(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミクロソームトリグリセリド転移蛋白質の高分子サブユニットをコードする、配列番号２で示される核酸配列からなることを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載の核酸配列に相補的であるＤＮＡ配列；または
（ｂ）請求項１に記載の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、ハイブリダイゼーションが、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、６５℃での最終洗浄を含むものであり、ヒトミクロソームトリグリセリド転移蛋白質のミクロソームトリグリセリド転移活性を有する蛋白質の高分子サブユニットをコードするもの
を有することを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子または請求項２に記載のＤＮＡ分子を含み、該核酸分子またはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列が適当な宿主細胞中で直接発現させるのに適した制御配列の制御下にあることを特徴とする発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする原核生物または真核生物の宿主細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主細胞をポリペプチドを発現しうる条件下に培養することを特徴とするポリペプチド分子の製造法。
【請求項６】
以下のいずれかの公知技術を使用することを含む、請求項１に記載の核酸分子または請求項２に記載のＤＮＡ分子の製造法；
（ａ）各ＤＮＡ配列についてゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ついで目的核酸分子またはｃＤＮＡ分子を単離する；
（ｂ）ＤＮＡ配列を化学的に合成する；または
（ｃ）ポリメラーゼ重合反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ配列を合成する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ミクロソームトリグリセリド転移蛋白質、該蛋白質のための遺伝子、該遺伝子を含有する発現ベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、該蛋白質の製造法、該蛋白質の阻害物質の検出法および該蛋白質および／またはその阻害物質の使用法にする。
【０００２】
【従来の技術】
ミクロソームトリグリセリド転移蛋白質（ＭＴＰ）は小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）間において、トリグリセリド（ＴＧ）、コレステリルエステル（ＣＥ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）の輸送を触媒する。ウェテロー（Wetterau）およびチルバースミット(Zilversmit)の「Chem.Phys.Lipids」,３８，２０５〜２２頁（１９８５年）参照。転移度を一定時間に転移されたドナー脂質のパーセントで表現するとき、リン脂質輸送に関してＭＴＰは中性脂質（ＴＧおよびＣＥ）輸送に対し、はっきりとした志向性を示す。ウシ肝臓由来の蛋白質が単離、定性された。ウェテローおよびチルバースミットの「Chem.Phys.Lipids」,３８，２０５〜２２頁（１９８５年）参照。精製された蛋白質のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析において、精製ＭＴＰを自然な条件下で電気泳動させるときシングルバンドが存在し、一方、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下に電気泳動させるときみかけの分子量５８０００と８８０００の２重バンドが見られることから、転移蛋白質はみかけの分子量５８０００と８８０００の２つのサブユニットの複合体であることが示唆される。本明細書において今後これらの２つのポリペプチドをそれぞれ５８ｋＤａおよび８８ｋＤａ、またはそれぞれＭＴＰの５８ｋＤａおよび８８ｋＤａ成分、もしくはそれぞれＭＴＰの低分子サブユニットおよび高分子サブユニットと称する。
【０００３】
ウシ肝臓ＭＴＰの５８０００分子量成分の定性により、それが先に定性された多機能蛋白質である蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）であることが示される。ウェテローらの「J.Biol.Chem.」,２６５，９８００〜７頁（１９８５年）参照。（１）ウシＭＴＰの５８０００ｋＤａ成分のアミノ末端２５アミノ酸がウシＰＤＩのものと同一であり、（２）５８ｋＤａ−８８ｋＤａ蛋白質複合体の解離に続いて、ウシＭＴＰがジスルフィドイソメラーゼ活性を発現することが、転移蛋白質にＰＤＩが存在することの証拠とされている。さらに、ウシＰＤＩに対する抗体（単独ではＴＧ転移活性はない）が、精製ウシＭＴＰを含有する溶液からウシＴＧ転移活性を免疫沈降することができた。
【０００４】
ＰＤＩは通常小胞体のルーメン内の新しく合成されたジスルフィド結合蛋白質の重複や集合に貢献する。ブレイド(Bulleid)＆フリードマン(Freedman)の「Nature」,３３５,６４９〜５１頁（１９８８年）参照。ＰＤＩはシスチン残基のジスルフィド結合への正しい対合を触媒し、したがってジスルフィド結合蛋白質の正しい重複を触媒する。また、ＰＤＩはヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのベータサブユニットと同一であると報告されている。コイブ(Koivu)らの「J. Biol. Chem.」,２６２,６４４７〜９頁（１９８７年）参照。ウシ転移蛋白質におけるＰＤＩの役割は明らかではない。いずれかが低転移活性の原因である低濃度の変性剤（塩酸グアニジン）、カオトロピック剤（過塩酸ナトリウム）または非変性剤（オクチルグルコシド）によってウシＭＴＰの８８ｋＤａ成分からＰＤＩを解離するとき、転移蛋白質の本質的な成分であると思われる。ウェテローらの「Biochemistry」,３０,９７２８〜３５頁（１９９１年）参照。単離ウェテローＰＤＩは脂質転移活性を示さず、８８ｋＤａポリペプチドが転移蛋白質であるかまたは蛋白質複合体に転移活性を授与することを示唆している。
【０００５】
ラットにおけるＭＴＰ活性の組織および準細胞分配が研究されている。ウェテローおよびチルバースミットの「Biochem. Biophys. Acta」,８７５,６１０〜７頁（１９８６年）参照。肝臓および腸において脂質転移活性が発見された。血漿、脳、心臓または腎臓には転移活性は僅かにしか認められなかった。肝臓内でＭＴＰはミクロソーム画分のルーメンに位置する溶解性蛋白質であった。平滑および粗面ミクロソームにおいておよそ同濃度のＭＴＰが認められた。
【０００６】
無ベータリポ蛋白血症（abetalipoproteinemia）とはアポリポ蛋白質Ｂ（アポＢ）を含有する血漿リポ蛋白質の事実上の欠乏を特徴とする常染色体性劣性疾患である。ケイン（kane）およびヘイブル(Havel)の「The Metabolic Basis of Inherited Disease」,６版,１１３９〜６４頁（１９８９年）参照。血漿ＴＧレベルは２〜３mg/dL程度であり、脂肪摂取後も上昇しない。血漿コレステロールレベルはしばしば２０〜４５mg/dLである。これらの異常は肝臓での超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）および腸でのキロミクロンの集合および／または分泌の遺伝子欠損の結果である。これらの欠損に対する分子レベルの基礎は以前には決定されていなかった。検査した患者では、トリグリセリド、リン脂質およびコレステロールの合成に関しては正常に見える。解剖では、患者にアテローム性動脈硬化は認められない。シェーファー(Schaefer)らの「Clin. Chem.」,３４,Ｂ９〜１２頁（１９８８年）参照。幾つかの家系では、アポＢ遺伝子と無ベータリポ蛋白血症のつながりは排除されている。タルムド(Talmud)らの「J. Clin. Invest.」,８２,１８０３〜６頁（１９８８年）参およびフアン(Huang)らの「Am. J. Hum. Genet.」,４６,１１４１〜８頁（１９９０年）参照。
【０００７】
無ベータリポ蛋白血症の患者は多くの病気に苦しんでいる。ケインおよびヘイブル（前記）参照。患者は腸細胞と肝細胞において、脂肪の吸収不良とＴＧ蓄積を起こしている。高ＴＧ血漿リポ蛋白質の欠乏のため、ビタミンＥなどの脂溶性ビタミンの輸送において欠損が起こる。この結果として、赤血球の有棘赤血球増加症、楔状束および薄束の退化に伴う旧小脳性運動失調、末梢神経障害、変性色素網膜症およびセロイドミオパシーが起こる。無ベータリポ蛋白血症患者の治療として、脂肪摂取の食事制限、ビタミンＡ，ＥおよびＫの食事供給が挙げられる。
【０００８】
現在まで、ＭＴＰの生理的役割は実証されていない。インビトロにおいて、ＭＴＰはリン脂質膜間の脂質分子の輸送を触媒する。おそらくＭＴＰはインビボにおいても同じ役割を演じており、従って脂質代謝においてある種の役割を演じているものと思われる。ＭＴＰの準細胞（ミクロソーム画分のルーメン）および組織分配（肝臓および腸）が血漿リポ蛋白質構成部位であることから、ＭＴＰが血漿リポ蛋白質の構成において役割を演ずるという推測が導かれる。ウェテローおよびチルバースミットの「Biochem. Biophys. Acta」,８７５,６１０〜７頁（１９８６年）参照。膜間のＴＧ輸送に対するＭＴＰの触媒能力はこの仮説と一致し、ＭＴＰが小胞体（ＥＲ）膜の合成部位からＥＲのルーメン内の新生リポ蛋白質粒子へのＴＧ輸送を触媒することを示唆している。
【０００９】
オルフソン（Olfsson）らはＨｅｐＧ２細胞のリポ蛋白質構成を研究した。ボストロム(Bostrom)らの「J. Biol. Chem.」,２６３,４４３４〜４２頁（１９８８年）参照。彼らの出した結果は小さな前駆リポ蛋白質が時間とともに大きなリポ蛋白質になることを示唆している。これは構成された新生リポ蛋白質へ脂質分子の付加または転移が行われることを意味する。ＭＴＰはこの工程で役割を演ずる。この仮説を支持して、ハウエル（Howell）およびパレード(Palade)の「J. Biol. Chem.」,９２,８３３〜４５頁（１９８２年）はラットの肝臓の肝ゴルジ体からの新生リポ蛋白質を単離した。種々の脂質および蛋白質組成物に存在する粒子のサイズスペクトルがあった。さらにアポＢを含む高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）密度の粒子が発見された。ヒギンズ（Higgins）およびハットソン(Hutson)の「J. Lipid Res.」,２５,１２９５〜１３０５頁（１９８４年）には、ゴルジ体から単離されたリポ蛋白質が小胞体から単離されたものよりも一貫して大きいことが報告され、リポ蛋白質の構成が進行性のイベントであることを示唆している。しかし、ＭＴＰが脂質代謝または血漿リポ蛋白質の構成において役割を演ずることを証明している先行文献には直接的な証拠がない。
【００１０】
【発明の構成と効果】
本発明はＭＴＰの高分子サブユニットの全部または１部をコードする核酸配列および／またはそれらのイントロン、５’または３’フランキング領域を特徴とする単離核酸分子に関する。核酸分子がＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分子であり、核酸配列がＤＮＡ配列であることが好ましい。配列番号１，２，５，７，８，１と５の組み合わせ、２と７の組み合わせ、２と８の組み合わせの最初の１０８塩基、または２と７と８の組み合わせの最初の１０８塩基で示されるヌクレオチド配列の全部または１部を有する核酸がより好ましい。
【００１１】
また本発明は上記配列および／またはそれらのイントロン、５’または３’フランキング領域に相補的な配列を有する核酸分子に関する。さらに本発明はＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターに関する。さらに本発明はＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターを含有する原核生物または真核生物の宿主細胞に関する。さらに本発明はＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部を特徴とするポリペプチド分子に関する。ヒトＭＴＰ高分子サブユニットまたは組換え形成されたウシＭＴＰ高分子サブユニットであるポリペプチドが好ましい。本発明はまたＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする核酸配列または関連核酸配列の検出法に関する。さらに本発明はＭＴＰの阻害物質の検出法に関する。
さらに本発明はＭＴＰの量または活性を減少する薬物の有効量を投与することを特徴とする哺乳動物の動脈硬化の治療法、血清コレステロール、ＴＧ、ＰＣまたはＣＥなどの血清脂質レベルの低減法に関する。このような薬物は膵臓炎、高グリシン血症、肥満症などの血清脂質レベルに依存する疾患の治療にも有用である。
【００１２】
語句の定義
次に述べる定義は、ほかに特別の例がないかぎり、本明細書を通じて用いられる語句に適用される。
「ＭＴＰ」とはポリペプチドまたは蛋白質複合体を意味し、それらは（１）ウシやヒトなどの有機体から得られたものならば、均質化した組織のミクロソーム分画から単離することができ、（２）合成リン脂質粒子、膜またはリポ蛋白質からのトリグリセリド、コレステロールエステルまたはリン脂質の転移を刺激するが、類似の触媒特性を有するコレステロールエステル転移［ドレイナ（Drayna）らの「Nature」，３２７，６３２〜６３４頁（１９８７年）参照］とは区別される。しかし、本発明のＭＴＰ分子は触媒的に活性であることは必ずしも必要ではない。例えば、触媒的に不活性なＭＴＰまたはそれらのフラグメントは蛋白質に対する抗体を作るのに有用である。
【００１３】
「修飾」とはヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関していえば、天然に見られる野生型配列とは異なるヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。
「関連」とはヌクレオチド配列に関していえば、ＭＴＰ高分子サブユニットのヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブに対してハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を意味する。
【００１４】
「制御領域」とはＭＴＰまたはそのいずれかのサブユニットの発現を制御するヌクレオチド配列を意味し、プロモーター、サイレンサー、エンハンサーエレメント、スプライス部位、転写開始エレメント、転写終結エレメント、ポリアデニル化信号、翻訳制御エレメント、翻訳開始部位、翻訳終結部位およびメッセージ安定エレメントなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。このような制御領域はコード領域に対する配列の５’または３’配列またはコード領域を分断するイントロンに位置している。
本明細書で用いる、動脈硬化を「安定化する」とは新たな動脈硬化性障害の進行を遅らせ、および／またはその形成を抑制することを意味する。
本明細書で用いる、動脈硬化の「退化を引き起こす」とは動脈硬化性障害を軽減および／または取り除くことを意味する。
【００１５】
用法および用途
本発明の核酸は本発明に従って様々な方法で用いることができる。例えば、ハイブリダイゼーションにより、ＭＴＰ高分子サブユニットに関連する蛋白質をコードする他のＤＮＡ配列を選択するように、他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリをスクリーンするためのＤＮＡプローブとして用いることができる。さらに、ヒトまたはウシＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする本発明の核酸は、ハイブリダイゼーションにより、他の有機体のＭＴＰ分子をコードするＤＮＡ配列を選択するように、他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリをスクリーンするためのＤＮＡプローブとして用いることができる。該核酸はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの増殖のためのプライマーの生産にも用いることができる。本発明のＤＮＡ配列はｃＤＮＡまたはゲノムの隣接配列（例えば、遺伝子をコード化する配列、そのフランキング配列およびその制御エレメントなど）の同定にも用いることができる。
本発明のポリペプチドはＭＴＰの特性（例えば、構造、作用メカニズム、脂質代謝またはリポ蛋白質粒子構成における役割など）の研究に有用である。
【００１６】
該核酸、ポリペプチド、発現ベクターおよび宿主細胞を用いる他の様々な方法を以下に詳述する。
本発明方法に従って、ＭＴＰの活性または量を減少する薬物を、治療を必要とするサル、イヌ、ネコ、ラット、ヒトなどの種々の哺乳動物に投与する。これらの薬物は経口または非経口にて全身投与することができる。
ＭＴＰの活性または量を減少する該薬物は、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤または注射用剤などの通常の全身投与剤形に製剤することができる。この投与剤形には必要な医薬的に許容しうる担体、賦形剤、潤滑剤、緩衝剤、抗バクテリア剤、増量剤（マンニトールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど）などをも含有することができる。経口投与剤形が好ましいが非経口投与剤形でも全く問題はない。
投与量は年令、体重、患者の状態、投与経路、投与剤形、養生法および所望の投与結果を考慮して注意深く調節しなければならない。一般に、上記の投与剤形は１日１回で、または２〜４回にわけて投与することができる。
【００１７】
特定の具体例の詳細な説明
［核酸］
本発明はＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする核酸配列を特徴とする単離核酸分子に関する。核酸分子がＤＮＡ分子であり、核酸配列がＤＮＡ配列であることが好ましい。配列番号１，２，５，７，８，１と５の組み合わせ、２と７の組み合わせ、２と８の組み合わせの最初の１０８塩基、または２と７と８の組み合わせの最初の１０８塩基で示されるヌクレオチド配列の全部または１部を有する核酸配列、またはこれらのＤＮＡ配列のひとつに相補的な核酸配列がより好ましい。ＭＴＰ高分子サブユニットの１部をコードするヌクレオチド配列（ＤＮＡ配列など）の場合、少なくともヌクレオチド配列が１５配列のヌクレオチドの長さを有することが好ましく、少なくとも２０〜３０配列の長さがより好ましい。
【００１８】
次にウシｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号１）、ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２）、ヒトとウシのｃＤＮＡ配列の比較、ウシアミノ酸配列（配列番号３）、ヒトアミノ酸配列（配列番号４）およびヒトとウシのアミノ酸配列の比較を表で示す。配列の比較において、枠囲み領域は２つの配列が完全に同一であることを表す。
【００１９】
【表１】
0004298801.tif 000002
【００２０】
【表２】
0004298801.tif 000003
【００２１】
【表３】
0004298801.tif 000004
【００２２】
【表４】
0004298801.tif 000005
【００２３】
【表５】
0004298801.tif 000006
【００２４】
【表６】
0004298801.tif 000007
【００２５】
【表７】
0004298801.tif 000008
【００２６】
【表８】
0004298801.tif 000009
【００２７】
【表９】
0004298801.tif 000010
【００２８】
【表１０】
0004298801.tif 000011
【００２９】
【表１１】
0004298801.tif 000012
【００３０】
【表１２】
0004298801.tif 000013
【００３１】
【表１３】
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【００３２】
【表１４】
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【００３３】
【表１５】
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【００３４】
【表１６】
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【００３５】
【表１７】
0004298801.tif 000018
【００３６】
【表１８】
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【００３７】
【表１９】
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【００３８】
【表２０】
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【００３９】
【表２１】
0004298801.tif 000022
【００４０】
【表２２】
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【００４１】
【表２３】
0004298801.tif 000024
【００４２】
【表２４】
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【００４３】
【表２５】
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【００４４】
【表２６】
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【００４５】
【表２７】
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【００４６】
【表２８】
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【００４７】
ウシｃＤＮＡはクローン２と２２のＤＮＡ配列の２９００個の塩基からなり、１から２５８０塩基の間に読み取り枠をもち、８６０個のアミノ酸、ＴＧＡ停止コドン、３箇所のプライム非コード領域の２９８個の塩基およびポリＡ領域からなる翻訳産物が予測される。
【００４８】
ヒトｃＤＮＡにおいては、３１８５個の塩基から、４８〜２７２９番目の塩基、ＴＧＡ停止コドン、３箇所のプライム非コード領域の４３５個の塩基およびポリＡ領域からの８９４個のアミノ酸翻訳産物が予測される。
ヒトとウシのｃＤＮＡを比較すると、コード領域（ウシでは１〜２５８３番目の塩基、ヒト塩基では１５０〜２７３２番目の塩基）においてオーバーラップしている配列間に約８８％の同一性がある。コード領域内にこのアラインメントを達成するためのいずれかのギャップを導入することは不必要である。３’非コード領域において相同性はいくらか弱く、適合アラインメントを得るために数個のギャップの導入を含んでいる。
【００４９】
ウシ蛋白質配列（配列番号３）はウシｃＤＮＡクローン２と２２の結合配列８６０個のアミノ酸翻訳産物である。オリゴヌクレオチドプローブのデザインに用いたペプチド断片に対する配列は以下のとおりである。残基３７と５１の間にペプチド１９Ａがあり、残基５３９と５５０の間にペプチド３７Ａがあり、残基５６５と５７２の間にペプチド２Ａがある。
ヒト蛋白質配列（配列番号４）はヒトｃＤＮＡクローン６９３の８９４個のアミノ酸翻訳産物である。
アミノ酸を比較すると、ウシ蛋白質はヒト翻訳産物と約８６％が同一配列である。非同一残基における高置換留保の点を考慮すると２つの蛋白質の間には約９４％の相同性がある。
【００５０】
本発明者らは前述のウシｃＤＮＡ配列の５’末端を伸長し、下記に示す５’から３’への配列を得た。上段はヌクレオチド配列（配列番号５）であり、下段はアミノ酸配列（配列番号６）である。新しく得られた配列（８３個の塩基）に下線を付している。
【表２９】
0004298801.tif 000030
本発明者らはまた前述のヒトｃＤＮＡ配列の５’末端も伸長した。追加の配列（配列番号７）を下記に示す。
ＡＧＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡ
この配列が１５個の塩基からなるヒトＭＴＰｃＤＮＡ配列の５’末端を伸長する。これらの配列は最初のヒトｃＤＮＡクローニング（実施例３参照）で単離されるヒト肝臓ｃＤＮＡクローン７５４から生産したが、クローン６９３の後に特定化された。
【００５１】
本発明者らはまた下記に示すように、ＭＴＰ高分子サブユニットのヒトゲノムＤＮＡ配列（配列番号８）の１部も解明した。垂線はイントロン／エクソン境界を示す。エクソン配列は普通字、イントロン配列は太字である。矢印は配列が不明のイントロン部分を表す（矢印の長さがイントロンの長さではない）。右欄の数字は上記のヒトｃＤＮＡ配列に対応する各エクソンの最初と最後の塩基の番号である。伸長ｃＤＮＡと同様に伸長ゲノム核酸およびそれらの断片も本発明に有用である。
【００５２】
【表３０】
0004298801.tif 000031
【００５３】
【表３１】
0004298801.tif 000032
【００５４】
【表３２】
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【００５５】
【表３３】
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【００５６】
【表３４】
0004298801.tif 000035
【００５７】
【表３５】
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【００５８】
【表３６】
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【００５９】
【表３７】
0004298801.tif 000038
【００６０】
本発明の核酸は現在のところ好ましい配列がヒトおよびウシｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡライブラリから単離されているが、種々様々な供給源から単離することができる。生産されるポリペプチド分子の正確なアミノ酸配列は最初のＤＮＡ配列によって異なるであろう。
本発明核酸は種々の公知の方法を用いて得ることができる。少なくとも３つの別々の原則的な方法を用いてもよい。すなわち、（１）ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；（２）ＤＮＡ配列の化学的合成；および（３）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の合成である。
【００６１】
第一の方法では、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を同定するために、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、ＭＴＰの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を同定するために、ウシまたはヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。種々のｃＤＮＡライブラリ、例えば、ウシ小腸ラムダｇｔ１０ライブラリ（クローンテック・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド、カリフォルニア州パロ・アルト）、ヒト肝臓ラムダＵＮＩ−ＺＡＰTMＸＲライブラリ（ストラタジーン・クローニング・システムズ、カリフォルニア州ラ・ジョラ）またはヒト腸ラムダｇｔ１０ライブラリ（クローンテック）などを用いることができる。
【００６２】
ＭＴＰ高分子サブユニットをコードする標的配列を得るために、種々の技術を用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。この技術は、例えば、ＭＴＰ高分子サブユニットをコードする配列と相補的な配列を有する標識した１本鎖ＤＮＡプローブを用いてもよい。例えば、１本鎖状態に変性されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのクローンコピーの配列を同定するために、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション操作を用いてもよい。適当なプローブには、同一種または関連種、合成オリゴヌクレオチドなどから取得しＭＴＰ高分子サブユニットのｃＤＮＡが含まれる。
免疫ブロッティング技術を用いてＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得るために、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリもまたスクリーニングすることができる。
【００６３】
ハイブリダイゼーション技術に適するひとつの典型的なスクリーニング法では、まずゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリを寒天平板に散布し、次いでクローンをニトロセルロース膜などの濾過膜に移す。ゲノムライブラリは通常ＥＭＢＬ３またはＥＭＢＬ４またはそれらの誘導体（λＤＡＳＨＴＭ）などのベクターに含まれる。ｃＤＮＡライブラリは通常λｇｔ１０、λｇｔ１１またはラムダＺＡＰなどのベクターに含まれる。次いで、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むクローンを同定するために、ＤＮＡプローブを該クローンにハイブリダイズすることができる。別法として、λｇｔ１０、λｇｔ１１またはラムダＺＡＰベクターを含む適当なＥ.coli株に、ベクターのｃＤＮＡ挿入部に対応する蛋白質断片を含む融合蛋白質の合成を誘発することができる。該融合蛋白質をニトロセルロースなどの膜に移す。次いで、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部を同定するために、抗体を融合蛋白質に結合させる。
【００６４】
第２の方法では、ＭＴＰの全部または１部をコードする本発明の核酸を化学的に合成することができる。１５〜５０ヌクレオチドなどの比較的短いオリゴヌクレオチドは直接合成することができる。より長いオリゴヌクレオチドに対しては、ＭＴＰ高分子サブユニットをコードするＤＮＡ配列は、５０〜１００塩基の一連のオリゴヌクレオチドとして合成し、次いでこれを順次連結（適当な末端制限部位を介して）し、ヌクレオチドの正確な直線配列を形成することができる。
【００６５】
第３の方法では、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする本発明の核酸をＰＣＲを用いて合成することができる。簡単に言えば、標的ＤＮＡ配列の両端にハイブリダイズする一般に少なくとも１５塩基の長さの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの１組を用いて、標的配列上のＤＮＡの介在領域を酵素的に増幅する。鋳型の加熱変性の繰り返しサイクル、プライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼでアニーリングされたプライマーの３’末端の伸長を行うとＰＣＲプライマーで限定された部分が増幅される。ホワイト（White）,Ｊ．Ｔ．らの「Trends Genet.」,５,１８５〜９頁（１９８９年）参照。
【００６６】
ＭＴＰの全部または１部をコードする本発明の核酸もまた修飾（すなわち、突然変異化）して種々の突然変異を製造することができる。このような突然変異は突然変異化コドンによってコード化されるアミノ酸配列を変化させるかまたは無視されてアミノ酸配列に変化をおこさない。例えば、種々の公知の方法を用いてコード化されたポリペプチドの１個以上のアミノ酸に突然変異が欠失、置換、挿入、転化または付加を引き起こすように、ＭＴＰ高分子サブユニットをコードする核酸を突然変異化してこれらの修飾核酸を製造することができる。テイラー(Taylor),Ｊ.Ｗ.らの「Nucl. Acids Res.」,１３,８７４９〜６４頁（１９８５年）およびクンケル(Kunkel),Ｊ.Ａ.らの「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」,８２,４８２〜９２頁（１９８５年）に記載の部位特異的突然変異法をもちいる。なお、部位特異的突然変異法のキットは市販されている。例えば、部位特異的突然変異を行うキットはアマーシャム・コーポレイション（イリノイ州アーリントン・ハイツ）から購入することができる。なお、セイヤーズ(Sayers),Ｊ.Ｒ.らの「Nucl. Ascids Res.」,１６,７９１〜８００頁（１９８８年）に記載の破断、欠失および先端切断法も用いることができる。突然変異は本発明のポリペプチドを生産したり使用する際に都合がよい。例えば、これらの突然変異は蛋白質の機能を修飾（活性の向上あるいは低下）し、蛋白質産物のレベルを高め、該蛋白質を精製を容易にし、あるいはさらに核酸に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を与える。すべてのこのような修飾核酸およびポリペプチド分子は本発明の請求の範囲に含まれる。
【００６７】
［発現ベクター］
本発明はさらにＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターまたはＭＴＰ高分子または低分子サブユニットの両方または部分を特徴とする蛋白質複合体に関する。配列番号１，２，５，７，８，１と５の組み合わせ、２と７の組み合わせ、２と８の組み合わせの最初の１０８塩基、または２と７と８の組み合わせの最初の１０８塩基で示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の全部または１部を有する発現ベクターが好ましい。ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１個をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結する１個以上の調節ＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターがより好ましい。この文脈で用いたように、語句「作動的に連結する」とは調節ＤＮＡ配列がＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１個をコードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を指示する能力があることを意味する。
【００６８】
本発明に有用な発現ベクターはしばしば「プラスミド」形状であり、これは円形二本鎖ＤＮＡ環を意味し、そのベクター形状において染色体に結合されない。しかし、本発明は同様な機能を提供する他の形状の発現ベクターも含むことを意図しており、そのことは本明細書を通じて今後も同様である。本発明の発現ベクターはＭＴＰ高分子サブユニットをコードするＤＮＡ配列を適当な宿主細胞（ＣＯＳまたはＨｅｐＧ２細胞）の染色体に安定して組み込むのにも用いることができる。
本発明に有用な発現ベクターの典型としては、複製起点、ＤＮＡ配列の５’（すなわち、上流）に位置するプロモーター、続いてＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列、転写終結配列および残りのベクターからなる。発現ベクターには他の公知のＤＮＡ配列、例えば、発現産物の安定性を提供する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を提供する分泌リーダー配列、成長培地中の栄養素または他の誘導物質の有無によって調節される構造遺伝子を発現させる配列、形質転換宿主において表現型選択を提供することができるマーキング配列、制限エンドンヌクレアーゼによる開裂部位を提供する配列、種々のタイプの宿主、例えばこれらに限定されるものではないが、原核生物、酵母、菌類、植物および高度真核生物などに発現させる配列が挙げられる。使用する現実の発現ベクターの特徴は、使用される宿主細胞と一致しなければならない。例えば、哺乳類細胞系においてＤＮＡ配列が発現するとき、発現ベクターはマウスメタロチオネインプロモーターなどの哺乳類細胞のゲノムから単離したプロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなどの哺乳類の細胞で成長するウイルスから単離したプロモーターを含むべきである。本発明で企図されるような発現ベクターは少なくとも複製を指示することができ、好ましくは本発明の核酸の発現を指示することができる。適当な複製起点としては、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３複製起点が挙げられる。適当なプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ｇａｌ１０プロモーターおよびオートグラファ・カリフォルニア（Autographa california）複核多角体ウイルス(ＡｃＭＮＰＶ)多角体プロモーターなどが挙げられる。適当な終結配列としては、例えば、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。選択可能マーカーの例としては、ネオマイシン、アンピシリンおよびハイグロマイシンレジスタンスなどが挙げられる。これらの物質のすべては公知であり、市販されている。
【００６９】
本発明のＤＮＡ配列を挿入し得る市販の適当な発現ベクターとしては、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ／Ｎｅｏ、バキュロウイルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ、原核生物発現ベクターｐｃＤＮＡＩＩおよび酵母発現ベクターｐＹｅｓ２（すべてインビトロゲン・コーポレイション、カリフォルニア州サン・ディエゴから入手可能）などが挙げられる。
公知の標準的な組換えＤＮＡ技術［サンブルック(Sanbrook)らの「Mplecular Cloning:実験室マニュアル」第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９年）に多くの技術が記載されている］を用いて、所望のコーディングおよび制御配列をもつ適当な発現ベクターを組み立てることができる。
【００７０】
［宿主細胞］
本発明はさらにＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターを含む宿主細胞に関する。後記実施例４の宿主細胞が好ましい。配列番号１，２，５，７，８，１と５の組み合わせ、２と７の組み合わせ、２と８の組み合わせの最初の１０８塩基、または２と７と８の組み合わせの最初の１０８塩基で示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の全部または１部を特徴とする発現ベクターを含む宿主が好ましい。後記実施例４の発現ベクターが好ましい。複製および／または発現を指示することができ、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結する１個以上の調節ＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターを含む宿主細胞がより好ましい。適当な原核宿主細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１が挙げられる。適当な真核宿主細胞としては、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞、ＣＯＳ−４細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞およびサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞が挙げられる。
【００７１】
発現ベクターは種々の公知の方法で宿主細胞に導入される。例えば、発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションをリン酸カルシウム沈殿法によって行うことができる。しかし、発現ベクターを宿主細胞へ導入する他の方法、例えば、エレクトロポレーション、リポソーム融合、核注入およびウイルスまたはファージ感染なども用いることができる。
発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、すぐに所望のポリペプチド（この場合、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部からなるポリペプチド分子）が大量に発現する条件下で宿主細胞を培養する。
ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含む宿主細胞は、下記の６つの一般的な方法の１種以上によって同定することができる。すなわち、（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）マーカー遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞におけるＭＴＰ高分子サブユニットをコード化するｍＲＮＡ転写産物の測定による転写レベルの評価；（ｄ）免疫学的な遺伝子産物の検出；（ｅ）酵素アッセイ；（ｆ）ＰＣＲ。
【００７２】
第１の方法では、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列の存在は、該ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。
第２の方法では、組換え発現ベクター宿主系は、あるマーカー遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗原耐性など）の有無に基づいて同定または選択することができる。マーカー遺伝子は、ＭＴＰコ−ディング配列を制御するのに用いたものと同一あるいは異なったプロモーターの制御下において、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列と同じプラスミドに配置することができる。該マーカー遺伝子の発現はＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ発現の発現を示す。
【００７３】
第３の方法では、ＭＴＰ高分子サブユニットをコード化するｍＲＮＡ転写産物は、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価することができる。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは該ＲＮＡ配列に相補的なプローブを用いるノーザンブロッティング法またはヌクレアーゼ保護アッセイにより単離、分析することができる。別法として、宿主細胞の全ＲＮＡを抽出し、このようなプローブにハイブリダイゼーションアッセイをおこなってもよい。
第４の方法では、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部の発現は、免疫学的、例えば抗体をＭＴＰにイムノブロッティングすること（ウエスタンブロッティング法）により評価することができる。
第５の方法では、ＭＴＰ高分子サブユニットの発現は、公知の方法を用いるＭＴＰ酵素活性のアッセイにより測定することができる。例えば、後記のアッセイを採用してもよい。
第６の方法は、発現系に存在する配列（すなわち発現ベクター配列またはＭＴＰ配列）に相同性があるオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ法において用い、宿主細胞における発現系の取込みを示す所定の長さのＤＮＡ断片を製造する。
【００７４】
本発明の発現ベクター、プラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、種々の公知の方法で決定してもよい。例えば、サンガー(Sanger)らの「Proc. Natl. Acad. Sci.USA」,７４,５４６３〜７頁（１９７７年）に記載のジデオキシ鎖終結法または「Proc. Natl. Acad. Sci.USA」,７４,５６０〜４頁（１９７７年）に記載のマキサム−ギルバート法を採用してもよい。
触媒的活性を有するＭＴＰを発現するために、ＭＴＰ高分子サブユニットおよび低分子サブユニットの両方を含む蛋白質複合体を製造することが必要である。ＭＴＰの低分子サブユニットは先に特定化された蛋白質、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である。ＰＤＩｃＤＮＡはヒト［ピハラジャニエミ(Pihlajaniemi)らの「EMBO J.」,６,６４３〜９頁（１９８７年）参照］、ウシ［ヤマグチ(Yamaguchi)らの「Biochem. Biophys. Res. Comm.」,１４６,１４８５〜９２頁（１９８７年）参照］、ラット［エドマン(Edman)らの「Nature」,３１７,２６７〜７０頁（１９８５年）参照］、ニワトリ［カオ(Kao)らの「Connective Tissue Research」,１８,１５７〜７４頁（１９８８年）参照］からクローニングされた。ＭＴＰ高分子サブユニットおよび低分子サブユニットの両方を含む蛋白質の製造に種々の方法を用いることができる。例えば、該サブユニットをコードするｃＤＮＡ配列を同じ発現ベクターまたは異なった発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞にて発現させて該蛋白質を製造してもよい。
【００７５】
もちろん、すべての発現ベクターとＤＮＡ制御配列が本発明ＤＮＡ配列の発現において同程度に機能するわけではないと理解すべきである。すべての宿主細胞が同じ発現系で同程度に機能することはない。しかし当業者ならば、試行錯誤や本発明の範囲から逸脱することなしに、本発明で提供するガイダンスを用いて発現ベクター、ＤＮＡ制御配列および宿主細胞を選択をすることができよう。
【００７６】
［ポリペプチド］
本発明はまたＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部からなるポリペプチド分子に関し、該ポリペプチド分子は配列番号３、４、または３と６の組み合わせで示されるアミノ酸配列の全部または１部を有するものが好ましい。ＭＴＰ高分子サブユニットの１部を特徴とするポリペプチド分子の場合、少なくとも約５〜８配列のアミノ酸の長さのポリペプチド分子が好ましく、少なくとも約１５〜２０配列のアミノ酸の長さのポリペプチド分子がより好ましい。少なくとも１８０配列のアミノ酸の長さのポリペプチドも好ましく、それは該蛋白質内の構造ドメインの大きさに近い。
【００７７】
本明細書中では、すべてのアミノ酸配列はその左から右への配向が通常のアミノ末端からカルボキシ末端への方向である方式で表現される。
本発明のポリペプチドは公知の方法でその構成アミノ酸からポリペプチドを化学合成するなどの合成手段によって得てもよい。例えば、ホートン(Houghton)らの「Proc. Natl. Acad. Sci,」,８２,５１３１〜５頁（１９８５年）に記載の固相法を採用してもよい。好ましいポリペプチドの製法は、ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を発現する原核生物または真核生物の宿主細胞による製造法またはＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡのインビトロ翻訳による方法である。例えば、配列番号１，２，５，７，８，１と５の組み合わせ、２と７の組み合わせ、２と８の組み合わせの最初の１０８塩基、または２と７と８の組み合わせの最初の１０８塩基のＤＮＡ配列またはそれらの部分配列を前記ＰＣＲにて合成し、適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主細胞の形質転換に用いてもよい。次いで、組換え宿主細胞を培養してＭＴＰ高分子サブユニットを製造する。これらの手段によるポリペプチドの製造技術は公知であり、本明細書に記載されている。
【００７８】
次いで、この方法で製造されたポリペプチドを単離し、種々の蛋白質精製技術を用いてある段階まで精製する。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー操作が採用されてもよい。
本発明のポリペプチドは非常に広範囲の方法に用いることができる。例えば、該ポリペプチドをそれに結合し得るポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に公知の手段で用いることができる。一方これらの抗体は、細胞試料などの試料において、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイまたは免疫細胞化学などのイムノアッセイ技術を用いて本発明のポリペプチドの検出に用いることもできる。抗体は種々の源から本発明のポリペプチドの単離または精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにも用いてもよい。
本発明のポリペプチドは決定したＤＮＡおよび演繹されるアミノ酸配列によって定義される。遺伝子コードの縮重を考慮して、配列番号３、４、３と６の組み合わせのものと同一のアミノ酸配列あるいはその部分配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明のポリペプチドの製造に用いてもよい。
【００７９】
これらのＤＮＡおよびアミノ酸配列のアレル変異体が天然に存在することがさらに理解されるべきであり、あるいはそれらは公知の方法で意図的に導入されてもよい。これらの変異体は全配列における１個以上のアミノ酸の変更、例えば欠失、置換、挿入、転化または該配列への１個以上のアミノ酸の付加などが挙げられる。このような変更は本発明のポリペプチドを製造または使用するときに有利である。例えば、アフィニティー精製によるＭＴＰまたはポリペプチドの単離など。アミノ酸置換は、極性、荷電、溶解度、疎水度、親水度および／または包含される残基の両親媒的性質の類似性などに基づいて行なうことができる。例えば、陰荷電アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸；陽荷電アミノ酸として、リシンおよびアルギニン；親水度の値が類似する非荷電極性ヘッド基または非極性ヘッド基をもつアミノ酸として、ロイシン，イソロイシン，バリン，グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびスレオニン、フェニルアラニおよびチロシンなどが挙げられる。他の企図される変異体として、前述のポリペプチドの塩およびエステル、前述のポリペプチドの前駆体、例えば、メチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニンおよびリーダー配列などのＮ末端置換基を有する前駆体が挙げられる。すべてのこのような変異体は本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
［核酸検出法］
また本発明は核酸を核酸配列の少なくとも一部分と特異的に結合する検出可能なマーカーと接触させ、結合したマーカーを検出することを特徴とするＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする核酸配列または関連核酸配列の検出法に関するものである。その結合マーカーの存在により核酸配列の存在を確認する。配列番号１，２，５，７，８，１と５の組み合わせ、２と７の組み合わせ、２と８の組み合わせの最初の１０８塩基、または２と７と８の組み合わせの最初の１０８塩基で示されるヌクレオチド配列の全部または１部を有するＤＮＡ配列またはその相補的配列である核酸配列が好ましい。
【００８１】
該ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ試料は、当業者にとっては公知の種々のＤＮＡ単離法を用いて単離することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ試料はそのＤＮＡを単離する組織を急速冷凍し、該組織を破砕して容易に温浸できる破片を製造し、破砕片をプロテイナーゼＫおよびＳＤＳの溶液に入れ、その溶液をほとんどの細胞蛋白質が分解するまで培養することにより該組織から単離することができる。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール連続抽出し、エタノール沈殿を回収し、乾燥し、緩衝液に再度懸濁させることによりゲノムＤＮＡを除蛋白する。
【００８２】
核酸配列がＲＮＡ配列である検出法が好ましい。ｍＲＮＡ配列であるＲＮＡ配列が好ましい。該ＲＮＡ配列が組織試料の細胞に存在するものである検出法が好ましい。該ＲＮＡ配列を有するＲＮＡ試料は、当業者にとって公知である種々のＲＮＡ単離法を用いて単離することができる。例えば、ＲＮＡ試料は培養細胞を該細胞を含まない培地で洗浄し、次いで４Ｍグアニジン溶液中で細胞溶解することにより該培養細胞から単離することができる。溶解液を２０ゲージの針を通して引くことにより得られる溶液の粘度を低下させる。次いで、塩化セシウム段階勾配でペレット化し、その上澄み液を注意深く除去してペレット中のＲＮＡを混合しているＤＮＡと蛋白質から完全に分離する。
ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする核酸配列またはその関連核酸配列を検出するのに有用な検出可能なマーカーはＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列の少なくとも１部分と相補的なヌクレオチド配列を有する標識ＤＮＡ配列（標識ｃＤＮＡ配列も含む）である。
検出可能なマーカーはＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列の少なくとも１部分と相補的な配列を有する標識ＲＮＡであってもよい。
【００８３】
本発明の検出可能なマーカーは32Ｐおよび35Ｓなどの通常採用される放射性標識で標識することができるが、ビオチンあるいは水銀などの他の標識を用いてもよい。当業者にとって公知の種々の方法で検出可能なマーカーに標識を付すことができる。例えば、ランダムプライマー法を用いてＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列に32Ｐや35Ｓで標識を付すことができる。適当な検出可能なマーカーを得たならば、すぐに当業者にとって公知の種々の方法でその試料を検出可能なマーカーと接触させる。例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションを公知の標準的操作を用いて行うことができる。ゲノムＤＮＡにおいてＭＴＰの全部または１部をコードするＤＮＡ配列を検出する典型的なＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション操作では、まず公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを単離し、次いで１種類以上の制限酵素で消化する。得られるＤＮＡ断片を寒天ゲル上で分離し、そのままで変性させ、膜フィルターに移す。プレハイブリダイゼーションにより非特異的ハイブリダイゼーションを減少させた後、放射性標識核酸プローブを固定化ＤＮＡ断片にハイブリダイズする。次いで該膜を洗浄して結合していないプローブや結合の弱いプローブを除去し、オートラジオグラフィーにてプローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を同定する。
【００８４】
結合した検出可能なマーカーの存在は当業者にとって公知の種々の方法を用いて検出することができる。例えば、検出可能なマーカーが放射性標識を付されているとき、オートラジオグラフィーが採用しうる。採用された標識に応じて、分光光度法などの他の検出法も用いることができる。
ＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードする核酸配列に関連する核酸配列もまた本明細書に記載の方法で検出することができることを理解すべきである。例えば、ＭＴＰ高分子サブユニットの遺伝子の保存領域のＤＮＡプローブは関連ＤＮＡ配列（マウス、ラット、ハムスターまたはイヌのＭＴＰ高分子サブユニットの全部または１部をコードするＤＮＡ配列など）の検出および単離に用いることができる。このようなすべての方法は本発明の範囲に包含される。
【００８５】
［ＭＴＰ阻害物質の検出法］
本発明はまたＭＴＰ阻害物質の検出法に関する。特に、本発明は（ａ）ＭＴＰ阻害物質を含有すると考えられる試料を検出可能な標識を付した脂質と共に、ドナー粒子、アクセプター粒子およびＭＴＰ中で培養し、（ｂ）検出可能な標識を付した脂質のドナー粒子からアクセプター粒子へのＭＴＰに刺激された転移を測定することを特徴とするＭＴＰ阻害物質の検出工程に関する。このアッセイにおいて、阻害物質は検出可能な標識を付した脂質のドナー粒子からアクセプター粒子へのＭＴＰ刺激性転移度を減少するように思われる。検出は核磁気共鳴（ＮＭＲ）、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）、放射性標識（これが好ましい）、蛍光標識などによって行う。ドナーおよびアクセプター粒子は膜、ＨＤＬ、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、ＳＵＶ、リポ蛋白質などである。好ましいドナー粒子はＨＤＬおよびＳＵＶであり、好ましいアクセプター粒子はＬＤＬおよびＳＵＶである。
【００８６】
前述の操作により、式［Ａ］：
【化１】
0004298801.tif 000039
で示されるＭＴＰ阻害物質が確認された。これは２−［１−（３，３−ジフェニルプロピル）−４−ピペリジニル］−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−１Ｈ−イソインドール塩酸塩（化合物Ａと称する）である。化合物Ａの調製が米国特許第３６００３９３号に記載されている。前述の操作により、式［Ｂ］：
【化２】
0004298801.tif 000040
で示されるＭＴＰ阻害物質も確認された。これは１−［３−（６−フルオロ−１−テトラニル）メチル−４−Ｏ−メトキシフェニルピペラジン（化合物Ｂと称する）である。これらの化合物は後記実施例に記載の操作により確認された。
【００８７】
［治療法］
また本発明はＭＴＰの量または活性を減少する薬物の有効量を投与することを特徴とする哺乳動物の動脈硬化を予防、安定化または退行させる新規方法に関する。
さらに本発明はＭＴＰの量または活性を減少する薬物の有効量を投与することを特徴とする哺乳動物のコレステロール、ＴＧレベルなどの血清脂質レベルを減少させる新規方法に関する。
ＭＴＰの量または活性を減少する薬物を用いる種々の他の症状や疾患の治療も本発明の意図するものである。例えば、ＭＴＰの量または活性を減少し、それゆえに血清コレステロールおよびＴＧレベル、ＴＧ，脂肪酸およびコレステロール吸収を減少する薬物は高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、膵臓炎、高血糖、および肥満症の治療に有用である。
【００８８】
ＭＴＰの量または活性を効果的に減少する種々の薬物は本発明の治療法の実施に用いることができる。ＭＴＰ阻害物質は上記および後記実施例５に記載のスクリーニング法を用いて単離することができる。ＭＴＰ阻害物質として確認されている（後記実施例６参照）化合物ＡおよびＢは前述の治療法の特別の具体例に有用である。
アンチセンス分子はＭＴＰの量を減少するのに用いることができる。［トウルメ(Toulme)およびヘレン(Helene)の「Gene」,７２,５１〜８頁（１９８８年）；イノウエ(Inouye)の「Gene」,７２,２５〜３４頁（１９８８年）；およびアルマン(Uhlmann)およびペイマン(Peyman)の「Chemical Reviews」,９０,５４３〜５８４頁（１９９０年）参照］。ＭＴＰアンチセンス分子は前述の５’および３’フランキング制御領域、他のフランキング配列またはイントロン配列に対応するゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡに基づいてデザインすることができる。このようなアンチセンス分子としては、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類縁体などが挙げられ、それらは約１５〜２５塩基以上からなる。このようなアンチセンス分子はＭＴＰ高分子サブユニットのＤＮＡまたはＲＮＡと非共有的または共有的に結合する。このような結合は例えば、ＭＴＰＤＮＡまたはＲＮＡを分裂させるかまたは分裂を促進し、核または細胞質ｍＲＮＡの分解を増加し、または転写、翻訳、トランス作用因子の結合または前駆体ｍＲＮＡのスプライシングあるいはプロセッシングを阻害することができる。これらの効果のすべてがＭＴＰの発現を減少し、したがってアンチセンス分子が前述の治療法において有用になる。
【００８９】
アンチセンス法の潜在的標的配列としては、ＭＴＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列、その５’および３’フランキング制御領域、他のフランキング配列および３重ＤＮＡの形成に用いる非クラシックワトソンおよびクリック塩基結合配列などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ＭＴＰ高分子サブユニットのタンデム配列に反対して指向するアンチセンス分子が有用である。
アンチセンス分子もまたそれらの安定性、活性、細胞内外への輸送などを増加させる付加的機能を有している。このような付加的機能により例えば、標的分子に結合されるかまたは結合を促進し、標的分子を分裂させるかまたは分裂を促進することができる。
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの合成を指示するベクターを構築することができる。この場合、アンチセンス分子の長さは例えば、４００ｂｐ以上であってよい。
【００９０】
ＭＴＰと血清コレステロールレベル、ＴＧレベルおよび動脈硬化との関係の実証
血清コレステロールあるいはＴＧレベルを低下するかまたは動脈硬化を予防、安定化または退化する本発明方法は遺伝子疾患である無ベータリポ蛋白血症が機能ＭＴＰの欠損によって引き起こされるという発明者の発見に部分的に基づいている。
【００９１】
無ベータ−リポ蛋白血症患者におけるＴＧ転移活性のアッセイ
Ａ．ＭＴＰアッセイ
ドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへのＴＧ転移の蛋白質刺激速度としてＴＧ転移活性を測定した。ドナーおよびアクセプターベシクルを調製するため、クロロホルム中の適当な脂質を１６×２５ｍｍホウケイ酸ガラスねじぶたチューブ(フィッシャー・サイエンティフィック(Ｆisher Ｓcientific Ｃo.,)、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、カタログＮｏ.１４−９３３−１Ａ)中で混合し、窒素流下で乾燥させた。この乾燥脂質に２ｍｌの１５／４０緩衝液(１５ｍＭトリス、ｐＨ７.４、４０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.０２％ＮａＮ3)を加え(またはアッセイ当たり１μＬ、いずれにせよ最小の容量)、窒素流を緩衝液上に流し、ついで、ふたを速やかにねじ込んで脂質懸濁液上に窒素雰囲気を捕らえた。緩衝液中の脂質をスペシャルウルトラソニッククリーナー(Ｓpecial Ｕltrasonic Ｃleaner)(カタログＮｏ.Ｇ１１ＳＰ１、ラボラトリー・サプライズ(Ｌaboratory Ｓupplies Ｃo.,)、ヒックスビル、ニューヨーク州)中で浴−超音波処理した(bath−sonicated)。痕跡量の[3Ｈ]ジパルミトイルホスファチジルコリン(ホスファチジルコリンＬ−α−ジパルミトイル[２−パルミトイル−９,１０,3Ｈ(Ｎ)]、３３Ｃｉ／ミリモル、デュポンＮＥＮ)を１００ｃｐｍ／ナノモルの適当な比活性で加えることにより、ドナーおよびアクセプターホスファチジルコリン(ＰＣ)(卵Ｌ−α−ホスファチジルコリン、シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州)を放射性標識した。４０ナノモル卵ＰＣ、０.２モル％[14Ｃ]ＴＧ[標識(トリオレイン[カルボキシル−14Ｃ]−，約１００ｍＣｉ／ミリモル、デュポンＮＥＮ)および非標識(トリオレイン、シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州)トリオレインとの、最終比活性が約２００,０００ｃｐｍ／ナノモルの混合物]、および７.３モル％カルジオリピン(ウシ心臓カルジオリピン、シグマ・ケミカル)を含有するドナーベシクル、および２４０ナノモル卵ＰＣおよび０.２モル％ＴＧを含有するアクセプターベシクルを５ｍｇの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)および０.７〜０.９ｍｌの１５／４０緩衝液中のＭＴＰ試料のアリコートと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。転移反応は、０.５ｍｌのＤＥＡＥ−セルロース懸濁液(１：１懸濁液ＤＥ−５２、前以て膨潤したＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換樹脂、フィッシャー、カタログＮｏ.０５７２０−５〜１５ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.０２％ＮａＮ3)を添加することにより終了させた。反応混合物を５分間撹拌し、ドナー膜に結合したＤＥＡＥ−セルロース(ドナー膜は負に荷電したカルジオリピンを含んでおり、ＤＥＡＥに結合している)を低速度遠心分離により沈降させた。
【００９２】
上澄み液中に残留する14Ｃ−ＴＧおよび3Ｈ−ＰＣをシンチレーションカウンティングにより測定した。ＴＧ転移の計算は、転移反応後の上澄み液中に存在する3Ｈ−ＰＣ(アクセプターベシクル回収のマーカー)に対する14Ｃ−ＴＧ(ドナー膜からアクセプター膜に転移されたもの)の比を、転移反応前のアッセイ中のアクセプター[3Ｈ]ＰＣに対する全ドナー14Ｃ−ＴＧの比と比較することにより行った。14Ｃ−ＴＧ転移のパーセンテージは、下記のようにして計算した。
【数１】
0004298801.tif 000041
ＭＴＰ刺激されたＴＧ転移速度を計算するため、ＭＴＰの不存在下でのＴＧ転移速度をＭＴＰの存在下でのＴＧ転移速度から差し引いた。一次速度論を用いてＴＧ転移を計算した。
【００９３】
Ｂ．抗体産生
抗８８−ｋＤａ抗体をシンシナチ大学から得た。抗８８ｋＤａ抗体の産生は、すでに記載されているウェテローら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６５、９８００〜７(１９９０))。ヒト消化ホモジネート中での抗血清の特異性を呈示するのを助けるため、アフィニティ精製した抗８８ｋＤａ抗体を生成させた。８〜１０ｍｇの精製ＭＴＰを０.１Ｍ ＭＯＰＳ、ｐＨ７.５中に透析し、ついで４℃の水で前もって３回洗浄しておいた４ｍｌのバイオラドアフィゲル(Ｂio Ｒad Ａffigel)１５(バイオ−ラド、リッチモンド、カリフォルニア州)に加えた。ＭＴＰを室温にてマトリックスに２時間かけてカップリングさせ、ついで４℃にて一夜放置した。ゲル１ｍｌ当たり０.１ｍｌの１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８.０、を加えることにより、アフィゲル上の残留する反応部位をブロックした。溶出した蛋白質の光学密度の測定を製造業者の教示に従って行ったところ、９０％以上のＭＴＰがカラムにカップリングしていることが示された。カラムを５０ｍｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５で、ついで５０ｍｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ２.５で、ついで５０ｍｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ８.８で、ついで５０ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン、ｐＨ１１.５で洗浄し、最後にカラムを１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５で再平衡させた。
【００９４】
抗血清中の抗体を硫酸アンモニウム沈澱(血清１ｍｌ当たり２２６ｍｇの硫酸アンモニウム)により部分精製した。ペレットを１５ｍＭトリス、ｐＨ７.５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％アジ化ナトリウム、および１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に再懸濁し、透析した。得られた部分精製抗体をＭＴＰ−アフィゲルカラムに２時間かけてゆっくりと適用した(抗体をカラム中に３回循環させた)。カラムを１００ｍｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５で、ついで１００ｍｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５で、ついで５００ｍＭ塩化ナトリウムで、ついで５０ｍｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ２.５で(この画分は５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８.０中に回収した)、ついで１０ｍＭトリス、ｐＨ８.８で(カラムが中性のｐＨになるまで)、ついで５０ｍｌのトリエチルアミン、ｐＨ１１.５(この画分は５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８.０中に回収した)で洗浄し、最後にカラムを１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５で再平衡した。酸性洗浄液中に溶出した抗体を保持し、蛋白質画分のイムノブロット分析に使用した。
【００９５】
Ｃ．抗８８ｋＤａ抗体を用いたウエスタンブロット
抗体の特異性を確認し組織ホモジネート中のＭＴＰの８８ｋＤａ成分を検出するため、０.７５ｍｍホーファーサイエンティフィックインスツルメントゲルアパラタス(サンフランシスコ、カリフォルニア州)を用い、精製ウシＭＴＰまたは試験しようとする画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した[本質的にラムリ(Ｌaemmli)、Ｎature２２７、６８０〜５(１９７０)の記載に従って]。ついで、バイオラドトランス−ブロットセル(ＢioＲad Ｔrans−blot cell)(バイオ−ラド、リッチモンド、カリフォルニア州)を用いたウエスタンブロッティングにより蛋白質をニトロセルロースに移した。ブロッティング緩衝液(２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８.３、２０％メタノール)を前以て４℃に冷却した。蛋白質の転移は、２５０ミリアンペア、室温にて１００分かけて行った。ブロッキング緩衝液(４リットルの５０ｍＭトリス、ｐＨ７.７、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中の４００μｌ消泡剤、約１０ｍｇのチメロサール、および２００ｇ脱脂粉乳)を用いて膜を５〜１０分間ブロックした。抗血清(１：３００希釈)またはアフィニティー精製抗体(アフィニティー精製抗体の１：２５希釈)のアリコートを加え、室温にて一夜反応させた。ブロッキング緩衝液で洗浄した後、第二の抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗−ウサギＩｇＧ(バイオラド)を１：２０００の希釈で加え、室温で３時間反応させた。洗浄工程の後、第二の抗体を発色剤(５０ｍｌのブロッキング緩衝液中の５０ｍｇイミダゾール、５０ｍｇ ３,３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩、および５０μＬ Ｈ2Ｏ2(３０％溶液))で可視化した。
【００９６】
Ｄ．消化生検中のＭＴＰ
絶食したコントロールおよび疾患状態の患者からの消化生検を凍結し、ブリストル−マイヤーズ・スクイブ(Ｂristol−Ｍyers Ｓquibb)(プリンストン)にドライアイス上にて船で送った。生検をポリトロン(ポリトロンＰＴ３０００、ブリンクマン・インスツルメント(Ｂrinkmann Ｉnstrument,Ｉnc.)、ウエストベリー、ニューヨーク州)を用いて１／２最大セッティングにてホモジナイズした。典型的に、一つの生検を０.２５ｍｌのホモジナイズ緩衝液(５０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、および２ｍＭ ＰＭＳＦ)中でホモジナイズした。蛋白質のアリコートを０.７ｍｌおよび１.４％ＳＤＳに調節し、蛋白質濃度をローリー(Ｌowry)らの方法[Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.１９３、２６５〜７５(１９５１)]により測定した。ホモジネートをホモジナイズ緩衝液で約１.７５ｍｇ蛋白質／ｍｌに希釈した。ある場合には、蛋白質はすでに一層希釈されており、直接用いた。ミクロソーム画分から可溶性蛋白質を放出させるため、１部のデオキシコール酸溶液(０.５６％、ｐＨ７.５)を１０部の希釈ホモジネートに渦立たせながら加えた。試料を４℃で３０分間インキュベートし、ついで１０３,０００×ｇで６０分間遠心分離にかけた。上澄み液を除き、１５／４０緩衝液で１：１に希釈し、ついで１５／４０緩衝液中に一夜透析した。処理した生検のアリコートをＴＧ転移活性についてアッセイし、ウエスタンブロット分析を用いて８８ｋＤａ蛋白質を検出した。ＴＧ転移活性は、ホモジナイズした消化生検蛋白質の関数として時間当たりに転移されたドナーＴＧのパーセントとして表した。
【００９７】
Ｅ．無ベータ−リポ蛋白血症患者での結果
ＭＴＰの欠失と無ベータ−リポ蛋白血症との間に関係が存在するかどうかを調べるため、５人のコントロール被験者および無ベータ−リポ蛋白血症の古典的な遺伝的劣勢形を有する４人の無ベータ−リポ蛋白血症患者から十二指腸生検または十二指腸−空腸生検中のＭＴＰ活性を測定した。５人の正常被験者からの消化生検をホモジナイズし、上記のようにして界面活性剤で処理した。ＴＧ転移活性は、５人のすべての被験者からの生検中で容易に検出することができた(図２)。生検中のＴＧ転移活性をさらに特徴付けた。ＴＧ加水分解が脂質転移活性の測定を妨害しないことを確認するため、一人の被験者のアクセプターベシクル(転移された脂質を含有していた)を転移反応後に抽出し、14Ｃ−ＴＧの同定を薄層クロマトグラフィーにより確認した。すべての14Ｃ−ＴＧは真性のＴＧと同一の移動度を有し、完全なＴＧがアッセイ中に転移されたことが確認された。
【００９８】
ヒトＭＴＰの熱安定性について特徴付けた。ヒトＭＴＰは、６０℃で５分間加熱すると不活化された。活性の喪失は、測定した脂質転移活性がコレステロールエステル転移蛋白質(ＣＥＴＰ)(これら条件下で熱安定である)(イーム(Ｉhm)ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５７、４８１８〜２７(１９８２))の細胞内形からのものではないことを示していた。
４人の無ベータ−リポ蛋白血症患者からの消化生検を得、ホモジナイズし、ＴＧ転移活性を上記と同様にして測定した。これら４人の患者のいずれの生検からも転移活性を回収することはできなかった(図３)。このような検出可能なＴＧ転移活性の欠如は、デオキシコール酸処理によって無ベータ−リポ蛋白血症生検のミクロソームからＭＴＰを放出することができないことと関係していたこともあり得た。この可能性を試験するため、界面活性剤処理に加えて、一人の患者からのミクロソームを超音波処理した。浴超音波は、界面活性剤処理に匹敵するＴＧ転移活性を独立に放出する。これら条件下でさえも、ＴＧ転移活性を検出することはできなかった。
【００９９】
考えられる次の可能性は、検出可能なＴＧ転移活性の欠如が、無ベータ−リポ蛋白血症内に存在するような細胞内脂肪小滴を多く含有している細胞中ではＴＧ転移活性を検出することができないことと関係しているということであった。この可能性を試験するため、３つのコントロールを行った。第一に、キロミクロン保持疾患(chylomicron retention disease)を有する患者の生検からＴＧ転移活性を測定した。キロミクロン保持疾患を有する患者はキロミクロンを組立てまたは分泌することができず腸細胞中に大きな脂肪小滴を有し、無ベータ−リポ蛋白血症患者と類似した状態となる。さらに、生検の前に絶食しなかった被験者および同型接合の(homozygous)低ベータ−リポ蛋白血症の患者から採取した生検からＴＧ転移活性を測定した。これら両被験者とも、脂肪に満たされた腸細胞を有していた。これら３つのすべての場合において、正常被験者に匹敵するＴＧ転移活性が認められ(図４)、細胞内脂質小滴の存在はＴＧ転移活性を検出する本発明者らの能力を妨害するものでないことが確認された。
【０１００】
転移活性の不存在の原因と考えられる生化学的欠陥を確立するため、ホモジナイズした生検のミクロソーム画分からＭＴＰを放出した後の可溶性蛋白質を、ウシＭＴＰの８８ｋＤａ成分に対して産生させた抗体を用いたウエスタンブロット分析により分析した。正常被験者(図５)またはコントロール被験者(図６)をポリクローナル抗８８ｋＤａ抗体で調べた場合は、ウシＭＴＰの８８ｋＤａ成分に相当するバンドが認められた。加えて、増加した移動度の別の蛋白質もこの抗体と交差反応した。ヒトＭＴＰの８８ｋＤａ成分の同定を確認するため、この抗体をＭＴＰアフィニティーカラム上でアフィニティー精製した。この処理後、ウシＭＴＰの８８ｋＤａ成分に相当する分子量の蛋白質のみが免疫反応した(図７)。
５人の正常被験者および３人のコントロール被験者すべてのミクロソームの界面活性剤処理後の可溶性蛋白質をウエスタンブロット分析したところ、ＭＴＰの８８ｋＤａ成分の存在が示された(図５〜７)。対照的に、無ベータ−リポ蛋白血症患者ではウシＭＴＰの８８ｋＤａ成分に対応する蛋白質は認められなかった(図８)。加えて、２人の無ベータ−リポ蛋白血症患者からの全消化ホモジネートからの１００μｇ蛋白質について同様の分析を行った。この場合も、ＭＴＰの８８ｋＤａ成分に対応するバンドは認められなかった(図８)。コントロールとして、抗ＰＤＩ抗体を用いたイムノブロット分析により後者の２人の無ベータ−リポ蛋白血症患者においてＰＤＩの存在が示された。これらの結果は、無ベータ−リポ蛋白血症患者におけるＭＴＰ活性の不存在の生化学的基礎がＭＴＰの８８ｋＤａ成分の著しい不足または不存在であることを示している。
【０１０１】
無ベータ−リポ蛋白血症患者における遺伝子欠損の説明
Ａ．ＰＣＲによるｍＲＮＡおよびＤＮＡの増幅
３９才の無ベータ−リポ蛋白血症患者の十二指腸粘膜から２つの消化生検を得た。以前の分析では、この患者から採取した消化生検中にＭＴＰ活性もＭＴＰの８８ｋＤａ成分も検出することができないことが示された。各生検は５〜１０ｍｇの重さであり、−７０℃で凍結貯蔵した。全ＲＮＡを単離するため、０.８ｍｌの冷ＲＮＡｚｏｌＢ(シンナバイオテックス・ラブズ(ＣinnaＢiotecx labs)、フレンズウッド、テキサス州)を入れたマイクロヒュージ管(microfuge tube)中に一つの凍結生検を入れた。この生検を直ちに、ポリトロン(ブリンクマン、ウエストベリー、ニューヨーク州)によりセッティング１０にて６ストロークホモジナイズした。クロロホルム(８０μｌ)を加え、混合物を２０回穏やかに逆さにした。氷上で５分間インキュベートした後、混合物をエッペンドルフマイクロヒュージ５４１５(ブリンクマン)中、４℃にて１５分間、１４,０００ｒｐｍにて遠心分離にかけた。上澄み液に３５０μＬのイソプロパノールを加えて全ＲＮＡを沈澱させた。生検からの収量は２０μｇの全ＲＮＡ、すなわち組織１ｍｇ当たり約２μｇのＲＮＡであった(０.２％)。
【０１０２】
２.５μＭランダムヘキサマープライマー、５ｍＭ塩化マグネシウム、各１ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸(ｄＮＴＰ)、１Ｕ／μｌ ＲＮＡsin、２.５Ｕ／μｌ モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ)、および１×ＰＣＲ反応緩衝液(パーキン−エルマー−シータス(Ｐerkin−Ｅlmer−Ｃetus) ＲＮＡ−ＰＣＲキットＮo.Ｎ８０８−００１７)を用い、ＲＮＡ(５０ｎｇ)を第一鎖ｃＤＮＡ中に逆転写した。２０μｌの反応液を室温にて１０分間インキュベートしてプライマーをアニールさせ、ついで４２℃で３０分間インキュベートしてＲＮＡを逆転写した。反応は、９９℃で５分間加熱し、５℃に冷却することにより終了させた。１.２５×ＰＣＲ緩衝液中に０.１５μＭ前プライマーおよび後プライマー、２ｍＭ塩化マグネシウム、各０.２ｍＭのｄＮＴＰ、および２.５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含有する１００μＬ ＰＣＲに上記第一鎖のｃＤＮＡを加えた。パーキン−エルマーＧeneＡmp ＰＣＲシステム９６００モデル熱サイクラー中、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で１分からなるサイクルを５０サイクル行って増幅を行った。ついで、反応液を７２℃で７分間インキュベートした。ＭＴＰの８８ｋＤａ成分をコードするＲＮＡの５'領域を増幅するのに用いる前プライマーおよび逆プライマーを下記に５'から３'の方向で示す。
【０１０３】
【表３８】
0004298801.tif 000042
下記に示すのは、使用したプライマーの組合せとＰＣＲ生成物の長さである。
0004298801.tif 000043
これらプライマー配列は、ＭＴＰの８８ｋＤａ成分をコードする正常なヒトｃＤＮＡに基づいている。プライマーはすべて５'から３'の方向に記載している。Ｆは前プライマーを、Ｒは逆プライマーをさす。下線はＥｃｏＲＩによって認識される制限部位(プライマー５７８Ｆ)またはＢａｍＨＩによって認識される制限部位(プライマー１０２９Ｒおよび２１１７Ｒ)を表し、これら部位はプライマーの５'末端中に導入された。
【０１０４】
患者ゲノムＤＮＡは第二の凍結生検から単離した。４００μＬ抽出緩衝液(１０ｍＭトリス、Ｃｌ、ｐＨ８.０、０.１Ｍ ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍＬ ＲＮＡseＩ)を入れたマイクロヒュージ管中に生検を入れ、直ちにホモジナイズした。ホモジナイズはポリトロンによりセッティング１０にて５ストロークで行った。プロテイナーゼＫを最終濃度１００μｇ／ｍｌで加え、反応液を５０℃で３時間インキュベートした。この混合物を周期的に渦巻かせた。
反応液を室温に冷却した後、４００μＬトリス−飽和フェノール／クロロホルム(ｐＨ８.０)を加えた。管を５分間穏やかに逆さにし、ついで１４,０００ｒｐｍ、室温にて５分間遠心分離にかけた。上澄み液(３５０μｌ)に２Ｍ塩化ナトリウム(３５μｌ)およびエタノール(０.７ｍｌ)を加えてＤＮＡを沈澱させた。このＤＮＡを簡単に遠心分離させ、７０％エタノールで穏やかに洗浄し、簡単に乾燥させ、２０μｌの脱イオン水(ｄＨ2Ｏ)中に再懸濁した。ＤＮＡの収量は２０μｇ、すなわち組織１ｍｇ当たり約２μｇのＤＮＡであった(０.２％)。
【０１０５】
ゲノムＤＮＡ(０.５μｇ)を９５℃で５分間加熱し、１.２５×ＰＣＲ緩衝液(パーキン−エルマー−シータス)中の０.１５μＭ前プライマーおよび逆プライマー、２ｍＭ塩化マグネシウム、各０.２ｍＭのｄＮＴＰ、および２.５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含有する１００μｌのＰＣＲ反応液に直ちに加えた。パーキン−エルマーＧeneＡmp ＰＣＲシステム９６００モデル熱サイクラー中、９７℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で１分からなるサイクルを３サイクル行って増幅を行った。９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で１分からなるサイクルも３２サイクル行った。ついで、反応液を７２℃で７分間インキュベートした。
この遺伝子のエクソン２は、ＭＴＰ ＲＮＡの８８ｋＤａ成分の塩基１０９〜２９６をコードする。患者ゲノムＤＮＡからのＭＴＰの８８ｋＤａ成分をコードする遺伝子のエクソン２を増幅するのに用いたプライマー(配列表１８および１９)を下記に示す。
【０１０６】
【表３９】
0004298801.tif 000044
これらプライマーは、ＭＴＰの８８ｋＤａ成分をコードする正常なヒトのＤＮＡ配列に基づいている。これらプライマーは、ＰＣＲ反応において該エクソンの全体が増幅されるように、１８８ｂｐエクソン２の両側のイントロンに相補的である。増幅生成物のサイズは、プライマーおよび両側のイントロン領域も含めて２９２ｂｐの長さである。
【０１０７】
Ｂ．ＰＣＲ生成物のシークエンシング
ＲＮＡおよびＤＮＡの両ＰＣＲから得られたＰＣＲ生成物をＴＡＥ緩衝液(４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０)中の１.４％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。このゲルを水中の０.５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム中で５分間染色し、水中で１０分間脱染色した。紫外光ボックス上でＤＮＡを視覚化した。所望のＰＣＲ生成物を含有するバンドを剃刀の刃で切り出し、ＤＮＡをＧeneＣlean法(Ｂio１０１、ラジョラ、カリフォルニア州)により精製した。２０μｌの蒸留水中のシリカマトリックスからＤＮＡを溶出した。各ＰＣＲ反応から約１μｇの所望のＤＮＡ断片が得られた。精製ＤＮＡの部分を、トレイシー(Ｔracy)およびマルカヒー(Ｍulcahy)のＢiotechniques、１１、６８(１９９１)の記載に従ってアプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.)３７３オートマチックシークエンサー上でのＴａｑポリメラーゼサイクルシークエンシングにより直接シークエンシングを行った。
【０１０８】
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ついでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化することにより、残りのＤＮＡをプラスミドベクター中へのクローニング用に調製した。５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールおよび５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ中の各２０μＭのｄＮＴＰ、１ｍＭ ＡＴＰ、４.５単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、５単位のＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼからなる５０μＬ反応混合物にＤＮＡ(５００ｎｇ)を加えた。３７℃で１時間インキュベートした。ついで、このＤＮＡをＧeneＣleanにより反応混合物から精製した。このＤＮＡを１０μｌのｄＨ2Ｏ中に溶出した。平滑末端化したＤＮＡを、ＳｍａＩで前以て切断し脱リン酸したｐＵＣ１８(ファルマシア)中にライゲートした。Ｄｈ５α細胞(１００μｌ、ギブコ−ＢＲＬ)を製造業者により供されたプロコールに従ってトランスフォームした。プラスミドＤＮＡを増幅し、モレキュラー・クローニング(サンブルック、フリッチュ、およびマニアチス編)コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１.２５〜１.２８(１９８９)に記載のアルカリ溶解法により単離した。これらプラスミドクローンを実施例１に記載の方法でシークエンシングした。
【０１０９】
結果
３つの独立したＲＮＡ−ＰＣＲ反応からの直接配列決定によると、無ベータ−リポ蛋白血症患者における翻訳の開始部位に比較してｃＤＮＡの塩基２６２においてシトシンが欠失していることがわかった。この一つの塩基の欠失によって読み取り枠がシフトし、２１塩基下流に停止コドン(ＴＧＡ)を生じる。この変異体ＲＮＡの翻訳はアミノ酸残基７８で終了する。下記に挙げるのは、正常被験者および無ベータ−リポ蛋白血症患者のＤＮＡおよびそれから導かれたアミノ酸配列の比較である。
【表４０】
0004298801.tif 000045
(それぞれ配列表Ｎｏ.２０〜２３)
【０１１０】
ゲノムＤＮＡの２つの独立したＰＣＲ増幅の直接配列分析により欠失が示された。このことは、この患者におけるＭＴＰの８８ｋＤａ成分をコードする遺伝子の両対立遺伝子がフレームシフト変異を示したことを示している。加えて、これらＤＮＡ断片をシークエンシングのためｐＵＣ１８中にクローニングした。８つのプラスミドクローンもまたシトシンの欠失を示し、両対立遺伝子上でのフレーンムシフト変異がさらに確認された。
【０１１１】
第二の無ベータ−リポ蛋白血症患者における遺伝子欠損の説明
Ａ．方法
Ｑiagen(チャッツワース(Ｃhatsworth)、カリフォルニア州)キットｎｏ.１３３４３を用い、製造業者のプロトコールに従って第二の無ベータ−リポ蛋白血症患者の血液からゲノムＤＮＡを単離した。第一の患者の場合と同様に、本発明者らは、この患者の消化生検からはＭＴＰ活性もＭＴＰの８８ｋＤａ成分も検出することができなかったことをすでに示した。このゲノムＤＮＡ(３００μｇ)をストラタジーン(ラジョラ、カリフォルニア州)に送り、ラムダＤＡＳＨTMベクター(ストラタジーン)中のゲノムＤＮＡライブラリーとした。加えて、ラムダＤＡＳＨTMベクター中の正常ゲノムライブラリーをストラタジーンから購入した(カタログＮｏ.９４３２０２)。
【０１１２】
各ライブラリーからの２００万個の独立した組換えファージプラークについて、ウシＭＴＰ ｃＤＮＡと相同の配列を含有するゲノムＤＮＡ挿入物をスクリーニングした。スクリーニング法は、大腸菌宿主株としてＰＬＫ１７を用い、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を６０℃とし、洗浄緩衝液として１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いた他は実施例１におけるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングと同様であった。ゲノムライブラリーのスクリーニングのためのプローブは、実施例２と全く同様に32Ｐ−標識したウシｃＤＮＡクローンｎｏ.２２からの２.４ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片であった。推定陽性クローン(各ライブラリーから約３０)を再スクリーニングし、さらに２回のハイブリダイゼーション分析の後に陽性であった。第三のスクリーニング後に単一の単離した陽性プラークをアガープレートから切り出し、５０μＬクロロホルムを用いて１ｍｌのＳＭ緩衝液中に沈澱させた。サンブロックらの上記文献ｐ２.６７からの「スモール−スケール・リキッド・カルチャーズ(Ｓmall−scale liquid cultures)」プロトコールに従い、各ファージストックについてファージ力価を増幅させた。１００μＬの増幅ストックを１００μＬの調製ＰＬＫ１７プレーティング細胞および１００μＬの１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ塩化カルシウムと混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。ついで、この混合物を用いて５０ｍｌ ２×ＮＺＹ(ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ)に０.２％カザミノ酸(ＣＡＡ、フィッシャー・サイエンティフィック ｎｏ.ＤＦ０２８８−０１−２)を接種し、３７℃で一夜増殖させた。Ｑiagenキットｎｏ.１２５４３を用い、Ｑiagen緩衝液およびプロトコールを用いて、溶解した培養液からラムダＤＮＡを単離した。
【０１１３】
ラムダＤＮＡを鋳型として用い、実施例１の記載に従ってゲノムＤＮＡ挿入物の直接ＤＮＡシークエンシングを行った。正常または無ベータ−リポ蛋白血症ゲノムクローンをシークエンシングするためのプライマーとして、ヒトｃＤＮＡ配列に相補的な約２０塩基のオリゴヌクレオチドを用いた。無ベータ−リポ蛋白血症ゲノムクローンおよび正常ゲノムクローンの特徴付けおよびシークエンシングを平行して行った(実施例９参照)。イントロン−エクソン境界の同定は、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列を比較することにより行った。シークエンシングプライマーは各エクソンについてイントロン配列５'および３'に対して設計し、境界を再シークエンシングすることによりイントロン／エクソン境界を確認するのに用いた。加えて、少なくとも一つの無ベータ−リポ蛋白血症ゲノムクローンの各エクソンについての両ＤＮＡ鎖のコード配列をシークエンシングした。無ベータ−リポ蛋白血症患者のエクソン１３のＤＮＡシークエンシング分析により、ヒトｃＤＮＡの塩基１８３０においてＣからＴへの点変異が明らかとなった。この塩基変化により、通常はアミノ酸残基Ａｒｇ595をコードする部位において停止コドンが導入された。
【０１１４】
塩基１８３０の周辺のヌクレオチド配列は正常ＤＮＡ配列においてはＴａｑＩエンドヌクレアーゼ制限部位をコードするのであるが(ＴＣＧＡ)、無ベータ−リポ蛋白血症患者のＤＮＡ配列ではそうではない(ＴＴＧＡ)。このヌクレオチド変化を確認しこの対立遺伝子の同型接合を呈示するため、正常コントロール、無ベータ−リポ蛋白血症患者および該無ベータ−リポ蛋白血症患者の両親からのゲノムＤＮＡにおいてＴａｑＩ消化を行った。正常コントロール、無ベータ−リポ蛋白血症患者および該無ベータ−リポ蛋白血症の母親および父親の血液から上記のようにしてゲノムＤＮＡを単離した。各試料からのゲノムＤＮＡ(１０μｇ)を１００μＬ １×ＲＥact緩衝液ｎｏ.２(ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ)中、６５℃にて５時間、１００単位のＴａｑＩ(ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ)で消化した。各消化反応物をＵltrafree−ＭＣ１０,０００ＮＭＷＬフィルターユニット(ミリポアからｎｏ.ＵＦＣ３ ＴＧＣ００)(分子量のカットオフ １０,０００)中で２,０００ｒｐｍにて３０分間回転させて反応容量を５０μＬに減少させた。ついで、これら制限消化反応物をＴＥＡ緩衝液中の１％ゲルにより２０ボルトにて１６時間、アガロースゲル電気泳動にかけた。アガロースゲルを臭化エチジウム染色し、写真をとり、ついでサザーン(Ｓouthern,Ｅ.Ｍ.)のＪ.Ｍol.Ｂiol.９８、５０３〜１７(１９７５)に記載の方法によりニトロセルロース膜に移した。
【０１１５】
サザーンハイブリダイゼーションのためのプローブは、エクソン１３および幾つかの両側イントロン配列を含有するＰＣＲ生成物であった(下記配列表Ｎo.２４参照)。鋳型としての正常ゲノムＤＮＡ(０.３μｇ)および各１０ピコモルの前プライマーおよび逆プライマーを１００μＬ反応容量中で用い、ＧeneＡmpキット(パーキン−エルマー、シータス・インダストリーズ)成分を用いてＰＣＲを行った。この反応混合物を９７℃で２分間インキュベートし、ついで９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、および７２℃で１分間からなるサイクルを３０サイクル行い、ついで７２℃で７分間インキュベートし、４℃で貯蔵した。増幅したＤＮＡを実施例１と同様にしてアガロース電気泳動に供し、期待される３０２ｂｐ断片を切り出し、ゲルから溶出した。ついで、このエクソン１３ＰＣＲ生成物を実施例２と同様にして32Ｐ標識し、サザーンハイリダイゼーションにおいてプローブとして用いた。ハイリダイゼーションおよび洗浄は実施例２と同様にして行った。ブロットを−８０℃にて５日間Ｘ線に暴露した。
【０１１６】
Ｂ．結果
第二の無ベータ−リポ蛋白血症患者から単離したＤＮＡからヒトゲノムライブラリーを生成した。２００万個のファージをウシｃＤＮＡプローブでプローブし、ウシＭＴＰ ｃＤＮＡに相同なヒトゲノムＤＮＡ挿入物を有する３０個のファージを特徴付けた。
無ベータ−リポ蛋白血症患者からのゲノムＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列分析により、ヒトＭＴＰ遺伝子のエクソン１３中の塩基１８３０においてＣからＴへの点変異が起こっていることが明らかとなった(エクソン１３はヒトｃＤＮＡの塩基１８１７〜１９１４に対応する)。このＣからＴへの点変異により、残基５９５における正常ＣＧＡアルギニンコドンがＴＧＡ翻訳停止シグナルに変わり、その結果、この蛋白質の３００アミノ酸部が切り取られる。このヌクレオチド変化は、この個体から特徴付けられた４つの独立のゲノムＤＮＡ挿入物すべてにおいて認められた。
【０１１７】
下記に示すのは、無ベータ−リポ蛋白血症患者のエクソン１３中のＣからＴへの変異の位置である。正常エクソン１３とその両側のイントロン配列の３０２塩基ＤＮＡ配列を示す。サザーンハイブリダイゼーションのプローブを作成するための前(→)ＰＣＲプライマーおよび逆(←)ＰＣＲプライマーに対応するＤＮＡは、適当な矢印の上に示してある。垂直の線はイントロン／エクソンの境界を示す。ＴａｑＩ認識配列は四角で囲んである。星印(＊)はＣからＴへの変異部位である塩基１８３０を示す。
配列表Ｎo.２４
【表４１】
0004298801.tif 000046
【０１１８】
塩基１８３０にあるＣの周囲の正常ヌクレオチド配列(ＴＣＧＡ)はＴａｑＩ制限部位をコードする。この無ベータ−リポ蛋白血症患者においては、この部位の配列は変異している(ＴＴＧＡ)。それゆえ、ＴａｑＩは正常ＤＮＡにおいてはこの部位でエクソン１３を切断するが、変異を含むＤＮＡでは切断しない。正常エクソン１３中にはただ一つのＴａｑＩ部位が存在する。
サザーンブロットによりこのヌクレオチド変化が確認される(図９)。コントロールの被験者、無ベータ−リポ蛋白血症患者、および該患者の母親および父親から単離したゲノムＤＮＡをＴａｑＩで完全に切断し、エクソン１３からの配列でプローブした。正常ＤＮＡはＴａｑＩにより２つの切片(エクソン１３にハイブリダイズする)に切断される。無ベータ−リポ蛋白血症ＤＮＡはＴａｑＩによって切断されないが、それはただ一つのハイブリダイゼーションバンドによって明示される。この結果から、ＴａｑＩ制限配列が欠如していることが確認される。両親からのＤＮＡは混合したパターンを示し、一つの正常な対立遺伝子と一つの変異した対立遺伝子とが存在することを示している。
【０１１９】
Ｃ．分析
上記結果およびそれから導かれる結論は、下記のようにまとめることができる。
ＭＴＰ活性および蛋白質は、研究した無ベータ−リポ蛋白血症患者においては検出することができない。ＭＴＰ遺伝子中の変異は、蛋白質および活性の欠如を完全に説明している。従前の結果は、無ベータ−リポ蛋白血症が単一遺伝子疾患であることを示している(ケイン＆ハベル、上記文献)。これら結果から、無ベータ−リポ蛋白血症はＭＴＰ活性の喪失によって引き起こされるという結論を導くことができる。
これらの結果は、ＭＴＰ活性がアポリポ蛋白Ｂを含有するリポ蛋白質粒子の有効な組立てと分泌に必要であることを示している。ＭＴＰ活性の喪失の結果、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質、およびコレステロールエステルの血清レベルが低下する。それゆえ、ＭＴＰ活性の量の低下の結果、低血清脂質レベルとなると結論することができる。
【０１２０】
さらに、低血清脂質レベルはアテローム性動脈硬化症の予防、安定化、または緩解と関連している。上記のように、ＭＴＰの活性の量の喪失は低血清脂質レベルという結果になる。加えて、無ベータ−リポ蛋白血症患者ではアテローム性動脈硬化症は起こらない(シェーファー、上記文献；ディシェ(Ｄische)およびポロ(Ｐorro)、Ａm.Ｊ.Ｍed.４９、５６８〜７１(１９７０)；およびソブレビラ(Ｓobrevilla)ら、Ａm.Ｊ.Ｍed.３７、８２１(１９６４))。それゆえ、ＭＴＰの抑制はアテローム性動脈硬化症の予防、安定化、または緩解となることを結論つけることもできる。
【０１２１】
【実施例】
つぎに、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
ウシＭＴＰの８８kＤa成分をコードするcＤＮＡクローンの単離およびＤＮＡ配列の分析
市販のバクテリオファージラムダgt１０／ウシ小腸cＤＮＡライブラリイをクロンテック(Ｃlontech)より購入した。１×１０6の独立した組換えファージプラークをウシＭＴＰの８８kＤa成分に対応するcＤＮＡについてスクリーニングした。
大腸菌宿主Ｃ６００株(クロンテック社製)を、マルトース０.２％および硫酸マグネシウム１０mＭを補充したルリアブロス(ＬＢ＝塩化ナトリウム１０g／l、バクトトリプトン１０g／l、および酵母エキス５g／l)５０ml中３０℃で一夜生育させてファージ感染用に調製した。その細胞を低速遠心によりペレット化し、１０mＭ硫酸マグネシウム２０mlに再懸濁させ、４℃で保存した。５００００バクテリオファージおよびＣ６００細胞３００μlの各２０アリコートを３７℃で１５分間培養し、ＬＢ７ml＋アガロース０.７％と混合し、１３２mmＬＢプレートに塗布した。そのプレートを３７℃で７〜１０時間、特異的ファージプラークが現われるまで培養し、ついで４℃に移した。
【０１２２】
各プレートについて複製プラークのニトロセルロース膜への転移を下記のようにして行った。ニトロセルロース膜(シュレイチャー＆シュエル、ニューハンプシャー、キーン)をファージ上に直接１分間(最初の転移)または３分間(第二の転移)に置いた。その膜に付着したファージＤＮＡを０.５Ｎ水酸化ナトリウムおよび１.５Ｍ塩化ナトリウム中で１分間変性させ、１Ｍトリス(pＨ８.０)および１.５Ｍ塩化ナトリウム中で１分間中和し、最後に２×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pＨ７.０)中で１分間洗浄した。そのＤＮＡを、８０℃、減圧下に２時間熱してニトロセルロース膜上に永久的に固定した。
８８kＤa成分を含むウシＭＴＰの単離を前述のとおりに行った(ウェテロー＆チルバースミット、Ｃhem．Ｐhys．Ｌipids３８(１９８５)、およびウェテローら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６５９８００〜７(１９９０)を参照)。その８８kＤa成分の内部ペプチドの配列を、該蛋白質をコードするcＤＮＡにハイブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドをデザインするために使用した。
【０１２３】
ここに記載の方法には下記ＤＮＡ配列(５'から３'へ記載)を有するプローブを用いた。
【表４２】
0004298801.tif 000047
プローブ２Ａは２０塩基オリゴヌクレオチド３２個の混合物であり、各々は、このプローブがそれからデザインされたペプチドのアミノ酸配列をコードするものである。プローブ３７Ａは唯一の３３塩基配列であり、プローブ１９Ａは唯一の３０塩基のものである。これらのオリゴヌクレオチド配列は内部ペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする。
オリゴヌクレオチド類は本明細書に記載のように市販のものから入手するか、またはβ−シアノエチルホスホルアミダイトによる方法にてミリゲン／バイオサーチ(ミリポア社、マサチューセッツ、ベッドフォード)上で８７００ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。シークエンシングプライマーは使用前にＮＡＰ−１０カラム(ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、ニュージャージー、ピスカタウエイ)にて脱塩した。プローブはＮＥＮＳＯＲＢ  Ｐrep  Ｒesin(デュポン社、ＮＥＮリサーチ・プロダクツ、マサチューセッツ、ボストン)上で精製した。
【０１２４】
プローブ２Ａはゲノシス・バイオテクノロジー社(テキサス、ザ・ウッドランズ)から購入し、そのオリゴヌクレオチド１μgを、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位およびγ標識32Ｐ−ＡＴＰ１２０μＣiを含む５０mＭトリス−Ｃl(pＨ７.５)１０mＭ塩化マグネシウム、５mＭジチオスレイトール(ＤＴＴ)、０.１Ｍエチレンジアミンテトラアセテート(ＥＤＴＡ)および０.１mＭスペルミジン中にて、５０μlの反応容量にて３７℃、３０分間培養して標識し、ついで６８℃で５分間加熱してキナーゼを失活させた。未反応のＡＴＰをＧ−２５セファデックススピンカラム(ベーリンガー・マンハイム社、イディアナポリス)を用い、仕様書にしたがって処理して除いた。その標識オリゴヌクレオチドは約２×１０8dpm／μgの比活性を持っていた。
そのニトロセルロース膜を、ハイブリダイゼーションバッファー(６×ＳＳＣ,２０mＭ  ＮaＰＯ4、２×デンハルツ(Ｄenhardts)、０.１％ＳＤＳ、および１００μg／ml鮭精子ＤＮＡ)(サンブルックら、前記文献デンハルツＢ１５頁を参照)１５０ml中、３７℃で２時間前ハイブリダイズした。そのハイブリダイゼーションバッファーを差換え、標識オリゴヌクレオチドプローブ２Ａを加え、３７℃で一夜ハイブリダイズした。その膜を２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ１リットル中４０℃で洗浄し、空気乾燥し、デュポン浅色強化スクリーン(デュポン、ＮＥＮ)にてＫodakＸＡＲ−５Ｘ線フィルムに８０℃にて５日間暴した。
【０１２５】
陽性と推例されるクローン(４０)を、２回ハイブリダイゼーションを行って同じプローブにて再スクリーニングした。Ｘ線フィルム上で陽性信号を示すものに対応する寒天プラグを原プレートから切取り、ＳＭ１ml＋５％ＣＨＣl3(ＳＭ＝１リットル当り塩化ナトリウム５.８g、硫酸マグネシウム２.０g、１Ｍトリス−Ｃl(pＨ７.５)５０ml、および２％ゼラチン５mlを含有)に入れる。そのファージを次のようにして再びプレートに塗布した。すなわち、ファージ元株０.００１μlを１０mＭ硫酸マグネシウム中、Ｃ６００細胞１００μlと混合し、３７℃で１５分間培養し、ＬＢ３ml＋０.７％アガロースを加え、８２mmＬＢプレートに塗布した。３７℃で一夜、ついで４℃で１時間培養したのち、ファージプラークをニトロセルロースに転移し、ついで、上記のように、標識オリゴヌクレオチドプローブ２Ａに再プローブ化した。第三ハイブリダイゼーションスクリーンにより、１６ファージプラークを単離した。
【０１２６】
該１６組換えファージの各々の挿入体を、市販のラムダgt１０アンプリマー(クロンテック社)およびＧemeＡmpＫit(パーキン−エルマー、セタス・インダストリース、コネチカット、ノーウォーク)を用い、仕様書に従って処理してＰＣＲ法により増幅した。増幅したＤＮＡを、トリス−ＥＤＴＡアセテートバッファー(ＴＥＡ＝４０mＭトリス−アセテート、１mＭ ＥＤＴＡ)中、１.２％アガロースゲルを通し、１００ボルトで２〜３時間電気泳動にかけた。そのアガロースゲルを臭化エチジウム(ＥtＢr)で染色し、水洗し、写真にとった。ついで、そのＤＮＡを、サウザーン法にて、そのゲルからニトロセルロース膜に移した。サウザーンハイブリダイゼーションを、標識オリゴヌクレオチドプローブ２Ａを用い、前記ハイブリダイゼーションバッファー５０ml中４０℃にて一夜行ない、ついで４５℃、４８℃および５１℃で洗浄した。ファージ番号６４および７６(図１)に対応する２つの増幅挿入体を２×ＳＳＣ中５１℃でプローブ２Ａにハイブリダイズした。これら２つのクローンのラムダＤＮＡは下記のようにしてプレートライゼート法(サンブルックら、前記文献２.１１８頁)にしたがって調製した。ファージＤＮＡの１／１０(５０ml中の５ml)を制限酵素ＥcoＲＩ(ニュー・イングランド・バイオラブス、マサチューセッツ、ビバリー)２０単位を用い、該製造会社のバッファー中３７℃で２時間消化させ、アガロース電気泳動に付した。これらのファージのＥcoＲＩ開裂により、ファージ番号６４は１.０kb挿入フラグメントを得、ファージ番号７６からのcＤＮＡからは０.９kbおよび０.４kbの２個のＥcoＲＩ断片を得た。これらのバンドをそのゲルから切取った。
【０１２７】
そのアガロースゲル切片を強制的に２１ゲージ針を通してＴ10Ｅ1Ｎ.3(１０mＭトリス−Ｃl(pＨ７.４)、１mＭ ＥＤＴＡ(pＨ８.０)および０.３Ｍ塩化ナトリウム)３mlにとり、−２０℃で一夜凍結させてＤＮＡを溶出させた。この試料を３７℃で３０分間融解させ、遠心してアガロースをペレット化し、水で１:１に希釈し、仕様書にしたがってＥlu.Ｔipカラム(シュレイチャー＆シュエル)を通した。そのＤＮＡ試料をエタノールで沈殿させ、エタノール洗浄後、約０.０５pmol／μl濃度で再懸濁した。
プラスミドベクター、ブルースクリプト(bluescript)ＳＫt(ストラタジーン)を、制限酵素ＥcoＲＩ(ニュー・イングランド・バイオラブス)２０単位にてその製造会社のバッファー中３７℃で２時間消化させ、ついでそのＥcoＲＩ反応液に直接子ウシアルカリホスファターゼ(ベーリンガー・マンハイム社)１単位を加えて３０分間処理して、そのcＤＮＡ挿入体を受入れるように調製した。このＤＮＡをついで１.２％アガロース／ＴＥＡゲルに１００ボルトにて２時間通して、電気泳動に付した。その線状プラスミドバンドを、前記と同様にして、切取り、溶出し、再懸濁した。
その調製したブルースクリプトプラスミドベクターにcＤＮＡ挿入体フラグメントを結紮させた。それは、ベクター０.０５pmolをcＤＮＡ挿入体０.１０pmolと、５０mＭトリス−Ｃl(pＨ７.４)、１０mＭ塩化マグネシウム、１mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰおよびＴ4ＤＮＡリガーゼ(ニュー・イングランド・バイオラブス)４０単位中で混合することにより行った。その反応物１０μlを１５℃で一夜培養した。その結紮反応物を、形質転換成分、大腸菌細胞ＤＨ５a株(ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース)１００μlと混合し、サンブルツクら前記文献１。７４頁に記載の標準法にて、プラスミドＤＮＡにて大腸菌細胞を形質転換した。その形質転換細胞をアンピシリン１００μg／ml含有ＬＢ−寒天プレートに塗布し、３７℃で一夜発育させた。
【０１２８】
バーンボイン＆ドリイ(Ｂirnboin＆Ｄoly)(Ｎucleic  Ａcids  Ｒes．７  １５１３−２３、１９７９)のアルカリリシス法にしたがってアンピシリン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。精製したプラスミドＤＮＡを前記のようにしてＥcoＲＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動に付し、ついで正しい大きさのＥcoＲＩcＤＮＡ挿入体フラグメントの発生を調べた。唯一のcＤＮＡ挿入体陽性コロニーからの細胞をアンピシリン１００μg／mlを含むＬＢ１００mlに接種し、３７℃で飽和点まで発育させた。プラスミドＤＮＡを、キアジエン(Ｑiagen)プラスミド単離キットＮo.１２１４３(キアジエン社、カリフォルニア、チャッツロース)を用い、仕様書にしたがって抽出した。
cＤＮＡクローンの配列決定を、アプライド・バイオシステムＩnc．(ＡＢＩ,カリフォルニア、フオスター・シティ)３７３自動ＤＮＡシークエンサーにて、染料標識プライマーまたは染料標識ジデオキシヌクレオチドのいずれかを用いて行った。染料標識プライマーによるサイクル配列決定は、Ｔaq Ｄye Ｐrimer Ｃycle Ｓequencing Ｋits(ＡＢＩ part Ｎo.４０１１２１および４０１１２２)にて行った。各反応には二本鎖ＤＮＡ１μgを用いた。閉環方法および配列決定用試料の濃度は“Ｃycle Ｓequencing of ＤＮＡ with Ｄye Ｐrimers manual"(ＡＢＩ part Ｎo.９０１４８２)に記載されている。別法として、染料標識ジデオキシヌクレオチドによるサイクル配列決定は、Ｔaq Ｄye ＤeoxyTM ＴerminatorＣycle Ｓequencing Ｋit(ＡＢＩ part Ｎo．４０１１１３)を用いて行った。代表的には各反応に鋳型１.２５μgとプライマー４pmolとを用いた。鋳型およびプライマー濃度は反応に適合するように適宜変えた。閉環反応はＴaq Ｄye ＤeoxyTM Ｔerminator Ｃycle Ｓequencing Ｐrotocol(ＡＢＩ  part  Ｎo．９０１４９７)に記載のＰerkin−Ｅlmer  Ｃetus  thermal  cycler(モデル９８１０)を用いて行った。
【０１２９】
サイクル反応後、Ｃentri−ＳepTM スピンカラム(プリストン・セパレイションズ、ニュージャージー、アデルフィア)を用いて過剰の染色ターミネーターおよびプライマーを除去した。スピンカラム溶出液をＴaq Ｄye ＤeoxyTM  Ｔerminator Ｃycle Ｓequencing  Ｐrotocol(ＡＢＩ part Ｎo．９０１４９７)の記載にしたがって沈澱および洗浄を行った。ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓequencing Ｓystem  使用者マニュアルに記載の方法で６％アクリルアミド変性ゲルを調製した。ゲルを流す直前に、試料を脱イオンホルムアミド／５０mＭ  ＥＤＴＡ(pＨ８.０)５／１(v／v)５μlに再懸濁させた。試料を９０℃で２分間変性させ、氷上ですばやく冷やし、ついで、事前に流すゲルに負荷した(ゲルは約１５〜２０分間事前に流した)。ゲルを、２５００ボルト、４０アンペア、３０ワット、４０℃にて１２時間流した。配列分析はＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ分析ソフトウエア(version１.０２)にて行った。最終配列はＡＢＩ ＤＮＡ Ｓequence Ｅditor software seq ＥdTM(version１.０)(ＡＢＩ社)を用いて得た。
【０１３０】
クローン番号６４の全１０３６bp挿入体の配列決定を行った。それは、その挿入体の３プライム末端を通して続くオープンリーディングフレームの９３６bpをコードする(それは少なくとも３４０００の分子量を有するポリペプチドに対応する)。このクローンの配列をヌクレオチド配列データバンクにある配列と比較したところ、そのクローンの５'末端の最初の９１塩基はウシミトコンドリア遺伝子に対応していることがわかった。それ故、そのクローン番号６４の１０３６bp挿入体はこのライブラリイの構築を通して２つの独立したcＤＮＡの結紮で得たものである。
クローン番号７６の４００bpＥcoＲＩフラグメントの配列を決定し、オープンリーディングフレーム８１bpおよびそれに続く３プライム非翻訳配列の２９８塩基およびポリＡ領域を示した。
ラムダgt１０ウシ小腸cＤＮＡライブラリイをオリゴヌクレオチドプローブ３７Ａで再スクリーニングし、３３bpがクローン番号６４でコードされるほぼ５'ペプチド配列にマッチしていた。２つの陽性クローン番号２２および２３(図１)が第三スクリーンを通して単離され、サブクローン化し、クローン番号６４として配列決定された。
【０１３１】
クローン番号２２および２３はそれぞれ２.８kbおよび１.７kb cＤＮＡ挿入体を含んでいた。クローン番号２２の２.８kb cＤＮＡ挿入体は塩基２および２５０６(９３.２kＤaポリペプチドに対応)の間の８３５アミノ酸の連続オープンリーディングフレームおよびそれに続く２９８塩基の３'非翻訳配列およびポリＡ領域と予想させるものであった。
ラムダgt１０ライブラリイをプローブ１９Ａで再スクリーニングし、クローン番号２２でコードされる５'ペプチドにほぼ相当するクローン番号２２の配列にマッチしており、クローン番号２を上記と同様にして単離した。クローン番号２からの１kb  ＤＮＡ挿入体のＤＮＡ配列を分析したところ、それはクローン番号２２とオーバラップし、ウシcＤＮＡの５'末端に１００塩基まで延びていることを示した。クローン番号２および２２のＤＮＡ配列複合体および予想される翻訳生成物はそれぞれ配列番号１および３の配列を示す。
要約すると、ＭＴＰの８８kＤa成分に対応するウシ小腸cＤＮＡクローンの配列決定により、２９００bpの連続した配列であり、それは８６０アミノ酸のオープンリーディングフレームおよびそれに続く２９８bpの３'非コード領域およびポリＡ領域をコードするものである。この複合配列の予想される蛋白質生成物は９６.１kＤaである。
【０１３２】
実施例２
関連種のＤＮＡハイブリダイゼーション分析
ウシ、ヒト、マウス、ハムスター(チャイニーズハムスター卵細胞、ＣＨＯ細胞)、ラット、およびイヌからのＤＮＡについてサウサーンハイブリダイゼーション分析を行った。各遺伝子ＤＮＡ(クロンテック社)１０μgをＥcoＲＩ(ニュー・イングランド・バイオラブス社)１４０単位にて１×ＥcoＲＩバッファー(ニュー・イングランド・バイオラブス社)１００μl中３７℃で一夜消化した。各消化反応物をＵltrafree−ＭＣ１００００ＮＭＷＬフィルターユニット(ミリポア社Ｎo．ＵＦＣ３  ＴＧＣ００)(１００００の分子量切断)中で２０００rpmにて３０分間回転させて容量を５０μlまで減少させた。その制限酵素消化反応物をついでＴＥＡバッファー中０.７５％ゲルにて８０ボルトで３時間アガロースゲル電気泳動に付した。そのアガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、写真を撮り、ついでサウサーン法にてニトロセルロース膜に転移した。
サウサーンハイブリダイゼーションを、プローブとしてウシcＤＮＡクローン番号２２からの２.４kb ＥcoＲＩフラグメントを用いて行った。そのＤＮＡフラグメント２５ngをＭultiprimeＤＮＡ  Ｌabelling  Ｓystem(アムシャム社、イリノイ、アーリントン・ハイツ)および32Ｐ−α−dＣＴＰ５０μＣiを用いて標識した。導入されなかった32Ｐを前記のようにしてセファデックスＧ２５スピンカラムを用いて標識プローブから分離した。ニトロセルロース膜をハイブリダイゼーションバッファー(前記)１００ml中３７℃で２時間事前ハイブリダイズした。そのハイブリダイゼーションは新しいハイブリダイゼーションバッファー５０ml中１.２×１０7dpm変性プローブを用いて６０℃で一夜行った。その膜を１×ＳＳＣ５００ml、０.１％ＳＤＳで６５℃にて１時間洗浄し、空気乾燥し、ついで強化スクリーンを用いて−８０℃で４日間Ｘ線フィルムに暴した。ウシクローン番号２２からの２.４kb  ＥcoＲＩフラグメントを特異的にハイブリダイズしたところ試験した全動物種に少なくとも２つのＤＮＡバンドが得られた。したがって、ウシcＤＮＡプローブで確立したハイブリダイゼーション条件はヒト、マウス、ハムスター、ラットおよび犬などの他の動物種からの類似ＤＮＡにも適合されうると結論される。
【０１３３】
実施例３
ヒトＭＴＰの８８kＤa成分をコードするcＤＮＡクローンの単離およびＤＮＡ配列分析
Ａ．クローニングおよび配列分析
ヒトＭＴＰの８８kＤa成分の全コード配列を得るために、ヒト肝臓cＤＮＡライブラリイを前記ウシＭＴＰ cＤＮＡ挿入体でスクリーニングした。そのライブラリイはストラタジーン社から入手した。それは、ラムダＺＡＰベクターに直接クローンした(ＥcoＲＩ〜ＸhoＩ)オリゴdＴ挿入肝臓cＤＮＡを含んでいた。そのプローブはウシ小腸クローン番号２２の１０μgを通常のバッファー(ストラタジーン社)中ＥcoＲＩ ５０単位にて消化し、０.９％低融点アガロース(ベテスダ・リサーチ・ラボラトリース、メリーランド、ゲイサースバーグ)、ＴＡＥ(４０mＭトリスアセテート、１mＭ ＥＤＴＡ)および臭化エチジウム０.５μg／mlからなるゲルを通して８０〜１５０ボルトにて電気泳動に付すことにより調製した。得られた２.４kbフラグメントをサンブルックらの前記文献６．３０頁に記載のフェノール抽出によって精製した。その精製フラグメントをマルチプライムＤＮＡ標識キットおよびα−32ＰdＣＴＰ(アムシャム社)にて製造会社の仕様書にしたがって１０9cpm／μgまでアイントープ標識した。取込まれなかった32Ｐを、前記のようにセファデックスＧ−２５スピンカラムを用いて標識プローブから分離した。
ライブラリイからの１０6プラークを製造会社の仕様書に(ストラタジーン社)にしたがってスクリーニングした。大腸菌ＸＬ１Ｂlue株(ストラタジーン社)を、０.２％マルトースおよび１０mＭ硫酸マグネシウムを補充したＬＢブロス(バセスダ・リサーチ・ラボラトリース)５０ml中で３７℃にて一夜振盪して生育させた。その細胞を低速遠心で沈殿させ、１０mＭ硫酸マグネシウムにＯＤ600＝０.５となるように再懸濁し、４℃で保存した。ファージを５００００プラーク形成単位／２５μl  ＳＭバッファーの濃度に希釈した。各プレートについて、バクテリア６００μlおよびファージ２５μlを混合し、３７℃で１５分間培養した。ＮＺＹブロス(ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース)および０.７％アガロース(ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース)からなる上面寒天(６.５ml)を５０℃に予熱し、これを該バクテリアとファージの混合物に加え、ついで１５０mmＮＺＹプレートに塗布した。その上面寒天を固化させ、そのプレートを３７℃で一夜培養した。
ついでそのプレートを４℃にて２時間冷却し、プラークをニトロセルロースフィルター上にとった。２回濾過を行ない、そのプレートに相対して膜を合せフィルターを通して寒天プレートにまで達する針穴をつけて記録した。そのフィルターを０.５Ｎ水酸化ナトリウム、１.５Ｍ塩化ナトリウム中で１分間、１Ｍトリス(pＨ８.０)、３Ｍ塩化ナトリウム中で１分間、さらに２×ＳＳＣ中で１分間培養した。そのフィルターを真空室内で８０℃で２時間加熱した。ついで、そのフィルターを、ハイブリダイゼーションバッファー[６×ＳＳＣ、２０mＭ  ＮaＰＯ4、２×デンダルツ(Ｄendardts)、０.１％ＳＤＳ、および１００μg／ml鮭精子ＤＮＡ]５ml／フィルター中で６０℃にて２時間培養した。そのバッファーを、同量のハイブリダイゼーションバッファー(プローブを３.５×１０6cpm／フィルター濃度で含有)で置換し、６０℃で一夜培養した。そのフィルターを１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中でまず室温にて、ついで５０℃にて２時間洗浄した。オートラジオグラフィの結果、５６の陽性体が認められた。
各陽性体を含むアガロースの小部分にＳＭバッファー１mlおよびクロロホルム１滴を加えて４℃で一夜培養した。その陽性ファージを、前記のようにして、小密度(約５０〜５００／１００mmプレート)でプレートに塗布し、スクリーニングに付し、単一の陽性プラークを単離することにより精製した。
【０１３４】
ＸＬ１Ｂlue細胞をＺＡＰベクター(ストラタジーン社)で感染させ、ヘルパーファージで共感染させると、そのベクターのブルースクリプト部が選択的に増幅され、環状化され、ついで一本鎖ファージミド(phagemid)中にパックされる。このファージミドを純ＸＬ１Ｂlue細胞に感染させて二本鎖プラスミドに変換する。得られたプラスミドのcＤＮＡ挿入体は直接配列決定に付され得る。陽性ヒト肝臓cＤＮＡ挿入体を含むプラスミドをストラタジーン社のヘルパーファージを利用し、その会社の指示にしたがって切った。
これらのクローンからのＤＮＡを下記のとおり精製した。単一コロニーをＬＢ２mlに接種し、３７℃で一夜振盪培養した。その１.５mlを遠心し、ＬＢ５０μlに再懸濁させ、ＴＥＮＳ(１×ＴＥ、０.１Ｎ水酸化ナトリウム、０.５％ＳＤＳ)３００μlを加え、５秒間渦巻攪拌した。その試料を１０分間マイクロ遠心し、その上澄液を回収し、エタノール０.９mlを加え、それを１０分間マイクロ遠心にかけた。そのペレットを７％エタノールで洗浄し、乾燥し、ついでＴＥ(１０mＭトリスpＨ７.４、１mＭ  ＥＤＴＡ  pＨ８)２０μl中に再懸濁した。
そのクローンからのＤＮＡは下記の特徴を有した。各クローンからのＤＮＡ５μlをＥcoＲＩ １０単位、ＸhoＩ  １０単位、およびＲＮＡse１０μgにて消化させ、フラクションに分け、１％アガロース、ＴＢＥ(４５mＭトリス−ボレート、１mＭ  ＥＤＴＡ)、臭化エチジウム０.５μg／mlのゲルを通して電気泳動に付した。そのゲルのサウサーンブロッティングはサンブルックらの前記文献９．４１頁に記載の方法で行った。このサウサーンブロットはコードする配列の５'末端に近いウシcＤＮＡのフラグメントをプローブとして行った。この５'プローブは前記のウシ小腸クローン番号２の２５μgをＥcoＲＩ ５０単位およびＮheＩ ５０単位を用いて消化し、２％低融点アガロース、ＴＢＥおよび臭化エチジウム０.５μg／mlゲルから３７６塩基対フラグメントを前記のように単離し、前述のようにしてアイソトープ標識をした。その結果物は下記のとおりであった。クローン番号６９３は３.７kＢ挿入体で５'プローブハイブリダイズされ、クローン番号７５４は１.２kＢ挿入体で５'プローブでハイブリダイズされ、クローン番号６８１は１.８kＢ挿入体で５'プローブではハイブリダイズされない。
【０１３５】
これら３つのクローンを含む一夜培養物をアンピシリン１００μg／mlを含むＬＢ２００ml中で生育させた。大量のプラスミドをキアジエン・プラスミド・マキシプレプ・キット(Ｑiagen  plasmid  maxiprep  kit)を用い、その製造会社の指示にしたがって精製した。クローン番号６９３の配列をみると２つの挿入体を含んでいた。その５５００bp挿入体はハプトグロビンに類似しており、それ以上は検討しない。そのあとにミュータントＸhoＩおよびＥcoＲＩ制限部位があった(その２つの部位を直接クローニングに用いた)。その３'挿入体は所望のcＤＮＡであった。それはいくつかの５'非翻訳配列を含んでおり、３つのリーディングフレームすべてにおいて終止コドンより示された。塩基４８〜２７２９に８９４アミノ酸に対応するＡＴＧ−開始オープンリーディングフレームがある。その演繹アミノ酸配列は
ＭＩＬＬＡＶＬＦＬＣＦＩ  (配列番号２８)
で始まる。その終止コドンは塩基２７３０〜２７３２にあり、その引続いて４３５塩基の３'非翻訳領域およびポリＡ領域がある。クローン番号６８１の配列はこのクローン３'１７６８塩基であることが確認され、またクローン番号７５４は１〜４４２塩基であることが確認された。
【０１３６】
Ｂ．８８kＤa  mＲＮＡの組織局在
マルチ・ティシュー・ノーザン・ブロット(Ｍulti  Ｔissue  Ｎorthern  Ｂlot)(クロンテック社)は、ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨核筋、腎臓または膵臓からのポリＡ+ＲＮＡを２μg／レーン含有していた。ノーザンハイブリダイゼーションをゲノムサウサーンブロッティングと同様に行った。前ハイブリダイゼーションを、前記ウシ小腸クローン番号２２からの５.２×１０7dpm標識２.４kb  ＥcoＲＩフラグメントを用いて、ハイブリダイゼーションバッファー５０ml中３７℃で２時間、ついで新しいバッファー２０ml中６０℃で一夜行った。ノーザンブロットを０.２×ＳＳＣ５００ml、０.１％ＳＤＳ中６０℃で１時間洗浄し、−８０℃でオートラジオグラフィに付した。Ｘ線フイルムに２０時間暴らしたのち、肝臓ＲＮＡレーン中約４.４kbに顕著な信号があったが、他には検出しうるハイブリダイゼーションはなかった。したがって、ウシcＤＮＡの２.４kbフラグメントと交差ハイブリダイゼーションでヒト肝臓ＲＮＡを特異的に検出できる。肝臓と腸の２つの組織についてのみ著しいＭＴＰ活性が報告されていることから、そのクローニングおよびノーザンブロッティング分析はＭＴＰの生化学的局在を支持するものである。また、ノーザン分析の結果から、ＤＮＡ:ＲＮＡハイブリドならびにＤＮＡ:ＤＮＡ相互反応にもこの検定が広がり得る。
【０１３７】
実施例４
ヒト線維芽細胞のセルラインにおけるＭＴＰの発現
１．方法
下記のものを除いて、すべて前記サンブルックの文献に記載の標準的分子生物学教書にしたがって行った。この実施例で用いた制限酵素はすべてベセスダ・リサーチ・ラボラトリース(ＢＲＬ、メリーランド、ゲイサースバーグ)から入手した。ヌクレオチド−６４〜３１３５(翻訳開始部位ＡＴＧコドン(＋１)のＡでその翻訳開始部位に相関する)から延びる３.２kbフラグメントをプラスミドp７５４(塩基−６４〜３８４)およびp６９３(塩基３８５〜３１３５)から以下のようにして構築した。
４８８bpＥcoＲＩ−ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントおよび２７５０bp  ＮcoＩ−ＸhoＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントをp７５４およびp６９３から各々切り出した。ゲル精製に付したのち、それらフラグメントをＥcoＲＩ−ＸhoＩ開裂プラスミドpＢluescript−ＳＫに結紮してプラスミドpＢＳ／hＭＴＰを得た。その全hＭＴＰフラグメントをＨindＩＩＩおよびＸhoＩによる制限酵素エンドヌクレアーゼ消化によりpＢＳ／hＭＴＰから単離し、プラスミドpcＤＮＡ／Ｎeo(インビトロジエン社、カリフォルニア、サン・デイエゴ)にサブクローンしてプラスミドpcＤＮＡ／ＭＴＰを得た。これを、高活性サイトメガロウイルスプロモーターの転写制御下に完全長hＭＴＰをコードする配列に入れた。
プラスミドを１５０８Ｔ形質転換ヒト皮膚線維芽細胞(Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．２６７,１３２２９−３８,１９９２)中にリポフェクチン試薬(ＢＲＬ社)によりトランスフェクトした。その細胞は、トランスフェクション２４時間前に１００mm皿に全面の２５％密度で分配した。トランスフェクションに際して、プラスミドを５０mg／１００mmプレートで血清フリーのダルベッコ・モディファイド・イーグル培地(Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagles Ｍedium;ＤＭＥＭ)１.５mlに溶かし、リポフェクチン試薬１２０μlの血清フリーＤＭＥＭ１.５ml中溶液に滴下した。１５分間室温で培養したのち、トランスフェクション混合物を血清フリーＤＭＥＭ７mlを含む１５０８Ｔ培養物に加えた。２４時間後、トランスフェクション混合物を除き、１０％ウシ胎児血清を含む新しいＤＭＥＭ１０mlをさらに２４時間かけて加えた。その細胞を皿から取除き、氷冷塩化ナトリウムりん酸バッファー(ＰＢＳ)で２回洗浄した。前記“Ａssay  for  ＴＧ  transfer  activity  inＡbetalipoproteinemic  subjects"に記載の方法によって、細胞抽出、ＭＴＰ活性測定、およびウエスタン分析を行った。
【０１３８】
ＩＩ．結果
ＭＴＰの完全コード配列を含むcＤＮＡを発現ベクターpcＤＮＡ／ＮcoにサブクローンしてpcＤＮＡ／ＭＴＰを構築した。このプラスミドを、リポソーム仲介トランスフェクションにより、１５０８Ｔ形質転換ヒト皮膚線維芽細胞(Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．２６７,１３２２９−３８,１９９２)に一時的に発現させた。トランスフェクションから４８時間後に、親プラスミドpcＤＮＡ／Ｎcoでトランスフェクトした細胞からの抽出物にて試験したバックグラウンド水準以上でＴＧ転移活性が容易に検出できた。ウエスタンブロット分析によれば、pcＤＮＡ／ＭＴＰでトランスフェクトした細胞にはＭＴＰの８８kＤa成分の存在が認められたが、pcＤＮＡ／Ｎcoでトランスフェクトした細胞には無かった。トランスフェクトした細胞中の蛋白質量および活性をＨepＧ２細胞のものと比較すると、発現ＭＴＰは活性転移蛋白質のＰＤＩ複合体中に充分に取込まれていた。
【０１３９】
実施例５
ＭＴＰの阻害物質を同定するためのスクリーニング
このスクリーニングでは、検出し得る標識脂質(例えば、ＮＭＲ、ＥＳＲ、アイソトープまたは蛍光的に標識したＴＧ、ＣＥ、またはＰＣ)の、ＭＴＰ存在下での、ドナー粒子(例えば、ドナー膜、小胞またはリポプロテイン)からアクセプター粒子(例えば、アクセプター膜、小胞、またはリポプロテイン)への転移率を測定する。ＭＴＰ阻害物質(例えば天然物抽出物または公知化合物に含まれる)の存在下に観察される転移率の減少を、ＭＴＰ機能の阻害物質の同定および単離のための試験に用い得る。この目的に各種のアッセイが用いられ、例えば、ウェテロー＆チルバースミット(Ｗetteran＆Ｚilversmit)(Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．２５９,１０８６３−６、１９８４)またはウェテロー(Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．２６５,９８００−７,１９９０)が発表している合成小胞アッセイまたは前記“Ａssay  for  ＴＧ  transfer  activity  in  Ａbetalipoproteinemic  subjects"に記載のアッセイがある。そのアッセイの一例を以下に示す。
【０１４０】
Ａ．基質の調製
標識リポプロテインを用いた代表的なスクリーニングでは、モートンおよびチルバースミット(Ｍorton  Ｋ.Ｅ.et  al、Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．２５６,１９９２−５、１９８１)による脂質分散法により市販の材料を用いてリポプロテインを[3Ｈ]−ＴＧで標識する。本調製においては、[3Ｈ]トリオレイン(Ｔriolein,[９,１０−3Ｈ(Ｎ)]−、ＮＥＮ  Ｒesearch  Ｐroducts、カタログ番号ＮＥＴ−４３１)３７５μＣi、卵ホスファチジルコリン１.５mgおよび非標識トリオレイン１６０μgをクロロホルム中で混合し、窒素気流中で蒸発乾固する。５０mＭトリス−ＨＣl、０.０１％Ｎa2ＥＤＴＡ、１mＭジチオスレイトール(pＨ７.４)２mlを加え、そのチューブを窒素でフラッシュする。その脂質を渦巻攪拌により再懸濁させ、その懸濁液を越音波浴中で２０分間隔で２回超音波処理する。その超音波処理した脂質を、８.２mＭジエチルp−ニトロフェニルホスフェート(Ｓigma社カタログＮo.Ｄ９２８６)５.８mlおよび０.４Ｍ  Ｎa2ＥＤＴＡ０.５ml、４％ＮaＮ3を含む家ウサギ血漿(Ｐel−Ｆreez  Ｂiologicals,アーカンサス、ロジャーズ)７５mlに加える。その血漿を窒素下に３７℃で１６〜２４時間培養する。その培養物および非標識の対照血漿から、連続超遠心(Ｓchumaker＆Ｐuppion、Ｍethods  Ｅnzymology１２８,１５５−１７０、１９８６)によって、低密度リポプロテイン(ＬＤＬ)および高密度リポプロテイン(ＨＤＬ)を単離する。単離したリポプロテインを０.９％塩化ナトリウム、０.０１％Ｎa2ＥＤＴＡおよび０.０２％ＮaＮ3で４℃にて透析し、４℃で保存する。
【０１４１】
Ｂ．転移アッセイ
代表的な１５０μlアッセイでは、アイソトープ標識ＴＧの[3Ｈ]−ＨＤＬ(５μgコレステロール)ドナー粒子からＬＤＬ(５０μgコレステロール)アクセプター粒子への転移を、１５mＭトリス(pＨ７.４)、１２５mＭ  ＭＯＰＳ、３０mＭ酢酸ナトリウム、１６０mＭ  ＮaＣl、２.５mＭ  Ｎa2ＥＤＴＡ、０.０２％ＮaＮ3、０.５％ＢＳＡ(約５０〜２００ngの精製ＭＴＰ含有)を用い、９６ウエルプレート中で３７℃で３時間測定することにより転移活性を測定する。検体(例えば天然物の抽出物)をアッセイ用溶媒、例えばエタノール、メタノールまたはＤＭＳＯ中にとかした溶液(代表例は、１０％ＤＭＳＯに物質５μlを加えたもの)を培養前にウエルに加えてスクリーニングする。その転移は、新しく調製した４℃ヘパリン／ＭnＣl2溶液(１.０gヘパリン、シグマ社カタログ番号Ｈ３３９３の１８７Ｕ／mgを１.５Ｍ  ＭnＣl2１３.９mlに加えた、０.４％ヘパリン(１８７Ｉ.Ｕ.)／０.１Ｍ  ＭnＣl2)１０μＬを加えることにより終了し、3Ｈ−ＴＧ−ＬＤＬアクセプター粒子が沈殿し、そのプレートを８００×gで遠心する。[3Ｈ]−ＴＧ−ＨＤＬドナー粒子を含む各ウエルの上澄液のアリコートをシンチレーションカクテルに移し、その放射活性を定量する。その酵素活性はＴＧ転移率に基づき、下記式にしたがって算出される。
【０１４２】
【数２】
0004298801.tif 000048
そのようなアッセイでは、ＴＧ転換率はＭＴＰ濃度の増加と共に増加するであろう。阻害物質となり得るものはＴＧ転換率を減少するであろう。同様のアッセイを標識ＣＥまたはＰＣで行なうこともできた。
【０１４３】
実施例６
ＭＴＰ阻害物質の活性の同定と実証
１．方法
Ａ．ＭＴＰ阻害物質の同定
実施例５に記載の方法を用い、ＭＴＰ阻害化合物ＡおよびＢを同定した。ウシＭＴＰの触媒によるアイソトープ標識ＴＧのドナーＨＤＬからアクセプターＬＤＬへの転移率を試験した。この方法では、阻害物質がアイソトープ標識ＴＧの転移率を減少させた。
これらの化合物のＭＴＰ阻害活性は、前記“Ａssay for ＴＧ transfer activity in abetalipoproteinemic subjects"に記載の方法によって独立したアッセイで確認された。そのアッセイでウシＭＴＰの触媒によるアイソトープ標識ＴＧのドナーからアクセプターＳＵＶへの転移を測定した。
【０１４４】
Ｂ．細胞培養
ヒト肝臓芽細胞腫セルライン、ＨepＧ２をＡＴＣＣから入手した(メリーランド、ロックビル、ＡＴＣＣ  Ｎo.８０６５)。１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地を入れたＴ−７５培養フラスコでその培養物を５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で維持した[すべての細胞培養培地およびバッファーはギブコ・ライフ・テクノロジイーズ(ＧＩＢＣＯ Ｌife Ｔechnologies;メリーランド、ゲイサースバーグ)から入手した]。
蛋白質分泌に対する化合物ＡおよびＢの効果の測定は４８ウエルプレート中で行った。ＨepＧ２細胞を１:２に二次培養し、薬物処理前少なくとも２４時間で合流するようにさせた。薬物処理開始前に、培地を除き、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、新しい培地１mlを定量的に加えた。化合物Ａをジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)１０μl溶液として２組のウエルに加え種々の化合物濃度とした。ＤＭＳＯ単独(１０μl)を陰性コントロールとして用いた。[注:この濃度でのＤＭＳＯのＨepＧ２細胞に対する影響は無視しうる程度である]。標準的培養条件で１６時間培養したのち、そのプレートを２,５００rpmにて４℃で５分間遠心して遊離の細胞を沈殿させた。培地を細胞培養培地でアポリポプロテインＢ(アポＢ)およびヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)のアッセイでは１０倍に、またアポリポプロテインＡ１(アポＡ１)アッセイでは２０倍に希釈した。その細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、均質化バッファー(０.１Ｍりん酸ナトリウム(pＨ８.０)、０.１％トリトンＸ−１００)０.５mlを加えた。その細胞をマイクロピペット剤１mlにてトリチュレートして均質化し、クーマシー試薬(Ｃoomassie reagent、Ｐierce Ｃhemical Ｃo.、イリノイ、ロックフォード)を用い、その製造会社の仕様書にしたがって蛋白質を測定した。
【０１４５】
Ｃ．アポＢ、アポＡ１およびＨＳＡのＥＬＩＳＡアッセイ
蛋白質量の測定はサンドイッチ法にてＥＬＩＳＡアッセイで行った。マイクロタイタープレートを目的の蛋白質に特異的なモノクローナル抗体(第１抗体)(バイオデザインズ・インターナショナル、ミドルイングリッシュ、ケンバンクポート)で被覆し、ひき続き、抗原または試料、目的の蛋白質に直結するポリクローナル抗体(第２抗体)(バイオデザインズ・インターナショナル)、および第２抗体に直結するアルカリホスファターゼに結合した第３抗体(シグマ・バイオケミカル、ミズーリ、セントルイス)で被覆した。９６ウエルマイクロタイタープレート(Ｃorning  Ｎo.２５８０１)を希釈モノクローナル抗体１００μlにて室温で一夜被覆した(最終濃度:抗アポＢ、アポＡ１およびＨＳＡが各々１μg／ml、２μg／mlおよび４μg／ml、０.１Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム(pＨ９.６)およびナトリウムアチド０.２mg／ml中)。被覆は室温で各一夜行った。被覆後、各二次培養工程の間に、プレートを０.９％塩化ナトリウムおよび０.０５％ツイーン２０にて５分間洗浄した。希釈培養培地または標準品(細胞培養培地で０.３１２５−０.３２０ng／mlに希釈した精製アポＢ、アポＡ１またはＨＳＡ)の２重アリコット(１００μl)をモノクローナル抗体で被覆したウエルに加えた。室温で１.５時間培養したのち、その抗原または試料を除き、ウエルを洗浄した。第２抗体をＰＢＳ＋０.０５％ツイーン２０(バッファーＩＩＩ)中に１:５００に希釈し、ついで各ウエルにその１００μlを加え、室温で１時間培養した。その抗体を除き、ウエルを洗浄した。全第２抗体はヒト蛋白質に対する山羊で生成したポリクローナル抗血清であった。アルカリホスファターゼに結合した兎抗山羊ＴgＧをバッファーＩＩＩで１:１０００に希釈し、その１００μlを各ウエルに加えた。室温で１時間培養後、その抗体を除き、ウエルを８回洗浄した。基質p−ニトロフェニルホスフェート(シグマ・バイオケミカル、ミズーリ、セントルイス)を、０.０５Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム(pＨ９.８)＋１mＭ塩化マグネシウム中１mg／mlの量で加えた。室温で４５分間反応させたのち、そのアッセイを止め、０.１Ｍトリス(pＨ８.０)＋０.１Ｍ  ＥＤＴＡ１００μlを加えて色を安定化させた。そのマイクロタイタープレートをＶ−Ｍax９６−well plate reader(モレキュラー・デイバイシス、カリフォルニア、メンロパーク)中で４０５nmにて読み取った。
バックグラウンド値を差引いたのち、標準値をセミlogグラフ上にプロットし、対数回帰曲線を作った。その曲線の等式を用いてアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡの濃度を算出した。蛋白質濃度は、ng／ml／mg細胞蛋白質の単位にて、全細胞蛋白質の濃度に標準化した。各薬物処理は２回行い、その平均をとった。各薬物処理でのアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡの濃度をＤＭＳＯコントロールでの対応蛋白質濃度で割った。その結果をコントロール対薬物濃度の％としてプロットした。
【０１４６】
Ｄ．脂質分析
ＨepＧ２細胞を６ウエル皿で二次培養し、薬物処理前少なくとも２４時間で合流するようにさせた。薬物を加える前に、培地を除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培地(ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ)１mlを定量的に加えた。化合物ＡをＤＭＳＯ １０μl中溶液で２組みのウエルに加え種々の薬物濃度とした。ＤＭＳＯ単独(１０μl)を陰性コントロールとした。標準用細胞培養条件下に１６時間培養後、培地を除き、標準的培地(ＲＰＭＩ１６４０、脂肪酸フリーＢＳＡ１６.５mg／ml、１mＭナトリウムオレート、１mＭグリセリン、５μＣi／ml  3Ｈグリセリン(アマシャム、イリノイ、アーリントンハイツ、カタログ番号ＴＲＡ２４４)１mlを化合物Ａの第二回添加と同時に加えた。その培養物を標準的細胞培養条件下に２時間培養した。培地(１ml)を１５mlガラスチューブに移し、直ちに氷冷メタノール２mlおよび重水１mlで希釈した。その細胞をＰＢＳで１回洗浄し、前記１−Ｂの記載と同様にして全蛋白質の測定を行った。
その培地から全脂質を抽出し、以下のようにして分析した。クロロホルム５.０mlおよび２％酢酸０.２mlを加え、そのチューブを１分間渦巻攪拌し、２０００rpmにて５分間遠心して水層と有機層に分けた。上層の水層を除き、０.１％酢酸を含むメタノール−水(１:１)３.６mlを加えた。少し渦巻攪拌したのち、そのチューブを上記と同様に遠心し、再度水層を除いた。その有機層をきれいな１５mlグラスチューブに定量的に移し、窒素下に溶媒を蒸発させた。乾燥した脂質をクロロホルム０.１mlに溶かし、各試料３０μlをシリカゲル６０Ａの１９路薄層クロマトグラフィプレート(ワットマン社)上にスポットした。クロロホルム１０μl中ＴＧ５〜１０μgを担体として加え、そのプレートをヘキサン:ジイソプロピルエーテル:酢酸(１３０:７０:４、v／v)で展開した。乾燥後、そのプレートをヨードに暴して脂質を染色した。ＴＧに対応するバンドをシンチレーションバイアル中に削り取った。重水０.５mlおよびＥcoＬite(ＩＣＮバイオメディカル社)シンチレーション液１０mlを加え、その試料を激しく渦巻攪拌した。粗データを細胞蛋白質に標準化し、ＤＭＳＯコントロールの％で表わした。
【０１４７】
ＩＩ．結果
Ａ．ＭＴＰ阻害物質の同定
最初のスクリーンでは化合物ＡがＭＴＰ触媒による3Ｈ−ＴＧのＨＤＬからＬＤＬへの転移を阻害したことを示した。化合物ＡのＭＴＰ触媒による脂質転移阻害能は、ＭＴＰ触媒による3Ｈ−ＴＧのドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの転移を測定した第二アッセイによって確認された。化合物ＡのＩＣ50は約１μＭである(図１０)。
【０１４８】
Ｂ．アポＢおよびＴＧ分泌の阻害
化合物Ａを、０.１５６〜２０μＭの範囲で２倍希釈系にてＨepＧ２に加えた。標準的細胞培養条件下に１６時間培養後、その処理培地のアリコートについてＥＬＩＳＡにてアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡを試験した。アポＢ分泌は、５μＭのＩＣ50にて用量レスポンスにて阻害された(図１１)。アポＡ１およびＨＳＨの分泌は最大用量２０μＭまでは影響を受けなかった。その事から阻害がアポＢに特異的であることが確認された。これらのデータは、ＭＴＰ阻害物質のヒト肝セルラインへの添加がアポＢを含むリポプロテインの分泌を阻害することを示している。
アポＢ、アポＡ１およびＨＳＡ分泌試験と同じ条件下に、１.２５μＭ〜２０μＭの範囲の用量の化合物ＡでＨepＧ２細胞を処理した。ＴＧの細胞内プールを賦形剤または種々の用量の化合物Ａの存在下に3Ｈグリセリンで２時間アイソトープ標識した。培地中に蓄積したアイソトープ標識ＴＧを定量的抽出、薄層クロマトグラフィ法および全細胞蛋白質への標準化により測定した。ＤＭＳＯ単独をコントロールとして用いた。ＴＧ分泌は用量レスポンスにて化合物Ａで阻害された。そのＩＣ50は約２.０μＭで、アポＢ分泌の阻害におけるＩＣ50と類似していた(図１２)。そのデータは、化合物ＡがアポＢを含むＴＧに富んだリポプロテインの分泌を阻害することを示している。
上記実験方法を化合物Ｂについても行った。その結果、化合物ＢはＭＴＰ触媒による3Ｈ−ＴＧのドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの転移を阻害し、そのＩＣ50は約４〜６μＭであった(図１３)。アポＢを含むリポプロテインの分泌もＨepＧ２細胞において化合物Ｂにより阻害される(図１４)。
【０１４９】
実施例７
ＭＴＰ触媒によるＣＥおよびＰＣ転移の阻害
１．方法
ウシＭＴＰ触媒による膜間のＣＥまたはＰＣの転移に対する化合物Ａの効果を測定するために、ＳＵＶ間のＴＧ転移を測定する脂質転移アッセイを改変した。ドナー小胞の組成は、標識ＴＧの代りに０.２５モル％14Ｃ−ＣＥまたは14Ｃ−ＰＣを用いたことを除いて同一であった。アクセプター小胞の組成は、標識ＰＣおよび非標識ＴＧを含まないことを除いて同一であった。ドナー小胞の沈殿後に、転移反応で得られた上澄液中のアクセプター小胞の14Ｃ−ＣＥまたは−ＰＣと試験に供した全14Ｃ−ＣＥまたは−ＰＣと比較して脂質転移率を算出した。ＭＴＰ非存在下での上澄液中の標識脂質をＭＴＰ存在下での標識脂質から差引いて、ＭＴＰ触媒によるドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの脂質転移を算出した。該アッセイのその他の点は基本的に前記と同じである。
【０１５０】
ＩＩ．結果
ＭＴＰ触媒によるアイソトープ標識ＣＥおよびＰＣの膜間転移に対する化合物Ａの阻害能も調べた。化合物ＡはＴＧ転移の阻害と同等程度にＣＥ転移を阻害した。化合物ＡはＰＣ転移を阻害したが、ＣＥおよびＴＧ転移よりはＰＣ転移の阻害は効果が低かった。ＴＧおよびＣＥ転移が８０％以上減少させた阻害物質の濃度でＰＣ転移は約４０％阻害された。
【０１５１】
実施例８
ウシＭＴＰ−５'末端クローニング
ラムダgt１０を包含しているウシ小腸cＤＮＡライブラリイをクロンテック社から入手した(＃ＢＬ１０１０Ａ)。そのライブラリイを５００００ファージ／１００μl含有するようにＳＭに希釈した(１:１００,０００希釈)。その希釈ファージ(１００μl)を大腸菌Ｃ６００細胞(クロンテック社)３００μlと混合し、３７℃で１５分間培養した。上面にアガロース７mlを加え、その混合物をＬＢアガロース７５mlを含む１５０mmプレート上に注いだ。全２５枚のプレート(各々約５×１０4ファージを含有)をこの方法で調製した。そのプレートを３７℃で一夜培養した。
ファージＤＮＡを単離するために、各プレートにＳＭ(ゼラチンなし)を加えた。そのプレートを室温にて２時間ゆるやかに振動した。溶出したファージ(約８ml／プレート)を集めてプールした。大腸菌細胞を１２０００×gで１０分間遠心して沈殿させた。
ＱＩＡＧＥＮ ｔip−１００(midi)組成物を用い、その製造会社の指針にしたがって、上記上澄液からラムダＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡをＴＥ(１０mＭトリス−Ｃl(pＨ８.０)、１mＭ ＥＤＴＡ)の全２００μl中に再懸濁した。
ラムダファージＤＮＡ１μg(約３×１０7分子)を２mＭ塩化マグネシウム０.２mＭ各デオキシヌクレオチドトリホスフェート、１.２５×バッファーおよびＴaqポリメラーゼ(Ｐerkin−Ｅlmer  Ｃetus、キット＃Ｎ８０１−０５５５)を含むＰＣＲ反応液１００μlに加えた。各プライマーの濃度は０.１５mＭであった。前方プライマーの配列(配列番号２９)は下記の通りであった。
【表４３】
４１                                              ６６
ＧＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣ
該前方プライマーの配列は、ＭＴＰの８８kＤa成分の４１〜６６塩基をコードするヒトcＤＮＡに基づいたものであった。その後方プライマー(配列番号３０)は次の配列を有していた。
【表４４】
0004298801.tif 000049
該後方プライマーの配列は、ＭＴＰの８８kＤa成分をコードする公知のウシcＤＮＡに基づいたものであり、ヒトcＤＮＡの８０７〜７８５塩基に対応するウシcＤＮＡの６５８〜６３６塩基からハイブリダイズされる。
ＰＣＲ増幅はパーキン−エルマー、熱同期モデル９６００で行った。９７℃で２分間培養後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分間３５周期反応を行った。最終反応を７２℃で７分間行った。
そのＰＣＲ生成物を前記のとおりＴＡＥバッファー中１％アガロースゲルにて電気泳動に付した。所望の７６６塩基フラグメントの収量は約２μgであった。そのＤＮＡをゲルから切取り、ジーン・クリーン(Ｇene・Ｃlean)(Ｂiolol、カリフォルニア、ラ・ジョラ)を用いて精製し、平滑末端とし、pＵＣ１８−ＳmaＩ(ファルマシア社)にクローンし、前述のように配列決定した。
ＭＴＰの８８kＤa成分の５'領域をコードするウシcＤＮＡから得られる新しい配列は配列番号５に示す。その配列は既報のウシcＤＮＡの５'末端に８８塩基を加えたものであった。
【０１５２】
実施例９
ＭＴＰの８８kＤa成分のためのヒトゲノムＤＮＡの配列決定
ヒトゲノムＤＮＡの配列決定を、前述の“Ｄemonstration of a gene defect in a second abetailpoproteinemic subject"および実施例１に記載の方法で行った。その結果はヒトゲノムの配列番号８のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウシcＤＮＡクローンを示す。５つのウシcＤＮＡ挿入体を図示している。図中の最上段の連続線は単離した全cＤＮＡ配列を示す。その線の上の小さい標識棒線はペプチドおよびプローブ配列の地図である。そのオープンリーディングフレームは第二線で示しており、それに続く＊＊印は３'非コード配列に相当する。クローン番号および長さを、その複合配列の対応領域を示す各線の左側に示している。クローン６４および７６はプローブ２Ａで単離し、クローン２２および２３はプローブ３７Ａで、またクローン２はプローブ１９Ａで単離した。cＤＮＡライブラリイ構築中に加えたＥcoＲＩリンカーは各挿入体の５'および３'末端でのＥcoＲＩ制限部位を与える。挿入体２２および７６における内部ＥcoＲＩ部位は該cＤＮＡ配列でコードされる。ＮheＩ制限部位をヒトcＤＮＡクローン(下記)単離用プローブの調製に利用した。各挿入体の線の下側の矢印は各々の配列決定反応を示す。
【図２】正常人におけるＴＧ転移活性を示す。蛋白質で刺激された14Ｃ−ＴＧのドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの転移を５人の正常人から得た。均質化腸生検体にて測定した。その結果を、均質化腸生検蛋白質の機能として１時間当りのドナーＴＧ転移％で示した。
【図３】無ベータリポプロテイン血症の者におけるＴＧ転移活性を示す。蛋白質で刺激された14Ｃ−ＴＧのドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの転移を４人の欠β−リポプロテイン血症者から得た均質化腸生検体にて測定した。その結果を均質化腸生検蛋白質の機能として１時間当りのドナーＴＧ転移％で示した。
【図４】コントロールにおけるＴＧ転移活性を示す。均質化腸生検における蛋白質で刺激された14Ｃ−ＴＧのドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの転移を３人のコントロール体から得たるその１人は(○印)、１人は同質接合的低ベータリポプロテイン血症の者(●印)および１人は非絶食者(×印)のものであった。その結果は均質化腸生検蛋白質の機能として１時間当りのドナーＴＧ転移％で示した。
【図５】正常人におけるＭＴＰのウエスタンブロッティング分析結果を示す。精製ウシＭＴＰのアリコート(レーン１)または３人の正常人からの均質化腸生検体２３μgを１０３,０００×g遠心後デオキシコレート処理した蛋白質(レーン２〜４)をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに転移した。そのブロットは抗８８kＤaでプローブした。
【図６】コントロールにおけるＭＴＰのウエスタンブロッティング分析結果を示す。精製ウシＭＴＰのアリコート(レーン１)またはキロミクロン貯留病(レーン２)、同質接合的低ベータリポプロテイン血症者(レーン３)、および非絶食者(レーン４)からの均質化腸生検体１５μg、２５μgおよび２５μgを１０３,０００×g遠心後デオキシコレート処理した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに転移した。そのブロットは抗８８kＤaでプローブした。
【図７】アフィニティクロマトで精製した抗体にて正常人におけるＭＴＰのウエスタンブロッティング分析結果を示す。精製ウシＭＴＰのアリコート(レーン１)または２人の正常人からの均質化腸生検体の３４μg(レーン２)または２５μg(レーン３)の１０３,０００×g遠心後デオキシコレート処理蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画して、ニトロセルロースに転移した。ブロットはアフィニティクロマト精製抗８８kＤaでプローブした。
【図８】無ベータリポプロテイン血症者におけるＭＴＰのウエスタンブロッティング分析結果を示す。精製ウシＭＴＰのアリコート(レーン１)または４人の異なる無ベータリポプロテイン血症者からの均質化腸生検体の１８μg(レーン２)、２３μg(レーン３)、２３μg(レーン４)、２３μg(レーン５)の１０３,０００×g遠心後デオキシコレート処理蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに転移した。レーン６および７では全腸均質体(レーン４および５に対応する者の)１００μgをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに転移した。ブロットは抗８８kＤaでプローブした。
【図９】無ベータリポプロテイン血症者における遺伝子欠損についてサウサーンブロッティング分析結果を示す。コントロール、無ベータリポプロテイン血症者(プロバンド)、および該無ベータリポプロテイン血症者の母および父からのゲノムＤＮＡ１０μgをＴaqＩで完全に切り、１％アガロースで電気泳動に付し、ニトロセルロースに転移した。プローブとしてエクソン１３cＤＮＡを用いてサウサーンハイブリダイゼーションを行った。正常レーンでの２つのハイブリダイゼーションバンドは正常エクソン１３にＴaqＩ部位が存在することを示した。無ベータリポプロテイン血症者のレーンにおける１つのハイブリダイゼーションバンドは、エクソン１３における両アレルにこの制限配列が無いことを示しており、この者に同質接合的変異があることを確認した。母および父に異質接合的状態があることが３つのハイブリダイゼーションバンドにより示され、それらは正常および変異制限パターンの両方に対応していた。
【図１０】ＭＴＰ触媒によるドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへのＴＧ転移の化合物Ａによる阻害を示す。化合物ＡをＤＭＳＯに溶かし１５／４０バッファーで希釈する。アリコートを脂質転移アッセイ系に加えて化合物を表示最終濃度にした。アッセイにおけるＤＭＳＯ濃度は２μl／６００μlを超えないようにし、その濃度はそのアッセイに対する影響が最小になるように独立して決定した。ＭＴＰ触媒による脂質転移を３７℃で３０分間測定した。ＴＧ転移を阻害物質を用いないコントロールアッセイと比較して計算した。３つの独立したアッセイ条件を化合物ＡによるＭＴＰ阻害を例示するために用いた。そのアッセイ条件は、ドナーＰＣ８nmol、アクセプターＰＣ４８nmol、ＭＴＰ７５ng(○印);ドナーＰＣ２４nmol、アクセプターＰＣ１４４nmol、ＭＴＰ１００ng(●印);ドナーＰＣ７２nmol、アクセプターＰＣ４３２nmol、ＭＴＰ１２５ng(□印)であった。
【図１１】ＨepＧ２細胞からのアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡの分泌に対する化合物Ａの用量レスポンスを示す。ＨepＧ２細胞を表示の用量の化合物Ａで１６時間処理した。培養後の細胞培養培地中のアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡの濃度を適当なＥＬＩＳＡアッセイで測定し、全細胞蛋白質に標準化した。示したデータはコントロール(ＤＭＳＯのみ)の％で表わしている。
【図１２】ＨepＧ２細胞からのＴＧ分泌に対する化合物Ａの効果を示す。ＨepＧ２細胞を表示の用量の化合物Ａで１８時間処理し、その最後の２時間は３Ｈ−グリセロール５μＣi／mlの存在下に行った。細胞培養培地中のアイソトープ標識トリグリセライドの濃度を定量的抽出、ひき続き薄層クロマトグラフィ分析および全細胞蛋白質への標準化により測定した。示したデータはコントロール(ＤＭＳＯのみ)の％として表示している。
【図１３】ＭＴＰ触媒によるＴＧのドナーＳＵＶからアクセプターＳＵＶへの転移の化合物Ｂによる阻害を示す。化合物ＢをＤＭＳＯに溶かし、１５／４０バッファーで希釈した。アリコートを脂質転移アッセイ系に加え、その化合物を表示の最終濃度にした。そのアッセイにおけるＤＭＳＯ濃度は２μl／６００μlを超えないようにし、その濃度はそのアッセイに対する影響が最小になるように独立に決定した。ＭＴＰ触媒による脂質転移を３７℃で３０分間測定した。ＴＧ転移は、阻害物質なしで行ったコントロールアッセイと比較して計算した。２つの独立したアッセイ条件を化合物ＢによるＭＴＰ阻害を例示するために用いた。そのアッセイ条件は、ドナーＰＣ２４nmol、アクセプターＰＣ１４４nmol、ＭＴＰ１００ng(○印);ドナーＰＣ７２nmol、アクセプターＰＣ４３２nmol、ＭＴＰ１２５ng(●印)であった。
【図１４】ＨepＧ２細胞からのアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡ分泌に対する化合物Ｂの用量レスポンスを示す。ＨepＧ２細胞を表示の用量の化合物Ｂで１６時間処理した。培養後の細胞培養培地におけるアポＢ、アポＡ１およびＨＳＡの濃度を適当なＥＬＩＳＡアッセイで測定し、全細胞蛋白質に標準化した。示したデータはコントロール(ＤＭＳＯのみ)の％として表示した。
【図１】
0004298801.tif 000050
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004298801.tif 000059
【図１１】
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【図１２】
0004298801.tif 000061
【図１３】
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【図１４】
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