(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列番号３または４のアミノ酸配列：
(1)ＲＰＬＰＰＲＦＧＣＶＰＬＧＣＬ（配列表配列番号３）
(2)ＮＳＧＳＩＣＧＦＳＶＰＷＹＳＣ（配列表配列番号４）
（Ｒはアルギニンを、Ｐはプロリンを、Ｌはロイシンを、Ｆはフェニルアラニンを、Ｇはグリシンを、Ｃはシステインを、Ｖはバリンを、Ｎはアスパラギンを、Ｓはセリンを、Ｉはイソロイシンを、Ｗはトリプトファンを、Ｙはチロシンをそれぞれ示す。）を含有し、ＭＣＰ−１と立体構造が類似し、抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ポリペプチドミミックス。
【請求項２】
ＭＣＰ−１とその受容体との相互作用を制御・調節する請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス。
【請求項３】
請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスと配列番号１のアミノ酸配列で表わされるジーン３蛋白質との融合体。
【請求項４】
請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス、あるいは請求項３記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスと配列番号１のアミノ酸配列で表わされるジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス、あるいは請求項２記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスと配列番号１のアミノ酸配列で表わされるジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる単球遊走阻害剤。
【請求項６】
抗ＭＣＰ−１抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得る請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスを発現しているファージクローンを単離することを特徴とする請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ペプチドミミックス（ｍｉｍｉｃｓ−模倣物の意）、その製造方法ならびにその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ケモカインとは白血球走化作用を有するサイトカインの総称である。約３０種が存在し、いずれも構造的に４つのシステイン残基の位置が保存され、約１万の分子量を有する。初めの２つのシステインの間にアミノ酸が１つ入るＣＸＣケモカインと、入らないＣＣケモカインに分別される。ＣＸＣケモカインは好中球に、ＣＣケモカインは単球またはマクロファージに作用する。これらのケモカインは炎症刺激により産生されることから、炎症時に炎症局所に白血球を誘導するものと考えられる（生化学、６９巻１２号、１３７３〜７７頁、１９９７年発行）。また、最近では走化作用以外にも、接着分子の発現、血管新生の抑制、脱顆粒、ヒスタミン遊離、抗腫瘍活性の増強、造血、器官形成への関与等が明らかになりつつある（呼吸、１７巻１号、２〜９頁、１９９８年発行）。従って、ケモカインを阻害する物質の、炎症性疾患への適用、すなわち、抗炎症剤、抗アレルギー剤等としての用途が期待されている。
【０００３】
標的細胞にはこのケモカインに対する受容体が存在する。現在９種類が同定されて、いずれも７回膜貫通型のＧ蛋白質結合性受容体ファミリーに属する。
【０００４】
Monocyte Chemoattractant Protein-1(ＭＣＰ−１)は７６個のアミノ酸からなる塩基性蛋白質で、その構造上からケモカインの中のＣＣサブファミリーに分類される。ＭＣＰ−１は単球に対して特異的な遊走活性を示す。また、単球表面の接着分子の発現にＭＣＰ−１が関与しており、炎症局所への単球の遊走、内皮細胞との接着および内皮下への浸潤というプロセスに深いかかわりを持つ。実際の疾患ではＭＣＰ−１は慢性関節リウマチ、肺線維症、腎炎等の慢性炎症性疾患、粥状動脈硬化症および種々の悪性腫瘍で産生が認められ、局所の単球・マクロファージの浸潤に重要な役割を果たしていると考えられている。また、近年ケモカイン受容体はＨＩＶ−１感染のコレセプター（補助受容体）であるという発見がなされ、ＭＣＰ−１のレセプターの一つであるＣＣＲ２もＨＩＶ−１感染のコレセプターのひとつであることが明らかにされている（ジャーナル・クリニカル・インベスト、１００巻、４９７〜５０２頁、１９９７年発行、参照）
【０００５】
最近、受容体−リガンド系における相互作用部位を同定する手段として、ファージランダムペプチドライブラリーを用いたスクリーニング法が注目されている（サイエンス、２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年発行）。これはファージの構成蛋白質であるｐ３分子をコードする遺伝子（ジーン３）にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子をコードする遺伝子を挿入することにより、当該ペプチド分子を含んだ形のｐ３分子（ジーン３蛋白質とランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子との融合体。以下、Ｇ３Ｐ体とも呼ぶ）をｆｄ−ｔｅｔファージ（繊維状一本鎖ＤＮＡのファージ）上に発現させ、ファージランダムペプチドライブラリーを作成し、パンニング等で目的とするペプチド分子を発現しているファージをスクリーニングし、当該ファージのジーン３遺伝子部分の塩基配列解析を行って、相互作用部位を決定する方法である。
【０００６】
この方法を用いて、抗ｐ５３モノクローナル抗体によるｐ５３分子上のエピトープの決定（ただし、ｐ５３と相同性が高い）、抗ｂＥＧＦ抗体によりスクリーニングされたｂＥＧＦ類似体がｂＦＧＦとその受容体ＦＧＦＲ−１の結合を阻害したこと、あるいは抗アセチルコリン受容体エピトープ抗体と結合するペプチド配列の発見（当該受容体とは相同性がないが、アセチルコリンと結合するか否かは言及せず）等が報告されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，ｐ５８〜７８，１９９５年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６３８〜４２および１０６４３〜４７，１９９３年発行）。
【０００７】
また、この手法をさらに発展させて、ＣＴＬＡ−４に関して、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を用いて、当該抗体が結合する標的分子の立体構造をアミノ酸の一次配列に依存せずに模倣する分子であり、且つ受容体−リガンドの相互作用を制御できるような分子を得る方法も報告されている（ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２６７〜２７０頁、１９９８年発行。）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、単球の遊走活性に密接に関与しているＭＣＰ−１の、受容体との相互作用を制御・調節することが可能なペプチドミミックスを提供することを目的とする。さらに本発明は当該ペプチドミミックスの単球遊走阻害剤としての利用を目的とする
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の事情を考慮して、さらに研究を行った結果、抗ＭＣＰ−１抗体と結合し、かつＭＣＰ−１の単球遊走活性に対する阻害効果を有するファージクローンを単離することに成功した。さらに、抗ＭＣＰ−１抗体と結合するＭＣＰ−１様ペプチドミミックスを同定し、本発明を完成した。
本発明は抗ＭＣＰ−１抗体と結合するＭＣＰ−１様ペプチドミミックス、当該ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融合体、当該ペプチドミミックスの単球遊走阻害剤としての用途、および抗ＭＣＰ−１抗体を用いてファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより当該ペプチドミミックスを得る方法に関する。
【００１０】
すなわち本発明は以下の通りである。
１）  以下の配列番号３または４のアミノ酸配列：
(1)ＲＰＬＰＰＲＦＧＣＶＰＬＧＣＬ（配列表配列番号３）
(2)ＮＳＧＳＩＣＧＦＳＶＰＷＹＳＣ（配列表配列番号４）
（Ｒはアルギニンを、Ｐはプロリンを、Ｌはロイシンを、Ｆはフェニルアラニンを、Ｇはグリシンを、Ｃはシステインを、Ｖはバリンを、Ｎはアスパラギンを、Ｓはセリンを、Ｉはイソロイシンを、Ｗはトリプトファンを、Ｙはチロシンをそれぞれ示す。）を含有し、抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ポリペプチドミミックス。
２）  ＭＣＰ−１とその受容体との相互作用を制御・調節する上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス。
３）  上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスと配列番号１のアミノ酸配列で表わされるジーン３蛋白質との融合体。
４）  上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス、あるいは上記３）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスと配列番号１のアミノ酸配列で表わされるジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる医薬組成物。
５）  上記１）に記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス、あるいは上記２）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスと配列番号１のアミノ酸配列で表わされるジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる単球遊走阻害剤。
６）   抗ＭＣＰ−１抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得る上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスを発現しているファージクローンを単離することを特徴とする上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスの製造方法。
【００１１】
【発明の実施の態様】
本発明において抗ＭＣＰ−１抗体と結合するＭＣＰ−１様ペプチドミミックスとは、抗ＭＣＰ−１抗体と結合する、ＭＣＰ−１と立体構造が非常によく類似している、ＭＣＰ−１のアミノ酸配列とは相同性がほとんどない、ＭＣＰ−１とその受容体との相互作用を制御・調節する、等の特徴を有するものである。全体では少なくとも８個のアミノ酸を有する分子であり、好ましくは１５個のアミノ酸からなるペプチドミミックスが例示される。
【００１２】
本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスの具体例としては、ＲＰＬＰＰＲＦＧＣＶＰＬＧＣＬ（配列表配列番号３；以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドミミックスを、後述する由来ファージクローンに基づいてＣ２７ミミックスともいう）、ＮＳＧＳＩＣＧＦＳＶＰＷＹＳＣ（配列表配列番号４；以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドミミックスを、後述する由来ファージクローンに基づいてＧ２５ミミックスともいう）等のアミノ酸配列からなるペプチド分子等が挙げられる。尚、各アミノ酸配列中の各記号は前述の定義のとおりである。
【００１３】
本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスは抗ＭＣＰ−１抗体と結合する為に必要な立体構造を保持した状態であればその使用形態は特に限定されず、何らかのキャリヤー上か、あるいは何らかの蛋白質に組み込まれた形態であるか、またはペプチド合成等により作成し得るペプチド単独の形態でも使用可能である。より具体的には前述のＣ２７ミミックス、Ｇ２５ミミックスならびにこれらのミミックスがジーン３蛋白質に組み込まれている態様であるＧ３Ｐ体（それぞれＣ２７−Ｇ３Ｐ、Ｇ２５−Ｇ３Ｐともいう）等が挙げられる。当該ペプチドミミックスは、それぞれのアミノ酸配列情報に基づきその立体構造を保持した状態で使用し、当該立体構造が保持された範囲であれば当該アミノ酸配列を欠失、置換、付加または修飾させてもよい。
【００１４】
本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスは、例えば、ＭＣＰ−１−受容体系に関与した分子間の結合を阻止し、且つＭＣＰ−１の立体構造を認識することができる抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用いて、１０8種類以上のランダムに並んだ少なくとも８個以上のアミノ酸を有するペプチド分子を提示する、ファージランダムペプチドライブラリーのスクリーニング、ファージクローンの選択、選択したファージクローンの回収、当該ファージからの精製といった一連の工程を行うことによって得ることができる。本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスは、精製した状態のものの他、ペプチドミミックスがその表面に提示されたファージとしても使用可能である。
【００１５】
本発明において使用される抗ＭＣＰ−１抗体は、ＭＣＰ−１−受容体系に関与した分子間の結合を阻害する能力のある抗体であればどのような動物種の抗体でもよく、サブクラスやアイソタイプは限定されないが、立体構造を認識することができる抗体が例示される。当該抗体としては、コンフォメーショナルエピトープを認識する抗体が挙げられる。
【００１６】
ここで、コンフォメーショナルエピトープを認識する抗体とは、エピトープの立体構造を認識する抗体、すなわち、その抗体の抗原結合領域がカウンターパートの立体構造の鋳型となるような抗体をいう。具体的には免疫沈降反応等抗原がネイティブな状態であれば結合できるが、抗原が変性状態にある場合に結合できない抗体のことであり、例えば還元状態下でのウエスタンブロッティング法では抗原と結合できない抗体、またはエピトープの構成アミノ酸配列をもとに合成されたリニアなペプチドには結合できないような抗体等が挙げられる。
【００１７】
本発明において使用される抗ＭＣＰ−１抗体の具体例としては、マウス抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体（Ｍ２７９、Ｅ１１、およびＦ９）が挙げられる。
【００１８】
当該Ｍ２７９ならびにＥ１１はＭＣＰ−１とその受容体との結合阻害活性を有する中和抗体であって、ＭＣＰ−１の一次構造を認識することができる。Ｍ２７９はＲ＆Ｄシステム社より販売されている。Ｅ１１はネイチャーバイオテクノロジー、１６巻、２６７〜２７０頁、１９９８年発行、での記載に準じて調製することができる。
【００１９】
また、Ｆ９は同じく中和抗体であって、ＭＣＰ−１の三次構造を認識することができる。Ｆ９もＥ１１と同じく、ネイチャーバイオテクノロジー、１６巻、２６７〜２７０頁、１９９８年発行、での記載に準じて調製することができる。
【００２０】
本発明で使用するファージランダムペプチドライブラリーは、ファージ表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子が提示されているものであれば、いかなる種類のファージベクターで構築されたものでも使用可能であり、具体的には公知の方法（サイエンス、２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年発行。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，ｐ５８〜７８，１９９５年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６３８〜４２および１０６４３〜４７，１９９３年発行。ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行等）によって作製され得る。ファージ表面に提示されるべく挿入される遺伝子は、８個以上、好ましくは１５個のアミノ酸からなるペプチド分子をコードするものが例示される。さらにランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子はファージの表面に提示されていれば、いかなるファージの構成蛋白質に挿入されていてもよいが、ジーン３蛋白質に挿入されたものが好ましい。ジーン３蛋白質のＮ末端から４番目のＡｌａと５番目のＧｌｙの間に８個以上、好ましくは１５個のランダムに並んだアミノ酸からなるペプチド分子が挿入されているものならば当該挿入されたペプチド分子の両端に延びるアミノ酸配列が、その挿入ペプチド分子の三次構造に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。
【００２１】
本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスの製造方法は、前述の抗ＭＣＰ−１抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることから開始する。スクリーニング法としては抗体をプレート上に固定化して使用する一般的なパンニング方法や、抗体を固定化したアフィニティーカラム法等を使用することができる。また、パンニング→ファージ回収→ファージの増殖→パンニングの工程を３回以上繰り返すことによって、目的のファージクローンを濃縮することができる。このようなスクリーニング法によって抗ＭＣＰ−１抗体に結合するペプチドミミックスをその表面に提示しているファージクローンを濃縮することができる。通常、このようにして得られたファージクローンは、抗体との結合力の差や保持されているアミノ酸配列の種類によって、いくつかのクローン集団に分類することができる。得られたファージクローンの遺伝子の塩基配列解析はジデオキシ法等の常法により簡単に行うことができる。
【００２２】
本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスは、その微細な受容体結合様式の違いにより、また、ＭＣＰ−１とその受容体の系に関与する分子の発現状態により、ＭＣＰ−１に対して正の制御または負の制御を行うことができる。特に炎症性疾患時のようにＭＣＰ−１−受容体系が異常亢進している場合には負の制御を行うことができる。故にＭＣＰ−１活性阻害剤あるいは単球遊走阻害剤として、また、慢性関節リウマチ、肺線維症、腎炎等の慢性炎症性疾患、アテローム、動脈硬化症、悪性腫瘍等の予防および治療に対して有用である。
【００２３】
本発明の医薬組成物ならびに単球遊走阻害剤は、有効成分である本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス、あるいはジーン３蛋白質と当該ＭＣＰ−１様ペプチドミミックスとの融合体を、必要に応じて適宜の医薬的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）等の製薬上必要な成分と混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等の態様にて経口的に、また注射剤等の態様にて非経口的に投与することができる。投与量は有効成分の種類（ペプチドミミックスの種類）、投与ルート、患者の病状および疾患の種類、体重、年齢、性別等に応じて適宜増減できるが、一般的には成人１日当たりペプチドミミックスの量で０．００１〜１０００ｍｇを、1日1回乃至数回に分けて投与するのが望ましい。
【００２４】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）ファージ・デイスプレイ・ライブラリーおよびパンニング
ファージランダムペプチドデイスプレイライブラリ−の構築およびマイクロパンニングは福本らの報告（ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行）に準じて行った。ｆｄ−ｔｅｔファージの改変体であるｆＵＳＥ５ベクター中のジーン３蛋白質（以下、Ｇ３Ｐとも呼称。このものはリーダー配列を切断して成熟型として存在する。）のＮ末から５番目の位置に１５残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチド分子を挿入した。種々のランダムペプチド分子をその表面に発現する各種ファージをライブラリーとして構築した。
【００２５】
続いて、抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体（Ｍ２７９、Ｅ１１、Ｆ９）を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーのパンニングを行った。当該抗ＭＣＰ−１抗体はファージを選択するための鋳型として使用した。ライブラリーをスクリーニングして、抗ＭＣＰ−１抗体に結合するファージクローンを単離した。
【００２６】
各種抗ＭＣＰ−１抗体をそれぞれ３５ｍｍのプラスチックプレート（岩城ガラス社製）に１０μｇコーテイングしたものに、先で調製したファージライブラリー〔５×１０12Transducing Unit（以下、ＴＵ）〕とを４℃で１６時間反応させた（パンニング）。未結合のファージを０．５％トウイーン２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩液（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス塩酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７．５）で洗浄後に、０．１Ｎ塩酸−グリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を用いて、各種抗ＭＣＰ−１抗体と結合したファージを溶出した。回収後に１Ｍトリス塩酸（ｐＨ９．１）で中和した。得られたファージを大腸菌Ｋ９１ｋａｎ（ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２６７〜２７０頁、１９９８年発行。）に感染・増殖させた。パンニングに用いる各種抗ＭＣＰ−１抗体量を５μｇ、１μｇと減らしながら同じ操作を繰り返し、より強く特異的に抗ＭＣＰ−１抗体と結合するファージクローンを選別した。
【００２７】
得られた約１００個のファージクローンについてＥＬＩＳＡ法による一次スクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト社製）に各種抗ＭＣＰ−１抗体  １００ｎｇ／４０μｌ／穴を用いて４℃で一晩コーテイングした。１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ社製）を含むＴＢＳ１００μｌを用いて室温で２時間ブロッキングした。０．５％トウイーン２０を含むＴＢＳでプレートを洗浄し、各種ファージクローン２×１０10ビリオン／４０μｌ／穴およびビオチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ファルマシア社製）４０ｎｇ／４０μｌ／穴を添加した。１０００分の１に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ストレプトアビジン（ベクターラボ社製）を室温で１時間反応させ、洗浄後に基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム６水和物（和光純薬）を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。７個のクローンが抗ＭＣＰ−１抗体と特異的に結合した。
【００２８】
さらに、抗ＭＣＰ−１抗体と特異的に結合した７個のファージクローンについて、それぞれのＧ３Ｐ体（すなわち各ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融合体）を福本らの報告（上記）に準じて精製した。
【００２９】
（２）  パンニングにより選択したファージに挿入されているＤＮＡの配列解析ジーン３蛋白質に組み込まれた各種ペプチドミミックスのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製の３７３Ａ−３６Ｓ型）を用いて解析した。プライマーとして以下の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
TGAATTTTCT GTATGAGG （配列表配列番号２）
結果、ジーン３蛋白質のアミノ酸配列（配列表配列番号１）の４番目のＡｌａと５番目のＧｌｙの間に挿入されているペプチドミミックスは配列表配列番号３または配列表配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものの２種類に分類できた。
配列表配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドミミックスが挿入されているファージクローンの代表的なものとしてＣ２７ファージ、配列表配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するペプチドミミックスが挿入されているファージクローンの代表的なものとしてＧ２５ファージをそれぞれ得た。尚、便宜上、上記ファージ由来の挿入されたペプチドミミックスはその由来に因んでそれぞれＣ２７ミミックス、Ｇ２５ミミックスと、さらにそれらのペプチドミミックスが挿入されているジーン３蛋白質（Ｇ３Ｐ体）をそれぞれＣ２７−Ｇ３Ｐ、Ｇ２５−Ｇ３Ｐという。
【００３０】
同定された二種類のペプチドミミックスのアミノ酸配列には明確な共通配列は見当たらなかった。さらにジーンワークス（帝人）あるいはＰＩＭＡ法によりこれらのミミックスとＭＣＰ−１とのホモロジー検索を行ったが、一次配列に類似性を示さなかった。Ｃ２７、Ｇ２５ミミックスは２個のシステイン残基を有していた。
【００３１】
実験例１
各種抗ＭＣＰ−１抗体（Ｍ２７９、Ｅ１１、Ｆ９）、マウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体（ＭＯＰＣ−２１、ファーミンゲン製）を用いて、実施例１で得られたファージクローンとの反応性を確認した。分析は実施例１のＥＬＩＳＡ法によった。その結果、いずれのミミックスとも抗ＭＣＰ−１抗体とは特異的に結合したが、ＩｇＧ１κ抗体とは反応しなかった。結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0004298051.tif 000002
【００３３】
実験例２
ファージクローンのＭＣＰ−１受容体への結合活性をＦＡＣＳにより確認した。
ＭＣＰ−１受容体発現細胞として、ＴＨＰ−１細胞（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（８），４６４６〜５４頁，１９９９年発行による）を用いた。ＴＨＰ−１細胞（５×１０5）をマウスＩｇＧ  ４００μｇ／ｍｌと１時間反応して、Ｆｃ受容体をブロックした。このものは、抗ＣＣＲ２モノクローナル抗体と反応することを別途確認した。
２％ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ3を含むＰＢＳで洗浄し、ＭＣＰ−１を２０μｇ／ｍｌ加え、あるいは加えないで１時間反応させた。細胞を洗浄し、各種ファージクローン３．３×１０13ビリオン／ｍｌを加えて1時間反応させた。細胞を洗浄し、ビオチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体３３μｇ／ｍｌを加えて３０分間反応し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（ラインコ社製）を用いて検出した。反応は氷上で行った。分析はコールターＥＰＩＣＳ  ＸＬによった。Ｌ４ファージ（抗ＭＣＰ−１抗体との結合性を有しないファージ）を対照ファージクローンとして用いた。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
0004298051.tif 000003
【００３５】
Ｃ２７ファージ、Ｇ２５ファージはＴＨＰ−１細胞に結合し、ＭＣＰ−１でその結合が阻害されることが判明した。
【００３６】
実験例３
ファージクローンの単球遊走阻害活性をケモタキス阻害分析法を用いて確認した。分析には４８穴ケモタキス・チャンバーと孔径５μｍのポリカルボネート・フィルター（いずれもニューロプローブ社製）を使用した。下層チャンバーに１０ｎＭ  ＭＣＰ−１を３０μｌ加え、上層チャンバーにＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cell（末梢血単核細胞）；４×１０4／４０μｌ）４０μｌと各種濃度（１×１０6〜１×１０10ビリオン／ｍｌ）のファージクローン１０μｌ加えた。３７℃、５％二酸化炭素下で９０分間反応させた後に、フィルターをＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色し、顕微鏡で遊走細胞を数えた。結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
0004298051.tif 000004
【００３８】
Ｃ２７ファージ、Ｇ２５ファージはＰＢＭＣの遊走、すなわち、単球の遊走を阻害することが判明した。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスは、単球の遊走に密接に関与しているＭＣＰ−１の、受容体との相互作用を制御・調節することが可能であり、単球遊走阻害剤として有用である。
炎症反応におけるＭＣＰ−１の作用を考えると、本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックスは、各種炎症性の疾患に適用可能である。
【００４０】
【配列表フリーテキスト】
配列表配列番号２：シークエンシングプライマーとして作用するよう設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表配列番号３：抗ＭＣＰ−１抗体によって認識されるペプチド。
配列表配列番号４：抗ＭＣＰ−１抗体によって認識されるペプチド。
【００４１】
【配列表】
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