(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定しようとする生体分子の代謝を電気化学的に定量することのできる、マイクロ構造のプレーナ型バイオセンサであって、
平面基板上に少なくとも２つの境界構造、即ち
乾燥した酵素膜で満たされている第１の内側境界構造と、
ポリマーのカバー層で満たされている第２の外側境界構造であって、ここでこのポリマーのカバー層は第１の内側境界構造を完全に覆っている、第２の外側境界構造と
を有する、マイクロ構造のプレーナ型バイオセンサ。
【請求項２】
補基質として酸素を必要とする酵素を使用する、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
酵素膜内に、トリエチレングリコールとリン酸緩衝剤からなる緩衝液が含まれている、請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
カバー層が、紫外線により網状化するポリマーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
カバー層が、光でパターニングの可能なヒドロキシエチルメタクリレート樹脂である、請求項４に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
酵素が、酵素膜内に結晶の状態で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
血液中のグルコース又はラクテートの極微の侵襲測定に使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオセンサの使用方法。
【請求項８】
第１の工程で液状溶液中のバイオ触媒を基板上の第１の内側境界構造内に満たし、第２の工程で乾燥し、最後に第３の工程で重合可能なカバー層でコーティングするバイオ触媒の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は微細構造のプレーナ型バイオセンサ、特にバイオ触媒として酵素を備えているバイオセンサに関する。更に本発明は、このバイオセンサの使用方法並びにバイオ触媒の固定化方法に関する。
【０００２】
酵素を使用し、代謝、例えば酸素により惹起される過酸化水素又は酸素の濃度の変化を電気化学的に又は電流検知により定量することのできる、酵素膜又は酵素層（この両概念はここでは同義語として扱う）から成る識別層を有する分析装置は既存である（シェラー（Ｆ．Ｓｃｈｅｌｌｅｒ）その他による「酵素センサ及びセルセンサ、その使用、傾向及び展望」科学スペクトル、１９９２年９月、第９９〜１０３頁）。このようなバイオセンサの、例えば飽和作用及び感度のような機能は、まず第１に使用される酵素膜の品質に依存するものである。この膜を製造する際、複数の評価基準が満たされなければならない（バドガマ（Ｐ．Ｖａｄｇａｍａ）及びクルンプ（Ｐ．Ｗ．Ｃｒｕｍｐ）著「バイオセンサ：最近の傾向」アナリスト、１９９２年１１月、第１１７巻、第１６５７〜１６７０頁）。できるだけ大量の活性酵素が十分にその機能と活性を保ち、同時に膜に捕らえられているように固定化もしくは結合されなければならない。膜内の酵素のこの結合をできるだけ損傷なしに行うため、一連の技術が開発されている。以下に記載する方法、即ち吸着、イオン結合、吸収、マイクロカプセル又は膜内への封入及び坦体物質への共有結合等が使用されている。
【０００３】
酵素膜の製造は１つには、酵素が網状組織内に捕らえられているように、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）のようなポリマーの「ゲル」に入れる、酵素の物理的結合により行われる。その際常にゲル分子と酵素タンパクとの間に相互作用が働き、この３次元の構造の柔軟性、そしてそれと同時に酵素の活性に悪影響を及ぼすと言う欠点がある。また他方では、酵素タンパクを直接ポリマーの坦体に共有化学結合により結び付ける技術も使用される。その際、例えば架橋結合、即ち網状化により酵素のアミノ酸側鎖と坦体の活性基との間で、当然タンパク質の三次構造の活力が真先に影響を受ける。しかしこの三次構造は、この酵素の活性の重要な前提条件であり、従ってこのような構造の柔軟性が制限されることは、この酵素に部分的不活性化を伴う。
【０００４】
欧州特許第０５８８１５３号明細書から、第１の内側境界構造と、第２の外側境界構造とを有するプレーナ型の、マイクロ構造のガスセンサチップの構造が公知である。この構造は、第１の内側境界構造内に電解液（ナベ）を入れ、第２の外側境界構造内に疎水性でかつ遮蔽性の材料（フタ）を入れ、この遮蔽材が電解液を第１の内側境界構造と共に完全に覆う、測定液（電解液）のナベ−フタ構造を形成することを可能にする。このプレーナ型のセンサチップで電気化学的に酸素及び二酸化炭素のような気体が定量される。
【０００５】
このようなセンサチップを使用するバイオセンサによる測定に、これまでナベ−フタ構造のものはなかった。それというのも識別層（「測定液」）として単独の均質層から形成されている酵素膜だけが使用されてきたからである。つまり、ナベ−フタ構造を形成するには単独の均質層の代わりに、２つの層が存在しなければならないため、このチップの２つの境界構造はこれまでバイオセンサによる測定に利用することはできなかった。
【０００６】
従って本発明の課題は、その識別層（測定液）が２つの層から成り、酵素の三次構造の活力が変えられることのない、改良された機能を有するバイオセンサを提供することにある。更に本発明の課題は、このようなバイオセンサの使用方法の提供にある。最後に本発明の課題は、センサチップ上に内側及び外側境界構造を有しているナベ−フタ構造を形成可能な方法を提供することにある。
【０００７】
従って本発明の対象は、センサが平面基板上に少なくとも２つの境界構造、即ち酵素膜で満たされている第１の内側境界構造と、この第１の境界構造を酵素膜で完全に覆うポリマーカバー層で満たされている第２の外側境界構造とを備えている、生体分子の代謝を電気化学的に測定することのできる、マイクロ構造のプレーナ型バイオセンサにある。
【０００８】
更に本発明の対象は、このバイオセンサを医療分野に、即ち血液中のグルコース及びラクテートのような標準代謝物の極微の侵襲測定に使用することにある。
【０００９】
最後に本発明の対象は、第１の工程で、液状溶液中のバイオ触媒を基板上の第１の内側境界構造内に満たし、第２の工程でそこで乾燥し、最後に第３の工程で重合可能なカバー層でコーティングするバイオ触媒の固定化方法にある。
【００１０】
本発明の有利な実施態様は、従属請求項及び明細書から明らかである。
【００１１】
バイオ触媒としては酵素、特に補基質（補酵素）として酸素を必要とする、グルコースオキシダーゼ（ブドウ糖酸化酵素）又はラクテートオキシダーゼ（乳酸塩酸化酵素）のような酵素を使用すると有利である。
【００１２】
酵素膜はトリエチレングリコール及びリン酸緩衝剤から成る緩衝液を含んでいると有利である。その一例には、５０００Ｕのグルコースオキシダーゼ、リン酸緩衝液（濃度１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７）１２０μｌ及びトリエチレングリコール３０μｌから成る溶液がある。
【００１３】
更に酵素膜にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような平坦化する補助物質が添加されると有利である。
【００１４】
カバー層の被着前に、酵素膜又は酵素層を含めてこの溶液をゲル状又は結晶状で存在するように乾燥しなければならない。この完成網状化カバー層は、透水性であり、従ってこの酵素層がバイオセンサの作動状態で酵素が活性であるように、再度湿潤可能である。
【００１５】
カバー層としては紫外線で網状化したカバー層を使用すると有利である。その一例には、ＨＥＭＡ２．３４７ｇ、ジメトキシフェニルアセトフェノン（ＤＭＡＰ）０．０２５ｇ及びテトラメチレングリコールメタクリレート（ＴＥＧＭ）０．０７５ｇをトリエチレングリコール６０μｌに入れた溶液から成る、光でパターニングの可能なヒドロキシエチルメタクリレート樹脂（ＨＥＭＡ−樹脂）がある。バイオ触媒が損傷されない条件の下に硬化又は完全重合できる限り、他の重合可能な物質を使用することもできる。完成、即ち完全重合されたカバー層は、バイオ触媒を除いて、反応に関与する全ての物質を透過できるような性質を持たねばならない。例えばカバー層がグルコースを測定する場合、水、酸素及びグルコースを透過する必要があるが、しかし酵素のグルコースオキシダーゼを透過してはならない。
【００１６】
バイオ触媒が膜内でできるだけ乾燥している、即ち結晶性あるいはゲル状で存在すると有利である。結晶性とは、この場合乾燥した平坦な酵素膜のことである。
【００１７】
境界構造物は、例えばポリイミドのようなプラスチックから形成可能なポリマー構造物である。これらの境界構造物は高さが異なっていても、同じであってもよい。
【００１８】
本発明は、生体分子が相互作用を妨げられることなく「ナベ」（電解液）内で可動であり、また「フタ」（遮蔽材）の故に測定溶液中に保持されるので、バイオセンサの機能を著しく改善することができる。これは本発明によるバイオセンサが極めて改善された飽和作用（約３５ｍｍｏｌ／ｌのグルコース濃度まで測定可能である）と、高められたセンサ感度（２０ｍｍｏｌ／ｌ以下のグルコース濃度で１００ｎＡ・ｌ／ｍｍｏｌ・ｍｍ2以上の電流密度）であることが判る。
【００１９】
得られた感度及び飽和作用は、本発明を３〜２０ｍｍｏｌ／ｌ（測定しようとする濃度）の範囲の医学生理学にも、また用途に応じて１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲まで、極端な場合にはそれ以上を要求するバイオテクノロジーに使用することができる。