(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内における転写因子との結合親和性を有する構造を有するポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１７のポリヌクレオチド配列からなる、抗ガン剤用単離医薬品組成物。
【請求項２】
前記宿主細胞は哺乳類細胞である、請求項１に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
【請求項３】
前記哺乳類細胞はヒト細胞である、請求項２に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
【請求項４】
前記ヒト細胞はヒトガン細胞である、請求項３に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、２本鎖構造か、１本鎖構造か、いずれかの構造を形成することができ、前記１本鎖構造は、鎖内または鎖間の相互作用により、２本鎖構造を形成するか、あるいは、ヘアピン状、シュードノット状、ステム・ループ状、亜鈴状および／または十字型の構造からなる２次構造を形成することができる、請求項１に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
【請求項６】
配列番号１７のポリヌクレオチド配列からなり、フォスフォチオ−結合ヌクレオチドで作られる、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１７のポリヌクレオチド配列からなり、親油性基質と、標的特異的抗体と、その他の標的を狙い打ちする機能を有する分子と、これらの組み合わせとからなるグループから選択されるリガンド分子に取り付けられている、標識ヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドは、注射可能な処方と、経口的な処方と、経皮的な処方と、丸塊と、エアロゾルと、坐薬と、トランスフェクションによる処方と、トランスジェニックな処方と、これらの組み合わせとからなるグループから選択される医薬の処方として調剤される、請求項１に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的となる転写因子に対して競合的に結合するシス・エレメントのデコイ（ｄｅｃｏｙ）としての合成オリゴヌクレオチドの組成物と、腫瘍生物学および抗腫瘍治療学の分野におけるその利用法とに関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍細胞の特徴の１つは、がん原遺伝子の過剰発現または増幅である。例えば、Ｃ−ＭＹＣは、白血病、リンパ腫および肉腫で過剰な発現をし、白血病、乳ガン、胃ガン、小細胞肺ガン、大腸ガン、神経芽腫およびグリア芽細胞腫では程度は異なるが増幅される。他の例は、骨肉腫およびリンパ腫でのＣ−ＦＯＳの過剰発現を含み、Ｃ−ＪＵＮは小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、大腸ガンおよび直腸ガンで非常に過剰な発現をすることが知られている。さらに、Ｃ−ＭＹＣおよびＣ−ＪＵＮは、（腫瘍の出現と関連する）腫瘍のイニシエーションおよびインキュベーションの段階で過剰発現をすることが知られている。最後に、Ｃ−ＭＹＣの増幅は腫瘍発生の必要条件の１つであることが知られている。
【０００３】
腫瘍細胞の別の特徴は、細胞周期の制御と細胞成長因子に対する適切な反応とができなくなることである。ＭＹＣ／ＭＡＸヘテロ２量体は、それ自体の発現と、ＣＹＣ２５Ａのようなその下流の遺伝子の発現とを活性化するために、Ｅ−ボックスと結合して、細胞成長の表現型を実現する。前記ヘテロ２量体は、Ｅ２Ｆとともに、サイクリンＡおよびサイクリンＥの活性化という、細胞周期のＧ１期からＳ期への移行のための鍵を握るできごとを引き起こすことができる。Ｃ―ＭＹＣは、テロメラーゼの発現を活性化し、腫瘍発生で重要な役割を果たすことが知られているが、Ｃ−ＪＵＮおよびＣ−ＦＯＳは、ＲＡＳ経路の下流の核段階でのシグナル伝達において重要である。さらに、Ｃ−ＭＹＣ、Ｃ−ＦＯＳおよびＣ−ＪＵＮは、細胞のアポトーシス、ゲノムの安定性および細胞の成熟において重要である。それゆえ、Ｃ−ＭＹＣ、Ｃ−ＦＯＳおよびＣ−ＪＵＮは、薬物の標的となりうるのである。これら３つのがん原遺伝子の異常な発現を修正することにより、ガンのような過剰成長の表現型が、良性でかつ正常な表現型に変わることができる。
【０００４】
がん原遺伝子と腫瘍抑制遺伝子とは、正常細胞および腫瘍細胞で共存している。正常細胞と腫瘍細胞との相違点は、前記２つのタイプの遺伝子の発現レベルにある。腫瘍細胞では、がん原遺伝子は２〜１０倍の過剰発現をしているが、腫瘍抑制遺伝子は不活性化されている。これらの異常は、前記遺伝子の調節領域のシストロンの結合状態、タイプおよび量と密接に関係している。前記遺伝子調節の状態を変化させることによりこれらの異常を除去することは、がん遺伝子治療の新規なアプローチである。
【０００５】
遺伝子発現レベルを変化させて細胞の表現型の変化を起こすために、転写因子と結合する特異的なＤＮＡ配列を利用する転写因子デコイは、有効な腫瘍治療薬として開発することができる。
【０００６】
ＤＮＡ−タンパク質相互作用の研究は、治療薬として核酸デコイを開発するための実験的な基礎である。試験管内で合成された特定配列のＤＮＡの短い断片が、核から抽出されたある種のタンパク質因子と結合した後で、得られたＤＮＡ−タンパク複合体のバンドは、遊離ＤＮＡと比較すると、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、泳動度が移動、すなわちシフトする。Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ（１９９０）が、１９９０年代に、遺伝子発現を調節するために２本鎖オリゴヌクレオチドを応用することを提案して以来、核酸デコイは、最初、心臓血管系の薬剤開発に利用されてきた。例えば、Ｅ２Ｆ因子を標的とする、ＣＡＢＧ（冠状動脈バイパスグラフト）後の内膜成長の治療のための核酸デコイ療法は、臨床治験に入っている（Ｍａｎｎら、１９９９）。ＮＦ−κβ（ＮＦ−κＢ）を標的とする、虚血の治療のための核酸デコイも報告されている（Ｓａｗａ、１９９７、Ｔｏｕｎｉｔａ、１９９８）。腫瘍治療における核酸デコイの応用は初期段階にある。ＣＲＥＢ因子についての核酸デコイ（Ｃｈｏ−ｃｈｏｎｇ、１９９９）が複数の腫瘍細胞株および動物モデルで試験されている。ＥＲについての核酸デコイは乳ガン細胞の成長を阻害するために使用されている（Ｐｉｖａ  Ｒ．ら、２００）。ＮＦ−κβについての核酸デコイは試験管内および生体内の両方でマウスの腫瘍の成長を阻害することがわかっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、配列特異的な核酸デコイを含むがん遺伝子スイッチ停止療法（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に関する。これらの種類の核酸は、ある種の転写因子と競合的に結合して、Ｃ−ＦＯＳ、Ｃ−ＪＵＮおよびＣ−ＭＹＣのようながん原遺伝子の発現を制御して、腫瘍細胞の成長を阻害し、腫瘍治療という目的を達成することができる。
【０００８】
本発明の第１の目的は、１または２以上の核酸デコイを含む医薬品組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、抗ガン剤としての前記核酸デコイの利用法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
これらのがん遺伝子スイッチ停止療法には、前記核酸デコイのコア配列として、転写因子と結合する特異的な配列を用いる。薬剤の安定性と薬剤の標的に対する親和性とを向上させるために、長くなった配列が３次元的な構造を形成するように、前記コア配列の両方向にヌクレオチドを付加して伸ばす。
【００１１】
本発明は、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＭＹＣ／ＭＡＸおよびＪＵＮ／ＡＴＦ転写機構のような転写因子の薬剤標的を特異的に狙い打ちする、核酸デコイ分子の複数の医薬品組成物を開示する。前記デコイは、細胞成長を阻害することが示され、抗ガン剤の候補として大きな将来性がある。前記医薬品組成物は、生理食塩水、緩衝液、リポソームおよびポリマーからなる担体と組み合わせることができ、前記ポリマーは、注射液と、経口のカプセル剤および錠剤と、丸塊と、坐薬と、皮膚塗布剤とからなる処方に加工される。前記医薬品組成物は、その効能を増強するために、化学療法および放射線療法と併用することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
１の好ましい実施態様では、Ｋ１０１Ａシリーズの治療薬が、がん原遺伝子Ｃ−ＦＯＳの過剰発現を調節するために設計される。転写因子ＣＲＥＢは、がん原遺伝子Ｃ−ＦＯＳのエンハンサーであるＣＲＥ配列ＳＴＧＡＣＧＴＭＲ（配列１、配列番号１）と結合するので、配列番号１が、ＣＲＥＢと競合的に結合してがん原遺伝子Ｃ−ＦＯＳの発現レベルを調節する核酸デコイのコア配列として用いられる。例えば、Ｋ１０１ａ（配列６、配列番号６）は、ヘアピン状構造を形成する１本鎖の２３量体オリゴヌクレオチドである。Ｋ１０１ａ−１は、前記コア配列を含む配列７（配列番号７）および配列８（配列番号８）の配列の結合により、十字型をしている。Ｋ１０１ａ−２は、前記コア配列を含む配列９（配列番号９）の配列により形成された２本鎖の線状構造をしている。すなわち、Ｋ１０１Ａシリーズの治療剤は、コア配列ＳＴＧＡＣＧＴＭＲを含み、長さがヌクレオチド１５〜４５個の１本鎖または２本鎖のＤＮＡである。
【００１３】
別の好ましい実施態様では、治療剤Ｋ１０１ｂおよびＫ１０１ｃが、複数のがん原遺伝子の発現を調節するために設計される。ＡＰ−１転写因子は、複数の遺伝子のシス・エレメントであり、かつ、これらの遺伝子の発現を活性化する配列ＳＴＧＡＳＴＭＡ（配列２、配列番号２）と結合する、ＪＵＮ／ＦＯＳのヘテロ２量体である。前記配列は、前記ＡＰ−１エンハンサーを含む遺伝子の発現レベルを下向き調節することができる核酸デコイの中のコア配列として用いられている。例えば、Ｋ１０１ｂは、前記コア配列を含む２０量体のオリゴヌクレオチドである配列１０（配列番号１０）によって形成される２本鎖ＤＮＡ分子である。Ｋ１０１ｂ−１（配列１１、配列番号１１）は、前記コア配列を含む１本鎖の２１量体のオリゴヌクレオチドによって形成されるヘアピン構造である。Ｋ１０１ｂ−２（配列１２、配列番号１２）は、コア配列を含む４２量体のオリゴヌクレオチドである。リガーゼが、Ｋ１０１ｂ−２の５’末端を３’末端と連結し、閉ループを形成するために用いられる。得られた亜鈴状の構造は、この薬剤の安定性を増強する。Ｋ１０１ｃ１（配列１３、配列番号１３）およびＫ１０１ｃ２（配列１４、配列番号１４）は、それぞれ２２量体および２１量体の１本鎖オリゴヌクレオチドである。Ｋ１０１ｃ３（配列１５、配列番号１５）およびＫ１０１ｃ４（配列１６、配列番号１６）は、それぞれ２３量体および２１量体の１本鎖のオリゴヌクレオチドである。４個の治療剤の全てが、セルフ・アニーリング（ｓｅｌｆ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を通じて、ヘアピン構造を形成するか、あるいは２本鎖となり、全てが前記コア配列を含む。要約すると、治療剤Ｋ１０１ｂおよびＫ１０１ｃのシリーズは、ＳＴＧＡＳＴＭＡという配列を含み、長さがヌクレオチド１５〜４５個の１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子である。
【００１４】
別の好ましい実施態様では、治療剤Ｋ１０２シリーズが、Ｃ−ＪＵＮのようながん原遺伝子の発現を調節するために、配列ＴＴＡＣＣＴＣＡ（配列３、配列番号３）を核酸デコイのコア配列として用いるように設計される。前記配列は、Ｃ−ＪＵＮが、それ自体の発現を増強するために結合する、保存されたエンハンサー配列である。同時に、１個の転写因子としてのＪＵＮ／ＡＴＦタンパクヘテロ２量体も、前記配列をエンハンサーとして有する遺伝子の発現を調節するために、前記配列と結合する。例えば、Ｋ１０２（配列１７、配列番号１７）は、前記コア配列を含む２３量体の１本鎖のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造であり、Ｋ１０２−１（配列１８、配列番号１８）は、２１量体のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造であり、Ｋ１０２−２（配列１９、配列番号１９）は、２２量体のオリゴヌクレオチドであり、Ｋ１０２−３（配列２０、配列番号２０）は、２０量体の１本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｋ１０２−４（配列２１、配列番号２１）は、線状の２０量体の２本鎖ヌクレオチドである。要約すると、治療剤Ｋ１０２シリーズは、配列ＴＴＡＣＣＴＣＡを含み、長さがヌクレオチド１５〜４５個の１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子である。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、治療剤Ｋ１０３ａが、がん原遺伝子Ｃ−ＭＹＣの発現を調節するために設計される。Ｃ−ＭＹＣはそれ自体のエンハンサーＴＣＴＣＴＴＡ（配列４、配列番号４）と結合するので、核酸デコイ薬剤は、Ｃ−ＭＹＣの発現レベルを下向き調節するため、前記配列をコア配列として取り込むように設計されている。例えば、Ｋ１０３ａは、配列２２（配列番号２２）を含む２本鎖ＤＮＡで、その両方が前記コア配列を含む。Ｋ１０３ａ−１（配列２３、配列番号２３）は、前記コア配列を含む２５量体のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造である。１０３ａ−２は、配列２４（配列番号２４）および配列２５（配列番号２５）を含む４３量体のオリゴヌクレオチドのステム・ループ構造で、両方の配列が前記コア配列を含む。Ｋ１０３ａ−３は、配列２６（配列番号２６）および配列２７（配列番号２７）を含む３６量体のオリゴヌクレオチドのハンマー構造で、両方が前記コア配列を含む。要約すると、治療剤Ｋ１０３ａシリーズは、配列ＴＣＴＣＴＴＡを含む、長さがヌクレオチド１５〜４５個の１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子である。
【００１６】
別の好ましい実施態様では、治療剤Ｋ１０３ｂが、細胞周期の調節に関連する遺伝子の発現レベルを調節するために設計される。ヘテロ２量体タンパクＭＹＣ／ＭＡＸは、配列ＲＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＹ（配列５、配列番号５）のシス・エレメントとの結合を通じて、細胞増殖を起こし、細胞周期の制御ができなくなる。核酸デコイ薬剤は、前記配列をコア配列として取り込むことにより設計される。前記薬剤は、試験管内で合成され、細胞内に導入された後、ＭＹＣ／ＭＡＸヘテロ２量体との結合について、前記シス・エレメントと競合し、下流の遺伝子発現を抑制し、悪性成長の表現型の抑圧する。例えば、Ｋ１０３ｂ（配列２８、配列番号２８）は、前記コア配列を含む２４量体のオリゴヌクレオチドである。Ｋ１０３ｂ−１（配列２９）およびＫ１０３ｂ−１（配列３０）は、セルフ・アニーリングをして２本鎖の２量体を形成することができ、かつ、前記コア配列を含む、２４量体の１本鎖オリゴヌクレオチドである。要約すると、治療剤Ｋ１０３ｂシリーズは、配列ＲＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＹを含む、長さがヌクレオチド１５〜４５個の１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子である。
【００１７】
前記の核酸デコイ薬剤は自動ＤＮＡ合成機により合成される。フォスフォロチオエート化、脱保護化、精製および凍結乾燥の後、前記核酸デコイ薬剤は、定性的および定量的な分析のために、水に溶かされる。肺ガン細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０が試験管内の機能的スクリーニングおよび効能試験に使用される。前記細胞は９６穴ペトリディッシュに添加され、完全培養液ＲＰＭＩ１６４０で２４時間培養される。この培養の後、リポソームと混合された核酸デコイ薬剤が添加され、前記細胞はさらに３７°Ｃ、５％ＣＯ２で７２時間培養される。細胞生存度は、ＳＲＢ比色法により決定される。スクリーニングの結果は、核酸デコイ薬剤の６つのシリーズ全てが程度は異なるがＮＣＩ−Ｈ４６０の成長を阻害することができ、Ｋ１０１ａおよびＫ１０２が最も強い阻害を示すことを表す。これら全ての核酸デコイが抗がん剤として開発することができる。
【００１８】
本発明の医薬品組成物は、新規な腫瘍治療剤の標的としてのＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＭＹＣ／ＭＡＸおよびＪＵＮ／ＡＴＦに作用する。これらのタンパク分子は、複数の遺伝子の発現レベルの調節に関与し、腫瘍発生と相関性が高いため、貴重な創薬の標的である。
【００１９】
前記創薬の標的に対する治療剤を開発するために考えられる多数の方法のうち、本発明に用いる核酸転写調節デコイは、新規な作用機構と、特異的配列で明確に定義された特異的な機能上の標的という長所を有する。これらのデコイ薬剤は、試験管内の実験で、腫瘍細胞の成長を有効に阻害することが示されてきた。これらの核酸デコイは、遺伝子療法による腫瘍治療と比較すると、送達可能な薬剤として処方することが容易で、はるかに小さな分子である。本発明の薬剤がアンチセンス薬剤より優れている点はその２本鎖構造にあり、１本鎖のアンチセンス薬剤よりも生体内でより安定である。さらに、デコイ薬剤は、効能を発揮するための必要量が少なく、全く新規な標的に作用する。その結果、前記デコイ薬剤は新規な治療剤としての資格がある。
【００２０】
前記核酸デコイ薬剤のコア配列は、長さがヌクレオチド６〜１２個である。これらの短い配列は容易に分解される。前記コア配列が形成する２本鎖構造は、安定ではなく、室温で容易に変性する。さらに、２次構造がないので、タンパクと結合しにくい。これらの短所を克服するため、デコイ薬剤は、安定性と転写因子に対する親和性とを増大させる目的で、鎖を伸ばすためにヌクレオチドを付加することにより改良される。ヘアピン状、十字型、ステム・ループ状および亜鈴状の構造が有利な２次構造であることを考慮すると、前記核酸デコイ薬剤は、全長がヌクレオチド１５〜４５個で、前記コア配列を含むように設計される。得られた配列は、１本鎖のままでいることもでき、あるいは、セルフ・アニーリングするか、ハイブリダイゼーションをして、さまざまな２次構造を形成することもできる。リボヌクレアーゼによる生体内での分解を避けて安定性を増強するために、前記デコイ薬剤の配列は化学的に修飾され、フォスフォロチオエートは最もありふれた保護方法である。さらに、デコイ分子の膜通過性と生体利用率とを向上させるために、コレステロールのような親油性官能基が前記デコイ分子の一方または両方の末端に取り付けられる。リポソーム法を同一の目的のために用いることができる。さらに、腫瘍の内部に前記デコイを優占的に濃縮することにより効能を増強するために、抗体のような標的をねらい打ちする分子を取り付けることもできる。
【００２１】
以上のとおり、薬剤標的としてのＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＭＹＣ／ＭＡＸおよびＪＵＮ／ＡＴＦに対する核酸デコイ分子の医薬品組成物について説明した。前記医薬品組成物は、生理食塩水と、緩衝液と、リポソームと、ポリマーとからなる担体と組み合わせることができ、前記ポリマーは、注射液と、経口カプセル剤および錠剤と、丸塊と、坐薬と、皮膚塗布剤とからなる製剤に加工される。前記医薬品組成物は、その効能を増強するために、化学療法および放射線療法と併用することができる。
【００２２】
【実施例】
実施例１
ＫＧＣＤシリーズの６個の核酸デコイによる肺ガン細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０の成長阻害
以下の６個の核酸デコイは合成の際にフォスフォロチオエート化処理を施した。Ｋ１０１ａ（配列６）、Ｋ１０１ｂ（配列１０）、Ｋ１０１ｃ１（配列１３）、Ｋ１０２（配列１７）、Ｋ１０３（配列２２）およびＫ１０３ｂ（配列２８）。陰性対照は、５’−ＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡ−３’であり、陽性対照は、５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’である。
【００２３】
ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞は、陰性対照、陽性対照、ブランク対照および前記ＫＧＣＤシリーズの６個の核酸デコイの実験群に分注される。前記細胞は、ウェルあたり２〜３ｘ１０４個ずつ、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液を入れた９６穴ペトリディッシュに植え継がれる。２４時間培養後、培養液を無血清のＲＰＭＩ１６４０に交換する。ウェルあたり０．６μｌのリポソームと、最終濃度２００ｎＭのさまざまな核酸デコイとが添加される。（ブランク対照には、ウェルあたり０．６μｌのリポソームのみが添加される。）５時間後、前記培養液は、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０に交換される。前記細胞は、３７°Ｃ５％ＣＯ２の条件下で培養される。７２時間後、前記細胞はＳＲＢで染色され、分光光度計（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて５１０ｎｍの波長（λ５１０ｎｍ）での吸光度（ＯＤ）を測定して、細胞生存度が決定される。細胞成長阻害活性のグラフは、前記ブランク対照を１００％としてプロットされる。結果を図１に示す。ＣＲＥが陽性の対照を表し、Ｃが陰性の対照を表し、残る６個がＫＧＣＤシリーズのデコイである。図１から、前記デコイはさまざまな程度でＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の成長阻害が起こすが、Ｋ１０１ａおよびＫ１０２が最も著しい成長阻害を示すことがわかる。
【００２４】
実施例２
核酸デコイＫ１０１ａおよびＫ１０２によるさまざまな腫瘍細胞株の成長阻害核酸デコイＫ１０１ａとＫ１０２が、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺ガン）、ＣＮＥ（鼻咽頭ガン）、Ｕ２５１（神経グリア芽腫）、ＮＣＦ−７（乳ガン）、ＢＥＬ−７４０２（肝ガン）という腫瘍細胞株および正常細胞Ｌ−０２（肝臓細胞）およびＮＩＨ３Ｔ３を処理するのに用いられる。図２の棒グラフの白抜きの棒（ミスマッチ配列）は陰性対照を表し、細胞成長への影響がほとんど無いことを示す。Ｋ１０１ａおよびＫ１０２は、程度は異なるものの、全ての腫瘍細胞株の成長を阻害するが、Ｕ２５１およびＮＣＩ−Ｈ４６０の成長阻害が最も著しい。前記デコイは、正常細胞の成長にはほとんど効果がない。
【００２５】
実施例３
核酸デコイＫ１０１ａおよびＫ１０２のＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍細胞に対するＩＣ５０
腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０が異なる濃度のＫ１０１ａおよびＫ１０２で処理される。一定時間の培養の後、細胞生存度を決定するために吸光度が測定される。図３に示すとおり、Ｋ１０１ａおよびＫ１０２はＮＣＩ−Ｈ４６０の成長を比較的低濃度で阻害することができ、ＩＣ５０は約３０〜５０ｎＭ、すなわち、３０〜５０μｇ／ｍｌである。これは、抗ガン剤のスクリーニングにおける基準（ＩＣ５０＜１０μｇ／ｍｌ）よりもはるかに高い。陰性対照のグループは細胞成長について濃度依存性の効果を示さない。
【００２６】
実施例４
治療剤Ｋ１０２の抗ガン活性の生体内での効能
治療剤Ｋ１０２は生理食塩水およびリポソームとともに処方される。Ｔ細胞のないヌードマウスに腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０を皮下注射で移植してから２４時間後、Ｋ１０２が、腫瘍の中に（ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ）、あるいは静注で（ｉ．ｖ．）、毎日投与される。投与量は、生理食塩水処方については、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇで、リポソーム処方については、２．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇである。生理食塩水および純粋なリポソームが対照実験に用いられた。腫瘍体積は動的に（ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ）測定される。２０日間連続して薬剤を投与した後、動物を安楽死させ、腫瘍を摘出して重量を計測する。生理食塩水処方のｉｔ  Ｘ  ２０  ｂｉｄグループでは、腫瘍の成長は、それぞれ、７３．５％、６７．５７％および６７．５７％（Ｖ／Ｖ）阻害されるが、ｉ．ｖ．  Ｘ  ２０  ｑｄのグループは５７．３％（Ｖ／Ｖ）の腫瘍阻害が達成される。リポソーム処方のｉｔ  Ｘ  ２０  ｂｉｄのグループでは、腫瘍成長は、それぞれ、７７．８４％、６５．４１％および６８．６５％（Ｖ／Ｖ）阻害されるが、ｉ．ｖ．  Ｘ  ２０  ｑｄグループは６０．５５％（Ｖ／Ｖ）の腫瘍阻害が達成される。図４は、ヒト肺ガン細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０を移植したヌードマウスにおけるＫ１０２処理後の腫瘍体積の動的な変化を示す。図４は、異なる濃度および処方のデコイ薬剤のグループが、薬剤投与の７日後に、程度は異なるが腫瘍の成長を阻害することを示す。２．５ｍｇ／ｋｇの濃度のリポソームのグループが、薬剤投与の２０日後に、７７％（Ｖ／Ｖ）という最高の成長阻害を示す。また、図４は、Ｋ１０２が処方に関係なく腫瘍成長について有効な阻害剤で有ることを示す。
【００２７】
実施例５
ゲルシフトアッセイ
Ｄｉｇｎａらの方法で核抽出液が調製される。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ３２Ｐ］ＡＴＰで３２Ｐ標識される。０．５ｎｇのプローブと、５μｇの核抽出物と、Ｋ１０２と核タンパクとの非特異的な結合を阻害するための２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）と、結合緩衝液［１０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール］とを含む結合反応混合液が、室温で２０分間インキュベーションされる。その後ゲルは乾燥され、増感スクリーンとともに−７０°Ｃでオートラジオグラフィーに供される。図５において、パネル１および３は、３２Ｐ標識されたＫ１０２と細胞核抽出物との間で形成された複合体を表し、パネル２および４は、３２Ｐ標識されたＫ１０２と細胞核抽出物との間で（特異的競合剤として用いられる）無標識のＫ１０２の存在下で形成された複合体を表し、パネル５は、細胞核抽出物なしで３２Ｐ標識されたＫ１０２のみを表す。図５に示す結果は、Ｋ１０２が核タンパク質と特異的な複合体を形成することを示し、Ｋ１０２の作用機序を裏付けるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＧＣＤシリーズの核酸デコイによるＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍細胞の成長阻害を示すグラフである。
【図２】核酸デコイＫ１０１ａおよびＫ１０２によるさまざまな腫瘍細胞株の成長阻害を表すグラフである。
【図３】核酸デコイＫ１０１ａおよびＫ１０２によるＮＣＩ−Ｈ４６０のＩＣ５０を表す。
【図４】ヒト肺ガン細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０を移植したヌードマウスにおけるＫ１０２処理後の腫瘍体積の変化を表す。
【図５】ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるＫ１０２のゲルシフトアッセイを表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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