(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかのポリペプチドからなる、以下の理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼ。
（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；
（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さない；
（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合の至適ｐＨが１０；及び、
（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定であるｐＨが５〜１０．５：
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１から１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列番号２で表される塩基配列において１から３０個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のＤＮＡあるいは請求項４記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
0004231709.tif 000026
（式中、Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｒ２は置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表されるジカルボニル基含有化合物とＲ３（Ｒ４）ＮＨ（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ３とＲ４は共に水素原子であることはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、請求項１に記載のデヒドロゲナーゼ、又は請求項５に記載の形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
Ｒ１が水素原子である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
Ｒ３がアミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基であり、Ｒ４が水素原子である、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
式（Ｉ）で表されるジカルボニル基含有化合物が、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、β―フルオロピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−ケトヘキサン酸又は２−ケトｎ−吉草酸である、請求項６から８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規デヒドロゲナーゼ、それをコードするＤＮＡ、及びそれを用いたＮ−アルキルアミノ酸の製造方法に関するものである。Ｎ−アルキルアミノ酸の中でも、特にＮ−メチルアミノ酸は、ジデムニン（Didemnin）あるいはドラスタチン（dolastatin）といった天然の生理活性物質の構造の一部で存在することが知られ(J.Am.Chem.Soc. 1981, 103号,p1857-1859;Tetrahedron 1993, 49号p9151-9170)、近年は医薬あるいは農薬の中間原料として注目されている有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−置換アミノ酸類の製造方法としては、アジドの還元的アルキル化による方法(J. Org. Chem. 1995, 60号, p4986-4987)、オキザゾリジン誘導体からの還元的開環反応による製法(Tetrahedron Letter 39 (1998) 1985-1986)といった化学的反応などが知られていた。
【０００３】
また、微生物を用いた方法としては、デヒドロゲナーゼ又はアミノトランスフェラーゼを用いた２−オキソカルボン酸誘導体からのアミノ酸類の製造方法が知られているものの、これらは主として、単なるアミノ化のみが行われているだけであり、置換アミノ基を用いたものとしては、シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物を用いてピルビン酸からＮ−メチルアラニンを製造する方法（J. Biol. Chem., 250号, p3746-3751(1975)）、及びロドコッカス属、アルスロバクター属の微生物を用いたメチルアミノ化方法（特開２００１−１９０２９８号公報）のように単なるメチルアミノ化のみが知られているのみであった。
【０００４】
また、上記反応に関与する酵素としては、J. Biol. Chem., 250号, p3746-3751(1975)に、シュードモナスＭＳ  ＡＴＣＣ２５２６２由来のＮ−メチルアラニンデヒドロゲナーゼが精製されたことが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のように、公知のアミノ酸デヒドロゲナーゼおよびＮ−メチルアミノ酸デヒドロゲナーゼは、アミン類又はジカルボニル基含有化合物といった基質特異性が限定されており、適用できる応用の範囲が狭い。また、上記した公知の酵素を用いてＮ−メチルアミノ化を行った場合、Ｎ−メチル−アミノ酸だけではなくアミノ基の置換基のない通常のアミノ酸も同時に製造されるため、工業的に有利な方法とは言えない。このため、新規なデヒドロゲナーゼの取得が望まれていた。即ち、本発明は、公知のデヒドロゲナーゼとは異なる性質を有する新規なデヒドロゲナーゼを提供することを解決すべき課題とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、シュードモナスプチダＡＴＣＣ１２６３３株より新規デヒドロゲナーゼを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼが提供される。
（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；
（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さない；
（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合の至適ｐＨが１０付近；及び、
（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定であるｐＨが５〜１０．５付近：
【０００８】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのポリペプチドが提供される。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列番号２で表される塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
（３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡまたは組換えベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、下記一般式（Ｉ）
【化４】
0004231709.tif 000002
（式中、Ｒ1は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表されるジカルボニル基含有化合物とＲ3（Ｒ4）ＮＨ（式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ3とＲ4は共に水素原子であることはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、本発明のデヒドロゲナーゼ、ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、Ｒ1は水素原子である。
好ましくは、Ｒ3はアミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基であり、Ｒ4が水素原子である。
好ましくは、式（Ｉ）で表される化合物は、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、β―フルオロピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−ケトヘキサン酸又は２−ケトｎ−吉草酸である。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、下記一般式（ＩＩ）：
【化５】
0004231709.tif 000003
（式中、Ｒ1は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表されるアミノカルボン酸類と、一般式（ＩＩ）で表されるアミノカルボン酸類を一般式（Ｉ）：
【化６】
0004231709.tif 000004
（式中、Ｒ1及びＲ2は、一般式（ＩＩ）における定義と同義である）で表される化合物に変換することのできる酵素と、Ｒ3（Ｒ4）ＮＨ（式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ3とＲ4は共に水素原子であることはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、本発明のデヒドロゲナーゼ、ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、Ｒ3はアミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基であり、Ｒ4が水素原子である。
好ましくは、一般式（ＩＩ）で表されるアミノカルボン酸類は、フェニルアラニンまたはメチオニンである。
好ましくは、式（ＩＩ）で表されるアミノカルボン酸類を式（Ｉ）で表されるアルキル置換アミン類に変換することのできる酵素は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（Ｉ）本発明のデヒドロゲナーゼ及びポリペプチド
本発明のデヒドロゲナーゼは以下の理化学的性質を有するものである。
（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；
（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さない；
（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合の至適ｐＨが１０付近；及び、
（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定であるｐＨが５〜１０．５付近：
【００１６】
本発明のデヒドロゲナーゼは、例えば、フェニルピルビン酸のようなジカルボニル基含有化合物と、ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨの存在下で、アンモニア、アルキルアミン及びジアルキルアミンを用いたスクリーニングを行うことにより、取得することができる。
【００１７】
スクリーニングに当たっては、デヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物から増殖菌体、該菌体破砕物、又はこれから通常の操作により単離した粗酵素又は精製酵素を用いることができる。
【００１８】
加えて、酵素の安定なｐＨが５〜１０．５付近である上で、至適ｐＨが１０付近となるといった特性を有することが本発明のデヒドロゲナーゼの特性である。
【００１９】
上記デヒドロゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダに属する微生物、特に好ましくは、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株より単離することができる。
【００２０】
上記デヒドロゲナーゼの具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、並びにそのホモログであってデヒドロゲナーゼ活性を有するものが挙げられる。
【００２１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるデヒドロゲナーゼの性質としては、上記（１）〜（４）で示される性質の他に以下のような特性も示す。
（５）Superose 12HR10/30（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いたゲル濾過法分析により測定される分子量が約８０〜９３キロダルトンであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動において、少なくとも約３６キロダルトンと推定されるポリペプチドのバンドを示す。
（６）フェニルピルビン酸とメチルアミンを基質とした場合の活性測定による至適温度は３５℃付近である。
（７）至適ｐＨ（フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合＝ｐＨ１０）において３０分処理したときの熱安定性は、約３０℃未満である。
（８）ピルビン酸だけでなく、少なくとも２−ケトヘキサン酸、フェニルピルビン酸、２−オキソ酪酸、β―フルオロピルビン酸、２−ケトｎ−吉草酸にも活性を示す。
（９）０．０１ｍＭの塩化水銀（ＨｇＣｌ2）及び０．０１ｍＭの塩化銅（ＣｕＣｌ2）といった２価の重金属によって活性が阻害される。
【００２２】
本発明のデヒドロゲナーゼのホモログとしては、
配列番号1で表されるアミノ酸配列において１から複数個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
が挙げられる。
【００２３】
尚、上記ポリペプチドのホモロジー検索は、例えば、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象に、FASTA programやBLAST  programなどを用いて行うことができる。
【００２４】
また、デヒドロゲナーゼ活性とは、一般に脱水素反応を触媒する活性の総称であるが、本発明ではＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の酸化還元反応に関する補酵素とアルキルアミン類によりカルボニル化合物をアルキルアミノ化させる活性をいう。
【００２５】
本発明のデヒドロゲナーゼの取得方法としては、上述したようにデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物から単離・精製する方法のほか、後述するように本発明のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作成したプローブを用いることにより、デヒドロゲナーゼ活性を有する任意の微生物から該還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。
【００２６】
あるいは、本発明のデヒドロゲナーゼは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米国Perkin Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオテク(Amersham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２７】
（II）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、上記デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたはそのホモログが提供される。
上記デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００２８】
本発明のデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのホモログとしては、
配列番号２で表される塩基配列において１から複数個（好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度）の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
が挙げられる。
【００２９】
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄＥｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、"モレキュラークローニング第２版" と略す）、ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより所望のホモログを得ることが可能である。
【００３０】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
上記したＤＮＡのホモログとしては、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
【００３２】
本発明のデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
【００３３】
まず、本発明のデヒドロゲナーゼを精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、染色体ＤＮＡからＰＣＲ法を用いたクローニング等の通常の遺伝子工学的解析手法を用いて、目的とするデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解析することができる。また、本発明により、その塩基配列が明らかになったため、当該塩基配列を元にプライマーを設定し、目的とする遺伝子をクローニングすることもできるし、ＤＮＡ合成装置により合成することもできる。
【００３４】
（III）本発明の組み換えベクター及び形質転換体
上記の（II）で取得された本発明のデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、公知の発現ベクターに挿入することにより、デヒドロゲナーゼ発現ベクターを提供することができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、デヒドロゲナーゼを該形質転換体から得ることができる。
【００３５】
本発明のデヒドロゲナーゼを発現させるための形質転換の対象となる微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３６】
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌；
ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；
ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ。
【００３７】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属であり、特に好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属である。
【００３８】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、モレキュラークローニング第２版などを参照）。
【００３９】
具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に本発明のＤＮＡを導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４０】
このとき、プロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込むことが好ましい。本発明で用いることができるプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、などに詳細に記述されている。
【００４１】
具体的には、例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４２】
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネータなどが利用できる。
【００４３】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで開発されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240を挙げることができる。
【００４４】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４５】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４６】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces  cerevisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４７】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４８】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００４９】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が開発されており、それらを適宜使用することができる。
【００５０】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が開発されており、好適に利用できる。
【００５１】
本発明のＤＮＡを有する形質転換体を培養し、培養物から公知の方法で本発明のデヒドロゲナーゼを単離精製することができる。
本発明のＤＮＡを有する形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５３】
形質転換体の培養物から、本発明のデヒドロゲナーゼを単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のデヒドロゲナーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５４】
また、本発明のデヒドロゲナーゼが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該デヒドロゲナーゼを回収後、該デヒドロゲナーゼの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がデヒドロゲナーゼが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該デヒドロゲナーゼを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００５５】
（IV）本発明のデヒドロゲナーゼを用いたＮ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造
さらに本発明は、下記一般式（Ｉ）
【００５６】
【化７】
0004231709.tif 000005
【００５７】
（式中、Ｒ1は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表されるジカルボニル基含有化合物とＲ3（Ｒ4）ＮＨ（式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ3とＲ4は共に水素原子であることはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、上記した本発明のデヒドロゲナーゼまたは形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法；及び、
下記一般式（ＩＩ）：
【００５８】
【化８】
0004231709.tif 000006
【００５９】
（式中、Ｒ1は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表されるアミノカルボン酸類と、一般式（ＩＩ）で表されるアミノカルボン酸類を一般式（Ｉ）：
【００６０】
【化９】
0004231709.tif 000007
【００６１】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、一般式（ＩＩ）における定義と同義である）で表される化合物に変換することのできる酵素と、Ｒ3（Ｒ4）ＮＨ（式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ3とＲ4は共に水素原子であることはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、本発明のデヒドロゲナーゼ、ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法に関する。
【００６２】
上記一般式（Ｉ）中のＲ1のアルキル基としては、ハロゲン原子、アリール基等の反応に不活性な基で置換されていていてもよい直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基であり、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、トリフルオロメチル基、ベンジル基等が挙げられる。このうち、好ましくは炭素数１〜１０、より好ましくは１〜４のものである。
【００６３】
上記Ｒ1として好ましくは、水素原子又は直鎖のアルキル基であり、特に好ましくは水素原子である。
【００６４】
上記Ｒ2のアルキル基としては、ハロゲン原子、水酸基、アリール基等の反応に不活性な基で置換されていていてもよい直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基であり、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシメチル基、ベンジル基等が挙げられる。
【００６５】
上記Ｒ2のアリール基としては、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、アリール基等の反応に不活性な基で置換されていていてもよいアリール基であり、具体例としては、フェニル基、トリル基、フルオロフェニル基、ヒドロキシフェニル基等が挙げられる。
【００６６】
上記置換されていてもよいアルキル基及びアリール基として好ましくは炭素数１〜１０のものである。
【００６７】
上記Ｒ2として好ましくは、アルキル基、ハロアルキル基、アラルキル基であり、このうち、直鎖状のものが特に好ましい。
【００６８】
一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい具体例としては、ピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸、フェニルピルビン酸、β−フルオロピルビン酸、２−ケトヘキサン酸、２−ケトイソヘキサン酸、２−オキソ酪酸、２−ケトオクタン酸又は２−ケトｎ−吉草酸が挙げられ、特に好ましくはピルビン酸、フェニルピルビン酸、β―フルオロピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−ケトヘキサン酸又は２−ケトｎ−吉草酸である。
一般式（ＩＩ）で表される化合物の好ましい具体例としては、フェニルアラニン、メチオニンである。
【００６９】
本反応に用いられるアミン類は、Ｒ3（Ｒ4）ＮＨで表されるものである。
ここで、上記Ｒ3及びＲ4として、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基であり、ここで、置換されていてもよいアルキル基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アリール基等の反応に不活性な基で置換されていていてもよい直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基である。
【００７０】
上記置換されていてもよいアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシメチル基、アミノメチル基、ベンジル基等が挙げられ、このうち好ましくは直鎖状のアルキル基又はアミノアルキル基である。
また、上記置換されていてもよいアルキル基としては、炭素数１〜６のものが好ましく、より好ましくは炭素数１〜４のものである。
【００７１】
上記アミン類の好ましい具体例としては、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジアミノメタン、ジメチルアミン、シクロヘキサンアミン等が挙げられ、より好ましくは１級のアミン類であり、特に好ましくはメチルアミンである。
【００７２】
本反応において、反応基質であるジカルボニル基含有化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。これらは、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
本反応において、反応基質であるアミノカルボン酸類は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。
【００７３】
また、アミン類は、ジカルボニル基含有化合物及びアミノカルボン酸類に対して等モル量以上、好ましくは１．５モル倍以上用いられる。上記範囲であれば、通常、系内のｐＨ及びコスト等を勘案して任意に用いればよいが、通常、５０モル倍量以下、好ましくは２０モル倍以下である。
【００７４】
本反応において、ジカルボニル基含有化合物及びアミノカルボン酸類に上記形質転換体を作用させるに当たっては、該形質転換体をそのまま、該形質転換体をアセトン、ＤＭＳＯ、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該形質転換体中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを用いることができる。
【００７５】
また、本反応においては、補酵素ＮＡＤ＋あるいはＮＡＤＰ＋（以下ＮＡＤ（Ｐ）＋と略）もしくはＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ（以下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略）を添加するのが好ましく、通常、０．００１mM〜１００mM、好ましくは０．０１〜１０mM添加する。
【００７６】
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、上記再生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
【００７７】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
【００７８】
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
【００７９】
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のデヒドロゲナーゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
【００８０】
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなど、の添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるジカルボニル基含有化合物に対して、０．１〜２０モル倍量、好ましくは１〜５モル倍量添加する。
【００８１】
また、上記３）の方法においては、本発明のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
【００８２】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００８３】
本反応は、反応基質及び本発明の形質転換体並びに必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
【００８４】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド等の水溶性有機溶媒や酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等の非水溶性有機溶媒などから適宜反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
【００８５】
本反応は、通常、４〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃の反応温度で、通常ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜１１で行われる。
また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００８６】
さらに、本反応において、一般式（Ｉ）で表される化合物のうちカルボン酸エステル類を反応原料として用いる場合には、市販の加水分解酵素を系内に共存させ、系内でＲ1が水素原子であるカルボン酸類に変換させ引き続き、Ｎ−アルキルアミノ化してもよい。
【００８７】
また、本反応においては、上記一般式（Ｉ）に対応するアミノカルボン酸類、すなわち一般式（ＩＩ）で表される化合物（Ｒ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＲ1）を反応原料として用い、一般式（ＩＩ）で表される化合物に作用し一般式（Ｉ）で表される化合物に変換する事の出来る酵素を共存させることにより、系内で上記一般式（Ｉ）で表される化合物を生成させ、引き続き、本デヒドロゲナーゼによりＮ−アルキルアミノ化してもよい。
【００８８】
一般式（ＩＩ）で表される化合物に作用し一般式（Ｉ）で表される化合物に変換する事の出来る酵素であれば特に限られないが、具体的にはアミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼやアミノ酸トランスフェラーゼがあげられる。好ましくは基質特異性の広い酵素が好ましい。具体的にはEnzyme and Microbial Technology vol.31(2002) p77-87に記載されているＬ−アミノ酸オキシダーゼ、シグマ社製のＤ−アミノ酸オキシダーゼなどがあげられる。用いられるアミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼやアミノ酸トランスフェラーゼは、アミノ酸にのみ反応するものであり、かつ本反応で用いられる補酵素に対応するものを使用できると補酵素の再生システムの代替ともなり好ましい。すなわち、本反応のＮ−アルキルアミノ化において、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いた場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは本反応のＮ−アルキルアミノ化によりＮＡＤＰ＋となるが、一方で、アミノカルボン酸類から上記一般式（Ｉ）で表される化合物を製造するに当たり、このＮＡＤＰ＋を利用してＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ変換することとなる。また一般式（ＩＩ）で表される化合物に作用し一般式（Ｉ）で表される化合物に変換する事の出来る酵素がカルボン酸基に置換基のないアミノ酸のみに作用する場合、該アミノカルボン酸をアミノ酸に加水分解する酵素をさらに共存させ、該アミノ酸を生成せしめた後に反応を行わせても良い。
【００８９】
本反応により生成するＮ−アルキル−アミノ酸誘導体は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９０】
【実施例】
本実施例における酵素活性は下記のような方法で測定した。
測定対象となる粗酵素液にフェニルピルビン酸ナトリウム（最終濃度１５ｍＭ）、メチルアミン−硫酸緩衝液（ｐＨ１０）（最終濃度４００ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（最終濃度１０ｍＭ）を加え全量５０μＬとした。３７℃で１時間反応させた。反応終了後、５μＬの１０％トリクロロ酢酸液を加え１３０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った。遠心上清１０μＬを４０μＬの高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）溶離液で希釈し０．４５μｍのフィルターで濾過後高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）にて分析した。
【００９１】
ＨＰＬＣの条件は
カラム：Ｕｌｔｒｏｎ  ＥＳＰｈ−ＣＤ（信和化工株式会社）
温度：４０℃
溶離液：２０％アセトニトリル、８０％  ２０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、Ｈ3ＰＯ4  ０．４ｍｌ／Ｌ（ｐＨ３）
流速：０．８５ml/min.
検出器：ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）
標準サンプルとしてＳｉｇｍａ社の試薬を用いた。
酵素の活性単位１ｕｎｉｔを一分間に１μモルのＮ−メチルフェニルアラニンを生成する酵素量と規定する。
【００９２】
実施例１：酵素精製
（１−１）
滅菌した液体培地１００ｍｌ（メチルアミン塩酸塩 ５g/L, グルコース １g/L, 酵母エキス ５g/L, リン酸水素二カリウム ７g/L, リン酸二水素カリウム ３g/L, 硫酸マグネシウム七水和物 ０．１g/Lを含む）×２本（５００ｍｌ坂口フラスコ）に、シュードモナス  プチダ  ＡＴＣＣ１２６３３株を接種し、２８℃で１８時間、好気的に振とう培養した（前々培養）。次に、同じ組成の滅菌した液体培地５００ｍｌ×４本（２Ｌ坂口フラスコ）に、前々培養で得られた培養液を各２Ｌ坂口フラスコに５０ｍｌずつ接種した。２８℃で８時間、好気的条件で振とう培養した（前培養）。１％ポリペプトン（ナカライテスク社製）、０．５％酵母エキス（ナカライテスク社製）、１％塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）を添加した培地（以下、ＬＢ培地と略す）２００Ｌを滅菌して、前培養で得られた培養液２２００ｍｌをすべて接種し、２８℃で好気的に１６時間培養した（本培養）。培養後得られた培養液を遠心分離し、２．５ｋｇの湿菌体を得た。この菌体を、５Ｌの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕によって５．９Ｌの粗酵素液を得た。
【００９３】
粗酵素に対し硫安分画を行ったところ、硫安濃度２０〜６０％画分に活性があった。この画分を集めて１５Ｌの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で５回透析した。酵素液の量は３１００ｍｌになった。
【００９４】
（１−２）SuperQ-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製
２０ｍＭトリス−塩酸バッファー (pH 7.0)で平衡化したSuperQ-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）７００ｍＬに、硫安分画20〜60％飽和の画分３１００ｍＬを供した。その後２０ｍＭトリス−塩酸バッファー  (pH 7.0) ４９００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には活性が検出されなかった。
上記洗浄後、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー３５００ｍＬで溶出した。この条件で、活性を持つタンパク質が溶出された。さらに、０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー３５００ｍＬで溶出したが、この画分では活性が検出されなかった。
【００９５】
上記０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファーで溶出した画分を回収し、タンパク量及び酵素活性を測定した。活性を示した溶液３９００ｍＬを、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) に１２Ｌで３回透析した。透析後の酵素液は３０００ｍＬであった。
【００９６】
（１−３）Butyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製
上記（１−２）で得た酵素液３０００ｍＬを、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で平衡化したButyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）５００ｍＬに流した。その２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２８００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分のタンパク量及び酵素活性を測定したところ、この画分に活性が検出された。洗浄で得た酵素液に直接硫安を加えて、硫安濃度が５〜２０％飽和の画分を取得し再びButyl-TOYOPEARLに流すことにした。
【００９７】
（１−４）Butyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による２回目の精製
得られた硫安画分の酵素液５７００ｍＬを、３０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で平衡化したButyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）５００ｍＬに流した。その後、３０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２３００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分のタンパク量及び酵素活性を測定したところ、この画分に活性が検出された。続いて、このカラムを１５％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で溶出した。その結果、溶出液にも活性が検出された。活性を示した上記両方の画分を回収し、60％飽和濃度になるように３０７０ｇの硫安を加えて撹拌し、濃縮した。その結果、酵素液は６００ｍＬとなった。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)１４Ｌで３回透析を行い、得られた酵素液は１０００ｍＬになった。
【００９８】
（１−５）DEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製
上記（１−４）において透析して得た酵素液１０００ｍＬを、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化したDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）６００ｍＬに供した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)４０００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には活性がみられなかった。続いて０．１Ｍの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２５００ｍＬで溶出した。その結果、この画分にほとんど活性が検出されなかった。次に、塩化ナトリウム濃度が０．１〜０．３Ｍとなるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したところ、１７００ｍＬの酵素液が得られた。この酵素液に７６０ｇの硫安を加えて撹拌し、濃縮した。その結果、酵素液は６０ｍＬになった。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)８Ｌで2回透析を行った。透析後、酵素液は１００ｍＬになった。
【００９９】
（１−６）Green-sepharose CL-4Bによる精製
市販の膨潤SepharoseCL-4Bゲル150mlをガラスフィルター上にとり、１Lの蒸留水を用いて吸引洗浄した。これを２Ｌ坂口フラスコに移した。これに、150mＬの水に溶かしたReactive Green 19(Sigma社製) 0.75ｇ（7.5mg色素／ｍＬゲルの割合）を加えた。さらに２２％塩化ナトリウム水溶液15mＬ（最終濃度：約2％）を加え、ゲルと色素がよく混ざり合う程度で、約30分間振とう撹拌した。１．５ｇの結晶炭酸ナトリウムを加えて、５０℃で一晩振とう撹拌した。反応終了後、ゲル懸濁液をガラスフィルターに移し、水（約１．５Ｌ）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（約１．５Ｌ）、水（約３Ｌ）の順序で、ろ液の着色が見られなくなるまで色素ゲルを洗浄し、Green-sepharose CL-4Bを調製した。
【０１００】
上記方法で調製したGreen  sepharose CL-4B ４５０ｍＬを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記（１−５）で得た酵素液１００ｍＬを流した。
その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)３０００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には、上記（１−５）で得られた酵素液のトータル活性の１５％ほどの活性が検出された。次に、塩化ナトリウム濃度が０〜３Ｍになるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したところ、２３１ｍＬの酵素液が得られた。これに、70％飽和濃度になるように硫安を１０９ｇ加えてタンパクを沈殿させた。沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)３ｍＬに懸濁し、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)９Ｌで８時間透析した。透析後、チューブ内に沈殿物が見られたため、透析と同じバッファー８．５ｍＬを加えて懸濁した。この操作でも沈殿物が溶解しなかったため、遠心して沈殿物と上清を分離した。活性がほとんど上清の方にみられたため、上清１３ｍＬをRESOURCE PHE（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。20 mＬの２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)と20 mＬの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)でグラジェントをかけてタンパクを溶出した。
回収した酵素液１９ｍＬを限外濾過で５ｍＬまで濃縮した後に、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で透析したところ、酵素液は６．５ｍＬになった。
【０１０１】
（１−７）Blue-sepharose 4B（アマシャムバイオサイエンス社製）による精製
Blue−sepharose  4B（アマシャムバイオサイエンス社製）５ｍＬを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記（１−６）で得られた酵素液６．５ｍＬを流した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)５０ｍＬで洗浄を行った。さらに、50 mＬの1Ｍ塩化ナトリウム水溶液と50 mＬの20mM トリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で、塩化ナトリウム濃度が０〜１Ｍとなるようにグラジエントをかけ活性画分を溶出させた。
上記（１−１）〜（１−７）の各精製ステップにおける酵素画分の比活性等を表１にまとめる。
【０１０２】
【表１】
0004231709.tif 000008
【０１０３】
実施例２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび部分アミノ酸配列の解析
各酵素精製ステップのサンプルをすべてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。
精製と共に量の増加が見られる約３５〜４０ｋＤａを通常の方法で切り出し、プロテインシーケンサーにより、エドマン法によるアミノ酸配列の解析を行い、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。該配列を配列表の配列番号３で示す。
ＢＬＡＳＴサーチにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼと相同性が高い蛋白であることが示唆された。
【０１０４】
実施例３：酵素遺伝子のクローニング
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＡＴＣＣ１２６３３株をＬＢ培地で培養し得られた菌体よりDNeasy Tissue Kit (Qiagen社製)を用いて、染色体DNAを調製した。
実施例２で決定されたN末端アミノ酸配列及びＢＬＡＳＴサーチで見出されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を元にプライマーを合成した。それぞれの塩基配列を、配列表の配列番号４(NMPDHf)及び５ (NMPDHr1) に示す。
【０１０５】
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株の染色体DNAを鋳型とし、NMPDHf、NMPDHr1をプライマーとして、PCR(98℃,20秒、68℃,3分)を30サイクル行い、特異的な増幅サンプルを得た。
上記で得られたＤＮＡ断片を常法に従い、クローニングベクターｐＥＴ２１ａ（宝酒造社製））に導入した。（このプラスミドをpENMadhとする）
【０１０６】
次に大腸菌（Escherichia coli）BL21（DE3）（Novagen社）を形質転換した。
形質転換株をアンピシリン（１００μg/mL）を含むＬＢ培地プレート（LB培地＋２％寒天）上で３７℃で生育させた。出現したいくつかの白いコロニーを培養しプラスミドの抽出を通常の条件で行った。とれたプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断後（３７℃で３時間）、目的ＤＮＡ断片がプラスミドに挿入されているかアガロース電気泳動で確認した。
【０１０７】
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、培養１４時間目にＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように添加しさらに培養を３時間続けて、集菌した。菌体を超音波破砕し粗酵素を得た。
得られた粗酵素の活性測定を行って目的蛋白の発現を確認した。
【０１０８】
目的断片が入ったコロニーから得られた粗酵素を用いるとＮ−メチル−フェニルアラニンの生成が確認され、プラスミドのみで形質転換した菌体破砕物ではＮ−メチル−フェニルアラニン生成が見られなかった。
活性確認されたプラスミド中の挿入断片の塩基配列を解析した。該遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【０１０９】
実施例４：形質転換体の無細胞抽出液を用いたＮ−メチル−フェニルアラニンの合成
ＬＢ培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分間蒸気殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌ アンピシリン水溶液を５μＬ加えた。これに実施例３で得られた大腸菌クローン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種して、３７℃で２４時間振とう培養した（前培養）。次にＬＢ培地５０ｍＬを５００ｍＬの坂口フラスコに入れて殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌアンピシリン水溶液を５０μＬ加えた。これに前培養で得られた大腸菌クローン株の培養液０．５ｍＬを接種して、３７℃で１０時間振とう培養した。この段階で１ＭのＩＰＴＧ水溶液を５０μＬ加え、さらに３７℃で３時間振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を集め、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で２回洗浄した。得られた菌体０．３７ｇを２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）８．０ｍＬに懸濁し、超音波で菌体を破砕した。遠心分離により菌体断片を除き、８．０ｍＬの無細胞抽出液を得た。
【０１１０】
５０ｍＬのビーカーに、フェニルピルビン酸ナトリウム６０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ２．３ｍｇ、グルコース脱水素酵素３５Ｕ、グルコース１ｇを含有する４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）５．８８ｍｌに、硫酸でｐＨ ８．０に調整した２４０ｍＭメチルアミンを５．８８ｍＬ、上記無細胞抽出液３．２５ｍＬを入れ、３０℃で反応を行った。反応は１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．０に調整しながら、撹拌しつつ行った。反応液の一部を定期的にＨＰＬＣで分析し、基質のフェニルピルビン酸ナトリウムが枯渇している場合には、さらに３０ｍｇを追加して反応を継続させた。この操作を８回繰り返しつつ、２４時間反応した。反応終了後のＮ−メチルフェニルアラニンの生成量は１４６ｍｇであった。
【０１１１】
実施例５：形質転換体からの酵素精製
ＬＢ培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分間蒸気殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌ アンピシリン水溶液を５μＬ加えた。これに実施例３で得られた大腸菌クローン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種して、３７℃で２４時間振とう培養した（前培養）。次にＬＢ培地５００ｍＬを２Ｌの坂口フラスコに入れて殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌ アンピシリン水溶液を５００μＬ加えた。これらに前培養で得られた大腸菌クローン株の培養液０．５ｍＬを接種して、３７℃で１４時間振とう培養した。この段階で１ＭのＩＰＴＧ水溶液を５００μＬ加え、さらに３７℃で３時間振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を集め、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で２回洗浄した。得られた菌体３．３ｇを２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２８ｍＬに懸濁し（全量３０ｍｌ）、超音波で菌体を破砕した。遠心分離により菌体断片を除き、２９ｍＬの無細胞抽出液を得た。次に実施例１で用いたGreen sepharose CL-4Bを用いて精製を行った。
Green sepharose CL-4B（樹脂１００ｍｌ量）をトリス塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記無細胞抽出液を流した。
【０１１２】
その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)８００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には、次に、塩化ナトリウム濃度が０〜１Ｍになるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収し、これをCentriprep（アマシャムバイオサイエンス社製）で濃縮した。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で８時間透析した。透析後、酵素液量は５９ｍｌとなった。
【０１１３】
次にDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製を行った。
上記の透析して得た酵素液を、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化したDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）（樹脂６０ｍＬ）に供した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)５００ｍＬで洗浄を行った。次に、塩化ナトリウム濃度が０〜０．３５Ｍとなるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収し、Centriprep（アマシャムバイオサイエンス社製）で濃縮した後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)に対して透析を行った。透析後、酵素液は６ｍＬになった。
上記の各精製ステップにおける酵素画分の比活性比を表２にまとめる
【０１１４】
【表２】
0004231709.tif 000009
【０１１５】
実施例６：本酵素の基質特異性
実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表３に示す各種ケト酸を最終濃度10mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、硫酸でｐＨ１０に調整したメチルアミンを最終濃度６0mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。β−フェニルピルビン酸を基質としたときを100％として相対活性の結果を表３に示した。
【０１１６】
【表３】
0004231709.tif 000010
【０１１７】
実施例７：至適ｐＨの測定
実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これにβ−フェニルピルビン酸を最終濃度10mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、硫酸で各ｐＨに調整したメチルアミンを最終濃度６0mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。一分間に１マイクロモルのβ−フェニルピルビン酸と反応する酵素量を１ｕｎｉｔととして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）とｐＨの関係の結果を図１に示した。反応の至適pHは10.0であった。
【０１１８】
実施例８：酵素の作用至適温度
実施例６と同様な反応条件のうちメチルアミン−硫酸（ｐＨ１０）にして、温度だけを変化させて活性を測定した。結果を図２に示す。至適温度は３０〜４０℃であった。
【０１１９】
実施例９：pH安定性
実施例５で得られた精製酵素を、緩衝液を用いてｐＨを変化させて30℃で30分間インキュベートし、残存活性を測定した。反応条件は実施例７と同様にメチルアミン−硫酸（ｐＨ１０）、３７℃で行った。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図３に示した。本発明による酵素は、ｐＨ６〜９において最も安定であった。
【０１２０】
実施例１０：酵素の温度安定性
実施例５で得られた精製酵素を２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃および５０℃の温度で３0分間放置した後、実施例７と同様に活性を測定した。結果は、未処理（氷中放置）の活性を１００とした残存活性で表し、図４に示した。本発明による酵素は、３０℃まで１００%の残存活性を示した。
【０１２１】
実施例１１：ＮＡＤＨを補酵素とした場合の本酵素の基質特異性
実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表４に示す各種ケト酸を最終濃度40mM（但しβ−フェニルピルビン酸は30mM）、ＮＡＤＨを最終濃度0.3mM、bis-Tris propane緩衝液（ｐＨ10.0）を最終濃度100mM、メチルアミンを最終濃度180mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。ピルビン酸を基質としたときを100％として相対活性の結果を表４に示した。
【０１２２】
【表４】
0004231709.tif 000011
【０１２３】
実施例１２：ＮＡＤＨを補酵素とした場合の至適ｐＨの測定
実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これにピルビン酸を最終濃度80mM、ＮＡＤＨを最終濃度0.3mM、硫酸で各ｐＨに調整したメチルアミンを最終濃度180mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。一分間に１マイクロモルのピルビン酸と反応する酵素量を１ｕｎｉｔととして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）とｐＨの関係の結果を図５に示した。反応の至適pHは9.5であった。
【０１２４】
実施例１３：ＮＡＤを補酵素とした場合の逆反応の検討
実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
Ｎ−メチル-L-アラニンを最終濃度50mM、ＮＡＤを最終濃度10mM、bis-Tris propane緩衝液（ｐＨ10.0）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。活性は7.8×10-3（ｕ／ｍｇ蛋白）であった。
【０１２５】
実施例１４：ＮＡＤＰＨを補酵素とした場合の本酵素の基質特異性
実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表５に示す各種アミン類を最終濃度60mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、β−フェニルピルビン酸を最終濃度10mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。メチルアミンを基質としたときを100％として相対活性の結果を表５に示した。
【０１２６】
【表５】
0004231709.tif 000012
【０１２７】
実施例１５：枯草菌からのDNAの精製
枯草菌（Bacillus subtilis 株）をLB培地上で培養し、菌体を調製した。菌体から染色体DNAの調製はQiagen  kit(Qiagen社製)を用い、付属マニュアル記載の方法により行った。
【０１２８】
実施例１６：枯草菌からのグルコース脱水素酵素遺伝子のクローニング
NADPHの再生を行わせるために、文献（J.Bacteriol.166,238-243(1986)）記載の枯草菌由来グルコース脱水素酵素（以下GDHと略す）遺伝子のクローニングを行った。文献記載の塩基配列を元に、GDH遺伝子のオープンリーディングフレーム部分ののみをPCRクローニングするため構造遺伝子の5-末、3'-末の配列を元にプライマー  BsuG_S(配列番号６)、BsuG_A(配列番号７)を合成した。実施例１７により調製した枯草菌染色体DNAを鋳型としてPCR（94℃、30秒、54℃、30秒、72℃1分）を30サイクル行い、特異的な増幅DNAを得た。得られたDNA断片をEcoRIとHindIIIの2種類の制限酵素で消化した。プラスミドベクターpKK223-3(アマシャム−ファルマシア社製)をEcoRIとHindIIIで消化し、上記PCR増幅DNA断片をT4DNAリガーゼで連結し、pKK223-3GDHを得た。挿入断片の塩基配列解析を行った結果、データベース(DDBJ AccessionNo. M12276)に収録されている塩基配列と全て一致した。得られたGDH遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
【０１２９】
実施例１７：pENMadh [pET21aに本デヒドロゲナーゼのDNA断片を挿入したプラスミド]と共発現できるＧＤＨプラスミドpSTV28-GDHの構築
実施例１６で構築したpKK223-3GDHをEcoRI、PstIの2種類の制限酵素で消化し、枯草菌GDH遺伝子を含む断片を調製した。プラスミドベクターpSTV28(TAKARA社製)をEcoRI、PstIで消化し、上記GDHを含む断片をT4DNAリガーゼで連結し、pSTV28-GDHを得た。
【０１３０】
実施例１８：枯草菌由来GDHと本デヒドロゲナーゼの大腸菌における共発現
pENMadh を保持する大腸菌BL21(DE3) クローン株をpSTV28-GDHで形質転換した。組み換え大腸菌を100ug/mLのアンピシリン、25ug/mLのクロラムフェニコールを含む液体LB培地に植菌し１７時間培養した後、1mM IPTGを添加し、さらに３時間培養した。集菌後、20mM Tris-HCL (pH7.0) にて懸濁し、超音波破砕によって得られた細胞粗抽出液の酵素活性を測定した。
【０１３１】
（１）本デヒドロゲナーゼ活性の測定
本デヒドロゲナーゼ活性の測定は100mMbis-trispropaneバッファー（pH10.0）、0.2mM NADPH、30mM methylamine、10mM ピルビン酸ナトリウムを含む反応液で30℃で行った。1Uは上記反応条件で1分間に1μmolのNADPHを酸化する酵素量とした。結果、6.6U/mg蛋白であった。
【０１３２】
（２）グルコース脱水素酵素活性の測定
粗酵素１０μlにグルコースを最終濃度100mM、ＮＡＤＰを最終濃度2mM、 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ9.0）を最終濃度100mM、となるように加えた反応液１ｍｌの３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３０℃にした。一分間に１マイクロモルのグルコースと反応する酵素量を１ｕｎｉｔととして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）を求めた。結果、１mg蛋白あたり3.4Uであった。
【０１３３】
実施例１９：グルコース脱水素酵素共発現形質転換体を用いたＮ−メチル−フェニルアラニンの合成
実施例１８で得られた大腸菌を実施例１７と同様に培養し培養液１００ｍｌを得た。培養後、遠心分離により菌体を集め、0.85%の食塩を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）４0ｍｌで２回洗浄休止菌体を得た。
得られた休止菌体に最終濃度100mMのフェニルピルビン酸ナトリウム、最終濃度0.2mMのＮＡＤＰ最終濃度100ｍＭのグルコース、および最終濃度700mMのメチルアミン−塩酸(pH９)を含む反応液を加え菌体の濁度を２０（66０nmの吸光度）となるようにした。３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応は１０規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８〜９に調整しながら、撹拌しつつ行った。２４時間反応後のＮ−メチルフェニルアラニンの生成量は13.4g/Lであった（反応収率７５％）。
【０１３４】
実施例２０：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとの共反応（１）
実施例１０と同様な方法で大腸菌クローン株の精製本酵素を得た。
これに最終濃度50mMとなるようにＤ−フェニルアラニン、またＮＡＤＰＨを最終濃度10mM、硫酸でｐＨを１０にあわせたメチルアミンを最終濃度６0mM、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液１００μlにＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社製  porcine kidney由来）を0.052unit加えた。このとき反応液中の本酵素の蛋白量は２６．５μｇとなるようにした。測定時の反応温度は３０℃にした。
【０１３５】
９００分後反応液にトリクロロ酢酸を最終濃度２％となるように２５μl添加し反応を終了させた。反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：ＯＤＳカラム  UK-C18 250 x 4.6mm （imtakt社製）
溶離液：水１００％
流速：0.5ml/min
温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０nm
測定の結果Ｎ−メチルフェニルアラニンが0.46g/L生成されていた。残存するフェニルアラニンは1.06g/Lであった。
【０１３６】
実施例２１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとの共反応（２）
フェニルアラニンを用いる代わりにＤ−メチオニンを用いた以外は実施例２０と同様に行った。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図６に示す。ＨＰＬＣのリテンションタイムはメチオニンが１０．６分であるが１４．１分にピークが反応と共に生成されておりＮ−メチルメチオニンと推測された。そこで同分析カラムを用いて下記の条件のＬＣ−ｍａｓｓにかけた。マススペクトルの結果を図７に示す。Ｎ−メチルメチオニンと推定されたピークの分子量は１６３となり、Ｎ−メチルメチオニンの分子量と一致した。
【０１３７】
ＬＣ−ｍａｓｓ条件
装置：Waters  ２６９０型セパレーションモジュール  および  micromass  ＺＭＤ型質量分析計
カラム：ＯＤＳカラム  UK-C18 250 x 4.6mm （imtakt社製）
溶離液：水１００％
流速：0.5ml/min
温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０nm
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）  正イオン検出
質量走査条件：m/z60-500 1sec
印可電圧：３．６ｋＶ
コーン電圧：１０Ｖ
【０１３８】
実施例２２：Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼとの共反応
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの代わりにＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（シグマ社製）、およびＤ−フェニルアラニンの代わりにＬ−フェニルアラニンを用いる以外は実施例２０と同様に反応を行った。
結果Ｎ−メチルフェニルアラニンが0.21g/L生成されていた。また残存するＬ−フェニルアラニンは2.75g/Lであった。
【０１３９】
実施例２３：
実施例１０と同様な方法で大腸菌クローン株の精製本酵素を得た。
本酵素の蛋白量１４μgに最終濃度30mMとなるようにメチルピルビン酸、またＮＡＤＰＨを最終濃度10mM、硫酸でｐＨを１０にあわせたメチルアミンを最終濃度６0mM、リン緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液１００μlを反応温度３０℃で４時間反応させた。反応終了後下記の条件のＨＰＬＣで分析を行った。
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＷＨ 250 x 4.6mm （ダイセル社製）
溶離液：2mM CuSO4
流速：0.5ml/min
温度：５０℃
検出：ＵＶ２５４nm
結果Ｎ−メチルアラニンが０．1g/L生成されていた。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明によれば、公知のデヒドロゲナーゼとは異なる性質を有する新規なデヒドロゲナーゼが提供される。本発明のデヒドロゲナーゼを用いることにより、医薬あるいは農薬の中間原料として有用なＮ−アルキルアミノ酸を製造することができる。
【０１４１】
【配列表】
0004231709.tif 000013
【０１４２】
0004231709.tif 000014
0004231709.tif 000015
【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの至適pHを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの至適温度を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼのpH安定性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの熱安定性を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼに対するpHの影響を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとの共反応産物をＨＰＬＣ分析した結果を示す。
【図７】図７は、図６のpeak-1とpeak-2についてマススペクトル解析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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