(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析部位がキャリアー（２１、５１）をくりぬいたマイクロディッシュ（２３、５３）からなり、マイクロディッシュの側壁および底、並びに、マイクロディッシュエッジと呼ばれる各マイクロディッシュの周りのキャリアー表面領域が、少なくとも一つの親水性部材（２４、２６、５５、５７）からなり、かつ、マイクロディッシュの周りの領域の間に配置されたキャリアーの平面状領域が疎水性部材（２７、５９）からなる、化学的または生物学的試薬を固定することができる複数の分析部位を備えたキャリアーを有する化学的または生物学的分析のための装置。
【請求項２】
マイクロディッシュが、扁平した錐体の形状を備え、その小さい方の底面がマイクロディッシュの底に対応する、請求項１記載の装置。
【請求項３】
マイクロディッシュの側壁、底およびエッジが、同一の親水性部材からなる、請求項１または２記載の装置。
【請求項４】
マイクロディッシュの底が、第一の親水性部材（２４、５５）からなり、少なくとも一部のマイクロディッシュの側壁とマイクロディッシュのエッジが第二の親水性部材（２６、５７）からなり、単独で第一の親水性部材が化学的または生物学的試薬を固定することができる、請求項１または２に記載の装置。
【請求項５】
親水性部材が、エポキシ基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−、−ＮＨ2および−ＣＯＯＨから選択された親水性基を含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
疎水性部材が、炭化水素含有基および過フッ化炭化水素含有基から選択された疎水性基を含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
第一の親水性部材が、第二の親水性部材とは異なる親水性基を含む、請求項４および５記載の装置。
【請求項８】
キャリアーが、電子的機能を有する集積電子システムを備えた活性基板を含む、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
生物学的試薬がオリゴヌクレオチドである、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
請求項３にかかる化学的または生物学的分析のための装置を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）キャリアーの表面においてマイクロディッシュをくりぬくこと、
ｂ）疎水性部材を含めるキャリアー表面の領域を規定すること、および
ｃ）疎水性部材を全く含まない、マイクロディッシュとキャリアー表面の領域上に親水性部材を形成すること、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項３にかかる化学的または生物学的分析のための装置を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）キャリアーの表面においてマイクロディッシュをくりぬくこと、および
ｂ）親水性部材を含めるキャリアー表面の領域に親水性部材を形成すること、を含む方法。
【請求項１２】
請求項４にかかる化学的または生物学的分析のための装置を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）キャリアーの表面においてマイクロディッシュをくりぬくこと、
ｂ）疎水性部材を含めるキャリアー表面の領域を規定すること、
ｃ）疎水性部材を全く含まないキャリアー表面、および、マイクロディッシュの表面に、第一親水性部材の部位に対応する第一領域と第二親水性部材の部位に対応する第二領域を規定すること、
ｄ）第一領域に第一親水性部材を、並びに、第二領域に第二親水性部材を形成すること、
を含む方法。
【請求項１３】
疎水性部材を含めるキャリアー表面の領域に疎水性部材を形成する付加工程を含む、請求項１０ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
マイクロディッシュがエッチングによって形成される、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
キャリアーが、ポリマーの表面層または電子的機能を備えた活性基板に沈着された鉱物酸化物を含み、マイクロディッシュがポリマーまたは酸化物層にエッチングによって形成される、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
キャリアーが、ケイ素またはガラスであり、疎水性部材は、ガラスまたはケイ素を予め酸化してから、疎水性シラニゼーション剤とを反応させることによって形成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
疎水性シラニゼーション剤が、以下の式：
【化１】
0004382285.tif 000005
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、同一または相違してもよく、Ｃ1ないしＣ3アルコキシ基およびハロゲン原子から選択され、かつＲ4が、それぞれ、直鎖または分枝状の、炭化水素含有基または過フッ化炭化水素含有基である］
を有するシランである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
キャリアーが、ケイ素またはガラスであり、親水性部材は、ガラスまたはケイ素を予め酸化してから、親水性シラニゼーション剤と反応させることによって形成される、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
親水性シラニゼーション剤が、以下の式：
【化２】
0004382285.tif 000006
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、同一または相違してもよく、Ｃ1ないしＣ3アルコキシ基およびハロゲン原子から選択され、かつＲ5が、直鎖または分枝状の、エポキシ基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2および−ＣＯＯＨから選択された少なくとも一つの親水性基を有する炭化水素含有基である］
を有するシランである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
疎水性部材が、疎水性炭化水素含有基または過フッ化炭化水素含有基を含むチオールまたはジスルフィドと、疎水性部材から形成される、キャリアー表面の領域に沈着された、金、銀、銅またはそれらの合金の一つの金属層との反応によって形成される、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
親水性部材が、エポキシ基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−、−ＮＨ2および−ＣＯＯＨから選択された少なくとも一つの親水性基を含むジスルフィドまたはチオールと、親水性部材から形成される、キャリアーの領域に沈着された、金、銀、銅またはそれらの合金の一つの金属層との反応によって形成される、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は、多数の分析部位を備えた化学的または生物学的分析のための装置であり、特に、薬理学的スクリーニングおよび生物学的ＤＮＡテストに使用することができる。
スクリーニングでは、同一試薬で被覆された多数の部位を備えたキャリアーおいて、連続的に各部位に選択的に沈着される、種々の分子の効果が、調べられなければならない。
【０００２】
ＤＮＡテストのような生物学的試験では、この装置の各部位は異なるＤＮＡプローブで被覆され、調べたいアナライト、そのゲノム配列が、全ての部位と、分析時に接触するように配置される。
分析化学において、化学反応用の皿（または化学的反応器）の小型化に対する強い要求がある。
これらの応用の全てについて、できるだけ多数の分析部位を備えたキャリアーを利用可能にすることが重要であるが、高密度の数の部位は、その部位に試薬またはサンプルの液滴を沈着させる際に十分な正確性の問題を生じる。
【０００３】
【従来の技術】
米国特許ＵＳ−Ａ−５４７４７９６号公報［１］は、キャリアーの表面にいくつかの分析部位を備えた装置を記載している。この装置では、分析部位は、平面状キャリアーの疎水性領域によって分けられた親水性領域によって形成されている。
添付した図１は、上に親水性領域３と疎水性領域５が設けられた、平面状キャリアー１を備えたこの装置の構造を示している。
【０００４】
これらの親水性および疎水性領域は、フォトマスキングの後に、親水性または疎水性シランをガラスキャリアーと反応させることにより、キャリアー１上に形成される。
この場合には、平面状領域によって形成された親水性領域３が、隣接する疎水性領域５の存在によって、沈着された試薬７の液滴を、そのままの場所に維持させる。
【０００５】
この装置は、試薬ディスペンサーが、液滴７のサイズが無限に減少されることを許容しないという事実によって顕著に制限される。
それゆえ、例えば、３００μｍ未満に間隔を増大するために、キャリアーの部位の数の密度および集積化(integration)を増大することが望まれる場合には、リソグラフィー技術を用いて、部位密度を増大させるために親水性および疎水性領域の表面を制限することが十分に可能であることから、システムを現在制限する、ディスペンサーの解像力である。
【０００６】
このシステムの他の重要なパラメーターは、例えばＤＮＡプローブのような試薬が、その部位で乾燥される溶液中の部位に移されるので、その部位の有効表面領域である。それゆえ、その部位の有効表面領域が低減されれば、乾燥後の試薬の量は、非常に少なくなる。
最後に、その表面上に沈着された液滴を有するキャリアーを扱うことは容易ではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主題はまさに、
その標準的な能力が、５０から１０００ピコリットルよりも少ない液滴を散布できない現行のディスペンサーを用いながらも、沈着物の良好な空間的精度で、キャリアーの部位の数の密度および集積化を増大させることが可能な化学的または生物学的分析のための装置である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明の主題は、分析部位がキャリアーをくりぬいたマイクロディッシュからなり、マイクロディッシュの側壁および底、並びに、マイクロディッシュエッジと呼ばれる各マイクロディッシュの周りのキャリアー表面領域が、少なくとも一つの親水性部材からなるか、処理によって親水性とされており、かつ、マイクロディッシュの周りの領域の間に配置されたキャリアーの平面状領域が疎水性部材からなるか、処理によって疎水性とされた、化学的または生物学的試薬を固定することができる複数の分析部位を備えたキャリアーを有する化学的または生物学的分析のための装置である。
【０００９】
明細書および特許請求の範囲において、用語“親水性部材”は、その部材が親水性であるか、処理を経て親水性とされたことを意味する。
同様に、用語“疎水性部材”は、その部材が疎水性であるか、処理を経て疎水性とされたことを意味する。
この装置において、マイクロディッシュは、特に、扁平した錐体の形状を備え、その小さい方の底面がマイクロディッシュの底に対応してもよい。
【００１０】
この装置において、マイクロディッシュが親水性部材であり、マイクロディッシュの周りの領域、すなわちエッジも親水性部材であり、疎水性部材によって表面上で分離されているという事実が、キャリアーの厚み内に液滴固定ゾーンを与えることを可能にし、それによって液滴の量を制限することなく、分析部位の直径を制限できることを意味する。このように、従来技術の平面上キャリアーと比べて、活性部位のより高い高密度化を可能にする。
【００１１】
それゆえ、本発明の構成は二つの興味ある利点を付与する：
１）制限された解像度を有する液滴ディスペンサーの使用を可能にする、および
２）溶媒を蒸発させた後により高濃度の溶質を与える、マイクロディッシュよりも大きな直径を有する液滴の使用を可能にする。
本発明の装置の第一の実施態様によれば、マイクロディッシュの側壁、底部およびエッジが、同一の親水性部材からなる。これは、特に、液滴がマイクロディッシュからあふれる場合に、マイクロディッシュ内およびマイクロディッシュのエッジ上における試薬の液滴のリフォーカシングおよび固定を確実にすることを可能にする。
【００１２】
本発明の装置の第二の態様によれば、マイクロディッシュの底部は、第一の親水性部材からなり、少なくとも一部のマイクロディッシュの側壁とマイクロディッシュのエッジが第二の親水性部材からなり、単独で第一の親水性部材が化学的または生物学的試薬を固定することができる。
この特別な構造から、第二の親水性部材によりマイクロディッシュに液滴を引きつけ、第一の親水性部材によりマイクロディッシュの底に試薬を確実に固定化することができる。この装置は、試薬が水性溶液に希釈される場合に特に興味深いものである。マイクロディッシュを形成することにより、基板の性質に本来備わっている抵触シグナル（蛍光）をしばしば生じる基板の面（plane）とは異なる面において、分析段階において蛍光を観察することができる。
それゆえ、水性溶液の液滴は、第二親水性部材を湿らせるが、少量で存在する試薬は、マイクロディッシュの底に固定される。
【００１３】
本発明によれば、このシステムのキャリアーは、特定の機能を持たない、有機ポリマー、ガラス、またはケイ素において化合しない基板であってもよい。本発明において、種々の電子的機能、部位アドレシング、例えば、局部加熱、もしくは蛍光の集積検出のためのＣＣＤを有する集積された電子的システムを備えた活性基板を含むキャリアーを用いることもできる。
このタイプの活性基板は、例えば、Eggersら, A versatile biochip for gene-based diagnotics, 1996, IEEE, p.87-92 [2]による刊行物に記載されている。かかるキャリアーでは、活性基板は、一般に、マイクロディッシュが形成されるポリマー層で被覆される。
【００１４】
本発明のこのシステムでは、親水性部材は、エポキシ基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−、−ＮＨ2および−ＣＯＯＨから選択された親水性基を含む部材であってもよい。
疎水性部材は、疎水性有機ポリマーのキャリアーに関してキャリアー自身に形成されてもよく、また、キャリアー上に形成されてもよい。一般に、疎水性部材は、炭化水素含有基または過フッ化炭化水素含有基を含む。
用いられたベース部材、ガラスまたはケイ素は、適切な表面処理を用いて選択的に親水性または疎水性とされてもよい。
本発明のさらなる主題は、上記のような化学的または生物学的分析のための装置を製造する方法である。
【００１５】
第一の実施態様によれば、この方法は、以下の工程
ａ）キャリアーの表面にマイクロディッシュ（またはマイクロウェルまたはマイクロキャビティー）をくりぬくこと、
ｂ）疎水性部材を含むキャリアー表面の領域を規定すること、および
ｃ）疎水性部材を含まない、キャリアー表面およびマイクロディッシュの領域に親水性部材を形成すること、
を含む。
第一の実施態様の変形によれば、この方法は以下の工程：
ａ）キャリアーの表面にマイクロディッシュをくりぬくこと、および
ｂ）親水性部材を含むキャリアー表面の領域に親水性部材を形成すること、
を必要とする。
【００１６】
上記方法は、側壁、底部およびエッジが同一の親水性部材からなるマイクロディッシュを製造するのに適している。
二つの異なる親水性部材を有するマイクロディッシュの形成に適した本発明の方法の第二の実施態様によれば、以下の工程：
ａ）キャリアーの表面にマイクロディッシュをくりぬくこと、
ｂ）疎水性部材を含むキャリアー表面の領域を規定すること、
ｃ）疎水性部材を含まないキャリアー表面に、および、マイクロディッシュの表面に、第一親水性部材の位置に対応する第一領域と第二親水性部材の位置に対応する第二領域を規定すること、
ｄ）第一領域に第一親水性部材を、並びに、第二領域に第二親水性部材を形成すること、
を必要とする。
【００１７】
このキャリアーが非疎水性部材であるならば、疎水性部材を含むキャリアー表面の領域に疎水性部材を形成するための付加工程を含む。
本発明の方法を適用するために、最初に、マイクロディッシュが、キャリアーの厚みにくりぬかれる。乾燥または化学的エッチングの後に従来のリソグラフィー技術が、この操作のために用いられてもよい。
キャリアーがケイ素である場合には、マイクロディッシュは、５４゜の傾斜と平坦な底を備えたマイクロディッシュ与える、結晶面の優先化学エッチングによって形成されてもよい。マイクロディッシュの間隔またはピッチは、１０ないし５００μｍの範囲とすることができ、マイクロディッシュの深さは、５ないし５００μｍの範囲とすることができる。一般に、リソグラフィー技術が所望の位置でマイクロディッシュを規定するために用いられる。
【００１８】
ガラスキャリアーでは、マイクロディッシュは、マイクロディッシュの位置を規定するリソグラフィー技術を用いて、角度のない、乾燥等方性エッチングによって形成されてもよい。
キャリアーが電子的機能を備えた活性基板を含む場合には、このキャリアーは、好ましくは、ポリマーまたは鉱物酸化物層を備えた上面に設けられ、ここでマイクロディッシュは、マイクロディッシュの位置を規定するリソグラフィー技術も用いてエッチングによって形成される。
【００１９】
いずれにしても、５ないし５００μｍの深さのマイクロディッシュが、１０ないし５００μｍのマイクロディッシュのピッチで、かつ、マイクロディッシュの上方の開口が３ないし４５０μｍで得られる。
この方法の次の工程は、キャリアーの表面に疎水性部材の領域と親水性部材の領域を形成することからなる。
これらの領域は、疎水性または親水性の基をグラフトすることによってキャリアーの表面を変更することによって形成することができる。
しかしながら、キャリアーが疎水性有機ポリマーである場合、または疎水性有機ポリマーで被覆されている場合には、キャリアーの表面を変更して疎水性領域を形成する必要はない。
【００２０】
キャリアーがシリコンまたはガラスである場合には、この変更は、シリコンまたはガラスを疎水性または親水性シラニゼーション剤と反応させることによって実施される。
キャリアーがケイ素である場合には、先に酸化に処され、次いで、通常のクリーニング処理（例えば、ＨＣｌ）されて、シラニゼーション剤と反応することができる表面上にＯＨ基を得る。
【００２１】
疎水性シラニゼーション剤は、以下の式：
【化３】
0004382285.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、同一または相違してもよく、Ｃ1ないしＣ3アルコキシ基およびハロゲン原子（好ましくは塩素原子）から選択され、かつＲ4が、直鎖または分枝状の、炭化水素含有基または過フッ化炭化水素含有基である］を有するシランであってもよい。
好ましくは、炭化水素基または過フッ化炭化水素基が、４ないし１８炭素原子を含む。
【００２２】
疎水性シラニゼーション剤の例として、以下の化合物を挙げることができる：
−“レペルシラン(Repelsilane)”と呼ばれる商業的に入手可能な製品、
−オクタデシルトリエトキシシラン、
−トリデカフルオロ-１,１,２,２-テトラヒドロオクチルジメチルクロロシラン、
−３-(１,１-ジヒドロペルフルオロオクチルオキシ)プロピルトリエトキシシラン、
−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）。
【００２３】
親水性シラニゼーション剤が、以下の式：
【化４】
0004382285.tif 000003
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、同一または相違してもよく、Ｃ1ないしＣ3アルコキシ基およびハロゲン原子、好ましくは塩素原子から選択され、かつＲ5が、直鎖または分枝状の、エポキシ基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＨ−および−ＣＯＯＨから選択された少なくとも一つの親水性基を有する炭化水素基である］
を有するシランであってもよい。
炭化水素基が、有利に３ないし１８の炭素原子を有する。
【００２４】
親水性シラニゼーション剤の例として、以下の化合物：
−アミノプロピルトリメトキシシラン“γＡＰＳ”、
−トリメトキシシリルプロピル−ジセエントリアミン(ditheyene)トリアミン“ＤＥＴＡ”、
−Ｎ-(２-アミノエチル)-３-アミノプロピルトリメトキシ-シラン“ＥＤＡ”、
−Ｎ,Ｎ-ビス(ヒドロキシエチル)アミノプロピルトリエトキシ-シラン、
−“Bind Silane”と呼ばれる商業的製品、
−アミノエチルアミノメチル フェネチルトリメトキシシラン“ＰＥＤＥＡ”またはさらなるメルカプトプロピルトリメトキシシラン：
【化５】
0004382285.tif 000004
を挙げることができる。
【００２５】
また、親水性または疎水性の基を添加するために、チオールまたはジスルフィドを用いてキャリアーに疎水性部材および／または親水性部材を形成することもできる。この場合、最初に、金、銀、銅またはそれらの合金の一つの金属層が変更される領域に沈着され、その後、この層が、一以上の親水性または疎水性基を含むチオールまたはジスルフィドと反応させられる。上述したように、疎水性基は、直鎖または分枝鎖状の炭化水素含有基または過フッ化炭化水素含有基とすることができる。親水性基は、エポキシ基、−ＯＨ、−ＮＨ−、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨおよび−ＳＨから選択することができる。
【００２６】
Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕを機能化するために、使用できるチオールおよびジスルフィドの例として、以下の化合物：
−オクタデカンチオール、Ｒ-ＳＨ（Ｒ＝Ｃ8ないしＣ18）、疎水性、
−ヘキサデカンチオール、
−３-メルカプトプロピオン酸  →  親水性（金を親水性にする）
を挙げることができる。
本発明の方法によれば、親水性部材の領域または親水性とされた領域、および疎水性部材の領域または疎水性とされた領域は、通常のマイクロエレクトロニクス技術、例えば、マスキングと樹脂展開を備えた、ネガティブまたはポジティブフォトレジストを用いたリソグラフィー法を用いてキャリアー上に規定することができる。展開された領域は、処理され、次いで、樹脂が除かれ、露出された領域が別のシラニゼーション剤で処理される。
【００２７】
それゆえ、本発明によれば、親水性および疎水性領域は、例えばキャリアーの全ての表面を処理して親水性または疎水性とし、次いで、例えばレーザーによってキャリアーの一部の領域の親水性または疎水性部材を除くことによって、エッチング法を用いてキャリアー上に形成される。露出された領域は、所望の疎水性または親水性領域を形成するように処理される。
本発明の他の特徴および利点は、例示的であって、非限定的な、添付の図面を参照することによって、より明確になる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
図２は、単一の親水性部材が用いられる、本発明にかかる装置の第一の実施態様を示す。
この図では、マイクロディッシュ２３がくりぬかれ、その小さい方のベースがマイクロディッシュの底２４に対応する扁平した錐体の形状を有するキャリアー２１が見られる。本発明の第一の実施態様では、底部２４、側壁２５、および以後、マイクロディッシュのエッジ２６と称する、各マイクロディッシュの周りのキャリアー表面の領域が、親水性部材から形成されるが、マイクロディッシュのエッジ間に位置するキャリアー表面は疎水性部材２７からなる。
【００２９】
図３は、二つの異なる親水性部材が用いられる、本発明にかかる装置の第二の実施態様を示す。
この図では、キャリアー２１、マイクロディッシュ２３および疎水性部材２７の領域を称するために、同一の参照番号が用いられる。この場合、マイクロディッシュの底２４と一部の側壁２５ａが第一の親水性部材からなり、残りの側壁２５ｂとエッジ２６は、第二の親水性部材からなる。これは、後に記載するように、化学的または生物学的試薬をマイクロディッシュの底に付着させることを可能にする。
【００３０】
本発明の装置にかかるこれら二つの実施態様では、キャリアーの三次元構造が多数の利点を得ることを可能にする。
この構造によれば、マイクロディッシュが、キャリアーの厚みにおいてくりぬかれ、かつ、より小さい有効表面領域に対してより多くの試薬またはサンプルを含むことができるので、マイクロディッシュの開口に対応する反応部位の表面を制限することを可能にする。
それゆえ、試薬またはサンプルを分散するロボットの位置づけ精度、または液滴の量によって制限されることなく、マイクロディッシュのピッチとサイズを微小(micronic)サイズに低減することができる。さらに、疎水性であるキャリアーの他の部分と対照的に、マイクロディッシュの周りおよびマイクロディッシュ内に親水性の領域を設けることにより、図４Ａおよび４Ｂに見られるように、液滴を、マイクロディッシュに固定および誘導することができる。
【００３１】
図４Ａを参照すると、親水性領域２４と疎水性領域２７を備えたマイクロディッシュ２３が設けられたキャリアー２１を有する、本発明の最初の実施態様にかかる装置が見られる。
図４Ａは、マイクロディスペンサー（マイクロピペッティングロボット）やインクジェットプリントヘッドによって沈着される試薬またはサンプルの液滴２９の供給段階の装置を示す。
【００３２】
図４Ａに見られるように、液滴はマイクロディッシュの開口に垂直に配置される必要はない。しかしながら、親水性領域２４と疎水性領域２７の存在が、液滴をマイクロディッシュに固定および誘導する。表面の親水性によって付与された表面張力により、沈着された液滴は位置にスライドして、図４Ｂに記載されているように完全にマイクロディッシュを満たす。それゆえ、液滴間にまたがって、試薬が混合される危険を伴うことなく、所定の液滴のサイズで、試薬部位のピッチがキャリアー上で低減される。また、液滴の配置が不完全であっても、以下から分かるように、マイクロ加工の使用を介して極端に精密なマイクロディッシュの位置決めによって付与されるような完全な空間的分布を可能にする。
【００３３】
この装置では、容量／試薬と接触する面の比率が、空間の同一占有(identical occupation)に関して増大することにも注意する。これは、親水性領域において、乾燥後に、固定される物質を試薬が含む場合に、それらは数字上遙かに大きい。
また、このタイプの構造は、例えば集積されたヒーティングまたは読み取り手段を備えたＤＮＡチップのような活性基板の上に添加することができる。
最後に、本発明の装置のこの構造は、局所的in situＤＮＡ合成法にも適する。プローブの最初の塩基をマイクロディッシュに固定した後、このプローブをマイクロディッシュにおいて塩基毎に構成する。
【００３４】
図５から図７は、ＤＮＡチップを製造するための、本発明の装置の第二態様にかかる装置を用いる利点を示す。
図５では、この装置のマイクロディッシュの一つが記載されている。これは、マイクロディッシュ内とそれらのエッジ上に第一親水性部材５５と第二親水性部材５７が存在し、かつ、マイクロディッシュ間に疎水性部材５９が存在するマイクロディッシュ５３を備えたキャリアー５１である。
【００３５】
この図は、第一親水性部材の親水性基５６、第二親水性部材の親水性基５８および疎水性部材の疎水性基６０を記載する。親水性基５６は親水性基５８と異なり、親水性基５６は試薬、例えば、試薬６５の液滴に存在する核酸プローブ６３を固定するように選択されることが分かる。それゆえ、図５は、この装置の液滴供給段階に相当する。
図６は、疎水性領域５９においてはじかれることにより、親水性領域上における液滴６５のリフォーカシング(refocusing)状態を示す。
図７は、第一親水性部材５５の親水性基５６と、プローブの親水性基６４の反応による、第一親水性部材５５上における核酸プローブ６３の固定化段階を示す。
【００３６】
例として、ヌクレオチドプローブがＯＨ基で官能化され、かつ、第一親水性部材５５がＯＨ親水性基を含み、一方で、第二親水性部材がＣＯＯＨまたはＮＨ2親水性基を含んでもよい。この場合、第一親水性部材５５にはプローブのみが結合する。
シラニゼーションによってあらかじめ修飾されたガラス表面におけるオリゴヌクレオチドプローブの固定化技術は、Beattieら Clin.Chem.,vol.39, No4,1993,714-722頁［３］に記載されている。
本発明の装置のこの態様は、特に興味深い。なぜなら、マイクロディッシュのピッチが低減すれば、蛍光が結果の読み取りに用いられる場合に、検出の問題を生じる、種々の試薬で被覆された部位が互いに近くなるからである。試薬部位間の十分な空間を維持しつつ、比較的多数の液滴の使用を可能にすることにより、一連の入手が単純化される。
【００３７】
さらに、かかる改良により、試薬はマイクロディッシュの底だけに得られ、異なる平面においてあらゆる化学反応の部位の位置を定めることを可能にする。これは、例えば、キャリアーの表面の蛍光を妨害することを克服するための読み取りシステムによって用いられてもよい（差異フォーカシング）。
【００３８】
上記マイクロディッシュは、機械的に分配された液滴を受けることができる。以下の本発明の二つの特別な利点が考慮されなければならないことが分かっている：
−ディスペンサーの本質的な精度を克服すること：不適切に調節された液滴でさえ、各ディッシュの周りのキャリアーの平面部にまたがる親水性領域（２６または５７）によりマイクロディッシュ内に“収まる”。
−液滴に含まれる実質的な量の試薬をディッシュに固定すること：ディッシュの周りにまたがる親水性領域によってディッシュにわたって集まるので、ディッシュよりもはるかに多い液滴が沈着されてもよい。液滴に含まれる試薬があまり濃縮できないか、分布の問題が生じるので、非常に重要である。
【００３９】
トポロジーに関して、例示的に、図２に示すような以下の大きさを備えた二つのタイプのディッシュを製造した。
１）−空洞の底のディッシュの直径Ｄ：１００μｍ
−ディッシュの深さＰ：３０μｍ
−各サイドの平面部にまたがる領域Ｌ：１５μｍ
−ピッチ：１８０μｍ
２）−空洞の底のディッシュの直径Ｄ：７０μｍ
−ディッシュの深さＰ：２０μｍ
−各サイドの平面部にまたがる領域Ｌ：１０μｍ
−ピッチ：１４０μｍ。
【００４０】
図８Ａから図８Ｅは、単一の親水性部材を用いて本発明の装置を製造する種々の工程を図示しており、親水性および疎水性領域がシラニゼーションによって形成され、キャリアーはケイ素である。
図８Ａでは、ケイ素の最初のキャリアー２１が図示されている。
図８Ｂは、キャリアー２１におけるマイクロディッシュ２３の形成段階を示す。これは、結晶平面に沿ったリソグラフィーおよび化学エッチングによって形成することができる。このようにして、５４゜の斜面と平坦な底を備えた扁平した錐体の形状のマイクロディッシュが得られる。試薬を自動沈着することによって分配された液滴の大きさに適合させるために、マイクロディッシュのピッチは１０〜５００μｍであり、その深さは５〜５００μｍとすることができる。
【００４１】
マイクロディッシュのリソグラフィーの後に、ケイ素表面にＯＨ基を得るために、このユニットを、８００℃よりも高い温度、例えば８５０℃で熱酸化処理する。
図８Ｃは、疎水性部材の領域がマスクを用いて規定される段階を示す。このマスクは、感光性樹脂Ｒからなり、キャリアー上に沈着され、必要なパターンを得るために露光され、疎水性領域を現すように現像される。樹脂Ｒは、マイクロエレクトロニクスにおいて用いられるフォトレジストであってもよい。特に、ポジティブシップリー(shippley)樹脂（Ｓ１８１３またはＳＴＲ１０７５）またはネガティブ樹脂ＳＡＬ６０１を使用することができ、Microposit MF 319現像薬を用いることができる。
【００４２】
図８Ｄは、例えば、トリデカフルオロテトラヒドロ−オクチルトリエトキシ−シラン（Ｆ１３とも言う）のようなシラニゼーション剤によって曝されたケイ素キャリアーの疎水性シラニゼーションによって疎水性部材２７の領域を形成するための工程を示す。
疎水性部材２７の領域を形成した後、親水性部材を含む領域を曝すために例えばアセトン中で樹脂Ｒを溶解して取り除く。
図８Ｅは、ＥＤＡ、γＡＰＳまたはＤＥＴＡを用いた親水性シラニゼーションによる親水性部材２４におけるかかる領域の形成を示す。
【００４３】
図９Ａ〜図９Ｄは、金プレーティングで被覆されたケイ素のキャリアーを備えた本発明の装置の態様の変形を示し、チオールが親水性部材と疎水性部材を形成するために用いられている。この場合、上記と同様に、扁平した形状の錐体形状２３のマイクロディッシュ２３が、結晶プレートに沿った化学的リソ-エッチングによりケイ素キャリアー２１にくりぬかれており、次いで、金が５０〜５０００μｍの厚みを備えた層を形成するようにキャリアー全体に沈着される。
図９Ａは、マイクロディッシュ２３を備え、かつ、金層Ｍで被覆されたたキャリアー２１を示す。
【００４４】
マイクロディッシュが形成された後に、親水性材料の領域が上述したように感光性樹脂Ｒを用いたリソグラフィーによって規定される。
このように、図９Ｂに示された構造は、金層Ｍが疎水性になる領域上で露呈されて得られる。
疎水性部材は、オクタデカンチオールＣＨ3-（ＣＨ2）１７-ＳＨのような疎水性チオールと、露呈された金の沈着との反応によって形成される。
これは、疎水性部材２７の領域を備えた図９Ｃに示された構造を与える。かかる操作の後、樹脂Ｒの層は、上述したように、アセトンにおける溶解によって取り除かれ、未被覆領域が親水性チオールで処理される。親水性チオールとして、ＨＯ（ＣＨ2）nＳＨ、ＨＯＯＣ（ＣＨ2）nＳＨが用いられる（ｎ＝３〜１８）。
【００４５】
このようにして、疎水性部材２７の領域で分離された親水性部材２４の領域を備えた図９Ｄに示された構造が得られる。
上記の二つの例では、親水性および疎水性部材が、シラニゼーション処理またはチオールによる修飾によって形成されたが、これら二つの可能な修飾を組み合わせることも当然に可能であり、一部の領域をシラニゼーションによって形成し、かつ、他の領域をチオールとキャリアーの反応によって形成するか、あるいは、別の親水性化または疎水性化技術によって形成することが可能である。
【００４６】
キャリアーがガラスの場合には、マイクロディッシュは、アングルフリーの等方性エッチングによって形成され、次いで、親水性部材の領域と疎水性部材の領域が上記方法を用いて形成されてもよい。これらの領域がシラニゼーションによって形成される場合には、マイクロディッシュをエッチングした後にキャリアーを酸化処理する必要はない。これは、ガラスが後の工程について必要なＯＨ官能性を持つからである。また、ガラス基板は、チオールとの反応により金を沈着させた後に親水性部材および疎水性部材の領域を形成し、これらの方法を組み合わせることができる。
【００４７】
ガラス基板の利点は、マイクロディッシュが等方性エッチングによって形成されることを可能にすることであり、アングルフリーマイクロディッシュを得ることを導き、それによって種々のすすぎ操作を容易にする。
上述したように、本発明は、集積エレクトロニクスを備えた活性基板を含むキャリアーに設けられてもよい。このタイプの基板は、部位の局所ヒーティングまたはこれらの部位で分析される試薬−電解質対のＣＣＤ読み取りを可能にし、あるいは、例えば電圧を適用する各部位のアドレッシングを可能にする。この活性基板は、フラットパネル技術を用いてケイ素またはガラスから形成されてもよい。
【００４８】
この場合、本発明の構造は、鉱物酸化物層またはポリマー層を用いて被覆することによって仕上がった活性基板上に構成され、沈着された層は、所望の深さのマイクロディッシュを形成するのに十分に厚いものとされる。
鉱物酸化物のポリマーの層にマイクロディッシュを形成した後に、親水性領域および疎水性領域は、上記のように、金層とチオールとの反応によって規定できる。ポリマー層については、疎水性領域はポリマー層によって形成されてもよい。
【００４９】
図１０Ａから１０Ｃは、この装置を製造する工程を例示する。
図１０Ａは、分析の部位に対応する位置に表面パッド２１ｂを設けた活性基板２１ａを示す。
このキャリアー２１ａでは、例えば、５ないし１００μｍの厚みを備えたポリイミドである、ポリマー２１ｃの厚い層が沈着され、次いで、マイクロディッシュ２３がリソグラフィーによってこの層からくりぬかれ、キャスティング。
親水性部材とされるキャリアーの領域では、金の層Ｍが親水性層を規定するために沈着される。
図１０Ｂは、活性基板２１ａ、表面パッド２１ｂ、ポリマー層２１ｃ、マイクロディッシュ２３および金層Ｍを含む構造を示す。
図１０ｃは、自身を金Ｍに固定して、親水性部材２４の領域を形成する親水性チオールを用いて、ユニット全体を処理することにより親水性領域を形成する工程を示す。
この場合、疎水性部材の領域を形成する必要はなく、これは、マイクロディッシュ２３間に残るポリマー２１ｃの層によって形成される。
【００５０】
図１１Ａから図１１Ｇは、二つのタイプの親水性部材を含む、本発明の第二実施態様にかかる装置の製造方法の種々の工程を示す。
この場合、図１１Ａに示されているように、キャリアー５１は、ケイ素であり、例えば、扁平した錐形のマイクロディッシュ５３が第一実施態様と同様にリソ−エッチングによって形成されている。次いで、金層Ｍがユニット全体に沈着される。
図１１Ｂは、第二親水性部材を含ませる領域に対応する場所で樹脂Ｒを沈着させた後のキャリアーの構造を示す。
図１１Ｃは、疎水性部材に対応する領域と第一親水性部材に対応する領域における金層を除去するために金のエッチングをした後であって、かつ、第二親水性部材に対応する領域から樹脂Ｒを除去した後に得られた構造を示す。
【００５１】
図１１Ｄは、第一樹脂Ｒと同一または異なる樹脂Ｒによってマイクロディッシュの底を保護した後に得られた構造を示す。この保護は、所望の部位において露光され、後に所望の領域から取り除かれる感光性樹脂を沈着させることによって、リソグラフィー技術を用いて実施することができる。
図１１Ｅは、Repel Silaneによるキャリアーの疎水性シラニゼーションによって形成される疎水性部材５９の領域の形成を示す。
図１１Ｆは、ＣＯＯＨまたはＮＨ2基を含有する親水性チオール、例えばＨＯＯＣ-（ＣＨ2）2-ＳＨと金との反応による第二親水性部材の領域５７の形成を示す。
図１１Ｇは、マイクロディッシュの底から樹脂Ｒを取り除き、かつ、このキャリアーをＯＨ（ＣＨ2）16−ＳＨを用いてシラニゼーション処理した後に得られた最終的な構造を示す。
【００５２】
それゆえ、シラニゼーション処理を用いて、ＯＨ親水性基を有する第一親水性部材５５が得られ、一方、第二親水性部材の領域５７は、ＣＯＯＨ親水性基を含む。ゆえに、ＯＨ基で官能化された、オリゴヌクレオチド、リンカーまたはヌクレオチド合成の前駆物質のようなＯＨ基を備えた試薬を用いることにより、この試薬を、マイクロディッシュの底に優先的に固定することができる。
明らかに、上記実施態様の例では、工程の順が異なってもよい。同様に、別の技術を、第一および第二の親水性部材の領域５７および５５を形成するために用いることができ、キャリアーが疎水性である場合には、疎水性部材の領域５９を形成する工程を廃止するために用いることができる。
【００５３】
引用文献
［１］米国特許第５４７４７９６号公報
［２］Eggersら, A versatile biochip for gene-based diagnotics, 0-7803-3271-7/96, 1996, IEEE, p.87-92
［３］Beattieら Clin.Chem.,vol.39, No4,1993,719-722頁
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来技術にかかる装置の図である。
【図２】  本発明の装置の第一の実施態様を示す。
【図３】  本発明の装置の第二の実施態様を示す。
【図４】  図４Ａおよび４Ｂは、本発明の装置における試薬の液滴の配置を示す。
【図５】  生物学的試薬をマイクロディッシュの底に付着させる、本発明の装置の第二の実施態様の利点を示す。
【図６】  生物学的試薬をマイクロディッシュの底に付着させる、本発明の装置の第二の実施態様の利点を示す。
【図７】  生物学的試薬をマイクロディッシュの底に付着させる、本発明の装置の第二の実施態様の利点を示す。
【図８】  図８Ａから８Ｅは、疎水性および親水性領域を形成するためにシラニゼーションが用いられる場合の、本発明の装置の製造方法の種々の工程を示す。
【図９】  図９Ａから９Ｄは、親水性および疎水性領域を形成するためにチオールを用いて本発明の装置を製造する方法の種々の工程を示す。
【図１０】  図１０Ａから１０Ｃは、疎水性ポリマー層で被覆された、電子的機能を有する活性基板を用いた本発明の装置の製造方法における工程を示す。
【図１１】  図１１Ａから１１Ｇは、本発明の第二の実施態様にかかる装置の製造方法の種々の工程を図示する。
【符号の説明】
２１  キャリアー
２３  マイクロディッシュ
２４  親水性部材
２５  側壁
２６  エッジ
２７  疎水性部材
【図１】
0004382285.tif 000007
【図２】
0004382285.tif 000008
【図３】
0004382285.tif 000009
【図４Ａ】
0004382285.tif 000010
【図４Ｂ】
0004382285.tif 000011
【図５】
0004382285.tif 000012
【図６】
0004382285.tif 000013
【図７】
0004382285.tif 000014
【図８Ａ】
0004382285.tif 000015
【図８Ｂ】
0004382285.tif 000016
【図８Ｃ】
0004382285.tif 000017
【図８Ｄ】
0004382285.tif 000018
【図８Ｅ】
0004382285.tif 000019
【図９Ａ】
0004382285.tif 000020
【図９Ｂ】
0004382285.tif 000021
【図９Ｃ】
0004382285.tif 000022
【図９Ｄ】
0004382285.tif 000023
【図１０Ａ】
0004382285.tif 000024
【図１０Ｂ】
0004382285.tif 000025
【図１０Ｃ】
0004382285.tif 000026
【図１１Ａ】
0004382285.tif 000027
【図１１Ｂ】
0004382285.tif 000028
【図１１Ｃ】
0004382285.tif 000029
【図１１Ｄ】
0004382285.tif 000030
【図１１Ｅ】
0004382285.tif 000031
【図１１Ｆ】
0004382285.tif 000032
【図１１Ｇ】
0004382285.tif 000033