(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のＤＮＡ複製開始に不可欠なタンパク質複合体（ＯＲＣ）又はそのサブユニットのＯＲＣ１が、ゲノムＤＮＡの複製開始領域に結合するのを妨害するために、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有する制御因子タンパク質（ＡＬＦ−Ｃ）を用いるものであることを特徴とする、哺乳類のＤＮＡ複製の阻害方法。
【請求項２】
哺乳類のＤＮＡ複製開始に不可欠なタンパク質複合体（ＯＲＣ）又はそのサブユニットのＯＲＣ１が、ゲノムＤＮＡの複製開始領域に結合するのを妨害するために、配列表の配列番号２の第２４９番〜第２６３番のアミノ酸配列を有するペプチドを用いるものであることを特徴とする、哺乳類のＤＮＡ複製の阻害方法。
【請求項３】
配列表の配列番号２の第２４９番〜第２６３番に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項３のペプチドをコードするＤＮＡであって、配列表の配列番号１の第７４５番〜第７８０番に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
ＯＲＣ１タンパク質の部分ペプチドであって配列表の配列番号３の第２１０番〜第２３９番に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項６】
請求項５のペプチドをコードするＤＮＡであって、配列表の配列番号３の第６２８番〜第７１７番に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、哺乳類のＤＮＡ複製開始に不可欠なタンパク質複合体に特異的に結合してＤＮＡ複製を阻害する方法およびその物質に関し、その方法・物質の使用により、とくにがん細胞やウイルスのＤＮＡ複製を阻止して増殖を抑えることを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物の細胞は、その増殖の際にG1、S、G2、Mという４つの時期を正確にまわる。  これを細胞周期とよぶ。  真核生物が膨大な遺伝情報を正確に子孫に伝えるためには、遺伝子であるＤＮＡの複製は上記した４つの時期のうち、Ｓ期（細胞周期のＤＮＡ合成期）における１回の細胞分裂において完全にかつ一度だけ行われなければならず、その破綻は遺伝情報の欠落や過剰を起こし、細胞死あるいは異常増殖、癌化につながる可能性がある。
【０００３】
真核生物においては、ゲノムＤＮＡは複数の染色体に分割されており、ＤＮＡ複製は、それらの上の多数の複製開始点から行われる。  これは、進化において必要であった多大な遺伝情報を効率よく複製するためには有利であるが、一方で正確な複製を保証するための調節メカニズムは極めて巧妙、複雑になった。  このＤＮＡ複製調節メカニズムに関する知識の多くは、基本的に単純な真核生物である酵母における所見に帰依しており、高等哺乳類細胞における研究はその複雑性ゆえに遥かに遅れている。
【０００４】
真核生物のＤＮＡ複製開始は、染色体上の特異的部位である複製開始点からおこる。  複製開始複合体を形成するのに不可欠な蛋白質は「origin recognition complex」（以下、単に「ＯＲＣ」と略す）であり、この複合体は、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、ＯＲＣ５、ＯＲＣ６と呼ばれる６つのタンパク質からなる。  ＯＲＣは酵母から、植物、ヒトに至るまで保存されている。  上記した６種のＯＲＣがそれぞれ機能しないとＤＮＡの複製がおこらず、細胞分裂が停止する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒトなど哺乳類では、ＯＲＣが直接ＤＮＡに結合するという報告はなく、なぜ、特異領域から複製が始まるのか、またＤＮＡに対して６種のＯＲＣのうち、いずれのものが特に結合に関係するのか等について、未だに詳細はつかめておらず、世界的に盛んに研究が進められている。  このような複製のメカニズムを解明することは生命科学の知識として重要であるのみならず、細胞の癌化やウイルスの増殖機構を解明し、抗がん剤、抗感染症剤の画期的な開発に繋がる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記したように、ヒトなど哺乳類のＤＮＡ複製のメカニズムが今だ解明されていないことから、本発明においてはこれらメカニズムを解明し、がん細胞やウイルスの複製を阻害することができるならば抗腫瘍剤として、あるいは抗感染症剤その他の先端医療開発に画期的な福音をもたらすことはいうまでもない。
【０００７】
そこで我々はＤＮＡ複製開始に必要なＯＲＣ、とくに前記した６種のＯＲＣのいずれに対して強力な影響力を有しているとみられるＯＲＣ１を、適当なタンパク質の断片で遮蔽することによりＤＮＡ複製開始を阻害できるのではないか、と考えた。  このような真核生物のＤＮＡ複製を阻害する物質の発見のため、種々の研究と実験を重ねた。  その結果、ＯＲＣ複製開始領域に結合して遮蔽することができる新規蛋白質 Aldolase B transcription factor for site C （アルドラーゼ  Ｂ遺伝子プロモーターのサイトＣに作用する転写制御因子；以下単に「ALF-C」と略す）を発見するとともに、またその構造決定にも成功した。
【０００８】
さらに、このALF-C が哺乳類ＤＮＡの複製開始に関わると推測し、ヒトＯＲＣとの結合を解析したところ、ALF-C の結合に必要なＯＲＣ１の結合部位のアミノ酸配列（〜２０アミノ酸）を突き止めた。  また逆に、ＯＲＣ１の結合に必要なALF-C の結合部位のアミノ酸配列（〜２０アミノ酸）も決定した。  これら、ALF-C の結合に必要なヒトＯＲＣ１の結合部位のアミノ酸配列、およびヒトＯＲＣ１の結合に必要なALF-C の結合部位のアミノ酸配列は我々によって初めて見出されたものである。
【０００９】
本発明は、真核生物のＤＮＡ複製を特異的に阻害する方法およびその物質に関する。本発明の方法は、哺乳類のＤＮＡ複製開始に不可欠なタンパク質複合体（ＯＲＣ）又はそのサブユニットのＯＲＣ１が、ゲノムＤＮＡの複製開始領域に結合するのを妨害するために、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなる制御因子タンパク質（ＡＬＦ−Ｃ）を用いるものであることを特徴とする、哺乳類のＤＮＡ複製の阻害方法に関する。また本発明の方法は、哺乳類のＤＮＡ複製開始に不可欠なタンパク質複合体（ＯＲＣ）又はそのサブユニットのＯＲＣ１が、ゲノムＤＮＡの複製開始領域に結合するのを妨害するために、配列表の配列番号２の第２４９番〜第２６３番のアミノ酸配列からなるペプチドを用いるものであることを特徴とする、哺乳類のＤＮＡ複製の阻害方法に関する。
【００１１】
上記の阻害方法において、ＯＲＣ又はそのサブユニットのＯＲＣ１が、ゲノムＤＮＡの複製開始領域に結合するのを妨害するために、配列表の配列番号２に示す制御因子タンパク質（ＡＬＦ−Ｃ）を用いることができる。また上記の阻害方法において、ゲノムＤＮＡの複製開始領域に結合するのを妨害するために、ＯＲＣ又はそのサブユニットのＯＲＣ１が配列表の配列番号２の第２４９番〜第２６３番のアミノ酸配列（Arg Gly Asn Arg Asn Arg Gly Asn Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gln ）からなるペプチドを用いることもできる。
【００１３】
また本発明は、ＤＮＡ複製開始複合体に結合して哺乳類ＤＮＡの複製を阻害する物質（ＡＬＦ−Ｃタンパク質、ＡＬＦ−Ｃの部分ペプチド、これらをコードするＤＮＡ）並びにＯＲＣ１タンパク質の部分ペプチド及びこれをコードするＤＮＡに関する。
【００１４】
さらに本発明のＯＲＣ１タンパク質の部分ペプチドは、配列表の配列番号４の第２１０番〜第２３９番に示すアミノ酸配列（Lys Arg Ile Glu Ser Arg His Ser Ala Ser Lys Ser Arg Gln Thr Pro Thr His Pro Leu Thr Pro Arg Ala Arg Lys Arg Leu Glu Leu ）からなるペプチドである。
【００１５】
さらに本発明のＡＬＦ−Ｃタンパク質は、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子タンパク質（ＡＬＦ−Ｃ）である。さらに本発明のＡＬＦ−Ｃ部分ペプチドは、配列表の配列番号２の第２４９番〜第２６３番に示すアミノ酸配列（Arg Gly Asn Arg Asn Arg Gly Asn Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gln ）からなるペプチドである。
【００１６】
さらに本発明は、ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子タンパク質（ ALF-C）をコードするＤＮＡであって、配列表の配列番号１に示すＤＮＡにも関する。また、本発明は、ＡＬＦ−Ｃ部分ペプチドをコードするＤＮＡであって、配列番号１の第７４５番〜第７８０番に示す塩基配列からなるＤＮＡにも関する。さらに本発明は、ＯＲＣ１タンパク質の部分ペプチドであって、配列表の配列番号３の第２１０番〜第２３９番に示すアミノ酸配列からなるペプチドにも関する。さらに本発明は、ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子タンパク質（ＡＬＦ−Ｃ）に対する抗体をも提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下において本発明の具体的な内容を説明すると、本発明は哺乳類のＤＮＡ複製に必要な複製開始複合体に複製を阻害する物質を結合させることにより哺乳類ＤＮＡの複製を阻害する手法およびその物質を要旨とするものである。  さらに哺乳類のＤＮＡ複製に必要な複製開始複合体としては、ＯＲＣタンパク質、とりわけてＯＲＣ１タンパク質が複製阻害物質の結合に特異的に優れている。
【００１８】
さらにこの場合のＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質中のアミノ酸配列表の配列番号４に示す塩基アミノ酸配列（Lys Arg Ile Glu Ser Arg His Ser Ala Ser Lys Ser Arg Gln Thr Pro Thr His Pro Leu Thr Pro Arg Ala Arg Lys Arg Leu Glu Leu ）を有するものであることを突き止めた。
【００１９】
またこの場合の、ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Arg Gly Asn Arg Asn Arg Gly Asn Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gln ）を含む真核生物のタンパク質、あるいはアミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Arg Gly Asn Arg Asn Arg Gly Asn Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gln ）のペプチドであることも確認した。
【００２０】
【実施例】
〔ALF-Cのクローニング〕
肝細胞で特異的に発現するラットのアルドラーゼＢ遺伝子の転写調節を研究していたところ、転写調節領域（プロモーター）がＤＮＡ複製開始領域としても機能することを見いだした。  ALF-C は、この遺伝子領域に結合する制御因子として、発現ベクターλgt11を用いたクローニングで単離した。  その後、このタンパク質は転写抑制因子であること、およびヒトやラットの複製開始因子（ＯＲＣ）と結合することなどを明らかにした。
【００２１】
具体的に、ALF-C のクローニングは以下のように行った。
ラット培養肝ガン細胞  FTO-2B（ Killary,A.M.,Lugo,T.G.,Fournier,R.E.K.,Biochem.Genet.22,201-213.1984）を培養し、１×１０７ 個回収した。  回収した細胞から総細胞ＲＮＡ extraction kit（Pharmacia社製）を用いて、添付の操作手順通りに行い総細胞ＲＮＡを抽出した。  さらに抽出した総細胞ＲＮＡからオリゴ dT-セルロース（TOYOBO社製）クロマトグラフィーによりｍＲＮＡを精製した。
【００２２】
精製したｍＲＮＡのうち１μｇから、ｃＤＮＡ合成キット（ Pharmacia Time SaverTM  cDNA Synthesis Kit ／ファルマシア社製）を用いて添付の操作手順にしたがって２重鎖のｃＤＮＡを合成した。  合成したｃＤＮＡの１０分の１量をλgt11ベクター（製品番号 #234211／Stratagene社製）に添付の操作手順通りに組み込み、さらにGigapack III Gold Packaging extract （ #200201, Stratagene社製）を用いて添付の操作手順通りに感染可能な形にパッケージしたのち、大腸菌 Y1090r-（ #200281, Stratagene社製）に添付の操作手順通りに感染させ、タンパク質発現ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【００２３】
〔ALF-Cのスクリーニング〕
つぎに、このタンパク質発現ｃＤＮＡライブラリーをつぎのようにスクリーニングした。  つまり、ラットのアルドラゼＢ遺伝子の転写および複製開始制御に関与する領域にある制御エレメントであるサイトＣの塩基配列の一部である 5'-GTGAGCCTGATTACAAAGATTGGCT-3'の 5'末端を32Pラベルし、これをプローブにしてスクリーニングを行い、このプローブに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡとしてALF-C ｃＤＮＡをクローニングした。
【００２４】
〔 ALF-CのＤＮＡ配列・アミノ酸配列の決定〕
この ALF-CのｃＤＮＡの塩基配列（アルドラーゼＢ遺伝子プロモーターのサイトｃＤＮＡに結合するｃＤＮＡクローン）をTaKaRa Taq cycle Sequencing core kit（製品番号R018  タカラ社製）とＤＮＡシークエンサー（ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer：ABI社製）を用いて配列表の配列番号１の通り決定した。
【００２５】
さらにこの決定したｃＤＮＡの塩基配列からアミノ酸配列を決定したところ、ALF-C は配列表の配列番号２に示したように、２８４アミノ酸からなる新規のタンパク質をコードしていることが判明した。
【００２６】
〔ALF-C の一部アミノ酸配列（1-89番目）をコードするタンパク質の作製〕
つぎに、配列表の配列番号２に示すALF-C タンパク質の１番目から８９番目までのアミノ酸をコードするタンパク質（以下、単にALF-C （1-89）と略す）の作成をおこなった。
【００２７】
つまりALF-C タンパク質の１番目から８９番目までのアミノ酸をコードするタンパク質に対応するｃＤＮＡを配列表の配列番号１に示すＤＮＡ配列より作製し、発現ベクター pGEX-6P-3（27-4599-01、アマシャムバイオサイエンス社製）に、添付の操作手順どおりに組み込み、大腸菌 BL21(DE3)pLysS（69388-3,Novagen社製）内でALF-C（1-89）とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下単にＧＳＴと略す）の融合タンパク質として作製した。
【００２８】
つぎに、Glutathion Sepharose 4B（17-07756-01、アマシャムバイオサイエンス社）を用いて添付の操作手順どおりに ALF-C（1-89）とＧＳＴの融合タンパク質を精製した。  さらに精製された8mgのALF-C（1-89）とＧＳＴの融合タンパク質を１ｍＬの消化バッファー（20mM TrisHCl(pH7.5), 20 % glycerol, 20 mM NaCl, 0.1 mM PMSF, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT）に懸濁し、さらに１０ユニットの PreScission Protease（ 27-0843-01、アマシャムバイオサイエンス社製）を加え、４℃で約１２時間程消化反応を行い ALF-C（1-89）とＧＳＴの融合タンパク質をそれぞれ ALF-C（1-89）タンパク質とＧＳＴタンパク質とに切断した。
【００２９】
さらに切断したタンパク質を８０℃で１０分間加熱処理することにより、ＧＳＴタンパク質のみを凝縮させ、さらに遠心分離機により12,000rpmで１５分間遠心し、上清中の ALF-C（1-89）タンパク質を回収した。
【００３０】
〔ALF-C （1-89）タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製〕
上記の ALF-C（1-89）タンパク質をウサギに免疫してポリクローナル抗体を作成した。  すなわち、日本白色種のメスウサギ１匹に対し、初回免疫は、上記操作で作製した ALF-C（1-89）タンパク質0.2mg、5mgのPolyＡ・PolyＵおよびフロイントコンプリートアジュバント溶液を混合し、エマルジョンを作成後、皮下投与し免疫した。
【００３１】
２、３回目の免疫は、上記操作で作製したALF-C(1-89)タンパク質0.2mg、5mgの PolyA・PolyU およびフロイントインコンプリートアジュバント溶液を混合し、エマルジョンを作成後、皮下投与し免疫した。  ４から６回目の免疫は、上記操作で作製したALF-C（1-89）タンパク質0.2mgとフロイントインコンプリートアジュバント溶液を混合し、エマルジョンを作成後、皮下投与し免疫した。  初回免疫以降、６回目の免疫までの投与は全て２週間間隔で行った。  ６回目の免疫（最終免疫）後、１週間目に全採血を行い、 ALF-C（1-89）タンパク質に対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を回収した。
【００３２】
〔作製した ALF-C（1-89）タンパク質に対するポリクローナル抗体のウエスタンブロッティング法による解析〕
上記により回収したポリクローナル抗体がALF-C タンパク質と反応することを、ウエスタンブロッティング法に基づく解析により確認した。  つまり、ラット培養細胞dRLh84全抽出蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写し、上記方法で作製したALF-C (1-89)タンパク質に対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を1000倍希釈した抗血清を用いて１次反応を行い、さらにパーオキシデース標識抗ウサギ抗体を用いて２次反応を行った。
【００３３】
さらにシグナルの検出を ECL Western Blotting Starter kit（RPN2108、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したPVDF膜上に、反応するバンドが出現したことから、ALF-C (1-89)タンパク質に対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を用いたウエスタンブロッティング法で、ALF-Cタンパク質がラットの生体内に存在することがわかった。
【００３４】
〔ALF-CとＯＲＣ１の結合について〕
つぎに、ALF-CとＯＲＣ１が特異的に結合する実験の具体的な方法と結果を以下に示す。
【００３５】
＜ALF-CとGSTの融合タンパク質の作製＞
まず、配列表の配列番号２に示すALF-C タンパク質のアミノ酸をコードするALF-C タンパク質の作成を行った。  つまりALF-C タンパク質に対応する配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列を発現ベクター pGEX-6P-3（27-4599-01、アマシャムバイオサイエンス社製）に、添付の操作手順どおりに組み込み、大腸菌 BL21（DE3）pLysS（ 69388-3、Novagen社製）内でALF-CとGSTの融合タンパク質として作製した。
【００３６】
＜ヒトＯＲＣ１タンパク質の作製＞
配列表の配列番号３に示すＯＲＣ１のＤＮＡ塩基配列を合成し、pcDNA3.1HisAベクター（インビトロゲン社製）に添付の操作手順所どおりに組み込み、ウサギ網状赤血球の転写・翻訳共役システム（TNT T7 coupled reticulocyte lysate system、プロメガ社製）を用いて添付の操作手順どおりに cDNAを翻訳してT7ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１タンパク質として合成した。
【００３７】
＜ALF-CとＯＲＣ１の結合の確認＞
上記で作製したALF-CとGSTの融合タンパク質10 μｇ をグルタチオンを結合させた25 μｌの樹脂ビーズ（glutathione-sepharose 4B、アマーシャム-ファルマシア製）に結合させ、さらに、10 μｌの上記 T7ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１タンパク質を反応させた。
【００３８】
ビーズを十分洗浄したのち、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ化させて解離させた。  解離させたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写し、抗T7ペプチド抗体（ Novagen社製）を用いて１次反応を行い、パーオキシデース標識抗マウスIg抗体を用いて２次反応を行った。
【００３９】
さらにシグナルの検出をECL Western Blotting Starter kit （RPN2108、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したPVDF膜上に、反応するバンドが出現したことから、T7ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１タンパク質とALF-CとGSTの融合タンパク質が結合していること、つまりALF-Cタンパク質とＯＲＣ１タンパク質が特異的に反応することを確認した。
【００４０】
〔ALF-Cの結合に必用なＯＲＣ１のタンパク質部分断片の解析〕
つぎにＯＲＣ１に対するALF-Cの結合・遮蔽に必用なＯＲＣ１のタンパク質部分断片の解析をおこなった結果を以下に示す。
【００４１】
＜ヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の作製＞
つぎに、ヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の作製について、（〜２０数アミノ酸を決定した具体的な方法とそのアミノ酸配列を中心に説明する。
【００４２】
配列表の配列番号３に示すＯＲＣ１タンパク質をコードするcDNA断片を制限酵素消化により種々作成し、pcDNA3.1HisAベクター（インビトロゲン社）に添付の操作手順所どおりに組み込んだ。  つぎに種々のＯＲＣ１遺伝子欠失体のＤＮＡ配列をTaKaRa Taq cycle Sequencing core kit（製品番号R018  タカラ社製）とＤＮＡシークエンサー（ABI PRISMR 310 Genetic Analyzer：ABI社製）を用いて決定したところ、ＯＲＣ１タンパク質のＮ末端側から数えて、ａ：１〜８６２（全長），ｂ：１〜２０８，ｃ：１〜２３９，ｄ：１〜２７８，ｅ：２１０〜５１０，ｆ：５１２〜８６２のアミノ酸をコードするそれぞれの変異体が作成できた。
【００４３】
さらに、ウサギ網状赤血球の転写・翻訳共役システム（TNT T7 coupled reticulocyte lysate system、プロメガ社製）を用いて添付の操作手順どおりに cDNAを翻訳してT7ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質として上記のａ〜ｆそれぞれのタンパク質を合成した。
【００４４】
＜ALF-Cタンパク質とヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の結合の確認＞
上記で作製したALF-CとGSTの融合タンパク質 10μｇ をグルタチオンを結合させた25 μｌの樹脂ビーズ（glutathione-sepharose 4B、アマーシャム-ファルマシア社製）に結合させ、さらに、10μｌ の 上記T7ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質をそれぞれ反応させた。
【００４５】
ビーズを十分洗浄したのち、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ化させて解離させた。  解離させたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写し、抗T7ペプチド抗体（Novagen 社製）を用いて１次反応を行い、さらにパーオキシデース標識抗マウスIg抗体を用いて２次反応を行った。
【００４６】
さらにシグナルの検出を ECL Western Blotting Starter kit（RPN2108、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したPVDF膜上に、前記ｂ、ｆ、のヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合、バンドが出現せず、また前記ａ、ｃ、ｄ、ｅ、のヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合に、バンドが出現したことから、ALF-C タンパク質に結合するヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の最小のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列のうちの下線部分（Lys Arg Ile Glu Ser Arg His Ser Ala Ser Lys Ser Arg Gln Thr Pro Thr His Pro Leu Thr Pro Arg Ala Arg Lys Arg Leu Glu Leu ）であることがわかった。
【００４７】
〔ＯＲＣ１の結合に必用なALF-Cタンパク質部分断片の解析〕
つぎにＯＲＣ１の結合に必用な ALF-Cタンパク質部分断片の解析をおこなった結果を以下に示す。
【００４８】
＜ヒトALF-C遺伝子欠失タンパク質の作製＞
ヒト ALF-C遺伝子欠失タンパク質の作製について、以下（〜２０数アミノ酸）を決定した具体的な方法とそのアミノ酸配列を中心に説明する。  まず配列表の配列番号１にあらわした ALF-C タンパク質をコードする cDNA断片を制限酵素消化により種々作成し、これを発現ベクター pGEX-6P-3（27-4599-01、アマシャムバイオサイエンス社製）に、添付の操作手順どおりに組み込んだ。
【００４９】
次に種々のALF-C遺伝子欠失体のＤＮＡ配列を TaKaRa Taq cycle Sequencing core kit（製品番号R018  タカラ社製）とＤＮＡシークエンサー（ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer：ABI社製）を用いて決定したところ、ａ：１〜２０６，ｂ：２０７〜２８４，ｃ：２４０〜２８４，ｄ：２４９〜２８４，ｅ：２６４〜２８４，ｆ：２０７〜２７２，ｇ：２０７〜２６３，ｈ：２０７〜２３８のアミノ酸をコードするそれぞれの変異体が作成できた。
【００５０】
さらに、大腸菌 BL21(DE3)pLysS（69388-3、Novagen社製）内でALF-C遺伝子欠失タンパク質とＧＳＴタンパク質の融合タンパク質として前記ａ〜ｈそれぞれのタンパク質を合成した。
【００５１】
＜ALF-C遺伝子欠失タンパク質とヒトＯＲＣ１タンパク質の結合の確認＞
上記で作製したａ〜ｈそれぞれの ALF-C遺伝子欠失とＧＳＴの融合タンパク質10 μｇをグルタチオンを結合させた25 μｌの樹脂ビーズ（glutathione-sepharose 4B、アマーシャム-ファルマシア社製）に結合させ、さらに、10 μｌの上記T7ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたヒトＯＲＣ１タンパク質を反応させた。
【００５２】
ビーズを十分洗浄したのち、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ化させて解離させた。  解離させたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写し、抗T7ペプチド抗体（ Novagen社製）を用いて１次反応を行い、さらにパーオキシデース標識抗マウスｌｇ抗体を用いて２次反応を行った。
【００５３】
さらにシグナルの検出を ECL Western Blotting Starter kit（RPN2108、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したPVDF膜上に、前記ａ、ｅ、ｈ、のヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合には、バンドが出現しなかった。
【００５４】
さらに前記ｂ、ｃ、ｄ、ｆ、ｇの各ヒトorc1遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合には、バンドが出現したことから、ヒトＯＲＣ１タンパク質に結合する ALF-C遺伝子欠失タンパク質の最小のアミノ酸配列は配列表の配列番号２にあらわした１５アミノ酸配列の中の下線部分（ Arg Gly Asn Arg Asn Arg Gly Asn Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gln）であることがわかった。
【００５５】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明はＯＲＣ１タンパク質のようなＤＮＡ複製開始に必要な複合体に対し、真核生物のＤＮＡ複製を特異的に阻害する物質としてアミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Arg Gly Asn Arg Asn Arg Gly Asn Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gln ）を含む真核生物のタンパク質あるいはペプチド等のような複製を阻害する物質を結合させるようにしたために、ALF-C タンパク質の断片をＤＮＡ複製開始に必要なＯＲＣ１タンパク質サブユニットに結合させてこれを遮蔽することにより、ＯＲＣ本来の機能を失活させてＤＮＡの複製を停止させることが可能となる。
【００５６】
その結果、この原理を利用することにより、優れた抗がん剤や抗ウイルス剤を提供することができる。  また本発明のＤＮＡ複製阻害物質は、とくにヒトＤＮＡ複製の阻害に適するが、このほかにもウシ、ブタ、イヌ等の家畜やペット等をはじめとした哺乳類細胞の複製阻害にも広く適用できることは勿論である。  またさらに、本願の発明におけるＤＮＡ複製阻害物質はアミノ酸の低分子化した化合物（ミミック）への応用、あるいは遺伝子治療への応用も可能である。
【００５７】
【配列表】
0004296295.tif 000002
0004296295.tif 000003
0004296295.tif 000004
0004296295.tif 000005
0004296295.tif 000006
0004296295.tif 000007
0004296295.tif 000008
0004296295.tif 000009
0004296295.tif 000010