(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１、第２、第３及び第４の色素ターミネーター分子と熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとを含む、ＤＮＡ配列決定のためのキットであって、各々の色素ターミネーター分子が異なっていて、次の式（Ｉ）の化合物を含む、キット。
【化１】
0004306960.tif 000014
［式中、Ａは次の構造のシアニン色素であり、
【化２】
0004306960.tif 000015
（曲線はシアニン色素の式に必要な炭素原子を意味し、Ｘ及びＹはＯ、Ｓ及びＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3からなる群から選択され、ｍは１、２、３及び４からなる整数から選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は独立してＨ、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸又はスルホネート基、エステル、アミド、エーテル、アルキル又はアリール基及びＢから選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6又はＲ7の一つはＢである。）、
Ｂは１０〜２５原子長のリンカーであって、原子は炭素、窒素、酸素、置換炭素及び硫黄から選択され、リンカーは一端でＡに及び他端でＣに結合しており、
Ｃは
【化３】
0004306960.tif 000016
からなる群から選択されるジデオキシヌクレオチドであり、リンカーはプリン（ｄｄＧ、ｄｄＡ）の７位及びピリミジン（ｄｄＴ、ｄｄＣ）の５位に共有結合し、Ｒは一又は三リン酸である。］
【請求項２】
前記ポリメラーゼが、変えられたｄＮＭＰ結合部位を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、天然ポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレオチドの結合が改善されているものである、請求項１記載のキット。
【請求項３】
次の式（Ｉ）の化合物。
【化４】
0004306960.tif 000017
［式中、Ａは次の構造のシアニン色素であり、
【化５】
0004306960.tif 000018
（曲線はシアニン色素の式に必要な炭素原子を意味し、Ｘ及びＹはＯ、Ｓ及びＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3からなる群から選択され、ｍは１、２、３及び４からなる整数から選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は独立してＨ、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸又はスルホネート基、エステル、アミド、エーテル、アルキル又はアリール基及びＢから選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6又はＲ7の一つはＢである。）、
Ｂは１０〜２５原子長のリンカーであって、原子は炭素、窒素、酸素、置換炭素及び硫黄から選択され、リンカーは一端でＡに及び他端でＣに結合しており、
Ｃは
【化６】
0004306960.tif 000019
からなる群から選択されるジデオキシヌクレオチドであり、リンカーはプリン（ｄｄＧ、ｄｄＡ）の７位及びピリミジン（ｄｄＴ、ｄｄＣ）の５位に共有結合し、Ｒは一又は三リン酸である。］
【請求項４】
前記リンカーが
−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−、
−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）9−ＮＨ−ＳＯ2−、
−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）10−ＮＨ−ＣＯ−、
−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−、
−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−、及び
−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）10−ＣＯ−
からなる群から選択される、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
次の式（ＩＩ）の化合物。
【化７】
0004306960.tif 000020
【請求項６】
次の式（ＩＩＩ）の化合物。
【化８】
0004306960.tif 000021
【請求項７】
次の式（ＩＶ）の化合物。
【化９】
0004306960.tif 000022
【請求項８】
次の式（Ｖ）の化合物。
【化１０】
0004306960.tif 000023
【請求項９】
式Ｉの化合物を含むデオキシリボ核酸。
【請求項１０】
式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶの化合物を含むデオキシリボ核酸。
【請求項１１】
式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶの化合物を含むＤＮＡ配列決定用キット。
【請求項１２】
更に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
ポリメラーゼが変えられたｄＮＭＰ結合部位を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、天然ポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレオチドの結合が改善されているものである、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
ＤＮＡ分子とハイブリダイズできるプライマーとＤＮＡ分子の、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと一連の４つの色素ターミネーターとを含む容器中でのインキュベート、及びサイズに従ってインキュベーション反応のＤＮＡ生産物を分離し、それによりＤＮＡ分子の少なくとも一部の塩基配列が決定できる段階を含む、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の決定法であって、上記色素ターミネーターの各々が次の式（Ｉ）の化合物を含む、方法。
【化１１】
0004306960.tif 000024
［式中、Ａは次の構造のシアニン色素であり、
【化１２】
0004306960.tif 000025
（曲線はシアニン色素の式に必要な炭素原子を意味し、Ｘ及びＹはＯ、Ｓ及びＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3からなる群から選択され、ｍは１、２、３及び４からなる整数から選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は独立してＨ、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸又はスルホネート基、エステル、アミド、エーテル、アルキル又はアリール基及びＢから選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6又はＲ7の一つはＢである。）、
Ｂは１０〜２５原子長のリンカーであって、原子は炭素、窒素、酸素、置換炭素及び硫黄から選択され、リンカーは一端でＡに及び他端でＣに結合しており、
Ｃは
【化１３】
0004306960.tif 000026
からなる群から選択されるジデオキシヌクレオチドであり、リンカーはプリン（ｄｄＧ、ｄｄＡ）の７位及びピリミジン（ｄｄＴ、ｄｄＣ）の５位に共有結合し、Ｒは一又は三リン酸である。］
【請求項１５】
ＤＮＡ分子とハイブリダイズできるプライマーとＤＮＡ分子の、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶの化合物とを含む容器中でのインキュベート、及びサイズに従ってインキュベーション反応のＤＮＡ生産物を分離し、それによりＤＮＡ分子の少なくとも一部の塩基配列が決定できる段階を含む、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の決定法。
【請求項１６】
該ポリメラーゼが、変えられたｄＮＭＰ結合部位を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、天然ポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレオチドの結合が改善されているものである、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、色素ターミネーター核酸配列決定および該配列決定のための試薬に関する。
【０００２】
(発明の背景)
以下は関連技術の記載であるが、いずれも特許請求の範囲の先行文献とは認められない。
配列反応性産物は標識されなければならない。こでは標識プライマー、標識ヌクレオチド(通常放射標識dNTP)または標識ddNTPターミネーターを使用して行うことができる。標識ターミネーターの使用は、偽停止を検出不可能のままにする利点を有する。
【０００３】
DNA配列バンドは必ずしも均質強度である必要はない。それは数的に変わりやすいバンド強度を示すのに有用である。これは、DNA配列の近くのバンド(恐らく４０塩基の窓内の)の最大対最小強度の比率の報告、またはバンド強度の二乗平均の報告による全体的“ドリフト”の標準化および補正により行うことができる(典型的にピーク高)(Fuller, C.W., Comments 16(3):1-8, 1989)。配列精度および読解長がより均質な強度のバンドで改善されるため、バンド強度の均質化が有利である。
【０００４】
正確な読解のために、一定の配列反応性産物の移動性はその長さのみに比例した速度で電気泳動ゲルを通して移動しなければならない。一定の長さで通常のものよりも速くまたは遅く移動する生産物は、配列あいまい性または“圧縮”として既知の誤りをもたらす。
【０００５】
異常な移動速度は、DNAの２次的構造によりもたらされ得、恐らくGC−リッチ領域での放射性標識(および他の)配列決定実験で見られる殆どの“圧縮”人工品の原因である。これらはしばしば７−デアザ−dGTPまたはdITPのようなdGTPのアナログの使用により解決され得る。他の圧縮様人工品は、ある色素標識ddNTPを配列決定に使用したときに観察される。この幾つかの例が、Lee, L.G., Connell, C.R., Woo, S.L., Cheng, R.D., McArdle, B.F., Fuller, C.W., Halloran, N.C., and Wilson. R.K., Nucleic Acids Res., 20:2471-2483, 1992 (テトラメチルボディピ(tetramethylbodipy)およびTMRで標識したddCTPまたはビフルオルで標識したddGTPを使用した図４ｇ、４ｈおよび６ｈ参照)で見ることができる。これらの圧縮様人口品は、放射活性的にまたは色素標識プライマーで配列決定したとき無圧縮である配列であってさえ、製造される。これらの人工品は、ある場合、dITPをdGTPにまたはアルファ−チオdNTPを正常dNTPに置換することにより除かれ得る(Lee, L.G. et al., Nucleic Acids Res., 20:2471-2483, 1992；米国特許5,187,085号)。Applied Biosystemsから、T7 DNAポリメラーゼでの配列決定の色素ターミネーター配列のために販売されてるフルオレッセイン色素標識ddNTPでみられる同様の人工品は、アルファ−チオdNTPを通常dNTPに変えることにより解決される(Lee, L.G. et al., Nucleic Acids Res., 20:2471-2483, 1992；米国特許5,187,085号)。
【０００６】
Prober, J.M., Trainor, G.L., Dam, R.J., Hobbs, F.W., Robertson, C.W., Zagursky, R.J., Cocuzza, A.J., Jensen, M.A. and Baumeister, K., Science 238:336-41 (1987)は、置換スクシニルフルオレッセインで標識したターミネーターと、１０原子長のリンカーを、dATP、dCTP、dTTP、７−デアザ−dGTPおよびＡＭＶ逆転写酵素と共に、および蛍光検出装置を使用した配列決定を行った。この文献の図６から、全体のバンド強度は１０倍以上変化し、色素プライマーまたは放射活性標識による現在の方法から利用可能な最良のものよりはるかに大きい。
【０００７】
Prober et al. (1987)ターミネーターと同じ塩基構造であるが、スクシニルフルオレッセインの代わりに４つのローダミン色素および５原子長のリンカーを使用したジデオキシNTPターミネーターは、Taqポリメラーゼでの配列決定に使用されている。これらのターミネーターを使用するために、dITPをdGTPまたは７−デアザ−dGTPの代わりに使用し、ひどい“圧縮”人工品を除く。この方法は、クローン化Taq DNAポリメラーゼ(Bergot, WO9105060; Parker, L.T., Deng, Q, Zakeri, H., Carlson, C. Nickerson, D.A., Kwok, P.Y., Biotechniques 19(1):116-121, 1995)および５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くTaqポリメラーゼの変異体(D49G、AmpliTaq CS)を使用して行われている。しかし、バンド強度は２０倍ほど変化し、本方法で可能な精度および読解長を限定する(Parker, L.T., Zakeri, H., Deng, Q., Spurgeon, S., Kwok, P.Y., Nickerson, D.A., Biotechniques 21(4):694-699, 1996)。
【０００８】
Lee, L.G., Connell, C.R., Woo, S.L., Cheng, R.D., McArdle, B.F., Fuller, C.W., Hallorand, N.D. and Wilson, R.K., Nucleic Acid Res., 20:2471, 1992)は、一連のddNTPターミネーターおよびT7 DNAポリメラーゼでの配列決定を記載する。全て、本質的にTaq配列決定で使用されるローダミンターミネーターと同じ方法でddNTPに結合したフルオレッセイン色素を有する。これらは修飾T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase(登録商標)バージョン２.０)およびアルファ−チオdNTPと使用する。チオdNTPを、dITPがTaq色素−ターミネーター法で使用されるように、“圧縮”人工品の解決に使用する。このシステムでの結果は、バンドが約１０倍の強度で変化するものである。
【０００９】
Wayne Barnesは、FY修飾ポリメラーゼおよびMn2+との色素ターミネーターのプロトコールを刊行している(Scientech Corp. St. Louis, MO)。バンドは本方法ではより均質であり、最大約４.５倍変化する。
【００１０】
１２原子の長さのリンカーを有するフルオレッセイン−１２ddNTPおよび１１原子の長さのリンカーを有するビオチン−１１ddNTPが利用可能である(Dupont NEW, Wilmington, DE)。これらの標識ddNTPは配列決定反応に有用であると記載されている。
【００１１】
ABI PRISMは、配列決定のための８原子長のプロパルギル／エチレンオキサイド／アミノ(“EO”)リンカーによりターミネーターに結合したジクロロローダミン色素を記載する(Rosenblum, B.B., Lee, L.G., Spurgeon, S.L., Khan, S.H., Menchen, S.M., Heiner, C.R., and Chen, S.M., Nucleic Acids Res. 25(22):4500-4504, 1997)。
シアニン色素は配列決定のための色素ターミネーターとして使用されている(Lee et al., Nucleic Acids Res., 20(10):2471, 1992)。
【００１２】
(発明の要約)
本発明は、DNA配列決定における均質バンド強度の提供および色素誘導圧縮人工品の解決を含む、多くの生理学的方法で有用な新規ジデオキシ色素標識ターミネーターを提供する。本発明のジデオキシ色素標識ターミネーターは、熱安定性であるか、変えられたdNMP結合部位を含むDNAポリメラーゼとの使用に特に適している(Tabor et al., 米国特許5,614,365)。本発明のターミネーターの配列決定への使用は、dITPまたはアルファ−チオヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログを色素誘導圧縮人工品の除去に使用する必要がない。出願人は、驚くべきことに、色素分子とヌクレオチドの結合の長さとバンドの間に強い相関があるが、色素のタイプ(または他のパラメーター)とバンド均一性には殆ど相関がないことを発見した。１０またはそれ以上の原子(伸長リンカー)から２５原子まで(１０、１１、１２......２５)のリンカーを有する色素ターミネーターは、配列決定反応で使用したとき、１０原子より短いリンカーの色素ターミネーターと比較して、有意に改善された均一性バンドを配列決定ゲルに産生する。
【００１３】
本発明の伸長リンカーを有する色素ターミネーターは、典型的に熱安定性DNAポリメラーゼ有りまたは無しの４個(ＡＴＧＣ)のグループを提供し、特に配列分析の方法で有用である。
【００１４】
第１の態様において、本発明は、各々の色素ターミネーター分子が色素分子、少なくとも１０原子の長さのリンカーおよび一または三リン酸としてddATP、ddCTP、ddGTPまたはddTTPのいずれかを含む第１、第２、第３および第４色素ターミネーター分子ならびに熱安定性DNAポリメラーゼを含む、DNA配列決定のためのキットに関する。
【００１５】
“色素分子”は、フルオレッセイン、ローダミン、テキサスレッド、エオシン、リッサミン(lissamine)、クマリン、シアニンおよびこれらの分子の誘導体を含むがこれらに限定されない検出可能な放出スペクトルを有する分子を意味する。色素はまたドナーおよびアクセプター色素を含むエネルギー移動色素を含む。
【００１６】
“リンカー”は、色素分子にジデオキシヌクレオチドにより結合している炭素、窒素および酸素を含む少なくとも１０個の原子の鎖を意味する。鎖はまた置換炭素または硫黄を含み得る。結合は典型的にはヌクレオチドの芳香族塩基部分で起こる。塩基に結合したリンカーの最初の２つの原子は、典型的に３重結合で結合する。
【００１７】
“置換炭素”は、１個またはそれ以上の水素がヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、酸素、硫黄、窒素、ハロゲン、−Ｎ(ＣＨ3)2、アミノおよび−ＳＨのようなしかしこれらに限定されない置換基で置換されていることを意味する。
“熱安定性DNAポリメラーゼは”、DNAポリメラーゼが９０℃で５分より長い半減期を有することを意味する。これらのポリメラーゼは、Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermus flavus、Thermococcus littoralis、Pyrococcus furiosus、Thermotoga maritinmaおよびThermotoga neapolitanaによりコードされるDNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
好ましい態様において、熱安定性DNAポリメラーゼは、変えられたdNMP結合部位を有し、天然ポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレオチドの結合が改善されている。変えられたdNMP結合部位を有するDNAポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの間を有意に識別しない。ジデオキシヌクレオチドが挿入される機会は、ジデオキシヌクレオチドと同じであるか、少なくともデオキシヌクレオチドの１／１０の効率である。
【００１９】
第２の態様において、本発明は式(Ｉ)
【化８】
0004306960.tif 000002
〔式中、
Ａは構造
【化９】
0004306960.tif 000003
のシアニン色素であり、曲線はシアニン色素の式に必要な炭素原子を意味する；ＸおよびＹはＯ、ＳおよびＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3からなる群から選択される；ｍは１、２、３および４からなる整数から選択される；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立してＨ、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸またはスルホネート基、エステル、アミド、エーテル、アルキルまたはアリール基、およびＢから選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の一つはＢである。
Ｂは少なくとも１０原子長のリンカーであり、原子は炭素、窒素、酸素、置換炭素および硫黄から選択され、リンカーは一端でＡにおよび他端でＣに結合している。
Ｃは
【化１０】
0004306960.tif 000004
からなる群から選択されるジデオキシヌクレオチドであり、リンカーはプリン(ddG、ddA)の７位およびピリミジン(ddT、ddC)の５位に共有結合し、ｒは一または三リン酸である〕
の化合物に関する。
【００２０】
“スルホン酸またはスルホネート基”なる用語は、ＳＯ3Ｈまたはその塩を意味する。
“エステル”なる用語は、式−(Ｒ)n−ＣＯＯＲ'(式中、ＲおよびＲ'は独立して飽和または不飽和アルキルおよび５員または６員アリールまたはヘテロアリールから選択され、ｎは０または１である)の化学部分を意味する。
【００２１】
“アミド”なる用語は、式−ＮＨＣＯＲ(式中、Ｒは水素、アルキル、ヒドロキシルおよび５員または６員アリールまたはヘテロアリールから選択され、環は所望によりアルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロまたはエステルから選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい)の化学置換基を意味する。
【００２２】
“エーテル”なる用語は、式Ｒ−Ｏ−Ｒ'(式中、ＲおよびＲ'は独立して飽和または不飽和アルキルおよび５員または６員アリールまたはヘテロアリールから選択され、ｎは０または１である)の化学部分を意味する。
【００２３】
“アルキル”なる用語は、直鎖または分枝鎖脂肪族炭化水素を意味する。アルキル基は、好ましくは１から１０炭素原子、より好ましくは１から７炭素、最も好ましくは１から４炭素の低級アルキルである。典型的アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、３級ブチル、ペンチル、ヘキシル等を含む。アルキル基は、置換されており、典型的アルキル置換基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、酸素、硫黄、ニトロキシ、ハロゲン、−Ｎ(ＣＨ3)2、アミノ、および−ＳＨを含む。
【００２４】
“アリール”なる用語は、結合したパイ電子系を含む少なくとも一つの芳香族基を意味し、炭素環式アリール(例えば、フェニル)および複素環式アリール基(例えばピリジン)の両方を含む。“炭素環式”なる用語は、１個またはそれ以上の共有結合的に閉環した環構造を含み、環の骨格を作る原子が全て炭素原子である化合物を含む。本用語は、従って、炭素環を、少なくとも一つの炭素と異なる原子を含む環骨格を含む複素環と区別する。“ヘテロアリール”なる用語は、少なくとも一つの複素環を含むアリール基を意味する。
【００２５】
好ましい態様において、リンカーは：
−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＯ−、
−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)9−ＮＨ−ＳＯ2−、
−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)10−ＮＨ−ＣＯ−、
−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−、
−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−、および
−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)10−ＣＯ−
からなる群から選択される。
【００２６】
好ましい態様において、ジデオキシ色素ターミネーターは、式(II)：
【化１１】
0004306960.tif 000005
の化合物；式(III)
【化１２】
0004306960.tif 000006
の化合物；式(IV)
【化１３】
0004306960.tif 000007
の化合物；式(Ｖ)の化合物である。
【００２７】
Cy5.5 ddGTPおよびddCTP化合物は、１０原子長のリンカーを有する。Cy5.5 ddCTPおよびddTTP化合物は、１７原子長のリンカーを有する。
第３の態様において、本発明は式Ｉ、II、III、IVまたはＶを含むじでオキシカルボン酸配列に関する。
好ましい態様において、本発明は式II、III、IVおよびＶを含むDNA配列決定のためのキットに関する。
【００２８】
更なる好ましい態様において、キットは更に熱安定性DNAポリメラーゼを含む；熱安定性DNAポリメラーゼは、変えられたdNMP結合部位を有し、天然ポリメラーゼと比較して、ジデオキシヌクレオチドの取り込みが改善されている。
【００２９】
出願人は、バンド均質性と最も強く相関するのは、色素とddNTPの間のリンカーの長さであることを驚くべきことに発見した。出願人は、色素とヌクレオチドの間のリンカー長を、任意の色素：ddNTP組合わせに関して、少なくとも１０塩基長に延ばすことにより、バンド均一性が実質的に改善され、色素誘導圧縮人工品が存在しないことを発見した。
【００３０】
従って、第４の態様において、本発明は、DNA分子とハイブリダイズできるプライマーとDNA分子の、熱安定性DNAポリメラーゼ、色素とヌクレオチドの間に少なくとも１０原子のリンカーを有する色素ターミネーターを含む容器中でのインキュベート、およびサイズに従ってインキュベーション反応のDNA生産物を分離し、それによりDNA分子の少なくとも一部の塩基配列が決定できる段階を含む、DNA分子のヌクレオチド塩基配列の決定法に関する。
【００３１】
好ましい態様において、色素ターミネーターは式Ｉ、II、III、IVまたはＶの化合物である；熱安定性DNAポリメラーゼはdNMP部位を変えられている。
本発明の他の性質および利点は、好ましい態様の以下の記載および特許請求の範囲から明らかになる。
本明細書で引用の全ての商品、刊行物および特許は、その全体を引用して本明細書に包含させる。
【００３２】
(図面の説明)
図１は、BamHI部位に挿入されたラムダおよびCy5.5 ddGTP、ddATP、ddTTPおよびddCTP色素ターミネーターから、１１５bp SauAIフラグメントを含むM13mp18を使用して産生したDNA配列データを示す。
図２はバンド強度可変性(rms)対リンカー長(原子)のグラフである。
【００３３】
(好ましい態様の記載)
以下の実施例は本発明の種々の具体的態様および態様の説明のために提供し、いかなる方法でも範囲を限定する意図はない。
【００３４】
実施例１：Cy5.5で標識した色素ターミネーターをプロパルギルアミノジデオキシヌクレオチド(Rober, J.M., Trainor, G.L., Dam, R.J., Hobbs, F.W., Robertson, C.W., Zagursky, R.J., Cocuzza, A.J., Jensen, M.A. and Baumeister, K., Science 238:336-41 (1987); 米国特許5,242,796、5,306,618および5,332,666)および“CyDye Fluorolink Cy5.5モノ反応性色素”生産物PA25501(Amersham Life Science)から化合物II、III、IVおよびＶを製造した。ddGおよびddAの場合、プロパルギルアミノヌクレオチドを直接Cy5.5のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと反応させた。ddCおよびddTの場合、長いリンカーをプロパルギルアミノヌクレオチドとＮ−トリフルオロアセチル−６−アミノカプロン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと反応させ、続いて水性アンモニア中のトリフルオロアセチル基の加水分解により行った。得られる化合物を次いでCy5.5色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと反応させ、Cy5.5色素とピリミジン塩基の間に１７原子リンカーを得た。
【００３５】
Cy5.5色素に加えて、当業者は、適当な光学特性を有する他のシアニン色素を含む他の色素をどのように同定し、用いるか知っている。また、種々のリンカーの構築および結合は当分野で既知である。リンカー構築の適当な試薬は、式Ｒ−ＮＨ−(ＣＨ2)n−ＣＯ2Ｒ'またはＲ−ＮＨ−(ＣＨ2)nＸ(ＣＨ2)m−ＣＯ2Ｒ'(式中、Ｒは酸または塩基不安定保護基、Ｒ'は反応性エステルまたは無水基、Ｓはアリール、Ｏ、Ｓ、またはＮＨおよびｎおよびｍは０−１２である)の化合物のようなアミノ保護アルキルまたはアリールアミノ酸の活性化形からなる１個またはそれ以上の化合物を含む。Ｎ−またはＯ−またはＳ−アルキル化により構築される他のリンカーも適当である。具体的な色素およびジデオキシヌクレオチド組合わせの、少なくとも１０原子長の正確なリンカー長は、経験的に記載のようなDNA配列決定のバンド均一性の追跡により決定できる(実施例３参照)。
【００３６】
実施例２：色素ターミネーターサイクル配列決定
DNAサイクル配列決定は、Thermo Sequenase(登録商標)DNAポリメラーゼ(Amersham, Cleveland, OH)およびCy5.5ジデオキシターミネーターを使用して、以下のサイクル配列決定プロトコールを使用して行った：
１．  マスター混合物を以下の成分を含んで調製した。
【表１】
0004306960.tif 000008
１０×反応緩衝液：
１５０mM  トリスHCl  ｐＨ９.５
３５ｍＭ  MgCl2
ポリメラーゼ：Thermo Sequenase(登録商標)DNAポリメラーゼ、１０Ｕ／μl、０.００１７Ｕ／μl、Thermoplasma acidophilum無機ピロリン酸：２０mMトリス−HCl、ｐＨ８.５、１mM DTT、０.１mM EDTA、０.５トゥイン−２０、０.５％Nonidet P-40および５０％グリセロール。
【００３７】
２．  ４つの微量遠心管を標識し、２μlのCy5.5標識ddG、ddA、ddT、ddC溶液を各試験管に入れた。
２５：１  ddＧ混合物、各々３００μMのdGTP、dATP、dTTP＆dCTP、
１２μM  Cy5.5 ddGTP
２５：１  ddＡ混合物、dGTP、dATP、dTTP＆dCTP、
１２μM  Cy5.5 ddATP
２５：１  ddＴ混合物、dGTP、dATP、dTTP＆dCTP、
１２μM  Cy5.5 ddTTP
２５：１  ddＣ混合物、dGTP、dATP、dTTP＆dCTP、
１２μM  Cy5.5 ddCTP
【００３８】
３．  ６μlのマスター混合物(段階１から)を各々４試験管に上記段階２から等量に分配した。循環を以下の通り行った：９５℃(３０秒)、４５−５５℃(３０秒)および７２℃(６０秒)で３５サイクル、次いで７２℃で５−７分インキュベート。
【００３９】
４．１μlの８Ｍ酢酸アンモニウムを各試験管に添加した。次いで、２７μl(反応容量の約３倍)の冷却１００％エタノールを添加した。次いで、混合物を混合し、氷上に２０分置いてDNAを沈殿させた。
５．混合物を微量遠心管(〜１２,０００rpm)で２０〜３０分、室温または４℃で遠心した。上清を除去し、次いで２００μlの７０％エタノールを添加してDNAペレットを洗浄した。
【００４０】
６．混合物を再び５分遠心し、上清を除去してペレットを２−３分、乾燥(真空遠心で)させた。
７．各ペレットを６μlのホルムアミド充填色素(Amersham, Cleveland, OH)に再懸濁させ、激しくボルテックス処理(１０−２０秒)し、全てのDNAが溶解したことを確認した。混合物を簡単に遠心して試験管の底のサンプルを回収した。
【００４１】
８．サンプルを７０℃で２−３分加熱し、DNAを変性させ、次いで氷上に置いた。
９．次いで、１.５−２μlの容量を配列決定ゲルに充填し、ゲルをMICRO Gene Blaster装置(VGI)上で流した。
【００４２】
この配列に関して、鋳型DNAは、BamHI部位に挿入されたバクテリオファージラムダ由来の１１５bp Sau3AIフラグメントを含むM13mp18であった(生産物番号US 70171 Amersham)。プライマーは〜４０Forward２３量体万能プライマー(5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3')(配列番号１)である。結果は図１に示す。
【００４３】
実施例３：リンカー長とバンド強度可変性の補正
配列決定反応を、種々の長さのリンカーを有するジデオキシヌクレオチドに結合した種々の色素分子で、実施例２に記載のように行った(表１参照)。標識DNA生産物を次いで変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、標識生産物を蛍光により検出した。バンドの強度を蛍光のグラムのピークの高さ(任意の単位で)として時間に対してとった。典型的にピーク高の全体的変化が連続的にプロットしたピーク高のグラフで見ることができる。ピーク高のこれらの全体的変化は、二次多項式関数に適合させた最小二乗法により設計される。曲線適合多項式関数の値による各バンドのピーク高の分割は、各ピークの標準化バンド強度をもたらす。これらのバンド強度の変化は、正常ピーク高の変動
【数１】
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の平方根で示すことができ、これは典型的に０と１の間の値を有し、より大きな可変性はより大きい数字で示される(Fuller, C.W., Comments 16(3):1-8, 1989)。この値は、１.０を標準化ピーク高から引いたとき、二乗平均と数学的に同等である。これらの値は表１に示され、図２にグラフ化する。バンド強度の可変性は、１０またはそれ以上の原子長を使用したとき有意に減少され、容易に正確に判断される配列データをもたらす。
【００４４】
【表２】
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【表３】
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ａ  色素の略語：Ｆ１、カルボキシフルオレッセイン；R110、ローダミン１１０；Ｒ６Ｇ、ローダミン６Ｇ；ROX、ローダミンＸ；TMR、テトラメチルローダミン；TXR、テキサスレッド(Molecular Probes)。色素Cy3、Cy3.5、Cy5およびCy5.5はAmersham Life Science, Cleveland, OHからであった。
【００４５】
ｂ  リンカー長はヌクレオシド塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ)の環構造と色素の環構造の間の原子の数である。
リンカー構造
ｃ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−
ｄ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＳＯ2−
ｅ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−
ｆ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＯ−
ｇ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)9−ＮＨ−ＳＯ2−
ｈ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)10−ＮＨ−ＣＯ−
ｉ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−
ｊ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−
ｋ  −Ｃ＝Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)10−ＣＯ−
【００４６】
【配列表】
【表４】
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【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  BamHI部位に挿入されたラムダおよびCy5.5 ddGTP、ddATP、ddTTPおよびddCTP色素ターミネーターから、１１５bp SauAIフラグメントを含むM13mp18を使用して産生したDNA配列データを示す。
【図２】  バンド強度可変性(rms)対リンカー長(原子)のグラフである。
【図１】
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【図２】
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