(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン、少なくとも一つのコレステロール又はコレステロール誘導体、及び生体活性薬剤を含む、ＤＮＡ−サンドイッチリポソーム組成物。
【請求項２】
組成物の正味チャージ値が２に等しい、請求項１記載のＤＮＡ−サンドイッチリポソーム組成物。
【請求項３】
生体活性薬剤が核酸である、請求項１記載のＤＮＡ−サンドイッチリポソーム組成物。
【請求項４】
さらに、標的化リガンドを加えて、それによって当該リガンドでサンドイッチリポソームの外側表面を飾ることを含む、請求項３記載のＤＮＡ−サンドイッチリポソーム組成物。
【請求項５】
脂質二重膜がある構造及び２又はそれより多くのサンドイッチリポソーム間に位置するＤＮＡ分子を含み、正味チャージが２であり、２００−４５０ｎｍの大きさである、ＤＮＡ−サンドイッチリポソーム組成物。
【請求項６】
さらに、１又はそれより多くの標的化リガンドを含む、請求項５記載のＤＮＡ−サンドイッチリポソーム組成物。
【請求項７】
ｉ）１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン及び少なくとも１のコレステロール又はコレステロール誘導体を加熱し、加熱された脂質成分を形成し、；
ii）前記の加熱された脂質成分を超音波処理し；そして、
iii）複数のフィルターであって、ポアサイズが大きいフィルターから小さいフィルターまで順次通して脂質成分を押出成形するが、ここで、最小のフィルターのポアサイズは少なくとも０．１μｍである：
工程を含む方法により作製した陥入する花瓶様リポソーム。
【請求項８】
さらにリポソームに生体活性薬剤を加える工程を含み、かつ、サンドイッチリポソームである、請求項７記載の陥入する花瓶様リポソーム。
【請求項９】
生体活性薬剤がＤＮＡであり、かつ、ＤＮＡサンドイッチリポソームである請求項８記載の陥入する花瓶様リポソーム。
【請求項１０】
さらに、標的化リガンドを加える工程を含み、それによってそのリガンドでＤＮＡ−サンドイッチリポソームの外部表面を飾ることを含む、請求項９記載の陥入する花瓶様リポソーム。
【請求項１１】
さらに、第２の生体活性薬剤を含む、請求項９記載の陥入する花瓶様リポソーム。
【請求項１２】
ＤＮＡ、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン及び少なくとも一つのコレステロール又はコレステロール誘導体が正味チャージ値２である、請求項９記載の陥入する花瓶様リポソーム。
【請求項１３】
ｉ）１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン及び少なくとも一つのコレステロール又はコレステロール誘導体の混合物を加熱し、加熱された脂質成分を形成し；
ii）前記加熱された脂質成分を超音波処理し；そして、
iii）複数のフィルターであって、ポアサイズが大きいフィルターから小さいフィルターまで順次通して脂質成分を押出成形し、陥入する花瓶様リポソームを形成させるが、ここで、最小のフィルターのポアサイズは少なくとも０．１μｍである：
工程を含む、陥入する花瓶様リポソームの調製方法。
【請求項１４】
さらに、前記の陥入する花瓶様リポソームにＤＮＡを加えて、ＤＮＡ−サンドイッチリポソームを形成する工程を含む、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、リポソームを形成する特定の脂質組成物に基づくリポソーム調製物に関する。また、本発明の目的は、生体活性薬剤を運搬するリポソーム組成物を調製する方法を提供することにある。本発明のリポソーム送達システムは、非常に効率の良い移入方法および治療方法として用いられる。
発明の背景
脂質粒子は、実質上、任意の生物物質と複合させることができる。この能力により、これらの複合物は、タンパク質、治療薬剤、化学療法薬剤および核酸の送達システムとして有用である。脂質複合体は多くの薬剤治療に用いられてきたが、これらの送達システムが有望な結果を示す領域の一つに、遺伝子治療が挙げられる。遺伝子治療のためには、標的細胞に遺伝子または生体活性薬剤を成功裡に効率よく、その上、安全に運搬することが要求される。それ故、送達システムを改良する必要性が、慣用の治療および遺伝子治療の両方で、常に、最前線にある。
脂質粒子は、多くのインビトロおよびインビボでの適用に有効なビヒクルであることが示された。ＤＮＡと複合させた脂質粒子は、プラスミドベクターをもちいて与えられた遺伝子を発現させるために、インビトロ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７；Ｇａｏら、１９９１）およびインビボ（Ｎａｂｅｌら、１９９０；Ｗａｎｇら、１９８７；Ｚｈｕら、１９９３；Ｓｏｒｉａｎｏら、１９８３）で用いられた。
カチオン脂質粒子とＤＮＡとの複合体の形成は、最近では、多くの研究室での研究の焦点となってきている。カチオン脂質調合物の改良は、組織培養中の細胞へのＤＮＡ送達の効率を、大きく増加させた（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）。対照的に、カチオンリポソームを用いた動物への静脈内注射によるＤＮＡ送達は、効率が悪く、遺伝子治療への非ウイルスベクターの治療への応用が制限される（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら、１９９５；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、１９９５；Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、１９９６）。マウスにおける静脈内ＤＮＡ送達の比較は、ＤＮＡに複合したカチオンリポソームを使用した場合と裸のＤＮＡを使用する送達で同様の結果を報告している（ＷＯ９３／２５６７３）。カチオンリポソーム／ＤＮＡ複合体の形態は、「スパゲッティ−ミートボール複合体」であると報告されている（Sternberg,B.（1996）,J.Liposome Res.6:515）。
改良されたインビボ送達用リポソーム調合物は、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療に代わる価値ある代替策であり、ウイルスを送達することに関連する様々な問題を回避する。新規のカチオン脂質合成への努力は、より効率的なトランスフェクション薬剤の発見に導いたが、組織培養物内で測定されたそれらの能力は、動物の全身投与後にＤＮＡを送達する能力とは関連しない（Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５）。インビトロでの実験に用いることによって明らかにされた機能的性質では、血漿内での複合体の安定性、またはそれらの薬物動態学および生体分布が評価されておらず、そのすべてがインビボ活性に重要である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９４）。それらの構成脂質の物理化学的性質に加えて、複合体のコロイド性から、これらのパラメーターを測定することができる。
リポソームは、遺伝子生成物の欠損または欠質による異常を修正するために、細胞内に正常で機能的な遺伝子物質をトランスファーすることのできる遺伝子療法でのウイルス送達システムの代替策を提供する。典型的には、トランスファーされる遺伝物質は、少なくとも、新規の遺伝子の発現を調節するためのプロモーターと共にトランスファーされた遺伝子を含むべきである。
ウイスルＤＮＡ送達システムの方法は、免疫応答、ウイルスＤＮＡベクターの繰り返し送達が不可能であること、高力価ウイルスの作成の難しさ、およびウイルス感染の可能性を含む多くの根元的問題に悩まされている。非ウイルス送達方法は、これらの問題を含まない代替システムを提供する。しかしながら、今日まで、リポソームによるＤＮＡ送達の効率の低さが、遺伝子治療へのこの技術の治療適用を制限していた。本発明のリポソームは、以前に報告されたものに対して、全身へのＤＮＡ送達および遺伝子発現を最大で１５０倍に増加させた。
それ故、本発明の目的は、患者に生体活性薬剤を送達する能力を持つ効率の高いリポソーム構造を合成することである。
本発明のもう一つの目的は、動物内の標的部位に核酸生成物を送達し発現するための核酸のキャリヤーとして、これらの安定なリポソームを用いることである。
本発明のさらなるもう一つの目的は、患者の全身に核酸生成物を送達し発現するための核酸のキャリヤーとして、これらの安定なリポソームを用いることである。
本発明のさらなる目的は、興味ある任意の核酸を運搬する能力を持つ、本発明の安定なリポソームを含むキットの作成である。
本発明のもう一つの目的は、病気治療においてヒトの遺伝子治療用の特定の薬剤を運搬するリポソームを用いることである。
本発明のさらなる目的は、患者内に組込まれていない核酸からの遺伝子生成物を長期に発現する方法を提供することに関係する。
発明の概要
本発明は、生体活性薬剤を運搬する能力を持つ新規のリポソームの構造に関する。これらのリポソーム構造は、患者の標的位置への生体活性薬剤の送達用の非常に有効なビヒクルであり、全身への薬剤の送達を提供する。本発明のリポソーム複合体は、サイズが小さく、＋／−ネットチャージ（”ρ”）が約２である。
さらに、本発明は、加熱、超音波処理、およびリポソーム構造の押出成形の段階を含む、これらの新規のリポソームの調製方法に関する。本発明の調製方法は、適当で均一なサイズの複合体を作成し、構造的にも安定であり、かつ最大の成形を作り出す。この方法によって調製されたリポソームもまた、本発明に包含される。
さらに、本発明は、核酸を運搬する能力を持つ新規のリポソーム構造に関する。また、本発明は、ＤＯＴＡＰ［１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン］およびコレステロール（”Ｃｈｏｌ”）およびインビボで例外的に高い遺伝子発現およびタンパク質生成を作り出す核酸を含む、改良されたリポソーム調合物に関する。これらの調合物は、非常に安定であり、サイズが均一であり、そして、広範囲の核酸：リポソーム比率で核酸を複合することができる。本発明は、以前に文献に記載されたことのある調合物と比較した場合、インビボで動物内に全身に送達された後、最大で１５０倍高い遺伝子発現を示す。
また、本発明は、非免疫原性標的化リガンドおよびステルス（stealth）脂質をもつリポソームに関する。これらのリガンドは、体内の特定の組織または部位へのリポソームの標的化送達を容易にする。
本発明は、その中に薬剤を運搬する能力を持つ本発明のリポソーム構造を持つキットに関する。そのようなキットの一つは、興味ある生物薬剤を付加するためにユーザーに用意されたリポソーム構造を含むことができる。さらに、キットは、リポソーム調製物およびリポソーム構造に付加される一つまたはそれより多くの特定の生体活性薬剤を含むことができる。本発明のもう一つのキットは、一セットのリポソーム構造を含み、そのそれぞれは、共にまたは順番に投与された場合に特定の疾病または病態の治療にとりわけ適当である、特定の生体活性薬剤を含んでいる。
本発明は、生体活性薬剤のリポソームによる簡易な送達に基づいて、疾病、病気（ailments）および病態を治療する治療方法を提供する。例えば、本発明は、全身投与に用いる核酸送達用の医薬としてのリポソーム調合物を提供して、与えられた核酸の長期間の発現を提供する。さらに、本発明は、インビトロでの細胞のトランスフェクション、さらに、トランスフェクトされた細胞を移植された組織内に取り込むことのできるような組織移植、を包含する。この方法は、インビトロ／エキソビボトランスファーと呼ばれる。その他の生体活性薬剤は、＋２の＋／−チャージが維持される限りにおいて、インビトロ／エキソビボ法で本発明のリポソーム内に封入することができる。
さらに、本発明は、抗原−免疫応答を高め、アジュバントで起こるような望ましくない外来性の免疫応答を低下させる、有効な送達を可能にする有効なワクチンビヒクルを提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ．  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体の状態図。リポソームを調製し（実施例１を参照のこと）、様々なＤＮＡ濃度でＤＮＡおよびリポソームを最終容量が２００μｌになるように複合した（実施例２を参照のこと）。４００ｎｍの吸光度を、ＤＮＡ：リポソーム複合体それぞれの１：２０希釈で測定し、プロットした。吸光度２．０は、複合体の沈殿を示している。白いボックスは、定量しなかったデータポイントを示している。
図１Ｂ．  様々なＤＮＡ：リポソーム調合物を用いて全身送達を行った後の、マウス肺内でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（”ＣＡＴ”）の生成。それぞれのマウスに、８２．５μｇのプラスミドＤＮＡ：５ｍＭリポソーム（５ｍＭカチオン脂質＋５ｍＭ中性脂質）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）調合物に対しては最適のＤＮＡ：脂質比率、を注射した。ＣＡＴ発現は、組織抽出物内のタンパク質濃度に対して正常化され、二重定量の平均値の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）として示される。
図２Ａ．  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ複合体の全身送達後の、インビボでのＣＡＴ生成。様々なＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ：リポソーム比率を用いた場合に起こる肺内での服用量に対する応答。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌの濃度を０．５ｍＭから６ｍＭに変化させ、尾静脈注射当たり５０から１７５μｇのＤＮＡと複合させた。（すべてのｍＭのリポソーム濃度は、カチオン脂質または中性脂質を指す；従って、６ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ＝６ｍＭ  ＤＯＴＡＰ＋６ｍＭ  Ｃｈｏｌである。）５ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを、５０、１００、１２５、１５０および１７５μｇのＤＮＡと複合した。１００μｇ  ＤＮＡでは、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを５．５ｍＭ、５ｍＭ、４．７５ｍＭ、４．５ｍＭ、４ｍＭおよび３ｍＭで複合した。５０μｇ  ＤＮＡでは、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭおよび０．５ｍＭで複合した。ここに示したデータポイントは、４０匹のマウス肺からのＣＡＴ生成の平均である。それぞれのデータポイントは少なくとも二重測定を行い、あるデータポイントは平均の１％から１８％まで変化する標準誤差を持つ４アッセイの平均であった。白いボックスは、測定されなかったデータポイントを示している。
図２Ｂ．  尾静脈注射当たり１００μｇのＤＮＡと複合させた３ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いた場合の様々な組織内でのＣＡＴ生成。ＣＡＴ発現は、組織抽出物内のタンパク質濃度に対して正常化され、平均＋／−ＳＥＭとして示される。
図２Ｃ．  様々なＤＮＡ：リポソーム比率を用いた場合の心臓内での服用量応答（全ＣＡＴ生成で示す）。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌの濃度を３ｍＭから５．５ｍＭまで変化させ、尾静脈注射当たり１００μｇのＤＮＡと複合させた。
図２Ｄ．  器官収集前に放血したマウスおよび放血しなかったマウスの肺でのＣＡＴ生成レベルの比較。さらに、全血液をアッセイした。肺内のＣＡＴ活性は、血液内と言うよりむしろ組織内での遺伝子発現による。ＣＡＴ発現は、組織抽出物中のタンパク質濃度に対して正常化され、平均＋／−ＳＥＭとして表される。
図２Ｅ．  異なるＤＯＴＡＰ調合物を用いた場合の、放血マウス肺内でのＣＡＴ生成の比較。以下に示した調合物のすべてに４ｍＭのＤＯＴＡＰ用いた；ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ（５０：５０）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＳ（５０：４５：５）、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（５０：５０）、およびＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ（５０：５０）。”ＤＯＰＳ”は、ジオレオイル（１８：１）ホスファチジルセリンである。”ＤＯＰＣ”は、オレオイル（１８：１）ホスファチジルコリン（９−ｃｉｓ）オクタデカン酸である。すべての調合物を、最終容量が２００μｌになるように、１００μｇのＤＮＡと複合した。ＣＡＴ発現は、組織抽出物中のタンパク質濃度に対して正常化され、平均＋／−ＳＥＭとして表している。
図３．  リポソームおよびＤＮＡ：リポソーム複合体の低温電子顕微鏡写真（cryoelectron micrographs）。（Ａ）５ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソーム。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ縣濁液中に７００メッシュの銅格子（copper grid）（直径３ｍｍ、厚さ３−４μｍ）を浸して引き上げることによって、薄膜を調製した。過剰の液体を吸い取った後、格子棒の間に形成された薄膜を融解エタン中でガラス状にした。低温トランスファー（cryotransfer）後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２顕微鏡を用い、低線量、１２０ｋＶ、−１７０℃で、検体を観察した（Ｆｒｅｄｅｒｉｋら、１９９１）。口を持つ花瓶（vase）の姿をした、小胞中のいくかつかに認められる同心円の二重膜間のつながりに注目されたい。（Ｂ）５ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームを１５０μｇ  ＤＮＡ／２００μｌと混合した。これらの構造を、ＤＮＡ−サンドイッチリポソームと呼ぶ。（Ａに示したように、）ＤＮＡ：リポソーム縣濁液から、薄くガラス状にした検体を調製し、−１７０℃で観察した。小胞内側のＤＮＡパッキング（脂質に加えて電子不透過）に注目されたい。脂質−ＤＮＡの相互作用は、明らかに小胞の作り替えの生じ、ＤＮＡの近づきやすさを変化させた。（Ｃ）ＤＮＴＡＰ：Ｃｈｏｌ花瓶の拡大像。（Ｄ）２つのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ花瓶間にパックされたＤＮＡの拡大像。（Ｅ）５ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥリポソーム。（Ｆ）最終容量が２００μｌになるように１５０μｇのＤＮＡと混合した５ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥリポソーム。
図４．  スーパーコイルプラスミドＤＮＡと相互作用したＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームの横断断片を示す提案モデル。Ｘは脂質二重膜の融合を示す。拡大領域は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌの２つの４ｎｍの二重膜間に濃縮されたＤＮＡの提案配列を示している。
図５．  尾静脈注射当たり１００μｇのＤＮＡと複合させた様々な濃度のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いて全身送達した後の、マウス肺内でのＣＡＴ生成。用いられたＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ濃度は、３．０ｍＭから５．５ｍＭまで変化させた。結果から、尾静脈注射当たり１００μｇ  ＤＮＡと複合させた３．０ｍＭおよび４．０ｍＭのリポソームを用いた場合の肺内でのＣＡＴタンパク質生成は、１５０μｇ  ＤＮＡと複合させた５．０ｍＭリポソームを用いて生成されたＣＡＴの量より、わずかな増加が認められた。さらに、異なる濃度のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いて作成されたＤＮＡ：リポソーム複合体を注射後、インビボでは服用量応答を生じた。
図６．  尾静脈注射当たり、様々なＤＮＡ量に複合させた５．０ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いて全身送達した後の、マウス肺内でのＣＡＴ生成。５．０ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを、ＤＮＡ：リポソーム複合体が沈殿しない範囲で、広範囲のプラスミドＤＮＡ濃度と複合させることができる。尾静脈注射当たり、５０μｇ、１００μｇ、１２５μｇ、１５０μｇおよび１７５μｇのＤＮＡプラスミドを含むリポソームを、マウスに注射した。広範囲のＤＮＡ：リポソーム比率での寛容性の高さは、如何なるリポソーム調合物でも一般的ではない：それ故、我々のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームは、この点に於いて、極めてユニークである。さらに、本発明は、異なる量のＤＮＡを注射に用いた場合のインビボでの服用量応答を示している。１５０μｇ  ＤＮＡで、肺内にもっとも高いＣＡＴ生成物が生成され、そのＣＡＴ生成レベルは、文献に報告された如何なるレベルより最大で１５０倍大きかった。
図７．  スクシニル化アシアロフェチュインでコートしたＤＮＡ：リポソーム複合体を用いて尾静脈注射した後２４時間のマウス肝臓内でのＣＡＴ生成。ＤＮＡ：リポソーム混合後、スクシニル化アシアロフェチュインを加えた、または加えていない、最終容量が２００μｌになるように１００μｇのＤＮＡに複合させた４ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを、それぞれのマウスに尾静脈注射した。ＣＡＴ発現は、組織抽出物中のタンパク質濃度に対して正常化され、二重定量の平均＋／−ＳＥＭとして示している。
図８．  散乱波−ベクトルｑに対するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体の放射平均強度のプロット。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ  ＤＮＡリポソーム複合体は、Ｘ線回折最大５８．８Åを示し、低温電子顕微鏡で測定されたＤＮＡ＋脂質の厚さを追認する。
発明の詳細な説明
本発明は、安定な構造を形成する特別な組成のリポソームが、生体活性薬剤の有効なキャリヤーであるという発見に関する。一つまたはそれより多くの生体活性薬剤を含むリポソームは、その後、哺乳動物宿主内に投与されると、標的細胞にその内容物を効率よく送達することができる。本発明のリポソームは小さく、生体活性薬剤と複合した場合に、約２のネット＋／−チャージ（本明細書中では”ρ”と呼ぶ）を持っている。リポソームは、薬剤を完全に隔離した状態で、生体活性薬剤を運ぶ能力を持つ。リポソームは、カチオン脂質、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。好ましくは、リポソームと複合される少なくとも一つの生体活性薬剤は、負にチャージしている。さらなる生体活性薬剤は、ρが１から３の範囲、好ましくは約２、に維持されている限りにおいて、それらのチャージに関係なく、リポソームと複合することができる。本発明のリポソーム−生体活性薬剤複合体は、生体活性薬剤が脂質の二重膜の間に挟まれ（そしてこのように隔離され）るため、本明細書中で「サンドイッチリポソーム」と名付けられた陥入（invagnate）構造を形成する。
また、本発明は、リポソームを特定の標的部位に送達することのできるような、標的化手段を提供する。標的化手段には、サンドイッチリポソーム複合体の外側を特定の標的部位（単数または複数）に特異的な一つまたはそれより多くのリガンドで装飾することが含まれる。
用語「生体活性薬剤」は、本明細書中では、生体システムに影響を与える分子を指す場合に用いられる。これらには、タンパク質、核酸、治療薬、ビタミンおよびそれらの誘導体、ウイルス画分、リポポリサッカライド、細菌画分ならびにホルモンなどの分子が含まれる。特に興味あるその他の薬剤として、癌患者の治療およびマネージメントに用いられる、化学療法薬剤が挙げられる。そのような分子は、一般的には、抗増殖薬剤、細胞毒性薬剤および免疫抑制剤として特徴付けられており、タキソール、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンカアルカロイド、アクチノマイシンおよびエトポシドのような分子が含まれる。
用語「核酸」は、様々な長さの任意の二本鎖または一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。核酸には、センスおよびアンチセンス鎖が含まれる。ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホネート類似体のような核酸類似体もまた、本明細書中で用いられる用語としては、核酸であると考えられる。また、核酸には、染色体および染色体フラグメントも含まれる。これらに限定するつもりはないが、有望な遺伝子には、免疫系タンパク質ＨＬＡ−Ｂ７およびＩＬ−２、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、ファクターVIII、ファクターＩＸ、インスリンおよびエリスロポエチンが、含まれる（Ｆｅｌｇｎｅｒ、１９９７）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の標的遺伝子に対して設計される可能性があり、その結果、それらの発現を阻害する。さらに、この送達システムは、リボザイムのようなその他の遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド、トリプルヘリックスを形成するオリゴヌクレオチド、または、特定のタンパク質あるいはその他の細胞内分子と特異的に結合する配列を持たないオリゴヌクレオチドのための、適当なキャリヤーであることができる。例えば、興味ある遺伝子には、レトロウイルスまたはウイルスの遺伝子、薬剤耐性遺伝子、腫瘍遺伝子、炎症性応答に関与する遺伝子、細胞接着遺伝子、ホルモン遺伝子、遺伝子の調節に関与する異常に過剰発現した遺伝子、が含まれるであろう。
本発明の一つの実施態様は、リポソーム内に核酸をカプセル化し、そしてプラスミドＤＮＡを使用することにより、標的宿主細胞内で核酸にコードされた遺伝子を発現することを含む。逆に、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することにより、遺伝子の発現を阻害することもできる。あるいは、化学療法薬剤は、生体活性薬剤として作用するため、リポソーム内に封入することによって、その毒性による影響を非標的組織から隠蔽することもできる。
本発明は、本発明のリポソーム内に、一つより多くの核酸または生体活性薬剤を用いることができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質のようなタンパク質をＤＮＡサンドイッチリポソームへのさらなる生体活性薬剤として添加して、治療効果を促進することができる。その他の例として、抗癌化学療法薬剤をも含む抗癌治療用遺伝子を持つサンドイッチリポソームが含まれる。この方法は、標的化したリポソームを用いて癌細胞に特異的な遺伝子治療および化学療法の両方を送達する場合に、特に魅力的である。
本明細書中で用いられている用語「リポソーム」は、内側の水性空間を取り巻く外側の二層または多層の脂質膜からなる閉環構造を指す。特に、本発明のリポソームは、脂質の二層間にそれらの内容物を陥入する花瓶様構造を形成している（図４を参照のこと）。リポソームを用いると、細胞に送達する任意の生体活性薬剤をパッケージすることができる。一つの例として、可溶型に維持されているであろう大サイズのプラスミドまたはウイルスベクターの場合でさえ、リポソーム内にＤＮＡをパッケージすることができる。そのような陥入リポソーム：ＤＮＡ複合体は、理論上、インビボシステムへの直接適用に適している。これらのリポソームは、水およびその他の溶媒中で極性および溶解度の変化する化合物を閉じこめている。
「核酸−サンドイッチ」リポソームとは、脂質層間に挿入され脂質層によって保護された核酸分子を持つ、脂質の二重層を有する構造を含む層状組成物を意味する。
本発明の一つの実施態様は、インビボで例外的に高い遺伝子発現とタンパク質生成物を生成する、核酸、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む、改良されたリポソーム調合物に関する。さらに、これらの調合物は、非常に安定であり、サイズが均一であり、広範囲の核酸：リポソーム比率で核酸を複合することができる。この柔軟性は、インビボ送達用に複合体を最適化することを可能にする。肺以外の多くの組織は、核酸：リポソームの比率に非常に敏感である。さらに、高濃度のリポソームおよびＤＮＡでＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームが安定であるため、送達および発現用のＤＮＡ濃度を高めるができる。
さらに、本発明は、これら新規リポソームを調製する方法であって、加熱し、超音波処理し、そしてそれに続いて、順々により小さいポアサイズのフィルターを通すことによる脂質の押出成形を行うことによって、小さくて安定なリポソーム構造を生成する工程を含む、これら新規リポソームの調製方法に関する。本発明の調製方法は、適当で均一な大きさの複合体を作成し、これらは構造的に安定であり最大の押出成形を作り出す。
モル比率の範囲２．０ｍＭ−１０ｍＭで存在する、ＤＯＴＡＰおよび少なくとも一つのコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体を含むリポソームは、有効な薬剤送達システムを提供する。より好ましくは、ＤＯＴＡＰ対コレステロールのモル比率は、１：１−３：１である。本発明のリポソーム組成物は、生物環境内で非常に安定であることが示された。
コレステロール誘導体を、本発明のリポソームのコレステロール要素の代わりに用いることも容易にできる。当業者らは、数多くのコレステロール誘導体を知っている。その例としては、限定するつもりはないが、コレステリルアセテートおよびコレステリルオレエートが含まれる。
当業者らは、多くのＤＮＡ調製プロトコールを利用することができ；任意のプロトコールを用いて、本発明のリポソームに用いるためのＤＮＡを調製することができる。アルカリ溶解に続くＰＥＧ沈殿、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）、および改良アルカリ溶解プロトコール（実施例３を参照のこと）と呼ばれる、３つのＤＮＡ調製プロトコールが好ましい。改良アルカリ溶解プロトコールは、高収率でＤＮＡを得るための特に好ましい方法であり、低いエンドトキシンレベルを持ち、高レベルの遺伝子発現を達成する。
トランスファー治療法
他の生体活性薬剤と共に、負に荷電した一つの生体活性薬剤のトランスファー治療を成し遂げるために、本発明のリポソーム組成物を患者に非経口で投与することができる。さらに、組織または細胞を患者からいったん除去して、治療し、最後に患者に再移植する、「エキソビボ（ex vivo）」トランスファー治療に、この技術を用いることもできる（米国特許第５，３９９，３４６号はエキソビボでのヒトの遺伝子治療の詳細について記載している）。一方で、本発明のリポソームを投与する際には、全身治療もまた有効である。
本発明の薬剤送達システムを通して、多くの病気を治療することができる。糖尿病、アテローム性動脈硬化症のような病気、化学療法で誘導された多薬剤耐性、ならびに一般的には、免疫病、神経病（ＨｏおよびＳａｐｏｌｓｋｙ、１９９７）およびウイルス病（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９９７）を、本発明の薬剤送達システムを用いて治療することができる。
本発明の送達システムを用いることのできる癌治療のための遺伝子治療研究の非限定例としては：（有害遺伝子によってコードされるタンパク質の合成を阻止するための）アンチセンス治療、（正常細胞を化学療法から保護するために、タンパク質を正常細胞に加える）化学防御、（癌に対する身体の免疫防御を強化する）免疫療法、（選択された薬剤に対して癌細胞を高感受性にするための）プロドラッグまたは自殺遺伝子治療、（失われたまたは障害を受けた癌−ブロッキング遺伝子に取って代わるための）腫瘍サプレッサー遺伝子、（腫瘍細胞内の癌関連タンパク質の活性を妨げるための）抗体遺伝子、ならびに（腫瘍細胞の制御されない増殖および広がりを助ける遺伝子を締め出すための）腫瘍遺伝子ダウンレギュレーション（Ｂｌａｅｓｅ、１９７７）：が含まれる。
また、本発明の送達システムは、ヒトのＣＦＴＲ（嚢胞性線維症トランスメンブレンコンダクタンスレギュレーター）（cystic fibrosis transmembrane donductance regulator）遺伝子を挿入することによる、嚢胞性線維症患者のイオントランスポート欠損の矯正に有用である。噴霧のような経口投与は、特に適当であろう。さらに、本発明のリポソームは、腫瘍形成を阻害する分子または血管形成因子のｍＲＮＡ転写物に向けられるアンチセンスポリヌクレオチドをコードする遺伝子を、腫瘍細胞内に投与することによって、腫瘍細胞を阻害するために用いることができる。さらに、リボザイムを封入して、特定の細胞内容物を酵素的に攻撃することもできる。
核酸薬剤を含む本発明のリポソームは静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、病巣内、経口またはエアロソル手段によって、投与することができる（Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、１９９２）。
エアロソル投与に関しては、患者は、リポソーム複合体の１回以上の鼻または気管支アエロソル投与を受ける。服用量は、年齢、身体組成および疾病または病状の重さに基づいて変化するであろう（Ｃａｐｌｅｎら、１９９５）。
その他の投与形路は、当業者に既知であり、本発明のリポソームを投与するために容易に用いることができるであろう。例としては、限定するつもりはないが、粘膜、子宮内、皮内、および皮膚が含まれる。
ヒトの治療に関する活性化合物の推薦される毎日の服用量は、０．１μｇ  ＤＮＡ／ｋｇから５．０ｍｇ  ＤＮＡ／ｋｇであり、１−１０用量で都合良く投与することができる。投与される実際の服用量は、体重、病状の重さ、患者の特発性疾患、および投与形路のような、肉体的および生理学的因子によって決定されることができる。これらを考慮して、特定の患者および／または治療経路のためのＤＮＡ−リポソーム複合体の服用量を、容易に決定することができる。
巨丸剤インジェクションまたは継続注入による非経口投与のために、本発明のリポソームを調合することができる。注射用調合物は、アンプル内にユニット服用形で、または加えられた保存剤と共に複数回の服用量を含む容器内に、存在させることができる。組成物は、縣濁液、溶液、または油性あるいは水性ビヒクル内エマルジョンの様な、形を取ることができ、縣濁剤、安定化剤および／または分散剤のような、調合用薬剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば無菌の発熱原因物質を含まない水で再構築されるための粉末の形で存在していて良い。
本発明によるリポソームは、任意の便利な方法で投与するために調合することができる。それ故、本発明は、その範囲内に、ヒトまたは獣医薬に使用するために調合された少なくとも一つのリポソーム化合物を含む医薬組成物を含む。そのような組成物は、生理学的に許容しうるキャリヤーまたは賦形剤、所望であれば補助的医薬薬剤と共に用いるために提供することができる。慣用のキャリヤーもまた、本発明と共に用いることができる。
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、許容しうる賦形剤を用いて慣用の手段によって調製された、錠剤、カプセル剤、粉末剤、溶液、シロップ剤または縣濁液の形を取ることができる。
本発明のリポソームを調製するための改良法は、超音波処理、加熱、および押出成形（詳細な説明の実施例１を参照のこと）を用いる。一般的には、方法は、脂質成分が適当な濃度で混合され、クロロホルムなどの有機溶媒中に溶解し、薄膜中に蒸発し、そして凍結乾燥することを必要とする。次いで、膜を水溶液中で再び水和し、３５−６０℃でしばらくの間、混合する。その後、混合物を超音波処理し、４０−６０℃の間の温度に加熱する。その後、通過するフィルターのポアサイズを順々に小さくして、この混合物を押出成形した。好ましくは、超音波処理したリポソームは、充分な加熱を用いることによって、０．１μｍを含む、ポアサイズが減少していくフィルターを通して押出成形される。
様々な核酸を、広範囲の濃度でこれらのリポソームに加えることができる。好ましくは、核酸は、服用量当たり５０−３００μｇの濃度でリポソームに添加する。これらの濃度は、特定のリポソーム調合物内のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌの比率に依存して広範囲に変化する。例えば、約１：１のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌのモル比率を持つリポソームを用いるならば、核酸の好ましい濃度は、服用量当たり８０−１７５μｇの間である。
本発明の方法によって調製された、押出成形されたＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームを、従来の方法で調製した押出成形していないＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソーム（多重膜ビヒクル、ＭＬＶｓ）と比較した（Ｌｉｕら、１９９７）。押出成形したリポソームは、サンドイッチリポソームを形成し、これに対して押出成形しなかったリポソームはそのような構造を形成していない。核酸：サンドイッチリポソームからのタンパク質の発現は、ＭＬＶｓと比較した場合、約２倍高かった。さらに、５ｍＭから１０ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを含むＭＬＶｓは、全身に送達された場合に毒性が増加した。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（”ＣＡＴ”）の生成は、タンパク質発現を測定するために最も広く用いられている方法であり、良く認識されているモデルタンパク質発現システムである（Ｗｈｅｅｌｅｒら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９６；Ｆｅｌｇｎｅｒ、１９９６）。本発明の一つの実施態様では、サンドイッチリポソーム複合体（例えば、図２Ａ、Ｄ、Ｅ）は、ＤＯＴＩＭ：Ｃｈｏｌ  ＳＵＶｓを用いて生成したＣＡＴと比較して、肺内で１００倍高い量のＣＡＴを生成した（Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５）。当業者らは、本発明に任意の核酸を用いることができることを、容易に認識するであろう。
核酸全身送達用にサンドイッチリポソームを用いることによって、報告されたその他の如何なるカチオンリポソーム調合物によって作り出された生体分散より大きい、広範囲の生体分散（例えば、図２Ｂ）が作り出される（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら、１９９５；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、１９９５；Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、１９９６；Ｗｈｅｅｌｅｒら、１９９６；Ｌｉｕら、１９９７；Ｈｏｎｇら、１９９７；Ｌｅｅら、１９９６；Ｆｅｌｇｎｅｒ、１９９６）。
標的化送達
生体活性薬剤がサンドイッチリポソーム内に隔絶されているため、標的化送達は、多量の薬剤を結合し送達するこれらのリポソームの能力を害さないペプチドおよびその他のリガンドを加えることによって、達成される。リガンドは、新規で単純な方法で、リポソームに加えられる。最初に、脂質を、興味ある生体活性薬剤と混合する。次いで、リガンドを、サンドイッチ−リポソームに直接加えると、それらの外側表面が装飾される。リポソームの安定性および正味の正のチャージ故に、リガンドをリポソームの外側に直接付加することができる。
本発明のサンドイッチリポソーム複合体を用いると、有効な人口ウイルスを作成することができる。サンドイッチリポソーム複合体の外側は、実質上、生体活性薬剤を含まないため、標的化リガンドの効果または送達され発現される生体活性薬剤の能力を害することなく、サンドイッチリポソーム形成後に標的化リガンドをその外側に配置することができる。このことにより、特定の器官および組織への送達が可能になる。効率的な送達を可能にするサンドイッチリポソーム複合体のサイズ、２００−４５０ｎｍ（表１を参照のこと）は、標的化リガンドの添加のために好ましい。我々の実験は、この方法の有効性を証明している（実施例９、図７を参照のこと）。
リポソーム送達の標的とされる部位によって、多くのリガンドを、リポソーム調製のこの標的化段階に用いることができる。例えば、ラクトシルセラミド、およびアポリポプロテインＥ３（”ＡｐｏＥ”）の様なＬＤＬレセプター関連タンパク質を標的とするペプチドは、本発明のリポソームの肝臓への標的化に有用であった。特に、ＡｐｏＥリガンドを用いると、結果として肝臓での遺伝子発現が４倍高くなる。
さらに、磁気共鳴画像診断から、サンドイッチリポソーム複合体の半減期は、循環中で少なくとも５時間であることがわかっている。このことは、サンドイッチリポソームが意図する標的に無傷で到達するために要する時間があることを示している。
別の方法として、脳、心臓、肺または肝臓を含む動物の特定の器官への標的送達をおこなうために、モノクローナル抗体フラグメントを用いることもできる。
複合体形成後に、外側表面にのみリガンドを付加する本方法はユニークであり、標的化リガンドとの立体的またはイオン的相互作用よる生体活性薬剤リポソーム複合体形成の崩壊を防ぐと言う利点を持つ。
本発明のリポソームの一つの実施態様は、二つの同心円層板（lamella）、および「花瓶構造」と呼ばれる（図３Ｃ）おおよその直径が５０ｎｍ（図３Ａ）の小さな口を持ち、完全に陥入している。例えば、５３６のビヒクルの内、８８％に陥入構造が認められ、１２％のみが典型的な小さな単層板（unilamella）ビヒクル（ＳＵＶｓ）であった。本発明の陥入サンドイッチリポソームには、二重層板（bilamella）花瓶、二重層板および単層板の管状形、単層板の赤血球形、および単層板の豆形のような、その他の構造が含まれる。
サンドイッチリポソーム形成プロセスのそれぞれの工程の後、リポソームを試験すると、０．１μｍフィルターによる押出成形を行うまでは、単層板の球体が認められる。この押出成形工程が、過剰な表面領域を持つ陥入構造を作り出す。ＤＯＴＡＰ：ＣＨｏｌリポソームを高頻度で超音波処理すると、ＳＵＶｓおよびミセルのみが作り出されるため、押出成形前は、温和な超音波処理（実施例１を参照のこと）のみを行うことを推奨する。本方法で調製されたサンドイッチリポソームのバルク（８８％）は、二重層板および単層板の陥入ビヒクルである。
生体活性薬剤は、静電気の相互作用により、陥入した管状のリポソーム上に吸収されるらしい（図４）。第二のリポソームがこの複合体を引きつける力は、結果としてさらなるチャージを中和する。リポソームが同一サイズでないならば、生体活性薬剤との静電気相互作用の拡大は、より大きなリポソームを反転させて生体活性薬剤全体を飲み込む原因となる。このような構造がサンドイッチリポソームである。このようなリポソームが生体活性薬剤との脂質相互作用によって作り出されたストレスの受け入れを許すリポソームの過剰な表面領域のために、これらのリポソームで逆転が起こる可能性がある。
例えば、ＤＮＡが結合すると、二重層の外側の小葉の表面領域が減少し、脂質が整列しカチオン脂質のヘッドグループ間の電荷反発作用が減少することにより、負の屈曲を誘導する。内面化された脂質サンドイッチの濃縮は、二重層間の空間を広げ、膜融合を誘導して図３Ｂ、Ｄの様な明らかに閉鎖された構造を作り出すことができる。２つより多くのリポソームの相互作用は、この顕微鏡写真に認められるような、より複合した構造を創造することができる。２つの二重層間に挟み込まれたＤＮＡの厚さは１０．５ｎｍと予想されたが（図３Ｄ、Ｇ）、この厚さは、図３Ｂに示すように、これら領域の観測測定結果と一致した。さらに、ＤＮＡ＋脂質の厚さを、小角Ｘ線散乱分析で確認した（図８）。
コレステロールと共にジオレオイル鎖を含む、柔らかい二重層を整列させることは、最大でマグニチュードのオーダーまで、伸縮弾性係数を増加させることが知られている（ＬａｓｉｃおよびＮｅｅｄｈａｍ、１９９５）。機械的に弱い二重層を持つリポソームは、効率良く反転することができず、このようなリポソームに複合した薬剤は、循環中、ほとんど保護されることはない。二重層中に適度な量のコレステロールが存在すると、有効な”花瓶”を形成するための充分な強度がリポソームに提供される。サイズ、機械的強度および脂質ビヒクルの柔軟性ならびに生体活性薬剤−リポソーム比率が、陥入リポソーム内部でのＤＮＡ濃縮のこのような自己集合メカニズムに重要である。このモデルから、脂質二重層”サンドイッチ”を生成することによる生体活性薬剤に付随する全チャージを中和するためには、おおよそ２のρ値が好ましいであろうことが、予想される。また、このことから、サンドイッチリポソーム複合体の外側は、正にチャージしており、生体活性薬剤を含まないであろうことが示される。
本発明は、コレステロールがインビボＤＮＡ送達用のリポソーム複合体に有効な中性脂質であることを、明らかに示している。コレステロールが多く含まれると、リポソームの安定性が増加することが知られている。コレステロールの存在は、二重層を安定化し、血漿成分への吸着時の機械的破壊に対する血漿中の複合体を安定化する。さらに、ＤＯＴＡＰは有効なカチオン脂質である。本発明の特別な方法でカチオンリポソームを作り出すＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌの組み合わせは、インビボ遺伝子送達のためのユニークで有用な性質を持つリポソームを結果として生じる。本発明は、従来技術と比較した場合、全身へのＤＮＡ送達のために押出成形ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームを用いて、様々の器官内で最大で１５０倍の遺伝子発現の改良を提供する。この非常に大きい改良により、インビボでの遺伝子トランスファー効率が増加する。
その他のカチオンリポソームとは異なって、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームは、一つの実施態様では、広範囲のＤＮＡ：リポソーム比率にわたって安定なＤＮＡ複合体を形成する。この柔軟性により、インビボでの異なる組織への送達用に、複合体を最適化することが可能になる。肺以外の多くの組織は、（ρ＝２に相当する）この比率に非常に敏感であり、従って、この比率は、それぞれのＤＮＡ濃度で注意深く最適化されねばならない。高濃度のリポソームおよびＤＮＡでもＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌが安定であるので、送達され発現されるＤＮＡの濃度を増加させることができる。有効なリポソームシステムは、循環中のＤＮＡを保護せねばならず、組織に効率良くＤＮＡを送達することが可能である。これらの性質は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームのより粘着性の二重層、ならびにそれらの取り込み能力およびそれによるＤＮＡの保護能力の結果として、そのようなＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームで達成された。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供され、如何なる場合もその範囲を制限するものとして解釈してはならない。
本発明をある具体的実施態様に関連して上記したが、多くの変更が可能であり、本発明から離れることなく、代わりの物質および試薬を用いることができることが、理解されるであろう。いくつかの場合には、そのような変更および置き換えにはいくつかの実験を必要とするであろうが、日常的試験が必要とされるのみであろう。
具体的実施態様の前記の記述は、本発明の一般的性質を充分に示すであろう。そして他者は、現在の知識を適用することによって、一般的概念から離れることなくそのような具体的実施態様を様々に適用するために、容易に修飾および／または採用することができ、それ故、そのような適用および修飾は、開示された実施態様の均等の意味および範囲内に包含されると考えられる。
本明細書に記載された参考文献はすべて、その全体を参照として本明細書内に取り込むものとする。
実施例１
ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームならびにその他のリポソーム調合物は、以下の方法を用いて調製された：カチオン脂質（ＤＯＴＡＰまたはＤＤＡＢ）を、中性脂質（ＣｈｏｌまたはＤＯＰＥ）と等モル濃度で混合した。１Ｌの丸底フラスコ中で、混合した粉末状脂質をＨＰＬＣ級クロロホルム（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）に溶解した。透明な溶液をＢｕｃｈｉのロータリーエバポレーターに３０℃で３０分間置くと、薄い膜が形成された。薄い脂質膜を含むフラスコを、減圧下で１５分間、乾燥させた。水中５％デキストロース（”Ｄ５Ｗ”）中で、膜を水和させると、最終濃度が２０ｍＭ  ＤＯＴＡＰ（または２０ｍＭ  ＤＤＡＢ）および２０ｍＭ  Ｃｈｏｌ（または２０ｍＭ  ＤＯＰＥ）となり、この状態を２０ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌと呼ぶ。水和された脂質膜を、５０℃のＨ2Ｏ浴中で４５分間、次いで３５℃でさらに１０分間、回転させた。フラスコをパラフィルムで覆い、混合物を室温に一晩置いた。次の日、フラスコ中の混合物を５０℃で５分間超音波処理し、チューブに移し、５０℃で１０分間加熱した。次に、注射器を用いて順々に減少していくサイズのフィルター：１μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍおよび０．１μｍ（Ｗｈａｔｍａｎ）を通過させて、混合物を押出成形した。Ｗｈａｔｍａｎ  Ａｎｏｔｏｐフィルター、０．２μｍおよび０．１μｍ、を用いた。最初に０．１μｍフィルターを通過しなかったリポソーム混合物部分は、新たな０．１μｍフィルターを通す前に、５０℃で５分間再加熱した。ろ過されたフラクションをプールし、４℃、アルゴンガス下で保存した。ＤＯＴＡＰおよびＤＯＰＥは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。ＤＤＡＢは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、高純度のコレステロールは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
実施例２  ：  ＤＮＡ−サンドイッチリポソーム
ＤＮＡ：リポソーム複合体は、動物宿主内でそれらを用いる前の日に、調製された。ＤＮＡをＤ５Ｗ（水中５％デキストロース）で希釈し、保存リポソームをＤ５Ｗで希釈して、様々な比率のＤＮＡ：リポソームを作成した。混合に用いられるＤＮＡ溶液およびリポソーム溶液の両溶液の最終容量は、同量にした。希釈および混合は、すべての試薬と共に、１．５ｍｌのエッペンドルフ（Eppendorf）チューブ中、室温で行なわれた。ピペットチップを用いて、リポソーム溶液の表面に、ＤＮＡ溶液を急速に加えた。ピペットマン（Pipetman）を二度急速に上下させることによって、ＤＮＡ：リポソーム混合物を混合した。ＤＮＡ：リポソーム複合体を４℃で一晩保存した。
ＤＮＡ調製に用いられたプロトコールは、本明細書中ではＤｅｂｓのプロトコールと呼ぶが、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載されたアルカリ溶解法を変形させた方法であり、ＲＮアーゼ消化の後すぐに、二時間のプロテイナーゼＫ消化段階を含む。この方法は、アルカリ溶解手順後ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を行った場合より、約２０倍多い量のＤＮＡを常に生成し、収率は、細菌培養液１リットル当たり１０−２８ｍｇのプラスミドＤＮＡの範囲であった。このＤＮＡ調製プロトコールは、マウス内でＤＮＡ：リポソーム複合体による毒性を示さなかった。異なる方法で調製されたＤＮＡのエンドトキシンのレベルを、色原体カブトガニアメーバ様細胞溶解産物アッセイ（the chromogenic limulus amebocyte lysate assay）（Ｋｉｎｅｔｉｃ−ＱＣＬ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いて、測定した。エンドトキシンレベルは、Ｍａｎｉａｔｉｓアルカリ溶解法に続くＰＥＧ沈殿法、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、およびプラスミドＤＮＡ調製用Ｄｅｂｓプロトコールで、それぞれ、１２０エンドトキシンユニット（ＥＵ）／μｇ  ＤＮＡ、１６ＥＵ／μｇ  ＤＮＡ、および８ＥＵ／μｇ  ＤＮＡと測定された。Ｄｅｂｓプロトコールによって調製されたＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ小フラグメント、またはＲＮＡは検出されず、すべてのプラスミドＤＮＡ調製物のＯＤ260/280比率は、２．０であった。
実施例３  ：  ＤＮＡ−サンドイッチリポソームのインビボ投与
インビボで静脈内投与を行うために、週齢６週（〜２０ｇ）のＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈内に、２７ゲージの注射針を用いて、２００μｌのＤＮＡ：リポソーム複合体を注射した。尾静脈注射前１時間、サンプルを室温に置いた。注射後２４時間で、マウスを屠殺し、器官を集めて、液体窒素で急速凍結した。組織抽出物を、前記の方法に従って、調製した（Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、１９９２）。リンパ節抽出物は、プールした腸間膜、腋か、腸骨、下顎骨下、および鼠径リンパ節からなる。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＥＬＩＳＡｓを行った。すべてのＣＡＴタンパク質測定値は、対照組織内で検出された任意のＣＡＴ免疫反応性に対して修正し、任意の実験組織で報告されたＣＡＴタンパク質のもっとも低いレベルでも、バックグラウンドより少なくとも３倍高かった。タンパク質の定量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行われた。この仕事は、承認された動物プロトコールを用いてＮＣＩ／ＦＣＲＤＣガイドラインに従って、行われた。
ＤＮＡがリポソーム内に保護されていることを証明するために、ＤＮＡ−サンドイッチリポソームを、様々なポアサイズのポリスルホンフィルターを通してろ過した。リポソームは、１．０μｍおよび０．４５μｍのフィルターを通しても全活性を維持し、このことは、ＤＮＡが外部から完全に隔絶され保護されていることを示している（表１を参照のこと）。もしＤＮＡがリポソームの外側にくっついていた場合、ポリスルホンは外側にＤＮＡを持つ複合体からＤＮＡを取り除くため、そのタンパク質発現活性はろ過によって失なわれたであろう。
また、表１は、有効なＤＮＡ送達能力を持つＤＮＡ−サンドイッチリポソームは、サイズが２００ｎｍより大きい方が好ましいことを示している。特に好ましいＤＮＡ−サンドイッチリポソームには、大きさが２００−４５０ｎｍの間のそのようなリポソームが含まれる。正確な大きさは、その中に含まれるＤＮＡ、投与経路および治療される状態によって変化するであろう。当業者は、これらのパラメーターを基にして適当な複合体サイズを容易に決定することができる。
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実施例４  ：  リポソーム組み合わせの比較
本発明の望ましくない姿を示すために、異なるリポソーム配合物についてＤＮＡと複合体を作る能力を試験した。様々な濃度のリポソームを、最終容量が２００μｌになるようにＤＮＡと混合し、それぞれのサンプルを１：２０希釈することにより、４００ｎｍの吸光度を測定した。ＤＮＡ：リポソーム状態図は、リポソームを含むＤＯＴＡＰが、広範囲のＤＮＡ：リポソーム比率で、多量のＤＮＡと安定に複合することを、示している（図１Ａ）。ＤＤＡＢリポソームを用いた溶解性複合体は、最大ＤＮＡ濃度がより低く、ＤＯＰＥまたはＣｈｏｌのいずれかを用いた場合、狭い範囲で安定であった。最大で８２．５μｇのＤＮＡが、沈殿を生じることなく、最終容量２００μｌにおいて５ｍＭ  ＤＤＡＢ調合物と最適に複合した。
それらの物理化学的性質に基づいて、これらのリポソーム調合物をＤＮＡと複合し、尾静脈注射によりマウスに導入した。８２．５μｇのプラスミドＤＮＡと複合した、それぞれ５ｍＭのＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌ、ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：ＣｈｏｌおよびＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥリポソームの１：１調合物（最終容量２００μｌ）を用いて、全身へのＤＮＡ送達および遺伝子発現を比較した。このＤＮＡ：リポソームの比率は、ＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌリポソームによって送達されたインビボでのＤＮＡ発現に最適であることが分かった（Ｌｉｕら、１９９５）。注射後２４時間で、マウスを屠殺し、肺内のＣＡＴ生成レベルを定量した（図１Ｂ）。上記の脂質調合物の押出成形および非押出成形の両調製物をマウスに注射し、結果を、互いに、そして他の研究者らによって得られた結果と比較した。非押出成形リポソーム調製物は、対応する押出成形した調製物を比較して、結果として、すべての場合に於いてより低くしか発現しなかった。押出成形せず超音波処理により調製したＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌリポソームを用いた場合のＣＡＴ生成は、同一の条件（Ｌｉｕら、１９９５、ＣＡＴ比活性＝１００，０００Ｕ／ｍｇ／分）、同一プラスミド（すべての実験に用いたＣＡＴプラスミドはｐ４１１９である；Ｌｉｕら、１９９５）を用いて報告されたＣＡＴ生成と卓越した一致を示した。ＤＮＡと混合する前のＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌリポソームの調製にさらなる加熱および押出成形段階を用いると（実施例１を参照）、発現が２倍に増えた。興味あることに、押出成形したＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体は、同一組織で超音波処理したＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌを用いて報告された最も高いレベルと比較して、肺内で５０倍高い量のタンパク質の発現を作り出した（Ｌｉｕら、１９９５）。さらに、本発明の新規の調合物を用いて肺内で生成されたＣＡＴタンパク質のレベルは、超音波処理したＤＯＴＭＡ：ＣＯＰＥ（ＤＯＴＭＡは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドであり、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTMとしても知られている）（Ｚｈｕら、１９９３）、または超音波処理したＤＯＴＩＭ：Ｃｈｏｌ（ＤＯＴＩＭは、１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−［８（Ｚ）−ヘプタデシニル］−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリドである）（Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５）を用いたそれと比較して、５０倍以上であった。押出成形したＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ−ＤＮＡリポソーム複合体および押出成形したＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ−ＤＮＡリポソーム複合体は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体と比較して、肺内では、はるかに少ないＣＡＴしか生成しなかった。
肺内で最適のＤＮＡ：リポソーム比率を用いて、その他の押出成形ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ調合物の送達が改善されるか否かを決定するために、１００μｇのＤＮＡと複合させた４ｍＭのＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥをマウスに注射した。ＣＡＴ生成は、４ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体で認められたＣＡＴ生成より５０倍低いままであった（図２Ｅ）。さらに、４ｍＭ  ＤＯＴＡＰ−ＤＮＡリポソーム複合体、４ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）−ＤＮＡリポソーム複合体、および４ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：オレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）−ＤＮＡリポソーム複合体を含む、その他の押出成形したリポソーム調合物を用いて、ＣＡＴ生成を測定した。図２Ｅに示すように、インビボでの遺伝子発現に関して、ＤＯＴＡＰとその他のすべての調合物は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌほど有効ではなく、これらの調合物は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いた場合ほど広い生物分配を提供しなかった（データには示していない）。少量のＤＯＰＳ（５％）をＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ（５０：４５）へ付加すると、インビボでの遺伝子発現が劇的に減少し（図２Ｅ）、Ｃｈｏｌの代わりにＤＯＰＣを用いると、インビボでの遺伝子発現はほとんど完全になくなる（図２Ｅ）。ＤＯＰＳおよびＤＯＰＣは両方共、大きなヘッドグループを含み、おそらく、我々のモデルに示したようなＤＮＡ：リポソームの組立てを妨げる可能性がある（図４）。
実施例５
インビボでの発現を評価するために、１００μｇのＤＮＡを様々な濃度のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌと混合した。最も高レベルのＣＡＴは、１００μｇのＤＮＡと複合した３ｍＭおよび４ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ（おおよその＋／−チャージ比率ρ＝２）を用いた場合に、肺内で生成された。しかしながら、有意の発現は、すべての比率で得られた（図２Ａ）。さらに、１００μｇのＤＮＡを用いた場合の最大発現は、１５０μｇのＤＮＡと複合させた５ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを注射することにより生成されたそれより、肺内ではより多く、この発現は、その他のカチオンリポソームを用いて以前に報告されたものよりおおよそ１００倍高かった（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５、ＣＡＴの比活性は、１００，０００Ｕ／ｍｇ／分を基準とした）。さらに、１００μｇのＤＮＡと混合した３ｍＭから４ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ複合体は、最適のＤＮＡ：リポソーム比率で１２５μｇおよび１５０μｇのＤＮＡと混合した複合体より、４℃で保存した場合、長期間安定であった。最適のＤＮＡ：リポソーム比率を用いることによって、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ調合物の送達が改良されるか否かを測定するために、１００μｇのＤＮＡと複合させた３ｍＭのＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥを注射した。しかしながら、生成されたＣＡＴレベルは、３ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体によって生成したそれより、５０倍低いままであった。
実施例６
５０μｇＤＮＡと複合させた異なる濃度のＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いると、より高い量のＤＮＡを含む調合物と比較した場合、肺内での服用量−応答は、より劇的に異なっていた。肺内での最適のＣＡＴ生成は、５０μｇのＤＮＡと複合させた２ｍＭのＤＯＴＡｐ：ＣＨｏｌを含む複合体を注射した後に認められた（図２Ａ）。このように、同量のＤＮＡ：リポソーム比率、即ちおおよそ＋／−チャージ比率ρ＝２において、全ＤＮＡ濃度の最適の発現が達成された。しかしながら、５０μｇのＤＮＡを用いたより低いコロイド濃度のＤＮＡおよびリポソームでは、最適のＤＮＡ：リポソーム比率の場合でさえ、発現レベルが減少した。さらに、ＤＮＡ：リポソーム比率が、最適より低いまたは高い場合はいずれも、ＣＡＴ生成が鋭く落ちた。
それぞれの組織内で発現したタンパク質の量を評価するために、１００μｇのＤＮＡに複合した３ｍＭまたは４ｍＭのＤＯＴＡＰ：ＣＨｏｌを受け取った動物での、全タンパク質生成を計算した（表２）。データから、高レベルの遺伝子発現は、全身への送達ビヒクルとしてＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いた場合に得ることができることが示された。肺内での発現は、比較的ＤＮＡ：リポソーム比率に鈍感であったが、ほとんどのその他の組織では、３ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌの代わりに４ｍＭのそれを用いた場合、タンパク質の生成は、２から４倍の減少を示した。このように、心臓で示されたＤＮＡ：リポソーム比率のより高い感受性（図２Ｃ）は、肺以外のほとんどの組織に適用することができる。
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実施例７
インビトロのデータから、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌが広範囲のＤＮＡ：リポソーム比率で安定なコロイド複合体を形成することが示された（図１Ａ）ため、マウスの別のグループに、５０−１７５μｇのＤＮＡと混合した０．５ｍＭから０．６ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌからなる複合体（最終容量２００μｌ）を注射した。目標は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌシステムでの最適のＤＮＡ：リポソーム比率を決定することにある。最初の実験で得られた結果から、ＤＮＡ送達および遺伝子発現は、このＤＮＡ：リポソーム比率の最適化によってさらに増加することが、示された。マウス肺内での最大のＣＡＴ生成は、１００μｇのＤＮＡに複合させた３−４ｍＭのＤＯＴＡｐ：Ｃｈｏｌを用いることによって、生成された（＋／−チャージ比率｛ρ｝は２に相当する、図２Ａ）。最も高レベルのＣＡＴ生成は、前に達成されたものよりおおよそ１００倍高かった（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５）。ＣＡＴ活性は、ＣＡＴの比活性１００，０００Ｕ／ｍｇ／分に基づいた。より多量のＤＮＡが、これらのリポソームと安定な複合体を形成したが、毒性は、それぞれ９ｍＭおよび１０ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌと複合した２５０および３００μｇのＤＮＡを２００μｌ注射した後、誘導された。
実施例８  ：  組織発現レベル
これらの実験で同定された、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌシステムでの最適のＤＮＡ：リポソーム比率およびコロイド濃度（１００μｇのＤＮＡと複合させた３ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ）を用いて、他の組織でのＣＡＴ生成について研究した（図２Ｂ）。有意量のＣＡＴが、試験したすべての組織で生成された（図２Ｂ）。ＣＡＴの比活性を１００，０００Ｕ／ｍｇ／分を基にして、他のカチオン脂質を用いて以前に報告されたＣＡＴ（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５）より、おおよそ７５−１５０倍多い量のＣＡＴが、肺、心臓、肝臓、筋肉および腎臓内で生成された。心臓内での発現は、３ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ＋１００μｇ  ＤＮＡで最適であり、その他の比率では明らかに減少した（図２Ｃ）。リンパ節および脾臓では、生成されたＣＡＴタンパク質のレベルは、以前の報告より、それぞれ約２５倍および２倍多かった。全組織内でのＣＡＴ生成を、すべての調合物について測定した。ＣＡＴ生成は、リンパ節を除いたすべての組織内で、１００μｇのＤＮＡと複合させた３ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いた場合に、最適であることが分かった。リンパ節での遺伝子発現は、１５０μｇのＤＮＡと複合させた５ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを用いた場合に最適であり、ＣＡＴ生成は、以前に報告されたそれの７５倍に増加した。胸腺、皮膚、尾、結腸および脳内において、これらの組織のいくつかでの発現は見つかっていたが、ＣＡＴ生成の定量が報告されたことはなかった（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐｓら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら、１９９５）。
全身に送達された複合体によって、血液中の有核細胞をトランスフェクトしたならば、いくつかの組織内でのＣＡＴ発現は、試料内に含まれる血液から生じうる。全血液中のＣＡＴ生成（４７ｐｇ／ｍｇ全タンパク質）は、同一マウスから得られた肺内でのそれより非常に低かった（図２Ｄ）ため、これは肺内のケースではありえない。さらに、放血したマウスの肺内で測定されたＣＡＴ濃度は、全タンパク質レベルが血液非存在時ではより低いため、約３０％上昇した。放血マウスからのその他の大部分の組織のＣＡＴレベルは、ＣＡＴ濃度の増加、または無血マウス組織と同様の濃度かのいずれかを示した。ＣＡＴ濃度レベルは、放血したマウスからアッセイされたサンプルの尾、皮膚および脳内で減少し、このことから、これらの組織内で検出されたＣＡＴの生成は、部分的には、有核血液細胞によって構築されているかもしれないことが示唆される。
実施例９  ：  標的化リガンド
前述の方法に従って、スクシニル化アシアロフェチュインを作成し（Ｋａｎｅｏら、１９９１）、４ｍＭのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを、１００μｇのＤＮＡと、最終容量が２００μｌになるように、複合した。これらの複合体を、０．４５μｍのポリスルホンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を通してろ過した。スクシニル化アシアロフェチュインは、最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌで得られ、Ｐｉｐｅｔｍａｎピペットチップを用いて、これらのろ過されたＤＮＡ：リポソーム複合体に加えた。この混合体を、ピペットチップ中に上下に二度ゆっくりと混合した。ＤＮＡ：リポソーム複合体を、４℃で一晩保存した。ＤＮＡ：リポソーム−アシアロフェチュイン複合体の沈殿は、起こらなかった。上記の方法に従って、これらの複合体をマウスの尾静脈に注射した。
スクシニル化アシアロフェチュインは、負にチャージしており、それ故、陥入したリポソームの間にＤＮＡを含むリポソームの正にチャージした表面と、しっかり結合することができる。スクシニル化アシアロフェチュインの添加後、ＯＤ400が服用量に依存して上昇した。４００ｎｍの吸光度を、スクシニル化アシアロフェチュインを含むまたは含まない以下のＤＮＡ：リポソーム複合体の１：２０希釈について測定した。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体のＯＤ400は、０．８１５であり、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ＋０．１ｇ／ｍｌのスクシニル化アシアロフェチュインおよびＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ＋０．２ｍｇ／ｍｌのスクシニル化アシアロフェチュインのＯＤ400の読みは、それぞれ０．８４４および０．８７３であった。０．２ｍｇ／ｍｌより多い量のスクシニル化アシアロフェチュインの添加は、すぐにＤＮＡ：リポソーム複合体の沈殿を生じた。これらの知見は、スクシニル化アシアロフェチュインは、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体と強く相互作用することを、示している。スクシニル化アシアロフェチュインをリポソーム複合体の表面に加えると、肝臓内での遺伝子発現がより多くなる。アシアロフェチュインは、末端にガラクトシル基を含むアシアログリコプロテインであり、肝臓へリポソームを効率的に向けるために用いられた（ＳｐａｎｊｅｒおよびＳｃｈｅｒｐｈｏｆ、１９８３；Ｓｐａｎｊｅｒら、１９８４；Ｄｒａｇｓｔｅｎら、１９８７；ＭｕｒａｈａｓｈｉおよびＳａｓａｋｉ、１９９６；Ｈａｒａら、１９９５）。さらに、ＤＮＡ：リポソーム複合体の外側の表面チャージが変化し、内皮プロテオグリカンとのイオン相互作用が減少すると（ＭｉｓｌｉｃｋおよびＢａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ、１９９６）、器官特異的送達が容易になる。
好ましいＤＮＡ：リポソーム複合体へのスクシニル化アシアロフェチュインの添加は、肝臓アシアログリコプロテインレセプター用のリガンドを提供し（ＡｓｈｗｅｌｌおよびＨａｒｆｏｒｄ；１９８２）、そして肝臓内でのＣＡＴ生成を７倍増加させた（図７）。図２Ｂに示したようにその他の器官でのＣＡＴの発現は増加しなかったため、この標的化は肝臓に特異的であった。この広範囲に用いられているリガンドを単独で用いると、リガンドを付加するための本方法の可能性を証明することができた。
実施例１０  ：  低温電子顕微鏡
リポソームまたはＤＮＡ：リポソーム縣濁液中に７００メッシュの銅グリッド（直径３ｍｍ、厚さ３−４μｍ）を浸し引き出すことによって、薄膜を調製した。過剰の液体を吸い取って除き、グリッドの棒の間に形成された薄膜を、融解エタン中でガラス状にした。低温トランスファーの後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２顕微鏡を用いて、試料を−１７０℃、低線量、１２０ｋＶ１９で観察した。
インビボでの遺伝子の良好な送達のメカニズムを試験するために、低温電子顕微鏡で、ＤＮＡ−サンドイッチ：リポソーム複合体の形態ならびにＤＮＡを含まない関連リポソームの形態を研究することによって、それらを試験した。ＤＮＡ不在下で押出成形したＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームは、二つの同心層板および小さな穴を持つ、多くの完全に陥入したリポソームを示した。大部分のリポソームは、おおよその直径が５０ｎｍの球体であった。
花瓶構造は、全体のリポソーム集団の１／３に現れた。また、大きなチューブ状構造も認められ、動的光散乱によってＣｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４粒子サイズアナライザーを用いて測定したところ、約２４０ｎｍのより大きいサイズを説明している。
＋／−チャージ比率ρ＝２を用いて、これらのリポソームを最適濃度でＤＮＡと複合した場合（Ｌａｓｉｃら、１９９７）、ＤＮＡはリポソーム内部に位置していた（図３Ｂ）。ＤＮＡとのＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン）およびＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ複合体は、それぞれ４４５ｎｍおよび４０５ｎｍの平均粒子サイズを持つ濃密なコロイド状溶液であった。粒子サイズは、希釈に依存せず、濁度はベールランバート（Beer Lambert）の法則に従い、このことから、インビトロではこれら複合体が安定であることを示している。また、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥリポソームは、「花瓶構造」を形成する；が、穴はより大きく、球形が多く形成された（図３Ｅ）。さらに、多くの構造は、押出成形したＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥリポソーム内に組み込まれたＤＮＡをほとんどまたは全く含まない構造が多く（図３Ｆ）、ＤＮＡは、しばしば、これらのリポソームの外側に見いだされた（図３Ｆ）。ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥおよびＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌリポソームは、「花瓶構造」を形成しなかった。「花瓶」内へのＤＮＡのインターナリゼーションは、押出成形されたＤＯＴＡＰリポソームのユニークな特徴であり、低温電子顕微鏡によって調べたその他の如何なるＤＮＡ：リポソーム複合体でも、認められなかった（Ｆｒｅｄｅｒｉｋら、１９９１）。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌに認められた「花瓶構造」は、これらのっ調合物で達成される高い全身への送達および遺伝子発現に寄与しているかもしれない。
小角Ｘ線散乱（Small Angle X-ray Scattering）（ＳＡＸＳ）
遠心分離または乾燥によって、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ複合体を高次構造に濃縮したが、両技術とも同一のＳＡＸＳ結果を生じた、２つのＸ線屈折鏡により焦点を合わせた回転陽極Ｘ線源、ＧＸ−１３（Ｅｌｌｉｏｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いることによって、ＳＡＸＳ実験を行った。フランク型カメラを用い、サンプルから１５ｃｍ離し、Ｋｏｄａｋのリンスクリーン（Ｋｏｄａｋ、ＮＹ）を用いて、二次元のＸ線写真を撮り、画像板リーダー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，ＣＡ）によってスキャニングした。放射線強度の平均は、ＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ  １．５７イメージプロセシングプログラム（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＭＤ）を修飾したプログラムを用いて、測定した。得られた結果を図８に示している。
参考文献
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0004203835.tif 000005
【図１Ａ】
0004203835.tif 000006
【図１Ｂ】
0004203835.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0004203835.tif 000009
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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