(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血または関節液をサイトカイン非存在下で１〜３週間培養することにより得られたヒト破骨細胞前駆細胞を支持細胞非存在下で培養することを特徴とする、当該ヒト破骨細胞前駆細胞をヒト破骨細胞に分化させる方法。
【請求項２】
ヒト破骨細胞前駆細胞からヒト破骨細胞への分化において、培養条件としてＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Eotaxin、Eotaxin-2、Eotaxin-3又はこれら２以上の組み合わせからなる混合物を含有する培地を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト破骨細胞前駆細胞からヒト破骨細胞への分化において、末梢血単核球マイトジェン刺激培養上清を含有する培地を使用する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
末梢血単核球マイトジェン刺激培養上清がヒト末梢血単核球フィトヘマグルチニン刺激培養上清である請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、破骨細胞前駆細胞を支持細胞非存在下で培養することを特徴とする当該破骨細胞前駆細胞を破骨細胞に分化させる方法、破骨細胞前駆細胞のみを単離する方法、該破骨細胞前駆細胞または該破骨細胞を用いたスクリーニング方法およびそのスクリーニング方法により得られた骨代謝疾患治療剤に関するものである。
背景技術
哺乳類の骨組織は、骨吸収と骨形成を繰り返している。そして、成長期はもちろん、個体が成熟した後もカルシウム代謝の中心として機能しながら骨吸収と骨形成のバランスが保たれている。
これは破骨細胞と骨芽細胞との間で密接な情報伝達が行われて、骨吸収と骨形成の平衡が保たれているためである。
しかし、骨吸収と骨形成のバランスが崩れると骨代謝疾患が生じる。骨代謝疾患としては、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、糖尿病にともなう骨量の減少、種々のホルモン異常、栄養障害、大理石病、骨軟化症などが挙げられるが、病態の細胞学的解明はあまり進んでいないのが現状である。
従って、これら骨代謝疾患を解明し、治療薬を開発するためには、破骨細胞や骨芽細胞の単離と性状解析が必要とされてきた。
従来、破骨細胞の単離に関する研究は、主にマウスやラットにおいて進められてきたが、近年はヒト破骨細胞の単離について研究が進められており、Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｓａｂｏｋｂａｒ，Ａ．，Ｎｅａｌｅ，Ｓ．，ａｎｄ  Ａｔｈａｎａｓｏｕ，Ｎ．Ａ．，”Ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５５；８１６−８２２，１９９６．において、慢性関節リウマチ患者の滑膜組織からマウス骨芽細胞様細胞株の存在下で破骨細胞を得ることが報告されている。該報告においては、マウス骨芽細胞様細胞株の存在下でヒト破骨細胞を得ている。これは破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化は、骨髄ストローマ細胞や骨芽細胞などとの協調により起こるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞前駆細胞の分化誘導には骨髄ストローマ細胞や骨芽細胞などの支持細胞の存在が不可欠であると考えられていたためである。
一方、特開平７−１９４３７３では、骨髄ストローマ細胞又は骨芽細胞を含まない培地にて、骨髄細胞を、骨芽細胞、破骨細胞又は軟骨細胞に分化させる方法について記述しているが、破骨細胞自体の単離には成功していない。
破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化機構を解析のためには、破骨細胞の前駆細胞から破骨細胞への分化に関与する因子が少ない、特に支持細胞を必要としない単離および破骨細胞への分化誘導方法の確立が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、破骨細胞への分化誘導について鋭意研究を重ねた結果、破骨細胞前駆細胞を支持細胞非存在下で培養することを特徴とする当該破骨細胞前駆細胞を破骨細胞に分化させる方法、破骨細胞前駆細胞のみを単離する方法、該方法により単離された破骨細胞前駆細胞、該方法により単離された破骨細胞前駆細胞を破骨細胞に分化させる方法、該方法により得られることを特徴とする該破骨細胞、該破骨細胞前駆細胞または該破骨細胞を用いることを特徴とする骨代謝疾患治療剤のスクリーニング方法及び該スクリーニング方法によって得られる骨代謝疾患治療剤に関する発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
0004271857.tif 000002
0004271857.tif 000003
0004271857.tif 000004
本発明の１つは、支持細胞非存在下で培養することを特徴とする破骨細胞前駆細胞を破骨細胞に分化させる方法に関する。この場合、「支持細胞」とは、破骨細胞前駆細胞に対し、接着および液性因子の産出を通じて、その分化誘導を行なうことができる間葉系細胞を意味する。「支持細胞」としては、骨髄ストローマ細胞、骨芽（細胞様）細胞、線維芽細胞、腫瘍細胞などが例示される。「破骨細胞前駆細胞」とは、夾雑細胞を実質的に含まない破骨細胞前駆細胞を意味し、具体的にはヒト破骨細胞前駆細胞である。「破骨細胞前駆細胞」とは、適当な培養条件下で破骨細胞に分化する能力を有する造血幹細胞由来の細胞を意味する。「破骨細胞」とは、夾雑細胞を実質的に含まない破骨細胞を意味し、具体的にはヒト破骨細胞である。「破骨細胞」は、多核（Ｎ＞３）で、酒石酸耐性酸フォスファターゼ染色により陽性反応を示し、骨吸収能を有する細胞を意味する。
さらに、本発明は、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ（Ｋｉｔａｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１３，７７２５−７７３０，１９９６）、Ｅｏｔａｘｉｎ−２（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，１２，２１７１−２１７６，１９９７）、Ｅｏｔａｘｉｎ−３（ヒトＣＣ型ケモカイン。塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す）又はこれら２以上の組み合わせからなる混合物を含有する培地で、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ分化させる方法に関する。ＩＬ−３、Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２またはＥｏｔａｘｉｎ−３は、天然型あるいは組換え型のいずれであってもよい。ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２またはＥｏｔａｘｉｎ−３又はこれら２以上の組み合わせからなる混合物を含有する培地として、単核球マイトジェン刺激培養上清を含有する培地を用いてもよい。末梢血単核球マイトジェン刺激培養上清としては、ヒト末梢血単核球フィトヘマグルチニン刺激培養上清を用いる場合もある。
また、本発明は、末梢血または関節液をサイトカイン非存在下で１〜３週間培養することにより破骨細胞前駆細胞のみを単離する方法に関する。具体的には末梢血または関節液を、サイトカイン「非存在下で」あるいは「不含の」哺乳類細胞基本培地に添加し、３５〜３７℃、５〜７％ＣＯ２下で１〜３週間培養することにより、破骨細胞前駆細胞を除く細胞を死滅させ、破骨細胞前駆細胞のみを単離する方法、または該方法により得られることを特徴とする破骨細胞前駆細胞に関するものである。
「末梢血」とは、哺乳動物の末梢血であり、具体的にはヒト末梢血である。ヒト末梢血を使用する場合には、健常人の末梢血を用いることが出来る。
「関節液」としては、健常人の関節液を用いることもできるが、具体的には慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節より得られた関節液を意味する。
［哺乳類細胞基本培地」とは、細胞が生存するために利用可能な無機塩類と必須アミノ酸またはその誘導体、ビタミン類またはその誘導体を含んだ等張の緩衝液を意味する。「哺乳類細胞基本培地」としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０またはＡＩＭ−Ｖなどが例示できる。
更に本発明は、前述の末梢血または関節液をサイトカイン非存在下で１〜３週間培養することにより破骨細胞前駆細胞のみを単離する方法により得られた破骨細胞前駆細胞を、支持細胞非存在下で培養することを特徴とする破骨細胞に分化させる方法に関する。具体的には、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ−３又はこれら２以上の組み合わせからなる混合物を含有する培地で、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ分化させる方法に関する。ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２またはＥｏｔａｘｉｎ−３は、天然型あるいは組換え型のいずれであってもよい。ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ−３又はこれら２以上の組み合わせからなる混合物の含有する培地として、末梢血単核球マイトジェン刺激培養上清を含有する培地を用いてもよい。末梢血単核球マイトジェン刺激培養上清として、ヒト末梢血単核球フィトヘマグルチニン刺激培養上清を用いる場合もある。
別の態様として、本発明は、本発明の破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を用いることを特徴とする骨代謝疾患治療剤のスクリーニング方法及び該スクリーニング方法によって得られる骨代謝疾患治療剤に関するものである。
「骨代謝疾患」としては、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、糖尿病にともなう骨量の減少、骨軟化症、大理石骨病などが例示される。
「骨代謝疾患治療剤のスクリーニング方法」としては、例えば、（１）破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化阻害活性を測定する方法、（２）破骨細胞の骨吸収阻害活性を測定する方法などが例示される。治療剤候補化合物が本発明の破骨細胞前駆細胞に対して分化阻害活性を示した場合には、該化合物は抗リウマチ剤として有望である。また、治療剤候補化合物が本発明の破骨細胞に対して骨吸収阻害活性を示した場合には、該化合物は過剰な骨吸収により生じる骨粗鬆症、糖尿病にともなう骨量の減少、骨軟化症などの治療に有用な化合物であることが示唆される。このように、本発明の破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を用いることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に骨代謝疾患治療剤として有望な化合物のスクリーニングを行なうことができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明ので目的とするヒト破骨細胞は以下に示す方法によって得ることが出来る。
破骨細胞前駆細胞の単離
破骨細胞前駆細胞の単離は、（１）細胞画分の分離工程および（２）破骨細胞前駆細胞の単離工程からなる。
（１）細胞画分の分離
破骨細胞前駆細胞は、健常人の末梢血または慢性関節リウマチ患者の関節液より得ることができる。該細胞を単離に必要な体液は、健常人の末梢血であれば５０ｍｌ〜２００ｍｌ、慢性関節リウマチ患者の関節液であれば１ｍｌ〜数十ｍｌである。健常人の末梢血を用いた場合には、該血液をヘパリンあるいはそれに代わる抗凝固剤の存在下で採取する。該血液より細胞画分を分離するため、比重遠心法や塩化アンモニウム等による赤血球の除去により末梢血単核球画分（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）を得る。
一方、慢性関節リウマチ患者の関節液を用いた場合には、該関節液にＲＰＭＩ１６４０などの哺乳類細胞基本培地を添加し、あるいはそのまま遠心分離することで、細胞画分を得ることができる。
（２）破骨細胞前駆細胞の単離
得られた細胞画分を、ＤＭＥＭなどの哺乳類細胞基本培地にて、３５〜３７℃、好ましくは３７℃、５〜７％ＣＯ２下で数週間、好ましくは１〜３週間培養しする。これにより破骨細胞前駆細胞を除く細胞は死滅し、破骨細胞前駆細胞を単離することができる。
破骨細胞の単離
破骨細胞の単離は、（１）培養培地の調製工程および（２）破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化誘導工程からなる。
（１）培養培地の調製
ＡＩＭ−Ｖなどの哺乳類細胞基本培地に分化誘導のためのサイトカインを添加し、培地を調製する。好ましくは、細菌の繁殖を防止するため、更に抗生物質を添加する。本発明によれは、破骨細胞前駆細胞を分化誘導するサイトカインとしては、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ−３が挙げられる。従って、該培地には、これらサイトカインを単独または混合物として添加し、調製する。
（２）破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化誘導
得られた破骨細胞前駆細胞を、前述の培養培地で、３５〜３７℃、４８〜９６時間培養する。破骨細胞前駆細胞は、前述のサイトカインの刺激により、破骨細胞に分化する。これにより、破骨細胞のみを単離することができる。
骨代謝疾患治療剤のスクリーニング
骨代謝疾患治療剤のスクリーニング方法としては、（１）破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化阻害活性を測定する方法、（２）破骨細胞の骨吸収阻害活性を測定する方法などが例示される。
（１）分化阻害活性の測定方法
本発明により得られた破骨細胞前駆細胞を、例えば、１ｘ１０６個／ｗｅｌｌとなるように調製して、４８穴プレートなどで培養する。培養に際しては、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ−３または末梢血単核球マイトジェン刺激培養上清を含む哺乳類細胞基本培地を用いる。各ｗｅｌｌには、各濃度の治療剤候補化合物を添加する。このように調製したプレートを、３７℃、４８〜９６時間培養する。培養後、プレートに付着した細胞を固定し、破骨細胞マーカー酵素である酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）の活性染色を行い、各ｗｅｌｌあたりの多核（Ｎ＞３）でＴＲＡＰ陽性の細胞を破骨細胞としてカウントする。その結果をＩＣ５０値で示すことにより、候補化合物の破骨細胞前駆細胞に対する分化阻害活性を評価することかできる。
（２）骨吸収阻害活性の測定方法
本発明により得られた破骨細胞を、例えば、１ｘ１０６個／ｗｅｌｌとなるように調製して、象牙スライスを敷いた４８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅなとで培養する。培養に際しては、哺乳類細胞基本培地を用いる。各ｗｅｌｌには、各濃度の治療剤候補化合物を添加する。このように調製した象牙スライス上で、３７℃、４８〜９６時間培養する。培養後、象牙スライスをヘマトキシリンで染色を行う。破骨細胞は、リン酸カルシウムを吸収する。従って、骨吸収があった場合には、吸収された部分（吸収窩）が染色される。生物顕微鏡または電子顕微鏡により、象牙スライスの吸収窩形成の有無を観察する。または、培養上清中のカルシウム濃度の変化を測定する。その結果をＩＣ５０値で示すことにより、候補化合物の破骨細胞に対する骨吸収阻害活性を評価することかできる。
破骨細胞形成阻害作用は、抗リウマチ活性を測る指標として重要となりつつある。従って、破骨細胞前駆細胞に対する分化阻害活性を有する化合物は、抗リウマチ剤として有望である。また、骨粗鬆症は、破骨細胞の過剰な骨吸収により生じる。破骨細胞に対する骨吸収阻害活性を有する化合物は、骨粗鬆症の治療剤として有望である。
実施例
実施例１  慢性関節リウマチ患者の関節液由来のヒト破骨細胞の単離
（１）細胞画分の分離
慢性関節リウマチ患者の関節より関節液を得た。関節液は、４℃で試験管中に保存した。なお、以下の操作は原則として無菌条件下で行う。１ｍｌ〜数十ｍｌ採取する。この関節液に等量のＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃２２４００又はその等価物）を添加した後、１０００〜２０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離し、顆粒球やリンパ球などを含む細胞画分を得た。
（２）破骨細胞前駆細胞の単離
得られた細胞画分を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃１２４３０−２１又はその等価物）にて、３７℃、５〜７％ＣＯ２下で数週間培養した。これにより破骨細胞前駆細胞を除く細胞は死滅し、破骨細胞前駆細胞（図１、図２）のみが残った。
（３）培地の調製
破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ分化させる培地を調製した。ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃８７−０１１２）４００ｍｌに、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃２２４００）６０ｍｌ、ヒトＴ−ＳＴＩＭ４０ｍｌ（１０ＢＲＭＰ／ｍｌ；ＢＲＭＰ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）、ＦＣＳ１０％（Ｖ／Ｖ）（予め５６℃で３０分間熱処理し非働化したもの）５０ｍｌおよび抗生物質（ペニシリン１００Ｕ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃１５１４０−０１５又はその等価物）を補充して、培地（以下、培地Ａと称する）とした。ヒトＴ−ＳＴＩＭとは、フィトヘマグルチニンで刺激した、ヒト末梢血単核球の培養上清である（Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ＳＴＩＭ  ｗｉｔｈ  ＰＨＡ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃４００４５）。
（４）破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化誘導
実施例１（２）で得られた破骨細胞前駆細胞を実施例１（３）に記載の培地Ａで刺激すると、３７℃・４８−９６時間で破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化が起こり、破骨細胞が得られた（図１、図２）。
（５）分化誘導能を有するサイトカインの特定
ヒトＴ−ＳＴＩＭは様々なサイトカインを含有している。このヒトＴ−ＳＴＩＭに含まれるサイトカインの内、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化誘導能を有するサイトカインを特定するため、実施例１（３）に記載の培地Ａの成分を変えて、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の分化を誘導を試みた。
▲１▼培地の調製
培地として、実施例１（３）に記載の培地Ａに含まれるヒトＴ−ＳＴＩＭを以下のサイトカインまたはサイトカインの混合物に代えて、以下に示す１６種類の培地（Ｂ〜Ｒ）を調製した。なお、ヒトＴ−ＳＴＩＭ以外の、ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃８７−０１１２）、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃２２４０）、ＦＣＳ  １０％（Ｖ／Ｖ）及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃１５１４０−０１５又はその等価物）は培地Ａと同一のものを使用した。
・培地Ｂ：リコンビナントヒトＩＬ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２０１−ＬＢあるいは＃２００−ＬＡまたはその等価物）０．５〜５ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｃ：リコンビナントヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２０２−ＩＬあるいはその等価物）５０〜２００Ｕ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｄ：リコンビナントヒトＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃４０３−ＭＬ−０１０あるいはその等価物）２〜１０ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｅ：リコンビナントヒトＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ，＃２１８１−０１あるいはその等価物）５０〜２００Ｕ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｆ：リコンビナントヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２０６−ＩＬあるいはその等価物）１０〜２０ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｇ：リコンビナントヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２０６−ＩＬあるいはその等価物）１０〜２０ｎｇ／ｍｌ＋リコンビナントヒト可溶化ＩＬ−６レセプター（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２２７−ＳＲあるいはその等価物）１００〜３００ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｈ：リコンビナントヒトＩＬ−７（Ｇｅｎｚｙｍｅ，＃１５８７−００あるいはその等価物）５〜２０ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｉ：リコンビナントヒトＩＬ−１１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１８−ＩＬあるいはその等価物）１〜４ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
培地Ｊ：リコンビナントヒトＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１６−ＭＣ−０１０あるいはその等価物）２．５〜１００ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｋ：リコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１５−ＧＭ−０１０あるいはその等価物）１〜５ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｌ：リコンビナントヒトＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃４０３−ＭＬ−０１０あるいはその等価物）２〜１０ｎｇ／ｍｌ＋リコンビナントヒトＩＬ−７（Ｇｅｎｚｙｍｅ，＃１５８７−００あるいはその等価物）５〜２０ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｍ：リコンビナントヒトＩＬ−７（Ｇｅｎｚｙｍｅ，＃１５８７−００あるいはその等価物）５〜２０ｎｇ／ｍｌ＋リコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１５−ＧＭ−０１０あるいはその等価物）１〜５ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｎ：リコンビナントヒトＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃４０３−ＭＬ−０１０あるいはその等価物）２〜１０ｎｇ／ｍｌ＋リコンビナントヒトＩＬ−７（Ｇｅｎｚｙｍｅ，＃１５８７−００あるいはその等価物）５〜２０ｎｇ／ｍｌ＋リコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１５−ＧＭ−０１０あるいはその等価物）１〜５ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｐ：リコンビナントヒトＥｏｔａｘｉｎ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，＃３２０−ＥＯあるいはその等価物）１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｑ：リコンビナントヒトＥｏｔａｘｉｎ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，＃３４３−Ｅ２あるいはその等価物）１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質
・培地Ｒ：リコンビナントヒトＥｏｔａｘｉｎ−３  １０〜１０００ｎｇ／ｍｌ＋ＡＩＭ−Ｖ培地４００ｍｌ＋ＲＰＭＩ１６４０培地６０ｍｌ＋ＦＣＳ５０ｍｌ＋抗生物質（Ｅｏｔａｘｉｎ−３は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ公開のヒトゲノムシーケンスデータ（ＨＲＧ３５６Ｅ０１）よりＣＣ型ケモカインと有為の相同性をもつが既知のケモカインとは異なるケモカイン蛋白質をコードすると考えられるｅｘｏｎ配列を見出すことにより得た。これをもとに配列番号１に示すｃＤＮＡを単離、該配列を含む組み換えバキュロウイルスを作成し、昆虫細胞に感染させ、その培養上清よりリコンビナントＥｏｔａｘｉｎ−３蛋白を回収した。）
▲２▼破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化誘導
実施例１（２）で得られた破骨細胞前駆細胞を、前述の培地Ｂ〜Ｎを用いて、３７℃・４８〜９６時間培養した。このうち、培地Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ及びＲでは破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化が確認された。一方、培地Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ及びＪでは、破骨細胞前駆細胞の分化が起こらなかった。この結果、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ２、およびＥｏｔａｘｉｎ３及びこれらの混合物は、破骨細胞前駆細胞に対する分化誘導能を有することが明らかとなった。一方、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１１及びＭ−ＣＳＦが破骨細胞前駆細胞に対する分化誘導能を有しないことも確認された。
従来、支持細胞を必要とする破骨細胞前駆細胞の分化においては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１又はＭ−ＣＳＦはそれぞれ単独で分化を促進するサイトカインであることが知られていた。しかし、これらサイトカインが破骨細胞前駆細胞そのものを刺激して分化が促進されたものであるか、サイトカインが支持細胞を刺激していた結果、破骨細胞前駆細胞の分化が誘導されたのかは明らかではなかった。
一方、本発明の支持細胞を必要としない破骨細胞前駆細胞の分化においては、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ２およびＥｏｔａｘｉｎ３が分化誘導能を有することが明らかとなった。同時に、破骨細胞前駆細胞そのものの分化に対して、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１又はＭ−ＣＳＦは少なくとも単独かつ直接には作用しないことが確認された。
実施例２  健常人の末梢血液由来のヒト破骨細胞の単離
健常人末梢血由来のヒト破骨細胞の単離
（１）細胞画分の分離
健常人の末梢血５０ｍｌ〜２００ｍｌをヘパリンあるいはそれに代わる抗凝固剤の存在下で採取した。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）比重遠心法により末梢血単核球画分（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）を得た。ＰＢＭＣはＦＣＳ１０％（Ｖ／Ｖ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に１０７個／ｍｌで浮遊後、６０ｍｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈに１〜１．５ｍｌ／ｄｉｓｈ、３７℃、５−７％ＣＯ２下で１−２時間培養した。培養後、３７℃のＦＣＳ１０％（Ｖ／Ｖ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地でｄｉｓｈをリンスし、浮遊系細胞を取り除く。ｄｉｓｈに付着した細胞は４℃の血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地で強く洗い流し、末梢血単球画分（全ＰＢＭＣの約３−８％）として回収した。
（２）破骨細胞前駆細胞の単離
得られた単球画分（０．５−１×１０６／ｍｌ）を、実施例１（２）と同様に、ＦＣＳ１０％（ｖ／ｖ）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，＃１２４３０−２１又はその等価物）にて、３７℃、５〜７％ＣＯ２下で数週間培養した。これにより破骨細胞前駆細胞を除く細胞は死滅し、破骨細胞前駆細胞のみが残った。さらに、該単球画分をＰＢＭＣからの単離直後にＲＡ患者滑膜ナース細胞と共培養することにより、破骨細胞前駆細胞の増殖効率を上昇させることができる。その際、培地は実施例１（２）と同じものを用いる。
（３）破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化誘導
この破骨細胞前駆細胞を実施例１（３）に記載の培地Ａで刺激すると、３７℃・４８−９６時間で破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化が起こり、破骨細胞が得られた。これにより、慢性関節リウマチ患者関節液からだけでなく、健常人末梢血からも、破骨細胞が単離されることが確認された。
実施例１（４）及び実施例２（３）で得られた細胞が、破骨細胞であることの確認は以下の試験例（１）から（３）に従い行った。
試験例
（１）形態学的観察
Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色（ＭＥＲＣＫ）により細胞を染色し、顕微鏡を用いて観察した。染色後の破骨細胞前駆細胞および破骨細胞の顕微鏡写真に代わる図面を図１に示す。この結果、分化前の破骨細胞前駆細胞は単球様の形態を有するのに対して、得られた破骨細胞は全て多核（３〜１００以上）の巨細胞であることが認められた。
（２）ＴＲＡＰ染色
分化前の破骨細胞前駆細胞および分化後の破骨細胞を、酒石酸耐性酸フォスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＴＲＡＰ）染色キット（ＳＩＧＭＡＣｏ．）により染色し、顕微鏡を用いて観察した。染色後の分化前の細胞（破骨細胞前駆細胞）および分化後細胞（破骨細胞）の顕微鏡写真に代わる図面を図２に示す。この結果、分化前の細胞（破骨細胞前駆細胞）でもＴＲＡＰ陽性であるが、分化後の細胞（破骨細胞）は核周囲に殊に強いＴＲＡＰ陽性像があることが認められた。
（３）骨吸収能
象牙スライスに分化前の破骨細胞前駆細胞を分化のおこる条件（実施例１（４））で培養後、ヘマトキシリン（ＳＩＧＭＡ  Ｃｏ．）で象牙スライスを染色し位相差顕微鏡を用いて観察した。それぞれの表面の顕微鏡写真に代わる図面を図３に示す。分化前の破骨細胞前駆細胞は象牙スライスに変化を及ぼさないものの、分化後の破骨細胞はリン酸カルシウムを吸収し、吸収された部分の象牙スライスは濃く染色された。また、分化後の破骨細胞により吸収された象牙スライスを走査電子顕微鏡を用いて観察した。走査電子顕微鏡写真に代わる図面を図４に示す。中央部に吸収窩の形成が認められる。これは象牙質中のリン酸カルシウムが吸収されたことにより、コラーゲン繊維が露出したことにより形成されたものである。
さらに、リン酸カルシウム焼結石英ディスク（ＯｓｔｅｏｌｏｇｉｃＴＭ、住商ファーマ）の上で、破骨細胞前駆細胞を実施例１（４）にしたがって分化させ、リン酸カルシウム焼結石英ディスクを位相差顕微鏡を用いて観察した。それぞれの表面の顕微鏡写真に代わる図面を図５に示す。分化前の破骨細胞前駆細胞はリン酸カルシウム焼結石英ディスクに変化を及ぼさないものの、分化後の破骨細胞はリン酸カルシウムの吸収（結晶に空隙のできている部分）が認められた。
以上、試験例に示された結果より、分化前の細胞が破骨細胞前駆細胞であることおよび分化後の細胞が破骨細胞であることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、同一個体から繰り返し破骨細胞が入手でき、病態生理学的な検討や免疫学的な検討を加えることができる。また、本発明の破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を用いることにより、候補化合物が骨代謝疾患の治療に有用であるか否かのスクリーニングを容易に行うことが可能である。例えば、破骨細胞の骨吸収活性を阻害する化合物をスクリーニングより得た場合、この化合物は、過剰な骨吸収により生じる骨粗鬆症、糖尿病にともなう骨量の減少、骨軟化症などの治療に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色後の破骨細胞前駆細胞および破骨細胞を示す顕微鏡写真である。
図２は、破骨細胞前駆細胞内および破骨細胞内のＴＲＡＰが染色されたことを示す顕微鏡写真である。
図３は、象牙スライスを用いた破骨細胞前駆細胞および破骨細胞のリン酸カルシウム吸収能を示す顕微鏡写真である。
図４は、破骨細胞が象牙スライスのリン酸カルシウムを吸収することで、形成された吸収窩を示す顕微鏡写真である。
図５は、リン酸カルシウム焼結石英ディスクを用いた破骨細胞前駆細胞および破骨細胞のリン酸カルシウム吸収能を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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