(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換基を有する充填剤粒子表面に親水基を有する化合物を吸着させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、
充填剤を含むスラリー中に親水基を有する化合物を溶解させ、０．５時間以上攪拌することを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤、特に充填剤の強度の低下を招くことなく親水性を向上させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イオン交換液体クロマトグラフィー法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法である。
【０００３】
これまでイオン交換液体クロマトグラフィー法に用いられる充填剤としては、 シリカ系化合物からなる基剤にイオン交換基を導入したもの、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含有化合物を反応させて得られるもの（特開平１−２６２４６８号公報）、あるいは架橋性単量体とイオン交換基を有する単量体とを重合して得られるもの（特公昭６３−５９４６３号公報、特公平８−７１９７号公報）等が知られている。
【０００４】
これらの充填剤においてイオン交換基以外の基材部分は、膨潤・収縮を避けるため、 より強度に架橋された粒子であることが望ましい。 しかし、強度を向上させようとすると親水性が低下して、疎水性物質の非特異吸着を引き起こし、 測定精度が低下することがあるという問題があった。
【０００５】
一方、 非特異吸着を抑制するために、従来の方法において親水性の単量体を多く含有させること等で親水性を向上させると、上記のごとく膨潤・収縮を引き起こしたり、 高流速下での分析ができなかったり、複数の溶離液を用いた場合の平衡化が遅れたりして測定時間の遅延を招くという問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点に鑑み、充填剤の強度を低下させることなく、親水性を向上させた充填剤を提供することにより、 イオン交換液体クロマトグラフィーにおいて、特にタンパク質などが非特異的に吸着するのを抑制し、測定精度や製造再現性を向上させることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１記載の発明は、 イオン交換基を有する充填剤粒子表面に親水基を有する化合物を吸着させたことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。
【０００９】
本発明の充填剤は、イオン交換充填剤であれば特に限定されず、 陽イオン交換基を有するものであっても、陰イオン交換基を有するものであってもよい。
【００１０】
上記イオン交換充填剤は、少なくとも一種類のイオン交換基を有するものであればよく、本発明においては、公知のイオン交換充填剤を用いることができる。
【００１１】
イオン交換充填剤の調製方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、高分子微粒子にイオン交換基を導入する方法や、イオン交換基を有する単量体を重合する方法等を用いることができる。
【００１２】
上記高分子微粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子等を挙げることができる。このうち、合成高分子粒子を用いる場合は、耐圧性・耐膨潤性を高めるため、架橋度の高い粒子を用いるのが好ましい。
【００１３】
上記高分子微粒子にイオン交換基を導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、官能基を有する高分子微粒子を調製後、その官能基にイオン交換基を有する化合物を化学反応によって導入する方法、あるいは、イオン交換基を有する単量体と、架橋性単量体等を混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法等を用いることができる。
また、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製したあと、イオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、イオン交換基を有する単量体を重合させる方法を用いることもできる。
【００１４】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性エステル化合物を架橋性単量体などと混合し、重合開始剤の存在下で重合したあと、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオン交換基に交換させてもよい。
【００１５】
本発明においては、直径が０．１〜１０μｍの粒径を持つ充填剤を用いるのが好ましい。また、粒度分布は、ＣＶ値（標準偏差÷平均粒径×１００）で、４０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。
【００１６】
上記イオン交換基としては、陽イオン交換基としては、 例えば、 カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられ、 陰イオン交換基としては、例えば、 ３級あるいは４級アミノ基等が挙げられる。
【００１７】
本発明において、「充填剤粒子表面が親水化処理される」とは、上記イオン交換充填剤ついて、以下に示す（１）〜（４）の方法のうち、少なくとも１つ以上の方法が施されることを意味する。（１）〜（４）の処理は適宜２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
（１）スラリー調製時における親水化処理
イオン交換充填剤に分散媒を注入する等によりスラリーを調製し、該スラリー中に０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％の親水基を有する化合物を溶解させ、 ０．５時間以上、 好ましくは２時間以上攪拌する。
【００１９】
（２）充填時における親水化処理
充填液中に０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％の親水基を有する化合物を溶解させてカラム本体に充填を行う。充填後、０．５時間以上、 好ましくは２時間以上放置する。
【００２０】
（３）充填後のカラムに親水基を有する化合物の溶液を通液させることによる親水化処理
イオン交換充填剤を充填したカラムに、０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％の親水基を有する化合物を溶解させた溶液を、流速０．０１〜１０ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは０．１〜５ｍＬ／ｍｉｎで１分以上通液させ、通液後、 ０．５時間以上、 好ましくは２時間以上放置する。
【００２１】
（４）充填後のカラムに親水基を有する化合物の溶液を注入させることによる親水化処理
イオン交換充填剤を充填したカラムに０．０１〜１０重量％、好ましくは、 ０．１〜１重量％の親水基を有する化合物の溶液を、注入量１〜１０００μＬ、好ましくは１０〜５００μＬ、流速０．０１〜１０ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは０．１〜５ｍＬ／ｍｉｎで注入させる。注入後、 ０．５時間以上、 好ましくは２時間以上放置する。
【００２２】
上記（１）〜（４）の処理方法においては、１５〜８０℃で処理・放置するのがよい。
【００２３】
本発明の充填剤は、その使用前に、測定に使用する最も溶出力の強い溶離液を、流速０．０１〜１０ｍＬ／ｍｉｎで１〜３００分間通液することが好ましい。
【００２４】
上記親水基を有する化合物は、充填剤粒子表面を親水化する物質であれば特に限定されるものではないが、特にヘモグロビン、アルブミン、グロブリン等のタンパク質、糖類、あるいはノニオン系界面活性剤を用いるのが好ましい。
【００２５】
本発明においては、上記親水化処理を行うことにより、イオン交換基を有する充填剤粒子表面の疎水性部分に、親水基を有する化合物が物理的あるいは化学的に吸着することによって、親水性が向上し、充填剤粒子表面の疎水性部分と測定対象物質（特にタンパク質）あるいは測定試料中の夾雑物質等との非特異吸着が抑制されるものと考えられる。
【００２６】
本発明の充填剤により測定可能な物質としては、特に限定されず、 従来からイオン交換クロマトグラフィーで分離されていた物質を分離することが可能である。とりわけ本発明の充填剤は、 カテコールアミン誘導体、 ヌクレオチド、ペプチド、タンパク質等生体関連物質の分離に好適である。
【００２７】
本発明の充填剤は、 ステンレス製等のカラム本体に充填することにより、液体クロマトグラフィー用カラムとして利用する。 充填方法としては特に限定されず公知の方法を用いることができ、例えば湿式法（スラリー法）を用いる場合、 充填剤粒子を溶離液に用いる溶媒等の分散媒に分散させ、 カラム本体にパッカー等を経由して圧入することにより充填することができる。
【００２８】
本発明の充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによる分析において、使用する溶離液については特に限定されず、 公知の溶離液を用いることができ、例えば、 リン酸、 硝酸、 塩酸、 過塩素酸などの無機酸及びその塩、 酢酸、 リンゴ酸、 酒石酸、 コハク酸、 クエン酸等の有機酸及びその塩を含む各種緩衝液を用いることができる。また、溶離液には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタノール等の有機溶媒を添加してもよい。
【００２９】
【作用】
本発明は、 充填剤粒子の強度を低下させることなく、親水性を向上させた充填剤であり、 測定対象物質（特に、 タンパク質）の非特異吸着を抑制することにより、測定精度や製造再現性を向上させることができる。
【００３０】
【実施例】
［実施例１］
（充填剤の調製）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ：東京化成工業社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体Ｂ：新中村化学製）４００ｇおよびベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、 ２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。 これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、 ８０℃で８時間重合した。 重合後、 洗浄・分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３１】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、 ５分間超音波処理したあと、 よく攪拌した。 次に、０．１％ＢＳＡ（和光純薬社製）水溶液３ｍＬを添加し、 室温で５時間攪拌処理したあと、 全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。 パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、 圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００３２】
［実施例２］
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを０．５％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（東京化成社製）含有１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、 ５分間超音波処理したあと、 室温で２４時間攪拌した。 この全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。 パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、 圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００３３】
［実施例３］
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、 ５分間超音波処理したあと、 よく攪拌した。 次に、その全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。 パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、 圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
次に、上記カラム内に０．０５％のＢＳＡ（和光純薬社製）を含有する１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を、室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／ｍｉｎで３０分間通液した。
【００３４】
［実施例４］
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散させ、 ５分間超音波処理したあと、 よく攪拌した。 次に、その全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。 パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、 圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
次に、上記カラム内に１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を、室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により通液し、オートサンプラ（ＡＳＵ−４２０、積水化学社製）により  ０．３％のヘモグロビン（ＤＩＦＣＯＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）水溶液０．１ｍＬを４回注入した。
【００３５】
［比較例１］
実施例１と同じ充填剤を用い、以下の様にして充填を行ったが、親水化処理は行わなかった。
上記充填剤０．７ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散させ、 ５分間超音波処理したあと、 よく攪拌した。 次に、その全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。 パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、 圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００３６】
（同時再現性の評価）
健常人血をＮａＦ採血し、 溶血希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを測定試料として以下の条件でヘモグロビンＡ１ｃの測定を１０回連続で行ない、同時再現性の比較を行った。 再現性の評価は、Ａ１ｃ値とＡ１ｃ成分の保持時間により行い、それぞれの結果を表１、表２に示した。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液：１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液を流した。
流速：１．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００３７】
【表１】
0004231165.tif 000002
【００３８】
【表２】
0004231165.tif 000003
【００３９】
（充填剤のロット間差の評価）
上記条件で充填剤を重合し、実施例についてはそれぞれ親水化処理し、比較例については処理しないでヘモグロビンＡ１ｃの測定を行ない、処理ロット間の保持時間のバラツキをみた。結果を表３に示した。
【００４０】
【表３】
0004231165.tif 000004
【００４１】
【発明の効果】
本発明のイオン交換充填剤は、粒子の強度を低下させることなく親水性を向上させたものであり、測定対象物質（特にタンパク質など）あるいは試料中の夾雑物質等の非特異吸着を抑制することができるため、測定精度と共に製造再現性を向上させることが可能となった。