(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質であって、ヒトヒスタミンＨ３受容体として機能するタンパク質をコードし、かつ、配列番号５および配列番号６より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離かつ精製されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１記載の単離かつ精製されたＤＮＡ分子であって、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する、上記ＤＮＡ分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである、請求項１または２記載の単離かつ精製されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
組換え宿主中でのヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の発現のための発現ベクターにおいて、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質であってヒトヒスタミンＨ３受容体として機能するタンパク質をコードし、かつ、配列番号５および配列番号６より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターであって、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する、上記発現ベクター。
【請求項６】
ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有し、前記タンパク質がヒトヒスタミンＨ３受容体として機能する、請求項４または５記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれかに記載の発現ベクターを含有する組換え宿主細胞。
【請求項８】
配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する、単離されかつ精製されたタンパク質。
【請求項９】
（ａ）請求項４ないし６のいずれかに記載の発現ベクターを適する宿主細胞中に導入する工程；および
（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞を、当該発現ベクターからのヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程
を含んで成る組換え宿主細胞中でのヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質であって、ヒトヒスタミンＨ３受容体として機能するタンパク質の発現方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
ヒスタミンは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を介して細胞内経路に結びつけられる細胞表面受容体を通してシグナルを発する(signals)多機能化学伝達物質である。この分類の細胞表面受容体はＧタンパク質共役型受容体もしくはＧＰＣＲと呼ばれる。現在、薬理学的に定義された３種のサブタイプのヒスタミン受容体が存在し、そしてＨ１、Ｈ２およびＨ３分類に分割されている（ヒル（Ｈｉｌｌ）ら  １９９７）。Ｈ１ヒスタミン受容体はクローン化されており（ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら  １９９１）、そしてアレルギー応答におけるヒスタミンの効果を封鎖するジフェンヒドラミンのような薬物の標的である。Ｈ２ヒスタミン受容体はクローン化されており（ガンツ（Ｇａｎｔｚ）ら  １９９１）、そして胃の酸分泌に対するヒスタミンの効果を封鎖するラニチジンのような薬物の標的である。第三のサブタイプのヒスタミン受容体は、１９８３年に存在することが仮定された（アラング（Ａｒｒａｎｇ）ら  １９８３）。それは、中枢神経系のヒスタミン含有ニューロンのシナプス前自己受容体として、および非ヒスタミン含有ニューロンの前シナプスヘテロ受容体として機能すると考えられる。Ｈ３受容体の機能の一はシナプス前部位での神経伝達物質の放出を調節することである。ヒスタミンＨ３受容体は従って中枢神経系で発現されるが、しかし心、肺および胃でもまた薬理学的に同定されており、そして他の組織にも存在することが推定されてきた。
【０００２】
本発明は、ヒスタミンＨ３受容体をコードするヒトｃＤＮＡの単離および特徴づけならびにその使用に関する。
【０００３】
【発明の要約】
ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡ分子がクローン化されかつ特徴づけられ、そしてそれはＧタンパク質に共役する(couple)受容体クラスの新規の一構成員を表わす。組換え発現系を使用して、ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードする機能的ＤＮＡ分子が単離された。これらのタンパク質の生物学的および構造的特徴が、アミノ酸およびヌクレオチド配列がされるように開示される。当該組換えタンパク質は、ヒトヒスタミンＨ３受容体のモジュレーターを同定することを包含するがしかしこれに制限されない多様な目的上有用である。本明細書に開示されるアッセイで同定されるモジュレーターは、例えば治療薬および診断薬として有用である。前記治療薬の適応症は、中枢神経系の障害、例えばうつ、不安、精神病（例えば精神分裂病）、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、肥満、高血圧、トゥーレット症候群、性的機能不全、薬物嗜癖、薬物濫用、認識障害、アルツハイマー病、老人性痴呆、強迫性挙動、パニック発作、痛み、社会的恐怖症、摂食障害および食欲不振、心血管および脳血管障害、非インスリン依存型糖尿病、高血糖症、便秘、不整脈、神経内分泌系の障害、ストレスならびに痙縮、ならびに、酸分泌、潰瘍、気道絞窄、喘息、アレルギー、炎症および前立腺機能不全を包含するがしかしこれらに制限されない。当該組換えＤＮＡ分子およびそれらの部分は、当該ＤＮＡ分子の相同物を単離する、当該ＤＮＡ分子のゲノム同等物を同定かつ単離する、そして当該ＤＮＡ分子の突然変異体を同定、検出もしくは単離するために有用である。
【０００４】
【詳細な記述】
本発明は、ヒト視床からのｃＤＮＡライブラリーから単離されたヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡに関する。本明細書で使用されるところのヒトヒスタミンＨ３受容体は、Ｈ３サブクラスのヒスタミンの受容体として特異的に機能し得るタンパク質を指す。
【０００５】
ヒトヒスタミンＨ３受容体の完全なアミノ酸配列は従来、知られておらず、またヒトヒスタミンＨ３受容体をコードする完全なヌクレオチド配列も知られていなかった。これはヒトヒスタミンＨ３受容体をコードする完全長のＤＮＡ分子の最初の報告されたクローニングである。多種多様な細胞および細胞型が記述されるヒトヒスタミンＨ３受容体を含有するであろうと予測されている。ヒトヒスタミンＨ３受容体を産生することが可能な脊椎動物細胞は、ヒスタミンに対する感受性を示すもしくはこれを結合する細胞から単離されるヒトヒスタミンＨ３受容体細胞を包含するがしかしこれに制限されない。
【０００６】
他の細胞および細胞系もまた、ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡを単離するための使用に適しうる。適する細胞の選択は、ヒスタミンに応答するアデニル酸シクラーゼの阻害についてスクリーニングすることによりなされうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体の活性は、3Ｈ−αメチルヒスタミン結合アッセイ（ポラー（Ｐｏｌｌａｒｄ）、モリュー（Ｍｏｒｅａｕ）ら  １９９３）を実施することにより、またはヒトヒスタミンＨ３受容体の活性化によるアデニル酸シクラーゼの阻害もしくはＧＴＰ−γ−Ｓの取り込み（クラーク（Ｃｌａｒｋ）、コルテ（Ｋｏｒｔｅ）ら  １９９３）の直接測定によりモニターされ得る。このアッセイにおいてヒトヒスタミンＨ３受容体活性を保有する細胞は、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離に適しうる。
【０００７】
当該技術分野で既知の多様な処置のいずれかがヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡを分子的にクローン化するのに使用されうる。これらの方法は、適切な発現ベクター系中でのヒトヒスタミンＨ３受容体を含有するｃＤＮＡライブラリーの構築後のヒトヒスタミンＨ３受容体遺伝子の直接の機能的発現を包含するがしかしこれに制限されない。別の方法は、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトヒスタミンＨ３受容体を含有するｃＤＮＡライブラリーを、ヒトヒスタミンＨ３受容体のサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることである。さらなる一方法は、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトヒスタミンＨ３受容体を含有するｃＤＮＡライブラリーを、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡでスクリーニングすることより成る。この部分的ｃＤＮＡは、精製されたヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。
【０００８】
別の方法は、ヒトヒスタミンＨ３受容体産生細胞からＲＮＡを単離し、そしてインビトロもしくはインビボの翻訳系を介してそのＲＮＡをタンパク質に翻訳することである。ペプチドもしくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳は、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができ、これは例えば抗ヒトヒスタミンＨ３受容体抗体での免疫学的反応性もしくはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の生物学的活性により同定され得る。この方法において、ヒトヒスタミンＨ３受容体産生細胞から単離されたＲＮＡのプールが、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在について分析され得る。ＲＮＡのプールのさらなる分画を行ない、非ヒトヒスタミンＨ３受容体のＲＮＡからヒトヒスタミンＨ３受容体のＲＮＡを精製することができる。この方法により産生されるペプチドもしくはタンパク質が、順にヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡの産生のためのプライマーを提供するのに使用されるアミノ酸配列を提供するように分析されうるか、もしくは、翻訳に使用されるＲＮＡを分析し、ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするヌクレオチド配列を提供しそしてヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのこの産生のためのプローブを生じさせることができる。この方法は当該技術分野で既知であり、かつ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９中に、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）に見出され得る。
【０００９】
他の型のライブラリーならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されるライブラリーがヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡを単離するために有用でありうることも当業者に容易に明白である。他の型のライブラリーは、他の細胞、ヒト以外の生物体、ならびにＹＡＣ（酵母の人工的染色体）およびコスミドライブラリーを包含するゲノムＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡライブラリーを包含するがしかしこれらに制限されない。
【００１０】
適するｃＤＮＡライブラリーがヒトヒスタミンＨ３受容体活性を有する細胞もしくは細胞系から調製されうることは当業者に容易に明白である。ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製での使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、最初に、ヒトヒスタミンＨ３受容体に関連する生物学的活性の測定、または3Ｈ−ヒスタミンリガンド結合アッセイもしくは3Ｈ−Ｎ−メチルヒスタミンリガンド結合アッセイ、またはヒトヒスタミンＨ３受容体に結合する能力を有するリガンドを必要とするいずれかの放射リガンド結合を使用して細胞に関連するヒトヒスタミンＨ３受容体活性を測定することによりなされうる。
【００１１】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は当該技術分野で公知の標準的技術により実施され得る。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出され得る。
【００１２】
ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡは適するゲノムＤＮＡライブラリーからも単離されうることがまた当業者に容易に明白である。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施され得る。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）中、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）に見出され得る。
【００１３】
上の方法によりヒトヒスタミンＨ３受容体の遺伝子をクローン化するために、ヒトヒスタミンＨ３受容体のアミノ酸配列が必要でありうる。これを成し遂げるために、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質が精製され得、そして部分的アミノ酸配列が自動化シークェネーターにより決定されうる。アミノ酸配列全体を決定することは必要でないが、しかし当該タンパク質からの６ないし８アミノ酸の２領域の直線的配列が、部分的ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの産生のため決定される。
【００１４】
適するアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列が合成される。遺伝暗号の縮重のため、１種以上のコドンが特定の一アミノ酸をコードするのに使用され得るので、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされ得る。その組のただ１個の構成員がヒトヒスタミンＨ３受容体の配列に同一であることができるが、しかし、不適正をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であることができる。不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトヒスタミンＨ３レセプターのＤＮＡになお十分にハイブリダイズすることができ、ヒトヒスタミンＨ３レセプターをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にする。これらの方法により単離されたＤＮＡが、多様な細胞型、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングしそして相同な遺伝子を単離するのに使用され得る。
【００１５】
精製された生物学的に活性なヒトヒスタミンＨ３受容体はいくつかの異なる物理的形態を有しうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体は、完全長の原始型もしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチド、あるいはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在しうる。完全長の原始型ヒトヒスタミンＨ３受容体ポリペプチドは、特異的なタンパク質分解性切断事象により翻訳後に修飾されることができ、それは完全長の原始型ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす。１個のフラグメント、もしくはフラグメント類の物理的会合はヒトヒスタミンＨ３受容体に関連する完全な生物学的活性を有しうるが、しかしながらヒトヒスタミンＨ３受容体の活性の程度は、個々のヒトヒスタミンＨ３受容体フラグメントおよび物理的に結合したヒトヒスタミンＨ３受容体ポリペプチドフラグメント間で変動しうる。
【００１６】
本明細書に記述される方法により得られるクローン化されたヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡは、適するプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含有しそして組換えヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を産生するように原核生物もしくは真核生物宿主細胞中に導入された発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現されうる。こうした操作のための技術はマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）ら、上記に十分に記述されかつ当該技術分野で公知である。
【００１７】
発現ベクターは、本明細書で、適切な宿主におけるクローン化された遺伝子のコピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。こうしたベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、ランソウ、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞、および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物の遺伝子を発現するのに使用され得る。
【００１８】
特異的に設計されたベクターは細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞または細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの繰り返し往復(shuttling)を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力、および活性のプロモーターを含有するはずである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡに結合するよう指図しそしてＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始されさせるものである。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドもしくはウイルスを包含しうるがしかしこれらに制限されない。
【００１９】
多様な哺乳動物発現ベクターが哺乳動物細胞中で組換えヒトヒスタミンＨ３受容体を発現するのに使用されうる。組換えヒトヒスタミンＨ３受容体の発現に適しうる商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、ｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＸＴ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＧ５（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＣＩｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を包含するがしかしこれらに制限されない。
【００２０】
多様な細菌発現ベクターが細菌細胞中で組換えヒトヒスタミンＨ３受容体を発現するのに使用されうる。組換えヒトヒスタミンＨ３受容体の発現に適しうる商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、ｐＥＴベクター（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））およびｐＱＥベクター（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を包含するがしかしこれらに制限されない。
【００２１】
多様な真菌細胞発現ベクターが、酵母のような真菌細胞中で組換えヒトヒスタミンＨ３受容体を発現するのに使用されうる。組換えヒトヒスタミンＨ３受容体の発現に適しうる商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、ｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を包含するがしかしこれらに制限されない。
【００２２】
多様な昆虫細胞発現ベクターが、昆虫細胞中で組換えヒトヒスタミンＨ３受容体を発現するのに使用されうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体の組換え発現に適しうる商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を包含するがしかしこれに制限されない。
【００２３】
ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡは、組換え宿主細胞中での発現のため発現ベクター中にクローン化されうる。組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類起源の細胞系を包含するがしかしこれらに制限されない哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコ由来細胞を包含するがしかしこれらに制限されない昆虫細胞を包含するがしかしこれらに制限されない原核生物もしくは真核生物でありうる。適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞系は、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）を包含するがしかしこれらに制限されない。
【００２４】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法、リポフェクションおよび電気穿孔法を包含するがしかしこれらに制限されない多数の技術のいずれか一を介して宿主細胞中に導入されうる。発現ベクター含有細胞がクローン的に増殖され、そして、それらがヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を産生するかどうかを決定するため個々に分析される。ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現する宿主細胞クローンの同定は、抗ヒトヒスタミンＨ３受容体抗体との免疫学的反応性、および宿主細胞に関連したヒトヒスタミンＨ３受容体活性の存在を包含するがしかしこれらに制限されないいくつかの手段によりなされうる。
【００２５】
ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡの発現はまた、インビトロで産生された合成ｍＲＮＡを使用しても実施されうる。合成ｍＲＮＡ、もしくはヒトヒスタミンＨ３受容体産生細胞から単離されたｍＲＮＡが、コムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を包含するがしかしこれらに制限されない多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳され得、ならびにカエル卵母細胞への微小注入を包含するがしかしこれに制限されない細胞を基礎とする系で効率的に翻訳され得、カエル卵母細胞への微小注入が一般に好ましい。
【００２６】
至適な水準のヒトヒスタミンＨ３受容体活性および／もしくはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を生じるヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡ配列（１種もしくは複数）を決定するため、以下、すなわちおよそ塩基２９９からおよそ塩基１６３４（これらの数は最初のメチオニンの第一のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する）までの４８５６５ｋＤａのタンパク質をコードするヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡの完全長の読取り枠ならびにヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分を含有するいくつかの構築物を包含するがしかしこれに制限されないヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡ分子が構築され得る。全部の構築物は、ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域のいずれも含有しない、全部もしくは部分を含有するように設計され得る。ヒトヒスタミンＨ３受容体の活性およびタンパク質発現の水準が、適切な宿主細胞へのこれらの構築物の単独でおよび組み合わせでの双方の導入後に測定され得る。一過性のアッセイにおいて至適の発現を生じるヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡカセットの決定後に、このヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡ構築物が、哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を包含するがしかしこれらに制限されない宿主細胞での発現のため多様な発現ベクターに導入される。
【００２７】
宿主細胞のトランスフェクション体および微小注入された卵母細胞が、以下の方法により、ヒトヒスタミンＨ３受容体の活性の水準およびヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の水準の双方をアッセイするのに使用されうる。組換え宿主細胞の場合には、これは、１個もしくはそれ以上のフラグメントもしくはサブユニットをコードするヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡを含有する１種またはおそらく２種もしくはそれ以上のプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。卵母細胞の場合には、これは、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質をコードするＲＮＡの共注入を必要とする。発現を見込むための適切な時間の期間の後に、細胞のタンパク質が、例えば35Ｓ−メチオニンで２４時間代謝的に標識され、その後、細胞ライセートおよび細胞培養上清が収穫され、そしてヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質に対し向けられるポリクローナル抗体を用いる免疫沈降にかけられる。
【００２８】
ヒトヒスタミンＨ３受容体活性を検出するための他の方法は、ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞全体もしくはヒトヒスタミンＨ３受容体のｍＲＮＡを注入された卵母細胞におけるヒトヒスタミンＨ３受容体活性の直接測定を必要とする。ヒトヒスタミンＨ３受容体の活性は、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡを発現する宿主細胞の特異的リガンド結合および生物学的特徴により測定される。ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現する組換え宿主細胞および卵母細胞の場合は、ｃＡＭＰの定量および受容体結合技術が、ヒトヒスタミンＨ３受容体活性を測定しかつヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を定量するのに使用され得る方法の適する例である。
【００２９】
宿主細胞におけるヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の水準もまた、免疫親和性および／もしくはリガンド親和性技術により定量される。ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞が、細胞膜に結合する放射活性のヒスタミンもしくはヒスタミンＨ３リガンドの量を測定することにより、発現されるヒトヒスタミンＨ３受容体分子の数についてアッセイされ得る。ヒトヒスタミンＨ３受容体特異的な親和性ビーズもしくはヒトヒスタミンＨ３受容体特異的な抗体が、例えば35Ｓ−メチオニン標識されたもしくは標識されないヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を単離するのに使用される。標識されたヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される。標識されないヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、ヒトヒスタミンＨ３受容体特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイにより検出される。
【００３０】
遺伝暗号が縮重しているため、１種以上のコドンが特定の一アミノ酸をコードするのに使用されることができ、そして従ってアミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされ得る。その組のただ１個の構成員がヒトヒスタミンＨ３受容体配列に同一であることができるが、しかし、適切な条件下で、不適正をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であることができる。代替の条件下では、不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドはヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡになおハイブリダイズすることができてヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡの同定および単離を可能にする。
【００３１】
特定の生物体からのヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡが、他の生物体からヒトヒスタミンＨ３受容体の相同物を単離かつ精製するのに使用されうる。これを成し遂げるため、第一のヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡが、適切なハイブリダイゼーション条件下でヒトヒスタミンＨ３受容体の相同物をコードするＤＮＡを含有するサンプルと混合されうる。ハイブリダイズされたＤＮＡ複合体が単離されることができ、そして相同物ＤＮＡをコードするＤＮＡがそれから精製されうる。
【００３２】
特定のアミノ酸をコードする多様なコドンにかなりの数の重複性が存在することが既知である。従って、本発明は、同一のアミノ酸の終局的な翻訳をコードする代替のコドンを含有するＤＮＡ配列にもまた向けられる。この明細の目的上、１種もしくはそれ以上の置き換えられたコドンを担持する配列は縮重変異と定義されることができる。発現されたタンパク質の最終的な物理的特性を本質的に変えないＤＮＡ配列もしくは翻訳されたタンパク質のいずれかにおける突然変異もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、ロイシンについてバリン、リシンについてのアルギニンもしくはグルタミンについてのアスパラギンの置換はそのポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないことができる。
【００３３】
あるペプチドをコードするＤＮＡ配列が天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えられうることが既知である。ＤＮＡ配列の変更方法は部位特異的突然変異誘発を包含するがしかしこれに制限されない。変えられた特性の例は基質に対する酵素もしくはリガンドに対する受容体の親和性の変化を包含するがしかしこれらに制限されない。
【００３４】
本明細書で使用されるところのヒトヒスタミンＨ３受容体の「機能的誘導体」は、ヒトヒスタミンＨ３受容体の生物学的活性に本質的に類似である生物学的活性（機能的もしくは構造的のいずれか）を保有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ヒトヒスタミンＨ３受容体の「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」もしくは「化学的誘導体」を包含することを意図される。「フラグメント」という用語はヒトヒスタミンＨ３受容体のいずれかのポリペプチドサブセットを指すことを意味される。「変異体」という用語は、ヒトヒスタミンＨ３受容体分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに構造および機能が本質的に類似の分子を指すことを意味される。ある分子は、双方の分子が本質的に類似の構造を有する場合、もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を保有する場合にヒトヒスタミンＨ３受容体に「本質的に類似」である。従って、２種の分子が本質的に類似の活性を保有する場合、それらは、それら分子の一方の構造が他者で見出されない場合さえ、もしくは２種のアミノ酸配列が同一でない場合でさえ、変異体であると見なされる。「類似物」という用語は、ヒトヒスタミンＨ３受容体分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに機能が本質的に類似の分子を指す。
【００３５】
ヒトヒスタミンＨ３受容体に対する一特異性抗体は、ヒトヒスタミンＨ３受容体に対して反応性の抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製されるか、もしくは、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）の技術を使用してヒトヒスタミンＨ３受容体と反応性のモノクローナル抗体として製造される。本明細書で使用されるところの一特異性抗体は、ヒトヒスタミンＨ３受容体に対する均質な結合の特徴をもつ単一の抗体種もしくは複数の抗体種と定義される。本明細書で使用されるところの均質な結合は、上述されるようなヒトヒスタミンＨ３受容体に関連するもののような特異的抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ヒトヒスタミンＨ３受容体に特異的な抗体は、免疫アジュバントを伴いもしくは伴わずにのいずれかで適切な濃度のヒトヒスタミンＨ３受容体を用いて、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物を免疫することにより生じられ、ウサギが好ましい。
【００３６】
免疫前血清が最初の免疫に先立ち収集される。各動物は、許容できる免疫アジュバントと連合された約０．１ｍｇと約１０００ｍｇとの間のヒトヒスタミンＨ３受容体を受領する。こうした許容できるアジュバントは、フロイントの完全、フロイントの不完全、明礬沈殿物、コリネバクテリウム  パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含有する油中水乳剤を包含するがしかしこれらに制限されない。最初の免疫感作は、皮下に（ＳＣ）、腹腔内に（ＩＰ）もしくは双方のいずれかの複数の部位での、好ましくはフロイントの完全アジュバント中のヒトヒスタミンＨ３受容体より成る。各動物は定期的間隔で、好ましくは毎週、抗体力価を測定するために放血される。動物は初期免疫感作後に追加免疫注入を受領してもよいかもしくはしなくてもよい。追加免疫注入を受領する動物は、一般に、同一の経路によりフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を与えられる。追加免疫注入は最大の力価が得られるまで約３週間間隔で与えられる。各追加免疫の免疫感作後約７日もしくは単一の免疫感作後ほぼ毎週に動物が放血され、血清が収集され、そしてアリコートが約−２０℃で保存される。
【００３７】
ヒトヒスタミンＨ３受容体と反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを、ヒトヒスタミンＨ３受容体およびそのいずれかのフラグメントで免疫にすることにより調製される。マウスは、上に論考されるような等体積の許容できるアジュバント中に組み込まれた約０．５ｍｌの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約０．１ｍｇないし約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのヒトヒスタミンＨ３受容体でＩＰもしくはＳＣ経路により免疫にされる。フロイントの完全アジュバントが好ましい。マウスは、第０日に初期免疫感作を受領し、そして約３ないし約３０週間休められる。免疫にされたマウスは、静脈内（ＩＶ）経路によりリン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝溶液中の約０．１ないし約１０ｍｇのヒトヒスタミンＨ３受容体の１回もしくはそれ以上の追加免疫の免疫感作を与えられる。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ級が、当該技術分野で既知の標準的処置により免疫にされたマウスから脾を取り出すことにより得られる。ハイブリドーマ細胞が、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより製造される。融合パートナーは、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ  ２／０を包含しうるがしかしこれらに制限されなくてよく、Ｓｐ  ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞は、約３０％から約５０％までの濃度の約１０００モル重量のポリエチレングリコール中で融合される。融合されたハイブリドーマ細胞が、当該技術分野で既知の手順によりヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での成長により選択される。上清液が約第１４、１８および２１日に成長陽性のウェルから収集され、そして、抗原としてヒトヒスタミンＨ３受容体を使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングされる。培養液はｍＡｂのアイソタイプを決定するためのオークターロニー沈降アッセイでもまた試験される。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞が、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、クルーズ（Ｋｒｕｓｅ）とペイターソン（Ｐａｔｅｒｓｏｎ）編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７３中のマックファーソン（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ）、Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓのソフトアガー技術のような技術によりクローン化される。
【００３８】
モノクローナル抗体は、初回抗原刺激後約４日に約２×１０6ないし約６×１０6個のハイブリドーマ細胞でのプリスタンで初回抗原刺激されたＢａｌｂ／ｃマウスの注入（マウスあたりおよそ０．５ｍｌ）によりインビボで産生される。腹水が、細胞導入後およそ８〜１２日に収集され、そしてモノクローナル抗体が当該技術分野で既知の技術により精製される。
【００３９】
抗ヒトヒスタミンＨ３受容体ｍＡｂのインビトロ産生は、十分な量の特異的ｍＡｂを得るように約２％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを成長させることにより実施される。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製される。
【００４０】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価が、沈降、受動凝集反応、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を包含するがしかしこれらに制限されない多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定される。類似のアッセイが、体液もしくは組織および細胞抽出物中のヒトヒスタミンＨ３受容体の存在を検出するのに使用される。
【００４１】
一特異性抗体を産生するための上述された方法がヒトヒスタミンＨ３受容体ポリペプチドのフラグメントもしくは完全長の原始型ヒトヒスタミンＨ３受容体ポリペプチド、または個々のヒトヒスタミンＨ３受容体サブユニットに特異的な抗体を産生するのに利用されうることが当業者に容易に明白である。とりわけ、ただ１種のヒトヒスタミンＨ３受容体サブユニットもしくは完全に機能的なヒスタミンＨ３受容体に特異的である一特異性抗体が生じうることが当業者に容易に明白である。
【００４２】
哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞または細菌を包含するがしかしこれらに制限されないいずれかの組換え宿主中で発現される場合にヒスタミンまたはヒスタミンもしくはＲ−α−メチルヒスタミンを包含するがしかしこれらに制限されない他のヒスタミンＨ３リガンドに感受性のヒトヒスタミンＨ３受容体を形成するタンパク質をコードする、ｐＨ３Ｒと名づけられたＤＮＡクローンが同定される。ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡの発現はヒトヒスタミンＨ３受容体で観察される特性の発現をもたらす。これらは、ヒスタミンもしくはＲ−α−メチルヒスタミンまたは当業者に既知のいずれかの他のヒスタミンＨ３リガンドでの直接活性化を包含する。
【００４３】
ヒスタミンは、ほぼ全部の生理学的および病理生理学的状況で何らかの能力において機能する生命活動に不可欠なアミン伝達物質である。ヒスタミンは、中枢神経系において神経伝達物質および神経調節物質として作用し、炎症およびアレルギー応答を媒介し、気道の機能を調節し、胃中の酸分泌を制御し、心血管機能ならびに動脈および静脈応答を調節し、そして疑いなしになお決定されるはずである過程に関与する。これらの効果を媒介するヒスタミン受容体は完全に特徴づけられていない。どのヒスタミン受容体がこれらの過程で関与するかを理解するための一方法は、研究の道具および治療の実体として当該受容体の化学的モジュレーター（アゴニスト、アンタゴニスト）を開発することである。ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現する組換え宿主細胞が、こうしたアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法の材料を提供するのに使用され得る。そのようなものとしての、ヒトヒスタミンＨ３受容体の本発明は、研究の道具として有用と判明しうるかまたはヒスタミン受容体を直接もしくは間接的に巻き込む障害を治療するための治療薬として使用されうる新たなアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための一方法を直接に教示する。
【００４４】
本発明はまた、インビボでヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現ならびにヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の機能を調節する化合物についてのスクリーニング方法にも向けられる。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質もしくは非タンパク質性有機分子でありうる。化合物は、ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の機能を増大もしくは減弱することにより調節しうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の機能を調節する化合物は多様なアッセイにより検出されうる。そのアッセイは、発現もしくは機能に変化が存在するかどうかを決定する単純な「はい／いいえ（ｙｅｓ／ｎｏ）」アッセイでありうる。当該アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を標準サンプル中の発現もしくは機能の水準と比較することにより定量的にされうる。この方法で同定されるモジュレーターは、治療薬、研究の道具および診断薬として有用である。
【００４５】
ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ヒトヒスタミンＨ３受容体に対する抗体、またはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を含有するキットが製造されうる。こうしたキットが、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出する、またはサンプル中のヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するのに使用される。こうした特徴づけは、法廷の分析、診断の応用および疫学的研究を包含するがしかしこれらに制限されない多様な目的上有用である。
【００４６】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体が、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡ、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＲＮＡもしくはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質をスクリーニングしかつその水準を測定するのに使用されうる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ヒトヒスタミンＨ３受容体の検出および型分類に適するキットの処方にそれら自身を与える。こうしたキットは、緊密な閉じ込めの最低１個の容器中に保持するのに適する区画に分けられた担体を含んで成ることができる。当該担体は、組換えヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質、もしくはヒトヒスタミンＨ３受容体を検出するのに適する抗ヒトヒスタミンＨ３受容体抗体のような試薬をさらに含むことができる。当該担体は、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出手段もまた含有しうる。
【００４７】
ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列がアンチセンス療法のために合成され得る。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他のヒトヒスタミンＨ３受容体アンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物でありうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体アンチセンス分子は、微小注入、リポソーム包皮化、もしくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞中に導入されうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体アンチセンス療法は、ヒトヒスタミンＨ３受容体活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用でありうる。
【００４８】
ヒトヒスタミンＨ３受容体の遺伝子治療が、ヒトヒスタミンＨ３受容体を標的生物体の細胞中に導入するのに使用されうる。ヒトヒスタミンＨ３受容体遺伝子は、受領体宿主細胞の感染によりヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡの導入を媒介するウイルスベクター中に連結され得る。適するウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ結合体もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体、リポフェクチン膜融合もしくは直接微小注入を使用する受容体媒介性の標的を定められたＤＮＡ導入を包含する非ウイルス的技術により遺伝子治療のため細胞中に導入され得る。これらの処置およびそれらの変法がエクスビボならびにインビボのヒトヒスタミンＨ３受容体の遺伝子治療に適する。ヒトヒスタミンＨ３受容体の遺伝子治療は、ヒトヒスタミンＨ３受容体の活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用でありうる。
【００４９】
ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡ、ヒトヒスタミンＨ３受容体のＲＮＡもしくはヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質、またはヒトヒスタミンＨ３受容体の受容体活性のモジュレーターを含んで成る製薬学的に有用な組成物は、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方されうる。こうした担体および処方の方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出されうる。有効な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはモジュレーターを含有することができる。
【００５０】
本発明の治療的もしくは診断的組成物は、ヒトヒスタミンＨ３受容体関連の活性の調節が示される障害を治療もしくは診断するのに十分な量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性および齢のような多様な要因によって変動しうる。他の要因は投与の様式を包含する。当該製薬学的組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内のような多様な経路により個体に提供されうる。
【００５１】
「化学的誘導体」という用語は、通常は塩基分子の一部でない付加的な化学的部分を含有する分子を記述する。こうした部分は、塩基分子の溶解性、半減期、吸収などを改良しうる。あるいは、当該部分は、塩基分子の所望されない副作用を減弱しうるか、もしくは塩基分子の毒性を減少させうる。こうした部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような多様な教科書に記述される。
【００５２】
本明細書に開示される方法により同定される化合物は、いかなる潜在的毒性も最小限にする一方でヒトヒスタミンＨ３受容体の受容体もしくはその活性の至適の阻害を得るために慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用されうる。加えて、他の作用物質の共投与もしくは連続的投与が望ましいことができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明の新規治療方法での使用のための適する局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を提供するという目的も有する。ヒトヒスタミンＨ３受容体の受容体の調節での使用のための有効成分として本発明により同定される化合物もしくはモジュレーターを含有する組成物は、投与のための慣習的ベヒクル中の広範な治療的投薬形態で投与され得る。例えば、当該化合物もしくはモジュレーターは、錠剤、カプセル剤（それぞれ、時限放出および持続性放出製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口投薬形態で、もしくは注入により投与され得る。同様に、それらは、静脈内（ボーラスおよび注入(infusion)の双方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴うもしくは伴わない局所、または筋肉内の形態でもまた投与されることができ、全部は製薬学的技術の当業者に公知の形態を使用する。有効なしかし非毒性の量の所望される化合物がヒトヒスタミンＨ３受容体調節剤として使用され得る。
【００５４】
生成物の１日投薬量は、患者あたり１日あたり０．０１から１，０００ｍｇまでの幅広い範囲にわたって変動されうる。経口投与のためには、当該組成物は、好ましくは、治療されるべき患者に対する投薬量の症候的調節のため、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線を付けられたもしくは割線を付けられない錠剤の形態で提供される。有効量の薬物は、通常、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量水準で供給される。この範囲は、より具体的には、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重までである。ヒトヒスタミンＨ３受容体の受容体モジュレーターの投薬量は、所望の効果を達成するために組み合わせられる場合に調節される。他方、これらの多様な作用物質の投薬量は相乗的結果を達成するために独立に至適化されることができかつ組み合わせられることができ、ここで、病状は、いずれかの作用物質が単独で使用された場合にそうであるとみられるよりも低下される。
【００５５】
有利には、本発明の化合物もしくはモジュレーターは単一の１日用量で投与されうるか、もしくは総１日投薬量が１日２、３もしくは４回の分割された用量で投与されうる。さらに、本発明のための化合物もしくはモジュレーターは、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介する鼻内の形態で、もしくは当業者に公知の経皮皮膚貼付物の形態を使用する経皮経路を介して投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与は、もちろん、投薬計画全体で間歇的よりはむしろ連続的であることができる。
【００５６】
１種以上の有効成分との併用療法（ここで、有効成分が別個の投薬量製剤中にある）のためには、有効成分は同時に投与され得るか、もしくはそれらはそれぞれ別個に時差的な時間に投与され得る。
【００５７】
本発明の化合物もしくはモジュレーターを利用する投薬計画は、患者の型、種、齢、体重、性および医学的状況；治療されるべき状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な要因に従って選択される。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、その状態の進行を予防、反撃もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方し得る。毒性なしに有効性を生じる範囲内の薬物の濃度の達成での至適の正確さは標的部位に対する薬物の利用性の力学を基礎とした計画を必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【００５８】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物もしくはモジュレーターは有効成分を形成し得、そして、典型的には、意図された投与の形態に関して適して選択された適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（集合的に本明細書で「担体」物質と称される）との、かつ、慣習的製薬学的実務と矛盾しない混合状態、すなわち経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などで投与され得る。
【００５９】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のためには、有効薬物成分は、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせられ得る。さらに、所望もしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた当該混合物に組み込まれ得る。適する結合剤は、制限なしに、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然のおよび合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしに、デンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【００６０】
液体形態のためには、有効薬物成分は、合成および天然のガム、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどのような適して風味をつけられた(flavored)沈殿防止剤もしくは分散助剤中に組み合わせられ得る。使用されうる他の分散助剤はグリセリンなどを包含する。非経口投与のためには滅菌の懸濁液および溶液が望ましい。適する保存剤を一般に含有する等張製剤が、静脈内投与が望ましい場合は使用される。
【００６１】
有効薬物成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール溶液、局所浄化剤(cleanser)、クレンジングクリーム、皮膚ゲル、皮膚ローションおよびクリームもしくはゲル製剤のシャンプーを形成するために、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油，鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合され得る。
【００６２】
本発明の化合物もしくはモジュレーターは、小さな単薄層状小胞(unilamellar vesicle)、大きな単薄層状小胞および多薄層状小胞のようなリポソーム送達系の形態でもまた投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成され得る。
【００６３】
本発明の化合物は、それに化合物分子が結合される別個の担体としてのモノクローナル抗体の使用によってもまた送達されうる。本発明の化合物もしくはモジュレーターは、標的を定められる薬物担体としての可溶性ポリマーともまた結合されうる。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含し得る。さらに、本発明の化合物もしくはモジュレーターは、薬物の制御された放出の達成で有用なある分類の生物分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合されうる。
【００６４】
経口投与のためには、当該化合物もしくはモジュレーターは、カプセル剤、錠剤もしくはボーラスの形態で投与されることができるか、または、あるいは、それらは動物飼料中に混合され得る。カプセル剤、錠剤およびボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸二カルシウムのような適切な担体ベヒクルとともに有効成分から構成される。これらの単位投与剤形は、均一な混合物が得られるように、有効成分を、希釈剤、増量剤、崩壊剤および／もしくは結合剤を包含する適する微細に粉末にされた不活性成分と緊密に混合することにより製造される。不活性成分は、当該化合物もしくはモジュレーターと反応することができず、かつ、治療されている動物に対し非毒性であるものである。適する不活性成分は、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ガムおよび油などを包含する。これらの製剤は、治療されるべき動物種の大きさおよび型、ならびに感染の型および重症度のような多数の要因に依存して、幅広く変動する量の有効および非有効成分を含有しうる。有効成分は、当該化合物を飼料と単に混合すること、もしくは当該化合物を飼料の表面に適用することにより、飼料に対する添加物としてもまた投与されうる。あるいは、有効成分は不活性担体と混合されることができ、そして生じる組成物がその後飼料と混合されるかもしくは動物に直接与えられるかのいずれかでありうる。適する不活性担体は、挽き割りトウモロコシ、柑橘飼料(citrus meal)、醗酵残渣、粗碾きダイズ(soya grit)、乾燥穀粒などを包含する。有効成分は、最終組成物が０．００１から５重量％までの有効成分を含有するように、粉砕(grinding)、攪拌、磨砕(milling)もしくは混転(tumbling)によりこれらの不活性担体と緊密に混合される。
【００６５】
当該化合物もしくはモジュレーターは、あるいは、不活性の液体担体に溶解された有効成分より成る製剤の注入を介して非経口で投与されうる。注入は筋肉内、intraruminal、気管内もしくは皮下のいずれかでありうる。注入可能な製剤は適切な不活性の液体担体と混合された有効成分より成る。許容できる液体担体は、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などのような植物性油、ならびにソルケタール(solketal)、規格のグリセロール(glycerol formal)などのような有機溶媒を包含する。一代替として、水性の非経口製剤もまた使用されうる。植物性油が好ましい液体担体である。当該製剤は、最終製剤が０．００５から１０重量％までの有効成分を含有するように有効成分を液体担体中に溶解もしくは懸濁することにより製造される。
【００６６】
当該化合物もしくはモジュレーターの局所適用が、水性の溶液もしくは懸濁液として本化合物もしくはモジュレーターを含有する液体浸積液もしくはシャンプーの使用により可能である。これらの製剤は、一般にベントナイトのような沈殿防止剤を含有し、そして、通常消泡剤もまた含有することができる。０．００５から１０重量％までの有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は、０．０１から５重量％までの本化合物もしくはモジュレーターを含有するものである。
【００６７】
以下の実施例は、しかしながらそれに対する制限なしに本発明を具体的に説明する。
【００６８】
実施例１
ヒトヒスタミンＨ３受容体のＤＮＡのクローニング（ｐＨ３Ｒ）
ｃＤＮＡの合成：
第一鎖の合成：およそ５μｇのヒト視床ｍＲＮＡ（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））を使用して、ｃＤＮＡ合成キット（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用してｃＤＮＡを合成した。２μｌのＮｏｔＩプライマーアダプターを５μｌのｍＲＮＡに添加し、そして混合物を１０分間７０℃に加熱し、そして氷上に置いた。以下の試薬、すなわち４μｌの５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）、２μｌの０．１ＭＤＴＴ、１０ｍＭのｄＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）混合物および１μｌのＤＥＰＣ処理水を氷上で添加した。反応を４２℃で５分間インキュベーションした。最後に、５μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＲＴＩＩを添加し、そしてさらに２時間４２℃でインキュベーションした。反応を氷上で停止した。
【００６９】
第二鎖の合成：第一鎖生成物を水で９３μｌに調節し、そして以下の試薬、すなわち３０μｌの５×第二鎖緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、４５０ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．７５ｍＭのβ−ＮＡＤ＋、５０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4）、３μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）、１μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（１０単位）１μｌのＲＮアーゼＨ（２単位）、４μｌのＤＮＡｐｏｌＩ（１０単位）を氷上で添加した。反応を１６℃で２時間インキュベーションした。第二鎖合成からのＤＮＡをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そして１６℃に置いてＤＮＡ端を平滑化した。二本鎖ｃＤＮＡを、１５０μｌのフェノールおよびクロロホルムの混合物（１：１、ｖ：ｖ）で抽出し、そして０．５体積の７．５ＭＮＨ4ＯＡｃおよび２体積の無水エタノールで沈殿した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして３７℃で乾燥して残余のエタノールを除去した。二本鎖ＤＮＡのペレットを２５μｌの水に再懸濁し、そして以下の試薬、すなわち１０μｌの５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１０μｌのＳａｌＩアダプターおよび５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。材料を穏やかに混合し、そして一夜１６℃で連結した。連結混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、徹底的にボルテックス攪拌し、そして１４，０００×ｇで５分間室温で遠心分離して相を分離した。水相を新たなチューブに移し、そして体積を水で１００ｍｌに調節した。精製されたＤＮＡを、クロマスピン（ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）１０００カラム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））上で大きさを選択してより小さなｃＤＮＡ分子を除外した。二本鎖ＤＮＡを、３７℃で３〜４時間、ＮｏｔＩ制限酵素で消化した。制限消化物を、０．８％低溶融アガロースゲル上で電気泳動した。１〜５ｋｂの範囲のｃＤＮＡを切り出し、そしてゲルザイム（Ｇｅｌｚｙｍｅ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して精製した。生成物をフェノール：クロロホルムで抽出し、そしてＮＨ4ＯＡｃおよび無水エタノールで沈殿した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして１０ｍｌの水に再懸濁した。
【００７０】
ベクターへのｃＤＮＡの連結：ｃＤＮＡを５本のチューブに分割し（各２μｌ）、そして、連結反応を、４．５μｌの水、２μｌの５×連結緩衝液、１μｌのｐ−ＳｐｏｒｔベクターＤＮＡ（ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断されそしてホスファターゼ処理された）および０．５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加することにより生じさせた。連結を４０℃で一夜インキュベーションした。
【００７１】
電気穿孔法による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への連結されたｃＤＮＡの導入：
連結反応の体積を水で２０μｌの総体積に調節した。５ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、１２．５ｍｌの７．５ＭのＮＨ4ＯＡｃおよび７０ｍｌの無水エタノール（−２０℃）を添加した。混合物を徹底的にボルテックス攪拌し、そして直ちに室温で１４，０００×ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、そして各ペレットを５ｍｌの水に再懸濁した。全部の５個の連結（２５ｍｌ）をプールし、そして１００μｌのＤＨ１０Ｂ電気コンピテント細胞（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を１ｍｌのＤＮＡで電気穿孔し（全部で２０の電気穿孔）、その後アンピシリンプレート上でプレート培養して１μｌあたりの組換え体の数（ｃｆｕ）を決定した。ライブラリー全体を２リットルのスーパー培地（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）中に植菌し、そしてマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）をプロメガ  マキシ  プレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐ）キットを使用して作成し、そして塩化セシウム勾配上で精製した。
【００７２】
ライブラリーのスクリーニング：
上で構築されたライブラリーの１μｌのアリコートを、エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に電気穿孔した。体積を、ＳＯＣ培地で１ｍｌに調節し、そして振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。ライブラリーをその後、プレートあたりコロニー５０００個の密度までＬＢを含有する５０個の１５０ｃｍ2のプレート上でプレート培養した。これらを３７℃で一夜成長させた。
【００７３】
ヒスタミンＨ３受容体のプローブを、以下のプライマー対を使用するポリメラーゼ連鎖反応により生じさせた。５’オリゴ：５’ＡＣＴＧＧＴＡＣＧＡＡＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣ３’［配列番号２］および３’オリゴ：５’ＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧ３’［配列番号１］。最終のプローブの配列を図６に示す。増幅は、５０〜６０℃のアニーリング温度および鋳型としてヒト視床ｃＤＮＡを用いて３５回循環させた。生じられたＰＣＲ断片（４００〜５００ｂｐ）を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントおよびオリゴ標識キット（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して32Ｐ標識した。このフラグメントをその後Ｓ−２００カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を通る１回の通過により浄化した。
【００７４】
ライブラリーのコロニーをニトロセルロースフィルター上に持ち上げ、そしてＵＶ照射（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を介して交差結合させた。フィルターを４２℃で緩衝液（５０ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中で３回洗浄した。フィルターをその後、１：１のサザンプレハイブ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｒｅｈｙｂ）：ホルムアミド中で４２℃で６時間、サケ精子ＤＮＡ（５０ｍｇ、煮沸された）とプレハイブリダイズさせた。フィルターをその後、プローブ（１×１０6カウント／ｍｌ）と一夜ハイブリダイズさせた。フィルターをその後、室温で２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分間１回、４５℃でそれぞれ３０分間０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。フィルターをその後プラスチックラップ中に包み、そして−８０℃で一夜フィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ））に曝露した。
【００７５】
陽性クローンを同定した。生じる陽性を元のプレートから中心をとり(cored)、ＬＢ中で３７℃で４５分間インキュベーションし、そして一夜再度プレート培養した。フィルターの持ち上げ／ハイブリダイズ／洗浄／コロニー拾い上げ手順を、個々のｃＤＮＡを表わす単一のクローンもしくはクローン類が単離されるまで繰り返した。
【００７６】
ヒトヒスタミンＨ３受容体についてのスクリーニングから、全部のｃＤＮＡクローンを単離かつ配列決定した。１種のクローンｐＨ３Ｒが２６９９ｂｐの挿入物を含有した（図１）。この配列はヌクレオチド２９９から１３３５まで明らかな読取り枠を有した（図２）。この読取り枠は４４５アミノ酸のタンパク質をコードした（図３）。
【００７７】
実施例４
哺乳動物発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのクローニング
ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡ（集合的にｐＨ３Ｒと称される）を、哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏにクローニングした。ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡクローンをヒト視床のｃＤＮＡライブラリーから単離した。完全長のｃＤＮＡを、クローニングのためのＥｃｏＲＩ（５’ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＡＡＣ３’）［配列番号３］およびＮｏｔＩ（５’ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧ３’）［配列番号４］部位をもつ特異的プライマーを使用するＰＣＲのための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物をカラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キット）上で精製し、そしてＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で消化して接着末端を創製した。この生成物を低溶融アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐＣＩｎｅｏベクターをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ酵素で消化し、そしてその後低溶融アガロースゲル上で精製した。直線状ベクターを使用してヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡ挿入物を連結した。ヒトヒスタミンＨ３受容体と称された組換え体を単離し、そしてＣａＰＯ4−ＤＮＡ沈殿により哺乳動物細胞（Ｌ細胞）をトランスフェクションするのに使用した。安定な細胞クローンをＧ４１８の存在下での成長により選択した。単一のＧ４１８耐性クローンを単離し、そして無傷のヒトヒスタミンＨ３受容体遺伝子を含有することを示した。ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡを含有するクローンを、（コニッヒ（Ｋｏｎｉｇ）、マハン（Ｍａｈａｎ）ら  １９９１）の方法に従ってヒスタミンに応答してのアデニル酸シクラーゼの阻害を測定することにより（図５）、もしくはフラッシュプレーツ（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ）（ＮＥＮ）を使用するラジオイムノアッセイによりｃＡＭＰの蓄積を直接測定することによりｐＨ３Ｒの発現について分析した。発現は、［3Ｈ］−Ｎ−α−メチルヒスタミン結合アッセイ（クラーク（Ｃｌａｒｋ）、コルテ（Ｋｏｒｔｅ）ら  １９９２）を使用してもまた分析した。ヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡを含有する組換えプラスミドを使用して、哺乳動物のＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３もしくはＬ細胞を形質転換した。
【００７８】
安定にもしくは一過性にヒトヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を使用して、ヒトヒスタミンＨ３受容体の発現および［3Ｈ］−Ｎ−α−メチルヒスタミン結合活性について試験する。これらの細胞を、ヒトヒスタミンＨ３受容体を調節、阻害もしくは活性化する、および放射活性のヒスタミン結合について競争するそれらの能力について他の化合物を同定かつ検査するのに使用する。
【００７９】
プロモーターに関して正の向きにヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡを含有するカセットを、プロモーターの３’の適切な制限部位に連結し、そして制限部位地図作製および／もしくは配列決定により同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、線維芽宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ１６５１）およびＣＶ−１ｔａｔ［ザッケヴィッツ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７）］、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ６３６２）］に、電気穿孔法もしくは化学的処置（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を包含するがしかしこれらに制限されない標準的方法により導入する。トランスフェクションされた細胞および細胞培養物上清を収穫し、そして本明細書に記述されるようなヒトヒスタミンＨ３受容体発現について分析する。
【００８０】
哺乳動物の一過性発現に使用されたベクターの全部が、ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現する安定な細胞系を樹立するのに使用され得る。発現ベクター中にクローン化された変えられないヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡ構築物は、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を作成するように宿主細胞を条件づけることが予期される。トランスフェクション宿主細胞は、ＣＶ−１−Ｐ［ザッケビッツ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら  Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０およびｄｈｆｒ−ＣＨＯ［カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）とシャープ（Ｓｈａｒｐ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１、（１９８２）］を包含するがしかしこれらに制限されない。
【００８１】
Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーぜを包含するがしかしこれらに制限されない薬物選択プラスミドを伴うヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡを含有するいずれかのベクターのコトランスフェクションは、安定にトランスフェクションされるクローンの選択を見込むことができる。ヒトヒスタミンＨ３受容体の水準が本明細書に記述されるアッセイにより定量される。
【００８２】
ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡ構築物はまた、最高の可能な水準のヒトヒスタミンＨ３受容体を合成する哺乳動物細胞クローンの産生のための増幅可能な薬物耐性マーカーを含有するベクターにも連結される。細胞へのこれらの構築物の導入の後、当該プラスミドを含有するクローンが適切な作用物質で選択され、そして高コピー数のプラスミドをもつ過剰発現クローンの単離が、増大する用量の作用物質での選択により成し遂げられる。
【００８３】
組換えヒトヒスタミンＨ３受容体の発現は、哺乳動物宿主細胞への完全長のヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのトランスフェクションにより達成される。
【００８４】
ヒトヒスタミンＨ３受容体の特徴づけ
マウスＬ細胞をｐＨ３Ｒでトランスフェクションし、そしてネオマイシンの存在下で１０日間選択した。個々のコロニーを拾い、そして６穴皿中で成長させた。細胞をその後９６穴プレート上でプレート培養し、そしてコンフルエンスまで成長させた。細胞を、イソブチルメチルキサンチン（１ｍＭ）とともに２０分間インキュベーションした。細胞をその後、ヒスタミン（１００ｎＭ〜１００μＭ）で５分間刺激した。細胞をその後フォルスコリン（３μＭ）で刺激し、そして３７℃で２０分間インキュベーションさせた。細胞をその後０．１Ｎ塩酸で処理した。細胞をその後凍結および融解した。上清のアリコートをその後、標準的ｃＡＭＰラジオイムノアッセイキット（フラッシュプレーツ（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ）、ＮＥＮ）を使用してそれらの環状ＡＭＰ含量について分析した。フォルスコリン処理はｃＡＭＰの細胞内濃度を上昇させる。フォルスコリンに応答してｃＡＭＰ含有量を減少させることによりヒスタミンに応答したいかなる細胞も活性の機能性ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現しているとみなした。本明細書に記述されるヒトヒスタミンＨ３受容体をコードするＤＮＡ分子から発現された組換えヒトヒスタミンＨ３受容体が、ヒスタミンＨ３受容体アゴニストにより特異的に活性化されることが示され、また、ヒスタミンＨ３受容体アンタゴニストにより阻害されることもまた示された。
【００８５】
実施例５
組換えヒトヒスタミンＨ３受容体での結合アッセイ  上述されたようなフォルスコリン刺激されたｃＡＭＰの蓄積を阻害したＬ細胞を１５０ｃｍ2の組織培養皿で成長させた。細胞を生理的食塩水溶液で洗浄し、細胞スクレーパーではがし、そして遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により収集した。ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現するＬ細胞は高親和性で3Ｈ−Ｎ−α−メチルヒスタミンを結合した（図７）。細胞膜を、高速で１０秒間のポリトロン組織ホモジェナイザーを用いる２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中での細胞ペレットの均質化により調製した。ホモジェネートを１０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離した。上清をその後収集し、そして２０，０００×ｇで２５分間４℃で遠心分離した。最終のペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌに再懸濁した。細胞膜を、過剰のヒスタミン（１００００ｎＭ）の存在もしくは非存在下で3Ｈ−Ｎ−α−メチルヒスタミン（０．０１ｎＭ〜２５ｎＭ）とともにインキュベーションした。インキュベーションは室温で４５分間実施した。膜を、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｃフィルター上での迅速濾過により収穫し、そして氷冷５０ｍＭトリスＨＣｌで４回洗浄した。フィルターをその後乾燥し、発光体(scintillant)と混合し、そして放射活性について計数した。ヒトヒスタミンＨ３受容体を発現するＬ細胞を使用して、多様な濃度の試験されるべき阻害剤もしくは化合物の存在下で上述された反応をインキュベーションすることにより、他の化合物の結合の親和性および3Ｈ−リガンド結合を置き換えるそれらの能力を測定した。
【００８６】
実施例６
ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の一次構造
ｐＨ３Ｒ受容体のヌクレオチド配列は約１３３５塩基対の単一の大きな読取り枠を示した。このｃＤＮＡはｐＨ３Ｒの約２９８および約１０６６ヌクレオチドの５’および３’非翻訳伸長を有する。第一の同じ読み枠のメチオニンを、約４８６５６の推定分子質量（Ｍr）をもつヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質を予測する１個の読取り枠の開始コドンとして指名した。
【００８７】
予測されるヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質をヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列し、そしてヒトヒスタミンＨ１およびヒトヒスタミンＨ２受容体に関連付けられることを見出した。ヒトヒスタミンＨ３受容体中のおよそ２５％のアミノ酸が高度に保存され、ヒスタミンＨ２受容体内の最低２５％、ヒスタミンＨ１受容体と２８％、そして生命活動に不可欠なアミンＧタンパク質共役型受容体のファミリーとおよそ２５％のアミノ酸同一性を示した。７個の保存された疎水性ドメインのような受容体のこのファミリーで見出される保存されたモチーフがヒトヒスタミンＨ３受容体配列中でもまた見出された。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第三の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたアスパラギン酸残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第一の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたアスパラギン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第三の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたアルギニン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第四の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたトリプトファン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第五の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたフェニルアラニン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第六の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたプロリン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質は、全部の生命活動に不可欠なアミン受容体の第七の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたチロシン残基を含有した。
【００８８】
実施例７
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのクローニング
組換えヒトヒスタミンＨ３受容体は、ｐＥＴシリーズ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を包含するがしかしこれらに制限されない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ３受容体発現カセットの導入後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生される。ｐＥＴベクターは、ヒトヒスタミンＨ３受容体発現を、しっかりと調節されるバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置く。誘導可能なｌａｃプロモーターにより駆動されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主へのこの構築物の導入の後、ヒトヒスタミンＨ３受容体の発現が、適切なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）が培養物に添加される場合に誘導される。発現されたヒトヒスタミンＨ３受容体の水準を、本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
【００８９】
ヒトヒスタミンＨ３受容体の読取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正の向きの構築物を配列分析により同定し、そして発現宿主株ＢＬ２１を形質転換するのに使用する。形質転換体をその後、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質の産生のため培養物を接種するのに使用する。培養物はＭ９もしくはＺＢ培地中で成長させることができ、その処方は当業者に既知である。ＯＤ600＝１．５までの成長の後に、ヒトヒスタミンＨ３受容体の発現を、１ｍＭのＩＰＴＧで３７℃で３時間誘導する。
【００９０】
実施例８
昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノム由来であるバキュロウイルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系統（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ番号  １７１１）中でｃＤＮＡの高レベル発現を提供するよう設計する。ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスを、以下の標準的方法（インヴィトロジェン  マックスバック  マニュアル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｘｂａｃ  Ｍａｎｕａｌ））により産生する。すなわち、ヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を包含する多様なバキュロウイルス導入ベクター中のポリへドリン遺伝子中に連結する。組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞へのバキュロウイルス導入ベクターおよび直線状にされたＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡのコトランスフェクション後の相同的組換えにより生じさせる［キッツ（Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］。組換えｐＡＣ３６０ウイルスを、感染した細胞中での封入体の非存在により同定し、そして組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現を基礎として同定する（サマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．）とスミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．）、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第１５５５号）。プラーク精製の後、ヒトヒスタミンＨ３受容体発現を本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
【００９１】
ヒトヒスタミンＨ３受容体の読取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。正の向きの構築物を配列分析により同定し、そして直線状のＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクションするのに使用する。
【００９２】
真正の活性のヒトヒスタミンＨ３受容体が感染した細胞の細胞質中で見出される。活性のヒトヒスタミンＨ３受容体を、低張もしくは洗剤溶解により、感染した細胞から抽出する。
【００９３】
実施例９
酵母発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのクローニング
組換えヒトヒスタミンＨ３受容体を、異種タンパク質の細胞内もしくは細胞外発現を指図するよう設計された発現ベクターへの至適のヒトヒスタミンＨ３受容体のｃＤＮＡのシストロンの挿入後に酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で産生する。細胞内発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのようなベクターをヒトヒスタミンＨ３受容体のシストロンに連結する［ライナス（Ｒｉｎａｓ，Ｕ．）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５４３−５４５（１９９０）；ホロヴィッツ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現のためには、ヒトヒスタミンＨ３受容体のシストロンを、ヒトヒスタミンＨ３受容体タンパク質のＮＨ2末端に分泌シグナル（酵母もしくは哺乳動物ペプチド）を融合する酵母発現ベクターに連結する［ジェイコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．）、Ｇｅｎｅ  ８５：５１１−５１６（１９８９）；リエ（Ｒｉｅｔｔ  Ｌ．）とベロン（Ｂｅｌｌｏｎ  Ｎ．）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
【００９４】
これらのベクターは、発現されるｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合するｐＡＶＥ１＞６［スティープ（Ｓｔｅｅｐ  Ｏ．）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６（１９９０）］および発現されるｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを融合するベクターｐＬ８ＰＬ［ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８−２７３２）］を包含するがしかしこれらに制限されない。加えて、ヒトヒスタミンＨ３受容体は、ベクターｐＶＥＰを利用してユビキチンに結合された融合タンパク質として酵母中で発現される［エッカー（Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５−７７１９（１９８９）、サビン（Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７０５−７０９（１９８９）、マクドネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：５５１７−５５２３（１９８９）］。発現されるヒトヒスタミンＨ３受容体の水準を、本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
【００９５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  発明にかかる、非翻訳領域を包含するヒトヒスタミンＨ３受容体の完全なヌクレオチド配列が示される。
【図２】  発明にかかる、ヒトヒスタミンＨ３受容体のコーディング領域のヌクレオチド配列が示される。
【図３】  発明にかかる、ヒトヒスタミンＨ３受容体のアミノ酸配列が示される。
【図４】  発明にかかる、ヒトヒスタミンＨ３受容体の組織分布が示される。
【図５】  発明にかかる、既知のＨ３アゴニスト（Ｒ−α−メチルヒスタミン）および既知のＨ３アンタゴニスト（チオペラミド）によるヒトヒスタミンＨ３受容体の調節が示される。
【図６】  発明にかかる、ｐＨ３Ｒプローブのヌクレオチド配列が示される。
【図７】  発明にかかる、ｐＨ３Ｒを発現するＬ細胞への［3Ｈ］−Ｎ−α−メチルヒスタミンの飽和結合が示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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