(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むがん患者由来の検体について、血管内皮増殖因子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズする少なくとも１対のヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、ＶＥＧＦ１８９が検出された場合には該がん患者においてがんの転移が生じているか、または予後が悪いと判定する、該がん患者のがんの転移または予後を判定する方法。
【請求項２】
１対のヌクレオチドプライマーの一方が血管内皮増殖因子遺伝子の一つのエクソンの塩基配列を含み、他方が血管内皮増殖因子遺伝子の異なるエクソンの塩基配列に相補的な配列を含むものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
１対のヌクレオチドプライマーの一方が血管内皮増殖因子遺伝子のエクソン１〜５の塩基配列を含み、他方が血管内皮増殖因子遺伝子のエクソン８の塩基配列に相補的な配列を含むものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
１対のヌクレオチドプライマーの一方が血管内皮増殖因子遺伝子のエクソン４〜５の塩基配列を含み、他方が血管内皮増殖因子遺伝子のエクソン７の塩基配列に相補的な配列を含むものである請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチドプライマーが５〜７０の塩基を持つ請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
１対のヌクレオチドプライマーの一方が配列番号１の塩基配列を含み、他方が配列番号３の塩基配列を含む請求項３記載の方法。
【請求項７】
１対のヌクレオチドプライマーの一方が配列番号２の塩基配列を含み、他方が配列番号４の塩基配列を含む請求項４記載の方法。
【請求項８】
がんが、大腸癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、神経膠腫、骨肉腫および腎臓癌からなる群より選択される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む検体が腫瘍組織である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むがん患者由来の検体に対してＶＥＧＦ１８９のＲＮＡまたはＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行い、該ＶＥＧＦ１８９が検出された場合には該がん患者においてがんの転移が生じているか、または予後が悪いと判定する、該がん患者のがんの転移または予後を判定する方法。
【請求項１１】
核酸プローブが、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域の塩基配列またはそれに相補的な配列を持つＤＮＡである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域の塩基配列またはそれに相補的な配列が１０〜１０００塩基を持つ請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域の塩基配列またはそれに相補的な配列が１０〜４００塩基を持つ請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
核酸プローブが標識されている請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
がんが、大腸癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、神経膠腫、骨肉腫および腎臓癌からなる群より選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む検体が腫瘍組織である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むがん患者由来の検体に対してＶＥＧＦ１８９に特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて特異的結合反応を行い、該ＶＥＧＦ１８９が検出された場合には該がん患者においてがんの転移が生じているか、または予後が悪いと判定する、該がん患者のがんの転移又は予後を判定する方法。
【請求項１８】
抗体が、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質抗原に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
アミノ酸配列が５個以上のアミノ酸を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
がんが、大腸癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、神経膠腫、骨肉腫および腎臓癌からなる群より選択される請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
検体が血清、脳脊髄液または体腔液である請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管内皮増殖因子アイソフォームの発現パターンを調べる方法、ＶＥＧＦ１８９の発現を検査する方法、ＶＥＧＦ１８９を検出する方法、およびそれらの方法に使用できる試薬キットに関する。
背景技術
多くの進行結腸癌の患者は外科治療の後でも肝転移のために死亡する。転移性のコロニーの形成に至る重要な特性と事象は充分に理解されてはいない。多くの研究ががんの遠隔転移に関連した基質の血管形成に向けられて来ている。塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子βおよび腫瘍壊死因子αは血管形成性因子としてよく知られている。
最近、血管形成因子として血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が研究されている（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ＶＥＧＦは、循環性巨大分子に対する微小血管系の透過性を増大する能力に起因して発見された（Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。ＶＥＧＦはｉｎ  ｖｉｖｏで内皮細胞に特異的な抗原および血管形成因子であり、この因子はさまざまな種類の新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ、腫瘍）の血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｓａｔｉｏｎ）に重要な役割を果たす。正常な組織（Ｂｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）と比較したＶＥＧＦの発現過多（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は結腸（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、胸（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、脳（Ｂｅｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、卵巣（Ｂｏｏｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）および肝臓（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，，１９９６）の新生物で立証されている。
２０６個、１８９個、１６５個および１２１個のアミノ酸のポリペプチドをコードするＶＥＧＦ転写体の４つの異なるアイソフォームがヒトの細胞で発現されることが報告されており（Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、これらのＶＥＧＦアイソフォームは異なる生物活性を保持している（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５は可溶性形態で分泌されるが、大きい２つのアイソフォーム（ＶＥＧＦ１８９とＶＥＧＦ２０６）はその細胞表面プロテオグリカンに対するより強いアフィニティーの故に細胞と会合したままでいる。ＶＥＧＦ１２１はヘパリン結合性タンパク質ではないが、他のアイソフォームはヘパリン結合活性を保有している（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５のマイトジェン活性は血小板第４因子によって阻害される（Ｇｅｎｇｒｉｎｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
ＶＥＧＦ１６５はほとんどの組織で発現される（Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が、他のＶＥＧＦ転写体アイソフォームの正確な発現パターンは充分には理解されていない。ＶＥＧＦのアイソフォームの交互発現は結腸癌細胞系においては細胞密度によって調節されている（Ｋｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＶＥＧＦアイソフォームの発現は肝臓の腫瘍組織と非腫瘍組織で異なっている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。結腸癌におけるＶＥＧＦアイソフォームの発現の異なるパターンの臨床病理的意味は充分には理解されていない。
本発明は、ＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンを調べる方法およびそれに使用できる試薬キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、検体中のＶＥＧＦ１８９の発現を検査する方法、検体中のＶＥＧＦ１８９を検出する方法およびそれらに使用できる試薬キットを提供することも目的とする。
発明の開示
本発明者は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」と記す。）の手法を用いて、結腸癌におけるＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンを解析し、アイソフォーム発現パターンは３つのグループに分類されることを見出した。さらに、ＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンと臨床的特徴との相関を分析したところ、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９の３種のアイソフォームの同時発現（タイプ３）が、結腸癌における肝転移、Ｍステージおよび悪い予後と相関していることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む検体について、血管内皮増殖因子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズする少なくとも１対のヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、検体の血管内皮増殖因子アイソフォームの発現パターンを調べる方法を提供する。上記の方法においては、少なくともＶＥＧＦ１８９の発現の有無を調べるとよい。少なくとも１対のヌクレオチドプライマーは、検体のＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンを調べることができるように設計される。例えば、１対のヌクレオチドプライマーの一方がＶＥＧＦ遺伝子の一つのエクソンの塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を含み、他方がＶＥＧＦ遺伝子の異なるエクソンの塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を含むようにするとよい。ヒト由来のＶＥＧＦ１８９遺伝子（エクソン１〜８を含む。）の全ヌクレオチド配およびそれがコードするアミノ酸配列を図５および６に示す。具体的には、１対のヌクレオチドプライマーの一方がＶＥＧＦ遺伝子のエクソン１〜５の塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を含み、他方がＶＥＧＦ遺伝子のエクソン８の塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を含むとよい。ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン１〜５の塩基配列の一部としては、配列番号１の塩基配列を挙げることができる。ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン８の塩基配列の一部に相補的な配列としては、配列番号３の塩基配列を挙げることができる。あるいはまた、１対のヌクレオチドプライマーの一方がＶＥＧＦ遺伝子のエクソン４〜５の塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を含み、他方がＶＥＧＦ遺伝子のエクソン７の塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を含むとよい。ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン４〜５の塩基配列の一部としては、配列番号２の塩基配列を挙げることができる。ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン７の塩基配列の一部に相補的な配列としては、配列番号４の塩基配列を挙げることができる。ヌクレオチドプライマーは、５〜７０の塩基、好ましくは１０〜５０の塩基を持つとよい。
また、本発明は、ＶＥＧＦのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズする少なくとも１対のヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とする、ＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンを調べるための試薬キットを提供する。この試薬キットを用いて行った検査の結果により、がんの転移または予後を診断することができる。この試薬キットは、プライマーの他、増幅試薬（例えば酵素、緩衝剤、およびヌクレオチドトリフォスフェートを含む）および緩衝液などを含んでもよい。このキットは、バイアル、チューブなどのような１つまたはそれ以上の容器手段をひとまとめにして納めるために区画化された担持手段を包含してもよく、この容器手段のそれぞれは、本発明の方法に使用すべき要素の一つを包含する。
さらに、本発明は、ＶＥＧＦのアイソフォームの一つであるＶＥＧＦ１８９のＲＮＡまたはＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブを用いて、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む検体中のＶＥＧＦ１８９の発現を検査する方法を提供する。すなわち、後述の実施例に示すように、タイプ３は他のタイプと比べ、ＶＥＧＦ１８９が特異的に発現している。従って、少なくともこのＶＥＧＦ１８９の有無を調べることにより、上記の発現パターンを調べる方法と同様に、がんにおける転移または予後を診断することができる。核酸プローブは、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域の塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を持つＤＮＡであるとよい。たとえば、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域としては、配列番号１１の配列の塩基番号１５〜１８５の塩基配列を挙げることができる。さらに好ましくは、塩基番号５８〜８７の塩基配列を挙げることができる。ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む塩基配列の一部またはそれに相補的な核酸プローブ配列は、好ましくは１０〜４００塩基、より好ましくは１５〜３０塩基を持つとよい。核酸プローブは、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光色素、化学発光物質、酵素、ビオチンなどで標識されているとよい。
本発明の上記の方法において、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む検体は、がん患者に由来するものであるとよい。がんは、大腸癌（結腸癌）、肝臓癌、乳癌、肺癌、神経膠腫、骨肉腫および腎臓癌からなる群より選択することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む検体は腫瘍組織であるとよい。
さらにまた、本発明は、ＶＥＧＦ１８９に特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて、検体中のＶＥＧＦ１８９を検出する方法を提供する。抗体は、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分にコードされているアミノ酸配列からなるタンパク質抗原に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるとよい。タンパク質抗原は、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域にコードされている、好ましくは５個以上、より好ましくは５から１００個のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるとよい。ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含む領域にコードされているアミノ酸配列としては、配列番号１２の配列のアミノ酸番号６〜６２のアミノ酸配列を挙げることができる。さらに好ましくは、アミノ酸番号１５〜３４のアミノ酸配列を挙げることができる。検体はがん患者に由来するものであるとよい。がんは、大腸癌（結腸癌）、肝臓癌、乳癌、肺癌、神経膠腫、骨肉腫および腎臓癌からなる群より選択することができる。検体は血清、脳脊髄液、体腔液（例えば、胸水、腹水など）であるとよい。
本発明は、また、ＶＥＧＦ１８９のＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブを含むことを特徴とする、ＶＥＧＦ１８９の発現を検査するための試薬キット、およびＶＥＧＦ１８９に特異的に結合する抗体またはアプタマーを含むことを特徴とする、ＶＥＧＦ１８９を検出するための試薬キットを提供する。これらの試薬キットを用いて行った検査の結果により、がんの転移または予後を診断することができる。この試薬キットは、さらに、プライマー、増幅試薬、あるいは反応のための適当な緩衝液などを含んでもよい。このキットは、バイアル、チューブなどのような１つまたはそれ以上の容器手段をひとまとめにして納めるために区画化された担持手段を包含してもよく、この容器手段のそれぞれは、本発明の方法に使用すべき要素の一つを包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法においては、遺伝子増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＭＡ（特表平４−５００７５９号）など）および直接法（例えば、ＤＮＡプローブを用いてＶＥＧＦ１８９のｍＲＮＡを直接検出する方法、ＶＥＧＦ１８９に特異的に結合するバインダーを用いてＶＥＧＦ１８９のタンパク質を検出する方法など）を用いることができる。以下、これらの手法について説明する。
１．遺伝子増幅法
遺伝子増幅法を用いて、ＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンを調べたり、特定のＶＥＧＦアイソフォームを検出することができる。
ＲＴ−ＰＣＲ
がん組織からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行う。まず、がん組織から抽出したＲＮＡをランダムプライマーおよびＲＴａｓｅによりｃＤＮＡを合成する。次に該ｃＤＮＡをプライマーＶ−ＳとＶ−Ａ、またはＶ−Ｓ４とＶ−Ａ７で増幅する（図１参照）。これらのプライマーの組み合わせにより、増幅したＤＮＡをその長さの違いでＶＥＧＦアイソフォームを見分けることができる。プライマーＶ−ＳとＶ−Ａを用いた場合については図２を参照されたい（４４７ｂｐのバンドがＶＥＧＦ１８９由来、３７５ｂｐのバンドがＶＥＧＦ１６５由来、２４３ｂｐのバンドがＶＥＧＦ１２１由来）。プライマーＶ−Ｓ４とＶ−Ａ７を用いた場合については図３を参照されたい（２０４ｂｐのバンドがＶＥＧＦ１８９由来、１３２ｂｐのバンドがＶＥＧＦ１６５由来）。ＶＥＧＦ１８９を発現する患者には肝転移が多く観察された（表１  タイプ３：１２／３２＝３７．５％；タイプ１，２：４／２９＝１３．８％）。また、ＶＥＧＦ１８９を発現する患者はそれを発現していない患者に比べ予後が悪かった（図４参照）。従って、タイプ３（すなわち、ＶＥＧＦ１８９を発現している）の患者に対しては、そのがんは高転移性である、あるいは、そのがんは予後が悪いと診断することができる。
なお、ここでの検出法はゲル電気泳動を用い増幅産物の長さの違いでＶＥＧＦ１８９を検出したが、その他の方法として、例えば、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（以下、「ＨＰＡ」と記す。）（Ａｒｎｏｌｄ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３５：１５８８−１５９４，１９８９）を挙げることができる。増幅終了後、例えば熱変性を利用して増幅産物である２本鎖ＤＮＡを変性する。これにアクリジニウムエステル（以下、「ＡＥ」と記す。）ラベルしたプローブを添加してＨＰＡを行う。該プローブは、ＶＥＧＦのエクソン６と７（図１）の境界部分を含む領域の塩基配列の一部またはそれに相補的な配列を持っており、ＡＥでラベルされている。よって、対照と比較して、高値の化学発光が観察されれば、検体中にＶＥＧＦ１８９のｍＲＮＡが存在することを知ることができる。
ＴＭＡ
ＴＭＡを用いてもＶＥＧＦアイソフォームｍＲＮＡを増幅することができる。例えば、Ｖ−ＳとＶ−Ａのプライマーの組み合わせで該増幅ができる。ただし、少なくとも一方の該プライマーは、その５’側に例えばＴ７ＲＮＡプロモーター配列を持っている。ＴＭＡで増幅された産物はＲＮＡであるが、ＲＴ−ＰＣＲの項と同じＨＰＡでＶＥＧＦ１８９の存在を知ることができる。ここで用いるＡＥラベルしたプローブは、Ｔ７プロモーターに導かれる塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
２．直接法
直接法を用いて、特定のＶＥＧＦアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１８９）あるいはその発現を検出することができる。
ＨＰＡ
ＲＴ−ＰＣＲやＴＭＡ等を用いて増幅しなくとも、検体から抽出したＲＮＡを材料に、例えばＨＰＡを直接適用することでＶＥＧＦ１８９のｍＲＮＡの存在を知ることができる場合もある。ここに用いるＡＥラベルプローブはＶＥＧＦ１８９のｍＲＮＡのエクソン６と７との境界部分を含む領域（例えば、配列番号１１の配列の塩基番号５８〜８７の塩基配列）の一部またはそれに相補的な配列をもち、化学発光物質であるＡＥが結合しているとよい（ＲＴ−ＰＣＲの項参照）。
バインダー
検体中のＶＥＧＦ１８９の存在は、該タンパク質をバインダーで検出することでも知ることができる。ここにいうバインダーとは該タンパク質に特異的に結合する例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはアプタマー等をいう。ここでは、モノクローナル抗体を例に取り説明する。ＶＥＧＦ１８９のｍＲＮＡのエクソン６と７の境界部分を含む領域（図１）に相当するポリペプチド（以下ポリペプチド６７とする）（例えば、配列番号１２の配列のアミノ酸番号１５〜３４のアミノ酸配列）をマウスに免疫し、該マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る。そして、抗原に用いたポリペプチド６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を選択することで、目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。ここで用いる抗原であるポリペプチド６７は、エクソン６および７の境界部分をそのほぼ中心に持ち、アミノ酸の数は少なくとも５個、より好ましくは２０個前後からなる。該抗原は単独で、または例えばＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｙｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、「ＫＬＨ」と記す。）に結合させ、免疫に用いるとよい。
また、アプタマーに関してはＤｒｏｌｅｔらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，ｐ．１０２１，１９９７）により作製することができる。
以上のように作製したバインダーは、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ  生化学実験法１２  東京化学同人）やＥＩＡ（酵素免疫測定法  第３版  医学書院）に利用することでＶＥＧＦ１８９を特異的に検出・定量することができる。
アプタマーを用いたアッセイは、例えば上記Ｄｒｏｌｅｔらの方法を用い構築することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願平１０−１８５３４号の明細書および図面に記載される内容をすべて包含する。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
材料と方法
対象と組織サンプル
本研究における対象は１９８９年１０月から１９９１年１０月の間に東海大学病院において切除手術を受けた結腸癌患者６１人である。患者はすべてＴＮＭスコア（ＵＩＣＣ，１９７８）によって評価した。患者の特徴を表１にまとめて示す。外科検体は急速冷凍し、分析するまで−８０℃で保存した。凍結検体から全細胞ＲＮＡを調製した。
ＶＥＧＦアイソフォーム転写体を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ分析
ＶＥＧＦのアイソフォームを、次のプライマー：Ｖ−Ｓ  ５−ＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧ−３（配列番号１）、Ｖ−Ｓ４  ５−ＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣ−３（配列番号２）、Ｖ−Ａ  ５−ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＡＣ−３（配列番号３）、Ｖ−Ａ７  ５−ＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣ−３（配列番号４）（図１）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。プライマーＶ−ＳおよびＶ−Ａを用いたＰＣＲ増幅によりプローブ（３７８ｂｐ）を調製し、その配列を自動シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ）で確認した。４２℃で６０分間逆転写を行なった（１μｇの全細胞ＲＮＡ、１００ｐＭのランダムプライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））。Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用い、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分から成るＰＣＲ３０回でＶＥＧＦｃＤＮＡ断片を増幅した。生成物のブロット（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を光化学的に標識したプローブ（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）とハイブリダイズさせ、Ｋｏｄａｋ  ＡＲフィルムに露光した。このＲＮＡの品質はβ２ミクログロブリンに対してＲＴ−ＰＣＲで評価した。
結腸癌の組織学的検査
結腸癌検体を１０％ホルマリンで固定し、通常の手法に従ってパラフィンで包埋した。各結腸腫瘍の中心から組織学的切片を切り出し、ＨａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎおよびＥｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）ならびにＶｉｃｔｏｒｉａ  ｂｌｕｅ−Ｈ＆Ｅで染色して結腸壁の静脈侵入を確定した。組織学的検査は２人の病理学者によって別々に検討した。静脈侵入の程度は次の４つのグループに分類した。ｖ０は静脈侵入なし。ｖ１＋は最小の静脈侵入、すなわち、組織学的切片中に１つか２つの静脈侵入の病巣あり。ｖ２＋は中程度の静脈侵入、すなわち、静脈侵入の病巣が３つか４つ。ｖ３＋は５つより多くの侵入病巣があるひどい静脈侵入、また、リンパ管侵入の程度はｌｙ１＋が軽いリンパ管侵入、ｌｙ２＋が中程度のリンパ管侵入、ｌｙ３＋がひどいリンパ管侵入である。
サザンおよびノーザンブロット分析
ＥｃｏＲＩで消化した細胞ＤＮＡ（１３μｇ）のブロット（３７℃で２０時間、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｎｙｔｒａｎ，ＭＳＩ）を３２Ｐで標識したＶＥＧＦｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、ＫＯＤＡＫ  ＲＰフィルムに−８０℃で１週間露光した。全細胞ＲＮＡのブロット（１５μｇ、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を３２Ｐで標識したＶＥＧＦｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた（上記参照）。ＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルはデンシトメトリー（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｕｉｌｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｚｅｉｓｓ）で評価した。
ＶＥＧＦ受容体（ｆｌｔ−１，ＫＤＲ）およびＴＧＦβ−１の発現
ＶＥＧＦ受容体遺伝子の発現（ｆｌｔ−１，ＫＤＲ）は、次のプライマー、ｆｌｔ１−Ｓ  ５−ＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＣＣＣ−３（２６６９−２６９０）（配列番号５）、ｆｌｔａ−Ａ  ５−ＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣ−３（３１２５−３１４６）（配列番号６）、ＫＤＲ−Ｓ  ５−ＣＧＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣ−３（２４０６−２４２９）（配列番号７）、ＫＤＲ−Ａ  ５−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＴＣＧＴＧＣＣＣＣＴＴＴＧＧ−３（２８１３−２８３６）（配列番号８）を用いて上記と同様な条件下でＲＴ−ＰＣＲで評価した。ＴＧＦβ−１遺伝子の発現もＲＴ−ＰＣＲにより、次のプライマー、ＴＧＦβ−１−Ｓ  ５−ＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣ−３（１６７９−１６９９）（配列番号９）、ＴＧＦβ−１−Ａ５−ＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＣ−３（１８６４−１８８５）（配列番号１０）を用いて評価した。
ｃ−Ｋ−ｒａｓがん遺伝子の活性化
ｃ−Ｋ−ｒａｓがん遺伝子の点突然変異をすでに報告されている（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）エンリッチド（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）ＰＣＲ法により評価した。直接配列分析によってｃ−Ｋ−ｒａｓがん遺伝子の点突然変異を確認した。
統計解析
患者のサブグループ間の生存率の差をｌｏｇ−ｒａｎｋテストで比較し、ＫａｐｌａｎとＭｅｉｅｒの方法に従って生存曲線をプロットした。グループ頻度間の比較にはχ２テストを応用した。
結果
ＶＥＧＦアイソフォームパターン
結腸癌検体はすべてＶＥＧＦ１２１（６１／６１）で発現した。アイソフォームパターンを３つのグループ、すなわちタイプ１のＶＥＧＦ１２１、タイプ２のＶＥＧＦ１２１＋ＶＥＧＦ１６５、タイプ３のＶＥＧＦ１２１＋ＶＥＧＦ１６５＋ＶＥＧＦ１８９に分類した。検査した６１の結腸癌のうち３つはタイプ１の発現を示した。６１人の患者のうち２６人はタイプ２の発現を示し、３２人はタイプ３のパターンを示した。検査したいずれの腫瘍もＶＥＧＦ２０６の発現を示さなかった。ＶＥＧＦのこれらのアイソフォームパターンは、ＶＥＧＦｃＤＮＡのいろいろな部分を２組のアンプライマー（ａｍｐｒｉｍｅｒ）で増幅することにより確認した（図２および図３）。
２５の正常な結腸組織のうちの２２はＶＥＧＦ−ｍＲＮＡを発現しなかった。ＶＥＧＦを発現する３つの正常な結腸検体のうちのひとつはタイプ１のアイソフォームＶＥＧＦ１２１を示したが、他の正常な粘膜検体はタイプ３のアイソフォーム発現を示した。
組織学的特徴とＶＥＧＦアイソフォームパターン
タイプ３のアイソフォーム発現を示す結腸癌検体は静脈血管関与のかなり高い発生率を示した（ｖ２＋およびｖ３＋）（Ｐ＝０．００６、χ２テスト、表１）。しかし、このアイソフォーム発現パターンとリンパ管の関与との間には明確な相関はなかった。組織学的グレードの結腸癌はＶＥＧＦアイソフォームパターンと有為な関連を示さなかった（表１）。
ＶＥＧＦアイソフォームと臨床特性との相関
１２人の患者は手術の時点で肝転移を起こしており、４人の患者は追跡期間中に肝転移を示した。唯一１人の患者のみが手術の時点で肺転移を示していたが、そのような転移は追跡期間中に４人の患者で検出された。２５人の患者が追跡期間中に結腸癌のために死亡した。
タイプ３のアイソフォーム発現パターンを示す結腸癌の３２人の患者は、残りのタイプ１とタイプ２の発現パターンを示す２９人の患者より予後がかなり悪かった（Ｐ＜０．０１、Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌ、図４）。
タイプ３のアイソフォーム発現パターンを示す結腸癌の患者は、タイプ１とタイプ２のアイソフォームパターンの患者（４／２９、１３．８％）より肝転移の発生率がかなり高かった（１２／３２、３７．５％）（Ｐ＜０．０５、χ２テスト、表１）。肝転移損傷の１６人の患者のうちの１２人（７５．０％）がタイプ３のパターンを示したが、肝転移のない４５人の患者のうちの２０人（４４．４％）がこのアイソフォーム発現パターンを示した。異常なＶＥＧＦ１８９発現（タイプ３）はＭ１ステージの結腸癌と有意に相関していた（Ｐ＜０．０５、χ２テスト、表１）。ステージＴｎＮｎＭ１の１７人の患者のうちの１３人（７６．５％）はＶＥＧＦ１８９発現も示したが、ステージＴｎＮｎＭ０の４４人の患者の１９人（４３．２％）はこのアイソフォームを発現した。ＶＥＧＦアイソフォームパターンと腫瘍サイズ（Ｔ‐ステージ）またはリンパ節（Ｎ‐ステージ）状態との相関はなかった。
ＶＥＧＦ遺伝子発現レベル
ノーザンブロット分析は検査した材料のすべてでＶＥＧＦの発現過多を示した（２０／２０）。ＶＥＧＦのアップレギュレーションのレベルはさまざまだった。５つの正常な結腸粘膜検体はＶＥＧＦ遺伝子の検出可能な発現を示さなかった。この発現レベルはＶＥＧＦアイソフォームパターンと相関していなかった。ＶＥＧＦ発現レベルは転移、生存期間、その他検査したあらゆる組織学的要因と有意な相関を示さなかった。サザンブロット分析はＶＥＧＦ遺伝子の増幅も再配列も示さなかった（データは示さない）。
ＶＥＧＦ受容体とＴＧＦβ−１の発現
検査した６１の結腸癌のうちの３０がｆｌｔ−１ｍＲＮＡを発現し、６１の結腸癌のうちの４３がＫＤＲｍＲＮＡを発現した。ＶＥＧＦアイソフォームパターンと有意に相関しなかった（表１）。６１の患者のうちの６人がＴＧＦβ−１ｍＲＮＡの発現を示した。
ｃ−Ｋ−ｒａｓがん遺伝子の活性化
ｃ−Ｋ−ｒａｓがん遺伝子の活性化が検査した６１の結腸癌のうちの２７で検出された。この２７の結腸癌の１８（６７％）がｃ−Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２に点突然変異（ＧＧＴ−ＧＡＴ）をもっていた。ホモ接合点突然変異は検出されなかった。ｃ−Ｋ−ｒａｓがん遺伝子の活性化はＶＥＧＦアイソフォームパターンと相関していなかった。
考察
多くの研究が結腸癌の遠隔転移に関する血管形成に向けられている。ＶＥＧＦは血管形成性因子として研究されて来ている（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９：Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。一次ヒト結腸癌検体のすべてでＶＥＧＦ転写体が検出されたが、ＶＥＧＦ発現は２５の正常な結腸組織のうちの３つでＲＴ−ＰＣＲにより検出可能であった。結腸癌は一般にＶＥＧＦ遺伝子を過剰に発現するが、ＶＥＧＦ転写体は正常な結腸検体においてはノーザンブロットで弱い。ＶＥＧＦを発現する細胞の高めの発生率は正常粘膜より胃腸がんで報告されている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。正常結腸粘膜のレベルと比較したＶＥＧＦの発現過多もまた結腸癌で立証されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。以上の結果は結腸癌におけるＶＥＧＦの発現過多を支持している。
これらのバルク研究において可変量の基質ＲＮＡが腫瘍から共に精製された可能性がある。本発明者は、基質エレメントがマウスの組織で置き換えられた結腸癌異種移植片をいくつか樹立し、対応する一次結腸癌材料を保存した。これらの結腸癌異種移植片は一次腫瘍と同じＶＥＧＦアイソフォーム発現パターンを示した。これらの結果は、ＶＥＧＦが基質でなく腫瘍細胞で発現されたことを示している。したがって、基質ＲＮＡで汚染される可能性はほとんど影響しない。
ヒトＶＥＧＦの４つの異なるアイソフォームが同定されている。それらはすべて単一の遺伝子の一次転写体の別のスプライシングによって生じるものである。２組の異なるプライマーを用いてＶＥＧＦアイソフォームのパターンを正確に分析した。この研究においてはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用してＶＥＧＦアイソフォーム発現パターンを確認した。ＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンはＰＣＲサイクルの数や鋳型の量を増大しても影響を受けなかった。本研究においては、結腸癌の患者はすべてＶＥＧＦ１２１を発現し、ほとんどの患者がＶＥＧＦ１６５を発現した。しかし、ＶＥＧＦ１８９はほぼ半分の患者で発現し、いずれの患者もＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ１８９を単独では発現しなかった。ほとんどの肝細胞がんでこれらのアイソフォームのうちＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５は大量に発現された（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。中枢神経系の新生物もすべてＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１８９を発現した（Ｂｅｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。結腸癌細胞系はＶＥＧＦの３つのアイソフォームをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現した（Ｋｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。しかし、どんな割合の結腸癌がこれらのアイソフォームを発現するのか明らかではない。この研究の結果は、脳腫瘍や肝細胞がんより少ない結腸癌がＶＥＧＦのこれらの異常なアイソフォームを発現することを示していた。ヒト胎児肝ＤＮＡライブラリーで検出されたＶＥＧＦ２０６（Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）の発現は、本発明者の検体ではまったく発現されなかった。
結腸癌においてＶＥＧＦのアイソフォームに対してどのような要因が影響をするか分かっていないが、すべての結腸癌が正常な組織と比べてＶＥＧＦ遺伝子を過剰に発現していた。この研究においては、ＶＥＧＦアイソフォームパターンは遺伝子発現レベルと有意な相関を示さなかった。ｃ−Ｋ／Ｈ−ｒａｓがん遺伝子の活性化はラットの腸細胞系におけるＶＥＧＦ遺伝子の発現過多と相関している（Ｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。そこで本発明者は結腸癌におけるＫ−ｒａｓがん遺伝子の活性化を検討した。４５％の結腸癌がＫ−ｒａｓがん遺伝子の活性化を示したが、ｒａｓがん遺伝子活性化とＶＥＧＦアイソフォームパターンとの間に相関はなかった。ＶＥＧＦ受容体ＫＤＲの発現は結腸癌における肝転移と相関している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。また本発明者はＶＥＧＦ受容体（ｆｌｔ−１、ＫＤＲ）遺伝子の発現も検討したが、ＶＥＧＦアイソフォームパターンとの相関はまったく見られなかった。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）はＶＥＧＦ遺伝子の発現をアップレギュレートすると報告されている（Ｄｏｌｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）が、本発明者は結腸癌におけるＴＧＦβ産生とＶＥＧＦアイソフォームとの相関をまったく見出だせなかった。
ＶＥＧＦの４つの異なるアイソフォームの血管形成特性についてはほとんど知られていない。各種のアイソフォームの中で、ＶＥＧＦ１８９タンパク質は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分に対する結合能が最も強い。ＶＥＧＦ１８９を発現する細胞から誘導されたＥＣＭで培養された内皮細胞では増殖が強く刺激されていた（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ＶＥＧＦ１８９アイソフォームはコンフルエントに培養した結腸癌細胞系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的にアップレギュレートされた（Ｋｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，，１９９６）が、このＶＥＧＦ１８９のアップレギュレーションの結果血管形成、腫瘍増殖および転移が増大する可能性があることが示唆された。ＶＥＧＦの発現過多は結腸癌の血管分布と関連していることが示唆されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかし、結腸癌の臨床特性とＶＥＧＦアイソフォーム発現パターンとの間の明白な相関は報告されていない。本発明者は、タイプ３のアイソフォームパターンの発現（ＶＥＧＦ１８９）が結腸癌における静脈の関与と大きく相関しているということを示した。この研究においては、本発明者はまた、ＶＥＧＦ１８９アイソフォームの異常な発現が結腸癌における肝転移およびＭ１ステージと相関していることも立証した。
最近の研究において、結腸癌における全ＶＥＧＦのアップレギュレーションと肝転移との間の相関が示唆された（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかし、ここに示した結果は、結腸癌の予後または悪性特性を論じるためには、ＶＥＧＦの発現レベルを検討するだけではなく、いずれのアイソフォームが発現されるのかも検討するのが重要であるということを示唆している。ＶＥＧＦアイソフォームパターンの検討は結腸癌の患者の予後を予想するのに役立つであろう。
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〔実施態様１〕
＜ＴＭＡ法による増幅およびＨＰＡ法によるＶＥＧＦ１８９の検出法＞
１）実施例１で述べた凍結検体から調製した全細胞ＲＮＡを用いてＶＥＧＦ１８９の発現を調べることができる。
２）ＶＥＧＦ１８９ｍＲＮＡを増幅するには、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法又はＴＭＡ法（ＲＮＡ合成法）を用いることができる。
３）ＰＣＲ法は実施例１で述べたが、ここでは、プライマーとしてプライマーＶ−Ｓ４（配列番号２）及びＶ−Ａ７（配列番号４）を用いたＴＭＡ法の例を示す。
４）ＴＭＡ法を用いてＶＥＧＦ１８９ｍＲＮＡを増幅する場合には、プライマーＶ−Ａ７の５’側にプロモーター配列を付加する。プロモーターとしてはＴ７ポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ポリメラーゼプロモーター等がある。
５）上記プライマーセットを含む増幅試薬を、実施例１で述べた全細胞ＲＮＡに添加し、４２℃で２時間インキュベートする。
６）増幅終了後、プローブ液を添加してＨＰＡ法により、アクリジニウムエステル（以下、「ＡＥ」と記す）の化学発光を測定し、ＶＥＧＦ１８９ｍＲＮＡの有無を調べる。
［プライマーの合成］
１）プライマーＶ−Ａ７（配列番号４）の５’側にＴ７プロモーター配列を付加したプロモータープライマーと、プライマーＶ−８４（配列番号２）とを市販のＤＮＡ合成機を用いて合成する。
［プローブの作製］
１）プローブとしては、配列番号１１で示したエクソン６とエクソン７の境界部分を含む領域の一部、たとえば塩基番号６３から塩基番号８２の配列をもつ下記のような
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オリゴヌクレオチドを市販の合成機を用いて合成する。
２）合成の際には、あとでＡＥを標識するために、塩基番号７２と塩基番号７３の間（矢印）に、アミノリンカーを導入する。ＡＥは、アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）等のＰＣＴ／ＵＳ  ８８／０３３６１の記載に従って標識し、ＡＥがラベルされたＤＮＡプローブを作製する。
［ＴＭＡ法によるＶＥＧＦｍＲＮＡの増幅］
１）Ｔ７プロモーター配列を付加したプライマーＶ−Ａ７ともう一つのプライマーＶ−Ｓ４を用い、ＶＥＧＦ１８９ｍＲＮＡを標的としてＴＭＡを行い、ＲＮＡを大量に合成する。
２）たとえば、実施例１で述べた凍結検体から調製した全細胞ＲＮＡ溶液を、６０℃で１０分間加温し、４２℃で５分間インキュベートする。
３）これに、上記の一対のプライマーを含む増幅試薬（８００ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、４００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、およびヌクレオチドトリフォスフェートなどを含む）を加え、反応物を４２℃で２時間インキュベートする。
４）増幅に用いる試薬は、１００μｌ中に、７０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）、４０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ｒＧＴＰ、４ｍＭ  ｒＣＴＰ、４ｍＭ  ｒＡＴＰ、４ｍＭ  ｒＵＴＰ、各１ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、および２２ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。
５）当業者に理解されるように、本法の変法を行うことができる。たとえば、異なる量の試薬およびインキュベーション温度／時間を用いて、アッセイを行うことができる。
［ＨＰＡ法によるＶＥＧＦ  ＲＮＡの検出］
１）ＴＭＡ法による、エクソン６とエクソン７の境界部分を含む増幅産物（ＲＮＡ）に、ＡＥ標識したオリゴヌクレオチドプローブを加え、ハイブリダイゼーションを行わせ、ＶＥＧＦｍＲＮＡの有無を調べる。
２）増幅産物（標的ＲＮＡ）にハイブリダイズ（結合）しないオリゴヌクレオチドプローブに標識されたＡＥは、加水分解に対して感受性であり、アルカリ存在下で過酸化水素を加えても化学発光しない。
３）しかし、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブに標識されたＡＥは、加水分解に対して耐性であり、化学発光する。
４）ハイブリダイゼーションおよび加水分解条件の例としては、１００ｍＭ  Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ、２３０ｍＭ  ＬｉＯＨ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２、１．２Ｍ  ＬｉＣｌ、２％  ＬｉＬＳ、３％  ＥｔＯＨを含有する溶液（ｐＨ４．７）中にて、６０℃で２０分間のハイブリダイゼーションを、次いで、６００ｍＭ  ホウ酸ナトリウム、１８２ｍＭ  ＮａＯＨ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液（ｐＨ８．５）を加え、６０℃で７〜１５分の加水分解を行う。
５）この後、ルミノメーターにより化学発光を測定することにより、ＡＥ標識ＤＮＡプローブと増幅産物（ＲＮＡ）との結合を調べることができる。
６）すなわち、エクソン６とエクソン７の境界部分をもつＶＥＧＦ１８９に対してのみ、ＡＥ標識プローブは高い化学発光値を示し、その境界部分をもたない他のアイソフォーム、たとえばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５の化学発光値に対して有意な差を示す。
〔実施態様２〕
〈抗体の作製およびＶＥＧＦ１８９の測定法〉
〔モノクローナル抗体の作製〕
ここではマウスモノクローナル抗体を例に取り説明する。ＶＥＧＦ１８９に特異的に結合するモノクローナル抗体を得るにはＶＥＧＦ１８９の全長ポリペプチド鎖を抗原に用いる方法もあるが、ＶＥＧＦ１８９のエクソン６とエクソン７との境界部分を含むペプチドを抗原に用いると、より効率よく望むモノクローナル抗体を得ることができる。つまり、該境界部分をほぼ中央に持つ５個のアミノ酸（例えばアミノ酸配列２２番目〜２６番目）、より好ましくは２０個程度のアミノ酸（例えばアミノ酸配列１５番目〜３４番目）からなるペプチド（以下「ペプチド６７」と記す）を抗原に用いる。ペプチド６７は単独で、または例えばＫｅｙｈｏｌｅ  ｌｙｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、「ＫＬＨ」と記す）に結合させマウスに免疫し、ハイブリドーマを作製する（単クローン抗体講談社サイエンティフィク、免疫実験操作法Ｉ，ＩＩ南江堂）。モノクローナル抗体のスクリーニングは、例えばペプチド６７またはＶＥＧＦ２０６を吸着させた９６穴プレートを用い行うことができる。つまり、ペプチド６７を吸着させたプレートに結合し、ＶＥＧＦ２０６を吸着したプレートに結合しないモノクローナル抗体を選択する。このようにして得られたモノクローナル抗体はＶＥＧＦ１８９にのみ特異的に結合すると判断できる。
〔ポリクローナル抗体〕
ここではウサギを例に取り説明する（免疫実験操作法Ｉ，ＩＩ南江堂）。モノクローナル抗体の項で述べたペプチド６７を単独であるいは例えばＫＬＨに結合させたものを抗原としてウサギに１ヶ月間隔で合計３から４回免疫する。最終免疫の７〜１０日後に採血し、抗血清を得る。該抗血清をプロテインＧカラム（ファルマシア  ＃１７−０６１８−０１）にかけ、ＩｇＧを精製する。該ＩｇＧをＶＥＧＦ２０６を結合させたカラム（ファルマシア  ＃１７−０４３０−０１）にかけ、該カラムに吸着しないで溶出した部分を集める。さらに該溶出液をペプチド６７を結合させたカラムにかける。該カラムに吸着した抗体を回収することでＶＥＧＦ１８９にのみ特異的に結合するポリクローナル抗体を得ることができる。
〔ＶＥＧＦ１８９の測定方法〕
ここではウサギポリクローナル抗体（以下、「ポリクローナル抗体」と記す）とマウスモノクローナル抗体（以下、「モノクローナル抗体」と記す）とを用いた酵素免疫測定法（酵素免疫測定法医学書院）を例に取り説明する。ＡＢＳビーズ（積水化学工業株式会社  ＃８０）にモノクローナル抗体を吸着させる（以下、「ビーズ」と記す）。一方、ポリクローナル抗体は例えばＨｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｄａｓｅで標識する（以下、「標識抗体」と記す）。チューブ（株式会社総研ＲＩＴ−２）に３００ｍＬのリン酸緩衝液を加えこれにビーズを静かに入れる。ここに５０ｍＬのＶＥＧＦ１８９標準品（検量線作成のため）、または検体（例えば血清、血漿、組織抽出液）を加え室温で１〜２時間インキュベートする。チューブ内の反応液を吸引除去後、４ｍＬの洗浄液を加えビーズを洗浄する。この洗浄操作を合計３回繰り返す。洗浄後のビーズに３００ｍＬの標識抗体を加え室温で１〜２時間インキュベートする。チューブ内の反応液を吸引除去後、４ｍＬの洗浄液を加えビーズを洗浄する。この洗浄操作を合計３回繰り返す。洗浄後のビーズに５００ｍＬの基質液（例えば、１，２−フェニレンジアミン液、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン液）を加え室温で３０分〜１時間インキュベートする。２ｍＬの３Ｎ硫酸溶液を加え酵素反応を停止する。基質液が１，２−フェニレンジアミンの場合は４９１ｎｍにおける吸光度を、基質液が３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンの場合は４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。各ＶＥＧＦ１８９標準品の測定値をもとに検量線を作成し、これから検体中のＶＥＧＦ１８９濃度を知ることができる。
産業上の利用可能性
ＶＥＧＦアイソフォームの発現パターンを調べる方法およびそれに使用できる試薬キットが提供された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
参考文献
ＡＮＤＯ  Ｍ，ＭＡＲＵＹＡＭＡ  Ｍ，ＯＴＯ  Ｍ，ＴＡＫＥＭＵＲＡ  Ｋ，ＥＮＤＯ  Ｍ  ＡＮＤ  ＹＵＡＳＡ  Ｙ．（１９９１）．Ｈｉｇｈｅｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃ−Ｋ−ｒａｓ  ２  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｔｙｐｉａ  ｔｈａｎ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，８２，２４５−２４９
ＢＥＲＫＭＡＮ  Ｒ  Ａ，ＭＥＲＲＩＬ  Ｍ  Ｊ，ＲＥＩＮＨＯＬＤ  Ｗ  Ｃ，ＭＯＮＡＣＣＩ  Ｗ  Ｔ，ＳＡＸＥＮＡ  Ａ，ＣＬＡＲＫ  Ｗ  Ｃ，ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ  Ｊ  Ｔ，ＡＬＩ  Ｉ  Ｕ  ＡＮＤ  ＯＬＤＦＩＥＬＤ  Ｅ  Ｈ．（１９９３）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｑｅｎｅ  ｉｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１５３−１５９
ＢＥＲＳＥ  Ｂ，ＢＲＯＷＮ  Ｌ  Ｆ，ＶＡＶ  ＤＥ  ＷＡＴＥＲ  Ｌ，ＤＶＯＲＡＫ  Ｈ  Ｆ  ＡＮＤ  ＳＥＮＧＥＲ  Ｄ  Ｒ．（１９９２）．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，３，２１１−２２０
ＢＯＯＣＯＣＫ  Ａ  Ｃ，ＣＨＡＲＮＯＣＫ−ＪＯＮＥＳ  Ｓ  Ｄ，ＳＨＡＲＫＥＹ  Ｍ  Ａ，ＭＣＬＡＲＥＮ  Ｊ，ＢＡＫＥＲ  ＪＰ，ＷＲＩＧＨＴ  Ａ  Ｋ，ＴＷＥＮＴＹＭＡＮ  Ｒ  Ｐ，ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ  Ｋ  Ｓ．（１９９５）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｌｔ  ａｎｄ  ＫＤＲ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．，８７，５０６−５１６
ＢＲＯＷＮ  Ｌ  Ｆ，ＢＥＲＳＥ  Ｂ，ＪＡＣＫＭＡＮ  Ｒ  Ｗ，ＴＯＧＮＡＺＺＩ  Ｋ，ＧＵＩＬＤＩ  Ａ，ＤＶＯＲＡＫ  Ｈ，ＳＥＮＧＥＲ  Ｄ，ＣＯＮＮＯＮＬＬＹ  Ｊ，ＡＮＤ  ＳＣＨＮＩＴＴ  Ｓ．（１９９５）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，２６，８６−９１
ＢＲＯＷＮ  Ｌ  Ｆ，ＢＥＲＳＥ  Ｂ，ＪＡＣＫＭＡＮ  Ｒ  Ｗ，ＴＯＧＮＡＺＺＩ  Ｋ，ＭＡＮＳＥＡＵ  Ｅ  Ｊ，ＳＥＮＧＥＲ  Ｄ，ＡＮＤ  ＤＶＯＲＡＫ  Ｈ．（１９９３）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，４７２７−４７３５
ＣＯＨＥＮ  Ｔ，ＧＩＴＡＹ−ＧＯＲＥＮ  Ｈ，ＳＨＡＲＯＮ  Ｒ，ＳＨＩＢＵＹＡ  Ｍ，ＨＡＬＡＢＡＮ  Ｒ，ＬＥＶＩ  Ｂ  Ｚ，ＡＮＤ  ＮＥＵＦＥＬＤ  Ｇ．（１９９５）．ＶＥＧＦ１２１，ａ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｉｓｏｆｏｒｍ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７０，１１３２２−１１３２６
ＤＯＬＥＣＫＩ  Ｇ  Ｊ，ＡＮＤ  ＣＯＮＮＯＬＬＹ  Ｄ  Ｔ．（１９９１）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８０，５７２−５７８
ＤＶＯＲＡＫ  Ｈ  Ｆ，ＢＲＯＷＮ  Ｌ  Ｆ，ＤＥＴＭＡＲ  Ｍ，ＡＮＤ  ＤＶＯＲＡＫ  Ａ  Ｍ．（１９９５）．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４６，１０２９−１０３８
ＧＥＮＧＲＩＮＯＶＩＴＣＨ  Ｓ，ＧＲＥＥＮＢＥＲＧ  Ｓ  Ｍ，ＣＯＨＥＮ  Ｔ，ＧＩＴＡＹ−ＧＯＲＥＮ  Ｈ，ＲＯＣＫＷＥＬＬ  Ｐ，ＭＡＩＯＮＥＳ  Ｔ  Ｅ，ＬＥＶＩ  Ｂ，ＡＮＤ  ＮＥＵＦＥＬＤ  Ｇ．（１９９５）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ−４  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＶＥＧＦ１２１  ａｎｄ  ＶＥＧＦ１６５  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７０，１５０５９−１５０６５
ＨＯＵＣＫ  Ｋ  Ａ，ＦＥＲＲＡＲＡ  Ｎ，ＷＩＮＥＲ  Ｊ  ，ＣＡＣＨＩＡＮＥＳ  Ｇ，ＬＩ  Ｂ，ＡＮＤ  ＬＥＵＮＧ  Ｄ  Ｗ（１９９１）．Ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，５，１８０６−１８１４
ＨＯＵＣＫ  Ｋ  Ａ，ＬＥＵＮＧ  Ｄ  Ｗ，ＲＯＷＬＡＮＤ  Ａ  Ｍ，ＷＩＮＥＲ  Ｊ，ＡＮＤ  ＦＥＲＲＡＲＡ  Ｎ（１９９２）．Ｄｕａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２６０３１−２６０３７
ＫＥＣＫ  Ｐ  Ｊ，ＨＡＵＳＥＲ  Ｓ  Ｄ，ＫＲＩＶＩ  Ｇ，ＳＡＮＺＯ  Ｋ，ＷＡＲＲＥＮ  Ｔ，ＦＥＤＥＲ  Ｊ  ＡＮＤ  ＣＯＮＮＯＬＹ  Ｄ  Ｔ．（１９８９）．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ｆａｃｔｏｒ，ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＰＤＧＦ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２４６，１３０９−１３１２
ＫＥＩＳＥＲ  Ａ，ＷＥＩＣＨ  Ｈ  Ａ，ＢＲＡＮＤＮＥＲ  Ｇ，ＭＡＲＭＥ  Ｄ，ＡＮＤ  ＫＯＬＣＨ  Ｗ．（１９９４）．Ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−Ｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，９６３−９６９
ＫＯＵＲＡ  Ａ  Ｎ，ＬＩＵ  Ｗ，ＫＩＴＡＤＡＩ  Ｙ，ＳＩＮＧＨ  Ｒ  Ｋ  ＲＡＤＩＮＳＫＹ  Ｒ  ＡＮＤ  ＥＬＬＩＳ  Ｍ  Ｌ．（１９９６）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｑｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３８９１−３８９４
ＬＥＵＮＧ  Ｄ  Ｗ，ＣＡＣＨＩＡＮＥＳ  Ｇ，ＫＵＡＮＧ  Ｗ  Ｊ，ＧＯＥＤＤＥＬ  Ｄ  Ｖ，ＡＮＤ  ＦＥＲＲＡＲＡ  Ｎ．（１９８９）．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｔｏｇｅｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６−１３０９
ＰＡＲＫ  Ｊ，ＫＥＬＬＥＲ  Ｇ−Ａ，ＡＮＤ  ＦＥＲＲＡＲＡ  Ｎ．（１９９３）．Ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｉｓｏｆｏｒｍｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｅｘｔａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｘｔａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ−ｂｏｕｎｄ  ＶＥＧＦ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，４，１３１７−１３２６
ＲＡＫ  Ｊ，ＭＩＴＳＵＨＡＳＨＩ  Ｙ，ＢＡＹＫＯ  Ｌ，ＦＩＬＭＵＳ  Ｊ，ＳＨＩＲＡＳＡＷＡ  Ｓ，ＳＡＳＡＺＵＫＩ  Ｔ，ＡＮＤ  ＫＥＲＢＥＬ  Ｒ  Ｓ．（１９９５）．Ｍｕｔａｎｔ  ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ  ＶＥＧＦ／ＶＰＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５，４５７５−４５８０
ＳＡＭＢＲＯＯＫ  Ｊ，ＦＲＩＴＳＨ  Ｅ  Ｆ，ＡＮＤ  ＭＡＮＩＡＴＩＳ  Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｎ，ｐ．７．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｑ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．ＳＥＮＧＥＲ  Ｄ  Ｒ，ＧＡＬＬＩ  Ｓ  Ｊ，ＤＶＯＲＡＫ  Ａ  Ｍ，ＰＥＲＵＺＺＩ  Ｃ  Ａ，ＨＡＲＶＥＹ  Ｖ  Ｓ，ＡＮＤ  ＤＶＯＲＡＫ  Ｈ  Ｆ．（１９８３）．Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ａ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３−９８５
ＳＵＺＵＫＩ  Ｋ，ＨＡＹＡＳＨＩ  Ｎ，ＭＩＹＡＭＯＴＯ  Ｙ，ＹＡＭＡＭＯＴＯ  Ｍ，ＯＨＫＡＷＡ  Ｋ，ＩＴＯ  Ｙ，ＳＡＳＡＫＩ  Ｙ，ＹＡＭＡＧＵＣＨＩ  Ｙ，ＮＡＫＡＳＥ  Ｈ，ＮＯＤＡ  Ｋ，ＥＮＯＭＯＴＯ  Ｎ，ＡＲＡＩ  Ｋ，ＹＡＭＡＤＡ  Ｙ，ＹＯＳＨＩＨＡＲＡ  Ｈ，ＴＵＪＩＭＵＲＡ  Ｔ，ＫＡＷＡＮＯ  Ｋ，ＹＯＳＨＩＫＡＷＡ  Ｋ，ＡＮＤ  ＫＡＭＡＤＡ  Ｔ．（１９９６）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３００４−３００９
ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ  Ｙ，ＫＩＴＡＤＡＩ  Ｙ，ＢＵＣＡＮＡ  Ｃ  Ｄ，ＣＬＥＡＲＹ  Ｒ  Ｋ，ＡＮＤ  ＥＬＬＩＳ  Ｌ  Ｍ．（１９９５）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＫＤＲ，ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｔｙ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５，３９６４−３９６８
ＷＡＲＲＥＮ  Ｓ  Ｒ，ＹＵＡＮ  Ｈ，ＭＡＴＬＩ  Ｒ  Ｍ，ＧＩＬＬＥＴＴ  Ａ  Ｎ，ＡＮＤ  ＦＥＲＲＡＲＡ  Ｎ．（１９９５）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｕｍｏｒｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５，１７８９−１７９７
【配列表】
0004362225.tif 000005
0004362225.tif 000006
0004362225.tif 000007
0004362225.tif 000008
0004362225.tif 000009
0004362225.tif 000010
0004362225.tif 000011
0004362225.tif 000012
【図面の簡単な説明】
図１は、ＶＥＧＦのアイソフォームの検出用プライマーを示す。図１において、矢印はプライマーＶ−Ｓ、Ｖ−Ａ、Ｖ−Ｓ４およびＶ−Ａ７の部位を示す。Ｖ−ＳおよびＶ−ＡによるＰＣＲでＶＥＧＦ１２１（２４３ｂｐ）、ＶＥＧＦ１６５（３７５ｂｐ）、ＶＥＧＦ１８９（４４７ｂｐ）およびＶＥＧＦ２０６（４９８ｂｐ）断片が得られた。Ｖ−Ｓ４およびＶ−Ａ７によるＰＣＲでＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６断片が得られた。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲ（プライマーセット；Ｖ−Ｓ，Ｖ−Ａ）によって決定された腫瘍におけるＶＥＧＦ発現を示す。レーン１：患者番号１、タイプ２。レーン２：患者番号４、タイプ３。レーン３：患者番号３８、タイプ３。レーン４：患者番号５、タイプ１。レーン５：患者番号２６、タイプ２。レーン６：患者番号４２、タイプ２。レーン７：患者番号４５、タイプ２。レーン８：患者番号５８、タイプ２。
図３は、ＲＴ−ＰＣＲ（プライマーセット；Ｖ−Ｓ４，Ｖ−Ａ７）によって決定された腫瘍におけるＶＥＧＦ発現を示す。レーン１：患者番号１、タイプ２。レーン２：患者番号４、タイプ３。レーン３：患者番号３８、タイプ３。レーン４：患者番号６０、タイプ２。レーン５：患者番号２６、タイプ２。レーン６：患者番号４２、タイプ２。レーン７：患者番号４５、タイプ２。レーン８：患者番号５８、タイプ２。
図４は、ＶＥＧＦのアイソフォームパターンに基づく全体生存率を示す。タイプ３アイソフォーム発現を示す患者はタイプ１または２のアイソフォーム発現パターンの患者より予後が悪かった（一般化されたＣｏｘ−Ｍａｎｔｅｌテスト、Ｐ＜０．０１）。
図５は、ヒト由来のＶＥＧＦ１８９遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一部（塩基番号１〜７０２）を示す。
図６は、ヒト由来のＶＥＧＦ１８９遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一部（塩基番号７０３〜１１９５）を示す。
【図１】
0004362225.tif 000013
【図２】
0004362225.tif 000014
【図３】
0004362225.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
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