(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において細胞損失または細胞損傷により引き起こされる脳損傷の処置のための治療剤であって、遺伝子的修飾により条件的不死にされた多能性神経上皮細胞を含む治療剤。
【請求項２】
多能性神経上皮細胞が温度感受性腫瘍遺伝子を含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
腫瘍遺伝子がＳＶ４０ラージＴ腫瘍遺伝子である、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
虚血または発作（stroke）を処置するための、請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
アルツハイマー病を処置するための、請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
細胞がヒト細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の治療剤。
【請求項８】
細胞が単一細胞系由来である、請求項１〜７のいずれかに記載の治療剤。
【請求項９】
細胞が、血清を含まない培地で培養される細胞系から得られ得る、請求項１〜８のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１０】
治療有効量の、遺伝子的修飾により条件的不死にされた多能性神経上皮細胞および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
細胞が温度感受性腫瘍遺伝子を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
腫瘍遺伝子がＳＶ４０ラージ腫瘍遺伝子である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本出願は、神経細胞の大脳内移植による行動的および／または精神的欠損の矯正、およびそのための細胞および医薬に関する。本発明は、該細胞系の産生および維持の方法にも関する。
行動的および／または精神的欠損は、多くの疾患によって生じ、脳が外傷を受けるときにも生じ得る。例えば、運動機能障害は、パーキンソン病の１つの症状である。今のところ、殆どの場合、満足な治療法は得られていない。
本発明は、治療的に有効な量の多能性の（pluripotent）神経上皮細胞を大脳内移植することを包含する、行動的および／または精神的欠損の治療方法を提供する。
本発明は、損傷した又は疾患を有する脳に移植したとき、その損傷または疾患が別にもたらす機能的欠損を代替または補償し得る表現型を担う（take up）ことにより、多能性神経上皮細胞が損傷または疾患を有する脳からのシグナルに応答するように見えるという観察に一部基づいている。
用語「多能性」は、本明細書では、細胞の異なるタイプまたは異なる表現型、特に意図される使用に好適な表現型を有する細胞に分化する潜在力（potential）を有する未分化の神経上皮細胞を表すものとして使用される。そのような多能性細胞が最終的に分化する細胞タイプまたは表現型は、細胞が存在する又はそれ自身を見い出す条件に少なくとも一部分依存する。
本発明で使用するために、神経上皮細胞は、脳の標的領域の損傷または疾患を修復または補償するのに好適な細胞に分化し得るべきである。移植のための細胞は、神経細胞の全てのタイプまたは表現型に分化し得る必要はないことが認識される。細胞は、例えば、二能性（bipotent）であっても良い。しかしながら、高度の潜在的能力（potency）は、脳の異なる領域に移植するのにより大きい柔軟性および潜在力（potential）を与えるので、これが一般に好ましい。
好適な多能性細胞は、「幹細胞」と呼ばれ又は知られているもの及び「前駆細胞」と呼ばれ又は知られているものを含む。
多能性神経上皮細胞は、有利なことに、また一般に、条件的に不死（conditionally immortal）である。
処置は、いかなる哺乳動物にも行なわれ得るが、本発明は、特にヒトの処置、とりわけヒト細胞を用い、ヒト細胞および細胞系を用いる処置に関する。
本発明は、本発明による処置を受けた哺乳動物を提供する。
本発明は、単離されたヒトの多能性神経上皮細胞を提供する。
本発明は特に、ヒトの条件的に不死の多能性神経上皮細胞を提供する。
本発明はさらに、特に治療的使用のための、より詳細には行動的および／または精神的欠損の処置のための、条件的に不死の多能性神経上皮細胞系を提供する。
本発明の細胞は、ヒトの脳の損傷部分にインプラントされたとき、行動的または精神的欠損を矯正し得る。用語「損傷」は、本明細書では、機能の低下または消失を含む。損傷は、物理的外傷、低酸素症（酸素の欠乏）、化学物質を含む多様な手段のいずれかによって生じ得、例えば損傷は、薬物中毒、および疾患により生じ得る。下記の疾患および病理的状態は、本発明により処置され得る行動的および／または精神的欠損を生じる疾患または状態の例である：外傷性脳傷害、発作（stroke）、脳性麻痺を含む周産期虚血、アルツハイマー、ピックおよび関連する痴呆化神経変性疾患、多梗塞性痴呆、パーキンソン病およびパーキンソン様疾患、ハンチントン病、コルサコフ病およびクロイツフェルト-ヤコブ病。
特に心停止または冠状動脈バイパス手術後のような一時的な全体性虚血の後の記憶喪失も、本発明に従い処置され得る。
本発明は更に、ヒトの、条件的に不死の、多能性の神経上皮細胞を産生する方法を提供し、該方法は以下の工程を包含する：
（a）ヒト胎児から神経上皮細胞を得ること、該細胞は発生経路の十分に早い段階にあるので、それらは様々な異なる脳細胞タイプに分化する能力を有する、
（b）それらの細胞に、適切な調節性エレメントの制御下で細胞に条件的不死を生じさせ得る配列を含むDNAを導入すること、および
（c）細胞をインビトロで許容（permissive）条件下で維持すること。
上記方法はさらに、１種以上の細胞系を得るために細胞をクローン化する工程を含んでも良い。
本発明のさらなる局面は、特にヒトの治療的使用のために、必要に応じて単離された形態で多能性神経上皮細胞を提供する。治療的使用は、行動的および／または精神的欠損の処置であり得る。
本発明のさらなる局面は、特にヒトの治療的使用のための、条件的不死の多能性神経上皮細胞を提供する。治療的使用は、行動的および／または精神的欠損の処置であり得る。
本発明はさらに、行動的および／または精神的欠損の処置のための医薬製造における、必要に応じて単離された形態での多能性神経上皮細胞の使用を提供する。投与されるべき医薬は、多能性神経上皮細胞を含む。
本発明は特に、行動的および／または精神的欠損の処置のための医薬製造における、条件的不死の多能性感覚上皮細胞の使用を提供する。投与されるべき医薬は、条件的不死の多能性神経上皮細胞を含む。
本発明による、また本発明で使用される条件的不死の細胞は、クローン化細胞系からのものであって良く又は混合ポピュレーションのものであって良い。クローン化細胞系からの細胞が好ましいものであり得る。単一細胞系からの細胞が使用されても良く又は２種以上の細胞系からの細胞の混合物が使用されても良い。
本発明はさらに、本発明による細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的調製物を提供する。
同種の胎児神経組織の、損傷した脳への移植は動物実験で研究され、その結果としての修復が、神経解剖学的、生理学的および行動学的レベルで観察された（ドゥネット（Dunnett）およびブジョルクルンド（Bjorklund）、1994）。パーキンソン病の運動機能障害の処置において、この業績の幾つかの適用が為されたが（リンドヴォール（Lindvall）、1994）、この技術の広い使用は、同種胎児脳に由来する組織の必要性により不利を被っている。要求される胎児組織は、修復を目指す損傷のタイプに特異的でなければならず、それは脳の領域と細胞タイプの両方によって異なる脳発生の間に、正確な時間限定された段階で採取されなければならない。これは、実際的および倫理的な問題の両方を導く。
特定のタイプの損傷で胎児組織移植（シンデン（Sinden）、1995）の作業を行なうと、認識機能の改善を得るには細胞タイプの非常に特異的なマッチングが必要とされることが示された。
我々は、条件的不死多能性神経上皮細胞が、損傷した脳にインプラントされたとき、細胞は損傷の修復のために要請される正しい形態の細胞に分化し、分化した細胞は機能の改善のために要請される適切な連結を形成し得る。分化した細胞の表現型は、損傷または失った細胞の表現型と同じであって良いが、しかしながら、分化した細胞は異なる表現型または多くの表現型のものであって良い。いずれの場合も、細胞は、損傷または失った細胞を機能的に統合し補償し得る表現型を担う。それは、我々が発見した、損傷した組織に移動し見付けだす細胞の傾向（propensity）によって支援される。
多能性細胞の使用は、１つのクローン化細胞系を用いて多くの異なる領域の脳の損傷を修復可能であることを意味する。それは、１種以上の特定の細胞タイプが所与の領域の損傷の修復に要請される場合、要請される異なるタイプの細胞に単一の多能性細胞系が分化し得ることも意味する。
条件的に不死の細胞とは、特定の許容条件下で不死であるが、非許容条件下では不死でない細胞である。本件では、これは、胎児組織から抽出した多能性前駆細胞を条件的に不死化し、それを許容条件下で維持することによって、前駆細胞の発生が選択された段階で停止され得、それが長期間増殖し得ることを意味する。条件的不死化を使用すると、インビトロで容易に拡張し得るクローン化系の発生が可能になる。細胞が維持されている条件が非許容条件にスイッチすれば、細胞の発生は持続される。正しい条件が提供されれば、細胞は発生を続け、分化していく。
不死化された細胞は通常、腫瘍遺伝子を細胞に形質導入して作製される。従って、長期的には腫瘍形成の危険があり、そのため、そのような細胞は本発明で使用するには好ましくない。
条件的不死細胞は、それが発生の所望の段階で「固定（frozen）」し、容易に維持され、許容条件下のとき良く増殖するが、それが移植される環境が非許容条件を有する限り移植に使用され得る、という点で不死細胞の利点を有する。本発明の細胞の場合、条件的不死性を付与するのに使用される遺伝子は、脳に存在する条件が非許容条件に対応するように選択されるべきである。
細胞を不死化する通常の方法は、腫瘍遺伝子の形質導入による。条件的不死細胞の使用は、非許容条件下で細胞が腫瘍遺伝子特性を有さず、従って、これにより腫瘍増殖を導く細胞のインプラントのいかなる可能性も排除される。
非不死細胞が使用される場合、これらは、成長因子を添加することによりインビトロで培養培地で維持され得る。
条件的不死性を付与するのに使用される遺伝子は、胎児性動物から抽出した後で、細胞に組み込まれ得る。或いは、その神経上皮細胞が条件的不死性を付与する遺伝子を含むヒト以外のトランスジェニック動物が作製され繁殖され得る。トランスジェニック動物が繁殖されるなら、胎児性動物組織から収集された細胞は既に条件的不死であり、さらなる処置を要求しない。
ヒトの処置に使用される細胞は、免疫拒絶の問題を少なくするために、好ましくはヒト細胞に由来すべきである。これは、胎児性組織の使用を要求する。条件的不死細胞の使用は、細胞のポピュレーションが一旦確立したら、胎児性組織を再び使用する必要がないことを意味する。例えば、発生の適切な段階でヒト胎児から細胞が取られ、細胞内で条件的不死性を引き起こすのに必要なDNAが挿入される。次に、それらの細胞は増殖され得、又はそれらはクローン化され、個々の細胞系が選択され得る。混合されたポピュレーションおよび／または選択された細胞系の維持により、インプラントのための一定のソースの材料が提供される。
患者を処置するために、脳内のどこで損傷が起きたかを知ることは一般に手助けとなる。損傷の存在が一旦証明されたら、それが１つの孤立した領域であろうと幾つかの領域であろうと、損傷領域に細胞インプランテーションする処置が行なわれ得る。しかしながら、多くの場合、損傷組織の位置および／またはタイプは、未知または僅かにしか特徴付けられていないかもしれない。例えば、神経変性疾患は、異なるタイプの細胞に広範囲な損傷をもたらし得る。そのような損傷の処置は、それでも可能であり、一旦移植されたら広く移動し損傷組織を見付け出す多能性神経上皮細胞の能力によって支援される。多能性細胞は、単一の箇所または好ましくは複数の箇所で移植されても良く、損傷の箇所（単数または複数）に移動し、一旦そこに来ると、局所的微細環境に応答して機能を改善または回復するのに必要な表現型（単数または複数）に分化し得る。条件的不死の多能性神経上皮細胞系の細胞の移植を受けたラットの脳を死後に分析すると、細胞が損傷組織に凝集することが示され、下記の実施例９を参照、よって、非損傷組織の領域よりも損傷領域に定着し（establish）それら自身を統合する（integrate）細胞の傾向を例示する。細胞の多能性性質および損傷組織に対するそれらの傾向は、高い潜在的能力（potency）を有する単一細胞系からの細胞を用いた処置が、多くの異なる細胞タイプからなる広範囲の損傷に補償をもたらし得ることを意味する。
処置後、患者の経過は、行動的および／または精神的テストを用いて、および／または必要なら脳の選択された領域で脳活動をモニターするテストを用いて、モニターされ得る。例えば、認識機能に関するテストが、移植の前後に行なわれ得る。
好ましくは、処置は実質的に、行動的および／または精神的欠損を矯正する。しかしながら、それは常に可能でないかもしれない。本発明の細胞、医薬および薬学的調製物を用いる本発明による処置は、完全な矯正がなくとも機能の改善をもたらし得る。そのような改善は、価値があり、有益である。
使用されるべき細胞の数は、損傷組織の性質および広さに依存して変動する。代表的には、移植に使用される細胞の数は、約十万〜数百万の範囲である。処置は、１回の移植に制限される必要はない。更なる移植が、さらに機能を改善するために行なわれ得る。
本発明は、脳に損傷を有するラットで我々が行なった業績によって例示される。下記の実験では、移植に使用される条件的不死細胞は、エム．ノーブル（M.Noble）と彼の同僚がルードウィッヒ・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチで開発したH-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスに由来する（ジャット（Jat）ら、1991）。このマウスからの全細胞は、温度感受性腫瘍遺伝子（tsA58、インターフェロンで誘導されるH-2Kbプロモーター制御下のSV40ラージT抗原の温度感受性突然変異体）を有し、その結果、細胞は許容温度（体温より低い、33℃）で分割するが、マウス体温（38-39℃）まで戻したときのみ分化する。条件的不死性をそれに提供するのは、この特徴である。これは我々に、それが次に宿主脳に移植されると分化する細胞系をインビトロでクローン化し拡張することを可能にした。多くの細胞系が、最初にトランスジェニックマウスから、特に胚性14日目（E 14）の海馬から取られた細胞のポピュレーションからクローン化された。我々は、それらの細胞の移植を受けたラットを少なくとも８ヶ月間研究し、どの場合も移植後に細胞は腫瘍を形成しなかった。さらに、死後の組織標本では、移植された細胞（lac-zレポーター遺伝子で事前トランスフェクションして印を付けた）は、齧歯類神経組織系に好適な分化細胞の外観を有する。
クローン化細胞系は、インビトロで１を超える表現型、例えば、大グリアおよびニューロンの両方の表現型に分化する潜在力を示す、下記の実施例４を参照。
クローン化細胞系が損傷した脳において機能を回復し得ることを我々が実証した病変および行動モデルは、胎児同種移植（シンデンら、1995を参照）を用いて我々が以前に集中的に研究したものである。それはラットを利用し、そこではヒトの心臓発作をシミュレートする４血管閉塞（4 VO）の技法が、背側海馬のCA 1錐体細胞に対する比較的限局性で特異的な損傷を起こさせ、スイミングプールの水面下の見えない壇（platform）を探し出すのが困難である認識的欠損を呈する。この病変および行動モデルは、脳損傷の通常の形態の帰結として、即ち、例えば心停止の際に起こり得るような脳への血液供給の一時的消失として起こる認識障害のモデルを提供する。
我々は以前、胎児細胞懸濁液の移植がこの試みにおいて能力を回復するには、それらが4VOにより生じた損傷に高度に特異的でなければならない：CA 1錐体細胞を含む移植が効果的であり；基底前脳からのコリン作動性細胞、歯状回からの顆粒細胞、または海馬からの異なるクラスの錐体細胞（CA3）さえも含む移植は効果的でないことを実証した。下記の実施例５〜８は、クローン化細胞系およびH-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスから取られたE 14海馬神経上皮細胞の混合ポピュレーションの両方とも、このモデルの認識機能の回復に効果的である移植物を提供する実験を記載した。
我々は、テストされた３つのクローン化細胞系のうちの２つである、MHP36細胞系（以前C36細胞系として公知）およびMHP3細胞系が、認識機能を回復するのに、CA 1錐体細胞を含む胎児ラット移植物と同じほど効果的であることを見い出した。テストされた第３の細胞系であるMHP15細胞系（以前C15細胞系として公知）は、機能の改善をもたらすが、MHP36およびMHP3と同じほどの改善は示さない。宿主の脳環境の性質に関係なくCA 1錐体細胞に分化したであろう細胞系を、我々が偶然選定するチャンスは小さい。従って、細胞系は損傷に関連するシグナルに応答し得、必要な連結を再度確立し、損傷組織によって排除（discharge）された機能（単一または複数）を回復し得る１種以上のタイプの細胞に分化するように見える。ヒト脳に対する等しく広い範囲の損傷の形態の結果起こる、広い範囲の行動的および精神的欠損を標的化する移植療法のための戦略および物質的基礎の両方を提供し、同時にヒト胎児組織の使用に関連する倫理的および実際的問題を回避するのが、この能力である。
これまでに機能を回復する最大の能力を示した２つの細胞系はともにFGF2-応答性である、即ち、それらはその成長因子の存在下に許容および非許容培養の両方でそれらの増殖を実質的に増加するが、第３の細胞系は僅かに応答性であるに過ぎない。従って、その培養環境への成長因子の添加に応答して増殖の有意な増加を示す細胞および細胞系が、一般に好ましい。細胞は、許容条件下および／または非許容条件下でテストされ得る。増殖の最大増加を示す細胞が、一般に最も好ましい。細胞をテストするのに使用される成長因子は、好ましくは細胞が使用を意図される、即ち、その領域で成長因子が分泌される脳の領域に好適であるべきである。例えば、海馬の組織の修復を意図した細胞は、FGF2（bFGFとしても公知）を用いてテストされ得る。FGF2に応答性の細胞が、一般に好ましい。EGFおよびNGFを含む、他の分裂促進成長因子がテストに使用され得る。
従って、本発明は、条件的不死の多能性神経上皮細胞系の細胞のポピュレーションをインビトロで維持し、成長因子、例えばFGF2の存在下および非存在下に許容条件下で細胞の一部分を培養し、細胞の増殖を測定することを包含する、テスト方法を提供する。好ましくは、細胞は、非許容条件下でもテストされる。応答性である、即ち、成長因子の存在下に、許容条件下および好ましくはさらに非許容条件下でも共に、増殖の有意な増加を示すそれらの細胞は、本発明の処置で使用するのに特に適切な細胞であるように見える。成長因子は、例えば、10ng/mlの濃度で使用され得る。
H-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスに由来する細胞に条件的不死性を付与する温度感受性腫瘍遺伝子は、インビトロでヒト細胞に導入できる。外因性DNAの導入に関する周知の技術が存在し、これらは使用され得、例えば、遺伝子は細胞のトランスフェクションによって導入され得る。遺伝子が導入されたことをチェックする通常のスクリーニング技術が使用され得、例えば、サザン・ブロッティングがDNA挿入部位をスクリーニングするのに使用され得る。或る場合には、マーカーが使用され得、即ち、ts SV40ラージT抗原遺伝子を使用する場合は、実施例４に記載されるように細胞はSV40発現のための許容温度でスクリーニングされ得る。
下記実施例に記載される実験は、条件的不死性を細胞に付与するts SV40ラージT抗原遺伝子を用いて行なわれたが、条件的不死性を生じ得るあらゆる他の遺伝子が使用し得ることが理解されるべきである。そのような遺伝子は、公知の腫瘍遺伝子から構築され得る。例えば、条件的不死遺伝子は、c-myc腫瘍遺伝子から構築され、ホシマイウアル（Hoshimaiuaru）ら、1996に記載されている。
下記実施例６、７および８に記載されるラットの実験では、条件的不死多能性細胞が非常に特異的なタイプの損傷を修復するのに使用された。本発明による細胞の使用は、特定のタイプの損傷の修復に限定されない。脳のいかなる領域への移植も、機能の結果的な改善とともに観察される。
そこから神経上皮細胞が取られる胎児脳の部分および正確な時間（段階および発生）は、変動し得る。多能性細胞が所望される場合、細胞はしかしながら、脳細胞タイプの所望の様々な異なるタイプおよび／または表現型に分化する能力を有するように、発生経路の十分に早い時点で取られなければならない。例えば、胚性マウスの海馬から取られる細胞の場合、細胞は、胚性14〜15日目に取られ得る。ヒト細胞は、等しい発生段階で取られ得る。例えば、細胞は、ヒト胎児から約８週目に取られ得る。
取り除かれた細胞は、それらがまだ分化し得る、特に好適なタイプまたは表現型の細胞に分化し得ることを確実にするよう、インビトロでスクリーニングされ得る。脳の異なる領域は、損傷されたとき異なるシグナル、例えば成長因子を産生し得、および／または異なるタイプの損傷は、異なるシグナルを生じ得る。分化する能力は、好適なシグナル、例えば、好適な成長因子の存在下にインビトロで測定し得る。下記の実施例４は、ニューロンおよびグリアの表現型に分化する細胞の能力が示され得る手順を記載している。
幾つかの行動的および／または精神的欠損は、あるいは健康な脳に１種以上の化学物質が存在しないことによって引き起こされる。トランスジェニック細胞の移植物は、欠けている化学物質を供給するのに使用できることを以前に提案した。本発明は、そのような問題と特に関連しない。本発明の細胞は、所望の生成物を発現する余分の遺伝子を含むように遺伝子的に修飾され得るが、本発明により使用される細胞は一旦移植されたら、分化し、その後、失われ損傷された細胞の代替物として十分に機能するので、これは通常は必要でない。細胞は、機能的統合を達成し、欠けた又は損傷した細胞を代替し補償する。それは、薬剤投与の単なる洗練化された方法である以上に、脳の機能性部分となる。従って、細胞の遺伝子的修飾は通常は、条件的不死化およびクローン化に必要な遺伝子の挿入に限定される。クローン化に必要な遺伝子は、例えば、選択を可能にするように、選ばれた抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子であり得る。薬理学的物質の分泌を可能にする遺伝子的修飾は、好まれない。
細胞をヒトおよび動物に移植する方法は、当業者に公知であり、当分野の文献に記載されている。本明細書で使用される用語「移植」は、インビトロで成長した、および遺伝子的に修飾されたかもしれない細胞の移植、ならびに他の生物から抽出された材料の移植を含む。細胞は、標的領域に公知の量の細胞をマイクロシリンジ注入によりインプランテーションして移植し得、該領域でそれらは通常、注射部位の周囲に分散する。それらはまた、脳の脳室腔に移植され得る。新生児にインプラントされたら、それは脳全体にわたって分散し得る。
本明細書で使用される語句「大脳内移植」は、脳の任意の部分への移植を含む。移植は、脳の前部およびより大きな部分に限定されない。
下記の非制限的実施例は、本発明を例示する。
図１〜２０は、実施例３および５〜８に記載される実験の結果を示す。図は、下記の通りである：
図１は、SFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図２は、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図３は、FGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図４は、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）およびFGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図５は、SFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図６は、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図７は、FGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図８は、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）およびFGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図９は、シャムグラフト（sham graft）を受けたシャム病変コントロールラット（CON）、シャムグラフトを受けた虚血性ラット（ISC）、CA1細胞（CA1）、CA3細胞（CA3）、またはH-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスから取った条件的不死海馬前駆細胞の混合ポピュレーション（tsA58）のインプラントを受けた虚血性ラットに関する、モリス（Morris）水迷路中での時間経過によるラットの潜時を示す。
図１０は、シャムグラフトを受けたシャム病変コントロールラット（CON）、シャムグラフトを受けた虚血性ラット（ISC）、CA1細胞（CA1）、MHP36細胞系の細胞（MHP36）またはH-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスから取った条件的不死海馬前駆細胞の混合ポピュレーション（tsA58）のインプラントを受けた虚血性ラットに関する、モリス水迷路中での時間経過によるラットの潜時を示す。
図１１は、シャムグラフトを受けたシャム病変コントロールラット（CON）、シャムグラフトを受けた虚血性ラット（ISC）、およびMHP36細胞系（24〜32継代）の細胞（MHP36）のインプラントを受けた虚血性ラットに関する、モリス（Morris）水迷路中での時間経過によるラットの潜時を示す。
図１２は、シャムグラフトを受けたシャム病変コントロールラット（CON）、シャムグラフトを受けた虚血性ラット（ISC）、MHP36細胞系の細胞（MHP36）、MHP15細胞系の細胞（MHP15）、またはMHP3細胞系の細胞（MHP3）のインプラントを受けた虚血性ラットに関する、モリス水迷路中での時間経過によるラットの潜時を示す。
図１３は、図１と同様だが０〜６日間の、SFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図１４は、図２と同様だが０〜６日間の、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図１５は、図３と同様だが０〜６日間の、FGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図１６は、図４と同様だが０〜６日間の、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）およびFGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP15細胞の増殖を示す。
図１７は、図５と同様だが０〜６日間の、SFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図１８は、図６と同様だが０〜６日間の、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図１９は、図７と同様だが０〜６日間の、FGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
図２０は、図８と同様だが０〜６日間の、ガンマ-インターフェロン（12U/ml）およびFGF2（10ng/ml）を含むSFMにおける、33℃および39℃でのMHP36細胞の増殖を示す。
実施例１
混合ポピュレーション培養物の調製
海馬は、E14 H-2Kb-tsA58マウスから切開した。トリプシン処理と機械的解離の両方の後、細胞懸濁液を調製し、10cm2培養皿に45×103〜50×103細胞/mlの濃度で細胞をプレートした。細胞は、DMEM：F12血清を含まない培地（SFM）、以下の添加物を含む、で培養した：ウシ血清アルブミン（0.0286%）；トランスフェリン（0.1mg.ml）；プトレシン（putrescine）（16.2μg/ml）；インシュリン（5μg/ml）；プロゲステロン（0.062μg/ml）；セレニウム（0.0383μg/ml）；L-グルタミン（2mM）；L-サイロキシン（0.4μg/ml）；トリ-ヨードサイロニン（0.337μg/ml）；ヘパリン（10USP単位/ml）；ペニシリン／ストレプトマイシン（10,000：1000単位/ml）、全てシグマ（Sigma）から得たものである。さらに、以前bFGFとして知られ現在FGF2として知られる基礎的な線維芽細胞成長因子、（FGF2-10ng/ml）およびガンマ-インターフェロン（g-IFN-12U/ml）を細胞に加え、それらを33℃で5% CO2中でインキュベートした。２〜３日毎に、培地の半分を交換し、全てFGF2およびg-IFNを含む。
実施例２
クローン化系の産生
lacZおよびネオマイシン耐性融合物からなりpGKプロモーターで駆動されるpPGKB-geoプラスミド（ピー．ソリアノ（P．Soriano）から得た）を終夜37℃でルリヤ・ベルタニ（Luria Bertani）肉汁中で増殖させ、次に市販されているキット（クィアゲン（Qiagen）、ドイツ）を用いて精製した。精製されたプラスミドDNAは、制限酵素Sal 1（プロメガ（Promega）、イギリス）を用いて直線化し、続いて滅菌し、TE緩衝液に最終濃度1mg/mlで再懸濁した。実施例１で調製されたような海馬神経上皮細胞の混合ポピュレーションをエレクトロポレーションして、細胞がlacZ融合遺伝子を組み込むようにした。
細胞を、適切なFGF2およびg-IFNが添加されたSFM（実施例１にリストされた添加物を有する）中に、105〜106細胞／プレートの濃度で播き、24時間後に、プラスミドを組み込んだ細胞のみ正しくG418耐性を発現できるようにさせるG418（ネオマイシン様抗生物質）（200μg/ml）を含むSFMと培地を交換した。培地は、週に２〜３回交換し、クローンが発生するように細胞を４〜６週間おいた。
選択されたクローンは、互いに離れており、シリコングリースに浸けられていたガラス製クローン化リングを用いて採取した。EDTA/EGTA（1:100）溶液を用いて37℃にて5分間簡単にインキュベーションした後、クローン化細胞を24ウェルプレートに移した。数日後、これらの細胞はコンフルエントになり、６ウェルプレート続いて10cm2培養皿に移し、その後でG418添加を例外として上記の混合ポピュレーション非トランスフェクト系と全く同じように処理した。採取された32クローンのうち、9クローンが永久細胞系に拡張した。
これらのクローン化海馬系の全ては、条件的に不死であることが示され；色素原性MTTアッセイによる細胞数は、FGF2添加することなく血清を含まない培地で、許容条件で２〜６日目にインビトロで（これ以降、”DIV”と称する）、当初のプレーティング密度から1-2×103倍の増殖を示し、非許容条件（39℃、ガンマ-IFN）ではプレートされた細胞数の急速な減少があった。しかしながら、これらの系が由来する海馬神経上皮ポピュレーションは、増殖のためにはFGF2の補足を要求した。９つの系のうちの２つは、さらに、FGF2応答性であり、この成長因子の存在下に許容および非許容培養の両方で、それらの増殖速度を実質的に増加させる。
系は複数継代維持され、凍結されたストックは解凍され、表現型に変化なく培養された。
実施例３
クローン化系MHP15およびMHP36のインビトロでの増殖（細胞系MHP36およびMHP15は以前、C36およびC15としてそれぞれ知られていた。C36およびC15の参考文献は、本願が優先権を主張している出願で使用された。細胞系は、同じ細胞系であり、名称のみ変更した。）
２つの永久細胞系からの細胞を、96ウェルプレートに8-12×103細胞／ウェルの密度で、基礎的な線維芽細胞成長因子（FGF2-10ng/ml）およびg-インターフェロン（12U/ml）の添加された血清を含まないDMEM:F12培地（SFM）に、24時間33℃にて5% CO2でプレートした。この期間の後、全ての培地、FGF2およびg-インターフェロンを除去し、８ウェルからなる各カラムを、
（i）補足物を含まないSFM；
（ii）g-インターフェロン（12U/ml）を含むSFM；
（iii）FGF2（10ng/ml）を含むSFM；または
（iv）g-インターフェロン（12U/ml）とFGF2（10ng/ml）の両方を含むSFM；
のいずれかで、２、４、６、８および14日間インビトロで、33℃または39℃にて処理した。細胞は、色素原性MTTアッセイを用い、それぞれの温度および補足物条件下に、それぞれの時点でカウントした。両方の細胞系とも、g-インターフェロンを含んでも含まなくてもSFM中で明確な温度感受性を示す；細胞は、許容温度（33℃）で200倍のプレーティング密度まで急速に増殖するが、非許容温度（39℃）では最小の増殖を示す。FGF2の添加は、MHP36系において両方の温度で増殖が増大するが；MHP15系においては僅かな効果しか有さず；細胞系がこの成長因子に対するその応答性において異なることを示す。
図１〜４は、MHP15細胞系の14日間までの結果を示し、図１３〜１６は、０〜６日目までの結果をより詳細に示す。図５〜８は、MHP36細胞系の14日間までの結果を示し、図１７〜２０は、０〜６日目までの結果をより詳細に示す。
実施例４
MHP15およびMHP36クローン化細胞系はインビトロで分化するときニューロンおよびグリアの潜在力を有する
分化剤ジブチリルcAMP（1mM）を添加したSFM中で、許容条件（33℃プラスg-インターフェロンにFGF2を添加した）および非許容条件（39℃）の両方の下、一連のマーカーを用いて、細胞を免疫細胞化学のために調製した。それぞれの系からの50-100×103細胞を、フイブロネクチン処理したチャンバースライド上に、FGF2およびg-インターフェロンを含むSFM中で、33℃にて48時間プレートした。スライドの半分をこの段階で固定し、残りの半分は培地除去して1mMジブチリルcAMPを含むSFMで置き換え、39℃で維持した。これらのスライドは、２〜８日後にインビトロで、4%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。表は、５個のランダムに選択された区域での、前駆細胞に関するマーカーであるネスチン（Nestin）；ニューロンマーカーであるニューロン特異的エノラーゼ（NSE）；グリアマーカーであるグリア原繊維酸性タンパク質（glial fibrillary acidic protein; GFAP）および不死化遺伝子抗原に関するマーカーであるSV40を発現する全細胞の割合を示す。両方の細胞系とも、分化の前ではなく後に、ニューロンおよびグリアの表現型を示す。
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MHP36のクローン化系の更なる特徴付け
MHP36細胞系を、許容と非許容培養の両方で、2DIVで更に特徴付けした。細胞は、許容条件で＞95% X-gal標識された（即ち、β-galトランスデュースマーカーへの組織化学的反応を示した）ことが見い出された。細胞はまた、２つの更なる抗体、ニューロンマーカーPGP 9.5（ウィルソン（Wilson）ら、1988）に対するものとブロモデオキシウリジン（BrdU）に対するものとを用いて、分割している細胞に関するマーカーとしてBrdU標識培地で１時間インキュベーションした後にテストした。許容培地において、BrdU染色細胞は、培地全体にわたって見られた。許容培地には、PGP 9.5細胞はなかった。
添加物なしの血清を含まない培地（SFM）において、非許容条件にスイッチした後では、この細胞系は分割を止め、細胞の大多数は、成熟したニューロンおよびグリアの表現型に分化することなく死んだ。しかしながら、フォルスコリン（forskolin）またはレチノイン酸（その両方とも分化剤である）の存在下では、培養物はより長期間（5-14 DIV）維持でき、細胞の１部分は2 DIVまでにニューロンまたはグリアの表現型を示した。MHP36細胞は、レチノイン酸（10-9M）の存在下に平坦な細胞形態を示し、多数のGFAP陽性の原繊維細胞を伴っており、SV40発現は30%まで減少しBrdU染色は細胞の5%まで減少した；PGP 9.5染色した細胞は見られなかった。しかしながら、フォルスコリン（10-8M）の存在下では、二極性PGP 9.5陽性細胞が頻繁に見られ、多くの細胞は長い神経突起のプロセスを有した。GFAP染色された原繊維は培養物中に見られず、SV40発現はダウンレギュレーション（トータル細胞の42%まで）され、BrdU染色は培養物の4%に見られた。これらの知見は、MHP36が多能性の神経前駆細胞系であり、その系列的運命は少なくとも一部分、誘導性シグナリングによって決定されることをさらに確認する。
実施例５
グラフトされたH-2Kb-tsA58海馬前駆細胞は、CA1細胞の細胞懸濁液のように、CA1の虚血性病変を有するラットの空間的学習および記憶を回復する。
E19 CA1（CA1）、E19 CA3（CA3）およびE14トランスジェニックH-2Kb-tsA58海馬神経上皮細胞の拡張された培養物（tsA58）（５継代で回収）の細胞懸濁液のグラフトの、15分間4VO虚血（ISC）してCA1に選択的病変を生じた後の、モリス水迷路中で隠された壇の位置を修得する効果が研究された。シンデンら、1995による論文に記載された方法、特に論文の第９項に記載された方法に、逆を示す場合を除いて従い行なった。論文は、虚血を引き起こすのに使用される方法、移植およびモリス水迷路テストを使用する方法の詳細を示している。手順の簡単な概要を以下に示す。
2%ハロタン麻酔（70%亜酸化窒素および30%酸素中）下に、第一頸椎の翼状孔（alar formanae）を介して、脊椎動脈を電気的凝固する4VO方法により、一時的全体的虚血を雄ウィスターラットに誘発し、シラスティック性結びヒモを頸動脈周囲に挿入し表面に引き出す。24時間後、そのヒモをきつくし、15分間クランプした。２分以内に起き上がり反射を失わなかったラットは実験に含めなかった。傷はクリップで直ぐにふさぎ、リグノカインを適用した。
H-2Kb-tsA58細胞を許容培養物から取り除き、グラフト用の1mM n-アセチル-L-システインを含むハンクス平衡塩類溶液に再懸濁した。細胞は、除去前に、0.5μCi/ml3H-チミジンで48時間パルスした。
グラフトは、背部CA1細胞区域に両側性に標的化し（各細胞タイプのグラフトにつき2部位/半球、2μl/部位、25K細胞/μl）、ラットは虚血手術より２〜３週間後にグラフトされた。tsA58細胞のグラフトを受けたラットを、移植後14日間１日おきに免疫抑制剤シクロスポリンＡ（サンド（Sandoz）、クレモフォア（Cremophore）EL中2.5mg/ラット、筋肉内）で処置した。トレーニング（２試行／日）は、移植より12週間後に開始した（被験体の数（Ns）=7〜11/群）。
シャム病変コントロールラットは、脊椎動脈の焼灼を受けたが頸動脈の結紮は受けず、その後シャム移植物を受けた。シャム移植物（グラフト）は、注射することなくグラフト注射針を適切な部位に降ろすことによって行なった。
水迷路は、黒のポリプロピレン製円形プール（直径2m、高さ0.5m、26℃の水の深さ0.25m、ミルク200mlを加えて不透明にしてあった）からなっていた。避難用壇は、プールの北西側四分円の中央に、水表面から0.02m下に位置する9cmの透明なパースペックス製密閉円柱であった。試行開始時、ラットはプールの中に壁を向いて入れられ、彼らが壇を見つけるまで泳がされ、壇で10秒間居たあと取り除かれた。60秒以内に壇を見つけられなかったラットは、実験者によってそれに導かれ、最大潜時が記録された。スタート位置は、北、南、東または西に疑似乱数的順序で指定され、壇に近い１スタート地点およびそれから遠い１スタート地点が各日に使用された。遊泳路が画像分析システム（HVSイメージ、VP112）によって記録され、ナビゲーション測定の範囲内にデジタル変換された。
エラーの棒は、分散分析の群×日の相互作用からの群間の２つの標準誤差を示す。CA1およびtsA58グラフトの両方を有する虚血ラットに関する壇を見つける潜時は、非病変コントロール（シャムグラフトを受けたシャム病変コントロールラット）（CON）とは有意に異ならなかったが、CA3またはシャムのグラフトを有する他の虚血群は、コントロール、CA1およびtsA58群と比較すると潜時および空間学習の他の測定において有意に損なわれていた。死後分析は、グラフトされた群のそれぞれを含む全虚血群において、宿主CA1からの類似の選択的CA1ニューロン損失（70-75%）を示した。グラフト生残は、全てのグラフト群で優れていた。
モリス水迷路テストでの潜時は、隠された壇に被験体が泳ぎ着くのに要する時間である。
結果を図９に示す。
実施例６
H-2Kb-tsA58海馬前駆細胞に由来するクローン化細胞系（MHP36）は、CA1の虚血性病変を有するラットの空間学習および記憶を回復する。
E19 CA1の細胞懸濁液（CA1）、E14トランスジェニックH-2Kb-tsA58海馬神経上皮細胞の拡張された培養物（tsA58）（５継代で回収）およびE14不死海馬前駆ポピュレーションに由来する拡張されたクローン化細胞系（MHP36）のグラフトの、15分間4VO虚血（ISC）しCA1の病変を生じた後で、モリス水迷路に隠された壇位置の修得に対する効果が研究された。方法は、実施例５に記載されるものと同じであった。MHP36細胞が許容培養物から取り除かれ、グラフト用の1mM n-アセチル-L-システインを含むハンクス平衡塩類溶液に再懸濁した。
実施例５のように、グラフトは、背部CA1細胞区域に両側性に標的化し（各細胞タイプグラフトにつき2部位/半球、2μl/部位、25K細胞/μl）、グラフト手術は虚血より７〜14日後に行なわれた。この実験の全ラット（非グラフト（シャム-グラフト）および非病変（シャム-病変）コントロールを含む）は、移植後14日間１日おきに免疫抑制剤シクロスポリンＡ（サンド、クレモフォア（Cremophore）EL中2.5mg/ラット、筋肉内）で処置した。トレーニング（２試行／日）は、移植より12週間後に開始した（Ns=７〜11/群）。エラーの棒は、分散分析の群×日の相互作用からの群間の２つの標準誤差を示す。我々の最初の実験を繰り返すと、CA1およびtsA58グラフトの両方を有する虚血ラットに関する壇を見つける潜時は、シャムグラフトを受けたシャム病変コントロールラット（CON）とは有意に異ならなかった。さらに、MHP36クローン化細胞系をグラフトされた群は、コントロール、CA1およびtsA58群と比較すると有意に損なわれていなかった。これらの実験の結果を、図１０に示す。
実験は、移植された前駆細胞が、損傷がもたらす機能的欠損を代替し補償し得る表現型を担うことにより、損傷された脳からのシグナルに応答するように見えることを実証する。
さらに、繰り返し測定をした分散分析（ANOVA）は、群（F4.38=2.92、P＜0.05）およびブロック（F5.896=36.50、P＜0.001）の有意な主要効果および有意な群×ブロック一次係数相互作用（F4.896=3.23、P＜0.02）を示す。一次係数間のt-検定比較は、虚血-シャム移植群が、コントロールおよび３つのグラフト群に比較して避難潜時能力を有意に損なったこと（最小t38=2.29、P＜0.05）；コントロールおよび３つのグラフト群はそれら自身の間で有意に異ならなかった（全t38＜1）ことを明らかにした。遊泳距離のANOVAsは、潜時結果に類似する結果を明らかにした。
実施例７
実施例５および６の水迷路テストが、さらなるセットの実験で繰り返された、下記を参照。（これらの実験では、全てのラットが、移植後15日間１日おきにシクロスポリンＡの筋肉内注射（クレモフォアEL中2.5mg/ラット）によって免疫抑制された。結果を図１１に示す。その図の中で、壇を見つけるのに要する平均時間は、トレーニングの２日間（４試行）ブロックの関数として表わされている。棒は、分散分析の群×ブロック相互作用からの2×s.e.m.を示す。
これらの結果は、MHP36細胞のグラフトが、虚血で誘導された学習欠損を逆転できることをさらに確認する。コントロール（シャムグラフトを受けたシャム-病変ラット）およびMHP36群の両方とも、シャムグラフトを受けた虚血を有する群よりも、有意に速い避難潜時と避難壇への短い遊泳距離を示した。
MHP36細胞のグラフトを有する虚血群（P24-32）（N=12）（黒塗り四角）が、シャム移植を受けた虚血（N=10）（黒塗り丸）およびシャム移植を受けたシャム-病変コントロール（N=10）（白塗り丸）と、同一の水迷路手順で比較された。避難潜時のANOVAは、群（F2.29=27.80、P＜0.001）およびブロック（F5.674=54.72、P＜0.001）の有意な主要効果および有意な群×ブロック相互作用（F10.674=5.81、P＜0.001）を示し、有意な一次係数相互作用（F2.674=23.31、P＜0.001）を有していた。一次係数間のt-検定比較は、虚血-シャム移植群が、コントロールおよびMHP36グラフト群の両方に比較して避難潜時能力を有意に損なったこと（最小t29=5.54、P＜0.001）；コントロールおよびMHP36群は有意に異ならなかった（t29＜1.01）ことを明らかにした。遊泳距離のANOVAsおよび水迷路中の空間学習の他の測定は、避難潜時結果と全体的に一致していた。
実施例８
実施例７の実験を、MHP3およびMHP15細胞系からの細胞のグラフトを用いて繰り返した。MHP3は、上記の実施例２に述べられた９個のクローン化細胞系の１つであり、FGF2に対する応答性を示した細胞系の１つである。結果を、図１２に示す。その図には、コントロールラット（シャムグラフトを受けたシャム病変ラットを再度）、シャムグラフトを受けた虚血ラットおよび上記実施例７のようにMHP36細胞系の細胞のインプラントを受けた虚血ラットに関する結果も示されている。MHP3およびMHP15に関してN=9である。そこで見られるように、MHP3細胞のグラフトは、MHP36のもののような有効な学習遂行能力を生じる、即ち、虚血群に関しては有意により速く、しかしコントロール群に関しては有意に遅くない。MHP15細胞のグラフトは、中間の効果を生じる、即ち、虚血群に関しては有意により速く、しかしコントロール群に関して有意に遅い。
実施例９
実施例７Ａにおける虚血脳損傷を死後に、皮質および線条を２つのレベルで、および海馬のCA1-4領域をさらに２つのレベルで、２人の別々の観察者よってクレシルバイオレット染色した切片から評価した。５段階スケールを用いると、穏やかなCA3細胞損失を示した２匹のラットを例外として、CA1以外のどの領域にも損傷は見い出されなかった。グラフトされた細胞の領域とは独立して、最大虚血損傷のレベルでの平均的CA1細胞損失（前両耳間5.7mm）は、虚血プラスシャム移植群の80%から虚血プラスCA1グラフト群の90%までの範囲であり、虚血のみ（シャム-グラフト）および虚血プラスグラフト群の間で有意差はなかった。E19胎児CA1細胞の移植物は、以前に報告されたものと同様に、CA1-損傷領域の上に位置する境界限定されたグラフト塊を形成した。3H-チミジン標識された拡張したポピュレーション細胞が、全体的な海馬形成、脳梁およびその上にある新皮質を通じて分散して見られ；標識細胞の幾つかのクラスターが病変化CA1細胞層内に見られた。X-gal陽性のMHP36細胞のグラフトは、さらにより限定された分布を有した：針の通った跡に隣接する以外に、標識細胞は海馬に限局されていることが示された。これは恐らく、より大きい感度の放射性ラベル、並びにこれらの実験での長い生存期間にわたるβ-gal発現のダウンレギュレーションの両方を反映する。パイロット実験は、いつMHP36細胞のグラフトが非病変化海馬に為されたかを示したので、X-gal陽性細胞は、全てのCA（歯状回は除く）ニューロン細胞体層に統合するように見えた。（別々の標識細胞が、海馬組織とくにCA3および4の領域に見られた）。しかしながら、非病変化海馬へのグラフトの場合とは違い、X-gal染色細胞の密な凝集がさらに虚血CA1細胞層内に見られた。グラフトの程度は、ラット間で異なり、その結果、X-galおよびニッスル染色された切片の両方で明らかなように、凝集はCA1区域の小部分で、即ち、特定の切片内で病変化区域に殆ど十分に集団形成していた。例えば、幾つかの凝集が、同じ半球内で損傷CA1層の吻尾軸に沿って異なる位置で見られた。このことから、MHP36細胞系の細胞が病変化CA1ニューロン層に凝集する傾向を有することが明らかである。
グラフトされた細胞を同定するために抗B-gal免疫組織化学を用いる、虚血ラットにおける標識化されたグラフトされたMHP36細胞の移動の時間経過による研究は、CA1への移動およびそこでの凝集が、グラフト後４週間までに完了することを示す。
参考文献
ドゥネット（Dunnett）およびブジョルクルンド（Bjorklund）、1994、Functional Neural Transplantation、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨーク（New York）ジャット  ピー．エス．（Jat P.S.）ら、1991、P.N.A.S.、（USA）88、p5096
リンドヴォール、オー（Lindvall，O）、1994、ドゥネット（Dunnett）およびブジョルクルンド（Bjorklund）、前掲書中
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ウィルソン，ピー．オー．ジー（Wilson，P.O.G.）、バーバー，ピー．シー．（Barber，P.C.）、ハミッド，キュー．エー（Hamid Q.，A.）、パワー，ビー．エフ（Power，B.F.）、ディロン，エー．ピー（Dhillon A.P.）、ロード，ジェイ（Rode，J.）、デイ，アイ．エヌ．エム（Day，I.N.M.）、トンプソン，アール．ジェイ（Thompson，R.J.）、およびポラック，ジェイ．エム（Polak J.M.）、Br．J．Exp．Pathol 69、p91-104（1988）
ホシマイウアル，エム．（Hoshimaiurau，M.）、レイ，ジェイ（Ray，J.）、サー，ディー．ダブリュ．ワイ（Sah，D.W.Y.）、ゲイジ，エフ．エイチ（Gage，F.H.）、PNAS USA、Vol．93、p1518-1523、（1996）
本発明は、発明を例示することを意図する上記の実施例の範囲に限定されない。実際、本明細書中に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾が、当業者に明らかとなり、添付の請求の範囲内に意図される。
上記の文献の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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