(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個含有してなるポリペプチド（Ｂ）を有する培養基材と、サイトカイン（Ｃ）を有する培地とを用いて未成熟肥満細胞（Ｄ）を成熟肥満細胞（Ａ）へ分化誘導する工程を含むことを特徴とする成熟肥満細胞（Ａ）の生産方法であって、（Ｂ）が１分子中にＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）9配列（１０）とを各々１３個有する数平均分子量１１万のポリペプチド又は１分子中にＩｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）9配列（１０）とを各々７個有する数平均分子量９万のポリペプチドであり、（Ｃ）がＩＬ−３とＳＣＦとの組み合わせ及び／又はＩＬ−４とＳＣＦとの組み合わせである成熟肥満細胞（Ａ）の生産方法。
【請求項２】
成熟肥満細胞（Ａ）が、骨髄液中の未成熟肥満細胞（Ｄ）から分化させた成熟肥満細胞である請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
ポリペプチド（Ｂ）の含有割合が、培養基材の培養表面積１００ｃｍ2あたり、０．１μｇ以上１００ｍｇ以下である請求項１又は２に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、成熟肥満細胞の生産方法に関する。さらに詳しくは未成熟肥満細胞を成熟肥満細胞に分化誘導して成熟肥満細胞を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
未成熟肥満細胞を分化誘導する方法として、臍帯（さいたい）血単核球中の未成熟肥満細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びインターロイキン−６を含有する培地中で培養した後、初代皮膚線維芽細胞を単層培養した面の上でＳＣＦ存在下に培養する方法が知られている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１１−１９９６００号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この方法によると、臍帯血単球細胞を６週間培養した後に初代皮膚線維芽細胞との共生培養へ植え替えて、さらに２ヶ月間培養が必要であり、臍帯血の採取から成熟細胞を得るまでに最低でも３．５ヶ月間必要であり、このような煩雑な操作と長い培養期間が大きな問題でであった。
すなわち、本発明の目的は、簡単な操作かつ短期間に成熟肥満細胞を生産する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドを有する培養基材と、サイトカインを有する培地を用いることにより上記の目的を達成し得ることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の成熟肥満細胞（Ａ）の生産方法の特徴は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個含有してなるポリペプチド（Ｂ）を有する培養基材と、サイトカイン（Ｃ）を有する培地とを用いて未成熟肥満細胞（Ｄ）を成熟肥満細胞（Ａ）へ分化誘導する工程を含む成熟肥満細胞（Ａ）の生産方法であって、（Ｂ）が１分子中にＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）9配列（１０）とを各々１３個有する数平均分子量１１万のポリペプチド又は１分子中にＩｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）9配列（１０）とを各々７個有する数平均分子量９万のポリペプチドであり、（Ｃ）がＩＬ−３とＳＣＦとの組み合わせ及び／又はＩＬ−４とＳＣＦとの組み合わせである点を要旨とする。
【０００６】
【発明の実施の形態】
成熟肥満細胞（Ａ）とは、哺乳動物の骨髄若しくは臍帯血等から得られる未成熟肥満細胞（Ｄ）を、サイトカイン等によって分化させて得られる細胞であり、細胞内にコンドロイチン硫酸、ヘパリン及びヒスタミン等を含む顆粒を有し、刺激に応じてその内容物を放出するものである。培養で得られる成熟肥満細胞は種々の表現型（刺激に対する応答や顆粒成分の構成等）において、哺乳動物の腹腔若しくは皮膚等の組織内に分布する成熟肥満細胞と同様に扱われる。
成熟肥満細胞（Ａ）には分布する組織環境に応じて様々な亜群が存在することが知られるが、大別して二つのグループに分けられる。一つは皮膚や腹腔等に分布するものと同様の表現型を有する組織結合型肥満細胞で、もう一つは腸管膜等に分布するものと同様の表現型を有する粘膜型肥満細胞である。一般的にアレルギーや炎症応答で重要な機能を果たすのは組織結合型の方であることから、成熟肥満細胞（Ａ）としては組織結合型肥満細胞が好ましい。また哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ及びヤギ等が挙げられる。これらのうち、ヒト及びマウスが好ましい。
未成熟肥満細胞（Ｄ）とは、成熟肥満細胞（Ａ）に分化する能力を有する細胞であり、一般に哺乳動物の骨髄又は臍帯血等に存在する。未成熟肥満細胞（Ｄ）としては、骨髄中に含まれる造血幹細胞、及び臍帯血中に含まれる造血幹細胞等が知られている。
【０００７】
次に、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個含有してなるポリペプチド（Ｂ）について説明する。
細胞接着性とは、特定の最小アミノ酸配列（Ｘ）が細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くものであればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０）５２７頁に記載されているもの等が挙げられる。
これらのうち、接着する細胞の種類が多いという点で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg Glu配列、Asp Gly Glu Ala配列（８）及びHis Ala Val配列が好ましく、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Ile Lys Val Ala Val配列（７）及びHis Ala Val配列、特に好ましくはIle Lys Val Ala Val配列（７）である。なお、アミノ酸配列はアミノ酸３文字表記で現わし、（  ）内にアミノ酸配列表に対応する配列番号を付記した（以下同様である。）。
【０００８】
ポリペプチド（Ｂ）中には前記最小アミノ酸配列が１分子中に少なくとも１個含有される必要がある。前記最小アミノ酸配列があると、細胞接着活性が高まり、未成熟肥満細胞（Ｄ）の成熟肥満細胞（Ａ）への分化誘導を促進することが可能となる。一方、前記最小アミノ酸配列が含有されない場合、細胞接着性が低下する結果、（Ｄ）の（Ａ）への分化誘導が不十分となりやすい。
【０００９】
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは５〜４０個、特に好ましくは１０〜３０個である。含有量がこの範囲であると、細胞接着活性がさらに高まり、未成熟肥満細胞（Ｄ）の成熟肥満細胞（Ａ）への分化誘導がさらに促進されやすくなる。
【００１０】
ポリペプチド（Ｂ）の数平均分子量は、細胞に対する毒性が低く、接着性能が高いという点で、５，０００以上が好ましく、さらに好ましくは１０，０００以上、特に好ましくは５０，０００以上である。また５，０００，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１，０００，０００以下、特に好ましくは５００，０００以下である。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Ｎａドデシルスルフェイト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）で、測定試料をゲル中で展開し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる。
【００１１】
ポリペプチド（Ｂ）は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ｂ）の熱安定性が高まるアミノ酸配列、例えばシルクフィブロイン由来のGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（９）を少なくとも２個有することが好ましく、このアミノ酸配列を３個以上有することがさらに好ましく、５〜３０個有することが特に好ましい。
【００１２】
ポリペプチド（Ｂ）としては、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とArg Gly Asp配列とを有するポリペプチド、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有するポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly Pro Pro)4）2配列（１１）とArg Gly Asp配列とを有するポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly Pro Pro)4）2配列（１１）とTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有するポリペプチド、及び（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とIle Lys Val Ala Val配列（７）とを有するポリペプチド（特表平３−５０２９３５号公報）等が挙げられる。
【００１３】
ポリペプチド（Ｂ）として市場から入手できるものとしては、例えば、三洋化成工業（株）製プロネクチンＦ（遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子中にArg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とを各々約１３個有する数平均分子量約１１万のポリペプチド）、同プロネクチンＦプラス（プロネクチンＦをジメルアミノエチルクロライドと反応させて水溶性にしたもの）、同プロネクチンＬ（遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子中にIle Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とを各々約７個有する数平均分子量約９万のポリペプチド）等が挙げられる。
【００１４】
また、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛ヒトフィブロネクチン細胞接着シグナルであるＣＳ１シグナルと細胞接着ドメインＴｙｐｅＩＩＩ及びヘパリン結合ドメインＩＩを１つずつ有する数平均分子量約6万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ｛Arg Gly Asp配列をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＩｇＧ結合ドメイン）に挿入した数平均分子量約３万のポリペプチド｝もポリペプチド（Ｂ）として使用可能である。
【００１５】
ポリペプチド（Ｂ）の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成することができる。
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。
生化学的合成法に関しては、例えば、組換えタンパク質生産法「塚越規弘 編著、株式会社学会出版センター、２００１年版」や特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。
高分子量のポリペプチド（Ｂ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法である。
【００１６】
ポリペプチド（Ｂ）の含有量としては、培養基材の培養表面積１００ｃｍ2あたり、０．０１μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特に好ましくは１μｇ以上、最も好ましくは１０μｇ以上である。また１０００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１００ｍｇ以下、特に好ましくは１０ｍｇ以下、最も好ましくは１ｍｇ以下である。
培養表面積あたりの細胞接着性ペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。例えば、培養基材に、ポリペプチド（Ｂ）と結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体）を反応させ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を測定することにより、培養表面積あたりのポリペプチドの含有量を測定できる。また、酵素の代わりにアイソトープ、色素、蛍光物質又は発光物質等を用いて抗体に標識し、酵素量の代わりに放射線量、色素量、蛍光強度又は発光強度等を測定することにより、培養表面積あたりのポリペプチドの含有量を測定することもできる。
なお、培養表面積は、培養容器の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味する。ここで、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、培養面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を培養表面積に含める。また培養容器が市販品の場合、培養表面積は容器メーカーがカタログ等に記載している培養容器の培養表面積をそのまま適用できる。
【００１７】
本発明で使用される培養基材は、培養容器にポリペプチド（Ｂ）を有していればよく、培養容器内部に練り込まれていてもよく、表面に付着していもよい。
培養容器としては特に制限はなく細胞培養に一般に用いられるものが使用でき、例えば、プレート、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアビーズ及びホローファイバー等が用いられる。
これらの培養容器の材質としては、細胞培養に使用できるものであればいずれも使用でき、例えば、プラスチック、ガラス等が挙げられる。
【００１８】
本発明で使用される培養基材を得る方法としては、例えば、培養容器にポリペプチド（Ｂ）をコーティング処理する方法、及びポリペプチド（Ｂ）を培養容器の原料に練り込んだ後、培養容器に成型する方法等が挙げられる。これらの方法のうち、ポリペプチド（Ｂ）の使用量が少なくて済むという観点から、培養容器にポリペプチド（Ｂ）をコーティング処理する方法が好ましい。
【００１９】
培養容器へのポリペプチド（Ｂ）のコーティング方法としては、ポリペプチド（Ｂ）を溶媒に溶かした溶液を予め作製し、培養容器に加え、所定のコーティング時間静置した後に余分の溶液を捨て乾燥させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥させる方法や、ポリペプチド（Ｂ）の溶液をローラーボトルに加え、所定のコーティング時間ローラーボトルを回転した後に余分の溶液を捨て乾燥させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥させる方法、ポリペプチド（Ｂ）の溶液中にマイクロキャリアビーズを入れて所定のコーティング時間必要に応じて攪拌した後に溶液から取り出し必要に応じて乾燥させる方法、及びポリペプチド（Ｂ）の溶液をホローファイバー中に所定のコーティング時間循環させ必要に応じて乾燥させる方法等が挙げられる。
【００２０】
ポリペプチド（Ｂ）の溶液を作製するために用いられる溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・糖、酸及び／又は塩基を０．１重量％以上５０重量％以下（好ましくは１重量％以上３０重量％以下）含有する水溶液及び水等が使用できる。
無機塩としては、ハロゲン化金属塩、硫酸金属塩、リン酸金属塩、硝酸金属塩、炭酸金属塩及び過ハロゲン酸金属等が使用でき、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、硝酸鉄、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム過塩素酸ナトリウム及び過塩素酸リチウム等が挙げられる。
【００２１】
有機酸塩としては、例えば、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石酸ナトリウム等が挙げられる。
アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等が挙げられる。
ビタミンとしては、例えば、コリン、イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミンＡ及びビタミンＢ１２等が挙げられる。
アルコールとしては、炭素数１〜４の脂肪族アルコール等が使用でき、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びブタノール等が挙げられる。
【００２２】
脂質・糖としては、例えば、脂質、単糖、２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。
酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸等が使用でき、例えば、塩酸、燐酸、酢酸、蟻酸、フェノール及び硫酸等が挙げられる。
塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜６の有機塩基等が使用でき、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びトリエチルアミン等が挙げられる。
水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。
これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を含有する水溶液及び水、特に好ましくは無機塩を含有する水溶液である。
【００２３】
ポリペプチド（Ｂ）の溶液の濃度は、溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特に好ましくは１μｇ以上である。また同様に１００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１ｍｇ以下である。
コーティング時間としては、用いる培養基材によっても異なるが、３０秒以上が好ましく、さらに好ましくは１分以上、特に好ましくは３分以上である。また４８時間以下が好ましく、さらに好ましくは２４時間以下、特に好ましくは１２時間以下である。
【００２４】
必要に応じて行われる乾燥の条件についても特に制限はなく、通常の方法が適用でき、例えば、必要に応じて順風乾燥機や減圧乾燥機などを用いて、０〜２００℃、０．００１Ｐa〜大気圧の圧力下で、１〜１００時間乾燥することで行える。
また、必要に応じて行われる乾燥の前又は後で、無機塩を含有する水溶液又は水で通常の方法で洗浄することもできる。
また、コーティングの後で、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限は無く、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００２５】
ポリペプチド（Ｂ）を培養容器の原料に練り込んだ後、成型する方法としては、原料樹脂等とポリペプチド（Ｂ）とを混練・成形する方法等が挙げられ、例えば、ポリペプチド（Ｂ）と熱可塑性樹脂（ポリエチレン、ポリスチレン及びポリアミド等）とを、この融点温度以上で、押出成形や射出成形等する方法や、（Ｂ）と熱硬化性樹脂（尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、ウレタン樹脂、エボナイト及びシリコーン樹脂等）とを混練・成形した後、加熱硬化する方法等が適用できる。
【００２６】
ポリペプチド（Ｂ）を培養容器に練り込ませる場合、ポリペプチド（Ｂ）の含有量は、培養基材１ｇ当たり、０．１μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは１μｇ以上、特に好ましくは１０μｇ以上である。また同様に１０００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１００ｍｇ以下、特に好ましくは１０ｍｇ以下である。
【００２７】
サイトカイン（Ｃ）としては、インターロイキン（ＩＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）及びケモカイン等が挙げられる。
ＩＬとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１８等が挙げられる。
【００２８】
ＳＣＦとしては、ＳＣＦが挙げられる。
ＣＳＦとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦ等が挙げられる。
ＩＦＮとしては、ＩＦＮ―α、ＩＦＮ―β及びＩＦＮ―γ等が挙げられる。
ＴＮＦとしては、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β等が挙げられる。
ＴＧＦとしては、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等が挙げられる。
ケモカインとしては、エオタキシン、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ-１β、ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳ等が挙げられる。
【００２９】
サイトカイン（Ｃ）は、２種以上を組み合わせて用いることもでき、これらのうち、ＩＬ及びＳＣＦが好ましく、さらに好ましくはＩＬの一種以上とＳＣＦとの組合せであり、特に好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１０からなる群より選ばれる一種以上とＳＣＦとの組合せであり、最も好ましくはＩＬ−４とＳＣＦとの組合せである。
【００３０】
本発明の成熟肥満細胞の生産方法に用いる培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地及びＷＥ培地等（朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地）、これらの培地に血清成分（仔ウシ血清、ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並びに市販の無血清培地［味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ１０３，同ＡＳＦ１０４，同ＡＳＦ３０１、ギブコ社製無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ，同ＶＰ−ＳＦＭ等］等が用いられる。
【００３１】
これらのうち、基礎培地に血清成分を加えたものが好ましく、さらに好ましくはＲＰＭＩ−１６４０培地に仔ウシ血清を加えたものである。
血清成分の使用量（重量％）は、基礎培地１００重量部に対して、１以上が好ましく、さらに好ましくは２以上、特に好ましくは５以上である。また５０以下が好ましく、さらに好ましくは３０以下、特に好ましくは２０以下である。
培地の使用量（ｍＬ）は、用いる培養基材の種類や成熟肥満細胞（Ａ）の種類等によって異なるが、培養基材表面積１ｃｍ2当り、０．０１以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また５０以下が好ましく、さらに好ましくは５以下、特に好ましくは０．５以下である。
【００３２】
サイトカイン（Ｃ）の使用量（μｇ）は、培地１０００ｍＬに対して、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上である。また1０００以下が好ましく、さらに好ましくは１００以下、特に好ましくは９０以下である。サイトカイン（Ｃ）の含有量がこの範囲であると、細胞の分化誘導が促進される。
サイトカイン（Ｃ）を培地に添加する方法としては、培地にサイトカイン（Ｃ）を直接加える方法や、予めサイトカイン（Ｃ）を前記の溶媒に溶解又は分散したものを培地に加える方法等が挙げられる。
【００３３】
さらに必要に応じて、細胞増殖因子（Ｅ）を培地中に含有させることにより、成熟肥満細胞（Ａ）の増殖速度をさらに高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。
細胞増殖因子（Ｅ）は細胞を増殖させる活性のある物質であり、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及びＢＭＰ等が挙げられ、この他に、ＫＧＦ、ＣＳＦ−１、ＳＣＦ、ＰＩＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＴＧＦ、ＮＤＦ及びインシュリン等｛例えば財団法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジニアリング（１９９９年）」４３〜５１頁及び同文献に付記されている参考文献に記載されているもの等｝も用いられる。細胞増殖因子（Ｅ）を培地に添加する方法としては、培地に（Ｅ）を直接加える方法や、予め（Ｅ）を前記の溶媒に溶解又は分散したものを培地に加える方法等が挙げられる。
【００３４】
さらに培地中には必要に応じて、他の成分（Ｆ）として、アミノ酸類（グルタミン、アラニルグルタミン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等）、ビタミン類（コリン、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミンＡ及びビタミンＢ１２等）、成長促進剤（アルブミン、ウシ脳下垂体抽出物、ニワトリ胚抽出液、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン及びエタノールアミン等）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン及びアクチノマイシン等）、安定化剤（例えば、酸化防止剤等）及びｐＨ調整剤（例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、炭酸ナトリウム及びリン酸ナトリウム等）等を含有させることができる。
【００３５】
未成熟肥満細胞を培養し、成熟肥満細胞に分化誘導する工程における未成熟肥満細胞（Ｄ）の量としては、用いる培養基材の種類等によって異なるが、培地１ｍＬ当り、５万〜５０００万個が好ましく、さらに好ましくは５０万〜１０００万個、特に好ましくは５００万〜５００万個である。
【００３６】
培養条件（分化誘導条件）としては特に制限はなく、ＣＯ2濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜７日毎に培地交換しなら培養（分化誘導）すること等が挙げられる。特に好ましい例としては、例えば、ＣＯ2濃度５体積％、３７℃の条件で、２〜３日毎に培地交換しながら１〜３６日間培養（分化誘導）することである。
【００３７】
具体的な培養条件（分化誘導条件）や処理の方法等は、朝倉書店発行日本組織培養学会編「組織培養の技術」に記載されている方法等が適用できる。例えば、培養基材としてＴ−フラスコ（培養面積；１０〜５００ｃｍ2等）、プレート（２〜３８４穴等）又はディッシュ（培養面積；５〜５００ｃｍ2等）を用いる場合、未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、深さが１〜２０ｍｍになる量だけディッシュ又はシャーレに加え、ＣＯ2濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で静置培養（分化誘導）する方法等が挙げられる。この際、１〜５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換することが好ましい。
【００３８】
培養基材としてローラーボトル（容量；０．１〜１０L等）を用いる場合、未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、０．５／１００〜３０／１００の容量になる量だけローラーボトルに加え、ＣＯ2濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で、０．１〜１０ｒｐｍの回転速度で回転させながら培養（分化誘導）する方法等が挙げられる。この際、１２〜５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換することが好ましい。
【００３９】
培養基材としてマイクロキャリアビーズ（粒子径；２０〜５００μｍ、表面積；１００〜１００００ｃｍ2等）を用いる場合、スピナーフラスコ（容量；１０〜5００ｍL等）中に、未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、１／１０〜７／１０の容量になる量だけ加え、マイクロキャリアビーズを、培地１Ｌ当り０．１〜５０ｇの割合で加え、ＣＯ2濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で、１〜１００ｒｐｍの回転速度で撹拌しながら培養（分化誘導）する方法等が挙げられる。この際、１２〜５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換することが好ましい。さらにスピナーフラスコの代わりに流動層型バイオリアクターや充填型バイオリアクター（容量；１０ｍＬ〜１０ｋＬ等）を用いて、マイクロキャリアビーズをバイオリアクター内にセットし未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した１〜５倍容量の培地を循環させた後、ＣＯ2濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で調整した培地を１〜１００ｃｍ／分の線速度で循環しながら連続培養（連続分化誘導）する方法等が挙げられる。
【００４０】
培養基材としてホローファイバー（内径１０〜５００μｍ等）を用いる場合、カートリッジ（容量；１０〜１０００ｍL等）中に、未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地をカートリッジに加えたあと、ホローファイバー内に、ＣＯ2濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で調整した培地を１〜１００ｃｍ／分の線速度で循環し連続培養（連続分化誘導）する方法等が挙げられる。
【００４１】
培養後は、ＥＤＴＡ等のキレート剤若しくはトリプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか又はスクレーパーで掻きとることによって、成熟肥満細胞が回収される。これらのうち、ＥＤＴＡで処理する方法が好ましい。
細胞の保存方法としては、細胞を、ジメチルスルホキシド等を１〜２０体積％（好ましくは５〜１５体積％、さらに好ましくは１０体積％）含有させた培地に分散させた後、−８０℃以下の温度の冷凍庫又は液体窒素中で保存する方法等が挙げられる。
【００４２】
以上の分化誘導させる方法は、成熟した肥満細胞を簡単な操作で短期間に得られるものであり、生産される成熟肥満細胞は、アレルギーの機構解明、並びに花粉症、アトピー性疾患及び慢性アレルギーの予防・治療薬の開発研究及び生産に有用であるとともに、各種サイトカイン（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５等）の大量生産用にも非常に有用である。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
＜実施例１＞
＜細胞培養プレートの作製＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とArg Gly Asp配列とを１２個含むＭｎ約１１万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白質"ＳＬＰＦ"を作製した。次いで、ＳＬＰＦの４．５規定の過塩素酸リチウム溶液（ＳＬＰＦの濃度；１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）でＳＬＰＦの濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、ＰｎＦ溶液を作製した。
旭テクノグラス製６０ｍｍφ細胞培養ディッシュにＰｎＦ溶液を1．５ｍｌ加え、室温で１週間放置して乾燥した（ＳＬＰＦの塗布量＝１５μｇ／ディッシュ）。さらにＰＢＳ５ｍｌで２回洗浄して、培養基材（ディッシュ１）を得た。［ＳＬＰＦ含有量：約０．５μｇ／ｃｍ2］
【００４４】
＜細胞培養＞
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスから骨髄液（骨髄細胞）を採取した。この骨髄液（骨髄細胞）を培地（シグマ社製ＲＰＭＩ−１６４０；１０００ｍL、インビトロジェン社製ウシ胎仔血清；１００ｍＬ、エンドゲン社製ＳＣＦ；１０μg、エンドゲン社製ＩＬ−４；３０μｇ、インビトロジェン社製ペニシリン；１００ｋＵ、インビトロジェン社製ストレプトマイシン；１００ｍｇ、インビトロジェン社製メルカプトエタノール；４．３ｍｇ（最終濃度50 μM）、インビトロジェン社製非必須アミノ酸溶液１０ｍＭ；１０ｍｌ）に縣濁し、細胞濃度；２×１０6個／ｍｌの細胞縣濁液を得た。
この細胞懸濁液５ｍｌを培養基材（ディッシュ１）に加えて（細胞数：１×１０7個／ディッシュ）、３７℃、５体積％ＣＯ2で培養した。培地交換は３日おきに行った。
細胞播種後１８及び２１日目に、アルシアンブルー・サフラニン染色で細胞を染色し、アルシアンブルー、サフラニンともに陽性の細胞、即ち成熟度の高い組織結合型肥満細胞様の細胞（成熟肥満細胞）の、全細胞に対する比率を求め、この結果を表１に示した。
【００４５】
＜実施例２＞
＜細胞培養プレートの作製＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１０）とIle Lys Val Ala Val配列（７）とを７個含むＭｎ約９万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白質"ＳＬＰＬ"を作製した。次いで、ＳＬＰＬの４．５規定の過塩素酸リチウム溶液（ＳＬＰＬの濃度；１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）でＳＬＰＦの濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、ＰｎＬ溶液を作製した。
旭テクノグラス製６０ｍｍφ細胞培養ディッシュにＰｎＬ溶液を１．５ｍｌ加え、室温で１週間放置して乾燥した（ＳＬＰＬの塗布量＝１５μｇ／ディッシュ）。さらにＰＢＳ５ｍｌで２回洗浄して、培養基材（ディッシュ２）を得た。［ＳＬＰＬ含有量：約０．５μｇ／ｃｍ2］
【００４６】
＜細胞培養＞
ディッシュ１の代わりにディッシュ２を用いた以外は実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種後１８及び２１日目に、全細胞中の成熟肥満細胞の割合を測定し、この結果を表１に示した。
【００４７】
＜実施例３＞
＜細胞培養プレートの作製＞
実施例２の培養基材（ディッシュ２）をそのまま使用した。
＜細胞培養＞
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスから骨髄液（骨髄細胞）を採取した。この骨髄液（骨髄細胞）を培地（シグマ社製ＲＰＭＩ−１６４０；１０００ｍL、インビトロジェン社製ウシ胎仔血清；１００ｍＬ、エンドゲン社製ＳＣＦ；１０μg、エンドゲン社製ＩＬ−４；３０μｇ、エンドゲン社製ＩＬ−３；１０μｇ、インビトロジェン社製ペニシリン；１００ｋＵ、インビトロジェン社製ストレプトマイシン；１００ｍｇ、インビトロジェン社製メルカプトエタノール；４．３ｍｇ（最終濃度50 μM）、インビトロジェン社製非必須アミノ酸溶液１０ｍＭ；１０ｍｌ）に縣濁し、細胞濃度；２×１０6個／ｍｌの細胞縣濁液を得た。
この細胞懸濁液５ｍｌを培養基材（ディッシュ１）に加えて（細胞数：１×１０7個／ディッシュ）、３７℃、５体積％ＣＯ2で培養した。培地交換は３日おきに行った。
細胞播種後１８日目に、アルシアンブルー・サフラニン染色で細胞を染色し、アルシアンブルー、サフラニンともに陽性の細胞、即ち成熟度の高い組織結合型肥満細胞様の細胞（成熟肥満細胞）の、全細胞に対する比率を求め、この結果を表２に示した。
【００４８】
＜比較例１＞
培養基材（ディッシュ１）の替わりに、旭テクノグラス製３５ｍｍφ細胞培養ディッシュを比較用の培養基材（ディッシュ３）としてそのまま使用すること以外は実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種後１８及び２１日目に、全細胞中の成熟肥満細胞の割合を測定し、この結果を表１に示した。
【００４９】
＜比較例２＞
旭テクノグラス製３５ｍｍφコラーゲンコート細胞培養ディッシュを培養基材（ディッシュ４）として用いて、ヘパリン処理した臍帯血をフィコール・ハイパック液（比重１．０７７、シグマ社）に重層して３００×ｇで３０分間室温で遠心して単核球を分離した後、これをＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）に懸濁した。なお、ＲＰＭＩ１６４０培地には、さらに、１０％のＦＢＳ｛ギブコ社（→インビトロジェン社）｝、５０μＭの２−メルカプトエタノール、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが加えられている。
次いで、懸濁液の単核球数濃度を２×１０6個／ｍｌに調製したもの５ｍｌを、培養基材（ディッシュ４）に播種し、実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種後１８及び２１日目に、全細胞中の成熟肥満細胞の割合を測定し、この結果を表１に示した。
また、６週間培養した段階で、上記培養細胞を、別途定法によって作製した肺由来の繊維芽細胞の単層培養の上に移し、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦの存在下で共培養した。２ヶ月後、全細胞中の成熟肥満細胞の割合を測定した結果、成熟肥満細胞の割合は２０．０％であった。
【００５０】
＜比較例３＞
培養基材（ディッシュ２）の替わりに、旭テクノグラス製３５ｍｍφ細胞培養ディッシュを比較用の培養基材（ディッシュ３）としてそのまま使用すること以外は実施例３と同様に細胞培養を行い、細胞播種後１８日目に、全細胞中の成熟肥満細胞の割合を測定し、この結果を表２に示した。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
表１に示すように、比較例１の培養１８日目では成熟肥満細胞の割合が低く、さらに２１日目では殆どの細胞が死滅してしまい、培養が維持できなかった。これに対し、実施例１及び２の培養１８日目では成熟肥満細胞の割合が極めて高く、さらに２１日目でも高水準を維持していることが判る。
また、従来知られている方法によっては、２１日後の成熟肥満細胞の割合は非常に低いものであり、また、その後、繊維芽細胞との共培養を２ヶ月間行っても、つまり、３．５ヶ月間細胞培養したにもかかわらず、成熟肥満細胞の割合は２０％に到達したにすぎなかった。
【００５３】
【表２】
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表２に示すように、比較例３では成熟肥満細胞が全く検出されなかったが、実施例３では成熟肥満細胞が明らかに検出されていることが分かる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明の成熟肥満細胞の生産方法を用いることによって、簡単な操作で短期間に成熟した肥満細胞を得ることができ、また、長時間維持することができる。
これによって、成熟肥満細胞を用いるアレルギーの研究開発や医薬品の生産が容易になることの他、サイトカイン等の生産も容易になるため、非常に有用である。
【００５５】
【配列表】
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