(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性条件下でキレート化剤とコラーゲン質組織を接触させ、続いて、酸と接触させ、続いて、緩衝化塩溶液と接触させ、この後、水を用いてすすぎ工程を行う化学的清浄処理により得られる生体再造形可能チューブ状補綴であって、
管腔表面および管腔外表面を有したチューブに形成された小腸の粘膜下層由来の加工組織マトリックスの第１層と、該第１層の前記管腔表面上の高密度フィブリルコラーゲンの第２層とを含んで成り、前記加工組織マトリックスは本質的には細胞および細胞破片を含まないことを特徴とする生体再造形可能チューブ状補綴。
【請求項２】
管腔表面および管腔外表面を有したチューブに形成された加工組織マトリックスの第１層の両端部は重なっており、チューブ周囲の少なくとも５％である結合領域を形成することを特徴とする請求項１記載の生体再造形可能チューブ状補綴。
【請求項３】
該補綴がＥＤＣで架橋されていることを特徴とする請求項２記載の生体再造形可能チューブ状補綴。
【請求項４】
アルカリ性条件下でキレート化剤とコラーゲン質組織を接触させ、続いて、酸と接触させ、続いて、緩衝化塩溶液と接触させ、この後、水を用いてすすぎ工程を行う化学的清浄処理により得られる生体再造形可能チューブ状構造体の製造方法であって、
該生体再造形可能チューブ状構造体は本質的には細胞および細胞破片を含まない加工組織マトリックスの層と高密度フィブリルコラーゲンの層とを含んで成り、本方法は、
（ａ）前記加工組織マトリックスの１端を水和し、スリーブ−被覆マンドレルを前記加工組織マトリックスの前記水和された１端に接触させることで前記スリーブ−被覆マンドレル周囲において前記加工組織マトリックスをフラッグ処理するステップと、
（ｂ）前記加工組織マトリックスを前記スリーブ被覆マンドレルに乾燥するステップと、
（ｃ）水和された加工組織マトリックスを形成するために前記加工組織マトリックスを水和剤で再水和するステップと、
（ｄ）加工組織マトリックスの２つの巻かれた水和層を形成するために前記水和された加工組織マトリックスを巻くように前記マンドレルを２回回転させるステップと、
（ｅ）前記加工組織マトリックスの層を脱水するステップと、
（ｆ）前記マンドレルから前記加工組織マトリックスを取り除くステップと、
（ｇ）前記コラーゲンを架橋させるために前記加工組織マトリックスを架橋剤と接触させるステップと、
（ｈ）前記チューブの管腔表面上に高密度フィブリルコラーゲンを堆積させるステップと、
を含んでいることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組織工学の分野にある。本発明は動物源に由来する洗浄された組織物質から調製された生物工学作成移植片補綴に指向される。本発明の生物工学作成移植片補綴は、加工された組織マトリックスの細胞適合性、強度および生体再造形性を保持する方法を用いて調製される。生物工学作成移植片補綴は移植、修復にまたは哺乳動物宿主における用途で使用される。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
組織工学の分野は、正常および病理学的哺乳動物組織において構造および機能の関係を理解するために工学の方法をライフサイエンスの原理と組み合わせる。組織工学の目標は組織機能を回復、維持および改良するための生物学的代替物の開発および最終的適用である。
【０００３】
コラーゲンは身体における主要な構造蛋白質であって、全身体蛋白質のほぼ３分の１を構成する。それは、皮膚、腱、骨および歯の有機物質のほとんどを含み、ほとんどの他の身体構造において繊維状封入体として起こる。コラーゲンの特性のいくつかはその高い引張強度；そのイオン交換能力、部分的には螺旋構造による可能な抗原決定基のマスキングによるその低い抗原性；およびその低い展延性、半透性および可溶性である。さらに、コラーゲンは細胞接着のための天然物質である。これらの特性および他の特性はコラーゲンを、移植可能な生物学的代替物および生体再造形可能補綴の組織工学および製造のために適した物質とする。
【０００４】
外植哺乳動物組織からコラーゲン質組織および組織構造を得る方法および組織から補綴を構築する方法は、外科的修復のためまたは組織もしくは器官置換のために広く調査されてきた。哺乳動物組織を置換または修復するのに首尾よく用いることができる補綴を開発するのは研究者の継続的目標である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
腸粘膜下組織のごとき生物学的に由来するコラーゲン質材料は組織修復または置換で用いるために多くの研究者によって提案されてきた。生体補綴適用のためのラミネートを形成するのに用いることができる腸コラーゲン（ＩＣＬ）の単一無細胞層を生成させるための近位ブタ空腸の機械的および化学的加工方法が開示されている。該加工は天然コラーゲン構造を維持しつつ細胞および細胞夾雑物を除去する。加工された組織マトリックスの得られたシートは、所望の仕様を持つ多層積層構築体を製造するのに使用される。本発明者らは、軟組織修復のための積層パッチの効果ならびに血管移植片用の支持体としてのチューブ化ＩＣＬの使用を調べた。この材料は、最小の接着を生じさせつつ必要な物理的支持体を提供し、周囲の天然組織に一体化し、宿主細胞が侵入するようになることができる。イン・ビボでの再造形は機械的一体化を許さない。弾性率、縫合保持およびＵＴＳのごときインプラントの保有かつ機能的特性は、ＩＣＬ層の数および架橋条件を変化させることによって具体的要件に対して操作することができる重要なパラメーターである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、哺乳動物宿主に移植されると、修復、増加または置換身体部分または組織構造として働くことができ、宿主細胞による再造形と同時におこる制御された生分解を受けるであろう組織作成補綴に指向される。かくして本発明の補綴は、置換組織として用いると二重の特性を有する。まず、それは代替身体部分として機能し、第２に、代替身体部分として依然として機能しつつ、それは宿主細胞の内方成長のための再造形鋳型として機能する。これを行うためには、本発明の補綴材料は、それ自体またもう１つの加工された組織マトリックスに結合されて患者に対する移植のための補綴を形成することができる哺乳動物由来コラーゲン質組織から開発された加工組織マトリックスである。
【０００７】
本発明は、洗浄された組織材料から組織作成補綴を作成する方法に指向され、ここに、該方法は補綴の生体再造形性を維持しつつ層を一緒に結合するのに接着剤、縫合またはステープルを必要としない。用語「加工組織マトリックス」および「加工組織材料」は動物源、好ましくは哺乳動物から獲得され、随伴組織から機械的に清浄され、細胞、細胞夾雑物から化学的に清浄され、非コラーゲン質細胞外マトリックス成分が実質的になくされた天然の通常の細胞組織を意味する。加工組織マトリックスは、非コラーゲン質成分が実質的になく、その天然マトリックス構造、強度および形状の多くを維持する。本発明の生体作成移植片を構成するための好ましい組成物は、限定されるものではないが、腸、大腿筋膜、心膜、硬膜、およびコラーゲン質組織マトリックスを含む他の平坦または平面構造組織を含めたコラーゲンを含む動物組織である。これらの組織マトリックスの平面構造はそれらが本発明の生体作成移植片を調製するように容易に清浄、操作および組み立てることができるようにする。同一の平坦シート構造およびマトリックス組成を持つ他の適当なコラーゲン質組織源は他の動物源において当業者によって同定され得る。
【０００８】
本発明の生体作成移植片を調製するためのより好ましい組成物は小腸の粘膜下膜に由来する腸コラーゲン層である。小腸についての適当な源はヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヤギまたはウマのごとき哺乳動物生物であるが、ブタの小腸は好ましい源である。
【０００９】
本発明の補綴を調製するための最も好ましい組成物は、ブタ小腸の粘膜下膜に由来する加工腸コラーゲン層である。加工腸コラーゲン層を得るには、ブタの小腸を収集し、伴う腸管膜組織を腸から大いに切開する。粘膜下膜は、好ましくは、対向ローラー間の原料腸材料を機械的に圧搾して筋肉層（筋肉膜）および粘膜（粘膜）を除去することによって小腸の他の層から分離しまたは脱ラミネートする。小腸の粘膜下膜は周囲の組織よりも硬くてしっかりしており、ローラーは粘膜下組織からより柔らかい成分を圧搾する。後記する実施例においては、Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーンを用いてブタ小腸から粘膜下膜を機械的に収集し、次いで、化学的に清浄して清浄組織マトリックスを得る。この機械的かつ化学的に清浄された腸コラーゲン層を本明細書中では「ＩＣＬ」と言う。
【００１０】
重要なことには、組織マトリックスの生体再造形性は、部分的には、清浄プロセスによって維持される。というのは、それはコラーゲンの生体再造形性に悪影響するであろう結合した洗剤残渣がないからである。加えて、組織は清浄プロセスの間に酵素での処理を受けていないので、コラーゲン分子はそのテロペプチド領域を保持している。
【００１１】
補綴デバイスのコラーゲン層は、ＩＣＬの２つ以上の層のごとき、同一コラーゲン材料、またはＩＣＬの１つ以上の層および大腿筋膜の１つ以上の層のごとき異なるコラーゲン材料に由来するものでよい。
【００１２】
加工組織マトリックスは生物工学形成移植片補綴の製造に先立って物理的または化学的に処理または改質することができる。シェーピング、延伸および緩和によるコンディショニング、または洗浄組織マトリックスの穴あけのごとき物理的修飾ならびに結合成長因子、選択された細胞外マトリックス成分、遺伝物質、および生体再造形に影響するであろう他の剤のごとき化学的修飾を行うことができ、身体部分の修復を処理し、改質しまたは置き換える。
【００１３】
ＩＣＬは本発明の生体作成移植片補綴の生産用の最も好ましい出発材料であるので、後記する方法はＩＣＬと密なフィブリルコラーゲンを含む生体作成移植片補綴を生産するのに好ましい方法である。
【００１４】
最も好ましい具体例において、ブタ小腸の粘膜下膜は、本発明の生体作成移植片補綴のための出発物質として利用される。ブタの小腸を収集し、その随伴する組織を除去し、次いで、機械的作用および水を用いる洗浄の組合せを用いて粘膜下膜から脂肪、筋肉および粘膜層を強制的に除去する腸清浄マシーンを用いて機械的に清浄される。機械的作用は、小腸がそれらの間で処理されると粘膜下膜からの連続層を圧縮し、該層を取り除く一連のローラーとして記載することができる。小腸の粘膜下膜は周囲の組織よりも比較的硬くてしっかりしており、ローラーは粘膜下組織から柔軟成分を圧搾する。マシーン清浄の結果は、腸の粘膜下層のみが残るものであった。
【００１５】
機械的に清浄した後、化学的清浄処理を使用して、細胞およびマトリックス成分を除去し、好ましくは室温にて無菌条件下で行う。次いで、腸をルーメンの長さ方向に切断し、次いで、ほぼ１５ｃｍ2シートセクションに切断される。材料を秤量し、腸材料に対する溶液の約１００：１ｖ／ｖの比率にて容器に入れる。国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／４９９６９（その開示をここに一体化させる）に開示された方法のごとき最も好ましい化学的清浄処理において、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加によって、アルカリ性条件下で、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）のごときキレート化剤とコラーゲン質組織を接触させ、続いて、酸と接触させ、ここに該酸は塩、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する塩酸（ＨＣｌ）を含有し、続いて、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０  ｍＭリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）のごとき緩衝化塩溶液と接触させ、最後に水を用いるすすぎ工程を行う。
【００１６】
各処理工程は、好ましくは、回転または震盪プラットフォームを用いて行う。すすいだ後、次いで、水を各容器から除去し、ＩＣＬを−８０℃、滅菌リン酸緩衝液中で４℃で凍結し、あるいは補綴の製造で用いるまで乾燥させて貯蔵する。乾燥して貯蔵すべきならば、好ましくはポリカーボネートのごとき比較的不活性または非反応性材料の平坦プレートのごとき表面上でＩＣＬシートを平坦化し、スカルペルを用いて材料の管腔外からいずれのリンパ系タグも除去し、ＩＣＬシートを雰囲気室温および湿度にて層流風土中で乾燥させる。
【００１７】
ＩＣＬは、その意図した用途に最終的には応じて補綴の形状にて補綴として使用されるべき種々のタイプの構築体を製造するのに使用することができる平面シート構造である。本発明の補綴を形成するには、加工マトリックス材料の生体再造形性を保持する方法を用いて構築体を製造しなければならないが、また置換組織としてその性能においてその強度および構造特徴を維持することもできる。補綴の構造層は、加工組織マトリックスの単一で、通常は略矩形シートから形成されるチューブ状構築体である。この組織マトリックスシートは、一方のエッジがシートの反対側のもうひとつのエッジに出会い、それに重複するように圧延される。該重複は結合領域として働く。本明細書中で用いる「結合領域」は、層が相互に重なって、自己−ラミネーションおよび化学結合によっていっしょに十分保持されるように処理された同一または異なる加工組織マトリックスの２つ以上の層の間の接触の領域を意味する。該結合領域は、臨床、移植で取り扱われる場合に、および患者の細胞が補綴に棲みつき引き続いて生体再造形して新しい組織を形成するまで初期治癒相の間に縫合およびストレッチングに耐えることができなければならない。導管またはダクトとして使用する場合、特に全身血流の収縮期および弛緩期圧力下で血管移植片として使用する場合、結合領域はそれが含有するまたは通過する物質の圧力に耐えることができなければならない。
【００１８】
好ましい具体例において、加工組織マトリックスを、管腔表面、管腔外表面、またはその双方上のフィブリルコラーゲンの層で覆われたチューブ状補綴に形成する。
【００１９】
より好ましい具体例において、加工組織マトリックスは小腸の粘膜下層に由来し、チューブ構造に形成され、密なフィブリルコラーゲンのコーティングが設けられる。
【００２０】
なおより好ましい具体例において、加工組織マトリックスはチューブ状構造に形成された加工ＩＣＬを含み、管腔表面に密なフィブリルコラーゲンのコーティングが設けられる。
【００２１】
最も好ましい具体例において、加工組織マトリックスはチューブ状構造に形成された加工ＩＣＬを含み、血管補綴を形成するためにヘパリンのような抗血栓形成剤が設けられた管腔表面に密なフィブリルコラーゲンのコーティングが設けられる。
【００２２】
ＩＣＬチューブは種々の直径、長さおよび層の数にて製造することができ、その使用のための適用に応じて他の成分を配合することもできる。チューブ状ＩＣＬ構築体は血管移植片として用いることができる。この適用では、移植片は密な継ぎ目と管腔表面を形成する結合領域として作用するための少なくとも５％重複を持つ層を少なくともひとつ含み、管腔表面を好ましくはヘパリンまたは血栓を予防する剤で処理する。もう１つの血管適用において、チューブ状ＩＣＬ構築体を外部ステントとして使用することができ、身体内に静脈自己移植片を移植する場合、移植静脈のための外部支持体が望まれる。さらにもう1つの血管適用において、チューブ状ＩＣＬ構築体が金属ステント上に形成されたステントのためのカバーを供する。該ＩＣＬは、移植すると、ステントのための平滑な保護被覆を供して、配置の間に宿主組織に対するさらなる損傷を妨げることによって受容者に益する。また、チューブ状ＩＣＬ補綴を用いて、胃腸管セクション、尿道、ダクト等の他の通常にチューブ状の構造を修復しまたは置き換えることもできる。また、細胞外マトリックス成分、成長因子または培養細胞を充填した神経成長チューブに製造した場合、それは神経系修復で使用することもできる。
【００２３】
チューブ状構築体を形成するには、形成された構築体の直径を決定するであろう直径測定でマンドレルを選択する。マンドレルは好ましくは断面が円筒または卵型であり、ガラス、ステンレス鋼または非反応性の医療グレードの組成物で作成される。マンドレルは直線、曲線、角度をつけたものであってよく、それは分岐または分岐点、あるいは多数のこれらの性質を有することができる。形成されるべきチューブ状構築体で意図した層の数は、ＩＣＬがマンドレルの回りまたはそれ自体にわたって巻かれる回数の数に一致する。ＩＣＬを巻くことができる回数の数は加工ＩＣＬシートの幅に依存する。２層チューブ状構築体では、シートの幅は少なくとも２回マンドレルの周りにシートを巻くのに十分でなければならない。シートの幅は、マンドレルの周りに所望の回数を巻くことが出来、結合領域として作用するための更なる割合の重複を持つのに十分であることが望ましい。マンドレル周囲の約５％ないし約２０％が、結合領域として働き、および密な継ぎ目を形成するのに十分である。同様に、マンドレルの長さは、その上で形成するとができるチューブの長さを指令するであろう。マンドレル上で構築体を扱う容易性のために、形成される構築体ではなくマンドレルが取り扱われる場合に接触されるように、マンドレルの長さは構築体の長さよりも長くあるべきである。
【００２４】
ＩＣＬはその天然チューブ状状態に由来する面性を有する。ＩＣＬは２つの対向表面；内方粘膜表面および外方漿膜表面を有する。これらの表面は補綴の手術後性能に影響し得る特徴を有するが、増強されたデバイス性能につきてこ入れされ得ることが判明した。血管移植片におけるごとき使用のためのチューブ状構築体の形成において、材料の粘膜表面は、形成された場合に、チューブ状移植片の管腔表面であるのが好ましい。粘膜表面を血流に接触させることは、利点を有する。というのは、それが患者に移植された場合に、移植片の閉塞を妨げるのが好ましいいくつかの非血栓形成性特性を有するからである。
【００２５】
マンドレルには、スリーブ形態である、非反応性で、医療グレードの品質の、弾性ゴムもしくはラテックス材料のカバーリングを設けるのが好ましい。チューブ状ＩＣＬ構築体はマンドレル表面に直接形成することができるが、該スリーブは形成されたチューブをマンドレルから取り出すのを容易とし、ＩＣＬ上の残物に接着したり、それと反応したりそれを残したりしない。形成された構築体を取り出すには、スリーブは、それと共にマンドレルからの構築体を運ぶにはマンドレルの一端から引っ張ることができる。加工されたＩＣＬはスリーブに軽く接着しているの過ぎず、かつ他のＩＣＬ層により接着している故に、ＩＣＬチューブの製造は容易とされる。というのは、チューブ化構築体は、該構築体を延ばしたりまたはそれに圧力を加えたり、あるいはそれに損傷を与える危険性なくしてマンドレルから取り出すことができるからである。最も好ましい具体例において、スリーブはＫＲＡＴＯＮ8（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、非常に安定な飽和中央ブロックを持つスチレン−エチレン／ブチレン−スチレンコポリマーよりなる熱可塑性ゴムを含む。
【００２６】
説明の簡単のために、４ｍｍ直径および１０％重複を持つ２層チューブ状構築体が４ｍｍ直径を有するマンドレル上に形成されるものとする。マンドレルには、該マンドレルの長さとほぼ同等の長さであって、その上に形成されるべき構築体よりも長いＫＲＡＴＯＮ8スリーブが設けられる。ＩＣＬのシートは、幅の寸法が約２８ｍｍであって、長さの寸法が構築体の所望の長さに依存して変化し得るように整えられる。層流キャビネットの滅菌場において、次いで、ＩＣＬを以下のプロセスによってコラーゲンチューブに形成する。該ＩＣＬは１つのエッジに沿って湿らせ、スリーブ被覆マンドレルと整列させ、ＩＣＬの接着性質をてこ入れし、それをスリーブ上に「舗装」し、所定の位置にて少なくとも１０分以上乾燥する。次いで、舗装したＩＣＬを水和させ、マンドレルの回りにおよび自身の上に１回転＋周囲の１０％だけ巻いて、密な継目を提供する。
【００２７】
単一チューブ状構築体の形成には、ＩＣＬは、構築体の周囲の約５％と等しい結合領域を供するための重複として、１回十分におよびさらなる回転の少なくとも５％だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。２層構築体では、ＩＣＬは、重複として、少なくとも２回および好ましくはさらに５％ないし２０％回転だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。２層巻きがＩＣＬの表面の間に１００％の結合領域を提供すると同時に、重複のための更なる割合は密で不浸透性の継目を確保する。３層構築体では、ＩＣＬは、重複として少なくとも３回および好ましくはさらに５％ないし２０％回転だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。意図した適用によって要求される移植片の仕様に応じて、構築体はいずれかの数の層にて調製することができる。典型的には、チューブ状構築体は、重複の程度を変化させて、１０層以下、好ましくは２ないし６層以上、より好ましくは２または３層有するであろう。巻いた後、いずれの気泡、巻き、および皺をマンドレルの下方から、および層の間から延ばす。
【００２８】
ＩＣＬは、手動で、またはマンドレルの下方またはＩＣＬの層の間に生じ得る気泡または水泡または皺を均等に張りそれを延ばすのを助ける装置の助けで圧延することができる。該装置は、マンドレルがそれがＩＣＬを巻くように回転するにつれてその長さに沿って接触できる表面を有するであろう。
【００２９】
次いで、スリーブ被覆マンドレル上に巻いた配置である間に、それを脱水することによって、巻いたＩＣＬの層を一緒に結合する。理論に拘束されるつもりはないが、脱水は、マトリックス中の繊維の間の空間から水を除去すると、コラーゲン繊維のごとき細胞外マトリックス成分を一緒に層に入れる。脱水は空気中、真空中、またはアセトンまたはエチルアルコールもしくはイソプロピルアルコールのごときアルコールによって行うことができる。脱水は室内湿度、通常は約１０％Ｒｈないし約２０％Ｒｈ以下；または約１０重量％ないし２０重量％水分まで行うことができる。脱水は、雰囲気室温、ほぼ２０℃および室内湿度にて、少なくとも約１時間ないし２４時間まで、ＩＣＬ層を層流キャビネットの気流まで入れるような角度にマンドレルを置くことによって容易に行うことができる。次いで、それと共にＩＣＬチューブを担うマンドレルからスリーブを取り出すことによってＩＣＬチューブをスリーブから取り出し、スリーブを端部から引っ張り、それを滑らせてマンドレルから離すことによって、スリーブを構築体の管腔から取り出す。構築体は、それを再水和剤液を含有する室温滅菌容器に移すことによって、少なくとも約１０ないし約１５分間水性再水和剤液、好ましくは水中で再脱水して、層を分離または脱ラミネートすることなくそれを再水和することができる。
【００３０】
もう１つの好ましい具体例において、管腔表面または管腔外表面、または形成されたチューブの管腔もしくは管腔外表面双方にコラーゲンコーティングを添加することができる。出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，２５６，４１８号の実施例５に記載されたごとく、コラーゲンをＩＣＬの表面に沈積させることができる。この沈積したコラーゲン層は「ＤＦＣ」ともいう「密なフィブリルコラーゲン」として特徴づけられ、それはコラーゲン溶液から形成されたフィブリルテロペプチドコラーゲンの層である。構築体を血管移植片として用いる場合、ＤＦＣ層は構造ＩＣＬ層の内部表面で平滑流表面として働く。該沈積工程は、図１における装置を用いて形成された静水圧ヘッドを用いて前記引用の特許出願に記載されているごとく達成することもできる。図１はコラーゲン貯蔵器１０、分岐したチューブ２０、ルーエルフィッティング２５、結合したＩＣＬのチューブ状構築体５０、およびＰＥＧ  ３５を含有する容器３０を示す。静水圧ヘッドを生じさせるために、コラーゲン溶液を含有するコラーゲン貯蔵器１０をチューブ状構築体５０の上方３−８フィートの距離に設け、構築体のいずれかの端部に固定されたルーエルフィッティング２５に付着された分岐チューブ２０を介して構築体に結合される。略言すれば、ＩＣＬをチューブ状とした後、ルーエルフィッティング２５によって多層ファブリックを一端で適合させ、脱イオン水で再水和させ、コラーゲン貯蔵器１０からのコラーゲンがチューブを満たす。コラーゲンを同時にチューブの両端部に流入させることによって、コラーゲンの内方層を沈積させることもできる。好ましいコラーゲン組成物は酢酸中の約１ないし約５ｍｇ／ｍＬの間の可溶化された酸抽出コラーゲン濃度である。次いで、等張リン酸緩衝化セーライン  （ＰＢＳ）（中性ｐＨ）で中の緩衝化２０％  ｗ／ｖポリエチレングリコール６００〜６５０ｍｍｏｌ／Ｋｇ分子量８００（ＰＥＧ）の槽に該チューブを入れる。コラーゲン沈積の間に移植片を火炎上に設けて、約１００ないし約１５０ｍｍＨｇの間、好ましくは約１２０ｍｍＨｇの静水圧を供する。組み合わせた内部コラーゲン溶液および外方ＰＥＧ溶液の間の浸透圧グラジエントは、内部構造層壁の管腔に沿ったコラーゲンの同時濃縮および沈積を引き起こす。ＤＦＣ沈積を、好ましくは約１０分ないし６時間の間、より好ましくは約１０分ないし約６０分の間、最も好ましくは約３０分の時間起こさせる。１０分間の沈積は約１５ないし約２０μｍのＤＦＣコーティングを生じ；３０分の沈積は約４０ないし約５０μｍのコーティングを生じる。より長い沈積時間はより濃厚なＤＦＣコーティングを生じるであろう。次いで、チューブをＰＥＧ槽から取り出し、ＰＢＳを満たし、補綴を乾燥しつつ構築体の管腔を維持する。管腔を維持するための１つの手段は、第１のものよりも小さな直径を持つ第２のマンドレルを管腔に挿入することである。管腔を維持する好ましい手段は空気を構築体に強制的に入れることである。次いで、補綴を乾燥させる。次いで、チューブを等張リン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）中で再水和させる。このプロセスは沈積したコラーゲン層が腸構造層中のわずかな凹凸を満たすようにし、かくし��、その結果、平滑な表面およびほぼ均一な厚みを有する層が得られる。該手法は腸コラーゲン層に対するコラーゲンゲルの結合も促進する。コラーゲン溶液の濃度またはｐＨ、ＰＥＧ溶液の濃度またはｐＨ、時間、および温度のごとき沈積条件を単に変化させることによって、厚みおよび密度を変化させたコラーゲン質層を生産することができる。パラメーターの変化はコラーゲン分野の技量のあるルーチン的実験者によって容易に決定できる。同一手法を用いてコラーゲンをＩＣＬの外方表面に適用して３層補綴を得ることができる。
【００３１】
ＩＣＬおよびＤＦＣ層を一緒に結合させるためには、水和および脱水の少なくとも２サイクルの間、補綴を水和し脱水する。水和は、好ましくは、水または中性ｐＨの等張リン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）いずれかのごとき水和剤中で行われる。脱水は、層流キャビネットの気流中におけるごとき無菌状態下で補綴を空気、好ましくは流動する空気に暴露することによって行われ、室温、ほぼ２０℃ないし室内湿度以下のキャビネット中で約１８±２時間乾燥する。また、脱水はエタノール、アセトンまたはイソプロパノールのごとく溶媒の手段によって達成することができる。
【００３２】
補綴は化学架橋剤を用いて化学的に架橋される。好ましい架橋剤は、約０．１  ｍＭないし約１００  ｍＭの間の濃度、より好ましくは約１．０  ｍＭないし約１０  ｍＭの間の濃度、最も好ましくは約０．１  ｍＭないし約１  ｍＭの間の濃度の水中のＥＤＣである。最も好ましい架橋剤は水中の１ｍＭ  ＥＤＣである。ＥＤＣは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である。ＥＤＣ以外に、他のカルボジイミドおよびフィブリンベースの膠のごときその付属物またはシアノアクリレート、ポリウレタン、酢酸ビニルまたはポリエポキシのごとき医療グレードの接着剤を架橋剤として用いることができる。水、リン酸緩衝化セーライン、または（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）緩衝液を用いて架橋剤を溶解することができる。次いで、水和ＩＣＬチューブをテストチューブまたは狭いパンのごとき容器に移し、層が被覆されかつ自由に浮遊し、気泡がチューブ内部に存在しないことを確実としつつ、架橋剤をパンに温和にデカントする。該パンを被覆し、フュームフード中に１８±１２時間置き、しかる後架橋溶液をデカントし、捨てる。架橋後、チューブをすすぐ。ＩＣＬチューブを、テストチューブまたはパン中にて滅菌水で各すすぎにつき約５分間３回すすいだ。
【００３３】
次いで、液相または気相中の化学滅菌剤を用いて補綴を化学的に滅菌する。出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，４６０，９６２号に記載されているごとくに、構築体を希薄過酢酸溶液中で滅菌する。コラーゲンで使用される他の滅菌システムは当該分野で知られており、それを用いることができる。好ましい方法において、および後記実施例において、ＩＣＬを０．１％過酢酸溶液で消毒し、４℃で使用するまで貯蔵した。滅菌剤との接触後にもし滅菌剤残渣が残れば、構築体をすすぐ。ＩＣＬチューブを、テストチューブまたはパン中にて各すすぎにつき約５ないし約１５分間滅菌水で３回すすぐ。
【００３４】
ヘパリンを形成されたチューブの管腔に適用することによって容器を非血栓形成性とすることができる。よく知られた種々の技術によって、ヘパリンを補綴に適用することができる。説明のために、ヘパリンは以下の３つの方法で補綴に適用できるものとする。まず、管腔を垂直に満たし、あるいは補綴を溶液中に浸漬し、次いで、それを風乾することによって、ベンザルコニウムヘパリン（ＢＡ−Ｈｅｐ）イソプロピルアルコール溶液を、補綴に適用する。この手法は、イオン結合したＢＡ−Ｈｅｐ複合体でコラーゲンを処理する。第２に、ＥＤＣを用いてヘパリンを活性化し、次いで、該ヘパリンをコラーゲン繊維に共有結合させることができる。第３に、ＥＤＣを用いてコラーゲンを活性化させ、次いで、プロタミンをコラーゲンに共有結合させ、次いで、イオン結合したヘパリンをプロタミンに結合させることができる。多くの他のコーティング、結合および付着手法が当該分野でよく知られており、これらも使用することができる。構築体の製造が完了すれば、使用するまでそれを滅菌容器に入れる。
【００３５】
次いで、医療デバイス滅菌の分野で知られた手段を用いて構築体を末端滅菌する。滅菌のための好ましい方法は、ここにその開示を一体化させる、米国特許第５，４６０，９６２号に従って、十分量の１０Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で中和した滅菌０．１％過酢酸（ＰＡ）処理と構築体を接触させることによる。汚染除去は、１Ｌ  Ｎａｌｇｅ容器のごときシェーカープラットフォーム上の容器中にて約１８±２時間行う。次いで、３倍容量の滅菌水と各すずきにて１０分間接触させることによって構築体をすすぐ。
【００３６】
チューブ状補綴を用いて、例えば、血管系、食道、気管、腸、およびＦａｌｌｏｐｉｕｓに起因するチューブのごときチューブ状器官の断面を置き換えることができる。これらの器官は外方表面および内方管腔表面を持つ基本的チューブ状形状を有する。平坦シートは器官支持体で用いて、例えば、膀胱または子宮のごとき器官のための三角布としてシートを用いることによって脱したおよび過剰運動性器官を支持することもできる。加えて、平坦シートおよびチューブ状構築体は一緒に形成して複合構築体を形成させ、心臓または静脈値を置き換えまたは増加させることができる。
【００３７】
本発明の生物工学移植片補綴を用いて、宿主組織で損傷したまたは病気となった身体構造を修復し置き換えることができる。代替身体一部または支持体として機能させつつ、補綴は、宿主細胞の内方増殖のための生体再造形可能マトリックス足場としても機能する。本明細書で用いる「生体再造形」とは、宿主細胞または酵素による移植補綴のマトリックス成分の生分解、再形成および置換の速度とほぼ等しい速度で宿主細胞の内方増殖による構造コラーゲンの生産、血管形成および細胞再集団形成を意味するように使用される。移植片補綴は、宿主によって全ての、または実質的に全ての宿主組織に再造形されつつその構造特徴を保持し、それ自体はそれが修復し置き換える組織のアナログとして機能する。
【００３８】
組織マトリックス補綴の収縮温度（℃）はマトリックス架橋の程度のインジケーターである。収縮温度が高ければ、材料はより架橋している。非架橋ＩＬＣは約６８±０．３℃の収縮温度を有する。好ましい具体例においては、ＥＤＣ架橋補綴は約６８±±１℃ないし約７５±１℃の間の収縮温度を有するべきである。
【００３９】
機械的特性は、補綴が生体再造形の間にクリープに抵抗し、加えて、柔軟であって縫合可能であるように機械的一体性を含む。用語「柔軟」は臨床使用の容易性のための良好な取り扱い特性を意味する。
【００４０】
用語「縫合可能」とは、層の機械的特性が、針および縫合材料が補綴の天然組織のセクションへの縫合への時点で補綴材料を通過することを可能とする縫合保持（吻合として知られたプロセス）を意味する。縫合の間、かかる補綴は縫合によりそれに適用された引張力の結果として裂けてはならず、また縫合が結ばれる場合に裂けてはならない。補綴の縫合性、すなわち、縫合されつつ裂けに抵抗する補綴の能力は、補綴材料の固有の機械的強度、移植片の厚み、縫合に適用された引張力、および結びが引かれて閉じられる速度に関連する。水中の１  ｍＭ  ＥＤＣ中で架橋した２層チューブ状補綴のための縫合保持は約３．９Ｎ±０．８Ｎである。好ましいより低い縫合保持強度は、架橋された平坦２層補綴では約２Ｎであり：縫合する場合の外科医の引張強度は約１．８Ｎである。
【００４１】
本明細書で用いる「非クリーピング」は、補綴が移植後に正常限界を超えて伸びたり、広がったり、拡大されたりしないように補綴の生物機械的特性が持続性を付与することを意味する。後記するごとく、本発明の移植された補綴の全ストレッチは許容される限界内にある。本発明の補綴は、生分解および再造形による移植された材料の機械的強度の喪失よりも速い速度で宿主細胞による構造コラーゲンの置換による移植後細胞生体再造形の機能としてストレッチングに対する抵抗性を獲得する。
【００４２】
層とされかつ結合されているにもかかわらず、本発明の加工された組織材料は「半透性」である。半透性は再造形のため、あるいは生体再造形性、細胞内方増殖、接着予防または促進、または血流に影響するであろう剤および成分の沈積のために宿主細胞の内方増殖を可能とする。補綴の「非多孔性」性質は補綴の移植によって保持されることを意図する流体の通過を防止する。逆に、もし多孔性または開口性質が補綴の適用に必要であれば孔を補綴中に形成することができる。
【００４３】
いくつかの具体例において、ＩＣＬが組織修復または置換のために構築体に再形成され、その上に沈積された密なフィブリルコラーゲン層を有した後、それには細胞が棲み着いて、ＩＣＬの結合した層および培養細胞を含む細胞組織構築体を形成する。細胞組織構築体を形成して、それらが修復し、または置き換える器官を模倣することができる。
【００４４】
組織を解離することによって、あるいは外植体方法によって、細胞培養を哺乳動物組織源から確立する。一次培養を確立し、それからバンクの一部を解凍し、接種し、継代培養して細胞数を拡大したマスター細胞バンクで低温保存する。無細胞ＩＣＬ構築体に細胞を棲み着かせるために、構築体を培養皿またはフラスコに入れ、懸濁された細胞を含有する培地への浸漬によって接触させる。コラーゲンは細胞接着のための天然物質であるので、細胞はＩＣＬ構築体に結合し、構築体のコラーゲン質マトリックス上でおよびそれに増殖させる。
【００４５】
本発明で用いる好ましい細胞タイプは腸間膜に由来する。より好ましい細胞タイプは繊維芽細胞、間質細胞、および他の支持結合組織細胞、またはヒト皮膚繊維芽細胞である。ヒト繊維芽細胞は、限定されるものではないが、新生児雄包皮、真皮、腱、肺、臍帯、軟骨、尿道、角膜間質、口腔粘膜および腸を含めた多数の源に由来し得る。ヒト細胞は限定されるものではないが、繊維芽細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞および腸間膜起源の他の結合組織細胞を含むことができる。組織構築体の生産で使用されるマトリックス−生産細胞の起源は、本発明の培養方法を用いた後に似せたりまたは模倣すべき組織タイプに由来するのが好ましいがそれが必要というのではない。例えば、多層シート構築体を繊維芽細胞と共に培養して、骨格筋構築体のために生きた結合組織を作った；または筋芽細胞を形成する。１を超える細胞タイプを用いてＩＣＬ構築体に棲みつかせることができ、例えば、チューブ状構築体をまず平滑筋細胞と共に培養し、次いで、第１の細胞タイプが棲みついた構築体の管腔を第２の細胞タイプとしての血管内皮細胞と共に培養して細胞血管置換デバイスを形成する。同様に、平滑筋細胞を第１の細胞タイプとして、次いで、尿内皮細胞を第２の細胞タイプとして用いて、尿膀胱壁パッチ補綴を同様に多層ＩＣＬシート構築体上に調製する。細胞ドナーは発生および年齢で変化し得る。細胞は胚、新生児または成体を含めた他の個体のドナー組織に由来し得る。腸間膜幹細胞のごとき胚先祖細胞を本発明で用い、それを誘導して分化させ所望の組織に発育させることができる。
【００４６】
ヒト細胞は本発明で用いるのに好ましいが、本発明の方法で用いるべき細胞はヒト源からの細胞に限定されない。限定されるものではないが、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジおよびネズミ源を含めた他の哺乳動物種からの細胞を用いることができる。加えて、自然発生的に、化学的にまたはウイルスによりトランスフェクトされた遺伝子工学作成細胞を本発明で用いることもできる。１を超える細胞タイプを取り込む具体例では、正常および遺伝的に修飾したもしくはトランスフェクトした細胞の混合物を用いることができ、２つ以上の種または組織源の細胞の混合物を用いることができ、あるいは双方を用いることができる。
【００４７】
組換えまたは遺伝子工学作成細胞を細胞マトリックス構築体の生産で用いて、増大したレベルの天然細胞産物または治療剤での治療を必要とする患者のための薬物送達移植片として作用する組織構築体を創製することができる。患者に存在する条件により生物学的に、化学的にまたは熱的に信号が発せられた場合、連続的な時間または必要に応じて、移植片組換え細胞産物、成長因子、ホルモン、ペプチド、または蛋白質を介して細胞を生産し、患者に送達することができる。また、細胞を遺伝子工学により作成して、「正常」であるが高レベルで発現されるか、あるいは改良された創傷治癒、促進されたもしくは指向された血管新生に治療的に有利である細胞外マトリックスおよび生細胞を含む移植片デバイスを作成するためにいくつかの方法で改質された蛋白質または異なるタイプの細胞外マトリックス成分を発現させることもできる。これらの手法は一般的に当該分野で公知であり、出典明示して本明細書の一部とみなすＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）に記載されている。結合したＩＣＬ層から形成された無細胞構築体から形成された細胞組織構築体の生産のためにすべての前記したタイプの細胞を本発明で用いることができる。
【００４８】
以下の実施例は本発明の実施をよく説明するために掲げ、本発明の範囲を断じて限定するものと解釈されるべきではない。その組成、形状および厚みにおけるデバイス設計は構築体のための最終適用に応じて選択されるべきであることが理解されよう。当業者ならば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に記載した方法に種々の修飾をなすことができるのを理解するであろう。
【００４９】
【実施例】
実施例１：機械的に清浄されたブタ小腸の化学的清浄
機械的作用および水を用いる洗浄の組合せを用いて粘膜下層から脂肪、筋肉および粘膜層を強制的に取り出すＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーン（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ）を用い、ブタの小腸を採取し、機械的にストリップした。機械的作用は、無傷小腸をその間に走行させると粘膜下層からの連続層を圧縮しそれをストリップする一連のローラーとして記載することができる。小腸の粘膜下層は周囲の組織よりも比較的硬くしっかりしておりローラーはより柔らかい成分を粘膜下組織から圧搾する。機械清浄の結果は、腸の粘膜下層のみが残るものであった。該手法の残りは無菌下かつ室温にて行った。化学溶液はすべて室温で用いた。次いで、腸を管腔の長さにそって切断し、次いで１５ｃｍセクションに切断した。材料を秤量し、小腸に対する溶液の約１００：１ｖ／ｖの比率にて容器に入れた。
【００５０】
Ａ．腸を含有する各容器に０．２、０．２２μｍ（ミクロン）濾過滅菌下１００ ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）／１０ ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、容器を約２００ｒｐｍにて約１８時間シェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＥＤＴＡ／ＮａＯＨを各ボトルから取り出した。
【００５１】
Ｂ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）／１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、約２００ｒｐｍにて約６ないし８時間の間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＨＣｌ／ＮａＣｌ溶液を各容器から取り出した。
【００５２】
Ｃ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０  ｍＭリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、２００ｒｐｍにてほぼ１８時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液を各容器から取り出した。
【００５３】
Ｄ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１０ｍＭ  ＰＢＳのほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、２００ｒｐｍにて約２時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、次いで、リン酸緩衝化セーラインを各容器から取り出した。
【００５４】
Ｅ．最後に、次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した水１Ｌを添加した。次いで、約２００ｒｐｍにて約１時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、次いで、水を各容器から取り出した。
【００５５】
組織学的分析のために処理された試料を切断し固定した。ヘモトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＭａｓｓｏｎ三色染色を対照および処理組織双方の断面および長手方向面試料で行った。加工ＩＬＣ試料は細胞および細胞球雑物がないように見え、他方、対照試料は正常かつ予測されたごとくに非常に細胞が見えた。
【００５６】
実施例２：コラーゲン質組織についての他の正常処理の比較実験
Ｋｅｍｐに対する米国特許第５，４６０，９６２号に記載されたコラーゲン質組織を消毒し滅菌する他の方法を、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１５８にＣｏｏｋらによって記載された同様の方法と比較した。非緩衝化過酢酸方法に加えてＫｅｍｐからの実施例１、２、および３を行った。
【００５７】
小腸を四匹の大きなブタから採取した。腸を採取し、外方腸間膜層をストリップし、腸に水を満たした。
【００５８】
実験は７つの条件を含むものであった：
条件Ａは国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１５８におけるＣｏｏｋらの実施例１の開示に従って行った。条件Ｂは、腸材料を開示された化学処理を使用する前に機械的に清浄した点でＡの変形である。条件Ｃ、ＤおよびＥはＫｅｍｐに対する米国特許第５，４６０，９６２号における実施例１、２および３の方法に従って行った。すべての条件において、材料に対する溶液の１０−対−１比率を用いた、すなわち、１００ｇの組織材料を１Ｌの溶液で処理する。
【００５９】
Ａ．４つの腸の各々からの材料を、５％エタノール中の０．２％過酢酸（ｐＨ２．５６）の１リットル溶液を含有する別々のボトルに入れ、シェーカープラットフォーム上で震盪させた。震盪の２時間後、条件ＡはＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーン上で機械的に清浄した。
【００６０】
他の６つの条件ＢないしＧについては、化学的処理に先立ってＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーンを用いて腸を機械的に清浄した。機械的清浄後、４つの腸からの代表的なピースを化学処理用の溶液を含有するボトルに入れた。ボトルをプラットフォーム上で１８±２時間震盪した。残りの６つの条件ＢないしＧは以下の通りであった：
Ｂ．５％エタノール中の０．２％過酢酸の１リットル溶液（ｐＨ２．５６）（ｎ＝５）。
【００６１】
Ｃ．リン酸緩衝化セーライン中の０．１％過酢酸の１リットル溶液（ｐＨ７．２）。
【００６２】
Ｄ．０．１％過酢酸および１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の１リットル溶液（ｐＨ７．２）。
【００６３】
Ｅ．０．１％過酢酸および１Ｍ  ＮａＣｌの１リットル溶液（ｐＨ２．９））。
【００６４】
Ｆ．実施例１で前記した「化学清浄」溶液の１リットル。
【００６５】
Ｇ．ｐＨ７．０に緩衝化された、脱イオン水中の０．１％過酢酸の１リットル溶液。
【００６６】
化学的および機械的処理、すべての条件を合計４回濾過滅菌精製水ですすいだ。機械的および化学的に処理した材料はＭａｙｅｒヘマトキシリンで細胞夾雑物を調べるのに大いに染色された。形態学的評価はヘマトキシリンおよびエオシン、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム、およびアリザリンレッド染色技術。種々の処理からの組織学的結果は、条件Ａの方法は化学的処理後にＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ上の粘膜層を取り出すのが非常に困難な場合に材料を生じさせることを示す。該材料は１０−１２回過剰にＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇを通さなければならなかった。該材料は一見して非常に膨潤し、材料の表面上および血管系においてかなり大量の細胞夾雑物を有した。条件Ｂの方法も非常に膨潤し、材料の表面上および血管系においてかなり多量の細胞夾雑部を示した。条件ＣおよびＤの方法は血管系中に最小細胞夾雑物を有する非膨潤材料を生じた。条件Ｅはわずかに膨潤し、血管系に最小の細胞夾雑物を含有する材料を生じた。
【００６７】
ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて清浄組織中に含有される残存ＤＮＡ／ＲＮＡを定量した。結果を表１にまとめる。
【００６８】
【表１】
0004341050.tif 000002
【００６９】
形態学的分析はＤＮＡ／ＲＮＡ定量と相関して、条件ＡおよびＢの清浄方法の結果、高度に細胞的なままであって結果として残存ＤＮＡを含有するコラーゲン質組織マトリックスが得られることを示す。Ｋｅｍｐの清浄方法はコラーゲン質組織マトリックスからの細胞および細胞夾雑物の除去でかなり効果的である。最後に、Ａｂｒａｈａｍらに対する国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／４９９６９に記載され、前記実施例１に概説した条件Ｆの化学的清浄方法はすべての細胞および細胞夾雑物ならびにそのＤＮＡ／ＲＮＡをこれらの方法により検出できないレベルまで除去する。
【００７０】
実施例３：チューブ状ＩＣＬ／ＤＦＣ移植片を作成する方法
層流キャビネットの滅菌分野において、ＩＣＬを以下のプロセスによってＩＣＬコラーゲンチューブに形成した。ＩＣＬの漿膜表面からリンパ系タグをトリムした。ＩＣＬを滅菌吸収剤タオルでにじませて過剰の水を材料から吸収し、次いで、多孔性ポリカーボネートシート上に広げ、層流キャビネットの気流中で乾燥した。一端乾燥すると、ほぼ１０％重複した２層移植片用にＩＣＬを２８．５ｍｍ×１０ｃｍピースに切断した。チューブの形成においてＩＣＬを支持するために、約４ｍｍの直径を持つ円筒ステンレス鋼マンドレルを、ＫＲＡＴＯＮ8（マンドレルからの形成されたコラーゲンチューブの取り出しを容易とし、ＩＣＬに接着せずまたはそれと反応しない弾性スリーブ材料）で被覆した。次いで、ＩＣＬの長いエッジを滅菌水で示され、マンドレルに接着させ、約１５分間乾燥させて「フラッグ」を形成させた。一旦接着すると、ＩＣＬを、マンドレルの周りおよびそれ自体にわたり一回完全に圧延した。ローリングが完了した後、気泡、折り畳みおよびしわを材料の下方および層の間から延ばした。マンドレルおよび
圧延した構築体（マンドレル上）を室温（ほぼ２０℃）にてキャビネット中約１時間層流キャビネットの気流中で乾燥させた。形成されたＩＣＬチューブおよびＫｒａｔｏｎをいっしょにマンドレルから取り出し、ＩＣＬチューブをＫｒａｔｏｎから取り出した。
【００７１】
密なフィブリルコラーゲン（ＤＦＣ）をチューブの管腔表面上に沈積させるために、チューブに付着させるためにルーエルバーブをチューブの両末端に付着させて、チューブの内部へのコラーゲンおよび沈積剤への送達を促進させた。ＤＦＣの最終コーティングのための所望の厚みに応じて、１０、３０または６０分間、１２０ｍｍＨｇの静的内圧下でまたは強制的空気流動下でチューブの管腔がコラーゲン溶液で満ちるまで、ほぼ２．５  ｍｇ／ｍｌの酢酸中の酸抽出コラーゲン溶液をルーエルバーブを通って添加した。コラーゲン溶液によってチューブの内部から空気を置換すると、第２の端部を、コラーゲンを第１の端部に供給するチューブ中の分岐に結合した。ほぼ５００ｍＬの循環ポリエチレングリコール  （ＰＥＧ）  Ｎ６００、ＭＷ８０００の槽にチューブ状を沈めた。次いで、ルーエルバーブを通じて、チューブにリン酸緩衝化セーラインを満たして静水圧にてコラーゲンの容量ほぼ６０ｃｃに打ち消し、ＤＦＣの新たに沈積した管腔カバーリングに損傷を与えないようにした。次いで、ルーエルバーブを乾燥した滅菌濾過空気源に付着させ、約２ないし３時間の所望の時間、あるいはほぼ室内の相対湿度に到達するまで、１２０ｍｍＨｇの静的内圧下で流動空気でチューブを乾燥した。チューブを少なくとも１時間ＰＢＳ中で再水和させ、同一の空気乾燥方法を用い、少なくとも２時間ないし一晩 （１８±２時間）再度乾燥した。次いで、チューブを滅菌水中の１ ｍＭ  ＥＤＣの約５０ ｍＬ架橋剤にて各々化学的に架橋した。次いで、チューブを３等容量の滅菌水ですすいで、残存する架橋剤および反応生成物を除去した。次いで、Ｋｅｍｐに従って６．７ないし７．１のｐＨに中和された脱イオン水中の０．１％過酢酸の溶液中でチューブを最後に滅菌した。次いで、チューブを２容量の滅菌水中ですすいで残存する滅菌剤を除去した。最後に、チューブを垂直に吊り下げ、少なくとも１分間で管腔にＢＡ−ＨＥＰを満たし、排出し、少なくとも１時間乾燥した。この手法をベンザルコニウムヘパリンの合計３回処理のために２回反復する。次いで、チューブ構築体を使用するまで滅菌ポリカーボネートテストチューブに充填した。
【００７２】
実施例４：ＩＣＬチューブ補綴の機械的テスト
２０％重複にてマンドレルの回りに巻かれ、水中の１ｍＭ  ＥＤＣで架橋されたＩＬＣの単一シートから形成された２層ＩＣＬチューブ状構築体の種々の機械的特性を測定した。「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ」，  ＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ，  １９９３年８月に従って、  縫合保持、破裂、多孔度およびコンプライアンステストを行った。縫合保持、破裂およびコンプライアンス分析はＴｅｓｔＳｔａｒ−ＳＸソフトウェアを備えたサーボヒドローリックＭＴＳテストシステムを用いて行った。
【００７３】
略言すれば、縫合保持は一定速度で移植片のエッジから２．０ｍｍ引かれる縫合よりなるものである。縫合が移植片を通じて裂かれた場合のピーク力を測定した。得られた平均測定値は必要な限界を超え、構築体が臨床における医師の縫合圧力に耐えることができることを示す。
【００７４】
破裂テストにおいて、移植片が破裂するまで１分間隔で圧力を２．０ｐｓｉで増分にて移植片に適用した。参照のために、収縮期圧力は正常血圧のヒトにおいてほぼ１２０ｍｍＨｇ  （１６．０  ｋＰａ）である。テストによって得られた破裂強度は、構築体が収縮期圧力の約７．７５倍に圧力を維持することを示し、かくして、構築体が血管適用のために移植でき厳格な血液循環に耐えることができることを示す。
【００７５】
コンプライアンステストでは、移植片を順次８０および１２０ｍｍＨｇとした。次いで、イメージ分析ソフトウェアを用いて各圧力にて移植片の直径を測定し、（Ｄ120−Ｄ80）／（Ｄ80×４０  ｍｍＨｇ）×１００％としてコンプライアンスを計算した。ウサギ頸動脈のコンプライアンスはほぼ０．０７％／ｍｍＨｇ，  ヒト動脈は約０．０６％／ｍｍＨｇであってヒト静脈は約０．０２％／ｍｍＨｇであり、これは構築体が血管移植片として働くのに必要なコンプライアンスを呈することを示す。
【００７６】
多孔度を測定するには、１２０ｍｍＨｇの静水圧下のＰＢＳを移植片に適用する。多孔度を測定するために７２時間にわたって移植片を透過したＰＢＳの容量を時間および移植片の表面積に正規化した。
【００７７】
収縮温度を用いてコラーゲン質材料における架橋の程度をモニターする。移植片がより架橋すれば、より多いエネルギーが必要となり、かくしてより高い収縮温度が必要となる。示唆走査熱量計を用いて熱的に制御された条件下で試料へのおよび試料からの熱流を測定した。収縮温度は温度−エネルギープロットにおける変性ピークの開始温度と定義した。
【００７８】
縫合保持は２Ｎをよく超え、これは補綴を所定の位置に縫合することを示唆した。測定された破裂強度は収縮期圧力の７倍を超えていた。コンプライアンスはヒト動脈および静脈の範囲内にあった。ＩＣＬチューブの多孔度は織った移植片として低く、プレ−クロッティングを要しない。収縮温度は非架橋ＩＣＬのそれに近く、低い量の架橋を示す。
【００７９】
【表２】
0004341050.tif 000003
【００８０】
実施例５：ＩＣＬ／ＤＦＣ補綴を用いる動物実験
脱イオン水中の１  ｍＭ  ＥＤＣで結合し、ＤＦＣでコートした管腔表面としてＩＣＬの粘膜側を有する２層の分かれたＩＣＬ構築体を調製した。２つのＤＦＣ層厚みをテストした：ほぼ１５ないし２０μｍのＤＦＣ層を有する１０分沈積およびほぼ４０ないし５０μｍ厚みのＤＦＣ層を有する３０分沈積。ウサギモデルにおいて移植片を大腿動脈置換移植片として用いた。
【００８１】
外科的処置および麻酔にちょうど先だって約２．０  ｋｇないし約２．５  ｋｇの間と秤量されたニュージーランド・ホワイトウサギを、皮下注射したケタミン塩酸塩  （３０−６０  ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン  （３−６  ｍｇ／ｋｇ）を用いて誘導した。麻酔は誘導用量の約５０％のケタミンで維持した。外科処置領域をクリップで留め、調製し、垂らして、フィールド滅菌性を維持した。手術前にバイトリル  （１０  ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内投与し、加熱パッドでの外科的処置の間に該動物を温め続けた。頸斜位切開を通じて、頸静脈を可動化し、結紮し、分割して頸動脈を露出した。右側頸動脈の完全な可動化に続き、かつ動脈クランピングに先だって、ヘパリン  （２００  ＩＵ／ｋｇ）を静脈内投与した。次いで、無外傷動脈クランプを動脈切開部位の近位および遠位側において流れを閉塞し、近位動脈切開を成した。動脈−対移植片の末端−対−側面近位吻合を１０−０  Ｅｔｈｉｌｏｎ縫合を用いて行った。移植片をすばやく満たした後、同様にして遠位吻合を行った。吻合間の大腿動脈のセグメントを切開し、３−４ｃｍ長の中位移植片を得た。動脈流を再確立し、筋膜のための３−０  Ｖｉｃｒｙｌおよび皮膚のための４−０  Ｅｔｈｉｌｏｎを用いて閉鎖を層中で行った。手術後直ちに、動物を個々に収納し、胸骨横臥を維持するまで１５分毎に観察した。合併症のいずれかの兆候につきすべての外科的創傷を１日に少なくとも１回チェックした。いずれの必要な修正行動も採り、記録に示した。
【００８２】
犠牲に先立ち動物の体重および一般的状態を評価するための一般的身体検査を行った。見積もった触診および抹消循環によって移植片パルスを評価した。移植につき記載したごとく麻酔を誘導した。従前の切開を再度開いた。移植片を可動化した後にヘパリンを前記したごとく投与した。近位大腿動脈にカニューレを入れ、静脈内投与したパントバルビタール  （１００ ｍｇ／ｋｇ）で動物を安楽死させた。安楽死の直後、イン・サイチュにて生理学的圧力（８０ ｍｍＨｇ）において、移植片にハンクスの平衡塩を満たした。組織学的に分析すべき移植片セグメントを同圧力にてＭｃＤｏｗｌｌ−Ｔｒｕｍｐ溶液で３０−６０分間固定した。固定されていない外植体を用い、機械的特性および生理学的応答性の分析を行った。移植片を最小取扱で切り出して外膜周囲組織摘出を回避した。剖検を行い、いずれの異常病巣または組織の分析のために中性ホルマリンに入れた。
【００８３】
ほぼ４０ないし５０μｍ厚みのＤＦＣ層を持つすべての血管移植片補綴が利用できた（ｎ＝２０）。ほぼ１０ないし２０μｍ厚みのＤＦＣ層を有する補綴は５０％利用できた（ｎ＝４）。ヘマトキシリンおよびエオシン染色によるおよび免疫組織化学による組織学は利用できる外植体中およびそれに沿った平滑筋内方増殖および血管内皮細胞移動を示した。これらの結果は、血管構築体が血管補綴として働きつつ宿主細胞によって生体再造形され得ることを示す。
【００８４】
前記発明は明瞭性および理解の目的で説明および例を挙げて幾分詳細に記載してきたが、ある種の変形および修飾を添付の請求の範囲内で実施できることは当業者に明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は密なフィブリルコラーゲンをＩＣＬチューブの管腔表面に沈積させるのに使用されている装置を示す。
【図１】
0004341050.tif 000004