(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＭＰ５２単量体。
【請求項２】
請求項１に記載のＭＰ５２単量体を発現しうるＤＮＡ配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞を用いて発現させる請求項１記載のＭＰ５２単量体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＭＰ５２単量体を有効成分とする軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【請求項４】
軟骨・骨疾患が骨粗鬆症である請求項３記載の軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【請求項５】
軟骨・骨疾患が変形性関節症または骨関節炎である請求項３記載の軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【請求項６】
軟骨・骨疾患が骨折である請求項３記載の軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【請求項７】
軟骨・骨疾患が歯根・歯槽の欠損である請求項３記載の軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
(１)  発明の属する技術分野
本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成に係わるシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋白質に関する。また、本発明は上記単量体蛋白質を発現しうるＤＮＡ配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて上記蛋白質を大量かつ高純度で製造する方法に関する。また、本発明は前記単量体蛋白質からなる軟骨・骨疾患の予防または治療剤に関する。
【０００２】
(２)  従来の技術
現在、骨疾患の予防ないし治療剤としては、エストロゲン、カルシトニン、ビタミンＤ３とその誘導体およびビスホスホン酸誘導体などが知られている。また最近になってＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する骨誘導因子（Bone morphogenetic protein：以降ＢＭＰと呼ぶ）でＢＭＰ−２からＢＭＰ−1４等の一連の蛋白質に骨誘導の作用のあることが報告されている。
【０００３】
さらにＧＤＦ−５あるいはヒトＭＰ５２と称される蛋白質に骨誘導の作用があることが報告されている（WO 93／16099、WO 95／04819、WO 94／15949 および Nature，vol.368, 1994, p.639-643)。成熟型ヒトＭＰ５２はＮ末端にアラニンを有する１２０残基からなる蛋白質であると考えられており、そのアミノ酸配列はこれらの特許出願に記載されている。
【０００４】
これらの蛋白質は、天然には一個所ジスルヒド結合を有するホモダイマーとして存在する。また、それらの組み換え体蛋白質の製造に関してもそれらのホモダイマーあるいはヘテロダイマーで行われ活性をもった蛋白質が得られている。たとえば、ヒトＭＰ５２に関しては特開平９−０３１０９８で報告されている。ところでＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体には２つの型が知られており、それぞれＩ型受容体、II型受容体と呼ばれている。これら骨誘導因子（二量体）を含むＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体を介しての細胞内シグナル伝達に関してはこれらの因子がＩ型受容体とII型受容体の両方に同時に結合することが必要であり、さらにはそれらが１組以上集まって多量体を形成し、細胞内シグナル伝達が行われていると考えられており（Bone, vol.19, 1996, p.569-574)、この多量体形成には因子が二量体であることが重要であろうと考えられているが、単量体での活性は未だ確認されていない。さらに、これら単量体としての組み換え体での製造は未だ行われていない。
【０００５】
【発明の要約】
本発明者らは、ヒトＭＰ５２単量体を大腸菌を使って遺伝子工学的手法により大量に製造することを試みた。すなわちＭＰ５２単量体分子間のジスルヒド結合に関与している配列表配列番号１のアミノ酸配列８３番のシステイン残基をアラニンに換わるようにコドンを変換した１１９残基よりなる配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のプラスミドを構築した。さらに、このプラスミドを導入した大腸菌を用いてヒトＭＰ５２単量体を大量発現させ、さらにはリフォールディングをおこない、配列表配列番号１の蛋白質を単量体として高純度で極めて収率よく生産することを見出した。
【０００６】
驚くべきことに、従来二量体としてのみ骨誘導活性を有すると考えられていたにもかかわらず、この単量体は、いくつかの細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、ＡＴＤＣ５）に対し骨細胞への分化誘導活性を有することが確認された。その分化誘導活性はその二量体に比べ重量あたり２倍の分化誘導活性を示すことを確認し、本発明を完成した。
【０００７】
【好適な実施態様の説明】
すなわち、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成に係わるシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋白質、これらの単量体蛋白質の製造方法、及びこれらの単量体蛋白質の一種または二種以上を含有してなる軟骨・骨疾患の予防または治療用の医薬品組成物に関する。
【０００８】
本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成に係わるシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋白質に関する。本発明におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーとはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−1４、ヒトＭＰ５２、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７等がある。置き換えられるべき他のアミノ酸は、アミノ酸側鎖の大きさを考慮してアラニン、スレオニン、セリン、バリンからなる群から選ばれるアミノ酸であればどれでもよい。最も好ましいアミノ酸はアラニンである。
【０００９】
本発明は、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する単量体蛋白質に関する。詳細には、この単量体蛋白質は分子間にジスルヒド結合を有する二量体ヒトＭＰ５２の分子間ジスルヒド結合に関与するシステインをアラニンに置き換えた蛋白質であり、配列表配列番号１のアミノ酸配列８３番目に示されている。本発明で得られる単量体蛋白質はその二量体蛋白質より重量あたり２倍の分化誘導活性を有する。
【００１０】
また、本発明は、上記単量体蛋白質を発現しうるＤＮＡ配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を用いて発現させる製造方法に関する。詳細には、本発明は、配列表配列番号２で示されるヒトＭＰ５２由来の１１９残基の蛋白質を大腸菌を用いて産生する製造方法に関する。すなわち、本発明は、配列表配列番号１で示されるヒトＭＰ５２由来の１１９残基のアミノ酸配列で８３番目のシステインをアラニンに換えた配列をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にメチオニンをコードするＤＮＡを含有するプラスミドの構築に関する。ヒトＭＰ５２ｃＤＮＡは、ＷＯ９３／１６０９９記載のｃＤＮＡを含んだプラスミドベクターを鋳型ＤＮＡとして、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を用いて増幅した。ここで用いるＰＣＲ法とは通常核酸ＤＮＡまたはＲＮＡの微量断片を米国特許番号４,６８３,１９５に記載されている方法で増殖することを意味する。
【００１１】
本発明は、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンをさらに付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを構築し、そのプラスミドを大腸菌に形質転換し、その大腸菌を培養することよって得られるインクルージョンボディを可溶化し、精製することによって変性単量体蛋白質を得た。本発明はリホールディングにより活性を有する蛋白質を製造し、さらに当該蛋白質を精製することによる配列表配列番号２の単量体蛋白質の製造方法に関する。すなわち、本発明の単量体蛋白質は大腸菌インクルージョンボディーを可溶化した後 SP-Sepharose FF カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）および Superdex 200 pg カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）によりＭＰ５２変性単量体蛋白質を得た。それからリホールディングを行った後逆相ＨＰＬＣの RESOURCE RPC カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を通すことにより精製された本単量体蛋白質を得る。得られた本単量体蛋白質の物理化学的性質はＮ末端アミノ酸配列、アミノ酸組成および電気泳動による分析で解析する。
【００１２】
本発明の単量体蛋白質の生物学的活性は、すでにヒトＭＰ５２二量体においてアルカリフォスファターゼ活性を上昇させる効果がみいだされている２種類の骨芽細胞株を用いてその分化誘導活性により評価した。本発明の単量体蛋白質は従来の二量体蛋白質に比べ重量あたり２倍の活性を示した。
【００１３】
また、本発明は、配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列を有効成分とする軟骨・骨疾患の予防または治療剤に関する。詳細には、本発明の単量体蛋白質は分化誘導活性すなわち軟骨・骨誘導活性を有すると考えられるため、骨粗鬆症、先天性軟骨・骨疾患、変形性膝関節症・変形性股関節症等の変形性関節症または、骨関節炎、半月損傷等の軟骨損傷、外傷・腫瘍摘出等による骨・軟骨欠損部の再生、骨・軟骨欠損、骨折、軟骨形成不全症・軟骨発育不全症・軟骨無形成症・口蓋裂・骨形成不全症等の先天性軟骨・骨疾患、さらには、歯根・歯槽の欠損等の予防および治療剤に関する。
【００１４】
さらに本発明の蛋白質は軟骨・骨誘導活性を有すると考えられるため美容外科の骨移植の治療等に用いることが出来る。これらの治療には、獣医外科の領域も含まれる。
【００１５】
全身投与方法としては静脈内、筋肉内および腹腔内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈内注射の他点滴静注が可能である。
【００１６】
注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は適当な水溶性賦形剤例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース等の一種または二種以上を加えて水で溶解し、バイアルまたはアンプルに分注した後凍結乾燥し密封して製剤とすることができる。
【００１７】
局所投与方法としてはその部位の軟骨・骨あるいは歯の表面をコラーゲンペースト、フィブリンのりまたは他の接着剤を用いて本蛋白質で覆う方法がある。これらのうち骨移植に用いる骨は天然骨の他、従来用いられる人工骨にも利用できる。人工骨とは金属、セラミックス、ガラス等の天然素材または人工無機質素材で出来た骨を意味する。人工無機質素材として好ましくはハイドロキシアパタイトがあげられる。例えば、人工骨の内部材料に金属そしてその外側の材料にハイドロキシアパタイトを使用する。さらに、本蛋白質は骨再構築を促進するために癌性骨組織にも投与出来る。また、軟骨移植にも利用可能である。
【００１８】
投与量については、本蛋白質の作用に影響する様々な要因、たとえば、形成が望まれる骨・軟骨の重量、骨・軟骨損傷の部位及びその状態、患者の年齢、性別、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮して担当医が決定する。また、用量は本蛋白質との再構成に用いる担体の種類によって変動し得る。一般的に、投与量は、支持体との組成物として使用するとき、所望の骨・軟骨湿重量当たり本単量体蛋白質として約１０〜１０6ナノグラム、注射剤として局所及び全身性に適用するとき、患者１人当たり０.１〜１０4マイクログラムを一週間に一度から一日に一度の頻度で投与することが好ましい。
【００１９】
骨・軟骨再生に対して既知の成長因子例えばインスリン様成長因子Ｉ（insulin−like growth factor−I）等を同時適用することにより相乗効果が期待できる。
【００２０】
このようにＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質のシステインを置換した単量体、および単量体としての工業的な規模での製造は未だ報告されておらず、軟骨・骨誘導活性を有する軟骨・骨疾患治療剤として有効である。さらに本発明の単量体蛋白質はその２量体蛋白質に比べ重量あたりの活性が２倍あり、軟骨・骨疾患治療剤の有効量を半分にすることができる。このことはＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する前述の骨誘導因子の製造にも応用できる。
【００２１】
配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒトＭＰ５２由来の単量体蛋白質はその二量体に比べ骨芽細胞株に対し２倍の分化誘導活性を有し、軟骨・骨疾患の予防または治療剤として有効である。さらに本発明の単量体蛋白質のアミノ酸の改変はシステインを減らすことから、大腸菌を用いた大量かつ純粋な単量体蛋白質の製造を容易にする可能性がある。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  単量体ヒトＭＰ５２発現ベクターの製作
(１) 変異型ヒトＭＰ５２成熟型部分の単離
ヒトＭＰ５２の単量体は、二量体を形成すると考えれているシステイン残基を別のアミノ酸残基に改変し、ヒトＭＰ５２単量体が二量体を形成しないようにして作製した。本発明では、ＷＯ９６／３３２１５の配列表配列番号１記載のプロリンから始まる成熟型ヒトＭＰ５２の８３番目のシステインのコドン（ＴＧＣ）をアラニンのコドン（ＧＣＣ）に変換した。
【００２４】
アミノ酸残基の置換は、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology (John Wiley & Sons, Inc.）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による変異法（section 8.5）を参考にし、目的の変異が導入されたＰＣＲプライマー（順方向）を用いることにより行なった。使用したＰＣＲプライマーの配列は、順方向プライマーとして配列番号３および逆方向プライマーとして配列番号４に記載した。
【００２５】
ＰＣＲは、ＷＯ９６／３３２１５に記載されたヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ245）を鋳型ＤＮＡ（10ナノグラム）として、同じ試験管内で、順方向および逆方向プライマーそれぞれ１０ピコモル、ｄＮＴＰ（0.4ミリモル）、ＭgＣl2（2.5ミリモル）をＬＡ Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ、寳酒造株式会社、カタログ番号ＲＲ013Ａ）と共に加えることにより行なった。反応は、変性（９４℃、１分間）、プライマーアニーリング（５５℃、１分間）、およびプライマー伸長（７２℃、２分間）から成る各サイクルを３０サイクル行なった。ＰＣＲ生成物は、制限酵素ＮcoＩとＨind IIIで消化後、１.５％低融点アガロース（FMC BioProducts社、カタログ番号 5170Ｂ）中で電気泳動により分離し、目的の約１７０塩基対から成るＤＮＡ断片を精製した。
【００２６】
単量体ヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ279）は、上記の手法で変異を導入したＮcoＩ−Hind IIIのＤＮＡ断片を、ＷＯ９６／３３２１５に記載されたヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ245）を改造したヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ277）のＮcoＩ−Ｈind III領域と交換することにより構築した。具体的には、ＷＯ９６／３３２１５に記載されたヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ245）のターミネーター下流に存在するＭＰ５２とは逆方向に転写されるlacＺプロモーターを除去したヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ277）を構築し、このＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ277）を制限酵素ＮcoＩとＨind IIIで消化後、１.５％低融点アガロース（FMC BioProducts社、カタログ番号 5170Ｂ）中で電気泳動により分離し、目的の２７１７塩基対から成るＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片と変異を導入した約１７０塩基対のＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌigation Ｋit（寳酒造株式会社、カタログ番号 6021）を用いて連結させ、単量体ＭＰ５２発現ベクターを構築（pＫＯＴ279、2.9kb）し、日本国茨城県つくば市東１丁目１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年２月５日に寄託し（受託番号 FERM P−16625)、その後１９９９年２月３日に原寄託よりブダペスト条約に基づく国際寄託への移管をした（受託番号 FERM BP−6637）。その後作製した本発明の単量体ヒトＭＰ５２発現ベクターの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社、ＡＬＦ）を用いて、目的の変異が導入されていることと生産されるヒトＭＰ５２の塩基配列（変異を導入した場所以外の配列）に誤りがないことを確認した。
【００２７】
(２) 形質転換
形質転換は、Ｋushnerらの塩化ルビジウム法（Genetic Engineering, p.17, Elsevier (1978)）に従った。即ち、ｐＫＯＴ２７９を宿主大腸菌Ｗ３１１０Ｍへ上記の手法に従い移入し、本発明の蛋白質発現大腸菌とした。
【００２８】
実施例２  培養
(１) 培養
本発明の蛋白質発現大腸菌を改変ＳＯＣ培地（Bacto tryptone 20ｇ／L, Bacto yeast extract ５ｇ／L, NaCl 0.5ｇ／L, MgCl2 0.95ｇ／L, Glucose 3.6ｇ／L）で前培養し、生産用培地（Bacto tryptone 20ｇ／L, Citric acid 4.3ｇ／L, K2HPO4 4.675ｇ／L, KH2PO4 1.275ｇ／L, NaCl 0.865ｇ／L, FeSO4・7H2O 100mg／L, CuSO4・5H2O １mg／L, MnSO4・nH2O 0.5mg／L, CaCl2・2H2O ２mg／L, Na2B4O7・10H2O 0.225mg／L, (NH4)6Mo7O24 0.1mg／L, ZnSO4・7H2O 2.25mg／L, CoCl2・6H2O ６mg／L, MgSO4・7H2O 2.2ｇ／L, Thiamine HCl 5.0mg／L, Methionine ２ｇ／L, Glucose ３ｇ／L）５Ｌに対し菌体懸濁液を１００mL添加し、１０Ｌの培養槽で通気攪拌しながら培養し、対数増殖前期（ＯＤ550＝５０）に達した段階で１mＭの濃度でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらにＯＤ550が１５０を超えるまで培養した。培養中、温度は３１℃、ｐＨはアンモニアを添加することにより７.２に制御し、溶存酸素濃度の低下を防ぐために攪拌速度をあげることにより空気飽和の５０％に溶存酸素濃度を制御した。また、培養中は高菌体濃度とするために、溶存酸素濃度の急激な上昇を指標として、０.１Ｍリン酸を含む５０％グルコース溶液をグルコース濃度が０.２％になるように添加した。
【００２９】
(２) 大腸菌封入体の調製
上記方法により得られた培養液を高圧ホモジナイザー（LAB40−10RBFI, APV・ゴーリン社）に５６０barで３回通すことにより菌体を破砕し、遠心して封入体を含む沈殿を回収した。
【００３０】
実施例３  精製
(１) 大腸菌封入体の可溶化
回収した封入体を１Ｍ尿素と５mＭ ＥＤＴＡを含む２０mＭ Ｔris−ＨＣl緩衝液（pH 8.3）で２回洗浄後、３０００×ｇで３０分間、４℃で遠心し、得られた沈殿を８Ｍ尿素、５０mＭ ＮaＣl、６４mＭ ＤＴＴ及び５mＭ ＥＤＴＡを含む２０mＭ Ｔris−ＨＣl緩衝液（pH 8.3）で超音波をかけながら可溶化した。
【００３１】
(２) 変性単量体蛋白質の精製
その可溶化液を２００００×ｇで３０分間、４℃で遠心し、その上清を回収した。得られた上清を２０mＭ Ｔris−ＨＣl緩衝液（pH 8.3）、６Ｍ尿素、１０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＥＤＴＡで平衡化した SP-Sepharose FF（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に通し、同溶液で洗浄後、０.４Ｍ食塩を含む同溶液で溶出させた。溶出液を２０mＭ Ｔris−ＨＣl緩衝液、ｐＨ８.３、６Ｍ尿素、０.５Ｍ食塩、１mＭ ＥＤＴＡ、１０mＭ ＤＴＴで平衡化した Superdex 200 pg（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）でゲル濾過を行い、単一な変性単量体蛋白質を得た。
【００３２】
(３) リホールディング
上記で得られた変性単量体蛋白質の溶液に９倍量の５０mＭ Ｎa−Ｇlycine緩衝液（pH 9.8）、０.５Ｍ食塩、２０mＭ ＣＨＡＰＳ、３mＭ ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）を加えた後撹拌し２０時間、４℃でリホールディングを行った。
【００３３】
(４) 活性をもつ単量体蛋白質の精製
リホールディングされた試料を１４mＭ ＮaＨ2ＰＯ4で２.８倍希釈し、等電点沈殿を行った。沈殿を３０００×ｇ ２０分の遠心で集めた後、０.０５％ＴＦＡに溶解した。その溶液を０.０５％ＴＦＡで平衡化しておいた逆相ＨＰＬＣの RESOURCE RPC カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に通し、０.０５％ＴＦＡ、０〜５０％アセトニトリルグラジェントにより溶出した。溶出液は吸光光度計を用い２８０nmの吸光度によりモニターし、精製された本発明の単量体蛋白質画分を得た。これに５ＮのＮaＯＨをｐＨ６.５から７.５の間になるように加え等電点沈殿をおこなった。沈殿を１０,０００×ｇ １０時間の遠心で集めた後、２０mＭ塩酸で約３mg／mLになるように溶解させ本発明の活性をもつ単量体蛋白質を得た。
【００３４】
(ｉ) Ｎ末端配列の分析
上記で得られた生成された本発明の単量体蛋白質のアミノ酸組成のＮ末端配列をシークエンサー（アプライド・バイオシステム社、モデル 476Ａ）により調べた。
(ii) アミノ酸組成分析
上記で得られた精製された本発明の単量体蛋白質のアミノ酸組成をアミノ酸分析機（ウオーターズ社、PICO. TAG. WORK STATION）により調べた。
(iii) 電気泳動による分析
上記で得られた精製された本発明の単量体蛋白質の分子量を非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、約１４ＫＤaの分子量を示した。
上記(ｉ)、(ii)および(iii)に示された結果より、本発明の単量体蛋白質はＮ末端が単一に配列表配列番号２で示すＰｒｏから始まる１１９残基からなる単量体蛋白質であることが解った。
【００３５】
実施例４  生物学的活性の測定
マウス胚細胞由来の軟骨細胞様に分化するＡＴＤＣ５（RIKEN GENE BANK，RCB0565）と、マウス由来の骨芽細胞様性格を持つＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（RIKEN GENE BANK，RCB1126）の２種類の培養細胞株を用いた、上記蛋白質のアルカリフォスファターゼ亢進活性を指標として、その分化誘導活性として評価した。結果を図２に示す。
【００３６】
ＡＴＤＣ５は５％牛胎児血清を含むＤＦ培地（Gibco社）に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は１０％牛胎児血清を含むＭＥＭ−α-培地（Gibco社）に１mLあたり１万個の濃度で懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１mLずつ撒き、５％ＣＯ2、３７℃にて３日間培養した。
【００３７】
その後、血清未添加のＭＥＭ−α-培地で細胞をリンスし、０.３％牛アルブミンを含むＭＥＭ−α-培地にて段階希釈した天然型２量体または単量体蛋白質を１ウェルあたり０.５mL加え、分化誘導を開始した。３日間培養を行った後、細胞をＰＢＳ（20mMリン酸緩衝液、150mM NaCl、pH 7.4）で２回洗い、２５０μLの細胞溶解液（0.2％ NP−40, １mM MgCl2）を加え２時間３７℃に置いた。その後、破砕された細胞を含む細胞溶解液全量をマイクロチューブに移し遠心（10,000回転、５分間）後の上清をアッセイに用いた。
【００３８】
酵素活性の測定は０.１Ｍ glycine buffer、ｐＨ１０.４、１mＭ ＺuＣl2、１mＭ ＭgＣl2中に溶解した終濃度１０mＭの p-nitrophenyl phosphate を基質として、その分解生成物である p-nitrophenol（pＮp）の４０５nmにおける吸光度の上昇をみることで行った。
吸光度の上昇を２分ごとに４０分間モニターし直線性のみられる範囲のデータからアルカリフォスファターゼ活性（μmol pＮp／min）を算出した。
また、同じ上清について BCA protein assay kit（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いて蛋白濃度を求め、蛋白質あたりのアルカリフォスファターゼ活性をμmol pＮp／min／mg protein として表記した。
【００３９】
【配列表フリーテキスト】
<210> １
<223> ＷＯ９５／０４８１９の配列番号１の１番から８２番および８４番から１１９番のアミノ酸残基に関連する。
注：８３番目のアミノ酸残基はシステインがアラニンに変換されている。
<210> ３
<223> 変異導入用順方向ＰＣＲプライマー
<210> ４
<223> 変異導入用逆方向ＰＣＲプライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１(２)で得られた本発明の蛋白質の発現ベクター（ｐＫＯＴ２７９）のプラスミドマップである。
【図２】  実施例４で得られた本発明単量体蛋白質とヒトＭＰ５２二量体の骨芽細胞分化誘導活性を比較したグラフである。(Ａ)はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における活性を、(Ｂ)はＡＴＤＣ５における活性を示す。白丸は本発明の単量体蛋白質の活性を、黒丸はヒトＭＰ５２二量体の活性をそれぞれ示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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