(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素遺伝子を導入した細菌類の形質転換体を培養して酵素を生産するに際し、当該培養を、フィチン酸化合物を0.01〜１重量％添加した培地中で行うことによる、培養中における宿主菌からのプラスミドベクターの脱落防止方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物にベクターを用いて遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して酵素を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え操作により得られた微生物形質転換体による酵素の工業的生産において、高い生産性を得るには、培養中に宿主菌からのベクターの脱落を最小限に抑えることが重要である。このため、例えば、抗生物質耐性プラスミドをベクターとして用い、その抗生物質を培地に添加するなど、従来、種々の技術的工夫がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、工業レベルでこのような方法を用いると、廃水処理施設への負担が大きくなってしまうため、大規模なプラントでの実施は困難であり、これは、特にベクターが不安定な形質転換体を用いる場合には、大きな問題である。
【０００４】
従って本発明は、微生物の形質転換体を培養して酵素を生産するに際し、抗生物質を用いることなく形質転換体からのベクターの脱落を防止して、酵素の生産性を向上することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、形質転換体からのベクターの脱落防止にフィチン酸化合物が有効であり、これにより酵素の生産性が向上することを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、酵素遺伝子を導入した微生物形質転換体を、フィチン酸化合物を0.01〜１重量％含有する培地中で培養した後、酵素を取得する酵素生産方法を提供するものである。
更に本発明は、酵素遺伝子を導入した微生物形質転換体を培養して酵素を生産するに際し、当該培養を、フィチン酸化合物を0.01〜１重量％含有する培地中で行うことによる、培養中における宿主菌からのベクターの脱落防止方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、形質転換体とは、微生物体内にプラスミドベクター又はファージベクターを用いて外来遺伝子が導入された結果、その性質が転換された微生物をいう。
【０００８】
また形質転換の対象となる微生物としては、形質転換が可能であり、形質転換体が酵素を産生するものであればいかなるものでもよく、例えば(1) 原核菌類、すなわちマイコプラスマ類、細菌類、粘液細菌類、スピロヘータ類又は放線菌類、(2) 真核菌類、すなわち変形菌類、細胞粘菌類、ラビリンチュラ類、卵菌類、サカゲツボカビ類、ツボカビ類、接合菌類、子嚢菌類又は担子菌類、(3) 藻類等、種々の微生物が挙げられる。これらのうち、特に大腸菌、枯草菌等の細菌類及び酵母類が、増殖が速く操作が簡便な点で好ましい。
【０００９】
フィチン酸は、myo-イノシトールの六燐酸エステルであり、高等植物の種子や幼植物に、カルシウムとマグネシウムの複塩（フィチン）として多量に存在する。遊離のフィチン酸は、フィチンに対する酸の作用により得られ、これから種々の金属塩が得られる。
【００１０】
本発明者らの検討の結果、フィチン酸化合物によるベクターの安定保持作用は、フィチン酸化合物に結合している金属の種類にはあまり関係せず、フィチン酸そのものによるものであることが判明した。従って本発明では、フィチン酸化合物としては、フィチン酸のほか、フィチン等の各種フィチン酸金属塩のいずれをも用いることができる。
【００１１】
本発明ではフィチン酸化合物は微生物形質転換体の培養に使用される培地に添加して使用され、その量は、フィチン酸に結合している金属の形や使用するフィチン酸の純度によっても異なるが、通常、培地に対して0.01〜１重量％、特に0.01〜0.2重量％が好ましい。
【００１２】
本発明に使用される培地としては、微生物形質転換体による酵素の生産に通常使用されるものであれば、いずれのものであってもよく、形質転換体の種類に応じて適宜選択することができる。
【００１３】
培養条件も、フィチン酸化合物を培地に添加する以外は通常と同様である。
【００１４】
【実施例】
以下の実施例において、「ベクター保持率」とは、培養液中の総生菌数に対するベクターを保持している生菌数の比率をいう。
【００１５】
実施例１
（１）形質転換体の取得
発現ベクタープラスミドpHSP64にBacillus sp. KSM-AP1378株（FERM BP-3048）由来液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子を導入して得たpHSPLAMY2をプラスミドとして用いた（Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 872-877, 1992）。
これをB. subtilis ISW1214（ヤクルト本社製）にプロトプラスト形質転換法（Chang, S. et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111, 1979）により導入することにより、α-アミラーゼ生産能を有する形質転換体を得た。
【００１６】
（２）形質転換体の培養
肉エキス（ディフコ社製）1.0重量％、酵母エキスB-2（オリエンタル酵母社製）0.3重量％、ロイシン0.2重量％、DL-メチオニン0.2重量％、リン酸一カリウム0.05重量％、塩化カルシウム二水和物0.04重量％、硫酸マグネシウム七水和物0.02重量％、及びマルトース一水和物9.0重量％を含む培地20mlをそれぞれ500ml坂口フラスコに入れ、これに市販フィチン酸カルシウム（和光純薬社製）0.2重量％を添加し、常法により殺菌した。これに上記形質転換体を接種し、30℃で96時間培養した。24時間ごとにサンプリングを行い、培養液中の形質転換体のプラスミド保持率及び遠心上清のα-アミラーゼ活性を測定し、フィチン酸化合物無添加の場合と比較した。
【００１７】
（３）結果
この結果を表１（ベクター保持率）及び表２（α-アミラーゼ生産量）に示す。なお、ベクター保持率及び酵素力価は、以下のようにして測定した。
【００１８】
●ベクター保持率の測定：
酵母エキス（ディフコ社製）0.05重量％、トリプトン（ディフコ社製）1.0重量％、塩化ナトリウム1.0重量％、スターチアズール（シグマ社製）0.4重量％及び寒天1.2重量％から成る培地（LBプレート）に培養液を適量塗抹し、30℃で１日培養した。出現したコロニーから無作為に100個選び、テトラサイクリン15ppmを含むLBプレートに爪楊枝を用いて移植した。これを30℃で培養し、１日後に出現したコロニー数を計測した。移植したコロニー数に対する、抗生物質含有プレートに出現したコロニー数の比率をベクター保持率とした。
【００１９】
●酵素力価の測定：
0.5％可溶性澱粉を含む40mMグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.0）0.9mlに、適当に希釈した培養上清0.1mlを加え、50℃で反応させ、生成する還元糖を3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）法により定量した。すなわち、反応液1.0mlにDNS試薬1.0mlを加え、５分間、100℃で加熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈し、波長535nmで比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
【００２０】
【表１】
0004351308.tif 000002
【００２１】
【表２】
0004351308.tif 000003
【００２２】
表１及び２から明らかなように、培地にフィチン酸カルシウムを添加することにより、無添加の場合に比べて形質転換体のベクター保持率は著しく改善され、それに対応してαーアミラーゼの生産量も増加した。
【００２３】
実施例２
実施例１と同様の培地20mlに、フィチン酸を０〜８mg添加し、常法により殺菌後、実施例１で得た形質転換体を接種し、30℃で96時間培養した。培養後、培養液中の形質転換体のプラスミド保持率及び遠心上清のα-アミラーゼ活性を実施例１と同様にして測定した。この結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
0004351308.tif 000004
【００２５】
表３から明らかなように、遊離のフィチン酸を培地に添加しても、形質転換体のベクター保持率は著しく改善され、それに対応してαーアミラーゼの生産量も増加した。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物形質転換体の培養による酵素生産において、抗生物質を用いることなく形質転換体からのベクターの脱落を防止し、酵素の生産性を向上することができる。