(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド一リン酸の合成中に、安定化SH試薬を加えることなく、タンパク質を安定化することなく安定であり、そして４種の天然デオキシヌクレオシド全てを受け入れるキイロショウジョウバエ（Drosophila Melanogaster）由来の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼであって、下記の工程：
１）キイロショウジョウバエ（Drosophila Melanogaster）由来のデオキシヌクレオシドキナーゼのコード配列を単離すること、
２）誘導プロモーターを有する大腸菌（E.coli）用の好ましい発現ベクターに構造遺伝子をクローニングすること、
３）好ましい大腸菌（E.coli）宿主株において発現ベクターを形質転換すること、および
４）適切な誘導によって大腸菌（E.coli）においてキイロショウジョウバエ（Drosophila Melanogaster）由来のデオキシヌクレオシドキナーゼ遺伝子を発現させること、
を含む方法によって、大腸菌（E.coli）から取得可能な上記組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ。
【請求項２】
４種の天然デオキシヌクレオシド全てに対して少なくとも20U/mg（1U＝1μmol/分）の特異的活性を示す精製状態にある請求項１に記載の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ。
【請求項３】
全ての天然デオキシヌクレオシドに対して＞10000M-1s-1の特異性定数kc/Km を示す、請求項１または２に記載の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４】
デオキシヌクレオシドキナーゼが、37℃において、5mM MgCl2 を含むトリス緩衝液中でt1/2 ≧50時間、水中でt1/2 ≧25時間の半減期を有するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ。
【請求項５】
40〜60℃の広範な最適温度を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ。
【請求項６】
ヌクレオシド一リン酸の合成に対する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキイロショウジョウバエ（Drosophila Melanogaster）由来の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼの使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えデオキシヌクレオシドキナーゼがヌクレオシドのリン酸化に使用されるものである、ヌクレオシド一リン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は、ヌクレオシド一リン酸の合成中に、安定化SH試薬を添加することなく、タンパク質および界面活性剤を安定化することなく安定であり、そして４つの天然デオキシヌクレオシド全てを受け入れる、例えば、Drosophila Melanogasterのような昆虫細胞由来の組換えキナーゼである。本発明のさらなる主題は、本発明のキナーゼをコードするDNA配列、ならびに本発明のキナーゼの調製方法およびヌクレオシド一リン酸の合成中におけるその使用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
（デオキシ）−ヌクレオシドキナーゼは、それぞれ、ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドの対応するヌクレオチド一リン酸へのリン酸化を触媒するものであり、よってヌクレオチド代謝の「再利用経路」において重要な役割を果たす。
【０００３】
触媒反応は下記のとおりである：
【０００４】
【化１】
0004350235.tif 000002
【０００５】
デオキシヌクレオシド一リン酸は、PCR反応用の試薬として大いに用いられているデオキシヌクレオシド三リン酸の出発物質である。
【０００６】
デオキシヌクレオシド一リン酸は、現在、３つの方法：
１．魚精子の加水分解
２．デオキシヌクレオシドからの化学合成
３．デオキシヌクレオシドからの酵素合成
により得ることができる。
【０００７】
従来公知の方法にはいくつかの欠点がある。例えば、魚精子の加水分解では、４つの一リン酸エステル全てがほぼ同量ずつ製造される。このため、市場の要求を捉え損ねているのは事実である（例えば、部分的にd-TTPの代わりに用いられるd-UTPはd-CTPから調製される）。さらに、加水分解から得られるd-TTPは、約２％のd-UTPが混入しており、実質的に単離することができない。
【０００８】
さらに、この抽出物の動物起源は、調節の観点（GMP）から重大であるものと評価されなければならない。また、魚精子由来の一リン酸エステルの市場はかなり限定される。
【０００９】
化学合成では、クロマトグラフィーでの精製による単離が困難ないくつかの副生物が製造される。さらに、いくつかの塩基（例えばグアノシン）には合成時間をかなり増大させるリン酸化の前に保護基を付与しなければならない。
【００１０】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
当技術分野の現状の欠点は、デオキシヌクレオシド一リン酸の合成中に、安定化SH試薬を添加することなく、タンパク質および界面活性剤を安定化することなく安定であり、４つの天然デオキシヌクレオチド：チミジン（dThd）、デオキシシチジン（dCyd）、デオキシアデノシン（dAdo）およびデオキシグアノシン（dGuo）全てを受け入れる、特にDrosophila melanogaster（Dm-dNK）などの昆虫細胞由来の組換え多機能デオキシヌクレオシドキナーゼの提供により克服された。本発明においては、安定とは、触媒された反応の収率が37℃にて５時間以内、好ましくは10時間以内、特に好ましくは12時間以内に減少しないことを意味する。酵素がチオールを含む安定剤を添加することなくそのように長時間安定であることは驚くべきことである。今までその他のキナーゼにおいてはこの安定性は観察されていない（１〜９）。合成において本発明のキナーゼを用いる場合、これらの安定剤を省略することによって合成はより安価なものとなり、とりわけ生成物の精製が非常に簡略化され得る。
【００１１】
さらに、従来公知のキナーゼはかなり高い基質特異性を有する。その結果、個々のヌクレオシドの合成に対して、対応する特異的キナーゼを有することも必要ない。ジデオキシヌクレオシドまたは塩基−もしくは糖ー修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシド類似体の合成に対しては特異性が低いことが特に都合がよい。塩基−修飾ヌクレオシドは、例えば、塩基がレポーター基（染料、ジゴキシゲニン、ビオチン）で標識された7-デアザ-ヌクレオシド、C-ヌクレオシドおよびヌクレオチドである。糖−修飾ヌクレオシドは、例えば、アザチミジン、アラビノシル−チミジンである。公知の類似の酵素と比較したDrosophilaキナーゼの速度定数を図１に示す。本発明のキナーゼの特異的活性kcは、従来公知のキナーゼのものよりも数倍大きい。酵素の活性は、参考文献：Munch-Petersonら(1991) J. Biol. Chem. 266, 9032-9038に記載されたようにして測定した。このことにより、dNMPを合成するのに必要な酵素の量はかなり低くなる（3.5〜14000倍、図１のKc値参照）。本発明のキナーゼの特異性定数（kc/KM）は、いくつかの能力により従来公知のものを超えるものであり、拡散定数の範囲にある。このことにより、キナーゼをd-NMP合成に加える場合、完全な収率が得られる。それらは従来公知のキナーゼの２〜6500倍高い（図１参照）。
【００１２】
驚いたことに、本発明の酵素は反応操作に都合がよい60℃でも安定である。好ましくは、本発明の酵素は、T=37℃で、５mM MgCl2 を含むトリス緩衝液中においてt1/2 ≧50時間、水中においてt1/2 ≧25時間の半減期を有するものであり、全ての天然デオキシヌクレオシドを受け入れる（実施例６）。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、その他の非脊椎動物生物、特にDrosophilaキナーゼの特性に匹敵する特性を示す六脚類クラスのその他の動物種由来のキナーゼである。特に、上記の安定性および上記の基質特異性を本質的に有するキナーゼである。好ましいキナーゼは、有翅類のサブクラスから単離されたキナーゼであり、特に好ましいのは双翅類クラス由来のものであり、Drosophilidaeファミリー由来のものが特に好ましい。
【００１４】
本発明のさらなる主題は、本発明のキナーゼをコードするDNA配列ならびにその機能的断片である。本発明のDNA配列は、以下に示す配列：
GGGAAGTGGCAGGAGTAGCTCCCG（配列番号２）
CTCCCGTTGTAGCCGTCGCCCTTCTGG（配列番号３）
GACGACTGGCTCGGGCAGCTCTTCACCGCGTTG（配列番号４）
TTCGATTTTTATTACCTCGCGAGGTAA（配列番号５）
AGGTAAAAATCGCGAGCGATAACGAAGCAC（配列番号６）
CACCGCATGCTTGCGTAGGCCGTCGCCCGAGCAAGACTCCTC（配列番号７）
GACTACATGTTTCTAGGGTTCTTCACC（配列番号８）
を有するプライマーが本発明のキナーゼのDNA配列上にハイブリダイズするという特徴を有する。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、DNA配列上に、配列番号２、３、５、７および８または配列番号２、４、５、７および８または配列番号２、５、６、７および８を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするそのようなキナーゼおよびDNA配列でもある。
【００１６】
下記のハイブリダイゼーション条件が都合がよい：
−ハイブリダイゼーション：0.75M NaCl、0.15トリス、10mM EDTA、0.1％リン酸ナトリウム、0.1％SLS、0.03％ BSA、0.03％ Ficoll 400、0.03％PVPおよび100μd/ml煮沸子ウシ胸腺DNA、50℃にて約12時間。
−洗浄：0.1×SET、0.1％SDS、0.1％リン酸ナトリウムおよび0.1Mリン酸緩衝液で45℃にて３×30分。
【００１７】
本発明のキナーゼ配列を図５の配列番号１に示す。
本発明のDNA配列は、下記の手順によってDrosophila Melanogasterから取得可能である：
【００１８】
特にデオキシヌクレオシドキナーゼをコードする推定遺伝子を含有する1.1kbpのcDNAインサートを含むpBluescript SK +/-ファージミドは、Berkeley Drosophilaゲノム配列決定プロジェクト（クローンLD15983）から得た。ファージミドの多重クローニング部位（MCS）にEcoRIおよびXhoIによりクローニングされた1.1kbpのcDNAの5'末端の最初の600塩基対は、カリフォルニア大学（バークリー）のHarveyらによって既に配列決定されている。これらの配列情報に基づいて、新規プライマーを設計した（インサートの完全配列決定を可能にするDm-TK1およびDm-TK2/5'-TCCCAATCTCACGTGCAGATC-3'(配列番号９)および5'-TTCATCGAAGAGTCCATTCAC-3'(配列番号１０)）。Dm-TK1は、推定翻訳開始領域の上流に結合する21bpのセンスプライマーである。Dm-TK2は、既に配列決定されているcDNA部分の3'領域の21bpのセンスプライマーとして設計した。
【００１９】
この配列を用いて、750bpを含み、250個のアミノ酸を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを同定することができた。DNA配列、配列番号１を図５に示す。このタンパク質の分子量の計算値は29kDaであり、したがって天然Dm-dNKについて分子量は約30kDaであるとするMunch-Petersonら（1998年）によってに示されたデータと一致する。
【００２０】
配列情報から出発して、Dm-dNKをコードする構造遺伝子はpBluescript SK +/-ファージミドの1.1kb cDNAインサートから「ポリメラーゼ連鎖反応」技法（PCR）によって単離することができる（Mullis, K.B.およびFaloona, F.A., Methods in Enzymol. 155(1987)335-350）。このために、適切な発現プラスミドへのその後の挿入の対応するエンドヌクレアーゼ制限部位を有する特異的プライマー対（5'-GCGCGAATTCATGGCGGAGGCAGCATCCTGTGC-3'(配列番号１１)および5'-GCGCAAGCTTATTATCTGGCGACCCTCTGGC-3'(配列番号１２)）を合成した。例えば、5'−プライマー（Dm-dNK3）はコード配列の上流にEcoRIエンドヌクレアーゼ制限部位を有するが、3'-プライマー（Dm-dNK4）はコード配列の下流にHindIIIエンドヌクレアーゼ制限部位を含む。さらに、3'-プライマーはコード配列の下流に翻訳を安全に終結させるための２個の終結コドンを含む。さらに、E.coliにおける翻訳開始のために最適化された適当なプライマーは以下の配列：
配列番号１３(Dm-dNK3)
5'-CGCGAATTCATGGCGGAAGCGGCGAGCTGCGCGCGTAAGGGGACC-3'
配列番号１４(Dm-dNK4)
5'-CGCAAGCTTATTAACGGGCGACCCTCTGGC-3'
を有する。
【００２１】
pUC18におけるDm-dNKについての構造遺伝子のクローニング
PCR調製物をアガロースゲルに加えて、そのアガロースゲルから750bpの構造遺伝子を単離した。PCR断片をEcoRIおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で１時間切断した。同時に、pUC18プラスミドをEcoRIおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で１時間切断し、次いで調製物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、2635bpのベクター断片を単離した。その後、PCR断片およびベクター断片をT4-DNA-リガーゼによりライゲートした。次いで、１μl（20ng）のベクター断片および３μl（100ng）のPCR断片、１μlの10×リガーゼ緩衝液（Maniatisら, 1989 Molecular cloning, a Laboratory manual, Sambrok, Fritsch, Maniatis, Book 3, Section B27; Munch-Peterson(1991) J. Biol. Chem. 266, 9032)、１μlのT4-DNA-リガーゼ、二回蒸留した(bidist.)４μlの無菌H2O をピペットで加え、注意深く混合して16℃で一晩インキュベートした。
クローニングされた遺伝子を制限分析および配列決定によってチェックした。
【００２２】
適切な発現ベクターにおけるDm-dNKについての構造遺伝子のクローニング
Dm-dNKの発現のために、構造遺伝子を適当なプロモーター、好ましくは誘導プロモーター、特に好ましくはlac-、lacUV5-、tac-またはT5プロモーターの調節下で右方向に挿入するという方法で構造遺伝子を適切な発現ベクターにクローニングした。好ましい発現ベクターは、lac-もしくはlacUV5プロモーターを有するpUCプラスミドまたはpKKプラスミドである。
【００２３】
このことに関し、構造遺伝子をDm-dNKについてのプラスミドpUC18からEcoRIおよびHindIIIによって切り出し、制限調製物をアガロース電気泳動により分離し、約750bpの断片をアガロースゲルから単離した。同時に、発現ベクターをEcoRIおよびHindIIIで切断し、制限調製物をアガロースゲル電気泳動により分離し、得られたベクター断片をアガロースゲルから単離した。得られた断片を記載されたようにしてライゲートした。遺伝子が適切に挿入されていることは制限分析および配列決定によって確認した。
【００２４】
pUC18、pKK177-3、pKKT5も好ましい発現ベクターである。pKKT5が特に好ましい。発現ベクターpKKT5は、pKK177-3（Kopetzkiら, 1989, Mol. Gen. Genet. 216:149-155）から、tac-プロモーターをプラスミドpDS（Bujardら, 1987, Methods Enzymol. 155:416-433）から誘導されたT5-プロモーターと交換することによって得られる。EcoRI-エンドヌクレアーゼ制限部位をT5-プロモーターの配列から点突然変異により除去した。
【００２５】
種々のE.coli発現株における発現ベクターの形質転換
種々のE.coli株のコンピテント細胞をHanahanの方法（J. Mol. Biol. 166(1983) pp.557）にしたがって調製した。得られた細胞200μlを単離したプラスミドDNA（発現ベクター）20ngと混合した。30分間氷上でインキュベートした後、熱ショック（42℃で90秒）を行った。その後、細胞を１mlのLB-培地に移し、37℃にて１時間表現型発現のためにインキュベートした。この形質転換調製物のアリコートを選択マーカーとしてアンピシリンを含むLBプレート上に加え、37℃で15時間インキュベートした。
【００２６】
適切な宿主細胞はE.coli K12、JM83、JM101、JM105、NM522、UT5600、TG1、RR1ΔM15、E.coli HB101、E.coli Bである。
【００２７】
E.coliにおけるDm-dNKの発現
Dm-dNKクローン含有プラスミドを発現させるために、３mlのLbamp 培地中でインキュベートし、37℃でシェーカー内でインキュベートした。550nmにおける吸光度0.5で細胞を1mM IPTGを用いて誘導し、37℃で4時間シェーカー内でインキュベートした。続いて、個々の発現クローンの吸光度を測定し、OD550 が3/mlであるアリコートを採取し、細胞を遠心分離した（6000rpm、4℃で10分間）。細胞を400μlのTE緩衝液（50mM TRIS/50mM EDTA、pH8.0）に再懸濁し、超音波により解離させ、遠心分離（14000rpm、4℃にて10分間）により可溶性タンパク質画分を不溶性タンパク質画分から分離した。SDSおよびβ-メルカプトエタノールを含有する緩衝液を全ての画分に加え、タンパク質を煮沸（100℃にて5分間）により変性させた。その後、それぞれ10μlずつを15％分析SDSゲルにより分析した（Laemmli U.K.(1970) Nature 227:555-557）。
【００２８】
本発明のさらなる主題は、下記の工程：
−ヌクレオシドから出発して酵素として本発明のキナーゼを用いる酵素的リン酸化によるヌクレオシド一リン酸の合成
−リン酸基ドナーとしてのヌクレオチド三リン酸の触媒量での使用
−再生系（CK/CP; PK/PEP;アセチルリン酸／アシルキナーゼ、ピロリン酸／ピロホスホリラーゼ）によるリン酸基ドナーのin situ再生
によってより詳細に特徴付けられるヌクレオシド一リン酸の製造方法である。
【００２９】
本発明のヌクレオシド一リン酸としては、もともとのヌクレオシド一リン酸、デオキシヌクレオシド一リン酸、ジデオキシヌクレオシド一リン酸ならびにその他の糖−および塩基−修飾ヌクレオシド一リン酸が適用可能である。
【００３０】
本発明のさらなる主題は、ヌクレオシド一リン酸の合成における本発明のキナーゼの使用である。
【００３１】
【実施例】
実施例１
組換えDmキナーゼの製造および単離
E.coli株BL21をpGEX-2Tベクター（Amersham Pharmacia Biotec）で形質転換した。そのDmキナーゼの構造遺伝子はCaCl2 法によってクローニングした（Sambrook, Molecular cloning,第二版, Cold Spring Harbor Laboratory press）。形質転換コロニーを、50μg/mlのアンピシリンを含む100mlのLB培地（10mgのトリプトン、５mgの酵母抽出物、８mgのNaCl/l）に37℃にて一晩懸濁した。翌日、培養物をLB培地１ｌでOD 0.6に調節し、100μl IPTGにより発現を誘導した。一晩25℃の培養温度に維持し、細胞を遠心分離により集めた。細胞を100mlの緩衝液Ａ（20mMのリン酸カリウム（pH7.5）、５mMのMgCl2 、１mMのDTT、10％のグリセリン、１％のトリトンX100および0.1mMのフェニルスルホニルフロリド）に再懸濁した。混合物をフレンチプレスで粉砕した。ホモジナイズした物質を遠心分離（20000rpm/15分）し、１μmのWhatmanガラスマイクロフィルターおよび0.45μmの酢酸セルロースフィルターで濾過した。
【００３２】
ホモジナイズした物質をGSHカラム（15×45mm）にかけ、該カラムは10カラム容の緩衝液Ｂ（140mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4 、1.8mMのKH2PO4 、1mMのDTT、10％グリセロール、１％トリトンX100、0.1mMのフェニルスルホニルフロリド、５mMのベンズアミジン、50mMのアミノカプロン酸）で平衡化しておいた。カラムを50床容の緩衝液Ｂおよび10容の緩衝液Ｃ（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM NaH2PO4、1.8mM KH2PO4 ）で洗浄し、その後融合タンパク質を、400Uのトロンビンを含む１カラム容の緩衝液Ｃの２時間にわたる再循環によって分離させた。次いで、Dm-ヌクレオシドキナーゼを３カラム容の緩衝液Ｃで溶出した。
【００３３】
実施例２
チオールを添加した場合と添加しない場合のd-CMPの合成の比較
d-Cyt                 22mg
トリス緩衝液pH8.0      2ml
MgAc                  10mg
ATP                   66mg
d-NK                  0.132U
DTT                   7mg/0mg
【００３４】
収量はHPLCを用いてピーク面積の積分により測定する。
反応は、DTTを添加しない場合の調製ではそれほど遅くはなく、特に45時間後でも終結していない（図２参照）。
【００３５】
実施例３
d-GMPおよびd-AMPの合成
d-Adoまたはd-Guo         28mg
水                        2ml
MgAc                     32mg
ATP                       3mg
CK                       100U
d-NK                     0.396U
CP（クレアチンリン酸）   20mg
【００３６】
反応は減速することなく32時間進み、収率は80％以上であり、チオールは加える必要はない。トリス緩衝液の添加は必ずしも必要ない（図３参照）。
【００３７】
実施例４
d-CMPの合成
d-Cyt                22mg
トリス緩衝液pH8.0     2ml
MgAc                 32mg
ATP                   3mg
CK                   100U
d-NK                 0.132U
CP                   20mg
【００３８】
66時間後でさえ、チオール安定剤を含まないにもかかわらず酵素は依然として活性である。収率はほんの触媒量のATPを用いたにもかかわらず80％である（図４参照）。
【００３９】
実施例５
NMP、dd-NMPおよび塩基修飾d-NTPの合成
基質溶液
CP        250mg
ATP       7mg
酢酸Mg    160mg
25mlの50mMトリスpH8.0中
【００４０】
それぞれ0.5mlの溶液を約2.5mgの対応するヌクレオシドに加える。次いで、50Uのクレアチンキナーゼおよび0.32Uのd-NKを加える。
【００４１】
【表１】
調製          ヌクレオシド      時間              収率
─────────────────────────────────
ａ）          シチジン          15時間            90％
ｂ）          dd-アデノシン     70時間            40％
ｃ）          Iso-グアノシン     2時間            80％
【００４２】
実施例６
種々の温度でのD.Melanogaster由来のキナーゼの活性
Dm-ヌクレオシドキナーゼの活性を種々の温度で測定した。Dm-ヌクレオシドキナーゼは広範な最適温度を有し、最高は60℃である（図６参照）。
活性試験は参考文献No.14に記載されている。
【００４３】
実施例７
天然Dm-キナーゼと比較した組換えDm-キナーゼの活性
天然の単離されたDm-キナーゼと比較した組換えDm-キナーゼの活性を測定した。50mMトリスpH7.5＋2.5mM MgCl2 中で37℃にて種々の時間インキュベーションした後、残留活性を測定した。
【００４４】
組換えDm-キナーゼはBSAを添加しない場合安定であるが、天然キナーゼの活性は50分以内に＜20％に減少する。2.5mg/mlのBSAを加えることにより、天然キナーゼは同様に安定である（図７(A)および７(B)）。
【００４５】
MgCl2 の存在下でのトリス緩衝液における半減期は50時間であり、MgCl2 を加えない場合31時間であり、純水においては28時間である。天然Dm-キナーゼは同一条件下で半減期が＜12分である。
【００４６】
参考文献
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【００４７】
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【００４８】
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【００５５】
10．Hanahan D.(1983) J. Mol. Biol. 166:557。
11. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T.,(1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual second Edition, B.27 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(USA)。
【００５６】
12. Mullis, K.B.およびFaloona, F.A.(1987) Methods in Enzymol. 155:335-350。
13. Munch-Peterson B., Piskur J.およびSondergaard L.(1998) J. Biol.Chem. 273, 3926-3931。
14. Laemmli U.K.(1970) Nature 227:pp.555-557。
【００５７】
【配列表】
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【００５８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号10：合成ＤＮＡ
配列番号11：合成ＤＮＡ
配列番号12：合成ＤＮＡ
配列番号13：合成ＤＮＡ
配列番号14：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のヌクレオシドキナーゼの速度定数を示す（hTK1/2=ヒトチミジンキナーゼ1/2; hdCK=ヒトデオキシ−シチジンキナーゼ; hdGK=ヒトデオキシ−グアノシンキナーゼ; HSV=単純ヘルペスウイルス）。データは
ａ）Munch Petersenら, J. Biol. Chem. 266, 9032(1991); J. Biol. Chem. 268, 15621(1993),
ｂ）Biochem. Biophys. Acta 1250, 158(1995),
ｃ）BohmannおよびEriksson Biochemistry, 27 4258(1988),
ｄ）Wangら, J. Biol. Chemistry 268, 22847(1993),
ｅ）Iwatsukiら. J. Mol. Biol. 29, 155(1967),
ｆ）Blackら, J. Gen. Virology 77, 1521(1996),
ｇ）Maら, P.N.A.S. 93, 14385(1996)
から採用したものである。
【図２】実施例２に記載した条件下でのシチジンからのd-CMPの生成を示す。
【図３】実施例４に記載した条件下でのアデノシンからのd-AMP、グアノシンからのd-GMPの生成を示す。
【図４】実施例３に記載した条件下でのシチジンからのd-CMPの生成を示す。
【図５】クローンのDNA配列を示す。
【図６】  D.Melanogaster由来のヌクレオシドキナーゼの最適温度を示す。
【図７】単離されたDm-ヌクレオシドキナーゼと比較した組換えDm-ヌクレオシドキナーゼの安定性を示す。(A)はBSAを添加することなく測定したものであり、(B)はBSAを添加して測定したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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