(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合し、
a. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号1)、
b. LVVGLCTCQIKTGPAC(配列番号2)、
c. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号3)、
d. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号4)、
e. DLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号5)、
f. LVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号6)、
g. LVVGLCTGQIKTGPACR(配列番号7)、および
h. LVVGLCTPQIKTGPACR(配列番号8)
から選択されるペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
a. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号1)、
b. LVVGLCTCQIKTGPAC(配列番号2)、
c. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号3)、
d. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号4)、
e. DLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号5)、
f. LVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号6)、
g. LVVGLCTGQIKTGPACR(配列番号7)、および
h. LVVGLCTPQIKTGPACR(配列番号8)
から選択されるペプチドに結合することができる抗体に結合する、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
疎水性コア及び正に荷電した伸長部からなる環式三次元構造を有する少なくとも１個の抗原性エピトープを含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
(i) 請求項１記載のいずれかの１またはそれより多くのペプチドを含む支持体；
(ii) 検出可能なマーカーに結合した、抗-ヒト免疫グロブリン抗体またはそのフラグメント；及び
(iii) アッセイを行うために必要な試薬；
を含む、精神分裂病の診断における使用のためのキット。
【請求項６】
(i)のペプチドが、配列番号２のペプチドである、請求項５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に精神病の診断のためのアッセイの分野である。より具体的には、本発明は精神分裂病の診断のためのアッセイを提供する。
【０００２】
先行類似技術
以下のものは本明細書中に引用した先行類似技術公開のリストである。
【０００３】
【表１】
0004364433.tif 000002
【０００４】
上記技術の本明細書における承認は、付加した請求項において定義したとおりの本発明の特許能力にこの技術がなんらかの点で関係することを示すものとして解釈されるべきではない。
【０００５】
上記公開は上記リストからそれらの番号を示すことにより以下において認められる。
【０００６】
発明の背景
精神分裂病は、幻聴、妄想症、妄想、緊張病、奇異行動または感情の引っ込みのような様々な精神症状を包含する症候群である。精神分裂病は全人口の約1%を冒し、社会に対するその経済的及び社会的負担は莫大である。疾病の発症は若年齢で起こり、従って、患者は典型的に生涯にわたる医学及び精神医学管理を必要とする。それ故、精神分裂病は産業世界における最も費用がかかる疾病の一つとみなされる1。
【０００７】
遺伝的素因、冬の間の出産並びに妊娠及び出産中の合併症のような精神分裂病と関連する様々な既知の危険因子がある。ウイルス感染及びそれに続く自己免疫反応もまた可能性がある原因因子として提示されている2-4。また、コントロール被験者、両極性の、鬱病の、人格障害のまたは分裂情動性（schizoeffective）患者と比較した場合に精神分裂病及び痴呆症患者では高レベルの自己抗体が検出されたので、精神分裂病患者における血小板に対する自己抗体の関与も示された5-6。ウェスタンブロット分析により、自己免疫性血小板減少症及び痴呆症を患っている患者から得られた自己抗体により認識されるものと異なる精神分裂病患者から得られた自己抗体により認識される血小板抗原のパターンが明らかになった7。精神分裂病患者から得られた自己抗体が特異的に結合する抗原は、その分子量により特性化されている。
【０００８】
発明の要約
本発明により、精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する自己抗体に結合するいくつかのタンパク質が同定された。これらのタンパク質が結合する抗体は、典型的には、血小板結合自己抗体（PAA）である。精神分裂病患者から得られたそのような自己抗体（以下「精神分裂病由来の抗体-SDA」）は上記の抗原に結合することが示されたが、一方、コントロールの非精神分裂病個体から得られた自己抗体（以下「非精神分裂病由来の抗体-NSDA」）はそうではなかった。
【０００９】
SDAに結合できることが示されたタンパク質を同定し、化学的及び酵素的方法によりさらに特性化した。同定した免疫反応性タンパク質のいくつかは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PD）、エノラーゼ、ケラチン、肝細胞増殖因子、細胞外カルシウム反応受容体及びさらにいくつかのような既知のタンパク質である。ウサギタンパク質エノラーゼを消化することにより、SDAに対する高い結合活性を有する免疫学的に活性のあるペプチドが明らかになった。
【００１０】
エノラーゼタンパク質の免疫学的に活性のあるエピトープである、明らかになったペプチドは以下の配列：
SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(配列番号１)
の28アミノ酸を含んでなった。
【００１１】
明らかになったペプチドに基づいて、さらなるペプチドを合成し、非常に活性のあるもの（すなわち、NSDAに対する非常に低い結合活性に比較した場合にSDAに対して高い結合活性を有したかまたはNSDAに全く結合しないようなもの）を同定した。さらに、合成した活性ペプチドは、精神分裂病患者から得られた血漿サンプルとコントロールの非精神分裂病個体から得られた血漿サンプルを初めて識別できた。
【００１２】
合成した非常に活性のあるペプチドの一つ（配列番号２）のさらなる分析により、このペプチドが2個のシステインを介して環をそして残りの遊離システインを介して二量体を形成することが示された。この形態のペプチドはSDAに結合するその能力において最も有効である。
【００１３】
以下に記述するように、本発明の合成の非常に活性のあるペプチドの抗原性エピトープは三次元の空間エピトープであるようである。
【００１４】
従って、本発明は精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合するペプチドを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合できるペプチドを提供し、ここで、そのペプチドは以下のアミノ酸配列：LVVGLCTCQIKTGPAC（配列番号２）を有するペプチドに特異的に結合できる抗体に結合する。そのようなペプチドのいくつかの限定しない例は以下のもの：
iii.  IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 3)
iv.   ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 4)
v.    DLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 5)
vi.   LVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 6)
vii.  LVVGLCTGQIKTGPACR (配列番号 7)
viii. LVVGLCTPQIKTGPACR (配列番号 8)
である。
【００１６】
また、本発明は精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合できるペプチドも提供し、そのようなペプチドは
i.    SGETEDTFIADLVVGLCTGQ (配列番号 9)
ii.   VVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 lO)
iii.  CTGQIKTGAPCR (配列番号 11)
iv.   LVVGLCTGQIKTGAPC (配列番号 12)
v.    LVVGLCTGQIKTGAP (配列番号 13)
vi.   LVVGLCTGQIKTGPAC (配列番号 14)
よりなる群から選択されるペプチドに結合しない抗体に結合できる。
【００１７】
また、本発明は、
i.    SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 1)
ii.   LVVGLCTCQIKTGPAC (配列番号 2)
iii.  IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 3)
iv.   ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 4)
v.    DLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 5)
vi.   LVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 6)
vii.  LVVGLCTGQIKTGPACR (配列番号 7)
viii. LVVGLCTPQIKTGPACR (配列番号 8)
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合できるペプチドも提供する。
【００１８】
好ましい態様により、本発明は、
i.    SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 1)
ii.   LVVGLCTCQIKTGPAC (配列番号 2)
iii.  IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 3)
iv    ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 4)
v.    DLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 5)
vi.   LVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 6)
vii.  LVVGLCTGQIKTGPACR (配列番号 7)
viii. LVVGLCTPQIKTGPACR (配列番号 8)
よりなる群から選択される精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合できるペプチドを提供する。
【００１９】
特定のアミノ酸を表すために上（及び以下）で使用した文字はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字アミノ酸（a.a.）記号に従う。
【００２０】
理論により拘束されることなしに、本発明により得られた結果に基づいて、NSDAと比較した場合にSDAが実質的により高い程度で結合できるペプチドの抗原性エピトープの構造が三次元のエピトープであることが明らかになった。最小エネルギー計算に基づくコンピュータープログラムを用いることにより、本発明のペプチドの抗原性エピトープは、疎水性コア及び約2個の正の電荷を有する伸長部を含んでなる環式構造であると予測される。正に荷電した伸長部は、多数の可能な空間配置のいずれかに位置することができる。
【００２１】
様々な抗体に対する本発明のペプチドの結合活性をELISAまたはウェスタンブロッティングのようなそれ自体既知の方法のいずれかにより決定することができる。例えば、試験したペプチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、それをPVDS膜上にブロットし、次にそれをSDAと反応させ、NSDAとのそれらの反応に比較することにより抗体に対するその結合活性に関して分析することができる。
【００２２】
検出可能なマーカーに連結したヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメントに対する抗体のような当該技術分野において既知のいずれかの検出系を用いることによりPAAに対する本発明のペプチドの結合の程度を決定することができる。マーカーは放射性基、蛍光基、検出可能な生成物を生じる反応を触媒できる酵素、アビジンにより検出できるビオチン基等であることができる。
【００２３】
本態様の好ましい態様により、本発明のペプチドを例えばPVDF膜のような固体支持体上に結合させ、試験サンプルと反応させ、検出可能なマーカーに結合した抗-ヒトFc抗体を用いてサンプル中のPAAの結合レベルを決定する。
【００２４】
特定の態様により、西洋ワサビペルオキシダーゼ（SIGMA）に結合した抗-ヒトFc及びFast-DABTM(SIGMA)または４−クロロ−ナフトール（SIGMA）を発色試薬として用いることにより試験ペプチドに結合した自己抗体のレベルを決定する。
【００２５】
SDAに対する本発明の試験ペプチドの結合をNSDAに対するその結合より「実質的に高い」とみなすためには、上記の実験方法により得られた結果と一緒に用いる当該技術分野において既知の統計学的方法のいずれか（例えばスチューデントのｔ-検定）により決定した場合にSDAに対する結合のレベルがNSDAに対するその結合より統計学的に有意に高くなければならない。
【００２６】
全ての上記ペプチドの類似体もまた本発明の態様を形成する。当業者により認識されるように、例えば、SDAに対するペプチドの結合能力を実質的に変えずに１個またはそれ以上のアミノ酸の付加、置換または欠失により本発明のペプチドのアミノ酸配列を改変することができる。従って、例えば、本発明のペプチドのアミノ酸配列の１番目の位置にあるロイシンをペプチドの結合活性を変えずにアミノ酸の同じファミリーに属するアミノ酸グリシンまたはバリンで置換することができる。当業者が、例えば、Molecular Biology of the Cell 編集者Alberts B. et al., Garland Publishing, Inc., New York and London, 第２版，1989, 54-55頁に見いだすことができるようなファミリーへのアミノ酸の既知のグループ分けに従ってペプチドのアミノ酸の各々をどのアミノ酸で置換できるかを決定するのは難しくない。
【００２７】
本発明のペプチドの範囲に入る類似体は、すなわち、例えば以下の実施例１において記述したもののような当該技術分野で既知の方法のいずれかにより決定した場合にNSDAに比較してSDAに対してより高いレベルの結合を有するペプチドのような、SDAに対する実質的に同じレベルの結合活性を有するようなものである。
【００２８】
本発明のペプチドをより長いタンパク質の（例えばクロストリパイン（Clostrapain）を用いる）酵素的消化または化学的（CNBr）消化により得ることができる。そのような場合、得られたペプチドをRP-HPLCのような当該技術分野において既知の方法により分離し、次に個々のペプチドを（例えば、Eurosequence b.v.(Nijenborgh 4;9749 Gronigen;The Netherlands)による）シークエンシングに用いることができ、そして上記のようにSDAに対するそれらの結合能力に関して分析することができる。
【００２９】
また、本発明のペプチドをEurosequence b.v.による10μmol規模でAbimed 522でのような当該技術分野において既知の方法により合成することもできる（以下の実施例における詳細な説明を参照）。新たに合成したペプチドの結合活性を上記のアッセイのいずれかを用いて決定する。
【００３０】
本発明のペプチドは精神分裂病を患っている個体から得られたサンプルと非精神分裂病個体から得られたサンプルを識別することができ、それ故、個体の精神分裂病の診断において有用である。従って、本発明はその別の態様として、個体の精神分裂病の診断における使用のためのペプチドを提供し、該ペプチドは精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合できる。
【００３１】
試験する個体のサンプルは、典型的には、血小板を含んでなる血液サンプルのPAA含有画分である。しかしながら、本発明により、サンプルからPAAをまず単離する必要なしに試験個体から採取した血漿サンプルにおいて精神分裂病の存在の可能性を決定することが初めて可能になった。従って、本発明では、試験する個体のサンプルは、当該技術分野において既知の方法のいずれかにより（例えば、多血小板血漿（PRP）を得ること及びそれからPAAを単離することにより）そこから得られた血漿サンプルまたはPAA含有画分のいずれかであってもよい。
【００３２】
本発明のペプチドはコントロールの非精神分裂病個体から得られたサンプルと比較した場合に精神分裂病患者から得られたサンプルにおいて血小板由来の自己抗体に異なるように結合できるので、それらのペプチドを個体の精神分裂病の診断のためのアッセイにおいて用いることができる。従って、本発明はさらなる態様により、以下の工程：
（ａ）血液サンプル、その血小板含有画分または血小板から離した血小板結合抗体(PAA)を含有する画分であるサンプルを個体から得ること；
（ｂ）精神分裂病患者の体液中に高レベルで存在する抗体に結合できるペプチドと該サンプルを接触させること；
（ｃ）該サンプルに対する該ペプチドの結合のレベルを決定し、非精神分裂病個体からのサンプルに対する該ペプチドの結合レベルより高いレベルは、該個体が精神分裂病にかかっている可能性が高いことを示すこと
を含んでなる、個体の精神分裂病の診断のためのアッセイを提供する。
【００３３】
さらなる態様により、上記の工程（ｂ）のペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合できる抗体に結合するペプチドである。別の態様により、上記の工程（ｂ）のペプチドが、
i.    SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 1)
ii.   LVVGLCTCQIKTGPAC (配列番号 2)
iii.  IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 3)
iv.   ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 4)
v.    DLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 5)
vi.   LVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 6)
vii.  LVVGLCTGQIKTGPACR (配列番号 7)
viii. LVVGLCTPQIKTGPACR (配列番号 8)
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００３４】
好ましい態様により、工程（ｂ）のペプチドが
i.    SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 l)
ii.   LVVGLCTCQIKTGPAC (配列番号 2)
iii.  IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 3)
iv.   ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 4)
v.    DLVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 5)
vi.   LVVGLCTGQIKTGAPCR (配列番号 6)
vii.  LVVGLCTGQIKTGPACR (配列番号 7)
よりなる群から選択されるペプチドである。
【００３５】
また、本発明は上記アッセイに有用なキットも提供する。本発明のキットは、上に固定した１個またはそれ以上の本発明のペプチドを含んでなる支持体及び抗-ヒト免疫グロブリン抗体またはそのフラグメントを含んでなる。抗-HIG抗体を検出可能なマーカーに結合することができ、あるいはまた、キットは該一次抗体に対して導かれる第二の型の抗体を含んでなってもよく、その場合、その二次抗体を検出可能なマーカーに結合する。キットはまたアッセイを行うために必要な様々な試薬及び使用説明書も含んでなる。
【００３６】
ここで、本発明を特定の態様の以下の限定しない記述及び付随する図面において具体的に示す。
【００３７】
実施例
材料及び方法
１．血小板及び抗-血小板自己抗体
抗凝血剤としてヘパリンを用いて患者及びコントロール被験者から静脈血(20ml)を抜き取った。室温での遠心分離（100g、20分間）により多血小板血漿(PRP)を得た。抗凝血剤として10ml mM EDTAを補足したリン酸緩衝食塩水（PBS）でそれらを3回洗浄することにより血漿を含まない血小板を得た（4000g;15分;4℃）。抗-血小板抗体の単離のために、血小板を0.1Mグリシン/10mM EDTA、pH 2.8と室温で10分間インキュベートし、次に遠心分離した（4000g;15分;4℃）。抗-血小板抗体を含有する上清をNa2PO4飽和溶液で中和し、使用するまで-20で保存した。
２．分取等電点電気泳動
血液型Ｏの血小板濃縮物を地元の血液銀行から購入し、上清が血漿を含まなくなるまでPBS/10mM EDTAで3〜5回洗浄した（4000g;15分;4℃）。それらの血小板（約20濃縮物）をまず水中0.5% Triton X-100/0.5% NP40 20mlを用いて穏やかな振盪下で室温で１５分間可溶化した。懸濁液を遠心分離し（10000g、15分、4℃）、上清を除き、ペレットを水中0.1% Triton X-100でもう2回抽出した。3つの上清を合わせ、AmpholyteTM 3/10（BioRad）を1%の最終濃度まで加えた。この溶液をROTOFOR TM室（容量60ml）中に添加し、次に、製造業者（BioRad）の説明マニュアルに従って分取等電点電気泳動を行った。典型的には、電気泳動を4.5時間（10℃；10ワット定電力）後に終了した。20画分を取り、画分のpHを決定した（pH勾配1.5-12）。それらの画分をさらに使用するまで-20℃で保存した。
３．免疫反応性画分の同定
ポリアクリルアミド（10%）ゲル電気泳動し、タンパク質をPVDF膜上にブロットし、そして膜を50mlのインキュベーションバッファー中1mlの自己抗体で調べることにより画分を免疫反応性に関して分析した。結合したヒト抗-血小板抗体を検出するためにSIGMAからの西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗-ヒトFc（ヤギ）（1:500希釈）及びFast-DAB TM（ＳＩＧＭＡ）または４−クロロ−ナフトール（SIGMA）を発色試薬として用いた。免疫反応性が6.0〜10.0の範囲のpHを有する画分で見られた。
４．分取ポリアクリルアミド（8%）ゲル電気泳動
免疫反応性画分（pH6-10）を合わせ、BioRadからのPrepCellにおいて製造業者の説明マニュアルに従って分取SDSポリアクリルアミドゲル（8%及び8cmの高さ）により還元条件下で分子量により分離した。1.5mlの画分（n=400）を集め：10番目毎の画分をSDSゲル電気泳動、続いて銀染色により分析して、400画分の分子量分布を決定した。
５．免疫反応性画分の同定
BioRadからのDotBlot装置（９６ウェル）を用いて５番目毎の画分（0.1ml）をPVDF膜上にドットブロットした。次に、免疫反応性画分を上記のように検出した（1.3）。
６．免疫反応性タンパク質の同定
先に記述したように、様々な免疫反応性タンパク質を同定した。タンパク質の量に対して高い比率の反応性を有するタンパク質に対してシークエンシングを優先した。サンプルの調製を典型的に以下のように行った：陽性画分のまわりの画分（+/-10）を1.5で上に記述したように再分析した。陽性画分を合わせ、凍結乾燥し、分析（0.75mm）SDSポリアクリルアミド(10%)ゲルで再び分け、クーマシーブルーで染色した。バンドを切り出し、Eurosequence b.v.に送った（酵素消化、ペプチドのRP-HPLC分離及びそれに続くアミノ酸シークエンシング）。
７．免疫反応性エピトープの同定
同定したタンパク質のうち、２つは市販されていることが分かった：
ａ）グリセルアルデヒド−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）
ｂ）エノラーゼ。
【００３８】
約10mgのタンパク質を酵素的（クロストリパイン）または化学的（CNBr）のいずれかで消化し、得られたペプチドをRP-HPLCにより分離した。1.5で記述したような免疫反応性の分析のために全ての画分のアリコート（20%）は、Eurosequence b.v.により主たる発明者に送られた。エノラーゼの酵素消化のみが活性のあるフラグメントをもたらし、それは続いてEurosequence b.v.によりシークエンスされた。
８．ペプチド合成
様々なペプチドがEurosequence b.v.により10マイクロモルの規模でAbimed 522で合成された。ペプチドを慣例的に1mlの水/DMF/DMSO(1:1:1;v/v/v)に溶解した。ペプチドをPVDF膜上に線状ブロットし、上記のように免疫反応性に関して試験した。
９．エピトープ走査
本発明のペプチドの水溶液モデルをMacIntoshコンピューターシステムで計算した。エノラーゼのｘ線三次元構造を公開ペプチドデータベースから作製し、水溶液モデルにより計算されたペプチドのエピトープと一致するエピトープを見いだすためにエノラーゼの表面を走査した。
実施例１：免疫反応性タンパク質の同定
上の1.3に記述したアッセイにより測定した場合に高いレベルで精神分裂病患者において高レベルで存在する自己抗体に結合できるようなものとして以下のタンパク質を同定した：
タンパク質：
グリセルアルデヒド−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
エノラーゼ
ケラチン
肝細胞増殖因子
細胞外カルシウム反応受容体。
【００３９】
上に同定したタンパク質を精神分裂病患者から得られた血漿サンプル及びコントロールの非精神分裂病患者から得られた血漿サンプルに対するそれらの結合能力に関して試験した。それらの結果は、精神分裂病患者から得られた血漿サンプルと非精神分裂病個体から得られたものを識別するために上記のタンパク質を使用できないことを示し、すなわち、それらの結合結果は判定に役立たなかった。
【００４０】
次に、上の２つの酵素を（精神分裂病患者から得られたサンプルから調製した）SDA及び（コントロールの非精神分裂病個体から調製した）NSDAと反応させることによりそれらの結合活性を試験した。以下の表１に示されるように、この場合、酵素の各々と陽性に反応したサンプルの数により表されるSDAに対するタンパク質の結合はNSDAに対するそれらの結合より実質的に高かった。
【００４１】
【表２】
0004364433.tif 000003
【００４２】
上記の結果は、本発明により得られたそれらのタンパク質が試験個体の精神分裂病の診断において有用な可能性があるが、個体から得て試験するサンプルが調製した血小板由来の自己抗体を含んでなることを必要とすることを示した。それらの酵素は血漿サンプルにおいて直接精神分裂病を検出するためには適していない。
実施例２：SDAに特異的に結合できる消化したタンパク質におけるエピトープの同定
エピトープを同定するためにヒトG-3-P-デヒドロゲナーゼ及びウサギエノラーゼの化学的（CNBr）及び酵素的消化（クロストリパイン）を用いた。エノラーゼの酵素消化のみが、免疫学的に活性のある、すなわち、NSDAに対する結合能力より高い程度でSDAに結合できる1個のペプチド（アミノ酸372-399；以下の表2において配列番号１を有するペプチド）を明らかにした。
【００４３】
消化したタンパク質において同定されたエピトープの配列に基づいて、多数のペプチドを上の1.8において記述した方法により合成した。次に、合成したペプチドを上記のようにNSDAに比較した場合のSDAに対するそれらの結合活性に関して評価した。
【００４４】
以下の表２に示されるように、合成したペプチドのいくつかは、NSDAに対するそれらの結合と比較した場合にSDAに対する実質的により高い結合活性を示し（表中、有りとして示す）、一方、残りのものは精神分裂病及び非精神分裂病個体からのサンプルに対するそれらの結合においていかなる有意な違いも示さなかった（表中、無しとして示す）。
【００４５】
【表３】
0004364433.tif 000004
【００４６】
合成したペプチドのうち、ペプチド配列番号２は精神分裂病患者において高レベルで存在する抗体に最も結合することができた。
実施例３：ペプチド配列番号２の特性化
（3個のシステインを含んでなる）ペプチド配列番号２の合成直後のレーザー脱離質量分光分析法により、システインを介した環形成のない単量体の存在が示される。しかしながら、ペプチド（約4mg）を1mlの水/DMF/DMSO(1:1:1;v:v:v)に溶解し、溶液を室温で一晩放置した後、ペプチドは2個のシステインを介して環をそして残りの遊離システインを介して二量体を形成する。いかなるより高分子の多量体も検出できなかった。それら２つの形態のペプチドのSDAに対する結合活性を試験した場合、二量体形態のペプチドが非二量体形態よりSDAに結合することにおいてさらに活性があることが明らかになった。
【００４７】
還元による、例えばメルカプトエタノールまたは水素化ホウ素ナトリウムによるペプチドの化学分析は免疫学的活性を完全に消失させ、一方、酸化、例えば空気または酸素は免疫学的活性を元に戻した。
実施例４：精神分裂病及び非精神分裂病個体からのサンプルに対するペプチド配列番号２の結合活性
単離したPAAに対するペプチド14（配列番号２）の結合活性を上記の方法を用いて試験した。図1Aに示されるように、上記のペプチドは異なる精神分裂病患者から得られた8個のPAAのうち7個に陽性に結合した。図1Bは、上記のペプチドが8人の異なる非精神分裂病個体から得られたPAAに結合しなかったことを示す。ペプチド配列番号９を陰性コントロールとして用いた。
【００４８】
次に、精神分裂病患者から得られた血漿サンプルにおいてSDAに結合するペプチド14（配列番号２）の能力を試験した。図2Aに示されるように、このペプチドは異なる精神分裂病患者からの5個のSDAのうち4個に陽性に結合した。図2Bは、上記のペプチドが15人の異なる非精神分裂病個体のうち14人からのNSDAに結合しなかったことを示す。ペプチド14（配列番号２）を陰性コントロールとして用いた。
実施例５：三次元構造：
本発明のペプチドの抗原性エピトープの三次元構造を最小エネルギー計算に基づくコンピュータープログラムを用いて予測した。
【００４９】
図３に示されるように、抗原性エピトープの予測された構造は、疎水性コア及び約2個の正の電荷を含んでなる伸長部を含んでなる環式構造である。正に荷電した伸長部は、多数の可能な空間配置のいずれかに位置することができる。
実施例６：ペプチドの計算したエピトープと一致するエピトープを見いだすためのエノラーゼの表面の走査
本発明のペプチドの水溶液モデル三次元構造を計算した。次に、公開ペプチドデータベースから作製したエノラーゼのｘ線三次元構造を走査し、本発明のペプチドの計算したエピトープの1個またはそれ以上と一致するエピトープをエノラーゼの表面上に見いだすことができるかどうかを調べるために本発明のペプチドのアミノ酸の位置をエノラーゼ表面のアミノ酸の位置と比較した。
【００５０】
エノラーゼの表面の走査のコンピューターシミュレーションである図４に示されるように、本発明のペプチドからシミュレートしたエピトープと一致する正に荷電したアミノ酸（アルギニン及びヒスチジン）により囲まれた疎水性アミノ酸（ロイシン、アラニン及びプロリン）のクラスターを含んでなるエピトープがエノラーゼの表面上に見いだされた。従って、本発明のペプチドの抗原性エピトープの予測された構造をエノラーゼの細胞表面上に実際に見いだすことができた。
【００５１】
【表４】
0004364433.tif 000005
【００５２】
【表５】
0004364433.tif 000006
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  精神分裂病患者（図1A）及び非精神分裂病個体（図1B）から得られたサンプルから調製したPAAに対する配列番号２を有するペプチド14の結合活性を示す図である。配列番号9を有するペプチドを陰性コントロールとして用いた。
【図２】  精神分裂病患者（図2A）及び非精神分裂病個体（図2B）から得られた血漿サンプルに対するペプチド14（配列番号２）の結合活性を示す図である。配列番号9を有するペプチドを陰性コントロールとして用いた。
【図３】  最小エネルギー計算に基づくコンピュータープログラムにより決定した場合の本発明のペプチドの抗原性エピトープの図式的に予測された三次元構造を示す図である。
【図４】  公開ペプチドデータベースから作製し、本発明のペプチドの水溶液モデルと
比較したエノラーゼのｘ線の三次元構造である。
エピトープ中に存在すると分かったアミノ酸を以下のように示す：
L＝ロイシン
A＝アラニン
P＝プロリン
R＝アルギニン
K＝ヒスチジン
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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