(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を有し、かつ、細胞内のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性及びトランスヒドロゲナーゼ活性が増強されていることを特徴とするエシェリヒア属細菌。
【請求項２】
スレオニンオペロン又はその一部がコードする酵素の活性が増強され、Ｌ−スレオニン生産能を有する請求項１記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
スレオニンオペロンがｔｈｒＡＢＣである請求項２記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】
ｉｌｖオペロン又はその一部がコードする酵素の活性が増強され、Ｌ−イソロイシン生産能を有する請求項１記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項５】
アスパルターゼ活性が増強された請求項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項６】
各々の酵素の活性の増強が、各々の酵素をコードする遺伝子又はオペロンのコピー数を高める、又は細胞内の前記遺伝子又はオペロンの発現を増強するように発現調節配列を改変することによるものである請求項１〜５のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項７】
前記遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である請求項６記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地に培養し、培地中にスレオニン又はイソロイシンを生成蓄積せしめ、スレオニン又はイソロイシンを該培地から採取することを特徴とするスレオニン又はイソロイシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵工業に関するものであり、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産するエシェリヒア属細菌、及び同細菌を用いてＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシン等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌などの微生物を用いて発酵法により工業生産されている。これらのアミノ酸生産菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株、あるい遺伝子組換えによりＬ−アミノ酸生合成酵素が増強された組換え体が用いられている。
【０００３】
具体的には、例えばＬ−スレオニンの製造法としては、エシェリヒア属細菌の変異株を用いるものに特開平５−３０４９６９号があり、組換え体エシェリヒア・コリを用いるものに特公平１−２９５５９号、特開平２−１０９９８５号、特開昭５６−１５６９６号、および特表平３−５０１６８２号がある。コリネバクテリウム属細菌の変異株を用いるものには、特開昭６２−２３９９９６号があり、組換え体コリネバクテリウム属細菌を用いるものには特開昭６１−１９５６９５号が報告されている。また、特開昭５５−１３１３９７号公報、特開昭５９−３１６９１号公報、特開昭５６−１５６９６号公報、および特表平３−５０１６８２号公報には、スレオニンオペロンを含有する組換えプラスミドにより形質転換された菌株によるＬ−スレオニンを製造する方法が示されている。
【０００４】
また、Ｌ−イソロイシンの製造法としては、エシェリヒア・コリを用いるものに特開平５−１３０８８２号があり、エシェリヒア・コリの組換え体を用いるものには特開平２−４５８号がある。また、コリネバクテリウム属細菌の変異株を用いるものとしては特公平３−６２３９５号があり、コリネバクテリウム属の組換え体を用いるものには特公平５−４７１９６号が報告されている。また、エシェリヒア・コリ由来のＬ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子を含むthrABCオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするilvA遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたilvGMEDAオペロンとを導入することにより、Ｌ−イソロイシン生産性を付与することができることが知られている（特開平8-47397参照）。
【０００５】
ところで、エシェリヒア・コリのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は配列が知られており（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(1984)）、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が実質的に解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びその遺伝子の利用法が開示されている（WO95/06114）。また、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産性の向上を目的として、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を強化した例が知られている（特開昭６０−８７７８８号）。さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を、他の酵素遺伝子とともに増強することにより、アミノ酸生産能を向上させる技術が開示されている。例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失したコリネ型細菌において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、クエン酸合成酵素遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を強化し、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させた例が報告されている（WO96/06180）。一方、エシェリヒア・コリでは、スレオニンオペロンを含有する組換えプラスミドにより形質転換されたエシェリヒア・コリのＬ−スレオニン生産菌B-3996株において野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を導入しても、Ｌ−スレオニンの生産能はあまり増大しなかったことが開示されている（WO95/06114）。
【０００６】
また、微生物細胞内のニコチンアミド・ヌクレオチド・トランスヒドロゲナーゼ（以下、「トランスヒドロゲナーゼ」と呼ぶことがある）の酵素活性を上昇させ、微生物の還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸生産能を上昇させることにより、アミノ酸等の物質の生産性を改善することができることが開示されている（W095/11985）。同公報には、スレオニンオペロンを含有する組換えプラスミドにより形質転換されたエシェリヒア・コリにおいてトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を強化することによって、Ｌ−スレオニン生産能が向上する例が示されている。尚、トランスヒドロゲナーゼ活性の上昇により生産性が改善されるアミノ酸として、Ｌ−イソロイシンが挙げられている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エシェリヒア属細菌のＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を向上させることを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性とトランスヒドロゲナーゼ活性を併せて増強することにより、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの生産能が顕著に増大することを見出し、さらに、アスパルターゼ活性を増強することによって一層生産能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
（１）Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を有し、かつ、細胞内のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性及びトランスヒドロゲナーゼ活性が増強されていることを特徴とするエシェリヒア属細菌。
（２）スレオニンオペロン又はその一部がコードする酵素の活性が増強され、Ｌ−スレオニン生産能を有する（１）のエシェリヒア属細菌。
（３）スレオニンオペロンがｔｈｒＡＢＣである（２）のエシェリヒア属細菌。
（４）ｉｌｖオペロン又はその一部がコードする酵素の活性が増強され、Ｌ−イソロイシン生産能を有する（１）のエシェリヒア属細菌。
（５）アスパルターゼ活性が増強された（１）〜（４）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（６）各々の酵素の活性の増強が、各々の酵素をコードする遺伝子又はオペロンのコピー数を高める、又は細胞内の前記遺伝子又はオペロンの発現を増強するように発現調節配列を改変することによるものである（１）〜（５）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（７）前記遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（６）のエシェリヒア属細菌。
（８）（１）〜（７）のいずれかのエシェリヒア属細菌を培地に培養し、培地中にスレオニン又はイソロイシンを生成蓄積せしめ、スレオニン又はイソロイシンを該培地から採取することを特徴とするスレオニン又はイソロイシンの製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を有し、かつ、細胞内のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）活性及びトランスヒドロゲナーゼ（以下、「ＴＨＹ」ともいう）活性が増強されていることを特徴とするエシェリヒア属細菌である。
【００１１】
エシェリヒア属細菌としては、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられるものが利用できる。たとえば、エシェリヒア・コリが挙げられる。
【００１２】
ここで「Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を有する」とは、培養したときに培地中にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを蓄積する能力を有することをいう。このＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能は、野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１３】
本発明のエシェリヒア属細菌は、さらに細胞内のアスパルターゼ（Ｌ−アスパラギン酸アンモニア−リアーゼ、以下「ＡｓｐＡ」ともいう）活性が増強されていてもよい。
【００１４】
エシェリヒア属細菌においてＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡの活性を高めるには、ＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて、宿主となるエシェリヒア・属細菌を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ppc遺伝子」、「pntAB遺伝子」、「apsA遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡの活性が高められる。
【００１５】
ppc遺伝子、pntAB遺伝子、及びapsA遺伝子は、ppc遺伝子及びpntAB遺伝子、又はこれらの遺伝子とaspA遺伝子の組合せで、エシェリヒア造細菌に導入される。これらの遺伝子は、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
【００１６】
ＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡ活性を高めることは、ppc遺伝子、pntAB遺伝子、及びapsA遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上にppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子を多コピーで導入するには、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ppc遺伝子、pntAB遺伝子又はapsA遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＰＥＰＣ、ＴＨＹまたはＡｓｐＡ活性が高められる。
【００１７】
ＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、ppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、lacプロモーター、trpプロモーター、ｔrcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、amyEプロモーター、spacプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子の発現が強化されることによってＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡ活性が増強される。発現調節配列の増強は、ppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００１８】
ppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子の供給源となる生物としては、ＰＥＰＣ、ＴＨＹ又はＡｓｐＡ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。ppc遺伝子、pntAB遺伝子、又はapsA遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００１９】
エシェリヒア・コリのppc遺伝子は、この遺伝子を有するプラスミドpS2（Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)）、あるいはpT2から得ることができる。pS2をAatIIとAflIIで切断することにより、ppc遺伝子を有するＤＮＡ断片が得られる。また、pT2をSmaIとScaIで切断することによってもppc遺伝子を有するＤＮＡ断片を得ることができる。pT2を保持するE. coli F15株（AJ12873）は、平成５年７月15日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、FERM P-13752の受託番号で寄託され、平成６年７月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4732の受託番号が付与されている。
【００２０】
pntAB遺伝子は、この遺伝子を含むプラスミドpMW::THY（W095/11985）をSmaI及びHindIIIで切断することにより、得ることができる。pMW::THYプラスミドを保持するエシェリヒア・コリAJ12929株は、平成５年１０月４日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受託番号FERM P-13890として寄託されており、平成６年９月１４日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、FERM BP-4798として寄託されている。尚、エシェリヒア・コリのトランスヒドロゲナーゼは２つのサブユニットからなり、それぞれpntA、pntBによってコードされている。
【００２１】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有するものであれば特に制限されないが、具体的には例えば、スレオニンオペロン又はその一部がコードする酵素の活性が増強されたことによりＬ−スレオニン生産能を有するエシェリヒア属細菌、及び、それに加えてｉｌｖオペロン又はその一部がコードする酵素の活性が増強されたことによりＬ−イソロイシン生産能を有する請エシェリヒア属細菌が挙げられる。
【００２２】
スレオニンオペロン又はその一部としては、thrABC又はそれらの一部が挙げられる。また、ilvオペロン又はその一部としては、ilvGMEDA又はそれらの一部が挙げられる。
【００２３】
Ｌ−スレオニン生産能を有するエシェリヒア・コリとして具体的には、エシェリヒア・コリVKPM B-3996（1987年11月19日にオール・ユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチバイオティクス（All-Union Scientific Center of Antibiotics）（Nagatinskaya Street 3-A,113105 Moscow,Russian Federation）に、登録番号RIA 1867のもとに寄託されている。米国特許第5,175,107号参照）、  エシェリヒア・コリAJ11335（特開昭55-131397）等が挙げられる。VKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D.Plasmid, 1986, 16, 161-167を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（WO90/04636国際公開パンフレット）を保持している。同オペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩは、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００２４】
また、Ｌ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、エシェリヒア・コリAJ12919（特開平8-47397号）また、VKPM B-3996株においてilvオペロンを増幅した株も、好適なＬ−イソロイシン生産菌である。
【００２５】
スレオニオペロンは、thrA、thrB、thrCの各遺伝子を有しており、各々順にアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、スレニオンシンターゼをコードしている。これらのうち、アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩは、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されていることが好ましい。
【００２６】
ilvGMEDAオペロンは、ilvG、ilvM、ilvE、ilvD、ilvAの各遺伝子を有しており、各々順に、アセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムIIの大サブユニット、小サブユニット、トランスアミナーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ及びスレオニンデアミナーゼをコードしている。ilvGMEDAオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、Ｌ−イソロイシン生産菌においては、生成するＬ−イソロイシンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていてもよい。ilvGMEDAオペロンとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のilvGMEDAオペロンが挙げられる。ilvGMEDAオペロンについては、WO96/26289に詳細に記載されている。ilvGMEDAオペロンは、アテニュエーションに必要な領域が除去されていることが好ましく、同オペロンがコードする各酵素のうち、スレオニンデアミナーゼはＬ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されていることが好ましい（特開平8-47397参照）。
スレオニンオペロンもしくはｉｌｖオペロン又はそれらの一部がコードする酵素の活性の増強は、PEPC、THY及びAspAと同様にして行うことができる。
【００２７】
本発明に用いる微生物は、上記の性質に加えて、目的のアミノ酸生合成に関与する経路を司る酵素遺伝子の増強、あるいはフィードバック阻害を受ける酵素の脱感作型（阻害解除型）酵素をコードする遺伝子あるいはオペロンを導入すると、一層Ｌ−アミノ酸生産能が向上する場合がある。
【００２８】
上記のようにしてＰＥＰＣ及びＴＨＹ、ならびに必要に応じてＡｓｐＡが増強され、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を有するエシェリヒア属細菌を培地に培養し、培地中にスレオニン又はイソロイシンを生成蓄積せしめ、スレオニン又はイソロイシンを該培地から採取することにより、スレオニン又はイソロイシンを製造することができる。
【００２９】
培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００３１】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３２】
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３３】
発酵液からのＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３５】
【実施例１】
各種遺伝子を含むプラスミドの作製
（１）aspA遺伝子を含むプラスミド（pMW118::aspA）の作製
エシェリヒア・コリW3110株の染色体DNAを鋳型とし、下記のプライマーを用いたPCRにより、aspA遺伝子を含むDNA断片を増幅した。
0004265093.tif 000002
得られた増幅断片を、pMW118(ニッポンジーン社)のSmaI切断部位に挿入し、pMW118::aspAを取得した（図１）。
【００３６】
（２）pntAB遺伝子とppc遺伝子を含むプラスミド（pPTS）の作製
W095/11985記載のpntAB遺伝子を含むプラスミドpMW::THYをSmaI及びHindIIIで切断し、pntABを含むDNA断片を回収した。次にW095/16042記載のppc遺伝子を含むプラスミドpppcをXbaIで切断後、両端を平滑末端化し、更にHindIIIで切断し、ここに前記のpntABを含むDNA断片を挿入して、プラスミドpPTSを得た（図２）。
【００３７】
（３）aspA遺伝子及びppc遺伝子を含むプラスミド（pAPW）の作製
pMWI18::aspAをSacIで切断後、両端を平滑末端化し、更にHindIIIで切断することにより、aspAを含むDNA断片を得た。次に、前記pppcをXbaIで切断後、両端を平滑末端化し、更にHindIIIで切断し、前記のaspAここに先のaspAを含むDNA断片を挿入して、pAPWを得た（図３）。
【００３８】
（４）aspA遺伝子、pntAB遺伝子、及びppc遺伝子を含むプラスミド（pAPT）の作製
pMW::THYをSmaI及びHindIIIで切断することにより、pntABを含むDNA断片を取得した。次に前記pAPWをXbaIで切断後、両端を平滑末端化し、更にHindIIIで切断し、ここに前記pntABを含む断片を挿入することにより、pAPTを得た（図４）。
【００３９】
（５）ilvGMEDAオペロンを含むプラスミド（pMWD5）の作製
ilvGMEDAオペロンを含むDNA断片は、WO96/26289に記載のilvGMEDオペロンを含むプラスミドpMWD5から調製した。pMWD5は、以下のようにして構築された。
【００４０】
エシェリヒア・コリMI162株より、染色体DNAを抽出した。該染色体DNAを制限酵素HindIIIで切断した。ilvGM遺伝子を含むHindIII-HindIII DNA断片は4.8kbの長さであることが判明している。そこで4.8kb前後の長さを有するHindIII-HindIII DNA断片と、プラスミドベクターpBR322（宝酒造（株）より購入）をHindIIIで切断して得られるDNA断片とを連結した。
【００４１】
得られたDNA連結反応混合物を、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株であるエシェリヒア・コリMI262（CGSC5769）株に導入した。形質転換されてアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損の形質が相補された株を選択し、その株が保有するプラスミドを単離した。同プラスミドの構造を解析した結果、pBR322のHindIII部位にilvGM遺伝子及びilvE遺伝子の５’末端側の一部を含む4.8kbのDNA断片が挿入されていた。同プラスミドをpBRGM7と命名した。
【００４２】
Gene 97, 21, (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されているilvGM遺伝子の塩基配列を参考にして、配列表配列番号３と配列番号４に記載した合成オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、MI162株の染色体DNAを鋳型として、PCR法にてDNAの増幅を行った。同断片を断片（Ａ）とする。
【００４３】
同様にして、Gene 97, 21, (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されている塩基配列を参考にして、配列表配列番号５と配列番号６に記載した合成オリゴヌクレオチドを合成した。両DNAをプライマーとして、MI162株の染色体DNAを鋳型として、PCR法にてDNAの増幅を行った。同断片を断片（Ｂ）とする。
【００４４】
断片（Ａ）をSmaIで消化して得られる大断片と、ベクターpUC18（宝酒造）をSmaIで消化して得られるDNA断片とを連結してプラスミドpUCAを作製した。断片（Ｂ）をKpnIで消化して得られる大断片と、pHSG399（宝酒造）をHincII及びKpnIで消化して得られる大断片とを連結してプラスミドpHSGBを作製した。
【００４５】
プラスミドpUCAをKpnIで消化し、DNAポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにPstIで消化し、最終的に断片（Ａ）を含むDNA断片を単離した。プラスミドpHSGBをHindIIIで消化し、DNAポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにPstIで消化し、最終的に断片（Ｂ）を含むDNA断片を単離した。両DNA断片を連結し、プラスミドpHSGSKを作製した。
【００４６】
pHSGSKに搭載される、断片（Ａ）及び断片（Ｂ）に由来するSmaI-KpnI断片を断片（Ｃ）と命名した。断片（Ｃ）は、ilvGM遺伝子を含む4.8kbのHindIII−HindIII断片をSmaIとKpnIで切断して得られる断片に相当し、プロモーター、SD配列及びilvG遺伝子上流域を含むが、リーダー配列からアテニュエーター領域に至る配列約0.2kbを欠いている。以上、pHSGSKを構築する手順を図５にまとめた。
【００４７】
プラスミドpHSGSKをSmaIとKpnIで消化することにより断片（Ｃ）を得、プラスミドpBRGM7をSmaIとKpnIで消化することにより大DNA断片を得、両者を連結した。得られたプラスミドをpdGM1と命名した。pdGM1に搭載される、ilvGM遺伝子を含む４．６ｋｂのHindIII −HindIII断片は、アテニュエーションに必要な領域を欠いている。アテニュエーションに必要な領域を欠いたilvGM遺伝子を、本実施例及び図面において「ΔattGM」と表現する。以上、pdGM1を構築する手順を図６にまとめた。
【００４８】
特開平2-458号公報に記載されているプラスミドpDRIA4は、エシェリヒア属細菌で自律複製可能でありかつブレビバクテリウム属細菌で自律複製可能なシャトルベクターpDR1120と、E. coli K-12由来のスレオニンデアミナーゼをコードするilvA遺伝子及びilvD遺伝子の３’末端側の一部を含むBamHI-BamHI断片とが結合されて調製される。なお同BamHI-BamHI断片は、特開平2-458号公報では、2.3kbと記載されているが、現在では2.75kbであることが判明している。プラスミドpDRIA4はブレビバクテリウム・フラバムAJ12358（FERM P-9764）あるいはブレビバクテリウム・フラバムAJ12359（FERM P-9765）の染色体DNA外に存在する。これらの株から常法によりプラスミドpDRIA4を調製できる。
【００４９】
プラスミドpDRIA4上のBamHI-BamHI 2.75kbのDNA断片中、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするilvA遺伝子を含むHindIII−BamHI断片を調製し、ベクターpMW119（ニッポンジーン社製）をHindIII及びＢａｍＨＩで切断して得られるDNA断片と連結した。こうして作製されたプラスミドをpMWA1と命名した。
【００５０】
プラスミドpMWA1をHindIIIで切断して得られるDNA断片と、プラスミドpdGM1をHindIIIで切断して得られるilvGM遺伝子を含むDNA断片とを連結した。プラスミド上に存在する制限酵素認識部位の位置を解析することによって、ilvGM遺伝子の転写方向とilvA遺伝子の転写方向とが同方向となったものを選択し、これをプラスミドpMWGMA2と命名した。pMWGMA2は、アテニュエーターを除去されたilvGM遺伝子、ilvE遺伝子の５’末端側の一部、及びilvD遺伝子の３’末端側の一部を有している。以上、pMWGMA2を構築する手順を図７にまとめた。
【００５１】
エシェリヒア・コリMI162株の染色体DNAを調製し、これをSalI及びPstIで切断してDNA断片混合物を調製した。一方、ベクターpUC19（宝酒造社）をSalI及びPstIで切断してDNA断片を調製した。DNA断片混合物とpUC19が切断されて得られるDNA断片とを連結し、DNA混合物を得た。同DNA混合物を、トランスアミナーゼＢ欠損株であるAB2070株（J. Bacteriol. 109, 703, 1972、エシェリヒア・コリ ジェネティックス トックセンターから分譲。CGSC2070）に導入し、形質転換されて分岐鎖アミノ酸要求性が回復した株を選択した。同株よりプラスミドを調製したところ、プラスミドpUC19がSalI及びPstIで切断して得られるDNA断片と、ilvE遺伝子を含むSalI-PstI DNA断片が連結されていた。このプラスミドをｐＵＣＥ１と命名した。pUCE1は、ilvM遺伝子の３’末端側の一部、ilvE遺伝子、及びilvD遺伝子の５’末端側の一部を有している。
【００５２】
pMWGMA2をHindIIIで部分消化してDNA断片混合物を調製した。一方、pUCE1をHindIIIで切断し、ilvE遺伝子の一部とilvD遺伝子の５’末端側の一部とを含む1.7kbのHindIII−HindIII DNA断片を調製した。両者を連結して得られるDNA混合物を用いてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD遺伝子産物）欠損株AB1280株を形質転換し、形質転換された株のうち分岐鎖アミノ酸要求性が消失したものを選択した。同形質転換株から、プラスミドを調製したところ、pMWGMA2がΔattGMとilvAとの間に存在するHindIII部位でのみ切断されて得られるDNA断片と、pUCE1に由来するilvE遺伝子の一部とilvD遺伝子の一部とを含む1.7kbのHindIII−HindIII DNA断片が連結されており、ilvGMEDAオペロンが再生されていた。こうして得られるプラスミドをpMWD5と命名した。以上、pMWD5を構築する手順を図４にまとめた。
【００５３】
以上の様にして得られたプラスミドpMWD5(Apr)は、pMW119をベクターとしており、アテニュエーションに必要な領域が除去されたilvGMEDAオペロンを搭載したプラスミドである。
【００５４】
（６）ilvGMEDAオペロン及びaspA遺伝子を含むプラスミド(pMWD5-aspA)の作製
pMW118::aspAをSacIとHindIIIで切断後、平滑末端化し、aspAを含むDNA断片を取得した。pMWD5をAflIIで切断後、平滑末端化し、ここに前記aspAを含むDNA断片を挿入してpMWD5-aspAを得た(図９)。
【００５５】
（７）ilvGMEDAオペロン及びpntAB遺伝子を含むプラスミド（pMWD5-THY）の作製
pMW::THYをSmaIとHindIIIで切断後、平滑末端化し、pntABを含むDNA断片を取得した。pMWD5をAflIIで切断後、平滑末端化し、ここに前記pntABを含むDNA断片を挿入し、pMWD5-THYを得た（図９）。
【００５６】
（８）ilvGMEDAオペロン及びppc遺伝子を含むプラスミド（pMWD5-ppc）の作製
pppcをSacIとXbaIで切断後、平滑末端化し、ppcを含むDNA断片を取得した。pMWD5をAflIIで切断後、平滑末端化し、ここに前記ppcを含むDNA断片を挿入し、pMWD5-ppcを得た（図９）。
【００５７】
（９）ilvGMEDAオペロン、pntAB遺伝子及びppc遺伝子を含むプラスミド（pMWD5-PTS）の作製
pPTSをSacIとHindIIIで切断後、平滑末端化し、ppc及びpntABを含むDNA断片を取得した。pMWD5をAflIIで切断後、平滑末端化し、ここに前記ppc及びpntABを含むDNA断を挿入し、pMWD5-PTSを得た（図９）。
【００５８】
（１０）ilvGMEDAオペロン、aspA遺伝子、pntAB遺伝子、及びppc遺伝子を含むプラスミド（pMWD5-APT）の作製
pAPTをSacIとHindIIIで切断後、平滑末端化し、ppc、pntAB及びaspAを含むDNA断片を取得した。pMWD5をAflIIで切断後、平滑末端化し、ここに前記ppc、pntAB及びaspAを含むDNA断片を挿入しpMWD5-APTを得た（図９）。
【００５９】
【実施例２】
各種プラスミドを保持するエシェリヒア・コリによるアミノ酸生産
（１）Ｌ−スレオニンの生産
実施例１で得られた各種プラスミドをエシェリヒア・コリVKPM B-3996に導入した。これらの株を、以下の条件で培養した。
【００６０】
培養は、表１記載の組成を有する培地を用い、培養時間38時間、温度37℃、攪拌114〜116rpmでおこなった。表１中、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分は別々に調製して殺菌し、冷却後、Ａ成分１６／２０容量、Ｂ成分４／２０容量、Ｃ成分３０ｇ／Ｌとなるように混合した。培地中のＬ−スレオニン蓄積量を測定した結果を表２に示した。Ｌ−スレオニン生産性エシェリヒア属細菌において、細胞内のＴＨＹ活性及びＰＥＰＣ活性を増強することにより、Ｌ−スレオニン生産性が改善されることが判明した。また、さらにＡｓｐＡ活性を増強することにより、一層Ｌ−スレオニン生産性が向上することが判明した。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
【表２】
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【００６３】
（２）Ｌ−イソロイシンの生産
実施例１で得られた各種プラスミドをエシェリヒア・コリVKPM B-3996に導入した。これらの株を、以下の条件で培養した。
【００６４】
培養は、Ｌ−イソロイシン生産用培地（グルコース４０ｇ、硫酸アンモニウム１６ｇ、リン酸一カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸第一鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物０．０１ｇ、酵母抽出物２ｇ、炭酸カルシウム４０ｇを水１Ｌ中に含む。ｐＨ＝７．０）を用いて、３７℃で２４時間培養した。培地中のＬ−イソロイシンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表３に示す。
【００６５】
Ｌ−イソロイシン生産性エシェリヒア属細菌において、細胞内のＴＨＹ活性及びＰＥＰＣ活性を増強することにより、Ｌ−イソロイシン生産性が改善されることが判明した。また、さらにＡｓｐＡ活性を増強することにより、一層Ｌ−イソロイシン生産性が向上することが判明した。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
【発明の効果】
本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの生産能を向上させることができる。
【００６８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  aspA遺伝子を含むプラスミドpMW118::aspAの構築過程を示す図。
【図２】  pntAB遺伝子とppc遺伝子を含むプラスミド（pPTS）の構築過程を示す図。
【図３】  aspA遺伝子及びppc遺伝子を含むプラスミド（pAPW）の構築過程を示す図。
【図４】  aspA遺伝子、pntAB遺伝子、及びppc遺伝子を含むプラスミド（pAPT）の構築過程を示す図。
【図５】  プラスミドpHSGSKの構築過程を示す図。
【図６】  プラスミドpdGM1の構築過程を示す図。
【図７】  プラスミドpMWGMA2の構築過程を示す図。
【図８】  プラスミドpMWD5の構築過程を示す図。
【図９】  pMWD5-aspA、pMWD5-THY、pMWD5-ppc、pMWD5-PTS、pMWD5-APTの構築過程を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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