(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質溶液由来の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を塩濃度
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でカチオン交換体と結合させ、塩濃度
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の範囲で、低分子ｖＷＦ多量体を含有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体、血小板凝集ｖＷＦ活性のない因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ：Ｃを溶出させ、特に高分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を、塩濃度
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好ましくは
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での段階的フラクション化によって回収することを特徴とする因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の回収方法。
【請求項２】
特に低分子ｖＷＦ多量体およびｖＷＦ分解産物、複合体形成していない因子ＶＩＩＩまたはｖＷＦと弱く結合している因子ＶＩＩＩ、および混入核酸を含まない、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を含有するフラクションを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨが４．５から８．５、好ましくは
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の範囲の緩衝液系で、カチオン交換体からポリペプチドを溶出させることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カチオン交換体がスルホプロピル基を有する担体またはカルボキシメチル基を有する担体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特に高分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を回収することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
血漿、血漿フラクション、クリオ沈降物、組換え細胞培養物の細胞を含まない上清または抽出物から、あるいは濃縮されたタンパク質溶液から因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を回収することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーおよび段階的溶出によって、生物学的出発物質から因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を精製する方法、ならびに特に高分子ｖＷＦ多量体を含む精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体に関する。
フォンビルブラント因子は、５から１０ｍｇ／Ｌの濃度で、主に因子ＶＩＩＩとの非共有結合複合体の形態で血漿中を循環している。クリオ沈降物（クリオプレシピテート）中では、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体が非常に豊富であり、そこから、あるいは血漿から、あるいは血漿フラクションから既知のフラクション化法によって単離することができる。
血友病では、ある血漿の血液凝固因子の欠如によって血液凝固が損なわれている。血友病Ａにおいて、出血しやすいのは因子ＶＩＩＩまたはｖＷＦの欠如のせいである（表現型血友病）。血友病Ａは主に、失われている凝固因子を因子の濃縮液で置換すること、例えば因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を注入することによって処置される。
ｖＷＦと複合体形成した精製された因子ＶＩＩＩは、血友病Ａの患者の処置に用いるのに望ましいばかりでなく、フォンビルブラント症候群の処置用にも望ましい（Berntorp，1994，Haemostasis 24:289-297）。特に、ｖＷＦを欠くか、あるいは低い含量しか有さない調製物では、出血時間の増加および因子ＶＩＩＩ：Ｃの半減期の減少がインビボで観察され得ることが繰り返し強調されてきた。因子ＶＩＩＩが排除される割合を減少させ、ならびに内因性の因子ＶＩＩＩの放出を助けることによって血漿中の因子ＶＩＩＩの濃度を維持するために、インビボのｖＷＦを正常化することは重要である（Lethagen et al．，1992，Ann．Hematol．65: 253-259）。
ＤＥ３ ５０４ ３８５には、因子ＶＩＩＩ複合体を硫酸基を介して結合させ、クエン酸緩衝液、塩化カルシウムおよびＮａＣｌ濃度勾配で溶出させる因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を精製するためのイオン交換クロマトグラフィーの実行方法が記載されている。ここでは、０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度で因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を担体から溶出させている。
ＥＰ０ ４１６ ９８３には、塩化バリウムまたは水酸化アルミニウム沈降およびＤＥＡＥフラクトゲルのアニオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体をヒト血漿から回収する方法が記載されている。
Harrisonら（Thrombosis Res．，1988；50，295-304）は、デキストラン−硫酸−セファロースクロマトグラフィーによる因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製方法について記載している。
ＥＰ０ ６００ ４８０には、アニオン交換／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる全血漿からの因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体用の精製方法を記載している。ここでは、ｐＨ６．６から７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを有するＣａを含む緩衝液を用いて、カチオン交換体に吸着したＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の溶出を行っている。
ＷＯ９６／１０５８４には、アニオン交換／ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによる高度に精製された組換えｖＷＦの回収方法が記載され、ＥＰ０ ７０５ ８４６には、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによる組換えｖＷＦの高分子フラクションおよび低分子フラクションの分離方法が記載されている。
先行技術分野で大部分まで記載されている因子ＶＩＩＩ調製物は、完全なｖＷＦ多量体パターンを含むが、高分子ｖＷＦ（HMW-vWF）および低分子ｖＷＦ（LMW-vWF）の割合（比率）に関して変化し、また、いわゆるトリプレット構造を示し、特にHMW-vWFのタンパク質分解を示す。それによりこれらの調製物の安定性は制限されることが多い。
実質的にHMW-vWFを含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ調製物は、ｖＷＦの主要な機能である血小板凝集を行い、血小板レセプター糖タンパク質ＩＢおよびＩＩｂ／ＩＩＩａに対して低分子ｖＷＦ多量体より高いアフィニティーを有するので、出血時間にポジティブな影響を与え得ることが繰り返し強調されてきた。
因子ＶＩＩＩ：Ｃ活性およびｖＷＦ活性の十分な比活性を有する因子ＶＩＩＩ複合体に対する要望が存在している。このような複合体の回収に関する問題は、特に低分子ｖＷＦ多量体を含む分子を分離し、高い特異的ｖＷＦ活性（ｖＷＦ比活性）を有する複合体を豊富にすることである。
したがって、改良された比活性および安定性を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を提供することが本発明の目的である。
上記因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の回収方法を提供することがさらなる目的である。この方法は組換えおよび血漿因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体いずれの精製にも用いることができる。
本発明にしたがい、タンパク質溶液由来の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体をカチオン交換体と結合させ、改良された特異的ｖＷＦ活性を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を段階的フラクション化溶出によって回収する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の回収方法を提供することでこの目的が達成される。特に、低塩濃度で因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を結合させ、段階的に塩濃度を上げることによって、中塩濃度で、低分子ｖＷＦ多量体、不活性なｖＷＦ分解産物および非特異的な付随タンパク質を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を含むフラクションを分離し、より高い塩濃度で、特に高分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を含むフラクションを回収することで、改良された活性および安定性を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦの回収および濃縮が行われる。
その酸性等電点（ＩＥＰ＝５．５〜６）およびその結果としての正味の負電荷のため、通常、弱酸性から塩基性環境下、正に帯電しているアニオン交換体によって因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を精製する。このように、従来、正に帯電しているアニオン交換体による因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製方法が記載されているため、複合体のＩＥＰより上のｐＨかつ低塩濃度で、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体がカチオン交換体の負に帯電しているゲルマトリックスに結合し、塩濃度を上げることによってそれから選択的に溶出可能であることは予測できないことであった。塩濃度
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の範囲で段階的に溶出させることによって、非特異的な付随タンパク質、不活性なｖＷＦ分解産物、低い比活性を有する複合体成分、低分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体、複合体形成していないか、あるいは弱く結合しているだけの因子ＶＩＩＩおよび遊離の因子ＶＩＩＩを溶出させ、塩濃度
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で、特に高分子ｖＷＦ多量体を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体が得られることも予測できないことであった。
本発明の方法を用いて、不純な生物学的物質から出発し、核酸が実質的に混入していない精製されたフラクションを得ることも本発明の範囲内に認められた。それにより、本発明の方法によればタンパク質調製物から核酸をも除去される。アニオン交換体による慣用の方法では、核酸がその負の電荷のためにアニオン交換体に結合し、塩濃度を上げるとアニオン交換体から再び脱着し、溶出液に入るため、この効果を示すことができない。
因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を精製する場合、５０００００から数百万のｖＷＦのサイズのせいで、用いる担体物質中での因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の拡散および分配を妨げないような担体物質のみが良好な精製および良好な収率をもたらすことに特に注意を払わなければならない。カチオン交換体によって高い比活性の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製を行う本発明の方法を実行する場合、高いローディング容量を有し、扱うのに丈夫であり、はっきりした溶出プロファイルを有するばかりでなく、工業規模で経済的に用いることができるゲルマトリックスを用いる。したがって、本発明の方法は、精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を大量工業規模で回収するために特に興味深い。
本発明の実施には、すべての既知のカチオン交換体を用いることができ、このカチオン交換体はスルホプロピル基またはカルボキシメチル基を有する担体であるのが好ましい。例えば、ＳＰ−セファロースR Fast FlowおよびＣＭ−セファロースR Fast Flow（Pharmacia）、フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３およびフラクトゲルR ＥＭＤ ＣＯＯＨ（Merck）、ＰｏｒｏｓR １０ ＳＰおよびＰｏｒｏｓR １０Ｓ（Perseptive Biosystems）およびトヨパール（Toyopearl）TM ＳＰ ５５０ ＣおよびトヨパールTM ＣＭ−６５０（Ｍ）（TosoHaas）は非常に適していることがわかっている。
フラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３およびフラクトゲルR ＥＭＤ ＣＯＯＨ（Merck）のタイプのテンタクル（tentacle）構造を有する多孔性のゲルは精製されたｖＷＦの回収に特に適当であることがわかっている。
緩衝液中の塩濃度
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で、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体はカチオン交換体に好ましく吸着する。これゆえ、好ましい吸着緩衝液は５０から２５０ｍＭ、特に１５０−２５０ｍＭの範囲の塩濃度（例えば１５０ｍＭ）を有する。緩衝液の塩濃度を段階的に上げることによって、特に高分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を塩濃度
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好ましくは
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で選択的に溶出させることができる。タンパク質溶液に含まれ、ｖＷＦ活性、特にリストセチン補因子活性に関して、低い比活性を有し、コラーゲン結合活性を有し、ならびに特異的な血小板凝集活性を有する、低分子ｖＷＦ多量体およびｖＷＦタンパク質分解産物を含有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体および遊離の因子ＶＩＩＩ：Ｃを、塩濃度
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好ましくは３００ｍＭでカチオン交換体から溶出させ、所望により回収する。このフラクション、特に血小板凝集ｖＷＦ活性を有さないものを、例えば因子ＶＩＩＩ：Ｃのさらなる精製用に用いることができる。
塩として一価または二価の金属イオンを含む緩衝液中で、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦの吸着および脱着を行うことができ、塩としてはＮａＣｌを用いるのが好ましい。
本発明の方法では、カチオン交換体と結合したタンパク質を溶出させるための緩衝液系として、緩衝物質、特にグリシン、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液、および塩からなる緩衝溶液を用いる。
溶出緩衝液はｐＨ４．５から８．５、好ましくはｐＨ
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の範囲のｐＨを有し得る。
本発明の方法はバッチ法として、あるいはカラムクロマトグラフィーとして行うことができる。
しかし、本発明の方法を行うのに最適なパラメーター、例えば塩濃度、ｐＨおよび温度はそれぞれ用いるカチオン交換体物質に依存する。しかし、個別に用いられるカチオン交換体タイプについて、本方法を実行するために本発明の範囲内で開示されている条件を最適化することは、当業者の一般的知識の範囲内である。
特に、本発明の方法によって、特に高分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を回収し、濃縮する。
回収された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体フラクションは、低分子ｖＷＦ多量体、比活性が低いｖＷＦ断片および混入核酸を実質的に含まない。
本発明の方法によって精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を回収するため、任意の因子ＶＩＩＩ複合体含有溶液を出発物質として用いることができる。出発物質は、特に血漿、血漿フラクション、クリオ沈降物または組換え細胞培養物の上清または抽出物のような生物学的物質である。
しかし、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を含有する溶液はまた、前精製工程、例えばゲルろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせによって前精製され、あるいは濃縮（enriched）されたタンパク質に富む溶液であり得る。
本発明の方法の特定態様では、アニオン交換体によって濃縮した因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を含有するフラクションを出発溶液として用いる。続くカチオン交換クロマトグラフィーでは、高分子または低分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製および分離を行う。しかしまた、アフィニティー／カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換／アフィニティー／カチオン交換クロマトグラフィーのような他の組み合わせでも、改良された比活性および安定性を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦの濃縮および選択的回収を達成することができる。
本発明の上記方法によって、改良された比活性を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦは、不純な因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体含有物質から数倍濃縮される。
原則として、あらゆる生物学的物質に感染性の病原体が混入し得るので、得られた因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体含有フラクションに対して、ウイルスを不活化または涸渇するための処理を行い、ウイルスに関して安全な調製物を生産する。この目的のために、先行技術分野に既知のすべての方法、例えば化学的／物理的方法、光活性化物質と光の組み合わせによる不活化、またはろ過による涸渇を用いることができる。特に、脂質包膜ウイルスおよび非脂質包膜ウイルスの両方を確実に不活化できる、溶液または固体状態での熱処理は、ウイルスの不活化に適当である。ウイルスの涸渇はナノフィルターでのろ過によって行うのが好ましい。
さらなる側面では、本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによって因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ含有溶液から得ることができる、特に高分子ｖＷＦ多量体を含む精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を提供する。低い純度および低い比活性の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦを含有する出発物質から出発して、好ましくは少なくとも６６Ｕ／タンパク質ｍｇの高い特異的ｖＷＦ活性を有し、ならびに好ましくは少なくとも５００Ｕ／タンパク質ｍｇの高い因子ＶＩＩＩ比活性を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦを濃縮し、付随タンパク質、特に結合していないか、あるいは弱く結合しているだけの、遊離の因子ＶＩＩＩ、または低ｖＷＦ活性を有する因子ＶＩＩＩ複合体を選択的に分離する。それにより、高分子ｖＷＦ多量体を含み、低分子ｖＷＦ多量体との因子ＶＩＩＩ複合体、ｖＷＦ分解産物、複合体形成していない因子ＶＩＩＩならびにおそらく因子ＶＩＩＩａを実質的に含まない、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を回収する。高分子ｖＷＦ多量体を選択的に濃縮するおかげで、本発明の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体は改良された血小板凝集活性および高い安定性を有する。
さらなる側面では、カチオン交換クロマトグラフィーおよび塩濃度
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の範囲での段階的溶出によって、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦを含有する溶液から得ることができる、血小板凝集性ｖＷＦ活性を実質的に有さない因子ＶＩＩＩ：Ｃを提供する。
さらなる側面では、特に高分子ｖＷＦ多量体を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体、または血小板凝集ｖＷＦ活性を実質的に含まない因子ＶＩＩＩ：Ｃを含有する精製された調製物を提供する。
血漿または組換え起源の出発物質を用いて本発明の調製物を回収および生産する場合、所望により上記のウイルスの涸渇／または不活化法を行って、感染性粒子を除去する。原理的には、出発物質から出発し、生産された医薬調製物までの各精製工程の前または後において、ウイルスの不活化および／またはウイルスの涸渇を行うことができる。それにより、いずれにしても、本発明の調製物はウイルスに関して安全であり、いかなる感染性物質をも含まないであろう。
また、生成物の純度および低い感染性についてのさらなる基準は、核酸が混入していないことである。したがって、本発明の調製物は実質的に核酸を含まない。ここで「実質的に」とは、２６０／２８０ｎｍの比を基準にして、核酸含量が
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であることを意味する。しかしまた、例えばＥＰ ０ ７１４ ９８７およびＥＰ ０ ７１４ ９８８に記載されている方法にしたがい、核酸を定量することもできる。
さらなる側面では、本発明の調製物は保存安定形態で存在する。改良された特異的ｖＷＦ活性を有する精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦを含む調製物を、溶液用調製物、凍結乾燥物、または急速冷凍状態で提供することができる。本調製物はその純度のために特に安定である。本発明の調製物は−２０℃で少なくとも６月、溶液中４℃で少なくとも４週間および凍結乾燥物として少なくとも１年間安定であることが示されている。各期間内に因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ活性は最大１０％減少するだけであり、ｖＷＦ多量体の多量体パターンはいかなる実質的な変化をも示さない。
本発明の調製物の製剤化は既知の慣用方法により行うことができる。本発明の調製物中に含まれる精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦを塩、例えばＮａＣｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物および／またはＣａＣｌ2、およびアミノ酸、例えばグリシンおよびリシンを含み、ｐＨ範囲が６から８の緩衝液と混合し、医薬調製物に製剤化する。
血友病、表現型（遺伝子発現型）血友病およびｖＷＤの患者の処置用薬物を生産するために本調製物を用いることができる。
さらなる側面では、本発明は、血漿または血漿フラクションから因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体調製物を調製する方法であって、血漿または血漿フラクションをカチオン交換体と接触させ、それにより因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を吸着させ、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を載せたカチオン交換体を所望により洗浄し、次いで因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を溶出させ、血漿を基準にして、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体に関し、少なくとも３００倍の純度および少なくとも５０％の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の収率を有する溶出液を得、次いで得られた溶出液を処理して因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体調製物にすることを特徴とする方法に関する。
驚くべきことに、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体は、血漿または血漿フラクションから出発し、カチオンクロマトグラフィーによって高い純度と同時に高い収率で提供され得ることが本発明の過程で認められた。
血漿フラクションとして、例えばプロトロンビン複合体を除去する前吸着処理後のクリオ沈降物またはコーン（Cohn）フラクションを用いる。
本方法は、効率的な精製のおかげで、大部分のさらなる精製工程、例えばさらなるクロマトグラフィー精製工程を必要としないため、因子ＶＩＩＩ複合体を血漿フラクションから工業規模で精製するのに非常に適している。驚くべきことに、単純なカチオン交換クロマトグラフィーによって、血漿と比べて少なくとも３００倍の純度、好ましくは少なくとも４００倍の純度、と同時に血漿を基準にして少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の高い収率で因子ＶＩＩＩ複合体を得ることができることが示されている。したがって、精製手順は、単一のクロマトグラフィー精製、すなわちカチオン交換体でのクロマトグラフィー精製のみを行うように設計されるのが好ましい。通常、最終精製工程としてこのクロマトグラフィー精製を行い、その後因子ＶＩＩＩ複合体を医薬調製物に製剤化する。
通常、カルシウム含有緩衝液中、出発物質をカチオン交換体にアプライする。そのアプライ直前に、潜在的に存在するウイルス、例えば血液を介して感染可能なヒト病原性ウイルスの不活化について測定することも想定できる。このために、殺ウイルス性の界面活性剤、または有機溶媒および／または界面活性剤で処理することが好ましい。例えばＥＰ０ １３１ ７４０にしたがい、ＴＮＢＰ（リン酸トリ（ｎ−ブチル））の存在下、トリトンまたはトゥイーンで処理する。続くカチオン交換クロマトグラフィーによって、効果的に殺ウイルス剤を除去する。吸着させた複合体を洗浄する場合、該洗浄は、イオン強度が吸着緩衝液よりも、例えば１０−３０％高い洗浄緩衝液を用いて行うのが好ましい。因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を溶出するためには、イオン強度をさらに高くするのが好ましい。好ましくは、出発溶液のイオン強度と比べて少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも１００％イオン強度を高くすることによって、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の溶出を行う。溶出緩衝液は塩化ナトリウムを含むのが好ましい。因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の医薬調製物を製剤化するため、通常、ダイアフィルトレーション（diafiltration）、滅菌ろ過および所望により凍結乾燥を行う。
カチオン交換クロマトグラフィーは因子ＶＩＩＩまたはｖＷＦの活性にほとんど影響しない。因子ＶＩＩＩ複合体の収率がクロマトグラフィー前の活性を基準にして確実に９０％以上であることがわかっている。それゆえ、慣用の因子ＶＩＩＩの安定化剤、例えば抗トロンビンＩＩＩおよび／またはヘパリンを用いずに、クロマトグラフィー精製を行うことができる。
常に、あらかじめ精製された因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体調製物に関してのみ、カチオン交換クロマトグラフィーを考慮している先行技術分野の既知の方法（ＥＰ０ ６００ ４８０ Ａ２参照）とは対照的に、本発明では、カチオン交換クロマトグラフィーが血漿または（粗製の）血漿フラクションから因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を直接精製するのに非常に適することが示された。上記方法を用いた場合、血漿または血漿フラクションから出発し、カチオン交換クロマトグラフィーによって達成される純度はすでに市販の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体調製物に対するあらゆる要求を満たしているので、因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体調製物を製造するためのさらなるクロマトグラフ法を提供する必要さえない。
以下の実施例および図面によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例示的態様に限定されるべきではない。
図１は、カチオン交換体での精製前および後におけるクリオ沈降物からの因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体のｖＷＦ多量体分析を表し；
図２は、アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる精製前および後におけるクリオ沈降物からの因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体のｖＷＦ多量体分析を表す。
実施例１は、カチオン交換クロマトグラフィーおよび段階的溶出による血漿因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製を記載し；実施例２は、アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせおよびカチオン交換体からの段階的溶出による因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製を記載し；実施例３は、カチオン交換体によるｒｖＷＦ／ｒ因子ＶＩＩＩ複合体の精製を記載し；実施例４は、カチオン交換体による因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の単離を記載する。
実施例１：
カチオン交換クロマトグラフィーによる血漿ＦＶＩＩＩ複合体の精製
ヒト血漿由来のクリオ沈降物をｐＨ７の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、溶液１ｍＬ当たり２０ユニットのヘパリンを加えた。クリオ沈降物１ｇ当たり２％ Ａｌ（ＯＨ）3懸濁液０．２５ｍＬを加え、３０分間インキュベートした。次いで、１０ ０００ｒｐｍで２０分間遠心し、濁りのないクリオ沈降物を得た。
クロマトグラフィーカラムにフラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３を充填し、これを緩衝液（３０ｍＭグリシン−ＮａＣｌ緩衝液）ですすいだ。次いで、溶解したクリオ沈降物をカチオン交換カラムを通してろ過し、交換体に結合しないタンパク質を流出液中に得た（フラクション１）。緩衝液中の０．３Ｍ ＮａＣｌでこのカラムをすすぎ、非特異的に結合したタンパク質を除去した（フラクション２）。次いで、それぞれ０．４Ｍおよび０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出を行い、交換体カラムからＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を溶出させた（それぞれフラクション３およびフラクション４）。
ｖＷＦおよびＦＶＩＩＩが両方ともカチオン交換体と結合することは表１から明らかである。カチオン交換体カラムを０．３Ｍ ＮａＣｌですすいだ（フラクション２）が、ｖＷＦを全く得ることができず、１０％のＦＶＩＩＩ活性しか得られなかった。この溶出工程では、機能的に活性なｖＷＦとの複合体として存在しないＦＶＩＩＩを分離した。次いで０．４Ｍ ＮａＣｌによって脱着させ（フラクション３）、機能的に活性なｖＷＦ約２０％およびＦＶＩＩＩ総量の約３０％を含むＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を得た。次いで、５００ｍＭ ＮａＣｌによって、残留するＦＶＩＩＩ複合体をカチオン交換体から溶出させた（フラクション４）。フラクション４は、クリオ沈降物から出発して、ｖＷＦ活性の８０％およびＦＶＩＩＩ活性の５０％を含む因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を含んでいた。カチオン交換クロマトグラフィーによって、クリオ沈降物と比べてＦＶＩＩＩの２０倍精製（比活性：ＦＶＩＩＩ：Ｃ １２ＩＵ／タンパク質ｍｇ）および血漿を基準にしてＦＶＩＩＩの３５０倍精製が達成された（フラクション４）。フラクション３からＦＶＩＩＩを回収することができる。
図１は、カチオン交換体での精製前および後の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体のｖＷＦ多量体分析を示し、レーンＡはクリオ沈降物の、レーンＢは３００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表１）の、レーンＣは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション３、表１）の、レーンＤは５００ｍＭ溶出液（フラクション４、表１）の、ｖＷＦ多量体パターンを示す。図１から、カチオン交換クロマトグラフィーによって、高分子ｖＷＦ多量体構造を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体が得られることは明らかである。低分子ｖＷＦ多量体を有する因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体はカチオン交換体に結合しない（フラクション１）か、あるいは０．３Ｍ ＮａＣｌでの溶出で分離する（フラクション２）。
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実施例２：
アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる血漿ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の精製
ヒト血漿のクリオ沈降物をｐＨ６．７の７ｍＭトリス、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭリシン、１２０ｍＭ ＮａＣｌの緩衝液に溶解させた。前処理としてＡｌ（ＯＨ）3を攪拌しながら加えた。次いでこの沈降物を遠心して分離した。
このように前処理したクリオ沈降物をフラクトゲルR ＥＭＤ−ＴＭＡＥのカラムにアプライした。このカラムを溶液緩衝液ですすぎ、非結合タンパク質を得た（フラクション１）。このフラクションはｖＷＦ活性の６０％を含んでいたが、ＦＶＩＩＩ活性のほんの１０％しか含んでいなかった。次いで４００ｍＭ ＮａＣｌでこのカラムからの溶出を行い（フラクション２）、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を得た。フラクション２は、クリオ沈降物から出発して、残りのｖＷＦ活性およびＦＶＩＩＩ活性の７０％を含んでいた。
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フラクション２のＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を２０ｍＭグリシン／ＮａＣｌ緩衝液で４倍希釈し、次いでフラクトゲルR ＥＭＤ−ＳＯ３のカチオン交換カラムにアプライした。非結合タンパク質をフラクション１中に得た。このカラムを２００ｍＭ ＮａＣｌですすぎ、弱く結合したタンパク質を除去した（フラクション２）。次いで４００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション３）および５００ｍＭ ＮａＣｌ（フラクション４）で段階的に溶出させた。フラクション３および４には、それぞれｖＷＦ活性４５％およびＦＶＩＩＩ活性５５％または４０％が認められた。
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表３から、ｖＷＦおよびびＦＶＩＩＩの両者がカチオン交換体と結合することは明らかである。このカチオン交換体カラムを０．２Ｍ ＮａＣｌですすいだ（フラクション２）がｖＷＦおよびＦＶＩＩＩは全く認められなかった。次いでＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体をフラクション３および４中に溶出させた。
クリオ沈降物中のＦＶＩＩＩ：Ｃの比活性は０．５９Ｕ／タンパク質ｍｇであったが、フラクション３およびフラクション４中のＦＶＩＩＩ：Ｃの比活性はそれぞれ５００Ｕ／タンパク質ｍｇおよび４７７Ｕ／タンパク質ｍｇであった。クリオ沈降物から出発してフラクション３および４中では、ｖＷＦの比活性は０．６Ｕ／タンパク質ｍｇから６６Ｕ／タンパク質ｍｇおよび８３Ｕ／タンパク質ｍｇに上がった。
図２は、アニオン／カチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる精製前および後の因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体のｖＷＦ多量体分析を示し、レーンａからｃはアニオン交換体でのクロマトグラフィーを示し、レーンｄからｇはカチオン交換体でのクロマトグラフィーを示す。図２のレーンａはクリオ沈降物の、レーンｂは流出液（フラクション１、表２）中の、レーンｃは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表２）中の、レーンｄはカチオン交換体前の４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表２）中の、レーンｅは２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション２、表３）中の、レーンｆは４００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション３、表３）中の、ならびにレーンｇは５００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液（フラクション４、表３）中の、ｖＷＦ多量体パターンを示す。
実施例３：
カチオン交換クロマトグラフィーによるｒｖＷＦ／ｒＦＶＩＩＩ複合体の精製（現時点で発明者らが、本発明の最良の実行方法であると考えているもの）
組換えｒＦＶＩＩＩ／ｒｖＷＦ複合体を含む細胞培養上清１０００ｍＬを、フラクトゲルR ＴＳＫ−ＳＯ３ ２０ｍＬを充填したカラムにアプライした。２５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の緩衝液でこのカラムを洗浄した後、６００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の緩衝液によって結合したｒＦＶＩＩＩ／ｒｖＷＦ複合体を溶出させた。表４にこのカラムの溶出結果を示す。
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この実施例は、（通常、組換えＦＶＩＩＩの発酵時に生じる）組換えＦＶＩＩＩおよび組換えｖＷＦからなる複合体がカチオン交換体と結合し、塩濃度を上げることにより、付随タンパク質から分離して選択的に溶出し得ることを示す。
この実施例では、特異的ＦＶＩＩＩ活性１３０Ｕ／タンパク質ｍｇを有するｒＦＶＩＩＩ／ｒｖＷＦ複合体を収率７５％で得た。これはこの工程での２８倍精製に相当する。ｒｖＷＦの比活性は発現されるｒｖＷＦの質に大きく依存している。この例では、溶出液中７Ｕ／ｍｇであり、３５倍精製に相当した。
出発物質中のｒＦＶＩＩＩ／ｒｖＷＦの関係を変化させることによって、あるいはさらなるクロマトグラフィー工程にかけることによってＦＶＩＩＩ：Ｃの比活性をさらに改良することができる。
実施例４：
カチオン交換による因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の単離
実施例４Ａ：
クリオ沈降物２１０ｇをＣａＣｌ2−ヘパリン含有クエン酸緩衝液９５０ｍＬに溶解させ、ｐＨ６．０に調節する。
不溶性物質、主にフィブリノーゲンを分離した。存在する可能性がある病原性ウイルスを不活化するため、透明な溶液を１％トリトンＸ１００および０．３％ＴＮＢＰ（リン酸トリ（ｎ−ブチル））で処理した。
伝導度１０ｍＳ／ｃｍの酢酸緩衝化ＮａＣｌ溶液ｐＨ６．０中で前もって平衡化しておいたMerck Darmstadt（DE）のフラクトゲルＥＭＤ−ＳＯ3-−６５０（Ｍ）１００ｍＬを用い、ウイルスを不活化したＦＶＩＩＩを吸着させた。
１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液５００ｍＬで前もって洗浄し、イオン強度を５００ｍＭ ＮａＣｌに増加させることによって、ＦＶＩＩＩをゲルから溶出させた。
実施例４Ｂ：
この実施例では、フラクトゲルＥＭＤ−ＳＯ3-の代わりにトヨパールＳＰ−５５０Ｃを用いた。
結果
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同じフラクションにＦＶＩＩＩｃおよびＦｖＷＦを回収した。
【図１】
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【図２】
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