(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質：
作用：トリベンゾイルグリセロールを加水分解する、
基質特異性：ｐ−ニトロフェニルベンゾエートに対する加水分解活性がｐ−ニトロフェニルアセテートに対する加水分解活性よりも、少なくとも３倍以上高い、
分子量    ：変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±１kDa及び
非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±１kDa、
由来の微生物：アシネトバクター属に属する微生物、
至適ｐH  ：約8.0、
ｐH安定性：約6.0〜8.0、
至適温度  ：約45℃、及び
熱安定性  ：35℃以下、
を有する、エステル分解酵素。
【請求項２】
アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus）ＦＥＲＭ  Ｐ−17224株。
【請求項３】
請求項１に記載のエステル分解酵素を製造する方法であって、請求項２に記載の微生物を培養する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なエステル分解酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エステル分解酵素は、種々の微生物に広く分布する酵素であり、エステル結合を分解する。中でも、リパーゼはトリグリセリドをモノ−及びジ−グリセリドと脂肪酸とに分解するだけでなく、非水溶媒系でエステル交換反応、エステル化反応等を触媒する。非水溶媒系におけるこのような反応は有機合成には非常に有用であることから、エステル分解酵素（特にリパーゼ）が種々の工業生産プロセスに用いられるようになってきており（Andreeら、J. Appl. Biochem. 2: 218-219 (1980)及びBlokingら、Trends Biotechnol. 9: 360-363 (1991)）、パーム油のエステル交換反応によるカカオ代用脂の製造に利用されている。
【０００３】
他方で、エステル分解酵素（リパーゼ）の基質特異性を利用して、油脂あるいは種々の薬剤を改変し、新たな付加価値を持たせる研究も進展しつつある。例えば、脂質は人体内では、２−モノグリセリドの状態で吸収されることから、トリグリセリドの２位に一定の機能を有する置換基を導入できれば、パーム油等の油脂を機能性食品に変換することができる。
【０００４】
しかし、一般に、エステル分解酵素（リパーゼ）はエステル結合近傍の官能基により著しく影響を受け、官能基が嵩高い場合には加水分解されにくいという問題がある。
【０００５】
そこで、近傍に嵩高い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエステル分解酵素（リパーゼ）が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、近傍に嵩高い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエステル分解（リパーゼ）活性を有する酵素を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的は、以下の性質を有する酵素を提供することにより、達成される。すなわち、本発明のエステル分解酵素は、トリベンゾイルグリセロールを加水分解し得る。
【０００８】
好ましい態様では、本発明のエステル分解酵素は、以下の性質：
基質特異性：トリベンゾイルグリセロールを加水分解する、
分子量    ：変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±１kDa及び
非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±１kDa、
至適ｐH  ：約8.0、
ｐH安定性：約6.0〜8.0、
至適温度  ：約45℃、及び
熱安定性  ：35℃以下、
という性質を有する。
【０００９】
本発明のエステル分解酵素は、さらに、ｐ−ニトロフェニルベンゾエートに対する加水分解活性がｐ−ニトロフェニルアセテートに対する加水分解活性よりも、少なくとも３倍以上高いという性質を有している。
【００１０】
好ましくは、本発明の酵素は、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物から得られる。
【００１１】
上記性質を有する本発明の酵素は、エステル結合近傍で嵩高い官能基を有する化合物の合成、新機能付与等の用途に用いられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のエステル分解酵素は、実施例で詳しく記載するが、まず、嵩高い基質、例えば、オレイルベンゾエート（以下、ＯＢという）を唯一の炭素源として生育する微生物を選択し、ついで、トリベンゾイルグリセロール（以下、ＴＢＧという）を分解し得るか否かをスクリーニングすることにより得られる。
【００１３】
ＴＢＧ分解活性を有するエステル分解酵素（以下、本酵素ということがある）を生産する微生物としては、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物が挙げられ、例えば、本発明者等が単離した、Acinetobacter calcoaceticus  subsp. antiratus  KM109株（工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−17224である）（以下、単にKM109株ということがある）が、本酵素を生産する。
【００１４】
本酵素は、本酵素を生産する微生物から、当業者が用いる適切な方法を組合せて得ることができる。アシネトバクター属の微生物を用いて取得する例を挙げると、アシネトバクター属に属する微生物をＮＢ培地（肉エキス  １％、ポリペプトン  １％、NaCl  0.2％）あるいは、ＬＢ培地（イーストエキス  0.5％、バクトトリプトン  1.0％、NaCl  １％）等の炭素源、窒素源、各種ミネラル等を含む培地で培養する（ただし、マルト培地では活性が低いので、使用しない方がよい）。培養に際して、ＯＢと界面活性剤とを添加しておくと、活性の誘導及び活性の向上が図れる。
【００１５】
適切な温度と時間（例えば、30℃、42時間）培養後、菌体を遠心分離して除き、例えば、上清にイソプロパノールを最終濃度60％となるように加えて、粗酵素を回収し、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理、HPLC処理、限外濾過による濃縮、透析等を単独でもしくは組合せて、本発明の酵素が精製される。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。
【００１７】
Ａ：基質及び基質の合成
本発明に用いた酵素の基質は、ｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）、ｐ−ニトロフェニルカプロエート（ｐＮＰＣ）、ｐ−ニトロフェニルベンゾエート（ｐＮＰＢ）、オレイルベンゾエート（ＯＢ）、トリベンゾイルグリセロール（ＴＢＧ）である。ｐＮＰＡは、東京化成工業（株）から購入し、ｐＮＰＣは東洋紡（株）から購入した。その他の基質は、以下のようにして合成した。
【００１８】
（ｐＮＰＢの合成）
ｐ−ニトロフェノール4.7g（Mw.139.11、0.0338mol）、ピリジン5.0ml（0.0618mol）、４‐ジメチルアミノピリジン0.21g（Mw.140.57、0.00149 mol）および溶媒としてヘキサン150 ml、ベンゼン50 mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル5.0 g（Mw.140.57、0.0356mol）を滴下した。滴下終了から２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させた。反応終了後、ＴＬＣ 上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝20：１）、ＵＶ吸収で生成物の確認し、生成物は１Ｈ−ＮＭＲ（HITACHI R-24B）、ＩＲ（HORIBA FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００１９】
（ＯＢの合成）
オレイルアルコール43.5ｇ（Mw.268.48、0.162mol）、トリエチルアミン16.4ｇ（Mw.101.19、0.162mol）、４−ジメチルアミノピリジン0.59ｇ（Mw.122.17、0.0048mol）および溶媒としてヘキサン300mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル25.0ｇ（Mw.140.57、0.178mol）を滴下した。滴下終了から２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させた。反応終了後、シリカゲル300ｇを用いたクロマトグラフィーにより、ヘキサン８Ｌで溶出して精製した。生成物の純度はＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝9.1）、ＵＶ吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UVG-54）、ＫＭｎＯ４発色で確認し、生成物は１H-NMR（HITACHI R-24B）、IR（HORIBA FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００２０】
（ＴＢＧの合成）
グリセロール2.18g（Mw92.07、0.0237mol）、４−ジメチルアミノピリジン２g（Mw.122.17、0.0163mol）および溶媒としてジクロロメタン：ピリジン＝１：１の400mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル10ｇ（Mw.140.57、0.0711 mol）を滴下した。滴下終了後、徐々に室温に戻し、一晩反応させた。反応終了後、酢酸エチルに溶かし、ヘキサンを加え室温で再結晶を行い精製した。生成物の純度はＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）、ＵＶ吸収（San Gabriel、CA91778  U.S.A.、UVG-50）で確認し、生成物は１H-NMR（HITACHI R-24B）、IR（HORIBA FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００２１】
Ｂ．加水分解活性の測定
加水分解活性の測定は、以下のように行った。
50mM リン酸カリウム（KPB、ｐH6.5）、2.5mM  ｐ−ニトロフェニルエステル、５％アセトニトリル、酵素を含む３mlの反応液を、予め、37℃に加温しておき、これにドライアセトニトリルに溶解したｐ−ニトロフェニルエステル（50mM）150μ１を加えることによって反応を開始した。反応は、エタノールを３ml加えて停止した。反応により生成したｐ−ニトロフェノール量を、400ｎｍにおける吸光度（ε４００ｎｍ＝11,670）から求めた。１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットと定義した。
【００２２】
（スクリーニング用培地）
一次スクリーニング培地として、0.5％（NH４)２SO４、0.1％KH２PO４、0.05％MgSO４、0.5％NaCl、及び1.0％ＯＢを含む培地（ｐH7.2）を用いた。固形一次スクリーニング培地は、上記組成に寒天を1.5％添加したものである。なお、ＯＢは、植菌時に加えた。
【００２３】
二次スクリーニング培地として、一次スクリーニング培地に0.2％ β‐サイクロデキストリン（日本食品加工株式会社）を加え、よく攪拌することによってＯＢを乳化させたものを用いた。固形二次スクリーニング培地は、上記組成に寒天を1.5％添加したものである。
【００２４】
（スクリーニング）
大阪府下より得られた土壌・水サンプルを、試験管中で一次スクリーニング培地（液体：３ml）にて30℃、48時間集積培養を行った。培地が白濁したものは、その１％を２度、同じ培地に植え継いだ後、固形ＮＢ培地（ＮＢ培地に1.5％寒天を添加したもの）上にて30℃、24時間培養し、シングルコロニーを形成させた。シングルコロニーとして得られた菌株は、固形スクリーニング培地上で30℃、24時間培養し、その成育を確認した。成育の認められた菌株については、ＬＢ培地（３ml）で30℃、８時間培養し、培養液を20％グリセロール溶液としたのち、使用まで−80℃で保存した。
【００２５】
一次スクリーニングで得られた菌株を、固形二次スクリーニング培地上に植菌し、30℃、７日間培養した。培養２日目での生育状態と、７日目でのＯＢを分解することによって生じるクリアゾーンの形成能を見た。
【００２６】
明瞭なクリアゾーンを形成した菌株を、500ml容坂口フラスコを用いてＯＢ0.5％を含むＬＢ培地（50ml）で30℃、120s.p.m,46時間培養し、遠心分離（５，500×ｇ、10分、４℃）により、菌体と培養上清を得た。菌体は、１mM  MgCl２を含むKPB（50mM、ｐH6.5）に懸濁後、30秒×２回超音波（海上電機（株）、4280型振動子）で破砕した。これを、再度遠心分離（12,000×ｇ、20分、４℃）して破砕菌体を取り除き、細胞抽出液を得た。ｐＮＰＢを基質として、この細胞抽出液と培養上清液の加水分解活性の測定をおこなった。
【００２７】
このスクリーニングにおいて、ｐＮＰＢに高い活性を示した株を選択し、さらに、ｐＮＰＡ、ｐＮＰＢおよびＯＢを基質としてスクリーニングした。このなかから、ｐＮＰＢおよびｐＮＰＡに対して高い活性を有する６株（ＫＭ016、ＫＭ069、ＫＭ083、ＫＭ109、ＫＭ252、およびＫＭ264）が得られた。表１に結果を示す。
【００２８】
【表１】
0004236323.tif 000002
【００２９】
ＫＭ109株は、ｐＮＰＢ活性がｐＮＰＡ活性よりも３倍以上も高く、そして、唯一トリベンゾイルグリセロールを分解した。この株が生産するエステル分解酵素は、嵩高い基質に対して作用できると考えられたので、以下、まず、この株を同定し、エステル分解酵素を単離精製した。
【００３０】
（ＫＭ109株の同定）
ＫＭ109株の菌学的性質を以下に示す。
【００３１】
Ａ．  形  態
（１）細胞の形                        球桿菌
（２）細胞の大きさ                    0.9-1.6×1.5-2.5μm
（３）運動性の有無                      −
（４）胞子の有無                        −
（５）グラム染色                        −
（６）抗酸性染色                        −
【００３２】
Ｂ．各培地における生育状態
(１）標準寒天平板培養          薄茶色、光沢あり、スム−ズ、正円
（２）標準寒天斜面培養          薄茶色、光沢あり、スムーズ
（３）標準液体培養              上層部がやや濃く、液面に薄い被膜
（４）標準ゼラチン穿刺培養      穿刺線に沿って弱い発育、液化は見られず
（５）リトマスミルク            変化なし
【００３３】
0004236323.tif 000003
0004236323.tif 000004
0004236323.tif 000005
【００３４】
以上の菌学的性質から、単離した株はアシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus）と同定された。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−17224）
【００３５】
（本発明の酵素の精製）
Ａ．粗酵素の調製
Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM109株をＬＢ培地６mlに植菌し、30℃、120s.p.m.で４時間培養した。得られた培養液５mlを、同じＬＢ培地500mlに加え、30℃、１20s.p.m.、８時間培養し、前培養液を得た。ＬＢ培地40Ｌを含む100Ｌ容ジャーファーメンター（（株）丸菱バイオエンジ、ＭＰＦ型）に、前培養液を400ml添加して、200rpm、１vvm、30℃で、40時間、培養した。
【００３６】
培養終了後、直ちに培養液を４℃ にまで冷却し、混合塩（CaCl２：Na２HPO４＝１：２）を１％（W／V〉となるように加え、よく攪拌した。菌体および生じた不溶物は、連続遠心分離（15,000rpm：関西遠心分離機製作所、Ｓ型超高速遠心分離機）で取り除き、培養上清液を得た。
【００３７】
得られた培養上清液を、限外濾過モジュール（分子量カットオフ 6,000、旭化成工業株式会社、ラボモジュールSIP 1013）を用いて3.5Ｌまで濃縮し、ドライアイスで−20℃にまで冷却したイソプロパノールを、最終濃度30％となるように加え、タンパク質を不溶化させた後、遠心分離（7,000×ｇ、20分、４℃）により除いた。上清液に対し、さらに同様のイソプロパノールを最終濃度60％となるように加え、タンパク質を不溶化させ、遠心分離（12,000×ｇｍ、20分、４℃）により回収し、−80℃にて凍結後、凍結乾燥（Refrigeration for Science Inc.、RFS 200B）により残留イソプロパノール、水分を除去し、粗酵素粉末を得て、以下の精製に用いた。以下の精製は、４℃で行った。
【００３８】
Ｂ．ゲル濾過による精製
凍結乾燥により得られた粉末1.0 g を、ノイゲンHCを０．１％含む50mMリン酸バッファー（KPB、ｐH6.5）100 ml に溶解した。次に、同バッファーであらかじめ平衡化させたセファローズＣＬ−68ゲル濾過クロマトグラフィー（50×630mm：Pharmacia LKB Biotechnology lnc．）にアプライし、同バッファーで溶出し、18mlずつ、80フラクションに分画し、ｐＮＰＡ及びｐＮＰＢを用いて加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢ活性を有する画分を回収、濃縮（分子量カット20、000、東洋濾紙株式会社、UP-20）し、ノイゲンＨＣを0.1％含む10mM  トリス−塩酸（ｐH8.0）に対し、透析をおこなった。
【００３９】
Ｃ．イオン交換樹脂による精製
次に、同バッファーで予め平衡化したDEAE Sephacel 陰イオン交換クロマトグラフィー（25×90mM、Pharmacia Biotechnology inc．）に吸着させ、バッファー中のNaClの０〜0.5Ｍの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出し、５mlずつ60フラクションに分画した。溶出画分のｐＮＰＡ、ｐＮＰＢに対する加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢに対する活性が認められる画分を回収・濃縮した。
【００４０】
Ｄ．HPLCによる精製
次に、0.1％ノイゲンＨＣ及び200mM  NaClを含む50mM  KPB（ｐH6.5）で予め平衡化させたG2000SWXL（7.8×300ｍｍ、東ソー株式会社）を用いた高速液体ゲル濾過クロマトグラフィー（日本分光株式会社、TRI ROTOR-V）にアプライし、同バッファーにより0.5ml／分で溶出した。タンパク質は280ｎｍにおける吸光度として検出した（日本分光株式会社、UVIDEC-100-V）。11〜33分の保持時間のものを30秒毎に分取し、ｐＮＰＡ、ｐＮＰＢを基質として加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢに対する活性が認められる画分を回収し、10mMトリス塩酸（ｐH8.0）に対し、透析した。
【００４１】
Ｅ．ＭｏｎｏＱによる精製
次に、同バッファーであらかじめ平衡化させたMONO Q PC1.6／５（1.6×50ｍｍ）を用いたＳＭＡＲＴＴＭシステム(Pharmacia LKB Biotechnology lnc.）に吸着させ、バッファー中の NaCl濃度を０〜0.125Ｍおよび0.125Ｍ〜0.5Ｍの二段階の直線濃度勾配により酵素を溶出した。タンパク質は280ｎｍ、254ｎｍの吸光度として検出した。15〜22分の保持時間の画分を15秒ごとに集め、ｐＮＰＢによる加水分解活性測定を行い、活性画分を集めた。
【００４２】
Ｆ．SDS-PAGEによる精製度の測定
得られた酵素を10−20％  ready  mixed gradient  gel（第一化学薬品株式会社、マルチゲル 10/20）を用いたSDS-PAGEによって展開し、銀染色キット（和光純薬株式会社、Silver stain II Kit Wako）を用いてプロトコルに従い、染色・検出した。SDS-PAGEでは、単一の蛋白質にまで精製されていた。以上の精製工程により、精製酵素0.03mgが回収された。なお、以下にのべる酵素の特性の決定には、0.71unit/mlの酵素を用いた。
【００４３】
（本発明の酵素の特性）
Ａ．SDS-PAGEによる分子量測定
得られた精製酵素の分子量を、変性−還元条件下のSDS-PAGEで測定した。キャリブレーションの結果を図１に示す。なお、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼｂ：分子量94,000、ウシ血清アルブミン：分子量67,000、オバルブミン：分子量43,000、及び、carbonic anhydrase：分子量30,000を用いた。
【００４４】
変性−還元条件下におけるSDS-PAGEによる分子量は、62kDa±１kDaであった。
【００４５】
Ｂ．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量測定
精製酵素の分子量を、Superdex  75 PC 3.2/30を用いるＳＭＡＲＴＴＭシステムで測定した。溶出は、200mM  NaClを含む50mM トリス塩酸（ｐH8.0）を用いて50μｌ／分で行い、280ｎｍ、254ｎｍにおける吸光度として検出した。マーカータンパク質としては、アルブミン：分子量65,000、オバルブミン：分子量46,800、キモトリプシノーゲンＡ：分子量20,600、及び、リボヌクレアーゼＡ：分子量15,700を用いた。結果を図２に示す。
【００４６】
この結果から、非変性条件下のゲル濾過クロマトグラフィーで、精製酵素の分子量は、50±１kDaであると推定された、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量がSDS-PAGEより若干低いが、これは、精製酵素がカラム担体と相互作用した結果、溶出位置にずれが生じたためと考えられる。
【００４７】
Ｃ．至適ｐH
酵素液10μlにKPBバッファー（ｐH６〜８）又はクエン酸バッファー（ｐH３〜６）465μlを加え、これにｐＮＰＢ(50mM)25μlを加えて反応を開始し、37℃、10分、反応を行った。500μlのエタノールを加えて反応を停止し、14,000rpm、５分の遠心分離を行い、その上清10μlをHPLCでの分析に供した。分解活性は、アセトニトリル：酢酸アンモニウム溶液（50mM、ｐH5.5）(1:1)を展開溶媒として使用し、吸光度303nmで検出されるp-ニトロフェノールの量を測定した。検量線はp-ニトロフェノールを用いて作製した。ｐH8.0付近で最大の分解活性が測定された。この結果は、至適ｐHが約8.0であることを示している。
【００４８】
Ｄ．ｐH安定性
ｐHを4.5から8.5まで0.5ずつ変化させた50mM  KPBに110量の酵素溶液を加えてｐHを変化させ、30分間 ４℃で保持後、37℃において、ｐＮＰＢ加水分解活性を測定し、ｐH安定性を測定した。結果を図３に示す。本酵素は、ｐH6.0〜8.0の間で、安定である。
【００４９】
Ｅ．反応至適温度
20℃、28℃、37℃、40℃、45℃、52℃の各温度条件下、ｐH7.0でｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。図４に、37℃での活性を１とした相対活性を示す。この結果から、至適反応温度は約45℃とした。
【００５０】
Ｆ．熱安定性
４℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃の各温度に酵素液を30分間処理し、４℃に冷却後、直ちに37℃において ｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。４℃で処理した酵素活性を１として、各処理温度における相対活性を図５に示す。35℃までの温度では、ほぼコントロールの４℃と同等の活性を保持していたが、それ以上の温度では次第に失活し、50℃で処理した酵素は、40％しか残存していなかった。本酵素は35℃以下の温度では安定であると言える。
【００５１】
（市販酵素との比較）
本発明の酵素を市販の酵素と比較した。比較した酵素は、リパーゼＯＦ（名糖産業株式会社：Candida  cylindrace由来）、リパーゼLP-051-1S（東洋醸造株式会社：Pseudomonas  sp由来）、ノボザイム435（ノボノルディスク工業：Candida  antractica由来）、リポプロテインリパーゼ（タイプＡ）（東洋紡株式会社：Pseudomonas  sp由来）である。結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
0004236323.tif 000006
【００５３】
本発明の酵素のみが、トリベンゾイルグリセロール分解活性を有しており、さらに、ｐＮＰＢ対して、高い特異性を有していることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明の酵素は、嵩高い基質の加水分解に有用であり、医薬品の中間原料に必要な光学活性な物質の製造等に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  SDS-PAGEによる分子量測定を示す図である。
【図２】ゲル濾過による分子量の測定を示す図である。
【図３】本発明の酵素のｐH安定性を示す図である。
【図４】本発明の酵素の至適反応温度を示す図である。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す図である。
【図１】
0004236323.tif 000007
【図２】
0004236323.tif 000008
【図３】
0004236323.tif 000009
【図４】
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【図５】
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