(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０７アミノ酸を含有し、見かけの分子量が３５ｋＤであり、且つプロインスリンをインスリンに変換する機能をもった、天然に存在する哺乳類膵臓カルボキシペプチダーゼＢのアミノ酸配列および酵素活性を有する酵素的に活性な哺乳類膵臓カルボキシペプチダーゼＢを製造する方法であって：
（a）ＤＮＡがプロカルボキシペプチダーゼＢの発現を指令するように、プロカルボキシペプチダーゼＢをコードするＤＮＡを含有する組換えバクテリア細胞を処理する工程と；
（b）そのようにして発現されたプロカルボキシペプチダーゼＢを、ｐＨ７〜９．５において可溶化する工程と；
（c）該可溶化されたプロカルボキシペプチダーゼＢを９〜９．５のｐＨでインキュベートして、該プロカルボキシペプチダーゼＢを折り畳ませる工程と；
（d）該折り畳まれたプロカルボキシペプチダーゼＢを酵素的切断に供し、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢを製造する工程と；
（e）該酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢを精製する工程と；
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記可溶化する工程（b）が、
（i）前記組換え細胞の細胞壁を破壊し、溶解物を製造する工程と；
（ii）遠心分離により、前記溶解物から細胞内沈殿物を単離する工程と；
（iii）前記細胞内沈殿物を適切な緩衝液中に可溶化する工程と；
を含んでなる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記インキュベーション工程（c）が、室温において２０〜２４時間行われる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記インキュベーション工程（c）が、ＺｎＣｌ2、酸化されたグルタチオンおよび還元されたグルタチオンの存在下に、室温で２０〜２４時間行われる方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記酵素的切断に供する工程（d）が、
（i）ｐＨを８．５に調製する工程と、
（ii）３７℃で６０分間トリプシンによりプロカルボキシペプチダーゼＢを切断する工程と
を含んでなる方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記精製工程（e）が、イオン交換クロマトグラフィーを含んでなる方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記精製工程（e）が、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを含んでなる方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記精製工程（e）が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびダイアフィルトイレーションを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記プロカルボキシペプチダーゼＢがＡＴＣＣ受託番号６９６７３の下に寄託されたプラスミドｐγプロカルボキシペプチダーゼＢにより発現される方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９５年１月２５日出願の米国特許出願第０８／３７８，２３３号の一部継続出願である（その内容は引用により本明細書の一部とみなされる）。
発明の背景
本出願を通して、種々の参照文献がカッコ内にアラビア数字で引用される。これらの参照文献の完全な引用は、明細書の最後の請求の範囲の前に記載される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する当該分野の技術の現状を十分に記載するため、全体として引用により本明細書の一部とみなされる。
天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢ［ペプチジル−Ｌ−リジン（−Ｌ−アルギニン）ヒドロラーゼ  ＥＣ３．４．１７．２］は、ペプチドからＣ−末端Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＯｒｎを特異的に除去する亜鉛含有性膵臓エキソペプチダーゼである（１、２）。
天然に存在するラットカルボキシペプチダーゼＢは、シグナル配列（１３アミノ酸）および活性化ペプチド（９５アミノ酸）を含む１０８アミノ酸の長さのＮ−末端断片を含有する、前駆体タンパク質であるプレプロカルボキシペプチダーゼＢから産生される。プレプロカルボキシペプチダーゼＢは酵素的に不活性である。
小胞体へのプレプロカルボキシペプチダーゼＢの輸送の間、シグナルペプチドは切断除去される。得られる酵素的に不活性なプロカルボキシペプチダーゼＢ前駆体は、細胞から分泌される。次に酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢは、トリプシンによる活性化ペプチドの切断により生成する（７）。
成熟ラットのカルボキシペプチダーゼＢは、３０７個のアミノ酸を含有し（５）、見かけの分子量３５kDを有する。これは７つのシステイン残基（このうち６つはＳ−Ｓ結合で対になっている）を含有する。
カルボキシペプチダーゼＢは、例えばインスリンや他の生物活性を有するポリペプチドの産生やタンパク質配列解析のような、販売目的および研究目的に広く利用されている。
ブタ膵臓から精製される市販のカルボキシペプチダーゼＢは非常に高価であり、他のプロテアーゼが完全に混入していない訳ではない。
ブタの前駆体プロカルボキシペプチダーゼＢの部分的アミノ酸配列およびウシのカルボキシペプチダーゼＢの完全なアミノ酸配列は、公表されている（それぞれ３、４）。さらにラット遺伝子とヒトｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列が公表されている（それぞれ５、６）。
Yamamotoら（６）は、活性化ペプチドの最初の１１アミノ酸が欠如した酵素的に不活性なヒトプロカルボキシペプチダーゼＢの組換え発現を報告した。
かれらはまた、プロカルボキシペプチダーゼが活性化ペプチドの最初の１１アミノ酸が欠如している、酵素的に不活性なβ−ガラクトシダーゼ−プロカルボキシペプチダーゼＢ融合蛋白の組換え発現を報告している。
ヨーロッパ公報第５８８１１８  Ａ２号は、ＯＳＦ−５と呼ぶ骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質を開示している。ＯＳＦ−５は、接着分子または増殖因子として作用し、骨代謝疾患の治療薬として使用できると考えられている。しかし、ＯＳＦ−５の実際の機能または活性は開示されておらず、天然に存在するかまたは組換え型の生物活性タンパク質の産生も証明されていない。
本発明は、組換え型の高度に精製された酵素的に活性な、かつ高価でないカルボキシペプチダーゼＢの産生を開示する。酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢは、まだ報告されておらず、その開示は新規である。
発明の概要
本発明は、ＤＮＡがプロカルボキシペプチダーゼＢの発現を指令するように、プロカルボキシペプチダーゼＢをコードするＤＮＡを含有する組換え細胞を処理する工程、こうして発現されたプロカルボキシペプチダーゼＢを細胞から回収する工程、回収されたプロカルボキシペプチダーゼＢをプロカルボキシペプチダーゼＢの折り畳み（folding）を可能にする条件下で処理する工程、折り畳まれたプロカルボキシペプチダーゼＢを酵素切断に付して酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼを産生する工程、そして酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢを精製する工程を含んでなる、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢの産生方法を提供する。
本発明はさらに、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢを提供する。
【図面の簡単な説明】
図２と３に示すプラスミドの制限地図は、必ずしもプラスミド上のすべての制限部位を記載していない。しかし、本発明の完全な理解に必要な制限部位は記載されている。
図１： 膵臓ラットプロカルボキシペプチダーゼＢのアミノ酸と対応するｃＤＮＡヌクレオチド配列
成熟カルボキシペプチダーゼＢヌクレオチド配列と活性化ペプチドヌクレオチド配列を含む、膵臓ラットプロカルボキシペプチダーゼＢのｃＤＮＡヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。このＤＮＡ配列は、Clauserら（５）が公表しているＤＮＡ配列とは４ヌクレオチド異なり、そのうち２つはアミノ酸の変化を引き起こす：Ｌｙｓ14→ＡｓｎおよびＡｒｇ142→Ａｓｐ。
クローニング（実施例１）時に使用した３つのプライマーのＤＮＡヌクレオチド配列も示す（大きい文字）：プロカルボキシペプチダーゼＢ５’末端プライマー、成熟したカルボキシペプチダーゼＢ５’末端プライマーおよびカルボキシペプチダーゼＢ３’末端プライマー。
アミノ酸の番号は、ウシ膵臓由来のカルボキシペプチダーゼＡ（１０、１２）との相同性に従って番号をつけ、成熟ラットのカルボキシペプチダーゼＢの最初のアミノ酸（Ａｌａ）を４番とする。星印（＊）は、カルボキシペプチダーゼＡに対してラットカルボキシペプチダーゼＢが有する追加のアミノ酸（Ｌｅｕ）を示す。
図２： プラスミドｐＣＰＢとプラスミドｐＣＰＢ−Ｃの作製
プラスミドｐＡＢＮをＢａｍＨＩとＮｃｏＩで消化した。２５００塩基対の断片を単離し、９４０塩基対のＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩカルボキシペプチダーゼＢ  ｃＤＮＡ断片に連結した（実施例１に記載のように得られた）。新たに得られたプラスミドをｐＣＰＢと命名し、大腸菌（E. coli）４３００を形質転換するのに使用した。
大きな断片を単離するためにプラスミドｐＣＰＢをＢａｍＨＩとＮｄｅＩで消化した。プラスミドｐＣＰＢはまた、大きな断片を単離するためにＡｓｅＩとＳｃａＩで消化した。
２つの大きな断片を、部位特異的突然変異誘発（実施例１）について調製される５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドとポリメラーゼ−リガーゼ緩衝液（５×緩衝液：３２．５mMトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、４０mM  ＭｇＣｌ2、５mM  ２−メルカプトエタノール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）とともに混合して、ヘテロ２本鎖を形成した（９）。ＤＮＡ鎖を変性させるために混合物を沸騰させ、ＤＮＡを復元するために徐々に冷却した。反応生成物を用いて大腸菌１６４５を電気穿孔法で形質転換した。形質転換体を、アンピシリン含有ＬＢ培地上での増殖と、突然変異のために調製された５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドとのその場（in situ）のコロニー差別的ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素解析とＤＮＡヌクレオチド配列決定後、突然変異体ＳｐｅＩ部位を含有するクローンを選択した。新たに得られたプラスミドをｐＣＰＢ−Ｃと命名し、これは２９０位のアミノ酸のシステインからセリンへの突然変異を有するカルボキシペプチダーゼＢをコードする。プラスミドｐＣＰＢ−Ｃを用いて大腸菌４３００を形質転換した。
図３： プラスミドｐＰｒｏＣＰＢ−ＣとプラスミドｐλＰｒｏＣＰＢの作製
活性化ペプチドとカルボキシペプチダーゼＢの一部をコードする４７０塩基対の断片を単離するために、プロカルボキシペプチダーゼＢ  ｃＤＮＡ（実施例１に記載のように得られた）をＮｄｅＩとＣｌａＩで切断した。
Ｃｙｓ290→Ｓｅｒ突然変異を含むカルボキシペプチダーゼＢの残りをコードする７６０塩基対の断片を単離するために、プラスミドｐＣＰＢ−ＣをＢａｍＨＩとＣｌａＩで切断した。
細菌での発現に必要なすべての成分（実施例１を参照）をコードする２５００塩基対の断片を単離するために、プラスミドｐＡＢをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断した。
上記の３つの断片を連結し、新たに得られたプラスミドをｐＰｒｏＣＰＢ−Ｃと命名した。
プラスミドｐＰｒｏＣＰＢ−ＣとｐＣＰＢをＳｔｕＩとＸｈｏＩで切断した。細菌での発現に必要なすべての成分（実施例１を参照）、活性化ペプチド全体およびカルボキシペプチダーゼＢの一部をコードする３７００塩基対の断片を、プラスミドＰｒｏＣＰＢ−Ｃから単離した。
カルボキシペプチダーゼＢの残りをコードする４４０塩基対の断片をプラスミドｐＣＰＢから単離した。
２つの断片を連結し、新たに形成されたプラスミドをｐλＰｒｏＣＰＢと命名した。
図４： 組換えカルボキシペプチダーゼＢと天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢの活性の比較
市販のブタカルボキシペプチダーゼＢ（シグマ（Sigma））と実施例５に記載のように作成した組換えカルボキシペプチダーゼＢの活性を、ヒプリルーＬ−Ａｒｇ基質を用いてFolkの方法（１１）に従って測定した。０．０２５〜１．０mMの間の基質濃度を用いて、触媒反応のＶ0を測定した。
発明の詳細な説明
プラスミドｐλＰｒｏＣＰＢは、「特許手続のための微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の規定に従い、かつこれを満足するように、大腸菌中でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州２０８５２）に、ＡＴＣＣ受託番号６９６７３で１９９４年８月４日に寄託した。
本明細書において「ＣＰＢ」は、組換えＤＮＡ法または他の方法で作成されたポリペプチドを意味し、これは天然に存在する哺乳動物のカルボキシペプチダーゼＢと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。すなわち、ＣＰＢという用語は、天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢと、１つまたはそれ以上のアミノ酸、好ましくは約１０以下のアミノ酸が異なるポリペプチドを含む。
本明細書において「ＰｒｏＣＰＢ」は、組換えＤＮＡ法または他の方法で作成されたポリペプチドを意味し、これは天然に存在する哺乳動物のプロカルボキシペプチダーゼＢと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。すなわち、ＰｒｏＣＰＢという用語は、天然に存在するプロカルボキシペプチダーゼＢと、１つまたはそれ以上のアミノ酸、好ましくは約１０以下のアミノ酸が異なるポリペプチドを含む。
当業者は、確立された公知の方法（例えば、ポリペプチドの細菌による発現をコードするＤＮＡ配列の設計と製造のための従来法、部位特異的突然変異誘発法によるｃＤＮＡとゲノム配列の修飾、組換えタンパク質および発現ベクターの作製、ポリペプチドの細菌による発現、および従来の生化学的測定法を用いるポリペプチドの生化学的活性の測定を含む）を用いて、どのアミノ酸残基が付加、欠失、または置換（そのような置換はどのアミノ酸で起きているかを含めて）されているかを容易に決定することができる。
本明細書において「酵素的に活性な」ＣＰＢは、天然に存在する哺乳動物カルボキシペプチダーゼＢの生物活性を有するＣＰＢを意味する。この定義において、天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢの生物活性とは、ペプチドからＣ−末端アルギニン、リジンまたはオルニチンを特異的に除去する能力である。
実質的に同じアミノ酸配列とは本明細書において、アミノ酸配列においてアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加を包含し、Lehningerの「生化学」、第２版、ワース出版（Worth Pub.）、ニューヨーク（１９７５）、第４章；Creighton、「タンパク質の構造、実際的アプローチ（Protein Structure, a Practical Approach）」、オックスフォード大学出版（Oxford Univ. Press）のアイアールエスプレス（IRL Press）、オックスフォード、英国（１９８９）；およびDayhoff、「タンパク質配列と構造のアトラス（Atlas of Protein Sequence and Structure）第５巻」、ナショナルバイオメディカル研究財団、メリーランド州（１９７２）、第９章により記載されている、相同的または同等の基に従って１０個までの基を包含するものと定義される。そのような置換は当業者には公知である。
好適な実施態様において、ＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢをコードするＤＮＡは、ヒト、ラット、ウシ、またはブタ起源から得ることができる。ＤＮＡはまた逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、合成または半合成手段、またはこれらの方法の２つ以上または当該分野の他の方法により得ることができる。
ＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢポリペプチドをコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法（例えば、Bauerら（１９８５）、Gene 37: 73-81）により突然変異され得る。突然変異された配列は、本明細書に記載の適当な発現ベクターに挿入され得、これは細胞に取り込まれ、次に突然変異されたＤＮＡがポリペプチドの発現を指令するように処理される。
当業者は、本出願に関連して寄託されたプラスミドは、ポリペプチドの発現をコードするように公知の方法（例えば、部位特異的突然変異誘発またはリンカーの挿入）により容易に改変できることは理解されるであろう。そのような方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.（1989）モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。
ＣＰＢまたはＰｒｏＣＰＢをコードする核酸を発現するために使用され得るベクターの例としては、細菌ウイルスのようなウイルス、例えばバクテリオファージ（例えばファージラムダ）、コスミド、プラスミドおよび他のベクターがある。ＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢをコードするｃＤＮＡは、当業者に公知の方法により適当なベクターに挿入される。例えば通常の制限エンドヌクレアーゼ酵素部位を用いて、挿入体およびベクターＤＮＡの両方とも切断して、互いに塩基で対合する相補的な末端を作成し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結することができる。あるいは、ベクターＤＮＡの制限部位に相補的な塩基配列を有する合成リンカーを、挿入体ＤＮＡに連結し、次にこれをその部位で切断する制限酵素で消化することができる。他の手段も利用できる。
ＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢをコードする配列を含む本発明のベクターは、一連の原核または真核宿主細胞、例えば細菌、酵母、カビ、昆虫細胞または他の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ニワトリ胚、繊維芽細胞、腎臓または他の公知の細胞株）中での発現に適合させることもできる。
これらのベクターにはさらに、宿主細胞中でのクローン化された遺伝子の発現に必要な制限成分が、その発現を可能にするようにＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢをコードする核酸に対して配置され、含有されている。
発現に必要な制御成分には、プロモーターおよびオペレーター配列およびリボゾーム結合部位が含まれる。例えば、細菌発現ベクターは、λＰLＯLまたはｄｅｏプロモーターのようなプロモーター−オペレーター配列を含有することができる。翻訳の開始のためにλＣ11またはｄｅｏリボゾーム結合部位を使用し得る。このようなベクターは市販されているか、または当業者に公知の方法（例えば、１９８９年５月１６日発行の同一出願人の米国特許第４，８３１，１２０号、および１９９２年９月１日発行の同一出願人の米国特許第５，１４３，８３６号（これらはλＰLプロモーターに関する方法を開示している）、並びに１９８９年２月２２日公開の同一出願人のヨーロッパ特許出願第３０３，９７２号（これはｄｅｏプロモーターに関する方法を開示している））により記載される配列から構築することができる。さらに適当な成分（例えばレプレッサーやエンハンサー）が存在し得る。当業者は、種々の発現系に適した制御成分の使用法を知っている。
本発明の発現プラスミドは、適当な宿主細胞中でＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢポリペプチドの発現を可能にするように、ＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢポリペプチドをコードするＤＮＡに対してプラスミド内に位置している適当な制御成分を含んでなる。このような制御成分は、プロモーターおよびオペレーター（例えば、ｄｅｏＰ1Ｐ2やλＰL）、およびリボゾーム結合部位（例えば、ｄｅｏおよびＣ11）、並びにレプレッサーやエンハンサーである。
本発明の好適な実施態様において、制御成分はＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢをコードするＤＮＡの近くおよびその上流に位置する。
本発明のプラスミドはまた、ＡＴＧ開始コドンを含有する。ＰｒｏＣＰＢまたはＣＰＢをコードするＤＮＡはＡＴＧ開始コドンと同じ相にある。
本発明のプラスミドはまた、宿主細胞中で自立的複製を可能にする細菌のプラスミドからの複製開始点を含んでなるＤＮＡ配列も含有する。適当な複製開始点は、多くの供給源（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ受託番号３７０１７））から得られる。
本発明のプラスミドはまた、プラスミドが宿主細胞中に存在する時現れる選択可能なまたは同定可能な表現型形質に関連する遺伝子（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性のような薬剤耐性）を含有するＤＮＡ配列も含む。
好適な細菌の宿主細胞は大腸菌細胞である。適当な大腸菌細胞の例は、４３００株であるが、他の大腸菌株および他の細菌もプラスミドの宿主として使用することができる。
宿主として使用される細菌は、栄養要求株（例えばＡ１６４５）、原栄養株（例えばＡ４２５５）、および溶菌株；Ｆ+およびＦ-株；λプロファージのｃＩ857レプレッサー配列を有する株（例えばＡ１６４５およびＡ４２５５）およびｄｅｏレプレッサーおよび／またはｄｅｏ遺伝子のない株（１９８９年２月２２日公開のヨーロッパ特許出願第０３０３９７２号を参照）を含む任意の株でよい。大腸菌４３００株は、ＡＴＣＣ受託番号６９３６３で寄託されている。
前述のすべての大腸菌宿主株は、当業者に公知の方法（例えば、R.P. NovickのBacteriol. Review 33, 210（1969）に記載の臭化エチジウム法）により、それらが有するプラスミドを「治療する（cure）」ことができる。
本発明は、ＤＮＡがＰｒｏＣＰＢの発現を指令するように、ＰｒｏＣＰＢをコードするＤＮＡを含有する組換え細胞を処理する工程、こうして発現されたＰｒｏＣＰＢを細胞から回収する工程、回収されたＰｒｏＣＰＢをＰｒｏＣＰＢの折り畳みを可能にする条件下で処理する工程、折り畳まれたＰｒｏＣＰＢを酵素切断に付して酵素的に活性なＣＰＢを産生する工程、そして酵素的に活性なＣＰＢを精製する工程を含んでなる、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢの産生方法を提供する。
好適な態様において、組換え細胞からのＰｒｏＣＰＢの回収は、組換え細胞の細胞壁またはその断片を破壊して溶解物を産生する工程、溶解物から遠心分離により細胞内沈殿物を単離する工程、および適当な緩衝液中で細胞内沈殿物を可溶化する工程を含んでなる。
別の態様において、回収されたＰｒｏＣＰＢの処理は、室温で約２０〜２４時間の間ｐＨ約９〜９．５で、ＰｒｏＣＰＢをインキュベートすることを含んでなる。
また別の態様において、回収されたＰｒｏＣＰＢの処理は、室温で約２０〜２４時間の間ｐＨ約９〜９．５で、ＺｎＣｌ2、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で、ＰｒｏＣＰＢをインキュベートすることを含んでなる。
折り畳まれたＰｒｏＣＰＢを酵素的切断に付すことは、ｐＨを約８．５に調整して、トリプシンで３７℃で約６０分間ＰｒｏＣＰＢを切断することを含んで成ることを企図する。
さらに、酵素的に活性なＣＰＢの精製はイオン交換クロマトグラフィーを含んでなることも企図される。
任意のイオン交換クロマトグラフィー法が使用できることは、当業者は理解できるであろう。ＤＥＡＥ−セファロースのような弱陰イオン性交換カラムが好ましい。弱陰イオン性交換カラムは通常、官能基として三級アミン（ジエチルアミノエチル）を有するが、四級アミノエチルまたは四級アミンも使用できる。
マトリックスは、無機化合物、合成樹脂、多糖類または有機ポリマーに基づくものでよい。可能なマトリックスは、アガロース、セルロース、トリスアクリル、デキストラン、ガラスビーズ、オキシランアクリルビーズ、アクリルアミド、アガロース／ポリアクリルアミド共重合体または親水性ビニルポリマーである。
また酵素的に活性なＣＰＢの精製はイオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを含んでなることも企図される。
任意の疎水性カラムが使用できることは、当業者は理解できるであろう。フェニル−セファロースが好ましい。官能基は、フェニル、ベンジル、オクチルまたはブチルであり得る。マトリックスは前述の任意のものであり得る。
さらに別の好適な実施態様において、酵素的に活性なＣＰＢの精製はイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション（diafiltration）を含んでなる。
特に好適な態様において、ＰｒｏＣＰＢはＡＴＣＣ受託番号６９６７３で寄託されたプラスミドｐλＰｒｏＣＰＢにより発現される。
本発明はさらに、哺乳動物起源の他の物質を含まない酵素的に活性なＣＰＢを提供する。
実施例
以下の実施例は本発明の理解を助けるために記載されるものであり、決して本発明の範囲を限定するものではなく、また限定するものと解釈してはならない。実施例は、ベクターの作製、このようなベクターへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、または得られるプラスミドの宿主への導入で使用される従来法の詳細については記載されていない。実施例はまた、このような宿主ベクター系により産生されるポリペプチドの測定について用いられた従来法を詳細には記載しない。このような方法は当業者に公知であり、多くの刊行物に公表されており、それらの開示内容は引用により本明細書の一部とみなされる。それらには例として以下のものがある：
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.（1989）モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）．
実施例１： ラットカルボキシペプチダーゼＢ  ｃＤＮＡのＰＣＲによるクローニング
Ｉ． ＤＮＡ増幅
スプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットの膵臓から総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡから４０μgのポリＡ+ ｍＲＮＡを単離した（オリゴｄＴ−セルロースカラムによる）。こうして得られたポリＡ+ ｍＲＮＡのアリコート（aliquot）（１０μg）を、合成カルボキシペプチダーゼＢ  ３’末端プライマー（５）（図１）の存在下で逆転写反応の鋳型として使用した。
１本鎖相補的ＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）の合成後、ｍＲＮＡをエタノールで沈殿させた。次にｓｓ−ｃＤＮＡのアリコートをＰＣＲ増幅に付した。
ＣＰＢをコードするＤＮＡ（９４０塩基対）の増幅のために、カルボキシペプチダーゼＢの３’末端に対応する合成プライマーおよび成熟したカルボキシペプチダーゼＢの５’末端に対応する合成プライマーを使用した（図１）。
ＰｒｏＣＰＢをコードするＤＮＡ（１２３０塩基対）の増幅のために、カルボキシペプチダーゼＢの３’末端に対応する合成プライマーおよびプロカルボキシペプチダーゼＢの５’末端に対応する合成プライマーを使用した（図１）。
ＰＣＲ増幅条件は以下の通りであった：
１．プライマー３’末端          ２μg
２．プライマー５’末端          ２μg
３．ｓｓ−ｃＤＮＡ              ５μl
４．緩衝液：
ｄＮＴＰ                        ０．２mM
トリス−塩酸                    ５０mM
ＫＣｌ                          ２０mM
ＭｇＣｌ2                       ８mM
５．ＴａｑポリメラーゼＩ        ２．５単位
総量：                          １００μl
６．鉱物油（蒸発に対して）      ５０μl
７．１サイクル×［９２℃で１分；４０℃で２分；７２℃で４分］
８．３５サイクル×［９２℃で１分；５３℃で２分；７２℃で３分］
９．１サイクル×［９２℃で１分；５３℃で２分；７２℃で１５分］
ＰＣＲ増幅生成物を、１％アガロースゲルで解析した。非増幅対照とサイズマーカーも含めた。約９４０塩基対と約１２３０塩基対の２つの顕著なバンドが認められた。９４０塩基対のバンドはＣＰＢヌクレオチド配列であり、１２３０塩基対のバンドは、活性化ペプチドヌクレオチド配列を含有するＰｒｏＣＰＢヌクレオチド配列である。
ＰＣＲ増幅後に、クロロホルムやフェノール抽出並びに酢酸アンモニウムやイソプロパノール沈殿により反応混合物からＤＮＡを精製した。
II． プラスミドｐＣＰＢ
プラスミドｐＣＰＢ（図２）は、ＣＰＢｃＤＮＡをＢａｍＨＩとＮｃｏＩで消化し、ゲル精製後プラスミドｐＡＢＮの２５００塩基対のＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ断片中にサブクローニングして作成し、これは細菌での発現に必要な以下の成分を含有する：
（ｉ）誘導により大腸菌細胞から遺伝子発現を可能にするλＰLプロモーター、すなわち温度を３０℃から４２℃に移動させ、これは温度感受性レプレッサーｃＩ857を不活性化する；
（ii）ｄｅｏリボゾーム結合部位（ｒｂｓ）；
（iii）ｔｒｐ転写ターミネーター（８）；
（iv）プラスミドｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子；および
（ｖ）ｐＢＲ３２２複製開始点。
III． プラスミドｐＣＰＢ−Ｃ
天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢのアミノ酸配列は、７つのシステイン残基を有し、そのうち６つはＳ−Ｓ結合で対になっており、１つ（Ｃｙｓ290）は、遊離のシステイン残基である（１）。我々は、この遊離のシステイン残基は組換えＣＰＢの再折り畳み時に好ましくない分子間または分子内Ｓ−Ｓ結合を形成し得ると考えた。Ｃｙｓ290は、カルボキシペプチダーゼＢの触媒部位にも基質結合部位にも存在せず、この酵素の酵素活性には必要がないようである（１、２）。従ってこのシステインがセリンで置換されているＣＰＢを産生することに決めた；このＣＰＢをＣＰＢ−Ｃと命名する。
２つのヌクレオチド置換を含有する５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを調製した：
0004250716.tif 000002
図２に記載のように部位特異的突然変異誘発によりプラスミドｐＣＰＢ中のセリンをコードするヌクレオチド配列で、Ｃｙｓ290をコードするヌクレオチド配列を置換するために、このオリゴヌクレオチドを使用した（９）。新たに得られたプラスミドをｐＣＰＢ−Ｃと命名した。
IV． プラスミドｐＰｒｏＣＰＢ−Ｃ
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃヌクレオチド配列を有するｐＰｒｏＣＰＢ−Ｃと呼ぶプラスミド（Ｃｙｓ290→Ｓｅｒ突然変異を有する）を作製し（図３）、大腸菌４３００を形質転換するのに使用した。
Ｖ． プラスミドｐλＰｒｏＣＰＢ
ＰｒｏＣＰＢヌクレオチド配列を含有するｐλＰｒｏＣＰＢと呼ぶプラスミドを作製し（図３）、大腸菌４３００を形質転換するのに使用した。このプラスミドは、１９９４年８月４日にＡＴＣＣ受託番号６９６７３でＡＴＣＣに寄託した。
プラスミドｐＣＰＢ、ｐＣＰＢ−Ｃ、ｐλＰｒｏＣＰＢ、ｐＰｒｏＣＰＢ−ＣからプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素解析とヌクレオチド配列決定を行い、正しい配列の存在を証明した。
実施例２： ＰｒｏＣＰＢとＣＰＢの発酵、増殖条件および精製
Ｉ ストック培養物
プラスミドｐλＰｒｏＣＰＢを有する大腸菌４３００のストック培養物を、アンピシリンを補足（１００μg/ml）したＬＢ培地上で増殖させた。
II 接種物
接種物をアンピシリンを補足（１００μg/ml）したＬＢ培地上で３０℃で、細胞濃度がＯ．Ｄ．660が２．０に達するまで増殖させた。
産生培地（ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml））を接種し、３０℃でインキュベートし、通気攪拌し、ＮＨ3でｐＨを７．２に維持した。２０ｇのグルコースを増殖中の培養物に加えた。細胞濃度がＯ．Ｄ．660が１２に達したら、温度を４２℃に上げてＰｒｏＣＰＢの発現を可能にした。２時間後、細胞濃度はＯ．Ｄ．660が２２〜２９に達し、細菌を採取した。
III 精製
プラスミドｐλＰｒｏＣＰＢにより発現させたＰｒｏＣＰＢが細胞内沈殿物中に蓄積し、これを以下の方法で単離した：４０ｇ（湿重量）の細菌ケーキを、１mMＰＭＳＦ（シグマ（Sigma））、５０mMトリス−塩酸（ｐＨ８）、１０mMＥＤＴＡを含有する４５０mlの緩衝液に懸濁し、リゾチーム（シグマ（Sigma））で３７℃で２時間処理して最終濃度５０μg/mlにした。
次に混合物を超音波処理し、トリトンＸ−１００（メルク（Merck））を最終濃度２％になるように加え、室温で２時間攪拌した。粗細胞内沈殿物を遠心分離（１４０００rpm、３０分、４℃）してペレットにし、水で洗浄した。
ＰｒｏＣＰＢを含む細胞内沈殿物を、２５mMＮａＣｌ、８Ｍ尿素、１０mMＤＴＴ、２０mMビス−トリス（ｐＨ７）を含有する緩衝液Ｂに溶解した。この溶液を、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースファーストフローカラム（Fast Flow column）で、クロマトグラフィーを行うと、タンパク質は、緩衝液Ｂ中約１００mMＮａＣｌで溶出し、ＰｒｏＣＰＢを４０％飽和の（ＮＨ4）ＳＯ4で０℃で沈殿させた。
後に、酵素的に活性なＣＰＢは前駆体タンパク質の産生を介してのみ産生されることが発見された。しかし最初、ポリペプチドＣＰＢとＣＰＢ−Ｃは、前述のＰｒｏＣＰＢの産生と同様に産生された。ＰｒｏＣＰＢ−Ｃもまた同様に産生された。使用したプラスミドはそれぞれ、ｐＣＰＢ、ｐＣＰＢ−ＣおよびｐＰｒｏＣＰＢ−Ｃである（実施例１に記載）。これらのプラスミドを有する大腸菌の増殖条件とポリペプチドの精製は、２０mMエタノールアミン（ｐＨ９）、１０mMＤＴＴおよび８Ｍ尿素を含有する組換えＣＰＢまたはＣＰＢ−Ｃを含む細胞内沈殿物を溶解するのに使用した緩衝液を除いて、基本的にＰｒｏＣＰＢについて前述したものである。
各場合に、前述の産生され精製されたポリペプチドは酵素活性がなかったことに注目されたい。
酵素的に活性なタンパク質を産生するためのポリペプチドの折り畳みは実施例３に記載されている。
実施例３： ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みと活性化
ポリペプチドＣＰＢとＣＰＢ−Ｃは実施例２に記載のように産生したが、酵素活性はなかった。既知の折り畳み法（後述）を使用したが、酵素的に活性なタンパク質は得られなかった。
酵素的に活性なタンパク質が得られないという問題を解決するために、前駆体タンパク質の発現と折り畳みに続いて、折り畳まれた前駆体タンパク質の活性化ペプチド部分を除去するための処理を含む代替法を開発した。これにより後述の方法が得られた。
実施例２に記載のように産生したＰｒｏＣＰＢ−Ｃを、８Ｍ尿素、５mM  ＨＣｌに１０mg/mlで溶解し、１００mMグリシン、０．２mM  ＺｎＣｌ2（ｐＨ９、１０、および１１）に１mg/mlで希釈した。これらが折り畳み溶液であった。
前記折り畳み溶液を室温で１７時間インキュベートして折り畳みを行った。こうして産生されたＰｒｏＣＰＢ−Ｃはこの段階で酵素活性がなかった（表Ｉを参照）。
次に折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃを含有する溶液のｐＨを、塩酸で８．５に調整し、トリプシン（１：２００w/w）で３７℃で３０分処理して活性化ペプチドを除去した。反応を停止させるために、ＰＭＳＦを最終濃度０．１mMになるように加えた。
こうして得られた折り畳まれたＣＰＢ−Ｃの酵素活性を、Folk（１９７０）（１１）の方法に従って試験した（表Ｉ）。１単位の活性（ｕ）は、２５℃において１分当たり１μモルのヒプリル−Ｌ−Ａｒｇ基質の加水分解を触媒して、光路長１cm当たり２５４nmで吸光度０．１２の増加をもたらす酵素の量であると規定する。市販のブタカルボキシペプチダーゼＢ（シグマ（Sigma））の比活性は２３０u/mgである。
0004250716.tif 000003
表Ｉは、酵素的に活性なＣＰＢ−Ｃは、前記の予備的条件を用いてＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みおよび折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃのトリプシン処理後に得られることを示す。
表Ｉはさらに、折り畳み混合物中のｐＨが１０または１１の時より、折り畳み混合物中のｐＨが９の時の方がＣＰＢ−Ｃの比活性が高いことを示す。
実施例４： 改良された折り畳み条件
以下の実験は、最適の折り畳み条件と活性化条件を確立するために行った。我々は、折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃのトリプシン切断により得られるＣＰＢ−Ｃの比活性が高いほど、ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳み条件に適していると仮定した。「基質のみ」と「市販のブタカルボキシペプチダーゼ」対照を、下記の実験以外に行った。
まず、折り畳みをｐＨ９．５で０．０５〜０．１mg/mlのＰｒｏＣＰＢ−Ｃを用いて行うと結果（実施例３に記載）が改善された。
Ｉ． ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに対する温度の影響
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みは、１００mMグリシン（ｐＨ９．５）中の０．０５mg/mlのポリペプチドを１０〜３７℃の間で９０時間インキュベートして行った。折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃの試料をトリプシン（１：２００w/w）で処理し、こうして得られたＣＰＢ−Ｃの比活性を実施例３に記載のように測定した。２０〜３０℃の間でＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みを行った時、ＣＰＢ−Ｃの最大の比活性が得られた。
II． ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに及ぼす酸化型および還元型グルタチオンの影響
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みは、１００mMグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）、０．０１mM  ＺｎＣｌ2中の０．０５mg/mlのポリペプチドを酸化型および／または還元型グルタチオン（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）またはアスコルビン酸の存在下で２５℃でインキュベートして行った（表ＩＩ）。次にインキュベートした溶液を、トリプシン（１：２００w/w）で３７℃で１時間処理し、１８時間および４５時間後の得られたＣＰＢ−Ｃの比活性を測定した（実施例３に記載）。
0004250716.tif 000004
表IIは、ＧＳＳＧとＧＳＨを一緒に加えるとＣＰＢ−Ｃの比活性が劇的に増加し、おそらくＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳み効率が上昇することを示す。ＧＳＳＨ単独でもＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳み効率が上昇し、アスコルビン酸でも上昇したが、程度は低かった。
別のシリーズの実験で、折り畳み溶液に０．１mMのＧＳＳＧと０．５mMのＧＳＨを加えるとＰｒｏＣＰＢ−Ｃの最適の折り畳みが得られたことがわかった。
III． トリプシンによる折り畳みＰｒｏＣＰＢ−Ｃの活性化
インキュベートした折り畳み溶液をトリプシン１：５０w/wで３７℃で１時間処理する時、ＰｒｏＣＰＢ−Ｃをトリプシン切断して活性化ペプチドを除去することにより、最も活性なＣＰＢ−Ｃが得られることが確立された。
IV． ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに及ぼすｐＨの影響
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに及ぼすｐＨの影響は、すでに最適化された条件下で一連の反応で測定した。
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みは、１００mMグリシン、０．０２mM  ＺｎＣｌ2、０．５mM還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１mM酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）中０．１mg/mlで、種々のｐＨ（８．７５〜１０．００の間）で２５℃で２４時間インキュベートして行った。折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃの試料を、トリプシン（１：５０w/w；１mM  ＨＣｌ、１０mM  ＣａＣｌ2に溶解した）で処理し、こうして得られたＣＰＢ−Ｃの比活性を実施例３に記載のように測定した。
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みをｐＨ９．２５で行った時、ＣＰＢ−Ｃの最大の比活性が得られた。
Ｖ． ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに及ぼすＺｎＣｌ2の影響
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに及ぼす折り畳み溶液中のＺｎＣｌ2濃度の影響を、すでに最適化した条件下で一連の反応で測定した。予測されるＣＰＢ−Ｃ濃度（モル／モル）より２〜２０倍高いＺｎＣｌ2濃度で、産生されたＣＰＢ−Ｃの比活性が最大であった。ＺｎＣｌ2を添加せずに折り畳みを行い、折り畳み混合物にＥＤＴＡを加えて残存する２価イオンをキレートさせると、ＣＰＢ−Ｃの比活性はゼロに低下した。
VI． ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みに及ぼすタンパク質濃度の影響
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みは、表IIIに示したタンパク質濃度で最適条件下で（前述）で２４時間行った。トリプシン分解後、実施例３に記載のようにＣＰＢ−Ｃ活性を測定した。
0004250716.tif 000005
表IIIは、タンパク質濃度０．０５mg/mlの時、産生されるＣＰＢ−Ｃの比活性が最大になることを示す。
VII． ＣＰＢ−Ｃの比活性の関数としての折り畳み時間
すでに最適化された条件下で一連の反応でＰｒｏＣＰＢ−Ｃの最適折り畳み時間を測定した。
ＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みは、１００mMグリシン（ｐＨ９．２５）、０．１mM  ＧＳＳＧ、０．５mM  ＧＳＨおよび０．０１mM  ＺｎＣｌ2中で０．１mg/mlで行った。折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃの試料をトリプシン（１：５０w/w）で処理し、こうして得られたＣＰＢ−Ｃの比活性を、折り畳みの開始から種々の時点（０〜４０時間）で実施例３に記載のように測定した。
折り畳まれたＰｒｏＣＰＢ−Ｃを折り畳みの開始後２０時間日にトリプシンで切断する時、ＣＰＢ−Ｃの最大の活性が得られた。２０時間を超える折り畳みはＣＰＢ−Ｃの比活性を変化させなかった。
実施例５： 異なるＣＰＢタンパク質の折り畳みと活性化
実施例２に記載のように産生し精製したＣＰＢ、ＣＰＢ−Ｃ、ＰｒｏＣＰＢおよびＰｒｏＣＰＢ−Ｃを、それぞれ１００mMグリシン緩衝液（ｐＨ９．２５）、０．０１mM  ＺｎＣｌ2、０．５mM  ＧＳＨ、０．１mM  ＧＳＳＧ中０．１mg/mlで室温で２４時間（すなわち、使用した折り畳み条件は実施例４で確立された基本的に最適の条件である）で折り畳みを行った。
折り畳まれたＣＰＢ、ＣＰＢ−Ｃ、ＰｒｏＣＰＢまたはＰｒｏＣＰＢ−Ｃを含有する各溶液のｐＨを、ＨＣｌで８．５に調整し、ＰｒｏＣＰＢとＰｒｏＣＰＢ−Ｃを含有する溶液をトリプシン（１：５０w/w）で３７℃で１時間処理して活性化ペプチドを除去した。反応を停止させるため、ＰＭＳＦを最終濃度０．１mMになるように加えた。ＣＰＢ、ＣＰＢ−Ｃ、ＰｒｏＣＰＢおよびＰｒｏＣＰＢ−Ｃの比活性を、実施例３に記載のように測定した。
0004250716.tif 000006
表IVは、活性化ペプチドを含有する前駆体を発現する細胞からのみ酵素的に活性なＣＰＢが産生されることを示す。すなわち、活性化ペプチドはＣＰＢの正しい折り畳みに必要である。
表IVはまた、遊離のＣｙｓ290残基を含有するＰｒｏＣＰＢ（プラスミドｐλＰｒｏＣＰＢにより発現される）の折り畳みと活性化から産生され、Ｃｙｓ290→Ｓｅｒ突然変異を有するＰｒｏＣＰＢ−Ｃの折り畳みと活性化からは産生されないことを示す。すなわち、Ｃｙｓ290はＣＰＢの最適の折り畳みおよび／または最大の活性のために必要なようである。
実施例６： ＰｒｏＣＰＢの改良された折り畳み
Ｉ． 粗細胞内沈殿物からのＰｒｏＣＰＢの折り畳み
ＰｒｏＣＰＢの最適な折り畳み条件は、実施例４で測定したＰｒｏＣＰＢ−Ｃの最適折り畳み条件と基本的に同じであった。
実施例２のIII部に記載の初期精製工程の必要性を省略して粗細胞内沈殿物を用いることにより、ＰｒｏＣＰＢの折り畳みと活性化の簡便法を行った。
ＰｒｏＣＰＢ（実施例２に記載のように産生される）を含有する粗細胞内沈殿物は、１００mMグリシン（ｐＨ９．５）と８Ｍ尿素中で高タンパク質濃度（表Ｖ）で溶解できることがわかった。
折り畳みは、最適条件下で室温で２４時間行った。ｐＨを最適ｐＨの９．５（すでに決定されている）に上げた。折り畳まれたＰｒｏＣＰＢをトリプシン（１：５０w/w）で切断し、実施例３に記載のようにＣＰＢの比活性を測定した。
0004250716.tif 000007
表Ｖは、粗細胞内沈殿物からＰｒｏＣＰＢを折り畳み、次にトリプシン消化することにより、酵素的に活性なＣＰＢが得られることを示す。さらにＣＰＢは、測定したすべてのタンパク質濃度で同様のレベルで酵素的に活性である。タンパク質濃度が折り畳み混合物中で増加する場合、折り畳み前にＤＥＡＥ−セファロース（実施例２）で精製したＣＰＢの比活性は低下したため、これは予想外の結果である。おそらく細胞内沈殿物がＰｒｏＣＰＢの折り畳みを助ける因子を含有するのであろう。
II． 粗細胞内沈殿物からのＰｒｏＣＰＢの折り畳みによるＣＰＢのスケールアップ
（ｉ）産生
プラスミドｐλＰｒｏＣＰＢを有しＰｒｏＣＰＢを発現する４２リットルの大腸菌４３００から、ほとんど均一になるまでＣＰＢを精製した。発酵と増殖条件は、基本的に実施例２に記載したものと同じである。
粗細胞内沈殿物を水中で洗浄し、１００mMグリシン（ｐＨ９．５）、８Ｍ尿素中に２０mg/mlで溶解し、１００mMグリシン（ｐＨ９．５）、０．１mM  ＺｎＣｌ2、０．５mM  ＧＳＨおよび０．１mM  ＧＳＳＧ中で１mg/mlに希釈し、得られた折り畳み溶液を２５℃で２４時間インキュベートした。次にＨＣｌでｐＨを８．５に調整し、折り畳まれたＰｒｏＣＰＢをトリプシン（２０μg/ml）で３７℃で１時間消化した。トリプシンを０．１mM  ＰＭＳＦで不活性化した。
（ii）精製
酵素的に活性なＣＰＢを、２０mMトリス−塩酸（ｐＨ８）で樹脂１ml当たり２０mgで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースファーストフローカラム（Fast Flow column）（ファルマシア（Pharmacia））にのせた。ＣＰＢを８０mM  ＮａＣｌ、２０mMトリス−塩酸（ｐＨ８）で溶出した。硫酸アンモニウム（０．８Ｍ）をＤＥＡＥ溶出液プールに加え、これをさらに２０mMトリス−塩酸（ｐＨ８）、０．８Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースファーストフローカラム（Fast Flow column）（ファルマシア（Pharmacia））でクロマトグラフィーを行った。ＣＰＢは０．４Ｍ硫酸アンモニウムで溶出し、これを濃縮し、１００mM  ＮａＣｌ、２０mMトリス−塩酸（ｐＨ８）に対してダイアフィルトレーションを行い、−２０℃で保存した。
上記精製法で、Ｏ．Ｄ．660＝３６のプラスミドｐλＰｒｏＣＰＢを有する大腸菌４３００の４２リットルを、前述のように処理し、比活性６３７u/mgを有する酵素的に活性な１．２５ｇのＣＰＢを得た。総収率は約６０％であった。
同じ実験条件で測定した市販のブタカルボキシペプチダーゼＢの比活性は、２９８u/mgであった。
実施例７： 酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼＢの性状解析
実施例５と６に記載のＣＰＢは、ブタカルボキシペプチダーゼＢに匹敵する生化学的および酵素的性質を有する。
そのアミノ酸組成から計算した組換えＣＰＢの吸光係数は、ε1%280＝１９．７である。市販のブタカルボキシペプチダーゼＢの吸光係数は、ε1%280＝２１．４である（１）。
組換えＣＰＢは比活性６３７u/mg（ヒプリルーＬ−Ａｒｇ基質）を有し、原子吸光法で測定すると酵素１モル当たり１モルのＺｎを含有する。
Ｎ−末端アミノ酸配列解析により、成熟ラットカルボキシペプチダーゼＢのアミノ酸配列解析から予測される（５）ように、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒが明らかになった。
組換えＣＰＢ活性の最適ｐＨは、２５mMの緩衝液（ＮａＯＡｃ、ｐＨ４〜６；ビス−トリス、ｐＨ６〜７．５；トリス−塩酸、ｐＨ７．５〜９；およびグリシン、ｐＨ９〜１２）を用いて測定した。ＣＰＢの比活性は実施例３に記載のように測定した。ＣＰＢの最適酵素活性は、ｐＨ８で得られた。５５℃でＣＰＢをインキュベートすると、活性が５０％失われ、６５℃では完全に失われた。
ヒプリルーＬ−Ａｒｇ基質を用いて組換えＣＰＢの速度論解析を行った（図４）。０．５mMを超える基質濃度でＣＰＢ活性が阻害された。
さらなる試験により、組換えＣＰＢは触媒生成物アルギニン（これはカルボキシペプチダーゼＢの競合的インヒビターである）により阻害されることが明らかになった。対応するLineweaver-Burk曲線は、Ｋｍ値０．３８mMを示した。
組換えＣＰＢはまた、強い２価イオンキレート物質である１，１０−フェナントロリンにより阻害され、従ってＣＰＢの酵素活性にＺｎイオンが重要であることが証明された。１mMの１，１０−フェナントロリンの存在下では、１mg/ml組換えＣＰＢの活性の５０％が失われることが観察された。
実施例８： ＣＰＢによるプロインスリンからインスリンへの変換
ＥＰ３４７７８１  Ｂ１に記載のミニ−プロインスリンは、実施例５と６において産生されたものと同様にトリプシンおよび組換えＣＰＢで処理することによりインスリンに変換される。
トリプシンは、アルギニン残基とＡ鎖の間を特異的に切断する。次にＣＰＢは、Ｂ鎖のＣ−末端からアルギニン残基を特異的に加水分解する。
市販のヒトインスリン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））は、標準物質、トリプシンと市販のブタカルボキシペプチダーゼＢにより切断されるミニ−プロインスリン、およびトリプシンのみに切断されるミニ−精製インスリンとして使用できる。
0004250716.tif 000008
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：バイオ−テクノロジー  ジェネラル  コープ
（ii）発明の名称：酵素的に活性な組換え型カルボキシペプチダーゼＢの製造
（iii）配列の数：８
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：クーパー＆ダンハム  エルエルピー
（B）通り：１１８５ アベニュー・オブ・ジ・アメリカズ
（C）市：ニューヨーク
（D）州：ニューヨーク
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：１００３６
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：Patent In リリース#1.0、バージョン#1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：未だ知らされず
（B）出願日：１９９６年１月２５日
（C）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：ホワイト，ジョン  Ｐ．
（B）登録番号：２８，６７８
（C）参照／ドケット番号：０３３６／４３８４７−Ａ−ＰＣＴ
（ix）電信情報：
（A）電話：（２１２）２７８−０４００
（B）テレファックス：（２１２）３９１−０５２５
（２）配列認識番号１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号１
0004250716.tif 000009
（２）配列認識番号２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．２８５
（xi）配列の記載：配列認識番号２
0004250716.tif 000010
（２）配列認識番号３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号３
0004250716.tif 000011
（２）配列認識番号４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号４
0004250716.tif 000012
（２）配列認識番号５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．９２７
（xi）配列の記載：配列認識番号５
0004250716.tif 000013
0004250716.tif 000014
（２）配列認識番号６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０９塩基対
（B）型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号６
0004250716.tif 000015
（２）配列認識番号７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号７
0004250716.tif 000016
（２）配列認識番号８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号８
0004250716.tif 000017
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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