(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、シュークロースPTSエンザイムII活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、シュークロースPTSエンザイムII活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号３７７９〜５７６１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号３７７９〜５７６１からなる塩基配列と６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下でハイブリダイズし、かつ、シュークロースPTSエンザイムII活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、コリネ型細菌のシュークロースの細胞内への取り込みに関与するタンパク質であるシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
背景技術
細菌は、多くの炭素源を資化することができるが、それらの細胞膜透過には種々の特異的な透過系が存在している。また、大抵の細菌は、限られた栄養下で生育するために環境の変化に応答することができる。環境をモニターして種々の炭素源の中から選択するために、細胞は検出器を備えている。このような、糖の透過系及び検出器として、ＰＴＳ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ：ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、又はｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ−ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ）がある（以下、ＰＴＳについては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｕｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）ｐｒｅｓｓ参照）。
【０００３】
ＰＴＳは、種々の糖（ＰＴＳ糖）の透過とリン酸化、これらの炭素源に向かう運動、及び多くの代謝経路の調節に関与している。ＰＴＳは、次の反応を触媒する。尚、ＰＥＰは、ホスホエノールピルビン酸を表す。
ＰＥＰ（細胞内）＋糖（細胞外）→ ピルビン酸（細胞内）＋リン酸化糖（細胞内）
ＰＴＳは、細胞内のホスホエノールピルビン酸（以下、「ＰＥＰ」ともいう。）にリン酸基を細胞外の糖に転移してリン酸化糖とピルビン酸を生成する反応を触媒する。糖のリン酸化は、糖の細胞膜透過とリンクしており、これらのプロセスに必要なエネルギーは、解糖系の中間体であるＰＥＰにより供給される。
【０００４】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）では、ＰＴＳを構成するタンパク質は、以下の反応を触媒する。
（１）ＰＥＰ＋ＥＩ→Ｐ−ＥＩ＋ピルビン酸
（２）Ｐ−ＥＩ＋Ｈｐｒ→Ｐ−Ｈｐｒ＋ＥＩ
（３）Ｐ−Ｈｐｒ＋ＥＩＩＡ→Ｐ−ＥＩＩＡ＋Ｈｐｒ
（４）Ｐ−ＥＩＩＡ＋ＥＩＩＢ→Ｐ−ＥＩＩＢ＋ＥＩＩＡ
（５）Ｐ−ＥＩＩＢ＋糖（細胞外）＋ＥＩＩＢ＋糖−Ｐ（細胞内）
【０００５】
上記反応にあずかるタンパク質のうち、ＥＩ（エンザイムＩ）及びＨｐｒ（ヒスチジンタンパク質）は、すべてのＰＴＳ糖のリン酸化に関与する可溶性の細胞質タンパク質であり、普遍的ＰＴＳタンパク質（ｇｅｒｅｒａｌ ＰＴＳ ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれている。一方、ＥＩＩ（エンザイムＩＩ）はＰＴＳ糖に特異的であり、糖によっていくつかのドメイン又はタンパク質からなっている。例えば、マンニトールではＥＩＩはＡ、Ｂ及びＣの３つのドメインからなる膜結合タンパク質であり、グルコースやシュークロースではＥＩＩは膜結合タンパク質であるＩＩＢ及びＩＩＣと、可溶性タンパク質であるＩＩＡからなる。いずれの場合でも、ＰＥＰから糖へのリン酸基の転移は、ＥＩ、ＨＰｒ、ＥＩＩＡ及びＥＩＩＢを介して行われる。ＥＩＩの膜内部分であるＥＩＩＣドメインは、転移チャネルを形成しており、おそらく基質の特異的結合部位であると考えられている。
ＥＩＩの第三のタイプは、マンノースＰＴＳにみられるものであり、Ａ、Ｂの両ドメインは単一の可溶性ポリペプチド中で融合しており、二つの膜内タンパク質（ＩＩＣ及びＩＩＤ）がマンノースの透過に関与している。
【０００６】
エシェリヒア・コリ及びサルモネラ・チフィムリウムでは、ＥＩをコードする遺伝子（ｐｔｓＩ）はクローニング、配列決定がなされている（Ｓａｆｆｅｎ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１６２４１−１６２５３（１９８７）、Ｄｅ Ｒｅｕｓｅ，Ｈ．ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ，Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，３８２７−３８３７（１９８８））。また、ＥＩＩについても、いくつかの糖ではクローニングされている（Ｓａｆｆｅｎ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１６２４１−１６２５３（１９８７）、Ｅｒｎｉ，Ｂ．ａｎｄ Ｚａｎｏｌａｒｉ，Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１６３９８−１６４０３（１９８６）、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３，１５８７−１５９３（１９８４））。
尚、糖の種類によっては、その細胞内への取込み系として、ＰＥＰを必要としない非ＰＴＳ（ｎｏｎ−ＰＴＳ）が存在するものも知られている。
【０００７】
発明の開示
上記のように、糖の細胞内への取り込みに関する研究が進んでいるが、産業上有用なコリネ型細菌ではＰＴＳに関する研究は進んでいない。本発明は、コリネ型細菌のシュークロースＰＴＳを構成するタンパク質をコードする遺伝子を提供することを課題とする。
本出願人は、コリネ型細菌のシュクラーゼ（インベルターゼ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離してその構造を決定し、さらに、増幅したシュクラーゼ遺伝子を保持するコリネ型細菌を用いたアミノ酸又は核酸の製造法を開発している（特開平５−２４４９５８号、特開平８−１９６２８０号）。前記ＤＮＡ断片のうち、約６ｋｂのＳｍａＩ断片及びそれに含まれるシュクラーゼ遺伝子の上流約１ｋｂの領域には、４つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ−Ｆ１、ＯＲＦ−Ｆ２、ＯＲＦ−Ｆ３及びＯＲＦ−Ｆ４）が存在している。そのうち、ＯＲＦ−Ｆ２がシュクラーゼをコードしていると推定されている。
【０００８】
しかし、本発明者らは、他のシュクラーゼ遺伝子との比較から、前記ＯＲＦ−Ｆ２はシュクラーゼ遺伝子全長を含んでいないのではないかと考えた。すなわち、既知のシュクラーゼ遺伝子から推定されるシュクラーゼのアミノ酸残基数は４６６〜５１１である（Ｇｕｎａｓｅａｋｒｅｎ，Ｐ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（１２）６７２７−３５（１９９０））のに対し、ＯＲＦ−Ｆ２がコードし得るアミノ酸配列は４２４アミノ酸残基と比較的短かった。そこで、ＯＲＦ−Ｆ２の下流の配列を再クローニングし、その塩基配列を決定した。そして、前記のシュクラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、２つの独立したクローン化断片が連結されたものであったことが明らかとなり、新たにシュクラーゼ遺伝子の下流にシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードする遺伝子が存在することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、シュークロースに結合する活性を有するタンパク質。
本発明はまた、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、シュークロースに結合する活性を有するタンパク質。
前記ＤＮＡとしては、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号３７７９〜５７６１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号３７７９〜５７６１からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シュークロースに結合する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、後記実施例においては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡのシュクラーゼ遺伝子の下流領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）によって増幅することによって取得されたものである。
染色体ＤＮＡ上の既知の領域に隣接する領域は、その領域を含むＤＮＡフラグメントにカセットを連結し、既知の領域に対応するプライマーと、カセットに対応するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅することができる。その際、カセットの５'末端を脱リン酸化しておくと、染色体ＤＮＡフラグメントとカセットの５'末端との接続部位にはニックが生じる。そのため、カセットプライマーから始まるＤＮＡ合成はこの接続部位で停止し、合成プライマーから合成されたＤＮＡのみがカセットプライマーからの合成の鋳型となり、相補鎖が形成される。その結果、特異的な増幅が可能となる（Ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，６，４６７−４７５））。この方法を利用したキットが市販されており（宝酒造（株）製ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ ＴＭ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、本発明のＤＮＡの取得に利用することができる。
【００１１】
本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡ及びその隣接領域の塩基配列が明らかとなったので、同塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、コリネ型細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、直接増幅することができる。そのようなプライマーとしては、配列番号１０及び配列番号２１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、本発明のＤＮＡは、その塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いるハイブリダイゼーションにより、染色体ＤＮＡライブラリーから単離することもできる。コリネ型細菌の染色体ＤＮＡは、例えばＳａｉｔｏらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９（１９６３）に記載）あるいはＫ．Ｓ．Ｋｉｒｂｙの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，６４，４０５，（１９５６））等の方法により取得することができる。
【００１２】
その他、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
本発明のＤＮＡのクローニングや染色体ＤＮＡライブラリーの作製等に使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
上記のようにして取得される本発明のＤＮＡを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列表の配列番号１に示す。同塩基配列中、塩基番号３７７９〜５７６１からなる領域が、本発明のタンパク質であるシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードしている。尚、配列番号１に示す塩基配列中、塩基番号３４２〜１５０５、及び塩基番号２３３８〜３６０９が、特開平８−１９６２８０号に記載のシュクラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片中のＯＲＦ−Ｆ１、ＯＲＦ−Ｆ２に各々相当する。また、配列番号１に示す塩基配列と、特開平８−１９６２８０号に記載の塩基配列とを比較すると、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号１〜３６８７の領域が、特開平８−１９６２８０号に記載の塩基配列と一致した。このことから、前記シュクラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、２つの独立したクローン化断片からなることが明らかとなった。
【００１３】
本発明のＤＮＡは、コードされるシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩのシュークロースに結合する活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするものであってもよい。ここで、「複数」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従って、シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩを構成するアミノ酸配列全体に対し、９５％以上の相同性を有し、シュークロースに結合する活性を有するものであってもよい。具体的には、前記「複数」は、好ましくは２〜５個である。
【００１４】
上記のようなシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００１５】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００１６】
変異を有するシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３７７９〜５７６１からなる塩基配列を有するＤＮＡ又は同塩基配列を有するＤＮＡからＰＣＲ法等により調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シュークロースに結合する活性を有するシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩを有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって、シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００１７】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ここで相同性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７，１４３５−１４４１（１９８５））又はＴａｋａｓｈｉ ＆ Ｇｏｔｏｈの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２，１１７３−１１７７（１９８４））により算出される値である。プローブの設計は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。
【００１８】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ発現産物の大きさを調べることによって、容易に取り除くことができる。
本発明のタンパク質は、上記本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。本発明のタンパク質は、シュークロースに結合する活性を有する限り、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
【００１９】
本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌のシュークロース取り込み能の改善等に利用することができる。また、ＰＴＳは、糖の細胞内への取り込みにＰＥＰを消費するため、生合成系の上流にＰＥＰが位置するアミノ酸等の合成にとっては不利であると考えられる。そこで、シュークロースＰＴＳを破壊し、ＰＥＰを必要としない取り込み系によりシュークロースを取り込むことができれば、シュークロースの取り込み速度やアミノ酸等の生産性の点からは有利であると考えられる。尚、コリネ型細菌では、シュークロースの非ＰＴＳは知られていないが、例えばシュクラーゼを細胞外に作用させれば、グルコース及びフルクトースを非ＰＴＳで取り込むことができる。
また、本発明のＤＮＡを改変し、機能が強化又は低減されたシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡ、又は他の遺伝子由来のプロモーター等の発現制御配列に連結した本発明のＤＮＡを、コリネ型細菌に導入することによって、シュークロース取り込み能が強化又は低減されたコリネ型細菌を創製することができる。具体的には、機能が強化されたシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡは、コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクター上又は染色体ＤＮＡ上に保持される。また、機能が低減されたシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードするＤＮＡは、相同組換えを利用した遺伝子置換によって染色体ＤＮＡ上に保持される。あるいは、温度感受性複製制御領域を含むプラスミドを用いた遺伝子置換（特公平７−１０８２２８号参照）によって、低温ではシュークロースＰＴＳが機能し、高温では機能しないコリネ型細菌を創製することもできる。
【００２０】
本発明を応用可能なコリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００２１】
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報参照）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。これらの内、ｐＨＳＣ４は温度感受性複製制御領域を含む。
【００２２】
pAJ655  エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)
コリネバクテリウム・グルタミカムSR8201(ATCC39135)
pAJ1844  エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)
コリネバクテリウム・グルタミカムSR8202(ATCC39136)
pAJ611   エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148  コリネバクテリウム・グルタミカムSR8203(ATCC39137)
pAJ440   バチルス・ズブチリスAJ11901(FERM BP-140)
pHC4    エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
pHSC4    エシェリヒア・コリAJ12571(FERM BP-3524)
【００２３】
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ １９２９（１９７８））、及び電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）も応用できる。
【００２４】
実施例
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
実施例１
シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３４）の染色体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションによる解析
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６を、Ｍ−ＣＭ２Ｓ培地（シュークロース５ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン０．１ｇ／Ｌ）４ｍｌ中で一晩培養し、菌体を回収した。得られた菌体よりＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液（組成：１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）５０μｌで溶出した。
【００２６】
上記のように抽出した染色体ＤＮＡについて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法に従い、サザンハイブリダイゼーションを行った。染色体ＤＮＡは、ＯＲＦ−Ｆ２のＣ末端側とＯＲＦ−Ｆ３のＮ末端側の領域を切断しないＢａｍＨＩ、ＳｍａＩで別々に消化し、アガロース電気泳動に供した。プローブとして、ｐＳＳＭ３０（特開平８−１９６２８０号）上にクローニングした６．９ｋｂのうちＯＲＦ−Ｆ２のＣ末端側とＯＲＦ−Ｆ３のＮ末端側の領域をカバーするようなＢａｍＨＩで切り出される約３ｋｂの断片（特開平８−１９６２８０、配列表の配列番号１６４９〜４６７５のフラグメント）を用いた。
ハイブリダイゼーションの結果、バンドが２本検出され、ＯＲＦ−Ｆ２とＯＲＦ−Ｆ３は染色体上では隣接しないことが明らかとなった。そこで、シュクラーゼ遺伝子の下流の配列を再確認することとした。
【００２７】
＜２＞シュクラーゼ遺伝子の下流領域の配列の決定
シュクラーゼ遺伝子の下流の領域の塩基配列の決定については、まず、下流領域をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは、宝酒造（株）製ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ ＴＭ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行った。具体的には以下のようにして行った。染色体ＤＮＡを、前記キット付属のカセット（配列表配列番号３〜８）と同じ切断末端を生じる制限酵素１０種類（ＳｐｅＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＡｖａＩ）を用いて完全消化した。これらのフラグメントを鋳型として、表１に示す合成プライマー１と、カセットプライマー１（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行った。カセットの５'末端にはリン酸基が付加されていないので、染色体ＤＮＡフラグメントとカセットの５'末端との接続部位にはニックが生じる。そのため、カセットプライマーから始まるＤＮＡ合成はこの接続部位で停止し、合成プライマーから合成されたＤＮＡのみがカセットプライマーからの合成の鋳型となり、相補鎖が形成される。
【００２８】
次に上記で得られた増幅産物を鋳型として、合成プライマー２とカセットプライマー２（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行った。その結果、鋳型として染色体ＤＮＡをＥｃｏＴ１４Ｉ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩで切断したＤＮＡを用いた場合に、フラグメントが増幅できた。ＢａｍＨＩ消化したＤＮＡフラグメントを鋳型として増幅された断片約１．８ｋｂについて、塩基配列決定を行った。
【００２９】
【表１】
0004254103.tif 000002
【００３０】
決定した配列を基に、合成プライマー３と４を合成した。上記と同様にして、合成プライマー３とカセットプライマー１の組み合せ、及び合成プライマー４とカセットプライマー２の組み合わせで、フラグメントを順次ＰＣＲにより増幅した。その結果、染色体ＤＮＡをＰｓｔＩまたはＢａｍＨＩで切断したＤＮＡを鋳型にした場合に、フラグメントが増幅できた。ＰｓｔＩ消化したＤＮＡ断片を基に増幅したフラグメントについて塩基配列の決定を行った。
【００３１】
決定した配列をもとに、合成プライマー５と６を合成した。合成プライマー５とカセットプライマー１、合成プライマー６とカセットプライマー２の組み合わせで、順次ＰＣＲを行ったところ、鋳型としてＥｃｏＴ１４消化染色体ＤＮＡ及びＰｓｔＩ消化染色体ＤＮＡを用いた場合に、増幅断片が確認できた。前者について塩基配列決定を行った。
更に、合成プライマー７と８を合成し、上記と同様の操作を行ったところ、ＥｃｏＴ１４消化染色体ＤＮＡを鋳型に用いたときに、増幅断片が確認できた。この増幅断片の塩基配列を決定した。
【００３２】
上記配列を基に、プライマー９と１０を合成し、上記と同様の操作を行ったところ、ＳｐｅＩ消化染色体ＤＮＡを鋳型に用いたときに、増幅断片が確認できた。この増幅断片の塩基配列を決定した。
塩基配列の決定は、ＡＢＩ社製のシーケンスキットを用いてプロトコールに従い反応させた後、蛍光標識法により増幅フラグメントの塩基配列を決定した。
以上の結果を、配列表の配列番号１に示す。同塩基配列中の塩基番号３６８４以降に、新規にＯＲＦが存在することが判明した。ＯＲＦは塩基番号３７７９〜５７６１の１９８３ｂｐからなり、決定した塩基配列を翻訳して得られる蛋白質は６６１アミノ酸であると推定された。同ＯＲＦについてＧＥＮＢＡＮＫ ＣＤＳデータベースにより相同性検索を行った。その結果、表２に示すように、前記ＯＲＦがコードし得るタンパク質は、シュークロースの取り込みに特異的な蛋白質であるシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩと高い相同性を示した。以下、前記ＯＲＦをｐｔｓＩＩｓｕｃ遺伝子と呼ぶ。
【００３３】
【表２】
0004254103.tif 000003
【００３４】
実施例２
シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩ遺伝子破壊株の作製
ｐｔｓＩＩｓｕｃ遺伝子が破壊されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムを作製した。まず、遺伝子破壊用のプラスミドを構築した（図１）。まず、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６の染色体を鋳型に、前記プライマー２（配列番号１０）及び以下に示す塩基配列を有するプライマー１１（配列番号２１）を用いてＰＣＲで増幅したｐｔｓＩＩｓｕｃ遺伝子断片を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングし、同プラスミドをｐＣＲＳ２とした。
（プライマー１１）
ＣＧＣＴＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号１の塩基番号５９４７〜５９２４に相当）
【００３５】
ｐＣＲＳ２より、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ消化により切り出した断片をｐＨＳＧ３９９のＸｂａＩサイトに接続し、ｐ３９９Ｓ２を構築した。このプラスミドをＨｐａＩ、ＢａｍＨＩ消化し、生じたフラグメント（配列番号１の塩基番号４３８５〜４７９８に相当）を、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ消化したｐＨＳＧ２９９と連結し、プラスミドｐｄＳＢを構築した。次に、ｐｄＳＢをＢａｍＨＩ消化し、プラスミドｐＢＣＴ４をＢａｍＨＩ消化して切り出したコリネ型細菌で複製可能な温度感受性複製起点（特公平７−１０８２２８号参照）を接続し、プラスミドｐｄＳＢＴを構築した。同プラスミドは、５'末端部及び３'末端部を欠失したｐｔｓＩＩｓｕｃ遺伝子を含んでいる。ｐｄＳＢＴは、コリネ型細菌中で、約１０〜３２℃では自律複製できるが、約３４℃以上では自律複製できない。
尚、ｐＢＣＴ４は、次のようにして構築した。特公平７−１０８２２８号に記載の温度感受性ベクターｐＨＳＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで切断し、得られた温度感受性複製起点を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。このＤＮＡ断片にＢａｍＨＩリンカーを接続し、これを再びＢａｍＨＩで切断した後、同じくＢａｍＨＩにて切断したｐＨＳＧ３９９と接続し、ｐＢＣＴ４を得た（図２）。
【００３６】
ｐｄＳＢＴでブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６を形質転換し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｓプレート上を用いて形質転換体を選択した。形質転換は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号参照）により行った。取得した形質転換体を、ＡＪ１２０３６／ｐＴＳＢＴと命名した。ＡＪ１２０３６／ｐＴＳＢＴ株をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＭ−ＣＭ２Ｓプレートに、プレートあたり１０ ３〜１０ ５ｃｆｕ程度になるように希釈して塗布した。このプレートを３４℃にて一晩培養した後、薬剤耐性を示す株を染色体にプラスミドが組み込まれた株として取得した。得られた株について、相同組換えにより宿主染色体のｐＴＳＩＩｓｕｃ遺伝子の中にベクタープラスミドが組み込まれていることを、ＰＣＲにより確認した。この組み込み株をＹｄＳ１と命名した。
【００３７】
ＹｄＳ１株について、糖源をグルコース又はシュークロースとする最少培地（グルコースまたはシュークロース２０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4 ０．００２ｇ／ｄｌ、ＭｎＳＯ4 ０．００２ｇ／ｄｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ２０００μｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン１０ｍｇ／ｄｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．６）にて３４℃にて培養した。結果を表３に示す。ＹｄＳ１株は、グルコースのみを炭素源とする最少培地では生育できるが、シュークロースのみを炭素源とする最少培地では生育不可能であったことから、ｐｔｓＩＩｓｕｃ遺伝子は、シュークロース取り込みにおいてシュークロース特異的な蛋白であるエンザイムＩＩをコードする遺伝子であると確認された。
【００３８】
【表３】
0004254103.tif 000004
【００３９】
産業上の利用可能性
本発明により、コリネ型細菌のシュークロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードする遺伝子、及びシュークロースＰＴＳが機能しないコリネ型細菌の菌株が提供される。これらの遺伝子及び菌株は、糖の取り込み速度やアミノ酸及び核酸等の生産性が向上した菌株の育種等に利用することができる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Ajinomoto Co., Inc.（味の素株式会社）
<120> シュークロースＰＴＳエンザイムIIをコードするＤＮＡ
<130> B644MSOP1027
<150> JP 11-189512
<151> 1999-07-02
<160> 21
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 5969
<212> DNA
<213> Brevibacterium lactofermentum
<220>
<221> CDS
<222> (3779)..(5761)
<400> 1
agtccgtcga cgccaccatt gatgtggtgg tcaccgagct tgcggaggct ttctacatct 60
acgctcccgt cggcgtggag tggggtcatt acgggtggga tcacgccggt gaaagttgcg 120
gaacccatgg tgttccttgt gggttgaggg aacgagtgcg ggtgagaagt ttttcaagtg 180
tctgcagttt ttaagttatg catcatcagc ttggaaggct gaggtaattc agtagacctg 240
caacagcagg cctcaagtcc gaagataatt aacctagatc cgtagacata agacatcata 300
cgtcctatgc ttgctggaag gaaccaaata acctcagaaa gatggcagaa gtggtgcatt 360
atcaagaaaa tgcaggtcaa gcagttaaaa aaattgaggg aagaattgtt ccccccctcg 420
gggtgattga tggctttctc caactcgaaa acggcatcat cacggaactc tctggagaac 480
cagcacctaa aaacgcagga ttccaccccg aactccccac gattgttccc ggttttattg 540
atcttcataa tcacggtgga aacggtggcg cgtttcctac gggaacgcag gaccaggcga 600
ggaacaccgc gcagtatcac cgcgaacatg gcacgaccgt gatgttgcca agcatggttt 660
cggcgccggc tgacgcactg gcagcgcagg tggaaaacct tattcccttg tgtgaagagg 720
tcctgctgtg cggcattcac ctcgagggcc ctttcatcaa cgcatgccgt tgtggtgctc 780
aaaacccgga tttcattttt cccggcaacc caacagatct tgcccgggtg atccatgcgg 840
gaaaaggttg gatcaaatcg atcacagtag cgccggaaac tgacaatctt tctgagcttc 900
tcgatctctg cgcagcgcac cacatcattg cttccttcgg gcacactgat gcagattttg 960
ataccactac cagcgcaatt gccttggcta aagagaaaaa tgtgacggtc acggctacgc 1020
atttgttcaa tgcgatgcct ccgctgcatc atagggctcc cggcagcgtg ggcgctttgc 1080
ttgctgcggc acgtgccggg gacgcatatg ttgagttgat cgccgacggc gtgcatttgg 1140
ccgatggaac ggtcgatcta gctcgttcca acaacgcctt tttcatcacg gacgccatgg 1200
aagccgccgg aatgccagac ggtgagtaca ttttgggcgt tttgaacgtc accgtcaccg 1260
atggagtcgc ccgtctgcgc gatggcggcg ccatcgccgg gggcaccagc acactagcga 1320
gtcagttcgt gcaccacgtg cgcaggggta tgacgcttat cgacgcgacc ctccacacct 1380
caaccgtcgc cgctaaaatt ctcggtcttg gcgatcacga aatcgctaaa tccaaccctg 1440
caaattttgt ggtctttgac tcaaacggcc aggtgcaaaa ggtccattta ggtcatcaag 1500
tactttaagt acgagtaaaa ctatcctgat tttaaaggag tcccaccatg gaaatcacta 1560
tctgcaaaga cgagcaagaa gtcggcaaag cagttgcagt cctaatcgca cccttcgcca 1620
acaagggtgg aaccttgggg cttgcaacag gatcctcacc actgagtacc taccaagagc 1680
tcattcgcat gtatgaagct ggggaagtgt cattcaagaa ctgcaaggca ttcttgttgg 1740
atgaatacgt gggactaacc cgtgacgatg aaaacagcta ctttaaaacc attcgcaaag 1800
agttcactga ccacatcgac atcgttgatg aagaggtcta cagcccagat ggtgcaaacc 1860
ctgatccata cgaagcagct gcagagtatg aggcaaagat cgctgcagaa tccgttgaag 1920
ttcaaatcct tggcatcggc ggaaacggca catcgctttc attgaaccat catcttctct 1980
gtcaggactg acaaaggtcc aggcgctgca ccctaaaact gtggaggaca acgctcgatt 2040
cttcaacacc atcgaagagg tcccaaccca cgccgtcacc cagggtttgg gcactttgtc 2100
ccgcgcgcaa aacatcgtgt tggtggcaac tggtgaagga aaagccgacg ccatccgcgg 2160
aactgtggaa ggcccagtga ctgcttcttg cccaggttcc atcctgtaga tgcacaacat 2220
gccaccatca tcgttggatg aagcagcagt atccaagctg gaaaacgctg atcactaccg 2280
tctcatggag caattaaagc tgcgctagaa acaaaaagga aagtactgtg tggggctatg 2340
cacacagaac tttccagttt gcgccctgcg taccatgtga ctcctccgca gggcaggctc 2400
aatgatccca acggaatgta cgtcgatgga gataccctcc acgtctacta ccagcacgat 2460
ccaggtttcc ccttcgcacc aaagcgcacc ggctgggctc acaccaccac gccgttgacc 2520
ggaccgcagc gattgcagtg gacgcacctg cccgacgctc tttacccgga tgcatcctat 2580
gacctggatg gatgctattc cggtggagcc gtatttactg acggcacact taaacttttc 2640
tacaccggca acctaaaaat tgacggaaag cgccgcgcca cccaaaacct tgtcgaagtc 2700
gaggacccaa ctgggctgat gggcggcatt catcgccgtt cgcctaaaaa tccgcttatc 2760
gacggacccg ccagcggttt cacaccccat taccgcgatc ccatgatcag ccctgatggt 2820
gatggttgga acatggttct tggggcccaa cgcgaaaacc tcaccggtgc agcggttcta 2880
taccgctcga cagatcttga aaactgggaa ttctccggtg aaatcacctt tgacctcagt 2940
gatgcacaac ctggttctgc tcctgatctc gttcccgatg gctacatgtg ggaatgcccc 3000
aaccttttta cgcttcgcga tgaagaaact ggcgaagatc tcgacgtgct gattttctgt 3060
ccacaaggat tggaccgaat ccacgatgag gttactcact acgcaagctc tgaccagtgc 3120
ggatatgtcg tcgacaagct tgaaggaacg accttccgcg tcttgcgagg attcagcgag 3180
ctggatttcg gccatgaatt ctacgcaccg caggttgcag taaacggttc tgatgcctgg 3240
ctcgtgggct ggatggggct gcccgcgcag gatgatcacc caacagttgc acaggaagga 3300
tgggtgcact gcctgactgt gccccgcaag cttcatttgc gcaaccacgc gatctaccaa 3360
gagctccttc tcccagaggg ggagtcgggg gtaatcagat ctgtattagg ttctgaacct 3420
gtccgagtag acatccgagg caatatttcc ctcgagtggg atggtgtccg tttgtctgtg 3480
gatcgtgatg gtgatcgtcg cgtagctgag gtaaaacctg gcgaattagt gatcgcggac 3540
gataatacag ccattgagat aactgcaggt gatggacagg tttcattcgc ttttccgggc 3600
cttcaaaggt gacactattg agagataagt catataaaag ggtcttttgt ggcgaattgt 3660
acaaatactt cgcaaaatcc cttgatcgga cacaaataaa caggtttaat attgtttagc 3720
ttttgaacaa acattcatgt ctgaatattt ttgtttcttc ccggttaagg agaaattc   3778
atg gac cat aag gac ctc gcg caa cgc atc ctg cgc gac att ggc ggc   3826
Met Asp His Lys Asp Leu Ala Gln Arg Ile Leu Arg Asp Ile Gly Gly
1               5                  10                  15
gaa gac aac att gtc gcc gcc gca cac tgt gca acg cgt tta cgc ctc   3874
Glu Asp Asn Ile Val Ala Ala Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Leu
20                  25                  30
gtg ctc aaa gac acc aag gat gtg gat cgc caa agt ctg gat gat gat   3922
Val Leu Lys Asp Thr Lys Asp Val Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Asp
35                  40                  45
cca gat ctg aaa ggc acc ttt gaa act ggc ggc atg ttc cag atc atc   3970
Pro Asp Leu Lys Gly Thr Phe Glu Thr Gly Gly Met Phe Gln Ile Ile
50                  55                  60
gtc ggg cca ggc gat gtg gat cat gtt ttc aaa gaa ctc gat gac gca   4018
Val Gly Pro Gly Asp Val Asp His Val Phe Lys Glu Leu Asp Asp Ala
65                  70                  75                  80
acc tcc aaa gac atc gct gtg tcc aca gag cag ctc aaa gat gtt gtg   4066
Thr Ser Lys Asp Ile Ala Val Ser Thr Glu Gln Leu Lys Asp Val Val
85                  90                  95
gct aac aac gcc aac tgg ttc agc cgt gct gtg aag gta ttg gcg gac   4114
Ala Asn Asn Ala Asn Trp Phe Ser Arg Ala Val Lys Val Leu Ala Asp
100                 105                 110
att ttc gtc ccg ctg att cca atc ttg gtt ggt ggc ggt ctg ctc atg   4162
Ile Phe Val Pro Leu Ile Pro Ile Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Met
115                 120                 125
gct atc aac aat gtg ttg gtt gcg cag gat ctg ttc ggt ccg caa tca   4210
Ala Ile Asn Asn Val Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Gly Pro Gln Ser
130                 135                 140
ctg gtg gag atg ttc cct cag atc agc ggt gtt gct gag atg atc aac   4258
Leu Val Glu Met Phe Pro Gln Ile Ser Gly Val Ala Glu Met Ile Asn
145                 150                 155                 160
ctg atg gca tct gcg ccg ttc gcg ttc ttg cca gtg ttg gtt ggt ttc   4306
Leu Met Ala Ser Ala Pro Phe Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Gly Phe
165                 170                 175
acc gca acc aag cgt ttc ggt ggc aat gag ttc ctg ggc gcc ggc att   4354
Thr Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Glu Phe Leu Gly Ala Gly Ile
180                 185                 190
ggt atg gcg atg gtg ttc cca acc ctg gtt aac ggc tac gac gtg gcc   4402
Gly Met Ala Met Val Phe Pro Thr Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala
195                 200                 205
gcc acc atg acc gcg ggc gaa atg cca atg tgg tcc ctg ttt ggt ttg   4450
Ala Thr Met Thr Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu
210                 215                 220
gat gtt gct caa gct ggt tac cag ggc acc gtg ctt cct gtg ctg gtg   4498
Asp Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val
225                 230                 235                 240
gtc tct tgg att ctg gca acg atc gag aag ttc ctg cac aag cga ctc   4546
Val Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu
245                 250                 255
atg ggc act gca gac ttc ctg atc acc cca gtg ttg act ctg ctg ctc   4594
Met Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu
260                 265                 270
acc ggc ttc ctt acg ttc att gct att ggt cca gca atg cgc tgg gtg   4642
Thr Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val
275                 280                 285
ggt gac ttg ctg gca cac ggt ctg cag gga ctc tat gat ttc ggt ggt   4690
Gly Asp Leu Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly
290                 295                 300
cca gtc ggc ggt ctg ctt ttc ggt ctg gtc tac tca cca atc gtt atc   4738
Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile
305                 310                 315                 320
act ggt ctg cac cag tcc ttc ccg cca att gag ctg gag ctg ttc aac   4786
Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn
325                 330                 335
cag ggt gga tcc ttc atc ttc gca acc gca tcc atg gcc aat atc gcg   4834
Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala
340                 345                 350
cag ggt gca gca tgt ttg gca gtg ttc ttc cta gcg aag agt gaa aag   4882
Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys
355                 360                 365
ctc aag ggc ctt gca ggt gct tca ggt gtc tcc gct gtt ctt ggt att   4930
Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile
370                 375                 380
aca gag cct gcg atc ttc ggt gtg aac ctt cgc ctg cgc tgg ccg ttc   4978
Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe
385                 390                 395                 400
tac att ggt atc ggt acc gca gct atc ggt ggc gct ttg att gca ctc   5026
Tyr Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu
405                 410                 415
ttt gat atc aag gca gtt gcg ttg ggc gct gca ggt ttc ttg ggt gtt   5074
Phe Asp Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val
420                 425                 430
gtt tct att gat gct cca gat atg gtc atg ttc ttg gtt tgc gcg gta   5122
Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val
435                 440                 445
gtt acc ttt gtc atc gca ttc ggc gca gcg att gct tat ggc ctt tac   5170
Val Thr Phe Val Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr
450                 455                 460
ttg gtt cgc cgc aac ggc agc att gat cca gat gca acc gct gct cca   5218
Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro
465                 470                 475                 480
gtg cct gca gga acg acc aaa gcc gaa gca gaa gca ccc gca gaa ttt   5266
Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe
485                 490                 495
tca aac gat tcc acc atc atc cag gca cct ttg acc ggt gaa gct atc   5314
Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile
500                 505                 510
gca ctg agc agc gtc agc gat gcc atg ttt gcc agc gga aag ctt ggc   5362
Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly
515                 520                 525
tca ggt gtt gcg atc gtc ccc acc aag ggg cag ctg gtt tca cca gtg   5410
Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val
530                 535                 540
agc gga aag atc gtg gtg gcc ttc cca tct ggt cac gct ttc gca gtc   5458
Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val
545                 550                 555                 560
cgc act aag gct gag gat ggt tcc aat gtg gat atc ttg atg cac att   5506
Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile
565                 570                 575
ggt ttc gac acc gta aac ctc aac ggc acg cac ttt aac ccg ctg aag   5554
Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys
580                 585                 590
aag cag ggc gat gaa gtc aaa gca ggg gag ctg ctg tgt gaa ttc gat   5602
Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp
595                 600                 605
att gat gcc att aag gct gca ggt tat gag gta acc acg ccg att gtt   5650
Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val
610                 615                 620
gtt tcg aat tac aag aaa acc gga cct gta aac act tac ggt ttg ggc   5698
Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly
625                 630                 635                 640
gaa att gaa gcg gga gcc aac ctg ctc aac gtc gca aag aaa gaa gcg   5746
Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala
645                 650                 655
gtg cca gca aca cca taagttgaaa ccttgagtgt tcgcacacag gttagactag   5801
Val Pro Ala Thr Pro
660
gggacgtgac tctacgcatc tttgacaccg gtacccgtac gcttcgagat tttaaacctg 5861
ttcaaccagg tcatgcctcg gtgtacctgt gtggtgccac cccgcaatct tcaccccaca 5921
ttggacatgt tcgttcagca gtagcgtttg atattttgcg ccgctgaa              5969
<210> 2
<211> 661
<212> PRT
<213> Brevibacterium lactofermentum
<400> 2
Met Asp His Lys Asp Leu Ala Gln Arg Ile Leu Arg Asp Ile Gly Gly
1               5                  10                  15
Glu Asp Asn Ile Val Ala Ala Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Leu
20                  25                  30
Val Leu Lys Asp Thr Lys Asp Val Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Asp
35                  40                  45
Pro Asp Leu Lys Gly Thr Phe Glu Thr Gly Gly Met Phe Gln Ile Ile
50                  55                  60
Val Gly Pro Gly Asp Val Asp His Val Phe Lys Glu Leu Asp Asp Ala
65                  70                  75                  80
Thr Ser Lys Asp Ile Ala Val Ser Thr Glu Gln Leu Lys Asp Val Val
85                  90                  95
Ala Asn Asn Ala Asn Trp Phe Ser Arg Ala Val Lys Val Leu Ala Asp
100                 105                 110
Ile Phe Val Pro Leu Ile Pro Ile Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Met
115                 120                 125
Ala Ile Asn Asn Val Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Gly Pro Gln Ser
130                 135                 140
Leu Val Glu Met Phe Pro Gln Ile Ser Gly Val Ala Glu Met Ile Asn
145                 150                 155                 160
Leu Met Ala Ser Ala Pro Phe Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Gly Phe
165                 170                 175
Thr Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Glu Phe Leu Gly Ala Gly Ile
180                 185                 190
Gly Met Ala Met Val Phe Pro Thr Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala
195                 200                 205
Ala Thr Met Thr Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu
210                 215                 220
Asp Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val
225                 230                 235                 240
Val Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu
245                 250                 255
Met Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu
260                 265                 270
Thr Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val
275                 280                 285
Gly Asp Leu Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly
290                 295                 300
Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile
305                 310                 315                 320
Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn
325                 330                 335
Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala
340                 345                 350
Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys
355                 360                 365
Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile
370                 375                 380
Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu
405                 410                 415
Phe Asp Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val
420                 425                 430
Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val
435                 440                 445
Val Thr Phe Val Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr
450                 455                 460
Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro
465                 470                 475                 480
Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe
485                 490                 495
Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile
500                 505                 510
Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly
515                 520                 525
Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val
530                 535                 540
Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val
545                 550                 555                 560
Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile
565                 570                 575
Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys
580                 585                 590
Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp
595                 600                 605
Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val
610                 615                 620
Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly
625                 630                 635                 640
Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala
645                 650                 655
Val Pro Ala Thr Pro
660
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Sau3AI cassette
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)
<223> complementary strand extends a single strand having
a sequence of 3'-ctag-5' at this position in the
direction of 5' from 3'
<400> 3
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata ggga                  44
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: EcoRI cassette
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> complementary strand extends a single strand having
a sequence of 3'-ttaa-5' at this position in the
direction of 5' from 3'
<400> 4
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagag               47
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: HindIII cassette
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> complementary strand extends a single strand having
a sequence of 3'-tcga-5' at this position in the
direction of 5' from 3'
<400> 5
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggaga                46
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PstI cassette
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(51)
<223> complementary strand does not exist
<400> 6
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagactgc a          51
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: SalI cassette
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> complementary strand extends a single strand having
a sequence of 3'-agct-5' at this position in the
direction of 5' from 3'
<400> 7
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagag               47
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: XbaI cassette
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> complementary strand extends a single strand having
a sequence of 3'-gatc-5' at this position in the
direction of 5' from 3'
<400> 8
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagat               47
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 9
cgtcttgcga ggattcagcg agctg                                       25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 10
agctggattt cggccatgaa ttcta                                       25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 11
gatctgttcg gtccgcaatc act                                         23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 12
cactggtgga gatgttccct cagat                                       25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 13
catcttcgca accgcatcca tggcc                                       25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 14
cgcgcagggt gcagcatgtt tggc                                        24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 15
gggccttgca ggtgcttcag gtgtc                                       25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 16
ccgctgttct tggtattaca gagcc                                       25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 17
gcagcgtcag cgatgccatg tttgc                                       25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 18
gcttggctca ggtgttgcga tcgtc                                       25
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: cassette
primer 1
<400> 19
gtacatattg tcgttagaac gcggtaatac gactca                           36
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: cassette
primer 2
<400> 20
cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga                            35
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR
<400> 21
cgctactgct gaacgaacat gtcc                                        24
【図面の簡単な説明】
図１は、シュークロースＰＴＳエンザイムＩＩ遺伝子破壊用プラスミドの構築過程を示す図。
図２は、ｐＢＣＴ４の構築過程を示す図。
【図１】
0004254103.tif 000005
【図２】
0004254103.tif 000006