(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象分析物と電気化学発光試薬とを結合させた分析物−発光試薬複合体を含む媒体と、電極とを接触させて電気化学発光を生ぜしめる分析装置であって、
前記発光と同時に、前記電極に流れる電流値を測定する手段と、
前記電流値を複数回測定し、当該複数回測定した電流値に基づいて、（１／τ）＝ｍ×Ｉｐ＋ｎの関係を満たすｍおよびｎを決定し、記憶する手段と、
前記（１／τ）＝ｍ×Ｉｐ＋ｎの関係と、前記ｍ、ｎおよびｍ、ｎを算出した前記Ｉｐとは異なるＩｐからτを決定し、記憶する手段と、
前記電極を流れる電流値の時間変化Ｉ(ｔ)を、Ｉｐexp(Ｈ2ｔ）erfc（Ｈ2ｔ1/2）により決定する、但し、τは発光ピーク時間、ｔは時間、Ｈは定数、Ｉｐは前記電極に流れる電流値の最大値、expは指数関数、erfc（ｘ）＝１−erf（ｘ），erf（ｘ）は誤差関数、ｍおよびｎは、それぞれ直線の傾きと切片である、ことを特徴とする電気化学発光分析装置。
【請求項２】
試料が流れる試料流路と、上記試料流路に設けられる作用電極と、作用電極に対向する対電極と、上記作用電極に印加する電圧の制御を行う電圧印加制御手段、上記試料流路からの発光の検出手段を具備するフロースルーセルと、前記発光と同時に、前記電極に流れる電流値を測定する手段と、前記電流値を複数回測定し、当該複数回測定した電流値に基づいて、（１／τ）＝ｍ×Ｉｐ＋ｎの関係を満たすｍおよびｎを決定し、記憶する手段と、
前記（１／τ）＝ｍ×Ｉｐ＋ｎの関係と、前記ｍ、ｎおよびｍ、ｎを算出した前記Ｉｐとは異なるＩｐからτを決定し、記憶する手段と、
前記電極を流れる電流値の時間変化Ｉ(ｔ)を、Ｉｐexp(Ｈ2ｔ）erfc（Ｈ2ｔ1/2）により決定する、但し、τは発光ピーク時間、ｔは時間、Ｈは定数、Ｉｐは前記電極に流れる電流値の最大値、expは指数関数、erfc（ｘ）＝１−erf（ｘ），erf（ｘ）は誤差関数、ｍおよびｎは、それぞれ直線の傾きと切片である、ことを特徴とする電気化学発光分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料溶液中の極微量物質を定量するための分析装置、特に電気化学発光を用いる分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫分析の分野では、試料中の極微量（１０-14mol・ｄｍ-3以下）の測定対象の濃度を、発光ラベルを利用して測定する分析法として、蛍光法，化学発光法  （Chemiluminescence法，ＣＬ法）、あるいは電気化学発光法（Electrochemiluminescence法，ＥＣＬ法）があり、広く利用されている。蛍光法では光励起により試料から発する発光を検出し、ＣＬ法では酸化剤等の触媒の存在下で試料から発する発光を検出し、ＥＣＬ法では試料に電圧を印加した時に試料から発する発光を検出する。
【０００３】
これらの各方法では、ホルモン，腫瘍マーカー，薬剤，ＤＮＡ分子等の測定対象物質に抗原抗体反応により発光試薬を結合して、発光試薬に由来する発光を定量するが、中でもＥＣＬ法は原理的に検出感度が高い。ＥＣＬ法では、測定対象試料に電極を接触させる必要があり、一般にフロースルーセル内に試料を流しながら測定を行う。本願明細書の以下の記載では、このフロースルーセルをＥＣＬ検出器またはＥＣＬフロースルーセルと呼び、ＥＣＬ検出器で測定する試料を  ＥＣＬサンプルと呼ぶ。
【０００４】
ＥＣＬ検出器に関する公知例は、例えば特表平4−502964 号公報に記載されている。電気化学発光法では、一般に発光試薬と還元剤の両者をＥＣＬサンプルに加える。本願明細書では、上記特表平4−502964 号公報に記載されている電気化学発光法、すなわち発光試薬としてTris(２，２′−bipyridyl）ruthenium(II）、還元剤としてトリプロピルアミン（Ｎ(ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3)3）の両者を用いる電気化学発光法を例にとる。以後、Tris(２，２′−bipyridyl）ruthenium(II）をＲｕ（bpy)32+、またはＲｕ錯体と略記する。またトリプロピルアミンをTPAと略記する。
【０００５】
Ｒｕ（bpy)32+は正電位の作用電極上で、Ｒｕ（bpy)33+へと酸化される。またＴＰＡも正電位の作用電極上で、ＴＰＡ・+へと酸化される。この後Ｒｕ（bpy)33+はＴＰＡ・と反応することでＲｕ（bpy)32+* になり、安定なＲｕ（bpy)32+に戻る際に約６００ナノメートル（ｎｍ）の波長の光を発する。（ジャーナル  オブ  エレクトロケミカル  ソサエティー（J.Electrochem.Soc.）１３７，３１２７−３１３１（１９９０）参照）。
【０００６】
Ｒｕ（bpy)32+ を測定対象（例えばホルモン，腫瘍マーカー，ＤＮＡ）と特異的に結合する分子にラベルしたものが発光試薬である。発光試薬と測定対象を十分に結合させた後、ＥＣＬ検出器内に流し入れて、Ｒｕ（bpy)32+ 由来の発光を光電子増倍管またはフォトダイオード等の光検出器で測定する。このように電気化学発光法では、発光量から測定対象物質の定量を行う。
【０００７】
電極に一定電圧を印加した場合、ＥＣＬの発光量は、電圧印加開始後、時間経過と共に増加し、最大値（ピーク値）をとった後、減少する。ＥＣＬ検出器のノイズ量は、一般的に、光電子増倍管の暗電流の大きさ（電気回路を流れる微小電流によるノイズ）によって決まる。そのためＥＣＬの発光量、すなわち検出信号量が大きいほど、検出感度（信号ノイズ比）が大きくなる。そこで、（１）発光量のピーク値を検出信号として用いるか、または（２）発光量がピーク値をとる時間近傍の発光量を一定時間だけ積分して、その発光量の積分値を検出信号として用いるのがよい。
【０００８】
本発明では、前述の（１）発光量のピーク値、または（２）発光量の時間積分値のうち、信号再現性のよい、（２）の時間積分値を検出信号として用いる場合に、より顕著に生じる課題とその解決法を提示する。しかし、たとえ（１）の発光量のピーク値を用いる場合であっても、本発明から有益な効果を得ることができる。なお本願明細書の以下の記載では、発光量のピーク値を、発光ピーク値と呼び、電圧印加開始後、ＥＣＬの発光量がピーク値をとるまでの時間を発光ピーク時間と記す。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＥＣＬ検出器で、発光ピーク時間近傍の発光量の時間積分値を得る場合、発光ピーク時間がいつなのかを知る必要がある。そのためには、（ａ）発光ピーク時間を、測定の都度、発光値のデータから決定するか、または（ｂ）発光ピーク時間を予測する必要がある。（ｂ）のように発光ピーク時間を予測する方が、(ａ)の発光値のデータから決定する方法よりも信号処理を簡便に行える。しかし検出器の、例えば電極配置，印加電圧値の違いにより、発光ピーク時間は変化してしまう。
【００１０】
発光ピーク時間の変化は、検出器を製造する際の加工精度、例えば数１００マイクロメートルの寸法のずれによっても、おこりうる。また印加電圧の数１００ミリボルトの違いによっても、発光ピーク時間は変化する。
【００１１】
この発光ピーク時間の検出器による違いは、特に、複数の検出器を並列させて測定する場合に問題となる。この並列測定装置において、同一のＥＣＬサンプルを測定する場合、検出器によらず、同一の信号値（発光値）が得られることが保証されなければならない。異なる検出器で、発光ピーク時間が異なることは、それぞれの検出器の特性が異なることに相当する。このような個々の検出器ごとの特性の違いは、検出器ごとの測定結果のばらつきを大きくする。ならば検出器間の特性の違い、すなわち、複数の検出器を比較した場合の発光ピーク時間の違いを考慮して、発光量の時間積分開始時間と終了時間とを検出器ごとに変更することで、並列測定装置の検出器ごとの測定のばらつきをより小さくできる。
【００１２】
そこで本発明では、検出器ごとの発光ピーク時間を予測し、それぞれの検出器の発光量時間積分の開始時間と終了時間を決定するために好適な方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明では、発光計測と同時に電極（例えば作用電極、または対電極、もしくはその両者）上の電流値を測定し、その電流値をもとに、発光ピーク時間（τ）を予測する。そしてτの前後の適当な時間、例えば数１０ミリ秒間の発光量を積分した値を、検出信号値とする。電流値からτを予測するために、電極を流れる電流値のピーク値Ｉｐ、または、電極上の電流値の時間変化曲線Ｉ（ｔ）を、  ＥＣＬの発光検出と同時に測定し、保存しておく。なお、電流値のピーク値Ｉｐは、以下の記述ではソフトウェアにより計算する手法を前提にしたが、ハードウェア（電気回路）によりＩｐを求めることもでき、いずれにおいても、本発明の方法を実施できる。
【００１４】
後述のように、電極を流れる電流値のピーク値Ｉｐと、発光ピーク時間の逆数（１／τ）は、数１の比例関係にある。すなわちｍとｎは、試料溶液中の電解質濃度に変化がなければ、一定である。
【００１５】
【数１】
（１／τ）＝ｍ×Ｉｐ＋ｎ                                   …（１）
但し、ｍとｎはそれぞれ、直線の傾きと切片
電気化学発光法に限らず、微量分析に際しては、試料溶液中の電解質濃度を同一に保つことが多い。このため、上記のｍとｎの値は、一定と考えてよい。また、Ｂ／Ｆ分離を十分に行うことで、上記のｍとｎの値は、測定対象の抗原の濃度や、測定対象を含む血清の患者間の差異によっても、変化しないことが分かっている。
【００１６】
電流のピーク値Ｉｐに基づいて、発光ピーク時間を予測する手順は以下の通りである。（１）あらかじめ、試料溶液と同一組成の溶液に電圧印加した際に電極上を流れる電流値に基づいて、上記、数１のｍとｎを決定しておく。（２）発光計測と同時に電極（例えば作用電極、または対電極、もしくはその両者）上の電流値を測定し、その電流値の最大値Ｉｐを記憶する。（３）Ｉｐの値を、数１に代入して、発光ピーク時間（τ）を決定する。そしてτの前後の適当な時間、例えば数１０ミリ秒間の発光量を積分した値を、検出信号値とする。
【００１７】
また、後述のようにＥＣＬサンプル測定時の、電極上の電流値の時間変化曲線Ｉ（ｔ）は、数２でフィッティングできる。そして発光ピーク時間の逆数は、数３のように数２の定数Ｃと比例関係にある。
【００１８】
【数２】
Ｉ(ｔ）＝Cexp（Ｈ2ｔ）erfc（Ｈ2ｔ1/2）                     …（２）
但し、ｔは時間、ＨとＣは定数、expは指数関数、
erfc（ｘ）＝１−erf（ｘ）、erf（ｘ）は誤差関数
【００１９】
【数３】
（１／τ）＝ｐ×Ｃ＋ｑ                                     …（３）
但しｐとｑはそれぞれ、直線の傾きと切片
上記ｐとｑは、試料溶液中の電解質濃度に変化がなければ、一定である。ｍ，ｎと同様にｐ，ｑも測定によらず変化しないことが分かっている。
【００２０】
電極上の電流値の時間変化曲線Ｉ（ｔ）に基づいて、発光ピーク時間を予測する手順は以下の通りである。（１）あらかじめ、試料溶液と同一組成の溶液に、ＥＣＬ測定の際の電極上を流れる電流値に基づいて、上記、数３のｐとｑを決定しておく。（２）発光計測と同時に電極（例えば作用電極、または対電極、もしくはその両者）上の電流値を測定し、その電流値の時間変化曲線Ｉ（ｔ）を記憶する。（３）数２のＣの値を、数３に代入して、発光ピーク時間（τ）を決定する。そしてτの前後の適当な時間、例えば数１０ミリ秒間の発光量を積分した値を、検出信号値とする。
【００２１】
なお、従来のＥＣＬ検出器で、発光計測と同時に電極上の電流値を測定し、その電流値を用いて、検出信号の補正を行っている例はない。
【００２２】
【発明の実施の形態】
図１は電気化学発光法により、ホルモン，腫瘍マーカー，薬物，酵素，サイトカイン，核酸等を定量するＥＣＬフロースルーセルの一例を図示している。電気化学発光標識物質を発光させるためには、作用電極(Working Electrode；ＷＥ）２と対電極(Counter Electrode；ＣＥ）３が必要である。そして、作用電極２と対電極３に印加する電圧の基準となる参照電極(Reference Electrode；ＲＥ）４を備えているのが望ましい。
【００２３】
上記各電極２，３，４は、ポテンシオスタット・電源回路１０により制御される。ポテンシオスタット・電源回路１０から、作用電極２と対電極３間の電位と電流値、または電位、または電流値を取り出し、アナログ／デジタル変換を行った後、パーソナルコンピュータ１２に取り込む。またフロースルーセル１にはその内部に、測定対象物を含む溶液を導入するための試料流入口５と、排出するための試料流出口６が必要である。
【００２４】
ここで、実施例では磁性ビーズを作用電極２に保持するための磁石７を設置した検出セルを示した。前述のように磁性ビーズを用いたＢ／Ｆ分離を利用する際には磁石７は必須となるが、本発明は必ずしも磁性ビーズを用いてＢ／Ｆ分離を行う装置に限ることなく、全てのＥＣＬ検出器に適用することができる。そして標識物質からの発光を検知するために光検出器８を作用電極２近傍に設けた。この光検出器８は電気化学発光法を用いる場合は必須である。図１では、作用電極２上で生じた発光は、対電極３側の透明窓９を透過して、光検出器８に入射する装置構成となっている。
【００２５】
本発明を実施するためのフロースルーセル１を構成する材料には、その透明窓９としてガラスやアクリル，ポリメタクリル酸メチル等の光透過性物質を用い、その他の不透明な部分にはプラスチック等の高分子化合物，Ａｌやステンレス等の金属、またはセラミックを用いることができる。
【００２６】
作用電極２や対電極３を構成する材料には、耐腐食性の高いＰｔや、電極として一般に用いられているＡｌ，Ａｇ等の金属を用いることができる。光検出器８としては、フォトマルチプライヤやフォトダイオード等を採用することができる。
【００２７】
実験装置構成では、光出射面を構成する試料流路の壁面の外部に磁石７を配置することで、磁性ビーズを用い、Ｂ／Ｆ分離を行って測定精度を向上させる方法を採用している。この磁石７は、電磁石であってもよいし、永久磁石であってもよい。磁石の磁力によってフロースルーセル１の作用電極２上に捕捉されている磁性ビーズは、分析終了後、電磁石への通電を遮断して、または永久磁石を機械的にフロースルーセルより遠ざけて磁力を弱めることにより、フロースルーセルから排出する。
【００２８】
図２は、ＥＣＬ検出器のポテンシオスタット・電源回路１０の内容である。作用電極２をＷＥ、対電極３をＣＥ、参照電極４をＲＥと記した。Ｅinに電圧印加を行うことで、ＣＥ−ＲＥ間に電圧印加を行い、ＥＣＬを生じさせ、その発光値を光検出器８で測定する。例えば、光電子増倍管を光検出器８に用いる場合は、高電圧電源１３により高電圧を光電子増倍管に印加する必要がある。ＥＣＬ検出器からの発光は、電気信号に変換され、更にアンプ１４により増幅してからパーソナルコンピュータ１２に取り込まれる。またＣＥ−ＷＥ間の電圧値はＥ＝−Ｅinとして取り出され、ＷＥ上の電流値は、Ｉ＝Ｖ／Ｒf として取り出されて、パーソナルコンピュータ１２に取り込まれる。なおＲf は可変抵抗であり、電流測定のレンジの調節に用いられる。
【００２９】
図３に発光試薬にＲｕ（bpy)32+ 、還元剤にＴＰＡを用いるＥＣＬに関係する化学反応式を示す（前記文献J.Electrochem.Soc.137,3127−3131(1990)参照）。
【００３０】
ＥＣＬの発光が生じるには、まずＲｕ（bpy)32+ が、電極上で酸化されて、  Ｒｕ（bpy)33+ が産出される必要がある（図３の反応式１）。またＴＰＡ分子も、電極上で酸化される（反応式２）。酸化されたＴＰＡ分子は、プロトンを遊離して、ラジカル化すると考えられている（反応式３）。ラジカルされたＴＰＡはＲｕ（bpy)33+と反応し、励起状態Ｒｕ（bpy)32+* を生じる（反応式４）。また励起状態Ｒｕ（bpy)32+*は、反応式５，反応式６の反応によっても産出される。この反応式４および反応式６で生じるＲｕ（bpy)32+*は安定状態のＲｕ(bpy)32+に戻る際に波長約６００ｎｍの発光を生じる。この波長約６００ｎｍの発光が、電気化学発光またはＥＣＬと呼ばれ、光センサで検出される。
【００３１】
反応式１は可逆反応（reversible reaction ）と言われ、電極上では、２価のＲｕ錯体（Ｒｕ（bpy)32+）と３価のＲｕ錯体（Ｒｕ（bpy)33+）が平衡状態にあると考えられる。一方、反応式２は、準可逆反応(quasi-reversible reaction）と言われ、ＴＰＡ→ｅ-＋ＴＰＡ・+、すなわち酸化方向の反応の反応速度定数  （cm／ｓ)ｋfと、ＴＰＡ←ｅ-＋ＴＰＡ・+、すなわち還元方向の反応の反応速度定数（cm／ｓ)ｋbを有する。
【００３２】
以下の実施例１から６では、
（実施例１）ＥＣＬ検出器の電極配置を変えた際の、発光量時間変化曲線の変化、
（実施例２）電極配置，印加電圧と発光ピーク時間との関係、
（実施例３）電極配置，印加電圧を変えた際の、電流値時間変化曲線の変化、
（実施例４）電流値の最大値Ｉｐと発光ピーク時間との関係、
（実施例５）電流値の時間変化曲線を理論式によりフィッティングした様子、
（実施例６）発光ピーク時間の違いを考慮して、発光値の積分開始時間と、積分終了時間とを変化させた場合に、甲状腺刺激ホルモン検出結果において測定値のばらつきが減少した様子、
を示す。
【００３３】
上記の実施例１〜３では、ＥＣＬ検出器の電極配置や、印加電圧が変わることで、発光ピーク時間が異なる様子を示している。すなわち実施例１〜３では、個々のＥＣＬ検出器が、製造上または電気回路上の違いにより、その特性が異なるという現状の問題点を示している。上記の実施例４では、実施例１〜３を整理したところ、発光ピーク時間の逆数（１／τ）は、電流値の最大値Ｉｐに比例していることを示している。実施例５は、電流の時間変化Ｉ（ｔ）を、数２〔すなわちＩ（ｔ）＝Cexp（Ｈ2ｔ）erfc(Ｈ2ｔ1/2）、但しｔは時間、ＨとＣは定数、  expは指数関数、erfc(ｘ）＝１−erf（ｘ）、erf（ｘ）は誤差関数〕でフィッティングした様子を示している。このフィッティングにより定数Ｃを得ることができる。定数Ｃは電流値の最大値Ｉｐと同義なので、定数Ｃと発光ピーク時間の逆数（１／τ）との関係も、実施例４のような比例関係になる。最後に、実施例６において、検出器間の測定値のばらつきを、本発明の方法により低減させた結果を示す。
【００３４】
以下の実施例１〜６において、ＥＣＬ測定時は、＋１.４Ｖ の一定電圧を１秒間、作用電極２と参照電極４間に印加した。作用電極２は５mm×５mm、厚さ0.2 mmのプラチナ板とし、その作用電極２の鉛直方向に、約１mm離して、２本のワイヤ状のプラチナ板（幅１mm）を対電極３として、作用電極２と平行に設置した。なお２本の対電極３は、それぞれ平行とした。参照電極４は銀／塩化銀電極    （Ａｇ／AgCl）とした。実施例１〜５において用いた測定試料は、（ｉ）磁性ビーズ表面にＲｕ錯体を結合させたものにＴＰＡを加えた試料である。また実施例６では、（ii）甲状腺刺激ホルモン（Thyroid Stimulating Hormone ）標準試料（ＴＳＨ測定）を用いた。Ｒｕ錯体を結合した磁性ビーズは、磁石によりＰｔ作用電極の表面に捕捉し、その状態で＋１.４Ｖの電圧印加を行った。
【００３５】
なお実施例１〜５では、リン酸緩衝液３００mmol・ｄｍ-3、ＴＰＡ  １８０  mmol・ｄｍ-3に、０.１３３ｍｇ・ｄｍ-3のビオチン−抗体−Ｒｕ（bpy)32+と、０.７２mg・ｄｍ-3のストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ（φ2.8μｍ）を混合して、約１０分間２８℃でインキュベートしたものを試料として用いた。実施例６の「ＴＳＨ測定」では、１.５９ｕＵ／ｍｌ のＴＳＨを含む血清をＴＳＨ分析キット（サンドイッチ法）と混合して、約１０分間３８℃でインキュベートした。ＴＳＨ分析キットは、ストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズと、抗ＴＳＨ抗体−ビオチン，抗ＴＳＨ抗体−Ｒｕ（bpy)32+ を含んでいる。
【００３６】
（実施例１）
図４に、前記の試料を２つの異なる電極配置のＥＣＬ検出器で、測定した際に観察された発光量の時間変化を、光電子増倍管（HAMAMATSU R1617 ）により測定した結果を示す。時刻０の瞬間に電圧印加を開始し、＋１.４Ｖ の一定電圧印加を１秒間継続させた。２本のワイヤ状の対電極の間隔（対電極間隔）を２mmにした場合の発光量の時間変化曲線Ｌ1 と、４mmにした場合の発光量の時間変化曲線Ｌ2 を記した。
【００３７】
対電極間隔２mmでの発光ピーク時間をτ1 、対電極間隔４mmでの発光ピーク時間をτ2 と記す。τ1 は約８０ミリ秒、τ2 は約１１０ミリ秒であった。対電極の間隔を大きくする程、発光ピーク時間が遅れる傾向にあった。この図４によると、発光量の時間変化曲線Ｌ1 とＬ2 を、それぞれ一定時間、時間積分をとって検出信号Ｓ1 とＳ2 にする場合、Ｌ1 とＬ2 とで、同一の時間帯、例えば０〜  ２００ミリ秒の間で積分すると、Ｓ1＞Ｓ2となり、同一の試料を測定したにもかかわらず、検出信号が異なってしまう。
【００３８】
この実施例１では、検出器の一方は対電極間隔を２mm、もう一方は４mmというように、比較した検出器同士の差が極端に大きかったが、工業的に大量生産される検出器では、加工精度の範囲内で、このような電極配置の差が存在することはやむを得ない。この検出器同士の差による、検出信号の差を小さくするためには、図４の発光量の時間変化曲線Ｌ1 とＬ2 それぞれの、発光ピーク時間τ1，τ2を知った上で、発光量の時間積分の範囲を、個々の検出器で変更させればよい。例えば、図４の例で、Ｌ1 をτ1 ―５０ミリ秒からτ1 ＋５０ミリ秒の範囲で積分して得られたＳ1 と、Ｌ2 をτ2 ―５０ミリ秒からτ2 ＋５０ミリ秒の範囲で積分して得られたＳ2 とを比較すると、Ｓ1〜Ｓ2とほぼ等しくなる。
【００３９】
（実施例２）
図５に、対電極間隔を５，６.７，８mm の３種類に変化させた場合の発光ピーク時間の変化の様子を示す。また作用電極２に対する印加電圧も１.２Ｖから1.4Ｖの範囲で変化させた。図５の横軸は銀／塩化銀（Ａｇ／AgCl）参照電極４に対する作用電極２の電位を表し、図５の縦軸は発光ピーク時間の逆数（１／τ）を表している。発光ピーク時間の逆数は、印加電圧の増加につれて増加した。反対に、対電極間隔の増加につれて、発光ピーク時間の逆数は減少した。しかし、図５だけでは、発光ピーク時間に関する法則性を見つけることができなかった。
【００４０】
（実施例３）
図６（ａ）に対電極間隔を５mmとして、作用電極２に対する印加電圧を、1.2 ，１.３，１.３５，１.４Ｖ に変化させた場合の作用電極２に流れる電流量の時間変化曲線の変化の様子を示す。時刻０が作用電極２に電圧印加をした瞬間である。作用電極２を流れる電流量は、電圧印加の瞬間（時刻０）で最大となり、以後減少した。電流量の最大値（ピーク値）は印加電圧の増加につれて増加した。図６（ｂ）に作用電極２に対する印加電圧を１.４Ｖ として、対電極間隔を５，６.７，８mm に変化させた場合の作用電極２を流れる電流量の時間変化曲線の変化の様子を示す。対電極間隔の増加につれて、電流量の最大値（ピーク値）は減少した。
【００４１】
図５と図６を比較すると、作用電極２の印加電圧の増加に対しては、発光ピーク時間の逆数（１／τ）と電流量の最大値のどちらも増加する傾向があること、並びに、対電極間隔の増加に対しては、発光ピーク時間の逆数（１／τ）と電流量の最大値のどちらも減少する傾向があることが分かった。
【００４２】
（実施例４）
図５と図６によると、印加電圧の大きさや対電極間隔の変化に応じて、作用電極２を流れる電流量の最大値（ピーク電流値：Ｉｐ）と発光ピーク時間の逆数は、同じ傾向で変化した。そこで、作用電極２を流れる電流量の最大値（Ｉｐ）と、発光ピーク時間の逆数との関係を図７に示す。すると、発光ピーク時間の逆数（１／τ）と、最大電流値Ｉｐは比例関係にあることが分かる。最小二乗法により測定点をフィッティングしたところ、Ｙ＝１.１５Ｘ−１.２５（但しＩｐをＸ，１／τをＹとおいた）、相関係数ｒ＝０.９９４ であった。こうして前記数１が成立することが分かった。
【００４３】
（実施例５）
定電位電解における電流の時間変化ｉ(ｔ)は、図３の反応式２のようにＴＰＡ→ｅ-＋ＴＰＡ・+、すなわち酸化方向の反応の反応速度定数（cm／ｓ）をｋf 、ＴＰＡ←ｅ-＋ＴＰＡ・+、すなわち還元方向の反応の反応速度定数（cm／ｓ）をｋb、ＴＰＡ分子の拡散係数（cm2／ｓ）をＤR、ＴＰＡ・+の拡散係数（cm2／ｓ）をＤo、ファラディー定数をＦ、電極面積（cm2）をＡ、溶液中のバルクのＴＰＡ濃度(mol／ｌ）をＣとすると、数４で表すことができる。
【００４４】
【数４】
ｉ（ｔ）＝FAkfCexp(Ｈ2ｔ）erfc（Ｈｔ1/2）                  …（４）
但し、  Ｈ＝ｋf／ＤR1/2＋ｋb／ＤO1/2
erfc（ｘ）＝１−erf（ｘ）
erf（ｘ）は誤差関数（error function）
（A.J.Bard and L.R.Faulkner 著、エレクトロケミカル  メソッズ、ファンダメンタルズ  アンド  アプリケーションズ（Electrochemical Methods.Fundamentals and Applications）、John Wiley＆Sons,(1980)参照）。
【００４５】
図４に示した、２本のワイヤ状の対電極の間隔(対電極間隔)を２mmにした場合の発光量の時間変化曲線Ｌ1 と、同時に測定した電流量の時間変化曲線Ｉ1(ｔ）を、数４を用いてフィッティングした様子を図８に示した。実験条件よりＡ＝  ０.２５cm2，Ｃ＝１８０mmol／ｌである。またＤo とＤR は１.０×１０-5cm2／ｓと仮定した。すると数４のｋf＝７.３５×１０-3cm／ｓ、ｋb＝３.７６×10-3cm／ｓにした場合に図８に示すようによいフィッティングが得られた。
【００４６】
数４のＦＡｋfＣ を比例定数Ｃと書き換えると、前記数２になる。この数２に、ｔ＝０を代入すると、Ｉ（０）＝Ｃとなり、数２の比例定数Ｃは、電流値のピーク値（Ｉｐ）と等しいことが分かる。そこで、Ｉｐと比例定数Ｃとを置き換えて、前記数３が得られる。
【００４７】
（実施例６）
設計上は同一の３個のＥＣＬ検出器において、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）測定試料の測定を行った。その際、実施例１に示した方法に、発光ピーク時間  （τ）による補正を行った場合と、行わなかった場合とで、測定値のばらつきの大きさをＣＶ値（標準偏差／平均値）で比較した。その比較の結果を表１に示す。測定のばらつきは、補正を行うことで小さくなる傾向を示した。測定のばらつきを抑えることは、検出下限の向上をもたらすので、分析装置の測定感度を向上させることができる。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、検出器間の特性の違い、すなわち、複数の検出器を比較した場合の発光ピーク時間の違い考慮して、発光量の時間積分開始時間と終了時間とを検出器ごとに変更することで、並列測定装置の検出器ごとの測定のばらつきをより小さくして、測定感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例に用いたフロースルーセルの要部断面図。
【図２】ポテンシオスタット・電源回路の回路図。
【図３】発光試薬にＲｕ（bpy)32+ 、還元剤にＴＰＡを用いた場合の化学反応を示す図。
【図４】ＥＣＬ検出器の電極配置を変えた際の、発光量時間変化曲線を示す図。
【図５】電極配置，印加電圧と発光ピーク時間との関係を示す図。
【図６】電極配置，印加電圧を変えた際の、電流値時間変化曲線を示す図。
【図７】電流値の最大値Ｉｐと発光ピーク時間との関係を示す図。
【図８】電流値の時間変化曲線を理論式によりフィッティングした様子を示す図。
【符号の説明】
１…電気化学発光フロースルーセル、２…作用電極、３…対電極、４…参照電極、５…試料流入口、６…試料流出口、７…磁石、８…光検出器（フォトマル，フォトダイオード等）、９…透明窓、１０…ポテンシオスタット・電源回路および電流値測定系、１１…試料流路、１２…パーソナルコンピュータ、１３…光検出器用高電圧、１４…アンプ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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