(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたTRAFのインヒビター(I-TRAF)ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示されたアミノ酸配列からなるヒトI-TRAFポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるマウスI-TRAF-αポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されたアミノ酸配列のN末端に、そのC末端で融合された、配列番号３のアミノ酸配列からなるマウスI-TRAF-βポリペプチド；
（ｄ）配列番号１に示されたアミノ酸配列の354位でのアミノ酸Gln(Q)に引き続きアミノ酸ValThrValLeuHis(VTVLH)で終結する、切り詰めたマウスI-TRAF-αポリペプチド；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸35-236または配列番号５のアミノ酸35-238に対応するアミノ酸配列を含み、TRAF2介在性NF-κB活性化を阻害することができる、（ａ）−（ｄ）のポリペプチドの断片；及び
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、TRAF2介在性NF-κB活性化を阻害することができるポリペプチド
(それぞれ開始メチオニンを含んでも含まなくても良く、それぞれの対立遺伝子変異体をも含む)
からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含む、単離されたI-TRAFポリペプチド。
【請求項２】
（１）５’末端に結合した配列番号４のヌクレオチド配列を有する若しくは有さない配列番号２、または（２）配列番号６、または（３）配列番号７、または（４）配列番号８の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸によってコードされる、TRAF2介在性NF-κB活性化を阻害することができる単離されたTRAFのインヒビター(I-TRAF)ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号６の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸によってコードされる請求項２に記載のI-TRAFポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６の核酸によってコードされる請求項３に記載のI-TRAFポリペプチド。
【請求項５】
配列番号７の核酸によってコードされる請求項２に記載のI-TRAFポリペプチド。
【請求項６】
配列番号８の核酸によってコードされる請求項２に記載のI-TRAFポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のI-TRAFポリペプチドに特異的に結合できる抗体。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。
【請求項９】
前記ポリペプチドが天然のヒトI-TRAFポリペプチドである請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが天然のマウスI-TRAFポリペプチドである請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
（１）５’末端に結合した配列番号４のヌクレオチド配列を有する若しくは有さない配列番号２、または（２）配列番号６、または（３）配列番号７、または（４）配列番号８の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、TRAF2介在性NF-κB活性化を誘導する細胞表面受容体との天然のTRAF2の相互作用を阻害できるポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含み、適切なホスト細胞においてそれを発現できるベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子でトランスフォームされたホスト細胞。
【請求項１４】
５’末端に結合した配列番号４のヌクレオチド配列を有する若しくは有さない配列番号２の配列を有する、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
配列番号６の配列を有する、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
配列番号７の配列を有する、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
配列番号８の配列を有する、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１から６のいずれか一項に記載のI-TRAFポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸分子を含み、適切なホスト細胞においてそれを発現できるベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸分子でトランスフォームされたホスト細胞。
【請求項２１】
（１）５’末端に結合した配列番号４のヌクレオチド配列を有する若しくは有さない配列番号２、または（２）配列番号６、または（３）配列番号７、または（４）配列番号８の配列を有する核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含み、適切なホスト細胞においてそれを発現できるベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸分子のいずれかでトランスフォームされたホスト細胞。
【請求項２３】
（ａ）TRAF2と請求項１から６のいずれか一項に記載のI-TRAFポリペプチドとを含む混合物を、候補の分子と共にインキュベートする工程、及び
（ｂ）I-TRAF/TRAF2の会合を調節する前記候補の分子の能力を検出する工程
を含む、TRAF2と請求項１から６のいずれか一項に記載のI-TRAFポリペプチドとの会合を調節できる分子を同定するためのアッセイ方法。
【請求項２４】
前記候補の分子がI-TRAF-TRAF2複合体の解離を防止または阻害する請求項２３に記載のアッセイ方法。
【請求項２５】
前記候補の分子がI-TRAFとTRAF2の会合を防止する請求項２３に記載のアッセイ方法。
【請求項２６】
前記候補の分子が10K未満の分子量を有する合成有機または無機化合物である請求項２３に記載のアッセイ方法。
【請求項２７】
前記TRAF2が天然のTRAF2ポリペプチドのTRAF2ドメインを含み、前記TRAF2ドメインがI-TRAFとの相互作用に必要である請求項２３に記載のアッセイ方法。
【請求項２８】
前記TRAF2及びI-TRAFポリペプチドがヒト由来である請求項２３に記載のアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はTRAF2を含む腫瘍壊死因子会合因子(TRAF)によるシグナル伝達をブロックする新しいポリペプチドの単離、組換え生産および特性指摘に関する。特に、本発明はTNF-R2およびCD40のようなTNF受容体スーパーファミリーの特定のメンバーによりシグナルを伝達されるTRAF2依存性NF-κB活性化の特異的な阻害剤として機能する新しいタンパク質、それらの生産の方法と手段およびスクリーニングアッセイにおけるまたは医薬としてのそれらの使用に関する。
発明の背景
腫瘍壊死因子(TNF)は活性化マクロファージにより主に生産される広い範囲の生物学的効果を導き出すサイトカインである。これらには内毒性ショックにおけるおよび炎症、免疫調節、増殖、細胞障害および抗ウイルス活性における重要な役割が含まれる(Goeddel,D.V.等,Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51,597-609[1986]にレビューされている;Beutler,B.とCerami,A.,Ann.Rev.Biochem.57,505-518[1988];Old,L.J.,Sci.Am.258(5),59-75[1988];Fiers,W.FEBS Lett.285(2),199-212[1991])。TNFによって介在される様々な細胞応答の誘導は、TNF-R1と名付けられたおよそ55kDaの受容体およびTNF-R2と名付けられたおよそ75kDaの受容体という二つの別個の細胞表面受容体との相互作用によって開始される。両受容体のタイプに相当するヒトおよびマウスcDNAは単離され特性指摘されている(Loetscher,H.等,Cell 61,351[1990];Schall,T.J.等,Cell 61,361[1990];Smith,C.A.等,Science 248,1019[1990];Lewis,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,2830-2834[1991];Goodwin,R.G.等,Mol.Cell.Biol.11,3020-3026[1991])。両TNF-R共細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を含む典型的な細胞表面受容体の構造を持っている。両受容体の細胞外部分は可溶性TNF結合タンパク質としても天然で見出されている(Nophar,Y.等,EMBO J.9,3269[1990]およびKohno,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,8331[1990])。ヒトTNF-R1のアミノ酸配列およびその元となる核酸配列はEP417,563(1991年3月20日に印刷された)に開示されており、一方EP418,014(1991年3月20日に印刷された)はヒトTNF-R2のアミノ酸配列および核酸配列を開示する。
両TNF受容体共TNF応答をシグナル伝達する独立の活性を持っている。TNF-R2による直接的シグナル伝達は、TNF-R2が胸腺細胞の増殖を刺激するリンパ性細胞およびネズミ細胞障害性T細胞系CT6内で観察されている(Tartaglia等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,9292-9296[1991];Tartaglia等,J.Immuno.151,4637-4641[1993])。TNF-R1およびTNF-R2の両者、それに例えばCD40のようなTNF受容体スーパーファミリーの他のメンバーを加えたものは、転写因子NF-κBの活性化を独立に介在することが示されている(Lenardo & Baltimore,Cell 58:227-229[1989];Laegreid,A.等,J.Biol.Chem.269,7785-7791[1994];Rothe等,Cell 78,681-692[1994];Wiegmann等,J.Biol.Chem.267,17997-18001[1992])。NF-κBは様々な重要な細胞の遺伝子およびウイルスの遺伝子の発現を制御する転写アクチベーターのRelファミリーのメンバーである(Lenardo & Baltimore,上記参照およびThanosとManiatis,Cell 80,529-532[1995])。TNF-R2もまた顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)遺伝子(Miyatake等,EMBO J.4:2561-2568[1985];Stanley等,EMBO J.4:2569-2573[1985])およびCT6細胞内のA20ジンクフィンガータンパク質遺伝子(Opipari等,J.Biol.Chem.265:14705-14708[1990])の転写誘導を介在し、細胞障害性のようなTNF-R1により一次的に介在される応答のシグナル伝達におけるTNF-R1に対するアクセサリー成分として関与する(Tartaglia,L.A.とGoeddel,D.V.,Immunol.Today 13,151-153[1992])。
最近の研究によりTNF-R2シグナル伝達カスケードに関与する75kDa腫瘍壊死因子受容体、TNF-R2の細胞内ドメインに会合するポリペプチド因子(「腫瘍壊死因子受容体会合因子」または「TRAF」)の単離がなされている。TRAF1およびTRAF2は新しいC末端ホモロジー領域、TRAFドメインを含むこの新しいタンパク質ファミリーの最初に同定された二つのメンバーであった(Rothe等,Cell 78,681-692[1994];1995年12月7日に印刷されたPCT WO95/3305)。さらなるTRAFドメインタンパク質、TRAF3(もともとCD40bp,CRAFまたはLAP1と名付けられた)もまた同定されている(Hu等,J.Biol.Chem.269,30069[1994];Cheng等,Science 267,1494[1995]およびMosialos等,Cell 80,389[1995])。ヒトTRAF2はSongとDonner,Biochem.j.809,825-829(1995)に開示されている。ヒトTRAFはMisialos等,上記参照に開示されている。TRAFはTNF-R2,CD40およびおそらく低アフィニティー神経細胞成長因子受容体,Fas抗原,CD27,CD30,OX40,4-1BBおよびTNFR-RPをまた含むTNF受容体スーパーファミリーの他のメンバー由来のシグナルを伝達する(Rothe等,上記参照;Hu等,J,Biol,Chem.269,30069-30072[1994];Cheng等,Science 267,1494-1498[1995];Mosialos等,Cell 80,389-399[1995];Rothe等,Science,印刷中;Smith等,Cell 76,959-962[1994])。両受容体の会合およびオリゴマー化に関与する共に存在する保存的なC末端TRAFドメインに加えて、TRAF2およびTRAF3はそれぞれN末端RINGフィンガードメインおよび五つのジンクフィンガー構造を含む弱い配列同一性を持つ。CD40およびTNF-R2はTRAF2と直接的に相互作用し、TRAF2/TRAF1ヘテロ二量体経由でTRAF1と間接的に相互作用する。TRAF2(またはTRAF2/TRAF1ヘテロ二量体)は、転写因子NF-κBのCD40介在性およびTNF-R2介在性活性化に必要である。TRAF3はCD40と相互作用し自己会合するが、TNF-R2,TRAF1またはTRAF2とは会合しないようである。シグナル伝達におけるTRAF3の役割はあまりよく定義付けられていないが、TRAF2の効果と拮抗するかもしれない(Rothe等,Science,印刷中)。TRAFタンパク質はまたエプスタインバーウイルストランスホーミングタンパク質LMP1のC末端細胞質ドメインとも相互作用する(Mosialos等,Cell 80,389[1995])。LMP1は細胞増殖および遺伝子発現に対して複数の下流の影響を持つ優性ガン遺伝子であり、少なくともそのいくつかはNF-κBの活性化に必要である(Laherty等,J.Biol.Chem.267,24157[1992];Rowe等,J.virol.68,5602[1994])。TRAF2はTNF-R2,CD40およびLMP1に対する共通のシグナル伝達子と考えられる。
発明の概要
本発明は「TRAFの阻害剤」(I-TRAF)と名付けられたある新しいTRAF相互作用タンパク質の同定、組換え生産および特性指摘に基づく。さらに特別に本発明はいかなる既知のタンパク質とも有意な配列相同性のないタンパク質をコードする様々な形態のネズミおよびヒトI-TRAFをコードするcDNAの単離と、該コードされたI-TRAFタンパク質の発現および特性指摘に基づく。
一面として本発明はTNF-R2、CD40および/またはTRAFが直接的にまたは間接的に会合するLMP1のような他の細胞タンパク質のような、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーとTRAFの相互作用を阻害する精製されたI-TRAFタンパク質に関する。
特に、本発明は以下のグループ：
(a)天然の配列のI-TRAFポリペプチド
(b)天然の配列のI-TRAFポリペプチドのTRAF結合ドメインと少なくとも約70%のアミノ酸配列同一性をもち、TRAF介在性シグナル伝達を阻害できるポリペプチド、および
(c)TRAF介在性シグナル伝達を阻害できる(a)または(b)のポリペプチドの断片から成るグループから選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたI-TRAFポリペプチドに関する。
好ましくは本発明のI-TRAFポリペプチドは天然のI-TRAFポリペプチド配列と少なくとも約60%の全体のアミノ酸配列同一性をもつ。I-TRAFポリペプチドは好ましくは天然のTRAFタンパク質との会合に必要かつ十分な天然の哺乳動物I-TRAFタンパク質の断片を含む。さらに好ましくは、I-TRAFポリペプチドは天然の哺乳動物I-TRAFまたは天然の哺乳動物TRAFタンパク質のTRAFドメインと相互作用する能力を維持するのに十分に相同なポリペプチドを含む。またさらに好ましくは、I-TRAFポリペプチドは天然のTRAF、好ましくはTRAF2と相互作用できる天然の哺乳動物I-TRAFのN末端部分を含む。哺乳動物タンパク質は好ましくはヒトである。
もう一面として、本発明はTNF-R2、CD40および/またはTRAFが直接的にまたは間接的に会合するLMP1のような他の細胞内タンパク質のような、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーとTRAFの相互作用を阻害するI-TRAFタンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。該核酸は好ましくは、413または447アミノ酸ネズミI-TRAFタンパク質(SEQ.ID.NO:1および3)または425アミノ酸ヒトI-TRAFタンパク質(SEQ.ID.NO:5)または図1(SEQ.ID.NO:8)に示されている切り詰めたネズミタンパク質を含むそれらの機能的な誘導体をコードする核酸配列を含む。もう一つの好ましい実施態様として、核酸はSEQ.ID.NO:2,4および6によって表される核酸分子のいずれのものかと相補的にハイブリダイズできる。
本発明はさらに、ベクター、細胞および該核酸を含む生物に関する。
さらなる一面として、本発明はI-TRAF/TRAF結合を調節する分子を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。好ましくは該分子はI-TRAF/TRAF相互作用を妨げるかI-TRAF/TRAF複合体の解離を妨げるまたは阻害するかどちらかである。該アッセイは候補の分子と共にTRAFおよびI-TRAFを含む混合物のインキュベーション、I-TRAF/TRAF結合を調節する、例えばTRAFとのI-TRAFの相互作用を妨げるかまたはI-TRAF/TRAF複合体の解離を妨げるまたは阻害する候補の分子の能力の検出を含む。該スクリーニング分子は好ましくは小分子薬剤候補である。
もう一面として、本発明は(a)候補の分子と共にTRAFおよびI-TRAFを含む混合物をインキュベートすることおよび(b)I-TRAFと形成した複合体からのTRAFを放出する候補の分子の能力を検出することを含む細胞のタンパク質と共にTRAFの会合によって介在されるシグナル伝達、つまりTRAF介在性シグナル伝達に作用する分子の同定のためのアッセイに関する。
さらにもう一面として、本発明はエプスタインバーウイルスに関連した腫瘍の治療法に関し、それには該腫瘍を形成しているまたは形成する危険のある患者に対し治療上の有効量のI-TRAFを投与することが含まれる。活性成分としてI-TRAFを含む製薬学的構成物もまた本発明の範囲内にある。
本発明はまたI-TRAFまたは機能的な誘導体をコードする核酸を細胞内に導入することを含む細胞におけるTRAF介在性シグナル伝達の調製法に関する。
【図面の簡単な説明】
図1(a)はネズミおよびヒトI-TRAFの導き出されたアミノ酸配列を示す。ネズミI-TRAFαおよびβスプライス変異体の翻訳開始コドンはそれぞれαおよびβによって示されている。スプライスジャンクションは星印(*)によって示されている。単離されたヒトI-TRAFcDNAクローンの全てがネズミI-TRAFαに相当する。ヒトI-TRAFの開始メチオニンの前には、ネズミI-TRAFαcDNAクローンには存在しない上流のインフレームストップコドンが先行する。未熟終結コドンで終結しているマウスI-TRAFαの二つの付加的なスプライス変異体のアミノ酸配列もまた示されている。
図1(b)は複数のマウス組織でのI-TRAFmRNAのノーザンブロット分析の結果を示す。
図2はI-TRAFがin vitro結合アッセイにおいてTRAF1,TRAF2およびTRAF3と会合することをを示す。
図3はI-TRAFがTNF-R2とのTRAF2の会合をブロックすることを示すウエスタンブロット分析の結果を示す。
図4はNF-κBの活性化に対するI-TRAFの阻害効果を示す。
SEQ.ID.NO:1は図1の”α”とマークされたアミノ酸を用いて開始する413アミノ酸のネズミI-TRAF(ネズミI-TRAFα)のアミノ酸配列を示す。
SEQ.ID.NO:2はネズミI-TRAFαの核酸配列を示す。この配列はいくつかの独立にクローン化されシークエンスされた混成物から得られた。
SEQ.ID.NO:3は図1の”β”とマークされたアミノ酸を用いて開始する447アミノ酸のネズミI-TRAF(ネズミI-TRAFβ)の配列中に存在する付加的な34アミノ酸を示す。
SEQ.ID.NO:4はネズミI-TRAFβの付加的な34アミノ酸をコードする核酸配列を示す。
SEQ.ID.NO:5はフルレングスヒトI-TRAFのアミノ酸配列を示す。
SEQ.ID.NO:6はフルレングスヒトI-TRAFの核酸配列を示す。
SEQ.ID.NO:7はネズミI-TRAFα(クローン8)をコードする一つのフルレングスクローンの完全なエディッティングされていない核酸配列である。
SEQ.ID.NO:8は図1(クローン23)に示されているVTVLH配列によって終結する切り詰められたネズミI-TRAFαタンパク質をコードする核酸配列である。
発明の詳細な説明
A.定義
「TRAFの阻害剤」、「TRAFタンパク質の阻害剤」、「TRAFポリペプチドの阻害剤」、「I-TRAFタンパク質」、「I-TRAFポリペプチド」および「I-TRAF」なる語は互換的に用いられ、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(例えばTNF-R2,CD40および/またはCD30)のようなTRAF介在性NF-κB活性化カスケードを誘導する細胞表面受容体との、および/または天然のTRAFが通常(直接的にまたは間接的に)会合するもう一つの細胞のタンパク質との天然のTRAFの相互作用を阻害する天然の配列のポリペプチド、またもし該I-TRAFポリペプチドがブロッキング抗体以外のものであればそれらの機能的な誘導体を示す。I-TRAFタンパク質は好ましくはTRAF1,TRAF2および/またはTRAF3のようなTRAFタンパク質に対して結合し、TRAFタンパク質を放出し得る潜在的な状態にそれをとどめておくことによって、例えばリガンド誘導性受容体凝集によって阻害効果を発揮する。「天然の配列のポリペプチド」および「天然のポリペプチド」なる語そしてそれらの文法上の変異形は互換的に用いられ、開始メチオニンがあるか否か、天然のソースから精製されたか、合成されたか、組換えDNA法により生産されたかまたはこれらの方法の組み合わせおよび/または他の方法により生産されたかに関わらず、いかなるヒトまたは非ヒト動物種のいかなる細胞タイプ内でも天然で生じるようなポリペプチドを意味する。天然の配列のI-TRAFポリペプチドは特異的に413アミノ酸ネズミI-TRAF(I-TRAFα;SEQ.ID.NO:1)、447アミノ酸ネズミI-TRAF(I-TRAFβ;SEQ.ID.NO:3)および425アミノ酸ヒトI-TRAF(SEQ.ID.NO:5)そしてそれらの付加的な天然で生じる選択的スプライスと対立遺伝子変異体を含む。ブタ、イヌ、ウマ等の他の哺乳動物種由来の天然のI-TRAFポリペプチドもまた含まれる。
「TRAF」、「TRAFタンパク質」および「TRAFポリペプチド」なる語は互換的に用いられ、TNF受容体スーパーファミリーの天然のメンバー(TNF-R2,CD40またはCD30のような)の細胞内ドメインと特異的に会合可能な天然の配列因子を示し、該天然の因子の機能的な誘導体をも示す。この定義に関係して、「特異的な会合」なる語は最も広い意味で用いられ、ヒトのまたは他のいかなる動物種のものでも天然のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞内ドメイン内の部位または領域との直接的な結合、およびもう一つのTRAFのようなさらなる分子によって介在される間接的な会合を含む。「天然の配列の因子」なる語は上述の「天然の配列のポリペプチド」の定義と類似した態様で定義される。天然の配列のTRAFポリペプチドは特異的にRothe等,Cell 78,681-692[1994]に開示されているような天然のネズミTRAF1およびTRAF2ポリペプチド、Hu等,上記参照、Cheng等,上記参照およびMosialos等,上記参照に開示されているようなTRAF3そしてヒト及び他の動物種におけるそれらの同等物をも含む。
天然のポリペプチドの「機能的な誘導体」とは天然のポリペプチドと共通して質的な生物学的活性を持つ化合物である。本発明の目的に対して、天然のI-TRAFの「機能的な誘導体」とは該機能的な誘導体が(抗TRAFまたは抗TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの)ブロッキング抗体ではないとの条件付きで、TRAFが天然で会合するTNF受容体スーパーファミリーのメンバーとのTRAFの会合を阻害する能力によって定義される。好ましくは機能的な誘導体はTRAF1,TRAF2および/またはTRAF3のような天然のTRAFポリペプチドに結合し、それによって(可逆的または不可逆的に)TRAF介在性NF-κB活性化カスケードを誘導する細胞表面受容体(例えばTNF-R2,CD40,CD30)との相互作用を妨げる。特に好ましい実施態様として、TRAF介在性シグナル伝達の妨害は可逆的であり、TRAFは例えばルガンド介在性受容体凝集によってその潜在的な阻害段階から放出され得る。機能的な誘導体は天然の配列のI-TRAFポリペプチド、好ましくはヒトI-TRAFと少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90%の全体のアミノ酸配列同一性をもつ。さらにより好ましくは、機能的な誘導体は天然の配列のI-TRAFポリペプチドのTRAF結合ドメインと少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%そして最も好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性を示す。様々な哺乳動物種由来の天然の配列のI-TRAFポリペプチドの断片および該断片と相同な配列は、I-TRAFの機能的な誘導体のもう一つの好ましいグループを構成する。該断片は好ましくはSEQ.ID.NO:1または3で表されるマウスI-TRAF配列の35-236アミノ酸およびヒトI-TRAF配列の同等の部分のような、TRAF結合に必要かつ十分な天然の配列のI-TRAFのN末端領域を含み、天然の配列のI-TRAFのTRAF結合N末端部分と少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは約90%の配列同一性を示す。I-TRAFの機能的な誘導体のもう一つの好ましいグループは、天然のI-TRAFポリペプチドをコードする核酸の相補的なものに対して厳しいコンディションでハイブリダイズする核酸によってコードされる。
本発明の目的にしかがって定義されるような天然のTRAFポリペプチドの機能的な誘導体は、TNF-R2,CD40および/またはCD30のようなTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞内ドメインと(直接的にまたは間接的に)会合するための天然のTRAFの能力を維持していることによって特性指摘される。該TRAFの機能的な誘導体は好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞内ドメインと共同しておよび/または天然のI-TRAFポリペプチドが結合する領域(類)と共にホモまたはヘテロ二量体化して、直接的に関与する天然のTRAF配列内の領域(類)を維持するまたは真似る。TRAFの機能的な誘導体の好ましいグループは、天然の配列のTRAFと少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、さらに好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90%の全体の配列同一性を示す。他の好ましい機能的な誘導体は天然の配列のTRAFタンパク質の保存的なTRAFドメインであるまたはそれを含む。このグループの中では、天然のTRAF2アミノ酸配列の少なくとも264から501アミノ酸を含むTRAF断片が特に好ましい。また好ましいTRAF変異体は、天然の配列のTRAFタンパク質、好ましくはTRAF2のTRAF領域と少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を示す。TRAFの機能的な誘導体のさらに好ましいグループは、ヒトを含めたいかなる哺乳動物種の天然の配列のTRAFポリペプチドの相補的なものに対して厳しいコンディションの下でハイブリダイズできる核酸によってコードされる。
ここでいう天然のポリペプチドまたはポリペプチドおよびその機能的な誘導体に関して「同一性」または「相同性」なる語は、配列を並べ、必要であれば最大のパーセントホモロジーを得るためにギャップを導入し、配列同一性の一部としていかなる仮定的な置換も考慮しない、相当する天然のポリペプチドの残基と同一の候補の配列内のアミノ酸残基のパーセントである。配列を並べることについての方法およびコンピュータープログラムは本分野でよく知られている。
「単離した」ポリペプチドまたは核酸なる語は、その天然環境でそれが会合する少なくともいくつかの物質を伴わないものをいう。単離したポリペプチドは、与えられたサンプルにおける全タンパク質の少なくとも約2%までの重さ、好ましくは少なくとも約5%までの重さを構成する。単離した核酸は、与えられたサンプルにおける全核酸の少なくとも約0.5%までの重さ、好ましくは少なくとも約5%までの重さを構成する。
「抗体」なる語は最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体(作用剤および拮抗剤抗体を含む)、ポリエピトープ性の特異性を持つ抗体構成物を特にカバーし、望ましい生物学的活性を示す範囲で抗体断片(例えばFab,F(ab’)2およびFv)をもカバーする。
ここで用いられている「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体をいう、すなわち集団に含まれている個々の抗体は、少量存在しているであろう潜在的に自然に生じ得る突然変異を除いて等しいものである。モノクローナル抗体は高い特異性をもち、単一の抗原部位に対して向けられている。さらに典型的に異なる決定基(エピトープ)に対して向けられた異なる抗体を含む伝統的な(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマカルチャーによって合成されるという利点があり、他の免疫グロブリンによって混合されていない。緩和された「モノクローナル」なる語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の性質を示し、いかなる特定の方法による抗体の生産を必要とするように構成されるものではない。例えば本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、Kohler & Milstein等,Nature 256:495(1975)に最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製され得るし、組換えDNA法[米国特許第4,816,567号(Cabilly等)参照]によって作製され得る。
モノクローナル抗体はH鎖および/またはL鎖の一部が特定の種由来の抗体内の相当する配列と等しいまたは同一源でありあるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属し、その一方で鎖(類)の残りの部分がもう一種由来の抗体の相当する配列と等しいまたは同一源でありあるいはもう一種の抗体のクラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体をここで特別に含み、同様に望ましい生物学的活性を示す範囲で該抗体の断片をも含む[米国特許第4,816,567号;Cabilly等;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。
非ヒト(例えばネズミ)抗体の「ヒト化」形態とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含むそれらの断片(Fv,Fab,Fab’,F(ab’)2または他の抗体の抗原結合部分配列)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は受容者の相補性決定領域(CDR)由来の残基が望ましい特異性、アフィニティーおよび力量を持つマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(提供者抗体)のCDR由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン(受容者抗体)である。ある例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が相当する非ヒト種残基によって置換されている。さらにヒト化抗体は受容者抗体にもインポートCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基をも含み得る。これらの修飾は抗体の能力をさらに精密にし最適化するためになされる。一般的にヒト化抗体は少なくとも一つ、典型的には二つの可変領域の実質的に全てを含み、可変領域内の非ヒト種免疫グロブリンのものに相当するCDR領域の全てまたは実質的に全ておよびFR領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであろう。ヒト化抗体はまた場合により典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Jones等,Nature 321:522-525(1986);Reichmann等,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992):および1993年7月6日に査定された米国特許第5,225,539号(Winter)参照。
本発明の目的として定義される「ベクター」なる語は、適したホストにおいてDNAの発現を遂げることができる適したコントロール配列と実施可能に結合されたDNA配列を含むDNA構築物をいう。該コントロール配列には、転写を遂げるためのプロモーター、場合により該転写をコントロールするためのオペレーター配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列および転写と翻訳の終結をコントロールする配列含む。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単に潜在的なゲノム挿入物であろう。一度適したホストにトランスフォームされると、ベクターはホストゲノムとは独立に複製し機能し、またはある場合にはゲノム自身に入り込むであろう。本明細書では「プラスミド」および「ベクター」とは、現在プラスミドが最も共通に用いられるベクターの形態であるように時に互換的に用いられる。しかしながら本発明は、同等な機能を有し、本分野で既知のまたは既知になる他の形態のベクターをも含むことが企図されている。哺乳動物細胞カルチャー発現に対する好ましい発現ベクターは、pRK5(EP307,247;Rothe等,Cell,上記参照)およびpSV16B(PCT出願番号WO91/08291)に基づく。
本発明に関係して、発現「細胞」、「細胞系」および「細胞カルチャー」なる語は互換的に用いられ、全ての該表記は子孫を含む。全ての子孫は計画的なまたは偶然の突然変異のためDNA内容物において正確に同一ではないであろう。もともとのトランスフォームされた細胞においてそれからスクリーニングされたものと同じ機能および生物学的性質を持つ突然変異子孫も含まれる。
本発明で用いられる「ホスト細胞」なる語は一般的に、原核生物または真核生物ホストである。該ホスト細胞は例えば1992年4月28日に査定された米国特許第5,108,901号およびPCT出願番号WO95/33051に開示されている。適した原核生物は例えば大腸菌またはバチルスのようにグラムネガティブまたはグラムポジティブ生物を含む。大腸菌B、大腸菌x1776(ATCC31,537)、大腸菌W3110(ATCC27,325)、シュードモナス種または霊菌のような他のグラムネガティブまたはグラムポジティブ原核生物も適してはいるが、好ましいクローニングホストは大腸菌294(ATCC31,446)である。原核生物に加えて、糸状菌および酵母のような真核生物微生物が本発明の適切なベクターに対する適したホストである。サッカロミセスセレビシエまたは一般的なパン酵母が、低級真核生物ホスト微生物の間で最も共通に用いられている。しかしながら上記引用した特許および特許出願に開示されているもののように、たくさんの他の属、種および株が一般的に入手可能でありここで有用である。本発明に対して好ましい酵母株は、サッカロミセスセレビシエHF7c(CLONTECH)である。
適したホスト細胞は多細胞生物由来でもよい。該ホスト細胞は複雑なプロセシング活性とグリコシレーション活性を持っている。ヒトのような哺乳動物由来の細胞が好ましいが、特にいかなる高等真核生物細胞カルチャーも脊椎動物由来であろうと無脊椎動物由来であろうと実施可能である。無脊椎動物細胞の例としては植物細胞および昆虫細胞が含まれ、これらについてはLuckow等,Bio/Technology 6,47も5(1988);Genetic Engineering,Setlow等,編,第8版(Plenum Publishing,1986),pp.277-279内のMiller等;およびMaeda等,Nature 315,592-594(1985)を参照。脊椎動物細胞において興味が最大であり、カルチャー内(組織カルチャー)での脊椎動物細胞の増殖はそれ自体が知られている。Tissue Culture,Academic Press,KruseとPatterson,編(1973)参照。有用な哺乳動物ホスト細胞系の例としては、SV40でトランスフォームされたサル腎CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎細胞系(293細胞または懸濁液カルチャー内での成長のためサブクローン化された293細胞,Graham等,J.Gen.Virol.36,59[1977]);ベイビーハムスター腎細胞9BHK,(ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,UrlaubとChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4216[1980]);マウスセルトリー細胞(TN4,Mather,Biol.Reprod.23,243-251[1980]);サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカグリーンサル腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);ヒト子宮頚ガン細胞(HELA,ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL3A,ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳腫瘍(MMT 060562,ATCC CCL 51);TRI細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383,44068[1992]);MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝ガン細胞系(Hep G2)がある。好ましいホスト細胞はヒト胚腎293およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。本発明に対して特に好ましいものは、Tartaglia等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,9292-9296(1991)およびPennica等,J.Biol.Chem.267,21172-21178(1992)に記述されているように維持されている、ネズミインターロイキン-2-依存性細胞障害性T細胞系CT6およびヒト胚腎細胞系293である。
「解離」なる語は二つの分子が相互作用を止める過程である：その過程は特異的な物理的コンディションの下で一定の平均した割合で生ずる。
B.天然のI-TRAFの同定および精製
天然のI-TRAFポリペプチドは例えばTRAF(例えばTRAF2)mRNAをもち、それを検出可能なレベルに発現している特定の組織から単離され精製されるであろう。ネズミI-TRAFは例えばネズミ胎児肝ストロマ細胞系7-4(FL;Rothe等,Cell,上記参照)またはネズミ末梢リンパ節(PLN;1994年4月19日に査定された米国特許第5,304,640号)から得られる。ヒトI-TRAFは例えばヒト末梢リンパ節から精製される。I-TRAFmRNAはまたTRAF、例えばTRAF2mRNAと共に、脳、脾臓、胚、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣組織にも存在し発現される。天然のI-TRAFは例えばTRAF2(またはもう一つのTRAF、例えばTRAF1)に結合するその能力に基づいて、そのmRNAを発現している組織から同定され精製される。天然のI-TRAFは免疫沈降したTRAF2と共に共沈降するであろう。好ましい実施態様として、ラジオラベルTRAF2または誘導体はプロテインA-アガロース(Oncogene Science)またはプロテインA-セファロース(Pharmacia)と共に免疫沈降する。それから免疫沈降物を用いられるラジオラベルに依存して、オートラジオグラフィーまたはフルオログラフィーによって分析する。I-TRAFタンパク質はTRAF2またはその誘導体と共沈降するであろうし、さらにアフィニティーカラム上での精製のように本分野で既知の方法で精製され得る。ラージスケールの精製のために、SmithとJohnson,Gene 67,31-40(1988)に記述されているものと同様のスキームが用いられ得る。精製されるI-TRAF(類)を含む細胞溶解物をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)-TRAF融合タンパク質アフィニティーカラムにアプライする。カラムに結合したタンパク質(類)を溶出し、沈降し、還元コンディションの下でのSDS-PAGEによって単離し、例えば銀染色によって明視化する。GST遺伝子融合ベクター(pGEXベクター)は、GST融合システムのクローニングおよび発現のためのキットと同様に、Pharmaciaから商業的に入手可能である(Pharmacia Catalog,1994,133および142-143ページ参照)。
C.I-TRAFポリペプチドの組換え生産
好ましくはI-TRAFポリペプチドはI-TRAFポリペプチド核酸を発現するためにトランスフェクトされた細胞を培養し(典型的には発現ベクターを用いて細胞をトランスフォームすることによって)、細胞からポリペプチドを回収することによる標準的な組換え法によって調製される。しかしながら相同的組換えによって、またはTRAFポリペプチドをコードするDNAを既に含んでいる細胞内に導入されたコントロールエレメントを利用した組換え生産法によって、I-TRAFポリペプチドを生産し得ることも構想される。例えば強力なプロモーター/エンハンサーエレメント、サプレッサーまたは外来転写調節エレメントを、望ましいI-TRAFポリペプチドをコードするDNAの転写に影響を及ぼすために十分に接近しておよび十分な配向で企図されたホスト細胞のゲノムに挿入することもできる。コントロールエレメントはI-TRAFポリペプチドをコードしておらず、むしろそのDNAはホスト細胞ゲノムに固有のものである。次に本発明のポリペプチドを生産する細胞のため、または必要であればより多くのまたはより少ない発現のレベルのためにスクリーニングする。組換えDNA法の一般的な方法は例えばSambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press),1989内に開示されている。
1.I-TRAFポリペプチドをコードするDNAの単離
本発明の目的のために、I-TRAFポリペプチドをコードするDNAを例えばTRAFmRNAをもち、それを検出可能なレベルに発現していると考えられる組織から調製したcDNAライブラリーから得る。例えばcDNAライブラリーを、TRAFタンパク質を発現していることが知られている細胞系からポリアデニル化mRNAを得、ダブルストランドcDNAを合成するためにそのmRNAを鋳型として用いることによって構築しうる。この目的のために適したヒトおよび非ヒト細胞系そして組織は上述してある。代わりに新しいI-TRAFポリペプチドをコードするDNAは、以前に同定したI-TRAFポリペプチドを検出可能なレベルで発現することが知られている組織から調製したcDNAライブラリーからも得られる。I-TRAFポリペプチド遺伝子はまた、ヒトゲノムコスミドライブラリーのようなゲノムライブラリーからも得られる。
ライブラリーはcDNAであれゲノムであれ、興味あるまたはそれによってコードされるタンパク質の遺伝子を同定するためにデザインされたプローブを用いてスクリーニングされる。cDNA発現ライブラリーのために適したプローブは、I-TRAFポリペプチドを認識しそれに特異的に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。cDNAライブラリーのために適したプローブは、同じまたは異なる種由来のI-TRAFポリペプチドの既知のまたは推測される部分をコードする慎重に選択されたオリゴヌクレオチドプローブ(通常約20-80ベースの長さである)および/または同じまたは相同な遺伝子をコードする相補的なまたは相同なcDNAまたはその断片を含む。ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするのに適切なプローブは、同じまたは相同な遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド、cDNAまたはそれらの断片および/または相同なゲノムDNAまたはそれらの断片を制限することなく含む。選択されたプローブを用いたcDNAまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)の第10-12章に記述されているような標準的な方法を用いてコントロールされ得る。
本発明を実施する好ましい方法は、様々な組織由来のcDNAライブラリーをスクリーニングするために慎重に選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いることである。プローブとして選択されてオリゴヌクレオチド配列は、間違ったポジティブを最小化するために十分な長さで十分に明白であるべきである。真の核酸配列(類)は、通常少なくともコドン重複性をもつI-TRAFの領域に基づいてデザインされる。オリゴヌクレオチドは一つ以上の位置で縮重しているであろう。縮重したオリゴヌクレオチドの使用は、選択的なコドン使用法が未知である種由来のライブラリーがスクリーニングされる場合特に重要である。
オリゴヌクレオチドはスクリーニングされるライブラリーにおいてDNAとのハイブリダイゼーションを検出するためにラベルされなければならない。ラベルのための好ましい方法は、オリゴヌクレオチドの5’末端をラジオラベルするためにAT-P(例えばγ32P)およびポリヌクレオチドキナーゼを用いることである。しかしながらビオチン化または酵素ラベルを制限することなく含む他の方法も、オリゴヌクレオチドをラベルするために用いられ得る。
I-TRAFをコードするcDNAは、1987年7月28日に査定された米国特許第4,683,195号、Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989の第14章、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等,編,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991内に記述されているような直接発現クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いるような、組換えDNA法という既知の方法以外によっても同定し単離することができる。この方法はI-TRAFをコードするDNAとハイブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。
本発明を実施するための好ましい方法にしたがって、I-TRAFタンパク質をコードする配列は、TRAFタンパク質、例えばTRAF2と相互作用するその能力に基づいた組換えcDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーにおいて同定され得る。この目的に対しては、ChevrayとNathans[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5789-5793(1992)]によって開示されているように、Fieldsと共同研究者[FieldsとSong,Nature(London)340,245-246(1989);Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,9578-9582(1991)]によって記述された酵母ゲノムシステムを用いることができる。酵母GAL4のような多くの転写アクチベーターは、一つはDNA結合ドメイン、もう一つは転写活性化ドメインである二つの物理的に分離したドメインから成る。前述の出版物に記述されている酵母発現システム(一般的に「トゥーハイブリッドシステム」と呼ばれている)はこの性質を利用しており、一つはターゲットタンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合したもの、もう一つは候補の活性化タンパク質が活性化ドメインに融合したものである二つのハイブリッドタンパク質を用いる。GAL4活性化プロモーターのコントロールの下でのGAL1-lacZレポーター遺伝子の発現は、タンパク質-タンパク質相互作用経由でGAL4活性の再構成に依存している。相互作用をしているポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質を用いて検出される。トゥーハイブリッド法を用いた二つの特異的なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するための完全なるキット(MATCHMAKERTM)は、Clontechから商業的に入手可能である。このシステムはまた特異的なタンパク質相互作用に関与するタンパク質のドメインをマップすることにも拡張でき、これらの相互作用に決定的であるアミノ酸残基を正確に指摘するためにも同様に拡張し得る。酵母トゥーハイブリッドクローニングは、TRAF2またはGAL4DNA結合ドメインベクターpPC97(ChevrayとNathans,上記参照)におけるTRAFドメインをおとりのように用いて、Rothe等,上記参照のように実施され得る。
一度配列がわかってしまえば、特定のI-TRAFポリペプチドをコードする遺伝子はまたEngelsとUhlmann,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.28,716(1989)に記述されている方法の一つにしたがって、化学的合成により得られ得る。これらの方法はトリエステル、亜リン酸塩、ホスホルアミダイトおよびH-ホスホネート法、PCRおよび他の自動プライマー法、そして固体の支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。
2.天然のI-TRAFタンパク質または断片のアミノ酸配列変異体
天然のI-TRAFおよびI-TRAF断片のアミノ酸配列変異体は、天然のまたは変異体I-TRAFDNAに適切な核酸変異を導入することによる、または望ましいポリペプチドのin vitro合成による本分野で既知の方法にしたがって調製される。アミノ酸配列変異体の構築には二つの原理の変異がある：突然変異の部位の位置および突然変異の性質である。I-TRAFをコードするDNA配列の操作を必要としない天然に生じる対立遺伝子を除いて、I-TRAFポリペプチドのアミノ酸配列変異体は好ましくは対立遺伝子または天然には生じないアミノ酸配列変異体に到達するためにDNAを突然変異させることによって構築される。天然のタンパク質内のターゲット残基の同定法およびアミノ酸配列変異体の作製法は本分野でよく知られており、例えば1992年4月28日に査定された米国特許第5,108,901号およびPCT出願WO95/33051に開示されている。好ましい方法としては、アラニンスキャニングミュータジェネシス、PCRミュータジェネシス、カセットミュータジェネシス、ファージアミドディスプレー法が含まれ、それらの詳細は例えばSambrook等,上記参照およびCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel等,編,上記参照のような一般的なテキストブックにも見出される。
本発明のI-TRAFアミノ酸配列変異体の好ましいグループは、TRAF結合に直接的に関与する領域内の一つ以上のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を含む。この領域内のアミノ酸の改変はI-TRAF/TRAF結合アフィニティーの本物の変化を引き起こすことが期待され、必要であれば天然のI-TRAFよりも強いまたは弱い結合アフィニティーを持つ変異体を生じ得る。
天然に存在するアミノ酸は一般的な側鎖の性質に基づいてグループに分割される：
(1)疎水性：ノルロイシン,met,ala,val,leu,ile;
(2)中性の疎水性:cys,ser,thr;
(3)酸性:asp,glu;
(4)塩基性:asn,gln,his,lys,arg;
(5)鎖配向性に影響する残基:gly,pro;および
(6)芳香族性：trp,tyr,phe
保存的な置換は一つのグループの一つのメンバーを同じグループ内のもう一つのメンバーに変換することを含む一方で、非保存的な置換はこれらの分類の一つのメンバーをもう一つのものに変換することを必然的に伴うであろう。非保存的な置換により得られた変異体は、得られた変異体の生物学的性質/機能により有意な変化を引き起こすことが期待される。
アミノ酸配列欠失は一般的に約1から30残基、より好ましくは約1から10残基の範囲であり、典型的には隣接している。TRAF結合ドメイン内の欠失、場合により他のタイプの突然変異との組み合わせも考えられるが、欠失は好ましくはTRAFとの相互作用に直接には関与しない領域に導入される。
アミノ酸挿入は1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端への融合を含み、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入をも含む。配列内挿入(すなわちI-TRAFタンパク質アミノ酸配列内への挿入)は、一般的に約1から10残基、より好ましくは1から5残基、さらに好ましくは1から3残基の範囲である。末端への挿入の例としては、N末端メチオニル残基、細菌組換え細胞カルチャーでの直接的な発現のアーティファクト、および組換えホスト細胞からの成熟したI-TRAFの分泌を容易にするためのI-TRAF分子のN末端への異種のN末端シグナル配列の融合を用いたI-TRAFポリペプチドが含まれる。該シグナル配列は一般的に企図されたホスト細胞種から得られ、それゆえ同細胞種に相同であろう。適した配列としては、大腸菌に対するSTIIまたはIpp、酵母に対するアルファファクターおよび哺乳動物細胞に対するヘルペスgDのようなウイルスシグナルが含まれる。
天然のI-TRAF分子の他の挿入変異体には、免疫原性ポリペプチド、例えばべータラクタマーゼのような細菌性ポリペプチドまたは大腸菌trpローカスにコードされている酵素、さもなければ酵母タンパク質のI-TRAFのN末端またはC末端の融合、および1989年4月6日に印刷されたWO89/02922に記述されているような免疫グロブリン領域(好ましくはイムノアドヘシンを生産するために免疫グロブリン定常領域)、アルブミンまたはフェリチンのような長い半減期を持つタンパク質を用いたC末端の融合が含まれる。免疫グロブリン融合物の生産に対しては、1995年6月27日に査定された米国特許第5,428,130号も参照。
変異体TRAFの特性指摘をあらかじめ予想するのはしばしば困難であるため、スクリーニングは最適な変異体を選択する必要があろうことが認識されるであろう。この目的のため、以下に記述されたもののような生化学的または他のスクリーニングアッセイが容易に実施されるであろう。
天然の配列のI-TRAFポリペプチドの好ましいアミノ酸配列変異体は、TRAF結合(例えばネズミI-TRAF配列の237番目からC末端までのほとんどのアミノ酸)が欠失されている必要はなく、唯一機能的に完全なドメインとしてTRAF相互作用領域がそのままである配列を持つ。該変異体はその結合性質、安定性または他の特徴を最適化するために、TRAF相互作用領域内にアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を付加的にもつであろう。
3.クローニング/発現ベクターへのDNAの挿入
一度天然のまたは変異体I-TRAFの核酸が入手されると、それをさらなるクローニング(DNAの増幅)または発現のため複製可能な発現ベクターに挿入する。
発現およびクローニングベクターは本分野でよく知られており、ベクターを一つ以上の選択されたホスト細胞で複製可能にする核酸配列を含む。適切なベクターの選択は、1)DNA増幅のために用いられるのかDNA発現のために用いられるのか、2)ベクターに挿入されるDNAのサイズ、3)ベクターを用いてトランスフォームされるホスト細胞に依存するであろう。各ベクターはその機能(DNAの増幅またはDNAの発現)およびそれが親和性であるホスト細胞に依存した様々な構成要素を含む。該ベクター構成要素は一般的に、以下の一つ以上を制限することなく含む：シグナル配列、複製オリジン、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。様々なホスト細胞の組み合わせで用いられる適した発現ベクターは本分野でよく知られており、それらの好ましい代表例は上記リストアップされている。
それからホスト細胞をトランスフォームし、培養し、そして遺伝子増幅/発現をSambrook等,上記参照,およびAusubel等,上記参照に開示されているもののように本分野でよく知られた方法で検出する。
4.I-TRAFポリペプチドの単離および精製
I-TRAFポリペプチドは典型的には組換え細胞カルチャーの溶解物から回収される。I-TRAFが一種のヒト由来以外の組換えホスト細胞において発現された場合、ヒト由来のタンパク質またはポリペプチドから完全にフリーである。しかしながら、I-TRAFと実質的に均質な調製物を得るために組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからI-TRAFタンパク質を精製する必要がある。最初の段階として、粒子状の細胞破片を取り除くためカルチャー培地または溶解物を遠心分離する。それから膜系および可溶性画分を分離する。それからI-TRAFタンパク質を可溶性タンパク質画分から精製し得る。以下の方法は適した精製法の例示的なものである：イオン交換カラム上での分別または免疫アフィニティー；エタノール沈殿；逆相HPLC;シリカ上でのまたはDEAEのようなカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫安沈殿；例えばSephadexG-75を用いたゲル濾過;IgGのような混在物を除去するためのプロテインA Sepharoseカラム。天然のI-TRAFが天然で存在する細胞からそれを精製する好ましいスキームは、組換えホスト細胞からの天然の分子の機能的な誘導体を含む組換えI-TRAFの精製に同等に適している。
D.I-TRAFポリペプチドの共有結合修飾
I-TRAFの共有結合修飾はここで発明の範囲に含まれる。該修飾は選択された側鎖または末端の残基に反応可能な有機誘導化試薬を用いてI-TRAFの目標とされるアミノ酸残基に反応することによって、または選択された組換えホスト細胞において機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用することによって伝統的に導入される。結果として生ずる共有結合誘導体は、生物学的活性、I-TRAFのイムノアッセイ、またはイムノアッセイ精製のための抗I-TRAF抗体の調製について重要な残基の同定に向けられたプログラムにおいて有用である。例えばニンヒドリンを用いた反応の後のタンパク質の生物学的活性の完全な不活性化は、少なくとも一つのアルギニル残基またはリシル残基がその活性にとって決定的であることを示唆するであろうし、その後選択されたコンディションの下で修飾された個々の残基が修飾されたアミノ酸残基を含むペプチド断片の単離によって同定される。該修飾は当業者の範囲内に有り、過度の実験なく実施される。
システイニル残基はカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得るために、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα-ハロ酢酸塩(および相当するアミン)を用いて最も一般的に反応される。システイニル残基はまたブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾル)プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリ安息香酸塩、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オクサ-1,3-ジアゾールを用いた反応によって誘導化される。
ヒスチジル残基はpH5.5-7.0でのジエチルピロカルボネートを用いた反応によって誘導化されるが、それはこの試薬がヒスチジル側鎖に比較的特異的なためである。パラ-ブロモフェナシルブロマイドもまた有用である：この反応はpH6.0での0.1Mカコジル酸ナトリウムにおいて実施される。
リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物を用いて反応される。これらの試薬を用いた誘導化はリシニル残基の電荷を転換する効果を持つ。α-アミノを含む残基の誘導化にとって他の適した試薬は、メチルピコリンイミデート；ピリドキサルリン酸塩；ピリドキサル；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸;0-メチルイソウレア;2,4-ペンタンジオンのようなイミドエステル；およびグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼ触媒性反応を含む。
アルギニル残基は一つ以上の伝統的な試薬を用いた反応で修飾され、それらの中にはフェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導化は、グラニジン官能基の高いpKaのため反応がアルカリコンディションで実施される必要がある。さらにこれらの試薬はリシンの基と同様に、アルギニンイプシロン-アミノ基とも反応するであろう。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンを用いた反応によってチロシル残基にスペクトルラベルを導入するという特別な興味を持ってなされるであろう。最も共通には、N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンがそれぞれ0-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成するために用いられる。チロシル残基はラジオイムノアッセイにおいて使用されるラベルされたタンパク質の調製のため125Iまたは131Iを用いてヨウ素処理される。
カルボキシル基(アスパルチルまたはグルタミル)は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(-4-アゾニア-4,4-ジメチルフェンチル)カルボジイミドのようなカルボジイミド(R’-N=C=N-R’)を用いた反応によって選択的に修飾される。さらにアスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンを用いた反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は相当するグルタミルおよびアスパルチル残基にしばしば脱アミド化される。代わりにこれらの残基は穏やかな酸性コンディションの下で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形も本発明の範囲にある。
他の修飾はプロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86[1983])、N末端アミンのアセチル化、いかなるC末端カルボキシル基のアミド化をも含む。さらに分子は、U.S.S.N.07/275,296または米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号または第4,179,337号に示されている方法で、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの非タンパク質性ポリマーに共有結合で結合され得る。
二官能試薬を用いた誘導体化はポリペプチドとのI-TRAFの分子内凝集を調製するのに有用であり、同様にアッセイまたはアフィニティー精製での使用のため非水溶性支持体マトリックスまたは表面へのI-TRAFポリペプチドの架橋にも有用である。加えて鎖内架橋の研究は構造に対する直接的情報を提供するであろう。一般に用いられる架橋試薬としては、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能イミドエステルおよび二官能マレイミドを含む。メチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような誘導化試薬は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性可能な中間体を生ずる。代わりに、臭化シアン活性化炭化水素のような反応性非水溶性マトリックスおよび米国特許第3,959,642号；第3,969,287号；第3,691,016号；第4,195,128号；第4,247,642号；第4,229,537号；第4,055,635号および第4,330,440号に記述されているシステム反応性基質が、タンパク質固定および架橋のため用いられる。
特定の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドにおける組換えホスト細胞の活動の結果である。グルタミニルおよびアスパリギニル残基は相当するグルタミルおよびアスパルチル残基にしばしば翻訳後脱アミド化される。代わりにこれらの残基は穏やかな酸性コンディションの下で脱アミド化される。これらの残基の各形態は本発明の範囲にある。
他の翻訳後修飾はプロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983)]を含む。
TRAFは例えばコアセルベーション法によってまたは界面重合化によって調製されたマイクロカプセル内に、コロイド状ドラッグデリバリーシステム内に(例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)、またはマクロエマルジョン内に封入されるであろう。該方法はRemington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.,編(1980)に開示されている。
E.I-TRAFポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の使用
本発明のI-TRAFポリペプチドをコードする核酸は、翻訳可能な転写物、他の種由来のI-TRAFをコードする核酸および/または構造的に関連するポリペプチドを同定するためのハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーおよび遺伝子治療の応用をふくむ治療上の核酸としての使用を含む、それ自身の様々な応用が見出される。
遺伝子治療の応用において、遺伝子は例えば欠失遺伝子の置換のためなど治療上の有効な遺伝子産物のin vivo合成を達成するために細胞に導入される。「遺伝子治療」なる語は、永続する効果が単一の治療により成し遂げられる伝統的な遺伝子治療と、治療上有効なDNAまたはmRNAの一度または繰り返される投与を含む遺伝子治療試薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNAおよびDNAが特定の遺伝子のin vivoでの発現をブロックするための治療試薬として用いられ得る。細胞膜による制限された取り込みのために低い細胞内濃度であるにもかかわらず、短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが阻害剤として機能する細胞にインポートされ得ることは既に示されている(Zamecnik等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,4143-4146[1986])。オリゴヌクレオチドは例えばその負にチャージしたリン酸エステルを非チャージ基に置換することなどのその取り込みを促進するために修飾され得る。
成育可能な細胞に核酸を導入するのに有用な方法は様々なものがある。方法は核酸が培養されている細胞にin vitroでトランスファーされるか、企図されたホストの細胞にin vivoでトランスファーされるかに依存して変わる。哺乳動物細胞にin vitroで核酸をトランスファーするのに適した方法は、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等の使用が含まれる。現在好ましいin vivoの遺伝子導入法は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターを用いたトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質-リポソーム介在性トランスフェクション(Dzau等,Trends in Biotechnology 11,205-210[1993])が含まれる。ある状況では、細胞表面膜タンパク質またはターゲット細胞に特異的な抗体、ターゲット細胞上の受容体に対するリガンド等のようなターゲット細胞を目標とする試薬を用いて核酸ソースを提供することが望ましい。リポソームが用いられた場合、エンドサイトーシスと関連した細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質は、例えば特定の細胞タイプに取り込まれるキャプシドタンパク質またはその断片、循環に取り込まれるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を目標とし細胞内半減期を促進するタンパク質などを目標としておよび/またはそれらの取り込みを容易にするために用いられるであろう。受容体介在性エンドサイトーシスの方法は例えばWu等,J.Biol.Chem.262,4429-4432(1987);およびWagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3410-3414(1990)に記述されている。現在既知の遺伝子作製法及び遺伝子治療プロトコールについてのレビューとしては、Anderson等,Science 256,808-813(1992)参照。
I-TRAFポリペプチドはI-TRAF/TRAF結合を調節する治療上の活性試薬のためのリード化合物を同定するためのアッセイにおいても有用である。特にI-TRAF/TRAF複合体の形成を妨げるまたは既に形成されたI-TRAF/TRAF複合体の解離を妨げるまたは阻害するリード化合物は便利に同定し得る。I-TRAFとTRAFの相互作用を妨げる分子は、免疫系の追加免疫が望ましい環境の下では有用性を見出し得る。I-TRAF/TRAF複合体の解離の阻害剤は、免疫抑制薬または抗炎症試薬として有用であろう。スクリーニングアッセイはまた例えばTNF,CD40リガンド,CD30リガンド等のTRAFタンパク質が会合するTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの天然のリガンドの生物学的活性を最小化するリード化合物を発見するためにもデザインされ得る。これらのスクリーニング法はI-TRAF阻害からTRAFを放出する能力のために候補の試薬をアッセイすることを含む。
本発明のスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高処理量スクリーニングを実施しやすく、小分子薬剤候補を同定することに特に適している。10K分子量より通常小さい小分子は、細胞に対してより透過的であり、様々な細胞のメカニズムによって分解されにくく、そしてタンパク質ほど免疫応答を誘導しがちではないために治療薬として望ましい。小分子は合成有機または無機化合物を制限することなく含む。多くの製薬会社は、該分子の広範なライブラリーを持っており、それは本発明のアッセイを用いて便利にスクリーニングされ得る。
アッセイはタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、細胞に基づくアッセイ等を含む様々な形式で実施され得る。該アッセイ形式は本分野でよく知られている。
アッセイ混合物は典型的にはI-TRAFおよびI-TRAFが通常会合する(例えばTRAF2またはTRAF3)TRAFタンパク質を通常単離された、部分的に精製されたまたは精製された形で含む。これらの構成要素の一つまたは両方は、例えばタンパク質-タンパク質結合を提供または促進し、アッセイコンディションの下での安定性を改良する等のもう一つのペプチドまたはポリペプチドと融合され得る。加えて構成要素の一つは通常検出可能なラベルを含むまたはそれと結合している。ラベルは放射性、発光、光学濃度または電子密度等を測定することによる直接的検出またはエピトープタグ、酵素等のような間接的検出のため提供される。アッセイ混合物は、付加的な候補の製薬学的試薬および場合により結合を容易にし、安定性を増大し、非特異的またはバックグランド相互作用を減少し、またはさもなければアッセイの効率または感度を改良する、塩類、バッファー、例えばアルブミン、界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗生物質等のキャリアータンパク質のような様々な他の構成要素を含む。
I-TRAF/TRAF結合の阻害剤のスクリーニングに対して、アッセイ混合物は候補の製薬学的試薬の存在下だがそれによってI-TRAFが基準の結合アフィニティーで特異的にTRAFタンパク質を結合するコンディションの下でインキュベートされる。混合物構成要素は必須の結合のために供給されるいかなる順序でも加えられ得る。インキュベーションは最適な結合を容易にするいかなる温度でも実施され、典型的には約4℃から40℃、最も一般的には約15℃から40℃である。インキュベーション期間は同様に最適な結合のために選択されるが、また高速の高処理量スクリーニングを容易にするために最小化され、典型的には約0.1から10時間、好ましくは5時間より短く、さらに好ましくは2時間より短く選択される。インキュベーションの後、I-TRAF/TRAF結合に対する候補の製薬学的試薬の効果をいかなる便利な方法ででも測定する。セルフリー結合型アッセイに対しては、分離工程が結合と非結合構成要素を分離するためにしばしば用いられる。分離は例えば沈殿(例えばTCA沈殿、免疫沈降法等)、固定化(例えば固体の基質上で)によって実施され、洗浄が後に続くであろう。結合タンパク質はそれに付加された検出可能なラベルを利用することによって、例えば放射性放出、光学濃度または電子密度を測定することによって、または例えば抗体接合を用いる間接的検出によって便利に検出される。
I-TRAF/TRAF複合体の解離を阻害または妨げる化合物は、候補の製薬学的試薬の不存在下でI-TRAF/TRAF複合体を形成し、混合物に試薬を添加し、そして候補の試薬の存在下だがTRAFが複合体から放出されるであろうようにコンディションを変化することによって便利に同定されうる。これは例えばインキュベーション温度を変化することによってまたは候補の製薬学的試薬の不存在下で複合体形成物からTRAFを放出するであろう化合物を混合物に添加することによって成し遂げられ得る。例としてこの化合物は例えばTNF,CD40リガンド,CD30リガンド等のTRAFによって介在されるシグナル伝達の天然のリガンドであり得る。それからフリーまたは結合TRAFの濃度を検出できおよび/またはI-TRAF/TRAF複合体の解離定数を測定しコントロールのものと比較し得る。
TRAFタンパク質が会合されるTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの天然のリガンド(例えばTNF,CD40リガンド,CD30リガンド等)の生物学的活性を最小化する治療上の活性試薬に対するリード化合物を同定するために、候補の試薬をI-TRAFとTRAF(例えばTRAF2またはTRAF3)の混合物に加える。TRAFタンパク質と細胞のタンパク質の相互の割合およびインキュベーションコンディションは、I-TRAF/TRAF複合体が候補の試薬の添加の前に形成されるように選択される。候補の試薬の添加によって、I-TRAF/TRAF複合体からTRAFを放出するその能力がテストされる。例えばインキュベーション温度、時間、結合と非結合物質の分離および検出等の典型的なアッセイコンディションは、上述したようなものである。このアッセイの特定のバージョンにおいて、アッセイ混合物は付加的にTRAFが通常会合される細胞のタンパク質(例えばTNF-R2またはCD40)を含み、TRAFタンパク質と細胞のタンパク質の相互の割合およびインキュベーションコンディションはTRAFシグナル伝達が候補のリガンド類似体の添加前に生じないように選択される。候補の分子の添加によって、TRAF介在性シグナル伝達を開始するその能力が検出される。最終段階として、TRAF介在性NF-κB活性化を誘導する候補の試薬の能力を伝統的な方法で測定することが可能である。好ましい方法にしたがって、E-セレクチン-ルシフェラーゼレポーター構築物(SchindlerとBaichwal,Mol.Cell.Biol.14,5820[1994])のようなNF-κB依存性レポーター遺伝子が細胞タイプアッセイにおいて用いられる。ルシフェラーゼ活性はβ-ガラクトシダーゼ発現に基づいて測定され標準化される。代わりにNF-κB活性は電気泳動移動度シフトアッセイ
0004382878.tif 000002
によっても分析され得る。しかしながら他の伝統的な生化学的アッセイも複合体形成した(および阻害された)形式からTRAFの放出を検出するのに同等に適している。
TRAFを結合するその能力に基づいて、本発明のI-TRAFポリペプチドは天然のおよび変異体TRAFそしてそれらの機能的な誘導体を精製するのに用いられ得、それらは順番にTNF-R2,CD40および本発明のポリペプチドが特異的に結合するTNF受容体スーパーファミリーの他のメンバーの精製に有用である。TNF受容体スーパーファミリーのメンバーは様々な病理学上のコンディションの治療に対する有望な候補であり、例えばTNF-R2(可溶性タンパク質のようなものまたはTNF-R2-Igイムノアドヘシンのようなもののいずれでも)は内毒性の(敗血性ショック)および慢性関節リウマチ(RA)の治療に対する臨床上の試験にある。
本発明のI-TRAF分子はブロッキング(拮抗剤)または作用剤抗I-TRAFを生産するために付加的に用いられ、それらはTRAF介在性シグナル伝達を阻害するためにI-TRAFの能力をブロックまたは最小化する。抗体を生産するための一般的な方法は本分野でよく知られており、例えば抗体の定義と関連しておよび組換えDNA法の一般的な方法に関して上述したテキストブックおよび他の文献に記述されている。
I-TRAF分子(天然のI-TRAFの機能的な誘導体を含めて)はまた細胞成長および遺伝子発現に対するガン遺伝子LMP1の下流の影響に関する病理学上のコンディションの治療に対する治療薬としても有用である。LMP1は西アフリカおよびパプアニューギニアで高い発病率を持つバーキットリンパ腫(Bリンパ球のガン)および南中国およびグリーンランドで最も一般的である鼻咽腔ガン腫のような、EBウイルスと関連した腫瘍成長に重要な役割を果たすと考えられるエプスタインバーウイルストランスフォーミングタンパク質である。LMP1を介したTRAF介在性シグナル伝達をブロックするその能力に基づいて、本発明のI-TRAFはLMP1介在性NF-κB活性化を含むLMP1の下流の影響を阻害し、場合により他のガン治療と共同してこれらのタイプのガンの治療に有望な試薬であろう。
本発明の治療のin vivoの効力は、様々なネズミモデルにおける化学的に誘発された腫瘍に対して研究され得る。in vitro細胞カルチャーにおいて増殖している腫瘍細胞系を実験的なネズミ、例えば皮下経路のような注射によってマウスに導入し得る。実験動物における腫瘍の化学的な誘導のための方法は、本分野でよく知られている。
本発明の治療は、放射線治療、化学療法および免疫毒素治療のような既知の腫瘍治療と組み合わせ得る。
機能的な誘導体を含めた本発明のI-TRAFポリペプチドを含む治療構成要素は、凍結乾燥処方または水溶液の形態中に場合により生理学的に許容できるキャリアー、賦形剤または安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編,1980)と共に望ましい純度を持った活性成分を混合することによって貯蔵物から調製される。許容できるキャリアー、賦形剤または安定剤は用いられる投与量と濃度において受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(約10残基より小さい)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸;グルコース、マンノースまたはデキストリンのような単糖類、二糖類および他の炭化水素;EDTAのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および/またはTween,PluronicsまたはPEGのような非イオン性界面活性剤を含む。
活性成分はまたコアセルベーション法によってまたは界面重合化によって調製されるマイクロカプセル内に(例えばそれぞれヒドロキシセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)、コロイド状ドラッグデリバリーシステム内に(例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン内に封入され得る。該方法はRemington’s Pharmaceutical Sciences,上記参照内に開示されている。
in vivo投与のために用いられる処方は、滅菌されていなければならない。これは凍結乾燥および再構成の前またはそれらに引き続いて、滅菌濾過メンブレンを通した濾過によって容易に成し遂げられる。
ここで治療上の構成要素は一般的に、例えば静脈注射針で穴をあけることが可能なストッパーを持った静脈溶液バッグまたはバイアルのような滅菌アクセスポートを持った容器内に置かれる。
投与経路は例えば静脈内、腹膜内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内または病変内経路、局所的投与によるあるいは持続放出システムによる注射または点滴のような既知の方法にしたがっている。
持続放出調製の適した例としては、例えばフィルムまたはマイクロカプセルといった形作られた商品の形態の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー(U.Sidman等,Biopolymers 22(１):547-556[1983])、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)(R.Langer等,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277[1981]およびR.Langer,Chem.Tech.12:98-105[1982])、エチレンビニルアセテート(R.Langer等,Id.)またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP133,988)が含まれる。持続放出構成要素はまたリポソームも含む。本発明の範囲にある分子を含むリポソームは本質的に既知の方法によって調製される:DE3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034(1980);EP52322;EP36676A;EP88046;EP143949;EP142641;日本国特許出願83-118008;米国特許第4,485,045号および第4,544,545号；およびEP102,324。通常リポソームは脂質含有量が30モル%コレステロールより多く、選択される割合は最適なNT-4治療のため調節される、小さく(約200-800オングストローム)単層上のタイプである。
活性成分の有効量は、例えば治療上の目的物、投与経路および患者の体調に依存するであろう。したがって医師は最適な治療効果が得られることが必要とされるために投与量を滴定し投与経路を修正することが必要とされるであろう。典型的な毎日の投与量は約1μg/kgから100mg/kg以上であり、上述のファクターに依存するであろう。典型的には臨床医は投与量が必要とされる生物学的効果を提供するものに到達するまで、本発明の分子を投与するであろう。この治療の過程は簡単なアッセイによって容易にモニターされる。
本発明のさらなる詳細は以下の非限定的な実施例から明らかであろう。
実施例1
ネズミおよびヒトI-TRAFのクローニング
I-TRAFはGAL4DNA結合ドメインベクターpPC97(ChevrayとNathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5789-5793[1992])内のフルレングスTRAF2をおとりのように用いて、記述されているような(Rothe等,Cell 78 681-692[1994])酵母トゥーハイブリッドスクリーニングシステム(FieldsとSong,Nature 340,245-246[1989])において同定された。GAL4転写活性化ドメインベクターpPC86(ChavrayとNathans,上記参照)内のプラスミドcDNAライブラリーを、Sal I-Not I改変ダブルストランド胎児肝ストロマ細胞系7-4cDNA(FL,Rothe等,上記参照)およびネズミ末梢リンパ節(PLN;P.Young,D.Dowbenko,およびL.Laskyによって提供される;1994年4月19日に査定された米国特許第5,304,640号)から構築した。二つのライブラリーに対するトランスフォーメーション効率は、それぞれ10,000,000および1,000,000であった。24のポジティブクローンの制限マップはほとんどが同じ遺伝子由来であることを示した。4つのFLおよび2つのPLNのcDNAクローンを373A自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems)を用いてシークエンスした。λgt22a内に調製されたCT6cDNAライブラリーをシークエンスすることによって単離された6つの付加的なネズミI-TRAFDNAクローンの5’末端もまたシークエンスした(Rothe等,上記参照)。単離されたcDNAはネズミI-TRAF遺伝子のいくつかの別個の転写産物に相当した。選択的スプライシングのため、これらの転写産物は2つの異なる翻訳開始コドンを利用している可能性がある。ネズミmRNAの2つのメジャーな形態は我々がI-TRAFαおよびI-TRAFβとそれぞれ名付けている413および447アミノ酸のタンパク質をコードすると予想される(図1a;SEQ.ID.NO:1および2)。
λgt11HUVECcDNAライブラリー(Hsu等,Cell 81,495-504[1995])をスクリーニングすることによって得られた5つのヒトI-TRAFcDNAクローンをシークエンスした。全ての単離されたヒトI-TRAFcDNAは、ネズミI-TRAFαと82%のアミノ酸同一性を示すフルレングス425アミノ酸タンパク質(M,48K)をコードする(図1a)。データベースサーチによりI-TRAFと有意な配列同一性をもついかなるタンパク質も明らかにされなかった。マウス組織由来のmRNAを用いたノーザンブロット分析により、〜2.4kbI-TRAFmRNAが偏在して発現されていることが示された(図1b)。マルチ組織ブロット(Clontech)は、ClontechプロトコールにしたがってネズミI-TRAFcDNAプローブとハイブリダイズされた。I-TRAFmRNAは〜2.4kbのバンドである。ネズミおよびヒトI-TRAFcDNA配列はGenBankおよびAmerican Type Culture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USAにおいてそれぞれ登録番号      および      の下で寄託されている。
実施例2
I-TRAFの特性指摘
(1)トゥーハイブリッド結合アッセイ
トゥーハイブリッドスクリーニングによって得られた様々なI-TRAFcDNAの検査により、ネズミI-TRAFのN末端部分(アミノ酸35-236)がTRAF2との相互作用に十分であることが示された。さらにTRAF2のどの部分がI-TRAFとの相互作用のために必要であるかを測定するためにトゥーハイブリッド実験が実施された。酵母HF7c細胞をGal4活性化ドメイン-I-TRAF融合タンパク質をコードする発現ベクターと指摘されたGal4DNA結合ドメイン発現ベクター(Rothe等,上記参照)を用いてコトランスフォームした。各トランスフォーメーション混合物をロイシンとトリプトファンを欠いた合成デキストロースプレート上に置いた。β-ガラクトシダーゼに対するフィルターアッセイを、融合タンパク質間の相互作用を検出するために実施した(FieldsとSong,上記参照)。データは以下の表1に記述されている。
0004382878.tif 000003
結果はTRAF2の保存されたTRAFドメイン(アミノ酸264-501)だけがI-TRAFとの相互作用に必要であることを示す。さらにTRAF1とTRAF3の両者もまたI-TRAFと会合する。
(2)In vitro結合アッセイ
35S-ラベルTRAF1(Rothe等,上記参照)、TRAF2(Rothe等,上記参照)、TRAF3(Hu等,上記参照)、TNF-R2(Smith等,Science 248,1019-1023[1990])およびTRADD(Hsu等,Cell 81,495-504[1995])の、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質(GST-I-TRAF)およびコントロールGSTタンパク質として発現されたI-TRAFαとの相互作用を調べた。GST-I-TRAFをpGEX3Xベクター(Pharmacia)を用いて発現し、記述されているように精製した(SmithとJohnson,Gene 67,31-40[1988])。35S-ラベルタンパク質をTNT結合網状赤血球溶解物システム(Promega)およびpBluescriptKS(Stratagene)またはpRK5(Schall等,Cell 61,361-370[1990])を用いて生産した。各結合アッセイのために、グルタチオンSepharoseビーズに結合した0.5μgGST-I-TRAFまたは0.5μgGSTを1mlのE1Aバッファー(50mM HEPES[pH7.6],250mM NaCl,0.1% NP-40,5mM EDTA)内に個々の35S-ラベルタンパク質の等量のcpmを用いて4℃で1時間インキュベートした。ビーズをE1Aバッファーで6回洗浄し、沈降物を10% SDS-PAGEによって分画した。ゲルを乾燥させ、Kodak X線フィルムにさらした。このアッセイによってI-TRAFがTRAF1,TRAF2およびTRAF3と特に相互作用することが見出された。
トゥーハイブリッドおよびin vitro結合実験の両者の結果により、I-TRAFがTRAF3よりもTRAF1とTRAF2とより強く相互作用することが示された。
(3)スリーハイブリッド相互作用テスト
I-TRAFはTNF-R2と直接には相互作用しない(表1)。しかしながらTRAF1とTRAF2がTNF-R2と複合体を形成するように、I-TRAFがTRAF経由でTNF-R2と間接的に会合し得るかどうかを調べることは重要であった。スリーハイブリッド相互作用テスト(Rothe等,上記参照)をこの疑問に答えるために実施した。TRAF2はTRAF1とTNF-R2に同時に結合し得る一方で(Rothe等,上記参照)、それはTNF-R2とのI-TRAF相互作用を介在することはできなかった。実際酵母におけるI-TRAFの発現はTNF-R2とのTRAF2の会合を阻害することが見出された(データは示していない)。この結果はTRAF2の同じC末端TRAFドメインにI-TRAFとTNF-R2の両者が結合することと一致する。
(4)哺乳動物細胞におけるTRAF2:TNF-R2相互作用の阻害
さらにTRAF2:TNF-R2相互作用に対するI-TRAFの観察される阻害効果を哺乳動物細胞において研究した。TRAF2とI-TRAFをサイトメガロウイルスに基づく発現ベクターpRK5(Schall等,上記参照)を用いて、N末端エピトープタグ(Kodak)を含むフルレングスタンパク質として発現した。ヒト肺腎293細胞(2×106)を150mmディッシュに接種し、引き続く日にpRK-TRAF2(0または1μg)発現ベクター(Rothe等,Science印刷中;PCT出願番号WO95/33051)と増大していく量のpRK-FLAG-I-TRAF(0,1,3または9μg)を用いてトランスフェクトした(Ausubel等,Curr.Prot.Mol.Biol.1,9.1.1-9.1.3[1994])。細胞を37℃で24時間インキュベートし、0.5mlE1Aバッファーで溶解した。溶解物の450μlに等分したものをグルタチオンSepharoseビーズに結合した10μlGST-TNF-R2融合タンパク質(Rothe等,Cell,上記参照;PCT出願番号WO95/33051)と共に4℃で15分インキュベートした。ビーズを0.6mlE1Aバッファーで3回洗浄し、結合したタンパク質を8%SDS-PAGEで分画し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。抗FLAGモノクローナル抗体M2(Kodak)およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス免疫グロブリン(Amersham)を用いてウエスタンブロット分析を実施した。Amershamプロトコールにしたがって促進した化学ルミネセンスによって検出をなした。溶解物の50μlの等分したもののウエスタンブロット分析により、TRAF2発現レベルはpRK-TRAF2を用いてトランスフェクトされた全てのサンプルにおいて同じであることが示された(データは示していない)。I-TRAFの増大していく量と共なるTRAF2の共同発現は、TRAF2:TNF-R2相互作用を効果的にブロックした(図3)。さらにI-TRAFはTRAF2:TNF-R2複合体によって全く沈殿しなかった。これらの結果は、おそらく結合部位がオーバーラップするため、TRAF2がTNF-R2とI-TRAFに同時に結合できないことを示す。
3つの既知のTRAFスーパーファミリーのメンバーを結合するI-TRAFの能力は、I-TRAFが一般的なTRAF介在性シグナル伝達の調節子として機能するという興味深い可能性を生じた。さらにTRAF2:TNF-R2相互作用に対するI-TRAFの観察された阻害効果は、I-TRAF発現がTRAF2シグナル伝達にネガティブに影響することを提起した。したがって我々はTRAF2介在性NF-κB活性化に対するI-TRAF発現の効果を測定した。
(5)NF-κBの活性化に対するI-TRAFの阻害効果
ヒト肺腎293細胞を6穴(35mm)ディッシュ上に2×105細胞/ウェルに接種し、引き続く日に(a)0.5μgpRK-TRAF2(Rothe等,Science印刷中;PCT出願WO95/33051)、(b)1μgpCDM8-CD40(Rothe等,上記参照;PCT出願番号WO95/33051)または(c)0.1μgpRK5mTNF-R2(Lewis等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,2830-2834[1991])、およびpRK-I-TRAF(0,0.1,0.32,1.0および3.0μg)の増大していく量を用いてトランスフェクトした。各トランスフェクションはまた0.25μgのpELAM-lucレポーテッドプラスミドおよび1μgpRSV-βgal(Hsu等,上記参照)を含んだ。(a),(b)および(c)のそれぞれに対して、pELAM-lucおよびpRSV-βgalのみを含むコントロールトランスフェクションを実施した。24時間後、ルシフェラーゼ活性とβ-ガラクトシダーゼレベルの標準化を記述されているように(Hsu等,上記参照)実施した。コントロールと比較した値は各トランスフェクションが三重に実施された実験に対する平均±SEMとして図4に示されている。
293細胞におけるTRAF2の一過性発現はNE-κB依存性レポーテッド遺伝子を強く活性化した(Rothe等,上記参照)。この活性化はI-TRAF共同発現により量依存的に劇的に阻害された(図4a)。我々は次にTRAF2相互作用受容体CD40およびTNF-R2によって引き起こされるNF-κB活性化に対するI-TRAF過剰発現の効果を調べた。これらの受容体の一過性発現は、TRAF2依存性プロセスにおけるNF-κBを活性化するリガンド非依存的受容体凝集を誘導することを示している(Rothe等,上記参照)。TRAF2に関して上記観察されたように、CD40(図4b)およびTNF-R2(図4c)の両者を通じたNF-κB活性化は、I-TRAFの増大した発現によって効果的にブロックされた。インターロイキン-1(IL-1)によって介在されるNF-κB活性化は、I-TRAF過剰発現によりわずかだけ抑制された(データは示していない)。それゆえI-TRAFはCD40およびTNF-R2によってシグナル伝達されるTRAF2依存性NF-κB活性化の特異的な阻害剤である。
(6)結論
概念上I-TRAF/TRAF系は広く研究されているIκB/NF-κB調節系と著しい類似性をもつ(LiouとBaltimore,Curr.Op.Cell.Bio.5,477-487[1993];Thanos ＆ Maniatis,Cell 80,529-532[1995])。両系とも阻害タンパク質の利用を通じた転写因子NF-κBの活性を調節することに関与する。IκBはNF-κBを細胞質において隔離し続けることによってNF-κBの機能を調節する。I-TRAFはTRAFと結合し、TRAF2介在性NF-κB活性化カスケードを誘導する細胞表面受容体(CD40,TNF-R2)とのTRAFの相互作用を妨げることによってより早期の段階で機能する。I-TRAFの機能はリガンド(CD40LまたはTNF)の不存在下で継続的なTRAFシグナル伝達を妨げることであろう。この機能は受容体凝集の不存在下でTRAF2過剰発現だけでNF-κB活性化を誘導し得るという発見とも一致する。リガンド誘導性受容体凝集は、新しいより高アフィニティーのTRAF結合部位を提供することによってI-TRAF阻害からTRAFを放出することが期待できよう。
明細書を通じて引用された全ての文書およびここで引用された全ての参考文献は、参考としてここで明白に取り込まれる。本発明は特定の実施態様を参考として記述されているが、特定の変更および修正が可能であり、一般的な当業者に容易になし得るであろうことは理解されるであろう。該変更および修正の全てが本発明の範囲に存在する。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：Genentech,Inc.
Tularik,Inc.
(ii)発明の名称：TRAF阻害剤
(iii)配列の数：8
(iv)相当する住所
(A)住所：Genentech,Inc.
(B)通り：460 Point San Bruno Blvd
(C)都市名：South San Francisco
(D)州：California
(E)国名：USA
(F)郵便番号：94080
(V)コンピューターが読み込むことのできる形態
(A)媒体腫：3.5インチ、1.44Mbフロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：WinPatin(Genentech)
(vi)現出願の情報
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人の情報
(A)名前：Dreger,Ginger R.
(B)登録番号：33,055
(C)委託/事件番号：P0960PCT
(ix)通信情報
(A)テレフォーン：415/225-3216
(B)テレファックス：415/952-9881
(C)テレックス：910/371-7168
(2)配列番号(SEQ ID NO):1の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：413アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:1：
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(2)配列番号(SEQ ID NO):2の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：1955ベースペアー
(B)型：核酸
(C)ストランド：シングル
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:2：
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(2)配列番号(SEQ ID NO):3の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：34アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:3：
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(2)配列番号(SEQ ID NO):4の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：170ベースペアー
(B)型：核酸
(C)ストランド：シングル
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:4：
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(2)配列番号(SEQ ID NO):5の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：425アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:5：
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(2)配列番号(SEQ ID NO):6の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：2108ベースペアー
(B)型：核酸
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(D)トポロジー：直鎖状
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(2)配列番号(SEQ ID NO):7の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：1922ベースペアー
(B)型：核酸
(C)ストランド：シングル
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(2)配列番号(SEQ ID NO):8の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：2160ベースペアー
(B)型：核酸
(C)ストランド：シングル
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:8：
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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