(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表わされる化合物：
【化１】
0004309037.tif 000008
［ただし、Ｒはアルキレン−イミノ−アルキレン基であり、Ｑはアルキレン基であり、Ｅは置換基を有していてもよいフェロセニル基であり、ＺおよびＺ１は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基である。］
【請求項２】
式中の二つのＥ、二つのＱ、そして二つのＲが、それぞれ、互いに同一の基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒに含まれるイミノが、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基で置換されている請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒに含まれるイミノが、メチル基で置換されている請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｑが、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基である請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｅが、フェロセニル基である請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｅが、下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）からなる群より選ばれる置換基を有しているフェロセニル基である請求項１に記載の化合物。
【化２】
0004309037.tif 000009
【請求項８】
ＺおよびＺ１が、それぞれ、水素原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
下記式（１）で表わされる酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータ：
【化３】
0004309037.tif 000010
［ただし、Ｒはアルキレン−イミノ−アルキレン基であり、Ｑはアルキレン基であり、Ｅは置換基を有していてもよいフェロセニル基であり、ＺおよびＺ１は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基である。］
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析のための電気化学的分析法に用いられる請求項９に記載の縫い込み型インターカレータ。
【請求項１１】
電極基板の表面に備えられた一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子と、該プローブ分子と相補的な関係にあるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とを水性媒体と請求項９に記載の縫い込み型インターカレータの存在下でハイブリダイズさせて、該縫い込み型インターカレータが挿入された、該プローブ分子とオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料との複合体を形成させる工程、そして上記電極基板に電位を付与し、これにより発生する電流を検知する工程を含むオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析方法。
【請求項１２】
電極基板の表面に備えられた一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子と、該プローブ分子と相補的な関係にあるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とを水性媒体の存在下でハイブリダイズさせ、次いで請求項９に記載の縫い込み型インターカレータを接触させることにより、該縫い込み型インターカレータが挿入された、該プローブ分子とオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料との複合体を形成させる工程、そして上記電極基板に電位を付与し、これにより発生する電流を検知する工程を含むオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析方法。
【請求項１３】
電極基板に付与する電位が１００乃至４００ｍＶの範囲内の電位であることを特徴とする請求項１１もしくは１２に記載の分析方法。
【請求項１４】
一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子が備えられた電極基板、そして請求項９に記載の縫い込み型インターカレータとからなるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析のための分析キット。
【請求項１５】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはペプチド核酸である請求項１４に記載の分析キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上に固定されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体などのプローブ分子と相補性を有する核酸断片などのポリヌクレオチド試料もしくはオリゴヌクレオチド試料を電気化学的に検出する際に電気化学活性な縫い込み型インターカレータとして有利に用いることのできる化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学や医学分野での遺伝子発現のモニタリング、核酸の塩基配列の決定、遺伝子変異解析、遺伝子多型解析等においては、特定の配列を有する核酸を検出する方法として、サザンハイブリダイゼーション法に代表されるハイブリダイゼーション法が用いられている。サザンハイブリダイゼーション法などの従来公知の方法では通常、標識としてＲＩ（放射性標識）が用いられている。ただし、サザンハイブリダイゼーション法では、ＲＩの代わりに蛍光を用いる手法も知られている。
【０００３】
近年、ＤＮＡ断片などのポリヌクレオチド試料あるいはオリゴヌクレオチド試料を、当該ＤＮＡ断片と相補性を示すヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を基板表面に固定した検出用具（一般に、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡアレイと呼ばれている）を用い、その相補性を利用して、ハイブリダイゼーションにより、基板上に固定して、その塩基配列などの分析を行なう技術が開発され、遺伝子の塩基配列の決定などの目的で利用されている。このＤＮＡチップ（あるいはＤＮＡアレイ）を用いる検出方法では、ＤＮＡ断片に蛍光標識を付して、ハイブリダイゼーションにより基板に固定されたＤＮＡ断片を検出する手段が利用されている。標識手段として蛍光を用いる方法は、蛍光の内部消光のために、一定以上の蛍光物質を標識として導入することは困難であるという欠点を有するものの、アトモルのレベルの極度に少ない量のＤＮＡ断片試料の解析が可能な点で有効な方法であるとされている。
【０００４】
一方、特開平９−２８８０８０号公報には、標識手段として導電性物質を使用する方法が開示されている。この方法によると、核酸断片などのヌクレオチド誘導体プローブ分子を電極表面に静電的に固定し、ここに、該ヌクレオチド誘導体に相補性を示すＤＮＡ断片試料、そして酸化還元活性を有する下記式で表されるフェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで標識された導電性の縫い込み型インターカレータを接触させると、プローブ分子とＤＮＡ断片試料とのハイブリダイゼーションによってらせん構造体などの複合体が形成され、その複合体の内部に導電性インターカレータが挿入されるため、電極に電位を印加すると、別に設けた対極と電極との間に導電性インターカレータを介して電流が流れるため、その電流量を測定することによって、ハイブリッドらせん構造体などの複合体の生成が検出できる。
【０００５】
【化４】
0004309037.tif 000002
【０００６】
上記の導電性縫い込み型インターカレータは、ナフタレンジイミド環状基をコア（中央核部分）とし、その両端部に鎖状のリンカー部分を有し、そして、リンカー部分の先端体部には酸化還元活性を持ち、共役系を有する導電性フェロセン分子が付いている。
【０００７】
電極上のプローブ分子に相補性を有する試料ＤＮＡ断片の検出では、電極に電位を印加して得られる電流量は、プローブ分子、ＤＮＡ断片試料、測定緩衝液の塩濃度等の条件によって若干変動するが、上記の導電性縫い込み型インターカレータを使用した場合には、流れる電流量は、約４５０乃至約６２０ｍＶの範囲にある電位を印加した場合にピーク値を示すため、通常、そのピーク電流値を与える約４５０ｍＶより高い電位を印加することによって行なわれる。
【０００８】
上記のピーク電流が発生する電位範囲の約４５０乃至約６２０ｍＶは比較的高い値であるため、そのような電位を電極に与える測定装置の製造は、製造コスト面で不利になる。また、電極表面に静電結合などの比較的弱い結合状態で固定されたプローブ分子は、高い電位の付与によって電極表面から離脱しやすくなるため、検出対象となるＤＮＡ断片試料の検出感度や検出精度の低下が問題となる。特に、プローブ分子を有する電極を、一旦結合したＤＮＡ断片試料とインターカレータとを離脱させたのち、同様の操作に繰り返し用いる場合には、検出感度や検出精度の低下が発生しやすい。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌクレオチド誘導体あるいはその類縁体が電極表面に固定されたＤＮＡチップを用い、ＤＮＡ断片試料などのポリヌクレオチド試料もしくはオリゴヌクレオチド試料を導電性縫い込み型インターカレータを利用して電気化学的に検出する操作の実施に於いて、相対的に低い電位の使用によっても高い検出感度や検出精度での検出操作を可能にする導電性縫い込み型インターカレータとして有用な化合物を提供することを主な課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記式（１）で表わされる化合物にある。
【００１１】
【化５】
0004309037.tif 000003
【００１２】
［ただし、Ｒはアルキレン−イミノ−アルキレン基であり、Ｑはアルキレン基であり、Ｅは置換基を有していてもよいフェロセニル基であり、ＺおよびＺ１は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基である。］
【００１３】
上記式（１）において、式中の二つのＥ、二つのＱ、そして二つのＲが、それぞれ、互いに同一の基であることが好ましい。
【００１４】
Ｒに含まれるイミノは、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。Ｒに含まれるイミノは、メチル基で置換されていることが好ましい。Ｑは、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基であることが好ましい。
【００１５】
Ｅは、フェロセニル基であるか、下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）からなる群より選ばれる置換基を有しているフェロセニル基であることが好ましい。
【００１６】
【化６】
0004309037.tif 000004
【００２０】
本発明はまた、前記式（１）で表わされる化合物からなる酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータにもある。この縫い込み型インターカレータは、特にオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析のための電気化学的分析法に有利に用いられる。
【００２１】
本発明の縫い込み型インターカレータは、下記のオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析のための電気化学的分析法に特に有利に用いられる。
（１）電極基板の表面に備えられた一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子と、該プローブ分子と相補的な関係にあるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とを水性媒体と縫い込み型インターカレータの存在下でハイブリダイズさせて、該縫い込み型インターカレータが挿入された、該プローブ分子とオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とのらせん構造体などの複合体を形成させる工程、そして上記電極基板に電位を付与し、これにより発生する電流を検知する工程を含むオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析方法。
【００２２】
（２）電極基板の表面に備えられた一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子と、該プローブ分子と相補的な関係にあるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とを水性媒体の存在下でハイブリダイズさせ、次いで縫い込み型インターカレータを接触させることにより、該縫い込み型インターカレータが挿入された、該プローブ分子とオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とのらせん構造体などの複合体を形成させる工程、そして上記電極基板に電位を付与し、これにより発生する電流を検知する工程を含むオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析方法。
【００２３】
上記の分析方法に於いて、本発明の縫い込み型インターカレータを用いると、電極基板付与する電位として、１００乃至４００ｍＶの範囲内の相対的に低い電位が利用できる。
【００２４】
なお、本発明の縫い込み型インターカレータは、一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子が備えられた電極基板と組合わせた分析キットとして利用することもできる。上記の、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはペプチド核酸を挙げることができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の発明者は、公知の導電性縫い込み型インターカレータを用いてのＤＮＡ断片試料の電気化学的検出操作において必要となる高い電位は、酸化還元活性を持ち、共役系を有する導電性フェロセン分子などの導電性基の共役系が、アミド結合部分などのπ結合系にまで拡大した共役系を形成するため、導電性基における移動性電子密度が低下することに関連があるという推定のもとに、導電性基の共役系をリンカー部分にまで拡大させないことにより、検出操作において必要な電位の低下が実現できるのではないかと期待して、そのような化学構造の化合物を合成し、その化合物を導電性縫い込み型インターカレータと使用して、ＤＮＡ断片試料の電気化学的検出操作を実施したところ、その期待通りの低電圧（低電圧）で電流検出が可能になった。
本発明は、上記の新規な知見に基づいて完成されたものである。
【００２６】
本発明において導電性縫い込み型インターカレータとして有利に用いられる化合物は、下記式（１）で表わされる化合物である。
【００２７】
【化７】
Ｅa−Ｌa−Ｘ−Ｌb−Ｅb   −−  （１）
【００２８】
本発明において導電性縫い込み型インターカレータとして特に有利に用いられる化合物は、下記式（２）で表わされる化合物である。
【００２９】
【化８】
Ｅa−Ｌ1a−Ｌ2a−Ｘ−Ｌ2b−Ｌ1b−Ｅb   −−  （２）
【００３０】
式（１）および式（２）において、Ｘは、置換基を有していてもよい二価の環状基を表す。二価の環状基としては、平面性を有する環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基、２位と６位、もしくは１位と５位（好ましくは２位と６位）とに結合手を有するアントラセン基、アントラセン基と同じ位置に結合手を有するアントラキノン基、２位と６位とに結合手を有するフルオレン基、２位と６位とに結合手を有するビフェニレン基、２位と７位とに結合手を有するフェナントレン基、および２位と７位とに結合手を有するピレン基からなる群より選ばれる環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基であることが特に好ましい。置換基としては、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル基であることが好ましいが、水素原子であることが好ましい。炭素原子数１乃至６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが好ましい。
【００３１】
前記式（１）において、ＬaおよびＬbは、互いに独立に、それぞれがＥaおよびＥbの共役系が延長される共役系を形成することのない連結基であって、少なくとも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する部位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換し得る部位を有する連結基である。ここで、「水溶性を付与する部位に変換し得る部位」とは、たとえば、メチル基を置換基として有するイミノ基のように、硫酸などの酸と接触した場合に、硫酸塩部位に変換され、水溶性を示すように変化する部位を有する。勿論、「本化合物に水溶性を付与する部位」に塩部分のような荷電部分を持っていてもよい。
【００３２】
ＬaおよびＬbは、互いに独立に、ＥaおよびＥbに隣接する側に、置換基を有していてもよい炭化水素基（前記式（２）のＬ1aとＬ1bに相当する基）を有し、一方、Ｘに隣接する側に炭素元素以外の元素を含む連結基（前記式（２）のＬ2aとＬ2bに相当する基）とからなる連結基であることが好ましい。従って、ＬaおよびＬbは、それぞれ、前記式（２）の−Ｌ1a−Ｌ2a−、そして−Ｌ2b−Ｌ1b−に該当する連結基であることが望ましい。ここで、Ｌ1aとＬ1bは、互いに独立に、置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が２乃至６のアルケニレン基であることが好ましく、一方、Ｌ2aとＬ2bとは、互いに独立に、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを含む連結基であることが望ましい。
【００３３】
Ｌ1aおよびＬ1bの置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアルキルアミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原子数が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至７のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０のＮ−アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカルボニル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニル基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、並びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン原子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の数が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基では、１乃至１２個であることが好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至６のアルケニレン基については、その数は１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。
【００３４】
Ｌ2aとＬ2bとは、互いに独立に、それぞれ、置換基を有していてもよい、アミド結合基、エステル結合基、エーテル結合基、チオエーテル結合基、ジイミド結合基、チオジイミド結合基、チオアミド結合基、イミノ結合基、カルボニル結合基、チオカルボニル結合基および１，４−ピペラジニル基からなる群より選ばれる基を一個もしくは複数個含む連結基であることが好ましく、特に好ましいのはアミド基（−ＮＨＣＯ−基、もしくは−ＣＯＮＨ−基）である。
【００３５】
Ｌ2aとＬ2bの置換基の例としては、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。炭素原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチル基もしくはエチル基であることが好ましく、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のアシル基としては、アセチル基であることが好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル基もしくはナフチル基であることが好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基としては、ベンジル基であることが好ましい。
【００３６】
Ｌ2aとＬ2bがイミノ結合基である場合、その置換基としては、メチル基であることが特に好ましい。従って、Ｌ2aとＬ2bは、それぞれ独立に、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ−プロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに好ましく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基であることが特に好ましい。
【００３７】
ＥaおよびＥbは、酸化還元活性を有し、これによって導電性を付与する基であり、互いに独立に、置換基を有していてもよい、一つ以上の結合手を持つメタロセン、２，２’−ビピリジン錯体、シクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、１，１０−フェナントロリン錯体、トリフェニルホスフィン錯体、カテコールアミン、あるいはビオローゲンなどであることが好ましい。置換基を有していてもよい一つの結合手を持つフェロセンであることが特に好ましい。ＥaおよびＥbは互いに同一の基であることが好ましい。次に、置換基を有するフェロセンの具体例を示す。置換基の位置は、シクロペンタジエニル基の何れの位置であってもよい。
【００３８】
【化９】
0004309037.tif 000005
【００３９】
本発明の縫い込み型インターカレータとして有利に用いることのできる化合物は、例えば、公知のジアミン化合物を原料として、公知の方法（特開平９−２８８０８０号公報）に準じる製造方法によって簡便に製造することができる。
【００４０】
また、本発明の化合物は、公知のジアミン化合物を出発物質とする下記の式で代表される合成ルートによっても安価に、かつ収率良く製造することができる。
【００４１】
【化１０】
0004309037.tif 000006
【００４２】
上記合成ルートは、反応＜ａ＞、＜ｂ＞、および＜ｃ＞からなる。公知のジアミン化合物を二種類以上使用し、ナフタレンジイミド構造（コア）に対して互いに異なるリンカー部分を縮合させてもよいが、本合成ルートでは、代表的な製造方法を示すこととする。
【００４３】
以下、それぞれの反応について分説する。
【００４４】
上記合成ルートの（４）の化合物：Ａ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ2は、（５）で表わされる公知のジアミンから、公知の方法（Green T.W.,Wuts.P.G.M,Protective Groups in Organic Synthesis(2nd Edition,Wiley,New York,1991,315-345,349-358）に準じる方法を利用して合成することができる。
【００４５】
Ａは、炭素原子数が２乃至５のアシル基、炭素原子数が２乃至５のアルコキシカルボニル基、および置換基を有していてもよいベンゾイル基もしくはベンジルオキシカルボニル基からなる群より選ばれる基であることが好ましく、アセチル基、ｔ−ブチルカルボニル基（ピバロイル基）、ｔ−ブトキシカルボニル基、もしくは置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基であることが特に好ましい。ベンゾイル基もしくはベンジルオキシカルボニル基が有していてもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、および炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。置換基の数は、１乃至５個であることが好ましく、１個であることが特に好ましい。
【００４６】
（４）の保護アミンは、一般的には、ジアミン化合物（５）に、Ａに対応する酸ハライド、もしくはＡに対応する酸無水物を反応させることによって得ることができる。Ａに対応する酸ハライド、もしくはＡに対応する酸無水物としては、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ（ＯＢｔ）基、スクシンイミジルオキシ（ＯＳｕ）基、３−チアゾリジン−２−チオン基等を脱離基として有する反応試薬であることが好ましい。このような試薬としては、３−ベンジルオキシカルボニル−１，３−チアゾリジン−２−チオンを用いることが特に好ましい。上記反応試薬に対して、ジアミン（５）を過剰量加えることが好ましく、その割合は、３乃至１０倍モルの範囲にあることが特に好ましい。
【００４７】
反応は、有機塩基もしくは無機塩基を用いて行なってもよい。有機塩基としては、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等を挙げることができる。無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を挙げることができる。塩基の添加量の割合は、酸ハライド等の反応試薬に対して、０．１倍乃至大過剰モルの範囲にあることが好ましく、１乃至１０倍モルの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
反応は、溶媒中にて実施することが好ましいが、無溶媒で実施することもできる。溶媒としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール等）、アミド類（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル）、エーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、ジメチルスルホキシド、スルホランおよび水を挙げることができる。これらの溶媒を二種類以上混合して用いてもよい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００４９】
（３）の化合物：Ａ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｑ−Ｅは、（４）の保護アミン化合物と、ＭＯ2Ｃ−Ｑ−Ｅ、あるいはＭ1ＯＣ−Ｑ−Ｅとを縮合させることによって製造することができる（反応＜ａ＞）。Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子（ナトリウム原子、カリウム原子等）、あるいは窒素原子に結合手を有するイミド基を表す。窒素原子に結合手を有するイミド基としては、スクシンイミド基、フタルイミド基、グルタルイミド基等を挙げることができる。Ｍ1は、活性基を表し、ハロゲン原子、−ＳＯ2Ｃｌ基、あるいは後述する縮合剤との反応中間体の該当する基であることが好ましい。
【００５０】
反応＜ａ＞は、アミノ基とカルボン酸基との縮合反応である。縮合反応は、Larock R.C.,Comprehensive Organic Transformations(VCH,New York,1989,972-976)に記載されている方法により行うことができる。縮合反応は、縮合剤を用いて行うことが好ましい。縮合剤としては、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等を用いることが好ましい。反応は、溶媒の存在下で行うことが好ましい。溶媒としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、前述の反応＜ａ＞で示した有機溶媒に加え、ハロゲン系溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等）、およびエステル類（酢酸エステル等）を挙げることができる。これらの有機溶媒を混合して用いてもよく、水、あるいは水とこれらの有機溶媒との混合溶媒も好ましく用いることができる。この反応では、（４）の化合物に対して、例えば、（６）のカルボン酸を過剰量加えることが好ましく、その割合は１乃至２倍モルの範囲にあることが好ましい。また、（４）の化合物に対しては、Ｍ1ＯＣ−Ｑ−Ｅの化合物を、過剰量加えることが好ましく、その割合は、１乃至３倍モルの範囲にあることが好ましい。
【００５１】
縮合剤として、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等を用いる場合には、更に、酸性の添加剤もしくは塩基性の添加剤を用いることができる。酸性の添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドキシベンゾトリアゾール、もしくは３，４−ジヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンを用いることが好ましい。塩基性の添加剤としては、第三アミン、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、もしくは４−ジメチルアミノピリジンを用いることが好ましい。添加剤の添加量は、縮合剤に対して、０．１倍乃至大過剰モルの範囲にあることが好ましく、１乃至３倍モルの範囲にあることが特に好ましい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００５２】
反応＜ｂ＞は、アミノ基の脱保護反応である。保護基Ａにより脱保護の条件を決定する。一般的には、Protective Groups in Organic Synthesisに記載されている条件を用いることができる。その中でも、ヨードトリメチルシランを用いる方法が特に好ましい。この反応は、溶媒中にて実施することが好ましいが、無溶媒で実施することもできる。溶媒としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、ハロゲン系溶媒（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン等）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル等）、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、芳香族系溶媒（トルエン、ベンゼン等）、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。この反応では、（３）の化合物に対してヨードトリメチルシランを過剰量加えることが好ましく、その割合は１乃至１０倍モルの範囲にあることが好ましい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００５３】
反応＜ｃ＞は、コア部分に相当するナフタレンジイミド構造（７）に、（２）の化合物を側鎖として脱水縮合させ、（１）の化合物を得る反応である。コア部分に相当するナフタレンジイミドの原料としては、一般的に、１，４，５，８−ナフタレン四カルボン酸二無水物を用いることが好ましい。反応は、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であることを条件に、前述の反応＜ａ＞、＜ｂ＞および＜ｃ＞で示した有機溶媒あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。反応では、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物に対して、（２）の化合物を２当量以上加えることが好ましい。使用する溶媒によっては、（２）の化合物の量は２当量以下であってもよい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことが、０℃乃至使用溶媒の沸点の温度範囲にて行なうことが特に好ましい。
【００５４】
次に、本発明の縫い込み型インターカレータを用いてＤＮＡ断片試料などの核酸断片試料（ポリヌクレオチド試料あるいはオリゴヌクレオチド試料）を検出する方法について説明する。
【００５５】
本発明の核酸断片試料の検出方法は、下記の工程を含む。
（１）電極表面にヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体であるプローブ分子を固定した電気化学分析素子に、核酸断片試料が溶解もしくは分散している水性液を、前記記載の本発明の縫い込み型インターカレータの存在下に接触させて、プローブ分子に対して相補性を有する核酸断片試料とを結合させ、二本鎖複合体を形成させると共に、該複合体に縫い込み型インターカレータを挿入させる工程を実施する。ここで、電気化学分析素子とは、基板表面に区画された、導電性を付与された一つまたは複数の領域のそれぞれにプローブがその一端で固定された構造を代表とする分析素子をいう。そして、（２）電気化学分析素子の導電性部分、好ましくは電極に電位を印加し、分析素子の電極と対極との間を、縫い込み型インターカレータを介して流れる電流量を測定する工程を実施する。なお、（１）の工程において、先にプローブ分子と核酸断片試料との複合体を形成し、ついで縫い込み型インターカレータに接触させて、複合体にインターカレータを挿入することもできる。
【００５６】
基板表面上に区画された一つまたは複数の領域とは、導電性を持たない基板上に配置された領域をいう。領域が複数個である場合には、それらは互いに接しないように、かつ規則的に配置されていることが好ましい。基板表面に区画された一つまたは複数の領域は、プローブ分子の固定および導電性の付与のため、その表面が予め処理されている。金、炭素、グラシーカーボン等で処理されていることが好ましく、金で蒸着処理されていることが特に好ましい。基板表面上に区画された一つまたは複数の領域には、金、炭素等で表面処理をする前に、電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって、表面処理後の領域の凹凸を軽減することができる。従って、基板表面に区画された、導電性を付与された一つまたは複数の領域とは、表面処理がなされた導電性を有する領域である。
【００５７】
基板としては、電気絶縁性の疎水性担体、あるいは電気絶縁性の低親水性の担体であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。基板の材質は、上記記載の各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。基板の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００５８】
導電性を有する一つまたは複数の領域が備えられた基板としては、文献（Sosnowski,R.G. et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,1119-1123(1997))に記載のシリコンチップのような、基板表面に電極を一つまたは複数配置したものも好ましく用いることができる。電極としては、金属、合金、金属酸化物、半導体等を挙げることができる。電極の他には、導線であってもよく、プリント配線基板のように、電極や導線が基板上の印刷されてなるものであってもよい。
【００５９】
プローブ分子の固定方法としては、公知の方法を用いることができる。基板表面に区画された一つまたは複数の領域が金で蒸着処理されている場合には、オリゴヌクレオチドなどのプローブ分子の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、オリゴヌクレオチドを当該領域に固定する。オリゴヌクレオチドにメルカプト基を導入する方法は、文献(M.Maeda et al., Chem.Lett.,1805~1808(1994)およびB.A.Connolly,Nucleic Acids Res.,13,4484(1985))に記載されている。基板表面に区画された一つまたは複数の領域がグラシーカーボンで塗布処理されている場合には、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、該領域にカルボン酸基が導入されるため、オリゴヌクレオチドは、アミド結合により該領域に固定される。実際の固定化方法については、文献(K.M.Millan et al.,Analytical Chemistry,65,2317~2323(1993))に詳細が記載されている。
【００６０】
プローブ分子とし用いるオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片およびＲＮＡ断片、あるいは合成されたオリゴヌクレオチドおよび合成されたポリヌクレオチドの何れも用いることができる。本発明に従う検出方法では、基板上の領域に固定されるプローブ分子が塩基配列既知のオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドであってもよく、あるいは検知対象の核酸断片試料がプローブ分子であってもよい。以下、基板上の領域に固定するプローブ分子が塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドである場合を例にして説明する。
【００６１】
プローブ分子として用いられるヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体（例えば、ＰＮＡ）は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。塩基配列の分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。プローブ分子の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。プローブ分子は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００６２】
プローブ分子の固定は、プローブ分子が溶解あるいは分散された水性液を基板上の領域に点着して行うことが好ましい。点着後、所定の温度（好ましくは、室温）でそのまま数時間放置するとプローブ分子の一端が基板上の領域に固定される。点着後、必要に応じてインキュベーションを行ってもよい。点着の条件は、使用する基板の種類、大きさ等によって異なる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、ＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタ装置を用いて行うことも好ましい。即ち、基板表面に区画された複数の領域に、スポッタ装置を用いてプローブ分子の水性液をスポットすることも好ましい。
【００６３】
上記の工程によって作製された電気化学分析素子の寿命は、プローブ分子としてｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡ電気化学分析素子で数週間、合成オリゴヌクレオチドが固定されてなる電気化学分析素子ではさらに長期間である。これらの電気化学分析素子は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する、核酸断片試料とのハイブリダーゼーションである。
【００６４】
試料核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によりｃＤＮＡとすることが好ましい。一回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量としては、測定条件によって異なるが、数μｇ以下を用いることが好ましい。電気化学分析素子上のプローブ分子がオリゴヌクレオチドである場合には、核酸断片試料は低分子化しておくことが望ましい。
【００６５】
ハイブリダイゼーションは、核酸断片試料が溶解あるいは分散した水性液を、電気化学分析素子上に点着することによって通常実施する。ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、蒸留水、緩衝液、またはそれらと界面活性剤との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸断片試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、本発明の縫い込み型インターカレータの存在下にて行なうことができる。本発明の酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータは、一般的に、電気化学分析素子上のプローブ分子と核酸断片試料とで形成されるハイブリッドＤＮＡ（電気化学分析素子上のプローブ分子およびハイブリダイゼーションに供される核酸断片試料の種類を問わず、形成される二本鎖核酸断片を「ハイブリッドＤＮＡ」と呼ぶ）に高い特異性で結合するため、電極に電位を印加することにより、電極と対極との間で、インターカレータを介して流れる電流量を測定することによって、相補性を有する核酸断片試料を検出することができる。本発明のインターカレータを用いて核酸断片試料の検知操作を行なう場合には、印加する電位は１００乃至４００ｍＶの範囲にあることが好ましく、２００乃至４００ｍＶの範囲にあることが特に好ましい。本発明のインターカレータが挿入されたハイブリッドＤＮＡは、一般的に、従来の代表的なインターカレータを用いた場合と異なり、印加した電位が上記の範囲にある場合に、ピーク電流値を示すからである。
【００６７】
本発明の縫い込み型インターカレータは、部分相補性を示す核酸断片試料を検出する方法にも使用することができる。部分相補性を示す核酸断片とは、プローブ分子Ａに対して相補性を有する核酸断片試料をＢとしたときに、核酸断片試料Ｂと塩基配列が部分的に同一性（即ち、部分的に非同一性）を示す核酸断片試料であって、通常、ミスマッチ試料との表現で表わされる。このような部分相補性を示す核酸断片試料としては、核酸断片試料Ｂに対して塩基欠損、塩基挿入等の塩基配列の変化を有する核酸断片試料を挙げることができる。部分相補性核酸断片の検出方法は、特に遺伝子診断分野での未知の異常遺伝子の探索・同定に重要な手法である。
【００６８】
本発明の縫い込み型インターカレータを用いて、部分相補性を示す核酸断片試料を検出する方法は、下記の工程を含む。
（１）基板表面に区画された一つまたは複数の領域のそれぞれにプローブ分子がその一端で固定されてなる電気化学分析素子に、部分相補性を示す核酸断片試料（ミスマッチ試料）が溶解あるいは分散していると推定される水性液を接触させ、本発明の縫い込み型インターカレータの存在下にて、分析素子に電位を印加することにより、該分析素子と対極との間をインターカレータを介して流れる電流量を測定する工程；
（２）電気化学分析素子に固定されているプローブ分子と完全な相補性を有する核酸断片試料（フルマッチ試料）を用いて（１）と同じ操作を行うことによって電流量を測定する工程；そして、
（３）工程（１）と工程（２）のそれぞれで測定された電流量を比較することによって、工程（１）で用いた核酸断片試料が、工程（２）で用いた相補性核酸断片に対して部分相補性の核酸断片（ミスマッチ試料）であるか否かを検出する工程である。
【００６９】
上記のミスマッチ試料の検出方法で使用するプローブ分子、電気化学分析素子、印加電位、および検出原理については、前記記載の相補性を有する核酸断片試料の検出方法の記載と同様である。本発明の検出方法では、電気化学分析素子上に固定されているプローブ分子が部分相補性核酸断片であっても、あるいは水性液中に含まれる核酸断片試料が部分相補性核酸断片試料であってもよい。
【００７０】
上記の工程（１）および工程（２）でそれぞれ得られる電流値間には有意な差を生じるため、部分相補性核酸断片とのハイブリッドＤＮＡ（ここでは、ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡ）を容易に検出することができ、このことは、部分相補性核酸断片を容易に検出することができることを示す。
【００７１】
本発明の核酸断片試料の検出キットは、電気化学分析素子、および本発明の縫い込み型インターカレータとを組み合わせてなり、遺伝子分野等の研究に携わる使用者によって特に有効に使用される。
【００７２】
【実施例】
［製造例１］
Ｎ，Ｎ’−ビス（７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプチル）ナフタレンジイミドの製造
【００７３】
【化１１】
0004309037.tif 000007
【００７４】
（１）Ｎ−１−ベンジロキシカルボニル−１，７−ジアミノ−４−メチル−アザヘプタンの製造
ジ（３−アミノプロピル）−Ｎ−メチルアミン（７３．０ｇ、５００ミリモル）をジクロロメタン（４００ｍＬ）に溶解し、ここに、３−ベンジロキシカルボニル−１，３−チアゾリジン−２−チオン（Synthesis,1990,27）（１２．８ｇ、５０ミリモル）のジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液を滴下し、室温にて３時間攪拌した。次いで、生成した沈殿を濾別し、濾液に酢酸エチルと水とを加えて、酢酸エチルで二度抽出した。酢酸エチル層を水および飽和食塩水で洗浄後、１規定塩酸水溶液で二度抽出し、得られた水層を酢酸エチルで洗浄した。水層を冷却しながら、ここに、６規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて、ｐＨを９乃至１０に調整し、酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を留去し、標題化合物を黄色油状物として得た（９．４ｇ、収率６６％）。
【００７５】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：
１．５８〜１．７２（４Ｈ，ｍ）
２．２０（３Ｈ，ｓ）
２．３５〜２．４５（４Ｈ，ｍ）
２．６４（２Ｈ，ｔ）
３．２３〜３．３２（２Ｈ，ｍ）
５．１５（２Ｈ，ｓ）
７．２２〜７．４５（５Ｈ，ｍ）
ＭＳ：ＦＡＢ  ２８０（Ｍ+＋１）（マトリックス：ｍ−ニトロベンゼン）
【００７６】
（２）Ｎ−１−ベンジロキシカルボニル−１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタンの製造
上記（１）で得られたＮ−１−ベンジロキシカルボニル−１，７−ジアミノ−４−メチル−アザヘプタン（３．０ｇ、１１ミリモル）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、ここに、フェロセン酢酸（２．７ｇ、１１ミリモル）、ピリジン（２ｍＬ）およびエチルＮ，Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（２．３ｇ、１２ミリモル）を加え、室温で３時間攪拌した。反応溶液に、塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで二度抽出し、酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた褐色油状物をアルミナカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）に付し、得られた結晶をヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒で洗浄し、標題化合物をオレンジ色の結晶として得た（２．６ｇ、収率９１％）。
【００７７】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：
１．５０〜１．７２（４Ｈ，ｍ）
２．０８（３Ｈ，ｓ）
２．２０〜２．３３（４Ｈ，ｍ）
３．１５〜３．３０（４Ｈ，ｍ）
３．３４（２Ｈ，ｓ）
４．１５（５Ｈ，ｓ）
４．１６（４Ｈ，ｓ）
５．１５（２Ｈ，ｓ）
５．５４（１Ｈ，ｂｓ）
６．４４（１Ｈ，ｂｓ）
７．３２〜７．４８（５Ｈ，ｍ）
【００７８】
（３）１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタンの製造
上記（２）で得られたＮ−１−ベンジロキシカルボニル−１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタン（１．６ｇ、３．０ミリモル）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解し、室温で攪拌しながら、ここに、ヨウ化トリメチルシラン（１．２５ｍＬ、８．８ミリモル）を滴下した。５分後、反応溶液に１規定塩酸水溶液と酢酸エチルとを加え、１規定塩酸水溶液にて三度抽出し、水層を酢酸エチルで洗浄した。氷冷した水層に、２規定水酸化カリウム水溶液を加えてｐＨ１０とし、クロロホルムにて二度抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄後、溶媒を留去し、標題化合物を褐色結晶として得た（１．０ｇ、収率７０％）。
【００７９】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：
１．４８〜１．６２（４Ｈ，ｍ）
２．０９（３Ｈ，ｓ）
２．２５〜２．３５（４Ｈ，ｍ）
２．７１（２Ｈ，ｔ）
３．２２〜３．３３（２Ｈ，ｍ）
３．３５（２Ｈ，ｓ）
４．１０〜４．２１（９Ｈ，ｍ）
６．７５（１Ｈ，ｂｓ）
【００８０】
（４）Ｎ，Ｎ’−ビス（７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプチル）ナフタレンジイミドの製造
上記（３）で得られた１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタン（０．９５ｇ、２．５ミリモル）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、室温で攪拌しながら、ここに、１，４，５，８−テトラカルボン酸ナフタレン二無水物（０．３ｇ、１．１ミリモル）を加えたのち７時間環流した。反応溶液を濾過した後、クロロホルムにて洗浄し、合わせた有機層から溶媒を留去して得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール＝１５：１）に付し、得られた結晶を酢酸エチルで洗浄し、標題化合物を褐色結晶として得た（０．３２ｇ、収率３０％）。
【００８１】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：
１．５６〜１．７０（８Ｈ，ｍ）
１．７８〜１．９２（４Ｈ，ｍ）
２．１２（６Ｈ，ｓ）
２．３３〜２．４６（８Ｈ，ｍ）
３．３０〜３．４２（４Ｈ，ｍ）
３．３６（４Ｈ，ｓ）
４．１３（１０Ｈ，ｓ）
４．２０（８Ｈ，ｓ）
６．８５（２Ｈ，ｂｓ）
８．８０（４Ｈ，ｓ）
ＭＳ：ＦＡＢ  ９７５（Ｍ＋Ｈ）（マトリックス：ｍ−ニトロベンゼン）
【００８２】
［実施例１］ハイブリッドＤＮＡの検出
（１）電気化学分析素子の作製
面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、５’末端にメルカプトヘキシル基を有する１００ピコモル／１μＬのチミンの２０量体（ｄＴ20）の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時間放置して電気化学分析素子を作製した。ｄＴ20の調製、および固定化については、特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に従って行った。
（２）試料ＤＮＡ断片の調製
試料ＤＮＡ断片として、アデニンの２０量体（ｄＡ20）を上記公報に記載の方法に従って調製した。
【００８３】
（３）ハイブリッドＤＮＡの検出
（１）で作製した電気化学分析素子の表面に、（２）で得たｄＡ20（７０ピコモル）を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを滴下し、２５℃で２０分インキュベートした。インキュベート後、分析素子表面を０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、未反応のｄＡ20を除去した。次いで、製造例１で得られた縫い込み型インターカレータ（５０μＭ）を含む０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）の混合溶液中に、洗浄後の分析素子を浸積し、デファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）を、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳ、印加電圧１００乃至７００ｍＶの範囲およびスキャン速度１００ｍＶ／秒の条件にて測定した。応答電位２６０ｍＶにおける電流量を求めた。また、試料ＤＮＡ断片ｄＡ20を滴下しない以外は上記と同様の操作を行って得られた電流量を基本値とし、上記測定によって得られた電流量の基本値からの変化量（％）を求めたところ、３６％であった。
【００８４】
［比較例１］
縫い込み型インターカレータとして、前記特開平９−２８８０８０号公報に記載されている公知の代表的なインターカレータを用い、応答電位４６０ｍＶにおける電流量を求める以外は実施例１と同様にして、電流量の変化量を求めたところ、３８％であった。
【００８５】
実施例１および比較例１の結果より、本発明の縫い込み型インターカレータを使用した場合には、従来の代表的な縫い込み型インターカレータと使用した場合に比べて、約２００ｍＶ低い電圧において、ほぼ同等の応答電流を得ることができることが分かる。また、試料ＤＮＡ断片とのハイブリッドＤＮＡの検出において、本発明の縫い込み型インターカレータを使用した場合に示す応答電流の変化率は、公知の縫い込み型インターカレータと使用した場合に示す応答電流の変化率とほぼ同じであることが分かる。
【００８６】
［実施例２］ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡの検出
（１）電気化学分析素子の作製
ｄＴ19Ｇ1を用いる以外は、実施例１の（１）と同様にして、電気化学分析素子を作製した。
（２）ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡの検出
電気化学分析素子として、実施例１の（１）で作製した電気化学分析素子、および上記（１）の分析素子をそれぞれ用いる以外は実施例１と同様の操作を行って、印加電圧２００乃至４００ｍＶの範囲でＤＰＶを測定し、２６０ｍＶでの電流量の変化率を求めたところ、それぞれ、３６％、２０％であった。
【００８７】
実施例２の結果から、ｄＴ19Ｇ1を固定して作製された電気化学分析素子に、試料ＤＮＡ断片ｄ20Ａを接触させて得られるハイブリッドＤＮＡは、ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡであり、本発明の新規縫い込み型インターカレータを用いて、２６０ｍＶという低電圧の印加によって、フルマッチ構造のハイブリッドＤＮＡとミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡとの応答電流の差を求めることができることが分かる。
【００８８】
従って、電気化学分析素子上のプローブ分子と、このプローブ分子と完全な相補性を有する塩基配列（フルマッチ）を持つＤＮＡ断片試料とで形成されるハイブリッドＤＮＡの応答電流の値が予め明らかとなっている場合に、本発明の新規縫い込み型インターカレータの使用および２６０ｍＶの印加電圧の条件下において、試料ＤＮＡ断片が、電気化学分析素子上のＤＮＡ断片と完全な相補性を有する塩基配列を持つものであることが容易に確認できることがわかる。
【００８９】
【発明の効果】
本発明の酸化還元活性を持つ縫い込み型インターカレータは、新規な導電性縫い込み型インターカレータであって、一般に、入手容易な試薬より簡便に合成することができるものである。核酸断片試料の検出において、本発明のインターカレータを用いた場合、従来の代表的なインターカレータを用いた場合より、低い印加電位にてピーク電流値を与えるため、本発明のインターカレータを使用することによって、電気化学分析素子の再利用回数を増加させ、検出精度や再現性を向上させることもできる。