(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質をもつ変異型loxP配列。
（ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列において、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）の塩基のうち少なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又は７番目（Ｇ）の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意の塩基に置換されていてもよい配列からなり、
【化１】
0004206154.tif 000008
（ｂ）リコンビナーゼCreの存在下でも野生型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、
（ｃ）リコンビナーゼCreの存在下、同一の配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こる。
【請求項２】
以下の性質をもつ変異型loxP配列。
（ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列において、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）及び４番目（Ｔ）の塩基から選ばれる一つの塩基が異なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意の塩基に置換されていてもよい配列からなり、
【化２】
0004206154.tif 000009
（ｂ）リコンビナーゼCreの存在下でも野生型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、
（ｃ）リコンビナーゼCreの存在下、同一の配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こる。
【請求項３】
リコンビナーゼCreの存在下でも異なる配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらない、請求項１又は２記載の変異型loxP配列。
【請求項４】
配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４２又は配列番号：４９で表される配列である請求項１記載の変異型loxP配列。
【請求項５】
請求項１ないし４いずれかに記載の変異型loxP配列を有するＤＮＡ。
【請求項６】
少なくとも一つの野生型loxP配列及び請求項１又は２記載の変異型loxP配列を少なくとも一つ有するＤＮＡ。
【請求項７】
野生型loxP配列と変異型loxP配列の間に所望の遺伝子が挿入された請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
互いに異なる配列をもつ少なくとも２つの請求項３記載の変異型loxP配列を有するＤＮＡ。
【請求項９】
互いに異なる配列をもつ２つの変異型loxP配列の間に所望の遺伝子が挿入された請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項６ないし９いずれかに記載のＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１１】
下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）をリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤＮＡ（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。
（ａ）野生型loxP配列、遺伝子Ａ及び請求項１又は２記載の変異型loxP配列をこの順に有するＤＮＡ。
（ｂ）野生型loxP配列、遺伝子Ｂ及びＤＮＡ（ａ）と同じ変異型loxP配列をこの順に有する環状ＤＮＡ。
（ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換されたＤＮＡ。
ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子である。
【請求項１２】
下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）をリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤＮＡ（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。
（ａ）互いに異なる配列をもつ２つの請求項３記載の変異型loxP配列（変異型loxP配列１及び変異型loxP配列２）及び遺伝子Ａを変異型loxP配列１／遺伝子Ａ／変異型loxP配列２の順に有するＤＮＡ。
（ｂ）変異型loxP配列１、遺伝子Ｂ及び変異型loxP配列２をこの順に有する環状ＤＮＡ。
（ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換されたＤＮＡ。
ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子である。
【請求項１３】
遺伝子Ｂが機能的な遺伝子ではないことを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子Ａが機能的な遺伝子ではないことを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二本鎖環状ＤＮＡウイルスのＤＮＡであることを特徴とする請求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されることにより二本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有することを特徴とする請求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルスの染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二本鎖環状ＤＮＡウイルスのＤＮＡであることを特徴とする請求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルスの染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されることにより二本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有することを特徴とする請求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ（ａ）の二本鎖ＤＮＡウイルスがアデノウイルスであることを特徴とする請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項６ないし９いずれかに記載のＤＮＡを染色体上に有するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２１】
請求項６ないし９いずれかに記載のＤＮＡからなる医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は変異型loxP配列とその応用に関する。さらに詳しくは、野生型loxP配列とは特異的組換え反応は起こさないが変異型どうしでは特異的組換え反応を起こす変異型loxP配列と、該変異型loxP配列を用いた遺伝子の置換方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物ウイルスや高等真核細胞である動物細胞の染色体の特定の部位に、任意の遺伝子を挿入すること、あるいは特定の遺伝子を欠如させることは容易ではない。例えば、動物細胞の染色体の特定の部位に遺伝子を挿入する方法として一般に行われているのは、目的遺伝子を挿入したい染色体の部位と同じ配列のDNAを目的遺伝子の両側に結合したプラスミドDNA等で細胞を形質転換し、相同組換えにより目的遺伝子が挿入された細胞を得る方法である。しかし、相同組換えの頻度は著しく低く、そのために目的遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子等を同時に組み込み、薬剤による選択を行う必要があり、目的の細胞を得るまでに数ヶ月を要する。また、目的遺伝子を挿入した組換え動物ウイルスの作製は、前述の細胞染色体の場合より多少簡便であるが、それでも例えば組換えアデノウイルスを作製する場合、目的の遺伝子を挿入したプラスミド等を用いて相同組換えを行い、その後組換えウイルスのクローン化ならびに選抜及び増殖をさせる必要がある（Bett et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 91, 8802-8806(1994)、Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 93, 1320-1324(1996)）。
【０００３】
このように動物細胞の染色体の特定の部位の遺伝子操作や組換えウイルス作製が困難な原因の一つは、頻度の低い相同組換えを用いているからである。これに対し、プラスミドやバクテリオファージの作製に用いる制限酵素のように、DNA配列を特異的に認識する酵素を用いることができれば、効率の向上が期待できる。そのような酵素の例として大腸菌のバクテリオファージP1由来のリコンビナーゼCreが挙げられる。
【０００４】
Creは、特定の塩基配列（loxP配列）を認識し、この配列間でDNA鎖の切断、鎖の交換と結合の全行程を行う特異的なDNA組換え酵素である（Sternberg et al., J. Mol. Biol., Vol. 150, 467-486(1981)、Abremski et al., J. Biol. Chem., Vol. 259, 1509-1514(1984)、Hoess et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.81, 1026-1029(1984)）。すなわち、同一DNA分子上に同方向の２つのloxP配列が存在する場合は、その間に挟まれたDNA配列が切り出されて環状分子となり（切り出し反応）、またその逆に、異なるDNA分子上に２つのloxP配列が存在し、その一方が環状DNAである場合は、loxP配列を介して環状DNAが他方のDNA分子上に挿入される（挿入反応）。Cre及びloxP配列はバクテリオファージで発見されたが、特異的なDNA組換え反応は、前核細胞だけでなく真核細胞である動物細胞や動物ウイルスでも機能することが知られており、切り出し反応の例としては、動物培養細胞（Sauer et al., Nucleic Acids Res., Vol.17, 147-161(1989)、Kanegae et al., Gene, Vol.181, 207-212(1996)）、動物ウイルス（Sauer et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.85, 5166-5170(1988)、Anton et al., J. Virol., Vol.69, 4600-4606(1995)、Kanegae et al., Nucleic Acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995)）、トランスジェニックマウス（Lakso et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 6232-6236(1992)、Orban et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 6861-6865(1992)、Gu et al., Cell, Vol. 73, 1155-1164(1993)、Gu et al., Science, Vol. 265, 103-106(1994)）等が挙げられる。
【０００５】
一方、挿入反応を利用すれば、loxP配列が既に存在する動物細胞の染色体やウイルスゲノムに、任意の遺伝子を挿入することが可能であるが、その頻度は極めて低く（Fukushige et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 7905-7909(1992)、Sauer et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.84, 9108-9112(1987)）、実用的でない。なぜならば、挿入反応と切り出し反応は可逆的であり、挿入反応により同一DNA分子上に２つのloxP配列が存在すると、ただちに切り出し反応も起こり、しかも反応の平衡は圧倒的に切り出し反応側に偏るからである。
【０００６】
この挿入反応の頻度を上げるため、本来のloxP配列（野生型）の塩基配列とは異なる配列のloxP配列（変異型）を用いた試みが行われた。loxP配列は34塩基のDNA配列から成り、２つの13塩基の逆方向反復配列（inverted repeat）に挟まれた8塩基の配列はスペーサー領域と呼ばれ、DNA鎖の組換えはスペーサー領域で行われることが知られている（Hoess et al., J. Mol. Biol., Vol. 181, 351-362(1985)）。
【化３】
0004206154.tif 000002
このスペーサー領域の塩基の７番目の塩基をＧ（グアニン）からＡ（アデニン）に置換したloxP配列（変異型loxP配列）は、野生型loxP配列との間では特異的DNA組換え反応が起きないが、２つの変異型loxP配列間では特異的DNA組換え反応が起きることが示された（Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)）。
【０００７】
また、あるDNA分子の変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に存在する遺伝子を、他のDNA分子上に存在する変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に挿入あるいは置換する試みが行われた。その例として、プラスミドベクター上の遺伝子のバクテリオファージ上の遺伝子との置換（Waterhouse et al., Nucleic Acids Res., Vol.21, 2265-2266(1993)）、ファージミドベクター上の遺伝子のプラスミドベクターへの挿入（Tsurushita et al., Gene, Vol.172, 59-63(1996)）、プラスミドベクター上の遺伝子の動物細胞染色体上の遺伝子との置換（Bethke et al., Nucleic Acids Res., Vol.25, 2828-2834(1997)）などが挙げられる。
【０００８】
しかしながら、これらの試みはただ１種類の変異型loxP配列、すなわちスペーサー領域の塩基の７番目の塩基をＧ（グアニン）からＡ（アデニン）に置換したloxP配列（変異型loxP配列）のみを用いて行われており、該配列の変異型loxP配列が野生型loxP配列との間で組換え反応を起こさないために好適であるかどうか明らかではない。さらに、上記３件の試みは、全て薬剤耐性遺伝子そのものか、あるいは目的遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子を挿入し、目的の組換えが生じたDNA分子を有する組換え体のみが薬剤耐性を獲得し増幅されるという実験系が用いられているので、loxP配列の変異が不十分で野生型loxP配列と反応が起き、実際の遺伝子挿入（遺伝子置換）の効率が低下していても、薬剤選択というバイアスがかかっているため、見かけ上の反応効率は高く表示されている可能性がある。
【０００９】
実際、本発明者らが考案した直接的かつ定量的な測定方法では、７番目の塩基をＧからＡに置換した変異型loxP配列は、約5%の頻度で野生型loxP配列との間で組換え反応が起こり、loxP配列の変異が不十分であることが確認された。
【００１０】
このように、従来の技術では変異型loxP配列と野生型loxP配列とを用い、動物細胞の染色体に存在する遺伝子置換を行う技術が考案されてはいるが、その効率は十分ではなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リコンビナーゼＣｒｅの存在下、野生型loxP配列とは組換え反応が起きず、かつ同一配列の２つの変異型loxP配列間での組換え反応は２つの野生型loxP配列間と同程度の効率で起こる変異型loxP配列を提供することである。さらに本発明の目的は、野生型loxP配列と変異型loxP配列、もしくは異なる配列の変異型loxP配列の組み合わせにより、動物細胞をはじめとする高等真核細胞で、効率の高い遺伝子挿入もしくは遺伝子置換を行う方法を提供し、その方法を動植物細胞への遺伝子導入、組換えウイルス作製、動植物個体での遺伝子操作などに応用することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、loxP配列のスペーサー領域の8塩基全てについて可能な１塩基置換の変異型loxP配列を作製し、非常に鋭敏な測定方法で反応性を試験することにより、２つのloxP配列間でのリコンビナーゼＣｒｅ依存組換え反応の機構を研究し、反応に必須の塩基配列を見出した。かかる知見に基づき、同一配列の２つの変異型loxP配列間では、２つの野生型loxP配列間と同程度の効率で組換え反応が起きるが、野生型loxP配列もしくは異なる配列の変異型loxP配列とは組換え反応が起こらない変異型loxP配列を見出した。さらに、これらのloxP配列を組み合わせることにより、動物細胞の染色体に非常に高い効率で遺伝子を挿入することに成功した。本発明は、かかる知見に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったものである。
【００１３】
すなわち、本発明の要旨は、次のとおりである；
（１）以下の性質をもつ変異型loxP配列。
（ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列において、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）の塩基のうち少なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又は７番目（Ｇ）の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意の塩基に置換されていてもよい配列からなり、
【化４】
0004206154.tif 000003
（ｂ）リコンビナーゼＣｒｅの存在下でも野生型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、
（ｃ）リコンビナーゼＣｒｅの存在下、同一の配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こる；
（２）以下の性質をもつ変異型loxP配列。
（ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列において、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）及び４番目（Ｔ）の塩基から選ばれる一つの塩基が異なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意の塩基に置換されていてもよい配列からなり、
【化５】
0004206154.tif 000004
（ｂ）リコンビナーゼＣｒｅの存在下でも野生型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、
（ｃ）リコンビナーゼＣｒｅの存在下、同一の配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こる；
（３）リコンビナーゼＣｒｅの存在下でも異なる配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらない、上記（１）又は（２）記載の変異型loxP配列；
（４）配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４２又は配列番号：４９で表される配列である上記（１）記載の変異型loxP配列；
（５）上記（１）ないし（４）いずれかに記載の変異型loxP配列を有するＤＮＡ；
（６）少なくとも一つの野生型loxP配列及び上記（１）又は（２）記載の変異型loxP配列を少なくとも一つ有するＤＮＡ；
（７）野生型loxP配列と変異型loxP配列の間に所望の遺伝子が挿入された上記（６）記載のＤＮＡ；
（８）互いに異なる配列をもつ少なくとも２つの上記（３）記載の変異型loxP配列を有するＤＮＡ；
（９）互いに異なる配列をもつ２つの変異型loxP配列の間に所望の遺伝子が挿入された上記（８）記載のＤＮＡ；
（１０）上記（６）ないし（９）いずれかに記載のＤＮＡによって形質転換された細胞；
（１１）下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）をリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤＮＡ（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。
（ａ）野生型loxP配列、遺伝子Ａ及び上記（１）又は（２）記載の変異型loxP配列をこの順に有するＤＮＡ。
（ｂ）野生型loxP配列、遺伝子Ｂ及びＤＮＡ（ａ）と同じ変異型loxP配列をこの順に有する環状ＤＮＡ。
（ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換されたＤＮＡ。
ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子である；
（１２）下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）をリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤＮＡ（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。
（ａ）互いに異なる配列をもつ２つの上記（３）記載の変異型loxP配列（変異型loxP配列１及び変異型loxP配列２）及び遺伝子Ａを変異型loxP配列１／遺伝子Ａ／変異型loxP配列２の順に有するＤＮＡ。
（ｂ）変異型loxP配列１、遺伝子Ｂ及び変異型loxP配列２をこの順に有する環状ＤＮＡ。
（ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換されたＤＮＡ。
ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子である；
（１３）遺伝子Ｂが機能的な遺伝子ではないことを特徴とする上記（１１）又は（１２）記載の方法；
（１４）遺伝子Ａが機能的な遺伝子ではないことを特徴とする上記（１１）又は（１２）記載の方法；
（１５）ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二本鎖環状ＤＮＡウイルスのＤＮＡであることを特徴とする上記（１１）ないし（１４）いずれかに記載の方法；
（１６）ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されることにより二本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有することを特徴とする上記（１１）ないし（１４）いずれかに記載の方法；
（１７）ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルスの染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二本鎖環状ＤＮＡウイルスのＤＮＡであることを特徴とする上記（１１）ないし（１４）いずれかに記載の方法；
（１８）ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルスの染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されることにより二本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有することを特徴とする上記（１１）ないし（１４）いずれかに記載の方法；
（１９）ＤＮＡ（ａ）の二本鎖ＤＮＡウイルスがアデノウイルスであることを特徴とする上記（１７）又は（１８）記載の方法；
（２０）上記（６）ないし（９）いずれかに記載のＤＮＡを染色体上に有するトランスジェニック動物；
（２１）上記（６）ないし（９）いずれかに記載のＤＮＡからなる医薬。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明における変異型loxP配列とは、野生型loxP配列のスペーサー領域の特定の塩基を本来とは異なる塩基に置換し、その置換によりリコンビナーゼCreによる特異的DNA組換え反応における基質特異性が変化する配列を指し、基質特異性に影響しない他の塩基の置換を含んでいてもよい。ここにいう基質特異性とは、例えば、野生型loxP配列、変異型loxP配列１、変異型loxP配列２の３種類のloxP配列が存在する場合、野生型loxP配列と変異型loxP配列１、野生型loxP配列と変異型loxP配列２、変異型loxP配列１と変異型loxP配列２のそれぞれの組合せでは、Creによる特異的DNA組換え反応が実質的に起こらないことをいう。本基質特異性の程度は、後述する遺伝子置換方法を実施する上で十分であればよい。
【００１５】
この変異型loxP配列と野生型loxP配列とをあらかじめ細胞の染色体に組み込んでおき、同じ組み合わせの２つのloxP配列の間に任意の遺伝子が存在する環状DNAを、リコンビナーゼCreとともに細胞に導入することにより、まず変異型loxP配列どうし、もしくは野生型loxP配列どうしによる挿入反応により、loxP配列が４ヶ存在する中間体が生成し、次いで、挿入反応とは異なる組み合わせのloxP配列間（挿入反応が野生型loxP配列間であれば変異型loxP配列間）で切り出し反応が起こることにより、環状DNAの変異型loxP配列と野生型loxP配列との間の任意の遺伝子が、細胞の染色体の変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に挿入される。また、細胞の染色体の変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に別の遺伝子が存在する場合は、上記反応によりこの遺伝子は染色体から除かれ、環状DNAに挿入されている遺伝子に置換される。従って、細胞の染色体に変異型loxP配列と野生型loxP配列が存在すれば、その部位に任意の遺伝子を効率よく導入することが可能となる。また、変異型loxP配列と野生型loxP配列との組み合わせの代わりに、特異的DNA組換え反応が起こらない２つの変異型loxP配列を用いることもできる。
【００１６】
本発明の変異型loxP配列は以下のようにして見出された。
loxP配列の基質特異性が変化した変異型loxP配列としては、スペーサー領域の塩基の７番目の塩基をGからAに置換した配列が知られている（Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)）。そのアッセイ法では、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子の両側に野生型loxP配列と変異型loxP配列とを挿入し、得られたプラスミドでCre発現大腸菌を形質転換した。そして、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌を選別後、カナマイシン耐性の有無（２つのloxP配列間で組換えが起きるとカナマイシン耐性を失う）で、野生型loxP配列と変異型loxP配列との間の組換え反応の程度を判断している。すなわち、１分子のプラスミドでのCreによる組換え反応の結果を何億倍にも増幅し、しかも薬剤による選択を行っているため、実際の組換え反応をどの程度反映しているかは明らかではない。
【００１７】
そこで本発明者らは、より直接的で定量的なアッセイ方法を確立し、Creによる組換え反応に必須のloxP配列内の塩基を同定した。まずそのアッセイ法を簡単に説明する。8塩基のスペーサー領域の全ての塩基を1塩基ずつ、可能な全ての塩基に置換した変異型loxP配列（計24種類）及び野生型loxP配列を含むDNAを通常の方法により合成し、適当な長さのDNA断片、例えばプラスミドpBR322を制限酵素消化し直鎖状にしたDNA断片の両端に、野生型loxP配列及び変異型loxP配列とを結合させたDNA断片を基質として用いた。この基質DNAをin vitroの無細胞系でCre蛋白と反応させ組換え反応を行い、適当な制限酵素で消化後電気泳動することにより、変異型loxP配列の野生型loxP配列との組換え反応の効率を定量的に測定した。その結果、以下に示す結果が得られた；
(1)スペーサー領域の１番目又は８番目の塩基を置換しても、野生型loxP配列と反応する；
(2)２番目、３番目、４番目又は５番目の塩基を置換すると、反応は大部分中間体で止まり、最終段階まではほとんど進まない。その程度は置換箇所により若干差があり、５番目の置換ではごく一部最終段階まで進む；
(3)６番目の塩基を置換すると、中間体はほとんどできないが、反応は一部最終段階まで進む。反応が最終段階まで進む割合は、５番目または７番目の塩基を置換した場合よりも多い。また置換する塩基の種類により反応の進行度は異なり、本来の塩基であるTをAに置換すると、CまたはGに置換した場合より、反応が最終段階まで進む割合が高い；
(4)７番目の塩基を置換すると、中間体はほとんどできないが、反応はごく一部最終段階まで進む。従来報告されているのは、この７番目の塩基のGからAへの置換であるが、この置換を行っても、反応は約5%の頻度で最終段階まで進行した。この頻度は、本発明の目的である遺伝子置換を行うのには高すぎる値である。なぜならば、野生型loxP配列と変異型loxP配列との間で5%もの頻度で組換え反応が起きると、Creによる切り出し反応により、２つのloxP配列（野生型及び変異型）の間に存在する遺伝子が欠失してしまう可能性があるからである。
【００１８】
なお、ここでいう中間体とは、二本鎖DNAのうち片側の鎖は組換わっているが他方は組換わっていない、いわゆるホリデー構造（Holliday-structure、Hoess et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 84, 6840-6844(1987)）の状態を意味する。２つのloxP配列間での組換え反応は、まずスペーサー領域の下側の鎖の７番目と８番目の塩基の間が切断され再結合した後、上側の鎖の１番目と２番目の塩基の間が切断され再結合することにより反応は完了することが知られている（Guo et al., Nature, Vol. 389, 40-46(1997)）。従って、２番目から５番目までの塩基の置換と、６番目７番目の塩基の置換とは質的に異なり、前者は下側の鎖の組換えは起きるが上側の鎖の組換えが起きずに中間体で反応が止まったもの、後者は下側の鎖の組換えの頻度は低いものが、その一部で組換え反応が起き、反応が最終段階まで進行したものであることが明らかになった。
【００１９】
次に、同様のアッセイ方法で、同じ配列の２つの変異型loxP配列間での組換え反応を検討した。置換箇所及び置換した塩基の種類により反応性に差はあるものの、２番目から７番目の塩基のうち１塩基を置換した２つの変異型loxP配列間で、Creによる特異的な組換え反応が認められた。その反応の程度の差は、置換箇所よりも、置換した塩基の種類に依存していた。例えば、３番目の塩基(G)のCへの置換、及び７番目の塩基(G)のTへの置換は、他の２種類の塩基に置換した場合よりも明らかに反応性は悪かった。
【００２０】
従って、野生型loxP配列において、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）及び４番目（Ｔ）の塩基から選ばれる一つの塩基が異なる塩基に置換された配列の変異型loxP配列及び該変異型loxP配列を有するDNAは本発明に含まれる。
【００２１】
また、以上の知見より、質的に異なる塩基の置換箇所、すなわち２番目から５番目の任意の箇所と６番目または７番目を、２つ以上組み合わせることにより、１塩基のみの置換とは異なり、極めて高い特異性を有し、同じ変異型loxP配列どうしでは１塩基置換に匹敵する組換え効率をもつ変異型loxP配列が得られることが予想された。
【００２２】
そこで、次に２番目から５番目の任意の一塩基の置換と７番目の塩基の置換とを組み合わせた変異型loxP配列について、野生型loxP配列との組換え反応効率、及び同じ配列の２つの変異型loxP配列間での組換え反応の効率を検討した。２塩基置換した変異型loxP配列のほとんどは、野生型loxP配列との組合せでは組換え反応は最終段階まで全く進まず、１塩基のみの置換よりも基質特異性が明らかに上昇した。しかしながら、同じ配列の２つの変異型loxP配列間での組換え反応の効率は、配列により大きく異なり、全く反応しない配列もあったが、次に示す変異型loxP配列は実用上十分な組換え効率を示した。T2C/G7A(#2171、配列番号：26)、T2A/G7A(#2271、配列番号：29)、T2A/G7C(#2272、配列番号：30)、G3A/G7A(#3171、配列番号：35)、G3T/G7A(#3371、配列番号：39)、T4C/G7A(#4171、配列番号：42)、A5G/G7A(#5171、配列番号：49)。なかでも、T2A/G7C(#2272)及びA5G/G7A(#5171)の反応効率は非常に高かった。なお、数字は置換する塩基の場所、数字の前の塩基は置換前の塩基、数字の後の塩基は置換後の塩基を示す。例えば、T2C/G7Aは、２番目の塩基をTからCへ、７番目の塩基をGからAへ置換した配列を示す。また、かっこ内の番号及び配列番号との関係は後記の表２に示されている。
【００２３】
このように、野生型loxP配列のスペーサー領域の２つの塩基を同時に置換した変異型loxP配列は、野生型loxP配列とは組換え反応を起こさず、２つの変異型loxP配列どうしでは高い効率で組換え反応が起きたことより、１塩基のみ置換したloxP配列よりもさらに基質特異性が増加したことが明らかとなった。
【００２４】
従って、野生型loxP配列において、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）の塩基のうち少なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又は７番目（Ｇ）の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異なる塩基に置換された変異型loxP配列及び該変異型loxP配列を有するDNAは、本発明に含まれる。
【００２５】
さらに本発明者らは、異なる配列の変異型loxP配列の間で組換え反応が起こるかどうかを検討した。その例としてT2C/G7A(#2171)とT2A/G7C(#2272)を挙げるが、これら２種の変異型loxP配列間では組換え反応は全く起こらなかった。このことは、野生型loxP配列、変異型loxP配列1、変異型loxP配列2の、少なくとも３種類の基質特異性が異なるloxP配列を見出したことを意味し、後述する遺伝子置換を行う上で有用である。
【００２６】
次に、本発明の変異型loxP配列を用いた遺伝子置換の方法及びその応用について説明する。
【００２７】
本発明の遺伝子置換方法は、野生型loxP配列、遺伝子Ａ及び変異型loxP配列をこの順に有するＤＮＡ（ａ）と、野生型loxP配列、変異型loxP配列をこの順に有する環状ＤＮＡ（ｂ）とをリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、ＤＮＡ（ａ）中の遺伝子Ａを遺伝子Ｂに置換することからなる。ここで、野生型loxP配列と変異型loxP配列とはＣｒｅ依存組換え反応は起こらず、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子である。
【００２８】
また本発明の遺伝子置換方法は、互いに異なる配列をもつ２つの変異型loxP配列（変異型loxP配列１及び変異型loxP配列２）及び遺伝子Ａを変異型loxP配列１／遺伝子Ａ／変異型loxP配列２の順に有するＤＮＡ（ａ）と、変異型loxP配列１、遺伝子Ｂ及び変異型loxP配列２をこの順に有する環状ＤＮＡ（ｂ）とをリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、ＤＮＡ（ａ）中の遺伝子Ａを遺伝子Ｂに置換することからなる。ここで、変異型loxP配列１と変異型loxP配列２とはＣｒｅ依存組換え反応は起こらず、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子である。
【００２９】
遺伝子置換の方法は、基本的に次のようにして行う。その例として、野生型loxP配列と変異型loxP配列を用いた方法につき説明するが、変異型loxP配列１と変異型loxP配列２を用いる場合も同様である。また、動物細胞の染色体の遺伝子を置換する場合を例として説明するが、本方法は動物細胞の染色体に限らず、動物ウイルスのゲノムや、植物細胞、酵母または細菌等の微生物の染色体や、バクテリオファージなどにも適用できる。
【００３０】
まず、動物細胞の染色体にあらかじめ野生型loxP配列と変異型loxP配列とを挿入しておく。野生型loxP配列と変異型loxP配列との間には任意の遺伝子Ａが存在してよく、この場合は遺伝子置換となり、遺伝子Ａが存在しない場合には、遺伝子挿入となる。
【００３１】
一方、野生型loxP配列と変異型loxP配列とを挿入した環状DNA分子の２つのloxP配列の間に、導入しようとする遺伝子Ｂを挿入しておく。この環状DNA分子は、例えばプラスミドDNAや二本鎖環状DNAウイルスのようにあらかじめ環状分子となったものを用いてもよいし、また何らかの操作により細胞内に導入後、環状分子となるものを用いてもよい。この遺伝子Ｂと野生型及び変異型loxP配列が存在する環状DNA分子を公知の方法により前述した細胞内に導入し、同時に公知の方法によりCre蛋白を細胞内で発現させることにより、環状DNA分子上の遺伝子Ｂが細胞の染色体上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入される。その際、細胞の染色体上の２つのloxP配列の間に遺伝子Ａが存在する場合は、この遺伝子Ａが除かれ遺伝子Ｂが挿入される遺伝子置換となる。染色体上の２つのloxP配列の間に遺伝子が存在しない場合には遺伝子挿入となる。さらに、環状DNAの２つのloxP配列の間に遺伝子が存在しない場合は、染色体上の遺伝子Ａを除くことができる。しかも、遺伝子Ａを除いても染色体上には２つのloxP配列は存在するので、２つのloxP配列の間に任意の遺伝子Ｃを有する別の環状DNA分子を用いることにより、再びこの染色体上の２つのloxP配列間に遺伝子を導入することができる。
【００３２】
動物細胞に環状DNA分子を導入する方法は、一般的に用いられている方法を使用することができる。その例として、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-dextran法、リポフェクション法、遺伝子銃などの物理化学的方法や、環状DNAウイルス等が挙げられる。環状DNAウイルスの例としては、パピローマウイルスやSV40などが挙げられる。また、細胞内に導入後、環状分子とする方法の例としては、リコンビナーゼを用いる方法が挙げられ、そのリコンビナーゼとしては、酵母の2mlプラスミド由来のFLPやチゴサッカロマイセス・ルーイイのpSR1プラスミド由来のR、そしてCreなどが挙げられる。
【００３３】
動物細胞の染色体にあらかじめ２つのloxP配列を挿入するには、例えば、２つのloxP配列が存在するプラスミドDNA等を用いて細胞を形質転換すればよい。形質転換時の遺伝子導入方法は、前述した物理化学的方法で行うことができる。さらに、レトロウイルスやアデノ随伴ウイルス、HIV等の、ウイルスゲノムを細胞の染色体に挿入する性質を有するウイルスを用いてもよい。
【００３４】
動物細胞内でCreを発現させる方法は、Creの遺伝子をコードするDNAやRNAを細胞に導入後、細胞内でCre蛋白を発現させる方法や、Cre蛋白そのものを細胞内に導入する方法を用いることができる。前者の例としては、Creの遺伝子をコードするDNAやRNAを前述した物理化学的方法で細胞に導入する方法や、ウイルスベクターを用いる方法が挙げられる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、ヘルペスウイルス、EBウイルスなどが挙げれられるが、その遺伝子導入効率の高さからアデノウイルスが好適な例として挙げられる。
【００３５】
本発明の変異型loxP配列を用いた動物細胞染色体上での遺伝子置換法の利点は、その効率の高さと染色体の特定の部位に遺伝子を挿入できることである。特に後者は形質転換細胞を取得する上では極めて重要である。なぜならば、DNAを用いた通常の形質転換法（相同組換え以外）や、レトロウイルスやアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを用いた方法では、染色体上での目的遺伝子の挿入部位はランダムであるため、挿入部位により目的遺伝子の発現量及びその染色体での安定性に大きな差があるからである。そのため、例えば目的遺伝子を安定に（長期間）、しかも高発現する形質転換細胞株を得るには、非常に多くの細胞株をスクリーニングしなければならない。しかも、一遺伝子ごとに、すなわち１回の形質転換ごとに、このスクリーニングを繰り返さなければならない。それに較べて、本発明による方法では、２つのloxP配列にはさまれたある遺伝子の発現を指標にして、その発現量が高く安定な細胞株を一旦取得すれば、任意のどの遺伝子を導入しても、遺伝子の発現が高く安定な細胞株を容易に取得することができる。しかも、その効率は極めて高いため、通常必要な薬剤選択の操作が必要なく、細胞のクローン化の操作だけで目的の細胞株を短期間に取得することができる。対象とする細胞株に特に制限はないが、トランスジェニック動物の作製に用いるES細胞などの形質転換には、特に有効である。
【００３６】
本発明による動物細胞染色体の遺伝子置換方法は、培養細胞だけでなく動物個体に対しても適用できる。特定の外来遺伝子を動物個体で発現させる方法として、トランスジェニック動物の技術が存在するが、目的の遺伝子を発現するトランスジェニック動物の作製には非常に時間がかかる。なぜならば、通常の方法でトランスジェニック動物を作製するには、まず目的遺伝子を発現するES細胞等を作製し、次いでこのES細胞等を仮親の腹で発生させ、生まれた子どもを目的遺伝子の発現を指標にスクリーニングし、さらに目的遺伝子を発現している動物個体をかけ合わせて初めて多数のトランスジェニック動物が得られるという、複雑な操作が必要であるからである。通常これらの操作には半年から１年を要する。本発明の方法を用いれば、一旦遺伝子導入用のトランスジェニック動物を作製すれば、個々の遺伝子に応じたトランスジェニック動物の作製は不要となる。遺伝子導入用のトランスジェニック動物とは、染色体に変異型loxP配列と野生型loxP配列とを挿入した動物で、その作製は従来のトランスジェニック動物作製と同様の方法で行い、薬剤による選択のため２つのloxP配列の間にネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挿入してもおいてもよい。この遺伝子導入用動物に、(a)野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に目的遺伝子を挿入した環状DNA分子、及び(b)Cre蛋白を導入することにより、(a)(b)両者が導入された組織や細胞で目的遺伝子が染色体に挿入され、その遺伝子を発現させることができる。動物個体への(a)(b)の導入は、リポソーム法やウイルスべクター、遺伝子銃など既存の方法で十分に行うことができる。本発明の方法を用いれば、異なる遺伝子を導入する場合でも、遺伝子に応じた環状DNA分子(a)を用いるだけでよく、非常に時間のかかるトランスジェニック動物の作製を行う必要がない。さらに、(a)(b)両者を局所的に導入するだけで、目的の臓器や組織にのみ目的遺伝子を挿入することもできる。
【００３７】
本発明は、組換えウイルスの作製にも用いることができる。ウイルスとしてDNAウイルスが挙げられ、DNAウイルスとして、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス等のヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス等のポックスウイルス、昆虫のバキュロウイルス等が挙げられる。また、ウイルスとしてRNAウイルスが挙げられ、特にレトロウイルスが好ましい。なぜなら、レトロウイルスベクターを作製する場合、力価の高いウイルス産生細胞を各遺伝子を産生するレトロウイルスベクターごとに選択しているが、本法を用いることにより、一度マーカー遺伝子を発現するウイルス高産生細胞株を樹立しておけば、この細胞株染色体上のマーカー遺伝子を目的遺伝子と置換することにより、高産生株を容易に得ることができると考えられるからである。
【００３８】
本発明方法による組換えウイルス作製の具体的な方法を、組換えアデノウイルスの作製を例として説明する。従来の技術での組換えアデノウイルスの作製方法は、アデノウイルスゲノム及び目的遺伝子を挿入したプラスミドベクターやコスミドベクター等で、293細胞などの細胞を形質転換し、相同組換えにより生じた組換えウイルスをクローン化後、目的のウイルスを選別し増殖させる方法であり、これには長期間の作業が必要である。本発明による方法では、効率の低い相同組換えを介さないため、短期間に目的の組換えウイルスを作製することができる。すなわち、変異型loxP配列と野生型loxP配列とを挿入した遺伝子導入用のアデノウイルスをまず作製しておき、次いでこのウイルスを293細胞など組換えアデノウイルス作製に適した細胞に感染させ、同時に野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に目的遺伝子を挿入したプラスミドDNAを該細胞に導入するとともにCre蛋白を発現させることにより、変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に目的遺伝子が挿入された組換えウイルスが高頻度に得られる。この場合、遺伝子導入用のアデノウイルスは、Creによる組換えによりloxP配列にはさまれたパッケージング配列が除去されるように作製し、プラスミドDNAから目的遺伝子と同時にパッケージング配列を加えて置換することにより、目的ウイルスが選択的に得られるようにしてもよい。Cre蛋白は、プラスミドDNAの形で導入してもよいし、またあらかじめ細胞を形質転換し、Cre蛋白を常時あるいは何らかの誘導により発現するようにしておいてもよい。
以下に上記方法をより詳しく説明する。外来遺伝子Ａが外来遺伝子Ｂに置換された組換えアデノウイルスを作製する場合について説明する。遺伝子導入用の組換えアデノウイルスの構造の例として、アデノウイルス左端逆方向反復配列（inverted terminal repeat：ITR）／野生型loxP配列／パッケージング配列／野生型loxP配列／遺伝子A／変異型loxP配列、の順にloxP配列を挿入したアデノウイルスが挙げられる。ここで、野生型loxP配列／遺伝子Aの断片はＥ１欠失部位に挿入される。外来遺伝子Ｂ挿入用プラスミドDNAの例としては、野生型loxP配列／パッケージング配列／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列の構造を有するプラスミドが挙げられる。これらの遺伝子導入用のアデノウイルスと外来遺伝子Ｂ挿入用プラスミドDNAとを同時に或いは順次、Cre蛋白を発現させるようにした293細胞などの細胞に導入すると、遺伝子導入用のアデノウイルスでは２つの野生型loxP配列に挟まれたパッケージング配列が除かれるとともに、野生型loxP配列／遺伝子A／変異型loxP配列の部分がプラスミド由来の野生型loxP配列／パッケージング配列／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列に置換された組換えアデノウイルスが生成する。遺伝子置換されなかった遺伝子導入用のアデノウイルスは、反応効率が高い二つの野生型loxP配列間の通常の「切り出し反応」によりパッケージング配列が除去されているため、ウイルスDNAは複製するもののウイルス粒子（virion）内にDNAがパッケージングされずウイルスとしては複製しない。一方、遺伝子置換されたアデノウイルスはパッケージング配列を有するため、ウイルスとして複製できるため、「遺伝子Ｂ」に置換された組換えアデノウイルスが高頻度に得られる。
遺伝子導入用のアデノウイルスの変異型loxP配列の挿入位置は、外来遺伝子Ａのすぐ隣であってもよいし、遺伝子Ａから離れたアデノウイルスゲノム内であってもよい。後者の挿入位置の例としては、L3遺伝子とE2A遺伝子との間の非翻訳領域、E3遺伝子の欠失部位、E4遺伝子の上流域と右側のITRとの間などが挙げられる。これらの位置に変異型loxP配列を挿入して遺伝子置換を行う場合、生成するアデノウイルスDNAがウイルス粒子（virion）に効率よくパッケージングされるように、目的遺伝子挿入用プラスミドの野生型loxP配列／変異型loxP配列間のDNAのサイズを調節する必要があるが、遺伝子置換された組換えアデノウイルスはウイルスの複製に必須の遺伝子を欠失しているため、遺伝子治療用ベクターとして用いる場合、現在のアデノウイルスベクターで問題となっている副作用が軽減できると考えられる。
【００３９】
本発明の変異型loxP配列をもつDNAは、医薬として遺伝子治療にも用いることができる。その方法を以下に説明する。
まず、ヒト細胞の染色体に変異型loxP配列と野生型loxP配列とをあらかじめ挿入する。そのために、変異型loxP配列と野生型loxP配列を有するDNAが医薬品として用いられる。該DNAは、例えば、レトロウイルスやアデノ随伴ウイルス（AAV）などのウイルスベクター中に含まれる形で投与される。なかでも、AAVを使用することが好ましい。なぜならば、レトロウイルスによる遺伝子導入は、染色体にランダムに挿入されるが、AAVでは染色体の特定の部位（第19番染色体のAAV-S1領域）に挿入される確率が高いからである。この染色体の特定部位への遺伝子導入にはAAVがコードするウイルス遺伝子（Rep）が必須であるが、現在用いられているAAVベクターではAAV遺伝子の大部分が除かれているため、染色体への特異的組み込み機構は失われている。しかし、変異型loxP配列と野生型loxP配列とを合わせてもわずか100塩基足らずであるため、AAVの全ウイルス遺伝子を保持したまま、２つのloxP配列を挿入したウイルスを作製できる。その挿入位置は、AAV遺伝子の両端に存在する逆方向反復配列（inverted terminal repeat：ITR）の各々すぐ内側が望ましい。この２つのloxP配列を挿入したAAVをヒトに投与することにより、染色体に２つのloxP配列を挿入することができる。
【００４０】
次いで、野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に目的遺伝子を挿入した環状DNA分子からなる医薬と、Cre蛋白もしくはCre遺伝子をコードするDNA分子を投与することにより、染色体上に存在する２つのloxP配列の間に挟まれたAAV遺伝子が除かれ、目的遺伝子に置換される。医薬としての環状DNA分子とCre蛋白もしくはCre遺伝子をコードするDNA分子をヒト細胞に導入する方法としては、ウイルスベクターやリポソームベクターなど既存の遺伝子治療に用いられているベクターを用いる方法が挙げられる。
【００４１】
このようにして染色体に遺伝子が挿入されたヒト細胞では、目的遺伝子の両端に変異型loxP配列と野生型loxP配列が存在し、さらにその外側にAAVのITRが存在するのみで、AAVの構造遺伝子は全く存在しないため、AAV由来の蛋白が発現し抗原となることもなく、目的遺伝子の発現が長期間安定に持続することが期待できる。また、挿入した遺伝子が不要になった場合、野生型loxP配列と変異型loxP配列の間に遺伝子が存在しない環状DNA分子を投与することにより、挿入した遺伝子を染色体から除くことができる。さらに、その後再び染色体への遺伝子の挿入が必要になった場合、２つのloxP配列が染色体上に残っているため、前述した方法で任意の遺伝子を挿入することができる。このように、本発明の変異型loxP配列をもつDNAは、染色体への遺伝子を挿入及び除去が自由にできる遺伝子治療のための医薬として用いることができる。
【００４２】
本発明の変異型loxP配列をもつDNAを医薬として用いる場合、該DNAの細胞内への導入方法としては、ウイルスベクターによるもの、及びその他のものに大別される（日経サイエンス、1994年４月号、20-45 頁、月刊薬事、36(1),23-48 (1994)、及びこれらの引用文献等) 。本発明の医薬においてはいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビス他のＲＮＡウイルス等に本発明の変異型loxP配列をもつDNAあるいは対応するRNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の導入方法としては、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法等が挙げられ、リポソーム法が特に好ましい。
【００４３】
また、本発明の変異型loxP配列をもつDNAを実際に医薬として作用させるには、該DNAを直接体内に導入するIn Vivo 法、及びヒトからある種の細胞を採取し体外で該DNAを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すEx Vivo 法がある（日経サイエンス，1994年４月号，20-45 頁、月刊薬事，36(1), 23-48 (1994) 、及びこれらの引用文献等) 。本発明の医薬においては治療目的の疾患、標的臓器等に応じて、適宜いずれかの方法を選択して適用することができる。
【００４４】
本発明の医薬において、In Vivo 法により投与する場合は治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与するか、又は腎臓、肝臓、肺、脳、神経等の疾患の対象部位に直接投与することができる。
【００４５】
また、Ex Vivo 法による場合には、常法に準じ、ヒトの細胞（例えば、リンパ球、造血幹細胞等）を採取し、それに本発明の医薬を感作させて遺伝子導入を行った後、その細胞をヒトへ戻すことが行われる。
【００４６】
In Vivo 法により投与する場合は、種々の製剤形態（例えば、液剤等）をとりうるが、一般的には有効成分である変異型loxP配列をもつDNAを含有する注射剤等とされる。また、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。当該注射剤等は常法により調製することができ、例えば、変異型loxP配列をもつDNAを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができ、また変異型loxP配列をもつDNAに代え、変異型loxP配列をもつDNAを組み込んだウイルスベクターを製剤化してもよい。さらに、変異型loxP配列をもつDNAを包埋したリポソーム（又はＨＪＶ−リポソーム）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００４７】
製剤中の変異型loxP配列をもつDNAの含量は、治療目的の疾患、標的臓器、患者の年齢、体重などにより適宜調製することができるが、通常変異型loxP配列をもつDNAとして0.0001mg〜 100mg、好ましくは 0.001mg〜１０mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが適当である。
【００４８】
以上は、野生型loxP配列と変異型loxP配列の組合せ、もしくは変異型loxP配列1と変異型loxP配列2の組合せの２つのloxP配列を用いた場合の遺伝子置換の方法の説明であるが、基質特異性の異なる３つ以上のloxP配列を用いることにより、遺伝子置換方法の応用範囲をさらに広げることが可能である。基質特異性の異なる３つのloxP配列の組み合わせとして、例えば、野生型loxP配列と２つの変異型loxP配列、３つの変異型loxP配列等が挙げられる。本方法を、野生型loxP配列、変異型loxP配列1、変異型loxP配列2の３つの異なるloxP配列が同一DNA上に存在する場合を例として説明する。野生型loxP配列／遺伝子Ａ／変異型loxP配列1／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列2をこの順に有するDNA(a)に、野生型loxP配列／遺伝子Ｃ／変異型loxP配列1を有する環状DNA(b)とをリコンビナーゼCreの存在下に反応させると、DNA(a)中の遺伝子Ａを遺伝子Ｃに置換することができる。一方、環状DNA(b)の代わりに、変異型loxP配列1／遺伝子Ｄ／変異型loxP配列2を有する環状DNA(c)とをリコンビナーゼCreの存在下に反応させると、DNA(a)中の遺伝子Ｂを遺伝子Ｄに置換することができる。すなわち、異なる環状DNAを用いるだけで、DNA(a)に存在する複数の遺伝子のうち目的の遺伝子のみを任意の遺伝子に置換することができる。
【００４９】
次に本発明の変異型loxP配列を用いた遺伝子置換の具体例について説明する。以下の例で、変異型loxP配列は、全てスペーサー領域の２番目の塩基をTからCへ７番目の塩基をGからAへの置換した配列（配列番号：２６）を用いた。
【００５０】
（１）アデノウイルスゲノムに存在する遺伝子の置換
置換する遺伝子の例として大腸菌lacZ遺伝子を用い、環状DNA分子上のlacZ遺伝子を、アデノウイルスゲノムの野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入する系で本発明の変異型loxP配列の有効性を確認した。
【００５１】
まず、遺伝子置換される側のアデノウイルス、すなわちターゲット用アデノウイルスとして、E1遺伝子及びE3遺伝子を欠失させたアデノウイルス５型のE1遺伝子欠失部位に、CAGプロモーター／野生型loxP配列／変異型loxP配列／ポリＡ配列を、その転写方向が左向き（アデノウイルスE1遺伝子の転写方向と逆向き）になるように挿入した組換えアデノウイルス（AxCALwM）を作製した。なお、ここに言うCAGプロモーターとは、高発現ベクターとして特開平3-168087号公報に開示されているものである。
【００５２】
lacZ遺伝子を野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入した環状DNA分子は、野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列の構造を有するプラスミドDNAとしてtransfectionにより直接細胞に導入してもよい。しかし、transfectionによる細胞への遺伝子導入効率は数10%にとどまり、全ての細胞には目的DNAを導入できないため、アデノウイルスベクターを用いてCre依存的に細胞内で環状DNA分子とする方法により、ほぼすべての細胞に環状DNA分子を導入した。そのために、E1遺伝子及びE3遺伝子を欠失させたアデノウイルス５型のE1遺伝子欠失部位に、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列を、その転写方向が左向きになるように挿入した組換えアデノウイルス（AxALZMOL）を作製した。この組換えウイルスAxALZMOLをドナー用アデノウイルスと呼ぶ。AxALZMOLにCre蛋白を作用させると、２つの野生型loxP配列間で組換え反応が起こり、野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列の構造の、環状DNA分子が生成する。なお、TK遺伝子のポリＡ配列は、未同定のアデノウイルス由来のプロモーターからlacZ遺伝子の転写が起こらないようにするために挿入した。また、Cre蛋白は、Cre発現組換えアデノウイルスAxCANCre（鐘ケ江ら、Nucleic Acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995)）により供給した。
【００５３】
次に、これら３種類の組換えアデノウイルスを用い、アデノウイルスゲノムに存在する遺伝子の置換（挿入）実験を行った。ドナー用アデノウイルスAxALZMOL、ターゲット用アデノウイルスAxCALwM、及びCre発現アデノウイルスAxCANCreを、動物培養細胞（CV-1細胞もしくはCOS-1細胞）に同時に感染させた。ドナー用アデノウイルスAxALZMOL及び生成した環状DNA分子はlacZ遺伝子を有するもののプロモーターが存在しないためlacZ遺伝子は発現しない。環状DNA分子上のlacZ遺伝子が、ターゲット用アデノウイルスAxCALwMのCAGプロモーターの下流、すなわち野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入されて初めてlacZ遺伝子が発現する。従って、lacZ遺伝子の発現は、実際に遺伝子置換（この場合は挿入）が起きたことの明確な証拠となる。
【００５４】
上記３種類のウイルス単独、もしくはそのうちの２つのウイルスの組合せではlacZ遺伝子が発現した細胞は全く存在しなかったが、３種類のウイルスを同時に感染することによりlacZ遺伝子の発現が明らかに認められ、しかもlacZ遺伝子を発現した細胞の割合はドナー用アデノウイルスの量に依存して増加し、最大約90%の細胞でlacZ遺伝子の発現を認めた。以上の結果より、ドナー用アデノウイルス上のlacZ遺伝子が、環状DNA分子の形を介して、ターゲット用アデノウイルスの野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に非常に効率よく挿入された、すなわち遺伝子置換が起きたことがを明らかとなった。
【００５５】
（２）動物細胞の染色体に存在する遺伝子の置換
次に、アデノウイルスゲノム上だけでなく、動物細胞の染色体に存在する遺伝子も効率よく置換できることを示すため、以下の実験を行った。実験系の原理は（１）と同じであるが、遺伝子置換される細胞株（ターゲット細胞）を得るため、CAGプロモーター／野生型loxP配列／ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列の構造のDNAを含むプラスミドで、CV-1細胞を形質転換し、ハイグロマイシンＢ耐性を有しかつ上記の構造のDNAが細胞当たり１コピーのみ挿入された細胞株を複数作製した。
【００５６】
これら細胞株にドナー用アデノウイルスAxALZMOL及びCre発現アデノウイルスAxCANCreを同時に感染させた。その結果、ドナー用アデノウイルスまたはCre発現アデノウイルス単独ではlacZ遺伝子を発現した細胞は全く存在しなかったが、両ウイルスを同時感染することにより、lacZ遺伝子が発現した細胞が非常に高頻度で認められた。その割合は用いた細胞株により異なるが、最大約30%の細胞でlacZ遺伝子が発現していた。この実験系においては細胞のクローン化は一切行っていないため、lacZ遺伝子が発現した細胞の割合は、染色体上での遺伝子置換が起きた割合を直接示している。従って、以上の結果は、本発明の変異型loxP配列を用いることにより、動物細胞の染色体での遺伝子置換を非常に効率よく行えることを示すものである。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明の一部として実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatisら編、第２版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory」に記載の方法に準じて行なった。
【００５８】
実施例１
＜２つの変異型loxP配列間でのリコンビナーゼCre依存組換え反応＞
（１）リコンビナーゼCreを含む細胞抽出液の調製
リコンビナーゼCre依存組換え反応に用いるCreを含む細胞抽出液を得る目的で以下の操作を行った。Cre発現組換えアデノウイルスベクターAxCANCre（鐘ケ江ら、Nucleic acid Res., Vol.23, 3816-3821(1995)）約1 x 109 PFUを、225cm2フラスコ１本の293細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）に感染（37℃、１時間）させ、培地（5% FCS含有DMEM培地）を添加後さらに24時間培養した。培養終了後、低速遠心機で1000回転5分遠心し、培養上清を捨て細胞を集めた。細胞に保存用緩衝液（50%グリセロール／20mMトリス塩酸(pH7.5)／300mM塩化ナトリウム／1mM EDTA(pH7.5)）5mlを加え細胞を懸濁し、密閉型ソニケーターを用い200W、２分（30秒x４回）で細胞を破砕し、細胞内に存在するCre蛋白を放出させた。得られた細胞破砕液をマイクロ遠心機で15000回転10分遠心し、その上澄を冷凍保存（−80℃）した。
【００５９】
（２）変異型loxP配列を含む合成DNAの作製
野生型loxP配列中の８塩基のスペーサー部分を１塩基もしくは２塩基同時に、他の塩基に置換した52塩基の合成DNAを作製した。合成したDNAの種類は、１塩基の変異が24種類、２塩基同時の変異が29種類で、それぞれセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成した。野生型loxP配列の合成DNAの構造を図１（センス鎖は配列番号：５５、アンチセンス鎖の配列番号：５６）に示す。また、変異型loxP配列（センス鎖及びアンチセンス鎖）を図２〜図５に示す。野生型センス鎖とアンチセンス鎖は全くの相補配列ではなく、各々の鎖をアニーリングし２本鎖DNAとした際、5'末端がそれぞれ４塩基突出し、両末端が制限酵素XbaI及びXhoIの消化断片になるように設計した。そのため、これらの２本鎖DNAは、XbaI断片側は制限酵素XbaI及びNheI消化断片と、XhoI断片側は制限酵素XhoI及びSalI消化断片とそれぞれ結合できる。
全ての１本鎖合成DNAは、5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、それぞれの変異に対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングした。以後、この２本鎖合成DNAを変異型loxP合成DNAと呼ぶ。
【００６０】
（３）２つの変異型loxP配列を含む基質DNAの調製
直鎖状DNAの両端に同じ配列の変異型loxP配列を有する基質DNAを得る目的で、以下の操作を行った。
プラスミドpBR322を制限酵素NheI及びSalIで同時に消化し、変異型loxP合成DNA（１塩基のみの置換）24種類をそれぞれT4 DNAリガーゼでligation反応（プラスミド：合成DNAのモル比１：６）を行った後、制限酵素XbaI及びXhoIで同時に消化した。この制限酵素処理によりpBR322 DNAの両端に複数個結合した変異型loxP合成DNAが除かれ、pBR322 DNAの両端に同じ配列の変異型loxP合成DNAが一ヶ所ずつ結合した約4.1kbの直鎖状DNAが生じる。次いで、未反応及び制限酵素消化された変異型loxP合成DNAをGEANCLEAN II（フナコシ社製）により除き、両端に変異型loxP配列が結合した直鎖状DNA（約4.1kb）を次に示す反応の基質DNAとして用いた。
【００６１】
（４）２つの変異型loxP配列間でのCre依存組換え反応
以下に示すアッセイ方法で、２つの変異型loxP配列間でCre依存組換え反応が起きるかどうかを検討した。
終濃度、50mMトリス塩酸(pH7.5)／10mM MgCl2／1mg/mlウシ血清アルブミン／1mMフェニルメチルスルフォニルフロライド(PMSF)／5μg/mlアプロチニンを含む緩衝液に、（３）で調製した基質DNA（1μg）と（１）で調製したCreを含む細胞抽出液10μlを加え（反応液量50μl）、37℃で30分反応した。反応終了後、反応液に45μlのＴＥバッファー（pH8.0）及び5μlのEDTA溶液（pH8.0）を加え、フェノール／クロロホルム抽出ならびにクロロホルム抽出を行い、さらにエタノール沈殿し、得られたDNAをRNaseA(20μg/ml)を含むＴＥバッファー（pH8.0） 30μlに溶解した。次いで、その半量を制限酵素BsaHI消化し、アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウム（EtBr）染色により検出されたDNAのバンドを解析した。
【００６２】
Creによる組換え反応を行う前の直鎖状の基質DNA（約4.1kb）を制限酵素BsaHI消化すると、2.7kb、610bp、380bp、360bpの４本のバンドが生じる。一方、基質DNAがCreにより組換え反応を起こすと、変異型loxPを１個有する約4.0kbの環状DNAと変異型loxPのみからなる約50bpの直鎖状DNAが生じるので、これらを制限酵素BsaHI消化すると、2.7kb、920bp、380bp、50bpの４本のバンドが生じる（図６参照）。従って、920bpのバンドはCreによる組換え反応が起きたことを示し、610bp及び360bpのバンドはCreによる組換え反応が起きていないことを示すので、これらのバンドの量比により組み換え反応の効率が分かる。結果を表１に示す。
【表１】
0004206154.tif 000005
（表中、反応の中間体及び最終反応体の量を０〜９までの10段階で表示した。数字が大きいほど生成量が多い。２つの野生型loxp配列間で反応を行った場合の最終反応体の量（DNAバンドの濃さ）を最大の「９」とし、DNAのバンドがほとんど検出できない場合（「９」の５％未満）を「０」とした。反応の中間体の詳細については、実施例２−（２）で説明する。）
【００６３】
#11、#73の変異型loxP配列は反応効率が悪かったが、その他の変異型loxP配列は配列により多少反応効率に差はあるものの同じ配列の変異型loxP配列どうしではCre依存組換え反応が生じることが確認された。
【００６４】
実施例２
＜野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存組換え反応（その１）＞（１）野生型loxP配列と変異型loxP配列を含む基質DNAの調製
〔1〕野生型loxP配列を一つ有するプラスミド（pBRwt）の構築
プラスミドpBR322に一つの野生型loxP配列を挿入したプラスミド（pBRwt）を構築するため、以下の(a)及び(b)の操作を行った。
(a)pBR322を制限酵素EcoNIで消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化し、フェノール／クロロホルム抽出を行ってEcoNIならびにKlenow酵素を失活させた後、ゲル濾過により反応液をＴＥバッファーに置換した。次いで、XhoIリンカー（5'-pCCTCGAGG-3'）をligationし、制限酵素XhoI及びPstIで同時消化後、アガロース電気泳動を行い約2.9kbのバンドを切り出した。このバンドをGEANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製し、片側の端がXhoI消化断片、他方がPstI消化断片である約2.9kbのDNA断片を得た。
(b)pBR322を制限酵素NheIで消化し、野生型loxP配列を含む合成DNA(52bp)をligation後、制限酵素XhoI及びPstIで同時消化し、反応液をアガロース電気泳動した。野生型loxP配列を一つ含む約1.4kbのバンドを切り出し、GEANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製した。この約1.4kbのDNA断片も片側の端がXhoI消化断片、他方がPstI消化断片である。
(a)(b)で調製した両DNAをligation後大腸菌を形質転換し、pBR322のNheIサイトとEcoNIサイトとの間に一つの野生型loxP配列が挿入されたプラスミドpBRwt(4.4kb、図７)を得た。
【００６５】
〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列を含む基質DNAの調製
直鎖状DNAの片側の端に野生型loxP配列を、他方に変異型loxP配列を有する基質DNAを調製するため以下の操作を行った。
プラスミドpBRwtの野生型loxP配列から約30bp離れた位置にSalIサイトが存在するので、このプラスミドを制限酵素SalIで消化し直鎖状にした後、実施例１−（３）と同じ変異型loxP合成DNA（52bp、24種類）をligationした（プラスミド：合成DNAのモル比１：６）。この操作によりpBRwtのSalI消化部位に変異型loxP合成DNAのXhoI消化断片側が結合する。次いで、反応液を制限酵素XbaI及びXhoIで同時に消化し、pBRwtの両端に複数個結合した変異型loxP合成DNAを除いた後、未反応及び制限酵素消化された変異型loxP合成DNAをGEANCLEAN II（フナコシ社製）により反応液から除き、片方の端に野生型loxP配列が、他方の端に変異型loxP配列が各一ヶ結合した直鎖状DNA（約4.4kb、図８）を得た。このDNAを基質DNAとして次に示す反応に用いた。
【００６６】
（２）野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存組換え反応
反応及び解析方法は実施例１−（４）と同様であるが、基質DNAは実施例１−（３）で示したDNAの代わりに実施例２−（１）で示したDNAを用いた。
下記に示した野生型loxP配列の塩基配列で、２つのloxP配列間での組換えは、８塩基のスペーサー領域の下側のDNA鎖の７番目と８番目の塩基の間の切断・再結合がまず起こり、次いで上側のDNA鎖の１番目と２番目の塩基の間の切断・再結合が起こることで反応が完了することが知られている（Guo et al., Nature, Vol. 389, 40-46(1997)）。
【化６】
0004206154.tif 000006
従って、下側のDNA鎖の組換えは起こるが上側のDNA鎖の組換えが起こらない場合は、反応の中間体として検出される。本発明者らが用いたアッセイ系では、この中間体は約970bp付近のバンドとして検出された。
【００６７】
実施例１−（４）で示したが、920bpのバンドは上側及び下側のDNAの両方が組換わり反応が完了したことに由来するバンドで、970bpのバンドは中間体で反応が止まっていることに由来するバンドである。この２本のバンドの有無に特に着目して解析した結果を表１に示す。また、表１の結果の概要を以下に示す（#の後の数字は変異loxP配列番号）。
#11,12,13(配列番号:2,3,4)：反応は最終段階まで進む；
#21,22,23(配列番号:5,6,7)：反応は中間体で止まり、最終段階まで進まない；#31,32,33(配列番号:8,9,10)：反応は中間体で止まり、最終段階まで進まない；#41,42,43(配列番号:11,12,13)：反応は中間体で止まり、最終段階まで進まない；
#51,52,53(配列番号:14,15,16)：反応は大部分中間体で止まるが、ごく一部最終段階まで進む（約５％）；
#61,63(配列番号:17,19)：中間体はほとんどできないが、反応はごく一部最終段階まで進む（５〜１０％）；
#62 (配列番号:18)：中間体はほとんどできないが、反応は一部最終段階まで進む（最終反応体は#61,63より多い）；
#71,72,73(配列番号:20,21,22)：中間体はほとんどできないが、反応はごく一部最終段階まで進む（約５％、最終反応体は#61,63より少ない）；
#81,82,83(配列番号:23,24,25)：反応は最終段階まで進む；
以上の結果、１番目から８番目の塩基の置換効果を置換箇所毎にまとめると、(1)１番目又は８番目の塩基を置換しても野生型loxP配列と反応する、(2)２番目、３番目又は４番目の塩基を置換すると野生型loxP配列とはほとんどど反応しない、(3)５番目、６番目又は７番目の塩基を置換すると野生型loxP配列と反応しにくくなるが一部反応する、ことが明らかになった。また、これらの結果から、２番目から５番目の塩基の置換と、６番目及び７番目の塩基の置換とは質的に異なり、前者は反応が中間体で止まり、後者は反応の最初のステップが著しく阻害されているためであることが明らかになった。
【００６８】
さらに本発明者らの測定法では、野生型loxP配列との間では特異的DNA組換え反応が起きないと報告（Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)）されている変異型loxP配列（#71に相当）は、野生型loxP配列との反応性が完全には失われてはおらず、約５％の頻度で組換え反応が起こることが明らかとなった。
【００６９】
実施例３
＜野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存組換え反応（その２）＞（１）野生型loxP配列と変異型loxP配列とを含む基質DNAの調製
野生型loxP配列と変異型loxP配列とのCre依存組換え反応を、実施例１及び２で用いたアッセイ系より感度の高いアッセイ系で検出するための基質DNAを得るために、以下の操作を行った。
【００７０】
〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列を有するプラスミド（pBLAmutant）の構築
pBR322の両端に野生型loxP配列と変異型loxP配列とが各一ヶ結合した約4.4kbの直鎖状DNAに、アデノウイルス５型由来のDNA断片を結合したプラスミドを構築するため、以下の操作を行った。
アデノウイルス５型のE1及びE3遺伝子以外のほぼ全長が挿入されたコスミドベクターpAxcw（特開平8-308585号公報15頁）を制限酵素XbaI及びXhoIで同時に消化し、反応液をアガロース電気泳動後約3.8kbのバンドを切り出し、GEANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製した。この3.8kbのDNA断片と、実施例２−（１）−〔2〕で調製した、片方の端に野生型loxP配列が他方の端に変異型loxP配列が各一ヶ結合した直鎖状DNA（約4.4kb）をligation後、大腸菌を形質転換しプラスミドpBLAmutant(8.2kb、図９)を得た。なおこのプラスミドpBLAmutantは、この操作を行ったプラスミドの総称で、実際には表１の#11,#21,#22,#23,#31,#41,#51,#61,#71,#72,#73,#81に対応する変異型loxP配列と野生型loxP配列とを各一ヶを有する個々のプラスミドを作製した。
【００７１】
〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列を含む基質DNAの調製
プラスミドpBLAmutantから、Cre依存組換え反応に基質に用いる野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有する直鎖状DNAを調製するため以下の操作を行った。プラスミドpBLAmutantには、挿入したアデノウイルスゲノム部分に制限酵素NcoIサイトが一ヶ所存在するので、このプラスミドを制限酵素NcoIで消化し直鎖状DNAとし、反応液をアガロース電気泳動後約8.2kbのバンドを切り出し、GEANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製した。この8.2kbの直鎖状DNAを次に示す反
応の基質として用いた。
【００７２】
（２）野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存組換え反応
前述した基質DNAを実施例１−（４）で示した反応液に加え、37℃で30分Cre依存組換え反応を行った。反応終了後、反応液に45μlのＴＥバッファー（pH8.0）及び5μlのEDTA溶液（pH8.0）を加え、フェノール／クロロホルム抽出ならびにクロロホルム抽出を行い、さらにエタノール沈殿し、得られたDNAをRNaseA(20μg/ml)を含むＴＥバッファー（pH8.0） 30μlに溶解した。次いで、その半量を制限酵素DraI消化し、アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウム（EtBr）染色により検出されたDNAのバンドを解析した。
【００７３】
基質として用いた直鎖状DNAには、野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にDraIサイトが２ヶ所存在するので、Creによる組換えが起きない場合は、DraI消化により5.9kb、1.3kb、0.7kbの３本のバンドが生じる（図１０）。一方、基質DNAがCreにより組換え反応を起こすと、２ヶ所のDraIサイト及びloxP配列一つを含む約4kbの環状DNAと、一つのloxP配列を含みDraIサイトが存在しない約3.8kpの直鎖状DNAが生じるので、DraI消化により3.8kb、3.3kb、0.7kbの３本のバンドが生じる。従って、3.8kb及び3.3kbのバンドの存在はCreによる組換え反応が起きたことを示し、5.9kb及び1.3kbのバンド存在ははCreによる組換え反応が起きていないことを示すので、これらのバンドの量比により組み換え反応の効率が分かる。さらに、実施例２−（２）で説明した反応の中間体は、このアッセイでは10数kbの位置に検出された。結果を以下にまとめた。
#11,81   ：反応は最終段階まで進む；
#21,22,23,31,41：反応は中間体で止まり、最終段階まで進まない；
#51      ：反応は大部分中間体で止まるが、ごく一部最終段階まで進む；
#61      ：中間体はほとんどできないが、一部最終段階まで進む；
#71      ：中間体はほとんどできないが、一部最終段階まで進む（最終産物は#72,73より多い）；
#72,73   ：中間体はほとんどできないが、ごく一部最終段階まで進む；
以上の結果より、実施例２よりも感度の高い方法でアッセイを行っても傾向は同じで、野生型loxP配列との間では特異的DNA組換え反応が起きないと報告（Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)）されている変異型loxP配列（#71に相当）でも、野生型loxP配列との反応性は一部残っており、その程度（最終反応物の量）は同じ箇所の置換である#72や#73よりも高く、#71の置換は野生型loxP配列との反応性を欠失させるためには不十分であることが再度確認された。
【００７４】
実施例４
＜２つの塩基を置換した変異型loxP配列と野生型loxP配列との間でのCre依存組換え反応＞
【００７５】
（１）野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存組換え反応
〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列とを含む基質DNAの調製
直鎖状DNAの片側の端に野生型loxP配列を、他方に変異型loxP配列を有する基質DNAを実施例２−（１）−〔2〕に示した方法に従い調製した。すなわち、プラスミドpBR322に野生型loxP配列が１個挿入されたプラスミドpBRwt（実施例２−（１）−〔1〕に記載）の制限酵素SalIサイトに、各々の２塩基置換した変異型loxP合成DNA（図４及び図５参照）をligationした直鎖状DNAを基質DNAとして調製した。
〔2〕Cre依存組換え反応（その１）
〔1〕で調製した基質DNAを用い、実施例１−（４）に示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結果を表２（右欄）に示す。
【表２】
0004206154.tif 000007
（表中、反応の中間体及び最終反応体の量を０〜９までの10段階で表示した。数字が大きいほど生成量が多い。２つの野生型loxp配列間で反応を行った場合の最終反応体の量（DNAバンドの濃さ）を最大の「９」とし、DNAのバンドがほとんど検出できない場合（「９」の５％未満）を「０」とした。反応の中間体の詳細については、実施例２−（２）での説明を参照されたい。）
#6171の変異型loxP配列を用いた場合は最終反応体（920bp）が一部認められ、野生型loxP配列との間で組み換え反応が生じた。しかし、それ以外の解析された変異型loxP配列は野生型loxP配列とは全く反応せず、その程度は１塩基置換の変異型loxP配列の場合よりもさらに少なかった。
〔3〕野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有するプラスミドの構築
#2171、#2272、#2373の変異型loxP合成DNAを用い、実施例２−（１）−〔2〕及び３−（１）−〔1〕に示した方法で、野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有するプラスミドpBLAmutant(8.2kb、図９参照)を３種類構築した。
〔4〕Cre依存組換え反応（その２）
〔3〕で構築したプラスミドを制限酵素NheIで消化し、実施例３−（１）−〔2〕に示した方法で野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有する直鎖上の基質DNA(8.2kb)を調製した。この基質DNAを用い、実施例３−（２）で示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結果、３種類の変異型loxP配列いずれの場合とも、反応の中間体及び最終反応体はほとんど生じなかった。すなわち、２塩基を置換した変異型loxP配列は、野生型loxP配列との組換え反応をほとんど起こさず、反応の特異性は１塩基置換の変異型loxP配列の場合よりもさらに高まったことが示された。
【００７６】
（２）２つの同じ配列の変異型loxP配列間でのCre依存組換え反応
〔1〕２つの変異型loxP配列を含む基質DNAの調製
29種類の変異型loxP配列（図４及び図５参照）について、実施例１−（３）に示した方法で直鎖状DNAの両端に同じ配列の変異型loxP配列を有する基質DNAを調製した。すなわち、上記変異型loxP合成DNAを、制限酵素NheI及びSalIで同時に消化したプラスミドpBR322にそれぞれligationし、pBR322 DNAの両端に同じ配列の変異型loxP合成DNAが結合した約4.1kbの直鎖状DNAを調製した。
〔2〕Cre依存組換え反応（その１）
〔1〕で調製した基質DNAを用い、実施例１−（４）に示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結果を表２（左欄）に示す。#2173や#2372のように全く組換え反応が起こらない変異型loxP配列もあったが、#2271、#2272、#3171、#3371、#4171、#6171、#6171は１塩基置換の変異型loxP配列とほぼ同程度、#2171、#2273、#3271、#4172は１塩基置換の変異型loxP配列の半分程度の効率で組換え反応が起きていることを確認した。
〔3〕変異型loxP配列を一つ有するプラスミドの構築
#2171、#2272、#2373の変異型loxP合成DNAを用い、実施例２−（１）−〔1〕に示した方法で、プラスミドpBR322のNheIサイトとEcoNIサイトとの間にそれぞれの変異型loxP配列を一つ挿入した３種類のプラスミド（pBR2171、pBR2272、pBR2373、各4.4kb、図７参照)を構築した。
〔4〕２つの同じ配列の変異型loxP配列を有するプラスミドの構築
〔3〕で構築した３種類のプラスミド（pBR2171、pBR2272、pBR2373）をそれぞれ制限酵素SalIで消化し、プラスミドに挿入されているのと同じ配列の変異型loxP合成DNA（#2171、#2272、#2373）をそれぞれligtion後、実施例２−（１）−〔2〕及び実施例３−（１）−〔1〕に示した方法で、２つの同じ配列の変異型loxP配列を有する３種類のプラスミド（pBLA2171x2、 pBLA2272x2、 pBLA2373x2、各8.2kb、図９参照）を構築した。
〔5〕Cre依存組換え反応（その２）
〔4〕で構築した３種類のプラスミドを制限酵素NheIでそれぞれ消化し、実施例３−（１）−〔2〕に示した方法で２つの同じ配列の変異型loxP配列を有する直鎖上の基質DNA(8.2kb)を調製した。この基質DNAを用い、実施例３−（２）で示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結果、変異型loxP配列#2272間での組換え反応は、野生型loxP配列間での組換え反応とほぼ同程度の非常に高い効率であった。変異型loxP配列#2171は、一部中間体で反応が止まるものの最終段階まで反応は進行した。一方、変異型loxP配列#2373は反応はほとんど中間体でとまり、最終段階まで進まなかった。
【００７７】
（３）異なる配列の変異型loxP配列間でのCre依存組換え反応の検討
〔1〕異なる配列の変異型loxP配列を有するプラスミドの構築
（２）−〔3〕で構築したプラスミドpBR2171及びpBR2272をそれぞれ制限酵素SalIで消化し、プラスミドに挿入されている変異型loxP配列とは異なる配列の変異型loxP合成DNA（pBR2171は#2272もしくは#2373と、pBR2272は#2373と）とligtion後、実施例２−（１）−〔2〕及び実施例３−（１）−〔1〕に示した方法で、２つの異なる配列の変異型loxP配列を有する３種類のプラスミド（pBLA2171-2272、pBLA2171-2373、pBLA2272-2373、各8.2kb、図４参照）を構築した。
〔2〕Cre依存組換え反応
〔1〕で構築したプラスミドを制限酵素NheIで消化し、実施例３−（１）−〔2〕に示した方法で２つの異なる配列の変異型loxP配列を有する直鎖上の基質DNA(8.2kb)を調製した。この基質DNAを用い、実施例３−（２）で示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結果、３種の異なる配列（#2171、#2272、#2373）の変異型loxP配列間では、いずれの組み合わせともCre依存組換え反応は全く起きなかった。すなわち、それぞれの変異型loxP配列は他のloxP配列と交叉反応しないことが示された。
【００７８】
以上、（１）から（３）の結果より、２つの塩基を同時に置換した変異型loxP配列は、一塩基のみ置換した変異型loxP配列より認識特異性が高まった。すなわち、２つの塩基を同時に置換した変異型loxP配列は、野生型loxP配列及び異なる変異型loxP配列とは反応せず、かつ同じ配列の変異型loxP配列どうしでは野生型loxP配列どうしと同程度反応することが明らかに示された。さらに、変異の部位としては、loxP配列のスペーサー領域の２番目、３番目、４番目、５番目の内うちの一つの塩基と、７番目の塩基との組み合わせが好ましく、かつ同じ塩基部位であっても置換する塩基の種類により、反応性及び反応特異性が異なることが示された。以上の結果より、本発明の目的とする変異型loxP配列として、具体的には#2171(配列番号:26)、 #2271(配列番号:29)、 #2272(配列番号:30)、 #3171(配列番号:35)、 #3371(配列番号:39)、 #4171(配列番号:42)、 #5171(配列番号:49)などが挙げられる。
【００７９】
実施例５
＜野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入された遺伝子の置換に必要なプラスミド及びコスミドベクターの構築＞
【００８０】
（１）遺伝子置換のターゲット側のプラスミド及びコスミドベクターの構築
〔1〕２つの野生型loxP配列間にクローン化部位（SwaIサイト）を持つプラスミド（puLwL）の構築
プラスミドpUC119の制限酵素Ecl136IIサイトに、野生型loxP配列が同方向に２つ挿入されたプラスミドpuLL（鐘ケ江ら、Nucleic acids Res.,Vol.23, 3816-3821(1995)）の、２つのloxP配列間に存在するクローン化部位を制限酵素NruIサイトからSwaIサイトに変えるため以下の操作を行った。
puLLを制限酵素NruIで消化し、SwaIリンカー（5'-pGATTTAAATC-3'、配列願号：６１）をligation後、再度NruIで消化した。NruIによる再度の消化は、SwaIリンカーが結合せずにNruIサイトが再生したプラスミドを除くために行った。反応液で大腸菌を形質転換し、２つの野生型loxP配列間にクローン化部位としてSwaIサイトを持つプラスミドpuLwL(3.3kb、図１１中のＡ)を得た。
【００８１】
〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にクローン化部位（SwaIサイト）を持つプラスミド（puLwM及びpuMwL）の構築
プラスミドpuLwLの２つの野生型loxP配列のうちの一つを変異型loxP配列に置換した２種類のプラスミドを構築するため、以下の（Ａ）、（Ｂ）の各操作を行った。プラスミドpuLwM（図１１中のＢ）は、同図に示したpuLwLの左側の野生型loxP配列を、プラスミドpuMwL（図１１中のＣ）は右側の野生型loxP配列をそれぞれ変異型loxP配列に置換したものである。なお、ここで変異型loxP配列として、野生型loxP配列のスペーサー部分の２番目と７番目の塩基を同時に変異させた#2171(配列番号:26)の配列を用いた。以下の実施例での変異型loxP配列とは、全てこの配列のものである。
（Ａ）puLwMの構築
puLwLを制限酵素XhoIで消化し、変異型loxP配列を含む60bpの合成DNA（図１２、上側の鎖の配列番号：５７、下側の鎖の配列番号：５８）をligation後大腸菌を形質転換し、野生型loxP配列と変異型loxP配列間にSwaIサイトを持つプラスミドpuLwM(3.3kb)を得た。さらに、このプラスミドpuLwMの合成DNA部分の塩基配列を解読し、野生型loxP配列及び変異型loxP配列が目的通り挿入されていることを確認した。なお、用いた合成DNAは一方の端はXhoI消化断片であるが他方はSalI消化断片になるように設計したので、プラスミドpuLwMの野生型loxP配列内のXhoIサイトは消滅している。
（Ｂ）puMwLの構築
puLwLを制限酵素MluIで消化し、変異型loxP配列を含む60bpの合成DNA（図１３、上側の鎖の配列番号：５９、下側の鎖の配列番号：６０）をligation後大腸菌を形質転換し、変異型loxP配列と野生型loxP配列間にSwaIサイトを持つプラスミドpuMwL(3.3kb)を得た。さらに、プラスミドpuLwMの場合と同様、puMwLの合成DNA部分の塩基配列を解読し確認した。なお、用いた合成DNAは一方の端はMluI消化断片であるが他方はBssHII消化断片になるように設計したので、プラスミドpuMwLの野生型loxP配列内のMluIサイトは消滅している。
【００８２】
〔3〕CAGプロモーターのクローン化部位に２つの野生型loxP配列を挿入したプラスミド（pCALL）の構築
CAGプロモーターのプロモーター部とポリＡ配列との間に２つの野生型loxP配列を挿入したプラスミドを得るため以下の両DNAを調製した。なお、ここに言うCAGプロモーターとは、高発現ベクターとして特開平3-168087号公報に開示されているものである。
(a)CAGプロモーターを含むプラスミドpCAGGS（Niwa et.al., Gene, Vol.108, 193-200(1991)）のクローン化部位であるEcoRIサイトをSwaIサイトに変えたプラスミドpCAGw（特開平8-84589号公報10頁）を制限酵素SwaIで消化したDNA。
(b)プラスミドpuLL（〔1〕に記載）を制限酵素BamHI及びEcoRIで同時に消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により回収した２つの野生型loxP配列を含む約100bpのDNA断片。
(a)(b)両DNAを断片をligationし、制限酵素SwaI消化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpCALL(4.9kb)を得た。
【００８３】
〔4〕プラスミドpCALLのクローン化部位をSwaIサイトに変えたプラスミド（pCALwL）の構築
プラスミドpCALLの２つのloxP配列間に存在するクローン化部位を制限酵素NruIサイトからSwaIサイトに変えるため以下の操作を行った。
pCALLを制限酵素NruIで消化し、SwaIリンカー（5'-pGATTTAAATC-3'、配列番号：６１）をligation後、再度制限酵素NruIで消化した。NruIによる再度の消化の理由は〔1〕と同じである。反応液で大腸菌を形質転換し、CAGプロモーター内に２つの野生型loxP配列が存在し、かつその間にクローン化部位としてSwaIサイトを持つプラスミドpCALwL(4.9kb、図１４中のＤ)を得た。
【００８４】
〔5〕CAGプロモーター内に野生型loxP配列と変異型loxP配列を挿入したプラスミド（pCALwM）の構築
プラスミドpCALwLの野生型loxP配列の一つを変異型loxP配列に置換したプラスミドを得るため以下の両操作を行った。
(a)プラスミドpCALwLを制限酵素MluI及びXhoIで同時に消化後、アガロースゲル電気泳動により野生型loxP配列を含まない約4.8kbの断片を回収した。
(b)プラスミドpuLwMを制限酵素MluI及びXhoIで同時消化後アガロースゲル電気泳動し、野生型及び変異型loxP配列を含む100bpのDNA断片を回収した。
(a)(b)で調製した両DNAをligation後大腸菌を形質転換し、プラスミドpCALwM(4.9kb、図１４中のＥ)を得た。pCALwMは、プロモーター／野生型loxP配列／SwaIサイト（クローン化部位）／変異型loxP配列／ポリＡ配列の構造を有するプラスミドである。
【００８５】
〔6〕組換えアデノウイルス作製用コスミドベクター（pAxCALwM）の作製
〔5〕で作製したプラスミドpCALwMの、プロモーターからポリＡ配列までの部分を挿入したコスミドベクターを作製するため以下の両操作を行った。なお、コスミドベクターの作製は既存の方法（Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996)、及び特開平7-298877号公報）に従った。
(a)アデノウイルス５型のE1及びE3遺伝子以外のほぼ全長が挿入されたカセットコスミドpAxcw（特開平8-308585号公報15頁）を制限酵素SwaIで消化した。
(b)プラスミドpCALwMを制限酵素ApaLI及びHindIII及びHincIIで同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化後、反応液をアガロースゲル電気泳動し約2.4kbの断片を回収した。
(a)(b)で調製した両DNAをligation後、反応液の一部をラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキット（ギガパックXL、Stratagene社製）を用いてパッケージング反応を行い、反応液を大腸菌に感染させカセットコスミドpAxCALwM(44.9kb)を得た。
【００８６】
（２）遺伝子置換のターゲット側のプラスミドの構築
〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にlacZ遺伝子を挿入したプラスミド（puLZM）の構築
プラスミドpuLwM（（１）−〔2〕に記載）の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に大腸菌lacZ遺伝子を挿入したプラスミドを得るため以下の両操作を行った。
(a)プラスミドpuLwMを制限酵素SwaIで消化後、アガロースゲル電気泳動により直鎖状のDNA断片を回収した。
(b)プラスミドpSRlacZ（Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996)）を制限酵素SalI及びPstIで同時に消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動によりlacZ遺伝子を含む約3.1kbのDNA断片を回収した。
(a)(b)で調製した両DNAをligationし、制限酵素SwaI消化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpuLZM(6.4kb、図１５中のＦ)を得た。
【００８７】
〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にSV40の複製オリジン（ori）及びポリＡ配列を挿入したプラスミド（puMOL）の構築
プラスミドpuMwLの野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にをSV40のori及びポリＡ配列挿入したプラスミドを得るため以下の両操作を行った。
(a)プラスミドpuMwL（（１）−〔2〕に記載）を制限酵素SwaIで消化後、アガロースゲル電気泳動により直鎖状のDNA断片を回収した。
(b)プラスミドpCAGGS（（１）−〔3〕に記載）を制限酵素BamHI消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動によりSV40のori及びポリＡ配列を含む約340bpのDNA断片を回収した。
(a)(b)で調製した両DNAをligationし、制限酵素SwaI消化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpuMOL(3.6kb、図１５中のＧ)を得た。
【００８８】
〔3〕野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列を挿入したプラスミド（puLZMOL）の構築
プラスミドpuLZMから変異型loxP配列を除き、プラスミドpuMOLの、変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列を含む断片を挿入するため以下の操作を行った。
(a)プラスミドpuLZMを制限酵素NheI及びXhoIで同時に消化後、アガロースゲル電気泳動により野生型loxP配列とlacZ遺伝子を含む約6.4kbのDNA断片を回収した。(b)プラスミドpuMOLを制限酵素NheI及びXhoIで同時に消化後、アガロースゲル電気泳動により、変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列を含む約440bpのDNA断片を回収した。
(a)(b)で調製した両DNAをligationし、制限酵素SwaI消化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpuLZMOL(6.8kb、図１６中のＨ)を得た。
【００８９】
〔4〕プラスミドpuLZMOLのlacZ遺伝子の5'上流にチミジンキナーゼ遺伝子のポリＡ配列を挿入したプラスミド（puALZMOL）の構築
単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）のチミジンキナーゼ（TK）遺伝子のポリＡ配列を、プラスミドpuLZMOLに挿入したプラスミドを構築するため次の両操作を行った。
(a)プラスミドpuLZMOLを、lacZ遺伝子の5'上流側の野生型loxP配列の5'上流で一ヶ所切断したDNA断片を得るため以下の操作を行った。puLZMOLを制限酵素SmaIで消化し次いで制限酵素KpnIで消化後、アガロースゲル電気泳動により約6.8kbの直鎖状DNA断片を回収した。
(b)プラスミドpTKは、HSV-1のTK遺伝子を含む約3.6kbのBamHI消化断片が、pBR322のBamHIサイトに挿入されたプラスミドである（M.Wigler et. al. Cell, Vol.14. 725-731(1978)）。pTKを制限酵素SmaI及びNcoI消化すると、約320bpのTK遺伝子のポリＡ配列が切り出せる。かつ切り出したDNA断片の両端をSmaI及びKpnIサイトにするため以下の操作を行った。プラスミドpTKを制限酵素NcoIで消化し、Klenow酵素により両端を平滑化した。次いで、KpnIリンカー（5'-pGGGTACCC-3'）をligationした後、制限酵素KpnIで消化した。さらに、制限酵素SmaI消化後アガロースゲル電気泳動を行い、TK遺伝子のポリＡ配列を含む約320bpのDNA断片を回収した。
(a)(b)で調製した両DNAをligation後、大腸菌を形質転換しプラスミドpuALZMOL(7.1kb、図１６中のＩ)を得た。puALZMOLは、TK遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列、の構造を有するプラスミドである。なお、この過程でTK遺伝子のポリＡ配列を挿入したのは、これら一連の遺伝子を有する組換えアデノウイルスを作製した場合、挿入部位の上流にある未同定のアデノウイルス由来のプロモーターからlacZ遺伝子の転写が起こらないようにするためである。
【００９０】
〔5〕組換えアデノウイルス作製用コスミドベクター（pAxALZMOL）の作製
プラスミドpuALZMOLの挿入遺伝子（TK遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列）を挿入したコスミドベクターを作製するため以下の操作を行った。
プラスミドpuALZMOLを制限酵素XbaI及びXhoI及びDraIで同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化後、反応液をアガロースゲル電気泳動し約4.5kbのDNA断片を回収した。このDNA断片と制限酵素SwaIで消化したカセットコスミドpAxcw（（１）−〔6〕で調製）とをligationし、制限酵素SwaIで消化後、反応液の一部をラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキット（ギガパックXL、Stratagene社製）を用いてパッケージング反応を行い、反応液を大腸菌に感染させカセットコスミドpAxALZMOL(46.7kb)を得た。
【００９１】
実施例６
＜遺伝子置換に必要な組換えアデノウイルスの作製＞
（１）遺伝子置換のターゲット用組換えアデノウイルス（AxCALwM）の作製
非増殖型アデノウイルスベクター（E1及びE3遺伝子を欠失）のE1遺伝子欠失部位に、プロモーター／野生型loxP配列／SwaIサイト（クローン化部位）／変異型loxP配列／ポリＡ配列、を挿入した組換えアデノウイルスを作製するため以下の操作を行った。なお、組換えアデノウイルスの作製は既存の方法（Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996)、及び特開平7-298877号公報）に従った。
E3遺伝子を欠失したヒトアデノウイルス５型由来株であるAd5-dlX（I.Saito et al., J.Virol., Vol.54, 711-719(1985)）のウイルスDNA−末端蛋白質複合体を制限酵素EcoT22I消化した。このウイルスDNA−末端蛋白質複合体と、実施例５−（１）−〔6〕で作製したコスミドベクターpAxCALwMとを用いリン酸カルシウム共沈法で293細胞を形質転換した。生じた組換えアデノウイルスのクローニングならびにウイルスの選別を行い、目的の組換えウイルスAxCALwM（図１７）を得た。この組換えウイルスを継代し、高力価の４次ウイルス液もしくは５次ウイルス液をCsCl超遠心法にて精製（Y.Kanegae et al., Jpn.J.Med.Sci.Biol., Vol.47, 157-166(1994)）したウイルス液を以後の実験に用いた。
【００９２】
（２）遺伝子置換のドナー用組換えアデノウイルス（AxALZMOL）の作製
非増殖型アデノウイルスベクター（E1及びE3遺伝子を欠失）のE1遺伝子欠失部位に、TK遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列、を挿入した組換えアデノウイルスを作製するため以下の操作を行った。
制限酵素EcoT22I消化したAd5-dlXのウイルスDNA−末端蛋白質複合体と、実施例５−（２）−〔5〕で作製したコスミドベクターpAxALZMOLとをリン酸カルシウム共沈法で293細胞を形質転換し、（１）と同様の方法で目的の組換えウイルスAxALZMOL（図１７）を得た。この組換えウイルスも４次ウイルス液もしくは５次ウイルス液をCsCl超遠心法にて精製したウイルス液を以後の実験に用いた。
【００９３】
実施例７
＜細胞の染色体上に存在する遺伝子の置換に用いる細胞株の作製＞
（１）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を発現する遺伝子置換用細胞株の作製
〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にクローン化部位を有するレポーター遺伝子挿入用プラスミド（pCALwMds）の構築
実施例５−（１）−〔5〕で作製したプラスミドpCALwM（図１４中のＥ）は、プラスミドpCAGGS（実施例５−（１）−〔3〕に記載）のCAGプロモーター内のクローン化部位であるEcoRIサイトに、野生型loxP配列／クローン化部位（SwaIサイト）／変異型loxP配列を挿入したプラスミドである。このpCALwMから、SV40のori及びポリＡ配列を除く目的で以下の操作を行った。
pCALwMをBamHI消化しSV40のori及びポリＡ配列を除き、次いで自己ligtion後大腸菌を形質転換しプラスミドpCALwMds(4.6kb、図１８中のＡ)を得た。
【００９４】
〔2〕ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を挿入したプラスミド（pCALhmBMds）の構築
プラスミドpCALwMdsのSwaIサイトにハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を挿入したプラスミドを構築するため、以下の両DNAを調製した。
(a)プラスミドpCALwMdsを制限酵素SwaIで消化したDNA断片。
(b)プラスミドpCHD2L（Ikeda et al., Gene, Vol.71, 19-27(1988)）を制限酵素SmaI及びDraIで同時に消化後、アガロース電気泳動により回収したハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含む約1.1kbのDNA断片。
(a)(b)両DNAをligation後大腸菌を形質転換し、プラスミドpCALhmBMds(5.7kb、図１８中のＢ)を得た。pCALhmBMdsは、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子がCAGプロモーター内の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入されたプラスミドである。
【００９５】
〔3〕ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を発現する形質転換細胞株の作製。
細胞の染色体上に、プロモーター／野生型loxP配列／ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列、の外来DNAを１コピー有する形質転換細胞株を得るため、以下の操作を行った。なお、細胞の形質転換は、Chen-Okayama法によるリン酸カルシウム-DNA共沈殿法にて行った。
(i)〔2〕で調製したプラスミドpCALhmBMds 20μgを終濃度250mMの塩化カルシウム溶液に溶解（液量100μl）し、100μlの2 x BBS溶液（50mM N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethane sulfonic acid／280mM NaCl2／1.5mM Na2HPO4 (pH6.95)）を加えた後、5% FCS添加DMEM培地で培養した6cmシャーレのCV-1細胞に添加し、3% CO2存在下35℃で約24時間培養した。
(ii)培養液を除き、PBS(-)で細胞を洗浄後、10% FCS添加DMEM培地を添加し、5% CO2存在下37℃で一晩培養した。
(iii)6cmシャーレから細胞をはがし96穴プレートにまきかえ、さらに一晩培養後、培養液に終濃度0.4mg/mlのハイグロマイシンＢを含む培地を添加し、さらに培養を続け、３から４日おきにハイグロマイシンＢを含む培地を交換した。
(iv)約３週間後に生存している細胞（ハイグロマイシンＢ耐性細胞株）をクローン化し、拡大培養後細胞のゲノムDNAを抽出した。形質転換に用いたプラスミドpCALhmBMdsには認識部位が存在しない制限酵素PvuIIで、このゲノムDNAを消化後電気泳動し、プラスミドpCALhmBMdの全長をプローブに用いてサザンブロットを行い、細胞の染色体上に目的の遺伝子が１コピーのみ挿入された形質転換細胞を18株得た。なお、目的の遺伝子が１コピーのみ挿入されていることは、プラスミドpCALhmBMdに認識部位が一ヶ所のみ存在する制限酵素EcoRIで、細胞のゲノムDNAを消化後に行ったサザンブロットでも確認した。
【００９６】
（２）ブレオマイシン耐性遺伝子を発現する遺伝子置換用細胞株の作製
〔1〕ブレオマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミド（pCALGFBMds）の構築
プラスミドpCALwMdsのSwaIサイトにブレオマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミドを構築するため、以下の操作を行った。
プラスミドpTracer-CMV（Invitogen社製）を制限酵素PmaCI消化後アガロース電気泳動を行い、緑色蛍光蛋白質（green fluorescent protein：GFP）とブレオマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質の遺伝子を含む約1.1kbのDNA断片を回収した。このDNA断片と、制限酵素SwaI消化したプラスミドpCALwMds（（１）−〔2〕で調製）とをligationし、制限酵素SwaI消化後大腸菌を形質転換しプラスミドpCALGFBMds(5.7kb、図１８中のＣ)を得た。pCALGFBMdsは、GFPとブレオマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質の遺伝子がCAGプロモーター内の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入されたプラスミドである。
【００９７】
〔2〕ブレオマイシン耐性遺伝子を発現する形質転換細胞株の作製。
細胞の染色体上に、プロモーター／野生型loxP配列／GFPとブレオマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質の遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列、の外来DNAを１コピー有する形質転換細胞株を得るため、以下の操作を行った。
基本的には、（１）−〔3〕で示したハイグロマイシンＢ耐性細胞株の作製方法と同じであるので、以下に相違点のみ示す。CV-1細胞の形質転換は、〔2〕で作製したプラスミドpCALGFBMdsを用いた。形質転換細胞株の選択薬剤は、ブレオマイシン（終濃度0.4mg/ml）を用いた。目的の遺伝子が１コピーのみ挿入された形質転換細胞を選択するためのサザンブロットは、pCALGFBMdsの全長をプローブに用いて行った。
得られたブレオマイシン耐性細胞株（全て目的の遺伝子が１コピーのみ挿入）を、挿入遺伝子の発現の強弱により分類するため、GFPの発現量を測定した。GFPの発現量は、478nmの励起光により発光した507nmの蛍光を観測することにより行い、GFPの発現の強い細胞株（C18, C35）、中程度の細胞株（C29, C38）、弱い細胞株（C19, C30）に分類された（数字は細胞株の番号）。
【００９８】
実施例８
＜アデノウイルスゲノム上に存在する遺伝子の置換＞
野生型loxP配列と変異型loxP配列との組み合わせにより、プラスミドDNA（環状DNA）上に存在するlacZ遺伝子をアデノウイルスゲノム上に置換できることを実証するために以下の実験を行った。本実験の原理は次の通りである（図１７）。実施例６で作製したドナー用組換えアデノウイルスAxALZMOLは、TK遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列、が挿入されている。このウイルスと実施例１で示したCre発現組換えアデノウイルスAxCANCreとを培養細胞に同時感染すると、２つの野生型loxP配列間で特異的組換え反応が起こり、TK遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列を有するアデノウイルス(a)と、野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列、の構造を有する環状DNA(b)が生じる。２つの野生型loxP配列を挿入した組換えアデノウイルスとCre発現組換えアデノウイルスとを用いたこの反応の効率は非常に高く（鐘ケ江ら、Nucleic acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995)）、ほぼ100%の培養細胞でアデノウイルス(a)と環状DNA(b)が生成することが予測される。環状DNA(b)は、SV40 oriのプロモーターを有するが、その転写は直後のSV40ポリＡ配列によりブロックされるため、lacZ遺伝子は発現しない。この環状DNA(b)が生成した細胞に、さらに実施例６で作製したターゲット用組換えアデノウイルスAxCALwMを感染させると、環状環状DNA(b)とAxCALwMとの間で組み換え反応が起こり、野生型loxP配列及び変異型loxP配列を各２ヶ有する中間体を経て、プロモーター／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列の構造を有するアデノウイルス(c)が生成する。アデノウイルス(c)ではlacZ遺伝子が発現し、lacZ遺伝子にコードされるβ-ガラクトシダーゼが産生され、以下に示す染色操作により細胞は青く染色される。
【００９９】
実際の実験では、ドナー用組換えアデノウイルスAxALZMOL、Cre発現組換えアデノウイルスAxCANCre、ターゲット用組換えアデノウイルスAxCALwMの３種類のウイルスを同時に培養細胞（CV-1細胞もしくはCOS-1細胞）に感染させた。それぞれのウイルスのmoi（重複感染度）は次の通りである。ターゲット用組換えアデノウイルス：moi=9、Cre発現組換えアデノウイルス：moi=5または15、ドナー用組換えアデノウイルス：moi=10、30、60、100、200。１時間のウイルス感染後、培地を加え培養した。３日後、培養液を除きPBS(-)で細胞面を洗浄後、0.25%グルタルアルデヒド液を加え4℃で10分間細胞を固定後、再度PBS(-)洗浄し、X-Gal染色液（5mMフェリシアン化カリウム／5mMフェロシアン化カリウム／2mM塩化マグネシウム／1mg/ml X-Gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-Galactoside)／PBS(-)）を加え一晩染色した。その結果を図１９に示す。
【０１００】
図１９は、Cre発現組換えアデノウイルスをmoi=15でCV-1細胞に感染させた場合の結果である。ドナー用組換えアデノウイルスのmoi=60では約60%、moi=100では約90%の細胞が青く染色された。また図１９には示していないが、ドナー用組換えアデノウイルスのみ、及びドナー用組換えアデノウイルスとCre発現組換えアデノウイルスを同時に感染させても青く染色される細胞は全く存在しなかった。さらに、Cre発現組換えアデノウイルスをmoi=5で感染させた場合、及びCOS-1細胞を用いて同じ実験を行った場合も図１９とほぼ同様の結果であった。
【０１０１】
以上の結果は、ドナー用組換えアデノウイルスのゲノム上に存在するlacZ遺伝子が、ターゲット用組換えアデノウイルスのゲノム上に挿入され、lacZ遺伝子がプロモーターと直結しβ-ガラクトシダーゼが発現した結果、細胞が青く染色されたことを示す。すなわち、ドナー用組換えアデノウイルスのゲノム上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に存在するlacZ遺伝子が、環状DNAの形を介して、ターゲット用組換えアデノウイルスのゲノム上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に非常に高い効率で置換されたことを明らかに証拠づけるものである。
【０１０２】
実施例９
＜細胞の染色体上に存在する遺伝子の置換＞
実施例８では、環状DNA上に存在する遺伝子をアデノウイルスのゲノムに置換できることを示したが、細胞の染色体上の遺伝子も置換できることを実証するため以下の実験を行った。その原理は実施例８と同じであるが、ターゲット用組換えアデノウイルスの代わりに、実施例７で作製したプロモーター／野生型loxP配列／ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列、のDNAが染色体上に１コピー挿入された形質転換細胞株（ターゲット細胞）を用いた（図２０）。
【０１０３】
実施例７で作製したハイグロマイシンＢ耐性の任意の６株のターゲット細胞（C3、C7、C8、C11、C19、C28）に、それぞれCre発現組換えアデノウイルスAxCANCreをmoi=5で、ドナー用組換えアデノウイルスAxALZMOLをmoi=10、30、100、300で同時に１時間感染させ、培地を添加し培養した。３日後に、実施例８と全く同じ操作を行いβ-ガラクトシダーゼが発現した細胞を染色した。結果を図２１に示す。細胞株により頻度は異なるが、ドナー用組換えアデノウイルスをmoi=100で感染した場合、10%（C19）から30%（C8）の細胞が青く染色された。ドナー用組換えアデノウイルスをmoi=300で感染すると、青く染色された細胞の割合はさらに増えたが、大量のアデノウイルス粒子による細胞毒性が認められた。また図には示していないが、ドナー用組換えアデノウイルスのみをmoi=100で感染しCre発現組換えアデノウイルスが存在しない場合は青く染色された細胞は全く存在しなかった。
【０１０４】
以上の結果は、ドナー用組換えアデノウイルスのゲノム上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に存在するlacZ遺伝子が、環状DNAの形を介して、ターゲット細胞の染色体上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に高い効率で置換されたことを明らかに証拠づけるものである。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明によって、リコンビナーゼＣｒｅの存在下、野生型loxP配列とは組換え反応が起きず、かつ同一配列の２つの変異型loxP配列での組換え反応は２つの野生型loxP配列間と同程度の効率で起こる変異型loxP配列が提供される。さらに本発明によって、野生型loxP配列と変異型loxP配列、もしくは異なる配列の変異型loxP配列の組み合わせにより、動物細胞をはじめとする高等真核細胞で、効率の高い遺伝子挿入もしくは遺伝子置換を行う方法が提供される。
【０１０６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAGTGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATATTGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATACTGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAACGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAAGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：７
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAGGTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：８
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATATATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：９
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATCTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１０
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATTTATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGCATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGAATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGGATG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTGTG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTTTG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTCTG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１７
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTACG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１８
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTAAG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：１９
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTAGG CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２０
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATG TTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATG GTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTATG ATATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAACGTATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２７
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAACGTATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２８
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAACGTATT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：２９
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAAGTATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３０
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAAGTATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAAGTATT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAGGTATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAAGGTATT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATATATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATATATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３７
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATCTATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３８
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATCTATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：３９
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATTTATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４０
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATTTATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATTTATT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGCATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGCATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGAATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGAATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGGATA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４７
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGGATC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４８
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGGATT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：４９
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTGTA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５０
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTTTC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTCTT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTACA CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTAAC CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５４
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
配列
ATAACTTCGT ATAATGTAGT CTATACGAAG TTAT                                 34
配列番号：５５
配列の長さ：５２
配列の型：核酸
配列
TCGAGGTGCA CATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TT             52
配列番号：５６
配列の長さ：５２
配列の型：核酸
配列
CTAGAACGCG TATAACTTCG TATAGCATAC ATTATACGAA GTTATGTGCA CC             52
配列番号：５７
配列の長さ：６０
配列の型：核酸
配列
TCGAGTCCGG AATAACTTCG TATAACGTAT ACTATACGAA GTTATGCTAG CATTTAAATG     60
配列番号：５８
配列の長さ：６０
配列の型：核酸
配列
TCGACATTTA AATGCTAGCA TAACTTCGTA TAGTATACGT TATACGAAGT TATTCCGGAC     60
配列番号：５９
配列の長さ：６０
配列の型：核酸
配列
CGCGCATTTA AATTCCGGAA TAACTTCGTA TAACGTATAC TATACGAAGT TATGCTAGCA     60
配列番号：６０
配列の長さ：６０
配列の型：核酸
配列
CGCGTGCTAG CATAACTTCG TATAGTATAC GTTATACGAA GTTATTCCGG AATTTAAATG     60
配列番号：６１
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
配列
GATTTAAATC                                                            10
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型loxP配列の合成DNAの構造を示す図である。（ｓ）はセンス鎖を、（ａ）はアンチセンス鎖を示す。
【図２】図２は、合成された１塩基置換の変異型loxP配列のスペーサー領域の配列（センス鎖）を示す。
【図３】図３は、合成された１塩基置換の変異型loxP配列のスペーサー領域の配列（アンチセンス鎖）を示す。
【図４】図４は、合成された２塩基置換の変異型loxP配列のスペーサー領域の配列（センス鎖）を示す。
【図５】図５は、合成された２塩基置換の変異型loxP配列のスペーサー領域の配列（アンチセンス鎖）を示す。
【図６】図６は、直鎖状DNAを基質とした場合の、変異型loxP配列間でのリコンビナーゼCre依存組換え反応を示す模式図である。「Ｍ」は変異型loxP配列を意味し、文字上の矢印はloxP配列の向きを示す。数字はＢｓａＨＩ消化した場合の断片の長さ（ｂｐ）を示す。
【図７】図７は、プラスミドpBRwtの構造を示す模式図である。「Ｌ」は野生型loxP配列を意味し、文字上の矢印はloxP配列の向きを示す。ＡｐＲはアンピシリン耐性遺伝子、ｏｒｉは大腸菌の複製オリジンを示す。
【図８】図８は、片方の端に野生型loxP配列が、他方の端に変異型loxP配列が各一ヶ結合した直鎖状DNAを示す模式図である。「Ｍ」は変異型loxP配列を、「Ｌ」は野生型loxP配列を意味し、文字上の矢印はloxP配列の向きを示す（以下の図でも同様である）。また、下向きの矢印はＢｓａＨＩサイトを示し、数字はＢｓａＨＩ消化断片の長さ（ｂｐ）を示す。
【図９】図９は、プラスミドpBLAmutantの構造を示す模式図である。太線部分はpBR322由来であり、細線部分はアデノウイルス由来である。
【図１０】図１０は、直鎖状DNAを基質とした場合の、野生型loxP配列と変異型loxP配列間でのリコンビナーゼCre依存組換え反応を示す模式図である。細い矢印はＤｒａＩサイトを示す。
【図１１】図１１は、プラスミドpuLwL（Ａ）、プラスミドpuLwM（Ｂ）及びプラスミドpuMwL（Ｃ）の構造を示す模式図である。
【図１２】図１２は、プラスミドpuLwMの構築に用いた変異型合成ＤＮＡの配列を示す図である。中央の下線部がloxP配列(34bp)、二重下線部がスペーサー領域(8bp)であり、変異を導入した塩基は太字で表示してある。
【図１３】図１３は、プラスミドpuMwLの構築に用いた変異型合成ＤＮＡの配列を示す図である。中央の下線部がloxP配列(34bp)、二重下線部がスペーサー領域(8bp)であり、変異を導入した塩基は太字で表示してある。
【図１４】図１４は、プラスミドpCALwL（Ｄ）及びプラスミドpCALwM（Ｅ）の構造を示す模式図である。ＣＡＰｒｏはＣＡＧプロモーター、ＧｐＡはβ−グロビンポリＡ配列を示す。
【図１５】図１５は、プラスミドpuLZM（Ｆ）及びプラスミドpuMOL（Ｇ）の構造を示す模式図である。ＳｐＡはＳＶ４０のｏｒｉ及びポリＡ配列を示す。
【図１６】図１６は、プラスミドpuLZMOL（Ｈ）及びプラスミドpuALZMOL（Ｉ）の構造を示す模式図である。ＴｐＡはチミジンキナーゼのポリＡ配列を示す。
【図１７】図１７は、野生型loxP配列と変異型loxP配列との組み合わせにより、プラスミドDNA（環状DNA）上に存在するlacZ遺伝子をアデノウイルスゲノム上に挿入できることを示すための実験の模式図である。
【図１８】図１８は、プラスミドpCALwMds（Ａ）、プラスミドpCALhmBMds（Ｂ）及びプラスミドpCALGFBMds（Ｃ）の構造を示す模式図である。ｈｍＢはハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ＧＦＢはＧＦＰとブレオマイシン耐性遺伝子との融合遺伝子を示す。
【図１９】図１９は、アデノウイルスゲノム上の遺伝子の置換実験の結果を示す図である。Cre発現組換えアデノウイルスをmoi=15でターゲット用組換えアデノウイルスをmoi=9でCV-1細胞に感染させた。ドナー用組換えアデノウイルスのmoi=60では約60%、moi=100では約90%の細胞が青く染色された。
【図２０】図２０は、野生型loxP配列と変異型loxP配列との組み合わせにより、プラスミドDNA（環状DNA）上に存在するlacZ遺伝子を細胞の染色体上の遺伝子に挿入できることを示すための実験の模式図である。
【図２１】図２１は、細胞の染色体上の遺伝子の置換実験の結果を示す図である。ハイグロマイシンＢ耐性の任意の６株のターゲット細胞（C3、C7、C8、C11、C19、C28）に、それぞれCre発現組換えアデノウイルスAxCANCreをmoi=5で、ドナー用組換えアデノウイルスAxALZMOLをmoi=10、30、100、300で同時に１時間感染させた。細胞株により頻度は異なるが、ドナー用組換えアデノウイルスをmoi=100で感染した場合、10%（C19）から30%（C8）の細胞が青く染色された。
【図１】
0004206154.tif 000010
【図２】
0004206154.tif 000011
【図３】
0004206154.tif 000012
【図４】
0004206154.tif 000013
【図５】
0004206154.tif 000014
【図６】
0004206154.tif 000015
【図７】
0004206154.tif 000016
【図８】
0004206154.tif 000017
【図９】
0004206154.tif 000018
【図１０】
0004206154.tif 000019
【図１１】
0004206154.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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