(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
板状基材の内部に形成された流路の両端に対応する位置にリザーバが形成されたマイクロチップを流路及びリザーバに泳動媒体を充填した状態で用い、流路内でサンプルを電気泳動させるマイクロチップ電気泳動におけるサンプル導入方法において、
サンプルを収容したキャピラリの一端を、流路及びリザーバに泳動媒体が充填されたマイクロチップのいずれかのリザーバ内に挿入し、前記キャピラリの他端と、前記キャピラリが挿入されたリザーバとは流路を介して連通するリザーバの間に電圧をかけることにより、前記キャピラリ内に収容されたサンプルを流路内に電気泳動的に導入することを特徴とするサンプル導入方法。
【請求項２】
前記キャピラリの一端をリザーバ内で前記流路の入口近傍に配置する請求項１に記載のサンプル導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、板状基材の内部に形成された流路の両端に対応する位置にリザーバが形成されたマイクロチップを流路及びリザーバに泳動媒体を充填した状態で用い、流路内でサンプルを電気泳動させるマイクロチップ電気泳動におけるサンプル導入方法に関するものである。
マイクロチップ電気泳動は、例えば極微量のタンパクや核酸、薬物などを含むサンプルを高速かつ高分解能に分析するのに使用される。
【０００２】
【従来の技術】
極微量のタンパクや核酸などを分析する場合、従来から電気泳動が用いられており、その代表的なものとしてキャピラリ電気泳動がある。キャピラリ電気泳動は、内径が１００μｍ（マイクロメートル）以下のガラスキャピラリ（以下、単にキャピラリともいう）内に分離媒体を充填し、一端側にサンプルを導入し、両端をランニングバッファに接液させ、ランニングバッファを介して両端間に高電圧を印加して分析対象物をキャピラリ内で展開させるものである。キャピラリは容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高いことから、高電圧の印加が可能となり、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの極微量サンプルを高速かつ高分解能にて分析することができる。
【０００３】
キャピラリはその外径が１００〜５００μｍ程度と細く破損しやすいため、ユーザが行なうべきキャピラリ交換時の取扱いが容易でないという問題を有する。また、放熱が十分でない場合が生じ、分離状態に悪影響を及ぼすという問題もあった。さらに、ランニングバッファを介してキャピラリの両端に電圧を印加するので、少なくともランニングバッファとの接液に必要な長さ寸法が必要であり、ある長さ以下には設計できないという問題もあった。
【０００４】
そこで、キャピラリに代わって、分析の高速化、装置の小型化が期待できる形態として、D. J. Harrison et al./ Anal. Chem. 1993, 283, 361-366 に示されているように、２枚の基材を接合して形成されたマイクロチップ（電気泳動用チップ）が提案されている。そのマイクロチップの例を図２に示す。
【０００５】
マイクロチップ１は、一対の透明板状の無機材料（例えばガラス、石英、シリコンなど）又はプラスチックからなる基材１ａ，１ｂからなり、例えば半導体製造プロセスに用いられる写真製版技術やマイクロマシニング技術などにより、一方の基材１ｂの表面に互いに交差する泳動用キャピラリ溝（流路）３，５を形成し、他方の基材１ａにはその流路３，５の端に対応する位置に貫通孔をアノードリザーバ７ａ、カソードリザーバ７ｃ、サンプルリザーバ７ｓ、ウエイストリザーバ７ｗとして設けたものである。マイクロチップ１は、両基材１ａ，１ｂを（Ｃ）に示すように重ねて接合した状態で使用される。
【０００６】
このマイクロチップ１を用いて電気泳動を行なう場合には、分析に先立って、例えばシリンジを使った圧送により、いずれかのリザーバ、例えばアノードリザーバ７ａから流路３，５内及びリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗ内に分離媒体を充填する。次いで、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗ内に充填された分離媒体を除去し、短い方の流路（サンプル注入用流路）３の一方の端に対応するサンプルリザーバ７ｓにサンプルを注入し、他のリザーバ７ａ、７ｃ，７ｗにランニングバッファを注入する。
【０００７】
泳動媒体、サンプル及びランニングバッファを注入したマイクロチップ１を電気泳動装置に装着する。各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに所定の電圧を印加し、サンプルを流路３中に泳動させて両流路３，５の交差部９に導く。各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに印加する電圧を切り換えて、長い方の流路（分離用流路）５の両端のリザーバ７ａ，７ｃ間の電圧により、交差部９に存在するサンプルを流路５内に電気泳動的に導入する。
【０００８】
流路５内にサンプルを導入した後、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに収容された溶液の電解電導度の差による電気泳動の不安定要素を除くため、リザーバ７ｓ内に収容されているサンプルをリザーバ７ａ，７ｃ，７ｗに収容されているのと同じランニングバッファで置換する。
その後、各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに電気泳動用の電圧を印加して、流路５内に注入したサンプルを流路５内で分離させる。流路５の適当な位置に検出器を配置しておくことにより、電気泳動により分離されたサンプルを検出する。検出は、吸光光度法や蛍光光度法、電気化学的又は電気伝導度法などの手段により行なわれる。
このようなサンプル導入方法は、クロスインジェクション法と呼ばれる。上記のクロスインジェクション法の説明では、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｗ及びサンプル導入後のサンプルリザーバ７ｓにランニングバッファが収容されているが、分離媒体が収容されることもある。
【０００９】
マイクロチップの例として、図２に示すものの他に、図３に示すものがある。マイクロチップ１１は、一対の透明板状の無機材料（例えばガラス、石英、シリコンなど）又はプラスチックからなる基材１１ａ，１１ｂからなり、例えば半導体製造プロセスに用いられる写真製版技術、又はマイクロマシニング技術などにより、一方の基材１ｂの表面に泳動用キャピラリ溝（流路）１３を形成し、他方の基材１ａには流路１３の端に対応する位置に貫通孔をサンプルリザーバ１５ａ、ウエイストリザーバ１５ｗとして設けたものである。マイクロチップ１１は両基材１１ａ，１１ｂを（Ｃ）に示すように重ねて接合した状態で使用される。
【００１０】
このマイクロチップ１１を用いて電気泳動を行なう場合、分析に先立って、例えばシリンジを使った圧送により、いずれかのリザーバ、例えばサンプルリザーバ１５ｓから流路１３内及びリザーバ１５ｗ内に分離媒体を充填する。次いで、リザーバ１５ｓ，１５ｗ内に充填された分離媒体を除去し、サンプルリザーバ１５ｓにサンプルを注入し、ウエイストリザーバ１５ｗにランニングバッファを注入する。
【００１１】
泳動媒体、サンプル及びランニングバッファを注入したマイクロチップ１１を電気泳動装置に装着する。両リザーバ１５ｓ，１５ｗに所定の電圧を印加し、サンプルを流路１３内に導入する。
サンプルを流路１３内に導入した後、リザーバ１５ｓ，１５ｗに収容された溶液の電解電導度の差による電気泳動の不安定要素を除くため、リザーバ１５ｓ内に収容されているサンプルをリザーバ１５ｗに収容されているのと同じランニングバッファで置換する。
【００１２】
その後、両リザーバ１５ｓ，１５ｗに電気泳動用の電圧を印加して、流路１３内に注入したサンプルを流路１３内で分離させる。流路１３の適当な位置に検出器を配置しておくことにより、電気泳動により分離されたサンプルを検出する。このようなサンプル導入方法はエレクトロカイネティック法と呼ばれる。上記のエレクトロカイネティック法の説明では、ウエイストリザーバ１５ｗ及びサンプル導入後のサンプルリザーバ１５ｓにランニングバッファが収容されているが、分離媒体が収容されることもある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
マイクロチップ電気泳動における従来のサンプル導入方法においては、エレクトロカイネティック法にせよ、クロスインジェクション法にせよ、サンプルリザーバに一旦収容したサンプルを他のリザーバと同じ溶液（分離媒体又はランニングバッファ）に置換する必要がある。このようなリザーバ内の溶液の置換は手間がかかるという問題があった。さらに、リザーバ内の溶液の置換作業中に気泡の発生する虞があるという問題があった。
【００１４】
また、マイクロチップでは、リザーバ内の溶液の乾燥による電気泳動の中断を防ぐため、リザーバ容量をある程度大きくする必要がある。従来のサンプル導入方法では、サンプルリザーバ容量に見合ったサンプル量が必要になるので、サンプル量を少量化するのに限界があった。
【００１５】
本発明は、マイクロチップ電気泳動におけるサンプル導入方法において、マイクロチップのリザーバにそれを満たすサンプルを収容することなく流路にサンプルを導入できるサンプル導入方法を提供することを目的とするものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、板状基材の内部に形成された流路の両端に対応する位置にリザーバが形成されたマイクロチップを流路及びリザーバに泳動媒体を充填した状態で用い、流路内でサンプルを電気泳動させるマイクロチップ電気泳動におけるサンプル導入方法であって、サンプルを収容したキャピラリの一端を、流路及びリザーバに泳動媒体が充填されたマイクロチップのいずれかのリザーバ内に挿入し、上記キャピラリの他端と、上記キャピラリが挿入されたリザーバとは流路を介して連通するリザーバの間に電圧をかけることにより、上記キャピラリ内に収容されたサンプルを流路内に電気泳動的に導入する。
ここで、泳動媒体の語は、分離用媒体及びランニングバッファ、その他サンプルが泳動される媒体を含む。
【００１７】
流路及びリザーバに泳動媒体が充填されたマイクロチップのいずれかのリザーバ内に、サンプルを収容したキャピラリの一端を挿入する。上記キャピラリの他端と、上記キャピラリが挿入されたリザーバとは流路を介して連通するリザーバの間に電圧をかけ、上記キャピラリ内に収容されたサンプルを流路内に電気泳動的に導入する。このように、マイクロチップのリザーバにそれを満たすサンプルを収容することなく、流路にサンプルを導入する。ここで、マイクロチップのリザーバにそれを満たすサンプルを収容する、とは、リザーバ容量一杯にサンプルを満たすことに限定されるのではなく、必要量のサンプルをリザーバ内に収容する意味を含む。上記キャピラリをリザーバから抜き取った後、導入したサンプルの分離泳動を行なう。
【００１８】
【発明の実施の形態】
キャピラリの一端をリザーバ内で流路の入口近傍に配置することが好ましい。その結果、キャピラリの一端から流路に向かって泳動するサンプルのリザーバ内での拡散を抑制することができる。
【００１９】
【実施例】
図１はマイクロチップの断面図である。図１は図２のＸ−Ｘ位置での断面を示す。図１及び図２を用いてサンプル導入方法の一実施例の操作を説明する。
マイクロチップ１の流路３，５に分離媒体１７を充填した後、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗにランニングバッファ１９を収容する。電極２１ｓ，２１ｗをリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに収容されたランニングバッファ１９に接液するように配置する。図１ではリザーバ７ａ，７ｃに配置する電極の図示は省略する。
【００２０】
例えばガラスや樹脂などの非導電材料からなり、外径が２５０〜３６５μｍ、例えば３６５μｍ、内径が５０〜１００μｍ、例えば１００μｍ、長さが５０〜７０ｍｍ、例えば５０ｍｍのキャピラリ２３の内部にサンプルを収容する。キャピラリ２３の一端２３ａをサンプルリザーバ７ｓ内に挿入し、サンプルリザーバ７ｓに接続されている流路３の入口３ａの近傍に配置する。キャピラリ２３の他端２３ｂ内に電極２５を配置する。
【００２１】
電極２１ｗ及び電極２５、並びにリザーバ７ａ，７ｃに配置された電極に所定の電圧を印加して、キャピラリ２３の他端２３ｂとウエイストリザーバ７ｗの間に電圧をかけることにより、キャピラリ２３内のサンプルを、サンプルリザーバ７ｓに収容されたランニングバッファ１９を介して、流路３に収容された分離媒体１７に電気泳動的に導入する。所定時間が経過し、サンプルが流路３内に導入された後、電極２１ｗ及び電極２５、並びにリザーバ７ａ，７ｃに配置された電極への電圧の印加を停止し、キャピラリ２３をサンプルリザーバ７ｓから抜き取る。その後、従来通りの分離泳動を行なう。
【００２２】
このように、上記の実施例によればサンプルをサンプルリザーバ７ｓ内にサンプルリザーバ７ｓを満たすように収容することなく、流路３内に導入することができる。これにより、サンプルリザーバ７ｓ内の溶液の置換が不要となり、溶液の置換作業にかかる時間の節約を実現でき、さらに溶液の置換作業に伴うサンプルリザーバ７ｓ内への気泡の混入の危険を回避することができる。
さらに、従来のサンプル導入方法ではリザーバ容量に見合ったサンプル量が必要なのでサンプル量を少量化するのに限界があったが、上記の実施例によれば、容量が小さいキャピラリを使用することにより必要サンプル量を少なくできる。
【００２３】
上記の実施例では、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗにランニングバッファを収容しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、流路３，５に収容したのと同じ分離媒体など、他の泳動媒体を使用してもよい。
また、上記の実施例では、キャピラリ２３の一端２３ａを流路３の入口３ａの近傍に配置しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、リザーバに収容された泳動媒体中であればどの位置に配置してもよい。ただし、マイクロチップの一端を流路の入口近傍に配置することが好ましい。
本発明で使用するマイクロチップは図２のものに限定されるものではなく、例えば図３に示すマイクロチップ１１など、板状基材の内部に形成された流路の両端に対応する位置にリザーバが形成されたマイクロチップであれば使用できる。
【００２４】
【発明の効果】
本発明にかかるサンプル導入方法では、サンプルを収容したキャピラリの一端を流路及びリザーバに泳動媒体が充填されたマイクロチップのいずれかのリザーバ内に挿入し、上記キャピラリの他端と、上記キャピラリが挿入されたリザーバとは流路を介して連通するリザーバの間に電圧をかけることにより、上記キャピラリ内に収容されたサンプルを流路内に電気泳動的に導入するようにしたので、サンプルをリザーバ内に収容することなく、流路内に導入することができる。これにより、サンプルを流路内に導入した後に従来法では行なっていたリザーバ内の溶液の置換が不要となり、溶液の置換作業にかかる時間の節約を実現でき、さらに溶液の置換作業に伴うリザーバ内への気泡の混入の危険を回避することができる。さらに、従来法ではリザーバ容量に見合ったサンプル量が必要なのでサンプル量を少量化するのに限界があったが、容量が小さいキャピラリを使用することにより必要サンプル量を少なくできる。
【００２５】
本発明において、キャピラリの一端をリザーバ内で流路の入口近傍に配置するようにすれば、キャピラリの一端から流路に向かって泳動するサンプルのリザーバ内での拡散を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロチップの断面図であり、図２のＸ−Ｘ位置での断面を示す。
【図２】マイクロチップの一例を表す図であり、（Ａ）は一方の基材の上面図、（Ｂ）は他方の基材の上面図、（Ｃ）は両基材を重ね合わせた状態での側面図である。
【図３】マイクロチップの他の例を表す図であり、（Ａ）は一方の基材の上面図、（Ｂ）は他方の基材の上面図、（Ｃ）は両基材を重ね合わせた状態での側面図である。
【符号の説明】
１      マイクロチップ
１ａ，１ｂ    基材
３，５      流路
７ａ      アノードリザーバ
７ｃ      カソードリザーバ
７ｓ      サンプルリザーバ
７ｗ      ウエイストリザーバ
９      交差部
１７      分離媒体
１９      ランニングバッファ
２１ｓ，２１ｗ，２５    電極
２３      キャピラリ
２３ａ    キャピラリの一端
２３ｂ    キャピラリの他端
【図１】
0004362987.tif 000002
【図２】
0004362987.tif 000003
【図３】
0004362987.tif 000004