(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生菌チーズを製造するための方法であって、ヒト胃腸管から単離された、非病原性で、酸および胆汁耐性であり、そしてヒト上皮細胞に接着する、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）株の０．０５−０．５％接種原を、スターター補助物（ａｄｊｕｎｃｔ）としてチーズ乳に添加する、ここで前記Ｌ．パラカゼイ株は、熟成期中、１０7  ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上のレベルに増殖することが可能である、ことを含む前記方法。
【請求項２】
Ｌ．パラカゼイの０．１−０．２５％接種原をチーズ乳に添加する、請求項１の方法。
【請求項３】
熟成期が少なくとも６か月である、請求項１または２の方法。
【請求項４】
熟成期が８か月またはそれ以上である、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｌ．パラカゼイが、熟成期中に、１０8  ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上のレベルに増殖することが可能である、請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Ｌ．パラカゼイが、３７℃またはそれ以上の温度に耐性である、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
Ｌ．パラカゼイを数えること及び常住菌叢から区別することが可能である、請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
各株ごとのＤＮＡフィンガープリントを行うことを可能にする無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法により、添加したＬ．パラカゼイを数えて、常住菌叢から区別する、請求項７の方法。
【請求項９】
製造されるチーズが、固いチーズである、請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
チーズがチェダーチーズである、請求項９の方法。
【請求項１１】
ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ  ３３８あるいはその突然変異体または変異体（ｖａｒｉａｎｔ）。
【請求項１２】
ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ  ３６４あるいはその突然変異体または変異体。
【請求項１３】
請求項１−１２いずれか１項記載の、生存可能な、活発に増殖しているＬ．パラカゼイ株を、前記Ｌ．パラカゼイをスターター補助物として使用し、製造した後、１０7  ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上の量、含む、生菌チーズ。
【請求項１４】
チェダーチーズである、請求項１３の生菌チーズ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、生菌チーズの製造、および特に、消費時に、生存可能な、活発に増殖している添加細菌株を含む、生菌チーズの製造に関する。
【０００２】
背景技術
健康およびよい生活状態を維持するため、生菌含有製品の重要性が、消費者の選択に影響を及ぼす重要な因子となってきている結果、それらの提唱される健康特性を利用する商業的関心が増加しているのに加え、こうした製品のための市場が迅速に成長しそして拡大してきている。すでに市場にある生菌食品の大多数、例えば発酵乳およびヨーグルトは、新鮮な製品であり、そして一般的に製造後数日または数週間で消費される。対照的に、固いチーズ、例えばチェダーは、２年までの長い熟成時間を有する。
【０００３】
生菌細菌は、「生きている」微生物と記載され、ある数で摂取されると、固有の基本栄養以上に、健康上の利益を発揮する。生菌は、食品構成要素または非食品調製どちらで消費されてもよい。こうした細菌を含む食品は、「機能する食品」のカテゴリーに属し、そしてこれらは「健康に陽性の影響を有すると主張される食品」と記載される。こうした製品は、先進世界中により広い人気を得て、そして認められてきており、そして既に日本および米国でよく認められている。さらに、生菌の提唱される健康特性を利用する商業的関心が増加していることは、市場のこの部門の迅速な成長および拡大に、重要な点で、寄与してきている。
【０００４】
生菌生物、例えばラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．を取り込む乳製品の潜在的な健康促進効果は、近年の主な研究努力を刺激してきている。今日まで、これらの培養の最も一般的な食品搬送系は、新鮮な発酵乳製品、例えばヨーグルトおよび発酵乳と共に、培養を添加した非発酵乳であった。
【０００５】
現在、市場に少数の「生菌チーズ」があるものの、生菌生物のキャリアーとしてのチーズに関する報告は比較的少ない。
【０００６】
１９９４年、ＤｉｎａｋａｒおよびＭｉｓｔｒｙ（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  ７７：２８５４−２８６４）は、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）を、スターター補助物（ａｄｊｕｎｃｔ）として、チェダーチーズに取り込んだ。本株は、チーズ中でよく生存し、そして熟成６か月であっても、チーズの風味（ｆｌａｖｏｕｒ）、きめ（ｔｅｘｔｕｒｅ）または外見に不都合な影響を与えず、およそ２  ｘ  １０7  ｃｆｕ／ｇの生存能力を維持した。この例により、チェダーが、長い期間に渡り、高レベルで生菌生物を維持するのに適した環境を提供することが可能であることが示唆される。しかし、熟成期間中、チーズ中でビフィズス菌の増殖は観察されず、そしてしたがって、ビフィドバクテリウム株は、製造および／または熟成中、増殖せず、そしてしたがって、比較的高い接種原で、添加しなければならないことを強調することが重要である。別の研究では、ビフィドバクテリウムを、Ｌｂ．アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株Ｋｉと組み合わせ、ゴーダチーズ製造のスターターとして用いた（Ｇｏｍｅｓ，  Ａ．Ｍ．Ｐ．ら（１９９５）；Ｎｅｔｈ．  Ｍｉｌｋ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．  ４９：７１−９５）。２つの株を単独のスターターとして用いると、両株とも、比較的大量の接種原（３％）を要し、そしてチーズ製造技術を適応させる必要があった。この場合、おそらくビフィドバクテリウムによる酢酸産生のため、熟成９週間後、生じた製品のチーズの風味に重大な影響があった。
【０００７】
生菌効果を発揮するため、培養は消費時まで、食品製品中で生存能力を維持しなければならない。これは、チェダーチーズでは、製造後何か月も後である。
【０００８】
チーズは、乳漿タンパク質／カゼイン比が、牛乳のものを上回らず、そしてレンネットの作用により牛乳を凝集させた後、乳漿排出により得られる、乳製品である。乳酸菌を含むスターター培養が、チーズ作成中、ラクトースを代謝するのに、まず必要とされ、それにより酢酸が生じ、そしてｐＨが減少する。例えば、チェダーチーズ製造中、スターターラクトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）が増殖し、塩処理時には、およそ１０9ないし１０10  ｃｆｕ／ｇの最大レベルに達する。しかし、チーズ中の条件、例えば水分中の高い塩（Ｓ／Ｍ）、低いｐＨ、発酵可能炭水化物の欠如および熟成の低温は、熟成の早い週のうちに、スターター数を劇的に減少させる結果につながる可能性がある。減少の速度は、株のいくつかの特性に依存し、これには、自己溶解特性、塩耐性およびファージ抵抗性が含まれる。同時に、非スターター乳酸菌（ＮＳＬＡＢ）と称される、主にラクトバチルス（Ｌｂ．  プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、カゼイ（ｃａｓｅｉ）およびブレビス（ｂｒｅｖｉｓ））およびペジオコッカス（ペジオコッカス・ペントサケウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ））からなる非病原性生物集団が、一般的に２−１６℃で行われる過程である、チーズ熟成につれ、増殖する。ＮＳＬＡＢは、製造段階中、チーズ乳に入り込むかまたは、減弱状態で低温殺菌を生き抜くと考えられる。にもかかわらず、その数は迅速に増加し、熟成チェダーチーズ中で１０7ないし１０8  ｃｆｕ／ｇの最大レベルに達する。実際、熟成チーズにおいて、ＮＳＬＡＢは、主な菌叢として存在する可能性がある。チーズの品質を決定する際のその役割は不明なままである。ＮＳＬＡＢは、一般的に、Ｒｏｇｏｓａまたはラクトバチルス選択（ＬＢＳ）寒天上での好気性プレート計数を用い、数えられる。
【０００９】
消費時に生菌製品に最終的に必要とされるものに対応する量で、チーズに生菌株を添加するのは、費用効率が高くない可能性がある。むしろ、必要とされるのは、スターター補助物として、低い接種原でチーズに添加することが可能であり、そしておよそ＞１０7  ｃｆｕ／ｇの必要とされる値に増殖する、生菌株である。
【００１０】
したがって、チェダーなどの長い熟成時間を持つ生菌チーズに必要とされるのは、製造および熟成期間中、生存しそして増殖することが可能な生菌株である。
【００１１】
発明の開示
本発明は、生菌チーズを製造するための方法であって、ヒト胃腸管から単離された、非病原性で、酸および胆汁耐性であり、そしてヒト上皮細胞に接着する、ラクトバチルス・パラカゼイ株の０．０５−０．５％接種原を、スターター補助物としてチーズ乳に添加する、ここで前記Ｌ．パラカゼイ株は、熟成期中、１０7  ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上のレベルに増殖することが可能である、ことを含む前記方法を提供する。
【００１２】
我々は、前記のＬ．パラカゼイ株が、チーズ製造過程を生き抜く能力および熟成／貯蔵期間中、増殖しそして生き抜く能力を有することを発見した。本発明の方法に用いられるＬ．パラカゼイ株はまた、以下に示されるように、胃腸管通過を生き抜く能力も有する。添加されたＬ．パラカゼイ株の存在は、チーズ組成、風味および香りに対し無視できる影響しか持たないことが見出されてきている。
【００１３】
好ましくは、チーズ乳に、Ｌ．パラカゼイの０．１−０．２５％接種原を添加する。
やはり好ましくは、熟成期は少なくとも６か月である。
さらに好ましくは、熟成期は８か月またはそれ以上である。
【００１４】
本発明の方法に用いられるＬ．パラカゼイ株は、本明細書に記載されるように、低接種原で添加された際、チーズ中で、熟成８か月に渡り、高い細胞数に増殖することが見出されてきている。
【００１５】
したがって、本発明の１つの態様において、Ｌ．パラカゼイは、熟成期中、１０8  ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上のレベルに増殖することが可能である。
【００１６】
好ましくは、Ｌ．パラカゼイは、３７℃またはそれ以上の温度に耐性である。
やはり好ましくは、Ｌ．パラカゼイは、数えることが可能であり、そして常住菌叢から区別することが可能である。
【００１７】
より好ましくは、添加Ｌ．パラカゼイ細胞を、各株に関し、はっきり区別されるＤＮＡフィンガープリントを生成することを可能にする無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法により、数えそして区別する。
【００１８】
用いられるＲＡＰＤは、チーズの天然菌叢により生じるものから、明らかに区別することが可能な、各株に関する、はっきり区別されるＤＮＡフィンガープリントの生成を可能にする。
【００１９】
好ましくは、製造されるチーズは固いチーズである。
特に好ましい態様において、チーズはチェダーチーズである。
【００２０】
チェダーチーズは、本明細書に記載されるように、生菌微生物のキャリアーとして、特に利点を有する。チェダーチーズは、より伝統的な生菌食品（例えばヨーグルトおよび発酵乳）よりも高いｐＨを有し、長期の生存を維持する、より安定した環境を提供する。さらに、該チーズのマトリックスおよびその比較的高い脂肪含有量は、胃腸管（ＧＩＴ）通過中、生菌細菌に対する保護を提供する。
【００２１】
本発明と一致して用いられるＬ．パラカゼイ株は、実施例に記載されるような、研究目的のためのいくつかの他の株と共に、制限される材料移送合意（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）下に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃｏｒｋから得た。
【００２２】
Ｌ．パラカゼイ株は、チーズ製造で使用するのに必要とされる特性を有することが見出されたが、例えば、調べたラクトバチルス・サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）株は、熟成期間中に死んだ。
【００２３】
本明細書において用いるＬ．パラカゼイ株は、チーズおよびＧＩＴ両方の微小菌叢に影響を与えるのに必要な能力、乳製品に基づく培地、例えば乳漿およびファージ阻害性培地中で増殖する培養能力、並びにチーズ製品の製造中および貯蔵寿命中、生存しおよび／または増殖する培養能力を有する。
【００２４】
本発明はまた、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ  ３３８も提供する。
【００２５】
また、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ  ３６４も提供する。
【００２６】
これらの細菌の試料は、１９９８年５月２９日、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＮＣＩＭＢ）に寄託されており、そしてそれぞれ寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４０９５４およびＮＣＩＭＢ  ４０９５５を与えられている。
【００２７】
本発明のさらなる態様において、先に定義されるような、生存可能な、活発に増殖しているＬ．パラカゼイ株を、前記Ｌ．パラカゼイをスターター補助物として使用し、製造した後、１０7  ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上の量、含む、消費準備の整った生菌チーズが提供される。
特に好ましいチーズは、チェダーチーズである。
【００２８】
生菌チェダーチーズは、本発明に一致し、高レベルのＬ．パラカゼイ株（１０8  ｃｆｕ／ｇチーズ）を、製造者に比較的低い費用で、そして同一の製造法を用い、製造することが可能である。重要なことに、我々は、これらの株の取り込みは、香り、風味およびきめを含む、チーズの品質に対し、陰性の影響を与えないことを示してきている。さらに、我々の結果により、チーズはまた、製品の明らかな年齢相違にも関わらず、ＧＩＴに対する生存細胞の搬送に関し、ヨーグルトに比べ好ましいことも示唆される。
【００２９】
【実施例】
本発明は以下の実施例により、さらに例示されるであろう：
【００３０】
実施例１
生菌株同定／計数
添加生菌株をうまく計数するための必要条件は、食品製品に見られる、天然の、しばしば複雑な微小菌叢からこれらを選択的に同定することが可能なことである。ＮＳＬＡＢは、熟成中、チーズ中で１０7−１０8  ｃｆｕ／ｇまでのレベルに達する可能性があるため、これらのＮＳＬＡＢからスターター補助物として添加するラクトバチルスを選択的に計数することを目的とするいくつかの方法を評価する必要があった。
【００３１】
本実施例に用いられる生菌ラクトバチルス株は、ヒト胃腸管から以前単離されており、そしてアイルランド、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃｏｒｋ、微生物学部のＪ．Ｋ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ教授から、前述の材料移送合意下に得た。これらの株は、総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、Ｌ．サリバリウス（ｓｓｐ．サリバリウス）およびＬ．パラカゼイ（ｓｓｐ．パラカゼイ）と同定され（Ｒｅｕｔｅｒ，  Ｇ．（１９９０）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ９：１０７−１１８）、そしてＬｂ．サリバリウスＮＦＢＣ  ３１０、ＮＦＢＣ  ３２１およびＮＦＢＣ  ３４８並びにＬ．パラカゼイＮＦＢＣ  ３３８およびＮＦＢＣ  ３６４と命名された。８週齢の商業的なチェダーチーズから以前得た、ＮＳＬＡＢラクトバチルス株（Ｌｂ．クルバトゥス（ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＤＰＣ  ２０４２および２０８１、Ｌ．プランタルムＤＰＣ  ２１０２および２１４２並びにＬ．カゼイｓｓｐ．カゼイＤＰＣ  ２０４７および２１０３）は、乳製品研究センターの培養コレクションから得た。すべてのラクトバチルス株は、日常的に、嫌気性条件下（‘Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ  Ａ’ガスパック；Ｍｅｒｃｋ、ドイツ・ダルムシュタットを備えた嫌気性ビン）で、ＭＲＳブロス（Ｄｉｎａｋａｒ，  Ｐ．およびＶ．Ｖ．  Ｍｉｓｔｒｙ（１９９４））（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ミシガン州デトロイト）中で、ＮＳＬＡＢおよび生菌株それぞれに対し、３０℃および３７℃で培養した。固形培地は、ブロス培地に１．５％寒天を添加することにより調製した。ストック培養は、４０％グリセロール補足ＭＲＳブロス中で、−８０℃で維持した。各培養は、ストックから使用する前にＭＲＳブロス中で、２回継代培養した。Ｃｈｒ．  Ｈａｎｓｅｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（アイルランド・コーク・リトルアイランド）から、凍結乾燥ペレットの形で得た、ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｓｓｐ．クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）株２２７および２２３を、チーズ製造のためのスターターとして用いた。これらは、熱処理（９０℃で３０分）１０％（ｗ／ｖ）還元脱脂粉乳（ＲＳＭ）中で２１℃で一晩増殖させた。
【００３２】
チーズの細菌学的解析
接種チーズ乳および熟成中のチーズにおけるラクトバチルス（生菌補助物およびＮＳＬＡＢ両方）の生存能力を、３０℃での嫌気性インキュベーション５日後、ＬＢＳ寒天上で測定する一方、スターターラクトコッカスを、３０℃でのインキュベーション３日後、ＬＭ１７寒天上で計数した。チーズ乳およびチーズ中の腸内細菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ）は、バイオレット・レッド胆汁寒天（ＶＲＢＡ；Ｏｘｏｉｄ）上で、３７℃で２４時間計数した。チーズは、熟成中、間隔を置いて、細菌学的解析のため、二つ組で無菌的に試料を採取した。チーズ試料を無菌２％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム中で乳化し、最大回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）希釈に希釈し、そして適切な希釈を蒔いた。１、３および６か月後間隔で、各チーズ由来の２０の個々のラクトバチルスコロニーをＲＡＰＤ−ＰＣＲ解析のため、ＬＢＳ寒天プレートから無作為に選択した。
【００３３】
ａ）ラクトバチルス補助物の胆汁および温度耐性
生菌およびＮＳＬＡＢラクトバチルス単離体両方の胆汁に対する耐性を調べるため、各ラクトバチルス株のＭＲＳブロス一晩培養を、最大回復希釈に連続希釈し（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．、英国ハンプシャー・ベイシングストーク）、そして適切な希釈を０、０．１、０．３、０．５、１．０または３．０％ブタ胆汁（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、英国ドーセット・プール）と共にＭＲＳ寒天上に蒔いた。インキュベーション３日後、プレートを調べ、そしてコロニーが存在する場所、その数および大きさを記録した。生菌ラクトバチルスの温度耐性を、適切な希釈の一晩培養をＬＢＳ寒天（Ｂｅｃｈｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国メリーランド州コッキースビル）上に蒔き（Ｒｏｇｏｓａ，  Ｍ．ら（１９５１）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ６２：１３２−１３３）、そしてプレートを嫌気的にどちらも３７℃（これらの株の増殖の最適温度）および４２℃でインキュベーションすることにより、調べた。５日後に得られたコロニー数を比較した。同じ方法で、チェダーチーズから単離した後の、これらの株およびＮＳＬＡＢの温度耐性もまた、調べた。
【００３４】
ヒト由来ラクトバチルスおよび選択したＮＳＬＡＢ両方の胆汁および温度耐性は、まず、これらのパラメーターのどちらかが製品から補助物を選択するための基本を成すことが可能であることを期待し、測定した。生菌補助物およびＮＳＬＡＢラクトバチルス株両方は、その胆汁耐性に関し、かなり異なった。０．３％胆汁で阻害される、スターター補助物として添加されたラクトバチルスに比べ、本実施例に用いた２つのＮＳＬＡＢ単離体は、３％までのレベルでブタ胆汁に耐性であった。したがって、胆汁耐性に基づく選択は、本実施例において、チェダーチーズに取り込まれた生菌補助物ラクトバチルスを、ＮＳＬＡＢラクトバチルスから区別するのに有用ではないであろう。同様に、温度耐性は、ＮＳＬＡＢからの生菌ラクトバチルスの選択の基本として用いることは不可能であった。アイリッシュチェダーチーズから単離されるＮＳＬＡＢは、４５℃で増殖しないが、いくつかのヒト由来生菌ラクトバチルスは、こうした温度に抵抗することが可能である（Ｋａｎｄｌｅｒ，  Ｏ．およびＷｅｉｓｓ，  Ｎ．（１９８９）Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ（監修），  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，中，  Ｖｏｌ．２．  Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏ．、メリーランド州バルティモア）。４２℃の温度を、ＮＳＬＡＢからの生菌株の選択的計数に関し評価した。新鮮な培養または熟成初期のチェダーチーズから単離した生菌ラクトバチルス株は、４２℃で増殖することが可能であったが、熟成チーズから単離した場合、この温度で増殖することができなかった。さらに、いくつかのＮＳＬＡＢラクトバチルスは、４２℃で増殖することが可能であることが見出され、この方法が、チェダーチーズからのヒト由来生菌ラクトバチルス株に関し、非選択性であることが確認された。
【００３５】
ｂ）ＲＡＰＤ−ＰＣＲ解析
各生菌ラクトバチルス株に対し、そしてチェダーチーズから単離されたラクトバチルスコロニーから増殖させた培養に対し、ＲＡＰＤ−ＰＣＲ解析を行った。ＨｏｆｆｍａｎおよびＷｉｎｓｔｏｎの方法（Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｃ．Ｓ．およびＷｉｎｓｔｏｎ，  Ｆ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  ５７：２６７−２７２）の修飾法を用い、１．５  ｍｌのＭＲＳブロス一晩培養から、ゲノムＤＮＡを単離した。本方法は、細胞を溶解するため、ガラスビーズでの剪断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）を利用し、そしてＣｏａｋｌｅｙら（Ｃｏａｋｌｅｙ，  Ｍ．ら（１９９６）；Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  １０２：３４４−３５４）に略述されるように修飾した。続くＰＣＲ増幅で、抽出ＤＮＡ１マイクロリットルを用い、該増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（米国コネチカット州ノーウォーク）ＤＮＡ熱サイクル装置中で２５μｌの総体積で行った。使用した方法は、本質的にＣｏａｋｌｅｙら（（１９９６）上記）に記載される通りであり、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（スウェーデン・ウプサラ）から得た、任意のヌクレオチド配列（５’ＡＴＧＴＡＡＣＧＣＣ３’）の単一のプライマーを用いた。以下の温度プロフィールを用い、ＤＮＡを３５サイクル増幅した：９３℃で１分間変性、３６度で１分間アニーリングした後、７２℃で１分間重合。最初の変性段階中、反応混合物にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．６２５単位、Ｂｉｏｌｉｎｅ）を添加した（ホットスタート）。５および１０μｌの間のＰＣＲ反応物を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｓｉｇｍａ）ゲル上で、エチジウムブロミド染色と共に解析した。分子量標準として１００  ｂｐラダー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。ゲルをおよそ３時間、１００Ｖで泳動し、そして紫外線透照（ＵＶ  ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）により、ＤＮＡを視覚化した。
【００３６】
その結果、任意のプライマーを用いたＰＣＲを伴う、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法を用い、各生菌株に関し、ＤＮＡフィンガープリントを生成した。各ラクトバチルス株は、再現可能な、はっきり区別されるＤＮＡフィンガープリントを生じ、これらは、それぞれのＮＳＬＡＢラクトバチルスのものとは実質的に異なることが見出された。したがって、ＲＡＰＤ法は、生菌株をうまく同定する手段であることが証明され、そしてチェダーチーズ中のＮＳＬＡＢ菌叢から株を選択的に同定する手段である可能性があることが立証された。
【００３７】
実施例２
チェダーチーズへのラクトバチルス種の取り込み
各チーズおけ中で、まず２５  Ｌの低温殺菌全乳を用い、実験室規模のチーズ製造試験（試験１および２）を行った。野生のラクトバチルスの混入を制限するため、これらのチーズは、ＭｃＳｗｅｅｎｅｙ，  Ｐ．ら（（１９９４）；Ｉｒｉｓｈ  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．  ３３：１８３−１９２）により記載されるように、調節された細菌学的条件下で製造した。１．５％接種原の混合株スターター培養を用い、そして各試験において、１つのおけ（おけ１）は、スターターのみが添加されたコントロールとして作用した。各試験おけに、１０％  ＲＳＭ中で一晩増殖させた１つの生菌ラクトバチルス株を、スターター培養に対する補助物として添加した。試験１では、生菌補助物Ｌ．サリバリウスＮＦＢＣ  ３４８およびＬ．パラカゼイＮＦＢＣ  ３６４を、接種原レベル０．１％で、それぞれおけ２およびおけ３に添加した。第二の試験では、Ｌ．サリバリウスＮＦＢＣ  ３１０（おけ２）、Ｌ．サリバリウスＮＦＢＣ  ３２１（おけ３）およびＬ．パラカゼイＮＦＢＣ  ３３８（おけ４）に、０．２％のレベルで接種した。その後、以下のように、標準的方法にしたがい、チェダーチーズを製造した：スターターおよび補助物添加３５分後、０．０７  ｍｌ／リットルの濃度で、フィルター滅菌レンネット（Ｃｈｒ．  Ｈａｎｓｅｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、そしておよそ４０分後に凝乳（ｃｕｒｄ）を取った。凝乳を３９℃に加熱し、ｐＨ  ６．１に調節し、そしておよそｐＨ  ５．３で粉砕した。２．８％（ｗ／ｗ）の率で塩を添加し、そして凝乳を鋳型に入れ、そしておよそ２００  ｋＰａで一晩加圧した。チーズを鋳型からはずし、真空パックし、そして８℃でおよそ８．５か月間熟成させた。続いて、実験室規模のチーズ中で、熟成中、高い生存能力を維持することが見出された、２つの補助ラクトバチルス株を用い、２つのパイロット規模のチーズ製造試験（試験３および４）を行った。各試験において、各々、標準化（脂肪：タンパク質＝１）低温殺菌全乳４５０リットルを含む、１つの実験および１つのコントロールの、２つのおけを用いた。実験室規模試験と同様、１．５％接種原のスターター２２３および２２７を各おけに添加した。さらに、各試験において、実験おけ（おけ２）は、スターター補助物として添加された、Ｌ．パラカゼイＮＦＢＣ  ３６４（試験３）またはＮＦＢＣ  ３３８（試験４）のどちらかの０．１％接種原を含んだ。チーズ製造法は、塩レベルが２．７％であり、そして凝乳をおよそ４１３  ｋＰａで一晩加圧した以外は、実験室規模のチーズに関し、先に記載した通りであった。
【００３８】
まず、実験室規模のチーズ試験を、微生物学的に調節された（したがって熟成中の多数のＮＳＬＡＢの成長を制限する）条件下で行い、チェダーチーズ中の５つの生菌ラクトバチルス株の反応を評価した。まず、接種目的のため、ＲＳＭにおけるこれらの株の反応を調べた。どの株も牛乳中でよく反応せず（わずか１０7−１０8  ｃｆｕ／ｍｌのレベルしか達成されず）、そして続いて非タンパク分解性であるか、または弱くしかタンパク質分解性でなかった（データは示されていない）。したがって、スターター補助物としてこれらのＬ．サリバリウスおよびパラカゼイ株の０．１−０．２％接種原を用いると、表１に示されるように、チーズ製造中、実験おけ中で、比較的低レベルの１０4−１０5  ｃｆｕ／ｍｌ牛乳が得られた。すべての補助物ラクトバチルスは、これらのチーズ製造過程を生き抜くことが見出され、そして牛乳中の増殖が劣っており、そして低い接種原を用いたとすると、該過程中の酸産生にはいかなる影響も持たないことが示された（データは示されていない）。結果により、ＮＦＢＣ  ３６４およびＮＦＢＣ  ３３８  Ｌ．パラカゼイ補助物（それぞれ試験１のおけ３、試験２のおけ４）で製造されたチーズは、熟成８か月後、これらの生菌株を高レベルで含むことが示された：それぞれ図１Ａおよび２Ａに示されるように、最終計数９．２  ｘ  １０7および１．４  ｘ  １０8  ｃｆｕ／ｇが達成された。
【００３９】
表１
補助物および／またはスターター培養での接種後の、チェダーチーズ製造に用いた牛乳中の細菌計数（ｃｆｕ／ｍｌ）
【表１】
0004203981.tif 000002
1２２７／２２３＝Ｌ．ラクティスｓｓｐ．クレモリス２２７＋２２３
2ＮＤ＝検出不可能
3試験１および２のチーズは、微生物学的に調節された条件下で、実験室規模で製造した。
4試験３および４のチーズは、実験室規模のチーズで熟成中、優れた生存を示した、２つのラクトバチルス補助物株（ＮＦＢＣ  ３３８およびＮＦＢＣ  ３６４）を用い、パイロット規模で製造した。
【００４０】
図１Ｂ−１Ｄは、各チーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤ  ＰＣＲプロフィールである（Ｂ、ＣおよびＤ）；レーン１は製造時、チーズに添加された生菌ラクトバチルス株のＲＡＰＤプロフィールを示す一方、レーン１９（Ｂ）およびレーン１１（ＣおよびＤ）で１００  ｂｐラダーが示され、そしてすべての他のレーン（Ｂ、ＣおよびＤ）は、６か月熟成チーズ由来のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤプロフィールを示す。
【００４１】
図２Ｂ−２Ｄは、各チーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤ  ＰＣＲプロフィールである（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）；レーン１は製造時、チーズに添加された生菌ラクトバチルス株のＲＡＰＤプロフィールを示す一方、レーン１１（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）で１００  ｂｐラダーが示され、そしてすべての他のレーン（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）は、６か月熟成チーズ由来のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤプロフィールを示す。
【００４２】
Ｌ．パラカゼイ株ＮＦＢＣ  ３６４およびＮＦＢＣ  ３３８に関し生成されたＲＡＰＤ  ＰＣＲフィンガープリント（図１Ｄおよび図２Ｅ、レーン１）並びにチーズから単離されたラクトバチルスに関し得られたもの（図１Ｄおよび図２Ｅ、レーン２−１０および１２−２０）を比較し、同一であることが見出され、高レベルの生菌株が確認された。対照的に、株ＮＦＢＣ  ３１０が添加されたチーズ（試験２のおけ２）中で、ラクトバチルスは高レベルに増殖し（１  ｘ  １０8  ｃｆｕ／ｇ）、そして続いて熟成中このレベルを維持しつづけた（図２Ａ）が、これらのラクトバチルス（図２Ｃ、レーン２−１０および１２−２０）は、ＲＡＰＤ  ＰＣＲにより、ＮＳＬＡＢと同定された。Ｌ．サリバリウス補助物ＮＦＢＣ  ３４８およびＮＦＢＣ  ３２１（それぞれ、試験１のおけ２および試験２のおけ３）を含むチーズ中のラクトバチルスのレベルは、熟成４か月後、それぞれ１．２  ｘ  １０5  ｃｆｕ／ｇおよび８．６  ｘ  １０4  ｃｆｕ／ｇに減少した（図１Ａおよび２Ａ）が、これらのレベルは、わずかに増加し、熟成８か月後、それぞれ３．５  ｘ  １０5  ｃｆｕ／ｇおよび１．１  ｘ  １０6  ｃｆｕ／ｇの最終レベルに達した。興味深いことに、これらの各チーズから６か月後に採取した単離体の遺伝子フィンガープリントにより、これらのラクトバチルスが主にＮＳＬＡＢであることが明らかになった（それぞれ、図１Ｃおよび図２Ｄ）。したがって、本実施例に用いられたＬ．サリバリウス株は、熟成中、チェダーチーズにおいて、生存能力を維持しなかった。さらに、補助物株が減少しているこれらのチーズから単離されたＮＳＬＡＢの多く（図１Ｃ、レーン３−６および図３Ｄ、レーン１２−１８）および生菌補助物がまったく添加されなかったコントロールチーズから単離されたＮＳＬＡＢの多く（図１Ｂ、レーン９−１３および図２Ｂ、レーン３−９）は、同一のＰＣＲ生成ＤＮＡフィンガープリントを生じた。これは、ＤＮＡが同一の株から得られたことを示唆し、そしてこれらのチーズのＮＳＬＡＢ集団において、特定のラクトバチルス株が主であることを示す。
【００４３】
続いて、パイロット規模チーズ試験を行い、実験室規模試験で高レベルに生存した２つのＬ．パラカゼイ株、ＮＦＢＣ  ３３８およびＮＦＢＣ  ３６４のみをチェダーチーズに取り込んだ。これらの株は、表１に示されるように、それぞれ１．７および８．９  ｘ  １０5  ｃｆｕ／ｍｌチーズ乳の接種原で試験３のおけ２（ＮＦＢＣ  ３３８）および試験４のおけ２（ＮＦＢＣ  ３６４）に添加した。その後、ＮＦＢＣ  ３３８およびＮＦＢＣ  ３６４は両方とも、チーズ中で、それぞれ１．１  ｘ  １０7および２．７  ｘ  １０7  ｃｆｕ／ｇの最初の数から、熟成３か月後に１．５および２．９  ｘ  １０8  ｃｆｕ／ｇの間のレベルに達し、そして生存能力は、熟成期間の残りに関し、このレベルで維持された（図３Ａおよび４Ａ）。実験室規模チーズにおけるように、これらの結果は、これらの各チーズ由来のいくつかの単離体（図３Ｂおよび４Ｂ）のＲＡＰＤ  ＰＣＲ解析（実施例１に記載されるようなもの）により確認した。
【００４４】
まとめると、実験室およびパイロット規模のチーズ試験からのデータは、生菌としての潜在能力に関し選択された株のチェダーチーズ中の持続性に関する、分子に基づく証拠を提供する。「生菌」食品の有益な影響を正当に評価するため、上に示されるように、生存生菌生物が、製品１グラムまたは１ミリリットル当たり、少なくとも１０7生存細胞のレベルで存在するべきであることが提唱されてきている。本発明に一致して得られる生菌含有チーズは、１０8  ｃｆｕ／ｇチーズまでのレベルを含み、したがって、「生菌」食品製品に関する規準を満たす。
【００４５】
また、すべての試験のコントロールチーズにおけるラクトコッカススターター数が、熟成期間中、特有の減少を示したことにも注目しなければならない（図１Ａ、２Ａ、３Ａおよび４Ａ）。しかし、これらのスターター生物を計数するのに用いられたＬＭ１７培地上のラクトバチルスの増殖のため、補助物ラクトバチルスが添加されていないチーズ中のスターターのみを、そしてまた熟成初期段階でのみ、モニターすることが可能であった。
【００４６】
ＲＡＰＤ  ＰＣＲ解析は、同定法として用いた場合、生菌Ｌ．パラカゼイ株が増殖し、そしてチーズ中で高い生存率（１０8  ｃｆｕ／ｇ）を維持する一方、使用された特定のＬ．サリバリウス補助物株は、こうした適用に適していないようであることを決定することが可能であった。さらに、これらの生菌ラクトバチルス株のチェダーチーズ中での多数の生存は、チーズおけ中の比較的低い接種原（０．１−０．２％）を用い、そしていかなる点でもチーズ製造過程を改変することなく達成された。これが可能であったのは、これらの株がスターター補助物として添加されたためであり、そしてしたがってこれらの株はチーズ製造中の酸産生に必要ではないためであった。したがって、生菌生物をチェダーチーズに取り込むための本発明の方法は、産業に特定の利益を提供し；現存のチーズ製造技術の改変は必要とされず、そして低接種原のため、低い費用を必要とするのみである。
【００４７】
実施例３
チーズ組成解析
おろしたチーズ試料を、塩に関し、電位差測定法（Ｉｒｉｓｈ  Ｄａｉｒｙ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ（１９７９）；Ｃｈｅｅｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｅｓｅ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ：ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．  ＩＤＦ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ８８）により、脂肪に関し、Ｇｅｒｂｅｒ法（Ｉｒｉｓｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（１９５５）；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｆａｔ  ｉｎ  ｃｈｅｅｓｅ．  Ｉｒｉｓｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ．  ６９）により、水分に関し、１０２℃でのオーブン乾燥（Ｉｒｉｓｈ  Ｄａｉｒｙ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ（１９８２）；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｔａｌ  ｓｏｌｉｄｓ  ｃｏｎｔｅｎｔ（ｃｈｅｅｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｅｓｅ）  ＩＤＦ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ４Ａ）により、そしてタンパク質に関し、ＬＥＣＯ  ＦＰ−４２８窒素測定装置上で、二重で解析した。２０  ｇのおろしたチーズと１２  ｍｌのＨ2Ｏを混合することにより調製したスラリーのｐＨを、標準的なｐＨメーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、デンマーク・コペンハーゲン）を用いて測定した。
【００４８】
チーズの組成は、表２に示されるように、チェダーに典型的な範囲内であることが見出された。
【００４９】
表２
コントロールおよび生菌チェダーチーズの組成1
【表２】
0004203981.tif 000003
1二重解析の平均
2水分中の塩
【００５０】
試験１のチーズに関し、水分中の塩（おけ３）、脂肪（すべてのおけ）およびｐＨ（おけ１）に関するいくつかの変則的な値が得られたが、これは実験室規模で、チーズ製造パラメーター（すなわち温度）を調節することが困難であることを反映する。対照的に、パイロット規模試験に関し、得られたすべての組成解析値は、概して、チェダーに典型的な範囲内だった。したがって、コントロールおよび実験チーズに関し観察される、匹敵する値（表２）は、生菌ラクトバチルスのスターター補助物としての取り込み、および多数の生存が、チーズ組成に直接的な影響を持たないことを示す。
【００５１】
実施例４
チェダーチーズの感覚的評価
地元のチーズ製造工場の商業的採点者が、３および６か月熟成後のチーズを、盲検で、等級付けした。それぞれ最大スコア４５および４０で、風味／香りおよびさわり（ｂｏｄｙ）／きめに関し、チーズを等級付けした。商業的チェダーチーズには、風味／香りおよびさわり／きめに関し、それぞれ、３８および３１の最低スコアが必要とされる。試験２のコントロールチーズを除き、熟成６か月後、すべてのチーズは、感覚的規準に関し、商業的等級であると記載することが可能であり、表３に示されるように、風味／香りおよびさわり／きめに関し、それぞれ、３８および３１の最低スコアを達成した。
【００５２】
表３
６か月でのチェダーチーズの感覚的評価
【表３】
0004203981.tif 000004
1最大スコア＝４５；最小商業的スコア＝３８
2最大スコア＝４０；最小商業的スコア＝３１
【００５３】
ラクトバチルス補助物は、以前、チェダーチーズの風味を改善することが報告されてきている（Ｂｒｏｏｍｅ，  Ｍ．Ｄ．ら（１９９０）；Ａｕｓｔ．  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ４５：６７−７３）が、いくつかの場合、風味の欠陥に責任があった（Ｐｕｃｈａｄｅｓ，  Ｒ．ら（１９８９）；Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ５４：８８５−８８８）。本例では、高レベルのラクトバチルス補助物を含む、実験室規模のチーズは、コントロールチーズのものに匹敵する風味およびきめを有することが見出され、これらの生菌ラクトバチルスをチェダーチーズに添加しても、感覚的規準にいかなる不都合な影響も持たないことが示される。さらに、より大規模で繰り返した際、高レベルのこれらの補助物の存在により、感覚的パラメーターは、依然、影響されなかった。
【００５４】
実施例５
実験室規模チェダーチーズのタンパク質分解
本質的にＡｎｄｒｅｗｓ（Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ａ．Ｔ．（１９８３）；Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．  ５０：４５−５５）の濃縮用ゲル系を用い、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ｘｉ垂直スラブゲル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．、英国ハーツ・ワットフォード）を用い、尿素−ＰＡＧＥ（Ｓｈａｌａｂｉ，  Ｓ．Ｌ．およびＦｏｘ，  Ｐ．Ｆ．（１９８７）；Ｉｒｉｓｈ  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １１：１３５−１５１）により、チーズを解析した。１０  ｍｇのおろしたチーズを、１  ｍｌの試料緩衝液に分散させ、そして５０℃で５分間加熱することにより、チーズ試料を調製した。使用まで試料を−２０℃で保存し、そして１０μｌをゲルに適用した。カゼインナトリウム（５μｌ）を比較目的のための標準として用いた。濃縮用ゲルを通じ、２８０  Ｖで、そして分離用ゲルを通じ３００  Ｖで試料を電気泳動した。ＢｌａｋｅｓｌｅｙおよびＢｏｅｚｉの直接染色法（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ，  Ｒ．Ｗ．およびＪ．Ａ．  Ｂｏｅｚｉ（１９７７）；Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：５８２−５８１）を用い、クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ２５０で、ゲルを染色した。
【００５５】
ＫｕｃｈｒｏｏおよびＦｏｘ（Ｋｕｃｈｒｏｏ，  Ｃ．Ｎ．およびＦｏｘ，  Ｐ．Ｆ．；（１９８２）；Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｈｃａｆｔ  ３７：３３１−３３５）の方法にしたがい、各チーズの水可溶性抽出物（ｐＨ  ４．６）を調製し、そして凍結乾燥した。Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ系（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）に取り付けたＴＳＫ  ２０００  ＳＷ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国ハイウィッカム）ゲル浸透カラム（７．５  ｍｍ  ｘ  ６０  ｃｍ）を用い、サイズ排除ＨＰＬＣにより、これらの凍結乾燥抽出物中のペプチドのサイズ分布を測定した。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む３０％アセトニトリルで、１  ｍｌ／分の流速で、カラムを溶出させた。凍結乾燥水可溶性抽出物をＨＰＬＣ等級の水で還元し（３  ｍｇ／ｍｌ）、Ｗｈａｔｍａｎ  ０．２μｍフィルターを通じ濾過し、そして２０μｌをカラムに適用した。カラム溶出物は、２１４  ｎｍで連続的にモニターした。ＰＣ  Ｍｉｎｉｃｈｒｏｍ系（ＶＧ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国チェシャー）を用い、データを集め、そして結果を、先に用意した較正曲線に比較した。
【００５６】
Ｌｙｎｃｈら（Ｌｙｎｃｈ，  Ｃ．Ｍ．ら（１９９６）；Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．  ６：８５１−８６７）に記載されるように、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ−Ｎ  ３３８０５２  Ｎａ+カラム（１２  ｃｍ  ｘ  ０．５  ｃｍ）を備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ６３００高性能解析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国ハイウィッカム）を用い、水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸（ＦＡＡ）を測定した。コンピューター制御Ｍｉｎｉｃｈｒｏｍデータプロセシングパッケージを用い、クロマトグラムを集めた。アミノ酸濃度はμｇ／ｍｌチーズ抽出物として表現され、その後μｇ／ｇチーズに変換した。
【００５７】
熟成８か月後の全チーズ試料の尿素−ＰＡＧＥ電気泳動パターン（図５）は、チェダーに典型的であり、そしてコントロールチーズおよび補助物ラクトバチルスを用い製造したものの間に主なタンパク質分解の度合いでのいかなる相違も示さなかった。
【００５８】
図５は、熟成８か月後のコントロール（レーン２および５）および実験（レーン３、４、６、７および８）チェダーチーズの尿素−ＰＡＧＥを示す。レーン１はカゼインナトリウム標準を含む。
【００５９】
チーズ由来の水可溶性抽出物中のペプチドの分子量分布（サイズ排除ＨＰＬＣにより測定されるようなもの）は、熟成中のチーズにおけるタンパク質分解の度合いのさらなる指標として利用可能である；タンパク質分解の度合いが高ければ、生成される低分子量ペプチドのレベルも高くなる。熟成６か月後、これらの低分子量ペプチド（＜５００  Ｄａ）のレベルは、すべてのチーズで高レベルに集積していることが見出された（データは示されていない）。さらに、コントロールおよび実験チーズにおいて、補助物ラクトバチルスが高レベルで生存しているチーズ（試験１のおけ３、試験２のおけ４のチーズ）においても、同様のレベルが検出され、小ペプチドの生成により示されるような、チーズ中のタンパク質分解の度合いは、補助物添加により影響を受けないことが示される。しかし、熟成６か月後、添加ラクトバチルスを用い製造したチーズにおいて、より高いレベルの個々のＦＡＡが検出された（図６）。
【００６０】
図６は、試験１（Ａ）および試験２（Ｂ）の６か月齢コントロールおよび実験チェダーチーズの水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸の濃度を示す。
【００６１】
最も重要なことに、いかなる補助物も添加されていないコントロールチーズ中よりも、添加ラクトバチルスを用い製造したチーズ中で、セリン、メチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンの濃度（試験１）に加えグルタミン酸およびバリンの濃度（試験２）が高かった（図６）。これは、熟成中、ラクトバチルス補助物が減少したチーズにも当てはまることが見出された。これは、該生物が死に、そして溶解する際の、細胞内ペプチダーゼの放出により、説明される可能性がある。したがって、一般的に、該結果は、補助物ラクトバチルスが、高レベルで生存していてもいなくても、ＦＡＡ形成の増加により立証されるように、チーズ中のタンパク質分解に寄与していたことを示唆する。
【００６２】
上記の結果は、チェダーチーズに取り込まれた、生菌Ｌ．パラカゼイ株が、スターター補助物として特に適していることが証明されたことを示す。これらの株は、比較的低い接種原で添加されても、熟成８か月に渡り、チーズ中で高細胞数に成長及び増殖することが見出された。さらに、ＲＡＰＤ  ＰＣＲは、これらの生菌補助物をＮＳＬＡＢから区別するのに非常に有用であることが証明された。さらに、コントロールチーズからの結果により、特定のＮＳＬＡＢ株が主であることが示唆される。チーズ熟成中のタンパク質分解は、ＦＡＡ形成レベルで、補助物により影響を受ける一方、チーズの風味、きめおよび外見は、影響を受けなかった。これらの生菌補助物のチェダーチーズへの取り込みは、本明細書に記載されるように、チーズ製造技術の改変なしに達成することが可能であり、したがって、本系は商業的利用に魅力的なものになっている。これらの結果は、チェダーチーズが、付随する利点と共に、消費者にこれらの株を搬送する、効率的なビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、実施例２に記載されるように、試験１におけるチーズ熟成中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇのグラフである。
図１Ｂ−１Ｄは、実施例２に記載されるように、各チーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤ  ＰＣＲプロフィールである。
【図２】  図２Ａは、実施例２に記載されるように、試験２におけるチーズ熟成中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇのグラフである。
図２Ｂ−２Ｅは、実施例２に記載されるように、各チーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤ  ＰＣＲプロフィールである。
【図３】  図３Ａは、実施例２に記載されるように、試験３におけるチーズ熟成中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇのグラフである。
図３Ｂは、実施例２に記載されるように、おけ２のチーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤ  ＰＣＲプロフィールを示す。
【図４】  図４Ａは、実施例２に記載されるように、試験４におけるチーズ熟成中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇのグラフである。
図４Ｂは、実施例２に記載されるように、おけ２のチーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤ  ＰＣＲプロフィールを示す。
【図５】  図５は、実施例５に記載されるように、熟成８か月後のコントロールおよび実験チェダーチーズの尿素ＰＡＧＥである。
【図６】  図６Ａは、実施例５に記載されるように、試験１に見られる、６か月齢のコントロールおよび実験チーズの水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸の濃度を示す。
図６Ｂは、実施例５に記載されるように、試験２に見られる、６か月齢のコントロールおよび実験チーズの水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸の濃度を示す。
【図１】
0004203981.tif 000005
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【図２】
0004203981.tif 000007
0004203981.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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