(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入してなる組み換え体ポリヌクレオチドを含み、ＫＲＥ２，ＫＴＲ１，ＫＴＲ３遺伝子の少なくとも１個を破壊した酵母細胞であって、
該ポリヌクレオチドが、
(1) 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(2) 配列番号２記載のアミノ酸配列においてその少なくとも２４７位：Ｓｅｒから６６０位：Ｔｈｒまでのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(3) 配列番号１記載の塩基配列を含む、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、又は
(4) 配列番号２記載のアミノ酸配列において、その少なくとも２４７位：Ｓｅｒから６６０位：Ｔｈｒまでのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択され、
該Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ又は該タンパク質が、
(5) 糖供与体としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
【化１】
0004274792.tif 000040
で表される部分構造を含む複合糖質をそれぞれ基質とし、下記式：
【化２】
0004274792.tif 000041
で表される部分構造を含む糖質を生成する作用を有するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼであるか、あるいは、
(6) 糖供与体としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
【化３】
0004274792.tif 000042
で表される部分構造を含む複合糖質をそれぞれ基質とし、下記式：
【化４】
0004274792.tif 000043
で表される部分構造を含む糖アミノ酸、糖ペプチドまたは糖タンパク質からなる糖質を生成する作用を有するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、
である、
ことを特徴とする前記酵母細胞。
【請求項２】
ＫＲＥ２，ＫＴＲ１，ＫＴＲ３遺伝子の三重破壊株である、請求項１記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを発現し保持する、請求項１記載の酵母細胞。
【請求項４】
更にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体を保持する、請求項３記載の酵母細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の酵母細胞を培養し、培養細胞を遠心分離、破砕し、改変糖鎖構造を含む糖鎖および糖質を得ることを特徴とする、糖鎖構造が改変された該糖鎖および糖質の製造方法。
【請求項６】
前記糖鎖の改変がＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖を哺乳類型ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ構造へ変換する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
酵母細胞のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を測定することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
糖供与体としてＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
【化５】
0004274792.tif 000044
で表される部分構造を含む複合糖質をそれぞれ基質とし、この基質にＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを作用し、下記式：
【化６】
0004274792.tif 000045
で表される糖ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離検出することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、複合糖質中の特定の糖鎖構造を認識して、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ構造を導入する新規なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＯＭＧｎＴ）酵素タンパク質、該タンパク質の活性測定法と製造法、および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。また、該ポリヌクレオチドを導入した細胞、それを用いる糖鎖および糖質（糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体）の製造方法、ならびに製造された該糖鎖および該糖質（糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体）に関するものである。
発明の背景
１．  糖タンパク質のＯ−結合（ｌｉｎｋｅｄ）Ｍａｎ型糖鎖
真核生物由来のタンパク質では、アミノ酸のみから成る単純タンパク質ではなく、糖鎖によって修飾された糖タンパク質が頻繁に見い出される。これら糖鎖は、タンパク質の安定性や立体構造の維持に関与したり、細胞間接着などにおける分子間の認識で重要な役割を果たすことが知られている。糖タンパク質の主要な糖鎖としては、アスパラギンに結合するＮ−結合（ｌｉｎｋｅｄ）型とセリン（Ｓｅｒ）あるいはスレオニン（Ｔｈｒ）に結合するＯ−結合型が挙げられる［竹内誠，グリコバイオロジーシリーズ５，グリコテクノロジー，木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，講談社サイエンティフィック，（１９９４），１９１−２０８］。Ｎ−結合型では全てＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がアスパラギンのアミド基に結合している。一方、Ｏ−結合型ではＳｅｒあるいはＴｈｒの水酸基に結合する糖が異なる数種類が存在する。その中で、マンノース（Ｍａｎ）が結合した一連の糖鎖はＯ−結合Ｍａｎ型として分類される。この他、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合するムチン型、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合するＯ−結合ＧｌｃＮＡｃ型も広く知られている。これらのＯ−結合型糖鎖はアミノ酸に結合している糖が異なるだけでなく、糖鎖構造全体も大きく違っている［Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．，Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９８），３３，１５１−２０８］。
Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖は酵母やカビなどの糖タンパク質でしばしば認められる。酵母の場合、構成糖のほとんどはマンノースであるが、リン酸やガラクトース（Ｇａｌ）が少数結合している場合が知られている。糖鎖構造は不均一で、酵母の種類によっても異なるが、タンパク質にマンノースが直鎖状に１〜３残基結合し、さらにマンノース、ガラクトース、あるいはマンノースリン酸が転移した７糖以下の構造が知られている［Ｇｅｍｍｉｌｌ，Ｔ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９９），１４２６，２２７−２３７］。
生合成についてはパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，以下Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を中心に研究が進められており、図１のような経路で進行すると考えられている。すなわち、最初にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴｐ）によってＳｅｒあるいはＴｈｒの水酸基にα−結合でマンノースを転移する反応が起こる［Ｓｔｒａｈｌ−Ｂｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｇｅｎｔｚｓｃｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｔａｎｎｅｒ，Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９９），１４２６，２９７−３０７］。さらに、ＫＲＥ２ｐ、ＫＴＲ１ｐ、ＫＴＲ３ｐのいずれかによってα−１，２結合でマンノースが伸長され、マンノースが２残基結合した構造が形成される。この糖鎖に引き続きＫＲＥ２ｐが作用すると、α−１，２結合でマンノースが３残基結合した構造となる［Ｌｕｓｓｉｅｒ，Ｍ．，Ｓｄｉｃｕ，Ａ．Ｍ．，Ｂｕｓｓｅｒｅａｕ，Ｆ．，Ｊａｃｑｕｅｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｓｅｙ，Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，１５５２７−１５５３１］。この後の生合成経路は、ＭＮＮ１ｐ、ＭＮＴ２ｐ、ＭＮＴ３ｐによってα−１，３結合でマンノースがさらに１〜２残基結合する場合［Ｒｏｍｅｒｏ，Ｐ．Ａ．，Ｌｕｓｓｉｅｒ，Ｍ．，Ｖｅｒｏｎｎｅａｕ，Ｓ．，Ｓｄｉｃｕ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｓｅｙ，Ｈ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９９），９，１０４５−１０５１］と、ＭＮＮ６ｐによりマンノースリン酸が転移される場合の２通りに分かれる［Ｊａｒｓ，Ｍ．Ｕ．，Ｏｓｂｏｒｎ，Ｓ．，Ｆｏｒｓｔｒｏｍ，Ｊ．，ａｎｄ  ＭａｃＫａｙ，Ｖ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５），２７０，２４８１０−２４８１７］。なお、α−１，３結合のマンノースが転移すると、マンノースリン酸の転位反応は阻害される［Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．，Ｆｅｎｇ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９８），１４２５，２５５−２６２］。
一方、動物のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖はほとんど知られていなかったが、近年、相次いで報告された。まずウシ末梢神経のα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎから、ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒという構造が見い出された［Ｃｈｉｂａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｉｎａｚｕ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｓ．，Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，２１５６−２１６２］。その後、同様の糖鎖構造はウサギの骨格筋やヒツジの脳由来のα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎにも存在することが確認された［Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９８），１４２５，５９９−６０６、Ｓｍａｌｈｅｉｓｅｒ，Ｎ．Ｒ．，Ｈａｓｌａｍ，Ｓ．Ｍ，，Ｓｕｔｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｅｌｌ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９８），２７３，２３６９８−２３７０３］。また、ウサギの脳抽出物には、神経回路の構築で重要な役割を果たすと考えられているＨＮＫ−１エピトープを含むＨＳＯ３→３ＧｌｃＡβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ構造も報告されている［Ｙｕｅｎ，Ｃ．−Ｔ．，Ｃｈａｉ，Ｗ．，Ｌｏｖｅｌｅｓｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｆｅｉｚｉ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，８９２４−８９３１］。これらのことから、Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖は動物においても存在することが明らかである。ただし、動物の糖鎖はシアル酸（ＮｅｕＡｃ）、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、硫酸基が結合しており、酵母やカビで知られているものとは構造が大きく異なる。
動物におけるＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖の生合成経路はほとんど分かっていない。タンパク質にマンノースを転移する酵素について酵母ＰＭＴ遺伝子の相同体が取得されているが、機能を確認するには至っていない［Ｐｅｒｅｚ  Ｊｕｒａｄｏ，Ｌ．Ａ．，Ｃｏｌｏｍａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｒｕｃｅｓ，Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（１９９９），５８，１７１−１８０］。また、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）では、体の捻れ（ｒｏｔａｔｅｄ  ａｂｄｏｍｅｎ）を生じる遺伝子変異が酵母ＰＭＴ遺伝子と高いホモロジーをもつ遺伝子に起きていることが分かっている［Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｌａｎｃｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｌｌｉｄｏ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９６），９３，６０４８−６０５２］が、この遺伝子についてもＰＭＴ活性をもっているか否かは明らかとなっていない。さらに、タンパク質に結合したマンノースにβ１，２結合のＮ−アセチルグルコサミンを転移する酵素（ＯＭＧｎＴ）などＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖の伸長に関わる酵素については分かっていない。
２．  Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖の機能
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにはタンパク質にマンノースを転移する酵素として７個のＰＭＴｐアイソザイムが存在する。これらのうち３個の遺伝子（ＰＭＴ１，ＰＭＴ２，ＰＭＴ４あるいはＰＭＴ２，ＰＭＴ３，ＰＭＴ４）を破壊すると生育できなくなる［Ｓｔｒａｈｌ−Ｂｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｇｅｎｔｚｓｃｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｔａｎｎｅｒ，Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９９），１４２６，２９７−３０７］。また、酵母のＰＭＴ遺伝子と高い相同性をもつショウジョウバエのｒｔ遺伝子の変異は形態異常の原因となっている［Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｌａｎｃｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｌｌｉｄｏ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９６），９３，６０４８−６０５２］。したがって、タンパク質のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖は生物の生育および形態形成で重要な役割を担っている可能性が考えられる。
動物では、Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖がα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎに結合していることが分かっている［Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９９），１４７３，２３７−２４６］。α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎはβ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎと共にｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ遺伝子にコードされる糖タンパク質で、翻訳後に切断されてαおよびβの２成分に分かれる［Ｉｂｒａｇｈｉｍｏｖ−Ｂｅｓｋｒｏｖｎａｙａ，Ｏ．，Ｅｒｖａｓｔｉ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅｖｅｉｌｌｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｓａｌｕｇｈｔｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｓｅｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９２），３５５，６９６−７０２］。両者は筋肉や神経組織の基底膜に発現しており、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎが膜貫通タンパク質のβ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎの細胞外ドメインに結合した状態で存在する。さらに、細胞外においてα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎは細胞外マトリックスのｌａｍｉｎｉｎ−１、ｌａｍｉｎｉｎ−２、ａｇｒｉｎなどと結合し、細胞内においてβ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎは細胞骨格タンパク質のｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎなどと結合するので、αおよびβ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎは細胞骨格と細胞外マトリックスを繋ぐ役割を果たしていると見なすことができる［Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（１９９９），１１，６０２−６０７］。このような複数の分子が結合した複雑な構造体はｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＧＣ）と呼ばれており、生物の形態形成と密接な関連が示されている。例えば、構成成分のｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ［Ｋｏｅｎｉｇ，Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｍｏｎａｃｏ，Ａ．Ｐ．，Ｆｅｅｎｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ，（１９８７），５０，５０９−５１７］、ｌａｍｉｎｉｎ−２［Ｘｕ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｒ．，Ｗｅｗｅｒ，Ｕ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，（１９９４），８，２９７−３０２］、ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ［Ｃｏｔｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｍｏｕｋｈｌｅｓ，Ｈ．，Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｏ，Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，（１９９９），２３，３３８−３４２］の遺伝子異常は、いずれも重篤な疾患である筋ジストロフィーの原因となっている。
ＤＧＣ中のα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎとｌａｍｉｎｉｎの結合には、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ上にあるＯ−結合型糖鎖の３’−ｓｉａｌｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ）構造が重要であることが示されている［Ｃｈｉｂａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｉｎａｚｕ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｓ．，Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，２１５６−２１６２］。この糖鎖構造は、骨格筋由来α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎのＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖で実際に認められているので［Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９８），１４２５，５９９−６０６］、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎとｌａｍｉｎｉｎの結合にＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖が重要な役割を果たしている可能性は高い。もしそうであれば、この糖鎖の生合成に必須であるＯＭＧｎＴに変異が起きるとＤＧＣ構造に異常が生じるものと推定され、延いてはＯＭＧｎＴは今だ解明されていない筋ジストロフィー様の神経疾患や形態異常の原因遺伝子である可能性が考えられる。
したがって、本発明のＯＭＧｎＴタンパク質を抗原として得られる抗体・抗血清、あるいは本発明のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブに用いれば、前述した筋ジストロフィー様の神経疾患や形態異常などによる病変の検出および遺伝子診断等に有用である。
α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎは、ハンセン氏病の原因でとして知られる細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（以下、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の末梢神経Ｓｃｈｗａｎｎ細胞への感染にも関与することが報告されている［Ｒａｍｂｕｋｋａｎａ，Ａ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｚａｎａｚｚｉ，Ｇ．，Ｍａｔｈｕｓ，Ｔ．，Ｓａｌｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，Ｐ．Ｄ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９８），２８２，２０７６−２０７９］。ここで筆者らは、Ｍ．ｌｅｐｒａｅがα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎと特異的に結合するｌａｍｉｎｉｎ−２  α２  ｃｈａｉｎのＧドメイン（ＬＮα２Ｇ）と結合し、選択的に末梢神経へ感染することを明らかにしている。さらに、末梢神経や骨格筋から調製したα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎにはＬＮα２Ｇを介してＭ．ｌｅｐｒａｅが結合するのに対し、大腸菌から調製した組み換え体α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎではこのような結合が認められないことから、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎの糖鎖がＭ．ｌｅｐｒａｅの感染に重要な要素となっていることを示している。
また、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎはＬａｓｓａ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ラッサ熱ウイルス）などのＡｒｅｎａ  ｖｉｒｕｓやＬｙｍｐｏｈｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）など病原ウイルスの感染ターゲットであることも明らかにされている［Ｃａｏ，Ｗ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．Ｄ．，Ｂｏｒｒｏｗ，Ｐ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｅｌｄｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｒａｖｋｏｖ，Ｅ．Ｖ．，Ｎｉｃｈｏｌ，Ｓ．Ｔ．，Ｃｏｍｐａｎｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ，，ａｎｄ  Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，Ｂ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９８），２８２，２０７９−２０８１］。この場合も、ウイルスはウサギ骨格筋由来のα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎには結合するが、大腸菌から生産させた組み換え体α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎには結合せず、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎの糖鎖が感染で重要な役割をもっていることが示されている。さらに、同じウサギ骨格筋由来の糖タンパク質でもｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘのα２サブユニットには結合しないことから、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎに特異的に結合している糖鎖の感染における重要性が指摘されている。このことから、非常に稀にしか認められないＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖がウイルスのターゲットとなっている可能性は極めて高いと考えられる。
以上のように、α−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ上のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖は病原性の細菌やウイルス感染にも深く関わっている可能性が高い。したがって、Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖を含む糖質は、生体に投与されると細菌やウイルスのα−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎへの結合を抑制することが期待できる。この作用は、前述した病原性細菌やウイルスの感染予防あるいは感染者の治療・症状悪化の防止に有益である。しかし、これらを実施するためには大量のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖を含む糖質が必要で、本発明のＯＭＧｎＴを該糖質の合成を利用することにより可能となる。また、ＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドを導入した宿主細胞のうち、例えば酵母細胞（詳細は後述）などは安価にヒト型のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖を生産することができるので有用である。
３．  酵母における哺乳類由来糖タンパク質の生産
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される種々の酵母は、組み換え体タンパク質を大量生産させるための宿主としてしばしば用いられている。通常、哺乳類の生理活性タンパク質の多くは生体から極少量しか得られないので、酵母で組み換えタンパク質として安価に大量生産できれば大変有益である。しかし、哺乳類のタンパク質の多くは糖鎖を結合しており、その構造が哺乳類と酵母で大きく違うために、単純に酵母で発現しても医薬品などとして利用できない場合が多い［Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｏｒｅｒ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８，４２３−４８８、Ｅｃｋａｒｔ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂｕｓｓｉｎｅａｕ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９６），７，５２５−５３０］。特に、酵母の糖鎖に含まれるＭａｎα１→３Ｍａｎα１→２構造がヒトにおいて抗原性をもつ点は大きな問題である［Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｄ．，Ｇｒａｄｗｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｍｅｓｔａｄ−Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｂ．，Ｗｏｌｄ，Ｊ．Ｋ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｒ．Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｈｏｕｎｓｅｌｌ，Ｅ．Ｆ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，（１９９８），１５，８１５−８２２］。
これらの問題を克服するために、近年、酵母の糖鎖構造を哺乳類と同様に変換する技術が開発されつつある。例えば、既に酵母のＮ−結合型糖鎖を動物の糖鎖構造に変換する技術は確立されている［Ｃｈｉｂａ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ａ．，Ｉｋｅｎａｇａ，Ｈ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｉｃｈｉｓｈｉｍａ，Ｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９８），２７３，２６２９８−２６３０４］。しかし、もう一つの主要な糖鎖であるＯ−結合型糖鎖については、そのようなアイディアや技術がなかった。Ｏ−結合型糖鎖についても、哺乳類と同様の糖鎖構造に変換する技術が確立されれば、Ｎ−結合型糖鎖の変換技術と合わせてほとんどの糖鎖について問題を解消できるものと考えられる。
４．  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）
タンパク質のセリンあるいはスレオニンに結合したマンノースにβ１，２結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する酵素（ＯＭＧｎＴ）については、これまで報告がない。しかし、マンノースにＮ−アセチルグルコサミンを転移するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）としては、ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、ＧｎＴ−ＩＩＩ、ＧｎＴ−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖ、ＧｎＴ−ＶＩが知られている［Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｈｕｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９８９），１７９，３５１−３９７］。これらは何れもＮ−ｇｌｙｃａｎの生合成に関与し、それぞれ固有の基質を認識して転移反応を行う。これまでに、ＧｎＴ−Ｉ［Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９０），８７，９９４８−９９５２、Ｓａｒｋａｒ，Ｍ．，Ｈｕｌｌ，Ｅ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．，Ｄｕｎｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９１），８８，２３４−２３８］、ＧｎＴ−ＩＩ［Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏ，ＧＡ．，Ｚｉｎｇｏｎｉ，Ａ．，Ｍｏｒｉｔｚ，ＲＬ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＲＪ．，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉａｋ，Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５），２７０，１５２１１−１５２２１］、ＧｎＴ−ＩＩＩ［Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ，Ｉｈａｒａ，Ｙ．，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｍ．，Ｋａｎｇａｗａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９２），２６７，１８１９９−１８２０４］、ＧｎＴ−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖ［Ｓｈｏｒｅｂａｈ，Ｍ．Ｇ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９２），２６７，２９２０−２９２７］についてはｃＤＮＡがクローニングされており、ＧｎＴ−ＩＶでは−ＩＶａ［Ｙｏｓｈｉｄａ，Ａ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｍ．Ｔ．，Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｓ．，Ｈａｒａ，Ｔ．，Ｏｇｕｒｉ，Ｓ．，Ｉｋｅｎａｇａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９９），９，３０３−３１０］および−ＩＶｂ［Ｙｏｓｈｉｄａ，Ａ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｍ．Ｔ．，Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｓ．，Ｈａｒａ，Ｔ．，Ｉｋｅｎａｇａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，（１９９８），１５，１１１５−１１２３］という２種類のアイソザイムの存在が明らかとされている。このうち同じ酵素活性をもつヒトのＧｎＴ−ＩＶａとＧｎＴ−ＩＶｂとの間にはアミノ酸レベルで６２％の同一性が認められる。しかし、類似した酵素反応を触媒するにもかかわらず、マンノースにβ１，２結合でＧｌｃＮＡｃを転移するＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩ、あるいはマンノースにβ１，４結合でＧｌｃＮＡｃを転移するＧｎＴ−ＩＩＩとＧｎＴ−ＩＶには明確な相同性が存在しない。さらに、ＧｌｃＮＡｃの転移様式が異なるＧｎＴ間には相同性は見い出せない。これらの知見から、マンノースにＮ−アセチルグルコサミンを転移す���各種のＧｎＴ間には相同性がないと一般的に考えられている。
ここでいう「同一性」とは、配列を構成する個々のアミノ酸残基がどの程度一致しているのかを示す表現である。この場合、ギャップの存在を考慮して整列させる処理をした場合も含む表現である。また、ここでいう「相同性」とは、上記同一性に加え更に類似のアミノ酸（例；イソロイシンとロイシン、アスパラギンとグルタミン酸等）も相同の範囲に加えた表現である。
本発明の目的は、新規のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（以下ＯＭＧｎＴという）活性を有するタンパク質（酵素）、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組み換え体ポリヌクレオチド、該組み換え体ポリヌクレオチドを含む哺乳類や酵母等の細胞、該細胞を培地に培養してＯＭＧｎＴ活性をもつ酵素蛋白質を生産する方法と該方法により生産される酵素蛋白質、ＯＭＧｎＴを用いた新規物質の製造法、該ポリヌクレオチドを導入した細胞を培地に培養してＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖と糖質（糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体）を生産する方法、ならびに該方法により生産されるＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖と糖質（糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体）を提供することにある。
発明の要約
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、ヒト脳由来ＲＮＡからＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。そして、このｃＤＮＡの産物がＯＭＧｎＴ活性を示すことを確認することにより、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２２）の発明である。
（１）  糖供与体としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
0004274792.tif 000002
で表される部分構造を有する複合糖質をそれぞれ基質とし、下記式：
0004274792.tif 000003
で表される部分構造を有する糖質を生成する作用を有するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ。
（２）  糖受容体が糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体である、上記（１）のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ。
（３）  糖供与体としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
0004274792.tif 000004
で表される部分構造を有する複合糖質をそれぞれ基質とし、下記式：
0004274792.tif 000005
で表される部分構造を有する糖質（糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体）を生成する作用を有するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ。
（４）  活性発現に２価のカチオンを要求すること特徴とする、上記（１）から（３）いずれかのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ。
（５）  配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（６）  配列番号２記載のアミノ酸配列の少なくとも２４７位：Ｓｅｒから６６０位：Ｔｈｒまでのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（７）  配列番号２記載のアミノ酸配列の少なくとも２４７位：Ｓｅｒから６６０位：Ｔｈｒまでのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を有し、かつ上記（１）から（４）のいずれかに記載のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（８）  上記（５）から（７）いずれかのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
（９）  配列番号１記載の塩基配列を有する、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
（１０）  上記（８）または（９）のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入したことを特徴とする組み換え体ポリヌクレオチド。
（１１）  上記（１０）の組み換え体ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
（１２）  上記（１０）の組み換え体ポリヌクレオチドを含み、ＫＲＥ２，ＫＴＲ１，ＫＴＲ３遺伝子の少なくとも１個を破壊した酵母細胞。
（１３）  上記（１０）の組み換え体ポリヌクレオチドを含み、ＫＲＥ２，ＫＴＲ１，ＫＴＲ３遺伝子の三重破壊株である酵母細胞。
（１４）  上記（１）から（４）いずれかのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を生物試料から採取することを含むＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
（１５）  上記（１１）から（１３）いずれかの細胞を培地に培養し、培養細胞または培養培地からＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含むＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを製造する方法。
（１６）  上記（１１）から（１３）いずれかの細胞を培養し、培養細胞を遠心分離、破砕し、改変糖鎖構造を有する糖鎖および糖質を得ることを特徴とする、糖鎖構造が改変された該糖鎖および糖質の製造方法。
（１７）  糖供与体としてＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
0004274792.tif 000006
で表される部分構造を有する複合糖質をそれぞれ基質とし、下記式：
0004274792.tif 000007
で表される糖ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離検出することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を測定する方法。
（１８）  上記（５）から（７）のいずれかのタンパク質を保持する酵母細胞。
（１９）  更にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体を保持する、上記（１８）の酵母細胞。
（２０）  上記（１０）の組み換え体ポリヌクレオチドを含み、ＫＲＥ２，ＫＴＲ１，ＫＴＲ３遺伝子のうちの１個〜３個の遺伝子が破壊されている、上記（１８）または（１９）の酵母細胞。
（２１）  上記（１８）から（２０）のいずれかの酵母細胞を培養し、培養細胞を遠心分離、破砕し、改変糖鎖構造を有する糖鎖および糖質を得ることを特徴とする、糖鎖構造が改変された該糖鎖および糖質の製造方法。
（２２）  前記糖鎖の改変がＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖を哺乳類型ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ構造へ変換する、上記（２１）の方法。
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドは、以下のようにして単離できる。
ヒトＧｎＴ−Ｉのアミノ酸配列に類似性のあるタンパク質の遺伝子をコードするＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）クローンをＢＬＡＳＴを用いてＤＮＡデータベースＧｅｎＢａｎｋで検索する。その結果の高度に類似性を示したクローンの塩基配列情報をもとにプライマーＤＮＡを作製し、ヒト組織（例えば脳）より抽出されたＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲおよびヒト組織から作製されたｃＤＮＡを用いた５’−ＲＡＣＥによってＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡの部分断片を増幅する。増幅された部分ｃＤＮＡの塩基配列は、例えばｐＣＲ−ＴＯＰＯ  ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などのプラスミドベクターに挿入して解析する。これらの塩基配列情報を統合して、ヒトＯＭＧｎＴをコードするｃＤＮＡの全塩基配列を決定する。次いでこのｃＤＮＡにコードされるＯＭＧｎＴポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。このようにして得られたヒトＯＭＧｎＴのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１および２に示した通りである。ヒトＯＭＧｎＴをコードするｃＤＮＡは、取得された部分断片を連結することによって作製することができる。また、ヒトＯＭＧｎＴをコードするｃＤＮＡは、ヒトＯＭＧｎＴの塩基配列情報をもとにプライマーＤＮＡを作製し、ヒト組織（例えば脳）より抽出されたＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによっても得ることができる。
配列番号２のアミノ酸配列あるいは配列番号２のアミノ酸配列のうち２４７：Ｓｅｒ〜６６０：Ｔｈｒの配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換された配列をコードするポリヌクレオチドを得るには、多くの方法を用いることができる。例えば、点変異または欠失変異を生じさせるためにヌクレオチドを変異原処理する方法；遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去または付加し、そして遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘発法等が挙げられる［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），１５．３−１５．１１３］。このような手法によって作製したポリヌクレオチドを発現させて得られるＯＭＧｎＴ変異体が活性を示せば、本発明開示のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドと同様に使用することができる。
ここで言う配列番号２のアミノ酸の変異（付加、欠失、挿入、および／または置換）の数が１もしくは複数とあるが、特に数に限定はない。少なくとも１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜数個または１〜１０個、最も好ましくは１〜３個である。
これら変異の数は実質的に該変異体がＯＭＧｎＴ活性を有する限りにおいて許容される。さらに、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてｐｏｓｉｔｉｖｅｓとして算出されるものである。
また、本発明のポリヌクレオチドには配列番号１に記載の塩基配列を有するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド以外に、該ポリヌクレオチド配列の全部または一部と厳格（ストリンジェント）な条件下でハイブリダイズすることにより取得されるポリヌクレオチド配列も含まれる。ここで厳格な条件として、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃での条件を挙げることができる。一般にイオン強度が低いほど、および／または温度が高いほど、ストリンジェンシーが高まることが知られている。はじめに低ストリンジェントまたは中ストリンジェントの条件でハイブリダイゼーションを行った後で、高ストリンジェントの条件で洗浄を行う場合にも、高ストリンジェンシーが達成できる。ハイブリダイゼーション条件については、たとえばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社製）に記載があり、これを参照することができる。
上記の方法により得られる本発明のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドを適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを作製し、それを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養することにより本発明のＯＭＧｎＴを製造することができる。用いられるプロモーターは、例えばヒトｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ由来プロモーターやサルｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ４０由来プロモーターである。用いられるベクターは、プラスミドでもバクテリオファージでもよい。例えば、後記の実施例に示されるベクター：ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることができる。また、ＯＭＧｎＴは本来膜貫通タンパク質であるので、Ｎ末端側の膜貫通領域を欠失させ、Ｉｇｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎの分泌シグナルに置換したタンパク質を発現させることによって、細胞外に可溶化型酵素として製造させることが可能である。組換え体ポリヌクレオチドを導入する宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞（動物細胞、酵母細胞、カビ細胞、昆虫細胞など）のように、遺伝子組換え技術で用いられる細胞ならば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、原核細胞としては大腸菌、真核細胞のうち動物細胞としては、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞、およびアフリカミドリサル腎臓由来のＣＯＳ細胞等の哺乳類細胞を用いることができる。
上記の形質転換は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。例えば、宿主が大腸菌であれば、塩化カルシウム法その他の方法により作製したコンピテント細胞に組換えポリヌクレオチドを含むベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導入することが可能である［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），１．７４−１．８５］。宿主が酵母細胞であれば、塩化リチウム法その他の方法により作製したコンピテント細胞に組換えポリヌクレオチドを含むベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導入することが可能である［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９１），１９４，１８２−１８７］。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組換え体ポリヌクレオチドを含むベクターをリン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法により導入することが可能である［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），１６．３０−１６．５５］。
このようにして得られた形質転換体を培地に培養することにより、ＯＭＧｎＴタンパク質を産生させることが可能である。形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては、それぞれの宿主が生育可能な培地ならば良い。例えば、宿主が大腸菌であればＬＢ培地などを用い、宿主が酵母であればＹＰＤ培地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＭＥＭに動物血清を加えたものなどを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。例えば、宿主が大腸菌ならば約３０〜３７℃で、約３〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることができる。宿主が酵母であれば約２５〜３７℃で、約１２時間〜２週間行い、必要により通気や撹拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれば約３２〜３７℃で、５％  ＣＯ２、１００％湿度の条件で約２４時間〜２週間行い、必要により気相の条件を変えたり撹拌を加えることができる。
培養後、培養菌体あるいは細胞をホモジェナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体または細胞を破壊し、菌体外にＯＭＧｎＴタンパク質を溶出させ、可溶性の画分から該タンパク質を得ることができる。また、目的のタンパク質が不溶性画分に含まれる場合は菌体または細胞を破壊後、遠心分離により不溶性画分を回収し、塩酸グアニジンなどを含む緩衝液などによって可溶性にして回収する方法も用いうる。このほか塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を含む緩衝液によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的のタンパク質を溶出させる方法もある。
上記の上澄み液からＯＭＧｎＴタンパク質を精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの方法としては、例えば遠心分離、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ＴＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などがある。
上記のようにして動物細胞で大量に発現させたＯＭＧｎＴ：酵素タンパク質の生化学的性質は以下の通りである。
（１）作用
糖供与体としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、糖受容体として下記式：
0004274792.tif 000008
で表される部分構造を有する複合糖質をそれぞれ基質とし、下記式：
0004274792.tif 000009
で表される部分構造を有する糖質を生成する。
糖受容体となる複合糖質は、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質およびそれらの誘導体（糖質）をいう。
（２）基質特異性
受容体となる糖質がｍａｎｎｏｓｙｌｎａｎｏｐｅｐｔｉｄｅの場合を１００％とすると、ｍａｎｎｏｓｅ、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｎｎｏｓｅには０％の反応性を示す。また、ＧｎＴ−Ｉの基質には０％の反応性を示す。
（３）分子量
ｃＤＮＡの塩基配列から、ＯＭＧｎＴは６６０アミノ酸残基からなる分子量約７１．５Ｋのタンパク質であると考えられる。但し、ＯＭＧｎＴ活性にはＣ末端側の４１４アミノ酸残基からなる分子量約５１．６Ｋのタンパク質で十分である。
（４）２価カチオン要求性
活性発現に２価カチオンが必須である。２価カチオンの中では、Ｍｎ２＋が最大の効果を示し、１０ｍＭ濃度下Ｍｇ２＋ではＭｎ２＋の約４０％程度、Ｃａ２＋では同じく約１５％程度の効果があった。Ｍｎ２＋の効果は１〜１０ｍＭの範囲で最大である。
（５）速度定数
０．４ｍＭ  Ｍａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ、７．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２，２００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ，０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％  ＢＳＡを含む１２５ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー，ｐＨ７．３で３７℃、２時間反応させるアッセイ条件で、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する見かけのＫｍ値は０．７３ｍＭである。一方、０．２ｎｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含む同様のアッセイ条件で、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）のＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するＫｍ値は１．８５ｍＭである。また、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する見かけのＫｍ値およびＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するＫｍ値は、それぞれ０．５７ｍＭ、１．３６ｍＭである。
（６）他のタンパク質との相同性
本発明のヒトＯＭＧｎＴポリヌクレオチドがコードするタンパク質はヒトＧｎＴ−Ｉタンパク質とアミノ酸レベルで２４．４％の同一性がある。しかし、ＯＭＧｎＴはＧｎＴ−Ｉ活性をもたず、ＧｎＴ−ＩもＯＭＧｎＴ活性をもたない。また、６６０アミノ酸からなるＯＭＧｎＴは、４４５アミノ酸からなるＧｎＴ−Ｉよりも１１５アミノ酸長く、特にＮ末端側の領域がより長い点が大きく異なる。
以上の生化学的性質により、本発明のＯＭＧｎＴは、従来の糖転移酵素では行うことのできなかった下記式の反応を行いうる点において、新規糖転移酵素と認定した。
0004274792.tif 000010
哺乳類細胞のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖および糖タンパク質を製造する酵母変異株は、以下のようにして作製することができる。
まず、外来ポリヌクレオチドを導入するための栄養要求性変異形質を保持し、かつ酵母特有の外糖鎖生合成系遺伝子が破壊された酵母変異株を作製する。ＫＲＥ２、ＫＴＲ１、ＫＴＲ３などの標的遺伝子の破壊には、それらのＤＮＡ断片が必要であるが、該ＤＮＡの塩基配列情報および染色体上の配座はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムプロジェクトにより明らかである［Ｍｅｗｅｓ．Ｈ．Ｗ．，Ａｌｂｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂａｈｒ，Ｍ．，Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｄ．，Ｇｌｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｈａｎｉ，Ｊ．，Ｈｅｕｍａｎｎ，Ｋ．，Ｋｌｅｉｎｅ，Ｋ．，Ｍａｉｅｒｌ，Ａ．，Ｏｌｉｖｅｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｚｏｌｌｎｅｒ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９７），３８７（ｓｕｐｐｌ．），７−８］。したがって、米国ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）など公的な機関から標的遺伝子の近傍を含む断片の分与を受けることが可能である［ＡＴＣＣ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３］。また、一般的手法にしたがってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからゲノムＤＮＡを抽出し、目的遺伝子を取得することも可能である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒらの方法［Ｃｒｙｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｅｃｃｌｅｓｈａｌｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（１９７５），１２，３９−４４］およびＰ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法［Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｐ．，Ｓｔｏｔｏｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｆ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９１），１９４，１６９−１８２］によって行なうことができる。さらに、標的遺伝子は塩基配列情報をもとにプライマーＤＮＡを作製し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅して得られる。
宿主酵母の栄養要求性変異形質を保持させたまま複数の標的遺伝子を破壊するためには、サルモネラ菌のｈｉｓＧ遺伝子ＤＮＡ断片がＵＲＡ３遺伝子の両端に結合されたｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧカセットを利用する方法が知られている［Ａｌａｎｉ，Ｅ．，Ｃａｏ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，Ｎ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９８７），１１６，５４１−５４５］。まず、ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧカセットを制限酵素を用いてプラスミド上の標的遺伝子に挿入し、破壊された対立遺伝子を含むプラスミドを構築する。このプラスミドをＵｒａ−の酵母に形質転換し、染色体の標的遺伝子と置換させることにより遺伝子破壊株を得る。プラスミドを酵母へ形質転換する方法としては、リチウム塩で処理して自然にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませる方法、あるいは電気的にＤＮＡを細胞内に導入する方法を採用できる［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９１），１９４，１８２−１８７］。染色体に挿入されたＵＲＡ３遺伝子はｈｉｓＧではさまれており、ｈｉｓＧ配列間での相同組み換えを起こし、１コピーのｈｉｓＧとともに染色体から自然に脱落することがある。この場合、染色体上の標的遺伝子にはなおも１コピーのｈｉｓＧ断片が残って破壊されたままであるが、宿主細胞は再びＵｒａ−表現形となる。Ｕｒａ３＋酵母株は５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）に感受性であるので［Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｒｕｅｈｅａｒｔ，Ｊ．，Ｎａｔｓｏｕｌｉｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９８７），１５４，１６５−１７４］、５−ＦＯＡを加えた培地で培養すれば目的のＵｒａ−酵母株を選択的に取得することができる。以上の結果、この酵母株の遺伝子破壊には再び栄養要求性変異形質のＵＲＡ３マーカーを用いることが可能である。例えば、この方法を繰り返し用いてＫＲＥ２、ＫＴＲ１、ＫＴＲ３を順次破壊すれば、Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖としてマンノースが１残基結合する栄養要求性三重破壊株（△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３）を取得できる。
このような栄養要求性三重破壊株に、本発明のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドを導入して発現させれば、酵母のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖を哺乳類で見られるＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒにすることができる。酵母固有のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖は哺乳類に対して免疫原性をもつが、この酵母変異株（ＯＭＧｎＴ，△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３）の糖鎖ではその点の改善が期待される。また栄養要求性を指標とせず、例えば薬剤耐性を付与する遺伝子をマーカーとし、酵母にＯＭＧｎＴ遺伝子を導入する場合には、既知の三重破壊株である酵母変異株（△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３）［Ｌｕｓｓｉｅｒ，Ｍ．，Ｓｄｉｃｕ，Ａ．Ｍ．，Ｂｕｓｓｅｒｅａｕ，Ｆ．，Ｊａｃｑｕｅｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｓｅｙ  Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２，１５５２７−１５５３１］を用いることも可能である。
さらに、この酵母変異株（ＯＭＧｎＴ，△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３）を宿主とすれば、Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖が哺乳類型（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ構造を有する［Ｃｈｉｂａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｉｎａｚｕ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｓ．，Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，２１５６−２１６２；Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９８），１４２５，５９９−６０６；Ｓｍａｌｈｅｉｓｅｒ，Ｎ．Ｒ．，Ｈａｓｌａｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｕｔｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｅｌｌ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９８），２７３，２３６９８−２３７０３；Ｙｕｅｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｃｈａｉ，Ｗ．，Ｌｏｖｅｌｅｓｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｆｅｉｚｉ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，８９２４−８９３１］）である有用な糖質を大量に製造することができる。このためには、酵母で機能するプロモーターの下流に目的の糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結し、相同組換えによって宿主酵母細胞に組み込む方法、あるいは、適当な発現プラスミドに挿入して宿主を形質転換する方法を利用する。得られた酵母株を公知の方法により培養すれば、酵母の細胞内または細胞外に目的の糖質が製造される。酵母の培養は、常法に従って行なうことができる。例えば、Ｄｉｆｃｏ社から供給される各種の培地成分を添加し、かつプラスミドの複製・保持に必要なマーカーによって供給可能となるアミノ酸を除いた合成培地（炭素源、窒素源、無機塩類、アミノ酸、ビタミン等を含む）等を利用できる［Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９１），１９４，３−２１］。培養物（培養液、培養菌体）から糖質を単離精製するためには、公知の分離・精製法を適切に行えばよい。例えば、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、公知のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子篩を用いたゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動等を単独あるいは組み合わせて用いれば、精製標品を得ることができる。
また、Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖が結合した糖質から糖鎖部分を遊離して調製する方法としては、希アルカリによるβ−脱離反応が知られている。例えば、上記精製により得られた糖タンパク質あるいは糖タンパク質を含む細胞を０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＢＨ４に溶解して４５℃で１８時間反応させ、糖鎖を遊離できる。さらに、４Ｎ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄでｐＨ６．０に調整した後、ＡＧ−５０Ｗ−Ｘ１２（Ｈ＋ｆｏｒｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラムに供し、素通り画分および水による洗浄画分を回収する。これをエバポレータで乾固させた後、ホウ酸がなくなるまでメタノール溶解と乾固の操作を繰り返す。得られたサンプルは、ペーパークロマトグラフィーやＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラムクロマトグラフィー等に供することにより分離精製することができる［Ｃｈｉｂａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｉｎａｚｕ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｓ．，Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７），２７２，２１５６−２１６２、Ｌｕｓｓｉｅｒ，Ｍ．，Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．，Ｓｄｉｃｕ，Ａ−Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｓｅｙ，Ｈ．，Ｙｅａｓｔ．（１９９３），９，１０５７−１０６３］。
実施例
以下に本発明を参考例および実施例によって説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されることはない。
（１）参考例および実施例に用いた試薬類
特に指定の無い試薬類は、シグマ製あるいは和光純薬製の最高グレードのものを使用した。また、制限酵素は宝酒造製のものを用いた。
（２）実施例に用いた機器類
ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）にはＡｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、さらに目的のＤＮＡ断片を増幅する際には、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。
また、遺伝子配列決定には、ＡＢＩ  ＰＬＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。
［参考例１］糖受容体Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（Ｍａｎ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（Ｍａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ）の調製
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｍａｎ）−ＯＨは次のように合成した。Ｎ−ｉｏｄｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅとｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄの存在下で、ｐｈｅｎｙｌ  ２，３，４，６，−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−１−ｔｈｉｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅとＮ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｂｅｎｚｙｌ  ｅｓｔｅｒ（Ｚ−Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ）を反応させ、ｂｅｎｚｙｌ基で保護されたＺ−Ｔｈｒ（Ｍａｎ（ＯＢｚｌ）４−ＯＢｚｌを７７％の回収率で得た。触媒による水素添加によって全てのｂｅｎｚｙｌ基とＺ基を脱保護した後、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを反応させＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｍａｎ）−ＯＨを７５％の回収率で得た。
Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（Ｍａｎ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２はＦｍｏｃ固相法により合成した［Ｍｉｚｕｏ，Ｍ．，Ｍｕｒａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｓｅｉｋｅ，Ｍ．，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｈａｎｅｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｉｎａｚｕ，Ｔ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，（１９９８），３９，５５−５８］。目的のＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅは、糖ペプチド樹脂から脱保護して得た粗標品をＧＬサイエンス社製Ｃ１８逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３，２０×２５０ｍｍ）によるカラムクロマトグラフィーで精製して得た。分離は、４５℃、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．１％  ＴＦＡ（溶液Ａ）と０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル（溶液Ｂ）を用いた濃度勾配によって行い、検出には２１４ｎｍを用いた。濃度勾配は２５ｍｉｎまで５％溶液Ｂで流した後、３５ｍｉｎまで直線的に溶液Ｂの濃度を上昇させ３５％にした。得られたＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅの構造は、１Ｈ−ＮＭＲ、アミノ酸組成分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって確認した。
［実施例１］ＯＭＧｎＴ活性の特異的測定法
これまでにＯＭＧｎＴ活性のアッセイ法は報告されていない。そこで、発明者らはＯＭＧｎＴ活性の新規測定法を開発し、以下の実施例に用いた。
０．４ｍＭ  Ｍａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ、０．２ｍＭ  ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（〜２２８，０００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＡＭＰ、２００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、２％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉｐａｉｎ、２μｇ／ｍｌ  ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、３μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、２μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含む１４０ｍＭ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ］バッファー（ｐＨ７．０）に酵素溶液を加えた反応液５０μｌを調製し、３７℃で３時間反応させた後、３分間煮沸して反応を止めた。０．２２μｍ孔のフィルターＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で固形物を除いた後、Ｗａｋｏｐａｋ  ５Ｃ１８−２００カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ，和光純薬社製）で分析した。分離は、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶液Ａと溶液Ｂを用いた濃度勾配によって行った。濃度勾配は１０ｍｉｎまで溶液Ｂの濃度を０％、３５ｍｉｎまで直線的に溶液Ｂの濃度を上昇させ２５％に、さらに４０ｍｉｎまで直線的に溶液Ｂの濃度を上昇させ１００％とした。ペプチドの検出には２１４ｎｍを用い、各フラクションの放射能は液体シンチレーションカウンターで測定した。
図２に典型的な結果を示した。３０分付近に溶出されたピークが反応産物の［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃが転移したＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅで、その放射能から活性を算出することができる。
この反応産物のＯ−結合型糖鎖の構造は以下の方法で調べた。反応産物を５００μｌの０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＢＨ４に溶解して４５℃で１８時間反応させ、ペプチドから糖鎖を遊離させた。４Ｎ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄでｐＨ５．０に調整した後、１ｍｌのＡＧ−５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ＋ｆｏｒｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラムに供し、素通り画分と１０ｍｌの水で洗浄した画分をまとめて回収した。これをエバポレーターで乾固させ、ホウ酸がなくなるまでメタノールで溶解と乾固の操作を繰り返した。得られたサンプルは６０℃でＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラムクロマトグラフィーに供し、放射能をもつ画分を回収した。この糖鎖をＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（Ｈｉｇｈ−ｐＨ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）で解析した［Ｋｏｔａｎｉ，Ｎ．ａｎｄ  Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｓ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９８），２６４，６６−７３］。分離は１５ｍＭ  ＮａＯＨを流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで流して行った。
図３に示したように、得られた糖鎖はＧｌｃＮＡｃβ１→２ＭａｎＯＨの溶出位置と完全に一致し、ＯＭＧｎＴはＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅにβ１→２結合でＧｌｃＮＡｃを転移することが確かめられた。
なお、ＧｌｃＮＡｃβ１→２ＭａｎＯＨはＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ（Ｄｅｘｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）をＮａＢＨ４で還元して調製した［Ｃｈｉｂａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｉｎａｚｕ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｓ．，Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅｎｄｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），２７２，２１５６−２１６２］。
［参考例２］ＧｎＴ−Ｉ活性測定法
ＧｎＴ−Ｉ活性は、以下に示した吉田らの方法［Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｎｏ，Ｓ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｉｋｅｎａｇａ，Ｈ．，Ｋｉｏｋａ，Ｎ．，Ｓａｋａｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｏｍａｎｏ，Ｔ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９９），９，５３−５８］によって測定した。酵素源を加えて終濃度が１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５μＭ  Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ５ＧＮ２−ＰＡ；宝酒造社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｏ１７）、１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ  ＡＭＰ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２％  ＢＳＡとなるよう反応液２０μｌを調製し、３７℃で１時間反応させた。沸騰水中で反応を停止させた後、Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製逆相ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ  ｃｏｌｕｍｎ）で分析した。
糖受容体をＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ３ＧＮ２−ＰＡ；宝酒造社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｏ１６）とした場合も同様の方法で解析した。
［実施例２］ＯＭＧｎＴ活性を有する酵素の調製および該酵素の２価カチオン要求性
（１）粗酵素の調製
動物組織または培養細胞１ｇに対して、９ｍｌの２μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉｐａｉｎ、２μｇ／ｍｌ  ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、３μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、２μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅを加え、ポッターホモジナイザー（井内社製デジタルホモジナイザー）でホモジナイズした。９００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清をさらに１００，０００ｘｇで１時間遠心分離し、ミクロソーム画分を沈殿として得た。可溶化した酵素を調製する場合には、この沈殿を５ｍＭ  ＡＭＰ、２００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、２％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉｐａｉｎ、２μｇ／ｍｌ  ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、３μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、２μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含む１４０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．０）（可溶化バッファーと呼ぶ）に懸濁して超音波処理した後、１００，０００ｘｇで１時間遠心分離して上清を用いた。
ＯＭＧｎＴは広く動物の臓器および細胞に存在する。例えば哺乳類では、ラット新生児の脳、ラットの脳、ブタの脳、ウシの脳、ラットｓｃｈｗａｎｎｏｍａ細胞ＲＴ−４、マウスｍｙｏｂｌａｓｔ細胞Ｃ２Ｃ１２から調製した酵素溶液を実施例１に記載した方法で調べたところ、いずれもＯＭＧｎＴ活性を示した（表１）。なお、タンパク質量は、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を標準物質として定量した。
0004274792.tif 000011
（２）２価カチオン要求性
表２に、ラット新生児の脳由来ＯＭＧｎＴを用いて酵素活性に対する２価カチオン要求性を調べた結果を示した。本酵素はＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）の添加で失活し、活性発現には２価カチオン（Ｍｎ２＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋）が必須であった。その効果はＭｎ２＋が最大で、Ｍｇ２＋がそれに次ぎ、Ｃａ２＋にも弱い効果が認められた。
0004274792.tif 000012
＊ＯＭＧｎＴ標品に１０ｍＭの各種金属イオンを添加してＯＭＧｎＴ活性を測定した。１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２添加の時のＯＭＧｎＴ活性を１００％として表示した。
［実施例３］ヒトＯＭＧｎＴ部分ｃＤＮＡの単離と塩基配列解析
（１）ヒトＧｎＴ−Ｉ相同体ｃＤＮＡの検索
ヒトＧｎＴ−Ｉと高い相同性をもつｃＤＮＡを含むＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）クローンをＢＬＡＳＴによってＧｅｎｅ  Ｂａｎｋで検索した。その結果、ＡＡ９１１２４８，Ｆ１１３７７，Ｗ７７８２６，Ｒ２００８６，ＡＡ４２２１８３を見い出した。さらに、これらｃＤＮＡとオーバーラップするｃＤＮＡを含むＥＳＴクローンを検索した結果、ＡＡ８４３６５２などが検出された。
これらのｃＤＮＡ配列を確認するために、ヒトの肝臓、肺、小腸、脳由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、プライマーｈＧｎＴｎ１  Ｆ１：ＧＡＣＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴ（配列番号３）とプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ１：ＧＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号４）にてＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子の増幅を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ヒトの肝臓、肺、小腸、脳由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したものを使用した。その結果、いずれのＲＮＡにおいても約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。ヒト脳のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｐＣＲ−ＴＯＰＯ  ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし、塩基配列を解析した。塩基配列決定は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてシーケンス反応後、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製３７７ＤＮＡシーケンサーによって解析した。その結果、１０６９ｂｐのｃＤＮＡ配列が明らかとなり、ＥＳＴのクローンを連結した配列とは７箇所が異なることが判明した。また、この配列にはヒトＧｎＴ−Ｉと高い相同性をもつアミノ酸配列がコードされていることが示唆された。
（２）ヒトＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡの取得
しかし、（１）で得られた配列にはストップコドンが見い出されなかった。そこで、下流の領域を取得するために、ヒト脳由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、プライマーｈＧｎＴｎ１  Ｆ３：ＣＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＴＣ（配列番号５）とプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ２：ＴＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣ（配列番号６）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅され、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ  ２．１にサブクローニングして塩基配列を解析したところ、ＥＳＴクローンで報告されている配列とは４箇所が異なる６９３ｂｐのｃＤＮＡ配列が明らかとなった。この配列には、ヒトＧｎＴ−Ｉと高い相同性をもつフレームにストップコドンが認められ、Ｃ末端側の遺伝子は完全に得られたと考えられた。
一方、上記のｃＤＮＡ領域には多くの糖転移酵素で認められる膜貫通ドメインが認められなかったことなどから、構造遺伝子のＮ末端側はカバーされていないと推定された。そこで、ヒト脳由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）を行った。ＰＣＲは２段階で行い、１回目はプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ１：ＧＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号４）とプライマーＡＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）：ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号７）、２回目はプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ５：ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧ（配列番号８）とプライマーＡＰ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）：ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ（配列番号９）を組み合わせて使用した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＴＯＰＯ  ２．１にサブクローニングして塩基配列を調べたところ、８２７ｂｐのｃＤＮＡ配列が明らかとなった。このｃＤＮＡ配列において、ヒトＧｎＴ−Ｉと高い相同性をもつフレームの上流部分でストップコドンが認められたので、ＡＴＧ（９５−９７）が開始メチオニンであると推定された。
以上のＲＴ−ＰＣＲおよび５’−ＲＡＣＥから、配列番号１に示したヒトＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡの塩基配列および配列番号２に示したヒトＯＭＧｎＴのアミノ酸配列が明らかとなった。ヒトＯＭＧｎＴは６６０個のアミノ酸からなるタンパク質で、２次構造予測およびハイドロパシー分析によれば、４３：Ａｌａ〜５９：Ｌｅｕの１７アミノ酸が膜貫通領域と推定されるｔｙｐｅ  ＩＩ型の膜タンパク質であると考えられる。
なお、ヒトＯＭＧｎＴをコードするｃＤＮＡの作製は、実施例５に記載した。
［実施例４］ヒトＯＭＧｎＴ可溶化型酵素の発現ベクター作製、発現、活性測定および諸性質
（１）可溶化型糖転移酵素の分泌発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏの作製  ヒトＯＭＧｎＴの可溶化型酵素を発現させるために、分泌発現ベクターを次のように構築した。ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をテンプレート、プライマーｐｃＤＮＡ  Ｆ：ＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣ（配列番号１０）とプライマーＩｇ−Ｈｉｓ  Ｒ：ＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＧＴＣＡＣ（配列番号１１）を用いたＰＣＲによって、Ｉｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ分泌シグナルのＤＮＡを増幅した。また、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をテンプレート、プライマーＩｇ−Ｈｉｓ  Ｆ：ＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号１２）とプライマーｐｃＤＮＡ  Ｒ：ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧ（配列番号１３）を用いたＰＣＲによって、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｘｐｒｅｓｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ、ｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅが連続した遺伝子を増幅した。さらに、これらのＰＣＲ産物を混合してテンプレートとし、プライマーｐｃＤＮＡ  Ｆ：ＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣ（配列番号１０）とプライマーｐｃＤＮＡ  Ｒ：ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧ（配列番号１３）を用いたＰＣＲによって、Ｉｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ分泌シグナル、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｘｐｒｅｓｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ、ｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅが連結したＤＮＡを増幅した。得られた約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をＳａｃＩ、ＡｐａＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣの同様の部位に挿入して分泌発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏを作製した。
（２）ヒトＯＭＧｎＴ可溶化型酵素の分泌発現ベクターｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏおよびｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｚｅｏの作製
ヒトＯＭＧｎＴの可溶化型酵素として、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）およびＨｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）の２種類をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で分泌発現させた。Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）はヒトＯＭＧｎＴ（配列番号２）の２４７：Ｓｅｒ以降の４１４アミノ酸（２４７：Ｓｅｒ〜６６０：Ｔｈｒ）、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）は６６：Ｓｅｒ以降の５９５アミノ酸（６６：Ｓｅｒ〜６６０：Ｔｈｒ）を各々含むタンパク質である。また、対照としてヒトＧｎＴ−Ｉの可溶化型酵素Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＧｎＴ−Ｉも同様に発現させた。これは、Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９０），８７，９９４８−９９５２に記載のＧｎＴ−１のアミノ酸配列中、３９：Ｓｅｒ以降の４０７アミノ酸を含むタンパク質である。
ヒト可溶化型ＯＭＧｎＴ（Ｓ）のｃＤＮＡは、ヒト脳由来のＲＮＡ、プライマーｈＧｎＴｎ１  Ｆ４：ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号１４）およびプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ４：ＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＴＣＡＴ（配列番号１５）を用いてＲＴ−ＰＣＲで増幅した。得られた約１．３ｋｂのＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏの同様の部位に挿入して発現プラスミドｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏを作製した。
ヒト可溶化型ＯＭＧｎＴ（Ｌ）の発現プラスミドｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｚｅｏは、次のように作製した。まず、ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏをＳａｃＩ、ＡｐａＩで消化してＩｇ−Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓＯＭＧｎＴをコードする約１．５ｋｂを取得した。このＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の同様の部位に挿入し、ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｚｅｏを構築した。次に、ヒト脳由来のＲＮＡ、プライマーｈＧｎＴｎ１  Ｆ６：ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧ（配列番号１６）およびプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ６：ＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＡＴＡＧＣ（配列番号１７）を用いてＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した。得られた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで消化し、ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｚｅｏの同様の部位に挿入して発現プラスミドｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｚｅｏを作製した。
（３）ヒトＧｎＴ−Ｉ可溶化型酵素の分泌発現ベクターｓＧｎＴ−Ｉ／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏの作製
ヒト可溶化型ＧｎＴ−ＩのｃＤＮＡは、ヒト脳由来のＲＮＡ、プライマーｈＧｎＴｌ  Ｆ１：ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＣＣ（配列番号１８）およびｈＧｎＴｌ  Ｒ１：ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡ（配列番号１９）を用いてＲＴ−ＰＣＲで増幅した。得られた約１．３ｋｂのＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏの同様の部位に挿入して発現プラスミドｓＧｎＴ−Ｉ／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｎｅｏを作製した。
（４）各種分泌発現ベクターの発現
各分泌発現プラスミドは、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過性発現させた。通常、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１０ｍＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社製）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／１００μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製＃１１９９５−０６５）で培養した。６ウェルプレートで５０−７０％コンフルエントの細胞に対して２μｇのプラスミドをリン酸カルシウム法でトランスフェクションし、１晩培養した後、培地を交換して４８時間培養した［Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．，Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９３），９０，８３９２−８３９６］。さらに、無血清培地に交換して４８時間培養後、培養上清を回収した。
（５）ヒトＯＭＧｎＴおよびヒトＧｎＴ−Ｉの可溶化型酵素のウエスタン解析
トランスフェクタントの無血清培地１００μｌをｍｉｃｒｏｃｏｎ−３０で１０μｌに濃縮して１５−２５％グラディエントゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）３１３，７５６−７６２］に基づいて実施した。電気泳動後、タンパク質はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）にトランスファーした。メンブランは１０％スキムミルクでブロッキングした後、１次抗体１／５０００  Ａｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２次抗体１／５０００  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  ｗｈｏｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）と反応させ、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出した。
図４に示した結果から、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＧｎＴ−Ｉの全てがほぼ等量発現していることが確認された。またＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動度から、各々の分子量はそれぞれ約５２、７６、および５２ＫＤａと算出された。
（６）ヒトＯＭＧｎＴおよびヒトＧｎＴ−Ｉの可溶化型酵素の酵素活性
実施例１に記載した方法により、無血清培地中のＯＭＧｎＴ活性を測定した。表３に示したように、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＧｎＴ−Ｉではほとんど活性が検出されなかったのに対し、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）およびＨｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）では有意に高いＯＭＧｎＴ活性が認められた。この結果より、配列番号１に示したＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡは糖転移酵素ＯＭＧｎＴをコードしており、２４７：Ｓｅｒ以降の４１４アミノ酸（２４７：Ｓｅｒ〜６６０：Ｔｈｒ）に酵素活性領域があることが確かめられた。また、この方法により本来膜結合型タンパク質であるＯＭＧｎＴの可溶化型酵素を細胞の培養上清に製造させることが可能であることが示された。
一方、参考例２に記載の方法により測定されたＧｎＴ−Ｉ活性については、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＧｎＴ−Ｉが５００ｐｍｏｌ／ｈｒ／ｍｌ  ｍｅｄｉｕｍの高い活性を示したのに対し、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）は共に全く活性を示さなかった。これらの結果から、ＯＭＧｎＴはＧｎＴ−Ｉ活性をもたないと考えられた。
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（７）ヒトＯＭＧｎＴの可溶化型酵素における基質特異性と速度定数
（７−１）基質特異性
表４に、ヒトＯＭＧｎＴの可溶化型酵素（Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）およびＨｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ））を用いて糖受容体に関する基質特異性を調べた結果を示した。これら２種類の可溶化型酵素は共にＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅを受容体とするが、Ｍａｎ、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｍａｎ、Ｍ５ＧＮ２−ＰＡ、Ｍ３ＧＮ２−ＰＡは受容体としない。Ｍａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅを受容体としたときの活性を１００％とすると、Ｍａｎ、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｍａｎ、Ｍ５ＧＮ２−ＰＡ、Ｍ３ＧＮ２−ＰＡに対しては、共に０％の反応性を示した。
0004274792.tif 000014
（７−２）速度定数
実施例２の測定法によって求められるＨｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）のＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するＫｍ値は１．８５ｍＭ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する見かけのＫｍ値は０．７３ｍＭであった。また、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）のＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するＫｍ値は１．３６ｍＭ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する見かけのＫｍ値は０．５７ｍＭであった。
［実施例５］ヒト全長ＯＭＧｎＴ発現プラスミドの作製、ＯＭＧｎＴ活性強化細胞の調製および該細胞での活性測定
（１）ヒトＯＭＧｎＴ発現プラスミドＯＭＧｎＴ／ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏの作製
ヒトＯＭＧｎＴのＮ末端側領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト脳由来のＲＮＡ、プライマーｈＧｎＴｎ１  Ｆ５：ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＡＣＴＧＧ（配列番号２０）およびプライマーｈＧｎＴｎ１  Ｒ６：ＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＡＴＡＧＣ（配列番号１７）を用いてＲＴ−ＰＣＲで増幅した。得られた約０．９ｋｂのＤＮＡ断片は、ＮｈｅＩとＰｓｔＩで消化し、ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）／ｐｃＤＮＡ３．１  ＩＨＸｚｅｏの同様の部位に挿入して発現プラスミドＯＭＧｎＴ／ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏを作製した。このプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）のＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ部位にヒトＯＭＧｎＴの全長をコードする約２．０ｋｂのｃＤＮＡが挿入されたと言い換えることができる。
（２）ヒトＯＭＧｎＴの発現および活性の測定
発現プラスミドは、実施例３記載の方法と同様にしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過性発現させた。１０ｃｍシャーレで５０−７０％コンフルエントの細胞に対して１５μｇのプラスミドをトランスフェクションした。１晩培養した後に培地交換を行い、４８時間培養後、細胞を回収した。
実施例２記載の方法により、細胞からミクロソーム画分を調製し、可溶画分および不溶画分のＯＭＧｎＴ活性を実施例１記載の方法で測定した。結果を表５に示す。
ＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡトランスフェクタントでは、可溶画分と不溶画分の両方でプラスミドをトランスフェクトしなかったコントロール（プラスミドなし）に対して、それぞれ約１２０および約１４０倍の高い活性が検出された。この結果より、配列番号１に示したＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡは糖転移酵素ＯＭＧｎＴをコードしていることが確認された。さらに、ＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡトランスフェクタントから調製したミクロソーム画分を界面活性剤存在下で超音波処理しても不溶画分に高い活性が認められることから、ＯＭＧｎＴはアミノ酸配列から予想される通り膜タンパク質であることが示された。また、弱いＯＭＧｎＴ活性がコントロール（プラスミドなし）の可溶画分および不溶画分で検出された。このことは、実施例２で述べたようにＯＭＧｎＴが広く動物細胞に存在し、酵素源となりうることを示す。
以上のように、ＯＭＧｎＴ  ｃＤＮＡを細胞に導入すれば、ＯＭＧｎＴ活性を強化した細胞の作出が可能である。
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［実施例６］出芽酵母におけるＯＭＧｎＴの発現および活性測定
（１）ＯＭＧｎＴ発現ベクターの構築
ＯＭＧｎＴタンパク質の発現を確認するため、水疱性口内炎ウィルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ配列（Ｋｒｅｉｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，９３１−９４１（１９８６））をタグとしてＮ末端に付加したＯＭＧｎＴを発現するベクターを構築した。すなわち、まず［実施例５］で作製したＯＭＧｎＴ／ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏからＫｐｎＩとＸｈｏＩでＯＭＧｎＴの酵素活性領域を切り出し、酵母発現用ベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰ（Ｋａｉｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，１３３−１４１（１９９９））のＫｐｎＩとＸｈｏＩ間に挿入した。これをＹＥｐ３５２−ＯＭＧｎＴ１と命名した。次にプライマーＹＦ１（ＴＧＡＡＴＡＧＡＴＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣ：配列番号２１）とプライマーＹＲ１（ＣＣＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣ；配列番号２２）を用いて、ＯＭＧｎＴ／ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏを鋳型にしＶＳＶ−ＧエピトープがＮ末端に付加したＯＭＧｎＴの部分タンパク質をコードするキメラ遺伝子を増幅した。さらに、このＤＮＡ断片を鋳型にして、プライマーＹＦ２（ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＡＴＴＧＧＧＴＡＡＧ：配列番号２３）と上記プライマーＹＲ１を用いてＰＣＲ法により増幅を行ない、ＥｃｏＲＩ部位を導入した。配列を確認後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで処理し、ＹＥｐ３５２−ＯＭＧｎＴ１のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位に挿入し、目的の発現ベクターＹＥｐ−ＯＭＧｎＴを完成させた。
また、酵母での発現量を向上させ、かつゴルジ体に効率良く局在させるため、酵母のα−１，６−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）（Ｎａｋａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，２５１１−２５１９（１９９２））の膜貫通領域部分とＯＭＧｎＴの酵素活性領域をコードするキメラ遺伝子を作製した。すなわち、まずプライマーＹＦ３（ＴＧＡＡＴＡＧＡＴＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＣ：配列番号２４）とプライマーＹＲ２（ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧ：配列番号２５）を用いて、Ｗ３０３−１ＡのゲノムＤＮＡを鋳型にし、ＯＣＨ１タンパク質の膜貫通領域部分（Ｍｅｔ１〜Ｌｅｕ６４）にＶＳＶ−Ｇエピトープが付加するようなタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ−ＯｃｈｌｐＴＭ−ＯＭＧｎＴ）をコードするキメラ遺伝子を増幅した。次にこのＤＮＡ断片を鋳型にして、上記プライマーＹＦ２と上記プライマーＹＲ１を用いてＰＣＲ法により増幅を行ない、ＥｃｏＲＩ部位を導入した。配列を確認後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで処理し、ＹＥｐ３５２−ＯＭＧｎＴ１のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位に挿入した。このプラスミドをＹＥｐ−ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴとした。
２種類のプラスミドＹＥｐ−ＯＭＧｎＴとＹＥｐ−ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴは各々宿主の出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ）に酢酸リチウム法で形質転換した。形質転換後、ＳＤ−Ｕｒａ培地のプレートにまいて、３０°Ｃで２日間培養し、各々の形質転換体を得た。ＹＥｐ−ＯＭＧｎＴを有する株をＳＳＹ１、ＹＥｐ−ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴを有する株をＳＳＹ２と命名した。
（２）出芽酵母におけるＯＭＧｎＴの発現確認と活性測定
出芽酵母におけるＯＭＧｎＴ発現の確認はｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いて行なった。
まず、得られた形質転換体を５００ｍｌのＳＤ−Ｕｒａ溶液で液体培養し、集菌した。冷水で洗浄後、スフェロプラスト培地（１Ｍソルビトールを含む５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５））５．７ｍｌに懸濁し、２−メルカプトエタノール９μｌと１２ｍｇのＺｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔを３００μｌのスフェロプラスト培地に溶解し加え、３０℃、４５分間保温した。１Ｍソルビトール１５ｍｌを加え、遠心後、沈殿を再び１Ｍソルビトール１５ｍｌで洗浄、集菌した。この沈殿にｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭソルビトール、２μｇ／ｍｌアンチパイン、２μｇ／ｍｌキモスタチン、３μｇ／ｍｌロイペプチン、３μｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）溶液）を４ｍｌ加え、ホモジナイザーで細胞を破壊し、２２０ｘｇで遠心して上清を回収した。この上清を１０，０００ｘｇで遠心し、その沈殿画分をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  １５０μｌに懸濁し、Ｐ２画分とした。上清についてはさらに１００，０００ｘｇで遠心し、その沈殿画分をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  １５０μｌに懸濁し、Ｐ３画分とした。
タンパク質量５０μｇのＰ２，Ｐ３画分それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写して常法に従いｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析を行なった。なお一次抗体はマウス抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、二次抗体にはラビット抗マウスＩｇ抗体アルカリフォスファターゼ複合体（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を用い、検出はＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を基質としてＸ線フィルムに露光することで行なった。その結果を図５に示した。ベクターのみの株に比べ、Ｗ３０３−１Ａ／ＹＥｐ−ＯＭＧｎＴでは数本の、Ｗ３０３−１Ａ／ＹＥｐ−ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴでは１本のシグナルが見られたが、Ｗ３０３−１Ａ／ＹＥｐ−ＯＭＧｎＴのほうがシグナルは強かった。また、いずれにおいても細胞内の小胞体等を含むＰ２画分に強いシグナルが見られた。
次にそれぞれのＰ２，Ｐ３画分についてＯＭＧｎＴ活性を測定した。なお活性測定は［実施例１］に示した方法で行なった。その結果を表６に示した。ベクターのみのコントロールが全く活性を示さなかったのに対し、ＳＳＹ１，ＳＳＹ２はともに明確なＯＭＧｎＴ活性を示した。また、いずれの株においてもＰ２画分にＰ３画分よりも多くの活性が検出された。
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これらの結果より、活性をもつＯＭＧｎＴタンパク質が酵母内で発現可能であることが確認された。また、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔと活性測定の結果を考え合わせると、ＯＭＧｎＴの発現量の低いＳＳＹ２のＯＭＧｎＴ比活性が高いと考えられた。よって以後の実施例はＯＣＨ１とのキメラ遺伝子を用いて行なった。
［実施例７］酵母特異的Ｏ−結合Ｍａｎ型糖鎖を欠損した酵母変異株（△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３マーカー保持型三重破壊株）の育種
（１）△ｋｒｅ２マーカー保持型破壊株の作製とその性質
すでに報告のあるｐＮＫ５１（Ａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１６，５４１−５４５（１９８７））より、ＵＲＡ３遺伝子の両端にサルモネラ菌ｈｉｓＧ遺伝子がダイレクトリピートで結合しているカセット（ＨＵＨ）をＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで切断し、大腸菌プラスミドｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。このプラスミドをｐＳＰ７３−ＨＵＨと命名した。
次に、ｐＳＰ７３−ＨＵＨをテンプレートとしてＨＵＨカセットの両末端にＫＲＥ２遺伝子の一部が付加したＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。付加したＫＲＥ２遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにＸ６２６４７で登録されており（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３０，２７３−２８３（１９９２））、ｈｉｓＧの外側にＫＲＥ２遺伝子の＋４１〜＋８０領域（下線で示した）を付加したプライマーＹＦ４（ＴＣＡＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ：配列番号２６）と、同じくＫＲＥ２遺伝子の＋１３１７〜＋１２７８領域（下線で示した）を付加したプライマーＹＲ３（ＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ：配列番号２７）を使用した。このＰＣＲ産物（△ｋｒｅ２：：ＨＵＨ）を用いてＷ３０３−１Ａ（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２  ｈｉｓ３−１１，１５  ａｄｅ２−１  ｕｒａ３−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００）を酢酸リチウム法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））で形質転換した。形質転換後、０．３  Ｍ  ＫＣｌを含むＳＤ−Ｕｒａ（２％グルコース、０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、ウラシルを除く核酸塩基、およびアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ））培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。
形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、上記のプライマーＹＦ４とＹＲ３を用いてＰＣＲ法によりウラシルマーカーがＫＲＥ２領域の染色体に組込まれていることを確認し、ＳＳＹ３株とした。
本株を、５−ＦＯＡを含有したＹＳＤ培地（１％酵母抽出液、２％グルコース、アデニン（４０ｍｇ／Ｌ）、ウラシル（２０ｍｇ／Ｌ））にて選抜を行ない、ＵＲＡ３遺伝子脱落株を得た。上記の方法と同様にＰＣＲ法を用いてＵＲＡ３遺伝子を脱落させたｋｒｅ２破壊株を確認した。△ｋｒｅ２：：ｈｉｓＧを含む本株をＳＳＹ４株とした。
（２）△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１マーカー保持型二重破壊株の作製とその性質
ＫＴＲ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにＸ６２９４１で登録されている（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３０，２７３−２８３（１９９２））。Ｗ３０３−１ＡのゲノムＤＮＡを鋳型にし、ＫＴＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（−１６３〜−１３９）をコードするプライマーＹＦ５（ＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣ：配列番号２８）と３’非翻訳領域（＋１３７２〜＋１３４８）をコードするプライマーＹＲ４（ＧＧＴＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣ：配列番号２９）を用いて、ＫＴＲ１遺伝子をＰＣＲで増幅した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣ１１８−ＫＴＲ１を作製した。本プラスミドをＫＴＲ１内部にある２ヶ所のＢｇｌＩＩ部位で切断後、ｐＳＰ７３−ＨＵＨからＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩで切断したＨＵＨ断片を挿入した。このプラスミドをｐＵＣ１１８−△ｋｔｒ１：：ＨＵＨと命名した。このプラスミドを再度上記のプライマーＹＦ５とプライマーＹＲ４でＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ断片を用いて、ＳＳＹ４株を酢酸リチウム法を用いて形質転換した。形質転換後、０．３  Ｍ  ＫＣｌを含むＳＤ−Ｕｒａ培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。
形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、上記のプライマーＹＦ５とＹＲ４を用いてＰＣＲ法によりウラシルマーカーがＫＴＲ１領域の染色体に組込まれていることを確認し、ＳＳＹ１３株とした。
本株を、５−ＦＯＡを含有したＹＳＤ培地にて選抜を行ない、ＵＲＡ３遺伝子脱落株を得た。上記の方法と同様にＰＣＲ法を用いてＵＲＡ３遺伝子を脱落させたｋｔｒ１破壊株を確認した。（△ｋｒｅ２：：ｈｉｓＧ，△ｋｔｒ１：：ｈｉｓＧ）を含む本株をＳＳＹ１４株とした。
（３）△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３マーカー保持型三重破壊株の作製
ＫＴＲ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにＺ３６０７４で登録されている（Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３，５７９５−５８０９（１９９４））。Ｗ３０３−１ＡのゲノムＤＮＡを鋳型にし、ｋｔｒ１遺伝子の５’非翻訳領域（−９５〜−７１）をコードするプライマーＹＦ６（ＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＧ：配列番号３０）と３’非翻訳領域（＋１３８５〜＋１３６１）をコードするプライマーＹＲ５（ＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＧ：配列番号３１）を用いて、ＫＴＲ３遺伝子をＰＣＲで増幅した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣ１１８−ＫＴＲ３を作製した。本プラスミドをＫＴＲ３内部にある２ヶ所のＥｃｏＲＶ部位で切断後、ｐＳＰ７３−ＨＵＨからＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑末端化したＨＵＨ断片を挿入した。このプラスミドをｐＵＣ１１８−△ｋｔｒ３：：ＨＵＨと命名した。このプラスミドを再度上記のプライマーＹＦ６とプライマーＹＲ５でＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ断片を用いて、ＳＳＹ１４株を酢酸リチウム法を用いて形質転換した。形質転換後、０．３  Ｍ  ＫＣｌを含むＳＤ−Ｕｒａ培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。
形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、上記のプライマーＹＦ６とＹＲ５を用いてＰＣＲ法によりウラシルマーカーが△ｋｔｒ３領域の染色体に組込まれていることを確認し、ＳＳＹ１７株とした。
本株を、５−ＦＯＡと０．３  Ｍ  ＫＣｌを含むＹＳＤ培地にて選抜を行ない、ＵＲＡ３遺伝子脱落株を得た。上記の方法と同様にＰＣＲ法を用いてＵＲＡ３遺伝子を脱落させたｋｔｒ３破壊株を確認した。（△ｋｒｅ２：：ｈｉｓＧ，△ｋｔｒ１：：ｈｉｓＧ，△ｋｔｒ３：：ｈｉｓＧ）を含む本株をＳＳＹ１８株とした。
［実施例８］△ｋｒｅ２△ｋｔｒ１△ｋｔｒ３マーカー保持型三重破壊株におけるＯＭＧｎＴ融合タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ−Ｏｃｈ１ｐＴＭ−ＯＭＧｎＴ）の発現と細胞表層マンナンタンパク質の糖鎖構造解析
（１）ＯＭＧｎＴ発現ベクター（染色体導入型）の構築とＳＳＹ１８株への導入
［実施例７］で作製したＹＥｐ−ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴから、ＶＳＶ−Ｇ−Ｏｃｈ１ｐＴＭ−ＯＭＧｎＴをコードする領域ならびにプロモーター、ターミネーターの領域をＢａｍＨＩで切りだした。これを染色体導入型ベクターのｐＲＳ４０３（ＨＩＳ３マーカー；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入した後、ＨＩＳ３内部のＮｈｅＩで切断し直鎖状にした。このＤＮＡ断片を用いてＳＳＹ１８株の形質転換を行なった。この形質転換は、ＳＳＹ１８株染色体のＨＩＳ３と相同的組み換えを起こすことにより目的遺伝子を１コピー染色体上へ導入するものである。形質転換は［実施例６］に従って行ない、形質転換体を得た。形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＹＦ７（ＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧ：配列番号３２）とプライマーＹＲ６（ＣＡＣＡＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＴＣ：配列番号３３）を用いてＰＣＲ法によって目的遺伝子のゲノム上への挿入の確認を行なった。遺伝子がＨＩＳ３ｌｏｃｕｓに１コピー導入されていることはプライマーＹＦ８（ＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＣＧ：配列番号３４）と上記プライマーＹＲ６を用いてＰＣＲ法によって確認した。この形質転換体をＳＳＹ１１株とした。
（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ｈＵＧＴｒｅ１２）遺伝子の導入
出芽酵母の糖タンパク質中の糖鎖は主にマンノースから合成されており、ゴルジ体でのＧｌｃＮＡｃ付加は起こらないと考えられている。従ってＯＭＧｎＴの糖供与体であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃがゴルジ体内に不足している可能性が考えられた。そこでヒトにおいて細胞質からゴルジ体へＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを輸送することが明らかとなっているヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子（ｈＵＧＴｒｅ１２）を導入した。ｈＵＧＴｒｅ１２の酵母での発現は石田らによって報告されている（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２６，６８−７７（１９９９））。この発現用ベクターをテンプレートにして、プライマーＹＦ９（ＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴＡＡ：配列番号３５）とプライマーＹＲ７（ＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣ：配列番号３６）でＰＣＲ法によりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子領域を増幅した。この配列を確認後、ＮｏｔＩとＳａｌＩで切断し、発現ベクターｐＧ３−Ｎ（Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０８，４０５−４０９（１９９５））のＮｏｔＩとＳａｌＩ部位間と置換した。次にこのプラスミドからＮａｅＩとＳｍａＩで、プロモーター領域を含むＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子断片を切り出し、染色体導入型ベクターのｐＲＳ４０４（ＴＲＰ１マーカー；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＳｍａＩ部位に挿入した後、ＴＲＰ１内部のＢｓｔＸＩで切断し直鎖状にした。このＤＮＡ断片を用いてＳＳＹ１１株の形質転換を行なった。形質転換は［実施例６］に従って行ない、形質転換体を得た。形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＹＦ１０（ＴＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＣ：配列番号３７）とプライマーＹＲ８（ＴＡＡＧＴＧＣＡＣＴＡＧＧＧＴＣＣＧＧＴＴＡＡＡＣ：配列番号３８）を用いてＰＣＲ法によって目的遺伝子のゲノム上への挿入の確認を行なった。遺伝子がＨＩＳ３  ｌｏｃｕｓに１コピー導入されていることはプライマーＹＦ１１（ＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴＴＴＣＴＡＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣ：配列番号３９）と上記プライマーＹＲ８を用いてＰＣＲ法によって確認した。この形質転換体をＳＳＹ１２株とした。
（３）酵母細胞表層マンナンタンパク質の分離とそのＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖の構造解析
酵母細胞表層マンナンタンパク質の分離はＣｈｉｂａらの方法（Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２６２９８−２６３０４（１９９８））にて、そのＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖はＩｗａｓｅらの方法（Ｉｗａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０６，２０２−２０５（１９９２））に基づいて行なった。各種酵母株を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れた０．３  Ｍ  ＫＣｌを含むＹＰＡＤ培地１５０ｍｌにおいて、３０℃で２４時間培養し、菌体を遠心分離によって集めた。これを２ｍｌの２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、オートクレーブ中で１２１℃、１時間加熱した。冷却後、遠心分離し、上清を取り、固形物は、もう一度２ｍｌの２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて同様に加熱、遠心分離し、上清を集めた。全抽出液を合わせて、３倍量のエタノール中に注加した。生じた白色の沈殿物を乾燥させた。これを１ｍｌのＨ２Ｏに懸濁し、Ｈ２Ｏに対して透析後、凍結乾燥しマンナンタンパク質を得た。
次に得られたマンナンタンパク質に対し、ヒドラジン分解法でＯ−結合型糖鎖を分離した。ヒドラジン分解はヒドラクラブ（ホーネン社製）を用いて行ない、方法はマニュアルにしたがった。分解条件は６５°Ｃ，３時間とした。分解後、再度Ｎ−アセチル化を行なった後、減圧乾固しＯ−結合型糖鎖調製品とした。
得られた糖鎖に対し蛍光標識（ピリジルアミノ化、ＰＡ化という）を行なった。ＰＡ化はＰＡＬ  Ｓｔａｔｉｏｎ（宝酒造社製）を用いて行ない、方法はマニュアルにしたがった。反応後の糖鎖を５００μｌのＨ２Ｏに懸濁し、粗ＰＡ化オリゴ糖調製品とした。
粗サンプルについては、未反応の２−アミノピリジンを除去するため、アンモニア水を２００μｌ加えた後、さらに等量になるようにフェノール：クロロホルム（１：１）を加え、激しく振盪してＰＡ化オリゴ糖を含む水層を回収した。これを７回繰り返し、未反応の２−アミノピリジンを除去した。上清について０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＰＡ化オリゴ糖調製品とした。
Ｏ−結合型糖鎖へのＧｌｃＮＡｃ転移を確認するため、得られたＰＡ化オリゴ糖調製品をＪａｃｋ  ｂｅａｎ（タチナタマメ）のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（生化学工業社製）で消化して解析した。ＰＡ化オリゴ糖調製品２０μｌを減圧乾固した後、１７．８μｌのＨ２Ｏにけん濁、１Ｍ  ＮａＯＡｃ  ０．２μｌ、ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ  ２μｌ（２０ｍＵ）を加えて、３７℃で一晩反応した。１００°Ｃ、５分処理して反応停止後、０．２２μｍのフィルターを通し、ＨＰＬＣで分析した。
アミノカラムを用いたＨＰＬＣにより、ＰＡ化オリゴ糖は鎖長の違いで分離することが可能である。カラムはＳＨＯＤＥＸ  ＡｓａｈｉＰａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（４．６ｘ２５０ｍｍ、昭和電工社製）を使用し、溶媒は、２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）とアセトニトリルとの１０：９０の混合液（Ａ液）、２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）とアセトニトリルとの４０：６０の混合液（Ｂ液）を用いた。予め溶媒Ａを流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒Ｂの割合を６０分かけて１００％まで直線的に上昇させ、ＰＡ化オリゴ糖を分離した。
ＯＭＧｎＴ発現株（ＳＳＹ１１株、ＳＳＹ１２株）および親株から調製したＰＡ化オリゴ糖調製品の構造解析結果を図６（Ａ，Ｃ，Ｅ）に示した。ＳＳＹ１１株およびＳＳＹ１２株には、親株では認められなかったＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃの明確なピークが検出された。Ｍａｎ−Ｍａｎ（Ｍ２）を基準とすると、Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃの生産量はＳＳＹ１２株の方がＳＳＹ１１株よりも多かった。さらにＪａｃｋ  ｂｅａｎのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで消化すると、Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃのピークは顕著に減少し、ＧｌｃＮＡｃがβ結合していることが確かめられた（図６、Ｄ，Ｆ）。これらの結果と先に実施例４で示したＯＭＧｎＴの酵素学的性質を勘案すれば、ＯＭＧｎＴを発現させることによって、酵母細胞壁のＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖は哺乳類型のＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ構造に変換できたと言える。
産業上の利用可能性
本発明によれば、新規なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＯＭＧｎＴ）、その可溶化型酵素、およびそれらの活性測定方法、製造方法ならびに該酵素をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のＯＭＧｎＴにより、既知の糖転移酵素では形成できなかった複合糖質を生産することが可能となり、複合糖質性の医薬品、試薬、および食品の製造や改良に役立つとともに、あらゆる生体高分子の表面糖鎖構造の改変や解析に有用である。
また本発明のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドは、形態異常、神経疾患などの病変の診断や治療、および微生物や動物等を利用した複合糖質製品の糖鎖構造の改変に有用である。
さらに、本発明のＯＭＧｎＴタンパク質を抗原として得られる抗体・抗血清、あるいは本発明のＯＭＧｎＴをコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブに用いれば、動物各組織、血液、血球成分、培養細胞、および微生物等のキャラクタライズが可能であり、形態異常や神経疾患などの病変の検出および診断等に有用である。
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本発明の説明のために多数の参考文献を引用したが、それらの開示の全体を本明細書に参照として取り入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＯ−結合Ｍａｎ型糖鎖生合成経路を示す。
図２は、逆相ＨＰＬＣによるＯＭＧｎＴ活性測定を示す。
パネルＡはラット脳由来のミクロソーム画分を反応液に添加して転移反応を行なった場合のパターン、パネルＢは添加しない場合のパターンである。［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃが転移したＭａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅの溶出位置をパネルＡ中に矢印で示した。点線は、アセトニトリルの濃度勾配（％）を示す。
図３は、ＯＭＧｎＴ反応生成物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる糖鎖構造解析を示す。
図中の矢印Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩは、それぞれＧｌｃＮＡｃβ１→６ＭａｎＯＨ、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎＯＨとＧｌｃＮＡｃβ１→３ＭａｎＯＨ、ＧｌｃＮＡｃβ１→２ＭａｎＯＨの溶出位置を示す。
図４は、動物細胞で発現した可溶化型酵素Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｓ）、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＯＭＧｎＴ（Ｌ）、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｓＧｎＴ−Ｉのウエスタンブロット解析を示す。
図５は、酵母細胞で発現した膜結合型ＯＭＧｎＴ、ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴのウエスタンブロット解析を示す。Ｐ２，Ｐ３，ｓｕｐはそれぞれ１０，０００×ｇで遠心した沈殿画分、１００，０００×ｇで遠心した沈殿画分、１００，０００×ｇで遠心した上清画分を表す。膜結合型ＯＭＧｎＴ、ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴそれぞれの発現した位置を矢印で示した。
図６は、酵母細胞表層マンナンタンパク質から得られたＯ−結合型糖鎖の順相ＨＰＬＣによる糖鎖構造解析を示す。パネルＡは親株（ＳＳＹ１８）の糖鎖構造解析の結果を示し、パネルＢはその糖鎖をβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理したものである。パネルＣは膜結合型ＯＭＧｎＴをコードする遺伝子を導入した株（ＳＳＹ１１）の糖鎖構造解析の結果を示し、パネルＤはその糖鎖をβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理したものである。パネルＥは膜結合型ＯＣＨ１−ＯＭＧｎＴをコードする遺伝子を導入した株（ＳＳＹ１２）の糖鎖構造解析の結果を示し、パネルＦはその糖鎖をβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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