(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤において凍結乾燥安定剤の小胞に対する重量比が少なくとも１０：１で前記凍結乾燥安定剤を含有し、２０℃を越えるガラス転移温度（Ｔｇ）を有し、そして２０℃を越える温度で熱安定である前記凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤。
【請求項２】
前記安定剤がスクロース、マルトース.Ｈ2Ｏ、トレハロース、ラフィノース及びスタキオースからなる群より選ばれる請求項１に記載の造影剤。
【請求項３】
前記安定剤がスクロースからなる請求項１及び２のいずれかの項に記載の造影剤。
【請求項４】
前記剤において前記安定剤の小胞に対する重量比が少なくとも２０：１である請求項１〜３のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項５】
前記剤において小胞がハロカーボンガス又はガス前駆物質を含有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項６】
前記剤において小胞がペルフルオロアルカンを含有する請求項５に記載の造影剤。
【請求項７】
前記剤において小胞がペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンから選ばれるペルフルオロアルカンを含有する請求項５に記載の造影剤。
【請求項８】
前記剤において小胞の膜がリン脂質からなる請求項１〜７のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項９】
小胞超音波造影剤及び凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物からなる水性分散体を凍結乾燥することからなる熱安定な凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤の製造方法であって、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なくとも２０℃のＴg値及び−３７℃又はそれより高いＴg′値（前記安定剤又は安定剤の混合物の最大限に凍結濃縮した純粋な水溶液のガラス転移温度）を有し、そして前記安定剤又は安定剤の混合物は前記小胞超音波造影剤に対する重量比が少なくとも１０：１で前記分散体に存在することを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
前記水性分散体が前記安定剤の１〜５０重量％を含有する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記小胞造影剤がハロカーボンガス又はガス前駆物質を含有する請求項９及び１０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１２】
前記小胞がペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンから選ばれるハロカーボンを含有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水性分散体がさらに増量剤を含有する請求項項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増量剤がＣ3ポリオールである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記水性分散体が前記増量剤の３〜１０重量％を含有する請求項１３及び１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
水性担体媒質、凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物及び音響発生小胞超音波造影剤からなる超音波造影媒質であって、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なくとも２０℃のＴg値及び−３７℃又はそれより高いＴg′値を有しそして前記安定剤又は安定剤の混合物は前記小胞超音波造影剤に対する重量比が少なくとも１０：１で前記媒質に存在することを特徴とする前記媒質。
【請求項１７】
凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物を少なくとも１０：１の小胞に対する重量比で含有しそして診断用超音波像形成を包含する診断に使用する小胞含有超音波造影媒質の製造のため、少なくとも２０℃のＴg値及び−３７℃又はそれより高いＴg′値を有する凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物の使用。
【請求項１８】
小胞含有超音波造影剤の貯蔵または輸送の方法であって、ここで前記剤は凍結乾燥形態であり、凍結乾燥安定剤を少なくとも１０：１の小胞に対する重量比で含有しそして少なくとも２０℃のガラス転移温度（Ｔg）を有し、そして貯蔵及び輸送を冷却を使用しないで実行することを特徴とする前記方法。
【請求項１９】
小胞含有超音波造影媒質の製造方法であって、前記方法は請求項１〜１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥した造影剤を生理学的に許容し得る水性分散媒質に分散させることからなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は熱安定化され凍結乾燥した小胞を含む超音波造影剤及びそれらの製造方法に関する。
小胞（この用語は本明細書において単ラメラ及び多ラメラ構造体、例えばリポソーム、ミセル、微小気泡及び微小気球のような多様な構造体を表すために使用される）は治療用又は診断用活性剤を送達するための手段としてしばしば使用される。超音波像形成用造影媒質の分野においては、体温で気体である小胞含有物質（本明細書においては小胞物質と称する）がエコー発生造影剤（echogenic contrast agents）として、特に脈管構造中に投与するために使用することができる。
小胞造影媒質は一般に水性担体媒質に低濃度の小胞を含有する水性分散体の形で投与される。従ってそのような小胞造影剤の貯蔵及び輸送はもし小胞を乾燥形態で貯蔵できれば極めて効率的になる。
小胞組成物の凍結乾燥は可能であり、そしてこのため、一般に乾燥技法を助ける配合補助剤が組成物に添加される。そのような補助剤は一般に二つの機能の一つを果たす。増量剤は機械的により強固な製造物とするため全固体含量を増加させるために添加される。安定剤、これは又低温保護剤又は親液保護剤とも称されるが、脱水の際生じるガラス状態の形成を助けるためそして乾燥製造物に物理的強度を与えるために添加される。このように使用される安定剤の例はマンニトール及びグルコースを含む。
凍結乾燥した小胞超音波造影剤は水性のすぐ使用できる分散体に対して容積が減少する点で輸送及び貯蔵に有利であるが、一方凍結乾燥製造物は輸送及び貯蔵の間に置かれる通常の周囲温度の範囲で熱安定性でなく、その結果として二次の造影剤調製より前には、周囲よりも低温（例えば５〜10℃）の環境に置かなければならないとの問題が生じる。
驚くべきことに凍結乾燥に使用する安定剤を適当に選択することにより、周囲温度及びそれより高温において、そして実際に輸送及び貯蔵の間に通常遭遇するすべての温度において熱安定である凍結乾燥した小胞超音波造影剤を製造することが可能であることを見いだした。
安定な凍結乾燥製造物はその後にその環境を温度制御する必要なしに貯蔵し輸送することができ、そして特に病院及び医師は特別な貯蔵設備を必要とすることなく供給を受け、現場で投与可能な分散体に処方することができる。
従って、一つの態様として、本発明は、凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を超える温度、好ましくは少なくとも２２℃、特に２２℃、少なくとも２５℃、より好ましくは少なくとも３０℃そしてとりわけ好ましくは少なくとも４０℃、例えば６５℃まで又はそれより高温において熱安定である凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤を提供する。又、別の態様により、本発明は凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を超え、好ましくは２２℃、特に好ましくは少なくとも２５℃、より好ましくは少なくとも３０℃そして取り分け好ましくは少なくとも４０℃、例えば６５℃まで又はそれより高いガラス転移温度（Ｔg）を有する凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤を提供するものである。
さらに別の態様として、本発明は小胞超音波造影剤及び凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物からなる水性分散体を凍結乾燥することからなる熱安定な凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤の製造方法を提供するもので、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なくとも２０℃（好ましくは少なくとも22℃、特に少なくとも25℃、より好ましくは少なくとも30℃そしてとりわけ好ましくは少なくとも40℃、例えば65℃まで又はそれより高い）のＴg値及び−３７℃又はそれより高い（好ましくは−36℃より高く、特に好ましくは−35℃より高く、例えば−10〜−37℃）Ｔg′値を有することを特徴とする。
さらに別の態様として、本発明は水性担体媒質、凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物及びエコー発生小胞超音波造影剤からなる超音波造影媒質を提供するもので、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なくとも２０℃（好ましくは少なくとも22℃、特に少なくとも25℃、より好ましくは少なくとも30℃そしてとりわけ好ましくは少なくとも40℃、例えば65℃まで又はそれより高い）のＴg値及び−３７℃又はそれより高い（好ましくは−36℃より高い、特に好ましくは−35℃より高い、例えば−10〜−37℃）Ｔg′値を有することを特徴とする。
さらに別の態様として、本発明は診断用超音波像形成を包含する診断に使用する小胞含有超音波造影媒質の製造のために、少なくとも２０℃（好ましくは少なくとも22℃、特に少なくとも25℃、より好ましくは少なくとも30℃そしてとりわけ好ましくは少なくとも40℃、例えば65℃まで又はそれより高い）のＴg値及び−３７℃又はそれより高い（好ましくは−36℃より高い、特に好ましくは−35℃より高い、例えば−10〜−37℃）Ｔg′値を有する凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物の使用を提供する。
さらに別の態様として、本発明は小胞超音波造影剤の貯蔵及び輸送の方法を提供するもので、ここで前記剤は凍結乾燥形態であり、凍結乾燥安定剤を含有しそして少なくとも２０℃（好ましくは少なくとも22℃など）のガラス転移温度を有し、そして貯蔵及び輸送を冷却なしで実行することを特徴とする。
さらに別の態様として、本発明は小胞含有超音波造影媒質の製造方法を提供するもので、この方法は本発明の凍結乾燥した造影剤を生理学的に許容し得る水性分散媒質に分散させることからなる。
任意の物質について、Ｔgは乾燥物質のガラス転移温度であり、一方、Ｔg′は物質の最大限に凍結濃縮した純粋な水溶液のガラス転移温度である。
改良された熱安定性のほかに、本発明の凍結乾燥した小胞造影剤は驚くべきことに超音波造影剤に一般に使用されるハロカーボンガス及びガス前駆物質を保持する能力をも高める。
本発明において、超音波造影剤は任意の生理学的に許容し得るエコー発生小胞剤でよいが、しかしながら小胞は気体又は気体前駆物質（例えば正常な人間体温（37℃）において実質的に気体（蒸気を含む）である化合物又は化合物混合物）を含有するのが好ましい。生体許容性の気体、気体前駆物質又は混合物のいずれも使用することができる。従ってこの気体は、例えば空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；不活性ガス例えばヘリウム、アルゴン、キセノン又はクリプトン；フッ化硫黄例えば六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリド；六フッ化セレニウム；場合によってハロゲン化されたシラン例えばテトラメチルシラン；低分子炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）、例えばアルカン例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン又はペンタン、シクロアルカン例えばシクロブタン又はシクロペンタン、アルケン例えばプロペン又はブテン、又はアルキン例えばアセチレン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化低分子炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）；又は上記化合物のいずれかの混合物を含むことができる。ハロゲン化ガスのハロゲン原子の少なくとも幾つかはフッ素原子であるのが有利である。従って生体許容性のハロゲン化炭化水素ガスは、例えばブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びペルフルオロカーボン、例えばペルフルオロアルカン例えばペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン（例えば、場合によって他の異性体例えばペルフルオロ−イソ−ブタンとの混合物であるペルフルオロ−ｎ−ブタン）、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン及びペルフルオロヘプタン；ペルフルオロアルケン例えばペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン（例えばペルフルオロブタ−２−エン）及びペルフルオロブタジエン；ペルフルオロアルキン例えばペルフルオロブタ−２−イン；及びペルフルオロシクロアルカン例えばペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン及びペルフルオロシクロヘプタンから選ぶことができる。その他のハロゲン化ガスはフッ素化された、例えば過フッ素化されたケトン例えばペルフルオロアセトン及びフッ素化された、例えば過フッ素化されたエーテル例えばペルフルオロジエチルエーテルを含む。
特に好ましくは、小胞はペルフルオロアルカン、特にペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン又はペルフルオロヘキサン、とりわけｎ−ペルフルオロブタンを含む。
小胞において、膜は任意の生理学的に許容し得る膜形成物質、特にリン脂質で形成されてよく、そして橋架けされても又はされなくてもよい。荷電した又は荷電していないリン脂質の混合物で形成された膜が特に好ましく、そして小胞は正味の表面電荷（net surface charge）、特に負電荷を有するのが特に好ましい。そのようなリン脂質小胞は特に好ましい血液滞留時間を有する。
小胞はさらに血液滞留延長剤を備えるのがよく、例えばそのような物質を膜又は膜の中に固定されて居る親油性基に結合させる。そのような血液滞留延長剤、例えばポリエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシドはオプソニン化阻害剤として作用し、細網内皮系による脈管構造からの小胞の摂取を遅らせることができる。
本発明の造影剤のリン脂質物質の望ましくは少なくとも７５％、好ましくは実質的に全部が製造及び／又は使用条件下で正味の全電荷を個々に担持しており、この電荷は正であるか、より好ましくは負である分子からなる。代表的な正に荷電したリン脂質はホスファチジン酸例えばジパルミトイルホスファチジン酸又はジステアロイルホスファチジン酸のアミノアルコール例えばヒドロキシエチレンジアミンとのエステルを含む。負に荷電したリン脂質の例は天然に存在する（例えば大豆又は卵黄由来の）、半合成（例えば一部分又は全部が水素化された）及び合成のホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びカルジオリピンを含む。そのようなリン脂質の脂肪族アシル基は通常はそれぞれ約１４〜２２個の炭素原子を含み、例えばパルミトイル及びステアロイル基である。そのような荷電したリン脂質のリソ形態も本発明にとって有用であり、この用語「リソ」は１個の脂肪族アシル基のみを含むリン脂質を表し、この脂肪族アシル基は好ましくはグリセロール部分の１位炭素原子にエステル結合している。荷電したリン脂質のそのようなリソ形態は２個の脂肪族アシル基を含む荷電したリン脂質と混合物にして有利に使用することができる。
ホスファチジルセリンは本発明の造影剤における使用に特に好ましいリン脂質を代表しており、そして好ましくはその当初のリン脂質含量の実質的部分、例えば少なくとも８０％、例えば８５〜９２％を占めるが、しかしながらこれはその後の処理例えば熱殺菌において或る程度まで、例えば約７０％まで減少されうる。我々は理論的考察に束縛されることを望まないが、隣接するセリン部分のカルボキシル及びアミノ基の間のイオン性橋架けがそのような系の安定性に寄与しているのかもしれない。好ましいホスファチジルセリンには飽和の（例えば水素化された又は合成の）天然ホスファチジルセリン及び合成又は半合成のジアルカノイルホスファチジルセリン例えばジステアロイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン及びジアラキドイルイルホスファチジルセリンが含まれる。
そのようなホスファチジルセリンをベースとする造影剤を使用することの重要な利点は身体が老化した赤血球及び血小板をその表面におけるホスファチジルセリンの濃度が高いことによりこれらを認識し、それにより老化した赤血球を除去するのと同じ仕方でそのような造影剤を血流から排除するであろうことである。その上、そのような造影剤の表面は体により内生物として記憶されるので、それらはある種のリポソーム製剤の投与の際に起こることのある有害な全身性副作用例えば血流力学的作用及びその他のアナフィラキシー反応の誘発を回避することができる（例えば、WO−A−95／12386参照）。
本発明による使用に適当なリポソーム超音波造影剤は文献に記述されたように製造することができ、例えば、WO−A−92／22247、WO−A−94／28780、WO−A−93／05819、WO−A−95／16467、PCT／GB96／01361、及びUnger等，Invest．Radiol．，29（Suppl．2）：S134-S136（1994）を参照されたい。
本発明により使用される安定剤は２０℃を超える、例えば２５〜７０℃のガラス転移温度（Ｔg）、及び−３７℃又はそれを超えるＴg′値を有する生理学的に許容し得る凍結乾燥安定剤（又は混合物）であることができる。適当な安定剤の例はスクロース、マルトース.Ｈ2Ｏ、トレハロース、ラフィノース及びスタキオースを含む。一つの特に好適な例は場合によって他の安定剤の少量（例えば20重量％まで、好ましくは10重量％まで）と混合物にしたスクロースである。
一般に安定剤は凍結乾燥される組成物中で小胞造影剤の濃度より著しく過剰な濃度で、例えば少なくとも１０：１、より正常には少なくとも２０：１、最適には200：１のような高い割合で、そして、例えば5000：１の重量割合まで又はそれを超えさえする割合で存在しうる。従って、乾燥製造物のガラス転移温度（Ｔg）への寄与は相対的に小胞成分と無関係であり、そして安定剤候補物質はそれらが水性担体媒質に存在する他の補助剤との組み合わせにおいて、乾燥させて２０℃を超えるガラス転移温度を有する製造物が形成されるか否かを決定する通常の技法により容易に選別することができる。
安定剤は凍結乾燥に当てる組成物中で１〜５０重量％、好ましくは５〜３０％、より特別には約１０〜２０重量％存在させるのが好都合である。安定剤の濃度は希望するなら等張濃度を超えてよく、なぜなら凍結乾燥後における復元（reconstitution）の際製造物は希釈され得るからである。小胞成分は0.01〜５重量％、好ましくは0.1〜３％、特に好ましくは約0.5〜1.5重量％存在させるのが好ましい（その重量としては膜形成性物質の重量のみを考慮する）。凍結乾燥製造物を投与可能な分散体に変えるために使用する復元液に対する安定剤の量は像形成される身体の部位又は器官及び選択される投与方法に依存して選ばれる。例として挙げれば凍結乾燥を受ける組成物におけるそれの少なくとも２倍でよい。
超音波適用例えば超音波心臓検査法の場合、肺系の自由な通過を可能にしそして約0.1〜１５MHzの好ましい像形成周波数との共鳴を達成するためには、0.1〜１０μm、例えば１〜７μmの平均の大きさの小胞を使用するのが好都合であろう。小胞は超音波心臓検査法にとって好ましい範囲内で極めて狭いサイズ分布をもって製造することができ、それによりそれらの音響発生性並びに生体内における安全性が大きく向上し、そして血圧測定、血流追跡及び超音波断層撮影法のような適用において特定の利益を造影剤に付与する。かくして、例えば小胞の９０％を超える（例えば少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％）部分が１〜７μmの直径を有し、そして小胞の５％未満（例えば３％以下、好ましくは２％以下）が７μmを超える直径を有する製造物を容易に製造することができる。
超音波適用においては、造影媒質は例えば注射される膜形成性物質（例えばリン脂質）の量が0.1〜１０μg／kg体重、より好ましくは１〜５μg／kgの範囲であるような用量を投与してよい。膜形成性物質のそのような低水準の使用はあるかも知れない有毒な副作用を最小にする点で実質的な利益があると評価されるであろう。
本発明の乾燥製造物を使用して作ったすぐ使用できる組成物中の全膜形成性物質濃度は望ましくは0.01〜５重量％の範囲、好ましくは0.05〜2.0％そして特に約0.5重量％である。
凍結乾燥に付される組成物は少なくとも一つの増量剤、例えばポリオール（例えばグリセロール又はプロピレングリコールのようなＣ3ポリオール）又は多糖例えばデキストラン、又はポリグリコール例えばポリエチレングリコール又はそれらの混合物を含有するのが有利である。典型的には増量剤は安定剤の濃度と同じか又は僅かに少ない濃度、例えば３〜１０重量％、好ましくは約５重量％の濃度で使用してよい。増量剤は凍結乾燥工程の際結晶化可能でなければならず、これによりこの状態においてのみそれらは製造物安定性に対して作用が中性である。かくしてそれらは凍結乾燥の間に非晶質状態でなければならない安定剤と区別される。
その他の補助剤は希望により乾燥させる組成物に存在させてよく、又は投与のための処方の際添加してよい。そのような補助剤は例えばｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、粘度増強剤、乳化剤などを包含してよく、そして慣用的な量で使用してよい。
乾燥製造物は一般に粉末形態であり、そして水、水溶液例えば塩水（注射用最終製造物が低張性にならないように釣り合わせるのが有利であろう）、又は１つ又はそれより多くの張度調節物質例えば塩類（例えば生理学的に許容し得る対イオンを有する血漿陽イオン）、又は糖、糖アルコール、グリコール及びその他の非イオン性ポリオール物質（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の溶液で容易に復元可能である。復元は一般に例えば手で穏やかに振盪するような最小限の撹拌を必要とするだけである。このようにして得られる小胞の大きさは一貫して再現性があり、そして実際に加えられる撹拌エネルギーの量とは無関係であり、最初の小胞分散体中に形成された小胞の大きさにより決まるが、このサイズパラメータは驚くべきことに凍結乾燥及び復元製造物を通じて実質的に維持される。従って、最初の分散体の小胞の大きさは撹拌の方法、速度及び時間のような工程パラメータにより容易に調節されるので、最終の小胞の大きさは容易に管理することができる。
復元液の量及び濃度は得られるすぐ使用できる処方物が実質的に等張性となるように釣り合わせるのが望ましい。この故に選択される復元液の量及び濃度は凍結乾燥製造物に存在する安定剤（及び他の増量剤）の種類及び量に依存する。
本発明の凍結乾燥製造物は周囲条件下で数カ月間貯蔵安定であることが証明された。水（又は上で述べたその他の復元液）で復元して得られる小胞分散体はかなりの長時間、例えば少なくとも１２時間まで安定であると思われ、注射前いつ乾燥製造物を復元するかの判断は相当な柔軟性をもつことが許される。
復元液が張度調節剤として凍結乾燥時安定剤として使用したのと同じ化合物を含有する場合、凍結乾燥のため組成物に存在する安定剤の量は凍結乾燥の間最適の安定化を与えるに十分であることのみを必要とする。従って最終製造物の等張性は復元液の適当な量及び濃度を選択することにより得ることができる。この故に凍結乾燥段階で安定剤（１つ又は複数）として使用する化合物（１つ又は複数）の濃度及び種類、並びに復元液の化合物（１つ又は複数）の濃度及び種類についてはかなりの柔軟性が許容される一方、それでもなお安定な復元製造物が得られるのである。
本発明による凍結乾燥は慣用的な方法で実行できるが、本発明の安定剤の使用はさらに利点を付加するものであり、何故なら乾燥前の組成物は一般にグルコース又はマンニトールのような低温保護剤を含有する同等の組成物より高いガラス転移温度（Ｔg′）を有し、より短い凍結乾燥サイクルを使用できるからである。
本発明は小胞超音波造影剤に関連して上に記述した。しかしながらその他の診断用像形成方式（例えばMRI、Ｘ線、SPECT、PET、磁力記録式像形成など）についても小胞性造影剤に適用することが可能である。
ここで本発明は以下の限定されない実施例に関連してさらに説明されるであろう。
実施例１
凍結乾燥製造物の製造
500.4mgの水素化卵ホスファチジルセリンを5.4％（w/w）のプロピレングリコールとグリセロールとの混合物（３：10w/w）を含む100mLの水に添加した。混合物を振盪しそして８０℃に５分間加熱し、室温に放冷し、再び振盪しそして使用する前一晩静置した。
得られる溶液の５０mLを、円錐状頚部を有する丸底フラスコに移した。２５℃に維持する水浴に接続した温度調節用入口及び出口を有するガラスジャケットにフラスコを取り付けた。ロータステータ撹拌軸を溶液に導入し、そしてガス漏洩を防ぐため頚部壁と撹拌軸との間の空隙をガス含量の調節及び圧力制御のためのガス入口／出口接続部とはめ合わせた特別に設計した金属栓で密封した。ガス出口を真空ポンプに接続しそして溶液を１分間脱気した。次にペルフルオロ−ｎ−ブタンガスの気体をガス入口から適用した。
溶液を23000rpmで１０分間均質化し、ロータステータ撹拌軸を開口部が液体表面の僅かに上にあるように保った。白色クリーム状の分散体が得られ、これを密封可能な容器に移しそしてペルフルオロ−ｎ−ブタンをフラッシュさせた。次に分散体を分離漏斗に移し、12000rpmで３０分間遠心分離して上に泡のクリーム状層及び混濁した下層液を得た。下層液を除き、水で置き換えた。次いで遠心分離を２回、但し今回は12000rpmで１５分間行った。最後の遠心分離後、上澄液を１０％（w/w）スクロースで置き換えた。得られた分散体を２mLづつ凍結乾燥用に特別に設計した１０mL平底バイアル瓶に分注し、そしてバイアル瓶を−４７℃に冷却し、約４８時間凍結乾燥して白色綿毛状の固体物質を得た。バイアル瓶を真空室に移し、そして空気を真空ポンプで除き、ペルフルオロ−ｎ−ブタンガスで置き換えた。使用する前、水を添加しそしてバイアル瓶を手で穏やかに数秒間振盪すると超音波造影剤として適当な微小泡分散体が得られた。
特性の測定
微小泡のサイズ分布及び容積濃度を測定範囲が１〜３０μmの５０μmの開口部を取り付けたコールターカウンターマークII装置を使用して測定した。２０μLの試料を空気を飽和させた２００mLの塩水に室温で希釈し、そして測定前３分間平衡させた。
超音波特性測定は、de Jong，N．及びHoff，Ultrasonics，31：175-181（1993）により僅かに修正した実験計画に従って実行した。この機器使用により造影剤の希釈懸濁液の２〜８MHzの周波数範囲における超音波減衰効力を測定する。減衰測定の際、試料を１２０mmHgの超過圧力に９０秒間さらして圧力安定性試験を実行した。典型的には２〜３μLの試料を５５mlのIsoton IIで希釈しそして希釈した試料懸濁液を分析する前３分間撹拌した。主要な反応パラメータとして3.5MHzにおける減衰と、超過圧力を解除後3.5MHzにおける回復減衰値とを併せて使用した。
0004250747.tif 000002
実施例２
上の実施例１により製造した５つの試料の気体内容物をそれぞれ空気、ペルフルオロブタン、六フッ化硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリド及びテトラメチルシランで次の手順により置き換えた。
実施例１の凍結乾燥製造物を含む２つの試料をガス入口及びガス出口を有するデシケータに入れた。デシケータを試料の制御された脱気が可能な
0004250747.tif 000003
168真空／蒸溜器制御装置及び選択したガスの入口に接続した。試料を約１０mbarで５分間脱気し、その後選択ガスを流入させて圧力を大気圧まで上げ、次いでバイアル瓶に注意深くキャップを付した。この手順を選択ガスのそれぞれにつき、別の試料の一対を使用して繰り返した。
２mLの蒸留水を各バイアル瓶に添加しそして使用前バイアル瓶を手で穏やかに振盪した。得られた微小泡分散体につき実施例１に記述したようにサイズ分布測定に関連した特性を把握した。結果を表２に要約して示す。
0004250747.tif 000004
上表の結果に見られるように気体交換によるサイズ分布における著しい変化は認められず、予め形成された微小泡の大きさは凍結乾燥及び再構成の両方を通じて実質的に維持されることを示している。
インビボの結果
５種類のガスをそれぞれ使用して製造した１バッチにつき１０MHzにおけるドップラー増強特性をインビボで評価した。分散体をチンチラ兎に耳動脈を経由して注射し、そして超音波プローブを直接頚動脈においてドップラー法を使用して測定した。信号の強度及び持続時間を記録しそしてドップラー曲線の積分を計算した。得られた結果（下記表３参照）はペルフルオロブタンを含む微小泡が最も強いドップラー強度増強を与えることを示している。六フッ化硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリド又はテトラメチルシランを含む微小泡はペルフルオロブタンを含むそれよりドップラー増強剤として僅かながら効力が劣り、ペルフルオロブタンの数値の６０〜８０％の積分を示す。
0004250747.tif 000005
実施例３
ペルフルオロブタンの雰囲気下で凍結乾燥物質を含むバイアル瓶を実施例１に記述したように製造した。使用の直前水をバイアル瓶に添加して微小泡懸濁液を作った。
２００mLのIsoton II液を室温で数日間空気にさらして十分に空気で飽和させた溶液を作った。別の２００mLの液体を真空フラスコ中で６０℃で１時間脱気しそして室温に冷却し、その間真空を保った。使用直前空気をフラスコに導入した。
微小泡懸濁液の１０μLづつを各々の液体に添加しそして得られた混合物をサイズ特性測定（コールターマルチサイザーマークII）の前５分間インキュベートした。
液体から微小泡への気体の拡散が予想されない脱気された環境で、平均微小泡直径は1.77μmであり、そして微小泡の0.25％は５μmより大きかった。空気で飽和させた液体では対応する値は2.43μm及び0.67％であった。さらに５分後行った繰り返し測定は微小泡の大きさが安定な値に達していることを示した。
これらの知見は微小泡の直径はそれらが動脈血に類似する空気で飽和させた液体にさらされる場合でも３７％増加するのみであり、毛細血管の閉塞を引き起こすことのある大きさに達する微小泡は極めて稀であることを示している。これは、WO−A−95／03835の実施例IIに報告されているように同様の環境（すなわち溶存空気を含む水中で高度に希釈された微小泡の分散体）で空気／ペルフルオロヘキサン含有微小泡の大きさが２倍になるのとは対照的である。
実施例４
比較試験
凍結乾燥前の上澄液を、（ａ）スクロース６５mg／mL＋マンニトール６５mg／mL、（ｂ）マンニトール100mg／mL＋グルコース５０mg／mL、（ｃ）スクロース２０mg／mL、マンニトール７６mg／mL及びグルコース３８mg／mL、及び（ｄ）スクロース９０mg／mLで置き換えて実施例１を繰り返した。
湿潤及び乾燥組成物のＴg′及びＴg値を測定した。結果を下の表４に示す。
0004250747.tif 000006
処方（ａ）〜（ｃ）は処方（ｄ）より長い凍結乾燥周期を必要とし、そして処方（ｄ）とは異なってそれらの完全性を維持するには周囲温度より低温で貯蔵しなければならない。
実施例５
気体の保持
凍結乾燥の前に、上澄液を（ａ）スクロース１０％（w/w）、（ｂ）PEG 3000 ５％（w/w）、（ｃ）マンニトール２％（w/w）及びグルコース１％（w/w）、並びにトレハロース５％（w/w）を使用して置き換えたことを除いて実施例１と同様に製造した物質をＮ2による大量のフラッシングにさらし、反復する真空周期にさらし、そして粉砕して製造物のペルフルオロブタンを保持する能力を試験した。圧力処理後残存するペルフルオロブタン含量を測定した。結果を下の表５に示す。
0004250747.tif 000007
前の実施例において、より高いパーセンテージ（例えば10％より20％）の安定剤を使用することができ、そして水以外の他の復元液、例えば塩水又は上に挙げたポリオール溶液を使用することができる。同様に、凍結乾燥される分注量はより多くてもよく（例えば２mLより４mL）、凍結乾燥バイアル瓶はより大きくてもよく（例えば２０mL）、そして凍結乾燥時間はより長くてもよい（例えば60時間）。