(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Asp Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Term
（ここで、
Xaa1は存在しないか、またはAla であり；
Xaa2は存在しないか、またはVal であり；
Xaa3は存在しないか、またはSer であり；
Xaa4は存在しないか、またはGlu もしくはGlu(OCH3) であり；
Xaa5は存在しないか、またはHis もしくはAla であり；
Xaa6は存在しないか、またはGln であり；
Xaa7は存在しないか、またはLeu であり；
Xaa11 はLys 、Arg 、またはLeu であり；
Xaa13 はLys 、Arg 、Tyr 、Cys 、Leu 、Cys(CH2CONH(CH2)2NH(ビオチニル))、Lys(７−ジメチルアミノ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−４−アセチル）、またはLys(ジヒドロシンナモイル)であり；
Xaa20 はArg またはLeu であり；
Xaa19 およびXaa21 は独立してLys 、Ala 、またはArg であり；
Xaa22-31は配列番号８６、２６、２７、または２９から選択され；
Xaa32 はHis 、Pro 、またはLys であり；
Xaa33 は存在しないか、またはPro 、Thr 、Glu 、もしくはAla であり；
Xaa34 は存在しないか、またはPro 、Arg 、Met 、Ala 、hSer、hSerlactone 、Tyr 、もしくはLeu であり；
Xaa35 は存在しないか、またはPro 、Glu 、Ser 、Ala 、もしくはGly であり；
Xaa36 は存在しないか、またはAla 、Arg 、もしくはIle であり；
Xaa37 は存在しないか、またはArg 、Trp 、もしくは３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンであり；
Xaa38 は存在しないか、またはAla もしくはhSerであり；
およびTermはＯＲまたはＮＲ2 であって、各Ｒは独立してＨ、（Ｃ1 −Ｃ4）アルキルもしくはフェニル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキルである）の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）もしくは副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の合成ポリペプチドアナログまたはその薬学的に受容可能な塩の合成方法であって、ここで、配列番号８６、２６、２７、および２９から選択されるアミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性αヘリックスを形成し、
ａ）固体樹脂支持体上で該ポリペプチドの３つの前駆体ペプチドフラグメント：Ｎ−末端フラグメント、中間部フラグメント、およびＣ−末端フラグメント（ここで、Ｎ−末端フラグメントはそのＣ−末端としてGly を有し、中間部フラグメントはそのＣ−末端としてLeu を有し、そしてＣ−末端フラグメントはそのＮ−末端としてLeu を有する）を、独立して合成する工程；
ｂ）該所望のポリペプチドの意図した最後のＣ−末端以外のすべての前駆体ペプチドフラグメントをそれらの各々の樹脂支持体から解離させる工程；
ｃ）該解離させた前駆体ペプチドフラグメントを樹脂結合Ｃ−末端ペプチドフラグメントと連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成させる工程；
ｄ）側鎖保護基を除去する工程；および
ｅ）該ポリペプチド産物を該樹脂支持体から解離させる工程、
を包含する方法。
【請求項２】
下式：
Xaa1 Val Ser Glu Ile Gln Xaa7 Xaa8 His Asn Xaa11 Gly Lys His Leu Xaa16 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 His Asn Xaa34 Term
（ここで、
Xaa1はSer またはAla であり；
Xaa7はLeu またはPhe であり；
Xaa8はLeu 、Met 、またはNle であり；
Xaa11 はLeu またはLys であり；
Xaa16 はAsn またはSer であり；
Xaa18 はLeu 、Met 、またはNle であり；
Xaa19 はGlu 、Thr 、またはArg であり；
Xaa21 はVal 、Ser 、またはArg であり；
Xaa22-31は配列番号２６、２７、または２９から選択され；
Xaa34 はPhe 、hSer、またはTyr であり；
TermはＯＲまたはＮＲ2 であり、ここでＲはＨまたは（Ｃ1 −Ｃ4）アルキルである）の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）もしくは副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の合成ポリペプチドアナログまたはその薬学的に受容可能な塩の合成方法であって、ここで、配列番号２６、２７、および２９から選択されるアミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性αヘリックスを形成し、
ａ）固体樹脂支持体上で該ポリペプチドの３つの前駆体ペプチドフラグメント：Ｎ−末端フラグメント、中間部フラグメント、およびＣ−末端フラグメント（ここで、Ｎ−末端フラグメントはそのＣ−末端としてGly を有し、中間部フラグメントはそのＣ−末端としてLeu を有し、そしてＣ−末端フラグメントはそのＮ−末端としてLeu を有する）を、独立して合成する工程；
ｂ）該所望のポリペプチドの意図した最後のＣ−末端以外のすべての前駆体ペプチドフラグメントをそれらの各々の樹脂支持体から解離させる工程；
ｃ）該解離させた前駆体ペプチドフラグメントを樹脂結合Ｃ−末端ペプチドフラグメントと連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成させる工程；
ｄ）側鎖保護基を除去する工程；および
ｅ）該ポリペプチド産物を該樹脂支持体から解離させる工程、
を包含する方法。
【請求項３】
以下
【表１】
0004229992.tif 000115
【表２】
0004229992.tif 000116
【表３】
0004229992.tif 000117
からなる群から選択される、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）もしくは副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の合成ポリペプチドアナログまたはその薬学的に受容可能な塩の合成方法であって、ここで、配列番号８６、２６、２７、および２９から選択されるアミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性αヘリックスを形成し、
ａ）固体樹脂支持体上で該ポリペプチドの３つの前駆体ペプチドフラグメント：Ｎ−末端フラグメント、中間部フラグメント、およびＣ−末端フラグメント（ここで、Ｎ−末端フラグメントはそのＣ−末端としてGly を有し、中間部フラグメントはそのＣ−末端としてLeu を有し、そしてＣ−末端フラグメントはそのＮ−末端としてLeu を有する）を、独立して合成する工程；
ｂ）該所望のポリペプチドの意図した最後のＣ−末端以外のすべての前駆体ペプチドフラグメントをそれらの各々の樹脂支持体から解離させる工程；
ｃ）該解離させた前駆体ペプチドフラグメントを樹脂結合Ｃ−末端ペプチドフラグメントと連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成させる工程；
ｄ）側鎖保護基を除去する工程；および
ｅ）該ポリペプチド産物を該樹脂支持体から解離させる工程、
を包含する方法。
【請求項４】
配列番号７のポリペプチド：ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡ−ＮＨ２またはその薬学的に受容可能な塩の合成方法であって、ここで、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性αヘリックスを形成し、
ａ）固体樹脂支持体上で該ポリペプチドの３つの前駆体ペプチドフラグメント：Ｎ−末端フラグメント、中間部フラグメント、およびＣ−末端フラグメント（ここで、Ｎ−末端フラグメントはそのＣ−末端としてGly を有し、中間部フラグメントはそのＣ−末端としてLeu を有し、そしてＣ−末端フラグメントはそのＮ−末端としてLeu を有する）を、独立して合成する工程；
ｂ）該所望のポリペプチドの意図した最後のＣ−末端以外のすべての前駆体ペプチドフラグメントをそれらの各々の樹脂支持体から解離させる工程；
ｃ）該解離させた前駆体ペプチドフラグメントを樹脂結合Ｃ−末端ペプチドフラグメントと連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成させる工程；
ｄ）側鎖保護基を除去する工程；および
ｅ）該ポリペプチド産物を該樹脂支持体から解離させる工程、
を包含する方法。
【請求項５】
前記Ｎ−末端フラグメントがＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧを含み、前記中間部フラグメントがＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬを含み、そして前記Ｃ−末端フラグメントがＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ−末端フラグメントが、ＬＥＫＬ、ＬＥＫＬ、およびＨＴＡの縮合によって形成される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
配列ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧである合成ペプチド。
【請求項８】
配列ＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬである合成ペプチド。
【請求項９】
配列ＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡである合成ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、骨粗鬆症の処置に有用な、ある新規な副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連ペプチドのアナログの合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は代謝的骨疾患 (metabolic bone disease) の最も一般的な形態であり、その徴候は骨喪失の骨折段階（骨減少症：osteopenia）であると考えられ得る。骨粗鬆症は多くの潜在的な疾患に対して二次的に起こり得るのであるが、全症例の９０％が特発性であるようである。閉経後の女性は、特に特発性骨粗鬆症の危険性が高い（閉経後骨粗鬆症もしくはＩ型骨粗鬆症）。特発性骨粗鬆症の危険性が高いもう一つの群は、両性の初老者である（老人性骨粗鬆症もしくはII型骨粗鬆症）。骨粗鬆症はまた、コルチコステロイドの使用、寝たきりもしくは長い病床生活、アルコール漬け、糖尿病、性腺傷害性化学療法 (gonadotoxic chemotherapy) 、過プロラクチン血症、神経性食欲不振、原発性もしくは続発性無月経および卵巣摘出にも関連している。
【０００３】
種々の形態の骨粗鬆症において、骨折 (bone fracture)は、機械的な破損点に達した骨喪失の結果であり、頻繁に起こるものである。閉経後骨粗鬆症は、手首および脊椎骨 (spine)の骨折によって特徴づけられるが、一方、大腿骨頸 (femoral neck) 骨折は、老人性骨粗鬆症の顕著な特徴であるようである。
【０００４】
それにより骨粗鬆症において骨が失われる機作は、それにより骨格がそれ自体を再生する過程における不均衡が関与すると考えられている。この過程は、骨再造形 (bone remodeling)と名付けられている。それは、活動の一連の不連続なポケットにおいて生じる。これらのポケットは、骨吸収部位としての所定の骨表面上で骨基質内において同時に現れる。破骨細胞（骨溶解もしくは骨再吸収細胞）は、骨の一般的に一定の寸法 (constant dimension) の部分の再吸収を司っている。この再吸収過程に、破骨細胞によって残された空洞を次に新しい骨で再充填する骨芽細胞（骨形成細胞）の出現が続く。
【０００５】
健康な成人被験者では、破骨細胞および骨芽細胞が形成される比率は、骨形成と骨再吸収の均衡がとれるようなものである。しかし、骨粗鬆症では、骨が作られるより速い速度で骨が失われることになる骨再造形過程における不均衡が進む。この不均衡はほとんどの個体において彼らが年をとるにつれてある程度起きるのであるが、閉経後骨粗鬆症もしくは卵巣摘出後においては、より重篤であり、より若年齢で起こる。
【０００６】
Adachi et alは、Seminars in Arthritis and Rheumatism 22:6, 375-84 (June 1993) において、コルチコステロイド誘導骨粗鬆症の病態生理学に関する矛盾する多くのデータにも関わらず、骨形成の相対的な減少と骨再吸収の相対的な増加があることが一般的に認められるということを報告している。結果として骨折および骨壊死を伴う骨喪失は、コルチコステロイド治療の結果よく起こる。骨喪失がコルチコステロイド治療の最初の６〜１２ヶ月以内に急速に起こるという証拠がある；また、骨喪失とコルチコステロイド用量との間には緊密な関係があるようである。男性もコルチコステロイドの効果に対して同等に感受性である。骨折と骨壊死の推定発生率は、３０〜５０％の範囲である。
【０００７】
さらなる骨喪失を遅らせるか、より望ましくは骨重量の正味の増加を生じさせるという目的を持って骨粗鬆症を処置しようとする多くの試みがあった。エストロゲンおよびビスホスホネートのようなある物質は、骨粗鬆症におけるさらなる骨喪失を遅らせるようである。骨喪失を遅らせる物質は、骨再吸収と骨形成の期間の差違のため、骨重量を増加させ得るようである（３〜７％程度）。しかし、この明らかな増加は、時間に限界があり、連続的でなく、「再造形空間」の減少によるものである。さらに、再吸収と形成の間に密接な関連があるため、骨再吸収を妨げる治療は最終的に骨形成をも妨げるのである。
【０００８】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）による処置が骨の代謝回転の増加と正の (positive) カルシウム均衡の両方を導くということが示唆されてきた。しかし、ヒトの臨床試験は、小柱骨 (trabecular bone)のいかなる増加も皮質骨の減少によって相殺され、その結果、骨総量における正味の増加はないことを示した。
【０００９】
Hefti et al は、Clinical Science 62, 389-396 (1982) において、ｂＰＴＨ（１−８４）もしくはｈＰＴＨ（１−３４）のいずれかを毎日皮下に投与することにより、全体内カルシウムと個々の骨の灰分が正常な成体雌ラットでも骨粗鬆症の成体雌ラットでも増加したということを報告した。
【００１０】
Liu et al は、J. Bone. Miner. Res. 6, 10, 1071-1080 (1991)において、成体雌ラットの卵巣摘出が、骨芽細胞数および小柱骨破骨細胞数の有意な増加を伴って、近位の脛骨幹端 (proximal tibial metaphysis) における小柱骨のパーセンテージの４７％の喪失を誘導したということに注目した。ｈＰＴＨ（１−３４）を毎日皮下注射することにより、小柱骨の喪失は完全に逆転し、偽薬 (sham) が作用していた対照のそれを上回る小柱骨の量を生じた。骨芽細胞数は増加し、破骨細胞数は減少した。
【００１１】
Hock et alは、J. Bone Min. Res. 7, 1, 65-71 (1992)において、ｈＰＴＨ（１−３４）を健康な成体雄ラットに１２日間毎日皮下注射することにより小柱骨カルシウムおよび皮質骨カルシウムならびに乾燥重量が増加したことを報告した。全骨重量、小柱骨体積、小柱の太さおよび数、ならびに骨芽細胞表面が増加した。
【００１２】
哺乳動物の副甲状腺ホルモン、例えば、ヒト（ｈＰＴＨ）、ウシ（ｂＰＴＨ）、およびブタ（ｐＰＴＨ）は、８４アミノ酸残基の単一ポリペプチド鎖で、分子量約９，５００を有する。生物学的活性は、明らかに最小限必要とされる残基（１−３４）を有するＮ−末端部分に関係している。
【００１３】
ヒトＰＴＨのＮ−末端セグメントは、ウシおよびブタホルモンのＮ−末端セグメントと、それぞれわずか３および２アミノ酸残基だけ異なっている：
0004229992.tif 000002
【００１４】
ＰＴＨの主な機能は、細胞外流体内の一定濃度のＣａ2+を維持するのに役立つ適応性のある変化を導き出すことである。ＰＴＨは腎臓に作用して尿からのＣａ2+の尿細管再吸収を増加させ、ならびにカルシフェジオールのカルシトリオールへの変換を刺激し、それは腸からのＣａ2+の吸収を司る。一つの顕著な効果は、骨からのＣａ2+の動員 (mobilization) を促進することである。ＰＴＨは骨に作用してＣａ2+とホスフェートの再吸収率を増加させる。ＰＴＨは破骨細胞による骨再吸収率を刺激し、間葉細胞の破骨細胞への分化率を増大させ、そしてこれら後者の細胞の半減期を延長する。ＰＴＨの作用が長引くことにより、骨形成骨芽細胞の数もまた増加する；したがって、骨代謝回転および再造形の率が促進される。しかし、個々の骨芽細胞は、正常のものに比べ活動が少ないようである。
【００１５】
Rosenblatt, et al は、米国特許第４，４２３，０３７号、同第４，９６８，６６９号および同第５，００１，２２３号において、Ｎ−末端（１−６）アミノ酸の欠失およびPhe7、Met8,18 、およびGly12 の選択的置換により得たＰＴＨアンタゴニストを開示した。Tyr34 −ＮＨ2 は、伝えるところによれば、これらの化合物の活性および安定性を増大させたという。
【００１６】
副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）は、１４０＋アミノ酸タンパク質であり、ＰＴＨｒＰとそのフラグメントは、ＰＴＨの主要な生物学的作用を再生する。ＰＴＨｒＰは、多くのヒトおよび動物の腫瘍ならびに他の組織によって作り上げられ、悪性の高カルシウム血症において働く。ｈＰＴＨｒＰ（１−３４）の配列は以下のようである：
0004229992.tif 000003
【００１７】
ｈＰＴＨとｈＰＴＨｒＰとの間の相同性は主として１３個のＮ−末端残基に限られており、そのうち８個が同一である；ｈＰＴｈの（２５−３４）レセプター結合領域の１０アミノ酸のうちわずかに１個がｈＰＴＨｒＰで保存されている。コンホメーションの類似性が共通の活性の基礎かもしれない。Cohen, et alは、J. Biol. Chem. 266, 3, 1997-2004 (1991) において、ＰＴＨ（１−３４）およびＰＲＨｒＰ（１−３４）の配列の多くが、特に領域（５−１８）および（２１−３４）において、αヘリックス様立体配置を呈することを示唆したが、この立体配置が生理学的条件下でカルボキシ末端について広がっているかどうかという幾分かの疑問があることに特に言及している。そのような二次構造は、脂質相互作用、レセプター相互作用、および／または構造安定性にとって重要であり得る。
【００１８】
骨粗鬆症に苦しむものを含めた哺乳動物被験体における骨重量の回復に関して改善された治療的特性を有するＰＴＨのアナログおよびＰＴＨｒＰのアナログは、既に国際特許出願公開第ＷＯ９４／０１４６０号において開示されている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、骨粗鬆症に苦しむものを含めた哺乳動物被験体における骨重量の回復に関して改善された治療的特性を有するＰＴＨのアナログおよびＰＴＨｒＰのアナログを提供することが本発明の課題である。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）もしくは副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の合成ポリペプチドアナログまたはその塩の改良された合成方法であって、ここで、配列番号８５、８６、２６、２７、２８、２９、および３０から選択されるアミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−ヘリックスを形成し、
ａ）該ポリペプチドの前駆体ペプチドフラグメントを、液相もしくは固相技術により独立して合成する工程；ｂ）該フラグメントを相互に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成させる工程；およびｃ）アミノ酸保護基を除く工程、を包含する方法を提供することが本発明の目的である。
【００２１】
１つの実施態様において、この発明は、ａ）樹脂支持体上で上記ポリペプチドの前駆体ペプチドフラグメントを独立して合成する工程；ｂ）そのポリペプチドのフラグメントをそれらの各々の樹脂支持体から解離させる工程；ｃ）そのフラグメントを連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成する工程；およびｄ）アミノ酸保護基を除去する工程、を包含するそのような改良された方法を提供する。
【００２２】
好ましい実施態様においては、ポリペプチドのＣ−末端以外のすべてのフラグメントをそれらのそれぞれの樹脂支持体から解離させ、ｃ）そのフラグメントを樹脂結合Ｃ−末端フラグメントと連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成させ；ｄ）アミノ酸保護基を除き、そしてポリペプチド産物を樹脂支持体から解離させる。
【００２３】
より具体的には、ａ）固体樹脂支持体上で所望のポリペプチドの前駆体ペプチドフラグメントを独立して合成する工程；ｂ）該所望のポリペプチドの意図した最後のＣ−末端以外のすべての前駆体ペプチドフラグメントをそれらの各々の樹脂支持体から解離させる工程；ｃ）該解離させた前駆体ペプチドフラグメントを樹脂結合Ｃ−末端ペプチドフラグメントと連続的に縮合させて所望のポリペプチド産物を形成する工程；ｄ）該側鎖保護基を除去する工程；およびｅ）該ポリペプチド産物を該樹脂支持体から解離させる工程、を包含する。
【００２４】
好ましい実施態様においては、これらの方法は３つの前駆体ペプチドフラグメント：Ｎ−末端フラグメント、中間部フラグメント、およびＣ−末端フラグメントを用いて実施される。より好ましい実施態様においては、これらのフラグメントは、所望の最終ポリペプチドの配列と一致する場合、グルタミン酸、グリシン、もしくはロイシン残基をそのＣ−末端に有する。最も好ましい実施態様においては、このポリペプチド産物は、３つの前駆体ペプチドフラグメント、Ｎ−末端、中間部、およびＣ−末端から調製され、ここで、Ｎ−末端フラグメントはそのＣ−末端としてGly を有し、中間部フラグメントはそのＣ−末端としてLeu を有し、そしてＣ−末端フラグメントはそのそのＮ−末端としてLeu を有する。別の実施態様においては、中間部ペプチドフラグメントはＣ−末端Glu を有し、そしてＣ−末端フラグメントはＮ−末端Leu を有する。
【００２５】
好ましい実施態様においては、本発明の方法は、上記最終ポリペプチド産物は、下式：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Asp Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Term、ここで：
Xaa1は存在しないか、またはAla であり；
Xaa2は存在しないか、またはVal であり；
Xaa3は存在しないか、またはSer であり；
Xaa4は存在しないか、またはGlu もしくはGlu(OCH3) であり；
Xaa5は存在しないか、またはHis もしくはAla であり；
Xaa6は存在しないか、またはGln であり；
Xaa7は存在しないか、またはLeu であり；
Xaa11 はLys 、Arg 、またはLeu であり；
Xaa13 はLys 、Arg 、Tyr 、Cys 、Leu 、Cys(CH2CONH(CH2)2NH(ビオチニル))、Lys(７−ジメチルアミノ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−４−アセチル）、またはLys(ジヒドロシンナモイル）であり；
Xaa20 はArg またはLeu であり；
Xaa19 およびXaa21 は独立してLys 、Ala 、またはArg であり；
Xaa22-31は配列番号８５、８６、２６、２７、２８、２９、または３０から選択され；
Xaa32 はHis 、Pro 、またはLys であり；
Xaa33 は存在しないか、またはPro 、Thr 、Glu 、もしくはAla であり；
Xaa34 は存在しないか、またはPro 、Arg 、Met 、Ala 、hSer、hSerlactone 、Tyr 、もしくはLeu であり；
Xaa35 は存在しないか、またはPro 、Glu 、Ser 、Ala 、もしくはGly であり；
Xaa36 は存在しないか、またはAla 、Arg 、もしくはIle であり；
Xaa37 は存在しないか、またはArg 、Trp 、もしくは３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンであり；
Xaa38 は存在しないか、またはAla もしくはhSerであるか、あるいはXaa38-42はThr Arg Ser Ala Trp であり；
およびTermはＯＲまたはＮＲ2 であって、各Ｒは独立してＨ、（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルもしくはフェニル（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルである；
のＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰアナログ、ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩を含む。
【００２６】
好ましい実施態様においては、本発明の方法は、上記ＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰのポリペプチドアナログが、下式：
Xaa1 Val Ser Glu Ile Gln Xaa7 Xaa8 His Asn Xaa11 Gly Lys His Leu Xaa16 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 His Asn Xaa34 Term、ここで：
Xaa1はSer またはAla であり；
Xaa7はLeu またはPhe であり；
Xaa8はLeu 、met 、またはNle であり；
Xaa11 はLeu またはLys であり；
Xaa16 はAsn またはSer であり；
Xaa18 はLeu 、Met 、またはNle であり；
Xaa19 はGlu 、Thr 、またはArg であり；
Xaa21 はVal 、Ser 、またはArg であり；
Xaa22-31は配列番号２６、２７、２８、２９、または３０から選択され；
Xaa34 はPhe 、hSer、またはTyr であり；
TermはＯＲまたはＮＲ2 であり、ここでＲはＨまたは（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルである；
ならびに、それらの薬学的に受容可能な塩を含む。
【００２７】
好ましい実施態様においては、本発明の方法は、上記ＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰアナログが、以下：
【００２８】
【表１】
0004229992.tif 000004
【００２９】
【表２】
0004229992.tif 000005
【００３０】
【表３】
0004229992.tif 000006
【００３１】
からなる群から選択される。
【００３２】
好ましい実施態様においては、本発明の方法は、上記ＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰアナログが、配列番号７のポリペプチド：
【００３３】
【表４】
0004229992.tif 000007
【００３４】
である。
【００３５】
好ましい実施態様においては、上記第１の（Ｎ−末端）フラグメントがＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧを含み、前記第２の（中間部）フラグメントがＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬを含み、そして前記第３の（Ｃ−末端）フラグメントがＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡを含む。
【００３６】
好ましい実施態様においては、前記第３の（Ｃ−末端）フラグメントが、ＬＥＫＬ、ＬＥＫＬ、およびＨＴＡの縮合によって形成される。
【００３７】
好ましい実施態様においては、上記第１の（Ｎ−末端）フラグメントがＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧを含み、前記第２の（中間部）フラグメントがＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥを含み、そして前記第３の（Ｃ−末端）フラグメントがＬＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡを含む。
【００３８】
好ましい実施態様においては、前記第３の（Ｃ−末端）フラグメントが、ＬＬＥＫ、ＬＬＥＫ、およびＬＨＴＡの縮合によって形成される。
【００３９】
さらに、ＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰアナログの調製のための上記の方法を行って、得られたＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰアナログを、１以上の薬学的に受容可能な添加剤と混合することを特徴とする医薬組成物の調製方法、特に、骨粗鬆症、特に骨折治癒の処置のための医薬組成物の調製のための方法を提供することが本発明の目的である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
種々の一般的なヌクレオチドおよびアミノ酸に関する１文字および３文字表記は、Pure Appl. Chem. 31, 639-645 (1972) and 40, 277-290 (1974)およびIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission において推奨されたようであり、37 CFR  §1.822 (55 FR 18245、１９９０年５月１日) に従う。１文字および３文字表記は以下のとおりである：
アミノ酸                  ３文字記号    １文字記号
アラニン                        Ala           Ａ
アルギニン                      Arg           Ｒ
アスパラギン                    Asn           Ｎ
アスパラギン酸                  Asp           Ｄ
アスパラギン＋アスパラギン酸    Asx           Ｂ
システイン                      Cys           Ｃ
グルタミン                      Gln           Ｑ
グルタミン酸                    Glu           Ｅ
グルタミン＋グルタミン酸        Glx           Ｚ
グリシン                        Gly           Ｇ
ヒスチジン                      His           Ｈ
イソロイシン                    Ile           Ｉ
ロイシン                        Leu           Ｌ
リジン                          Lys           Ｋ
メチオニン                      Met           Ｍ
フェニルアラニン                Phe           Ｆ
プロリン                        Pro           Ｐ
セリン                          Ser           Ｓ
スレオニン                      Thr           Ｔ
トリプトファン                  Trp           Ｗ
チロシン                        Tyr           Ｙ
バリン                          Val           Ｖ
他のアミノ酸                    Xaa           Ｘ
表記は、Ｄ−もしくはＤ，Ｌ−の指定がない限り、Ｌ−アミノ酸を示す。あるアミノ酸は天然のものも非天然のものもアキラルであり、例えば、グリシンがそうである。すべてのペプチド配列はＮ−末端を左側にそしてＣ−末端を右側にして示される。
【００４１】
本明細書中で用いられる他のアミノ酸および化合物についてのさらなる表記は：
hSer            ホモセリン
hSerlac         ホモセリンラクトン
Nle             ノルロイシン
である。
【００４２】
「ＰＴＨもしくはＰＴＨｒｐの生理学的に活性な短縮されたアナログ」とは、ＰＴＨもしくはＰＴＨｒｐにみられるアミノ酸の完全な相補物には欠けるが、同様の生理学的応答を誘導するものを含む配列を有するポリペプチドをいう。短縮されたＰＴＨもしくはＰＴＨｒｐは、同様の生理学的応答を誘導するためにＰＴＨもしくはＰＴＨｒｐと完全に相同である必要はない。ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨｒｐ（１−３４）が好ましいが、限定的ではなく、これらの群の代表である。
【００４３】
「両親媒性α−ヘリックス」とは、特定のポリペプチドによって示される二次構造をいい、そこでは、アミノ酸が、ヘリックスの長軸方向を指向する向かい合わせの極性および非極性表面を有するα−ヘリックス様立体配置をとっている。目的のポリペプチド中のα−ヘリックス構造の可能性は、"Schiffer-Edmundson wheel"〔M. Schiffer and A. B. Edmundson, Biophys. J. 7, 121 (1967)〕の構造により、適当なピッチの構造により、そしてヘリックスが外接しているシリンダーの向かい合った面上の親水性残基および親油性残基の分離に注意することによりある程度探索し得る。あるいは、観察によって立証できる証拠、例えば、円二色性データもしくはＸ線回折データが利用可能であり得、それらは所定のポリペプチドにおけるα−ヘリックス様領域の存在を指示する。理想的なα−ヘリックスは１回転あたり３．６アミノ酸残基を有し、隣接した側鎖は１００°の弧によって分離されている。Eisenberg et al は、Nature 299, 371-374 (1982)およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984) において、疎水性スケールをヘリックスホイールと組み合わせて両親媒性ヘリックスの概念を定量した。疎水性モーメントの平均は、ヘリックスを構成している成分アミノ酸の疎水性のベクトル合計として定義された。以下のアミノ酸についての疎水性は、Eisenberg (1984)により「コンセンサス」スケールとして報告されたものである。
【００４４】
【表５】
0004229992.tif 000008
【００４５】
１回転あたり３．６アミノ酸残基を有する（もしくは側鎖間が１００°（＝３６０°／３．６）の弧）理想的なα−ヘリックスの疎水性モーメント、μH 、は、以下から計算し得る：
【００４６】
【数１】
0004229992.tif 000009
【００４７】
式中、ＨN はＮthアミノ酸の疎水性値であり、周期数δ＝１００°の配列におけるＮアミノ酸から合計をとる。疎水性モーメントは、＜μH ＞を得るためにμH をＮで割ることにより残基あたりの平均疎水性モーメントとして表現され得る。１００°±２０°における約０．２０以上の＜μH ＞の値は、両親媒性ヘリックス形成を暗示する。ｈＰＴＨｒｐ（２２−３１）およびｈＰＴＨ（２２−３１）の１００°での＜μH ＞の値は、それぞれ０．１９および０．３７である。
【００４８】
Cornett, et al. は、J. Mol. Biol., 195, 659-685 (1987)において、両親媒性の予測物としての「両親媒性指数 (amphipathic index)」の導入により両親媒性α−ヘリックスの研究をさらに拡大した。彼等は、公知のすべてのα−ヘリックスのほぼ半数が両親媒性であり、主な頻度は１００°ではなくむしろ９７．５°であり、１回転あたりの残基数は３．６より３．７に近いと結論付けた。そのような細かい点は科学的には興味あるところだが、所定の配列を両親媒性と分類するには、特に両親媒性α−ヘリックスを形成する配列を最初から設計しているような場合には、Eisenberg, et al. の基本的なアプローチで十分である。
【００４９】
代わりの両親媒性α−ヘリックスアミノ酸配列は、天然に生じるポリペプチドの所定のセグメントの配列との相同性を欠くかもしれないが、類似した二次構造、すなわち、向かい合わせの極性および非極性表面を有するα−ヘリックスを生理学的環境において導く。天然に生じるアミノ酸配列を代わりの配列で置き換えることは、変更された親ポリペプチドの生理学的活性、安定性もしくはその他の特性に有益な影響を及ぼし得る。そのような配列の設計および選択についての手引きは、J. L. Krstenansky, et al., FEBS Letters 242, 2, 409-413 (1989)およびJ. P. Segrest, et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics 8, 103-117 (1990)等に提供されている。
【００５０】
ある配列が、この発明の配列であるために十分に両親媒性であるかを決定する簡便な方法は、上で定義した平均疎水性モーメントを計算することである。１００°±２０°における残基あたりのピーク平均モーメントが約０．２０を越えているなら、その時にはその配列は両親媒性ヘリックスを形成し、この発明の配列である。
【００５１】
例えば、（配列番号２６）、Xaa=Glu についての１００°での残基あたりの平均疎水性モーメントは以下のように計算される：
【００５２】
【表６】
0004229992.tif 000010
【００５３】
この配列では、平均ピーク疎水性モーメントは、９２°で生じ、その値は０．４８である。
【００５４】
一つの局面において、この発明は、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ、ならびにＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの生理学的に活性なアナログもしくはそれらの塩の合成方法を提供する。ここで、アミノ酸残基（２２−３１）は、両親媒性のα−ヘリックスを形成し、その残基（２２−３１）の配列は、以下から選択される：
ａ）Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10、ここで：
Xaa1およびXaa4は独立してGlu 、Glu(OCH3) 、His 、またはPhe であり；
Xaa2はLeu またはPhe であり；
Xaa5はLys またはHis であり；
Xaa7およびXaa10 は独立してLeu またはIle であり；
Xaa8はAla 、Arg 、またはGlu であり；そして
Xaa9はLys またはGlu （配列番号８５）であり；
好ましくはGlu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu であり、ここで
Xaa はGlu またはArg （配列番号２６）であり；
ｂ）Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Arg Leu Leu Xaa8 Arg Leu 、ここで：
Xaa1およびXaa4は独立してGlu 、Glu(OCH3) 、His 、またはPhe であり；
Xaa2はLeu またはPhe であり；
Xaa8はGlu またはLys （配列番号８６）であり；
好ましくはGlu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu であり、ここで
Xaa はGlu またはLys （配列番号２７）である；
ｃ）Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu （配列番号２８）
ｄ）Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu （配列番号２９）
ｅ）Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu （配列番号３０）。
【００５５】
別の局面において、この発明は、下式：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Asp Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Term、ここで：
Xaa1は存在しないか、またはAla であり；
Xaa2は存在しないか、またはVal であり；
Xaa3は存在しないか、またはSer であり；
Xaa4は存在しないか、またはGlu もしくはGlu(OCH3) であり；
Xaa5は存在しないか、またはHis もしくはAla であり；
Xaa6は存在しないか、またはGln であり；
Xaa7は存在しないか、またはLeu であり；
Xaa11 はLys 、Arg 、またはLeu であり；
Xaa13 はLys 、Arg 、Tyr 、Cys 、Leu 、Cys(CH2CONH(CH2)2NH(ビオチニル))、Lys(７−ジメチルアミノ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−４−アセチル）、またはLys(ジヒドロシンナモイル）であり；
Xaa20 はArg またはLeu であり；
Xaa19 およびXaa21 は独立してLys 、Ala 、またはArg であり；
Xaa22-31は配列番号２６、２７、２８、２９、または３０から選択され；
Xaa32 はHis 、Pro またはLys であり；
Xaa33 は存在しないか、またはPro 、Thr 、Glu 、もしくはAla であり；
Xaa34 は存在しないか、またはPro 、Arg 、Met 、Ala 、hSer、hSerlactone 、Tyr 、もしくはLeu であり；
Xaa35 は存在しないか、またはPro 、Glu 、Ser 、Ala 、もしくはGly であり；
Xaa36 は存在しないか、またはAla 、Arg 、もしくはIle であり；
Xaa37 は存在しないか、またはArg 、Trp 、もしくは３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンであり；
Xaa38 は存在しないか、またはAla もしくはhSerであるか、あるいはXaa38-42はThr Arg Ser Ala Trp であり；
およびTermはＯＲまたはＮＲ2 であって、各Ｒは独立してＨ、（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルもしくはフェニル（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルである；ならびに、それらの薬学的に受容可能な塩、
のＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ、ならびにＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの生理学的に活性なアナログもしくはそれらの塩の合成方法を提供する。
【００５６】
さらに別の局面において、この発明は、下式（Ｉ）：
Ala Val Ser Glu Xaa5 Gln Leu Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Asp Leu Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Term、ここで：
Xaa5  はHis またはAla であり；
Xaa11 およびXaa13 は独立してLys 、Arg 、またはLeu であり；
Xaa19 およびXaa21 は独立してAla またはArg であり；
Xaa22-31は以下のａ）〜ｅ）から選択され：
ａ）Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu 、ここで
Xaa はGlu またはArg （配列番号２６）であり；
ｂ）Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu 、ここで
Xaa はGlu またはLys （配列番号２７）であり；
ｃ）Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu （配列番号２８）；
ｄ）Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu （配列番号２９）；
ｅ）Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu （配列番号３０）；
Xaa32 はHis またはLys であり；
Xaa33 はThr 、Glu 、またはAla であり；
Xaa34 はAla 、hSer、Tyr 、またはLeu であり；
およびTermはGly Arg Arg 、lactone 、ＯＨまたはＮＲ2 であり、ここで各ＲはＨまたは（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルであり；ならびに、それらの薬学的に受容可能な塩（式（Ｉ））、
に示す、生理学的に活性な短縮されたホモログｈＰＴＨｒｐ（１−３４）のポリペプチドアナログの合成方法を含む。
【００５７】
本発明のより特定の局面は、式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含し、ここで、Xaa22-31は（配列番号２６）であり、それについての１００°での＜μH ＞は０．４５を越えている。本発明のさらに特定の局面は、Xaa22-31が（配列番号２６）であり、Xaa11 およびXaa13 がどちらもLys であり；そしてXaa19 およびXaa21 がどちらもArg である、式（Ｉ）のポリペプチドを包含する。本明細書中で開示される方法によって調製される代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys
Leu His Thr Ala OH（配列番号５）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr Ala OH（配列番号６）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr Ala NH2 （配列番号７）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr hSer  NH2 （配列番号８）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr hSerlac （配列番号９）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH（配列番号１０）；および
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu Lys Glu Leu NH2 （配列番号１１）。
【００５８】
この発明の別の局面は、Xaa22-31が（配列番号２６）であり、Xaa11 およびXaa13 がどちらもLys であり；そしてXaa19 およびXaa21 のうちの一方がArg であり他方がAla である式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含する。本明細書中で開示される方法によって調製され得るこの亜種 (subgenus) の代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr Ala NH2 （配列番号１２）および
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Thr Ala NH2 （配列番号１３）。
【００５９】
別の局面において、この発明は、Xaa22-31が（配列番号２６）であり；Xaa11 およびXaa13 のうち一方がLeu であって他方がLys であり；そしてXaa19 およびXaa21 がいずれもArg である式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含する。本発明の方法によって調製され得るこの亜種の代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれに限定されない：
Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Ala Leu OH（配列番号１４）。
【００６０】
別の局面において、この発明は、式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含し、ここで、Xaa22-31は（配列番号２７）であり、それについての１００°での＜μH ＞は０．５０を越えている。この発明のさらなる局面は、Xaa22-31が（配列番号２７）であり、Xaa11 およびXaa13 がどちらもLys もしくはどちらもArg であり；そしてXaa19 およびXaa21 がどちらもArg である、式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含する。この発明の方法によって調製され得るこの亜種の代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg
Leu His Thr Ala OH（配列番号１５）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg
Leu His Thr Ala OH（配列番号１６）；
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg
Leu His Thr Ala OH（配列番号１７）；
【００６１】
別の局面において、この発明は、式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含し、ここで、Xaa22-31は（配列番号２８）であり、それについての１００°での＜μH ＞は約０．２５である。この発明の方法によって調製され得るこの亜種の代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれに限定されない：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala
Leu His Thr Ala NH2 （配列番号２０）。
【００６２】
別の局面において、この発明は、式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含し、ここで、Xaa22-31は（配列番号２９）であり、それについての１００°での＜μH ＞は約０．２８である。この発明の方法によって調製され得るこの亜種の代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser
Leu His Thr Ala NH2 （配列番号２１）。
【００６３】
別の局面において、この発明は、式（Ｉ）のポリペプチドの合成を包含し、ここで、Xaa22-31は（配列番号３０）であり、それについての１００°での＜μH ＞は約０．２９である。この発明の方法によって調製され得るこの亜種の代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys
Leu His Thr Ala NH2 （配列番号２２）。
【００６４】
この発明のさらに別の局面は、以下の式（II）：
Xaa1 Val Ser Glu Ile Gln Xaa7 Xaa8 His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa16 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 His Asn Xaa34 Term、ここで：
Xaa1はSer またはAla であり；
Xaa7はLeu またはPhe であり；
Xaa8はmet またはNle であり；
Xaa16 はAsn またはSer であり；
Xaa18 はLeu 、Met またはNle であり；
Xaa19 はGlu またはArg であり；
Xaa21 はVal またはArg であり；
Xaa22-31は配列番号２６、２７、２８、２９、および３０から選択され；
Xaa34 はPhe またはTyr であり；
TermはＯＨまたはＮＲ2 であり、ここで各ＲはＨまたは（Ｃ1 −Ｃ4)アルキルであり；ならびに薬学的に受容可能なそれらの塩、
に示すｂＰＴＨ（１−３４）の生理学的に活性なホモログのポリペプチドアナログの合成を包含する。
【００６５】
この発明の方法によって合成され得る代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu
Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Asn Tyr NH2 （配列番号２３）および
Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu
Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
Leu His Asn Tyr NH2 （配列番号２４）。
【００６６】
この発明のさらに別の局面において、３４個未満のアミノ酸を有するＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのアナログの合成方法が提供される。これらの化合物は以下の一般式で表される：
Ala Val Ser Glu Xaa5 Gln Leu Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Asp Leu Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Term、
【００６７】
この発明の方法によって調製され得る代表的なポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない：
0004229992.tif 000011
【００６８】
当業者は、ポリペプチドアナログの多くの置換物 (permutation)が合成され、それらは、１００°±２０°での残基あたりの平均疎水性モーメントが約０．２０より大きいアミノ酸配列が（２２−３１）位に挿入される限り、本明細書中に記載されたものの所望の特性を有するということを理解するであろう。
【００６９】
本発明のポリペプチドフラグメントは、以下に記載されたような方法により合成されてもよい：固相合成に関しては、G. Barany, R. B. Merrifield, The Peptides, E. Gross and J. Meienhofer eds., Academic Press, New York (1979), Vol.2, pp.1-284; J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984) およびJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol.2, Academic Press, New York, (1973)、および液相合成に関しては、E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, Vol.1, Academic Press, New York, (1965) 。一般に、これらの方法は、保護アミノ酸の伸長しつつあるペプチド鎖への連続的な添加を含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基もしくはカルボキシル基のいずれかと任意の反応性側鎖基が保護される。次いで、この保護アミノ酸を、不活性な固体支持体に付着させるか、もしくは液体で用いて、配列中の次のアミノ酸であって、やはり適切に保護されているものを、アミド結合の形成に反応し得る条件下で添加する。すべての所望のアミノ酸が適切な配列に連結されたのち、保護基および任意の固体支持体は取り除かれて、粗ポリペプチドが産生される。このポリペプチドを、好ましくはクロマトグラフィーにより、脱塩および精製し、最終産物を得る。
【００７０】
この発明の実施においては、前駆体ペプチドフラグメントを液相技術もしくは固相技術のいずれかあるいはそれらの任意の組合せにより調製することができる。例えば、いくつかのフラグメントを溶液中で調製し、次いで、樹脂結合Ｃ−末端フラグメントと縮合させるか、あるいは各フラグメントを固相技術によって調製し、樹脂から解離させ、溶液中で縮合させてもよいし、あるいは液相および固相合成を混合したプロトコールを用いてもよい。
【００７１】
約４０アミノ酸未満を有するこの発明のＰＴＨおよびＰＴＨｒＰアナログを調製する好ましい方法は、固相フラグメント縮合ペプチド合成を包含する。この方法では、最終生成物は、いくつかのペプチド前駆体フラグメントの縮合の結果得られる。当業者の好みによりいかなるフラグメントの組合せを用いてもよい。例えば、３４アミノ酸産物は、２つの１７アミノ酸ペプチド前駆体フラグメントから調製してもよいし、異なる長さの、３つのペプチド前駆体フラグメント、４つの前駆体フラグメントなどから調製してもよい。実際の考察については、Tetrahedron, 49, 11065-11133 (1993) におけるP. LLoyd-Williams et al., "Convergent Solid Phase Peptie Synthesis" を参照されたい。
【００７２】
一般に、α−アミノ（Ｎα）官能基および任意の反応性側鎖は、酸感受性基もしくは塩基感受性基によって保護される。保護基はペプチド結合形成の条件に対して安定であるべきであり、一方、伸長したポリペプチド鎖に影響を及ぼさずに容易に除去され得るべきである。適切なα−アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミロキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、α、α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシカルボニル、好ましくは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含むがこれらに限定されない。適切な側鎖保護基は：アセチル、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブチル、シクロヘキシル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル（Ｃｌ−ｚ）、２，６−ジクロロベンジル、２，４−ジニトロフェニル、シクロペンチル、イソプロピル、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、トリメチルシリル、メチルトリチル、メシチレンスルホニル（Ｍｔｓ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）を含むがこれらに限定されない。
【００７３】
固相合成では、Ｃ−末端アミノ酸が適切な樹脂支持体に最初に付着する。適切な樹脂支持体は、ステップワイズ縮合の試薬および反応条件ならびに脱保護反応に対して不活性であり、同時に、用いる溶媒中で不溶性の物質である。市販の樹脂の例は、反応性の基で修飾されたスチレン／ジビニルベンゼン樹脂、例えば、塩化メチル化されたコ−ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ヒドロキシメチル化されたコ−ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、およびベンジル化され、ヒドロキシメチル化されたフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂を含む。酸末端ペプチドを調製するために、Wang樹脂を用いてもよい。好ましい樹脂は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミノ−コ−ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂（ＭＢＨＡ）である。
【００７４】
好ましい実施態様においては、Ｃ−末端フラグメント以外のすべてのフラグメントは酸感受性樹脂、例えば、Sasrin（２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール）もしくは４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸４−メチルベンズヒドリルアミン（ＨＭＰＢ−ＭＢＨＡ）上で調製される。ＨＭＰＡ−ＭＢＨＡ、ＨＭＰＢ−ＢＨＡ、およびＨＭＰＡ−ＢＨＡ樹脂もまた、カルボキシ末端ペプチドにとって適切である。このＣ−末端フラグメントは、Knorr ハンドル−ＭＢＨＡ樹脂を用いて調製される。Sieberアミド樹脂、Rinkリンカー−ＭＢＨＡもしくはＢＨＡ樹脂、およびRamageリンカー−ＭＢＨＡもしくはＢＨＡ樹脂はすべてアミド末端ペプチドにとって適切である。これらの樹脂は、最初のアミノ酸が既に結合している形で市販されており、あるいは最初のアミノ酸はリンカーに付着させられていてもよい。ＨＭＰＢ−ＭＢＨＡおよびKnorr ハンドル樹脂はＭＢＨＡ樹脂から以下の実施例１、２および３に記載されているようにして調製され得る。残りの保護アミノ酸の連続的なカップリングは、当該分野で周知の方法により行うことができる。各保護アミノ酸は、好ましくは約１．５〜２．５モル過剰で導入され、カップリングは不活性で、非水性の極性溶媒、例えば、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、もしくはそれらの混合物中で、好ましくは室温で行われる。代表的なカップリング剤は、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）もしくは他のカルボジイミドであり、単独でもしくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｏ−アセチル尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミドもしくはオキシムの存在下である。あるいは、保護アミノ酸活性エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニルなど）もしくは対称無水物 (symmetrical anhidride)を用いてもよい。Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸の連続的なカップリングは、Ｆｍｏｃ基を取り除くため、２級アミン、例えば、ピリジンの溶液を用いて行われる。ペプチド樹脂は、各カップリング工程後にKaiser試験によりカップリングが完了したことを検査してもよい。
【００７５】
固相合成の最後に、完全に保護されたペプチドを、側鎖の保護基の成熟前脱保護を誘導しない条件を用いて樹脂から除く。このペプチドは、鹸化 (saponification) もしくはエステル交換反応または穏やかな酸性脱保護レジメンにより、例えば、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて解離され得る。保護ペプチドはシリカゲルクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７６】
溶液は脱塩し（例えば、BioRadAG-3（登録商標）陰イオン交換樹脂を用いて）、ペプチドは、以下のタイプの任意のもしくはすべてを用いる一連のクロマトグラフィー工程により精製することができる：誘導体化されていないコ−ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、例えば、Amberlite （登録商標）XAD による疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースによる陽イオン交換クロマトグラフィー；例えばSephadex（登録商標）G-25による分配クロマトグラフィー；向流分配；もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、オクチル−もしくはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）結合相カラムパッキングによる陽イオン交換および逆相ＨＰＬＣ。
【００７７】
多重フラグメント合成の１つの実施態様においては、中間部およびＮ−末端フラグメントを単離し、連続的にＣ−末端フラグメントに縮合させる。ポリペプチド産物は脱保護し、樹脂から解離させ、さらに精製する。精製順序は一般に、クロマトグラフィー分離の総合的な連続である。ＨＰＬＣ分析は、精製の順序および選択を決定する。典型的な順序は、陽イオン交換、逆相ＨＰＬＣ、そして逆相濃縮カラムである。最終溶液を凍結乾燥させ、薬剤生成物を琥珀色ビンに保存する。保護アミノ酸は、Genzyme (Cambridge, MA, USA)、Propeptide (Princeton, NJ, USA) 、またはSynthetec (Albany, OR, USA) から入手した。
【００７８】
【実施例】
配列番号７のポリペプチドは、３４アミノ酸ペプチド、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡ−ＮＨ2 であり、３つのフラグメントを縮合させる手法を用いて調製した。Ｎ−末端フラグメントは、アミノ酸１〜１２、中間部フラグメントは、アミノ酸１３〜２３、そしてＣ−末端フラグメントは、アミノ酸２４〜３４からなっていた。各フラグメントを、Vega 296 Automated Peptide Synthesizerで固相法により調製した。Ｎα−保護基の解離とカップリング後の洗浄には自動化されたモードを用いた。カップリング試薬および溶媒を、カップリング工程中に反応容器に手で加えた。中間部およびＮ−末端フラグメントをＨＰＬＣにより精製し、連続的にＣ−末端フラグメントに縮合させた。最終ポリペプチドを脱保護し、樹脂から解離させ、そして精製した。
【００７９】
実施例１．Ｎ−末端フラグメントの調製
アミノ酸１−１２、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧからなるＮ−末端フラグメントを、酸感受性樹脂、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸  ４−メチルベンズヒドリルアミン（ＨＭＰＢ−ＭＢＨＡ）上で２５０ミリモルの規模にて調製した。この樹脂を、ＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem)から以下のとおりに調製した：
【００８０】
【表７】
0004229992.tif 000012
【００８１】
少なくとも１回のＤＭＦ／ＣＨ2 Ｃｌ2 の洗浄後、第１のアミノ酸（12Ｇｌｙ）のカップリングを、下記のプロトコールを使用し、ＤＭＦ／ＣＨ2 Ｃｌ2(１／１）中でＦｍｏｃ−ＧｌｙＯＨ（１．５〜２．２当量）、ＤＩＣ（１．５〜２．２当量）およびＤＭＡＰ（０．０５当量）を用い、室温にて約１５時間行った：
【００８２】
【表８】
0004229992.tif 000013
【００８３】
次いでこの樹脂を、工程３〜８を反復することにより洗浄し、下記のプロトコールを用いてキャッピングした：
【００８４】
【表９】
0004229992.tif 000014
【００８５】
残るアミノ酸を、下記の保護アミノ酸を使用し、逆の順序で引き続くカップリングサイクルにて樹脂に結合させた：
ａａ１１  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
ａａ１０  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
ａａ９    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎim−トリチル−Ｌ−ヒスチジン
ａａ８    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
ａａ７    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
ａａ６    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎg −トリチル−Ｌ−グルタミン
ａａ５    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎim−トリチル−Ｌ−ヒスチジン
ａａ４    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
ａａ３    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
ａａ２    Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリン
ａａ１    Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン
【００８６】
カップリングはＮＭＰ中において１．５〜２．２当量のアミノ酸（０．１〜０．２５M ）、ＨＯＢｔおよびＤＩＣを使用して室温にて行った。１．５〜３時間後、ＤＭＳＯを添加し、１．５〜３時間、カップリングを継続した。各カップリングは次の工程を含んでいた：
【００８７】
【表１０】
0004229992.tif 000015
【００８８】
カップリングの完全性を、Kaiser試験により確認し；試験が正である場合には、場合によりＰｙＢＯＰをカップリング試薬として使用して工程８〜１４を反復した。
【００８９】
保護ペプチドを樹脂から解離させるために、この樹脂の懸濁物をＣＨ2 Ｃｌ2 中１％ＴＦＡ中で（４mL/gm レジン）０℃または室温にて最長１５分間撹拌した。この溶液を濾過し、５％ＮａＨＣＯ3 にて抽出した。樹脂のＴＦＡ処理を３回反復した。有機部分を合わせ、水、５％ＮａＨＳＯ4 、および再度水にて洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、蒸発させた。残渣を下記のとおりにＨＰＬＣにて精製した：
カラム：Zorbax Pro-10/150 Ｃ８，  ６″×４０cm
カラム温度：室温
流速：２. ２〜３．０mL／分cm2
検出器波長：２５０nm
移動相：トリエチルアミン、ＣＨ3 ＣＮを含む０. １％ＨＯＡｃ、pH６〜６. ２。
【００９０】
保護ペプチドを、６５〜７０％ＣＨ3 ＣＮ中でカラムに負荷した。勾配を、ＣＨ3 ＣＮの割合が８５％まで増加するように操作した。画分を合わせ、濃縮し、生成物をＣＨ2 Ｃｌ2 抽出により単離した。有機相を、重炭酸ナトリウムの希釈溶液または水にて洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。
【００９１】
実施例２．中間部フラグメントの調製
アミノ酸１３−２３、ＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬからなる中間部フラグメントを、酸感受性樹脂、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸  ４−メチルベンズヒドリルアミン（ＨＭＰＢ−ＭＢＨＡ）上で２３０ミリモルの規模にて調製した。この樹脂を、ＭＢＨＡ樹脂から上の実施例１に記述されるように調製した。第１のアミノ酸（ａａ２４）を、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシンを使用して、示したようにして取り込んだ。残るアミノ酸を、実施例１の手法を使用し、引き続くカップリングサイクルにて樹脂に結合させた：
ａａ２３  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
ａａ２２  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎg −４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンジルスルホニル−Ｌ−アルギニン
ａａ２１  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎg −４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンジルスルホニル−Ｌ−アルギニン
ａａ２０  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎg −４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンジルスルホニル−Ｌ−アルギニン
ａａ１９  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
ａａ１８  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
ａａ１７  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎg −トリチル−Ｌ−グルタミン
ａａ１６  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−イソロイシン
ａａ１５  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
ａａ１４  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
【００９２】
実施例１に教示したようにしてペプチドを遊離酸として樹脂から解離させ、有機部分を抽出し、乾燥させ、そして蒸発させた。残渣をジクロロメタン中に溶解し、ｔ−ブチルメチルエーテル（ｔ−ＢｕＯＭｅ）に添加することによって沈殿させてもよい。濾過後、ｔ−ＢｕＯＭｅにて洗浄し、真空乾燥させた後に、生成物を前述のZorbaxカラム上で、７５％ＣＨ3 ＣＮを用いてイソクラティックに検出器波長２６７nmにてＨＰＬＣにより精製した。
【００９３】
実施例３．Ｃ−末端フラグメントの調製
アミノ酸２４−３４、ＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＡからなるＣ−末端フラグメントを、Ｆｍｏｃ−２，４−ジメトキシ−４′−（カルボキシメトキシ）−ベンズヒドリルアミン・リンカーを使用し、ＭＢＨＡ樹脂上で１３０ミリモル規模にて下記のように調製した：
【００９４】
【表１１】
0004229992.tif 000016
【００９５】
残るアミノ酸を、下記の保護アミノ酸を使用し、逆の順序で引き続くカップリングサイクルにて樹脂に結合した：
ａａ３４  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン
ａａ３３  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
ａａ３２  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎim−トリチル−Ｌ−ヒスチジン
ａａ３１  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
ａａ３０  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
ａａ２９  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
ａａ２８  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
ａａ２７  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
ａａ２６  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
ａａ２５  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
ａａ２４  Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン
【００９６】
カップリングはアミノ酸３４から２６までについて、ＮＭＰ中において１．５〜２．２当量のアミノ酸、ＨＯＢｔおよびＤＩＣを使用して室温にて１．５〜３時間行われた。アミノ酸２４および２５については、３当量のアミノ酸、ＨＯＢｔおよびＤＩＣを使用した。１．５〜３時間後、２０％ＤＭＳＯを添加し、１．５〜３時間、カップリングを継続した。各カップリングはＦｍｏｃ解離およびカップリング後の洗浄を含み、次の工程を含んでいた：
【００９７】
【表１２】
0004229992.tif 000017
【００９８】
カップリングの完全性は、各カップリング工程に後にKaiser試験により確認した。試験が正である場合（＞１．５％が未カップリング）には、工程８〜１４を反復し；試験が負の場合には、この樹脂をアセチル化した。
【００９９】
実施例４．３つのフラグメントの縮合
上記の実施例１、２および３に記述されるようにして、３つのフラグメントを調製した。Ｃ−末端フラグメントの残留するＮα−Ｆｍｏｃ基を、実施例３のプロトコールの最後に記述した工程１〜７を使用して除去した。
【０１００】
中間部フラグメントＢ（１７２ｇ、６１．８ミリモル）、ＨＯＢｔ（５９．２ミリモル）、ＨＯＡｔ（３．７ミリモル）およびＤＩＣ（６１．９ミリモル）を、ＮＭＰ（９００mL）およびＣＨ2 Ｃｌ2 中のＣ−末端フラグメント樹脂（１９０ｇ、４１ミリモル）に添加した。この混合物を、室温にて２２時間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（７mL）を添加し、撹拌をさらに１日継続した。この樹脂を、実施例１（工程９〜１３）に記述したように洗浄した。Kaiser試験は、２％未満の未結合の残留物を示した。この樹脂をアセチル化し（実施例３、工程１４〜２０）、Ｆｍｏｃ基を除去した（実施例３、工程１〜７）。
【０１０１】
Ｎａ塩としてのＮ−末端フラグメントＡ（１５３ｇ、６２．４ミリモル）、ＨＯＢｔ（５９．２ミリモル）、ＨＯＡｔ（３．７ミリモル）、ＰｙＢＯＰ（６２．５ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１２５．１５ミリモル）を、ＮＭＰ（９００mL）およびＣＨ2 Ｃｌ2 中の樹脂に添加した。この混合物を室温にて２４時間撹拌し、濾過し、洗浄した（実施例３、工程９〜１３）。Kaiser試験は、１％未満の未結合残留物の存在を示した。この樹脂をアセチル化し、反応器から取り出し、減圧下で乾燥させた。
【０１０２】
チオアニソール（１５２．６mL）およびＴＦＡ（１L ）中のフェノール（６０．３ｇ）の溶液を、Ｎ2 下でペプチド−樹脂（６４ｇ）に添加した。この混合物を、−１０℃に冷却し、ＴＭＳＢｒを徐々に添加した。この混合物を閉鎖系内で−１０℃にて０．５時間、室温にて１〜２時間撹拌した。この混合物を減圧下、５０℃にて半分の容量まで濃縮し、樹脂を濾過し、ＴＦＡ（２５０mL）および氷酢酸（２５０mL）で２回洗浄した。濾液を、ｔ−ブチルメチルエーテル：ヘキサンの３：１混合物（６．５L ）に添加することにより沈殿させた。粗ペプチドを濾過し、ｔ−ブチルメチルエーテル、トルエン、およびｔ−ブチルメチルエーテル（各２×２５０mL）にて洗浄し、メタノール（５００mL）への溶解およびｔ−ブチルメチルエーテル（７L ）への添加により沈殿生成させた。この粗精製物を濾過し、ｔ−ブチルメチルエーテルにて洗浄し、減圧下で乾燥させて３３ｇのペプチドを得た。
【０１０３】
同様の方法で、酸末端ペプチドのかわりに適当な樹脂を用いて、以下のＰＴＨｒＰアナログを調製し得る：
【０１０４】
【表１３】
0004229992.tif 000018
【０１０５】
【表１４】
0004229992.tif 000019
【０１０６】
【表１５】
0004229992.tif 000020
【０１０７】
〔Met34 ，Ala35 〕（配列番号２５）、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬＥＫＬＨＴＭＡ−ＮＨ2 （配列番号２５）は、上述の方法に従って、調製および精製し得る。このポリペプチドは、以下のようにホモセリンラクトンに変換され得る。精製ペプチドを４４％ギ酸に溶解する。この溶液を、４４％ギ酸中のシアノゲンブロマイド（７００ｍｇ）およびフェノール（１．６mg）の混合溶液と０℃にて合わせる。この溶液を０℃にて２時間、室温にて２時間撹拌する。生成物の形成は、ＨＰＬＣ（Vydac(登録商標)   Ｃ−１８、３００オングストローム、４．６×２５０mm、流速１．２mL／分、１０分間で０．１％ＴＦＡ中の２５〜４５％アセトニトリルの勾配）により監視し得る。試料を濃縮し、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Vydac(登録商標）  Ｃ−１８、０．１％ＴＦＡ中の２５〜４５％アセトニトリルの勾配）により精製して配列番号９を得る。
【０１０８】
【表１６】
0004229992.tif 000021
【０１０９】
同様に、この方法に従って、配列番号７９が調製され得る。
【０１１０】
【表１７】
0004229992.tif 000022
【０１１１】
ホモセリンアミドを調製するために、粗製ホモセリンラクトンアナログ、化合物４を濃縮し、メタノール中の飽和ＮＨ3 、２５mLにより処理した。この溶液を０℃にて２時間、室温にて１６時間撹拌した。反応は、ＨＰＬＣ（Vydac(登録商標）  Ｃ−１８、３００オングストローム、４．６×２５０mm、流速１．２mL／分、０．１％ＴＦＡ中の２５−４５％アセトニトリルの勾配）により監視し得る。この溶液を濃縮し、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Vydac(登録商標）  Ｃ−１８、０．１％ＴＦＡ中の２５−４５％アセトニトリルの勾配）により精製する。ホモセリンアミドペプチドの分画を集め、凍結乾燥して配列番号８を得る。
【０１１２】
【表１８】
0004229992.tif 000023
【０１１３】
同様に、Ｃ−末端としてメチオニンを使用し、この方法に従って化合物２２、２３および２８を調製し得る。
【０１１４】
【表１９】
0004229992.tif 000024
【０１１５】
ホモセリンアルキルアミドは、ホモセリンラクトンを対応するアルキルアミンの過剰量を含むＤＭＦ中に溶解することによりホモセリンラクトンから同様に調製し得る。室温にて数日撹拌後（反応は分析用ＨＰＬＣにて監視し得る）、この混合物を蒸発乾固し、ペプチドを調製用ＨＰＬＣにて精製する。ホモセリンアルキルアミドの代表例は、化合物５５および５６である。
【０１１６】
【表２０】
0004229992.tif 000025
【０１１７】
上記ホモセリンラクトンアナログの水溶液は、ブタ肝臓エステラーゼ（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)で処理し得る。ラクトンのＣ−末端ホモセリンへの加水分解は、分析用ＨＰＬＣにて監視し得る。加水分解が完了したものと判断される場合には、この物質は上述のように調製用ＨＰＬＣにて精製され得る。
【０１１８】
【表２１】
0004229992.tif 000026
【０１１９】
この発明は、３個のフラグメントからの３４アミノ酸ポリペプチドの合成の開示により例示されてきたが、異なるフラグメントからの異なる長さの別のＰＴＨおよびＰＴＨｒＰアナログについても同様に適用し得る。一般的に、グルタミン酸、グリシン、ロイシンおよびプロリンは、好ましいフラグメントのＣ−末端である。前述の実施例において、フラグメント２および３の間のロイシン−ロイシンカップリングは、予期せぬ高収率を与えた。同様にロイシン−ロイシンカップリングは、フラグメント１−７、８−２３、２４−２７、および２８−３４からの配列番号７のポリペプチドの調製により利用され得た。他の実施態様においては、アミノ酸２４−２７（ＬＥＫＬ）が２８−３１と同じである場合、溶液または固体相技術のいずれかによって４個のアミノ酸のフラグメントを調製し、それ自身を縮合してフラグメント２４−３１を与えることもできる。あるいは、４アミノ酸フラグメント２３−２６（ＬＬＥＫ）を調製し、自身で縮合させて２３−３０のフラグメントを与えることもできる。精製の容易性は、容易に結晶化するより小さなフラグメントの使用により促進されるが、フラグメント数の増加は、より多くのフラグメント縮合工程を必要とする。
【０１２０】
【配列表】
0004229992.tif 000027
【０１２１】
0004229992.tif 000028
【０１２２】
0004229992.tif 000029
【０１２３】
0004229992.tif 000030
【０１２４】
0004229992.tif 000031
【０１２５】
0004229992.tif 000032
【０１２６】
0004229992.tif 000033
【０１２７】
0004229992.tif 000034
【０１２８】
0004229992.tif 000035
【０１２９】
0004229992.tif 000036
【０１３０】
0004229992.tif 000037
【０１３１】
0004229992.tif 000038
【０１３２】
0004229992.tif 000039
【０１３３】
0004229992.tif 000040
【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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