(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にコリネ型細菌由来のシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流に異種タンパク質をコードする核酸配列が接続された発現遺伝子構築物を有し、かつ、同じ発現遺伝子構築物を有する野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869と比べて少なくとも２倍の該異種タンパク質を分泌する能力を有するコリネ型細菌変異株を培養し、生成した異種タンパク質を回収することを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記コリネ型細菌変異株がコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)又はその変異株である、前記方法。
【請求項２】
コリネ型細菌変異株がコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コリネ型細菌変異株がコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)より誘導された、細胞表層タンパク質PS2を生産しない変異株である請求項１記載の方法。
【請求項４】
シグナルペプチドがコリネ型細菌由来の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドであって、配列番号1〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
シグナルペプチドが、配列番号１〜３の何れかに記載のアミノ酸配列において唯一つのアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
コリネ型細菌由来変異株の培養がカルシウムイオンを2.25mM以上含有する培地で行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
コリネ型細菌由来変異株の培養が溶存酸素濃度を3%以下に制御しつつ行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、異種タンパク質をコリネ型細菌で効率よく分泌生産する方法に関するものである。
異種タンパク質の分泌生産としてはこれまでにバチルス属細菌による分泌生産の総説［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｒｅｖ．，５７，１０９−１３７（１９９３）］、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓによる分泌生産の総説［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，９０５−９１０（１９９３）］、そしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のカビによる工業的生産の報告［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，１４１９−１４２２（１９８８）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９，９７６−９８１（１９９１）］等のように多数報告されている。
本発明の１つの実施態様において分泌生産されるトランスグルタミナーゼはタンパク質のペプチド鎖内にあるγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素である。本酵素をタンパク質に作用させると、ε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架橋形成反応、Ｇｌｎの脱アミド化によるＧｌｕへの置換反応が起こりうる。このトランスグルタミナーゼは、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、あるいはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等に利用されている（特公平１−５０３８２）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上利用性の高い酵素である。
トランスグルタミナーゼはこれまでに動物由来のものと微生物由来のもの（マイクロバイアルトランスグルタミナーゼ：以下「ＭＴＧ」という）が知られている。前者は、カルシウムイオン依存性の酵素で、動物の臓器、皮膚、血液などに分布している。例えば、モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ（Ｋ．Ｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７，２８９８（１９８８））、ヒト表皮ケラチン細胞トランスグルタミナーゼ（Ｍ．Ａ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，９３３３（１９９０））、ヒト血液凝固因子ＸＩＩＩ（Ａ．Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，６９００（１９９０））などがある。
後者については、ストレプトバーチシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌から、カルシウム非依存性のものが発見されている。例えば、ストレプトバーチチシリウム・グリセオカルニウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）ＩＦＯ  １２７７６、ストレプトバーチシリウム・シナモニウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  ｓｕｂ  ｓｐ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）（以後Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍと略すことがある）ＩＦＯ  １２８５２、ストレプトバーチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）（以後、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅと略すことがある）ＩＦＯ  １３８１９等があげられている（特開昭６４−２７４７１）。これらの微生物が生産するトランスグルタミナーゼの一次構造はペプチドマッピング及び遺伝子構造解析の結果、動物由来のものとは相同性を全く持たないことが判明している（ヨーロッパ特許公開公報０  ４８１  ５０４  Ａ１）。
微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）は、上記菌類等の培養物から精製操作をへて製造されているため、供給量、効率等の点で問題があった。また、遺伝子工学的手法によるトランスグルタミナーゼの製造も試みられている。トランスグルタミナーゼタンパク質およびその遺伝子については例えば、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８２−８７（１９９４），Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８８−９２（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８０，３１３−３１９（１９９８）．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５７０−５７６（１９９８），ＷＯ  ９６／０６９３１、ＷＯ  ９６／２２３６６などに報告されており、これらには例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主ベクター系での発現生産に関する報告がなされている。これらの情報と共に、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母等の微生物における分泌発現（特開平５−１９９８８３）による方法とＥ．ｃｏｌｉでＭＴＧを不活性融合タンパク質封入体として発現させた後、この封入体をタンパク質変性剤で可溶化し、脱変性剤処理を経て再生させることにより活性をもつＭＴＧを生産する方法（特開平６−３０７７１）が報告されている。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉや酵母等の微生物によるこのような分泌発現においては、その発現量が非常に少ないという問題点が指摘される。
一方、コリネ型細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産するための研究としては、これまでにコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（以後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍと略すことがある）によるヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）やリパーゼの分泌［ＵＳ４９６５１９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，１８５４−１８６１（１９９２）］及び、サチライシン等のプロテアーゼの分泌［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，１６１０−１６１３（１９９５）］、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質の分泌に関する研究［特表平６−５０２５４８］、これを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，４３９２−４４００（１９９７）］、変異型分泌装置を利用してタンパク質の分泌を向上させた報告［特開平１１−１６９１８２］等があるが、ごく限られたタンパク質について極めて少数の報告があるのみである。タンパク質の蓄積量でみると、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，１６１０−１６１３（１９９５）において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のサチライシン遺伝子（ａｐｒＥ）のプロモーター、リボソーム結合部位及びシグナルペプチドの配列を利用してＤｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｄｏｓｕｓ由来のアルカリ性プロテアーゼの遺伝子をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて発現させ、約２．５ｍｇ／ｍｌの蓄積を認めた例はあるものの、ＵＳ４９６５１９７、特表平６−５０２５４８、あるいは特開平１１−１６９１８２の記載においては具体的な分泌蓄積の値が記載されておらず、また、フィブロネクチン結合タンパク質の分泌［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，４３９２−４４００（１９９７）］においては、最大約２．５μｇ／Ｌという非常に少量の分泌蓄積が確認されているに過ぎない。この様に、実用的なレベルで効率よく培地中に異種タンパク質を蓄積させたという報告は未だなされていない。
また、コリネ型細菌の遺伝子操作技術は、プロトプラストによるトランスフォーメーション法の確立［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６−３１１（１９８４）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１，４６３−４６７（１９８５）］、各種ベクターの開発［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６−３１１（１９８４）；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０，２２３７−２２４６（１９８４）；Ｇｅｎｅ，４７，３０１−３０６（１９８６）；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，６５−６９（１９８９）］、遺伝子発現制御法の開発［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４２８−４３０（１９８８）］及びコスミドの開発［Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５）］など、プラスミドやファージを用いた系で発展してきた。またコリネ型細菌由来の遺伝子クローニング［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，１０１１３−１０１１（１９８６）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６７，６９５−７０２（１９８６）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，１０５９８（１９８７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，３９２２（１９８７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，９８５９（１９８８）；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，５２５−５３１（１９８８）；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，６３−７２（１９８８）；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，３３０−３３９（１９８９）；Ｇｅｎｅ，７７，２３７−２５１（１９８９）］についても報告されている。
さらにコリネ型細菌由来の転移因子についても報告されている［ＷＯ９３／１８１５１；ＥＰＯ４４５３８５；特開平６−４６８６７；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９−７４６（１９９４）；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４，５７１−５８１（１９９４）；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４５，３９７−４０５（１９９４）；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２６，１−６（１９９５）；特開平７−１０７９７６］。
転移因子とは染色体上で転移し得るＤＮＡ断片で、原核生物から真核生物までの広い範囲の生物に存在する事が知られている。転移因子を利用したトランスポゾンが開発され［ＷＯ９３／１８１５１；特開平７−１０７９７６；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４５，３９７−４０５（１９９４）；特開平９−７０２９１］、トランスポゾンで異種遺伝子を発現させることも可能になってきた。
発明の開示
本発明は、コリネ型細菌に産業上有用な異種タンパク質、例えばトランスグルタミナーゼを生産させ、これを効率的に菌体外に分泌（分泌生産）させることによって、異種タンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、コリネ型細菌を用いて異種タンパク質を生産するに際し、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９と比べて顕著に高い生産能を示す変異株を見いだし、産業上有用な異種タンパク質を効率よく分泌生産する方法を発明するに至った。
すなわち、本発明は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９と比べて少なくとも２倍の異種タンパク質を分泌する能力を有するコリネ型細菌変異株に、コリネ型細菌由来のシグナルペプチドの下流に異種タンパク質が接続された融合タンパク質を産生させ、該異種タンパク質を菌体外に分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法である。
より具体的には、本発明は、コリネ型細菌由来のシグナルペプチド領域、特に細胞表層タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする配列の下流に目的タンパク質遺伝子配列を結合した発現構築物をコリネ型細菌に導入し、得られた形質転換コリネ型細菌を培養し、生じたタンパク質を菌体外に効率よく分泌させ、菌体外に放出されたタンパク質を回収することによって、多量の目的異種タンパク質、例えばトランスグルタミナーゼを得る方法である。
なお、本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいい、最終的にそのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、菌体表層に存在している場合も含む。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法により、コリネ型細菌が宿主ベクター系として用いられ、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドの下流に目的タンパク質遺伝子を結合した発現構築物が作製され、これがコリネ型細菌内に導入され、発現され、菌体外に分泌された多量の目的タンパク質が得られる。本発明の方法で分泌生産される異種タンパク質は産業上有用な酵素や生理活性タンパク質、ペプチド等であり、本発明の実施態様の一つにおいて分泌生産されるトランスグルタミナーゼは食品加工や医薬等に幅広く利用されている。
分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、成熟型タンパク質になることが知られている。すなわち、一般に、プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。本明細書において、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体のＮ末端に存在し、かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とはそのようなタンパク質前駆体から切り取られるペプチドをいう。一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断される。このようなシグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した配列上の特徴を有するが、ある生物種で分泌機能を示すシグナルペプチドが他の生物種においても必ずしも分泌機能を発揮するということではない。
本明細書において、シグナルペプチドおよびプロ部分の両方を有するタンパク質、すなわち、一次翻訳産物を「プレプロタンパク質」と称することがあり、また、シグナルペプチドを有しないがプロ部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」と称することがある。プロタンパク質のプロ部分は「プロ構造部」または単に「プロ構造」と称することもあり、本明細書においてタンパク質の「プロ構造部／プロ構造」とタンパク質の「プロ部分」とは互換的に使用される。プレプロタンパク質またはプレタンパク質において、そのシグナルペプチドは異なるタンパク質に由来する場合であっても、目的タンパク質に天然に存在するシグナルペプチドであってもよいが、使用する宿主の分泌型タンパク質に由来することが好ましい。あるいは、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
さらに本発明の目的に使用し得るシグナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を一部含んでいてもよい。シグナルペプチドが異なるタンパク質に由来する場合はプレプロタンパク質を特に「異種融合プレプロタンパク質」と称することもある。例えば、タンパク質がトランスグルタミナーゼの場合は、それぞれ「プレプロトランスグルタミナーゼ」、「プロトランスグルタミナーゼ」および「異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ」と称される。また、「プロ部分を切断した」タンパク質とは、ペプチド結合を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも１以上のアミノ酸を除去したタンパク質をいい、そのＮ末端領域が天然の成熟型タンパク質のものと完全に一致するタンパク質、および、そのタンパク質の活性を有する限り、天然のタンパク質に比較してＮ末端にプロ部分に由来する１以上の余分のアミノ酸を有するものおよび天然の成熟型タンパク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。
これまでコリネ型細菌を用いて異種タンパク質を菌体外に分泌生産した例は従来の技術の項に述べた如く極めて少なく、かつ技術としては未完である。さらにまたコリネ型細菌が自身で菌体外にプロテアーゼ等のタンパク質を分泌しているという例は知られておらず、内在性ＤＮａｓｅの分泌［ＵＳ４９６５１９７］と、本発明において使用する細胞表層タンパク質［特表平６−５０２５４８］が細胞表層より剥がれ落ちて菌体外に見出されている事実が知られている例である。ただし、コリネ型細菌では分泌に関わるシグナルペプチドは細胞表層タンパク質を除いてはこれまで知られていない。これまでに知られているコリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の細胞表層タンパク質であるＰＳ１及びＰＳ２の遺伝子［特表平６−５０２５４８］、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（以後、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓと略すことがある）の細胞表層タンパク質であるＳｌｐＡの遺伝子［特開平１０−１０８６７５］が知られているだけである。これらのタンパク質の内、ＰＳ１とＳｌｐＡの間には若干の相同性（約３０％）が認められるが、その他にはほとんど相同性は認められず、さらにシグナル配列領域に関しては互いに相同性は認められていない。シグナル配列の例として、コリネバクテリウム・グルタミカムのＰＳ１とＰＳ２のシグナル配列を配列番号１と２に、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスのＳｌｐＡのシグナル配列を配列番号３に示す。
そこで、本発明者らはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（旧名称ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ））ＡＴＣＣ１３８６９株よりＰＳ２タンパク質遺伝子をクローン化し、その配列を決定したところ、シグナル配列領域には既知のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の配列（特表平６−５０２５４８）との違いが認められなかったが、成熟型細胞表層タンパク質のＮ末端アミノ酸の３８残基までに２つの違いが認められた（既知の配列では、配列番号５に示すアミノ酸配列において４０残基目のＡｓｎがＴｈｒ、５５残基目のＧｌｕがＧｌｙとなっている）。そのシグナル配列３０アミノ酸残基および成熟型細胞表層タンパク質のＮ末端アミノ酸３８残基を含む６８残基をコードする塩基配列及びプロモーター領域を含むその５’−上流領域を配列番号４に、アミノ酸配列を配列番号５に示した。
次に、本発明者はコリネ型細菌において異種タンパク質を多量に菌体外に分泌生産することが可能かどうかを試みるべく細胞表層タンパク質のプロモーター領域やシグナルペプチドを含む領域を利用しての異種タンパク質の分泌研究を行った。
放線菌由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子はＧＣコンテントが高いが、コリネ型細菌もそれに近く、またコドン利用性も近似しているので、放線菌の遺伝子そのものがそのまま利用しうる利点がある。そこで本発明者は放線菌由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子をそのまま利用しうるか否かを検討した結果、放線菌由来のトランスグルタミナーゼのシグナルペプチドはコリネ型細菌では機能しないことがあきらかになった。しかしながらコリネ型細菌由来の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドと融合した放線菌由来のプロ構造部を含む成熟タンパク質をコードするトランスグルタミナーゼ遺伝子はそのまま有効に機能し、プロ構造部を有するプロタンパク質として効率良く菌体外に分泌されることが明らかとなった。さらにまた細胞表層タンパク質のシグナルペプチド３０アミノ酸残基と成熟細胞表層タンパク質のＮ末端部分の３８アミノ酸残基を余分に含む、すなわち、成熟細胞表層タンパク質のＮ末端部分が融合したプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ遺伝子を使用するとプロトランスグルタミナーゼの菌体外分泌効率がさらに増大することが示された。
本発明に言うコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性かん菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９９１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点としてはこれまでに異種タンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が簡略化、省略化できることであり、また糖、アンモニアや無機塩等のシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていることである。
本発明において宿主菌として使用できるコリネ型細菌としては、Ｌ−グルタミン酸生産菌に代表されるブレビバクテリウム・サッカロリティクムＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・インマリオフィルムＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１５９９０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）ＡＴＣＣ６８７１等の野生株またはその変異株より誘導される変異株であって、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９と比べて少なくとも２倍の異種タンパク質を分泌する能力を有する変異株である。
本発明の変異株としては、例えばグルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ酸生産変異株、イノシン等の核酸のような他の物質を生産する変異株も含まれる。本発明の変異株は、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することにより得ることができる。
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９よりストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４）（昭和５９年３月２６日原寄託）（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号３０５−８５６６）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である。さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。
本発明に使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、およびコリネ型細菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。目的タンパク質は、Ｎ末端にプロ構造部を有していてもよい。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、コリネ型細菌中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。コリネ型細菌由来のプラスミドは特に好ましい。これらには、例えばｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。
また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えばｔａｃプロモーター等のＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターであってもよい。その中で、ｔａｃプロモーター等の強力なプロモーターがより好ましい。
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のＰＳ１、ＰＳ２、ＳｌｐＡの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル−ＡＴＰピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
本発明で使用するシグナルペプチドは、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドであり、好ましくは、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドである。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来するＰＳ１及びＰＳ２（特表平６−５０２５４８）、及びＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓに由来するＳｌｐＡ（特開平１０−１０８６７５）が挙げられる。ＰＳ１のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に、ＰＳ２のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、ＳｌｐＡのシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、米国特許４９６５１９７によれば、コリネ型細菌由来のＤＮａｓｅにもシグナルペプチドがあると言われており、そのようなシグナルペプチドも本発明に利用することができる。
シグナルペプチドには、それが由来する分泌性タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の一部が付加されていてもよい。シグナル配列は、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
これらのシグナルペプチドを使用する場合、目的とするタンパク質をコードする遺伝子は、シグナルペプチドをコードする遺伝子の３’−末端側に接続し、かつ、上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置する。
本発明によって分泌生産し得る有用タンパク質は、本質的には動植物や微生物由来の分泌型タンパク質全般が含まれ、特に限定されない。例えば、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼおよびキチナーゼ等のタンパク質を本発明によって分泌生産することができる。本発明によって分泌生産されるタンパク質は天然で分泌型であるタンパク質が好ましく、プロ構造部が付加したタンパク質でもよく、トランスグルタミナーゼは本発明によって分泌生産される有用タンパク質として特に好ましい。トランスグルタミナーゼ遺伝子としては放線菌、例えばＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ  １３８１９、Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  ＩＦＯ  １２８５２、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ  ＩＦＯ  １２７７６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｙｄｉｃｕｓ［ＷＯ９６０６９３１］等やＯｏｍｙｃｅｔｅｓ［ＷＯ９６２２３６６］等のカビなどの分泌型のトランスグルタミナーゼの遺伝子が本発明の目的に利用可能である。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および望みの活性を得るために改変することができ、それらには１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれ、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。
天然でプレプロペプチドとして発現されるタンパク質を本発明によって分泌生産する場合は、プロ構造部（プロ部分）を含むプロタンパク質をコードする遺伝子断片を使用することが特に好ましいが必須ではない。プロタンパク質をコードする遺伝子を使用した場合、その遺伝子の発現によって得られるタンパク質のプロ構造部は適当な手段、例えばプロテアーゼによって切断すればよく、アミノペプチダーゼ、適切な位置で切断するエンドペプチダーゼ、あるいは、より特異的なプロテアーゼを使用することができるが、その結果生じるタンパク質が天然のタンパク質と同等またはそれ以上の活性を有するような位置で切断するプロテアーゼが好ましい。あるいは、目的タンパク質または目的タンパク質のプロ構造部をコードする遺伝子配列を改変して、望みの位置に特異的なプロテアーゼの認識部位を有するタンパク質を発現するように設計することもできる。このような改変技術、遺伝子のクローニング技術、生産されたタンパク質の検出技術を含む、一般的な分子生物学的手法は当業者によく知られたものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｊｎｃ．（１９９４）、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ等を参照することができる。
本発明により最終的に得られるタンパク質のＮ末端領域は必ずしも天然のタンパク質と同一でなくてもよく、１〜数個のアミノ酸を余分に付加された、あるいは欠失したものであってもよい。プロテアーゼを使用する場合は、そのタンパク質の活性という観点から、一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のものと同一の成熟ペプチドであることがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロペプチドを切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。しかしながら、特定の目的については、天然のタンパク質に比較してＮ末端がアミノ酸１〜数個分長いあるいは短いペプチドがより適切な活性を有することがある。そのようなプロテアーゼにはＤｉｓｐａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。
放線菌由来のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を除去するための他の好適なプロテアーゼの例としては、ストレプトマイセス・アルボグリセオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）（以後、Ｓ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓと略すことがある）の産生するセリンプロテアーゼであるＳＡＭＰ４５がある。配列番号６および７にＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのトランスグルタミナーゼの遺伝子配列とコードされる全アミノ酸配列（１〜３１番目がシグナル配列、３２〜７６番目がプロ構造部、７７〜４０７番目が成熟トランスグルタミナーゼ）を示すが、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのプロトランスグルタミナーゼの場合、ＳＡＭＰ４５はプロ構造部中の７２番目のＳｅｒと７３番目のＰｈｅの間を優先的に切断するため、天然型の成熟トランスグルタミナーゼのＮ末端にプロ構造部のＣ末端のＰｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏの４個のアミノ酸（配列番号６０）が付加された構造のタンパク質が生成される。本発明者らは、このようなタンパク質もトランスグルタミナーゼ活性を有していることを確認した。なお、ＳＡＭＰ４５遺伝子の配列は既に決定されており、配列番号８にプロ構造の付加したタンパク質（プロＳＡＭＰ４５）のアミノ酸配列を示した（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４３０−４３８（１９９７））。
さらに、本発明者らが見出した、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅＩＦＯ１３８１９の生産するプロリン特異的ペプチダーゼ（ｓｖＰＥＰ）をＳＡＭＰ４５と組み合わせて使用することにより、Ｎ末端に付加したＰｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏの４個のアミノ酸も除去され、天然型と同一の成熟トランスグルタミナーゼを得ることができる。
このｓｖＰＥＰは、以下の式（Ｉ）で表されるペプチドまたはペプチド類似物を式中↓の箇所で、すなわちＮ末端から３番目または４番目のプロリン残基のカルボキシル側を特異的に切断する酵素である。
Ｙ−Ｐｒｏ−↓−Ｚ    （Ｉ）
（式中、Ｙは２または３アミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、Ｚはアミノ酸、ペプチド、アミド、またはエステルである。）
ｓｖＰＥＰの遺伝子の塩基配列とそれにコードされる全アミノ酸配列を配列番号９および１０に示す。ｓｖＰＥＰは、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｃｅの培養液またはＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｃｅ菌体の形態でプロテアーゼと共にプロトランスグルタミナーゼに作用させた場合に、プロ構造部を完全に切断することができ、この結果、プロ構造部が完全に除去された成熟トランスグルタミナーゼを得ることができる。あるいは、プレプロｓｖＰＥＰ遺伝子及びプレプロプロテアーゼ遺伝子を導入したコリネ型細菌をプロトランスグルタミナーゼを菌体外に分泌生産するコリネ型細菌と共に培養することにより、同様にプロ構造部が完全に除去された成熟トランスグルタミナーゼを得ることができる。また、プレプロトランスグルタミナーゼの遺伝子を導入したコリネ型細菌にＳＡＭＰ４５遺伝子とｓｖＰＥＰ遺伝子の両方を同様の方法で導入し、プロトランスグルタミナーゼ及びＳＡＭＰ４５と同時にｓｖＰＥＰを菌体表層または菌体外に分泌生産させることにより、天然と同一の構造を持つ成熟トランスグルタミナーゼの生産を効率よく行うことができる。
本発明に使用し得る遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，１０６７−１０７０）（１９８９））等を使用することができる。得られた遺伝子導入形質転換体は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、形質転換体は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はｐＨ５．０〜８．５、１５℃〜３７℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１〜７日間程度培養する。このような条件下で形質転換体を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。トランスグルタミナーゼについては、微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であることが知られているが、本発明によれば生産されたトランスグルタミナーゼは菌体外に放出されるため、致死的影響を受けることなく連続的にトランスルグタミナーゼが生産される。
本発明によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。本発明によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用しても良い。
実施例
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。
実施例１：Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来のプレプロトランスグルタミナーゼのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９における発現
（１）Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来トランスグルタミナーゼ遺伝子の取得
Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＤＳＭＺ株由来トランスグルタミナーゼ遺伝子の配列は既に決定されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５７０−５７６（１９９８）］。この配列を参考にして、配列番号１１と配列番号１２に示したプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］）調製したＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ    ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡから成熟トランスグルタミナーゼ配列をコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
0004362651.tif 000002
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１１，１２：ＰＣＲプライマー
次に増幅した約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて、添付のプロトコールに従って反応させ、ＤＮＡプローブを作製した。作製したプローブとＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ９．３１（１９８９）］に記載されているような一般的な方法に従って、サザンブロットハイブリダイゼーションを行ったところ、制限酵素ＳａｃＩで切り出される約４ｋｂの断片にトランスグルタミナーゼ遺伝子が存在していることが確認できた。そこでＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡをＳａｃＩで消化した約４ｋｂの断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により回収し、これをｐＵＣ１８（宝酒造社製）のＳａｃＩ部位に挿入した後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）のコンピテントセルに導入し、ライブラリーを作製した。
先に作製したトランスグルタミナーゼのＤＮＡプローブを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ１．９０（１９８９）］記載のコロニーハイブリダイゼーションにより、ライブラリーのスクリーニングを行い、トランスグルタミナーゼ遺伝子断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収し、ｐＵＩＴＧと名付けた。ｐＵＩＴＧにクローン化されている断片の塩基配列を決定したところ、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９のトランスグルタミナーゼの遺伝子は、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＤＳＭＺ株のトランスグルタミナーゼの遺伝子と同じ塩基配列を有することが確認された。
塩基配列の決定の結果、このＳａｃＩの約４ｋｂの断片はシグナル配列（プレ部分）が一部欠けた不完全なＤＮＡ断片であることが判明した。そこでプロモーター領域と完全なシグナル配列領域のクローニングを試みた。クローニングはＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）と配列番号１３及び配列番号１４に示した合成プライマーを利用し、添付のプロトコルに従って実施した。
0004362651.tif 000003
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１３，１４：Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのプロモーター領域およびシグナル配列のためのＰＣＲプライマー
その結果、ＳａｌＩのカセットプライマーを用いたときに約８００ｂｐのＰＣＲ増幅断片が得られ、この断片の塩基配列を決定したところトランスグルタミナーゼ遺伝子のプロモーター領域とシグナル配列領域を含む断片であることが確認された。そこで、この約８００ｂｐのＰＣＲ増幅断片を特開平９−０７０２９１記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＶＩＴＧＳ５を得た。さらにｐＵＩＴＧをＳａｃＩで消化することにより、トランスグルタミナーゼ遺伝子を含む約４ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、この断片をｐＶＩＴＧＳ５のＳａｃＩ部位に挿入し、完全長のトランスグルタミナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＶＩＴＧＣを構築した。尚、塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。配列番号６にプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子の配列とコードされる全アミノ酸配列を示したが、Ｎ末端の３１アミノ酸配列（１〜３１番目）がシグナル配列（プレ部分）であり、４５アミノ酸（３２〜７６番目）がプロ構造部で、３３１アミノ酸（７７〜４０７番目）が成熟トランスグルタミナーゼであると考えられた。
（２）トランスグルタミナーゼ遺伝子プロモーター領域の変換
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子の配列は既に決定されている［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］。この配列を参考にして配列番号１５と配列番号１６に示したプライマーを合成し、常法に従って調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＳ２タンパク質遺伝子のイニシエーションコドンの５’−上流域のプロモーターを含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000004
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１５，１６：ＰＣＲプライマー
一方、実施例１（１）で決定したトランスグルタミナーゼの遺伝子配列をもとに配列番号１２と配列番号１７に示したプライマーを合成し、実施例１（１）で取得したｐＵＩＴＧからプレプロトランスグルタミナーゼの遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000005
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１２，１７：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子のプロモーターを含む領域と、やはり増幅させたプレプロトランスグルタミナーゼの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号１５と配列番号１２を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーターを含む領域に接続されたプレプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約１．８ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＶＫＰＴＧＯを得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
（３）プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９での発現
実施例１（１）で構築したｐＶＩＴＧＣ（プロモーターおよびプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子のすべてがＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来）あるいは、実施例１（２）で構築したｐＶＫＰＴＧＯ（プロモーターはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子由来で、プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子はＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来）でＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｓ寒天培地（酵母エキストラクト  １０ｇ、トリプトン  １０ｇ、シュークロース  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天  １５ｇ、水で１Ｌにする）で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＩＴＧＣあるいは、ｐＶＫＰＴＧＯを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＭＭ液体培地（グルコース  ３０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．４ｇ、硫酸アンモニウム  ３０ｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、硫酸鉄七水和物  ０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物  ０．０１ｇ、チアミン塩酸塩  ２００μｇ、ビオチン  ５００μｇ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ、炭酸カルシウム  ５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）でそれぞれ３０℃、４８時間培養した。培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８２−８７（１９９４）記載の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従って（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（前述）に記載されるような一般的な手順）ウエスタンブロットを行った。
その結果トランスグルタミナーゼの分泌を検出することはできなかった。以上の結果よりＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのトランスグルタミナーゼのシグナル配列はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９においては機能しないことが確認された。
実施例２：コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９）の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドおよびＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来の成熟トランスグルタミナーゼをコードする融合遺伝子を用いた成熟トランスグルタミナーゼの分泌生産
（１）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するトランスグルタミナーゼ遺伝子の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子の配列は既に決定されている［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］。この配列を参考にして配列番号１５と配列番号１８に示したプライマーを合成し、実施例１（２）の方法により調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＳ２に相当するタンパク質のＮ末端側アミノ酸４４残基（シグナルペプチド３０アミノ酸残基と成熟細胞表層タンパク質の１４アミノ酸残基）をコードする領域とプロモーター領域を含む５’−上流域とをＰＣＲ法にて増幅した。また配列番号１８に示したプライマーはトランスグルタミナーゼとの融合遺伝子を構築するために、成熟トランスグルタミナーゼのＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000006
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１５，１８；ＰＣＲプライマー
一方、実施例１（１）で決定したトランスグルタミナーゼの遺伝子配列をもとに配列番号１１と配列番号１２に示したプライマーを合成し、実施例１（１）で取得したｐＵＩＴＧから成熟トランスグルタミナーゼの遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。
次に、増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質のＮ末端側アミノ酸４４残基をコードする領域とプロモーター領域を含む５’−上流域とのＰＣＲ反応液１μｌと、やはり増幅させた成熟トランスグルタミナーゼの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号１５と配列番号１２を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸４４残基をコードする領域に接続された成熟トランスグルタミナーゼの融合遺伝子を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により約１．７ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＶＫＴＧ３を得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
また、ｐＶＫＴＧ３をＫｐｎＩとＸｂａＩを用いて消化することにより、約１．７ｋｂのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域に接続された成熟トランスグルタミナーゼの融合遺伝子を切り出し、アガロースゲル電気泳動により回収した。この断片を特開平９−３２２７７４記載のｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＴＧ３を構築した。
（２）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いての成熟トランスグルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドｐＶＫＴＧ３あるいはｐＰＫＴＧ３（両者ともにプロモーターとシグナルペプチドおよびＮ末端１４アミノ酸残基からなる遺伝子はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来で、成熟トランスグルタミナーゼ遺伝子はＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来）を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールあるいは２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＫＴＧ３あるいはｐＰＫＴＧ３を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールあるいは２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＭＭ液体培地で３０℃、４８時間培養した。培養終了後、１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８２−８７（１９９４）記載の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロットを行った。その結果、両菌株において培養上清に成熟トランスグルタミナーゼとほぼ同じ分子量を有する、分泌されたトランスグルタミナーゼを少量検出する事ができた。
実施例３：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドに結合したＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来のプロトランスグルタミーゼ融合遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌生産
（１）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子配列［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］を参考にして、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、そして配列番号２２に示したプライマーを合成した。実施例１（２）の方法により調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡから、配列番号１５と配列番号１９、あるいは配列番号１５と配列番号２０、あるいは配列番号１５と配列番号２１、あるいは配列番号１５と配列番号２２の組み合わせにより、ＰＳ２に相当するタンパク質のＮ末端側アミノ酸をそれぞれ３０、３１、４４、および６８残基コードする領域（シグナルペプチド３０アミノ酸残基を含む）とプロモーター領域を含む５’−上流域とをＰＣＲ法にて増幅した。
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、そして配列番号２２に示したプライマーはプロ構造部付きトランスグルタミナーゼとの融合遺伝子を構築するために、プロトランスグルタミナーゼのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000007
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１５，１９〜２２：ＰＣＲプライマー
一方、実施例１（１）で決定したトランスグルタミナーゼの遺伝子配列をもとに配列番号２３と配列番号１２に示したプライマーを合成し、実施例１（１）で取得したｐＵＩＴＧからプロトランスグルタミナーゼの遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000008
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１２，２３：ＰＣＲプライマー
次に、それぞれ増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸３０、３１、４４、および６８残基をコードする領域のＰＣＲ反応液各々１μｌと、やはり増幅させたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号１５と配列番号１２を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、それぞれＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域およびＮ末端側アミノ酸３０、３１、４４、および６８残基をコードするそれぞれの領域に接続されたプロトランスグルタミナーゼとの融合遺伝子、すなわち、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９表層タンパク質遺伝子のプロモーターに結合した異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子断片を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約１．８ｋｂから１．９ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、それぞれｐＶＫＰＴＧ１、ｐＶＫＰＴＧ２、ｐＶＫＰＴＧ３、そしてｐＶＫＰＴＧ４を得た。前述の方法に従って挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
また、ｐＶＫＰＴＧ１、ｐＶＫＰＴＧ２、ｐＶＫＰＴＧ３、そしてｐＶＫＰＴＧ４をＫｐｎＩとＸｂａＩを用いて消化することにより、約１．８ｋｂから１．９ｋｂのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸３０、３１、４４、および６８残基をコードするそれぞれの領域に接続されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子を切り出し、アガロースゲル電気泳動により回収した。これらの断片を特開平９−３２２７７４記載のｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＰＴＧ１、ｐＰＫＰＴＧ２、ｐＰＫＰＴＧ３、そしてｐＰＫＰＴＧ４を構築した。
（２）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いてのプロトランスグルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドｐＶＫＰＴＧ１、ｐＶＫＰＴＧ２、ｐＶＫＰＴＧ３、ｐＶＫＰＴＧ４、ｐＰＫＰＴＧ１、ｐＰＫＰＴＧ２、ｐＰＫＰＴＧ３、あるいはｐＰＫＰＴＧ４を用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールあるいは２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＫＰＴＧ１、ｐＶＫＰＴＧ２、ｐＶＫＰＴＧ３、ｐＶＫＰＴＧ４、ｐＰＫＰＴＧ１、ｐＰＫＰＴＧ２、ｐＰＫＰＴＧ３、あるいはｐＰＫＰＴＧ４を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールあるいは２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＭＭ液体培地でそれぞれ３０℃、４８時間培養した。培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８２−８７（１９９４）記載の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロットを行った。その結果、ｐＶＣ７あるいはｐＰＫ４のどちらのベクターでも、ほぼ同量のプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの分泌が確認されたが、ＰＳ２に相当するタンパク質の成熟タンパク質のＮ末端側アミノ酸残基の長さに応じて分泌量に有意な差違が認められた。代表的な分泌量を表１に示した。
0004362651.tif 000009
実施例４：コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２）の細胞表層タンパク質のシグナル配列、およびＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来のプロトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する融合遺伝子を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌生産
（１）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）の構築
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）の遺伝子配列［特開平１０−１０８６７５］を参考にして配列番号２４と配列番号２５に示したプライマーを合成し、常法に従って調製したＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの染色体ＤＮＡから細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸２５残基（シグナルペプチド）をコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。また配列番号２５に示したプライマーはプロトランスグルタミナーゼとの融合遺伝子を構築するために、プロトランスグルタミナーゼのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000010
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号２４，２５：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸２５残基をコードする領域のＰＣＲ反応液１μｌと、実施例３（１）で増幅させたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号２４と配列番号１２を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＮ末端側アミノ酸２５残基をコードする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により、約１．７ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、ｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによってｐＶＳＰＴＧ１を得た。
（２）プロモーター領域の変換；Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーターとの結合
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子配列［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］を参考にして配列番号１５と配列番号２６に示したプライマーを合成した。実施例１（２）の方法により調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域をＰＣＲ法にて増幅した。また配列番号２６に示したプライマーはＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ遺伝子との融合遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）を構築するために、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列のＮ末端側アミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000011
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１５、２６：ＰＣＲプライマー
一方、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ遺伝子との融合遺伝子配列をもとに配列番号２７と配列番号１２に示したプライマーを合成し、実施例４（１）で取得したｐＶＳＰＴＧ１からＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000012
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１２，２７；ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域のＰＣＲ反応液１μｌと、やはり増幅させたＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号１５と配列番号１２を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域を有する、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のＮ末端側アミノ酸２５残基をコードする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により約１．８ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによってｐＶＫＳＰＴＧ１を得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
また、ｐＶＫＳＰＴＧ１をＫｐｎＩとＸｂａＩを用いて消化することにより、約１．８ｋｂのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域を有する、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のＮ末端側アミノ酸２５残基（シグナルペプチド）をコードする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）を切り出し、アガロースゲル電気泳動により回収した。この断片を特開平９−３２２７７４記載のｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＳＰＴＧ１を構築した。プラスミドｐＶＫＳＰＴＧ１およびｐＰＫＳＰＴＧ１はともに、プロモーターはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子に由来し、シグナルペプチドはＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのＳｌｐＡに由来し、プロトランスグルタミナーゼはＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅに由来する遺伝子で構成されている。
（３）Ｅ．ｃｏｌｉのｔａｃプロモーターへの変換
Ｅ．ｃｏｌｉのｔａｃプロモーターがクローン化されているプラスミドｐＫＫ２２３−３（アマシャムファルマシア社製）の配列を参考にして配列番号２８と配列番号２９に示したプライマーを合成した。ｐＫＫ２２３−３のＤＮＡからｔａｃプロモーターに相当する領域をＰＣＲ法にて増幅した。また配列番号２９に示したプライマーはＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ遺伝子との融合遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）を構築するために、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列のＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000013
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号２８、２９：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたｔａｃプロモーターに相当する領域のＰＣＲ反応液１μｌと、実施例４（２）で増幅させたＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号２８と配列番号１２を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、ｔａｃプロモーターを有する、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のＮ末端側アミノ酸２５残基をコードする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子（異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子）を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により、約１．５ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによってｐＶＴＳＰＴＧ１を得た。前述の方法に従って挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
また、ｐＶＴＳＰＴＧ１をＫｐｎＩとＸｂａＩを用いて消化することにより、約１．５ｋｂのｔａｃプロモーターを有する、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のＮ末端側アミノ酸を２５残基コードする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遺伝子を切り出し、アガロースゲル電気泳動により回収した。この断片を特開平９−３２２７７４記載のｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＴＳＰＴＧ１を構築した。プラスミドｐＶＴＳＰＴＧ１およびｐＰＴＳＰＴＧ１はともに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｔａｃプロモーター、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのＳｌｐＡに由来するシグナルペプチド、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅに由来するプロトランスグルタミナーゼ遺伝子で構成されている。
（４）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いてのプロトランスグルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドｐＶＫＳＰＴＧ１、ｐＶＴＳＰＴＧ１、ｐＰＫＳＰＴＧ１、ｐＰＴＳＰＴＧ１を用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールあるいは２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に選択したｐＶＫＳＰＴＧ１、あるいはｐＶＴＳＰＴＧ１、ｐＰＫＳＰＴＧ１、ｐＰＴＳＰＴＧ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールあるいは２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＭＭ液体培地でそれぞれ３０℃にて４８時間培養した。培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８２−８７（１９９４）記載の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロットを行った。その結果、ｐＶＣ７あるいはｐＰＫ４のどちらのベクターでも、ほぼ同量のプロトランスグルタミナーゼの分泌が確認された。代表的な分泌量を表２に示した。
0004362651.tif 000014
実施例５：Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列、およびＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来のプロトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する融合遺伝子を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌生産
（１）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列、およびＳ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来のプロトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する融合遺伝子の構築
Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２のトランスグルタミナーゼ遺伝子の配列は既に決定されている（特願平１１−２９５６４９）。アミノ酸配列の１番目から３２番目までがプレ部分の配列、３３番目から８６番目までがプロ部分の配列、８７番目から４１６番目までが成熟型トランスグルタミナーゼの配列であると推定されている。この塩基配列とコードされる全アミノ酸配列を配列番号３０および３１に示す。
また当該遺伝子を含むプラスミドｐＵＪ−ＭＴＧで形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＪ１３６６９は、１９９９年１０月１４日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１７６０２として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託してあり、２０００年８月２８日付けでブダペスト条約に基づく寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８７が付与されている。
まずｐＵＪ−ＭＴＧより制限酵素ＢａｍＨＩでプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子の全長をカバーする領域約３．５Ｋｂを切り出し、これをｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入したｐＵＣＳＣＴＧを作製した。
ｐＵＣＳＣＴＧを鋳型として、配列番号３２と配列番号３３に示したプライマーを合成し、Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来のプロトランスグルタミナーゼを含む遺伝子領域をこれまでと同じようにＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000015
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３２，３３：ＰＣＲプライマー
次に、実施例４（２）で構築したｐＰＫＳＰＴＧ１を鋳型として、配列番号３４と配列番号３５の組み合わせにより、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列を含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。
配列番号３５に示したプライマーはＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来のプロトランスグルタミナーゼとの融合遺伝子を構築するために、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来のプロトランスグルタミナーゼのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000016
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３４，３５：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＳ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来のプロトランスグルタミナーゼを含む遺伝子をコードする領域のＰＣＲ反応液１μｌと、やはり増幅させたＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列を含む領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号３４と配列番号３３を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列に接続された異種融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子断片を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により、約１．８ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ消化した後、アガロースゲルから回収し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによって、ｐＵＫＳＰＴＧ２’を得た。前述した方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。このｐＵＫＳＰＴＧ２’をＥｃｏＲＩで消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）で平滑末端化し、５’−末端がリン酸化された５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧ−３’の配列を持つＸｂａＩリンカー（宝酒造社製）を挿入し、再環状化しｐＵＫＳＰＴＧ２を構築した。ｐＵＫＳＰＴＧ２をＸｂａＩを用いて消化することにより、約１．８ｋｂの融合プレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子（プロトランスグルタミナーゼ遺伝子はＳ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来）を切り出し、アガロースゲル電気泳動により回収した。これらの断片を前述のｐＰＫ４のＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＳＰＴＧ２を構築した。
次にプロ構造部のＮ末端側の一部がＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのプロ構造部に置き替わったキメラプロ構造部を有するプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子の構築を行なった（成熟型トランスグルタミナーゼ遺伝子とプロ構造部の一部はＳ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来）。
まず実施例４（２）で構築されているプラスミドｐＰＫＳＰＴＧ１（Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来のプロトランスグルタミナーゼ発現用）より、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩの約１．８ｋｂのプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を含む断片を切り出し、ｐＵＣ１９のＥｃＯＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した（ｐＵＫＳＰＴＧ１）。ｐＵＫＳＰＴＧ１をＡａｔＩＩ消化して約１．２ｋｂの断片を切り出すと共に、ｐＵＫＳＰＴＧ２’についてもＡａｔＩＩ消化して約１．２ｋｂ断片を除去した約３．３ｋｂの断片を調製した。この約３．３ｋｂの断片とｐＵＫＳＰＴＧ１由来の約１．２ｋｂのＡａｔＩＩ断片とをライゲイションし、常法の遺伝子操作法に基づき、ＡａｔＩＩ断片の挿入されたクローンを選択した。その中でＡａｔＩＩ断片の挿入された方向を知るために順次シークエンスを行ない、目的の方向（プレプロトランスグルタミナーゼがコードされている）に挿入されたものを選択した（ｐＵＫＳＰＴＧ３’）。
さらにｐＵＫＳＰＴＧ３’についても先にｐＵＫＳＰＴＧ２’で行なったと同じようにそのＥｃｏＲＩ部位を平滑末端化し、ＸｂａＩリンカーを挿入し、ｐＵＫＳＰＴＧ３を構築した。さらにｐＵＫＳＰＴＧ３よりＸｂａＩの約１．８ｋｂ断片を切り出し、ｐＰＫ４のＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＳＰＴＧ３を構築した。
（２）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いてのＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来プロトランスグルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドｐＰＫＳＰＴＧ２およびｐＰＫＳＰＴＧ３を用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＰＫＳＰＴＧ２およびｐＰＫＳＰＴＧ３を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース  ６０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．４ｇ、硫酸アンモニウム  ３０ｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、硫酸鉄七水和物  ０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物  ０．０１ｇ、チアミン塩酸塩  ４５０μｇ、ビオチン  ４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ、炭酸カルシウム  ５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）でそれぞれ３０℃、３日間培養した。培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、前述の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロット解析を行った。本抗体はＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来のトランスグルタミナーゼに対する抗体であるが、Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ由来のトランスグルタミナーゼに対しても反応性を示した。その結果、プロ構造部付きＳ．ｃｉｎｎａｍｏｎｉｅｕｍ  ＩＦＯ１２８５２由来トランスグルタミナーゼの分泌が確認された（約３０〜５０ｍｇ／Ｌ）。
実施例６：セリンプロテアーゼ（ＳＡＭＰ４５）遺伝子のクローン化と発現プラスミドの作製評価
（１）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するプロ構造部付きセリンプロテアーゼ（ＳＡＭＰ４５）遺伝子（異種融合プレプロセリンプロテアーゼ（ＳＡＭＰ４５）遺伝子）の構築
Ｓ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓの産生するセリンプロテアーゼであるＳＡＭＰ４５の遺伝子の配列は既に決定されている［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４３０−４３８（１９９７）］。この配列を参考にして配列番号３６と配列番号３７に示したプライマーを合成し、ＳＡＭＰ４５のＮ末端プロ構造、成熟ＳＡＭＰ４５、そしてＣ末端プロ構造を含む遺伝子領域を先に述べた同じ方法に従いＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000017
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３６，３７：ＰＣＲプライマー
次に、実施例４（２）で構築したｐＰＫＳＰＴＧ１を鋳型として、配列番号３８と配列番号３９の組み合わせにより、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡ遺伝子のシグナル配列を含む領域を同じくＰＣＲ法にて増幅した。
配列番号３９に示したプライマーはプロ構造部付きセリンプロテアーゼとの融合遺伝子を構築するために、プロセリンプロテアーゼのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000018
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３８，３９：融合プレプロセリンプロテアーゼ遺伝子構築のためのＰＣＲプライマー
次に、それぞれ増幅させたＳＡＭＰ４５のＮ末端プロ構造、成熟ＳＡＭＰ４５、そしてＣ末端プロ構造を含む遺伝子をコードする領域のＰＣＲ反応液各々１μｌと、やはり増幅させたＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡ遺伝子のシグナル配列を含む領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号３８と配列番号３７を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列に接続された異種融合プレプロセリンプロテアーゼ遺伝子断片を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により、約３．９ｋｂの増幅断片を検出した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約３．９ｋｂの断片をアガロースゲルから回収し、前述のｐＶＣ７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、それぞれｐＶＳＳ１を得た。先に述べた方法に従って挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融命遺伝子が構築されていることを確認した。
（２）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いてのセリンプロテアーゼの分泌
構築したプラスミドｐＶＳＳ１を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＳＳ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む上記ＭＭＴＧ液体培地で３０℃、７０時間培養した。この培養液１ｍｌを遠心分離により培養上清と菌体に分離した。菌体は０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。セリンプロテアーゼの活性測定は以下のようにして行った。０．２５ｍＭのＢｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（バッケム社製）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、培養上清あるいは菌体懸濁液５０μｌを加え、総液量０．６ｍｌで３０℃、２０分間反応させた後、５０％酢酸を０．４ｍｌ加えて反応を停止させた。４１０ｎｍの吸光度を測定し、遊離したｐＮＡ（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）の量を算出することにより活性を決定した。なお、酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのｐＮＡを遊離させる酵素量とした。その結果、培養上清にはセリンプロテアーゼの活性は検出されず、菌体懸濁液に活性を検出することができた。検出された活性値と文献［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４３０−４３８（１９９７）］による比活性値（１．９６ｕ／ｍｇ）から計算した結果、約９ｍｇ／ｌ相当のセリンプロテアーゼが菌体表面に分泌発現していることが確認された。
実施例７：プロリン特異的ペプチダーゼ（ｓｖＰＥＰ）遺伝子のクローン化と発現プラスミド作製評価
（１）Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９の生産するプロリン特異的ペプチダーゼ（ｓｖＰＥＰ）の精製とＮ末端アミノ酸配列解析
ＩＳＰ２液体培地（酵母エキストラクト  ４ｇ、マルトエキストラクト  １０ｇ、グルコース  ４ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．３に調整）を５Ｌ坂口フラスコに８００ｍＬ張り込み、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９株をプレートより植菌して３０℃で４８時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。
培養液を遠心分離し、培養上清を除いて菌体を回収した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液で洗浄後、得られた菌体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。氷上で４時間振盪後、遠心分離により得られた上清を回収した。ニトロセルロースフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社製）を用いて濾過滅菌後、ＦＰＬＣ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラム（１．６φ×１０ｃｍ）に通し、同緩衝液中、硫酸アンモニウム１．５−０  Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性成分を含有する画分を回収し、さらに同条件でＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（１ｍＬ、Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に通し、活性画分を回収し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩、４℃で透析した。これにより、部分精製酵素液を得た。
部分精製酵素液を逆相クロマトグラフィーにかけてさらに純化精製した。逆相クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣ装置：  ポンプ：ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−６３００、検出器：Ｌ−４０００Ｈ
カラム：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ４  ２１４ＴＰ５４１０（ＶＹＤＡＣ社製）
溶出条件：２４−４０％アセトニトリル直線勾配／０．１％トリフルオロ酢酸
（２０ｍｉｎ）室温にて溶出
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２８０ｎｍ
上記条件で純化した酵素試料をメンブランカートリッジ（パーキンエルマー社製）を用いてＰｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ−ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜に転写し、気相プロテインシークエンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）にてＮ末端アミノ酸配列を解析した。その結果、配列番号４０に示した２０残基のＮ末端アミノ酸部分配列が得られた。
0004362651.tif 000019
（２）Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９由来プロリン特異的ペプチダーゼ（ｓｖＰＥＰ）遺伝子の取得
決定したｓｖＰＥＰのＮ末端２０アミノ酸配列から推定される塩基配列中で縮重の少ない部位Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号４１）を選び配列番号４２に示した合成オリゴヌクレオチドを作製した。この合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、常法に従って調製したＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡを、６塩基配列を認識する種々の制限酵素で消化し、サザンブロットハイブリダイゼーション法により解析したところ、ＳａｃＩ切断により約６ｋｂの単一バンドが検出された。そこで、先の方法により調製したＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ  ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡをＳａｃＩで消化し、約６ｋｂの断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガローズゲル電気泳動により回収した。回収断片をｐＵＣ１８のＳａｃＩ部位に挿入した後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）のコンピテントセルに導入し、ライブラリーを作製した。作製したライブラリーを、配列番号３８に示した合成オリゴヌクレオチドの３２Ｐラベル化物をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションにより、ライブラリーのスクリーニングを行い、ｓｖＰＥＰ遺伝子断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株をスクリーニングし、目的とする遺伝子を取得した。この菌株より回収したプラスミドをｐＵＭＰ１と名付けた。
0004362651.tif 000020
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４２：ｓｖＰＥＰ用のプローブ
ｐＵＭＰ１としてクローン化した断片の塩基配列を決定した。この遺伝子にコードされるアミノ酸配列を推定したところ、先に精製酵素タンパク質より決定したＮ末端部分アミノ酸配列（２０残基）を見出し、配列番号９に示したようなｓｖＰＥＰのシグナル配列およびプロ構造と想定される領域を含む全アミノ酸の一次配列を決定した。アミノ酸配列１〜２５番目までがシグナル配列であり、２６〜３３番目までがプロ構造部であり、アミノ酸配列３４〜４７７番目までが成熟型ｓｖＰＥＰと推定される。
ｐＵＭＰ１で形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＪ１３６９１をＦＥＲＭ  ＢＰ−７１６０として、２０００年５月１５日付けでブダペスト条約に基づき通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託してある。
（３）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するプロ構造部付きプロリン特異的ペプチダーゼ（ｓｖＰＥＰ）遺伝子（異種融合プレプロプロリン特異的ペプチダーゼ（ｓｖＰＥＰ）遺伝子）の構築
実施例７（２）で決定したｓｖＰＥＰの配列を参考にして、実施例７（２）で構築したｐＵＭＰ１を鋳型として、配列番号４３と配列番号４４に示したプライマーを合成し、ｓｖＰＥＰのプロ構造、そして成熟ｓｖＰＥＰを含む遺伝子領域をこれまでと同じ方法でＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000021
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４３，４４：ＰＣＲプライマー
次に、実施例４（２）で構築したｐＰＫＳＰＴＧ１を鋳型として、配列番号３８と配列番号４５の組み合わせにより、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡ貴伝子のシグナル配列を含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。
配列番号４５に示したプライマーはプロ構造部付きｓｖＰＥＰとの融合遺伝子を構築するために、ｓｖＰＥＰのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000022
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３８，４５：ＰＣＲプライマー
次に、それぞれ増幅させたｓｖＰＥＰのプロ構造、そして成熟ｓｖＰＥＰを含む遺伝子をコードする領域のＰＣＲ反応液各々１μｌと、やはり増幅させたＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列を含む領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号３８と配列番号４４を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列に接続された異種融合プレプロｓｖＰＥＰ遺伝子断片を増幅させた。
0004362651.tif 000023
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３８，４４：ＰＣＲプライマー
アガロースゲル電気泳動により、約２．１ｋｂの増幅断片を検出した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２．１ｋｂの断片をアガロースゲルから回収し、実施例６（１）記載のｐＶＳＳ１のＨｉｎｄＩＩ１部位に挿入することによって、それぞれｐＶＳＳＳＰ１を得た。常法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
（４）Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いてのプロリン特異的ペプチダーゼの分泌
構築したプラスミドｐＶＳＳＳＰ１を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＳＳＳＰ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む上記ＭＭＴＧ液体培地で３０℃、７０時間培養した。この培養液１ｍｌを遠心分離により培養上清と菌体に分離した。菌体は０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。ｓｖＰＥＰの活性測定は以下のようにして行った。０．２５ｍＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（バッケム社製）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、培養上清あるいは菌体懸濁液５０μｌを加え、総液量０．６ｍｌで３０℃、２０分間反応させた後、５０％酢酸を０．４ｍｌ加えて反応を停止させた。４１０ｎｍの吸光度を測定し、遊離したｐＮＡの量を算出することにより活性を決定した。なお、酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのｐＮＡを遊離させる酵素量とした。その結果、培養上清にはｓｖＰＥＰの活性は検出されず、菌体懸濁液に活性を検出することができた。検出された活性値と実施例７（１）による比活性値（３５．５ｕ／ｍｇ）から計算した結果、約５０ｍｇ／ｌ相当のｓｖＰＥＰが菌体表面に分泌発現していることが確認された。
（５）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９において分泌発現されたセリンプロテアーゼとプロリン特異的ペプチダーゼによるプロ構造部付きトランスグルタミナーゼのプロ構造部の切断
構築したプラスミドｐＶＳＳＳＰ１を用いて、実施例４（２）に記載したプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの分泌発現プラスミドｐＰＫＳＰＴＧ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＳＳＳＰ１及びｐＰＫＳＰＴＧ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＭＭＴＧ液体培地で３０℃、７０時間培養した。培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、前述の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従って、ウエスタンブロット解析を行った。その結果ＳＡＭＰ４５およびｓｖＰＥＰが正常に分泌発現し、やはり分泌されているプロ構造部付きトランスグルタミナーゼのプロ構造部が切断され、天然型の成熟トランスグルタミナーゼとほぼ同じ分子量を有するトランスグルタミナーゼの分泌が認められた。
この培養上清について前述のハイドロキサメート法にてトランスグルタミナーゼ活性を確認したところ、天然型とほぼ同じ比活性（約２０Ｕ／ｍｇ）を有する事が確認できた。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、前述の方法に従って、ＰＶＤＦ膜にセミドライブロッティングした。ブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をクマシーブリリアントブルーで染色し、脱染、風乾した。成熟トランスグルタミナーゼの部分を切り取り、プロテインシークエンサーでＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。その結果、配列番号６に示したＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来の７７番目のＡｓｐから始まる天然型の成熟トランスグルタミナーゼと同一のＮ末端を有する配列を取っていることが確認された。
実施例８：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列、およびヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）をコードする配列を有する融合遺伝子を用いたヒト上皮細胞増殖因子の分泌生産
（１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するｈＥＧＦ遺伝子の構築
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子の配列は既に決定されている［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］。この配列を参考にして配列番号４６と配列番号４７に示したプライマーを合成し、斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．，７２，６１９（１９６３）］により調製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。配列番号４６に示したプライマーは５’端側にプラスミドへ挿入するために必要な制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を含んでいる。
0004362651.tif 000024
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４６，４７：ＰＣＲプライマー
一方、配列番号４８と配列番号４９に示したプライマーを合成し、ｈＥＧＦ遺伝子の配列を含んでいるプラスミドｐＴ１３ＳΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｈＥＧＦ（Ｈ３）（特開昭６４−２５８３）からｈＥＧＦをコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。また当該遺伝子を含むプラスミドｐＴ１３ＳΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｈＥＧＦ（Ｈ３）を形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＪ１２３５４はＦＥＲＭ  Ｐ−９７１９として、昭和６２年１１月２０日に、現  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に原寄託され、平成１４年３月１８日付けで同センターにおいてブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６６が付与されている。
配列番号４８に示したプライマーはＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域との融合遺伝子を構築するためにＰＳ２のシグナル配列Ｃ末端側のアミノ酸をコードする遺伝子配列を含んでいる。
0004362651.tif 000025
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４８，４９：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域のＰＣＲ反応液１μｌと、やはり増幅させたｈＥＧＦの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号４６と配列番号４９を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域に接続されたｈＥＧＦの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ（宝酒造社製）により切断し、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により精製し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＥＧＦを得た。ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７７Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
（２）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するｈＥＧＦ遺伝子の構築
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）の配列［特開平１０−１０８６７５］を参考にして配列番号２４と配列番号５０に示したプライマーを合成し、実施例８（１）記載の方法により調製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの染色体ＤＮＡから細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を２５残基コードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。また配列番号５０に示したプライマーはｈＥＧＦとの融合遺伝子を構築するために、ｈＥＧＦのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
0004362651.tif 000026
＜配列表フリーテキスト＞
配列２４，５０：ＰＣＲプライマー
一方、配列番号５１と配列番号４９に示したプライマーを合成し、ｈＥＧＦ遺伝子の配列を含んでいるプラスミドｐＴ１３ＳΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｈＥＧＦ（Ｈ３）（特開昭６４−２５８３）からｈＥＧＦをコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。
0004362651.tif 000027
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４９，５１：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を２５残基コードする領域のＰＣＲ反応液１μｌと、ｈＥＧＦ遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号４９と配列番号２４を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を２５残基コードする領域に接続されたｈＥＧＦの融合遺伝子を増幅させた。
さらに、配列番号５２と配列番号５３に示したプライマーを合成し、実施例８（１）により作製したプラスミドｐＰＫＥＧＦを鋳型としてＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域をＰＣＲ法にて増幅した。また配列番号５３に示したプライマーはＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域の３’側の配列とＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列Ｎ末端側アミノ酸をコードする配列を含んでいる。
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＜配列表フリーテキスト＞
配列番号５２、５３：ＰＣＲプライマー
一方、先にＰＣＲで増幅したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）の５’−上流域を含むシグナル配列を有するｈＥＧＦ遺伝子との融合遺伝子の配列をもとに、配列番号５４と配列番号４９に示したプライマーにより、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するｈＥＧＦの遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いており、反応条件はこれのプロトコールに従った。
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＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４９，５４：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域のＰＣＲ反応液１μｌと、やはり増幅させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のシグナル配列を有するｈＥＧＦの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号５２と配列番号４９を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域と、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質（ＳｌｐＡ）のＮ末端側アミノ酸を２５残基コードする領域に接続されたｈＥＧＦの融合遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いており、反応条件はこれのプロトコールに従った。アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ（宝酒造社製）により切断し、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）により精製した。これを特開平９−３２２７７４記載のプラスミドｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによって、ｐＰＳＥＧＦを得た。ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７７Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
（３）ｈＥＧＦ生産株の作製
（２）で作製したｈＥＧＦ発現プラスミドｐＰＳＥＧＦを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９をエレクトロポレーション法により形質転換し、カナマイシン耐性株を取得した。得られた株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース  ６０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．４ｇ、硫酸アンモニウム  ３０ｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、硫酸鉄七水和物  ０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物  ０．０１ｇ、チアミン塩酸塩  ４５０μｇ、ビオチン  ４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン  ０．１５ｇ、炭酸カルシウム  ５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）でそれぞれ３０℃、３日間振とう培養した。菌体を遠心除去した培養上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。市販ｈＥＧＦ（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨＥＣ  ＬＴＤ）を標準品として同時に泳動し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った結果、同移動度の位置にバンドを検出した。培養上清中に他の不純タンパク質はほとんど検出されなかった。
（４）プラスミドｐＰＳＥＧＦを有するｈＥＧＦ生産株のｈＥＧＦ生産量の測定  ｈＥＧＦ生産株の培養上清をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−ＡＰ２０３Ｃａ３００Ａ．Ｃ１８，粒径５μｍ，径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）、バッファー０．１％ＴＦＡ／２４％アセトニトリル，０．１％ＴＦＡ／４４％アセトニトリル、１％／ｍｉｎリニアグラジエント、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍで分析しｈＥＧＦの標準品を分析した時のピーク面積との比較により定量を行った結果、およそ１００ｍｇ／Ｌであった。
（５）プラスミドｐＰＳＥＧＦを有するｈＥＧＦ生産株により分泌されたｈＥＧＦの生物活性測定
ｈＥＧＦ生産株の培養上清中ＥＧＦ活性を測定した。ＭＣＦ−７細胞（Ａ．Ｖ．Ｋｒｉｓｈｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，１０９９−１１０７，１９９１）を９６穴プレートに１穴あたり初発細胞数１×１０４個まき、ＥＧＦ生産株の培養上清の２倍希釈列を添加した。７２時間培養後のチミジンの取りこみ量を測定した。市販のｈＥＧＦ標準品（フナコシ）１０７Ｕ／ｍｇと比較し活性値を算出した結果、１．４×１０９Ｕ／ｍｌであった。
（６）プラスミドｐＰＳＥＧＦを有するｈＥＧＦ生産株により分泌されたｈＥＧＦのＮ末端アミノ酸配列の解析
ｈＥＧＦ生産株の培養上清１２０μｌをＨＰＬＣカラムにかけ、ＨＰＬＣによる定量に記載した条件で分離した。そして、ｈＥＧＦ標準品の溶出位置と一致するピークを分取した。このサンプルをＮ末端アミノ酸解析に供した。測定は気相アミノ酸シークエンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所）を用いた。測定結果は、Ｎ末端より１残基目Ａｓｎ、２残基目Ｓｅｒ、３残基目Ａｓｐ、４残基目Ｓｅｒであった。この結果は、配列番号５５に記載したｈＥＧＦのアミノ酸配列のＮ末端配列と一致した。
（７）プラスミドｐＰＳＥＧＦを有するｈＥＧＦ生産株により分泌されたｈＥＧＦの分子量測定
ｈＥＧＦ生産株の培養上清１２０μｌをＨＰＬＣカラムにかけ、ＨＰＬＣによる定量に実（４）に記載した条件で分離した。
そして、溶出されたｈＥＧＦのピークを分取した。このサンプルをさらに再度、同ＨＰＬＣにより分取を行ない、ＨＰＬＣにおいて１ピークであることを確認した。このサンプルを分子量分析に供した。測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計）ＭＡＬＤＩ  ＩＶ（島津製作所）を用いて行った。２回の測定値の平均は６１７６であり、この結果は、ｈＥＧＦの分子量、すなわち分子内に３つのＳ−Ｓ結合が存在するとして計算された理論値６２１７と誤差範囲内であった。従って、上記記載の方法で作製されたＥＧＦ生産株の分泌しているｈＥＧＦが予想されたアミノ酸配列と構造を有していることが確認された。
実施例９：異種タンパク質分泌能の向上したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６およびＡＪ１２０３６より細胞表層タンパク質（ＰＳ２）遺伝子破壊株の作製とこれらの変異株を用いる異種タンパク質の分泌生産評価
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６より細胞表層タンパク質（ＰＳ２）遺伝子破壊株の作製
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９より既にストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性株ＡＪ１２０３６が育種されており、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでの遺伝子組換え用の一つの宿主として使用されている（米国特許第４，８２２，７３８号）。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（旧名称Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＪ１２０３６は昭和５９年３月２６日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４として、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
ＡＪ１２０３６株は細胞表層タンパク質（ＰＳ２）を少量、培地中に分泌していることが確認されたので、完全にＰＳ２を生成しないように遺伝子破壊を行なえばタンパク質の分泌効率をさらに向上させることができるのではないかと考えられる。そこで以下のようにＰＳ２遺伝子完全欠損株の造成を相同組換え法を用いて行なった。
斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３）］により調製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡから、下記に示したプライマーを合成し、配列番号５６と５７、配列番号５８と５９の組み合わせでＰＣＲを行なった。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子配列は米国特許第５，５４７，８６４号に記載されており、またコーディング領域の一部およびその５’上流域の遺伝子配列は配列番号４に示されている。
次に増幅したそれぞれの断片と配列番号５６と５９のプライマーの組み合わせでＣｒｏｓｓｏｖｅｒ−ＰＣＲを行ない、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域およびコーデイング領域のＮ末端側を欠損させたΔＰＳ２断片を増幅させた。この断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローン化し、ｐＵΔＰＳ２を構築した。ｐＵΔＰＳ２をＫｐｎＩとＸｂａＩ消化してΔＰＳ２断片を切り出し、プラスミドｐＨＭ１５１９由来の温度感受性プラスミドベクターであるｐＨＳ４（米国特許第５，６１６，４８０号）のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することにより、ｐＨＳΔＰＳ２を構築した。プラスミドｐＨＳ４で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＪ１２５７０はＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２３として、平成２年１０月１１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
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＜配列表フリーテキスト＞
配列番号５６〜５９：ＰＣＲプライマー
次にｐＨＳΔＰＳ２をＡＪ１２０３６株にエレクトロポレーションにより導入し、日本特許登録２７６３０５４に記載した相同組換え法によりＰＳ２遺伝子完全欠損株を取得した。本株をＹＤＫ０１０株と命名した。
（２）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６およびＡＪ１２０３６よりの細胞表層タンパク質（ＰＳ２）遺伝子破壊株を用いる異種タンパク質の分泌生産評価
ＡＪ１２０３６株とＹＤＫ０１０株にプロトランスグルタミナーゼ分泌発現プラスミドである実施例４（２）のｐＰＫＳＰＴＧ１を導入し、形質転換体を得た。これらの形質転換体とｐＰＫＳＰＴＧ１を野生株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９に導入したものを対照として、分泌生産量について比較評価した。
同様にＳＡＭＰ４５分泌発現プラスミドｐＶＳＳ１、ｓｖＰＥＰ分泌発現プラスミドｐＶＳＳＳＰ１、および、ｈＥＧＦ分泌発現プラスミドｐＰＳＥＧＦについてもそれぞれＡＪ１２０３６株とＹＤＫ０１０株の形質転換体を得て、分泌生産量を評価した。
２．５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で３０℃で一晩生育した菌株をＭＭＴＧ培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ６０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １．５ｇ／Ｌ，ＶＢ１・ＨＣｌ  ４５０μｇ／Ｌ，Ｂｉｏｔｉｎ  ４５０μｇ／Ｌ，ＤＬ−Ｍｅｔ  ０．１５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．５）にＣａＣＯ３  ５％およびカナマイシン２５μｇ／ｍｌを添加した培地の４ｍｌを張り込んだ大型試験管に接種し、３０℃、３日間行なった。
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その結果、表３〜６に示したように宿主を野生株よりストレプトマイシン耐性株ＡＪ１２０３６に変更することにより大幅なプロトランスグルタミナーゼ、ＳＡＭＰ４５、ｓｖＰＥＰおよびｈＥＧＦの分泌生産量の改善が認められた。しかしＡＪ１２０３６株から細胞表層タンパク質（ＰＳ２）遺伝子を完全欠損することによる分泌生産量の向上効果はわずかに認められたに過ぎなかった。ＰＳ２の分泌によるプロトランスグルタミナーゼおよびｈＥＧＦの分泌への拮抗によるマイナス効果はこの場合には顕著には認められなかった。ただし、ＰＳ２遺伝子完全欠損株ではＰＳ２の分泌が全く認められないことより、培地中の不要夾雑タンパク質の低減化には寄与しており、プロトランスグルタミナーゼおよびｈＥＧＦの精製過程でのメリットがある。
実施例１０：プロトランスグルタミナーゼ分泌に対する培養有効因子
先のｐＰＫＳＰＴＧ１でＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０株を形質転換した組換え体を用いて、プロトランスグルタミナーゼの分泌生産における培養条件検討を行なった。
２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で３０℃で一晩生育した菌株をＣＭ２Ｓ液体培地の２０ｍｌを含む５００ｍｌ容の坂口フラスコに接種し、３０℃で一晩培養した。これをシードとして用いた。
メイン培養として、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ６０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １．５ｇ／Ｌ，ＶＢ１・ＨＣｌ  ４５０μｇ／Ｌ，Ｂｉｏｔｉｎ  ４５０μｇ／Ｌ，ＤＬ−Ｍｅｔ  ０．１５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．５）を基本培地としてＳ型ジャー培養にてＣａＣｌ２の添加効果を検討した。培地の３００ｍｌを張り込み、シード量は５％（１５ｍｌ）とし、溶存酸素濃度３％以下に抑制して、３０℃、３日間培養を行なった。
培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、上記記載の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロット解析を行った。その結果、表７に示すようにＣａＣｌ２を添加した培養区は無添加の区に比し、約１．３倍〜２倍の分泌量を示し、カルシウムの添加効果が認められた。
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さらに上記ＭＭＴＧ培地にＣａＣｌ２の２．０ｇ／Ｌを含む培地を用いて、通気攪拌条件を検討した結果、培地中の溶存酸素濃度を測定限界である３％以下に抑制することの方が良好との結果を得た（表８）。
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本発明により、コリネバクテリウム属細菌に有用タンパク質、例えばトランスグルタミナーゼやヒト上皮細胞成長因子等の異種タンパク質を多量に産生させ、かつ効率よく菌体外に分泌させることができる。本発明によって生産されるタンパク質は培地中に放出されるため、既知の適切な方法により、簡便かつ大規模に培地から直接回収することができる。
本発明により、コリネ型細菌に産業上有用な異種タンパク質、例えばトランスグルタミナーゼやヒト上皮細胞成長因子を生産させ、これを効率的に菌体外に放出（分泌生産）させることによって、異種タンパク質を製造する方法が提供される。
【配列表】
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