(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）リーダー配列なしの（ａ）で定義されるポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるポリペプチドの融合タンパク質、化学的に改変された誘導体およびそれらの混合物；
からなる群より選択され、ＩＬ−１８に結合し、ＩＬ−１８に誘導されたＩＦＮ−γ産生を遮断するＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）。
【請求項２】
非ウイルスタンパク質である請求項１記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項３】
ヒトのタンパク質である請求項２記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項４】
約４０ｋＤの分子量を有する請求項１、２または３記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項５】
融合タンパク質が免疫グロブリンまたはその断片からなる請求項１、２、３または４記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項６】
ＩｇＧ２重鎖の定常領域に融合されたＩＬ−１８ＢＰから選択される融合タンパク質である請求項５記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項７】
化学的に改変された誘導体がポリエチレングリコール側鎖を含む請求項１、２、３、４、５または６記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項８】
可溶性形態における請求項１、２、３、４、５、６または７記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項９】
グリコシル化ＩＬ−１８ＢＰである請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項１０】
非グリコシル化ＩＬ−１８ＢＰである請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のＩＬ−１８ＢＰ。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
３′末端に終止コドンをもつ請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号１のＤＮＡ配列からなるＤＮＡであって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
プロモーターおよびエンハンサーなどの発現を促進する他のＤＮＡ配列に機能的に連結させた請求項１１、１２または１３記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
ゲノムＤＮＡである請求項１１、１２、１３または１４記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
ｃＤＮＡである請求項１１、１２、１３、１４または１５記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号１のＤＮＡ配列からなる請求項１６記載のｃＤＮＡ。
【請求項１８】
細菌宿主における発現用に適合されている請求項１６または１７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８記載のＤＮＡからなる複製可能なベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載のベクターからなる形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
真核細胞である請求項２０記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
哺乳類細胞である請求項２１記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２３】
ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から選択される請求項２２記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
原核細胞である請求項２０記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のＩＬ−１８ＢＰの産生方法であって、該ＩＬ−１８ＢＰの発現に適する条件下で請求項２０、２１、２２、２３または２４記載の宿主細胞を培養すること、および該ＩＬ−１８ＢＰを単離することからなる方法。
【請求項２６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体。
【請求項２７】
ポリクローナル抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項２８】
モノクローナル抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項２９】
抗イディオタイプ抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項３０】
キメラ抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項３１】
ヒト化抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項３２】
請求項１記載のＩＬ−１８ＢＰの単離方法であって、
（ａ）ヒトの体液をＩＬ−１８が結合するクロマトグラフのカラムに通すこと、
（ｂ）ＩＬ−１８に結合できるタンパク質を溶出すること、および
（ｃ）該タンパク質を精製すること
からなる方法。
【請求項３３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０記載のＩＬ−１８ＢＰからなるＩＬ−１８阻害剤。
【請求項３４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０記載のＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡからなるＩＬ−１８阻害剤。
【請求項３５】
ＩＬ−１８の精製用の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のＩＬ−１８ＢＰの使用。
【請求項３６】
ＩＬ−１８ＢＰの検出検定における請求項２６、２７、２８、３０または３１記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の分野］
本発明は、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）結合タンパク質、以下ＩＬ−１８ＢＰという、ＩＬ−１８に結合できるタンパク質に関する。さらに詳細には、本発明は、体液から得られる可溶性ＩＬ−１８ＢＰ、宿主細胞における適したＤＮＡベクターの発現により得られる可溶性ＩＬ−１８ＢＰ、宿主細胞における適したＤＮＡベクターの発現により得られるＩＬ−１８ＢＰのウイルスがコードするホモログ、多様なＩＬ−１８ＢＰを発現するベクター、ヒトおよび他の哺乳類におけるＩＬ−１８ＢＰの発現に有用なベクター、ＩＬ−１８ＢＰに対する抗体、ＩＬ−１８活性を調節および／または遮断することによる該ＩＬ−１８ＢＰの治療用途、ＩＬ−１８活性の調節および／または遮断における該発現ベクターの治療用途ならびに該抗体の用途に関する。
【０００２】
［本発明の背景］
１９８９年に、マウスの脾臓細胞から得られるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を誘導した内毒素誘導性血清活性が記述された（27）。この血清活性は、ＩＦＮ−γの直接的な誘導物質としてではなく、ＩＬ−２または分裂促進因子とともに共刺激物質として機能した。内毒素後（post-endotoxin）のマウス血清から該活性を精製する試みにより、見かけ上均質な５０〜５５ｋＤａのタンパク質が明らかになった（26）。他のサイトカインはＩＦＮ−γ産生のための共刺激物質として作用し得るので、該血清活性を中和するためのＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６またはＴＮＦに対する抗体を中和できないことから、それが異なる因子であることが示唆された。１９９５年に、同一の科学者により、ＩＦＮ−γ産生のための内毒素誘導性共刺激物質が挫瘡プロピオンバクテリウム（P. acnes）で前調整したマウスからの肝臓抽出物に存在することが立証された（31）。このモデルでは、肝臓マクロファージ集団（クッパー細胞）が増大し、前調整されていないマウスにとっては死に到ることのない低用量の細菌リポ多糖（ＬＰＳ）がこれら前調整したマウスにとっては致死的になる。その因子は、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）と名づけられ、後にインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）と称されるが、１２００グラムの挫瘡プロピオンバクテリウムで処理したマウスの肝臓から均質に精製された。精製されたＩＬ−１８のアミノ酸配列に由来する縮重オリゴヌクレオチドはマウスＩＬ−１８ ｃＤＮＡをクローニングするために用いられた（31）。ＩＬ−１８は１５７アミノ酸からなる１８〜１９ｋＤａのタンパク質であり、データベースによればいかなるペプチドに対しても明らかな類似性を有していない。ＩＬ−１８およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のメッセンジャーＲＮＡは、クッパー細胞で容易に検出され、マクロファージを活性化した。組換え体ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２よりも強力に、明らかに異なる経路を介してＩＦＮ−γを誘導する（31）。内毒素で誘導された血清活性と類似して、ＩＬ−１８はそれ自体でＩＦＮ−γを誘導しないが、主として分裂促進因子またはＩＬ−２との共刺激物質として機能する。ＩＬ−１８は明らかにＩＬ−２依存性経路を介してＴ細胞の増殖を強化し、インビトロでＴｈ１サイトカイン産生を強化し、ならびにＩＬ−１２と組み合わせた際に強化されたＩＦＮ−γの産生に関して相乗作用を示す（24）。
【０００３】
マウスＩＬ−１８に対する抗体の中和により、挫瘡プロピオンバクテリウムで前調整されたマウスにおける低用量ＬＰＳの致死を防げることが示された。他にも、前調整されたマウスにおけるＬＰＳ致死の媒介物質としてのＩＦＮ−γの重要性を報告した。たとえば、抗−ＩＦＮ−γ抗体の中和はシュワルツマン様のショックからマウスを防御し（16）、ＩＦＮ−γ受容体が欠損したガラクトサミン処理のマウスはＬＰＳ誘導死に耐性であった（7）。したがって、マウスＩＬ−１８抗体の中和は、挫瘡プロピオンバクテリウムで前調整したマウスを致死性ＬＰＳから防御したことは予期できないものではなかった（31）。抗マウスＩＬ−１８処理はまた、生存マウスを重篤な肝性細胞障害から防御した。
【０００４】
マウスの形態がクローニングされた後、１９９６年にＩＬ−１８のヒトｃＤＮＡ配列が報告された（38）。組換えヒトＩＬ−１８は天然のＩＬ−１８活性を示す（38）。ヒト組換えＩＬ−１８は、ヒトＴ細胞において直接的なＩＦＮ−γ誘導活性はないが、ＩＦＮ−γおよび他のＴヘルパー細胞−１（Ｔｈ１）サイトカインの産生のための共刺激物質として作用する（38）。これまでに、ＩＬ−１８は、主としてＴｈ１サイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）（20）のための共刺激物質として、またマウスのナチュラルキラー細胞クローンのＦＡＳリガンド媒介性細胞障害のための共刺激物質としてみなされる（37）。
【０００５】
冒された組織からＩＬ−１８をクローニングし、ＩＬ−１８遺伝子の発現を研究することにより、このサイトカインと自己免疫病との密接な関連性が見出された。非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、自己免疫インスリン炎および糖尿病が自然に進行し、シクロフォスファミドの単一注射によって促進し、同時進行しうる。ＩＬ−１８ ｍＲＮＡは、インスリン炎の初期段階のＮＯＤマウスの膵臓における逆転写酵素ＰＣＲによって証明された。ＩＬ−１８のレベルは、シクロフォスファミド処理後に急速に増加し、ＩＦＮ−γｍＲＮＡの増加より前に起き、その後糖尿病になった。興味深いことに、これらの動態はＩＬ−１２−ｐ４０ ｍＲＮＡのそれと似ており、各ｍＲＮＡレベルの密接な関係に帰結する。膵臓ＲＮＡからＩＬ−１８ ｃＤＮＡをクローニングし、続いて塩基配列を決定することにより、クッパー細胞およびインビボで前活性化されたマクロファージからクローニングされたＩＬ−１８配列との同一性を明らかにした。また、ＮＯＤマウスマクロファージは、ＩＬ−１８遺伝子発現によりシクロフォスファミドに応答し、一方、平行して処置されたＢａｌｂ／ｃマウスのマクロファージは応答しなかった。したがって、ＩＬ−１８発現は、自己免疫ＮＯＤマウスにおいて異常に調節され、糖尿病の進行と密接に関連している（32）。
【０００６】
ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞上のＦａｓリガンドの機能的活性を増大することにより、免疫調節または炎症における潜在的役割を果たしている（10）。ＩＬ‐１８はまた、腎皮質で発現し、したがって分泌された神経−免疫調節物質であり、ストレスの多い実験後に免疫系を統制する重要な役割を果たしている可能性がある（９）。
【０００７】
インビボで、ＩＬ−１８はプロＩＬ−１８の切断によって形成され、その内在活性が挫瘡プロピオンバクテリウムにおけるＩＦＮ−γ産生およびＬＰＳ−媒介性致死の原因となるらしい。その活性のため、ヒトの疾病におけるＩＬ−１８の生物学的活性を遮断することが、多くの疾病における治療上の戦略である。これは、可溶性受容体を用いることで、または細胞に結合したＩＬ−１８受容体に対する抗体を遮断することで成し遂げられ得る。
【０００８】
サイトカイン結合タンパク質（可溶性サイトカイン受容体）は、各々の細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインに相当する。それらは、細胞表面受容体に共通なプレｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、または細胞表面受容体のタンパク質分解性切断により誘導される。とりわけ、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ（30）、ＴＮＦ（11、12）、ＩＬ−１およびＩＬ−４（21）、ＩＦＮ−α／β（28、29）などを含む可溶性受容体が過去に記載されてきた。オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、破骨細胞阻害因子としても知られる−ＯＣＩＦ）と呼ばれ、ＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーのメンバーである１つのサイトカイン結合タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例であるらしい（１、34、39）。
【０００９】
［本発明の要旨］
本発明は、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）およびウイルスにコードされたＩＬ−１８ＢＰのホモログ（以下、ウイルスＩＬ−１８ＢＰという）、ならびにＩＬ−１８に結合可能なその融合タンパク質、突然変異タンパク質、機能的誘導体、活性断片、および環状変更された誘導体を提供する。本発明はまた、ヒトの体液からＩＬ−１８ＢＰを単離する方法、および組換え手段によってそれらを得るための方法を提供する。本発明はまた、ヒトおよび他の哺乳類におけるＩＬ−１８ＢＰの発現に適したＩＬ−１８ＢＰの発現ベクターも提供する。本発明の特異的ＩＬ−１８ＢＰ、そのウイルスにコードされたＩＬ−１８ＢＰのホモログ、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片および環状変更された誘導体は、ＩＬ−１８の生物学的活性を調節および／または遮断するために有用である。
【００１０】
宿主細胞における多様なＩＬ−１８ＢＰの発現に適したＤＮＡを含む複製可能な発現ビヒクル、それで形質転換された宿主細胞、ならびにそのような宿主の発現によって産生されるタンパク質およびポリペプチドもまた提供される。
【００１１】
本発明はさらに、ヒトおよび他の哺乳類における発現のため、ＩＬ−１８活性の調節または遮断を要する疾病または症状の治療のため、適切なビヒクルおよびＩＬ−１８ＢＰ、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、またはベクターからなる医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、アフィニティー精製および免疫検定に適したＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰに対する抗体を提供する。
【００１３】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、ＩＬ−１８に結合する多様なＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰに関する。そのようなＩＬ−１８ＢＰは、ＩＬ−１８の生物学的活性を調節および／または遮断しうる。「ＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰ」という用語には、（シグナル配列なしの）成熟タンパク質、シグナル配列、ＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質、ＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰの誘導体ならびにＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰの短縮形態ならびにそれらの塩からなるタンパク質が含まれる。
【００１４】
本発明はさらに、宿主細胞および宿主細菌における多様なＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの発現に適した複製可能な発現ビヒクルに関する。本発明はさらに、ヒトおよび他の哺乳類における多様なＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの発現に適した発現ベクターに関する。
【００１５】
本発明はさらに、多様なＩＬ−１８ＢＰ、そのウイルスＩＬ−１８ＢＰ、突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分および混合物をコードするＤＮＡに関する。該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲ産物またはその組合せでありうる。本発明にしたがって、宿主細胞における多様なＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰの発現のために、これらのＤＮＡは複製可能な発現ビヒクルに挿入されうる。ストリンジェントな条件下で上記のＤＮＡにハイブリダイズでき、ならびにＩＬ−１８に結合もできるタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡもまた本発明に含まれる。
【００１６】
そのようなＤＮＡの１つは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、３′末端に終止コドンをもつＩＬ−１８ＢＰをコードする。
【００１７】
ヒトおよび他の哺乳類における多様なＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの発現用、すなわち遺伝子治療用に適した発現ベクターは、ウイルスベクターまたは他のタイプのベクターであり得、ヒトおよび他の哺乳類におけるＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの効率的な発現を可能にする方法で該ベクターにＩＬ−１８ＢＰ遺伝子またはＩＬ−１８ＢＰ ｃＤＮＡまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡが挿入された。ストリンジェントな条件下で上記のＤＮＡにハイブリダイズし、ＩＬ−１８に結合できるタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡもまた本発明に含まれる。
【００１８】
ＩＬ−１８ＢＰの単離は、たとえば尿または血清などのヒト体液をＩＬ−１８が結合するクロマトグラフィーカラムに通し、その後、結合したＩＬ−１８ＢＰを溶出するなどにより、本発明にしたがって実施されうる。
【００１９】
多様なＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰもまた、組換え手段、すなわち、たとえば正しい方向で発現させる特定の宿主に適したプロモーター、発現エンハンサー、調節配列などを機能的に連結した後、適切な宿主でＩＬ−１８ＢＰを発現することにより調製されうる。
【００２０】
多様なＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰおよびヒトおよび他の哺乳類におけるＩＬ−１８ＢＰを発現するためのベクターが、治療、およびＩＬ−１８が関与する、または外因的に投与されたもしくは内因的に産生された過剰のＩＬ−１８によって生じる症状の緩和に使用され得る。そのような症状には、たとえば自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、移植拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、虚血性心臓病（心臓発作を含む）、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎、急性膵炎などがある。
【００２１】
本発明にしたがって、ＩＬ−１８ＢＰが、１回のクロマトグラフ段階により正常なヒトの尿から単離された。５００Ｌの正常なヒトの尿から濃縮された未精製のヒト尿タンパク質の調製物をアガロースに結合させたヒトＩＬ−１８からなるカラムにかけた。カラムを洗浄し、結合タンパク質を低ｐＨで溶出した。溶出画分を中和し、アリコートを非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）および銀染色によって分析した。約４０ｋＤのタンパク質バンドが溶出画分から特異的に得られた（図１）。
【００２２】
第１段階で得られた約４０ｋＤのタンパク質は、125Ｉ−ＩＬ−１８と特異的に架橋できるＩＬ−１８結合タンパク質として同定された（図２）。約４０ｋＤのタンパク質はさらにＮ末端タンパク質配列分析によって特徴決定された。溶出されたタンパク質からのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングされ、タンパク質マイクロ配列分析にかけた。同様に、溶出タンパク質からのアリコートを直接タンパク質マイクロ配列分析にかけた。両方の場合で、２つのポリペプチド配列が得られた。主要配列と少数配列であり、後者はアミノ酸６５で始まるヒトのデフェンシン（登録番号ｐ１１３９８）断片に相当する。既知のデフェンシン配列を消去により、下記の配列が与えられた：
【００２３】
【配列表１】
0004272348.tif 000002
【００２４】
ｘはまだ未決定のアミノ酸を示す。
【００２５】
より長くより正確な配列を得るために、ならびに潜在的なシステイン残基を同定するために、変性条件下で溶出画分のアリコートをＤＴＴで還元し、４−ビニルピリジンと反応させ、マイクロ限外ろ過装置（ウルトラフリー（Ultrafree）、カットオフ１０，０００Ｄａ、ミリポア（Millipore）社）によって脱塩し、タンパク質マイクロ配列分析にかけた。配列決定サイクル１番を行った後、プロリン以外の全てのＮ末端ポリペプチドを遮断するために残りのタンパク質をｏ−フタルアルデヒドと反応させた後、配列決定を再開した。この方法で、以下のただ１つのタンパク質配列が得られた：
【００２６】
【配列表２】
0004272348.tif 000003
【００２７】
（T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=未決定;A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu）
得られた配列は、タンパク質データベースを調査することによって決定された他の既知タンパク質の配列とは有意に異なっている。しかし、ｃＤＮＡファイルを備えたｔｂｌａｓｔｎ研究プログラムによるゲノム研究機関（The Institute of Genomic Research（TIGR）、HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov）のデータベースを調査することにより、ＴＨＣ１２３８０１であることが示され、翻訳されるその読みとり枠（２１８コドン）は、ＩＬ−１８ＢＰのＮ末端配列に高い相同性を示す配列を含む。ここに相同性が示される：
【００２８】
【配列表３】
0004272348.tif 000004
【００２９】
（上段配列（１〜４０）は本発明にしたがって単離されたＩＬ−１８ＢＰの配列であり、下段配列（５１〜１００）はＴＩＧＲファイルＴＨＣ１２３８０１のｃＤＮＡの翻訳によって推定される）。
【００３０】
しかしながら、ＴＨＣ１２３８０１として同定されたｃＤＮＡ配列は、ＥＳＴ（発現された配列タグ（expressed sequence tag））のみであり、すなわち任意に選択されたｃＤＮＡクローンである。このＥＳＴが読み取り枠を含むか否か、タンパク質がＥＳＴに相当する遺伝子またはＥＳＴ自身から発現されるか否か、同定されているＴＨＣ１２３８０１によってコードされるタンパク質のいかなるも有さないのかは分析されていない。ＴＨＣ１２３８０１がＩＬ−１８ＢＰをコードする読み取り枠を含むという情報は全く入手されなかった。
【００３１】
アフィニティー精製された尿ＩＬ−１８ＢＰは、標識されたリガンド（125Ｉ−ＩＬ−１８）に結合する能力および次の共有結合架橋を保持し、分子量５８ｋＤの複合体が形成された。この複合体の分子量は、１：１割合の約４０ｋＤのＩＬ−１８ＢＰおよび１９ｋＤのＩＬ−１８に相当する（図２）。
【００３２】
アフィニティー精製された尿ＩＬ−１８ＢＰは、ヒトおよびマウスＩＬ−１８の生物学的活性を遮断した。したがって、ＩＬ−１８ＢＰをヒトまたはマウスＩＬ−１８のいずれかに添加した時、ＩＬ−１８がマウスの脾臓細胞の培養にリポ多糖（ＬＰＳ）とともに添加するとインターフェロン‐γの産生を誘導する能力を遮断した（図３）。
【００３３】
本記載の目的のために、「ＩＬ−１８の生物学的活性」という表現は、とりわけ下記の生物学的性質の少なくとも１つを指す：
（ｉ）単核細胞、マウス脾細胞、ヒト末梢血単核細胞、ヒトＫＧ−１細胞系統およびＴ細胞などの多様な細胞型において分裂促進因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＬＰＳとともに主として共刺激物質としてＩＦＮ−γの誘導、
（ii）Ｔ細胞増殖の増強、
（iii）主として共刺激物質としてインビトロでのＴｈ−１サイトカイン産生の増強、
（iv）増強されたＩＦＮ−γ産生に関するＩＬ−１２との相乗作用、ＩＦＮ−γおよび他のＴヘルパー細胞−１サイトカインの産生ための共刺激作用、
（ｖ）マウスナチュラルキラー細胞クローンのＦＡＳリガンド媒介性細胞障害のための共刺激作用、
（vi）おそらく５０ＮＦ−κＢホモダイマーおよびｐ６５／ｐ６０ ＮＦ−κＢヘテロダイマーの形成を誘導することにより、ヒトＫＧ−１細胞におけるＮＦ−κＢの活性の誘導、
（vii）ＩＬ−８の誘導。
【００３４】
本明細書で用いられるように、「ＩＬ−１８への結合」という表現は、たとえば本明細書の実施例２のようにアフィニティー精製時に標識ＩＬ−１８への結合によって証明されるようなＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８への結合能を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられるように、「ＩＬ−１８の活性を調節する」という表現は、遮断以外のたとえば部分的阻害、増強などのＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８活性の調節能を意味する。
【００３６】
本明細書で用いられるように、「ＩＬ−１８の活性を遮断する」という表現は、ＩＬ−１８の上記に例示した生物学的活性の少なくとも１つを遮断するためのＩＬ−１８ＢＰの活性を指す。ＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８遮断活性は、マウスの脾細胞におけるＩＬ−１８関連ＩＦＮ−γ発現を遮断するためのＩＬ−１８ＢＰの能力によって例示される。より詳細に以下に示されるように、ＩＬ−１８ＢＰの調節または遮断能力は、ある程度ＩＬ−１８ＢＰがＩＬ−１８によるＮＦ−κＢの活性を阻害するという事実による。さらに、ＩＬ−１８ＢＰはＩＬ−１８の下記の活性、すなわちヒトおよびマウスの細胞におけるＩＦＮ−γの誘導、ＩＬ−８の誘導およびＮＦ−κＢの活性の少なくとも１つを遮断する。
【００３７】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブは、特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーならびにＴＩＧＲ配列からのプライマーとヒトのジャルカット（Jurkat）Ｔ細胞からのＲＮＡを用いて逆転写ＰＣＲにより調製した。得られるＰＣＲ産物はＤＮＡ配列分析によって確認された。このＰＣＲ産物は32［Ｐ］で標識され、末梢血単核細胞、ジャルカットＴ細胞系統、ＰＢＭＣおよびヒトの脾臓に由来する４つのヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用のプローブとして用いられた。多様な独立のｃＤＮＡクローンは４つのＩＬ−１８ＢＰスプライス変異体に相当した（配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７）。全てのスプライス変異体は、想定される可溶性の分泌タンパク質をコードした。最も多量のもの（ＩＬ−１８ＢＰａ）は１９２コドンの読み取り枠を有し、本明細書でしばしば２８アミノ酸残基の「リーダー配列」として引用されるシグナルペプチド、続いて最初の４０残基が完全に尿ＩＬ−１８ＢＰ（配列番号２）のＮ末端タンパク質配列と一致する推定の成熟ＩＬ−１８Ｂｐａがコードされる。システイン残基の位置から、このポリペプチドが免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属することが示唆された。興味深いことに、成熟ＩＬ−１８ＢＰａ内の４つのＧｌｎ残基のそれぞれが潜在的なＮ−グリコシル化部位であった。残り３つのＩＬ−１８ＢＰの変異体はＩＬ−１８ＢＰａほど多量にはなかった。それらには、２８アミノ酸残基のシグナルペプチドとそれに続く８５アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードする、より短い１  ｋｂのＩＬ−１８ＢＰｂ ｃＤＮＡが含まれた（配列番号４）。３番目の変異体であるＩＬ−１８ＢＰｃは２．３ｋｂ ｃＤＮＡに相当し、２８アミノ酸残基のシグナルペプチドとそれに続く１６９アミノ酸残基の成熟ＩＬ−１８ＢＰをコードした（配列番号６）。４番目の変異体であるＩＬ−１８ＢＰｄは、２８アミノ酸残基のシグナルペプチドとそれに続く１３３アミノ酸残基の成熟ＩＬ−１８ＢＰをコードした（配列番号８）。
【００３８】
さらなるＩＬ−１８ＢＰのスプライス変異体の可能な存在をさらに研究するために、ＩＬ−１８Ｂｐ ｃＤＮＡの全長に相当するプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。長さの異なる５つのゲノムクローンがこのライブラリーで同定された。これらのクローンは外性および内性プライマーを用いてＤＮＡ配列分析にかけた。概して、７．８ｋｂの配列がこれらのクローンから組み立てられた（配列番号９）。７．８ｋｂの配列内で、膜貫通（ＴＭ）受容体をコードするエキソンは同定されなかった。全ての変異体は共通の翻訳開始部位を共有し、２８アミノ酸残基の同一のシグナルペプチドおよびサイズとＣ末端配列の異なる可溶性の成熟タンパク質をコードした。ＩＬ−１８ＢＰの遺伝子座は、さらなる遺伝子を含み、マイナス鎖に位置する核有糸分裂装置タンパク質１（ＮＵＭＡ１）をコードする。この発見により、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子はヒト染色体１１ｑ１３に配置される（36）。
【００３９】
相同性の調査が、スミス  ウォーターマン  アルゴリズムを用いて、完全なＩＬ−１８ＢＰａのタンパク質配列とGenPeptデータベース（HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov）とで実施された。ＩＬ−１８ＢＰのホモログは、いくつかのポックスウイルスにおいてあらかじめ未知の機能をもつ分泌タンパク質として発現することが見出された。ウイルスは多様なサイトカイン受容体をコードすること、ならびにウイルスにコードされるそのような分子は対応するサイトカインを中和することにより免疫応答を阻害するおとり（decoy）受容体として有用であることが以前に報告された（スプリッグ  エムケー（Spriggs, MK）、１９９４年、Curr. Opin. Immunol.、６巻、５２６〜５２９頁）。したがって、本発明はさらに、ＩＬ−１８の生物学的活性の遮断物質または調節物質としても有用なＩＬ−１８ＢＰのウイルスにコードされるホモログに関する。ウイルスにコードされるＩＬ−１８ＢＰのホモログの例を表１で提供する。
【００４０】
本発明にしたがって、ウイルスにコードされるＩＬ−１８ＢＰのホモログは原核性または真核性宿主で発現されうる。本明細書で用いられるように、「ウイルスにコードされるＩＬ−１８ＢＰのホモログ」という表現は、少なくとも７０アミノ酸残基の配列において少なくとも５０％の同一性を指す。より好ましくは、１００アミノ酸残基の配列において、それに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または最も好ましくは少なくとも９０％の類似性を有する。
【００４１】
【表１】
0004272348.tif 000005
【００４２】
ＩＬ−１８ＢＰａはサルのＣＯＳ７細胞で発現した。このため、ＩＬ−１８ＢＰａのｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳに挿入した。組換えタンパク質の精製を促進するために、枠内のＩＬ−１８ＢＰ ＯＲＦの３'末端に（Ｈｉｓ）6配列をコードするカセットをつけ加えた。ＣＯＳ７細胞を発現ベクターで一過的にトランスフェクションし、これらの細胞の無血清培地（１５０ｍｌ）を濃縮し、金属キレートクロマトグラフィーによって精製した。ＩＬ−１８ＢＰａは、還元および非還元条件下において銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一のバンドとして移動し、尿ＩＬ−１８ＢＰと同じ見かけ分子量を有した。この調製物のタンパク質配列分析により、尿ＩＬ−１８ＢＰと同じＮ末端配列であることが示された。尿ＩＬ−１８ＢＰに対して生じた抗体を用いたＩＬ−１８ＢＰａのイムノブロット分析により、尿タンパク質と同じ分子量バンドが示された。さらに、免疫沈降に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを用いて、ＩＬ−１８ＢＰａは抗体への結合を尿125Ｉ−ＩＬ−１８ＢＰと置き換わることができた。したがって、ＩＬ−１８ＢＰａは尿から単離されたＩＬ−１８ＢＰと構造的に一致する。
【００４３】
未精製および精製ＩＬ−１８ＢＰａをＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する能力について試験した。ＩＬ−１８ＢＰａは、マウス脾細胞、ＰＢＭＣおよびヒトＫＧ−１細胞系統においてヒトおよびマウスＩＬ−１８の活性を阻害した（図９）。これらの結果により、生物学的に活性なＩＬ−１８ＢＰをコードするものとＩＬ−１８ＢＰａ ｃＤＮＡとの同一性が確認される。
【００４４】
本発明はさらに、ＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質および断片、ならびに他のポリペプチドまたはタンパク質を融合させた、野生型ＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰまたはその突然変異タンパク質またはそれらの断片からなり、ＩＬ−１８またはそのホモログに結合できる融合タンパク質に関する。
【００４５】
本明細書で用いられるように、「突然変異タンパク質」という用語は、ＩＬ−１８ＢＰの類似体またはウイルスＩＬ−１８ＢＰの類似体を指し、野生型ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８への結合と比較して得られる産物の能力が相当に変化することなく、天然のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの１つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置換され、または欠失し、または１つ以上のアミノ酸残基が天然のＩＬ−１８ＢＰの配列またはウイルスＩＬ−１８ＢＰに付加する。これらの突然変異タンパク質は、既知の合成および／または部位標的突然変異誘発技術、またはそのための適切な他の既知技術によって調製される。
【００４６】
このような任意の突然変異タンパク質は、実質的にＩＬ−１８ＢＰと同じ活性をもつように、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰと充分に重複的な、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰと充分に重複的なアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１８ＢＰの活性の１つはＩＬ−１８結合能である。突然変異タンパク質がＩＬ−１８への実質的な結合活性を有する限り、アフィニティークロマトグラフィーによるなどのＩＬ−１８の精製に使用され得、したがってＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有すると考えられ得る。したがって、たとえばラジオイムノ検定またはエリザ（ＥＬＩＳＡ）検定といった、適切に標識されたＩＬ−１８に結合するか否かを測定するための簡単なサンドイッチ競合検定にそのような突然変異タンパク質をかけることからなる常套実験により、所与の突然変異タンパク質はＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有するか否かが決定され得る。
【００４７】
好ましい実施態様において、そのような任意の突然変異タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスにコードされたＩＬ−１８ＢＰホモログのいずれかの配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、それらに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【００４８】
本発明にしたがって使用され得るＩＬ−１８ＢＰポリペプチドの突然変異タンパク質またはウイルスＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質、またはそれをコードする核酸は、本明細書で与えられる教示および指導に基づいて、過度の実験を行なうことなく、当業者によって常套的に得ることのできる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に相応する有限集合の配列を含む。タンパク質化学と構造の詳細な説明として、本明細書に参照文献として組み込まれる、シュルツ  ジーイー（Schulz, G.E.）ら、タンパク質構造の原理（Principles of Protein Structure）、スプリンガー−ベルラグ（Springer-Verlag）社、ニューヨーク、１９７８年；クレイトン  ティーイー（Creighton, T.E.）、タンパク質：構造と分子学的性質（Proteins：Structure and Molecular Properties）、ダブリュエイチ  フリーマン（W.H. Freeman）社、サンフランシスコ、１９８３年を参照。コドンの優先性などのヌクレオチド配列置換の説明に関しては、前出のオースベル（Ausubel）ら、Ａ．１．１〜Ａ．１．２４および前出のサムブロック（Sambrook）ら、付録ＣおよびＤを参照。
【００４９】
本発明にしたがって、突然変異タンパク質の好ましい変化は「保存的」置換として知られているものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドまたはタンパク質またはウイルスＩＬ−１８ＢＰの保存的アミノ酸置換は、充分に類似の物理化学的性質を有するグループ内の同義アミノ酸を含み、該グループのメンバー間での置換は、グランサム（Grantham）、サイエンス、１８５巻、８６２〜８６４頁（１９７４年）の分子の生物学的機能を保存し得る。アミノ酸の挿入および欠失は、機能を変化させることなく、上記に定義された配列においてもなされ得り、詳細には該挿入または欠失がたとえば３０以下、好ましくは１０以下の数アミノ酸のみを伴うなら、アンフィンセン（Anfinsen）、「タンパク質鎖の折りたたみを支配する原理（Principles That Govern The Folding of Protein Chains）」、サイエンス、１８１巻、２２３〜２３０頁（１９７３年）のシステイン残基などの機能的構造に重要なアミノ酸を除去または置換することはない。このような欠失および／または挿入によって産出されるタンパク質および突然変異タンパク質は本発明の範囲内にある。
【００５０】
しかし、生物学的活性を要求されないシステイン残基は、たとえばＩＬ−１８ＢＰの活性低下をもたらし得る望ましくない分子内または分子間ジスルフィド架橋の形成を避けるために他の残基と置換されてもよい。
【００５１】
好ましくは、同義アミノ酸グループは表Ｉで定義されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸グループは表IIで定義されるものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸グループは表IIIで定義されるものである。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
本発明における用途のため、ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドまたはタンパク質の突然変異タンパク質、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質を得るために用いられ得るタンパク質におけるアミノ酸置換の産生の例として、マーク（Mark）らの米国特許再発行第３３，６５３号、第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号；コス（Koths）らの第５，１１６，９４３号；ナーメン（Namen）らの第４，９６５，１９５号；チョング（Chong）らの第４，８７９，１１１号；およびリー（Lee）らの第５，０１７，６９１号などで提示されるような既知の方法段階および米国特許第４，９０４，５８４号（シャウ（Shaw）ら）で提示されるリシン置換タンパク質が含まれる。
【００５６】
本発明の好ましい他の実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの任意の突然変異タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰのアミノ酸配列に本質的に相当する配列を有する。「本質的に相当する」という用語は、とくにＩＬ−１８への結合能力の範囲では天然タンパク質の基本的特性に作用せず、力の天然タンパク質の配列に対して微小な変化をもつタンパク質を包含することが意図される。「本質的に相当する」という言葉に収まると一般的に考えられる変化のタイプは、これらのタンパク質をコードするＤＮＡの簡便な突然変異誘発技術に起因するものであり、少数の微小変化をもたらし、上記の方法で所望の活性をスクリーニングする。ＩＬ−１８への結合に加えて、該突然変異タンパク質はまたＩＬ−１８活性を調節および／または遮断し得る。
【００５７】
本発明の突然変異タンパク質には、本発明にしたがってストリンジェントな条件下でＩＬ−１８ＢＰをコードするまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質が含まれる。本発明はまた、所望の核酸の同定および精製におけるプローブとしても有用な核酸も含む。さらに、そのような核酸は、本発明のＩＬ−１８ＢＰの機能的活性を保持するポリペプチドをコードするかどうかを決定するための主要な候補でありうる。「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が常習的に「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄条件を指す。アウスベル（Ausubel）ら、「分子生物学の最新プロトコル」、前出、インターサイエンス（Interscience）社、ニューヨーク、６．３および６．４（１９８７年、１９９２年）、および前出のサムブロックらを参照。制約がないならば、ストリンジェントな条件の例には、研究中のハイブリッドの算出Ｔｍから１２〜２０℃低く、たとえば２ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で５分間、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５分間；３７℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で３０〜６０分間、次いで６８℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で３０〜６０分間の洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件がまた、ＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基などの）オリゴヌクレオチドプローブまたは混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解している。混合プローブが用いられる場合、ＳＳＣのかわりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用するのが好ましい。前出のアウスベルを参照。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のＩＬ−１８ＢＰをコードするが、遺伝コードの重縮によるコドンの配列において異なる核酸を含む。おそらくストリンジェントな条件下において図４から７で示されるＤＮＡ配列にハイブリダイズしないが、それにもかかわらず本発明のＩＬ−１８ＢＰをコードできるようなＤＮＡも本発明に含まれる。
【００５９】
「融合タンパク質」という用語は、たとえば体液におけるより長い滞留時間を有する他のタンパク質と融合されたＩＬ−１８ＢＰ、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、またはそれらの突然変異タンパク質からなるポリペプチドを指す。したがって、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰは、たとえば免疫グロブリンまたはその断片などの他のタンパク質、ポリペプチドなどに融合されてもよい。滞留時間を延ばすためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と融合されてもよい。
【００６０】
本明細書の「塩」という用語は、ＩＬ−１８ＢＰ、ウイルスＩＬ−１８ＢＰ、それらの突然変異タンパク質、または融合タンパク質のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当分野で知られる方法によって形成され得、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛の塩などの無機塩、たとえばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンで形成される有機塩基との塩が含まれる。たとえば酸付加塩には、たとえば塩酸、硫酸などの鉱酸との塩、および、たとえば酢酸または蓚酸などの有機酸との塩が含まれる。もちろん、このようないずれの塩も、ＩＬ−１８ＢＰに対して実質的に同様の活性を有さなければならない。
【００６１】
本明細書で使用される「機能的誘導体」は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、およびそれらの突然変異タンパク質および融合タンパク質の誘導体を包括し、それらは当分野で知られる方法によって、たとえば残基上の側鎖として存在する官能基またはＮ−もしくはＣ−末端基から調製され得、薬学的に許容されうる限り、すなわちＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの活性と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に対して毒性を与えない限り本発明に含まれる。これらの誘導体には、たとえばポリエチレングリコール側鎖が含まれ、それは抗原性部位を遮蔽し、体液におけるＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの滞留を延長しうる。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアと第１または第２アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部（たとえばアルカノイルまたは炭素環状アロイル基）で形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部で形成された（たとえばセリルまたはスレオニル残基の）遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００６２】
ＩＬ−１８ＢＰ、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、突然変異タンパク質および融合タンパク質の「活性断片」として、本発明は、画分が実質的にＩＬ−１８を結合する能力を保持しているならば、単独のまたはたとえば糖またはリン酸残基などのタンパク質分子に結合する関連分子もしくは残基ととものタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片もしくは前駆体、それら自身によるタンパク質分子または糖残基の凝集体を包括する。
【００６３】
本明細書で使用される「環状変更された誘導体」という用語は、環状分子を産生するために末端が直接的にまたはリンカーを介してともに連結し、続いて本来の分子での末端と異なる末端を有する新しい直線分子を産生するために環状分子が他の位置で開環する直線分子を指す。環状変更には、環状化され、次いで開環する分子と等価な構造の分子が含まれる。したがって、環状変更された分子は直線分子としてデノボ合成されてもよく、環状化および開環段階を経ない。環状変更された誘導体の調製は、国際公開第ＷＯ９５／２７７３２号公報に記載されている。
【００６４】
たとえば大腸菌などの原核細胞、または酵母もしくは昆虫細胞などの他の真核細胞などの多様な組換え細胞は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰを産生できる。組換え体ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰを産生するために、ＩＬ−１８ＢＰをコードし、かつ形質転換（たとえば大腸菌、哺乳類細胞および酵母細胞）または昆虫細胞を感染するのに適したＤＮＡを担う適切なベクターを構築するための方法は当分野でよく知られている。たとえば、アウスベル（Ausubel）ら編、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols In Molecular Biology）の最新プロトコル、１９９３年；およびサムブロック（Sambrook）ら編、「分子クローニング：実験手引き（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、第２版、コールドスプリングハーバー出版（Cold Spring Harbor Press）、１９８９年を参照。
【００６５】
ＩＬ−１８ＢＰタンパク質、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰの発現のために、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、それらの断片、突然変異タンパク質または融合タンパク質、および機能的に連結された転写および翻訳調節シグナルをコードするＤＮＡが、宿主細胞の染色体に所望の遺伝子配列を組み込むことのできるベクターに挿入される。安定して導入ＤＮＡを染色体に組み込んだ細胞を選択できるためには、発現ベクターを含む宿主細胞の選択用に１つ以上のマーカーが使用される。該マーカーは、栄養要求性宿主に対するプロトトロフィー、たとえば抗生物質などの生物致死剤耐性、銅などの重金属に対する耐性を与えうる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接的に連結されるか、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入されうる。さらなる要素もまた、単鎖結合タンパク質ｍＲＮＡの最適合成に必要とされうる。これらの要素には、転写プロモータ、エンハンサー、および終止シグナルと同様にスプライスシグナルが含まれ得る。
【００６６】
選択細胞に導入されうるＤＮＡ分子は、好ましくは受容宿主において自律複製可能なプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。好ましい原核性プラスミドはｐＢｒ３２２の誘導体である。好ましい真核性ベクターには、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−マイクロンサイクルなど、またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラスミドおよびベクターは当分野で周知である（2〜5、22）。一度、該ベクターまたは該構築物を含むＤＮＡ配列を発現用に調製すると、発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクションなどの多様な適した方法のいずれかによって適切な宿主細胞に導入され得る。
【００６７】
本発明で使用されうる宿主細胞は、原核性または真核性であり得る。好ましい原核性宿主には、大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、シュードモナス、サルモネラ、セラッティアなどの細菌が含まれる。最も好ましい原核性宿主は大腸菌である。特に重要な細菌宿主には、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ-、ラムダ-、光栄養性（ＡＴＣＣ２７３２５）が含まれる。このような条件下において、該タンパク質はグリコシル化されない。原核性宿主は、発現プラスミドにおいてレプリコンおよび制御配列と和合性がなければならない。
【００６８】
しかし、天然のＩＬ−１８ＢＰがグリコシル化タンパク質ならば、原核性宿主より真核性宿主が好ましい。好ましい真核性宿主は、たとえばヒト、サル、マウス、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞であり、なぜならば、それらは正しい部位でのグリコシル化と同様に正しい折りたたみ、正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分子の翻訳後修飾を提供するためである。酵母細胞および昆虫細胞もまた、高マンノースグリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実施しうる。
【００６９】
強力なプロモータ配列および多コピー数のプラスミドを利用し、酵母および昆虫細胞における所望のタンパク質の産生に利用され得る多数の組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母および昆虫細胞は、クローニングされた哺乳類遺伝子産物においてリーダー配列を認識し、成熟得ＩＬ−１８ＢＰを分泌する。ベクターの導入後、宿主細胞は、ベクターを含む細胞の増殖を選別する選択培地で増殖する。クローン化された遺伝子配列の発現により、ＩＬ−１８ＢＰ、ウイルスＩＬ−１８ＢＰ、それらの融合タンパク質、または突然変異タンパク質または断片が産生される。上述されたクローニング、クローンの単離、同定、特性決定および配列決定手順は、以降の実施例においてより詳細に記載される。
【００７０】
その後、発現タンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む任意の常套手法によって、またはたとえばカラム内に含まれるゲルマトリックス上に固定化された抗−ＩＬ−１８ＢＰモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって単離および精製される。該組換えＩＬ−１８ＢＰを含む粗調製物をカラムに通し、それによりＩＬ−１８ＢＰを特異的抗体によってカラムに結合させ、一方で不純物を流す。洗浄後、本目的のため通常使用される条件下、すなわちたとえばｐＨ１１またはｐＨ２などの高いまたは低いｐＨで該タンパク質をゲルから溶出させる。
【００７１】
本発明はさらに、哺乳類およびより特異的にはヒトにおけるＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰまたはそれらの誘導体の発現に有用なベクターに関する。哺乳類における遺伝子の短および長期の発現用ベクターは、文献で周知である。たとえば骨格筋、血管平滑筋および肝臓への遺伝子送達により全身レベルの治療タンパク質をもたらすことが、研究によって示されてきた。骨格筋は、その多量性、血管分布、およびアクセス性のため、有用な標的である。しかしながら、他の標的および特異的には免疫細胞の骨髄前駆体もうまく用いられてきた。たとえば筋などにおけるタンパク質発現のための最近入手可能なベクターには、プラスミドＤＮＡ、リポソーム、タンパク質−ＤＮＡ共役物ならびにアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスに基づくベクターが含まれる。これらのうち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターが、遺伝子発現の持続期間およびレベルの点で、ならびに安全性考慮の点で最もうまくいっている（ケスラー  ピーディー（Kessler, P.D.）、１９９６年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９３巻、１４０８２〜１４０８７頁）。
【００７２】
ＡＡＶ系のベクターの構築手法は、詳細に記載され（シニダー（Snyder）ら、１９９６年、ヒト遺伝学における最新プロトコル（Current Protocols In Human Genetics）、１２．１．１〜１２．１．１７章、ジョン  ウィレイ＆ソンズ（John Wiley ＆ Sons）社）、本発明に組み込まれる。簡潔には、野生型ＡＡＶゲノムを含むプラスミドｐｓｕｂ２０１は、制限酵素ＸｂａＩで切断され、たとえばサイトメガロウイルスプロモータ、コザック共通配列などの効率的な真核プロモータ、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、またはそれらの突然変異タンパク質または融合タンパク質またはそれらの断片、適切な３'非翻訳領域およびたとえばシミアンウイルス４０のポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ配列からなる構築物と連結する。得られる組換えプラスミドは、たとえばヒトＴ２９３細胞などの哺乳類細胞へ、たとえばｐＡＡＶ／ＡｄなどのヘルパーＡＡＶプラスミドでコトランスフェクションする。次いで、該培養物をヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスで感染し、４８〜６０時間後に培養上清を回収する。該上清を硫酸アンモニウム沈降により分画し、ＣｓＣｌ密度勾配で精製し、透析した後、アデノウイルスを破壊するために５６℃で過熱し、他方で、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、またはそれらの突然変異タンパク質または融合タンパク質を発現できる、得られる組換えＡＡＶはこの段階で安定である。
【００７３】
これまで、可溶性サイトカイン受容体の生理学的役割は確立されていなかった。たとえばＴＮＦ系で示されたように（11、12）、可溶性受容体は特異的なリガンドに結合し、ほとんどの場合それらの生物学的活性を阻害する。たとえばＩＬ−６などのごく少数の場合、可溶性受容体が生物学的活性を増強する。ＴＢＰ（ＴＮＦ結合タンパク質）としても知られる組換え可溶性ＴＮＦ受容体は、動物モデルにおいて敗血症ショックを妨げることが見出され、一方、ＩＬ−１受容体の可溶形態は、マウスの同種移植レシピエントにおけるインビボでのアロ反応性の進行において強い阻害作用を有することが見出された。
【００７４】
同様に、本発明のＩＬ−１８ＢＰおよびウイルスＩＬ−１８ＢＰは、たとえばＩ型糖尿病において、敗血症において、自己免疫疾患において、移植拒絶、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、急性心臓発作を含む虚血性心臓病、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性肝炎、および急性肝炎において、ＩＬ−１８活性の調節物質としての用途が見出され得る。したがって、たとえばＩＬ−１８の内因的産生または外因的投与が疾患を誘起するまたは患者の症状を悪化させる任意の疾患において使用され得る。
【００７５】
本発明はさらに、薬学的に許容しうる担体および本発明のＩＬ−１８ＢＰもしくはウイルスＩＬ−１８ＢＰまたはそれらの活性な突然変異タンパク質、融合タンパク質およびそれらの塩、それらの機能的誘導体または活性断片からなる医薬組成物に関する。
【００７６】
本発明はさらに、薬学的に許容しうる担体、および本発明のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰまたはそれらの突然変異タンパク質または断片または融合タンパク質のインビボでの発現を達成するために、すなわち遺伝子治療での用途のために、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰまたはそれらの突然変異タンパク質、それらの断片または融合タンパク質を発現し、かつヒトおよび他の哺乳類への投与に適したＡＡＶ系のウイルスベクターまたは他のベクターの任意の１つのたとえばウイルスベクターからなる医薬組成物に関する。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、またはそれらの誘導体、または発現用ベクターを生理学的に許容しうる担体、および／または安定剤および／または賦形剤と混合することにより、投与用に調製され、たとえば投薬用バイアルでの凍結乾燥による投薬形態で調製される。投薬方法は、同様な薬剤の許容される任意の投与様式を介しうるものであり、たとえば静脈内に、筋内に、皮下的に、局所注射または局部塗布により、または継続注入などにより治療されうる症状に依存する。投与されうる活性化合物の量は、投与経路、治療される疾患および患者の症状に依存する。たとえば局所注射は、静注よりも体重あたり低量のタンパク質を要する。
【００７８】
したがって、ＩＬ−１８の異常な発現から過剰のＩＬ−１８に至る、または外因的に投与されたＩＬ−１８による合併症の場合の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、移植拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、急性心臓発作を含む虚血性心臓病、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎および急性膵炎および同様な疾患の治療のために、ＩＬ−１８ＢＰ、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、またはインビボで前記を発現するベクターが必要とされる。
【００７９】
本発明はまた、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰに対する、ならびにそれらの突然変異タンパク質、融合タンパク質、塩、機能的誘導体および活性画分に対する抗体を含む。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、キメラ抗体、可溶性または結合形態で標識され得る抗体に対する抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、およびヒト化抗体ならびに酵素切断、ペプチド合成または組換え技術などの、しかしこれらに限らない任意の既知技術により提供されるそれらの断片を含むことを意味する。
【００８０】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清由来の抗体分子の不均一な集団である。モノクローナル抗体は、実質的に抗原に特異的な抗体の均一な集団を含み、その集団は実質的に同様なエピト−プ結合部位を含む。ＭＡｂは当業者に周知の方法により得られ得る。たとえば、コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）、ネイチャー２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）；米国特許第４，３７６，１１０号；アウスベルら編、前出、ハロー（Harlow）およびレーン（Lane）、抗体：実験手引き（ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８８年）；およびコリーガン（Colligan）ら編、免疫学の最新プロトコル、グリーネ出版協会およびヴィレイ  インターサイエンス（Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience）、ニューヨーク、（１９９２年、１９９３年）を参照。これらの文献の内容は参照文献として本明細書に完全に組み込まれる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスのものであり得る。本発明のＭＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュ、またはインビボで培養され得る。インビボまたはインサイチュでの高力価なＭＡｂの産生により、これが現在好ましい産生方法である。
【００８１】
キメラ抗体は分子であり、それらの異なる部分は異なる動物種に由来し、マウスＭＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する。キメラ抗体は、適用における免疫原性を減少させるため、および産生の収率を増加させるために主として用いられ、たとえばマウスＭＡｂはハイブリドーマからより高い収率をあげるがヒトにおいてより高い免疫原性を有し、ヒト／マウスキメラＭＡｂが用いられる。キメラ抗体およびその産生方法は、当分野で周知である（キャビリー（Cabilly）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１巻：３２７３〜３２７７（１９８４年）；モリソン（Morrison）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１巻：６８５１〜６８５５（１９８４年）；ボウリアネ（Boulianne）ら、ネイチャー３１２巻：６４３〜６４６頁（１９８４年）；キャビリー（Cabilly）ら、欧州特許出願１２５０２３（１９８４年１１月１４日発行）；ノイベルガー（Neuberger）ら、ネイチャー３１４巻：２６８〜２７０頁（１９８５年）；タニグチ（Taniguchi）ら、欧州特許出願１７１４９６（１９８５年２月１９日発行）；モリソン（Morrison）ら、欧州特許出願１７３４９４（１９８６年５月５日発行）；ノイベルガーら、ＰＣＴ出願、国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号公報（１９８６年３月１３日発行）；クドウ（Kudo）ら、欧州特許出願１８４１８７（１９８６年６月１１日発行）；モリソンら、欧州特許出願１７３４９４（１９８６年５月５日発行）；サハガン（Sahagan）ら、J.Immunol. １３７巻：１０６６〜１０７４頁（１９８６年）；ロビンソン（Robinson）ら、国際特許出願、国際公開第ＷＯ９７／０２６７１号公報（１９８７年５月７日発行）；リウ（Liu）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４巻：３４３９〜３４４３頁（１９８７年）；サン（Sun）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４巻：２１４〜２１８頁（１９８７年）；ベター（Better）ら、サイエンス２４０巻：１０４１〜１０４３頁（１９８８年）；およびハロー（Harlow）およびレーン（Lane）、抗体：実験手引き、前出。これらの文献は、参照文献として本明細書に完全に組み込まれる。
【００８２】
抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位とともに、一般的に独自の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ＭＡｂの起源として同じ種および遺伝型の動物（たとえばマウス系統）に抗−Ｉｄが調製されるＭＡｂを免疫することにより調製され得る。免疫化された動物は、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基（抗−Ｉｄ抗体）に対する抗体を産生することにより応答する。たとえば、本明細書に参照文献として完全に組み込まれる米国特許第４，６９９，８８０号を参照。
【００８３】
抗−Ｉｄ抗体は、さらに他の動物での免疫応答を誘発し、いわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を産生するための「免疫原」としても用いられる。抗−抗−Ｉｄは、抗−Ｉｄを誘発した源のＭＡｂにエピトープが同一であり得る。したがって、ＭＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同一な特異性をもつ抗体を発現する他のクローンを同定できる。
【００８４】
したがって、ＩＬ−１８ＢＰおよび本発明の関連タンパク質に対して生じるＭＡｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適切な動物において抗−Ｉｄ抗体を誘発するために用いられ得る。このような免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、抗−Ｉｄ Ｍａｂを分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを産生するために使用される。さらに、抗−Ｉｄ Ｍａｂは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合し、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するために用いられ得る。これらのマウス由来の血清は、ＩＬ−１８ＢＰエピトープまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰのエピトープに対して特異的な始原ＭＡｂの結合性質を有する抗−抗−Ｉｄ抗体を含む。
【００８５】
したがって、抗−Ｉｄ ＭＡｂは、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰなどの評価されるエピトープに構造的に類似したそれ自体のイディオタイプエピトープ、すなわち「イディオトープ」を有する。
【００８６】
「ヒト化抗体」という用語は、たとえばよりヒトの体に和合するよう遺伝工学手法でマウス抗体を操作することによって得られる抗体を含むことを意味する。そのようなヒト化抗体は、低減した免疫原性を有し、ヒトの薬物動態を改善した。これらは、たとえばMolecular Immundogy、３０巻、１６号、１４４３〜１４５３頁、１９９３年におけるヒト化抗−ＴＮＦ抗体で記載されるような当分野で周知の技術によって調製され得る。
【００８７】
「抗体」という用語はまた、完全な分子と同様に抗原に結合できるＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２などのそれらの断片の両方を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２断片は完全な抗体のＦｃ断片を欠き、血液循環をより速く通過し、完全な抗体より少ない非特異的な組織結合を有し得る（ウォール（Wahl）ら、J. Nucl. Med. ２４巻：３１６〜３２５（１９８３年））。ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２および本発明に有用な抗体の他の断片が、完全な抗体分子用に本明細書で開示された方法にしたがって、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの検出および定量化に用いられ得ることが理解されよう。そのような断片は、典型的には（Ｆａｂ断片を産生するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ′）２断片を産生するために）ペプシンなどの酵素を用いるタンパク質分解切断によって産生される。
【００８８】
抗体が分子と特異的に反応でき、それによって該分子が抗体に結合する場合、抗体は分子を「結合できる」といわれる。「エピトープ」という用語は、抗体によって結合され得、抗体によって認識もされ得る任意の分子の部分を指すことを意味する。エピトープすなわち「抗原決定基」は、通常アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。
【００８９】
「抗原」は抗体によって結合され得、さらに動物に抗原のエピトープに結合できる抗体を産生することを誘発できる分子または分子の１部分である。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。上記で言及された特異的反応は、きわめて選択的な様式で抗原が相応する抗体と反応し、他の抗原によって誘起されうる多数の他の抗体とは反応しない。
【００９０】
本発明に有用な抗体の断片を含む抗体は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、または試料中の関連タンパク質を定量的にまたは定性的に検出するために、または本発明のこのようなタンパク質を発現する細胞の存在を検出するために使用されうる。これは、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と共益した蛍光標識抗体（以下参照）を用いる免疫蛍光技術によって達成され得る。
【００９１】
本発明に有用な抗体（またはそれらの断片）は、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、および本発明の関連タンパク質のインサイチュ検出のために免疫蛍光または免疫電子顕微鏡などのように組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的試料を取り、そのような試料に本発明の標識抗体をあてがうことによって達成され得る。抗体（または断片）は、好ましくは生物学的試料に該標識抗体（または断片）をかけるまたはかぶせることによって提供される。このような手法の使用により、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、または関連タンパク質のみだけでなく、試料組織上の分布も決定できる。本発明を用いて、当業者は、このようなインサイチュ検出を達成するために（染色手法などの）様々な任意の組織学的方法が改変され得ることを容易に理解されよう。
【００９２】
ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、または本発明の関連タンパク質のための検定は、生物学的流体、組織抽出物、リンパ球または白血球、または組織培養でインキュベーションされた細胞などの新鮮に採取された細胞などの生物学的試料をＩＬ−１８ＢＰまたは関連タンパク質を同定できる検出可能に標識された抗体の存在下でインキュベーションし、当分野で周知の多数の任意の技術によって抗体を検出することからなる。
【００９３】
生物学的試料は、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化できる他の支持体または担体で処理され得る。次いで、支持体または担体は適切な緩衝液で洗浄され、続いて本発明にしたがって検出可能に標識された抗体で処理され得る。次いで、固相支持体または担体は、非結合の抗体を除去するために緩衝液で２回洗浄され得る。その後。固体の支持体または担体上に結合した標識の量は、常套手段によって検出され得る。
【００９４】
抗原または抗体に結合できる任意の支持体または担体は、「固相支持体」、「固相担体」、「固体の支持体」、「固体の担体」、「支持体」または「担体」によって意図される。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス（gabbros）、およびマグネタイトが含まれる。該担体の性質は、本発明の目的のためにはある程度可溶性であるか、不溶性であるかのいずれかであり得る。支持体材料は、結合分子が抗原または抗体に結合できる限り、事実上任意の可能な構造配置を有し得る。したがって、支持体または担体の構造は、ビーズ、または円筒形のような、試験チューブの内表面、または棹の外表面のような球形であり得る。または、該表面は、シート、試験片などの平坦であり得る。好ましい支持体または担体にはポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体または抗原を結合するための他の多くの適切な担体を知っていよう、または常套実験の使用によって上記を確かめることができよう。
【００９５】
本発明にしたがって所与の多数の抗体の結合活性は、周知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、常套実験を行なうことにより各測定用の有効なおよび最適な検定条件を決定できよう。
【００９６】
洗浄、撹拌、振とう、ろ過などの他の段階が、慣習的にまたは特定の条件に必要なように、該検定に付け加えられてもよい。
【００９７】
本発明の抗体が検出可能に標識され得る方法の１つとして、酵素に上記を結合させ酵素免疫検定（ＥＩＡ）で使用する。その結果、この酵素は、後に適切な基質に曝されると、検出される化学的部分を産生するような方法で、たとえば分光光度、蛍光光度または視覚的手段により、基質と反応する。検出可能に抗体を標識するのに使用され得る酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシターゼ、アルカリフォスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、リボヌクレア−ゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６‐リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限らない。該検出は、酵素に対して色素原基質を用いる比色法により達成され得る。検出はまた、同様に調整された標準と比較して基質の酵素反応の程度の視覚的比較によっても達成され得る。
【００９８】
検出は、様々な他の任意の免疫検定を用いて達成され得る。たとえば、抗体または抗体断片を放射標識することにより、放射免疫検定（ＲＩＡ）の使用でＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰを検出できる。ＲＩＡの良い説明は、本明細書に参照文献として組み込まれ、チャード  ティー（Chard T.）による「放射免疫検定および関連技術への序論（An Introduction to Radioimmuno Assay and Related Techniques）」とタイトルされた章に詳しい文献のあるワーク  ティーエス（Work, T.S.）らによる分子生物学の実験技術および生物化学（Laboratory Techniques and Biochemistry In Molecular Biology）、北オランダ出版会社（North Holland Publishing Company）、ニューヨーク（１９７８年）に見出される。放射活性アイソトープは、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの方法によりまたはオートラジオグラフィーにより検出され得る。
【００９９】
本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体は適切な波長の光に曝すと、その存在が蛍光により検出され得る。最も広く使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレアミンがある。
【０１００】
抗体は、152Ｅｕまたは他のランタニド系列などの蛍光放出金属を用いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン５酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート基を用いて抗体に付着され得る。
【０１０１】
抗体はまた、ビオチンに結合させることにより検出可能に標識され得る。次いでビオチン化抗体は、蛍光化合物またはペルオキシダーゼなどの酵素または放射活性アイソトープなどに結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって検出され得る。
【０１０２】
抗体はまた、化学発光化合物に結合させることにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光タグ化された抗体の存在により、化学反応の過程で生じる化学発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化合物の例として、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
【０１０３】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、酵素タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的システムに見出される化学発光の１タイプである。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することにより測定される。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１０４】
本発明の抗体分子は、「ツーサイト（two-site）」または「サンドウィッチ」検定としても知られるイムノメトリック検定での利用に適用され得る。典型的なイムノメトリック検定において、一定量の非標識抗体（または抗体の断片）が固体の支持体または担体に結合し、検出可能に標識された一定量の可溶性抗体は、固相抗体、抗原、および標識抗体間で形成された３重複合体の検出および／または定量ができるよう添加される。
【０１０５】
典型的なおよび好ましいイムノメトリック検定には、固相に結合させた抗体をまず試験試料に接触させ、二元固相抗体−抗原複合体の形成によって試料から抗原を抽出する「おもて」検定が含まれる。適切なインキュベーション期間後、固体の支持体または担体を洗浄し、もしあるならば未反応の抗原を含む液体試料の残基を除去し、続いて，未知量の（「レポーター分子」として機能する）標識抗体を含む溶液と接触させる。非標識抗体を介して固体の支持体または担体と結合させた抗原と標識抗体とを複合化させるための第２インキュベーション期間後、固体の支持体または担体を２回洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。
【０１０６】
本発明の抗原に有用でもあり得る「サンドウィッチ」検定の他のタイプには、いわゆる「同時」および「逆」検定も用いられる。「同時」検定は、固体の支持体または担体に結合させた抗体および標識抗体の両方が同時に試験試料に添加されるようにただ１回のインキュベーション段階が含まれる。インキュベーションが完了した後、固体の支持体または担体を洗浄し、液体試料の残基および非複合化標識抗体を除去する。続いて、支持体または担体とともに標識抗体の存在は、慣習的な「おもて」サンドウィッチ検定におけるように測定される。
【０１０７】
「逆」検定において、まず標識抗体溶液を液体試料に、続いて適切なインキュベーション期間後、固体の支持体または担体に結合させた非標識抗体を添加する段階的な添加が利用される。第２のインキュベーション後に、固相を常套な様式で洗浄し、試験試料の残基および未反応の標識抗体溶液を除去する。次いで、固体の支持体または担体とともに標識抗体の測定は、「同時」および「おもて」検定におけるように測定される。
【０１０８】
本発明はまた、上記で定義された本発明の任意のタンパク質をコードするＤＮＡ分子、任意の該ＤＮＡ分子からなる複製可能な発現ビヒクル、発現ビヒクルで形質転換された原核性および真核性の宿主細胞好ましくはＣＨＯ細胞を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、ヒトおよび他の哺乳類における発現の目的のために本発明の任意のタンパク質をコードする発現ベクターの産生方法を含む。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の形質転換細胞を培養し、このような形質転換された宿主細胞内で該ＤＮＡ分子および発現ビヒクルによってコードされるタンパク質を回収することにより本発明の任意のタンパク質の産生方法を含む。
【０１１０】
ＩＬ−１８活性の調節におけるＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰの使用に加えて、それらはもちろんＩＬ−１８自身の精製用にも使用され得る。この目的のために、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスＩＬ−１８ＢＰをアフィニティーカラムに結合させ、粗ＩＬ−１８を通す。次いで、ＩＬ−１８がたとえば低ｐＨにおける溶出などにより、カラムから回収され得る。
【０１１１】
本発明は、以下の非制約的な実施例によって説明されよう。
【０１１２】
実施例１：ＩＬ−１８結合タンパク質の単離
大腸菌ＩＬ−１８（２．５ｍｇ、ペプロテック（Peprotech）社、ニュージャージ州）を製造業者の説明書にしたがってアフィゲル（Affigel）−１０（０．５ｍｇ、バイオラッド（BioRad））に結合させカラムに詰めた。粗尿タンパク質（１０００倍濃縮、５００ｍｌ）を０．２５ｍｌ／分の流速でカラムにかけた。カラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２５０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。続いて、結合タンパク質をｐＨ２．２の２５ｍＭクエン酸およびベンズアミジン（１ｍＭ）で溶出し、直に１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3で中和した。１ｍｌの画分を採取した。該画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析した。ＩＬ−１８結合タンパク質を約４０，０００ダルトンのタンパク質として画分２〜８で溶出した（図１）。ＩＬ−１８ＢＰに相当する約４０ｋＤのバンドは、銀染色において明瞭な黄色を呈した。様々な画分を実施例２で記載するように125Ｉ−ＩＬ−１８との架橋、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。ＩＬ−１８結合タンパク質は画分２〜８で見出され、ＩＬ−１８アガロースゲルカラムから溶出された（図２）。
【０１１３】
実施例２：標識ＩＬ−１８に対するアフィニティー精製ＩＬ−１８ＢＰの架橋
アフィニティー精製段階から得られるＩＬ−１８ＢＰの試料（４０μｌ）を125Ｉ−ＩＬ−１８（５，０００，０００ｃｐｍ）とインキュベーション（７０分、４℃）した。続いて、ジメチルスルホキシド（Ｍｅ2ＳＯ、２０ｍＭ）に溶解したジスクシンイミジルスベリン酸（ＤＳＳ）を最終濃度が２ｍＭになるよう添加し、混合物を４℃で２０分間おいた。ＰＨ７．５の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび最終濃度１００ｍＭの１Ｍ ＮａＣｌを添加することにより、反応を停止した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ、最終２５ｍＭ）を含む試料緩衝液を添加し、混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％アクリルアミド）、続いてオートラジオグラフィーによって分析した（図２）。
【０１１４】
おそらく約２０ｋＤの125Ｉ−ＩＬ−１８に架橋した約４０ｋＤのタンパク質からなる分子量５８ｋＤの特異的バンドがＩＬ−１８アフィニティーカラム（レーン２および３）から溶出された画分で観察されたが、他の全ての粗尿タンパク質を含むカラム洗浄（レーン１）では観察されなかった。
【０１１５】
実施例３：タンパク質配列分析
実施例１のアフィニティーカラムから得られた溶出画分を非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）によって分離し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした（プロ−ブロット（Pro-Blot）、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）、アメリカ合衆国）。膜をクマシーブルーで染色し、約４０ｋＤのバンドを切除し、プロサイスマイクロシークエンサー（Procise microsequencer）（アプライドバイオシステム社、アメリカ合衆国）によるタンパク質配列分析にかけた。つぎの主要配列が得られた：
【０１１６】
【配列表４】
0004272348.tif 000009
【０１１７】
ｘはまだ未決定のアミノ酸を表す。
【０１１８】
さらに、微小配列が得られた：
【０１１９】
【配列表５】
0004272348.tif 000010
【０１２０】
この２つの配列のため、より長い配列データを得ることはできなかった。微小配列は、デフェンシンのアミノ酸６５で始まるヒトのデフェンシン断片（登録番号ｐ１１３９８）として同定された。主要配列は、ｂｌａｓｔｐおよびｔｂｌａｓｔｎ研究プログラムによるＮＣＢＩおよびＴＩＧＲにおける入手可能な全てのデータベースを調査することにより決定した際に、他の任意の既知タンパク質と結びつかなかった。
【０１２１】
より長くより正確な配列を得るために、ならびに潜在的なシステイン残基を同定するために、ＩＬ−１８−アガロースカラムから溶出された画分の他のアリコートを６ＭグアニジンＨＣｌ中ＤＴＴで還元させ、４−ビニルピリジンと反応させ、マイクロ限外ろ過装置（ウルトラフリー（Ultrafree）、カットオフ１０，０００ダルトン、ミリポア社（Millipore））によって脱塩し、タンパク質微小配列分析にかけた。サイクル番号１の配列決定後、フィルターをｏ−フタルアルデヒドと反応させ、Ｐｒｏ以外のＮ−末端ポリペプチドを遮断した。この方法で、主要配列のみが下記のように得られた：
【０１２２】
【配列表６】
0004272348.tif 000011
【０１２３】
（T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln;X=未知;A=Ala; R=Arg; K=LYS; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu）
サイクル６、７、８および１１において、低レベルのＴｈｒシグナルが得られた。この低いレベルのため、本発明者らは該サイクルで特異的なアミノ酸残基を特定しないようより慎重に考慮した。
【０１２４】
得られる配列は、タンパク質データベースを調査することにより決定されるように他の任意の既知タンパク質の配列と有意に異なる。しかし、ｔｂｌａｓｔｎ研究プログラムによるＴＩＧＲデータベースの調査により、ｃＤＮＡファイルが与えられ、翻訳されるとオープンリーディングフレーム（２１８コドン）がＩＬ−１８ＢＰのＮ−末端配列ときわめて相同な配列を含むＴＨＣ１２３８０１であることが示された。本明細書によって相同性が示され：
【０１２５】
【配列表７】
0004272348.tif 000012
【０１２６】
（上段の配列（１〜40）は本発明にしたがって単離されたＩＬ−１８ＢＰの配列であり；下段の配列（51〜100）はＴＩＧＲファイルＴＨＣ１２３８０１のｃＤＮＡの翻訳によって推定される）。
【０１２７】
ファイルＴＨＣ１２３８０１を翻訳することにより得られる推定タンパク質配列は、ＩＬ−１８ＢＰの残基２および４が不明瞭であった。ＩＬ−１８ＢＰのアミノ酸残基６、７および８がＴｈｒとして同定されることを確認し、残基１１に関してもそのようである。
【０１２８】
実施例４：ＩＬ−１８ＢＰは糖タンパク質である
実施例１の溶出画分のアリコート（０．３ｍｌ）をスペロース（Superose）１２カラム（１×３０ｃｍ、ファルマシア社（Pharmacia）、スウェーデン）でサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムをあらかじめ平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速でリン酸緩衝生理食塩水およびアジ化ナトリウム（０．０２％）で溶出し、１分の画分を採取した。ＩＬ−１８結合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって測定されるように約４０，０００ダルトンのタンパク質として画分２０〜２５で溶出した。約４０，０００ダルトンのタンパク質（画分２３、５０μｌ、約５０ｍｇのタンパク質）を含む試料は、製造業者の説明書にしたがってＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ、バイオラブ（Biolab））と反応させた。つまり、５％ＳＤＳの存在下で１０分間煮沸、１０ｘＧ７緩衝液（２．５μｌ）、１０％ＮＰ−４０（２．５μｌ）およびＰＮＧアーゼＦ（１μｌ）で３７℃１時間によってアリコートを変性した。試料は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）によって分析し、同じスペロース１２画分から得られる非消化ＩＬ−１８ＢＰと比較した。ＩＬ−１８ＢＰの約４０ｋＤのバンドがＰＮＧアーゼで処理した画分で消失することが見出された。３０ｋＤ（ＰＮＧアーゼバンドのすぐ上）および２０ｋＤに相当する新しいバンドが得られた。約４０ｋＤのバンドがないことから、このバンドがＮ−グリコシル化タンパク質であることが示唆される。
【０１２９】
実施例５：ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８の生物学的活性の遮断
ＩＬ−１８活性を遮断するために尿から単離されたＩＬ−１８ＢＰの活性は、単核細胞においてＩＬ−１８に誘導されるＩＦＮ−γの産生を測定することにより決定された。ＩＬ−１８は、低濃度のＬＰＳ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２または他の刺激物質のいずれかとともに添加されるとＩＦＮ−γを誘導する。ＩＬ−１８の活性をマウス脾細胞、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびヒトＫＧ−１細胞系統で試験した。脾臓細胞は、健康なマウスから調製され、洗浄し、ならびに５×１０6細胞／ｍｌの１０％胎児ウシ血清補足ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。組換えヒトまたはマウスＩＬ−１８（０．５または５ｎｇ／ｍｌ）とともにＬＰＳ（０．５または１μｇ／ｍｌ）で１．０ｍｌの培地を刺激した。ヒトＩＬ−１８結合タンパク質（０、５または５０ｎｇ／ｍｌ）は、脾臓細胞に添加する前に組換えＩＬ−１８に添加した。２４時間の培養後、脾臓細胞を３回の凍結（−７０℃）および解凍サイクル（室温）にかけ、細胞デブリスを遠心により除去し、マウスＩＦＮ−γ（エンドゲン社（Endogen））用のＥＬＩＳＡキットを用いて上清をＩＦＮ−γ検定した。図３Ａに示されるように、ＩＬ−１８ＢＰは用量依存性様式でマウスの脾細胞におけるｈｕＩＬ−１８の活性を遮断した。対照的に、対照としての可溶性インターフェロン−α／β受容体は作用を有さなかった。組換えマウスＩＬ−１８の活性は、同様にヒトＩＬ−１８ＢＰにより阻害され、ヒトＩＬ−１８ＢＰがマウスＩＬ−１８を認識することを示唆する（図３Ｂ）。内因性ＩＬ−１８は、マウス脾細胞において高濃度のＬＰＳにより誘導され、ＩＦＮ−γが産生される。実際に、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）によるＩＦＮ−γ誘導はまた、尿ＩＬ−１８ＢＰによっても阻害された（図３Ｃ）。コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）はＴ細胞を活性化し、ＩＬ−１８不在下においてＩＦＮ−γを産生する（13）。実際に、ＣｏｎＡによるＩＦＮ−γの誘導は高濃度のＩＬ−１８ＢＰでさえ阻害されなかった（図３Ｄ）。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＦＮ−γ産生の非特異的阻害剤というよりＩＬ−１８の生物活性の特異的阻害剤であった。ＩＬ−１８ＢＰはまた、ＩＬ−１８およびＴＮＦ−αの組合せによって誘導されるヒトのＫＧ−１細胞においてヒトＩＬ−１８の活性を阻害した。
【０１３０】
ヒトおよびマウス単核細胞におけるＩＦＮ−γの共誘導によって測定されるように、上記のデータにより、尿ＩＬ−１８ＢＰがヒトだけでなくマウスＩＬ−１８活性を阻害することが立証される。＞９０％までＩＬ−１８活性を低減したＩＬ−１８ＢＰの濃度は、ＩＬ−１８自身の濃度と同程度であり、これら２つのタンパク質間の高親和的相互作用が示唆される。
【０１３１】
実施例６：ＩＬ−１８ＢＰをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Jurkat T細胞（ＣＲＬ ８１６３、アメリカンタイプカルチャーコレクション）をスーパースクリプト（SuperScript）ＲＮアーゼＨ-逆転写酵素（ギブコビーアールエル社（Gibco-BRL））およびランダムプライマー（プロメガ社（Promega）、ウィンスコンシン州マディソン）で逆転写した。続いて、タック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（シグマ（Sigma）社）およびＴＩＧＲクローンＴＨＣ１２３８０１のヌクレオチド２４〜４４（センス）および５００〜４８１（逆）に相当するプライマーを用いて、得られるｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。増幅は、アニーリング（５５℃、２分）および伸張（７０℃、１分）の３０サイクルで実施した。得られるＰＣＲ産物は、アガロース（１％）ゲル電気泳動により分離し、溶出し、ｐＧＥＭ−Ｔイージー（easy）ＴＡクローニングベクターにクローニングした（プロメガ社）。個々のクローンから得られるＤＮＡをＴ７およびＳＰ６プライマーで配列決定した。
【０１３２】
得られる４７７ｂｐの断片をランダムプライミングによって32Ｐ標識した。様々なヒトｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするために、このプローブを用いた。対のニトロセルロース膜を取り、６ｘＳＳＣ、１０ｘデンハルト溶液、０．１％ ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で６０℃でプローブとハイブリダイゼーションした。膜を洗浄し、−８０℃で一晩コダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ膜に感光させた。対のポジティブクローンをプラーク精製した。プラスミドをλｐＣＥＶ９クローンから切除し、自己連結した。製造業者の説明書にしたがって、他のライブラリーから得られるｃＤＮＡクローンを単離した。モデル３７３Ａおよび３７７シークエンサー（アプライドバイオシステム社）を用いて、単離クローンの自動ＤＮＡ配列分析を実施した。標準プロトコルにはこれらのクローニング手法が用いられた（３３）。
【０１３３】
つぎのライブラリーがスクリーニングされた：λｐＣＥＶ９クローニングベクター（１５）で構築され、ティー  ミキ（T. Miki）の厚意により提供されたヒト単球ｃＤＮＡライブラリー；クローンテック社（Clontech）（カリフォルニア州パロアルト（Palo Alto））からの、ヒトJurkat白血性Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー、ヒト末梢血白血球ｃＤＮＡライブラリーおよびヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー。ラムダＦＩＸ ＩＩベクターのヒト胎盤ゲノムライブラリーはストラタジーン社（Stratagene）（カリフォルニア州、ラジョラ（La Jolla））から入手した。
【０１３４】
４つの異なるＩＬ−１８ＢＰスプライス変異体に相当する全てのｃＤＮＡクローンを得、特徴決定された。全てのスプライス変異体は、推定可溶性分泌タンパク質をコードした。最も多量のもの（ＩＬ−１８ＢＰａ）は、２８アミノ酸残基のシグナルペプチド、続いて最初の４０残基（配列番号１０）が尿ＩＬ−１８ＢＰ（配列番号２）のＮ−末端タンパク質配列と完全に一致する推定成熟ＩＬ−１８ＢＰａをコードする１９２コドンのオープンリーディングフレームを有した。システイン残基の位置から、このポリペプチドが免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属することを示唆された。成熟ＩＬ−１８ＢＰａ内の４つの各Ｇｌｎ残基は潜在的なＮ−グリコシル化部位であった。ＩＬ−１８ＢＰの他の３つのスプライス変異体は有意に豊富ではなかった。
【０１３５】
他の１ｋｂのＩＬ−１８ＢＰｂｃＤＮＡは８５アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードした（配列番号４）。第３の変異体であるＩＬ−１８ＢＰｃは、１６９アミノ酸残基の成熟ＩＬ−１８ＢＰをコードする２．３ｋｂのｃＤＮＡによって示される（配列番号６）。第４の変異体であるＩＬ−１８ＢＰｄは１３３アミノ酸残基の成熟ＩＬ−１８ＢＰをコードした（配列番号８）。エキソン内で、プロｍＲＮＡに沿ってスプライシングが２つの部位に生じた。ＩＬ−１８ＢＰｄにおけるこれらの事象とさらなる５'エキソンにより、多様なｃＤＮＡクローンで３つの異なる５′ＵＴＲを生じた。したがって、異なるＩＬ−１８ＢＰ変異体が明瞭な転写調節シグナルに応答して生じる可能性があり得る。
【０１３６】
膜貫通ドメインをもつ受容体をコードするｃＤＮＡはこれまで見つからなかった。
【０１３７】
実施例７：哺乳類発現ベクターの構築、組換えＩＬ−１８ＢＰの産生、および組換えＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性の評価
ＩＬ−１８ＢＰａ ｃＤＮＡのコード領域は、センスプライマー５′ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡおよび逆プライマー：５′ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＣを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクター（２５）のＸｂａＩ部位にクローニングし、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＬ−１８ＢＰａを得た。該構築物をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３８】
記載されているように（３５）、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＬ−１８ＢＰａプラスミドＤＮＡ（１０μｇ）およびＤＥＡＥデキストラン（１２０μｇ）を含む１．４ｍｌのＴＤ緩衝液での６×１０7ＣＯＳ細胞のバッチを室温で３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ−１０で４時間平板培養し、洗浄し、無血清ＤＭＥＭで３〜５日間インキュベーションした。培地を回収し、限外ろ過（１０ｋＤカットオフ）により６倍に濃縮し、製造業者の説明書にしたがってＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ6をイミダゾールを用いてタロン（Talon）カラム（クローンテック社（Clontech））上で溶出物として分離した。
【０１３９】
尿の免疫学的交差反応性およびＣＯＳ７で発現されるＩＬ−１８ＢＰをつぎのように評価した：尿ＩＬ−１８ＢＰ（５μｇ）をクロラミンＴ法により125Ｉで標識した。ＣＯＳ７細胞の上清（２５０μｌ）を尿ＩＬ−１８ＢＰに対する抗体と混合し（１時間、室温、最終容量５００μｌ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．０５％ツイーン（Tween）２０および０．５％ウシ血清アルブミン（ウォッシュ緩衝液（Wash Buffer））で１：１０００に希釈した。次いで、125Ｉ標識された尿ＩＬ−１８ＢＰ（１０6ｃｐｍ）を添加し、１時間後にタンパク質Ｇ−セファロース（２０μｌ）を添加した。混合物を懸濁し（１．５時間、４℃）、続いてビーズを単離し、３ｘウォッシュ緩衝液およびＰＢＳで一回洗浄した。次にビーズを試料緩衝液で溶出し、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）で分離し、オートラジオグラフィーを行なった。
【０１４０】
ＩＬ−１８ＢＰａは、還元および非還元条件下における銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドとして移動し、尿ＩＬ−１８ＢＰと同様な見かけ分子量を有した（データは示さず）。この調製物のタンパク質配列分析により、尿ＩＬ−１８ＢＰと同様なＮ−末端配列が明らかにされ、後者はＮ−末端で分解されなかったことを示唆している。
【０１４１】
尿ＩＬ−１８ＢＰに対して生じた抗体を用いるＩＬ−１８ＢＰａのイムノブロット分析により、尿タンパク質と同様な分子量バンドが示された。さらに、免疫沈降、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを用いて、ＩＬ−１８ＢＰａが尿125Ｉ−ＩＬ−１８ＢＰの抗体への結合と取って代わることができた。したがって、ＩＬ−１８ＢＰａは尿ＩＬ−１８ＢＰに構造的に一致する。
【０１４２】
未精製および精製ＩＬ−１８ＢＰａをＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する能力について試験した。ＩＬ−１８ＢＰａは、用量に依存的な様式でマウス脾細胞、ＰＢＭＣおよびヒトＫＧ−１細胞系統においてヒトおよびマウスＩＬ−１８の活性を誘導するＩＦＮ−γを阻害した（図９）。
【０１４３】
様々な生物学的検定および移動度変位検定（実施例８）の結果から、ＩＬ−１８活性の阻害がクローンＩＬ−１８ＢＰの固有性質であり、尿ＩＬ−１８ＢＰにおけるデフェンシンの共溶出断片などの任意の付随不純物の性質ではないことが証明された。
【０１４４】
実施例８：電気泳動移動度変位検定
ヒトＫＧ−１細胞でのＮＦ−κＢのＩＬ−１８誘導活性における尿および組換えＩＬ−１８ＢＰの作用も研究された。ヒトのＫＧ−１細胞（１ｍｌのＲＭＰＩ中４×１０6個）をｈｕＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１８ＢＰ（２０分、室温）とあらかじめ混合したｈｕＩＬ−１８のどちらかで刺激した。３７℃で２０分後に細胞を氷冷のＰＢＳで３回洗浄し、直ちに液体窒素で凍結した。充填した該細胞容積の３倍の緩衝液Ａ（１０ｍＭ トリスｐＨ７．６、０．４ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、グリセロール（２０％容量）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＤＴ）、０．４ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、ロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニン各２μｇ／ｍｌ）に細胞ペレットを再懸濁した。細胞デブリスを遠心（１５，０００ｘｇ、１５分）により除去し、上清のアリコートを液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。標準としてウシ血清アルブミンを用いてブラドフォード検定（バイオ−ラッド（Bio-Rad））によりタンパク質濃度を測定した。ＮＦ−κＢ結合要素（１０ｐｍｏｌ、プロメガ社（Promega））に相応する２本鎖オリゴヌクレオチドを［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラブ社（New England Biolabs））で標識した。遊離ヌクレオチドをスピンカラムによって除去した。ＩＬ−１８でまたはＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰで処理された細胞の抽出物（１０μｇタンパク質）をＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよびグリセロール（５％容量）からなる２０μｌの緩衝液中でポリｄＩ．ｄＣ（５００ｎｇ、ファルマシア社（Pharmacia））および変性サケ精子ＤＮＡ（１００ｎｇ、シグマ社）とともに標識プローブ（３×１０4ｃｐｍ）とインキュベーション（１５分、室温）した。続いて、混合物を５％未変性ポリアクリルアミドゲルにかけた。０．５ｘＴＢＥ（４０ｍＭ トリスＨＣｌ、４５ｍＭホウ酸および２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中１８５Ｖで電気泳動を行なった。ゲルを真空乾燥し、−８０℃で一晩オートラジオグラフィーを行なった。ＩＬ−１８は、ｐ５０ＮＦ−κＢホモダイマーおよびｐ６５／ｐ５０ ＮＦ−κＢヘテロダイマーの形成を誘導することが見出された。ＮＦ−κＢ共通配列に相当する放射標識オリゴヌクレオチドと結合したＫＧ１細胞の抽出物を用いた電気泳動移動度変位検定による測定時に、尿および組換えＩＬ−１８ＢＰはＩＬ−１８によるＮＦ−κＢの活性化を阻害した。
【０１４５】
実施例９：大腸菌、酵母および昆虫細胞におけるＩＬ−１８ＢＰの発現
ＩＬ−１８ＢＰはまた、たとえば大腸菌などの原核細胞または酵母および昆虫細胞などの他の真核細胞などの他の組換え細胞によって産生され得る。任意のＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡを担い、組換えＩＬ−１８ＢＰを産生するために大腸菌および酵母細胞の形質転換または昆虫細胞の感染に適する、ふさわしいベクターを構築するため、周知の方法が利用される。酵母細胞での発現のため、ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡ（実施例６）を切断し、酵母細胞のトランスフェクションに適した発現ベクターに挿入される。昆虫細胞での発現のため、ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡをバキュロウイルスに挿入し、該昆虫細胞を該組換えバキュロウイルスで感染させる。大腸菌での発現のため、ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡを適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位標的突然変異誘発法にかけ、その結果、開始ＡＴＧコドンが成熟ＩＬ−１８ＢＰの第１コドンの直前に挿入される。または、このようなＤＮＡを適切なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲにより調製され得る。続いて、得られるｃＤＮＡ構築物を当分野で周知の技術により適切に構築された原核発現ベクターに挿入される（23）。
【０１４６】
実施例１０：ＩＬ−１８ＢＰａのインビボ発現のためのアデノ関連発現ベクターの構築
ＩＬ−１８ＢＰａをコードする機能的遺伝子は、プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社（Invitrogen）、カリフォルニア州サンディエゴ）に基づいて構築される。５'端にコザック（Kozak）共通配列をもつＩＬ−１８ＢＰ ｃＤＮＡを制限部位を破壊する方法でｐｃＤＮＡ３のＸｂａＩ部位に連結する。部位標的突然変異誘発法により、新しいＸｂａＩ部位がネオマイシンカセットの前（本来のｐｃＤＮＡ３配列の塩基２１５１）かつＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの後（本来のｐｃＤＮＡ３配列の塩基３３７２）に挿入される。次いで、この構築物をＸｂａＩで切断し、得られる４．７ｋｂのミニ遺伝子が記載（シニダー（Snyder）ら、１９９６年、ヒト遺伝学の最新プロトコル（Current Protocols In Human Genetics）、１２．１．１〜１２．１．１７章、ジョンウィリー＆ソンズ（John Wiley ＆ Sons））のプラスミドｐｓｕｂ２０１のＸｂａＩ部位に挿入される。ヘルパーＡＡＶプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄを用いて、得られる組換えプラスミドをヒトＴ２９３細胞にコトランスフェクションする。次に、培養物をヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスに感染させ、４８〜６０時間のインキュベーション後に細胞を採取する。細胞を３回の凍結−融解サイクルにかけ、細胞デブリスを遠心により除去し、上清を硫酸アンモニウムで３３％飽和させる。続いて、混合物を遠心し、該硫酸アンモニウムを５０％飽和させることにより、上清からｒＡＡＶを沈降させる。ウイルスをさらにＣｓＣｌにより精製し、透析し、いかなるアデノウイルスも破壊するために５６℃で１５分最終加熱する。
【０１４７】
実施例１１：ＩＬ−１８ＢＰの組換え融合タンパク質の構築
ＩｇＧ２重鎖の定常領域と融合させたＩＬ−１８ＢＰからなるタンパク質の産生は次のように実施されうる：適切なオリゴヌクレオチドを用いて、ＩＬ−１８ＢＰのＤＮＡを部位標的突然変異にかけ、コード配列の直前および直後に単一の制限部位を導入する。ＩｇＧ２重鎖の定常領域をもつプラスミド、たとえばｐＲＫＣＯ４２Ｆｃ１（６）を部位標的突然変異誘発法にかけ、融合タンパク質の相で翻訳されるようにＩｇＧ１重鎖のＡｓｐ２１６にできるだけ近くに同じ単一の制限部位を導入する。５'非翻訳配列からなり、ＩＬ−１８ＢＰをコードするｄｓＤＮＡ断片が、単一の制限部位での消化により、または適切に設計されたプライマーを用いたＰＣＲにより調製される。変異したｐＲＫＣＤ４２Ｆｃ１は、該プラスミドおよびＩｇＧ１配列を含む大断片を生じるように同様に設計される。続いて、２つの断片を連結し、ＩＬ−１８ＢＰおよびＩｇＧ１重鎖の約２２７個のＣ−末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）からなるポリペプチド前駆体をコードする新しいプラスミドを生じる。融合タンパク質をコードするＤＮＡが適切な制限酵素を用いた消化により該プラスミドから単離され、続いて効率的な原核または真核発現ベクターに挿入される。
【０１４８】
実施例１２：化学的に改変されたＩＬ−１８ＢＰｓの産生
血漿におけるＩＬ−１８ＢＰの半減期を増加させるため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学的に改変されたＩＬ−１８ＢＰｓが作製されうる。ＩＬ−１８ＢＰ郡市のシステイン残基にＰＥＧを架橋させることにより、改変がなされ得る。アミノ末端に余分のシステイン残基、グリコシル化部位、および各ＩＬ−１８ＢＰのカルボキシル末端を含む変異体ＩＬ−１８ＢＰｓが構築され得る。所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより、突然変異誘発が実施され得る。これらの変異タンパク質は当分野で周知の通常の様式で発現される。これらのタンパク質のペギレーション（Pegylation）が実施され、活性が評価される。
【０１４９】
実施例１３：ＩＬ−１８ＢＰに対するポリクローナル抗体の調製
まず、完全フロイントアジュバンドに乳化された尿ＩＬ−１８ＢＰの純化調製物５μｇをウサギに皮下注射した。３週間後、不完全フロイントアジュバンドのＩＬ−１８ＢＰ調製物５μｇを再び皮下注射した。ＰＢＳ溶液としてのＩＬ−１８ＢＰをさらに２回１０日おきに注射した。最終免疫の１０日後にウサギから採血した。抗体レベルの進行は放射免疫検定によって追跡された。125Ｉ−標識ＩＬ−１８ＢＰ（１６６，０００ｃｐｍ）をウサギ血清の様々な希釈物（１：５０、１：５００、１：５，０００、１：５０，０００）と混合した。タンパク質−Ｇアガロースビーズ（２０μｌ、ファルマシア社（Pharmacia））の懸濁物を全容積が２００μｌになるよう添加した。混合物を１時間室温におき、続いてビーズを３回洗浄し、結合放射活性が測定された。ヒトレプチンに対するウサギ抗血清がネガティブコントロールとして用いられた。ＩＬ−１８Ｒ抗血清の力価は１：５００および１：５０００の間であり、ネガティブコントロールの力価は１：５０より低かった。
【０１５０】
実施例１４：ＩＬ−１８ＢＰに対するモノクローナル抗体の調製
最初に、完全フロイントアジュバンドの乳化物の精製ＩＬ−１８ＢＰ ２μｇを雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（３ヵ月齢）注射し、３週間後、不完全フロイントアジュバンドで皮下注射した。ＰＢＳでＩＬ−１８ＢＰをさらに３回１０日おきに皮下注射した。最終免疫の１０日後にウサギから採血した。融合の４および３日前に、最終ブースト（boosts）がＩＲＩＡによる測定時に最も高い結合力価を示すマウスの腹腔内に施される（下記参照）。融合は、ＮＳＯ／１ミエローマ細胞系統および融合パートナーとしての動物の脾臓およびリンパ節からの両方から調製されるリンパ球を用いて融合が実施される。融合細胞は、ミクロ培養プレートに播種し、ＨＡＴおよび１５％馬血清を補足したＤＭＥＭでハイブリドーマを選別する。ＩＬ−１８ＢＰに対する抗体を産生することが見出されるハイブリドーマを限界希釈法でサブクローニングし、腹水産生のためプリスタン（pristane）で初回免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスに注射した。抗体のアイソタイプは市販のエリザキット（アマーシャム社（Amersham）、英国）を用いて定義される。
【０１５１】
抗ＩＬ−１８ＢＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングが次のように実施される：逆固相放射免疫検定（ＩＲＩＡ）により、ハイブリドーマの上清を抗−ＩＬ−１８ＢＰ抗体の存在下で試験する。エリザプレート（ダイナテックラボラトリー社（Dynatech Laboratories）、バージニア州アレキサンドリア）をタロンで精製したＩＬ−１８ＢＰａ−Ｈｉｓ6（１０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／穴）でコーティングする。４℃で一晩インキュベーション後、プレートをＢＳＡ（０．５％）およびツィーン２０（０．０５％）を含むＰＢＳで２回洗浄し、３７℃で少なくとも２時間洗浄溶液中で遮断する。プレートを３回洗浄し、室温で２時間、ヤギ−抗−マウスホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ、ジャックソンラブズ（Jackson Labs）、１：１０，０００、１００μｌ／穴）の複合物を添加する。プレートを４回洗浄し、基質としてＨ2Ｏ2を用いるＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６‐スルホン酸、シグマ社）により発色させる。プレートを自動エリザ読み取り機で読み取る。ネガティブコントロール値より少なくとも５倍高いＯＤを与える試料がポジティブと考えられる。
【０１５２】
実施例１５：モノクローナル抗体を用いたＩＬ−１８ＢＰのアフィニティークロマトグラフィー
ＩＬ−１８ＢＰに対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによってＩＬ−１８ＢＰの精製に利用される。ハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体を含む腹水液を５０％飽和の硫酸アンモニウム沈降により精製され、続いてＰＢＳで長い透析を行なった。製造業者によって指定されるように、約１０ｍｇの免疫グロブリンを１ｍｌのアフィゲル（バイオラッドＵＳＡ社（BioRad USA））に結合させる。
【０１５３】
４℃および０．２５ｍｌ／分の流速で、（２５０ ｌの粗尿に等価な）２５０ｍｌのヒト尿タンパク質を０．５ｍｌの抗ＩＬ−１８ＢＰ抗体カラムにかける。洗浄でタンパク質が検出されなくなるまでカラムをＰＢＳで洗浄する。ＰＨ２．２の２５ｍＭクエン酸緩衝液（８ｘ１カラム容量画分）でＩＬ−１８ＢＰを溶出し、直ちに１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3で中和する。この調製物のさらなる精製物は、サイズ排除クロマトグラフィーにより得られる。
【０１５４】
実施例１６：エリザ試験
マイクロタイタープレート（Microtiter plate）（ダイナテック（Dynatech）またはマキシソーブ（Maxisorb）、ヌンク社（Nunc）製）を４℃で一晩抗‐ＩＬ−１８ＢＰモノクローナル抗体（無血清ハイブリドーマ上清または腹水液の免疫グロブリン）でコーティングする。プレートをＢＳＡ（０．５％）およびツィーン２０（０．０５％）を含むＰＢＳで洗浄し、３７度で少なくとも２時間同じ溶液で遮断する。試験試料は、遮断溶液で希釈し、３７℃で４時間ウェルに添加する（１００μｌ／穴）。続いて、プレートをツィーン２０（０．０５％）を含むＰＢＳで３回洗浄し、４℃で一晩のさらなるインキュベーションのためウサギ抗‐ＩＬ−１８ＢＰ血清を添加する。プレートを３回洗浄し、室温で２時間、ヤギ‐抗−ウサギホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ、ジャックソンラブズ（Jackson Labs）、１：１０，０００、１００μｌ／穴）の複合物を添加する。プレートを４回洗浄し、基質としてＨ2Ｏ2を用いるＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３‐エチルベンズチアゾリン‐６‐スルホン酸、シグマ社）により発色させる。プレートを自動エリザ読み取り機で読み取る。
【０１５５】
実施例１７：非グリコシル化ヒトＩＬ−１８ＢＰは生物学的に活性である。
【０１５６】
精製組換えＩＬ−１８ＢＰａをＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する能力について試験した。ＩＬ−１８ＢＰａは、用量に依存的な様式でマウスの脾細胞、ＰＢＭＣおよびヒトＫＧ−１細胞系統におけるヒトおよびマウスＩＬ−１８の活性を誘導するＩＦＮ−γを阻害した（図９）。
【０１５７】
Ｃ末端でＨｉｓ6タグを有する精製ＩＬ−１８Ｂｐａ（１．５μｇ、５０μｌ）をｐＨ７．５に調整し、Ｎ−グリコシダーゼＦ（３μｌ、５００，０００Ｕ／ｍｌ、ＰＮＧアーゼＦ、ニューイングランバイオラブ社（New England Biolabs））と混合した。混合物を非還元条件下で３７℃で２４時間インキュベーションした。非還元ン条件下において試料由来および非消化ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ6由来のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてＩＬ−１８ＰＢに対する抗体でイムノブロティングした。ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ6の約４０ｋＤのバンドがＰＮＧアーゼ処理画分で消失することが見出され、新規な約２０ｋＤのバンドが得られた。該産物の分子量およびＰＮＧアーゼＦの特異性から、ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ6充分グリコシル化されたことが示された。
【０１５８】
ＰＮＧアーゼ処理画分、非分解ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ6および緩衝液中にＰＮＧアーゼを含む対照試料をタロンビーズにそれぞれ吸収させ、燐酸緩衝液で洗浄し、イミダゾール（１００ｍＭ）で溶出した。ヒトＩＬ−１８（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）およびマウスの脾細胞を用いて、溶出画分を生物検定にかけた。結果を以下の表に示す：
【０１５９】
【表５】
0004272348.tif 000013
【０１６０】
したがって、脱グリコシル化ＩＬ−１８ＢＰはＩＬ−１８活性の調節物質として生物学的に活性であると結論づけられる。
【０１６１】
具体的な実施態様の前記記載から、本発明の一般的性質が明らかにされ、最新の知識を応用することにより、そのような具体的実施態様を一般的概念から逸脱することなく容易に改変および／または様々な適用に適応させることが可能であり、したがってそのような適応および改変は開示された実施態様に等価な意味および範囲内で理解されることが意図されるべきであり、意図されているものである。本明細書で用いられる表現または専門用語は説明の目的のためのものであり、限定のためのものではないことが理解されよう。
【０１６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  リガンドアフィニティー精製されたＩＬ‐１８結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。（５００Ｌの正常なヒトの尿の限外ろ過により濃縮された）粗尿タンパク質をＩＬ−１８アガロースカラムにかけた。このカラムを洗浄し、結合タンパク質をｐＨ２．２で溶出した。溶出画分を中和し、アリコートを非還元条件および銀染色の下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）によって分析した。レーンは、１：粗尿タンパク質（１．５μｇ、ゲル上にのせた）；２〜９：それぞれＩＬ−１８アガロースカラムからの溶出１〜８；１０：右側に示すようにｋＤの分子量マーカー。矢印はＩＬ−１８ＢＰに相当するバンドを示す。
【図２】  下記の調製の可溶性ＩＬ−１８結合タンパク質に架橋させた125Ｉ−ＩＬ−１８（見かけ分子量１９ｋＤ）からなる複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％アクリルアミド）のオートラジオグラムを示す。レーン１：ＩＬ−１８アフィニティーカラムの洗浄。レーン２：ＩＬ‐１８アフィニティーカラムの溶出２。レーン３：ＩＬ−１８アフィニティーカラムの溶出３。分子量マーカーは（ｋＤで）右側に示す。矢印は架橋した産物を示す（５８ｋＤ）。
【図３】  ＩＬ−１８ＢＰによるＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導産生の阻害を示す。
（Ａ）直接どちらかを添加する、または尿ＩＬ−１８ＢＰとあらかじめ混合する（１ｈ、３７℃）というＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）およびヒトＩＬ−１８（５ｎｇ／ｍｌ）の示される組合せでマウスの脾細胞を刺激した（２４ｈｒ、３７℃）。培養におけるｍｕＩＦＮ−γのレベルは２４時間後に測定された。
（Ｂ）増加濃度のヒトＩＬ−１８ＢＰとあらかじめ混合した（１ｈ、３７℃）マウスＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）とともにＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）とマウスの脾細胞をインキュベーションした（２４ｈ）。
（Ｃ）増加濃度のヒトＩＬ−１８ＢＰとともにＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）とマウスの脾細胞をインキュベーションした（２４ｈ）。
（Ｄ）増加濃度のヒトＩＬ−１８ＢＰとともにＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）とマウスの脾細胞をインキュベーションした（２４ｈ）。
（Ｅ）ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｈｕＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）のいずれか単独を添加し、または尿ＩＬ−１８ＢＰとあらかじめ混合し（１ｈ、３７℃）、ヒトＫＧ−１細胞を刺激した。
【図４】  ヒトＩＬ−１８ＢＰａ ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。シグナルペプチドに下線を施す。
【図５】  ヒトＩＬ−１８ＢＰｂ ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。シグナルペプチドに下線を施す。
【図６】  ヒトＩＬ−１８ＢＰｃ ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。シグナルペプチドに下線を施す。
【図７】  ヒトＩＬ−１８ＢＰｄ ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。シグナルペプチドに下線を施す。
【図８】  ヒトＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の配列を示す。ヒトゲノムクローンの配列（７．１ｋｂ）を決定し、３つのｃＤＮＡライブラリーから単離された多様なｃＤＮＡクローンの配列と比較した。共通の翻訳開始コドンはヌクレオチド６８３〜６８５である。ＮｕＭＡ１遺伝子は、ヌクレオチド３５７８から末端までのマイナス鎖上に位置する。
【図９】  ヒトおよびマウスのＩＬ−１８活性における組換え体ＩＬ−１８ＢＰの作用を示す。
Ｈｉｓ6でタグをつけたＩＬ−１８ＢＰａは、ＣＯＳ７細胞で一過的に発現し精製された。
（Ａ）ヒトＩＬ−１８（５ｎｇ／ｍｌ）を、Ｈｉｓ6でタグをつけたＩＬ−１８ＢＰａまたはＲＰＭＩのどちらかとあらかじめ混合し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）とともにマウスの脾細胞に添加した。ＩＦＮ−γ産生を２４時間後に測定した。
（Ｂ）マウスＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）を、Ｈｉｓ6でタグをつけたＩＬ−１８ＢＰａまたはＲＰＭＩのどちらかとあらかじめ混合し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）とともにマウスの脾細胞に添加した。ＩＦＮ−γ産生を２４時間後に測定した。
（Ｃ）ヒトＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）を、ＣＯＳ７−ＩＬ−１８ＢＰａまたはＲＰＭＩのどちらかとあらかじめ混合し、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でヒトＰＢＭＣに添加した。
（Ｄ）ヒトＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）を、ＣＯＳ７−ＩＬ−１８ＢＰａまたはＲＰＭＩのどちらかとあらかじめ混合し、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でヒトＫＧ−１細胞に添加した。
【配列表】
0004272348.tif 000014
0004272348.tif 000015
0004272348.tif 000016
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0004272348.tif 000022
0004272348.tif 000023
0004272348.tif 000024
0004272348.tif 000025
【図１】
0004272348.tif 000026
【図２】
0004272348.tif 000027
【図３ａ】
0004272348.tif 000028
【図３Ｂ−Ｄ】
0004272348.tif 000029
【図３Ｅ】
0004272348.tif 000030
【図４】
0004272348.tif 000031
【図４Ａ】
0004272348.tif 000032
【図５】
0004272348.tif 000033
【図５Ａ】
0004272348.tif 000034
【図６】
0004272348.tif 000035
【図６Ａ】
0004272348.tif 000036
【図６Ｂ】
0004272348.tif 000037
【図６Ｃ】
0004272348.tif 000038
【図６Ｄ】
0004272348.tif 000039
【図６Ｅ】
0004272348.tif 000040
【図７】
0004272348.tif 000041
【図７Ａ】
0004272348.tif 000042
【図８】
0004272348.tif 000043
【図８Ａ】
0004272348.tif 000044
【図８Ｂ】
0004272348.tif 000045
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
0004272348.tif 000048
【図８Ｆ】
0004272348.tif 000049
【図９】
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