(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中のアンチトロンビンIIIに酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定するアンチトロンビンIIIの測定法において、反応系にArg、Arg-Gly及びGly-Gly-Tyr-Argから選ばれるアミノ酸又はペプチドを終濃度が３０ｍＭ〜２００ｍＭとなるように添加することを特徴とするアンチトロンビンIIIの測定法。
【請求項２】
反応系にArg又はArg-Glyを添加することを特徴とする請求項１記載のアンチトロンビンIIIの測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の活性型凝固因子の最も重要な阻害物質として血液の凝固、線溶をコントロールしているアンチトロンビンIII（以下「ＡＴIII」という）の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内における酵素反応は、その活性化物質やその反応を阻害する阻害物質により制御・調整され、機能の調節が図られている。例えば、血液凝固機能においては血管損傷部位以外での血液凝固反応や、過度の凝固亢進・線溶亢進を阻害する酵素阻害物質が存在し、これにより血液凝固・線溶の制御・調節が行われている。酵素阻害物質のうち、ＡＴIIIは、血液中の活性型凝固因子の最も重要な阻害物質として、血液の凝固、線溶をコントロールしている。その血中レベルは汎発性血管内凝固症（ＤＩＣ）、肝疾患、ネフローゼ症候群で低下するなど種々の疾患、症状により変動し、また、血中レベルが低下すると、ヘパリン治療の効果が現れないことがある。そのため、ＡＴIIIの活性は、これらの疾患のスクリーニング、病体解析、予後判定、及びヘパリン治療、あるいはＡＴIII濃縮製剤投与時の指標となっている。
従って、ＡＴIIIを測定することは、重要な意義を有する。
【０００３】
従来、この様な酵素阻害物質は、測定対象である酵素阻害物質と過剰量の酵素と反応させ、残存する酵素を測定することにより定量されてきた。例えば、生体試料（検体）中のＡＴIII量を測定する場合には、ＡＴIIIが活性型血液凝固第１０因子（ＦＸａ）あるいはトロンビンを阻害することを利用して、一定量のＦＸａあるいはトロンビンを検体中のＡＴIIIと反応させた後、残存するＦＸａあるいはトロンビンの活性を測定することにより、ＡＴIII量を求めることが行われている。そして、この場合、ＦＸａあるいはトロンビンの活性は、発色性合成基質の加水分解速度を吸光度の変化をもって測定する方法などにより求められる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、検体中にはＡＴIIIが高濃度（約２５mg／dl）で存在するため、通常の検体量（２〜５０μｌ）で希釈せずに従来法によりＡＴIIIを測定することは次の理由から困難であった。
【０００５】
（１）高濃度のＡＴIIIを含む検体を希釈しないで測定するには、検体量を極端に少なくすることが考えられる。しかし検体量を少なくすると測定値の再現性が低下するという問題があり、また２μｌ未満のサンプリングは実質的に不可能である。
（２）通常の検体量の非希釈検体を用いて測定しようとすると、酵素（ＦＸａ又はトロンビン）は希釈検体に対応した濃度に調整されているため酵素が消費し尽くされてしまい、残存酵素量に基づいて検体中のＡＴIII量を測定することは不可能である。
（３）一方、これを回避するために酵素量を増加させると、残存酵素量が多くなりすぎ、合成基質を用いる方法では吸光度が３以上となり測定が不可能となる。
（４）更に、残存酵素量の差（例えば、ＡＴIII濃度が０％と１００％での残存酵素量の差）が大きくなることから、各残存酵素量で反応速度に差が生じやすくなり、検体の希釈系列は湾曲し、検体の希釈直線性は不十分となる。
（５）また、各残存酵素量での反応速度が一定になるように合成基質濃度を増加させると、反応開始後、短時間で吸光度が３以上となり測定が不可能となる。特に、分解されやすい基質を用いた場合、各残存酵素量で反応速度に差が生じやすく、短い反応時間で吸光度が３以上となる傾向が強くなる。
【０００６】
従って、従来、ＡＴIIIを測定するには、検体を希釈せざるを得なかったが、希釈の操作は煩雑であり、測定の迅速化、簡便化を図る上でこれは障害となっていた。
【０００７】
これに対し、検体を希釈することなくＡＴIII等の酵素阻害物質を測定する方法として、第二の酵素阻害物質を添加する方法が報告されている（特開平６−１８１７９８号）。
しかしながら、この方法に用いる第二の酵素阻害物質は酵素の活性中心に少量で強く作用するため、使用濃度の調整が難しく、反応系中に入る微妙な量の違いや分析装置の攪拌能力の差により、反応液中での酵素、第二酵素阻害物質及び合成基質の競合の仕方が測定毎に異なり、このため、データの再現性、希釈直線性等の性能に問題を有していた。
【０００８】
従って、本発明の目的は、検体を希釈することなく、ＡＴIIIを精度良く測定できる方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
斯かる実状に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、検体と酵素液（ＦＸａ、トロンビン）又は残存酵素と合成基質液のそれぞれの反応を弱く阻害する物質を新たに見出し、これを用いることにより検体を希釈することなく、ＡＴIIIを上記問題点がなく測定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、被検体中のＡＴIIIに酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定するＡＴIIIの測定法において、反応系にアルギニン又はアルギニンを含む２〜６個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを添加することを特徴とするＡＴIIIの測定法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、アルギニン又は上記オリゴペプチドを添加することで、検体と酵素又は残存酵素と合成基質の反応を弱く阻害する。このうちオリゴペプチドは、アルギニンを有するジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド又はヘキサペプチドである。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、アルギニンを有すること以外は特に限定されず、アルギニン以外のアミノ酸としては、グリシン、チロシン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、イソロイシン、アスパラギン、バリン、グルタミン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はピペコリン酸が好ましい。本発明で用いられるアミノ酸又はオリゴペプチドを構成するアミノ酸は水溶液等での溶解性が良好であれば、アセチル基、ベンジル基等の通常考えられる修飾基が付加されていてもよく、また、塩酸塩等の塩であってもよい。
【００１２】
本発明で用いられるアルギニン又はオリゴペプチドの濃度又は添加量は、これらの種類により異なるが、反応系中での終濃度が、検体の希釈系列を測定したときに湾曲を生じない濃度であり、かつ測定感度（０％と１００％濃度のＡＴIII量を測定したときの吸光度変化量の差）が極端に低下しない濃度であれば、いずれの濃度であってもよい。例えば終濃度が２０mM以上となるよう添加することが好ましく、特に３０〜２００mMとなるように添加することが好ましい。
【００１３】
本発明の測定法は、被検体中のＡＴIIIに酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定するＡＴIIIの測定法であり、上記アルギニン又はオリゴペプチドはこの反応系に添加すればよく、第１試薬液（ＦＸａ等の酵素）又は第２試薬液（合成基質等）のいずれでもよい。最近普及してきている血液凝固自動分析装置を用いることを考慮して、検体希釈液に添加してもよい。すなわち、アルギニン又はオリゴペプチドは、残存酵素と合成基質との反応時に存在していればよい。
【００１４】
本発明に用いる酵素、すなわちＡＴIIIが阻害する酵素は、ＦＸａ又はトロンビンが好ましい。これらの酵素は、分子量の違いによりα型、β型又はγ型等があり、本発明では、いずれも用いることができるが、特にα型が好ましい。本発明に用いるこれら酵素は、クロモジェニックス社等で市販されているものを用いることもできる。またこれらα型、β型又はγ型のＦＸａ、更にα型、β型又はγ型のトロンビンは、単独又は混合物としても用いることができる。また、使用量は、検体無希釈液に含まれるＡＴIII量の１．５倍量以上に対応できる量であれば特に制限されないが、ＦＸａでは、０．２〜６nkat／assay、特に０．５〜３nkat／assay、トロンビンでは、０．２〜６．２nkat／assay、特に０．５〜３．１nkat／assayとなるような範囲で用いるのが好ましい。なお、１nkatは、ＦＸａでは１秒間に１nmolのＦＸａ合成基質（Ｓ−２２２２）を分解するＦＸａ量を言い、トロンビンでは１秒間に１nmolのトロンビン合成基質（Ｓ−２２３８）を分解するトロンビン量をいう。
【００１５】
本発明で用いられる合成基質としては、特に制限されないが、例えばクロモジェニックス社製の合成基質、ＦＸａでは、Ｓ−２２２２、Ｓ−２３３７、Ｓ−２７３２、Ｓ−２７６５、Ｓ−２７６７、Ｓ−２７７２、Ｓ−２７８２、Ｓ−２７８７などが使用できる。また、トロンビンでは、Ｓ−２２３８、Ｓ−２３６６、Ｓ−２８４６などが使用できる。合成基質の濃度としては、合成基質の種類により異なり、検体の希釈系列を測定したときに湾曲を生じない濃度で、更に、測定感度が極端に低下しない濃度であれば、いずれの濃度でも使用できる。例えば、Ｓ−２７７２では、０．５mM以上、特に０．５〜５．０mMとすることが好ましい。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様としては、まずＦＸａ又はトロンビンを適当な緩衝液に溶解し、これに血漿等の検体を加え、反応させ、次いでアルギニン又は上記オリゴペプチドと合成基質を含有する液を加え、吸光度の変化を測定し、検体中のＡＴIII量を定量する方法が挙げられる。なおアルギニン又はオリゴペプチドの添加時は、前記した様にこれに限られない。
【００１７】
【発明の効果】
本発明によれば、検体を希釈することなく高い測定精度を維持しながらＡＴIIIを測定することができる。また、本発明は操作性に優れ、簡便かつ迅速にＡＴIIIを測定でき、特に自動分析装置に好適に使用することができる。
【００１８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
下記組成の第１試薬１８０μｌに、所定量のＡＴIIIを含む血漿検体３μｌを加え、５分間３７℃で反応させ、次いで下記組成の第２試薬１８０μｌを添加後、１分間３７℃で反応させ、２％クエン酸９００μｌを添加し、反応を停止させ、波長４０５nmで吸光度を測定した。本実施例では、第２試薬液にＡｒｇ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ又はＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを１００mM添加し、pHを７．４に調整した後使用した。この時の切片及び感度を表１に示す。
【００２０】
第１試薬
牛ＦＸａ                ９．８nkat／ml
ヘパリン                ４IU／ml
50mMトリス・塩酸緩衝液  （pH７．４）
【００２１】
第２試薬
Ｓ−２７７２                ２．３mM
（アセチル−Ｄ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩）
100mMアルギニン・ＨＣｌ又はオリゴペプチド・ＮａＯＨ緩衝液（pH７．４）
【００２２】
【表１】
0004311796.tif 000002
【００２３】
本結果から明らかなように、アルギニン又は上記のオリゴペプチドを反応系中に添加することで、切片及び感度を低下させることができた。なお、切片はＡＴIII濃度が０％の時の吸光度、感度は切片からＡＴIII濃度が１００％の時の吸光度を減じた値を示す。
【００２４】
実施例２
下記組成の第１試薬５３０μｌに、所定量のＡＴIIIを含む血漿検体２μｌを加え、１分間３７℃で反応させ、次いで下記組成の第２試薬５３０μｌを添加後、１分間３７℃で反応させ、２％クエン酸２６５０μｌを添加し、反応を停止させ、波長４０５nmで吸光度を測定した。本実施例では、第２試薬にＡｒｇ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを１００mM添加し、pHを７．４に調整した後使用した。この時の切片及び感度を表２に示す。
【００２５】
第１試薬
牛トロンビン            ２．２nkat／ml
ヘパリン                ４IU／ml
50mMトリス・塩酸緩衝液  （pH７．４）
【００２６】
第２試薬
Ｓ−２３６６                ２．５mM
（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩）
100mMアルギニン・ＨＣｌ又はオリゴペプチド・ＮａＯＨ緩衝液（pH７．４）
【００２７】
【表２】
0004311796.tif 000003
【００２８】
本結果から明らかなように、アルギニン又は上記のオリゴペプチドを反応系中に添加することで、切片及び感度を低下させることができた。なお、切片ＡＴIII濃度が０％の時の吸光度、感度は切片からＡＴIII濃度が１００％の時の吸光度を減じた値を示す。
【００２９】
実施例３
下記組成の第１試薬１８０μｌに、所定量のＡＴIIIを含む血漿検体３μｌを加え、５分間３７℃で反応させ、次いで下記組成の第２試薬１８０μｌを添加後、波長４０５nmで１分間当たりの吸光度の変化量を測定し、検体中のＡＴIII量（活性：％）と吸光度の変化量を求めた。本実施例では、第２試薬にアルギニンを１００mM添加し、pHを７．４に調整した後、日立７１５０の自動分析装置にて、０〜１７５％濃度のＡＴIII検体の希釈系列を測定した（ｎ＝２測定）。この時の切片及び感度を表３に示す。また、検体の希釈系列を測定した時のデータを図１、２に示す。
【００３０】
第１試薬
ＦＸａ                  ９．８nkat／ml
ヘパリン                ４IU／ml
50mMトリス・塩酸緩衝液  （pH７．４）
【００３１】
第２試薬
Ｓ−２７７２                １．３mM
（アセチル−Ｄ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩）
100mMアルギニン・塩酸緩衝液（pH７．４）
【００３２】
【表３】
0004311796.tif 000004
【００３３】
本結果から明らかなように、感度の低下が認められるものの良好な希釈系列が得られた。なお、切片はＡＴIII濃度が０％の時の吸光度変化量、感度は切片からＡＴIII濃度が１００％の時の吸光度変化量を減じた値を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルギニン無添加の場合の検体の希釈系列を示す図である。
【図２】アルギニン添加の場合の検体の希釈系列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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