(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
0004275738.tif 000018
からなる神経刺激性ペプチドを製薬的に許容される担体とともに含む痴呆の治療用医薬組成物。
【請求項２】
痴呆の治療用医薬組成物を製造するための、アミノ酸配列：
0004275738.tif 000019
からなる神経刺激性ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は神経刺激性ペプチドに関し、特にアンギオテンシンIVの同族体として作用することができるペプチドに関する。本発明のペプチドは中枢神経系の種々の部位に高い親和性と特異性をもって結合し、運動および認識機能ならびにニューロン発達の調節物質として有用である。
本発明の背景
レニン−アンギオテンシン系は体液および電解質液平衡、および血圧調節の制御に種々の役割を有する。これらの作用は、循環性のホルモンおよび組織で局所的に生産されるホルモンの両者によって心臓血管系、副腎腺、腎臓、および中枢および末梢神経系を含む種々の標的器官で発揮される。ほとんどのこれらの作用はオクタペプチドであるアンギオテンシンIIが行うが、Ｃ末端ヘプタペプチドであるアンギオテンシンIIIもいくらかの活性を有する。アンギオテンシンIIの３−８断片（すなわち、アミノ酸３−８）に対応するヘキサペプチド、NH2-Val Tyr Ile His Pro Phe−COOHはまた、アンギオテンシンIV（ＡｎｇIV）と称され、最近まで生理活性の欠けている不活性なデグラデーション産物であると考えられていた。
しかし、Hardingおよび共同研究者らはＡｎｇIVが中枢神経系活性を有しており、学習および行動を制御できる（Wrightら、1995）という早期の報告（Braszkoら、1988）を確認した。さらに、ＡｎｇIVは血管作用性効果を有しており、大脳動脈を膨張させ（Haberlら、1991）、腎臓の血流量を増加させる（Swansonら、1992）。このことは、ウシ副腎および他の組織の非常に特異的で、高親和性のＡｎｇIV結合部位の発見とあいまって、このヘキサペプチドへの関心を再びめざめさせ、課題が包括的に総括された（Wrightら、1995）。
ＡｎｇIVは常同症行動を増加させ（Braszkoら、1988）、受動回避実験において記憶回復を可能にする中枢神経系効果に関連している（Braszkoら、1988；Wrightら、1995）。ＡｎｇIVはまた、大脳小動脈を膨張させ（Haberlら、1991）、腎臓の血流量を増加させる（Swansonら、1992）。
レセプターオートラジオグラフィー実験により、モルモット、ヒツジおよびサル中枢神経系のコリン作動性のニューロンに付随する領域および体性運動および感覚に関連する領域における広く豊富であるが選択的および特徴的な（ＡＴ4レセプターとして既知の）［125Ｉ］ＡｎｇIV結合部位の分布が示されている（Miller-Wingら、1993；Moellerら、1995、Moellerら、1996）。さらにＡｎｇIV結合部位は自律神経系の上部脊髄成分に豊富であり、脊髄中、交感神経前節ニューロン、背部基底節、および後角の層II、および前角の運動ニューロンに見られる（Moellerら、1995）。
ＡｎｇIV結合部位の分布はＡｎｇIIＡＴ1またはＡＴ2レセプターの局在性と異なる。さらに、それぞれのレセプターの薬理性質は、ＡｎｇIV部位が非サブタイプの選択的ＡｎｇIIアンタゴニストである［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、およびそれぞれ特異的ＡＴ1およびＡＴ2レセプターアンタゴニストであるロサルタン（losartan、du pont-Merck）およびＰＤ１２３３１９（Parke-Davis）に対して低〜非常に低い親和性を示す点で区別できる（Miller-Wingら、1993；Swansonら、1992；Hanesworthら、1993）。逆に、ＡｎｇIIレセプターはＡｎｇIV結合部位に対して低い親和性を示す（BennettおよびSnyder、1976）。
ＡｎｇIV結合部位が運動性、感覚性およびコリン作動性の領域に広く分布することは、中枢神経系でのこのペプチドの重要な役割を示唆する。しかし、ニューロンにおけるこのペプチドの生理作用は未だ明確にされていない。
非常にたくさんの神経伝達物質および神経ペプチドがニューロン発達の制御に関与している。アセチルコリンは胚ニワトリ毛様体神経節細胞および交感ニューロン（PughおよびBerg、1994；Smallら、1995）、およびラット海馬ニューロン（Muttson、1988）の神経突起伸長を阻害する。逆に血管作用性の腸ペプチドは頸部神経節の分岐を刺激し（Pincusら、1990）、ソマトスタチンはヘリソーマ（Helisoma）頬側神経節ニューロンからのニューロンの神経突起形成を増加させる（Bulloch、1987）。
現在、驚くべきことに、本発明者らはβ−グロビンから派生するペプチドＬＶＶ−ヘモルフィン−７がＡＴ4レセプターのアゴニストとして作用し、これが脳内ＡＴ4レセプターに対する内生リガンドであることを発見している。本発明者らはその薬理活性を特徴付けした。このことはＡｎｇIV活性の新規アゴニストおよびアンタゴニストの設計を可能にする。
本発明の要旨
１つの態様では、本発明はアミノ酸配列：
0004275738.tif 000002
を有する、本明細書中に定義するアンギオテンシンIVの生物学的活性の少なくとも１つを有する神経刺激性ペプチド、または該ペプチドの生物学的に活性な同族体または断片を提供する。
生物学的活性が維持されていれば、保存アミノ酸置換、挿入、欠失または拡張によって本発明の配列を変更できることははっきりと理解されよう。このような変異体には例えば、Ｄ−アミノ酸、非天然存在アミノ酸および／またはアミノ酸同族体を含む配列を含ませることができる。
別の態様では、本発明は本発明の上記第一態様のペプチドの非ペプチド同族体を提供する。この非ペプチド同族体は本発明の化合物の生物学的利用能、代謝安定性、体内での半減期を改善し、あるいはその生物学的活性を変更するためのペプチド構造の変更または置換を含むと理解すべきである。このような非ペプチド同族体、例えばペプチドバックボーンが非ペプチド鎖に置き換えられている化合物は当分野に既知であり、しばしば擬似ペプチド化合物として表される。一方、１つまたはそれ以上のペプチド結合において窒素および炭素原子の順序が逆になり、擬似ペプチド結合を形成することがある。１つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖をより安定な類似構造によって置き換えることができる。そのような他のバリエーションの多くは当業者によって案出されるであろう。唯一必要とされることは、ＡＴ4レセプターに適度な親和性で結合する能力が維持されるほど全体の三次元構造が十分に保存されていることである。現在のペプチド合成法および結合化学を用いて、非常に多数の同族体を短時間に合成し、試験することが可能であり、製薬会社では、このような合成およびスクリーニングが繰り返し行われている。
高い親和性を有するために必要とされるＡｎｇIVペプチドの構造的特徴に関し、かなりの情報が入手可能であり、これらの結果は本発明のペプチドの修飾に関してガイドラインとして用いることができる。例えば、Wrightら、1995参照。
配列の変更あるいは非ペプチド同族体の構築によって、本発明の化合物の活性を非常に大きく変更できることは当業者の認識するところであろう。活性の改善が得られるばかりでなく、ＡｎｇIV活性を阻害するようにＡＴ4レセプターに結合する化合物を得ることもできる。このような阻害化合物はＡｎｇIVの活性と拮抗する能力を有し得る。当業者であれば当分野に周知の方法を用いて容易に修飾ペプチドおよびペプチド同族体を合成し、それらがＡｎｇIVアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性を有しているか否かを試験できるであろう。
これゆえ、第二の態様にしたがって、本発明はまた、本発明の神経刺激性ペプチドのアンタゴニストとして作用することができる化合物を提供する。
第三の態様にしたがって、本発明は運動性ニューロン活性、コリン作動性ニューロン活性またはニューロン発達の調節方法であって、有効量の本発明の化合物を上記処置を必要としている哺乳類に投与する過程を特徴とする方法を提供する。本発明のこの態様には具体的に、未知の、存在すら知られていないデカペプチドの活性に依存する本発明の方法に、上記のデカペプチド配列を使用することが含まれる。
哺乳類はヒトであることが好ましい。
本発明に記載のＡｎｇIVアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、以下に示す種々の症状の処置に有用であるが、これらに限定されない：
アルツハイマー疾患を含む痴呆、
運動性ニューロン疾患のようなコリン作動性経路、運動性経路または感覚性経路を伴う他の神経退化障害、
感覚性および運動性末梢神経障害、
トラウマ、低酸素症または血管疾患による脳または脊髄損傷。
本発明の詳細な説明
以下の非限定的な実施例および図を参照して、ここに本発明を詳細に説明する。
図中；
図１は増加濃度の以下の非ラベルリガンド：▲ＡｎｇIV、□ＡｎｇII、■ＡｎｇIII、△ＡｎｇII（１−７）、●ロサルタンおよび○ＰＤ１２３３１９の存在下に、［125Ｉ］ＡｎｇIVとインキュベートした前頭葉前部皮質切片から導いた競合曲線を示す。値は２個体の動物からのそれぞれ４切片の平均値である。Ｂ／Ｂｏ×１００は有効なレセプターの占有パーセントとして表す；
図２は、種々の濃度の非ラベル化合物：
▲ＡｎｇIV、◇Ｎｌｅ1−ＡIV、△ＣＧＰ４２１１２、□ＡｎｇII、▼Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミド、
0004275738.tif 000003
■［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、●ＰＤ１２３３１９および○ロサルタンでのＥ１３ニワトリ漿尿膜に対する［125Ｉ］ＡｎｇIV結合の阻害を示す競合結合実験の結果を表す。値は全結合に対するパーセントとして表し、２つの実験からまとめたものである。Ｂ／Ｂｏ×１００＝有効なレセプターの占有％；
図３は、種々の濃度の非ラベル化合物：
■［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、□ＡｎｇII、△ＣＧＰ４２１１２、◇Ｎｌｅ1−ＡIV、▲ＡｎｇIV、○ロサルタン、●ＰＤ１２３３１９、
0004275738.tif 000004
および▼Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミドでのＥ１３ニワトリ漿尿膜に対する125Ｉ［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII結合の阻害を示す競合結合実験をまとめたものである。値は全結合に対するパーセントとして表し、２つの実験からまとめたものである。Ｂ／Ｂｏ×１００＝有効なレセプターの占有％；
図４はＥ１１ニワトリの交感ニューロンからの神経突起伸長に対するＡｎｇIVの効果を示す。値は標準対照レベルのパーセントとして表し、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。結果は、それぞれ少なくとも４０の神経突起の測定を行う３つの実験からまとめる。★はボンフェローニ（Bonferroni）試験を用いた対照標準値からの有意差を示す；
図５は１μＭ Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミド、ＷＳＵ−４０４２、Ｎｌｅ1−ＡIV、［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、ロサルタン、ＰＤ１２３３１９およびＣＧＰ４２１１２の存在下における１０ｎＭ ＡｎｇIVの神経突起伸長に対する効果を示す。
値は対照標準レベルに対するパーセントとして表し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。この結果は、それぞれ少なくとも４０の神経突起の測定を行う３つの実験からまとめる。★はボンフェローニ試験を用いた対照標準値からの有意差を示す；
図６は１μＭ Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミド、ＷＳＵ−４０４２、Ｎｌｅ1−ＡIV、［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、ロサルタン、ＰＤ１２３３１９およびＣＧＰ４２１１２の存在下における１０ｎＭ ＡｎｇIIの神経突起伸長に対する効果を示す。値は対照標準レベルのパーセントとして表し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。この結果は、それぞれ少なくとも４０の神経突起の測定を行う３つの実験からまとめる。★はボンフェローニ試験を用いた対照標準値からの有意差を示す；
図７は125ＩアンギオテンシンIVのヒツジ脊髄に対する結合を例示する。矢印は脊髄の損傷部位を指す；
図８は、種々の濃度の非ラベル化合物：
▲ＡｎｇIV、△ＬＶＶ−ヘモルフィン−７、■ＡｎｇIII、□ＡｎｇII、○ＰＤ１２３３１９、●ロサルタン、★ナロキソンおよび▽ハロペリドールでの［125Ｉ］ＬＶＶ−ヘモルフィン−７のヒツジ小脳皮質膜に対する結合の阻害を示す競合結合実験の結果をまとめたものである。値は３つの実験の平均値である。Ｂ／Ｂｏ×１００＝有効なレセプターの占有％；
図９は、種々の濃度の非ラベル化合物：
▲ＡｎｇIV、△ＬＶＶ−ヘモルフィン−７、■ＡｎｇIII、□ＡｎｇII、○ＰＤ１２３３１９、●ロサルタン、★ナロキソンおよび▽ハロペリドールでの［125Ｉ］ＡｎｇIVのヒツジ小脳皮質膜に対する結合の阻害を示す競合結合実験の結果をまとめたものである。値は３つの実験の平均値である。Ｂ／Ｂｏ×１００＝有効なレセプターの占有％；
図１０はクローニングおよびＰＣＲ実験に用いるオリゴヌクレオチドプローブの位置を図解する概略図である。（Ａ）用いるオリゴヌクレオチドの相対的位置および方向を示すβ−グロビン前駆体の概略図。影の領域は以下に記載するＬＶＶ−ヘモルフィン−７配列を表す。（Ｂ）本実験に用いるオリゴヌクレオチドＨ１７０〜Ｈ１７３の配列（それぞれ配列番号２〜５）；
図１１はＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングによるヒツジ小脳および大脳皮質、心臓および肝臓のβ−グロビンｍＲＮＡの検出を図解する。分子量マーカーを左側に示す；
図１２はクローンＥＸの完全ヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；ならびに
図１３はラットＥＸクローンのヌクレオチド配列（配列番号７）および誘導アミノ酸配列を示す。
潜在的ＬＶＶ−ヘモルフィン−７の領域は太字で示す。
図１４はスコポラミン処理ラットの受動回避作業試験における目標達成能に対するＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果をまとめたものである。
図１５はスコポラミン処理ラットの水迷路習得試験における目標達成能に対するＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果をまとめたものである。
非ラベルリガンド、ＡｎｇIV（Peninsula Laboratories，California USA）、ＡｎｇIIおよびＡｎｇIIアンタゴニスト［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII（Sigma，Missouri USA）、ＡｎｇII部分的アゴニストＣＧＰ４２１１２（Ciba-Geigy，Basle Switzerland）、ＡｎｇIIＡＴ1アンタゴニスト、ロサルタン（Du Pont Merck Pharmaceutical Company，Delaware USA）、ＡｎｇIIＡＴ2アンタゴニスト、ＰＤ１２３３１９（Parke-Davis，Michigan USA-Ms.C.L.Germain）、およびＡｎｇIV同族体、ＷＳＵ４０４２、Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミドおよびＮｌｅ1−ＡIV（Sardiniaら、1993によって以前に記載されているように製造した）を最終濃度１０-9〜１０-4Ｍの範囲で用いた。
実施例１ サル脳におけるアンギオテンシンＡＴ4レセプターのマッピング
本発明者らはモルモット脳に観察される広くはっきりしたこのレセプターの分布が霊長類にも見出されるかどうかを決定するため、インビトロレセプターオートラジオグラフィーを用い、マカカ・ファサイクラリス（Macaca fascicularis）脳においてＡｎｇIVに対するレセプター（ＡＴ4レセプター）分布をマッピングした。最初に前頭葉前部皮質脳切片での競合実験において結合部位を薬理学的に特徴付けした。これらの結果を図１にまとめる。ＡｎｇIV、ＡｎｇIIIおよびＡｎｇIIはそれぞれが５ｎＭ、８０ｎＭおよび７３０ｎＭのＩＣ50値で［125Ｉ］ＡｎｇIV結合に競合したが、ＡｎｇII（１−７）は弱い競合物であった（ＩＣ50値２４ｍＭ）。ＡＴ1レセプターアンタゴニスト、ロサルタン（du Pont-Merck）およびＡＴ2レセプターアンタゴニスト、ＰＤ１２３３１９（Parke-Davis）は、濃度１０ｍＭでさえ不活性であった。これらの薬理的性質は、ウシ副腎およびモルモット隔膜のＡＴ4レセプターについて以前に記載された性質と類似しており、このことは本発明者らが同じレセプターの分布をマッピングしたことを確かにするものである。
ＡＴ4レセプターの分布は、その分布がいくつかの神経系にまで広がっている点で注目すべきであった。これを表１にまとめる。最も注目すべき発見は、このレセプターが運動核および運動関連領域に局在していることであった。これらには前角脊髄運動性ニューロン、眼球運動、滑車、顔面および舌下ニューロンを含むすべての脳神経運動性ニューロン、および迷走神経の背部運動性ニューロンが含まれていた。レセプターはまた、前庭の、細網の、ならびに下位のオリーブ核、小脳の顆粒層および運動性皮質のベッツ（Betz）細胞にも存在していた。適度なＡＴ4レセプター密度はすべての小脳核、腹部視床核および黒質緻密質に見られ、尾状核および被殻においてより低いレセプター密度で観察された。中枢神経系のすべてのレベルの運動性階層におけるＡＴ4レセプターの局在性は、運動活性における結合部位の重要な役割を示唆する。
0004275738.tif 000005
値は動物１個体からの４つの切片の平均値であり、ＡＴ4レセプターの相対密度を表す。★値は比較的高い結合を示す個々の細胞体からではなく、全範囲から求める。
体性運動核および自律神経節前運動核に加え、豊富なＡＴ4レセプターはまた、他のコリン作動性系およびその突起、例えばマイネルト基底核、対角バンドの頭頂肢および海馬などに観察された。運動性ニューロンの神経伝達物質であること以外に、アセチルコリンはまた、認識に関与する。これは抗コリン作動性薬物は記憶障害および混乱を誘導し；アルツハイマー疾患では、マイネルトの豊富なコリン作動性基底核にニューロン喪失が生じるからである。ＡｎｇIVは受動および条件化回避試験において記憶を回復させることが２つの独立した実験で示されており（Braszkoら、1988；Wrightら、1993）、脳室内投与した場合、海馬においてｃ−ｆｏｓ発現を誘導する（Robertsら、1995）。この領域にＡＴ4レセプターが高密度に存在することとともに、これらの観察はＡｎｇIVが認識機能の調節に重要な役割を有しているかもしれないことを示す。
ＡＴ4レセプターはまた、脊髄三叉神経、薄束、楔状束および視床腹部後核および体性感覚皮質のような感覚領域にも適度な量で観察された。運動および認識領域に観察されたレセプター密度と比べ、感覚性ニューロンではレセプター密度は低かったが、ＡＴ4レセプターは、脊髄層II、薄束、楔状束および脊髄三叉神経核、腹部視床後および外側膝状体核および感覚皮質を含む感覚関連領域中いたるところに位置し、このことは感覚活性の実質的改善を示す。この分布パターンはモルモットおよびヒツジ脳でも観察されている。また、実施例２に示すようにヒツジ背部基底神経節にも豊富なＡＴ4レセプターが観察された。
実施例２ ヒツジ脊髄のアンギオテンシンＡＴ4レセプターのマッピング
本発明者らは、上位脊髄運動および感覚領域におけるＡＴ4レセプターの強い存在性が脊髄内で存続しているかどうかを調べるため、ＡＴ4レセプターの局在性をヒツジ脊髄にまで拡大調査した。
ヒツジ脊髄の第８頸部セグメント（Ｃ８）において［125Ｉ］ＡｎｇIVの結合特性を評価した場合、結合に競合する種々の非ラベルリガンドの親和性はサル脳に対して観察された親和性と類似していることを本発明者らは発見した。
ヒツジ脊髄では、高密度ＡＴ4レセプターはすべての被検セグメントの前角の層IXに見られた。細胞レベルでは、外側または内側運動性ニューロンの細胞質表面およびその突起に結合が見られたが、結合は細胞核には存在しなかった。ＡｎｇIV結合部位の明確な機能はまだ決められていないが、上位脊髄運動領域での強い存在性に加え、脊髄の前角の運動性ニューロンに豊富に局在することから運動活性との関連性は強まる。
高密度ＡＴ4レセプターはまた、中間外側細胞柱の交感神経節前ニューロンに対応するすべての胸郭セグメントおよび腰部セグメントＬ１−Ｌ４の層VIIの外側尖にも見られた。しかし、Ｌ５およびＬ６ならびに仙骨部セグメントＳ１およびＳ２には結合が存在しなかった。
すべての脊髄セグメントに付随する背部基底神経節では、高密度ＡＴ4レセプターは感覚性ニューロンの小および大細胞体の細胞質に見られたが、サテライト（satellite）細胞および神経節内結合組織には存在しなかった。層ＩおよびII、背部基底神経節感覚求心性神経の末端部分では、層IIにおける少量のレセプターに注目する。層IIの少量のＡＴ4レセプターにもかかわらず、背部基底神経節には多量に存在することおよびほとんどの上位脊髄感覚領域で少量であること以外は一貫して多いことから、ＡＴ4レセプターはまた、感覚情報をプロセッシングすることに役割を有しているかもしれないことが示される。
少量のＡＴ4レセプターはまた、軟膜表面に放射状に広がった血管中、腹側および背側裂溝の血管中、および中心管上衣に見られた。ＡｎｇIVはウサギ軟膜小動脈の内皮依存性膨張を誘導すること、またラットにおいてＡｎｇIVは実験的くも膜下出血後の急性脳血流減少を回復させることが報告されている。
本発明者らの局在性実験はＡＴ4レセプターがその薬理的特性および脳および脊髄におけるその分布パターンの点で、既知のアンギオテンシンレセプター、ＡＴ1a、ＡＴ1bおよびＡＴ2レセプターとはっきりと区別できることを示す。さらにＡＴ4レセプターの分配パターンは、これらが運動機能、感覚機能、および認識を含むコリン作動性系に関係するニューロンの機能に関与するかもしれないことを示す。
実施例３ ニワトリ胚ＡｎｇIVおよびＡｎｇII結合部位の特徴付け
ニワトリ胚ＡＴ4およびＡｎｇIIレセプターの薬理性質を特徴付けするために、１３日胚（Ｅ１３）ニワトリ由来の漿尿膜（ＣＡＭ）を用いた。この膜を取り出し、−４０℃まで冷却したイソペンタン中で凍結した。
ａ）ニワトリ胚ＡｎｇIV結合部位の特徴付け
ＣＡＭを低張緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ）３０ｍＬ中でホモジナイズし、次いで５００ｇおよび４℃で１０分間遠心した。上清画分を取り出し、４０，０００ｇおよび４℃で２０分間遠心した。得られたペレットを低張緩衝液２ｍＬ中で再ホモジナイズし、Bioradタンパク質アッセイで求めてタンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにホモジネートの最終容量を調節した。結合アッセイは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、２０μＭベスタチンおよび０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中、総量２７０μＬでＣＡＭ（タンパク質１００μｇ）、［125Ｉ］ＡｎｇIV０．１４μＣｉ（約２６０ｐＭ）、および競合リガンドを含んでいた。結合系は３７℃で２時間インキュベートした。
ｂ）ニワトリ胚ＡｎｇII結合部位の特徴付け
以下のことを除いては上記のようにＣＡＭを調製した。等張緩衝液は５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４および６．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含み、低張緩衝液は５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１２５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含んでいた。さらに、それぞれ１μＭ濃度で用いるペプチダーゼ阻害剤、ロイペプチン（leupeptin）、リシノプリル、ホスホラミドン、プランマー（Plummer’s）阻害剤およびベスタチン、および１ｍＭベンズアミジン、および２．５ｍＭフェナントロリンを両緩衝液に含ませた。
Ｅ１３ニワトリでの結合競合実験では、［125Ｉ］ＡｎｇIV結合はＡｎｇIVおよびＮｌｅ1−ＡIVによって強く阻害され（それぞれＩＣ50値１８および４３ｎＭ）、一方ＷＳＵ−４０４２、Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミドおよびＡｎｇIIはそれぞれＩＣ50値５、２．２、０．６５μＭを有するより弱い競合物質であり、ロサルタンおよびＰＤ１２３３１９は１０μＭまでの濃度で不活性であった。［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇIIおよびＣＧＰ４２１１２は部位の５０％に対する競合のみにおいて、すなわちそれぞれ１０および０．５μＭの濃度でのみ有効であった。これらの結果を図２にまとめる。
ＣＡＭに対する125Ｉ［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII結合の実験では、ＡｎｇII、［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇIIおよびＣＧＰ４２１１２はそれぞれＩＣ50値１００、１３および１８０μＭを有して結合に競合し、一方ＡｎｇIV、ＮＩｅ1−ＡIVおよびロサルタンは非常に弱い競合物質（それぞれＩＣ50値５０、８および１００μＭ）であった。ＰＤ１２３３１９、ＷＳＵ−４０４２およびＮｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミドは１００μＭより大きいＩＣ50値を示した。これらの結果を図３に示す。
実施例４ ＡｎｇIVの神経突起伸長に対する効果
運動、感覚、コリン作動性領域におけるＡＴ4レセプターの広い分布は中枢神経系でのこのペプチドの重要な役割を示す。しかし、ニューロンにおけるＡｎｇIVの生理的作用は未だ明らかにされていない。多数の神経伝達物質および神経ペプチドがニューロン発達の制御に関係している。例えば、アセチルコリンはニワトリ胚の毛様体神経節細胞、交感性ニューロンおよびラット海馬ニューロンの神経突起伸長を阻害する。逆に、血管作用性腸内ペプチドは上位頸部神経節の分岐を刺激し、ソマトスタチンはヘリソーマ（Helisoma）頬側神経節ニューロンからの神経の発芽を増加させる。
本発明者らは培養ニワトリ胚交感性ニューロンからの神経突起の伸長に対する効果を試験することによって、ＡｎｇIVが中枢神経系の作用に関する役割を有しているかどうかを決定した。
トリプシン／ベルセネ（Versene）を用いてＥ１１ニワトリ由来の交感神経節を解離させ、２４ウェルプレート中、１％（ｖ／ｖ）インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ成長補給物質（Gibco BRL、Maryland USA）、１００ｍＭプトレッシン、１．６７ｍｇ／ｍＬプロスタグランジンＦ２α、６．６７ｎｇ／ｍＬプロゲステロンおよび５ｎｇ／ｍＬ神経成長因子（Sigma、Missouri USA）を含有するＤＭＥＭおよびハム（Ham）のＦ１２培地で培養した。ニューロンをウェルに接着させ（約２時間）、ペプチドおよび／またはそのアンタゴニストで２４時間処理した。用いたペプチドおよびアンタゴニストはＡｎｇIVまたはＡｎｇIIのいずれかを加える０．５時間前に培養物に加えた。ＡｎｇIV用量作用曲線は濃度範囲１０-11〜１０-5Ｍにわたって機能していた。培養皿を０．１ｍｇ／ｍＬポリリジンでコーティングし、次いでリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬラミニンでコーティングした。ウェルはＰＢＳで洗浄して、培養に用いた。
実験の終わりには、培養培地をウェルから取り出し、ＰＢＳ中の２．５％グルタルアルデヒドでニューロンを２０分間固定し、ＭＤ３０Ｐｌｕｓイメージ分析ソフトウェア（Adelaide、Australia）に接続した位相差顕微鏡下で試験した。試験したすべてのニュウロンの神経突起の長さ（５０μｍより長い）を測定した。処理群ごとに最低４０の神経突起を測定し、各々の実験処理は少なくとも３回実行した。
実験の最後には、０．１％アニリンブルーを除去して細胞の生存能力を確認した。
胚（Ｅ１１）ニワトリ交感性ニューロンの培養では、ＡｎｇIVは、しきい値１０-11Ｍ、１０-10Ｍで半最大阻害ならびに１０-9Ｍで最大作用を有して、用量依存的に神経突起の伸長を阻害した。１０-9〜１０-5Ｍの間、伸長は最大限に阻害された（Ｐ＜０．０５）。これらの結果を図４に示す。１０-8Ｍ ＡｎｇIVでは、神経突起伸長の阻害が１μＭのＡｎｇIV同族体ＷＳＵ−４０４２、Ｎｌｅ1−Ｙ−Ｉ−アミドおよびＮｌｅ1−ＡIVによって全体的に回復した。この同族体単独の作用は統計的に対照標準値と異なる値とはならなかった。ＡｎｇIV同族体と対照的に、ＡｎｇIIアンタゴニスト、［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、ＡＴ1およびＡＴ2アンタゴニスト、ロサルタンおよびＰＤ１２３３１９、およびＡｎｇII部分的アゴニスト、ＣＧＰ４２１１２は、図５に示すように、ＡｎｇIV応答に全く作用しなかった。
１０-8Ｍ ＡｎｇIIでは、神経突起の伸長が２５％まで阻害され、これは非常に有意であった。ＡｎｇIV同族体はこの作用を完全に回復させたが、一方ＡｎｇIIアンタゴニスト［Ｓａｒ1Ｉｌｅ8］ＡｎｇII、ロサルタン、ＰＤ１２３３１９およびＣＧＰ４２１１２は作用しなかった。これを図６に示す。
これらの研究は両ペプチドによる神経突起の伸長の阻害はＡＴ4レセプターによって媒介され、神経突起モデリングにおけるアンギオテンシンIVの役割を補助することを示す。
実施例５ 脊髄損傷に対するアンギオテンシンIVの作用
グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）−陽性星状細胞は脊髄への損傷後の神経突起形成のモデリングに関与する（Bovolentaら、1992）。損傷誘発性可塑は発育中の胎児に観察された可塑と類似の状態である（Schwartz、1992）。脊髄組織のＡｎｇIVとの結合能に関する本発明者らの知見（実施例２）を考慮して、本発明者らはＡｎｇIV結合に対する脊髄損傷の影響を試験した。驚くべきことに、本発明者らは損傷脊髄切片では［125Ｉ］ＡｎｇIVの結合が顕著に増加していることを発見した。これを図７に例示する。
これらの結果はＡＴ4レセプターが脊髄損傷の影響を緩和するのに適当な標的であることを示す。
実施例６ ＡＴ4レセプターに結合する内生脳ペプチドの精製
脳内のＡｎｇIVレベルは非常に低く、検出できない（DJ Campbell、personal communication）。中枢神経系におけるＡＴ4レセプターの広く特徴的な分布は、このレセプターに対する未だ同定されていないペプチドリガンドが存在し得ることを示す。それゆえ本発明者らは慣用のタンパク質化学精製技術をＡＴ4レセプターアッセイ系とともに用いて、この系にて［125Ｉ］ＡｎｇIV結合に競合するヒツジ脳の抽出物中の物質を検出し、モニターするために、このようなリガンドの探究に着手した。
ａ）125ＡＴ4レセプター結合アッセイ
125Ｉ−ＡｎｇIVのウシ副腎膜に対する結合をヒツジ大脳皮質画分におけるＡＴ4レセプター結合活性に関してスクリーニングするためのアッセイ系として用いた。アバトーア（abbatoir）から得られたウシ副腎腺をさいの目に切って１ｍｍ×１ｍｍのブロックとし、低張緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）３ｍＬ中でホモジナイズし、次いで５００ｇで１０分間遠心した。上清を取り出し、４０，０００ｇで２０分間遠心し、得られたペレットを低張緩衝液２ｍＬ中で再ホモジナイズした。結合アッセイサンプルは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、２０μＭベスタチンおよび０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中、総量２７０μＬでウシ副腎（Bioradタンパク質アッセイで求めたところ、タンパク質５６ｍｇ）、０．１４μＣｉの［125Ｉ］ＡｎｇIV（約２６０ｐＭ）および試験サンプル１０μＬを含んでいた。125Ｉ−ＡｎｇIV結合に競合する画分の相対的強さを既知量の非ラベルＡｎｇIVを加えた（１０-10〜１０-6Ｍ）標準曲線から決定した。最も高い活性を示す画分を次の精製工程に付すこととし、各精製工程の画分を［125Ｉ］ＡｎｇIV結合に対する競合能に関してアッセイした。
ｂ）精製手順
ヒツジ大脳皮質を２Ｍ酢酸中でホモジナイズし（２ｍｇ／組織ｇ）、遠心し、上清をデカンテーションした。調製用Ｃ１８物質のカラム（５５−１０５ｍｍ、Waters）を用いて抽出物の予備精製を行った。Ｃ１８溶出物を凍結乾燥し、再構成し、一連の精製工程に付し、画分をＡｎｇIV置換活性に関してアッセイした。簡単に、クロマトグラフィー工程は：種々の孔サイズのカラム（Ｄｅｌｔａｐａｋ Ｃ１８、３００°ＡおよびＮｏｖａｐａｋ Ｃ１８）を用い、ならびにイオン対形成剤、溶媒および濃度勾配溶出条件を変化させる３つの連続する逆相ＨＰＬＣ工程であり；この後、microbore ＬＣ Ｃ８カラムでの最終精製で陰イオン交換し、次いで陽イオン交換した。オンラインモデル１２０Ａ ＰＴＨアナライザー付のApplied Biosystemsモデル４７０Ａタンパク質シーケンサーを用いて精製した活性ペプチドの配列を決定した。
ヒツジ大脳皮質は最初のＣ１８ Ｄｅｌｔａｐａｋカラムの後、湿重量ｇ当たり１．９nmolesのＡＴ4レセプター結合活性を生じた。第三のPoly ＬＣカラム（５５℃）の後、ＡｎｇIV活性は主要ＵＶ吸収ピークとともに溶出し、このピークから以下のペプチド配列が得られた。
0004275738.tif 000006
タンパク質データベース登録の調査によりこの配列がヒトβ、δ、γおよびεグロビン鎖のアミノ酸配列３２−４１に対応し、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７として知られていることが示された。
ＬＶＶ−ヘモルフィン−７は脳、下垂体、視床下部および骨髄に見られ、高い親和性でアンギオテンシンＡＴ4レセプターに結合する１０アミノ酸ペプチドである。ヒツジペプチド配列はヒツジβA、βB、βCおよびεグロビン前駆体のアミノ酸３０−３９（GarnerおよびLingrel、1989；SabanおよびKing、1994）と同一であり、この配列はヒトを含む多くの種で保存されている（例えばKarelinら、1994参照）。ヒトでは、第１１染色体に密集している６つのβ−グロビン様遺伝子ε、γA、γG、δ、βおよび偽遺伝子Ψβが存在し、これらはすべてＬＶＶ−ヘモルフィン−７配列をコードしている（KarlssonおよびNienhuis、1985）。この配列はいずれのαグロビンファミリーの遺伝子にも存在しない。ＬＶＶ−ヘモルフィン−７およびこのペプチド内のより短い配列のいくつかはオピオイド活性を有し、配列ＶＶＹＰがこの活性に必要であることがわかっている（Karellinら、1994）。
実施例７ 合成ＬＶＶ−ヘモルフィン−７の性質
Chiron Mimotopesの条件下に上記単離の配列を有するデカペプチドを合成し、以下のようにその生化学的および薬理学的性質を特徴付けした：
ａ）ＨＰＬＣ
予備的な高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、合成ペプチドが配列決定された画分とともに溶出しないことが示された。この画分が４℃での長時間の保存のために分解していたことがわかった。これが事実であるかどうかを決定するため、質量スペクトル分析を行った。もとの精製物質を長時間保存した後に生じた２つの活性ピークの質量スペクトル分析から得られたデータはまさに分解物と一致していた。早く溶出するピークはカルボキシ末端からのフェニルアラニン残基欠失物に正確に対応する質量を与え、一方第二の活性ピークはアミノ末端のロイシン残基欠失物に正確に対応する質量を与えた。さらにこれらのデータ（質量記録はすべて明白である）は、ペプチドコア内またはアミノもしくはカルボキシル末端いずれにおいても活性ペプチドが翻訳後修飾されないことを強く示す。
ｂ）リガンド結合実験
ウシ副腎膜およびヒツジ小脳皮質膜での125Ｉ−ＡｎｇIVの結合に関する競合におけるデカペプチドＬＶＶ−ヘモルフィン−７の薬理学的性質を決定した。クロラミンＴを用いてＬＶＶ−ヘモルフィン−７およびＡｎｇIV両方を放射性ヨード化し、２０−８０％メタノール濃度勾配中の０．５％トリフルオロ酢酸を用いてＣ１８Ｓｅｐ−ｐａｋカラムで分離した。
ウシ副腎膜またはヒツジ小脳皮質膜を低張緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）３０ｍＬ中でホモジナイズし、次いで５００ｇで１０分間遠心した。上清を取り出し、４０，０００ｇで２０分間遠心し、得られたペレットを低張緩衝液２ｍＬ中で再ホモジナイズした。結合アッセイは：
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、２０μＭベスタチンおよび０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中、総量２７０μＬで；
Bioradタンパク質アッセイ（Bradford、1976）で決定したウシ副腎（タンパク質５６μｇ）またはヒツジ小脳膜（タンパク質２６μｇ）；
０．１４μＣｉの［125Ｉ］ＡｎｇIV（約２６０ｐＭ）または０．１１μＣｉの［125Ｉ］ＬＶＶ−ヘモルフィン−７（約２００ｐＭ）、および
競合リガンドを含んでいた。
アッセイは３７℃で２時間インキュベートした。
この放射性レセプターアッセイ系での２つのペプチドの相対的強さを決定するため、ウシ副腎膜において一定の濃度範囲の非ラベルＬＶＶ−ヘモルフィン−７またはＡｎｇIVをアッセイ系に加えた。ＡｎｇIVおよびＬＶＶ−ヘモルフィン−７は両方とも125Ｉ−ＡｎｇIV結合に対する競合において同等な親和性（約１−５ｎＭ）を示したが、ＡｎｇIVのほうが少し高い親和性を示した。
ヒツジ小脳皮質膜での競合実験に関して、非ラベルリガンド、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７、ＡｎｇIV、ＡｎｇII、ＡｎｇIIIおよび非特異的オピオイドアンタゴニスト、ナロキソン、ＡｎｇIIＡＴ1アンタゴニスト、ロサルタン、ＡｎｇIIＡＴ2アンタゴニスト、ＰＤ１２３３１９およびsigmaオピオイドおよびドーパミンＤ2アンタゴニスト、ハロペリドールの希釈物を１０-13〜１０-4Ｍの範囲の濃度で用いた。レセプター結合の定量は２実験の平均値として計算した。
これらの実験において、ヒツジ小脳皮質膜に対する125Ｉ−ＬＶＶ−ヘモルフィン−７の結合は、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７、ＡｎｇIV、ＡｎｇIIIおよびＡｎｇII（それぞれＩＣ50値５．６ｎＭ、１ｎＭ、７７ｎＭおよび１．６μＭ）によって競合された。ＰＤ１２３３１９は弱い競合物質であった（ＩＣ50値４６μＭ）が、一方ロサルタン、ナロキソンおよびハロペリドールは作用しなかった（ＩＣ50値は１００ｍＭより大きい）。これらの結果を図８に示す。同様に小脳膜に対する［125Ｉ］ＡｎｇIVの結合は、ＡｎｇIV、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７、ＡｎｇIIIおよびＡｎｇIIによってそれぞれＩＣ50値１．１３ｎＭ、２ｎＭ、６．９ｎＭおよび２μＭで競合されたが、一方ＰＤ１２３３１９、ロサルタン、ナロキソンおよびハロペリドールは１０μＭで不活性であった。これらの結果を図９に示す。
Ｃ）125Ｉ−ＬＶＶ−ヘモルフィン−７のヒツジ脳に対する結合
ヒツジ菱脳切片を用いて125Ｉ−ＬＶＶ−ヘモルフィン−７およびＡＴ4レセプター部位の分布を比較した。１０μｍ厚の切片を２２℃に平衡化し（３０分間）、次いで５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、２０μＭベスタチンおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含む等張緩衝液ｐＨ７．４中で３０分間プレインキュベートした後、さらに２．８４μＣｉの［125Ｉ］ＬＶＶ−ヘモルフィン−７または［125Ｉ］ＡｎｇIV（約１４０ｐＭ）を含む同緩衝液中に２時間インキュベートした。１μＭ非ラベルＬＶＶ−ヘモルフィン−７またはＡｎｇIVどちらかで放射性リガンドの結合を交叉置換した。インキュベート後、この切片を４℃で２分間緩衝液で３回洗浄し、Ｘ線フィルムに１４〜２８日間暴露した。
［125Ｉ］ＬＶＶ−ヘモルフィン−７および［125Ｉ］ＡｎｇIVはヒツジ菱脳において同一の結合パターンを示した。結合は運動関連領域、小脳の顆粒層、下オリーブ、舌下神経および外側網様核、自律神経系領域、迷走神経の背側運動核および疑核、および感覚領域、外部楔状束および脊髄三叉神経核に局在していた。両放射性リガンドの結合は１μＭ濃度の非ラベルＡｎｇIVまたはＬＶＶ−ヘモルフィン−７によって置換され、このことは２つの結合部位が同じ脳領域に分布していることだけでなく、２つの放射性リガンドが実際に同じ部位に結合していることを示す。
実施例８ 潜在的ＬＶＶ−ヘモルフィン−７前駆体クローンの単離
ＬＶＶ−ヘモルフィン−７が脳で合成されるかどうか、あるいはヘモグロビンの崩壊から派生するかどうかは知られていない。脳におけるＬＶＶ−ヘモルフィン−７前駆体ｍＲＮＡの存在を証明することは前者の証拠を提供するであろう。ＬＶＶ−ヘモルフィン−７前駆体ｍＲＮＡが脳に存在することを示す可能な方法には以下の工程が含まれる：
（ａ）脳ｃＤＮＡライブラリーからの特定ｃＤＮＡクローンの単離；
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲによる脳中のｍＲＮＡの検出；
（ｃ）インシトゥーハイブリダイゼーション組織化学によるＬＶＶ−ヘモルフィン−７前駆体ｍＲＮＡの検出；ならびに
（ｄ）脳特異的細胞培養物中のｍＲＮＡの存在証明。
ノザン分析によって示されるように、α−およびβ−グロビンｍＲＮＡがマウス脳で発現されていることは以前に報告されている（Ohyagi，Y．，ら、1994）。
これらのアプローチはそれぞれ特定の有利点を有する。インシトゥーハイブリダイゼーション組織化学および脳特異的細胞培養物中のｍＲＮＡの検出は脳内における合成の証拠を提供するであろう。クローンの単離およびｍＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）検出は脳内におけるｍＲＮＡの存在を示すであろうが、網状赤血球の混入を排除できない。しかし、ｃＤＮＡクローンの単離は前駆体の構造についてかなりの情報を提供する。ＬＶＶ−ヘモルフィン−７の前駆体は例えばβAなどのβ−グロビンファミリーの一員、または代替のスプライシンググロビンであるかもしれないし、あるいは未知の非グロビンペプチドであるかもしれない。
ＬＶＶ−ヘモルフィン−７ペプチドの前駆体をコードする潜在的クローンを単離するため、本発明者らはＬＶＶ−ヘモルフィン−７配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いてラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
オリゴヌクレオチド設計
図１０に示すように、いくつかのオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドＨ１７０（配列番号２）は、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７配列をコードするヒツジβ−グロビン遺伝子領域に対応するように設計した。このプローブはライブラリーのスクリーニングに用い、またＰＣＲのセンスオリゴヌクレオチドとして用いた。オリゴヌクレオチドＨ１７３（配列番号５）はＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーとして設計した。Ｈ１７０／Ｈ１７３を用いるＰＣＲはイントロン２を挟み、鋳型としてｃＤＮＡを用いると２５５ｂｐ断片を、ゲノムＤＮＡを用いると１０９８ｂｐ断片を生じるだろう。オリゴヌクレオチドＨ１７２（配列番号４）はＨ１７０／Ｈ１７３ＰＣＲ産物の内部プローブとして用いることができる。オリゴヌクレオチドＨ１７２およびＨ１７３（配列番号４、５）はヒツジβ−グロビン遺伝子のエキソン２および３に対応するアンチセンスプローブであり、インシトゥーハイブリダイゼーション組織化学に用いた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による脳内β−グロビン様配列の検出
ヒツジ小脳および大脳皮質、心臓および肝臓からＲＮＡを単離した。１００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、５００μＭ ｄＮＴＰｓ（Progen）、１２μｇ／ｍＬランダムヘキサマー（Boehringer Mannheim）、４０単位ＲＮａｓｉｎ（Progen）およびＡＭＶ逆転写酵素（Boehringer Mannheim、２５単位）を含む反応液２５μＬ中、このＲＮＡ（２０μｇ）を４２℃で１時間逆転写した。一定量の逆転写反応液（１０％）をポリメラーゼ連鎖反応に用いた。β−グロビンｍＲＮＡの増幅に用いたプライマーはセンスＨ１７０およびアンチセンスＨ１７３であった（図１０参照）。ＰＣＲは以下のものを含む反応液中で行った：
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４００μＭ ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑポリメラーゼ（Bresatec、２．５単位）、３μＭ ＭｇＣｌ2およびそれぞれのプライマ−４００ｎＭ。９４℃、６０℃および７２℃で１分間、それぞれ変性、アニーリングおよび伸張を４０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間最終伸張した。
ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、ハイボンドＮ＋に移し、内部オリゴヌクレオチド（Ｈ１７２）を用いたサザン分析を行い、産物がグロビン前駆体から派生したことを確かめた。図１１に示すように、予想サイズ２５５ｂｐの特定バンドを試験した４つの組織すべてから検出した。
β−グロビン様配列に対するラットｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ヒツジβ−グロビンのＬＶＶ−ヘモルフィン−７領域のヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド（Ｈ１７０）をラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene Cat No:936515、Sprague-Dawley、脳全体）のスクリーニングに用いた。約８×１０5クローンをプレートにまき、標準的方法（例えば、Maniatisら：Molecular Cloning）を用いてプラークを採取した。ろ過物をＲａｐｉｄ−Ｈｙｂ（Amersham）中、４２℃で１時間プレハイブリダイズし、次いで５’末端をラベルしたＨ１７０を２時間加えた。次いでろ過物を２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で３回洗浄した。Ｂｉｏｍａｘフィルムおよび増強スクリーンを用いてろ過物を４日間オートラジオグラフィーした。総量２４個の推定ポシティブクローンを単離した。ポシティブクローンをＰＳＢで溶出させた。
次いでＰＣＲに基づく方法を用いてポジティブクローンをさらに特徴付けした。５’プライマーとしてオリゴヌクレオチドＨ１７０、３’プライマーとしてＨ１７３を用いてＰＣＲを行った。Ｈ１７０／Ｈ１７３から生じるＰＣＲ産物はヒツジβ−グロビン遺伝子のイントロンを挟み、１０９８ｂｐ断片を生じるであろう。
一定量の溶出λクローンを５分間煮沸し、次いで氷上で冷却した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４００μＭ ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑポリメラーゼ（Bresatec、２．５単位）、３μＭ ＭｇＣｌ2およびそれぞれのプライマ−４００ｎＭを含むＰＣＲ反応液中、鋳型ＤＮＡとしてこれを用いた。９４℃、６０℃および７２℃で１分間、それぞれ変性、アニーリングおよび伸張を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間最終伸張した。ＰＣＲ産物を１．４％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
Ｈ１７０ポシティブ／ＰＣＲネガティブクローンをさらに特性化するために保存した。これらは非グロビン前駆体、代替スプライシング前駆体またはグロビンクローンの断片のいずれかであり得ると考えられる。
ラットβ−グロビンクローンの配列決定
ＰＣＲによって選択された６つのポジティブクローンをプラーク精製し、製造業者の指示にしたがってプラスミドを切除した。酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕIIで別々の制限地図を作成し、挿入物サイズを決定した。クローンＥＸ、ＦＸ、ＬＸ、ＲＸおよびＴＸは約５００ｂｐの挿入物を含む。クローンＤＸは最も長く、約２５００ｂｐの挿入物を含んでいた。内部オリゴヌクレオチド（Ｈ１７２）を用いたクローンのサザン分析によってこれらのクローンがグロビン前駆体から派生したものであることを確認した。
PharmaciaＴ７配列決定キットを用いてこれらのプラスミドの配列を決定した。共通のプライマーを用いたクローンＥＸ、ＦＸおよびＬＸの配列決定は、β−グロビンの３’非翻訳領域に対する配列相同性を示した。共通のプライマーを用いて配列決定した場合のクローンＲＸおよびＴＸ、ならびに逆プライマーを用いて配列決定した場合のクローンＤＸは開始コドンＡＴＧを含むβ−グロビン遺伝子の５’末端に配列相同性を示した。
クローンＤＸを入れ子状欠失分析に付し、配列決定用のよりよい鋳型を作成した。このクローンはβ−グロビン配列、およびグロビンクラスターと相同でない約１．８ｋｂの配列を含み、１つのクローン中に２つ挿入物がある結果かもしれない。
図１２に示すように、クローンＥＸの完全な配列は、このクローンがラットβA−グロビン（Genbank accession No：X16417）と同一であることを示した。図１３は、推定ＬＶＶ−ヘモルフィン−７領域を示すクローンＥＸのヌクレオチド配列および派生アミノ酸配列を示す。
実施例９ インシトゥーハイブリダイゼーション組織化学
エキソン２のＣ末端（図１３のＨ１７２）およびエキソン３のＮ末端領域（Ｈ１７３）を含むβ−グロビン遺伝子の種々の領域に対するオリゴヌクレオチド領域を用いて、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７およびその前駆体ペプチドをコードするｍＲＮＡの分布を調べた。アンチセンス（初めはＨ１７２、Ｈ１７３）オリゴヌクレオチドを末端ｄ−トランスフェラーゼを用いて35Ｓ−ｄＡＴＰで３’末端ラベルし、Nensorbカラムで精製した。次いで総量７５μＬの５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、２％サルコシル（sarcosyl）、２０ｍＭ Ｎａ2ＰＯ4、緩衝液（ｐＨ７）、１０％硫酸デキストラン、５０μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡおよび０．２ｍＭジチオスレイトール中で、ヒツジ脳切片を７．５×１０5ｃｐｍのラベルプローブとハイブリダイズさせた。１６時間のハイブリダイゼーション後、この切片を１×ＳＳＣ中で４回洗浄し、蒸留水中ですすぎ、増加量のエタノールを通して脱水し、Hyperfirm β-maxに暴露した。オリゴヌクレオチドＨ１７２およびＨ１７３を用いた予備実験では脊髄三叉神経の下丘および核にβ−グロビンｍＲＮＡが検出された。さらにインシトゥーハイブリダイゼーション組織化学実験にβ−グロビン配列の異なる領域由来の別のアンチセンスおよびセンス合成オリゴヌクレオチドを使用し、本発明者らが脳核におけるβ−グロビンｍＲＮＡを発見したことを確認する。次いでこの新規ペプチド系の役割をさらに明らかにするため、β−グロビンｍＲＮＡの分布を本発明者らのオートラジオグラフィーによるＡＴ4レセプターの局在性と比較する。
実施例１０ ＬＶＶ−ヘモルフィン−７の放射性免疫アッセイおよび免疫組織化学的検出
２頭のヒツジをジフテリア変性毒素と共役させたＬＶＶ−ヘモルフィン−７配列で免疫し、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７に対する放射性免疫アッセイを行うのに適切な力価を有する抗血清および親和性精製抗血清両方を得た。このデカペプチドの他の可能性ある生理的作用に関してさらに情報を得るため、通常のタイプの放射性免疫アッセイを用いて種々の組織あるいは組織内の特定領域のＬＶＶ−ヘモルフィン−７の濃度を決定する。
また、抗血清を免疫組織化学的に用いて、特に脳内のＬＶＶ−ヘモルフィン−７の組織分布を決定する。モルモットをリン酸緩衝塩溶液中の４％パラホルムアルデヒドで心臓内潅流し、この組織を切開し、２０％スクロース溶液中に一晩浸す。次いでこの組織を凍結し、５−１０ミクロン切片に切断し、メタノール中の０．５％水素ペルオキシダーゼ（hydrogen peroxidase）中で３０分間インキュベートすることによって内生ペルオキシダーゼを遮断した後、３％正常ヤギ血清を含むリン酸緩衝塩溶液中で一次抗体と一晩インキュベートする。リン酸緩衝塩溶液中で２、３回洗浄した後、この切片を二次抗ヒツジ抗体とインキュベートし、ストレプトアビジン−ビオチン／ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体系（Vectastain）を用いて検出する。本発明者らはＬＶＶ−ヘモルフィン−７のレセプターがニューロンに存在することをすでに示しているので、ニューロン内のＬＶＶ−ヘモルフィン−７の検出によりデカペプチドがニューロン内で合成され、それゆえニューロペプチドとして機能し得ることがさらに支持される。またペプチドの亜細胞性分布、特に細胞内貯蔵顆粒中に存在するかどうかを評価するため、免疫組織化学を電子顕微鏡レベルで行う。
またＬＶＶ−ヘモルフィン−７に対する放射性免疫アッセイを用いて、このペプチドの神経系組織からの分泌を調べる。ＬＶＶ−ヘモルフィン−７免疫反応性に富むことがわかった脳領域から調製したスライスを３７℃のクレブスリンガー重炭酸緩衝液中でインキュベートし、このペプチドがニューロンから分泌されるかどうかを試験するため、高Ｋ+培地および種々の分泌促進物質による脱分極作用を評価する。このペプチドを含むことがわかった培養ニューロンセルラインで同様の実験を行う。血漿および脳脊髄液を含む体液の放射性免疫アッセイを用いて、正常および異常症状下のこれらの液体中のこのペプチドのレベルを決定する。
さらにこのペプチドが他の分泌ニューロペプチドに生じるように亜細胞性顆粒に貯蔵されるかどうかを評価するため、シナプトソームを含む神経組織由来の亜細胞画分の放射性免疫アッセイにより、このペプチドの亜細胞性分布を評価する。
実施例１１ 受動回避条件化試験におけるＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果
アンギオテンシンIVは受動回避作業試験において記憶の保持と回復能を改善させ、その効果はＡＴ4レセプターが仲介していることが示されている［Braszkoら、1988、Wrightら、1993］。ムスカリン作動性レセプターアンタゴニストであるスコポラミンを使用し、記憶喪失が誘導された。アンギオテンシンIVのより安定な同族体であるＷＳＵ２０８８がスコポラミンによって誘導された受動回避作業試験における学習崩壊を回復させることが報告された。スコポラミン非処置および処置ラットにおいて、条件化受動回避作業試験に対するＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果を試験した。
脳室内カニューレをラットに外科的に差込み、毎日取り扱った。条件化の日に、ギロチンドアを閉じた受動回避条件化装置の区画における暗闇に各ラットを５分間慣らした。次いで、元のホームケージに５分間戻した後、ギロチンドアを開いた明るい区画に入れた。暗い区画に４本すべての足が入っている時間を秒単位で測定した。この試験はラットが暗い区画に入っている時間が２０秒以内になるまで繰り返すが、試験と試験の間は５分間ホームケージに入れる。条件化の日における最後の試験の前に、以下のようにラットを無作為に４群に分ける：
（a）食塩水、次いで食塩水、
（b）食塩水、次いで１．０ｎｍｏｌ ＬＶＶ−ヘモルフィン−７、
（c）７０ｎｍｏｌスコポラミン、次いで食塩水、
（d）７０ｎｍｏｌスコポラミン、次いで１．０ｎｍｏｌ ＬＶＶ−ヘモルフィン−７；
すべての投与はそれぞれ最終試験の５分前に用量２．５μｌで３０分間の脳室内投与で行う。最後の試験では、ギロチンドアを閉じ、ラットに格子床から１．５秒間、低レベルのショック（０．２ｍＡ）を１回与えた。次いで、ラットをそれぞれのホームケージに２４時間戻し、次いで次ぎの４日間毎日１回試験し、暗い区画に再度入る時間を測定した。得られた結果を図１４に示す。
この受動回避パラダイムでは、条件化が成功した対照ラットは暗い区画に入っている時間が長く、スコポラミンで処置したラットは暗い区画に入っている時間が非常に短く、学習および記憶の欠損を示した。スコポラミン投与後にＬＶＶ−ヘモルフィン−７を投与したラットにおける暗い区画に入っている平均時間は対照ラットのそれと有意な差が無く、このことは、これらのラットではＬＶＶ−ヘモルフィン−７がスコポラミン誘発性の記憶喪失を完全に回復させたことを示している。しかし、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７のみを投与したラットはスコポラミン処置ラットよりもその挙動は悪化した。
これらの結果は、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７がスコポラミン処置により誘発される記憶崩壊を成功裏に打ち消すことを示している。しかし、このペプチド単独投与は学習に害を及ぼし、これは高用量使用による神経系の過剰刺激に由来するものと考えられる。
ＬＶＶ−ヘモルフィン−７の有効量はＬＶＶ−ヘモルフィン−７を用いる用量−作用試験を行い、スコポラミン誘発性記憶喪失を有するラットを含む動物における受動回避作業試験の学習に対する効果を観察することによって決定される。同様の試験を行うことで、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７に起因する記憶崩壊がそのペプチドの過剰な高用量に由来するものであるか否かが決定される。
実施例１２ 水迷路習得試験におけるＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果
円形水迷路（モリス水迷路）は不透明にした水を含み、水表面下に隠れた台を有する円形タンクからなる。スコポラミンはこの作業試験の時間が試験毎に減少することを妨げるが、この効果は短期間記憶の障害に由来するものと思われる。この作業試験におけるスコポラミン誘発性記憶喪失に対するＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果を試験した。
脳室内カニューレをラットに外科的に差込み、毎日取り扱った。試験の日に、回避台から等距離にある種々のスタート位置からラットそれぞれを水迷路に導いた。各ラットが回避台に到着する時間を記録した。各ラットについて毎日、各試験の間に６０秒の休憩時間を設ける４つの連続した試験を行う。動物が回避台に到着する平均の時間をプロットし、図１５に示す。試験の１および２日目（非空間）は、いずれのラットも薬物処置を施さない。スコポラミン群は１日目に時間が増加したが、２日目の時間は対照レベルにまで減少した。次いで、ラットを以下のように３群に分け、５日間の試験に供した：
（a）食塩水対照、
（b）２．５μｌ中、７０ｎｍｏｌスコポラミン、および
（c）７０ｎｍｏｌスコポラミン、次いで１．０ｎｍｏｌ ＬＶＶ−ヘモルフィン−７。試験の３０分前にスコポラミンを脳室内処置すると、回避台を探し出す時間が有意に増加したが、これは記憶障害を示している。スコポラミン投与の２５分後にＬＶＶ−ヘモルフィン−７で処置したラットでは、スコポラミン誘発性の回避台発見時間が全体的に回復され、これらのラットは対照群のものと区別できなかった。８日目に処置を取り止めると、スコポラミン処置群の時間が対照レベルにまで戻ったが、このことはスコポラミン誘発性の記憶喪失が可逆的であることを示している。
実施例１３ ラット海馬におけるアセチルコリン放出に対するＬＶＶ−ヘモルフィン−７の効果
アセチルコリンは、抗コリン作動性薬物が記憶障害および錯乱を誘発することから、認識機能のプロセッシングに関与する主要な伝達物質と考えられている。アルツハイマー疾患では、コリンが豊富な領域、特に海馬中隔経路にニューロン喪失が報告されている。アンギオテンシンＡＴ4レセプターはサル脳のマイネルト（Mynert）の基底核、海馬のＣＡ２および歯状脳回、および体性および自律性神経節前単ニューロンに豊富に見出されている。このレセプター分布パターンはコリン作動性ニューロンの分布に非常によく似ており、これはＡＴ4レセプターがコリン作動性経路と中枢的に関係しているかもしれないことを示している。さらに、実施例１２にて示されているように、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７はスコポラミン（ムスカリン作動性レセプターアンタゴニスト）によって誘発される学習障害を回復させることができる。従って、本発明者らはＬＶＶ−ヘモルフィン−７が海馬中隔ニューロンからのアセチルコリン放出をＡＴ4レセプターを介して調節できるのではないかと仮定した。
ペントバルビトン ナトリウムでラットを麻酔し、海馬背部（尾部から前頂３．８ｍｍ、側面から中線２．５ｍｍおよび腹部から頭部表面３．０ｍｍの座標）または海馬腹部（尾部から前頂５．３ｍｍ、側面から中線５．４ｍｍおよび腹部から頭部表面６．５ｍｍの座標）のいずれかに脳内ゲージカニューレを定位に差し込んだ。ゲージカニューレを歯科用セメントで固定し、頭部の３つのスクリューにつなぎ留めた。次いで、擬似プローブをゲージカニューレに挿入し、カニューレの閉塞を予防した。ラットを５−７日間回復させた。実験日に、３ｍｍ透析膜を有する微小透析プローブをゲージカニューレに挿入し、人工脳脊髄液（１４８ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．４ｍＭ ＣａＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ、１．３ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、０．２ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）を流速２．０μｌ／分で注入した。ネオスチグミン（１．０μＭ）を人工脳脊髄液に加え、アセチルコリンの回復を促した。プローブ挿入の１時間後に２０分基準サンプルを４つ捕集し、次いでＬＶＶ−ヘモルフィン−７（人工脳脊髄液に１μｍｏｌ溶解および１μＭネオスチグミン）をプローブにより注入した実験時の２０分サンプルを４つ捕集した。回復期には、ペプチド注入を止め、２０分サンプルを４つ捕集した。
透析液中のアセチルコリンを、電気化学的検出を行うＨＰＬＣによって測定した。アセチルコリンおよびコリンを１０ｃｍポリマー基礎分析カラムで分離し、次いで分析カラムにカップリングした固定化酵素リアクター（アセチルコリンエステラーゼおよびコリンオキシダーゼ）によって過酸化水素およびベタインに変換した。移動相は抗菌試薬カトーンＣＧ（Kathoon CG）を加えた３５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．５である。
実施例１４ ＲＴ−ＰＣＲによる種々のニューロンセルラインのβ−グロビン配列の検出
全ＲＮＡを以下のセルラインから単離した：
（a）ＮＧ１０８ラット神経膠腫−神経芽腫ハイブリッド
（b）ＳＫＮＭＣヒト神経芽腫、および
（c）ＰＣ１２Ｗラットクロム親和性細胞腫。
全ＲＮＡは次ぎのようにして調製した：４Ｍグアニジン チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム４ｍＬ中で１０7個細胞をホモジナイズし、次いで２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０（０．４ｍｌ）、フェノール飽和水４ｍｌおよびクロロホルム−イソアミルアルコール０．８ｍｌを連続して加えた。得られたホモジネートを混合し、氷上で１５分間冷却し、次いで２０００ｇで１５分間遠心した。水層を取り出し、フェノール−クロロホルムで２回抽出し、次いでイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈澱させる。
次いで、ｍＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲをかける。逆転写酵素および無作為ヘキサマーを用いて全ＲＮＡ約２０μｇからｃＤＮＡを合成した。各サイクルが９４℃１分の変性、６０℃１分のプライマーのアニーリングおよび７２℃１分のプライマー伸張からなる４０サイクルのＰＣＲによってｃＤＮＡ産物の１０％を増幅し、次いで最後に７２℃にて１０分インキュベートした。使用したプライマーは次ぎの通りであり、これらは高い相同性をもってヒツジβ、δ、εグロビン鎖に対応しており、２５５ｂｐ ｃＤＮＡ断片がフランキングしている：
0004275738.tif 000007
センスプライマーはＬＶＶ−ヘモルフィン−７をコードするヌクレオチド配列をまたぎ、アンチセンスプライマーはグロビン遺伝子の第２のイントロンをまたぎ、ｃＤＮＡが夾雑ゲノムＤＮＡと区別できるようにした。０．４Ｍ ＮａＯＨ中の下向きサザーンブロッティングにより、ＰＣＲ産物をハイボンドＮ＋膜に移した。ＰＣＲに使用したプライマーの内部に位置し、β、δおよびεグロビン鎖と結合する32Ｐ末端標識したオリゴヌクレオチド5’CTCAGGATCCACATGCAGCTTATCACAG 3’（配列番号３）を含む４２℃で５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液および０．５％ドデシル硫酸ナトリウム中で得られた膜をハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの１２時間後に、得られたフィルターを、最終ストリンジェンシー０．５×ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの緩衝液中、４２℃で洗浄した。
マカカ・ファサイクラリス（Macaca fascicularis）の脳およびヒツジ脊髄のＡＴ4レセプターの分布をマッピングした。このレセプターは運動および感覚関連領域および経路およびコリン作動性細胞体、例えば脳幹および脊髄におけるすべての運動核などの、顕著かつ特徴的な分布を示す。本発明者らは、アンギオテンシンIVがニワトリ胚ニューロン培養物の神経突起成長を阻害し、従ってこのペプチドが中枢および末梢神経系の成長および発達に役割を果たしている可能性を証明した。
本発明者らは、ＡＴ4レセプターと高い親和性で結合する内生脳ペプチドを精製した。このデカペプチドはヒツジβ−グロビンの内部アミノ酸配列３０−３９と１００％同一である。このβ−グロビン様配列の存在はＰＣＲによってヒツジ脳および他の組織において証明された。ラット脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、配列がラットβA−グロビンと同一のクローンが単離された。
本発明者らは、β−グロビンｍＲＮＡが脳組織に存在することを証明し、ラット脳ライブラリーからβ−グロビンｃＤＮＡクローンを単離した。これらのデータは、ＬＶＶ−ヘモルフィン−７が脳にて合成されるβ−グロビン前駆体から誘導されるが、網状赤血球の夾雑は避けられなかったことを示している。配列決定したｃＤＮＡクローンのすべてはラットβA−グロビンをコードする配列に対応している。ラットＬＶＶ−ヘモルフィン−７ペプチド配列は１０位にトリプシンがフェニルアラニンと置き換わる保存性置換を有している。
従って、ウシＬＶＶ−ヘモルフィン−７の配列に相当するペプチドは脳に存在し、β−グロビンから前駆体として誘導されると思われる。このペプチドは殆ど確かに豊富な脳ＡＴ4レセプターの内生リガンドであり、従って規定された運動感覚およびコリン作動性のニューロンに対して一定の作用を及ぼすことができる。
本発明者らはＬＶＶ−ヘモルフィン−７が受動回避条件化試験および水迷路習得試験の両試験においてスコポラミンの記憶崩壊作用を回復させることを示した。しかし、高容量の本ペプチドは神経系の過剰刺激により学習に害を及ぼす場合がある。
概観すれば、この本発明者らの知見は、β−グロビンは、特異的な開裂酵素によって中枢神経系にて生成され、一定のレセプター群と相互作用する一定の神経刺激性ペプチド群の前駆体である可能性を示している。
本発明を明瞭にし、理解を容易にするためにある程度詳細に説明してきたが、本明細書に記載される態様および方法には、本発明に示される発明概念の範囲を逸脱することなく種々の改変および修飾を施すことができることは当業者であれば明白であろう。
本明細書に引用している文献を以下に列挙するが、これらは引用によって本明細書に包含される。
引用文献
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0004275738.tif 000009
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ハワード  フローレイ  インスティテュト  オブ  イクスペリメンタル  フィジオロジー  アンド  メディシン
メンデルソン，フレッド  チャイ，シュー・イーン  モーラー，イングリッド  アルドレッド，ピーター  スミス，イアン・エイ  ルー，レベッカ・エイ
（ii）発明の名称：神経刺激性ペプチド
（iii）配列の数：７
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：グリフィス・ハック
（Ｂ）通り：セント・キルダ・ロード５０９番
（Ｃ）市：メルボルン
（Ｄ）州：ビクトリア
（Ｅ）国：オーストラリア国
（Ｆ）ＺＩＰ：３００４
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release（パテントイン・リリース）ナンバー1.0、バージョン・ナンバー1.30
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＡＵ  ＰＯ０８９３
（Ｂ）出願日：１９９６年７月９日
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人 情報：
（Ａ）氏名：サンター，ヴィヴィアン・ビー
（Ｃ）参照／整理番号：Ｐ２１１５４
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：＋６１  ３  ９２４３  ８３００
（Ｂ）ファックス番号：＋６１  ３  ９２４３  ８３３３/４
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列：配列番号１：
0004275738.tif 000010
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列：配列番号２：
0004275738.tif 000011
（２）配列番号３の情報：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列：配列番号３：
0004275738.tif 000012
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列：配列番号４：
0004275738.tif 000013
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列：配列番号５：
0004275738.tif 000014
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：該当せず
（xi）配列：配列番号６：
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0004275738.tif 000016
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（xi）配列：配列番号７：
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【図１】
0004275738.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004275738.tif 000029
【図１１】
0004275738.tif 000030
【図１２】
0004275738.tif 000031
【図１３】
0004275738.tif 000032
【図１４】
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【図１５】
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