(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の哺乳動物の血液中の糖化ヘモグロビンを同一条件で測定するための液体クロマトグラフィー装置であって、測定カラムとしてアミノフェニルボロン酸基を有する充填剤を充填したカラムを装備し、
前記カラムを用いた糖化ヘモグロビンの測定を行なう際に、
前記充填剤の有するアミノフェニルボロン酸基への糖化ヘモグロビンの吸着を許容し、かつ非糖化ヘモグロビンの吸着を許容しない、１０から１００ｍＭの塩化マグネシウム、及び１から１５％のアセトニトリルを含む緩衝液からなる第一の溶離液、及び
前記充填剤に吸着した糖化ヘモグロビンの速やかな離脱を引き起こす、１０から１００ｍＭのソルビトール、１０から１００ｍＭのＥＤＴＡ、及び１から１５％のアセトニトリルを含む緩衝液からなる第二の溶離液を使用することを特徴とする、糖化ヘモグロビン測定装置。
【請求項２】
前記測定されるべき糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする、請求項１に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は家畜、愛玩動物、実験研究用動物等の、多種類の動物の血液中糖化ヘモグロビンを測定可能とした糖化ヘモグロビン測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の糖化ヘモグロビンは、過去１から2ヶ月間の平均血糖値を反映しており、ヒトにおいては、既に糖尿病の治療経過の判定や糖尿病のスクリーニングによる早期発見の指標として広く測定されている。ヒトの糖化ヘモグロビン測定は、陽イオン交換カラムや、アミノフェニルボロン酸基を用いたアフィニティーカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー装置や、糖化ヘモグロビンに対する特異抗体を使用する測定試薬等によって行われており、該測定試薬としては、具体的に免疫比濁法又はラテックス凝集法を採用した試薬が市販されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記した従来の糖化ヘモグロビン測定装置等は、ヒトの血液中に存在する糖化ヘモグロビンを測定するために開発されたものであるが、今日では、ヒト以外の多種類の脊椎動物の血液中に存在する糖化ヘモグロビンを測定するための装置に対する要望が強まっている。すなわち、ヒトの糖尿病治療に有効な化合物を、糖尿病を発症した脊椎動物を用いてスクリーニングしたり、このようにして得られた候補化合物の薬効・副作用を確認したり、更には愛玩動物として飼育される各種動物の糖尿病の診断・予防・治療を行うために、多種類の動物について糖化ヘモグロビンを測定できる装置が必要となっている。
【０００４】
しかしながら、動物種によってヘモグロビンはそのアミノ酸配列が異なり、その結果等電点が相違するために、前記した陽イオン交換カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー装置では、多種の動物の糖化ヘモグロビンを測定する際には動物種毎の測定条件を設定しなければならないという課題がある。溶離液の塩濃度やグラジエントパターンを、測定する動物種のヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを分離測定できるようにその都度調整できれば良いが、予め予想される全種類の溶離液を準備し、かつ、予想される全動物種のためのグラジエントパターン等を装置に記憶させておくのは実際上不可能である。また、予め予想される全種類の溶離液を準備し、全動物種のためのグラジエントパターン等を装置に記憶させたとしても、多種動物の血液試料が混在する状況下では、実際に測定する血液試料がいかなる動物に由来するのかを装置に自動的に認識させなければ、操作者が動物種情報を入力する必要が残り、自動測定装置を提供することはできない。そして、上記課題の全てを解決したとしても、結局は異なる測定条件で糖化ヘモグロビン測定を実施することに変わりはない。
【０００５】
そして前記した特異抗体を用いる測定試薬では、使用する抗体の認識部位によっては多種の動物の糖化ヘモグロビンを測定することが不可能となったり、また測定が可能であっても再現性の低い結果しか得られないという課題がある。
【０００６】
一方、アミノフェニルボロン酸基を用いたアフィニティーカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー装置は、アミノフェニルボロン酸基と糖化タンパク質のシスジオール結合との親和性を利用するため等電点の相違による影響を受けず、多種動物の糖化蛋白質を非糖化蛋白質と分離し得ることが報告されている（例えば、アメリカ特許第４２６９６０５号、Ｖ．Ｂｏｕｒｉｏｔｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｇｉａ  ２１，５７９（１９８１）、Ｔ．Ｓ．Ｒｅｉｄ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １２，２４９（１９８９））。しかしながら、該装置を用いて多種の動物のグリコヘモグロビン測定を行ったとの報告はなく、同一の測定条件にて、多種動物の血液試料について当該試料中に存在する種々の糖化蛋白質の影響を排除し、糖化ヘモグロビン測定を実施し得るか否かは不明である。また更に、同一条件で多種動物の糖化ヘモグロビン測定が可能であったとしても、該条件がいったいいかなるものであるかは全く不明である。
【０００７】
そこで本発明の目的は、多様な動物種の血液中に存在する糖化ヘモグロビンを、同一条件で測定するための装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために完成された本願請求項１の発明は、多種類の動物の血液中の糖化ヘモグロビンを測定するための液体クロマトグラフィー装置であって、測定カラムとしてアミノフェニルボロン酸基を有する充填剤を充填したカラムを装備した、動物の血液中糖化ヘモグロビン測定装置である。そして本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記測定されるべき糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明の装置は、測定カラムとしてアミノフェニルボロン酸基を有する充填剤を充填したカラムを装備する点に特徴を有するが、該カラムのほかに、一般的な液体クロマトグラフィー装置が装備する部品を含むものである。かかる部品としては、例えば、送液ポンプ、試料注入バルブ、測定カラム、検出器、測定カラムを一定温度に保つカラムオーブン、被検試料血液を自動的に希釈溶血するオートサンプラー等が例示できるが、これらに限定されるものではない。中でも、測定カラムを一定温度に保つカラムオーブンと被検試料血液を自動的に希釈溶血するオートサンプラーは、高精度の自動測定装置を提供するうえで採用することが好ましい。なお前記部品は、例えば測定時間の短縮を可能とする、いわゆる高速液体クロマトグラフィー装置を提供する場合には、それぞれ要求される耐圧を有するものを採用すれば良い。
【００１０】
本発明の装置は、動物から採取した血液に希釈液を加えて希釈溶血し、セットするような構成としても良いが、装置が自動的に採血管等に採取した動物血液をサンプリングし、希釈液を加えて自動的に希釈溶血し、その後自動的に糖化ヘモグロビンを測定するように構成しても良い。この際使用する希釈液は、例えば非イオン性の界面活性剤溶液である。
【００１１】
前記測定カラムは、アミノフェニルボロン酸基を有する充填剤を充填したカラムであれば、市販のカラム等を使用することができる。かかる市販のカラムとして、ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ）（商品名、東ソー（株）製）を例示できる。前記検出器としては、一般的な液体クロマトグラフィー用の紫外可視検出器のうち、例えばヘモグロビン検出に適した４１５ｎｍの吸収を検出可能なものを採用することができる。
【００１２】
次に、本発明の装置を用いる、多種の動物の糖化ヘモグロビンの測定について説明する。測定には、２種類の溶離液（以下、第１液及び第２液とする）を使用する。第１液は糖化ヘモグロビンのアミノフェニルボロン酸基への結合を許容し、かつ、非糖化ヘモグロビンのアミノフェニルボロン酸基への吸着を許容しないように塩濃度やｐＨ等が調製された緩衝液であり、第２液は吸着した糖化ヘモグロビンの速やかな離脱を引き起こすように塩濃度やｐＨ等が調製された緩衝液である。これら緩衝液の種類（緩衝剤の種類）、塩濃度、ｐＨ等は、前述の文献の記載に基づいて適宜調製することが可能であるが、本発明者の知見によれば、１５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０ｍＭ塩化マグネシウム及び５％アセトニトリルを含むｐＨ８．８の緩衝液と５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭソルビトール、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％アセトニトリルを含むｐＨ８．０の緩衝液をそれぞれ第１液、第２液とすることで、多種動物の糖化ヘモグロビン測定を実施することが可能となる。第１液としては、前記した以外にも、具体的にＨＥＰＥＳ、酢酸アンモニウム又はグリシン等の緩衝剤、１０から１００ｍＭ塩化マグネシウム、そして、１から１５％のアセトニトリル、エタノール又はメタノール等を含む液を例示できる。第２液としては、前記した以外にも、具体的にトリスヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ）等の緩衝剤、１０から１００ｍＭのソルビトール、マンニトール、キシリトール又はグルシトール等、１０から１００ｍＭのＥＤＴＡ、そして、１から１５％のアセトニトリル、エタノール又はメタノール等を含む液を例示できる。
【００１３】
希釈溶血した動物からの血液試料の一定量をサンプリングし、試料注入バルブにより液体クロマトグラフィーの送液ラインに試料を注入し、第１液と第２液を交互に切り替えて送液する。第１液と第２液の送液切り替えのタイミングは血液試料の注入間隔（Ｔ）に連動させることが、迅速に測定を行い、一定時間当たりの測定数を向上するうえで好適である。例えば、第１液によって平衡化した測定カラムに対し、まず血液試料を注入し、血液試料注入後一定時間一定時間（Ｔ１）は第１液を、さらにその後一定時間（Ｔ２）は第２液を送液し、その後、一定時間（Ｔ３）は再度第１液を送液する。ここでＴ＝Ｔ１＋Ｔ２＋Ｔ３である。試料中の非糖化ヘモグロビン成分は測定カラムに吸着しないため、第１液とともに溶出する。一方、糖化ヘモグロビン成分は、第２液を送液した際ににカラムから溶出する。カラムからのヘモグロビン成分の溶出は、４１５ｎｍの吸光度を連続的に測定することでモニターでき、データ処理装置やチャートレコーダで記録できる。
【００１４】
糖尿病の指標となる糖化ヘモグロビン％は、溶出した非糖化ヘモグロビン画分の吸光度の積分値と糖化ヘモグロビン画分の吸光度の積分値の和に対する糖化ヘモグロビン画分の吸光度の積分値により算出できる。また得られた糖化ヘモグロビン％をヘモグロビンＡ１ｃ％に換算する場合は、予めヘモグロビンＡ１ｃ％値が既知のキャリブレータを測定してキャリブレーションすることで求めることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１６】
図１は、多種類の動物の血液中の糖化ヘモグロビンを測定するための液体クロマトグラフィー装置の一例について、その概略を示す図であり、該装置は、溶離液を切り替える切り替えバルブ４、試料血液を送液する送液ポンプ５、試料を注入するインジェクションバルブ６、測定カラム７、検出器８、プリンター９から構成されている。図示した装置は、市販されている、ヒトの糖化ヘモグロビンを自動的に測定するための装置（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ、商品名、東ソー（株）製）を改造した本発明の装置であり、溶離液の種類及び数、溶離液の送液を切り替える時間（タイミング）、そして測定カラムが変更されている。測定カラムは、イオン交換カラムからアミノフェニルボロン酸基を有する充填剤を充填した市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ、商品名、東ソー（株）製）に変更した。
【００１７】
図示した装置を用いて、多種の動物からの血液試料について測定を実施した。測定に際しては、血液試料の溶血希釈及びインジェクションバルブを含むサンプラ部の洗浄液として市販の溶血洗浄液（前記市販の自動グリコヘモグロビン分析計用のＨＳｉ溶血洗浄液、東ソー（株）製）、第１液（図中１）（１５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０ｍＭ塩化マグネシウム及び５％アセトニトリルを含むｐＨ８．８の緩衝液）及び第２液（図中２）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭソルビトール、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５％アセトニトリルを含むｐＨ８．０の緩衝液）を使用した。なお、図には溶離液３を記載しているが、これは前記市販装置を使用する場合の溶離液であり、本実施例では使用していない。
【００１８】
血液試料をラット及び家兎から採取し、前記条件で測定を実施した。エッペンドルフチューブに各血液試料を１０μｌずつ採り、前記溶血洗浄液を１ｍｌ加え、ボルテックスミキサーにより溶血希釈を行った。装置は溶血試料を装置のオートサンプラにセットしスタート指示するだけで、一定時間おきに溶血試料を自動的に吸引して測定を実行する。本実施例においては、前記Ｔを２．５分とし、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３をそれぞれ５０秒、３０秒、７０秒に設定した。
【００１９】
以上のようにして測定を実施した時の、４１５ｎｍ吸収の変化を図２及び図３に示す。図２はラットの血液試料についての結果であり、図３は家兎の血液試料についての結果である。
【００２０】
図からも明らかなように、ラットと家兎という、異なる脊椎動物の血液中の糖化ヘモグロビンが同一測定条件によって測定可能であった。
【００２１】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明の装置によれば、多種動物の血液中の糖化ヘモグロビンを同一条件で測定することが可能である。この結果、測定しようとする動物種によって測定条件を変更し、溶離液の塩濃度やグラジエントパターンを調整する必要がない。従って、例えば多種動物の血液試料が混在しているような状況下でも、操作者が動物種情報を入力することなく、自動的に測定を実施することが可能となる。
【００２２】
従って本発明の装置は、ヒトの糖尿病治療に有効な化合物を、糖尿病を発症した脊椎動物を用いてスクリーニングしたり、このようにして得られた候補化合物の薬効・副作用を確認したり、更には愛玩動物として飼育される各種動物の糖尿病の診断・予防・治療を行うために有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の一実施形態について、その概略を示す図である。
【図２】実施例において取得されたクロマトグラムを示すものである。
【図３】実施例において取得されたクロマトグラムを示すものである。
【符号の説明】
１、２    溶離液
４        切り替え弁
５        ポンプ
６        インジェクションバルブ
７        測定カラム
８        検出器
９        プリンター
【図１】
0004306116.tif 000002
【図２】
0004306116.tif 000003
【図３】
0004306116.tif 000004