(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性部材の表面に、下記式（Ｉ）
0004382088.tif 000004
（式中、Ｍは、鉄（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩＩ）であり、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基を示し、２つのＬのうち少なくとも１つは、錯形成定数１０４Ｍ−２以上で安定な５配位錯体または６配位錯体を与えるイミダゾール誘導体を示す）
で表される金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の電界重合膜を形成したスーパーオキシドアニオン用電極、対極及び参照電極を含む被毒防止型スーパーオキシドアニオン濃度測定用センサー。
【請求項２】
前記式（Ｉ）において、Ｒが２−チオフリル基または３−チオフリル基である請求項第１項記載の被毒防止型スーパーオキシドアニオン濃度測定用センサー。
【請求項３】
イミダゾール誘導体がアルキルイミダゾールまたはアリールアルキルイミダゾールである請求項第１項または第２項記載の被毒防止型スーパーオキシドアニオン濃度測定用センサー。
【請求項４】
金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体電解重合膜の導電率が１０−３Ｓ／ｃｍ以上である請求項第１項ないし第３項の何れかの項記戲の被毒防止型スーパーオキシドアニオン濃度測定用センサー。
【請求項５】
金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体重合膜中の金属とスーパーオキシドアニオンラジカルとの間の酸化還元反応で生じる電流を、請求項第１項ないし第４項のいずれかの項記載の被毒防止型スーパーオキシドアニオン濃度測定用センサーで測定することを特徴とする試料中のスーパーオキシドアニオンラジカルを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、生体内のスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）等のスーパーオキシドアニオン用電極及びこの濃度測定用電極を用いるスーパーオキシドアニオン濃度測定用センサーに関する。さらに詳細には、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも適用でき、かつ、測定系内に存在する被毒性物質、例えば、過酸化水素による影響を受けることのないスーパーオキシドアニオン用電極及びスーパーオキシドアニオンの濃度測定用センサーに関する。
【背景技術】
活性酸素種であるスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）は、生体内ではキサンチン・キサンチン酸化酵素（ＸＯＤ）によるキサンチン並びにヒポキサンチンなどの尿酸への酸化及び酸素のヘモグロビンによる還元等により生成されるものであり、生体内で生理活性物質の合成、殺菌作用、老化現象などに関連して重要な役割を有している。その一方で、スーパーオキシドアニオンラジカルから派生する種々の活性酸素種はガンなどの各種疾患を引き起こすといわれており、従って生体内のスーパーオキシドアニオンラジカルを含む活性酸素種の濃度測定は、上記各種疾患を特定するためにも重要なものであると考えられる。
このスーパーオキシドアニオンラジカルは、基質の存在しない場合には、式（１）に示されるように不均化反応により過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と酸素分子（Ｏ２）になる。この不均化反応は、スーパーオキシドアニオンラジカルへのプロトン付加によるＨＯ２・の生成、ＨＯ２・と酸素分子の反応による過酸化水素と酸素分子の生成、及びＨＯ２・同士の衝突による過酸化水素と酸素分子の生成からなるものである（式（１）〜式（４））。
２Ｈ＋  ＋  ２Ｏ２−・  →  Ｈ２Ｏ２  ＋  Ｏ２              ……（１）
Ｈ＋    ＋  Ｏ２−・  →  ＨＯ２・                          ……（２）
ＨＯ２・  ＋  Ｏ２−・  ＋  Ｈ＋  →  Ｈ２Ｏ２  ＋  Ｏ２    ……（３）
ＨＯ２・  ＋  ＨＯ２・  →  Ｈ２Ｏ２  ＋  Ｏ２              ……（４）
この反応系においては、スーパーオキシドアニオンラジカルは電子受容体（酸化剤）、電子供与体（還元剤）及び水素イオンの受容体（塩基）としてはたらくが、このうちの前二者の性質を利用して、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が試みられていた。例えば、フェリチトクロームｃ（３価）からフェロチトクロームｃ（２価）への変換反応や、ニトロブルーテラゾリウム（ＮＢＴ）からブルーホルマザンの生成反応及びテトラニトロメタン（ＴＮＭ）の還元反応を利用して、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が試みられていたが、これらは全て体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での測定方法であった。
一方、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を定量的に検出する方法についての検討も行われていた。例えば、マックネイル（ＭｃＮｅｉｌ）ら、タリオフ（Ｔａｒｉｏｖ）ら、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）らは、金や白金電極の表面を酵素であるＮ−アセチルシステインで修飾し、その上にヘムといわれる鉄錯体を酸化還元中心とした金属蛋白質であるチトクロームｃなどの蛋白質をＳ−Ａｕ結合させて固定化させた酵素電極（チトクロームｃ固定化電極）を作製し、これによりスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を電気化学的に検出することができると報告している（Ｃ．Ｊ．ＭｃＮｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７，８９（１９８９）；Ｍ．Ｊ．Ｔａｒｉｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３，１８４７（１９９１）；Ｊ．Ｍ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３４７，２６７（１９９３））。
この検出方法の測定原理は以下のとおりである。すなわち、チトクロームｃ（３価）（ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ３＋））は、スーパーオキシドアニオンラジカルと式（５）のように反応して、チトクロームｃ（２価）（ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ２＋））に還元される。次に、式（６）のように、Ｏ２−により還元されたチトクロームｃ（２価）を電気化学的に再酸化し、その際の酸化電流を測定することにより、間接的にスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を定量的に検出するものである。
ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ３＋）＋Ｏ２−  →  ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ２＋）＋  Ｏ２  ……（５）
ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ２＋）→  ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ３＋）＋  ｅ−            ……（６）
しかしながら、チトクロームｃは、生体細胞内のミトコンドリアの膜上に存在する電子伝達蛋白質であるため、上記測定に十分な量のチトクロームｃを固定化させた電極を作製するには、１０５〜１０６個という多量の細胞が必要とされ、また、使用する酵素が数日間で失活してしまうという問題もあった。
また、本発明者は先にポルフィリン化合物の中心に金属原子を導入した金属ポルフィリン錯体の重合膜を導電性部材の表面上に形成した電極は、多量の酵素を要せず、また、失活の問題もなく、活性酸素種の存在や濃度の検出に利用できることを見出し特許出願した（ＷＯ  ０３／０５４５３６）。
しかし、前記反応に示されるスーパーオキシドアニオンラジカルの不均化反応では過酸化水素が発生し、しかもこれが金属ポルフィリン錯体重合膜の被毒物質となるので、スーパーオキシドアニオンの測定に当たってはその影響を受けないような工夫が必要であった。
従って、本発明は、簡単にスーパーオキシドアニオンラジカルを測定できるとともに、発生する過酸化水素等の被毒性物質の影響を排除した電極の開発が望まれていた。
【発明の開示】
本発明者らは、金属ポルフィリン錯体の重合膜を導電性部材の表面上に形成した電極について、更に、その性能を改良すべく鋭意研究を行っていたところ、ポルフィリン化合物のメソ位置換基の種類および特定の軸配位子の使用により、被毒による影響を防げることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、導電性部材の表面に、下記式（Ｉ）
0004382088.tif 000002
（式中、Ｍは、鉄（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩＩ）であり、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基を示し、２つのＬのうち少なくとも１つは、錯形成定数１０４Ｍ−２以上で安定な５配位錯体または６配位錯体を与えるイミダゾール誘導体を示す）
で表される金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の電解重合膜を形成したスーパーオキシドアニオン用電極、対極及び参照電極を含む被毒防止型スーパーオキシドアニオン濃度測定用センサーを提供するものである。
また本発明は、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体重合膜中の金属とスーパーオキシドアニオンとの間の酸化還元反応で生じる電流を、上記の被毒防止型センサーで測定することを特徴とする被毒物質の影響を受けない試料中のスーパーオキシドアニオンの検出方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明電極を製造するために用いる３電極式セルの一例を示す図面である。
図２は、本発明電極を製造するために用いる２室型３電極式セルの一例を示す図面である。
図３は、本発明電極を製造するために用いるニードル型の電極および２室型３電極式セルの一例を示す図面。図中、（Ａ）は２室型３電極式セルを、（Ｂ）はニードル型の電極全体を、（ｃ）はニードル型電極の先端部分を示す。
図４は、本発明電極を製造するために用いる改良／ニードル型の電極を示す図面であり、図中、（Ａ）は改良／ニードル型の電極全体を、（Ｂ）は改良／ニードル型の電極の先端部分を示す。
図５は、活性酸素種の測定用に用いる測定装置の一例を示す図面である。
図６は、活性酸素種の測定用に用いる測定装置の別の一例を示す図面である。
図７は、［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）］ブロミドのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを示したグラフである。
図８は、［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（イミダゾリル）］ブロミドのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを示したグラフである。
図９は、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリンのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを示したグラフである。
図１０は、本発明品の電解重合時のＣＶ曲線を示すグラフである。
図１１は、比較品１のＸＯＤ添加時の酸化電流の経時変化を示すグラフである。
図１２は、本発明品１のＸＯＤ添加時の酸化電流の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のスーパーオキシドアニオン用電極（以下、「電極」とする）は、導電性部材の表面に金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜を形成してなるものである。
本発明の電極を構成する導電性部材としては、一般に電極用として使用される部材であれば特に制限なく使用でき、例えばグラッシーカーボン（Ｇｌａｓｓｙ  Ｃａｒｂｏｎ：ＧＣ）、グラファイト、パイロリティックグラファイト（ＰＧ）、ハイリーオリエンティッドパイロリティックグラファイト（ＨＯＰＧ）、活性炭等のカーボン類、又は白金、金、銀等の貴金属、又はＩｎ２Ｏ３／ＳｎＯ２（ＩＴＯ）等を使用することができるが、特に経済性、加工性、軽量性などを考慮して、グラッシーカーボンを用いることが好ましい。また、導電性部材の形状は、電極として使用できる形状であれば特には制限はなく、円柱状、角柱状、ニードル状、繊維（ファイバー）状等の各種形状とすることができるが、例えば、生体内でのスーパーオキシドアニオン濃度を測定するためには、ニードル状の形状とすることが好ましい。
本発明では、上記の導電性部材の表面に金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜を形成するが、この金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜の形成に使用される金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の例としては、下記の式（Ｉ）で表されるものが挙げられる。
0004382088.tif 000003
（式中、Ｍは、ＩＩ価とＩＩＩ価間の酸化還元電位がＯ２−・の酸化電位より高く、水の酸化電位より低い金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基を示し、２つのＬのうち少なくとも１つは、錯形成定数１０４Ｍ−２以上で安定な５配位錯体または６配位錯体を与える軸配位子を示す）
上記式（Ｉ）で表される金属チオフリルポルフィリン錯体において、Ｍは、ＩＩ価とＩＩＩ価間の酸化還元電位がＯ２−・の酸化電位より高く、水の酸化電位より低い金属としては、鉄（ＩＩＩ）やマンガン（ＩＩＩ）等が挙げられる。また、Ｒであるチオフリル基としては２−チオフリル基、３−チオフリル基等が挙げられる。更に、Ｌである錯形成定数以上で安定な５配位錯体または６配位錯体を与える軸配位子としては、イミダゾール誘導体、例えば、メチルイミダゾール、エチルイミダゾール、プロピルイミダゾール、ジメチルイミダゾール等のアルキルイミダゾールや、ベンジルイミダゾール等のアリールアルキルイミダゾール等、あるいはベンズイミダゾール等が挙げられる。
本発明の金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体は、チオフリルポルフィリン化合物に軸配位子と金属原子を配位させた錯体化合物である。このチオフリルポルフィリン化合物は、４つのピロール環がα位置で４つのメチン基と交互に結合した環状化合物であり、４つの窒素原子が中心に向かい合って形成され、メチン基の置換基（式（Ｉ）中、Ｒ）として、少なくとも一つのチオフリル基を有するものである。他のメチン基の置換基は、同じチオフリル基であっても良く、また別の基、例えば、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、アルキル基、アリール（ａｒｙｌ）基等や水素原子であっても良い。
本発明で使用されるチオフリルポルフィリン化合物の例としては、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（２−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（３−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（２−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（３−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（２−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（３−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（２−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（３−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリン等が例示される。
またこのチオフリルポルフィリン化合物に対する軸配位子（式（Ｉ）中、Ｌ）は、少なくとも一つが前記イミダゾール誘導体であることが必要であり、他の軸配位子としては、イミダゾール誘導体であっても、またそれ以外の、例えば、ピリジンおよびその誘導体、アニリンおよびその誘導体、ヒスチジンおよびその誘導体、トリメチルアミンおよびその誘導体等の窒素系軸配位子、チオフェノールおよびその誘導体、システインおよびその誘導体、メチオニンおよびその誘導体等の硫黄系軸配位子、安息香酸およびその誘導体、酢酸およびその誘導体、フェノールおよびその誘導体、脂肪族アルコールおよびその誘導体、水等の酸素系軸配位子であっても良い。
上記の軸配位子を有するチオフリルポルフィリン化合物に、金属原子（式（Ｉ）中、Ｍ）を挟み込むことで、錯体化合物として金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体を形成することができる。該錯体化合物を形成するには、通常使用される金属錯体の形成方法、例えばメタレーション（Ｍｅｔａｌａｔｉｏｎ）等の方法を用いて、金属原子をチオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の中心に導入すればよい。
本発明において、導電性部材の表面に上記の金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜を形成させるには、電解重合法、溶液重合法、不均一重合法等の各種重合法を用いることができる。このうち電解重合法を用いて重合膜を形成するのが好ましく、具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等の有機溶媒中、テトラブチルアンモニウムパークロレート（ＴＢＡＰ：Ｂｕ４ＮＣｌＯ４）、テトラプロピルアンモニウムパークロレート（ＴＰＡＰ：Ｐｒ４ＮＣｌＯ４）、テトラエチルアンモニウムパークロレート（ＴＥＡＰ：Ｅｔ４ＮＣｌＯ４）等適当な支持電解質を加え、導電性部材を作用極、白金（Ｐｔ）電極等の貴金属電極、チタン電極、カーボン類電極、ステンレス綱電極等の不溶性電極を対極、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、銀−塩化銀電極等を参照極として、２電極（作用極−対極）式の電解、あるいは３電極（作用極−対極−参照極）式の定電位、定電流、可逆電位掃引、パルス式の電解等を行い、重合させることにより導電性部材の表面に金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体重合膜を形成させることができる。
この電解重合は、例えば、図１に示すような３電極式セルを用い、可逆電位掃引電解法等により行うことが好ましい。図１中、１はセル容器、２は導電性部材、３は対極、４は参照極、５は金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体溶液、６はポテンシオスタット、７はＸ−Ｙレコーダーを示す。
また、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体溶液として高濃度のものを使用する場合は、例えば、図２に示すような２室型３電極式セルを用いても良い。図２において、１から７は図１と同じものを意味し、８は電解質溶液、９はサンプルバイアルを示す。
また、生体内測定、複合化測定、臨床での診断・治療などを考慮し、単純化したスーパーオキシドアニオン用電極（ニードル型の電極）を作製する場合は、例えば、図３（Ａ）および（Ｂ）に示すようなニードル型の電極１０および３電極式セルを用いても良い。図３において、１はセル容器、４は参照極、５は金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体溶液、６はポテンショスタット、７はＸ−Ｙレコーダーを示し、８は電解質溶液、９はサンプルバイアル、１０はニードル型の電極、１１は対極部分、１２は導電部材端部（金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体重合膜形成部分）、１３は電気絶縁性材料、１４は対極用配線である。
この電極は、図３（Ｃ）に示すように電気絶縁性材料１３で調製された細管中に導電性部材を入れ、更にこの細管の外側を対極となる金属等の材料で被覆し、対極部分１１としたものである。そして、導電性部材端面１２上に金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体重合膜を形成させることにより、ニードル型電極として使用可能になる。
なお、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜の厚さは、電極及び金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の種類等により適宜決定されるが、電極活性、修飾安定性等という点で、１０μｍ以下であることが好ましい。また、その導電率は１０−３Ｓ／ｃｍ以上であることが好ましい。
更に、不必要な生体内電流、電流ノイズ等の除去、感度、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）等の向上を目指して図３の単純化したスーパーオキシドアニオン用電極（ニードル型の電極）を改良した単純化したスーパーオキシドアニオン用電極（改良／ニードル型の電極）を作製する場合は、例えば、図４（Ａ）に示すような改良／ニードル型の電極１５及び図３（Ａ）に示す３電極式セルを用いても良い。図４において、１１は対極部分、１２は導電部材端部（金属ポルフィリン重合膜形成部分）、１３は電気絶縁性材料、１４は対極用配線、１５は改良／ニードル型の電極、１６はアース部分、１７はアース用配線である。
この電極は、図４（Ｂ）に示すように導電性部材を電気絶縁性材料１３中に入れ（２層構造）、それらを対極用材料１１中に入れ（３層構造）、更に、それらを電気絶縁性材料１３中に入れ（４層構造）、最終的にこの細管の外側をアースとなる金属等の材料で被覆（５層構造）し、アース部分１６としたものである。そして、導電性部材端面１２上に金属ポルフィリン重合膜を形成させることにより、改良した単純化したスーパーオキシドアニオン用電極（改良／ニードル型の電極）として使用可能になる。
なお、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜の厚さは、電極及び金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の種類等により適宜決定されるが、電極活性、修飾安定性等という点で１０μｍ以下であることが好ましい。また、その導電率は１０−３Ｓ／ｃｍ以上であることが好ましい。なお、この改良／ニードル型の電極は複合化測定等にも用いるので、１０数層程度までの多層構造が可能である。なお、アースの構成材料としては、白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス鋼、鉄−クロム合金等の耐食性合金、カーボン類等の材料を使用することができるが、アースは生体内に入ることが多いため、安全性の高い材料（例えば、白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス鋼、カーボン類等）等で構成することが好ましい。
本発明の電極をスーパーオキシドアニオンの測定、特にその濃度の測定に使用するには、この電極に、▲１▼対極と参照極（３電極式）または▲２▼対極（２電極式）を組み合わせることが好ましい。この対極の構成材料としては、白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス綱、鉄−クロム合金等の耐食性合金、カーボン類等の材料を使用することができるが、対極は生体内に入ることが多いため、安全性の高い材料（例えば白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス綱、カーボン類等）で構成することが好ましい。
また、参照電極としては、通常、銀／塩化銀電極、水銀／塩化第二水銀等の各種参照電極を用いることができ、また、固体の基準電極を用いることもできる。更に、白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス鋼、鉄−クロム合金等の耐食性合金、カーボン類等の材料を用いることができる。
具体的に、スーパーオキシドアニオンの測定用に用いることのできる測定装置の一例を示せば図５の通りである。図５中１、３、４、６および７は図１と同じものを意味し、１８は測定電極（作用極）、１９はマイクロシリンジ、２０は測定溶液、２１はマグネティックスターラー、２２は攪拌子をそれぞれ示す。
また、スーパーオキシドアニオンの測定用に用いることのできる測定装置の別の一例を図６に示す。図６中の１、６、７、１９から２２は図４と同じものを意味し、１０はニードル型電極である。
本発明のスーパーオキシドアニオン用電極は、上記のような装置でスーパーオキシドアニオンを検出するための電極として用いることもできるが、▲１▼対極と参照極（３電極式）または▲２▼対極（２電極式）と共に用いることで、スーパーオキシドアニオン濃度測定用のセンサーとすることができる。上記の構成のスーパーオキシドアニオン濃度測定用センサーを、スーパーオキシドアニオンラジカルが存在する測定系で使用すると、重合膜を形成する金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体中の金属がスーパーオキシドアニオンラジカルにより還元される。例えば、該金属が鉄であれば、スーパーオキシドアニオンラジカルにより、Ｆｅ３＋からＦｅ２＋に還元される（式（７））。
そして、スーパーオキシドアニオンラジカルにより還元されたＦｅ２＋を、酸化されうる程度に濃度測定電極の電位（▲１▼の３電極式の場合）または電圧（▲２▼の２電極式の場合）を保持した状態で電気化学的に再酸化し（式（８））、この時に流れる電流（酸化電流）を測定すれば、その電流値は、スーパーオキシドアニオンラジカル濃度と対応するため、該酸化電流から試料溶液中に溶解しているスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を定量的に検出することができる。すなわち、上記した式（５）及び式（６）と同様の原理により、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が可能とされるものである。
Ｐｏｒ（Ｆｅ３＋）＋Ｏ２−・  →  Ｐｏｒ（Ｆｅ２＋）＋  Ｏ２    ……（７）
Ｐｏｒ（Ｆｅ２＋）  →  Ｐｏｒ（Ｆｅ３＋）  ＋  ｅ−            ……（８）
（式（７）及び式（８）中、「Ｐｏｒ」はポルフィリンを意味する）
本発明のスーパーオキシドアニオン用電極は、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の重合膜を導電性部材の表面に形成してなるのであるため、従来の金属ポルフィリン重合膜を用いた電極に比べ、過酸化水素等の被毒物質の影響を受けにくいものであり、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子の重合膜の強度も強いものであり、繰り返しの使用にも耐えうるものである。また、電解重合法等を用いて行われるため、従来の電極に比べ、その調製も極めて容易であり、特に生体内で使用しやすい形状、例えばニードル状とすることもできる。
このように、本発明のスーパーオキシドアニオン用電極は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）はもちろん、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の環境であっても、スーパーオキシドアニオンラジカルの検出や、対極や参照電極と組み合わせることにより、これらスーパーオキシドアニオンを定量測定できるので、各種分野で広く利用することができる。
すなわち、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）では、例えば血液中のスーパーオキシドアニオンの濃度を測定することにより、ガン等の疾患の特定を行うことが可能とされる。
一方、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でも、食品内のスーパーオキシドアニオンやその濃度を測定することにより、該食品の腐敗状態を観察することができる。また、水道水や下水等の水中ののスーパーオキシドアニオンやその濃度を測定することにより、水質汚染の状態を観察することができる。
さらに、スーパーオキシドアニオンラジカル及び該アニオンを消去するはたらきを持つ酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ：以下、「ＳＯＤ」とする）の濃度も、ＳＯＤを含む試料を加えたときのスーパーオキシドアニオンラジカルの消失程度を測定することにより、測定することが可能である。
本発明のスーパーオキシドアニオン用電極により、過酸化水素などの被毒物質による被毒を防止できる理由は、次のように考えられている。
すなわち、被毒物質、例えば過酸化水素は、活性中心である金属、例えば鉄に配位し、これを被毒すると考えられる。これに対し、軸配位子であるイミダゾール類が予め鉄の第五、六配位座に配位し、ここを占有すると、過酸化水素は鉄に配位できなくなる（鉄の第一ないし第四は、既にポルフィリンのピロールにより配位されている）。このように、イミダゾール類等の軸配位子が活性中心である鉄に配位し、過酸化水素の被毒を抑止するため、過酸化水素の存在下であっても安定にスーパーオキシドアニオンラジカを測定できるのである。
【実施例】
以下に参考例、実施例、比較例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
参考例１
金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の合成（１）：
５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミド０．０３６ｇと１−メチルイミダゾール２００μｌを蒸留ジクロロメタン１ｍｌに溶解し、５時間室温下で撹拌した。これをエバポレータを用いて蒸発乾固し、［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（１−メチルイミダゾリル）］ブロミドを得た（収率９２％）。
ＵＶ（ＣＨＣｌ３，ｎｍ，λｍａｘ）：  ４１９。
イミダゾールフリー錯体の吸収波長（λｍａｘ＝４２４ｎｍ）とは異なることから、イミダゾール配位が確認された。また、磁気円偏光二色性スペクトルにおいて、５８０および６００ｎｍ付近の偏光角がイミダゾールの配位により減少したことより、六配位構造が確認された。
用いた原料である５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミドのＵＶスペクトルを図７に示す。また、生成物である［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（１−メチルイミダゾリル）］ブロミドのＵＶスペクトルを図８に示す。
参考例２
金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体の合成（２）：
５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミド０．０４１ｇと１−ベンジルイミダゾール０．０８ｇを蒸留クロロホルム３ｍｌに溶解し、５時間室温下で撹拌した。これをエバポレータを用いて蒸発乾固し、［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（１−ベンジルイミダゾリル）］ブロミドを得た（収率９０％）。
ＵＶ（ＣＨＣｌ３，ｎｍ，λｍａｘ）：  ４１８。
イミダゾールフリー錯体の吸収波長（λｍａｘ＝４２４ｎｍ）とは異なることから、イミダゾール配位が確認された。
参考例３
（１）プロピオン酸５０ｍｌ、３−チオフェンカルボアルデヒド２．０ｍｌおよびピロール１．４ｍｌからなる溶液を絶えず撹拌しながら９０℃で１時間還流した。室温まで放冷後、氷冷し、２００ｍｌのメタノール中に滴下した。沈殿物を濾別し、メタノールで洗浄後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）にて精製した。この結果、生成物である５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリンを収率１９％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）：δ
−２．７（ｓ，２Ｈ），７．７（ｔ，４Ｈ），８．０（ｍ，８Ｈ），８．９（ｓ，８Ｈ）。
５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリンのＵＶスペクトルを図９に示す。
（２）次いで、厳密な窒素雰囲気下に保たれた臭化水素酸（４８％）１０ｍＬに還元鉄１００ｍｇを加え、１００℃で撹拌した。溶液を蒸発乾固後、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン２５０ｍｇとジメチルホルムアミド２００ｍＬを添加し、窒素下で４時間撹拌した。これに、クロロホルム２００ｍＬを添加し、イオン交換水で洗浄し、脱水、蒸発乾固後、アルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製した。溶出液に４８％臭化水素酸を加え、脱水、蒸発乾固後に再結晶し、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミドを収率５４％で得た。
ＵＶ（ＣＨＣｌ３，ｎｍ，λｍａｘ）：  ４２４。
参考例４
参考例３で示した５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミド合成法の改良：
３００ｍｌの丸底フラスコに、プロピオン酸１５０ｍｌ、３−チオフェンカルボアルデヒド８．０ｍｌおよびピロール５．６ｍｌを取り、この溶液を撹拌しながら１６０℃で１時間還流した。室温まで放冷後、０℃に冷却したメタノール２００ｍｌを添加し、生成沈殿を吸引濾過により回収後、減圧乾燥した（１２０℃、６時間）。得られた黒色粉末結晶をクロロホルムに溶解し、不溶部を濾別した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）および再結晶により精製した。減圧乾燥後、生成物である５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリンを収率２０％で黒紫色微結晶として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）：δ
−２．７（ｓ，２Ｈ），７．７（ｔ，４Ｈ），８．０（ｍ，８Ｈ），８．９（ｓ，８Ｈ）。
次いで、純アルゴン雰囲気下に保たれた５００ｍｌ四つ口フラスコに、臭化水素酸（４８％）６ｍＬを導入し、還元鉄２００ｍｇを加え、撹拌しながら９０℃にて反応させた。溶液を蒸発乾固後、得られたＦｅＢｒ２に純アルゴン下でジメチルホルムアミド１５０ｍｌを添加し、さらに５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン１５０ｍｇを加え、純アルゴン下で６時間還流した（１４０℃）。ＤＭＦを留去後、クロロホルム２００ｍＬを添加して溶解し、イオン交換水で洗浄し、次いで臭化水素酸を２滴添加し、溶媒留去後に減圧乾燥（１００℃、６時間）した。生成物である５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミドは収率７４％で得られた。
実施例１
スーパーオキシドアニオン用電極の作製（１）：
グラッシーカーボン（ＧＣ）電極（直径１．０ｍｍ）をアルミナ研磨剤（０．０５μｍ）で研磨し、このものを水で洗浄後、さらにメタノールで洗浄した。この電極の表面に対して、下記の電解溶液及び操作手順を用いて、電解重合法により、表面に５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）に２分子のイミダゾールが配位した重合膜が形成されたグラッシーカーボン電極（本発明品１）を作製した。
（試料溶液）
金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体としては、参考例１で合成した［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（イミダゾリル）］ブロミドを、０．００１Ｍの濃度として用いた。溶媒は支持電解質として０．１Ｍの過塩素酸テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４ＮＣｌＯ４／ＴＢＡＰ）を含むジクロロメタン（無水）を用いた。なお、溶媒中の溶存酸素はアルゴンガスにより除去した。
（操作手順）
電解重合は図１に示す構成の３電極式セル（作用電極：ＧＣ、対極：Ｐｔ線、参照電極：ＳＣＥ）により可逆電位掃引電解法で行なった。掃引範囲は、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）に２分子のイミダゾールが配位した重合膜を用いたスーパーオキシドアニオン用電極を調製する場合は、ＳＣＥに対し、０〜２．０Ｖであり、参考例２の５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）に２分子の１−ベンジルイミダゾールが配位した重合膜を用いたスーパーオキシドアニオン用電極を調製する場合は、ＳＣＥに対し、−０．２〜１．８Ｖであった。また、掃引速度は、何れも０．０５Ｖ／ｓで、掃引回数は、いずれの場合も１５回掃引した。なお、この電解操作において得られたサイクリックボルタモグラム（ＣＶ曲線）を図９及び図１０に示す。
図１０に、金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体として［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（イミダゾリル）］ブロミドを用いて作成した電極（本発明品１）の電解重合時のＣＶ曲線を示す。この結果により、ＧＣ電極の表面に金属チオフリルポルフィリン−軸配位子錯体（５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）に２分子のイミダゾールが配位した錯体）の重合膜が形成されていることが確認できた。
比較例１
比較スーパーオキシドアニオン用電極の作製：
参考例３の、軸配位子を有さない金属チオフリルポルフィリン［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ブロミド］を用い、以下、参考例３と同様にして、金属チオフリルポルフィリン重合膜被覆グラッシカーボン電極（比較品１）を調製した。
試験例１
スーパーオキシドアニオンラジカル量の測定試験：
本発明品１及び比較品１の電極を用い、スーパーオキシドアニオンラジカル量の測定を行った。
まず、本発明品１または比較品１の電極を作用極、Ｐｔ線を対極としてセル容器中に設置し、参照電極として銀／塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を用い、試験用３電極式セルを構成した。この試験用３電極式セルを中心に、図５に示すような装置を準備した。試験において、電位掃引範囲は、比較品１の電極で−０．２〜０．２５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）、本発明品１の電極で−０．５〜０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）に設定した。また、掃引速度は数種類で測定した。
一方、１４．４ｍＭキサンチンを含む２ｍＭ水酸化カリウム水溶液および１０ｍＭ塩化カリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．５）を調製し、前者を０．３６５ｍｌ、後者を１４．６３５ｍｌ分取し、これらを混合して、０．３５ｍＭキサンチン溶液を調製し、測定溶液とした。この測定溶液中の溶存酸素を高純度アルゴンガスで除去した。
次に、上記測定溶液を、それぞれ試験用３電極式セルに入れ、各電極の酸化還元電位より充分貴な電位である０．２Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加した。この測定溶液中に、終濃度が０〜１００ｍＵ／ｍｌになるようにキサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ：ＸＯＤ）を添加し、その時の酸化電流の経時変化を記録した。本発明品１についての結果を図１２に、比較品１についての結果を図１１に示す。なお、ＸＯＤは使用前に１０ｍｌリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）にて透析した。また、測定はすべて室温下で行った。
この結果から、比較品の電極では過酸化水素の妨害電流の影響を受け、スーパーオキシドアニオンの検出電流は速やかに減衰するが、イミダゾール配位錯体である［５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）ビス（１−メチルイミダゾリル）］ブロミドを重合して得られた電極では定常的な検出電流が観測されることが分かった。
【産業上の利用可能性】
本発明のスーパーオキシドアニオン用電極は、金属ポルフィリン錯体の重合膜を有する電極の有する優れた性能に加え、過酸化水素などの被毒性物質による被毒を防止することができるので、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれの環境であっても、過酸化水素等の被毒物質の影響を受けることなくスーパーオキシドアニオンラジカルの検出を行うことができる。また、対極や参照電極と組み合わせることにより、これらスーパーオキシドアニオンを定量測定できるので、各種分野で広く利用することができるものである。
従って、例えば、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での使用により、生体内の活性酵素種や他のラジカル活性種から各種疾病を特定することができる。
一方、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用により、例えば、食品内のスーパーオキシドアニオンやその濃度を測定することができ、該食品の腐敗状態を判断することが可能となる。また、水道水や下水等の水中のスーパーオキシドアニオンやその濃度を測定することにより、水質汚染の状態を観察することができる。
【図１】
0004382088.tif 000005
【図２】
0004382088.tif 000006
【図３】
0004382088.tif 000007
【図４】
0004382088.tif 000008
【図５】
0004382088.tif 000009
【図６】
0004382088.tif 000010
【図７】
0004382088.tif 000011
【図８】
0004382088.tif 000012
【図９】
0004382088.tif 000013
【図１０】
0004382088.tif 000014
【図１１】
0004382088.tif 000015
【図１２】
0004382088.tif 000016