(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化処理を行ったプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属の菌体を緩衝液に懸濁し、抽出を行った後の上清をゲル濾過に供して得られる分子量1kDa〜40kDaの画分を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を有効成分として含有することを特徴とする抗ニキビ用組成物。
【請求項２】
請求項１記載の抗ニキビ用組成物を有効成分として含有するニキビ用化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はニキビによる皮膚の炎症を予防・防止する抗ニキビ組成物及びニキビ用化粧料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニキビは、軽度のものを含めると約半数の人が罹患する最も一般的な炎症性の皮膚疾患であり、主として思春期に発現し、２０代後半には減少する。
ニキビは、種々の要因が複雑に絡み合って引き起こされると言われており、第１段階として皮脂の分泌過剰と毛穴の閉塞による面皰の形成、第２段階として面皰の形成による皮脂の貯留に伴いＰ.ａｃｎｅｓ,Ｐ.ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍなどの皮膚常在菌が増殖し、それらの菌体が産生する物質により毛包上皮が破壊され、炎症が引き起こされると考えられている。
【０００３】
これまでに、ニキビ治療用外用剤として、例えば以下のようなものが提案されている。▲１▼特開平２−１２１９０８号公報には、Ｐ.ａｃｎｅｓが菌体外に産生するリパーゼを免疫した鶏が産生する卵より調製された卵黄抗体を含有することを特徴とするニキビ用化粧料が開示されている。
【０００４】
▲２▼特公平７−５６４号公報には、ニキビ菌に特異的に結合する鶏卵抗体を含有する抗ニキビ菌皮膚外用剤が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、Ｐ.ａｃｎｅｓのリパーゼによって産生される遊離脂肪酸はＣ１６以上の長鎖脂肪酸（オレイン酸、リノレン酸が最も多い）が主であり、毛包上皮に刺激を与えて炎症を引き起こすと考えられているＣ８〜Ｃ１４の遊離脂肪酸（Ｋｅｌｌｕｍ,Ｒ.Ｅ. ｅｔ ａｌ.：Ａｒｃｈ.Ｄｅｒｍ.,５４：４８,１９７０）とは異なっている。すなわち、遊離脂肪酸生成を阻止する抗リパーゼ剤の外用は臨床的には無効であり（Ｗｅｅｋｓ,Ｊ.ｇ.ｅｔａｌ.：Ｊ.Ｉｎｖｅｓｔ.Ｄｅｒｍ.,６９：２３６,１９７７）、上記▲１▼のニキビ用化粧料によるニキビの予防及び治療には充分な効果は期待できない。
【０００６】
更に、Ｐ.ａｃｎｅｓのリパーゼにより産生される遊離脂肪酸は皮表を酸性に保ちＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ,β-ｈｅｍｏｌｙｔｉｃＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等の病原性の強い皮膚常在菌の発育を抑制して皮表を浄化する働きがあり、Ｐ.ａｃｎｅｓ,Ｐ.ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍなどの皮膚常在菌の生育を強く抑制することは皮膚の浄化作用を阻害し、かえって他の病原菌による疾患を招く恐れがあり望ましいものではない。
【０００７】
また、上記▲２▼の抗ニキビ菌皮膚外用剤は、抗原として全菌体を用いるため、得られる抗体の抗体価、すなわちニキビ菌の制菌効果が低く、ニキビの予防及び治療には事実上効果は期待できない。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、皮膚の常在細菌叢に影響を与えることなくニキビを予防すると共にニキビの治療効果を有する抗ニキビ組成物及びニキビ用化粧料を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を行った結果、P. acnesから抽出した1kDa〜40kDaの画分を抗原に用いて鶏に免疫し、その鶏が産生する卵より調製した抗体が、ニキビ菌に由来する炎症に対して高い抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の抗ニキビ用組成物は、不活性化処理を行ったプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属の菌体を緩衝液に懸濁し、抽出を行った後の上清をゲル濾過に供して得られる分子量1kDa〜40kDaの画分を抗原として鶏に免疫した鶏の卵から得られた抗体を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１１】
上記発明によれば、ニキビ菌に特異的に作用し、皮膚の常在細菌叢に影響を与えることなくニキビを予防すると共にニキビの治療効果を有する抗ニキビ用組成物を提供できる。
【００１２】
また、本発明のニキビ用化粧料は、前記抗ニキビ用組成物を有効成分として含有する。
上記発明によれば、効果的にニキビを予防・抑制するニキビ用化粧料を提供できる。
【００１３】
【発明の実施形態】
本発明の抗ニキビ用組成物は、不活性化処理を行ったプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属の菌体を緩衝液に懸濁し、抽出を行った後の上清をゲル濾過に供して得られる分子量1kDa〜40kDaの画分を抗原として鶏に免疫し、その鶏が産生する卵より調製される抗体を有効成分として含有する。
上記プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属の菌としては、例えばPropionibacterium acnes（プロピオニバクテリウム・アクネス），Propionibacteriumgranulosum（プロピオニバクテリウム・グラヌロサム），Propionibacteriumlimphophilum（プロピオニバクテリウム・リンフォフィラム）などが挙げられる。
【００１４】
また、鶏免疫用の抗原蛋白質は、例えば以下のような方法で調製できる。
【００１５】
常法に従ってＰ.ａｃｎｅｓ菌株を培養し、ホルマリンで不活化処理を行った後、適当な緩衝液、例えばグリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．０）、ＫＣｌ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．０）に懸濁、撹拌する。この懸濁液を遠心して上清を回収し、ゲルろ過により分子量１ｋＤａ〜４０ｋＤａの画分を分取後、必要に応じて凍結乾燥を行う。この分子量１ｋＤａ〜４０ｋＤａの画分には、ニキビ発症時の炎症に関与すると認められている菌体由来のプロテアーゼ及びヒアルロニダーゼ等が含まれると考えられる。
【００１６】
得られた抗原を鶏に免疫する方法としては、種々の方法が知られており、いずれの方法を採用してもよく、例えばProduction and Characterization of Anti-human Insulin Antibodies inthe Hen's Egg（Agric．Biol．Chem．，55（8）．2141-2143.1991）に記載された方法等を採用できる。
【００１７】
本発明の抗ニキビ用組成物の有効成分である抗体は、上記ニキビ菌から抽出した分子量1kDa〜40kDaの画分を抗原として鶏に過免疫を行い、その鶏が産生する卵（以下、免疫卵という）から調製される。なお、免疫卵から得られる上記抗原に対する抗体とは、卵黄及び／又は卵白中に含まれる抗体であり、好ましくは卵黄中に含まれる抗体である。
【００１８】
そして、目的の抗体は、例えば以下の方法により免疫卵から調製できる。
免疫卵から卵黄を分離し、得られた卵黄を粉末化する。この卵黄粉末をエタノール等の溶媒を用いて脱脂して脱脂卵黄粉末を得る。得られた脱脂卵黄粉末１質量部に対して３〜６質量部の緩衝液（例えばリン酸バッファー、トリス−ＨＣｌバッファー等を加えて撹拌・抽出し、上清を回収する。この上清を適宜脱塩、濃縮、粉末化することにより調製できる。
【００１９】
本発明の抗ニキビ用組成物は、有効成分として上記抗体を0.1mg〜1g含むことが好ましく、5mg〜500mg含むことがより好ましい。上記抗体の含有量が0.1mg未満であると充分なニキビの予防及び治療効果が得られず、1000mg以上では、製品の物性に影響を与え、問題を生じる可能性がある。
【００２０】
なお、上記免疫の卵黄粉末又は脱脂卵黄粉末をそのまま本発明の抗ニキビ組成物として用いることもできる。
【００２１】
また、本発明の抗ニキビ用組成物は、上記基本的成分の他に、緑茶ポリフェノール、ぶどうポリフェノール、りんごポリフェノールなどの天然抗菌剤、ヒアルロン酸などの保湿剤、パラベンなどの防腐剤等を適宜含むことができる。
【００２２】
本発明のニキビ用化粧料は上記抗ニキビ用組成物を有効成分として含有する。ニキビ用化粧料における上記抗ニキビ用組成物の添加量は抗体換算で0.001質量％以上が好ましい。上記抗ニキビ用組成物の添加量が抗体換算で0.001質量％未満であると、充分なニキビの予防及び治療効果が期待できない。
【００２３】
本発明のニキビ用化粧料の形態としては、例えばクリーム、軟膏、ローション、乳液等が挙げられる。
【００２４】
【実施例】
以下に試験例、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
実施例１
１）Ｐ.ａｃｎｅｓの培養
ブレインハートインフュージョン培地を用いてＰ.ａｃｎｅｓ（ＡＴＣＣ１１８２７）を嫌気的に３７℃で３〜５日間培養し、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、菌体をホルマリンで不活化した後、凍結乾燥して菌体粉末を得た。
【００２５】
２）免疫用抗原の調製
全菌体抗原（比較例１）
実施例１で得られた菌体粉末を4mg/mlになるようにイオン交換水に分散し、超音波処理した。この溶液を抗原液Ａとした。
【００２６】
菌体由来リパーゼ抗原（比較例２）
実施例１で得られた菌体の培養上清から、特開平2-121908号公報に記載された方法にしたがってリパーゼ活性を示す画分を分取後、凍結乾燥して粉末化した。この粉末を蛋白質として2mg/mlになるようにイオン交換水に溶解して、抗原液Ｂとした。
【００２７】
本発明抗原（実施例）
実施例１で得られた菌体粉末0.5gをグリシン塩酸緩衝液（pH2.0）50mlに添加し、室温で3時間撹拌した後、遠心分離して上清を回収した。この上清をゲルクロマトグラフィー（YMC-Pack Diol-200, 500×8mm I.D., YMC）に供した。そして、分子量40kDa以下の画分を分取後、これを凍結乾燥して粉末化した。この粉末を蛋白質として2mg/mlになるようにイオン交換水に溶解して、抗原液Ｃとした。
【００２８】
３）鶏への免疫、免疫卵の採取
産卵鶏（ホワイトレグホン）９０羽を３群（１群３０羽）に分け、上記３種類の抗原液をフロイントコンプリートアジュバントと混合し、筋肉注射（抗原液  １ｍｌ／羽）による免疫操作を行った。
初回免疫後１週ごとに集められた鶏卵から卵黄を分離し、これを抗体価測定用サンプルとした。抗原液Ａを免疫した鶏から得られた卵を免疫卵Ａとし、同様に免疫卵Ｂ、免疫卵Ｃとした。
【００２９】
得られた各免疫卵の卵黄中抗体価の推移をそれぞれの免疫抗原を固相化したプレートを用いた酵素免疫測定法にて測定した。
初回免疫から２週間目に卵黄中抗体価が上昇し、抗体価が低下した時点（１１週目）を確認後、初回免疫と同様に追加免疫を行った。その後、週毎の抗体価を測定し、１４週目でピークに達することを確認した。その結果を図１に示す。
抗体価上昇を確認した後、鶏卵を採取し、これを免疫卵とした。
【００３０】
【図１】
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【００３１】
４）卵黄抗体の調製
上記の各免疫卵から卵黄を分離し、噴霧乾燥にて粉末化して各抗原に対する抗体を含んだ卵黄粉末をそれぞれ得た。そして卵黄粉末１ｋｇにエタノール５ｌを加えて混合し、脱脂操作を繰り返し行い脱脂卵黄粉末を得た。
【００３２】
得られた各脱脂卵黄粉末５００ｇにリン酸生理食塩水(ＰＢＳ)１．５ｌを加え、撹拌して卵黄水溶性蛋白質を抽出した。この抽出液を凍結乾燥して粉末化し、抗原液Ａの免疫卵から得られた粉末を抗体粉末Ａ、抗原液Ｂの免疫卵から得られた粉末を抗体粉末Ｂ、抗原液Ｃの免疫卵から得られた粉末を抗体粉末Ｃとした。更に市販の卵を用いて上記と同様の脱脂、抽出、乾燥操作を行い、コントロール抗体粉末を調製した。
【００３３】
実施例２  ニキビ用乳液の調製
表１に示す処方にて、実施例１で得られた各抗体粉末を添加した乳液を調製した。抗体粉末Ａ添加乳液を乳液Ａ、抗体粉末Ｂ添加乳液を乳液Ｂ、抗体粉末Ｃ添加乳液を乳液Ｃ、コントロール抗体粉末添加乳液をコントロール乳液とする。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
試験例１  ニキビの予防・治癒効果試験
ニキビ症状を有する被検者４０名を１０名ずつ４グループに分け、実施例２で得られた乳液Ａ、乳液Ｂ、乳液Ｃ、コントロール乳液を用いて皮膚塗布試験を行った。乳液の塗布は、１日に朝、夕２回ずつ２ヶ月間連続で行い、期間中の▲１▼かゆみ、▲２▼痛み、▲３▼発赤、▲４▼外観について、以下の基準に基づいて判定した。その結果を表２〜５に示す。なお、表中の単位は全て（人）とする。
判定基準
完治した：５点、著しい症状の改善が認められる：４点、症状が改善した：３点、わずかに症状が改善した：２点、変化なし：１点、悪化したもしくは新たな発症がある：０点
【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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【００３８】
【表４】
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【００３９】
【表５】
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【００４０】
表２〜５から、乳液Ａ、コントロール乳液を使用したグループでは明確なニキビ治癒効果は認められなかった。乳液Ｂ、乳液Ｃを使用したグループでは、ニキビ治癒効果が高いことが確認された。特に、乳液Ｃのグループでは、▲１▼かゆみ、▲２▼痛み、▲３▼発赤の炎症による症状を改善する効果が極めて高いことが分かる。
【００４１】
試験例２  皮膚の水分含量測定試験
試験例１の被験者４０名に対して試験期間中の皮膚水分含量について測定した。皮膚の水分含量の測定はニキビ発症部位以外で行い、試験サンプル（乳液Ａ、乳液Ｂ、乳液Ｃ、コントロール乳液）塗布開始前（０週）、開始後２週間、４週間、６週間、８週間の計５回行った。水分含量は水分量により、誘電率が変化することを利用し、それに伴って変化する静電容量から水分含量を測定した。（株式会社Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製  ＣＯＲＥＮＯＭＥＴＥＲ  ＣＭ８２５）その結果を図２に示す。
【００４２】
【図２】
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【００４３】
図２から、乳液Ａ、乳液Ｂを用いたグループでは、６週目頃より皮膚の水分含量の低下が認められたが、乳液Ｃ、コントロール乳液を使用したグループでは水分含量に大きな変化は認められず、健常皮膚と同様に１８％〜２１％であった。
なお、乳液Ａ、乳液Ｂの使用により皮膚の水分含量が低下した理由は、Ｐ.ａｃｎｅｓにより産生される遊離脂肪酸は皮膚表面を油性に保ち、水分保持に関わるといわれていることから、リパーゼの活性阻害により遊離脂肪酸の産生が抑えられることで皮膚の水分保持能が低下したためと考えられる。
【００４４】
試験例３  皮膚表面ｐＨ測定試験
試験例１の被験者４０名に対してニキビ治癒効果試験中の皮膚表面のｐＨ変化について測定を行った。ｐＨの測定は、皮膚専用ｐＨメーター（大王電機株式会社製、商品名「Ｃ−ｐＨ−１４３」）を用いて、ニキビが発症していない健常部位で行い、試験サンプル（乳液Ａ、乳液Ｂ、乳液Ｃ、コントロール乳液）塗布開始前（０週）、開始後２週間、４週間、６週間、８週間の計５回行った。その結果を図３に示す。
【００４５】
【図３】
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【００４６】
図３から、乳液Ｂはニキビ症状の回復に伴いｐＨが上昇する傾向があり、乳液Ａ、乳液Ｃ、コントロール乳液は試験期間中を通じて弱酸性を示すことが分かる。通常の皮膚表面のｐＨはＰ．ａｃｎｅｓなどの皮膚常在菌が産生するリパーゼにより産生される遊離脂肪酸によって弱酸性を呈し、他の病原性の強い細菌の増殖を抑制しているといわれている。しかし、Ｐ．ａｃｎｅｓが産生するリパーゼを強く阻害することにより、遊離脂肪酸の産生も抑制され、皮膚表面のｐＨをアルカリ側に変化させてしまうことが分かる。
【００４７】
試験例４  皮膚常在細菌叢への影響
実施例１で得られた抗体粉末を用いて、皮膚常在細菌叢への影響について検討した。
ブレインハートインフュージョン培地に、予め前培養したＰ．ａｃｎｅｓ（ＡＴＣＣ１１８２７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＩＦＯ１２７３２）の２菌株を、それぞれ１０８個になるように接種し、試験培養液を調製した。各試験培養液に実施例１で得られた抗体粉末（抗体粉末Ａ、抗体粉末Ｂ、抗体粉末Ｃ、コントロール抗体粉末）をそれぞれ０．１質量％になるように添加して、３７℃で２日間嫌気培養後、培地のｐＨ及びＰ.ａｃｎｅｓ、Ｓｔ.ａｕｒｅｕｓの生菌数を測定した。結果を表６、７に示す。
【００４８】
【表６】
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【００４９】
【表７】
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【００５０】
表６から、抗体粉末Ｃ、コントロール抗体粉末を添加した場合、培地のｐＨが４．６〜４．７であった。また、抗体粉末Ａを添加した場合、培地ｐＨは５．４、抗体粉末Ｂを添加した場合、ｐＨ６．２となった。
【００５１】
表７から、抗体粉末Ａ、抗体粉末Ｂを添加することにより、Ｐ.ａｃｎｅｓの増殖が強く抑制され、病原性の強いＳｔ.ａｕｒｅｕｓの生菌数が反対に増える傾向が認められた。一方、抗体粉末Ｃを添加することにより、Ｐ.ａｃｎｅｓの生菌数は多少減少するものの、Ｓｔ.ａｕｒｅｕｓの生菌数が大きく減少していることが分かる。表６、表７の結果から、抗体粉末Ｃの添加ではＰ．ａｃｎｅｓにより産生される遊離脂肪酸の作用によって培地ｐＨが弱酸性になることで、Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓが生育しにくくなり、Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓの生菌数が大きく減少したと考えられる。
【００５２】
一方、抗体粉末Ａ、抗体粉末Ｂの添加では、Ｐ．ａｃｎｅｓの増殖を強く阻害するにつれて培地のｐＨが上昇し、Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓの生育に適した環境となったため、Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓの生菌数が増えたと考えられる。
【００５３】
Ｐ．ａｃｎｅｓにより産生される遊離脂肪酸により、ｐＨが酸性に傾くという現象は通常の皮膚表面でも認められているが、表６、表７の結果よりｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験系においても遊離脂肪酸は、病原性の強い細菌であるＳｔ．ａｕｒｅｕｓなどの細菌の増殖を抑制するために必要不可欠なものであることが確認された。
【００５４】
【本発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ニキビ菌に特異的で皮膚の常在細菌叢を変えることなく高いニキビ予防、治癒効果を有する安全性の高い抗ニキビ用組成物及びニキビ用化粧料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  卵黄中の抗Ｐ.ａｃｎｅｓ抗体価の推移を表す図表である。
【図２】  試験期間中の皮膚水分含量の推移を表す図表である。
【図３】  試験期間中の皮膚表面ｐＨの変化を表す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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