(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ（ＰＡＦ−ＡＨは、Platelet-activating factor acetylhydrolaseの略称である）に対するモノクローナル抗体を用いて、血液検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質を酵素免疫定量法に従い定量検出し、アポリポ蛋白質Ｂを免疫学的定量法に従い定量検出し、これらの定量値を基に血液検体中のアポリポ蛋白質Ｂ量当たりのヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量を算出し、当該算出値が健常者に対して低値であることを、検体提供者における、高脂血症又は糖尿病の指標とすることを特徴とする、ＰＡＦ−ＡＨの検出方法。
【請求項２】
ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体を用いた、血液検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質の定量検出が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われることを特徴とする、請求項１に記載のＰＡＦ−ＡＨの検出方法。
【請求項３】
ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体及びアポリポ蛋白質Ｂに対する抗体を構成要素として含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＰＡＦ−ＡＨの検出方法を行うための検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内の脂質代謝に関連する特定成分の、モノクローナル抗体を用いる検出方法に関する発明である。当該検出方法を行うことにより、高脂血症又は糖尿病の検出を行うことができる。
【０００２】
【従来の技術】
脂質代謝において、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）は抗動脈硬化的作用を有し、冠動脈疾患に対して予防的に働いていると考えられている。ＨＤＬの抗動脈硬化的作用は、ＨＤＬを構成しているアポリポ蛋白質〔例えば、アポリポ蛋白質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）〕などのリポ蛋白質構成蛋白質や血液中でＨＤＬに結合している蛋白質〔例えば、アポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）、アポリポ蛋白質Ｆ（ａｐｏＦ）、アポリポ蛋白質Ｊ（ａｐｏＪ）、paraoxonase （ＰＯＮ）など〕、あるいはＨＤＬに結合または作用し、ＨＤＬの粒子サイズ、構造、機能を変化させる作用をもつ蛋白質（例えば、lecithin:cholesterol acyltransferase（ＬＣＡＴ）、lipoprotein lipase（ＬＰＬ）、hepatic lipase（ＨＴＧＬ）、phospholipid transfer protein （ＰＬＴＰ）など）の働きによると考えられている。すなわち、前者のＨＤＬ結合蛋白質は脂質の抗酸化作用を有し、後者のＨＤＬに作用する蛋白質は末梢細胞から余剰のコレステロールを引き抜き、肝臓へ戻すコレステロール逆転送に関与していると考えられている。
【０００３】
このような、脂質代謝に関連する要素のうちのいくかは、自覚症状として認められ難い、動脈硬化の進行等を検出するための指標として用いられている。特に、血清脂質の検査は、以前より、一般的に行われているが、さらに一歩突っ込んだ、動脈硬化等に関する知見を得るために、種々の要素を、動脈硬化等を検出するための指標として用いる試みがなされている（例えば、特開２０００−３３３６７４号公報等）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
動脈硬化やこれに関連する生活習慣病は、脂質代謝に深く係わっており、脂質代謝の複雑性が明らかになるにつれて、動脈硬化等を、さらに多面的にとらえるために、新たな動脈硬化等に関連する指標が必要となっている。
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、脂質代謝に関連する要素のうち、動脈硬化等に対する新たな指標となり得るものを見出し、この指標による、動脈硬化等の検出手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討の結果、脂質代謝に関連する要素のうち、血漿型Platelet-activating factor acetylhydrolase（本件明細書において、ＰＡＦ−ＡＨともいう）に着目し、これを指標として利用する、高脂血症又は糖尿病に対する新たな検出手段を提供するに至った。
【０００７】
つまり、本発明者は、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体を提供し、さらに、このモノクローナル抗体を用いたヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの検出方法により、血漿型ＰＡＦ−ＡＨの異常が関係していると考えられている疾患である、高脂血症又は糖尿病の診断に用いることが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体（以下、本モノクローナル抗体ともいう）を用いて、血液検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質を酵素免疫定量法に従い定量検出し、アポリポ蛋白質Ｂを免疫学的定量法に従い定量検出し、これらの定量値を基に血液検体中のアポリポ蛋白質Ｂ量当たりのヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量を算出し、当該算出値が健常者に対して低値であることを、検体提供者における、高脂血症又は糖尿病の指標とすることを特徴とする、ＰＡＦ−ＡＨの検出方法（これを「本検出方法」ともいう）、を提供する発明である。
【０００９】
なお、本明細書において、血漿型ＰＡＦ−ＡＨまたはＰＡＦ−ＡＨは、特に断わらない限り、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを意味するものとする。
血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、ＰＡＦ（1-O-alkyl-2-acetyl- sn-glycero-3-phosphocholine)のsn-2位のアセチル基を加水分解するホスホリパーゼA2活性を有し、ＰＡＦの有する生理活性、すなわち細胞活性化、炎症アレルギー反応、血管収縮、喘息、アポトーシスなどを不活性化することが知られている（Ho YS et al., Nature, 385:89-93, 1997 ）。また、ＰＡＦ−ＡＨは、カルシウム非依存性の酵素活性を示し、中性リパーゼやセリンエステラーゼ同様、Gly-X-Ser-X-Gly モチーフを有している。
【００１０】
血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、肝臓と単球由来マクロファージで合成され、その産生はインターフェロン（ＩＮＦ）−γ、lipopolysaccharide（ＬＰＳ）により合成が抑制されるが、他のサイトカイン〔例えば、ＩＮＦ−α、インターロイキン（ＩＬ）−１ａ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、tumor necrosis factor （ＴＮＦ）−α、granurocyte/macrophage colony-stimulating factor（Ｇ／Ｍ−ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ〕は影響されない特徴をもつことが知られている(Cao et al., J.Biol Chem, 273:4012-4020, 1998)。
【００１１】
血漿型ＰＡＦ−ＡＨ活性は、血中の低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール濃度と正相関し、スタチン系高脂血症治療薬の服用により、ＬＤＬコレステロールの低下に比例して、ＰＡＦ−ＡＨ活性も低下が認められることが知られている（Guerra et al., J Lipid Res, 38:2281-2288, 1997）。また、血漿型ＰＡＦ−ＡＨ活性は、家族性高コレステロール血症において、ＬＤＬコレステロールと正相関するが、家族性低ベータリポ蛋白質欠損症では相関が認められないことから、ＰＡＦ−ＡＨ活性は、血中におけるＬＤＬの代謝回転率を示していると考えられる。さらに、家族性高コレステロール血症において、ＬＤＬ中のリゾホスファチジルコリン（lysoPC）／スフィンゴミエリン比は、血漿型ＰＡＦ−ＡＨ活性と、lysoPCの上昇と正相関し、さらに低ＨＤＬコレステロール血症では、ＨＤＬ中のＰＡＦ−ＡＨ活性の低下が認められることから、家族性高コレステロール血症における動脈硬化促進作用、あるいは冠動脈疾患へのハイリスクはＨＤＬのＰＡＦ−ＡＨ活性の低下によるＨＤＬの抗動脈硬化作用、あるいは抗酸化作用の低下に起因することが考えられる（Karabina et al., Eur J Clin Invest, 27:595-602, 1997）。
【００１２】
血漿型ＰＡＦ−ＡＨ欠損症は、常染色体優性遺伝形式をとり、日本人の重症喘息患者に発見されている（Stafforini et al, J Clin Invest, 97:2784-2791, 1996 ）。後天性ＰＡＦ−ＡＨ欠損症は、重篤な炎症を伴ういくつかの疾患で発見されている。日本人においては、約４％がホモ型欠損症で、約２７％のへテロ型欠損症が存在すると考えられる。
【００１３】
血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、sn-2位にエステル結合した短鎖脂肪酸、特に、酸化修飾によりフラグメント化したリン脂質のアシル結合脂肪酸を加水分解する。Minimally modified  ＬＤＬ (ＭＭ−ＬＤＬ) にＰＡＦ−ＡＨを作用させると、ＭＭ−ＬＤＬが誘導する単球の内皮細胞への結合が阻害される。これは同様の現象が、ＨＤＬを作用させても生じることから、ＰＡＦ−ＡＨが酸化修飾されたリン脂質をリゾリン脂質にすることにより、ＭＭ−ＬＤＬ中の生物学的活性を有する脂質を、除去あるいは不活性化することによる（Stremler et al, J Biol Chem, 266:11095-11103, 1991; Watson et al, J Clin Invest, 95:774-782, 1995 ）と考えられる。
【００１４】
しかしながら、血漿型ＰＡＦ−ＡＨが、直接的な高脂血症又は糖尿病の臨床的な指標となり得ることについては、未だ知られておらず、特に驚くべきことに、本検出方法を用いることにより、血液検体中のアポリポ蛋白質Ｂ量当たりの血漿型ＰＡＦ−ＡＨの蛋白質量が健常者に対して低値であることを、高脂血症又は糖尿病の直接的な臨床的指標として用いることが可能となる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本モノクローナル抗体とハイブリドーマ：
本モノクローナル抗体は、上述のように、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体である。
【００１６】
このようなモノクローナル抗体を得るための前提条件として、適切な免疫抗原を選択して用いることが必要である。本発明においては、免疫抗原として、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを用いることが好適である。
【００１７】
ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、天然のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを、単離・精製して用いることも可能であり、組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを製造して用いることも可能である。これらのヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨについての基礎的な知見を基に、常法を行うことにより得ることができる。
【００１８】
天然のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの単離・精製は、例えば、ヒトの血漿画分を、さらに分画を行い、その中から、ＰＡＦ−ＡＨ活性〔活性測定法は、例えば、Tew et al.,Arterioscler Thromb Vasc Biol.,vol.16,pp591-599(1996)〕を伴う画分を、単離・精製することにより行うことができる。
【００１９】
また、組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、既に知られている、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質遺伝子の塩基配列(Tjoelker LW,et al.,Anti-inflammatory properties of a platelet-activating factor acetylhydrolase.Nature,374,549-533)を基にして、例えば、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を、常法により行い、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子を入手して、これを基に製造することが可能である。
【００２０】
まず、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子の５’末端側と３’末端側の配列を含むＤＮＡ断片をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を行うことにより、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子を大量に増幅させて入手することができる。さらに、ホスファイト−トリエステル法[Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984)] 等の公知の方法を用いて、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子を化学合成することも可能であり、このような化学合成法を応用したＤＮＡシンセサイザーを用いて、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子を合成することもできる。
【００２１】
このようにして調製することができるヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ遺伝子を、この遺伝子を発現可能な遺伝子発現用ベクターに組み込み、このベクターに対応する宿主に、この組換えベクターを導入して形質転換を行い、この形質転換体を培養して生産させることによって、組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを入手することができる。
【００２２】
本モノクローナル抗体の免疫抗原としては、上述のようにして得られるヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの全部または一部を用いることができる。特に、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの一部を、免疫抗原として用いる場合には、これをペプチド合成法、例えば、固相法や液相法により、容易に合成することができる。また、ペプチドシンセサイザーを用いて合成することも、勿論可能である。また、他の方法、例えば、上述のようにして得られたヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対して、酵素処理等を施して所望するペプチドを得る方法や、所望するアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え体から、そのアミノ酸配列のペプチドを得る方法等を用いることも可能である。また、このような他の方法により得られるペプチドにおいても、所望する抗原決定基としての特性を失わない範囲で、必要に応じてアミノ酸配列を改変することも可能である。
【００２３】
さらに、特に、小分子量のペプチドにおいては、モノクローナル抗体の免疫反応性を向上させるために、ハプテンを結合させてることができる。
このハプテンとしては、通常、ハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、傘貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
【００２４】
上記のペプチドとハプテンを結合させるために、架橋剤を用いることができる。かかる架橋剤は、選択するハプテンの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、後述する実施例のように、ハプテンとして、傘貝ヘモシアニンを選択する場合には、ｍ−マレイニミドベンジル−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）等を用いることができる。なお、選択する架橋剤の種類に応じて、必要な処理を、上記のペプチドに施すことができる。例えば、上記のＭＢＳを架橋剤として用いる場合には、結合反応に必要なスルフィド結合を有するシステイン残基を、上記ペプチドの両末端のいずれかに付加することが必要である。また、選択したペプチドにおけるシステイン残基は、これを他のアミノ酸に置換するか、保護基を結合させることによって保護することが好ましい。
【００２５】
本モノクローナル抗体を製造するために、上述のようにして得られる免疫抗原で免疫される動物も、特に限定されるものではなく、マウス、ラット等を広く用いることが可能であり、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００２６】
免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
より、具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に、２週間程度毎に、上記手法により数回投与し、本モノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができる。
【００２７】
モノクローナル抗体を製造する場合、この免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
【００２８】
上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495(1975)）等に準じて行うことができる。
【００２９】
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
【００３０】
所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
【００３１】
目的とするモノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタロニー法、ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。
【００３２】
このようにして得られるヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する、本モノクローナル抗体を産生する本ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
【００３３】
本ハイブリドーマからの本モノクローナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
【００３４】
なお、インビトロで免疫細胞を、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ、または、その一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることで本モノクローナル抗体を得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53: 261(1982)；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96:1149(1983））。
【００３５】
また、上記のようにして得られるモノクローナル抗体は、更に塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。
【００３６】
このようにして得られる本モノクローナル抗体は、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対して特異反応性を有する抗体である。
この、「ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対して特異反応性を有する」とは、本モノクローナル抗体は、少なくとも、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対しては交差反応性を示す、という意味である。
【００３７】
このような性質の本モノクローナル抗体は、後述するように、臨床において用い得ることは勿論のこと、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ自体の分離・精製のための試薬としても極めて有用である。
【００３８】
本モノクローナル抗体の、より具体的な内容は、実施例において後述する。
このようにして得られる本モノクローナル抗体を、必要に応じて標識物質で標識して、後述する本発明に係わる測定方法等において用いることができる。
【００３９】
かかる標識物質は、その標識物質単独で又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。
【００４０】
これらの標識物質による、本モノクローナル抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いることができる。
【００４１】
また、本モノクローナル抗体（標識されたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化モノクローナル抗体として、後述する本検出方法等に用いることもできる。
【００４２】
本モノクローナル抗体は、必要に応じて、不溶性担体に固定化して用いることができる。かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。
【００４３】
これらの不溶性担体における、本モノクローナル抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体において既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００４４】
本検出方法
本検出方法は、上述したように、本モノクローナル抗体を利用して、血液検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを、酵素免疫定量法に従い定量検出することを含む、ＰＡＦ−ＡＨの検出方法である。
【００４６】
酵素免疫定量法（エンザイムイムノアッセイ法ともいい、以下、このように称する）は、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。エンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする”ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ”と、このＢ／Ｆ分離を必要としない”ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ”とに大別される。本検出方法においては、これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる、前者の”ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ”を選択するのが好適であり、イムノソルベントを用いる、”ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”  を選択するのが、特に好適である。
【００４７】
ＥＬＩＳＡの、典型的な検出態様として、いわゆるサンドイッチ法による、エンザイムイムノアッセイ法（以下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができる。サンドイッチ法は、特に、操作の簡便性、経済上な利便性、とりわけ臨床検査における汎用性を考慮すると、特に好適に検出態様の一つとして挙げられる。
【００４８】
サンドイッチ法を行うに際しては、本モノクローナル抗体が、９６穴マイクロプレートに代表される、多数のウエルを有するマイクロプレートに固定化された、固定化モノクローナル抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素やビオチン等により標識された本モノクローナル抗体を用いることが好適である。
【００４９】
サンドイッチ法は、少なくとも、下記(a) および(b) の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法である。
(a) 不溶性抗体に、本モノクローナル抗体（第１抗体）を固定化した、固定化モノクローナル抗体に、血液検体等の検体を反応させる工程。
【００５０】
この工程(a) においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体は、固定化モノクローナル抗体から除去される。
(b) 固定化モノクローナル抗体と、検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨとの結合により形成される、抗原抗体複合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素やビオチン等に標識された本モノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
【００５１】
この工程(b) においては、反応させた第２抗体における標識物質の種類に応じた標識シグナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。例えば、標識物質として、ビオチンを選択した場合には、アビジンやストレプトアビジンを用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。また、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、その酵素の基質を発色物質と共に添加して、標識シグナルを顕在化させることができる。
【００５２】
このようにして、顕在化させた発色シグナルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定手段を用いて検出することで、検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの検出を行うことができる。
【００５３】
なお、本検出方法において用いられる血液検体は、特に限定されないが、血漿、血清、全血等である。
【００５４】
本検出方法においては、本モノクローナル抗体により検出される、検体中のＰＡＦ−ＡＨを指標として、冠動脈疾患、すなわち、心筋梗塞や狭心症のリスクとなり得る高脂血症又は糖尿病を検出することができる。特に、検体（特に、血液検体）中の、ＰＡＦ−ＡＨとアポリポ蛋白質Ｂ（ａｐｏＢ）とを関連付けた複合指標を用いることで、的確に高脂血症又は糖尿病を検出することが可能である。この複合指標は、血中のＰＡＦ−ＡＨが結合して局在するＬＤＬ量に対応する指標であると考えられ、好適な態様として、後述する実施例において示すように、例えば、ａｐｏＢ量当たりのヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量比（ＰＡＦ−ＡＨ／ａｐｏＢ比）等を挙げることができる。
【００５５】
実施例において示すように、一般に、高脂血症又は糖尿病が認められると判断すべき場合には、ａｐｏＢ量当たりのヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量比が、相対的に減少する傾向が認められる。
【００５７】
本発明においては、本モノクローナル抗体を、本検出方法において用いるための、本モノクローナル抗体を含む、ＰＡＦ−ＡＨ検出用キットも提供される〔以下、本検出用キットともいう〕。
【００５８】
本検出用キットにおいては、本モノクローナル抗体を、検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを検出のために供するための要素、例えば、前記の標識された本モノクローナル抗体や固定化された本モノクローナル抗体等が含まれ得る。
【００５９】
また、高脂血症又は糖尿病を検出するために、ＰＡＦ−ＡＨとａｐｏＢとの複合指標を用いる場合には、検体中のａｐｏＢを検出するための要素、例えば、ａｐｏＢに対する抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、また、標識抗体や固定化抗体を含む）を、本検出用キットの構成要素とすることが可能である。
【００６０】
本検出用キットも、本検出方法に対応して、ＥＬＩＳＡ、特に、サンドイッチ法による検出を容易に行い得る構成のキットであることが好ましい。
なお、後述する実施例において示すように、本検出用キットに、希釈液を構成要素として含める場合で、かつ、希釈液中に界面活性剤を含有させる場合には、界面活性剤として、Tween20 を用いることが好適であり、さらに、緩衝液としてＰＢＳを用いることが好適である。
【００６１】
【実施例】
以下に、本発明を、実施例により、さらに具体的に説明する。ただし、この実施例は、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【００６２】
１．ＰＡＦ−ＡＨ活性の測定
ＰＡＦ−ＡＨ活性測定は、Tew ら(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1996;16:591-599)の方法に準じ、改良した変法により行った。
【００６３】
〔基質溶液の調製〕
[3H-acetyl] ＰＡＦ (NEN:NET-910) 4.7μCiと、クロロホルムに溶解したＰＡＦ - C16 (Cayman: 60900)400nmol を、各々Ｎ2 気流下で乾固する。これに、HEPES 緩衝液 (0.1M HEPES/KOH, pH 7.2) 4mL を加え、氷中で、ソニケーション(5分、3 回) を行い、これを基質溶液とする。調製した基質溶液は-20 ℃で保存し、使用前に溶解して使用する。
【００６４】
〔活性測定〕
HEPES 緩衝液で希釈したヒト血漿、または、精製ＰＡＦ−ＡＨ 10 μL を反応液（40μL 基質溶液を150 μL HEPES 緩衝液に添加した混合液）に加え、37℃で、30分間反応させる。反応後、クロロホルム/ メタノール混合液(2:1 = v/v) 600 μL を加え、１分間撹拌した。遠心 (15000 RPM 、4 ℃、10分間) 後、上層の水相を、新しい遠心チューブに分取し、さらにクロロホルム500 μL を加え、１分間撹拌した後、再び遠心する。あらかじめ、ASCII(Amersham Pharmacia社製) 5mL を入れたシンチレーションバイアルに上層の水相を加え、シンチレーションカウンターで、放射活性を測定する。得られた放射活性値から、ＰＡＦ−ＡＨ活性を算出する。ＰＡＦ−ＡＨ活性は、以下の式（Ｉ）より算出する。
【００６５】
式（Ｉ）：
〔ＰＡＦ−ＡＨ活性(nmol/h/mL) 〕＝
[( 被検体の放射活性(cpm)/基質1nmol 当たりの放射活性(cpm) ×希釈倍率)]／[(測定に用いたサンプル量(mL)×反応時間(h))]
〔ウエスタンブロット法〕
後述する例において、得られた画分等が、所望するヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨであるか等を確認するために、ウエスタンブロット法を行った。このウエスタンブロット法は、下記の要領に従って行った。
【００６６】
まず、１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、溶出画分を分離した後、ＰＶＤＦ膜(Millipore社製) に転写する。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにおいて、４℃下で、一晩静置する。静置後、０．１％Tween20 を含むPBS(洗浄液) で、２回洗浄後、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する抗体〔penta-His 抗体(Qiagen 社製) 〕を、1 μg/mLの濃度に、洗浄液で希釈した抗体溶液を、室温下、２時間反応させる。反応後、洗浄液で、５回洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG 抗体(Zymed社製) または西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(Zymed社製) を、洗浄液で0.05μg/mLに希釈したものを、室温下、２時間反応させる。反応後、洗浄液で、５回洗浄した後、化学発光試薬(NEN) と添付の取り扱い説明書に従い、反応させた後、暗室で、Ｘ線フィルム(Kodak社製) を感光させ、現像して、血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するシグナルを検出する。
【００６７】
２．ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの精製
ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨは、Tew ら〔 Arterioscler Thromb Vasc Biol.,vol.16,pp591-599(1996)〕の方法を参考にし、精製を行った。原材料は、高コレステロール血症患者に行われる、ＬＤＬアフェレーシス後のカラムに吸着した、血漿画分を用いた。
【００６８】
上記の血漿画分に、MES 、CHAPS 、および、NaClを、終濃度50mM MES/NaOH, pH6.0、10mM CHAPS、0.5M NaCl になるように加え、ＬＤＬに結合している、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨを可溶化した。可溶化画分を、上記緩衝液で平衡化した、AF-Blue トヨパール（東ソー社製) カラム(2.6 x 40 cm) に添加した。同緩衝液で、流速1 mL/minでカラムを洗い、緩衝液の吸光度（λ＝280nm ）が、0.3 以下になるまで洗浄した。続いて、約600 mLのMOPS緩衝液(50mM MOPS/NaOH ，pH7.4 ，0.5M NaCl ，10mM CHAPS) で洗浄した。次いで、トリス緩衝液(50 mM Tris/HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, 10mM CHAPS) で溶出し、溶出液を、10mL毎に分取した。分取した各画分のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定し、ＰＡＦ−ＡＨ活性が認められる画分を集めて、AF-Blue 画分とした。
【００６９】
得られたAF-Blue 画分を、YM-30(分画サイズ30000, Millipore社製) を用いて限外ろ過法にて濃縮した。濃縮したAF-Blue 画分を、20mM Tris/HCl,pH7.4, 10mM CHAPS 溶液2Lで、4 ℃で、約16時間透析を行った。透析溶液は、3 回交換した。透析したAF-Blue 画分を、予めトリス緩衝液で平衡化したHiTrap Qカラム(Amersham Pharmacia)にアプライし、同トリス緩衝液にて非吸着蛋白質を除いた。次いで、0〜1M NaCl の濃度勾配にて溶出を行い、溶出液を10mLずつ分取し、分取した画分のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定し、ＰＡＦ−ＡＨ活性を含む画分を集めてHiTrap Q画分とした。
【００７０】
次に、HiTrap Q画分を、2LのMES 緩衝液において透析（4 ℃、約16時間）を行った。透析溶液は、3 回交換した。透析したHiTrap Q画分を、予め、MES 緩衝液で平衡化したHiTrap Blue カラム(Amersham Pharmacia)にアプライし、同MES 緩衝液で、吸光度が0.3 以下になるまで洗浄した。続いて、約3mL のMOPS緩衝液で洗浄後、トリス緩衝液で溶出し、溶出液を1 mLずつ分取した。分取した各画分のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定し、ＰＡＦ−ＡＨ活性が認められる分画を、精製ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ画分とした。精製ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ画分の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、第１図（レーン２）に示した。
【００７１】
なお、レーン３は、本モノクローナル抗体である、抗体８Ｂ１における、精製ヒト血漿ＰＡＦ−ＡＨに対する優れた特異性を示している（後述する）。
３．大腸菌由来および動物細胞由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ (rhＰＡＦ−ＡＨ) の調製
１）大腸菌由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ(rh ＰＡＦ−ＡＨ) の調製
ヒト末梢血単球由来マクロファージから、ｍＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲ法で、ＰＡＦ−ＡＨｃＤＮＡを増幅し、クローニングした。得られたＰＡＦ−ＡＨｃＤＮＡの塩基配列については、シーケンスを行ない、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨｃＤＮＡ（アクセッション番号: U20157）と相違ないことを確認した。得られたＰＡＦ−ＡＨｃＤＮＡを、発現ベクターpQE30(Qiagen社製) に挿入し、ベクターpQE-30/ ＰＡＦ−ＡＨを得た。ベクターpQE-30/ ＰＡＦ−ＡＨを、大腸菌株M-15(pREP4) に導入し、大腸菌M-15／ＰＡＦ−ＡＨを得た。大腸菌M-15／ＰＡＦ−ＡＨを、100 μg/mLアンピシリン、25μg/mLカナマイシンを含む、ＴＢ培地で培養し、1 mM IPTG により誘導し、rhＰＡＦ−ＡＨを発現させた。培養液を、遠心（5000rpm, 5分, 4 ℃）し、沈殿した菌体を10mM CHAPS、10mM 2- メルカプトエタノール、0.5M NaCl 、および、10mM imidazole含有50mMリン酸緩衝液(pH8.0) に懸濁後、氷上で、ソニケーションにより破砕し、遠心（15000rpm, 30分, 4 ℃）を行い、rhＰＡＦ−ＡＨを含む上清を得た。上清は、同緩衝液で、予め平衡化した、Ni-NAT agarose（Qiagen社製）に結合させた。溶出は、10mM CHAPS、10mM 2- メルカプトエタノール、0.5M NaCl および250mM imidazole 含有、50mM MES緩衝液(pH6.0) で行った。溶出画分を10mM CHAPS、10mM 2- メルカプトエタノール、および0.5 M NaCl含有50mM MES緩衝液(pH6.0) で、予め平衡化したCibacron Blue agarose(Sigma 社製) に結合させた。溶出は、10mM CHAPS、10mM 2- メルカプトエタノール、および1.5 M NaCl含有50 mM トリス緩衝液(pH8.0) で行った。次いで、溶出画分を、同緩衝液で、予め平衡化したNi-NAT agarose（Qiagen社製）に結合させた。溶出は、10mM 2- メルカプトエタノール、1.5M NaCl 、および250mM imidazole 含有50 mM リン酸緩衝液(pH8.0) で行った。溶出画分を、PBS において透析し、大腸菌由来精製rhＰＡＦ−ＡＨを得た。得られた大腸菌由来精製rhＰＡＦ−ＡＨは、ＰＡＦ−ＡＨ活性、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。大腸菌由来精製rhＰＡＦ−ＡＨの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、第２図（レーン２）に示した。
【００７２】
なお、レーン３は、本モノクローナル抗体である、抗体Ａ７Ｇにおける、大腸菌由来精製rhＰＡＦ−ＡＨに対する優れた特異性を示している（後述する）。
２）動物細胞由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ(rh ＰＡＦ−ＡＨ) の調製
ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨｃＤＮＡを、常法により、動物細胞発現ベクターpEF321-3.1.1に挿入し、ベクターpEF321-3.1.1/ ＰＡＦ−ＡＨを得た。なお、動物細胞発現ベクターpEF321-3.1.1は、ヒトEF1 αプロモーターを有するpEF321 (kim DG et al, Gene 91; 217-223, 1990) に、組換え蛋白質を細胞外に分泌させるためのインヒビンαシグナルシークエンス、および、リコンビナント蛋白質の精製を容易にするためのヒスチジンタッグを付加したものである。リン酸カルシウム法を用いて、pEF321-3.1.1/ ＰＡＦ−ＡＨとpEF321/neo (pEF321ベクターにネオマイシンの１種ゲネチシン耐性遺伝子を挿入したもの) を、同時にＣＨＯ細胞に導入し、ゲネチシン耐性を指標に導入した遺伝子が安定に組み込まれた細胞を選別し、その結果、rhＰＡＦ−ＡＨ／ＣＨＯ細胞を得た。ＣＨＯ細胞およびrhＰＡＦ−ＡＨ／ＣＨＯ細胞の培養上清のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定したところ、培養上清にのみ、ＰＡＦ−ＡＨ活性が検出され、rhＰＡＦ／ＣＨＯ細胞が、rhＰＡＦ−ＡＨを培地中に分泌することが確認された。
【００７３】
rhＰＡＦ−ＡＨ／ＣＨＯ細胞を、CHO-S-SFMII 培地(Gibco社製) で培養し、rhＰＡＦ−ＡＨを含む培養上清を得た。得られた培養上清は、YM-30 膜(Millipore社製) を用いた限外ろ過法により濃縮し、トリス緩衝液（20mM Tris/HCl,pH7.4, 1mM EDTA ）で、予め平衡化したHiTrap Qカラムに添加した。同緩衝液で、非吸着物質を取り除き、溶出はO 〜1M NaCl による濃度勾配により溶出し、溶出液を10mLずつ分取した。分取した画分のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定し、ＰＡＦ−ＡＨ活性を含む画分を回収し、HiTrap Q画分とした。
【００７４】
次いで、HiTrap Q画分を、MES 緩衝液で透析（２L で３回、4 ℃、約16時間）し、MES 緩衝液で、予め平衡化したHiTrap Blue カラムに添加した。HiTrap Blue カラムをMOPS緩衝液 3mLで洗浄後、トリス緩衝液にて各1mL ずつの溶出画分を得た。溶出した画分のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定し、ＰＡＦ−ＡＨ活性を含む画分を回収し、HiTrap Blue 画分とした。
【００７５】
さらに、HiTrap Blue 画分を、トリス緩衝液（20mM Tris/HCl, pH7.4, 0.5M NaCl ）で透析（2L、4 ℃、約16時間）後、Wheat germ lectin Sepharose ( ゲル容積 3mL) に添加した。同トリス緩衝液にて非吸着物質を取り除き、0.5 M N-acetyl-D(+)glucosamineを含むトリス緩衝液（20mM Tris/HCl, pH7.4, 0.5M NaCl ）で、1mL ずつ溶出した。得られた溶出画分を、動物細胞由来精製rhＰＡＦ−ＡＨとし、ＰＡＦ−ＡＨ活性を確認して、適切な画分を選別した。この画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、第３図（レーン２）に示した。
【００７６】
なお、レーン３は、本モノクローナル抗体である、抗体８Ｂ１における、動物細胞由来精製rhＰＡＦ−ＡＨに対する優れた特異性を示している（後述する）。
４．モノクローナル抗体の調製
精製rhＰＡＦ−ＡＨ(25 μg)、または、rhＰＡＦ−ＡＨ(25 μg)を、それぞれ、等量のフロイント完全アジュバンドと混和し、７週齢のBalb/cマウス（雌) の腹腔に免役した。2 週間後、フロイント不完全アジュバンドを用いて、同様に追加免疫を行い、それ以降は２週間に１回、計４回免疫した。最終免疫３日後のマウスの脾細胞を、マウスミエローマ細胞(SP2 / 0-Ag14)と混和し、50％ポリエチレングリコール（平均分子量1500) 含有PBS 溶液を用いて細胞融合を行った。融合後、細胞を、RPMI1640培地に、ウェル当たり５x １０5 個の割合になるように浮遊させ、96ウェルプレートに播いた。翌日から、各々のウエルにHAT 試薬を添加し、７日間選択培養を行った。各ハイブリドーマの培養上清中の、ヒト血清型ＰＡＦ−ＡＨに対する特異的モノクローナル抗体の産生は、精製rhＰＡＦ−ＡＨまたはrhＰＡＦ−ＡＨを固相化した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を行うことで、確認した。すなわち、各ウェル当たりに、50 ng の精製rhＰＡＦ−ＡＨ、または、rhＰＡＦ−ＡＨを、常法により固相化し、100 μL の各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間反応した。反応後、各ウェルを洗浄液(0.1% Tween 20 / PBS) で洗浄し、洗浄液で希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗マウスIgG 抗体を加えて、室温下で１時間反応した。反応後、同洗浄液にてウェルを洗浄し、100 μL の発色溶液(0.012% 過酸化水素、0.4mg/mL OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride、シグマ社製) 含有クエン酸・リン酸緩衝液、pH 5.0) を添加後、室温下で30分反応させた後、2N硫酸を添加し、反応を停止した。波長492nm の吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。1.0 以上の吸光度を示すハイブリドーマ培養上清を陽性とした。また、陽性のハイブリドーマ培養上清はウエスタンブロット法で、精製rhＰＡＦ−ＡＨ、または、rhＰＡＦ−ＡＨに対する反応性を確認し、両方法にて特異性が認められたクローンを選別した。
【００７７】
さらに、選別したハイブリドーマは、ＨＡＴ試薬を添加したRPMI1640培地で、各ウェル0.5 個の細胞になるように調整して、96ウェルプレートに播き、同様のスクリーニングによる選別操作を３回繰り返し、精製rhＰＡＦ−ＡＨまたはrhＰＡＦ−ＡＨに対する特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。
【００７８】
最終的に、精製rhＰＡＦ−ＡＨまたはrhＰＡＦ−ＡＨを固相化したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法、および、ヒト血漿、精製rhＰＡＦ−ＡＨ若しくはrhＰＡＦ−ＡＨ対するウェスタンブロット法により選別し、陽性クローンは、精製rhＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体産生クローンが１０個、および、rhＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体産生クローンが４個認められた。
【００７９】
得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマからの抗体の調製、および、精製は以下の要領で行った。
すなわち、Balb/cマウス（雌) に、一匹あたりハイブリドーマ（１０6 〜１０7 個／0.5mL ）を、腹腔内に注入した。注入１０日後、マウスを開腹し腹水を採取した。得られた腹水は、遠心により得られた上清に、等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し２時間放置した。さらに、４℃下で、10000 x g で10分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液（３Ｍ塩化ナトリウム、1.5Mグリシン溶液、pH8.9)に溶解し、プロテインＡセファロースと混和し、４℃で一晩転倒混和した。結合させたプロテインＡセファロースを、カラムに充填し、結合溶液（６倍容量）で洗浄後、溶出溶液(0.1 Mクエン酸溶液、pH4.0)で１mLずつ溶出した。溶出された画分は、２Ｍトリス溶液 (pH10.0) 0.1mL で中和した。各溶出画分の吸光度(280nm) を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収し、ＰＢＳで透析し(4℃、一晩) 、精製モノクローナル抗体を得た。
【００８０】
得られたモノクローナル抗体のアイソタイプは、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット（ベーリンガー社製）を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。精製rhＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体産生クローンが産生した抗体は、全てIgG1、rhＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体産生クローンが産生した抗体は、IgG2b またはIgG1であった。
【００８１】
精製rhＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、１つを「mouse hybridoma PAF-AH 8B1」として、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託を行い（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８１６）、rhＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、１つを「mouse hybridoma PAF-AH A7G」として、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託を行った（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８１５）。
【００８２】
これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体〔mouse hybridoma PAF-AH 8B1が産生した抗体は、「８Ｂ１」を付して表現し、mouse hybridoma PAF-AH A7Gが産生した抗体は、「Ａ７Ｇ」を付して表現する〕の特異性は、抗原に対するウエスタンブロット法で（第１図〜第３図のレーン３）、および、抗原を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法にて確認した（第４図）。
【００８３】
これらの結果から、これらの本モノクローナル抗体における、ＰＡＦ−ＡＨに対する特異性は、ＰＡＦ−ＡＨの出所にかかわらず認められることが明らかになった。
【００８４】
なお、抗体８Ｂ１は、Cayman Chemicals社から販売されている、PAF Acetylhydrolase Blocking Peptide(Catalog No.360603) 配列：Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln Asn Ser Ser Gly Ile Glu Lys Tyr Asn （ＰＡＦ−ＡＨのアミノ酸配列の４２０〜４４１番目のアミノ酸残基に相当する）と反応することが確認された。このPAF Acetylhydrolase Blocking Peptideは、同社で販売されているPAF Acetylhydrolase (human)polyclonal antiserum(Catalog No.160603)の抗原として用いられたものであり、このPAF Acetylhydrolase (human)polyclonal antiserum は、ＰＡＦ−ＡＨ活性を阻害することから、この上記のアミノ酸配列は、ＰＡＦ−ＡＨの活性部位、または、その近傍に位置する、ＰＡＦ−ＡＨにおいて本質的なアミノ酸配列であると考えられる。従って、同様に、上記の PAF Acetylhydrolase Blocking Peptide を認識する、抗体８Ｂ１は、ＰＡＦ−ＡＨの本質部分を特異的に認識するモノクローナル抗体であり、本モノクローナル抗体として、特に、有用であることが明らかとなった。
【００８５】
また、抗体Ａ７Ｇは、上記のPAF Acetylhydrolase Blocking Peptideに対しては、反応が認められなかった。よって、抗体Ａ７Ｇのエピトープは、ＰＡＦ−ＡＨの他の部位であることが判明した。
【００８６】
５．ビオチン化モノクローナル抗体の調製
精製モノクローナル抗体(1mg) を、0.1M NaHCO3 (pH8.3) 溶液で、４℃下、１６時間の透析を行った。60μg のNHS-biotin（ピアス社製）を、ＤＭＳＯに溶解したものを加えて撹拌し、室温で、４時間反応させた。ＰＢＳ(5L)で、４℃下、約１６時間の透析を行い、ビオチン化モノクローナル抗体を得た。
【００８７】
６．サンドウィッチＥＬＩＳＡ法による血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量測定系の構築
マイクロプレートに、０．０５％NaN3含有ＰＢＳで希釈した各固相化抗体溶液(2.5μg/mL) を、各ウェル100 μL ずつ加え、４℃下で、一晩静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、ペーパータオルなどで液を完全に除いた。ＢＳＡ(Sigma社製）を、ＰＢＳで溶解した溶液を、各ウェル２００μL ずつ加えて、室温下、２時間静置した。各ウェルを、洗浄液(0.1% Tween20/ＰＢＳ)300μL で２回洗浄した。洗浄液で、あらかじめ希釈した測定試料（精製rhＰＡＦ−ＡＨもしくはrhＰＡＦ−ＡＨ、rhＰＡＦ−ＡＨ培養上清、コントロール血漿および測定血漿検体) を100 μL ずつ加えて、室温下、２時間静置した。洗浄液で、各ウェルを５回洗浄した。洗浄液で希釈したビオチン標識抗体溶液（０．５μg/mL) を、各ウエルに100 μL ずつ加え、室温下、２時間静置した。洗浄液で、各ウエルを、５回洗浄後、洗浄液にて希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識アビジン溶液(0.05 μg/mL) 100 μL を加えて、室温下、1 時間静置した。反応後、洗浄液で、各ウエルを５回洗浄後、使用直前に調整した発色溶液(0.012% 過酸化水素/0.4 mg/mL  OPD (O-phenylenediamine dihydrochloride)/ クエン酸・リン酸緩衝液 pH 5.0)を、各ウエルに100 μL ずつ加え、室温下、0.5 時間発色し、反応停止液(2N H2SO4 溶液) 25μL を各ウェルに加え、反応を停止した。波長492nm の吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００８８】
rhＰＡＦ−ＡＨを用いた標準曲線を第５図に示す。また、精製rhＰＡＦ−ＡＨ、および、ヒト血漿に対する反応性を、第６図に示す。これらの結果より、本モノクローナル抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにおける反応性は、精製rhＰＡＦ−ＡＨと、検体として用い得るヒト血漿においても同等であり、定量測定が可能であることが示された。
【００８９】
７．界面活性剤の影響の検討
次いで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた、本検出方法における界面活性剤の影響を検討した。精製rhＰＡＦ−ＡＨ（▲１▼）、血漿検体の希釈溶液（▲２▼）、および、rhＰＡＦ−ＡＨ培養上清（▲３▼）に、界面活性剤Tween20 （和光純薬社製）（Ａ）、ＰＢＳ（Ｂ）、Triton X-100（和光純薬社製）（Ｃ）、Nonidet P-40（ナカライテスク社製）（Ｄ）、ＳＤＳ（ナカライテスク社製）（Ｅ）、および、CHAPS （同仁化学社製）（Ｆ）、Sodium cholate（和光純薬社製）（Ｇ）を、最終濃度０．１％になるように、ＰＢＳ溶液で調製し、上述のサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いる本検出方法によるＰＡＦ−ＡＨ蛋白質定量を行なった。この結果を、第１表に示す。なお、第１表中の数字は、０．１％Tween20 を含むＰＢＳ希釈溶液（Ａ）における反応性を１００％としたときの、各希釈溶液での血漿等の検体の反応性を表す数値（％）である。
【００９０】
0004203878.tif 000002
第１表に示すように、精製rhＰＡＦ−ＡＨに対しては、Tween 20が最も反応性が良く、ＰＢＳでは、やや反応性の低下が観察され、ＳＤＳでは測定をすることが実質的にできなかった。また、rhＰＡＦ−ＡＨ培養上清も同様の傾向であった。一方、血漿では、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P-40で反応性が良く、ＰＢＳとＳＤＳでは、実質的に測定をすることができなかった。以上の結果より、スタンダード、および血漿検体の測定は、０．１％ Tween20を含むＰＢＳ溶液を、希釈溶液として用いるのが好適であることが判明した。
【００９１】
８．ヒト血漿におけるＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量とＰＡＦ−ＡＨ活性の相関
日本人１９３名について、血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量、およびＰＡＦ−ＡＨ活性を測定した（第７図）。血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量およびＰＡＦ−ＡＨ活性は、非常に強い正相関(r=0.87, p<0.0001)を示したことから、ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量測定が、血漿中のＰＡＦ−ＡＨ量を測定するために用いることが可能であることが示された。
【００９２】
上述の実施例により、本モノクローナル抗体を用いた本検出方法、特に、好適には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた本検出方法により、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの蛋白質量の検出法が確立された。本検出方法は、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの活性値と非常に良く正相関することから、血漿等の検体中のヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの活性値を反映するものと考えられる。
【００９３】
９．本検出方法の有用性についての検討
（１）冠動脈疾患に関連する有用性の検討
非糖尿病の高脂血症患者（総コレステロール値が、２００mg/dL 以上：ＴＣ＞２００）、および、糖尿病患者（ＤＭ）について、血漿中のＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量の測定を行った。血漿中のＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量は、日本人において高頻度で検出される、ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質の第２７９アミノ酸残基であるバリン（Ｖ）が、フェニエルアラニン（Ｆ）に変異している、「Ｖ２７９Ｆ変異」を有する者の群（Ｖ２７９Ｆ変異群）と、有さない者の群（Ｖ２７９Ｆ非変異群または野生型）に分類し、検討した（第８図）。なお、本検討における協力者は、健常者９６名（野生型６０名、Ｖ２７９Ｆ変異群３６名）、非糖尿病の高脂血症患者３９名（野生型２７名、Ｖ２７９Ｆ変異群１２名）、糖尿病患者３９名（野生型２８名、Ｖ２７９Ｆ変異群１１名）、冠動脈疾患患者８名（野生型５名、Ｖ２７９Ｆ変異群３名）、喘息患者３６名（野生型とＶ２７９Ｆ変異群の別に関する情報なし）である。
【００９４】
非糖尿病の高脂血症、糖尿病、および、健常者において、Ｖ２７９Ｆ変異群と非変異群間における、血漿中のＰＡＦ−ＡＨの蛋白質量の有意差は認められなかった。しかしながら、血漿中のａｐｏＢ量当たりのヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量比（ＰＡＦ−ＡＨ／ａｐｏＢ比）に換算すると、第８図に示すように、このＰＡＦ−ＡＨ／ａｐｏＢ比は、野生型の健常者においては、１８．６±３．６７であったのに対し、野生型の非糖尿病の高脂血症患者においては、１３．９±４．０３（ｐ＜０．０１）、同糖尿病患者においては、１３．５±４．１６（ｐ＜０．０１）と、有意な低下が認められた。Ｖ２７９Ｆ変異群（ヘテロ接合体）における、ＰＡＦ−ＡＨ／ａｐｏＢ比は、健常者が、９．４９±１．８７であったのに対し、高脂血症患者においては、５．６４±２．１９（ｐ＜０．０１）、糖尿病患者においては、７．２３±１．５５（ｐ＜０．０１）と、有意な低下が認められた。
【００９５】
さらに、冠動脈疾患（ＣＨＤ）を罹患した症例においても、野生型は、１５．１±２．７５（ｐ＜０．０５）、ヘテロ接合体は、４．８６±１．１７（ｐ＜０．０１）と、有意な低下が認められた。
【００９６】
このように、冠動脈疾患のリスクを有する、高脂血症患者と糖尿病患者において、ＰＡＦ−ＡＨ／ａｐｏＢ比の低下が認められ、かつ、冠動脈疾患罹患者においても、同比の低下が、ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質の変異にかかわらず認められた。
【００９７】
（２）喘息に関連する有用性の検討
喘息患者において、血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量の分布について検討を行ったところ、健常者の血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量のモードが、１．７〜１．８であるのに対して、喘息患者における同モードは、１．１〜１．２であり、血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量は、喘息患者においては低下していた（第９図）。これは、喘息患者では、炎症反応のメディエーターの一つであるＰＡＦの産生量が増加することにより、その不活性化酵素であるＰＡＦ−ＡＨの消費が増大し、血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量が低下したために現れた現象であると考えられる。
【００９８】
すなわち、血漿中ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量は、喘息患者における炎症反応の指標となり得る、ＰＡＦの産生量を把握する上での好適な指標となり得ることが見出された。
【００９９】
上記のごとく、ＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量の測定は、冠動脈疾患をはじめとする動脈硬化症のリスクを把握する上で好適な指標となるばかりでなく、喘息においても、炎症反応の指標となることが明らかとなった。近年、血漿中のレシチンアシルトランスファーゼ（ＬＣＡＴ）、あるいは、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ１）の酵素が、ＰＡＦの加水分解活性を有することが報告されており、血漿中のＰＡＦ−ＡＨ活性が、必ずしもＰＡＦ−ＡＨの蛋白質量を反映しないこことが示されている(LiU M & Subbaiah PV.Hydrolysis and transesterification of platelet-activating factor by lecithin-cholesterol acyltransferase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91;6035-6039,1994;Rodrigo L et al.,Hydrolysis of platelet-activating factor by human serum paraoxonase. Biochem J,354;1-7,2001)。このことからも、ＰＡＦ−ＡＨの蛋白質量を指標として、ＰＡＦ−ＡＨの検出を行う本検出方法は、ＰＡＦ−ＡＨ活性を検出するＰＡＦ−ＡＨの検出方法よりも、ＰＡＦ−ＡＨに関連する冠動脈疾患や喘息との関わりにおいて、特異性が強い方法である。
【０１００】
【発明の効果】
本発明により、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対するモノクローナル抗体を用いた、高脂血症又は糖尿病の指標となるＰＡＦ−ＡＨの検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの電気泳動の結果と、本モノクローナル抗体（８Ｂ１）の精製ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する反応性を検討したウエスタンブロットの結果を示す図面である。
【図２】大腸菌由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの電気泳動の結果と、本モノクローナル抗体（Ａ７Ｇ）の大腸菌由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する反応性を検討したウエスタンブロットの結果を示す図面である。
【図３】動物細胞由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの電気泳動の結果と、本モノクローナル抗体（８Ｂ１）の動物細胞由来組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する反応性を検討したウエスタンブロットの結果を示す図面である。
【図４】２種類の本モノクローナル抗体の精製ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する反応性を検討した図面である。
【図５】本モノクローナル抗体の組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨに対する標準曲線である。
【図６】本検出方法により、組換えヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨとヒト血漿における、ヒト血漿型ＰＡＦ−ＡＨの検出を行った結果を示す図面である。
【図７】ヒト血漿におけるＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量とＰＡＦ−ＡＨ活性の相関を示した図面である。
【図８】種々の対象におけるＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量／ａｐｏＢ比に関する比較を行った結果を示す図面である。
【図９】健常者および喘息患者におけるＰＡＦ−ＡＨ蛋白質量の分布を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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