(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴの根部から抽出されるコラーゲン産生促進物質を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴの根部から抽出されるコラゲナーゼ活性阻害物質を有効成分として含有することを特徴とするコラゲナーゼ阻害剤。
【請求項３】
水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴの根部から抽出される線維芽細胞増殖作用物質を有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖作用剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の有効成分を配合したことを特徴とする老化防止用皮膚化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、線維芽細胞によるコラーゲンの産生を活発化する作用を有するコラーゲン産生促進剤、コラーゲンの減少・変性に関与するコラゲナーゼ活性を阻害するコラゲナーゼ阻害剤、線維芽細胞を増殖させる作用を有する線維芽細胞増殖作用剤、及びこれら有効成分を配合してなる皮膚の老化予防・改善作用を有する老化防止用皮膚化粧料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。中でも、若い皮膚においては、これら皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力低下を起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始め、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。
【０００４】
このような皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少、変性が関与していることが知られてきている。
【０００５】
近年、この変化を誘導する因子として、特にマトリックス系プロテアーゼの関与が指摘されている。マトリックス系プロテアーゼの中でも、コラゲナーゼ、即ちＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ）は、皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるタイプＩ，ＩＩＩコラーゲンを分解する酵素として知られるが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線によるコラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成等の大きな要因となることが考えられる。
【０００６】
このため、安全性、及び生産性に優れ、かつ安価に提供することができ、優れた皮膚の老化防止・改善効果を有するコラゲナーゼ阻害剤、コラーゲン産生促進作用剤、及び線維芽細胞増殖作用剤の提供が強く望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。
【０００７】
本発明は、このような状況下、従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。本発明の第一の目的は、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進して皮膚の老化を防止及び／又は改善し得るコラーゲン産生促進物質を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤を提供することにある。また、本発明の第二の目的は、コラゲナーゼ活性を阻害することを通じてコラーゲンの減少・変性を抑制し、皮膚の老化を防止及び／又は改善し得るコラゲナーゼ活性阻害を有効成分として含有するコラゲナーゼ阻害剤を提供することにある。また、本発明の第三の目的は、線維芽細胞増殖作用を通じて線維芽細胞を賦活化し、皮膚の老化を防止及び／又は改善し得る線維芽細胞増殖物質を有効成分として含有する線維芽細胞増殖作用剤を提供することにある。また、本発明の第四の目的は、優れたコラーゲン産生促進作用、コラゲナーゼ阻害作用、及び線維芽細胞増殖作用を有し、皮膚の老化を防止及び／又は改善に有用な老化防止用皮膚化粧料を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、バラ科オニイチゴの根部を、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いて抽出した抽出物が、線維芽細胞によるコラーゲンの産生を活発化する作用、コラーゲンの減少・変性に関与するコラゲナーゼ活性を阻害する作用、及び線維芽細胞を増殖させる作用を有することを知見し、該抽出物を有効成分として含有する老化防止用皮膚化粧料が、高い安全性と皮膚の老化を防止及び／又は改善し得ることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００９】
従って、本発明は、前記課題を解決するため、下記のコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖作用剤及び老化防止用皮膚化粧料を提供する。
【００１０】
請求項１の発明は、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴの根部から抽出されるコラーゲン産生促進物質を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤である。請求項２の発明は、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴの根部から抽出されるコラゲナーゼ活性阻害物質を有効成分として含有することを特徴とするコラゲナーゼ阻害剤である。請求項３の発明は、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴの根部から抽出される線維芽細胞増殖作用物質を有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖作用剤である。請求項４の発明は、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の有効成分を配合したことを特徴とする老化防止用皮膚化粧料である。
【００１１】
なお、バラ科オニイチゴは、果実が食用にされているが、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてオニイチゴの根部からの抽出物が優れたコラーゲン産生促進作用、コラゲナーゼ阻害作用、及び線維芽細胞増殖作用を有し、皮膚の老化防止及び／又は改善に有用であることは全く知られておらず、これらのことは本発明者らの新知見である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について更に詳しく説明する。本発明のコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤、及び線維芽細胞増殖作用剤は、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてオニイチゴの根部から抽出されるコラーゲン産生促進物質、コラゲナーゼ活性阻害物質、及び線維芽細胞増殖作用物質を有効成分として含有する。
【００１３】
ここで、オニイチゴ(学名：Ｒｕｂｕｓ  ｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ、中国名：切頭懸鉤子)は、バラ科に属し、新鮮な果実は香りがあり食用にされている。オニイチゴはヒマラヤから東南アジア、中国東南部で自生又は栽培されており、これらの地域から容易に入手することができる。
【００１４】
抽出原料として用いるオニイチゴの構成部位は、根部を抽出原料として用いる。
【００１５】
抽出原料であるオニイチゴの根部などは、採取後ただちに乾燥し粉砕したものが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。オニイチゴは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、オニイチゴの抽出溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１６】
前記抽出溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を使用するのが好ましい。好適な抽出溶媒の具体例としては、水、低級脂肪族アルコール、含水の低級脂肪族アルコール等を例示でき、これらを単独で、又はこれら２種以上の混合物として使用することができる。好適な低級脂肪族アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等を例示することができる。
【００１７】
抽出溶媒として使用し得る水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
２種以上の親水性有機溶媒の混合溶媒を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比を７：３〜２：８（質量比）とすることができる。
【００１９】
抽出処理は、オニイチゴの根部に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温乃至還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
【００２０】
例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、ときどき攪拌しながら可溶性成分を溶出させる。この際、抽出条件は抽出原料等に応じて適宜調整し得るが、抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、抽出時間は通常１〜３時間であり、抽出温度は通常常温〜９５℃程度である。
【００２１】
抽出処理により可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことによって、抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２２】
得られた抽出液はそのままでもコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖作用剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。
【００２３】
また、オニイチゴの根部からの抽出物は特有の匂いと味を有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、老化防止用皮膚化粧料に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２４】
以上のようにして得られるオニイチゴ根部からの抽出物は、コラーゲン産生促進作用、コラゲナーゼ阻害作用及び線維芽細胞増殖作用を有する。オニイチゴ根部から抽出物は、そのままでもコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖作用剤として使用することができるが、常法に従って製剤化して提供することもできる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアー、その他任意の助剤を添加することができる。オニイチゴ根部からの抽出物は、製剤化により粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。
【００２５】
＜老化防止用皮膚化粧料＞  本発明のコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤及び線維芽細胞増殖作用剤は皮膚の老化を防止及び／又は改善することができると共に、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、老化防止用皮膚化粧料に配合するのに好適である。なお、老化防止用皮膚化粧料には、コラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤及び線維芽細胞増殖作用剤のいずれか１種を配合してもよいし、２種以上を組み合わせて配合してもよい。この場合、本発明のコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤及び線維芽細胞増殖作用剤の配合量は、老化防止用皮膚化粧料の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的なオニイチゴの根部からの抽出物に換算して老化防止用皮膚化粧料全体に対し約０．０１〜１０質量％である。
【００２８】
本発明の皮膚化粧料において、前記コラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤及び線維芽細胞増殖作用剤と共に構成成分として利用可能なものとしては、特に制限されないが、収斂剤、殺菌・抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料などが用いられる。これらの構成成分は、前記オニイチゴの根部からの抽出物と共に、併用した場合、相乗的に作用して、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００２９】
前記収斂剤としては、例えば、クエン酸又はその塩類、酒石酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム・カリウム、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、パラフェノールスルホン酸亜鉛、硫酸亜鉛、ジユエキス、エイジツエキス、ハマメリスエキス、ゲンノショウコエキス、チャカテキン類、オドリコソウエキス、オトギリソウエキス、ダイオウエキス、ヤグルマソウエキス、キズタエキス、キューカンバーエキス、マロニエエキス、サルビアエキス、メリッサエキスなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３０】
前記殺菌・抗菌剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、塩化ジステアリルメチルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、塩酸クロルヘキシジン、感光素１０１号、感光素２０１号、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ソルビン酸、ハロカルバン、レゾルシン、パラクロロフェノール、フェノキシエタノール、ビサボロール、ヒノキチオール、メントール、キトサン、キトサン分解物、ジユエキス、クジンエキス、エンメイソウエキス、ビワエキス、ユッカエキス、アロエエキス、ケイヒエキス、ガジュツエキスなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
前記紫外線吸収剤としては、例えば、β−イソプロピルフラノン誘導体、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、オキシベンゾン、オキシベンゾンスルホン酸、テトラヒドロキシベンゾフェノン、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシベンゾフェノン、シノキサート、ジイソプロピルケイヒ酸メチル、メトキシケイヒ酸オクチル、パラアミノ安息香酸グリセリル、パラジメチルアミノ安息香酸アミル、パラジメチル安息香酸オクチル、パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸エチル、酸化チタン、β−カロチン、γ−オリザノール、コメヌカエキス、アロエエキス、カバノキエキス、シラカンバエキス、カミツレエキス、ヘンナエキス、チョウチグルミエキス、イチョウ葉エキス、カミツレエキス、セイヨウサンザシエキス、油溶性カンゾウエキスなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３２】
前記保湿剤としては、例えば、セリン、グリシン、スレオニン、アラニン、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ヒドロネクチン、フィブロネクチン、ケラチン、エラスチン、ローヤルゼリー、コンドロイチン硫酸ヘパリン、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、リノール酸又はそのエステル類、エイコサペンタエン酸又はそのエステル類、ペクチン、ビフィズス菌発酵物、乳酸発酵物、酵母抽出物、レイシ菌糸体培養物又はその抽出物、小麦胚芽油、アボガド油、米胚芽油、ホホバ油、ダイズリン脂質、γ-オリザノール、ビロウドアオイエキス、ヨクイニンエキス、ジオウエキス、タイソウエキス、カイソウエキス、キダチアロエエキス、ゴボウエキス、マンネンロウエキス、アルニカエキス、小麦フスマなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３３】
前記細胞賦活剤としては、例えば、リボフラビン又はその誘導体、ピリドキシン又はその誘導体、ニコチン酸又はその誘導体、パントテン酸又はその誘導体、α−トコフェロール又はその誘導体、アルニカエキス、ニンジンエキス、ナタネニンジンエキス、ヘチマエキス（サポニン）、シコンエキス、オウバクエキス、ボタンピエキス、シャクヤクエキス、ムクロジエキス、ベニバナエキス、アシタバエキス、ビワ葉エキス、ヒキオコシエキス、ユキノシタエキス、黄杞エキス、サルビアエキス、ニンニクエキス、マンネンロウエキスなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
前記消炎・抗アレルギー剤としては、例えば、アズレン、アラントイン、アミノカプロン酸、インドメタシン、塩化リゾチーム、イプシロンアミノカプロン酸、オキシベンゾン、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、感光素３０１号、感光素４０１号、塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸又はその誘導体、アデノシンリン酸、エストラジオール、エスロン、エチニルエストラジオール、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルニカエキス、インチンコウエキス、サンシシエキス、ジュウヤクエキス、カンゾウエキス、トウキエキス、ヨモギエキス、ワレモコウエキス、リンドウエキス、サイコエキス、センキュウエキス、セイヨウノコギリソウエキス、オウレンエキス、シソエキスなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３５】
前記抗酸化・活性酸素消去剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没子食酸プロピル、バイカリン、バイカレイン、スーパーオキサイドディスムターゼ、カタラーゼ、ローズマリーエキス、メリッサエキス、オウゴンエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、ホップエキス、ハマメリスエキス、シャクヤクエキス、セージエキス、キナエキス、カミツレエキス、ユーカリエキス、シソエキス、イチョウ葉エキス、タイムエキス、カルダモンエキス、キャラウェイエキス、ナツメグエキス、メースエキス、ローレルエキス、クローブエキス、ターメリックエキス、ヤナギタデエキスなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３６】
前記油脂類としては、例えば、大豆油、アマニ油、ゴマ油、ヌカ油、綿実油、ナタネ油、サフラワー油、トウモロコシ油、オリーブ油、ツバキ油、アーモンド油、ヒマシ油、落花生油、カカオ油、パーム核油、牛脂、ミンク油、ホホバ油、月見草油、馬油などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
前記ロウ類としては、例えば、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、蜜ロウ、サラシ蜜ロウ、鯨ロウ、セラックス、ラノリン類などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３８】
前記炭化水素類としては、例えば、流動パラフィン、ワセリン、マイクロスリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ポリエチレン末などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３９】
前記脂肪酸類としては、例えば、ステアリン酸、リノール酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヘベニン酸、ラノリン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸、イソステアリン酸などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４０】
前記アルコール類としては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラノリンアルコール、水添ラノリンアルコール、オレイルアルコール、ヘキサデシルアルコール、２−オクチルドデカノール、グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール又はその重合体、ブドウ糖、白糖、コレステロール、フィトステロール、セトステアリルアルコールなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４１】
前記エステル類としては、例えば、オレイン酸デシル、ステアリン酸ブチル、ミリスチン酸ミリスチル、ラウリン酸ヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、ジオレイン酸プロピレングリコール、フタル酸ジエチル、モノステアリン酸グリセリン、トリミリスチン酸グリセリン、乳酸セチルなどが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４２】
前記界面活性剤としては、ノニオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤などを使用することができるが、中でも皮膚疾患の発生のない、又は軽微な化粧品原料基準に収載された界面活性剤が好ましい。例えば、大豆レシチン、卵黄レシチン、サポニン、オリゴ配糖体、リン脂質系バイオサーファクタント、アシルペプチド系バイオサーファクタント、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブチルエーテル、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラノリン、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシプロピレンブチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリン酸ナトリウム、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビット、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミドなどの界面活性剤が挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４３】
前記香料としては、例えば、メントール、カルボン、オイゲノール、アネトール、ハッカ油、スペアミント油、ペパーミント油、ユーカリ油、アニス油などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４４】
なお、本発明の老化防止用皮膚化粧料は、優れた皮膚の老化を防止及び／又は改善効果を有しており、例えば、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、口紅、リップクリーム、入浴剤等に幅広く用いることができる。
【００５０】
なお、本発明のコラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖作用剤、老化防止用皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００５１】
【実施例】
以下、製造例、実施例及び比較例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５２】
〔製造例１〕
オニイチゴの根部の粗粉砕物３００gを表１に示した４種類の抽出溶媒２０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、７０℃に保った後、ろ過し、ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、更に、減圧乾燥機で乾燥してオニイチゴ根抽出物を得た。抽出物の収率は表１に示したとおりであった。なお、抽出溶媒が混合物の場合、以下に示す混合比は質量基準によるものである。
【００５３】
【表１】
0004350331.tif 000002
【００５４】
〔製造例２〕
製造例１で用いたものと同じオニイチゴ根の粗粉砕物３００ｇを表２に示した３種類の抽出溶媒２０００ｍＬに投入し、攪拌しながら８０℃で３時間保持した後、ろ過して、表２に示した固形分濃度の抽出液約１５００ｍＬを得た。なお、抽出溶媒が混合物の場合、以下に示す混合比は質量基準によるものである。
【００５５】
【表２】
0004350331.tif 000003
【００５６】
〔実施例１〕  コラーゲン産生促進作用の試験
製造例１及び２で得られた試料Ｎｏ．１〜７の抽出物について、コラーゲン産生促進作用の試験を行った。具体的には、以下のようにして試験を行った。
【００５７】
まず、ヒトの線維芽細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下にて、各試料添加培地（試料濃度：２５ｐｐｍ又は１２．５ｐｐｍ）で数日間培養した後、上清９０μＬをＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅに移し換え、４℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔでｐｌａｔｅに吸着させた後、溶液を捨て、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行った。
その後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、抗ヒトコラーゲンタイプＩ抗体（ウサギＩｇＧ；ケミコン社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた後、同様の洗浄操作を行い、発色反応を行った。
コラーゲン産生促進率は、標準品を用いて上記ＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成し、試料無添加時のコラーゲン産生量を１００％として算出した。各試料のコラーゲン産生促進率（％）を表３に示す。なお、試料が製造例２による抽出液の場合、「試料濃度」は固形分換算濃度である。
【００５８】
【表３】
0004350331.tif 000004
表３の結果より、オニイチゴ根からの抽出物が線維芽細胞のコラーゲン産生を促進する作用を有することが確認された。また、かかるオニイチゴ根抽出物のコラーゲン産生促進作用の強さは、オニイチゴ根抽出物の濃度に依存して変化し、オニイチゴ根抽出物の濃度を調節することによりコラーゲン産生促進作用の強さを調節できることが確認された。
【００５９】
〔実施例２〕  コラゲナーゼ阻害作用の試験
製造例１及び２で得られた試料Ｎｏ．１〜７の抽出物について、コラゲナーゼ阻害作用を試験した。具体的には、以下のようにして試験を行った。
【００６０】
まず、各試料溶液（溶媒：２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１））５０μＬ、コラゲナーゼ溶液５０μＬ及び基質溶液４００μＬを混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。
次いで、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液１ｍＬで反応を停止し、酢酸エチル５ｍＬで抽出した。
得られた抽出液について、波長３２０ｎｍの吸光度（対照液：酢酸エチル）を測定した。上記と同様の酵素反応と吸光度測定を、試料溶液の代わりに試料溶液と等量の前記緩衝液を添加して行った。更に、それぞれの場合について、コラゲナーゼ溶液の代わりに前記緩衝液を添加して同じ操作と測定を行った。
なお、コラゲナーゼ溶液はシグマ社のコラゲナーゼＴｙｐｅ ＩＶ ５ｍｇを前記緩衝液１ｍＬに溶解させ、使用時に５０倍に希釈したものを使用した。基質溶液には、前記緩衝液にＢＡＣＨＥＭ Ｆｅｎｉｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ社Ｐｚ−ペプチドを濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌになるように溶解して使用した。
【００６１】
測定結果より、次式によりコラゲナーゼ阻害率を算出した。
＜数式１＞
コラゲナーゼ阻害率（％）＝〔1−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
但し、Ａ：試料溶液添加，酵素添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加，酵素無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加，酵素添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加，酵素無添加時の吸光度
【００６２】
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、コラゲナーゼの活性を５０％阻害する試料溶液濃度を内挿法により求めた。結果を表４に示す。なお、コラゲナーゼの５０％阻害濃度が４００ｐｐｍ以下であるとコラゲナーゼ阻害活性が充分であると判断できる。
【００６３】
【表４】
0004350331.tif 000005
表４に示される結果より、オニイチゴ根からの抽出物がコラゲナーゼ阻害作用を有することが確認された。また、かかるオニイチゴ根抽出物のコラゲナーゼ阻害作用の強さは、オニイチゴ根抽出物の濃度に依存して変化し、オニイチゴ根抽出物の濃度を調節することによりコラゲナーゼ阻害作用の強さを調節できることが確認された。
【００６４】
〔実施例３〕  線維芽細胞増殖作用の試験
製造例１及び２で得られた試料Ｎｏ．１〜７の抽出物について、線維芽細胞増殖作用をＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ９３，１５７，１９８６）に準拠して試験した。具体的には、以下のようにして試験を行った。
【００６５】
まず、２５ｃｍ２の培養フラスコに入れた１０％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）にヒト正常新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）１×１０６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。
次いで、トリプシン処理し、遠心分離して細胞を集めた。沈澱として得られた細胞を５％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）に懸濁し、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ１穴につき７×１０３個ずつ分注した。２４時間培養後、試料を溶解した５％ＦＢＳ含有培地を１穴につき１００μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で３日間培養した。
培養後、培地を１穴につき１００μＬずつ除去し、ＭＴＴ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，５ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ（−）溶液）２０μＬを添加し、４．５時間インキュベーションした（増殖した細胞中のミトコンドリア由来の活性酸素がＭＴＴ試薬と反応し、黄色であった試薬の色が５７０ｎｍに吸収のピークを有する青黄色に変わる。）。
その後、各穴に１０質量％ドデシル硫酸ナトリウム−０．０１ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を１００μＬずつ分注し、１８時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度を測定した。別に、試料だけでもブランクをとり、同様の操作を行い吸光度の測定を行った。なお、各吸光度測定値は、同時に測定した６５０ｎｍの吸光度を差し引いて、増殖した細胞による濁度の影響を補正した。補正後の各吸光度より次式により細胞増殖促進率を求めた。
【００６６】
＜数式２＞
細胞増殖促進率（％）＝〔（Ａ−Ｃ）−（Ｂ−Ｄ）〕／（Ｂ−Ｄ）×１００
但し、Ａ：試料添加時の吸光度
Ｂ：試料無添加時の吸光度
Ｃ：試料添加、細胞無添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、細胞無添加時の吸光度
【００６７】
次に、試料濃度を４００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ及び１００ｐｐｍ段階的に減少させて上記細胞増殖促進率の測定を行い線維芽細胞増殖作用を試験した。結果を表５に示す。
【００６８】
【表５】
0004350331.tif 000006
表５の結果から、オニイチゴ根からの抽出物が線維芽細胞増殖作用を有することが確認できた。また、かかるオニイチゴ根抽出物の線維芽細胞増殖作用の強さは、オニイチゴ根抽出物の濃度に依存して変化し、オニイチゴ根抽出物の濃度を調節することにより線維芽細胞増殖作用の強さを調節できることが確認された。
【００６９】
〔実施例４〕  シワ改善作用（皮膚の老化防止・改善作用）の試験
製造例１の試料Ｎｏ．２のオニイチゴ根５０％エタノール抽出物を配合した下記組成の乳液（以下、「本発明乳液」という。）を常法に従って調製した。
オニイチゴ根抽出物（製造例１の試料Ｎｏ．２）                  ０．１ｇ
セチルアルコール                                              ０．５ｇ
ミツロウ                                                      ２．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（１０Ｅ.Ｏ）          １．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル                                    １．０ｇ
ヒアルロン酸                                                  ０．１ｇ
プロピレングリコール                                          ５．０ｇ
エタノール                                                    ３．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．３ｇ
香料                                                        ０．０３ｇ
精製水                                  残部（全量を１００ｍＬとする）
【００７０】
本発明乳液と、オニイチゴ根抽出物を含まない以外は本発明乳液と同じ組成からなる比較乳液とを用いて、下記の評価試験を行った。
＜評価試験＞
２２〜５１歳の女性多数の中から、皮溝・皮丘が消え、広範囲の角質がめくれている、又は皮溝・皮丘が不鮮明で、角質が部分的にめくれているなど肌荒れと判定された２０名を選抜して被験者とした。
各被験者に、顔の右半分には本発明乳液を、左半分には比較乳液を、朝夕各１回、３０日間塗布し、下記判定１及び判定２を行った。
【００７１】
[判定１：シワ改善効果]
塗布試験終了後、シルフロ（ＦＬＥＸＩＣＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＳ ＬＴＤ製）によるレプリカ法を用いて顔のレプリカをとり、各レプリカの写真を撮影し、スキャナにより画像を取り込み、画像処理ソフト（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ｒ） ５．０）を用いて処理し、各レプリカのヒストグラムを作成した。皮膚のシワの状態を観察し、表６に示す評価基準で判定した。判定結果を表７に示す。
【００７２】
【表６】
0004350331.tif 000007
【００７３】
【表７】
0004350331.tif 000008
表７の結果から、本発明乳液を塗布した領域は、比較乳液を塗布した領域に比べて顕著にシワが改善された。
【００７４】
[判定２・官能評価]
使用感と肌への効果について、本発明乳液と比較乳液とを比較した場合の優劣を被験者全員に質問した。回答の集計結果を表８に示す。
【００７５】
【表８】
0004350331.tif 000009
表８の結果より、官能評価によっても、上記判定１と同様の効果と、優れた使用感を有することが確認された。
【００７６】
従って、判定１及び２の結果より、オニイチゴ根抽出物を配合した皮膚化粧料が皮膚の老化防止・改善作用（肌荒れ改善作用）を有すると共に、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れていることが確認された。
【００７７】
〔実施例５〕  乳液
下記の組成の乳液を常法により製造した。
ホホバオイル                                                      ４ｇ
オリーブオイル                                                    ２ｇ
スクワラン                                                        ２ｇ
セタノール                                                        ２ｇ
モノステアリン酸グリセリル                                        ２ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ）                ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(２０Ｅ.Ｏ)                ２ｇ
１，３−ブチレングリコール                                        ３ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．１５ｇ
アスコルビン酸リン酸マグネシウム                              ０．１ｇ
黄杞エキス                                                    ０．１ｇ
イチョウ葉エキス                                              ０．１ｇ
コンキオリン                                                  ０．１ｇ
オウバクエキス                                                ０．１ｇ
カミツレエキス                                                ０．１ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム                                    ０．１ｇ
香料                                                        ０．０５ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例１の試料Ｎｏ．３）                  ０．１ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例２の試料Ｎｏ．５）                      １ｇ
精製水                                    残部（全量を１００ｇとする）
【００７８】
〔実施例６〕  化粧水
下記の組成の化粧水を常法により製造した。
グリセリン                                                        ３ｇ
１，３−ブチレングリコール                                        ３ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(２０Ｅ.Ｏ)            ０．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．１５ｇ
クエン酸                                                      ０．１ｇ
クエン酸ソーダ                                                ０．１ｇ
油溶性甘草エキス                                              ０．１ｇ
海藻エキス                                                    ０．１ｇ
キシロビオースミクスチャー                                    ０．５ｇ
クジンエキス                                                  ０．１ｇ
香料                                                        ０．０５ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例１の試料Ｎｏ．１）                  ０．２ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例２の試料Ｎｏ．５）                      ２ｇ
精製水                                    残部（全量を１００ｇとする）
【００７９】
〔実施例７〕  クリーム
下記の組成のクリームを常法により製造した。
流動パラフィン                                                    ５ｇ
サラシミツロウ                                                    ４ｇ
セタノール                                                        ３ｇ
スクワラン                                                      １０ｇ
ラノリン                                                          ２ｇ
ステアリン酸                                                      １ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(２０Ｅ.Ｏ)            １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル                                        ３ｇ
１，３−ブチレングリコール                                        ６ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                      １．５ｇ
レチノイン酸                                                  ０．１ｇ
酵母抽出液                                                    ０．１ｇ
シソ抽出液                                                    ０．１ｇ
シナノキ抽出液                                                ０．１ｇ
ジユ抽出液                                                    ０．１ｇ
香料                                                          ０．１ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例１の試料Ｎｏ．３）                  ０．１ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例２の試料Ｎｏ．５）                      １ｇ
精製水                                    残部（全量を１００ｇとする）
【００８０】
〔実施例８〕  パック
下記の組成のパックを常法により製造した。
ポリビニルアルコール                                            １５ｇ
ポリエチレングリコール                                            ３ｇ
プロピレングリコール                                              ７ｇ
エタノール                                                      １０ｇ
パラオキシ安息香酸エチル                                    ０．０５ｇ
酢酸トコフェロール                                            ０．１ｇ
セージ抽出液                                                  ０．１ｇ
トウキ抽出液                                                  ０．１ｇ
ニンジン抽出液                                                ０．１ｇ
香料                                                        ０．０５ｇ
オニイチゴ根抽出物（製造例２の試料Ｎｏ．５）                      ５ｇ
精製水                                    残部（全量を１００ｇとする）
【００８３】
実施例５〜８の老化防止用皮膚化粧料は、いずれも優れたコラーゲン産生促進作用、コラゲナーゼ阻害作用、及び線維芽細胞増殖作用を発揮し得、皮膚の老化防止及び／又は改善に有用なものであった。
【００８４】
以上説明したように、本発明によれば、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴから抽出されるコラーゲン産生促進物質であって、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進して皮膚の老化防止及び／又は改善し得るコラーゲン産生促進物質を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤を提供することができる。また、本発明によれば、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴから抽出されるコラゲナーゼ阻害物質であって、コラゲナーゼ活性を阻害することを通じてコラーゲンの減少・変性を抑制し、皮膚の老化を防止及び／又は改善し得るコラゲナーゼ活性阻害を有効成分として含有するコラゲナーゼ阻害剤を提供することができる。また、本発明によれば、水、メタノール、及びエタノールの少なくともいずれかを用いてバラ科オニイチゴから抽出される線維芽細胞増殖物質であって、線維芽細胞増殖作用を通じて線維芽細胞を賦活化し、皮膚の老化を防止及び／又は改善し得る線維芽細胞増殖物質を有効成分として含有する線維芽細胞増殖作用剤を提供することができる。また、本発明によれば、優れたコラーゲン産生促進作用、コラゲナーゼ阻害作用、及び線維芽細胞増殖作用を有し、皮膚の老化を防止及び／又は改善に有用な老化防止用皮膚化粧料を提供することができる。