(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FK706またはその医薬として許容される塩を有効成分とするしわの予防、治療剤。
【請求項２】
しわの予防、治療のための薬剤を製造するためのFK706またはその医薬として許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明はヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質を有効成分とする皮ふの老化の予防、治療剤に関するものである。
背景技術
皮ふの老化は30歳代から始まると言われている。皮ふの老化の所見としては、表面的には潤い、つや、なめらかさ、はり等の減少、さらに、しわの増加が挙げられる。これらは皮ふを構成している器官・組織の形態的および機能的変化に基づくものと考えられる。具体的には、加齢に伴い表皮では表皮厚の菲薄化等が、真皮では真皮乳頭部の弾性線維（oxytalan fiber）の消失等が認められる。
皮ふの老化、例えばしわはとくに女性の美容上の大きな問題であるが、現在未だ満足のいく薬剤は少ない。
この発明者は、ヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質が皮ふの老化の予防、治療に有効であるという新知見を得、この発明を完成した。
発明の開示
この発明は、ヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質を有効成分とする皮ふの老化の予防、治療剤である。
この発明の皮ふの老化の予防、治療剤において有効成分として使用できるヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質は、ヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質であればいずれでもよい。また、この発明で使用可能なヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質には、直接的な阻害のみならず、白血球の浸潤の抑制やエラスターゼ産生阻害により間接的に白血球エラスターゼ活性を阻害する物質も含まれる。すなわち、そのような活性を有する物質は種々知られているが、それら公知の物質を使用することができるのみならず、ヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有するものであれば、新規物質も使用可能である。これらのうち、特に好適な化合物を以下に例示する。
（１）WS7622Ａモノもしくはジ硫酸エステルおよびそれらの医薬として許容される塩類：それらのうち、WS7622Ａジ硫酸エステルの二ナトリウム塩およびWS7622Aジ硫酸エステルの二カリウム塩はそれぞれ下記の物理化学的性質を有する公知物質である（特開平４−279600号公報）。
WS7622Ａジ硫酸エステルの二ナトリウム塩（以下FR134043と略す場合がある。）：
外観：無色の結晶
0004320791.tif 000002
融点：257〜263℃（分解）
比旋光度：［α］23D+37.5°（C=1、メタノール）
分子式：Ｃ47Ｈ61Ｎ9Ｏ19Ｓ2Ｎａ2
元素分析：
計算値：（C47H61N9O19S2Na2・62Oとして）：
C 44.30，H 5.77，N 9.89，S 5.03，Na 3.61%
実測値：C 44.98，H 5.90，N 10.06，S 5.00，Na 3.98%
分子量：FAB−MS m/z 1188（M+Na）+
薄層クロマトグラフィー：
0004320791.tif 000003
赤外吸収スペクトル：
νKBrmax 3360，2960，1735，1660，1640，1530，1500，1380，1250，1200，1060，1030，940，890cm-1
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル：
（400MHz,D2O）δ
7.50         （1H,s）
7.27         （1H,s）
7.33-7.24    （3H,m）
6.94         （1H,q,J=7Hz）
6.85         （2H,br d,J=8Hz）
5.53         （1H,m）
5.37         （1H,m）
4.80         （1H,br s）
4.63-4.57    （2H,m）
4.53         （1H,m）
4.06         （1H,m）
3.99         （1H,d,J=10Hz）
3.56         （1H,br d,J=14Hz）
3.46         （1H,m）
2.97         （3H,s）
2.97-2.88    （2H,m）
2.72         （1H,m）
2.59         （1H,m）
2.51-2.38    （2H,m）
2.09-1.91    （4H,m）
1.82-1.60    （3H,m）
1.77         （3H,d,J=7Hz）
1.50         （3H,d,J=6.5Hz）
1.40         （1H,m）
1.11         （6H,d,J=7Hz）
0.99         （3H,d,J=6.5Hz）
0.97         （3H,d,J=6.5Hz）
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル：
（100MHz,D2O）δ
183.6        （s）
177.9        （s）
177.7        （s）
174.8        （s）
173.8        （s）
173.3        （s）
172.4        （s）
167.8        （s）
161.5        （s）
145.5        （s）
144.9        （s）
139.6        （d）
139.0        （s）
137.0        （s）
136.0        （s）
132.3        （d）×2
131.0        （d）×2
129.6        （d）
127.4        （d）
125.9        （d）
77.4         （d）
75.1         （d）
63.8         （d）
62.7         （d）
59.1         （d）
55.9         （d）
54.9         （d）
51.9         （d）
41.9         （t）
37.2         （d）
36.9         （t）
34.1         （q）
32.3         （d）
31.9         （t）
31.8         （t）
31.2         （t）
27.5         （t）
23.7         （t）
21.7         （q）
21.4         （q）×2
21.3         （q）
21.1         （q）
15.5         （q）
アミノ酸分析：
WS7622Ａジ硫酸エステルの二ナトリウム塩（１mg）を６規定塩酸（１m1）、110℃、20時間の条件で加水分解し、減圧乾固して得た混合物を日立835型自動車アミノ酸分析計により測定した。アミノ酸スタンダード標品として、和光純薬工業（株）のタイプＨ（和光コード013−08391）とタイプＢ（016−08641）を使用した。
その結果、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、オルニチン、アンモニアと数種の未知ニンヒドリン陽性成分が検出された。
WS7622Ａジ硫酸エステルの二ナトリウム塩の部分化学構造式として、次のような式が提案される。
0004320791.tif 000004
WS7622Ａジ硫酸エステルの二カリウム塩：
外観：無色無定形粉末
0004320791.tif 000005
融点：230〜237℃（分解）
比旋光度：［α］23D+34°（C=1、メタノール）
分子式：Ｃ47Ｈ61Ｎ9Ｏ19Ｓ2Ｋ2
元素分析：
計算値：（C47H61N9O19S2K2・６H2Oとして）：
C 43.21，H 5.63，N 9.65，S 4.91，K 5.99%
実測値：C 43.96，H 5.44，N 9.97，S 5.09，K 4.49%
分子量：FAB−MS m/z 1236（M+K）+
薄層クロマトグラフィー：
0004320791.tif 000006
赤外吸収スペクトル：
νKBrmax 3360，2960，1735，1660，1640，1530，1500，1405，1380，1250，1200，1050，1030，940，890cm-1
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル：
（400MHz,D2O）δ
7.52         （1H,s）
7.28         （1H,s）
7.34-7.25    （3H,m）
6.96         （1H,q,J=7Hz）
6.87         （2H,br d,J=8Hz）
5.56         （1H,m）
5.40         （1H,m）
4.84         （1H,br s）
4.70-4.55    （3H,m）
4.10         （1H,m）
4.03         （1H,m）
3.60         （1H,br d,J=14Hz）
3.50         （1H,m）
3.00         （3H,s）
3.00-2.85    （2H,m）
2.76         （1H,m）
2.62         （1H,m）
2.55-2.40    （2H,m）
2.12-1.95    （4H,m）
1.90-1.65    （3H,m）
1.79         （3H,d,J=7Hz）
1.53         （3H,d,J=6.5Hz）
1.45         （1H,m）
1.14         （6H,d,J=7Hz）
1.02         （3H,d,J=6.5Hz）
1.00         （3H,d,J=6.5Hz）
アミノ酸分析：
WS7622Ａジ硫酸エステルの二カリウム塩（１mg）を６規定塩酸（１ml）、110℃、20時間の条件で加水分解し、減圧乾固して得た混合物を日立835型自動アミノ酸分析計により測定した。アミノ酸スタンダード標品として、和光純薬工業（株）のタイプＨ（和光コード番号013-08391）とタイプＢ（016-08641）を使用した。
その結果、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、オルニチン、アンモニアと数種の未知のニンヒドリン陽性成分が検出された。
WS7622Ａジ硫酸エステルの二カリウム塩の部分化学構造式として、次のような式が提案される。
0004320791.tif 000007
WS7622Ａモノもしくはジ硫酸エステルの医薬として許容される塩としては、例えばアルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえばカルシウム塩など）、アンモニウム塩、エタノールアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ピリジン塩などの、無機塩基あるいは有機塩基とのモノもしくはジ塩を挙げることができる。
上記WS7622Ａモノもしくはジ硫酸エステルの合成のための出発物質であるWS7622Ａ物質もヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有し、しわの予防、治療剤として使用できる。該物質は次のような物理化学的性質を有する物質として知られている（特開平３−218387号公報、特開平４−279600号公報）。
WS7622Ａ物質の物理化学的性質：
外観：無色プリズム晶
物質の性質：酸性
0004320791.tif 000008
薄層クロマトグラフィー（TLC）：
クロロホルム−メタノール（５：１、ｖ／ｖ）
Rf値  0.51
アセトン−メタノール（10：１）      Rf値  0.62
（キーゼルゲル60Ｆ254シリカゲルプレート、メルク社）
融点：250〜252℃（分解）
比旋光度：［α］23D+36°（C=1、メタノール）
UVスペクトル：λMeOHmax 287nm（ε=3600）
λMeOH-HClmax 287nm
λMeOH-NaOHmax 298nm
分子式：Ｃ47Ｈ63Ｎ9Ｏ13
元素分析：
計算値：（C47H63N9O13・2H2O）：
C 56.56，H 6.77，N 12.63%
実測値：C 56.65，H 6.62，N 12.27%
分子量：FAB−MS m/z 984（M+Na）+
赤外吸収スペクトル：
νKBrmax 3400，3300，3060，2980，2940，1735，1710，1690，1670，1660，1640，1540，1520，1470，1380，1330，1300，1260，1220，1200，1160，1130，1090，1000，980，940，920cm-1
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル：
（400MHz,CD3OD）δ
7.22-7.09    （3H,m）
6.88-6.77    （3H,m）
6.74         （1H,s）
6.46         （1H,s）
5.46         （1H,m）
5.18         （1H,s）
4.85         （1H,s）
4.77         （1H,m）
4.65         （1H,m）
4.50         （1H,m）
3.96         （1H,m）
3.91         （1H,d,J=9Hz）
3.60-3.47    （2H,m）
3.03         （1H,m）
2.90         （3H,s）
2.86         （1H,m）
2.59-2.49    （2H,m）
2.39         （1H,m）
2.29-2.16    （2H,m）
2.00         （1H,m）
1.84        （1H,m）
1.74         （3H,d,J=6Hz）
1.72-1.53    （4H,m）
1.44         （3H,d,J=6Hz）
1.12         （1H,m）
1.10         （6H,d,J=6Hz）
0.99         （3H,d,J=6Hz）
0.94         （3H,d,J=6Hz）
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル：
（100MHz,CD3OD）δ
179.7        （s）
176.3        （s）
174.7        （s）
173.3        （s）
172.4        （s）
171.4        （s）
170.3        （s）
165.8        （s）
160.2        （s）
145.7        （s）
145.6        （s）
137.5        （s）
134.0        （d）
131.4        （s）
130.6        （d）×2
129.8        （s）
129.1        （d）×2
129.1        （s）
127.6        （d）
119.1        （d）
118.0        （d）
76.0         （d）
73.4         （d）
63.1         （d）
61.4         （d）
57.1         （d）
53.6         （d）
52.7         （d）
50.5         （d）
39.9         （t）
36.1         （t）
35.8         （d）
31.8         （q）
31.0         （t）
30.8         （d）
29.9         （t）
29.7         （t）
25.2         （t）
22.3         （t）
20.2         （q）
20.0         （q）×2
19.7         （q）
19.5         （q）
13.3         （q）
アミノ酸分析：
WS7622Ａ（１mg）を６規定塩酸（１ml）、110℃、20時間の条件で加水分解し、減圧乾固して得た混合物を日立835型自動アミノ酸分析計により測定した。アミノ酸スタンダード標品として、和光純薬工業（株）のタイプＨ（和光コード番号013-08391）とタイプＢ（016−08641）を使用した。
その結果、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、オルニチン、アンモニアと数種の未知ニンヒドリン陽性成分が検出された。
WS7622Ａの部分化学構造式として、次のような式が提案される：
0004320791.tif 000009
WS7622Ａ物質の塩としては、アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえば、カルシウム塩など）、アンモニウム塩、エタノールアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などの、無機塩基または有機塩基との塩が挙げられる。
同様にヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有するWS7622Ｂ、ＣおよびＤ物質、ならびにそれらの誘導体（特開平３−218387号公報）もしわの予防、治療剤として使用できる。
上記WS7622Ａ物質（WS7622Ｂ、ＣおよびＤ物質も同様）は例えばストレプトミセス・レシストミシフィクス（Streptomyces resistomycificus）No.7622株の培養によって製造することができ、該菌株はブダペスト条約に基く国際寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号FERM BP−2306の下に寄託されている。
（２）式：
0004320791.tif 000010
［式中、Ｒ1はカルボキシ、エステル化されたカルボキシおよびジ−低級アルキルカルバモイルから選ばれた１または２の置換基を有する低級アルキル基；フェニル部分にハロゲン、アミノまたはニトロ、アルキル部分にカルボキシまたはエステル化されたカルボキシを有していてもよいフェニル（低級）アルキル基；ハロフェニル基；モルホリノ基；またはモルホリノ（低級）アルキル基を、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ低級アルキル基を、Ｘは−または−NH−を、
0004320791.tif 000011
をそれぞれ意味する］で示されるトリフルオロメチルケトン誘導体およびその医薬として許容される塩。
（３）式：
0004320791.tif 000012
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は上記（２））の化合物と同じ意味）で示されるトリフルオロメチルケトン誘導体およびその医薬として許容される塩。
（４）３（RS）−［［４−（カルボキシメチルアミノカルボニル）フェニルカルボニル］−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル］アミノ−１,１,１−トリフルオロ−４−メチル−２−オキソペンタンまたはそのナトリウム塩（以下、このナトリウム塩をFK706と略す場合がある）
上記（２）〜（４）に記載の化合物は、例えば特開平４−297446号公報に記載されている公知化合物である。また、（２）〜（３）の化合物の医薬として許容される塩としては、アルカリ金属塩（たとえばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえばカルシウム塩など）、アンモニウム塩、エタノールアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などの無機または有機塩基との塩およびメタンスルホン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩などの有機または無機酸付加塩を挙げることができる。
前記定義の好適な例を以下に詳細に説明する。「低級」とは、特記ない限り、炭素原子数１ないし６を意味する。好適な「ハロゲン」の例としては弗素、塩素、臭素および沃素が挙げられる。好適な「低級アルキル基」としては、炭素原子１ないし６個を有する直鎖および分枝アルカンの残基、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなど、好ましくは炭素原子１ないし４個を有するものを挙げることができる。好適な「エステル化されたカルボキシ基」としては、アルキルエステル、すなわち、アルコキシカルボニル、たとえば低級アルコキシカルボニル（たとえばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニルなど）およびフェニル（低級）アルキルエステル、すなわち、フェニル（低級）アルコキシカルボニル、たとえばベンジルオキシカルボニル、ならびにベンゾイル（低級）アルキルエステル、すなわち、ベンゾイル（低級）アルコキシカルボニル、たとえばベンゾイルメトキシカルボニルなどを挙げることができる。
好適な「低級アルキレン基」としては、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレンなどを挙げることができる。好適な「ジ低級アルキルカルバモイル基」としては、Ｎ,Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジエチルカルバモイルなどを挙げることができる。
（５）下記の物理化学的性質を有するFR901451物質およびその医薬として許容される塩：
外観：白色粉末
0004320791.tif 000013
融点：243〜245℃（分解）
比旋光度：［α］23D-15°（C=0.65，H2O）
紫外線吸収スペクトル：λMeOHmax nm（ε）275（4300），281（4500），290（3900）
分子式：Ｃ60Ｈ79Ｎ13Ｏ18
元素分析：C60H79N13O18・10H2Oとしての
計算値：C 49.68，H 6.88，N 12.55
実測値：C 49.95，H 6.28，N 12.42
分子量：FAB−MS m/z 1270（M+H）+
薄層クロマトグラフィー：
0004320791.tif 000014
FT赤外線吸収スペクトル：
νKBrmax 3390，3070，2970，2880，1740，1660，1530，1450，1410，1380，1350，1250，1190，1110，1080，1010，750，700，670，660，620，600cm-1
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル：
（400MHz,D2O）δ
7.70         （1H,d,J=7Hz）
7.52         （1H,d,J=7.5Hz）
7.44-7.23    （7H,m）
7.22         （1H,s）
5.59         （1H,q,J=7Hz）
4.94         （1H,t,J=4.5Hz）
4.85-4.74    （3H,m）
4.58         （1H,dd,J=6Hz，10Hz）
4.45-4.35    （3H,m）
4.30         （1H,dd,J=4Hz，7Hz）
4.07         （1H,m）
3.99         （1H,dd,J=10Hz，4.5Hz）
3.66-3.50    （3H,m）
3.44-3.25    （4H,m）
3.16-2.93    （4H,m）
2.87         （1H,d,J=18Hz）
2.80-2.68    （2H,m）
2.56-2.48    （2H,m）
2.08         （1H,dd,J=16Hz，4Hz）
1.87-1.53    （9H,m）
1.43         （3H,d,J=7Hz）
1.30         （3H,d,J=6.5Hz）
1.45-1.17    （4H,m）
0.95         （3H,d,J=6Hz）
0.84         （3H,d,J=6Hz）
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル：
（100MHz.D2O）δ
177.2（s）  130.0（d）×2  56.0（d）  31.4（t）
176.5（s）  129.8（d）×2  54.1（d）  28.8（t）
174.6（s）  128.5（d）     53.8（d）  26.6（t）
174.2（s）  127.8（s）     53.2（d）  25.1（d）
174.0（s）  125.5（d）     53.1（d）  23.2（q）
173.2（s）  123.2（d）     52.9（d）  23.2（t）
173.0（s）  120.9（d）     52.8（d）  23.1（t）
172.8（s）  118.7（d）     49.5（d）  20.8（q）
172.6（s）  113.1（d）     48.6（t）  19.4（q）
172.5（s）  108.8（s）     40.1（t）  18.3（q）
172.1（s）  73.3 （d）     39.6（t）
171.7（s）  69.7 （d）     39.4（t）
171.4（s）  64.3 （t）     38.9（t）
170.3（s）  62.1 （d）     35.3（t）
137.2（s）  60.9 （d）     34.8（t）
136.0（s）  57.1 （d）     31.7（t）
上記FR901451物質はフレキシバクター（Flexibacter）属のFR901451物質生産菌が生産する物質として知られている（例えば、国際公開番号：WO93／02203号公報）。また該生産菌の１株フレキシバクター・spNo.758株はブダペスト条約に基く国際寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号FERMBP−3420として寄託されている。
また、上記FR901451物質の医薬として許容される塩としては、前記（２）〜（３）に記載の化合物の医薬として許容される塩として例示した塩がそのまま例示される。
上記のほか、エラスターゼ阻害活性を有する物質の例として、α１−アンチトリプシン、SLP１（Secretory Leukocyte Protease Inhibitor）（American Review of Respiratory Diease Vol.147、1993、Ｐ442-446）、ウリナスタチン、コルヒチン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ICI200、880、ONO−5046（American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol.153、Ｐ391−397）、抗エラスターゼ抗体等が挙げられる。
この発明においては、皮ふの老化全般の予防、治療に対してヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質が有効であり、適用可能である。具体的には、皮ふの潤い、つや、なめらかさ、はり等の減少、さらには、しわの増加の予防、治療、皮ふのたるみの予防、治療に適用可能である。これらの皮ふの老化現象は皮ふを構成している器官・組織の形態および機能的変化に基づくものと考えられ、具体的には、加齢に伴い表皮では表皮厚の菲薄化等が、真皮では真皮乳頭部の弾性線維（oxytalan fiber）の消失等が認められる。
これら皮ふの老化のうち、とくにしわの消失、減少、あるいはしわの増加の予防、治療、皮ふのテクスチャー（きめ、手触り）の改善、皮ふ色調（くすみ）の改善等にヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質の効果が顕著である。
また、真皮乳頭部の弾性線維の新生、表皮直下の真皮部位での微細な膠原線維の新生、表皮厚の増加等において顕著な効果がある。
このほか、ヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質は、強皮症、象皮病、はんこん、ステロイドによる表皮のひはく化、ケロイド、じょくそう、創傷、難治性かいよう、乾癬、しみ、そばかす、老人斑、はだあれ、はたけ等の皮ふ疾患にも有効である。
次のこの発明の試験例を示す。
実験目的：好中球エラスターゼ阻害剤の「皮ふの老化」に対する治療効果をヘアレス犬を用いて評価する。
使用動物：メキシカンヘアレスドッグとビーグル犬の交配によって作出された実験用ヘアレス犬の成犬（老齢犬）２頭を使用。
若齢犬には認められない、加齢に伴う微細な「しわ」の形成が体表面に見られる老齢犬を対象とした。
No.8807（10歳、雄）
No.8808（10歳、雌）
被検薬剤：1）FK706・0.2％
2）FK706・0.02％
3）FR134043・0.2％
4）FR134043・0.02％
5）ポリエチレングリコール（PEG）（溶媒、コントロール）（１〜４の薬剤の溶媒はPEG）
薬剤投与：各犬の背部（５×５cm）に各薬剤を１個所ずつ（計５個所）塗布
塗布量は約４μL／cm2とし、一日一回（土、日、祝日は除く）３ケ月塗布。
評価項目：1）皮膚性状：肉眼観察及びビデオマクロスコープによる観察
2）組織学的検査：Ｈ−Ｅ（ヘマトキシリン−エオジン）染色（一般的染色）、ワンギーソン染色（コラーゲン線維の染色）、ワイゲルト染色（エラスチン線維の染色）による生検サンプルを用いた組織学的変化の観察
3）表皮の厚さ：Ｈ−Ｅ染色組織標本を用いた表皮の厚さ（角質層を除く）の変化を検討（特に皮膚症状の改善が顕著であったFK706 0.2％塗布部位のみ検討）
試験結果：
1）皮膚性状（しわの改善、緩和）
（肉眼観察）
No.8807：FK706・0.2%>FK706・0.02%>FR134043・0.2%=FR134043・0.02%の順で、しわの消失、減少が認められた。また、この所見はtexture（きめ、手触り）の改善を伴い、さらに皮膚の美白化（白色・淡紅色化する等）も伴っていた。
No.8808：FK706・0.2%>FK706・0.02%>FR134043・0.2%=FR134043・0.02%の順であった。
なお、いずれの犬においても副作用は認められなかった。
（ビデオマクロスコープによる観察）
肉眼所見とほぼ同様の結果が認められた。
No.8807：FK706・0.2%>FK706・0.02%>FR134043・0.2%>FR134043・0.02%の順に効果があった。
No.8808：FK706・0.2%=FK706・0.02%>FR134043・0.2%=FR134043・0.02%の順であった。
2）組織学的所見
ワンギーソン染色：FK706・0.2％塗布例に、表皮と真皮の境界部に層状の薄いコラーゲン線維の新生像が観察された（8807の犬）。
ワイゲルト染色：FK706・0.2％に表皮と真皮の境界部に微細なエラスチン線維（加齢と共に消失すると言われるoxytalan fiberと考えられる）の増殖像が認められた（8807の犬）。
3）表皮厚の検討
有意な表皮厚の増加が認められた（8807，8808の犬、共にｐ＜0.05）。
8807：17.0±1.9μm→26.8±5.9μm（平均値±SD）
8808：24.6±3.6μm→42.0±9.0μm
この発明の皮ふの老化の予防、治療剤は、通常は外用剤（例えば、ローション剤、軟膏剤、貼付剤、リニメント剤、エアゾール剤、懸濁剤、乳剤等）、外用の散剤（例えば、酵素洗顔剤）として使用されるが、このほか散剤、細顆粒剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠、注射剤、吸入剤、マイクロカプセル剤、カプセル剤、坐剤、液剤、シロップなどの慣用の医薬製剤の形で使用可能であり、すらには洗顔剤、メイク落とし（浸潤剤）、入浴剤としても使用可能である。必要な場合、希釈剤または崩解剤（たとえば庶糖、乳糖、澱粉、結晶性セルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、合成ケイ酸アルミニウムなど）、結合剤（たとえばセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコールなど）、着色剤、甘味剤、滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウムなど）その他を分散配合することができる。
この発明の皮ふの老化の予防、治療剤の使用量は、使用化合物、症状等にもよるが、一般に、外用剤においてはヒト白血球エラスターゼ阻害活性を有する物質またはその医薬として許容される塩として0.001〜20％程度、好ましくは0.01〜10％程度の範囲で使用するのが適当である。