(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を照射することにより、通過する測定対象物が発する蛍光を受光手段が受光して蛍光を検出する際、
レーザ光の照射位置を測定対象物が通過するとき、前記受光手段が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集する第１のステップと、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過した後の、前記測定対象物がレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光手段が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集する第２のステップと、
前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める第３のステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分の値とにより構成されるデータである請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記第３の位相差情報は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引いたデータである請求項２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を、前記流れに向けて出射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射によって発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
前記測定対象物がレーザ光の照射位置を通過するタイミングを検知するタイミング検出部と、
前記検知したタイミングに従って、前記受光部が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集し、さらに、前記測定粒子がレーザ光の照射位置を通過後のレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光部が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集し、前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める処理・分析手段と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分と値とにより構成されるデータである請求項４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記処理・分析手段は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引くことにより前記第３の位相差情報のデータを求める請求項５に記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や細菌等の測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出方法及び蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を測定対象物としてバッファー液に含んで構成される混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、生体物質中の蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで生体物質を識別するものである。
このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって識別し、識別した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においてはより多くの測定対象物を短時間に蛍光の情報から識別することが要求されている。
【０００３】
下記特許文献１には、蛍光検出装置が開示されている。この蛍光検出装置では、レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させ、このレーザ光を生体物質等に照射する。このとき試料から発する蛍光を受信して、レーザ光の変調信号に対する位相差情報を用いて生体物質等が発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。これにより、多数の蛍光の種類を識別することができ、特に短時間で効率よく蛍光信号を識別することができる、とされている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２６６９８号公報
【０００５】
上記特許文献１の装置は、生体物質等が発する蛍光の蛍光強度が強い場合、受光した蛍光の種類を正確に識別することができるが、生体物質等が発する蛍光の発光領域が限られ、しかも蛍光強度が比較的弱い場合、必ずしも正確な識別ができないといった問題が生じる。
例えば、予め蛍光緩和時間が既知の蛍光色素の発する蛍光を測定した場合、蛍光強度が弱いとき、求められた蛍光緩和時間が既知の蛍光緩和時間とずれが生じるため、正確な識別ができないといった問題が生じる。この他、生体物質がレーザ光の照射位置を通過するたびに蛍光緩和時定数を求め、求めた複数の蛍光緩和時定数を横軸に採り、縦軸にその頻度を採ったヒストグラムにおいて、ヒストグラムを形成する山の形状がブロードになり、複数の蛍光を正確に識別することができない。
【０００６】
今日、生体物質中の極めて限られた狭い局所領域を蛍光の発光領域とする生体物質を扱うことが多くなっている。この場合、生体物質の発する蛍光の発光領域が小さくなるので、蛍光強度も弱くなる。このため、上述したように蛍光の正確な識別が益々困難となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、レーザ光を照射することにより生体物質等の測定対象物が発する蛍光を検出する際、従来に比べて正確に蛍光緩和時定数を算出する蛍光検出方法及び蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を照射することにより、通過する測定対象物が発する蛍光を受光手段が受光して蛍光を検出する際、
レーザ光の照射位置を測定対象物が通過するとき、前記受光手段が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集する第１のステップと、前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過した後の、前記測定対象物がレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光手段が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集する第２のステップと、前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める第３のステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
【０００９】
その際、前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分の値とにより構成されることが好ましい。さらに、前記第３の位相差情報は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引いたデータであることが好ましい。
【００１０】
また、本発明は、測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を、前記流れに向けて出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射によって発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記測定対象物がレーザ光の照射位置を通過するタイミングを検知するタイミング検出部と、前記検知したタイミングに従って、前記受光部が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集し、さらに、前記測定粒子がレーザ光の照射位置を通過後のレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光部が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集し、前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める処理・分析手段と、を有することを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
【００１１】
その際、前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分と値とにより構成されるデータであることが好ましい。さらに、前記処理・分析手段は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引くことにより前記第３の位相差情報のデータを求めることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の蛍光検出方法及び蛍光検出装置は、測定対象物の発する蛍光のみならず、測定対象物がレーザ光の照射位置を通過した後のバッファー液の発する蛍光に対しても、蛍光検出の計測対象とする。これは、測定対象物の蛍光が比較的弱い場合、バッファー液自体が発する蛍光を無視できないからである。測定対象物がレーザ光の照射位置の通過時において計測される蛍光には、測定対象物の発する蛍光の他にバッファー液自体が発する蛍光が含まれているが、本発明では、測定対象物がレーザ光の照射位置を通過した後のバッファー液の発する蛍光に対しても蛍光を計測を行うので、この計測結果を用いて、測定対象物の発する蛍光の位相差情報を正確に求めることができる。これにより、従来に比べて正確かつ迅速に蛍光緩和時定数を算出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の蛍光検出方法を実施する本発明の蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。以下説明する実施形態では、バッファー液に懸濁した蛍光色素を有する生体物質Ｍを、測定対象物として説明するが、生体物質Ｍの他に所定の蛍光色素を備え、生体物質Ｍと生体結合をするマイクロビーズを生体物質Ｍとともにバッファー液に含ませ、生体物質Ｍ及びマイクロビーズを測定対象物とすることもできる。
【００１４】
フローサイトメータ１０は、レーザ光を照射することにより蛍光を発する生体物質Ｍをバッファー液に懸濁して構成された試料１２に照射し、試料１２中の生体物質Ｍが備える蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。
【００１５】
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の変調周波数で強度変調させる変調信号を生成するために制御する制御部、及び試料１２からの蛍光信号を識別する信号処理部を含んだ制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液に、生体物質Ｍを含んだバッファー液からなる試料１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の生体物質Ｍを識別し分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
【００１６】
レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ1＝４０５ｎｍ、λ2＝５３３ｎｍおよびλ3＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点を形成する。この測定点が、本発明におけるレーザ光の照射位置に対応する。
【００１７】
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する部分である。
レーザ光源部２２は、主に赤色のレーザ光ＲをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調するＲ光源２２ｒと、緑色のレーザ光ＧをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調するＧ光源２２ｇと、青色のレーザ光ＢをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調するＢ光源２２ｂと、を有する。
さらに、レーザ光源部２２は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのそれぞれを駆動するレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂに分配するパワースプリッタ３５と、を有する。
【００１８】
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時定数に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
ダイクロイックミラー２３ａ1は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ2は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点の試料１２を照射する照射光となる。
【００１９】
Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質Ｍに付着されており、生体物質Ｍが測定対象物として管路３０を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。さらに、生体物質Ｍが測定点を通過後も、好ましくは通過直後も、生体物質Ｍが無い状態でバッファー液に対し一定期間レーザ光を照射し、バッファー液の発する蛍光の検出を行う。
【００２０】
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する生体物質Ｍによってレーザ光が前方散乱することにより、生体物質Ｍが測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において生体物質Ｍが管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
なお、生体物質Ｍが測定点を通過する時間をＴとし、生体物質Ｍの平均直径をＤ、フローセルを流れる生体物質Ｍの速度をＶとし、レーザ光の測定点におけるスポット幅をＷとしたとき、時間Ｔは、Ｔ＝（Ｄ＋Ｗ）／Ｖとなる。この時間Ｔは既知の値である。信号処理装置２０は、受光部２４で生成されるトリガ信号を計測開始のタイミングとして、蛍光の検出を開始し、時間Ｔの２倍の時間２・Ｔの間計測を続行する。計測とは、時間Ｔの期間中、試料１２の発する蛍光を受光して、後述する制御・処理部２８にて信号処理を行い、分析装置８０に位相差情報を供給することをいう。この計測により、測定点を生体物質Ｍが通過するとき、受光部２６が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集し、生体物質Ｍが測定点を通過した後の、生体物質Ｍが測定点に無いバッファー液のみの状態において、受光部２６が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集することができる。
【００２１】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２から発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【００２２】
図３に示す受光部２６は、試料１２中の生体物質１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２と、バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
【００２３】
バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。
【００２４】
光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光はレーザ光の変調信号に対して位相差情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は位相差情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部２８に供給される。
【００２５】
制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。なお、制御・処理部２８は、本発明における第１の蛍光信号及び第２の蛍光信号を収集する部分に対応する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）する変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のパワースプリッタ３５に供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号（第１の蛍光信号、第２の蛍光信号）を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
【００２６】
信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により試料１２が発する蛍光の位相差情報を含む信号を処理する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ〜５４ｃと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ５６と、この変調信号を参照信号として増幅された蛍光信号と合成するＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃと、を有して構成される。
【００２７】
ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃは、光電変換器２７ａ〜２７ｃから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成する装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃのそれぞれは、図５に示すように、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分（参照信号と同位相の信号成分）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分（参照信号に対して９０度の位相差のある信号成分）と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。
【００２８】
コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の変調信号（正弦波信号）を生成させるように制御し、さらに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を求める部分である。
【００２９】
具体的には、コントローラ４４は、信号処理装置２０の各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
システム制御器６０は、レーザ光の強度変調のために、発振器４６の発振周波数を定める。
コントローラ４４は、ローパスフィルタ６２によってフィルタリング処理されて高周波信号が除去されたｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値をアンプ６４で増幅し、さらに、Ａ／Ｄ変換器６６によりサンプリングすることにより、デジタル化されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を、分析装置８０に供給する。
【００３０】
分析装置８０は、生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求め、試料１２中の生体物質Ｍの蛍光の種類を、蛍光緩和時定数から識別する部分である。所定の蛍光色素を付着したマイクロビーズを試料１２に含ませて、生体物質Ｍが生体結合するか否か等の生体物質Ｍの特性を調べることもできる。
なお、分析装置８０は、本発明における蛍光緩和時定数を算出する処理部を形成し、コンピュータにより構成される。
【００３１】
生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数の算出は、バッファー液に懸濁する生体物質Ｍが測定点を通過するとき発する蛍光の第１の蛍光信号の変調信号に対する位相差情報と、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が発する蛍光の第２の蛍光信号の位相差情報とを用いて行われる。
上述したように、受光部２４で生成されるトリガ信号に基づいて計測を開始し、生体物質Ｍが測定点を通過する時間Ｔの２倍の時間２・Ｔの間計測を続ける。このため、計測開始から最初の時間Ｔまでは、バッファー液に懸濁する生体物質Ｍが測定点を通過するときの蛍光を検出し、時間Ｔ〜時間２・Ｔでは、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が発する蛍光を検出する。したがって、分析装置８０に供給されるｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号は、計測開始から最初の時間Ｔまでの蛍光の位相差情報、すなわち、バッファー液と生体物質Ｍとが発する蛍光の位相差情報と、時間Ｔ〜時間２・Ｔまでの蛍光の位相差情報、すなわちバッファー液が発する蛍光の位相差情報を含んでいる。
【００３２】
生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数の算出は、具体的には、コントローラ４４から供給された上述のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値をベクトル成分とする計測ベクトルを位相差情報を含むデータとして用いる。この計測ベクトルについて、バッファー液に懸濁する生体物質Ｍが測定点を通過するときの第１の蛍光信号の計測ベクトルをＰmsとし、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が蛍光を発するときの第２の蛍光信号の計測ベクトルをＰmbとし、生体物質Ｍの発する蛍光のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値からなる生体物質ＭのベクトルをＰsとしたとき、Ｐs＝Ｐms−Ｐmbで表される。図６には、計測ベクトルＰms，Ｐmbと、生体物質ＭのベクトルＰsとの関係を示している。図６に示す図は、横軸にレーザ光の変調信号のｃｏｓ成分（実数部）の値（振幅）を、縦軸にはｓｉｎ成分（虚数部）の値（振幅）を採って表している。すなわち、本発明における位相差情報は、変調信号と同相の信号成分（ｃｏｓ成分）の値と、変調信号に対して９０度位相差のある信号成分（ｓｉｎ成分）の値とにより構成されるデータとなっている。
【００３３】
実際、生体物質Ｍが測定点を通過するとき試料１２から発する蛍光は、生体物質Ｍが発する蛍光とバッファー液が発する蛍光を含む。このため、分析装置８０では、これらの蛍光が混在した状態で、受光部２６で蛍光か受光される。したがって、分析装置８０で得られる計測ベクトルＰmsは、生体物質Ｍが発する蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値と、バッファー液が発する蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値とが含まれる。このため、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が発する蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値からなる計測ベクトルＰmbを、計測ベクトルＰmsから差し引くことにより、生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsを算出することができる。すなわち、計測ベクトルＰmsのｃｏｓ成分の値,ｓｉｎ成分の値から計測ベクトルＰmbのｃｏｓ成分の値、ｓｉｎ成分の値を成分ごとに差し引くことにより、生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsを算出する。
【００３４】
生体物質Ｍの蛍光が弱い場合、背景成分となって生体物質Ｍの蛍光の蛍光信号に含まれるバッファー液の発する蛍光は無視できない。本実施形態では、生体物資Ｍが測定点を通過した直後の一定期間（時間Ｔ〜２・Ｔの期間）、例えば、生体物質Ｍが測定点を通過する時間Ｔと同じ時間の長さで、バッファー液の発する蛍光を計測することにより、上述のように、生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsを算出する。図７は、試料１２が発する蛍光の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図７中の領域Ｒ1は、生体物質Ｍが発する蛍光とバッファー液が発する蛍光とが混在する領域である。一方、領域Ｒ2は、バッファー液が発する蛍光のみが存在する領域である。このように、受光部２４から出力されるトリガ信号の生成を計測の開始のタイミングとして計測開始〜時間Ｔの間、領域Ｒ1の計測を行い、この直後、領域Ｒ2の計測を行う。なお、ベクトルＰsの算出は、光電変換器２７ａ〜２７ｃで得られた蛍光信号毎に行われる。
【００３５】
分析装置８０は、こうして求められた生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsから、蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求める、蛍光緩和時定数は、生体物質Ｍが測定点を通過するたびに供給される計測ベクトルＰms，Ｐmbを用いて算出される。このため、分析装置８０では、算出された蛍光緩和時定数の頻度を表すヒストグラムを作成し、蛍光緩和時定数を統計的に処理して、蛍光緩和時定数の平均値及び分散を求める。これにより、生体物質Ｍの発する蛍光を識別することができる。
【００３６】
なお、蛍光緩和時定数の算出方法は、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数に依存しており、例えば蛍光を１次緩和過程で表した場合、下記式に従って算出される。
τ  ＝  １／ω・ｔａｎθs
ここで、θsは、算出されたベクトルＰsの、ｃｏｓ成分の軸に対する傾斜角度（図６参照）であり、ωはレーザ光の変調信号の周波数であり、τは蛍光緩和時定数である。蛍光緩和時定数τは、レーザ光をパルス照射したときの初期蛍光強度をＩ0とすると、この時点から蛍光強度がＩ0／ｅ（ｅは自然対数の底、ｅ≒２．７１８２８）となる時点までの時間をいう。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
【００３７】
このようなフローサイトメータ１０の信号処理装置２０は、まず、コントローラ４４からの指示により、所定の周波数の変調信号を発信器４６に発生させ、この信号がアンプ５０により増幅されて、レーザ光源部２２及び信号処理部４２に供給される。
この状態で、試料１２が管路３０を流れ、フローが形成される。フローは、例えば１００μｍの流路径に１〜１０ｍ／秒の流速を有する。
測定点を通過する生体物質Ｍにレーザ光が照射されると、受光部２４で生体物質Ｍの通過を検出する検出信号がコントローラ４４にトリガ信号として出力される。
コントローラ４４では、この検出信号をトリガ信号とし、計測開始の指示信号を各部分に供給する。
【００３８】
レーザ光源部２２から出射したレーザ光は測定点において試料１２中の蛍光色素を励起させるために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が蛍光を発し、受光部２６にて受光される。レーザ光は、所定の周波数で強度が変調しているので、蛍光もこれに対応して蛍光強度が所定の周波数で変調している。
このようなレーザ光で照射されて発する蛍光色素からの蛍光は、レーザ光の強度を変調する変調信号に対して位相差の情報を持っている。
【００３９】
このとき、生体物質Ｍが測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、所定の周波数で振幅変調するレーザ光が生体物質Ｍに照射される。レーザ光の変調周波数は、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
生体物質Ｍが測定点を通過する計測開始〜時間Ｔの期間中、蛍光の計測、すなわち、図７に示す領域Ｒ1の計測が行われ第１の蛍光信号が得られ、時間Ｔの経過直後、さらに、時間Ｔの間、蛍光の別の計測、すなわち、図７に示す領域Ｒ2の計測が行われ第２の蛍光信号が得られる。
【００４０】
受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで受光されて出力される第１、第２の蛍光信号は、アンプ５４ａ〜５４ｃで増幅され、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃにより、信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号と合成される。
ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃでは、正弦波信号である変調信号（参照信号）と第１、第２の蛍光信号を乗算した合成信号が生成されるとともに、正弦波信号である変調信号（参照信号）に対して位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号を乗算して合成した信号が生成される。
次に、生成された２つの合成信号は、コントローラ４４のローパスフィルタ６２に送られ、高周波成分が除去されて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号が取り出される。
この蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号は増幅され、Ａ／Ｄ変換され、分析装置８０に送られる。Ａ／Ｄ変換は、受光部２４からのトリガ信号のタイミングで同期が取られ、サンプリングが行われる。
このような信号処理は、計測によって得られる蛍光信号が光電変換機２７ａ〜２７ｃから供給されるとオンタイムで行われ、分析装置８０へ信号処理後のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値が逐次供給される。
【００４１】
分析装置８０では、供給されたｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を逐次収集した後、このｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を用いて算出される領域Ｒ1の計測ベクトルＰmsの平均値と、領域Ｒ2の計測ベクトルＰmbの平均値の差分が求められ、生体物質ＭのベクトルＰmが求められる。分析装置８０では、さらに、このベクトルＰmを用いて、τ  ＝  １／ω・ｔａｎθsの式に従って蛍光緩和時定数τが求められる。
【００４２】
このように本実施形態では、生体物質Ｍが測定点を通過する時の蛍光を計測した直後に、バッファー液の発する蛍光も計測し、これらの計測結果の情報を用いて蛍光緩和時定数を算出する。これによって、生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数を正確に、かつ効率的に算出することができる。
なお、バッファー液の発する蛍光を計測する前に、バッファー液の蛍光の蛍光緩和時間を一度計測して分析装置８０に記憶保存し、生体物質Ｍの蛍光の蛍光緩和時間を算出するときに呼び出して用いる方法もある。
しかし、一定の期間に計測すべき試料１２が複数種類かつ多量にあり、しかも、バッファー液の種類が異なる場合、上記方法では迅速に対応できない。また、蛍光タンパク質を導入した細胞等が培地中に存在し、これを希釈して試料１２とする場合、希釈の度合いによって、試料１２中に含まれる培地の量が変化し、バッファー液が発する蛍光緩和時間も変化するため、上記方法では対応できない。さらに、生体物質１２がその生体活動によりバッファー液の成分も変化し、バッファー液の発する蛍光緩和時間も変化するため、上記方法では対応できない。
このような不都合を、本実施形態は解消し、迅速にかつ正確に蛍光緩和時定数を算出することができる。
【００４３】
なお、本実施形態においては、計測ベクトルＰms及びＰmbを求める方法は、信号処理部４２及びコントローラ４４における上述した処理方法の替わりに、レーザ光の変調信号を入力信号とし、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃから出力される処理信号を応答信号とする伝達関数の周波数スペクトルを周波数分析器を用いて求め、この周波数スペクトルにおける、実数部の値及び虚数部の値を求め、このときのＤＣ成分の実数部の値及び虚数部の値を計測ベクトルＰms,Ｐmbのベクトル成分とし、生体物質Ｍの発する蛍光のベクトルＰs＝Ｐms−Ｐmbを求めることにより、蛍光緩和時定数の算出することもできる。
【００４４】
以上、本発明の蛍光検出方法及び蛍光検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】本発明の蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。
【図３】本発明の蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。
【図４】本発明の蛍光検出装置に用いられる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。
【図５】図４に示す制御・処理部のＩＱミキサを説明する図である。
【図６】本発明の蛍光検出装置で行う蛍光緩和時定数の算出方法を説明する図である。
【図７】蛍光強度の時間的変化の概略の様子を示す図である。
【符号の説明】
【００４６】
１０  フローサイトメータ
１２  試料
２０  信号処理装置
２２  レーザ光源部
２２ｒ  Ｒ光源
２２ｇ  Ｇ光源
２２ｂ  Ｂ光源
２３ａ1，２３ａ2，２６ｂ1，２６ｂ2  ダイクロイックミラー
２３ｃ．２６ａ  レンズ系
２４，２６  受光部
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ３  バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ  光電センサ
２８  制御・処理部
３０  管路
３２  回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ  レーザドライバ
３５，４８，５６  パワースプリッタ
４０  信号生成部４０
４２  信号処理部
４４  コントローラ
４６  発信器
５０，５２，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４  アンプ
５８ａ，５８ｂ，５８ｃ  ＩＱミキサ
６２  ローパスフィルタ
６６  Ａ／Ｄ変換器
８０  分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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