(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエー蛋白質を有効成分とする、タイトジャンクションでの物質透過を抑制するタイトジャンクション透過抑制剤。
【請求項２】
ホエー蛋白質がβ‐ラクトグロブリンである請求項1記載のタイトジャンクションでの物質透過を抑制するタイトジャンクション透過抑制剤。
【請求項３】
血清アルブミンまたはその分解物を有効成分とする、タイトジャンクションでの物質透過を抑制するタイトジャンクション透過抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ホエー蛋白質またはその分解物を有効成分とするタイトジャンクション透過抑制剤に関する。また、本発明は、血清アルブミンまたはその分解物を有効成分とするタイトジャンクション透過抑制剤に関する。本発明のタイトジャンクション透過抑制剤は、タイトジャンクションでのアレルゲン物質などの透過を抑制するので、アレルギー疾患などの予防や治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
腸管の上皮細胞間には、粘膜表層細胞同士を洩れなくシールし、表層細胞の周囲を鉢巻き状に取り囲んでいるタイト・ジャンクション（Tight Junction) が存在している。そして、イオンなどの低分子物質は、このタイト・ジャンクションの間を通り抜けて体内に吸収されることが知られている。また、消化されずに残った細菌、ウィルス、蛋白質などの巨大分子も腸管の上皮細胞間を通り抜けて体内に吸収される場合があり、これが感染症や食物アレルギーを引き起こす原因のひとつと考えられている。なお、タイト・ジャンクションの物質に対する透過性は一定でなく、グルコース、サイトカラシンＤなどの存在により変化することが知られている。しかし、これらの物質はいずれもタイト・ジャンクションの透過性を緩めるものであり、タイト・ジャンクションの透過性を減少させる物質の存在については知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、食物アレルギーの予防という観点から、腸管上皮細胞間のタイト・ジャンクションの物質透過を抑制する物質について、モデル系を作成し鋭意検討を行ったところ、ホエー蛋白質またはその分解物がタイト・ジャンクションでの物質透過を抑制する作用を有することを見出した。そして、ホエー蛋白質および／またはその分解物を用いた動物実験により、アレルゲン物質の透過が抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、タイト・ジャンクションの物質透過を抑制する作用を有し、その結果としてアレルギーなどを予防する効果を発揮するタイト・ジャンクション透過抑制剤を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明では、タイト・ジャンクション透過抑制剤の有効成分として、ホエー蛋白質、ホエー蛋白濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白単離物（ＷＰＩ）などやそれらの分解物をそのまま用いることもできるが、特に、ホエー蛋白質中に含まれる血清アルブミンまたはその分解物やβ−ラクトグロブリンまたはその分解物を用いると良い。また、血清アルブミンについては、哺乳動物由来のものであれば使用可能であるが、入手が容易なウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いると良い。なお、分解物については、通常、蛋白質の加水分解に用いられる蛋白質加水分解酵素で加水分解したものでも良いし、あるいは、酸やアルカリで分解したものでも良い。
【０００５】
本発明のタイト・ジャンクション透過抑制剤を投与するに際しては、有効成分のホエー蛋白質またはその分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従って、粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤など製剤化して用いることもできる。さらに、このタイト・ジャンクション透過抑制剤を各種栄養剤や食品などに混ぜてアレルギーを予防することも可能である。
【０００６】
本発明のタイト・ジャンクション透過抑制剤の投与量は、年齢、治療効果、病態などにより異なるが、通常、一人当たり一回に体重１kg当たり 130mg〜13g の範囲で、一日一回から数回投与すればよい。
【０００７】
なお、本発明のタイト・ジャンクション透過抑制剤の効果については、先に本発明者らが確立したタイト・ジャンクションの物質透過性を定量する実験系を用いて行った。以下、その実験系について説明する。
【０００８】
ヒト結腸癌由来の培養細胞株であるCaco-2（ATCC HTB37）を 100μg/ml濃度のタイプＩコラーゲン（新田ゼラチン製）溶液でコーティングした透過性膜（ミリセルＣＭ、ポアサイズ；0.4 μm, 0.6cm2 、ミリポア製）上に撒き、10％ウシ胎児血清（バイオセラム製）を含むＤＭＥＭ培地（日本水産製）で一定期間培養した後、培地を洗浄してハンクス液に置き換え、ミリセルＥＲＳ（ミリポア製）で経上皮電気抵抗を測定したところ、培養開始48時間で 550Ω・cm2 となった。これは、タイト・ジャンクションが形成されて安定化したことを示す。
【０００９】
一方、10％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に代えて無血清培地（コスモバイオ製）を用い、Caco-2（ATCC HTB37）を同様に培養して経上皮電気抵抗を測定したところ、最大値で 160Ω・cm2 であり、タイト・ジャンクションの形成が不十分であることが判った。そこで、この無血清培地にウシ胎児血清を添加し、１時間処理した後、経上皮電気抵抗を測定したところ、ＤＭＥＭ培地を用いて培養したものと同様の値まで上昇し、タイト・ジャンクションが形成されて安定化したことが判った。したがって、この無血清培地を用いた実験系により、タイト・ジャンクションを形成し、タイト・ジャンクション透過抑制効果を示す物質の選択を行うことができると考えた。  図１に経上皮電気抵抗を測定する実験系を示す。
【００１０】
【試験例１】
ホエー蛋白質のタイト・ジャンクション形成促進効果について、上述の実験系により確認した。
【００１１】
無血清培地を用いてCaco-2（ATCC HTB37）を透過性膜上で一日培養した後、10％ホエー蛋白質溶液を無血清培地に添加してさらに培養し、経上皮電気抵抗を測定した。その結果を図２に示す。
【００１２】
【試験例２】
ホエー蛋白質中のタイト・ジャンクション形成促進に有効な画分について、逆相ＨＰＬＣでホエー蛋白質を分画し、上述の実験系により確認した。
【００１３】
なお、逆相ＨＰＬＣの条件を以下に示す。カラム：Asahipak ODP-50 10× 250mm (旭化成工業株式会社製) 、流速：2ml/min.、流動相： 0.1％トリフルオロ酢酸を含む超純水、溶出相：アセトニトリル、グラジェント： 0.1％トリフルオロ酢酸を含む超純水で平衡化した後、０〜30分までは１％／min.でアセトニトリルを増加させ、30〜65分でアセトニトリルを直線的に30％から 100％に上げた。試料：ホエー蛋白質１ml。図３に逆相ＨＰＬＣのチャートと分画した各画分の番号を示す。なお、このようにして得られた各画分については、蒸留水で希釈した後、凍結乾燥を行った。
【００１４】
無血清培地を用いてCaco-2（ATCC HTB37）を透過性膜上で一日培養した後、10％濃度となるよう調製した各画分の溶液を無血清培地に添加してさらに培養し、経上皮電気抵抗を測定した。その結果を図４に示す。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、経上皮電気抵抗が最も高かった第５画分にはβ−ラクトグロブリンが多く含まれており、また、第３画分には血清アルブミンが多く含まれていることが判った。
【００１５】
【試験例３】
β−ラクトグロブリンのタイト・ジャンクション形成促進効果について、上述の実験系により確認した。
【００１６】
常法〔R.Aschaffenburg and J.Drewry, Biochem.J., vol.65, p.273 (1957)〕に従って生脱脂乳より得たβ−ラクトグロブリン含有画分を、さらにDEAE-Sephacel(ファルマシア社製）で精製し、β−ラクトグロブリンを得た。
【００１７】
無血清培地を用いてCaco-2（ATCC HTB37）を透過性膜上で一日培養した後、β−ラクトグロブリンを各濃度で無血清培地に添加してさらに培養し、経上皮電気抵抗を測定した。その結果、５μmole/lのβ−ラクトグロブリンを添加することにより、経上皮電気抵抗は 1.4倍以上増加し、また、10μmole/lのβ−ラクトグロブリンを添加することにより、経上皮電気抵抗は２倍以上増加した。
【００１８】
【試験例４】
ウシ血清アルブミンのタイト・ジャンクション形成促進効果について、上述の実験系により確認した。
【００１９】
無血清培地を用いてCaco-2（ATCC HTB37）を透過性膜上で一日培養した後、ウシ血清アルブミン（シグマ製）を各濃度で無血清培地に添加してさらに培養し、経上皮電気抵抗を測定した。その結果、５μmole/lの血清アルブミンを添加することにより、経上皮電気抵抗は２倍以上増加した。
【００２０】
【試験例５】
血清アルブミン酵素加水分解物のタイト・ジャンクション形成促進効果について、上述の実験系により確認した。
【００２１】
10％濃度のウシ血清アルブミンを溶解した蟻酸アンモニウム緩衝液(pH 8.0)に、基質濃度の１/100量のトリプシンを添加し、37℃で12時間反応させた。そして、トリプシンと同量の大豆トリプシンインヒビターを添加することにより反応を停止し、血清アルブミン酵素加水分解物を得た。
【００２２】
無血清培地を用いてCaco-2（ATCC HTB37）を透過性膜上で一日培養した後、血清アルブミン酵素加水分解物を無血清培地に添加してさらに培養し、経上皮電気抵抗を測定した。その結果、５μmole/lの血清アルブミン酵素加水分解物を添加することにより、経上皮電気抵抗は２倍以上増加した。なお、反応停止に用いた大豆トリプシンインヒビターによる経上皮電気抵抗の変化は認められなかった。
【００２３】
【試験例６】
動物実験により、本発明のタイト・ジャンクション透過抑制剤の効果を確認した。実験は一群３匹とし、18日齢のＤＢＡ／２マウス（日本クレア製）を２日間予備飼育した後、飼料重量の 0.1％及び１％の有効成分を添加した市販のＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母製）を摂取させ、７日間飼育した。そして、AIN-76配合 (20％カゼイン食) の粉末飼料（オリエンタル酵母製）を自由摂取させてカゼインを経口投与し、眼底静脈叢より 0.5週 (３日又は４日) 毎に 100μl 採血して血清中カゼイン特異的抗体価の変動を測定した。その結果を図５及び図６に示す。なお、カゼイン特異的抗体価の測定は、以下のように行った。
【００２４】
ウシαS1−カゼイン（シグマ製）を10μg/mlの生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した溶液 100μl をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、室温にて２時間放置して、ウシαS1−カゼインを固定した。次に、0.05％Tween 20を含む生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、10mg/ml 濃度の血清アルブミン（生化学工業製) を含む0.1Mクエン酸緩衝液(pH 6.4) 200μl を各ウエルに添加した。室温にて２時間放置し、ブロッキングした後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、試料 100μl を各ウエルに添加した。試料は１％血清アルブミン及び0.05％Tween 20を含む生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳＴＢ）で血清を 100倍に希釈したものを用いた。４℃にて17時間放置後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（シグマ製）を10,000倍にＰＢＳＴＢで希釈したもの 100μl を各ウエルに添加した。室温にて１時間放置後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、アビジン標識アルカリフォスファターゼ溶液を 5,000倍にＰＢＳＴＢで希釈したもの 100μl を各ウエルに添加した。室温にて 0.5時間放置後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、1Mジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pH 9.8)に0.02％塩化マグネシウム及びp-nitrophenyl phosphate 1mg/mlを溶解させた基質溶液を各ウエルに 100μl 添加し、室温で発色させ、吸光度(415 nm)を二連で測定した。試料の非特異的吸着の影響を知るため、カゼイン溶液に替えて、血清アルブミンを10μg/mlのＰＢＳに溶解した溶液 100μl を各ウエルに添加し、血清アルブミンを固定したウエルも作成した。抗体価は一群３匹の吸光値の相乗平均とした。
【００２５】
図５及び図６に示すように、無添加群ではカゼイン特異的抗体価がカゼイン投与開始後 1.5週で上昇し始めるのに対し、ホエー蛋白質（ＷＰＣ）１％添加、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１％添加、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 0.1％添加、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）・トリプシン分解物１％添加、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）・トリプシン分解物 0.1％添加、β−ラクトグロブリン（ｂ−Ｌｇ）１％添加、β−ラクトグロブリン（ｂ−Ｌｇ） 0.1％添加の各群では、カゼイン特異的抗体価が上昇し始める時期が１〜２週間遅れ、また、抗体価も低い値であった。したがって、本発明のタイト・ジャンクション透過抑制剤は、マウスの未熟なタイト・ジャンクションにおいて物質の透過性を減少させ、タイト・ジャンクションからのカゼインの生体内への進入を防止したものと考えられる。このように、食物由来成分のタイト・ジャンクションでの透過性を減少させることにより、特に、食物アレルギー発症に最も影響のある離乳期などに、食物アレルギーを予防・治療することが可能となる。
【００２６】
【実施例１】
本発明の有効成分100gとラクトース 65gを混和し、60メッシュの篩を通した後、アルコール性ポリビニルピロリドン 20gで湿らせ、12メッシュの篩を通して乾燥した。そして、タルク 25gと澱粉 10gを加え、常法により打錠して重量 300mgの錠剤を調製した。
【００２７】
【実施例２】
本発明の有効成分100g、メチルセルロース 75g、コーンスターチ 40g及び香料を混和し、60メッシュの篩を通した後、アルコール性ポリビニルピロリドン 15gで湿らせ、 0.7mm径ステンレススチールの篩を通して顆粒剤を調製した。
【００２８】
【発明の効果】
ホエー蛋白質またはその分解物、特に、ホエー蛋白質中に含まれる血清アルブミンまたはその分解物やβ−ラクトグロブリンまたはその分解物、あるいは、血清アルブミンまたはその分解物は、タイト・ジャンクションの形成を促進し、タイト・ジャンクションでの物質の透過性を減少させる効果を有するので、これらの物質は、乳幼児などの食物アレルギーなどの予防および治療に用いる飲食品や医薬品などの有用な素材である。また、これらの物質は、通常の食品素材として用いられている成分であり、安全性も高いと言える。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、試験例で用いた経上皮電気抵抗を測定する実験系を示す。
【図２】は、試験例１で確認したホエー蛋白質のタイト・ジャンクション形成促進効果について示す。
【図３】は、試験例２で行ったホエー蛋白質の逆相ＨＰＬＣによる分画と各画分の番号を示す。
【図４】は、試験例２で確認したホエー蛋白質各画分のタイト・ジャンクション形成促進効果について示す。
【図５】は、試験例６で確認したホエー蛋白質及び血清アルブミンの抗体産生抑制効果について示す。
【図６】は、試験例６で確認したβ−ラクトグロブリンの抗体産生抑制効果について示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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