(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)加熱分解（digestion）ステップを含む前処理ステップ、(b)少なくとも一つの蒸留ステップ、並びに(c)少なくとも一つの定量及び／又は分析ステップを具備するケルダール法によって、窒素含有物及び／又は窒素含量に直接関連する少なくとも一つの化合物及び／又は分析パラメータを定量する方法であって、前記蒸留ステップ(b)が、
i)少なくとも一つの希釈液を用いて、前処理した窒素含有物の試料を希釈することと、
ii)水蒸気を導入し、水蒸気蒸留を開始する、
iii)少なくとも一つのアルカリ化合物を添加する
というサブステップを具備し、前記アルカリの添加が、水蒸気の前記導入及び前記水蒸気蒸留の開始後1〜60秒後に行われ、前記水蒸気蒸留中に生じた留出物を酸性及び／又は錯化媒質に回収することを特徴とする方法。
【請求項２】
サブステップ(i)の希釈液が水であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サブステップ(i)の希釈液が、7〜9のpH値を与えるアルカリ水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サブステップ(ii)で添加されるアルカリ化合物が、水蒸気蒸留開始後2〜20秒後に添加されることを特徴とする請求項1〜3の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
サブステップ(ii)で添加されるアルカリ化合物が、水蒸気蒸留開始後2〜5秒後に添加されることを特徴とする請求項1〜4の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
サブステップ(ii)で添加されるアルカリ化合物が、水溶液として添加されることを特徴とする請求項1〜5の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
サブステップ(ii)で添加されるアルカリ化合物が、水酸化カリウム及び／又は水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項1〜6の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
サブステップ(ii)で添加されるアルカリ化合物が、10〜14のpH値を与える量で添加されることを特徴とする請求項1〜7の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
サブステップ(ii)で添加されるアルカリ化合物が、12±0.2のpH値を与える量で添加されることを特徴とする請求項1〜8の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記窒素に直接関連する化合物がタンパク質、アミン、又はアミノ酸である請求項1〜9の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記窒素に直接関連する化合物がアンモニウム、尿素、ニトロ、アゾ、又はヒドラゾ化合物であることを特徴とする請求項1〜9の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記留出物が回収される酸及び／又は錯化媒質がほう酸又は硫酸であることを特徴とする請求項1〜10の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ほう酸又は硫酸が水溶液として存在する請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前処理ステップ(a)が、窒素含有物の試料と酸性試薬を混合した後、300〜600℃で前記試料の加熱分解（digestion）をすることを具備することを特徴とする請求項1〜13の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前処理ステップ(a)が、窒素含有物の試料と酸性試薬を0〜50℃で混合することを具備することを特徴とする請求項1〜13の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(c)の定量及び／又は分析ステップが少なくとも一つの滴定を具備することを特徴とする請求項1〜15の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
滴定が少なくとも一つの酸塩基滴定であることを特徴とする請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、実質的に複数ステップの作業工程を備えた装置を用いて、窒素、主としてケルダール窒素を定量する方法に関する。該作業工程には、試料の調製に加えて、加熱分解（digestion）等の窒素含有物の試料の前処理、これに続く蒸留及び窒素含量の定量／分析、該窒素含量に直接関連する一以上の化合物の量及び／又は該窒素含量に直接関連する分析パラメーターの測定が含まれる。前記測定／分析は、適切には重力分析、容量分析、及び／又はクロマトグラフィー分析によって実施される。より具体的には、本発明の方法は、前記蒸留の新しいサブステップ系列に関し、操作上の安全性の増大及び分析の正確さの増加のような多数の驚くべき利点が得られる。
窒素定量のためのケルダール法は1883年に導入され、それ以来該方法を改良する目的で多大な開発努力がなされてきた。ケルダール法による窒素の定量は、例えば食品及び飼料産業において、原料及び最終産物を分析するための分析法の中で今日もっともよく使用されている方法の一つである。ケルダール法の化学的原理は、簡潔にいえば、高温で実施される加熱分解ステップ（通常は硫酸を含む酸性試薬と触媒の存在下で、タンパク質のような窒素含有試料がアンモニウムイオンに転換される）にあるといえるであろう。続いて、該試料を冷却し、該加熱分解された試料にアルカリを添加して、前記アンモニウムを気体状のアンモニアに変え、蒸留中に気体状のアンモニアとして回収される。蒸留されたアンモニアの量は、最後に、例えば滴定分析によって決定される。高い能力を持つ現代の実験室では、前記加熱分解、蒸留、及び分析を自動的に実施するようにデザインされた現代的な装置が一般的に用いられている。これらの装置は、増加した収容力及び操作の安全性を与えるともに、無人操作の延長により操縦者の時間を開放する。
市販の装置を使用してケルダール法により窒素を定量するときの典型的な作業系列は、加熱分解、蒸留、及び滴定であり、例えば以下のようなものであり得る。100〜1000mLの加熱分解用チューブの中に、調製した窒素含有物の試料を0.1〜0.5g秤り取った後、5〜20mLの酸性試薬（通常は濃硫酸）と3〜9gの触媒／塩混合物を添加する。該触媒／塩混合物は、例えば、硫酸カリウムのようなカリウム塩とともに銅及び／又はセレン、必要に応じて過酸化水素のような過酸化物を含有する。加熱分解用チューブは、通常、耐熱ガラス製の円筒チューブ（いわゆるケルダールチューブ）である。加熱分解は、通常400〜500℃又は好ましくは約420℃という300〜600℃の温度で、例えば45〜120分間行われる。該加熱分解には、結合した窒素又は物質の試料中にその他の態様で含まれる窒素をアンモニウムイオンに変換する化学反応が含まれる。時には、試薬と塩／触媒が添加された物質の試料は、蒸留前に放置しておく。このような状態中で加熱がなくても、ある程度の加熱分解（化学反応）は起こる。加熱分解完了後の加熱分解混合物中には、2〜15mLのような一定量の酸が通常存在する。加熱分解された試料は通常液体（酸性溶液）であるが、試料の冷却中に酸塩のクラストが時々形成される。該酸塩のクラストの形成を回避するために、ある限度内で、加熱分解条件を調整することができる。多量の酸を使用すれば、通常、冷却後にも液状の溶液が得られる。多量の酸を使用する不都合は明白であり、エネルギー消費の増加、原料コストの増加、老廃物廃棄コストの増加、濃酸を扱うことによる衛生上の問題、及び分析精度と操作の安全性の減少が含まれる。加熱分解後には、加熱分解された試料を含有するチューブを蒸留装置に移し、多くの場合、例えば水で希釈する。該希釈は、主に、加熱分解された試料中の酸の強度を下げるために行われる。より簡易な装置では、希釈は手で行い、より高性能な装置では、自動制御システムによって行われる。この時点で、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのようなアルカリを加えて、pHの値を約０から10以上、好ましくは約12に増加させる。試料（希釈されているにもかかわらず強度に酸性である）にアルカリを加えると熱が発生し、該溶液は、蒸留の前に通常少なくともある程度混合される。続いて、蒸留、多くの場合水蒸気蒸留を開始して、ほう酸のような酸及び／又は錯化媒質の中に、得られたアンモニア含有留出物を回収する。アンモニア、タンパク質、及び窒素、すなわちケルダール窒素の定量は滴定分析、いわゆる酸塩基滴定によって行われる。
ケルダール窒素を定量するためのISO、CEN、SIS、AOAC等のような標準的方法は、通常、試料を手で扱うのに適合している。これらの方法は、基本的には、蒸留ステップのサブステップを含む上述の操作に従う。同じことが、市販の自動装置で使用されるコントロールシステムにも妥当する。該プロセスのステップ及びサブステップは、常に以下の系列で行われる。
a)試料の前処理、通常は加熱分解
b)サブステップ：
a)希釈、
b)アルカリの添加
c)水蒸気蒸留のような蒸留
を具備する蒸留
c)定量／分析
例えば、何れかの標準的方法に従って行われる上記操作は、多くの欠点及び危険を包含している。水での希釈は、操作者が加熱分解された強酸性試料を水と混合することを意味している。層の形成及び該層間の大きな濃度差等、水と強酸を混合することの危険は周知である。加熱分解中に形成された酸含有塩のクラストは、水の添加によって、僅かな程度しか影響を受けない。加熱分解及び／又は蒸留チューブに存在する条件下では、前記塩のクラストを溶解するのにかなりの時間がかかる。通常、市販のケルダール装置では、例えばポンプによって、15〜30秒にわたって、閉鎖系の中でアルカリの添加が行われる。混合の程度は、例えば、アルカリ添加に使用されるポンプに依存する。添加したアルカリは、通常チューブの底に向かって徐々に下降して界面層を形成し、もし加熱分解中に塩のクラストが形成されれば、塩のクラストの下に存在する液体層の下側に向かって下降する。アルカリの添加は不確実で、酸とアルカリの間で高熱を発生する反応が起こり得る。アルカリ溶液は、水で希釈した試料溶液の下に層を形成する傾向があり、アルカリと酸の反応が起こる前に、大過剰のアルカリが添加される理由である。アルカリと酸の反応によって発生した熱は、加熱分解された試料中に残存する酸の量に比例する。続くステップである蒸留ステップは、通常アルカリ添加後5〜30秒後に開始される。酸を含有する加熱分解された試料溶液とアルカリ溶液は、これらの溶液の間に存在する界面の中に、主として拡散プロセスによって、前記5〜30秒の間にある程度混ざり合う。水蒸気蒸留用の水蒸気を注入すると、温度の上昇を伴いながら、酸性の試料とアルカリが迅速に混合される。大過剰の酸又は塩のクラスト存在は、激しい反応、時には危険な程激しい反応を生じせしめ得る。アルカリ及び／又は試料は、チューブのひび又は安全ロック扉の活性化等のためにチューブから漏れ出るかもしれない。これらのリスクは、市販のケルダール装置のユーザーに周知であって、多くのユーザーが手で試料を希釈する理由であり、これによって、より効率的な混合が得ることができ、水蒸気を注入する間の迅速な混合によって引き起こされる激しい反応が減弱される。手動での希釈は、試料の希釈後チューブがまだ暖かいうちに行われるが、これは操作上の危険をもたらす。
上述した酸性の試料とアルカリとの激しい反応は、さらに水蒸気やアンモニアのような気体を発生するのみならず、突発的な激しい液体の混合を引き起こす。これは、しばしば装置全体と蒸留中のアンモニアの回収に用いられる酸及び／又は錯化媒質（ほう酸溶液）にわたって衝撃波をもたらす。それ故、不正確な分析収率を伴うアンモニア及び／又は回収用媒質喪失というリスクが存在する。
本発明によれば、例えばケルダールによる窒素定量に関する前示の欠点及び問題を回避することが全く予期し得ないほど可能になる。本発明は、蒸留ステップ中のサブステップに関して完全に新規な作業系列を具備する。本発明のステップ及びサブステップは、(a)窒素含有物の試料の前記加熱分解等の前処理、(b)(i)例えば水又は弱アルカリ水溶液で前処理した試料を希釈して、試料のpHを7〜9にする、(b)(ii)水蒸気を注入し、水蒸気蒸留を開始する、(b)(iii)好ましくは水溶液としてアルカリを添加する、(c)例えば滴定によって、定量／分析することを具備する。ステップ(b)のサブステップ(i)で添加する弱アルカリ溶液中のアルカリとステップ(b)のサブステップ(iii)で添加するアルカリは、適切には、酸化カリウム及び／又は水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物である。ステップ(b)のサブステップ(ii)は、加熱分解された酸性試料とステップ(b)のサブステップ(i)で加えた希釈用の液体とを完全に混合し、前処理／加熱分解中に形成され得る塩のクラストの分解と溶解をもたらす。水蒸気の注入は、常にステップ(b)のステップ(iii)によるアルカリの添加前に開始され、これによって完全な混合が得られ、異なる酸又はアルカリ濃度を有する層の形成が最小限に抑えられる。ステップ(b)のサブステップ(ii)とサブステップ(iii)の適切な時間間隔は、1〜60秒以内である。前記サブステップ(ii)と(iii)を開始する時間の間隔が長すぎると、アルカリ添加中に前記前処理／加熱分解され、希釈された試料を過熱させる危険がある。該危険は、前記ステップ(b)のサブステップ(iii)の間に酸とアルカリとの反応によって生じた熱に関連する。ステップ(b)の前記サブステップ(ii)と(iii)との間隔は、適切には60秒未満、好ましくは2〜20秒又は2〜5秒のように30秒未満である。加熱分解され希釈された試料と添加したアルカリの得られた混合物のpH値が10〜14、好ましくは11〜13、最も好ましくは12±0.2に達するまで、適切には水酸化カリウム及び／又は水酸化ナトリウムの水溶液の形態で、アルカリを添加し続ける。できる限り正確な分析結果を得るために、前記pH値は10未満であるべきではない。アルカリの添加は、水蒸気の注入と実質的に同時に行われ、これによって、前記水蒸気の注入が継続的に混合され、異なる酸及びアルカリ濃度を有する層が避けられる。ステップ(b)で形成された留出物は、適切には従来から使用されている方法、例えばほう酸又は硫酸の水溶液のような酸媒質及び／又はアンモニア錯化媒質によって回収される。ステップ(c)は、適切には、重力分析、容量分析、クロマトグラフィー操作等の滴定のような公知の操作に従って実施される定量／分析を具備する。
本発明の方法は、ケルダール法による窒素の定量（該窒素に直接関連する化合物及び／又は分析パラメーター定量を含む）に極めて適している。前記窒素直接関連し得る化合物の例は、タンパク質、アミン、及びアミノ酸、並びにアンモニム、尿素、ニトロ、アゾ、ヒドラゾ化合物、ニトラート及びニトライトのような窒素含有化合物であり得る。
さらに、本発明の蒸留ステップ中のサブステップ系列は、シアン化物及びフェノールのような化合物の定量法に取り入れるのにも適している。
本発明の方法は、前処理ステップを具備している。前処理は、酸性試薬と窒素含有物を混合した後、300〜600℃、好ましくは400〜500℃、最も好ましくは400〜450℃の温度で加熱分解すること、又は0〜50℃、好ましくは20〜25℃の温度で窒素含有物と酸性試薬を混合した後、要求される効果で蒸留を実施し得るようになるまで、前記温度で放置することを具備し得る。本発明の方法は、さらに、滴定のような前述した測定又は分析を少なくとも一つ具備する。
本発明の方法によって得られる利点は複数あり、要約すれば
i)蒸留ステップ中に、塩のクラストを徐々に分解及び溶解する
ii)突発的な激しい液体の混合とこれに伴う使用している装置全体にわたる衝撃波を最少にするか、又は実質的に減少する
iii)取り扱い時の安全性を向上し、装置の損傷に関連する危険を減弱する
iv)分析精度と操作上の安全性を改善する
ことである。
本発明の方法の実用性及び応用性は、硫酸のような酸性試薬が多量に存在する従来用いられていた方法に比べて非常に向上している。高い分析精度（正しい窒素の収量）を保って、より長い間酸性を用いることができるが、これは、多量の産生試薬が用いられる分析条件を必要とする、又は要求するISO、IDF、AOAC等のような多くの標準的な方法で利点となる。
これら及びその他の目的並びに付随する利点は、実施例１〜３と共に、以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。ここで、例１は、ケルダール窒素の定量に使用される本発明の態様を教示し、例２（比較例）は、従来から公知である前記定量を行うための方法を教示し、例３は、本発明の方法及び従来から使用されている方法によって得られた窒素の収量を表している。前記窒素の収量は、グラフとして示されている（グラフ１）。本発明の実施態様が示されているが、多くの修飾をなし得、それ故、このような修飾は全て本発明の真の精神及び範囲に入るものとして、以下の請求の範囲でカバーされると考えられるので、本発明が実施態様に限定されないことは、無論理解されるであろう。
例１
加熱分解：穀物産物均一な窒素含有試料1.000gを加熱分解チューブ（いわゆるケルダールチューブ）に秤量する。濃硫酸12ｍＬと7.0gのK2SO4及び0.8gのCuSO4・5H2Oからなる触媒／塩を試料に添加した。加熱分解用チューブを過熱ブロックに移し、60分間、420℃の温度で加熱分解を行った。試料と触媒／塩混合物との化学反応によって、酸は加熱分解中に消費される。20個の試料をラックシステム中で同時に加熱分解した。加熱分解が完了した後に、該試料を冷却した。冷却中に、約75％の試料が、チューブの底に塩のクラストを形成した。この時点では、試料物中の窒素は、アンモニウムとして存在していた。
蒸留：加熱分解された試料を含有する加熱分解チューブを蒸留装置接続した。残存する酸を希釈するために、まず70ｍＬの水を添加した。ここで、水蒸気を導入して、水蒸気蒸留を開始した。塩のクラストは分解して、徐々に溶解した。２秒後に、50ｍＬの40％w/w水酸化ナトリウム水溶液を加えて、ｐＨ値を10より大きくした。この高いｐＨ値では、アンモニウムイオンがアンモニアに変わり、25ｍＬの４％w/wほう酸水溶液を含有する採集器に、生じたアンモニアを水蒸気蒸留した。ほう酸溶液は、ｐＨ指示薬（ブロモクレゾールグリーン／メチルレッド）を含有していた。計150ｍＬを採集器に蒸留した。ほう酸はアンモニアと錯体を形成した。
滴定及び計算：窒素の定量は、0.2000Ｍ HClを用いる酸塩基滴定によって行った。消費された酸は、以下の数式を用いて、試料物の窒素含量に換算した。
Ｎ=（Ｔ-Ｂ）×（Ｎ×14.007×100％／試料重量（ｍｇ）
Ｔ=試料の滴定値
Ｂ=ブランクの滴定値
Ｎ=滴定物質の規定度
タンパク質の定量は、以下のように、上記のごとく得られた結果に経験的なタンパク係数を乗ずることによって行った。
％タンパク質=％Ｎ×Ｆ
Ｆ=タンパク質係数（6.25）
例２
加熱分解：例１のとおりで、同様の結果が得られた。
蒸留：加熱分解された試料を含有する加熱分解チューブを蒸留装置に接続した。残存する酸を希釈するために、まず70ｍＬの水を添加した後、50ｍＬの40％w/w水酸化ナトリウム水溶液を加えて、ｐＨ値を10より大きくした。水及び／又は水酸化ナトリウム溶液の添加によって、塩のクラストは全く、又は極めて少ない程度しか影響を受けなかった。この高いｐＨ値では、アンモニウムイオンはアンモニアに転換されていた。水酸化ナトリウムを添加してから５秒後に水蒸気を導入し、水蒸気蒸留を開始した。25ｍＬの４％w/wほう酸水溶液を含有する採集器に、生じたアンモニアを水蒸気蒸留した。ほう酸溶液は、ｐＨ指示薬（ブロモクレゾールグリーン／メチルレッド）を含有していた。計150ｍＬを採集器に蒸留した。ほう酸はアンモニアと錯体を形成した。
滴定と計算：例１のとおり
例３
０〜18ｍＬの硫酸を添加し、硫酸アンモニウム形態の既知量の窒素を用いて、本発明の方法（例１）と従来から使用されてきた方法（例２）の蒸留及び滴定中の窒素収率を決定した。
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グラフ１は、本発明の方法が、非常に高い分析精度を有しており、極めて多量の酸を用いたときに、本方法を使用し得ることを明確に示している。