(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なEタンパク質であって、そのアミノ酸配列が、配列認識番号１１の26番目から459番目の残基で示されるEタンパク質。
【請求項２】
Eタンパク質をコードしているDNAの発現を制御するヌクレオチド配列を有したベクターを、遺伝子工学的に含むようにした宿主細胞系の細胞培養により組み換え体として合成される、前記Eタンパク質であって、該宿主細胞系が、細菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞株、及び哺乳類細胞株からなる群より選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記の培養細胞が細菌である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記の培養細胞が酵母である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記の培養細胞が糸状菌である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記の培養細胞が昆虫細胞株である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記の培養細胞が哺乳類細胞株である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項８】
Eタンパク質をコ−ドしているDNA配列を具備した組み換えベクターであって、前記Eタンパク質のアミノ酸配列が、配列認識番号１１の26番目から459番目の残基で示される、組み換えベクター。
【請求項９】
前記のベクターが、プラスミドベクター、ファ−ジミドベクター、コスミドベクター、及びウイルスベクターからなる群より選択される、請求項８に記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
モラクセラ・カタルハリス（M. catarrhalis）に感染した患者に受動免疫するのに有益な組成物であって、該組成物がモラクセラ・カタルハリスの外膜のEタンパク質を認識する、精製した抗血清を具備し、そのアミノ酸配列が、配列認識番号１１の26番目から459番目の残基で示される、組成物。
【請求項１１】
モラクセラ・カタルハリスの外膜Eタンパク質をコードした、単離された遺伝子であって、該遺伝子が配列認識番号１１のタンパク質読み取り枠の1377塩基対からなる、遺伝子。
【請求項１２】
配列認識番号１１の26番目から459番目の残基で示されるアミノ酸配列を有するモラクセラ・カタルハリスのEタンパク質を発現する、感染性の組み換え体微生物。
【請求項１３】
前記の微生物がワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはサイトメガロウイルスである、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記の微生物がサルモネラ（Salmonell）属である、請求項１２に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）交付の政府補助金番号A１２８３０４のもと、及び退役軍人関係課の援助のもと行なわれた。アメリカ合衆国政府は、この発明に関しての一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、以前ブランハメラ・カタルハリス（Branhamella catarrhalis）と名付けられていたモラクセラ・カタルハリス（Moraxella catarrhalis）の外膜に会合している、タンパク質、ペプチド、及びオリゴペプチドを具備した組成物に関する。より特異的には本発明は、熱修飾性タンパク質で、見かけの分子量が約３５，０００ダルトンで、１００℃に加熱されると約５０，０００ダルトンである、モラクセラ・カタルハリスの外膜「E」タンパク質に関連するタンパク質、ペプチド、及びそのオリゴペプチドの組成に関する。組み換えDNA及び/または生化学的技術により、Eタンパク質、Eペプチド、及びEオリゴペプチドの調製方法についても記述している。それに関連して、EをコードしているDNA配列、並びにE、Eペプチド、及びEオリゴペプチドの発現検出に有益なベクタ、並びにそのようなベクタで形質転換された宿主細胞を記述している。
上記のタンパク質、ペプチド、オリゴペプチドは、能動免疫用のワクチン組成物中の免疫原として使用することが可能であり、受動免疫に有益なタンパク質-特異的抗血清、及びペプチド-特異的抗血清を調製するために使用することが可能であり、また診断アッセイ用の試薬として使用することが可能である。開示したヌクレオチド配列は、モラクセラ・カタルハリスの遺伝物質の検出用の診断アッセイの試薬として使用することができる、対応するオリゴヌクレオチドの合成を提供する。
発明の背景
モラクセラ・カタルハリス（Moraxella catarrhalis）（Branhamell catarrhalisとしても知られている）は、ヒトの気道の重要な病原体である。モラクセラ・カタルハリスは、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）及び型が同定できないインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）に続く、乳幼児における中耳炎の三番目の病因であり、これは鼓室穿刺を使用して病因を確立した研究で考証された（Murphy, 1989, Pediatr. Infect. Dis. J.. 8:S75-S77）。モラクセラ・カタルハリスは、幼児及び成人の副鼻腔炎及び結膜炎の共通した病原であり（例としては以下の文献を参照されたし：Bluestone, 1986, Drug 31:S132-S141; Brorson et al., 1976, Scand. J. Infect. Dis. 8:151-155;及びRomberger et al., 1987, South. Med. J. 80:926-928）、慢性の気管支炎、及び慢性の閉塞性肺疾患の成人における気道下部の感染の重要な病因である（Murphy et al., 1992, Am. Rev. Respir. Dis. 146:1067-1083; Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320）。更に、モラクセラ・カタルハリスは、免疫無防備状態の宿主において、肺炎、心内膜炎、敗血症、及び髄膜炎を引き起こす（Cocchi et al., 1968, Acta Paediatr. Scand. 57:451-3; Douer et al., 1977, Ann. Intern. Med. 86:116-119; McNeely et al., 1976, Am. Rev. Respir. Dis. 114:399-402）。
中耳炎の再発は、実質的な罹患率と関わっているので、この感染を防ぐための方法を決定することに興味がある。そのようなアプローチの一つとしては、ワクチンの開発がある。細菌性の中耳炎の予防用の効果的なワクチンは、肺炎球菌、非同定型のインフルエンザ菌、及びモラクセラ・カタルハリスによる感染に対しての保護が得られる抗原を含む必要がある。実際、肺炎球菌、非同定型のインフルエンザ菌に対するワクチンの開発が進行中であり、保護性の抗原が同定されて、試験が現在行なわれている（例としては以下の文献を参照されたし：Murphy et al., U.S.Patent No. 5,173,294;及びVella et al., 1992, Infect. Immun. 60:4977-4983）。このワクチンが開発されて広く使用されるにつれて、モラクセラ・カタルハリスがこれから先、中耳炎の病原菌としてますます重要になっていくであろう。モラクセラ・カタルハリスによる中耳炎を予防するワクチンによって、乳幼児がうける恩恵以外にも、慢性の閉塞性肺疾患の成人、及び免疫無防備状態の幼児と成人も、モラクセラ・カタルハリスによる感染を予防することで恩恵が受られる。
ワクチン抗原の候補として調べた細菌の組成物には、多糖、リポ多糖、またはこれらの修飾体、及び外膜タンパク質が含まれる。一般的に、インフルエンザ菌のb型莢膜多糖に例示されるように、多糖抗原は１８ケ月未満の幼児では免疫原としては非力であることが示された。リポ多糖（LPS）による能動免疫は、その固有の毒性のために無理である。LPSの病態生理学的影響には、発熱、ロイコペニア（leucopenia）、ロイコサイトーシス（leucocytosis）、シュワルツマン（Schwartzman）反応、汎発性血管内凝固、及び多量の場合にはショック死がある。一般的にいって、タンパク質は３ケ月位の乳児では免疫原性である。そのため、ワクチン抗原の候補として、外膜タンパク質を調べた。
最近の研究がモラクセラ・カタルハリスの外膜タンパク質に焦点をあてているが、このタンパク質に関しての抗原性及び分子構造に関してはほとんど分かっていない。精製した外膜タンパク質に関しての、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による研究で、該細菌の間でかなり均一なパターンがあることが明らかになった（Bartos and Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765）。A〜Hと命名した、８つの主要な外膜タンパク質が同定された（Murphy et al., 1989, Microbial Pathgen, 6:159-174; Bartos et al., 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765）。モラクセラ・カタルハリスの25240株に対する抗血清に、２０株のモラクセラ・カタルハリスを吸収させた実験は、外膜Eタンパク質が該細菌の表面で発現している、抗原的に保存された決定基であることを示している（Murphy et al., 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941）。
その結果、重要な細菌性病原体としてのモラクセラ・カタルハリスがより強く認識されると、幼児と成人とにおいて免疫原性であるワクチンの必要性が生じる。このようなワクチンは、表面に露出しているエピトープを有し、モラクセラ・カタルハリスの株間で保存されている、生細菌の組成物に向けられなくてはならないであろう。
発明の要約
本発明は、熱修飾が可能であり、その結果、処理方法によってはSDSゲル中での泳動度に変化を生じる見かけ分子量が約35,000から約50,000ダルトンである外膜タンパク質に関連する、タンパク質、ペプチド、及びオリゴポリペプチドに向けられていている。本発明の、Eタンパク質、及びそのペプチド（本願では「Eペプチド」、または「Eオリゴペプチド」とも呼ぶ）は、予防用及び/または治療用ワクチンの免疫原として使用することが可能であり、またはモラクセラ・カタルハリス特異的抗体の血清のタイタの上昇を測定して、モラクセラ・カタルハリス感染の検出に向けた診断用免疫アッセイ用の抗原として使用することも可能である。
更に、本発明のEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドは、受動免疫用、及び臨床検体中のモラクセラ・カタルハリスの存在の検出に向けられた診断アッセイ用の試薬として有益である。Eペプチド、またはEオリゴペプチドは化学的合成、モラクセラ・カタルハリスからの精製、本願で開示されている核酸分子を利用した、組み換えベクタ発現系による合成によって得ることが可能である。
本発明の一つの態様は、プラスミドDNA、及びヒトウイルス、動物ウイルス、昆虫ウイルス、またはバクテリオファージのようなウイルスDNAであってEタンパク質、Eペプチド、またはEオリゴペプチドを、発現後にタンパク質又はペプチドの精製が行なわれる、適切な宿主中で発現させるのに使用することが可能な、ウイルスDNAを含む、新規のDNA配列、及びベクタを構築することに向けられている。
本発明の別の態様は、Eをコードする遺伝子を分子クローニングする方法を提供し、またEをコードしている該遺伝子の配列内のオリゴヌクレオチドを具備した組成物を提供する。本発明の核酸配列は、核酸ハイブリダイゼーションにより、モラクセラ・カタルハリスの遺伝物質の分子診断アッセイに使用することが可能であるが、該ハイブリダイゼーションには、増幅、及び増幅済み核酸の検出用のプライマ、及び/またはプローブとして使用することが可能な、E配列-特異的オリゴヌクレオチドの合成が含まれる。
更に、Eタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドは、モラクセラ・カタルハリスの病原性株に対する、予防用、及び/または治療用ワクチン製剤中の免疫原として使用することが可能であるが、この免疫原は化学的に合成されたものでも、モラクセラ・カタルハリスより精製されたものでも、組み換え発現ベクタ系より精製されたものでもかまわない。あるいは、Eをコードする遺伝子、またはEペプチドもしくはEオリゴペプチドをコードする、一つ又はそれ以上の遺伝子断片を、組み換え細菌または組み換えウイルスを具備した細菌性またはウイルス性ワクチンに挿入してもよいが、この組み換え細菌及びウイルスは、それ自身により一つ又はそれ以上の免疫原性Eエピトープを合成するように改変されている。
更に、Eをコードする遺伝子、またはEペプチドもしくはEオリゴペプチドをコードする、一つ又はそれ以上の遺伝子断片は、一つ又はそれ以上の制御配列に機能するように連結されていて、ヒトに直接導入して、Eタンパク質、Eペプチド、またはEオリゴペプチドを発現し、保護的免疫反応を惹起することが可能である。
図の簡単な説明
図１は、モラクセラ・カタルハリスの外膜Eタンパク質に関するカイ・ドーライト疎水性の特徴を、Eをコードする核酸配列から推定したアミノ酸配列を使って決定したものである。プラスの値は疎水領域を表し、マイナスの値は親水性領域を表す。
図２は、種々の制限酵素で消化した、異なるモラクセラ・カタルハリスの株のゲノムを使った増幅産物をながした、ポリアクリルアミドゲルで、エチジウムブロマイドで染色したものである。
図２Aは、Sau96Iで消化した増幅産物を示すゲルである。
図２Ｂは、BslIで消化した増幅産物を示すゲルである。
発明の詳細な説明
本発明は、モラクセラ・カタルハリスの、「E」と命名されている細菌性外膜タンパク質、及びそのペプチドの組成物に向けられている。該Eタンパク質のSDS-PAGEでの泳動パターンは、熱修飾可能なタンパク質の特徴である。すなわち、泳動パターンは先の試料調製温度に依存する。故にEタンパク質を含む試料がSDS-PAGEの前に２５℃で加熱されると、見かけ分子量は約３５，０００ダルトンであり、もし試料が１００℃で加熱されると、見かけ分子量は約５０，０００ダルトンである。本発明の核酸配列（配列認識番号１１）により示されるように、Eをコードする遺伝子は、成熟型Eタンパク質の推定のアミノ酸配列から計算すると、約４７，０３０ダルトンの分子量を有することが分かった。本発明の、これらEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドは、本願で例示するように組み換えDNA技術により合成することが可能であり、または本願で開示したアミノ酸配列より化学的に合成することも可能である。更に、ペプチドは成熟型のタンパク質の酵素的又は化学的開裂により生成することも可能である。免疫原性エピトープを有するEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドは、モラクセラ・カタルハリスにより引き起こされる、中耳炎、副鼻腔炎、結膜炎、下部気道感染を予防するための、ワクチン製剤中の免疫原として使用することが可能である。更に本願発明では、上記の合成したEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドを、モラクセラ・カタルハリスによる感染に対する受動免疫に有益な、モラクセラ・カタルハリス特異的抗血清を作成するのに使用することが可能である。
本願発明は更に、Eをコードする遺伝子のヌクレオチド配列同様、該単離遺伝子の推定アミノ酸配列を提供する。本願発明の一つの態様においては、Eをコードする遺伝子、または免疫原性エピトープを有する一つまたはそれ以上のEペプチドをコードする遺伝子断片が、組み換えDNA技術を利用して発現ベクタに導入され、該組み換えベクタは適切な宿主細胞へ導入され、それにより上記配列の発現を上記の特別な宿主細胞で行う。宿主細胞へ導入された組み換えベクタを具備した発現系は、以下のように使用することが可能である：
a）ワクチン製剤で免疫原として使用することが可能な、Eタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドの合成用に使用；
b）診断免疫アッセイ、または治療及び/または診断的価値のある、モラクセラ・カタルハリス特異的抗血清の作成のための抗原として使用する、Eタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドの合成用に使用；または
c）組み換え発現ベクタがワクシニアウイルスのような生ウイルスであるときには、該ベクタ自身を生、または不活化ワクチン調製物として使用することが可能であるので、Eペプチド、またはEオリゴペプチドの発現を行わせるために、宿主の細胞へ該生ワクチン製剤、または該不活化ワクチン製剤を導入して使用；または、
d）個体をワクチン接種するためのEタンパク質、Eペプチド、またはEオリゴペプチドを発現するために使用される、生の弱毒化細菌細胞へ、組み換え発現ベクタを導入する場合に使用；または
e）組み換え発現ベクタが、直接的に個体に導入されて、コードされ、発現されたEタンパク質、Eペプチド、またはEオリゴペプチドに対して免疫する場合に使用。
説明のため、以下の態様において本願発明の方法及び化合物を例示する：
態様A：Eをコードする遺伝子の分子クローニング及び配列決定、並びにE-特異的エピトープ発現ベクタ；
態様B：モラクセラ・カタルハリスの株間での、Eをコードする遺伝子の保存；
態様C：モラクセラ・カタルハリス検出用の分子診断アッセイにおいてE-特異的ヌクレオチド配列を使用する方法；
態様D：E、Eペプチド、Eオリゴペプチドを診断免疫アッセイで作成及び使用する方法；
態様E：E、Eペプチド、Eオリゴペプチドに関連したワクチン製剤の、方法と化合物。
態様A
Eをコードする遺伝子の分子クローニング及び配列決定、並びにE-特異的エピトープ発現ベクタ
用いた方法は以下のとおりであった：
モラクセラ・カタルハリスよりゲノムDNAを単離する；
単離したDNAを断片に開裂する；
該断片の発現ベクタへの挿入を具備したゲノムライブラリを構築する；
該組み換えベクタを適切な宿主細胞へ導入する；
Eタンパク質の末端のアミノ酸配列に対応する、標識済みのオリゴヌクレオチドの縮重したファミリを使ったフィルタハイブリダイゼーションにより、Eをコードしている遺伝子を含む宿主細胞クローンのスクリーニングを行う。
大腸菌（E.coli）を対照として、モラクセラ・カタルハリスのＤＮＡに対するサザンブロットによりプレスクリーニングを行い、縮重したオリゴヌクレオチドのうちどれが最もモラクセラ・カタルハリスのDNAに対して強くハイブリダイズしたかを決定した。
モラクセラ・カタルハリス株25240を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より入手して、細菌ゲノムDNAとして使用した。モラクセラ・カタルハリスをチョコレート・アガープレート上で37℃、５％CO2、または脳・心臓注入インフュージョン・ブロス中で増殖させた。大腸菌（E.coli）LE392を、ラムダ・バクテリオファージ（EMBL-3）に対する宿主として使用した。状況に応じて大腸菌は、0.2％マルトース及び10mM MgSO4を補充したトリプトン・ブロス中で増殖さるか、またはスクリーニングには、50μg/mlのアンピシリンを含有したNZCYMアガープレート上で増殖させた。
EMBL-3ゲノムライブラリを、以前に記載された方法（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1989, John Wiley and Sons出版）により、モラクセラ・カタルハリス25240のゲノムDNAを使用して構築した。
モラクセラ・カタルハリス25240株のゲノムDNAを、界面活性剤による抽出、及びプロテイナーゼ処理を利用して精製した。精製したゲノムDNAを、次に、制限酵素Sau3Aによる一部消化させて、サイズの異なる断片を生成させた。該DNA断片を１０〜４０％のショ糖を使ったショ糖勾配遠心により分離した。約９から２３キロ塩基（kb）のサイズの断片を含む画分を回収して、コウシ腸管内ホスファターゼ（calfintestinal phosphatase）を使って脱リン酸化し、引き続いてファージのアームに連結してファージ内にパッケージングした。得られたEMBL-3ライブラリの一部を大腸菌（E.coli）LE392を宿主として、NZCYMプレートにまいた。
プラークをニトロセルロースフィルタのディスクに移し、外膜Eタンパク質のアミノ末端配列に一致し、縮退した標識済みオリゴヌクレオチドのファミリ（代表的な例を、配列認識番号１〜８に示した）にハイブリダイズさせてスクリーニングした。全部で約8100個のプラークをスクリーニングして6個の陽性クローンを同定した。最初の陽性クローンを使い、緩衝液に溶出し、次いで低密度でのプレーティングにより精製し、全てのプラークが陽性になるまで同じオリゴヌクレオチドで再スクリーニングを続けた。陽性クローンの液体抽出物を使用して、挿入部を有するラムダDNAを単離した。単離したラムダDNAをSal Iで消化した後アガロースゲルで電気泳動にかけ、挿入部の確認を行った。陽性クローンの挿入部のサイズは１２から１７kbの間であった。１２kbの挿入部を使用して、該挿入部にあるEをコードしている遺伝子の位置付けを行った。該クローンのDNAをSal Iで消化して12kbの挿入部をゲル断片より電気的に溶出して、一つまたはそれより多くの異なる制限酵素（Nde I, Nco I, Hind III, Sac I, EcoRI,及びNde IとNco I）で消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけて、断片をオリゴヌクレオチドを利用してサザンブロットで分析した。
4.4kbのNde I-Sal I断片、及び1.9kbのNco I-Sal I断片を選択して、プラスミドpET22b+またはpGEM5zf-の何れかにサブクローニング操作をして、次の配列決定に供した。対照DNA及び形質転換の対照では成功したのにも関わらず、E.coliを組み換えプラスミドで形質転換する試みは、繰り返してもうまくいかず、E、またはその一部をコードしている遺伝子の断片は、E.coliに毒性があると結論づけた。故に別の方法をとり、ヌクレオチド配列決定を行った。1.9kbの断片の末端配列をマクサム・ギルバートの方法により決定した。この1.9kbの断片をHind IIIで消化して、1.1kb及び0.8kbの二つの断片を精製した。これらの断片を標識して、マクサム・ギルバートの方法により配列を決定した（1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560-564）。この配列分析により二つのオリゴヌクレオチドを追加して合成した（配列認識番号9及び10）。
二つのプライマ（配列認識番号7及び１０）を選択して12kbの挿入部を有するクローンの挿入部DNA断片を、PCRにより増幅した。反応は50μlの容量で、0.25μgのプライマと2.5mMのdNTPとを使用して行った。プレ変性は95℃で3分間であった。変性は96℃で15秒、アニーリングは62℃で1分間、及び重合反応は74℃で1分間行い、3mMのMgSO4存在下で15サイクル行った。これら二つのプライマを使用したPCRにより、0.8kbの増幅産物が得られた。この0.8kbの増幅産物をアガロースゲル電気泳動と電気的溶出により精製して、次いでM13mp18のEcoRI部位にサブクローニングした。M13の一本鎖DNAを組み換え体より調製して0.8kbの産物のヌクレオチド配列を、ジデオキシ鎖終結法により決定した。Eをコードする残りの部分は、Eをコードする遺伝子領域に一致する追加オリゴヌクレオチドを合成して、ラムダクローンの12kbの挿入部から直接的に配列決定した。
完全なヌクレオチド配列（配列認識番号１１）を基に、Eをコードする遺伝子が、154のコドンより開始されて1531のTAAで終了する（459アミノ酸をコードする）1377塩基対のタンパク質読み取り枠として決定された。リボソームが結合する可能性のある部位、GGAGAをATG翻訳開始コドンの上流５塩基の所に見出した。TAAストップコドンの下流30塩基の所には、転写の終結信号となる可能性のあるステムループ構造を形成することが可能な、以下の回文（パリンドローム）配列が存在していた：
ATAAAAAATAGCTTGAATTTCAAGCTATTTTTTAT。Eをコードする遺伝子の、全体のグアニン及びシトシン（G+C）含有量は43.4％で、モラクセラ・カタルハリスゲノムに関して報告されているG+C含有量と同等であった（Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev, 3:293-320）。
上記タンパク質読み取り枠より推定したアミノ酸配列から計算すると、Eの分子量は49,334ダルトンとなる。Eからアミノ酸配列を推定すると、25番目と26番目のそれぞれのアミノ酸、アラニンの間に開裂可能な部位を有するシグナルペプチドが存在することが示唆される。タンパク質読み取り枠より推定したアミノ酸配列中の、推定の開裂部位から前の24アミノ酸は、精製した外膜Eタンパク質より決定したN末端タンパク質配列に正確に一致する。以上の観察から更に、Eをコードする遺伝子は、25アミノ酸で構成されるシグナルペプチドを有する前駆体をコードし、また該前駆体として合成されるということが確認できる。推定アミノ酸配列（図１）の疎水性の特徴は、シグナルペプチドに対応する強い疎水性部分を示していた。予想の抗原決定基は、図１に図示した親水性領域に相当する。該抗原決定基には以下の範囲のアミノ酸が含まれる：369-374、29-34、及び294-299。成熟型のタンパク質の推定分子量は47,030ダルトンであり、これはモラクセラ・カタルハリス含有試料中の外膜Eタンパク質のSDS-PAGEでの泳動度とよく相関している。Eを構成するアミノ酸の分析により、アラニン、グリシン、ロイシン、及びバリンに最も富んでいて（13-18％）、システインは一切存在しないことが示された。
Eをコードした遺伝子の転写開始部位を決定するために、対応するmRNAの5’領域にハイブリダイズする、E−特異的な二つの異なるプライマ（配列認識番号１２及び１３）を使用してプライマ伸長分析を行った。チオシアン酸グアニジン法により、モラクセラ・カタルハリスの25240株より全RNAを抽出した。上記のE特異的プライマの5’末端を[32P]ATPで標識した。プライマの伸長には50μgの全RNAを100fmolの標識済みプライマにアニールし、55℃で45分間インキュベーションした。この後、デオキシリボヌクレオシド三リン酸存在下で、逆転写酵素を42℃、1時間効かせて伸長させた。プライマ伸長産物を8％尿素アクリルアミド配列決定ゲルで分析した。同じプライマでプライミングされ、配列決定ラダーを生成する、ジデオキシヌクレオチド反応決定反応物もまた、隣のレーンにながして電気泳動し、Eに相当する転写産物の正確な開始点を調べた。転写は、ATGコドンの上流78塩基のところの75番目のグアニン残基から開始されることを示す結果が得られた。-10 TAAGAT、またはプリブノ−ボックス（Pribnow Box）（ヌクレオチド63-68）の可能性のある部分は、+1の転写開始点の上流6塩基の所に位置していた。-35（40-45部位の）TTGTTは、-10配列の上流7塩基のところに位置していた。ハイフンを付した二分子対称性の二つの領域（5′-TTAATTTCATTTAA-3′及び5′-TACAAATGTGTAAGACTTTTGTA-3′）が、Eをコードする遺伝子の発現制御に関わる可能性のある-35領域の下流に同定された。
Eをコードする遺伝子のヌクレオチド配列に基づき、三種類のオリゴヌクレオチドプライマを合成して、該遺伝子の一部をPCRにより増幅し、サブクローニング及び発現分析を行った。二つのプライマ（配列認識番号１４及び１５）を使用して、該遺伝子及びプロモータ領域を完全に含む1.573kbの該遺伝子を増幅した。別の組のプライマ（配列認識番号１６及び１７）を使用して、該遺伝子のその他の部分と、リーダ配列をコードする配列を含んだ1.391kbの遺伝子を増幅した。三組目のプライマ（配列認識番号１７及び１８）を使用して、成熟型タンパク質の最初のアミノ酸からカルボキシ末端までをコードする、1.313kbの遺伝子を増幅した。三つの増幅産物、それぞれ1.573kb, 1.391kb, 1.313kbの長さのものを別個に、ベクタ、ファージミドpCR-Script SK+にサブクローニングし、標準的な方法により大腸菌（E.coli）に形質転換した。1.573kbの断片を含む組み換えプラスミドを使った形質転換の試みは、うまくいかず、このことはモラクセラ・カタルハリスのEタンパク質の大腸菌内発現は、形質転換された細菌にとって毒性があることを再び示唆した。1.391kbの挿入部（プロモータ以外の全タンパク質読み取り枠）、及び1.313kbの挿入部（成熟タンパク質をコードする配列）を有する組み換えプラスミドで形質転換体を同定した。挿入部末端の配列決定による挿入部の確認により、全ての確認済みクローンが、プラスミドプロモータによるタンパク質発現にとって、誤った方向を向いていることが確認され、これはEタンパク質の発現が大腸菌（E.coli）にとって毒性であることを示す更なる証拠となる。
故にこの態様は、E、またはその一部をコードするヌクレオチド配列を、ファージベクタやプラスミドといった種々のベクタに挿入することが可能であることを例示している。Eタンパク質及びEタンパク質のペプチドをうまく発現するには、Eタンパク質のエピトープをコードする遺伝子、若しくはその断片を具備した挿入部、またはベクタ自身のうちどちらか一方が、転写及び翻訳に必要な配列であって、宿主内での発現系に適合して尚且つ認識されるものを有していることが必要である。Eタンパク質、Eペプチド、EオリゴペプチドをコードするDNAは合成することが可能であり、または単離して、本願の態様A,B，Eにて例示されている方法により配列を決定することも可能である。Eタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドを発現するために使用できる種々の宿主系には以下のものが含まれるが、これには制限されない：バクテリオファージベクタ、プラスミドベクタ、またはコスミドDNAで形質転換した細菌；酵母ベクタを有する酵母；真菌ベクタを有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）感染した昆虫細胞；及びプラスミドまたはウイルス発現ベクタで形質転換された、または組み換えウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）に感染した哺乳類細胞。
上記した方法を含む、分子生物学で知られる方法を使用して、Eアミノ酸配列、すなわち外膜Eタンパク質、Eペプチド、またはEオリゴペプチドをコードしたベクタ、またはDNA配列に、種々のプロモータ及びエンハンサを挿入して、Eアミノ酸配列の発現を増加させることが可能であるが、ただしEアミノ酸配列の増加した発現は、使用する特異的な宿主細胞系に適合（例えば、毒性がない）するものである。故に重要なことであるが、DNA配列は、Eタンパク質、またはEタンパク質の機能的エピトープをコードする如何なる遺伝子の断片からなることができる。更に該DNAを、その他の細菌の外膜タンパク質、またはその他の細菌、真菌類、寄生虫、若しくはウイルス性の抗原などのその他の抗原をコードするDNAに融合して、遺伝的に融合した（共通のペプチドのバックボーンを共有して）多価の抗原を、改善されたワクチン組成物として使用することが可能である。
プロモータの選択は、使用する発現系に依存するであろう。プロモータは種々の強度、すなわち転写を促進する能力を有する。一般的には、クローン化した遺伝子を発現するためには、遺伝子の高レベルの転写と遺伝子産物の発現を得るために、強力なプロモータを使用することが望まれる。例えば、当該技術分野で知られる細菌、ファージ、またはプラスミドのプロモータで、大腸菌内での高レベルの転写が見られるものには、lacプロモータ、trpプロモータ、recAプロモータ、リボソームRNAプロモータ、PR,PLプロモータであるlacUV5, ompF, bla, lppなどが含まれ、これらはEアミノ酸配列をコードする、挿入DNA配列の転写を提供するのに使用することが可能である。
更に、Eタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドが仮に宿主細胞にとって致命的または有害であるならば、プロモータの作用が特別に誘導されるまでは阻害されているように、宿主の細胞株/系統及び発現ベクタを選択することが可能である。例えばある種のオペロンでは、特別な誘導剤の添加は、挿入DNA（例えばlacオペロンがラクトースまたはイソプロピルチオ-ベータ-Dガラクトシドの添加により誘導される）の効果的転写にとって必須である。trpオペロンのような種々のオペロンは異なる制御機構下にある。trpオペロンは、トリプトファンが増殖培地中に欠損しているときに誘導される。PLプロモータは、温度感受性ラムダリプレッサーを有する宿主細胞の温度上昇により誘導される。このようにして、95％以上のプロモータ依存性転写を、非誘導細胞で阻止することが可能である。故に形質転換または形質導入した細胞を、Eアミノ酸をコードする挿入DNAからの発現を制御するプロモータが誘導されない様にした条件下で培養することにより、組み換えE、Eペプチド、Eオリゴペプチドの発現を制御することが可能であり、該細胞が増殖培養液中で適切な濃度にまで増えたときに、プロモータを誘導して挿入DNAの発現を行うことが可能である。
効率的な、遺伝子の転写及び伝令の翻訳のためのその他の制御配列には、エンハンサ、及び制御シグナルが含まれる。エンハンサの配列とは、近傍の遺伝子に関して、その位置とは相対的に独立した方法及び向きにおいて、転写活性を上昇させるDNA配列のことをいう。故に、使用する宿主細胞と発現ベクタに応じて、エンハンサはEアミノ酸をコードする挿入DNA配列の上流または下流に配置して、転写効率を上昇させることができる。この態様で上に例示されているように、Eをコードする遺伝子からの発現に影響を与える、その他の特異的制御配列が同定された。転写若しくは翻訳開始シグナルのような、上記の又はその他の制御部位を使用して、E、またはその断片をコードする遺伝子の発現を制御することができる。このような制御配列は、本明細書でDNA配列の挿入に関して記載した組み換えDNA技術により、Eアミノ酸をコードするDNA配列、または近傍のベクタDNA配列に挿入することが可能である。
すなわち、モラクセラ・カタルハリスのヌクレオチド配列でE、Eペプチド、またはEオリゴペプチドをコードする領域を含むものは、発現ベクタのプロモータ、制御、及びレギュレータ配列に関して特異的な部位で該ベクタに連結し、組み換えベクタを宿主細胞に導入したときにモラクセラ・カタルハリスのE−特異的DNA配列を宿主細胞内で発現することができる。例えば、自らの制御配列を有するE-特異的DNA配列は、ベクタのEアミノ酸配列の発現を可能にするプロモータや制御配列との位置（relation）又は向きを考慮して発現ベクタへ連結することが可能である。次いで上記組み換えベクタを、適切な宿主細胞内へ挿入して、宿主細胞を選択して、組み換えベクタを含む細胞をスクリーニングする。選択とスクリーニングは、プラスミド中のマーカ遺伝子発現の検出、E−特異的エピトープに対して作成した抗血清を使った、E−特異的エピトープの産生の免疫スクリーニング、及び本明細書の態様Cに記載の方法により、一以上のオリゴヌクレオチドを使用して、宿主細胞のDNAをE−特異的ヌクレオチド配列にプロービングを含む、当該技術分野で知られる方法により行うことが可能である。
遺伝子工学的手法を使用して、コードされているEペプチド、またはEタンパク質の特徴付け、修飾及び/又は適応を行うことができる。例えば、部位特異的突然変異導入により、保護ドメインの外側にある領域中の外膜タンパク質の断片を修飾して、細断片の可溶性を増して、精製を容易にすることが望ましい。更に、遺伝子工学的手法を使用して、Eのアミノ酸配列の一部をコードするDNA配列を作り出すことが可能である。例えば、配列認識番号11に開示した配列から、どの制限酵素、又はその組み合わせによりEペプチド、またはEオリゴペプチドをコードする配列を作り出すことが可能であるかが決定できる。制限酵素の選択は、得られるペプチド、またはオリゴペプチドの免疫潜在力を破壊しないように行ってもよい。タンパク質の抗原部位は大きさが異なるが、約７から１４アミノ酸からなる。故にEの大きさのタンパク質には多くの別個の抗原部位が含まれる可能性があり、よって多くの遺伝子の部分配列はEのエピトープをコードすることが可能である。結果的に、図1及び配列認識番号１１をガイドとして使用して、制限酵素の組み合わせにより、適切なベクタに挿入されたときにE-特異的アミノ酸配列（ペプチドまたはオリゴペプチド）の産生を行わせることが可能なDNA配列を作り出すことが可能である。
態様B：モラクセラ・カタルハリスの株間での、Eをコードする遺伝子の保存。
抗体の吸着を利用した以前の研究により、表面に露出した一つ以上の、モラクセラ・カタルハリスの決定基が、株間で抗原的に保存されていることが証明された（Murphy etal., 1989，前出）。しかしながら、これらの研究では株間において、Eをコードする遺伝子の保存については言及されていなかった。本発明のヌクレオチド配列が診断アッセイにおいて有益であるためには、Eをコードする遺伝子はモラクセラ・カタルハリスの株間で高く保存されていなくてはならない。更に、遺伝子が高く保存されていることは、タンパク質の配列もまた高く保存されていることを示す。細菌のタンパク質、またはペプチドが、モラクセラ・カタルハリスによる感染に対するワクチン製剤の抗原として有益であるには、該タンパク質、または該ペプチドは、免疫原性であり、尚且つモラクセラ・カタルハリスの株間で保存されているエピトープを有していなくてはならない。モラクセラ・カタルハリスの株間での、Eをコードしている遺伝子の保存度を決定するために、多様な臨床分離源及び地理的分離源より得た19株のゲノムDNAを精製して分析した。まず、分離株の精製済みDNA由来のE-特異的遺伝子配列をプライマ（配列認識番号１６及び１７）を利用したPCRで増幅した。アガロースゲル電気泳動による増幅産物を分析すると、Eをコードする遺伝子が試験した全ての株間で同じサイズ（約1.4kb）であったことが示された。更に制限断片長の多形性を、増幅産物の制限（Hind III, Sau96I, Bsl I,またはBsgI）、及び6％アクリルアミドゲルの電気泳動後の臭化エチジウム染色による該断片の視覚化により分析した。増幅産物のバンドパターンは、制限部位の存在及び該断片の見かけのサイズに関して、試験した株間で変化がないことを示していた（Sau96Iに関しては図２A、Bsl Iに関しては図２bに例示）。増幅産物の制限に使用した4種類の制限酵素のうちの、３つはそれぞれ増幅産物の内の３つの異なる部位で切断し、残りの１つは二つの異なる部位で切断する。故に全ての株において同様の結果が得られたことは、１１の部位で認識される配列は、試験した株において同じであることを示している。制限断片の多形性に関して試験した株を、ゲル（図２A及び図２Bのレーン２から始まる）と同じ順序で表１に示した。異なる株間での制限パターンの差異はありえるが、これらの使用した特異的制限酵素では、差異は見られなかった。
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以上の結果は、Eをコードする遺伝子はモラクセラ・カタルハリスの株間で高く保存されていて、よって本明細書に記載のヌクレオチド配列には、診断やワクチンへの適用性がある。
態様C
モラクセラ・カタルハリス検出用の分子診断アッセイにおいてE-特異的ヌクレオチド配列を使用する方法。
態様Bで開示されているように、Eをコードしている遺伝子が保存されているため、本発明の核酸配列は、モラクセラ・カタルハリスの遺伝物質の検出用の診断アッセイにおいて使用することが可能である。特に、また配列認識番号１〜１０、及び１２〜１８に例示されているように、E-特異的オリゴヌクレオチドは、モラクセラ・カタルハリスの核酸を増幅するためのプライマ、または増幅した産物を検出するためのプローブとして使用するために合成することが可能である。分子生物学における近年の発展により、酵素的に核酸配列を増幅するいくつかの方法が提供された。現在最も一般的に使われている方法はPCR（登録商標、ポリメラーゼ連鎖反応の略、Cetus Corporation）であり。これでは、耐熱性のDNAポリメラーゼ、プライマとして既知の配列、及びデオキシリボ核酸（DNA）の複製鎖を分けて、注目している遺伝子を対数的に増幅させる加熱サイクルを用いている。現在開発中のその他の増幅方法であるLCR（登録商標、リガーゼ連鎖反応の略、Biotechnica International）には、以下のものを使用する：DNAリガーゼ；増幅するDNAの配列に相補的な配列の半分ずつの断片を一組（二つ）有するプローブ；QBレプリカーゼ酵素（Gene-Trak Systems）；増幅するDNAに相補的なプローブに付属するリボ核酸（RNA）配列テンプレートであって、相補的RNAを対数的に合成するためのDNAテンプレートを作るために使用するもの；及び増幅する核酸配列としてのRNAまたはDNA上で作用するNASBA（登録商標、nuceic acid sequence-based amplificationの略、Cangene Corporation）を用いる。
特異的遺伝子配列にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブは検体当り103〜104生物体にまで達する感度で生物学的検体中の特異的病原体を検出するのに使われて、成功している（1990, Gene Probes for Bacteria, eds. Macario and deMacario, Academic Press）。特異的標的DNA配列の増幅を行う方法と組み合わせると、種特異的核酸プローブは、臨床的検体中の生物体の検出感度を顕著に上げることが可能である。これらのプローブを使用すると、前培養及び/または通常の生化学的同定技術に頼ることなく、直接的な検出を行うことが可能になる。本発明のこの態様は、モラクセラ・カタルハリスのEをコードする、種特異的配列を増幅するプライマ、及び上記増幅配列に特異的にハイブリダイズするプローブに向けられている。本発明の核酸配列、及び本発明の方法を用いることにより、10μg/mlの外来性DNAの存在下で、1個といった少数のモラクセラ・カタルハリスをも検出することが可能である。
本態様は、モラクセラ・カタルハリスDNAがもし存在するならば、臨床的検体から抽出したDNAより、モラクセラ・カタルハリスのDNAの配列を増幅するのに使用することが可能な、種特異的オリゴヌクレオチドに向けられていて、該臨床検体には中耳液、痰、血液、並びに上咽頭、目、及びアデノイドからの液体が含まれ、次いで本態様は、増幅が起きたかどうかを決定することにも向けられている。本発明の一つの態様においては、一組のモラクセラ・カタルハリス特異的DNAオリゴヌクレオチドプライマを使用して、臨床的検体中に存在する可能性のあるモラクセラ・カタルハリスゲノムDNAにハイブリダイズさせ、酵素的合成及び温度サイクルを使用して、二つのフランキング（flanking）プライマの間のゲノムDNAの特異的断片を増幅させる。プライマのそれぞれの組は、Eをコードする遺伝子を具備したモラクセラ・カタルハリスの核酸配列（すなわち、配列認識番号１１に含まれるゲノムの領域内）にハイブリダイズするように設計され、該遺伝子を補完するように、すなわち二本鎖DNAのそれぞれの鎖に一つずつが補完するように合成されている。故に反応は、μgの量の外来性DNAが存在しても、特異的である。この記載のため以下では、DNAのプラス鎖（遺伝子側）配列由来のプライマを「プラスのプライマ」と呼び、マイナス鎖（相補鎖側）配列由来のプライマを「マイナスのプライマ」と呼ぶ。
DNAの増幅は商業的に利用できるいかなる方法でも行うことができる。例えば、PCRを使用してDNAを増幅することもできる。プライマが標的DNAの反対の鎖に一旦ハイブリダイズすると、温度を上げて、二つの該プライマの間の領域のDNAの特異的断片の複製を、耐熱性のDNAポリメラーゼで行わせる。次いでそれぞれのサイクルで、もしモラクセラ・カタルハリスのDNAの配列が存在するならばそれが増幅されるように、二つの該プライマ間の配列のDNA量を二倍にする様にして反応を温度サイクルにかける。モラクセラ・カタルハリスのDNAから由来する、増幅したDNA断片を更に同定することは、液相ハイブリダイゼーションにより行うことができる。この試験では、一つ以上の、標識したオリゴヌクレオチドを、モラクセラ・カタルハリスのDNAの断片を増幅するために特異的にハイブリダイズするプローブとして使用する。配列特異的に増幅したDNAの存在を検出することは、オートラジオグラフィーを使うゲル遅延アッセイなどの、当該技術分野で知られるいくつかの方法を使用して行うことができる。故に本発明のヌクレオチド配列は、モラクセラ・カタルハリスの診断用キットの商業的応用性を有する、オリゴヌクレオチドの合成の基礎を提供する。関連した態様においては、プライマとして使用するオリゴヌクレオチドを直接的に標識したり、標識を取り込むように合成することが可能である。使用する標識に応じて増幅産物は、アイソトープ的または比色的検出により親和性マトリックスへの結合後に検出することができる。
当該技術分野で知られる方法により、モラクセラ・カタルハリスを含む可能性のある臨床的検体から、DNAを抽出することが可能である。例えば、検体中に含まれる細胞をTE緩衝液中で洗浄して、遠心により沈殿させる。次いで細胞を、界面活性剤及びプロテネースKを含む、100μlの増幅反応緩衝液に再懸濁する。PCRを利用するにあたって、得られた試料は以下の組成の緩衝液中の細胞から構成されていてもよい：10mMトリス（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01％ゲラチン、0.45％NP40（登録商標）、0.045％Tween20（登録商標）、及び60μg/mlプロテイナーゼK。試料を55℃の水浴中で1時間インキュベーションする。インキュベーション後、試料を95℃で10分間インキュベーションしてプロテイナーゼKを熱で不活化する。次いで試料を、以下に示すPCR用のプロトコールにそって行い、増幅させることができる。
PCRにより核酸を増幅するいくつかのプロトコールのうちどれか一つ使って、モラクセラ・カタルハリスのDNAを増幅することができる。この態様の一つの様式において、Eをコードする遺伝子を以下の条件で、19個のB・カタルハリスの臨床的分離株から増幅した。増幅するDNA（1μgのゲノムDNA）を、0.5mlの微小チューブに分注して、以下のものを具備した反応混合液を加えて、容量を50μlにした：0.2mM dNTPs（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、それぞれ0.25μgのプラスオリゴヌクレオチド及びマイナスオリゴヌクレオチド、１単位の耐熱性DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ１０X緩衝液（5μl）、3mM MgSO4（最終濃度）、及び滅菌水（最終容量調節のため）。DNAポリメラーゼは、使用する直前に反応混合液に加えて静かに混合し、ボルテックスは避けた。約二滴のミネラルオイルをそれぞれのチューブに加え、次いで各チューブをサーマル・サイクラー（thermal cycler）にかけた。細菌のDNA増幅には、通常30から35サイクルで十分である。1サイクルは、96℃で15秒、62℃で1分、及び74℃で1分からなる。第一サイクル目では、95℃、3分のインキュベーションにより、変性を完全に行わせる。
モラクセラ・カタルハリスのEをコードするDNAに特異的にハイブリダイズし、DNA増幅及び/またはDNA検出に使用される、プライマまたはプローブとして有益なオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られる方法により、本発明で開示されたヌクレオチド配列から生化学的に合成することが可能である。該オリゴヌクレオチドのモラクセラ・カタルハリスに対する特異性はそれぞれの配列に対してジェンバンク・データベース（Genbank）で調べることができる。一般的には、オリゴヌクレオチドはG-C含有量が低いようにして選択するべきである。この態様において、Eをコードする遺伝子全体を増幅するために使用したプライマの組には、配列認識番号１４及び１５がある。該遺伝子の一部を増幅するのに使われたプライマの組には、配列認識番号１６及び１７、並びに１７及び１８がある。
検出のため、本発明のオリゴヌクレオチドを放射性同位体でその末端を標識してもよい。遺伝子配列を増幅するために使用するプローブの配列（二つのプライマの内側にある）は、T4ポリヌクレオチドキナーゼとガンマ32P ATPとで末端を標識することができる。キナーゼ緩衝液（50mMトリスpH7.6, 10mM MgCl2, 5mMジチオスレイトール, 0.1mMスペルミジン-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.0）中の20pmolのプローブDNAを、120μCiのガンマ32P ATPと混合して、37℃で1時間インキュベーションした。標識されたプローブを、取り込まれなかった標識から分離して8％のアクリルアミドゲルに200ボルトで1時間、トリス・ホウ酸塩・EDTA（TBE）緩衝液中で室温でながした。アクリルアミドゲルをX線フィルムに3分間露出して、標識済みプローブを最初に位置づけた。得られたオートラジオグラムを上記ゲルの下において、標識プローブを含むバンドををゲルより切りだした。ゲルの切片を1mlの滅菌水中で紛粋して、プローブを37℃で一晩震盪して溶出させた。クロマトグラフィー調製用カラムを使用して遠心し、溶出したプローブをゲルの紛粋物より分離した。液体シンチレーションにより、グラスファイバーフィルタ上の1mlの標識プローブを計測して、プローブの放射活性を決定した。上記プローブは、以下の配列の何れかより選択することが可能である：配列認識番号１から１０、１２から１８；ただし、プローブ配列は、本発明で開示した所望のヌクレオチド配列の増幅に使用する二つのプライマの内側にある。
当該技術分野で知られる別の方法を使用し、本発明の組成及び方法にしたがって、増幅した標的配列の検出を改善することが可能である。増幅したDNA配列の検出感度は、配列を液相ハイブリダイズにかけることにより改善することができる。ゲル電気泳動、並びにサザンハイブリダイゼーション及びオートラジオグラフィーを行うゲル電気泳動に加えて、本発明の組成及び方法にしたがって使用することが可能な、当該技術分野で知られる別の検出方法には以下のものがある：制限酵素消化とゲル電気泳動、標識オリゴヌクレオチドプローブを使用したスロット-ブロット・ハイブリダイゼーション、放射標識したプライマによる増幅とゲル電気泳動、サザンハイブリダイゼーションとオートラジオグラフィー、放射性標識したプライマによる増幅とドットプロット/オートラジオグラフィー、親和性タグ（例えばビオチン、またはビオチン導入プライマとDNA結合タンパク質特異的な配列のプライマとの組）を含むオリゴヌクレオチドでの増幅と親和性に基づいたアッセイによる検出（例としてはELISA）、及び蛍光担体（fluorophores）を含むオリゴヌクレオチドによる増幅と蛍光の検出。
非放射性の検出に関する態様一つには、ビオチンを本発明のオリゴヌクレオチドプライマに導入することがある。プライマの5’アミノ基は、スルホ-NHS-ビオチンでビオチンかすることが可能であり、またはビオチンで標識したdNTPs存在下でプライマを合成してビオチンを直接プライマに導入することも可能である。非放射性の標識を有するプライマを臨床的検体からのDNA増幅に使用することが可能である。増幅した標識配列の存在または非存在の検出は、アビジンが結合した親和性マトリックスを使用して、増幅した標的配列を捕獲し、次いで基質の展開時にアビジンコンジュゲートとの複合体を視覚化することができる酵素を含む、該アビジンコンジュゲートとインキュベーションすることにより行うことができる。または、増幅した標的配列は標的配列に対応したプローブにハイブリダイズすることで固定化することができ、該プローブは担体に固定させる。検出は、基質の展開時にアビジンコンジュゲートとの複合体を視覚化することができる酵素を含む、該アビジンコンジュゲートにより行うことができる。
態様D：E、Eペプチド、Eオリゴペプチドを診断免疫アッセイで作成及び使用する方法；
Eタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドはワクチン製剤用の免疫源として精製して使用することが可能であり、また診断アッセイ用の抗原として、または治療及び/または診断的価値のあるモラクセラ・カタルハリス特異的血清の作成のためにも使用することが可能である。モラクセラ・カタルハリス由来のEタンパク質またはそのペプチド、または発現ベクタ系より作成した組み換えの、Eタンパク質、Eペプチド、若しくはEオリゴペプチドは、当該技術分野で知られている以下の方法により精製することができる：界面活性剤による抽出、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、免疫アフィニティー、または分子ふるい分けのカラム）、差動遠心（differential centrifugation）差動可溶性（differential solubility）、またはタンパク質精製用のその他の標準的技術。例を挙げると、細菌の外膜を主として含有する粗精製物は以下のようにして調製することができる。30枚のチョコレートアガープレートでEを発現している細菌を、25mlのPBS（pH7.2）にこすり落とし、12,000Xgで20分間、4℃で遠心して回収した。細菌の沈殿を10mlの1M酢酸ナトリウム-0.001Mβメルカプトエタノール（pH4.0）に再懸濁した。5％ツイッタージェント（Zwittergent）Z3-14（Calbiochem-Behring社）、及び0.5％MのCaCl2を含む溶液90mlを加え、該懸濁液を室温で1時間混合した。25mlの冷エタノールを加え、次いで17,000Xgで10分間、4℃で遠心して核酸を沈殿させた。残留のタンパク質は、375mlの冷エタノールを加え、次いで17,000Xgで20分間、4℃で遠心して回収した。沈殿を乾燥させ、次いで0.05％のツイッタージェント（Zwittergent）、0.05Mのトリス、0.01EDTA、pH8.0を含む界面活性剤緩衝液中に懸濁し、室温で1時間攪拌した。細菌の外膜タンパク質は、12,000Xgで10分間4℃で遠心した後の、界面活性剤緩衝液中の可溶性画分に含まれていた。
外膜タンパク質調製物からのEタンパク質を免疫的に精製するのは、当該技術分野で知られる、イミュノアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。E-特異的モノクローナル抗体は、アフィニティー担体を形成するようにクロマトグラフ担体に連結してもよい。外膜タンパク質の調製物を次いで、アフィニティー担体とインキュベーションして、該抗体をEに結合させる。該アフィニティー担体を次いで洗浄して非結合組成物を除去し、Eを次いで該アフィニティー担体より溶出してEタンパク質の精製調製物を得る。精製したEは、診断アッセイ用の抗原として、または当該技術分野で知られる方法により、化学的または酵素的に開裂させてペプチドにする。またはEをコードする遺伝子の配列を参照することで推定したアミノ酸配列を使って、Eペプチド、もしくはEオリゴペプチドを化学的に合成してもよい。組み換えEタンパク質は、同様の方法により精製することができる。
本明細書においてEオリゴペプチドは、配列認識番号１１に開示されているEタンパク質のアミノ酸配列の一部に一致する、一連のペプチドであって、単体として、または化学的に連結されてものとして合成されるものである。このようなペプチド、またはオリゴペプチドは、当該技術分野で知られる以下のいくつかの方法のうちの一つにより合成することができる：標準的な固相ペプチド合成法で、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ酸（Mitchell et al., 1978, J.Org. Chem. 43:2845-2852）を使用する方法、または9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸をポリアミド支持体上で使用する方法；ペプスキャン（pepscan）合成法（Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 03:259; 1984,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998）；または標準的な液相ペプチド合成。アミノ酸の欠失、及び置換（並びにアミノ酸の伸長及び付加を含む）及びその他の方法による、ペプチドまたはオリゴペプチドの修飾は、上記のペプチドまたはオリゴペプチドの免疫学的性質を実質的に落とすことなく行うことができる。特に、Eタンパク質のアミノ酸配列は、1以上のアミノ酸を機能的に同等のアミノ酸と置換することで、当該タンパク質、ペプチド、またはオリゴペプチドの物理化学的性質において目だった変化を起こさせずに、変異させることができる。
精製したEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドは、モラクセラ・カタルハリス荷よる感染が疑われる患者の体液中に存在する、モラクセラ・カタルハリス特異的抗血清の検出用の、免疫アッセイにおける抗原として利用することができる。体液には、中耳液、痰、血液、並びに上咽頭、目及びアデノイドからの液体が含まれるが、これらに限定されない。免疫アッセイの抗原としてのE、Eペプチド、またはEオリゴペプチドの検出には、当該技術分野で知られるいかなる免疫アッセイも含まれるが、以下に示したものには限定されない：ラジオ免疫アッセイ、酵素結合免疫測定法（ELISA）、「サンドイッチ」アッセイ、沈降素反応、凝集素アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及び化学蛍光依存性免疫アッセイ。
態様E：E、Eペプチド、Eオリゴペプチドに関連したワクチン製剤の、方法と化合物。
本発明のこの態様は、モラクセラ・カタルハリスによる感染の治療、または保護のための能動免疫用の、予防及び/または治療ワクチン中のEタンパク質、及び/またはそのペプチドを提供することにある。ワクチンの開発用に、免疫源を具備したE-特異的アミノ酸配列は、モラクセラ・カタルハリス、またはE、Eペプチド、若しくはEオリゴペプチドを発現する組み換えベクタを有する宿主から精製することができる。このような宿主には、形質転換した、細菌、酵母、糸状真菌、及びEアミノ酸配列をコードするベクタで形質転換されるか、または感染した培養細胞が含まれるが、これらには限定されない。Eタンパク質の一部に一致するペプチド、またはオリゴペプチドは、化学的に、若しくはEタンパク質を酵素的に開裂して産生させるか、または当該技術分野で知られる方法と、Eをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を参照することで推定したアミノ酸配列とにより化学的に合成することができる。またはEペプチド、若しくはEオリゴペプチドは、組み換えベクタより産生させることもできる。どちらの場合においても、上記のEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドの免疫源は、ワクチン製剤中に関連した免疫源物質として含まれ、また治療的に有効な量で含まれて、免疫反応を引き起こす。ワクチン接種するヒトまたは動物に、ワクチン製剤を導入するための多くの方法が知られている。これらのなかには、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、接眼、鼻腔内、及び経口的投与が含まれるが、これらには限定されない。該ワクチンは更に、溶液、ポリマー若しくはリポソームのような生理学的担体、及びアジュバント、またはそれらの組み合わせを具備していてもよい。
種々のアジュバントが、ワクチン製剤と組み合わせて使用される。アジュバントは、ワクチンの抗原のみを投与したときに比べて、より少量のワクチン抗原、及びより少ない投与回数で、より長期で高レベルの免疫を得るのを助ける。アジュバントの作用は複雑で完全には理解されていない。しかしながら、抗原の遅延放出、及び抗原の分解/プロセッシングによる免疫認識の促進と同様に、サイトカインの生成、ファゴサイトーシス、及び細網内皮系のその他の活性を通じての免疫調節が関わる可能性がある。アジュバントの例には、不完全フロイントアジュバント、アジュバント65（ピーナッツオイル、モノオレイン酸マンナイド（mannide monooleate）、モノステアリン酸アルミニウムを含有する）、オイルエマルジョン、リビ（Ribi）アジュバント、プルロニック（pluronic）アジュバント、ポリアミン、アブリジン（avvridine）、キル（Quil）A、サポニン、MPL、QS-21、及び、水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウムのような鉱物ゲルなどが含まれる。
本発明のこの様式の別の態様には、ハプテン、すなわちそれ自身では免疫反応を惹起できない分子として、E-特異的アミノ酸配列を産生することが含まれる。この場合、ハプテンは担体、または免疫系に露出されたときにハプテンに免疫原性を与える免疫的源分子に共有結合されていてもよい。故に、このような、担体に連結されたE−特異的ハプテンはワクチン製剤中の免疫源となりえる。本態様の別の様式は、生の、組み換えウイルスワクチン、組み換え細菌ワクチン、組み換え弱毒細菌ワクチン、または不活化した組み換えウイルスワクチンの何れかであって、モラクセラ・カタルハリスによる感染に対しての保護に使えるものを提供する。当該技術分野では、ワクシニアウイルスは、他の個体由来のワクチン抗原を発現する感染性ウイルスのなかで最もよく知られている例である。生の組み換えワクシニアウイルスは、弱毒化、またはそれ自身では発病させないように処理されてから、宿主を免疫するのに使用される。引き続いて組み換えウイルスが宿主内で複製すると、免疫系を連続的にE、またはEペプチドのようなワクチン抗原で刺激して、それにより長期間続く免疫が提供される。その他の生のワクチンベクタには以下のものが含まれる：アデノウイルス、サイトメガロウイルス、及び好ましくはワクシニアのようなポックスウイルス（Paoleti and Panicali, U.S. Patent No. 4,603,112）、及び弱毒化サルモネラ株（Stocker et al., U.S. Patent Nos. 5,210,035; 4,837,151;及び4,735,801;及びCurtiss et al., 1988, Vaccine 6:155-160）。生ワクチンは特に有益であるが、なぜならば生ワクチンは免疫系を連続して刺激して、実質的に長期間に渡る免疫を与えるためである。免疫反応が、その後のモラクセラ・カタルハリスによる感染に対して保護的であると、生ワクチン自体はモラクセラ・カタルハリスに対する保護的ワクチンとして使用することができる。
本態様のこの様式を例示するために、態様Aに例示したような分子生物学的技法を利用して、Eをコードする遺伝子、または一つ以上のEペプチドをコードする遺伝子断片を、Eエピトープの発現を許容するが、ワクシニアウイルスベクタの複製または増殖に負の影響を与えないような、ワクシニアウイルスゲノムDNA中の部位に挿入することができる。得られた組み換えウイルスは、ワクチン製剤中の免疫源として使用することができる。免疫原として使用する前に、当該技術分野で知られる化学的方法により、発現された免疫原の免疫原性が実質的に影響されないようにして、組み換えウイルスが不活化されること以外が同じである方法を使用して、不活化された組み換えウイルスワクチン製剤を構築することが可能である。異なるエピトープを発現する不活化ウイルスの混合物を、多価の不活化組み換えウイルスの製剤として使用してもよい。何れの場合にも、不活化組み換えウイルス、または不活化ウイルスの混合物は適切なアジュバントとともに、調製されてワクチン抗原に対する免疫反応を促進する。
この態様の別の変形例においては、遺伝物質を直接ワクチン製剤として使用している。E、Eペプチド、またはEオリゴペプチドをコードする配列を含む核酸（DNAまたはRNA）で、一つ以上の制御配列に機能するように連結されているものは、モラクセラ・カタルハリスの病原性株に対して、個体をワクチン接種するために、直接的に導入することができる（直接的トランスファー）。ワクチン接種した個体へ直接的遺伝子トランスファーを行うと、主要器官の組織と同様に、血管内皮細胞のような、ワクチン接種を受けた個体の細胞による遺伝物質の発現が起きることが、発現プラスミドを静脈内注射のような、当該技術分野でよく知られる方法により証明された（Zhu et al., 1993, Science 261:209-211）。ベクタDNAを標的細胞へ運ぶその他の効果的方法は、当該技術分野で知られている。一つの例としては、ウイルス遺伝子を含有する、精製した組み換えプラスミドDNAを使用してワクチン接種（非経口的（parentally）、粘膜的、または遺伝子銃免疫）して、保護免疫反応を誘導する（Fynan et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11478-11482）。別の例では、個体より取り除いた細胞を当該技術分野で知られるトランスフェクション、またはエレクトロポレーションすることができ、組み換えベクタDNAを標的細胞へ導入することができる。組み換えベクタDNAを含む細胞を次いで、ベクタ中の選択標識の発現を介在するような、当該技術分野で知られる方法を利用して選択し、選択した細胞を次いで、再び個体へ導入してEタンパク質、Eペプチド、Eオリゴペプチドを発現させることが可能である。
遺伝物質でワクチン接種する、一つの好ましい方法は、個体へ核酸分子を投与するステップを具備していて、該分子は、一つ以上のEタンパク質、Eペプチド、またはEオリゴペプチドをコードしていて、該核酸分子は発現に必要な一つ以上の制御配列に機能するように連結している。該核酸分子は、直接投与することも可能であり、また一旦ウイルスベクタに導入して、ベクタを経由して投与することも可能である。該核酸分子は、薬学的に許容されうる担体または希釈剤中に含めて投与することが可能であり、またワクチンの効果を促進することができる化合物を含んでいてもよい。これら付加的化合物には、以下のものが含まれるが、これらには限定されない：免疫反応を促進または調節するアジュバント、細胞による核酸の取り込みを増やす、その他の化合物。核酸分子での免疫はいかなる非経口的（parental）経路（すなわち静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋肉内）、または上咽頭、気管、若しくは消化管の粘膜表面との接触により行うことが可能である。
モラクセラ・カタルハリスによる感染により生存が危ぶまれている、免疫無防備状態の個体の場合のときは、能動免疫に代わる方法として、免疫方法は受動的であってもよく、すなわちEエピトープに対する抗体を含む、精製したヒト免疫グロブリンを投与することを具備した免疫をしてもよい。
本発明は、本明細書において詳しく記述されているが、例は例示する目的のみにおいて示されていることを理解する必要がある。生物学、医学診断、及び関連分野の当業者にとって自明な、本発明の態様のその他の修飾は、書き加えた請求項の範囲に含まれている。
配列表
（１）一般的情報
（i）出願人：Murphy, Timothy F.
Bushan, Reva
（ii）発明の名称：モラクセラ・カタルハリス（Moraxella catarrhalis）に対するワクチン
（iii）配列の数：１８
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：ホッグソン、ラス、アンドリュー、ウッズ、アンド  グッドイヤー
（B）通り：１８００  ワン  M & Tプラザ
（C）市：バファロー
（D）州：ニューヨーク
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：１４２０３−２３９１
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：ディスケット、３．５インチ、容量１．４４kb
（B）コンピュータ：IBM PCコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：MS-DOS/マイクロソフト・ウィンドウズ３．１
（D）ソフトウエア：ワードパーフェクト
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vi）以前の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：Nelson, M. Bud
（B）登録番号：35,300
（C）参照／ドケット番号：11520.0063
（ix）電信情報：
（A）電話：（716）856-4000
（B）テレファックス：（716）849-0349
（２）配列認識番号１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１
0004260879.tif 000003
（３）配列認識番号２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号２
0004260879.tif 000004
（４）配列認識番号３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号３
0004260879.tif 000005
（５）配列認識番号４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号４
0004260879.tif 000006
（６）配列認識番号５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号５
0004260879.tif 000007
（７）配列認識番号６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号６
0004260879.tif 000008
（８）配列認識番号７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号７
0004260879.tif 000009
（９）配列認識番号８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号８
0004260879.tif 000010
（１０）配列認識番号９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号９
0004260879.tif 000011
（１１）配列認識番号１０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１０
0004260879.tif 000012
（１２）配列認識番号１１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１６５０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：YES
（iv）直接の起源：
（A）ライブラリー名：ゲノム
（B）クローン名：EMBL-3クローン
（v）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（vi）配列の特徴：
（A）存在位置：E遺伝子領域、154-1531
（v）配列：配列認識番号１１
0004260879.tif 000013
0004260879.tif 000014
0004260879.tif 000015
0004260879.tif 000016
（１３）配列認識番号１２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２４ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１２
0004260879.tif 000017
（１４）配列認識番号１３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２４ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１３
0004260879.tif 000018
（１５）配列認識番号１４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１４
0004260879.tif 000019
（１６）配列認識番号１５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３８ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１５
0004260879.tif 000020
（１７）配列認識番号１６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１６
0004260879.tif 000021
（１８）配列認識番号１７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１７
0004260879.tif 000022
（１９）配列認識番号１８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３４ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA
（iii）直接の起源：合成
（vi）起源：
（A）生物名：モラクセラ・カタルハリス
（B）株名：25240
（C）細胞の種類：細菌
（v）配列：配列認識番号１８
0004260879.tif 000023
【図１】
0004260879.tif 000024
【図２Ａ】
0004260879.tif 000025
【図２Ｂ】
0004260879.tif 000026