(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
ａ）生物学的液体材料を、ウイルスに浸透することができ且つ該ウイルスから除去すると該ウイルスを不活性化することが可能な臨界流体または臨界状態に近い流体と混合接触させる工程；および
ｂ）該材料及び該ウイルスから該臨界流体または臨界状態に近い流体を除去して、該材料に含まれるウイルスを不活性化する工程；
からなる、生物学的液体材料に含まれるウイルスの不活性化方法であって、
該臨界流体または臨界状態に近い流体は、フルオロカーボン、エチレン、アルカン、亜酸化窒素、二酸化炭素、窒素からなる群から選択される、前記方法。
【請求項２】
臨界状態または臨界状態に近い流体が、高圧条件下でウイルスに浸透する、請求項１の方法。
【請求項３】
生物学的液体材料が、蛋白質及び核酸からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
臨界流体または臨界状態に近い流体が、フルオロカーボン、アルカン、並びに亜酸化窒素、二酸化炭素及びそれらの混合物のような二元流体から実質的になる群から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は超臨界流体を用いるウイルスの不活性化のための方法および装置に関するものである。
背景技術
感染性ウイルスは、不活性化しないならば、ヒト血漿から誘導された生物製品、または組換えＤＮＡおよびモノクローナル抗体源から容易に伝染することがある。肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）および非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＨＶ）は長い間、患者、医者および製剤業者を悩ませてきた。近年、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体−が極めて重大かつ差し迫った問題になってきている。幾つかの症例において、凝固因子濃縮物によりＨＩＶが血友病患者に感染し、そのうちの何人かについてその後ＡＩＤＳが発病する（米国の２０，０００人の血友病患者のうち、６５％がＨＩＶに感染していると推定される：ウォールストリートジャーナル１９９０年１２月２７日）。この分野の指導的研究者である、Morgenthalerは「血漿製品におけるウイルスの不活性化（１９８９）」における彼の序論において、「治療用途を意図している成分を損なわずに、血液中のウイルスを不活性化する方法が必要なことは、明らかである」と述べている。
組換えＤＮＡ製品のウイルス不活性化はバイオテクノロジーおよび製薬産業並びに取締り機関において、依然として重大かつ未解決の関心事である。ＦＤＡは、「ヒト用のモノクローナル抗体製品の製造および試験において考慮すべきポイント」において、「もし存在するならば、ウイルスおよびＤＮＡを除去および／または不活性化する．．．不活性化処理を、精製中に用いることを強く勧める．．」と述べている。安全性および公衆の健康のために、慣用のウイルス不活性化技術に対して一般に不安定であり、かつ極めて敏感である生物活性製品を変成することなしに、ウイルスを不活性化する方法を発見および開発することが、探求されるべきことである。
ヒトの血漿およびその他の生物活性原材料から誘導される治療用タンパク中のウイルスを不活性化するために、多くのアプローチが使用されてきた。これらのアプローチのいくつかは、加熱または低温滅菌、化学的不活性化剤、紫外線（ＵＶ）およびガンマ線の照射、必須脂質の溶剤抽出、抗体による中和、およびウイルス分画技術による除去等がある。
個々のタンパクの生物的活性に対する悪影響なしに、ウイルスを不活性化する幾つかの加熱処理方法が発明されている。これら方法の大部分は、タンパクを保護するための安定剤を必要とし、または凍結乾燥状態での材料の熱処理を必要とする。Fernandez等（米国特許４，４４０，６７９）では、非常に熱に敏感な健康タンパクであるVIII因子の低温滅菌に炭化水素安定剤を使用している。
Reubenstein（米国特許４，４５６，４９０）では、IX因子は、もし最初に凍結乾燥した場合には、６０℃、１０時間で低温滅菌できることが示されている。Thomas（米国特許４，４９５，２７８）ではIX因子について同様なことが示されている。Mitra等には、ｐＨ、温度および時間の条件を制御することによる、免疫グロブリン製品中でのウイルス不活性化が示されている。Feldman等（米国特許４，８７６，２４１）は、ウイルスおよび細菌の汚染の熱不活性化に先立って、糖および糖アルコールと硫酸および酢酸の塩との混合物で、生物製品及び薬剤製品を安定化する方法が示されている。ヒト血清アルブミンを肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＮＡＮＢＨＶの両方）を含まないようにするための現在の標準は、６０℃で１０時間の低温滅菌である。典型的には、低温滅菌中に生物活性を保護するために高濃度の安定化剤（例えば、クエン酸塩、蔗糖およびカプリル酸塩）が使用される。VIII因子のような血漿画分も凍結乾燥状態で低温滅菌できる。これは、安定化剤の存在下に６０℃で７２時間以上血漿粉末を乾燥することが必要である。低温滅菌の主な問題は、長い処理時間、血漿タンパクおよび画分の不活性化、および高濃度の安定化剤の使用である。この安定化剤は、治療への使用の前に除去しなければならない。（また、安定化剤はウイルスおよびタンパクを保護する傾向があり、それによって、長時間の苛酷な処理条件が必要とされる。）
最近、ニューヨーク血液センターにおいて１９９０年１１月１６日にＮＨＬＢＩ許可Ｎｏ．ＨＬ４１２２１によって部分的に指示され、かつVox Sanquinis 1991に掲載されるよう受理されている「ヒト血液血漿中のＨＩＶおよび他のウイルスの高温−短時間加熱不活性化」において、Charm等は安定化剤も凍結乾燥も用いずにヒト血液血漿中のＨＩＶおよび他のウイルスを高温−短時間（ＨＴＳＴ）で加熱不活性化する方法を報告した。不活性化データは極めて有望なものであるが、肝炎Ｂおよび肝炎Ｃウイルスの不活性化を実証することを含め、さらなる研究が必要である。ある種のウイルスを不活性化するのに必要な条件下で、ＨＴＳＴ法は生物活性の顕著な低下という問題を生じることがある。その上、このマイクロ波技術は、極めて粘稠な材料を取扱うことができないことがあり、また非常に定量化できにくいいことがある。ＨＴＳＴ装置は、タンパクを無傷の状態に保つために必要な速かな昇温速度および短い滞留時間を達成するために、非常に小さい直径の管の使用が必要である。
ウイルスを不活性化する化学的方法は、それ単独でまたは他の物理的分離方法と組合せて使用されてきた。すなわち、銅フェナスロリンおよびその類縁化合物（Lembach米国特許４，５３４，９７２）；リン酸トリーｎ−ブチルおよびその類縁化合物（Horowitz米国特許４，４８１，１８９）；カプリル酸ナトリウムと加熱およびアミノ酸との組合せ（Naito等米国特許４，４４６，１３４）；非イオン化濃度のカプリル酸（Seng等米国特許４，９３９，１７６）；コロイド状シリカに吸着したβ−プロピオノラクトン（米国特許４，３７０，２６４）；血液および血液成分中のＨＩＶウイルスを不活性化するためのフェノールとホルムアルデヒドとの組合せ（Louderback米国特許４，８３３，１６５）；洗浄剤、アルコールおよびエーテルの混合物（Prince米国特許４，５９１，５０５）；ジーまたはトリーアルキルホスフェートおよび洗浄剤（Neurath等米国特許４，７６４，３６９）；他の界面活性剤を用いる種々の方法（米国特許４，３１４，９９７；４，３１５，９１９；および４，６１３，５０１）。マイルス社（Miles, Inc.）のカッターバイオロジカル部門（Cutter Biological Division）バークレイ、カリフォルニアによって開発された１，１０−フェナンスロリン−第一銅錯体のような化学的滅菌法は依然として開発途中であり、恐らく、化学的除去、残存毒性、および正常細胞の損傷抑制（これらの化学的手法は核酸の分解によって達成される）について問題を生じるであろう。
界面活性剤の使用をする又はしない多くの有機溶媒技術が工夫された。米国特許第４，５１１，５５６号においては、ハロヒドロカーボンによる処理が提案され、そして種々のアルカン、ケトンおよびペルフルオロカーボンが、米国特許第４，４９０，３６１号に提案されている。有機溶媒／界面活性剤混合物（例えばエチルエーテル／ツイーン８０、アミルアセテート／デオキシコレート、およびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート／ソディウムコレート）が開発されている。これらの技術には下記の問題がある：最終生成物から有機溶媒および界面活性剤を除去する事に伴う操作上の問題；血液の血漿タンパク質およびフラクション中の残留毒性物質；およびウィルスコート中のリピッド含量が無視できる量であるポリオのようなウィルスに対して有効でないこと。
第２次世界大戦の間に開発されたUV照射は、しばしばHBVの感染性および不活性化のための断面積が非常に小さい病原体の除去ができない；UV照射はまた、正常細胞に対してタンパク質の変性およびＤＮＡ損傷を生じる。UV照射はまた、ヨーロッパにおいては、発癌性物質と考えられるＢ−プロピオノラクトンと一緒に用いられている。
幾つかの会社は、従来流動液体からバクテリアを除去するために用いられているミクロ濾過装置を、組換えＤＮＡおよびモノクローナル抗体生産物からウィルスを除去するために開発している。Ｐａｌｌ  Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ社は、そのような生産物からウイルスや粒子を除去するために、０．０４ミクロン（４０ナノメーター（nm））の親水性フィルターを開発した。このフィルターは、８０ないし１２０nmのサイズ範囲のウイルスに対しては有効であったが、サイズが７０nmより小さいウイルスに関しては一定した試験結果は得られず、そして非常に小型のウイルス（例えば直径２５nmのポリオ）は効果的に除去されないと考えられている（Toth, C.S.：”Retention of Viral Contaminants by 0.04 micron ND filters,”the Engineering Conference，マイアミ，フロリダ,1990における発表）。マサチュセッツ州、ベッドフォードのMillipore Corporation）は、最近（1991年6月）、タンパク質溶液からウイルスを除去するための非選択的濾過システムを開発しと発表した。開発者は、サイズが28nm以上のウイルスの4-log除去が出来たこと、そしてレトロウイルス（100nm）を７-log以上除去し、且つ70,000より小さい分子量のタンパク質の回収率が90％より大きかったことを報告している。Millipore社はまた、モノクローナル抗体や血清を基礎とする生産物のような生物学的治療剤のための他の膜も開発中であると発表している。ミクロ濾過に付随する問題のいくつかは次のようである：小型ウイルスに対しては効果がない；生産物の非特異的吸着および損失；剪断力に起因する変性；激しい発泡および孔の目詰まり；およびウイルスを不活性化することができないという最も重大な欠点の解消が困難なために、除去に1％の不効率があると生産物にコンタミネーションを招来することである。
従って、発癌性、毒性および／または生物学的に活性な化合物に対して損傷性の添加剤を用いることなく、熱に不安定で感受性のタンパク質の存在下でウイルスを不活性化することには、未だに非常な困難が存在する。そのような添加剤を用いると処理後に無菌的に除去しなければならず、従来のウイルス不活性化技術にさらなる費用と時間の負担を付加する。
タニグチらは、超臨界二酸化炭素による処理を用いた、血漿粉末の滅菌法を記載している。ウイルスの除去には触れられておらず、そしてこの先行技術の焦点はバクテリアの除去の試験にあてられている。
従って、本発明の主な目的は、タンパク質性生産物中のウイルス特にエンベロープまたはリピッド皮膜を被ったウイルスを、実質的変性を生じることなく不活性化するための新規方法および装置を提供することである。
発明の概要
ウイルス（ウイルス様粒子も含むが、特にエンベロープまたはリピッド皮膜を被ったウイルス）を、タンパク質性生産物の実質的変性および生物学的活性の損失無しに、不活性化するために、臨界流体が有効であることが発見された。
本発明の方法は、材料を臨界流体に接触させ、該材料を臨界流体から分離し、そして該材料を無菌条件下で分離することを含む。処理すべき材料は固体状、固体に結合している状態、または液状で、処理することが出来、そして好ましくは材料は実質的にウイルスが無くなるのに十分な時間臨界流体と接触させる。一つの好ましい応用においては、材料は所望の活性を有する所望の生物学的分子を含み、そして該材料は該生物学的分子が実質的にその活性を保持する条件下で臨界流体と接触させる。
好ましい温度は、0.5 Trないし2.0 Trであり（ここでTrは絶対操作温度を絶対臨界温度で割った修正温度である）、最も好ましくは4℃ないし40℃である。さらに、材料を超臨界または近臨界流体に、0.2 Prないし20.0 Prの範囲の圧力（ここでPrは操作圧力を臨界圧力で割った、修正圧力である）で接触させることが好ましく、そして最も好ましくは0.5 Prないし10.0 Prの範囲である。
マウスのレトロウイルスをＡＩＤＳウイルスのモデルとして用い、臨界流体によるウイルス不活性化方法は、非常に温和な条件下で、エンベロープをもつウイルスを不活性化する可能性をもつことが証明された。本発明者らはさらに、この方法が比較的低温でそして比較的短い滞留時間操作ででき、血液タンパク質および他の有用な血漿成分に対して無視できる程度の変性しか生じないことも発見した。５分間という短時間内にウイルス活性を４−ｌｏｇも低下させることに成功した。本発明の方法は、連続流動操作にも適合性であり、容易に大規模化できる。可能な応用としては、血漿およびそのフラクション、血清、組換え−ＤＮＡによる治療剤、ワクチンおよび生物医学用および研究用の装置および器具における、ウイルスの不活性化をあげることができる。本発明はまた、上記方法のための新規装置も提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の装置の模式図である。
図２は、種々の抽出工程を用いた種々のパン酵母抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図３は、種々の抽出工程を用いた種々のパン酵母抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図４は、種々の抽出工程を用いた種々のパン酵母抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図５は、臨界流体による処理の前の酵母細胞を示す、走査電子顕微鏡写真である（15,600倍）。
図６は、臨界流体による処理の後の単一酵母細胞を示す走査電子顕微鏡写真である（20,600倍）。
詳細な説明
本発明は、臨界流体を用いてウイルスおよび他の粒子様病原体を不活性化する方法に関する。そのような粒子様病原体は、本明細書中でウイルスと称する用語に包含されるものとする。臨界流体の用語は、超臨界状態にある流体を意味する。この用語はまた、超臨界状態に近似する（例えば、若干低い）状態、および特に臨界温度より若干温度が低く、そして臨界圧力またはそれを実質的に越える圧力の流体も含まれる。好ましい流体は常温条件ではガス状であり、そして０℃ないし１００℃に臨界温度を有し、最も好ましくは０℃と６０℃の間に臨界温度を有するものである。生物学的材料（例えばタンパク質性材料）を扱う場合は、より一層生物学的活性を保つために、実質的に６０℃より低い（例えば４０℃の）臨界温度を有する流体が好ましい。好ましい流体はクロロジフルオロメタンのようなフルオロカーボン、エチレン，プロパンおよびエタンのようなアルカン、および亜酸化窒素および二酸化炭素のような二元流体である。これらの流体は、技術分野で共溶媒として知られている極性のエントレイナー（entrainer）もしくは修飾剤の少量と一緒に用いてもよい。共溶媒は、エタノール、メタノール、アセトンおよびエチレングリコールのような物質を包含する。そのような共溶媒は、とりわけ臨界流体に極性を与え、それにより臨界流体がある種の材料中のウイルスを不活性化する能力を増強する。
処理すべき材料は、材料のその分野での使用目的に実質的悪影響なしに、選択された臨界流体と混合できる任意の材料でありうる。例えば、材料は固体、非有機材料、固体の有機材料、懸濁液または溶液でありうる。本発明の方法は生物学的活性を有する材料に特に利用可能で、そして特に固体支持体マトリックスに結合されたもしくは溶液中に含まれているタンパク質性物質に利用可能である。例として、血液血漿、血液血漿のフラクション、哺乳類細胞の培養に用いられる血清および組換えＤＮＡ誘導体タンパク質を含む溶液が挙げられる。処理されるタンパク質は生きている細胞中にさえも含まれていてよいが、典型的には処理される材料は非細胞性である。非細胞性とは、原核細胞または真核細胞を実質的に含まない材料を意味し、特に所望の生物学的物質を製造するために適合させた遺伝子工学細胞ラインまたはハイブリッド細胞ラインその他を含まない材料を意味する。非細胞性材料中には、結果に影響しない程度の量の細胞が存在することは差し支えなく、例えば、材料中の細胞を除去する前工程（例えば遠心もしくは細胞破壊）が100％効果を奏しなくてもよい。本発明の方法は、食料、スパイス、薬剤粉末や錠剤、生物医学的器具、および透析膜等の膜のような、汚染される可能性のある半固体および固体マトリックス中のウイルスおよび他の粒子様病原体の不活性化にも利用可能である。
以下に示すように、ウイルスの不活性化において、異なる流体は異なる程度の成功を発揮する。当業者により認識されるように、具体的流体は少なくとも二種類の因子に基づいて選択される。第一に、選択する流体は所望程度にウイルスを不活性化することが必要である。ある場合には、特定のウイルスの不活性化が目的であり、そして流体はそれに応じて選択される。第二に、流体は処理される材料の使用目的の分野との関連で、該材料に損傷を与え、不活性化しまたは何らかの悪影響を及ぼさないように選択すべきである。例えば、タンパク質の場合には、実質的に60℃より低い臨界温度を有し、そしてタンパク質を化学変性させたり、タンパク質と不所望な相互作用する傾向のない流体が望ましい。
選択される具体的流体ならびに該臨界流体の材料への暴露時間、混合物の温度および混合物の圧力は、相互依存性であり、所望結果のための適当な条件を全体としてまたは個々に決定することは、当業者により理解されよう。例えば、材料の臨界流体への暴露時間は、ウイルスの不活性化の程度に影響するであろう。従って、材料の処理条件は材料が実質的にウイルスを含まないことを確実にするために十分な時間の暴露のための条件を含むであろう。実質的にウイルスを含まないとは、本明細書に記載する方法によって検出可能な量より少ない量までウイルスが減少することを意味する。暴露時間並びに温度は一緒になって、処理される単離材料に影響するであろう。タンパク質に関しては、タンパク質の所望の生物学的活性が実質的に保持されるように条件を選択することが好ましい。実質的に保持されるとは、所望生物学的活性の少なくとも50％が保持されることを意味する。発明の概要の項に記載したとおり、材料は臨界流体から無菌条件下に分離される。例えばタンパク質を含有する溶液の場合には、分離を達成するためには混合物を減圧し、それによりタンパク質性生成物を含有する溶液からの流体の相分離を生じさせる。次いで材料を無菌的条件下で単離する。
材料を単離することとは、例えば滅菌瓶または容器（例えば、フラスコ）あるいは密閉されたパッケージのようなパッケージ内において、本発明の装置から材料を分離することを意味する。本発明の滅菌装置の一部である区画または容器中に、材料を、臨界流体から単に分離することは含まれない。にもかかわらず、材料を単離することに使用される容器またはパッケージは、本発明の装置の装置に少なくとも一時的には付着可能であり、滅菌容器またはパッケージ中で装置から単離された状態への材料の移動を促進するものと理解するべきである。処理された物質はまた、最初に装置から回収され、次いで、無菌条件下において物質を単離するために、例えば細菌を除去するためのフィルターを通してろ過される。
本装置は、流体源、高圧再循環ループ、分離室および少なくとも１つの低圧トラップを含む。ウイルスの不活性化は、高圧再循環ループ中で生じ、それは、5,000psigおよび100℃における継続操作する能力を有する。高圧再循環ループは、処理すべき物質および臨界流体が導入される室１０、生成物をソーキングチャンバーに導入するための注入口１２、生成物および流体の混合物を継続して混合するためのスタティックインラインミキサー１４および混合物をインラインミキサーに移動させるための循環ポンプ１６、一つは分離室に付いていて（熱電対T1）もう一方はインラインミキサーの少し上流に位置している（熱電対T2）二つの熱電対、スタティックインラインミキサーの少し上流に位置している圧力表示計P2、および高圧再循環ループを通る流体の動きを方向付けしたり、調節したりするための各種の相互連絡管１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６並びに幾つかのプロセスバルブPV-3、PV-4、PV-5、PV-6およびPV-7から成る。
ウイルスの汚染を含むタンパク質性生成物の臨界流体ウイルス不活性化は、図１に示されるような装置、または、臨界流体を生成物に添加することを許容するために改造されたり、圧力、温度、混合および滞留時間を調節するために改造されたり、そしてウイルス的に不活性化したタンパク質性生成物から臨界流体を分離するために改造された他の同様の変形装置において、行うことができる。
プロセスバルブPV-3、PV-5、PV-6およびPV-7は全て１００℃で6,000psigの性能の１／４インチ全開二方向ステンレス鋼ボールバルブである（Parker, Huntsville, Alabama）。PV-4は、３方向ステンレス鋼バルブである（Parker, Huntsville, Alabama）。本発明のある態様においては、プロセスバルブPV-7は、背圧力調節器（型番号、26-1722-24, Tescom Corporation, Elk River, Minnesota）であり、これによって作動者は分離室および高圧循環ループの減圧を調節することができるのである。使用した特定のソーキングチャンバー１０は、150mlの容積および100℃で5,000psigの作動圧力を有する高圧ステンレス鋼容器であった（型Z148, Hoke Ink., Cresskill, New Jersey）。K型の熱電対T1をソーキングチャンバー１０の外面に接触するように設置し、温度をデジタル温度指示計調節器において監視した（型番号、CN-310KC, Omega Engineering, Inc., Stamford, Connection）。
ソーキングチャンバー１０は、上部入口ライン１８および底部出口ライン２０を有する。入口ライン１８は、流体の合流点に、臨界流体源、生成物注入口１２、およびスタテティックインラインミキサー１４の出口ライン２２との連絡している。ソーキングチャンバー１０の出口ライン２０および導管線２４の片方の先端は流体の合流点で連結し、この合流点はまた減圧バルブPV-7に連結する。導管線２４のもう一方の先端は、流体の合流点において、循環ポンプ１６の入口ライン２６に連結する。使用した特定の循環ポンプは１６は、１０から２０psigの圧力差で300ml/分の流速を生じさせ得る可変速度（0から9,000rpm）、高圧（150℃で5,000psig）のギアポンプであった（改良型番号、１８３、特注品Micropump, Concord, California）。循環ポンプ１６は、５℃に等しい温度および15,300Btu/hの冷却速度を維持することができる循環冷却水槽に連結したアルミニウムブロックで構成された冷却頭部を有した（型番号、HX-150, Neslab, Inc., Concord, New Hampshire）。循環ポンプ１６の排出ライン２８は、流体の合流点において時に、導管線３０の片方の先端に連結し、この合流点がさらに流出バルブPV-6に連結する。導管３０のもう一方の先端は、流体の合流点においてスタティックインラインミキサー１４の入口ライン３２に連結し、この合流はさらにはけ口バルブPV-5に連結する。導管３０は、インライン圧力指示計P-2および温度指示計調節器に連結されたインラインK型熱電対T2を有する（型番号、CN-310KC, Omega, Stamford, Connecticut）。
使用した特定のスタティックインラインミキサーは、３００Ｆで4,642psigの能力を有する3/16“ID×7 1/2”長×２７エレメントのチューブミキサーであった（Kenics, Mixer型番号37-03-075, Chemineer, Dayton, Ohio）。スタティックインラインミキサー１４の出口ライン２２および分離チャンバー１０への入口ライン１８は、流体合流点において連結する。この合流点は臨界流体供給バルブPV-3に連結し、また、三方向プロセスバルブPV-4にも連結する。三方向プロセスバルブPV-4は、注入口１２と、リサイクル導管３４またはソーキングチャンバー１０の入口ライン１８のいずれかとの間における流体の連結を許す。リサイクル導管の他方の先端は、循環ポンプ１６の導管２４および入口２６の間の合流点に連結する。
臨界流体は、バルブ、ポンプおよびフィルターによって遮断されている一連の導管線を介して供給バルブPV-3と流体連絡している。容器３６からの臨界流体の放出は、高圧容器の頂部のバルブPV-1によって調節される。流体は、容器３６から圧縮機３８の入口に導管４０を介して送られる。使用した特定の圧縮機は、１分当たり４０標準リットルの流速において10、000psigまで、ガスまたは液体を圧縮することができる片面ダイヤフラム圧縮機であった（型番号、J-46-13411,Superpressure Gas Compressor, Newport Scientific, Jessup, Maryland）。プロセスバルブPV-2は、圧縮機３８の出口に接続され、所望の圧力が達成された時に、閉鎖することができる。流体は、圧縮機３８から一対のインラインフィルター４２、４４に、導管線４６を介して送られる。使用した特定のインラインフィルターは、７ミクロン焼結ステンレス鋼カップフィルター４２（型番号、6TFステンレス鋼ハウジンング、Nupro Company, Willoughby, OhioのSS-8F-K4-7）および０.5ミクロン焼結ステンレス鋼フィルター４４（型番号、6TFステンレス鋼ハウジング、Nupro Company, Willoughby, OhioのSS-8F-K4-05）であった。流体は、フィルター４４の出口から出て、導管４８を通してバルブPV-3に送られる。
高圧再循環ループは、産物回収部、即ち、５００ｍｌ減圧チェンバー５０、第一低圧トラップ５２並びに数個のツーウェイバルブおよび結合ラインからなる、装置の低圧半部（ｌｏｗ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈａｌｆ）と向かい合っている。排気システムは第二低圧トラップ５４からなり、第二低圧トラップ５４は大気中に排出される排出ラインにつながっている。本発明のその他の態様において、排出された臨界流体（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）は、まず濾過され、次に圧縮機（ｃｏｍｐｒｅｓｓｏｒ）Ｐ−１の入口に再循環される。
ソーキングチェンバー（ｓｏａｋｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ）１０中の混合物は、減圧バルブＰＶ−７により出口ライン２０を通り、減圧チューブ５６まで移動されることができる。減圧チューブ５６は、減圧チェンバー５０の底部約１／４インチまで伸びている。減圧チェンバー５０は１つの入口および２つの出口ラインを有し、該入口を通して減圧チューブ５６が挿入、シールされている。底部の出口ライン５８はチェンバー５０の底部を出て、プロセスバルブＰＶ−８（ＰＶ−２と同じタイプ）に結合している。プロセスバルブＰＶ−８は、液体溶剤およびスラリーの回収のための試料ポート６０に結合している。頂上部の出口ライン６２は減圧チェンバー５０の頂上部を出て、低圧トラップ５２に結合している。具体的に適用された減圧チェンバーは、１００℃で５，０００ｐｓｉｇの圧力の５００ｍｌステンレス鋼高圧チェンバーであった（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．Ｚ１５２，ＨｏｋｅＩｎｃ．，Ｃｒｅｓｓｋｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。
低圧トラップ５２は入口６４を１つ有しており、該入口６４を通して低圧チェンバー５０の頂上部出口ライン６２が挿入、シールされている。低圧トラップ５２はさらに２つの出口を有している。底部出口ライン６６は低圧トラップ５２の底部を出て、プロセスバルブＰＶ−９に結合している。ＰＶ−９は減圧工程から持ち越された全ての液体溶剤およびスラリーの回収のための試料ポート６８に結合している。頂上部出口ライン７０は減圧トラップ５２の頂上部を出て、第二減圧トラップ５４に結合している。第二低圧トラップ５４は入口７２を１つおよび２つの出口ラインを有しており、該入口７２を通して、低圧トラップ５２の頂上部出口ライン７０が挿入、シールされている。底部出口ライン７４は第二低圧トラップ５４の底を出て、プロセスバルブＰＶ−１０に結合している。ＰＶ−１０は、減圧工程から持ち越された全ての液体溶剤およびスラリーの回復のための試料ポート７６に結合している。頂上部出口ライン７８は第二低圧トラップ５４の頂上部を出て、大気中に排出される。具体的に適用された低圧トラップは、１００℃で５，０００ｐｓｉｇの圧力の１５０ｍｌ高圧Ｍｏｎｅｌチェンバーであった（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．Ｚ１５２，ＨｏｋｅＩｎｃ．，Ｃｒｅｓｓｋｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。
安全および装置の順応性のために、装置の生産物回収半部もまた、１００Ｃで５，０００ｐｓｉｇの圧力で連続作動できるようにデザインされた。装置の高圧循環ループおよび産物回収半部は共に、閉じ込めチェンバーとして機能するポリカーボネート（Ｌｅｘａｎ）ボックス８０中に収められている。このチェンバーは１５００Ｗ（Ｐｅｌｏｎｉｓ）ヒーター８２によって熱せられ、固定された状態のＯＮ−ＯＦＦ温度指示コントローラー８４（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．ＣＮ−３１０ＫＣ，Ｏｍｅｇａ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）によって、循環ポンプＰ−２  １６の排出ライン２８に付属した導管３０中のインライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）温度Ｔ２に基づいて制御される。
開始の状態として、システムを清浄、滅菌そして乾燥し、全てのプロセスバルブ（ＰＶ）を閉じた状態で作動温度（室温から４０℃）にする。
これを達成するために、システムを０．５Ｍ  ＥＤＴＡでリンスし、装置内部の残存している金属を全てキレート化し除去する。７ミクロンおよび０．５ミクロンのフィルター部を経て７０％エタノールで満たすことによってシステムを滅菌する。続いてシステムを４０℃に加熱し、装置の高圧循環ループ内にエタノールを３０分間循環させる。続いて吹出しバルブＰＶ−７を開け、システム全体をＬＰＴ−２以降の排出バルブまで７０％エタノールで満たす。全てのバルブ、即ち、ＰＶ−４、ＰＶ−５、ＰＶ−６、ＰＶ−８、ＰＶ−９およびＰＶ−１０でエタノールが観察されるまで抽気（ｂｌｅｅｄ）した。バルブＰＶ−４およびＰＶ−６を７０％エタノールに浸したガーゼで覆い、アルミニウムホイルで覆った。システムを４０℃に約３０分間保った。続いて、加圧（約１００ｐｓｉｇ）し、（７ミクロンおよび０．５ミクロンのフィルターを通して）濾過した窒素を用いて、ＰＶ−６，ＰＶ−８，ＰＶ−９およびＰＶ−１０を通してシステムからエタノールを除いた。液体がそれ以上排出されなくなってから、エタノールに浸したガーゼおよびアルミニウムホイルでこれらのバルブを全て覆った。続いて、０．２ミクロンフィルターで濾過し、蒸留し、脱イオン化した（ＤＤＩ）水でシステム全体をリンスした。全てのバルブを抽気し、加圧下で濾過した窒素を用いてシステムから水を除いた。試料装填チューブ、収集フラスコおよび充填ベル（ｆｉｌｌｂｅｌｌ）（シリコーンチューブをつけたもの）を全て、２５０Ｆに調節したオートクレーブで３０分間、迅速に排気しながら滅菌した。装填チューブはガーゼで包んだ；約２ｍｌのＤＤＩ水を（蒸気を発生させるために）、アルミニウムホイルでカバーしたガーゼおよび綿栓を有するフラスコ中に配置した。蒸気サイクル（ｓｔｅａｍ  ｃｙｃｌｅ）が終了すると、２０分間の乾燥サイクルを行った。
通常の作動モードでは、バルブＰＶ−４およびＰＶ−５が開けられており、滅菌シリンジおよびあらかじめ滅菌した充填チューブを用いて３−ウェイバルブＰＶ−４を通して試験溶液のアリコートを無菌的に導入する。次に３−ウェイバルブＰＶ−４を回して臨界溶液再循環ラインがソーキングチェンバーとつながるようにし、排出バルブＰＶ−５を閉じる。続いてＰＶ−１を開き、圧縮機Ｐ−１に溶剤を満たす。圧縮機のスイッチを入れ、その直後にバルブＰＶ−２およびＰＶ−３を開き、高圧循環ループに臨界流体溶媒を導入する。作動圧力に達したら、圧縮機のスイッチを切り、バルブＰＶ−３を閉じる。
システムの安定化の後、循環ポンプＰ−２のスイッチを入れ、速度を典型的には最高速度の７５％または６，７５０ｒｐｍに調節する。Ｐ−２はソーキングチェンバーの底部からの蛋白質様の産物および同ユニットの頂上部からの臨界流体相の両方を引き込む。混合物は反時計回りにくみ出され、スタティックオンラインミキサーで混合され、そしてソーキングチェンバーに戻される。定められた滞留時間混合した後、Ｐ−２のスイッチを切る。続いて減圧バルブＰＶ−７を全開し、ソーキングチェンバーおよび高圧循環ループを減圧する。減圧の速度は、ＰＶ−７が１／４インチボールバルブの時には約５００ｐｓｉ／秒であった。減圧バルブＰＶ−７として１／４インチボールバルブの代わりに逆圧力（ｂａｃｋ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ）調節器を用いた場合、減圧の速度を調節できる。いくつかの実験において減圧の速度は約１，０００ｐｓｉ／分に調節された。減圧速度は速くても（５００ｐｓｉ／秒）遅くても（１，０００ｐｓｉ／分）、ウイルス感染性および生産物活性に与える臨界流体の影響に差は観察されなかった。後述の実施例１の実験は低速減圧で行い、後述の残りの実施例の実験は高速減圧で行った。減圧後、無菌的に無菌充填ベルに結合された試料ポート６０を通して、産物を無菌的に減圧チェンバー５０から滅菌フラスコに収集した。収集した試料は分析するまで氷上に貯蔵した。
本明細書中に記載されている実施例では、組換えネズミＣタイプレトロウイルスの試料は以下のように調製された。欠損Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス粒子（ウイルス核酸を欠くが、それ以外は野生型である粒子）を生産する細胞系列Ｐｓｉ−２（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９）を、レトロウイルスベクターＬＮＣＸ（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０）を含むプラスミドＤＮＡで形質転換（トランスフェクト）した。該レトロウイルスベクターＬＮＣＸは、ＬＮＣＸベクターのＳｔｕＩ部位にキメラ  ベータ−チューブリン遺伝子（Ｂｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：４６１−４６８）を挿入することによってあらかじめ修飾してあった。形質転換されたＤＮＡを恒常的に発現するクローン細胞系列が得られ、ウイルス生産ストックとして維持された。形質転換されたＤＮＡによって生成されたＲＮＡを欠損粒子にパッケージングすることによって、これらの細胞は、全体構造、安定性および感染の態様に関し完全に正常だが、野生型ではなくプラスミド由来の遺伝性物質（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，同書）を含む、感染性の粒子を生産する。
ＬＮＣＸ配列は抗生物質耐性遺伝子ｎｅｏおよび適当なプロモーターを含むので、組換えレトロウイルスによる細胞の感染は抗生物質ゲネチシン（Ｇ４１８）に対する細胞の耐性によって知ることができる。従って、細胞およびその子孫のゲネチシン耐性の獲得をウイルス力価を決定するための特性として利用した。具体的には、新鮮な培養培地（１０％鉄添加ウシ血清［Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ］、グルタミン［１ｍＭ］、ペニシリン［１００Ｕ／ｍｌ］およびストレプトマイシン［１００μｇ／ｍｌ］を添加したＤｕｌｅｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地）中、ウイルス生産細胞を高密度（５０％コンフルエント）で３７℃、１８時間、加湿した５％ＣＯ2雰囲気下で培養することによってウイルスストックを調製した。培養培地を収集し、０．２ミクロンフィルターを通し、アリコートに分配し、ドライアイス／エタノール浴を用いて素早く凍らせ、−８０℃で保存した。使用する直前に試料を３７℃の水浴で丁度解けるまで温め、氷上で保持した。単一のウイルス調製品のアリコートを後述の実施例のために使用した。
ウイルス含有試料を他の物質と混合して各実施例に記載するように処理した後、これを氷に戻して８時間以内にアッセイした。アッセイを行う前夜に、３５ｍｍの培養皿に上記培地３ｍｌ中のマウス繊維芽細胞系（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を１ウエル当たり１０，０００細胞の密度で播くことによって力価試験を行った。１０0（希釈せず）から１０-6までの各種希釈率で、ウイルス試料を細胞上の培地に加えた。いくつかの場合（指摘した場合）には、最終濃度２μｇ／ｍｌでウイルスとともにポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を加えた。ポリブレンは、見たところウイルス粒子の細胞表面への吸着を増強することによってレトロウイルスの感染力を１００倍まで増強するポリカチオンであり、ポリブレンはマウスレトロウイルスの力価をアッセイするのによく用いられている。ウイルスを加えた後、試験細胞をインキュベーターに一晩戻し、次いでゲネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）１ｍｇ／ｍｌを含む新しい培地中で洗浄した。続く２週間にこの培地を２−３回補充し、その後細胞のプレートを固定（リン酸緩衝溶液中の１０％ホルマリンで）し、クーマシーブルー染料で染色し、２５％エタノールで洗浄して風乾した。２週間の成長の間に、各ウイルス感染した細胞はゲネチシン耐性細胞のコロニーを生じる。ＬＮＣＸ−ゲノムは新しいウイルス粒子を生産するのに必要な機能をコードしないので、ウイルス感染粒子は近くの細胞に感染を広げない。したがって、最初の一晩にウイルスにさらした間に感染しなかった細胞はすべて抗生物質に感受性であり続け、２週間のインキュベーション中に死滅する。したがって、２週間目に存在するコロニー数（クーマシーブルー染色で見えたもの）によって、細胞に最初に適用された感染性ウイルス粒子の数が正確に得られる。ウイルスにさらされなかった細胞は２週間でコロニーを全く生産せず、また未処理ウイルスにさらした細胞は予期された数のコロニーを生産することを示すために、ここに示したすべての実施例と平行して対照実験を行った。
以下に記載する実施例を含む我々の実験の結果、臨界流体がウイルスに対して毒性でありうることを発見した。毒性の原因はまだ不明であるが、以下の少なくとも４つのメカニズムのいずれかを含むかも知れない：
ウイルス成分の抽出：臨界流体は優れた溶媒である。臨界流体は液体様の密度を示し、かつ同時に拡散率、粘性および表面張力などの気体様の性質も示す。臨界流体は細胞や副細胞構造に浸透できる（有機溶媒と同様の可溶化性を示す）。例えば、３，０００ｐｓｉｇで４０℃の超臨界二酸化炭素は０．８ｇ／ｃｃの密度をもち、気体の拡散率をもつ有機溶媒のようにふるまう。密度を変える（温度および／または圧力を変えることによる）ことによって溶媒和容量を容易に調整できる点、およびアルコールなどの極性共留剤の型と濃度によって選択性が変更できる点において、臨界流体は有機物に比べてより自由度が大きい。臨界流体によって破壊されるウイルス成分の１つは、細胞由来の脂質を含むウイルスエンベロープである。酵母細胞を用いた予備研究（図２参照）により、臨界流体が生物試料からのリン脂質の抽出に極めて有効であることが示唆された。図２ａは、未処理パン酵母フィードストックのヘキサン−イソプロパノール抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示し；標準品を用いて同定、定量された主要なリン脂質のピークがはっきりと示されている。図２ｃは、超臨界亜酸化窒素（ＳＣＦ  Ｎ2Ｏ）がパン酵母からのいくつかのリン脂質の放出に極めて有効であることを示す。図２ｂは、圧力、温度および時間が同じ条件における対照溶媒である超窒素（ＳＣＦ  Ｎ2）がパン酵母からのリン脂質放出にあまり有効でないことを示す。
爆発減圧（Ｅｘｐｌｏｓｉｖｅ  Ｄｅｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）：減圧すると臨界流体は大きな特異的容積変化を示す。例えば、３，０００ｐｓｉｇで４０℃から大気条件に減圧すると、超二酸化炭素は約４００倍膨張する。減圧が十分迅速である場合には、爆発減圧力は微視的構造の破壊にある役割を果たすのかも知れない。この現象を図３に示す；ここでは図１に示す装置を用いて酵母細胞を臨界流体ウイルス不活性化法に付した。上の走査電子顕微鏡写真は処理前の単一酵母細胞（倍率１５，６００倍）であり、下のプレートは処理後の酵母細胞（倍２０，６００倍）を示す。通常堅い酵母細胞壁が明らかに破壊されている。このような爆発力が酵母よりもかなり小さいウイルスの不活性化にも寄与した可能性があるが、直接の証拠はまだ得られていない。
ウイルス粒子の分解：ウイルス成分（タンパク質、核酸、および場合によっては脂質）は細胞中で自己凝集して感染性ウイルス粒子を生産する。タンパク質凝集の非共有結合力がこれらの粒子をまとめる主要な原因である。非常に高い圧力（例えば、２０，０００ｐｓｉｇおよびそれ以上）では、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−脂質の相互作用が破壊される。従って、我々が使用したような条件下ではウイルス粒子が部分的または全体的に分解した可能性がある。
化学修飾：大気条件下では、ほとんどのウイルスは化学的に極めて安定である。しかしながら、高圧条件下および臨界流体の存在下では、大気条件下では通常起こらない化学反応がかなりの率で起こることがある。このような反応の例としては、脂質の酸化（おそらくは亜酸化窒素によって触媒される）、または核酸の加水分解や化学修飾が挙げられ、これらはいずれもウイルス機能を阻害する。ウシ血漿に及ぼすウイルス不活性化法の極めて穏やかな効果（以下を参照）から、タンパク質はこの方法によって比較的影響されないことが示唆されたが、タンパク質を含む化学修飾も起きるかも知れない。
臨界流体がウイルスに毒性でありうることを示すことに加えて、生物活性タンパク質および小さい分子に及ぼす臨界流体ウイルス不活性化法の影響を調べた。もしも臨界流体不活性化が血漿、細胞培地、医薬物質、および組換えＤＮＡ手法により得られる物質などの生物学的試料中にあるウイルスの破壊に有用であるならば、この方法はこれらの物質中の有用成分に比較的無害でなければならない。タンパク質は温度、極端なｐＨおよびイオン強度、乾燥、非水性液体や界面活性剤にさらすことや機械的剪断さえ含む多くの要因によって変性する恐れがあるので、タンパク質がこの点に関して最も心配である。
臨界流体を用いる他のいくつかのバイオ分離方法に関する研究を行う間に、いくつかの天然または組み換えＤＮＡ蛋白質を異なる条件で種々の臨界流体に供した。バイオ医薬会社と共同で行った１つの特に明らかな研究において、商業的に重要な組み換えＤＮＡ成長ホルモンを超臨界流体で処理し、その活性を非常に精密なＨＰＬＣ技術（ＦＤＡおよびＷＨＯにより認可されている）により測定した。このデータによれば、（以下の実施例における条件と非常に類似した条件において）試験した蛋白質の活性および構造には、検出しうる変化はなかった。超臨界二酸化炭素は、酸性のｐＨの効果のため、流体媒体系として優れた候補ではないことが観察された。蛋白質に対するこの負の影響の他には、広い圧力範囲（０から１０，０００ｐｓｉｇ）にわたり、臨界流体による生物学的活性の有意な変化は検出されなかった。
ウイルスの不活性化に必要な条件が蛋白質性の生成物の有益な成分に非常に有害ではないことを示すためにいくつかの実験を行い、これを以下の実施例１、２、３および４に記載する。次に同様の条件を用いて、異なるレベルの蛋白質の存在下においてウイルス粒子の不活性化を行った。これらの実験は、以下の実施例５、６および７に記載する。
以下に記載する本発明の開示の実施例は、臨界流体のタイプ、補助溶剤の濃度、温度、圧力および時間等の変数が、ウイルス活性および生物学的活性の低下にどのように影響しうるかを示す。以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の臨界流体ウイルス不活性化方法は、これらの実施例により制限されるものではない。
実施例１
ウシ血漿に及ぼす超臨界二酸化炭素および亜酸化窒素の影響
臨界流体処理が血漿の有益な成分に悪影響を与えるか否かを評価するために、ウシ血漿を用いていくつかの実験を行った。無菌的に集め抗凝血剤（クエン酸ナトリウム）で処理したウシ血液を、冷却遠心分離機で１０℃において３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄みの血漿を図１に示す装置に導入して、表１の上半分に示される条件で臨界流体と接触させ、次に大気圧条件まで徐々に減圧した。
この一連の実験においては、２つの対照を用いた。ＣＦＩ−０は、未処理加工の血漿であり、ＣＦＩ−３は臨界流体を用いずに臨界流体ウイルス不活性化装置（ＣＦＩ）で処理したものである。後者の対照は、蛋白質その他の有益な成分に及ぼす混合の機械的影響を明らかにするためのものである。回収した試料を冷却遠心分離機において１０℃、３，０００ｒｐｍで３０分間回転させ、次に透明になった血漿を分析のためにタフツ大学獣医学診断研究所（Tufts University Veterinary Diagnostic Laboratory, Boston, MA）に送った。この分析の結果は、表１の下半分にまとめられている。この結果は、超臨界二酸化炭素が、ウシ血漿の有益な成分、すなわちアルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）およびクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）に対して悪影響を有しているが、超臨界亜酸化窒素の影響ははるかに小さいことを示す。
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実施例２
ウシ血漿に及ぼす臨界流体亜酸化窒素の圧力の影響
第２の実験は、超臨界亜酸化窒素を用いて異なる圧力において行った。処理から２４時間以内に、回収された血漿について、バイオラン研究所（Bioran Laboratories, Cambridge, MA）によるＳＭＡＣ分析を行った。すべてのＳＭＡＣの結果は、バイオラン研究所により反復され確認された。これらの実験の条件および分析の結果を表２に示す。実験の最後に、臨界流体とウシ血漿との混合物を急速に（約１００ｐｓｉｇ／ｓｅｃの速度で）減圧し、処理された血漿から臨界流体を分離した。表２に示される結果は、超臨界亜酸化窒素が、試験された圧力の範囲にわたり、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、ＡＫＰ、ＬＤＨ、アルブミン、トリグリセリド、およびコレステロールに対してほとんどまたは全く影響を及ぼさないこと、および１，０００から３，０００ｐｓｉｇのレベルの圧力に対して感受性がほとんどまたは全くないことを示す。実験ＣＦＩ−４からＣＦＩ−７のグルコース値が対照ＣＦＩ−００の約２倍であることに注目すべきである。第１の実施例において、４，０００ｐｓｉｇおよび４０℃におけるＳＣＦ  Ｎ2Ｏで処理したウシ血漿のグルコースレベルは対照とほぼ同一であるため（表１）、これらの結果を推測することは困難である。より高いグルコースレベルは、血漿の調製において除去されなかった赤血球細胞の臨界的破壊によって生じたものであるかもしれない。
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実施例３
ウシ血漿に対する臨界液の影響
種々の臨界液を用いて以下に記載する一連の試験を行った。ただし、対照であるＣＦＩ−００については試験条件を例外的に３，０００ｐｓｉｇ、４０℃で３０分とした。臨界液として、酸化二窒素（Ｎ2Ｏ）、エチレン（Ｃ2Ｈ4）、エタン（Ｃ2Ｈ6）、プロパン（Ｃ3Ｈ8）、トリフルオロメタン（ＣＨＦ3またはＦｒ−２３）、クロロジフルオロメタン（ＣＨＣｌＦ2またはＦｒ−２２）を用いた。これらの試験の条件および関連する熱力学的諸性質を、表３の上半分に示した。プロパンとフレオン−２２を除く溶媒は、すべて３０００ｐｓｉｇ、４０℃の試験条件下で超臨界状態にある。これらの臨界液とウシ血漿を用いた爆発的減圧試験の結果は表３の下半分に示すとおりであり、この試験結果は表２の対照値と比較することができる。グルコース濃度が２倍であり、ＣＦＩ−７からＣＦＩ−１２のＬＤＨに対する種々の悪影響があるものの、表３の最初の６つの試験臨界液の血液成分に対する影響は無視しうる程度であった。近臨界液フレオン−２２および超臨界液フレオン−２３は、試験前のＬＤＨ濃度を５０％を少し上回る程低下させ、影響が最も大きかった。
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実施例４
ウシ血漿の臨界液処理に対する滞留時間と操作温度の影響
３０００ｐｓｉｇにてＳＣＦＮ2Ｏで処理したウシ血漿中の諸有用成分に対する滞留時間と操作温度の影響を試験した結果を表４に示した。この結果は、時間よりも温度の方が、ＳＣＦＮ2Ｏで処理したウシ血漿に対する影響が大きいことを示している。例えば、３０℃で試験を行ったＣＦＩ−１４およびＣＦＩ−１５のグルコース、蛋白質およびＬＤＨに対する影響は、４０℃で試験したＣＦＩ−７の影響と比べると無視しうる程度であった。また、滞留時間が３０分であるＣＦＩ−１４と５分であるＣＦＩ−１５は、影響に有意差がなかった。
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実施例５
臨界液による培地中のマウスＣ型レトロウイルス不活性化に対する滞留時間の影響
マウスＣ型レトロウイルスと超臨界酸化二窒素を含有する培地３０ｍｌを用いて、約３０００ｐｓｉｇ、４０℃にて数種類の試験を行った。これらの試験（表５に示すＣＦＩ−１８、ＣＦＩ−１９およびＣＦＩ−２０）は、５−１２１分の異なる滞留時間において行った。表５に示すＣＦＩ−２１は、超臨界窒素を用いて類似の温度圧力条件下で３０分処理した。各試験の間には、上述のように試験器具を無菌脱イオン水ですすぎ、７および０．５ミクロンのフィルターを通した７０％エタノールで無菌化し、再び無菌脱イオン化蒸留水ですすいだ後、フィルターを通した圧縮窒素または空気で乾燥した。
各試験後、回収したサンプルを二等分し、一方を２５００ｒｐｍで１０分間回転沈降させて、上澄液を０．４５ミクロンのフィルターに通した。３Ｔ３線維芽細胞感染能とＧ４１８抵抗付与能を検討するための滴定試験を、６段階の希釈濃度を有する２．３ｍｌのサンプルを２つずつ用意して行った。回収したサンプルの滴定濃度を表５に示し、これを滞留時間の機能として図４に示した。これらの結果は、レトロウィルスの不活性化に対して、超臨界窒素は比較的小さな影響しか及ぼさないが、超臨界酸化二窒素はかなり大きな影響を与えることを示している。超臨界窒素の試験結果は、図３に示すようにリン脂質を溶解／遊離させない機能と関連づけることができる。一方、超臨界酸化二窒素は３０−１２１分でレトロウィルスを迅速に不活性化する。
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実施例６
血清中のネズミーＣレトロウイルスのウイルス不活性化に対する臨界的液体タイプおよび共溶媒の影響
いくつかの臨界的液体ウイルス不活性化実験を、血清中ネズミーＣレトロウイルスについて行った。蛋白質はウイルスの生活力に対して保護作用を有することが知られている。これらの実験を行って蛋白質に富む培地での臨界的液体ウイルス不活性化技術の効果を評価した。培地中のネズミーＣレトロウイルスを血清（血清はハイクロン胎仔牛血清とハイクロン鉄添加子牛血清との５０／５０混合物であった）と５０／５０の割合で混合して５等分した。実験はいくつかの臨界的液体、すなわち亜酸化窒素（Ｎ2Ｏ）、亜酸化窒素と２モル％エタノールとの混合物、クロルジフルオルメタン（ＣＨＣ1Ｆ2またはＦｒ−２２）およびプロパン（Ｃ3Ｈ8）について約３，０００ｐｓｉｇおよび４０℃で滞留時間３０分で行われた。それらのうち１つの臨界的液体実験（ＣＦＩ−２６）は６０℃で行った。これらの実験は表６に概括してある。臨界的液体で処理されないいくつかの対照実験を行った。それらのうち１つは４０℃で、他の１つは血清中２モル％エタノールと４０℃で、さらに他の１つは６０℃で行った。
力価の測定は対照について行い、ポリブレンによる増強なしの試料（６倍希釈で２重に実験）およびポリブレンによる増強を施した試料（４倍希釈で２重に実験）を回収した。力価測定の結果、２モル％エタノールは力価に影響しないが６０℃で加熱するとレトロウイルスを壊滅することが示された。表６に示された力価測定結果はポリブレンで増強したものでの測定結果である（これらの数値はポリブレンなしで測定された力価と一致する）。４０℃対照は６５，０００ｃｆｕ／２．３ｍｌの力価を有した。表６に列挙した結果は、蛋白質の存在が超臨界的亜酸化窒素の効果を１または２桁の大きさで低下させることを示している（表６中のＣＦＩ−２７を表５中のＣＦＩ−１８と比較せよ）。また、２モル％エタノールは殆どまたは全く超臨界的亜酸化窒素の作用に影響しなかった。しかし、フレオンー２２はネズミーＣレトロウイルスに有意の影響を及ぼし、血清と接触３０分後にウイルス活性を対数目盛りで約３．２低下させた。
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実施例７
血清中のネズミーＣレトロウイルスのウイルス不活性化に対する滞留時間、臨界的液体タイプおよび圧力の影響
実施例６の結果にもとづいて、いくつかの実験をフレオンー２２について約３，０００ｐｓｉｇおよび４０℃で行い、ウイルス減少能力に対する滞留時間の影響を測定した。これらの測定は表７に列挙され、フレオンー２２が検定の検出限界内で５分以内でウイル活性を除去できることを示している。
この実施例はまた、臨界的液体ウイルス不活性化の効力に圧力が有意の影響を及ぼすことを示している。表７のＣＦＩ−３４は超臨界的亜酸化窒素が５，０００ｐｓｉｇおよび４０℃で３０分の滞留時間にウイルス全部（検定の検出限界内で）を不活性化したことを示しているのに対し、表６でのＣＦＩ−２７は超臨界的亜酸化窒素が３，０００ｐｓｉｇおよび４０℃で３０分の滞留時間にウイルス活性を１．４ｌｏｇのみ低下させたことを示したにすぎない。
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参考文献
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上記の開示内容と実施例に基づけば、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、変形物（variations）および均等物（equivalents）は当業者にとってすぐにわかるであろう。したがって、実施例は例証のためにのみ挙げたものであって、変形物と均等物は次の請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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