(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メイラード反応における反応過程で生成される中間生成物から選択される１以上の生成物の生成反応を阻害させるための第１阻害剤と、メイラード反応における最終生成物から選択される１以上の生成物の生成反応を阻害させるための第２阻害剤と、を組み合わせるメイラード反応阻害剤の製造方法であって、
上記第１阻害剤は、糖化タンパクおよび／または３−デオキシグルコソンの生成反応を阻害するものであるとともに、上記第２阻害剤は、蛍光物質(励起波長が約370nm、蛍光波長が約440nm)および／またはベントシジンの生成を阻害するものであり、かつ、
上記第１阻害剤および上記第２阻害剤は、それぞれ、ガンビールノキ、シラカバ、セイヨウサンザシ、チャノキ、チョウジノキ、ドクダミ、トルメンチラ、バラ、ブドウ、マロニエ、およびローマカミツレからなる植物群より選択される１種以上の植物の抽出物を含んでいることを特徴とする、メイラード反応阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、同一または異なるメイラード反応における複数の生成物(中間生成物および最終生成物)に対して有効に生成を阻害できるメイラード反応阻害剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体組織においては、組織中のタンパク質やアミノ酸が糖化するメイラード反応が生じている。メイラード反応の進行は、皮膚組織においては皮膚の老化(弾性低下)を招き、血管壁組織においては動脈硬化を招くといわれている。また、メイラード反応における反応生成物は、糖尿病の合併症の発症・進展に対して大きな影響を与えるものでもある。
【０００３】
このため、メイラード反応を阻害することを目的に、種々の研究がなされている。たとえば、皮膚の老化を予防する目的で、植物の抽出物を利用することが検討され(たとえば特許文献１〜３)、糖尿病の合併症阻害剤として、アミノグアニジンやカテキンを使用することが検討されている。
【０００４】
一方、メイラード反応における最終生成物が生成されるまでの反応経路については、現在では不明な点が多い。しかしながら、メイラード反応の研究が進むにつれ、タンパク質やアミノ酸が酸化を受けて最終生成物が生成される反応経路(糖酸化)、およびタンパク質やアミノ酸が糖化することにより、中間生成物を経た後に最終生成物が生成される反応経路があることが判明してきた。前者の反応経路の例としては、タンパク質(主にアルギニン残基)が糖(主にペントース)により酸化され、最終生成物としてペントシジンが生成される反応経路がある。一方、後者の反応経路の例としては、タンパク質(主にリジン残基)が糖(主にヘキソース)と非酵素的に反応し、糖化タンパク、３−デオキシグルコソンを経て、最終生成物が生成される反応経路がある。後者の反応経路における最終生成物は、主として蛍光物質(励起波長が約370nm、蛍光波長が約440nm）であり、低率ではあるがペントシジンが副生する。
【０００５】
このように、メイラード反応の反応経路としては、中間生成物を経て最終生成物が生成される反応経路が確認されている。その一方、メイラード反応の中間生成物が増加・蓄積することにより副反応が生じ、この副反応によってよって生体機能が低下することも知られている。たとえば、中間生成物がヘモグロビンと反応した場合には血液中における酸素吸着能(酸素搬送能)が低下することが知られている。
【０００６】
しかしながら、メイラード反応を阻害するための研究においては、最終生成物に着目し、最終生成物の生成量によってメイラード反応の阻害効果を判定しているのが現状である。すなわち、中間生成物の影響を十分に考慮せずに、メイラード反応を阻害する物質の模索・研究がなされており、既存のメイラード反応阻害剤では、中間生成物の影響を十分に排除することができない。また、単一種のメイラード反応阻害剤を使用する方法、あるいは無作為に複数のメイラード反応阻害剤を組み合わせて使用する方法では、生成を抑制できる最終生成物や中間生成物の種類に限界がある。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１１−１０６３３６号公報
【特許文献２】
特開２００２−２４１２９３号公報
【特許文献３】
特開２００２−２４１２９９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述のような事情の下に考え出されたものであり、同一または異なるメイラード反応における複数の生成物(中間生成物および最終生成物)に対して生成を有効に阻害できるメイラード反応阻害剤の製造方法を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、メイラード反応における反応過程で生成される中間生成物から選択される１以上の生成物の生成反応を阻害させるための第１阻害剤と、メイラード反応における最終生成物から選択される１以上の生成物の生成反応を阻害させるための第２阻害剤と、を組み合わせるメイラード反応阻害剤の製造方法であって、上記第１阻害剤は、糖化タンパクおよび／または３−デオキシグルコソンの生成反応を阻害するものであるとともに、上記第２阻害剤は、蛍光物質(励起波長が約370nm、蛍光波長が約440nm)および／またはベントシジンの生成を阻害するものであり、かつ、上記第１阻害剤および上記第２阻害剤は、それぞれ、ガンビールノキ、シラカバ、セイヨウサンザシ、チャノキ、チョウジノキ、ドクダミ、トルメンチラ、バラ、ブドウ、マロニエ、およびローマカミツレからなる植物群より選択される１種以上の植物の抽出物を含んでいることを特徴とする、メイラード反応阻害剤の製造方法が提供される。
【００１２】
植物抽出物は、植物体のどの部位から抽出したものであってもよく、たとえば全草、花、種子、果実、葉、枝、樹皮、根皮、根茎、あるいは根から抽出したものを採用することができる。植物抽出物の性状についても特に制限はなく、たとえば液状、ペースト状、固形状、あるいは粉体状のいずれの性状のものも使用することができる。
【００１７】
なお、ペントシジンは、主たる最終生成物として蛍光物質が生成されるメイラード反応において、副次的に生成されることもあるが、本発明でいう最終生成物という場合には、副次的に生成される最終生成物は含まないものとする。この点において、蛍光物質とペントシジンとは異なるメイラード反応において生じる最終生成物として定義される。
【００１８】
【実施例】
以下においては、複数の植物抽出液の阻害能評価試験について説明する。
【００１９】
[阻害能評価試験]
本試験においては、下記表１に示した複数の植物抽出液のそれぞれについて、メイラード反応における中間生成物および最終生成物の生成を阻害する能力について評価した。本試験の対象となる中間生成物は糖化タンパクおよび３−デオキシグルコソンとし、本試験の対象となる最終生成物は蛍光物質(励起波長が約370nm、蛍光波長が約440nm)およびペントシジンとした。すなわち、本試験においては、リジン残基を有するタンパク質を出発物質とし、糖化タンパクおよび３−デオキシグルコソンを中間生成物として経た後に最終生成物として蛍光物質が生成される第１の反応経路と、アルギニン残基を有するタンパク質を出発物質として中間生成物を経ることなく最終生成物としてペントシジンが生成される第２の反応経路において、複数の植物抽出液について中間生成物および最終生成物に対する阻害能を検討した。
【００２０】
【表１】
0004206479.tif 000002
【００２１】
メイラード反応阻害能の測定
メイラード反応阻害能については、中間生成物や最終生成物の反応率に基づいて評価した。反応率は、下記表２に示した４種類の反応液Ａ〜Ｄについて、糖化タンパク、３−デオキシグルコソン(3DG)、蛍光物質、およびペントシジンを後述する手法によりそれぞれ定量し、各反応液Ａ〜Ｄに対する定量結果から、数式１にしたがって計算した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
【数１】
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【００２４】
糖化タンパクの定量
糖化タンパクの定量は、反応液Ａ〜Ｄ中の糖化タンパクを加水分解してフロシン溶液を調製した後、フロシン溶液中のフロシン量を特定することにより行った。フロシン溶液は、各反応液Ａ〜Ｄを60℃で40時間インキュベーションした後のものに基づいて調製した。フロシン量の特定は、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を利用するとともに、絶対検量線法によりフロシン量を計算することにより行った。HPLCにおいては、検出光として波長280nmのUV光を、ガードカラムとしてTSK GUARDGEL ODS-80TMを、カラムとしてTSK−GEL ODS-80TM 4.6×250を、移動相としては7mMのリン酸緩衝液を使用した。
【００２５】
３−デオキシグルコソン(3DG)の定量
3DGの定量は、3DGを誘導体化したサンプルを調製した後、サンプル中の誘導体量を特定することにより行った。誘導体を含むサンプルは、各反応液Ａ〜Ｄを60℃で40時間インキュベーションした後のものに基づいて調製した。誘導体量の特定は、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を利用するとともに、内部標準法により誘導体量を計算することにより行った。HPLCにおいては、内部標準として2,3−Pentanedioneを、検出光として波長268nmのUV光を、ガードカラムとしてTSK GUARDGEL ODS-80TMを、カラムとしてTSK−GEL ODS-80TM 4.6×250を使用した。溶離液としては、phosphate buffer (50mmol)(＝Ａ)、methanol(＝Ｂ)およびacetonitrile(＝Ｃ)を混合した液を使用した。ただし、3DGの誘導体を溶出させる場合には、溶離液としてＡ:Ｂ:Ｃの混合比を21:6:7とした混合液を使用し、2,3−Pentanedioneを溶出させる場合には、溶離液としてＡ:Ｂ:Ｃの混合比を1:2:2とした混合液を使用した。
【００２６】
蛍光物質の定量
蛍光物質の定量は、希釈試料における蛍光物質からの蛍光の強度を測定することにより行った。希釈試料は、各反応液Ａ〜Ｄを60℃で40時間インキュベーションした後に、400μLの反応液Ａ〜Ｄを2400μLの蒸留水により希釈することにより作成した。蛍光の強度の測定は、希釈試料に対して波長が370nmの光を照射して蛍光物質を励起させる一方で、蛍光物質から発せられる波長が440nmの蛍光の強度を測定することにより行った。ただし、蛍光物質の量は、0.1μg/mLの硫酸キニーネ溶液に対して同様な条件で蛍光の強度を測定したときの測定値を100とした相対値として評価した。
【００２７】
ペントシジンの定量
ペントシジンの定量は、ペントシジンに特異的に反応するポリクローナル抗体(ウサギ由来)を用いた競合ELISA法を利用して行った。競合ELISA法においては、測定波長を450nmとして最終生成物の吸光度を測定し、その測定結果と検量線からペントシジン量を決定した。
【００２８】
結果の考察
メイラード反応阻害能の測定結果は、下記表３に示した通りであった。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
表３からは、次のことが分かる。第１に、糖化タンパクの生成阻害には、ドクダミ、ローマカミツレ、ガンビールノキ、およびチャノキの抽出物が有効である。第２に、３ＤＧの生成阻害には、トルメンチラ、マロニエ、ドクダミ、シラカバ、ローマカミツレ、ガンビールノキ、ブドウ、セイヨウサンザシ、バラ、チョウジノキおよびチャノキの抽出物が有効である。第３に、蛍光物質の生成阻害には、トルメンチラ、マロニエ、ドクダミ、ローマカミツレ、シラカバ、ガンビールノキ、ブドウ、セイヨウサンザシ、バラ、およびチャノキの抽出物が有効である。第４に、ペントシジンの生成阻害には、マロニエ、ドクダミ、ローマカミツレ、シラカバ、ブドウ、セイヨウサンザシ、およびチョウジノキの抽出物が有効である。
【００３１】
さらに詳細に検討すると、第１の反応経路において、中間生成物(糖化タンパクおよび３ＤＧ)の生成を抑制し、かつ最終生成物(蛍光物質)の生成を抑制するためには、ドクダミの抽出液、ローマカミツレの抽出液、ガンビールノキの抽出液(アセンヤク)、およびチャノキの抽出液(カテキン)からなる第１群より少なくとも１種を選択し、トルメンチラの抽出液、マロニエの抽出液、ドクダミの抽出液、ローマカミツレの抽出液、シラカバの抽出液、ガンビールノキの抽出液(アセンヤク)、ブドウの抽出液、セイヨウサンザシの抽出液、バラの抽出液、およびチョウジノキの抽出液からなる第２群より少なくとも１種を選択して組み合わせて使用すればよい。ただし、第１群および第２群からは、互いに異なる抽出物が選択される。
【００３２】
また、第１の反応経路において中間生成物および最終生成物の生成を抑制するとともに、第２の反応経路において最終生成物の生成を抑制するためには、ドクダミの抽出液、ローマカミツレの抽出液、ガンビールノキの抽出液(アセンヤク)、およびチャノキの抽出液(カテキン)からなる第１群より少なくとも１種を選択する一方で、マロニエの抽出液、ドクダミの抽出液、ローマカミツレの抽出液、シラカバの抽出液、ブドウの抽出液、セイヨウサンザシの抽出液、およびチョウジノキの抽出物からなる第２群より少なくとも１種を選択すればよい。ただし、第１群および第２群からは、互いに異なる抽出物が選択される。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、１以上のメイラード反応において、中間生成物および最終生成物が人体に与える影響を効果的に抑制できるメイラード反応の阻害剤を提供することができるようになる。