(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２，１３−エポキシ環の還元的開裂によるトリコテセンの無毒化のための、純粋培養物中のオウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物ＤＳＭ１１７９８。
【請求項２】
デオキシニバレノール（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ）（ＤＯＮ）、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ニバレノール（ｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、モノアセトキシサーペノール（ｍｏｎｏａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、ジアセトキシサーペノール（ｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、トリコダーモル（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｏｌ）、ベルカリン（ｖｅｒｒｕｃａｒｉｎ）、ロロジン（ｒｏｒｏｄｉｎ）、アセチルデオキシニバレノール（ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、イソトリコダーミン（ｉｓｏｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、ヒドロキシイソトリコダーミン（ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、カロネクトリン（ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉｎ）、Ｔ−２テトラオール（Ｔ−２  ｔｅｔｒａｏｌ）、Ｔ−２トリオール（Ｔ−２  ｔｒｉｏｌ）、デアセチルネオソラニオール（ｄｅａｃｅｔｙｌｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、ネオソラニオール（ｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、アセチルネオソラニオール（ａｃｅｔｙｌｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、スポロトリキオール（ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｌ）、トリコトリオール（ｔｒｉｃｈｏｔｒｉｏｌ）、サンブシノール（ｓａｍｂｕｃｉｎｏｌ）、及びカルモリン（ｃｕｌｍｏｒｉｎ）を無毒化することを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
分子内に含まれるエポキシド基の還元的生物学的転換によりトリコテセンを無毒化することを特徴とする、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
個別に、対で、又は長鎖で発生する嫌気性グラム陽性桿状非胞子形成性細菌であることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の微生物。
【請求項５】
１６Ｓ  ＲＮＡ配列、即ち
【化１】
0004362603.tif 000007
を含有することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
純粋培養物ＤＳＭ１１７９８が、希釈系列及び嫌気的培養条件において少なくとも２回培養及び／又は発酵を行うことにより、微生物ＤＳＭ１１７９８から得られることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の微生物の培養物を得るための方法。
【請求項７】
培養及び／又は発酵がＨ２及びＣＯ２の気体雰囲気において実施されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
気体雰囲気が、１０：９０から９０：１０、特に約８０：２０のＨ２：ＣＯ２比で選択されることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
培養及び／又は発酵が、０．２から３バール、特に０．５から１バールの過剰圧力において実施されることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養又は発酵が、３５から４２℃、特に３７℃の温度において実施されることを特徴とする、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
培養及び／又は発酵が、６と８の間のｐＨ、特に７と７．５の間のｐＨにおいて実施されることを特徴とする、請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
培養及び／又は発酵が、アルギニン、シトルリン、ペプトン、酵母抽出物、（一つ又は複数の）脂肪酸混合物、（一つ又は複数の）鉱物溶液、グルコース、ヘミン（ｈａｅｍｉｎ）溶液、メナジオン、ビタミン溶液、微量元素、還元剤の中から選択される成分を含む培地調製物において実施されることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
０．１から０．５重量％、特に０．２重量％のグルコースが、培養及び／又は発酵の開始時に添加されることを特徴とする、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
活性のあるトリコテセン無毒化微生物及び／又はその他の嫌気性微生物の酵素調製物が添加されることを特徴とする、請求項６から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８が、特に増殖刺激因子としてＬアルギニンが添加された培地調製物における少なくとも２回のさらなる希釈系列により、培養溶液及び／又は発酵溶液から得られることを特徴とする、請求項６から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培地調製物の純粋培養物の発酵のため、１から４重量％の還元剤、特にシステイン／硫化ナトリウム／炭酸ナトリウムの混合物を含む溶液が添加されることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
培養溶液及び／又は発酵溶液を濃縮すること、特に発酵溶液を遠心分離もしくは濾過によって濃縮すること、及び／又は特に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥もしくはカプセル化により安定化することによって、培養溶液及び／又は発酵溶液を製剤化することを特徴とする、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
安定化が、ケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、ＰＶＰＰのような充填剤又は担体材料の添加により実施されることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
飼料添加剤の調製のための純粋培養物（ＤＳＭ１１７９８）中の微生物の使用。
【請求項２０】
純粋培養物（ＤＳＭ１１７９８）が、凍結乾燥又は噴霧乾燥及び／又はカプセル化された、担体材料が添加されていてもよい固定化物として使用されることを特徴とする、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の微生物もしくは請求項６から１８のいずれか一項に従い調製された微生物の純粋培養物を、飼料１０００ｋｇ当たり１０８から１０１５細胞、特に１０１０から１０１２細胞の量で含むことを特徴とする、飼料又は動物の消化管におけるトリコテセンの不活化のための飼料添加剤。
【請求項２２】
担体材料及び／又は充填剤を、飼料１０００ｋｇ当たり０．５から８ｋｇ、特に０．７から４ｋｇの量でさらに含むことを特徴とする、請求項２１記載の飼料添加剤。
【請求項２３】
ケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、及び／又はＰＶＰＰが担体材料又は充填剤として含まれていることを特徴とする、請求項２２記載の飼料添加剤。
【請求項２４】
１から６５重量％、特に５から５０重量％の噴霧乾燥又は凍結乾燥された微生物の固定化物と、９９から３５重量％、特に９５から５０重量％の担体材料及び／又は充填剤との混合物からなることを特徴とする、請求項２１、２２又は２３に記載の飼料添加剤。
【請求項２５】
飼料又は動物の消化管におけるデオキシニバレノール（ＤＯＮ）、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ニバレノール、モノアセトキシサーペノール、ジアセトキシサーペノール、トリコダーモル、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコダーミン、ヒドロキシイソトリコダーミン、カロネクトリン、Ｔ−２テトラオール、Ｔ−２トリオール、デアセチルネオソラニオール、ネオソラニオール、アセチルネオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サンブシノール、及びカルモリンの不活化のための、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の飼料添加剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、純粋培養物又は混合培養物においてトリコテセンの無毒化に適しているオウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物に関し、それらの単離、製造、及び処方のための方法、並びにその使用、並びに微生物を含む飼料添加剤に関する。
【０００２】
マイコトキシン・クラスに属するトリコテセンは、多数の動物飼料に含まれており、通常穀物又は草上に見出される糸状菌を介して飼料に導入される。マイコトキシン、特にトリコテセンの動物への望ましくない投与の結果として、動物の生産性及び例えば成長の両方が阻害され、動物の健康障害に加え、飼料消費の増加と同時に飼料利用効率の低下が起こる。マイコトキシンの有害な効果を排除するため、これらの毒素を結合又は吸着するための多数の方法が既に開示されている。
【０００３】
このように、例えば国際特許公開第９１／１３５５５号には、マイコトキシンを不活化するためにフィロケイ酸塩鉱物の粒子が飼料に添加される、マイコトキシンの不活化のための飼料添加剤及び方法が記載されている。これらのフィロケイ酸塩の効果を増加させるため、効果を加速するための金属イオン封鎖剤で粒子がコーティングされる。さらに、例えば国際特許公開第９２／０５７０６号からは、モンモリロナイト粘土が飼料添加剤として含まれている飼料が既知である。大きな内表面積を有するこれらの天然粘土鉱物は、多孔性であるため、表面にマイコトキシンを結合させ、このようにしてそれらを固定化する。
【０００４】
さらに、エポキシダーゼ及びラクトナーゼを形成し、飼料及び動物の胃腸管の両方において化学的にマイコトキシンを分解することができる酵素調製物が用いられている飼料添加剤が、オーストリア実用新案（Ａｕｓｔｒｉａｎ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  Ｍｏｄｅｌ）ＡＴ−Ｕ５０４において開示されている。ＡＴ−Ｕ５０４によると、この酵素調製物の作用は、ゼオライトなどの添加により増加されうる。
【０００５】
そこで、本発明は、生化学的分解により、マイコトキシン、特にトリコテセンを、生理学的に無害であり特に動物飼育において無害である物質へと制御された様式で変換することが可能な、天然の環境から単離された特定の微生物又は定義された混合培養物を利用可能にすることを目的とする。
【０００６】
この目的を解決するため、純粋培養物ＤＳＭ１１７９８中、又はエンテロコッカス・カッセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）の菌株との混合培養物ＤＳＭ１１７９９中、もしくはその他の嫌気性微生物との混合培養物中の、トリコテセンの無毒化に適しているオウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物が単離された。本発明の新規な改良によると、微生物は、特にエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、又はラクトバチルス（Ｌａｃｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の、その他の嫌気性微生物との混合培養物において、トリコテセンの無毒化に適している。
【０００７】
オウバクテリウム属との関連のためオウバクテリウム種とも呼ばれる、コレクション・オブ・ジャーマン・マイクロオーガニズムズ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）にＤＳＭ１１７９８の番号で純粋培養物中に寄託された、又はコレクション・オブ・ジャーマン・マイクロオーガニズムズにＤＳＭ１１７９９の番号で寄託されたエンテロコッカス・カッセリフラバスの菌株との混合培養物中のオウバクテリウム属の微生物は、本発明により、特にデオキシニバレノール（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ）（ＤＯＮ）、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ニバレノール（ｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、モノアセトキシサーペノール（ｍｏｎｏａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、ジアセトキシサーペノール（ｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）、トリコダーモル（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｏｌ）、ベルカリン（ｖｅｒｒｕｃａｒｉｎ）、ロロジン（ｒｏｒｏｄｉｎ）、アセチルデオキシニバレノール（ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、イソトリコダーミン（ｉｓｏｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、ヒドロキシイソトリコダーミン（ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、カロネクトリン（ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉｎ）、Ｔ−２テトラオール（Ｔ−２  ｔｅｔｒａｏｌ）、Ｔ−２トリオール（Ｔ−２  ｔｒｉｏｌ）、デアセチルネオソラニオール（ｄｅａｃｅｔｙｌｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、ネオソラニオール（ｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、アセチルネオソラニオール（ａｃｅｔｙｌｎｅｏｓｏｌａｎｉｏｌ）、スポロトリキオール（ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｌ）、トリコトリオール（ｔｒｉｃｈｏｔｒｉｏｌ）、サンブシノール（ｓａｍｂｕｃｉｎｏｌ）、及びカルモリン（ｃｕｌｍｏｒｉｎ）の無毒化に特に適している。本発明に係る微生物は、マイコトキシン、特にトリコテセンの毒性を担っている、分子内に含まれるエポキシド基の還元的生物学的転換によりトリコテセンを無毒化する。下記式に相当するトリコテセンにおいて、エポキシド基の分解は、毒性を有する１２，１３−エポキシ環の還元的開裂により実施される。
【０００８】
【化２】
0004362603.tif 000002
本発明に係る微生物の形態学は、好ましくは、それがいずれも個別に、対で、又は特に最大約１５０μｍの長鎖で発生する、０．１から３μｍ長の嫌気性グラム陽性桿様非胞子形成性細菌であることを示す。本発明に係る微生物の系統発生学的分析は、特に１６Ｓ  ＲＮＡ配列、即ち
【０００９】
【化３】
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を示した。
【００１０】
細菌のドメインの一部である代表的な微生物の既知の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列と比較されている微生物の配列データ。この比較分析は、オウバクテリウム属の細菌に対して最も大きい一致性を示した。しかし、既知の微生物に十分に一致する遺伝子配列を見出すことはできず、従って、本発明に係る微生物は、現在までのところ未だ単離及び分類がなされていないオウバクテリウム属に属する微生物である。例えば発酵スペクトル、硝酸塩の亜硝酸塩へ還元のような生理学的調査も、オウバクテリウム属との関連を示した。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８、並びにそのエンテロコッカス・カッセリフラバスの菌株との混合培養物ＤＳＭ１１７９９、及びその他の嫌気性微生物との混合培養物の両方を得るための方法を可能にすることであり、経済的にも量的にも収量を最適化することを特に目的とする。
【００１２】
この目的を達成するため、本発明に係る方法は、希釈系列及び嫌気的培養条件において少なくとも２回培養又は発酵を行うことにより、ウシ第一胃由来の微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスの菌株とから混合培養物ＤＳＭ１１７９９が得られるように実施される。本発明に係る微生物の混合培養物及び純粋培養物の両方を得るためには、そのようにすることで所望の生成物の確実な純粋性、特に干渉副生成物又は不要な微生物を含む混入物の除去が達成されうるので、少なくとも２回希釈系列において培養及び／又は発酵を行うことが好適であることが証明された。嫌気的条件を維持するため、本発明に係る培養及び／又は発酵は、好ましくはＨ２及びＣＯ２の気体雰囲気において実施され、１０：９０から９０：１０、特に約８０：２０のＨ２：ＣＯ２比を有する気体雰囲気が、特に好ましくは選択される。本発明に係る微生物の増殖にとっては、低い酸化還元電位を有する嫌気的条件が重要であり、驚くべきことに、Ｈ２の存在下でのみ充分に迅速な増殖を達成することが可能である。
【００１３】
本発明に係る微生物のさらに迅速な増殖は、０．２から３バール、特に約０．５から１バールの過剰圧力において培養及び／又は発酵を実施することにより達成されうるが、これはさらに好ましい実施態様に相当する。好ましくは３５から４２℃、特に３７℃の温度において培養及び／又は発酵を実施することにより、本発明に係る微生物ＤＳＭ１１７９８のさらに改良された増殖を達成することが可能であった。本発明に係る方法における培養又は発酵にとって最適なｐＨは、好ましくは６と８の間、特に７と７．５の間であった。これらの条件下で、可能な限り短時間で、比較的少ない希釈系列を用いて、前記の微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８及びその混合培養物（ＤＳＭ１１７９９）の両方を得ることが可能である。最適な結果は、好ましくはアルギニン、シトルリン、ペプトン、酵母抽出物、（一つ又は複数の）脂肪酸混合物、（一つ又は複数の）鉱物溶液、グルコース、ヘミン（ｈａｅｍｉｎ）溶液、メナジオン、ビタミン溶液、微量元素、及び還元剤から選択される成分を含む培地調製物において培養及び／又は発酵を実施することにより、本発明に係る方法を用いて達成されうる。
【００１４】
培地調製物に含まれる成分は、この場合、部分的に交換可能であり、例えばグルコースの添加により、混合培養物中の平衡を、エンテロコッカス・カッセリフラバス又は対応するその他の嫌気性微生物の方向へシフトさせることが可能であり、添加されたグルコースの量に特異的に依存して方法を調節することが可能である。特に好ましい本発明の態様によると、培養及び／又は発酵の開始時に、０．１から０．５重量％、特に０．２重量％のグルコースが添加される。０．１から０．５重量％のグルコースの添加により、培養及び／又は発酵の開始時にエンテロコッカス・カッセリフラバスの増殖が促進され、それにより酸化還元電位の低下がもたらされる。酸化還元電位を低下させることにより、本発明に係る微生物にとって最適な増殖条件が作出されるため、グルコースの調節された添加により、例えば培地調製物中のシステインのような化学物質を省くことが可能になる。
【００１５】
マイコトキシン、特にトリコテセンの無毒化を達成するため、本発明に係る微生物及び／又は混合培養物によるその他の有利な効果に、好ましくは、活性のあるトリコテセン無毒化微生物及び／又はその他の嫌気性微生物の酵素調製物を、本発明により追加することも可能である。
【００１６】
微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８を得るため、好ましくは、微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８が、特に増殖刺激因子としてＬ−アルギニンが添加された培地調製物における少なくとも２回のさらなる希釈系列により、培養溶液又は発酵溶液から得られるように、本発明に係る方法は実施される。培養溶液又は発酵溶液から培地調製物におけるさらに２回の希釈系列を実施することにより、エンテロコッカス・カッセリフラバスを含む混合培養物から完全に純粋に微生物ＤＳＭ１１７９８を得ることができ、増殖刺激因子Ｌ−アルギニンの添加は平衡を微生物の純粋培養物の方向へと有利にシフトさせる。これに関して、本発明に係る細菌の増殖は、Ｌ−アルギニンの濃度が高くなるほど促進される。
【００１７】
培地調製物の酸化還元電位をさらに低下させるため、培地調製物の純粋培養物の発酵のため、１から４重量％の還元剤、特にシステイン／硫化ナトリウム／炭酸ナトリウムの混合物が添加された方法が、本発明により好ましくは用いられる。特に経済的理由により、本発明により、還元剤の添加は可能な限り少なく維持され、比較実験の過程で、４重量％を超える還元剤の濃度の増加は微生物の増殖をそれ以上加速させないことが示された。
【００１８】
保存可能な最終生成物を得るため、本発明に係る方法は、好ましくは、濃縮、特に遠心分離もしくは濾過、及び／又は安定化、特に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥もしくはカプセル化により、培養溶液又は発酵溶液を製剤化するまで継続される。これに関して、例えば、培養溶液又は発酵溶液は、第一工程において、遠心分離もしくは濾過による液体の除去、並びに／又は好ましくはケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、及びＰＶＰＰのような充填剤もしくは担体材料が添加された発酵溶液からの直接的な安定化の実施により濃縮される。これらの担体又は充填剤の添加により、以後の安定化工程、特に凍結乾燥、噴霧乾燥、ペレット化工程のカプセル化において、トリコテセンの無毒化に適した、微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８又はそのエンテロコッカス・カッセリフラバス株との混合培養物ＤＳＭ１１７９、もしくは特にエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、又はラクトバチルス属由来のその他の嫌気性微生物との混合培養物の固体生成物が担体上に直接沈積した固体生成物を得ることが可能であり、その結果として、特に容易に管理可能かつ保存可能で、さらに代謝的に好適な生成物が得られる。粘土質の土、ケイ酸アルミニウム、ゼオライトなどのような大きな内表面積を有する物質上に、微生物又はその混合培養物を沈積させることにより、本発明により意図されたトリコテセンの分解がさらに助長される。なぜなら、これらは大きな内表面積を有する物質に物理的に結合し、そこで、本発明に係る微生物による生化学的攻撃が明確に助長されるためである。
【００１９】
本発明によると、微生物は、飼料添加剤の製造のため、純粋培養物及び／又は混合培養物（ＤＳＭ１１７９８、ＤＳＭ１１７９９）においてさらに用いられる。特に好ましい本発明に係る使用においては、本質的に、純粋培養物及び／又は混合培養物（ＤＳＭ１１７９８及びＤＳＭ１１７９９）が、適宜担体材料が添加された、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥及び／又はカプセル化もしくはペレット化された固定化物として使用される。本発明に係る微生物の純粋培養物及び／又は混合培養物、並びに噴霧乾燥された固定化物はいずれも、飼料添加剤として直接的に用いられうるが、飼料添加剤を、調製中に飼料に直接混合すること、及び／又は動物への給餌中に固体又は液体のいずれかの形態で飼料に混合することも可能である。
【００２０】
可能な限り完全なトリコテセンの生理学的に許容される物質への分解又は化学的変換を達成するため、飼料又は動物の消化管におけるトリコテセンの不活化のための本発明に係る飼料添加剤は、本発明に係る微生物の、もしくは本発明により調製された微生物の純粋培養物及び／又は混合培養物を、飼料１０００ｋｇ当たり１０５から１０１２細胞／ｋｇ、特に１０７から１０９細胞／ｋｇの量で含むことを本質的に特徴とする。１０５から１０１２細胞／ｋｇ、特に１０７から１０９細胞／ｋｇの、トリコテセンの無毒化に適した、本発明に係る微生物、又は微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバス、もしくは特にエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、又はラクトバチルス属のその他の嫌気性微生物との本発明に係る混合培養物の使用により、飼料中の高濃度のトリコテセン、特にデオキシニバレノール、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ニバレノール、モノアセトキシサーペノール、ジアセトキシサーペノール、トリコダーモル、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコダーミン、ヒドロキシイソトリコダーミン、カロネクトリン、Ｔ−２テトラオール、Ｔ−２トリオール、デアセチルネオソラニオール、ネオソラニオール、アセチルネオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サンブシノール、及びカルモリンを、デオキシニバレノールのデエポキシ代謝物（ＤＯＭ−１）のような化学的に無害な物質に変換することが可能であり、従って本発明に係る飼料添加剤を用いて、動物の生産性の増加、及び毒性の減少のための飼料変換率の改良の両方が達成されうる。
【００２１】
本発明によりマイコトキシン、特にトリコテセンの生化学的分解をさらに助長するため、好ましくは、飼料１０００ｋｇ当たり０．５から８ｋｇ、特に０．７から４ｋｇの量で、担体材料及び／又は充填剤が、飼料添加剤にさらに含まれていてもよい。担体材料及び／又は充填剤の添加により、所望により、飼料中に含まれているかもしれない分解すべきマイコトキシンとさらにその他の有害な物質を物理的に物質に結合させ、その結果としてそれがもはや代謝に利用され得なくすることが可能である。
【００２２】
この場合、毒素、特にトリコテセンの結合に特に有利であることが証明されているケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、及び／又はＰＶＰＰが、担体材料及び／又は充填剤として特に使用される。
【００２３】
特に好ましい飼料添加剤は、１から６５重量％、特に５から５０重量％の噴霧乾燥又は凍結乾燥された微生物の固定化物と、９９から３５重量％、特に９５から５０重量％の担体材料及び／又は充填剤との混合物からなることを特徴とする。この型の飼料添加剤は、飼料及び動物の消化管の両方における、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ニバレノール、モノアセトキシサーペノール、ジアセトキシサーペノール、トリコダーモル、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコダーミン、ヒドロキシイソトリコダーミン、カロネクトリン、Ｔ−２テトラオール、Ｔ−２トリオール、デアセチルネオソラニオール、ネオソラニオール、アセチルネオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サンブシノール、及びカルモリンの不活化に特に適している。
【００２４】
本発明に係る微生物の特徴決定、その増殖及び活性の条件、並びに本発明に係る微生物の補助によるトリコテセンの代謝生成物の形成により、そして給餌試験の実施例により、以下に本発明をさらに説明する。
【００２５】
本発明に係る微生物は、活性のあるトリコテセン転換株、特にデオキシニバレノール転換株であり、嫌気的培養条件、即ちＣＯ２：Ｈ２（２０／８０ｖ／ｖ）気体雰囲気及び０．５から１．５バールの過剰圧力における、最適化された栄養培地における反復培養により、ウシ第一胃から得られる。本明細書においては、それぞれの場合において、異なる濃度の２つの異なる鉱物溶液、メナジオン・ストック溶液、ヘミン溶液からなるＰＹＧ及びＰＹ培地を培地調製物として用いた。ＰＹＧ培地には酵母抽出物、ペプトン、グルコースが付加的に添加されていた。酸化還元電子を低下させるため、システイン／Ｎａ２Ｓ／Ｎａ２ＣＯ３溶液からなる２から４重量％の還元溶液を、ＰＹＧ培地及びＰＹ培地の両方に添加し、ＣＯ２通気によりｐＨを７から７．５の値に調整した。この培地調製物の補助により、いくつかの希釈系列を実施することにより微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８を得ることも可能であるし、特にＰＹＧ培地を用いて、微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物（ＤＳＭ１１７９９）を得ることも可能である。微生物の増殖は、充分に低い酸化還元電位を有する絶対嫌気的条件下で、かつＨ２の存在下でのみ達成される。３５℃と３８℃の間で微生物の適度な増殖を達成することも可能であるが、微生物の最適な増殖は、約３７℃で達成されうる。微生物の純粋培養物ＤＳＭ１１７９８を培養するためには、液体培地中のＬ−アルギニンが刺激効果を有する。
【００２６】
本発明に係る微生物を用いて、トリコテセンにおいて、毒性１２，１３−エポキシ環の還元的開裂によりこれらを無毒化することが可能である。
【００２７】
ここでは一般的なトリコテセン及び特定のトリコテセン、デオキシニバレノールの補助により、以下に反応図式を示す。
【００２８】
【化４】
0004362603.tif 000004
本発明に係る微生物ＤＳＭ１１７９８、及びその他の通性嫌気性微生物との共培養物、及びエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物（ＤＳＭ１１７９９）の発酵を例にとり、発酵条件及び使用可能な発酵法の両方を以下に例示する。
【００２９】
発酵条件：
３５と４２℃の間、特に約３７℃の発酵温度；
６と８の間、特に７．０〜７．５の発酵のためのｐＨ範囲；
酸化還元電位：方法が実施される態様に応じて０〜−３５０ｍＶ；
気体雰囲気：１０：９０から９０：１０、特に８０：２０のＨ２／ＣＯ２；
発酵圧力：０．２〜３バール、特に０．５から１バール。
【００３０】
必須の培地構成成分：アルギニン、シトルリン、酵母抽出物、ペプトン、ヘミン、及びヘミン含有物質、低級脂肪酸、鉱物溶液、炭酸塩緩衝液（炭酸ナトリウム＋ＣＯ２）、場合によりグルコース、微量元素溶液、ビタミン溶液、及び還元剤。
【００３１】
発酵法を実施するための様々な様式が、本明細書において選択されうる。
【００３２】
１）純粋培養物ＤＳＭ１１７９８の回分発酵：
手順：１２１℃かつ１．５バール、又は滅菌濾過における培地の滅菌。滅菌されたＣＯ２の通気、並びに炭酸ナトリウム及び還元剤の添加を行いながら、３５〜４２℃、特に３７℃の発酵温度へ培地を冷却。６〜８、特に７〜７．５のｐＨが達成されるまで通気を継続する。その後、２４〜４８時間予備培養された１〜１０％、特に５％の接種物を添加。定常期の開始まで、基質濃度に応じて約２０〜５０時間、又は１０１３〜１０１６の範囲の微生物数が達成されるまで発酵。
【００３３】
このプロセスは、基質濃度により本質的に調節される。
【００３４】
２）純粋培養物ＤＳＭ１１７９８の流加発酵：
手順：１と同様の培地の滅菌、緩衝、還元、及び接種。基質、例えばアルギニン、シトルリンの回分的又は連続的な添加による生物量の増加。培養物は、比較的高いレベルに基質濃度を維持することにより、対数増殖期に維持される。この方法の実施法を用いて、最大６０時間の発酵時間が可能である。
【００３５】
方法は、基質添加及び発酵時間（最終代謝生成物の蓄積）により本質的に調節される。
【００３６】
３）純粋培養物ＤＳＭ１１７９８の連続発酵：
手順：１と同様の培地の滅菌、緩衝、還元、及び接種。定常期の開始まで回分発酵を行った後、無菌栄養溶液の添加により連続発酵に変換。流出物を貯蔵槽に回収し、回分的又は連続的に噴霧乾燥して製剤化する。
【００３７】
４）その他の通性嫌気性微生物及び絶対嫌気性微生物との共培養における純粋培養物ＤＳＭ１１７９８の連続発酵、又は共培養物ＤＳＭ１１７９９の発酵。
【００３８】
使用されうる共培養物の例：
H2生成体                  DSM11798+ブチルビブリオ(Butyrvibrio)種
DSM11798+ルミノコッカス(Ruminococcus)種
プロバイオティクス(probiotics)   DSM11798+エンテロコッカス・カッセリフラバス=DSM11799
DSM11798+ストレプトコッカス種(エンテロコッキ(enterococci)
乳酸ストレプトコッキ(lactic acid streptococci)
嫌気性ストレプトコッキ(anaerobic streptococci))
DSM11798+ロイコノストック(Leuconostoc)種.
DSM11798+ヘ゜ディオコッカス(Pediococcus)種
DSM11798+ラクトバチルス種
DSM11798+ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)種
DSM11798+バチルス種
DSM11798+メガスフェラ(Megasphera)種
酵母                        DSM11798+サッカロミセス(Saccharomyces)種
DSM11798+クリベロミセス(Klyveromyces)種
DSM11798+カンジダ(Candida)種
発酵における共存生物の使用は、一方では、発酵における酸化還元電位を減少させ、ＤＳＭ１１７９８のための水素を生成し、かつ製剤化及び安定化における防御的生物として機能する。ＤＳＭ１１７９８の微生物数減少の最少化がここで起こり、それらは、いくつかの場合においては、動物生産における付加的な生産性促進因子として機能する。
【００３９】
４ａ）共培養における回分発酵：
Ｉ）炭酸塩含有培地における共存生物の予備培養。還元剤は含まないが、この目的のため炭酸塩を付加的に含む前記の培地が、酸化還元電位を減少させるために用いられる。その後、共存生物の不活化及びＤＳＭ１１７９８の接種。
【００４０】
ＩＩ）共存生物及びＤＳＭ１１７９８の同時接種、並びに０．１〜１％炭酸塩の培地への添加。還元剤は含まないが、この目的のため炭酸塩を付加的に含む前記の培地が用いられる。共存生物の増殖は促進され、酸化還元電位が急速に減少し、理想的な増殖条件のためＤＳＭ１１７９８が増殖を開始する。
【００４１】
ＩＩＩ）Ｉ＋ＩＩとの組み合わせ：発酵の最後に、共存生物の再発酵のための炭酸塩を添加。これにより、増加した生物収量のため、製剤化及び安定化における防御効果（酸素）がもたらされる。
【００４２】
４ｂ）共培養における流加発酵：
＊）４ａＩに相当する回分期、その後、２に相当する基質（アルギニン、シトルリン）の連続的／回分的添加。
【００４３】
＊＊）４ａＩに相当する回分期、その後、基質組み合わせ（アルギニン／炭酸塩又はシトルリン／炭酸塩）の連続的／回分的添加。
【００４４】
４ｃ）共培養物の連続発酵：
４ａＩに相当する回分期、その後、アルギニン／炭酸塩又はシトルリン／炭酸塩を含有する栄養溶液の添加による連続的発酵への変換。３と同様の製剤化。
【００４５】
発酵生成物の製剤化：
１）膜濾過法（限外濾過、微量濾過）又は遠心分離による濃縮。その後、有機及び／もしくは無機担体材料を用いた、又は用いない、噴霧乾燥又は凍結乾燥。
２）有機及び／もしくは無機担体材料を用いた、又は用いない、直接的な噴霧乾燥又は凍結乾燥。
３）有機及び／もしくは無機担体材料を用いた、又は用いない、連続的な発酵液の噴霧乾燥。
４）１、２、又は３と組み合わせられたカプセル化又はペレット化。
【００４６】
腸内培地におけるＤＯＮ生物学的転換株（ＤＳＭ１１７９８）の活性を確認するため、ブタの腸を用いたインビトロ・モデルを開発した。
【００４７】
これに関して、第一の実験において、腸内容物を含む、凍結乾燥物が添加された緩衝液を用いたインビトロ・モデルを開発した。
【００４８】
新たに屠殺されたブタの小腸及び大腸を、ＣＯ２雰囲気下で維持した。ＣＯ２雰囲気下で、腹側、中央、及び背側の小腸及び大腸の切片の内容物を個別の容器に空けた。
【００４９】
２０ｍｌの嫌気的緩衝液＋１ｇの腸内容物（ＣＯ２通気）＋ＤＯＮを、ＣＯ２又はＨ２／ＣＯ２雰囲気下で３７℃でインキュベートした。
【００５０】
ここで、小腸の腹側切片には、活性のある凍結乾燥物を添加した場合、著しい陽性の効果が認められることが見出された。純粋なＣＯ２通気下においても著しい活性が検出されうるという事実は、ここで特に重要であった。
【００５１】
第二のインビトロ実験は、活性のある懸濁液が添加されたブタの腸の完全な切片を用いて実施された。
【００５２】
嫌気的な還元された予備インキュベートされた緩衝液（３０ｍｌ）中で、３７℃で、ブタの腸の切片（腹側、中央、背側、大腸、各々６〜８ｃｍ）を、２００ｐｐｍのＤＯＮと共に２４時間インキュベートした。
【００５３】
この改変されたインビトロ試験変法は、屠殺直後に完全な腸が実験室に輸送され、そこで所望の長さの切片に血行が止められるため、腸の生理学的条件がほとんど影響を受けないという利点を有する。その後、切片は分離され、ＤＯＮ及び活性のある培養物を含む緩衝溶液中でインキュベートされる。
【００５４】
結果は、明白である。ＤＯＮのＤＯＭ−１への脱エポキシ化は、活性のある培養物により達成されうる。この活性が腸の全ての切片において示され、最も高い活性が腹側腸において見出されるということは重要である。これは、食物吸収の主要な部分である限りにおいて重要であり、従ってマイコトキシンの放出も同様にそこで起こる。
【００５５】
ニワトリ細胞培養物に関する実験プロトコルの補助により、ブタ及びニワトリにおける給餌例において、純粋培養物（ＤＳＭ１１７９８）、並びに微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物（ＤＳＭ１１７９９）、及び特にエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、又はラクトバチルス属のその他の嫌気性微生物との混合培養物の両方における本発明に係る微生物の作用を以下に証明する。
【００５６】
ニワトリ細胞培養物を用いた実験プロトコルの補助により、微生物がマイコトキシン、特にトリコテセン、特にデオキシニバレノール及びＴ−２毒素を化学的に分解することができ、特に還元し生理学的に許容される物質、デオキシニバレノールの場合であればその脱エポキシ代謝物、即ちＤＯＭ−１へと変換することができることが示された。
【００５７】
ニワトリ・リンパ球を培養するため、以下の条件が付加された。
【００５８】
用いられた細胞数：２×１０６細胞／ｍｌ
刺激：ＣｏｎＡ  ５μｇ／ｍｌ
マイコトキシン：ＤＯＮ、ＤＯＭ−１、及びＴ２毒素
濃度範囲：ＤＯＮ：１０〜０．０８μｇ／ｍｌ
ＤＯＭ−１：２３２〜１．８１μｇ／ｍｌ
Ｔ２毒素：３０〜０．２３４ｎｇ／ｍｌ
総インキュベート時間：４４時間。そのうち１６時間はインキュベーター中での培養中の標識時間：４０℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気雰囲気。
【００５９】
ニワトリ・リンパ球細胞培養物を用いた実験プロトコルの補助により、活性のある培養物がマイコトキシン、特にトリコテセンを生化学的に分解することができ、特に還元し生理学的に許容される物質へと変換することができることが示された。ＤＯＮ及びその脱エポキシ代謝物ＤＯＭ−１を例として、これを以下に示す。
【００６０】
細胞培養物の顕微鏡による確認：
ニワトリ・リンパ球を含む細胞培養物を、培養中、継続的に顕微鏡により確認した。
【００６１】
２０時間後の確認：
未刺激細胞は、厚く、不均一に分布しており、ＣｏｎＡを用いた確認は、強力な刺激及び明白な増殖フォーカスを示す。
【００６２】
ＤＯＮ：全ての濃度段階において増殖フォーカスが見られるが、１０μｇ／ｍｌ〜０．６２５μｇ／ｍｌの濃度範囲において、毒素濃度が増加するにつれ、増殖フォーカスの著しい減少が観察される。
【００６３】
ＤＯＭ：５８μｇ／ｍｌという最も高い濃度段階まで、対照と比較して明白な変化がない、全ての濃度段階における増殖フォーカス。
【００６４】
これは、２０時間後ですら、０．６２５μｇ／ｍｌの濃度から、毒素バッチにおける細胞活性に対する著しい有害効果が存在し、脱エポキシ代謝物自体には、細胞培養物に対する負の効果が、５８μｇ／ｍｌの濃度ですら見られないことを意味している。
【００６５】
２８時間後及び４４時間後の確認：
対照バッチ（未刺激及びＣｏｎＡ）は不変である。
【００６６】
細胞培養物に対するＤＯＮの作用はさらに増加した。２０時間後ですら変化が見出されたこれらの系列において、細胞に対する著しい損傷が見られた。
【００６７】
これらのインキュベーション時間の後ですら、５８μｇ／ｍｌの脱エポキシ代謝物濃度ですら、細胞活性に対する有害な効果は見出すことができなかった。
【００６８】
第二の実験において、離乳子豚に給餌された、マイコトキシン、デオキシニバレノールを４５０ｐｐｂの量で含む飼料における、本発明に係る飼料添加剤の作用を調査した。
【００６９】
動物：「ラージホワイト（Ｌａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅ）」及び「ランドラッセ（Ｌａｎｄｒａｓｓｅ）」という品種の子豚を、陰性比較群、陽性比較群、及び被検群に分割した。離乳（子豚の２０から２２日齢）の直後に開始された実験；動物の生産性パラメータを１４日後に決定した。
【００７０】
給餌：離乳の７日後に商業的に入手可能な子豚スターターをブタに給餌し、その後、商業的に入手可能な子豚成長飼料を与えた。マイコトキシン、デオキシニバレノールを、陽性比較群及び被検群の飼料に導入するため、４５０ｐｐｂの濃度で（エタノールに溶解して）飼料の少量の一部と混合した。飼料は無制限に与えた。
【００７１】
飼料添加剤の用量：飼料添加剤を被検群の飼料に１ｋｇ／ｔの用量で添加した。用いられた飼料添加剤は、本発明に係る微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物（ＤＳＭ１１７９９）であり、ケイ酸アルミニウムが担体として混合培養物に添加されていた。
【００７２】
微生物数：４×１０８細胞／ｋｇの最終飼料。
【００７３】
結果：結果は表１に要約されている。表１は、この試験における体重増加の平均及び飼料変換率の平均を示し、陰性対照群はマイコトキシンも本発明に係る微生物も含まない飼料を給餌され、陽性対照群はマイコトキシンのみ含む飼料を給餌され、被検群はマイコトキシン及び本発明に係る微生物を含む飼料を給餌された。
【００７４】
表１
【００７５】
【表１】
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考察：この試験より、飼料添加剤が、離乳子豚に対するデオキシニバレノール混入の有害効果を補償できること、並びにマイコトキシン及び飼料添加剤の両方を受容した子豚が、陰性対照群と本質的に同量の飼料を消費し、同等の飼料変換率（ＦＣＲ）をも示したことが明らかである。これらの結果は、本発明に係る混合培養物（ＤＳＭ１１７９９）により、デオキシニバレノールの負の効果をほぼ完全に補償することが可能であることを明らかにした。
【００７６】
さらなる試験において、本発明に係る飼料添加剤のトリコテセン混入に対する効果が、ニワトリ飼料において示された。用いられたパラメータは、最終体重、飼料摂取量、及び飼料変換率、並びにニワトリの損失である。臨床的な症状も記録された。
【００７７】
動物：コブ（Ｃｏｂｂ）品種のニワトリを誕生日以後調査した。１０，７００匹、１０，９００匹、及び１５，７００匹のニワトリを含む３つの群を用いて試験を実施した。特定のニワトリ飼料を無制限にニワトリに投与した。
【００７８】
飼料添加剤の用量：飼料添加剤をニワトリ飼料１ｔ当たり１ｋｇの用量で含ませ、被検群のみに飼料添加剤を与えた。用いられた飼料添加剤は、微生物の純粋培養物（ＤＳＭ１１７９８）であった。
【００７９】
微生物数：最終飼料１ｋｇ当たり１×１０９細胞。
【００８０】
トリコテセンを７５０ｐｐｂの全量（５００ｐｐｂのＤＯＮ及び２５０ｐｐｂのＴ−２毒素）で含む飼料を、被検群及び陽性対照群に投与した。
【００８１】
結果：以下の表は３つの群全ての生産性パラメータを示す。
【００８２】
表２
【００８３】
【表２】
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臨床的観察：陽性対照群の多くの動物に著しい口内炎症が認められた。
【００８４】
考察：この場合においても、飼料添加剤は、家禽に対するトリコテセンの有害効果を、生産性パラメータ及び臨床的症状に関して補償することができた。家禽の場合においても、マイコトキシンに加えて微生物ＤＳＭ１１７９８を受容した被検群のニワトリは、陰性対照群よりもわずかに低い平均飼料摂取量で、わずかに高い平均最終体重を有し、その結果として、幾分改良された生産性パラメータが陰性対照群との関係において生じた。本発明に係る微生物を含む本発明に係る飼料添加剤を用いた場合、マイコトキシンの有害な効果が補償されるのみならず、微生物ＤＳＭ１１７９８を受容した動物において生産性のさらなる増加を達成することが可能であることが示される。