しかし、当発明の適用は、これらの例に示されている内容のみにとどまるものではない。これらの例は、説明のみの目的で使用されている。
例５  ヒト−ブタキメラの作成
最初の実験では、成人のヒトの末梢血液中のリンパ球が、受精後５０日目のブタ胎児（推定体重１００ｇ）に導入される。細胞集団は、麻酔処理した雌ブタの腹部を切開し、子宮を外部に露出させた状態で、注入された。超音波変換器を子宮の上に設置し、細胞集団の懸濁物を、ブタ胎児の腹部に注射した。細胞の導入量は、体重１kgあたり約１０万細胞であった。細胞注入が行われた子宮には、他の実験処理群と区別するために、縫合線が置かれた。
手術後、雌ブタには、未成熟収縮｛premature contraction｝と感染を防ぐため、プロゲステロンと抗生物質が投与された。超音波診断によって、約４週間にわたり、ブタ胎児の成長と生存が確認された。手術後３５日目に、帝王切開によって、子ブタは摘出された。リンパ液｛cord blood｝が採集された。体重を測定し、crown-rumpの長さを測定し、これらはGvHDの証拠について、検査がおこなわれた。ほとんどの子ブタは、血を抜いて、安楽死処理が行われた。リンパ液とリンパ組織はフローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学的検査によって、検査された。フローサイトメトリーはヒトCD45，CD4，CD8のモノクローナル抗体について行われた。免疫組織化学的検査には、ヒトCD45に対するアルカリフォスファターゼ検査が含まれている。
処理子ブタ８個体のうち６個体には、末梢血液とリンパ節にヒトとのキメラ化が認められた。CD4+とCD8+のリンパ球がフローサイトメトリーによって検出された。どの子ブタにもGvHDの証拠は認められなかった。これらの子ブタは、体重、全長とも、この妊娠齢としては正常であった。
例６  キメラブタの作成
第２の実験は、キメラ化の程度を増進させる目的で、早い発達段階（妊娠４２日目）のブタ胎児に細胞集団を導入した以外は、例５の実験と同様の手順で行われた。今回の場合、ブタ胎児は極めて小さく（推定体重１０ｇ）、免疫機構の発達においては、有意義に初期の段階にあった。細胞を導入された最初の同腹子ブタは全て流産された。この流産の原因を探るために行われた死体解剖の結果は、外傷性の致死であった。第２腹目のブタ胎児には、体重１kgあたり約４０万細胞、あるいは４００万細胞を導入した。細胞導入量の多かった３頭の胎児は、細胞導入直後に死亡した。一方、細胞導入量の低かった３頭の胎児のうち、１頭は分娩時も健康であり、また１頭は短期間生存した。細胞導入量の生存に対する影響はGvHDによるものと考えられた。
生き残った子ブタ（９５日目に分娩された）は、GvDHの証拠は認められず、ヒト細胞に対して、骨髄に８％、末梢血液に６％、脾臓に８％のキメラ化が認められた。５０％のリンパ球にはCD4にのみ陽性の細胞であった。アルカリフォスファターゼを用いた抗体染色の結果、胸腺の皮質に大量のヒト細胞が、また、胸腺の髄質にまばらなヒト細胞が認められた。このブタ胎児では、細胞導入後、ヒト細胞数は１０倍に増加したと予想された。
以後の細胞移植では通常、全T細胞数は体重１kgあたり約２０万細胞以下に抑えられた。しかし、３頭の雌ブタの２４頭のブタ胎児に、体重１kgあたり約４００万細胞（４人のヒト患者由来の細胞）を移植したところ、GvDHに起因する流産は全くみられなかった。妊娠最終段階（１００日目）の同腹個体を超音波診断したところ、全ての同腹ブタ胎児は生存しており、この段階の妊娠齢としては正常な大きさであった。出産予定日に出産された子ブタの１頭では、リンパ液中の２９％のリンパ球がヒト由来であり、またGvHDの証拠は認められなかった。
これらの研究により、ヒト細胞は、ブタ胎児中で増殖、分化できることが示された。早い発達段階で、すなわち、妊娠３期中の第２期の始まりである妊娠齢４２か４３日目に、ヒト患者由来のリンパ球や幹細胞を導入した場合のほうが、導入細胞の定着の度合いは明らかに高かった。これは、免疫機構の発達段階が初期であるためと同様に、胎児の体重が少ない（１０％）ため、単位体重あたりの細胞導入量が増したためと考えられる。したがって、導入細胞が、すでにあるリンパ球と競合する必要はない。一般的に、ヒト造血細胞や、ヒトリンパ球を初期の段階に導入することが望ましいが、細胞導入と臓器摘出の待ち時間を減らすことが重要である場合には、発達段階後期での導入もまた有用である。
例７  キメラブタ内のサプレッサー細胞
ブタ胎児への最初の細胞導入（例５の低容量導入）と高容量の細胞導入で生き延びた子ブタ（例６、体重１kgあたり約４０万細胞導入、骨髄のキメラ化率１０％）から得られたキメラ細胞は、サプレッサー細胞と、免疫抑制の抗原特異性について、調べられた。これにつけ加え、高容量の細胞導入で生き延びた子ブタ（例６）から得られたキメラ細胞は、サプレッサー細胞の相対的出現率について、調べられた。
全体的な免疫活動は、２種の活性成分を持つ｛two-way｝リンパ球の反応（MLR）と、これに対応するautologous反応の比較によって、測定された。子ブタキメラ細胞（１０万個）を、患者あるいは無関係の対照個体由来のリンパ球（１０万個）と反応させた。６週間の培養後、トリチウム標識されたチミジンが加えられ、その吸収が測定された。異種混合反応の標識チミジンの吸収は、同種混合反応でのチミジン吸収量と比較された。
免疫活動の抑制は、２種の活性成分を持つMLR（キメラ細胞１０万個と、患者あるいは無関係の対照個体由来のリンパ球１０万個の混合物）と１種の活性成分を持つ｛one-way｝MLR（キメラ細胞と不活性化ヒト細胞の混合物、及び不活性化キメラ細胞とヒト細胞の混合物での標識チミジン取り込み）の総和を比較することによって、測定された。MLRは標準的な方法にしたがっておこなわれ、細胞は37。C，5% CO2存在下で培養された。培養６日後、標識チミジンが加えられ、リンパ球が回収され、フィルター上で洗浄され、標識チミジンの吸収が測定された。相対的な免疫抑制の抗原特異性を測定するため、このサプレッサー細胞アッセイは、無関係のヒト細胞と混合されたキメラ細胞、あるいは、無関係のブタ細胞と混合された患者由来のヒト細胞に基づくサプレッサー細胞アッセイと比較された。対照のアッセイには、autologous反応が含まれる。
入念な免疫学的研究が、例６で骨髄に１０％のキメラ化（末梢血液で８％、脾臓で６％）が見られた子ブタについておこなわれた。図４に示されているように、ヒト患者由来の細胞とキメラ細胞の２種の活性成分を持つMLRは、autologous反応に比較して、最小限の免疫反応しか認められなかった。これとは対照に、患者由来の細胞を無関係のブタ細胞と反応させて場合、あるいは、キメラ細胞を無関係のヒト細胞と反応させた場合には、激しい反応が認められた（SIは9.13以上）。
免疫活動の抑制は、２種の活性成分を持つMLRと、これに対応する１種の活性成分を持つMLR（キメラ細胞かヒト細胞のどちらかが不活性化）の総和を比較することによって、測定された。図５が明らかにするように、キメラブタ細胞とヒト患者由来の細胞の２種の活性成分を持つMLRでは、87%の免疫抑制がおこっていた。これとは対照に、無関係のヒト細胞とキメラ細胞の混合、あるいは、無関係のブタ細胞と患者由来のヒト細胞の混合では、免疫抑制よりも活性化がみられた。これらの研究は、キメラブタ内に産出された細胞が、キメラブタの抗原による免疫反応を引き起こすという、ヒト患者由来の細胞の能力を、効果的に抑制していることを示している。
キメラブタ内でのサプレッサー細胞の相対的出現の指標として、活性キメラ細胞が様々な希釈率で、１種の活性成分を持つMLR（ヒト細胞と不活性化キメラ細胞の混合）に加えられた。この結果は、図６に示されている。活性キメラ細胞が、１００分の１の希釈で加えられたときでさえも、70%のMLR抑制が観察された。対照的に、ヒト患者細胞と無関係なブタ細胞の混合では、最小限のMLR抑制しか起こらず、また、無関係なヒト細胞とキメラブタ細胞の混合では、全くMLR抑制が検出されなかった。
この例における研究は、キメラブタ内で産出された細胞は、対応するブタの抗原による反応を引き起こすという、ヒト患者由来の細胞の作用を、効果的に阻害していることを示している。この免疫抑制は、抗原特異的であり、多数の抑制的部分が存在しているように見える。代理ブタからの少量のサプレッサー細胞が、ヒト患者への免疫寛容を、移行させることが可能であり、ブタ抗原へのキメラブタリンパ球の反応と同様に、ヒトリンパ球の反応を回避することができる。比較的、免疫抑制が特異的であるため、臓器移植は重大な免疫不全をもたらすことはなく、また、患者に深刻な感染をもたらすこともないはずである。
例８  同腹個体間における相対的な抗原特異的免疫抑制
同腹の１１頭の子ブタについての免疫抑制の研究結果が、図７に示されている。それぞれのブタ個体由来の細胞とヒト患者細胞、あるいは無関係なヒト細胞間でのMLRの抑制を、検査した。図７に示されているように、子ブタNo. 5とNo.11は免疫活動の抑制を示したが、子ブタNo. 5でのみ、この免疫抑制は、導入細胞が由来するヒト患者の抗原と細胞に特異的であった。
これらの研究は、制限されたヒトキメラ化についての研究で見られた、同様の発見を確証するものであった。３つのヒトリンパ液の受容体のうち、１個体のキメラ子ブタの末梢血液で、対応するヒト患者のリンパ球に対する最小限の反応が、また、無関係なヒトリンパ球に対する正常な反応が、観察された。２種の活性成分を持つMLRと、これに対応する１種の活性成分を持つMLRを比較した場合、97%の反応抑制が見られた。この結果はまた、免疫抑制の原因となる細胞が、放射能感受性（radiosensitive）であることも示している。他の２個体の受容体は、50%の免疫抑制しか示さなかった。
子ブタにおける、制限されたキメラ化についてのこれらの試験は、選択の利点を示している。患者が臓器移植を受けた際、その成否は、その患者体内での免疫寛容の発達いかんに依存している。しかし、代理体での免疫寛容の発達では、複数の胎児に細胞導入がおこなわれ、そのうち最大の免疫寛容を示した個体を選択できる。明らかに、この例の子ブタNo. 5、あるいは、例６の最初のブタが、他の同腹子ブタよりも優れているであろう。治療の現場では、これらの子ブタのリンパ球や対応する移植臓器が使用できるであろう。
例９  キメラ臓器の細胞再集団化
代理動物の臓器における、ヒト細胞の再集団化が示された。例６で10%の骨髄キメラ化を示した子ブタの皮膚と胸腺の凍結切片が、免疫組織化学法によって、検査された。ヒト白血球に共通の抗原（CD45）に対する、アルカリフォスファターゼを用いた免疫染色が、おこなわれた。対照標本として、ヒト細胞を導入していないブタの標本が含まれている。
皮膚の断片では、血管内皮細胞の付近にヒトCD45+細胞が見られる。髄質の真皮では、樹状細胞が、ヒトCD45に陽性であった。さらに、胸腺の細胞の多くは、ヒトCD45で染色された。この染色は、ヒト細胞を導入していないブタでは見られなかった。このように、キメラブタの組織を検証した場合、これらの組織（皮膚と胸腺）は部分的にヒトリンパ球と混在していた。
例１０  代理動物における生体内でのサプレッサー細胞誘発
免疫性テストによって、生体内での免疫寛容とサプレッサー細胞の検査がおこなわれた。もし、代理動物が患者に対して免疫寛容であり、代理動物に対するヒト患者のリンパ球の反応を阻害するサプレッサー細胞を有しているならば、患者細胞の大量導入は、深刻なGvHDなしに、キメラ化を増進させるはずである。一方、もし、代理動物が患者に対して免疫寛容でなければ、患者細胞は拒絶されるはずである。もし、代理動物が患者に対して免疫寛容ではあるが、サプレッサー細胞を有していないならば、リンパ球は導入されるであろうが、移植体と受容対の異常に起因する病理を引き起こすはずである。
免疫性テストは以下のように行われた。LEWラットに、生後すぐ（24時間以内）、C57B1/6マウスの骨髄細胞が注射された。生後８週に、ラットは約0.5％のマウス細胞（Ly5+）を、末梢血液に含んでいた。このキメララットに、4000万個のマウス骨髄細胞、4000万個のマウス脾臓細胞、あるいは、媒体のみが注射された。２週間後、血液細胞は、マウス細胞（Ly5+）について検査された。また、皮膚のバイオプシーがGvHD検出のため、おこなわれた。
骨髄細胞、あるいは、脾臓細胞の導入は、ラットの末梢血液において、５〜１０倍のマウス細胞数増加をもたらした（図８参照）。皮膚のバイオプシーでは、GvDHは検出されなかった。キメララットの体重増加は継続した。
この実験はキメララット代理動物におけるサプレッサー細胞の存在を、生体内で証明している。キメララットがサプレッサー細胞を有していなければ、生きたマウス細胞の導入はGvDHをもたらしたはずである。導入されたマウス細胞は、拒絶もされなければ、GvDHを引き起こしもしなかった。実際に、相対的なマウス細胞数は、５〜１０倍に増加した。この過程は、キメラ化がGvDHを伴わずに、促進されるかもしれないという可能性を示している。このように、潜在的には、代理動物でのサプレッサー細胞の増大の可能性がある。
当業者にとっては、代理体での免疫寛容化の方法について、この発明の範囲と精神を逸脱しない範囲での様々な修正が、行えることが明らかであろう。そして、これらの修正と変法は、請求の範囲およびその均等内であるかぎり、本発明の範囲内であることも明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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