(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を生体外で誘導するための方法であって、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とインキュベートする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
化合物が、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を生体外で維持するための方法であって、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞を継続培養する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
化合物が、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を生体外で拡大培養する方法であって、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記工程において、さらに抗ＣＤ３抗体の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記工程において、細胞傷害性Ｔ細胞をフィーダ細胞とともにインキュベートする請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
フィーダ細胞が非ウイルス感染細胞である請求項７記載の方法。
【請求項９】
化合物が、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項５〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれかに記載の方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞含有培養物から抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の回収方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医療分野において有用な、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導、維持ならびに拡大培養する方法に関する。
背景技術
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）４マーカーを有し主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨ）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴＣ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある。）クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原性ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原性ペプチド及びＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原性ペプチドが自己由来のものなのか、或は、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特に免疫機能が正常なヒト由来のＣＴＬ又はＴ細胞から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（イン・ビトロ）で誘導した後、患者へ移入する養子免疫治療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルを用いた養子免疫療法がウイルス感染及び腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されており〔グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．）著、アドバンセズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１９９２年発行〕、さらに、免疫不全患者にＣＴＬを投与することにより、毒性を示すことなく、急速かつ持続的にサイトメガロウイルスが排除される特異的ＣＴＬ応答の再構築が行われた〔ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第７８巻、第１３７３〜１３８０頁（１９９１）〕ことなどから、先天性、後天性及び医原性によるＴ細胞免疫不全症患者への使用も注目されている。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
またＣＴＬの細胞数の維持及び増加については、動物モデルでの研究からヒトの養子免疫療法において有効な細胞数を推測すると、１０９〜１０１０個の抗原特異的Ｔ細胞が必要とされている〔グリーンバーグ著、アドバンセズ・イン・イムノロジー、１９９２年発行〕。すなわち、養子免疫療法においては、イン・ビトロでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性の維持及び増強については、ＣＴＬの抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、この方法は、一時的には細胞数が増える場合もあるが、最終的には、細胞数が減ってしまい、必要とする細胞数が得られない。この対応策としては、抗原による刺激を繰り返す初期の段階において細胞を凍結保存するか、クローニングを行って得られた抗原特異的ＣＴＬクローンの、一部を凍結保存した後、長期培養により細胞数や抗原特異的傷害活性が低下した時に、凍結した細胞を融解して再度抗原刺激を繰り返すしかないのが、現状である。
マウスＴ細胞を用いて長期培養でＴ細胞を樹立する方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９４巻、第６９７〜６９９頁（１９８１）〕が報告されているが、これはＴ細胞を単離・株化する方法であり、この方法でＴ細胞を１０９〜１０１０個の細胞まで増殖することは不可能である。次に、米国特許第５，０５７，４２３号には、インターロイキン２（ＩＬ−２）を高濃度で大量に使用してリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を誘導し、３〜４日間で細胞数を１００倍まで増やす方法が開示されている。これは、通常、１個の細胞が分裂して２個に増殖するのに約２４時間かかることを考えれば、飛躍的な細胞数である。また、同様に高濃度のＩＬ−２を用いて腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を誘導して養子免疫療法を試みている〔ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、第３１６巻、第１３１０〜１３２１（１９８６）；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、第１６７６〜１６８０頁（１９８８）；Ｂｌｏｏｄ、第８１巻、第２０９３〜２１０１頁（１９９３）〕。しかし、前者は抗原に対して非特異的なＴ細胞の取得法であり、後者は活性化しているポリクローナルなリンパ球集団を用いるために特異性があったとしても僅かである。更に、上記の方法ではともに細胞増殖を促進する為に高濃度のＩＬ−２を用いており、高濃度のＩＬ−２で処理されたＴ細胞がＩＬ−２非存在下で特異的抗原刺激を受けた場合にアポトーシス（細胞死）を起こす可能性があるとの報告〔Ｎａｔｕｒｅ、第３５３巻、第８５８〜８６１頁（１９９１）；ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第２３巻。第１５５２〜１５６０頁（１９９２）〕から、上記方法で得られたＬＡＫ細胞やＴＩＬの有効性には問題がある。
また、Ｔ細胞をＴ細胞増殖因子とＩＬ−２存在下で低密度（５×１０３〜１×１０４個／ｍｌ）で培養すると７日間にわたって急速に増殖し、最終的には細胞数が３〜５×１０５個／ｍｌという飽和密度まで増殖する。しかしながら、ひとたびこの飽和密度に達すると、細胞が常に死んでしまうという報告もある〔イムノロジカル・レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．、第５４巻、第８１〜１０９頁（１９８１）〕。従って、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ及び低密度によるＴ細胞培養方法は、実用面においても、有用面においても問題を有している。
次に、抗原特異的なＣＴＬに関しては、同系異種由来のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬをイン・ビトロにて５〜１２週間培養してＣＴＬを増殖させた後、免疫不全の患者に静脈内投与する養子免疫療法（Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８〜２４０，１９９２）、自己ＣＭＶ感染繊維芽細胞とＩＬ−２〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１４６巻、第２７９５〜２８０４頁（１９９１）〕及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１２８巻、第１８９〜２０１頁（１９９０）〕を用いてＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法が報告されている。しかし、これらの方法には大きな問題点が存在する。すわなち、１×１０９個／ｍｌの抗原特異的ＣＴＬを得るのに約３ヶ月を要してしまい、その間に患者の症状が進行してしまう為、状況に応じた対応をとることが難しい。
このような問題点を解決する方法として、国際公開第９６／０６９２９号パンフレットにはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬ及びＴＨを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供できる点が特徴であるが、次のような問題点が存在する。ＲＥＭ法においては、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）とエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増殖させているが、Ｔ細胞へのＥＢＶトランスフォームＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）の混入の危険性が否定されない点（安全性の問題）、フィーダ細胞として大量のＰＢＭＣ（必要とする抗原特異的ＣＴＬ数の少なくとも約４０倍のＰＢＭＣ）が必要である点、増殖したＣＴＬの抗原特異的細胞傷害活性が充分満足しうるものではない点、Ｔ細胞クローン以外のＴ細胞集団を用いて増殖させた場合、Ｔ細胞が有する抗原特異的な傷害活性は細胞の増殖と共に低下する点、等の問題を有している。
すなわち、従来の抗原特異的ＣＴＬ調製法では、治療への使用に有効な抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを、短期間で、かつ充分な量を調製するという、養子免疫療法において必要不可欠な問題が未だ解決されていないのが現状である。
本発明の目的は、養子免疫療法への使用に適した、抗原特異的な細胞傷害活性を高いレベルで保持したＣＴＬを誘導、維持ならびに拡大培養する方法を提供することにある。
発明の開示
すなわち、本発明は、
〔１〕  抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための方法であって、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とインキュベートする工程を含むことを特徴とする方法、
〔２〕  化合物が、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である前記〔１〕記載の方法、
〔３〕  抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を維持するための方法であって、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞を継続培養する工程を含むことを特徴とする方法、
〔４〕  化合物が、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である前記〔３〕記載の方法、
〔５〕  抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を拡大培養する方法であって、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする工程を含むことを特徴とする方法、
〔６〕  前記工程において、さらに抗ＣＤ３抗体の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする前記〔５〕記載の方法、
〔７〕  前記工程において、細胞傷害性Ｔ細胞をフィーダ細胞とともにインキュベートする前記〔５〕または〔６〕記載の方法、
〔８〕  フィーダ細胞が非ウイルス感染細胞である前記〔７〕記載の方法、
〔９〕  化合物が、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である前記〔５〕〜〔８〕いずれか記載の方法、
〔１０〕  前記〔１〕〜〔９〕いずれかに記載の方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞含有培養物から抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の回収方法、
〔１１〕  前記〔１〕〜〔１０〕いずれかに記載の方法で調製された抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞、ならびに
〔１２〕  前記〔１１〕に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含有することを特徴とする治療剤、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物により、意外にもＣＴＬの抗原特異的な細胞傷害活性の維持または増強能（以下、作用という場合がある）が発揮されることを見出し、完成するに至ったものである。本発明により、前記化合物を有効成分として使用する、養子免疫療法への使用に適した、抗原特異的な細胞傷害活性を高いレベルで保持したＣＴＬを誘導、維持ならびに拡大培養する方法が提供される。なお、本発明の有効成分として使用される化合物にＤ体とＬ体の別がある場合、両者とも使用可能であるが、Ｌ体の使用が好適である。
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法
通常、抗原提示細胞により誘導されたＣＴＬは、維持、増殖させる間にその抗原特異的な細胞傷害活性を低下させていくことが知られている。本発明により、誘導後の細胞を長期間にわたって維持または増殖させても、従来観察されたような抗原特異的な細胞傷害活性が著しく低下しない抗原特異的なＣＴＬの誘導方法が提供される。
本発明のＣＴＬの誘導方法は、前記有効成分の存在下にＣＴＬを誘導することを１つの大きな特徴とする。ＣＴＬの誘導は、当該有効成分の存在下、得られるＣＴＬに所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞とともにＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞をインキュベートすることにより実施される。前駆細胞は、ＣＴＬになる前段階で、しかもＣＴＬに分化するように運命付けられている細胞であれば特に限定されるものではなく、たとえば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞等が挙げられる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はない。例えば、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、本発明に使用することができる。
抗原提示細胞は、抗原提示能を有する細胞に抗原ペプチドを付加し、その表面に抗原ペプチドを提示させることにより調製することができる〔たとえば、文献：Ｂｅｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４７  ｐ４０４７−４０５３（１９９１）を参照〕。また、抗原提示能を有する細胞が抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）する能力を有している場合には、当該細胞に抗原を付加することにより、抗原が細胞内に取り込まれてプロセッシングを受け、断片化された抗原ペプチドが細胞表面に提示される。なお、抗原ペプチドを抗原提示能を有する細胞に付加する場合、使用される抗原提示細胞、誘導しようとするＣＴＬのＨＬＡ拘束性に合致する抗原ペプチドが使用される。
なお、本発明において使用される抗原は特に限定されるものではなく、たとえば、細菌、ウイルス等の外来性抗原や腫瘍関連抗原（癌抗原）等の内在性抗原等が挙げられる。
本発明においては、抗原提示細胞は非増殖性とすることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、例えばＸ線等の放射線照射又はマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行えばよい。
本発明のＣＴＬの誘導方法において使用される培地には特に限定はなく、ＣＴＬ、その前駆細胞、ならびに抗原提示細胞の維持、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有する培地が本発明に使用される。
本発明の有効成分として使用される酸性多糖としては、動物由来、植物由来、微生物由来、藻類由来および合成の酸性多糖のいずれもが使用できる。またリン酸化多糖類、例えば核酸も本願発明の酸性多糖に包含される。
動物由来の酸性多糖としては、例えばヒアルロン酸や種々の硫酸化多糖が使用でき、硫酸化多糖としてはコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等が使用できる。また、ナマコ、ウニ、ヒトデ等の棘皮動物由来の硫酸化多糖、サメ軟骨等の魚類由来の硫酸化多糖も本発明に使用できる。硫酸化多糖を含有するナマコとしては、例えば特開平４−９１０２７号公報に記載のナマコがあり、当該公報記載の方法にてナマコより硫酸化多糖を調製することができる。
植物由来の酸性多糖としては、例えばペクチン酸等が使用できる。
微生物由来の酸性多糖としては、例えばヒアルロン酸やキサンタンが使用できる。
藻類由来の酸性多糖としては、例えば褐藻類、紅藻類、緑藻類、藍藻類由来の酸性多糖が使用できる。
褐藻類由来の酸性多糖としては、例えば種々の硫酸化多糖が使用でき、例えばフコイダン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化フコグルクロノマンナン、グルクロノキシロフカン、サルガッサン、グルクロノマンノガラクタン、キシロフコグルクロナン、アスコフィラン、グルクロノガラクトフカン、硫酸化グルクロノフカン等が使用できる。
また、原料となる褐藻類としては、例えばガゴメ昆布、マコンブ、トロロ昆布、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア  ニグレセンス、アスコフィラム  ノドッサム、ジャイアントケルプ等の昆布目、ながもつも目、ひばまた目の褐藻が挙げられる。
褐藻類由来の硫酸化多糖としては、例えばガゴメ昆布からフコイダンを調製し、該フコイダンをグルクロン酸含有フコイダン（Ｕ−フコイダンと称す）とグルクロン酸非含有フコイダン（Ｆ−フコイダンと称す）に分離することができ、本発明の有効成分としてそれぞれのフコイダンを使用することが出来る。またガゴメ昆布から硫酸化フコガラクタン（以下、Ｇ−フコイダンと称す）を調製し、本発明に使用することができる。
Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンはガゴメ昆布からフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメ昆布由来のＵ−フコイダン及びＦ−フコイダンの存在比は約１：２であり、Ｕ−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約２０％、Ｆ−フコイダンはフコースとガラクトースを含み、硫酸含量は約５０％、分子量は両物質共に約２０万を中心に分布している（第１８回糖質シンポジウム要旨集、第１５９頁、１９９６年）。
例えばガゴメ昆布から調製したフコイダン溶液をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにアプライ後、ＮａＣｌ含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、Ｕ−フコイダンとＦ−フコイダンに分離することができる。第１図にその１例を示す。すなわち第１図はＵ−フコイダンとＦ−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
紅藻類由来の酸性多糖としては、例えば硫酸化ガラクタン、カラギーナン、フノラン、アガロペクチン等が使用できる。また、紅藻類由来の寒天類、アガロースについても、本発明に使用することができる。
また、紅藻類としては、例えばマクサ、オゴノリ、プテロクラディア  カピラセア等が挙げられる。
緑藻類由来の酸性多糖としては、例えばラムナン硫酸が使用できる。緑藻類としては、例えばアオサ、アオノリ、カサノリ、クロレラ等が挙げられる。またスピルリナ等の藍藻類から得られる酸性多糖も本発明に使用できる。
本発明においては、アルギン酸、ペクチン酸、ヒアルロン酸等をそのまま本発明の有効成分である酸性多糖として使用可能であるが、さらに、それらに対し、たとえば、硫酸基を付加した合成酸性多糖も使用可能である。当該合成酸性多糖としては、例えば合成硫酸化多糖を挙げることができ、セルロース、デンプン、マンナン、キシラン、アルギン酸、ペクチン、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フラクタン、アラビナン、キチン、プルラン、キシログルカン、デキストラン、スターチ等の硫酸化物を使用することができる。さらに例えば、リボフラナン硫酸、キシロフラナン硫酸、レンチナン硫酸、カードラン硫酸、マンノピラナン硫酸、硫酸化スターチ、硫酸化ペクチン等の合成硫酸化多糖やパルミトイル基を有するリボフラナン硫酸等の合成硫酸化アルキル多糖を使用することができる。また硫酸化多糖をさらに硫酸化することにより、高硫酸化硫酸化多糖を調製し、合成酸性多糖として本発明に使用することができる。これらの合成酸性多糖はそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。また市販のデキストラン硫酸、硫酸化セルロースも本発明に使用できる。また、これらの合成酸性多糖の塩を本発明に使用しても良い。
これらの酸性多糖の調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該酸性多糖含有物等を本発明に使用することができる。酸性多糖含有物としては、例えば藻類由来酸性多糖画分が好適に使用でき、藻類としては、前述した藻類を原料として好適に使用することができる。
また、これらの酸性多糖を分解して得られる低分子化された酸性多糖も細胞傷害性Ｔ細胞の抗原特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有していれば、本発明の酸性多糖として使用することができる。
次に本発明で使用できる酸性オリゴ糖、酸性単糖としては、細胞傷害性Ｔ細胞の抗原特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有する酸性オリゴ糖、酸性単糖であれば良く、特に限定はないが、前出の酸性多糖の分解物、合成酸性オリゴ糖および合成酸性単糖が使用できる。また、酸性オリゴ糖、酸性単糖としては、例えば硫酸化オリゴ糖および硫酸化単糖が例示される。これらの硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖は、それぞれ対応するオリゴ糖、単糖を原料として、それぞれ公知の方法にて硫酸化して調製することができる。また、これらの塩も好適に使用できる。また、本発明において酸性単糖としては例えば硫酸化フコース、硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化２−デオキシ−グルコース、硫酸化マンノース、硫酸化タロース等の硫酸化単糖が例示される。これらの硫酸化単糖は合成法で合成しても良く、また天然物中から得た硫酸化多糖を分解し、当該分解物中より精製して調製しても良い。また常法によりその塩を調製し、本発明に使用することもできる。また、前述した硫酸化多糖と同様に、これらの硫酸化オリゴ糖および硫酸化単糖をさらに硫酸化することにより、高硫酸化硫酸化オリゴ糖および高硫酸化硫酸化単糖を使用することができる。なお本発明においてオリゴ糖とは単糖が２個から１０個の範囲でつながった糖化合物、多糖とは単糖が１１個以上つながった糖化合物と定義する。
また本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の抗原特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有する酸性多糖の分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて調製し、細胞傷害性Ｔ細胞の特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有する分解物を選択し、使用することができる。
なお、分解物とは、分解対象とする酸性多糖にもよるが、酸性多糖を分解して得た、概ね分子量が好ましくは１０万〜２００、より好ましくは３万〜１０００の範囲のものをいう。
本発明で使用する酸性多糖の分解物の好適な調製方法としては酸分解法があり、当該酸性多糖を酸分解することにより細胞傷害性Ｔ細胞の特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有する分解物を調製することができる。
本発明で使用する酸性多糖の酸分解条件は、細胞傷害性Ｔ細胞の特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有する分解物（以下、本発明の分解物と称す）が生成する条件であれば、特に限定はない。
例えば酸性多糖を酸水溶液等に溶解またはけん濁し、酸分解反応を行うことにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。
酸性多糖を溶解又はけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。
酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．０１〜１規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定は無いが好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すれば良い。
また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒〜数日に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は、本発明に使用する分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、フコイダンの分解物の製造に際しては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数１０ｍＭ〜数Ｍ、加熱温度は５０〜１１０℃、好適には７０〜９５℃、加熱時間は数分〜２４時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコイダンの酸分解物としてはガゴメ昆布由来フコイダンの酸分解物が例示される。
本発明の分解物は細胞傷害性Ｔ細胞の特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強作用を指標としてさらに分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により分子量分画することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超、分子量５０００以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−２５を用い、例えば分子量５０００以下の画分を分子量５０００〜３０００超、分子量３０００〜２０００超、分子量２０００〜１０００超、分子量１０００〜５００超、分子量５００以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳＯ３８２を使用することにより分子量３００００以下の画分を、同ＦＥ−ＦＵＳ−Ｔ６５３を使用することにより分子量６０００以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を使用することにより分子量５００以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。
本発明で使用できる酸性多糖の分解物、例えばフコイダンの分解物としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物、式（ＩＩＩ）で表される化合物が例示され、これらの化合物は国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際公開第００／５０４６４号パンフレット記載の方法で調製することができる。なお、式（Ｉ）で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するフコイダン、及びオリゴ糖、式（ＩＩ）で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するフコイダン、及びオリゴ糖、また式（ＩＩＩ）で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するフコイダン、及びオリゴ糖もそれぞれ本発明の酸性多糖および酸性オリゴ糖として使用することができる。また、本発明の酸性多糖の分解物としては、例えばフコイダンの分解物として、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際公開第００／５０４６４号パンフレット記載のフコイダンの分解物が例示される。
0004231688.tif 000002
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004231688.tif 000003
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004231688.tif 000004
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
式（Ｉ）で表される化合物は前出Ｆ−フコイダンを、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（Ｉ）で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式（ＩＩ）で表される化合物は前出Ｕ−フコイダンを、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＩＩ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお式（Ｉ）で表される化合物の例としては後述の式（ＩＶ）で表される化合物がある。また式（ＩＩ）で表される化合物の例としては後述の式（ＶＩ）で表される化合物がある。また式（ＩＩＩ）で表される化合物の例としては後述の式（Ｖ）で表される化合物がある。
ガゴメ昆布由来フコイダンをアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するＦ−フコイダン分解酵素、及びフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するＵ−フコイダン分解酵素で分解し、分解物を除去することにより、前出Ｇ−フコイダンを精製することができる。
フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）はこのＧ−フコイダンを特異的に分解するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｇ−フコイダン分解酵素）も産生し、当該Ｇ−フコイダン分解酵素をＧ−フコイダンに作用させることにより、当該Ｇ−フコイダンの分解物を調製し、当該分解物中より、目的に応じ分解物を精製することができる。式（ＩＩＩ）で表される化合物はその例である。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＩＩＩ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお、上記各酵素については、国際公開第９７／２６８９６号パンフレットまたは国際公開第００／５０４６４号パンフレットに記載されている。
またガゴメ昆布由来フコイダンを有機酸存在下で、加熱処理することによりグルクロン酸とマンノースの重合体を得ることができ、この重合体も本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の抗原特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を有する酸性多糖として使用することができる。また加熱処理条件、加熱時間を調整することにより任意の重合度の重合体を調製することができる。
以上、本発明において使用する有効成分は、ＣＴＬの抗原特異的な細胞傷害活性を維持あるいは増強する作用を有する限り特に限定はなく、さまざまな酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及び／又はそれらの塩が使用できるが、特に好適には、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を使用することができる。また、本発明においては、これまでに医薬品として使用されてきた酸性多糖の使用が好適であり、例えばデキストラン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヘパリン等が使用できる。デキストラン硫酸ナトリウムはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍによるショ糖の発酵によって生産されたデキストランの部分分解物を硫酸化して得た硫酸化エステルのナトリウム塩である。
本発明に使用される酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖の塩としては、ＣＴＬの抗原特異的な細胞傷害活性を維持あるいは増強する作用を有する限り特に限定はないが、たとえば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基等との塩が例示される。たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、またはジエタノールアミン、エチレンジアミン等との塩が挙げられる。これらの塩は、たとえば、酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖に存在する酸性基、例えばフコイダン等に存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる。かかる塩としては薬理学的に許容され得る塩が好ましい。
本発明で有効成分として使用される酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及び／又はそれらの塩は単独で若しくは２種以上混合して用いることができる。また、当該有効成分の誘導体、例えば脂肪酸誘導体等も、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を示す限り、特に限定なく使用することができる。
本発明においては、ＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とともにインキュベート（共培養）して、ＣＴＬを誘導するための一般的な条件は公知の条件〔たとえば、文献：Ｂｅｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４７  ｐ４０４７−４０５３（１９９１）を参照〕に従えばよい。共培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。この共培養は通常、２〜１５日程度実施されるが、その間に抗原提示細胞を新たに調製したものに取り替えて再刺激を行ってもよい。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
共培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は培地中に溶解して存在するのが好ましい。
こうして誘導されたＣＴＬは所望の抗原を特異的に認識する能力を有しており、例えば該抗原を有する細胞を、その細胞傷害活性により特異的に破壊する。このＣＴＬの細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。たとえば、抗原提示細胞により提示されたペプチドと放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する傷害性、放射能の取り込みよって測定できるＣＴＬ増殖の抗原特異的な増加若しくはＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより評価することができる（後述の実施例１−１−（３）を参照）。その他、蛍光色素等によって標識された抗原ペプチドや複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させてから第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）分析によって行うことができる。
本発明の方法により誘導されたＣＴＬは、誘導後の細胞を長期間にわたって維持、あるいはこれを増殖させても、従来観察されたような抗原特異的な細胞傷害活性の著しい低下がないという優れた性質を有している。従って、誘導されたＣＴＬをクローン化することにより、安定した細胞傷害活性を有するリンパ球として維持することもできる。例えば、誘導されたＣＴＬに抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させ、拡大培養することができる。このＣＴＬの維持、拡大培養には、後述する本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法、拡大培養方法の使用が好適である。
このような本発明の効果は、本発明の方法で誘導されたＣＴＬを適切な方法で維持、あるいは拡大培養した後に、その細胞傷害活性を上記に記載された方法により測定し、確認することができる。
（２）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法は、ＣＴＬを抗原特異的な細胞傷害活性を保ったままで維持する方法である。該方法は、本発明の有効成分を含有する培地中でＣＴＬを継続培養することを１つの大きな特徴としており、該細胞の有する抗原特異的な細胞傷害活性を継続的に維持させることができる。
上記方法を適用可能なＣＴＬには限定はなく、公知の方法で得られたＣＴＬをその抗原特異的な傷害活性を維持させたまま、本発明の方法で維持することができる。また、上記（１）に記載の本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法によって得られたＣＴＬの維持にも好適に使用される。
本発明においては、ＣＴＬの継続培養の一般的な条件は公知の条件〔たとえば、文献：Ｃａｒｔｅｒ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９８６  Ｊａｎ．５７（１）ｐ１２３−１２９を参照〕に従えばよい。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法に使用される培地にも特に限定はなく、たとえば上記のＣＴＬの誘導方法に使用される培地を使用することができる。
本発明の方法は、前記有効成分を培地に添加して実施される。培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は培地中に溶解して存在するのが好ましい。また、前記有効成分としては、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種が好適である。さらに、培地にはサイトカインやその他の公知の成分を所望により添加することができる。本発明には好適にはＩＬ−２を含有する培地が使用される。培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
上記のように、本発明の有効成分を含有する培地中にてＣＴＬを継続的に培養することにより、その特異的な細胞傷害活性の低下を抑制してＣＴＬを維持することができる。このような本発明の効果は、本発明の方法で維持されたＣＴＬの有する細胞傷害活性を、上記（１）に記載された方法により測定し、確認することができる。また、該方法で維持されたＣＴＬは公知の拡大培養法により増殖させることができるが、こうして増殖されたＣＴＬも特異的な細胞傷害活性を保持している。なお、ＣＴＬの拡大培養方法としては、後述する本発明のＣＴＬの拡大培養方法を好適に使用することができる。
（３）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法
細胞傷害性Ｔ細胞は適切な条件下で培養を行うことにより、細胞数を増加させることができる（拡大培養）。従来、いくつかのＣＴＬの拡大培養方法が開発されているが、短期間で効率よくＣＴＬを増殖させることが可能なものとしてリデル（Ｒｉｄｄｅｌｌ）らの開発した前出のＲＥＭ法が知られている。該方法はＸ線照射により非増殖性としたＰＢＭＣ（フィーダ細胞として使用）とＥＢＶで形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）とを使用し、ＩＬ−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下にＣＴＬを培養する方法である。しかしながら、該方法ではＴ細胞へのＥＢＶ−Ｂ細胞の混入の危険性が否定されない点が問題とされていた。
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法は、抗原特異的な細胞傷害活性を保ったままで当該細胞数を増加させることが可能な方法である。該方法は、本発明の前記有効成分の存在下に細胞をインキュベート（培養）することを特徴とする。
本発明の方法において、適用可能なＣＴＬには限定はなく、公知の方法で得られたＣＴＬや、上記（１）に記載の本発明のＣＴＬの誘導方法によって得られたＣＴＬや、上記（２）に記載の本発明のＣＴＬの維持方法によって得られたＣＴＬの拡大培養に好適に使用することができる。なお、本発明においては、ＣＴＬの拡大培養の一般的な条件は公知の条件〔たとえば、文献：Ｕｂｅｒｉ  Ｊ．Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｔｈｏｌ．１９９４  Ｍａｒ．７０（３）ｐ２３４−２４０を参照〕に従えばよい。
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法においては、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、好ましくは抗ＣＤ３モノクローナル抗体をさらに含有する培地中でＣＴＬを培養するのが望ましい。また、さらに好適には、ＣＴＬは適切なフィーダ細胞と共培養される。
上記方法に使用される培地には特に限定はなく、ＣＴＬの培養、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地であってもよい。なお、ＣＴＬをフィーダ細胞と共培養する場合には、ＣＴＬ、フィーダ細胞の両者の維持、生育に適した培地であることが望ましい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の公知の成分を含んでいてもよく、例えば、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に好適に使用される。抗ＣＤ３抗体、特に抗ＣＤ３モノクローナル抗体はＣＴＬ上のＴ細胞レセプターを活性化する目的で添加することができる。なお、抗ＣＤ３抗体の培地中における含有量は公知の条件に従って決定すればよく、たとえば、０．０１〜１μｇ／ｍｌが好適である。
本発明のＣＴＬの拡大培養方法は、前記有効成分を培地に添加して実施される。なお、前記有効成分としては、フコイダン、ヘパリン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ペクチン酸、ヒアルロン酸、フコイダン分解物、硫酸化グルコース、硫酸化フコース及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種が好適である。また、培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は培地中に溶解して存在するのが好ましい。
本発明の方法に使用されるフィーダ細胞は、抗ＣＤ３抗体と協同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプターを活性化するものであれば特に限定はない。本発明には、例えば、ＰＢＭＣやＥＢＶ−Ｂ細胞が使用される。通常、フィーダ細胞は放射線照射のような手段で増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は公知の条件に従って決定すればよく、たとえば、１×１０５〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。
本発明の特に好ましい態様においては、フィーダ細胞として、非ウイルス感染細胞、たとえば、ＥＢＶ−Ｂ細胞以外のものが使用される。これにより、拡大培養されたＣＴＬ中にＥＢＶが混在する可能性を排除することができ、養子免疫療法のようなＣＴＬを利用した医療の安全性を高めることが可能となる。
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法において、その培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
なお、ＣＴＬの拡大培養方法については、本発明の有効成分を使用されている培地に添加していれば特に限定は無く、上記以外の従来のＣＴＬ拡大培養法において、本発明の有効成分を培地に添加する態様も本発明に包含される。
本発明の拡大培養方法によれば、例えば１４日間の拡大培養によって１００〜１０００倍に細胞数の増加したＣＴＬを得ることができる。さらに、こうして得られたＣＴＬは従来のＣＴＬ拡大培養法、例えばＲＥＭ法で得られたものに比べてより高い抗原特異的な細胞傷害活性を保持している。
このような本発明の効果は、本発明の方法で拡大培養されたＣＴＬの有する細胞傷害活性を、上記（１）に記載された方法により測定し、確認することができる。
また、本発明に使用される有効成分は、ＣＴＬの抗原特異的な細胞傷害活性の維持または増強に働く、ＣＴＬ誘導剤、ＣＴＬ維持剤あるいはＣＴＬ拡大培養剤（以下、これらをＣＴＬ培養剤という）として使用することができる。当該ＣＴＬ培養剤は、有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、たとえば、ＣＴＬの誘導方法において使用される培地、ＣＴＬの維持方法において使用される培地またはＣＴＬの拡大培養方法において使用される培地に含まれる、ＣＴＬやフィーダ細胞等の培養、生育に必要な成分、ならびに適当なタンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また、これらのＣＴＬ培養剤を含有する培地はＣＴＬ誘導用、維持用、あるいは拡大培養用培地（以下、これらをＣＴＬ用培地という）として使用することができる。これらの培地は細胞培養のための基本的な成分と上記の化合物の他、それぞれの用途に応じた適切な成分を任意に含むものである。なお、前記ＣＴＬ培養剤およびＣＴＬ用培地は公知の方法により製造することができる。
上記の本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法を用いることにより得られたＣＴＬ含有培養物中には、通常、ヘルパーＴ細胞等のＣＴＬ以外の細胞も混在している。本発明においては、該培養物から遠心分離等により該培養物中の細胞を回収し、本発明の方法により得られたＣＴＬとして、たとえば、そのまま使用することができる。
また、さらに該培養物から、抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを高含有する細胞集団（あるいは培養物）を分離し、本発明の方法により得られたＣＴＬとして使用することもできる。すなわち、本発明においては、前記ＣＴＬ含有培養物中のＣＴＬ以外の細胞（たとえば、ヘルパーＴ細胞）とＣＴＬとの分離操作を施すことにより抗原特異的な細胞傷害活性に関して濃縮された細胞集団を調製して使用することができる。このような、前記細胞集団を分離することによる抗原特異的な細胞傷害活性の濃縮は従来のＲＥＭ法ではなしえなかったことである。よって、本発明の一態様として、本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法のいずれかにより得られたＣＴＬ含有培養物から抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の回収方法が提供される。なお、本発明のＣＴＬの回収方法は、１つには高い抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬの細胞集団を選択的に得る方法をいうが、広義には、当該ＣＴＬの細胞集団を生産または獲得する方法をいう。該細胞集団の選択方法については特に限定はないが、例えば上記のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法を用いて得られたＣＴＬ含有培養物から、ＣＴＬ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ８抗体を結合させた磁気ビーズまたはカラムを用いてＣＴＬのみを選択的に回収し、ＣＴＬを高含有する細胞集団を得ることができる。フローサイトメーターを用いてＣＴＬを選択的に分離することもできる。また、本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法により得られたＣＴＬ含有培養物中から、ＣＴＬ以外の細胞を除去することにより、ＣＴＬを高含有する細胞集団を得ることができる。例えば、当該培養物からヘルパーＴ細胞を除去するためにヘルパーＴ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体を結合させた磁気ビーズまたはカラムを用いてヘルパーＴ細胞を選択的に除去し、ＣＴＬを高含有する細胞集団を得ることができる。また、ヘルパーＴ細胞の除去にはフローサイトメーターを用いることもできる。このようにして得られたＣＴＬを高含有する細胞集団は、ＣＴＬ含有培養物から非選択的に回収された細胞集団と比較してより強い細胞傷害活性を有しており、本発明の方法により得られたＣＴＬとしてより好適に使用できる。また、本発明においてはＣＴＬを高含有する細胞集団として、ＣＴＬのみの細胞集団も包含する。
また、本発明のＣＴＬの維持方法ならびに拡大培養方法により得られたＣＴＬを用いて、さらに本発明のＣＴＬの維持方法ならびに拡大培養方法によりＣＴＬの維持または拡大培養を行うこともできる。例えば、本発明の拡大培養方法により得られたＣＴＬから上記の方法によりＣＴＬを高含有する画分を得、該画分を用いて本発明の拡大培養方法を行うことにより、さらに細胞傷害活性の高いＣＴＬを得ることもできる。また、本発明の拡大培養方法により得られたＣＴＬを本発明の維持方法を用いてその細胞傷害活性を維持させておくこともできる。
さらに本発明は、上記の本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法で得られたＣＴＬを提供する。かかるＣＴＬは、いずれも抗原特異的な細胞傷害活性を有しており、長期間に渡る継続培養や拡大培養を行っても細胞傷害活性の低下が少ないという性質を有する。また、本発明は、当該ＣＴＬを有効成分として含有する治療剤を提供する。当該治療剤は、特に養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適した抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬが、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は、製薬分野で公知の方法に従い、たとえば、本発明の方法により調製されたＣＴＬを有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。当該ＣＴＬとしては、特に、本発明のＣＴＬ拡大培養方法によってＥＢＶ感染細胞を使用することなく調製されたＣＴＬがこの目的に好適である。なお、治療剤におけるＣＴＬの含有量、治療剤の投与量等、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定することができる。
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は特段の事情がない限り重量％を意味する。
製造例１
ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。水道水９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物２０ｋｇを混合した。液温１２℃から液温９０℃となるまで水蒸気吹込みにより４０分間昇温させ、次いでかくはん下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物１１００リットルを得た。次いで固液分離装置（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。固液分離上清液３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、また２０リットルまで濃縮するという操作を５回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液２５リットルを調製した。該溶液１リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコイダン乾燥物１３ｇを得た。
製造例２
製造例１記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）（生化学工業社製）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの５０ｍＭから１．９５Ｍの濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍｌ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション４３〜４９、フラクション５０〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３〜４９よりＩ画分（３４０ｍｇ）、フラクション５０〜５５よりＩＩ画分（８７０ｍｇ）、フラクション５６〜６７よりＩＩＩ画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。第１図にガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。第１図において縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び電導度（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
製造例３
（１）アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース  ０．２５％、ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０２％、下記実施例２−（２）に記載の硫酸化多糖  ０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍｌのＦ−フコイダンに選択的に作用するＦ−フコイダン分解酵素液を調製した。
（２）乾燥したガゴメ昆布２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々かくはんしながら９５℃で２時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間かくはんした。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過機により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過を行い、２０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇの硫酸化多糖を調製した。
（３）乾燥したガゴメ昆布２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍｌの上記製造例３−（１）で調製したＦ−フコイダン分解酵素、１０％のエタノール、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む２０リットルの緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間かくはんした。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間かくはん後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間かくはんし、直径３２μｍのステンレス金網でろ過、洗浄した。
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６３付近）が均一であった。
そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化したフェニルセルロファインカラム（樹脂量２００ｍｌ）（生化学工業社製）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０５ｍｌを得た。
得られた脱塩液のうち４０ｍｌを１０％のエタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの下記式（ＩＶ）で表される化合物の乾燥品を得た。以下、該化合物を７−１２ＳＦｄ−Ｆと称す。
0004231688.tif 000005
（４）製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）の２．５％水溶液８０ｍｌに１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を１６ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２水溶液を１６ｍｌ、４Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を２４ｍｌ、実施例３−（１）で得たＦ−フコイダン分解酵素液を８ｍｌ、蒸留水を１７６ｍｌ添加し、３０℃で３時間加熱した。この酵素処理Ｆ−フコイダン溶液を酵素処理Ｆ−フコイダンの最終濃度が２％になるようにロータリーエバポレーターで濃縮し、その後蒸留水中で透析操作を行い、２％酵素処理Ｆ−フコイダン水溶液を調製した。この試料をＨＰＬＣ（カラム：ＳＢ８０２．５、カラム温度：３５℃、移動相：５０ｍＭ  ＮａＣｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＲＩ  ＡＴＴ＝８）で分析した。その結果、試料中の約４０％が式（ＩＶ）記載の７−１２ＳＦｄ−Ｆであることが明らかになった。
製造例４
（１）乾燥ガゴメ昆布２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び製造例３−（１）で調製したアルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）Ｆ−フコイダン分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で２日攪拌し、次いで穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎの塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎの水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
（２）上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍＭの塩化ナトリウム及び国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を培養し、該培養物から得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン分解酵素）を９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日反応後、エバポレーターで約３００ｍｌに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮後、１０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物０．８５ｇを得た。得られた硫酸化フコガラクタン（Ｇ−フコイダン）は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。
（３）Ｇ−フコイダン分解酵素の生産のため、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）をグルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを１２０℃、２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時間培養して種培養液とした。実施例４−（１）の方法で調製したガゴメ昆布由来のフコイダン画分０．２％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）０．０１％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターにいれ１２０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２３時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
得られた菌体を、１２００ｍｌの０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に終濃度が９０％飽和となるように硫安を添加し生じた沈殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を１５０ｍｌの５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した５００ｍＬのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシャムファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
得られた活性画分を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した１００ｍＬのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、４Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した２０ｍＬのフェニルセルロファイン（生化学工業社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１０ｍＬのフェニルセルロファイン（生化学工業社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、３Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。このようにして得られた精製酵素をＧ−フコイダン分解酵素として用いた。
（４）製造例４−（２）記載のＧ−フコイダンに上記の精製Ｇ−フコイダン分解酵素を作用させ低分子化物を調製した。すなわち、１．９４ｇのＧ−フコイダンを０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１８６ｍＵのＧ−フコイダン分解酵素を加え、２５℃で、６日間反応させた。反応液をエバポレーターにより８０ｍｌに濃縮し、セルロファインＧＣＬ−１０００（生化学工業社製）のカラム（４×９０ｃｍ）による分子量分画を行った。分子量１５，０００以下の画分を集め、Ｇ−フコイダン酵素消化物画分とした。
（５）上記Ｇ−フコイダン酵素消化物をエバポレーターで５００ｍｌに濃縮後、電気透析装置により脱塩し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、１０ｍＭから９００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は６１ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。２７０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを形成していたので、それを集め２７０ｍＭ溶出画分（ロ）とした。
また上記の２７０ｍＭ溶出画分（ロ）に関しては、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）と同じ電導率になるように水を添加し、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから３００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は１２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。１６０ｍＭから１８０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック（サバントインストルメンツ社製；ＳＡＶＡＮＴ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）で２ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（生化学工業社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、（Ｄ）とした。
上記画分（Ｄ）について電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び質量を分析した。また、定法により重水で置換後ＮＭＲ分析による構造解析を行った。
（Ｄ）の物性
分子量；１３５８
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−Ｈ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１−Ｈ），４．６２（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−Ｈ），４．５９（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ２−１−Ｈ），４．５４（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−３−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ４−１−Ｈ），４．３７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−３−Ｈ），４．２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．２１（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−３−Ｈ），４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ４−４−Ｈ），４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｆ２−４−Ｈ），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ）、３．９６（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ），３．９３（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−２−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−５−Ｈ），３．５８（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−２−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４，Ｆ２−６−Ｈ）
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：４（モル比）
硫酸基  ５分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。以下、該化合物を６−５ＳＦｄ−Ｇと称する。
0004231688.tif 000006
製造例５
製造例３−（２）で調製した硫酸化多糖１２０ｇを２０ｍＭの塩化カルシウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び１０Ｕの製造例３−（１）で調製したＦ−フコイダン分解酵素を含む８リットルの２０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、２５℃で３日間かくはんし、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用い、上記緩衝液を添加しながら限外ろ過した。
限外ろ過内液に、製造例４−（２）記載のＵ−フコイダン分解酵素を添加して、２５℃で２日間かくはんし、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過を行い、水を添加しながら限外ろ過した。
ろ液を集め、エバポレーターで１．５リットルに濃縮後、脱塩装置により完全に脱塩し、あらかじめ３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した３リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、６リットルの同緩衝液で洗浄後、３０ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に要した液量は４８リットルであった。溶出液は１８０ｍｌずつ分取し、その糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。また、２３２ｎｍにおける吸光度も同時に測定した。１３０ｍＭから１７０ｍＭの塩化ナトリウム溶出画分が一つのピークを形成したので、これらの画分を集め、脱塩装置により脱塩後、凍結乾燥し、５．８５ｇのオリゴ糖を得た。このオリゴ糖は質量分析により、分子量１１２８でありＮＭＲ分析により下記式（ＶＩ）で表される化合物であることを確認した。以下、該化合物を６−２ＳＦｄ−Ｕと称す。
0004231688.tif 000007
製造例６
（１）Ｄ−（＋）−グルコース２００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆｅｒ  Ｔｒｉｏｘｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｐｙｒ・ＳＯ３：東京化成）１．０５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃で１時間攪拌した。反応液を水で希釈し、飽和水酸化バリウム水溶液でｐＨを中性付近に調整してから減圧乾固した。得られた濃縮物に再度水を添加し再び減圧乾固した。この操作をもう一度繰り返した。得られた濃縮物に少量の水を添加し遠心で硫酸バリウムの沈澱を除去し、得られた上清を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）（オルガノ）〕に供した。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化Ｄ−（＋）−グルコース  ナトリウム塩７００ｍｇを調製した。
（２）Ｌ−フコース５００ｍｇ（３．０５ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍＬに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３  ２．３３ｇ（１４．６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、製造例６−（１）と同様の操作で、硫酸化フコースナトリウム塩を得た。
実施例１  抗原特異的細胞傷害活性を保持したＣＴＬの継続培養方法
実施例１−１
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
ＨＬＡ−Ａ２４もしくはＡ２．１保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をＰＢＳ（−）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）上に重層後５００ｇ×２０分間遠心した。中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）／１０％ジメチルスルホキシド（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
（２）  抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導はＢｅｄｎａｒｅｋらの方法（Ｂｅｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４７  ４０４７−４０５３）を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＢｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、２４穴細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１ｍｌ／ウェルずつまき、５％ＣＯ２湿式インキュベーター内にて、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した。その後、非接着性の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとしてインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド〔配列表の配列番号：１に記載のヌクレオプロテイン由来ＨＬＡ  Ａ２４結合性ペプチド（ＦｌｕＮＰＡ２４）ＲＦＹＩＱＭＣＴＥＬもしくは配列表の配列番号：２に記載のマトリックスプロテイン由来ＨＬＡ  Ａ２．１結合性ペプチド（ＦｌｕＭＰＡ２．１）ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ〕５μｇ／ｍｌおよびβ２マイクログロブリン（スクリプス社製）１μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩを０．５ｍｌづつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（５５００Ｒ）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を１〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５ＨＲＰＭＩに懸濁し、１ｍｌ／ウェルづつ抗原提示細胞上に添加した。このとき、試料を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。対照として、試料を添加しない群を設定した。試料としては、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを用いた。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。培養開始後２日目に、ＩＬ−２（塩野義製薬社製）６０Ｕ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの最初に添加した試料と同じ試料を含む５ＨＲＰＭＩ  １ｍｌ（対照は、ＩＬ−２のみ含有）を各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後同様のＩＬ−２および試料含有培地（対照はＩＬ−２のみ含有）を１ｍｌづつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を１〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁し、上記と同様にして調製した抗原提示細胞上に１ｍｌ／ウェルづつ添加し、再刺激した。このとき、試料を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（対照は、無添加）。再刺激後２日目に、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの試料を含む（対照は、ＩＬ−２のみ含有）５ＨＲＰＭＩ１ｍｌを各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌづつ添加し、さらに培養を２日続け、ＣＴＬを誘導した。
（３）  ＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１−１−（２）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法（Ｒｕｄｏｌｆ  Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １７２（１９９４）２２７−２３９）にて評価した。
一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２４またはＡ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（ＴＩＳＩまたは２２１Ａ２．１）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５％ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（ドータイト社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後２０倍量のＫ５６２細胞と混合し、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。
実施例１−１−（２）で調製したメモリーＣＴＬをエフェクター細胞として１×１０５〜９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５／ｍｌに調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μｌ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００ｇ×１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。
４時間後、各ウェルから培養上清１００μｌを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたｃａｌｃｅｉｎ量を測定した。特異的細胞傷害活性は以下の式１にしたがって算出した。
〔式１〕
特異的細胞傷害活性（％）＝
〔（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）〕×１００
上式において最小放出量は標的細胞およびＫ５６２細胞のみ含有するウェルのｃａｌｃｅｉｎ放出量であり、標的細胞からのｃａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は標的細胞に界面活性剤トリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のｃａｌｃｅｉｎ放出量を示している。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差は無かった。
（４）  ＣＴＬの継続培養
実施例１−１−（２）で調製し、実施例１−１−（３）でエピトープペプチド特異的細胞傷害活性を確認したＣＴＬを５ＨＲＰＭＩで洗浄後、３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ中でさらに１０〜１４日間継続的に培養した。その際、ＣＴＬ誘導時に試料を添加した群にはＣＴＬ誘導時と同じ試料を同濃度で培地に添加して培養した。また、ＣＴＬ誘導時に試料を添加していない対照は、引き続き試料を添加せずに培養を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、２〜３日毎に培養上清を半分除去後、除去前と同じ組成の培地を１ｍｌずつ添加した。継続培養後、実施例１−１−（３）と同様の方法によりＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１に示す。なお、表中においてＥ／Ｔ比は標的細胞数（Ｔ）に対するエフェクター細胞数（Ｅ）の比を、ペプチド付加は標的細胞に対するペプチド付加の有無を意味する。
0004231688.tif 000008
その結果、ＣＴＬ誘導時と継続培養時の両段階で試料を添加した群においては、１０〜１４日間の継続培養後においてもその活性を高く維持していた。しかし、一方で、ＣＴＬ誘導中および継続培養中のどちらにもガゴメ昆布由来フコイダンを添加しなかった群（対照）では、その活性を明らかに低下させていた。
このことより、ガゴメ昆布由来フコイダンをＣＴＬ誘導時と継続培養時に添加することにより、継続培養時にペプチド等による刺激を付加することなく、抗原特異的な細胞傷害活性を保持した状態のＣＴＬの継続培養が可能であることが明らかになった。
実施例１−２
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）と同様の方法で、ＰＢＭＣの分離を行い、保存しておいたＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）とＩＩ画分（Ｕ−フコイダン）、製造例３で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆをそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。対照として試料を添加しない群を設定した。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、抗原特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの継続培養
実施例１−２−（１）で調製したＣＴＬを実施例１−１−（４）と同様の方法で、さらに１０〜１４日間継続的に培養した。この際、試料として、実施例１−２−（１）でＣＴＬ誘導時に添加した試料をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。また、ＣＴＬ誘導時に試料を添加していない対照は、引き続き試料を添加せずに培養を行った。継続培養後、実施例１−１−（３）と同様の方法によりＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表２に示す。
0004231688.tif 000009
この結果、ＣＴＬ誘導時と継続培養時の両段階でこれらの試料を添加した群は、どの群においても、１０〜１４日間の継続培養後にも、その活性を高く維持していた。しかし、一方で、ＣＴＬ誘導時および継続培養時のどちらにも試料を添加しなかった群（対照）では、その活性を明らかに低下させていた。
このことより、ガゴメ昆布由来フコイダン、Ｆ−フコイダン、Ｕ−フコイダンまたは７−１２ＳＦｄ−ＦをＣＴＬ誘導時と継続培養時に添加することにより、ペプチド等による刺激を付加することなく、抗原特異的な細胞傷害活性を保持した状態でＣＴＬの継続培養が可能であることが明らかになった。
実施例１−３
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存しておいたＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、Ｌ．Ｍ．Ｗ．ヘパリン（商品名  Ａｒｄｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ；ＣＥＬＳＵＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．社製）、非膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、製造例６−（１）で調製した硫酸化グルコースナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム（生化学工業社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。また、対照として試料を添加しない群を設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの継続培養
実施例１−３−（１）で調製したＣＴＬを実施例１−１−（４）と同様の方法で、さらに１０〜１４日間継続的に培養した。この際、実施例１−３−（１）でＣＴＬ誘導時に添加した試料と同じ試料をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。また、ＣＴＬ誘導時に試料を添加していない対照は、引き続き試料を添加せずに培養を行った。継続培養後、実施例１−１−（３）と同様の方法によりＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表３に示す。
0004231688.tif 000010
この結果、ＣＴＬ誘導時と継続培養時の両段階でこれらの試料を添加した群は、どの群においても、継続培養後にも、その活性を高く維持していた。しかし、ＣＴＬ誘導時および継続培養時のどちらにも試料を添加しなかった群（対照）では、その活性を明らかに低下させていた。
このことより、フコイダン同様、硫酸化多糖であるヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａナトリウムを、ＣＴＬ誘導時と継続培養時に添加することにより、ペプチド等による刺激を付加することなく、抗原特異的な細胞傷害活性を保持した状態でＣＴＬの継続培養が可能であることが明らかになった。つまり、フコイダン以外の硫酸化多糖にも同様の活性があることが明らかになった。さらに、硫酸化多糖以外でも、硫酸化単糖である硫酸化グルコースナトリウム塩にもフコイダン同様の活性があることから、硫酸化された糖はその大きさには関係無く細胞傷害活性維持効果を有していることが明らかになった。一方、硫酸化糖ではない非膨潤性および膨潤性アルギン酸にもフコイダン同様の活性があることが示されたことより、上記の活性は硫酸化された糖に特有のものではなく、酸性糖であれば糖の種類には影響されずに細胞傷害活性維持効果を発現することが明らかになった。
実施例１−４
（１）  抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存しておいたＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、ペクチン酸（ナカライテスク社製）、製造例６−（２）で調製した硫酸化フコースナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム（生化学工業社製）をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。対照として試料を添加しない群を設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの継続培養
実施例１−４−（１）で調製したＣＴＬを実施例１−１−（４）と同様の方法で、さらに１０〜１４日間継続的に培養した。この際、実施例１−４−（１）でＣＴＬ誘導時に添加した試料と同じ試料をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。また、ＣＴＬ誘導時に試料を添加していない対照は、引き続き試料を添加せずに培養を行った。継続培養後、実施例１−１−（３）と同様の方法によりＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表４に示す。
0004231688.tif 000011
この結果、ＣＴＬ誘導時と継続培養時の両段階でこれらの試料を添加した群は、どの群においても、継続培養後にも、その活性を高く維持していた。しかし、ＣＴＬ誘導時および継続培養時のどちらにも試料を添加しなかった群（対照）では、その活性を明らかに低下させていた。
このことより、硫酸化多糖であるコンドロイチン硫酸Ｂナトリウム、硫酸化単糖である硫酸化フコースナトリウム塩、酸性多糖であるペクチン酸がいずれも細胞傷害活性維持効果を有していることが明らかになった。
実施例１−５
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存しておいたＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、上記の実施例に用いられたような試料は全く添加しなかった。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。
（２）  ＣＴＬの継続培養
実施例１−５−（１）で調製したＣＴＬを実施例１−１−（４）と同様の方法で、さらに１０〜１４日間継続的に培養した。この際、試料として、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）、ＩＩ画分（Ｕ−フコイダン）、Ｌ．Ｍ．Ｗ．ヘパリン（商品名  Ａｒｄｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ；ＣＥＬＳＵＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳＩＮＣ．社製）、ペクチン酸（ナカライテスク社製）、非膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、製造例６−（１）で調製した硫酸化グルコースナトリウム塩、製造例６−（２）で調製した硫酸化フコースナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム（生化学工業社製）をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。継続培養後、実施例１−１−（３）と同様の方法によりＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表５と６に示す。
0004231688.tif 000012
0004231688.tif 000013
その結果、ＣＴＬ誘導時に試料を添加しなくても、継続培養の段階で上記の試料を添加した群は、どの群においても、継続培養後にも、その活性を高く維持していた。しかし、継続培養中に試料を添加しなかった群（対照）では、その活性を明らかに低下させていた。
このことより、ガゴメ昆布由来フコイダン、Ｆ−フコイダン、Ｕ−フコイダン、Ｌ．Ｍ．Ｗ．ヘパリン、ペクチン酸（ナカライテスク社製）、非膨潤性アルギン酸、膨潤性アルギン酸、硫酸化グルコースナトリウム塩、硫酸化フコースナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウムを、継続培養時に添加することにより、ペプチド等による刺激を付加することなく、抗原特異的な細胞傷害活性を保持した状態でＣＴＬの継続培養が可能であることが明らかになった。つまり、継続培養時にのみ酸性糖を添加することにより、抗原特異的な細胞傷害活性を保持したＣＴＬを継続培養することが可能であることが明らかになった。
実施例１−６
（１）抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存しておいたＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）、ＩＩ画分（Ｕ−フコイダン）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの継続培養
実施例１−６−（１）で調製したＣＴＬを実施例１−１−（４）と同様の方法で、さらに１０〜１４日間継続的に培養した。この際、実施例１−６−（１）でＣＴＬ誘導時に添加した試料と同じ試料をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した群と添加しない群を設定した。また、ＣＴＬ誘導時に試料を添加していない対照は、引き続き試料を添加せずに培養を行った。継続培養後、実施例１−１−（３）と同様の方法によりＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表７に示す。
0004231688.tif 000014
この結果、ＣＴＬ誘導時に、これらの試料を添加した群においては、継続培養時の試料の添加の有無に関わらず、継続培養後においてもその活性を高く維持していた。一方で、ＣＴＬ誘導時および継続培養時のどちらにもこれらの試料（ガゴメ昆布由来フコイダン）を添加しなかった群（対照）では、その活性を明らかに低下させていた。
このことより、ガゴメ昆布由来フコイダン等の酸性糖をＣＴＬ誘導時に添加し、継続培養時には添加しない場合にも、ペプチド等による刺激を付加することなく、抗原特異的な細胞傷害活性を保持した状態でＣＴＬの継続培養が可能であることが明らかになった。
以上の結果より、ＣＴＬの誘導時と継続培養時に酸性糖を添加することにより、ＣＴＬの特異的細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬを継続培養できることが明らかになった。さらに、酸性糖をＣＴＬの誘導時、あるいは、継続培養時どちらか一方に添加するのみでも、ＣＴＬの特異的細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬを継続培養できることが明らかになった。
実施例２  特異的細胞傷害活性を保持したＣＴＬの拡大培養
実施例２−１
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−１−（１）で調製したＣＴＬを５ＨＲＰＭＩで洗浄後、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。一方、実施例１−１−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ−Ａ２４およびＡ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。これらのＣＴＬ（２．５×１０４ｃｅｌｌｓ）とａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣ（１．２５×１０７ｃｅｌｌｓ）を１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコ（ファルコン社製）に入れ、３７℃湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、試料として終濃度１０μｇ／ｍｌのガゴメ昆布由来フコイダンを添加する群と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、試料添加群の培地には同濃度のガゴメ昆布由来フコイダンを添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表８に示す。拡大増殖率（×倍率）は、拡大培養後の細胞数を拡大培養前の細胞数で除して求めた。
0004231688.tif 000015
その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にガゴメ昆布由来フコイダンを添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもガゴメ昆布由来フコイダンを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。また、ＣＴＬ誘導時にガゴメ昆布由来フコイダンを添加せず、抗ＣＤ３抗体による拡大培養時にガゴメ昆布由来フコイダンを添加した群、ならびにＣＴＬ誘導時にガゴメ昆布由来フコイダンを添加し、拡大培養時にはこれを添加しなかった群においても特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保存した状態でＣＴＬを拡大培養することができた。つまり、少なくともＣＴＬ誘導時または拡大培養時のいずれかにガゴメ昆布由来フコイダンを添加することによって、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬを拡大培養することが可能になることが明らかになった。
実施例２−２
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）、ＩＩ画分（Ｕ−フコイダン）を、それぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例２−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した試料と同じ試料をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から試料を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび試料１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表９に示す。
0004231688.tif 000016
その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にこれらの試料を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの試料を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、フコイダンの構造、種類に関係無く、フコイダンをＣＴＬ誘導時と拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例２−３
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、製造例３で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆを、終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−３−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例２−３−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した試料と同じ試料を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から試料を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび７−１２ＳＦｄ−Ｆ  １０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１０に示す。
0004231688.tif 000017
その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に７−１２ＳＦｄ−Ｆを添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにも試料を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、フコイダンのような高分子の硫酸多糖だけでなく、Ｆ−フコイダンの構成単位である７−１２ＳＦｄ−Ｆのように分子量が小さい硫酸化糖でも、ＣＴＬ誘導時と拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例２−４
（１）  抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、Ｌ．Ｍ．Ｗ．ヘパリン（商品名  Ａｒｄｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ；ＣＥＬＳＵＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．社製）、ペクチン酸（ナカライテスク社製）、非膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、製造例６−（１）で調製した硫酸化グルコースナトリウム塩、製造例６−（２）で調製した硫酸化フコースナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム（生化学工業社製）、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム（生化学工業社製）を、それぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＮＰＡ２４を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−４−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例２−４−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した試料と同じ試料をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から試料を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび試料１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１１に示す。
0004231688.tif 000018
この結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にこれらの試料を添加した群のＣＴＬは、いずれも１４日間の拡大培養後に特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにも試料を添加しなかった群では、その活性は明らかに低下していた。つまり、硫酸化糖だけでなく、糖の種類、修飾等に関係無く、酸性糖をＣＴＬ誘導時と拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例２−５
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、上記実施例に使用されたような試料は全く添加しなかった。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−５−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように試料を添加する群と、試料を添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび試料１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。試料としては、製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）を用いた。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１２に示す。
0004231688.tif 000019
この結果、拡大培養時にＦ−フコイダンを添加した群のＣＴＬは、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにも試料を添加しなかった群では、その活性は明らかに低下していた。つまり、Ｆ−フコイダンを誘導時からでなく、拡大培養時だけに添加しても、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例２−６
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料は、全く添加しなかった。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−６−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように試料を添加する群と、試料を添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび試料１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも試料の添加は行わなかった。試料としては、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、製造例２で調製したＩＩ画分（Ｕ−フコイダン）、製造例３で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ、Ｌ．Ｍ．Ｗ．ヘパリン（商品名  Ａｒｄｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ；ＣＥＬＳＵＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．社製）、ペクチン酸（ナカライテスク社製）、非膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、膨潤性アルギン酸（和光純薬社製）、製造例６−（１）で調製した硫酸化グルコースナトリウム塩、製造例６−（２）で調製した硫酸化フコースナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム（生化学工業社製）、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム（生化学工業社製）を用いた。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１３と１４に示す。
0004231688.tif 000020
0004231688.tif 000021
この結果、拡大培養時にこれらの試料を添加した群のＣＴＬは、いずれも１４日間の拡大培養後において特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにも試料を添加しなかった群では、その活性は明らかに低下していた。つまり、酸性糖を誘導時からでなく、拡大培養時だけに添加しても、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例２−７
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。試料としては、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、製造例２で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）、ＩＩ画分（Ｕ−フコイダン）、製造例３で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ、Ｌ．Ｍ．Ｗ．ヘパリン（商品名  Ａｒｄｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ；ＣＥＬＳＵＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．社製）を用いた。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無、試料の違いによる細胞傷害活性の差は無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例２−７−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例２−７−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した試料と同じ試料を添加する群と添加しない群、及び、誘導時から試料を全く添加しない対照群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび試料１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１５に示す。
0004231688.tif 000022
その結果、ＣＴＬ誘導時と拡大培養時の両方でこれらの試料を添加した群、ＣＴＬ誘導時だけに、これらの試料を添加した群のいずれにおいても、１４日間の拡大培養後のＣＴＬは特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもガゴメ昆布由来フコイダンを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、誘導時に酸性糖を添加すれば、拡大培養時に酸性糖を添加の有無に関係なく、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
以上の結果より、ＣＴＬの誘導時と拡大培養時のいずれかまたは両方に酸性糖を添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例３  ＲＥＭ法との比較及びＲＥＭ法との組み合わせ
実施例３−１
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料として、製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例３−１−（１）で調製したＣＴＬを５ＨＲＰＭＩで洗浄後、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。一方、実施例１−１−（１）と同様に採取したＨＬＡ−Ａ２４およびＡ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し培地で洗浄後５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。これらのＣＴＬ（２．５×１０４ｃｅｌｌｓ）とａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣ（１．２５×１０７ｃｅｌｌｓ）を１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコ（ファルコン社製）に入れ、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、試料として終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを添加する群と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、試料添加群の培地には終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを添加した。拡大培養開始後、１４日目に、実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１６に示す。
一方、ＲＥＭ法による拡大培養は以下のように実施した。ＨＬＡ−Ａ２４およびＡ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し培地で洗浄後５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。また、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ感染ヒトＢ細胞株（ＥＢＶ−Ｂ細胞）をＸ線照射（８０００Ｒ）し、培地で洗浄後１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。実施例３−１−（１）で調製したＣＴＬ（２．５×１０４ｃｅｌｌｓ）とａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣ（１．２５×１０７ｃｅｌｌｓ）、ＥＢＶ−Ｂ細胞（２．５×１０６ｃｅｌｌｓ）を１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコ（ファルコン社製）に入れ、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、試料として終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを添加する群と添加しない群を設定した。ＥＢＶ−Ｂ細胞を除いた以外は上記と同様に調製したフラスコも上記と同様に培養した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌ含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、試料添加群の培地には終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように製造例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを添加した。拡大培養開始後、１４日目に、実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１７に示す。
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0004231688.tif 000024
その結果、ガゴメ昆布由来フコイダンを添加せずに誘導したＣＴＬ（ＣＴＬ誘導剤無添加）は、ＲＥＭ法で拡大培養した場合には高い細胞傷害活性を維持していた。しかし、ＥＢＶ−Ｂ細胞を使用しないＲＥＭ法で拡大培養を行った場合には細胞傷害活性は著しく低下した。
一方、ガゴメ昆布由来フコイダンをＣＴＬ誘導時と拡大培養時の両方、あるいはどちらか一方に添加しておくとＥＢＶ−Ｂ細胞を添加しなくても１４日間の大量培養後におけるＣＴＬ細胞傷害活性を十分高く維持させておくことができた。さらに、本発明による拡大培養後の抗原特異的細胞傷害活性は、ＲＥＭ法と比較しても高いものであった。
また、ＲＥＭ法で拡大培養する場合、拡大培養に先立ち、ＣＴＬ誘導時から、本発明の方法のＣＴＬ活性維持効果を持つ化合物の１つであるガゴメ昆布由来フコイダンを添加しておくと、従来技術で誘導したＣＴＬ細胞を単にＲＥＭ法で拡大培養することにより、細胞傷害活性を高く維持することができた。
つまり、本発明による、ＣＴＬ活性維持効果を持つ化合物を添加する拡大培養方法においては、ＲＥＭ法では必須であるＥＢＶ−Ｂ細胞を必要とせず、ＥＢＶ−Ｂ細胞を用いる危険性を回避することができる。さらに、ＲＥＭ法より高いＣＴＬ活性が維持できる。これらのことより、本発明のＣＴＬ細胞の拡大方法は、ＲＥＭ法より、安全で優れた方法である。
さらに、本発明で使用される化合物をＲＥＭ法に導入するとさらに高い活性を保持するＣＴＬを拡大培養することができる。すなわち、本発明で使用される化合物は、あらゆるＣＴＬの拡大培養方法への適応が可能であり、様々なＣＴＬ拡大培養方法において本発明で使用される化合物を使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態を維持できることが明らかとなった。
実施例３−２
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、試料としてヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰ  Ａ２．１を用いた。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例３−２−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−１−（２）と同様に拡大培養をおこなった。この際、試料として終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにヒアルロン酸を添加する群と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、試料添加群の培地には終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにヒアルロン酸を添加した。拡大培養開始後、１４日目に、実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１８に示す。
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その結果、ヒアルロン酸を添加せずに誘導したＣＴＬ（ＣＴＬ活性維持試薬無添加）は、ＲＥＭ法で拡大培養した場合には高い細胞傷害活性を維持していた。しかし、ＥＢＶ−Ｂ細胞を使用しないＲＥＭ法で拡大培養を行った場合には細胞傷害活性は著しく低下した。
一方、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時と拡大培養時の両方に添加しておくとＥＢＶ−Ｂ細胞を添加しなくても１４日間の大量培養後におけるＣＴＬ細胞傷害活性を十分高く維持させておくことができた。さらに、本発明による拡大培養後の標的特異的細胞傷害活性は、ＲＥＭ法と比較しても高いものであった。
また、ＲＥＭ法で拡大培養する場合、拡大培養に先立ち、ＣＴＬ誘導時から、本発明の方法のＣＴＬ活性維持効果を持つ化合物の１つであるヒアルロン酸を添加しておくと、従来技術で誘導したＣＴＬ細胞を単にＲＥＭ法で拡大培養するするより、細胞傷害活性を高く維持することができた。
つまり、本発明のＣＴＬの拡大培養方法においては、ＲＥＭ法では必須であるＥＢＶ−Ｂ細胞を必要とせず、ＥＢＶ−Ｂ細胞を用いる危険性を回避することができる。さらに、ＲＥＭ法より高いＣＴＬ活性が維持できる。これらのことより、本発明のＣＴＬ細胞の拡大方法は、ＲＥＭ法より、安全で優れた方法である。
さらに、ヒアルロン酸をＲＥＭ法に導入するとさらに高い活性を保持することができ、ヒアルロン酸はあらゆるＣＴＬ細胞の拡大培養方法への適応が可能であり、様々なＣＴＬ拡大培養方法に本発明で使用される化合物を添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になる。
実施例４  ヒアルロン酸を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの拡大培養
実施例４−１
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、ヒアルロン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、ヒアルロン酸を添加しない群も設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例４−１−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例４−１−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時からヒアルロン酸を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよびヒアルロン酸１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、ヒアルロン酸を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１９に示す。
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その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにも試料を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例４−２
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、ヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、試料を添加しない群も設定した。抗原ペプチドにはＦｌｕＭＰＡ２．１を用いた。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例４−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例４−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸はまったく添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表２０に示す。
0004231688.tif 000027
その結果、ＣＴＬ誘導時のみにヒアルロン酸を添加した群においては、拡大培養時にヒアルロン酸を添加しなくても、１４日間の拡大培養後において特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもヒアルロン酸を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時のみに添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例５  腫瘍関連抗原特異的細胞傷害活性を保持するＣＴＬの拡大培養
実施例５−１
（１）  抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）特異的ＣＴＬの誘導を行った。抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）特異的ＣＴＬの誘導はＰｌｅｂａｎｓｋｉらの方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２５；１７８３−１７８７）を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＢｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に２〜４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後半量に分けた。半量はレスポンダー細胞として氷上保存とし、もう半量は抗原提示細胞として用い、抗原ペプチドとしてメラノーマ抗原ＭＡＧＥ３由来エピトープペプチド（配列表の配列番号：３に記載のメラノーマ抗原ＭＡＧＥ３由来ＨＬＡＡ２．１結合性ペプチド  ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）８０μｇ／ｍｌおよびβ２マイクログロブリン（スクリプス社製）６μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩを等量添加し、５％ＣＯ２湿式インキュベーター内にて、３７℃で２時間インキュベートした。その後５ＨＲＰＭＩを用いて洗浄し氷上保存していたレスポンダー細胞と混合後、２ｘ１０ｅ６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。ＩＬ−７およびＫＬＨをそれぞれ終濃度２５ｎｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４穴細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に２ｍｌ  ／ｗｅｌｌずつ入れた。このとき、Ｌ．Ｍ．Ｗヘパリン（生化学工業社製）またはヒアルロン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。また対照として、試料を添加しない群も設定した。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。
培養開始後４日目に培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と１０μｇ／ｍｌのＬ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸を含む５ＨＲＰＭＩ  １ｍｌ（対照は、ＩＬ−２のみ含有）を各ウェルに添加した。
７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあとＸ線照射（５５００Ｒ）し、４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製した。１週間培養したレスポンダー細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁、調製した抗原提示細胞上と等量混合し、１ｍｌ／ウェルづつ２４穴細胞培養プレートに添加し、さらに終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を加えて再刺激した。このとき、Ｌ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（対照は、無添加）。再刺激後１日目に、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのＬ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸を含む（対照は、ＩＬ−２のみ含有）５ＨＲＰＭＩ１ｍｌを各ウェルに添加、また３日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌづつ添加した。同様の再刺激を１週間に１度、計４回実施しＣＴＬを誘導した。
（２）  ＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例５−１−（１）で調製した誘導開始後３５日目のＣＴＬの細胞傷害活性は実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。ただし、この際標的細胞として、一晩エピトープペプチドと共培養もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名  ２２１Ａ２．１）を用いた。
この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のＬ．Ｍ．Ｗヘパリンおよびヒアルロン酸添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。
（３）  ＣＴＬの拡大培養
実施例５−１−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例５−１−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したＬ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸を１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から試料を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよびＬ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表２１に示す。
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その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＬ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの試料を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）ＣＴＬの拡大培養時においても、Ｌ．Ｍ．Ｗヘパリンもしくはヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例５−２
（１）  抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例５−１−（１）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）特異的ＣＴＬの誘導を行った。抗原ペプチドとしてメラノーマ抗原ＭＡＲＴ１由来エピトープペプチド（配列表の配列番号：４に記載のメラノーマ抗原ＭＡＲＴ１由来ＨＬＡ  Ａ２．１結合性ペプチド  ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）を用いた。このとき、ガゴメ昆布由来フコイダンもしくはヒアルロン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。また対照として、試料を添加しない群も設定した。
こうして調製した誘導直後のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。ただしこの際、標的細胞としてエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名  ２２１Ａ２．１）、二晩１００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−γ存在化で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ガン細胞株（細胞名  ６２４ｍｅｌ；ＨＬＡ−Ａ２．１保持ＭＡＲＴ１発現細胞）もしくはＨＬＡ−Ａ２．１非保持ガン細胞株（細胞名  ８８８ｍｅｌ；ＨＬＡ−Ａ２．１非保持ＭＡＲＴ１発現細胞）を用いた。
この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例５−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例２−１−（２）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例５−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したガゴメ昆布由来フコイダンもしくはヒアルロン酸を１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から試料を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌおよびガゴメ昆布由来フコイダンもしくはヒアルロン酸１０μｇ／ｍｌを含む５ＨＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、試料を添加していない群においては、培地交換の際にも、試料の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表２２に示す。
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その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にガゴメ昆布由来フコイダンもしくはヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの試料を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。また腫瘍細胞株に対する特異的細胞傷害活性についてもＣＴＬ誘導時および拡大培養時にガゴメ昆布由来フコイダンもしくはヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）ＣＴＬの拡大培養時においても、ガゴメ昆布由来フコイダンもしくはヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
実施例６  抗体結合マグネチックビーズによる細胞選択
実施例６−１
（１）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルスメモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、ガゴメ昆布由来フコイダンを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、ガゴメ昆布由来フコイダンを添加しない群も設定した。
こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の試料添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。
（２）  ＣＴＬの拡大培養
実施例６−１−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例３−１−（２）と同様の方法でＣＴＬの拡大培養を行った。この際、試料として終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにガゴメ昆布由来フコイダンを添加する群と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、ＩＬ−２  ６０Ｕ／ｍｌ含む５ＨＲＰＭＩ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、試料添加群の培地には終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにガゴメ昆布由来フコイダンを添加した。拡大培養開始後、１４日目に、実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。
（３）  抗体結合マグネチックビーズによる細胞選択
実施例６−１−（２）で調製した拡大培養後のＣＴＬを氷冷した２％ＦＢＳ／ＰＢＳにて洗浄後、同バッファーにて１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。これらの細胞懸濁液に、あらかじめ氷冷した２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄しておいたＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ４（抗ＣＤ４抗体結合マグネチックビーズ、ダイナル社製）を１ｘ１０７ｃｅｌｌｓの細胞あたり１５０μｌずつ添加した。ビーズを含む細胞懸濁液を４℃で緩やかに振盪しながら３０分インキュベートした。インキュベート後の細胞懸濁液の入ったチューブに氷冷した２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ用磁石台（ダイナル社製）を用いてビーズおよびビーズ結合細胞を除去した。このようにして得られた抗ＣＤ４抗体結合ビーズ非結合細胞集団および選択前の細胞集団についてフローサイトメーターを用いてＣＤ８＋細胞の含有率を確認した。その結果を表２３に示す。さらに実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を比較した。この結果を表２４に示す。
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その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にガゴメ昆布由来フコイダンを添加した群においては、抗体結合ビーズで細胞選択することによってその細胞傷害活性をさらに高くすることができた。また、ＲＥＭ法によりＣＴＬを拡大培養し、抗体結合ビーズで細胞選択してもその細胞傷害活性は変わらなかった。また、ＲＥＭ法とガゴメ昆布由来フコイダン添加の併用条件で拡大培養後に抗体結合ビーズで細胞選択することによって、その細胞傷害活性をさらに高くすることが出来た。
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配列表フリーテキスト
配列番号：１は、インフルエンザウイルス由来のヌクレオプロテインを元にデザインしたＨＬＡ  Ａ２４結合性ペプチドである。
配列番号：２は、インフルエンザウイルス由来のマトリックスプロテインを元にデザインしたＨＬＡ  Ａ２．１結合性ペプチドである。
配列番号：３は、メラノーマ抗原ＭＡＧＥ３由来のＨＬＡ  Ａ２．１結合性ペプチドを元にデザインしたペプチドである。
配列番号：４は、メラノーマ抗原ＭＡＲＴ１由来のＨＬＡ  Ａ２．１結合性ペプチドを元にデザインしたペプチドである。
産業上の利用可能性
本発明により、抗原特異的な細胞傷害活性を高いレベルで保持したＣＴＬを誘導、維持ならびに拡大培養する方法が提供される。当該方法は大量のＣＴＬを必要とする養子免疫療法等の細胞医療の分野で極めて有用である。また当該方法により調製されるＣＴＬは安全な方法で調製されることから、極めて安全性の高い細胞医薬となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。
【図１】
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