(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（２）、（３）または（７）のいずれかで示される、コレステロール誘導体。
0004272518.tif 000012
0004272518.tif 000013
0004272518.tif 000014
【請求項２】
請求項１に記載のコレステロール誘導体が固着された固相であって、β２−ＧＰＩを測定するための固相。
【請求項３】
下記の工程を少なくとも含むことを特徴とする、β２−ＧＰＩの測定方法：
工程１：請求項２に記載の固相に検体を接触させて、固相に固着された前記コレステロール誘導体と検体中のβ２−ＧＰＩとの複合体を形成させる工程；および
工程２：工程１において形成された複合体におけるβ２−ＧＰＩを検出する工程。
【請求項４】
下記の工程を少なくとも含むことを特徴とする、「請求項１に記載のコレステロール誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体の測定方法：
工程１：請求項２に記載の固相にβ２−ＧＰＩと検体を接触させて、「固相に固着された前記コレステロール誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」と、これを認識する検体中の抗体との複合体を形成させる工程；および
工程２：工程１において形成された複合体における前記抗体を検出する工程。
【請求項５】
前記検体が、ＡＰＳ（抗リン脂質抗体症候群）及び／またはＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）患者のものである、請求項４に記載の抗体の測定方法。
【請求項６】
ＡＰＳ（抗リン脂質抗体症候群）及び／またはＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）患者が、血栓症または妊娠疾患の履歴を有する患者である、請求項５に記載の抗体の測定方法。
【請求項７】
下記の（Ａ）および（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とするβ２−ＧＰＩの測定キット：
（Ａ）請求項２に記載の固相；および
（Ｂ）β２−ＧＰＩに結合する物質。
【請求項８】
下記の（Ａ）および（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする「請求項１に記載のコレステロール誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体の測定キット：
（Ａ）請求項２に記載の固相；および
（Ｂ）「『請求項１に記載のコレステロール誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」に結合する物質。
【請求項９】
疾患の検出用キットである、請求項８に記載の測定キット。
【請求項１０】
疾患が、抗リン脂質抗体症候群又は血栓症である、請求項９に記載の測定キット。
【請求項１１】
血栓症が、動脈血栓症である、請求項１０に記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、β２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）に対する特異的なリガンド及びその誘導体、並びにこれらを用いたβ２−ＧＰＩの測定方法、これらとβ２−ＧＰＩとの複合体を認識する抗体の測定方法、及び疾患の検出方法に関する。
背景技術
β２−ＧＰＩは、抗リン脂質症候群患者に存在する「抗リン脂質抗体」の認識する主要な抗原であり、酸化された低密度リポタンパク質（酸化ＬＤＬ；ｏｘＬＤＬ）に特異的に結合するが、酸化されていない（ネイティブな）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）には結合しないことが知られている。ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ９５／９３６３号には、このようなβ２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬとの特異的結合能を利用したｏｘＬＤＬの測定方法や、これを応用した動脈硬化性疾患の診断用キット等が開示されている。
しかしながら、β２−ＧＰＩがｏｘＬＤＬ中の如何なる構造部分を認識して結合するのかについては知られていなかった。
β２−ＧＰＩに特異的に結合するｏｘＬＤＬ中の構造部分が明らかになれば、当該構造からなる物質を用いて、より簡便かつシンプルな系でβ２−ＧＰＩの測定等を行うことができる。のみならず、測定に用いる試薬の取扱いや保存もさらに容易となり、安定した品質の測定試薬やキット等を安価に提供することにもつながる。
そこで本発明者は、β２−ＧＰＩに特異的に結合する構造を有する物質、この物質を利用したβ２−ＧＰＩ等の極めて実用的な測定方法、およびこの測定方法を応用した極めて実用的な疾患の検出方法を提供すべく鋭意検討を重ねた結果、β２−ＧＰＩに特異的に結合する構造からなる物質を単離し、この物質を利用したβ２−ＧＰＩ等の測定方法、およびこの測定方法を応用した疾患の検出方法を提供するに至り、本発明を完成した。
発明の開示
すなわち本発明は、下記一般式（１）で示されるコレステロール誘導体（以下、本発明誘導体という）である。
0004272518.tif 000002
式中のＲは、置換基を有していてもよいＣ３〜Ｃ２３の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素残基を示し、コレステロール骨格に−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＯＯＨ、エポキシ基が付加されていてもよい。
ここでいう置換基は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨＯ、オキソ基およびエポキシ基からなる群から選ばれる１又は２以上の基であることが好ましい。
またＲは、１又は２以上のオキソ基を有していてもよいＣ３〜Ｃ２３の飽和又は不飽和の脂肪酸残基であるものが好ましい。なかでも、Ｒが、ＨＯＯＣ−Ｒ′−で示される基（Ｒ′は１又は２以上のオキソ基を有していてもよいＣ２〜Ｃ２２の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素残基を示す）であるものが好ましい。
また、このＲ′は、１のオキソ基を有する直鎖の脂肪族炭化水素残基であるものが好ましい。
このような本発明誘導体として具体的には、下記式（２）〜（７）で示されるコレステロール誘導体が挙げられる。
0004272518.tif 000003
0004272518.tif 000004
また本発明は、本発明誘導体が固着された固相（以下、本発明固相という）である。
また本発明は、下記の工程を少なくとも含むことを特徴とする、β２−ＧＰＩの測定方法（以下、本発明測定方法１という）である。
工程１：本発明固相に検体を接触させて、固相に固着された前記コレステロール誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体を形成させる工程。
工程２：工程１において形成された複合体におけるβ２−ＧＰＩを検出する工程。
また本発明は、下記の工程を少なくとも含むことを特徴とする、「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体の測定方法（以下、本発明測定方法２という）である。
工程１：本発明固相にβ２−ＧＰＩと検体を接触させて、「固相に固着された前記コレステロール誘導体とβ−ＧＰＩとの複合体」と、これを認識する抗体との複合体を形成させる工程。
工程２：工程１において形成された複合体における前記抗体を検出する工程。また本発明は、本発明測定方法２によって血中の「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定し、血中の当該抗体量と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法（以下、本発明検出方法という）である。疾患としては、抗リン脂質抗体症候群又は血栓症が好ましい。また血栓症は、動脈血栓症が好ましい。
また本発明は、下記の（Ａ）、（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とするβ２−ＧＰＩの測定キット（以下、本発明測定キット１という）である。
（Ａ）本発明固相
（Ｂ）β２−ＧＰＩに結合する物質
また本発明は、下記の（Ａ）、（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体の測定キット（以下、本発明測定キット２という）である。
（Ａ）本発明固相
（Ｂ）「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」に結合する物質
本発明測定キット２は、疾患の検出用キットであることが好ましい。疾患としては、抗リン脂質抗体症候群又は血栓症が好ましい。また血栓症は、動脈血栓症が好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。まず、本明細書において用いる略号を説明する。
ａＰＬ：抗リン脂質抗体
ａＣＬ：抗カルジオリピン抗体
ＡＰＳ：抗リン脂質症候群
β２−ＧＰＩ：β２−グリコプロテインＩ
ＣＬ：カルジオリピン
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質
ｏｘＬＤＬ：酸化されたＬＤＬ
Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬ：ＣｕＳＯ４で酸化したｏｘＬＤＬ
ｏｘＬｉｇ−１：式（２）で示される化合物。９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸（９−ｏｘｏ−９−（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３β−ｙｌｏｘｙ）ｎｏｎａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）。７−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ）とも称する。
ｏｘＬｉｇ−２：式（７）で示される化合物。４，１２−ジオキソ−１２−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ドデカン酸（４，１２−ｄｉｏｘｏ−１２−（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３β−ｙｌｏｘｙ）ｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）
１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ：式（３）で示される化合物。１３−オキソ−１３−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）トリデカノイン酸（１３−ｏｘｏ−１３−（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３β−ｙｌｏｘｙ）ｔｒｉｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）
ＰＳ：ホスファチジルセリン
ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｃｈｏｌ：コレステロール
ＤＯＰＣ：ジオレオイルホスファチジルコリン
［３Ｈ］ＤＰＰＣ：Ｌ−３−ホスファチジル［Ｎ−メチル−３Ｈ］コリン，１，２−ジパルミトイル
ＤＰＰＳ：ジパルミトイルフォスファチジルセリン
ＰＡＰＣ：１−パルミトイル−２−アラキドノイル−フォスファチジルコリン
なお、本文中＜  ＞内に示した数字は、原則として後述の文献番号を示すものである。
＜１＞本発明誘導体
本発明誘導体は、下記一般式（１）で示されるコレステロール誘導体である。
0004272518.tif 000005
式中のＲは、置換基を有していてもよいＣ３〜Ｃ２３の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素残基を示す。そのなかでもＣ５〜Ｃ２０のものが好ましく、Ｃ８〜１５のものがより好ましく、Ｃ９〜Ｃ１３のものが特に好ましい。コレステロール骨格には、−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＯＯＨ、エポキシ基が付加されていてもよい。ここでいう置換基は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨＯ、オキソ基およびエポキシ基からなる群から選ばれる１又は２以上の基であることが好ましい。
またＲは、１又は２以上のオキソ基を有していてもよいＣ３〜Ｃ２３の飽和又は不飽和の脂肪酸残基であるものが好ましい。そのなかでもＣ５〜Ｃ２０のものが好ましく、Ｃ８〜１５のものがより好ましく、Ｃ９〜Ｃ１３のものが特に好ましい。
また、Ｒは、ＨＯＯＣ−Ｒ′−で示される基（Ｒ′は１又は２以上のオキソ基を有していてもよいＣ２〜Ｃ２２の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素残基を示す）であるものが好ましい。そのなかでもＣ４〜Ｃ１９のものが好ましく、Ｃ７〜１４のものがより好ましく、Ｃ８〜Ｃ１２のものが特に好ましい。
また、このＲ′は、直鎖の脂肪族炭化水素残基であるものが好ましく、さらに１のオキソ基を有するものがより好ましい。この脂肪族炭化水素残基の好ましいＣの数は、上記と同様である。
このような本発明誘導体として具体的には、下記式（２）〜（７）で示されるコレステロール誘導体が挙げられる。
0004272518.tif 000006
本明細書において、式（３）で示される物質を「１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ」という。
0004272518.tif 000007
本明細書において、式（７）で示される物質を「ｏｘＬｉｇ−２」という。
本発明誘導体は、後述の実施例に記載の方法でｏｘＬＤＬから単離することによって製造することもでき、また後述の実施例に記載の方法で化学合成することもできる。
本発明誘導体の単離や合成は、各種ＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ）分析、質量分析、β２−ＧＰＩへの結合能の分析等により確認することができる。
＜２＞本発明固相
本発明固相は、本発明誘導体が固着された固相である。
本発明誘導体を固着するために用いる固相は、本発明誘導体を固着させることができ、かつ、水、検体または測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。
これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
これらの固相に本発明誘導体を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法等、脂質の一般的な固着方法を利用することができる。
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
物理的吸着法として具体的には、例えば本発明誘導体を、エタノール、メタノール、メタノールとクロロホルムの混合液等の溶媒に溶解し、この溶液を固相（例えばマイクロプレート）に接触させて、溶媒を蒸発（エバポレーション）させることによって本発明誘導体を固相に吸着させる方法を挙げることができる。
また、本発明誘導体を固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに検体中のβ２−ＧＰＩや他の分子種が固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して本発明誘導体が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
ブロッキングの方法として具体的には、例えばブロッキング物質（血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等）を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間保存するか、常温（１５〜２５℃）で１〜２時間保存する方法を挙げることができる。
＜３＞本発明測定方法
本発明測定方法１は、下記の工程を少なくとも含むことを特徴とする、β２−ＧＰＩの測定方法である。
工程１：本発明固相に検体を接触させて、固相に固着された前記コレステロール誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体を形成させる工程。
工程２：工程１において形成された複合体におけるβ２−ＧＰＩを検出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
工程１：
本発明固相についての説明は、前記と同様である。
本発明固相に接触させる検体は、測定の対象物質であるβ２−ＧＰＩが含有されている、あるいはβ２−ＧＰＩが含有されている可能性がある検体である限りにおいて特に限定されない。また検体は、β２−ＧＰＩについて精製されていなくてもよい。検体として具体的には、例えば血液、血清、血漿等が例示される。本発明固相への検体の接触方法は、当該固相に固着された本発明誘導体の分子と、検体中に含まれるβ２−ＧＰＩ分子とが接触する限りにおいて特に限定されない。例えば、本発明固相に検体を添加して接触させても良く、検体に本発明固相を添加して接触させても良い。
なおこれら両者を接触させた後、固相に固着された本発明誘導体と検体中のβ２−ＧＰＩとを十分に結合させるために、例えば０〜４５℃、好ましくは４〜３７℃で１時間程度反応させることが好ましい。また反応後、固相と液相の十分な分離または固相の洗浄、例えば、固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異吸着物や、反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい。
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）を用いることが好ましい。
本発明固相に検体を接触させることにより、検体中に含有されているβ２−ＧＰＩと固相に固着された本発明誘導体が複合体を形成し、検体中に含有されているβ２−ＧＰＩが本発明誘導体を介して固相に固定されることになる。
工程２：
工程１において形成された複合体におけるβ２−ＧＰＩの検出の方法は特に限定されないが、β２−ＧＰＩに結合する物質を用いることが好ましい。
β２−ＧＰＩに結合する物質としては、例えばβ２−ＧＰＩを認識する抗体が挙げられる。ここで用いる抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、β２−ＧＰＩの測定目的、必要とされる精密度や感度等に応じて、適宜選択することができる。一般に、モノクローナル抗体、特にβ２−ＧＰＩを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いると、β２−ＧＰＩ以外の物質によるノイズを低減させることができ、ポリクローナル抗体に比してより高い精密度や感度を実現することができる。
β２−ＧＰＩに対する抗体は、β２−ＧＰＩを抗原として、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の通常の調製方法に従って製造することができる。また、β２−ＧＰＩを認識する抗体として公知のものを用いることもできる。公知のモノクローナル抗体としては、例えばＥＹ２Ｃ９（ＩｇＭ）＜３６＞、ＷＢ−ＣＡＬ−１（ＩｇＧ２ａ，κ）＜３７＞、Ｃｏｆ−２２（ＩｇＧ１，κ）＜３８＞等が例示される。これらの抗体の特性等については、実施例で詳述する。
このような「β２−ＧＰＩに結合する物質」は、標識物質で標識されていることが、検出が容易となることから好ましい。
また、「β２−ＧＰＩに結合する物質」自体が標識されていなくても、「β２−ＧＰＩに結合する物質」に結合する物質が標識されていてもよい
このような標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など〕、化学発光物質（ルミノールなど）、ビオチン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等〔「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照〕等から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐ５７−６３，ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＡＮＹ，１９９４年発行参照）、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭６３−１７８４３号公報記載の方法等から適宜選択できる。
例えば、β２−ＧＰＩに結合する物質としてβ２−ＧＰＩに対する抗体（標識していないもの）を用いる場合には、当該抗体（イムノグロブリン）に結合する抗体（標識したもの）を二次抗体として用いることができる。より具体的には、例えばＥＹ２Ｃ９を用いた場合には、標識物質で標識した抗ヒトＩｇＭ抗体を用いることができ、ＷＢ−ＣＡＬ−１やＣｏｆ−２２を用いた場合には、標識物質で標識した抗マウスＩｇＧ抗体を用いることができる。標識物質は、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））等を用いることができる。このような二次抗体は、市販のものを使用することができる。
このような「β２−ＧＰＩに結合する物質」を介してβ２−ＧＰＩに結合した標識物質を検出することによって、工程１において形成された複合体におけるβ２−ＧＰＩを検出することができる。
検出は、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを使用した場合には、当該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定することにより検出を行うことができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
なお本明細書における「検出」という用語には、定性的な検出（検出対象物質の有無を調べるための検出）のみならず、定量的な検出（検出対象物質の量（濃度）を調べるための検出）も含まれる。本明細書における「測定」という用語についても同様である。
定量的な検出（測定）を行う場合には、既知濃度のβ２−ＧＰＩ標準液を用いて予めβ２−ＧＰＩ濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線を作成しておき、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを用いることにより求めることができる。
本発明測定方法１をさらに一歩進めることによって、本発明測定方法２が提供される。本発明測定方法２は、本発明測定方法１の工程１において形成される「固相に固着された本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」に対して検体を接触させ、この検体中に含まれる「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定せんとするものである。
具体的には、本発明測定方法２は、下記の工程を少なくとも含むことを特徴とする、「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体の測定方法である。
工程１：本発明固相にβ２−ＧＰＩと検体を接触させて、「固相に固着された前記コレステロール誘導体とβ−ＧＰＩとの複合体」と、これを認識する抗体との複合体を形成させる工程。
工程２：工程１において形成された複合体における前記抗体を検出する工程。以下、工程ごとに説明する。
工程１：
本発明固相についての説明は、前記の通りである。
本発明固相に接触させるβ２−ＧＰＩは、完全に精製されていてもよく、そうでなくてもよく、所望の感度等に応じて当業者が適宜選択することができるが、精製されたβ２−ＧＰＩを用いることが好ましい。β２−ＧＰＩの精製は、例えば後述の実施例に記載の方法で行うことができる。
本発明固相に接触させる検体についての説明は、本発明測定方法１と同様である。また、β２−ＧＰＩと検体を本発明固相に接触させる方法も本発明測定方法１と同様であって、少なくとも本発明固相に固着された本発明誘導体の分子とβ２−ＧＰＩ分子とが接触する機会があり、かつ、「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」と検体中に存在する当該複合体を認識する抗体分子とが接触する機会がある限りにおいて限定されない。
なおこれらを接触させた後、固相に固着された本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとを十分に結合させ、かつ、検体中の抗体と「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」とを十分結合させるために、例えば０〜４５℃、好ましくは４〜３７℃で１時間程度反応させることが好ましく、この点も本発明測定方法１と同様である。また反応後の洗浄等に関する説明についても、本発明測定方法１と同様である。
本発明固相にβ２−ＧＰＩと検体を接触させることにより、β２−ＧＰＩと固相に固着された本発明誘導体が複合体を形成し、検体中に含有されている「固相に固着された前記コレステロール誘導体とβ−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体が当該複合体に結合することによって、検体中の抗体が本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体を介して固相に固定されることになる。
工程２：
工程１において形成された複合体における前記抗体の検出の方法は、特に限定されないが、「前記抗体に結合する物質」を用いることが好ましい。検体中の前記抗体に結合する物質としては、例えば検体中の抗体（イムノグロブリン）を認識する抗体が挙げられる。例えば、ヒトの血清中に存在する抗体（自己抗体）を測定する場合には、抗ヒトＩｇＧ抗体を二次抗体として用いることができる。
前記抗体に結合する物質（二次抗体等）に関するその他の説明は、本発明測定方法１と同様である。また、前記抗体に結合する物質が標識物質で標識されていることが好ましい点や、標識として使用される標識物質、標識方法、標識物質の検出方法に関する説明等についても、いずれも本発明測定方法１と同様である。
＜４＞本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明測定方法２によって血中の「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定し、血中の当該抗体量と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法である。
本発明検出方法においては、まず本発明測定方法２によって血中の「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定する。本発明測定方法２についての説明は前記の通りである。ここで用いる検体は「血液」であるが、全血である必要はなく、血中の前記抗体量を反映するサンプルであればよい。具体的には、血液に由来する血漿や血清はもちろん、これらを希釈したものや、サンプル中の前記抗体に影響を与えない範囲でこれらを加工したものであってもよい。
本発明検出方法においては、次いでこのような検体中に含まれる前記抗体量（濃度）と疾患とを関連づけることにより、疾患を検出する。なお「抗体量」は、前記抗体の標準品濃度と標識物質の検出結果との関係について作成した検量線を用いて求めた前記抗体量（実測値）であっても良く、また当該検量線を用いずに健常人（疾患に罹患していないヒト）の血中の前記抗体量に対する比（相対値）であっても良い。
前記の抗体量はある種の疾患によって増加することから、血中の前記抗体量が健常人のそれに比して少ない場合には、「疾患に罹患している」もしくは「疾患に罹患している可能性が高い」と関連づけることができる。血中の前記抗体量が健常人のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
また本発明検出方法においては、疾患への罹患の有無のみでなく、罹患の程度の検出も含まれる。例えば、ある個人の血中の前記抗体量を定期的に測定し、前記抗体量が増加傾向にある場合には「疾患が進行している」もしくは「疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、測定された前記抗体量が減少傾向にある場合には、「疾患が改善方向にある」もしくは「疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また測定された前記抗体量に変化がない場合には、「疾患の程度（または健常性）に変化がない」もしくは「疾患の程度（または健常性）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
ここでいう「疾患」は、抗リン脂質抗体症候群又は血栓症であることが好ましい。また血栓症は、動脈血栓症であることが好ましい。
＜５＞本発明キット
本発明キット１は、下記の（Ａ）、（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とするβ２−ＧＰＩの測定キットである。
（Ａ）本発明固相
（Ｂ）β２−ＧＰＩに結合する物質
また本発明キット２は、下記の（Ａ）、（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体の測定キットである。
（Ａ）本発明固相
（Ｂ）「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」に結合する物質
本発明固相についての説明は、前記の通りである。また、β２−ＧＰＩに結合する物質や「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」に結合する物質についての説明も、前記の本発明測定方法１および２と同様である。本発明測定キット１および２は、それぞれ上記（Ａ）および（Ｂ）を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度の標準品（本発明キット１の場合にはβ２−ＧＰＩ、本発明キット２の場合には「本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体」を認識する抗体）、標識物質の検出試薬、β２−ＧＰＩに結合する物質や「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」に結合する物質を標識する試薬、あるいは標識されたこれらの物質等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
これらの構成は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
本発明キット１を用いたβ２−ＧＰＩの測定は本発明測定方法１に従って行うことができ、本発明キット２を用いた「『本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」の測定は本発明測定方法２に従って行うことができる。
なお本発明測定キット２は、疾患の検出用キットであることが好ましい。疾患としては、抗リン脂質抗体症候群又は血栓症が好ましい。また血栓症は、動脈血栓症が好ましい。この場合の疾患の検出は、本発明検出方法に従って行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
＜１＞材料と方法
まず、本実施例中で用いた材料・方法を説明する。
（１）試薬
Ｌ−α−ジパルミトイルフォオスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ＣＬ、Ｃｈｏｌおよび７−ケトコレステロール（５−ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ−３β−ｏｌ−７−ｏｎｅ）はシグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から入手した。ＰＡＰＣおよびＤＯＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．より入手した。［３Ｈ］ＤＰＰＣ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はアマシャム−ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社より入手した。他の化学物質は、市販の試薬グレードのものを用いた。
（２）ヒトβ２−ＧＰＩの精製
β２−ＧＰＩは、健常人の血漿から＜３５＞に記載の方法に準じて精製した。プールした健常人の血漿は、ヘパリン−セファロースカラム（またはＣＬ−ポリアクリルアミドゲルカラム）、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、および抗β２−ＧＰＩアフィニティーカラムを用いて精製した。種々のＩｇＧによるコンタミネーションを除去するために、β２−ＧＰＩ含有画分をさらにプロテインＡ−セファロースカラムに通した。最終的なβ２−ＧＰＩ画分は、ｎ−ブタノールで十分に洗浄することによって脱脂した。
（３）抗β２−ＧＰＩ陽性の血清は、動脈血栓症の履歴をもつＡＰＳ患者から採取した。実験によっては内在性のβ２−ＧＰＩを除去するために血清をヘパリン−セファロースカラムに通した。溶出液をＰＢＳに対して透析し、ＥＬＩＳＡに用いた。
（４）モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）
ＥＹ２Ｃ９（ＩｇＭ）：ヒトモノクローナル抗β２−ＧＰＩ自己抗体である。ＡＰＳ患者の末梢血リンパ球から確立された抗体である＜３６＞。
ＷＢ−ＣＡＬ−１（ＩｇＧ２ａ，κ）：マウスモノクローナル抗β２−ＧＰＩ自己抗体である。（ＮＺＷｘＢＸＳＢ）Ｆ１マウスから確立された抗体である＜３７＞。
Ｃｏｆ−２２（ＩｇＧ１，κ）：モノクローナル抗ヒトβ２−ＧＰＩ抗体である。ヒトβ２−ＧＰＩで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから確立された抗体である＜３８＞。
ＥＹ２Ｃ９およびＷＢ−ＣＡＬ−１は、β２−ＧＰＩとＣＬとの複合体、または酸素化したポリスチレンプレートに吸着したβ２−ＧＰＩのいずれにも結合する。これに対してＣｏｆ−２２はヒトβ２−ＧＰＩに特異的であって、ネイティブな構造を認識する。
（５）ｏｘＬＤＬの調製および脂質の抽出
血漿ＬＤＬ（１．０１９＜ｄ＜１．０６３ｇ／ｍｌ）は、＜３９＞に記載の方法に従って、新鮮な健常人血漿を超遠心することによって単離した。ＬＤＬ（１００μｇタンパク質／ｍｌ）は、５μＭ  ＣｕＳＯ４（ＰＢＳ溶液）とともに３７℃で８時間インキュベートすることによって酸化した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって酸化を停止し、酸化されたサンプルは１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳに対して十分に透析した。
タンパク質濃度はＢＣＡ  プロテイン・アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ピアス社）製）を用いて決定した。また、酸化の程度を調べるためのチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）値＜４０＞の決定と、アガロースゲル電気泳動による移動度の解析に用いるためにサンプルの一部を採取した。脂質画分は＜４１＞に記載の方法でＬＤＬから抽出した。
（６）分子間相互作用のアッセイ
リアルタイムの分子解析は、光学バイオセンサー  ＩＡｓｙｓ（アフィニティーセンサー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）製）を用いて行った。
ＬＤＬまたはリポソームへのβ２−ＧＰＩの結合：ビオチン化したβ２−ＧＰＩをストレプトアビジンを介してビオチン化キュベットに固定化した。種々のＬＤＬまたはリポソームをそのキュベットに入れた。ＬＤＬまたはリポソームへの抗体の結合：ビオチン化したＷＢ−ＣＡＬ−１を前記キュベットに固定化した。種々の濃度のＬＤＬまたはリポソームを、β２−ＧＰＩの存在下（１０μｇ／ｍｌ）または非存在下で添加した。
（７）β２−ＧＰＩと抗β２−ＧＰＩ抗体との結合を検出するためのＥＬＩＳＡ
ＬＤＬｓへの結合：１Ｄ２（抗ａｐｏＢ  １００抗体；１０μｇ／ｍｌ、ヤマサ醤油株式会社製）のＦ（ａｂ’）２  ５０μｌをマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に入れ、４℃で一晩インキュベートすることによってコートした。このプレートを１％スキムミルクを含有するＰＢＳでブロッキングした後、ＬＤＬとともに１時間インキュベートした。ウエルを、β２−ＧＰＩ（１５μｇ／ｍｌ）、Ｃｏｆ−２２、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧの順で、ぞれぞれ１時間インキュベートした。Ｈ２Ｏ２およびｏ−フェニレンジアミンで発色させ、４９０ｎｍのＯＤを測定した。
抽出した脂質への結合：エタノールを蒸発させることによって、ＬＤＬｓから抽出した脂質（５０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウエル）でマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）をコートした。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでウエルを１時間ブロッキングし、次いで３０μｇ／ｍｌのβ２−ＧＰＩでウエルを１時間インキュベートした。β２−ＧＰＩの結合は、Ｃｏｆ−２２およびＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。また場合によっては、コートしたプレートに、抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２、ＷＢ−ＣＡＬ−１又はＥＹ２Ｃ９；１．０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウエル）を０．３％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈したものを添加して、β２−ＧＰＩ（１５μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした。抗体の結合は、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＭで検出した。Ｈ２Ｏ２およびｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）で発色させ、４９０ｎｍのＯＤを測定した。これらのステップの間で、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで十分に洗浄した。
（８）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とリガンドブロット分析
抽出された脂質を、ポリグラム・シリカゲル・プレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ｐｌａｔｅ；Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社製）にスポットし、クロロホルム／メタノール／３０％アンモニア／水（１２０：８０：１０：５，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；以下、溶媒Ａという）で展開した。そのプレートを、Ｉ２の蒸気、またはモリブデンブルー（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ  ｂｌｕｅ）、２％オルシン（ｏｒｃｉｎ）を含有する２Ｎ硫酸、もしくは氷酢酸／硫酸（１９：１，ｖ／ｖ）（リーベルマン−ブルヒアルト反応；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ｂｕｒｃｈａｒｄ反応）のスプレーで染色した。また場合によっては、展開したプレートはβ２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ抗体を用いたリガンドブロットに付した。ＴＬＣプレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳでブロッキングし、次いでそのプレートをβ２−ＧＰＩ、抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２、ＷＢ−ＣＡＬ−１、またはＥＹ２Ｃ９）で１時間インキュベートし、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体で１時間インキュベートした。それぞれのステップで、プレートをＰＢＳで十分に洗浄した。発色はＨ２Ｏ２と４−メトキシ−１−ナフトール（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−１−ｎａｐｈｔｏｌ；アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社製）を用いて行った。ＴＬＣプレートから擦り取ったリガンドを多く含むバンドは、別のＴＬＣ（クロロホルム／メタノール（８：１，ｖ／ｖ；以下、溶媒Ｂという）に付した。リガンドを大量精製する場合には、抽出した脂質を２ｍｍ厚のＴＬＣシリカゲル６０プレート（ＰＬＣプレート；メルク（Ｍｅｒｃｋ）社製）に付した。
（９）ＨＰＬＣ
２段階のＴＬＣによって得られたリガンド（ｏｘＬＤＬ由来）を多く含む画分は、Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ−１８  ５−μｍカラム（４．６ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いた逆相ＨＰＬＣによって分析した。カラムは、アセトニトリル／イソプロパノール／水の混合液（６０：３０：２，ｖ／ｖ／ｖ；以下、溶媒Ｃという）を用い、流速０．５ｍｌ／分で溶出し、１分ごとに分画した。ぞれぞれの溶出画分をＴＬＣプレートにスポットし、β２−ＧＰＩおよびＥＹ２Ｃ９を用いたリガンドブロットに付した。
（１０）ＮＭＲ
１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＡＳＸ−３００スペクトロメータ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定した。
（１１）質量分析
合成ｏｘＬｉｇ−１の質量分析は、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＶＰ−ＯＤＳカラム（４．６ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ）を接続したＬＣ／ＭＳ−ＱＰ８０００α（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．）で、溶媒Ｃを用いて行った（ＬＣ／ＭＳ；液体クロマトグラフィー／質量分析法）。正および負イオン化マススペクトルは、５０−８５０の質量レンジで得た。
またβ２−特異的リガンドであるｏｘＬｉｇ−１、バンド−２から精製したｏｘＬｉｇ−２、および合成した１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣの質量分析は、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＦＣ−ＯＤＳカラム（４．６ｍｍ  ｘ  ３０ｍｍ）を接続したＬＣ／ＭＳ−２０１０スペクトロメーター（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。カラムは、水に対して、５０−１００％の溶媒Ｆ（３０％アセトンｉｎメタノール）の直線濃度勾配によって行った。正および負イオン化マスシグナルは、５０−７５０のマスレンジで検出した。
合成ｏｘＬｉｇ−１およびメチル化ｏｘＬｉｇ−１のｆｉｅｌｄ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ（ＦＤ）マススペクトルは、それぞれＪＭＳ−ＳＸ１０２ＡスペクトロメーターおよびＪＭＳ  ＡＸ−５００スペクトロメーター（ＪＥＯＬ製）で記録した。
（１２）β２−ＧＰＩ−特異的リガンド（ｏｘＬｉｇ−１）の合成
ｏｘＬｉｇ−１は、Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬを２段階のＴＬＣ、次いでＨＰＬＣにかけることによって初めて単離され、最終的に９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ）（図１）と同定された。本実施例では、精製したｏｘＬｉｇ−１の代わりに合成したｏｘＬｉｇ−１を用いた。７−ケトコレステロール（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；５−ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ−３β−ｏｌ−７−ｏｎｅ；５０．１ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）とアゼライン酸（ａｚｅｌａｉｃ  ａｃｉｄ；７０．６ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（４ｍｌ）に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；９５．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ；３０．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で２日間攪拌し、濃縮して、クロロホルムで抽出した。抽出物を２Ｍ塩酸で連続的に洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。残存物を、トルエン／酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライし、ｏｘＬｉｇ−１を得た（３６．０ｍｇ、収率５０．４％）。
（１３）合成ｏｘＬｉｇ−１の諸分析の結果
（ＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ＝５．７１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），４．７８−４．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ＝２０２．５，１７９．７，１７３．４，１６４．５，１２７．１，７２．４，５５．２，５０．４，５０．２，４５．８，４３．５，３９．９，３８．７，３６．６，３６．１，２９．２，２８．９，２８．４，２５．３，２５．０，２４．２，２３．２，２３．０，１９．３，１７．７，１２．４
（質量分析）
ｍ／ｚ（ＦＤ−ＭＳ）：
５７１［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３６Ｈ５９Ｏ５］
（１４）ｏｘＬｉｇ−１のメチル化
室温で、精製または合成したｏｘＬｉｇ−１のそれぞれ２ｍｌ（７．５ｍｇ，０．０１３１ｍｍｏｌ）にジアゾメタン−エーテル溶液を加えて２時間攪拌した。この攪拌している溶液に酢酸を添加して１日経った後、溶媒を蒸発させてメチル化ｏｘＬｉｇ−１を得た。
以下、メチル化したものについては最初に「Ｍｅ−」を付して表記することもある。
（１５）メチル化した合成ｏｘＬｉｇ−１の諸分析の結果
（ＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
ｄ＝５．７１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），４．７８−４．６９（ｍ，ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．６７（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
ｄ＝２０２．４，１７４．７，１７３．４，１６４．４，１２７．１，７２．４，５５．２，５０．４，４５．８，４３．５，３９．９，３８．７，３６．６，３６．４，３６．１，２９．３，２８．４，２６．７，２５．３，２４．２，２３．２，２３．０，２１．６，１９．３，１７．７，１２．４
（質量分析）
ｍ／ｚ（ＦＤ−ＭＳ）：
５８５［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３７Ｈ５１Ｏ５］
（１６）ｏｘＬｉｇ−１のメチル化
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソメチルグアニジン（１−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｄｉｎｅ；０．２０ｇ）を、氷冷中で２Ｍ水酸化ナトリウム（１０ｍｌ）とジエチルエーテル（１０ｍｌ）との混合液に添加した。この混合液を数分間攪拌することにより、軽い液体として分離される淡黄色の液体をメチル化に用いた。ジアゾメタン溶液（２ｍｌ）を、０℃下で、脂質リガンド（ｏｘＬｉｇ−２または１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ；１．０ｍｇ）のジエチルエーテル溶液（１ｍｌ）に滴下して加えた。それぞれの溶液は、冷蔵庫中で１晩保存した。混合液のＴＬＣによると、出発物質は完全に消失していた。空気を吹き付けることによって溶媒を除去し、白色の非結晶質のメチルエステルを得た。
（１７）１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣの合成
７−ケトコレステロール（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；５−ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ−３β−ｏｌ−７−ｏｎｅ；５０．１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）とトリデカンニ酸（ｔｒｉｄｅｃａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ；ｂｒａｓｓｙｌｉｃ  ａｃｉｄ；６１．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（４ｍｌ）に、ＷＳＣ（９５．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３０．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で２日間攪拌し、濃縮して、クロロホルムで抽出した。抽出物を２Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および塩水で連続的に洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。残存物を、トルエン／酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライし、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣを得た（４４ｍｇ、収率５６．０％）。ＮＭＲスペクトルおよび質量分析スペクトル（ＦＤ−ＭＳ）は、前記と同様に測定した。
（ＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ＝５．６９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），４．８０−４．６７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ＝２０２．２，１７９．６，１７３．１，１６４．７，１２６．９，７２．３，５５．３，５０．５，５０．１，４５．３，４３．５，４０．６，３９．２，３８．６，３６．５，３６．０，２９．１，２８．８，２８．３，２５．２，２４．９，２４．１，２３．１，２２．９，１９．２，１７．６，１２．３
（質量分析）
ｍ／ｚ（ＦＤ−ＭＳ）：
６２７［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ４０Ｈ６７Ｏ５］
（１８）リポソームの調製
リポソームは、以下の脂質組成で＜４２＞に記載の方法にしたがって調製した。０，１０，２５および５０％  ＰＳ−リポソームの脂質のモル組成は、以下の通りである：
ＤＯＰＣ／ＤＰＰＳ／［３Ｈ］ＤＰＰＣ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
０％：１００／０／０．００２２５
１０％：９０／１０／０．００２２５
２５％：７５／２５／０．００２２５
５０％：５０／５０／０．００２２５
０，５，１２．５および２５％  ＰＳ−Ｃｈｏｌ−リポソームの脂質のモル組成は、以下の通りである：
ＤＯＰＣ／ＤＰＰＳ／Ｃｈｏｌ／［３Ｈ］ＤＰＰＣ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
０％：５０／０／５０／０．００２２５
５％：４５／５／５０／０．００２２５
１２．５％：３７．５／１２．５／５０／０．００２２５
２５％：２５／２５／５０／０．００２２５
０，１０，２０および４０％  ｏｘＬｉｇ−１（精製物）−リポソームの脂質のモル組成は、以下の通りである：
ＤＯＰＣ／ｏｘＬｉｇ−１／［３Ｈ］ＤＰＰＣ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
０％：１００／０／０．００２２５
１０％：９０／１０／０．００２２５
２０％：８０／２０／０．００２２５
４０％：６０／４０／０．００２２５
また、０，５，１０，２０，３０および４０％  ｏｘＬｉｇ−１（精製物）−Ｃｈｏｌ−リポソームの脂質のモル組成は、以下の通りである：
ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ｏｘＬｉｇ−１／［３Ｈ］ＤＰＰＣ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
０％：５０／５０／０／０．００２２５
５％：５０／４５／５／０．００２２５
１０％：５０／４０／１０／０．００２２５
２０％：５０／３０／２０／０．００２２５
３０％：５０／２０／３０／０．００２２５
４０％：５０／１０／４０／０．００２２５
ｏｘＬｉｇ−１（合成物）のリポソームは、合成したｏｘＬｉｇ−１を用いてｏｘＬｉｇ−１（精製物）−リポソームと同様に調製した。クロロホルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）に溶解した所望の脂質の混合物を西洋なし型のフラスコに入れ、減圧したロータリー・エバポレーター中で溶媒を除去した。乾燥した脂質を、ミキサーを用いて０．３Ｍ  グルコース水溶液中に分散させた。このリポソーム溶液を、プローブタイプのソニケーターを用いて７０℃で５分間超音波処理した。
またｏｘＬｉｇ−２、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ等を用いたリポソームも、以下の脂質組成で同様に調製した。０、１０、２５、３０および５０％のリガンド含有リポソームは、ＤＯＰＣ／リガンド／［３Ｈ］−ＤＰＰＣ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いて作製した。［３Ｈ］−ＤＰＰＣの量は０．２２５％とした。リガンドとしては、コレステリルリノレート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、ＤＰＰＳ、ｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２、メチル化ｏｘＬｉｇ−２（Ｍｅ−ｏｘＬｉｇ−２）、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ又はメチル化１３ＣＯＯＨ−７ＫＣ（Ｍｅ−１３ＣＯＯＨ−７ＫＣ）を用いた。
（１９）細胞培養およびリポソームの結合
理研細胞バンク（筑波）から入手したマウスマクロファージ様細胞（Ｊ７７４Ａ．１）の単層のカルチャーを、１０％仔ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した。結合実験のために、細胞（８ｘ１０５細胞／ｍｌＲＰＭＩ１６４０）を１２ウエルの培養プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に１ｍｌ／ウエルで分注し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培養液をＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地（住友製薬製）に置換した。３７℃で１時間プレインキュベートした後、β２−ＧＰＩ（２００μｇ／ｍｌ）およびＷＢ−ＣＡＬ−１（１００μｇ／ｍｌ）存在下または非存在下の５０μｌのリポソーム（５０ｎｍｏｌ脂質／ウエル）をそれぞれの培養物に添加し、細胞を４℃及び／又は３７℃でインキュベートした。次いで冷ＰＢＳでウエルを洗浄し、１ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって細胞を溶解させた。その一部を採取し、細胞のタンパク質および細胞に含まれる放射活性を調べた。タンパク質濃度は前記と同様に測定した。
（２０）抗β２−ＧＰＩ  ＥＬＩＳＡ（β２−ＧＰＩに対するＩｇＧ自己抗体のＥＬＩＳＡ）
抗β２−ＧＰＩ  ＥＬＩＳＡ（β２−ＧＰＩに対するＩｇＧ自己抗体のＥＬＩＳＡ）は、＜４３＞に記載の方法で行った。すなわち、β２−ＧＰＩを酸素化したポリスチレンプレート（カルボキシル化、Ｓｕｍｉｌｏｎ  Ｃ−ｔｙｐｅ、住友ベークライト社（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））に１０μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウエル）入れて、４℃で一晩インキュベートすることによって吸着させた。このプレートを３％ゼラチンを用いてブロッキングし、１００μｌ／ウエルの抗β２−ＧＰＩモノクローナル抗体または１００倍希釈した血漿サンプルを加えて１時間インキュベートした。β２−ＧＰＩへの抗体の結合は、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧもしくはＩｇＭ、または抗マウスＩｇＧを用いて調べた。Ｈ２Ｏ２およびｏ−フェニレンジアミンで発色させ、４９０ｎｍのＯＤを測定した。これらのステップの間で、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで十分に洗浄した。
（２１）タンパク質−ｏｘＬｉｇ−１複合体に対する抗体のＥＬＩＳＡ
合成したｏｘＬｉｇ−１（５０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウエル）をエバポレーションによってポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ；Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に吸着させ、このプレートを１％ＢＳＡでブロックした。血清（０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈したもの）をウエル中でβ２−ＧＰＩ（１５μｇ／ｍｌ）または他のタンパク質ととともに室温で１時間インキュベートした。抗体の結合は、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧによって検出した。その後のステップは「抗β２−ＧＰＩ  ＥＬＩＳＡ」に記載された方法で行った。
（２２）β２−ＧＰＩ依存性ａＣＬ
ＣＬ（５０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウエル）をポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ）に吸着させ、その後のステップは「タンパク質−ｏｘＬｉｇ−１複合体に対する抗体のＥＬＩＳＡ」に記載の方法で行った。
（２３）統計解析
統計解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウエア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社）を用いて行った。自己抗体と臨床履歴を比較する場合には、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ検定を用いた。
また抗体価と臨床履歴との関連性を評価する場合には、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定を用いた。
＜２＞結果
（１）分子間の相互作用
ｏｘＬＤＬはβ２−ＧＰＩに対して特異性の高い結合を示したが、ネイティブなＬＤＬでは見られなかった（図１Ａ）。β２−ＧＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下においてのみ、固相化ＷＢ−ＣＡＬ−１に対するｏｘＬＤＬの用量依存的な結合が見られたが、ネイティブなＬＤＬの特異的な結合は観察されなかった（図１Ｂ）。コントロール実験においては、ＣＬはβ２−ＧＰＩに高い結合性を示し、ＤＯＰＥは特異的結合を示さなかった（図１Ｃ）。ＣＬは更にβ２−ＧＰＩの存在下でＷＢ−ＣＡＬ−１に対して用量依存的な結合を示したが、ＤＯＰＥは示さなかった（図１Ｄ）。
（２）固相化ＬＤＬｓまたはこれに由来する脂質に対する、β２−ＧＰＩと抗β２−ＧＰＩ抗体の結合
β２−ＧＰＩは、固着させたｏｘＬＤＬに対して高い結合力で特異的に結合したが、ネイティブなＬＤＬに対してはそのような結合は見られなかった（図２Ａ）。脂質は、ＬＤＬｓから抽出し、プレートに固相化して、Ｃｏｆ−２２モノクローナル抗体および抗β２−ＧＰＩ抗体（すなわち、ＷＢ−ＣＡＬ−１およびＥＹ２Ｃ９）で検出することによってβ２−ＧＰＩの結合アッセイに付した。このアッセイによって、ｏｘＬＤＬ由来の脂質に対するβ２−ＧＰＩ（図２Ｂ）およびβ２−ＧＰＩを介した抗体（図２ＣおよびＤ）の特異的な結合が示されたが、ネイティブなＬＤＬ由来の脂質に対してはこのような結合は見られなかった（図２Ｂ〜Ｄ）。
（３）β２−ＧＰＩ特異的なリガンドの精製と特性
両方のＬＤＬから抽出された脂質をＴＬＣプレートにスポットし、溶媒Ａを用いて展開した（図３ＡおよびＢ）。ｏｘＬＤＬ由来の脂質は、Ｉ２蒸気およびモリブデンブルーで処理したプレートにおいて、ネイティブなＬＤＬ由来の脂質に比してＰＣ（ホスファチジルコリン）が少なく、またリゾＰＣ（ｌｙｓｏＰＣ）と共に移動する極性型が多く観察された。オルシン／硫酸染色すると、Ｃｈｏｌ、ＰＣ、ＣＬ等と同様のＲｆの位置に偽陽性のバンドが観察された。リーベルマン−ブルヒアルト反応をさせた場合、Ｃｈｏｌのバンドは両抽出物においてトップに近い位置に観察されたが、ｏｘＬＤＬ由来の脂質においてはＣＬのＲｆの位置に付近にはほとんどバンドが観察されなかった。β２−ＧＰＩ特異的リガンドを同定するために、展開したプレートをβ２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ抗体で処理することによって、リガンドブロットに付した（図３Ｂ）。試験した３種類の抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２、ＷＢ−ＣＡＬ−１、およびＥＹ２Ｃ９）全てにおいて２本の主要なバンドといくつかの拡散した脂質のバンドが染色され、そのＲｆ位置はＣＬやガラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｃｅｒ）やグルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）のような糖脂質と同様であった。リガンドブロットで検出されたバンドは、モリブデンブルーのスプレーでは染色されなかった（図３ＡおよびＢ）。
β２−ＧＰＩリガンドを多く含む脂質を最初のＴＬＣプレートから削り取り（以下、この脂質を「削り取った脂質」という）（図３Ｂ）、これを他のＴＬＣ（溶媒Ｂで展開）に付し、２本の主要なバンドを削り取って、リガンドブロットに付した（図３ＣおよびＤ）。β２−ＧＰＩに反応する２本の主要なバンド（図３中に矢印で示す）について、上のバンドをバンド−１、下のバンドをバンド−２と命名した。
バンド−１は、β２−ＧＰＩ、ＥＹ２Ｃ９（またはＷＢ−ＣＡＬ−１）の順に２段階で処理するとほとんど染色されないが、同時に（１段階）で処理すると強く染色された。これに対してバンド−２は、β２−ＧＰＩおよびＥＹ２Ｃ９を用いたいずれの処理によっても良好な染色が見られた（個々の実験のデンシトメトリー解析によって有意な差が見られた）。
バンド−１をアルカリで加水分解（２０％  ＮａＯＨ、１００℃、３０分）することによって得られた産物は、リガンドブロットにおいてβ２−ＧＰＩと結合しなかった（データは示さない）。バンド−１を溶媒Ｃを用いた逆相ＨＰＬＣに付した。２２分目に、β２−ＧＰＩとＥＹ２Ｃ９を用いたリガンドブロットで陽性染色され、非常に僅かにリーベルマン−ブルヒアルト反応を生ずる主要なピークが出現した（図４）。このピークをｏｘＬｉｇ−１と命名した。１００ｍｇのタンパク質に相当するｏｘＬＤＬから、約２．５ｍｇのｏｘＬｉｇ−１が回収された。
（４）ｏｘＬｉｇ−２の精製
β２−ＧＰＩ特異的リガンドであるｏｘＬｉｇ−２は、リガンド含有画分からＳｅｐｈａｓｉｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた逆相ＨＰＬＣによって精製した。分離されたバンド−２を、０．２％酢酸を含有する水（溶媒Ｅ）に対する５０−１００％  アセトニトリル／イソプロパノール（３０／７０、ｖ／ｖ）（溶媒Ｄ）の直線濃度勾配（１５分）、次いで１００％の溶媒Ｄ（１５分）で、流速０．５ｍｌ／分で溶出させ、２１０ｎｍまたは２３４ｎｍの吸光度（Ａ）をモニターした。溶出物は２分ごと（１ｍｌ／チューブ）で分画した。それぞれの画分をＴＬＣプレートにスポットし、β２−ＧＰＩおよびＥＹ２Ｃ９を用いたリガンドブロット分析に付した。
（５）ｏｘＬｉｇ−２の精製および性質
バンド−２のＨＰＬＣにより、新規なリガンド（ｏｘＬｉｇ−２）が得られた（図１６ＡおよびＢ）。
β２−ＧＰＩおよびＥＹ２Ｃ９に特異的な結合を示すピークは、約２６．７分（溶出体積１３．４ｍｌに相当）の位置に溶出された。ＯｘＬｉｇ−２（画分番号１４）の精製度を確認するために、この画分を同じＨＰＬＣ条件下で再度クロマトグラフィーを行い（図１６ＣおよびＤ）、ＬＣ／ＭＳ分析に付した。
ＯｘＬｉｇ−２の正イオン化マススペクトルによって、３つのシグナル（ｍ／ｚ３８３，４４１および６２７）が検出された（図１７Ｃ）。これらの２つの小さなピーク、すなわちｍ／ｚ３８３（７−ケトコレステロールに相当）および４４１（７−ケトコレステロール（＋アセトン）に相当）は、ｏｘＬｉｇ−１および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣにおけるものと同様である（図１７Ａ、ＣおよびＥ）。
Ｍ／ｚ５７１、６２７、および６２７のシグナルは、それぞれｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２、および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣの正マススペクトルにおいて母イオン［Ｍ＋Ｈ］＋として検出された（図１７Ａ、ＣおよびＥ）。これに対して、ｍ／ｚ５６９、６２５、および６２５のシグナルは、それぞれｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣのイオンマススペクトルにおいて母イオン［Ｍ＋Ｈ］−として検出された（図１７Ｂ、ＤおよびＦ）。ｏｘＬｉｇ−２の分析において、ｄｉｈｙｒｏ−ｏｘＬｉｇ−２の母イオンとしてｍ／ｚ６２７にもシグナルが検出された（図１７Ｄ）。負のモードにおいて、ｍ／ｚ１８７、２４３、および２４３におけるシグナルが、それぞれｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２、および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣにおいて娘イオン［Ｄ−Ｈ］−として検出された（図１７Ｂ、Ｄ、Ｆ、および図１８）。
溶媒ＡまたはＢを用いたＴＬＣリガンドブロットのいずれにおいても、ｏｘＬｉｇ−２のＲｆ位置は、関連するモノカルボニル誘導体（ｏｘＬｉｇ−１および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ）よりも低く、このことは予測される極性の相違にも合致する（図３、図８、図１５）。
溶媒Ｂを用いたＴＬＣリガンドブロット分析において、ジアゾメタンによるメチル化の後のｏｘＬｉｇ−２および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣに相当するバンド（それぞれＭｅ−ｏｘＬｉｇ−２およびＭｅ−１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ）のＲｆ位置は、未処理のリガンドに比していずれもより高かった（図８、図１５）。逆相ＨＰＬＣにおけるＯｘＬｉｇ−２のピーク（２６．７分）は、ｏｘＬｉｇ−１（２７．３分）および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ（２８．９分）に比して早期に出現した。さらに、メチル化されたｏｘＬｉｇ−２および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣのピークは、これらの未処理のものに比して遅れて出現した（それぞれ２７．１分および３０．０分）。驚くべきことに、リガンドがメチル化されることによって、ＴＬＣリガンドブロットにおけるβ２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２およびＥＹ２Ｃ９のいずれも）との相互作用がいずれも完全に抑制された。
リガンドがコートされたプレートを用いた抗β２−ＧＰＩ抗体のＥＬＩＳＡにおいて、固相化されたｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣに対しては抗β２−ＧＰＩ自己抗体（ＷＢ−ＣＡＬ−１およびＥＹ２Ｃ９）の有意な結合が観察されたが、固相化されたメチル化ｏｘＬｉｇ−２、メチル化１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣおよびコントロールの脂質（コレステリルリノレート）に対しては観察されなかった。同様の結果はヒトβ２−ＧＰＩで免疫したマウスから取得されたマウスモノクローナル抗β２−ＧＰＩ抗体を用いた場合も同様であった（表１）。これら３つの抗体は、いずれも固相化されたコレステロールおよび７−ケトコレステロールには結合しなかった。これらの結果および以前の報告＜５２＞から、ｏｘＬｉｇ−２の構造はコレステリルリノレートの酸化物である４，１２−ｄｉｏｘｏ−１２−（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３β−ｙｌｏｘｙ）ｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄである可能性が極めて高いと結論付けられた（図１８）。
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また、ｏｘＬｉｇ−２、Ｍｅ−ｏｘＬｉｇ−２、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣおよびＭｅ−１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣについてのリガンドブロットの結果を図１５に示す。図１５の結果から、ｏｘＬｉｇ−２や１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣをメチル化するとβ２−ＧＰＩおよびβ２−ＧＰＩ抗体の反応性が消失することが示された。
ｏｘＬｉｇ−１をさらにＬＣ／ＭＳで解析した。検出波長２３４ｎｍ（図５Ａ）における主要なピーク（８．３分）について、ｏｘＬｉｇ−１に由来する正および負イオンの両方を検出した。正イオン化マススペクトルにおいては（Ｍ＋Ｈ）＋イオンと考えられるｍ／ｚ５７１の位置および、７−ケトコレステロールイオン（図５Ｂ）と同じｍ／ｚ３８３の位置（図５Ｄ）にシグナルが検出された。
負イオンモードにおいては、ｍ／ｚ１８７の位置にフラグメントイオンのシグナルが検出された（図５Ｃ）。ｏｘＬｉｇ−１をジエチルエーテル中のジアゾメタンで処理してメチル化ｏｘＬｉｇ−１を得、ＬＣ／ＭＳで解析した。メチル化したｏｘＬｉｇ−１は、ｏｘＬｉｇ−１よりも遅れて溶出され（図５Ａの下の図）、最も大きなフラグメントイオン（９．０分）が正および負のモデルにおいてそれぞれｍ／ｚ５８５およびｍ／ｚ２０１の位置に検出された（図５ＥおよびＦ）。これらの結果は、９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸の構造と符合する。
（６）ｏｘＬｉｇ−１の合成と分析
ｏｘＬｉｇ−１の構造を確認するために、７−ケトコレステロールとアゼライン酸からｏｘＬｉｇ−１を合成した。図６に示す通り、これら両物質を、アセトン中のＷＳＣとＤＭＡＰを用いて室温、２日間で結合させた。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで単離した。１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル並びにＦＤマススペクトルによって、合成されたｏｘＬｉｇ−１の構造が、精製されたｏｘＬｉｇ−１のものであることが証明された。合成されたｏｘＬｉｇ−１（ｓｙｎ−ｏｘＬｉｇ−１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図７Ａ）において、Ｈ−３およびＨ−６のシグナルがそれぞれδ４．６９−４．７８および５．７１ｐｐｍの位置に、それぞれ多重および一本として検出された。さらにδ２０２．５、１７９．７および１７３．４ｐｐｍの位置にカルボニル炭素として帰属できる３本のピークが、δ１６４．５および１２７．１ｐｐｍの位置のオレフィン炭素の２本のシグナルとともに示された（図７Ｂ）。
合成ｏｘＬｉｇ−１をジエチルエーテル中のジアゾメタンによってエステル化し、メチル化ｏｘＬｉｇ−１を得た。図７ＣおよびＤに、合成ｏｘＬｉｇ−１の１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるδ３．６７ｐｐｍの位置に観察された新しい１本のシグナルから、ｏｘＬｉｇ−１がカルボキシル基を有していることが強く示唆された（図７Ｃ）。合成ｏｘＬｉｇ−１を、ＴＬＣ、β２−ＧＰＩと抗β２−ＧＰＩ抗体を用いたリガンドブロット分析に付した。合成ｏｘＬｉｇ−１は、先に述べたｏｘＬＤＬ由来のｏｘＬｉｇ−１と同様のＲｆの位置およびＣｏｆ−２２、ＷＢ−ＣＡＬ−１およびＥＹ２Ｃ９抗体に対する結合特性を示した（図３および図８）。
合成ｏｘＬｉｇ−１とそのメチル化化合物を、さらにＬＣ／ＭＳに付した。両化合物のＬＣクロマトグラムとマススペクトル（図９）は、ｏｘＬＤＬ由来の対応する化合物（図５）と同一であった。図９Ｄの８．３分に位置する小さいピークには、メチル化反応せずに残った合成ｏｘＬｉｇ−１が含まれる。この未反応物は、マススペクトルによって合成ｏｘＬｉｇ−１であると同定された。
（７）マクロファージへのリポソームの結合
外因性ＰＳ−Ｃｈｏｌ−リポソームのＪ７７４Ａ．１細胞への結合はＤＰＰＳ量に依存して増加した（図１０）。これに対し、ｏｘＬｉｇ−１−Ｃｈｏｌ−リポソームの細胞への結合は比較的弱かった。同様の結合特性は、ＰＳまたはｏｘＬｉｇ−１のＣｈｏｌを含有しないリポソームにおいて得られた。Ｊ７７４Ａ．１細胞の代わりにマウスの腹腔マクロファージを用いた場合にも同等のリポソーム結合が見られた。
（８）マクロファージに対する、抗体依存性のリポソーム結合
ＰＳ−リポソームとｏｘＬｉｇ−１−リポソームの結合（４℃、２時間）は、β２−ＧＰＩとＷＢ−ＣＡＬ−１の同時添加によって劇的に増加し、ＷＢ−ＣＡＬ−１の濃度に依存した（図１１ＡおよびＢ）。サブクラスが同じコントロールの抗体を用いて同じアッセイを行った場合には、このような結合能は見られなかった。Ｊ７７４Ａ．１細胞によるｏｘＬｉｇ−１−リポソームの取り込み（３７℃、５時間）は、β２−ＧＰＩとＷＢ−ＣＡＬ−１とともにインキュベートした場合には（４．３６ｐｍｏｌ［３Ｈ］ＤＰＰＣ／ｍｇタンパク質）、これらなしにインキュベートした場合（０．７２ｐｍｏｌ［３Ｈ］ＤＰＰＣ／ｍｇタンパク質）と比較して有意に増加した（データは示さない）。図１１Ｃに示した通り、マクロファージに対する合成ｏｘＬｉｇ−１−リポソームの結合も、リポソーム中のリガンド濃度に依存して増加した。合成ｏｘＬｉｇ−１の場合、１０ｍｌ％において結合はほぼプラトーに達した。
（９）ｏｘＬｉｇ−２、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ等についてのマクロファージに対するリポソームの結合
Ｊ７７４Ａ．１細胞に対するｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２または１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣを含有するリポソームの直接結合を、ＤＰＰＳを含有するリポソームの結合と比較した。ＤＰＰＳ−含有リポソームは、ＤＰＰＳ分子に依存した結合を示した。これに対し、ｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２または１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣを含有するリポソームの結合は比較的に弱いか、又は無視しうる程度であった（図１９）。これらの結果から、スカベンジャー受容体は、ＤＰＰＳ−含有リポソームを除き、これら全てのリポソームのマクロファージへの結合には関与しないことが示された。換言すれば、ｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２または１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣを含有するリポソームのＪ７７４Ａ．１細胞への取り込みは、β２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ抗体（ＷＢ−ＣＡＬ−１）の両方の存在下において、コレステリルリノレート−リポソーム（コントロール）に比して有意に増強された（図２０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）。これに対し、リポソームの結合は、ｏｘＬｉｇ−２または１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣをメチル化することによってほぼ完全に消失した（図２０ＣおよびＤ）。
（１０）β２−ＧＰＩ−合成ｏｘＬｉｇ−１複合体を用いたＥＬＩＳＡによる、動脈血栓症の履歴を持つＡＰＳ患者中の自己抗体の検出
図１２に示す通り、β２−ＧＰＩと合成ｏｘＬｉｇ−１の複合体に対する自己抗体は、ＡＰＳ患者で高頻度に検出される。この複合体抗原に対する自己抗体の値と、β２−ＧＰＩ依存性ａＣＬおよび抗β２−ＧＰＩ抗体の値との間には、良好な相関性が見られた。調べた限りにおいて、このようなＡＰＳ由来の自己抗体は、ＣＬおよびｏｘＬｉｇ−１と複合体を形成したβ２−ＧＰＩと交叉反応するが、酸化ＰＡＰＣ（ｏｘＰＡＰＣ）との複合体とは交叉反応しなかった（表２の実験１）。このような抗体の結合は、脂質のＴＢＡＲＳの量とは相関を示さなかった。さらに、この抗体の結合は、ｏｘＬｉｇ−１と完全な（インタクトな）β２−ＧＰＩとの間の相互作用によってのみ与えられた（実験２）。これに対し、ニックを入れたβ２−ＧＰＩや、「スシドメイン（Ｓｕｓｈｉ  ｄｏｍａｉｎ）」を有するハプトグロビン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）（ＰＬ結合特性を有さない）の場合には、結合は見られなかった。
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なお表２は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における、抗β２−ＧＰＩ抗リン脂質抗体（Ａｂ）の脂質−タンパク質複合体への結合を示すものである。
実験１の数字はβ２−ＧＰＩの存在下（１５μｇ／ｍｌ）における抗体の結合を示し、実験２は、表中に表示したタンパク質の存在下（１５μｇ／ｍｌ）で、合成ｏｘＬｉｇ−１を固相化したプレートを用いてＥＬＩＳＡを行った結果を示すものである。表中のＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）は、ｎｍｏｌマロンジアルデヒド当量／ｍｇ脂質として示した。またＡＰＳ−１およびＡＰＳ−２は、動脈血栓症の履歴をもつ個々のＡＰＳ患者の血清からβ２−ＧＰＩを除去したものであり、ｏｘＰＡＰＣはＰＡＰＣを室温で空気中に２４時間暴露したものであり、ニック（Ｎｉｃｋ）を入れたβ２−ＧＰＩは、プラスミン処理によって調製した＜４３＞ものである。
（１１）抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体と臨床所見との関係をさらに調べた結果、以下の結果が得られた。なお、サンプル中の抗体価（ＯＤ）が、３０人の健常人（ボランティア）の血漿サンプル中の平均値の標準偏差の３倍を上回る場合に、特定の抗体について陽性と判断した。（カットオフ値として）
ＩｇＧ抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体は、初期のＡＰＳでは７３％（３５／４８）の患者で、ＳＬＥを伴うＡＰＳ（第２次のＡＰＳ）では５９％（２３／３９）の患者で、ＳＬＥのみでは１１％（５／４６）の患者でそれぞれ見られた（表３）。
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抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体の抗体価は、今回調べた全ての患者（１３３人）において、β２−ＧＰＩ依存性ａＣＬ（抗β２−ＧＰＩ−ＣＬ抗体）の抗体価と抗β２−ＧＰＩ抗体の抗体価の双方と強い相関があった（相関係数ｒ２はそれぞれ０．７２、０．８１）（図１４）。
これらの患者（１３３人のＡＰＳ及び／又はＳＬＥ患者）では、抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体は、血栓症（動脈及び／又は静脈血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症）の履歴や妊娠疾病率（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）と有意な関連性が見られたが、血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｎｉｃａ）とは有意な関連性は見られなかった（それぞれ、ｐ＝４．２ｘ１０−８（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）；Ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ  ８．１５、ｐ＝１．７ｘ１０−７；８．００、ｐ＝０．０１８；２．２９、ｐ＝０．００７７；３．０３、およびｐ＝０．３１；１．３８）（表４）。動脈血栓症診断のためのアッセイの感度、特異性および期待値は、いずれも静脈血栓、妊娠疾病率、および血小板減少症のそれらよりも非常に良好であった（表４）。
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さらに、抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体は、β２−ＧＰＩ依存性ａＣＬおよび抗β２−ＧＰＩ抗体に比してより血栓症（動脈及び／又は静脈）と関連性が強かった（それぞれ、ｐ＝１．５ｘ１０−６（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）；Ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ  ６．０２、ｐ＝５．２ｘ１０−５；４．９３）。
血栓症（動脈及び／又は静脈血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症）および妊娠疾病の履歴のある患者における抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体の抗体価は、これらの履歴がない者の抗体価よりも有意に高かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔで、それぞれｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．０２５、およびｐ＝０．０１１）（図１５）。これに対し、この抗体の存在または抗体価と、血小板減少症の履歴とは全く無関係であった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔで、ｐ＝０．４５）。
＜３＞考察
本研究において我々は、光学バイオセンサーを用いて、β２−ＧＰＩ、ｏｘＬＤＬおよび抗β２−ＧＰＩ自己抗体の間の特異的結合の相互作用の証拠を得た。我々はβ２−ＧＰＩに対する特異的リガンドを精製し、その構造および合成リガンドを用いて、ｏｘＬＤＬのマクロファージへの取り込みにおける関与について調べた。そのリガンドの構造は、化学的に合成した９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸を用いたその特性の再現性によって確認された。
ＬＤＬの酸化はアテローム形成に重要な役割を担っていると考えられている＜４４＞。アテローム性動脈硬化の発生に関するメカニズムを調べるために、ＭＤＡ−ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、ＣｕＳＯ４を介したｏｘＬＤＬ（ＣｕＳＯ４−ｏｘＬＤＬのような変性ＬＤＬを用いた実験モデルが用いられてきた。これらのＬＤＬの間でも特にＣｕ２＋イオンがＬＤＬの酸化を誘導することができ、高い再現性でＬＤＬにダメージを与えることができる＜４５＞。このプロセスによって、細胞によって酸化されたＬＤＬまたはアテローム性動脈硬化のプラークから抽出されたＬＤＬと多くの構造的および機能的性質を共有するｏｘＬＤＬを調製することができる。ＬＤＬを、種々の異なったタイプの細胞とともに、または細胞の非存在下でＣｕ２＋イオンとともにインキュベートすると、同様の性質を有する酸化修飾されたＬＤＬが生成する＜４６＞。ＣｕＳＯ４−ｏｘＬＤＬを自己抗原として用いることは、ｏｘＬＤＬがアテローム性の傷害において見られること、およびアテローム性傷害から抽出されたｏｘＬＤＬが、ＣｕＳＯ４−ｏｘＬＤＬの物理化学的および免疫学的性質のほとんど全ての性質を有することから、一般的に承認されている＜２４＞。
ｏｘＬＤＬに対する抗体は、アテローム性動脈硬化病巣に存在し、正常の動脈に存在しない物質を認識する。ＳＬＥ患者のａＣＬがＭＤＡ−ＬＤＬと交叉反応することが報告されている＜２７＞。一方他の研究グループは、抗ｏｘＬＤＬ抗体の他のポピュレーションが、ＬＤＬ分子に存在する酸化ＰＣ（例えばＰＯＶＰＣ）−タンパク質に反応することを見出している＜３３、４７＞。
しかしながら最近の研究で我々は、ＴＢＡＲＳ産生が、ＣｕＳＯ４−ｏｘＬＤＬへのβ２−ＧＰＩの結合と一致しないことを見出している＜４８＞。
ＭＤＡは親水性の短鎖のアルデヒドであることから、容易にＬＤＬ分子から拡散する＜４９＞。我々はまた、透析した後においては、ｏｘＬＤＬ調製物中のＴＢＡＲＳが検出できない程度の低いレベルにまで減少していることを見出した。本研究においてはＣｕＳＯ４−ｏｘＬＤＬが固相化されたβ２−ＧＰＩに対して特異性の高い結合をすることが示された（図１Ａ）。β２−ＧＰＩへのネイティブなＬＤＬの弱い結合は、リポタンパク質［ａ］（ＬＤＬとアポリポタンパク質［ａ］（ａｐｏ［ａ］）からなる；＜５０＞）へのβ２−ＧＰＩの結合を反映しているものと考えられる。しかしながら、このようなネイティブなＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの間の相互作用は、抗β２−ＧＰＩ自己抗体に対する適当なエピトープを露出するものではない（図１Ｂ）。さらに、β２−ＧＰＩとＣｕＳＯ４−ｏｘＬＤＬ由来の脂質リガンドとの複合体の存在下においてのみ、抗β２−ＧＰＩ自己抗体、２つのモノクローナル抗体、および２つの典型的な抗β２−ＧＰＩ陽性血清（動脈血栓症の履歴があるＡＰＳ患者由来）の特異性の高い結合が観察された（図２、３および１２、表２）。ＬＤＬの酸化修飾は、脂質の過酸化、活性アルデヒドによるアミノ酸側鎖の修飾、表面の電化の増加、およびポリマー化のような一連の複雑な変化を伴う。
ｏｘＬＤＬのなかの種々の修飾された分子のうち、β２−ＧＰＩは明らかに脂質部分のコンポーネントと結合している。
リノール酸は、ＬＤＬのなかで見られる主要な多不飽和脂肪酸であり、主にＣｈｏｌ−エステルとして存在している＜５１＞。
マイルドに酸化されたＬＤＬにおいては、コレステリル  ハイドロペルオキシオクタデカジエノエート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏａｔｅ（Ｃｈｏｌ−ＨＰＯＤＥ））、およびコレステリル  ハイドロキシオクタデカジエノエート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏａｔｅ（Ｃｈｏｌ−ＨＯＤＥ））が酸化生成物の主要な構成要素として検出された＜５２＞。Ｃｈｏｌ−ＨＰＯＤＥは、血小板由来成長因子を不活性化すると報告されている＜５３＞。７−ハイドロキシコレステロール（フリーのものとエステル化されたものの両方）は、ＬＤＬ酸化の初期に形成される主要なオキシステロールであり、ＬＤＬ酸化の後期に７−ケトコレステロールが優勢となる。＜５４＞。最近の研究では＜５５＞、７β−ヒドロキシコレステロールの血漿レベルは、アテローム性動脈硬化症のリスクの増加に関係する。ＬＤＬ酸化の後期のステージにおいて、コレステリルリノレート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）に由来する９−オキソノナノエートのコレステリルエステルまたは７−ケトコレステリルエステル＜５６＞は、酸化コレステリルリノレートが最も豊富な画分として検出された＜５７，５８＞。コレステリルエステルのコアアルデヒドは、リジンのフリーのε−アミノ基と反応し、タンパク質との複合体を形成し、ヒトのアテローム動脈硬化に関する傷害において顕著に存在するようになる＜５８、５９＞。本研究において、ｏｘＬｉｇ−１は、コレステリルリノレートの酸化生成物の１つである９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸であって、β２−ＧＰＩの主要なリガンドであると同定された。しかしながら、９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸がｏｘＬＤＬリガンドとして実際に生体サンプル中に存在しているか否かについては、検討課題として残されている。
化学的に修飾されたＬＤＬは、レセプターを介するエンドサイトーシスによって速やかにマクロファージに取り込まれ、泡沫細胞の形成に至る＜４４＞。ｏｘＬＤＬのモデルとして、我々はｏｘＬｉｇ−１−およびＰＳ−リポソームを用いてこれらのＪ７７４Ａ．１細胞への結合を調べた（図７）。ＰＳ−リポソームはスカベンジャーレセプターを介してマクロファージに結合したが、一方、ｏｘＬｉｇ−１はスカベンジャーレセプターの主要なリガンドではないようである。しかしながら、４℃におけるｏｘＬｉｇ−１−リポソームのＪ７７４Ａ．１細胞への結合は、β２−ＧＰＩとＷＢ−ＣＡＬ−１と同時にｏｘＬｉｇ−１−リポソームを加えた場合には、最高１４倍にまで増加した。３７℃におけるＪ７７４Ａ．１細胞によるｏｘＬｉｇ−１−リポソームの取り込みも、β２−ＧＰＩとＷＢ−ＣＡＬ−１とともにインキュベートすることによって有意に増加した。この結合および取り込みは、Ｆｃγレセプターを介していると考えられる。ｏｘＬＤＬを含有する免疫複合体の、マクロファージによるＦｃγタイプ１レセプターを介した取り込みは、マクロファージを泡まつ細胞へと変化させ＜６０，６１＞、アテローム形成を促進しうる＜６２〜６４＞。
β２−ＧＰＩとの複合体を形成した固相化ｏｘＬｉｇ−１に対する自己抗体が、動脈血栓症の履歴を有するＡＰＳ患者の血清から検出された（図１２）。さらに、抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体価、抗β２−ＧＰＩ抗体価、およびβ２−ＧＰＩ依存性ａＣＬの力価の間で、良好な相関性が見られた。これに対し、いくつかのａＰＬが、酸化されたＰＬｓおよびβ２−ＧＰＩの付加物を認識することが報告されている＜３１＞。本研究において我々はｏｘＬｉｇ−１がβ２−ＧＰＩと共に付加物を形成できるか否かについては確認しておらず、その可能性は排除できない。しかしながら、ｏｘＬｉｇ−１とβ２−ＧＰＩとの間の相互作用は、表２の実験２に示した自己抗体についての抗原性の発現に必須であることは明らかである。また、ＰＬ−結合領域を含むドメインＶ＜１５，１６＞は、ＡＰＳ患者に存在するａＰＬによって認識されるエピトープが存在するドメインとは異なることが示唆される＜３８，６５＞。
マクロファージにおける脂質の堆積の促進に加え、ｏｘＬＤＬはアテローム形成を促進するという他の特性を有していると考えられる。ｏｘＬＤＬは単球およびＴ細胞の走化性因子であり＜６６，６７＞、培養内皮細胞の細胞毒性因子でもある＜６８＞。また、脂質代謝と直結している転写調節因子であるペルオキシソーム増殖剤応答性レセプターγ（ＰＰＡＲγ）が９−ＨＯＤＥのようなｏｘＬＤＬの構成成分によって活性化され、１３−ＨＯＤＥ、およびスカベンジャーレセプターであるＣＤ３６は、ＰＰＡＲγおよびレチノイドＸレセプターリガンドのコンビネーションによってアップレギュレートされることが報告されている＜６９＞。ＰＰＡＲγはｏｘＬＤＬの取り込みを促進し、これによって泡沫細胞の形成が促進される。ｏｘＬｉｇ−１が、核受容体や細胞内情報伝達のような他の生物学的機能に対して特異的な影響を及ぼすのか否かは、これから調査すべきこととして残されている。
要約すると、我々はｏｘＬＤＬに存在するβ２−ＧＰＩに対するリガンドを単離して特性を調べた。そのリガンド（ｏｘＬｉｇ−１）、すなわち９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸、は、β２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ自己抗体の存在下において、マクロファージによるリポソームの取り込みを媒介する。我々のリガンドに関する知見は、β２−ＧＰＩと抗β２−ＧＰＩ自己抗体とＡＰＳにおけるアテローム形成との間の、特異な構造的・機械的関連性を示すものである。
Ｃｕ２＋酸化によって導入されたω−カルボキシル基が、β２−ＧＰＩとリガンドとの相互作用に重要であることが示された。我々は、ｏｘＬｉｇ−２が、４，１２−ジオキソ−１２−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ドデカン酸であることを示す証拠を得た（図１８）。
ｏｘＬｉｇ−２のメチル化の実験により、そのアシル鎖にカルボキシル基が存在することが示されるが、ケトンの正確な位置は質量分析では決定することができない。しかし、コレステリルリノレートはＬＤＬの１つの主要なコレステリルエステルを構成すること＜５２＞から、９位および／または１３位の可能性が高い。
β２−ＧＰＩはコレステロール、７−ケトコレステロールまたはコレステリルリノレートには結合しないが、ｏｘＬｉｇ−１、ｏｘＬｉｇ−２または１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣには有意な結合が見られた。よって、カルボキシル化された長いアシル鎖を有するこれらのオキシステロールエステルは、β２−ＧＰＩに適した両親媒性リガンドの新たなクラスを構成する。さらに、これらのリガンドのメチル化によりβ２−ＧＰＩとの相互作用が妨げられることから、フリーのカルボキシル基が認識に必要であることが示された。
我々は、酸化されたコレステリルエステル、特に７−ケトコレステロールを有し、かつ、アシル基中にカルボキシル基を有するものがβ２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ自己抗体のリガンドとして機能することを示した。血漿ＬＤＬに由来する主要な生化学的酸化化合物の１つは、おそらくｏｘＬｉｇ−１やｏｘＬｉｇ−２のようなω−カルボキシル化されたオキシステロールである。１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣは人工的に合成された化合物ではあるが、ｏｘＬｉｇ−１およびｏｘＬｉｇ−２と同様に、β２−ＧＰＩへの有意な結合を示した。
＜４＞本発明キットの作成
下記の構成からなる本発明キット１を作成した。
１．ＯｘＬｉｇ−１が固着された９６ウェルのイムノプレート  １枚
２．β２−ＧＰＩ標準溶液  １セット
３．抗β２−ＧＰＩ抗体（ＷＢ−ＣＡＬ−１）  １本
４．ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体  １本
５．ｏ−フェニレンジアミン溶液  １本
６．過酸化水素水  １本
７．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
下記の構成からなる本発明キット２を作成した。
１．ＯｘＬｉｇ−１が固着された９６ウェルのイムノプレート  １枚
２．β２−ＧＰＩ  １本
３．ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体  １本
４．テトラメチルベンジジン溶液  １本
５．過酸化水素水  １本
６．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
＜５＞引用文献
１５．Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６５３−６５９
１６．ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：５１６６−５１７４
２４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１０８６−１０９５
２７．Ｌａｎｃｅｔ．３４１：９２３−９２５
３１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：８１５−８２５
３３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１１７−１２８
３５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３８８５−３８９１
３６．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３７：１４５３−１４６１
３７．Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１０６３−１０６８
３８．Ｂｌｏｏｄ．８７：３２６２−３２７０
３９．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４３：１３４５−１３５３
４０．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５：３５１−３５８
４１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７−５０９
４２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：５２２６−５２３１
４３．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１８３−１１９２
４４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０９６３−２０９６６
４５．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：２０６６−２０７２
４６．Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１１（Ｓｕｐｐｌ．Ｅ）：８３−８７
４７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５２７４−１５２７９
４８．Ｌｕｐｕｓ．７（Ｓｕｐｐｌ．２）：１３５−１３９
４９．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２８：４９５−５０９
５０．Ｂｌｏｏｄ．９０：１４８２−１４８９
５１．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１５：１１３１−１１３８
５２．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：７９−８９
５３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９４０５−１９４１０
５４．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３８：１７３０−１７４５
５５．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１４２：１−２８
５６．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０４：２６９−２７２
５７．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６：１８７６−１８８６
５８．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３８：１３４７−１３６０
５９．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３９：１５０８−１５１９
６０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１０４１−１０５９
６１．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１３５：１６１−１７０
６２．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１２：１２５８−１２６６
６３．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１５：９９０−９９９
６４．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６：７１４−７２４
６５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１５５４２−１５５４６
６６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：２９９５−２９９８
６７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１００４−１００８
６８．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．３：２１５−２２２
６９．Ｃｅｌｌ．９３：２２９−２４０
産業上の利用可能性
本発明誘導体はβ２−ＧＰＩに特異的に結合することからβ２−ＧＰＩの検出等や精製等に利用でき、さらに本発明固相、本発明測定方法、本発明検出方法および本発明測定キットにも応用できることから極めて有用である。更に本発明誘導体を利用して競合法によってｏｘＬＤＬを測定したり、ｏｘＬＤＬ測定の標準物質として利用することもできる。
本発明固相はβ２−ＧＰＩの簡便・迅速な検出や精製等に利用することができ、本発明測定方法、本発明検出方法および本発明測定キットにも応用できることから極めて有用である。
本発明測定方法１および２によれば、β２−ＧＰＩや本発明誘導体とβ２−ＧＰＩとの複合体に対する自己抗体等を簡便・迅速に測定することができることから極めて有用である。
本発明検出方法によれば、疾患を簡便・迅速に検出することができることから極めて有用である。
本発明測定キット１および２を用いれば、本発明測定方法１および２をさらに簡便・迅速に実施することができ、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、光学バイオセンサーで検出した、β２−ＧＰＩ、ＬＤＬ、リン脂質（ＰＬ）および抗β２−ＧＰＩ自己抗体の間の分子間相互作用を示す図である。
Ａ：固相化β２−ＧＰＩに結合したＬＤＬ（白の四角）またはｏｘＬＤＬ（黒の四角）。
Ｂ：β２−ＧＰＩ存在下において、固相化ＷＢ−ＣＡＬ−１に結合したＬＤＬ（白の四角）またはｏｘＬＤＬ（黒の四角）。
Ｃ：固相化β２−ＧＰＩに結合したＤＯＰＥ（白丸）またはＣＬ（黒丸）。
Ｄ：β２−ＧＰＩ存在下において、固相化ＷＢ−ＣＡＬ−１に結合したＤＯＰＥ（白丸）またはＣＬ（黒丸）。
図２は、血漿ＬＤＬｓまたはこれらの脂質抽出物への、β２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ自己抗体の結合を示す図である。
Ａ：血漿ＬＤＬｓ、β２−ＧＰＩおよびマウス抗ヒトβ２−ＧＰＩモノクローナル抗体（Ｃｏｆ−２２）を、抗ａｐｏＢ１００モノクローナル抗体（１Ｄ２）のＦａｂフラグメントでコートしたプレート中で順にインキュベートした。結合はＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧで検出した。
Ｂ〜Ｄ：ＬＤＬｓからの脂質抽出物をプレートにコートした。β２−ＧＰＩの結合は、Ｃｏｆ−２２とＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを用いて検出した（Ｂ）。その後のＷＢ−ＣＡＬ−１（Ｃ）とＥＹ２Ｃ９（Ｄ）の結合は、それぞれＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ（Ｃ）およびＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＭ（Ｄ）で検出した。オープンカラムはβ２−ＧＰＩの非存在下、クローズドカラムはβ２−ＧＰＩの存在下での結果を示す（Ｃ，Ｄ）。データは、３つのサンプルの平均値±ＳＤとして示した。
図３は、ＬＤＬｓからの脂質抽出物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とリガンドブロットを示す図である。
ＬＤＬｓから抽出された脂質をシリカゲルプレートにスポットし、溶媒Ａで展開した。
Ａ：図中に示した通り、Ｉ２蒸気、モリブデンブルー、オルシン／硫酸、および硫酸／酢酸による染色。
Ｂ：β２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ抗体を用いたリガンドブロット。＊で示した領域を削り取ってさらに精製した。Ｇｌｕ−Ｃｅｒはグルコシルセラミドを、Ｇａｌ−Ｃｅｒはガラクトシルセラミドを示す。
Ｃ：削り取った脂質（バンド−１およびバンド−２）のリガンドブロットを、β２−ＧＰＩと抗β２−ＧＰＩ抗体を用いて順に処理することによって行った（２段階）。
Ｄ：溶出液のリガンドブロットを、β２−ＧＰＩと抗β２−ＧＰＩ抗体を共にインキュベートすることによって行った（１段階）。
図４は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるバンド−１の溶出プロファイルを示す図である。
削り取ったバンド−１をセファシル−ペプチドカラム（Ｓｅｐｈａｃｉｌ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ）で溶出し、２１０ｎｍ（Ａ）および２３４ｎｍ（Ｂ）で検出した。ＥＹ２Ｃ９を用いた、溶出液のリガンドブロット分析のデータを併せて示す（Ｃ）。
図５は、精製ｏｘＬｉｇ−１およびそのメチル化化合物のＬＣ／ＭＳを示す図である。
Ａ：ｏｘＬｉｇ−１（上段）およびメチル化ｏｘＬｉｇ−１（下段）の２３４ｎｍにおけるＨＰＬＣプロファイル。
Ｂ：７−ケトコレステロールの正イオン化マススペクトル。
Ｃ：ｏｘＬｉｇ−１の負イオン化マススペクトル。
Ｄ：ｏｘＬｉｇ−１の正イオン化マススペクトル
Ｅ：メチル化ｏｘＬｉｇ−１の負イオン化マススペクトル。
Ｆ：メチル化ｏｘＬｉｇ−１の正イオン化マススペクトル。
図６は、ｏｘＬｉｇ−１（９−オキソ−９−（７−ケトコレスト−５−エン−３β−イルオキシ）ノナン酸）の合成と、そのメチル化。
図７は、合成ｏｘＬｉｇ−１とそのメチル化化合物の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル。合成ｏｘＬｉｇ−１（Ａ）またはメチル化ｏｘＬｉｇ−１（Ｃ）の３００ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。合成ｏｘＬｉｇ−１（Ｂ）またはメチル化した合成ｏｘＬｉｇ−１（Ｄ）の７５．３ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲ。
図８は、合成ｏｘＬｉｇ−１のＴＬＣとリガンドブロット分析を示す図である。
Ａ：ｏｘＬｉｇ−１と合成ｏｘＬｉｇ−１をＴＬＣプレートにスポットし、溶媒Ａで展開して、Ｉ２蒸気で検出した。
Ｂ：合成ｏｘＬｉｇ−１のリガンドブロットを、β２−ＧＰＩの存在下（＋）または非存在下（−）で、抗β２−ＧＰＩ抗体を用いて行った。
図９は、合成ｏｘＬｉｇ−１およびそのメチル化化合物のＬＣ／ＭＳ。
Ａ：合成ｏｘＬｉｇ−１の２１０および２３４ｎｍにおけるＬＣクロマトグラム。
Ｂ：合成ｏｘＬｉｇ−１の正イオン化マススペクトル。
Ｃ：合成ｏｘＬｉｇ−１の負イオン化マススペクトル。
Ｄ：メチル化した合成ｏｘＬｉｇ−１の２１０および２３４ｎｍにおけるＬＣクロマトグラム。
Ｅ：メチル化したｏｘＬｉｇ−１の正イオン化マススペクトル
Ｆ：メチル化した合成ｏｘＬｉｇ−１の負イオン化マススペクトル。
図１０は、リポソームのマクロファージへの結合に対する、フォスファチジルセリン（ＰＳ）またはｏｘＬｉｇ−１含量の効果を示す図である。単層のＪ７７４．Ａ１細胞を、３Ｈ標識したリポソーム（５０ｎｍｏｌ脂質／ウエル）を含有するＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地中で４℃、２時間インキュベートした。
白丸はＰＳ−リポソームを、黒丸はＰＳ−Ｃｈｏｌ−リポソームを、白四角はｏｘＬｉｇ−１−リポソームを、黒四角はｏｘＬｉｇ−１−Ｃｈｏｌ−リポソームを示す。データは、３つのサンプルの平均値±ＳＤとして示した。
図１１は、リガンドを含有するリポソームの、マクロファージに対するβ２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩモノクローナル抗体依存性の結合を示す図である。単層のＪ７７４．Ａ１細胞を、β２−ＧＰＩ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、３Ｈ標識したリポソーム（５０ｎｍｏｌ脂質／ウエル）およびＷＢ−ＣＡＬ−１を含有するＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地中で４℃、２時間インキュベートした。
Ａ：β２−ＧＰＩ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下（黒四角）または非存在下（白四角）におけるＰＳ−リポソームの（ＰＳ；５０ｍｏｌ％）のＪ７７４．Ａ１細胞への結合。
Ｂ：β２−ＧＰＩ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下（黒四角）または非存在下（白四角）におけるｏｘＬｉｇ−１−リポソームの（ｏｘＬｉｇ−１；４０ｍｏｌ％）のＪ７７４．Ａ１細胞への結合。
Ｃ：単層のＪ７７４．Ａ１細胞を、β２−ＧＰＩ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、３Ｈ標識した合成ｏｘＬｉｇ−１リポソーム（５０ｎｍｏｌ脂質／ウエル）およびＷＢ−ＣＡＬ−１を含有するＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地中で４℃、２時間インキュベートした。
β２−ＧＰＩおよびＷＢ−ＣＡＬ−１の非存在下における合成ｏｘＬｉｇ−１−リポソームの結合（白丸）、β２−ＧＰＩの存在下おける合成ｏｘＬｉｇ−１−リポソームの結合（白四角）、ＷＢ−ＣＡＬ−１の存在下おける合成ｏｘＬｉｇ−１−リポソームの結合（黒四角）、β２−ＧＰＩおよびＷＢ−ＣＡＬ−１の両者の存在下おける合成ｏｘＬｉｇ−１−リポソームの結合（黒丸）。データは、３つのサンプルの平均値±ＳＤとして示した。
図１２は、ＡＰＳ患者の血清中に存在する、固相化したβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１複合体に対する自己抗体。血清は健常人（ｎ＝２４）および血栓症の履歴をもつＡＰＳ患者（ｎ＝５２）から得た。
Ａ：個々の血清サンプルにおける抗体価。
Ｂ：抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体価と、β２−ＧＰＩ依存性ａＣＬ価との間の関係。
Ｃ：抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体価と、抗β２−ＧＰＩ抗体価との間の関係。
図１３は、抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体ＥＬＩＳＡ、β２−ＧＰＩ依存性ａＣＬ（抗β２−ＧＰＩ−ＣＬ抗体）、および抗β２−ＧＰＩ抗体ＥＬＩＳＡ間における抗体価の関係。ＡＰＳ及び／又はＳＬＥ患者１３３人の血漿サンプル（ＡＰＳ患者８７人、ＳＬＥのみの患者４７人）を、材料及び方法で説明した方法でアッセイした。
図１４は、抗体価と臨床履歴との関係。ＡＰＳ及び／又はＳＬＥ患者の抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体の個々の抗体価をプロットした。白丸：臨床履歴なし。灰色の丸：臨床履歴あり。ｐはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔによる結果である。線（ｄａｓｈｅｄ  ｌｉｎｅ）はカットオフ値（健常コントロールにおける平均を上回る３ＳＤのレベル）を示す。
図１５は、ｏｘＬｉｇ−２、Ｍｅ−ｏｘＬｉｇ−２、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣおよびＭｅ−１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣのＴＬＣとリガンドブロットを示す図である。
図１６は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるバンド−２の溶出プロファイルを示す図である。
削り取ったバンド−２をセファシル−ペプチドカラム（Ｓｅｐｈａｃｉｌ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ）で溶出し、２１０ｎｍ（Ａ）および２３４ｎｍ（Ｂ）で検出した。ＥＹ２Ｃ９を用いた、溶出液のリガンドブロット分析のデータを併せて示す（Ｂ）。画分番号１４については、純度を確認するために同じＨＰＬＣで再度精製した（ＣおよびＤ）。
図１７は、精製又は合成β２−ＧＰＩリガンドのＬＣ／ＭＳを示す図である。  左側はｏｘＬｉｇ−１（Ａ）、ｏｘＬｉｇ−２（Ｃ）および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ（Ｅ）の正イオン化マススペクトルを、右側はｏｘＬｉｇ−１（Ｂ）、ｏｘＬｉｇ−２（Ｄ）および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ（Ｆ）の負イオン化マススペクトルを示す。
図１８は、β２−ＧＰＩのリガンドとして作用するコレステリルエステルの構造を示す図である、
コレステリルリノレート（Ａ）、ｏｘＬｉｇ−１（Ｂ）、ｏｘＬｉｇ−２（Ｃ）および１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ（Ｅ）の、構造を示した。質量分析において予測されるフラグメンテーションのスキームを示した。矢印で示した部分の開裂により、娘イオン”Ｄ”が得られる。
図１９は、マクロファージに対するリガンド含有リポソームの直接的な結合を示す図である。
単層のＪ７７４Ａ．１細胞を、４℃条件下で２時間、［３Ｈ］−ラベルしたリポソーム（所定のリガンドを含有する；５０ｎｍｏｌ脂質／ウエル）を含有するＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地中でインキュベートした。ＤＰＰＳ含有リポソーム（白四角）、ｏｘＬｉｇ−１含有リポソーム（黒四角）、ｏｘＬｉｇ−２含有リポソーム（黒丸）、１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ含有リポソーム（黒三角）。データは、３つのサンプルの平均値±ＳＤとして示した。
図２０は、リガンド含有リポソームの、マクロファージに対するβ２−ＧＰＩおよび抗β２−ＧＰＩ抗体依存性の結合を示す図である。
単層のＪ７７４Ａ．１細胞を、４℃条件下で２時間、β２−ＧＰＩ（２００μｇ／ｍｌ）およびＷＢ−ＣＡＬ−１（１００μｇ／ｍｌ）の存在下（黒四角）または非存在下（白四角）で、［３Ｈ］−ラベルしたリポソーム（所定のリガンドを３０ｍｏｌ％含有する；５０ｎｍｏｌ脂質／ウエル）を含有するＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地中でインキュベートした。
パネルＡ：コレステリルリノレート含有リポソーム、パネルＢ：ｏｘＬｉｇ−１含有リポソーム、パネルＣ：ｏｘＬｉｇ−２含有リポソーム、パネルＤ：１３−ＣＯＯＨ−７ＫＣ含有リポソーム。パネルＣおよびＤにおいては、メチル化されたリガンドのリポソームの結合も比較した。データは、３つのサンプルの平均値＋ＳＤとして示した。
【図１】
0004272518.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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