(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：Ｘ−（Ｙ’）ｂ−（Ｐｘ）２−Ｇ’−Ａ−（Ｇ’）ａ−Ｒ７
［式中、全てのアミノ酸残基は独立にＤ型であり、
ＸはＨまたはＡｃを表し；
Ｇ’はグリシン残基またはＳａｒを表し；
Ａはアラニンを表し；
Ｐｘは３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、またはＰｒｏのアミノ酸残基を表し；
Ｙ’はハロゲンまたはヒドロキシでフェニル環において任意に置換されるチロシンまたはフェニルアラニンを表し；
ａ及びｂは独立に０または１であり；
Ｒ７はＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＮＨ２、Ａｓｎ−ＮＨ２、またはＧｌｎ−ＮＨ２を表す］
を有する化合物及びその製薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＨ；
Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物２）
からなる群から選択された、請求項１に記載の化合物およびその製薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物、及び製薬学的に許容可能な担体または希釈液を含む製薬組成物。
【請求項４】
注射調製物である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
不整脈の治療用医薬の調製のための、請求項１または２に記載の化合物の使用。
【請求項６】
前記不整脈が心房細動、心室細動、または房室ブロックである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記不整脈が徐脈不整脈である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記不整脈が頻拍不整脈である、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記頻拍不整脈が心室頻拍である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
収縮減少の治療用医薬の調製のための、請求項１または２に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
Ｔ波交代を有する患者の治療用医薬の調製のための、請求項１または２に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はin vitro、in vivoで改良された安定性をもった直鎖状あるいは環状構造の新規の抗不整脈性ペプチドを含む新規のペプチドと、上記のペプチドを構成する組成物、そして薬剤調合時における上記のペプチドの使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
心臓不整脈による突然死は、欧米圏における主要な死因のひとつである。突然死を引き起こす最も共通した疾患は、虚血性心疾患であるが、若年層の患者では、肥大性心筋症の様な遺伝病やlong QT症候群もまた重大である。
【０００３】
心臓不整脈は、衝動形成や衝動伝導あるいは両者の組み合わせの異常によって生じても良い。衝動形成と伝導の調節は、自律神経系、心臓のイオンチャンネルそして心臓のギャップ結合との間の複雑な相互作用を必要とする。
【０００４】
特に虚血によって生じる不整脈を薬理的に防止する試みは期待はずれだった。この様に臨床試験は、幾つかの第一群および第三群の抗不整脈薬は虚血心疾患をもつ患者の死亡率を増加すると報告している。現在使用されている抗不整脈薬全てに共通する特徴は、それらが心臓のイオンチャンネル（ナトリウム、カリウム、及びカルシウムチャンネル）または自律神経系を阻害することにより、活動電位の生成を阻害することである。これは、おそらくそれらが抗不整脈に作用するだけでなく、左心室の機能が低下した患者や鬱血性心不全の患者、あるいは持続性の心室頻拍性不整脈の病歴をもった患者で特に致死的な不整脈を引き起こす可能性のある後不整脈作用をもつためである。抗不整脈薬の例は、フレカイニド、エンカイニド、モリシジン、キニジンである。アミオダロンやソタロールのような心臓の再分極化を長引かせる抗不整脈薬は、特異的なそして衝撃的な不整脈、トルサード・ド・ポワンの発生しうることと関連している。トルサードは、非常に急激な心室不整脈であるが、おそらく、心臓下垂症、徐脈、遅延伝導といった一連の関連した特徴が膜の安定性を変え、振動を促進するときに生じる。ソタロールのようなアミオダロンは、生命を脅かすような不整脈に対してのみ処方される。この薬剤はナトリウムチャンネルとある程度カルシウムチャンネルを阻害するとともに、ベータ阻害効果を持っている。初期の試験では、副作用の結果（投与量に応じてであるが）、一年間に患者の20%までに薬剤投与を停止することになった。心臓への毒性は、洞徐脈、房室阻害、鬱血性心不全、心室不整脈を含む。
【０００５】
結局、現在利用される不整脈薬では、心臓不整脈による突然死を防ぐことが出来ない。そのために、生命を脅かす不整脈の治療に新しく、安全で効果的な抗不整脈薬の重要な未知の需要がある。深刻な副作用のため現在の抗不整脈薬の使用は限られており、完全に異なる作用様式をもつ新しい種類の抗不整脈薬が望まれている。上述したように、鼓動形成と伝導の調節とは、自律神経系、心臓のイオンチャンネル及び心臓のギャップ結合関の複雑な相互作用である。従来、不整脈薬の開発は自律神経系や心臓のイオンチャンネルに焦点を合わせたものであり、心臓のギャップ結合を解放する薬剤は現在のところ存在しない。しかし、最近いくつかの証拠が不整脈の進展におけるギャップ結合の重要な薬割を証明した。それゆえに、ギャップ結合の調節は不整脈治療の非常に興味深い、新しい標的である。
【０００６】
ギャップ結合は細胞膜の特化した領域であり、そこでは100から1000のギャップ結合チャンネルが密集して、隣り合う二つの細胞の細胞質を直接連絡している。このギャップ結合チャンネルは、二つの隣り合う細胞のそれぞれに由来する二つのヘミチャンネル（コネクソン）から構成されている。それぞれのコネクソンは、コネキシンと呼ばれる6つのタンパク質から構成されている。コネキシンは、4つの膜貫通領域、2つの細胞外ループ、1つの細胞質ループを基本構造に持つタンパク質の大きなファミリーである。細胞外ループと膜貫通領域は、種関、コネキシンアイソフォーム関で高く保存されている。しかしながら、C末部分の長さは著しい変化に富んでおり、その分子量を基にコネキシンの分類が行なわれている。異なる型のコネキシン（Cx）の分布は、心臓全体で変化に異なっている。Cx43アイソフォームは心室では主要な型であるが、心房や伝導系ではCx40が最も豊富なアイソフォームである。ギャップ結合チャンネルは、ねじれの動きによって開放状態と閉鎖状態とを移行する。開放状態では、1000D以下のイオンや小分子が穴を通過できる。電気的衝動伝導は、ギャップ結合を通じて起こり、それ故に正常に機能するギャップ結合は、正常な伝導とそれによって起こる心臓の正常な律動の必要条件である。
【０００７】
様々な型のコネキシンを欠くノックアウトマウスの開発によって、異常伝導におけるギャップ結合の重要な役割について理解が深まってきた。これらの研究から、Cx43遺伝子を標的欠失したホモ接合体のマウスは、心臓と肺の機能不全から生後間もなく死亡すること、一方へテロ接合体のマウスは生き延びることが示された。しかし、へテロ接合体の遺伝型を持つマウスは、野生型に比べ伝導が有意に遅延した[2]。成体マウス（6-9カ月）では鼓動のペースの心室心外膜伝導が44%まで遅れ、心電図のQRS群は野生型マウスのものに比べ著しく長引いた。Cx43遺伝子欠失のへテロ接合体のマウスにおいて、Cx43の発現減少が虚血の間の心室不整脈の発生率増加に直接関係している[3]。このようにへテロ接合体マウスから単離した灌流された心臓において、部分的に虚血を誘導後、心室頻拍を同時に発生する率は、野生型マウス心臓における発生率の二倍である。さらに、Cx43を欠失した心臓をもつマウスは、同時に心室不整脈と突然心臓死を進行し、2カ月齢までに死亡率100%に達する。Cx40遺伝子のノックアウトは致死ではないが、心房、心房室、そしてHis-プルキンエの伝導がCx40-/-マウスでは、Cx40+/+マウスに比べ著しく遅延する。またCx40-/-マウスは不整脈と索枝阻害の危険性が上昇した状態にある[4-6]。
【０００８】
コネキシンの異常と心疾患との関係は、人間でも確立している。ひとつの例は、原生寄生生物Trypanosoma cruziによって引き起こされるシャガス病である。この疾病は、ラテンアメリカにおける心臓機能障害の主要な原因である。Trypanosoma cruziが感染した細胞では、Cx43の分布の変化が観察されており、この変化がこの病疾を特徴づける、伝導障害の発生に関与しているのかもしれない[7]。慢性的虚血、仮眠状態、あるいは肥大心臓におけるCx43の発現および分布のいくつかの研究もまた、Cx43発現の減少および変化した分布様式を述べている[8-10]。実際、コネキシンの発現および／あるいは分布は、これまでに研究された、心臓の全ての慢性的疾患状態において変化している。
【０００９】
結局のところ、ギャップ結合の機能不全、欠失が不整脈発生増加の危険性の原因とする証拠と、慢性心疾患におけるコネキシンの発現、分布変化を示す証拠は十分である。上述したように、現在ギャップ結合の機能を昂進させて作用する抗不整脈薬は存在しない。しかし、ギャップ結合の伝導度を上昇させるペプチド群（抗不整脈性ペプチド）がこれまでに報告されている。
【００１０】
1980年にウシ心房から、分子量470Dの8アミノ酸からなるペプチドがAonuma et al.によって単離された[11]。新生ラット心筋細胞で、このペプチドは0.1mg/mlで、ウワバイン、高濃度のカルシウム（3mM）、低濃度のカリウム（0.7mM）によって誘導される細動を正常な律動に変えることができたことが示された。さらに、このペプチドは2.5-5.0mg/mlで、単離したラット心房が、低濃度のカリウム（0.3mM）とアセチルコリンによって誘導された不整脈の動きを正常な律動に変えることが出来た。こうして、このペプチドは抗不整脈性ペプチド（APP）と名付けられた（比較例1下記（CE1））。
【００１１】
細胞培養中の培地に添加したとき、APPは拍動中心の数、広がる細胞の相対量、タンパク質合成を増加した[12]。1982年には、APPのアミノ酸配列がH-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OHであることが決定された[13]。後に、in vivoの研究で、in vitroで観察されたAPPの抗不整脈効果が確認された。そこでは、10mg/kgのAPPがCaCl2-、ウワバイン、やアコチニンによって誘導されたマウスの不整脈に対し効果的であることが示された[14]。いくつかのAPPの合成誘導体が試され、マウスやラットにおいて実験的に誘導した不整脈に対して、内生のAPPよりも効果的であることが判明した[15-17]。最もよく研究された合成誘導体は、AAP10（H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2）（比較例2下記（CE2））である。単離し灌流されたウサギ心臓において、このペプチドは0.1nmol/lから10nmol/lで正常な条件下、心室心外膜に設置した256の電極によって計測した活性化-回復間隔の分散を減少した[18]。AAP10は、平均活動電位持続、左心室終拡張期圧、冠状流、QRS持続、PQ間隔には効果をもたなかった。心臓が、30分間左環状動脈下行枝の閉塞によって局部的な虚血を受けた場合に、10 nmol/lのAAP10出の前処理は、活性化様式および活性化-回復間隔の減少した分散の、虚血によって誘導された変化において著しい減少に導いた。付加的な研究により、AAP10は1mmol/lまでの濃度では、単離したギニアピッグの乳頭筋において活動電位には影響しないことが示された[18]。これらの知見は、Argentieri et al.の知見[19]と一致する。彼等は、単離したイヌのプルキンエ線維の活動電位における効果を調べることにより、AAPの抗不整脈的な性質の機構を研究した。このモデルでは、AAPは変力性あるいは測定した電気生理学のパラメータ（最大拡張期電位、活動電位振幅、分極の最大速度、50%と95%再分極時の活動電位持続）のどれにも影響しなかった。そのため、AAP’sは膜貫通のイオン電流には影響しないと結論づけられた。ギニアピッグの乳頭筋で共役する時間、すなわち電気刺激から活動電位の開始までの時間間隔、に対する効果が調査された[20]。その結果、AAP10は高濃度（1mM）で、正常酸素圧条件下、刺激-応答の間隔を約10%まで減少することが判明した。さらに酸素圧低下やグルコースなしの灌流中、刺激-応答の間隔が増加したことから、脱共役はAAP10 10nmol/lにより阻害されることが示された。共役時間に対するAAP10の効果は、あまりよく共役しない細胞において最もはっきりしていたので、著者らはAAP10は、あまりよく共役しない細胞に対して優先的に作用すると示唆した。共役時間に対する効果により、AAP10はギャップ結合伝導度に対する効果を通じて作用を及ぼすことが、示唆された。この理論を検討するために、著者らは成体ギニアピッグの心室心筋細胞で、ギャップ結合伝導度に対するAAP10の効果を、double-cell voltage clamp techniqueを使って調査した。これらの研究により、AAP10 10nmol/lでギャプ結合伝導度が急速なそして回復しうる増加を示すことが、証明された。このように、ギャップ結合共役の改善、それによって活動電位分散を減少し、伝導の遅延を防ぐことによって、AAP10が抗不整脈的な性質をもつことが説明された。
【００１２】
要約すると、抗不整脈性ペプチドとは、ギャップ結合に選択的に作用して、細胞の脱共役を減少し、活動電位持続の分散と活動電位の持続や形状に影響することなく御し難さを減少する一群のペプチドである。そのため抗不整脈性ペプチドは、現在利用されている多くの抗不整脈薬の使用を制限する後不整脈効果をもたないと期待されている。これより、抗不整脈性ペプチドは新しく、安全な種類の抗不整脈化合物として、非常に興味深い。しかし、内生のAAPは合成AAP10同様、幾つかの好ましくない特徴、不安定性、効果的な濃度の高さなどを持っている。そのため、今のところは薬剤としての利用はできない。Grover and Dhein[21]は、核磁気共鳴スペクトルからAAP10の二つの半環状構造を明らかにした。それゆえに、安定な抗不整脈性ペプチドを得る一つのアプローチは、抗不整脈性ペプチドの環状誘導体の供給である。DE19707854は、見たところ環状のCF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONHと環状のCO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONHを発表している。これらは、AAPやAAP10と同じ抗不整脈性ペプチドを有するが、水溶液中や凍結融解を繰り返した後においても安定性が向上していることを述べている。しかし、DE19707854で述べられた実験条件では、上記の環状化合物の調合には不十分であり、また上記の環状化合物の同定に、HPLCを用いて化学的に同定したデータではその点で不十分である。US4,775,743はHP5、N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OHという配列をもち、血小板凝固に対して活性をもつペプチド誘導体を発表している。Dhein and Tudyka[22]は、抗不整脈性ペプチド群に属するペプチド誘導体を含むペプチドについて、活性と濃度の面で文献を再調査した、表1を参照。そして7化合物が活性をもち、さらに4化合物が弱い活性をもつことが明らかになった。しかし、これらのペプチドやペプチド誘導体はいずれも不安定であり、食餌療法には効果的ではないことが示されている。
【００１３】
さらに、抗不整脈作用をもつが、内生のエステラーゼに対して弱いエステル結合もつ、環状デプシペプチドが日本国特許出願第08281636号と第09308589号において発表されている。さらに、WO96/21674において、チロシン残基のフェニル環の水素がハロゲンに置換された、AAP10誘導体が発表されている。上記のAAP10誘導体は抗不整脈的な性質を有しており、リドカインやフレカイニドに比べ、後不整脈の危険性を減少した。
【００１４】
次のAAPペプチドとAAP様化合物は、文献に述べられている。
(AAP) H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Pro-4Hyp-OH,
H-Gly-Pro-OH,
H-Gly-Pro-Leu-OH,
H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-OH,
H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH,
H-4Hyp-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Gly-Gly-OH,
H-Pro-Pro-Gly-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Pro-4Hyp-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-OH,
(HP5) N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-フェニルプロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-フェニルプロピル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
(AAP10) H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-OH,
H-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-I)-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-F)-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Cl)-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Br)-NH2,
H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Val-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Ala-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Phe-NH2,
シクロ(CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH), and
シクロ(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH).
【００１５】
次の化合物
H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (AAP),
H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2 (AAP10),
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-OH,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-I)-NH2,
H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (HP5),
N-3-フェニルプロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
シクロ(CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH), and
シクロ(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH)
は、試験モデルにおいて活性あるいは弱い活性を示す、例Dhein and Tyduka (1995)を参照。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
活性的な抗不整脈性ペプチドは提供されているが、これらはどれも抗不整脈薬剤のさらなる探索を進展させるには至っていない。本発明の目的は、様々な冠状心疾患の治療と薬剤の調製に有効な抗不整脈性ペプチドと機能性類似体をさらに提供することである。さらに、その点で新規のペプチドは、脊椎動物、特に哺乳動物組織においてギャップ結合細胞内伝達を亢進する。また、これらは哺乳類のような脊椎動物において、以下に述べるような、細胞内ギャップ結合伝達が減少することに関連する、あるいはそれによって生じる、広範囲の病気の治療や栄養物に有効である。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、次の一般式Iをもつ抗不整脈性ペプチド化合物を含む、ペプチドでなされる。
【化１２】
0004327398.tif 000002
式中、
破線は、式Iが選択的に環状であることを示し、示された結合は、共有結合を表わし；
そこでAは、AをXおよびBに結合するペプチド結合の一部を形成するアミノ基（ラジカル）およびカルボキシル基（ラジカル）を有する化学部分を表わし；
Bは、BをAおよびYに結合するペプチド結合の一部を形成するアミノ基（ラジカル）およびカルボキシル基（ラジカル）を有する化学部分を表わし；
Xは、Yが独立にL-あるいはD-型を取り得る2-5アミノ酸残基のC末端ペプチド配列を表わす場合に、独立にL-あるいはD-型を取り得る1-3アミノ酸残基のペプチド配列を表わし；
あるいは、XはYが独立にL-あるいはD-型を取り得る2-5アミノ酸残基のC末端ペプチド配列を表わす場合に、A-B基のN末端修飾を表わし；あるいは
Xは、Yが独立にL-あるいはD-型を取り得る1-3アミノ酸残基のC末端ペプチド配列を表わす場合に、独立にL-あるいはD-型を取り得る2-5アミノ酸残基のペプチド配列を表わし；
および式Iが直鎖状ペプチドを表わす場合、XはそのN末端で選択的に化学的に修飾され、Lは0-8原子骨格を含む選択的な結合基であり；
および式Iの鏡像体あるいはレトロ類似体、あるいは式Iの誘導体であり、製薬学的に許容可能な塩、アルキル、アリールあるいはアラルキルエステル、アミド、置換がアルキル基、アリール基、あるいはアラルキル基、ヒドラジド基、あるいはアルコール基である、一あるいは二置換されたアミドであり、；
以下の化合物は、式Iによって含まれない、という条件を有する、
H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-フェニルプロピオニル- Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-フェニルプロピル- Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-OH,
N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-OH,
H-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Hyp-Pro-Tyr(3-I)-NH2,
H-Gly-Ala-Hyp-Pro-Tyr(3-F)-NH2,
H-Gly-Ala-Hyp-Pro-Tyr(3-Cl)-NH2,
H-Gly-Ala-Hyp-Pro-Tyr(3-Br)-NH2,
H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Val-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Ala-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-His-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Phe-NH2,
シクロ(CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH), 及び
シクロ(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH).
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい実施にあたり、ペプチド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、還元アミド結合、アルコキシ結合、オキシカルボニル結合、アシルオキシアルコキシ結合の中から、共有結合を選択する。
【００１９】
AとBの例は、式IIを含む。
【化１３】
0004327398.tif 000003
式中nは、値3, 4, 5を有する整数であり、Rは選択的な置換、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシ、NH2、C(1-6)アルキル基からなる群から好ましくは選択される、を表わす。本発明の好ましい実施において、AおよびBはそれぞれ、アミノ酸あるいは機能的なアミノおよびカルボン酸基を有する誘導体を表わす。AおよびBのさらなる例は、式IIaによって表わされる。
【化１４】
0004327398.tif 000004
式中nは、値0, 1, 2, 3を有する整数であり、pは値0, 1, 2, 3を有する整数であり、Zは酸素あるいは硫黄を表わし、Rは選択的な置換、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシ、アミノ基、C(1-6)アルキル基からなる群から好ましくは選択される、を表わす。AおよびBが、式IIaによって表わされる本発明の例示化合物は、
化合物11 H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2
化合物12 H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2
化合物13 H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2
化合物14 H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH2
およびその塩である。
【００２０】
AおよびBの例は、次の化合物のN-およびC(O)-ラジカルを含むが、それに制限されない：
D/L-アゼチジン-3-カルボン酸、
D/L-アゼチジン-2-カルボン酸、
D/L-インドリン-2-カルボン酸、
D/L-1,3-ジヒドロ-イソインドール-1-カルボン酸、
D/L-チアゾリジン-4-カルボン酸、
D/L-ピペコリン酸、
D/L-ニペコチン酸、
イソニペコチン酸、
L/D-2-カルボキシモルフォリン、
L/D-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-3-カルボン酸、
L/D-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-3-カルボン酸、および
4-カルボキシ-4-フェニル-ピペリジン。
【００２１】
好ましくは、AとBの化学的部分はそれぞれ、窒素やリンのような一つまたはそれ以上の異原子からなる4、5、6員環の飽和炭素環構造をもつアミノ酸残基を表わす。上記のアミノ酸は、L、D型、天然そして非天然アミノ酸、そして3、4、5位で一つあるいはそれ以上の置換を受けたプロリン残基のような誘導体を含む。上記の誘導体とは、ヒドロキシ、アミノ、またはフェニル；およびN-置換されたアミノ酸、例えばサルコシン、N-シクロヘキシルグリシンやN-フェニルグリシンから好ましくは選択される。
【００２２】
好ましくは、配列A-BはSar-Sar、Sar-Hyp、Hyp-Sar、Pro-Sar、Sar-Pro、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro、Hyp-Hypからなる一群から選択されたジペプチドを表わす。ここでProとHypは、独立にLまたはD型であっても良く、ProとHypの環状構造は、任意にハロゲン、ニトロ、メチル、アミノ、またはフェニルで置換されている。また、Hypは3-ヒドロキシプロリンまたは4-ヒドロキシプロリンを表わす。または、A-Bのアミノ酸の一つあるいは両方はSar、あるいはN-シクロヘキシルグリシン残基である。
【００２３】
本発明の一つの好ましい実施において、式Iは直鎖状ペプチドを表わす。式中、XのN末における上記の化学修飾は、
任意に置換された、酢酸、プロピオン酸、酪酸、そして他の脂肪酸のようなC(1-22)アルキルカルボキシル酸、または任意に置換されたC(2-22)アルケニルカルボキシル酸、または安息香酸のようなアリールカルボキシル酸によるアシル化であり、ここでは置換は、ヒドロキシ基、ハロゲン、C(1-6)アルキル基、ニトロ基、あるいはシアノ基から選択され、炭素鎖または、芳香環において行われるかもしれない。；
または、任意に置換されたC(1-22)アルキル、C(2-22)アルケニル、あるいはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニルプロピル基、2-ヒドロキシルフェニルプロピル基のようなアリール基によって置換されたアリールC(1-22)アルキルによるアルキル化であり、ここでは置換基は、ヒドロキシ基、ハロゲン基、C(1-6)アルキル基、ニトロ基、あるいはシアノ基から選択され、炭素鎖または、芳香環において行われるかもしれない。
【００２４】
より好ましくは、Yが上に定義したように2から5アミノ酸残基からなるC末のペプチド配列を表わす場合、XはC(1-4)カルボキシル酸、好ましくは酢酸によって任意にアシル化されたL-tyrやD-tyrからなる一群から選択される。
【００２５】
またXは、Aへアミド結合によって結合したA-BのN末修飾を表わしており、上記の修飾は、フェニルプロピオン酸および4HPPや2HPPのようなその誘導体；フェニル酢酸および4HPA、3HPA、2HPAのような、その誘導体；フェノキシ酢酸と4HPPA、2HPPA、4HPMAのような、その誘導体；ベンゾイルグリシンと4HBG、3HBG、2HBGのような、その誘導体；そしてフェニルグリシンとAにアミド結合によって結合した、その誘導体から好ましくは選択される。
【００２６】
A-Bは、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro、Hyp-Hypからなる群からより好ましくは選択され、ここではProとHypは独立にLあるいはD型で取り得る、そしてHypは4Hypを好ましくは表わす。
【００２７】
Yは、好ましくは3から5アミノ酸残基のペプチド、あるいは独立にL-またはD-型をとり、そのC末にSarまたはGlyを好ましくは有する、好ましくは3か4アミノ酸残基のペプチドを表わす。また、Yは、以下の群から選択されたペプチド配列をより好ましくは表わす。
Xが1アミノ酸を表わす場合、
Gly-L-Ala-Gly-OH、
Gly-L-Ala-Gly-NH2、
Gly-D-Ala-Gly-OH、
Gly-D-Ala-Gly-NH2、および
Sar-Aib-Sar-OH/NH2。
【００２８】
式Iの直鎖状化合物の例は
H-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-OH/NH2,
Ac-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly- NH2 (化合物2),
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (化合物1),
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2,
Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH,
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2,
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-Pro-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-Pro-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-Pro-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-Pro-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-4Hyp-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-4Hyp-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-4Hyp-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-4Hyp-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-4Hyp-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Sar-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPPA-D-Sar-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HMPA-D-Sar-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPA-D-Sar-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2,
4HBG-D-Sar-D-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPP-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HMPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2,
4HBG-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2,
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2,
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4HPP-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩；アルキル、アリール、アラルキルエステル；一および二置換されたアミド、ここでは置換基はアルキル、アリール、アラルキル；ヒドラジド；アルコールからなる群から選択される、からなる群から選択される、その誘導体である。
【００２９】
本発明のもう一つの好ましい実施において、式Iは環状ペプチドを表わし、その中でA-BはSar-Sar、Sar-Hyp、Hyp-Sar、Pro-Sar、Sar-Pro、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro、そしてHyp-Hypからなる群から選択され、ここでProとHypは、独立にLまたはD型であっても良く、Hypは4-ヒドロキシプロリンを好ましくは表わす。さらに好ましくは、A-Bは置換されていないL-Pro-L-4Hyp、L-4Hyp-L-Pro、D-Pro-D-4Hyp、D-4Hyp-D-Proを表わすことである。
【００３０】
Yが独立にL-またはD-型をとり、C末にAspまたはGluを好ましくは有する、3あるいは4アミノ酸残基からなるペプチドを表わす場合、およびYが以下の群から選択されたペプチド配列をより好ましくは表わす場合に、Xは1アミノ酸残基、 さらに任意にハロゲン基、フェニル基、NH2、そしてハロゲン基で任意に置換されたC(1-6)アルキル基によって、そのその芳香環において任意に置換されたL-TyrまたはD-Tyrであることが好ましい。
Gly-L-Ala-L-Asn,
Gly-D-Ala-L-Asn,
Gly-L-Ala-Gly-L-Asn,
Gly-L-Ala-Gly-D-Asn,
Gly-L-Ala-L-Gln,
Gly-L-Ala-Gly-L-Gln,
Gly-L-Ala-Gly-D-Gln,
Gly-D-Ala-D-Asn,
Gly-D-Ala-Gly-D-Asn,
Gly-D-Ala-Gly-L-Asn,
Gly-D-Ala-D-Gln,
Gly-D-Ala-Gly-D-Gln,
Gly-D-Ala-L-Gln,
Gly-D-Ala-Gly-D-Gln,
Gly-L-Ala-L-Asp,
Gly-D-Ala-L-Asp,
Gly-L-Ala-Gly-L-Asp,
Gly-L-Ala-Gly-D-Asp,
Gly-L-Ala-L-Glu,
Gly-L-Ala-Gly-L-Glu,
Gly-L-Ala-Gly-D-Glu,
Gly-D-Ala-D-Asp,
Gly-D-Ala-Gly-D-Asp,
Gly-D-Ala-Gly-L-Asp,
Gly-D-Ala-D-Glu,
Gly-D-Ala-Gly-D-Glu,
Gly-D-Ala-L-Glu,
Gly-D-Ala-Gly-D-Glu,
あるいは、Yが一アミノ酸残基、好ましくは、その芳香環でClのようなハロゲンでさらに任意に置換された、L-TyrあるいはD-Tyrを表わす場合、Xは以下からなる群から好ましくは選択された、ペプチド配列を表わす。
Gly-L-Ala-L-Asp,
Gly-L-Ala-Gly-L-Asp,
Gly-L-Ala-L-Glu,
Gly-L-Ala-Gly-L-Glu,
Gly-D-Ala-D-Asp,
Gly-D-Ala-Gly-D-Asp,
Gly-D-Ala-D-Glu,
Gly-D-Ala-Gly-D-Glu,
【００３１】
式Iは、アミノ酸残基が全てL-型、全てD-型、あるいはL-型、D-型の混合した配列からなる環状ペプチド配列を表わしていても良い。
【００３２】
式Iの環状化合物の例は、
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asn) (化合物4),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-L-Asn),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asp),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asn) (化合物3),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp),
シクロ(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asn),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp),
シクロ(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asn),
シクロ(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Asn),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asp),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Gln),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-L-Gln),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Glu),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Gln),
シクロ(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu),
シクロ(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Gln),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Gln),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu),
シクロ(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Gln),
シクロ(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Gln),
シクロ(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Glu),
シクロ(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)化合物44
シクロ(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-)化合物45
シクロ(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-)化合物46
シクロ(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)化合物47
および、その鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施例において、式Iは基XとYがアミノカルボニル結合、アルコキシ結合、エステル結合、還元アミド結合、あるいはジスルフィド結合によって連結した環状化合物を表わしている。
【００３４】
XとY が、式IIIの結合Lを有するアルコキシ結合によって連結される化合物の例は：
【化１５】
0004327398.tif 000005
そこでは、R’およびR’’それぞれは、水素あるいは低級アルキルおよび／あるいは低級アリール、好ましくはメチルおよびフェニルを表わし、以下にリストにされる、
のうシクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-CH2-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(メチル,フェニル)-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００３５】
XとY が、式IVの結合Lを有するカルボニル結合によって連結された化合物の例は；
【化１６】
0004327398.tif 000006
下にリストにされる：
シクロ(HNC(O)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(HNC(O)-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００３６】
XとY が、式Vの結合Lを有するエステル結合によって連結された化合物の例は：
【化１７】
0004327398.tif 000007
そこではR’およびR’’それぞれは、水素あるいは低級アルキルおよび／あるいは低級アリール、好ましくはメチルおよびフェニルを表わし、好ましくはR’≠R’’であり、下にリストにされる：
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(R’,R’’)C(O)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(O-C(フェニル,メチル)C(O)-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００３７】
エステル結合が、本発明の環状化合物において骨格の一部であるとき、LはヒドロキシC(3-6)アルキルカルボサイクリック酸のようなオキシカルボン酸由来かもしれない。本発明のある実施例において、Lは一般式HO-C(R1)(R2)-COOHのa-ヒドロキシカルボキシル酸由来であり、そのなかでR1とR2は、独立に水素、C(1-6)-アルキル、C(2-6)-アルケニル、アリール、アリールC(1-4)-アルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールC(1-4)-アルキルであり；あるいはR1とR2は、それらに結合した炭素結合とともにシクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロペンチル環を形成しており；ここではアルキルまたはアルケニル基は、アミノ基、シアノ基、ハロゲン基、イソシアノ基、イソチオシアノ基、チオシアノ基、スルファミル基、C(1-4)-アルキルチオ基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノ基、ヒドロキシ基、C(1-4)-アルコキシ基、アリール基、ヘテロアリール基、アリロキシ基、カルボキシ基、C(1-4)-アルコキシカルボニル基、C(1-4)-アルキルカルボニロキシ基、アミノカルボニル基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノカルボニル基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノ基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノ-C(1-4)-アルキル基、C(1-4)-アルキルカルボニル-アミノ基、スルフォノ基、そしてスルフィノ基から選択した1から3置換基によって置換されていても良い；ここではアリール、またはヘテロアリール基は、C(1-4)-アルキル基、C(2-4)-アルケニル基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、ハロゲン基、イソシアノ基、イソチオシアノ基、チオシアノ基、スルファミル基、C(1-4)-アルキルチオ基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノ基、ヒドロキシ基、 C(1-4)-アルコキシ基、アリロキシ基、カルボキシ基、C(1-4)-アルコキシカルボニル基、C(1-4)-アルキルカルボニロキシ基、アミノカルボニル基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノカルボニル基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノ基、モノ-またはジ-C(1-4)-アルキル-アミノ-C(1-4)-アルキル基、C(1-4)-アルキルカルボニルアミノ基、スルフォノ基、そしてスルフィノ基から選択した1から3置換基によって置換されていても良い。他の実施例において、Lはヒドロキシアリール(3-6)-アルキル-カルボキシル酸、またはLはヒドロキシC(2-6)アルケニル-カルボキシル酸、またはLはヒドロキシC(3-6)アルキルカルボキシル酸由来である。R1とR2は異なる基を表わしていることが望ましい。
【００３８】
本発明の環状化合物において、環状化はエステル結合によって行われ、アミノ酸残基の数は5であり、A-BはSar-Hyp、Hyp-Sar、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro、そしてHyp-Hypからなる一群から選択され、ProとHypは独立にLまたはD型であっても良く、好ましくはHypは4-ヒドロキシプロリンを表わしている。さらに好ましくは、A-Bは置換されていないL-Pro-L-4Hyp、L-4Hyp-L-Pro、D-Pro-D-4Hyp、またはD-4Hyp-D-Proを表わしている。
【００３９】
本発明の化合物の例は
シクロ(O-(CH2)5C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)および
LがヒドロキシC(3-6)アルキルカルボン酸である場合、
シクロ(O-(CH2)5C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) および
シクロ(O-(4-ヒドロキシメチルベンゾイル)C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)および
LがヒドロキシアリールC(1-4)アルキルカルボン酸である場合、
シクロ(O-(4-ヒドロキシメチルベンゾイル)C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)であり、
およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００４０】
環状化がセリンで形成される、本発明の環状化合物：
【化１８】
0004327398.tif 000008
及びスレオニンで形成される、本発明の環状化合物：
【化１９】
0004327398.tif 000009
【００４１】
ジスルフィド結合をもつ、本発明の環状化合物の例は
LおよびDアミノ酸の組み合わせ、Sarおよび他のN-置換された自然アミノ酸で置換されたアミノ酸、およびそれらのそれぞれの鏡像体、それらのレトロ類似体、と同様に製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような誘導体、を有する化合物を含む。
【化２０】
0004327398.tif 000010
【化２１】
0004327398.tif 000011
【００４２】
XとYが、式XのリンカーLを有する還元アミド結合によって連結されている、化合物の例：
【化２２】
0004327398.tif 000012
は下にリストにされる：
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH2NH)-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
であり、およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００４３】
XとYが、式XIのリンカーLを有する還元アミド結合によって、連結されている化合物の例：
【化２３】
0004327398.tif 000013
は下にリストにされる
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
シクロ(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
であり、およびその鏡像体、そのレトロ類似体、および製薬学的に許容可能な塩およびアミドのような、その誘導体である。
【００４４】
さらに好ましくは、本発明は一般式XIIのペプチドおよびペプチド誘導体に関連し、式XIIは式中、アミノ酸残基がD-および／あるいはL-型であっても良いペプチド配列を表わし、N*でN末端およびC*でC末端を有し、および破線で示されるようにN*とC*の間の、および破線Uによって示されるようにRdとC*の間の共有結合によって任意に環状をとり；
【化２４】
0004327398.tif 000014
および式中、
Xはアミノ末端のN*に結合されうる光プローブのようなN末端部分、あるいは酢酸、プロピオン酸、酪酸のようなC(2-22)アルキルカルボン酸由来のアシル基、およびヒドロキシ基、ハロゲン、C(1-6)アルキル基、ニトロ基、シアノ基からなる群から選択された一つあるいはそれ以上の置換基で任意に置換された、ベヘン酸のような他の脂肪酸から誘導されたアシル基を表し；
あるいはXはハロゲンを表わす；
N*とC*の間の結合が存在しない場合、R7は、OH、あるいはNH2、あるいはNHNH2、あるいはOR8を表わし、あるいはN*とC*の間の結合が存在する場合、R7は存在しない；
R8は水素あるいは直鎖あるいは枝分かれ状のC(1-6)アルキル基、アリールおよびアラルキル基を表わす。
RaはHypあるいはProのアミノ酸側鎖を表わす；
RbはHypあるいはProのアミノ酸側鎖を表わす；
RcはGly、Sarのアミノ酸側鎖、芳香環あるいはRcにおいて一つあるいはそれ以上のヒドロキシ基、ハロゲン、あるいは低級アルコキシ基で任意に置換された芳香族アミノ酸側鎖を表わす；
RdはAla、Gly、Glu、Asp、Dab、Dapa、Lys、Asn、Gln、Orn、あるいはCysのアミノ酸側鎖を表わす；
ReはAlaのアミノ酸側鎖を表わす；
RfはAla、SarあるいはGlyのアミノ酸側鎖を表わす；
RgはL-4Hypの側鎖を除く、任意のアミノ酸側鎖、あるいは式IIあるいはIIaの部分を表わす；
RhはAlaのアミノ酸側鎖を表わし、あるいはRhは式IIあるいはIIaの部分、好ましくはProを表わす；
RiはGlyのアミノ酸側鎖を表わし、あるいはRiは芳香環において一つあるいはそれ以上のハロゲン基で任意に置換された芳香族アミノ酸、好ましくはTyr、Phe、Trp、あるいはNalを表わす；
RjはAsn、Gln、Asp、Glu、Cys、あるいはTyrを表わす；
およびj、k、l、m、n、p、およびqのそれぞれは独立に0あるいは1をとる；
および式XIIのペプチド配列のレトロ型、全D型、あるいはレトロ全D型およびその塩およびアミド。
【００４５】
式XIIの好ましい実施において、Xは2-ヒドロキシ4-アジド-5-ヨードベンゾイルのような5位で任意にヨード化されたASALおよびABおよびAcのようなアシル基のような光プローブからなる一群から好ましくは選択される。R7はNH2が好ましい。RaはProのアミノ酸側鎖であるのが好ましい。RbはHypのアミノ酸側鎖であるのが好ましい。RcはGlyかTyrのアミノ酸側鎖であるのが好ましい。RdはGly、Asp、Glu、Dapa、あるいはDabのアミノ酸側鎖であるのが好ましい。ReはAlaであるのが好ましい。RfはGlyかAlaのアミノ酸側鎖であるのが好ましい。Rgは、式XIIが直鎖状ペプチドを表わすとき、Asn、Gly、D-4Hyp、あるいはL-/D-Proのアミノ酸側鎖を表わすのが好ましく、あるいは式XIIがN*とC*の間で環状化したペプチドを表わす場合、RgはL-/D-4HypあるいはL-/D-Proのアミノ酸側鎖を表わす。Rhは、Uが存在しないときAlaのアミノ酸側鎖であり、あるいはUが存在する場合、RhはProあるいはHypである。Riは、芳香環で一つかそれ以上ヒドロキシ基またはハロゲン基、特にF、Clで任意に置換されたTyr、Phe、Trp、Nalである。RjはAspまたはGluのアミノ酸側鎖である。R8は水素、安息香酸、第三ブチルまたはメチル基を表わす。
【００４６】
jとkは、Uが存在する場合、0であり、Uが存在しない場合、1であり、式XIIは環状ペプチドを表わし、mはUが存在しない場合、0であり、pはUが存在する場合1であり、そしてqはUが存在する場合0である。式XIIの非環状または直鎖状ペプチドは、レトロ全D型である。式XIIが環状ペプチドを表わすとき、ペプチドは3から9アミノ酸、より好ましくは3から7アミノ酸からなる。
【００４７】
式XIIと同等の式、しかし式中ペプチド結合の一つあるいはそれ以上が、i.a.ジスルフィド結合、エステル結合、還元アミド結合、アルコキシ結合、オキシカルボニル結合、アシルオキシアルコキシ結合から選択された共有結合に変換された、を有するペプチド様化合物は、本発明の化合物と同様の条件および栄養物の治療に有効であることは、技術に熟練した人には明らかである。
【００４８】
好ましい実施において、本発明は式中、アミノ酸残基がLおよび／あるいはD型をとりうるペプチド配列を特定する、一般式XIIIの化合物に関連し、
X-(G’)a-A-G’-(Px)2-(Y’)b-R7         (XIII)
式中
Xは、水素あるいはアセチル基を表わす；全てのアミノ酸残基がL-型である場合には、Xはアセチル基を表わす；
G’は、グリシン残基あるいはSarのようなグリシン類似体を表わし、G’はグリシンであるのが好ましい；
Aは、アラニンを表わす；
Pxは、HypあるいはProのような式IIあるいはIIaのアミノ酸残基を表わし、好ましくはプロリンを表わす；
Y’は、フェニル環においてハロゲンあるいはヒドロキシ基で任意に置換されたチロシンあるいはフェニルアラニンを表わす；Y’はチロシンであるのが好ましい；
aおよびbは独立に0あるいは1であり、
R7は、OH、NH2、NHNH2、Asn-NH2、Gln-NH2を表わし；
および式中全てのアミノ酸がD-型であり、および全ての記号が式XIIIで上述したものと同様の意味を有する、式XIIIa: X-(Y’)b-(Px)2-G’-A-(G’)a-R7を有するそのレトロ型を表わし；
および式中少なくとも一つのPx残基がD-アミノ酸であり、残りがL-アミノ酸である、式XIIIのペプチド化合物を表わし；
および式中Xが水素を表わし、R7がY’に共有結合を有するAsnあるいはGlnを表わし、bが1、およびaが1である、式XIIIの環状配列を表わす；
およびその塩を表わす。
【００４９】
式XIIの望ましい環状ペプチド化合物は、一般式XIVあるいはXVの一つを有することで特徴づけられる。
【化２５】
0004327398.tif 000015
式中
Xは、水素あるいはN末端に結合可能な光プローブのようなN末端部分、あるいは酢酸、プロピオン酸、酪酸、およびヒドロキシ基、ハロゲン、C(1-6)アルキル基、ニトロ基、シアノ基からなる群から選択された、一つあるいはそれ以上の置換基で任意に置換されるベヘン酸のような他の脂肪酸、のようなC(2-22)アルキルカルボン酸でのアシル化を表わす；
R1は、水素あるいはメチル基、好ましくは水素を表わす；
R2およびR3は、異なるあるいは同じであり、任意の可能なアミノ酸側鎖、好ましくは水素あるいはメチル基を表わす；
【化２６】
0004327398.tif 000016
は、任意の結合を表わす；
R4およびR5は、任意の可能なアミノ酸側鎖を表わし、任意の結合が存在する場合に、R5およびR4は結合した炭素および窒素原子とともに、ヒドロキシ基で任意に、好ましくは4位で置換されたプロリン環を表わし、あるいはR5およびR4は、結合した炭素および窒素原子とともに、上の式IIあるいはIIaの部分、好ましくはProあるいはHypを表わす；
R6は芳香族アミノ酸側鎖、好ましくはそのフェニル環でハロゲン、ニトロ基、ヒドロキシ基から選択された、一つあるいはそれ以上の置換基で任意に置換されたベンジル基を表わし、R6はチロシンを好ましくは表わす；
pは0あるいは1であり；
nは1,2,3,4であり；nは1であるのが好ましい；
およびその塩を表わす。
【００５０】
式XIVの化合物の例は
【化２７】
0004327398.tif 000017
およびその塩である。
【化２８】
0004327398.tif 000018
XV
式中R8は上述と同様であり、好ましくは水素を表わす；
R6は水素あるいはメチル基、好ましくは水素を表わし；
R4およびR5は異なり、あるいは同じであり、任意の可能なアミノ酸側鎖、好ましくはGlyあるいはAlaを表わす；
【化２９】
0004327398.tif 000019
は任意の結合を表わす。
R2およびR3は任意の可能なアミノ酸側鎖を表わし、あるいは任意の結合が存在する場合に、R2およびR3は結合した炭素および窒素原子とともに、4位において好ましくはヒドロキシ基で任意に置換される、プロリン環を表わし、あるいはR2およびR3は式IIあるいはIIaの部分を表わす；
R1は、芳香族アミノ酸側鎖、好ましくはTyr側鎖を表わす；
pは0あるいは1であり；
nは1,2,3,4;好ましくはnは1である；
およびその塩。
【００５１】
式XVの例示化合物は
【化３０】
0004327398.tif 000020
【００５２】
さらに驚くべきことに、AAP10のHyp-Pro配列をアスパラギンあるいはグルタミン残基に置換することで新規の抗不整脈性ペプチド、下記例21の化合物21、となることが明らかになった。このように本発明の好ましい実施は、アミノ酸残基がD-と/またはL-型であっても良い、そして一般式XVIをもつペプチド化合物に関連している。
【化３１】
0004327398.tif 000021
式中、R1はペプチドのNおよびC末の間の、任意のアミド結合を表わし、水素あるいはアセチル基を表わす；
Aa1は、好ましくは0から4アミノ酸残基の間のペプチド配列を表わし、Aa1が1から4アミノ酸残基のペプチド配列を表わす場合に、Aa1はAla、Gly-Ala、Gly-Ala-Tyr、Gly-Asn-Tyr-Alaからなる群から好ましくは選択される；
AlはGly、ベータアラニン、Sarからなる群から選択された、アミノ酸残基を表わす。
Aa2はAsn、Gln、Gly、Tyr、あるいはヒドロキシ酸、アミノスルホン酸、リン酸基のような化学単位、あるいは4つの共有結合を介してGとArを結合する炭化水素鎖からなる群から選択されたアミノ酸残基を表わす；
ArはF、Cl、Br、I、OH、NO2、NH2、COOH、CONH、のような、一つあるいはそれ以上のハロゲンで任意に置換されたTyr、Trp、Phe、His、Nalのような、芳香族アミノ酸残基を表わす；
R2はヒドロキシ基、アミノ基、を表わし、あるいは存在しない；レトロ類似体、レトロ全D類似体（レトロ-逆類似体）およびその塩。
【００５３】
式XVIの例示化合物は、
化合物39 H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2
化合物44 シクロ(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-）
化合物45 シクロ(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-）
化合物46 シクロ(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-）
化合物47 シクロ(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-）
化合物40 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2
化合物41 H-Gly-Asn-Tyr-NH2
化合物42 Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2
化合物43 H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2
および、この中に定義したように、それらの塩である。
【００５４】
光／温度不安定ペプチド誘導体
アフィニティラベリングは生物学的な活性をもつ分子の相互作用を研究するために頻繁に使用される技術である。光あるいは温度不安定の化合物類似体が、調査に使用される。
【００５５】
暗がりでは安定である、調査中の化合物の光不安定の類似体は、照明によって挿入反応に用いられる反応性中間体に変換される。これは、共有結合を形成することにより、生物学的な親和性に基づいた相互作用を安定化する。光プローブとして、芳香アジドや安定化されたジアゾ化合物は、光分解によって、挿入反応に用いることができる、非常に反応性の高い、非特異的な中間体、それぞれニトレンとカルベンを生じる。このように、光プローブとしてアリールアジドや安定化したジアゾ化合物を使用する光親和性標識は、炭化水素結合を含むどの結合部位においても行うことができ、また結合部位に特別に反応性の高い基を必要としない。それゆえに、標識の特異性は受容体へのリガンドの特異的な結合にのみ依存し、結合部位の標識を保証する反応を形成する非特異的な共有結合によって続けられる。光親和性のプローブは、反応性の高い機能的な基が存在しなくても良いが、炭素-水素結合は含む、ホルモンレセプターの部位を標識するのに特に有効である。光反応性の高さから、アジド、ジアジリノ、a-ジアゾケトン、チア-およびセレノジアゾール、ベンゾフェノン、ニトロフェニルが特に有用である。アリールアジドを用いた標識工程は、励起波長300-320nm、光感受性のペプチド類似体とレセプターを含む室温の水溶液中で0.5-2時間の光分解を含む。
【００５６】
温度不安定の化合物は、アミノ基、メルカプト基に対する特異性を有する、温度制御可能な反応において、共有結合を形成することができる反応基を含む。温度不安定プローブとして、脂肪族ハロゲン化物、特にヨウ素化そして臭素化されたもの、N-ヒドロキシサクシニミドのような反応性の高いエステル、酸塩素化合物、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボジイミド、そしてマレイミドが、が使用可能である。
【００５７】
in vitroへの適用のためのプローブは、多くの場合、ヨウ素-125や131、炭素-14、そしてトリチウムのような放射性同位体、または蛍光プローブ、またはビオチン、あるいはハプテンとして選ばれる。リガンドの結合活性への標識の影響は、受容体の親和性が維持されていることを保証するためにも、調査する必要がある。放射性標識として、ヨウ素-125は60日の半減期と低いフォトン放射のために、in vivo適用例ではよく用いられる。半減期が長いことは、光反応性類似体とそれによって標識されたタンパク質産物を、使用または分析前に長期間の準備と保存を可能にする。ペプチドリガンドへのヨウ素(I-125)の取り込みは、ペプチド配列中にチロシンまたはヒスチジンが存在すれば、容易である。ペプチドの標識がリガンドの生物学的活性へ及ぼす影響は、生物学的活性が維持されていることを保証するために調査しなければならない。Dhein et al. (WO96/21674)は、AAP10のある誘導体はそのチロシン残基のフェニル環がヨウ素-125で置換されているが、生物学的活性をもつことを示した。しかし、上記のAAP10誘導体は、おそらくリガンドあるいは受容体への可逆的な結合のため、親和性プローブとして使用できなかった。アリールアジドを使用した光親和性標識によって、標的タンパク質（受容体）に非可逆的に結合した、ペプチドリガンドの大体50-60%が標識された。このように本発明の目的は、抗不整脈性ペプチドのリガンド、あるいは受容体を同定するための検定に用いるために、光または温度プローブおよび任意の放射性標識での修飾を最適化した、抗不整脈性ペプチドをさらに供給することである。上記の目的は、上記の光プローブ、好ましくは4-アジドサリシロイル(ASAL)やAB(4-アジドベンゾイル)の一つで誘導された式I、XII、XIIIまたは9の化合物によってなされる。好ましくは、上記の誘導された化合物は、さらにヨウ素-125のような放射性標識で置換される。
光プローブで修飾された、および放射性標識された式I、XII、XIIIまたは9の化合物の例は
化合物31 ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
化合物32 ASAL(3-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
化合物32a ASAL(6-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
化合物33 AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
化合物34 AB-Tyr(3,5-di-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
およびその塩である、下の合成例31-34を参照。
【００５８】
さらに、本発明は以下の一般式からなる群から選択されたペプチド化合物に関連する
2: H-GAG-(Pa)2-NH2
式中、Paは任意のアミノ酸残基あるいは式IIあるいはIIaの部分であり；少なくともPaの一つは、Dアミノ酸であり；好ましくはPaはHyp、P、GあるいはAである；
3: H-GAG-(Px)2-Y-NH2
式中、Pxは式IIあるいはIIaの部分であり、そこではあるPxが式II、IIaの部分、および他のPxがPあるいはHypである；
4: Ac-Y’-GAG-(Px)2-OH
式中、Y’はYあるいはFであり、およびPxはPあるいはHypである；
5: Cys(Acm)-AAP10*-Cys(Acm)あるいはCys(Acm)-retroAAP10*-Cys(Acm)
式中、Acmはアセタミドメチル基であり、およびAAP10*はAAP10配列あるいはその短縮された形である；
6: X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-NH2
式中、Xは水素あるいはアセチル基であり、およびPxは式IIあるいはIIaの部分であり、好ましくはHypあるいはPであり；一つあるいはそれ以上の炭素あるいは窒素同位体を任意に有する；
7: H-(Px)n-Y(N/Q)G-AG-(Px)m-NH2
式中、PxはPあるいはHypであり、nは1あるいは2であり、およびmは0あるいは1であり、好ましくはn=2の場合にm=0、およびn=1の場合にm=1である；
8: H-G’-A-G’-(Px)2-Y-NH2
式中、G’はSarあるいはGlyであり、および少なくともあるG’はSarであり、およびPxはPあるいはHypである；
9: X-(Y)p-(Px)2-GAG-NH2
式中、XはASALあるいはABであり、pは0あるいは1であり、およびYのフェニル環は、一つあるいはそれ以上のハロゲン置換基、好ましくはI、を任意に有し、およびPxはPあるいはHypである；
10: シクロ(-GAG-(Px)2-Y-N/Q-)
式中、PxはPあるいはHypである；
11: シクロ(-Y-(Px)2-GA-(G)q-N/Q-)
式中、qは0あるいは1であり、Yのフェニル環は、一つあるいはそれ以上のハロゲン置換基、好ましくはI、を任意に有し、およびPxはPあるいはHypである；
12: X-Zd-G(N/Q)Y-NH2
式中、ZdはGあるいはAから選択された0、1、2アミノ酸残基の配列であり、Xは水素あるいはアセチル基である；
およびその塩。
【００５９】
塩
本発明の化合物は、薬剤的に許容可能であるために、直鎖状化合物のC末のカルボキシル酸、またはもし存在すれば、環状化合物の自由なカルボキシル酸によって形成される塩、アルキルエステル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、またはヒドラジドの形で使用される。直鎖状化合物のアミドと低級のアルキルアミドは、本発明の好ましい化合物の中の一つである。塩とは、酸添加の塩や塩基性塩のような薬剤的に許容可能な塩である。酸添加の塩の例は、塩化水素塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、などである。塩基性塩の例は、陽イオンが、ナトリウムやカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムやアンモニウムイオン+N(R3)3(R4)のようなアルカリ地金属から選択されるような塩であり、ここではR3とR4は、任意に置換されたC1-6-アルキル、任意に置換されたC2-6-アルケニル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールを独立に示す。薬剤的に許容可能な塩の他の例は；例えば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences” 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.)に述べられたもの、そしてEncyclopedia of Pharmaceutical Technologyに述べられたもの、である。
【００６０】
定義
記述と請求を通じて、自然アミノ酸の三文字表記を他のa-アミノ酸の一般的に用いられる三文字表記と同様使用する、例えばサルコシン(Sar)、a-アミノ-イソ-酪酸(Aib)、1-ナフチルアラニン(1Nal)や 2-ナフチルアラニン(2Nal)を含むナフチルアラニン(Nal)、フェニルグリシン(Phg)、2,4-ジアミノ酪酸(Dab)、2,3-ジアミノ酪酸(Dapa)、そしてヒドロキシプロリン(Hyp)である。何も特定しない場合、Hypは4-ヒドロキシプロリンを表わす。自然または必須アミノ酸とは、タンパク質を構成するアミノ酸である。芳香族アミノ酸は、Phe、Tyr、Trp、1Nal、2Nal、そしてHisである。LかD型か特定しない場合、件のアミノ酸は自然なL型であると理解しなければならない、参照 Pure & Appl. Chem. Vol. 56(5) pp595-624 (1984)。
【００６１】
何も特定しない場合、本発明の化合物のC末アミノ酸は遊離のカルボキシル酸として存在すると理解しなければならなく、これもまた”-OH”として特定しても良い。本発明の化合物のC末アミノ酸は、末端の機能”-OH/NH2”をもつと表記されるかもしれなく、これは化合物が二つの優先的な型をとることを意味する：遊離のアミノ酸とアミド誘導体。本発明の6ペプチド化合物は、配列Ala-Gly-Hypを含んでおり、またC末にアミド基をもつが、C末のPheまたはTyrまたはフェニル環にハロゲンをもつそれらの誘導体は含まない。
【００６２】
抗不整脈性ペプチドの“機能的類似体”によって、内生のAAPの有効な抗不整脈または抗血栓症作用の一つあるいはそれ以上を発揮するために、内生のAAPと十分類似した構造と／または結合性をもつ、任意の化学的なものまたは化合物を示す。
【００６３】
“へテロアリール”という語は、窒素、酸素とピロリル、フロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、のような硫黄、から選択された1-4のヘテロ原子を含む、5または6員環、芳香族、単環、ヘテロ環状基を含み、また窒素、酸素、キノリニルのような硫黄から選択された1-6ヘテロ原子を含む、芳香族、複環状、ヘテロ環状基を含む。
【００６４】
“レトロ類似体”という語は、配列が名付けられたペプチドの逆であるようなペプチドを指している。
【００６５】
“ハロゲン”という語は、フッ素、塩素、臭素、そしてヨウ素を指し、ここではフッ素とヨウ素が望ましい。
【００６６】
“アルキル”という語は、任意の炭素原子から水素原子の除去により、アルカン由来の単結合基を指す：CnH2n+1- 。枝分れのないアルカンの末端炭素原子から水素原子の除去により誘導された基は、ノーマルアルキル基（n-アルキル）を形成する：H[CH2]n-。基RCH2-、R2CH-（Rは水素ではない）、R3H-（Rは水素ではない）は、それぞれ第一、第二、第三アルキル基である。 C(1-22)アルキル基は、1から22の炭素原子をもつ任意のアルキル基を指し、メチル基、エチル基、プロピル基、イソ-プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、そしてそれらの可能な全ての異性体のようなC(1-6)アルキル基を含む。“低級アルキル基”によって、C(1-6)アルキル基、好ましくはC(1-4)アルキル基、より好ましくはメチル基やエチル基を指す。
【００６７】
“アルケニル”という語は、一つかそれ以上の炭素間二重結合を含む、直鎖状の、あるいは枝分れした、あるいは環状の炭化水素基をさす。C(2-22)アルケニルは、1から22個の炭素原子をもつ任意のアルケニル基をさし、C(2-6)アルケニル、ビニル基、アリル基、1-ブテニル基、などを含む。
【００６８】
“アラルキル”という語は、アリールC(1-22)アルキル基をさし、“アリール”という語は、この明細事項を通してフェニル基またはナフチル基をさす。
【００６９】
HPPは、ヒドロキシフェニルプロピオニルをさす。
4HPPは、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニルをさす。
2HPPは、3-(2-ヒドロキシフェニル)プロピオニルをさす。
4HPPAは、4-ヒドロキシフェノキシ酢酸をさす。
2HPPAは、2-ヒドロキシフェノキシ酢酸をさす。
4HMPAは、4-(ヒドロキシメチル)フェノキシ酢酸をさす。
4HPAは、4-ヒドロキシフェニル酢酸をさす。
3HPAは、3-ヒドロキシフェニル酢酸をさす。
2HPAは、2-ヒドロキシフェニル酢酸をさす。
4HBGは、N-(4-ヒドロキシベンゾイル)グリシンをさす。
3HBGは、N-(3-ヒドロキシベンゾイル)グリシンをさす。
2HBGは、N-(2-ヒドロキシベンゾイル)グリシンをさす。
4HPGは、N-(4-ヒドロキシフェニル)グリシンをさす。
Acは、アセチル基をさす。
Tfaは、トリフルオロアセチル基をさす。
ASALは、4-アジドサリシロイル基をさす。
ABは、4-アジドベンゾイル基をさす。
HOBtは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールをさす。
HOAtは、1-ヒドロキシ7-アザベンゾトリアゾールをさす。
Acmは、アセトアミドメチル基をさす。
Pd(PPh3)4はテトラキス(トリフェニルフォスフィン)パラジウム(0)である。
【００７０】
本発明の化合物の安定性
さらに、本発明の化合物は、酵素的な分解に対して安定であり、および／あるいは血漿中での分解に対して安定であり、および／あるいは改良されたin vivoの半減期を有することで特徴づけられる。
【００７１】
本発明の抗不整脈化合物を含む化合物は、酵素的な分解に対して安定であり、および／あるいは血漿中で安定であることが好ましい。本発明によって示したように、AAPの本来のペプチド配列の様々な誘導体と化学修飾、例えばC末のアミド化またはエステル化、D-アミノ酸の使用、自然アミノ酸の誘導体、N末修飾そして環状類似体、すべてが安定性を高めるように意図した修飾を表わす一方で、本来のAAPの本質的な抗不整脈的および／あるいは抗血栓症的な性質を残している。
【００７２】
下の表1は、本発明の様々な化合物の分解による半減期(T1/2)とAAP10、AAP、HP5のものとの比較を示す。表から本発明の化合物2、3、27、48そして49は、3時間またはそれ以上の半減期をもち、血漿および血清液中で半減期が10分以下のAAP10、12分以下のHP5に対し、著しく安定であるようである。
【００７３】
表1  血漿および血清中でのin vitro安定性検定の結果、T1/2は分および時間。
【表１】
0004327398.tif 000022
*５時間で反応なし
【００７４】
in vitro血漿安定性の分析方法
ペプチドの安定性を様々な種類の血漿と血清中で分析する。ペプチドを血漿中37℃におき、t=0からt=156分の間に一定間隔でおよそ9回分取したサンプルをHPLCによって分析する。
HPLC分析のための適切な条件（カラム、溶媒、勾配、そして温度）を、薬剤と血漿のピークが同じ保持時間を示さないように評価する。これは、薬剤、血漿の連続的な注入と同時の注入によって行い、満足いく分離が得られるまでLC法変数の最適化を続ける。各血漿種に対し、三つの平行した実験を行う。t=0でペプチド100mlと血漿900mlを混合し、37℃におく（薬剤-血漿混合液濃度0.1mg/ml）。適切な間隔で薬剤-血漿混合液からサンプル100mlをとり、10mlのMeCN: TFA 50: 50 v/vでサンプルを沈降させることで分解を停止した。同様に処理した薬剤を加えていない対照の血漿サンプルもまた分取する。血漿サンプルは、大気温度中、12,000回転／分（エッペンドルフ遠心機）で15分間遠心する。生じた上清溶液は、300mlのHP autosampler vialsに移され、HPLCによって分析される。HPLC分析は次のように行われる：
【００７５】
化合物CE1
カラム：Vydac 218MS52、250×2.1mm、flow: 0.200mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 25 min.
Inj. vol.: 15mL. Detection: DAD1 A、214.5nm
【００７６】
化合物CE2
カラム：Kromasil KR100-10C8、250×4.6mm、flow: 1mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 20 min.
Inj. vol.: 25mL. Detection: VWD 1A, 214.5nm
ウサギ血清を除いて：DAD1 A、214.5nm
ラット血漿を除いて：MeOH/MQW/TFA (0.1%). Detection: VWD1 A, 210nm
【００７７】
化合物CE3
カラム：Vydac 218MS52、250×2.1mm、flow: 0.200mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 35 min.
Inj. vol.: 15mL. Detection: DAD1 A、214.5nm
【００７８】
化合物3
カラム：Kromasil KR100-10C8、250×4.6mm、flow: 1mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 25 min.
Inj. vol.: 25mL. Detection: DAD1 A、214.5nm
【００７９】
化合物2
カラム：Luna 3u C18(2)、150×2mm、flow: 0.250mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/HFBA (0.02%). Run time: 25 min.
Inj. vol.: 25mL. Detection: DAD1 A、214.5nm
ヒト血漿を除いて：カラム: Luna 5u C18、150×2mm、Temp.: 10℃.
ヒト血清を除いて：カラム：Kromasil KR100-10C8、250×4.6mm、flow: 1mL/min.溶媒：MeCN/MQW/TFA(0.1%).
【００８０】
化合物27
カラム： Kromasil KR100-10C8、250×4.6mm、flow: 1mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 25 min.
Inj. vol.: 25mL. Detection: VWD1 A、214.5nm
【００８１】
化合物49
カラム： Kromasil KR100-10C8、250×4.6mm、flow: 1mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 25 min.
Inj. vol.: 25mL. Detection: DAD1 A、214.5nm
【００８２】
化合物48  180
カラム： Kromasil KR100-10C8、250×4.6mm、flow: 1mL/min. Temp.: 40℃. 溶媒: MeCN/MQW/TFA (0.1%). Run time: 25 min.
Inj. vol.: 25mL. Detection: DAD1 A、214.5nm
【００８３】
サンプルは、次の順序で分析される：対照、ペプチド0.1mg/mL、ペプチドを加えていない血漿、t=0における三つの平行したサンプル、t=5における三つの平行したサンプル、t=10における三つの平行したサンプル、など。そして最後に、 t=0における三つの平行したサンプルが、分析中に分解または他の失敗が起きていないことを確認するため繰り返された。サンプル濃度（mAUで表わした）は時間に対してプロットされ、一次指数崩壊を描く関数に適合させる（Excel）。様々な種類の血漿中におけるペプチドの半減期は、平均(n=3)±標準偏差として表1に示される。
【００８４】
多細胞生物において、細胞間の同調は最も重要である。細胞のクロストークの様々な手段の一つ、ギャップ結合は最も直接的な経路である。ギャップ結合は、隣接する細胞間に形成された結合複合体の一つの型であり、隣接する細胞の内部（細胞質）を直接連結する凝集したチャンネルからなる。成体哺乳類では、ギャップ結合は一つの既知の例外、循環する血液要素を除いて、多くの細胞種でみられる。
【００８５】
ギャップ結合チャンネルの構造単体は、コネクソンまたはヘミ-チャンネルである。各コネクソンは、一つの細胞質膜にかかる孔を形成するように複合体化した、六つのコネキシンポリペプチドからなる。完全なギャップ結合チャンネルを形成するために、隣接する細胞由来の二つのコネクソンが並び、連続的なチャンネルを形成するようにお互いにつながり、二つの細胞の細胞質を連結する。
【００８６】
ギャップ結合チャンネルを形成するコネキシンは、これまでに発見された少なくとも14の哺乳類コネキシンによる、多くの遺伝子ファミリーを構成する。コネキシンの発現は、組織そして細胞特異的であり、幾つかの細胞ではコネキシン同型が、多種発現している。実験的な事実は、二つの異なる混成形もありうることを示唆している：異種細胞間チャンネルでは、それぞれのコネクソンまたはヘミチャンネルは、特異的なコネキシンアイソフォームによって構成される；またはヘテロマーのチャンネルでは、それぞれのコネクソンは特定の細胞種で発現する異なるコネキシンアイソフォームの混成物である。コネキシンは、細胞、組織そして発生特異的な様式で発現する。
【００８７】
コネキシン遺伝子の構造については、比較的あまり知られていない。マウスCx43に関して報告された結果から、Cx43は5’非翻訳領域に二つのエキソンと一つのイントロンを含むことが明らかになった。さらなる解析により、Cx43転写は胚、成体組織両者においてポイントで開始することが示された。幾つかの推定転写因子結合部位が、5’側プロモーターにおいて同定された。in vitroの研究により、浸透性のチャンネルは異なるCxの対によって構成されたヘミチャンネルによって生じることが示された。例えば、Cx43はCx32、Cx37、そして卵母細胞の内生のCx(Cx38)と機能的なチャンネルを構成するが、卵母細胞のCx28とは構成しない。しかし、それらの性質と同様これらのヘテロチャンネルの透過性の調節については、ほとんど知られていない。Cxは広範で多くの組織において発現しており、一つの細胞は幾つかの異なるCxを発現しうる。透過性のギャップ結合は、異なる種類のCxを発現する細胞間で形成されうる。このように、組織におけるギャップ結合細胞内伝達(GJIC)は、組織の完全性の維持に非常に重要であるようである。その遺伝子の一つの変異によるGJICの欠失を防ぐように、幾つかの遺伝子が等価の産物を作っているようである。
【００８８】
形成されたギャップ結合チャンネルの孔の直径は、0.8-1.4nmの幅であると報告された。ギャップ結合は比較的非選択的であり、約1000ダルトンまでの分子は、そこを通過できる。そのような物質は、i.a. イオン、水、糖、ヌクレオチド、アミノ酸、脂肪酸、低分子ペプチド、薬剤、そして発がん物質である。チャンネル通過は、ATPを必要とせず、受動的拡散に因っているようである。ギャップ結合チャンネルを介した細胞間の物質のこの流入は、ギャップ結合細胞間伝達(GJIC)として知られ、細胞の代謝、増殖、そして細胞間のシグナル伝達の調節に重要な役割を果たしている。GJICの最も重要な生理的な関与の一つは、組織中のギャップ結合により共役した細胞は、個々、分離した存在ではなく、その隣接した細胞と高度に統合されている。この性質は、ホメオスタシスを容易にし、また組織において細胞応答を同調するように細胞間の二次メッセンジャーの迅速、直接的な伝達を可能にする。
【００８９】
GJICの過程は、大きく二つの主要な種類に分けることのできる、様々な機構によって調節されている。一つ目の種類の調節は、発現、分解、細胞質膜へのコネキシンの細胞内輸送、または機能的なギャップ結合へのコネキシンの組み立てを調節することによって、ギャップ結合の細胞内存在量を調節する。がん化細胞において、コネキシンの低発現によって生じるGJICの障害は、この種類の調節の例である。二つ目の種類の調節は、一般的にギャップ結合またはコネキシンの細胞内の量のどんな著しい変化にも関与しないが、存在するギャップ結合の開放、または閉鎖または遮断することを含む。マイトジェン(例  DTT)、ホルモン(例  カテコールアミン)、麻酔薬(例  ハロタン)のような細胞外の可溶性因子、細胞内生理活性分子（例  cAMP）、そして細胞ストレス（例  機械的または代謝ストレス）などがこの種類の調節に結び付く。さらに、GJICは細胞周期中、そして細胞移動中に調節される。
【００９０】
GJIC調節または結合のゲーティングの様式は、ギャップ結合、とくにコネキシン43(Cx43)について広く研究されており、このように全てのコネキシンの代表例として用いられている。いくつかの因子が、GJICに間接的に、例えば脂質環境、細胞膜流動性を変化させることによって、阻害効果を及ぼし、一方で他のGJIC阻害剤は、Cx43の様々な修飾を誘導する、腫瘍遺伝子、成長因子、そして腫瘍促進剤を含む。結合の透過性の破壊は、後者の群の特異的な生物学的機能を仲介するのに必要であっても良い。これらの薬剤は、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、そして相互作用するタンパク質の活性化からなる複雑なシグナル経路を開始する。これらのGJIC調節因子の作用機構を理解することは、結合の調節を担う、それらのそれぞれのシグナル経路を明らかにするだけでなく、GJICとコネキシンの生物学的機能を特徴づけるための実験的な手段を与えるだろう。
【００９１】
Cx43の細胞質側のC末端領域の特異的な部位のリン酸化状況の変化は、ギャップ結合のチャンネルの開放と閉鎖に重要であるようだ。C末端領域のリン酸化もまた、Cx43ギャップ結合ヘミ複合体の表層膜への結合、その内部への取り込み、そして分解の過程においてもまた重要であっても良い。コネキシンは、多くの細胞質膜タンパク質（数日）に比べ半減期が短い（数時間）、例えばラット心臓におけるCx43の半減期は、11/2時間以下である。このように代謝速度の調節は、GJICの調節において重要な因子である。
【００９２】
C末端領域は、多くのタンパク質キナーゼ（PKA、PKC、PKG、MAPK、CaMkIIそしてチロシンキナーゼ）にとっての推定リン酸化部位を含む。C末端領域のこれらの部位のリン酸化により、ギャップ結合は閉鎖し、Cx43ギャップ結合チャンネルの様々な阻害剤は、そのC末端領域のリン酸化を誘導するために様々なシグナル経路を利用する。細胞種と特定の阻害剤は、どのシグナル経路が使用されるか決定し、関与したキナーゼの種類は利用される細胞内メッセンジャー機構を示す。このようにPKAの活性化は、cAMPセカンドメッセンジャー機構の関与を必要とすることが報告されている一方で、PKCはイノシトールリン酸細胞内シグナル機構を必要とする。
【００９３】
チャンネル開閉を調節する他の機構は、水素イオン、カルシウムイオンの細胞内濃度、結合間の電位、そして遊離基を含む。pHまたはpCaの減少は、細胞そしてコネキシン特異的な様式でチャンネル閉鎖を誘導する。
【００９４】
成長制御の他にも多くの生理的な役割が、GJICに提案されている：
ホメオスタシス。GJICは、細胞間の栄養素、イオン、そして流動性の迅速な平衡を可能にする。これは、これらのチャンネルの最も古く、広く行きわたった、重要な機能である。
電気的共役。ギャップ結合は、心臓の筋細胞、平滑筋細胞、ニューロンのような電気的興奮を受けうる細胞において、電気的なシナプスとして機能する。これらの組織では、電気的共役は化学的なシナプスに比べ、活性電位のより迅速な細胞間伝達を可能にする。心臓筋細胞や平滑筋細胞では、これはそれらの同調的な収縮を可能にする。
ホルモンへの組織応答。GJICは、外からの刺激への組織の反応性を高めるかもしれない。環状ヌクレオチド、カルシウム、イノシトールリン酸のようなセカンドメッセンジャーは十分小さいため、ホルモンにより活性化した細胞から静止状態の細胞へ、ギャップ結合チャンネルを通じて通過し、後者を活性化する。そのような効果は、アゴニストへの組織応答を増加しても良い。
胚発生の調節。ギャップ結合は、胚における化学的および／あるいは電気的発生シグナルの、そして発生中のコンパートメントの境界を決定するための細胞間経路として機能しても良い。GJICは胚細胞に特異的な様式で生じ、GJICの障害は、発生異常や多くの化学物質の奇形発生効果に関連している。
【００９５】
細胞間伝達は、個々の細胞の活性が同調した形で起こることを保証し、これらの活性を活動中の組織の動きに統合し、それを含む生物の役に立つ。それゆえに、広範な病理学的な状況がGJICの低下と関連しているのは、特に驚くべきことではない。
【００９６】
薬理学
心臓への適用
本発明の背景の記述において概説したように、正常なそして病理学的な状況下、心臓筋細胞においてGJICの重要な役割を支持する十分な証拠がある。GJICの障害に関連した特異的な心臓の状況は、以下に検討し、心臓においてGJICを上昇する化合物が、心臓における一連の病理学的な状況の予防および／あるいは治療に有効であることを示すために、in vitro、in vivoの証拠を示す。
【００９７】
再入不整脈
心臓の不整脈は、異常衝動開始または異常衝動伝導によって生じる。異常衝動伝導によって生じる不整脈の一つ、再入機構によって起こる不整脈は最も深刻である。
【００９８】
心室再入
再入は、持続性の心室細動や突然心臓死の主要な原因である。再入は、衝動の伝播が心臓の完全な活性化後に消えず、しかし不応期の終了後に心臓を再活性化し続けるときに生じる。再入の誘導は、伝導遅延、再分極の分散増加、非一様有方性そして単一方向の伝導阻害によって容易になる。心室の再入の多くの場合の原因を担う、元となる病気は、虚血性心疾患（例えば、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、安定狭心症、および不安定狭心症）である。急性虚血性心疾患中では、ギャップ結合チャンネルは閉鎖し、隣接する細胞の脱共役状態になる。イオンチャンネルとギャップ結合の不均一な変化により、活動電位持続の分散増加と、虚血領域を正常な心筋層から隔てる境界地帯で特に効果的な不応期とを生じる。活動電位持続の分散増加は、心室細動の誘導を容易にすることが古くから知られている[23]。正常に、よく共役した細胞では、活動電位持続における差は、電気的共役のため滑らかに起こる。しかし脱共役は、この滑らかさを妨げ、活動電位持続の分散と不応期の均一化の原因となる[24]。虚血が持続する場合には、Cx43の発現低下と変化した分布様式が観察されうる。慢性虚血における発現と分布様式の変化と同様、急性虚血中のギャップ結合の閉鎖により、伝導遅延、分散増加、非一様有方性、そして単一方向の伝導阻害、を生じるかもしれなく、それによって再入不整脈の誘導が容易に生じる。このように実験的な研究により、異常なコネキシン発現、分布の部位と再入心室頻拍回路の位置との間の関連性が示された[26]。
再入の進展を促すような状況、つまり伝導遅延、再分極の分散増加、非一様有方性そして単一方向性伝導阻害、は多くの他の心疾患においても様々な程度に存在する。このように、伝染性あるいは自律的心筋症において、生じる炎症は、心筋層における繊維状組織の剥奪を引き起こすかもしれなく、それによって伝導遅延、分散増加、そして単一方向性伝導阻害の集中点をつくりだす。肥大性心筋症（例えば、高血圧、大動脈弁狭窄症、先天性のため）は、大量の心筋組織と、比較的少量の伝導遅延、分散増加、そして単一方向性伝導阻害を引き起こすかもしれない伝導組織との間の不一致のために再入不整脈になるのかも知れない。先天性疾患（例えば、long-QT症候群）やQT間隔を長びかせる薬剤（例えば、抗不整脈薬、抗精神病薬、抗ヒスタミン、抗生物質など）もまた、おそらく心筋層の様々な層をつうじたイオンチャンネルの分布の不均一性のため、活動電位持続の分散を増加させ、若年層患者の再入によって引き起こされる突然死の主要な原因となっている[26]。
【００９９】
心房再入
心房細動-最も共通する心臓不整脈-もまた再入機構によって生じる。この場合、多数の小波が心房を横断し、もはや無反応性にない組織を再興奮させる。心房細動は数年間持続すると、実際に心房の再構築につながる。再構築過程の重要な部分は、ギャップ結合の分布における変化である。このように、Cx40の分布様式は、不均一化が進むようになる。Cx40ギャップ結合の分布と量における変化の時間経過は、AFの安定性と複雑さの上昇と関連しており、Cx40ギャップ結合再構築は持続性心房細動の病理発生に関与しているの可能性を示唆する[27]。さらに、いくつかの証拠が心房伝導の遅延を生じるような状況では、心房細動の発生率が高くなるという考えを支持する。
【０１００】
再分極交代
上昇した心臓速度あるいは代謝損傷にたいして心電図T波交代の出現は、ほぼ一世紀間観察されている。肉眼で見えるT波交代は、突然不整脈死の前兆として認められる。最近の研究は、基質の解剖上の性質に依存し、様々な再入不整脈の開始に不調和再分極交代の存在を関連させる可能性を有する、共通の機構を示唆する[28]。変時性あるいは代謝のストレス下、心筋活動電位の再分極相は、形態および持続において交代を発展させる。付加的なストレスで、あるいは構造的な障害の存在において、再分極交代は、空間的に不調和になる。不調和交代は、単一方向阻害および再入を生じるように、十分に大きな再分極勾配に導く。構造的な障害のない場合、再入は機能的であり、心室細動あるいは多形性心室頻拍としてあらわれる。構造的な障害の設置において、再入は解剖学的に固定されるようになり、結果的に単形性心室頻拍になる。
【０１０１】
要約して、ギャップ結合コンダクタンスを増加させ、有方性をより一様にする、本発明の化合物のような物質は、単一方向性阻害および再入不整脈を防止するようである。そのような物質は、心房および心室の両者を起源とする再入回路を有する患者に有効であろう。T波変化を有する患者は、再入不整脈の傾向があり、ギャップ結合共役を増加させ、有方性を減少させる、物質はこれらの患者における、致死性の心室不整脈の防止に有効であっても良い。
【０１０２】
徐脈不整脈
徐脈不整脈は、洞房結節、房室結節、His束、あるいは右あるいは左索枝の遅延した伝導あるいは伝導阻害によって生じうる。伝導系を通じてのコンダクタンスを担う、主要なコネキシンはCx40である。Cx40遺伝子のホモ同型接合体のノックアウトマウスは、著しく遅延した心房、房室、およびHis-プルキンエの伝導を有し、不整脈および索枝阻害の危険性の増加した状態にある。このように、正常に機能するCx40ギャップ結合は、正常な律動の維持に必須である。
【０１０３】
ギャップ結合コンダクタンスを増加させる本発明の化合物のような、物質は心臓における遅延した伝導の防止および／あるいは治療に有効である。
【０１０４】
収縮減少
収縮減少は、多くの慢性心疾患の共通する性質である。最悪の場合のシナリオにおいて、（すなわち、心臓機能不全の最終段階）、収縮は放出画分が非常に低いため、器官灌流の基礎必要量が全く維持されなくなる点まで減少する。実験的と同様、臨床的証拠は、心臓機能不全の終段階にある患者の、心臓におけるコネキシンの発現および分布が変化することを示している。このように、Cx43は異常な組織において、非常に不整な分布とともに、著しく低調節される。正常な状況では、非常に制限されるCx45の発現は、機能不全の心臓において著しく増加する；しかしCx45の伝導性は、Cx43の性質に劣っており、それゆえにCx43における減少を補完できない。最近の証拠は、いくつかの調節性イオンチャンネルおよび受容体が、細胞間結合の部位に濃縮されることを示し、それゆえにCx43の発現および分布における変化が、興奮-収縮共役およびこのように収縮性に影響しうることは非常に有り得ることである[30]。ギャップ結合機能と収縮性の間の連携に対する強力な証拠は、Cx43欠失胎性幹細胞および野生型胚盤胞から形成されたキメラマウス、このようにCx43のヘテロ同型の欠失を発現する、が厳しい収縮性欠損を発生させるという事実である[31]。
【０１０５】
我々は、ギャップ結合コンダクタンスを増加させる物質が、興奮-収縮共役に関与する仲介物質の細胞間伝達を改良し、それによって収縮性を改善することを示唆する。
【０１０６】
【実施例】
実施例１
心筋細胞におけるGJICに対する化合物2の効果
細胞調製：細胞は、ランゲンドルフ法に従いギニアピッグ心臓からコラゲナーゼで灌流により単離した。つまり、ギニアピッグはヘパリン（1000 IU/kg）の腹腔内注入でヘパリン化された。30分後、ギニアピッグは首を殴打して殺し、首の脊柱を切断した。胸部を開き、大動脈はカニューレした。そして、カニューレを結紮糸により大動脈に固定し、タイロード液で2、3分灌流した。タイロード液の組成は、mMで次のとおり：Na+ 135.33、K+ 4、Cl- 145、PO4- 0.33、Mg2+ 1、Ca2+ 2、Hepes 10、Glucose 10、pH 7.4。全ての灌流液は、100%酸素で泡立たせた。この後心臓は、Ca2+なしのタイロード液で2分間灌流し、続いてmMで次のもの： Na+ 20、K+ 120、Cl- 22、グルタミン酸 120、Mg2+ 1、Ca2+ 25mM、Hepes 10、Glucose 10、pH 7.4、を含む高K+溶液で2分間、灌流した。
【０１０７】
そうして心臓は、0.6mg/mlの濃度でコラゲナーゼを添加した高K+溶液で灌流され、これは心臓の様子から判断して10-15分間行われた。心房は切り離され、心室は細かく切り刻まれ、そのあとで切片はコラゲナーゼ溶液中で100%酸素を穏やかに泡立てることにより、かき混ぜられた。細胞はこし器を通して、遊離した細胞を単離し、コラゲナーゼは遠心分離により除去した。細胞は、Ca2+を含まないタイロード溶液に懸濁し、Ca2+をゆっくり0.65mMに増加調整した。実験容器に移すまで、細胞は室温で溶液中に静置した。
【０１０８】
電気物理学：カバーガラスは、倒立顕微鏡のステージ上のオープンチャンバーにのせ、そこで細胞を37℃、Dulbeccos PBS 1ml/minで組織の上面を液で洗い流した。この溶液は： Na+ 152、K+ 4.2、Cl- 141.5、PO43- 9.5、Ca2+ 0.9、Mg2+ 0.5、pH 7.2、を（mMで）含む。パッチクランプピペットは、Sutter Flaming-Brown P-87 microelectrode pullerを用いて1.5mmガラスキャピラリー（GC150F-15、Harvard Apparatus）から引き伸ばし、4-6MWに火で研きあげた。ピペットは細胞内様の： K+ 145、Na+ 15、Cl- 5、Gluconate- 153、ピルビン酸 5、EGTA 1、HEPES 5、Ca2+ 0.42、Mg2+ 1.6、pH 7.2、をmMで含む溶液で満たした。この溶液に、アンフォテリシンB(240mg/ml)を60mg/ml 保存溶液から加えた。
【０１０９】
パッチクランプ設置は、二つの同調化した不連続増幅器（SEC-05LX、NPI electronics）からなる。そしてデータは、INT-10 インターフェース（NPI electronics）とPC1200 data acquisition board(National Instruments)を使ってデジタル化する。電流と電圧信号の両者は、増幅器内部のフィルターを用いて1kHz以下を捉えるようにフィルターをかけ、10kHzでデジタル化する。
【０１１０】
一つの細胞対は、PatchMan 5173 micromanipulator(Eppendorf)を使って近づける。細胞が接触する（入力抵抗の突然の上昇として認められる）とGiga seal configurationが確立するまで、吸引を行う。この方法は他の細胞について繰り返された。そしてピペットの下の膜が、短い吸引により破れ、細胞内部の電位が、細胞の自然膜電位に近い-70mVに固定された。10秒ごとに細胞のそれぞれが、1秒間10mVまで連続して高分極を起こし、その結果他の細胞における電流変化は、数式を使って細胞内コンダクタンス（Gj）を算出するのに使用されうる。
【数１】
0004327398.tif 000023
【０１１１】
そして、Ip,pulseとIp,restはそれぞれ衝動中、と衝動前の受動性の細胞における電流を表わし、またUpとUaは受動性と活動性の細胞の電圧を表わす。この種の実験は、細胞間の接触とそれゆえに機能的なギャップ結合チャンネルの量に差があるため、Gjの絶対値について比較はできない。しかし、薬剤のような標準化した介在物に対するGj値の変化は、Gjにおける相対的な変化を比較することによって分析することができる。
【０１１２】
結果：9回の成功した実験から得た結果は、図2に要約する。この図は、化合物2(10-8M)による刺激の前と間の時間の関数として相対的なGjを示す。全5回の実験において、細胞を化合物2で処理し、この化合物はGjに有意な増加を生じ、Gjは約400秒の刺激（DGj=+120±46%）後定常状態に達した。全4回の化合物処理したサンプルにおいて、コンダクタンスは通して変化しなかった（DGj=-3±5%）。
【０１１３】
これらの知見は、合成AAP類似体AAP10を用いた文献で報告された実験とよく一致し、この実験は刺激後、心筋細胞間の電気的共役が増加したことを示している[32]。しかし、Muller et al.[32]によるこの研究では、ギャップ結合コンダクタンスは対照の条件中、不安定であった。このように、6回の実験のうち3回において、AAP10の適用はコンダクタンスを増加させなかったが、ギャップ結合コンダクタンスの減少を防いだ。また6回の実験のうち2回は、ギャップ結合コンダクタンスは、対照の時間中に実際に増加した。ここに示した実験では、化合物2は安定な対照の条件においたサンプルにおいてギャップ結合コンダクタンスを増加した。
【０１１４】
実施例２
マウス心臓より調製した組織への化合物2の結合
調製
心臓はマウス（Balb/cJ, 20 g）から切り出し、氷冷（0℃）0.32Mシュクロースで二回すすぎ、氷上、10倍の体積のシュクロース中、Ultra Turrax homogeniser（1000rpm）で2分間均質化した。均質液は10分間、4℃、1000gmeanで遠心し、上清をとり、4枚重ねたガーゼで濾した。濾過物は、それから45分間、4℃、50,000gmeanで遠心し、沈降物は10倍体積（org.湿重量）の氷冷蒸留水に懸濁し、60分間、0℃でインキュベート後、再び45分間、4℃、50,000gmeanで遠心した。生じた沈降物は、2倍体積（org.湿重量）のPBS(Phospate Buffered Saline)に懸濁し、使用するまで-80℃で保存した。
【０１１５】
化合物2での置換実験
40-250mgの濾過物または膜調製物を0.8nM[125I]AAP10と濃度を増加した試験化合物AAPと化合物2を含む、全量100mlのD-PBS(1g/l MgCl2・6H2O & CaCl2を含むDulbecco’s Phosphate Buffered Saline)中でインキュベートする。非特異的な結合は、10mM AAP10(CE2)で決定する。
【０１１６】
計算
置換実験より得られたデータに以下の方程式を適用した。
f = (Total - ns)/(1+ s/IC50) + ns
ここでTotalは標識したリガンドの濃度sでの全結合放射活性であり、nsは非特異的な結合、そしてIC50は特異的な結合の最大値の50%まで特異的な結合(Total - ns)を減少させる、試験化合物の濃度である。
【０１１７】
結果
【表２】
0004327398.tif 000024
マウス心臓から調製した組織での0.8nM[125I]AAP10の置換(n.t.: 試験せず)
【０１１８】
上の表2に示した値は、ラビット心臓から調製した膜を使用したDhein et al.[33]によってAAP10で示された値（0.2 nM）と同程度である。
【０１１９】
完全な細胞におけるin situ結合の方法
CHO細胞培養
CHO細胞は、24穴ディッシュに7,900 cells/cm2(〜 15,000 cells/well)の密度でまき、10% Foetal Calf Serum (FCS)と1000 units penicillin/1000 mg streptomycin (pen/strep)を添加したF-12K Nutrient Mixture 1ml/wellで、37℃、5% CO2と100%湿度の大気中、3日間、In Vitro (DIV)で生育させる。細胞密度は、この間に295,000 cells/cm2 (152 pgprot/cell〜85mgprot/well)まで増加する。
【０１２０】
前処理
分析する日に、細胞をインキュベーターから出し、各ウェルを実験によって2mlのあらかじめ暖めた（37℃）または氷冷（0℃）のD-PBSで、血漿を除くために2回洗う。洗浄中に細胞が乾燥するのを避けるため、生理的溶液のない状態に細胞をおく時間を最小にすることが重要である。氷冷溶液で洗浄した細胞は、結合アッセイに直接使用し、暖めた溶液で洗浄した細胞は、グルコースと酸素を欠乏させる実験で使用する。
【０１２１】
グルコースと酸素の欠乏
細胞は、窒素で37℃、少なくとも10分間、前もって平衡化した、グルコース無添加D-PBS (pH 7.2)で、窒素大気中、10分間、インキュベートする。対照の細胞は単に、グルコース（6mM）を添加したD-PBSで、通常の大気条件、37℃、10分間、同様にインキュベートする。
【０１２２】
結合検定
in situの結合は、Koenigによる方法[34]に基づいた変法によって行う。D-PBSは細胞培養から除去し、標識していないリガンドを添加または無添加の0.5ml[125I]AAP10溶液あるいは試験化合物を加える。細胞は、平衡に達するように4℃で一晩インキュベートする。各ウェルは、時間にひとつ 1ml D-PBSで2回素早くリンスし、乾燥させる。
0.25mlの0.5% Triton-X-100(v/v)を各ウェルに加え、細胞を可溶化するために少なくとも1時間おく。抽出液は、計測用バイアルに移し、ウェルは0.25mlの水でリンスし、リンスによる抽出液は対応するバイアルに加えた。バイアルは、γ-カウンターで計測した。
【０１２３】
In situの結合、IC50 (nM)。
【表３】
0004327398.tif 000025
【０１２４】
これらの結果は、いくつかの異なる本発明の物質によるCHO細胞への高親和性の結合が、以前の方法によるペプチドと同等であることを示している。
【０１２５】
実施例３
CHO細胞における化合物2のcAMP形成への効果
CHO細胞培養
CHO細胞は、96穴マイクロタイタープレートに6,000 cells/cm2 (〜2,000 cells/well)の密度でまき、前項で述べたように200ml/wellの生育培地中、4日間、in vitroで生育させる。
【０１２６】
前処理
分析の日に、細胞を培養器から出し、200mlのあらかじめ暖めた（37℃）D-PBSで2回洗い、血清を除く。細胞は、前項で述べたように窒素大気中、グルコースを含まないD-PBSで10分間インキュベートする。
【０１２７】
cAMP効能検定
CHO細胞は、6mMグルコース、2.0mM IBMX（フォスフォジエステラーゼ阻害剤）、10mMフォルスコリン（cAMP形成を刺激する）および増加した濃度の試験化合物を含むD-PBS (pH 7.2)中、37℃でインキュベートする。反応は、20分後に20mlの0.5M塩酸の添加によって停止し、少なくとも20分間室温におく。
cAMP量は、180mlの[125I]cAMP tracer溶液を含むFlashPlateTM (NEN assay kit SMP001)に20mlの酸性細胞抽出液を混和することによって分析する。 FlashPlateTMは、4℃で一晩インキュベートし、プレートに結合した放射活性は、TopCount (Packard Instrument)で計測した。データは、前項に述べたように計算する。
【０１２８】
結果
CHO細胞におけるAPP様化合物の、フォルスコリン刺激によるcAMP形成の阻害は、AAP受容体がcAMP 2次メッセンジャー系に負に共役することを示している。さらに、それはCHO細胞において機能的なAAP受容体の存在を示している。
【０１２９】
CHO細胞におけるフォルスコリン刺激によるcAMP形成の阻害
【表４】
0004327398.tif 000026
【０１３０】
実施例４
ラット一次心筋細胞におけるホスホイノシトール分析
一次心筋細胞培養
新生ウィンスターラット（1-2日齢）を使用する。10mM HEPESで緩衝した、Hank’sカルシウムおよびマグネシウム無添加平均化塩溶液は、細胞分離手続き中の洗浄に使用される。心臓は切除され、心室は単離され、組織は小片に刻まれる。心筋細胞は、[35]によって述べられているように、コラゲナーゼ0.05%で段階的な酵素的分解により単離される。遠心と洗浄を繰り返した後、沈降された細胞はEarle’s salt、10% NCS、ペニシリン（75 U/mL）、ストレプトマイシン（75 U/mL）を添加したM199培地に再び懸濁される。非付着細胞は培地中集められ、2.5×105 cells/wellでマルチディッシュにまかれる。培養は、水飽和CO2保温器内37℃で維持される。心筋細胞培養は、6-7日後分析に使用される。
【０１３１】
ホスホイノシトール代謝回転の分析
心筋細胞培養は、イノシトールリン脂質を標識するために、4 mCi/mL myo-[2-3H]イノシトールを含む培地中、48時間インキュベートされる。分析の日に、培地は、Meier et al.[36]によって述べられているように、リチウムを含む緩衝溶液に置換され、37℃でインキュベートされる。少なくとも5分後に、この緩衝液は、試験化合物を含む同体積の緩衝液に置換され、正確に20分間インキュベートされる。反応は、氷冷4% (v/v)過塩素酸（PCA）による緩衝液の急速置換および0℃で少なくとも20分間のインキュベーションによって停止される。PCA抽出液は中和され、100mg SAX第4アミンを含むAmprepTMカラムを使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによって、[3H]イノシトールリン酸は分離される。[3H]イノシトール-リン酸は溶出され、分画中の放射活性は液体シンチレーション測定によって計測される。
【０１３２】
グルコースおよび酸素欠乏
培養に試験物質を加える前に、細胞は窒素大気中、グルコース無添加のリチウム緩衝液に37℃、10分間インキュベートすることにより、グルコースと酸素を欠乏させる。対照の細胞は、通常の大気条件下およびグルコースを含む緩衝液中でのみ、同様にインキュベートされる。
【０１３３】
ノルアドレナリン（NA）は、心筋細胞培養において濃度依存の様式でリン酸イノシトール代謝を刺激する。しかし、ノルアドレナリン（300 nM NA）のリン酸イノシトール代謝を刺激する活性は、図3に示すように10分間のグルコースと酸素欠乏の後の培養において著しく減少する。通常の大気および栄養条件下、Emax値3852 ± 266 cpmおよびEC50値203 nM (SDR = 1.2)が得られた一方で、窒素大気およびグルコース欠乏条件下の細胞では、Emax値2248 ± 702 cpmおよびEC50値303 nM (SDR = 1.7)が示された。
【０１３４】
細胞ストレスが虚血およびグルコース欠乏によって誘導された間、リン酸イノシトール回転速度において、減少したノルアドレナリン誘導性の増加における本発明の物質の効果を調査するために、化合物2またはAAP10 (CE 2)が心筋細胞培養に加えられた。両物質ともにリン酸イノシトール回転速度を非常に高める効能を有していたが、化合物2は最も効能を有していた。下の表5に示したようにAAP10 (CE 2)のEC50値は、化合物2のEC50値に比べ、正常酸素圧中では200倍高く、低酸素圧およびグルコース欠乏によって誘導された代謝ストレス中では10倍高かった。
【０１３５】
表5  低酸素圧およびグルコース欠乏によって誘導された代謝ストレス中の、化合物2およびAAP10によつリン酸イノシトール回転速度の上昇。
【表５】
0004327398.tif 000027
【０１３６】
化合物2の添加は、対照条件の間中、新生ラット心筋細胞においてリン酸イノシトール代謝速度におけるノルアドレナリン誘導の増加に対して、さらなる効果は有していなかったが、低酸素圧およびグルコース欠乏（代謝ストレス）、化合物2（100 nM）＋ノルアドレナリン（300 nM）の添加は、図4に示したように、減じたリン酸イノシトール回転速度を標準に戻し、増加分はノルアドレナリン単独の効果による増加よりも70%高かった。
【０１３７】
実施例５
マウスにおけるカルシウム誘導の不整脈
本発明の化合物の抗不整脈効果は、Lynch et al. [37]に従いカルシウム誘導の不整脈のin vivoモデルにおいて試験された。マウス（25-30 g）は、neurolept anaesthetic combination (Hypnorm（登録商標） (フェンタニルクエン酸 0.315mg/mlおよびフアノシン 10mg/ml) + ミダゾラン (5mg/ml)) で麻酔された。ハイポノームおよびミダゾランの商品溶液は、蒸留水で1:1に希釈し、希釈したHypnorm（登録商標） の一部は、希釈したミダゾランの一部と混合される。
【０１３８】
麻酔は、0.05- 0.075 ml/10 gマウスの投与量で皮下投与によって誘導された。静脈カニューラが尾静脈に挿入された。誘導II ECGシグナルが、右前肢および左後肢においてステンレスECG電極の位置によって、連続的に記録された。アース電極は右後肢に置かれた。シグナルは、Hugo Sachs Electronic model 689 ECG moduleによって増幅され（×5,000-10,000）およびフィルター（0.1-150 Hz）をかけられた。類似のシグナルは、12 bit data acquisition board (Data Translation model DT321)によってデジタル化され、Windows（登録商標） NT用のNotocord HEM 3.1 softwareを使用して1000Hzで標本抽出された。10分間の平衡期間後、薬剤の試験サンプルは尾静脈に注入された。薬剤なしの溶液で前処理したマウスは、非処理動物における対照レベルの計測として試験された。注入体積は、全ての実験において100 mlだった。CaCl2 (30 mg/ml, 0.1 ml/min ≒ 100 mg/kg/min (calciumchlorid-2-hydrat, Riedel-de Haen, Germany))の注入は、薬剤または溶液のみの皮下投与後3分で開始された。二次段階 AV阻害の開始までのタイムラグは、CaCl2注入から最初の不整脈症状が現われるまでの時間として決定された。二次段階AV阻害は、付随するQRS complexなしのP波によって特徴づけられるAV伝導の断続的不能として定義された。
【０１３９】
反応は、溶液のみで処理したマウスにおいて起こった二次段階AV阻害までの時間に比較して表わした。各試験物質の最大効果は、下の表6に要約される。
【０１４０】
表6、本発明の化合物のin vivo抗不整脈活性。+++は、不整脈までの時間において60%以上の延長を示す；++は、不整脈までの時間において30-50%の延長を示す；+は、不整脈までの時間において15-29%の延長をしめす；(+)は、不整脈までの時間において15%以下の延長を示し、ndは”not determined”を示す。
【０１４１】
【表６】
0004327398.tif 000028
0004327398.tif 000029
0004327398.tif 000030
【０１４２】
表6に示した結果にみられるように、本発明の広範な種類の新規化合物が、化合物AAP、AAP10、および前技術によるHP5と同等の抗不整脈活性を示している。
【０１４３】
実施例６
単離した灌流ラビット心臓に対する化合物2の効果
ランゲンドルフ技術の原理
ランゲンドルフ技術は、単離した心臓に十分な代謝の必要物を維持する方法を与え、それによって数時間にわたる心臓全体を用いたin vitro実験を可能にする。ランゲンドルフ準備において、心臓は大動脈に挿入したカニューレによって逆に灌流された。灌流溶液が大動脈にはいると、その結果大動脈に生じた圧力が大動脈弁を閉じ、それによって心臓内への流入を防ぐ。代わりに、灌流溶液は心臓に供給する冠状循環に入る。ランゲンドルフ技術においては、動脈における全体の流量は、このように冠状の流量に等しい。ランゲンドルフ実験は、ドイツ、Hugo Sachs Elektronik社製ISOLATED HEART SIZE 5, Type 833 apparatusを使用して行われる。この機器の中心コンポーネントは、aortic blockであり、心臓はそれにカニューレによってくっつけられる。aortic blockは回転つまみで操作する人工flow resistorに直接接続され、それによってafterloadおよび灌流圧力の調整を可能にする。灌流液は、thermostated reservoirからaortic blockへ回転ポンプに接続された管によって運ばれる。ポンプによって運ばれる体積は、様々な必要に応じて調節することが可能である。過剰な溶液は、aortic blockからreservoirへ戻る。Aortic blockの下は、心臓をおおうように高くすることが可能な温度制御された心臓チャンバーである。この準備は、冠状流量、左心室圧（LVP）、灌流圧、12-誘導ECG、8単相活動電位（MAP’s）の連続的な記録を可能にする。これらの多種記録の出力は、NOTOCORD HEM 3.3ソフトウェアを使用して分析される。このソフトウェアは、広範な心電図のおよび血液力学の変数の計算を可能にする。
【０１４４】
灌流方法および灌流溶液
実験は、定圧灌流様式にて行う。供給ポンプは、70ml/minを与えるように調整し、afterloadは50mmHgに調整して灌流圧力が約60mmHgになるようにする。心臓は他に明示しない限り、あらかじめ暖めた（38℃）、次の組成（nmol/l）：NaCl: 118, Kcl: 4.7, CaCl2,H2O: 2.52, KH2PO4: 1.18, Mg2SO4,7H2O: 1.64, ピルビン酸ナトリウム: 2.0, NaHCO3: 24.88, グルコース: 5.55をもつ変更Krebs-Henseleit溶液で灌流する。溶液を使用前に45mmボトルトップフィルターによってフィルター濾過する。
溶液の約7.4のpHおよび適切な酸素量は、カルボジェン(95% O2/5% CO2)での連続的な泡立てによって得られる。2リットルあるいはそれ以上の体積は、少なくとも20分間、カルボジェンで平衡化するようにし、一方1リットル以下の体積は10分間、平衡化することにする。
【０１４５】
麻酔, 手術、および実験方法
Hvidesten, Allerod, Denmarkから購入したオス Ssc:CPHラビット（2.5-4.0kg）が使用される。それらは、1.2 ml Hypnorm（登録商標） (フェンタニルクエン酸 0.315mg/mlおよびフルアニソン 10mg/ml）の筋肉への投与で沈静させる。10分後麻酔は、0.55 ml Dormicum (ミダゾラン 5 mg/ml)を静脈へゆっくり投与することで誘導する。さらに500IUのヘパリンを静脈に投与し、凝結を防ぐ。
ラビットは前足を脇腹に固定して仰向けにされ、切開は気管をさらすように行う。気管切開術が行われ、ラビットはUgo Basile rodent ventilator (tidal volume: 18ml, frequency: 60 pr. min)を使用して、通気される。腹腔は剣状突起にちょうど尾部まで開かれ、腹部筋肉は両側で横方向に切断される。胸腔へ近づくように、横隔膜は、肋骨下に開かれ、切開は肋骨湾曲に沿って左右両側に延長する。縦隔洞は可能な限り胸骨に接近するように切開され、肋骨は胸骨に平行な線で両側に切開され、胸壁を頭蓋の方向に持ち上げられるようにする。持ち上げた胸壁は、ラビットの頭の上で固定され、胸腔の完全な概観が見られるようにする。心膜嚢は切開され、静脈が露出させられる。結んでいない結紮糸は、静脈の周りにおかれる。尾部の大静脈は、心臓への逆流が減少するように肝臓に締められ、頭蓋の大静脈および肺動脈は、心臓の体積過負荷を減少させるために開放される。静脈は開放され、灌流液で満たされている延長チューブによってaortic blockに接続されたカニューレは、即座に静脈に挿入され、人工的灌流を行う。結索糸はきつく締められ、心臓は切除され、灌流機器に移される。尾部の大静脈の締め付けからカニューレの挿入までの時間は、約30秒である。
【０１４６】
心臓を機器に移したときに、切開は左心耳で行い、左心室圧の計測のために左心室における溶液で満たしたバルーン (size 12)の挿入を可能にする。バルーンの体積を約10mmHgの終拡張期血圧を与えるように調節する。12-誘導ECGの計測のための電極リングを、5thおよび6th胸部誘導の間の左心室の先端で、心臓の周りに環状溝のレベルにおく。MAP5およびMAP6は、右心室上におかれ、一方他のMAP電極は、左心室全体に均一に分布させる。この方法は、Zabel et al.[38]によって使用されたものと同一である。全ての電極を正しい場所においたときに、心臓を常に38℃のKrebs-Henseleit溶液に浸すことを確保するように、心臓チャンバーは上げられた。
実験開始前に、結索糸は左心室の大部分に供給する回旋動脈の主要な枝の周りにおかれる。結索糸の両端は、小プラスチックチューブを通され、心臓に対してプラスチックチューブを押すこと、および結索糸の端を締め付けることによって虚血の誘導を可能にする。実験開始前に、全ての心臓は15分間平衡化することにする。
【０１４７】
実験の時間予定は次のとおり：
1. 通常のKrebs-Henseleit緩衝液で15分間の灌流（平衡期間）
2. 化合物を添加したKrebs-Henseleit緩衝液で15分間の灌流（正常カリウム血対照期間；t=0-15 min）
3. 化合物を添加した、K+濃度（2.5 mM）を減少させたKrebs-Henseleit緩衝液で15分間の灌流 ( 低カリウム血症対照期間；t=15-30 min)
4. 部分的な虚血の誘導、続けて化合物を添加した、K+濃度（2.5 mM）を減少させたKrebs-Henseleit緩衝液で30分間の灌流( 低カリウム血症虚血期間；t=15-30 min)
【０１４８】
実験の終わりに、心臓はEvans Blue 染料で灌流し、梗塞の危険にある領域を評価する。心房と右心室は切除され、残りの左心室はEvans Blueによって染色された領域および染色されない領域、すなわち危険な状態にある領域、に分離される。この二つの領域はペーパータオルを使って、吸い取り乾燥され、梗塞の危険にある領域の割合を決定するために重量を計測される。
【０１４９】
記録
次の変数は連続的に記録された：冠状流量, 左心室圧、灌流圧、12-誘導ECG, 8 MAP記録。ECGおよびMAP’sは2000Hzで、そして圧力およびフロー変数は500Hzで標本抽出される。平均活動電位持続は、最大脱分極（dV/dt最大の時間）の時間から再分極の90%の時間までの平均持続として、8 MAP記録から算出される。この持続をAPD90と呼び、APD90分散はAPD90の8計測の標準偏差として算出される。
【０１５０】
結果
図5に示したように、3群が研究された。ラビット心臓はKrebs-Henseleit緩衝液のみ（溶媒；n=11実験）、10-10 mol/l 化合物2、（n=10実験）、あるいは10-10 mol/l AAP10 (CE2; n=3実験）で灌流された。溶媒処理したラビット心臓において、低カリウム血症、急性心筋虚血症の間に観察されたAPD90分散における増加は、10-10 mol/l 化合物2によって防止されたが、10-10 mol/l AAP10 (CE2）では防止されなかった。これらの知見は、化合物2が虚血中の電気分散における増加を防止されることを示し、化合物2の抗不整脈薬的な性質はこの機構に関連していることを示唆する。AAP10 (CE2)が、ラビットにおいて、最大効果10-8 mol/l の濃度で心外膜の活性化-回復間隔の分散を減少、および部分的な虚血によって誘導された心外膜活性化のパターンの変化を減少することができると以前から報告されていた[39]。我々の実験では、化合物2は、10-10 mol/lの濃度で、虚血中に誘導された電気的分散における増加を効果的に防止した一方で、AAP10 (CE2)はこの濃度では効果を有していなかった。これらの相違は、心筋の 梗塞のサイズにおける相違のせいではなかった、なぜなら虚血中の冠状流における減少および危険にある領域は、全ての群において同様であった。これらの結果は、化合物2はAAP10 (CE2)より効能があることを示している。
【０１５１】
実施例７
イヌにおける心室再入不整脈に対する化合物2の効果
不整脈におけるギャップ結合の影響は、心室の伝導性におけるコネキシン43 (Cx43)の影響についての研究において明らかにされた[33]。Cx43に欠損を生じたヘテロ接合体ノックアウトマウスにおいて、冠動脈閉塞 (CAO)で同時のVTの頻度は二倍である[3]。虚血は、イヌにおいて6時間後、Cx43の効果を低下させ、おそらく脱リン酸化についで、端と端をつないだCx43において60%の減少、横と横をつないだCx43において49%の減少を示す[40]。イヌにおける亜急性虚血において、心外膜再入はCx43が減少する領域で容易になる[25]。このように再入機構は、Cx43の低下を仲介する虚血および、多分VTおよびVFに前もって仕向ける回復および伝導の不均質をつくるギャップ結合の抵抗性、に決定的に依存しているのかもしれない。
【０１５２】
下に述べた研究において、我々は前下行枝動脈のCAOによって引き出された心筋虚血中再入不整脈に対する化合物2の効果を調査した。
【０１５３】
動物調製
3匹のイヌが麻酔され、マッピングのための電極設置を容易にするために開胸した状態で研究された。a-クロラロースを丸薬（200 mg/kg）および8mg/kg/hr (ポリエチレングリコールに溶解して、MW=200)で一定注入として与えた。大腿部の静脈と動脈は、溶液および薬剤の投与および上昇する大動脈圧の計測それぞれのために、カニューレされた。
【０１５４】
電気生理学的方法
洞房結節は締められ、心房の付属器官は二倍の拡張期閾値で定電流出力をもつ、プログラム可能なstimulatorでペースをとられた。ペース速度は、対照の心臓速度に対して200 b/min以上だった。正常領域における多極針の心室拍動の一つの極は、腹筋において陰極（7 cm2ステンレス鋼）を使用された。
心内膜 Effective Refractory Period (ERP)は、標準的な外刺激テクニックによって計測された。後期心室拡張期閾値は、それぞれの干渉中に計測された；拍動 電流は4倍の閾値だった。
【０１５５】
電気図の記録
試験部位は、16極針（J. Kassell, Fayetteville, NC）の柄に沿って選ばれた；各極は、隣接するプルキンエstrandsの記録から針方向の方向性を妨げるように針柄を完全に取り囲む。6双極電気図（1mm間隔）は、心室拍動中、針の柄を下ろして1000倍までの増幅、3-1300 Hzからフィルターがけ、およびオシロスコープによる記録によって連続的に記録された。4つの壁内電気図がそれぞれの多極針について記録される。外心膜電気図は、それぞれの針について最後に活性化される。23多極電極の並びは、Xing and Martins[41]によって述べられたように、17が前下行枝冠状静脈の梗塞危険領域に、6が周りの正常領域に使用された。心外膜で計測された針間の距離は、12-16kgのイヌにおいて6-10 mmにわたって変化する。
【０１５６】
不整脈誘導
内心膜は、基底、上皮隔膜および聞けん領域のちょうど外側の側部の遊離壁でERPが決定された後、S1-S2間隔が4 msec>ERPまで延長され、S3は50 msec>S1-S2に等しいS2-S3間隔で、d最初にプロトコルに加えられた。間隔は、捕捉できなくなるまで短縮された。心室頻拍が任意の拍動部位で誘導されなかった場合、3回目（S4）および4回目（S5）が加えられた。我々は、針重量による人為的な心室頻拍あるいは血流を傷つける針のための虚血を除外するために、CAOの前に、完全な心室頻拍誘導プロトコルを実施した。生理学のblood gasesおよび適切な麻酔後、前下行枝CAOが結合された。60分後、梗塞の大きさは、危険領域の約75%であり、梗塞領域のさらなる拡大は、無視できる。そして心室頻拍は、介入前に少なくとも2回誘導された。繰り返し試験は20分ごとに行われ、CAO後、3時間まで継続された。正常な心筋ERPは各介入で記録された。
【０１５７】
不整脈マッピング
心外膜マッピングは、BARD Electrophysiology Inc.製のコンピューターを基にしたシステムを使用して行われた。ソフトウェアは、データの64チャンネルを12-bit解像度、1 kHz/チャンネルのサンプリング頻度で取り込む。フィルターリングは、30-300Hzから行った。Eight-second windows（登録商標）が外部からの引き金をひかれ、シグナルの引き金の前の8秒間までのデータを含んでいる。このシステムは、各記録電極について外部の、心外膜 2-3 双極から記録するために使用される。
最適化したコンピューターソフトウェアシステムが、各心内膜多極電極における内部3双極からのプルキンエシグナルを、チャンネルあたり3kHzでサンプリングすることによって解析するのに使用された。フィルターは、プルキンエ頻度(3-1300 Hz)を取り込む。サンプリングレートは、235kHzであった。PCは、analog signal multiplexorおよび64 instrument amplifier circuitsから構成される増幅器とインターフェースで接続された。それぞれ、選択できるgain (1000まで）およびバンド幅cutoffを有している。電気生理学的データの獲得、加工、可視化は、ソフトウェアにより行われた。高速獲得により、シグナルが生じる前の8秒間までを含んでいる14秒間のデータの取り込みが可能になった。
【０１５８】
マッピング分析
マッピング分析は、オフラインで行われた。コンピュータは、一次最大dv/dtを用いて活性化時間を選択する。電気図は、刺激で再現されない場合にのみ、説明できないおよびマップから除外するとみなされる；実質的なボルトおよびdt/dv欠失が、不応期より短い間隔の共役と複合して生じる場合に、電気的あるいはfar field電位が存在すると考えられる。同時値は手で描かれる。心室頻拍機構は、次の様に定義される：再入心室頻拍は、電極が初期の活性を記録する時に発生し、単一方向性阻害後の発生は、以前の複合体から最後の活性化の部位に隣接して即座に示され、拡張期活性は複合体間に記録される。心外膜再入は急性虚血において常に記録され、壁の逆向きの活性化（心外膜から心内膜へ）が観察される。
【０１５９】
実験プロトコル
心臓の器具使用後および一時間のCAOが行われた後、心室頻拍を誘導するための拍動プロトコルが、再現性のある誘導性（同様の表面形態を示す心室頻拍の二度の誘導）か、あるいは誘導性の失敗（一時間以上、心室頻拍なしで3箇所すべて二度拍動する）かを確認するために行われた。再誘導性の心室頻拍を示す3匹のイヌにおいて、再入機構は同定された。これらの3匹のイヌにおいて、化合物2は静脈に丸薬注入として投与された後、2匹のイヌにおいて3種類の投与量で30分間の一定点滴を続け、一方3番目のイヌはサリンで処理された。外部刺激試験は、心室頻拍が生じているか否かを決定するために、全ての部位において、全体のプロトコルを通じて繰り返された。化合物2は、それぞれ10-10 M (丸薬：0.1 mg/kg; 点滴: 2 ng/kg/min）、10-9 M (丸薬: 1.1 mg/kg; 点滴: 21 ng/kg/min)、10-8 M (丸薬: 11 mg/kg; 点滴: 210 ng/kg/min)の血漿濃度を生じるように、3種類の投与量で静脈に投与された。
【０１６０】
結果
図6-9が得られた最初の動物は、持続性の単形性VTの誘導が、２時間10分および2時間20分に側部の心室の拍動部位からのみ、二度連続的に起こり、CAOが続いて起こった後に研究された。図6では、隔膜刺激後、活性化マップは現われるが、VTを引き出すことはできなかった。これは、刺激後6msecで活性化されるPURK 拍動部位の早期の活性化および107msecで活性化される心外膜部位の後期の活性化からなる、正常な順行活性化パターンを示している。心外膜における最後の活性化のすぐ東および南の86 msecでの隣接活性化は図7におけるE-Sであることに特に言及する。VTの一次複合体の心外膜活性化は、表面QRSの開始に先んじて-44 msecで開始し、図7におけるE-Cで記録された電気図に対応している。
【０１６１】
図7では、再入回路を引き起こす、側部の心外膜心室拍動部位での刺激によって誘導された、持続性の単形性心室頻拍が示されている。活性化は、北西ループにおいて最初-17 msecそして続けて57 msecで活性化する二重ループ再入において進行する。南東ループでは、最初 2 msec、31 msec、そして57 msecに活性化が進行する。VTを誘導するプロトコルは、S1-S2=150, S1-S3=280, S1-S4=390, S1-S5=490 msecであった。図は、VT の4 複合体を保証する、第2次から5次早期外刺激(E-Lによく示された）にかけて、表面誘導ECG IIで記録された心外膜 (E-)電気図およびV5Rを示している。電気図は、側部、境界領域（L）拍動部位、東（E)、北（N）、中心（C）、心外膜下(SE)、E-Cの下では、同様にE-Cの南（S）、および北西（NW）、南西（SW）から記録された。E-Cは、2番目のコンポーネント（垂直線）の阻害を示す、最後の早期と徐々に分離した電気図を示している。ESにおける隣接伝導の遅延は、 ECとESの間に続く再入興奮をもって（直線および矢印つき直線）、伝導が中心部位の周りおよび後ろに進行することを可能にする。
【０１６２】
図8は、表面QRSの開始に先んじて-44 msecで開始し、図7におけるE-Cで記録された電気図に対応する心室頻拍の一次複合体の心外膜活性化中の活性化マップを示す。活性化は、最初-17 msecで活性化し、そして北西ループにおいて57 msecに進行する二重ループ再入において先行する。南東ループは、最初2 msec、31msec、そして57 msecに活性化される。この活性化マップもまた、再入不整脈中の心室壁の逆行活性化を示している。
【０１６３】
化合物2は、3通りの増加IV投与量で投与され、平均心房圧（MAP = 80mmHg）は変化しなかった。対照における効果的な不応期は150 msecであり、最も低い投与量では154 msecであり、最も高い投与量および最後の投与量では148 msecであった。誘導性のVTは、図7および8に示した、典型的な心外膜 再入であった。化合物2の最初の投与（丸薬：0.1mg/kg; 点滴：2 ng/kg/min）後、化合物2の投与前のVTを誘導した誘導プロトコルが、再現性をもって実行されたという事実にもかかわらず、VTはもはや誘導性を示さなかった；薬剤投与前のVTを誘導したプロトコルはS1-S2=150, S1-S3=280, S1-S4=390, S1-S5=490 msecであり、化合物2の点滴中、間隔はそれぞれ150, 270, 370, 470 msecであった。VTは、化合物2の最も低い投与量の点滴が開始した後、1時間30分まで決して誘導されなかった。化合物2の最も低い投与量の静脈投与後の心電図を図9に示す。これらの結果は、化合物2はこのイヌにおいて再入 VTを効果的に防止することを示している。
【０１６４】
二匹目のイヌは、誘導性のVT、二つの境界領域、つまり側部および隔膜に位置する拍動部位、からのこの時間で研究された。再び化合物2は、MAPに変化を生じなかった、90mmHgで開始し、90mmHgで終了した。誘導の二つの部位における効果的な不応期は、CAO後85分で開始し、さらに2時間継続した、化合物2の試験期間をつうじて、それぞれ163および144 msecのままであった。化合物2の最も低い投与後、側壁から誘導されたVTは、決して誘導されなかった；このVTの機構は、心外膜 再入であり、図7-9に示したものに非常に類似していた。隔壁部位から誘導されたVTもまた、化合物2の投与前の心外膜再入であったが、続く化合物2の静脈投与により、心外膜再入は完全に防止された。このように、これらの2つの実験において心外膜再入VTは、化合物2の最も低い投与前に誘導性であり、続く物質の投与では、再入は投与量に関わらず、再び誘導されることはなかった。最後にもう1匹のイヌが、上述の2実験で使用した時間枠で、化合物2の導入なし、生理食塩水のみの導入で、電気生理学的試験を受けた。心外膜再入は、CAO後1時間で誘導され、同様のVT形態および再入機構がCAOの11/2 - 21/2時間で誘導された。このように、この時間制御した実験において再入VTの再現性は、再入不整脈をもつ状態で効果的な抗不整脈化合物である化合物2と一致する。
【０１６５】
これらの実験は、化合物2が致死的な再入不整脈の予防および／または治療に効果的であることを示している。このように、本発明の目的は、上室あるいは心室原点の心臓再入不整脈の予防および／または治療に有効な薬剤を調製するための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XVと式2-12この中に、より特別には、合成例1-47この中に含まれる化合物のような、本ペプチド化合物で成し遂げられる。
【０１６６】
実施例８
骨細胞に対するギャップ結合開放剤の効果
背景
骨芽細胞は、骨形成細胞であり、骨細胞sとよく接続されている。電子顕微鏡で調査すると、骨芽細胞-骨芽細胞, 骨芽細胞-骨細胞, 骨細胞-骨細胞接続が骨切片でみられる[42]。骨に関連するコネキシンの最も興味深いものは、心臓においてと同様にCx43である。骨細胞では、これらのタンパク質の発現はいくつかの骨芽細胞特異的なタンパク質の発現に関連している。カルシオトロピックホルモンもまたギャップ結合タンパク質の発現を調節しうる。
【０１６７】
ヒト骨芽細胞 (HOB)および間質細胞由来の骨髄 (BMSC) は、ともにCx43およびCx45を発現することが示されている。Lucifer Yellow (LY) dye transfer techniqueで示されているように[43]、それらは機能的に共役している。ラット骨芽細胞細胞系統は、ヒト一次培養とは異なっている；ROS 17/2.8細胞は、Cx43のみを発現し、よく共役しているのに対し、UMR 106-01は主にCx45を発現するが、染色剤とあまり共役していない[44]。ラット骨芽細胞の 細胞系統はともに電気的に共役している。UMR細胞へのCx43のトランスフェクションは、染色剤と高度に共役した細胞を生じた。このように、Cx43はLYおよび他の大きな分子の移動を可能にする一方で、Cx45はこの通過を可能にしない。対照的に、Cx43を発現する細胞へのCx45の導入は、染色剤共役を減少させる。骨芽細胞分化において、Cx43の発現は変化する；このように骨芽細胞はより成熟し、Cx43の発現は高くなる[45]。
【０１６８】
骨細胞における様々な刺激の効果およびギャップ結合伝達における変化への関連が、研究された。骨への適度の機械的なストレスが、骨密度を増加させることがよくしられている。この状況を模倣するために、ROS 17/2.8細胞が周期的なストレスにさらされ、その結果細胞の染色剤共役において増加を示した。周期的なストレスをあまり共役しないUMR 106-01細胞へ適用した結果、染色剤共役に同様に増加を示したが、ROS細胞に比較すると劇的に少なかった。Cx43のmRNAには増加が認められず、しかしリン酸化された型のCx43がより認められ、骨芽細胞に対する周期的なストレスが、ギャップ結合タンパク質Cx43の細胞内局在を調整することによって、細胞間のギャップ結合伝達を増加させることを示している。同じグループが、あまり共役していないUMR 106-01細胞へのCx43のトランスフェクションが、染色剤共役[46]だけでなく、成熟骨芽細胞の産物、オステオカルシンおよびbone sialoprotein (BSP)の発現をも増加させることを示した。細胞にCx45をトランスフェクションすることによって、骨芽細胞 (ROS)間の共役を減少させることは、オステオカルシンおよびBSP、骨マトリックス形成および石灰化に重要な遺伝子、の発現を減少させる。最近の研究は、Cx43ノックアウトマウスは野生型マウスに比べ、骨形成および発生に欠損をもっていることが示された[47]。このように、細胞内ネットワークの伝達が、正常な骨形成および回転速度と同様に、分化した骨芽細胞の表現型の完全な仕上げに必要である。欠損をもつギャップ結合伝達は、それゆえに骨の損失を増加させるのかもしれない。
【０１６９】
ギャップ結合は、骨細胞において細胞内カルシウムシグナルの伝播に、部分的に役割を果たしていることも示されている。in vitro単層の細胞において、あるヒト骨芽細胞の機械的な刺激は、多くの周りを囲む細胞に伝播するカルシウムパルスを増加させる。このシグナルの伝播は、ギャップ結合を通じて伝達分子の通過をともない、続いて隣り合う細胞の活性化を行う[48;49]。これらのシグナルは、おそらく機械的な刺激に応じて、in vivo、骨における細胞ネットワークを通して伝達され、骨に対する機械的な負荷に応じて増加する、骨形成を担っているのかもしれない。
【０１７０】
ギャップ結合伝達およびカルシオトロピックホルモンの効果は、関連している。ヒト肌線維芽細胞の1,25 (OH)2 vit.D3刺激は、Cx43タンパク質およびmRNAの増加と同様に、ギャップ結合を通じて伝達を高めることが示されているが[50]、機能的なビタミンD受容体 (VDR)の存在する場合においてのみである。Cx43発現の欠失は、PTH受容体の数あるいはcAMP応答にいかなる変化もなく、細胞のPTHに対する反応性を減少させることが示されている[51]。あべこべに、PTHおよびPGE2は、骨芽細胞培養においてギャップ結合伝達を二つの機構を介して高める；細胞の膜への最初の急速な再分布、およびCx43遺伝子発現の後期刺激である[52]。このように、細胞内伝達の調整は、骨栄養因子が骨形成細胞の活性を調節する機構を表わしている。
【０１７１】
ギャップ結合細胞内伝達は、最も重要な機構の一つであることが非常によく証明されており、それによって骨細胞は機械的およびホルモンによる刺激に対する活性と応答を協調させる。このように、骨細胞間のギャップ結合伝達が薬剤的に増加させられ得るのであれば、骨芽細胞活性は増加し、in vivo骨形成を亢進することができる。
【０１７２】
心筋細胞もまた、ギャップ結合によって連結されており、骨芽細胞においてと同様に、主要なコネキシンはCx43である。ある化合物は、心筋細胞間のギャップ結合伝達を増加させることが明らかにされており、人工的に合成されたAAP10 (CE2)が最も研究されている。心筋細胞は、細胞の共役を減少させて虚血に反応する。in vitroの実験では、虚血をうけた心筋細胞へのAAP10 (CE2)の添加は、欠失した細胞の共役のいくつかを回復した。心筋細胞が、この一群の化合物にギャップ結合の共役を増加させることで応答しているのであれば、骨芽細胞も同様であっても良い。この場合、細胞の共役における増加は、骨芽細胞成熟化および活性における増加、そして続けて骨形成における増加によって非常によく伴われていることは明らかである。この仮説を調査するために、我々は、ヒト骨芽細胞およびラット骨肉腫細胞におけるGJICに対する化合物2の効果を調査した。さらに、我々はヒト骨芽細胞活性および骨形成のためのマーカー（すなわち、アルカリフォスファターゼ）に対する化合物2の効果を研究した。
【０１７３】
方法
細胞培養
ヒト骨芽細胞（hOB）: 細胞は、健康なボランティア（20-36歳）の後腸骨棘の穿刺によって得たヒト骨髄から単離された：10-15 mlの髄物質は、100 U/mlヘパリン(Sigma, Cat. No. H-3149)を添加した15 mlのPBS+Ca,Mg (Life Technologies, Cat.No. 14040)に集めた。髄の単核球画分は、Lymphoprep gradient (Nycomed Pharma, Cat.No. 1001967)で2200 rpm、30分間の遠心によって単離した。分取した後、単核球画分は、培地で1回洗浄され、1800rpmで10分間、遠心された。続いて細胞数を計測し、8×106 cells/100 mmディッシュで培養培地に撒いた。hOB培地（全ての試薬は、Life Technologiesから購入した）：10% heat inactivated fetal calf serum (Cat.No. 10106) および0.1% Penicillin/Streptomycin (Cat.No. 15140)を添加したMEM w/o Phenol Red w/ Glutamax (Cat.No. 041-93013)。培地は翌日かえられ、細胞は7日ごとにかえた培地で、5%CO2中、37℃で培養された。培養3-4週間後、細胞は70% confluenceに達した。培地に7日間、100nM Dexamethasone (Sigma, Cat.No. D-4902)を添加した。細胞は、ビデオイメージング実験のためにまかれた：25mm #1カバーガラスを35mmディッシュ（または、6穴マルチディッシュの各ウェル）におき、細胞は2-3×105 cells/coverslipでカバーガラスにまかれ、使用前2-3日培養された。
カルシウムウェーブの測定
カバーガラス上で培養した細胞は5mM fura-2-AM (Molecular Probes, Cat.No. F-1221)で、37℃、30分間、新鮮な培地で20分間インキュベートされた。カバーガラスは、Zeiss Axiovert microscope上のPDMI-2 culture chamber (Medical Systems Corp.)にはり付け、上面をCO2で洗い流され、37℃に維持された。細胞間カルシウムウェーブは、Eppendorf 5157 micromanipulatorにはり付けたborosilicate glass micro pipetteを使用して、一つの細胞を機械的に刺激することによって誘導された。イメージングは、MetaMorph imaging system (Universal imaging)を使用して行われた。励起光（340および380 nm）はmonochromator (T.I.L.L. Photonics GmbH)によって供給された。画像は、intensified CCD camera (Dage MTI)で得られ、Matrox MVP image processing boardでデジタル化された。
【０１７４】
マイクロインジェクション
カバーガラス上で培養した細胞は、上述したように顕微鏡に設置された。マイクロインジェクションは、 Eppendorf 5157 micromanipulatorおよびEppendorf Transjector 5346 systemを使用して行われた。マイクロピペットは10mM Lucifer Yellow (LY) solution (Sigma, Cat.No. L-0259)で満たされた。単層における細胞は、LYを注意深く30秒間注入され、マイクロピペットは細胞から除去され、30秒後に染色剤の転移を示した細胞の数を計測した。LYの励起光は430 nmであり、画像を上述したように取得した。
【０１７５】
アルカリフォスファターゼ検定
1日目：細胞を、200mlの通常の培養培地に8000 cells/well (hOB)あるいは3000 cells/well (ROS)の濃度で96穴プレートにまいた。
2日目：細胞に対する培地を交換した。
4日目：（ROSの場合、3日目）：細胞を200ml MEM, 0.1% BSA (Sigma, Cat.No. A-9418)で洗った。様々な濃度の化合物2を含む200ml MEM, 0.1% BSAを細胞に加え、培養を4日間続けた（ROSの場合、2日間）。
8日目：（ROSの場合、5日目）：アルカリフォスファターゼ（ALP）検定は、酵素活性を計測するためのcolorimetric endpoint methodであり、Alkaline Phosphatase Kit (Sigma, Cat.No. 104-LL)を使用して行った：細胞を1回200 ml PBS+Ca,Mgで洗った。100 ml Substrate Solutionを各ウェルに加え、プレートは37℃で30分間インキュベートした。反応を停止させるために、各ウェルに100 ml 2.0 N NaOHを加えた。吸光度はプレートリーダーを使用して405 nmで計測された。
【０１７６】
GJICに対する化合物2の効果
細胞間カルシウムシグナルを仲介するギャップ結合を介した伝達を増加させる、ギャップ結合修飾剤の効能を評価するために、カバーガラス上のヒト骨芽細胞ic cellsの単層をfura-2でインキュベートした。リアルタイムイメージング中、ガラスマイクロピペットで機械的な刺激を与えた。周りの細胞へシグナルの広がりに続く、細胞内カルシウムに増加が現われた。ウェーブにおいて細胞の平均数は、6.5細胞だった。次にpurinergic受容体を脱感作させるために、100 mMアデノシン三リン酸（ATP）を加えた。脱感作後、カルシウムウェーブの伝播は、著しくGJICに依存する。ATP刺激により、細胞内カルシウムにおける増加が、視野内のほとんどの細胞において見られた。再び、ある一つの細胞を機械的に刺激した。直ちに、ウェーブ伝播は、ウェーブにおいて平均4.5細胞のみに制限された。化合物2が、容器中の溶液に10-8 mol/lの濃度で加えられた。細胞内カルシウム濃度における増加が、視野内のほとんどの細胞において見られた。化合物2で10分間インキュベーションした後、ある一つの細胞を機械的に刺激した。再び、刺激された細胞は、ウェーブの伝播に続く、細胞内カルシウム濃度を増加させた。直ちに、ウェーブは平均6.2細胞に広がり（図10）、これは化合物2を添加する前に比較して、有意な増加である。
【０１７７】
抑圧されたギャップ結合の共役を回復する化合物の効能を試験するために、同様の実験を骨芽細胞細胞系統ROS 17/2.8 (ROS)に対して、細胞の共役を減少させることが知られている条件、3-6% O2のみでの低酸素圧条件下、細胞の48時間のインキュベーション後に行った。単層におけるROS細胞は、fura-2でインキュベートされ、上と同様の条件下、機械的な刺激が行われた。ROS細胞は、purinergic受容体を発現しないため、ATPでの前処理は行わなかった。刺激により、細胞内カルシウム濃度は刺激された細胞において増加し、ウェーブが開始され、全体の平均で2.2細胞（n=18）に広がった。そして化合物2が容器中の溶液に最終濃度10-8 mol/lで加えられた。10分後、機械的な刺激が繰り返された。直ちにウェーブが平均5.4細胞（n=18）に伝播し（図11）、これは化合物が加えられる前に比較して有意な増加である。この様に、化合物2はギャップ結合の仲介する細胞間カルシウムウェーブを効果的に増加させる。
【０１７８】
直接の細胞の共役に対する化合物の効果を試験するために、マイクロインジェクション実験が上述した方法にしたがって行われた。染料Lucifer Yellow (LY)が、単層におけるある一つのヒト骨芽細胞に注入された。30秒後、染料を含む多くの細胞が評価された。生理学的な条件下、染料は14細胞に広がった（n=19）。細胞の共役を抑圧するために、細胞は直ちに48時間、低酸素圧(3-6% O2)中でインキュベートされた。そして細胞の共役は、LYをマイクロインジェクションすることによって、再び評価され、この時点で染料は平均7細胞にのみ通過した。化合物2が培地に加えられ、10分後に染料共役が再び評価された。化合物2で10分間のインキュベーションの後すでに、細胞の共役は9細胞（n=11)への染料の移動をもって増加した。
【０１７９】
同様の実験がROS細胞で行われた。ROS細胞において生理学的条件下、基礎的な共役は12細胞（n=19）だった。3-6% O2中48時間のインキュベーション後、染料移動における減少は9細胞（n=27）にみられた。再び、化合物2が容器中の溶液に加えられ、細胞の共役は実際に前低酸素圧レベル、平均12細胞へのの染料移動をもって、回復した。このように、化合物2はギャップ結合伝達を増加し、細胞の共役における低酸素圧による誘導の減少を回復することができる。
【０１８０】
低血糖症によって誘導される代謝ストレスもまた、ギャップ結合伝達を減少させることが知られている。それゆえに、我々は化合物2が細胞共役において低血糖症誘導による減少を戻すことができるか試験することを望んだ。ヒト骨芽細胞は、カバーガラス上、単層で培養され、fura-2でインキュベートされた。上述のようにATP脱感作後、ある一つの細胞が機械的に刺激され、ウェーブにおける細胞の数が記録された。このセットの実験において、ウェーブは平均3.2細胞（n=19）に広がった。培地はグルコース無添加の培地に交換され、8分後に他の機械的な刺激が行われた。直ちに、1.4細胞（n=20）のみのウェーブ伝播で、ウェーブはほとんど阻害された。化合物2が、培地に終濃度10-8 Mで加えられた。最後の刺激が行われ、そして直ちにウェーブはほとんど回復し、平均で2.9細胞（n=18）へ広がった（図13）。このように、化合物2は低血糖症誘導の細胞脱共役を回復することができる。
【０１８１】
最後に、骨形成および骨芽細胞活性に対する化合物2の効果を評価するために、我々は細胞のアルカリフォスファターゼ（ALP）活性に対する化合物の効果を測定した。ヒト骨芽細胞は、1×10-13から1×10-6までの様々な濃度の化合物2で刺激され、無処理の対照と比較された。通常の培養条件下、化合物2は有毒であっても良い（図14）、最も高い濃度（10-6 mol/l）を除いて、試験した濃度のほとんどでALP活性を増加させた。さらに、ALP活性に対する化合物の効果もまた、低酸素圧条件中で試験された。ヒト骨芽細胞は5% O2中、4日間培養された。培地は、様々な濃度の化合物2に富んでおり、正常酸素圧条件中の反応に比較された。低酸素圧中、化合物2の誘導するALP活性の刺激は、10-11から10-8 mol/lまでの範囲における全ての濃度で正常酸素圧中よりも約15%大きかった（図15）。
【０１８２】
要約して、これらの結果は化合物2が低酸素圧中、ヒト骨芽細胞間の減少したGJICを標準化することができることを示している。さらに、化合物2はアルカリフォスファターゼの生産を刺激し、化合物2は骨芽細胞の活性および、それゆえに骨形成を刺激することができることを示唆している。このように、化合物2は骨再吸収に関連した、骨形成に障害をもつ骨疾患の治療に有効であっても良い。低酸素圧中の細胞間共役に対する化合物2の効果は、本発明の物質が、骨組織における低血管新生, 低酸素圧, 虚血と結び付いた骨疾患の治療および／または予防に有効であっても良いということを示唆する。
【０１８３】
これらの実験から、GJICを増加させる本発明の物質は、骨粗鬆症の予防および／または治療のための医薬の調製に有効であっても良いと結論することができる。ある例では、骨粗鬆症は、Cushing’s syndromeあるいは骨形成不全症のような他の疾患の兆候である。しかしながら、骨粗鬆症の多くの場合、他の疾患は現われない。ある形は、両方の性の子供あるいは若い成人において、および正常な生殖腺の機能をもって、生じ、しばしば特発性骨粗鬆症と呼ばれ、他の型の多くもまた、未知の発病からなる。I型骨粗鬆症は、51から75歳までの一連の閉経後の女性に生じ、小柱骨の急速なそして不均化な損失によって特徴づけられる。脊椎、および前腕の骨折は、共通の合併症である。上皮小体機能の減退は、増加する骨再吸収への補償であっても良い。II型骨粗鬆症は70歳以上の女性および男性において生じ、大腿付け根、上腕骨基部、脛骨基部、骨盤、皮質および小柱骨両者を含む部位の骨折に結び付いている。骨粗鬆症に加え、GJICを増加させる物質は、くる病および骨軟化症のような代謝骨疾患において、および慢性グルココルチコイド投与、あるいは慢性腎不全のための骨粗鬆症において骨形成を増加させるかもしれない。このように、本発明の目的は骨粗鬆症の予防および／あるいは治療において有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XVおよび式2-12その中、さらに特別に、合成例1-47その中の化合物のような、本ペプチド化合物で成し遂げられる。
【０１８４】
軟骨組織に対するギャップ結合開放剤の効果
関節の軟骨組織は、関節の動きの間の圧縮に耐えるように設計された組織であり、in vivo広範な機械的負荷を受ける。機械感受性は、軟骨細胞代謝および軟骨ホメオスタシスに影響することが示されている。多くの細胞種において、機械的な刺激は、細胞間Ca2+ウェーブとして細胞から細胞へ伝播する細胞質のCa2+濃度の増加を誘導する。ギャップ結合をつうじた細胞間伝達は、代謝および細胞外の刺激に対する感受性の組織の協調性の基礎となる：細胞内二次メッセンジャーに対するギャップ結合の透過性は、いくつかの細胞間で共有されるシグナル伝達経路を可能にし、究極的に協調した組織応答に帰結する。機械的に誘導したCa2+シグナリングは軟骨細胞において研究され、ギャップ結合伝達が軟骨細胞において機械的に誘導したCa2+シグナリングに必須であることが示されている[53]。さらに機械的刺激は、フォスフォリパーゼCを活性化し、こうして細胞内イノシトール1,4,5-三リン酸の上昇になる。二次メッセンジャーは、透過性のギャップ結合によって、隣接する細胞において細胞内Ca2+の解放を刺激し、このシステムは軟骨細胞において機械的な負担を受ける間に、協調したシグナリングのために非常に重要と考えられ、軟骨細胞において代謝ストレスを受ける間に、代謝活性を協調させるための機構を与えているのかもしれない[53;54]。軟骨組織における主なコネキシンは、Cx43であり、代謝およびシグナリングの細胞間の調節における役割に加え、Cx43は正常な軟骨生成に必須である[47;55]。
【０１８５】
このように、GJICを増加させる本発明の物質は、細胞間共役に障害を伴う関節疾患の予防および／あるいは治療に使用されても良いようである。
【０１８６】
我々がヒト骨芽細胞で示したように、我々はGJICを増加させる物質は、代謝ストレスを伴う関節疾患の予防および／あるいは治療のために使用されても良いことを示唆する。これらは減少した血管新生あるいは破壊された軟骨組織の治癒と関連した関節炎の任意の形態を含む。このように、本発明の目的は、関節炎を含む関節疾患の予防および／あるいは治療に有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XVおよび式2-12その中の化合物、より特別には合成例1-47その中の化合物のような本ペプチド化合物で成し遂げられる。
【０１８７】
ガンに対するギャップ結合開放剤の効果
ギャップ結合の透過性およびGJICの調節は、細胞において様々なレベルで起こる。GJICの減少あるいは欠失は、転写および翻訳中のCx発現における変化、および翻訳後プロセシングの変化、およびコネクソンアセンブリおよび形質膜への挿入の変化の結果であっても良い。Cxの珍しい性質は、他の膜タンパク質と比較して短い半減期をもつことである。コネキシンの迅速な回転速度は、1.5と2時間の間であることが明らかにされている。Cxの分解は、あるコネキシンのサブタイプの不安定化に導く、リン酸化に依存していることが示されている。急速な回転速度は、GJICがCxのmRNA半減期、翻訳、細胞内輸送、ギャップ結合へのCxのアセンブリに影響を及ぼす物質によって迅速に調節されるような、付加的な機構を与える。
ギャップ結合の透過性を調節する他の方法は、ある状況下、コネクソンの六つのサブユニットの機械的なねじれによってギャップ結合チャンネルの完全あるいは部分的な閉鎖である。ギャップ結合の開閉は、GJICを減少させる腫瘍増進剤によって影響を受けることがしられている。腫瘍増進剤は、腫瘍開始後繰り返し与えられたときに発癌を亢進あるいは加速させる薬剤である。腫瘍増進剤がGJICを調節する機構は、完全には理解されていないが、腫瘍増進剤がCxのリン酸化の変化および／またはCx発現およびアセンブリの阻害によって、GJICに影響を与えるかもしれないことを支持する証拠がある。最近の結果は、低いGJIC容量をもつ悪性腫瘍において、レトロウイルスによるコネキシン43のin vivo遺伝子移転が、腫瘍発生を減少させたことを示している[56]。癌の防止において正常なGJICの必須な役割のさらなる支持において、Cx32欠損マウスは、自然発生的な肝臓腫瘍の非常に高い発生率をもち、化学的に誘導した肝臓腫瘍の進展の受けやすさが上昇していることが示された[57]。さらにフェノバルビタールの腫瘍増進作用は、腫瘍発達に機能的なCx32を必要とする[58]。これは、GJICの脱共役がフェノバルビタールの腫瘍作用に重要であることを示唆している[58]。
【０１８８】
発癌は、成長因子、腫瘍遺伝子、および腫瘍抑制遺伝子が関与する成長制御機構の進行性の傷害によって特徴づけられる。GJICの変化は、成長制御の変化に帰結するので、GJICに対する成長因子および腫瘍遺伝子の影響が、発癌に決定的であっても良い。いくつかの腫瘍遺伝子が、GJICの調節低下を仲介していることが示された[59]。pp60v-srcはMAPキナーゼによるC末端セリン残基のリン酸化を伴うball and chain機構を介してCx43ギャップ結合閉鎖を仲介していることが示されている[59]。興味深いことに、いくつかの場合において、腫瘍遺伝子をトランスフェクトした細胞は、お互い連絡することができるが、隣接する正常な細胞との異種の連絡を欠いている。
腫瘍細胞における、染料移動検定を使用したギャップ結合の透過性は、周りの肝臓組織におけるGJICより低かった。興味深いことに、多くの腫瘍は細胞外マトリックス様の構造に包まれ、正常な組織から物理的に分離されている。
【０１８９】
正常なヒト組織において新生形質転換は、遺伝的な変化の蓄積の結果として起こる。しかし、発癌および腫瘍発生における一般的なテーマは、GJICの調節低下である。様々なコネキシンが組織特異的な様式で発現されている。Cx43, Cx26, Cx32は、正常な胸部組織において検出される。ヒト乳癌のパネルが、Cx43の発現レベルに対して分析された。Cx43ギャップ結合は、in situ、導管癌、浸潤導管癌、および浸潤小葉癌において観察されず、それらはエストロゲン、プロゲステロン、およびerbB2受容体の状態とは独立であるようである。対照的に、ヒト乳癌細胞系統および齧歯動物乳房癌腫組織は、Cx43の調節低下を示し、結局のところmRNA量においてであり、乳癌におけるCx43減少のための転写機構を示唆する[60]。癌とGJICの関連の他の例は、肝細胞癌腫であり、コネキシン32ノックアウトがこの特異的な癌種の場合に傾向があることが示されている[57]。卵細胞での研究は、それらが肝細胞に分化しうること、および卵細胞の新生派生物が肝細胞および胆汁の新生細胞を生じうることを示した。分化する卵細胞によって発現する特異的なコネキシンは、それが肝細胞あるいは胆汁上皮細胞と連絡するかどうか決定している。この連絡は、分化する卵細胞のさらなる分化および調節された成長に必要であるかもしれず、GJICの傷害は、肝細胞および胆管細胞新生細胞の形成に寄与しても良い。このようにGJICは、卵細胞の分化において鍵となる因子であるかもしれず、阻害されたGJICは、それらの新生形質転換を促進しても良い。さらに、マロチレートで処理したラット肺内皮細胞における腫瘍浸潤のin vitro分析は、マロチレートはギャップ結合による細胞間接着の発達を促進し、腫瘍細胞の浸潤の阻害に帰結した[61]。ともに、これらの知見は、GJICの変化は発癌において決定的な出来事であり、GJICを増加させる本発明の物質は癌治療において有益であっても良いという仮説を強く支持する。それゆえに本発明のさらなる目的は、GJICを増加させる新規の化合物を供給することである。我々は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV, XVIおよび式2-12のペプチド化合物が、それらの効果的な濃度の低さおよびその結果として低い毒性のために癌の治療薬として、ここに特に有利であっても良いと示唆する。
【０１９０】
実施例９
ヒト骨芽細胞 cellsにおいてDDTによって誘導されたギャップ結合伝達における減少に対する化合物2の効果
プロトコルおよび結果
化合物1,1-bis(p-chlorophenyl)-2,2,2-trichlorethaneは、殺虫剤DTTとしても知られ、ギャップ結合伝達の阻害剤であり、腫瘍促進作用をもつ。それはギャップ結合タンパク質Cx43のリン酸化された（活性的な）型の減少した細胞レベルと同様に、ギャップ結合の数とサイズを減少させることによって、細胞間連絡を阻害し、これらの作用はその化合物の発癌性にとって重要であると考えられる[64]。このように、腫瘍増進剤の誘導するGJICの減少を防止する活性をもつ化合物は、腫瘍促進からの保護および癌治療[65]における使用にとって可能性のある候補であっても良い。本発明の物質が、腫瘍増進剤誘導のGJICにおける減少を防止するかどうか調査するために、我々はヒト骨芽細胞細胞において、DDTの誘導する脱共役に対する化合物2の効果を調査した。
【０１９１】
方法
細胞培養
ヒト骨芽細胞細胞（hOB）: 細胞は、健康なボランティア（20-36歳）の後腸骨棘の穿刺によって得たヒト骨髄から単離された：10-15 mlの髄物質は、100 U/mlヘパリン(Sigma, Cat. No. H-3149)を添加した15 mlのPBS+Ca,Mg (Life Technologies, Cat.No. 14040)に集められた。髄の単核球画分は、Lymphoprep gradient (Nycomed Pharma, Cat.No. 1001967)で2200 rpm、30分間の遠心によって単離された。分取した後、単核球画分は、培地で1回洗浄され、1800rpmで10分間、遠心した。続いて細胞数が計測され、8×106 cells/100 mmディッシュで培養培地に撒かれた。hOB培地（全ての試薬は、Life Technologiesから購入した）：10% heat inactivated fetal calf serum (Cat.No. 10106) および0.1% Penicillin/Streptomycin (Cat.No. 15140)を添加したMEM w/o Phenol Red w/ Glutamax (Cat.No. 041-93013)。培地は翌日かえられ、細胞は7日ごとにかえられた培地で、5%CO2中、37℃で培養された。培養3-4週間後、細胞は70% confluenceに達した。培地に7日間、100nM Dexamethasone (Sigma, Cat.No. D-4902)を添加した。細胞は、ビデオイメージング実験のためにまかれた：25mm #1カバーガラスを35mmディッシュ（または、6穴マルチディッシュの各ウェル）におき、細胞は2-3×105 cells/coverslipでカバーガラスにまかれ、使用前2-3日培養された。
【０１９２】
マイクロインジェクション
カバーガラス上で培養した細胞は、上述したように顕微鏡に設置された。マイクロインジェクションは、 Eppendorf 5157 micromanipulatorおよびEppendorf Transjector 5346 systemを使用して行われた。マイクロピペットは10mM Lucifer Yellow (LY) solution (Sigma, Cat.No. L-0259)で満たされた。単層における細胞は、LYを注意深く30秒間注入され、マイクロピペットは細胞から除去され、30秒後に染色剤の転移を示した細胞の数を計測した。励起光（430 nm）は、monochromator (T.I.L.L. Photonics GmbH)によって供給された。画像は、intensified CCD camera (Dage MTI)で取得し、MetaMorph imaging software (Universal Imaging)を使用して、Matrox MVP image processing boardでデジタル化した。
【０１９３】
結果
ギャップ結合修飾剤の腫瘍促進を防止する活性を評価するために、我々はギャップ結合修飾剤が、よく知られた腫瘍促進薬剤、DDTによって誘導されたギャップ結合伝達における減少を回復させるかどうか試験することを望んだ。それゆえに、カバーガラス上のヒト骨芽細胞細胞の単層を5% CO2を含む湿り気を与えた大気中、37℃でインキュベートした。DDTは、終濃度13mMで培地に加えられ、60分間おかれた。
【０１９４】
DDT処理後、直接の細胞共役に対する化合物2の効果を評価するために、マイクロインジェクション実験が、上述の方法にしたがって行われた。染料Lucifer Yellow (LY)が、単層のある一つのヒト骨芽細胞に注入された。30秒後、染料を含む細胞数が評価された。対照条件（DDT処理なし）下、染料は中央値14.5細胞（n=12）に広がった。同様の実験をDDTにさらした細胞について行った。これらの細胞は、中央値7（n=13）で減少した細胞共役を示した。化合物2が終濃度10-8 mol/lで容器中の溶液に加えられ、10分後、他のマイクロインジェクションが行われた。化合物2は、全ての調合において中央値8.3細胞で細胞間染料移動において増加を生じる（図15）。この増加は、Wilcoxon non-parametric統計検定を使用して、p < 0.01で高度に有意である。このように、ギャップ結合開放剤は、腫瘍促進に関連した減少した細胞間共役を回復する活性をもち、これは本発明の物質が、癌の化学的防止および／あるいは治療に有益であっても良いことを示唆する。本発明の化合物は、癌の化学的防止および／あるいは治療のための薬剤の調合に有益である。本発明の化合物はまた、他の抗癌剤と組み合わせた療法において使用されても良い。このように、本発明の目的は癌の防止および／あるいは治療に有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XVおよび式2-12の化合物、より特異的には、合成例1-47の化合物のような、本ペプチド化合物で成し遂げられる。
【０１９５】
傷治療におけるギャップ結合開放剤の効果
傷は、肌をともなう正常な人体の不連続性であり、外科的あるいは外傷性の傷であり得、あるいは糖尿病、動脈硬化症、栄養失調などのようないくつかの疾患に二次的でありうる。通常の傷治癒は全身的な過程であり、段階的に起こり、ヘモスタシスおよび炎症を含む。リモデリングはこれらの過程に続いておこり、数年続き、傷跡組織の形成の原因となる。フィブリンでの止血は、その下で傷の端の移動および動きが生じる、表面を与える。傷の治癒に上皮化、線維増殖および毛管拡散が、即座に開始する。脈管形成の毛細管新芽は、フィブリン傷凝塊に侵入し、数日中に微小管網を、白血球および単核食細胞からなる肉芽組織を通じて組織する。
非常にダイナミックな相互作用が、傷治癒過程に関与する様々な組織構成要素の間で起こる。脈管形成過程は成功した傷治癒に必須である。細胞間の連絡において、ギャップ結合は、線維芽細胞の合胞体および毛管ネットワークの拡散の創造に必須である。コネキシン43の正常な分布が様々な組織構成要素のこの成長に必要である。
【０１９６】
水腫、虚血、低酸素張力、感染と同様の病理学的な条件中にみられる、いくつかの局所的な因子は、傷治癒過程を遅延させる。多くの細胞種の相互作用、およびギャップ結合によって仲介された細胞間連絡をともなう傷治癒は、組織および器官の成長および発生中の細胞の代謝の協調に重要な役割を果たすと考えられる[66-68]。
【０１９７】
我々は、GJICを増加させる本発明の物質が、傷の治療および特に傷治癒を加速させるために使用される。心臓および骨組織についての実験は、これらの物質が代謝ストレス（つまり低血糖症, 低酸素圧, 虚血）中、高くなった効能をもつことを示唆し、これらの物質は虚血性潰瘍の治療に特に有益であっても良いと推測されても良い。このように、本発明の目的は、傷の治療に有益な薬剤の調合のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XVおよび式2-12の化合物、より特異的には合成例1-47の化合物のような本ペプチド化合物で成し遂げられる。
【０１９８】
胃および十二指腸の潰瘍の治癒におけるギャップ結合開放剤の効果
Mine et al.は、正常なヒト胃粘膜がコネキシン32およびコネキシン43の両者を含むことを示している[69;70]。対照的に、慢性胃潰瘍傷害を囲む胃粘膜は、少量のコネキシン32およびコネキシン43を含む。Mine et al.による研究において、コネキシンの出現と潰瘍治癒との関係が調査された。潰瘍治癒が観察されるとき、活発な潰瘍段階に減少した、コネキシン32および43は、正常な胃粘膜において観察されるレベルまでほとんど回復した。これらのデータは、コネキシン32およびコネキシン43両者の消失が、慢性胃潰瘍傷害の段階に密接に関連していることを示す。さらに酢酸で誘導した慢性胃潰瘍のラットモデルを使用して、研究者の同じグループは、抗潰瘍薬剤シメチジンの臨床効果は、コネキシン32の再出現に密接に関連していることを示した[69]。
【０１９９】
それゆえに、GJICを増加させる本発明の物質は、胃および十二指腸の潰瘍の治癒を促進しても良い。このように本発明の目的は、胃および十二指腸の潰瘍の治療において、有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV,および式2-12の化合物、さらに特異的には合成例1-47の化合物のような、本化合物で成し遂げられる。
【０２００】
導管生物学におけるギャップ結合の役割
血液と下にある組織の間の内皮の共界面での細胞応答の協調は、ギャップ結合を介した直接の細胞間伝達を含む、多くのシグナリング機構によって仲介されている。内皮のギャップ結合による細胞間伝達が関係している機能の一つは、傷害、脈管形成、内皮の成長および老化、血管運動応答の同調後の内皮細胞の移住作用である[71]。
広くダイナミックな範囲における血流の調節は、抵抗性および供給動脈の同調した応答を必要とする。そのような導管間の同調は、流れる血液によって行使された流動ストレスの導管効果によって、あるいは導管壁の細胞に沿った血管運動シグナルの伝導によってなされうる。実際、アセチルコリン（Ach）あるいはノルエピネフリン（NE）のような、あるバソアクティブ化合物の局所的な適用は、局所の膨張あるいは収縮だけでなく、数ミリメートル上流および下流で血管運動応答を誘導した[71]。血管運動応答はまた、毛細管から小動脈へ伝導され得、組織の需要と血液の供給の調和に貢献していても良い。これは次の方法において示された：一つの筋肉線維が収縮するように刺激されたとき、これらの線維に供給する毛細管の上流の小動脈が膨張することが観察された[72]。
【０２０１】
高い伝導速度は、導管壁に沿ったシグナルの電気的伝達と一致する。実際、局所的に誘導した高分極および脱分極は、内皮および導管の平滑筋細胞において、数ミリメートル上流で伝導されることが示されていた。電気的シグナルの伝導は、細胞間の低い電気的抵抗の導管を供給する、ギャップ結合による導管細胞の共役を必要とする。導管組織において、少なくとも3種類の異なるコネキシン（Cx）タンパク質（Cx37, Cx40, Cx43）が発現され、ギャップ結合を形成する。Cx40は、動脈内皮細胞において主要なコネキシンアイソフォームであるようであり、一方平滑筋においてはCx43の発現が豊富である。
【０２０２】
Cx40欠損マウス（Cx40-/-）における研究は、アセチルコリンあるいはブラディキニンの局所への適用により誘導された血管拡張の分散が、正常な野生型（Cx+/+）動物に比較して、Cx40-/-動物においてひどく弱まった[73]。さらに動脈血圧は、正常な野生型（Cx+/+）動物に比較して、Cx40-/-動物において著しく上昇する。これらの結果は、導管の細胞間伝達においてCx40の重要な役割を支持し、それらは、導管壁における障害をもったギャップ結合伝達が、導管抵抗の増加および高血圧の生成に転ずる、内皮依存の血管拡張神経応答の減少した伝達と関連していることを示す。最近のin vivoの研究は、腎臓において正常な圧力振動が、血圧の調節にとって極めて重要であることを示唆する[74]。このように、貧弱な細胞間共役のため障害をもつ血管運動応答がCx40欠損動物において高血圧の発生に寄与していても良い。
【０２０３】
老化内皮細胞において、Cx43のmRNAおよびタンパク質レベルの低調節は、障害をもつギャップ結合細胞間伝達が、導管老化において役割を果たしている可能性を示唆する[75]。導管応答におけるギャップ結合の役割について利用できる情報に基づくと、導管壁におけるギャップ結合共役を増加させる薬理学的な化合物は、伝導した導管応答を容易にし、増加した代謝需要（例えば、運動、頻拍）を示す条件中、および虚血中に、血液供給を改善するようである。さらに、そのような物質は、高血圧を防止する、および／または治療するようである。それゆえに本発明のさらなる目的は、導管壁においてギャップ結合共役および／またはGJICを増加させ、こうして高血圧の防止あるいは治療に有効である化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV,および式2-12の化合物、さらに特異的には合成例1-47の化合物のような、本化合物で成し遂げられる。
【０２０４】
神経組織におけるギャップ結合開放剤の効果
CNSにおいて、8種類のことなるコネキシンが発現されている（Cx 26, 30, 32, 37, 40, 43, 45, 46）。さらにCx36は、ニューロンにおいて主に発現しているようである。異なるコネキシンは、多様な細胞群の間の伝達を可能にし、あるいは細胞をそのコネキシン発現の様式に従い、分離したコンパートメントに隔離する。異種の共役が機能的な妥当性をもつコンパートメントの境界は、希乏突起神経膠細胞 (Cx32, Cx45)と神経膠星状細胞(Cx43, Cx45, Cx40, Cx30)あるいはニューロン(Cx26, Cx32, Cx43)の間である[76]。
【０２０５】
コネキシンの特異的な組み合わせが、特別な脳コンパートメントにおいて、機能的な優位性を与えることは、実行可能である；すなわち、高度あるいは低度の一元のコンダクタンスは、同調する神経入力あるいは伝導の迅速さにおいて、機能的に容易あるいは制限されていても良い。
【０２０６】
未成熟な神経芽および出生後のニューロンにおいて、広範なギャップ結合が細胞間共役を仲介することが、述べられている[76;77]。神経のギャップ結合の出生後の増加およびその皮質組織化は、皮質発生の重要な段階の基礎をなす形態形成における、これらのギャップ結合の必須な役割にとって示唆に富む。神経輸送におけるギャップ結合の関与は、神経伝達物質がギャップ結合の共役を変化しうるという事実によって、強められる。
【０２０７】
それゆえに、我々はGJICを増加させることが知られる本発明の物質が、神経傷害後あるいは脳組織への未成熟細胞（先祖細胞）の移植中に、修復を加速する可能性を示唆する。中枢神経系において、細胞修復のための実験的な評価を現在受けている技術の一つは、パーキンソン病、ハンチントン病、および他の神経退行性の脳疾患のような病気の治療に使用される、先祖細胞、胎児組織、ウイルスベクターで移植することである。
【０２０８】
軸索傷害は、即座に軸索切断されたニューロンに近接するミクログリアおよびアストログリア細胞を活性化する。運動軸索傷害のあとで、神経膠星状細胞は一時間（数時間）内にギャップ結合タンパク質コネキシン-43を高調節し、一日でglial fibrillary acidic protein (GFAP)を高調節する。同時に、ミクログリア細胞は軸索切断されたニューロン細胞質に向けて増殖および移動する。軸索傷害後のグリア細胞活性化の仮説の機構は、傷害を受けたニューロンは最初に隣接する神経膠星状細胞とGJICを通じて相互作用することを含む。続いて、隣接して休止しているミクログリア細胞が活性化される。これらのグリア反応は、パラクリンおよびオートクリン機構によって増幅され、そこではサイトカインが重要なメディエーターである。活性化したグリア細胞の特異的な機能的性質は、ニューロン生存、軸索再生、シナプス可塑性に対する影響を決定する。これらの反応の誘導および進行の制御は、それゆえに例えば神経外傷、脳虚血、慢性神経退行性疾患の克服に重要でありうる[78]。
【０２０９】
ギャップ結合は、グリアコンパートメントの個々の構成要素の間の、同調した遠距離シグナリングの分子的な関連を与えると考えられている。同様に、神経膠星状細胞は導管bedに接触するある先端とニューロン実質に近接した他の極をもって、機能的に分極しているので、ニューロンの代謝支持には理想的に適している[76]。このように、そのような支持機構の機能障害は、統合されたニューロンの経路の機能障害の手段およびそれによって中枢神経系における疾患の結果であっても良い。それゆえに、我々はGJICを増加させることが示されている、本発明の物質が憂鬱、不安、学習および記憶欠陥、フォビアス、幻覚のような兆候をもってあらわれる器質性精神病をもつ患者に、非常に重要であっても良い。このように、本発明の目的は脳において虚血損傷を防止することにおいて、および憂鬱、不安、学習および記憶欠陥、フォビアス、幻覚を含む器質性精神病の治療に有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、中枢神経系に利用可能であるように選択され、あるいは処方される本発明のペプチド化合物で成し遂げられる。
【０２１０】
白内症に対するギャップ結合開放剤の効果
脊椎動物の眼レンズは、表面への新しい細胞の添加によって、生涯を通じて成長する細胞の固体の嚢胞である。古い細胞は、新しい世代によって埋められ、長い、プリズム状の線維に分化し、細胞オルガネラを消失し、そして高濃度の可溶性タンパク質、クリスタリンで細胞質を満たす。長く存続するレンズ線維は、それ自身とおよびレンズ表面で単純な立方上皮細胞の前の層の両者と、ギャップ結合によって相互に連絡されている。このギャップ結合のネットワークは、レンズ細胞を小分子に関して合胞体につなぎ、代謝的な協調を可能にする：イオン、中間代謝物、水の細胞間分散。レンズ表面での栄養物とは対照的に、上皮細胞はその細胞オルガネラを残し、クリスタリンが溶液中に残っているような、レンズ線維細胞質中にイオンおよび中間代謝物の適切な濃度を維持するように代謝エネルギーを供給することができ、凝集しない（白内症）。3種類のコネキシンがレンズに存在し：Cx43, Cx46, Cx50、これらのギャップ結合タンパク質のそれぞれにおける変異は、白内症に関連している[79-81]。これらの知見は、GJICがレンズの正常な代謝および機能に必須であることを示している。それゆえに、我々はGJICを増加させることが知られる、本発明の物質が白内症の防止および／または治療に使用される可能性を示唆する。このように本発明の目的は、白内症の防止および／または治療に有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV,および式2-12の化合物、さらに特異的には合成例1-47の化合物のような、本化合物で成し遂げられる。
【０２１１】
耳疾患におけるギャップ結合の効果
Cx32の多くの様々な変異が、遺伝性末梢神経病-難聴 X染色体連鎖 Charcot-Marie-Tooth症候群において明らかにされ、Cx26およびCx31のいくつかの変異が、難聴において検出されている[80]。このように、我々はGJICを増加させることが知られる、本発明の物質が耳において障害を受けたGJICと関連する、ある種の難聴の防止および／または治療に使用される可能性を示唆する。このように本発明の目的は、障害を受けたGJICと関連する難聴の防止および／または治療に有用な医薬の調製のための化合物を供給することである。この目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV,および式2-12の化合物、さらに特異的には合成例1-47の化合物のような、本化合物で成し遂げられる。
【０２１２】
腸におけるギャップ結合開放剤の効果
Cx43およびCx45はともに、小腸壁において発現される[82]。小腸の深筋叢に沿ったCx45発現細胞は、特異的な型のギャップ結合をつうじて作用する、細胞ネットワークを形成することによって、伝導系を含んでも良い、ペースメーカー機構の構成要素として作用していると考えられている。腸および結腸において、Cajal (ICC)の腸細胞は、腸平滑筋間に位置するペースメーカー細胞である；それらは、平滑筋のゆっくりとした波動を自然発生的に生じ、神経伝達を仲介する。ICCの三次元細胞ネットワークは、ICC間およびICCと平滑筋細胞との間の両者を、Cx43ギャップ結合によって連結する。Hirschsprung病の患者において、神経節細胞欠損腸におけるCx43の発現の欠除は、ICCと平滑筋の間の障害をもつ細胞間伝達が、この病気において運動性機能障害の一部原因になっていても良い[83]。Chagas病（原生動物Trypanosoma Cruziiの感染による）の患者は、これらの患者でみられる、心筋症と同様、深刻な拡張巨大結腸の両者の原因と考えられる、Cx発現の著しい減少をおよぼす[7]。このように、ICC間およびICCと平滑筋の間の正常なギャップ結合伝達は、小腸および結腸において正常な運動性に必須であると考えられる。それゆえに、さらなる本発明の目的は、腸においてギャップ結合伝導を増加させる物質を供給することであり、それゆえに胃腸運動性疾患の治療に有効であっても良い。
【０２１３】
生殖器とギャップ結合
卵巣
顆粒膜細胞間および卵母細胞と周りを囲む顆粒膜細胞の間のギャップ結合は、卵巣の濾胞発生中に重要な役割を果たす。生まれたときに、卵巣は支持（顆粒膜）細胞の単層によって取り囲まれた、減数分裂期に停止した卵母細胞からなる原始濾胞を含む。周期的に、原始濾胞のセットは、卵母細胞のサイズが増加するようなさらなる発生を受け、顆粒膜細胞は増殖、層を形成、液に充たされた洞を発達させる。排卵後、卵母細胞は減数分裂を再び開始し、濾胞に残った顆粒膜細胞は、黄体を形成するステロイド産生細胞に分化する。
【０２１４】
ギャップ結合は隣接する細胞を直接連絡し、イオン、中間代謝物、卵巣サイクルおよび女性の繁殖力の調節にとって重要な他の潜在的なシグナル分子の、拡散移動を可能にする。通常の卵巣機能にとってのギャップ結合の必須な役割を支持して、Cx37欠損マウスは成熟した（Graafian）濾胞を消失し、排卵することができず、多くの不適切な黄体に発生する。さらに、卵母細胞の発生は、減数分裂する能力が成し遂げられる前に、停止する。このように、細胞間チャンネルをつうじた細胞間シグナリングは、成熟卵形成および排卵を成功させるために必要な、高度に同調した細胞の相互作用のひとそろいをきわどく調節する[84]。
【０２１５】
濾胞刺激ホルモン（FSH）は、卵巣濾胞の成長および発生の主要な調節因子である。濾胞成熟に対する、その多くの作用に従って、FSHは顆粒膜細胞間の細胞間共役を改善し、Cx43遺伝子発現とおそらく、新しいギャップ結合の形成を亢進する[85]。逆に、黄体形成ホルモン（LH）は卵巣濾胞中の細胞間伝達を中断し、減数分裂の再開によって続く、卵母細胞内のcAMP濃度における減少に導く[86]。
【０２１６】
これらのデータは、Cx37およびCx43を通じての正常なギャップ結合伝達の存在が、正常な濾胞成長および排卵に必須であることを例証する。このように、ある種の女性の不妊の型は、卵巣における貧弱な細胞間共役のためであるようである。それゆえに細胞間共役を増加させる物質は、卵巣のギャップ結合の発現および／あるいは調節の障害をもつ女性において女性不妊症の治療に有効であっても良い。GJICを増加させる活性をもつ本発明の化合物は、卵巣における貧弱な細胞間共役が原因である女性不妊症の治療に有効である。
【０２１７】
子宮
分娩において子宮の強力な同調した収縮は、ギャップ結合による子宮筋層平滑筋の電気的な共役に依存している。ヒトおよび他の哺乳動物において、ギャップ結合は、妊娠していない子宮の子宮筋層において少ないが、分娩の時期におよび／あるいは開始で豊富になる。ヒト子宮筋層平滑筋細胞によって発現される主要なギャップ結合タンパク質は、Cx43であり、Cx26、Cx40、Cx45もまたヒト子宮筋層において同定されている[87;88]。
【０２１８】
分娩中の同調した筋収縮の重要性のために、本発明のさらなる目的は筋収縮の同調化に正の影響をもつことが期待される、子宮筋層における細胞間共役を増加させる物質を供給することであり、上記の物質は分娩の誘導および容易化のため、オキシトチンと一緒に使用されても良い。上記の目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV,および式2-12の化合物、さらに特異的には合成例1-47の化合物のような、本ペプチド化合物で成し遂げられ、本発明はさらに分娩の誘導および容易化のための医薬の調製のための本発明のペプチド化合物の使用に関連している。
【０２１９】
男性生殖器官
Cx43は精巣において最も豊富なコネキシンであり、興味深いことにCx43発現の減少したラット系統は、精子形成に障害を有する（ebo/ebo, jun-d-/-, Cx43 +/- マウス）[89]。さらに、初期の研究は低あるいは無精液症患者が、精巣において減少したギャップ結合をもつことを示唆した[90]。これらのデータは、精巣において減少した細胞間共役が男性不妊症に導くかもしれないいう示唆を支持し、それゆえに本発明のさらなる目的は、細胞間共役を増加させ、このように障害のある細胞間共役と関連した男性不妊症の治療に、有効な療法であっても良い、物質を供給することである。
【０２２０】
膵臓におけるギャップ結合の役割
Cx43からなるギャップ結合チャンネルは、膵島およびラット島細胞腫細胞系統のグルコース感受性細胞を共役させる[91]。対照的に、インスリンを異常に分泌するいくつかの細胞系統の細胞は、Cx43を発現せず、数個のギャップ結合を有し、不十分に共役している。Cx43の安定なトランスフェクションによってこれらの欠損の補正後、天然のベータ細胞において観察されるように、Cx43のあまり多くない量を発現し、共役する細胞は、インスリン遺伝子の発現を示し、インスリンの量は、野生型（共役していない）細胞およびCx43を過剰発現する、トランスフェクトした細胞の両者において観察されるものと比較して、著しく上昇する。これらの知見は、Cx43の十分な共役が適切なインスリン生産および貯蔵にとって必要とされることを示す[91]。さらに、グリベンクラミドによるインスリンのin vivo刺激は、Cx43の発現増加および膵島中の隣接するベータ細胞間の細胞間共役増加と関連している[92]。
【０２２１】
これらの観察は、インスリンの生産および放出にとって膵島ベータ細胞間のギャップ結合共役の重要な役割を示している。このように、本発明のさらなる目的は、ギャップ結合の電気的なコンダクタンスを増加させ、このように、インスリン非依存性糖尿病の患者においてグルコース寛容を改善する物質を供給することである。上記の目的は、式I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV,および式2-12の化合物、さらに特異的には合成例1-47の化合物のような、本ペプチド化合物で成し遂げられる。
【０２２２】
血栓症におけるギャップ結合開放剤（抗不整脈性ペプチド）
本発明の物質に密接に関連した二つのペプチドの抗血栓症活性は、抗血栓症活性を有することが以前に示されている。このように、Dikshit et al.[15]は、ペプチドGly-Pro-Prp-Gly-Ala-GlyおよびGly-Pro-Gly-Gly-Ala-Glyが、コラーゲンおよびアドレナリンの静脈投与を与えたマウスにおいて、肺梗塞の発展を妨げることを明らかにした。US 4,775,743は、HP5、配列N-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OHを有し、血小板凝結に対して活性であるAAPのペプチド誘導体を明らかにする。本発明の化合物は、著しい類似性を有し、それらが血栓症に対する同等の効果を示すかもしれないようである。このように、本発明の物質は血栓症の防止に有効であっても良い。
【０２２３】
組成物
本発明はまた、製薬学的に受容できる担体および／あるいは希釈剤と組み合わせてこのなかに定義されたように、薬理的に活性な抗不整脈性ペプチドを構成する組成物に関する。そのような組成物は、口腔の、皮下の、非経口的（静脈内、腹膜腔内）、筋肉内、直腸の、硬膜外の、気管内、鼻腔内、真皮の、膣の、頬の、目の、直接脳の、あるいは肺の投与に適した形においてであるかもしれず、好ましくは皮下、静脈、あるいは口腔投与に適した形においてであり、そのような組成物は、技術に熟練した人によく知られた方法で調製されても良い、例えば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985および、より最近の版において、および”Drugs and the Pharmaceutical Sciences” series, Marcel Dekkerにおけるモノグラフにおいて一般的に述べられているように。組成物は、慣習的な形で、例えば、静脈点滴濃縮液を含む注射のための溶液および懸濁液、カプセルおよび錠剤において、好ましくは腸の組織立ての形で、例えば口腔投与のためにUS 5,350,741に明らかにされているように、現われるかもしれない。
【０２２４】
使用される薬理的な担体あるいは希釈液は、慣習的な固体あるいは液体担体であっても良い。固体担体の例は、ラクトース、白陶土、シュクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、あるいはセルロースの低級アルキルエステルである。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、および水である。
【０２２５】
同様に、担体あるいは希釈液は、単独あるいはワックスとの混合したグリセリルモノエステル酸あるいはグリセリルジエステル酸のように、技術において知られた任意の一様の開放原料を含む。
【０２２６】
固形担体が口腔投与にisusedの場合、調合は錠剤、粉末あるいはペレットの形で硬質のゼラチンカプセルにおさめたものであっても良く、あるいはトローチあるいはロゼンジの形においてでありうる。固形担体の量は、広く異なるが、通常約25 mgから約1 gである。
【０２２７】
慣習的な錠剤形成技術によって調合されても良い典型的な錠剤は：芯：活性的な化合物（遊離の化合物あるいはそれの塩として）100 mg; コロイド状シリコン二酸化物（エーロシル）1.5 mg; セルロース、微結晶（avicel）70 mg; 加工セルロースガム（Ac-Di-Sol）7.5 mg;ステアリン酸マグネシウムを含んでも良い。
【０２２８】
コーティング：HPMCおおよそ9 mg; *Mywacett 9-40Tおおよそ0.9 mg;フィルムコーティングのための可塑化剤として*acylated monoglyceride。
【０２２９】
液体担体が使用される場合、調合はシロップ、乳状液、軟質ゼラチンカプセルあるいは水性あるいは非水性の液体懸濁液あるいは溶液のような、滅菌した注射可能な液体の形であっても良い。
【０２３０】
組成物はまた、局所的あるいは全身的注射あるいは点滴に適した形であるかもしれず、およびそれ自体、滅菌水あるいは等張生理食塩水あるいはグルコース溶液でまとめられるかもしれない。組成物は、技術においてよく知られた、慣習的な滅菌技術によって滅菌されても良い。結果得られる水溶液は、使用に際して詰め込まれ、無菌条件下濾過され、凍結乾燥されるかもしれず、凍結乾燥標品は投与前に滅菌水溶液と合わせられる。組成物は、緩衝剤、浸透圧調整剤および同類、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのような、生理的条件に近づけるために必要な、薬理的に受容できる補助物質を含んでも良い。
【０２３１】
静脈注射のためのペプチドの形態
多投与形態は、滅菌、等張生理食塩水において本発明の化合物の溶液として調合され、蓋つきバイアルに保存されるかもしれず、必要であれば保存量が加えられる（例えば安息香酸塩）。固定した投与形態は、滅菌、等張生理食塩水において化合物の溶液として調合され、ガラスアンプルに保存され、必要であれば、不活性ガスで満たされても良い。化合物のそれぞれの投与は、アンプルあるいは蓋つきバイアル内に乾燥させて保存され、必要であれば、不活性ガスで満たされる。化合物の安定性が低いとき、固定した投与形態が使用されうる。ペプチドはまた静脈点滴濃縮液として形態化されても良い。
【０２３２】
鼻腔投与のために、調合は液体担体、特にエーロゾル適用のための水性担体に溶解したあるいは懸濁した本発明の化合物を含んでも良い。担体は、可溶化剤、例えばプロピレングリコールのような添加物、バイル酸塩あるいはポリオキシエチレン高級アルコールエステルのような表面活性剤、レシチン（フォスファチジルコリン）あるいはシクロデキストリンのような吸収増進剤、パラビンのような保存料を含んでも良い。
【０２３３】
さらに、大きなペプチドに比較して粘膜を介した比較的迅速な吸収は、特に十二指腸および回腸において酵素的分解を最小にするので、本発明のペプチド化合物の小さいサイズは、口腔および鼻腔投与に有利であっても良い。
【０２３４】
化合物2を含む腸錠剤の調合
400 mg L-タルタリック酸および40 mgポリエチレングリコールーhydrogenated castor oilは、5mlメタノールに溶解される。溶液は、あらかじめ30℃に暖めた乳鉢におかれる。この溶液に1.5 mgの化合物2が加えられる。化合物2の添加後すぐに、混合物は40℃の熱気流下、乳棒でかき混ぜられ、そして溶媒を除去するために、一晩真空下デシケーター内におかれる。結果生じる固形塊は、乳棒で粉状にされ、30 mgのsodium bicarboneteおよび少量の70%エタノールで練られる。そしてこの混合物は分けられ、錠剤に成形され、乾燥される。この乾燥した錠剤は、腸錠剤を得るためにヒドロキシプロピルメチルセルロースパサラットのコーティングを与えられる。
【０２３５】
本発明はまた、薬理的に活性を有する抗不整脈性ペプチド、あるいはペプチド誘導体、あるいは療法における使用、および療法における使用、例えば不整脈および急性虚血心疾患（例えば、安定狭心症、不安定狭心症、急性心筋梗塞）、うっ血性心不全（例えば、収縮期、拡張期、高拍出量、低拍出量、右あるいは左側心疾患）、先天性心疾患、肺心症、心筋症、心筋炎、高血圧性心疾患、のような心臓血管障害中、および冠状血管新生中の血栓症合併症の治療において、のための薬剤の組成物の製造のためにこの中に定義したようなそれらの使用のためにこの中に明らかにしたようにそれの機能的な類似体に関する。
【０２３６】
特殊な実施において、本発明にしたがった抗不整脈性ペプチドは、徐脈不整脈（例えば洞結節における疾患のため、AV結節、His束、右あるいは左束枝）および再入に関連した期外不整脈（例えば心房早期複合体、AV junctonal complexes、心室早熟複合体、心房細動、心房性粗動、発作性上室頻拍症、洞結節再入頻拍症、AV結節再入頻拍症、および非持続性心室頻拍症）の治療および／あるいは防止するために、単独であるいはI群の薬剤（例えばリドカイン）、II群の薬剤（例えばメトプロロールあるいはプロプラノロール）、III群の薬剤（例えばアミダロンあるいはソタロール）あるいはIV群の薬剤（例えばベラパミル）のような、他の抗不整脈化合物と組み合わせて使用されても良い。
【０２３７】
特殊な実施において、本発明に従う抗不整脈性ペプチドは、血管壁における疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、血小板生産増加（一般的な多血球血症）、および／あるいは減少した流量（心疾患、導管疾患）を有する患者における血栓症の出来事を単独あるいはGP IIb/IIIa阻害剤（例えば、c7E3 Fab; abciximab）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、アスピリン）、thromboxane A2 antagonists、coumadine誘導体（例えば、ワーファリン）、あるいは合成ペプチド、インテグリリンと組み合わせることで防止するのに使用されても良い。
【０２３８】
特殊な実施において、本発明に従う抗不整脈性ペプチドは、細胞間ギャップ結合に対するその効果のために、骨欠失の治療および／あるいは防止、および骨折の治癒を増加させ[93];血管新生の減少した軟骨および関節における疾患[94]を治療および／あるいは防止; 白内症[81]の治療および／あるいは防止；角膜の栄養失調による疾患状態における角膜の血管新生の治療および／あるいは防止、および角膜傷害の治癒を増加させ[95]；上皮細胞系統由来の癌細胞の様な、癌細胞の成長および転移を治療および／あるいは防止[96]；血管運動を増加させることによる高血圧を治療および／あるいは防止[74]；生物における細胞および器官のような移植物の拒絶を防止するのに使用されても良い。
【０２３９】
ペプチド合成
好ましい一般的な方法は、以下に述べられる。しかし、固相ペプチド合成のより詳細な記述は、WO98/11125においてみられ、これによってその全体に編入される。
【０２４０】
機器および合成手順
ペプチドは、N-a-アミノ保護基および側鎖機能性に適した共通の保護基として、9-フルオレニルメチロキシカルボニル（Fmoc）を使用する濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器において、バッチ法で合成された。
【０２４１】
溶媒
溶媒DMF (N,N-dimethylformamide, Riedel de-Haen, Germany)は、強力な陽イオン交換レジン（Lewatit S 100 MB/H strong acid, Bayer AG Leverkusen, Germany）を詰められたカラムを通過させることによって精製され、遊離のアミンが存在する場合に黄色（Dhbt-O-陰イオン）を生じる3,4-ジヒドロ3-ヒドロキシ4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン（Dhbt-OH）の添加によって、使用前に遊離のアミンを分析された。溶媒DCM (dichloromethane, analytical grade, Riedel de-Haen, Germany)は、精製なしで直接使用された。アセトニトリル (HPLC-grade, Lab-Scan, Dublin Ireland)は、精製せず直接使用された。
【０２４２】
アミノ酸
F-moc保護アミノ酸は、適切な側鎖保護型でAdvanced ChemTech(ACT)から購入された。異なる保護アミノ酸（Fmoc-Glu(OH)-OAllyl; Fmoc-Asp(OH)-OAllyl)はNovaBiochem (Switzerland)から、Fmoc-4-Hyp(OtBu)-OH;はBachemから）購入された。
【０２４３】
共役試薬
共役試薬ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）は、 Riedel de-Haen, Germanyから購入され、PyBopはAdvanced ChemTechから購入された。
【０２４４】
共役剤
（4-ヒドロキシメチルフェノキシ）酢酸（HMPA）は、 NovaBiochem, Switzerlandから購入され；DICによって生成された、あらかじめ生成された1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステルとして、レジンに共役された。
【０２４５】
固形支持体
Tentagel S resins 0.22-0.31 mmol/g (TentaGel-S-NH2; TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc; Rapp polymere, Germany)におけるFmoc法に従い、合成された。
【０２４６】
触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）は、Aldrich, Germanyから購入され、エチレンジアミンはFlukaから、ピペリジンおよびピリジンは、Riedel-de Haen, Frankfurt, Germanyから購入された。4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン（DMAP）は、Fluka, Switzerlandから購入され、対称的なアンハイドライドをともなう共役反応において触媒として使用された。エタンジオールは、 Riedel-de Haen, Frankfurt, Germanyから購入された。3,4-ジヒドロ3-ヒドロキシ4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン（Dhbt-OH）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(HOAt)は、Fluka, Switzerlandから得られた。
【０２４７】
カップリング方法
最初のアミノ酸は、適切なN-a-保護アミノ酸およびDICから生成されたDMFにおいて、対称的なアンハイドライドとしてカップリングされた。次のアミノ酸は、DMFにおけるDICによって適切なN-a-保護アミノ酸およびHOBtあるいはHOAtから生成され、in situで生成されたHOBtあるいはHOAtエステルとしてカップリングされた。アシル化は、試験中のFmoc脱保護を防止するように80℃で行った、ニンヒドリン試験によって点検された[97]。
【０２４８】
N-a-アミノ保護基（Fmoc）の脱保護
Fmoc基の脱保護は、DMFでの洗い (5×15 ml, 各5分間)によって続けられる、20% ピペリジンDMF溶液での処理（1×5および1×10分間)によって、排出したDMFにDhbt-OHの添加後、黄色が検出されなくなるまで、行われた。
【０２４９】
アリル基の脱保護
15-20 mlのCHCl3、酢酸、NMM (37:2:1)に溶解した3当量のPd(PPh3)4の溶液は、ペプチドレジンに加えられた。この処理は、室温で3時間続けられ、混合液中、窒素気流の泡立てによって同時に行われた。
【０２５０】
HOBt-エステルの共役
3当量のN-a-アミノ基保護アミノ酸は、3当量のHOBtおよび3当量のDICとともにDMFに溶解され、そしてレジンに加えられた。
【０２５１】
あらかじめ生成した対称的なアンハイドライド
6当量のN-a-アミノ基保護アミノ酸は、DCMに溶解され、0℃に冷却された。DIC (3当量)が加えられ、反応は10分間継続した。溶媒はin vacuo除去され、remanenceはDMFに溶解された。溶液は、即座にDMAPの0.1当量によって続けられるレジンに加えられた。
【０２５２】
レジン上のペプチドの環状化
1.5当量PyBopは、1.5当量HOBtとともにDMFに溶解され、3当量NMMはペプチドレジンに加えられた。反応は、一晩継続された。
【０２５３】
酸によるレジンからのペプチドの切断
ペプチドはレジンから、室温で2時間、95%トリフルオロ酢酸（TFA, Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany）-水v/vあるいは95% TFA-水および5%エタンジチオールv/vでの処理によって切断された。濾過されたレジンは、95% TFA-水で洗浄され、濾過物および洗浄液は減圧下、蒸発させた。残留物はエーテルで洗浄され、酢酸-水から凍結乾燥させた。粗製凍結乾燥産物は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析され、electrospray ionisation mass spectrometry (ESMS)によって同定された。
【０２５４】
TentaGelレジン上のバッチ法ペプチド合成（PEG-PS）
TentaGelレジン（1g, 0.22-0.31 mmol/g）は濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれた。レジンはDMF（15ml）で増加させ、レジン上プロトン化していないアミノ基の存在を保護するために20%ピペリジンDMF溶液で処理された。レジンは排出され、排出したDMFにDhbt-OHの添加後、黄色が検出されなくなるまで、DMFで洗浄された。
HMPA (3当量)は、上述したようにあらかじめ生成されたHOBt-エステルとして共役され、共役は24時間続けられた。レジンは排出され、DMFで洗浄され (5×5 ml, 各5分間)、アシル化はニンヒドリン試験によって点検された。最初のアミノ酸は、上述のように、あらかじめ生成された対称的なアンハイドライドとして共役された。配列に従い、次のアミノ酸は上述のように、あらかじめ生成されたFmoc保護されたHOBtエステル（3当量）として共役された。共役は他に明記しない限り、2時間続けられた。レジンは排出され、過剰の試薬を除去するためにDMFで洗浄された（5×15 ml, 各5分間）。全てのアシル化は、80℃で行われたニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンは、DMF（3×15 ml, 各5分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、最後にジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）で洗浄され、in vacuo乾燥された。
【０２５５】
HPLC条件
勾配HPLC分析は、HP1100 Quaternary Pump、HP1100 Autosampler、HP1100 Column ThermostatおよびHP1100 Multiple Wavelength Detectorから構成される、Hewlett Packard HP 1100 HPLC systemを使用して行われた。LC software (rev. A.06.01)のためのHewlett Packard Chemstationが、機器制御およびデータ取得のために使用された。次のカラムおよびHPLC緩衝液系が使用された：
【０２５６】
カラム
Kromasil, Phenomenex 00F-3033-E0, 329889 (new); 5mm C-18, 100A 150×4.6 mm; Batch nr. 5243-10.
バッファー系：A: 0.1% TFA in MQV; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.
勾配：
1-1.5分  25% B
1.5-13.5分 25-50% B
13.5-14.5分  50-100% B
14.5-15.5分  100% B
15.5-17.5分  100-25% B
17.5-20分  25% B
Flow 1.5 ml/min
Oven温度 40℃
UV検出：λ= 215 nm
Mass spectraはMicro-mass LCT instrumentで得られた。
【０２５７】
本発明はさらに、次の特殊な合成例によって説明される。
【０２５８】
個々のペプチドのペプチド合成
合成例1. TentaGel-S-NH2; Rapp polymere, Germany 上でのAc-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (化合物1）のペプチド合成。
一次バッチ：乾燥TentaGel-S-NH2 (0.27 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におき、N末端のチロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに無水酢酸（1 ml, 10.5mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製凍結乾燥品は、HPLCによって分析され、純度が70%以上であることが明らかにされ、ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 619.24, 計算値MH+ 619.26）。粗製品の収量は、137.7 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、58 mgのペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、35%だった。
二次バッチ：乾燥TentaGel-S-NH2 (0.27 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におき、N末端のチロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに無水酢酸（1 ml, 10.5mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製凍結乾燥品は、HPLCによって分析され、純度が70%以上であることが明らかにされ、ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 619.25, 計算値MH+ 619.26）。粗製品の収量は、137.3 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、27.9 mgのペプチド産物が、91%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、15.5%だった。
【０２５９】
合成例2. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAc-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (化合物2）のペプチド合成。
一次バッチ：乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におき、N末端のD-チロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに無水酢酸（1 ml, 10.5mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。凍結乾燥品の収量は、119.7 mgだった。ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 619.25, 計算値MH+ 619.28）。上述のような予備HPLCを使用した精製後、42 mgのペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、30%だった。
二次バッチ：乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におき、N末端のD-チロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに無水酢酸（1 ml, 10.5mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。凍結乾燥品の収量は、119.7 mgだった。ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 619.29, 計算値MH+ 619.28）。上述のような予備HPLCを使用した精製後、100 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、71%だった。
【０２６０】
合成例3. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (化合物3）のペプチド合成。
一次バッチ：乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して、環状化された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥され、57 mgの粗製品を生じた。上述のような予備HPLCを使用した精製後、2.7 mgの環状ペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、1..3%だった。ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 673.32, 計算値MH+ 673.28）。
二次バッチ：乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して、環状化された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥され、57 mgの粗製品を生じた。上述のような予備HPLCを使用した精製後、10 mgの環状ペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、7%だった。ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 673.30, 計算値MH+ 673.29）。
【０２６１】
合成例4. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Asn) (化合物4）のペプチド合成。
一次バッチ：乾燥TentaGel-S-NH2 (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して、環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、粗製品を生じるように酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、環状ペプチド産物が、収集された。
二次バッチ：乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して、環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、粗製品58.6 mgを生じるように酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、5.7 mgの環状ペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、4.4%だった。ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 616.25, 計算値MH+ 616.27）。
【０２６２】
合成例5. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (化合物5）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-NH2 (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、46.6 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、28.6%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 576.27, 計算値MH+ 576.26）。
【０２６３】
合成例6. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2 (化合物6）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、26 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、16.3%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 560.25, 計算値MH+ 560.28）。
【０２６４】
合成例7. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2 (化合物7）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、18.9 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、12.2%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 534.25, 計算値MH+ 534.26）。
【０２６５】
合成例8. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2 (化合物8）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は130 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、70.1 mgのペプチド産物が、94%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、48.2%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 520.25, 計算値MH+ 520.56）。
【０２６６】
合成例9. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2 (化合物9）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は131 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、72.4 mgのペプチド産物が、92%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、49%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 550.28, 計算値MH+ 550.59）。
【０２６７】
合成例10. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2 (化合物10）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は150.8 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、93.1 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、58%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 576.63, 計算値MH+ 576.63）。
【０２６８】
合成例11. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2 (化合物11）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は24.3 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、10.2 mgのペプチド産物が、91%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、4%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 602.23, 計算値MH+ 602.32）。
【０２６９】
合成例12. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2 (化合物12）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は29.9 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、19 mgのペプチド産物が、97%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、50%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 578.18, 計算値MH+ 578.23）。
【０２７０】
合成例13. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2 (化合物13）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は27.3 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、12.7 mgのペプチド産物が、97%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、34%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 546.28, 計算値MH+ 546.55）。
【０２７１】
合成例14. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH2 (化合物14）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は23.4 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、13.5 mgのペプチド産物が、97%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、34.6%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 574.32, 計算値MH+ 574.29）。
【０２７２】
合成例15. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAc-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物15）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のチロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。 N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに無水酢酸（1 ml, 10.5mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は89.9 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、80.1 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、58.9%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 618.30, 計算値MH+ 618.28）。
【０２７３】
合成例16. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2 (化合物16）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のシスチン（Acm）の共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は47.3 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、29.1 mgのペプチド産物が、97%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、12.9%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 924.50, 計算値MH+ 924.36）。
【０２７４】
合成例17. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Cys(Acm)-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2 (化合物17）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のシスチン（Acm）の共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は45.67 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、29.15 mgのペプチド産物が、94%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、14.9%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 796.25, 計算値MH+ 796.30）。
【０２７５】
合成例18. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys(Acm)-NH2 (化合物18）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のシスチン（Acm）の共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製凍結乾燥品はHPLCにより分析され、化合物17と同様の方法で特徴づけされた。
合成例19. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-NH2 (化合物19）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のシスチン（Acm）の共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、2.76 mgのペプチド産物が、94%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、17.9%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 796.25, 計算値MH+ 796.30）。
【０２７６】
合成例20.
【化３２】
0004327398.tif 000031
(化合物20）の合成。
19 mgのペプチドH-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys-NH2 は、1.5 ml (水およびDMSO 4: 1 v/v pH  〜6の溶液における5%酢酸溶液）にペプチドを溶解することによって酸化された。混合物は冷凍庫で6日間おかれた。
上述のような予備HPLCを使用した精製後、91 mgのペプチド産物が、97%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、47%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 652.29, 計算値MH+ 652.21）。
【０２７７】
合成例21.
【化３３】
0004327398.tif 000032
(化合物21)の合成。
32 mgのペプチドH-Cys-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH2 は、1.5 ml (水およびDMSO 4: 1 v/v pH 〜6の溶液における5%酢酸溶液）にペプチドを溶解することによって酸化された。混合物は冷凍庫で6日間おかれた。
上述のような予備HPLCを使用した精製後、6.13 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、3%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 652.23, 計算値MH+ 652.21）。
【０２７８】
合成例22. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH2 (化合物22）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、47 mgのペプチド産物が、94%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、30%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 576.26, 計算値MH+ 576.26）。
【０２７９】
合成例23. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asn-OH (化合物23）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は93.7 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、60.7 mgのペプチド産物が、93%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、47.5%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 690.32, 計算値MH+ 690.30）。
【０２８０】
合成例24. Ac-D-Tyr(3,5-di-I)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (化合物24)の合成。
40.6 mg (64mmol)のペプチド（化合物2）は、10 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解される。
75.6 mg KI (400mmol)は、10 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解され、120 Iodobeads (IODO-BEADS, N-chloro-benzensulfonamide, Oxidative capacity 0.55mmol/bead; PIERCE, 28665ZZ)が加えられ、溶液は室温に10分間おかれる（溶液B）。
溶液AおよびBは混合され、15分間穏やかにかき混ぜられる。ヨード化されたペプチドは単離され、上述のような予備HPLCを使用した精製後、39.5 mgのペプチド産物が、90%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 870.09, 計算値MH+ 870.08）。
【０２８１】
合成例25. Ac-D-Tyr(mono-Iodo)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (化合物25)の合成。
40.6 mg (64mmol)のペプチド（化合物2）は、10 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解される。
75.6 mg KI (400mmol)は、10 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解され、120 Iodobeads (IODO-BEADS, N-chloro-benzensulfonamide, Oxidative capacity 0.55 mmol/bead; PIERCE, 28665ZZ)が加えられ、溶液は室温に10分間おかれる（溶液B）。
溶液AおよびBは混合され、15分間穏やかにかき混ぜられる。ヨード化されたペプチドは単離され、上述のような予備HPLCを使用した精製後、3.3 mgのペプチド産物が、90%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 744.19, 計算値MH+ 744.18）。
【０２８２】
合成例26. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAc-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-(1,213C,15N-Gly)-D-Ala-(1,213C,15N-Gly)-NH2 (化合物26）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のD-チロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、N末端のアミノ基は、2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに無水酢酸（1 ml, 10.5mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は142.4 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、79.7 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、50%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 624.25, 計算値MH+ 624.26）。
【０２８３】
合成例27. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH2 (化合物27）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のプロリンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、135.7 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、82.7%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 690.38, 計算値MH+ 690.31）。
【０２８４】
合成例28. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物28）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端の4-ヒドロキシプロリンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備的HPLCを使用した精製後、127 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、69.8%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 690.25, 計算値MH+ 690.31）。
【０２８５】
合成例29. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (化合物29）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のサルコシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端のアミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は150 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、85.5 mgのペプチド産物が、93%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、57%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 604.33, 計算値MH+ 604.30）。
【０２８６】
合成例30. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (化合物30）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端のアミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は124 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、64.8 mgのペプチド産物が、96%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、41.6%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 590.19, 計算値MH+ 590.29）。
【０２８７】
合成例31. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物31）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のプロリンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、 N末端のアミノ基は上述のように標準的な共役方法を使用して、アジドサリチル酸でアセチル化された。共役は、一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、15.9 mgのペプチド産物が、94%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 575.23, 計算値MH+ 575.56）。
【０２８８】
合成例32. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのASAL(mono-iodo)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物32）のペプチド合成。
10.3 mg のペプチド（化合物31）は、2.5 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解される。
18.9 mg KI (100mmol)は、2.5 ml リン酸緩衝液 pH 6.5に溶解され、30 Iodobeads (IODO-BEADS, N-chloro-benzensulfonamide, Oxidative capacity 0.55 mmol/bead; PIERCE, 28665ZZ)が加えられ、溶液は室温に10分間おかれる（溶液B）。溶液AおよびBは混合され、1時間穏やかにかき混ぜられる。ヨード化されたペプチドは単離され、上述のような予備HPLCを使用した精製後、4.4 mgのペプチド産物が、90%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 701.13, 計算値MH+ 701.46）。
【０２８９】
合成例33. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物33）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のチロシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、 N末端のアミノ基は上述のように標準的な共役方法を使用して、アジドベンゾイチック酸でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、20.5 mgのペプチド産物が、90%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 721.28, 計算値MH+ 721.26）。
【０２９０】
合成例34. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAB-Tyr(3,5-di-iodo)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物34）のペプチド合成。
10.3 mg のペプチド（化合物33）は、2.5 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解される。
18.9 mg KI (100mmol)は、2.5 ml リン酸緩衝液 pH 6.5に溶解され、30 Iodobeads (IODO-BEADS, N-chloro-benzensulfonamide, Oxidative capacity 0.55 mmol/bead; PIERCE, 28665ZZ)が加えられ、溶液は室温に10分間おかれる（溶液B）。溶液AおよびBは混合され、1時間穏やかにかき混ぜられる。ヨード化されたペプチドは単離され、上述のような予備HPLCを使用した精製後、1.2 mgのペプチド産物が、90%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 973.08, 計算値MH+ 973.46）。
【０２９１】
合成例35. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-) (化合物35）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Glu(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Gln）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のグリシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は135.3 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、19.1 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、6.6%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 687.38, 計算値MH+ 687.32）。
【０２９２】
合成例36. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-) (化合物36）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のグリシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は63.4 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、13.2 mgのペプチド産物が、97%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、6.2%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 673.38, 計算値MH+ 673.30）。
【０２９３】
合成例37. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-) (化合物37）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のグリシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は85.1 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、9.8 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、3.5%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 657.38, 計算値MH+ 657.31）。
【０２９４】
合成例38. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(Tyr(3,5-diiodo)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (化合物38）のペプチド合成。
10.8 mg のペプチド（化合物3）は、2.5 ml 0.1Mリン酸緩衝液 pH 6.5 (溶液A）に溶解される。
18.9 mg KI (100mmol)は、2.5 ml リン酸緩衝液 pH 6.5に溶解され、30 Iodobeads (IODO-BEADS, N-chloro-benzensulfonamide, Oxidative capacity 0.55 mmol/bead; PIERCE, 28665ZZ)が加えられ、溶液は室温に10分間おかれる（溶液B）。溶液AおよびBは混合され、2時間穏やかにかき混ぜられる。ヨード化されたペプチドは単離され、上述のような予備HPLCを使用した精製後、9.8 mgのペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 925.10, 計算値MH+ 925.30）。
【０２９５】
合成例39. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (化合物39）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端のアミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は124 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、26.5 mgのペプチド産物が、96%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、20.5%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 480.24, 計算値MH+ 480.50）。
【０２９６】
合成例40. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAc-Gly-Asn-Tyr-NH2 (化合物40）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。Fmoc基の脱保護後、 N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに、無水酢酸（1 ml, 10.5 mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のアシル化後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は90.4 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、63.4 mgのペプチド産物が、99%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、65.1%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 394.16, 計算値MH+ 394.20）。
【０２９７】
合成例41. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Asn-Tyr-NH2 (化合物41）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は、一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は91.4 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、62.1 mgのペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、54.5%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 352.16, 計算値MH+ 352.18）。
【０２９８】
合成例42. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのAc-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (化合物42）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のアラニンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。Fmoc基の脱保護後、 N末端のアミノ基は2 ml DMFに溶解した100 mlピリジンとともに、無水酢酸（1 ml, 10.5 mmol）でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のアシル化後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は105 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、52 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、45%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 465.22, 計算値MH+ 465.30）。
【０２９９】
合成例43. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (化合物43）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のアラニンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は、一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は104.5 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、77.8 mgのペプチド産物が、96%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、58.8%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 423.19, 計算値MH+ 423.28）。
【０３００】
合成例44. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) (化合物44）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は60.2 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、5.0 mgのペプチド産物が、87%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、4.3%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 564.25, 計算値MH+ 564.57）。
【０３０１】
合成例45. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-) (化合物45）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は79.1 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、20 mgのペプチド産物が、90%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、14.0%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 569.25, 計算値MH+ 569.67）。
【０３０２】
合成例46. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-) (化合物46）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は58.9 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、15.9 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、11%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 740.31, 計算値MH+ 740.75）。
【０３０３】
合成例47. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのシクロ(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-) (化合物47）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。最初のアミノ酸Fmoc-Asp(OH)-OAll は、切断後、最終的にアミド化された（Asn）で終わるように、側鎖カルボキシル酸を介してTentaGel-S-Ram に結合された。“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べた方法は、N末端のチロシンの共役が終了するまで続けられた。全ての共役は一晩継続された。Fmoc基およびアリル基の脱保護後（上述の方法にしたがって）、レジンに結合したペプチドは、上述のように共役試薬としてPyBopを使用して環状化され、共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。合成完了後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドは上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は54.1 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、19.6 mgのペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、15%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 649.10, 計算値MH+ 649.68）。
【０３０４】
合成例48. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (化合物CE-1）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-NH2 (0.27 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は、一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。上述のような予備HPLCを使用した精製後、16.9 mgのペプチド産物が、92%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、10.1%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 471.22, 計算値MH+ 471.21）。
【０３０５】
合成例49. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上でのH-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (化合物CE-2）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のグリシンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は、一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。N末端アミノ基のFmoc基の脱保護後、ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は159 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、101 mgのペプチド産物が、98%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、60%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 576.26, 計算値MH+ 576.26）。
【０３０６】
合成例50. TentaGel-S-Ram; Rapp polymere, Germany 上での3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (化合物CE-3）のペプチド合成。
乾燥TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1 g)は、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器におかれ、N末端のプロリンの共役が終了するまで、“TentaGelレジン上でのバッチ法ペプチド合成”の項目下に述べたように処理された。全ての共役は、一晩継続された。Fmoc基の脱保護後、N末端アミノ基は上述のように標準的な共役方法を使用して、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸でアセチル化された。共役は一晩継続された。アシル化は、前述のように80℃で行うニンヒドリン試験によって点検された。 ペプチド-レジンはDMF（3×15 ml, 各1分間）、DCM（3×15 ml, 各1分間）、ジエチルエーテル（3×15 ml, 各1分間）、で洗浄され、in vacuo乾燥された。
ペプチドはレジンから上述のように切断され、酢酸中から凍結乾燥された。粗製品の収量は143 mgだった。上述のような予備HPLCを使用した精製後、73.7 mgのペプチド産物が、95%以上の純度で収集された。精製したペプチド産物の全体の収量は、50%だった。
ペプチドの同一性はES-MSによって確認された（実測値MH+ 561.30, 計算値MH+ 561.24）。
【０３０７】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】    図1は、ペプチド配列の環状化に有効な様々な原理の図解である。
【図２】    図2は、単離したギニアピッグ筋芽細胞における、化合物2（10-8 M）あるいは溶液のみでの刺激前および間の時間の機能として、細胞間コンダクタンスGjにおける相対的な変化を示す。コンダクタンスにおける変化は、化合物2での灌流直前のコンダクタンスに比較してパーセントの変化として表わされる。
【図３】    図3は、新生ウィスターラットから単離した心筋細胞の培養において、グルコースおよび酸素欠乏の10分間に続く、ノルアドレナリン濃度の機能として、イノシトールリン酸（PI）回転速度を示す。
【図４】    図4は、心筋細胞培養に加えられた場合に、虚血およびグルコース飢餓によって誘導された代謝ストレス中のイノシトールリン酸回転速度における、減衰したノルアドレナリン誘導の増加に対する化合物2の効果を示す。
【図５】    図5は、4種類の連続する灌流プロトコル中の電気的分散（APD90分散）の程度として、APD90の標準偏差の測定を示す。*は溶液のみの処理群と比較してp<0.05を示す。
【図６】    図6は、プルキンエ層が環状動脈閉塞後、約2時間刺激されるイヌ心臓の、左上に心外膜（EPI）の活性化平面および最後の未成熟刺激の右に下って描写した心外膜下の（S-EPI）、MIDWALL、心内膜下（S-ENDO）の、心内膜（ENDO）のおよびプルキンエの（PURK）平面を有する活性化地図である。
【図７】    図7は、例が図6, 7, 8, 9において示され、VTの4複合体を保証する2番目から5番目の外刺激中（E-Lにおいてよくみられる）、表面lead ECG IIおよびV5Rで記録される、同じイヌにおける心外膜（E-）の電気図を図解する。電気図は、側面の、境界領域（L）の律動部位、およびE-Cの東（E）、北（N）、中心（C）、心外膜下（SE）、E-Cの下、と同様に、南（S）、および北西（NW）、および南西（SW）から記録される。
【図８】    図8は、表面QRSの開始前-44 msecで開始し、図7においてE-Cで記録された電気図に対応する、心室頻拍の第一複合体の、外心膜活性化を図解する。活性化は、最初に-17 msecで活性化する二重ループ再入において先行し、そして北西ループにおける57 msecに先行する。2 msecで最初に活性化する南東ループは、31 msecそして57 msecに活性化する。
【図９】  図9は、図7において示された同じイヌからの同じleadを示す。この図は、図7で使用したのと同じ部位の刺激中に記録された、心外膜の（E-）電気図を図解するが、化合物2の静脈投与後のものである。30分後に化合物2の2回目の投与が行われ、さらに30分後に3回目の投与が行われた。抗不整脈性ペプチドが投与された後、1時間30分までこれらの投与のどの投与後にもVTは、誘導されなかった。
【図１０】  図10は、ヒト骨芽細胞における細胞間カルシウムウェーブの伝播に対する、1×10-8 Mの化合物2の短期間の効果を示す。化合物2の容器中の溶液への添加前（1）および10分後（2）、ウェーブにおける細胞数がプロットされる。
【図１１】    図11は、低酸素条件（5% O2）下培養された、ROS 17/2.8細胞への化合物2の添加前（1）および10分後（2）にプロットされた、カルシウムウェーブにおける細胞数を示す。
【図１２】    図12は、低酸素条件下（3-6% O2）培養されたROS 17/2.8細胞における、染料移動を図解する。共役した細胞数は、1×10-8 Mの化合物2の容器中の溶液への添加前（1）および10分後（2）、プロットされる。
【図１３】    図13は、低血糖条件下、ヒト骨芽細胞において細胞間カルシウム伝播に対する1×10-8 Mの化合物2の短期間の効果を図解する。図は、低血糖症中（1）および低血糖の容器中溶液への化合物2の添加後10分間（2）のウェーブにおける細胞数を示す。
【図１４】    図14は、ヒト骨芽細胞の培養におけるアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を示す。ALP活性は、骨芽細胞の活性の程度である。ALPは、それぞれの培養において、10-13から10-6 Mの化合物2での4日間の刺激を経て計測され、および非処理の対照に比較された。処理および非処理培養におけるALP活性間の割合が、化合物のそれぞれの濃度に対してプロットされた。化合物2は、10-13から10-7 Mの濃度範囲における全ての濃度で、 ALP活性、およびこのように骨芽細胞活性を刺激した。
【図１５】    図15は、13 mM DDT、化合物1,1-ビス(p-クロロフェニル)-2,2,2-トリクロロエタンで処理された、ヒト骨芽細胞におけるLucifer Yellow（LY）染料移動における化合物2の効果を示す。10-8 Mの化合物2での10分間インキュベートは、全ての実験において染料共役細胞の数における増加を生じた（1は、容器への化合物2の添加前を表わし、2は添加後を示した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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