(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁体膜である細胞膜で囲まれ、内部が電解質液である細胞基質で満たされた細胞の内部に存在する油脂含量を測定する方法であって、
前記細胞の懸濁系の誘電緩和周波数を測定する段階及び／又は前記細胞基質の導電率を測定する段階を備えることを特徴とする測定方法。
【請求項２】
さらに、
前記細胞の油脂含量と該細胞の誘電緩和周波数との関係を示す検量線を予め求める段階と、
前記検量線において、測定された前記誘電緩和周波数に対応する油脂含量を求める段階と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
さらに、
前記細胞の油脂含量と該細胞の導電率との関係を示す検量線を予め求める段階と、
前記検量線において、測定された前記導電率に対応する油脂含量を求める段階と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記細胞が楕円体、桿状体及び繊維状体の微生物であることを特徴とする請求項１−３の何れか１つに記載の測定方法。
【請求項５】
前記細胞が球体の微生物であることを特徴とする請求項１−３の何れか１つに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、絶縁体膜で囲まれた電解質液中に非電解質が存在する粒子の場合に、粒子懸濁液の誘電緩和現象を利用して、電解質液の誘電率及び／又は導電率を測定することにより、当該電解質液中の非電解質の濃度を測定する方法に関する。より具体的には、絶縁体膜である細胞膜で囲まれ、内部が電解質液である細胞基質で満たされた細胞に存在する油脂量の簡便且つ迅速な計測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物や微生物から得られる油脂はその多くが細胞内に蓄積されるから、油脂原料の受入検査、製造工程管理及び該工程の改善において、油脂含量の測定は非常に重要である。通常、油脂含量測定のためには、まず油脂を抽出しなければならず、油脂の抽出方法としては、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒を使用する方法、又は、原料の破砕、圧搾によって抽出する方法などが知られている。油脂を抽出した後、さらに溶媒等の不純物を除去し、油脂重量を測定する方法やクロマトグラフィーで油脂含量を測定する方法が多く用いられているが、これら方法は繁雑であり、多くの時間と労力を必要とするという問題がある。
【０００３】
例えば、微生物菌体中の油脂含量を測定する従来の方法（例えば、特開平６−１５３９７０号公報参照）では、培養液より乾燥菌体を得るための濾過・乾燥に約３時間程度の時間を要する。次いで、Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒの抽出法によって総脂質を抽出するためには、約1時間程度の時間を要する。これを、無水メタノール−塩酸を用いてメチルエステル化するために３時間を要する。得られた、脂肪酸メチルエステルを抽出、溶媒除去するために約４時間を要する。さらに、メチルエステル濃縮物を再度、所定量の溶媒に溶解し、ガスクロマトグラフィーで分析するために、全脂肪酸成分をクロマトグラフィーで溶出させるための時間を加味すると、約１時間程度の時間を要する。こうして、分析に要する時間は以上の合計約１２時間となるが、分析は昼間作業で行う事が一般的であるため、分析を終えるのはサンプル採取の翌日になる。このため、脂肪酸生成量を工程管理項目とすることは、実際の工程進行と分析終了の時間差が大きいので、従来技術では実用上不可能であった。
【０００４】
一方、微生物懸濁液の電気計測によって得られる誘電率は、当該微生物懸濁液の菌体濃度と高い相関を持つことが知られており、誘電率の電気計測は迅速且つ簡便であることから、誘電率は菌体濃度の計測に利用されている。誘電率測定の特徴として、（１）測定が容易であり連続自動測定ができること、（２）光学測定では難しい濁った試料や着色した試料についても測定できること、（３）細胞濃度を直接測定しているため、細胞の代謝量などからの間接測定に比べて正確であること、及び（４）細胞膜のイオンに対するバリア能を利用するため生きた細胞のみを測定できることが挙げられる。
【０００５】
例えば、誘電体の電気計測を廃水処理（特公平４−２５８００号公報）、培養酵母（「計装」（１９９６）、第３９巻第３号、第５１−５５ページ）、動物及び植物の培養細胞（「Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（１９９４）、Ｎｏ．１１、第２１３−２２２ページ）、培養中の固定化微生物（「Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（１９９２）、Ｖｏｌ．７２、Ｎｏ．４、第２９１−２９５ページ）に適用して、菌体又は細胞の濃度を計測する試みが報告されている。なお、上記の（）内は、こうした試みを報告した文献の一例を挙げたものである。
【０００６】
これら菌体又は細胞の濃度を測定する試みだけでなく、細胞内の液胞の体積変化を計測する試みも報告されている（「ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」（１９９５）、Ｎｏ．１２４５、第９９−１０５ページ参照）。しかし、これは、細胞膜による誘電緩和ではなくて、液胞の絶縁体膜（液胞膜）の誘電緩和を解析することによって計測された例である。
【０００７】
以上のように、誘電計測の利用例は数多く報告されているが、細胞膜などの絶縁体膜で囲まれた電解質液中における油脂などの非電解質の含量を簡便且つ迅速に計測する試みは、これまで報告されていない。
【０００８】
こうした次第であるから、例えば、高度不飽和脂肪酸などの油脂を微生物で生産する場合、該微生物によって作られて細胞内に蓄積された油脂の含量を簡便且つ迅速に測定する方法が強く望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術の上記のとおりの課題に鑑みて提案されたものであり、本発明の目的は、絶縁体膜である細胞膜で囲まれた細胞基質中に存在する油脂の量を簡便且つ迅速に計測する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の油脂含量測定技術の現状を鑑みて、鋭意様々な方法の検討を行なった結果、絶縁体膜である細胞膜で囲まれ内部が細胞基質で満たされた細胞中の油脂の体積と該細胞内部の誘電緩和周波数及び／又は導電率との間には、直線で近似することができる相関関係があることを見出した。本発明は、こうした知見に基づいて提案されたものであって、絶縁体膜である細胞膜に囲まれた細胞基質中の油脂の量を測定するために、細胞膜による誘電緩和周波数及び／又は細胞基質の導電率を測定することを特徴とする。一方、粒子中の油脂の体積と該粒子内部の誘電緩和周波数及び／又は導電率との間の相関関係を示す検量線を予め求めておくことにより、測定された誘電緩和周波数又は導電率をこの検量線に当てはめることにより、当該細胞の油脂含量を求めることができる。
【００１１】
例えば、生物の細胞は細胞質とそれを取り囲む細胞膜から構成されており、細胞膜は主として脂質二重層で構成されているから、導電性が極めて低く絶縁体とみなすことができる。一方、細胞質を満たしている細胞基質は、水と、この水に溶解した各種イオンとで構成されているから、導電性を有する電解質液とみなすことができ、細胞質中の油脂は非電解質とみなすことができる。
【００１２】
そこで、本発明は、細胞膜で囲まれ細胞基質で満たされた細胞質中の油脂量と該細胞質の誘電率及び／又は導電率との間に所定の相関が存在するとの知見に基づいて、細胞の誘電緩和周波数から細胞基質の導電率を測定することによって細胞質中の油脂含量を計測する方法を提供する。
【００１３】
本発明に係る、絶縁体膜である細胞膜で囲まれ、内部が電解質液である細胞基質で満たされた細胞の内部に存在する油脂含量を測定する方法は、例えば、微生物細胞中の油脂含量の計測に利用することができる。当該計測に用いる検体は、油脂蓄積能を有する微生物の場合は、該微生物の培養液又は懸濁液であることが望ましい。
【００１４】
上記油脂蓄積能を有する微生物として、例えば、コニディオボラス(Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ)属、エントモフソラ(Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ)属、アブシディア(Ａｂｓｉｄｉａ)属、クニングァメラ(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ)属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、リゾプス(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)属、ムコール(Ｍｕｃｏｒ)属、ピィティウム(Ｐｙｔｈｉｕｍ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、フザリウム(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)属、ペリクラリア(Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ)属、ペニシリウム(Ｐｅｎｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)属、クラドスポリウム(Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、トリポスポリウム(Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、又はクラビセプス(Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ)属の糸状菌、キャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属、クリプトコッカス(Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、エンドマイセス(Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ)属、ガラクトマイセス(Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ)属、ウィリオプシス(Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ)属、ワルトマイセス(Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ)属、リポマイセス(Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ)属、ロドスポリディウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ロドトルラ(Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ)属、トリコスポロン(Ｔｔｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、又はヤロウィア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属の酵母、及びスピルリナ(Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ)属、クロレラ(Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ)属、クリプセコディウム(Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｕｍ)属、イソクリシス(Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ)属、ナノクロロプシス(Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ)属、フォダクティラム(Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ)属、ポルフィリディウム(Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ)属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、又はシゾキトリウム(Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ)属の藻類などが挙げられる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に係る油脂含量測定方法を実施するため、まず、測定対象物の懸濁液の少なくとも１つの箇所に、周波数が変化する交流電場を印加する。測定対象物の懸濁液への交流電場の印加は、一対以上の電極を設置し該電極間に測定対象物の懸濁液を配置する方法や、コイルの周りに電磁誘導で発生する電界を測定対象物の懸濁液に印加する方法（例えば、「計装」（１９９６）、第３９巻第３号、第５１−５５ページ参照）が利用できる。交流電場の周波数は５Ｈｚから１００ＭＨｚの範囲で掃印されて測定対象物の誘電率及び導電率の一連の測定値を得、これによって測定対象物の誘電率及び導電率の周波数特性を測定する。印加する交流電場の大きさは、測定対象とする細胞に損傷を与えない程度の大きさに選定するのがよく、微生物細胞の場合、好ましくは２Ｖ以下、より好ましくは１Ｖ以下の電圧がよい。
【００１６】
次に、上で求めた導電率の一連の測定値より、粒子（細胞）媒質の導電率ｋａ（単位Ｓ／ｍ）を求める。粒子（細胞）濃度が低い場合には、最も低周波数側の導電率測定値、あるいは、低周波数側の導電率収束値又はその予測値を、導電率ｋａの近似値として用いることができる。
【００１７】
さらに、上で求めた誘電率の周波数特性より、緩和周波数ｆｃ（単位Ｈｚ）を求める。緩和周波数ｆｃは、「誘電率の低周波数側収束値と高周波数側収束値の中点が観測される周波数」を意味する。緩和周波数ｆｃを求めるための１つの方法は、誘電率の周波数特性実測値がＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ式（「Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ」（１９４１）、Ｎｏ．９、第３４１−３５１ページ参照）、即ち、
【００１８】
【数１】
ε＝εh＋Ｒｅ｛（εl−εh）／（１＋（ｊｆ／ｆｃ）β）｝      （１）
の曲線と最も良く合うようなパラメータｆｃを、計算機を用いて非線型最小自乗法で求めることである。但し、式（１）において、εは誘電率、εhは誘電率の高周波数側収束値、εlは誘電率の低周波数側収束値、ｆは印加された交流電場の周波数、ｆｃは緩和周波数、βはＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅパラメータ、ｊは虚数単位（＝√（−１））である。しかし、緩和周波数ｆｃの算出方法はこれに限られるものではない。通常、本発明における緩和周波数ｆｃは周波数帯域１００ｋＨｚから１０ＭＨｚの範囲に入る。
【００１９】
以上の測定に基づいて、目的とする電解質液中の非電解質の含量、即ち、細胞質中の油脂含量は以下のようにして計測することができる。
（１）上で求めた導電率ｋａが一定で，殆ど変化しない場合：
例えば細胞を一定濃度の電解質液に懸濁又は分散して測定に供する場合などは、緩和周波数ｆｃと絶縁体膜で囲まれた内部の電解質液中の油脂含量との間には、直線で近似できる相関関係がある。そこで、こうした相関関係を示す検量線を予め求めておくことにより、誘電率の周波数特性から求めた緩和周波数ｆｃを用いて、簡便且つ迅速に、油脂含量を求めることができる。
【００２０】
（２）上で求めた導電率ｋａが変化する場合：
例えば、微生物の培養液などで、培養液中の電解質濃度が培養経過と共に変化する場合などは、以下の方法で細胞質中の油脂含量を求めることができる。細胞膜で囲まれた細胞質の導電率ｋｉ（単位Ｓ／ｍ）と粒子媒質の導電率ｋａと緩和周波数ｆｃとの間の関係は、細胞の形状、すなわち、微生物の形状がほぼ球形の場合には
【００２１】
【数２】
１／ｆｃ＝Ａ［（１／ｋｉ）＋（１／ｋａ）］      （２）
で近似することができ、長軸が短軸より十分に長い楕円体、桿状体及び繊維状体の場合は
【００２２】
【数３】
１／ｆｃ＝Ｂ［（１／ｋｉ）＋（１／ｋａ）］      （３）
で近似することができる。但し、式（２）において、ＡはπＤＣｍに等しい定数、Ｄは細胞の直径（単位ｍ）、Ｃｍは細胞膜の面積当り静電容量（単位Ｆ／ｍ2）であり、式（３）において、ＢはπＴＣｍに等しい定数、Ｔは楕円体の場合は細胞の短軸直径、桿状体及び繊維状体の場合は桿又は繊維の直径（単位ｍ）、Ｃｍは細胞膜の面積当り静電容量（単位Ｆ／ｍ2）である。
【００２３】
式（２）及び式（３）において、定数Ａ及びＢの値は細胞膜で囲まれた電解質液に固有の値である。しかも、導電率ｋｉと細胞質中の油脂含量との間には直線で近似できる相関関係があることが判明している。したがって、当該細胞について、こうした相関関係を示す検量線と定数Ａ、Ｂの値とを予め求めておくことにより、測定対称の細胞の導電率ｋｉを測定することによって、簡便且つ迅速に、細胞質中の油脂含量を求めることができる。
【００２４】
測定対象である細胞の定数Ａ、Ｂの値が予め求められていない場合は、例えば、該細胞の懸濁液に無機塩類等の電解質を添加した場合の１／ｋａに対する１／ｆｃの変化をプロットし、その傾きから定数Ａ、Ｂの値を求めることができる。しかし、定数Ａ、Ｂを求める方法はこれに限られるものではない。
【００２５】
以上述べた方法を用いることにより、微生物細胞の油脂含量を測定することができる。当該方法は、測定対象物を破壊することなく迅速且つ簡便に実施することを可能とするものであり、液体培養中の微生物細胞の油脂含量の変化をオンラインで計測することに適用することも可能であるから、本発明は、微生物による油脂生産の工程制御及び工程管理に適用して極めて有益である。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明に係る油脂含量測定方法の具体例を若干の実施例で説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
糸状菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＣＢＳ７５４．６８を５０Ｌ培養槽で、大豆タンパク、グルコースを主成分とする培地で培養した。培養液を経時的に５００ｍＬビーカーに採取し、液中心付近に電磁誘導式プローブを入れて培養液の誘電率及び導電率を１００ｋＨｚから３０ＭＨｚの周波数範囲で計測した。得られた誘電率データのうち、４００ｋＨｚから３０ＭＨｚの周波数範囲の誘電率データを用いて、非線型最小自乗法による式（１）への曲線合わせによって緩和周波数ｆｃを求め、導電率ｋａとして１００ｋＨｚにおける導電率値を用いた。
【００２８】
使用菌株は糸状菌であるので、粒子が繊維状である場合に適用される式（３）を用いることとした。定数Ｂの値を求めるために、培養液にＫＣｌ水溶液（濃度２５％）を０．５ｍＬずつ計６回添加し、添加の都度、緩和周波数ｆｃと導電率ｋａを求めて両者の逆数をプロットし、その傾きから定数Ｂの値を求め、１．３５×１０-7［Ｆ／ｍ］と決定した。このようにして求めた緩和周波数ｆｃ、導電率ｋａ及び定数Ｂを用いて式（３）から導電率ｋｉを求めた。一方、例えば特開平６−１５３９７０号公報に記載された、菌体より油脂を抽出する公知の方法を用いて、当該糸状菌の乾燥菌体当たり脂肪酸含量を求めた。
【００２９】
以上の手順を同一の糸状菌について、脂肪酸含量が異なる毎に反復し、得られた脂肪酸含量と導電率ｋｉとの関係をプロットしたところ、図１を得た。図１は、糸状菌の導電率ｋｉと脂肪酸含量との間に直線で近似できる関係のあることを示している。したがって、図１のグラフを検量線として予め求めておくことにより、当該糸状菌の脂肪酸含量が未知のとき、その糸状菌の導電率ｋｉを上記の手順で算出することにより、その脂肪酸含量を求めることができる。
【００３０】
実施例２
酵母Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ  ＩＦＯ１０３８５株を１０Ｌ培養槽で、酵母エキス、グルコースを主成分とする培地で培養した。経時的に培養液を採取し、実施例１と同様の方法で誘電計測を行ない、球体に適用される式（２）を使って導電率ｋｉを計算した。その後、培養液を遠心して酵母菌体を集め、水洗を３回繰り返して洗浄酵母菌体を得た後、これを乾燥させ、実施例１と同様の方法で菌体当たり脂肪酸含量を測定した。以上の手順を同一の酵母について、脂肪酸含量が異なる毎に反復し、得られた脂肪酸含量と導電率ｋｉとの関係をプロットしたところ、図２を得た。図２は、酵母の導電率ｋｉと脂肪酸含量との間に直線で近似できる関係のあることを示している。したがって、図２のグラフを検量線として予め求めておくことにより、当該酵母の脂肪酸含量が未知のとき、その酵母の導電率ｋｉを上記の手順で算出することにより、その脂肪酸含量を求めることができる。
【００３１】
実施例３
糸状菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＣＢＳ７５４．６８を５０Ｌ培養槽で、大豆タンパク、グルコースを主成分とする培地で培養した。培養液より遠心分離で菌体を得た後、１０ｍＭ  ＫＣｌ溶液で洗浄し、遠心分離して菌体を得た。同様の洗浄操作をさらに２回繰り返した後、１０ｍＭ  ＫＣｌ溶液に懸濁して白金電極セルに充填し、電極間に周波数帯域５Ｈｚから１０ＭＨｚの交流電場を加えて、その誘電率の周波数特性を計測したところ、細胞膜の誘電緩和による緩和が２箇所で観測され、そのときの低周波数側の収束値はおおよそ１０ｋＨｚ以下の周波数帯域に、高周波数側の収束値は１００ｋＨｚから１０ＭＨｚまでの周波数帯域に各々観測された。そこで、電極分極の影響を差し引いた後、これら２つの収束値の中点として緩和周波数ｆｃを求めると共に、実施例１ど同様の方法で菌体当たり脂肪酸含量を測定した。
【００３２】
以上の手順を同一の糸状菌について、脂肪酸含量が異なる毎に反復し、その結果得られた脂肪酸含量と緩和周波数ｆｃとの関係をプロットしたところ、図３を得た。図３は、糸状菌の緩和周波数ｆｃと脂肪酸含量との間に直線で近似できる関係のあることを示している。したがって、図３のグラフを検量線として予め求めておくことにより、当該糸状菌の脂肪酸含量が未知のとき、その糸状菌の緩和周波数ｆｃを上記の手順で算出することにより、その脂肪酸含量を求めることができる。
【００３３】
【発明の効果】
以上、若干の実施例に基づいて本発明に係る油脂含量測定方法を説明したところから理解できるように、本発明は、糸状菌や酵母などの微生物細胞の油脂含量を迅速且つ簡便に測定することができるという格別の効果を奏する。したがって、本発明は、微生物による油脂生産の工程制御及び工程管理に適用して極めて有益である。
【図面の簡単な説明】
【図１】糸状菌細胞質の導電率ｋｉと乾燥菌体当たりの脂肪酸含有量との関係を示すグラフである。
【図２】酵母細胞質の導電率ｋｉと乾燥菌体当たりの脂肪酸含有量との関係を示すグラフである。
【図３】糸状菌の緩和周波数ｆｃと乾燥菌体当たりの脂肪酸含有量との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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