(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子およびグリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含む発現カセットで適当な宿主細胞を形質転換すること；
（ii）単糖、オリゴ糖、多糖および単一炭素基質から成る群から選択される最低１種の炭素源の存在下に（ｉ）の形質転換された宿主細胞を培養してそれによりグリセロールを産生すること；および
（iii）（ii）で産生されたグリセロールを回収すること、
を含んで成る、組換え生物体からのグリセロールの産生方法。
【請求項２】
適する宿主細胞が、細菌、酵母および糸状菌から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
適する宿主細胞が、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、クロストリジウム属（Clostridium）、クレブシエラ属（Klebsiella）、アエロバクター属（Aerobacter）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、アスペルギルス属（Aspergillus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、スキゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ジゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、ピキア属（Pichia）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ケカビ属（Mucor）、トルロプシス属（Torulopsis）、メチロバクター属（Methylobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、バチルス属（Bacillus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびシュードモナス属（Pseudomonas）から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
適当な宿主細胞が大腸菌（E.coli）もしくはサッカロミセス属（Saccharomyces）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
炭素源がグルコースである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対応し、また、そのアミノ酸配列が、その酵素の機能特性を変えないアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を包含する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
グリセロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子が配列番号１３もしくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対応し、また、そのアミノ酸配列が、その酵素の機能を変えないアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を包含しうる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は分子生物学の分野および所望の化合物の製造のための組換え生物体の使用に関する。より具体的には、本発明は、グリセロールの高められた産生のための、別個にもしくは一緒にのいずれかのグリセロール−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）およびグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）のクローン化された遺伝子の発現を記述する。
背景
グリセロールは、化粧品、液体石鹸、食物、医薬品、潤滑剤、不凍液、および多数の他の応用での使用のため産業による大きな要求にある化合物である。グリセロールのエステルは脂肪および油脂工業で重要である。
全ての生物体がグリセロールを合成する生来の能力を有するわけではない。しかしながら、グリセロールの生物学的産生はいくつかの種の細菌、藻類および酵母について既知である。細菌バチルス  リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）およびラクトバチルス  リコペルシカ（Lactobacillus lycopersica）はグリセロールを合成する。グリセロール産生は、耐塩藻ドゥナリエラ属（Dunaliella）の種およびアステロモナス  グラチリス（Asteromonas gracilis）で高い外的塩濃度に対する保護のため見出される（ベン・アモツ（Ben-Amotz）ら、（1982）Experientia 38:49-52）。同様に、多様な耐浸透圧酵母が保護手段としてグリセロールを合成する。サッカロミセス属（Saccharomyces）の大部分の株はアルコール醗酵の間に若干のグリセロールを産生し、そしてこれは浸透圧ストレスの適用により生理学的に増大され得る（アルバーティン（Albertyn）ら、（1994）Mol.Cell.Biol.14、4135-4144）。今世紀の初期には、亜硫酸塩もしくはアルカリのようなスティアリング剤（steering reagent）を添加するサッカロミセス属（Saccharomyces）の培養によりグリセロールを商業的に産生していた。不活性複合体の形成により、スティアリング剤はアセトアルデヒドのエタノールへの転化を阻止もしくは阻害し；従って、過剰の還元同等物（ＮＡＤＨ）が、グリセロールを産生する還元用のジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に利用可能か、またはこれに向けて「舵取り（スティアリング）される」。この方法は、亜硫酸塩による酵母の成長の部分的阻害により制限される。この制限は、異なる機構により過剰のＮＡＤＨ同等物を創製するアルカリの使用により部分的に克服され得る。この実施に際して、アルカリはカニッツァロ不均化を引き起こして２当量のアセトアルデヒドからエタノールおよび酢酸を生じた。
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ＤＡＲ１、ＧＰＤ１）は、サッカロミセス  ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）（ワン（Wang）ら、（1994）、J.Bact.176:7091-7095）からクローニングされかつ配列決定されている。ＤＡＲ１遺伝子をシャトルベクターにクローニングし、そして大腸菌（E.coli）を形質転換するのに使用し、ここで発現が活性の酵素を産生した。ワン（Wang）ら、上記は、ＤＡＲ１が細胞の浸透圧環境により調節されることを認識するが、しかし、当該遺伝子が組換え生物体でのグリセロール産生を高めるのにどのように使用されうるかを示唆しない。
他のグリセロール−３−リン酸脱水素酵素が単離されている。例えば、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸脱水素酵素が、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）からクローニングされかつ配列決定されている（ララソン（Larason）ら、（1993）Mol.Microbiol.、10:1101、（1993））。アルバーティン（Albertyn）ら（（1994）Mol.Cell.Biol.、14:4135）はＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）からのグリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードするＧＰＤ１のクローニングを教示する。ワン（Wang）らと同様、アルバーティン（Albertyn）らおよびララソン（Larason）らの双方がこの遺伝子の調節の浸透圧感受性を認識するが、しかし、当該遺伝子が組換え生物体でのグリセロール産生にどのように使用されうるかを示唆しない。
Ｇ３ＤＰＨでのように、グリセロール−３−ホスファターゼがサッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から単離されており、また、当該タンパク質はＧＰＰ１およびＧＰＰ２遺伝子によりコードされると同定されている（ノルベック（Norbeck）ら、（1996）J.Biol.Chem.、271:13875）。Ｇ３ＤＰＨをコードする遺伝子と同様にＧＰＰ２は浸透圧で誘導されるようである。
一緒にもしくは別個に発現されるＧ３ＰＤＨ／Ｇ３Ｐホスファターゼをもつ組換え生物体からのグリセロール産生を教示する既知の技術は存在しない。細胞に対する何らかのストレス（塩もしくはオスモライト（osmolyte））を適用することを必要としないこれら２種の酵素活性をもついずれかの野生型生物体からのグリセロール産生を教示する既知の技術も存在しない。ユーステース（Eustace）（（1987）、Can.J.Microbiol.、33:112-117）は組換えＤＮＡ技術によりグリセロール産生を達成することから離れて教示する。選択的育種技術により、これらの研究者は親株より高いレベルでグリセロールを産生した交配酵母株を創製したが；しかしながらＧ３ＰＤＨ活性は不変もしくはわずかにより低いままであった。
生理学的条件下でグリセロールを産生することが可能な微生物は、とりわけ浸透圧ストレスもしくはスティアリング剤の添加により混乱され得るより複雑な異化もしくは生合成経路の一部としてインビボでグリセロールそれ自身が基質として使用されうる場合に、工業的に望ましい。
従って、解決されるべき問題は、ある酵素活性、とりわけそれぞれジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）およびその後グリセロールへの転化を触媒するＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの添加もしくは強化により炭素の流れをグリセロールの産生に向かわせる方法である。この方法は組換え生物体に関して以前には記述されておらず、また、２種の酵素をコードする遺伝子の単離およびそれらのその後の発現を必要とする。遭遇された驚くべきおよび予期されない困難は宿主に対するＧ３Ｐホスファターゼの毒性であり、これは成長阻害を避けるためのその発現レベルの慎重な制御を必要とした。
発明の要約
本発明は、（ｉ）（ａ）グリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子；
（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子、
のいずれかもしくは双方を含む発現カセットで適当な宿主細胞を形質転換すること；（ii）単糖、オリゴ糖、多糖、および単一炭素基質、もしくはそれらの混合物から成る群から選択される最低１種の炭素源の存在下に、形質転換された宿主細胞を培養して、それによりグリセロールを産生すること；そして（iii）グリセロールを回収すること、を含んで成る、組換え生物体からのグリセロールの製造方法を提供する。グルコースが最も好ましい炭素源である。
本発明は、さらに、グリセロールの産生のための、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素およびグリセロール−３−ホスファターゼ活性を発現することが可能な発現カセットを含んで成る形質転換された宿主細胞を提供する。
生物学的寄託物および配列表の簡単な記述
発明者は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Micro-organisms for the Purposes of Patent Procedure）の合意のもとに以下の生物学的寄託を行った。すなわち
0004330041.tif 000002
「ＡＴＣＣ」は、１２３０１パークローンドライヴ、ロックヴィル、米国メリーランド州、２０８５２（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 U.S.A.）に位置するアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（American Type Culture Collection）国際寄託所を指す。指定は寄託された試料の受託番号である。
発明者は、特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準的表示規則（the Rules for the Standard Representation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications）（1992年12月のＯＪ  ＥＰＯに対する補遺第２号に出版されたＥＰＯ会長決定に対する付属書類ＩおよびII（Annexes I and II to the Decision of the President of the EPO,published in Supplement No.2 to OJ EPO,12/1992））、ならびに連邦規則集１．８２１−１．８２５ならびに付録ＡおよびＢ（ヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列を含有する出願開示の要件（Requirements for Application Disclosures Containing Nucleotides and/or Amino Acid Sequences））に従って23個の配列を提供した。
発明の詳細な記述
本発明は、組換え生物体での醗酵可能な炭素源からのグリセロールの生物学的産生方法を提供する。当該方法は、化粧品および医薬品工業で有用なグリセロールの迅速、安価かつ環境的に信頼できる供給源を提供する。当該方法は、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）および／もしくはグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）をコードするクローニングされた同種もしくは異種の遺伝子を含有する微生物を使用する。当該微生物を炭素源と接触させ、そしてグリセロールをコンディションド培地（conditioned medium）から単離する。遺伝子はグリセロールの産生のため別個にもしくは一緒に宿主微生物中に組込まれうる。
本明細書で使用されるところの以下の用語が請求の範囲および明細書の解釈に使用されうる。
「グリセロール−３−リン酸脱水素酵素」および「Ｇ３ＰＤＨ」という用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転化を触媒する酵素活性の原因であるポリペプチドを指す。インビボのＧ３ＰＤＨはＮＡＤＨ；ＮＡＤＰＨ；もしくはＦＡＤ依存性である。ＮＡＤＨ依存性の酵素（ＥＣ．１．１．１．８）は、ＧＰＤ１（ジェンバンク（GenBank）Ｚ７４０７１ｘ２）もしくはＧＰＤ２（ジェンバンク（GenBank）Ｚ３５１６９ｘ１）もしくはＧＰＤ３（ジェンバンク（GenBank）Ｇ９８４１８２）もしくはＤＡＲ１（ジェンバンク（GenBank）Ｚ７４０７１ｘ２）を包含するいくつかの遺伝子によりコードされる。ＮＡＤＰＨ依存性の酵素（ＥＣ．１．１．１．９４）は、ｇｐｓＡ（ジェンバンク（GenBank）Ｕ３２１６４３、（ｃｄｓ１９７９１１−１９６８９２）Ｇ４６６７４６およびＬ４５２４６）によりコードされる。ＦＡＤ依存性の酵素（ＥＣ．１．１．９９．５）は、ＧＵＴ２（ジェンバンク（GenBank）Ｚ４７０４７ｘ２３）もしくはｇｌｐＤ（ジェンバンク（GenBank）Ｇ１４７８３８）もしくはｇｌｐＡＢＣ（ジェンバンク（GenBank）Ｍ２０９３８）によりコードされる。
「グリセロール−３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセロール−３−ホスファターゼ」もしくは「ｄ，ｌ−グリセロールホスファターゼ」、および「Ｇ３Ｐホスファターゼ」という用語は、グリセロール−３−リン酸のグリセロールへの転化を触媒する酵素活性の原因であるポリペプチドを指す。Ｇ３ＰホスファターゼはＧＰＰ１（ジェンバンク（GenBank）Ｚ４７０４７ｘ１２５）もしくはＧＰＰ２（ジェンバンク（GenBank）Ｕ１８８１３ｘ１１）によりコードされる。
「グリセロールキナーゼ」という用語は、反応条件に依存してグリセロールのグリセロール−３−リン酸への、もしくはグリセロール−３−リン酸のグリセロールへの転化を触媒する酵素活性の原因であるポリペプチドを指す。グリセロールキナーゼはＧＵＴ１（ジェンバンク（GenBank）Ｕ１１５８３ｘ１９）によりコードされる。
「ＧＰＤ１」、「ＤＡＲ１」、「ＯＳＧ１」、「Ｄ２８３０」および「ＹＤＬ０２２Ｗ」という用語は互換可能に使用され、そして、サイトゾルのグリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードしかつ配列番号１に示される塩基配列を特徴とする遺伝子を指す。
「ＧＰＤ２」という用語は、サイトゾルのグリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードしかつ配列番号２に示された塩基配列を特徴とする遺伝子を指す。
「ＧＵＴ２」および「ＹＩＬ１５５Ｃ」という用語は互換可能に使用され、そして、ミトコンドリアのグリセロール−３−リン酸脱水素酵素をコードしかつ配列番号３に示された塩基配列を特徴とする遺伝子を指す。
「ＧＰＰ１」、「ＲＨＲ２」および「ＹＩＬ０５３Ｗ」という用語は互換可能に使用され、そして、サイトゾルのグリセロール−３−ホスファターゼをコードしかつ配列番号４に示された塩基配列を特徴とする遺伝子を指す。
「ＧＰＰ２」、「ＨＯＲ２」および「ＹＥＲ０６２Ｃ」という用語は互換可能に使用され、そして、サイトゾルのグリセロール−３−ホスファターゼをコードしかつ配列番号５に示された塩基配列を特徴とする遺伝子を指す。
「ＧＵＴ１」という用語は、サイトゾルのグリセロールキナーゼをコードしかつ配列番号６に示された塩基配列を特徴とする遺伝子を指す。
本明細書で使用されるところの「機能」および「酵素機能」という用語は、特定の化学反応を実施するのに必要とされるエネルギーを変えることにおける酵素の触媒活性を指す。こうした活性は、生成物および基質双方の産生が適する条件下で成し遂げられうる平衡での反応に当てはまりうる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書で互換可能に使用される。
「炭素基質」および「炭素源」という用語は、本発明の宿主生物体により代謝されうる炭素源を指し、そしてとりわけ単糖、オリゴ糖、多糖および一炭素基質もしくはそれらの混合物から成る群から選択される炭素源を意味する。
「宿主細胞」および「宿主生物体」という用語は、外来すなわち異種の遺伝子を受領しかつそれらの遺伝子を発現して活性の遺伝子産物を産生することが可能な微生物を指す。
「外来遺伝子」、「外来ＤＮＡ」、「異種遺伝子」および「異種ＤＮＡ」という用語は全て、異なる宿主生物体内に置かれた１種の生物体生来の遺伝子物質を指す。
「組換え生物体」および「形質転換された宿主」という用語は異種すなわち外来の遺伝子で形質転換されたすべての生物体を指す。本発明の組換え生物体は、適する炭素基質からのグリセロールの産生のためＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼをコードする外来遺伝子を発現する。
「遺伝子」は、コーディング領域に先行する（５’非コーディング）および後に続く（３’非コーディング）調節配列を包含する特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然」および「野生型」の遺伝子という用語は、それ自身の調節配列を伴い天然に見出されるような遺伝子を意味する。
本明細書で使用されるところの「コーディング（encoding）」および「コーディング（coding）」という用語は、それにより遺伝子が転写および翻訳の機構によりアミノ酸配列を生じる方法を指す。特定のアミノ酸配列をコードする方法は、コードされたアミノ酸の変化を引き起こさない塩基の変化を伴いうる、または１個もしくはそれ以上のアミノ酸を変えうるがしかしそのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基の変化を伴うＤＮＡ配列を包含することを意味する。従って、本発明は特定の例示的配列以上を包含する。生じるタンパク質分子の機能特性に本質的に影響を及ぼさない沈黙変化を生じる配列中の欠失、挿入もしくは置換のような配列に対する改変もまた企図される。例えば、遺伝コードの縮重を反映する、もしくは与えられた部位での化学的に同等なアミノ酸の産生をもたらす遺伝子配列の変化が企図され；従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのような別のより少なく疎水性の残基またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのようなより疎水性の残基をコードするコドンにより置換されうる。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような１個の負に荷電した残基の代わりの別のもの、もしくはアルギニンの代わりにリシンのような１個の正に荷電した残基の代わりの別のものの置換をもたらす変化が生物学的に同等の産物を生じることもまた期待され得る。タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化がそのタンパク質の活性を変えることが期待されないともまたみられる。いくつかの場合では、実際、そのタンパク質の生物学的活性に対する変化の影響を研究するためにその配列の突然変異体を作成することが望ましいであろう。提案された改変のそれぞれは、コードされた産物での生物学的活性の保持の測定がそうであるように、当該技術分野における慣用技術内に十分ある。さらに、当業者は、本発明により包含される配列がストリンジェントな条件下（0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、65℃）で本明細書に例示される配列とハイブリダイゼーションするそれらの能力によってもまた定義されることを認識する。
「発現」という用語は、その遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写および翻訳を指す。
本明細書で使用されるところの「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、その細胞の中心的代謝の一部でなくかつ通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子をしばしばもつ染色体外要素を指す。こうした要素は、いずれかの起源由来の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの直鎖状もしくは環状の自律的複製性配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であることができ、ここでは、多数のヌクレオチド配列が、プロモーター断片および適切な３’非翻訳配列と一緒の選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を細胞中に導入することが可能である独特の構築物中に結合もしくは再結合されている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有しかつその外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を助長する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有しかつその外来遺伝子に加えて異種宿主中でのその遺伝子の高められた発現を見込む要素を有する特定のベクターを指す。
「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、核酸の取り込み後の細胞中での新たな遺伝子の獲得を指す。獲得された遺伝子は染色体ＤＮＡに組込まれうるか、もしくは染色体外複製配列として導入されうる。「形質転換体」という用語は形質転換から生じる細胞を指す。
「遺伝子的に変えられた」という用語は、形質転換もしくは突然変異により遺伝物質を変化させる方法を指す。
代表的酵素経路
グリセロールは大部分の微生物で見出されるグリセロール生合成経路の操作により組換え生物体で産生されうることが企図される。典型的には、グルコースのような炭素基質がＡＴＰの存在下にヘキソキナーゼを介してグルコース−６−リン酸に転化される。グルコースリン酸異性化酵素がグルコース−６−リン酸のフルクトース−６−リン酸、そしてその後６−ホスホフルクトキナーゼの作用によりフルクトース−１，６−二リン酸への転化を触媒する。二リン酸はその後、アルドラーゼを介してジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に取られる。最後に、ＮＡＤＨ依存性のＧ３ＰＤＨがＤＨＡＰをグリセロール−３−リン酸に転化し、これはその後Ｇ３Ｐホスファターゼによりグリセロールに脱リン酸化される（アガルワル（Agarwal）（1990）、Adv.Biochem.Engrg.41:114）。
グリセロール産生の代替経路
ＤＨＡＰからのグリセロール産生の代替経路が提案されている（ワン（Wang）ら、（1994）J.Bact.176:7091-7095）。この提案された経路では、ＤＨＡＰは特異的もしくは非特異的ホスファターゼにより脱リン酸化されてジヒドロキシアセトンを与え得、これがその後ジヒドロキシアセトン還元酵素によりグリセロールに還元され得る。ジヒドロキシアセトン還元酵素は原核生物およびスキゾサッカロミセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）で既知であり、そして、適切なホスファターゼと一緒になったこうした活性のクローニングおよび発現がグリセロール産生につながり得る。ＤＨＡＰからのグリセロール産生の別の代替経路が提案されている（レドカー（Redkar）（1995）、Experimental Mycology、19:241、1995）。この経路では、ＤＨＡＰが普遍的糖分解酵素トリオースリン酸異性化酵素によりグリセルアルデヒド−３−リン酸に異性化される。グリセルアルデヒド−３−リン酸はグリセルアルデヒドに脱リン酸化され、これがその後アルコール脱水素酵素もしくはＮＡＤＰ依存性グリセロール脱水素酵素活性により還元される。アスペルギルス  ニズランス（Aspergillus nidulans）からのホスファターゼおよび脱水素酵素活性のクローニングおよび発現がグリセロール産生につながり得る。
Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子
本発明は、宿主細胞中でのＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ活性の発現に適する遺伝子を提供する。
Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子は既知である。例えば、ＧＰＤ１がサッカロミセス属（Saccharomyces）から単離されており、そして配列番号７に与えられるアミノ酸配列をコードする配列番号１により与えられる塩基配列を有する（ワン（Wang）ら、上記）。同様に、配列番号８に与えられるアミノ酸配列をコードする配列番号２に与えられる塩基配列を有するＧＰＤ２によりコードされるＧ３ＰＤＨ活性もまたサッカロミセス属（Saccharomyces）から単離されている（エリクソン（Eriksson）ら、（1995）Mol.Microbiol.、17:95）。
本発明の目的上、Ｇ３ＰＤＨ活性の原因であるポリペプチドをコードするいかなる遺伝子も適することが企図され、ここでその活性はジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転化を触媒することが可能である。さらに、それぞれ遺伝子ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＵＴ２、ｇｐｓＡ、ｇｌｐＤおよびｇｌｐＡＢＣのαサブユニットに対応する配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示されるようなＧ３ＰＤＨのアミノ酸配列をコードするいかなる遺伝子も本発明において機能性であることができることが企図され、ここでそのアミノ酸配列は酵素の機能を変えないアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を包含しうる。当業者は、他の起源から単離されたＧ３ＰＤＨをコードする遺伝子もまた本発明での使用に適することができることを真価を認めることができる。例えば、原核生物から単離された遺伝子は、ジェンバンク（GenBank）受託Ｍ３４３９３、Ｍ２０９３８、Ｌ０６２３１、Ｕ１２５６７、Ｌ４５２４６、Ｌ４５３２３、Ｌ４５３２４、Ｌ４５３２５、Ｕ３２１６４、Ｕ３２６８９およびＵ３９６８２を包含する。真菌から単離された遺伝子はジェンバンク（GenBank）受託Ｕ３０６２５、Ｕ３０８７６およびＸ５６１６２を包含し；昆虫から単離された遺伝子はジェンバンク（GenBank）受託Ｘ６１２２３およびＸ１４１７９を包含し；そして哺乳動物の起源から単離された遺伝子はジェンバンク（GenBank）受託Ｕ１２４２４、Ｍ２５５５８およびＸ７８５９３を包含する。
Ｇ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子は既知である。例えば、ＧＰＰ２はサッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から単離されており、かつ、配列番号５に示される塩基配列を有し、これは配列番号１３に示されるアミノ酸配列をコードする（ノルベック（Norbeck）ら、（1996）、J.Biol.Chem.、271:13875）。
本発明の目的上、Ｇ３Ｐホスファターゼ活性をコードするいかなる遺伝子も当該方法での使用に適し、ここでその活性はグリセロール−３−リン酸のグリセロールへの転化を触媒することが可能である。さらに、それぞれ遺伝子ＧＰＰ２およびＧＰＰ１に対応する配列番号１３および１４に示されるようなＧ３Ｐホスファターゼのアミノ酸配列をコードするいかなる遺伝子も、Ｇ３Ｐホスファターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を包含するいかなるアミノ酸配列も包含する本発明で機能性であることができる。当業者は、他の起源から単離されたＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子もまた本発明での使用に適するであろうと認識するであろう。例えば、グリセロールを生じるグリセロール−３−リン酸の脱リン酸化は、以下の一般的もしくは特異的ホスファターゼ、すなわちアルカリホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１）［ジェンバンク（GenBank）Ｍ１９１５９、Ｍ２９６６３、Ｕ０２５５０もしくはＭ３３９６５］；酸ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２）［ジェンバンク（GenBank）Ｕ５１２１０、Ｕ１９７８９、Ｕ２８６５８もしくはＬ２０５６６］；グリセロール−３−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．−）［ジェンバンク（GenBank）Ｚ３８０６０もしくはＵ１８８１３ｘ１１］；グルコース−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１０）［ジェンバンク（GenBank）Ｍ３３８０７］；グルコース−６−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．９）［ジェンバンク（GenBank）Ｕ００４４５］；フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１１）［ジェンバンク（GenBank）Ｘ１２５４５もしくはＪ０３２０７］またはホスファチジルグリセロリン酸ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３２７）［ジェンバンク（GenBank）Ｍ２３５４６およびＭ２３６２８］の１種もしくはそれ以上を用いて達成されうる。
グリセロールキナーゼをコードする遺伝子は既知である。例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）からのグリセロールキナーゼをコードするＧＵＴ１が単離されかつ配列決定されており（パヴリク（Pavlik）ら（1993）、Curr.Genet.、24:21）、そしてその塩基配列が配列番号６に示されており、これは配列番号１５に示されるアミノ酸配列をコードする。当業者は、グリセロールキナーゼは本来グリセロールの分解を触媒するとは言え、同一の酵素がグリセロールの合成で機能して適切な反応エネルギー条件下でグリセロール−３−リン酸をグリセロールに転化しうるであろうと認識するであろう。グリセロールキナーゼによるグリセロール産生の証拠が存在する。嫌気的もしくは呼吸阻害条件下で、トリパノソーマ  ブルセイ（Trypanosoma brucei）はグリセロール−３−ＰおよびＡＤＰの存在下にグリセロールを生じさせる。この反応はグリコソーム（glycosome）区画で起こる（ハモンド（Hammond）、（1985）、J.Biol.Chem.、260:15646-15654）。
宿主細胞
Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの発現によるグリセロールの組換え産生に適する宿主細胞は原核生物もしくは真核生物のいずれかであることができ、そして、活性の酵素を発現するそれらの能力によってのみ制限されうる。好ましい宿主細胞は、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、クロストリジウム属（Clostridium）、クレブシエラ属（Klebsiella）、アエロバクター属（Aerobacter）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、アスペルギルス属（Aspergillus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、スキゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ジゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、ピキア属（Pichia）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ケカビ属（Mucor）、トルロプシス属（Torulopsis）、メチロバクター属（Methylobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、バチルス属（Bacillus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびシュードモナス属（Pseudomonas）のようなグリセロールの産生に典型的に有用な細菌、酵母および糸状菌であることができる。大腸菌（E.coli）およびサッカロミセス属（Saccharomyces）が本発明で好ましい。
ベクターおよび発現カセット
本発明は、適当な宿主細胞へのＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼのクローニング、形質転換および発現に適当な多様なベクターならびに形質転換および発現カセットを提供する。適当なベクターは使用される細菌と適合性であるものであることができる。適当なベクターは、例えば、細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７もしくはＭ−１３由来ファージのような）、コスミド、酵母もしくは植物由来であり得る。こうしたベクターを得るおよび使用するためのプロトコールは当業者に既知である（サンブルック（Sambrook）ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual-第１、２、３巻（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989））。
典型的には、当該ベクターもしくはカセットは、適当な遺伝子の転写および翻訳を指図する配列、選択可能なマーカー、ならびに自律的複製もしくは染色体組込みを可能にする配列を含有する。適するベクターは、転写開始制御をもつ遺伝子の５’の領域および転写終止を制御するＤＮＡ断片の３’の領域を含んで成る。双方の制御領域が、形質転換された宿主細胞と同種の遺伝子由来である場合が最も好ましい。こうした制御領域は産生宿主として選ばれた特定の種に生来の遺伝子由来である必要はない。
所望の宿主細胞でのＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子の発現に至らせる（drive）のに有用である開始制御領域すなわちプロモーターは多数であり、かつ当業者に馴染みである。事実上、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯおよびＴＰＩ（サッカロミセス属（Saccharomyces）での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア属（Pichia）での発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、λＰL、λＰR、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃ（大腸菌（E.coli）での発現に有用）を包含するがしかしこれらに制限されない、これらの遺伝子を至らせることが可能ないかなるプロモーターも本発明に適する。
終止制御領域もまた、好ましい宿主に生来の多様な遺伝子由来でありうる。場合によっては終止部位は不必要でありうるが；しかしながら包含される場合が最も好ましい。
本酵素の有効な発現のためには、当該酵素をコードするＤＮＡは、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように選択された発現制御領域に開始コドンにより操作可能に連結される。
グリセロール産生のための適当な宿主の形質転換ならびにＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの発現
適当なカセットが構築されれば、それらを使用して適当な宿主細胞を形質転換する。Ｇ３ＰＤＨおよび／もしくはＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子を含有するカセットの宿主細胞への導入は、例えばカルシウムで浸透可能にされた（permiabilized）細胞を使用する形質転換、電気穿孔法、もしくは組換えファージウイルスを使用するトランスフェクションによるような既知の処置により成し遂げられうる（サンブルック（Sambrook）ら、上記）。
本発明では、一般的方法および実施例に完全に記述されるように、ＡＨ２１およびＤＡＲ１カセットを使用して大腸菌（E.coli）ＤＨ５αを形質転換した。
培地および炭素基質
本発明の醗酵培地は適する炭素基質を含有しなければならない。適する基質は、グルコースおよびフルクトースのような単糖、乳糖もしくはショ糖のようなオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースのような多糖、またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー浸透液、トウモロコシ浸出液、テンサイ糖蜜およびオオムギ麦芽のような再生可能な供給原料からの未精製の混合物を包含してよいがしかしこれらに制限されなくてよい。加えて、炭素基質は、二酸化炭素、もしくはそれについて重要な生化学的中間体への代謝転化が立証されているメタノールのような単一炭素基質でもよい。
単一炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒドもしくはギ酸）からのグリセロール産生は、メチル栄養性酵母（ヤマダ（Yamada）ら（1989）、Agric.Biol.Chem.、53（2）:541-543）および細菌（ハンター（Hunter）ら（1985）、Biochemistry、24:4148-4155）で報告されている。これらの生物体は、メタンからギ酸までの酸化段階の範囲にわたる単一炭素化合物を同化し得、そしてグリセロールを産生し得る。炭素同化の経路は、リブロース一リン酸、セリン、もしくはキシルロース一リン酸を通ってであり得る（ゴットシャルク（Gottschalk）、Bacterial Metabolism、第２版、シュプリンガー・フェアラーク（Springer-Verlag）：ニューヨーク（1986））。リブロース一リン酸経路は六炭糖を形成するリブロース−５−リン酸とのギ酸の縮合を必要とし、この六炭糖はフルクトースそして最終的に三炭素産物グリセルアルデヒド−３−リン酸になる。同様に、セリン経路は単一炭素化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸を介して解糖経路に同化する。
単一および二炭素基質に加え、メチル栄養性の生物体は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンおよび多様なアミノ酸のような多数の他の炭素含有化合物を利用することもまた既知である。例えば、メチル栄養性酵母はメチルアミンからの炭素を利用してトレハロースもしくはグリセロールを形成することが既知である（ベリオン（Bellion）ら（1993）、Microb.Growth Cl Compd.、［国際シンポジウム］、第７回、415-32。編者：マレル（Murrell,J.Collin）；ケリー（Kelly,Don P.）。発行者：インターセプト（Intercept）、英国アンドーヴァー（Andover））。同様に、カンジダ属（Candida）の多様な種はアラニンもしくはオレイン酸を代謝することができる（サルター（Sulter）ら（1990）、Arch.Microbiol.、153（5）:485-9）。これゆえに、本発明で利用される炭素源は広範な炭素含有基質を包含してよく、かつ、生物体の選択によってのみ制限されることができる。
上述された炭素基質の全ておよびそれらの混合物が本発明で適するとは言え、好ましい炭素基質は単糖、オリゴ糖、多糖、一炭素基質もしくはそれらの混合物である。グルコース、フルクトース、ショ糖、麦芽糖、乳糖のような糖類ならびにメタノールおよび二酸化炭素のような単一炭素基質がより好ましい。グルコースが炭素基質として最も好ましい。
適切な炭素源に加え、醗酵培地は、培養物の成長およびグリセロール産生に必要な酵素経路の促進に適する当業者に既知の適するミネラル、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有しなければならない。
培養条件
典型的には、細胞は適切な培地中で30℃で成長される。好ましい成長培地は、ルリア・ベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地、サブローグルコース（Sabouraud Dextrose）（ＳＤ）培地、もしくは酵母培地（yeastmedium）（ＹＭ）培地のような普遍的な商業的に製造された培地である。他の合成（defined）すなわち合成（synthetic）成長培地もまた使用されることができ、そして、特定の微生物の成長に適切な培地が微生物学もしくは醗酵科学の当業者により知られることができる。直接もしくは間接的に同化抑制を調節することが既知の作用物質、例えば環状アデノシン２’：３’−一リン酸の使用もまた反応培地に組み込まれうる。同様に、グリセロール産生の強化につながる酵素活性を調節することが既知の作用物質（例えば、スルフェート、ビスルフェートおよびアルカリ）の使用は、遺伝子操作とともにもしくはこれに対する代替として使用されうる。
醗酵に適するｐＨ範囲はｐＨ5.0ないしｐＨ9.0の間であり、ここでｐＨ6.0ないしｐＨ8.0の範囲が初期条件に好ましい。
反応は好気的もしくは嫌気的条件下で実施されることができ、ここで嫌気的もしくは微小好気的（microaerobic）条件が好ましい。
Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの同定および精製
タンパク質Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの発現レベルを酵素活性により測定する。Ｇ３ＰＤＨ活性のアッセイはＧ−３−ＰへのＤＨＡＰの転化における共基質（cosubstrate）ＮＡＤＨのスペクトル特性に頼る。ＮＡＤＨは固有のＵＶ／可視吸収を有し、そしてその消費を340nmで分光測光的にモニターし得る。Ｇ３Ｐホスファターゼ活性はこの反応で遊離される無機リン酸を測定するいずれかの方法により測定し得る。最も普遍的に使用される検出方法は青色のリンモリブデン酸アンモニウム錯体の可視分光測光的測定を使用する。
グリセロールの同定および回収
グリセロールは、細胞を含まない抽出物での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）分析により同定かつ定量されうる。醗酵培地を0.01N硫酸の移動相を定組成の様式で使用する分析的イオン交換カラムで分析する方法が好ましい。
醗酵培地からのグリセロールの回収方法は当該技術分野で既知である。例えば、グリセロールは、反応混合物を以下の一連の段階、すなわち濾過；水の除去；有機溶媒抽出；および分別蒸留にかけることにより細胞培地から得ることができる（米国特許第2,986,495号）。
補足による形質転換体の選択
機能性のｇｐｓＡにコードされたＧ３ＰＤＨの非存在下すなわち膜の生合成の阻止につながる条件では、大腸菌（E.coli）細胞はＧ３Ｐを合成することが不可能である。こうした封止を伴う細胞は栄養要求性であり、グリセロールもしくはＧ３Ｐのいずれかが膜のリン脂質の合成のため培養培地中に存在することを必要とする。
クローニングされた異種の野生型ｇｐｓＡ遺伝子は染色体のｇｐｓＡの突然変異を補足してグリセロールもしくはＧ３Ｐを欠く培地中での成長を可能にすることが可能である（ワン（Wang）ら（1994）、J.Bact.176:7091-7095）。この補足（complementation）戦略を基礎とすれば、ｇｐｓＡ欠損細胞のグルコースでの成長は、それらがプラスミドにコードされたｇｐｓＡを保有する場合にのみ起こるとみられ、ＤＨＡＰからのＧ３Ｐの合成を基礎とした選択を可能にする。培養の間に組換えｇｐｓＡプラスミドを喪失する細胞はＧ３Ｐを合成することに失敗するとみられ、そして細胞の成長がその後阻害されるとみられる。補足するＧ３ＰＤＨ活性はｇｐｓＡからのみならずしかしまたＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＰＤ３、ＧＵＴ２、ｇｌｐＤおよびｇｌｐＡＢＣのようなＧ３ＰＤＨ活性を発現する他のクローニングされた遺伝子からもまた発現され得る。これらはＢＢ２０のようなｇｐｓＡ欠損大腸菌（E.coli）株中で維持され得（クロナン（Cronan）ら（1974）、J.Bact.、118:598）、抗生物質の選択を使用する必要性および大スケール醗酵でのそのひどく高い費用を軽減する。
関連する戦略がＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）の浸透圧調節突然変異体の発現および選択に使用され得る（ラーソン（Larsson）ら（1993）、Mol.Microbiol.、10:1101-1111）。これらのｏｓｇ１突然変異体は低水分潜在性で成長することが不可能であり、そしてグリセロール産生の低減された能力および抑制されたＧ３ＰＤＨ活性を示す。ｏｓｇ１の塩感受性の欠損はクローニングかつ発現されたＧ３ＰＤＨ遺伝子により補足され得る。かように、グリセロールを合成する能力が所望のグリセロール産生細胞についての選択マーカーとして同時に使用され得る。
実施例
一般的方法
リン酸化、連結および形質転換の手順は当該技術分野で公知である。以下の実施例での使用に適する技術は、サンブルック（Sambrook）ら、Molecular Cloning:A laboratory Manual、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（1989）に見出されうる。
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法は当該技術分野で公知である。以下の実施例での使用に適する技術は、Manual of Methods for General Bacteriology（ゲルハルト（Phillipp Gerhardt）、マーレイ（R.G.E.Murray）、コスティロウ（Ralph N.Costilow）、ネスター（Eugene W.Nester）、ウッド（Willis A.Wood）、クリーク（Noel R.Krieg）とフィリップス（G.Briggs Phillips）編）、アメリカ微生物学会（American Society for Microbiology）、ワシントンＤＣ（1994）もしくはBiotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology（ブロック（Thomas D.Brock）、第２版（1989）サイナウアー  アソシエーツ  インク（Sinauer Associates,Inc.）、マサチューセッツ州サンダーランド）に見出されうる。細菌細胞の成長および維持に使用される全ての試薬および材料は、別の方法で明記されない限り、アルドリッチ  ケミカルズ（Aldrich Chemicals）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ディフコ  ラボラトリーズ（DIFCO Laboratories）（ミシガン州デトロイト）、ギブコ／ＢＲＬ（GIBCO/BRL）（メリーランド州ゲイタースバーグ）もしくはシグマ  ケミカル  カンパニー（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス）から得た。
略語の意味は以下のようである。すなわち、「ｈ」は時間（１もしくは複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（１もしくは複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（１もしくは複数）を意味し、「ｄ」は日（１もしくは複数）を意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
細胞株
以下の大腸菌（Escherichia coli）株をＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの形質転換および発現に使用した。株は大腸菌（E.coli）遺伝子ストックセンター（E.coli Genetic Stock Center）もしくはライフ  テクノロジーズ（Life Technologies）（メリーランド州ゲイタースバーグ）から得た。
ＡＡ２００（ｇａｒＢ１０  ｆｈｕＡ２２  ｏｍｐＦ６２７  ｆａｄＬ７０１  ｒｅｌＡ１  ｐｉｔ−１０  ｓｐｏＴ１  ｔｐｉ−１  ｐｈｏＭ５１０  ｍｃｒＢ１）（アンダーソン（Anderson）ら、（1970）、J.Gen.Microbiol.、62:329）。
ＢＢ２０（ｔｏｎＡ２２  ΔｐｈｏＡ８  ｆａｄＬ７０１  ｒｅｌＡ１  ｇｌｐＲ２  ｇｌｐＤ３  ｐｉｔ−１０  ｇｐｓＡ２０  ｓｐｏＴ１  Ｔ２Ｒ）（クロナン（Cronan）ら、J.Bact.、118:598）。
ＤＨ５α（ｄｅｏＲ  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｈｓｄＲ１７  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦＶ１６９）ｐｈｉ８０ｌａｃＺΔＭ１５Ｆ-）（ウッドコック（Woodcock）ら、（1989）、Nucl.Acids Res.、17:3469）。
グリセロールの同定
グルコースのグリセロールへの転化をＨＰＬＣおよび／もしくはＧＣによりモニターした。分析はクロマトグラフィーの当業者に利用可能な標準的技術および材料を使用して実施した。１個の適する方法はＵＶ（210nm）およびＲＩ検出を使用するウォーターズ  マキシマ（Waters Maxima）８２０ＨＰＬＣシステムを利用した。サンプルを、0.01N硫酸を移動相として0.5mL/minの流速で使用する50℃に温度制御されたショウデックス（Shodex）ＳＨ−１０１１Ｐプレカラム（６mm×50mm）を装備されたショウデックス（Shodex）ＳＨ−１０１１カラム（８mm×３００mm；ウォーターズ（Waters）、マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。定量分析を所望した場合は、サンプルを、0.01N硫酸を移動相として0.69mL/minの流速で使用する50℃に温度制御されたショウデックス（Shodex）ＳＨ−１０１１Ｐプレカラム（６mm×50mm）を装備されたショウデックス（Shodex）ＳＨ−１０１１カラム（８mm×300mm；ウォーターズ（Waters）、マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。定量分析を所望した場合は、サンプルを、外部標準としての既知量のトリメチル酢酸を含んで調製した。典型的には、グリセロール（ＲＩ検出）およびグルコース（ＲＩ検出）の保持時間はそれぞれ17.03minおよび12.66minであった。
グリセロールはＧＣ／ＭＳによってもまた分析した。グリセロールの質量分析検出および定量を伴うガスクロマトグラフィーを、以下の条件すなわち注入器：分割、１：15；サンプル量：１μL；温度プロフィル：30secの保持を伴う150℃の初期温度、180℃へ40℃/min、240℃へ20℃/min、2.5min保持で、ＤＢ−ＷＡＸカラム（30m、直径0.32mm、0.25μm薄膜厚、Ｊ＆Ｗサイエンティフィク（J & W Scientific）、カリフォルニア州フォルソン）を使用して行った。検出：ＥＩ質量分析（ヒューレット  パッカード（Hewlett Packard）５９７１、カリフォルニア州サンフェルナンド）、グリセロールおよびグリセロール−ｄ８の標的イオンとしてイオン61ｍ／ｚおよび64ｍ／ｚ、ならびにグリセロールの修正体（qualifier）イオンとしてイオン43ｍ／ｚを使用する定量的ＳＩＭ。グリセロール−ｄ８を内部標準として使用した。
グリセロール−３−ホスファターゼ、ＧＰＰについてのアッセイ
酵素活性のアッセイを、抽出物をビス−トリスもしくはＭＥＳおよびマグネシウム緩衝液、ｐＨ6.5中で有機リン基質とインキュベーションすることにより実施した。使用された基質は１−α−グリセロールリン酸もしくはｄ，１−α−グリセロールリン酸のいずれかであった。アッセイでの試薬の最終濃度は、緩衝液（20mM、ビス−トリスもしくは50mMＭＥＳ）；塩化マグネシウム（10mM）；および基質（20mM）である。サンプル中の総タンパク質が少なくそして可視的沈殿が酸クエンチ（acidquench）で発生しなかった場合はサンプルをキュベット中で便宜的にアッセイした。この方法は、20mMの基質（50μL、200mM）、50mMのＭＥＳ、10mMの塩化マグネシウム、ｐＨ6.5緩衝液を含有したキュベット中で酵素サンプルをインキュベーションすることを必要とした。最終のホスファターゼアッセイ体積は0.5mLであった。酵素を含有するサンプルを反応混合物に添加し；キュベットの内容物を混合し、そしてその後キュベットを５ないし120分間Ｔ＝37℃の循環水浴中に置いた。時間の長さは酵素サンプル中のホスファターゼ活性が２から0.02U/mLまでの範囲にわたったかどうかに依存した。酵素反応を酸モリブデン酸試薬（0.4mL）の添加によりクエンチした。フィスケ  サバロウ（Fiske SubbaRow）試薬（0.11mL）および蒸留水（1.5mL）を添加した後に溶液を混合しそして発色させた。完全な色の発生を可能にするための10分後に、サンプルの吸光度をケアリー（Cary）２１９ＵＶ／可視分光光度計を使用して660nmで読み取った。遊離された無機リン酸の量を、ストック無機リン酸溶液（0.65mM）を使用すること、そして0.026から0.130μmol/mLまでの範囲にわたる最終無機リン酸濃度の６種の標準品を調製することにより調製した標準曲線と比較した。
グリセロール３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）活性の分光測光的アッセイ
以下の手順を、ベル（Bell）ら（1975）、J.Biol.Chem.、250:7153-8により発表された方法から下に改変されたように使用した。この方法は、30℃で1.0mLの総体積中に５mMＤＴＴを含む0.1Mトリス／塩酸、ｐＨ7.5緩衝液中に0.2mMＮＡＤＨ；2.0mMジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）および酵素を含有したキュベット中で酵素サンプルをインキュベーションすることを必要とした。分光光度計を340nmの固定波長での吸光度変化をモニターするよう設定した。機器を、緩衝液のみを含有するキュベットをブランクにした。酵素をキュベットに添加した後に吸光度の読みを取った。最初の基質ＮＡＤＨ（５０μLの４mMＮＡＤＨ；吸光度はおよそ1.25ＡＵに増大するはずである）を添加してバックグラウンド速度を測定した。この速度は最低３分間追跡すべきである。第二の基質ＤＨＡＰ（50μLの40mMＤＨＡＰ）をその後添加し、そして経時的（over time）吸光度変化を最低３分間モニターして全体速度を測定した。Ｇ３ＰＤＨ活性を、全体速度からバックグラウンド速度を差し引くことにより定義した。
プラスミド構築および株の構築
大腸菌（E.coli）でのグリセロール産生の増大ためのグリセロール３−ホスファターゼのクローニングおよび発現
サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体Ｖのλクローン６５９２（ジーンバンク（GeneBank）、受託番号Ｕ１８８１３ｘ１１）をＡＴＣＣから得た。グリセロール３−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）遺伝子を、５’端にＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＸｂａＩ切断部位および３’端にＳｍａＩ切断部位を組込む合成プライマー（配列番号１７と配列番号１６）を使用して標的ＤＮＡとしてのλクローンからのクローニングによりクローニングした。この産物をＳｒｆＩ切断部位でｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene）、ウィスコンシン州マジソン）にサブクローニングしてＧＰＰ２を含有するプラスミドｐＡＨ１５を生じさせた。プラスミドｐＡＨ１５はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋中でｌａｃプロモーターからの発現に関し不活性な向きにＧＰＰ２遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１５からのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔII  ＳＫ＋に挿入してプラスミドｐＡＨ１９を生じさせた。ｐＡＨ１９はｌａｃプロモーターからの発現に適正な向きにＧＰＰ２遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＰＨＯＸ２に挿入してプラスミドｐＡＨ２１を創製した。ｐＡＨ２１／ＤＨ５αが発現プラスミドである。
大腸菌（E.coli）でのＤＡＲ１の過剰発現のためのプラスミド
ＤＡＲ１を、合成プライマー（配列番号１９と配列番号１８）を使用するゲノムのＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）のＤＮＡからのＰＣＲクローニングにより単離した。成功したＰＣＲクローニングはＤＡＲ１の５’端にＮｃｏＩ切断部位を置き、ここでＮｃｏＩ内のＡＴＧはＤＡＲ１のイニシエイターのメチオニンである。ＤＡＲ１の３’端にはＢａｍＨＩ切断部位を翻訳ターミネーターに続いて導入する。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、そして発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）内の同一部位にクローニングしてｐＤＡＲ１Ａを与えた。
ＤＡＲ１の５’端により良好なリボソーム結合部位を創製するため、合成プライマー（配列番号２１と配列番号２０）を連結することにより得られたＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＤＡＲ１ＡのＮｃｏＩ切断部位に挿入してｐＡＨ４０を創製した。プラスミドｐＡＨ４０はｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のプロモーターからの発現に適正な向きに新たなＲＢＳおよびＤＡＲ１遺伝子を含有する。ｐＤＡＲ１ＡからのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、および合成プライマー（配列番号２３と配列番号２２）を連結することにより得られた第二の組のＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーを、ｐＢＣ−ＳＫ＋（ストラタジーン（Stratagene）、ウィスコンシン州マジソン）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＡＨ４２を創製した。プラスミドｐＡＨ４２はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
ＤＡＲ１およびＧＰＰ２の発現カセットの構築
ＤＡＲ１およびＧＰＰ２の発現カセットを、標準的な分子生物学の方法を使用して、上述された個々のＤＡＲ１およびＧＰＰ２の二次クローンから集成した。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＡＨ４０に挿入してｐＡＨ４３を創製した。ＲＢＳおよびＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＡＨ４２に挿入してｐＡＨ４５を創製した。
ＧＰＰ２の５’端のリボソーム結合部位を以下のように改変した。合成プライマーＣＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ（配列番号２５）を伴うＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡ（配列番号２４）を、ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片に連結することにより得られるＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＳｐｅＩリンカーを、ｐＡＨ４０のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断部位に挿入してｐＡＨ４８を創製した。プラスミドｐＡＨ４８はＤＡＲ１遺伝子、改変されたＲＢＳおよびＧＰＰ２遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のｔｒｃプロモーターからの発現に適正な向きに含有する。
大腸菌（E.coli）の形質転換
ここで記述された全てのプラスミドを標準的な分子生物学の技術を使用して大腸菌（E.coli）ＤＨ５αに形質転換した。形質転換体をそのＤＮＡのＲＦＬＰパターンにより確かめた。
実施例１
Ｇ３ＰＤＨ遺伝子で形質転換された大腸菌（E.coli）からのグリセロールの産生
培地
合成培地を、ｐＤＡＲ１Ａで形質転換された大腸菌（E.coli）細胞を使用するグリセロールの嫌気的もしくは好気的産生に使用した。この培地は、１リットルあたり、6.0gのＮａ2ＨＰＯ4、3.0gのＫＨ2ＰＯ4、1.0gのＮＨ4Ｃｌ、0.5gのＮａＣｌ、１mLの20％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、8.0gのグルコース、40mgのカザミノ酸、0.5mlの１％塩酸チアミン、100mgのアンピシリンを含有した。
成長条件
ｐＤＡＲ１ＡもしくはｐＴｒｃ９９Ａベクターをもつ株ＡＡ２００を、37℃で250mLフラスコ中、250rpmで振とうする50mLの培地中で好気的条件で成長させた。Ａ600が0.2〜0.3でイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを１mMの最終濃度に添加し、そしてインキュベーションを48時間継続した。嫌気的成長のため、誘導された細胞のサンプルを使用してファルコン（Falcon）＃２０５４チューブを満たし、これに栓をしそして回転により37℃で48時間穏やかに混合した。グリセロール産生を培養上清のＨＰＬＣ分析により測定した。株ｐＤＡＲ１Ａ／ＡＡ２００は、48時間後に嫌気的条件下で0.38g/L、および好気的条件下で0.48g/Lのグリセロールを産生した。
実施例２
Ｇ３Ｐホスファターゼ遺伝子（ＧＰＰ２）で形質転換された大腸菌（E.coli）からのグリセロールの産生
培地
合成ｐｈｏＡ培地を振とうフラスコ中で使用して大腸菌（E.coli）でのＧＰＰ２発現によるグリセロールの増加を立証した。ｐｈｏＡ培地は、１リットルあたり、アミソイ（Amisoy）12g；硫酸アンモニウム0.62g；ＭＯＰＳ10.5g；クエン酸ナトリウム1.2g；ＮａＯＨ（１M）10mL；１MＮｇＳＯ412mL；100×微量元素12mL；50％グルコース10mL；１％チアミン10mL；100mg/mLのＬ−プロリン10mL；2.5mMＦｅＣｌ3５mL；混合リン酸緩衝液２mL（５mLの0.2MＮａＨ2ＰＯ4＋９mLの0.2MＫ2ＨＰＯ4）、および7.0までのｐＨを含有した。ｐｈｏＡ培地１リットルについて100×微量元素は、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、0.58g；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、0.34g；ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、0.49g；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、0.47g；Ｈ3ＢＯ3、0.12g、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、0.48gを含有した。
振とうフラスコ実験
株ｐＡＨ２１／ＤＨ５α（ＧＰＰ２遺伝子を含有する）およびｐＰＨＯＸ２／ＤＨ５α（対照）を、250mL振とうフラスコ中37℃で45mLの培地（ｐｈｏＡ培地、50μg/mLのカルベニシリンおよび１μg/mLのビタミンＢ12）中で成長させた。培養物を嫌気的条件（250rpmの振とう）下で24時間成長させた。グリセロール産生を培養上清のＨＰＬＣ分析により測定した。ｐＡＨ２１／ＤＨ５αは24時間後に0.2g/Lのグリセロールを産生した。
実施例３
ＧＰＰ２およびＤＡＲ１双方を含有する組換え大腸菌（E.coli）を使用するＤ−グルコースからのグリセロールの産生
ｐＡＨ４３を含有する大腸菌（E.coli）ＤＨ５αによる増大されたグリセロール産生の立証のための成長を、振とうフラスコ培養（三角フラスコ、液体体積は総体積の１／５）で37℃で嫌気的に進行する。
最小培地／１％グルコース振とうフラスコでの培養を、抗生物質選択を伴う一夜ＬＢ／１％グルコース培養物からの接種により開始する。最小培地は濾過滅菌された合成培地、最終ｐＨ6.8（ＨＣｌ）であり、１リットルあたり12.6gの（ＮＨ4）2ＳＯ4、13.7gのＫ2ＨＰＯ4、0.2gの酵母抽出物（ディフコ（Difco））、１gのＮａＨＣＯ3、５mgのビタミンＢ12、５mLの改変バルク（Balch）微量元素溶液（その組成はMethods for General and Molecular Bacteriology（ゲルハルト（P.Gerhardt）ら、編、p.158、アメリカ微生物学会（American Society for Microbiology）、ワシントンＤＣ（1994））に見出され得る）を含有した。振とうフラスコを活発な振とうを伴い一夜37℃でインキュベーションし、その後それらを上清のＧＣ分析のためサンプリングする。ｐＡＨ４３／ＤＨ５αは24時間後に3.8g/Lのグリセロール産生を示した。
実施例４
ＧＰＰ２およびＤＡＲ１双方を含有する組換え大腸菌（E.coli）を使用するＤ−グルコースからのグリセロールの産生
実施例４はＧＰＰ２およびＤＡＲ１双方の遺伝子を含有する組換え大腸菌（E.coli）ＤＨ５α／ｐＡＨ４８からのグリセロールの産生を具体的に説明する。
株ＤＨ５α／ｐＡＨ４８を一般的方法に上述されたように構築した。
前培養
ＤＨ５α／ｐＡＨ４８を醗酵段階での接種（seeding）のための前培養をした。前培養のための成分およびプロトコールを下に列挙する。
前培養培地
ＫＨ2ＰＯ4                                     30.0g/L
クエン酸                                        2．0g/L
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                              2.0g/L
98％硫酸                                        2.0mL/L
クエン酸アンモニウム鉄                          0.3g/L
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                              0.2g/L
酵母抽出物                                      5.0g/L
微量金属                                        5.0mL/L
グルコース                                     10.0g/L
カルベニシリン                                100.0mg/L
上の培地成分を一緒に混合し、そしてｐＨを水酸化アンモニウムで6.8に調節した。培地をその後濾過滅菌した。
微量金属は以下の配合表に従って使用した。すなわち
クエン酸一水和物                                4.0g/L
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                              3.0g/L
ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ                                0.5g/L
ＮａＣｌ                                        1.0g/L
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                              0.1g/L
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ                              0.1g/L
ＣａＣｌ2                                       0.1g/L
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                              0.1g/L
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ                              10mg/L
ＡｌＫ（ＳＯ4）2・12Ｈ2Ｏ                       10mg/L
Ｈ3ＢＯ3                                        10mg/L
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ                           10mg/L
ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ                              10mg/L
Ｎａ2ＳｅＯ3                                    10mg/L
Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ                             10mg/L
培養を、50μLの凍結ストック（低温保護剤として15％グリセロール）から２Lの三角フラスコ中の600mLの培地に接種された接種培養物（seed culture）から開始した。培養物を30℃で250rpmの振とう機中およそ12時間成長させ、そしてその後醗酵器に接種するのに使用した。
醗酵成長
容器
15Lの攪拌タンク醗酵器
培地
Ｋ2ＰＯ4                                        6.8g/L
クエン酸                                        2.0g/L
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                              2.0g/L
98％硫酸                                        2.0mL/L
クエン酸アンモニウム鉄                          0.3g/L
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                              0.2g/L
メイズ（Mazu）    ＤＦ２０４消泡剤（antifoam）  1.0mL/L
上の成分を醗酵器容器中で一緒の滅菌した。ｐＨを水酸化アンモニウムで6.7に上昇させた。酵母抽出物（５g/L）および微量金属溶液（５mL/L）を濾過滅菌されたストック溶液から無菌的に添加した。グルコースを60％供給材料（feed）から添加して10g/Lの最終濃度を与えた。カルベニシリンを100mg/Lで添加した。接種後の体積は６Lであった。
醗酵のための環境的条件
温度を36℃に制御し、また、空気流速を１分あたり６標準リットル（standard liter）で制御した。背圧を0.5barで制御した。攪拌機を350rpmに設定した。水性アンモニアを使用してｐＨを6.7に調節した。グルコース供給材料（60％グルコース一水和物）の速度は、過剰のグルコースを維持するように制御した。
結果
醗酵運転の結果を表１に与える。
0004330041.tif 000003
配列表
（１）  一般的情報：
（ｉ）発明者：
（Ａ）名称：Ｅ．Ｉ．デュポンド・ネムール・アンド・カンパニー（E.I.Du Pont de Nemours and Company）
（Ｂ）通り：１００７マーケット，ストリート（1007 Market Street）
（Ｃ）都市名：ウィルミントン
（Ｄ）州名：デラウェア
（Ｅ）国名：米国
（Ｆ）郵便番号：１９８９８
（Ｇ）電話：３０２−８９２−８１１２
（Ｈ）ファックス：３０２−７７３−０１６４
（Ｉ）テレックス：６７１７３２５
（Ａ）名宛人：ジェネンコール  インターナショナル，インク（Genencor International,Inc.）
（Ｂ）通り：４  ケンブリッヂ  プレイス（4 Cambridge Place）１８７０サウス・ウィントンロード（1870 South Winton Road）
（Ｃ）都市名：ロチェスター
（Ｄ）州名：ニューヨーク
（Ｅ）国名：米国
（Ｆ）郵便番号：１４６１８
（ii）発明の名称：組換え生物体によるグリセロールの製造方法
（iii）配列の数：２５
（iv）コンピューターで解読可能な形：
（Ａ）媒体の型：ディスケット，３．５インチ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ互換機
（Ｃ）オペローティングシステム  マイクロソフト  ワードウィンドーズ９５
（Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト  ワード  バージョン７．０Ａ
（ｖ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）申請日：
（Ｃ）分類：
（vi）以前の出願データ：
（Ａ）出願番号：６０／０３６０２
（Ｂ）申請日：１９９６年１１月１３日
（Ｃ）分類：
（vii）代理人の情報：
（Ａ）氏名：フロイド，リンダ・アクサメティ（Floyd,Linda Axamethy）
（Ｂ）登録番号：３３，６９２
（Ｃ）参照／−件書類番号：ＣＲ−９９８１−Ｐ１
（２）  配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１３８０
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１：
0004330041.tif 000004
（２）  配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２９４６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号２：
0004330041.tif 000005
0004330041.tif 000006
（２）  配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３１７８
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号３：
0004330041.tif 000007
0004330041.tif 000008
（２）  配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８１６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号４：
0004330041.tif 000009
（２）  配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７５３
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号５：
0004330041.tif 000010
（２）  配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５２０
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号６：
0004330041.tif 000011
0004330041.tif 000012
（２）  配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３９１
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号７：
0004330041.tif 000013
0004330041.tif 000014
（２）  配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３８４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号８：
0004330041.tif 000015
0004330041.tif 000016
（２）  配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６１４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号９：
0004330041.tif 000017
0004330041.tif 000018
0004330041.tif 000019
（２）  配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３９９
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１０：
0004330041.tif 000020
0004330041.tif 000021
（２）  配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５０１
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１１：
0004330041.tif 000022
0004330041.tif 000023
0004330041.tif 000024
（２）  配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５４２
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１２：
0004330041.tif 000025
0004330041.tif 000026
0004330041.tif 000027
（２）  配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５０
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１３：
0004330041.tif 000028
（２）  配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２７１
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１４：
0004330041.tif 000029
（２）  配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７０９
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１５：
0004330041.tif 000030
0004330041.tif 000031
0004330041.tif 000032
0004330041.tif 000033
（２）  配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５１
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１６：
0004330041.tif 000034
（２）  配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１７：
0004330041.tif 000035
（２）  配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１８：
0004330041.tif 000036
（２）  配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３９
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１９：
0004330041.tif 000037
（２）  配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号２０：
0004330041.tif 000038
（２）  配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号２１：
0004330041.tif 000039
（２）  配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１９
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号２２：
0004330041.tif 000040
（２）  配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１９
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号２３：
0004330041.tif 000041
（２）  配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸プライマー
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号２４：
0004330041.tif 000042
（２）  配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸プライマー
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号２５：
0004330041.tif 000043
0004330041.tif 000044
0004330041.tif 000045