(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性質（ａ）〜（ｅ）を有し、下記の（ｘ）〜（ｚ）のいずれかのタンパク質であるフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。
（ｂ）至適ｐＨ：６．０〜８．０
（ｃ）作用適温の範囲：２０〜５０℃
（ｄ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
（ｘ）配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｙ）配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｚ）配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列と９５％以上同一である相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
ε−フルクトシルリジンに作用しにくいものである、請求項１記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
【請求項３】
以下の理化学的性質（ａ）〜（ｅ）を有し、下記の（ｘ）〜（ｚ）のいずれかのタンパク質であるフルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子。
（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。
（ｂ）至適ｐＨ：６．０〜８．０
（ｃ）作用適温の範囲：２０〜５０℃
（ｄ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
（ｘ）配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｙ）配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｚ）配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列と９５％以上同一である相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項４】
配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡからなる請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３または４記載の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼと同等のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するフルクトシルペプチドオキシダーゼを生産する能力を有し、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、及びユウペニシリウム属からなる群から選ばれた糸状菌を培地に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とする請求項１に記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法。
【請求項９】
アカエトミエラ属に属する糸状菌がアカエトミエラ・ヴィレシェンス  ＡＴＣＣ  ３２３９３（Achaetomiella virescens ATCC 32393）またはカエトミウム属に属する糸状菌がカエトミウムｓｐ. ＮＩＳＬ  ９３３５（Chaetomium sp. NISL 9335）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７９９）である請求項８記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項２に記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼと同等のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するフルクトシルペプチドオキシダーゼを生産する能力を有し、ユウペニシリウム属またはコニオカエタ属に属する糸状菌を培地に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とする請求項１に記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法。
【請求項１１】
ユウペニシリウム属に属する糸状菌がユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）、ユウペニシリウム・センティコサム  ＩＦＯ  ９１５８（Eupenicillium senticosum IFO 9158）、ユウペニシリウム・アイダホーエンス  ＩＦＯ  ９５１０（Eupenicillium idahoense IFO 9510）及びユウペニシリウム・ユーグラウカム  ＩＦＯ  ３１７２９（Eupenicillium euglaucum IFO 31729）からなる群から選ばれたユウペニシリウム属に属する糸状菌、またはコニオカエタ属に属する糸状菌がコニオカエタｓｐ. ＮＩＳＬ  ９３３０（Coniochaeta sp. NISL 9330）（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）である請求項１０記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ、それをコードするフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子、及び新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的にグリコシル化された蛋白質であり、糖、すなわちアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）側のアルデヒド基と、蛋白質側のアミノ基が非酵素的に共有結合した結果、生成したものである。蛋白質のアミノ基としては、Ｎ末端αアミノ基、内部リジン残基側鎖εアミノ基があげられる。これらの糖化蛋白質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転移を受けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれる。
【０００３】
糖化蛋白質は、生体内の血液などの体液や、毛髪などの生体試料中に含有されている。血液中に存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコースなどの糖類の濃度に強く依存している。糖尿病状態では糖化蛋白質の生成が亢進しており、赤血球に含まれる糖化ヘモグロビンや血清中の糖化アルブミンの濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映していることから、それらの糖化蛋白質を測定することは、糖尿病の症状の診断や症状管理に重要となっている。
【０００４】
従来糖化蛋白質を定量する方法として、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（Chromatogr. Sci., 10, 659（1979））、硼酸を結合させた固体を詰めたカラムを用いる方法（Clin. Chem., 28, 2088-2094（1982））、電気泳動を用いる方法（Clin. Chem., 26, 1598-1602（1980））、抗原抗体反応を利用する方法（JJCLA, 18, 620（1993））、還元能をテトラゾリウム塩を用いて比色定量する方法（Clin. Chim. Acta, 127, 87-95（1982））、チオバルビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法（Clin. Chim. Acta, 112, 197-204（1981））、糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いる方法（特公平０５−３３９９７、特開平１１−１２７８９５、ＷＯ９７−１３８７２、特公平６−６５３００、特開平２−１９５９００、特開平３−１５５７８０、特開平４−４８７４、特開平５-１９２１９３、特開平６−４６８４６、特開平１１−１５５５９６、特開平１０−３１３８９３、特開平１１−５０４８０８、特開２０００−３３３６９６、特開２００１−５４３９８、特開２００１−２０４４９５、特開２００１−２０４４９４）等が知られている。また最近、上記方法より精度良く糖化蛋白質を測定する方法として、新しい糖化蛋白質の測定法が開示された（特開２００１−９５５９８）。この測定方法は、糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理し、糖化蛋白質からフルクトシルペプチドを遊離させ、遊離したフルクトシルペプチドにオキシダーゼを作用させ、生成物を測定することにより糖化蛋白質を測定する方法であり、短時間かつ簡単な操作で、精度の良い測定方法として注目されている。
【０００５】
従来の糖化アミノ酸オキシダーゼを用いる方法は、糖化蛋白質をプロテアーゼで処理したのち、生成した糖化アミノ酸を酵素的に測定する。詳しくは、糖化蛋白質をプロテアーゼ等で処理することにより生成したフルクトシルアミノ酸に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、生成される過酸化水素を測定する方法である。これらの測定方法に用いられているフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属菌の生産するオキシダーゼ（特公平５−３３９９７、特公平６−６５３００）、アスペルギルス属菌の生産するオキシダーゼ（特開平３−１５５７８０）、ギベレラ属菌の生産するオキシダーゼ（特開平７−２８９２５３）、フサリウム属菌の生産するオキシダーゼ（特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２）、ペニシリウム属菌の生産するオキシダーゼ（特開平８−３３６３８６）、トリコスポロン属菌の生産するオキシダーゼ（特開２０００−２４５４５４）、ケトアミンオキシダーゼ（特開平５−１９２１９３）などが知られている。しかし、これらの酵素は、フルクトシルアミノ酸に良く作用するが、フルクトシルペプチドに作用しない。また、フルクトシルペプチドに作用する酵素として、特開２００１−９５５９８に記載されている大腸菌ＤＨ５α（ｐＦＰ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２７９）の生産するオキシダーゼが知られている。しかしこのオキシダーゼについては、酵素の基本的な理化学的性質は知られておらず、安定性が悪いなど、測定キットの調製上困難な点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、新規でかつ安定性に優れたフルクトシルペプチドオキシダーゼ、それをコードするフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子及び新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、広く自然界より探索して得られた、種々の微生物が安定性に優れた新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼを生産することを見出した。そして本酵素の取得に成功し、このフルクトシルペプチドオキシダーゼが糖化蛋白質の測定に有利な種々の新規な理化学的性質を有していることを見出し、さらに、フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒するフルクトシルペプチドオキシダーゼである。 さらに、上記反応を触媒し、４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存するフルクトシルペプチドオキシダーゼであり、そして、上記反応を触媒する、分子量、約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼである。さらに、上記反応を触媒し、４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存し、かつ分子量、約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼである。
【０００９】
さらに、以下の理化学的性質を有するフルクトシルペプチドオキシダーゼである。
（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０
（ｃ）作用適温の範囲：２０〜４５℃
（ｄ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
（ｆ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
さらに本発明は、上記フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有する糸状菌、および上記フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有するアカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、及びユウペニシリウム属からなる群から選ばれた糸状菌を培地に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法である。
【００１０】
また、本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい前記反応を触媒するフルクトシルペプチドオキシダーゼであり、さらに４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存する該フルクトシルペプチドオキシダーゼである。さらに、下記の理化学的性質を有する該フルクトシルペプチドオキシダーゼである。
（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０
（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４０℃
（ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
さらに本発明は、該フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有する糸状菌、および該フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有するユウペニシリウム属に属する糸状菌またはコニオカエタ属に属する糸状菌を培地に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法である。
【００１１】
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
さらに、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】
さらに、本発明は以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
さらに、本発明は、上記の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡである。
さらに、本発明は、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体である。
【００１３】
さらに、本発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法である。
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
さらに、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
さらに、本発明は以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
さらに、本発明は、上記の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡである。
さらに、本発明は、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体である。
さらに、本発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下「本発明オキシダーゼ」という）とは、酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する以下の反応式を触媒するオキシダーゼであり、この作用を有する酵素であれば、如何なるオキシダーゼでも本発明オキシダーゼに含まれる。
【反応式】
フルクトシルバリルヒスチジン ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２ → α−ケトアルデヒド＋ バリルヒスチジン ＋Ｈ２Ｏ２
例えば、ε−フルクトシルリジンやフルクトシルグリシンなどの他のフルクトシルアミノ酸に作用するオキシダーゼや種々のフルクトシルペプチドに作用するオキシダーゼなどでも上記反応を触媒する作用を有するオキシダーゼ（本発明オキシダーゼという）であれば全て本発明に含まれる。一方、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにくいフルクトシルペプチドオキシダーゼ（フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼという）とは、上記反応式を触媒するオキシダーゼで、かつ、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いたときの活性に比べて、ε−フルクトシルリジンを基質として用いたときの活性が低い本発明オキシダーゼをいい、ε−フルクトシルリジンを含む測定用試料中のフルクトシルバリルヒスチジンを精度良く測定することのできるオキシダーゼであればよい。さらにε−フルクトシルリジンに作用しない本発明オキシダーゼなども本発明に含まれる。これらのε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼは、ε−フルクトシルリジンを含む生体試料中のフルクトシルバリルヒスチジンを測定する場合に、特に好ましい。
【００１６】
また、本発明オキシダーゼの一形態として、例えば、上記反応を触媒する作用を有する分子量、約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、上記反応を触媒する作用を有し、かつ４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存するフルクトシルペプチドオキシダーゼ、上記反応を触媒する作用を有し、かつ４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存する分子量、約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ等が挙げられる。さらには、上記反応を触媒する作用を有すると同時に、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の理化学的性質をそれぞれもしくはそれらを適宜併せて有するフルクトシルペプチドオキシダーゼなども本発明オキシダーゼとして挙げられる。
（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行ない、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の理化学的性質を有する本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４５℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行ない作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の理化学的性質を有する本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、４５℃で１０分間処理した後、本酵素の残存活性を測定する。理化学的性質のうち、特に高温域で高い安定性を有する本発明オキシダーゼが産業利用上特に好ましい。例えば、上記処理条件下で、５０％以上、好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上活性が残存している本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
例えば、緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜９．０の理化学的性質を有する本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｅ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
例えば、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求める。例えば、分子量として４５，０００〜６０，０００、好ましくは、４７，０００〜５７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分子量を有する本発明オキシダーゼなどが挙げられる。現在、蛋白質の分子量を測定する場合、一般にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法が多く用いられている。本測定法により得られた分子量の測定誤差を考慮すると、分子量約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の測定値は、４７，０００〜５７，０００の範囲の分子量が含まれると考えられている。
【００１７】
一方、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼとは、以下に示す酵素活性の測定において、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いたときの活性に比べて、ε−フルクトシルリジンを基質として用いたときの活性が低い本発明オキシダーゼをいい、ε−フルクトシルリジンを含む測定用試料中のフルクトシルバリルヒスチジンを精度良く測定することのできるオキシダーゼであればよい。すなわち、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いたときの活性を１００としたとき、ε−フルクトシルリジンを基質として用いたときの活性が７０以下、好ましくは５０以下、さらに好ましくは２０以下のε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼをいう。
【００１８】
ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの一形態として、例えば、上記反応を触媒する作用を有し、かつフルクトシルバリルヒスチジンに作用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい性質を有する、４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存するフルクトシルペプチドオキシダーゼ、さらには、上記作用および性質を有すると同時に、以下の（ａ）〜（ｄ）に記載の理化学的性質をそれぞれもしくはそれらを適宜併せて有するフルクトシルペプチドオキシダーゼなどもε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼとして挙げられる。
（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行ない、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の理化学的性質を有するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４０℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行ない、作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の理化学的性質を有するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、４５℃で１０分間処理した後、本酵素の残存活性を測定する。理化学的性質のうち、特に高温域で高い安定性を有する本発明オキシダーゼが産業利用上特に好ましい。例えば、上記処理条件下で、５０％以上、好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上活性が残存しているε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
例えば、緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜９．０の理化学的性質を有するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
【００１９】
本発明オキシダーゼやε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ(本発明オキシダーゼ等という)の酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成するα−ケトアルデヒド、ペプチド、過酸化水素などの量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。以下、本発明オキシダーゼ等の活性測定には、ことわりのない限り、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【００２０】
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
１．０ｋＵのパーオキシダーゼ（東洋紡社製、ＴＹＰＥ ＩＩＩ）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：２，４−ジクロロフェノールサルフェート溶液
市販２％溶液（ナカライ社製）２５ｍｌをイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度  ５ｍＭ）
フルクトシルバリルヒスチジン６２４ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。フルクトシルグリシンまたはε−フルクトシルリジンを基質として用いるときはそれぞれ、３５７ｍｇ、４６２ｍｇをイオン交換水に溶解して、１０ｍｌに定容した溶液を用いる。フルクトシルバリンヒスチジンは特開２００１−９５５９８記載の方法により調製した。フルクトシルグリシン、ε−フルクトシルリジンは堀内らの方法により調製した（Agric. Biol. Chem., 53, 103-110, 1989, Agric. Biol. Chem., 55, 333-338, 1991）
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３０℃で５分間予備加温する。その後１００μｌの試薬３を加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−２０００Ａ、日立社製）により、５１０ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５１０ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これをあらかじめ作製しておいた過酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３０℃、１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。ε−フルクトシルリジンに作用するか否かを測定する時は、フルクトシルバリルヒスチジンの代わりに、ε−フルクトシルリジンを基質として用いた試薬３（基質溶液）を用いることにより、上記と同様の操作で測定することができる。
【００２１】
このように本発明オキシダーゼ等は、酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する、前式に示した反応を触媒するオキシダーゼであり、例えば、前記作用を有し、前述した種々の理化学的性質をそれぞれもしくは適宜組み合わせて、併せ持つ本発明オキシダーゼ等も挙げることができる。そしてこれらの本発明オキシダーゼ等は、糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理し、遊離したフルクトシルバリルヒスチジンに効率よく作用するため、糖化蛋白質の測定用酵素として有効に用いられる。さらに、理化学的性質のうち、高い熱安定性を有する本発明酵素は、臨床診断用酵素として利用する上で、特に好ましい本発明オキシダーゼ等として挙げられる。
一方、糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理したとき、用いる試料によっては、フルクトシルバリルヒスチジンと同時にε−フルクトシルリジンが遊離される。この場合、本発明オキシダーゼでフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定する時、本発明オキシダーゼがε−フルクトシルリジンにもよく作用する性質を有していると、精度の良い測定結果を得ることが困難となる場合がある。そのような場合には、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼはさらに好ましい。
【００２２】
本発明オキシダーゼ等は、微生物や動物、植物起源の酵素を探索して、自然界より取得することができる。例えば、本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物を探索する場合、フルクトシルバリルヒスチジンなどの酵素生産誘導物質を加えた培地で微生物を培養し、得られた微生物菌体を破砕し、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用い、フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を調べることにより本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物を取得できる。ここで用いる微生物は土壌から新たに分離してもよく、さらには、微生物保存機関等より入手した微生物を用いることも出来る。さらに、例えば、保存安定性に優れた本発明オキシダーゼを得るには、上記のようにして得られた微生物菌体破砕液を、例えば４５℃、１０分などの熱処理をしたのち活性を測定し、残存活性の高いものを選抜することで可能である。本発明オキシダーゼ生産能を有する生物としては、取り扱いの容易さ、生産性等の点から、例えば、微生物の生産する本発明オキシダーゼが好ましく、微生物でも、例えば、糸状菌などの生産する本発明オキシダーゼが好ましく、糸状菌としては、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属などに属する糸状菌が挙げられる。それらの内でも、アカエトミエラ属、カエトミウム属、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属などに属する糸状菌等が好ましい微生物として挙げられる。さらに、アカエトミエラ・ヴィレシェンス  ＡＴＣＣ  ３２３９３（Achaetomiella virescens ATCC 32393）、カエトミウムｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３５  (Chaetomium sp. NISL 9335)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９９）、コニオカエタｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７９８）、ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）などが特に好ましい微生物として挙げられる。
【００２３】
一方、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物を探索する場合は、上記探索により得られた本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物のうち、ε−フルクトシルリジンを基質として用いたときの活性が、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いたときの活性に比べて低い本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物を選抜する。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物としては、例えば、糸状菌などの生産する本発明オキシダーゼが好ましく、糸状菌としては、例えばユウペニシリウム属に属する糸状菌やコニオカエタ属に属する糸状菌、それらの内でも、例えば、ユウペニシリウム属に属する糸状菌がユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）、ユウペニシリウム・センティコサム  ＩＦＯ  ９１５８（Eupenicillium senticosum IFO 9158）、ユウペニシリウム・アイダホーエンス  ＩＦＯ  ９５１０（Eupenicillium idahoense IFO 9510）及びユウペニシリウム・ユーグラウカム  ＩＦＯ  ３１７２９（Eupenicillium euglaucum IFO 31729）などやコニオカエタ属に属する糸状菌がコニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ  ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）などが好ましい糸状菌として挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明オキシダーゼとして、遺伝子工学的技術や変異処理などの方法により、天然型の本発明オキシダーゼを改変して得られる本発明オキシダーゼばかりでなく、従来公知の酵素遺伝子、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子などを改変して得られる本発明オキシダーゼなども挙げられる。
改変する方法としては、例えば、上記オキシダーゼを生産する生物に、紫外線、Ｘ線、放射線などを照射したり、もしくはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの変異誘発剤を接触させることにより、改変された本発明オキシダーゼを生産する微生物を得、得られた微生物から本発明オキシダーゼを得る方法などが挙げられる。一般的には、遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするオキシダーゼなどをコードする遺伝子を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることもできる。
【００２５】
次に本発明オキシダーゼ等の製造方法について述べる。本発明では、本発明オキシダーゼ等の活性を有する生物体より本発明オキシダーゼ等を、通常用いられている種々の蛋白質分離方法を用いて、回収することにより製造することができる。例えば、前記した本発明オキシダーゼ等の生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質やフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有し、ε−フルクトシルリジンに作用しにくいタンパク質を回収することにより、本発明オキシダーゼ等を製造する方法が好ましい方法として挙げられる。一例として、本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物を用いる以下の方法が、具体的な製造方法として採用できる。
まず、探索の結果、得られた本発明オキシダーゼを生産する微生物（以下「微生物」と総称する）を培養する。この場合、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液など１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガンなどの無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミンなどを適宜添加したものが用いられる。酵素生産誘導基質として、フルクトシルグリシン、フルクトシルバリルヒスチジン、ε−フルクトシルリジンなどの酵素基質を適宜添加するのも生産量をあげるのに有効である。
【００２６】
なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調製するのが適当である。また培養は、２５〜４２℃、好ましくは３０℃前後で１〜５日間、通気攪拌深部培養、振とう培養、静置培養などにより実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明オキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることが出来る。
【００２７】
次いで、培養液から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明オキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などにより、菌体から本発明オキシダーゼを採取するのが好ましい。
【００２８】
このようにして得られた粗酵素液から本発明オキシダーゼを精製、単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。このようにして、本発明オキシダーゼを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一のバンドを示すまでに単離することができる。また、上記精製方法を適宜組み合わせて、用途に応じた精製度合いの異なる酵素標品を調整することもできる。また、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼについても、該オキシダーゼを生産する微生物を用いて、上述した本発明オキシダーゼの製造方法と同様の方法により製造することができる。
【００２９】
このようにして得られた本発明オキシダーゼは、例えば、以下に述べる糖化蛋白質の測定などに有効に用いられる。先ず、ＨｂＡ１ｃなど糖化タンパク質をモルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（キッコーマン 販売）や、カルボキシペプチダーゼＹ、プロチンＰ（大和化成 販売）などのプロテアーゼにより消化し、フルクトシルペプチドを遊離させる。次に遊離したフルクトシルバリルヒスチジンを本発明オキシダーゼにより測定する。その際、同時に遊離するε−フルクトシルリジンが問題となる場合は、ε−フルクトシルリジンに作用する酵素、例えば真菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２、特開平８−３３６３８６など）や、フルクトシルアミンオキシダーゼ（特開平０３−１５５７８０）などで消化した後、本発明オキシダーゼでフルクトシルバリルヒスチジンを測定することもできる。また、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼを用いれば、遊離したε−フルクトシルリジンを消化しなくともフルクトシルバリルヒスチジンを精度良く測定することができる。
【００３０】
さらに、本発明オキシダーゼとして、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）などの本発明オキシダーゼなどが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
ここで、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたことを意味する。
また、「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であれば特に制限がなく、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００３１】
上記本発明オキシダーゼとして、例えば、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ  ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られるオキシダーゼや、ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られるオキシダーゼなどが挙げられる。さらに、自然界より取得された種々起源のフルクトシルペプチドオキシダーゼなどからも得られる。
【００３２】
次に、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼをコードするフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）としては、例えば、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）などの本発明オキシダーゼをコードする遺伝子や、さらに以下の（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡを含む本発明オキシダーゼをコードする遺伝子などが挙げられる。
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｋ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｌ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３３】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等（Current Protocols in Molecular Biology （WILEY Interscience，1989））を行った際、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、この条件は使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。このような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出してしまう場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。より具体的には、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡなどが挙げられる。本発明における、「全長又は塩基配列の１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ」の相同性は、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００３４】
上記本発明オキシダーゼをコードする遺伝子として、例えば、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ  ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られるオキシダーゼをコードする遺伝子やユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られるオキシダーゼをコードする遺伝子などが挙げられる。
【００３５】
また、上記ＤＮＡとして、例えば、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ  ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子やユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子などが挙げられる。さらに、自然界より取得された種々起源のフルクトシルペプチドオキシダーゼなどからも上記本発明オキシダーゼをコードする遺伝子や上記ＤＮＡが得られる。
さらに、天然型のフルクトシルペプチドオキシダーゼから得られた種々の変異型フルクトシルペプチドオキシダーゼからも、上記本発明オキシダーゼ、上記本発明オキシダーゼをコードする遺伝子、そして上記ＤＮＡが得られる。
次に本発明遺伝子の取得方法について説明する。
【００３６】
本発明遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、前述した本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（WILEY Interscience，1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。ついで、上記本発明オキシダーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’-ＲＡＣＥ法や３’-ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の本発明遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。さらに、上記プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを用いて、種々の生物から本発明オキシダーゼをコードする本発明遺伝子を得ることもできる。
【００３７】
例えば、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ  ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）の本発明遺伝子やユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）の本発明遺伝子は以下のようにして得ることができる。
まず、上記微生物等を培養し、得られた菌体を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより、細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて、通常の方法により染色体ＤＮＡを抽出する。次いで、前記菌体片から、市販のＲＮＡ抽出キットなどを用いて、通常の方法により全ＲＮＡ画分を抽出し、この抽出液からエタノール沈殿によりＲＮＡを回収する。さらに必要により、市販の Oligo dT カラムなどを用い、通常の方法により、ポリＡ鎖を有するＲＮＡを分画しても良い。
【００３８】
次いで、上記微生物等の生産する本発明オキシダーゼを精製、単離し、それらのＮ末端アミノ酸配列を決定する。また、それをトリプシンやリジルエンドペプチダーゼで消化して得られたペプチド断片のアミノ酸配列を決定することにより、内部のアミノ酸配列を決定しても良い。次に、得られた部分アミノ酸配列の情報、上記微生物のコドン使用頻度などを考慮して、ＰＣＲに用いるプライマーを合成する。これらのプライマーと上記の得られた染色体ＤＮＡやＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲを行ない、本発明オキシダーゼの一部をコードするＤＮＡ断片を得る。さらに適宜、得られたＤＮＡ断片の塩基配列に基づきプライマーを合成する。
【００３９】
次に、上記プライマーとＲＮＡを用い、５’-ＲＡＣＥ法や３’-ＲＡＣＥ法などの適当なＲＴ−ＰＣＲ法により、本発明遺伝子の断片を含むｃＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて、全長の本発明遺伝子を含むｃＤＮＡを得ることができる。また、ＲＮＡを鋳型として、５'末端配列、及び３'末端配列に相補的な合成プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより、本発明遺伝子を含むｃＤＮＡを増幅することもできる。
増幅されたＤＮＡは、通常の方法に準じてクローニングできる。この増幅されたＤＮＡを適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを得る。クローニングには、例えば、ＴＡ Cloning Kit （Invitrogen 社）等の市販のキットやベクターとしては、ｐUC１１９（寶酒造社製）、ｐBR３２２（寶酒造社製）、ｐMAL−C2（NEW England Labs 社製）、ｐBluescript I I  SK+（Stratagene社製）、pKK223-3（アマシャム・バイオテク社）等のプラスミドベクターDNA やλENBL3（Stratagene社製）、λDASH I I （フナコシ社製）等のバクテリオファージベクターDNA等を用いることが出来る。
【００４０】
このようにして得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（共に東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ（株）製）等を形質転換又は形質導入し、組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得ることが出来る。形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法(Method in Enzymology,68,326-331,1979)により行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法 (Method in Enzymology,68,299-309,1979)により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌のほか、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生物や動物細胞など使用できる。
【００４１】
上記増幅されたＤＮＡの全塩基配列は、例えば、LI-COR MODEL 4200L シークエンサー（LI-COR社製）、３７０Ａ  ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマー社製）などを用いて、解析することができる。塩基配列を部分アミノ酸配列の情報と比較することにより、本発明遺伝子が取得できたか否かを確認することもできる。得られた本発明遺伝子の解析により、翻訳されるポリペプチド、すなわち、本発明オキシダーゼのアミノ酸配列が確定される。
本発明遺伝子の一例として、配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子などが挙げられる。配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３２として寄託されており、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミドｐｕｃ−ＥＦＰは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３１として寄託されている。
さらに、上記本発明遺伝子を改変することにより、種々の改変された本発明オキシダーゼを得ることができる。
【００４２】
上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができるが、例えば、前記の組換え体ＤＮＡに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸などの化学変異剤を接触させる方法、またはＰＣＲ法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組換え体ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組換え体ＤＮＡを得ることができる。
これらの改変により、例えば、配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる本発明遺伝子が得られる
さらに、本発明遺伝子を改変することにより、例えば、配列番号１、又は３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質や配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質等の本発明オキシダーゼがえられる。
次に、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼを採取する。一般に、形質転換体又は形質導入体の培養は、用いられた宿主の生育に適した培地を用いて培養される。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、形質転換体をＬＢ培地１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンタを用いて、通気量１Ｌ／min 、攪拌速度６００rpmの条件で、３０℃、２４時間培養した。得られた培養液１０Ｌを７０００rpm、１０分間遠心分離して集菌し、菌体を得る。得られた菌体から、先に述べた方法により、本発明酵素を取得することができる。
【００４３】
【実施例】
以下、実験例、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【００４４】
（実験例１）本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物の検索
検索には、土壌より分離した菌、および微生物保存機関から分与された保存菌を用いた。土壌由来菌については、千葉県野田市、茨城県筑波付近の土壌を約１００箇所採取し、それぞれ小スパーテル１さじを濃縮培地（イーストエキス ０．５％、リン酸二水素カリウム ０．２％、硫酸マグネシウム ０．０５％、フルクトシルバリルヒスチジン ０．１％、ｐＨ６．５）を用いて、３０℃、１日振とう培養したのち、平面培地（濃縮培地＋寒天 １．２％）で分離した。分離した菌株は約５０００株で主にバクテリア、酵母であった。保存菌は酵母３８０株、糸状菌４８０株、放線菌７００株を用いた。
土壌由来菌および酵母は上記濃縮培地、糸状菌は酵素誘導培地１（イーストエキス  ０．１％、マルツエキス  ０．１％、リン酸二水素カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、フルクトシルバリルヒスチジン  ０．１％、ｐＨ７．３）、放線菌は酵素誘導培地２（乾燥酵母  ０．２％、大豆粉  １．２５％、フルクトシルバリルヒスチジン ２％）３ｍｌにそれぞれ接種した。土壌由来菌は２４時間、酵母、糸状菌および放線菌は３〜５日、３０℃で振とう培養した。この培養液を３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して菌体を得た。その後、溶菌バッファー（１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁し、超音波処理（１〜３分）またはヒストコロン（５０パワー、３０秒、２回、（株）日音医理科器機社製）等により菌体を破砕し、トリトンＸ−１００を０．５％となるように添加後、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素液とした。この粗酵素液について、上記活性測定法にて、フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性の有無を調べたところ、同活性をもつものが糸状菌から１９株得られた。すなわち、アカエトミエラ属の糸状菌１株、アカエトミウム属の糸状菌８株、シエラビア属の糸状菌１株、カエトミウム属の糸状菌２株、ゲラシノスポラ属の糸状菌１株、ミクロアスカス属の糸状菌１株、コニオカエタ属の糸状菌１株、ユウペニシリウム属の糸状菌４株であった。
【００４５】
（実施例１）アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの製造
アカエトミエラ・ヴィレシェンス  ＡＴＣＣ ３２３９３を０．１５Ｌ容三角フラスコに入れた培地（イーストエキス ０．４ ％、マルツエキス １％、グルコース ２％、トリプトン ０．１％、リン酸二水素カリウム ０．１％、硫酸マグネシウム ０．０５％、ｐＨ７）０．０５ Ｌに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。これを種培養として、５Ｌ三角フラスコに入れた上記培地１Ｌに１０ｍｌずつ接種し、３０℃、９０ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この培養液より、ろ紙を張ったブフナーろうとを用いて菌体を回収した。得られた菌体は−８０℃で凍結保存した。
【００４６】
凍結菌体（６Ｌ培養液分）をバッファーＡ（０．４Ｍ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８）１Ｌに懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液は９,０００ｒｐｍで、１５分遠心し、上清をあらかじめバッファーＡで平衡化したＤＥＡＥセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（５ｃｍ×１８ｃｍ）にかけた。さらに５００ｍｌのバッファーＡを上から流し、溶出液すべてを回収した。溶出液に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上清に硫酸アンモニウムを６５％飽和となるよう徐々に添加し、目的の蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、沈殿物を回収した。
【００４７】
これに、３０ｍｌのバッファーＢ（１０ｍＭ トリス、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ グリセロール、ｐＨ８．６）を加え溶解し、ＰＤ−１０（アマシャムバイオテク社製）により脱塩した後、あらかじめバッファーＢで平衡化したＱセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。１５０ｍｌのバッファーＢで洗浄後、バッファーＢからバッファーＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、ｐＨ８．６）のリニアグラジェントで溶出させた。活性は約０．０８Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。
溶出された活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮、透析し、ＴＳＫｇｅｌ  ｓｕｐｅｒＱ（東ソー社製）にかけた。溶出はバッファーＢ〜バッファーＣのリニアグラジェントで行った。流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行い、２８０ｎｍでモニターした。活性は約０．０８Ｍ 塩化ナトリウムで溶出した。
【００４８】
得られた活性画分はマイクロコン１０（アミコン社製）で濃縮し、ＰＯＲＯＳ  ＰＥ（パーセプティブ・バイオシステムズ社製）にかけた。溶出はバッファーＤ（２Ｍ 硫酸アンモニウム、２０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ７）〜バッファーＥ（２０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、ｐＨ８）のリニアグラジェントで行った。流速は２ ｍｌ／ｍｉｎで行い、２８０ｎｍでモニターした。活性は約１Ｍ硫酸アンモニウムで溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、単一なバンドが得られた（分子量約５２，０００）。得られた活性画分を以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
【００４９】
（実施例２）アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの理化学的性質
実施例１により得られた本発明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の通りであった。
（ａ）作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活性を測定した。本発明オキシダーゼは、ε−フルクトシルリジンに対する活性を１００％とすると、フルクトシルバリルヒスチジンは４２％、フルクトシルグリシンは１８％であった。
（ｂ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行った。結果を図１に示す。本発明オキシダーゼは、ｐＨ８．０において最も高い活性を示した。また、ｐＨ７．０−８．０でもｐＨ８．０付近における活性値の７０％以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ７．０−８．０であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ８．０であると判断した。
（ｃ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質フルクトシルバリルヒスチジン濃度を変化させて活性測定を行ない、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値は２．３ｍＭであることが判かった。
（ｄ）至適温度の範囲
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図３に示す。最も高い活性を示した温度である、４０℃付近での活性に対して５０％以上の活性を示す温度範囲は、３０〜４５℃であった。
以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、３０〜４５℃であると判断した。
（ｅ）熱安定性
２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果は、図４に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、５０℃付近まで安定であった。
（ｆ）安定ｐＨの範囲
緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定した。結果を図２に示す。最も高い残存活性を示したｐＨである、ｐＨ７．０付近での活性に対して７０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ６．０−９．０であった。
【００５０】
以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ６．０−９．０であると判断した。
（ｇ）分子量
マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。本発明オキシダーゼの分子量は、約５２，０００であった。
（ｈ）反応産物の特定
反応産物を特定するために反応液をＨＰＬＣ解析した。５０μｌの反応液（２ｍＭ フルクトシルバリルヒスチジン、５ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ８．０）、本発明オキシダーゼ  ０．００３Ｕ）を３７℃で２時間インキュベートし、１０倍希釈した後、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラム（東ソー社製）で反応産物を解析した。コントロールとして酵素のかわりにバッファーを添加したものも同時に行った。その結果、コントロールではフルクトシルバリルヒスチジンのみがピークとして検出されたが、酵素添加ではフルクトシルバリルヒスチジンのピークは消失しており、バリルヒスチジンのピークのみが確認された。このことから、本発明オキシダーゼはフルクトシルバリルヒスチジンを分解してバリルヒスチジンを生ずることが確かめられた。また、この反応は糖化アミノ酸オキシダーゼの反応様式と同様に、αケトアミン結合を切断することが示唆された。
【００５１】
（実施例３）熱安定性の比較
アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼと特開２００１−９５５９８記載のオキシダーゼの熱安定性について比較検討した。特開２００１−９５５９８記載のオキシダーゼを生産する大腸菌ＤＨ５α（ｐＦＰ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９７）をＬＢ−ａｍｐ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ バクトイーストエキストラクト、０．５％ 塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７）１０ｍｌに植菌し、３０℃で２０時間、１２０ｒｐｍで往復振とう培養した。得られた培養液を１２，０００ｒｐｍで１０分遠心することにより集菌したのち、溶菌バッファー（５０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８）１０ｍｌで懸濁し、超音波破砕した。破砕液を１２，０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液を２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて４５℃、１０分処理した後、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として、活性を測定したところ、活性は得られなかった。この結果、特開２００１−９５５９８記載のオキシダーゼは、耐熱性が低く、臨床診断用酵素としてキット試薬中に処方する上で保存安定性に問題があった。一方、先にも述べたとおり、本発明オキシダーゼは、４５℃、１０分の処理で８０％以上の活性を保持しており、熱安定性に非常に優れていた。
【００５２】
（実施例４）糸状菌の生産する本発明オキシダーゼ
実験例１の探索で得られた糸状菌のうち、アカエトミエラ属の糸状菌１株、アカエトミウム属の糸状菌８株、シエラビア属の糸状菌１株、カエトミウム属の糸状菌２株、ゲラシノスポラ属の糸状菌１株、ミクロアスカス属の糸状菌１株、コニオカエタ属の糸状菌１株、ユウペニシリウム属の糸状菌１株の生産する本発明オキシダーゼを製造し、更に、得られたそれらのオキシダーゼの理化学的性質を調べ、それらの結果を表１および２に示した。上記糸状菌１６株をそれぞれ３ｍｌの上記酵素誘導培地１で３０℃、４日間培養し、菌体を回収した。得られた菌体は、溶菌バッファー０．９ｍｌに懸濁し、ヒスコトロン、および超音波処理により破砕し、トリトンＸ−１００を０．５％となるように添加後、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素標品とした。それぞれの粗酵素標品についてフルクトシルバリンヒスチジン（ＦＶＨ）、フルクトシルグリシン（ＦＧ）、ε−フルクトシルリジン（εＦＬ）に対する活性を確認した。また、活性値はε−フルクトシルリジンに対する活性を１００％として換算し、比較した。さらに、それぞれの粗酵素標品を熱処理（４５℃、１０分）した後フルクトシルバリルヒスチジンに対する活性を測定し、処理前の活性値と比較した。表１および２に示したように、培地あたりの活性は菌株により差があるものの、全ての菌株の標品はフルクトシルバリルヒスチジンに作用した。基質特異性は菌株により若干異なるものの、ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）やコニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ ９３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）の本発明オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジンに良く作用するがε−フルクトシルリジンには非常に作用しにくく、特に好ましい性質を有していた。アカエトミエラ・ヴィレシェンス  ＡＴＣＣ  ３２３９３ (Achaetomiella virescens ATCC 32393)、カエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ  ９３３５ (Chaetomium sp. NISL 9335)（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９９）の本発明オキシダーゼは比較的フルクトシルバリルヒスチジンに強く作用することがわかった。また、この熱処理条件では、１２株の本発明オキシダーゼ標品が１００％以上の残存活性を示し、４株の標品が８０〜１００％の残存活性を示し、非常に安定であることがわかった。
【００５３】
【表１】
0004231668.tif 000002
【００５４】
【００５５】
【表２】
0004231668.tif 000003
【００５６】
（実施例５）カエトミウム属およびコニオカエタ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの製造
カエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ ９３３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９９）、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ ９３３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）を培養して得られた菌体から本発明オキシダーゼを精製した。二つの菌について、同じ精製操作を用いた。
ガラスチューブ（径１．６ｃｍ×１２．５ｃｍ）に入れた培地（イーストエキス０．４  ％、マルツエキス  １％、グルコース  ２％、トリプトン  ０．１％、リン酸二水素カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、ｐＨ７）３ｍｌに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで１日間往復振とう培養した。これを種培養として、１Ｌ容三角フラスコに入れた上記培地０．４Ｌに３ｍｌずつ接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この培養液より、ろ紙を張ったブフナーろうとを用いて、または遠心分離（１２,０００ｒｐｍ、１０分）により菌体を回収した。得られた菌体は−８０℃で凍結保存した。
【００５７】
凍結菌体（０．４Ｌ培養液分）を０．０２５ＬのバッファーＡに懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液は１２,０００ｒｐｍで、１０分遠心し、上清に硫酸アンモニウムを６５％飽和となるよう徐々に添加し、目的の蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、沈殿物を回収した。
【００５８】
これに、５ｍｌのバッファーＤを加え溶解し、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分）した後、上清をＰＯＲＯＳ  ＰＥにかけた。溶出はバッファーＤ〜バッファーＥのリニアグラジェントで行った。流速は２ ｍｌ／ｍｉｎで行い、２８０ｎｍでモニターした。活性は両酵素ともに約０．２５Ｍ 硫酸アンモニウムで溶出した。得られた活性画分はマイクロコン１０（アミコン社製）で濃縮脱塩し、以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
【００５９】
（実施例６）カエトミウムｓｐ．の生産する本発明オキシダーゼの理化学的性質
実施例５により得られたカエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ ９３３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９９）の生産する本発明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の通りであった。
（ａ）作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活性を測定した。本発明オキシダーゼは、ε−フルクトシルリジンに対する活性を１００％とすると、フルクトシルバリルヒスチジンは４０％、フルクトシルグリシンは２８％であった。
（ｂ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行った。結果を図５に示す。本発明オキシダーゼは、ｐＨ８．０において最も高い活性を示した。また、ｐＨ６．０−８．０でもｐＨ８．０付近における活性値の７０％以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０−８．０であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ８．０であると判断した。
（ｃ）至適温度の範囲
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図７に示す。最も高い活性を示した温度である、３７℃付近での活性に対して６０％以上の活性を示す温度範囲は、２０〜４５℃であった。
以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、２０〜４５℃であると判断した。
（ｄ）熱安定性
２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果は、図８に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、５５℃付近まで安定であった。
（ｅ）安定ｐＨの範囲
緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定した。結果を図６に示す。最も高い残存活性を示したｐＨである、ｐＨ７．０付近での活性に対して７０％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ５．０−９．０であった。
【００６０】
以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ５．０−９．０であると判断した。
【００６１】
（実施例７）コニオカエタｓｐ．の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの理化学的性質
実施例５により得られたコニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ ９３３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）の生産する本発明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の通りであった。
（ａ）作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活性を測定した。本発明オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジンに対する活性を１００％とするとε−フルクトシルリジンに対する活性は６１％、フルクトシルグリシンは３９％であり、ε−フルクトシルリジンに作用しにくいことがわかった。
（ｂ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行った。結果を図９に示す。本発明オキシダーゼは、ｐＨ７．０において最も高い活性を示した。また、ｐＨ６．０−８．０でもｐＨ７．０付近における活性値の７０％以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０−８．０であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．０であると判断した。
（ｃ）至適温度の範囲
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図１１に示す。最も高い活性を示した温度である、４０℃付近での活性に対して６０％以上の活性を示す温度範囲は、２０〜４０℃であった。
以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、２０〜４０℃であると判断した。
（ｄ）熱安定性
２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果は、図１２に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、５０℃付近まで安定であった。
（ｅ）安定ｐＨの範囲
緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ６．８−９．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定した。結果を図１０に示す。最も高い残存活性を示したｐＨである、ｐＨ７．０付近での活性に対して７０％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ５．０−９．０であった。
【００６２】
以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ５．０−９．０であると判断した。
【００６３】
（実施例８）ユウペニシリウム・テレナムの生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの製造
ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７ (Eupenicillium terrenum ATCC 18547)を０．１５Ｌ容三角フラスコに入れた培地（イーストエキス  ０．１  ％、マルツエキス  ０．１％、リン酸二水素カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、ｐＨ７．３）０．０５Ｌに接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。これを種培養として、５Ｌ三角フラスコに入れた上記培地１Ｌに１０ｍｌずつ接種し、２５℃、１００ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この培養液より、ろ紙を張ったブフナーろうとを用いて菌体を回収した。得られた菌体は−８０℃で凍結保存した。
【００６４】
凍結菌体（６Ｌ培養液分）をバッファーＦ（１０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８）５００ｍＬに懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液を９,０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清にバッファーＦを加え、５００ｍＬの粗酵素液とした。粗酵素液に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。４℃で一晩放置後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上清を回収した。さらにこの上清に硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう徐々に添加し、蛋白質を沈殿させた。４℃で一晩放置後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、沈殿物を回収した。
【００６５】
沈殿物に１０ｍｌのバッファーＧ（１０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８）を加え溶解し、ＰＤ−１０（アマシャムバイオテク社製）によりバッファー置換した後、あらかじめバッファーＧで平衡化しておいたＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ３４（ＩＢＦバイオテクニクス社製）カラム（２．８ｃｍ×８５ｃｍ）にアプライした。こののち、１ＬのバッファーＧで溶出させ、活性画分を回収した。
得られた活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮後、バッファーＦでバッファー置換し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（１．０ｃｍ×８ｃｍ）にアプライした。
溶出はバッファーＨ（１０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、ｐＨ８）〜バッファーＩ（１０ｍＭ リン酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ グリセロール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）のリニアグラジエントで行った。
得られた活性画分は、再度セントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮し、ＰＯＲＯＳ  ＰＥ（パーセプティブ・バイオシステムズ社製）にアプライした。溶出はバッファーＤ〜バッファーＥのリニアグラジェントで行った。流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＯＤ２８０ｎｍによりタンパク量をモニターした。活性は約０．０１Ｍ 硫酸アンモニウムで溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、単一なバンドが確認できた（分子量約５３ｋＤａ）。こうして得られた活性画分を用いて以下の理化学的性質を決定した。
【００６６】
（実施例９）ユウペニシリウム・テレナムの生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの理化学的性質
ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７ (Eupenicillium terrenum ATCC 18547)の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の通りであった。
（ａ）作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活性を測定した。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジンに対する活性を１００％とすると、フルクトシルグリシンは１８２％、ε−フルクトシルリジンは９．７８％であり、フルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルグリシンに高い特異性をもつことがわかった。
（ｂ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．０−８．５）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行った。結果を図１３に示す。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼは、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０において最も高い活性を示した。また、同緩衝液ｐＨ６．０−８．０においてｐＨ８．０における活性値の７０％以上を示したことから、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０−８．０であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．０であると判断した。
（ｃ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質フルクトシルバリルヒスチジン濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、本酵素のフルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値は４．２５ｍＭであることが判かった。
（ｄ）至適温度の範囲
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図１５に示す。最も高い活性を示した温度は３５℃であり、その活性の６０％以上の活性を示す温度範囲は、２５〜４０℃であった。
以上から、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、２５〜４０℃であると判断した。
（ｅ）熱安定性
２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、各温度で１０分間処理した時の残存活性を図１６に示す。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼは安定性に優れており、４５℃付近までほぼ１００％の残存活性を示すことがわかった。
（ｆ）安定ｐＨの範囲
緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−６．０）、２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−７．０）、２００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．０−８．５）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本オキシダーゼの残存活性を測定した。結果を図１４に示す。リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０において最も高い残存活性を示したが、その活性に対し６０％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ６．０−９．０であった。
【００６７】
以上から、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ６．０−９．０であると判断した。
（ｇ）分子量
マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの分子量は、約５３，０００であった。
（ｈ）反応産物の特定
反応産物を特定するために反応液をＨＰＬＣ解析した。５０μｌの反応液（２ｍＭ フルクトシルバリルヒスチジン、５ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ８．０）、本酵素 ０．００３Ｕ）を３７℃、２時間インキュベートし、１０倍希釈後、ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（東ソー社製）で反応産物を解析した。コントロールとして酵素のかわりにバッファーを添加したものも同時に行った。その結果、コントロールではフルクトシルバリルヒスチジンのみがピークとして検出されたが、酵素添加ではフルクトシルバリルヒスチジンのピークは消失しており、バリルヒスチジンのピークのみが確認された。このことから、本酵素はフルクトシルバリルヒスチジンを分解してバリルヒスチジンを生ずることが確かめられた。また、この反応は糖化アミノ酸オキシダーゼの反応様式と同様に、αケトアミン結合を切断することが示唆された。
【００６８】
（実施例１０）ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ
実験例１の探索により得られた本発明糸状菌のうち、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼを生産するユウペニシリウム属に属する糸状菌として、ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）に加えて、さらにユウペニシリウム属に属する糸状菌３株を得た。そこで、これらのユウペニシリウム属に属する糸状菌、ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547） 、ユウペニシリウム・センティコサム  ＩＦＯ  ９１５８（Eupenicillium senticosum IFO 9158）、ユウペニシリウム・アイダホーエンス  ＩＦＯ  ９５１０（Eupenicillium idahoense IFO 9510）及びユウペニシリウム・ユーグラウカム  ＩＦＯ  ３１７２９（Eupenicillium euglaucum IFO 31729）の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼを製造し、更に、得られたそれらのオキシダーゼの理化学的性質を調べ、それらの結果を表３に示した。
【００６９】
上記糸状菌４株をそれぞれ３ｍｌの上記酵素誘導培地１で３０℃、４日間培養し、菌体を回収した。得られた菌体は、溶菌バッファー０．９ｍｌに懸濁し、ヒスコトロン、および超音波処理により破砕し、トリトンＸ−１００を０．５％となるように添加後、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素標品とした。それぞれの粗酵素標品についてフルクトシルバリンヒスチジン（ＦＶＨ）、フルクトシルグリシン（ＦＧ）、ε−フルクトシルリジン（εＦＬ）に対する活性を確認した。また、活性値はフルクトシルバリンヒスチジンに対する活性を１００％として換算し、比較した。さらに、それぞれの粗酵素標品を熱処理（４５℃、１０分）した後フルクトシルバリルヒスチジンに対する活性を測定し、処理前の活性値と比較した。表３に示したように、培地あたりの活性は菌株により差があるものの、全ての菌株の標品はフルクトシルバリルヒスチジンおよびフルクトシルグリシンに作用した。特にフルクトシルバリルヒスチジンに対する活性は、ε−フルクトシルリジンに対する活性に比べ、２株は２倍以上、１株は３倍以上、１株は１０倍以上という高い値であった。なお、この熱処理条件では、４株の本発明オキシダーゼ標品はすべて９０％以上の残存活性を示し、非常に安定であることがわかった。
【００７０】
【表３】
0004231668.tif 000004
【００７１】
（実施例１１）糖化ペプチドのプロテアーゼ処理生成物への本発明オキシダーゼの反応
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）をエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃで処理することにより、糖化ヘモグロビンβ鎖よりα−糖化ヘキサペプチド（フルクトシルVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu）が遊離する(Clin. Chem., 43; 10 1944-1951, 1997)。このα−糖化ヘキサペプチドと同一物質である、ペプチド研究所製のフルクトシルVal-His-Leu-Thr-Pro-Gluを用いて以下の実験を行った。
（１）試薬の調製
（Ａ）２０ｍＭ  α−糖化ヘキサペプチド
α−糖化ヘキサペプチド（フルクトシル Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu、ＭＷ＝８５６、ペプチド研究所製）３．４３４ｍｇを０．２ｍｌの水に溶解させた。
（Ｂ）プロテアーゼ
モルシン（キッコーマン製）１５ｍｇを０．２ｍｌのバッファー（１０ｍＭ 酢酸バッファー、ｐＨ３．０）に溶解した。
（Ｃ）０．２Ｍ 酢酸バッファー、ｐＨ３．０
（Ｄ）反応基質
（ａ）α−糖化ヘキサペプチドのプロテアーゼ消化物
Ａ １００μｌ、Ｂ ５μｌ、Ｃ ５μｌをマイクロチューブ内で混和し、３７℃で１７時間インキュベートした。反応後、反応液をマイクロコン１０（アミコン社製）でろ過し、プロテアーゼを除いた。
（ｂ）２０ｍＭ  フルクトシルグリシン（コントロール）
４．５ｍｇのフルクトシルグリシンを１ｍｌの水に溶解した。
（E）発色液
５μｌ        １０ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノアンチピリン
７．５μｌ    ２％  ２，４−ジクロロフェノールスルフェート
１μｌ        ３３００Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ
１００μｌ    １Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ８）
２８６．５μｌ  水
を混和した。
（F）本発明オキシダーゼ
（ａ）アカエトミエラ・ヴィレシェンス  ＡＴＣＣ  ３２３９３由来精製酵素
（ｂ）ユウペニシリウム・テレナム  ＡＴＣＣ  １８５４７由来精製酵素
（ｃ）コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ ９３３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９８）由来精製酵素
（ｄ）２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０
（２）反応測定
反応基質（Ｄ−ａ、ｂ）２０μｌ、発色液（E）２０μｌ、および本発明オキシダーゼ（F−ａ〜ｄ）１０μｌを９６穴アッセイプレートで反応させ、波長５１０ｎｍでプレートリーダー（イムノミニＮＪ−２３００、日本インターメッド社製）を用いて７０分間測定した。結果はフルクトシルグリシンに対する活性を１００％として相対活性で示した（表４）。Ｎ．Ｄ．は発色が検出限界以下であったことを示す。いずれの本発明オキシダーゼともにα−糖化ヘキサペプチドのプロテアーゼ消化物と反応することが確認された。
【００７２】
【表４】
0004231668.tif 000005
【００７３】
（実施例１２）本発明遺伝子（Coniochaeta sp.）のクローニングと形質転換体による発現
（１）Coniochaeta sp. ｍＲＮＡの調製
Coniochaeta sp.を０．１５Ｌ容三角フラスコに入れた培地（イーストエキス０．４％、マルツエキス  １％、グルコース  ２％、トリプトン  ０．１％、リン酸二水素カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、ｐＨ７）０．０５Ｌに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで１日間回転振とう培養した。これを種培養として、１Ｌ三角フラスコに入れた上記培地０．５Ｌに１ｍｌずつ接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで２日間回転振とう培養した。この培養液より、１２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離することで菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素の入った乳鉢と乳棒で粉砕し、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）１０ｍｌに縣濁し、２，７００ｒｐｍで５分遠心分離することによりＲＮＡ画分を得た。これより、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法に従い、ｍＲＮＡ  ０．５１ｍｇを得た。
【００７４】
（２）プライマーの合成
実施例５に記載した方法により精製したフルクトシルペプチドオキシダーゼ約１０μｇをトリプシン消化し、ＨＰＬＣで分取したペプチド７個をＡＢＩ４７０Ａプロテインシークエンサー（パーキンエルマー社製）に供し、内部アミノ酸配列を決定した。これらの情報により配列番号５及び６に記載したプライマーをアマシャムバイオテク社のカスタム受託合成により合成した。
【００７５】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
反応液を以下の組成で調整し、４２℃、３０分逆転写反応を行った後、９９℃、５分変性させ、５℃で保存した。
【００７６】
0004231668.tif 000006
次に下記の組成で調製した反応液８０μｌを逆転写を行ったチューブに添加し、変性を９４℃、３０秒間、アニールを６２℃、３０秒間、伸長反応を７２℃、１．５分間で３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行なった。
【００７７】
0004231668.tif 000007
【００７８】
*宝酒造社製
ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約０．７７ｋｂに目的の断片と思われるバンドが確認されたので、そのバンドを切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（ＢＩＯ  １０１社製）にて精製した。
【００７９】
（４）精製ＤＮＡ断片の解析
精製したＤＮＡ断片を３７０Ａ ＤＮＡシークエンシス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列より予想されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(Leu-Ser-Lys-Met-Pro-Leu-Leu-Gln-Arg)が確認された。このことより、上記のＲＴ−ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片にはConiochaeta sp.由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の一部の配列が存在していることが確認された。
【００８０】
（５）３'-ＲＡＣＥによる下流領域の解析
先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、アマシャムバイオテク社により合成した（ＤＮＡ配列７）。これと上記のｍＲＮＡと３'−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  ＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、３'未知領域の増幅を行った。反応液をアガロース電気泳動にかけ、約５００ｂｐのＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の決定および解析を行ったところ、決定した塩基配列の５'領域に上記 Coniochaeta sp.由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の部分配列の３'配列と同じ配列を含むことが確認された。また、決定した塩基配列より予想されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Phe-Gln-Asp-Lys-Glu-Leu-Phe-Asn-Arg）が確認された。
【００８１】
（６）５'-ＲＡＣＥによる上流領域の解析
先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、アマシャムバイオテク社により合成した（ＤＮＡ配列８〜１２）。これと上記のｍＲＮＡと５'−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  ＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、５'未知領域の増幅を行った。反応液をアガロース電気泳動にかけ、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の決定および解析を行ったところ、決定した塩基配列の３'領域に上記 Coniochaeta sp.由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の部分配列の５'配列と同じ配列を含むことが確認された。また、決定した塩基配列より予想されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Ser-Gly-Tyr-Ala-Pro-Ala-Asn-Ile-Thr）が確認された。
【００８２】
（７）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子断片の取得
上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドンを推定し、Ｎ末領域とＣ末領域のプライマーＤＮＡをアマシャムバイオテク社により合成した（合成ＤＮＡ１３，１４）。これらと上記ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲを行い、反応液をアガロース電気泳動で解析した。その結果、約１．３ｋｂのバンドが確認された。このバンドに含まれるＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出した。一方プラスミドｐＫＫ２２３−３（アマシャム社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（宝酒造社製）で平滑化し、上記精製抽出したＤＮＡ断片とライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたプラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰは、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３２として寄託されている。
【００８３】
（８）活性の確認
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）菌体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌにて３２℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、さらに３時間培養した。この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理した。これをエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、前述した酵素活性測定法によりフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を測定したところ、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）は４．７４Ｕ／ｍｌとフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を持っていた。
【００８４】
（９）フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の解析
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性が確認されたので、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰの挿入断片がフルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子を含むことが明らかとなった。そこで、このプラスミドＤＮＡについて３７０Ａ ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号２に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に夫々示した。フルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子は、１３１４ｂｐのコーディング領域を有し、４３７個のアミノ酸をコードしていた。
【００８５】
（実施例１３）本発明遺伝子（Eupenicillium terrenum）のクローニングと形質転換体による発現
（１）Eupenicillium terrenum ｍＲＮＡの調製
Eupenicillium terrenum ATCC 18547を０．１５Ｌ容三角フラスコに入れた培地（イーストエキス  ０．１％、マルツエキス  ０．１％、リン酸二水素カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、ｐＨ７．３）０．０５Ｌに接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。これを種培養として、１Ｌ三角フラスコに入れた上記培地０．５Ｌに１ｍｌずつ接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この培養液より、１２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離することで菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素の入った乳鉢と乳棒で粉砕し、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）１０ｍｌに縣濁し、２，７００ｒｐｍで５分遠心分離することによりＲＮＡ画分を得た。これより、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法に従い、ｍＲＮＡを得た。
【００８６】
（２）プライマーの合成
実施例８に記載した方法により精製したフルクトシルペプチドオキシダーゼ約１０μｇをトリプシン消化し、ＨＰＬＣで分取したペプチド６個をＡＢＩ４７０Ａプロテインシークエンサー（パーキンエルマー社製）に供し、内部アミノ酸配列を決定した (Thr-Asn-Val-Trp-Leu-Glu-Ser-Glu, Asp-Leu-Ala-Glu-Met-Pro-Gly, Asn-Phe-Ile-Leu-Ala, Leu-Pro-Asn-Ile-Gly, x-Pro-Thr-Asp-x-Tyr-Pro, Leu-His-Gln-Pro-Tyr-Gly-Ala-x-x-Pro)。これらの情報により配列番号１５及び１６に記載したプライマーをアマシャムバイオテク社のカスタム受託合成により合成した。
【００８７】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
反応液を以下の組成で調整し、４２℃、３０分逆転写反応を行った後、９９℃、５分間変性させ、５℃で保存した。
【００８８】
0004231668.tif 000008
次に下記の組成で調製した反応液８０μｌを逆転写を行ったチューブに添加し、変性を９４℃、３０秒間、アニールを６２℃、３０秒間、伸長反応を７２℃、１．５分間で３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行なった。
【００８９】
0004231668.tif 000009
【００９０】
*宝酒造社製
ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約０．９ｋｂに目的の断片と思われるバンドが確認されたので、そのバンドを切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（ＢＩＯ  １０１社製）にて精製した。
【００９１】
（４）精製ＤＮＡ断片の解析
精製したＤＮＡ断片を３７０Ａ ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列より予想されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(Asn-Phe-Ile-Leu-Ala, Leu-Pro-Asn-Ile-Gly, x-Pro-Thr-Asp-x-Tyr-Pro, Leu-His-Gln-Pro-Tyr-Gly-Ala-x-x-Pro)が確認された。このことより、上記のＲＴ−ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片には Eupenicillium terrenum 由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の一部の配列が存在していることが確認された。
【００９２】
（５）３'-ＲＡＣＥによる下流領域の解析
先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、アマシャムバイオテク社により合成した（配列番号１７）。これと上記のｍＲＮＡと３'−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  ＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、３'未知領域の増幅を行った。反応液をアガロース電気泳動にかけ、約４００ｂｐのＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の決定および解析を行ったところ、決定した塩基配列の５'領域に上記 Eupenicillium terrenum 由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の部分配列の３'配列と同じ配列を含むことが確認された。
【００９３】
（６）５'-ＲＡＣＥによる上流領域の解析
先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、アマシャムバイオテク社により合成した（ＤＮＡ配列１８〜２２）。これと上記のｍＲＮＡと５'−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  ＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、５'未知領域の増幅を行った。反応液をアガロース電気泳動にかけ、約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の決定および解析を行ったところ、決定した塩基配列の３'領域に上記 Eupenicillium terrenum 由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の部分配列の５'配列と同じ配列を含むことが確認された。
【００９４】
（７）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子断片の取得
上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドンを推定し、Ｎ末領域とＣ末領域のプライマーＤＮＡをアマシャムバイオテク社により合成した（配列番号２３，２４）。これらと上記ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲを行い、反応液をアガロース電気泳動で解析した。その結果、約１．３ｋｂのバンドが確認された。このバンドに含まれるＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出した。一方プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＳｍａＩで消化後、上記精製抽出したＤＮＡ断片とライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたプラスミドｐｕｃ−ＥＦＰは、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３１として寄託されている。
【００９５】
（８）活性の確認
大腸菌ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＥＦＰ）菌体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌにて３０℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、さらに３時間培養した。この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理した。これをエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、前述した酵素活性測定法によりフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を測定したところ、ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＥＦＰ）は０．０１Ｕ／ｍｌのフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を持っていた。
【００９６】
（９）フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の解析
大腸菌ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＥＦＰ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性が確認されたので、ｐｕｃ−ＥＦＰの挿入断片がフルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子を含むことが明らかとなった。そこで、このプラスミドＤＮＡについて３７０Ａ ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号４に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に夫々示した。フルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子は、１３１４ｂｐのコーディング領域を有し、４３７個のアミノ酸をコードしていた。
【００９７】
【発明の効果】
本発明によれば、種々の理化学的性質を有する新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ及びそれらの製造方法が提供され、診断用酵素として測定用キットに容易に利用されると同時に、安価に大量に供給されることにより産業上有用である。さらに、フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼは、特に糖尿病の診断用酵素として有用であり、安定性に優れた本発明オキシダーゼおよびその製造方法が提供され、保存安定性に優れた臨床診断用キットの開発が可能になり、産業上より有用である。
【００９８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。
【図２】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。
【図３】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す図。
【図４】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。
【図５】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。
【図６】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。
【図７】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す図。
【図８】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。
【図９】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。
【図１０】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。
【図１１】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す図。
【図１２】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。
【図１３】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。
【図１４】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。
【図１５】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す図。
【図１６】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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