(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつ肝がん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質を具備することを特徴とする肝がん診断マーカー。
【請求項２】
被検体内から採取した組織を用いた肝がんの検出方法であって、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつ肝がん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質を具備する診断マーカーにより肝がんの検出を行うことを特徴とする肝がんの検出方法。
【請求項３】
被検体内から採取された細胞・組織を用いる肝がんの診断方法であって、
前記細胞・組織中に配列番号２のアミノ酸配列若しくは配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつ肝がん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質をスクリーニングし、該タンパク質の発現に基づき診断することを特徴とする肝がんの診断方法。
【請求項４】
配列番号３から配列番号８のポリヌクレオチド全部又は一部を具備し、
配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつ肝がん細胞で過剰発現を示すタンパク質を定量することを特徴とする肝がん分析用定量キット。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列又はその相補的配列並びにそれらの配列の一部もしくは全部からなる遺伝子を含む複数の遺伝子断片を具備することを特徴とする肝がん細胞スクリーニングキット。
【請求項６】
肝細胞における配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質の発現レベルを分析することを特徴とする肝がん分析方法。
【請求項７】
前記タンパク質は、β−カテニン変異により過剰発現が誘導されることを特徴とする請求項６に記載の肝がん分析方法。
【請求項８】
前記タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体であり、Ｃ末端にＳＨ２及びＳＨ３ドメインを有することを特徴とする請求項６に記載の肝がん分析方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達系の活性により転写が亢進されることを特徴とする請求項６に記載の肝がん分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、がん細胞に特異的に過剰発現するタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。更に、これらを用いたがんの処置方法、検出方法、予後診断方法等の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
がんは遺伝子が変異することにより発症する病気である。遺伝子が変異することにより、がん化した細胞は正常細胞とは異なった性質を獲得し、無制限に増殖を繰り返し、転移腫瘍を形成するようになってしまう。
【０００３】
従来このような性質を有するがんに対する診断・治療方法として切除、放射線、抗がん剤あるいは免疫療法等が行われてきたが、最近では遺伝子診断・治療等の遺伝子工学的手法を用いて遺伝子・タンパク質レベルでがんの作用機序を解明し、より精度良いがんの診断・治療をしようと様々な研究がなされている。
【０００４】
例えば、がん化した細胞は特有のタンパク質を発現することが多い。このため、がん化した細胞に特異的に発現するタンパク質及びその遺伝子をマーカーとして、血液検査や免疫学的な検査等から腫瘍組織の存在の有無を検査することが可能である。
【０００５】
このような検査に用いられているマーカーとしては、ＣＥＡ、ＳＣＣ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが、種々同定され、がんのスクリーニングに利用されている。
【０００６】
ところで、がんの中でも肝臓がんは死亡率の高いがんの一つであり、依然増加傾向にある。肝臓がんは多くの場合、肝炎ウィルスに感染することにより慢性肝炎及び肝硬変となった肝臓において発生している。このような肝臓がんの発生を減少し、進行を抑制するためには、抗ウィルス治療及び抗腫瘍治療のみならず肝がんの発生及び進展の分子機構の解明も重要である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、肝臓がんにおいては現在までに様々な遺伝子の変異が報告されているが、肝臓がんの発がん及びがんの進行に関する分子機構の詳細を解明するまでには至らず、根本的な治療法は未だ確立されていない。
【０００８】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、肝臓がんを始めとする様々ながんの発がん及びがんの進行に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子、更にそれらのがんへの用途を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は以下の手段を提供することを目的とする。
【００１０】
（１）配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞で過剰発現を示すタンパク質、（２）β−カテニン変異により過剰発現が誘導されることを特徴とする（１）に記載のタンパク質、（３）Ｇタンパク質共役型受容体であり、Ｃ末端にＳＨ２及びＳＨ３ドメインを有することを特徴とする（１）に記載のタンパク質、（４）Ｗｎｔシグナル伝達系の活性化により転写が亢進されることを特徴とする（１）に記載のタンパク質、（５）配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基配列のうち１又は数個の塩基が付加、欠失若しくは置換されている塩基配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質をコードする遺伝子、（６）配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質を具備することを特徴とするがん診断マーカー、（７）被検体内から採取した組織を用いたがんの検出方法であって、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質を具備する診断マーカーによりがんの検出を行うことを特徴とするがんの検出方法、（８）被検体内から採取された細胞・組織を用いるがんの診断方法であって、前記細胞・組織中に配列番号２のアミノ酸配列若しくは配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質をスクリーニングし、該タンパク質の発現の有無に基づき診断することを特徴とするがんの診断方法、（９）被検体のがん細胞組織に発現した配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質を標的として、該タンパク質に特異的に結合する化合物を用いることを特徴とするがんの処置方法、（１０）がん処置後の予後診断方法であって、被検体内からがん処置部の組織を取り出し、分子中に配列番号２のアミノ酸配列若しくは配列番号２の１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質をスクリーニングし、該タンパク質の発現の有無に基づいて診断することを特徴とするがんの予後診断方法、（１１）がんの処置方法であって、配列番号１の塩基配列又はその相補的配列並びにそれらの配列の一部若しくは全部からなる遺伝子を含む複数の遺伝子及びその遺伝子産物を直接若しくは間接的な標的として、該遺伝子又は該遺伝子産物に特異的に結合する抑制化合物を投与することを特徴とするがんの処置方法、（１２）配列番号３から配列番号８の塩基配列の少なくとも２つからなり、配列番号１の塩基配列又は���列番号１の塩基配列のうち１又は数個の塩基が付加、欠失若しくは置換されている塩基配列及びその相補的配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示す遺伝子並びにタンパク質の合成、増幅及び検出に用いられるポリヌクレオチド、（１３）配列番号３から配列番号８のポリヌクレオチド全部又は一部を具備し、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞で過剰発現を示すタンパク質を定量することを特徴とするタンパク質の定量キット、（１４）配列番号１の塩基配列又はその相補的配列並びにそれらの配列の一部若しくは全部からなる遺伝子を含む複数の遺伝子断片を具備することを特徴とするがん細胞スクリーニングキット。
【００１１】
本発明者らは、（肝臓）がんの発生と進行について研究するために、様々ながん患者の組織を採取・分析したところ、がん細胞において高頻度に過剰発現する遺伝子を見いだした。このようながん細胞では、ほとんど全例でβ−カテニンの変異が生じていた。次いでこのｃＤＮＡを単離してクローニングし、その配列を解析した。
【００１２】
得られた塩基配列をＢＬＡＳＴを用いてホモロジーサーチを行ったところ、アクセッションナンバーＮＭ＿００３６６７の遺伝子配列と１００％の相同性を有する部位があることが判明した。また、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅに登録されているＧｐｒ４９であることも判明した。
【００１３】
しかしながら、該タンパク質とがんとの関連性を見出したという見解はいまだかつてなく、本発明者らががんにおける発現と相関性を見出したことにより初めて本発明を完成するに至ったものである。
【００１４】
近年、β−カテニンが、カドヘリンによる細胞接着及びＷｎｔシグナル伝達系異常に深く関与することが多くの研究から明らかになっている。細胞接着はがん細胞の転移に、Ｗｎｔシグナル伝達系は細胞増殖に関わる機能である。このβ−カテニンが変異を起こすことによりこれらの機能が低下若しくは異常となり、細胞ががん化する原因の一つと考えられている。
【００１５】
以上のことから、本発明のタンパク質を、例えばがん特異的なマーカーとしてがん診断や処置に用いることにより、現在以上に精度の良い診断、処置若しくは予測を行うことが可能となる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１７】
まず、本発明のタンパク質について説明する。
【００１８】
本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質である。
【００１９】
また、本発明のタンパク質は、がん細胞でβ−カテニンが変異を起こすことにより過剰発現が誘導されることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明のタンパク質はＧタンパク質共役型受容体であり、Ｃ末端にＳＨ２及びＳＨ３ドメインを有することを特徴とする。
【００２１】
本発明のタンパク質はＧタンパク共役型７回膜貫通レセプターであり、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）、ろ胞刺激ホルモンレセプター（ＦＳＨＲ）及び黄体形成ホルモンレセプター（ＬＨＲ）等が含まれる糖タンパクホルモンレセプターサブファミリーに属している。
【００２２】
ＳＨ２、ＳＨ３ドメインはどちらもシグナル伝達に関与する機能ドメインである。ＳＨ２はリン酸化チロシンを認識し、ＳＨ３はプロリンリッチ配列を認識する。すなわち、本発明のタンパク質は、増殖、分化等様々な機能に関する複数のシグナル伝達に作用すると考えられる。
【００２３】
また、本発明はβ−カテニンの変異によりＷｎｔシグナル伝達系が活性化され、それにより転写が亢進されることを特徴とする。Ｗｎｔシグナル伝達系は細胞の増殖に関わる伝達系であり、該系が異常を起こすことにより細胞ががん化することが知られているが、この伝達系の中で、β−カテニンが重要な働きを担っていることが示されている。β−カテニンが変異を起こすことによりＷｎｔシグナル伝達系が活性化されたのと同様の状況となり、本発明のタンパク質をはじめとする下流の遺伝子の転写が亢進すると考えられる。
【００２４】
このことから、本発明のタンパク質はＷｎｔシグナル伝達系の異変及びβ−カテニン変異を検知するためのマーカーとして有用であるといえる。
【００２５】
本発明のタンパク質は、従来公知の方法によりヒト臓器や細胞株等から単離、クローニングして用いることができる。
【００２６】
また、ペプチドとして用いる場合には、本発明の配列番号２のアミノ酸配列に従って、化学的に合成することも可能である。
【００２７】
本発明のタンパク質は、従来公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、後述する本発明に係る遺伝子を適当なベクターに組み込み、該ベクターを適当な形質転換体に導入することにより、形質転換体にタンパク質を産生させることも可能である。
【００２８】
更に、本発明のタンパク質はがんに強発現するという特性を有するため、後述するようにがんの診断、処置に有効に用いることができる。
【００２９】
本発明の遺伝子は本発明のタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基配列のうち１又は数個の塩基が付加、欠失若しくは置換されている塩基配列及びその相補的配列からなり、該配列は本発明のタンパク質の塩基配列ｃＤＮＡ全長を示す。同じく本発明のタンパク質の塩基配列（配列番号１の塩基配列）を示す図１〜図７において、小文字部分はアクセッションナンバーＡＦ０６２０００６と同一配列部分、大文字は本発明者らが同定した配列部分を表す。
【００３０】
本発明の遺伝子は、例えば本発明に係るｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから単離することができる
本発明に係る遺伝子は、例えばその塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作成したヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより、得ることができる。あるいはこのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法を用いて合成することも可能である。
【００３１】
一般に遺伝子は個体差による多型が認められるので、１または複数個の塩基の付加、欠失または置換されているものも当然この発明に含まれる。そして、これらの変更によって生じる１又は複数個のアミノ酸の付加、欠失又は置換されているアミノ酸からなるタンパク質も、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を有する限り、本発明に含まれるものである。
【００３２】
また、本発明の遺伝子又はそれらと相補的な配列の全て又は一部断片は、がんの遺伝子診断用プローブとして用いることができる。更にこれら断片を複数含むキットを作成し、がんの検出、診断に用いることもできる。
【００３３】
例えば、配列番号３〜８の塩基配列は本発明のタンパク質のプライマーとして用いることができる。これらのうち配列番号３及び４はフォワードプライマーとして、配列番号５及び６はリバースプライマーとしてＰＣＲ法に用いて本発明のタンパク質の定量を行うことができる。また配列番号７及び８は本発明に係るマウスホモログのプライマーとして該ホモログにおける本発明のタンパク質の定量を行うことができる。
【００３４】
次に本発明のタンパク質及び遺伝子の用途を説明する。
【００３５】
本発明のがん診断マーカーは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に対して過剰発現を示すタンパク質を具備している。上述したように、このマーカーをプローブとして用いて遺伝子診断を行うだけでなく、診断対象となる組織から、従来公知の方法を用いてタンパク質を分離して、スクリーニングにより本発明のタンパク質の発現の有無を測定し、その発現レベルからがんを検出、診断することも可能である。
【００３６】
例えば本発明のタンパク質はがん細胞特有に細胞膜上に過剰発現するので、該タンパク質を標的として、これに特異的に結合する化合物を用いて治療を行うことが可能であり、これによりがん細胞に対して効率よく治療を行うことが可能となる。
【００３７】
ここで言う、本発明のタンパク質に特異的に結合する化合物としては、該タンパク質の抗体、アンタゴニスト、アゴニストがあげられる。
【００３８】
本発明に係る抗体は、従来公知の方法により作製されたハイブリドーマを用いて、本発明のタンパク質を抗原とするモノクローナル抗体として得ることができる。
【００３９】
また、本発明に係るアンタゴニスト並びにアゴニストは、ＤＮＡ、タンパクまたは非タンパク質であっても良い。
【００４０】
また、ミサイル療法だけでなく、本発明のタンパク質を直接の標的として、本発明の遺伝子の一部を置換、付加若しくは欠失させることにより改変し、該タンパク質の機能を阻害することによりがん治療を行うことも可能である。
【００４１】
また、本発明のタンパク質をスクリーニングし、該タンパク質の発現の有無に基づいて診断することにより、がんの検出、診断のみならず、手術によりがん組織を除去した後の再発診断（予後診断）を行うことができる。
【００４２】
また、がん細胞の診断では、本発明の遺伝子を含む複数の遺伝子断片を具備したスクリーニングキットを用いて検査組織内の遺伝子をスクリーニングすることにより診断を行うことも可能である。
【００４３】
このように、本発明のタンパク質、遺伝子並びにこれらを用いたがん治療への用途によれば、より精度の高いがん治療を行うことが可能となる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００４５】
<材料調整>
１９９８年７月から１９９９年６月までに国立がんセンター病院で切除手術を行った患者（平均年齢６２．６歳、２０〜７６歳）から、３８例の肝細胞がん（ＨＣＣ）及びそれらに対応する非がん肝臓組織を採取し、分析に用いた。
【００４６】
正常肝臓は肝臓に転移が見られた大腸がん患者から採取した。組織はすぐに凍結保存処理を行い使用するまで保存した。
【００４７】
ＨＣＣ、非がん組織及び正常肝臓組織の判定は組織学的に行った。臨床病理的特徴は図１６の表に示す通りである。組織病理学的グレードとＨＣＣの肉眼型によるタイプ分類は、肝がん取り扱い規約（第三版）に基づいて分類した。血管への浸潤は門脈内への腫瘍の浸潤と肝臓内転移の両方を含めて定義された。多中心性ＨＣＣの場合には、最大結節を以下の分析に用いた。ヒトＨＣＣ細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨｅｐＧ２はＡＴＣＣから入手した。ＫＹＮ−１，ＫＹＮ−２及びＫＩＭ−１は久留米大学の神代正道氏により提供されたものを用いた。その他ＨＣＣ細胞株Ｌｉ７，Ｌｉ２１，Ｌｉ２４，ｔＰＨ５Ｔ及びそれに対応する非腫瘍性肝細胞株ｔＰＨ５ＣＨ、及びマウス肝細胞ＭＨＴは本発明者らにより樹立された。ｔＰＨ５Ｔ，ｔＰＨ５ＣＨ及びＭＨＴはＳＶ４０ラージＴ抗原により不死化された。
【００４８】
上記のようにして全ての細胞株は、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【００４９】
<ＲＮＡ調整>
Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ‐ｐｈｅｎｏｌ‐ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法（ＡＧＰＣ法）を用いてトータルＲＮＡを調整した。
【００５０】
上述した３８例の組織切片それぞれ０．１〜０．２ｇに、４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び０．１Ｍ  ２‐メルカプトエタノールの混合液０．５ｍｌを加え、ホモジナイザーで均一にし、このホモジネートを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【００５１】
これに、１）２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）５０μｌ、２）フェノール０．５ｍｌ、３）クロロホルム／イソアミルアルコール（４９／１）１００μｌを順次加え、そのたびに２〜３回混合し、最後に１０秒間激しく混ぜた後１５分間氷冷した。
【００５２】
次いで、１００００×ｇで２０分間遠心後、水層を別のチューブに移した。水層にイソプロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で１時間以上置いた。
【００５３】
次いで遠心によりＲＮＡを沈殿させた。更に沈殿物を８０％エタノールで洗い、乾燥後、オートクレーブをかけた蒸留水に溶解し、トータルＲＮＡを得た。
【００５４】
<ｍＲＮＡ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ＰＣＲ(ｍＲＮＡ  ＤＤ−ＰＣＲ)>
このようにして得られたトータルＲＮＡに、複数のサンプル間で遺伝子発現の違いを網羅的に解析する方法の一つであるｍＲＮＡ  ＤＤ−ＰＣＲ法を行った。
【００５５】
０．５ｍｌチューブにＲＮＡ２．５μｇ、アンカープライマー５０ｐｍｏｌを加え、ＤＥＰＣ処理水で全量を１０μｌにして、７０℃に加温したサーマルサイクラーで１０分間程度加温する。加温後チューブを急冷して軽く遠心した。チューブに２×ＲＴミックス（ＤＥＰＣ処理水２×Ｎμｌ、１０×ＰＣＲバッファー２×Ｎμｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２×Ｎμｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２×Ｎμｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １×Ｎμｌ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １×Ｎμｌ）を１０μｌ加えて混合した。２５℃に冷却したサーマルサイクラーにチューブをセットし、２５℃で１０分、４２℃で５０分、７０℃で１５分反応させた。その後、チューブを軽く遠心し、ＴＥ８０μｌを加えてよく混合してｃＤＮＡ溶液とした。
【００５６】
このようにして得られたｃＤＮＡ溶液２．０×Ｎμｌ、ｄＨ２Ｏ１３．０×Ｎμｌ、１０×ＧｅｎｅＴａｑバッファー２．０×Ｎμｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ１．６×Ｎμｌ、アンカープライマー０．２×Ｎμｌを混合したＰＣＲミックスを調整した。
【００５７】
各ウェル又はチューブに任意プライマーを１μｌずつ分注した。ＰＣＲミックスにそれぞれ０．１×ＮμｌのＧｅｎｅＴａｑと通常のＴａｑポリメラーゼを加えて混合した。その後、各ウェル（チューブ）に１９．０μｌずつＰＣRミックスを加えていった。プレートをサーマルサイクラーにセットして、以下の通りに反応させた。
（９４℃×３分＋４０℃×５分＋７２℃×５分）×１サイクル
（９５℃×１５秒＋４０℃×２分＋７２℃×１分）×２０〜２５サイクル
７２℃×５分
上記のようにして得られた反応産物５μｌをポリアクリルアミド電気泳動にかけ、得られたバンドから、興味ある発現量の差を示すバンドを切りだした。
【００５８】
このようにして得られたゲル片の半分を０．５ｍｌチューブに移し、５０〜１００μｌの系で、以下の条件でＰＣＲを行い、バンドを再増幅した。
９４℃×３分×１サイクル
（９５℃×１５秒＋４０℃×２分＋７２℃×１分）×１〜２０サイクル
７２℃×５分
上記ＰＣＲ反応物５μｌ程度をＨＡ−Ｙｅｌｌｏｗ（Ｔａｋａｒａ）含有アガロースゲルで電気泳動し、目的とするバンドを切り出し、更に、同様のＰＣＲ条件で再増幅後、ＨＡ−Ｒｅｄ（Ｔａｋａｒａ）含有アガロースゲルで電気泳動し、クローニングを行った。
【００５９】
<ノザンブロット解析>
上述の通り調整した各例のトータルＲＮＡ１５μｇを用い、１．０％アガロースホルムアルデヒド変性ゲル電気泳動を行った。その後、キャピラリーブロッティング法によりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+膜（アマシャム）へ転写、固定した。膜へ固定後、プレハイブリダイゼーションを行い、Ｇｐｒ４９のＤＮＡプローブとグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）とをハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後に、膜を０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用いて６５℃、３０分間、２回洗浄した。その後、−８０℃でオートラジオグラフィーを行い、デンシトメーターで反応の定量を行った。
【００６０】
以上の通りにして得られたクローンの中からクローン１４１を得た。その結果を図９に示す。図９はクローン１４１及びＧＡＰＤＨｃＤＮＡ（コントロール）のノザンブロットである。また、図１０はクローン１４１のｍＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量し、ＧＡＰＤＨで標準化したグラフである。縦軸は本発明のタンパク質のＧＡＰＤＨに対する発現比を示し、横軸は各細胞株１：ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、２：ＫＹＮ−２、３：Ｌｉ７、４：ＫＩＭ−１、５：ＨｅｐＧ２、６：Ｌｉ２１、７：Ｌｉ２４、８：ｔＰＨ５ＴＨ、９：ｔＰＨ５ＣＨ、１０：ＫＹＮ−１を示す。
【００６１】
<Ｇｐｒ４９のクローニング>
上述のようにして得られたクローン１４１の解析だけではＢＬＡＳＴからも充分な情報を得られないため、更にｃＤＮＡライブラリを用いてスクリーニング・クローニングを行った。
【００６２】
・ｃＤＮＡライブラリ作製
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株由来ｍＲＮＡをエタノール沈殿する。該沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、１５μｌの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解する。次いで６５℃、５分間保温した後、３７℃に移す。その後、以下の組成の溶液を加える。
１０×逆転写酵素緩衝液  ３．０μｌ
２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ  ３．０μｌ
２０ｍＭ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  ３．０μｌ
１．２μｇ／μｌベクタープライマー  ３．０μｌ
１５ユニット／μｌ  ＲＴａｓｅ  ３．０μｌ
Ｈ２Ｏ  ２．３μｌ
この溶液を加えた後、３７℃、３０分間保温する。その後ＴＣＡ沈殿を確認後、残りの溶液に以下の組成の液を加え攪拌する。
０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ３．０μｌ
１０％ＳＤＳ  １．５μｌ
次いで、３５μｌフェノール／クロロホルムを加え、良く攪拌した後１分間遠心する。その上清に３５μｌフェノール／クロロホルムを加え、良く攪拌した後１分間遠心する。上清に３５μｌの４Ｍ酢酸アンモニウム及び１４０μｌエタノールを加え、ドライアイス・エタノール混合液あるいはドライアイス上に１５分間放置する。次いで、チューブを室温に１〜２分間放置し、その間沈殿したヌクレオチドの濁りが消えたら、軽く攪拌し、１５分間遠心する。次いでエタノールを取り除いた後、沈殿物に３５μｌのＴＥを加え、攪拌した後３５μｌの４Ｍ酢酸アンモニウムと１４０μｌのエタノールを加え、エタノール沈殿を行う。エタノールを除いた後再びエタノール沈殿を行う。このようにして得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄する。
【００６３】
上記沈殿物に以下の組成の溶液を加え、攪拌した後３７℃で５分間保温する。
Ｈ２Ｏ  １２μｌ
１０×ＴｄＴ緩衝液  ２μｌ
０．１５μｇ／μｌポリＡ  ２μｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ  ２μｌ
２ｍＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  ０．６μｌ
次いで１０％ＣＴＡに浸したミリポアフィルター（０．４５μｍ  ＴｙｐｅＨＡ）上に、上述の通り作製したサンプル０．５μｌを抜き取ってスポットし、素早く吸引する。これを３ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌ、０．１ｍＭピロリン酸ナトリウム液で２回洗浄する。３０ユニットのＴｄＴを加え、３７℃、５分間保温した後氷上に放置する。ＴＣＡ沈殿のチェックを行った後、以下の溶液を加えて攪拌する。
０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ２μｌ
１０％ＳＤＳ  １μｌ
次いで２０μｌのフェノール／クロロホルムを加え、攪拌後遠心する。この上清に２０μｌの４Ｍ酢酸アンモニウムと８０μｌのエタノールを加え、上述のエタノール沈殿と同様の処理を行い、沈殿物を７０％エタノールで洗浄する。
【００６４】
上述のようにして得られた沈殿物に２５μｌの水と３μｌのＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液を加えて攪拌する。次いで１４ユニットのＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃、１時間保温する。その後サンプルを１μｌ抜き取り、１％アガロースゲル電気泳動を行いＨｉｎｄＩＩＩ切断のチェックを行う。
【００６５】
残りのサンプルに、３．０μｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、１．５μｌの１０％ＳＤＳを加えた後、３５μｌのフェノール／クロロホルムを加え攪拌、遠心する。遠心により生じた上清に再度フェノール／クロロホルムを加え、攪拌、遠心して上清を取る。この上清に３５μｌの４Ｍ酢酸アンモニウムと１４０μｌのエタノールを加えてエタノール沈殿を行う。更に上清に３５μｌのＴＥを加えて溶解し、再度エタノール沈殿を行う。生じた沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、該沈殿物を１０μｌのＴＥに良く溶かした後、１０μｌのエタノールを加えて−２０℃で保存する。
【００６６】
上記のようにして得られたサンプル１．０μｌに、０．１５ｐｍｏｌ／μｌ  ｄＧ−ｌｉｎｋｅｒを０．５μｌ（０．０８ｐｍｏｌ）、５×ハイブリダイゼーション緩衝液２，０μｌ、Ｈ２Ｏ６．５μｌを加え、攪拌する。その後６５℃で５分間保温する。次いでサンプルを入れたチューブを４３℃のインキュベータに移し、３０分間保温する。更に１８．０μｌの５×リガーゼ緩衝液、Ｈ２Ｏ７０．７μｌ、１０ｍＭ  βＮＡＤ１．０μｌを加え、氷上で１０分間冷却する。０．６μｇの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を加え、緩やかに攪拌してから１２℃でオーバーナイトで反応させる。次に以下の溶液、酵素を加える。
２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ  ２．０μｌ
１０ｍＭ  βＮＡＤ  ０．５μｌ
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ  ０．６μｌ（ＴＡＫＡＲＡ６０ユニット／μｌ）
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ  ０．５μｌ（ＴＡＫＡＲＡ６ユニット／μｌ）
ＲＮａｓｅＨ  ０．２μｌ（ＴＡＫＡＲＡ６０ユニット／μｌ）
その後緩やかに攪拌し、１２℃で１時間反応させ、チューブを室温（約２２℃）に移し、１時間反応させる。次いで０．５μｌを抜き取り、５０μｌのＴＥで薄め、大腸菌（ＤＨ５）コンピテントセルにトランスフェクトさせ、ｃＤＮＡライブラリのサイズを測定する。
コンピテントセルを氷水中に置いた１５ｍｌのプラスチックチューブに２００μｌずつ分注する。上記サンプルを分注したコンピテントセルに対して３〜５μｌずつ分注し、氷上に３０分間放置する。４２℃で３０秒間保温した後、氷水中に１〜２分間置く。更に各チューブに０．８ｍｌのＳＯＣを加え、１時間３７℃で振盪する。次いで１ｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン入り）に上記サンプルを全て加える。攪拌後、１００、３０、１０、２μｌ抜き取り、４７℃に保温してあったトップアガーを３ｍｌずつ加えてＬプレート（アンピシリン入り）に撒く。残りは３７℃で一晩振盪培養する。Ｌプレートも３７℃で一晩培養する。振盪培養したＬＢを９３ｍｌとり、７ｍｌのＤＭＳＯと混合する。
【００６７】
・スクリーニング
上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリを用いて、常法によりスクリーニングを行った。常法によりレプリカフィルターを作成し、プレハイブリダイゼーションに続いてハイブリダイゼーションを行った後、陽性反応を示すクローンを選択し、単離した。
【００６８】
・プレーティング
０．５ｍｌのプレーティングバクテリアと２〜３×１０４ｐｆｕのファージを入れて混合し、更に０．７％トップアガロースを７ｍｌ加えた後、１５０ｍｍＬＢプレートへ撒き、全体に広げる。アガロースが固まったら、プレートを逆さにして３７℃のインキュベータで、プラークがｃｏｎｆｌｕｅｎｔになる直前までインキュベートする。その後、プレートを４℃に１時間以上置いて冷却する。
【００６９】
次いで上記プレートにニトロセルロース膜を載せ、プラークを転写する。
【００７０】
転写した膜を０．２Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌがしみ込んだ濾紙上に載せアルカリ処理を行い、その後０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／２×ＳＳＣのしみ込んだ濾紙上にのせ、中性に戻す。膜を乾燥させた後、８０℃で１．５〜２時間又は４２℃で一晩加熱し、ＤＮＡをフィルターに固定する。
【００７１】
このようにして得られたレプリカフィルターを用いて、従来公知の方法によりプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションを行う。これにより陽性反応を示したプラークを採取し、クロロホルムの入った懸濁培地に入れ、１００ｍｍプレート当り５００プラーク以下程度の密度になるように、３〜６枚プレーティングする。
【００７２】
上述のプレーティング方法と同様にしてレプリカフィルター作製、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションを行い、陽性反応を示したプラークを再び選出する。再び同様の手順を繰り返して陽性反応を示したプラークのみを選出し、単一クローンのみとなるまで上記手順を繰り返し、所望のクローンを選出した。
【００７３】
このようにして２３２４−ｂｐのクローンを得、その配列をＢＬＡＳＴで解析した。該クローンの５´末端側の８４６−ｂｐ配列がＢＬＡＳＴのアクセッションナンバーＮＭ＿００３６６７のオーファンＧタンパク共役型レセプターと１００％の相同性を有し、また、ユニジーンデータベースにＧｐｒ４９として登録されている遺伝子であることが分かった。
【００７４】
上記のようにして得られた本発明のタンパク質（Ｇｐｒ４９）の塩基配列を図１〜図７に示す。小文字部分はＮＭ＿００３６６７と相同性１００％を有する部分を、大文字は本実験で発明者らが同定した部分を示す。
<リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ>
次にＳＹＢＲグリーンＰＣＲコア試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、従来の方法に従いＲＴ−ＰＣＲによる本発明のタンパク質のＲＮＡの発現解析を行った。
【００７５】
各組織サンプルと細胞株のｃＤＮＡを、オリゴｄｔプライマーとＡＭＶ逆転写酵素ＸＬ（ＴａＫａＲａ）を用いて従来通りにＤＮアーゼ処理したトータルＲＮＡから調整した。プライマー発現ソフト（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、以下のＧｐｒ４９用プライマーを作成した。
ＧＳＰ１（フォワード）：５´−ＣＴＣＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＡＣＴＴＣ−３´
ＧＳＰ２（フォワード）：５´−ｇａｇｇａｔｃｔｇｇｔｇａｇｃｃｔｇａｇａａ−３´
ＧＳＰ３（リバース）：５´−ｃａｔａａｇｔｇａｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｔａａ―３´
ＧＳＰ４（リバース）：５´−ＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＣＣ‐３´
また、ＧＰＲ４９のマウスホモログであるＦＥＸ用のプライマーとして、以下のプライマーを作成した。
ＧＳＰ５(フォワード)：５´−ＧＡＧＴＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＡＧＴＡＴＣＣ‐３´
ＧＳＰ６（リバース）５´−ＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧ‐３´
上述のようにして得られたプライマーの中から、ＧＳＰ２、３、５及び６をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲに用いた。
また、ＲＮＡ量の標準化のため、コントロールとしてＧＡＰＤＨの発現を定量した。
【００７６】
また、無対ｔテストにより、ＨＣＣ及び対照となる非がん肝臓組織における本発明のタンパク質の発現レベルの差異を分析した。また、χ２検定及びフィッシャーの直接確立検定を用いてＧｐｒ４９発現と臨床病理学的パラメーターとの関連を、ＳｔａｔＶｉｅｗ（Ｖｅｒ．５．０）（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて分析した。Ｐ値が０．０５以下を有意と判定した。
【００７７】
これらの結果を図１１に示す。図１１は各サンプルにおける本発明のタンパク質のＲＮＡの発現量を示すグラフである。グラフの左側が肝細胞における本発明のタンパク質のＲＮＡの発現量を示し、右側が非がん肝臓組織若しくは正常肝臓組織で発現する量を示す。このグラフからも分かるように、本発明のタンパク質のＲＮＡは多くのがん組織で発現しているが、正常組織ではほとんど発現しなかった。
【００７８】
さらに、ＨＣＣにおける本発明のタンパク質のＲＮＡの過剰発現について検討するため、腫瘍と非がん肝臓における発現レベル比（Ｔ／Ｎ比）を計算した。Ｔ／Ｎ比が３を超えた場合に過剰発現と判定した。この結果を図１２の表及び図１６の表に示す。図に示すように、がん化組織ではＴ／Ｎ>３となる例が３８例中１８例（４７％）に達し、これらは全て過剰発現と分類した。
【００７９】
<β−カテニンとの相関関係>
・ＰＣＲ及びβ−カテニン配列解析
本発明のタンパク質のＲＮＡが非常に過剰発現しているＰＲＦ／ＰＬＣ／５及びＨｅｐＧ２では、β−カテニンが細胞質及び核に蓄積していることが示されたため、β−カテニンの変異と関係している可能性があると考えられた。そこで、本発明のタンパク質とβ−カテニンの変異との相関関係を調べるため、以下の実験を行った。
【００８０】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ‐３β）のリン酸化に関与すると考えられる４つの部位を含んでいるβ−カテニンのエキソン３を、上記調整例で得た各サンプルのｃＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した。
【００８１】
ＰＣＲには、β−カテニンのエキソン２フォワードプライマー（５´−ＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡ‐３´）及びβ−カテニンエキソン４リバースプライマー（５´−ＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣ‐３´）を用いた。
【００８２】
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により確認後、両方向から、ＰＣＲで用いたプライマーを用いてシーケンス解析を行った。
・β−カテニン変異株の作成及びレトロウイルス感染
コード領域全てを含む野生型β−カテニンｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンした。ＧＳＫ−３βリン酸化サイトに相当するＴｈｒ−４１及びＳｅｒ−４５がアラニンに変化しているβ−カテニン変異株をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。引き続き、野生型β−カテニン及びβ−カテニン変異株をレトロウイルス発現ベクターｐＬＮＣＸ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローンした組換えレトロウイルスを、上記野生型及び変異型β−カテニンを組み込んだｐＬＮＣＸ２とｐＣＬ−Ｅｃｏを２９３個の細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてコトランスフェクトして生成した。トランスフェクションして２４時間後、２９３個の細胞の上清を回収し、滅菌０．４５−マイクロフィルターにより濾過し、８μｇ／ｍｌのポリブレンを加えたＭＨＴ細胞上に、レトロウィルス含有上清として移して感染させた。
【００８３】
感染後２４時間、該感染培地を１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を加えた１６４０培地に置き換えた。感染後４８時間、細胞をジェネチシン５００μｇ／ｍｌを含む培地に分割した。その後、耐性クローンからトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
【００８４】
上記結果を図１１及び図１３〜図１５に示す。図１１の例ではβ−カテニンのエキソン３が体細胞性変異を起こしている例には＊印を付している（３８例中１６例：４２％）。例３３及び４０では二つの変異型が見出された。また、例８ではエキソン３をＰＣＲで増幅したところ、バンドが二つに分離した（データ省略）。このバンドを分析すると、５１−ｂｐの欠失が見出された。
図１３及び図１４はミスセンス変異及びアミノ酸置換を示す電気泳動図である。ほとんどの場合、セリン又はスレオニンをコードする残基３３、３７、４１若しくは４５でアミノ酸置換が起こっているかこれらの隣接残基に生じていた。また、β−カテニン変異は本発明のタンパク質の過剰発現を起こしている肝細胞がんでは頻繁に見られた（１８例中１４例：７８％）。その一方、本発明のタンパク質の過剰発現が見られない例でのβ−カテニン変異は２０例中２例（１０％）に過ぎなかった。また、図１５はマウス肝細胞における本発明のタンパク質の発現に対するβ−カテニンの影響を示すグラフである。変異β−カテニンを導入されたマウス肝細胞における本発明のタンパク質の発現レベルは他の野生型β−カテニンあるいはＭＯＣＫｐＬＮＣＸ２を導入した肝細胞と比べておよそ4倍にも達することがわかった。
【００８５】
これらのことから、本発明のタンパク質の過剰発現とβ−カテニン変異とは強い相関性を有することが分かった。
【００８６】
また、過剰発現率は、女性・男性でそれぞれ約８３％、３４％と差が認められた（データ省略）。このことから、本発明のタンパク質が性差により生じるがんの発現差にも関与していると考えられる。
【００８７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のタンパク質及びその遺伝子は肝がん細胞特異的に強発現し、β−カテニンの変異により過剰発現が誘導されるという特性を有する。この特性を利用してがんの診断、治療において、がんの診断マーカー、標的治療、遺伝子診断や遺伝子治療、その他がんの再発診断等様々な用途に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（１）である。
【図２】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（２）である。
【図３】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（３）である。
【図４】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（４）である。
【図５】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（５）である。
【図６】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（６）である。
【図７】本発明のタンパク質の塩基配列を示す図（７）である。
【図８】プライマーとしてＧＳＰ１及びＧＳＰ４を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動画像である。
【図９】肝細胞がん細胞株及び非がん肝細胞株（ＧＡＰＤＨ）におけるクローン１４１及びＧＡＰＤＨの発現量を示す画像である。
【図１０】調整例で調整した各サンプルのＧＡＰＤＨで標準化したクローン１４１のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図１１】肝細胞がん組織における本発明のタンパク質のＲＮＡ発現状態を示す表である。
【図１２】肝臓のがん組織（Ｔ）及び非がん肝組織（Ｎ）の本発明のタンパク質のｍＲＮＡの発現レベル平均を示すグラフである。
【図１３】β−カテニン遺伝子のエキソン３の変異分析の図であって、サンプル例２４の３１番目コドン（ＴＣＴからＴＧＴ）の変異を示す電気泳動図である。
【図１４】Ｇｐｒ４９過剰発現した１８例中１６例で生じたβ−カテニン変異におけるアミノ置換を示す模式図である。
【図１５】ＭＯＣＫ，野生型β−カテニン及び変異β−カテニンをレトロウイルスにより感染させたマウスＭＨＴ細胞におけるＦＥＸｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図１６】調整例で得られた肝細胞がん３８例のＧｐｒ４９の発現レベルを示す表である。
【配列表】
0004280814.tif 000002
0004280814.tif 000003
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0004280814.tif 000013
【図１】
0004280814.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004280814.tif 000020
【図８】
0004280814.tif 000021
【図９】
0004280814.tif 000022
【図１０】
0004280814.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
0004280814.tif 000025
【図１３】
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【図１４】
0004280814.tif 000027
【図１５】
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【図１６】
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