(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
非晶質リン酸カルシウムを得るように、カルシウムイオン、ホスフェートイオン及びカーボネートイオンを水溶液中で反応させ；及び
反応性の非晶質リン酸カルシウムを得るように、前記非晶質リン酸カルシウムから残留水の少なくとも一部、及び前記カーボネートイオンの少なくとも一部を除くために選ばれた条件下で前記非晶質リン酸カルシウムを加熱する
ことを含む反応性の非晶質リン酸カルシウムの製造方法。
【請求項２】
前記カルシウムイオン、ホスフェートイオン及びカーボネートイオンを反応させる工程が、前記水溶液から非晶質リン酸カルシウムを沈殿させることを含む請求項１の方法。
【請求項３】
反応性の非晶質リン酸カルシウムが、カルシウム対ホスフェート比１．１〜１．９の範囲を有する請求項１の方法。
【請求項４】
前記カーボネートイオンが、生成物反応性の非晶質リン酸カルシウム中のカルシウム対ホスフェート比を変更する請求項１の方法。
【請求項５】
前記カーボネートイオンが、非晶質リン酸カルシウムの非晶質性を安定にさせる請求項１の方法。
【請求項６】
更に、下記の工程：
リン酸カルシウムの非晶質性を保つのに選ぶ条件下で非晶質リン酸カルシウムを乾燥させた後に前記カーボネートイオンの少なくとも一部を除く
を含む請求項１の方法。
【請求項７】
前記カーボネートイオンを除く工程が、リン酸カルシウムの非晶質性を保つのに選ぶ条件下で加熱する工程を含む請求項１の方法。
【請求項８】
前記カーボネートイオンを除く工程が、前記カーボネートイオンを分解する工程を含む請求項１の方法。
【請求項９】
カーボネートイオンを除く工程が、非晶質リン酸カルシウムからカーボネートイオンを溶解する工程を含む請求項１の方法。
【請求項１０】
前記カーボネートイオンを除く工程が、非晶質リン酸カルシウム中に存在する前記カーボネートイオンの６０％までを除くことを含む請求項２の方法。
【請求項１１】
反応性の空位を、除去工程の間に非晶質リン酸カルシウム中に導入する請求項１の方法。
【請求項１２】
更に、下記：
骨再生用タンパク質又は抗生物質を非晶質リン酸カルシウムに加えた後に乾燥することを含む請求項６の方法。
【請求項１３】
非晶質特性を少なくとも９０％有しかつ３７℃の水中で二リン酸二カルシウムとの混合物として１：１で調製した場合に、混合物は１０〜６０分以内で硬化することを特徴とする反応性の非晶質リン酸カルシウム。
【請求項１４】
非晶質リン酸カルシウムのカーボネートプレー成分を熱分解して、ガス状又はベーパー状副生物とすることにより除くことによって得られる、反応性の非晶質リン酸カルシウム。
【請求項１５】
非晶質リン酸カルシウムの化学変化を起こしやすい成分を熱分解して、ガス状又はベーパー状副生物とすることにより除くことによって得られる、反応性の非晶質リン酸カルシウム。
【請求項１６】
非晶質特性を少なくとも９０％有しかつ３７℃の水中で二リン酸二カルシウムとの混合物として１：１で調製した場合に、反応は４０分以内で実質的に完了することを特徴とする反応性の非晶質リン酸カルシウム物質。
【請求項１７】
カルシウム対ホスフェート比が１．１〜１．９の範囲である請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウム。
【請求項１８】
Ｃａ／Ｐ比が１．５８である請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウム。
【請求項１９】
下記：
請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウムを第二のリン酸カルシウムと反応させて混合物を作り、前記第二のリン酸カルシウムと前記反応性の非晶質リン酸カルシウムは、結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムを形成する割合である
ことを含む結晶性不良なヒドロキシアパタイトの製造方法。
【請求項２０】
下記：
請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウムをプロモーターと反応させて混合物を作り、プロモーターは、反応性の非晶質リン酸カルシウムを結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムに転化させるように選ぶ
結晶性不良なヒドロキシアパタイトの製造方法。
【請求項２１】
結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムは、前記結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムが内部に配置される宿主によって吸収可能である請求項１９の方法。
【請求項２２】
反応を流体中で行い、流体を水、生理学的に許容し得るｐＨ緩衝溶液、塩水、血清及び組織培地からなる群より選ぶ請求項１９の方法。
【請求項２３】
反応の工程が、下記：
非晶質リン酸カルシウムと第二のリン酸カルシウムとを混合し；及び
水溶液を混合物に、反応を開始させる程の量で加える
ことを含む請求項１９の方法。
【請求項２４】
プロモーターが非晶質リン酸カルシウムを含む請求項２０の方法。
【請求項２５】
反応性の非晶質リン酸カルシウム物質を、
非晶質リン酸カルシウムを得るように、カルシウムイオン、ホスフェートイオン及びカーボネートイオンを反応させ；及び
反応性の非晶質リン酸カルシウムを得るように、非晶質リン酸カルシウムにおいて前記カーボネートイオンの少なくとも一部を除く
ことによって得る請求項１９の方法。
【請求項２６】
結晶性不良なヒドロキシアパタイトのＣａ／Ｐ比が１．５よりも小さい請求項１９の方法。
【請求項２７】
第二のリン酸カルシウムが非晶質又は微結晶性である請求項１９の方法。
【請求項２８】
更に、下記：
骨再生用タンパク質又は抗生物質を混合物に加える
ことを含む請求項１９の方法。
【請求項２９】
ラット筋肉内部位に入れた際に、骨代用物質の少なくとも１００ｍｇの吸収が、１カ月以内で完了することを特徴とする結晶性不良なヒドロキシアパタイトを含む骨代用物質。
【請求項３０】
骨代用物質の少なくとも３００ｍｇの吸収が、１カ月以内で完了する請求項２９の骨代用物質。
【請求項３１】
反応混合物を形成するように、非晶質リン酸カルシウムと第二ホスフェートとを流体中で反応させることによって調製する際に、反応混合物は２２℃において６０分よりも長い時間の後に硬化し、かつ反応混合物は３７℃において１０〜６０分以内で硬化することを特徴とする請求項２９の骨代用物質。
【請求項３２】
混合物が、２２℃において６０分よりも長い時間の間注入可能である請求項３１の骨代用物質。
【請求項３３】
混合物が、２２℃において６０分よりも長い時間の間成形可能である請求項３１の骨代用物質。
【請求項３４】
カルシウム対ホスフェート比が１．１〜１．９の範囲である請求項２９の骨代用物質。
【請求項３５】
カルシウム対ホスフェート比が１．３〜１．５の範囲である請求項２９の骨代用物質。
【請求項３６】
下記：
請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウム、第二のリン酸カルシウム粉末との混合物、及び
所望のコンシステンシーをもたらす程の量の流体
を含み、該混合物は、２２℃で硬化することができる、骨代用物質として使用するのに適した、前記骨代用物質が内部に配置される宿主によって吸収可能な成形可能なペースト。
【請求項３７】
下記：
請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウム、反応性の非晶質リン酸カルシウムをヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムに転化させるように選ばれたプロモーターとの混合物、及び
所望のコンシステンシーをもたらす程の量の流体
を含み、該混合物は、２２℃で硬化することができる、骨代用物質として使用するのに適した成形可能なペースト。
【請求項３８】
混合物が、２２℃において６０分よりも長い時間の後に硬化し、かつ混合物が３７℃において１０〜６０分以内で硬化する請求項３６のペースト。
【請求項３９】
混合物が、２２℃において６０分よりも長い時間の間注入可能である請求項３８のペースト。
【請求項４０】
混合物が、２２℃において６０分よりも長い時間の間成形可能である請求項３８のペースト。
【請求項４１】
流体を水、生理学的に許容し得るｐＨ緩衝溶液、塩水、血清及び組織培地からなる群より選ぶ請求項３６のペースト。
【請求項４２】
第二のリン酸カルシウム粉末が非晶質又は微結晶性である請求項３６のペースト。
【請求項４３】
更に、骨再生用タンパク質又は抗生物質を含む請求項３６のペースト。
【請求項４４】
請求項１３、１４又は１５の反応性の非晶質リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム粉末、及び骨増殖に対して所望のコンシステンシーをもたらす程の量の流体を含む薬品。
【請求項４５】
更に、骨再生用タンパク質又は抗生物質を含む請求項４４の薬品。
【請求項４６】
流体を水、生理学的に許容し得るｐＨ緩衝溶液、塩水、血清及び組織培地からなる群より選ぶ請求項４４の薬品。
【請求項４７】
結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムは、前記結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムが内部に配置される宿主によって吸収可能である請求項２０の方法。
【請求項４８】
反応を流体中で行い、流体を水、生理学的に許容し得るｐＨ緩衝溶液、塩水、血清及び組織培地からなる群より選ぶ請求項２０の方法。
【請求項４９】
反応性の非晶質リン酸カルシウム物質を、
非晶質リン酸カルシウムを得るように、カルシウムイオン、ホスフェートイオン及びカーボネートイオンを反応させ；及び
反応性の非晶質リン酸カルシウムを得るように、非晶質リン酸カルシウムにおいて前記カーボネートイオンの少なくとも一部を除く
ことによって得る請求項２０の方法。
【請求項５０】
結晶性不良なヒドロキシアパタイトのＣａ／Ｐ比が１．５よりも小さい請求項２０の方法。
【請求項５１】
更に、下記：
骨再生用タンパク質又は抗生物質を混合物に加える
ことを含む請求項２０の方法。
【請求項５２】
混合物が、２２℃において６０分よりも長い時間の後に硬化し、かつ混合物が３７℃において１０〜６０分以内で硬化する請求項３７のペースト。
【請求項５３】
流体を水、生理学的に許容し得るｐＨ緩衝溶液、塩水、血清及び組織培地からなる群より選ぶ請求項３７のペースト。
【請求項５４】
２θ値２６°、２８．５°、３２°及び３３°に広いピークを含むＸ線回折図を有する、請求項２９の骨代用物質。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、人又は動物の骨代用物質として及びその他の目的に有用な結晶性不良な合成ヒドロキシアパタイトに関する。発明は、更に、結晶性不良なヒドロキシアパタイトを低い温度で形成するのに有用な非晶質ホスフェート化合物の合成に関する。
発明の背景
リン酸カルシウムは、硬組織（硬骨、軟骨、歯エナメル質及び象牙質）の主成分である。自然発生の骨ミネラルは、ヒドロキシアパタイト構造を有するナノメートルサイズの結晶性不良なリン酸カルシウムで造られている。しかし、骨ミネラルの組成は、Ｃａ／Ｐ原子比１．６７を有する理想的な化学量論的結晶性ヒドロキシアパタイトであるＣａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2と違って、相当に異なっていて、下記式によって表わされ得る：
Ｃａ8.3（ＰＯ4）4.3（ＨＰＯ4，ＣＯ3）1.7（ＯＨ，ＣＯ3）0.3。
骨ミネラルの非化学量論は、主に、三価のＰＯ43-イオンに代わられるＣＯ32-やＨＰＯ43-のような二価イオンが存在することによる。ＨＰＯ43-やＣＯ32-イオンによる置換は、Ｃａ／Ｐ比の変化を生じ、年齢や骨の場所に応じて１．５０〜１．７０の範囲になり得るＣａ／Ｐ比を生じる。Ｃａ／Ｐ比は、骨の加齢の間に増大するのが普通であり、このことは、骨が古くなる程、カーボネート種の量が増大するのが典型的であることを示唆する。
骨ミネラルの特定の溶解度特性を生じるのは、ナノ結晶サイズ及び結晶性不良な性質と共にＣａ／Ｐ比である。そして、骨組織は、ミネラル吸収性細胞（破骨細胞）やミネラル産生性細胞（骨芽細胞）によって支配される一定の組織修復を受けることから、ミネラルの溶解度挙動は、これらの細胞活性の間の微妙な代謝バランスを保つのに重要である。
自然の骨ミネラルに精密に似せて造られる合成の骨移植物質は、自然の骨に代わる有用な代替え品になることができる。許容される合成の骨は、自生の骨（患者の自身の骨）の入手可能性や採取の問題並びにウイルス性感染の危険のような異系移植骨（死体からの骨）に伴う危険や合併症の問題を回避することができる。従って、移植片として用いるために自然の骨に精密に似たセラミック物質を合成しようとする試みが相当にあった。ヒドロキシアパタイトは、それが化学量論的であるとはいえ、一般に一層大きな結晶サイズを有する結晶形態が、骨中の自然発生ミネラルに化学的に最も近いことから、好適な選択である。
理想的な合成の骨移植片は、最小限下記の４つの性質を保持すべきである：（１）ヒドロキシアパタイトのように化学的に生物学的適合し得るべきである；（２）移植片を、患者の自身の骨がその回りに癒着するまで、同じ場所にかつ完全にして置くために、構造上の保全性をある程度備えるべきである；（３）患者の自身の骨が外来のヒドロキシアパタイトに取って代わるように、吸収を可能にするために、可溶性形態にすべきである：及び（４）骨形成用骨芽細胞を刺激することができる骨増殖タンパク質のような生体分子を合成の骨物質中に組み込むことが必要になり得ることから、その物質を形成するのに用いられるプロセスを低い温度で行うことが望ましい。（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓのような）骨増殖タンパク質のほとんどは熱過敏性であり、体温を越える温度においてそれらの生物活性を失う。
これらの要件の達成は、Ｃａ／Ｐ比、結晶サイズ、結晶度、多孔度、密度、熱安定性及び物質純度のようなパラメーターが制御される物質によって行われることができる。
従来技術（ニューヨーク、Ｋａｒｇｅｒ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９１においてＬｅＧｅｒｏｓ  Ｒ．Ｚ．）は、ヒドロキシアパタイトの高結晶性形態が、溶液沈殿の後に高い温度（８００°〜１２００℃）で焼結することによって製造されることを教示している。高温処理は、結晶サイズが数ミクロン程度で、Ｃａ／Ｐ原子比１．６７を有する極めて化学量論的なヒドロキシアパタイトを生じる。そのような高結晶性ヒドロキシアパタイトは、宿主組織に本質的に不溶性にさせる極めて小さい溶解度を有する。従って、それは生骨組織によって取って代わられず、患者内で望ましくない程に長期にわたる期間無傷のままである。
従来技術は、更に、ヒドロキシアパタイトが、初晶性リン酸カルシウム反応体の固体状態酸−塩基反応によって製造されることを教示している。そのようなアプローチは、時には反応不良で、均質でなくかつ結晶性ヒドロキシアパタイトを有意の含量で有する物質を生じる。
Ｃｏｎｓｔａｎｔｚは、米国特許第４，８８０，６１０号において、高濃厚な濃リン酸とカルシウム源とを塩基及びヒドロキシアパタイト結晶の存在において反応させることによってリン酸カルシウムミネラルを製造することを報告している。生成した生成物は、結晶形態のヒドロキシアパタイトミネラルを含有する多結晶質の物質である。同様に、Ｃｏｎｓｔａｎｔｚ等に係る米国特許第５，０５３，２１２号は、酸／塩基混合物の作業性及び混合性を向上させるために粉末酸源を使用することを開示しているが、米国特許第４，８８０，６１０号と同様の混合相リン酸カルシウム物質が報告されている。最近になって、Ｃｏｎｓｔａｎｔｚ等は、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６７巻、１７９６〜９頁（１９９５年３月２４日））において、リン酸一カルシウム１水和物、ベータ−トリカルシウムホスフェート、アルファ−トリカルシウムホスフェート、及び炭酸カルシウムをリン酸ナトリウム溶液中で反応させてリン酸カルシウム物質をもたらすことから炭酸塩化されたアパタイトを形成することを報告したが、得られたリン酸カルシウム物質は、依然、自然発生の骨ミネラルに比べて、性質が実質的に一層結晶性である。
同様に、Ｂｒｏｗｎ等は、米国再発行特許第３３，２２１号において、結晶性リン酸二カルシウム（Ｃａ／Ｐ比２．０）と酸性リン酸カルシウムとを反応させることを報告している。Ｌｉｕ等は、米国特許第５，１４９，３６８号において、結晶性リン酸カルシウム塩と酸性クエン酸塩とを反応させることを開示している。
これらの従来技術の参考文献は、すべてリン酸カルシウムの結晶性固体を反応させることによって得られた結晶性形態のヒドロキシアパタイト固体を生じる化学反応を開示している。非晶質のリン酸カルシウム（Ｃａ／Ｐ比１．５）を反応体の一つとして用いることは、ほとんど報告されていていない、というのは、非晶質のリン酸カルシウムは、リン酸カルシウムの中で最も考えられない固体でありかつ慣用の非晶質のリン酸カルシウムは、大部分は不活性でありかつ非反応性固体であると考えられるからである。
従来技術における非晶質のリン酸カルシウム物質の唯一の言及は、非晶質のリン酸カルシウムを、高結晶性ヒドロキシアパタイト化合物を通常高い温度処理下で形成する直接のプリカーサーとして用いることに焦点を合わせてきた。そのような高結晶性物質は、生理学的条件下で極めて不溶性であることから、合成骨用には不適当である。
例えば、Ｐａｌｍｅｒ等は、米国特許第４，８４９，１９３号において、酸性リン酸カルシウム溶液を水酸化カルシウム溶液と、両方の溶液を飽和に近くして、非晶質ヒドロキシアパタイト沈殿粉末を形成するように反応させることによって結晶性ヒドロキシアパタイト粉末を形成することを報告している。次いで、非晶質粉末を直ぐに乾燥させかつ７００°〜１１００℃の高い温度で焼結して極めて高い結晶性のヒドロキシアパタイトを得ている。Ｂｒｏｗｎ等は、米国再発行特許第３３，２２１号において、特にリン酸四カルシウム（Ｃａ／Ｐ比２．０）に制限する非晶質相と一層酸性のリン酸カルシウムの内の少なくとも一種とを反応させることによって歯科用セメント用の結晶性ヒドロキシアパタイトを形成することを報告している。更に、Ｂｒｏｗｎ等は、そのような非晶質状態のリン酸四カルシウムの製法又は性質を開示していない。Ｔｕｎｇは、米国特許第５，０３７，６３９号において、標準の非晶質リン酸カルシウムペーストを、歯を再ミネラル化するために使用及び適用することを開示している。Ｔｕｎｇは、標準の不活性な非晶質リン酸カルシウムを、チューインガム、口すすぎ用水又は練り歯磨きに混合しかつそれらを通して送達させるのに使用することを提案しており、該非晶質リン酸カルシウムは、口液に入る際に、結晶性フルオリド含有ヒドロキシアパタイトに転化し、これは歯エナメルを再ミネラル化するのに有用である。Ｓｉｍｋｉｓｓは、ＰＣＴ／ＧＢ９３／０１５１９において、Ｍｇイオン又はピロホスフェートのようなインヒビターを、非晶質のリン酸カルシウムに混合して、生組織中に移植するのに用いることを記載している。非晶質のカルシウム−マグネシウムホスフェートは、例えばＭｇイオンを周囲の身体液中に浸出させる際に、転化して結晶性ヒドロキシアパタイトになる。
骨中の自然発生ミネラルの性質に一層よく似た新規な合成の骨物質を開発する必要が依然ある。特に、低い温度で形成することができる、完全に生物吸収性の、結晶性不良な、ナノメートルサイズの結晶である合成の骨物質を提供する必要がある。
発明の要約
本発明の目的は、生物吸収可能な骨代用物質を提供するにある。
本発明の更に別の目的は、低い温度で形成することができ及び容易に成形可能でありかつ注入可能な骨代用物質を提供するにある。
本発明のそれ以上の目的は、自然発生ミネラルに匹敵し得るＣａ／Ｐ比を有するナノ−サイズの、結晶性不良なヒドロキシアパタイト固体を形成するにある。
本発明の目的は、標準の不活性な非晶質リン酸カルシウムを反応性の非晶質リン酸カルシウムに転化する方法を提供するにある。
本発明の目的は、自然発生の骨ミネラルの表面反応性に似た表面特性を有する反応性の非晶質リン酸カルシウムを提供するにある。
本発明の更に別の目的は、結晶性不良なヒドロキシアパタイトを低い温度（体温の３７℃で）で形成することができる反応性の非晶質リン酸カルシウムを提供するにある。
本発明のなおそれ以上の目的は、注入可能なリン酸カルシウム混合物を提供するにある。
本発明の一態様では、反応性の非晶質リン酸カルシウムを得る方法を提供する。反応性の非晶質リン酸カルシウムは、非晶質リン酸カルシウムを得るように、カルシウムイオン、ホスフェートイオン及び第三イオンを反応させ、次いで反応性の非晶質リン酸カルシウムを得るように、第三イオンの少なくとも一部を除くことによって調製してもよい。
本明細書で用いる通りの「非晶質」なる用語は、有意の非晶質特性を有する物質を意味する。有意の非晶質特性は、７５％よりも大きい非晶質含量、好ましくは９０％よりも大きい非晶質含量を意図し、広い特徴のないＸ線回折図を特徴とする。物質に結晶度が小さい度合いで存在してもよいことが認識されるが、発明の非晶質成分の場合、そのような結晶度は、生成物である結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムにおいて所望される度合の結晶度よりも大きくならないことが期待される。
”反応性”とは、本明細書中、本発明の非晶質リン酸カルシウムと他のリン酸カルシウムとの反応性を言うのに用いる。反応性は、リン酸カルシウム又は結晶化プロモーターの存在において非晶質リン酸カルシウムが３７℃において５時間よりも短い時間で硬化し、実質的に約１〜５時間で硬化することができることを特徴とする。反応の完全性、反応の速度、生成した生成物の均質性及び別のように不活性な化合物と反応することができることは、発明の反応性ＡＣＰの特性を示すものである。
発明の別の態様は、非晶質特性を少なくとも９０％有しかつ３７℃の水中で二リン酸二カルシウムとの混合物として１：１で調製した場合に、混合物は約１０〜約６０分内で硬化することを特徴とする反応性の非晶質リン酸カルシウムを含む。発明は、また、非晶質リン酸カルシウムのカーボネートプレ−成分を、プレ−成分を熱分解してガス状又はベーパー状副生物とすることによって除くことによって得られる反応性の非晶質リン酸カルシウムも含む。発明は、尚更に、非晶質リン酸カルシウムの変化しやすい成分を、成分を熱分解してガス状又はベーパー状副生物とすることによって除くことによって得られる、反応性の非晶質リン酸カルシウムを含む。発明は、尚一層更に、非晶質特性を少なくとも９０％有しかつ３７℃の水中で二リン酸二カルシウムとの混合物として１：１で調製した場合に、反応は約７５分内、好ましくは４０分内で実質的に完全な混合物になることを特徴とする反応性の非晶質リン酸カルシウム物質を含む。
発明の別の態様では、発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムを第二のリン酸カルシウムと反応させる結晶性不良なヒドロキシアパタイトを製造する方法を提供する。第二のリン酸カルシウムと反応性の非晶質リン酸カルシウムとを、ヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムを形成する割合いで混合する。
発明の別の態様では、発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムをプロモーターと反応させる結晶性不良なヒドロキシアパタイトを製造する方法を提供する。プロモーターは、反応性の非晶質リン酸カルシウムをヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムに転化させるように選ぶ。
発明の別の態様は、実質的に図７ｄに示す通りのＸ線回折図を有する結晶性不良なヒドロキシアパタイトを含む吸収可能な骨代用物質を含む。発明は、また、２θ値２６°、２８．５°、３２°及び３３°に広いピークを含むＸ線回折図を有する結晶性不良なヒドロキシアパタイトを含む吸収可能な骨代用物質も含む。発明は、更に、ラット筋肉内部位に入れた際に、骨代用物質の少なくとも１００ｍｇ、好ましくは３００ｍｇの吸収が、１カ月以内で完了することを特徴とする結晶性不良なヒドロキシアパタイトを含む吸収可能な骨代用物質を含む。
吸収可能な骨代用物質は、更に、非晶質リン酸カルシウムと第二ホスフェートとを流体中で反応させることから調製する際に、反応混合物は約２２℃において６０分よりも長い時間の後に硬化し、かつ反応混合物は３７℃において約１０〜約６０分以内で硬化することを特徴とする。好適な実施態様では、混合物は、約２２℃において約６０分よりも長い時間の間注入可能である。その他の好適な実施態様では、混合物は、約２２℃において約６０分よりも長い時間の間成形可能である。
発明の別の態様は、吸収可能な骨代用物質として使用するのに適した成形可能なペーストを含む。ペーストは、発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムと、第二リン酸カルシウム粉末との混合物及び所望のコンシステンシーをもたらす程の量の流体を含み、該混合物は、約２２℃で硬化することができる。
発明のペーストは、また、発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムと、プロモーターとの混合物及び所望のコンシステンシーをもたらす程の量の流体を含むことができ、プロモーターは、反応性の非晶質リン酸カルシウムをヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムに転化させるように選び、該混合物は、約２２℃で硬化することができる。好適な実施態様では、混合物は、約２２℃において６０分よりも長い時間の後に硬化し、かつ混合物は約３７℃において約１０〜約６０分以内で硬化する。
【図面の簡単な説明】
発明の説明を、下記の図を参照して行う：
図１は、比較的に不明瞭な境界を有しかつ一部形のない形態（矢印）で浸漬されたクラスター内のナノメートルサイズのグレインを例示する反応性の非晶質リン酸カルシウムの高分解能の透過型電子顕微鏡写真である；
図２は、本発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムの、加熱工程（ａ）前及び（ｂ）後の赤外スペクトルである。熱処理した後にＨ−Ｏ−Ｈ基（〜３，５５０ｃｍ-1及び１，６４０ｃｍ-1）及びＣＯ32-基（１４２０−１４５０ｃｍ-1）の消失に留意すること；
図３は、本発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムの、真空加熱工程（ａ）前及び（ｂ）後のＸ線回折図である。その物質は、真空加熱処理した後に非晶質状態が保存されていることを示している。それは、回折角２０°〜３５°の間に鋭いピーク及び広い最大が存在しないことを特徴とする。固体の非晶質状態は、本発明のプロセス全体にわたって保たれる；
図４は、真空加熱手順後に、１．５８であるＣａ／Ｐを生じた本発明の反応性の非晶質リン酸カルシウムのエネルギー分散型電子マイクロプルーブスペクトルである；
図５は、本発明の非晶質リン酸カルシウムから誘導される結晶性不良なヒドロキシアパタイト生成物の、結晶性ヒドロキシアパタイトに比べた場合の溶解度カーブである。３７℃の溶液中に放出されるカルシウムイオンの量によって測定する通りの、本発明の物質の溶解度が、一層結晶性の形態のヒドロキシアパタイトに対して相対的に一層大きいことに留意すること；
図６は、発明の骨代用物質を形成する反応において用いる（ａ）反応性の非晶質リン酸カルシウム；及び（ｂ）二リン酸二カルシウムのＸ線回折図である；
図７ａ−ｄは、本発明の骨代用物質を形成するための反応性の非晶質リン酸カルシウムと二リン酸二カルシウムとの混合物の反応の進行を追跡するＸ線回折図である；
図８は、（ａ）リン酸二カルシウム２水和物、（ｂ）発明の活性化されたＡＣＰ、及び（ｃ）本発明の結晶性不良なＨＡの赤外スペクトルである；及び
図９は、自然発生の骨のＸ線回折図である。
発明の詳細な説明
本発明は、骨の疾患及び損傷を治療するための骨代用物質（ＢＳＭ）並びに吸収可能なリン酸カルシウムを要求するその他の生物学的用途として有用な完全に吸収可能なかつ再骨化用の結晶性不良なヒドロキシアパタイト（ＨＡ）を提供する。発明の結晶性不良なＨＡは、その生物学的吸収性及びその最小の結晶度を特徴とする。それは、高度に多孔性で急速に吸収可能でも、或は多孔度を小さくしてゆっくり吸収可能にしてもよい。その結晶度特性は、自然の骨と実質的に同じであり、一層高い結晶度は、当分野に知られている骨代用物質に見られる一層高い結晶度を有しない。発明の結晶性不良なＨＡは、また、生物学的適合性であり、宿主に有害でない。
発明の重要な態様では、結晶性不良なＨＡを外科的な植え付けにおいて用いることの容易性は、当分野に知られているその他の骨代用物質に比べて相当に向上される。特には、反応は体外で開始され、室温においてゆっくり進行し、それによりその物質が外科部位に適用する前に「固まって」使用できなくなる可能性を最小にする。反応は体温において加速され、その物質は正しい場所で硬化する。その上に、結晶性不良なＨＡのコンシステンシー及び成形適性並びに反応速度は、治療要求に従い、簡単なパラメーターを少し変更することによって変えることができる。
本発明の骨代用物質の吸収性は、その多孔性と有意の非晶質性との組合せに起因し得る。発明の骨代用物質は、自然の骨に認められるのと実質的に同様な結晶性不良なヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムを含む。アパタイトに結晶性が不足していることは、他の一層結晶性の種に比べて水性系への溶解度が幾分増大することに関連付けられ、これより低結晶度及び／又は安定な非晶質性アパタイト性領域が存在することは、生物学的系への吸収性を促進するものと考えられる。多孔度は、細胞及び細胞プロセスの骨代用物質マトリックス中への浸透並びに物質のマトリックス内部への及びマトリックス内部からの拡散の両方を助成する。従って、多孔度の一層小さい骨代用物質は、多孔度の大きいものに比べてインビボで吸収されるのが一層遅くなる。
好適な実施態様では、反応体を体外で混合し、外科部位に適用するのに適した成形適性な骨代用物質を生じる。その反応は、通常、外科部位に適用した後に完結される。発明の骨代用物質は、通常５時間よりも短い時間で硬化し、生理学的条件下で実質的に約１〜５時間で、好ましくは約１０〜３０分で硬化する。好適な実施態様では、反応を、蒸留水を２つの乾燥成分の混合物に加えることによって開始させて約３０分で硬化する濃厚なペーストを形成する。蒸留水の代わりに、血清又は組織培地のようなその他の水性剤を使用してよい。生成した吸収可能な結晶性不良なヒドロキシアパタイトがカルシウム不足になることは最もしばしばあり、カルシウム対ホスフェート比は、ヒドロキシアパタイトについて理想的な化学量論値のおよそ１．６７に比べて、１．５よりも小さくなる。
発明は、また、適した反応性骨代用物質及び反応性プリカーサーを識別するテストも提供する。そのテストは、１成分を組み合わせ、成形可能な物質を製造し、それが体温又はその付近で適した量の時間で硬化する能力を明らかにすることを含む。このようにして硬化する成分を、次いでテスト動物の筋肉内に入れて生物学的吸収性を調べてもよい。本発明の骨代用物質１００ミリグラム（ｍｇ）、好ましくは３００ミリグラム（ｍｇ）が、ラット筋肉に１ヵ月よりも短い期間で吸収されることになる。吸収の一層遅い骨代用物質のいくらかは、齧歯動物に完全に吸収されるのに１年よりも長い期間を要し得る。
骨代用物質形成反応は、少なくとも一種の非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）プリカーサーを用い、活性化されたＡＣＰを用いるのが好ましい。反応が、管理された様式で一部又は全部が発明の結晶性不良なＨＡ（骨代用物質）に転化されるプリカーサーＡＣＰを一種だけ用いてよい例がいくつかある。別法として、反応は、ＡＣＰと組み合わさって発明の結晶性不良なヒドロキシアパタイトを生じる更なるプリカーサーを一種又はそれ以上、好ましくはカルシウム及び／又はホスフェート源を用いてよい。何にしても、体外で開始させ、ペースト様形状で続行させることができかつ３７℃で有意に加速されて硬化されたリン酸カルシウム生成物に至る反応は、極めて好適である。
ＡＣＰプリカーサーだけ：非晶質リン酸カルシウムを単独のプリカーサーとして用いて吸収可能な骨代用物質を製造する場合に、ＡＣＰが転化して高結晶性ヒドロキシアパタイトになる自然の傾向を調節することが重要である。他方で、転化の時間経過は、外科的使用効果を有する程に速くすべきである。一つのアプローチは、結晶形成のインヒビターを含有するプリカーサーＡＣＰ（例えば、例１のＡＣＰ）を、結晶形成のインヒビターを含有しないＡＣＰ（例えば、プロモーター）と組み合わせることである。反応体を、適した粒子寸法及びインヒビター含有ＡＣＰを過剰にして、乾燥状態で混合してもよい。反応体を、次いで、水を添加するような結晶形成条件に、次いで体中に導入した後に起きるような昇温に暴露させて反応体を発明の結晶性不良なＨＡに転化させることができる。
ＡＣＰプリカーサー＋更なるリン酸カルシウム源：ＡＣＰを、任意の反応助成技術を用いて第二カルシウム源（第二ＡＣＰを含む）と反応させてもよい。助成する反応は、非晶質リン酸カルシウムをナノ結晶性又は結晶性不良なヒドロキシアパタイトに転化させることである。そのような反応は、酸／塩基、変位、置換、及び加水分解反応並びに純粋に物理的な及び機械的な反応（例えば、粉砕、混合）を含む。任意の反応スキーム下で、ＡＣＰは、反応全体にわたって有意の非晶質性を保持することが重要である。特には、出発生成物内の総括的結晶度は、最終生成物において所望される総括的結晶度を越えることができない。これより、所定の反応スキームは、反応期間全体にわたってＡＣＰの非晶質性を安定化することを要し得る。当分野に知られているそのような適した結晶形成のインヒビターの例は、カーボネート、フルオリド、及びマグネシウムを含む。
本発明の多数の態様では、プリカーサーの内の少なくとも一つを、他の成分と生理学的条件で反応させるように、活性にしなければならない。いくつかの好適な実施態様では、ＡＣＰ成分を、第二のカルシウム含有反応体との反応を助成するために、加熱下で活性にする。そのような適した第二反応体の例は、ＤＣＰＤ、その他の結晶性又は結晶性不良なリン酸カルシウム、カルシウム源又はホスフェート源、或は第二のＡＣＰを含む。触媒作用又はイオン性溶媒の使用のような当分野に知られているその他の活性化方法もまた、置換基の間の反応を助成するのに用いてもよい。第二のリン酸カルシウム反応体は、任意の結晶構造のものがよく、第一のＡＣＰと、直接か又はイオン性溶媒のような反応助成用ビヒクルを使用することによるかのいずれかで反応性になるように選ぶべきである。適した反応条件は、反応体を混合しかつ水を添加した後に、３７℃で急速に硬化することを明らかにすることによって決めることになる。
骨代用物質形成反応は、また、多孔質の最終生成物を生成するようにデザインしてもよい。一実施態様では、酸／塩基ケミストリーの原理＋管理された粒径の反応体の乾燥混合物を使用することが、多孔質の骨代用物質に至る。化学的又は物理的エッチングや浸出のような多孔質を助成するその他の方法を採用してもよい。
本発明は、標準の不活性な非晶質リン酸カルシウム沈殿を高反応性の非晶質固体に転化する新規な方法を提供する。非晶質固体を上記の反応において用いて生物学的活性、生物学的吸収性及び構造上の保全性を備えた結晶性不良な又はナノ結晶性の合成ヒドロキシアパタイトを形成することができる。この新規な物質を他のリン酸カルシウムと３７℃又はそれよりも低い温度で反応させて結晶性不良なヒドロキシアパタイトからなる骨様物質を形成することができる。
本発明の非晶質リン酸カルシウムは、他の酸性又は塩基性リン酸カルシウムの方向に極めて反応性である。また、本発明の非晶質リン酸カルシウムは、それが、従来ＡＣＰに対して「不活性」と考えられる種々のカルシウム又はリン保持化合物、例えばＣａＯ、ＣａＣＯ3及び酢酸カルシウムと室温において反応することができる点で、反応性と考えられる。慣用の結晶性リン酸カルシウムの従来技術の酸−塩基反応は、反応不良な固体を生じ、これらは、あまりに結晶性で生組織に十分に溶解することができない反応生成物を有する。従来技術からの反応は、通常不完全であり、反応生成物は均質でない。対照して、本発明の非晶質リン酸カルシウムは、広範囲のリン酸カルシウム及びその他のカルシウム又はリン保持物質と急速にかつ完全に反応して均質な生成物を供する。
高められる反応性の源は、完全には理解されない；しかし、それは、本発明のプロセスによって造られる通りの、非晶質性（結晶性の欠如）及びいくつかの実施態様では、部位空孔に関連するものと考えられる。空孔は、続く反応のための部位を供し得る。これらの観察は、以下に一層完全に検討することにする。
本発明の方法は、１０００Åよりも小さい、好ましくは２００〜５００Å、最も好ましくは３００Åの非晶質リン酸カルシウム粒子の初期形成を可能にし、それらのそれ以上の成長は、溶液からの生成物の急速な沈殿によって終結される。カルシウム及びホスフェートイオンを反応させて非晶質リン酸カルシウムを形成する間、第三イオンを溶液中に導入し、それでこれらのイオンを、三価のＰＯ43-基の代わりに非晶質の沈殿構造に組み込むようにする。いくらかのＰＯ43-が第三イオンに取り替えられることから、総括のＰＯ43-は減少し、こうして非晶質沈殿のＣａ／Ｐ比を増大させ（標準の非晶質リン酸カルシウムに比べて）かつリン酸カルシウムの原子価又は電荷状態を変更させる。非晶質固体を、次いで急速に凍結乾燥させてその物質の化学的及び物理的性質を保存してもよい。非晶質固体を、次いで第三イオンの少なくともいくらかを除くのを助成するのに選ぶ特定の条件下で処理してもよい。カーボネートの場合では、特定の温度及び圧力条件は、非晶質性を保ちながら、恐らく非晶質固体からガス状二酸化炭素及び酸素として、全炭素を減少させるに至る。
生成した物質は、過去において一般に１．５０であると報告されている非晶質リン酸カルシウムにおいて典型的に認められるよりも大きなＣａ／Ｐ比を有する非晶質固体である。更に、その物質から炭素を除くと、非晶質固体内の侵入型構造に空孔を生じ、それを極めて反応性の固体にさせる。それらは、いくつかの可能な空孔源になり得る。その物質は、表面積を増大させるような種々の手段によって反応性を促進する多孔性を保有する。その物質は、また、第三イオンを除く際に、化学量論バランスの変化も受け得る。この化学量論変化は、電荷不均衡を生じ得、これは、非晶質リン酸カルシウムの反応性の増大の原因になる。
プロセス全体にわたってその物質の非晶質性を保つことが望ましい。プロセスの間に又は最終生成物において、結晶性を全体として（単一の結晶性領域）又は局部領域（微結晶性領域）においてさえ導入するならば、固体はその反応性を失うことが分かった。生成した高反応性のリン酸カルシウムは、性質が非晶質でありかつカルシウム対三価リン比１．５５〜１．６５の範囲を有する。好適な実施態様では、非晶質リン酸カルシウムは、Ｃａ／Ｐ比約１．５８を有する。
非晶質状態は、沈殿プロセスの速度及び期間を調節することによって引き起される。本発明の非晶質ヒドロキシアパタイトは、初期の沈殿が急速な条件下で溶液から沈殿される。急速な沈殿は、極めて小さいリン酸カルシウム核を多数形成することになる。加えて、急速な結晶又はグレイン成長は、各々のグレイン内に欠陥を一層生じるに至り、それによりまた溶解度を増大させる。スペクトルの一番端において、結晶又はグレイン成長は非常に急速でありかつ欠陥密度は非常に有意であるので非晶質リン酸カルシウムが生じる。非晶質リン酸カルシウムはゲル様であり、変動組成を有する固溶体を含む。これらのゲルは、もはやレンジ構造を持たず、オングストロームスケールで測定した場合に均質である。これらの非晶質化合物は、生理学的条件下で高い溶解度、高い成形レート及び結晶性不良なヒドロキシアパタイトへの高い転化レートを有する。
この方法によって得られる非晶質リン酸カルシウム固体は、最終反応中に導入する程に長い期間実質的に非晶質の固体としてそれらの非晶質性を十分に保持する。それらは、また、ホスフェートを含有する他の固体又は溶液と混合しかつ反応させてナノメートルサイズの結晶を均一な分布で含有する固体を得ることもできる。更に好適な実施態様では、非晶質リン酸カルシウムは他の固体と完全に反応することから、生成する固体のＣａ／Ｐは、そのような反応から全カルシウム及びリンを構成することになる、すなわち本質的に完全な反応が存在することになる。溶液又は固体からの適当なモル濃度のホスフェートを新規な非晶質リン酸カルシウム物質と反応させる場合に、結晶性不良なヒドロキシアパタイト物質（Ｃａ／Ｐ１．１〜１．９）が得られる。これより、本発明は、生成する生成物の化学的組成をデザイン及び変更することを可能にし、それにより骨移植物質として使用する最終生成物の生物学的活性を調節するそれ以上のモードを提供する。
本発明の一実施態様では、カルシウム及びホスフェートイオン並びに第三イオンを、リン酸カルシウムの急速な核形成及び沈殿を助成することになる濃度、ｐｈ及び温度で含有する溶液を調製する。沈殿が十分に急速である場合に、非晶質のゲル様リン酸カルシウムが形成される。ヒドロキシアパタイトの熱力学的に有利な結晶性形態は、反応の速度を低減させることによって増進されることから、非晶質化合物を確実に得るために、反応の速度を増大させる所定の加工工程を採用してもよい。本発明の非晶質リン酸カルシウムを急速に沈殿させるための溶液をデザインする場合に、下記のファクターを取り分け考慮すべきである。
好適な条件：カルシウム及びホスフェート源を急速に混合して反応の速度を増大させる。不安定相の方を生成物として好むために、反応の速度を増大させる。イオンの各々について一層の反応時間を正確に並置させて固体を形成すると、一層熱力学的に有利な結晶性及び安定な構造を生じることになる。
好適なカルシウム及びホスフェート源：高濃厚な又は近過飽和の溶液を使用すると、一層急速な反応が起きるのを確実にする。
好適な温度：反応は、室温で行うことができるが、一反応体の濃度を増大させるために沸点に近い温度にすることは、反応の速度を増大させることの可能な手段である。
一実施態様では、カルシウムイオン、ホスフェートイオン及びカーボネートイオンの水溶液を一緒にして迅速に混合してカーボネート含有非晶質リン酸カルシウム固体を得る。イオンの相対濃度は、所望のＣａ／Ｐ比を有する沈殿をもたらすように選ぶ。カーボネートイオンは、非晶質リン酸カルシウムにおけるホスフェートイオンに置換する。炭酸塩化された非晶質リン酸カルシウムは、カーボネート水溶液から沈殿によって得てもよい。適したカーボネート水溶液は、単に例として、バイカーボネート溶液、炭酸ナトリウム溶液、炭酸カリウム溶液を含む。更に、非水性溶液を使用することは、発明の範囲内として意図する。
炭酸塩化された物質を使用することは、それがＰＯ43-をＣＯ32-で置換することによってＣａ／Ｐ比の調節を可能にすることから、望ましい。加えて、ＣＯ32-の存在は、非晶質リン酸カルシウムにおいて結晶性の発現を遅延させることが知られている。しかし、Ｃａ／Ｐ比を変更する際に及び反応性部位空孔を非晶質リン酸カルシウム中に導入する際に、カーボネートの代わりに又はカーボネートに加えて、単に例として、ニトレート、ニトリット、アセテート、Ｍｇ+2及びＰ2Ｏ74-イオンのようなその他のイオン又はイオンの混合物が適し得ることが認められる。
非晶質リン酸カルシウム沈殿を捕集しかつろ過した後に活性化してもよい。この工程を、捕集された沈殿の非晶質状態を保存するように、冷蔵庫中で又は周囲以下の温度で行うのが好適である。捕集は、典型的には、重力ろ過、真空ろ過又は遠心分離を含み、これらに限定しない任意の慣用の手段によって行うことができる。捕集された沈殿はゼラチン状であり、蒸留水で１回以上洗浄する。
洗浄した沈殿を、物質の非晶質性を保つ任意の条件下で乾燥させる。凍結乾燥が適しているが、唯一の技術ではない。凍結する際、沈殿は凍結させたまま、乾燥させて同伴される液の大部分を除く。この手順は、凍結された沈殿を真空チャンバーの中に所定の時間入れることによって行ってもよい。凍結乾燥は、液体窒素温度で１２〜７８時間の範囲の時間、好ましくは約２４時間かつ１０-1〜１０-4トルの範囲の真空、好ましくは１０-2トルの真空下で行われるのが典型的である。凍結乾燥において典型的に用いられる極低温は、物質のそれ以上の結晶化を抑制することから、好適な方法は凍結乾燥を含む。その結果、それによって得られた非晶質リン酸カルシウムは、極めて微細な自由流動性の粉末である。
凍結させたＡＣＰを、次いで活性化してもよい。カーボネートがＡＣＰ中に存在する好適な実施態様では、ＡＣＰ粉末を加熱して残留する自由水、水和水を駆逐しかつ炭素を、恐らくＣＯ32-を分解してＣＯ2及び酸素にすることによって除く。加熱工程は、非晶質リン酸カルシウムの結晶性ヒドロキシアパタイトへの転化を防ぐように、５００℃よりも低いが、４２５℃よりも高い温度で行う。加熱は、温度４５０°〜４６０℃の範囲で行うのが好ましい。好適な実施態様では、凍結乾燥させた非晶質リン酸カルシウム粉末を減圧下で加熱する。減圧環境では、同じ結果を得るのに、温度を相当に低く、すなわち約１７５°〜２２５℃の範囲にすることができる。温度を低くすることは、非晶質粉末の結晶化の危険性を低減させることから、望ましくなり得る。
低結晶度及び部位空孔（多孔性及び／又は化学量論的変化）は、本発明の非晶質リン酸カルシウムの反応性が高くなることが観測されることの理由を説明し得る。これは、下記の観測によって実証される。５２５℃に加熱したカーボネート含有非晶質リン酸カルシウムは、結晶性ヒドロキシアパタイトの形成の増大を有しかつ対応して反応性の低下を有することが観測される。ほんの４００℃に加熱した非晶質リン酸カルシウムは、非晶質性を保持するが、反応性の低下を示す。恐らく、この反応性の低下は、この低い温度で処理したサンプルにおいてＩＲによって観測される一層高いカーボネートレベル（及び一層少ない部位空孔）に関連する。これは、非晶質性及び減少した炭素含量（空位の反応性部位）が反応性のファクターになることを示唆している。これは、決して反応性についての唯一の基準であることを意図しない。観測される反応性についてのその他の基準は、発明の範囲内であると考える。生成した非晶質リン酸カルシウム粉末は、Ｃａ／Ｐ比１．１〜１．９、好ましくは約１．５５〜１．６５、最も好ましくは約１．５８を有する高反応性の非晶質リン酸カルシウム物質である。その粉末を、種々の分析技術によって特性表示した。
図１に、本発明の好適な反応性非晶質リン酸カルシウムの形態学的特性及びオングストロームサイズの性質を例示するために、高分解能の透過型電子顕微鏡写真を示す。好適な粒径は、１，０００Åよりも小さく、好ましく３００〜４００Åの範囲である。結晶性物質に対照して、明瞭なエッジ及び表面を欠く、小球様クラスターを分離する不明瞭な境界に注目すること。図２ａ及び２ｂは、凍結乾燥プロセスの後（ａ）及び次いで４５０℃で１時間熱処理した後（ｂ）の非晶質リン酸カルシウムの赤外スペクトルを例示する。物質中に局部化学基が存在することを例示する赤外ピークは、Ｈ−Ｏ−Ｈ基（およそ３，４００ｃｍ-1及び１，６４０ｃｍ-1に）及びＣＯ32-基（１４２０−１４５０ｃｍ-1に）の存在が、熱処理した後に相当に低減されることを示す。しかし、同様の物質の図３におけるＸ線回折図は、凍結乾燥した後の非晶質状態（ａ）が、熱処理した後（ｂ）に実質的に不変であることを示す。本発明の非晶質性は、既知の結晶性リン酸カルシウムに一致する回折角の任意の位置に鋭いピークの存在しない広いピーク及び漠然としたバックグラウンドによって特性表示される。波長−分散型Ｘ線分析を、熱処理した後の同じ物質の電子マイクロ−プローブに関して用いて行うＣａ／Ｐ測定は、１．５８であるＣａ／Ｐを生じる（図４）。
これらの特性表示は、非晶質リン酸カルシウム固体における所定の基の局部部分に変化があっても、総括の非晶質性はプロセス全体を通して維持されることを立証する。これより、物質の判定を、ＡＣＰを活性化し得る局部部位又は「孔」を非晶質構造中に含有すると認める。
別の好適な実施態様では、高反応性の非晶質リン酸カルシウムに酸性又は塩基性リン酸カルシウムを反応させて結晶性不良なヒドロキシアパタイトを得る。先に検討した通りに、ヒドロキシアパタイトは熱力学的に好適な反応生成物で、容易に結晶化して、生理学的条件下で不溶性であることにより、生物学的適合性でない生成物をもたらす。有意に結晶化しないで、急速かつ完全に反応して生成物ヒドロキシアパタイトになることができる非晶質リン酸カルシウムを使用することは、生理学的条件下で吸収可能な結晶性不良なヒドロキシアパタイトへの新規なルートを提供する。
本発明の非晶質リン酸カルシウム粉末に種々の第二成分を混合物し、それにより反応させて結晶性不良な形態のヒドロキシアパタイトを形成してもよい。この反応は、粉末を種々の酸性及び塩基性の両方のリン酸カルシウムと、水、塩水、緩衝溶液、血清又は組織培地のような、しかしこれらに限定されない流体の存在において混合する際に、室温で起きる。本発明の非晶質リン酸カルシウムと酸性リン酸カルシウムとの混合物は、加える流体の量に応じて、種々の度合のペーストコンシステンシーを有する極めて成形適性な及び／又は極めて注入適性なペーストを生じる。
適当なリン酸カルシウムは、ヒドロキシアパタイト性リン酸カルシウムを得る反応について適当な化学量論を供する酸性及び塩基性の両方のリン酸カルシウムを含む。好適な実施態様では、酸性（ｐＨ５〜７）リン酸カルシウムを用いる。適した酸性リン酸カルシウムは、下記を含み、これらにいささかも限定されない：メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム２水和物、リン酸七カルシウム、リン酸三カルシウム、ピロリン酸二カルシウム２水和物、結晶性不良なＨＡ、ピロリン酸カルシウム、及びリン酸八カルシウム。適した塩基性リン酸カルシウムは、更なるＡＣＰを含む。自然の骨に近い所望のＣａ／Ｐ比を生じるために、単に例として、ＣａＯ、ＣａＣＯ3、酢酸カルシウム、及びＨ3ＰＯ4のようなホスフェート又はカルシウムの源となるその他の固体を混合して最終生成物を形成してもよい。同様に、非晶質又は結晶性不良な状態の第二成分を供するのが望ましいかもしれない。
ヒドロキシアパタイトは、熱力学的に好都合な形態のリン酸カルシウムである。従って、化学的反応なしでＡＣＰのＨＡへの転化を助成する成分を添加することによって、単に反応性ＡＣＰの結晶性不良なＨＡへの転化を助成することは、発明の範囲内である。適したプロモーターは、水及び熱を含み、しかしこれらに限定されない。
第二のリン酸カルシウムは、Ｘ線回折図（図６ａ）において関心のあるリン酸カルシウムを象徴する鋭い回折ピークが存在することによって証明される通りに、結晶性であるのがしばしばである。対照して、反応性のＡＣＰは、非晶質でありかつＸ線回折により識別し得るピークを示さない（図６ｂ）。しかし、二リン酸二カルシウムは、結晶性が一層高いにもかかわらず、反応性のＡＣＰとの反応で消費され、生成物ＨＡは、ずっと低い結晶度を有する。
反応体の内の少なくとも一つは、非晶質でありかつ高反応性であることから、反応は、室温で進行して結晶性不良な又は微結晶性ミクロ構造を有するアパタイト性物質を供する。反応は、また、実質的に完全であり、それにより混合物のすべてのカルシウム及びホスフェートは、生成するヒドロキシアパタイト生成物によって確実に消費される。これは、単に出発の非晶質リン酸カルシウム及び第二リン酸カルシウムの相対割合を選定することによって、信頼し得るヒドロキシアパタイト生成物の信頼し得る製造を可能にする。カルシウム対ホスフェート比約１．２〜１．６８、好ましくは約１．５よりも小さく、最も好ましくは約１．３８を保つのが望ましい。
生成物のヒドロキシアパタイト物質は、自然発生の骨の特性を示す化学変化を起こしやすい環境を含有する。自然発生の骨では、ミネラルはナノメートルサイズの構造を特徴とし、高い表面積を備えて周囲の組織環境と相互作用し、組織の吸収及びリモデリングを生じる。本発明は、生成物としてのそのナノメートルサイズの結晶により、自然発生の骨によく似ている。更に、骨の生組織に認められるミネラル性をシミュレートするために、結晶性やＣａ／Ｐ比のような性質を本発明において厳密にデザインする。
別の好適な実施態様では、骨修復部位に導入することができる注入適性なペーストを調製してもよい。そのペーストは、本発明の非晶質リン酸カルシウムと第二成分とを、注入するための所望のコンシステンシーを生じる程の量の水又は緩衝剤中で混合することによって調製するのが普通である。これは、依然１６〜１８ゲージの注入器を通過させることを可能にしながら、できるだけ濃厚にするのが最もしばしばである。その物質は、ペースト中の成分固体が非晶質性であることから、従来技術の組成物に勝る著しく改良された流動特性を有する。生成したペーストの流動特性は、練り歯磨き様であり、他方従来技術の物質は、粒状又はオートミール様コンシステンシーを継承する。ペーストは、室温に保ちかつ気化を最少にするならば、使用する前、幾時間かの期間までに調製してもよい。貯蔵時間は、気化を最少にするための工程を採用しさえすれば、ペーストを冷蔵庫中に１°〜１０℃の範囲の低い温度に保つことによって伸ばしてもよい。
骨代用物質ペーストの粘度を要求に従い、反応体に加えるべき液体の適当な量を選ぶことによって調整してもよい。ペーストを、注入適性な又は成形適性なコンシステンシーのいずれかで調整してもよい。注入適性なコンシステンシーとは、依然１６〜１８ゲージの針を通過すことができながら、できるだけ濃厚であることを意味する。これは、「練り歯磨き」様コンシステンシーになるのが最もしばしばである。成形適性とは、物質にその形状を保持させるコンシステンシーを言う。成形適性なコンシステンシーの極端な場合では、ペーストは、ガラスパテ又はコーキングコンパウンドのコンシステンシーを有することになる。ペーストは、また、丁度注入適性及び成形適性の両方にする程の液によって調整してもよい。
いくつかの好適な実施態様（例えば、下記の例９〜１４）では、反応は、室温でゆっくり起きるが、体温で有意に促進される。反応体を水と混合することによって形成されるペーストは、室温に保ちながら、相当の期間（幾時間かまで）注入適性なままであるので、これは、外科的な場所で特に有用である。これより、ペーストは、室温（約２２℃）において、１時間よりも長い時間の後に硬化しかつ１０分よりも長い、好ましくは１時間よりも長い、最も好ましくは３時間よりも長い間成形適性及び／又は注入適性なままである。ペーストは、移植部位（約３７℃）に注入した後に、約１時間よりも短い内に、好ましくは約１０〜３０分で硬化する。
発明の別の実施態様では、骨再生用タンパク質（ＢＲＰ）を非晶質リン酸カルシウム及び酸性リン酸カルシウム混合物中に加入することを意図する。ＢＲＰは、骨成長の速度を増大させかつ骨治癒を促進するのが立証された。ナノ結晶性又は結晶性不良なヒドロキシアパタイト及びＢＲＰを含む骨移植片は、本発明のヒドロキシアパタイトを単独で用いる骨移植片に比べて、骨治癒を更に一層速く促進することが期待される。ＢＲＰの効能は、ナノ結晶性又は結晶性不良なヒドロキシアパタイトの溶解度を、それがＢＲＰ、カルシウム、及びリンを骨成長について最適な用量で送達する速度で溶解するように調節することによって、更に増進される。そのようなＢＲＰを加入する方法は、蒸留水の代わりに、ＢＲＰを含有する緩衝溶液をタンパク質活性を維持するその最適なｐＨで混合することを含み、これに限定されない。ＢＲＰの例は、下記を含み、これらにいささかも限定されない：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ、Ｃｅｌｌ−Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、及びＢｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ。そのようなＢＲＰは、現在、マサチューセッツ、ケンブリッジ在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；カリホルニア、パロアルト在のＧｅｎｅｎｔｅｃｈ；及びマサチューセッツ、ホプキントン在のＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発されている。
発明の別の実施態様では、抗生物質又はその助剤を非晶質リン酸カルシウム及びその混合物中に加入することを意図する。臨床の点から、骨移植外科学から起きる主要な関係の一つは、術後の炎症又は感染を制御したい要求である。結晶性不良なヒドロキシアパタイト及び抗生物質を含む骨移植片は、手術部位における局部感染の機会を減少させ、感染のない、これより一層速い骨治癒プロセスに寄与することが期待される。抗生物質の効能は、結晶性不良なヒドロキシアパタイトの放出を、それが抗生物質ペプチド又はその活性な成分を最も有効な用量で組織修復部位に送達する速度で溶解するように調節することによって、更に増進される。抗生物質の例は、下記を含み、これらにいささかも限定されない：ペニシリン、クロルテトラサイクリン塩酸塩（オーレオマイシン）、クロラムフェニコール及びオキシテトラサイクリン（テラマイシン）。骨組織修復について最適な条件を助成する際に必要な成分の全部又はほとんどを局所送達するために、抗生物質、大概ポリペプチド及び骨再生用タンパク質の両方を、本発明の結晶性不良なヒドロキシアパタイト物質と混ぜ合わせてもよい。
例
発明を下記の例によって更に例証するが、下記の例は、単に例示するために提示するものであり、発明を制限するものと考えるべきでない。
例１．本例は、比較的に不活性な非晶質リン酸カルシウム固体を本発明の高反応性非晶質リン酸カルシウムにさせるための段階調製及び方法について記載する。
室温で、Ｎａ2ＨＰＯ4．７Ｈ2Ｏ（リン酸ナトリウム）５５ｇ、ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）５０ｇ、ＮａＨＣＯ3（炭酸水素ナトリウム）３０ｇを蒸留水１．３リットルに急速に溶解することによって、溶液Ａを調製した。また、Ｈ2Ｏを０．７〜１．３ｍｌの範囲の容積で用いた。室温で、Ｃａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ（硝酸カルシウム４水和物）４３ｇを蒸留水０．５リットルに急速に溶解することによって、溶液Ｂを調製した。
次いで、室温で、溶液Ｂを急速に撹拌する溶液Ａに急速に加えることによって、不活性な炭酸塩化された非晶質リン酸カルシウムを調製した。このようにして形成されたゲル様非晶質リン酸カルシウムの沈殿を、直ぐにろ紙（０．０５平方ｍ）を使用して並のろ過速度及び約１０-2トルの減圧でろ過した。その物質は薄いケークを形成し、これを、蒸留水およそ４リットルで、水をろ過用漏斗の中に加えることによって洗浄した。洗浄した物質を、次いでスパチュラを用いて捕集し、かつ２．５Ｌ容器内の液体窒素中に浸漬した。硬い凍結された片を形成した後に、容器を真空室の中に２４時間（１０-1〜１０-2トル）の間、微細なかつ乾燥した粉末が得られるまで、移した。
上記した手順は、室温で行ってもよいが、全プロセスは、更に非晶質な状態を一層安定な結晶形態に転化させないように、周囲温度よりも低い温度（４°〜５℃）で行うのが好ましい。更に、結晶性ヒドロキシアパタイト生成のインヒビターとして作用するのが知られているそのような元素又はイオンを、溶液中に微量で加えてもよい。これらは、例えば、１．０ｇよりも少ないＭｇＣｌ2．６Ｈ2Ｏ（塩化マグネシウム）の形態のＭｇイオン、２ｇよりも少ないＮａ4Ｐ2Ｏ7．１０Ｈ2Ｏ（ピロリン酸ナトリウム）の形態のピロホスフェートイオンにすることができる。
プロセスのこの点における不活性な非晶質物質の赤外スペクトルを図２ａに示す。このスペクトルは、Ｐ−Ｏ基（６００及び１０００ｃｍ-1）、ＣＯ32-基（１，４２０−１，４５０ｃｍ-1）の特性を示すピークを、Ｏ−Ｈ基（〜３，５５０ｃｍ-1）の比較的に大きなピークと共に含有する。同じ物質のＸ線回折図（図３ａ）は、結晶度の測定を、干渉性ピーク対バックグラウンドの比を取ることによって求める際に、鋭いピークが存在しないことによって立証される通りに物質の非晶質性を示す。
上記した不活性な非晶質物質を、次いで４５０℃（±３℃）において６０分間加熱することによって、反応性形態に造った。加熱した物質のＩＲを図２ｂに示す。このスペクトルは、特定のＯ−Ｈ及びＣＯ32-基の減少を示し、Ｈ2Ｏ及びＣＯ32-のＣＯ2及びＯ2としての有意の減少を示す。同様に調製したサンプルでは、炭素含量はおよそ６０％低下し、全カーボネート比は１．５６％から０．５％に減少するのが観測された。しかし、その物質の非晶質性は、このプロセスの間、図３（ｂ）に示すＸ線回折図によって立証される通りに、失なわれなかった。熱処理した後のこの物質のＣａ／Ｐ比測定値は、定量的電子マイクロプローブ分析の方法を用いて、１．５７５であるのが求められた（図４）。非晶質物質の総括的な形態学の及び微細構造の性質を、透過型電子顕微鏡下で見られる通りに、図１に示す。各々のグラニュールを分離する鋭いエッジが存在せず、物質の所定の部分が形のない形態（矢印）を示す、物質の「非晶質な」外観に注目すること。極端に高い比表面積１２０ｍ2／ｇが、平均細孔サイズおよそ１３０Åと共に、この物質において観測された。
例２．調製を上の例１に記載する通りにして行ったが、溶液Ａ及びＢの調製を下記の反応に代えた。溶液Ａは、室温で、Ｃａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ  ９０．６８ｇを炭酸塩化された蒸留Ｈ2Ｏ  １．２リットルに急速に溶解することによって、調製した。溶液Ｂは、Ｋ2ＨＰＯ4４０．５７ｇを、４５容積％のＫＯＨ溶液２４ｍｌを含有する蒸留Ｈ2Ｏ  １．５３リットルに溶解することによって、調製した。この手順から生じた生成物非晶質リン酸カルシウムの化学的及び物理的性質は、例１に従って調製した物質と同様であった。
例３．調製を上の例１に記載する通りにして行ったが、溶液Ａ及びＢの調製を下記の反応に代えた。溶液Ａは、室温で、Ｃａ（ＮＯ3）2．６Ｈ2Ｏ  １０．５８ｇを、ＮａＯＨによって調整する通りの９．０よりも大きなＰｈの炭酸塩化された蒸留Ｈ2Ｏ  ０．１５リットルに急速に溶解することによって、調製した。溶液Ｂは、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4７．８ｇを蒸留Ｈ2Ｏ  ０．３５リットルに溶解することによって、調製した。この手順から生じた生成物非晶質リン酸カルシウムの化学的及び物理的性質は、例１及び２に従って調製した物質と同様であった。
例４．本例は、発明の骨代用物質の調製について記載する。
本例において用いるリン酸二カルシウム２水和物（ＤＣＰＤ）を、下記のようにして調製した。溶液Ａは、室温で、Ｈ9Ｎ2Ｏ4Ｐ（リン酸水素二アンモニウム）を蒸留水５００ｍｌにｐＨ４．６〜４．８で急速に溶解することによって、調製した。溶液Ｂは、、室温で、Ｃａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ（硝酸カルシウム４水和物）１７．１ｇを蒸留水２５０ｍｌに急速に溶解することによって、調製した。リン酸二カルシウム２水和物は、室温で、溶液Ｂを撹拌する溶液Ａに急速に加えることによって、調製した。直ぐ後に、サンプルを、ろ紙（０．０５平方ｍ）を使用して並のろ過速度及び約１０-2トルの減圧でろ過した。その物質は薄いケークを形成し、これを、蒸留水約２リットルで洗浄し、次いで室温で２４〜７２時間乾燥させた。
例１、２又は３からの調製した反応性非晶質リン酸カルシウム物質にリン酸二カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ）を５０：５０重量％で、乳鉢及び乳棒を使用して３〜５分間物理的にドライミックスした。次いで、水（１ｍｌ／混合物質１ｇ）を粉末混合物に加えてペースト様コンシステンシーを生じた。加えるＨ2Ｏの量は、濃厚なペーストを所望するか或は希薄なペーストを所望するかどうかに応じて、変えた。ペースト物質を、次いで、湿気のある組織環境に入れ、そこで体温（３７℃）に到達した際に、発熱挙動なしで、硬化して固体マスになった。硬化プロセスは、それを冷却温度４℃の中に入れることによって幾時間も遅らせることができた。硬化された物質は、合成のヒドロキシアパタイト物質について報告されている溶解度を越える固有の溶解度特性を有するナノメートルサイズの結晶性不良なヒドロキシアパタイトで構成された。これは、図５に立証されており、図５では、調節されたｐＨ緩衝液中に３７℃において２４時間にわたって放出されるカルシウムイオン濃度は、標準の結晶性ヒドロキシアパタイト物質に（カーブ５２）に比べて、本発明の結晶性不良なＨＡ物質の場合に、相当に高くなった。
例５．本例は、選定した粒径を有する物質を使用する骨代用物質の調製を立証する。
例１、２又は３からの調製した反応性非晶質リン酸カルシウム物質に１００μｍよりも小さい粒径を有するリン酸二カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ）を５０：５０重量％で、８５０５アルミナ粉砕チャンバーを有するＳＰＥＸ８５１０実験室ミルを使用して２分間物理的にドライミックスし、次いで、篩分けして１００μｍよりも小さいサイズにした。次いで、水（１ｍｌ／混合物質１ｇ）を粉末混合物に加えてペースト様コンシステンシーを生じた。
例６．例１、２又は３で調製したままの反応性非晶質リン酸カルシウム物質にその他のリン酸カルシウム化合物を、例４に記載する方法に従ってドライミックスした。これらの化合物は、下記を含み、これらに限定されない：Ｃａ（ＰＯ3）2（メタリン酸カルシウム）、Ｃａ7（Ｐ5Ｏ16）2（リン酸七カルシウム）、Ｃａ2Ｐ2Ｏ7（ピロリン酸カルシウム）、Ｃａ3（ＰＯ4）2（リン酸三カルシウム）。ドライ混合物比を適宜に計算して、反応性リン酸カルシウムに混合した化合物のＣａ／Ｐモル比に応じて、Ｃａ／Ｐ比１．５〜１．７０であった。生成した物質は、図５に示すのと同じ溶解度特性を有する結晶性不良なヒドロキシアパタイト固体であった。
例７．本例は、結晶性不良なヒドロキシアパタイト固体を形成するための注入適性ペーストの調製について記載する。
例４又は６に従って調製したドライミックスした物質に蒸留したＨ2Ｏ（２．３ｍｌ／ｇ）を混合した。手で容易に造形することができる又は内直径が０．５ｍｍ程に小さいノズルを通して注入することができるペーストを形成した。ペーストを４℃で２〜３時間冷却した後に、流動性が増大した。
その物質は、気密の容器中に４℃で約１２時間の間ペースト形態で硬化しないで貯蔵することができた。
例８．生成物骨代用物質の結晶性含量を、Ｘ線回折及びＩ−Ｒ分光測定によってモニターした。
図７ａ〜ｄは、例４に記載する通りのＤＣＰＤと反応性非晶質リン酸カルシウムとの間の反応生成物のＸ線回折スペクトルである。反応混合物を３７℃の湿った環境に入れ、Ｘ線回折分光測定によって異なる時間に調べた。Ｘ線走査条件は、（ａ）銅陽極、（ｂ）λ＝１．４５４０５９８Å、並びに（ｃ）ステップ０．０２及びステップ間隔２秒において走査範囲２０〜３５°である。図８は、リン酸二カルシウム２水和物の赤外スペクトル（ａ）、発明の活性化されたＡＣＰの赤外スペクトル（ｂ）、及び本発明の結晶性不良なＨＡの赤外スペクトル（ｃ）を示す。
図７ａ〜ｄのサンプルを、それぞれ０、２０分、７５分及び２時間の間インキュベートした。サンプルを注記した時間で取り出し、かつ凍結乾燥させて化学的特性を保存した。反応の開始において取った図７ａは、出発ＡＣＰ及びリン酸二カルシウムに起因し得るピークの組合せを表わす（構成成分ＸＲＤパターンについて図６を参照）。結晶性二リン酸二カルシウムについて約２０．２５°、２３．５°、２９．５°、３０．７５°及び３４．２°において鋭いピークが容易に観測される。反応時間が増大するにつれて、鋭い結晶性ピークが低下し、広い（非晶質）ピークが、２６°、２８．５°、３２．０°及び３３．０°に中心を置いて現れる。７５分の反応の後にスペクトルに変化がなく、これは、反応が本質的に１時間に過ぎない時間で完了することを示すことに留意することは、興味がある。発明の骨代用物質のＸ線回折図（図７ｄ）を、図９に示す自然発生の骨のＸ線回折図に比較することができる。２つのスペクトルはほぼ同じであり、発明の骨代用物質のバイオミメトリーが近いことを示す。
例９〜１４：  これらの例は、骨代用物質の形成において使用すべき注入適性なペーストのコンシステンシー及び反応性に流体容積が及ぼす効果を立証する。ペーストの各々を上記の例７に記載する通りにして調製し、室温及び３７℃におけるコンシステンシー及び反応の速度を求めた。観測を表２に報告する。
0004260880.tif 000002
例１３：  この研究の目的は、モデルを、発明の結晶性不良なヒドロキシアパタイトカルシウム骨代用物質のホスフェートセラミック物質をニュージーランドホワイトラビットの脛骨の手術により生成した欠陥中に移植した際の移植されたそれの効能の分析として評価するにあった。
Ｉ．テスト品及び動物
テスト品：使用するテスト品を例７に記載する通りにして調製したが、タンパク質又はペプチド生物学的活性について最適なｐＨ（サリーン）範囲を有する緩衝溶液を使用した。
動物：この研究において、７匹の成体の雄及び雌ＮＺＷラビット（２．５〜３．０ｋｇ）を使用した。動物は、Ｐｉｎｅ  Ａｃｒｅｓ  Ｒａｂｂｉｔｒｙ／Ｆａｒｍから得た。動物を最低１０日間隔離及び順応に保った後に、研究を開始した。動物を、獣医によって全般的な健康について評価させた後に、隔離から解いた。動物を、個々に吊したステンレスチールケージに入れた。ケージの下の滴下パン中にかんなくずを使用した。動物を、番号を付けた耳タグ又は入れ墨により及び対応するケージカードによって識別した。動物は、すべて同じ処置を受けた−一つの欠陥を一つの脛骨に入れた。評価するためのタイムポイントは、０、２、４、及び８週であった。
手術手順：無菌の技術を用いて適当な麻酔を得た後に、切開を近位の脛骨上に造った。軟組織をそらせて骨を暴露した。低速歯科用ハンドピースドリルに５ｍｍトレフェンを、必要に応じて潅注（０．９％生理的食塩水）しながら使用して、骨盤をフリーに切り裂いて移植するための部位を造った。サリーンを混合した骨代用物質を欠陥に入れた。この方法を用いて、動物当り１サンプルを施した。軟組織を、次いで層で３−０縫合物質で閉じた。動物をモニターし、目覚めた際にブプレノルフィン（ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ）（０．０２〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下に）及びセファロチン（２０ｍｇ／ｋｇ、皮下に）を与えた。鎮痛剤及び抗生物質を、手術した後５〜７日間、１日に２度投与した。
ＩＩ．実験観察
臨床上の観察及びレントゲン写真：  動物の全般的な健康及び特に歩行に関する安寧を、少なくとも毎週行った。脛骨のレントゲン写真を、手術後及び剖検の時を含む予定した間隔で行った。
動物を予定した期間治癒させた。脛骨のレントゲン写真のために、動物に麻酔をかけた。かかる脛骨のレントゲン写真は、研究全体にわたって２週毎に取った。レントゲン写真を用いて研究の期間を決めた。およそ２週毎に、２匹の動物を犠牲にし、テスト部位を組織学のために取り去った。動物を毎日モニターして食餌或は挙動の変化が起きるかどうかを見た。研究の終りに、動物を、処方した安楽死溶液（ケタミンＨＣｌ及びＸｙｌａｚｉｎｅ、次いで飽和ＫＣｌ）を過剰投与することによって安楽死させた。
顕微鏡的病理学：  移植部位を未脱灰及び脱灰セクションとして調製した。脱灰スライドを、プラスチック埋設ライトグリーンベーシクフスキン（ｆｕｓｃｈｉｎ）９０ミクロンスライドとして調製し；未脱灰スライドを、ヘマトキシリン及びエオシン及びマソンの三色染色で染色した。スライドを、実験室動物病理学において経験を有するボード公認の獣医病理学者（ＡＣＶＰ）によって顕微鏡的に評価させた。
ＩＩＩ．結果
臨床上の観察及びレントゲン写真：  脛骨の欠陥のレントゲン写真は、放射密度が経時的に増大するのを示した。
剖検：  脛骨の欠陥部位は、経時的に小さくなるように見えた。外科学により予想されるのと異なる過度の炎症は、肉眼で観察されなかった。
顕微鏡的病理学：  ２週で、骨代用物質リン酸カルシウムは、依然欠陥部位において、部位及び局部マクロファージの両方で結晶として観察された。小柱の骨の小さな骨片が、欠陥エッジ及び欠陥部位の両方において見られた。４週までに、デバイスの結晶は、有るとしてもほとんど目に見えず；一層厚くなった小柱の骨が欠陥部位全体にわたって見られた。試験片は、６週及び８週で、デバイスの跡を有せず；欠陥部位において見られた骨は、非常に厚い小柱の〜皮質のタイプの骨であった。
例１６：  本例は、例に従って調製した結晶性の及び非晶質のプリカーサー並びに同様のプリカーサーを反応させることによって製造した最終の結晶性不良なＨＡの赤外スペクトルを比較する。図８ａは、例４に記載する通りにして調製したブラッシュ石（ＤＣＰＤ）のＩＲスペクトルを提示し；図８ｂは、例１に記載する通りにして調製した、熱処理した後のＡＣＰのスペクトルを提示し；及び図８ｃは、例４に記載する通りにして調製した結晶性不良なＨＡのＩＲスペクトルである。
先の記載から明らかにされた目的の中で、上述した目的が効率的に達成され、上記のプロセスを実施する際にかつ挙げた組成においていくつかの変更を、発明の精神及び範囲から逸脱しないでなし得るので、上記の記載に含有されかつ添付図面に示されるすべてのことが、例示として解釈されるべきであり、制限する意味で解釈されるべきでないことを意図することは了解されるものと思う。
更に、下記の請求項の記載が、そこに記載する発明の全体の及び特定の特徴のすべて、並びにそれらの間に入ると言うことができる発明の範囲のすべての記述に及ぶことを意図することは了解されるものと思う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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