(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法であって、以下の工程を具備する方法；
（１）第１の標的配列に相補的な配列を含み且つその５’末端を介して固相化されているターゲット核酸に対して、前記対象から得られた第１の被検核酸を反応させる工程と、
（２）検出可能な第１の信号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少なくとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用いて、前記（１）の工程で得られたターゲット核酸に対してハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも５’側に更なる配列を含む第１のプローブ核酸の前記更なる配列の部分を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末端を伸長し、第２の標的配列を含むターゲット核酸を得る工程と、
（３）前記（２）で得られた第２の標的配列を含むターゲット核酸にハイブリダイズしている第１のプローブ核酸を解離させる工程と、
（４）前記（３）で得られた第２の標的配列を含むターゲット核酸に、前記対象から得られた第２の被検核酸を反応させる工程と、
（５）検出可能な第２の信号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少なくとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用いて、前記（４）の工程で得られた第２の標的配列を含むターゲット核酸にハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも５’側に更なる配列を含む第２のプローブ核酸を鋳型とし、第２の標的配列を含むターゲット核酸の３’末端を伸長する工程と、
（６）前記（５）において得られた伸長されたターゲット核酸に含まれる標識物質からの第１および／または第２の信号を検出することによって、対象における遺伝子の発現頻度を解析する工程。
【請求項２】
前記被検核酸がｍＲＮＡ断片であり、前記ターゲット核酸がポリヌクレオチドであり、前記標識物質が蛍光物質であり、且つ前記基質核酸がジデオキシヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする請求項１に記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法であって、前記（２）の伸長する工程が、次の群より選択されることによってその伸長が停止されることを特徴とする方法；
（ａ）前記非標識基質核酸のうち、前記ターゲット核酸の伸長を停止したい部位に対応するプローブ核酸の塩基に相補的な塩基を含む非標識化基質核酸を、ジデオキシヌクレオチド三リン酸とすることにより、前記伸長を停止すること、
（ｂ）前記非標識基質核酸のうち、前記ターゲット核酸の伸長を停止したい部位に対応するプローブ核酸の塩基に相補的な塩基を含む非標識化基質核酸を、前記（２）の伸長する工程において存在させないことにより、前記伸長を停止すること。
【請求項４】
前記標的配列が１０から１５塩基のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の細胞における遺伝子の発現頻度を検出する方法方法。
【請求項５】
前記ターゲット核酸がそこにおいて核酸について反応を行うことが可能な反応容器の内壁に固相化されていることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法。
【請求項６】
前記反応容器の容器内部の形状がキャピラリー形状であることを特徴とする請求項５記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸に関連した分析、特に、対象における遺伝子の発現頻度解析に関する。
【０００２】
【従来の技術】
所謂ＤＮＡマイクロアレイは、多数の異なったターゲットＤＮＡをガラスなどの固相基板上に高密度に固定した装置である。このような基板にターゲット核酸を固定した装置は、その製造方法から２種類に大別される。１つは、光リソグラフ方式によりＤＮＡをガラス表面上で合成していくタイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡチップと称される装置である（Proc Natl Acad Sci USA(1994)91:5022-5026)。もう１つは、予め調製したＤＮＡをスライドガラス上に機械的に並べ、それによってＤＮＡを張り付けていく（即ち、固相化する）タイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡマイクロアレイと称される装置である（Science(1994)270:467-470)。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイの基本的な測定原理は、固定されたターゲット核酸に対して相補的な標識化プローブ核酸をハイブリダイズさせ、各々のプローブ核酸からのシグナルを検出し、得られたシグナルを基に試料に含まれるプローブ核酸を検出するものである。このような原理によって、遺伝子の大量解析が可能になり、検出感度の向上、装置のマイクロ化によるサンプルの節約、データの取得の自動化およびデータ処理の簡便化などが達成されると期待されている。
【０００４】
しかしながら、このようなＤＮＡマイクロアレイを使用する遺伝子発現頻度解析には、以下のような問題点がある；１）測定したい試料、例えば、ＲＮＡなどの抽出後に、蛍光標識化基質核酸と逆転写酵素とを用いてプローブＤＮＡを標識しなければならず、標識化の効率が悪く、各操作段階で試料に変性が生じ易い、２）プローブ核酸となる遺伝子をランダムにラベルしなければならないので効率が悪い、３）ハイブリダイゼーションまでの前処理が煩雑である、３）ディファレンシャルな遺伝子発現を見るための系であるので、結果は相対的にしか得られない、４）測定は乾燥状態で行われるので蛍光シグナルの検出効率が低い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記の状況に鑑み、本発明の目的は、効率のよい遺伝子発現頻度解析方法を提供することである。また本発明の更なる目的は、複数のプレート間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
鋭意研究の結果、本発明者らは、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法であって、以下の工程；
（１）前記対象に由来する被検核酸を得る工程と、
（２）標的配列に相補的な配列を含み、且つその５’末端を介して固相化されているターゲット核酸に対して、前記被検核酸を反応させる工程と、
（３）検出可能な信号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少なくとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用いて、前記（２）の工程で得られたターゲット核酸に対してハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも５’側に更なる配列を含むプローブ核酸の前記更なる配列の部分を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末端を伸長する工程と、
（４）前記（３）において得られた伸長されたターゲット核酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによって、対象における遺伝子の発現頻度を解析する工程
を具備する方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の態様に従うと、対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法が提供される。ここで使用される「対象」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ及びサルを含む任意の哺乳動物などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物、また、個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
【０００８】
ここで使用される「被検核酸」の語は、遺伝子の発現頻度を解析する場合には、一般的には対象において発現されるｍＲＮＡを指す。対象から被検核酸を得る工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能であり、例えば、被検核酸がｍＲＮＡである場合には、例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカラムを使用してもよいが、これに限定されるのもではない。また、標識されたターゲット核酸を得る場合には、何れの核酸であってもよい。ここにおける「核酸」は、天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などであってもよく、その塩基配列および修飾の有無などは任意に選択すればよい。また、試料中のプローブ核酸は、対象から抽出された後に、増幅されて本発明の態様に従う方法に共されてもよい。
【０００９】
ここで使用される「標的配列」の語は、検出されるべき塩基配列を示す。ここで使用される「プローブ核酸」の語は、検出されるべき塩基配列を含む核酸を示す。また、ここで使用される「ターゲット核酸」の語は、標的配列を検出するための核酸を示す。例えば、標的配列に相補的な塩基配列をその一部に含む核酸であればよい。
【００１０】
また、本発明の態様に従うターゲット核酸は、その５’末端を解して固相化されている。ターゲット核酸の固相化は、従来公知の何れかの基体に対して所望のターゲット核酸を固定することによって行うことが可能である。
【００１１】
本発明の態様に従って使用され得る基体は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用される反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反応容器であっても、その面において反応を行うような板状および球状の基体であってもよい。処理の容易さから、キャピラリー形状の反応部を有した反応容器が好ましい。
【００１２】
ここで使用される「標識物質」の語は、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであってよい。また、酵素反応などで発色する基質を用いてもよい。また、異なる部位に存在する複数の標的核酸を標的配列として検出する場合や、複数のターゲット核酸を１つの基体において同時に用いる場合など、所望に応じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００１３】
以下、本発明に従う態様例を用いて本発明について更に説明する。
【００１４】
第１の実施例
本発明の態様において使用され得る反応容器の例を図１に示す（図１）。本例における反応容器１は、そこにおいて反応を行うための反応部２を具備する。ここで、反応部２は、１Ｂに示す通りの容器内部の形状がキャピラリー形状である（図１）。１Ｂは、１Ａの線１Ｂ−１Ｂに沿った断面図である。
【００１５】
また、１Ａおよび１Ｂに示すように反応容器１は、反応部２に試薬などを挿入および／または反応部２から試薬などを排出するための開口部４ａおよび４ｂを有している（図１）。また、反応部２の底部には、検出しようとする標的配列に相補的な配列を含むターゲット核酸３が所望の領域に固相化されている（１Ｂ）。このような反応容器１の製造は次のように行った。
【００１６】
即ち、溝およびその溝の両端に孔を有する第１の基板と、その表面にターゲット核酸が固相化された第２の基板を、第１の基板の溝と第２の基板の表面により形成される空間に前記ターゲット核酸が含まれるように接合することにより製造した。より具体的には次の通りである。
【００１７】
第１の基板は、ガラス板に長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を形成し、この溝の両端にそれぞれ貫通孔を形成した。第２の基板は、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グライナー・ジャパン）に対して、点着装置を用いて５’末端をビオチン標識したＲＶターゲット（ggaaacagctatgaccatg；配列葉号１）を点着し、ビオチン−アビジン反応を利用して固相化して形成した。このような第１の基板と第２の基板を接合した。ここで、前記溝により形成されたキャピラリー内に、前記ＲＶターゲット核酸は具備されている。このようにして形成した反応容器１を用いて、次の実験を行った。
【００１８】
前記キャピラリー内に、プローブ核酸として前記ＲＶターゲット核酸の配列に相補的なＲＶcomp target(tgcacatggtcatagctgtttcc；配列番号２)を１００ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加し、３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応のプローブ核酸をキャピラリー内から取り除いた。次に０．０２ｍＬの伸長反応溶液[１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（DNA ポリメラーゼＩ，Large Fragment;TOYOBO）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を前記キャピラリー内に添加し３７℃で１〜２時間反応させた。反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄して未反応物を取り除き蛍光を測定した（表１）。
【００１９】
表１は、ターゲット核酸の基体への点着量を１０ｎＭまたは１ｎＭとした場合に、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしとした場合について、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値を示す。
【００２０】
【表１】
0004229623.tif 000002
【００２１】
表１に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、相対値は非常に低かった。従って、ターゲット核酸への標識核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラーゼによる伸長であることが確認できた。また、ターゲット核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増加した。従って、本発明の態様に従う方法は、定量性を有していると示唆された。
【００２２】
このような反応により生じる現象を、図２に模式的に示した。本反応では、２Ａに示すように、標的配列を含む被検核酸としてプローブ核酸２１を、ターゲット核酸としてターゲット核酸２２を使用した。また、非標識核酸にはそこに含まれる塩基をＡとし、それに相補的な塩基を含む標識化基質核酸として蛍光標識した塩基Ｕ２３を用いた（２Ａ）。本明細書において、各略語はそれぞれ、「Ａ」はアデニン、「Ｕ」はウラシル、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシンである。また、本明細書において例として挙げる塩基は、記載の便宜上、例として挙げているに過ぎないので、それらの塩基に限定するものではない。
【００２３】
また、プローブ核酸２１は、標的配列を含み、且つその標的配列の５’側に非標識核酸を含む。この標的配列によって、ターゲット配列とのハイブリダイゼーションが達成される。続く、ターゲット核酸２２の３’端の伸長は、プローブ核酸の標的配列よりも５’側の配列を鋳型として達成される。更に、そのプローブ核酸の標的配列よりも５’側に含まれる被標識核酸の塩基に対して、標識化基質核酸がハイブリダイズして取り込まれることによって、標識化が達成される。
【００２４】
ここで、非標識核酸は連続した複数の塩基を含んでいてもよく、または断続的な複数の塩基であってもよい。
【００２５】
以下、反応を説明する。
【００２６】
まず、２Ｂにおいて、反応容器１の反応部２５の底面２４に固相化されたターゲット核酸２２に対して、ハイブリダイゼーション可能な条件下で、プローブ核酸２１を添加する。その結果、２Ｃに示すように、ターゲット核酸２２とプローブ核酸２１が反応し、ハイブリダイゼーションが生じる。続いて、これについて標識化基質核酸(Ｕ)２２と非標識化基質核酸(Ａ、ＴおよびＣ；図示せず)とを用いてポリメラーゼの存在下で伸長反応を行う。その結果、２Ｄに示すように伸長され標識されたターゲット核酸２６が得られる。
【００２７】
従って、前記の取り込まれた基質核酸に具備される標識物質の蛍光を検出すれば、標的配列を有するプローブ核酸の存在が検出される。
【００２８】
上記のようなキャピラリー形状の反応容器を使用すると使用する試料および試薬も微量で済むという利点がある。しかしながら、本発明において使用される反応容器は、キャピラリー形状に限られるものではない。また、上記の例では１つの反応容器に１本のキャピラリーが具備される装置の例を示したが、これに限定されるものではなく、１つの反応容器に複数のキャピラリー形状などの内部形状を有する反応部を有する反応容器を用いてもよい。
【００２９】
上記の模式図では、便宜上、１つのターゲット核酸について示したがこれに限定するものではない。また、ターゲット核酸の配列は上記の配列に限定するものではなく、所望に応じて任意に選択し得る。また、複数の異なる配列をそれぞれに有するターゲット核酸を１つの基体において用いてもよく、同じ種類のターゲット核酸を複数使用してもよい。
【００３０】
また、本発明に従って使用される反応容器は、例えば、以下の様に変更することも可能である。即ち、図１の１Ｃにその断面を示すように、基体の反応部２の下方にヒーターおよび温度センサーを配置してもよい（図１の１Ｃは１Ａの線１Ｂ−１Ｂに沿った断面である）。その場合、例えば、ターゲット核酸３が固相化されるポリイミド薄膜５の下にヒーター６を配置し、ヒーター６の下に温度センサー７を配置すればよい。このような装置はそれ自身公知の何れかの手段により製造することが可能である。また、このような装置に含まれるヒーターおよびセンサーの配置および配置パターンは所望に応じて変更してもよい。
【００３１】
以上のような本発明の態様に従うと、ターゲット核酸のラベルを容易に行うことが可能である。本態様に従うと、所望する特定の配列を有するターゲット核酸の特定の塩基を選択的に標識することが可能であり、これによって、被検試料中に含まれる被検核酸に標的配列が存在するか否かを判定することが可能である。それにより、遺伝子の発現頻度を解析することが可能である。
【００３２】
第２の実施例
第１の実施例に記載した反応容器を用いて、同様に第２の実施例を実施した。
【００３３】
また、第１の実施例において使用した伸長反応液に変えて、次の伸長反応液［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（DNA ポリメラーゼＩ，Large Fragment;TOYOBO）を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰまたは１０μＭのｄｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を用い、他の条件は第１の実施例の記載と同様にして反応を行った。
【００３４】
この反応の結果、０μＭのｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＣｙ３−Ｕまで伸長された。即ち、その後のＧ、ＣおよびＡは伸長されない。また、１０μＭのｄｄＧＴＰを用いた場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＧまで伸長された。即ち、その後のＣ、Ａは伸長されない。
【００３５】
表２は、ターゲット核酸の基体への点着量を１０ｎＭと１ｎＭとし、且つＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしの場合について、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値を示す。
【００３６】
【表２】
0004229623.tif 000003
【００３７】
表２に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、相対値は非常に低かった。従って、ターゲット核酸への標識核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラーゼによる伸長であることが確認できた。また、ターゲット核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増加した。従って、本発明の態様に従う方法は、定量性を有していると示唆された。
【００３８】
本発明は、プローブ核酸とハイブリダイゼーションしたターゲット核酸のみを標識化している。また、標的配列にハイブリダイズするべき標識化基質核酸以外の非標識化基質核酸を、それ以降伸長反応できないヌクレオチド(例えば、ddNTPなど)にすること、または反応系に存在させないことによって、プローブ核酸への標識量および伸長程度を制御することができる。
【００３９】
また、ターゲット核酸に取り込まれる標識物質の量は、プローブ核酸の量、即ち、発現頻度に依存して変化するため、標識物質の変化を定量的に検出することによって、遺伝子発現頻度を計測することが可能である。このような遺伝子発現頻度解析方法は、微量な試料で行うことが可能である。即ち、全ての処理を小型の容器内で、一連の処理として行うことが可能であるので、核酸基質(例えば、dNTPなど)の量および必要な試薬の量を低減することが可能であり、また、多検体について短時間に解析することも可能である。
【００４０】
第３の実施例
第３の実施例を模式図である図３を用いて説明する。本例では、それぞれに異なる第１、第２および第３のターゲット核酸３ａ、３ｂおよび３ｃを固相化した以外は第１の実施例と同様に作成した反応容器３０を使用する。３Ａに示す通り、それぞれのプローブ核酸３１ａ〜３１ｃに含まれる標的配列は便宜上「Ａ」として示した。
【００４１】
第１の実施例において記載した方法に従って、先ず、３Ｂに示すようにプローブ核酸３１ａ〜３１ｃをターゲット核酸３２ａ〜３２ｃに対してハイブリダイズし、次に、３Ｃに示すように伸長反応する。続いて、３Ｃにおいて、反応部３５を例えば、約９５℃に温度を上昇させ、伸長したターゲット核酸３６からプローブ核酸３１を解離させ、反応部３５を具備するキャピラリー内に０．１×ＳＳＣ溶液などの緩衝液を注入し、排出することにより内容液をフローする。それにより、解離したプローブ核酸を除去して、３Ｄに示すように、伸長され標識されたターゲット核酸３６ａから３６ｃを１本鎖として得ることが可能である。
【００４２】
上記の態様では、２本鎖核酸の解離手段として熱処理を行っているが、本発明の態様に従って使用可能な２本鎖核酸の解離手段は、これに限定するものではない。即ち、それ自体公知の一般的に２本鎖核酸を１本鎖に解離する場合に使用される手段であれば何れの手段であってよい。例えば、アルカリ溶液、尿素またはホルムアミド等を用いてもよい。
【００４３】
また、プローブ核酸がＲＮＡであり、ターゲット核酸がＤＮＡである場合、１本鎖への解離は、前記ＲＮＡを分解するような酵素、例えば、ＲＮＡａｓｅＨなどを用いて行ってもよい。
【００４４】
上記では３種類のターゲット核酸とプローブ核酸の例を示したが、これ以上または以下の種類のターゲット核酸および／またはプローブ核酸を用いてもよく、また、各種類の核酸を１以上で用いてもよい。
【００４５】
本発明の態様に従うと、上述した第１の実施例から第３の実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせて実行しても、また、所望に応じて一部を変更して実施してもよい。
【００４６】
本発明の更なる側面に従うと、上述のような本発明の態様により得られた１本鎖標識化ターゲット核酸も本発明の更なる態様として提供される。
【００４７】
例えば、本発明の態様に従って得た伸長され標識されたターゲット核酸を、１本鎖にした後に、更なる標識化ターゲット核酸として、後述する第６の実施例として記載するようなヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用することも可能である。
【００４８】
従来の方法では、ターゲット核酸の中間部位を標識化する場合には、高度な技術が必要とされている。また、中間部位が標識されたターゲット核酸の作製を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必要とされている。しかしながら、本発明の態様に従うと、ヌクレオチドの伸長反応を制御できるので、最終的に得られる更なるターゲット核酸の所望の中間位置を容易に標識化することが可能である。従って、ヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用するためのターゲット核酸も短時間に効率よく作製することが可能である。
【００４９】
第４の実施例
本発明の更なる側面に従うと、１ターゲット核酸に対して、複数回、被検核酸を含む被検試料を繰り返し処理することが可能である。
【００５０】
第１の実施例に記載するような反応容器１を使用し、本発明の態様に従い２回繰り返して処理する場合の例を各工程における各分子の状態を模式的に示した図４を用いて説明する。
【００５１】
まず、ターゲット核酸４２を反応部４５の底面４４に固相化する。次に、反応部４５に対して、第１のプローブ核酸４１ａと第１の蛍光標識化基質核酸４３ａ（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（４Ｂ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第１の標的配列（図４では「Ａ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（４Ｃ）。
【００５２】
ここで、所望の箇所、即ち、第１の標的配列の次の塩基で伸長反応を停止するためには、第１の標的配列の次の次の塩基に相補的な塩基からなるｄＮＴＰを添加しない。
【００５３】
続いて、４Ｃに示すように、反応部４５に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液を満たした状態で９５℃に温度を上昇させ、伸長されたターゲット核酸４６ａからプローブ核酸４１を解離させる。反応部４５を具備するキャピラリー内に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液などを注入し排出することによって内容液をフローして解離核酸を除去する。その結果、４Ｄに示すように、伸長され標識されたターゲット核酸４６ａが１本鎖として得られる（図４）。
【００５４】
続いて、４Ｅに示すような第２のプローブ核酸４２ｂと第２の蛍光標識化基質核酸４３ｂ（ここでは例として標識化ｄＡＴＰを記載している）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）をハイブリダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（４Ｆ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第２の標的配列（図４では「Ｔ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行う（４Ｃ）。続いて、得られた第２の伸長され標識された第２のターゲット核酸について、第１の蛍光物質および第２の蛍光物質の蛍光強度を測定する（４Ｅ）。
【００５５】
この態様においては、第２の標的配列の次の塩基まで伸長反応を行った例を示したが、それ以上伸長しても、第２の標的配列まで伸長することも可能である。
【００５６】
また、上記の例では、ターゲット核酸の伸長において、第１の標的配列と第２の標的配列の間に１の塩基が配置される例を示したが、これに限定するものではなく、当該間に塩基が配置されなくとも、また２以上の塩基が配置されてもよい。
【００５７】
４Ｅに示すように、得られた第２の伸長され標識されたターゲット核酸４６ｂに含まれる第１の蛍光物質（図４では星印でしめす）と第２の蛍光物質（図４ではＸ印で示す）は、識別可能であることが望ましく、互いに異なる波長の蛍光を生じる物質であることが望ましい。また、検出される蛍光強度の違いによって、判定する場合や、使用する検出手段の選択によっては、必ずしも互いに異なる波長である必要はない。
【００５８】
また更に、得られた第２の伸長され標識されたターゲット核酸４６ｂを更に１本鎖に変性し、上述した方法の更なる繰り返しを行ってもよい。
【００５９】
以下に、具体的な１例を挙げて更に説明する。
【００６０】
まず、第１の実施例に記載の反応容器１を用いて、ハイブリダイゼーション可能な条件下で第１のターゲット核酸と第１のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行う。続いて伸長反応溶液を[１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5)、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ(DNAポリメラーゼＩ，Large Fragment;TOYOBO)を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を用いることを除いて第１の実施例に記載の方法と同様に伸長反応を行う。
【００６１】
このハイブリダイゼーションと伸長反応によって、第１のプローブ核酸の存在が第１のターゲット核酸の伸長および標識化に反映される。即ち、第１のターゲットにハイブリダイズした第１のプローブ核酸を鋳型として、第１のターゲット核酸が伸長され、Ｃｙ３−Ｕが取り込まれ、Ｇの手前まで伸長される。その結果、第１のプローブ核酸にハイブリダイズされた、第１の伸長され標識されたターゲット核酸が得られる。
【００６２】
次に、温度を約９５℃に上昇させることにより、第１の伸長され標識されたターゲット核酸から第１のプローブ核酸を解離する。更に、反応部に含まれる溶液をフローすることにより、遊離した第１のプローブ核酸を除去する。
【００６３】
続いて、第２のプローブ核酸をハイブリダイゼーション可能な条件下においてハイブリダイズさせ、伸長反応溶液を[１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5)、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ(DNAポリメラーゼＩ，Large Fragment;TOYOBO)を０．４ユニット／μＬ、１０μＭのＣｙ５−ｄＡＴＰ、０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのｄＴＴＰを含む］を用いることを除いて第１の実施例に記載の方法と同様に伸長反応を行う。
【００６４】
上記の反応により、第２のプローブ核酸の存在が反映され、第２のプローブ核酸と第１の伸長され標識されたターゲット核酸とのハイブリダイゼーションが生じ、続いて、更なる伸長および標識化が生じ、第２の伸長され標識されたターゲット核酸が得られる。即ち、第２の伸長され標識されたターゲット核酸は、Ｃｙ５−Ａで標識化され、Ｃの手前まで伸長されている。
【００６５】
Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光強度をそれぞれにまたは相対的に測定することにより第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸の発現頻度または相対的発現頻度を測定することが可能である。
【００６６】
上述の本発明の態様に従うと、比較したい２つ以上のプローブ核酸を同じターゲット核酸に対して連続してハイブリダイゼーションし、ハイブリダイゼーションとプローブ核酸の配列に依存して、そのターゲット核酸を伸長し、識別可能な信号を生じる複数の標識物質を用いて、そのターゲット核酸に対して標識化を行うことが可能である。その後、ターゲット核酸に取り込まれた各標識物質を検出することにより、非相対的に、複数の対象について発現頻度解析を行うことが可能である。
【００６７】
このような発明の態様に従うと、複数のハイブリダイゼーションおよび標識化に関する全ての処理が、小型の容器内で、一括して、即ち、一連の操作によって行うことが可能である。従って、少ない試料で、所望する遺伝子発現頻度解析を短時間に、簡便に行うことが可能である。また、ターゲット核酸の伸長の程度を制御でき、また、所望のターゲット核酸を伸長していく途中の所望の部位に容易に標識を行うことが可能である。
【００６８】
第５の実施例
本発明の態様に従い使用され得るターゲット核酸とプローブ核酸がハイブリダイズした時の状態の例を図５の５Ａから５Ｄまでに模式的に示す。
【００６９】
上述した通り、ターゲット核酸５１は、基板表面５２にその５’末端を介して固相化されている。
【００７０】
５Ａに示すように、プローブ核酸５３Ａの全長は、ターゲット核酸５１Ａの全長よりも長いことが好ましい。それにより、プローブ核酸５３Ａとターゲット核酸５１Ａがハイブリダイズした際に、その長さの違いから生じるプローブ核酸５３Ａの１本鎖の部分を鋳型として、ターゲット核酸５１Ａの３’末端は伸長される。また、このとき被標識核酸はプローブ核酸５３Ａの１本鎖の部分に存在する。
【００７１】
また、プローブ核酸５３のターゲット核酸５１へのハイブリダイゼーションの位置は、５Ａおよび５Ｃに示すように、ターゲット核酸５１の全長に相補的な配列をプローブ核酸５３が含み、その上で、更に余分な配列がプローブ核酸の５’側に含まれるようにしてもよい。
【００７２】
或いは、５Ｂおよび５Ｄに示すように、ターゲット核酸５１の一部に相補的な配列をプローブ核酸５３の３’側が含み、更に余分な配列をプローブ核酸の５’側に含むように設計してもよい。
【００７３】
また、５Ａおよび５Ｂに示すように、被標識核酸として１ヌクレオチドが１箇所に設定されてもよく、５Ｃおよび５Ｄに示すように、被標識核酸として１ヌクレオチドが２箇所以上で設定されてもよい。
【００７４】
第６の実施例
ヌクレアーゼプロテクションアッセイへの利用
核酸分解酵素（nuclease）であるＳ１ヌクレアーゼは、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼであり、DNAおよびRNAともに酸可溶性の５’−Ｐのヌクレオチドに分解し最終的には、全体の９０％以上を５’−Ｐのヌクレオチドに分解する。また２本鎖中の１本鎖部分にも作用し、これを分解する酵素である。また、この酵素はＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の１本鎖部分の除去などによく用いられる。また、エキソヌクレアーゼＩも、１本鎖特異的エクソヌクレアーゼであり、１本鎖ＤＮＡの３’端から順番に加水分解して５’−Ｐのヌクレオチドにする。これらの酵素は、ＰＣＲ後のプライマーの除去などに用いられている（図６）。
【００７５】
ヌクレアーゼプロテクションアッセイ(Nuclaase Protection Assay)は、固相したターゲット核酸をあらかじめラベルをしておき、ハイブリダイゼーション後に１本鎖特異的ヌクレアーゼを反応させる解析方法である。例えば、プローブ核酸とハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡは、このヌクレアーゼからプロテクションされるので標識が保護されるのに対し、未反応のターゲット核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡなど）は分解されるので標識が遊離してしまう。従って、そのプロテクションされたターゲット核酸の標識量を、ターゲット核酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによって測定し、それによって遺伝子の発現頻度を測定する方法である（図７）。
【００７６】
このようなヌクレアーゼプロテクションアッセイを本願発明の一部として利用することも可能である。例えば、第３の実施例に記載する方法により得た１本鎖標識化ターゲット核酸を用いてヌクレアーゼプロテクションアッセイにより核酸を解析してもよい。また、第１、第２および第４の実施例に記載する方法により得た２本鎖標識化ターゲットを第３の実施例に記載するような手段により１本鎖して得られた１本鎖標識化ターゲット核酸を用いてもよい。また、そのようにして得られた１本鎖標識化ターゲット核酸は、本発明の態様に従って得られたままで、即ち、基体に固相化されたままでヌクレアーゼプロテクションアッセイに利用してもよく、或いは基体から遊離させ回収して利用してもよい。更に、回収した後に生成した後に使用してもよい。
【００７７】
本発明の更なる態様を、図８の模式図を用いて説明する。まず、第３の実施の態様に記載した方法と同様に、蛍光強度の検出以前の段階まで、即ち、図８の８Ａから８Ｄまでを行う。これにより、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化ターゲット核酸が得られる(８Ｄ)。
【００７８】
次に、核酸配列の解析を行うべき試料を添加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で反応する。８Ｅに示すように、試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合それらはハイブリダイズする。即ち、前記標的核酸を含む被検核酸８７ａおよび８７ｂと標識化ターゲット核酸８６ａおよび８６ｂがそれぞれハイブリダイズする。その後、８Ｆに示すように、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼを添加し、適切な条件下で反応する。その結果、ハイブリダイゼーションの生じなかった標識化ターゲット核酸８６Ｃは分解される（８Ｅ）。続いて、反応部８５内の容器をフローさせ、分解された核酸を除去し（８Ｇ）、蛍光強度を検出する（８Ｈ）。
【００７９】
本態様により使用されるヌクレオチドプロテクションアッセイの詳細な条件は、実施者によって、適宜決定されればよい。
【００８０】
ここに示した態様では、ターゲット核酸の伸長および標識化から、ヌクレアーゼプロテクションアッセイまでを連続して行う例を示したが、これに限るものではなく、上述したターゲット核酸の伸長および標識化により得られた更なる伸長され標識されたターゲット核酸を、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための１本鎖標識化ターゲット核酸として予め作成し、所望に応じてヌクレアーゼプロテクションアッセイに使用してもよい。
【００８１】
キャピラリー形状の反応容器を用いる場合の利点の１は、各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定までの処理を自動化できる可能性が大きいことである。また、キャピラリー形状の反応容器の場合、そこに含まれる溶液を容易に置換することが可能であることも更なる利点である。
【００８２】
上述したような本発明の態様によって得られた標識化ターゲット核酸を用いれば、ヌクレアーゼプロテクションアッセイは次のような利点を得ることが可能である。即ち、ターゲット核酸を予め蛍光ラベルしておけるのでハイブリダイゼーション前のターゲット核酸の固相量を予め知ることが可能である。即ち、ターゲット核酸の固相の量や点着スポットの状態を反応前に知ることが可能である。従って、ターゲット核酸の固相の精度管理が可能である。また、試料としてｍＲＮＡを用いる場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイブリダイゼーション反応させることが可能であるので、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作業により生じる効率のロスを避ることが出来る。
【００８３】
【発明の効果】
本発明の態様に従うと、効率のよい遺伝子発現頻度解析方法が提供される。また、複数のプレート間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法が提供される。
【００８４】
本発明の態様に従うと、反応容器内で、検出するべき標的配列を含むプローブ核酸とハイブリダイゼーションしたターゲット核酸についてのみ選択的に標識化することが可能である。従って、効率のよい遺伝子発現頻度解析が可能であると共に、ターゲット核酸の標識化を効率的に行うことも可能である。
【００８５】
本発明の態様に従うと、遺伝子の発現頻度の解析を、煩雑な操作を必要とせずに行うことが可能である。
【００８６】
本発明の態様に従うと、標識化から発現頻度解析までの全ての処理を１つの容器内で一括して行うことが可能である。
【００８７】
本発明に従う遺伝子の発現頻度の解析は、従来の解析方法のような競合反応ではないので、他検体との反応容器間(例えば、キャピラリー間や、プレート間など)の比較が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１態様に従って使用される反応容器の例を示す図。
【図２】本発明の１態様に従う方法の例を模式的に示す図。
【図３】本発明の１態様に従う方法の例を模式的に示す図。
【図４】本発明の１態様に従う方法の例を模式的に示す図。
【図５】本発明の１態様に従い使用されるターゲット核酸およびプローブ核酸の例を模式的に示す図。
【図６】Ｓ１ヌクレアーゼによる核酸分解の例を模式的に示す図。
【図７】ヌクレアーゼプロテクションアッセイの原理を模式的に示す図。
【図８】本発明の１態様に従う方法の１例を模式的に示す図。
【符号の説明】
１．反応容器    ２．反応部    ３．ターゲット核酸    ４．開口部    ５．ポリイミド薄膜    ６．ヒーター    ７．温度センサー    ２１．プローブ核酸  ２２．ターゲット核酸    ２３．標識化基質核酸    ２４．反応部の底面    ２５．反応部    ２６伸長され標識されたターゲット核酸    ３１．プローブ核酸    ３２．ターゲット核酸    ３３．標識化基質核酸    ３４．反応部の底面３５．反応部    ３６．伸長され標識されたターゲット核酸    ４１．プローブ核酸    ４２．ターゲット核酸    ４３．標識化基質核酸    ４４．反応部の底面    ４５．反応部    ４６．伸長され標識されたターゲット核酸    ５１．ターゲット核酸    ５２．反応部の底面    ５３．プローブ核酸    ５４．第１の標識化基質核酸    ５５．第２の標識化基質核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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