(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＨ２ドメインのリン酸化アミノ酸と結合する部位であるヒトＧｒｂ２の９６位アミノ酸又はそれに相当する位置のアミノ酸がグリシンに変異されたＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン変異体。
【請求項２】
ヒトＧｒｂ２の９６位アミノ酸であるセリンをグリシンに改変することを特徴とする請求項１に記載のＳＨ２ドメイン変異体を製造する方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＳＨ２ドメイン変異体を含有する、３−ヨードチロシンと結合しうるアダプター−タンパク質。
【請求項４】
アダプター−タンパク質が、Ｇｒｂ２である請求項３に記載のアダプター−タンパク質。
【請求項５】
アダプター−タンパク質が、ヒト由来のものである請求項３又は４に記載のアダプター−タンパク質。
【請求項６】
リン酸化されたチロシンよりもリン酸化された置換チロシン誘導体を含有するペプチド又はタンパク質とより強く結合し得るよう、アダプター−タンパク質のＳＨ２ドメインのリン酸化アミノ酸と結合する部位のアミノ酸配列が改変された請求項１に記載のＳＨ２ドメイン変異体を用いることを特徴とする、置換チロシン誘導体のリン酸化を認識し得る細胞内情報伝達系を構築する方法。
【請求項７】
アダプター−タンパク質が、Ｇｒｂ２である請求項６記載の方法。
【請求項８】
置換チロシン誘導体が、３−ハロチロシンである請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、成長因子等のレセプターの下流に存在してその因子の刺激を細胞内に伝達するアダプター−タンパク質のＳＨ２と呼ばれるドメインの変異体に関する。より詳細には、本発明は、非天然アミノ酸のリン酸化を認識し得る新規な人工的な細胞内情報伝達系に関する。
本発明は、リン酸化された天然のアミノ酸よりもリン酸化された非天然アミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質とより強く結合し得るように改変されたＳＨ２ドメイン変異体、それを含有するアダプター−タンパク質、及びそれを用いた細胞内情報伝達系、並びにそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内シグナル伝達系、即ち細胞膜の受容体から細胞質を経由して核に至る情報の伝達系として、種々の系が見出されてきた。その中の最も代表的なものとしてレセプター型チロシンキナーゼにおけるＲａｓ−ＭＡＰＫカスケードが知られている。このカスケードの概要は、レセプター→Ｇｒｂ２→Ｓｏｓ→Ｒａｓ・ＧＴＰ→Ｒａｆキナーゼ→ＭＡＰキナーゼと情報が伝達される。この系におけるタンパク質Ｇｒｂ２は、中央にＳＨ２ドメインを有し、その両側にＳＨ３ドメインを有する分子量約２５ｋＤの比較的小さなタンパク質である。ＳＨドメイン(Src Homology)は、Ｓｒｃファミリー−タンパク質間でよく保存された領域であり、ＳＨ２ドメインはリン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）と結合し、ＳＨ３ドメインはプロリンに富んだ部位と結合する。
タンパク質Ｇｒｂ２の構造からも明らかなように、Ｇｒｂ２自体には酵素活性はなく、物理的に２種のタンパク質を結合させることにより情報を伝達する「アダプタータンパク質」である。具体的には、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインがレセプターのリン酸化されたチロシンに結合し、２個のＳＨ３ドメインがＳｏｓタンパク質のプロリンに富んだ領域と結合して、レセプターからＳｏｓタンパク質に情報を伝達する。
【０００３】
さらに詳細には、例えば細胞膜の上皮成長因子（ＥＧＦ）のレセプターは、細胞外からのリガンドの刺激（ＥＧＦの結合）によって、レセプター分子の細胞内に存在するキナーゼ（リン酸化酵素）ドメインが活性化され、自己タンパク質内のチロシン残基がリン酸化される（自己リン酸化）。チロシンが自己リン酸化されると、リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）に特異的に結合するアダプタータンパク質であるＧｒｂ２がその自己リン酸化部位に結合して、その結果として下流にその信号を伝達する役割を担っている（Lowenstein, et al., (1992)  Cell, 70, 431-442）。
Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインは、特に−ｐＴｙｒ−Ｘ−Ａｓｎ−（Ｘは任意のアミノ酸を示す。）という配列を好んで結合することが知られているおり、ＳＨ２ドメインとそれらの配列を含むペプチドとの複合体の立体構造はすでにいくつかの報告がなされている（Rahuel, et al., (1996) Nat. Struct. Biol., 3, 586-589；Rahuel, et al., (1998) J. Mol. Biol., 279, 1013-1022；Ettmayer, et al., (1999) J. Med. Chem., 42, 971-980；Furet, et al., (1999) J. Med. Chem., 42, 2358-2363；Schiering, et al., (2000) Biochemistry, 39, 13376-13382）。
【０００４】
これらの複合体の立体構造をもとに、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメイン阻害剤を開発しようという試みはいくつもなされている。
また、Ｓｒｃというタンパク質のＳＨ２ドメインは、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインとは異なって、−ｐＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−という配列を好んで結合するが、ＥＦ１という位置のトレオニンをＧｒｂ２のＳＨ２ドメインに特徴的なトリプトファンという残基に変換することによって、ＳｒｃのＳＨ２ドメインがＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン特異的配列である−ｐＴｙｒ−Ｘ−Ａｓｎ−に結合できるように変換した例（Kimber, et al., (2000) Mol. Cell, 5, 1043-1049）も報じられている。
さらに、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインの８９位のＧｌｕをＬｙｓに変異させたり、８６位のＡｒｇをＧｌｙに変異させた例（Cussac, et al., (1994) EMBO J., 13, 4011-4021］などもあるが、これらの場合は−ｐＴｙｒ−Ｘ−Ａｓｎ−を含むペプチドとの結合の強さが変動することが報告されている。
【０００５】
一方、タンパク質中のあるアミノ酸残基を通常の２０種類以外のアミノ酸(以下、非天然アミノ酸と呼ぶ)に置換して、有用な機能や性質を持たせた変異型タンパク質を作製しようとする試みがある。このような、非天然アミノ酸を取り込んだタンパク質をアロタンパク質（alloprotein）と呼ぶことが提唱されており(Koide et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6237-6241)、その生産にはいくつかの手法がある。具体的には、（１）培地に非天然アミノ酸を大量に加えて大腸菌を培養し、半ば強制的に大腸菌にアロタンパク質を生産させる方法(Koide et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6237-6241)、（２）事前に別の系で非天然アミノ酸を結合したサプレッサーｔＲＮＡを、無細胞翻訳系に利用する方法(Noren et al. (1989) Science, 244, 182-188)、（３）ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を結合させるアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素の変異体を作成し、それを基質となるｔＲＮＡと組で細胞に発現させてアロタンパク質を生体内（in vivo）で合成する方法(Wang et al. (2001) Science, 292, 498-500)などの手法が挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも、天然のアミノ酸にすり替えて非天然アミノ酸をタンパク質中に導入しているために、天然のアミノ酸とかけ離れた形をした複雑な非天然アミノ酸をタンパク質中に取り込むのは、いまだ非常に困難である。
【０００６】
非天然アミノ酸自体に天然のアミノ酸にはない付加価値があれば、そのような非天然アミノ酸を導入したアロタンパク質はそれだけでも非常に有用なものになってくる。例えば、非天然アミノ酸自体が蛍光発色団を持っていたり特殊な反応基を持っていれば、蛍光観察やタンパク質の化学修飾において、それらの非天然アミノ酸を含んだアロタンパク質は非常に役に立つだろう。しかしながら、そのような官能基を持つ非天然アミノ酸は天然のアミノ酸とはかけ離れた形状をしている場合がほとんどであり、現時点の技術では、そのような複雑な非天然アミノ酸を容易にアロタンパク質中の任意の位置に導入するという訳にはいかない。
それ自体に付加価値がある複雑な形状の非天然アミノ酸を容易にアロタンパク質に導入できない以上、導入する非天然アミノ酸の形状は単純でもそのアミノ酸を特異的に結合して働くアダプターを開発することが、アロタンパク質利用の近道であると考えられる。
【０００７】
そして、近年になって位置置換チロシンを細胞内でタンパク質の任意の位置に導入できる技術が確立されつつあり、ＥＧＦレセプターなどが持つキナーゼ活性で位置置換チロシンがリン酸化を受けることも確認されている。しかし当然ながら、天然にはない非天然アミノ酸のリン酸化されたものを受容するアダプターは天然には用意されていないので、非天然アミノ酸がリン酸化されても、この情報は細胞内に伝達されないことになる。
アダプター−タンパク質は、リン酸化されたアミノ酸に結合するドメインと、次に情報を伝達するタンパク質と結合するドメインを有するタンパク質であり、このアダプター−タンパク質のリン酸化されたアミノ酸に結合するドメインを変異させて、リン酸化された非天然アミノ酸に結合し得るドメインを有する変異体アダプター−タンパク質を作成すれば、新たな人工情報伝達経路を構築することができることになる。そのような人工情報伝達経路を細胞内に確立することにより、細胞内外の働きをコントロールしたり、細胞研究・解析の一助となったりして、将来的にもいろいろな医学的応用に結びつく可能性もある。
【０００８】
発明者の一人横山等は、すでに３位に置換基を持つチロシンアナログをチロシンよりも優先的にｔＲＮＡに結合するチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）の変異体を開発してきた（特願２００１−２３４１３５号）。これをアンバーサプレッサー系や人工塩基対システムに応用すれば、非常に近い将来、高等生物の細胞中で、任意の位置にチロシンの位置置換アナログを導入したアロタンパク質を合成できるものと考えられる。そこで、まず、位置置換チロシンに対するアダプターの開発にむけて、細胞内での天然のタンパク質中に含まれるチロシン残基特有の役割に注目した。
前述してきたように、天然のチロシンにおけるリン酸化チロシンと特異的に結合するアダプター−タンパク質であるＧｒｂ２のＳＨ２ドメインに変異を加えて、リン酸化されたチロシンアナログを含有する配列と特異的に結合することができるタンパク質を開発すれば、新たな人工の情報伝達経路を細胞内に構築することができることになる。
本発明は、このような新規な人工の情報伝達経路を構築することを目的とするものであり、現在までのところ、本発明のようにＳＨ２ドメインに変異を与えて、リン酸化チロシン部分の特異性の改変した例や非天然アミノ酸のリン酸化体に適合させた例は報じられていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、リン酸化された非天然アミノ酸である「リン酸化置換チロシン」を含む配列を結合できるＳＨ２ドメインを提供することである。
また、本発明は、レセプターの自己リン酸化部位に位置置換チロシンを導入し、「リン酸化置換チロシン」を含む配列を結合できる変異体ＳＨ２ドメインを用いることにより、細胞内にその非天然チロシンアナログのリン酸化の有無をスイッチとした新たな人工情報伝達経路を構築することを目的にしている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アダプター−タンパク質の１種であるＧｒｂ２のＳＨ２ドメインのアミノ酸配列を改変することにより製造された変異体ＳＨ２ドメインが、リン酸化されている非天然アミノ酸である「リン酸化置換チロシン」を含むペプチドを、野生型Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインが本来結合するリン酸化チロシンを含むペプチドよりも強く結合することを見出した。このようなＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン変異体は、レセプターの自己リン酸化部位に存在するチロシン残基が人為的にチロシンの 位置置換体に置き換えられたときに、そのリン酸化をきっかけに結合する新たなアダプター−タンパク質として、新規の人工情報伝達経路の構築に役立てることができ、本発明に至った。
【００１１】
本発明は、アダプター−タンパク質のＳＨ２ドメインのリン酸化アミノ酸と結合する部位のアミノ酸配列を、リン酸化された天然のアミノ酸よりもリン酸化された非天然アミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質とより強く結合し得るように改変されたＳＨ２ドメイン変異体、及びその製造方法に関する。
また、本発明は、前記したＳＨ２ドメイン変異体を含有してなるアダプター−タンパク質に関する。本発明のアダプター−タンパク質は、リン酸化された非天然アミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質とより強く結合し、これを認識し得るものであるから、本発明のアダプター−タンパク質は新規な人工的な細胞内情報伝達系を提供することができるものである。即ち、本発明は、前記したアダプター−タンパク質を用いた新規な細胞内情報伝達系、及びそれを構築する方法に関する。
【００１２】
ＳＨ２ドメインは、種々のタンパク質間で非常によく保存された構造を有し、７つのβ−ストランドと２つのα−ヘリックス、及びこれらを結ぶループ部からなる約１００個のアミノ酸からなるタンパク質である。ヒトのＧｒｂ２のＳＨ２ドメインに相当する部分である、ヒトＧｒｂ２の５５番目〜１６０番目までのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字標記で表すと、次のとおりであある。なお、以下本明細書においてはアミノ酸の位置の番号はＳＨ２ドメインではなく、ヒトＧｒｂ２の全長のアミノ酸配列の番号を用いて説明する。
ＭＫＰＨＰＷ  ＦＦＧＫＩＰＲＡＫＡ  ＥＥＭＬＳＫＱＲＨＤ   80ＧＡＦＬＩＲＥＳＥＳ  ＡＰＧＤＦＳＬＳＶＫ  ＦＧＮＤＶＱＨＦＫＶ  110ＬＲＤＧＡＧＫＹＦＬ  ＷＶＶＫＦＮＳＬＮＥ  ＬＶＤＹＨＲＳＴＳＶ  140ＳＲＮＱＱＩＦＬＲＤ  ＩＥＱＶＰＱＱＰＴＹ                        160
【００１３】
ＳＨ２ドメインの構造解析によれば、リン酸化チロシンを含むアミノ酸配列は、ＳＨ２ドメインのβ−シートの最上部の４本目のβ−ストランドに交差するようにして結合する。
本発明者らは、このような過去に報告されているヒトＧｒｂ２のＳＨ２ドメインとリン酸化チロシンを含むペプチドとの複合体の立体構造を精査に検討し、リン酸化チロシンがリン酸化非天然アミノ酸、例えばリン酸化置換チロシンに置き換わった際に生じる立体障害等を排除する方向でそのＳＨ２ドメインに変異を与えることにより、リン酸化非天然アミノ酸、例えばリン酸化置換チロシンと結合し得るＳＨ２ドメインを構築できる可能性を検討した。具体的には、リン酸化置換チロシンを結合させるために変異を導入すべき残基は、ヒトＧｒｂ２の９６位のセリン残基近辺であると想定した。そこで、本発明者らは、ヒトＧｒｂ２の９６位のセリン残基を他のアミノ酸で変異させて、その結合能を検討した。
【００１４】
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから、次のプライマー（１）及び（２）を用いてＰＣＲによってＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン領域（アミノ酸５５−１６０）をコードする遺伝子をクローニングした。
プライマー(1):
5'-CGCGGGATCCATGAAACCACATCCGTGGTTTTTTGG-3'
プライマー(2):
5'-CGCGGTCGACTCAGTATGTCGGCTGCTGTGGCACC-3'
これをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Glutathione S-transferase ）との融合タンパク質として発現させるように設計された発現用ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を利用して、そのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ制限酵素部位に組み込み、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインのＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターを作成した。
【００１５】
野生型では、Ｇｒｂ２の９６位はセリン残基であるので、チロシンのフェニル環に置換基が付加した位置置換チロシンを受容させるためには、セリンよりも側鎖の小さい残基、例えばアラニンやグリシンに改変する必要がある。このために、変異すべき９６位のアミノ酸の置換体をコードするＤＮＡ配列を作成するための変異導入用のプライマーを設計し、これをキットを用いて変異導入を行った。アミノ酸配列の改変のための変異導入用のプライマーとしては次のプライマー（３）及び（４）の２種を用いた。
プライマー(3):
5'-GCTCCTGGGGACTTCGCTCTCTCTGTCAAGTTTG-3'
プライマー(4):
5'-GCTCCTGGGGACTTCGGCCTCTCTGTCAAGTTTG-3'
【００１６】
調製された野生型および変異型のＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン遺伝子を含むプラスミドを用いて大腸菌に形質転換し、それぞれのプラスミドを有する形質転換体は、常法の単離・培養を経て、目的タンパク質をＧＳＴ融合タンパク質の形で得る。ＧＳＴ融合タンパク質はＧＳＴに親和性の強い樹脂で回収し、樹脂から溶出したのちに、融合部分に設けられたプロテアーゼ消化部位を利用して消化し、野生型および変異型Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメイン−タンパク質を得た。これらのタンパク質はさらに精製を施し、最後にゲル濾過カラムを用いて、単量体を二量体から分離した。
これらの遺伝子操作及びタンパク質の精製については通常の方法に沿って行った。これらの操作技術の参考のために、次の文献を挙げておく。
“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 3rd Edition, ed. by Sambrook, J., Russell, D.W., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
“Short Protocols in Molecular Biology," 4th Edition, ed. by Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K., John Wiley & Sons, 1999.
【００１７】
このようにして得られた野生型及び変異体のＳＨ２ドメインの位置置換チロシンのリン酸化物との結合活性を測定した。ペプチドとタンパク質との間の結合の強さを測る方法はいろいろあるが、相対的な結合特異性の変化を測るには、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した方法を用いるのが簡便である。表面プラズモン共鳴を利用した方法では、金でコートされたセンサーチップの表面に、リン酸化チロシンまたはリン酸化置換チロシンを含むペプチドを固定化し、その表面にＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン変異体溶液を流すことにより、結合量に応じて信号が得られる。この信号の時間変化および流す変異体タンパク質濃度依存性からペプチドと変異体との間の結合の強さを見積ることができる。
【００１８】
ＳＰＲのセンサーチップ上に固定化されたペプチドとしては、次のペプチド（１）及びペプチド（２）の２種を用いた。
（１）リン酸化チロシンを含むペプチド:
biotin-Ahx-Pro-Val-Pro-Glu-pTyr-Ile-Asn-Gln-Ser-Val-Pro-Lys-Arg-OH
（２）リン酸化３−ヨードチロシンを含むペプチド：
biotin-Ahx-Pro-Val-Pro-Glu-pTyr(I)-Ile-Asn-Gln-Ser-Val-Pro-Lys-Arg-OH式中、ｂｉｏｔｉｎはビオチンを示し、Ａｈｘはビオチンとのスペーサーとして入れた６−アミノヘキサン酸（6-aminohexanoic acid）残基を示し、ｐＴｙｒはリン酸化チロシンを示し、ｐＴｙｒ（Ｉ）はリン酸化３−ヨードチロシンを示す。
これらの配列は、ヒトＥＧＦレセプターの自己リン酸化部位のうちＧｒｂ２が結合するとされる部位の近辺の配列（ＰＶＰＥＹＩＮＱＳＶＰＫＲ、ＥＧＦレセプターの配列番号で１０６４−１０７６）に基づいている。
【００１９】
ＳＰＲの測定により、ＳＰＲのセンサーチップに固定化したリン酸化チロシンを含むペプチド（１）およびリン酸化３−ヨードチロシンを含むペプチド（２）と、各ＳＨ２ドメインとのＢＩＡＣＯＲＥセンサーグラムが得られた。そして、センサーチップ上に流したＳＨ２ドメイン−タンパク質濃度を１０００、７５０、５００、２５０、１００ｎＭの順に変化させることにより、定量化して解離定数を算出（表１）した。なお、ＳＰＲのセンサーグラムの変化量から結合の強さを推定することもできた。
このＳＰＲの測定結果から、野生型のＳＨ２ドメイン、９６位のセリンをアラニンに改変した変異体ＳＨ２ドメイン（Ｓ９６Ａ）、及び９６位のセリンをグリシンに改変した変異体ＳＨ２ドメイン（Ｓ９６Ｇ）について、前記ペプチド（１）及びペプチド（２）とのおおよその解離定数の値（有効数字１桁）を算出した結果を次の表１に示す。
【００２０】
【表１】
0004229227.tif 000002
【００２１】
表１中の「結合せず」は結合が観測できなかったことを示している。また、解離定数の数値が小さいほど、結合の強さは強い。
この結果、野生型のＳＨ２ドメインは天然のリン酸化チロシンとは強く結合するが（解離定数：４μＭ）、非天然のリン酸化置換チロシンである３−ヨードチロシンとは結合しない。そして、９６位のセリンをアラニンに改変した変異体ＳＨ２ドメイン（Ｓ９６Ａ）も同様に、天然のリン酸化チロシンとは強く結合するが（解離定数：７μＭ）、非天然のリン酸化置換チロシンである３−ヨードチロシンとは結合しないものであった。
しかし、９６位のセリンをグリシンに改変した変異体ＳＨ２ドメイン（Ｓ９６Ｇ）では、天然のリン酸化チロシンとは非常に弱く結合するが（解離定数：８０μＭ）、非天然のリン酸化置換チロシンである３−ヨードチロシンとはその約４倍の強さで結合する（解離定数：２０μＭ）ことがわかった。このＳ９６Ｇ変異体は野生型とくらべて、ペプチド（１）とペプチド（２）への結合の強さが逆転しており、Ｓ９６Ｇ変異体は、むしろリン酸化された非天然アミノ酸を含むペプチドの方を好んで結合するものである。
【００２２】
この結果は、ＳＨ２ドメインのアミノ酸配列を改変することにより、天然のアミノ酸よりも非天然のアミノ酸のリン酸化物により強く結合することができるＳＨ２ドメイン変異体を製造することができることを具体的に示すものであり、この結果、非天然のリン酸化アミノ酸を認識することができるアダプタータンパク質が製造できることを示すものである。また、アダプター−タンパク質は、それ自体に酵素活性があるのではなく、物理的にリン酸化されたアミノ酸を含有するレセプタータンパク質と情報伝達系のタンパク質とを結合させるだけのものであるから、本発明のこの結果は、非天然のリン酸化アミノ酸を認識する新規な人工の細胞内情報伝達系を構築し得ることを強く示すものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以上の結果からも明らかなように、本発明は非天然のリン酸化アミノ酸を認識できる、天然のリン酸化アミノ酸よりもより強く結合することができるＳＨ２ドメインの変異体を提供することができることを初めて示すものであり、本発明により人工の細胞内情報伝達系を構築することを可能とするものであるのみならず、非天然アミノ酸を含有するアロプロテインの生体に対する意義を飛躍的に高めることができる。
本発明は、アダプター−タンパク質のＳＨ２ドメインのリン酸化アミノ酸が結合する部位のアミノ酸配列を改変することにより、非天然アミノ酸のリン酸化物を含有するペプチド又はタンパク質を、天然のアミノ酸のリン酸化物を含有するペプチド又はタンパク質よりも、より強く結合することができるＳＨ２ドメイン変異体の存在を初めて明らかにするものであり、非天然アミノ酸のリン酸化物を含有するペプチド又はタンパク質を認識し得るＳＨ２ドメイン変異体を初めて提供するものである。
【００２４】
本発明は、非天然アミノ酸のリン酸化物を含有するペプチド又はタンパク質を認識することができる、即ち天然のリン酸化されたアミノ酸よりもより強く結合することができるＳＨ２ドメインの変異体を初めて提供するものである。
本発明のＳＨ２ドメイン変異体のＳＨ２ドメインとしては、特に制限はないが、好ましくはアダプター−タンパク質Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインが挙げられる。ＳＨ２ドメインは比較的高度の保存されているものであるから、いずれのタンパク質のＳＨ２ドメインであってもよいが、細胞内情報伝達系という観点からアダプター−タンパク質、より具体的にはＧｒｂ２のＳＨ２ドメインが好ましい。また、本発明のＳＨ２ドメインはヒトＳＨ２ドメインに限定されるものではなく、他の生物のＳＨ２ドメインにも広く応用することができる。
【００２５】
本発明のＳＨ２ドメイン変異体のアミノ酸配列を改変する位置としては、目的の非天然アミノ酸を受容できる位置であれば特に制限はないが、非天然アミノ酸として位置置換チロシンを採用する場合にはチロシンのフェニル基が受容される位置のアミノ酸を改変するのが好ましい。例えば、ヒトＧｒｂ２のＳＨ２ドメインにおいては、ヒトＧｒｂ２の全長の９６位アミノ酸が好ましい位置として挙げられる。この位置に「相当する位置」とは、他の生物におけるＧｒｂ２において、ヒトＧｒｂ２の９６位アミノ酸に相当する位置のことである。
改変されるアミノ酸としては、目的に応じて種々のアミノ酸を選択することができるが、前記の実験結果で示した例では立体的に小さなアミノ酸、例えばグリシンなどが好ましい。前記の例では、非天然アミノ酸がチロシンの位置置換体であり立体的に天然のアミノ酸よりも大きくなることから、受容体の構造としてはより小さなアミノ酸が好ましかったが、立体的により小さなアミノ酸を非天然アミノ酸として選択する場合には、ＳＨ２ドメインを改変するアミノ酸としては立体的により大きなアミノ酸が好ましい。
【００２６】
ＳＨ２ドメインの改変に方針としては、前記してきた例ではアミノ酸の立体的な大きさを例示してきたが、本発明の変異体はこれに限定されるものではなく、水素結合の強さや位置、また相互の分子間力などに基づいて改変することも可能である。
本発明のＳＨ２ドメインの改変方法としては、通常のアミノ酸変異体を製造する方法が挙げられる。前記で例示してきた改変用のプライマーを用いた遺伝子操作による方法が簡便で確実で好ましいが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明の非天然アミノ酸としては、各種のアミノ酸が適用できるが、細胞内情報伝達系の観点から、レセプター型チロシンキナーゼが好ましいことから、チロシンの誘導体、好ましくはフェニル環に置換基を有する位置置換チロシンが好ましい。置換位置としては、フェニル環の２位、３位及び４位のいずれであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。置換基としては炭素数１から１０程度のアルキル基、アルコキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、水酸基、アミノ基、ハロゲンなどのものが挙げられるが、生体内において水酸基やハロゲンが好ましく、ハロゲン、特にヨウ素がより好ましい。好ましい位置置換チロシンとしては、例えば、３−ヨードチロシンが挙げられる。
【００２８】
本発明は、前記してきた本発明のＳＨ２ドメイン変異体を含有してなるアダプター−タンパク質を提供するものである。アダプター−タンパク質は、それ自体に酵素活性があるのではなく、物理的にリン酸化されたアミノ酸を含有するレセプタータンパク質と情報伝達系のタンパク質とを結合させるだけのものであるから、本発明のＳＨ２ドメイン変異体を野生型のＳＨ２ドメインに代えて導入することにより、リン酸化された非天然アミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質と、情報伝達系のタンパク質とを物理的に結合させることができる。
本発明のアダプター−タンパク質としては、ＳＨ２ドメインを有するものであれば特に制限はないが、Ｇｒｂ２が単純な構造であることから好ましいアダプター−タンパク質として挙げられる。本発明のアダプター−タンパク質としては、ヒト由来のものが好ましいが、これに限定されるものではなく、マウスやラット、ウサギなどのものであってもよいし、ヒトＳＨ２ドメイン変異体を他の生物のアダプター−タンパク質のＳＨ２ドメイン領域に導入したものであってもよい。本発明のＳＨ２ドメイン変異体の導入方法としては、遺伝子操作による各種の通常の導入方法により行うことができる。
【００２９】
さらに、本発明は、人工的な新しい発想に基づく細胞内情報伝達系を提供するものである。前述してきたようにアダプター−タンパク質は物理的な作用により細胞内の情報伝達系に寄与しているものであるから、アダプタータンパク質として前述してきた本発明のアダプタータンパク質を使用することにより、新たな細胞内情報伝達系を構築することができる。したがって、本発明は、リン酸化された非天然アミノ酸のリン酸化情報を伝達し得る細胞内情報伝達系、及びその構築方法を提供するものである。
本発明の新規な細胞内情報伝達系は、人工的なものであり、天然の通常のタンパク質によっては情報を伝達することができないものであるから、アロプロテインによる選択的な細胞内情報伝達が可能となり、細胞の情報伝達系の解析、細胞内の情報伝達機構の調整などに極めて有用となる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  （発現ベクターの作成）
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、前記したプライマー（１）及び（２）を用いたＰＣＲによってＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン領域（アミノ酸配列番号５５−１６０）をコードする遺伝子をクローニングした。そのＤＮＡ断片を増幅したのちに、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断して、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に組み込むことにより、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインのＧＳＴ融合タンパク質の発現ベクターｐＧＥＸ−Ｇｒｂ２ＳＨ２を作成した。
【００３２】
実施例２  （部位特異的変異の導入）
９６位のアミノ酸置換体をコードするオリゴヌクレオチドを、それぞれ変異導入プライマーとして合成し、市販のキット（Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社)）を用いて、同キットの推奨する方法にしたがって、変異を導入した。使用した変異導入用のプライマーとしては、前記したプライマー（３）及び（４）を用いた。
【００３３】
実施例３  （野生型および変異型のＧｒｂ２のＳＨ２ドメインの発現・精製）
上述の過程から得られた野生型および変異型のＧｒｂ２のＳＨ２ドメインの遺伝子を含むプラスミドを、ハナハンの方法（Hanahan, D (1983) J. Mol. Biol., 166, 557-580）に準じた形質転換方法により、それぞれ大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に形質転換した。それぞれのプラスミドを有する形質転換体は、常法にしたがって単離し、ＬＢ（ａｍｐ＋）培地中、３０℃で培養した。タンパク質の発現誘導は、菌体の培養液（１Ｌ）の濁度Ｏ．Ｄ．６００が０．６になった時点で、ＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を加えることにより行った。菌体は、発現誘導の後、さらに３０℃で４時間培養してから、遠心することにより回収した。
野生型および変異型のＧｒｂ２のＳＨ２ドメインは、以下に記すような方法で、回収した大腸菌から精製した。全ての作業は４℃で行った。回収した菌体の懸濁液を超音波破砕し、遠心上清をＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（５ｍＬ）（Amersham Pharmacia Biotech社）にかけ、洗浄ののち、２０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．０］で、目的のＧＳＴ融合タンパク質を溶出させた。タンパク質溶液には最終濃度０．３ＭになるようにＮａＣｌを加えてから、５００ｕｎｉｔのトロンビン（Thrombin）プロテアーゼで室温、１２時間処理して、ＧＳＴとの融合タンパク質から目的のＧｒｂ２のＳＨ２ドメインを切り離した。プロテアーゼ消化反応液は、ＰＤ−１０カラム（Amersham Pharmacia Biotech社）を用いて脱塩すると同時に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）に緩衝液を置換した。ベンザミジンセファロース６Ｂ（Benzamidine Sepharose 6B）カラム（Amersham Pharmacia Biotech社）で残留トロンビン（Thrombin）プロテアーゼを除いたのち、さらにＳＰセファロースファストフロー（SP Sepharose Fast Flow）カラム（Hiload 16/10）（Amersham Pharmacia Biotech社）を用いて、精製を行った。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．５）に緩衝液中で、０−０．５Ｍ  ＮａＣｌの塩強度勾配で溶出すると、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ付近と０．１９Ｍ  ＮａＣｌ付近との２カ所に溶出ピークが現れるが、前者が主にＧｒｂ２のＳＨ２ドメインの単量体、後者が主に二量体である。Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインは、Ｇｒｂ２全長では報告されていないが、ＳＨ２ドメインだけだと二量体を形成する傾向にある。
２つのピークは、それぞれ別個に回収してセントリコンＹＭ−３（Centricon YM-3）（MILLIPORE社）を用いて濃縮し、４℃に保存した。
【００３４】
単量体と二量体の交換速度は４℃では非常に遅いため、リン酸化ペプチドとの結合測定をする直前に、ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８  ｍｍ  ３０ｃｍ）（東ソー）でさらに単量体と二量体とを分離・精製し、溶媒も結合測定に用いているＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（BIACORE社）に置換した。
上述の方法を用いて、９６位のセリン残基をアラニン、グリシンに置換した変異体を作成した。これらの変異体は、それぞれＳ９６Ａ、Ｓ９６Ｇ変異体と呼ぶことにする。
遺伝子操作のために用いた全ての酵素は宝酒造、東洋紡、またはニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）社から購入し、遺伝子操作のための条件は、その酵素の供給元の助言にしたがった。
【００３５】
実施例４  （リン酸化ペプチド結合アッセイ）
これらのＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン変異体の、リン酸化ペプチドへの結合能力は、表面プラズモン共鳴装置ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（BIACORE社）を用いて行った。
センサーチップとしては、表面がすでにストレプトアビジンでコートされたセンサーチップＳＡ（Sensor Chip SA）（BIACORE社）を用い、ビオチンを介してリン酸化チロシンまたはリン酸化３−ヨードチロシンを含む前記したペプチド（１）及び（２）を固定化した。用いたペプチドは、ＥＧＦレセプターの自己リン酸化部位のうちＧｒｂ２が結合するとされている部位周辺の配列で、そのアミノ酸配列は前記したとおりである。ペプチドの固定化量は、いずれもおよそ１００ＲＵで、２種のペプチドを同じセンサーチップの異なる流路に固定化して同時に結合をモニターできるようにした。試料となるＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン・タンパク質は、野生型及び変異体のいずれもＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（BIACORE社）に溶かし、ランニングも同緩衝液で行った。１００−１０００ｎＭのＳＨ２ドメインタンパク質を、温度２５℃、流速２０ｍｌ／ｍｉｎで４０ｍｌ（２分間）ずつ流し、解離待ち時間も２分間とって、センサーグラムを得た。
センサーチップの再生は、１０ｍＭ  グリシン−塩酸（Glycine-HCl）（ｐＨ２．０）を１０ｍｌ（１分間）流すことによって行った。センサーグラムは、ＢＩＡＣＯＲＥ装置に付属する解析プログラム“ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１”で解析し、おおよその解離定数を求めた。
この結果に基づいて解離定数を算出した結果を表１に示す。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、リン酸化された非天然アミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質とより強く結合し得る新規な発想に基づくＳＨ２ドメイン変異体を提供するものであり、このようにアミノ酸配列が改変されたＳＨ２ドメインがリン酸化された天然のアミノ酸よりもリン酸化された非天然アミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質とより強く結合し得るという新規な知見を発明しただけでなく、これにより新規な細胞内情報伝達系を提供することができ、さらに、アロプロテインに選択的な細胞内情報伝達系を構築し得る手法を提供するものである。
本発明により、天然の細胞内情報伝達系とは全く異なる、天然のタンパク質では応答することができない新規な情報伝達系を細胞内に導入することが可能となり、細胞内情報伝達系の解明に寄与するだけでなく、新規な細胞応答システムを人工的に構築することが可能となるために、細胞の活動の機構の解明や各種の疾患の発生、治療、予防方法などの確立に極めて有用な手法を提供するものである。
【００３７】
【配列表】
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