(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法における検体の処理方法であって、免疫学的分析法が免疫クロマトグラフィー法であり、かつ、検体に糖質が含有され、該糖質がグルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース及びセロビオースからなる群より選ばれた少なくとも１種であり、かつ、該糖質の含有量が、検体１００重量部に対し、２〜４０重量部となされていることを特徴とする検体の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法における検体の処理方法、特に検体中に糖質を含有させることで、測定感度を向上させること等を目的とした検体の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、 抗原−抗体による特異的反応を利用して、検体中における特定の抗原または抗体を分析する免疫学的分析法が知られている。特に、ラテックス粒子等の担体を用いた免疫学的アッセイ法は、単純な目視により被分析対象物質を検出する試験や、測定装置を用いた定量的な分析方法の何れにも使用することができるので、免疫学的分析法の主流となっている。
【０００３】
上記のようなラテックス粒子等の担体を用いた免疫学的アッセイ法は、被分析対象物質に対する抗体もしくは抗原を結合させたラテックス粒子を使用する方法であり、例えば免疫凝集反応測定法や免疫クロマトグラフィー法（米国特許第４１６８１４６号、第４０９４８４７号、第４２３５６６０１号、第４３６１５３７号等）が知られている。
【０００４】
しかしながら、ラテックス粒子は、 疎水性表面をもつため、測定系中で非特異反応などを起こしやすい。この結果、 免疫凝集反応測定法においては、溶液中でラテックス粒子が非特異的な凝集を起こし、 測定感度の低下や大きな誤差の発生をもたらすという問題点があった。また、免疫クロマトグラフィー法においても、ラテックス粒子は、一般に金属コロイド等の他の担体に比べて粒子径が大きく、 非特異反応により、多孔性メンブレン中で目詰まりを起こし、粒子が流れなくなり、この結果感度低下を起こしたり、正確な判定ができないという重大な問題点があった。特に検体として、 血清または血漿を用いた場合には、 これらの非特異反応が大きく、測定結果に大きな影響を与え、 大きな誤差を生じる原因になっていた。
【０００５】
上記問題点を解決するために、 粒子径を小さくして測定に与える影響を少なくする試みもなされているが、同時に測定感度も低下するといった問題点があった。また、免疫クロマトグラフィー法では、多孔性膜の孔径を大きくする等の種々の検討がなされてきたが、孔径を大きくすると検体等の展開速度が増進し、検出感度が低下するなどの恐れがあった。 また、血清・血漿等を分析するのに際して、 展開促進液や希釈液等を用いる方法も検討されているが、検体が希釈されるため測定感度が低下する等の問題点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法において、ラテックス粒子の非特異反応を防止し、 測定感度の向上、誤差の低減、信頼性の向上を図るための検体の処理方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、 ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法における検体の処理方法であって、検体に糖質が含有され、該糖質の含有量が、検体１００重量部に対し、２〜４０重量部となされていることを特徴とする検体の処理方法である。
【０００８】
請求項２記載の発明は、 免疫学的分析法が、免疫凝集反応測定法または免疫クロマトグラフィー法であることを特徴とする請求項１記載の検体の処理方法である。
【０００９】
請求項３記載の発明は、 糖質が単糖類、二糖類及びオリゴ糖からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の検体の処理方法である。
【００１０】
請求項４記載の発明は、 糖質がグルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース及びセロビオースからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の検体の処理方法である。
【００１１】
本発明は、ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法における検体の処理方法であって、検体に糖質が含有され、該糖質の含有量が、検体１００重量部に対し、２〜４０重量部となされていることを特徴とするものである。以下、本発明について説明する。
【００１２】
上記免疫学的分析法としては、例えば、 溶液中での凝集反応を利用した免疫凝集反応測定法や、固相での毛管現象による展開移動を利用した免疫クロマトグラフィー法などが挙げられるが、ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法であれば特にこれらのみに限定されるものではない。
【００１３】
上記免疫凝集反応測定法に用いられる免疫凝集反応測定測定試薬、あるいは上記免疫クロマトグラフィー法に用いられる免疫クロマトグラフィー装置は、特に限定されるものではなく、公知のものを用いることができる。
【００１４】
上記ラテックス粒子としては特に限定されないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等の微粒子等が挙げられ、特にスチレン系のものが好ましい。
【００１５】
上記ラテックス粒子の粒径は、特に限定されるものではないが、５０〜５０００ｎｍが好ましい。
【００１６】
上記検体としては、全血、血清、血漿等生体関連の試料ならば特に限定されないが、血清若しくは血漿であるのがより好ましい。
【００１７】
本発明においては、検体中に糖質が含有される。また、その含有量は、検体１００重量部に対し、２〜４０重量部となされる。この結果、ラテックス粒子の非特異反応を防止し、 測定感度の向上、誤差の低減、信頼性の向上を図ることが可能となる。なお、検体中における糖質のより好ましい含有量は、検体１００重量部に対して、４〜２０重量部である。
【００１８】
上記糖質は、免疫学的分析が行われる前に、検体中に含有されていればよく、含有される方法としては特に限定されない。ここで、免疫学的分析が行われる前とは、上記免疫凝集反応測定法においては、検体中に免疫凝集反応測定試薬を添加する前または添加する時点を意味し、また、上記免疫クロマトグラフィー法においては、検体を免疫クロマトグラフィー装置に添加する前または添加する時点を意味するものとする。
【００１９】
従って、本発明の検体の処理方法において、上記糖質を検体に含有させる方法としては、所定量の糖質を直接、あるいは緩衝液若しくは水などの液体に溶解したものを予め検体に添加する方法や、検体が収容される容器等に予め所定量の糖質を添加しておく方法など挙げられる。
【００２０】
上記糖質としては、多価アルコール・単糖類・二糖類・オリゴ糖等、一般的に糖質に分類される物質であればよいが、特に単糖類、二糖類及びオリゴ糖を用いるのが好ましい。なお、多価アルコール・単糖類・二糖類・オリゴ糖には、これらの修飾体も含まれるものとする。
【００２１】
上記多価アルコールとしては、例えば、ソルビトース、マンニトール等が挙げられる。
【００２２】
上記単糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、エリスリトール等が挙げられる。
【００２３】
上記二糖類としては、例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース等が挙げられる。
【００２４】
上記オリゴ糖としては、例えば、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ポリデキストロース等が挙げられる。
【００２５】
上記糖質の中でも、特に、単糖類であるグルコース、フルクトース、マンノース、二糖類であるスクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオースから選ばれる少なくとも１種を用いるのがより好ましい。
【００２６】
本発明の検体の処理方法においては、検体中に糖質を含有させる前後あるいは同時点において、検体中に、ブロッキング剤、緩衝液、血液凝固促進剤、血液抗凝固剤、 界面活性剤等を添加してもよい。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（Ａ）免疫凝集反応測定法における検体の処理方法
［実施例１］
１）免疫凝集反応測定試薬の調製
ラテックス粒子分散液（ラテックスＮ−４００  １０％（ｗ／ｖ）、粒子径４００ｎｍ、積水化学工業社製）１．０ｍｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９ｍｌを加え、 １５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。 得られた沈渣に、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のＨＢｓ抗原を含有する１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、 十分混和して、室温にて１時間攪拌した。 未反応のＨＢｓ抗原を除去するため、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、 沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌに懸濁させ、 再度遠心分離を行った。さらに、１％（ｗ／ｖ）濃度の牛血清アルブミンを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌに、この沈渣を懸濁させ、 室温で１時間攪拌し、ブロッキング処理を行った。 その後、 １５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、 １％（ｗ／ｖ）濃度の牛血清アルブミン及び０．０１％（ｗ／ｖ）濃度のアジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに、沈渣を懸濁させ、冷蔵保存した。
【００２８】
２）検体の処理
２μｇ／μｌ濃度のスクロースを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１μｌをＨＢｓ抗体陰性血清５０μｌに添加した。 （血清１００重量部当りスクロース３．９重量部。但し、 血清の比重は、１．０２８で算出した）
【００２９】
３）免疫学的分析
０．５％（ｗ／ｖ）濃度のＨＢｓ抗原感作ラテックス粒子、１％（ｗ／ｖ）濃度の牛血清アルブミン及び０．０１％（ｗ／ｖ）濃度のアジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌと、上記２）でスクロースを添加した検体とを混合し、 凝集反応測定板（積水化学工業社製）にて３分間ゆるやかに攪拌した後、 凝集を目視にて観察し、 凝集しないものを０、凝集が著しいものを５として６段階で評価した。 ３名の判定者の平均値を凝集強度とし、結果を表１に示した。
【００３０】
［実施例２］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り３９重量部に変えたこと以外、実施例１と同様にして行った。 結果を表１に示した。
【００３１】
［比較例１］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り１．３重量部に変えたこと以外、実施例１と同様にして行った。 結果を表１に示した。
【００３２】
［比較例２］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り５０重量部に変えたこと以外、実施例１と同様にして行った。 結果を表１に示した。
【００３３】
（Ｂ）免疫クロマトグラフィー法における検体の処理方法
［実施例３］
１）免疫クロマトグラフィー装置の調製
Ｈｉ−ＦｌｏｗTMニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ：Millipore 社製）を幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍに裁断し、その上端より３０ｍｍの部位に、２．０ｍｇ／ｍｌ濃度のＨＢｓ抗原を含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１μｌを円形状に塗布し、室温で２時間乾燥した。この後、牛血清アルブミン（ＤＩＦＣＯ社製）を１％（ｗ／ｖ）濃度で含有する１００ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った後、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して、室温で乾燥した。
【００３４】
青色着色ラテックス粒子分散液（カラーラテックスＣ−３００Ｂ、１０％（Ｗ／Ｖ）、粒子径３００ｎｍ、積水化学工業社製）１．０ｍｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９ｍｌを加え、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、０．５ｍｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原を含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、 十分混和して、 室温にて１時間攪拌した。 未反応のＨＢｓ抗原を除去するため、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、 沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌに懸濁させ、 再度遠心分離を行った。１％（ｗ／ｖ）濃度の牛血清アルブミンを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌに、沈渣を懸濁させ、 室温で１時間攪拌し、ブロッキング処理を行った。 その後、 １５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、 牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）及びアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに、沈渣を懸濁させ、冷蔵保存した。
【００３５】
ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、 この液２０μｌを幅５ｍｍ、長さ１５ｍｍのガラス繊維フィルター（ＧＦＦ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に含漬させ、室温で乾燥させた。
【００３６】
上記ＨＢｓ抗原を感作させたニトロセルロースメンブレンを５ｍｍ、長さ６０ｍｍの粘着基材に貼り、 下端に上記ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を含漬させたガラス繊維フィルターと５ｍｍ重なるようにして装着し、テープにて圧着して、免疫クロマトグラフィー装置を調製した。
【００３７】
２）検体の処理
２μｇ／μｌ濃度のスクロースを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２μｌをＨＢｓ抗体陰性血清１００μｌに添加した。（血清１００重量部当りスクロース３．９重量部、但し血清の比重１．０２８で算出）
【００３８】
３）免疫学的分析
上記スクロースを添加した検体を上記免疫クロマトグラフィー装置のガラス繊維フィルターに添加し、 青色のスポットが検出されるかどうかを判定した。 また、ガラス繊維フィルターと重なる部位のメンブレン上で、目詰まりして移動しない青色粒子を目視にて観察し、 目詰まりしないものを０、目詰まりが著しいものを５として６段階で評価して、目詰まり強度を算出した。 なお、目詰まり強度は３名の評価者による平均値を算出し、結果を表２に示した。
【００３９】
［実施例４］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り１９．５重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４０】
［実施例５］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り３９．０重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４１】
［実施例６］
上記２）において、スクロースの代わりにトレハロースを用い、トレハロースの含有量を、血清１００重量部当り１９．５重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４２】
［実施例７］
上記２）において、スクロースの代わりにトレハロースを用い、トレハロースの含有量を、血清１００重量部当り３９．０重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４３】
［比較例３］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り１．３重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４４】
［比較例４］
上記２）において、スクロースの含有量を、血清１００重量部当り５０重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４５】
［比較例５］
上記２）において、スクロースの代わりにトレハロースを用い、トレハロースの含有量を、血清１００重量部当り１．３重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４６】
［比較例６］
上記２）において、スクロースの代わりにトレハロースを用い、トレハロースの含有量を、血清１００重量部当り５０重量部にした以外は、 実施例３と同様に行った。 結果を表２に示した。
【００４７】
【表１】
0004260980.tif 000002
【００４８】
【表２】
0004260980.tif 000003
【００４９】
【発明の効果】
本発明の検体の処理方法を実施することにより、ラテックス粒子を用いた免疫学的分析法において、ラテックス粒子の非特異反応を防止することができ、 この結果、測定感度の向上、誤差の低減及び分析結果の信頼性の向上を図ることが可能となった。