(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含む可溶性融合タンパク質であって、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、可溶性融合タンパク質。
【請求項２】
上記融合タンパク質が、少なくとも１つのタンパク質標識をさらに含んでなる請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項３】
上記ペプチドリンカー配列が、２〜２０個のアミノ酸を含んでなる請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項４】
上記バクテリオファージ外殻タンパク質が、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質である請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項５】
一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質とを含む可溶性融合タンパク質であって、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、可溶性融合タンパク質。
【請求項６】
上記Ｃ−β鎖フラグメントのＣ−末端とバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質のＮ−末端とに共有結合されたタンパク質標識をさらに含んでなる請求項５に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項７】
一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質とを含む可溶性融合タンパク質であって、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、可溶性融合タンパク質。
【請求項８】
上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、細胞障害性Ｔ細胞から単離されたものである請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項９】
可溶性融合タンパク質をエンコードする配列と、機能可能に連結されたプロモータ配列およびリーダー配列とを含んでなるＤＮＡセグメントであって、
該可溶性融合タンパク質は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、ＤＮＡセグメント。
【請求項１０】
可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成されるＤＮＡセグメントであって、
該可溶性融合タンパク質は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、ＤＮＡセグメント。
【請求項１１】
可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成されるＤＮＡセグメントであって、
該可溶性融合タンパク質は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、ＤＮＡセグメント。
【請求項１２】
請求項９に記載のＤＮＡセグメントを含んでなるＤＮＡベクター。
【請求項１３】
上記プロモータおよびリーダー配列が、それぞれ大腸菌由来のｐｈｏＡおよびｐｅｌＢである請求項９に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１４】
可溶性融合タンパク質を呈示する複数のバクテリオファージを含んでなるバクテリオファージ・ライブラリであって、
上記複数の可溶性融合タンパク質はいずれも、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、バクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項１５】
上記ペプチドリンカー配列により、Ｖ−α鎖のＣ−末端がＶ−β鎖のＮ−末端と共有結合されてなる請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項１６】
上記可溶性融合タンパク質が、少なくとも１つのタンパク質標識をさらに含んでなる請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項１７】
上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、免疫的に虚弱な哺乳類から単離されたものである請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項１８】
上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、マウスから単離されたものである請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項１９】
上記マウスが、ＨＬＡ−Ａ２抗原複合体を発現可能なトランスジーンを有するものである請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２０】
上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、癌、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギーを発症、または発症の疑いのある人から入手されたものである請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２１】
上記感染症が、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスの感染によるものである請求項２０に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２２】
上記ＲＮＡウイルスが、ヒト免疫不全ウイルスである請求項２１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２３】
上記ＤＮＡウイルスが、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、インフルエンザウイルス、またはポックスウイルスより構成される群から選択されるものである請求項２１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２４】
上記バクテリオファージ外殻タンパク質が、遺伝子VIIIタンパク質である請求項１４に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２５】
請求項１４に記載のバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ、宿主細胞サンプル、および、その使用説明書から構成されるキット。
【請求項２６】
可溶性融合タンパク質突然変異物を呈示する複数のバクテリオファージを含んでなるバクテリオファージ・ライブラリであって、
上記複数の可溶性融合タンパク質突然変異物はいずれも、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、バクテリオファージ・ライブラリ。
【請求項２７】
可溶性融合タンパク質の単離方法であって、
可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターを宿主細胞に導入する工程と、
上記融合タンパク質の発現が可能な低速誘導条件下において、上記宿主細胞を培養培地中で培養する工程と、
上記融合タンパク質を上記宿主細胞または培地から精製して可溶性融合タンパク質を単離する工程とを含んでなり、
該可溶性融合タンパク質は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、可溶性融合タンパク質の単離方法。
【請求項２８】
上記宿主細胞または培養培地の抽出物を、上記融合タンパク質を特異的に結合可能な合成マトリックスに接触させる工程と、
上記融合タンパク質を合成マトリックスより精製して、可溶性融合タンパク質を単離する工程とをさらに含んでなる請求項２７に記載の可溶性融合タンパク質の単離方法。
【請求項２９】
可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成されるＤＮＡセグメントの単離方法であって、
複数の可溶性融合タンパク質を呈示する、複数のバクテリオファージを含んでなるバクテリオファージ・ライブラリを宿主細胞に感染させる工程と、
上記複数のバクテリオファージの増殖が可能な低速誘導条件下において、上記宿主細胞を培養する工程と、
分子と少なくとも１つのバクテリオファージとの間に特異的結合が形成可能な条件下で、上記複数のバクテリオファージと該分子とを接触させて、特異的結合複合体を形成した少なくとも１つのバクテリオファージを生産する工程と、
上記特異的結合複合体を形成するバクテリオファージの１つを同定する工程と、
上記バクテリオファージを増殖し、該バクテリオファージからＤＮＡセグメントを単離する工程とを含んでなり、
該可溶性融合タンパク質はいずれも、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、ＤＮＡセグメントの単離方法。
【請求項３０】
上記宿主細胞中で可溶性融合タンパク質を発現可能なＤＮＡベクターに、上記ＤＮＡセグメントを挿入する工程をさらに含んでなる請求項２９に記載のＤＮＡセグメントの単離方法。
【請求項３１】
リガンドに対する一本鎖Ｔ細胞レセプターの特異的結合親和性を増強する方法であって、
上記一本鎖Ｔ細胞レセプターとリガンドとの間の、第１の特異的結合親和性を決定する工程と、
バクテリオファージの増殖が可能な条件下で、請求項２６に記載のバクテリオファージ・ライブラリを複数の宿主細胞に感染させる工程と、
上記複数の宿主細胞を、少なくとも一つのバクテリオファージとの間で特異的結合が十分に可能な上記リガンドと接触させることにより、上記バクテリオファージとリガンドとからなる少なくとも一つの特異結合複合体を生産する工程と、
上記特異結合複合体を形成するバクテリオファージを同定する工程と、
可溶性融合タンパク質突然変異物をエンコードする配列を含んでなり、該可溶性融合タンパク質突然変異物を発現するＤＮＡを、上記バクテリオファージより単離する工程と、
上記可溶性融合タンパク質突然変異物より、可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物を分離する工程と、
上記一本鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物とリガンドとの間の、第二の特異的結合親和性を決定する工程と、
上記第一の特異的結合親和性より大きな第二の特異的結合親和性を有する一本鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物を、リガンドに対する増強された特異的結合親和性を有する一本鎖Ｔ細胞レセプターとして同定する工程とを含んでなる、リガンドに対する一本鎖Ｔ細胞レセプターの特異的結合親和性を増強する方法。
【請求項３２】
Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子の検出方法であって、
それぞれが複数の融合タンパク質を呈示する、複数のバクテリオファージを含んで構成されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリと、上記分子とを、該分子とライブラリ中の少なくとも一つのバクテリオファージとの間に特異的結合複合体が十分に形成可能な条件下でインキュベートする工程と、
上記特異的結合複合体を、Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子を示すものとして検出する工程とを含んでなり、
該融合タンパク質は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まない、Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子の検出方法。
【請求項３３】
リガンドとＴ細胞レセプターとの特異的結合を阻害可能な分子の検出方法であって、
可溶性融合タンパク質を、上記リガンドの存在下でインキュベートする工程と、
一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質を含み、該一本鎖Ｔ細胞レセプターのＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間に共有結合されたマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントをさらに含んでなる可溶性融合タンパク質を、上記リガンドおよび分子の存在下でインキュベートする工程と、
上記分子の存在下および非存在下での、リガンドと可溶性融合タンパク質との相互作用を評価する工程とを含んでなり、
該可溶性融合タンパク質は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質とを含み、
該一本鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖、ならびに該Ｖ−α鎖のＣ−末端と該Ｖ−β鎖のＮ−末端との間を共有結合によって連結するペプチドリンカー配列からなり、
該可溶性融合タンパク質は、該Ｖ−β鎖のＣ−末端と該バクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端との間を共有結合によって連結するマウス由来Ｃ−β鎖フラグメントを含んでおり、
該Ｃ−β鎖フラグメントは、長さが５０個から１２６個のアミノ酸であり、かつマウスＣ−β鎖領域全長の第１２７位のシステイン残基を含まないフラグメントであり、
上記分子の存在下での上記融合タンパク質とリガンドとの相互作用が、該分子の非存在下での相互作用と比較して低下する場合、該分子がリガンドとＴ細胞レセプターとの特異的結合を阻害可能であることを示す、リガンドとＴ細胞レセプターとの特異的結合を阻害可能な分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
１．発明の分野
本発明は、バクテリオファージ外殻タンパク質と一本鎖Ｔ細胞レセプターとを含んでなる融合タンパク質、ならびに該融合タンパク質の製造および使用方法に関するものである。この融合タンパク質は、イン・ビトロにおいて結合分子のスクリーンニングに使用されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成等、様々な応用で有用である。
２．発明の背景
Ｔ細胞反応（応答）は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合する抗原により調節される。ＴＣＲの一種に、α・β鎖からなり、免疫グロブリン可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域に類似に形成される細胞膜結合ヘテロダイマーがある。ＴＣＲのα鎖は、共有結合したＶ−αとＣ−α鎖を含んでおり、β鎖はＣ−β鎖に共有結合したＶ−β鎖を含んでいる。Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（人の場合、ＨＬＡ複合体）と関連して、スーパー抗原または抗原を結合可能なポケット（嚢）またはクレフト（裂溝）を形成する。一般的な事項に関してはFundamental Immunology 3rd Ed.,W.Paul Ed.Rsen Press LTD.New York（1993）を参照されたい。
ＴＣＲは、免疫システムの発生および機能に関して重要な役割を担うと見なされている。例えば、ＴＣＲは、細胞攻撃を仲介し、Ｂ細胞の増殖を促進し、ガン、アレルギー、ウイルス感染、自己免疫疾患等の種々の疾患の発症および悪化の原因となることがすでに報告されている。従って、以前から、研究および医療現場用のＴＣＲ入手方法の開発には、多大な関心が寄せられている。
一般に、ＴＣＲを大量に単離することは容易ではなかった。例えば、大部分のＴＣＲ調製方法は、大腸菌における発現を利用しているが、大腸菌では、変則的に折り畳まれた不溶性ＴＣＲ分子の実例としての封入体が頻繁に形成される。従って、上記の方法では、可溶化およびタンパク質を再び折り畳むという厄介なステップを実施してからでないとＴＣＲは入手できず、しかも上記ステップは、ＴＣＲの生産率を著しく低下させ、ＴＣＲの安定性および機能性に悪影響を与える。
他のＴＣＲの入手法として、より可溶性が高いＴＣＲを構成する試みが専らなされている。例えば、ＴＣＲと、免疫グロブリンの不変領域、ホスファチジルイノシトール結合配列（phosphatidylinositol linkage sequences）、ＣＤ３鎖等の様々なポリペプチド配列とを融合させている。多くの場合、その目的は、ＴＣＲを細胞表面に発現させ、より多くのタンパク質を折り畳まれた状態とすることにある。その後、ＴＣＲ融合タンパク質を細胞表面から分離してＴＣＲを入手する。しかしながら、上記方法では、可溶性かつ機能性を有するＴＣＲの生成量はとても少ない。例えば、Gregoire,C.,et al.（1991）PNAS,88,8077;Matsui,K.,et al.（1991）Science 254,1788（1991）;Engel,I.,et al.（1992）Science 256,1318;Lin,A.Y.et al.,（1990）Science 249,677を参照されたい。
他の試みとして、融合Ｖ−αおよびＶ−β鎖を有する一本鎖Ｔ細胞レセプター（つまりｓｃＴＣＲ）を生成するものがある。
0004382881.tif 000002
を参照されたい。
しかながら、ｓｃＴＣＲ単離方法の多くは、変則的に折り畳まれた不溶性分子を生成すると報告されている。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１８１０５公報には、ｓｃＴＣＲを大腸菌において発現させる方法が開示されているが、開示方法では、ｓｃＴＣＲを入手するには厄介なタンパク質を再び折り畳むステップや可溶化ステップが必要であり、ｓｃＴＣＲの生産率は通常低い。上述のWard,E.S.et al.及び上述のSchlueter,C.J.を参照されたい。
ｓｃＴＣＲの精製度を高める方法が数種開発されている。該方法では、細胞表面、または細菌原形質空間において、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させている。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｓｃＴＣＲとＣ−β鎖および細胞内シグナル領域（ＷＯ９６／１８１０５参照）とを融合させることで生成される。しかしながら、生成したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、細胞表面より取りはずさなくてはならない上に、変則的に折り畳まれていることが多く、その生産率が低下する。他のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成方法では、マルトース（麦芽糖）結合タンパク質を融合させ、原形質空間で発現させることに焦点を当てている（ＷＯ９６／１３５９３参照）。しかしながら、通常、大量のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を得るためには、タンパク質を再び折り畳むという厄介なステップが必要とされる。
イン・ビトロおよびイン・ビボにおける、免疫システムに関わる分子の相互作用の研究には、以前から重大な関心が寄せられていた。該相互作用の研究方法の一つに、免疫システムに関わる分子を簡便な形態で提供することがあった。例えば、バクテリオファージ・ライブラリは、イン・ビトロにおいて結合分子をスクリーニングするための抗体およびエピトープ（抗原決定基）を呈示する目的で使用されてきた。Smith,G.P.and Scott,J.K.Methods in Enzym.217,228（1993）;Winter,G.et al.Ann.Rev.Immunol.12,433（1994）等を参照されたい。
従って、その取りはずしステップや、タンパク質を再び折り畳むステップを行うことなく、十分な機能性を有する可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を大量に生成する方法が望まれる。さらに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、結合分子の生体外（イン・ビトロ）スクリーニングが可能な形態で提供されるのが望ましい。
発明の開示
本発明は、バクテリオファージ外殻タンパク質（例えば、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質）と共有結合（つまり融合）されたｓｃＴＣＲ分子を含んでなるｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関するものである。バクテリオファージ外殻タンパク質は、予期する以上にｓｃＴＣＲ融合タンパク質の可溶性を高めるので、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生産率および機能性を著しく向上させる。このｓｃＴＣＲ融合タンパク質は十分な可溶性かつ機能性を有しており、可溶化、取りはずし、または、再び折り畳むという厄介なステップを行うことなく大量に単離される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の可溶性および機能性は、低速ホスト（宿主）細胞誘導条件の付与、ならびに融合タンパク質の発現に作用するベクター配列（リボソーム結合配列、リーダ（誘導）配列、およびプロモータ配列）を最適化することでさらに向上する。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、様々な形態で提供することが可能であり、例として、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と特異的に結合する結合分子のスクリーニングに使用されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを挙げることができる。
本発明の融合タンパク質（以降、場合によりｓｃＴＣＲ融合タンパク質または可溶性融合タンパク質と称す）は、予期する以上の可溶性を有する。つまり、ｓｃＴＣＲとバクテリオファージ外殻タンパク質とを融合させると、可溶化、取りはずし、あるいはタンパク質を再び折り畳むという厄介なステップを行うことなく可溶性融合タンパク質が生成されることが発見された。発現細胞において形成される封入体はごくわずかであるので、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成率が飛躍的に向上する。加えて、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、予期する以上の機能性を有する。つまり、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合されたバクテリオファージ外殻タンパク質の存在下で、特異的に結合分子（抗原）またはその他のリガンド（配位子）と結合する。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融通性のあるペプチドリンカー配列を介してＶ−α鎖と共有結合されたＶ−β鎖と融合される、バクテリオファージ外殻タンパク質またはそのフラグメント（断片）を含んでなる。
一般に、バクテリオファージ外殻タンパク質とは、バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質を意味する。本発明において、バクテリオファージ外殻タンパク質は、全長を有する外殻タンパク質またはその好適なフラグメント（下記参照）を含む。バクテリオファージ外殻タンパク質またはその好適なフラグメントは、バクテリオファージ内にｓｃＴＣＲを包含し、該ｓｃＴＣＲをバクテリオファージ外殻をなす融合タンパク質構成分として呈示する。具体的なバクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントおよびバクテリオファージ包含方法については、以下に詳細に記載される。
また、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、通常融合タンパク質標識を１つ以上（通常１つか２つ）有しており、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と共存する細胞成分からｓｃＴＣＲ融合タンパク質を精製する際に利用される。あるいは、さらに、該タンパク質標識を使用して、特異的な分解サイト（部位）を可溶性融合タンパク質に導入し、ｓｃＴＣＲ分子を該融合タンパク質から分解（分離）することも可能である。従って、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を使用して、融合タンパク質を含まない十分な可溶性かつ機能性を有するｓｃＴＣＲ分子を入手することが可能である。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から、重要な利益が多数得られる。例えば、従来では、ｓｃＴＣＲ融合を入手するのには長時間にわたる調製過程が必要であり、大量に生産する場合は、可溶化、およびタンパク質を再び折り畳むステップが必要な場合が多かった。一方、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、上記ステップを行うことなく容易に単離および精製できるので、融合タンパク質の可溶性、生産率、安定性および機能性が十分向上する。ここで重要なのは、融合タンパク質を使用することで、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびスーパー抗原とｓｃＴＣＲとの相互作用がより容易に分析可能となることである。加えて、以下に詳細に記載するが、スーパー抗原やＡＰＣとの相互作用に関し、広範な種類の融合タンパク質が提供可能となった。
本発明の融合タンパク質は、十分な可溶性かつ機能性を有するｓｃＴＣＲを含む。従って、該融合タンパク質は、融合タンパク質と所望のリガンドとの相互作用テストに使用可能な種々の発現システムと組み合わせて使用できる。
このｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、種々の利用法において有用である。例えば、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片（フラグメント）は、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成に使用可能である。ｓｃＴＣＲフラグメントを発現するライブラリとは対照的に、本バクテリオファージ・ライブラリは、全長を有するｓｃＴＣＲを融合タンパク質として発現する。よって、本バクテリオファージ・ライブラリを使用すれば、ｓｃＴＣＲ、特にｓｃＴＣＲ抗原結合ポケットの分析が促進される。従って、本バクテリオファージ・ライブラリは、抗原、抗体、小分子、スーパー抗原、ＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体等、種々の結合分子を使用してのスクリーニングにおいて有用である。ここで重要なのは、本バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖を伴った融合タンパク質を発現するので、生体内で発見されるＴＣＲにより類似した融合タンパク質が生成されることである。
加えて、本バクテリオファージ・ライブラリは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と結合分子との特異的結合複合体を最大量形成するため、逆に、殆ど結合していない、または結合力の弱い結合分子の検出がより増強される。本バクテリオファージ・ライブラリは、生体パニング技術（biopanning technique）、例えば、細胞パニングや免疫パニング技術、への応用が容易である。
バクテリオファージ・ライブラリの構成および使用
本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、種々の結合分子のスクリーニングに使用されるキット中に備えられる。つまり、キットには、Ｔ細胞等の対象とされる細胞から生成された１つ以上のバクテリオファージ・ライブラリと、適切な宿主細胞株（例えば、大腸菌株）と、キット使用説明書とが含まれる。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、十分な可溶性と機能性を有するポリペプチドとして発現する。バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの構成として使用する場合、ｓｃＴＣＲを、遺伝子IIIタンパク質、もしくは遺伝子VIIIタンパク質、またはそれらの適切なフラグメントに融合させ、ｓｃＴＣＲをバクテリオファージ外殻（カプシド）成分として発現させる。何れの形態でも、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を適切な結合分子に接触させて、特異的結合複合体を形成する。該結合分子は、以下に記載の標準的な方法により検出可能、また（所望する場合）精製可能でもある。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構成する目的で使用されるｓｃＴＣＲは、様々なソースから生成される。該ソースには、以下に記載の市販のＴＣＲ  ＤＮＡ配列、または哺乳類、とくに人等の霊長類から採取される免疫細胞等の生物的ソースが含まれる。
本バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物を呈示するように構成しても良い。通常、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物とは、ｓｃＴＣＲ突然変異物に共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク質、またはその適切適当なフラグメントを含んでなる。該ｓｃＴＣ突然変異物は、所望する結合分子に対する特異的結合親和性を高めるため、本発明に従って選択可能である。ｓｃＴＣＲ突然変異物およびｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物の生成方法は、以下に詳細に記載する。
また、本発明は、ｓｃＴＣＲに共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク質またはその適切なフラグメントを含む可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質、をエンコードする配列からなるＤＮＡセグメントに関連する。通常、該ＤＮＡセグメントは、適切な宿主細胞中で融合タンパク質を発現可能なＤＮＡベクターとして提供される。該ＤＮＡセグメントは、機能可能に連結されたプロモータおよびリーダ配列を含み、以下に記載の宿主細胞培養条件下でより多くの可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させる。
さらに、本発明の可溶性融合タンパク質を単離する方法が試みられている。該方法においては、可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターを適切な宿主細胞に導入し（形質転換またはトランスフェクション）、低速誘導条件下で宿主細胞を培地中で培養する。通常、低速誘導条件とは、培地から必須栄養素（アミノ酸やリン酸塩等）が数時間かけて緩やかに取り出され、融合タンパク質をエンコードする配列の発現が誘導される細胞培養条件のことを指す。通常、低速誘導条件で誘導可能なＤＮＡベクターが選択される。そして、生成された融合タンパク質は、（所望する場合）精製され、実質的に純粋なｓｃＴＣＲ融合タンパク質が生成される。以下に詳細に記載するが、低速誘導条件は、可溶性と十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生産を向上させる。あるいは、上記方法を、一本鎖Ｔ細胞レセプターをエンコードするＤＮＡベクターを含む場合に適用し、可溶性の一本鎖Ｔ細胞レセプターを発現させ、（所望する場合）それを精製することも可能である。宿主細胞とは、細菌、昆虫、あるいは哺乳類の細胞である。
本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に、１つ以上の適切なタンパク質標識（例えば、６ＸＨｉｓ）を付与し、融合タンパク質の細胞からの精製を容易とすることが望ましい場合がある。通常、細胞培地あるいは細胞抽出物を、タンパク質標識を結合した合成マトリックスに接触させる。あるいは、または、さらに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に、ｓｃＴＣＲを該融合タンパク質より分離する目的で使用可能な１つ以上の分解性タンパク質標識を付与し、これにより可溶性かつ十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ分子を生成しても良い。
本発明には、本発明の可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡセグメントの単離方法も含まれる。通常、該方法では、本発明により生成されたバクテリオファージ・ライブラリを宿主細胞に感染させ、細胞内でバクテリオファージが増殖可能な条件下（例えば、低速誘導条件）で、該細胞を培養する。次に、結合分子と少なくとも１つのバクテリオファージとが結合可能な条件下で、感染細胞を所望の結合分子、望ましくは検知可能な標識が付された結合分子に接触させる。バクテリオファージ・ライブラリのスクリーニング方法は当該技術分野では公知であり、例えば、以下に記載のSambrook et al.に説明されている。結果として形成される特異的結合複合体は認識され、続いて、それを有するバクテリオファージが単離され、さらに、（所望する場合）精製される。このようにして、該複合体に含まれるｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが単離される。
タンパク質、ポリペプチド、および核酸等の結合分子に、検出可能な標識を付す方法は当該技術分野では公知であり、例えば下記のSmbrook et al.やAusubel et al.に説明されている。
さらに、所望のｓｃＴＣＲの特異的結合親和性の向上方法も提供される。通常、該方法では、ｓｃＴＣＲと所望の結合分子（例えば、抗原やその他のリガンド）との間の特異的結合親和性が決定され、続いて、適切な宿主細胞を融合タンパク質突然変異物を発現するバクテリオファージ・ライブラリにより感染させる。次に、感染細胞を、所望の結合分子、望ましくは検知可能な標識を付した結合分子に接触させて特異的結合複合体を形成した後、該特異的結合複合体が認識される。次に、対応する融合タンパク質突然変異物をエンコードするＤＮＡセグメントが、標準的な手段で単離される。所望する場合、ＤＮＡセグメントを、適切なＤＮＡベクターにサブクローン化し、宿主細胞内で増殖させても良い。上記方法により生成されたｓｃＴＣＲ突然変異物は、（所望する場合）適当なタンパク質標識を分解して融合タンパク質から分離される。次に、抗原とｓｃＴＣＲ突然変異物との間の特異的結合親和性が決定される。向上された特異的結合親和性を示すｓｃＴＣＲは、ｓｃＴＣＲタンパク質よりも大きな特異的結合親和性を有するｓｃＴＣＲ突然変異物として、容易に識別される。
哺乳類における不所望な免疫反応は、１つの方法、または、該方法に代わる他の方法を組み合わせることで本発明により抑制または排除できる。通常、本発明は、薬学上可能な処方で有効量のｓｃＴＣＲを供給することにより、哺乳類における免疫反応（応答）を抑制または排除する治療法を提供する。通常、ｓｃＴＣＲは、特に、ウイルス感染、自己免疫疾患、移植拒絶、またはガン等に伴う病原性Ｔ細胞において発生するＴＣＲのうちの１つ以上のＴＣＲと、抗原をめぐり競合しうるものである。特に、対応ＴＣＲと比較して、抗原に対する特異的結合親和性が大きな（例えば２〜１０倍）ｓｃＴＣＲを使用して、所望の免疫反応を抑制または排除することが可能である。タンパク質競合分析法は、当該技術分野では公知であり、ｓｃＴＣＲの競合活性のスクリーニングに使用される。
加えて、本発明は、ｓｃＴＣＲまたはｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製サンプルを使用した、標準的免疫技術による（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体の生成方法を含む。通常、ｓｃＴＣＲは本発明の可溶性融合タンパク質より入手されるので、ｓｃＴＣＲの生産率が従来と比較して向上する。抗体は、１つ以上のｓｃＴＣＲのエピトープを含んでなる免疫原性ペプチドからも生成可能である。上記のような抗体、特にモノクローナル抗体は、血液または血清などの生体サンプル中の病原性Ｔ細胞の検出など、様々な応用で有用である。また、該抗体を使用して特に標的Ｔ細胞と抗原またはＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体との相互作用を抑えることにより、イン・ビボまたはイン・ビトロにおける標的Ｔ細胞の活性を大幅に抑制、または、阻害しても良い。公知のように、適当な細胞障害性物質または代謝拮抗物質を、該抗体に共有結合させておくことが望ましい場合もある。
さらに、本発明は、有効量のｓｃＴＣＲ（本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から分離されたもの）を投与して、哺乳類、とくに人等の霊長類の免疫反応を誘導する方法にも関連する。ｓｃＴＣＲの単離は、本発明にかかる可溶性かつ十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質からｓｃＴＣＲを入手することで行われる。該ｓｃＴＣＲは、Ｔ細胞（つまり、標的Ｔ細胞）の表面に発生し、免疫反応において病原性、または、不所望な機能を果たすＴＣＲ抗原性構造に対する免疫を、哺乳類に付与する目的で使用される。上記Ｔ細胞は生体サンプル中で、従来公知の種々の方法により認識される。次に、該Ｔ細胞は精製され、以下に記載の実施例に従い、イン・ビトロにおいて増殖反応が可能か否かが分析される。増殖反応を示すＴ細胞は培養細胞系として確立され、該培養細胞系から、本発明で開示の方法により、ＴＣＲをエンコードするＤＮＡが単離され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物などの、対応するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成に使用される。対象となるＴＣＲ抗原構造とは、通常、クロノトピックエピトープ（clonotypic epitope）、Ｖ−αまたはＶ−βファミリー特異的エピトープ（Ｖ−α or Ｖ−β family-specific epitope）、配座エピトープ（conformational epitope）、直線エピトープ等を指す。Ｔ細胞の表面に発生するＴＣＲ抗原構造に対する免疫が付与されると、Ｔ細胞の活動が阻止され、該Ｔ細胞の病原性または不所望な作用が抑制または排除される。通常、哺乳類は、有効量のｓｃＴＣＲ（本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から分離されたもの）を薬学上可能な処方により投与されることで該免疫を取得し、これにより宿主免疫システムが標的Ｔ細胞を著しく減少させる、または、排除する。
さらに、ＴＣＲと特異的に結合可能な結合分子（例えば、抗原）の検出方法も試みられている。通常、該方法はイン・ビトロ  スクリーニングにより行われ、本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、上記分子がライブラリ中の少なくとも１つのバクテリオファージと特異的に結合する条件下で、該分子共の存下でインキュベートされる。バクテリオファージにより呈示されるｓｃＴＣＲ融合タンパク質と、結合分子との間で形成された特異的結合複合体は、容易に検出される。通常、該特異的結合複合体の存在は、バクテリオファージによりエンコードされたｓｃＴＣＲに対応する、ＴＣＲと特異的に結合可能な結合分子の存在を示唆する。選択されたバクテリオファージは、本発明で開示する方法により容易に増殖され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが単離される。
さらに、本発明は、抗原とＴＣＲとの間の特異的な結合を阻害可能な結合分子の検出方法に関連する。該方法は、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、抗原と該融合タンパク質とが特異的結合複合体を形成可能な条件下で、結合分子と共にインキュベートするイン・ビトロ  スクリーニングを含むものである。他の反応において、該融合タンパク質は、同一または類似のインキュベート条件下で、抗原と結合分子と共にインキュベートされる。以降、リガンドの存在下および非存在下での抗原と融合タンパク質との相互作用が、標準的な結合分析法により分析される。抗原とＴＣＲとの間の特異的な結合を阻害可能なリガンドとは、該リガンドの存在下で、融合タンパク質と抗原との相互作用がより低頻度で観測されるものを指す。
【図面の簡単な説明】
図１ＡはｐＪＲＳ１４９ベクターを、図１ＢはｐＫＣ１２ベクターを示す図である。
図２は、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクター形成のアウトラインを説明するフローチャートである。
図３は、ｐＫＣ４４、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１  ＤＮＡベクターの一部を示す図である。
図４は、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）、およびｐＫＣ５１  ＤＮＡベクター形成のアウトラインを説明するフローチャートである。
図５は、ＰＥＮ２  ＤＮＡベクターを示す図である。
図６Ａは、ｐＫＣ６１、ｐＫＣ６３、およびｐＫＣ６５  ＤＮＡベクターの一部を示す図であり、図６Ｂは、ｐＫＣ６０、ｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）、ｐＫＣ６４、ｐＫＣ６６、およびｐＫＣ６７  ＤＮＡベクターの一部を示す図である。
図７は、ｐＫＣ６０、および、ｐＫＣ４６  ＤＮＡベクターそれぞれからの融合タンパク質の合成を比較するウエスタン・ブロットである。
図８は、ＭＭ２９４、Ｋ９１Ｋａｎ、ＸＬ１−Ｂ、ＴＢ−１、およびＵＴ−５６００細胞系における、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現を示すウエスタン・ブロットである。
図９は、バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質を含んでなるｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫親和精製のアウトラインを示す図である。
図１０は、ＤＮＡベクターｐＫＣ５１およびｐＫＣ４６、ならびにその精製フラクション（画分）由来の融合タンパク質の発現を示すウエスタン・ブロットである。
図１１は、ｐＫＣ５１ベクター由来の精製ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を示すクーマシーブルー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ゲルである。
図１２は、ｐＫＣ５１ベクター由来の精製ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のウエスタン・ブロットである。
図１３は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６２による免疫沈降（immunoprecipitation）実験を示すウエスタン・ブロットである。
図１４は、ｐＫＣ５１がエンコードする融合タンパク質の表面プラズマ共鳴分析を示すグラフである。
図１５は、表面プラズマ共鳴分析による、抗−ＴＣＲ（Ｖ−β  ８．２）抗体（ＭＲ５−２）、抗−αβＴＣＲ抗体（Ｈ５７−５９７抗体）、および抗−Ｍ１３抗体間の相互作用を示す模式図である。
図１６は、ｐＫＣ６０がエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質と、ＳＥＣ３スーパー抗原との間の結合の、表面プラズマ共鳴分析を示すグラフである。
図１７は、抗−ＨＳ７抗体を用いたエライザ法による、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現するバクテリオファージの捕獲を比較するグラフである。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｐｃＫ４６ベクターから発現したものである。
図１８は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現する、ｐＫＣ５１ベクターを用いて構成されたバクテリオファージの、エライザ法による滴定分析を示すグラフである。
図１９Ａは、ｐＫＣ５１ベクターがエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質による、ｇＤ１２ハイブリドーマ細胞のＩＬ−２産生阻害を示す図であり、図１９Ｂは、ｐＫＣ５１ベクターがエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質による、Ｄ０１１．１０Ｔハイブリドーマ細胞のＩＬ−２産生阻害を示す図である。
図２０は、ｐＫＣ７０、ｐＫＣ７１、およびｐＫＣ７２バクテリオファージベクターを示す図である。
図２１Ａ〜２１Ｇは、以下に記載のＤＡＮベクターの構築に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマーを示す表である。図２１Ａには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１−１６）、図２１Ｂには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１７−３０）、図２１Ｃには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：３１−４５）、図２１Ｄには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：４６−６３）、図２１Ｅには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：６４−７９）、図２１Ｆには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：８０−９５）、図２１Ｇには（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：９７−１００）を示す。
図２２は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−β鎖の構築に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１１６−１３１）を示す表である。
図２３は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖の構築に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１０１−１１５）を示す表である。
発明の詳細な記述
ここまでの記述でまとめたように、我々は、ｓｃＴＣＲ分子に共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその好適なフラグメントを含んでなる、十分に可溶でかつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質を得た。該ｓｃＴＣＲは、一本鎖ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖に共有結合したＶ−α鎖を含む。該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードしているＤＮＡのセグメントとベクターとは、イン・ビトロにおいて結合分子を検出するのに好適な形でｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示するバクテリオファージ・ライブラリを構築するのに役に立つ。
一般に、本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ここに開示する過程と、一般に知られた組換えＤＮＡ技術とを用いて調製することができる。従来の技術には、例えば、プラズマＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切り出し、ＤＮＡのライゲーション、宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、あるいはバイオリスティック転換、宿主細胞の培養、発現させたＤＮＡの単離と精製などがあげられる。一般的な説明については、Sambrook et al.in Molecular Cloning:A Laboratory Manual（2nd ed.1989）;及びAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1989を参照されたい。なお、これらの文献は参考文献としてここに記されるものである。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、あるｓｃＴＣＲに融合したバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその適当なフラグメントを含んだ一本鎖融合タンパク質である。通常、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントは、大腸菌の繊維状ファージ由来の遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質である。該ｓｃＴＣＲは、好適なペプチドリンカーによりＶ−β鎖に融合されたＶ−α鎖を含んでなる。したがって、該ｓｃＴＣＲはＴ細胞に関連したＴＣＲ由来のＶ−α鎖及びＶ−β鎖に相当する。Ｔ細胞は自然の状態でも存在するし、あるいは癌に付随して起こる免疫機構疾患、自己免疫機構障害、アレルギー、あるいはウイルス感染などの病気と関連しても見つかる。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖及びＶ−β鎖は、長さがおよそ２００個から４００個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ３００個から３５０個のアミノ酸に相当し、また、ＴＣＲのＶ−α鎖及びＶ−β鎖に少なくとも９０％、好ましくは１００％相同なものである。ここで、”相同である”とは、該Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖をなすアミノ酸が、対応するＴＣＲのＶ−α鎖及びＶ−β鎖と１００％同一であることを意味する。本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質と結合分子との間の特異的な結合は、免疫吸着や免疫滴下などの方法で評価することができる。
先に述べたように、該ｓｃＴＣＲは大腸菌の繊維状ファージ由来のバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントと融合させることができる。繊維状ファージの典型的な例は、上記のSambrook et al.とSmith and Scottとが開示している。ここで”フラグメント”とは、バクテリオファージにパッケージングする（包含される）ことができ、かつバクテリオファージの表面に本発明に係る可溶性融合タンパク質を呈示できるバクテリオファージ外殻タンパク質の一部を意味している。一般に、バクテリオファージ遺伝子VIIIフラグメントは、長さが４０個から５０個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ５０個のアミノ酸に相当する。バクテリオファージ遺伝子IIIフラグメントは、長さがおよそ２００個から４００個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ４００個のアミノ酸に相当する。バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントが好適にバクテリオファージにパッケージされているかどうかを決定する方法は公知であり、一般に血小板型分析に関する方法で行われる。さらに、バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントは、下記の生体パニング分析などの標準的な免疫学的方法で決定したものにしたがってｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージの表面に呈示することができる。バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントは、ここで記述するように、バクテリオファージ外殻タンパク質をエンコードするＤＮＡの一部が除去されるようにＤＮＡベクターを突然変異（つまり、サイト標的突然変異誘導あるいは端末の欠失）させる、等の様々な方法で作ることができる。そして、該ＤＮＡベクターは、フラグメントをエンコードするＤＮＡを、ｓｃＴＣＲをエンコードする所望のＤＮＡのセグメントに融合させる目的で使用される。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに融合する好適なペプチドリンカーを介してＶ−β鎖に共有結合している。Ｖ−β鎖は、Ｖ−β鎖のＣ末端に融合したＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでいても良く、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端とに融合したＣ−αフラグメントをさらに含んでいても良い。一般に、Ｃ−β鎖フラグメントは、長さがおよそ５０個から１２６個のアミノ酸に相当する。重要なことは、該Ｃ−β鎖フラグメントが、第１２７位（最後）のシステイン残基を含まないことである。Ｃ−α鎖フラグメントは、長さがおよそ１個から２１個のアミノ酸に相当し、おおよそＣ−α鎖の第１位のアミノ酸（イソロイシン）から第２１位のアミノ酸に相当する。該Ｃ−α鎖フラグメントはシステイン残基を一切含まない。バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントは、Ｖ−β鎖あるいはＣ−βフラグメントのＣ末端と融合される。また、これとは異なり、タンパク質標識をＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端と、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合させても良い。また、該タンパク質標識をＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端と、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合させ、第２のタンパク質標識（同じでも良いし、異なっていても良い）をバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＣ末端に融合させても良い。これとはさらに異なり、該タンパク質標識をバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＣ末端に融合させ、このバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントをＮ末端においてさらにＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端に融合させても良い。
さらに手が加えられたｓｃＴＣＲ融合タンパク質としては、Ｖ−α鎖のＮ末端に融合されたタンパク質標識を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質が挙げられる。また、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントをＶ−α鎖（あるいはＣ−αフラグメント）のＣ末端に融合させ、この鎖をＶ−α鎖のＮ末端に融合したペプチドリンカーによってＶ−β（あるいはＣ−βフラグメント）のＣ末端と共有結合的にリンクさせても良い。
本発明に係る別のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列を２つ含んでおり、第１のペプチドリンカー配列はＶ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに融合している。Ｖ−β鎖のＣ末端は、適当なＣ−β鎖フラグメントのＮ末端に融合している。さらに、第２のペプチドリンカー配列は、Ｃ−β鎖フラグメントのＣ末端とバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合している。
融合タンパク質に含まれるｓｃＴＣＲ分子は、ペプチドリンカー配列を含んでなり、該ペプチドリンカー配列はＶ−α鎖とＶ−β鎖を効果的に配置する目的で柔軟な使い方ができる。つまり、ペプチドリンカー配列によりＶ−α鎖とＶ−β鎖とは、抗原などの分子を特異的に結合可能なポケットに配置される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に結合する抗原は、下記の分析で決定したＴ細胞の活性を調節する目的で使用できる。こういった分析の典型的な例として、ＴＣＲを発現するＴ細胞を培養して増殖させ、Ｔ細胞をｓｃＴＣＲ融合タンパク質（あるいはそこから得られたｓｃＴＣＲ）と接触させ、次に該融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節できるかどうか評価する一連のステップを含んだイン・ビトロ分析が挙げられる。
以上で述べたｓｃＴＣＲ融合タンパク質のいずれにおいても、Ｖ−β鎖は、Ｖ−β鎖のＣ末端とＶ−α鎖のＮ末端とに融合する好適なペプチドリンカーを介してＶ−α鎖に共有結合している。
所望のＶ−α鎖とＶ−β鎖とをエンコードするＤＮＡセグメントは、Ｔ細胞ハイブリドーマや、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などのＴ細胞を初めとする様々なものから得ることができる。ＣＴＬは自然の状態でも存在するし、また、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ）あるいは霊長類（人、チンパンジー）の病原免疫機構反応と関連しても存在する。例えば、ＣＴＬはウイルス感染、癌、自己免疫疾患、アレルギー、あるいは移植拒絶反応を起こしている患者、あるいはその疑いのある患者から採取することができる。さらに具体的には、ＣＴＬを、ＤＮＡあるいはＲＮＡウイルスに罹患した患者から単離して、本発明の方法にしたがってｓｃＴＣＲ融合タンパク質を作り出すことができる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、長期非進行と類別されたＨＩＶ患者から得られるＣＴＬを使って調製できる。下記の実施例１８を参照されたい。ＣＴＬは、これ以外に、定着（established）悪性腫瘍や黒色腫の患者から単離される、抗原特異的なＣＴＬやＴＩＬからも得られる（例えば、Cox A.et al.Science（1994）264:716;Rosenberg,S.A.et al.N.Eng.J.Med.（1988）319:1676;Kawakami,Y.et al.J.Exp.Med.（1994）180:347;Kawkami,Y.et al.PNAS（1994）91:6458を参照）。特に注目される病原免疫反応としては、硬化症、インシュリン依存糖尿病、リュウマチ性の関節炎、アレルギー、癌（つまり、ＣＥＡなど、腫瘍に関連する抗原に対する免疫反応）、組織や皮膚などの移植手術を行った患者の細胞組織拒絶反応、感染性の疾患、特にＲＮＡウイルスあるいはＤＮＡウイルスが関与する感染性の疾患などが挙げられる。具体的に注目されるウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ポックスウイルス、エプステインバー（Epstein Barr）、アデノウイルス、ポリオーマウイルスなどが挙げられる。また、該Ｖ−α鎖とＶ−β鎖とをエンコードするＤＮＡのセグメントは、以下に記すＴＣＲのＤＮＡ配列を開示する公共のデータベースからも入手可能である。
細胞からＶ−α鎖とＶ−β鎖とを得ることに関し、そのＤＮＡセグメントを調製するにはいくつかの方法がある。具体的には、α鎖ＤＮＡとβ鎖ＤＮＡとを調製するために、所望のＴＣＲ結合特異性を示す細胞よりｍＲＮＡを分離する。この方法では、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、つまりｍＲＮＡから作った第１ストランドｃＤＮＡ鋳型を用いるプロトコールが使用される。そして、標準的な組換え技術を使って該所望のＶ−α鎖とＶ−β鎖を作る。上記所望のα鎖とβ鎖とをエンコードするＤＮＡセグメントを、次に、適当なペプチドリンカー配列とタンパク質標識とを含むように調製する。次に、必要に応じて、ＤＮＡを適当なパッケージングシステムにパッケージし、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示する組換えバクテリオファージを生成する。該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントは、サブクローニング技術、あるいは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の挿入片の側方に付されたバクテリオファージＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅法など、従来の組換え技術でバクテリオファージから容易に分離できる。一般に、オリゴヌクレオチドは、その長さがおよそ１２個から５０個のヌクレオチドよりなり、より好ましくは、およそ２０個から２５個のヌクレオチドよりなる。このようにして得られた、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡを使えば、大腸菌などの好適な宿主細胞内で相当量の可溶性融合タンパク質（１ｇの細胞に対してミリグラム単位の量）が調製できる。
ＤＮＡセグメントは通常リーダー配列を含み、適切な細胞プロセシングを行うことができる。一般に、リーダー配列はｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列の５’末端に融合している。具体的には、該リーダーはＶ−α鎖を（実施の形態によってはＶ−β鎖を）エンコードするＤＮＡ配列の５’末端に共有結合している。ただし、特異的なリーダー配列はベクター中の特定のα鎖あるいはβ鎖にリンクしているのであるが、組換え技術を使って融合タンパク質のプロセシングに悪影響を及ぼすことなくリーダー配列を入れ替えることができることが理解されよう。したがって、好適な実施例のうちの一つでは、Ｖ−α鎖の５’末端がリーダー配列の３’末端に共有結合している。リーダー配列は、長さがおよそ１２個から２６個のアミノ酸残基よりなる。好適なリーダー配列は、下記の実施例３で開示する改変Ｐｅｌ  Ｂ配列である。
ＤＮＡセグメントは通常、ｔｒｐオペロンプロモーター、ラックプロモーター、ｔｒｐ−ラックプロモーター、ラックuvsプロモーターあるいはｐｈｏＡプロモーターなどのプロモーターをさらに含んでなる。好適なプロモーターは、例えばｐｈｏＡなどの、数時間（例えば２時間から１０時間）にわたる低速誘導条件下において、強力かつ調節的な発現に寄与するものである。好適な培養条件下では、強力なプロモーターのほとんどが、宿主細胞のタンパク質総量の１０％程度、あるいはそれを超える融合タンパク質を生成しうる。
本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、数ステップで容易に作ることができる。例えば、ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡセグメントは、上で概説した方法で作ることができる。次にＤＮＡを好適なファージあるいはファージ由来のベクター（例えばファージミド）にライゲーションし、該ＤＮＡを、バクテリオファージ外殻タンパク質、通常は、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質をエンコードする配列に融合させる。これ以外に、バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントに融合させても良い。このようにして生成された組換えファージ、あるいはファージ由来の組換えベクターは、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントに融合したｓｃＴＣＲを含んでいる。場合によっては、上記のように単数あるいは複数のタンパク質標識をエンコードする配列、あるいは停止コドンをさらに含んでいることが望ましい。続いて、好適な大腸菌系統に感染させると、バクテリオファージの表面に該融合タンパク質が多数部（通常は数十部から数百部）呈示される。注目しているｓｃＴＣＲを呈示する組換えビリオンの生成量を増やすためには、ヘルパーファージを加える。異なるバクテリオファージと大腸菌系統とを用いてバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを構築する一般的な方法は開示されている。一般の記述については、上記のSmith and ScottやParmley,S.F.,and Smith,G.P..（1988）Gene 73,305を参照されたい。
バクテリオファージ・ライブラリを作成するに使用される特定のｓｃＴＣＲとしては、哺乳類から得られるＶ−α鎖及び／またはＶ−β鎖を有するｓｃＴＣＲが挙げられる。哺乳類の典型例としては霊長類やげっ歯類が挙げられるが、霊長類中では特に人とチンパンジーが挙げられ、げっ歯類としては、免疫的に虚弱な、ヌードマウス、あるいはＨＬＡ−ＡＳ抗原複合体を発現可能なトランスジーンを含んだマウスが挙げられる（Vitiello,A.et al.,J.Exp.Med.,（1991）175,1002）。人の中で特に注目すべきは癌、感染症、自己免疫疾患、あるいは移植拒絶反応を起こしている、あるいはその疑いのある患者である。
本発明に係るバクテリオファージ・ライブラリは、融合タンパク質突然変異物を呈示するようにも構築できる。この”突然変異物”とは、突然変異したアミノ酸を１分子当たり平均１つ含んだ融合タンパク質を指す。さらに具体的には、アミノ酸の突然変異とは、融合タンパク質のｓｃＴＣＲ部分においてアミノ酸が置換されたものを指し、これによりｓｃＴＣＲ突然変異物が生成される。一般に、ｓｃＴＣＲ突然変異物は、平均して１つのアミノ酸置換を含むように構築される。突然変異物の生成及び分析方法については以下に詳しく記す。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物を呈示するバクテリオファージ・ライブラリは数ステップで容易に生成できる。例えば、上記のようにペプチドリンカー配列によって結合された、好適なＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡセグメントとＶ−β鎖をエンコードするＤＮＡセグメントとを単離することで、所望のｓｃＴＣＲが得られる。該ＤＮＡをライゲーションし、次に、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖およびＶ−β鎖における所望の領域内に、例えば、局所的に突然変異を導入することで該ＤＮＡを改変する。突然変異の誘導方法の典型例としては、アラニン走査突然変異誘導（alanine scanning mutagenesis）が挙げられる（例えば、Nisbet,I.T.et al.（1985）Gene Anal.Tech.2,23;Hines,J.C.,Gene（1980）11,207;及び上記のSambrook et al.を参照）。上記突然変異は、ｓｃＴＣＲの相補性決定領域（すなわちＣＤＲ、あるいは高頻度可変領域とも呼ばれる）が有する結合親和性に影響を及ぼすアミノ酸置換であれば、ここでは好適である。更に具体的には、該アミノ酸置換とは同類置換あるいは非同類置換であり、ここで使用するように、あるアミノ酸とｓｃＴＣＲ中のアミノ酸とを置き換えることを意味している。場合によっては、この置換には、あるアミノ酸を、化学的性質が相当類似した他のアミノ酸で置き換える（同類置換）ことが含まれるし、また、場合によっては、あるアミノ酸を、化学的性質が相当異なる他のアミノ酸で置き換える（非同類置換）ことが含まれる。したがって、フェニルアラニン残基でｓｃＴＣＲ中のチロシン残基の置換が行われると、これは同類アミノ酸置換であり、プロリン残基でアラニン残基の置換が行われると、これは非同類アミノ酸置換である。当業者であれば、突然変異誘導によって、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖とＶ−β鎖とを分かつペプチドリンカー配列のアミノ酸構成の長さも変化する可能性があると解するであろう。しかしながら、大抵の場合、突然変異誘導はＶ−α鎖とＶ−β鎖とに焦点を絞っており、融合タンパク質のＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖内で平均１つのアミノ酸突然変異置換を引き起こすものである。突然変異誘導の程度は、突然変異を起こしたＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖のＤＮＡ配列の解析を行うことで容易に分析できる。
上記方法ほど好適ではないが、本発明に係るバクテリオファージ・ライブラリを、アミノ酸置換基の導入作用が知られる化学的突然変異原（例えばＥＭＳ）に曝しても良い。これにより、バクテリオファージの表面に呈示されるｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合タンパク質突然変異物を含むこととなる。このような方法を取る場合、化学的突然変異原の使用量（あるいは、該突然変異原への暴露の程度）は、Ｖ−α鎖あるいはＶ−β鎖毎に平均１つのアミノ酸置換をおこす程度に調整することが好ましい。上記のような、融合タンパク質突然変異物（ｓｃＴＣＲ突然変異物も含む）を発現するバクテリオファージ・ライブラリは、所望の抗原に対する特異的な結合親和性が強化された融合タンパク質を検出する際に特に有用である。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、通常、ある一つのＴＣＲに対応したある一つのｓｃＴＣＲを含んでなる。一般に、ＴＣＲを発現するＴ細胞は、自然条件下で、あるいは、イン・ビボにおいては病理学的条件下（例えばＴS、ＴC、あるいはＴH細胞）で存在する。あるいは、Ｔ細胞ハイブリドーマとして培養することもできる（例えば、Ｄ１０あるいはＢ１２細胞系）。下記の実施例１を参照されたい。上記のように、Ｔ細胞は、癌、感染症、自己免疫不全、あるいはアレルギーを発症している、またはその疑いのある患者から分離したＣＴＬを含んでいる。このＴ細胞は、ＴＣＲ配列（すなわちＶ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、及びＣ−β鎖配列）をエンコードするＤＮＡを生成するが、こういったＤＮＡは本発明中で開示する方法で得られる。該ＤＮＡを得るには、これ以外にも、従来の方法で、公的に入手可能なＤＮＡ配列に相応のオリゴヌクレオチドプライマーを形成し、そのＤＮＡをＰＣＲ増幅しても良い。例えば、Kabat,E.A.,et al.（1987）Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed.Public Health Service,N.I.H.Washington,D.C.and Chotia,C.et al.（1988）EMBO J.7:3745を参照されたい。
より具体的には、所望されるＶ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列をエンコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法やその他好適なＤＮＡクローニング方法により増幅することができる。ＰＣＲ法を選択した場合には、オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する既定のＴＣＲ  ＤＮＡ（Ｖ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列）を増幅すべく、ＰＣＲ用ＤＮＡオリゴヌクレオチドが選択される。ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドは、通常、長さがおよそ１２個から５０個のヌクレオチドに相当し、好ましくは、およそ２０個のヌクレオチドに相当する。該プライマーは、所望のＴ細胞から分離されたゲノムＤＮＡ、あるいは、Ｖ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列をエンコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡベクター内のＤＮＡを増幅する目的で使用される。ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物に、必要に応じてライゲーション部位を導入するための特異的な制限酵素切断部位を付加する制限部位を含んでいれば好適である。プライマーの典型的な例は、以下の実施例と図面とに記す。生成したＰＣＲ生成物は増幅されたＶ−α鎖配列とＶ−β鎖配列とを含んでなり、さらに、融合タンパク質を最適に発現できるよう、以下に記すようにリボソーム結合配列と、リーダー配列と、プロモーター配列とを含むよう調節しても良い。好適な、プライマー、ＰＣＲ条件、及び発現ベクターは以下の実施例と図面とに開示する。
上記ペプチドリンカー配列により、融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖とは、抗原結合ポケットの形成が効果的に行われるように配置される。こうすることにより可溶性融合タンパク質は、抗原（例えば、スーパー抗原、あるいはＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体中の抗原）と特異的に結合することができる。重要なのは、これによって、融合タンパク質が、自然にあるいは病理学的に存在するＴ細胞の表面に位置するＴＣＲと競合することができる点にある。”競合する”とは、対応するＴＣＲの特異的結合親和性に等しいか、好適にはそれを超えたレベルで該融合タンパク質が抗原と結合できることを意味する。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質（あるいはそこから派生したｓｃＴＣＲ分子）は、対応するＴＣＲに比べておよそ２倍から１０倍高い結合親和性を示す。結合親和性を決定する方法は公知であり、ここで開示する。”対応する”とは、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖及び／或いはＶ−β鎖を作るためにＴＣＲ（あるいはそれをエンコードするＤＮＡ）を使用することを意味する。
本発明の好適な実施例では、ポリペプチドリンカー配列はおよそ７個から２０個のアミノ酸からなり、好適にはおよそ１０から２０個のアミノ酸からなり、さらに好適にはおよそ１２から２０個のアミノ酸からなっている。リンカー配列は、抗原を最適に結合できるかたちにＶ−α鎖とＶ−β鎖とを配置すべく該融合タンパク質中に設けられるが、この配置には通常、融通性が持たされる。リンカーは好ましくは、その大部分がグリシン、アラニン、セリンなどの小さな側鎖を持ったアミノ酸からなっていて、これが上記融通性を与えている。好ましくは、およそ８０％から９０％、あるいはそれ以上のリンカー配列が、グリシン残基、アラニン残基、あるいはセリン残基からなり、中でも特にグリシン残基とセリン残基とからなっている。リンカー配列に、融通性を阻害するプロリン残基が一切含まれないことが好適である。リンカー配列は、好適には融合タンパク質のＶ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに連結されている。実施例１、実施例２、及び図３、図６Ａ、図６Ｂ、及び図２０を参照されたい。
（ＧＧＧＧＳ）4配列（すなわち、Gly Gly Gly Gly Sel）4を含んだ好適なリンカー配列には、ＪＡ３０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）とＪＡ３０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）とがある。リンカー配列は、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖のＣ末端残基と同Ｖ−β鎖の第１アミノ酸との間にリンクしていることが好ましい。抗体可変領域を好適に組合わせることによる融通性にすぐれたリンカー設計を含めた、異なるリンカー配列が使用できる（M.Whitlow et al.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology,2:97-105（1991）を参照）。このような好適なリンカー配列は実験的に簡単に識別できる。例えば、リンカー配列を含んだ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントを含んでなるＤＮＡベクターは、クローン化して発現することが可能であり、融合分子は、例えば標準抗原結合分析（上記のHarlow and Laneを参照）にあるように、実験によって、該分子が抗原と結合可能がどうかを決定することができる。これ以外に、以下に記す実施例８及び実施例１０〜１２に開示した分析法によりＴ細胞活性の調節能についてテストし、発現された、リンカー配列を含んでなる融合タンパク質を決定することができる。リンカー配列の好適な大きさと配列とは、融合タンパク質の想定した大きさと形状とに基づき行われる、コンピュータを用いた従来のモデル化技術で決定することもできる。
好ましくは、Ｖ−α鎖あるいはＶ−β鎖をコードする、実質的にいかなるヌクレオチド配列であっても、これをベクターに組み込むことができるように、ＤＮＡベクター内の制限部位が加工される。さらに、ＤＮＡベクターは、好適なバクテリオファージ外殻タンパク質（遺伝子IIIタンパク質、遺伝子VIIIタンパク質）あるいはその好適なフラグメントをエンコードするＤＮＡを組み込むための制限部位を、１つあるいはそれ以上含むように設計されてもよい。さらに、ｍｙｃ、ＥＥ、あるいは６ＸＨＩＳなどのタンパク質標識を１つあるいはそれ以上エンコードするＤＮＡを、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターに従来公知の方法で連結することもできる。例えば、Manstein,D.S.et al.Gene（1995）162（1）,129;Grussenmeyer,T.et al.PNAS（USA）（1985）82 7952,Tang,E.and Henry,H.L.J.Biol.Chem.（1993）268（7）,5069を参照されたい。
さらに具体的には、以下の実施例で具体的に示す好適な系においては、好適な制限部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位）が、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖との間に位置するポリペプチドリンカー配列の両端に存在する。適当なＤＮＡベクターに融合させると、該制限部位とバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントとの融合が生じる。
ここで開示するｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列を含んだＤＮＡベクターは、一般的に次の（１）から（８）を満たしてなる：（１）大腸菌中で作用する、例えばＰＢＲ３２２由来の複製起点を有するもの、（２）選択可能な抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するもの、（３）転写終結領域、例えば、大腸菌ｔｒｐオペロンの終結領域を有するもの、（４）転写プロモーター、例えば、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｔａｃ−ｌａｃ、ｌａｃＺ、ｌａｃuvs、Ｔ７、あるいはＴ３プロモーターを有するもの、（５）リーダー配列、例えば、ｐｅｌＢやｏｍｐＡリーダーを有するもの、（６）ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡセグメントを有するもの、（７）バクテリオファージ外殻タンパク質、例えば、遺伝子IIIタンパク質や遺伝子VIIIタンパク質（あるいは、その好適なフラグメント）を有するもの、（８）転写ターミネーター、例えば、大腸菌のリボソームＲＮＡ座由来のＴ１Ｔ２配列を有するもの。場合によっては、ＤＮＡベクターが、上記のようにタンパク質標識をエンコードするＤＮＡ配列をさらに１つあるいはそれ以上含んでいても良い。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現とその安定性とを、特にここで記述する低速誘導条件下で最適化するために、特定のヌクレオチド配列をＤＮＡベクターに含有させても良い。例えば、以下で記述するｐｈｏＡプロモーター配列とｐｅｌＢリーダー配列とは、リン酸欠乏誘導環境下においてｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させるのに特に好ましい。下記の実施例４を参照されたい。翻訳効率を上げるために、強力な翻訳開始配列を該構成に含有させてもよい。哺乳動物の細胞における発現の場合、好適な開始配列はＫｏｚａｋ共通配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）である。
ＤＮＡベクターに含まれるリーダー配列は、融合タンパク質の発現を宿主細胞の細胞膜上あるいは宿主細胞培地中に好適に誘導するためのものであり、注目のＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡが融合タンパク質をエンコードする構成に好適にライゲーションされるよう、効果的に配置された制限部位を含んでいる。好適には、制限部位は、当業界では結合配列（Junction Sequence）と称されることもあるリーダー配列（例えば、長さがおよそ２個から１０個のコドンに相当する）の３’末端に組み込まれ、Ｖ−α鎖に連結している。その結果、Ｖ−α鎖のコード領域は、通常Ｖ−αコード領域の第１アミノ酸となる。例として、１つの制限部位がＳＦｉＩ部位であり、一方、他の切断部位がＶ−α鎖のコード領域の前に組み込まれ、Ｖ−α鎖をより好適にベクター構成に挿入可能となっているものを挙げることができる。以上議論したように、このような制限部位を、通常Ｖ−α鎖の頭に位置する別の制限部位と共に使用することにより、多種多様なＶ−α鎖、あるいはＶ−α、Ｃ−α鎖のコード配列を迅速かつ容易に挿入できるようになる。好ましいリーダー配列は強力な翻訳開始部位を含むものであり、また、時には、そのｍＲＮＡの３’末端にキャップ部位を含んでいても良い。典型的なリーダー配列としは、ｐｅｌＢとＯｍｐＡが挙げられる。下記の実施例４に記すように、特に好ましいリーダー配列はｐｅｌＢである。
ここで、”ベクター”という語は、宿主細胞に取り込ませることが可能な注目の核酸配列のいずれかであり、注目の核酸が発現する結果、上記ｓｃＴＣＲ融合タンパク質などが生成する。ベクターとしては、例えば、線形核酸配列、プラスミド、コスミド、ファージミドや、染色体外ＤＮＡなどが挙げられ、具体的にはベクターは組み替えＤＮＡであってもよい。また、ここでいう、”発現”、あるいは”遺伝子発現”とは、ＤＮＡの転写やＲＮＡの翻訳を含み、注目している核酸配列に対応したタンパク質生成物が生成することを指す。通常は、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが、ベクター、好ましくはＤＮＡベクターに挿入され、好適な宿主細胞の中で該ＤＮＡセグメントの複製が行われる。
本発明に係る、十分に可溶性かつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターは、好ましくは、低速誘導される宿主細胞により長時間かけて発現される。特定の理論に言及するわけではないが、およそ２〜８時間をかけた、好ましくはおよそ４〜６時間をかけた低速での誘導により、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現が安定し、細胞間におけるタンパク質の折り畳みが最適化される。特に、強力なプロモーターによって発現がなされている場合には、低速誘導にかかるこれらの効果が明らかである。例えば、ＤＮＡベクターは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列に機能可能に連結されたｐｈｏＡプロモーター（強力）を含んで生成される。そしてＤＮＡベクターによって、宿主細胞が宿主細胞培地中で形質転換される。そして、宿主細胞培地中のリン酸塩は数時間、一般には２〜１０時間かけて、通常は４〜６時間かけて培地中で使い切られるよう設定された。上記の低速誘導条件と強力なプロモーターとを組み合わせて使用すると、化学的誘導物質と弱いプロモーターとを使用した高速誘導法（例えば、ＬａｃＺプロモーターのＩＰＴＧ誘導法）と比較して、十分に可溶性かつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質の産生量が大幅に増加することが分かった。下記の実施例４を参照されたい。好適な宿主細胞は、レトロウイルスによる転換、カルシウム、リポソーム、あるいはポリブレン仲介トランスフェクション、生体分解による転換、など、従来公知の様々な方法で形質変換することができるものである。
上記のように、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、１つあるいは複数個のタンパク質標識（同じでも良いし、異なっていても良い）を含んでいても良い。このタンパク質標識には、プロテアーゼ分解部位を含んでなるものも含まれる。例えば、タンパク質標識は６ＸＨＩＳなどの、生理的ｐＨ条件下で電荷を保持するポリペプチドであり、この場合、好適な合成マトリックスを使って融合タンパク質を純化することができる。さらに具体的には、該合成マトリックスは、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの商業的に入手可能なセファロースマトリックスであってもよく、あるは６ＸＨＩＳ標識をｐＨ６〜９条件下で結合させうる他のマトリックスであっても良い。これ以外の好適な標識としては、商業的に入手可能なモノクローナル抗体により特異的に結合される、ＥＥあるいはｍｙｃエピトープが挙げられる。一般に、抗体、好ましくは商用的に入手可能なモノクローナル抗体により特異的に結合される、様々なエピトープがタンパク質標識として機能する。他の好適な合成マトリックスとしては、本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と特異的な結合が形成される結合抗体、を有する合成マトリックスが挙げられる。分解部位を含んでなる典型的なタンパク質標識としては、エンテロキナーゼ、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、ヘビ毒、あるいは、トロンビン分解部位を含んでなるタンパク質標識が挙げられる。例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／１３５９３を参照されたい。
原核生物、真核生物、あるいは昆虫細胞の中で、本発明に係る可溶性融合タンパク質を発現させる方法は幾つか挙げられる。例えば、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡは、例えば、該ＤＮＡがベクターにライゲーションされるように、酵素を使用して既定の場所でベクターを制限する、などの既知の手段で好適なベクター内に取り込ませることができる。上記のように、ベクターには、バクテリオファージ外殻タンパク質、あるいはその好適なフラグメントをエンコードする配列も含まれている場合がある。そして、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡを含んでなるベクターが好適な宿主に導入され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が発現される。好適なベクターは、クローニングプロトコールに関する要因に基づいて、実験的に選択される。例えば、ベクターは、使用する宿主細胞に適合したものであり、かつ、適当なレプリコンをもっているものでなければならない。さらに、ベクターは、発現される融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列コードを収容できるものでなければならない。典型的なベクターの例としては、大腸菌中、特に、バクテリオファージ・ライブラリの構築に好適な宿主系統中で融合タンパク質を発現できるものが挙げられる（上記、Smith,G.P.and J.K.Scott参照）。これ以外のＤＮＡベクターとしては、哺乳動物の細胞中で融合タンパク質を発現可能なｐＣＤＶＡ３（InVitrogenより入手可能）などが挙げられる。その他哺乳動物で使用可能なＤＮＡベクターについては、上記Sambrook et al.及びAusubel et al.を参照されたい。
さらに具体的には、本発明に係る融合タンパク質を発現するに好適な宿主細胞としては、容易に形質転換可能であり、培地中で急速な成長を見せる細胞などが挙げられる。特に好ましい宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌などがあげられる。宿主細胞としては、これ以外に動物細胞や、S.cerevisiaeなどの酵母や、昆虫細胞などの真核細胞が挙げられる。ここで開示したバクテリオファージ・ライブラリを増殖する目的では、ＸＬ１−Ｂ、Ｋ９１や、Ｋ９１Ｋａｎなどの大腸菌系統が好適である。昆虫細胞での発現に好適な細胞は、バキュロウイルスが感染可能なＳｆ９などの細胞である。一般には従来の培養条件を採用し、さらに、例えば好適な細胞選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子、あるいは、Ｇ４１８）をベクターに取り込むことで、安定に形質変換やトランスフェクションがなされた細胞系が選択される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現する細胞は、以下に記すようにＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖と特異的に結合する、商業的に入手可能なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析などの、既知の手法で決定することができる。
発現されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、免疫アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着、免疫沈降などの既知の方法で単離・精製することができる。重要なことは、調製工程で時間をかけて再度折り畳むステップを実行することなく、相当量の融合タンパク質が生成される点である。以下でタンパク質精製法を詳しく記述するが、この方法によれば、大半のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成量は、宿主細胞ペースト５０〜１００グラム当たり２〜２０ミリグラムの範囲内となる。
一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を調製するためには、細胞の抽出物あるいは宿主細胞培養培地を遠心分離し、その結果得られた上澄みを、例えばＡタンパク質あるいはＧタンパク質アフィニティークロマトグラフィーや、発現されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質分子と特異的に結合する抗体を使用した免疫プロトコールなどの、アフィニティークロマトグラフィーあるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。該抗体としては、例えば、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖と特異的に結合可能な、商業的に入手可能なモノクローナル抗体が挙げられる。該抗体の典型的な例としては、Ｐｈａｒｍａｇｅｎ社の製品である、Ｈ５７、ＭＲ５−２、Ｆ２３．１などが挙げられる。モノクローナル抗体を使ったタンパク質の親和（アフィニティー）精製は公知であり、例えば、Harlow and Lane著Antiboides:A Laboratory Manual（1988）などに開示されている。
本発明に係る融合タンパク質は可溶で十分に機能的なかたち、すなわち、培地中に安定して分泌されうるかたちで提供される。さらに具体的には、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、界面活性剤などの撹乱物質が殆どあるいは一切無いという条件をほぼ満たす環境下、すなわち、生理的条件下で安定するかたちで提供される。すなわち、本融合タンパク質は、ＴＣＲ貫膜タンパク質領域内で見られるアミノ酸のような、疎水性アミノ酸リッチな領域を一般に含まない。しかしながら、場合によっては、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が十分に可溶性である限り、疎水性アミノ酸リッチな領域が一部含まれていてもよい。すなわち、融合タンパク質の発現は、相当量の封入体を好適な宿主細胞中で形成することにはつながらないかもしれない。封入体は、顕微鏡を用いて、あるいは従来の生化学的手法で容易に検出することができる。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は上記説明のように調製できるが、以下に記す実施例でも同様の方法で調製できる。一般に、所望のＶ−α鎖をコードするＤＮＡ、及びＶ−β鎖をコードするＤＮＡは、上記のように、Ｔ細胞やＴハイブリドーマ系、あるいは公的に入手可能な上記Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖配列など、適当なところから得られる。該ＤＮＡは、ＰＣＲ法、クローニング、あるいはその他の好適な手段で増幅することができる。例えば、所望のＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡを好適なベクターとしてクローン化し、次に所望のＶ−β鎖をエンコードするＤＮＡと好適な一本鎖リンカー配列とをクローン化することで、所望のｓｃＴＣＲを生成することができる。上記のように、場合によっては、ｓｃＴＣＲにはＣ−α鎖フラグメント及び／またはＣ−β鎖フラグメントをエンコードするＤＮＡが含まれている。そして、バクテリオファージタンパク質あるいはそのフラグメントとバクテリオファージ機能に必要なその他の配列とをエンコードするＤＮＡ配列を含んでなる、好適な部位で切断されたＤＮＡベクターに、ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡをライゲーションすることで、ｓｃＴＣＲ分子構造にバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその好適なフラグメント（例えば遺伝子IIIタンパク質あるいは遺伝子VIIIタンパク質）がさらに融合される。バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質あるいはバクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターの典型的な例は以下に記す。上記のように、１つあるいは複数のタンパク質標識をエンコードするＤＮＡは、好適には所望のタンパク質標識を既に含んだＤＮＡベクターを選択することにより、必要に応じて融合タンパク質に加えても良い。これにより、ライゲーションされたＤＮＡベクターが、好適な宿主中で発現され、さらに必要に応じて融合タンパク質を回収・精製することができる。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、一般に、プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖・Ｃ−β鎖フラグメント；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖・Ｃ−α鎖フラグメント／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖；あるいは、プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖・Ｃ−α鎖フラグメント／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖・Ｃ−β鎖フラグメント；の配列が共有結合したＤＮＡ構造によってエンコードされている。融合タンパク質を発現し精製するために、ここで開示した特異的な発現体系を含んでなるＤＮＡベクターは、バクテリア細胞、バキュロウイルス−昆虫系細胞、または哺乳類細胞中に、好適に導入される。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質の分子量は、例えば、融合バクテリオファージ外殻タンパク質またはフラグメントとして何を選択したのか、あるいは、採用したタンパク質標識は１つかそれ以上なのかといった、いくつかの要素によって変化する。一般に、可溶性で十分に機能的な融合タンパク質は、その分子量がおよそ４５ｋＤＡを越え、かつ、その内にしめるＶ−α鎖とＶ−β鎖の分子量が２０ｋＤＡを越えるが、通常該分子量は２１〜２６ｋＤａの範囲内である。また、本発明に係る融合タンパク質は通常、分子量がおよそ４８〜５０ｋＤａである。上記の分子量は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法などの従来の分子サイズ決定実験で決定することができる。一般的な説明については上記Harlow and Lane及びAusubel et al.による著作を参照されたい。
本発明に係る多価ｓｃＴＣＲ融合タンパク質も、有用な応用がいろいろ可能である。例えば、ｓｃＴＣＲの価数が増加すると機能が強化されると考えられている。多価融合タンパク質は、例えば標準ビオチン・ストレプタビジン（streptavidin）・ラベリング技術を用いて、あるいはラテックスビーズなどの適当な固体支持具に接合させることで、融合タンパク質を１個ないし４個（同じでも良いし、異なっていても良い）共有結合させて作出することができる。化学的に架橋されてなる融合タンパク質（例えば、架橋によりデンドリマー（dendrimer）としたもの）も、同じく多価種として適当である。例えば、融合タンパク質は、化学的に活性な側鎖を有する、例えば、ＣｙｓあるいはＨｉｓ等のアミノ酸残基をエンコードする配列を含むことで修飾することができる。化学的に活性な側鎖を有するこれらのアミノ酸は、該融合タンパク質中で様々な位置に配置することができるが、ｓｃＴＣＲの抗原結合領域から遠位に配置することが好ましい。例えば、融合タンパク質のＣ−β鎖フラグメントのＣ末端は、タンパク質精製標識と、あるいは、活性なアミノ酸を含んだ他の融合タンパク質と共有結合させることができる。好適な側鎖を含むことで複数の融合タンパク質を化学的に結合させて好適なデンドリマー粒子とし、多価分子を作ることができる。デンドリマーとは科学的に合成された重合体であり、その表面に複数の異なる官能基のいずれかを含んでなるものでもよい（D.Tomalia,Aldrichimica Acta,26:91:101（1993）を参照）。本発明で使用するに好適な典型的なデンドリマーとしては、例えば、システイン残基と結合可能な、Ｅ９スターバースト（starburst）・ポリアミン・デンドリマーや、Ｅ９コンバースト（comburst）・ポリアミン・デンドリマーなどが挙げられる。多価融合タンパク質の例は、下記の実施例９に記す。
本発明に係る融合タンパク質であって、さらに他の物質、特にＢ−７遺伝子族（例えばＢ７−１やＢ７−２）などのＴ細胞共刺激因子（T cell co-stimulatory factor）を含んだものをエンコードするＤＮＡベクターを構築し、融合タンパク質を含む細胞を活性化することも、また望ましい。
本発明に係る融合タンパク質は、組換えペプチド抗原、例えば、ＭＨＣ分子あるいはＨＬＡ分子中のスーパー抗原や抗原を検出し、特徴づける目的で使用可能である。例えば、本発明に係る方法を用いて、Ｔ細胞に対し非特徴的なエピトープを以下のようにマッピングすることができる。すなわち、ランダムペプチド・ライブラリ、あるいは選択ペプチド・ライブラリをエンコードする配列が、ペプチドライブラリ内に提供される。そして、該ライブラリは融合タンパク質、好ましくは検出可能にラベリングされた融合タンパク質を用いてスクリーニングされる。続いて、該融合タンパク質と特異的に結合したペプチドが好適に増幅される。次に、該ペプチドの配列の解析を行い、融合タンパク質と結合した配列を識別する。さらに、該融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖とに対応のＴＣＲを発現するＴ細胞との結合について、クローニングしたペプチド配列の試験が行われる。数個あるランダムペプチドライブラリのいずれを採用しても良い。例えば、J.Scott et al.,Science（1990）249:386;J.Devlin et al.,Science,（1990）249:404;S.Cwirla et al.,PNAS（USA）,（1990）;87:6378;J.Hammer et al.,J.Exp.Med.（1992）176:1007;Rhode,P.R.et al.J.Immunol.（1996）157:4885;及びD.O’Sullivan et al.,J.Immunolo.,（1991）147:2663を参照されたい。
極めて有用な一本鎖クラスＩ、及びクラスIIＭＨＣ／ペプチド複合体（すなわち”ｓｃＭＨＣ複合体”）が、公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４（出願日１９９５年２月１日）及び同シリアル番号０８／５９６，３８７（出願日１９９６年１月３１日）とに開示されている。上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４（出願日１９９５年２月１日）及び同シリアル番号０８／５９６，３８７（出願日１９９６年１月３１日）とにおいては、ここに開示したｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能を試験する目的で使用可能な、極めて有用なイン・ビトロ及びイン・ビボでのＴ細胞結合分析方法が開示されている。
より具体的には、上記公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び同シリアル番号０８／５９６，５８７には、オボアルブミン（ＯＶＡ）のアミノ酸３２３−３３９由来の提示（presenting）ペプチド、あるいは、ＨＳＶ−１  ｇＤペプチド（ｇＤ１２等）のアミノ酸２４６−２６１由来の提示ペプチドを含んだ一本鎖ＭＨＣクラスIIＩＡd複合体（例えば、ｓｃＩａd分子等）が開示されている。上記の審査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，５８７が開示しているように、ＯＶＡペプチドとｇＤ１２ペプチドとは、融合、あるいは、ｓｃＩＡd複合体に非共有結合的にリンクさせたかたちで提供されうる。上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，５８７とは、参考文献としてここに記す。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＴ細胞活性の調節能（例えば、増殖などに関するＴ細胞活性を抑制する、あるいは消滅させる）は、イン・ビトロ分析で容易に決定される。イン・ビトロ分析と、該分析を行うに必要な典型材料については、上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されている。
一般に、該分析に好適に使用されるＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマや、哺乳類、例えば、人などの霊長類；ネズミ、ウサギといったげっ歯類；から単離したＴ細胞などの、形質転換されたＴ細胞系から得られる。これ以外の好適なＴ細胞には、１）公的に入手可能、または、既知の方法で調製可能なＴ細胞ハイブリドーマ、２）ヘルパーＴ細胞、３）Ｔ細胞障害細胞、好ましくは細胞障害ＣＤ８+細胞がある。Ｔ細胞は、既知の方法で哺乳類から単離することができる。例えば、R.Shimonkevitz et al.,J.Exp.Med.,（1983）158:303を参照されたい。
上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、イン・ビトロ分析をすることで、ある分子がＴ細胞の活性を調節することが可能であるか否かを決定することができる。特に、該分析は、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、容易に適用可能である。一般に、該分析は以下に示す１から５の連続ステップで行われる。Ｔ細胞は分析可能なマーカーを発現し、該マーカーは、Ｔ細胞の活性、あるいは、活性化後に調節を受けたＴ細胞の活性を示すものである。したがって、例えば、下記の実施例８に開示するように、活性化時にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するマウスのＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０を使用することができる。ＩＬ−２の濃度を測定することにより、ある特定のｓｃＴＣＲが該Ｔ細胞ハイブリドーマの活性を調節できるか否かを決定することができる。該分析は、一般に例えば次のような工程を順に行うことにより実行される。
１．Ｔ細胞ハイブリドーマ、あるいは本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対応するＴＣＲを含んだＴ細胞を得る。典型的なＴ細胞は、上記のように、増殖可能な人のＣＴＬである。
２．上記Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、増殖可能な条件下で培養する。
３．増殖したＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、上記のｓｃＴＣＲ融合タンパク質に接触させる。
４．該ＴＣＲ（及びｓｃＴＣＲ融合タンパク質）と特異的に結合し、加えて、該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を活性化する能力のある抗原に、該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を接触させる。典型的な抗原としては、スーパー抗原、上記の提示ペプチドを有するｓｃ−ＭＨＣクラスＩあるいはクラスII複合体、あるいは、好適なＡＰＣなどが挙げられる。
５．該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を好適な共刺激因子（co-stimulatory factor）に接触させて、活性化に必要なシグナルを供給する。次に、該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、マーカーにより分析する。すなわち、例えば、ＩＬ−２産生量を計測する。ＩＬ−２産生量が、例えば２４時間で４０％またはそれ以上減少したとすると、この減少はすなわち、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節して免疫反応を抑制したことを示す。
下記の実施例８が該分析の典型例である。
上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、分析において使用されるＴ細胞は、通常、増殖に好適な条件下でインキュベートされる。例えば、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマは、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び５×１０-5Ｍ  ２−メルカプトエタノールを添加してなるＰＲＭＩ  １６４０）中で、３７℃、ＣＯ2５％条件下でインキュベートされると好適である。通常１０-12〜１０-6Ｍの濃度となるように、ある融合タンパク質を連続希釈した希釈液が、Ｔ細胞の培養培地に加えられる。Ｔ細胞の活性化シグナルは、相応しい抗原を保持した抗原提示細胞により供給されることが好ましい。抗原薬物（antigen dose）と、Ｔ細胞を最高値より若干低いレベルにまで活性化するＡＰＣ群とを使用することが、融合タンパク質に対するＴ細胞の応答阻害を検出するに好適であると考えられている。ｓｃＴＣＲとの接触に後続してＩＬ−２の産生量が減少することは、すなわち、融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節していることを示す。
上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、Ｔ細胞活性調節の同定は、ＩＬ−２などの発現されたタンパク質量を測定するよりは、むしろ、当業者にとって周知の放射線ラベリング技術を用いて抗原依存性Ｔ細胞の増殖の変化を測定することにより、好適に行われる。例えば、検出可能にラベリングした（例えば、トリチウム化した）ヌクレオチドを分析用の培養培地に導入しても良い。このような標識付きのヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みは、Ｔ細胞増殖の目安となる。この分析は、その成長に抗原の提示を要しないＴ細胞、例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマには適していない。この分析は、哺乳類から単離した非形質転換Ｔ細胞ついて、該Ｔ細胞の活性調節を測定するに好適である。融合タンパク質との接触に後続しておこるＴ細胞の増殖レベルの低下は、分子がＴ細胞の活性を調節し免疫反応を抑制可能であることを示している。下記の実施例８や実施例１０を参照されたい。イン・ビトロでのＴ細胞増殖分析法は、上記の融合タンパク質が、イン・ビボでのＴ細胞クローナル増殖の抗原特異的な変化におよぼす影響を測定するに好適に使用される。この分析については以下の例１１で具体的に記述する。
以下の実施例に説明されるように、ＩＬ−２産生量の測定、もしくはＴ細胞増殖の測定は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節しうるかどうかを調べる目的で使用することができる。例えば、融合タンパク質との接触に後続しておこる、ＡＰＣで刺激されたＴ細胞によるＩＬ−２産生の減少は、融合分子がＴ細胞の活性を調節し、Ｔ細胞仲介型の免疫反応を抑制可能であることを示している。
また、イン・ビボ分析は、Ｔ細胞の発達を阻害、もしくは該細胞を不活性化する能力などの、融合タンパク質のＴ細胞の活性を調節する能力を調べる目的で使用することもできる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の有する、免疫グロブリンのクラス変更（即ち、ＩｇＭからＩｇＧ）阻害能力を分析することができる。例えば、P.Linsley et al.,Science,（1992）252:792-795参照。
融合タンパク質を用いる診断法は、イン・ビボ診断イメージングおよびＨＬＡ型分析としても実現されている（例えば、A.K.Abbas,Cellular and Molucular Immunology,Page 328（W.B.Saunders Co.1991）を参照）。イン・ビボ  イメージングへの適用の際には、融合タンパク質は放射性標識（例えば、125I、32P、99Tc）、もしくは哺乳類に投与可能な他の検出可能標識を含んで構成され、被験者はｓｃＴＣＲの結合を検出する目的で公知の方法によりスキャンされる。哺乳類に対するこのような分析は、例えば、免疫システムの疾患に係るＡＰＣの不所望な発現などの、多くの疾患の診断および治療に際し助けとなりうる。
また、分析は、自己免疫疾患の治療のために使用されるｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）を評価する目的でも使用可能である。例えば、上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、実験用アレルギー性脳髄炎（experimental allergic encephalomyelitis（ＥＡＥ））は、マウスの自己免疫疾患であり、多発性硬化症の認められたモデルである。一つの分析例では、あるマウスの系統がＥＡＥを発症するように処理され、その後に、適当なｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）が投与される。その後、該動物は、融合タンパク質もしくはｓｃＴＣＲの投与によってＥＡＥの進行が阻害もしくは防止されたか否かを調べるべく評価される。このような検定は、特に、以下の実施例１２において詳しく説明される。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質の有する、免疫反応（上記記載の標的疾患に対する予防接種などを含む）を封じこめる能力は、イン・ビボ検定によって簡単に調べることができる。例えば、融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）をマウスなどの哺乳類に投与し、その血液サンプルを、最初の投与時、およびその後定期的に数回（例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の投与の２、５、および８週間後）摂取する。続いて、血清を血液サンプルより採取し、免疫感作により産生された抗原が存在するか否かの分析が行われる。抗体の濃度は、一般的な免疫学的方法によって調べることができる。
また、本発明は、哺乳類、特に人などの霊長類の細胞内で融合タンパク質を発現する、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントの投与方法を提供するものである。好ましくは、融合タンパク質のコーディング領域を有するＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターのような適切なプロモーターにより制御された状態で、公知の方法により被験者の骨格筋へ直接注入される。プラスミドＤＮＡの投与方法、そのＤＮＡが投与された被験者の細胞への該ＤＮＡの取り込み、および、タンパク質の発現について報告がなされている（J.Ulmer et al.Science,（1993）259:1745-1749参照）。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、治療学上さまざまに適用することができる。例えば、融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）を、哺乳類の免疫反応を低減もしくは除去する目的で投与することができる。これにより、例えば、癌、感染症、アレルギー、もしくは、例えば、多発性硬化症、インシュリンによる真性糖尿病、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患などを患っている、もしくはその虞れがある人などの哺乳類を治療することができる。投与は、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡの直接投与など、適切な手段を介して行うことができる。また、この治療に適しているのは、不所望な免疫反応を患っているか、患う虞れのある患者、例えば、心臓、腎臓、皮膚、または他の器官の移植手術を経験している患者などである。移植拒絶を伴う状況では、治療プロトコールは、手術が行われる以前に適切に開始されてもよい。
本発明によれば、哺乳類の免疫反応を低減もしくは除去するために、いくつかの特有のアプローチを使用することができる。例えば、不所望な免疫反応を低減するための一つの治療法では、病原性Ｔ細胞と抗原との相互作用を低減もしくは除去するために、好適なｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、好ましくは、それ由来のｓｃＴＣＲ）が有効量投与される。これにより、Ｔ細胞の増殖、分化、活性化、もしくは、Ｂリンパ球刺激などの、Ｔ細胞仲介型の免疫反応を選択的に制御することができる。融合タンパク質は、不所望な免疫反応を仲介する病原性Ｔ細胞と、少なくとも同レベル、好ましくはそれ以上の、抗原特異的結合親和性を示すことが好ましい。これに関し特に好ましいのは、上述したリガンドに対して大きな特異的結合親和性を表すｓｃＴＣＲ突然変異物である。
ここに開示されている方法で調製されたｓｃＴＣＲもしくはＴＣＲに対する抗体の投与は、例えば、腹膜腔内注射もしくは静脈注射などの注射方法によって哺乳類に投与することができる。融合タンパク質のうち、少なくとも治療への応用において用いられる分子は、哺乳類細胞もしくは他の適切な細胞から生産され、実質的に、もしくは完全に発熱物質（pyrogen）が存在しないように使用前に精製されることが好ましい。ある治療へ応用する際の最適投与量は、従来の手段に基づいて決められてもよいが、一般的には、投与経路、患者の体重、健康状態、性別、および当業者によって認められる要因を含むいくつかの要因によって変動する。
投与は、一回投与でもよく、日もしくは週間隔での連続的な投与であってもよい。ここで用いられる「一回投与」とは、単一（solitary）投与であってもよいし、継続放出（sustained release）投与であってもよい。被験者は哺乳類（例えば、人、もしくは牛のような家畜、もしくは犬や猫のようなペット）であってもよく、また、ｓｃＴＣＲもしくは抗体を含む製薬組成としての治療を含むものとする。本発明のこのような製薬組成は、当該技術において公知の手順に従って製造および使用される。例えば、融合タンパク質の治療有効量を含む処方は、例えば、封止されたアンプルおよびバイアルなどの単一服用単位もしくは複数服用単位として提供されてもよく、例えば、水注入による無菌液体キャリアーの添加のみを使用直前に要する凍結乾燥状態として保存されてもよい。リポソームの処方も多くの適用に際し好適である。また、その他の組成も非経口投与の目的で適切に用いることができ、これには、抗酸化剤、バッファ、静菌剤、および標的受領者の血液と等張となる量の溶質を含んでなる、水溶性および非水溶性無菌注入溶液が含まれ、また、懸濁剤および濃化剤などを含む、水溶性および非水溶性無菌懸濁液が含まれる。
Ｔ細胞反応（応答）の低減もしくは除去を含んでなる本発明の方法は、Ｔ細胞仲介型の疾患に対するより効果的な治療を提供する目的で、公知の免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、もしくは抗炎症剤を併用して行われてもよい。例えば、融合タンパク質は、自己免疫疾患およびアレルギーの治療のため、従来の、シクロスポリン（cyclosporin）などの免疫抑制薬剤、もしくはコルチコステロイド（corticosteroid）のような抗炎症薬剤、および非ステロイド薬剤と共に使用することができる。
上述したように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、それから分離されたｓｃＴＣＲ分子）は、一般的に当該技術において知られる方法により抗体を産生する目的で使用可能であり、通常、融合タンパク質の精製サンプルとして生成される。ほとんどの場合、抗体を増産させるために選択されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、上述したように、まず、バクテリオファージ外殻タンパク質もしくはそのフラグメントを除去するべく分解される。このようにして得られたｓｃＴＣＲは、免疫原として使用される。抗体は、注目ｓｃＴＣＲの１つもしくはそれ以上のエピトープからなる免疫原性ペプチドから構築することもできる。
さらに詳しく述べると、抗体は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製サンプル、融合タンパク質から分離されたｓｃＴＣＲ分子、もしくは上記の免疫原性ペプチド（それ単独もしくは適切なキァリアーとの複合体）により、哺乳類を免疫感作することで得られる。好ましくは、ｓｃＴＣＲ分子を免疫原として使用する。また、適切な哺乳類としては、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット、およびマウスなどの一般的な実験動物が挙げられる。ラットおよびマウス、特にマウスは、モノクローナル抗体を得る目的で好適に使用される。抗原は、皮下注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、および皮膚内注射などの数ある経路のいずれによっても哺乳類に投与可能である。最適な免疫感作間隔および免疫感作量などは、比較的大きな範囲内をとることができ、ここでの開示に基づいて実験的に求めることができる。通常の手順では、抗原は、数週間に渡り数回注射される。抗体は、免疫感作された動物の血清から一般的な方法で採取され、ｓｃＴＣＲに対して特有の抗体を検出するためにスクリーニングされる。特に注目すべきは、Ｖ−αもしくはＶ−β鎖、該鎖中でも特に高可変性領域に限定的に結合する抗体、例えば、該領域上にある直鎖状もしくは立体配座のエピトープを認識する抗体である。モノクローナル抗体は、抗体を産生する細胞内、およびハイブリドーマ細胞形成のための標準的な融合方法を用いてモノクローナル抗体を産生するために用いられる細胞内、において産生することができる（G.Kohler,et al.,Nature,（1975）256:456参照）。通常、ここにおいては、ハイブリッド細胞を生成するために、抗体産生細胞を骨髄膜細胞などの不朽細胞系統と融合する工程を伴う。もしくは、モノクローナル抗体は、Huse,et al.,Science,（1989）256:1275の方法により、細胞より産生されてもよい。
一つの適切なプロトコールは、精製ｓｃＴＣＲ複合体を含んでなる組成を用いて、約２〜７ケ月間にわたって行われる、マウスの腹膜腔内注射による免疫感作である。その後、免疫感作マウスから脾臓細胞を摘出することができる。免疫感作マウスの血清は、脾臓細胞を切除する以前に、ｓｃＴＣＲに特異的な抗体を用いた滴定により分析される。その後、切除されたマウスの脾臓細胞は、適当な均質もしくは不均質（好ましくは均質）のリンパ系細胞系統と融合される。該リンパ系細胞系統は、ヒポキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠失（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency （HGPRT-））、もしくは、チミジン  キナーゼ欠失（thymidine kinase deficiency（TK-））などの標識を有する。好ましくは、リンパ系細胞系統として骨髄膜細胞が使用される。骨髄膜細胞と脾臓細胞とは、例えば、骨髄膜細胞１に対して脾臓細胞４の割合で混合される。これら細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法により融合することができる（G.Kohler,et al.,Nature,Supra参照）。このようにクローン化されたハイブリドーマは、例えば、RPMI-1640培地で培養される（G.E.More,et al.,Journal of American Medical Association,（1967）199:549参照）。融合処理後成長したハイブリドーマは、精製ｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗体を分泌することを利用して、放射線免疫分析法もしくは酵素免疫分析法などによりスクリーニングされる。従来の方法に従いＥＬＩＳＡ法を用いて、血清を含む抗体をスクリーニングすることもできる。このようなスクリーニング処理に対し正の結果を示すハイブリドーマは、限界希釈培養法により増殖およびクローン化することもできる。好ましくは、溶液内および生サンプル内で、ｓｃＴＣＲに結合可能な抗体を選択するためのさらなるスクリーニングが行われる。単離された抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどの適切な免疫学的方法によりさらに精製することもできる。
いくつかの適用においては、ｓｃＴＣＲと特異的に結合するキメリック抗体誘導体（例えば、人間以外の動物の可変領域と人間の不変領域とを結合する抗体分子）を産生し、これにより、被験者（人）内における免疫原性を、対応する非キメリック抗体と比較して低減することが好ましい場合がある。このようなキメリック抗体は、例えば、可変領域のいくつかの部分、特に抗原結合領域において保存領域が人間に起源し、高可変領域のみが非人間に起源する人可変領域キメラを産生する方法により、様々な種類のものを得ることができる。（S.L.Morrison,Science,（1985）229:1202;Oi et al.,BioTechniques,（1986）4:214;Teng et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,（1983）80:7308-7312;Kozbor et al.,Immunology Today,（1983）4:7279;Olsson et al.,Meth.Enzymol.,（1982）9:3-16に記載の人キメリック抗体およびその生成方法を参照）。
ここで用いられる用語「抗体」とは、一般的に、ｓｃＴＣＲに結合する、全免疫グロブリン、および、免疫的に活性な断片（フラグメント）を指す。免疫グロブリン、およびその免疫的に活性なフラグメントには、抗体結合部位（融合タンパク質に特異的に結合可能なペリトープ）が含まれる。抗体フラグメントの例としては、例えば、Fab,F（v）,Fab’,F（ab’）2フラグメント、免疫グロブリンのジスルフィド結合を還元することにより得られる「半分子」、一本鎖免疫グロブリン、および他の抗原結合フラグメントなどが挙げられる（例えば、Bird et al.,Science,（1988）242;Huston et al.,PNAS,（USA）,（1988）85:5879;Webber et al.,Mol.Immunol.,（1995）32:249参照）。抗体、もしくはその免疫的に活性なフラグメントは、動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）のものであってもよいし、キメラ体であってもよい（例えば、Morrison et al.,PNAS,（1984）81:6851;Jones et al,Nature,（1986）321参照）。
「特異的結合」およびこれと同様の用語は、ここで開示されている分子が別の分子に結合し、特異的結合ペアを形成することを意味する。しかしながら、該分子は、例えば、ウエスタンブロッティング・エライザ法（western blotting ELISA）、RIA法、移動度変位分析法（mobility shift assey）、酵素免疫分析法（enzyme-immuno assay）、競合分析法（competitive assey）、飽和分析法（saturation assey）、もしくは当該技術分野において公知の他のタンパク質結合分析法によって得られる他の分子を認識せず、またそれらに結合もしない。分子同士の特異的結合の検出方法の例については、一般的に、Ausubel,et al supra;Sambrook,et al,supra;Harlow and Lane,supraおよびその中の参照文献を参照されたい。
ここで文言されている全ての文献は、それらを完全な形で参照することによってここに取り入れられている。
本発明の、実施例を以下に示すが、本発明は特にこれらに限定されるものではない。
実施例１−可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の形成
マウスＤＯ１１．１０細胞ＴＣＲのＤＮＡ配列は報告されている（Kappler,J.et al.PNAS（1994）91 8462）。ＴＣＲは、１−ＡdＭＨＣクラスII分子中に含まれたかたちのニワトリ  オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド・スパニングアミノ酸３２３−３３９を認識し、これに結合する。ＴＣＲをエンコードするＤＮＡは、概して、KapplerおよびMarrack,supraに開示の方法に従い調製された。
簡単に説明すると、１×１０6個のＤＯ１１．１０細胞は、製造者（Ｄｙｎａｌ）の指示に従い、oligo-dTコーティング・マグネティックビーズを用いて単離された。ＴＣＲのα鎖ｃＤＮＡは、Ｃ−α特異的「バック」プライマーＫＣ１１３（ＳＥＱ  ＩＤＮｏ．６）と、ＤＯ１１．１０  ｍＲＮＡとを含んでなる混合物をインキュベートすることにより得られた。該ｃＤＮＡを得るために、後続して、標準量のヌクレオチドおよび逆転写酵素をこの混合物に添加した。同様にしてβ鎖ｃＤＮＡが得られたが、ＫＣ１１３プライマーの代わりに、「バック」プライマーＫＣ１１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）が使用された。アルファ鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫＣ１１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）およびＫＣ１１３の共存下でＰＣＲ反応が行われ、６５０ｂｐの５’ＸｈｏＩ−３’ＸｍａＩα鎖フラグメントが増幅された。７５０ｂｐのβ鎖は、５’および３’末端に、順にＳｆｉＩおよびＳｐｅＩ部位を含んでなるプライマーＫＣ１１１及びＫＣ１１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）を用いたＰＣＲ法により増幅された。
ｓｃＴＣＲは、ＤＯ１１．１０  ＴＣＲより、共有結合されたＶ−α鎖およびＶ−β鎖を含むかたちで構築された。場合によっては、Ｖ−α鎖は、Ｃ−α鎖フラグメントおよびＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでいた（例えば、図３、および図６Ａ、６Ｂ参照）。一般的に、Ｃα鎖フラグメントは、アミノ酸約９個分の長さを有していた。Ｃ−β鎖は、通常、完全な長さのＣ−β鎖におけるアミノ酸残基１２７（すなわちシステイン残基）の直前のアミノ酸残基１２６の位置で切断された。このシステイン残基が含まれているとｓｃＴＣＲの発現に有害であることが見いだされた。Ｖ−β鎖（もしくは、Ｃ−β鎖）フラグメントの３’末端には、通常、バクテリオファージ遺伝子III外殻タンパク質、もしくはバクテリオファージ遺伝子IV外殻タンパク質をエンコードする融合タンパク質精製標識（例えば、ＥＥもしくは６ｘＨｉｓ）ＤＮＡが付加されていた。
実施例２−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質発現のためのベクター
実施例１で得られたｓｃＴＣＲ  ＤＮＡは、強い細菌プロモーター（ｐｈｏＡ）もしくは弱い細菌プロモーター（ｌａｃＺ）を有するベクター内へ挿入された。ｓｃＴＣＲを発現させるために使用されたベクターは、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示すｐＪＲＳ１４９およびｐＫＣ１２  ＤＮＡベクターである。これらベクターは、ｓｃＴＣＲのバクテリオファージ外殻タンパク質への融合を可能にする。融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターの構築については、図２および以下に概略的にアウトラインを示す。
Ａ．ＤＮＡベクターｐＪＲＳ１４９
ｐＪＲＳ１４９  ＤＮＡベクターは、pBluScriptTM（Invitrogen）バックボーンを有するファージミドである。このベクターは、以下の実施例１４〜１８に説明するバクテリオファージ・ディスプレイ実験で使用される、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を生成するために使用される。
Ｂ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１２
遺伝子IIIをエンコードするＤＮＡは、図１Ｂに示すｐＫＣ１２ベクターにクローン化された。
Ｃ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１４およびベクターｐＫＣ１５
遺伝子VIIIＤＮＡ配列は、鋳型（テンプレート）としてのfd tetバクテリオファージ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３７０００）、プライマーＯＰＲ１５６（「フロント」ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５８）、並びに、プライマーＯＰＲ１５７（「バック」ＳＥＱ  ＩＤ．ＮＯ．５９）を用いてＰＣＲ法により増幅された。その後、遺伝子VIIIのＰＣＲ産物は、ベクターｐＫＣ１４を得るために、ＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてベクターｐＬＬ００１内にクローン化された。ｐＬＬ００１プラスミドは、ＰＵＶＣ−１９  ＤＮＡ由来であり、遺伝子VIIIセグメントをサブクローニングできるように、そのポリリンカー領域にＸｍａIおよびＥｃｏＲI部位を含んでいる。また、ｐＬＬ００１ベクターは、遺伝子VIIIＤＮＡをクローン化するためのシャトルベクターとして使用される。ベクターｐＫＣ１５はｐＫＣ１４由来であり、９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、図１に示すｐＪＲＳ１４９ベクターにクローン化することにより得られる。ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、複数のクローニング部位（例えば、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩ）を有する合成ポリリンカー、ｐｅｌＢリーダ、ｐｈｏＡプロモーター、および遺伝子VIII遺伝子を含んでなる。ベクターｐＫＣ１５は、ｐＪＲＳバックボーンから得られる第二のｐｅｌＢリーダを有し、ジ−シストロニック（di-cistronic）オペロン制御下での遺伝子クローニングを可能にする。
Ｄ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１６およびｐＫＣ１８
ｐＫＣ１６由来のＸｈｏＩ−ＸｍａＩフラグメントをクローン化するため、アルファ鎖ｃＤＮＡは、プライマーＫＣ１１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（「フロント」）およびＫＣ１１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）（「バック」）を用いてＴＣＲ  Ｖ−α、Ｃ−α遺伝子を増幅するための鋳型として使用された。Ｖ−β、Ｃ−β遺伝子フラグメントは、プライマーＫＣ１１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）（「フロント」）およびプライマーＫＣ１１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（「バック」）、並びに、β鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ法により増幅された。続いて、該遺伝子フラグメントは、ベクターｐＫＣ１８を得るためにｐＫＣ１５内にクローン化された。
図３は、これら実験で用いられている、ｐＫＣ４４、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１  ＤＮＡベクターを示すものである。ｐＫＣ１５からのＤＮＡベクターの形成については、図２および以下にそのアウトラインが示されている。
Ｅ．ＤＮＡベクターｐＫＣ２７、ｐＫＣ４２、およびｐＫＣ４４
ベクターｐＫＣ２７は、アニーリングされたプライマーＪＡ３０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９５）およびＪＡ３０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９６）によって形成され、これにより（Ｇ4Ｓ）4ポリペプチドリンカーを得た。その後、該リンカーは、ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＫＣ１５ベクター内にクローン化された。その後、Ｖ−α１３．１、及びＶ−β、Ｃ−β領域は、それぞれ、ｐＫＣ２７  ＤＮＡ内にクローン化された。簡単に説明すると、Ｖ−α１３．１遺伝子フラグメントは、鋳型としてのベクターｐＫＣ１６  ＤＮＡと、プライマーＫＣ１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（「フロント」）およびＫＣ１２６（「バック」）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）とを用いて、ＰＣＲ法を用いて増幅することにより生成された。Ｖ−α１３．１遺伝子は、ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして、ｐＫＣ４２内にクローン化された。Ｖ−β８．２、および、Ｃ−β鎖ＤＮＡは、ｐＫＣ１８をＸｈｏＩおよびＸｍａＩにより切断された後にゲル精製された。このフラグメントは、ｐＫＣ４４ベクターを得る目的でｐＫＣ４２内にクローン化された。一般的に、ｐＫＣ４４ベクターは、ｐｈｏＡプロモーターによる転写制御下で、ｓｃＴＣＲをｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質のかたちで含むよう構成された。
Ｆ．ｐＫＣ１２、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１  ＤＮＡベクター
ｐＫＣ１２（図２）からの、ベクターｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１の形成のアウトラインについては図４に記載され、また、以下に説明される。
ｐＫＣ１２ベクターは、ｓｃＴＣＲをエンコードする実施例１のＤＮＡが、ｌａｃＺプロモーターの転写制御下で発現されるように修飾された。簡単に説明すると、ｐＫＣ１２ベクターはｐＫＣ４５ベクターを得るために、アニーリングされたプライマーＫＣ１３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）（「フロント」）およびプライマーＫＣ１３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）（「バック」）をｐＫＣ１２内にクローン化することにより修飾された。この修飾により、すでにＳｆｉＩ部位（サイト）およびＥｃｏＲＩ部位を含んでなるｐＫＣ１２のポリリンカー領域に対し、ＸｍａＩ部位がさらに付加された。また、ｐＫＣ４５は、ＥＥ−標識の５’末端およびアンバーストップコドンに付された遺伝子VIIIをエンコードするＤＮＡ配列を含んだ。
アンバーストップコドンは、ＸＬ１−ｂｌｕｅなどのｌａｃＩqアンバーサプレッサー宿主内で、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現レベルを約１５〜２０％低下させた。ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質をエンコードするＤＮＡをｐＫＣ４５内にクローン化するために、ｐＫＣ４４ＤＮＡは、ＳｆｉＩおよびＸｍａＩで分割（切断）された。その後、ｓｃＴＣＲフラグメントは、ｐＫＣ４６を得るために、ゲル精製された後にｐＫＣ４５内にクローン化された。ｐＫＣ４６へのｓｃＴＣＲ挿入断片は図３に示されるように、ＥＥ−標識、及び遺伝子VIII外殻タンパク質と融合されている。
ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質は、ｐＫＣ４４およびｐＫＣ４６ベクターをＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化（切断）することにより、ｌａｃＺプロモーターの転写制御下に置かれた。遺伝子VIIIのＤＮＡ配列は、ベクターｐＫＣ５１を得るために、消化されたｐＫＣ４４ＤＮＡから単離され、ＳｆｉＩおよびＸｍａＩフラグメントとしてゲル精製されたベクターＤＮＡ  ｐＫＣ４６内にクローン化された。そのあと、ベクターｐＫＣ５１内の該ｓｃＴＣＲ挿入断片は、図３ｃに概略的に示すように、遺伝子VIII外殻タンパク質と融合された。ベクターｐＫＣ４６とは異なり、ｐＫＣ５１ベクターは、ＥＥ−標識およびアンバーストップコドンを含んでいない。
実施例３−融合タンパク質をエンコードするＤＮＡのＤＮＡベクターｐＥＮ２へのクローニング
実施例１で生成された可溶性ｓｃＴＣＲの発現は、図５に示すように、ｐＥＮ２ベクター内にサブクローニングすることにより増大された。ｐＥＮ２ベクターは、ｐｈｏＡプロモーター、遺伝子１０リボゾーム結合部位、および修飾ｐｅｌＢリーダを有している。ｐＥＮ２ベクターフォーマット内の可溶性ｓｃＴＣＲ挿入断片は、図６Ａおよび図６Ｂに概略的に示され、以下に説明される。図６Ａおよび６Ｂでは、ＤＮＡベクターは、ｐＥＮ２ベクターから構築される。
Ａ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６０の構築
ｐＫＣ６０ベクターは、１２０４ｂｐのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＥＮ２へ導入することによって得られた。ＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｖ−α、Ｖ−β、およびＣ−β領域（ドメイン）からなっている。このフラグメントは、プライマーＫＣ１１４（「フロント」ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＪＷＴＣＲ２０８（「バック」ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）を用いて、テンプレート（鋳型）としてのｐＫＣ５１  ＤＮＡを増幅することにより得られた。ＪＷＴＣＲ２０９プライマーは、ＥＥ−標識およびＣ−β領域３’末端のＸｍａＩ部位（サイト）を含んでいる。ＸｍａＩ部位の付加は、遺伝子IIIおよび遺伝子VIIIのクローニングを促進した。ｐＫＣ６０ベクターは、上述したｓｃＴＣＲ  ＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＥＮ２ベクター内にクローン化することにより得られた。
Ｂ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６１の構築
切断されたｓｃＴＣＲを形成するために、ベクターｐＫＣ４６のＶ−αおよびＶ−β配列は、プライマーＫＣ１１５（「フロント」ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＪＷＴＣＲ２０９（「バック」ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）を用いてＰＣＲ法により増幅された。形成されたＰＣＲ増幅産物はベクターｐＫＣ６０内にサブクローン化され、これによりベクターｐＫＣ６１を得た。ｐＫＣ６１ベクターは、６ＸＨｉｓ標識をＥＥ標識配列の３’末端に付加することにより更なる修飾を受けた。
Ｃ．ｐＣＫ６２およびｐＫＣ６４  ＤＮＡベクターの構築
バクテリオファージ遺伝子IIIをエンコードするＤＮＡは、ｐＫＣ６４ベクターＤＮＡをテンプレートとして用い、また、プライマーＴＣＲ２１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ６８）および２１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ６４）を用いて増幅された。続いて、該ＤＮＡはｐＫＣ６０内にクローン化されてベクターｐＫＣ６４を得た。遺伝子VIII遺伝子は、ベクターｐＫＣ５１  ＤＮＡをテンプレートとして用い、また、プライマーＴＣＲ２１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ７１）および２１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ７０）を用いて増幅され、ベクターｐＫＣ６２を得るためにｐＫＣ６０内にクローン化された。
Ｄ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６３およびｐＫＣ６５の構築
遺伝子III（ｐＫＣ６５）および遺伝子III（ｐＫＣ６３）融合タンパク質は、それぞれに対応の遺伝子フラグメントがＰＣＲ法により増幅された後、ベクターバックボーンｐＫＣ６１内にクローン化される。これにより、ｐＫＣ６５およびｐＫＣ６３双方は、そのプライマー配列中にエンコードされた６ＸＨｉｓ末尾を含むことになる。
Ｅ．ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７  ＤＮＡベクターの構築
ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターは、Ｖ−α鎖フラグメント、およびＣ−α鎖フラグメントの最初の８個のアミノ酸を含んでなるＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、テンプレートとしてのｐＫＣ５１  ＤＮＡ、並びに、プライマーＫＣ１１４（フロント  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＪＷＴＣＲ２１７−β（バック  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）を用いて増幅することにより得られた。ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターを得るために、ＫＣ１１４およびＪＷＴＣＲ２１７−βプライマーを用いてＴＣＲ  ＤＮＡがＰＣＲ法により増幅された。その後、増幅されたＤＮＡは、ｐＫＣ６２内に、もしくはＳｆｉＩおよびＳｐｅＩで予め消化されたｐＫＣ６０内にサブクローン化された。これらベクターは、それぞれ、Ｃ−α領域のＮ−末端から数えて８個のアミノ酸残基を含んでいる。これらベクターは、以下に説明されるＴＣＲライブラリの形成に使用される。ベクターｐＫＣ６６は、遺伝子VIII遺伝子を含んでいる。
ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、12301 Parklawn Drive,Rockville,MDのBudapest Treaty（ブダペスト条約）with the American Type Culture Collection（ATCC）に準じて寄託されている。これらＤＮＡベクターは、１９９７年２月２６日にＡＴＣＣに寄託され、Accession Nos.97895（ｐＳＵＮ１８）および97896（ｐＳＵＮ１９）に指定された。ＤＮＡベクターｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、ｐｈｏＡプロモータ、修飾ｐｅｌＢ配列、遺伝子１０リボソーム結合部位、およびバクテリオファージ遺伝子VIIIプロモータを含んでなる。ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）は、ｌａｃＺプロモータ、ＥＥ標識、およびバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質を含んでなる。これらＤＮＡベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）、もしくは他の適切な宿主細胞内で、標準的な方法により増殖させることができる。
ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、様々なＶα、Ｖβ−Ｃβおよびポリペプチドリンカー配列を収容（accomodate）可能に設計されている。これら両ＤＮＡベクターのＶα鎖は、ＳＦｉＩおよびＳｐｅIの制限消化により切除することができる。Ｖβ−Ｃβ鎖は、ＸｈｏＩ−ＸｍａＩの制限消化により切除することができる。また、これらＤＮＡベクターでは、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩの制限消化により、ペプチドリンカー配列の交換が可能である。
実施例４−ＴＣＲ融合タンパク質の発現の調節
１．ｐｈｏＡプロモータ
ＸＬ１−Ｂ細胞は、ｐｈｏＡプロモータを含むベクターｐＫＣ４４で形質転換された。形質転換された細胞は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の誘導を防止するため、リン酸を含む培地で一晩生育された。培地からリン酸を取り除くと、ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIIIタンパク質が発現する。シェーカーフラスコで一晩成長された後、細胞は、リン酸欠乏培地で数回洗浄された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現は、洗浄された細胞を、リン酸欠乏培地に再び懸濁することによって開始された。４時間の誘導の後、細胞は収集された。通常、４時間の誘導により、ウエスタンブロット分析により分析可能な、適切なレベルの可溶性ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質が供給される。ｐｈｏＡプロモータ制御下におけるｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質のより高い収率（例えば、約１０〜４００mgの間）は、細胞を、３〜１０リットルのファーメンター、もしくはバイオリアクターなどの他の大規模な作成容器内で増殖することにより得られる。
一般的に、ｐｈｏＡプロモータを含むベクターは、Ｌａｃなどの他のプロモータを含むベクターよりも好適に使用された。また、ｐＥＮ２ベクターを用いた発現は、多くの理由から特に好ましいとされた。例えば、ｐＥＮ２ベクターは、ｐｈｏＡプロモータの他に、翻訳を増強する遺伝子１０リボゾーム結合部位を含んでいる。ｐＥＮ２ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにとって好適なコドンを含むべく修飾されたｐｅｌＢリーダペプチドをさらに含んでいる。修飾されたｐｅｌＢリーダ配列およびペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９および１３０に図示されている。図７に示すウエスタンブロットは、このような修飾が、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現を約１０〜５０倍と、大幅に向上する様を示している。
図７に示すウエスタンブロットは、抗−ＥＥ標識抗体（１：５０００希釈）を用いてプローブされ、その後、ヤギ  抗−マウスＨＲＰ抗体（１：２００００希釈）を用いてプローブされた。視覚化は、標準的な免疫学的手法によって行われた。レーン１は、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を示す。レーン２は、１０ＯＤ／ｍｌのｐＫＣ６０由来ｓｃＴＣＲ（誘導された）５マイクロリットルを示す。レーン３は、誘導されていない（derepressed）ことを除けばレーン２と同一条件である。レーン４は、１０ＯＤ／ｍｌのｐＫＣ５１由来ｓｃＴＣＲ（ＥＥ標識なし）５マイクロリットルを示す。レーン５は、５０ＯＤ／ｍｌのＩＰＴＧで誘導されたｐＫＣ４６由来ｓｃＴＣＲ５マイクロリットルを示す。
２．ＬａｃＺプロモーター
ｓｃＴＣＲ／遺伝子III（ベクターｐＫＣ４６）およびｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII（ベクターｐＫＣ５１）融合タンパク質は、約３リットルのファーメンター内で発現された。ｐｈｏＡプロモーターによる転写制御下でｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させると、Ｌａｃプロモーターを含むベクターを用いる場合よりも多量の融合タンパク質が生成した。よって、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、一般的に、ｐｈｏＡプロモーターを含むベクターを用いて発現された。
実施例５−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質系の発現
いくつかのＥ．ｃｏｌｉ菌株（系統：ＸＬ１−Ｂ、ＭＭ２９４、ＴＢ１、ＵＴ５６００、および，Ｋ９１Ｋａｎ）につき、そのｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現能に関し分析がなされた。上記の宿主細胞系統は、実施例４で得られたｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させるべく、ｐＫＣ６０で形質転換された。全ての形質転換された系統は、３０℃のリン酸培地で成長するように適応された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の誘導は、リン酸欠乏培地内で成長させることにより行われた。ｓｃＴＣＲ発現のレベルは、図８に示すウエスタンブロット分析により求められた。図８では、レーン１は、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を示す。レーン２は、１０ＯＤ／ｍｌのＭＭ２９４  ライゼート（ｐＫＣ６０）４マイクロリットルを示す。レーン３は、宿主系統がＫ９１Ｋａｎであることを除けばレーン２と同一条件である。レーン４〜６も、宿主系統が、順にＸＬ１−Ｂ、ＴＢ１、および、ＵＴ５６００であることを除けばレーン２と同一条件である。全ての免疫沈降（沈澱）は、可溶性細胞画分でｐｈｏＡ誘導細胞から調製された。簡単に説明すると、ウエスタンブロットは、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、形質転換細胞の５ＯＤ／ｍｌの細胞懸濁液５μｌを添加することによって行われ、続いて、標準的なウエスタンブロット法によりブロットへ写しとられた。ｓｃＴＣＲは、University of San Diego,San Diego CalforniaのGernot Walter’s Labratoryから認可された、抗−ＥＥ標識抗体を用いてブロットをプローブする方法で検出された。これとは別に、他の抗−ＥＥ標識抗体およびＥＥ標識を使用することもできる（例えば、pharmaciaから得られるもの）。抗体を結合後、ヤギ  抗−マウスＨＲＰで標識されたコンジュゲート（Jackson Laboratories）が添加された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現は、Ｋ９１Ｋａｎ系統で最大であった（図８）。
実施例６−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製
ベクターｐＫＣ５１によりエンコードされた融合タンパク質は、従来の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、形質転換細胞から精製された。図９は、ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質の免疫アフィニティークロマトグラフィーによる精製を概略的に示すものである。
簡単に説明すると、精製は、タンパク質−Ａ被覆（coated）セファロースビーズ１ｍｌに対し、ハムスター  抗マウスαβＴＣＲ抗体Ｈ５７−５９７（ＡＴＴＣ  Accession ＨＢ−２１８）５ｍｇをカップリングすることで、クロマトグラフィー用のカラムを作成することにより行われた。Ｅ．ｃｏｌｉライゼートは、ファーメンターから取り出した細胞ペースト５０gを、溶解バッファ（0.05M Tris,pH8.0,150mM NaClおよび5mM EDTA）１００ｍｌに溶解することにより得られた。再懸濁後の細胞は、フレンチプレスにより、２経路で溶解された。不溶性物質は、１０，０００Ｇの遠心分離を２０分間行うことにより除去された。上澄みは保持され、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで抗体カラムに供された。その後、カラムは、２０カラム量のＰＢＳにより洗浄され、結合したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）により溶離され、その１ｍｌ画分が、２Ｍ Tris ０．０５ｍｌ（ｐＨ８．０）を含む管内に収集された。ｓｃＴＣＲを含む画分はプールされ、ＰＢＳ４リットルにより一晩透析された。次の日に、精製されたタンパク質は、セントリコン濾過装置（ｍｗ  １００カットオフ）を用いて、５〜１０倍に濃縮された。
得られたｓｃＴＣＲタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動、その後のクーマシー・ブリリアントブルー染色により評価された。タンパク質の完全度は、抗体Ｈ５７−５９７もしくは抗Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）標識抗体をプローブとして用いたウエスタンブロット分析により求められた。ＥＥ抗体は、９つのアミノ酸よりなる直鎖状エピトープ、EEEEYMPME（SEQ ID NO 98）（図１０）を認識する。Ｖ−β８．２立体配座エピトープに結合するその他２つの抗体（ＭＲ５−２抗体、およびＦ２３．１抗体（PherMingen））も、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製のために用いられた。また、Ｎｉ2+ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによるｓｃＴＣＲタンパク質の精製を容易とするため、６ＸＨｉｓ末尾（テール）が、いくつかの構造物（図６Ａ参照）に付加された。
図１０は、ｐＫＣ５１（レーン２）、ｐＫＣ４６（レーン３）、Ｈ５７抗体カラムで精製されたｐＫＣ４６（レーン５）、Ｈ５７カラムにおいて再度折り畳まれ、精製されたｐＫＣ４６（レーン６）由来のｓｃＴＣＲタンパク質の、発現を示すウエスタンブロットを表したものである。レーン７には、レーン１もしくは６と比較して約５倍量の融合タンパク質が付与された。分子量マーカーは、レーン１に示されている。可溶性カラム画分（レーン１）および不溶性カラム画分（レーン１０）からのフロースルーも示されている。レーン４および８はブランクである。該ブロットは、抗−ＥＥ標識モノクローナル抗体の1:5000希釈液を用いてプローブされ、その後、ヤギ  抗マウスＨＲＰ抗体の1:20,000希釈液を用いて視覚化された。着色は標準的な方法によって行われた。
実施例７−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特徴分析（characterization）
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特徴分析のために、抗−αβＴＣＲ  ｍＡｂｓパネルが使用された。ハムスターｍＡｂであるＨ５７−５９７は、Ｃ−β領域上のエピトープを認識する。競合テストが行われ、ＭＲ５−２とＨ５７−５９７との競合効果が示された。このことは個々の抗体により接合されるエピトープは近位であることを示唆している。同じＴＣＲ分子に工学的に導入された、９つのアミノ酸よりなるＥＥ配列、および、遺伝子III・遺伝子VIIIタンパク質に特異性を有するポリクローナル  ヒツジ  抗−バクテリオファージ血清（Phermacia）等の他の抗体もｓｃＴＣＲの特徴分析に使用された。
Ａ．分子量
ベクターｐＫＣ５１から発現されたｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供され、その後、クーマシーブルー（図１１参照）で染色された。図１１において、レーン２は、ＸＬ１−Ｂ細胞の１０ＯＤ／ｍｌ培養物から産生された融合タンパク質を示す。図１１のレーン３は、ｓｃＴＣＲを精製するのに使用されるＨ５７抗体カラムからのフロースルーを示す。図中のレーン４は、カラムからの精製ｓｃＴＣＲを示す。図１１のレーン１は、分子量マーカーを示す。ゲルの観察により、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ゲル内を約４６ｋＤの位置まで移動したことが明らかになった。この結果は、ｓｃＴＣＲは完全であることを示す。
図１２に示すウエスタンブロットは、４６−５０ｋｄの分子量を示すタンパク質の、ＥＥ−標識，バクテリオファージタンパク質、もしくはＣ−β領域内のエピトープそれぞれと結合する抗体を用いてプローブされた（図１２）。他のＤＮＡベクターから産生されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、同様の方法で分析された。
Ｂ．立体配座折り畳み（Conformational Folding）
ｐＫＣ６０  ＤＮＡベクターによってエンコードされた融合タンパク質は、抗−Ｖ−β８．２抗体（ＭＲ５−２およびＦ２３．１）および抗−idotype mab ＫＪ１（Dr.KapplerおよびMarrackの好意による提供）を用いた結合検定を行うことにより、その折り畳み構造の適切さのテストが行われた。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、抗−Ｖ−β８．２抗体と共に４℃で一晩インキュベートされ、翌日、ヤギ  抗−マウス被覆（coated）マグネティックビーズ（Dynal）と結合された。この物質は、さらに一時間、室温（ＲＴ）でインキュベートされた。免疫複合体は、標準的な手順により沈降された。その後、ビーズは、非特異的に結合したタンパク質を除去するために、０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌにより丁寧に洗浄された。４回の洗浄後、マグネティックビーズは、β-2  メルカプトエタノールを含有する、もしくは含有しないＳＤＳを含んでなる５０μｌのクラッキングバッファー内に再懸濁され、それぞれ３分間煮沸された。続いて、マグネティックビーズを除去し、その溶液は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、１２０ボルトで１時間さらされた。これにより、サンプルは電気泳動された。続いて、得られたブロットを、ＨＲＰ標識された抗−ＴＣＲ抗体（Phermingenより得られたＨ５７）もしくは抗−ＥＥ標識抗体でプローブすることにより、サンプルに対するウエスタンブロットが行われた（図１３）。
図１３は、抗−ＥＥ標識抗体の1:5000希釈液によりプローブされたウエスタンブロット、および、それに後続する、ヤギ  抗−マウス−ＨＲＰの1:20,000希釈液による視覚化の結果を示すものである。ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６２双方の培養物は、リン酸欠乏により誘導された。レーン１は、ｐＫＣ可溶性画分の１０ＯＤ／ｍｌサンプル１０マイクロリットルを示す。レーン２は、ＭＲ５−２モノクローナル抗体により形成された、ｐＫＣ６０由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫沈降を示す。レーン３は、ＭＡｂＦ２３．１を使用することを除いては、レーン２と同様にして得られた免疫沈降を示す。レーン４は、ＭＡｂＫＪ１により形成された、ｐＫＣ６０由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫沈降を示すものである。レーン５〜８は、ｐＫＣ６２由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質が分析されたこと以外は、順にレーン１〜４と対応する（同様の）ものである。全てのレーンは、誘導培養物からのものである。ｓｃＴＣＲタンパク質は、立体配座的に正しいＶ−β部を持つことが、このデータにより示唆される。
３．表面プラズマ共鳴分析（BiaCore）
ｐＫＣ５１によりエンコードされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、表面プラズマ共鳴分析により、さらにその特徴が分析された（図１４）。融合タンパク質はまず、ｓｃＴＣＲ分子をＭＲ５−２もしくはＨ５７抗体で被覆されたバイオセンサーチップ上に捕捉する、従来のサンドウィッチ検定により検出された。この検出は、概して製造者（Phermacia）の指示に従い行われた。一般的に、抗体の一方がｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕捉するために使用された場合、他方の抗体は、サンドウィッチ複合体を形成するために使用される。２つの抗体は、β鎖の異なる領域を認識し、ｓｃＴＣＲとの結合において競合することが、データにより示唆された（図１４）。図１５は、相互作用を概略的に示す。ｓｃＴＣＲは、抗−Ｍ１３抗体によって、さらに結合されることも可能であり、このことは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質上に、バクテリオファージタンパク質が存在することを示している。
スーパー抗原（例えば、ＳＡｇ）は、ＭＨＣフォーマットにおける提示とは無関係に、いくつかのＶ−β鎖と結合可能である。ＴＣＲとＳＡｇとの相互作用は、Ｖ−β鎖の高可変性４（ＨＶ４）領域で起こる。ＳＡｇとＨＶ４領域との相互作用は立体配座による。そのため、ｓｃＴＣＲタンパク質が、チップ上にコートされたＳＡｇと結合可能か否かを調べるために、表面プラズマ共鳴分析が使用された（図１６）。ＳＡｇは、ＴＣＲ  Ｖ−β８．２と結合することが知られている。表面プラズマ共鳴分析が行われたうち、報告されている最も高い親和性は５×１０-5モルであると信じられており、この相互作用が、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用と比較可能である。
ＳＥＣ３（Toxin Technology,Tempa FL.）として知られるStreptococcus ＳＡｇが、標準的なアミン結合化学的手法を用いてチップと結合された。精製されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、濃度約２μＭ〜１６μＭの範囲内で、かつ、流速２μｌ／ｍｉｎでチップ上を通過させた。コントロールとして、融合タンパク質とブランクチップとの非特異的結合の計測が、ＳＥＣ３により被覆されたチップとの特異的結合の計測実験と並行して行われた。結合データは、２つのチップ間での、ｓｃＴＣＲ結合の違いを比較することによりまとめられた。該データは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とチップ上のＳＥＣ３  ＳＡｇとの間には、特異的相互作用があることを示した。さらに、これらデータは抗体結合データをサポートし、ｓｃＴＣＲが立体配座的に正しいＶ−β８．２領域を含んでなることを示唆する（図１６）。
実施例８−ＯＶＡ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ結合分析における融合タンパク質の活性
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能と生物学的作用を調べるため、細胞ベースの競合（拮抗）阻害検定が使用された。一般的に、ＭＨＣ分子中に捕捉された抗原からＤＯ１１．１０細胞をブロックする目的で、上記実施例４で精製された融合タンパク質（Ｔ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０由来）が使用された。相互作用は、ＩＬ−２の産生を計測することにより検出された。
上述したように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能性をテストするための分析の例は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。特に、上記審査中の米国特許出願番号０８／５９６，３８７には、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定、該検定に使用される細胞（例えば、ＤＯ１１．１０）、ｓｃ−ＭＨＣクラスＩおよびII分子、特に、共有結合された、もしくは非共有的に結合された提示ペプチド（例えば、ＯＶＡもしくはＨＳＶｇＤ１２ペプチド）を有するｓｃ−ＭＨＣ  ＩＡdクラスII分子が開示されている。
Ａ）Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定
ｓｃＴＣＲ誘導タンパク質分子の機能性をテストするＴ細胞ハイブリドーマ検定は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。
簡単に説明すると、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ系統は、ニワトリ  オボアルブミン由来の１７アミノ酸よりなるＯＶＡペプチトフラグメント（アミノ酸３２３〜３３９）に特異性を有する細胞表面Ｔ細胞レセプターを発現する。ＯＶＡペプチドは、マウス  クラスIIＭＨＣ分子Ｉ−Ａｄを発現するＡＰＣにより、ＤＯ１１．１０細胞に提示される。ペプチドが、適切なＡＰＣにより提示された場合、ＤＯ１１．１０細胞は、ＩＬ−２を産生すべく応答し、これはＴ細胞活性の指標として使用することができる。Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定の例を以下に簡単に示す。
ｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡ複合体は、ＤＰＢＳ（Ｍｇ2+およびＣａ2+イオン非含有）により希釈され、９６ウェルプレートの有するウェルに受動的に供給された。ｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡペプチドは、共有結合された提示ペプチドを含んでいることが好ましい。室温で一晩インキュベートされた後、ウェルを、Ｍｇ2+およびＣａ2+イオン非含有ＤＰＢＳで、２回洗浄してもよい。約１×１０5ＤＯ１１．１０細胞は、０．５μg ＭＨＣ／ペプチド分子が供給されたウェルの存在化もしくは非存在化で、３５℃で４時間または７時間インキュベートされる。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特異性をさらに実証するために、ＩＡｄ制限型であるがＨＳＶペプチドを認識する、第二のＴ細胞ハイブリドーマ（ｇＤ）を使用することもできる。ｇＤＴ細胞ハイブリドーマは、上記の審査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，３８７に開示されている。この検定は、以下のことを実証するために行われる。すなわち、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ＤＯ１１．１０ハイブリドーマ細胞によるＩＬ−２産生を阻害可能であり、一方、ｇＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２の産生に対しては、仮にあるとしても、非常に小さい阻害効果を有することを実証するためである。培養は、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを添加してなるＲＰＭＩ１６４０）で、９６ウェル平底マイクロプレート上で行われた。４時間もしくは７時間のインキュベーションの後、ＩＬ−２の存在を調べるため、培養物の上澄みをＩＬ−２サンドウィッチＥＬＩＺＡ法により分析した。
適切なＩＬ−２検出プロトコールは、上記の公開ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。ここで行われるＩＬ−２サンドウィッチＥＬＩＺＡ法のプロトコールは、基本的には、PharMingenに説明されているものである。簡単に説明すると、ウェルは、２μｇ／ｍｌのラット  抗−マウスＩＬ−２抗体５０μｌによりコートされる。抗体を、４℃で一晩インキュベート後、これを受動拡散によりプラスチックに結合する。プレートは、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０により２回洗浄される。その後、細胞培養物の上澄み１００μｌがそれぞれのウェルに加えられ、室温で４時間インキュベートされる。その後、プレートは、ビオチニル化（biotinylated）ラット  抗−マウスＩＬ−２抗体、すなわち、第二の抗体が加えられる前に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄される。この抗体は、室温で１時間インキュベートされ、その後、該プレートは、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄される。最後に、２５μｇ／ｍｌのstrepavidnperoxidase１００μlが、各ウェルに加えられ、室温で３０分間インキュベートされる。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで8回洗浄後、ＡＢＴＳ基質１００μｌが加えられ、シグナルが、ＯＤ４０５ｎｍで読まれる。産生ＩＬ−２の濃度は、ＩＬ−２スタンダード曲線に対するプロットにより数量化された。ＤＯ１１．１０およびｇＤ１２細胞の活性化のためのＩ−Ａd／ペプチド分子の最適投与量は、最大反応よりも若干低めの反応を促すものである。従い、実験は、０．５μg Ｉ−Ａｄ／ペプチドでコートされたウェル、および、４時間もしくは７時間のインキュベーションにて行うことができる。
本発明の可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関し、その濃度１０-9〜１０-4Ｍの範囲内での、ＤＯ１１．１０細胞内におけるＩＬ−２の産生をブロックする能力についてテスト可能である。テストは、可溶性ｓｃＴＣＲとプレート上にコートされた可溶性Ｉ−Ａｄ／ペプチド分子とのモル比が、約１０：１から１：１の範囲内で行うことができる。濃度は、必要に応じて調節することができる。期待されることは、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質共存下でのプレインキュベーション後に、ｇＤ１２と比較して、ＤＯ１１．１０のＩＬ−２産生が低下することであり、これは可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が、ＴＣＲ特異的な免疫反応を抑制可能であることを示す。
ＴＣＲはＭＨＣ／ペプチドに対する結合親和性が低いので、阻害検定において、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いたＩＬ−２産生の低下が常に観察できるとは限らない。しかしながら、相互作用の親和性は、多価ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構築することにより増大できる。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の親和性を増大すること（また、その解離を妨げること）により、ＭＨＣ／ペプチド複合体と結合する機会が与えられるＴＣＲ量がより少なくなると考えられている。
実施例９−多価融合タンパク質の調製
多価分子をつくるには、広く知られた方法がいくつかある。多価融合タンパク質は、標準的な方法でｓｃＴＣＲをビオチニル化し、その後、分子に対し、streptavidin添加後、架橋することで得られる。biotin-streptavidin接合によれば、通常、４量体型の多価融合タンパク質が形成される。
多価融合タンパク質は、公知の方法（例えば、Newman,S.L.et al.J.Immunol.（1995）154,753参照）に従って、融合タンパク質をラテックスビーズ（Polysciences,Inc.Warrington,PA）に共有結合することによっても作出できる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、アミン基もしくはジスルフィド基を介して、ビーズに直接結合することもできる。ｓｃＴＣＲの変性は、ラテックスビーズを、strepavidinもしくはｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗体でコートすることにより最低限にすることができる。例えば、上記のようにｓｃＴＣＲがＥＥ−標識を含む場合、ＥＥ−標識抗体は、ラテックスビーズをコートするために使用できる。
実施例１０−イン・ビトロでの抗原刺激性Ｔ細胞増殖に対するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の効果
上記の各実施例で形成された可溶性融合タンパク質に関し、抗体刺激性Ｔ細胞増殖の抑制能についてテスト可能である。このようなテストの例は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。
この公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、並びに、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている方法の一つでは、Ｔ細胞は、マウスなどの全ての哺乳類から単離することができる。例えば、完全フロイントアジュバント中の５０μｇＯＶＡ３２３−３３９−ＫＬＨを用いて、皮下注射により尾の付け根から免疫感作することで、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＭＨＣクラスII：Ｉ−Ａｄ）からＯＶＡ−ｐｒｉｍｅｄ  Ｔ細胞を得ることができる（Harlow and Lane,Supra参照）。例えば、７日間隔で２回の免疫感作を行うことが可能であり、２回目の注射から１週間後にマウスは解剖され、鼠蹊およびリンパ腺が切除され、これが分散されて単一細胞懸濁液が得られる。その後、単一細胞懸濁液はナイロンウールおよびSephadex G-10カラムでのインキュベーションにより、抗原提示細胞が取り除かれる。精製されたＴ細胞群は、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地のみ、もしくはＣｌｉｃｋ’ｓ培地に溶解されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質と共に、さらにインキュベートされる。
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の活性化Ｂ細胞を、従来のＢ細胞増殖検定（assay）において抗原提示細胞として用いる。例えば、Ｂ細胞は以下の方法で調製する。即ち、脾臓細胞に５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（即ち、リポサッカライド）を加えて４８−７２時間培養する。培養終了後、活性化された細胞を、Ficoll／Hypaque（Pharmacia製）を用いて密度勾配遠心分離により単離する。その後、活性化されたＢ細胞にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの存在下で３時間パルスをかけ、厳密に洗浄し、さらに、Ｂ細胞の増殖を阻害するべくパラホルムアルデヒドを加えて固定したものを、精製Ｔ細胞単独、あるいはＴ細胞と可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質との混合物に加える（Selected Methods in Cellular Immunol.（1980）B.B.Mishell and S.M.Hiigi W.H.Freeman and Co.San Franciscoを主に参照）。
標準のＢ細胞増殖検定は、９６ウェル丸底マイクロプレート中、３７℃、５％ＣＯ2条件下で、３−５日かけて行われる。ウェルに、ＷＳＴ−１（Boehringer Mannheim製）試薬を加えて４時間パルスをかけた後、培養を終結させる。その後、培養物の光学濃度を記録する。免疫感作（免疫付与）後のマウス中で起こったＴH細胞応答（即ち、クローンの増殖）は、ペプチド反応性Ｔ細胞の増殖度により示される。
実施例１１−イン・ビボにおける、抗原刺激性Ｔ細胞増殖に対するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の影響
可溶性融合タンパク質に対し、さらに、イン・ビボにおけるＴ細胞クローンの増殖阻害試験を以下の出願に記載された方法に従って行う。即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
例えば、３つの試験用グループを次のようにして準備する。即ち、１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、完全フロイントアジュバント中に混合されたＯＶＡ３２３−３３９−ＫＬＨを、腹膜腔内注射（ＩＰ）により約１０−１００μｇ投与し、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する免疫応答を誘導する。ＯＶＡ−ＫＬＨによる免疫感作の前日及び２日後に、５匹のマウスに対して、抗−ＯＶＡ／Ｉ−Ａｄ  ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をＰＢＳに加えたものを、ＩＰによる約１０−１００μｇ投与する。このｓｃＴＣＲはＩ−Ａｄ／ＯＶＡ  ＭＨＣクラスII分子に結合して、抗原特異的Ｔ細胞上のＴＣＲ分子がＡＰＣ上のＩ−Ａｄ／ＯＶＡ分子に結合するのを抑制あるいは排除する。残りの１０匹のマウスは、コントロールとして用いる。例えば、５匹のマウスにはＰＢＳを与え、他の５匹のマウスには異なる特異性を有するｓｃＴＣＲを与える。マウスは、免疫感作の１０日後に解剖する。リンパ節を除去し、これを分散することで、単一細胞の懸濁液を調製する。該懸濁液をナイロンウール上でインキュベートし、Sephadex G-10カラムにかけることにより、懸濁液から抗原提示細胞を取り除く。
得られた精製Ｔ細胞群に対し、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドと共にパルスをかけたＡＰＣを加え、該精製Ｔ細胞群をインキュベートする。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の活性化されたＢ細胞を、増殖検定におけるＡＰＣとして用いる。Ｂ細胞は以下の方法で調製する。即ち、マウスの脾臓細胞に５０μｇ／ｍｌのＬＰＳを加えて４８−７２時間培養する。培養終了後、活性化された細胞を、Lymphoprepを用いた密度勾配遠心分離により単離する。その後、活性化されたＢ細胞にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを加えて３時間パルスをかけ、厳密に洗浄し、さらに、Ｂ細胞の増殖を阻害するべくパラホルムアルデヒドを加えて固定したものを、精製Ｔ細胞に加える。
Ｔ細胞増殖検定は、９６ウェル丸底マイクロプレート中、３７℃、５％ＣＯ2条件下で、３−５日かけて行う。ウェルにＷＳＴ−１試薬を加えて４時間パルスをかけた後に培養を終結させ、異なる波長における吸光度を読みとる。免疫感作後のマウス中で起こったＴh細胞応答（即ち、クローンの増殖）は、この検定におけるペプチド反応性Ｔ細胞の増殖度により示される。予想されることは、ＯＶＡ−ＫＬＨあるいはＨＳＶ−ＫＬＨによる免疫感作を行うとともに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の投与を行ったことにより、クローンの増殖量が制限され、それに続くＯＶＡ反応性Ｔ細胞系のイン・ビトロにおける増殖は、ＨＳＶ反応性Ｔ細胞系の増殖に影響を及ぼすことなく、制限されるということである。
実施例１２−マウスの自己免疫疾患の抑制
実験用アレルギー性脳髄炎（experimental allergic encephalomyelitis（ＥＡＥ））は、マウスの自己免疫疾患であり、一般に多発性硬化症に対応する動物モデルと考えられている。２つのタンパク質の起脳炎領域、すなわちミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ  アミノ酸９１−１０３）及びプロテオリポタンパク質（proteolipoprotein）（ＰＬＰ  アミノ酸１３９−１５１）の起脳炎領域は決定されている（Martin,R.et al.Ann.Rev.Immunol.（1992）10:153を主に参照）。
ＳＪＬマウス系統では、ＥＡＥの誘導・発症は、起脳炎ペプチドによる免疫感作、あるいはＭＢＰ反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達によってもたらされる。可溶性の抗−ＭＢＰ９１−１０３Ｔ細胞受容体（レセプター）、又は可溶性の抗−ＰＬＰ１３９−１５１  Ｔ細胞レセプターのうち、いずれにより処理するとＴ細胞活性化後のＥＡＥの発症が防止されるかを決定するために、ＳＪＬマウスに対してＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ芽細胞、及びＰＬＰ１３９−１５１反応性Ｔ芽細胞をイン・ビボで投与する。このようなマウスにおいてＴ細胞の増殖を検出する適切な方法は、以下の出願に記載されている。即ち、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
また、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７は、さらに以下の内容を記載している。即ち、ＳＪＬマウスでＥＡＥを誘導するには、ＳＪＬマウスの背（dorsum）に対し、完全フロインド・アジュバント中のＭＢＰ９１−１０３を約４００μｇ投与して免疫感作する。１０−１４日後、部分的に流れ出た（regional draining）リンパ系細胞を上述のように収集し、２４ウェルプレートで培養する。該細胞の濃度は、１ウェルあたり細胞６×１０6個とし、１．５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地／１０％ウシ胎児血清／１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ＭＢＰ５０μｇ／ｍｌ中で培養する。４日間イン・ビトロで刺激を与えた後、ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ芽細胞を、Ficoll／Hypaque密度勾配（Pharmacia製）により収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１．３×１０7個の該細胞を個々のマウスに投与する。
起脳炎ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ細胞を与えたマウスには、さらに以下のものを投与する。即ち、ＭＢＰ９１−１０３特異的ｓｃＴＣＲ融合タンパク質約１００μｇ（IAsコンテクスト（context））、ＰＬＰ１３９−１５１特異的ｓｃＴＣＲ融合タンパク質１００μｇ（ネガティブコントロール）、あるいは生理食塩水（模擬コントロール（sham control））を、その同日、３日後、７日後に、静脈注射（i.v.）により投与する（トータル投与量３００μｇ）。続いて、臨床評価または組織学的評価を行い、ＭＢＰ９１−１０３＋ＩＡｓに対し反応性を有するｓｃＴＣＲ分子が、マウス中のＥＡＥの発症を阻害したことを確認する。
上記公開ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７に記載のように、ＰＬＰペプチド１３９−１５１によりＳＪＬマウス中でＥＡＥを誘導するために、ＰＢＳに溶解したＰＬＰペプチド１３９−１５１と、マイコバクテリア結核菌Ｈ３７Ｒａを４ｍｇ／ｍｌで含有する完全フロイントアジュバントとを１：１の割合で混合したものを、該マウスに投与して免疫感作する。これにより、マウスに１５２μｇのペプチド−アジュバント混合物を投与する。その同日及び４８時間後に、すべてのマウスに百日咳毒素を４００ｎｇ与える。その後、ＥＡＥの養子免疫伝達を上述のように行う。
上述の方法に従って（実施例１参照）、ＴＣＲ  ＤＮＡを、正常なＳＪＬマウス及びＥＡＥ疾患のＳＪＬマウスから得る。そして、ＴＣＲ  ＤＮＡを用いてｓｃＴＣＲを構築する。ｓｃＴＣＲは、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントを有する適切なＤＮＡベクターにライゲーションされる。その後、ＰＬＰ反応性ｓｃＴＣＲペプチド融合物あるいはＭＢＰ反応性ｓｃＴＣＲペプチド融合物を発現させ、上記実施例に従い、必要に応じて精製する。そして、これらのｓｃＴＣＲペプチド融合タンパク質に対し、ＥＡＥの発症防止能試験を行う。
以下の実施例１４及び１５に述べるように、ＰＬＰ  ｓｃＴＣＲ融合タンパク質及びＭＢＰ  ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いて、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを作成することもできる。そのｓｃＴＣＲバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリから、ＩＡsと共同して、ＭＢＰ（９１−１０３）ペプチドあるいはＰＬＰ（１３９−１５１）ペプチドに結合するレセプターをスクリーニングする。以下の実施例１５においてさらに詳しく述べるように、結合したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、適切なパニング技術（panning technique）により単離される。このようにして得られたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成に用いる。そして、この可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関し、ＳＪＬマウスの自己反応性Ｔ細胞に対する阻害作用の評価を行う。
実施例１３−ｓｃＴＣＲ抗原結合領域の親和性向上
親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対しては、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体との不所望な相互作用を抑制あるいは排除する作用が期待される。不所望な相互作用とは、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び移植時の拒絶反応において生じるものである。親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、例えば、対応するネイティブＴＣＲと競合して、ＴＣＲを有するＴ細胞とＭＨＣ／ペプチド分子を有するＡＰＣとの結合を抑制あるいは排除する。あるいは、該ｓｃＴＣＲ分子はスーパー抗原との結合を抑制する。ネイティブＴＣＲは、結合の親和性が弱く、また、解離速度が速いので、多くのｓｃＴＣＲ融合タンパク質が単一のＭＨＣ／ペプチド分子と相互作用することができると考えられている。
親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いて、自己反応性Ｔ細胞を活性化するＭＨＣ／ペプチド分子との結合を抑制あるいは排除することができる。これを実現するためには、遺伝子工学（例えば、部位特異的突然変異の誘導あるいはリンカー走査突然変異（site directed or linker scanning mutagenesis）の誘導）を利用し、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の親和性を改善すること、特に解離速度を向上することにより実現される。従来の結合検定は、タンパク質の解離速度を研究するために行われてきた。ｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗原性ペプチドの配列が分かっているか、あるいはすぐに決定できるものである場合は、該ペプチドを、例えば、アラニン走査突然変異（alanine scanning mutagenesis）の誘導により突然変異させ、ｓｃＴＣＲのＣＤＲ３領域に特異的に結合する残基を同定する。突然変異した抗原性ペプチドとｓｃＴＣＲとの結合は、本願で述べる結合検定により評価する。従って、このペプチドにおいて同定されたアミノ酸残基は、ｓｃＴＣＲ分子における接触残基（contact residue）の同定を可能にする。好ましくは、この方法で生成されたｓｃＴＣＲタンパク質突然変異物が、ＴＣＲの抗原に対する結合特異性、及び抗体の親和性を有することである。改良ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成方法としては、上述したように突然変異融合タンパク質を生産することによって行われる。
改良ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、以下の実施例に述べるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、自己反応性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を単離することにより生成できる。そして、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、ＰＬＰタンパク質及びＭＢＰタンパク質から得られるペプチドに共有結合するＩＡs分子を捕捉することができる。一旦ｓｃＴＣＲを単離すれば、ｓｃＴＣＲタンパク質突然変異物により、上述したように、ペプチド接触残基のさらなるキャラクタリゼーションを行うことができる。
実施例１４−バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成
上記実施例１においては、ＤＮＡベクターｐＫＣ４６及びｐＫＣ５１を用いて、ＩＰＴＧ誘導後、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージ表面上にディスプレイ（呈示）した。バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成は一般的に知られており、これを用いれば、約５０ＫＤまでのポリペプチドやタンパク質をディスプレイすることができる（Smith,G.P.and Scott,J.K.in Methods in Enzymology（1993）217:228を主に参照）。
要約すれば、２x Luria Broth（ＬＢ）＋０．５％グルコース、及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを入れたフラスコに、大腸菌系統、即ち、プラスミドベクターｐＫＣ４６あるいはｐＫＣ５１を含むＸＬ１−Ｂ細胞を接種した。一晩成長させた後、遠心分離により細胞をペレット状にし、グルコース非含有２x ＬＢに再度懸濁させた。再び細胞を遠心分離し、２x ＬＢ中で２回洗浄した。２回目の洗浄の後、細胞をもう一度５０ｍｌの２x ＬＢに懸濁し、ここにＩＰＴＧを加えて最終濃度を１ｍＭとした。細胞を２時間、３７℃で成長させた後、ヘルパーバクテリオファージであるＶＣＳＭ１３を、細胞培養物５ｍｌ当たり１０ｐｆｕ加えた。１５分後、ＸＬ１−Ｂ細胞、及びヘルパーバクテリオファージの混合物を、テトラサイクリン、アンピシリン、及び１ｍＭのＩＰＴＧを含む加温した２x ＬＢ中に入れて５０倍に希釈した。１時間、３７℃で成長させた後、培養物にカナマイシンを加えてヘルパーバクテリオファージに感染した細胞を選択した。細胞培養物を一晩成長させ、その次の日に、２段階のＰＥＧ沈殿を行ってからバクテリオファージを精製した。大量の残留物をサンプルから除去するために、精製したバクテリオファージ調製物を、０．２ミクロンのフィルタにかけた。さらに、１００セントリコン・メンブレン（centricon membrane）（１００ｍｗカットオフ）を用いて１％ＦＢＳ／ＰＢＳ中でサンプルを洗浄し、残留ＰＥＧをバクテリオファージ調製物から除去した。バクテリオファージの力価は、プレート上で成長するコロニーをカウントして決定した。この力価の決定は、バクテリオファージを１０倍に連続希釈し、希釈したサンプルと感染力に優れたＸＬ１−Ｂ細胞とを混合し、アンピシリンを含む２x ＬＢ寒天上に該混合物を載せて行った。バクテリオファージの力価は、約１０10〜１０14ｃｆｕ／ｃｅｌｌの範囲内であった。
２回目のＰＥＧ沈殿後、バクテリオファージを、０．２ミクロンのフィルタにかけて不要な粒子及びバクテリアを取り除いくことで殺菌した。フィルタにかけた調製物は、その後、セントリコン１００（１００ｍｗカットオフ）フィルタを用いて厳密に洗浄し、バクテリオファージを濃縮し、バッファを１％ＦＢＳ／ＰＢＳに交換した。
実施例１５−バクテリオファージライブラリのキャラクタリゼーション
Ａ）ＥＬＩＳＡ検定
ＴＣＲ特異的ＥＬＩＳＡ検定を行って、バクテリオファージ表面にディスプレイされたＴＣＲ分子を分析した。要約すれば、９６穴プレートを、コーティングバッファ（ｐＨ９．０）中のneutrAvidin（Pierce）、２００ｎｇ／ｗｅｌｌ量によりコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、５％無脂肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）により１時間ブロック後、抗−α，βＴＣＲ（Ｈ５７）ビオチンラベル（標識）抗体あるいは抗−Ｖ−β８．２（ＭＲ５−２）ビオチンラベル抗体を、２．５％ＮＦＤＭを含んだ１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に希釈した。そして、希釈した抗体をそれぞれウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．５％）（ＴＢＳＴ）中で６回洗浄し、該プレートに結合していない抗体を除去した。
バクテリオファージ上で発現した融合タンパク質の検出は、抗体コーティングしたウェル中で、１時間、室温条件下でバクテリオファージ粒子をインキュベートすることによって行った。プレートをＴＢＳＴで６回洗浄した後、２．５％ＮＦＤＭ中に希釈した抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（Pharmacia）を加えた。１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳＴで８回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、１０分後、１Ｍ硫酸１００μｌを加えて反応を停止した。そして、プレートの４５０ｎｍでの吸光度を読み取った（図１７）。また、コントロールバクテリオファージ（ＣＡIII遺伝子III抗体ライブラリから調製）に対し、抗体Ｈ５７及び抗体ＭＲ５−２への非特異的結合試験を行った。さらなるコントロールとして、ｗ／ＢＳＡあるいは抗−Ｖ−β１７をコーティングしたウェルに対する非特異的結合検定も行った。
図１７及び１８に示すのは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の、非誘導状態（即ち抑制解除状態）及び誘導状態におけるＥＬＩＳＡ分析の結果である。図１７はｐＫＣ４６から生成したｓｃＴＣＲ融合タンパク質の分析結果、図１８はｐＫＣ５１から生成した融合タンパク質の分析結果を示す。各図において、黒塗りのバーは非誘導状態での培養物を示し、より明るい色のバーは誘導状態での培養物を示す。図１７及び１８から分かることは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がバクテリオファージ・ライブラリで発現され、バクテリオファージの表面にディスプレイされたということである。４５０ｎｍでの吸光度を比較すると、誘導によりｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現しているバクテリオファージ調製物は、非誘導のバクテリオファージ調製物の約６０−２００倍大きかった（図１８）。ＥＬＩＳＡ検定によって検出されたレベルを比較すると、遺伝子VIIIｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージは、遺伝子IIIｓｃＴＣＲ融合物をディスプレイするバクテリオファージの約２００−５００倍高かった（図１７）。この結果から、ＴＣＲ／遺伝子VIIIバクテリオファージは、多数のｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージ表面に発現していると考えられる。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のバクテリオファージ・ディスプレイの多価性により、ＭＨＣ／ペプチド複合体を捕捉する機会が増大する。これは、多価であるため結合活性が強くなるからと理由づけられる。
Ｂ）バクテリオファージ・ライブラリにディスプレイされた融合タンパク質の活性
バクテリオファージ上の融合タンパク質が生物学的に活性であることを実証するために、ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合物をディスプレイするバクテリオファージに対し、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞上のＴＣＲと固定化ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子との特異的相互作用の阻害能の分析を行った。ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞系及び一本鎖ＭＨＣ分子を用いて上記のような相互作用を検出する模範的な検定については、上述した通りである。
ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマ及びＩＡｄ／ＯＶＡの系は、上記実施例８に示した方法にほぼ沿うように用い、バクテリオファージ上に発現したｓｃＴＣＲ（以下、ｓｃＴＣＲ／バクテリオファージ分子と呼ぶこともある）存在下でのＩＬ−２レベルの低下を測定した。実験の結果、バクテリオファージ上で発現したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、固定化ＩＡｄ／ＯＶＡと相互作用したことが分かった。これは、ＩＬ−２レベルが、ｓｃＴＣＲ／バクテリオファージ分子の入ったウェルにおいて低下したためである。これに対して、同じ力価のコントロールバクテリオファージ（ｓｃＴＣＲをディスプレイしない）を加えてインキュベートしたウェルにおいては、阻害作用の低下は見られなかった。従って、バクテリオファージ上で発現したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は生物学的に活性である。
阻害作用の細かな特異性を試験するために、ＤＯ１１．１０とｇＤ１２  Ｔハイブリドーマとの間で阻害レベルを比較する検定を行った。
実施例８にて述べたように、ｇＤ１２  Ｔ細胞ハイブリドーマは、ＩＡd制限（ＩＡdrestricted）であるが、ＨＳＶ−１由来のペプチドを認識する。両細胞ともＩＡdにより制限されたペプチドを認識するという点を考慮すると、バクテリオファージ上で発現したＤＯ１１．１０由来のｓｃＴＣＲは、ＩＡd／ＨＳＶ−１分子と何らかの相互作用をする可能性があると考えられる。ただし、この相互作用はＩＡd／ＯＶＡ  ＭＨＣ／ペプチド分子との相互作用に比べてかなり弱いものであると考えられる。図１９Ａに示すように、低レベルのＩＬ−２阻害がｇＤ１２  Ｔ細胞ハイブリドーマグループには見られるものの、ＤＯ１１．１０グループでのＩＬ−２阻害レベルは約８−１０倍高かった。図１９Ａにおいては、約８〜２５０×１０10個のファージを各実験で用いた。ＣＡIIIとは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイしないコントロールファージを指す。図１９Ｂに示すのは、関連実験の結果であり、その実験では、ＩＬ−２の産生がＤＯ１１．１０  Ｔハイブリドーマ細胞から測定された。
Ｃ）融合タンパク質のバイオパニング（BioPanning）
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示するバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、公知の方法に従って特異的ＴＣＲ分子を捕捉する（例えば、McCafferty,J.et al.Nature（1990）348:352;Castagroli,L.et al.J.Mol.Biol.（1991）222:301;Lebeddee,S.L.et al.PNAS（USA）（1992）,89:3175;Smith,G.P.and Scott,J.K.supra;Blake,J.et al.J.Exp.Med.（1996）184:121参照）。従来の捕捉技術は一般に、標的抗原と抗体との相互作用の強さに依存している。その強さは、典型的には１０-6〜１０-8の範囲内にある。しかしながら、ほとんどのＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用は、典型的には５×１０-5Ｍの範囲であり、ＫＤ値とともに弱くなる。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＭＨＣ／ペプチド複合体との結合活性（avidity）及び結合価は、ファージ上に発現する融合タンパク質の数を増やすことによって増大させることができる。他に採用できる戦略としては、洗浄の厳密さを変える、抗原の量を増やす、温度を下げて解離速度を小さくする、インキュベーション時間を長くするなどが挙げられる。
ｉ）抗体捕捉
ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲ融合タンパク質特異的抗体を用いて、ｓｃＴＣＲ分子を捕捉した。要約すれば、複数のマイクロウェルに２００ｎｇのneutrAvidinをコーティングした後、Ｃ−βドメイン、Ｖ−β８．２ドメイン、あるいはＶ−β１７を認識する非特異的抗体に結合するビオチンラベル抗体を加えてインキュベートした。非特異的結合に関しては、ＢＳＡをコーティングしたウェルを用いた場合について調べた。実験は、２×１０6個のＴＣＲ／遺伝子VIIIバクテリオファージ粒子を、無関係の抗体バクテリオファージバンク由来の１×１０11個の粒子に希釈して行った。即ち、最終的には１：５０，０００の希釈を行った。抗−ＴＣＲ抗体（Ｈ５７）あるいは抗−Ｖ−β８．２抗体（ＭＲ５−２）の両方に対する集積（enrichment）を１ラウンド行ったところ、５０００倍の集積が見られた。一方、ＢＳＡネガティブコントロールでは、集積が特異的であることを示唆するような陽性クローンは全く得られなかった。１ラウンドでの２０〜１００００倍の集積は、抗体抗原捕捉実験においてはまれではない。したがって、本実験で見られた集積は、報告されている集積実験の許容範囲内にあることが分かる。
ii）細胞捕捉（cell panning）
細胞捕捉は、細胞表面タンパク質に対する抗体の単離を行う方法として、従来より定番である。この方法は、実施例１８にて作成したバクテリオファージ・ライブラリの中から、求める融合タンパク質をスクリーニングする際に容易に適用できる。細胞捕捉に用いる細胞は、任意の適切な細胞源から得られる。例えば、ＭＨＣ／ペプチド分子を発現する細胞、あるいは審査中のＵＳ出願シリアル番号０８／５９６，３８７に記載のような、適当なペプチドが結合可能な空のＭＨＣ複合体を含む細胞である。さらに、一本鎖クラスＩＭＨＣ遺伝子、あるいは一本鎖クラスIIＭＨＣ遺伝子によりトランスフェクトされてなる細胞であり、該細胞中で適当なペプチドがＭＨＣ複合体に結合あるいは共有結合したものも利用できる。適切な一本鎖クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体、あるいは一本鎖クラスIIＭＨＣ／ペプチド複合体を有する細胞の例は、以下の出願に記載されている。即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号published  ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
一般に、適切なＭＨＣ複合体を発現する細胞を用いて捕捉すると、いくつかの利点が得られる。即ち、そのような細胞の利用可能な供給量を増大できること、時間のかかるＭＨＣ／ペプチド複合体の精製を行わずに済むことなどである。
細胞捕捉の方法の一例としては、以下の方法が挙げられる。即ち、エッペンドルフチューブ（１．７ｍｌ）中で、約２×１０6個のＤＯ１１．１０バクテリオファージを含むトータル約１０11個のバクテリオファージを体積０．２ｍｌの１０6個の細胞と混合し、４℃で２時間インキュベートする。その後、５０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離して細胞をペレット状にし、氷冷したＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ（０．５％ｗ／ｖ）中で５回洗浄する。続いて、５０μｌ、ｐＨ５．０のクエン酸バッファを加えて、細胞からバクテリオファージを溶離する。集積されたバクテリオファージは、大腸菌に感染させて一晩培養することにより、その数を増大させることができる。その後、バクテリオファージを、例えば上記実施例１４にて述べたような標準の手順で精製する。５ラウンドの集積の後、コロニーの中からランダムにサンプリングしたものを取出し、その遺伝子配列を解析する。ＤＯ１１．１０  ＴＣＲ遺伝子の発見頻度により、さらなる集積が必要かどうかを決める。例えば、ＤＯ１１．１０  ＴＣＲ／バクテリオファージの開始時の希釈割合が１：５００００であれば、５ラウンドの集積後にその発見頻度が増大していることが予想される。このときの増大は、約１０００−２０００倍の範囲にあることが予想される。
iii）ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体を用いた捕捉
可溶性ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体の生成は、例えば、昆虫細胞において、上記の公開ＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７に記載の方法に従って行う。
昆虫細胞中で生産された可溶性ｓｃＭＨＣ／ペプチド分子を用いて、可溶性融合タンパク質を発現するバクテリオファージを捕捉する。例えば、ある量のｓｃＩＡd／ＯＶＡ（例えば１−１０μｇ／ウェル）を用いて９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）をコーティングする。続いて、２×１０6個のＤＯ１１．１０バクテリオファージを、トータルで１０11個のバクテリオファージに希釈し（１：５００００）、固定化ＩＡd／ＯＶＡ共存下でインキュベートした。２時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳＴ中で５回洗浄する。結合したバクテリオファージは、１００μｌの０．１Ｍ塩酸／グリシンを加えて溶離する。結合したＤＯ１１．１０  ＴＣＲ／バクテリオファージの頻度決定は次のようにして行う。即ち、標準コロニーリフト（standard colony lifts）を行い、タンパク質標識に対する抗体（例えば、上述の抗−ＥＥ標識抗体）、あるいはＤＮＡ特異的プローブを用いて陽性なものをスクリーニングする。ＤＮＡ特異的プローブとしては、例えばラベルされた３００ｂｐ  α鎖ＤＮＡプローブがあり、Amershamから得られる。タンパク質標識に対する抗体あるいはＤＮＡ特異的プローブはそれぞれ、ｓｃＴＣＲ遺伝子あるいはｓｃＴＣＲ遺伝子産生物を認識する。
実施例１６−融合タンパク質の蛍光利用細胞選別同定
蛍光利用細胞選別（Fluorescence Assisted Cell Sorting）（ＦＡＣＳ）は、細胞の検出及び選別に用いる定番の方法である（例えば、Davey,H.M.and Kell,D.B.in Microbiological Reviews（1996）60:641;and Darzynkiewca,Z.et al.（1994）in Flow Cytometry 2nd Ed.,Vols.41 and 42 Academic Press,New York参照）。ＦＡＣＳにより、細胞とｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージとの相互作用を検出する。ＦＡＣＳ実験を行うために、ｓｃ−ＩＡd／ＯＶＡ複合体を発現する細胞を上述のようにして生成した。ＩＡd特異的抗体ＡＳＭII−ＦＩＴＣ（Pharmingen）による染色を行い、細胞がＩＡdを発現したことを確認した。ＯＶＡペプチドがＩＡdグルーブに存在することを確かめるために、以下の出願に記載のように、Ｔ細胞活性検定を行う。即ち、上述の公開ＰＣＴ国際出願番号published  ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
様々な色素原を用いてＦＡＣＳ解析用のバクテリオファージをラベルできる。１つのアプローチとしては、バクテリオファージにフィコエリトリン（phycoerythrin）などの適切な色素原を結合させる。別のアプローチとしては、Flurotag FITC複合キット（Sigma,St.Louis,MO）に示されているような公知の方法に従って、バクテリオファージにＦＩＴＣを結合させる。また別のアプローチとしては、フィコエリトリンとバクテリオファージとを間接的に結合させる。即ち、まずバクテリオファージをビオチニル化（biotinylating）し、それにstrepavidn−フィコエリトリンを結合させる。さらに別のアプローチとしては、異なるフルオレセイン標識を有するような２つの抗体アプローチを用いる。具体的には、一方の抗−バクテリオファージ抗体をＦＩＴＣでラベルし、ｓｃＴＣＲに対する２つめの抗体（例えばＨ５７）をフィコエリトリンでラベルする。
バクテリオファージ結合方法としては、例えば次のようなものがある。即ち、１０12ｃｆｕのｐＫＣ５１ファージをバッファ交換して０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファ（０．２ｍｌ、ｐＨ９．０から９．５）に入れる。Flurotag FITC複合キットを用いて、ＦＩＴＣの入ったバイアルに０．１Ｍ炭酸−重炭酸溶液１ｍｌを混合し、すべてのＦＩＴＣが溶解するまで攪拌する。ＦＩＴＣラベル約５０μｌをバクテリオファージ調製物に加え、ＦＩＴＣのファージに対する最終比率を４０対１とし、フルオレセイン／タンパク質（Ｆ／Ｐ）モル比を適切なものにする。そして、サンプルをチューブに入れ、アルミホイルで覆って２時間インキュベートする。ラベルされたバクテリオファージは、サンプルをG-25 Sephandexカラムにかけることによって単離する。典型的には、ラベルされたバクテリオファージは主画分（例えば画分６〜８）に含まれる。Ｆ／Ｐモル比は、その後、分光光度計を用いて２８０ｎｍ及び４９５ｎｍでの吸光度を読み取って決定する。Ｆ／Ｐモル比を決定するのに用いる式は次のようなものである。
Molar F/P=2.77×A495/A280（0.35×Ａ495）
複合サンプルの吸光度の読み取り値は、０．３から１．０の間に適切におさまるべきである。
ＦＩＴＣラベルされたファージは、従来のＦＡＣＳ方法に従って、ｓｃ−ＩＡd／ＯＶＡ複合体を発現する細胞を添加してインキュベートする。これにより、細胞に結合するバクテリオファージを検出する。結合したバクテリオファージを細胞から溶離し、標準的方法に従って増殖させる。
実施例１７−バクテリオファージｆ８８におけるｓｃＴＣＲ融合タンパク質のクローニング及び発現
上述の捕捉方法で用いているのは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイさせるために、野生型繊維状（filamentous）バクテリオファージ（即ち、ＶＣＭＳ１３）をさらにに感染させた、ファージミド形質転換細胞（phagemid-transformed cell）を用いるものである。この方法は、次のようにすれば改善できる。即ち、組換えｓｃＴＣＲ構築物をより効率よく包含（パッケージング）可能なバクテリオファージベクターを用いればよい（これにより、ビリオン全体数当たりの組換え分子の収率が上がる）。例えば、バクテリオファージｆ８８−４は、８８型ベクター（９２７３塩基対）で、遺伝子VIII遺伝子を２つ含む。そのうち一方は野生型で、他方は組換え遺伝子をディスプレイする（即ち、遺伝子VIII遺伝子融合体）。バクテリオファージｆ８８−４は、ワシントン大学のG.Smith博士から得られる。バクテリオファージｆ８８−４は、遺伝子VIII構築物のパッケージングを効率よく行うので、収率が最大１０％向上する。この収率の向上は、組換えビリオンの多重度（即ち、ビリオン全体数当たりの組換え分子の数）が増加するためであると考えられている。この収率の向上により、１個のビリオン当たり約３００個のｓｃＴＣＲ融合タンパク質が構築されると考えられる。従って、ｆ８８−４バクテリオファージは、収率と多重度を増加させ、標的への結合活性を向上させ、その結果、特異的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質の単離率を増大させる。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を含む組換えバクテリオファージの構築は、ｆ８８−４バクテリオファージのＰｓｔＩ部位及びＨｉｎｄIII部位にｓｃＴＣＲ遺伝子をクローニングすることによって行った。導入されたｓｃＴＣＲ遺伝子の発現は、従って、ｔａｃプロモーターの制御下で行われ、その誘導は１ｍＭのＩＰＴＧ添加後に起こる。
図２０に概略的に示すのは、いくつかの組換えバクテリオファージベクターであって、ｆ８８−４バクテリオファージ（ｐＫＣ７０、ｐＫＣ７１、及びｐＫＣ７２）を用いて生成したものである。
実施例１８−ＨＩＶ感染細胞からのｓｃＴＣＲバクテリオファージ・ライブラリの構築
ＨＩＶ感染患者のＣＴＬ由来の、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージ・ライブラリを、ここで述べる方法により作成する。ＨＩＶ感染患者としては、長期非進行であると診断あるいは類別されている患者（即ち、ＬＴＮＰ）を対象とする。こういったＨＩＶ感染患者は、ｇａｇやｐｏｌ等の様々なＨＩＶウイルス抗原に対するＣＴＬ応答の、研究対象とされてきた。このような患者からのＣＴＬプロファイルは、典型的には、ＡＩＤＳになりやすい患者に比べて、ＨＩＶ抗原に対して強い免疫活性を示す（Miedema,F.and Klein,M.R.Science（1996）272,505を主に参照）。
ＣＴＬ応答に関わるＴＣＲを同定し、対応する融合タンパク質を構築するために、クラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２制限ヒトＴＣＲライブラリをＴ細胞から作成する。このＴ細胞は、上述の実施例で述べた方法によりＬＴＮＰ患者から単離する。
いくつかの方法によりクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２制限バクテリオファージ・ライブラリを調製できる。例えば、１０7個のＴ細胞を、３人のＨＬＡ−Ａ２  ＬＴＮＰ患者から、上記のようにして単離し、プールする（Altman,J.D.et al.Science（1996）274:94参照）。メッセンジャーＲＮＡを、これらの細胞、及び標準的手順で得たｃＤＮＡから精製する。標準的手順とは、ヒトのＣ−αＴＣＲ及びＣ−βＴＣＲに対応のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるなどの方法である。模範的なプライマーを図２２（SEQ ID NOs.:116-128）及び図２３（SEQ ID NOs.:101-115）に示す。具体的には、Ｖ−α遺伝子は、１２個のフォワードプライマー（図２２ SEQ ID NO.116-127）、及びＣ−α遺伝子配列の５’末端にハイブリダイズする１つのバックプライマー（SEQ ID NO.:128）を用いてＰＣＲ法により増幅される。β鎖は、Ｖ−β鎖の５’末端にハイブリダイズする１３個のフォワードプライマー（図２３，SEQ ID NOs:101-113）、及びβ不変領域中３７８塩基に置かれた２つのバックプライマー（図２３ SEQ ID NOs:114,115）を用いてＰＣＲ法により増幅される。ＰＣＲ法による増幅は標準の方法に従って行う。
ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡは、例えば、実施例１４に記載のＤＮＡベクターのような、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントを発現する適切なＤＮＡベクターに導入される。詳しくは、実施例２で述べたｐＫＣ４５  ＤＮＡベクターを用いて、Ｖ−α鎖をベクターのＳｆｉＩ部位及びＳｐｅＩ部位にサブクローニングし、Ｖ−β／Ｃ−β鎖をベクターのＸｍａＩ部位にクローニングする。そして、ｓｃＴＣＲバクテリオファージ融合タンパク質をエンコードする適切なベクターを上述の実施例に従って生成する。あるいは、Ｖ−α鎖及びＶ−β／Ｃ−β鎖を、例えば挿入可能なＨｉｎｄIII−ＰＳＴＩフラグメントとして、ｆ−８８バクテリオファージベクターに（実施例１７参照）サブクローニングする。このようにして生産された組換えバクテリオファージを適切な宿主細胞に感染させ、上述の実施例に従って該組換えバクテリオファージを増殖させスクリーニングする。
場合によっては、標準的な組換え技術に従ってｆ８８バクテリオファージのクローニング部位を修飾し、例えば適切なリンカー配列を組み込むことによって、特定のフラグメント（例えばＳｆｉＩ−ＸｍａＩフラグメント）のクローニングを可能にすることも望ましい。このような修飾を実現するには、例えば、適切な制限部位プライマーをバクテリオファージのＨｉｎｄIII部位及びＰｓｔＩ部位にアニーリングする。このようにして生産したバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを、標準の手順に従って増殖させ、保管する。
実施例１９−ＨＩＶ感染細胞由来のバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリのスクリーニング
実施例１８にて生産した組換えバクテリオファージ・ライブラリは、選択可能ないくつかのアプローチによってスクリーニングできる。例えば、ライブラリは、検出可能にラベルした様々なプローブを用いてスクリーニングできる。プローブの例としては、完全（非活性化された）ＨＩＶウィルス、ＨＩＶタンパク質、中でもＨＩＶ外殻タンパク質、及びＭＨＣ／ＨＬＡ複合体としてＨＩＶペプチドを発現しているＡＰＣが挙げられる。また、スクリーニングは、イン・ビボにおいてＨＩＶウイルスに対する免疫応答を刺激することが知られているＨＩＶ外殻タンパク質のペプチドエピトープを用いて行うことができる。そのようなペプチドエピトープに関しては、いくつかの例が知られており、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ及びｐｏｌ外殻タンパク質から単離されたペプチドがこれに含まれる。
ａ）ＨＩＶ  ｇｐ１２０外殻タンパク質を用いたスクリーニング
ｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループ由来のペプチドエピトープを用いて、バクテリオファージ・ライブラリをスクリーニングする。典型的なペプチドとしては、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質のＴ１（アミノ酸４２８−４４３）ペプチド及びＴ２（アミノ酸１１２−１２４）ペプチドが挙げられる。ｇｐ１２０Ｖ３ループ由来のペプチドエピトープは、ＨＩＶ中和抗体を誘導可能なものの一種である（Berzofsky,J.A.et al.（1991）FASEB J.5:2412;Ahlers,J.D.et al,（1993）J.Immunology 150:5647参照）。バクテリオファージ・ライブラリからのｓｃＴＣＲ融合タンパク質のスクリーニングに利用できるペプチドエピトープの他の例としては、Karzon,D.T.et al.and Hart,J.K.et al.も参照のこと（Karzon,D.T.et al.（1992）Vaccine 14:1039;Hart,J.K et al.PNAS（USA）（1991）88:9448）。
Ｂ．ＨＩＶ外殻タンパク質を発現するＡＰＣを用いたバイオパニング
上記実施例１８にて構築したｓｃＴＣＲライブラリから、例えば、ＨＩＶ  ｇａｇあるいはｐｏｌタンパク質から得られる、免疫原性ＨＩＶペプチドに結合するｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕捉することができる。このＨＩＶ外殻タンパク質は、一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞と関連して存在している。一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子は、Garboczi,D.N.et al.PNAS（USA）（1992）89:3429の記載にしたがって生成する。一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞は、公知の方法（Altman,J.D.et al.,supra）に従って生成する。
バイオパニングは、いくつかの方法により実現できる。例えば、一つの方法として、ＭＨＣ／ペプチド標的を２つの異なる様式で提示する。すなわち、捕捉の第一段階では、ＨＬＡ−Ａ２を発現するトランスフェクション細胞を用いると共に、ｇａｇあるいはｐｏｌペプチドを標的抗原として用いる。捕捉は、実施例１８にて述べたバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ由来の約１０11個のバクテリオファージを用いて行う。そして、バクテリオファージ・ライブラリに、ＨＬＡ−Ａ２を提示する細胞、及びｇａｇあるいはｐｏｌペプチドを接触させる。バクテリオファージを、トランスフェクション体約１０6個の共存下で２時間、４℃でインキュベートし、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で２回洗浄し、０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ５．０）１００μｌ中に溶離させた後、０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）１０μｌで中和する。溶離されたバクテリオファージは、大腸菌系統Ｋ９１ｋａｎなどの適切な宿主に感染させて増殖させ、バクテリオファージを一晩成長させる。バクテリオファージ粒子は標準的方法により精製する。
細胞、または、適切なＭＨＣ／抗原を保持する固形支持体に対する捕捉作業を繰り返し行うことにより、細胞捕捉実験で同定されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質を有するバクテリオファージの純度を向上することができる。例えば、細胞捕捉法により単離されたバクテリオファージを、一本鎖ＨＬＡ−Ａ２及びペプチドをコーティングした固形支持体（例えば、マイクロディッシュ）に対する捕捉作業に供して精製する。２時間インキュベートした後、ウェルを、０．３ｍｌのＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで約８回洗浄して、非特異的なバクテリオファージを除去する。結合したバクテリオファージは、０．１ｍｌの０．１Ｍ塩酸（グリシン中、ｐＨ３．０）に溶離され、１０μｌの２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和される。さらなる捕捉は、細胞及び固定化ＭＨＣ／ＨＬＡペプチド分子のうち、使用するものを一方から他方に変更して行う。捕捉を約５、６回行うことにより、ｓｃＴＣＲをディスプレイするバクテリオファージ調製物が、十分に高い純度で得られる。続いて、ＤＮＡをバクテリオファージから単離し、バクテリオファージ内にエンコードされたｓｃＴＣＲのα可変領域及びβ可変領域のＤＮＡ配列を決定する。予想されることは、αあるいはβ可変領域の使用頻度に偏りあるいは集積（bias or enrichment）が見られれば、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ中のｓｃＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド抗原との間で生産的相互作用が行われたことを示すということである。
検出可能にラベルされたプローブを用いると、バクテリオファージ・ライブラリから所望の組替えバクテリオファージを集積することができる。例えば、プローブがｇｐ１２０Ｖ３ループ由来のペプチドエピトープである場合、そのペプチドに特異的に結合する組換えバクテリオファージを単離できる。典型的には、いくつかの集積過程を経るが、この集積過程のステップ数を左右する因子はいくつかある。例えば、ライブラリ中での、求める組換えバクテリオファージの呈示状態や、検出可能にラベルされたプローブの結合活性がその因子である。組換えバクテリオファージ由来のＤＮＡは、標準的手段により単離する。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡは、標準的方法に従ってその配列が解析される。いくつかの単離された組換えバクテリオファージのＤＮＡ配列を解析すると、検出可能にラベルされたプローブと組換えバクテリオファージによりエンコードされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質との特異的結合が示される。
高頻度クローンは、上述のｐＫＣ６０及びｐＫＣ６２ベクターといった適切なベクターにおいて、可溶性で十分に機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質として発現される。そして、発現された融合タンパク質は、標準的方法に従って、上記のＨ５７モノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーにより必要に応じて個々に精製される。
実施例２０−抗−ＨＩＶ捕捉により検出されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質のキャラクタリゼーション
いくつかの選択可能な方法により、上記のように検出された組換えバクテリオファージとＨＩＶ抗原との特異的結合を評価する。
Ａ）バイオコア分析（Biocore Analysis）
ＨＩＶペプチドを用いて、実施例１８にて述べたバクテリオファージ・ライブラリに対するスクリーニングを行う場合、該ペプチドを用いて以下の出願に記載の方法に従ってｓｃＭＨＣクラスＩ分子を生成する。以下の出願とは即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号published  ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。好ましくは、該ペプチドをｓｃＭＨＣクラスＩ分子に共有結合させる。そして、ここで得たｓｃＭＨＣクラスＩペプチド複合体を用いて、実施例７及び以下の実施例２０に記載のように、バイオコア分析のチップをコーティングする。より具体的には、ｇａｇあるいはｐｏｌ抗原（Altman,J.D.et al.supra参照）と結合した一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を、アミン反応性部位を介してバイオセンサチップに共有結合させる。そして、該チップにｓｃＴＣＲ融合タンパク質を含むサンプルを接触させる。すると、上記のように、特異的結合がチップ上で検出される（Seth,A.et al.Nature（1994）369:324;Matsui,K.et al.PNAS（USA）（1994）91:12862も参照のこと）。ほとんどのｓｃＴＣＲ融合タンパク質の相互作用が１０-5〜１０-7Ｍの範囲内にあることが予想される。
ｓｃＭＨＣクラスＩペプチド複合体とｓｃＴＣＲ融合タンパク質との特異的結合が検出された場合は、特異的なｓｃＴＣＲ−ペプチド結合複合体が存在することを示している。
単離された各ｓｃＴＣＲ融合タンパク質について結合係数を決定することにより、細胞に結合して細胞死を引き起こすレセプターの有効度を容易に予測することができる。
Ｂ）ｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体への結合
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＨＩＶペプチドとの特異的結合の検出は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体との結合検定を上記の実施例（実施例９参照）に従って行うことによっても可能である。４量体のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合物をエンコードするＤＮＡを、Ｂｉｒ  Ａ−依存ビオチニル化部位（Bir A-dependent biotinylation site）を有する適切なＤＮＡベクターに挿入することによっても生成できる（Schatz,P.J.Biotechnology（1993）11:1138参照）。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、アビジン−フィコエリトリンを標準の方法に従って加えることで修飾を施し、４量体のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を生成することもできる。ＨＩＶペプチドをディスプレイするべくトランスフェクションされた細胞は、上記の方法、及び以下の出願に記載の方法に従って調製する。即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号published  ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。トランスフェクションされた細胞を用いれば、ライブラリに対するスクリーニングを行うことができる。また、トランスフェクションされた細胞に対して、ラベルされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体を用いて染色し（stain）、細胞への特異的結合の検出を行うこともできる。ＦＡＣＳ分析で検出されるより強力な結合は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＭＨＣクラスＩペプチド複合体との特異的相互作用の指標となる。
上記実施例１９において単離したｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、結合アフィニティー及び活性の試験を行って、該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的に結合するか否かを決定する。この適切な検定は、上記の実施例において述べたようなものである。
Ｃ．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳを行うことにより、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と上記実施例１６にて述べた標的細胞との相互作用を検出することができる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を標準の方法に従ってビオチニル化し、続いて、strepavidin−フィコエリトリンと結合させることでラベルしたｓｃＴＣＲ４量体を形成する。ＦＡＣＳにより、ｓｃＴＣＲとＡ２０細胞や腫瘍細胞系などの適当な標的細胞との相互作用を定量的に測定する。あるいは、実施例１６のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、適切な固形支持体（例えばラテックスビーズ）に結合させ、ｓｃＴＣＲを複数ディスプレイさせることも可能である。これに関連の方法を用いて、４量体のクラスＩＭＨＣ／ペプチド分子が生産されている（例えば、Altman,J.D.et al.supra参照）。
Ｄ．ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞におけるＩｌ−発現
ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞の活性は、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，３８７に記載のように、ＩＬ−２活性を測定することで容易に検定することができる。この検定により、実施例１６において生産されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能を検定することができる。例えば、ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞に対し、上述の方法に従って実施例で産生したｓｃＴＣＲ分子をエンコードするＤＮＡのトランスフェクションを行う。ＦＡＣＳ染色は、実施例１６にて述べたように行い、細胞表面におけるｓｃＴＣＲレセプターの発現を検出する。レセプター陽性クローンは、以下の出願に記載済のＩＬ−２活性検定に用いる。以下の出願とは即ち、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。ｓｃＴＣＲレセプターが活性である場合（即ち、ｓｃＴＣＲレセプターがＭＨＣ／ペプチド標的に特異的に結合する場合）、ｇＤ１２細胞からのＩｌ−２産生は、容易に検出及び測定できる。
実施例２１−クラスII制限ＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する自己免疫タンパク質融合物の単離
本実施例の方法により、自己免疫タンパク質及びペプチドに特異的に結合するｓｃＴＣＲ融合タンパク質を単離することができる。例えば、Ｔ細胞を、ＤＲ−２＋の個体で、かつ、多発性硬化症であると診断された個体から、従来の方法に従って単離することができる。該Ｔ細胞からＴＣＲ  ＤＮＡを得る。そして、得られたＴＣＲ  ＤＮＡを用いて、上記実施例にて述べた方法に従いｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構築する。バクテリオファージ・ディスプレイライブラリを、上記の実施例１４〜１５に従って、作成し、試験をおこなう。
バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、多発性硬化症のＤＲ−２＋患者数人から１０7個のＴ細胞を単離することによって作成する。Ｔ細胞ｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを上記実施例１に述べたように生成する。ＴＣＲのＶ−α及びＶ−β／Ｃ−β鎖のＰＣＲ法による増幅を、実施例１と同じプライマーを用いて行う。Ｖ−α及びＶ−β／Ｃ−β鎖は、適切なバクテリオファージ・ディスプレイ・ベクターのクローニング部位にクローニングする。適切なバクテリオファージ・ディスプレイ・ベクターのクローニング部位とは、例えば、実施例１７にて述べたｆ８８−４バクテリオファージ・ベクターＤＮＡの、ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ部位、及びＸｈｏＩ−ＸｍａＩ部位である。ライブラリは、特異的抗原標的を捕捉する標準的方法に従って、増殖させ、保管する。
一本鎖ＤＲ−２分子を、上述及び以下の出願に記載の方法に概ね従って作成する。以下の出願とは即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７、Rhode,P.et al.J.of Mol.Immunology,（1996）32,555である。具体的には、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を提示するＥＢＶ形質転換リンパ球芽細胞から精製する。簡潔に説明すれば、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファに細胞を溶解させ、標準の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。そして、細胞ライゼートを抗体−セファロースカラムにかける。ＤＲ２を結合させ、これを０．０５％  Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド界面活性剤（N-dodecyl-B-D-maltoside detergent）を含むリン酸バッファ（ｐＨ１１．３）中で溶離させる。得られた画分を直ちに１Ｍ酢酸により中和し、これをＤＥＡＥイオン交換カラムを通すことにより、ＤＲ２プールを０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸（ｐＨ８．０）中に収集する。タンパク質の画分に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、及び銀染色により、純度の検定を行う。
バクテリオファージ・ライブラリは、いくつかの方法によりスクリーニングできるが、特に、一本鎖ＤＲ−２分子をコーティングした固形支持体を用いて、上記の方法に従って捕捉を行う方法が好適である。捕捉の方法としては、昆虫細胞などの宿主において一本鎖ＤＲ−２分子を生成し、その一本鎖ＤＲ−２分子をマイクロプレート壁などの固形支持体に固定化する。
さらに、バクテリオファージ・ライブラリを、ＤＲ−２分子によりトランスフェクションさせた細胞を用いて精製する（DeKruif,J.et al.PNAS（USA）（1995）92,3938参照）。ＤＲ−２タンパク質と特異的な結合をなすｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現するバクテリオファージ粒子の集積を、上記の実施例に述べた方法により行う。
発明の詳細な説明の項においてなした具体的な実施態様、または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ウェイダンズ  ジョン  エー
カード  キンバーリン  エフ
ウォン  ヒン  シー
（ｉｉ）発明の名称：バクテリオファージ外殻タンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターを含んでなる融合タンパク質
（ｉｉｉ）配列の数：１３０
（ｉｖ）住所
（Ａ）名宛人：ダイク、ブロンスタイン、ロバーツ、クッシュマン  エル  エル  ピー
（Ｂ）通り：１３０  ウォーター  ストリート
（Ｃ）市：ボストン
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：０２１０９
（ｖ）コンピュータ読み取り方式
（Ａ）媒体のタイプ：ティスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  コンパチブル
（Ｃ）作動システム：ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ファストＳＥＱ  バージョン１．５
（ｖｉ）元の出願データ
（Ａ）出願番号：０８／８１３，７８１
（Ｂ）出願日：１９９７年３月７日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（ｖｉｉｉ）代理人情報
（Ａ）氏名：ピーター  エフ  コーレス
（Ｂ）登録番号：３３，８６０
（Ｃ）参照／ドケット番号：４６７４５−ＰＣＴ
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話番号：６１７  ５２３  ３４００
（Ｂ）ファックス番号：６１７  ５２３  ６４４０
（Ｃ）テレックス：
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0004382881.tif 000003
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0004382881.tif 000004
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0004382881.tif 000005
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0004382881.tif 000006
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0004382881.tif 000007
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0004382881.tif 000008
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0004382881.tif 000009
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0004382881.tif 000010
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0004382881.tif 000011
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0004382881.tif 000015
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0004382881.tif 000016
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0004382881.tif 000017
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：
0004382881.tif 000019
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８：
0004382881.tif 000020
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６：
0004382881.tif 000028
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７：
0004382881.tif 000029
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９：
0004382881.tif 000031
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０：
0004382881.tif 000032
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１：
0004382881.tif 000033
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２：
0004382881.tif 000034
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３：
0004382881.tif 000035
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４：
0004382881.tif 000036
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５：
0004382881.tif 000037
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６：
0004382881.tif 000038
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７：
0004382881.tif 000039
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８：
0004382881.tif 000040
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９：
0004382881.tif 000041
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０：
0004382881.tif 000042
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１：
0004382881.tif 000043
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２：
0004382881.tif 000044
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３：
0004382881.tif 000045
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４：
0004382881.tif 000046
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５：
0004382881.tif 000047
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６：
0004382881.tif 000048
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７：
0004382881.tif 000049
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８：
0004382881.tif 000050
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９：
0004382881.tif 000051
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０：
0004382881.tif 000052
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３：
0004382881.tif 000055
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４：
0004382881.tif 000056
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５：
0004382881.tif 000057
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６：
0004382881.tif 000058
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７：
0004382881.tif 000059
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８：
0004382881.tif 000060
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９：
0004382881.tif 000061
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０：
0004382881.tif 000062
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１：
0004382881.tif 000063
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２：
0004382881.tif 000064
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３：
0004382881.tif 000065
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４：
0004382881.tif 000066
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５：
0004382881.tif 000067
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６：
0004382881.tif 000068
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７：
0004382881.tif 000069
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８：
0004382881.tif 000070
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９：
0004382881.tif 000071
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０：
0004382881.tif 000072
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１：
0004382881.tif 000073
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２：
0004382881.tif 000074
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３：
0004382881.tif 000075
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４：
0004382881.tif 000076
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５：
0004382881.tif 000077
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６：
0004382881.tif 000078
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７：
0004382881.tif 000079
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８：
0004382881.tif 000080
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９：
0004382881.tif 000081
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０：
0004382881.tif 000082
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１：
0004382881.tif 000083
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２：
0004382881.tif 000084
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３：
0004382881.tif 000085
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４：
0004382881.tif 000086
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５：
0004382881.tif 000087
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６：
0004382881.tif 000088
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７：
0004382881.tif 000089
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８：
0004382881.tif 000090
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９：
0004382881.tif 000091
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０：
0004382881.tif 000092
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１：
0004382881.tif 000093
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２：
0004382881.tif 000094
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３：
0004382881.tif 000095
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４：
0004382881.tif 000096
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５：
0004382881.tif 000097
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６：
0004382881.tif 000098
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７：
0004382881.tif 000099
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８：
0004382881.tif 000100
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９：
0004382881.tif 000101
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００：
0004382881.tif 000102
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１：
0004382881.tif 000103
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２：
0004382881.tif 000104
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３：
0004382881.tif 000105
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４：
0004382881.tif 000106
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５：
0004382881.tif 000107
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６：
0004382881.tif 000108
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７：
0004382881.tif 000109
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８：
0004382881.tif 000110
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９：
0004382881.tif 000111
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０：
0004382881.tif 000112
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１：
0004382881.tif 000113
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２：
0004382881.tif 000114
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３：
0004382881.tif 000115
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４：
0004382881.tif 000116
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５：
0004382881.tif 000117
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６：
0004382881.tif 000118
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７：
0004382881.tif 000119
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８：
0004382881.tif 000120
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９：
0004382881.tif 000121
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０：
0004382881.tif 000122
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１：
0004382881.tif 000123
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２：
0004382881.tif 000124
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３：
0004382881.tif 000125
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４：
0004382881.tif 000126
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５：
0004382881.tif 000127
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６：
0004382881.tif 000128
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７：
0004382881.tif 000129
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８：
0004382881.tif 000130
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９：
0004382881.tif 000131
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０：
0004382881.tif 000132
【図１Ａ】
0004382881.tif 000133
【図１Ｂ】
0004382881.tif 000134
【図２】
0004382881.tif 000135
【図３Ａ】
0004382881.tif 000136
【図３Ｂ】
0004382881.tif 000137
【図３Ｃ】
0004382881.tif 000138
【図４】
0004382881.tif 000139
【図５】
0004382881.tif 000140
【図６Ａ】
0004382881.tif 000141
【図６Ｂ】
0004382881.tif 000142
【図７】
0004382881.tif 000143
【図８】
0004382881.tif 000144
【図９】
0004382881.tif 000145
【図１０】
0004382881.tif 000146
【図１１】
0004382881.tif 000147
【図１２】
0004382881.tif 000148
【図１３】
0004382881.tif 000149
【図１４】
0004382881.tif 000150
【図１５】
0004382881.tif 000151
【図１６】
0004382881.tif 000152
【図１７】
0004382881.tif 000153
【図１８】
0004382881.tif 000154
【図１９Ａ】
0004382881.tif 000155
【図１９Ｂ】
0004382881.tif 000156
【図２０】
0004382881.tif 000157
【図２１Ａ】
0004382881.tif 000158
【図２１Ｂ】
0004382881.tif 000159
【図２１Ｃ】
0004382881.tif 000160
【図２１Ｄ】
0004382881.tif 000161
【図２１Ｅ】
0004382881.tif 000162
【図２１Ｆ】
0004382881.tif 000163
【図２１Ｇ】
0004382881.tif 000164
【図２２】
0004382881.tif 000165
【図２３】
0004382881.tif 000166