(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性標識ペプチド(ただし、99mTcで放射性標識されたヒト血清アルブミンは除く)、及びポビドンを含む安定なペプチド−放射性同位体組成物であって、ここで、
当該ポビドンが、放射能による当該ペプチドの分解を軽減するために十分な量で存在する、前記組成物。
【請求項２】
アスコルビン酸、ベンジル・アルコール、システアミン、シスタミン、プロピレン・グリコール、デキストラン、及びゲンチシン酸から成る群から選ばれる二次安定化剤を更に含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記二次安定化剤がアスコルビン酸である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アスコルビン酸が前記組成物中10mg/ml以下で存在する、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記アスコルビン酸が前記組成物中0.9〜1.3mg/mlの範囲で存在する、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
前記放射性標識ペプチドは、600mCi超の総放射能場、且つ5mCi/ml超の活性濃度を供給する、請求項2に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポビドンが前記組成物中0.5〜10%(w/v)の範囲内で存在する、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポビドンが前記組成物中5〜6%(w/v)の範囲内で存在する、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
前記放射性標識ペプチドは、10mCi/ml以下の活性濃度を供給する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポビドンのK値が17である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポビドンの粘度平均分量が6〜38kDの範囲内にあり、且つ、その重量平均分子量が10〜50kDの範囲内にある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記放射性標識ペプチドが抗体である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が、CD20抗原に結合する、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記放射性標識ペプチドが、β粒子、光量子、α粒子、オージェ電子、及び内部変換電子から成る群から選ばれるものを放射する放射性同位体によって放射性標識されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
前記放射性標識ペプチドが、111In、67Ga、90Y、131I、125I、123I、32P、47Sc、67Cu、90Y、109Pd、111Ag、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、199Au、211At、212Bi、223Ra、225Ac、213Bi、及び99mTcから成る群から選ばれる放射性同位体によって放射性標識されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
前記放射性同位体が131Iである、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
前記放射性同位体が、131Iによって放射性標識された抗CD20抗体であり、そして組成物中、当該抗体が1.5〜2.5mg/mlの濃度で存在し、ポビドンが5〜6%(w/v)の濃度で存在し、且つ、アスコルビン酸が0.9〜1.3mg/mlの濃度で存在する、請求項3に記載の組成物。
【請求項１８】
前記131Iの放射能レベルが8〜12mCiである、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記131Iの放射能レベルが112〜166mCiである、請求項17に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物中、8.5〜9.5mg/mlの濃度の塩化ナトリウム、1.11〜1.35mg/mlの濃度且つpH7.0〜7.2のリン酸カリウム、及び1〜2%(w/v)の濃度のマルトースを更に含む、請求項17に記載の組成物。
【請求項２１】
放射性標識ペプチドを含む組成物の放射能による分解を軽減する方法であって、分解軽減量のポビドンを前記組成物と接触させるステップを含む前記方法。
【請求項２２】
アスコルビン酸、ベンジル・アルコール、システアミン、シスタミン、プロピレン・グリコール、デキストラン、及びゲンチシン酸から成る群から選ばれる二次安定化剤を前記組成物と接触させることを更に含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記二次安定化剤がアスコルビン酸であり、そしてこれが前記組成物中10mg/ml以下の最終濃度を達成するために十分な量で提供される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物は、600mCi超の総放射能、且つ、5mCi/ml超の活性濃度を供給する、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポビドンが前記組成物中0.5〜10%(w/v)の範囲内の最終濃度を達成するために十分な量で提供される、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポビドンが前記組成物中5〜6%(w/v)の範囲内の最終濃度を達成するために十分な量で提供される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は、10mCi/ml以下の活性濃度を供給する、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポビドンのK値が17である、請求項21に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポビドンの粘度平均分量が6〜38kDの範囲内にあり、且つ、その重量平均分子量が10〜50kDの範囲内にある、請求項21に記載の方法。
【請求項３０】
前記放射性標識ペプチドが抗体である、請求項21に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、CD20抗原に結合する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記放射性標識ペプチドが、β粒子、光量子、α粒子、オージェ電子、及び内部変換電子から成る群から選ばれるものを放射する放射性同位体によって放射性標識されている、請求項21に記載の方法。
【請求項３３】
前記放射性標識ペプチドが、111In、67Ga、90Y、131I、125I、123I、32P、47Sc、67Cu、109Pd、111Ag、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、199Au、211At、212Bi、223Ra、225Ac、213Bi、及び99mTcから成る群から選ばれる放射性同位体によって放射性標識されている、請求項21に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヨウ素の放射性同位体が131Iである、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
放射性標識ペプチドと接触させられ得る安定化剤溶液を含む放射性標識ペプチドのための放射線保護剤であって、当該安定化剤溶液が放射能による放射性標識ペプチドの分解を軽減させるための薬剤としてのポビドンと、アスコルビン酸、ベンジル・アルコール、システアミン、シスタミン、プロピレン・グリコール、デキストラン及びゲンチシン酸から成る群から選ばれる二次安定化剤とを含む、前記保護剤。
【請求項３６】
前記二次安定化剤がアスコルビン酸であり、そしてこれが、放射性標識ペプチド及び前記安定化剤溶液を含有する組成物中10mg/ml以下で存在する、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項３７】
前記安定化剤溶液が、600mCi超の総放射能場、且つ、5mCi/ml超の活性濃度を提供する放射性標識ペプチドを含む組成物を、安定化させる、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項３８】
前記ポビドンが、放射性標識ペプチド及び前記ポビドンを含有する組成物中0.5〜10%(w/v)の範囲内で存在する、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項３９】
前記安定化剤溶液が、10mCi/ml以下の活性濃度を供給する放射性標識ペプチドを含む組成物を、安定化させる、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項４０】
前記ポビドンが6〜38kDの範囲内の分子量を、且つ、10〜50kDの範囲内の重量平均分子量をもつ、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項４１】
前記安定化剤溶液が、放射性標識抗体を含む組成物を安定化させる、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項４２】
前記安定化剤溶液が、CD20抗原に結合する放射性標識抗体を含む組成物を安定化させる、請求項41に記載の放射線保護剤。
【請求項４３】
前記安定化剤溶液が、β粒子、光量子、α粒子、オージェ電子、及び内部変換電子から成る群から選ばれるものを放射する放射性同位体によって放射性標識されている放射性標識ペプチドを含む組成物を安定化させる、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項４４】
前記安定化剤溶液が、111In、67Ga、90Y、131I、125I、123I、32P、47Sc、67Cu、109Pd、111Ag、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、199Au、211At、212Bi、223Ra、225Ac、213Bi、及び99mTcから成る群から選ばれる放射性同位体によって放射性標識されている放射性標識ペプチドを含む組成物を安定化させる、請求項35に記載の放射線保護剤。
【請求項４５】
安定化剤溶液が、放射性同位体131Iにより放射性標識されている放射性標識ペプチドを含む組成物を安定化させる、請求項44に記載の放射線保護剤。
【請求項４６】
放射能による放射性標識ペプチドの分解を軽減させるための有効成分としてポビドンを含有する、放射性標識ペプチド安定化剤。
【請求項４７】
アスコルビン酸を更に含む、請求項46に記載の安定化剤。
【請求項４８】
前記放射性標識ペプチドが、約70Ci以下の総放射能場を提供する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記放射性標識ペプチドが、共有結合標識付けにより放射性標識されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記放射性標識ペプチドが、直接置換法により放射性標識されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５１】
前記放射性標識ペプチドが、キレート形成法により放射性標識されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記放射性標識ペプチドが、前記ペプチドと放射性同位体との物理的混合物として存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、患者への投与のために好適である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項１に記載の安定化ペプチド−放射性同位体組成物の製造方法であって、以下のステップ：
ペプチドを放射性同位体で標識付けし、そして
前記標識化ステップの直後に、当該標識されたペプチドをポビドンと接触させる、
を含む前記方法。
【請求項５５】
前記標識されたペプチドを、アスコルビン酸、ベンジル・アルコール、システアミン、シスタミン、プロピレン・グリコール、デキストラン、及びゲンチシン酸から成る群から選ばれる二次安定化剤と接触させるステップをさらに含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記二次安定化剤がアスコルビン酸である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記アスコルビン酸が、前記組成物中0.9〜1.3mg/mlの範囲内の最終濃度を達成するために十分な量で提供される、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、600mCi超の総放射能場、及び5mCi/ml超の活性濃度を提供する、請求項55に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポビドンが、前記組成物中5〜6%(w/v)の範囲内の最終濃度を達成するために十分な量で提供される、請求項54に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物が、10mCi/ml以下の活性濃度を提供する、請求項54に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、放射性標識されたペプチド、例えば抗体、その他のタンパク質及び小ペプチドなどのための保護剤の使用に関する。
背景
放射性免疫治療及び放射性免疫診断では、臨床治療薬又は画像診断薬を、体内の必要部位に優先的に供給する。この集中化方法は、有害な副作用を減らすことができるので、特に有望である。抗体、特にモノクローナル抗体は、治療上又は診断上の放射線照射が最も有効と思われる患者体内の腫瘍又は特異的組織部位に、有効量の放射線を供給する臨床薬としてよく用いられる。リガンド−受容体結合を介した方法で放射性同位体を標的へ供給するためには、他のペプチドも用いられる。
放射性標識された抗体及びその他のペプチドに共通する問題点は、完全な放射性標識産物の寿命が短いことである。ペプチドに保持されている放射性同位体によって、放射性分解の一環として、そのペプチドの分解が引き起こされる。この分解は、ペプチドを放射性標識した直後から始まり、多くの場合には、有用な効果を与えるために、その放射性標識産物を患者に投与する前までに、容認できないレベルまで進行する。通常タンパク質と呼ばれている大きいペプチド、例えば抗体などの場合には、この様な分解は特に問題となる。その分子の構造及び立体配置は、その活性に関係しており、元の構造の単一の修飾でさへも、その機能に悪い影響を与えることがある。例えば、敏感な、そして時に得ることが困難であるタンパク質又はペプチド、例えばモノクローナル抗体では、放射性同位体の粒子放射によって、又は、放射性同位体存在下に水溶液中に発生するフリーラジカルによって、損傷が誘発される。
放射性分解される性質から、放射性標識産物の保存及び輸送が困難となり、多くの場合、放射性標識する中央施設ではなく、患者に投与する場所において、実際に産物を放射性標識する必要が生じる。多くの放射性薬剤調剤部では、高レベルの放射性標識ができないので、患者への利用度が制限される。この様な放射性標識を行うために備えられた放射性薬剤調剤部では、職員の特別の訓練が要求される。しかもこの様な環境では、産物の再現性が低く、処理費用が実質的に高くなる。更に一般的には、患者を治療する当日に、その場で放射性標識しなければならない。
以前から、ヒト血清アルブミン(HSA)が、放射性標識抗体を保護するために用いられてきた。しかし、薬物調剤におけるHSAの使用は、費用、供給困難性、そして最も重要な点として、ウイルス及び他の病原体の混入可能性の点で問題がある。例えば、業者から供給されたHSAは、クロイツフェルト・ヤコブ病などの疾病の伝染可能性から、回収されたことがある。代替品として、他の物質、例えばゲンチシン酸(米国特許5,384,113参照)及びプロピレングリコールが提唱されている。しかし、患者の許容性、費用、他の目的のために投与される薬物との配合禁忌などを考慮すると、代りの放射線保護剤が望まれる。従って、ペプチドの放射線保護のために、他の物質及び方法が求められている。
発明の要約
本発明の目的は、ペプチドの放射線保護のために、以前に用いられていたものとは異なる構造及び活性を有する物質を用いた方法及び組成物を提供することである。前記目的は、ポリビニルピロリドン(PVP)として広く知られているポビドンを、放射性標識されたペプチド、特にタンパク質、例えば抗体、の分解を軽減するための放射線保護剤として使用することによって達成される。ポビドンは、放射線保護剤として、単独で、あるいは、アスコルビン酸又は別の二次安定化剤と組み合せて用いられる。
本発明の別の点は、ポビドン単独、あるいは、アスコルビン酸又は別の二次安定化剤と組み合せたポビドンのいずれかによって保護された放射性標識ペプチドを含有する安定なペプチド−放射性同位体組成物である。
本発明の更に別の点は、放射性同位体によってペプチドを標識すること、次にその放射性標識ペプチドを、ポビドンを含有する放射線保護剤に接触させることを含んで成る、安定なペプチド−放射性同位体組成物を生産する方法である。
放射線保護剤を、放射性標識ペプチドの分解を軽減するための使用説明書と共に供給する製品も、本発明に含まれる。
実施態様の説明
ポビドンは、直鎖状に重合された1-ビニル-2-ピロリドン(ビニルピロリドン)から本質的に成る合成ポリマーであり、重合度によって様々な分子量のポリマーとなる。ポビドンは、周知の物質であり、種々の等級、例えば医薬等級のものが商業的に入手可能である。米国の医薬等級(USP)のポビドンの詳細を知るために、例えば業者の種々の文献、例えばGAF Chemicals Corporation(1361 Alps Road,Wayne,NJ)から入手できるPlasdone▲Ｒ▼C-15/Plasdone▲Ｒ▼C-30/ポビドンUSPの製品説明書を参照するとよい。
ポビドンは、典型的には、水の粘度と比較した水溶液状態での粘度によって特徴付けられ、この粘度はK値として表わされ、典型的には10〜120の範囲である。K値は、粘度測定から分かる様に、分子量の関数となり、Fikentscherの式から計算される(Fikentscher et al.,Modern Plastics,23(3):157-161,212,214,216,218(1945)参照)。K値が17であるポビドンでは、粘度平均分子量(Mv)は約7kDであり、重量平均分子量(Mw)は約10kDである。K値が30であるポビドンでは、粘度平均分子量は約38kDであり、重量平均二分子量は約50kDである。
ポビドンは、長年、医薬調合剤中に用いられてきた。これは、最初、1940年代に血漿増量剤として用いられたが、現在では、この目的では、デキストランに取って代られている。ポビドンは、広く、特に経口用錠剤及び液剤において、賦形剤としても利用されており、本質的に無毒性とみなされている。更にポビドンは、局所的に皮膚に適用されても、皮膚に対する刺激性がなく、感作を誘導しない。
水と混合した場合、ポビドンは網状構造を形成し、そして混合液中のポビドンの重量%が増加するに連れて、生成物の粘度が増加する。従って、ある調合剤中に放射線保護剤として存在するポビドンの量は、その調合剤の必要性に応じて、種々の程度の保護効果及び粘度を得るために、調整される。一般に、ポビドンの含有量の上限は、調合剤における希望又は要求される粘度によって決定される。例えば、静脈内(IV)注射用調合剤中には、一般に20%未満、より普通には10%未満、好ましくは7.5%未満のポビドンが含まれる(本明細書中の%は、特に言及しない場合、調合剤全容量あたりの重量による)。最も好ましい静脈内注射用調合剤には、5〜6%のポビドンが含まれる。より高濃度では、放射線保護効果が継続するので、粘度によって制限されない他の目的のためには、より高濃度用いてもよい。組成物中のポビドンの含有量の下限は、希望する放射線保護の程度によって決定され、その調合剤の放射活性(普通はミリキュリー(mCi)で表わされる)に応じて変動する。本発明は、活性濃度が7.5mCi/ml以下であるペプチド−放射性同位体組成物に適用することが好ましい。しかし10mCi/ml程度の活性濃度でも、ポビドンが調合剤中に5%の濃度で含まれた場合、131Iによって標識されたテスト抗体に対して優れた保護効果を示し、更に、より低量で含まれた場合にも、統計的に有意な保護効果を示した。
本発明では、安定なペプチド−放射性同位体組成物を作成するために、放射活性によるペプチドの分解を軽減するために十分な最小量のポビドンが、調合剤中に含まれる。このペプチドの分解は、普通は、ペプチドの生物活性(抗体又は他のタンパク質の特異的抗原又は基質に結合する活性など)の低下、あるいは、ペプチドと結合している放射活性レベルの経時的減少によって測定される。本文では、用語「安定な」とは、ペプチドの使用目的のために一般的に容認されるレベル以上の生物活性及び物理化学的完全性を保つことを意味する。例えば、本発明の安定なペプチド−放射性同位体組成物では、患者に投与して治療又は診断するために必要な生物活性及び物理化学的完全性が、その投与に必要な期間維持される。更に、この安定なペプチド−放射性同位体組成物には、例えば免疫反応分画(IRF)検査によって測定される特異結合が55%以上、そして例えば即時薄層クロマトグラフィー(ITLC)によって測定されるペプチドと結合した放射活性が90%以上で保持されている性能の組成物が含まれる。当然、人間の治療での使用を目的とするペプチドでは、例えばインビトロの診断キットでの使用を目的とするペプチドに比べて、より高レベルの生物活性及び物理化学的完全性が要求されるだろう。本発明の安定なペプチド−放射性同位体組成物中には、好ましくは、その組成物の約0.5〜10%(w/v)、より好ましくは約1〜7.5%(w/v)、そして更により好ましくは5〜6%(w/v)の範囲で、ポビドンが含まれる。
検査した全ての分子量のポビドンが、統計的に有意な放射線保護効果を示したことから、放射線保護剤として用いるポビドンの分子量に関して、特定の制限はない。従って、本発明における使用のためには、17〜30の範囲のK値を有するポビドンが適当であり、すなわち、粘度平均分子量が約6〜38kDの範囲であり、且つ重量平均分子量が約10〜50kDであるものが適当である。しかし、粘度平均分子量6〜8kD且つK値17であるポビドンが、より高い粘度平均分子量を有する等量のポビドンに比べて、より長い期間、幾分より強い放射線保護効果を示したことから、好ましい。
ポビドンは、それ自身で十分な放射線保護効果を発揮するが、保護効果を追加するために、又はその他の目的のために、他の物質とポビドンとを混合することも当然可能である。例えば、タンパク質の有害な酸化を防ぐためには、普通アスコルビン酸が用いられており、ポビドンを含有する調合剤においても、この目的のために用いられ得る。ビタミンCとしても知られているアスコルビン酸は、医薬組成物、及び生物学的目的のために用いられる他の調合剤においてしばしば使用され、一般に安全であると認められている(GRAS)物質であり、容易に入手できる。これは、最終的調合剤中で10mg/ml程度のレベルで用いることができるが、最も低い有効濃度、普通は0.9〜1.3mg/mlの範囲の濃度が好ましい。下記実施例で説明するいくつかの調合剤では、特に5〜6%(w/v)のポビドンと1mg/ml(0.1%w/v)のアスコルビン酸との組み合わせが有効であった。ポビドンの放射線保護効果を補足するために、本発明の組成物に用いることができる二次安定化剤の別の例には、ベンジルアルコール、システアミン、シスタミン、プロピレングリコール、デキストラン、及びゲンチシン酸がある。
アスコルビン酸などの二次安定化剤は、一定の放射性標識ペプチド組成物の放射線保護のためにポビドンと組み合せた場合、特に有効である。例えば、治療での使用のために大容量で生産する必要がある放射性標識ペプチドは、大きな容器中に集められることがある。大容量の調合剤には、バイアル中の放射性標識ペプチドに比べて、高レベルの放射活性が含まれる。大容量で作業する場合、光量子からのγエネルギーの蓄積は、小容量の場合よりも非常に高く、すなわち単位量あたりの蓄積が増え、その結果ペプチドを損傷する能力がより強まる。従って、より強い放射線保護効果が必要とされるだろう。この様な場合、ポビドンの濃度を増加させることは、最終的な放射性標識ペプチド組成物の粘度を上げることになるので、好ましくない。従って、粘度の増加を伴うことなく放射線保護効果を増すために、生産特性及び放射性標識ペプチド組成物の希望する最終特性に応じて、アスコルビン酸又は別の二次安定化剤をポビドンと混合することができる。下記実施例では、放射性同位体の光量子放射による損傷から放射性標識ペプチド組成物の大容量生産物を保護する際に、特にアスコルビン酸をポビドンと組み合せることが有効であった。放射性標識ペプチドが600mCiを超える放射活性、及び5mCi/mlを超える活性濃度で含まれる場合には、放射線保護のために、ポビドンと組み合せて二次安定化剤を用いるのが好ましい。二次安定化剤の追加による安定性の向上は、放射活性が50Ci及び70Ci且つ活性濃度が8.2mCi/mlである放射性標識ペプチドの場合にも認められた。
従って本発明は、放射性標識ペプチド及び、放射線保護剤としてポビドンを含有する安定なペプチド−放射性同位体組成物を含む。本安定化組成物は、有意な程度に放射性分解から防護される。更に本組成物は、放射線保護剤として、ポビドンと組み合わせてアスコルビン酸又は別の二次安定化剤を含んでもよい。
本発明の別の点は、ポビドン、あるいは、アスコルビン酸又は別の二次安定化剤と組み合せたポビドン含んでいる放射線保護剤を組成物に加えることによって、放射性標識ペプチドを含有する組成物の分解を軽減するための方法である。また本発明は、ペプチドを既知の方法によって標識し、次に本発明の放射線保護剤と接触させることによって、安定なペプチド−放射性同位体組成物を生産する方法も含む。理想的には、ペプチドを放射性標識した直後に、本放射線保護剤を、その放射性標識ペプチドと接触させる。例えば、放射性標識ペプチドを生産する工程において、比較的少規模な臨床用の生産か又は大規模製造における生産かに関わらず、放射性標識されたペプチドが放射性分解を受けるであろう時間を最小限にするために、放射性標識したペプチドを、直接、本放射線保護剤が入っている適当な容器に採取することができる。
本発明の別の点は、ポビドン、又は安定化剤溶液(例えば溶出緩衝液)中のポビドン、又はアスコルビン酸若しくは別の二次安定化剤と組み合せたポビドンが、放射性標識ペプチドの放射線保護のために一般的に有効な濃度で、又は、特定のペプチド及び特定の放射性同位体のために特別に調整した濃度で含まれている、放射線保護剤又は安定化剤である。本放射線保護剤は、調製した放射性標識ペプチドと混合することができる安定化剤溶液として供給することが好ましく、この場合、この安定化剤溶液を放射性標識ペプチドに直接加える。
更に、本発明は、本発明の放射線保護剤と、放射活性による放射性標識ペプチドの分解を軽減するための本放射線保護剤の使用説明書とを組み合せて含んでいる製品を含む。
当業界の種々の既存の方法を用いて、ペプチドの放射性標識(これ自体は本発明には含まれない)を行うことができる。放射性同位体によるペプチドの標識は、例えば、キレート化剤を用いることによって、ペプチドと直接反応することができる物質(例えばヨウ素)を共有結合させることによって、あるいは、直接的標識(ペプチド中に存在する原子を、14C又はトリチウムなどの放射性同位体によって置換すること)によって行うことができる。放射性標識方法に関する一般技術(及び、本明細書に記載したポビドンによる保護以外で、放射性同位体を含有する調合剤の調製に関する他の一般的情報)に関して、米国特許5,384,113、並びに、多数の他の特許及び文献を参照すること。本明細書では、用語「放射性標識された」とは、種々の既知の方法、例えば、共有結合による標識方法、直接置換による方法、あるいはキレート化による方法によって、放射性同位体と結合した生産物を記述し、更に、物理的混合物の様に、放射性同位体と非常に近接したペプチドを記述するものである。ペプチドと放射性同位体との混合物に対しても、本発明の放射線保護剤は有効である。ペプチドと結合した放射活性又はタンパク質と結合した131I値などの表現において、用語「ペプチドと結合した」又は「タンパク質と結合した」は、前記混合物に対しても用いられ、同様に、用語「ペプチド−放射性同位体組成物」は、前記混合物も含んで意味する。
本発明は、種々の大きさ及び立体構造のペプチドのために広く用いられる。従って、本明細書では、用語「ペプチド」は、小さなペプチド、大きなポリペプチド、及び全ての多様なタンパク質を含んで意味する。同様に、本発明は、放射性標識ペプチド組成物中に存在する放射性同位体の種類によって限定されない。本放射線保護剤は、β粒子、光量子(X線及びγ線)、α粒子、オージェ電子、及び/又は内部変換電子を放射する放射性同位体から、ペプチドを保護することができる。従って、本発明は、111In,67Ga,90Y,131I,125I,123I,32P,47Sc,67Cu,109Pd,111Ag,153Sm,166Ho,177Lu,186Re,188Re,199Au,211At,212Bi,223Ra,225Ac,213Bi,及び99mTcを含む広範囲の放射性同位体を原因とする放射性分解からペプチドを保護するために、有利に用いられ得る。
放射性標識産物の完全性は、例えば、放射性標識抗体の機能を決定するために、免疫反応性を経時的に測定することによって、あるいは、非結合のヨウ素若しくは他の放射性同位体の値を測定するために、又は、キレート化剤からの放射性同位体の分離を決定するために、薄層クロマトグラフィー、例えば即時薄層クロマトグラフィー、を用いることによって、検査することができる。望ましくない凝集、断片化、又は非結合放射性同位体の遊離を検査するために、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いることもできる。
本発明の組成物における経時的安定性の向上は、各時点で採取したサンプルにおいて、安定化された生物活性及び/又は放射性同位体結合(例えば、免疫反応性、及び、結合したヨウ素又は他の放射性同位体の値)を決定することによって証明することができる。生産後８日を含む日まで凍結し、融解及び再検査したサンプルにおいて、安定性を長期間維持するために、本発明の調合剤は有効であった。生産後８時間を含む時間まで室温で保持したサンプルも、安定であった。
ここでは、本発明を一般的に記述した。以下の実施例を参照することによって、本発明を理解することができるだろう。この実施例は、説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。以下の実施例の大部分は、米国特許5,595,721に記載されている、患者を治療するための131I標識抗CD20抗体の使用に関するものである。
実施例
実施例1：放射線保護剤を含有する131I標識抗CD20抗体の調合剤
米国特許5,595,721に記載されている放射線免疫治療に用いるために、本発明に従って、放射性標識産物の調合剤を調製した。詳しくは、CD20抗原に対するモノクローナル抗体である131I標識B1抗体を、本発明の放射線保護剤を含有する組成物の成分として用いる。更に、本組成物は、周知の生理緩衝液及び安定化剤、例えばリン酸カリウム、塩化ナトリウム及びマルトースを含有する。
前記調合剤のために、一般的には、ポビドン粉末と溶出緩衝液(リン酸カリウム及び塩化ナトリウムを含むもの)とから、22.22%(w/v)ポビドンの濃縮水溶液を作る。そのpHを7.1±0.1に調整する。この溶液を0.22μmフィルターに通して濾過滅菌し、ガラスボトルに分配する。このポビドン溶液を、その外観、濃度、無菌性、pH及び内毒素について検査する。
前記調合剤のために、前記溶出緩衝液とアスコルビン酸粉末とから、11mg/mlのアスコルビン酸保存溶液を調製する。そのpHを7.1±0.1に調整する。この溶液を0.22μmフィルターに通して濾過滅菌し、ガラスボトルに分配する。このアスコルビン酸保存溶液を、その外観、濃度、pH、無菌性及び内毒素について検査する。
非ホジキンリンパ腫を治療するための本調合剤を、放射性標識中央施設で調製し、臨床現場に輸送する。この調合剤は、通常の輸送期間及び治療のための投与期間を通して安定である。中央施設で、微量用量(画像検査若しくは線量測定用)で標識するか、又は治療用量(放射線免疫治療用)で標識した抗体を含有する医薬調合剤を、本発明の放射線保護剤を用いて作り、保存し、そして臨床治療現場に輸送することができる。本発明は、放射性標識中央施設で実際に行われた。
下記成分から成る1.4ml溶液を含む典型的線量測定用10mlバイアル
・タンパク質：2.0±0.5mg/ml
・較正済放射活性：8-12mCi
・ポビドン：5.5±0.5%
・アスコルビン酸：1.1±0.2mg/ml
・リン酸カリウム：12.5mM(1.23±0.12mg/ml),pH7.0-7.2
・塩化ナトリウム：150mM(9.0±0.05mg/ml)
・マルトース：1-2%(0.01-0.02g/ml)
下記成分から成る20.0ml溶液を含む典型的治療用30mlバイアル
・タンパク質：2.0±0.5mg/ml
・較正済放射活性：112-166mCi
・ポビドン：5.5±0.5%
・アスコルビン酸：1.1±0.2mg/ml
・リン酸カリウム：12.5mM(1.23±0.12mg/ml),pH7.0-7.2
・塩化ナトリウム：150mM(9.0±0.05mg/ml)
・マルトース：1-2%(0.01-0.02g/ml)
実施例2：異なる濃度のポビドン存在下における放射性標識産物の相対的安定性
異なる濃度のポビドンを用いて、131I標識B1抗体のサンプルを調製した。特に、最終組成物中0.5%,1%,2.5%及び5%(w/v)のポビドンを含有するサンプルを調製した。これらのサンプルでは、放射活性濃度5mCi/ml、比活性3.2mCi/mg、そして抗体タンパク質濃度1.6mg/mlとした。以前から、濃度5-6%のポビドンが生理学的投与のために許容されていて、そして可能な限り最小の有効濃度が一般的に望ましいので、本実験ではより高濃度のポビドンは検査しなかった。放射性標識産物の安定化のために、標準的濃度(5% w/v)のHSAを含有するサンプル、並びに、標準的濃度(2% w/v)のプロピレングリコール(PG)を含有するサンプルも調製した。
これらのサンプルを室温で保存し、1日目、2日目及び5日目に、放射性化合物の純度、すなわち放射性標識産物の安定性について、即席薄層クロマトグラフィー(ITLC)で検査した。二分割した一方のサンプルを、0日目に-70℃で凍結し、5日目に解凍して、比較のために検査した。
サンプルを、ITLC用シリカゲル線状切片の底部に加えて、ITLCを行う。この薄層切片を、ITLC用チャンバー中で、80-85%メタノールと15-20% H2Oとの溶液によって泳動する。低分子量断片及び非結合ヨウ素は、完全な131I標識B1抗体よりも原点から遠くに移動する。非結合ヨウ素及び低分子量断片は上半分に局在し、一方完全な抗体は、原点近くの薄層切片の底部に留まる。展開した薄層切片を半分に切り、各半切片を、ガンマカウンターで測定する。放射性化合物の純度を、上半分のcpm値を切片全体の総cpm値と比較して決定する。
その結果、図1で示す通り、5%ポビドン(5% PVP)を含有する望ましい調合剤は、最も高レベルのタンパク質と結合した131Iを有すること、更に、検査した全時点で、事前に指定した産物特性限界(product specification limit)である95%を超えた。詳しくは、図1の5aの時点で示す様に、好ましい5%ポビドン含有調合剤の凍結/融解サンプルは、その調合剤の室温サンプルの値と同程度のタンパク質結合131Iレベルを示した。反対に、5% HSAのサンプル及び2% PGのサンプルでは、1日目に、結合131Iの割合が即座に急激に減少した。これらのサンプルも、凍結保存した場合、5日目の検査(時点5a)でより良く保存されていた。しかし、この処理は、最良の場合を意味しており、実際の生産、保存及び輸送では提供されない。
本実験の結果から、室温での5日間保存における生産物の安定性維持に関して、5%ポビドンが5% HSAよりも優れていることが分かる。5%ポビドン含有調合剤の5日目のITLCの値は、室温保存の場合と凍結保存の場合とで、等価である(96.0対96.3%結合131I)。また、5%ポビドン含有調合剤は、生産物の安定性維持の点で、2%プロピレングリコール含有調合剤よりも優れている。調合剤中のポビドンの割合の変更効果も調べた。ポビドンの割合が下がるに連れて、各検査時点で、それに伴なった結合131I値の低下が見られた。
実施例3：異なる濃度のポビドン存在下における放射性標識産物の相対的能力
調製した131I放射性標識B1抗体を、種々の割合のポビドン中に、放射活性濃度7.5mCi/mlに希釈した。この調合剤の比活性は4mCi/mgであった。異なる時点で、この調合剤からサンプルを取り出し、IRF検査、及び前記のITLCによって検査した。
異なる濃度のポビドン存在下の131I標識B1抗体の能力と機能性を、免疫反応分画(IRF)検査にて、前記抗体の抗原CD20との結合能力から決定した。IRF法は、凍結乾燥した標準細胞株を用いた全細胞を基にした検査方法であり、本検査では、CD20抗原を発現しているBall-1細胞株を用いた。一定の濃度の131I標識B1抗体を、既定容量の細胞とインキュベーションした。% IRFを、検査液に加えた総cpm量に対する、抗原と結合した標識抗体に由来する分画のcpm量の比率×100(%結合cpm/総cpm)として計算した。前記の両値は、非特異的結合を基にして補正したものである。これが、免疫反応分画検査である。この% IRFは、また、ITLCによって測定した放射性化合物の純度を基にして補正される。本検査は、放射性標識工程が、抗体分子の生物活性を低下させないことを保証するために行われる。IRF検査は、また、種々の保存条件において放射性標識抗体の経時的安定性の測定としても有効である。
前記サンプルを、室温で検査期間保存した。図2の通り、5%,7.5%及び10%のポビドンを含有する調合剤は、8時間まで生産物能力を維持すると認められる。各時点のIRF値は少し異なるが、これらの差は、細胞を基にした検査で予測される分散の範囲内である。最大差は、8時間の時点で見られるが、全ての値が、事前に指定した産物特性限界である65%を超えている。
図3で示した結果からは、5%,7.5%及び10%ポビドン含有調合剤は、室温で24時間まで、容認できるレベルのタンパク結合131Iを示すことが分かる。
実施例4：放射線保護剤ポビドン存在下における中間レベルの放射活性を有する放射性標識産物の評価
中間レベルの放射活性を有する放射性標識産物を、放射線保護剤の5%ポビドンと混合して調製した。詳しくは、54mgのB1抗体を268mCiの131Iによって標識して、標識比活性5mCi/mgを得た。この放射性標識抗体を、活性濃度6.4mCi/ml、比活性3.6mCi/mg及び抗体タンパク質最終濃度1.7mg/mlに調整した。この調合剤を5mlずつに分け(32mCi/バイアル)、その内いくつかのサンプルを-70℃で凍結保存し、他のサンプルを室温に放置した。前記同様、非結合131Iの最終的産物特性限界を5%以下に設定した。
図4に示した通り、全ての検査時点で、室温保存及び凍結保存の両方の場合で、放射線保護剤として5%ポビドンを含むサンプルは、タンパク質結合131I値の事前設定した産物特性限界を超える安定性を示した。更にIRF検査を行ったところ、5日目の凍結/溶解サンプルの免疫反応性レベルは、0時点のサンプルで示された値と同程度であることが示された(図4の最初と最後の時点)。
実施例5：異なる分子量のポビドン存在下における放射線標識産物の相対的安定性
B1抗体を200mCiの131Iで標識して、C-15又はC-30型のポビドン(GAF Chemicals Corporation,1361 Alps Road,Wayne,NJから入手できる)の5.5%溶液中に希釈した。C-15型ポビドンは、粘度平均分子量(Mv)7kDであり、そしてK値17である。C-30型ポビドンは、Mv38kDであり、そしてK値30である。最終活性濃度は7.5mCi/mlであり、全サンプルを室温で放置し、0,3,6,10及び24時間の時点で検査した。
サンプルの安定性及び能力を、実施例2及び3の記載通り、ITLC及びIRF検査によって決定した。図5及び図6は、両ポビドン含有組成物が有意な放射線保護効果を示したことを示す。タンパク質結合131I値及び産物能力の両方が徐々に低下することは、活性濃度7.5mCi/mlの標識産物を室温保存することから予想される。しかしながら、このデータは、24時間までの間、事前設定した特性限界を超えて安定性を維持する際に、ポビドンが有効であることを証明している。図5のITLCによる安定性のデータを詳細に見ると、特に最後の時点で、C-15ポビドンの方が、C-30ポビドンよりもより強く保護効果を呈したことが分る。同様に、図6のIRFによる能力のデータからは、より後半の時点で、C-15ポビドンの方が好ましいことが示される。より低分子量であることから、腎によるより早いポビドンの清掃と排出が可能となり、その結果潜在的な毒性が減少する。従って一般的にも、C-15ポビドン、すなわちK値17のものが好ましい。
実施例6：放射線保護剤としてのポビドン及びポビドン/アスコルビン酸存在下における相対的安定性及び能力
放射活性が高レベルである場合の放射線保護剤の適応性を調べるために、2つの異なる生産実験を行った。1番目の実験では、放射線保護剤として5.5%ポビドンを、2番目の実験では、放射線保護剤として5.5%ポビドン及び0.1%アスコルビン酸を、大容量産物の室温保存における安定性の維持効果について評価した。
各実験では、900mgのB1抗体を4500mCiの131Iで放射性標識した。ポビドン単独を評価する最初の実験では、その最終産物の特異性は、総活性3735mCi、容量511ml、較正日における活性濃度6.1mCi/ml(製造後すなわち放射性標識後48時間経過したとして、この特定の抗体/放射性同位体組成物について較正した；製造時7.3mCi/ml)、較正時の比活性4.2mCi/mg、そしてタンパク質濃度1.8mg/mlであった。ポビドン/アスコルビン酸の放射線保護剤を評価する2番目の実験では、その最終産物の特異性は、総活性3780mCi、容量518ml、較正時の活性濃度6.1mCi/ml(製造時7.3mCi/ml)、較正時比活性4.0mCi/mg、そしてタンパク質濃度1.5mg/mlであった。
従って、この放射性標識抗体を、5.5%ポビドン、又は5.5%ポビドン/0.1%アスコルビン酸のいずれかの放射線保護剤によって安定化した。これらの大容量分画を室温で180分間放置した。0,60,90及び180分の時点で、各分画からサンプルを取り出し、ITLC及びIRF法によって、タンパク質結合した131Iレベル及び能力を各々決定した。
図7及び8は、検査サンプルの相対的安定性及び能力を示す。図7で示した通り、ポビドン(5% PVP)及びポビドン/アスコルビン酸(5% PVP/0.1% AA)を含有する調合剤は、事前設定した特性限界である95%を超えて、タンパク質結合131Iレベルを維持した。図8では、60,90及び180分の時点で、前記の2つの異なる放射線保護剤によって同程度の安定性が得られたことが示されている。ポビドンを含有する調合剤では、0分の時点に対して、180分の時点の能力が低下しているので、このレベルの総活性及び活性濃度では、典型的な製造工程期間で大容量の本薬品を生産するためには、放射線保護剤として、ポビドン/アスコルビン酸を用いるのが好ましい。
実施例7：ポビドン/アスコルビン酸の放射線保護剤を含有する高レベル放射活性の放射性標識産物の評価
製造条件の最悪の場合を模倣するために、131I標識B1抗体の別のバッチを大容量で作成し、検査した。産物安定性を維持するために、5.5%ポビドンと0.1%アスコルビン酸との組合せを用いた。標識ペプチドを、標識及び精製装置から直接、前記放射線保護剤を含有する大容量薬剤容器に採取することによって、前記放射線保護剤を131I標識B1抗体に加えた。このバッチでは、総活性3600mCi、容量480ml、較正時の活性濃度6.3mCi/ml(製造時7.5mCi/ml)、較正時の比活性3.5mCi/mg、そしてタンパク質濃度1.8mg/mlであった。
放射性標識抗体及び放射線保護剤を含有する組成物を、大容量薬剤生産工程の最終時点で、室温で180分間まで故意に放置した。0,90及び180分の時点で検査のためにサンプルを取り出した。また、本組成物の一部分を即座にバイアルに分配し、室温で90及び180分間放置した。また、サンプルを大容量容器から即座に取り出し(1分の時点、T=1)、検査した。このサンプルを、以下に示すデータのベースライン値とした。規定された時点での大容量容器保存サンプル及びバイアル保存サンプルのIRF検査及びITLCによる値を比較して、産物の安定性及び能力に対する、最終大容量薬剤容器中に存在する高レベル放射活性の影響を評価し、そして最終薬剤の機能に対する、延長した室温露出の有害効果を決定した。
0004291417.tif 000002
表1の結果から、最終産物のバイアル状態及び大容量状態の両方において、3時間の検査期間中、その能力が維持されたことが分かる。同様に、ITLCの結果から、3時間の検査期間中、タンパク質結合131Iの安定なレベルが認められた。前記通り、産物特性限界を、ペプチド結合放射活性(結合ヨウ素)では95%以上、そして免疫反応分画検査での特異的結合では65%以上に設定した。これらの結果から、製造工程期間及びその後のバイアル状態において、最終薬剤の安定性を維持する際に、ポビドンとアスコルビン酸との組合せが有効であることが示された。即座にバイアルに分配する場合及び凍結する場合に比べても、大容量状態で室温で90及び180分間薬剤を保持する場合、ポビドン/アスコルビン酸の放射線保護剤を用いることによって、少くとも3時間は、最終薬剤は、その状態で安定であることが示された。
実施例8：医薬等級のポビドン/アスコルビン酸の放射線保護剤の存在下における大容量放射性標識産物の評価
900mgのB1抗体及び4500mCiの131Iによる生産容量の別の標識産物を、医薬等級の5-6%のC-15ポビドン及び0.9-1.3mg/mlアスコルビン酸の放射線保護剤中に調製した。このバッチでは、総活性3735mCiであり、容量485mlであった。較正時の活性濃度は6.5mCi/ml(製造時7.7mCi/ml)であり、較正時の比活性は4.2mCi/mgであり、そしてタンパク質濃度は1.7mg/mlであった。
生産工程において、131I標識B1抗体10mCiを各々含んでいる20個の線量用バイアル(DX)、及び131I標識B1抗体125mCiを各々含んでいる20個の治療用バイアル(RX)に分配した。各時点において、分配工程の最初から最後までの代表的なバイアルを検査した。分配した順に、バイアルに連続的に番号を付けた。従って、より小さいバイアル番号は、製造及び分配工程においてより早くに調製されたバイアルであることを意味する。これらを-70℃以下で保存した。
前記のITLC及びIRF検査に加えて、凝集体形成を調べるために、HPLCを行った。流動相としてPBS(pH7.0)を用いたサイズ排除HPLCによって、単量体131I標識B1抗体から凝集体を分離した。サンプルをスキャンして放射線のピーク及びUV/可視吸光を測定するために、放射線検出器及びUV/可視モニターの両方から成る二重検出系を利用した。このHPLCカラムで、単量体131I標識B1抗体、非結合ヨウ素及び他の外来物のピークから凝集体のピークを分離する。凝集体ピーク及び単量体ピークのカウント数を、カラムに添加したサンプルの総カウント数に対する割合%として計算することによって定量する。標識最終産物を、分配及び凍結する前に大容量状態で室温で3時間保持したサンプル(T＝3)と、即時に分配及び凍結したサンプル(T＝O)とを比較して、1,3,6及び8日目の時点で検査を行い、安定性を評価した。各検査日に、RX及びDx、並びにT=0及びT=3の各々の代表的バイアルを解凍して検査した。ベースライン用のサンプルは、0日の時点で採取し、PBS＋1% HSAによって1:100に希釈したものである。放射性標識B1抗体は、この緩衝液中で2-8℃で14日間まで安定であった。ベースラインサンプルは、各時点での内部コントロールとして機能する。
0004291417.tif 000003
最終産物の安定性は、8日目まで、ITLC及びIRF検査の両値によって証明された。表2から分かる様に、1日目と8日目との間に、あるいは線量用容量(DX)と治療用容量(RX)との間に、非結合ヨウ素又はIRF検査値における有意な差は存在しなかった。更に、T=0で分配及び凍結したサンプルと、最終産物を室温で3時間放置したサンプルとの差は極わずかであった。この実験から、検査した製造容量において、5-6%ポビドンと0.9-1.3mg/mlアスコルビン酸との組合せは、最終投与形及び大容量生産状態の両方において産物の安定性を維持する際に有効であった。これらの結果から、実施例6で概説した結果が確認され、放射性標識ペプチドの商業的生産が実行され得る。
実施例9：循環型冷凍庫及び標準的冷蔵条件下での大容量放射性標識産物の評価
900mgのB1抗体及び4500mCiの131Iによる生産容量の別の標識産物を、医薬等級の5.5%のC-15ポビドン及び1.1mg/mlアスコルビン酸による放射線保護剤中に調製した。このバッチでは、総活性3600mCiであり、容量570mlであった。較正時の活性濃度は6.3mCi/ml(製造時7.5mCi/ml)であり、較正時の比活性は3.9mCi/mgであり、そしてタンパク質濃度は1.7mg/mlであった。
生産工程において、131I標識B1抗体10mCiを含んでいる線量用バイアル(DX)、及び131I標識B1抗体125mCiを含んでいる治療用バイアル(RX)に分配した。これらを、-20℃の循環型冷凍庫に、8日目まで保存した。循環型冷凍庫は、除霜のために一定間隔で0-5℃まで温度増加するものである。これは、典型的な家庭用冷凍庫であり、例えば放射性薬剤部に普通にある。
凍結保存後、2,5及び8日目に、RX及びDXの代表的バイアルを取り出し、解凍し、そして検査した。ベースライン用サンプルは0日目に採取し、PBS＋1% HSAによって1:100に希釈したものである。放射性標識B1抗体は、この緩衝液中で2-8℃で14日間まで安定であることが示されている。ベースラインサンプルは、各時点での内部コントロールとして機能する。両方の用量形態のバイアルを、0日目において事前設定した特性限界と比較して、%結合放射性同位体(ITLC)、能力(IRF)及び純度(HPLC)について評価した。このために、実施例2及び3に記載したITLC法及びIRF検査、並びに実施例8に記載したHPLC法を用いた。
前記条件下の最終産物の安定性を、ITLC,IRF及びHPLCの測定値によって、8日目まで証明した。図9〜11では、%結合放射性同位体、能力及び純度は、全ての産物バイアルにおいて、0日目に設定した特性限界内であった。図9で示す通り、両方の用量バイアル形態及びコントロールで、タンパク質結合131Iレベルは、事前設定特性限界である95%を超えて維持された。図10で示す通り、検査した全ての産物バイアルで、特異的結合レベルは、事前設定特性限界である65%を超えて維持された。図11で示す通り、検査した全ての産物バイアルで、凝集体レベルは、事前設定特性限界である5%未満に維持された。
前記実験に加えて、2日目に解凍した産物バイアルを、標準的研究室用冷蔵庫で2-8℃で保存した場合の解凍後の安定性について評価した。DX及びRX用量のシリンジ形態を、DX及びRX用量のバイアル形態と共に検査した。DX用量のシリンジ形態は、DX用量を0.9%溶液によって30mlに希釈したものをシリンジ中に保存したものである。RX用量のシリンジ形態は、希釈せずに、全RX用量をシリンジ中に保存したものである。図12〜14は、これらの検査サンプルの相対的安定性及び能力を示す。安定性とは、各安定性検査測定値が、0日目に設定した特性限界内にあることを意味する。各検査における失敗とは、ある時点での安定性の不達成を意味する。図12に示す通り、DXバイアルは、24時間まで安定であり、DXシリンジは48時間まで安定であり、RXバイアル及びRXシリンジは8時間まで安定であり、タンパク質結合131Iレベルは、事前設定した特性限界である95%を超えて維持された。図13で示す通り、全てのDX及びRX投与形態で、特異的結合レベルは、事前設定特性限界である65%を超えて維持された。図14で示す通り、全てのDX及びRX投与形態で、120分まで、凝集体レベルは事前設定特性限界である5%未満に維持された。
この実験から、最適でない保存条件下においても、例えば循環型冷凍庫及び標準的2-8℃の研究室用冷蔵庫においても、最大安定性のために推奨される-70℃以下保存に比較して、最終投与形態において産物安定性を維持する際に、5-6%(w/v)ポビドンと0.9-1.3mg/mlアスコルビン酸との組合せが有効であることが証明された。
実施例10：大容量生産における大容量放射性標識薬剤産物の評価
50及び70Ciの高レベル放射活性存在下における131I標識B1抗体の安定性を評価した。本調合剤には、12.5mMのPBS,5.5%ポビドン及び1.1mg/mlアスコルビン酸が含まれる。本放射線標識抗体は、容器中で、室温で7時間、活性濃度8.2mCi/mlで放置された。
容器から一定間隔で一定量を取り出し、0日目に設定した特性限界と比較して、%結合放射性同位体(ITLC)、能力(IRF)及び%放射性単量体及び凝集体(HPLC)の各パラメーターで示される安定性について検査した。このために、実施例2及び3に記載されたITLC法及びIRF検査、並びに実施例8に記載されたHPLC法を用いて、サンプルを評価した。
図15〜18は、検査サンプルの相対的安定性及び能力を示す。図15で示す通り、70Ci含有形では、タンパク質結合131Iレベルは、事前設定特性限界である95%を超えて維持された。一方50Ci含有形では、前記レベルは、前記95%限界付近又は超えて維持された。図16で示す通り、50Ci及び70Ci含有形の両方で、特異的結合レベルは、事前設定特性限界65%を超えて維持された。図17で示す通り、両含有形で、%放射性単量体レベルは、事前設定特性限界95%を超えて維持された。図18で示す通り、両含有形で、凝集体レベルは、事前設定特性限界5%未満に維持された。
この実験から、本発明の放射線保護剤は、超高レベル放射活性の放射性標識ペプチドに対してさえも非常に有効であることが示された。
任意の安定性パラメーターにおいて極小の変化が検査期間に亘って認められたが、131I標識B1抗体産物は、室温で7時間まで安定であった。
実施例11:ポビドン/アスコルビン酸及びHSAの放射線保護剤存在下における放射性標識産物の薬物動態学的等価性
ポビドン/アスコルビン酸放射線保護剤含有調合剤は、HSA放射線保護剤含有調合剤と比較して、放射性標識ペプチドの薬物動態及び生体内組織分布性を変化させないことを証明するために、動物実験を行った。
放射性標識抗CD20抗体、特にB1抗体と、異なる放射線保護剤とを含有する調合剤において、それらの組織結合性及び血液清掃性を比較検査するために、正常のSwiss/Webster系マウスを用いた。放射線保護剤として、1つのサンプルではポビドン/アスコルビン酸を、もう1つのサンプルではHSAを用いた。更に、1つのサンプルでは、131Iで標識した抗体を、もう1つのサンプルでは、125Iで標識した抗体を用いた。両サンプルは、同一比活性(5mCi/mg)を有した。125I標識抗体をPBS/5% HSAと調合し、そして131I標識抗体をPBS/5.5%ポビドン/0.1%アスコルビンと調合した。
2つの標識を用いることによって、125I標識及び131I標識抗CD20抗体を含む両調合剤を、同一動物に静脈内投与することができ、そのために比較が容易になり、抗体清掃における動物個体間の内在的な差異を克服することができる。
各時点のサンプル群は6匹の動物から成り、データは各群内の平均カウント数として表示する。本実験では、各時点のサンプル群内の平均値の標準誤差は、典型的には5%未満であった。特異的組織への分配性及び血中清掃率の等価性について検査するために、本実験は2つに分けられた。
2つの放射性同位体間のカウント窓における約20.2%の交差性の補性を容易化するために、約107cpm(1分間あたりカウント数)の125I標識抗体、及び5×106cpmの131I標識抗体を各マウスに注射した。これらの標識抗体は、各々タンパク質量1μgに相当する。注射されるタンパク質の総量は、マウスあたり100μgの未標識抗体を加えて調整した。最終的には、125I標識抗体溶液及び131I標識抗体溶液の等量混合液を注射した。従って最終的な131I/125I標識抗体混合物の注射液には、2.75%ポビドン、0.05%アスコルビン酸及び2.5% HSAが含まれた。2つの放射性同位体の崩壊速度の差による誤差を最小にするために、表3及び図9に表示したデータは、本実験の最後に計測したサンプルに由来するものである。本実験では、マウスに明白な毒性効果は認められなかったし、殺処理するまで健康であった。
特異的組織における分布の等価性
種々の時点で、被注射動物を殺処理し、選択した組織を取り出し、そして組織1gあたりの対注射用量比(% ID)を決定した。この計算のために、殺処理時に全ての臓器を取り出し、それらの重量を測定し、そしてガンマカウンターで計測した。このグラムあたりの対注射用量比(% ID)は、各放射性標識抗体のために作成した個別の基準を用いて、注射された総cpm値に対する組織1gのcpm値の割合として計算される。
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表3は、9日間に亘って、抗CD20抗体の2つの標識産物の血液と組織における生体内分布を比較したものである。このデータは、動物を殺した時点で各組織に存在する2つの抗体産物の残存量の比率として表示する。詳しくは、各組織及び各抗体産物毎に、組織1gあたりの対注射用量比を得て、そして125I標識抗体(HSA含有調合剤)対131I標識抗体(ポビドン/アスコルビン酸含有調合剤)の比率によって比較表示する。
ほとんど全ての組織及び全ての時点で、前記比率は1.0±0.1であり、このことは、前記の2つの標識抗体産物間で、ほとんど同一の清掃速度であることを意味する。いくつかの値が前記の範囲外であるが、それらの値は、この種の実験における変動範囲内である。
各動物に投与された、5.5%ポビドン及び0.1%アスコルビン酸を含有する抗体溶液の用量は、20gのマウスの全血液量の2〜3%に相等する。人間の平均全血液量に比較対応させると、前記用量は、5.5%ポビドン及び0.1%アスコルビン酸100mlにほぼ相等し、すなわち米国特許5,595,721に記載された方法で提唱された用量のほぼ3倍である。
血中清掃速度の等価性
平行した実験において、血中清掃動態を測定するために、いくつかの時点で、注射したマウスから血液を採取し(1回5μl)、最後には216時間の時点でマウスを殺した。
図19に示す通り、131I標識及び125I標識抗体産物について、その注射用量の50%超が、注射後24時間以内に血中から排除された。2つの曲線間に、24時間の時点から始まるわずかな相違が認められるが、各データ値を分析したところ、それらの違いは、全ての検査時点において、5%ポイント未満であった。これらの値を、対応のない群における両側でのstudent-t検定法で検定したところ、そのp値は0.9288であり、2つの曲線間に有意差は認められなかった。図19から分かる様に、131I標識抗体は、125I標識抗体に比べて少し速い速度で血中から排除される様である。しかし、これらの違いは有意ではなく、この種のインビボ生体内分布測定では変動範囲内である。
これらの結果から、再び、ポビドン/アスコルビン酸放射線保護剤は、標識抗CD20抗体の血中清掃を変更しないことが分かった。
本明細書中に記載した全ての文献及び特許出願を引用して、その各々を本明細書に組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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