(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア属細菌由来又はコリネ型細菌由来のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を置換することによって、細胞中のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
【請求項２】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリンから選ばれる請求項１記載のコリネ型細菌。
【請求項３】
前記Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミクム又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである、請求項１又は２記載のコリネ型細菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリンから選ばれる請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記培地は炭素源としてフルクトースを含むことを特徴とする請求項４又は５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の製造法、及び同方法に用いる微生物及び新規遺伝子に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。
背景技術
従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子（変異型ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（ｄａｐＡ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）（ＷＯ９６／４０９３４）、ｌｙｓＡ及びｄｄｈ（特開平９−３２２７７４号）、ｌｙｓＣ、ｌｙｓＡ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）（特開平１０−１６５１８０号）、変異型ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ、ｄａｐＡ、ｌｙｓＡ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ）（特開平１０−２１５８８３号）を導入することにより、同細菌のＬ−リジン生産能が向上することが知られている。
また、エシェリヒア属細菌においては、ｄａｐＡ、変異型ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）（又はテトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺伝子（ｄａｐＤ）及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（ｄａｐＥ））を順次増強するとＬ−リジン生産能が向上することが知られている（ＷＯ  ９５／１６０４２）。尚、ＷＯ  ９５／１６０４２ではテトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼがスクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼと誤記されている。
一方、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（特公平７−１２１２２８号）。また、特開昭６１−２６８１８５号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さらに、特開昭６３−２１４１８９号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
しかし、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の構造はコリネ型細菌では報告されておらず、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子をコリネ型細菌の育種に利用することも知られていない。
尚、ブレビバクテリウム属細菌等のコリネ型細菌のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子は知られていない。
発明の開示
本発明は、従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法、及びそれに用いる菌株を提供することを課題とする。また本発明の他の課題は、前記菌株の構築に好適に利用することができるコリネ型細菌のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を提供することである。
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子をコリネ型細菌に導入し、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を増幅することにより、Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の生産量を増大させることができることを見出した。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）細胞中のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
（２）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリンから選ばれる（１）のコリネ型細菌。
（３）前記フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性の増強が、前記細菌細胞内のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによるものである前記（１）のコリネ型細菌。
（４）前記フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（３）のコリネ型細菌。
（５）前記フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子がコリネ型細菌由来である（３）のコリネ型細菌。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかのコリネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリンから選ばれる（６）の方法。
（８）前記培地は炭素源としてフルクトースを含むことを特徴とする（６）又は（７）記載の方法。
（９）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（９）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列のうち、塩基番号８８１〜２９４４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列のうち、塩基番号８８１〜２９４４からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、細胞中のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増強されたコリネ型細菌である。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン等が挙げられる。これらの中では、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。以下、本発明の実施の形態を、主としてＬ−リジン生産能又はＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌について説明するが、本発明は、目的とするＬ−アミノ酸固有の生合成系がフルクトースホスホトランスフェラーゼよりも下流に位置するものについては同様に適用され得る。
本発明でいうコリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム    ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム      ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・カルナエ                ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミクム            ＡＴＣＣ１３０３２
（ブレビバクテリウム・ディバリカタム）      ＡＴＣＣ１４０２０
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９
（コリネバクテリウム・リリウム）            ＡＴＣＣ１５９９０
（ブレビバクテリウム・フラバム）            ＡＴＣＣ１４０６７
コリネバクテリウム・メラセコーラ            ＡＴＣＣ１７９６５
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム      ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム      ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ロゼウム                ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス          ＡＴＣＣ１９２４０
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム      ＡＴＣＣ１５３５４
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス      ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、住所１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）より分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ＡＪ１２３４０株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブダペスト条約に基づいて寄託されている。
また、上記菌株以外にも、これらの菌株から誘導されたＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸生産能を有する変異株等も、本発明に利用できる。この様な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０８２（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７０）、特公昭５６−１９１４号、特公昭５６−１９１５号、特公昭５７−１４１５７号、特公昭５７−１４１５８号、特公昭５７−３０４７４号、特公昭５８−１００７５号、特公昭５９−４９９３号、特公昭６１−３５８４０号、特公昭６２−２４０７４号、特公昭６２−３６６７３号、特公平５−１１９５８号、特公平７−１１２４３７号、特公平７−１１２４３８号参照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第４４１１９９７号）。
また、Ｌ−スレオニン生産能を有するコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＪ１２３１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１７２）（米国特許第５，１８８，９４９号参照）等が、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネ型細菌としてはブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１２１４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９）（米国特許第４，６５６，１３５号参照）等が挙げられる。
＜２＞フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性の増幅
コリネ型細菌細胞中のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を増幅するには、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅される。フルクトースホスホトランスフェラーゼは、エシェリヒア・コリではｆｒｕＡ遺伝子にコードされている。
フルクトースホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、コリネ型細菌の遺伝子を用いることが好ましいが、エシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。
エシェリヒア・コリのｆｒｕＡ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２３１９６）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及び２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）参照）によって、ｆｒｕＡ遺伝子を取得することができる。
また、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｆｒｕＡ遺伝子は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、キサントモナス・コンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｐｅｓｔｒｉｓ）等の公知のｆｒｕＡ遺伝子から予想されるアミノ酸配列間で相同性の高い領域を選択し、その領域のアミノ酸配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを合成し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムを鋳型とするＰＣＲ反応を行うことによって、部分配列として取得することができる。前記プライマーとしては、配列番号３および配列番号４に示すオリゴヌクレオチドが挙げられる。
次に、前記のようにして取得されるｆｒｕＡ遺伝子の部分配列を利用して、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０，６２１−６２３（１９８８））法、又はＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いる方法等によって、ｆｒｕＡ遺伝子の５’未知領域及び３’未知領域を取得する。ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いる場合、ｆｒｕＡ遺伝子の３’未知領域は、例えば、一次ＰＣＲとして配列番号５、配列番号９に示すプライマーによるＰＣＲを、二次ＰＣＲとして配列番号６、配列番号１０に示すプライマーによるＰＣＲを行うことにより取得できる。また、ｆｒｕＡ遺伝子部分断片の５’未知領域は、例えば一次ＰＣＲとして配列番号７、配列番号９に示すプライマーによるＰＣＲを、二次ＰＣＲとして配列番号８、配列番号１０に示すプライマーによるＰＣＲを行うことにより、取得することができる。このようにして得られるｆｒｕＡ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１３に示す。また、この塩基配列から推定されるオープン・リーディング・フレームをアミノ酸配列に翻訳した配列を配列番号１４に示す。
また、本発明によりブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのｆｒｕＡ遺伝子及びその隣接領域の塩基配列が明らかとなったので、これらの隣接領域の塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、ｆｒｕＡ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
他の細菌のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
本発明のｆｒｕＡ遺伝子は、コードされるタンパク質のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から２００個、好ましくは、２から５０個、より好ましくは２から２０個である。
上記のようなフルクトースホスホトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、ｆｌｕＡの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、フルクトースホスホトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１３に記載の塩基配列のうち塩基番号８８１〜２９４４からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、フルクトースホスホトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄を行う条件が挙げられる。
プローブとして、配列番号１３の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１３の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１３の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を、Ｍｏｒｉ，Ｍ．＆  Ｓｈｉｉｏ，Ｉ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２９−１３８（１９８７）記載の方法で測定することによって、容易に選別することができる。
フルクトースホスホトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１４に示すアミノ酸配列と、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有し、かつフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｈ．Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｉｕｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
ＰＣＲ法により増幅されたフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０等が挙げられる。
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報参照）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
ｐＡＪ６５５    エシェリヒア・コリＡＪ１１８８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３
６）
コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０１（ＡＴＣＣ
３９１３５）
ｐＡＪ１８４４  エシェリヒア・コリＡＪ１１８８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３
７）
コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０２（ＡＴＣＣ
３９１３６）
ｐＡＪ６１１    エシェリヒア・コリＡＪ１１８８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３
８）
ｐＡＪ３１４８  コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０３（ＡＴＣＣ
３９１３７）
ｐＡＪ４４０    バチルス・ズブチリスＡＪ１１９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１
４０）
ｐＨＣ４        エシェリヒア・コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５
３２）
フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
上記のように調製した組み換えＤＮＡをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））も応用できる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする活性の増幅は、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅される。
フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のフルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、フルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が強化されることによってフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅される。
また、本発明のコリネ型細菌は、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性に加えて、他のアミノ酸生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化することによって、それらの酵素活性が増強されてもよい。例えば、Ｌ−リジンの製造に利用可能な遺伝子の例としては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼαサブユニット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコードする遺伝子（ＷＯ９４／２５６０５国際公開パンフレット）、コリネホルム細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭６０−８７７８８号公報）、コリネホルム細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（特公平６−５５１４９号公報）等が知られている。
また、Ｌ−グルタミン酸の製造に利用可能な遺伝子の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、特開昭６１−２６８１８５号）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラターゼ（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、フルクトースホスホトランスフェラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（特開昭６３−１０２６９２号）、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
さらに、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して同Ｌ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。例えば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（ＷＯ  ９５／２３８６４参照）。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリン酸デヒドロゲナーゼ、等がある。
さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（ＷＯ９６／０６１８０号参照）。このようなコリネ型細菌としては、ＷＯ９６／０６１８０号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１３０２９が挙げられる。ＡＪ１３０２９株は、１９９４年９月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５０１として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１８９が付与されている。
また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産させることができる（ＷＯ９６／０６１８０号参照）。このような菌株としては、ＷＯ９６／０６１８０号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２９９３株が挙げられる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３４８で寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１８８が付与されている。
＜３＞Ｌ−アミノ酸の生産
フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅され、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、同Ｌ−アミノ酸が培地に蓄積する。例えば、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅され、かつＬ−リジン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−リジンが培地に蓄積する。また、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が培地に蓄積する。
さらに、フルクトースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅され、かつＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が培地に蓄積する。Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に醗酵生産する場合には、Ｌ−リジン生産菌をＬ−グルタミン酸の生産条件下で培養してもよいし、あるいはＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌とＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を混合培養してもよい（特開平５−３７９３号公報）。
本発明の微生物を用いてＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を製造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。本発明においては、これらの中ではフルクトースが特に好適である。通常、コリネ型細菌を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の生産においては、培地の炭素源としてフルクトースを用いると収率が低下する傾向にあるが、本発明に用いる微生物は、フルクトースを炭素源とする培地でＬ−アミノ酸を効率よく産生する。この効果は、特にＬ−リジン生産において顕著である。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム塩、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティーブ・リカー、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、通常のＬ−アミノ酸の製造法と同様にして行うことができる。例えば、Ｌ−リジンの採取は、通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。また、Ｌ−グルタミン酸を採取する方法も常法によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよい。Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸の両方を製造する場合、これらを混合物として用いる場合には、これらのアミノ酸を相互に分離することは不要である。
発明の実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  ｆｒｕＡ遺伝子導入コリネ型細菌の構築
＜１＞エシェリヒア・コリＪＭ１０９株のｆｒｕＡ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリのｆｒｕＡ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２３１９６）。報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりフルクトースホスホトランスフェラーゼ遺伝子を増幅した。
合成したプライマーの内、配列番号１は、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２３１９６に記載されているｆｒｕＡ遺伝子の塩基配列の１番目から２４番目の塩基に至る配列に相当し、配列番号２は、２０００番目から１９７７番目の塩基に至る配列に相当する。
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反応条件を用いた。
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、ＳｍａＩで切断したプラスミドｐＨＣ４と、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。取得した形質転換体よりプラスミドを抽出し、ベクターにｆｒｕＡ遺伝子が結合したプラスミドｐＨＣ４ｆｒｕを得た。
ｐＨＣ４を保持するエシェリヒア・コリは、プライベートナンバーＡＪ１２６１７と命名され、１９９１年４月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１２２１５として寄託され、１９９１年８月２６日に、ブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５３２が付与されている。
次に、クローニングされたＤＮＡ断片がフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることを確認するため、ＪＭ１０９株及び、ｐＨＣ４ｆｒｕを保持するＪＭ１０９株のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性をＭｏｒｉ，Ｍ．＆  Ｓｈｉｉｏ，Ｉ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２９−１３８（１９８７）に記載の方法により測定した。その結果、ｐＨＣ４ｆｒｕを保持するＪＭ１０９株は、ｐＨＣ４ｆｒｕを保持しないＪＭ１０９株の約１１倍のフルクトースホスホトランスフェラーゼ活性を示すことから、ｆｒｕＡ遺伝子が発現していることを確認した。
＜２＞コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株へのｐＨＣ４ｆｒｕの導入とＬ−グルタミン酸生産
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１３０２９を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐＨＣ４ｆｒｕで形質転換し、得られた形質転換株を得た。得られた形質転換株ＡＪ１３０２９／ｐＨＣ４ｆｒｕを用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たＡＪ１３０２９／ｐＨＣ４ｆｒｕ株の菌体を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む下記組成を有するＬ−グルタミン酸生産培地に接種し、３１．５℃にて振とう培養し、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、同じ組成の培地に５％量接種し、３７℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌ＡＪ１３０２９株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
〔Ｌ−グルタミン酸生産培地〕
下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１１５℃で１５分殺菌する。
フルクトース            １５０ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                ２ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        １．５ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      １５ｍｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ      １５ｍｇ
大豆蛋白加水分解液        ５０ｍｌ
ビオチン                    ２ｍｇ
サイアミン塩酸塩            ３ｍｇ
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表１に示した。
0004306169.tif 000002
＜３＞コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へのｐＨＣ４ｆｒｕの導入とＬ−リジン生産
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０８２を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐＨＣ４ｆｒｕで形質転換し、得られた形質転換株を得た。得られた形質転換株ＡＪ１１０８２／ｐＨＣ４ｆｒｕを用いてＬ−リジン生産のための培養を以下のように行った。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たＡＪ１１０８２／ｐＨＣ４ｆｒｕ株の菌体を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む下記組成のＬ−リジン生産培地に接種し、３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌ＡＪ１１０８２株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０８２は、１９８１年１月３１日にアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（アメリカ合衆国  イリノイ州  ６６１６０４  ピオリア  ノースユニバーシティ通り１８１５（１８１５  Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４  Ｕ．Ｓ．Ａ．））に国際寄託され、受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７０が付与されている。
〔Ｌ−リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。
フルクトース            １００ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４        ５５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        １ｇ
ビオチン                ５００μｇ
チアミン              ２０００μｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．０１ｇ
ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．０１ｇ
ニコチンアミド              ５ｍｇ
蛋白質加水分解物（豆濃）  ３０ｍｌ
炭酸カルシウム            ５０ｇ
培養終了後、培養液中のＬ−リジン蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表２に示した。
0004306169.tif 000003
＜４＞コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産株へのｐＨＣ４ｆｒｕの導入とＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸同時生産
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２９９３を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐＨＣ４ｆｒｕで形質転換し、得られた形質転換株を得た。得られた形質転換株ＡＪ１２９９３／ｐＨＣ４ｆｒｕを用いてＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たＡＪ１２９９３／ｐＨＣ４ｆｒｕ株の菌体を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む前記Ｌ−リジン生産培地に接種して３１．５℃にて培養した。培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシフトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌ＡＪ１２９９３株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表３に示した。
0004306169.tif 000004
実施例２  ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのｆｒｕＡ遺伝子の単離
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９のｆｒｕＡ遺伝子の部分断片取得
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、キサントモナス・コンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｐｅｓｔｒｉｓ）のＦｒｕＡ間でアミノ酸配列の相同性の高い領域を選択し、その領域のアミノ酸配列から塩基配列を推定し、配列番号３および配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを合成した。一方、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮＡを０．５μｇ、前記オリゴヌクレオチドをそれぞれ２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ、各２．５ｍＭ）４μｌ、１０×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）５μｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造）１Ｕに滅菌水を加えて全量５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラーＴＰ２４０（宝酒造社製）を用いて、変性９８℃  １０秒、会合４５℃  ３０秒、伸長反応７２℃  ９０秒の条件で２５サイクルのＰＣＲを行ない、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動したところ、反応液に約１．２ｋｂのバンドが含まれることが判明した。
前記反応物をＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製し、配列番号５、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドを用いて、挿入断片の両端の塩基配列をＳａｎｇｅｒの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４３，１６１（１９８０））で決定した。具体的には、塩基配列の決定にはＢｉｇ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＡＢＩ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。決定された塩基配列をアミノ酸に翻訳し、バチルス・サブチリス、エシェリヒア・コリ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、キサントモナス・コンペストリスのｆｒｕＡ遺伝子から予測されるアミノ酸配列を比較したところ、高い相同性を示したことから、クローニングされた断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｆｒｕＡ遺伝子であると判断した。
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９のｆｒｕＡ遺伝子の全塩基配列決定
上記＜１＞で調製したプラスミドに含まれる断片はｆｒｕＡ遺伝子の部分断片であり、さらにｆｒｕＡ遺伝子全長の塩基配列を決定する必要がある。既知の領域に隣接する未知の塩基配列を決定する方法として、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０，６２１−６２３（１９８８））法や、ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いる方法などがあるが、ここではＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔにより未知配列の決定を行なった。具体的には＜１＞で決定した塩基配列をもとに配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドを合成し、ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔのプロトコールに従い行った。
ｆｒｕＡ遺伝子部分断片の３’未知領域に関しては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ処理後、Ｋｉｔ内のＨｉｎｄＩＩＩ  Ａｄａｐｔｅｒとライゲーション後、一次ＰＣＲとして配列番号７、配列番号１１によるＰＣＲを、二次ＰＣＲとして配列番号８、配列番号１２によるＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動したところ、約７００ｂｐのバンドが認められた。このバンドをＳｕｐｒｅｃ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて精製し、配列番号８、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを用いて、＜１＞記載の方法と同様にして７００ｂｐのＰＣＲ産物に含まれるｆｒｕＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
ｆｒｕＡ遺伝子部分断片の５’未知領域に関してはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ処理後、Ｋｉｔ内のＳａｕ３ＡＩ  Ａｄａｐｔｅｒとライゲーション後、一次ＰＣＲとして配列番号９、配列番号１１によるＰＣＲを、二次ＰＣＲとして配列１０、配列１２によるＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動したところ、約１５００ｂｐのバンドが認められた。このバンドをＳｕｐｒｅｃ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて精製し、配列番号１０、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを用いて、＜１＞記載の方法と同様にして１５００ｂｐのＰＣＲ産物に含まれるｆｒｕＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
こうして決定された塩基配列のうち、ｆｒｕＡ遺伝子を含む約３３８０ｂｐのｆｒｕＡ遺伝子を含む塩基配列を配列表配列番号１３に示す。この塩基配列から推定されるオープン・リーディング・フレームをアミノ酸配列に翻訳した配列を配列番号１４に示した。すなわち、配列表配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質がブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９のＦｒｕＡである。なお、たんぱく質Ｎ末端側にあるメチオニン残基は開始コドンであるＡＴＧに由来するため、たんぱく質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られており、上記たんぱく質の場合にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行なった。用いたデータベースはＧｅｎｅＢａｎｋおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号１３に示されるＤＮＡは、既に報告されているｆｒｕＡと相同性を持つ、コリネバクテリウム属細菌では新規な遺伝子であることが判明した。
配列番号１３に示されるＤＮＡは、バチルス・ズブチリス、エシェリヒア・コリ、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｅｎｅｔｉｌｉｕｍ）、及びキサントモナス・コンペトリウス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｐｅｓｔｒｉｓ）のｆｒｕＡと、アミノ酸レベルで各々４２．１％、５１．０％、３７．４％、及び４５．５％の相同性を示した。尚、塩基配列及びアミノ酸配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ（ソフトウェア開発、東京）により解析した。相同性解析は、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｓｏｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）の方法にしたがって行った。
産業上の利用の可能性
本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、本発明により、新規なブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のフルクトースホスホトランスフェラーゼ遺伝子が提供される。同遺伝子は、本発明によるＬ−アミノ酸の製造に適したコリネ型細菌等の育種に好適に用いることができる。
【配列表】
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