(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨への癌転移を予防するための薬剤の調製における、治療に有効な量の、PTHrpに対して免疫応答性および免疫特異性を有する抗体またはその断片の使用。
【請求項２】
骨における転移した癌細胞の増殖を抑制するための薬剤の調製における、治療に有効な量の、PTHrpに対して免疫応答性および免疫特異性を有する抗体またはその断片の使用。
【請求項３】
骨への癌細胞の転移によってもたらされる骨溶解を予防するための薬剤の調製における、治療に有効な量の、PTHrpに対して免疫応答性および免疫特異性を有する抗体またはその断片の使用。
【請求項４】
癌細胞が、胸部、肺、腎臓、頭部／首、前立腺、膵臓、皮膚、甲状腺、精巣、肝臓、尿路上皮、子宮内膜、頸、食道、血液、神経系、およびリンパ組織からなる群より選択される原発部位から転移したものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
薬剤が、患者における癌細胞の増殖および／または癌細胞の転移の二次的な総体的症状の改善をさらにもたらす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
二次的な総体的症状が、癌細胞の転移の予防および／または癌細胞の増殖の抑制により改善されるものであって、かつ該改善が以下からなる群より選ばれる、請求項５に記載の使用：
疼痛がみられる患者における、該疼痛の軽減；
神経圧迫の危険性がある患者における、該圧迫の回避または軽減；
高カルシウム血症である患者における、該高カルシウム血症の改善；
危篤状態にある患者における延命；
病的骨折の危険性がある患者における、該危険性の減少；
悪液質である患者における、該悪液質の改善；および
上記の総体的症状の組み合わせを有する患者における、該総体的症状の組み合わせの改善。
【請求項７】
癌細胞が、扁平上皮癌細胞、腺癌細胞、黒色腫細胞、骨肉腫細胞、神経芽腫細胞、または血液系癌細胞からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
薬剤が、原発性の癌腫瘍の外科的除去前、除去中、または除去後に患者を治療するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
薬剤が、癌細胞の転移による骨吸収の部位を有する患者を治療するためのものである、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
抗体が、ヒト以外の哺乳動物に由来する可変領域およびヒトに由来する定常領域を含むキメラ抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
抗体が、トランスジェニックマウスに由来するヒト化抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
抗体がヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
薬剤が、治療に有効な量の、下図の一般構造式を有するビスホスホン酸もしくはピロリン酸、ならびに薬学的に許容されるその塩、水和物および部分水和物をさらに含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
0004231106.tif 000006
（式中、Xはホスホン酸基を連結する結合部である。）
【請求項１４】
Xが、-O-、および
0004231106.tif 000007
からなる群より選択される、請求項１３に記載の使用。
［式中、R1、R2はH、OH、Cl、NH2、S、チオフェニル（該フェニル環はCl、OH、およびHN2からなる群より選択される置換基で置換されていてもよい）、1から12個の炭素原子を含むアルキル基、1から12個の炭素を含む置換アルキル基（該置換基はO、S、NH2、N、および1から12個の炭素原子を含むN-アルキル基からなる群より選択される）、1から12個の炭素原子を含み、かついずれの炭素原子もCl、OH、およびNH2からなる群より選択される置換基で置換されていてもよい環状化合物、ならびに1から12個の炭素原子を含み、かついずれの炭素原子もCl、OH、およびNH2からなる群より選択される置換基で置換されていてもよい複素環式化合物（該ヘテロ原子はO、N、Sからなる群より選択される）からなる群よりそれぞれ独立に選択される。］
【請求項１５】
Xが、-O-、
0004231106.tif 000008
からなる群より選択される、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本出願は、1995年1月23日に出願された特許出願第08/376,359号の一部継続出願である、1995年2月9日に本発明者らが出願した特許出願第08/386,361号の一部継続出願である、本発明者らが1995年6月6日に出願した先の特許出願第08/481,088号の一部継続出願である。上記の出願は参照として本明細書に組み入れられ、本発明者らは上記出願に対して米国特許法第120条の下に優先権を主張する。
技術分野
本発明は、骨への癌転移および骨癌の増殖の予防ならびに治療に関し、さらにそれに関連する骨溶解、および多くの起源の癌の問題のある局面の一部に関する。特に、本発明は、これらの状態を改善するための副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTH-rp）に対する抗体の使用、および抗PTH-rp単独、またはビスホスホン酸塩と組み合わせた抗PTH-rpの他の形態に関する。
発明の背景
特に外科的技術が容易に利用できるという事実を考慮にいれると、起点における癌細胞増殖の全身系への続発症が、癌による罹患および死の原因の一部であることが、かなり以前より理解されている。悪性腫瘍の進行は、原発腫瘍の別の部位への転移、この転移の直接的または非直接的な結果としての標的部位の破壊、悪液質、高カルシウム血症、および他の総体的症状を特徴とする。これらの続発症を引き起こす機構には、数ある因子の中で、多種のサイトカイン、増殖因子、および細胞接着分子が関与すると信じられている。しかしながら、骨転移において癌細胞が骨を溶解する機構については、現在まで全く分かっておらず、骨を溶解できることが知られている細胞は破骨細胞のみである。癌の増殖に適合させるため、どのように転移癌が骨を溶解するかに関しても知られていない。
上記過程の少なくとも一部において役割を担うことが知られている多数の因子の１つとして、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTH-rp）が挙げられる。それは、PTHと類似しているため、悪性腫瘍の体液性高カルシウム血症（HHM）の伝達物質として認識されている。この役割において、腫瘍から分泌されるPTH-rpは、血液を循環し、骨吸収の指標となる高カルシウム血症に関与する。
PTH-rpは、全身性の骨吸収および尿細管における尿からのカルシウム再吸収の原因であることが示されている。これらはいずれも、全身における血中カルシウム濃度の上昇をもたらす。この因子は、米国特許第5,116,952号にHHMと関連して記載されている。この特許は、部分的に配列が決定されたタンパク質のペプチドサブユニットを用いた抗PTH-rp抗体の作製についても記載している。このタンパク質は、米国特許第5,312,810号においてはアデニル酸シクラーゼ刺激因子（ACSF）、米国特許第5,114,843号においては体液性高カルシウム血症因子（hHCF）とも呼ばれている。HHMとPTH-rpとの関連性は、「イェーツ（Yates）,A.J.P.ら、J Clin Invest（1988）81:932-938」によっても開示されている。1992年8月18日に公開された日本特許出願第A4-228089号は、マウス／ヒトキメラを含む抗PTH-rp抗体の組み換えによる作製について記載している。この出願は、マウスの腹腔内にPTH-rpを全身的に注入することにより、またはPTH-rpを産生する前立腺癌細胞系をヌードマウスに移植することによりHHMを生じさせたモデル系において、PTH-rpに対するマウスまたはキメラモノクローナル抗体が、HHMの作用を改善することを証明する動物実験についても開示している。
PTH-rpはヒトの肺癌、乳癌、および腎細胞癌から精製されている。PTH-rpは当所腫瘍細胞に関連して発見されたが、正常組織にも広く存在する。「スバ（Suva）,L.J.ら、Science（1987）237:893〜895」により、PTH-rpをコードする遺伝子がクローニングされ、発現させられた。PTH-rpは、PTH受容体に結合し（アバウ−サムラ（Abou-Samra）,A.ら、Proc Natl Acad Sci USA（1992）89:2732〜2736）、PTHに類似の活性を有する（ホリウチ（Horiuchi）,N.ら、Science（1987）23:1566〜1568）ことが示されている。PTHは、腎臓および骨系においてアデニル酸シクラーゼを刺激し、尿細管におけるカルシウムの再吸収を増加させ、腎臓でのリン酸の取り込みを低減させ、1α-水酸化酵素を刺激することが示されている。従って、PTH-rpが循環している場合、PTH-rpのPTH様作用の阻害剤が、腎臓の尿細管における尿から血液へのカルシウム再吸収および全身系の骨吸収を含む生物学的事象を阻害すると考えられる。しかし、破骨細胞にはPTH/PTH-rp受容体は見出されない。これらの受容体はいずれも、特性決定が困難であり、またはPTH-rpが破骨細胞に及ぼす影響の程度を明らかにすることが困難であり、その作用は、例えば骨芽細胞（PTH/PTH-rp受容体を有することが知られている）から未知の伝達物質が分泌されることなどによる、ある未知の機構によって発揮されるのかもしれない。PTH-rpと破骨細胞を介した骨吸収とを関連づける証拠は得られていない。
PTH-rpは、「マレッテ（Mallette）,L.E.Endocrine Rev（1991）12:110〜117」の概説に要約されているように胎盤のカルシウム輸送を制御するなど、PTHにはない性質も有している。本明細書において、本発明と特に関連することとして、PTH-rpは乳癌での骨転移の定着にも関与している（ポーウェル（Powell）,G.J.Cancer Res（1991）51:3059〜3061;サウスバイ（Southby）,J.ら、Cancer Res（1990）50:7710〜7716）。これらの開示で提供されるデータは、単にPTH-rpと乳癌の骨転移との関連性を示すものであり、因果関係を意味するものではない。PTH-rpは、限られた数の腫瘍に対する可能な自己分泌因子としてみなされてきた（バートン（Burton）,P.B.J.ら、Biochem Biophys Res Com（1990）167:1134〜1138;リー（Li）,X.ら、Cancer Res（1993）53:2980〜2986）。
従って、原発性癌の作用の媒介におけるPTH-rpの正確な役割はよく理解されていない。この状態の進行に関与するさらなる因子が存在するだけでなく、PTH-rpの産生は、プロラクチン、糖質コルチコイド、上皮増殖因子、TGF-α、TGF-β、エストロゲン、「ストレッチ（stretch）」、および細胞外カルシウム濃度などの因子によって影響されると信じられている。新たに追加される因子の存在はとりわけ重要であり、この機構をより不明瞭にするものである。特に、IL-1、IL-6、IL-11、M-CSF、およびGM-CSFなどの因子は骨吸収に重要とみなされてきた。「ササキ（Sasaki）,A.ら、J Bone Min Res（1994）9増刊1:S 294,B 257」による報告では、ヌードマウスの頭蓋冠にヒトIL-1α組換え体を投与することにより、左心室に接種した癌細胞の転移が引き起こされたが、IL-1αを投与しなかった同動物の他の骨では癌転移は見られなかった。「ギレス（Gilles）,J.ら、同書S 337,B 433」は、IL-6が骨吸収因子の破骨細胞による骨吸収に対する作用を著しく増強すること、骨でのIL-6産生は、サイトカインを介した骨吸収においても、エストロゲン関連性骨喪失、骨髄腫、およびパジェット病などのサイトカインを介した骨吸収が関与している可能性のある病状においても、重要であることを示唆している。IL-6遺伝子のノックアウトにより改変されたトランスジェニックマウスでは骨粗鬆症のモデルにおいて骨喪失が減少することも示されてきた。破骨細胞はIL-6およびIL-11に対する受容体を有することが確認されている。M-CSFおよびGM-CSFで処理した破骨細胞は、培養中に成熟が促進される。M-CSF遺伝子が遺伝的に欠損しているトランスジェニックマウスも骨粗鬆症に擬した状態を示し、この状態はM-CSFを注射することにより治療されうる。このように、局所的な骨吸収および／または破骨細胞の活性化に主要な役割を果たしていると考えられる多数の因子が知られている。
「サトウ（Sato）,Kら、.J Bone Min Res（1993）8:849-860」では、PTH-rpのアミノ酸配列1〜34位に相当するペプチドを注射したマウスの不死化した脾臓細胞から得られるマウスモノクローナル抗体を羅患マウスに投与するという、HHMのマウスモデルで得られた結果について記述している。受動免疫により、ヒトのPTH-rp産生腫瘍を移植された高カルシウム血症のヌードマウスにおいて血清カルシウム濃度が減少した。HHMのモデルを提供するため、これらの腫瘍は非骨組織に移植された。筆者らは、この抗体がヒトでも得られるなら、それをPTH-rpによる悪性腫瘍関連性の高カルシウム血症の治療に使用しうることを示唆している（該論文でサトウ（Sato）,K.らは「悪性腫瘍関連性の高カルシウム血症」という用語を使用しているが、それはHHMと同義である）。このモデルでは、血中で高濃度のPTH-rpが維持されているが、それが抗PTH-rp抗体の投与により明らかに低下する。同様の研究が「ククレジャ（Kukreja）,S.C.J Clin Invest（1988）82:1798-1802」により行われ、HHMのヒト腫瘍モデルにおいてポリクローナル抗PTH-rp抗体が高カルシウム血症を抑制することが示された。これはHHMに対する抗PTH-rpの治療的効果についての最初の開示である。このモデルの信憑性は、高カルシウム血症の乳癌患者147人の内15％が骨転移を示さないという「タシュジアン（Tashjian）,A.H.ら、J Exp Med（1964）119:467」の発見により立証される。
高カルシウム血症は破骨細胞が介在する骨溶解によっても引き起こされうる。「ムンディ（Mundy）,G.R.J Clin Invest（1988）82:1-6」には、乳癌転移の周辺領域において破骨細胞による骨吸収が増加したことが記述されている。さらに、乳癌細胞はインビトロで直接的に骨を吸収することが示されている（エイロン（Eilon）,G.&ムンディ（Mundy）G.R.,Nature（1978）276:726-728）。
「コオノ（Kohno）,N.ら、Surgery Today,Japan J Surg（1993）4:215-220」では、PTH-rpの最初の34アミノ酸をマウスに免疫することにより調製された抗PTH-rp抗体を用いて、外科的に切除した乳癌の不死化した切片について行った研究が報告された。該抗体は腫瘍の57％に結合し、骨格の転移を起こした患者に由来する腫瘍の83％に結合したが、肺の転移を起こした患者、または全く転移していない患者では腫瘍の38％にしか結合しなかった。著者らは、これらの結果がPTH-rp陽性腫瘍が骨に対して親和性を有することを示唆するものであると結論づけている。しかし、この観察は単に抗PTH-rpによる癌組織の染色に関するものであり、定量的なものではない。従って、上記結果は、PTH-rpの存在と、骨転移の促進または増殖エンハンサーとの因果関係を示すものではない。同様に、PTH-rpは、転移、癌の増殖および／または骨溶解の原因ではなく結果であるということも考えられる。本発明者らは、転移した癌細胞の骨に対する局所的な作用のための有効な治療を開発するため動物モデルを用い、それにより本発明を成し遂げた。
発明の概要
本発明は、転移癌細胞の骨に対する局所的な作用の治療を提供するいくつかの面を含む。治療は、一つもしくは複数の単独の抗体、または一つもしくは複数のビスホスホン酸塩を組み合わせた一つもしくは複数の抗体と、担体とを含む、治療に有効な量の、薬学的に許容される製剤を投与することにより行われる。
特異的な局所的な効果が得られる。すなわち、骨への癌転移を予防でき、骨に存在する癌細胞の増殖を抑制でき、骨溶解作用を予防および治療できる。さらに、骨での局所的な現象に伴う転移、増殖、および骨溶解の二次作用が軽減される。
担体は、好ましくは、薬学的に許容される注射可能な担体である。抗体は、PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25-ジヒドロキシビタミンD3からなる群より選択される化合物に対して免疫応答性があり、結合する。PTHrpに対する抗体が好ましく、望ましくは、単独の抗PTHrp、または一つまたは複数のビスホスホン酸塩を組み合わせた抗PTHrpを含む注射可能な製剤として注射により投与される。
PTHrpに対する抗体は、好ましくは、注射可能な製剤であり、静脈注射により投与される。製剤は、ビスホスホン酸塩と同時投与してもよいし、またはビスホスホン酸塩と共に製剤化して、投与してもよい。有用なビスホスホン酸塩には、エチドロン酸（etidronate）、パミドロン酸（pamidronate）、リセドロン酸（risedronate）、ピロリン酸、クロドロン酸（clodronate）、チルドロン酸（tiludronate）、アレンドロン酸（alendronate）、BM21.0955、YM-175、CGP42446、およびそれらの薬学的に許容される塩、水和物および部分水和物が含まれる。抗体の作用機序がビスホスホン酸塩とは異なるため、上述したタイプの抗体とビスホスホン酸塩とを組み合わせることにより、転移癌細胞の骨に対する局所作用の治療において、相乗的な結果を得ることが可能である。
パミドロン酸二ナトリウムなどのビスホスホン酸塩は、アミノ置換したビスホスホン酸塩化合物である。これらの化合物は、ハイドロキシアパタイト結晶の表面に、好ましくは骨の代謝回転が早い領域に、カルシウムをすばやく化学結合させ、それにより鉱化基質の溶解度を下げ、破骨細胞の再吸収をより困難にさせる。再吸収の初期に、予め結合させたパミドロン酸塩が基質表面から高い局所濃度で放出されると、破骨細胞前駆体は鉱化基質へ付着できない。従って、前駆体から成熟した機能的な破骨細胞への形質転換および骨基質の溶解が抑制される。
他の面では、本発明は、骨への癌細胞の転移によってもたらされる骨溶解を抑制する方法、および／または骨への癌転移を予防する方法、および／または転移癌細胞、もしくは骨を起源とする癌細胞の骨内、または骨上での増殖を抑制する方法に関し、該方法は治療に有効な量の特異的抗体（例えば、抗PTH-rp）を単独で、もしくはビスホスホン酸塩と組み合わせて、治療の必要がある患者に投与することを含む。
上述した一次標的の攻撃における本発明の方法の他の効果は、二次的な総体的症状の改善である。これらには、疼痛、対麻痺または麻痺をもたらす神経圧縮、高カルシウム血症、病的骨折の危険性、悪液質、および生存予後の減少が含まれる。
さらなる他の面として、本発明は、本発明の方法において有用な組成物、および本発明の治療法が有効な患者を同定し治療する方法、ならびに本発明の方法に有用な抗体を得るための方法に関する。
上記に基づいて、本発明の第一の目的は、骨への癌細胞転移によりもたらされる骨溶解を局所的に抑制することができる局所治療の方法において有用な、薬学的に活性のある製剤を提供することである。PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25-ジヒドロキシビタミンD3、ならびにそれらの抗原性断片からなる群より選択される化合物に対して免疫応答性を有する抗体、抗PTH-rpを、単独でまたはビスホスホン酸塩と組み合わせて含む、治療に有効な量の注射可能な製剤の投与により行われる。
本発明の他の目的は、タンパク質の抗体のみ、またはビスホスホン酸塩と組み合わせたタンパク質の抗体と、薬学的に許容される注射可能な担体とを含む、骨への癌転移を予防するための、好ましくは注射可能な形態の製剤を提供することである。
本発明の他の目的は、タンパク質の抗体のみ、またはビスホスホン酸塩と組み合わせたタンパク質の抗体と、薬学的に許容される注射可能な担体とを含む、骨に存在する癌細胞の増殖を阻止するための、好ましくは注射可能な形態の製剤を提供することである。
本発明の他の目的は、骨溶解を予防するため、タンパク質の抗体のみ、またはビスホスホン酸塩と組み合わせたタンパク質の抗体と、薬学的に許容される注射可能な担体とを含む、好ましくは注射可能な形態の製剤を提供することである。
本発明の特徴は、タンパク質の抗体およびビスホスホン酸塩が、特に従来の抗癌化合物と比べて、比較的無毒性であることである。
本発明の利点は、転移によってもたらされる骨溶解を抑制する局所作用が予想外に相加的なものであること、すなわちタンパク質の抗体の作用がビスホスホン酸塩の作用に対して相加的であり、そのことにより異なる作用機序による外科的効果を提供することである。
本明細書の一部をなす添付の図面を参照しながら、以下により十分に記載されている、これらの製剤および治療プロトコルの詳細を読めば、本発明の上記ならびに他の目的、利点、および特徴が、当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
図1は、腫瘍保持マウスにおける血清カルシウムレベルに対するPTH-rp特異的モノクローナル抗体の効果を示すグラフである。
図2は、臓器培養モデルでのPTH-rp、PTH、IL-1、または1,25ジヒドロキシビタミンD3により刺激された骨吸収における、カルシウム放出に対するPTH-rp特異的モノクローナル抗体の効果を示すグラフである。
図3は、腫瘍保持マウスにおける、Ｘ線診断により骨傷害と関連していることが示された領域全体に対する、抗PTH-rp抗体の投与の効果を示すグラフである。
図4は、実施例3に記載する実験プロトコルの結果を示すグラフである。
図5は、刺激されたマウス骨髄に対するPTH-rp抗体の効果を示すグラフである。
図6は、免疫グロブリンの一般的な構造を示す。
図7は、対照マウスおよび実施例5による動物におけるPTH-rp濃度を示すグラフである。
好ましい態様の詳細
癌細胞の転移によってもたらされる骨溶解を抑制する本方法、およびそれに用いる製剤を記載する前に、本発明が、記載された特定の抗体、ビスホスホン酸塩、または製剤および方法に限定されるものでなく、もちろん変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語が、特定の態様のみを記載するためのものではなく、本発明の範囲の制限するためのものでもなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
本明細書で特に明示しない限り、本明細書および添付の請求の範囲で使用される単数形「a」、「an」、および「the」には複数形も含まれることに留意すべきである。従って、例えば「ビスホスホン酸塩」という記載にはビスホスホン酸塩の混合物、および複数個の特定のビスホスホン酸塩分子が含まれ、「抗体」という記載には複数の抗体が含まれ、「方法」という記載には、本開示を読めば当業者に明らかになるであろう、本発明を実施する際に有用な一つまたは複数の方法が含まれる。
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本発明を実施、または試験する際に、本明細書で記載する方法および材料と類似の、または等価なあるゆる方法および材料を使用できるが、以下に好ましい方法および材料について記載する。本明細書に記載される全ての刊行物は、引用された刊行物が関連する材料を開示、説明するために参照文献として本明細書に組み入れられる。
定義
本明細書で用いられるように、「抗PTH-rp」という用語は、PTH-rpに対して免疫応答性を有する抗体、ならびに当技術分野において既知の抗体の類似体、置換体、および断片を指す。抗PTH-rpはまた、免疫特異的、即ちPTHなどの関連物質と実質的に交差反応しないことが望ましい。しかし、抗PTH-rpは、PTH-rp自体に対して免疫応答性を有する限り、本発明の方法において有効である。全ての本発明の方法および組成物には、PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3またはそれらの抗原性断片からなる群より選択される化合物に対して免疫応答性および免疫特異性を有し、従って該化合物に特異的、選択的に結合する物質が使用される。例えば、PTH-rpに対して免疫応答性を有する物質は一般的に「抗PTH-rp」と呼ばれ、TGFαに免疫応答性を有する化合物は一般的に「抗TGFα」と呼ばれる。PTH-rpに対して免疫応答性および免疫特異性を有する化合物が好ましい。
「精製された抗体」とは、天然では共存している他のタンパク質、炭水化物、および脂質をほとんど含まないものを意味する。このような抗体は、PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3（またはそれらの抗原性断片）からなる群より選択される化合物に「選択的に結合する」。すなわち、抗原性に関与しない他の分子を実質的に認識し、結合することはない。本発明の精製された抗体は、好ましくはPTHrp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3（またはそれらの抗原性断片）からなる群より選択される化合物に対して免疫応答性および免疫特異性を有する。
PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3からなる群より選択される化合物の「抗原性断片」とは、該化合物またはその断片を哺乳動物に免疫することにより産生される抗体に結合できる化合物の一部分を意味する。好ましくは、単離された抗原性断片のエピトープに特異的に結合する抗体は、該断片が由来する元のタンパク質においても同じエピトープに結合するであろう。
「抗体」とは、抗原に結合できる免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明細書において用いられるように、抗体には、目的の抗原または抗原性断片に結合できる抗体断片（例えばF（ab’）2、Fab’、Fab）が含まれるものとする。
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書において、CDRがヒト以外の起源に由来し、Ig分子またはその断片の残りの部分が、好ましくはヒト抗体をコードする核酸配列から産生されるヒト抗体に由来する、完全な抗体分子（すなわち、二つの完全な軽鎖と二つの完全な重鎖から構成される）、および抗体断片のみから構成される抗体（例えば、Fab、Fab’、F（ab’）2、およびFv）を記載するために用いられる。
本明細書において「ヒト抗体」という用語は、抗体分子の全部分がヒト抗体をコードする核酸配列に由来する抗体を記載するために使用される。このようなヒト抗体は、ヒトの患者で免疫応答をほとんど、または全く誘発しないため、抗体治療における使用に最も好ましい。
本明細書において「キメラ抗体」という用語は、「ヒト化抗体」という用語の定義で上述したように、抗体分子および抗体断片を記載するために使用される。「キメラ抗体」という用語はヒト化抗体を包含するものである。キメラ抗体は、第一の哺乳動物の種に由来する少なくとも重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の少なくとも一部、および第二の異なる哺乳動物の種に由来する重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の他の部分を有する。好ましくは、可変領域はヒト以外の哺乳動物種に由来し、定常領域はヒト種に由来する。特に、キメラ抗体は、好ましくは可変領域をコードするヒト以外の哺乳動物に由来するヌクレオチド配列、および抗体の定常領域をコードするヒト由来のヌクレオチド配列から産生される。
「特異的に結合する」とは、抗体が特異的なポリペプチドに対して高結合活性および／または高親和性で結合することを意味する。この特異的ポリペプチド上のエピトープに対する抗体の結合は、あらゆるエピトープ、特に目的の特異的ポリペプチドの分子中、または該ポリペプチドと同じ試料中に存在するエピトープに対する同抗体の結合よりも強力である。目的のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、微弱ではあるが検出できるレベルで（例えば、目的のポリペプチドに対して示される結合の10％以下）、他のポリペプチドに結合しうる。このような弱い結合、すなわちバックグラウンド結合は、例えば適当な対照を設けることにより、目的の化合物またはポリペプチドに結合する特異的抗体と容易に区別できる。
「検出可能に標識された抗体」、「検出可能に標識された抗PTHrp」、または「検出可能に標識された抗PTHrp断片」とは、検出可能な標識を結合させた抗体（または結合特異性を保持する抗体断片）を意味する。検出可能な標識は、通常化学結合により結合させるが、標識がポリペプチドである場合、かわりに遺伝子工学技術によって結合させることもできる。検出可能に標識されたタンパク質を製造する方法は、当技術分野では周知である。検出可能な標識は、当技術分野で既知の種々の標識から選択することができるが、通常は放射性同位元素、発蛍光団、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシターゼ）、または検出可能なシグナル（例えば、放射性活性、蛍光、色素）を発するか、もしくは基質に標識を露出した後に検出可能なシグナルを発する他の物質または化合物である。様々な検出可能な標識／基質の組み合わせ（例えば、西洋ワサビペルオキシターゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識する方法、および抗原（PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3からなる群より選択される化合物など）を検出するために標識された抗体を用いる方法は、当技術分野では周知のものである（例えば、ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）編、「抗体：実験の手引き（Antibodies：A Laboratory Manual）、1988年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州」参照）。
本明細書で用いる「治療（treatment）」、「治療すること（treating）」等の用語は、一般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、病気やその徴候を完全に、もしくは部分的に予防するという意味で予防的なものであり、ならびに／または病気および／または該病気が原因の有害な作用を部分的もしくは完全に治療するという意味で治療的なものである。本明細書で用いる「治療（treatment）」には、哺乳動物、特にヒトにおける病気のあらゆる治療が包含され、（a）病気の素因があるが、まだ病気とは診断されていない患者での病気を予防すること、（b）病気を抑制すること、即ちその進行を阻止すること、または（c）病気を回復すること、即ち病状の緩解をもたらすこと、が含まれる。本発明は、癌患者の治療、特に局所的な骨への癌細胞転移を治療することに関する。即ち、一つまたは複数の特異的部位での癌細胞転移を予防、抑制、または回復させることに関する。症状の治療において、本発明は、神経圧迫、高カルシウム血症、寿命の短縮、病的骨折、および悪液質の治療に関する。治療とは、特に扁平上皮癌細胞、腺癌細胞、黒色腫細胞、骨肉腫細胞、神経芽腫細胞、または血液系癌細胞からなる群より選択される癌細胞の転移を治療することに関する。より具体的には、「治療」は、骨への癌転移および骨での癌細胞増殖、ならびに骨溶解およびその症候的な続発症を患う患者に対して、治療上検出可能で有益な効果を提供することを目的とする。
さらに具体的には、「治療」とは、（1）PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3、ならびにそれらの抗原性断片からなる群より選択される化合物が骨に局所的に産生されることにより、特に副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrp）が骨に局所的に産生されることにより媒介される骨溶解を予防、改善、ならびに／または抑制することを意味する。特定の治療では、PTHrpが骨に局所的に産生されることにより媒介される異常な骨溶解を予防、または抑制することを目的とする。治療には、骨へ癌細胞が転移することにより引き起こされる、および／または骨へ癌細胞が転移することに関する骨吸収を予防または抑制することが含まれる。
本明細書において、「共力的な」、「共力作用」等の用語は、一つまたは複数の抗体と一つまたは複数のビスホスホン酸塩とを組み合わせることにより高い治療効果が得られることを意味する。ある分野では、共力作用とは相加性以上の作用（例えば1+1=3）を意味するが、癌治療の分野においては、相加性（1+1=2）、または相加性以下の作用（1+1=1.6）を共力作用ということができる。例えば、二つの薬物を個別に投与すると、それぞれが癌細胞の増殖を50％抑制する場合、二つの薬物を組み合わせ完全に腫瘍の増殖を停止させることは期待できない。多くの場合、副作用が許容範囲を超えるため、二つの薬物をともに投与することはできない。薬物を同時に投与すると、お互いに中和し、腫瘍の増殖の抑制が50％未満になることもある。従って、二つの薬物が、いずれかの薬物を単独に投与する場合よりも腫瘍の増殖を抑制し（好ましくはいずれかの薬物を単独に投与する場合と比較して50％以上増殖を減少させる）、副作用、例えば毒性が許容範囲を越えて増加することがないのなら、共力作用が得られていると言える。
「治療指数」という用語は、LD50/ED50として定義される化合物の治療指数を指す。LD50（致死量、50％）は、被験動物の50％が死亡する化合物量として定義され、ED50は個体の50％に有効な化合物量として定義される。単一に近い治療指数を有する（即ち、LD50/ED50がほぼ1に等しい）化合物は、毒性レベルに極めて近い用量で所望の効果に達し、該化合物は狭い治療域（therapeutic window）を有する。即ち投与可能な用量の範囲が狭い。
抗体の製造
PTH-rp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3またはそれらの抗原性断片からなる群より選択される化合物に特異的に結合するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体は、当技術分野では既知の通常の方法に従って作製することができる（例えば、ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、1988年、「抗体：実験の手引き（Antibodies：A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州」；シュライアー（Schrier）ら、1980年、「ハイブリドーマ技術（Hybridoma Techniques）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州、参照）。具体的には、本発明に用いられる抗体を製造するためには、スペロース（Superose）-12ゲル濾過によりPTHrpを単離し、単離された化合物をフロイント完全アジュバンドと組み合わせてニュージーランド・アルビノ・ウサギに注射する。21日おきにフロイント不完全アジュバントを加えたタンパク質を動物に追加注射する。3度目の追加免疫後、血清試料を採取し、通常のドットブロット検定を用いて抗体を検出する。ニトロセルロース上での段階希釈により、抗体価を決定する。プロブロット（Problot）（Promega）系を用いて、抗体の結合を検出する。
当技術分野において既知の抗体の類似体、断片および置換体の例には、Fab断片、Fab’断片、およびF（ab’）2断片などの断片、ならびに軽鎖および重鎖の可変領域をコードする遺伝子を組み換えにより融合することにより得られるFv断片と呼ばれる一本鎖の形態も含まれる。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであっても良く、抗原の投与に応答して産生される未改変の抗体であってもよい。または組み換え技術が利用できるため、これらの抗体を改変することも可能である。例えば、異なる種に由来するアミノ酸配列の領域を含むキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、および抗原の特異性を変えずに他の生物種に類似するように変えられた、ある生物種により産生される改変型の抗体も抗PTH-rpに含まれる。本発明の抗PTH-rpの特に好ましい態様には、ヒト抗体が産生されるように免疫系が改変されたトランスジェニックマウスへのPTH-rp投与に応答して産生されるヒト抗体が含まれる。
抗PTH-rpは様々な方法で調製されうる。一つの方法としては、免疫原に対して免疫応答できる脊椎動物に、PTH-rpまたはそのサブユニットなどの適当な免疫原を投与することである。PTH-rpの特に好ましいサブユニットには、N末領域、特に1〜34位が含まれる。免疫原として用いられるPTH-rpまたはサブユニットには、抗体を作製したい特定の種のPTH-rpに特徴的なエピトープが含まれる。免疫した動物から採取された適当なポリクローナル抗血清を使用してもよい。しかし、再生産が可能であり、容易に調製できるモノクローナル調製物を得ることが望ましい。免疫した動物の抗体産生細胞を不死化し、適当な免疫応答性をスクリーニングすることにより、該モノクローナル調製物を得ることができる。免疫特異性は、PTHなどの密接に関連する物質と交差反応性を有する抗体を分泌するこれらのハイブリドーマをスクリーニングすることによっても確認できる。
得られる抗体をそれ自体で使用してもよいし、またはそれらの抗体の断片から、標準的なタンパク質分解技術を用いて、Fab断片、Fab’断片、および（Fab’）2断片を調製してもよい。または抗体の特徴を改変するため、抗体をコードする遺伝子を、例えばハイブリドーマから単離し、操作してもよい。単離した遺伝子を用いて、単一のペプチドユニットで共有結合された軽鎖および重鎖の可変領域を含むFvユニットを構築することができる。
キメラ抗体
キメラ抗体は、第一の哺乳動物種に対応するアミノ酸配列（可変領域）と、他の哺乳動物種に対応する残りの分節のアミノ酸鎖（定常領域）とを備えた重鎖または軽鎖の一部を有する抗体である。典型的には、キメラ抗体には、第一の哺乳動物種（一般的にはヒト以外）に由来する重鎖および軽鎖の両方の可変領域と、他の哺乳動物種（一般的にはヒト）の配列に対応する定常領域とが含まれる。
可変領域（目的の抗原に特異的に結合する）は、接種済みのウサギなどの安価な起源から簡便に得ることができ、容易に入手できるハイブリドーマを用いて再生産できるため、キメラ抗体を製造することが望ましい。これらの可変領域を、ヒトの細胞系に由来する定常領域に連結できる。得られるキメラ抗体の利点は、目的の生物起源を用いて所望の特異性を有するように容易に、かつ安価に調製される可変領域を有する一方で、抗体をヒトに投与してもヒトの患者からはほとんど免疫応答を誘発しないヒト起源の定常領域を保持するという点である。
図6は免疫グロブリビンの一般的な構造を示す図である。構造単位には、約23,000ダルトンの分子量を有する二つの同一のポリペプチド軽鎖と、分子量が53,000〜70,000の範囲にある二つの同一の重鎖とが含まれる。四つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Y」字型に連結される。この「Y」字型においては、「Y」の口から分岐領域まで重鎖に軽鎖が重なっている。「枝部」をFab領域と呼ぶ。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それらはいくつかのサブクラスを備えている。重鎖の性質により、IgG、IgM、IgA、IgBまたはIgEという抗体の「クラス」が決定される。
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。各々の重鎖は、カッパまたはラムダの軽鎖と共に調製される。免疫グロブリンがハイブリドーマまたはB細胞のいずれかによって産生される際、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、二つの重鎖の「尾」部はジスルフィド共有結合により互いに結合される。図6を参照すると、キメラ抗体においては、「可変領域」と表記された白色の領域が第一の動物起源に由来し、「定常領域」と表記された灰色の領域が第二の異なる動物起源、好ましくはヒトに由来する。
本発明のキメラ抗体は、上記の図6で示された抗体の一般的な構造、ならびに上記のキメラ抗体の一般的な構造および特徴を参照することにより理解される。キメラ抗体は、多数の異なる経路により作製されうる。キメラ抗体は、最初に化学合成法により製造された。キメラ抗体の化学合成法は、ボブルゼッカ（Bobrzecka）ら「ボブルゼッカ（Bobrzecka）,K.,コニーシズニー（Konieczny）,L.,レイドラー（Laidler）,P.,およびリバルスカ（Rybarska）,J.,1980.Immunology Letters.2:151〜155」、およびコニーシズニー（Konieczny）ら「コニーシズニー（Konieczny）,L.,ボブルゼッカ（Bobrzecka）,K.,レイドラー（Laidler）,P.,およびリバルスカ（Rybarska）,J.,1981.Haematologia.14:95〜99」（合わせて、「リバルスカの論文」）に開示されている。上記の論文で、可変領域をウサギなどの動物で簡便に、かつ安価に製造し、ヒト起源から得られる定常領域に結合する、望ましいキメラ抗体を作製する一般概念が開示された。得られるキメラをヒトに投与しても、免疫応答が生じる可能性は低い。
キメラ抗体に応用しうる基本的なキメラタンパク質の作製技術は、早くも1987年には知られていた（イタクラ（Itakura）らの1987年11月3日に発行された米国特許第4,704,362号を参照）。イタクラらの技術をキメラ抗体の製造に応用する具体例は、キャビリー（Cabilly）らの1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に記載されている。
ヒトおよび多くの動物起源に由来する抗体の可変領域および定常領域の両方を含むDNA配列が公開されている。現在では、特定の抗体をコードする遺伝物質を単離することは比較的一般的な手段である。この技術を用いて、PTH-rpに対して免疫応答性および免疫特異性を有するウサギ産生抗体の可変領域をコードする遺伝物質を単離できる。このDNA配列を、ヒト抗体の定常領域をコードするDNA配列に連結できる。構築物は、適当なベクター内に挿入され、適当な宿主細胞に導入される。宿主細胞はヒトの細胞であっても良く、培養しても、または個体に直接導入しても良い。いずれの場合でも、形質転換細胞は、PTH-rpに結合するキメラ抗体を産生すると考えられる。同様に、可変領域がPTH-rp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、および1,25ジヒドロキシビタミンD3またはそれらの抗原性断片のいずれかに結合する、他のキメラ抗体を製造できる。得られるキメラ抗体をヒトに投与しても、その抗体により免疫応答が引き起こされることはなく、骨への癌転移および癌細胞の増殖、ならびに骨溶解およびその症候的な続発症の治療に有用である。
ヒト化抗体
非ヒト抗体およびヒト／非ヒトキメラ抗体はいずれも、ヒトに投与すると免疫応答を誘発する（即ち、抗原性である）。「ヒト化抗体」は、ヒトに投与される抗体の抗原性を回避する一方で、非ヒト抗体の抗原特異性を保持するように開発された。
ヒト化抗体は、1）抗体に所望の抗原特異性を与える非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）の相補性決定領域（CDR）の全てまたは一部、2）ヒト抗体の可変領域に由来するフレームワーク領域（FR）、および3）ヒト抗体に由来する定常領域を含む、遺伝子工学により作出された免疫グロブリン（Ig）分子である。従って、CDRのみが非ヒトの起源に由来し、抗体の他の全ての部分はヒト抗体に由来する。このようなヒト化抗体の技術では、動物を使用して所望の抗原特異性を有する抗体を得、次に遺伝子工学技術が用いて、非ヒト抗体の抗原特異性を有し、非ヒト抗体の抗原性はもたない抗体を製造する。本明細書で使用されるように、「ヒト化抗体」には、CDRが非ヒトの起源に由来し、Ig分子またはその断片の残部がヒト抗体に由来する、完全な抗体分子（即ち、二つの完全な軽鎖および二つの完全な重鎖から構成される）、ならびに抗体断片（例えば、Fab、Fab’、F（ab’）2、およびFv）が含まれる。
ヒト化抗体は、当技術分野では既知の方法に従って調製されうる（ジョーンズ（Jones）ら、1986 Nature 321:522;リーッヒマン（Riechmann）ら、1988 Nature 332:323;ベルホイエン（Verhoeyen）ら、1988 Science 239:1534;プレスタ（Presta）ら、1992 Curr Opin Struc Biol 2:593；米国特許第5,225,539号；国際公開第91/09968号（WO91/09968））。ヒト化抗体のCDRが最終的に抗原と接触し、抗原特異性を決定するが、CDRの結合活性はCDRをはさむフレームワーク残基（FR）により制御される。CDRによる標的抗原の結合を変えるために、FRを改変する様々な技術的方法が、例えば「ジョリッフェ（Jolliffe）ら、1993 Intern Rev.Immunol 10:241」、「ユングハンズ（Junghans）ら、1990 Cancer Res 50:1495」、「リーッヒマン（Riechmann）ら、1988 Nature 332:323」、「シム（Sim）ら、1993 J Immunol 151:2296」、「チョシア（Chothia）ら、1987 J Mol Biol 196:901」、「カーター（Carter）ら、1992 Proc Natl Acad Sci USA 89:4285」および「プレスタ（Presta）ら、1993 J Immunol 151:2623」に記載されている。所望の核酸配列（目的とする非ヒト抗体部分およびヒト抗体部分をコードする配列など）を単離し、操作する方法、およびインビトロで組換え抗体を発現する方法は、当技術分野では周知のものである（例えば、サムブルック（Sambrook）ら、1989年、分子クローニング：実験手引き（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州；カビリー（Cabilly）ら、米国特許第4,816,567号；モリソン（Morrison）ら、1984 Proc Natl Acad Sci USA 81:6851）。
ヒト抗体
本明細書で用いられるように、「ヒト抗体」とは、抗体分子の全部分がヒト抗体をコードする核酸配列に由来する抗体を意味する。このようなヒト抗体は、ヒトの患者において免疫応答をほとんどまたは全く誘発しないため、抗体治療における使用に最も望ましい。
ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて調製されうる。例えば、ヒト抗体を発現するヒトハイブリドーマは、目的の抗原特異性を有する抗体を発現するヒトB細胞と、ヒト骨髄腫またはキメラ（即ち、ヒト／非ヒト）のヘテロ骨髄腫とを融合することにより作製できる。ヒトのハイブリドーマ細胞系の製造方法は、当技術分野では周知のものである（例えば、コズボー（Kozbor）ら、1984 J Immunol 147:86；ボルヂュール（Bordeur）ら、1987年、「モノクローナル抗体製造の技術および応用（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications）」、マルセル・デッカー社（Marcel Dekker,Inc.）、ニューヨーク、ニューヨーク州、51〜63頁）。
好ましいヒト抗体の製造方法では、ヒトのIg遺伝子を発現するトランスジェニック動物が使用される。マウスが、一般的に選択される宿主動物である。このようなヒト抗体を産生するトランスジェニック動物は、まず宿主動物の内生Ig遺伝子を不活化し、次に宿主動物の生殖系DNAに目的のヒトIg遺伝子（例えば、組み合わされた際に目的の特異性を有するヒト抗体を提供する、抗体の重鎖および抗体の軽鎖をコードするヒトの遺伝子）を導入するという技術の組み合わせを用いることにより作出される。免疫応答を誘発するため、導入遺伝子によってコードされるヒト抗体が特異的に結合する抗原をトランスジェニック動物に免疫することにより、目的のヒト抗体を発現するB細胞の分化および成熟が促進される。ハイブリドーマ細胞系は、当技術分野では周知の方法を用いてトランスジェニック宿主動物から作出される（例えば、コーラー（Kohler）ら、1975,Nature,256:495；グリーン（Green）ら、1994,Nature Genetics 7:13；クッチャーラパティ（Kucherlapati）ら、国際公開第94/02602号（WO94/02602）；ニシ（Nishi）、1995年6月、日経サイエンス、?巻、40頁；およびカペッチ（Cappechi）、1994年5月、日経サイエンス、?巻、52頁）。
さらに、ヒト抗体および／またはその断片を製造するための他の方法では、例えば「マックカフェルティー（McCafferty）ら、1990 Nature 348:552」、「ジョンソン（Johnson）ら、1993 Curr Opin Struc Biol 3:564」、「クラックソン（Clackson）ら、1991 Nature 352:624」、「マークス（Marks）ら、1991 J Mol Biol 222:581」、「グリフィス（Griffith）ら、1993 EMBO J 12:725」、「マークス（Marks）ら、1992 Bio-Technol 10:779」、「ウオーターハウス（Waterhouse）ら、1993 Nucl Acids Res 21:2265」、国際公開第93/06213号公報（WO93/06213）に記載されるようなファージ・ディスプレイ技術が用いられる。
ビスホスホン酸塩
本発明に関連して用いられるビスホスホン酸塩化合物は、以下の一般構造式を有する。
0004231106.tif 000002
式中、Ｘはリン酸基を連結する結合基である。有用なビスホスホン酸塩には、これらの薬学的に許容される塩、水和物、ならびに複合水和物および部分水和物（例えば、二水和物、ヘミ水和物）が含まれる。
好ましいビスホスホン酸塩は、式中のＸが-O-および式
0004231106.tif 000003
［式中、R1、R2はH、OH、Cl、NH2、S、チオフェニル（該フェニル環はCl、OH、およびHN2からなる群より選択される置換基で置換されていてもよい）、1から12個の炭素原子を含むアルキル基、1から12個の炭素を含む置換アルキル基（該置換基はO、S、NH2、N、および1から12個の炭素原子を含むN-アルキル基からなる群より選択される）、1から12個の炭素原子を含み、かついずれの炭素原子もCl、OH、およびNH2からなる群より選択される置換基で置換されていてもよい環状化合物、ならびに1から12個の炭素原子を含み、かついずれの炭素原子もCl、OH、およびNH2からなる群より選択される置換基で置換されていてもよい複素環式化合物（該ヘテロ原子はO、N、Sからなる群より選択される）からなる群よりそれぞれ独立に選択される。］からなる群より選択される。
より好ましいビスホスホン酸塩には、Ｘが-O-および式
0004231106.tif 000004
からなる群より選択されるものが含まれる。
特に好ましいビスホスホン酸塩は、治療に有効な量の、PTHrp、TGFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、リンホトキシン、TNF、PGE、1,25-ジヒドロキシビタミンD3およびそれらの抗原性断片からなる群より選択される化合物に対して免疫応答性および免疫特異性を有する抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含有する、注射可能な薬学的製剤中に含まれる、
0004231106.tif 000005
である。有用なビスホスホン酸塩には、エチドロン酸（etidronate）、パミドロン酸（pamidronate）、リセドロン酸（risedronate）、ピロリン酸、クロドロン酸（clodronate）、チルドロン酸（tiludronate）、アレンドロン酸（alendronate）、BM 21.0955、YM-175、CGP42446、およびそれらの薬学的に許容される塩、水和物および部分水和物が含まれる。
製剤−一般
適当な抗体または抗PTH-rpの他の形態は、該物質を投与するための慣習的な投与方法で製剤化される。典型的な製剤は、「レミントンの薬剤学（Remington’sPharmaceutical Sciences）、最新版、マック出版社（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア州」に記載されているものである。好ましくは、抗PTH-rpは、筋肉注射、静脈注射（IV）、皮下注射、腹膜注射を含む注射、最も好ましくは静脈注射、局所注射により投与される。しかし、坐薬、皮膚貼付剤として、または鼻腔内に適用することができる、経粘膜性または経皮性製剤のような、抗PTH-rpが全身循環系中に進入できる手段が利用できるならば、他の投与様式を用いることもできる。さらに、脳脊髄注射、または骨転移部位もしくは骨折部位への局所注射による局所投与も使用されうる。血流へ、または局所的に骨へ、抗PTH-rpを輸送させる作用を有する適当な製剤であれば、どの製剤も用いることができる。
適当な注射用の製剤には、一般的に安定化剤もしくは他の微量元素を任意に含む生理食塩水、ハンク溶液（Hank’s Solution）もしくは他の緩衝液を用いた水溶液または懸濁液が含まれる。リポソーム調製物および他の微小乳濁液の形態も使用されうる。抗PTH-rpは凍結乾燥状で供給っし、投与する際に再生してもよい。経粘膜性および経皮性の製剤には、一般的に胆汁酸塩、フシジン酸およびその類似体、種々の界面活性剤などの、粘膜または皮膚関門の通過を促進する試薬が含まれる。抗PTH-rpが消化管を痛めないように適当な腸溶コーティングが処方されうるなら、経口投与も可能である。
製剤の性質は、ある程度、選択される抗PTH-rpの性質によるものであり、既知の技術および当業者には周知の製剤化の原理を用いて、適当な製剤が調製される。特定の薬学的組成物に含まれる抗PTH-rpの割合も、製剤の性質に応じたものである。即ち抗PTH-rpの割合は、典型的には約1から約85重量パーセントの広範囲にわたると考えられる。
投薬量
適当な投薬レベルはまた、治療すべき患者の性質、治療すべき状態の特質およびその重篤度、有効成分として使用される抗体の性質、投与形式、製剤、ならびに治療者の判断を含む多くの因子に応じて変更されると考えられる。注射可能な製剤中の抗PTHrpなどの抗体が投与される際、投薬量は一回の投薬で50μg/kg〜50mg/kgであり、好ましくは1mg/kg〜10mg/kgの範囲にあると考えられる。上述の要因を考慮して決定されるプロトコルに従って、反復投与が必要である場合もある。典型的には、3〜10日の期間にわたって毎日投与することが必要とされる。または静脈投与を連続的に行っても良い。慢性状態なら、投与は必要な期間だけ長く続けてもよい。
本明細書に記載するように、いずれかの抗体（例えば、抗PTH-rp）の投与が有効な患者は、骨への癌細胞転移、または骨での癌細胞の増殖、または骨溶解を示す。体液系によって媒介される高カルシウム血症の患者とは異なり、該患者では、血中を循環するPTH-rpの濃度が上昇することもあるし、上昇しないこともある。1992年8月18日に公開された日本特許出願第H4-228089号に記載されるように、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症は、骨への腫瘍細胞の浸潤により促進される骨吸収（局所骨溶解高カルシウム血症（LOH））によって、またはPTH-rpの全身作用（悪性体液高カルシウム血症（HHM））によって引き起こされる。この開示によると、LOHにより引き起こされる高カルシウム血症の主な例としては、多発性骨髄腫、乳癌等の骨転移から生じるものがあり、HHMにより引き起こされる高カルシウム血症の例としては、扁平上皮細胞癌および腎／泌尿器癌に関連した疾患がある。しかし、日本特許出願第H4-228089号には、局所骨溶解性高カルシウム血症とPTH-rpとの関連性については開示されていない。
ビスホスホン酸塩化合物は、一般的に標準体型の成人に対して隔週で約30〜60mgの範囲量で投与される。または、ビスホスホン酸塩を一ヶ月に一度約60〜90mgの量で投与してもよく、その際、ビスホスホン酸塩は1〜24時間かけて投与される。本発明に関しては、ビスホスホン酸塩は、抗PTH-rpなどの抗体と組み合わせて、毎日少量投与される。例えば、本明細書に記載されるタイプのビスホスホン酸塩は、約70kgの成人男子に対して約5〜25mgの量で毎日投与することができる。投与量は、治療される個人の体格、年齢、または状態に応じて減らしたり、増やしたりできる。どの薬物に関しても、比較的少量の有効成分で治療を開始し、患者の治療での薬物の効果を決定しながら、必要に応じて次第に投薬量を増やすことが好ましい。
製剤−具体例
本発明の製剤は、抗体の製剤とビスホスホン酸塩の製剤とを組み合わせることによって調製されうる。二つの製剤を、別容器内に保持し、同時に投与することもできるが、単一の製剤内に抗体とビスホスホン酸塩化合物とを組み合わせ、治療の目的で患者にこの製剤を投与することが可能である。本発明に関連して使用されうる製剤の例には、以下のものが含まれる。
製剤番号 1
ビスホスホン酸塩                      5〜25mg
抗体                                  70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号 2
ビスホスホン酸塩                      5〜25mg
抗PTHrp                               70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号 3
ビスホスホン酸塩                      5mg
抗TGFα                               70mg
賦形剤                                5ml
製剤番号 4
ビスホスホン酸塩                      25mg
抗IL-1α                              700mg
賦形剤                                25ml
製剤番号 5
ビスホスホン酸塩                      5mg
抗IL-1β                              700mg
賦形剤                                5ml
製剤番号  6
ビスホスホン酸塩                      25mg
抗IL-6                                700mg
賦形剤                                25ml
製剤番号  7
ビスホスホン酸塩                      25mg
抗リンホトキシン                      700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  8
ビスホスホン酸塩                      5mg
抗TNF                                 70mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  9
ビスホスホン酸塩                      5mg
抗PGE                                 70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  10
ビスホスホン酸塩                      5mg
抗1,25ジヒドロキシビタミンD3          70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  11
ピロリン酸塩                          5〜25mg
抗PTHrp                               70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  12
エチドロン酸塩                        5〜25mg
抗PTHrp                               100mg
賦形剤                                10ml
製剤番号  13
クロドロン酸塩                        5mg
抗PTHrp                               200mg
賦形剤                                5ml
製剤番号  14
パミドロン酸塩                        20mg
抗PTHrp                               500mg
賦形剤                                20ml
製剤番号  15
チルドロン酸塩                        15mg
抗PTHrp                               600mg
賦形剤                                15ml
製剤番号  16
アレンドロン酸塩                      25mg
抗PTHrp                               700mg
賦形剤                                25ml
製剤番号  17
リセドロン酸塩                        15mg
抗PTHrp                               350mg
賦形剤                                15ml
製剤番号  18
エチドロン酸塩                        2.5g
抗PTHrp                               70mg
賦形剤                                25ml
製剤番号  19
エチドロン酸塩                        2.0g
抗PTHrp                               300mg
賦形剤                                25ml
製剤番号  20
抗体（キメラ）                        70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  21
抗PTHrp（キメラ）                     70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  22
抗TGFα（キメラ）                     70mg
賦形剤                                5ml
製剤番号  23
抗IL-1α（キメラ）                    700mg
賦形剤                                25ml
製剤番号  24
抗IL-1β（キメラ）                    700mg
賦形剤                                5ml
製剤番号  25
抗IL-6（キメラ）                      700mg
賦形剤                                25ml
製剤番号  26
抗リンホトキシン（キメラ）            700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  27
抗TNF（キメラ）                       70mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  28
抗PGE（キメラ）                       70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
製剤番号  29
抗1,25ジヒドロキシビタミンD3（キメラ）70〜700mg
賦形剤                                5〜25ml
本発明の製剤において、各ビスホスホン酸塩成分は類似した様式で作用すると考えられる。さらに、それぞれの抗体成分はいくらかの類似作用を有することが予期される。従って、本発明の製剤を提供するため、所与のビスホスホン酸塩またはビスホスホン酸群のいずれも、所与の抗体または抗体群のいずれとでも組み合わされることができ、治療において共力的な結果を得ることができる。特に好ましい製剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる群より選択される抗体と賦形剤とを含む注射可能な製剤であり、ビスホスホン酸塩が含まれていても、含まれていなくてもよい。
癌細胞転移モデル
本発明者らは、骨溶解を生じる骨へのヒト乳癌細胞転移のモデルを開発した（ナカイ（Nakai）,M.ら、Cancer Res（1992）52:5395-5399；ササカイ（Sasakai）,A.ら、J Bone Min Res（1993）8（増刊1）:No.92）。ヌードマウスの左心室へ移植した癌細胞は、Ｘ線検査によって視診でき、組織学的に確認できる骨溶解障害を引き起こすことが示される（このモデルは正常マウスおよびヌードマウスに適用できる）。A375黒色腫細胞およびヒト乳癌細胞系MDA231が、このモデルに使用されてきた。このモデルを用いて、骨転移がラミニンに対するアンタゴニストによって抑制されうることが証明された。
このモデルは、「ヨネダ（Yoneda）,T.ら、J Bone Min Res（1994）9（増刊1）:S 293,B 225」による要約で述べられているように、インビボでヒト神経芽腫細胞の転移性質を証明するためにも使用されている。神経芽腫細胞を接種した6週間後、Ｘ線により脛骨での骨溶解性および骨芽性の両障害が示されたが、高カルシウム血症または悪液質は示されなかった。従って、骨の癌転移は明らかに骨芽細胞および破骨細胞の両方を産生できる複雑な状態であり、常に高カルシウム血症または悪液質などの全身性疾患を伴うわけではない。組織学的検査により、神経芽腫細胞が骨髄腔を占め、骨内膜の骨面上に多数の骨を吸収する破骨細胞が存在した（破骨細胞がPTH/PTH-rp受容体を発現することは証明されていない）。腫瘍細胞の培養上清により、ラット胎児の長骨の器官培養で骨吸収が刺激され、骨芽性の骨肉腫細胞の増殖が増大し、それにより骨形成が促進された。培養液には、有意な濃度のPTH-rpおよび高濃度のIL-6が含まれていた。破骨細胞には、IL-6受容体が存在する。
骨溶解性障害の数は、モデルにおいて使用されるMDA231細胞のPTH-rp発現を促進させることにより増加するが、アンチセンスのPTH-rp構築物で形質転換されるMDA231細胞により減少する。ヒトのプレプロPTH-rpをコードするcDNAでMDA231細胞を形質転換することにより、過剰発現するクローンを得た。また、このペプチドの産生が減少したクローンは、細胞系をアンチセンス構築物で形質転換することにより得た。Ｘ線撮影で比較すると、アンチセンス構築物で形質転換されたクローンでは、0.3pM/24時間未満が分泌され、わずか7.6±.22の障害が産生されたが、PTH-rp発現が増加したクローン（100pM/24時間）では3週目で16.3±3.8の障害が産生された。1.6〜8.4pM/24時間のPTH-rpが産生される未改変のMDA231細胞を投与したマウスにおける障害数は、少ないPTH-rpが産生されるアンチセンス構築物を含むように改変されたMDA231細胞を投与したマウスにおける障害数と近似する。これらの研究で用いられたいずれのマウスにおいても、PTH-rpの血清濃度は検出されなかった。即ち、高カルシウム血症は極めて少なく、PTH-rpの産生が促進されるMDA231細胞を有するマウスにのみ生じた。本発明者らは、骨細胞により産生される細胞外基質上でMDA231細胞を培養すると、MDA231細胞による調製無血清培地でPTH-rp濃度が2倍に増加したことも示した。これらの結果は「グイセ（Guise）,T.A.ら、J Bone Min Res（1994）9（増刊1）:S 128,No.30」により報告されている。
上述のモデルを用いて、本発明者らは、PTH-rpに対して特異的な抗体が転移の抑制、および骨に局在する悪性腫瘍細胞の作用の改善に効果的であることを見出した。これにより、効果的な薬理学的な治療方法が提供される。
骨溶解性転移と区別される高カルシウム血症
悪性の体液性高カルシウム血症（HHM）と、本明細書に記載される抗PTH-rp治療の標的となる、転移／骨溶解（（高カルシウム血症になることも、またはならないこともある）との差異を証明する際に、上述の動物モデルは効果的である。このような転移／骨溶解に対するPTH-rpの関連性は、ナカイ（Nakai）ら（前記）で本発明者らにより記載されたマウスモデル系において明らかに証明される。２つの腫瘍細胞系をこのモデルに使用した。即ち、培地中に多量のPTH-rp（251±8pM）を産生するヒトの肺の扁平上皮細胞癌であるRWGT-2、およびインビトロで少量のPTH-rp（3.1±.3pM）を産生する、上記のヒトの乳線癌であるMDA231である。培養した腫瘍細胞は、筋肉内注射（107細胞）または心臓内注射（105細胞）により無胸腺症のヌードマウスに接種された。骨格のＸ線写真および骨の組織学を得ると共に、血中のカルシウムイオン濃度および血漿中のPTH-rp濃度を測定した。
いずれの細胞系を筋肉内接種されたマウスも、３週間転移せずに局所腫瘍を発症した。RWGT-2を保持するマウスは、PTH-rpが増加し（11.8±2.2pM）、高カルシウム血症（2.44±16mMカルシウム）に罹った。MDA231を保持するマウスは正常なカルシウム濃度（1.22±.03mM）のままであり、PTH-rpは血漿中で増加しなかった（0.69±.17pM）。破骨細胞による骨吸収はRWGT-2を保持するマウスで引き起こされたが、MDA231を保持するマウスでは起こらなかった。
他方で、いずれかの細胞系を左心室に接種されたマウスは、４週間で骨溶解性障害を発症した。RWGT-2保持マウスと同様に（1.45±.19mM）、MDA231保持マウスは、正常なカルシウム濃度（1.22±.03mM）を維持した。血漿中のPTH-rp濃度はMDA231保持マウスでは増加せず（0.88±.15pM）、RWGT-2保持マウスではごくわずかに増加した（2.75±2.68pM）。しかし、腫瘍は、いずれの群においても破骨細胞による骨吸収が増加した領域に隣接して存在した。
この結果は、PTH-rpが産生される場に応じて、PTH-rpにより引き起こされる症候が異なることを示している。即ち、骨から離れた部位で高濃度で腫瘍により産生される場合（RWGT-2）、血漿PTH-rpが増加し、転移性の骨の病気を伴わずに高カルシウム血症が引き起こされる。PTH-rpが骨の腫瘍細胞（MDA231）により局所的に産生される場合、高カルシウム血症を伴う、または伴なわない、局所の骨破壊により必ずしも循環血中PTH-rpの増加が引き起こされるわけではない。これに反して、観察される骨溶解は、一部、転移癌からのシグナルに応答して他の細胞により放出されるPTH-rpにより引き起こされうる。さらに、骨基質の環境内に存在する場合は、高濃度のPTH-rpが転移癌細胞によって産生される可能性がある。それにもかかわらず、本発明の方法により扱われる症候は明白にHHMと区別されることは明白である。
本発明の方法に反応性を有する状態に苦しむ患者は容易に同定される。病気自体の性質により診断できる場合もある。骨粗鬆症、骨軟化症、腎性骨ジストロフィー、およびパジェット病などの内因性の骨溶解の状態は、常法により診断される。一般的に骨溶解の存在は、Ｘ線スキャンを用いて骨障害の存在を突き止めることにより検証される。概して、骨起源の癌、または骨に転移した癌、もしくは骨への転移が予想される癌に羅患していると診断される患者がふさわしい患者である。予後は、生検および類別によって確かめられる腫瘍の既知の性質に基づいて行われてもよく、または生検腫瘍、骨に関連する成分の存在下において高いレベルでPTH-rpを産生する能力を分析することによりそれぞれ判定してもよい。上記したように、本発明者らは、骨細胞により産生される細胞外基質上で細胞を培養すると、転移性の腫瘍MDA231により高レベルのPTH-rpが産生されることを示した。
このように、様々な基準により、本発明の方法により治療可能な特定の症候を示す患者が確認される。
本明細書に記載される治療の利点は明白である。骨転移およびそれに伴う骨障害を減少させる抗PTH-rpの直接的な効果に加えて、転移および骨障害の二次的な効果にも対処できる。このように、転移および骨溶解を示す患者は、骨の破壊による高カルシウム血症を二次的に示すかもしれない。骨溶解に起因する骨折した骨、またはもろくなった骨により、近辺の神経ネットワークが圧縮され、最終的に麻痺または対麻痺が引き起こされうる。明らかに病的骨折の危険性があり、しばしば悪液質になりうる。疼痛を伴う骨破壊は免れない。前記の全ては、直接的または非直接的に生存予後を短縮させる。骨もしくは他の組織のいずれかに起源を有する癌による骨周辺への癌転移の予防または治療によって、骨における癌増殖の予防および治療によって、そして上記によって引き起こされる骨障害の予防および治療によって、これらの負の作用が軽減される。複数の因子が、本明細書に記載される総体的症状の原因となることが示唆されているが、本発明の方法の核となる抗PTH-rpが、治療を成功させるための焦点である。
治療方法−具体的な用量
本発明による治療方法は、一般的に上述した特定の製剤を用い、「製剤−一般」の項に記載した製剤を投与することにより実施される。一般的に、抗体は、注射可能な溶液内に含まれる、適当な緩衝液および他の微量成分を含む生理食塩水等の注射可能な製剤へと製剤化される。患者に投与する抗体の正確な量は、患者の年齢、性別、体重、状態、および治療に対する患者の反応性などの因子に応じて変化しうる。一般的に、注射可能な製剤において、抗体は約50μg/kg〜50mg/kgの範囲の用量で、より好ましくは1回の投薬につき1mg/kg〜10mg/kgの範囲の用量で投与される。該投薬量が、一定の期間にわたって繰り返し患者に投与される。一般的に、該投薬量が毎日投与されるが、2日に1回投与されても、または3日から10日ごとのように頻度を減らして投与されてもよい。好ましい投与は3日から10日の期間にわたって毎日施される。患者の反応性を測定した後、治療プロトコルを反復して行ってもよい。
製剤の項に示したように、抗体は同じ製剤中のビスホスホン酸塩と同時に輸送されてもよい。または、ビスホスホン酸塩単独の注射可能な製剤を患者に投与してもよい。抗体と違って、投与されるビスホスホン酸塩の量は、一般的に、患者の年齢、性別、体重、および状態に応じて変化しない。しかし、患者の反応性は考慮する必要がある。典型的には、抗体が投与される度に、ビスホスホン酸塩が投与されなくてもよい。より典型的には、パミドロン酸二ナトリウムなどのビスホスホン酸塩が、平均体型の成人に対して隔週約30から60ミリグラムの量が投与される。60から90ミリグラムの範囲内の、より多くの量を1ヶ月ごとに投与してもよい。典型的には、ビスホスホン酸塩も静脈内投与される。60ミリグラムのビスホスホン酸塩溶液が、1から24時間かけて患者に注入することができる。一定の時間にわたって所望の用量が投与された後、患者の反応性を測定するため、一般的に管理者はさらにビスホスホン酸塩を再投与する前にある期間待つ。典型的には、60から90ミリグラムを投与した後、管理者はビスホスホン酸塩の追加投与を行う前に、3から6ヶ月待つ。しかし、これらは患者の具体的な必要性に応じて大きく変化しうる。
投与されるビスホスホン酸塩の量は、一般的に、投与される具体的なビスホスホン酸塩に応じて大きく変化する。当業者は、使用する具体的な化合物に応じて用量を調整できる。例えば、骨吸収の抑制能に関して、パミドロン酸塩はエチドロン酸塩よりもおよそ100倍以上の効力を有する。上記の投薬量は、パミドロン酸塩の投与に基づいた情報である。従って、同じ効果を得るためには、実質的に、より多量のエチドロン酸塩を投与することが必要である。
原発性の癌腫瘍の患者は外科的に治療されることが多い。癌腫瘍の外科的除去の危険性の１つとして、癌細胞が患者の全身に広がることが予想される。これを予防するために、本発明の製剤が手術前に、手術中に、または手術後に投与されうる。より典型的には、該製剤は手術前に投与される。従って、抗体の製剤（例えば、抗PTHrp）は、ビスホスホン酸塩の投与とともに注射によって投与される。変則的ではあるが、ビスホスホン酸塩は経口投与してもよい。さらに、本発明においては、薬学的に生理学的に許容される多様な投与形態が使用される。
本明細書に記載される治療プロトコルは、他の診断および治療プロトコルと組み合わせて実施されうることにも留意されたい。例えば、本発明は、特に癌細胞の転移により骨吸収が起きているとＸ線診断された患者に関して、適用されうる。患者のＸ線画像により、患者が骨吸収を患っていることが示される場合、単独の抗PTH-rp、またはビスホスホン酸塩と組み合わされた抗PTH-rpのような、抗体を含む本発明の製剤が投与される。図4に示すように、抗PTHrpの使用により癌患者の骨吸収を減少させる上で有意な効果がある。
実施例
以下の実施例は、製剤を製造する方法、および本発明の方法を実施する方法についての完全な開示ならびに説明を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を制限することを意図するものではない。本明細書では、用いる数字に関して正確性を保証するよう努力した（例えば、用量、細胞数、温度、時間等）が、いくらかの実験誤差および偏差も考慮されるべきである。他に示さない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、単位は通常のメートル法単位であり、温度は摂氏温度で、およそ18から25℃の範囲にある室温であり、圧力は大気圧、またはおよそ大気圧である。
ヒトのPTHrpに特異的に結合する抗体の製造
組換えヒトPTHrpに対して特異的な抗体、または天然のヒトPTHrp、もしくは遺伝子工学によるヒトPTH-rpの断片は、以下のようにして製造できる。PTHrp（組換えまたは天然）の全て、または一部に対応するポリペプチドは、ヒトのPTHrpをコードするcDNAの全長または一部を宿主細胞中で発現させることにより産生される。または、ヒトのPTHrp、もしくはそのペプチド断片は、標準的技法を用いて合成化学により製造してもよい。必要に応じて、免疫原性を高めるために、ペプチドを担体のタンパク質または他のアジュバンドに結合させてもよい。
ポリクローナル抗体を作製するためには、ペプチドまたはペプチド担体を、フロイントアジュバンドと混合し、動物（例えば、マウス、モルモット、ウサギ）に接種する。ヒトPTHrpの組換え蛋白質、またはその断片に特異的に結合するモノクローナル抗体が、標準的なハイブリドーマ技術を用いて製造される（例えば、ケーラー（Kohler）ら、1975,Nature 256:495；ケーラー（Kohler）ら、1976,Eur.J.Immunol.6:292；ケーラー（Kohler）ら、1976 Eur.J.Immunol.6:551；ハマーリング（Hammerling）ら、「モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ」、1981年、エルセビア（Elsevier）、ニューヨーク州;オースベル（Ausubel）ら、前記；ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）編、「抗体：実験手引き」、1988年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）。抗体が産生された後、ウェスタンブロット、免疫沈降解析、または当技術分野で既知の他の方法により、ヒトのPTHrpタンパク質に対する該抗体の特異的結合性が検定される（オースベル（Ausubel）ら、前記；ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、前記）。このように産生された抗体は、本発明の製剤および治療方法に使用される。または、該抗体を標識し、注射し、転移による骨吸収の部位を同定するために使用しても良い。
調製A
HHMモデルのカルシウムレベルに対るPTH-rpモノクローナル抗体の効果
HHMのカルシウムレベルを下げる抗PTH-rpの効果を確証するため、0日目にCHOK-1細胞、またはRWGT-2と呼ばれる骨要求性の扁平肺癌細胞のいずれかをマウスに皮下注射もしくは血管内注射した。注射の際、マウスは0.05mg/gのペントバルビタールで麻酔した。細胞（1x105）を0.1mlのPBSに懸濁した。19日目および20日目に、0.3mlのPBS、または75μgの抗PTH-rp（1-34）モノクローナル抗体（サトウ（Sato）ら、J Bone Min Res（1993）8:849〜860）を含む0.3mlのPBSのいずれかをマウスに皮下投与した。
血漿中のカルシウムレベルを、0、7、14、17、19および21日目に測定した。測定の際、マウスを麻酔し、「ヨネダ（Yoneda）,T.ら、J Clin Oncol（1991）2:468〜477」に記載されているように、チバ−コーニング（Ciba-Corning）カルシウムpH分析器を用いて、カルシウムイオンを測定した（モデル634、コーニング（Corning）、メッドフィールド（Medfield）、マサチューセッツ州）。
結果を図1に示す。図1に示されるように、CHOK-1細胞を移植された対照マウスは正常なカルシウムレベルを維持する。RWGT-2を保持するマウスでは、PBSのみを投与すると、継続的にカルシウム濃度が増加し（黒丸）、一方、抗PTH-rpを投与されたマウスの血中カルシウムレベルは劇的に低下する（黒三角）。従って、このHHMモデルにおいて、循環血中のPTH-rpにより媒介される高カルシウム血症は、抗PTH-rpによって制御される。
実施例1
種々の試薬により刺激される骨吸収に対する抗PTH-rpの効果
この実施例において、ラット胎児の長骨から放出される標識されたカルシウム（45Ca）の割合を骨吸収の測定に用いた。骨を標識するため、妊娠18日目の妊娠雌ラットに50μCiの標識されたカルシウム塩を皮下注射した。翌日に胚を回収し、妊娠19日目に胎児から長骨を得た。種々の推定骨吸収刺激因子の存在下または非存在下で、ならびに調製Aで用いられた抗PHT-rp（1-34）抗体の存在下または非存在下において、骨を標準培地で120時間培養した。結果を図2に示す。
図2に示されるように、120時間の時間域にわたって、未処理の骨から、標識されたカルシウムのおよそ20％が培地中に放出された。10ng/mlのPTH-rpを培地中に添加することにより、標識されたカルシウムのほぼ90％が放出される。しかし、抗PTH-rp抗体の添加により、標識されたカルシウムの放出がおよそ30％にまで減少する。10mg/mlのPTH自体を培地中に添加することによっても、骨吸収のカルシウム指示薬のほぼ90％が放出されるが、該抗体はPTH-rpに対して十分に免疫特異的であるため、この抗体の存在効力による影響は本質的に見られない。該抗体により、10-8Mの1,25 D-3の存在により刺激されるカルシウムの放出も減少すると考えられる。しかし、これらの結果は再現されなかった。10-10MのαIL-1の添加によるカルシウム放出効果はほとんどなく、抗体の添加にも効果はなかった。
実施例2
長骨の障害に対する抗PTH-rpの効果
「ナカイ（Nakai）,M.ら、Cancer Res（1992）52:5395〜5399」の骨溶解性／転移性モデルを使用した。MDA231±4細胞を、0日目に0.05mg/gのペントバルビタールで麻酔下においたマウスの左心室へ接種した。14、17、および20日目に、75μgの蛋白質を含む0.3mlの（上述した調製Aと同様の）抗PTH-rp（1-34）または0.3mlのPBSを皮下注射した。骨障害の領域はＸ線写真で判定した。マウスに強く麻酔をかけ、フィルム（22 x 27cm、X-O Mart AR、コダック社、ローチェスター（Rochester）、ニューヨーク）に対して俯せの位置に寝かせ、ファックストロンＸ線診査ユニット（Faxtron Radiographic Inspection Unit）（モデル8050-020、フィールド・エミッション社（Field Emission Corporation,Inc.）、マックミンビル（McMinnville）、オレゴン州）を用いて6秒間、35kvpでＸ線に感光させた。RPX-Oマート・プロセッサー（RPX-O Mart Processor）（モデルM8B、コダック社）を用いて、フィルムを現像した。全てのＸ線写真は、3人の異なる者によって充分に評価された。骨における線透過性の障害（radiolucid lesions）の分画として認識される転移病巣を数えた。転移性の腫瘍の存在を確認するため、そして腫瘍と関連する骨との関係を調べるため、実験の最後に、マウスを屠殺し、骨を10％ホルマリン緩衝液で固定し、脱灰した。
結果を、前脚および後脚の骨における全障害領域として作表し、図3に一本の骨に換算したものを示した。示したように、y軸上に示される一本の骨における全障害領域は、抗PTH-rpを投与すると減少し、24日目で統計的に有意に減少する。
実施例3
4週齢の雌ヌードマウス（Balb c Nu/Nu、ハルラン・スプラーグ−ダウレイ（Harlan Sprague-Dawley）社、ヒューストン、テキサス州）に、ヒトの乳癌細胞MDA-231（1X105細胞／動物）を左心室へ接種される7日前に（-7）、または接種時に（0）、PTH-rPAb（MAb）を投与した。抗PTH-rp（1-34）（上述した調製Aと同様）抗体、または対照1gG（75μg／動物）を28日間、3日ごとに皮下注射した。これらのマウスの四肢における骨溶解性の障害の発症をファクシトロン（商標登録）（モデル43855A、ファクシトロン・Ｘ線社（Faxitron X-ray Corp.）、バッファロー・グローブ（Buffalo Grove）、イリノイ州）を用いて、毎週、Ｘ線写真によりモニターした。17、24、および26日目に撮ったＸ線写真により骨溶解性の障害を調べ、各マウスの四肢における障害領域をコンピューターに接続させた画像解析装置によって定量化した。データは、マウスにおける溶解性障害の領域（mm2）および各治療群の12匹のヌードマウスの平均±標準誤差として表されている。統計的差異は、分散分析後に対試験により解析された。
上記の手順に従った結果を、図4に図示する。対照マウスでは、骨溶解性の障害（骨吸収）において劇的な増加が示されたが、抗PTH-rpで処理したマウスではごく少量の骨溶解性の障害が示された。
実施例4
マウス骨髄細胞の培養
マウスの骨髄培養を行った。C57BLマウス（雄、4〜6週齢；ハルラン・インダストリーズ（Harlan Industries）、ヒューストン、テキサス州）の大腿骨および脛骨から、骨髄細胞を採取し、無血清アルファ最小必須培地（αMEM；ハゼルトン・バイオロジック社（Hazelton Biologic,Inc.）、レネクサ（Lenexa）、カンザス州）で2度洗浄し、1.3x106細胞／cm2の終密度で48穴プレート（ファルコン（Falcon）；ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）；ラブウェア（Labware）、リンカーン・パーク（Lincoln Park）、ニュージャージー州）に接種し、10％PCS（ハイクローン・ラボラトリーズ（Hyclone Laboratories）、ローガン（Logan）、ユタ州）、および10nM 1,25D3（バイオモル・リサーチ・ラボラトリー社（Biomol Research Laboratory Inc.）、プリマス・ミーティング（Plymouth Meeting）、ペンシルバニア州）を添加し、かつ抗生物質は添加しないαMEM中で6日間、37℃で5％の湿潤大気中で培養した。他に特筆しない限り、2日ごとに、10％PCSおよび10nM 1.25D3を含有する新鮮なαMEMに交換し、細胞に栄養を与えた。
培養の最後に、細胞をPBSで洗浄し、60％アセトンのクエン酸緩衝溶液（pH5.4）中で30秒間固定し、風乾し、市販のキット（シグマ社）を用いて、マウス破骨細胞の細胞化学的マーカーとして広く受け入れられている酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）を染色した。染色された培地を200倍率で光顕下において調べた。秩序だった方式で手動的にウェル上をくまなく観察することにより、各ウェルにおけるTRAP陽性（赤の染色）の多核（3個以上の核）細胞（TRAP（+）MNC）を計数した。刺激されたマウスの骨髄に対する抗PTH-rp（1-34）抗体（上記の調製Aに記載した）の効果について得られた結果を図5に示す。
実施例5
動物マウスにおける抗PTHrpの効果
（1）骨へ転移した癌細胞のPTHrp濃度に対する効果、および（2）抗PTHrp投与の転移癌に対する効果を測定するために、以下の手順を行った。まず、マウスを２つの群に分けた。第一群（対照群）は正常マウスから構成された。第二群は、「癌細胞転移モデル」という項で上述したように左心室に癌細胞を注射された、第一群と同タイプの正常マウスから構成された。癌細胞を注射されたマウスの群は、癌細胞が注射された以外は対照群と同様な方法で扱われ、飼育された。注射された癌細胞を骨へ転移させた。
対照群、および癌細胞を注射された第二群の両方で、末梢血のPTHrp濃度、および骨髄のPTHrp濃度を測定した。対照群においては、末梢血と骨髄の両方で、PTHrp濃度が1ピコモル濃度未満であることが示された（図7参照）。しかし、癌細胞を接種された群においては、血中PTHrp濃度は1ピコモル濃度未満であったが、局所の骨髄のPTHrp濃度は3ピコモル濃度であった（図7参照）。局所の骨髄において、さらに高いPTHrp濃度、例えば6ピコモル濃度を示す動物もいた。対照群、および癌細胞を注射された群における骨髄のPTHrp濃度の差異は、統計学的に有意であることが示された。従って、癌細胞を骨に転移させた場合、対照群の骨髄におけるPTHrp濃度と比較して、該PTHrp濃度が統計学的に有意に増加するという結果が示された。
癌細胞を注射された第二のマウス群を、さらに2つの群に分類した。第一群は新たな対照群とし、第二群は抗PTHrp抗体で処理した点を除いて、第一群（新規の対照群）と同様に処理した。対照群、即ち癌細胞は注射したが、抗PTHrp抗体は投与しなかった群において、癌細胞の組織学的な検査により、癌細胞が生存していることが示された。しかし、抗PTHrp抗体を投与した群においては、癌細胞の組織学的な検査により、細胞壊死、即ち局所の癌細胞の死が示された。従って、上記の結果により、動物モデル内で、抗PTHrp抗体の投与による局所的な抗癌活性が証明される。
本発明のうち最も実用的で、好ましい態様と考えられるものを本明細書に示し、記載した。しかし、本発明の範囲内でそれらを改変することができること、および本開示を読めば当業者に明らかな変更が想起されるであろうことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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