(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖あるいは複合糖質上の糖鎖との相互作用を利用した糖鎖構造の解析方法。
（ａ）糖鎖に相互作用を示す複数種のタンパク質を、複数の反応槽に仕切られた基板上に固定化する工程、
（ｂ）該反応槽に、標識した被検糖鎖または被検複合糖質含有試料溶液を満たして、固定化されたタンパク質と標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させる工程、
（ｃ）基板を洗浄せずに、反応槽に標識した被検糖鎖または被検複合糖質含有試料溶液を満たした状態で、上記基板端面より入射する励起光で発生させたエバネッセント波を作用させて、固定化された糖鎖に相互作用を示すタンパク質毎に励起される蛍光強度を測定する工程、
（ｄ）測定された各蛍光強度を、上記相互作用の有無のみではなく、レベル分けして、各糖鎖に相互作用を示すタンパク質に対する被験糖鎖または被験複合糖質上の糖鎖についての複数の相互作用情報をパターン化し、糖鎖構造の識別情報を得る工程、
【請求項２】
複数の反応槽が、複数の穴を有するラバーを基板に貼り付けるによって形成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラバーが黒色であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ラバーがシリコンゴムからなることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法
【請求項５】
基板がGTMS（３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン）によりコートされていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、上記請求項１の（ｄ）工程において得られたパターンをデータベースに格納された構造既知糖鎖についてのパターンと照合する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
被検複合糖質含有試料が、生体由来の混合試料であって、個体間や病態間での糖鎖構造の差を一斉解析することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
糖鎖に相互作用を示す複数種のタンパク質が、レクチンであり、複合糖質が糖タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
レクチンが糖認識能毎にグループ分けして配置固定化されていることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グループ分けして配置固定化されたレクチンが、フコース認識レクチン群、シアル酸認識レクチン群、ラクトサミン構造認識レクチン群、ガラクトース認識レクチン群、ガラクトサミン認識レクチン群、マンノース認識レクチン群、及びキチン構造認識レクチン群に属するタンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
レクチンとともに、さらに糖タンパク質のコアタンパク質部分を認識する抗体が固定化された基板に、被験糖タンパク質を接触させ、各レクチン毎の蛍光強度と、糖タンパク質と抗体との結合に基づく蛍光強度とを測定することを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  生体の生命機能を担う主役であるタンパク質が、細胞社会の中において秩序正しく機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が大変に重要な役割を担っている。生体内のほとんどのタンパク質は糖鎖による修飾をうけており、タンパク質に付加した糖鎖がウィルスの感染、原虫の寄生、感染、毒素の結合、ホルモンの結合、受精、発生分化、タンパク質の安定性、がん細胞転移、アポトーシスなど、生命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが近年次々と明らかになってきた。【０００３】  糖鎖機能の解析のためには、まずその糖鎖の構造解析が欠かせない。今後も糖鎖構造解析法の重要性は増すことが予想される。しかし糖鎖の構造解析は多大な時間と労力、経験を要することから、従来の手法に基づき完全な構造決定を目指すのではなく、より簡便に、高速、高感度、かつ高精度に多彩な糖鎖構造の特徴を抽出し、相互識別できるシステム開発が期待されていた。【０００４】  マイクロアレイは多種のＤＮＡ・タンパク質等の固定化試料を高密度に固相担体（ガラス・メンブレン・シリコンチップ）上にスポット状に固定化したものの総称であり、固定化した多種の試料スポットに対して特異的に結合する分子（以下プローブ）の有無を検出することが可能である。プローブ分子には一般的には蛍光標識化されたものが用いられており、プローブ溶液をアレイ表面と反応させた後に、蛍光検出スキャナーで観察することにより各試料スポットに結合したプローブ分子の定量的解析を行うことができる。米国Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社がＤＮＡマイクロアレイを開発して以来、マイクロアレイは非常に広範な研究分野において使用され、人類に様々な新しい知見をもたらしてきた。【０００５】  第三の生命鎖と呼ばれる糖鎖の構造・機能情報を研究する上で、マイクロアレイを利用した糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質（糖結合性タンパク質、例えば、レクチン等）の迅速かつ高感度な大規模相互作用解析が可能となれば、基礎研究から医療診断や産業応用に至るまで、広範囲に利用されうる非常に有用なツールになることが考えられる。【０００６】  糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の結合は抗原抗体反応の一般的な解離定数（Ｋｄ＝１０−８以下）等に比べて、一般的に弱い相互作用であることが知られており、これらの解離定数（Ｋｄ）は１０−６Ｍかそれ以上であることが多い。また糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の相互作用は比較的速い解離−会合反応から成り立っていることが知られており、結果的に一般的なタンパク質間相互作用や相補的ヌクレオチド断片間の相互作用に比べ、洗浄操作などにより解離側に平衡が傾きやすい。例えば、レクチンを糖タンパク質固定化カラム等にて精製を行う際にも、レクチンの結合が弱い場合は洗浄操作中にレクチンがカラム外に流出してしまう現象がしばしば観察される。【０００７】  従来のスライドガラスを用いた一般的なマイクロアレイ技術では、プローブ溶液を固定化試料と接触させて結合反応に至らしめる過程後にプローブ溶液を洗浄・除去し、ジェットガスや遠心機を用いてスライドガラスに付着している水分を完全に除去する操作を行った後に、マイクロアレイスキャナーを用いてイメージングを行う。これは一般的なマイクロアレイリーダーが、水分の付着した状態でスライドガラス上の蛍光を観察することが出来ないことに起因している。このようにスキャニングの前段階でプローブ溶液を除去しても、相補的ヌクレオチド断片や抗原−抗体反応等、強い結合を示す相互作用においては解離速度定数が十分に小さいため、プローブ分子の解離反応は容易に進行しないと考えられる。しかし、糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間に一般的に見られる解離速度定数の大きい、すなわち弱い相互作用の観察に際しては、プローブ溶液の除去・洗浄操作を行う時点で糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の解離反応が進行してしまい、平衡状態下での正確な相互作用情報を得ることが困難になる。このため、マイクロアレイにおいて糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の平衡状態での相互作用情報を精密に解析する場合、このプローブ溶液の洗浄操作が大きな問題点となる。【０００８】  ＤＮＡマイクロアレイは現在大変広範囲に利用されている。タンパク質のマイクロアレイについてもＤＮＡの転写産物であるタンパク質の生体内での機能を解明する等の基礎研究分野やタンパク質の量的・質的な変化に基づいた診断・判断等の応用分野においても、将来の利用が期待されており、研究面においても世界中で活発な研究が行われてきた。しかしタンパク質マイクロアレイの開発・普及はＤＮＡマイクロアレイに比べ、圧倒的に遅れているのが現状である。この原因の一つとして、様々に異なる性質を持つタンパク質試料を、活性を保ったままの状態で、一定の割合で固定化していくという工程が技術的に大変に難しいということが、以前より多くの研究者によって指摘されている。【０００９】  タンパク質をアレイ上に固定化する方法として、最も初期に開発された方法としてＰＶＤＦ膜（非特許文献１）に代表されるメンブレン上にタンパク質を物理的に吸着させる方法が挙げられる。転写因子など一部のタンパク質では、ある程度の活性を維持できると報告されているが、一般性には乏しい。またメンブレン上に固定化する場合、アレイの高密度化に限界があった。高密度化を達成するために、金属やガラスなどの固体表面に対してタンパク質を固定化していく方向で研究が進められてきたが、一般にタンパク質は金属やガラスなどの固体表面への接触によって変性しやすいという性質を持つ。このため、固体表面とタンパク質を架橋するための何らかのリンカーを使用する固定化方法が、鋭意研究・開発されてきた。【００１０】  タンパク質の変性の問題を軽減する手法の一例としては、スライドガラス上に厚さ１０〜１００μｍのポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパク質をスポットする手法が挙げられる（非特許文献２および３）。この場合、タンパク質は３次元空間に固定化されるために、２次元表面に固定化する手法に比べて、量的に１００倍以上の向上が望めるという。また、タンパク質を多孔性ポリアクリルアミドゲル内にアミノ基を介して固定化する方法もある（非特許文献４）。しかしこれらの方法は高価で特殊なスライドガラスを作製する必要があり、一般的な普及には至っていない。また固定化されたタンパク質の層に厚みがあることは、検出法によって���好ましくないこともある。【００１１】  現在最も精力的に研究されている固相へのタンパク質固定化法として、何らかのタグを付加した形でタンパク質を発現し、タンパク質のタグ部分を介した固相担体への固定化を行う方法がある。この方法ではタンパク質の有効リガンド濃度が向上するといった効果やタンパク質の向きをそろえることが原理的に可能であるといわれている。このような手法の一例として、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法や（非特許文献５）、アビジン−ビオチンを介した固定化法（特許文献１）を挙げることができる。【００１２】  このような方法はタンパク質の活性を保ったまま固定化する、あるいは固定化率をそろえるという点で有効な方法であると考えられる。しかしマイクロアレイに固定化しようとするすべてのタンパク質について遺伝子レベルでタグを付加し、大腸菌、ないし無細胞系等で発現及び精製を行うことは多額のコストと莫大な労力が必要となると考えられる点で、現時点で一般的な研究者が自在かつ個々の要求に合わせる形で気軽に利用することは難しい。【００１３】  これに対し、タンパク質の官能基を固相担体との固定化に利用する方法は、天然から抽出したままのタンパク質や市販のタンパク質試料をそのまま固定化し、マイクロアレイに利用できるという特徴をもつ。タンパク質中のアミノ基を介した固相担体への固定化方法としては、固相表面に結合させた活性エステル基を介してタンパク質を固定化する方法や、固相表面に配置したエポキシ基を介してタンパク質を固定化する手法が挙げられる（非特許文献６）。タンパク質をアミノ基を介して固定化する方法はシンプルな方法であるが、市販のタンパク質や生体抽出・成分、特定のタグのない組み換えタンパク質等においても簡便に固定化することができるため、個々の使用者が自分の目的に合わせ、自在にタンパク質を選択し、迅速かつ安価に目的にあったマイクロアレイに最適化して使用することができる。タンパク質のアミノ基を介した固定化方法の欠点としては、タンパク質中のリジン残基の数が個々のタンパク質によって異なることや、固定化に用いられるリジン残基の位置によってはタンパク質の不活化が起こる可能性等が挙げられる。【００１４】
【特許文献１】特許出願２００１−５２０１０４
【特許文献２】特許公開平８−２０１３８３
【特許文献３】特許公表２００２−５４４４８５
【非特許文献１】Ｌ．Ｊ．Ｈｏｌｔ，Ｋ．Ｂｕｓｓｏｗ，Ｇ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｉ．Ｍ．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，Ｅ７２，２０００
【非特許文献２】Ｄ．Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ａ．Ｚａｓｌａｖｓｋｙ，Ａ．Ｇｅｍｍｅｌｌ，Ｖ．Ｓｈｉｃｋ，Ｄ．Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ，Ｐ．Ａｒｅｎｋｏｖ，Ａ．Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，２０３−２１１，１９９７
【非特許文献３】Ａ．Ｌｕｅｋｉｎｇ，Ｍ．Ｈｏｒｎ，Ｈ．Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｋ．Ｂｕｓｓｏｗ，Ｈ．Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｇ．Ｗａｌｔｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０，１０３−１１１，１９９９
【非特許文献４】Ｐ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，２２５−２２９，２００２
【非特許文献５】Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１−２１０５，２００１
【非特許文献６】Ｈ．Ｚｈｕ，Ｊ．Ｆ．Ｋｌｅｍｉｃ，Ｓ．Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｋ．Ｇ．Ｋｌｅｍｉｃ，Ｄ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ａ．Ｒｅｅｄ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２６，２８３−２８９，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】  本発明の目的は、より簡便に、高速、高感度、かつ高精度に糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】  本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。
タンパク質のアミノ基を介した固定化方法では、一般的にタンパク質内のランダムな位置で固相担体との架橋が起こるため、ある確率で活性が損なわれてしまう分子もありうるが、逆に、ある確率でタンパク質の活性が生き残る可能性が高い（タンパク質が全滅する危険性が小さい）。多数の性質の異なるタンパク質や性質が未知であるタンパク質を固定化していくことを想定したマイクロアレイにおいては、このような性質は実用上、非常に有用である。【００１７】  そこで、本発明者らは、レクチンアレイを作製するに当たりマイクロアレイの実用面・応用面での有用性、解析目的対象物に対する即応性、市場での競争力（コスト面も含む）等を総合的に考慮すると現時点ではタンパク質のアミノ基を利用した固定化法が最適であると判断した。本発明ではアミノ基を介した固定化法の最適条件をシグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）とタンパク質固定化密度の向上を目指し多角的に検討した。【００１８】  その結果、スライドガラス表面に３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）コートを施すことにより、タンパク質試料は、従来製品よりＳ／Ｎ比の高い条件で固定化された。さらに、本発明者らは、複数の穴を有するラバーを貼り付けることで、ガラス上に複数の反応槽を形成させた基板を作成し、レクチンのスポット周囲に正確に蛍光標識化プローブ溶液を満たすことを可能にした。また、レクチンをスポットし、ＰＢＳＴで洗浄することで、レクチン固定化密度の向上を図り、糖鎖−レクチン間の弱い相互作用をより感度良く検出することに成功した。【００１９】  本発明では、レクチン−糖鎖間の平衡状態での相互作用情報を精密に解析する上での大きな問題点であったプローブ溶液の洗浄除去操作が不要となり、従来法では洗浄時に洗い流されてしまうような弱い相互作用をも検出することが可能となった。【００２０】  このように、固定化方法および検出方法の改良より、レクチンアレイの実用化が可能となった。すなわち本発明は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法に関し、以下の〔１〕〜〔２２〕を提供するものである。
〔１〕以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法。
（ａ）糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に蛍光標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させる工程
（ｂ）基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程
〔２〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）である、〔２〕に記載の方法。
〔４〕以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法。
（ａ）被検複合糖質が固定化された基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接触させる工程
（ｂ）基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程
〔５〕被検複合糖質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法。
（ａ）複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に被検複合糖質を接触させる工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接触させる工程
（ｃ）基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程
〔８〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板である、〔７〕に記載の方法。
〔９〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す抗体である、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕励起光がエバネッセント波である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕複合糖質が、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質である、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板であって、糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板。
〔１５〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）である、〔１４〕に記載の基板。
〔１６〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す抗体である、〔１４〕または〔１５〕に記載の基板。
〔１７〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、〔１４〕または〔１５〕に記載の基板。
〔１８〕複合糖質が、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質である、〔１４〕〜〔１７〕のいずれかに記載の基板。
〔１９〕以下の工程を含む、基板の製造方法。
（ａ）基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質を固定化する工程
〔２０〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す抗体である、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、〔１９〕に記載の方法。
〔２２〕複合糖質が、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質である、〔１９〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のシステムの構成図である。検出手段は、マイクロアレイスキャナー装置である。
【図２】本発明のシステムにおけるコンピューターの構成図である。記憶手段６には、マイクロアレイスキャナー装置を利用したシステムの処理を実行するためのプログラム６１〜６３が少なくとも格納されている。記憶手段（データベース）７には、糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報、および／または該相互作用情報の組み合わせパターン情報が格納されている。
【図３】ガラス表面に対するＧＴＭＳの反応過程を示す図である。ＧＴＭＳのアルコキシシリル基は水で加水分解されてシラノール基となる。このシラノール基は不安定で、経時変化により部分的に縮合してオリゴマー状態になり、続いてガラス表面に水素結合的に吸着する。その後、ガラスを乾燥処理することでガラス表面のシラノール基と脱水縮合反応が起こり、強固な共有結合となる。
【図４】本実施例で用いた８つの反応槽を形成させた基板を示す図である。新規設計した８穴ラバーの厚さは１ｍｍであり、専用のアジャスター上でスライドガラスと密着させることによってスポット周囲に正確に蛍光標識化糖プローブ溶液を満たすことが可能となる。反応槽内に満たす試料の最適量は５０μＬである。
【図５】２種のレクチンを固定化したアレイ上にＣｙ３−ＡＳＦ溶液を加えた、レクチンアレイの性能実験の概念図である。
【図６】固定化時のレクチン溶液濃度とスポットの蛍光強度との関係を示す図及び写真である。親和定数の高いレクチン−糖鎖間の相互作用の検出においては、スポットするレクチン試料の濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上に高濃度化することがシグナル強度の向上に有効であることが分かった。
【図７】レクチン−糖鎖相互作用の検出と、阻害糖による相互作用への影響を示す図及び写真である。ＲＣＡ１２０のスポットにおいて強い蛍光が、またＥＷ２９（Ｃｈ）のスポットにおいては中程度の蛍光が観察された。
【図８】阻害糖のレクチン−糖鎖相互作用への影響をグラフとして示す図である。ラクトース（競合阻害糖）共存下で実験を行った。共存するラクトース（競合阻害糖）の濃度増加に従って、スポットの蛍光強度が減少していることから、蛍光糖タンパク質プローブの結合はレクチンと糖鎖間の糖特異的結合反応であるということが確認できた。
【図９】各糖鎖関連アレイと糖鎖の相互作用の模式図である。Ａ：レクチンアレイ、およびプローブとして糖鎖を用いた場合の模式図である。蛍光標識糖鎖の構造類推に用いることができる。なお、糖鎖は、間接的に蛍光標識することもできる。Ｂ：レクチンアレイ、およびプローブとして糖タンパク質を用いた場合の模式図である。タンパク質上の糖鎖構造の類推に用いることができる。なお、糖鎖は、間接的に蛍光標識することもできる。Ｃ：糖ペプチドアレイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の模式図である。分画したペプチド上の糖鎖構造の類推に用いることができる。Ｄ：糖タンパク質アレイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の模式図である。２次元分画したタンパク質上の糖鎖構造の類推に用いることができる。Ｅ：抗体アレイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の模式図である。クルードな糖タンパク質上の糖鎖構造の類推に用いることができる。
【図１０】レクチン−抗体ハイブリッドアレイの実施例を示す写真である。具体的には、７種のレクチンと２種の抗体を固定化したアレイに対して、各モデルタンパク質を蛍光標識化したプローブ溶液を接触させ、平行化した後にエバネッセント励起型スキャナーを用いて観察した結果を示す。
【図１１】８つの反応槽を使用して、同一スライド上に異なる濃度の阻害糖を共存させて、相互作用の阻害を観察した結果を示す写真及び図である。（Ａ）ＲＣＡ１２０とＡＳＦの結合にラクトースを加えたケース、（Ｂ）ＣｏｎＡとＲＮａｓｅ  Ｂの結合にマンノースを加えたケースである。
【図１２】マウス肝由来糖ペプチドサンプルのＨＰＬＣ分画フラクションを固定化した、糖ペプチドアレイの検出実験の結果を示す図及び写真である。図中、Ｆｕｃはフコース認識レクチン群、Ｓｉａはシアル酸認識レクチン群、Ｌａｃはラクトース認識レクチン群、Ｇａｌはガラクトース認識レクチン群、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン認識レクチン群、Ｍａｎはマンノース認識レクチン群、Ｃｈｉｔｉｎはキチン認識レクチン群を意味する。
【図１３】レクチンアレイの検出に糖ペプチドプローブを用いる実験の結果を示す写真及び図である。
【図１４】生体由来のクルードな試料をプローブ化した際のレクチンアレイによる解析結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  本発明は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供する。本発明の方法は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に蛍光標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させる工程、および、基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程を含む。【００２３】  本発明における糖鎖としては、例えば、糖タンパク質系糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖とＯ−結合型糖鎖）、糖脂質系糖鎖、グリコサミノグリカン系糖鎖、または多糖類由来オリゴ糖鎖などが挙げられる。また、１）Ｎ−結合型糖鎖としては、高マンノース型・混成型・複合型からなるＮ−結合型糖鎖など、２）Ｏ−結合型糖鎖としては、ムチン型（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ）・Ｏ−Ｆｕｃ型・Ｏ−Ｍａｎ型・Ｏ−Ｇｌｃ型などからなるＯ−結合型糖鎖など、３）糖脂質系糖鎖としては、ガングリオ系列・グロボ系列ウクト・ネオラクト系列糖鎖など、４）グリコサミノグリカン系糖鎖としては、ヒアルロン酸・ケラタン硫酸・ヘパリン・ヘパラン硫酸・コンドロイチン硫酸・デルマタン硫酸など、５）多糖類由来オリゴ糖鎖としては、キチン、セルロース、カードラン、ラミナリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アラビノガラクタン、アルギン酸、フルクタン、フコイダン、キシランなどに由来するオリゴ糖鎖などが例示できる。【００２４】  その他の糖鎖としては、Ｍ３・Ｍ５Ａ・Ｈｙｂｒｉｄ（ｍｏｎｏａｇａｌａｃｔｏ，ｂｉｓｅｃｔ）・ＮＡ１・ＮＡ１（α１−６Ｆｕｃ）・ＮＡ２（ｍｏｎｏａｇａｌａｃｔｏ）・ＮＡ２（ｍｏｎｏａｇａｌａｃｔｏ，ｂｉｓｅｃｔ）・ＮＡ２・ＮＡ２（α１−６Ｆｕｃ）・Ａ２・ＮＡ２（ｂｉｓｅｃｔ）・ＮＡ３・ＮＡ３（α１−６Ｆｕｃ）・ＮＡ４・ＮＡ４（α１−６Ｆｕｃ）・ＮＡ５（ｐｅｎｔａａｇａｌａｃｔｏ，ｂｉｓｅｃｔ）・Ｌａｃｔｏｓｅ・ＧＡ２・ＧＡ１・ＧＭ３−ＮｅｕＡｃ・ＧＭ３−ＮｅｕＧｃ・ＧＭ１・ＧＭ２・ＧＤ１ａ・ＧＤ１ｂ・ＧＤ３・Ｇｂ３・Ｇｂ４・Ｆｏｒｓｓｍａｎ・ＬＮｎＴ・ＬＮＴ・Ｇａｌｉｌｉ  ｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ・Ｂ−ｈｅｘａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ・ＬＮＦＰ−Ｉ・ＬＮＦＰ−ＩＩ（Ｌｅａ）・ＬＮＦＰ−ＩＩＩ（ＬｅＸ）・ＬＮＦＰ−ＩＩ（Ｌｅｂ）・Ａ−ｈｅｘａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ・Ａ−ｈｅｐｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ・Ｂ−ｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ・６’Ｓｉａｌｙｌ  Ｌａｃｔｏｓｅ・ｐＬＮＨ・βＧａｌＬａｃ・βＧａｌ２Ｌａｃ・ＬＮ３・ＧＮ３・ＧＮ４・ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ・Ｓｉａｌｙｌ  ＬｅＸなどを挙げることができる。【００２５】  また、本発明において、複合糖質とは、糖鎖を持つ生体内高分子の総称である。本発明の複合糖質としては、糖タンパク質（糖ペプチドも含む）、プロテオグリカン、糖脂質が挙げられる。【００２６】  本発明の糖鎖に相互作用を示すタンパク質には、糖鎖に相互作用を示すペプチドも含まれる。本発明の糖鎖に相互作用を示すタンパク質としては、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、これらの変異体、または糖鎖に相互作用を示す抗体などが挙げられる。【００２７】  上記レクチンとしては、動・植物、真菌、細菌、ウィルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」、真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」、多細胞動物に広く存在し、「セレクチン」、「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」、動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」、植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」、およびこれと構造類似性をもち動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」、リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６−リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」、グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」、免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「Ｉ型レクチン」などが挙げられる。【００２８】  その他のレクチンとしては、ＡＣＡ（センニンコクレクチン）・ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン）・ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン）・ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン）・ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン）・ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）・ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ  Ｔｒｅｅレクチン）・ＧＮＡ（ユキノハナレクチン）・ＧＳＬ  Ｉ（グリフォニアマメレクチン）・ＧＳＬ  ＩＩ（グリフォニアマメレクチン）・ＨＨＬ（アマリリスレクチン）・ジャカリン（ジャックフルーツレクチン）・ＬＢＡ（リママメレクチン）・ＬＣＡ（レンズマメレクチン）・ＬＥＬ（トマトレクチン）・ＬＴＬ（ロータスマメレクチン）・ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン）・ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン）・ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン）・ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメレクチン）・ＰＮＡ（ピーナッツレクチン）・ＰＳＡ（エンドウレクチン）・ＰＴＬ−Ｉ（シカクマメレクチン）・ＰＴＬ−ＩＩ（シカクマメレクチン）・ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン）ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン）・ＳＢＡ（ダイズレクチン）・ＳＪＡ（エンジュレクチン）・ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン）・ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン）・ＳＴＬ（ジャガイモレクチン）・ＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン）・ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン）・ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｓｔｉｎｇｉｎｇ  Ｎｅｔｔｌｅレクチン）・ＵＥＡ  Ｉ（ハリエニシダレクチン）・ＶＦＡ（ソラマメレクチン）・ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン）・ＷＦＡ（フジレクチン）・ＷＧＡ（パンコムギレクチン）などを挙げることができる。【００２９】  上記糖結合ドメインを有する酵素タンパク質としては、各種グリコシダーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ）、および糖転移酵素（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＧａｌＮＡｃ転移酵素）などが例示できる。また、糖鎖に親和性を有するサイトカインとしては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などが例示できる。また、糖鎖に相互作用を示す抗体としては、糖鎖関連腫瘍マーカー（ＣＡ１９−９、フォルスマン抗原、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シアリルＴ抗原）、血液型関連糖鎖（Ａ，Ｂ，Ｈ，Ｌｅａ，Ｌｅｘ抗原）、分化関���抗原（Ｉｉ，ＳＳＥＡ−１−４）に対する抗体などが例示できる。【００３０】  本発明における基板としては、ガラス、石英ガラス、合成石英ガラスなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。また、本発明における糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板である。【００３１】  エポキシ基を活性基として有する化合物としては、好ましくは３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）が挙げられるが、これに限定されない。その他に、２−（３、４エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、または分岐したスペーサーの先端にエポキシ基を複数持つシランカップリング化合物で、好ましくはスペーサーとしてポリエチレングリコールやタンパク質、ビオチン・アビジン等を含む化合物などが例示できる。【００３２】  本発明の、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板は、下記の方法で作成することができる。【００３３】  まず、基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする。例えば、エポキシ基を活性基として有する化合物としてＧＴＭＳを用いる場合、実施例に記載の方法で行うことができる。具体的には、スライドガラスを１０％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液に浸し、容器ごと振盪させた状態で１時間放置しガラス表面を処理し、これを十分量の精製水（ミリＱ水）により洗浄した後、６０℃のオーブン内で乾燥させる。次にスライドガラスを２％ＧＴＭＳアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら１時間反応させる。
ＧＴＭＳのアルコキシシリル基は水で加水分解されてシラノール基となっており、このシラノール基は不安定で、経時変化により部分的に結合してオリゴマー状態になり、続いてガラス表面に水素結合的に吸着する。反応後、スライドガラスを１１０℃のオーブン内で８時間乾燥させる。乾燥処理により、ガラス表面のシラノール基と脱水縮合反応が起こり、強力な共有結合となる。一連のＧＴＭＳコーティング方法を図３に示す。【００３４】  次に、エポキシ基を活性基として有する化合物をコーティングした基板に、糖鎖に相互作用を示すタンパク質を固定化する。糖鎖に相互作用を示すタンパク質の固定化は、共有結合によって行われる。具体的には、該基板にアミノ基を活性基として有する化合物をスポットし、反応させることで固定化することができる。スポッターとしては、日本レーザ電子社製ＳＴＡＭＰＭＡＮなどを利用することができる。糖鎖に相互作用を示すタンパク質がレクチンである場合、スポットするレクチンの濃度は、特に限定はないが、１ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。さらに、より好ましくは、スポット処理後Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）で洗浄することにより、未結合レクチンを除去することができる。【００３５】  上記糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板は、複数の反応槽を形成させた基板であることが好ましい。より好ましくは、複数の穴を有するラバーを貼り付けることで、複数の反応槽を形成させた基板である。一例としては、実施例に記載のように、糖鎖に相互作用を示すタンパク質を固定化したスライドガラスに対し、本発明者らが設計・開発した８穴ラバーを所定の位置に貼り付け、８つの反応槽を作製させる。この８穴ラバーには８つの長方形の穴が規則正しく空いており、スライドガラスに貼り付けたときに８つの反応槽を形成することができる。この反応槽に蛍光標識化プローブ溶液を満たすことで、糖鎖に相互作用を示すタンパク質との接触を円滑に行うことが可能になる。また、この反応槽は８穴ラバーに限定されるものではなく、例えばガラス表面の非スポット領域を撥水コートすることで反応場を形成することも可能である。より好ましくは反応場を多数化することである。本発明においては、同一基板上に複数種の糖鎖に相互作用を示すタンパク質をスポットして用いることもできる。【００３６】  本発明の方法では、上記糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に蛍光標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させる。【００３７】  本発明において、被検糖鎖または被検複合糖質の蛍光標識剤としては、２−アミノピリジン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、フルオレセイン骨格を持つ蛍光色素各種、モレキュラープローブス社製蛍光色素Ａｌｅｘａシリーズ、量子ドット蛍光色素が挙げられるが、糖鎖を蛍光標識する性質を有する物質であれば、これらに限定されない。【００３８】  被検糖鎖または被検複合糖質は、直接的または間接的に蛍光標識することができる。被検糖鎖と予め蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を結合させることにより、被検糖鎖を間接的に蛍光標識できる。【００３９】  また、予め蛍光標識したタンパク質であって、被検複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を示すタンパク質（例えば被検複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を示す抗体）と被検複合糖質を結合させることにより、被検複合糖質を間接的に蛍光標識できる。【００４０】  また、予め蛍光標識したタンパク質であって糖鎖に相互作用を示すタンパク質と被検複合糖質を結合させることによっても、被検複合糖質を間接的に蛍光標識できる（この場合、被検複合糖質が有する糖鎖のうち、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が結合した糖鎖以外の糖鎖が基板に結合する）。【００４１】  例えば、標的複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を示す予め蛍光標識した抗体を、標的複合糖質試料を含むサンプル・血液・体液・生体抽出成分・食品成分等のクルードな試料に作用させることで、クルードな試料から標的複合糖質を分離・精製することなく選択的に蛍光標識できる。また、予め蛍光標識した上記抗体を作用させたクルードな試料を、例えばレクチンが固定化された基板に接触させることで、標的複合糖質の糖鎖情報だけを選択的に観察できる。【００４２】  本発明の方法では、次いで、基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、それぞれの糖鎖に相互作用を示すタンパク質に対する被検糖鎖または被検複合糖質の相互作用を測定する。【００４３】  糖鎖に相互作用を示すタンパク質と被検糖鎖または被検複合糖質の相互作用は一般的に良く知られているタンパク質間相互作用などに比べて弱いため、プローブ溶液の除去・洗浄操作を行うことで糖鎖に相互作用を示すタンパク質と被検糖鎖または被検複合糖質間の解離反応が進行してしまい、平衡状態下での正確な相互作用情報を得ることが出来ないケースが生じていた。【００４４】  本発明者らは上記問題を、プローブ溶液の洗浄を行うことなく、励起光を作用させて励起される蛍光の強度を測定することで解決した。より具体的には、励起光を基板の固定化されていない面から入射して、励起された蛍光を検出する測定方法である。本発明における励起光としては、特に限定はなく、白色光から切り出した光源、好ましくは単一波長からなるレーザ光、より好ましくはエバネッセント波が挙げられる。励起光の検出は、エバネッセント型励起マイクロアレイスキャナーの使用が好ましいが、その他に共焦点型マイクロアレイスキャナーを使用することもできる。【００４５】  例えば、エバネッセント励起方式では励起光をガラス内部で全反射させた際に界面からの高さ２００〜３００ｎｍ（励起波長の半分程度）の範囲に、エバネッセント光と呼ばれる微弱光がしみ出し、このエバネッセント光により蛍光物質を励起するために、プローブ分子を含む溶液をスライドガラス上に接触させた状態で励起光を入射して蛍光を観察する際にも、ブラウン運動をしているプローブ分子をほとんど励起することなく、結合反応に預かるプローブ分子を選択的に観察することができる。【００４６】  本発明の方法は、蛍光標識した被検糖鎖と基板に固定化された糖鎖に相互作用を示すタンパク質との相互作用を利用した糖鎖構造解析に用いることができる。すなわち本発明の方法は、糖鎖構造解析を迅速・簡便に行う糖鎖プロファイラーとしての応用が期待される。例えば、蛋白質核酸酵素２００３年８月号増刊Ｖｏｌ．４８．ＮＯ．１１に記���のプロファイリング方法が応用可能である。【００４７】  すなわち、本発明は、コンピューターを用いた糖鎖構造分析システムに利用可能である。該システムを使用することで、被検糖鎖が既知構造を有している場合は被検糖鎖の構造を同定することができ、被検糖鎖が未知構造を有している場合であっても被検糖鎖中に存在する特徴的な構造（α２−３シアル酸・α２−６シアル酸・α１−３ガラクトース・α１−３フコース・α１−６フコース・バイセクトＮ−アセチルグルコサミン・硫酸化など）の予測、ないし既知構造糖鎖との類似性を指摘することができる。このシステムは、蛍光標識した被検糖鎖を接触させた糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定化された基板をマイクロアレイスキャナー装置にセットすると、自動的に、被検糖鎖の構造が表示されるシステムである。本発明のシステムでは、糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定化された基板に蛍光標識した被検糖鎖を接触させる工程を自動化することもできる。すなわち、微小流路系を基板上の反応槽に導き、流路内に送液する溶液の種類・濃度・流速をコントロールすることで、ブロッキングやブロッキング液の洗浄除去工程、蛍光標識糖鎖溶液の接触工程を一元的にコントロールすることができる。本発明のシステムには質量分析や、酵素消化を組み合わせることもでき、これらの方法を用いることでさらに信頼度の高いデータを得ることができるため、大変に有用である。【００４８】  図１に本発明のシステム構成図の一例を示す。マイクロアレイスキャナー装置を用いたシステムは以下から構成される。
（ａ）糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報が格納されている記憶手段（データベース）
（ｂ）糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定化された基板に、蛍光標識した被検糖鎖を接触させ、洗浄操作を行わずに、該基板に励起光を入射し、励起される蛍光の強度を検出する検出手段
（ｃ）検出された蛍光強度の組み合わせ情報を、（ａ）に格納されている情報と照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出する演算手段を含むコンピューター
（ｄ）選出結果を表示する表示手段【００４９】  データベースについては、図１のようにコンピューターの外部にある場合、図２のようにコンピューター内部にある場合、共に許容される。また、該データベースを利用することで、限定されたレクチン数であっても多種類の糖鎖を識別することが可能である。理論的には１０種類のレクチンであってもその特異性が異なる場合、識別可能な糖鎖の種類は６１０＝６０，４６６，１７６となり、事実上自然界に存在する殆どの糖鎖構造の識別が可能である。【００５０】  図２に、本発明のシステムにおけるコンピューター構成図の一例を示す。入力手段１と出力手段２がバス線３に接続されている。一時記憶手段４は、入力された情報、および算出された情報などを一時的に記憶する。中央処理装置（ＣＰＵ）５は、本発明のプログラムの命令を受けて各種演算を行う。記憶手段（データベース）７には、糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報、および／または該相互作用情報の組み合わせパターン情報が格納されている。相互作用情報として、本発明のマイクロアレイスキャナー装置を利用した方法やシステムによって得られた蛍光強度情報、また、これまでに確立されている様々な実験系から得られた情報が利用可能である。【００５１】  記憶手段６には、本発明の処理を実行するためのプログラムを含む各種プログラムが格納されている。本発明の処理を実行するためのプログラムには、入力された蛍光強度の組み合わせ情報を、データベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報と照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖（データベースに格納されている構造既知糖鎖情報）を１つないし複数選出するプログラム６１、表示プログラム６２、およびこれらを制御するためのプログラム６３が少なくとも含まれる。【００５２】  相互作用情報の組み合わせ情報の照合過程においては、相互作用情報の組み合わせ情報の値同士を比較してもよい。プログラム６１には、例えば、入力された蛍光強度の組み合わせ情報の値とデータベースに格納されている相互作用情報の組み合わせ情報の値を比較して、その値の近さから構造既知糖鎖を１つないし複数選出する機能が組み込まれていてもよい。【００５３】  また、相互作用情報の組み合わせ情報の照合過程においては、相互作用情報の組み合わせ情報をパターン化して、そのパターン同士を比較してもよい。このような観点から、記憶手段６には、プログラム６１の代わりに（または、プログラム６１とともに）、入力された蛍光強度の組み合わせ情報をパターン化するプログラム６１−１、データベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報をパターン化するプログラム６１−２、および、入力された蛍光強度の組み合わせ情報のパターンを、データベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報のパターンと照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出するプログラム６１−３が格納されていてもよい。こ��パターン化に際しては、適切な内部標準を用いて相互作用情報の規格化を行うことも可能である。プログラム６１−１や６１−２には、例えば、任意の設定スレッショルド値が入力されることで、そのスレッショルドの範囲に相互作用情報をレベル分けし、コード化する（各レベルに対して、例えば異なる数字や異なる色を当てはめる）機能が組み込まれている。【００５４】  プログラム６１−３は、プログラム６１−１を実行して得られるパターンを、プログラム６１−２を実行して得られるパターンと照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出するプログラムである。なお、データベースにパターン情報が格納されている場合は、プログラム６１−３は、プログラム６１−１を実行して得られるパターンを、データベースに格納されているパターンと照合し、パターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出する。プログラム６１−３には、例えば、構造既知糖鎖のコードと被検糖鎖のコードを比較して、被検糖鎖とコードが一致する構造既知糖鎖を選出する機能が組み込まれている。【００５５】  プログラム６２は、例えば、蛍光強度情報の表示、相互作用情報の表示、選出された構造既知糖鎖情報の表示などを行う。【００５６】  本発明においては、上述のプログラムを１つのプログラムにまとめることもできる。【００５７】  本発明のシステムにより実行される処理のフローの一例としては、まず、蛍光標識した被検糖鎖を接触させた糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定化された基板がマイクロアレイスキャナー装置にセットされた場合に、該基板に励起光が入射され、励起される蛍光の強度が検出される。複数の基板がマイクロアレイスキャナー装置にセットされた場合は、該複数の基板が順次自動的に検出部に固定され、スキャニングが行われる。処理のフローの一例としては、次いで、蛍光強度情報が自動的にコンピューターに入力される。入力された情報は、コンピューターの記憶手段または一時記憶手段に格納しておくことができる。また、蛍光強度情報は、データベースに格納されてもよい。蛍光強度情報を蓄積することで、今まで存在しえなかった大規模かつ実用性の高い、糖鎖に相互作用を示すタンパク質に対する糖鎖の相互作用情報データベースを構築することができる。【００５８】  本発明では、中央処理装置（ＣＰＵ）などの演算手段が記憶手段中のプログラム６２の指令を受け、記憶手段または一時記憶手段に格納された蛍光強度情報を読み出し、該蛍光強度情報を表示することもできる。例えば、あらかじめ性状を十分に調査した基準となる糖鎖に相互作用を示すタンパク質試料スポット（内部標準スポット）の発する蛍光強度を基準として、各スポットの輝度値を補正した値を表示することができる。内部標準スポットは複数であってもよい。【００５９】  処理のフローの一例としては、次いで、入力された蛍光強度の組み合わせ情報を、データベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報と照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出する。この処理工程は、中央処理装置（ＣＰＵ）などの演算手段が��憶手段中のプログラム６１の指令を受け、記憶手段または一時記憶手段に格納された蛍光強度の組み合わせ情報とデータベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報を読み出し、それぞれの組み合わせ情報を照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出する。選出された構造既知糖鎖情報は、コンピューターの記憶手段または一時記憶手段に格納しておくことができる。【００６０】  データベースがコンピューターの外部にある場合は、中央処理装置（ＣＰＵ）などの演算手段が記憶手段中のプログラム６１の指令を受け、データベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報をコンピューターに入力し、記憶手段または一時記憶手段に格納された蛍光強度の組み合わせ情報を読み出し、それぞれの組み合わせ情報を照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を１つないし複数選出する。【００６１】  なお、プログラム６１の代わりに、プログラム６１−１〜６１−３を用いるときも、同様なフローで処理される。【００６２】  処理のフローの一例としては、次いで、選出結果が表示手段によって表示される。この処理工程では、中央処理装置（ＣＰＵ）などの演算手段が記憶手段中のプログラム６２の指令を受け、記憶手段または一時記憶手段に格納された構造既知糖鎖情報を読み出し、表示する。【００６３】  本発明は、被検複合糖質が固定化された基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接触させる工程、および、基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供する。【００６４】  本発明における、被検複合糖質が固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板であり、より好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物が、ＧＴＭＳである基板である。各工程は、上述の方法と同様である。本発明の方法は、基板に固定化された被検複合糖質の糖鎖付加状況を蛍光標識レクチン等により調べることで、生体にあるタンパク質を分離後、各タンパク質成分それぞれについての糖鎖付加状況をタンパク質の一団について一度に調べる（グライコフォーム解析）ことができる手段として有用である。またタンパク質製剤等の糖鎖部分の品質管理チェック等に応用が期待される。【００６５】  本発明は、また、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に被検複合糖質を接触させる工程、該工程で得られた基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接触させる工程、および、基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供する。【００６６】  本発明における、被検複合糖質が固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板であり、より好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物が、ＧＴＭＳである基板である。また、本発明における複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質は、好ましくは、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す抗体である。また、糖鎖に相互作用を示すタンパク質は、好ましくは、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、これらの変異体、または糖鎖に相互作用を示す抗体である。各工程は、上述の方法と基本的に同様であるが、さらに、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板であって、被検複合糖質を接触させた基板に、蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接触させる工程を含む。該工程は、例えば、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に対し、被検複合糖質試料を含むサンプル・血液・体液・生体抽出成分・食品成分等の原液または希釈溶液を接触させ、十分な反応時間を確保した後に、ＰＢＳないしＰＢＳＴで十分に洗浄して被検複合糖質以外の成分を除く。その後に糖鎖部分に相互作用を示す蛍光標識プローブ溶液を接触させることで行うことができる。【００６７】  本発明は、異なる複合糖質の混合物中から、目的としたタンパク質の糖鎖修飾の状況を迅速かつ簡便に調べる方法として有用であり、血液・体液・生体抽出成分・食品成分等の原液または希釈溶液等の様々な成分の混合溶液を精製することなく、目的タンパク質の糖鎖修飾の状況を観察することで、診断・治療状況の把握等を行うような分野での応用が考えられる。【００６８】  本発明は、（ａ）基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする工程、および、（ｂ）工程（ａ）で得られた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質を固定化する工程を含む、基板の製造方法を提供する。該方法の工程は、詳しくは、上述のとおりである。本発明はまた、上記方法で製造された基板も提供する。【００６９】  すなわち、本発明は、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板であって、糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板を提供する。本発明の基板としては、好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）である基板である。また、好ましくは、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す抗体である基板、あるいは、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、これらの変異体、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、基板である。エポキシ基を活性基として有する化合物がレクチンである場合、スポットするレクチンの濃度は、特に限定はないが、１ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。さらに、より好ましくは、ＰＢＳＴで洗浄することでレクチンが固定化された基板である。本発明の基板は、複数の反応槽を形成させた基板であることが好ましい。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７０】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕レクチンアレイを利用した糖鎖とレクチンとの相互作用解析
（１）蛍光標識化糖タンパク質プローブ（Ｃｙ３−ＡＳＦ）の調製
蛍光標識化糖タンパク質プローブとして、アシアロフェツイン（ＳＩＧＭＡ社、以下ＡＳＦ）を５５０ｎｍ付近に吸収極大波長を持つ蛍光色素であるＣｙ３  Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ（アマシャムファルマシア社、以下Ｃｙ３）を用いて蛍光標識化して調製した。ＡＳＦはＮ−結合型糖鎖とＯ−結合型糖鎖を３本ずつ分子中に持ち、かつ糖鎖中の非還元末端のシアル酸キャップが部分的に外れている糖鎖構造を持つことが知られている。ＡＳＦを０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に終濃度１ｍｇ／ｍＬになるよう調製した後、１ｍＬについて１．０ｍｇのＣｙ３粉末と混合させ、１時間、適時攪拌しながら暗所で反応させた。【００７１】  次に担体としてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、遊離のＣｙ３とＣｙ３−ＡＳＦを分離回収し、精製したＣｙ３−ＡＳＦについて吸光光度計を用いて濃度及び蛍光標識効率を測定した。タンパク質ベースの収率は３５−４０％、蛍光標識効率（１タンパク質分子あたりの蛍光色素数）は約３．０であった。【００７２】（２）スライドガラスへのＧＴＭＳコーティング
エポキシ基を活性基として有する３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社、以降ＧＴＭＳ）をコーティングしたスライドガラス（図３）を用い、レクチンをガラス表面に固定化した。ＧＴＭＳコーティングは、松浪硝子工業社製のスライドガラスを用い、以下の手順で行った。スライドガラスを１０％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液に浸し、容器ごと振盪させた状態で１時間放置しガラス表面を処理した。これを十分量の精製水（ミリＱ水）により洗浄した後、６０℃のオーブン内で乾燥させた。次にスライドガラスを２％ＧＴＭＳアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら１時間反応させた。反応後、１１０℃のオーブン内で８時間乾燥させた後、十分量の精製水により洗浄し、乾燥させた。【００７３】（３）スライドガラスへのレクチンの固定化
（２）のＧＴＭＳコーティングを施したスライドガラスにレクチンをスポットした。マイクロアレイスポッターとして日本レーザ電子社製ＳＴＡＭＰＭＡＮを使用し、先端直径０．４０ｍｍのスタンプピンを使用してスポットを行ことで、直径約０．６−０．７ｍｍのスポットをスライドガラス上に配置した。スポットする各レクチンを濃度１ｍｇ／ｍＬ（レクチンによっては一部０．２５ｍｇ／ｍＬ）となるようにリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（以下ＰＢＳ）に溶解した。これを９６穴のＰＣＲ用マイクロタイタープレート（コーニング社）の各反応槽に１０μＬずつ分注したものを、マイクロアレイスポッターにセットした。【００７４】  スライドガラスへのレクチンの固定化操作に際しては以下の条件をマイクロアレイスポッター付属のコンピューターに記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させた。まずスタンプピンを９６穴ＰＣＲ用マイクロタイタープレート内の固定化試料溶液中に１秒間浸した後に引き上げ、スライドガラス表面の所定の位置に１秒間接触させた。この動作を１スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液から横１列に４点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄工程を行った。洗浄工程ではスタンプピンの針先を０．０５％ＳＤＳ溶液に２秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で１５秒間乾燥させ、さらに精製水に２秒間浸した後に、バキューム装置内で１５秒間乾燥、最後にエタノールに２秒間浸してからバキューム装置内で１５秒間の乾燥操作を行った。【００７５】  本実施例では様々な糖結合特異性をもったレクチン４種（ＲＣＡ１２０、ＳＳＡ、組み換え放線菌由来キシラナーゼのキシラン結合ドメイン（以下ＸＢＤ）、組み換えミミズ２９ｋＤａレクチン由来のＣ末端側ドメイン（以下ＥＷ２９（Ｃｈ））とネガティブコントロール１種（ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ））の計５種のタンパク質をスポットした。ＲＣＡ１２０、ＢＳＡについてはＳＩＧＭＡより購入したもの、ＳＳＡは生化学工業より購入したもの、ＸＢＤ，ＥＷ２９（Ｃｈ）については本発明者らの研究室で大腸菌にて発現・精製したものを用いた。【００７６】（４）非スポット面のブロッキング
レクチン溶液をスポット処理後１時間反応させガラス表面に固定化した後、未結合レクチンを洗浄した。洗浄は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）を数回ピペットでスライドガラスに吹き付けるようにかけて洗浄した後、ＰＢＳを用いてさらに十分に洗浄した。【００７７】  このレクチン固定化後のスライドガラスに対し、本発明者らが設計・開発した８穴ラバーを所定の位置に貼り付け、８つの反応槽を作製した（図４）。この８穴ラバーは厚さ１ｍｍからなる黒色のシリコンゴム製で、縦横９．５×７．５ｍｍからなる８つの長方形の穴が規則正しく空いており、スライドガラスに貼り付けたときに８つの反応槽を形成することができる。この反応槽に５０μＬ程度の試料を加えれば、内部を十分量の試料溶液で満たすことができる。【００７８】  レクチンをスポットした領域以外のガラス表面には活性基であるエポキシ基が残存しているため、非スポット面に対するブロッキング操作を行った。なお、ブロッキング剤には高純度ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）を使用した。８つの反応槽内に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を５０μＬずつ満たし、湿度を９０％以上に保った保存容器中で４℃、１時間放置し、スライドガラス上の非スポット面へのブロッキングを行った。反応の間はガラス表面の乾燥防止に留意した。【００７９】  次にスライドガラス上のブロッキング溶液を除去し、ＰＢＳを用いて十分に洗浄した後、水分を除去した。タンパク質固定化後はガラス表面の乾燥によるタンパク質の変性や、乾燥に伴うバックグラウンドの上昇を防ぐため、可及的速やかに次の操作に移った。【００８０】（５）プローブ溶液の添加とスキャニング
（４）で作製したレクチン固定化スライドガラス上の反応槽に相互作用を解析したい蛍光標識化糖タンパク質プローブ溶液を加えた。蛍光標識化糖タンパク質プローブは終濃度１０μｇ／ｍＬになるようＰＢＳに溶解したものを調製し、それぞれの反応槽に５０μＬを滴下した。【００８１】  レクチン−糖鎖間の反応が平衡に達するまで静置した後に、エバネッセント励起方式マイクロアレイスキャナーであるＧＴＭＡＳ  Ｓｃａｎ  ＩＩＩ（日本レーザ電子社）を使用してスライドガラス端面より励起光を入射し、励起されて生じた蛍光発光を、スライドガラス下面に配置されているＩＣＣＤ（イメージインテンシファイアー付電荷結合素子）カメラで検出した。スライドガラスのほぼ全面に対する蛍光イメージをスキャニングし、得られたイメージ画像をＴＩＦＦファイル形式（１枚につき約１００Ｍ  Ｂｉｔｅ）にて保存した。スキャニング時のパラメーターはＧａｉｎ「５０００倍」、積算回数「４回」、露光時間「３３ｍｓｅｃ」で統一した。【００８２】（６）スキャニング画像の数値化
スキャニング画像の数値化には市販のマイクロアレイ用解析ソフトであるＡｒｒａｙ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を使用した。各スポットの輝度を上記解析ソフトを用いて算出し、非スポット領域の輝度をバックグラウンド値とした。各スポットの輝度からバックグラウンド値を差し引いたものを正味の輝度値とし、横列に４点並べた同一試料由来のスポットごとに平均値と標準偏差を算出した。【００８３】  以降は各レクチン試料に対するプローブの結合に対してはこの同一試料由来の４点の平均輝度値を用いて評価を行った。以降に示す各レクチンアレイの性能評価は操作（２）〜（６）の一連の行程を経た後に行われた。【００８４】（７）ＧＴＭＳコートスライドガラスの性能評価
上述のように作製したＧＴＭＳコートスライドガラスの性能を、既存のスライドガラス（６種）と比較評価した。すなわち表面コートされた各スライドガラスに、あらかじめＣｙ３標識したレクチン（１００μｇ／ｍＬ）をアレイ状に固定化し、（３）〜（６）の行程を経た後に、スポッティング領域の輝度値（Ｓ）と非スポッティング表面の輝度値（Ｎ）からＳ／Ｎ比を算出した。その結果、表１に示すように（２）の行程で作製したＧＴＭＳコートスライドガラスの輝度値は、最高値を示したスライドガラスＡの２分の１程度にとどまったが、バックグラウンドが非常に低いため、そのＳ／Ｎは１６．１となり、今回評価したスライドガラスの中で最良値を示した。【００８５】
【表１】
0004374447.tif 000002
【００８６】（８）アレイ上の固定化レクチン濃度の検討（図５および６）
ＲＣＡ１２０とＣｏｎＡはそれぞれ複合型糖鎖と高マンノース型糖鎖に対し高い親和性をもつことが知られる代表的なレクチンである。これらのレクチンを様々な濃度で調製し、同一試料について横に４点並べてアレイ状にスポットした。このアレイの各反応槽に対して１０μｇ／ｍＬのＣｙ３−ＡＳＦを各５０μＬずつアプライして結合反応を起こさせた後に、スキャナーで蛍光を観察した。【００８７】  上述したようにＡＳＦはＮ−結合型糖鎖とＯ−結合型糖鎖を３本ずつ分子中に持ち、かつ糖鎖中の非還元末端のシアル酸キャップが外れラクトサミン構造が突出した糖鎖構造を持つことが知られている。よってＲＣＡ１２０とＣｏｎＡを固定化したレクチンアレイに対し、Ｃｙ３−ＡＳＦを添加した実験系においては、ＲＣＡ１２０が非常に強い親和性を示し、ＣｏｎＡが弱い親和性を示すことが予想された。【００８８】  実験の結果、ＲＣＡ１２０のスポットが強い蛍光を発したのに対し、ＣｏｎＡのスポットは同条件のＲＣＡ１２０のスポットに比べて１／３程度の蛍光強度を示すに止まった。ＣｏｎＡが弱いながらも複合型糖鎖を持つＡＳＦに結合したのは、Ｎ−結合型糖鎖のうちＡＳＦに主として存在する３本鎖型糖鎖には結合できないものの、少量存在するとされる２本鎖型糖鎖には結合できるためと考えられた。またこのデータから同一試料由来の４点についての標準偏差（ＳＤ）は約±２０％程度になるということが分かった（図６）。【００８９】  次にスポット時のレクチン濃度と蛍光強度の関係をグラフ化したところ、スポット時のレクチン濃度と蛍光強度の間に正の相関関係があり、スポットするレクチン試料の濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上に高濃度化することで、効果的にシグナル強度を向上することができることが分かった。すなわち親和定数の小さい（結合の弱い）レクチン−糖鎖間の相互作用の検出は固定化レクチン濃度を上げる事により可能となることが分かった（図６）。【００９０】（９）レクチンアレイの性能評価
様々な糖特異性をもったレクチン４種（ＲＣＡ１２０、ＳＳＡ、ＸＢＤ、ＥＷ２９（Ｃｈ））、とネガティブコントロール１種（ＢＳＡ）の計５種のタンパク質を同一試料について横に４点並べてアレイ状にスポットした。このアレイについて１０μｇ／ｍＬのＣｙ３−ＡＳＦを各５０μＬずつ滴下し、スキャナーで蛍光を観察した。【００９１】  実験の結果ＦＡＣでラクトサミン構造に親和性があると確認することができたＲＣＡ１２０、ＥＷ２９（Ｃｈ）の２種のレクチンのスポットにおいて蛍光シグナルが観察された（図７）。またそれぞれの蛍光強度を比較すると、ＲＣＡ１２０のスポットにおいて強い蛍光が、ＥＷ２９（Ｃｈ）のスポットにおいては中程度の蛍光が観察され、ＦＡＣ解析データと一致した。【００９２】  また同条件のアレイに対しラクトース（競合阻害糖）共存下で同様の実験を行ったところ、阻害糖の濃度上昇に伴って、スポットの蛍光強度の減少が観察された（図８）。このことから、蛍光糖タンパク質プローブとの結合はレクチンと糖鎖間の糖特異的結合反応によるものであることを確認することが出来た。【００９３】〔実施例２〕他の糖鎖関連アレイへの応用
糖鎖関連アレイには、糖鎖をプローブに用いるレクチンアレイの他、糖タンパク質をプローブに用いるレクチンアレイ、レクチンをプローブに用いる糖ペプチドアレイ、レクチンをプローブに用いる糖タンパク質アレイ、レクチンをプローブに用いる抗体アレイの５タイプが挙げられる。図９に、各糖鎖関連アレイと糖鎖の相互作用の模式図を示す。【００９４】  それぞれのアレイを使用して得られた蛍光強度情報をコード化する。輝度値の数値は１６ｂｉｔで取り込まれた数値であるため、０−６５３５５の間の値となる。そこでＧａｉｎ「１０００倍」での（輝度値−バックグラウンド値）の値を１００００刻みで６段階に分類することで０から５までのコード化を行った。Ｇａｉｎ「１０００倍」で輝度信号値が飽和している場合は、Ｇａｉｎを下げて観察しＧａｉｎ「１０００倍」時の値に換算する。信号値が飽和しているかどうかの判定は、Ｇａｉｎ値を変化させた際にＧａｉｎ値と信号強度の相関の直線性が保たれているかどうかで判断する。【００９５】現在のスレッショルド値  （輝度値−バックグラウンド値）
０−１００００              レベル０
１０００１−２００００              レベル１
２０００１−３００００              レベル２
３０００１−４００００              レベル３
４０００１−５００００              レベル４
５０００１以上                      レベル５【００９６】〔実施例３〕  レクチン−抗体を同一区画内にスポットしたアレイによる解析（図１０）
１．材料と方法
（１）モデル糖タンパク質の蛍光標識化プローブの調製
本実験例ではレクチンアレイ上に固定化するレクチンとして、様々な糖結合特異性を持つレクチンとして６種（ＲＣＡ１２０、ＥＣＡ、ＣｏｎＡ、ＧＮＡ、ＳＳＡ、ＳＮＡ）を選択した。またネガティブコントロールとして糖鎖と結合しないタンパク質であるＢＳＡを選択した。また今回の実験では、プローブのコアタンパク部分を認識する抗フェツイン抗体と抗ＲＮａｓｅ抗体の２種を、レクチンと同じ区画内にスポットした。ＧＮＡ、ＳＮＡはＶＥＣＴＯＲ社より購入したもの、ＢＳＡについてはＳＩＧＭＡ社より購入したもの、ＲＣＡ１２０、ＥＣＡ、ＣｏｎＡ、ＳＳＡは生化学工業より購入したものを用いた。【００９７】  モデル蛍光標識化糖タンパク質プローブは、ＡＳＦ、ＦＥＴ、ウシ膵由来リボヌクレアーゼＢ（ＲＮａｓｅ  Ｂ）、またネガティブコントロールとしてウシ膵由来リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）、ＢＳＡなどのタンパク質（全てＳＩＧＭＡ社より購入）を５５０ｎｍ付近に吸収極大波長を持つ蛍光色素であるＣｙ３  Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ（アマシャムファルマシア社、以下Ｃｙ３）を用いて蛍光標識化することで調製した。プローブ作製時は前述のタンパク質を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に終濃度１ｍｇ／ｍＬになるよう調製した後、１．０ｍｇのＣｙ３粉末と混合させ、１時間、適時攪拌しながら暗所で反応させ、担体としてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、Ｃｙ３標識タンパク質を精製した。【００９８】（２）スライドガラスへのＧＴＭＳコーティング
エポキシ基を活性基として有する３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社、以降ＧＴＭＳ）をコーティングしたスライドガラス（図３）を用い、レクチンをガラス表面に固定化した。ＧＴＭＳコーティングは、松浪硝子工業社製のスライドガラスを用い、以下の手順で行った。スライドガラスを１０％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液に浸し、容器ごと振盪させた状態で１時間放置しガラス表面を処理した。これを十分量の精製水（ミリＱ水）により洗浄した後、６０℃のオーブン内で乾燥させた。次にスライドガラスを２％ＧＴＭＳアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら１時間反応させた。反応後、１１０℃のオーブン内で８時間乾燥させた後、十分量の精製水により洗浄し、乾燥させた。【００９９】（３）レクチンアレイの作製
（２）で作製したＧＴＭＳコートスライドガラスに対してレクチンをスポットし、レクチンアレイを作製した。マイクロアレイスポッターとして日本レーザ電子社製ＳＴＡＭＰＭＡＮを使用し、先端直径０．４０ｍｍのスタンプピンを用い、直径約０．５ｍｍのスポットをスライドガラス上に配置した。スライドガラスへのレクチンの固定化操作に際しては以下の条件をマイクロアレイスポッター付属のコンピューターに記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させた。まずスタンプピンを９６穴ＰＣＲ用マイクロタイタープレート内の固定化試料溶液中に１秒間浸した後に引き上げ、スライドガラス表面の所定の位置に１秒間接触させた。この動作を１スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液から横１列に６点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄を行った。洗浄工程ではスタンプピンの針先を０．０５％ＳＤＳ溶液に２秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で１５秒間乾燥させ、さらに精製水に２秒間浸した後に、バキューム装置内で１５秒間乾燥、最後にエタノールに２秒間浸してからバキューム装置内で１５秒間の乾燥操作を行った。【０１００】（４）非スポット面のブロッキング
上記の操作でレクチンをスポットしたスライド上に、シリコンゴム製の８穴ラバーを接着して８つの反応槽を作製した。この反応槽に０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）を満たすことで、スライド固層に結合しなかった余剰レクチンを洗浄・除去した。次に１％  ＢＳＡを溶解したＰＢＳ溶液を各反応槽に２００μＬずつ満たした後に、湿度を９０％以上に保った保存容器中で４℃、１時間放置することで非レクチンスポット領域のブロッキング操作を行った。【０１０１】（５）プローブ溶液の添加とスキャン
ブロッキングを終えたスライドに対し、約１００ｎｇ／ｍＬに調整した各蛍光標識化糖タンパク質プローブ溶液を各反応槽に５０μＬずつ加えることで、アレイ上にプローブ溶液を接触させた。【０１０２】  レクチン−糖鎖間の反応が平衡に達するまで静置した後に、エバネッセント励起方式マイクロアレイスキャナーであるＧＴＭＡＳ  Ｓｃａｎ  ＩＩＩ（日本レーザ電子社）を使用してスライドガラス端面より励起光を入射し、励起されて生じた蛍光発光を、スライドガラス下面に配置されているＩＣＣＤ（イメージインテンシファイアー付電荷結合素子）カメラで検出した。スライドガラスのほぼ全面に対する蛍光イメージをスキャンした後、得られたイメージ画像をＴＩＦＦファイル形式にて保存した。スキャン時の各パラメーターは、Ｇａｉｎ「４０００倍」、積算回数「８回」、露光時間「１１０ｍｓｅｃ」で統一した。【０１０３】（６）スキャン画像の数値化
スキャン画像の数値化には市販のマイクロアレイ用解析ソフトであるＡｒｒａｙ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｖｅｒ．４．５（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を使用した。各スポットの輝度を上記解析ソフトで算出し、非スポット領域の輝度をバックグラウンド値とした。各スポットの輝度からバックグラウンド値を差し引いたものを正味の輝度値とし、横列に５点並べた同一試料由来のスポットごとに平均値と標準偏差を算出した。
以降は各レクチン試料に対するプローブの結合に対してはこの同一試料由来の５点の平均輝度値を用いて評価を行った。【０１０４】２．結果と考察
今回の実験では多様な特異性を持つレクチンを並べたアレイを構成し、既知の糖鎖構造を持つ糖タンパク質プローブをアプライした際の各レクチンスポットの蛍光パターンから、レクチンアレイとしての性能評価を行った。また本実験では、プローブのコアタンパク部分の情報も同時に取得することを目指し、糖タンパク質プローブのコアタンパク部分を認識する抗体もレクチンと並べてスポットしたアレイを作製した。モデル糖タンパク質としては、コアタンパク部分の構造は同一だが修飾糖鎖部分の構造が異なるタンパク質として、ＡＳＦとＦＥＴの組み合わせと、ＲＮａｓｅ  ＡとＲＮａｓｅ  Ｂの組み合わせを選択した。【０１０５】  実験（Ａ）・（Ｂ）では、プローブとして用いたＡＳＦとＦＥＴの糖鎖プロファイルを比較した（図１０Ａ及びＢ）。ＦＥＴはＮ−結合型糖鎖とＯ−結合型糖鎖を３本ずつ分子中に持ち、各糖鎖構造の非還元末端が高度にシアル酸で修飾されていることが知られている。一方、ＡＳＦはＦＥＴ糖鎖のうち末端シアル酸を酵素或いは酸処理によって除去したタンパク質であり、ラクトサミン構造が露出している。このためＡＳＦプローブを用いた場合、ラクトサミンを認識するＲＣＡ１２０やＥＣＡのスポットが観察され、ＦＥＴプローブを用いた場合、シアル酸を認識するＳＳＡ、ＳＮＡのスポットが観察されると予想された。また抗体スポットに対してはＦＥＴもＡＳＦもコアタンパク部分は同一であるため、両プローブ共に結合が観察されると予想された。実験の結果、末端ラクトサミン構造を持つＡＳＦプローブではＲＣＡ１２０やＥＣＡの非常に明るいスポットが検出されたが（図１０Ａ）、ラクトサミン構造がシアル酸でキャッピングされているＦＥＴプローブではＲＣＡ１２０、ＥＣＡのスポットは非常に暗くなった（図１０Ｂ）。この結果はＲＣＡ１２０、ＥＣＡがラクトサミン構造を強く認識し、ラクトサミン構造の末端がシアル酸でキャップされると親和性が大幅に低下するという従来の知見と一致していた。また実験（Ｂ）ではＦＥＴプローブに特徴的なシアル酸の存在に対応して、シアル酸認識レクチンであるＳＳＡやＳＮＡのスポットが観察された（図１０Ｂ）。ＣｏｎＡのスポットでは実験（Ａ）、（Ｂ）共に弱い蛍光が観察された（図１０Ａ及びＢ）。これはＮ−結合型糖鎖のうち、主として存在する３本鎖型糖鎖には親和性が低いものの、少量存在するとされる２本鎖型糖鎖には結合できるためと考えられた。共通コアタンパク部分を認識するＦＥＴ抗体のスポットは、実験（Ａ）、（Ｂ）において蛍光が観察された（図１０Ａ及びＢ）。【０１０６】  実験（Ｃ）・（Ｄ）ではＲＮａｓｅ  ＡとＲＮａｓｅ  Ｂプローブの糖鎖プロファイルの相違を比較した（図１０Ｃ及びＤ）。ＲＮａｓｅ  Ｂは、ハイマンノース型のＮ−結合型糖鎖を分子内に１本のみ持ち、ＲＮａｓｅ  Ａは、コアタンパク部分はＲＮａｓｅ  Ｂと同一の構造を持つが糖鎖を全く持たないことが知られている。これらのプローブをレクチンアレイに接触させた場合、両プローブ共に抗ＲＮａｓｅ抗体スポットに対しては親和性を示すが、レクチンのスポットに対する反応性に相違が生じる（ＲＮａｓｅ  ＢプローブはＣｏｎＡなどのマンノース認識レクチンに親和性を示すのに対し、ＲＮａ���ｅ  Ａは親和性を示さない）ことが予想された。実験の結果、抗体に対する反応性では、両プローブにおいて共通コアタンパク部分を認識するＲＮａｓｅ抗体との結合が観察された。一方レクチンに対する反応性では、ハイマンノース構造を持つＲＮａｓｅ  ＢでＣｏｎＡのスポットにおいて結合が観察されたが、糖鎖を持たないＲＮａｓｅ  Ａではレクチンのスポットにおいて、結合による蛍光は観察されなかった。実験（Ｅ）ではネガティブコントロールとして、糖鎖を持たないタンパク質であるＢＳＡを用いた。ＢＳＡプローブでは予想通り、抗体・レクチンスポットともに結合は観察されなかった（図１０Ｅ）。【０１０７】  実験（Ａ）〜（Ｅ）を通して、微量の糖タンパク質試料から迅速に、レクチンの糖結合特異性を反映したプロファイルを得ることができた（図１０Ａ〜Ｅ）。また今回の実験では、レクチンと抗体を同一アレイ上にスポットすることで、糖タンパク質のコアタンパク部分と、修飾糖鎖部分の情報を同時並行的に一枚のスライド上で取得することができた。同一スライド上で同時並行解析を行うことで、各反応槽間の実験条件（温度、反応時間等）を揃えた形での観察が可能となるという利点が生じた。【０１０８】〔実施例４〕  レクチンアレイを用いた阻害濃度解析（図１１）
１．材料と方法
先の実験で観察されたレクチンとプローブ分子間の結合が、糖鎖を介した特異的結合であることを確認する為に競合阻害糖を用いた阻害実験を行った。実験（Ａ）ではスライドガラス上の８つの反応槽内にＲＣＡ１２０をスポットしてアレイを構成した上で、競合阻害糖（ラクトース）の濃度を変えた８種類のＡＳＦプローブ溶液を同時に接触させ、結合反応の阻害を観察した（図１１Ａ）。実験（Ｂ）では固定化レクチンとしてＣｏｎＡを用い、プローブとしてＲＮａｓｅ  Ｂ、競合阻害糖としてマンノースを用い、同様の操作で結合の阻害を観察した（図１１Ｂ）。アレイ作成時に要した材料・操作は、実施例３と同じであるため記述を省略する。【０１０９】２．結果と考察
実験の結果、競合阻害糖の濃度上昇に伴ってスポットの蛍光強度の減少が観察され（図１１）、阻害曲線をカーブフィッティングすることにより、阻害物質固有の半阻害濃度を算出することができた。この結果から、蛍光糖タンパク質プローブとの結合はレクチンと糖鎖間の特異的結合反応によるものであることを確認できた。またこのような阻害実験を用い、半阻害濃度を算出することで結合の強さを評価したり、結合する相手分子を探索することが可能であることが示された。【０１１０】〔実施例５〕  レクチンアレイの糖ペプチドプローブによる検出（図１２）
１．材料と方法
（１）糖ペプチドプローブの調製
実施例３（１）に記述した方法でＣｙ３−ＡＳＦを調製した後に、このＣｙ３−ＡＳＦをトリプシン処理により断片化し、Ｃｙ３−ＡＳＦペプチドを調製した。
（２）スライドガラスへのＧＴＭＳコーティング
実施例３（２）に記述した方法で行った。
（３）レクチンアレイの作製
固定化するレクチンは、各レクチンの持つ主要な糖認識能ごとにグループ分けを行った上で、フコース認識レクチン５種、シアル酸認識レクチン６種、ラクトサミン構造認識レクチン３種、ガラクトース認識レクチン６種、ガラクトサミン認識レクチン１１種、マンノース認識レクチン４種、キチン構造認識レクチン５種の計４０種類のレクチンを選択し、スライドガラスに固定化したアレイを作製した。実験操作は実施例３（３）に記述した方法で行った。
（４）非スポット面のブロッキング
（５）プローブ溶液の添加とスキャン
（６）スキャン画像の数値化
上記（４）〜（６）の操作については、Ｃｙ３−ＡＳＦペプチドプローブを用い、実施例３（４）〜（６）に記述した方法と同様の操作にて、実験を行った。【０１１１】２．結果と考察
実験の結果、レクチンアレイに糖ペプチドプローブを供することで、糖鎖構造を反映した糖鎖プロファイルを得ることができた。得られた糖鎖プロファイルは酵素消化する前のＡＳＦと同等であり、レクチンアレイに糖タンパク質だけでなく糖タンパク質のペプチド消化産物をプローブとして利用できることが示された。この技術を用いれば糖ペプチドをＨＰＬＣ等で分画した後にプローブとしてレクチンアレイに供することで糖ペプチド各成分の糖鎖プロファイルの観察が可能になり、有用である。【０１１２】〔実施例６〕  糖ペプチドアレイによる、糖ペプチド上の糖鎖プロファイリング（図１３）
１．材料と方法
（１）レクチンプローブの調製
本実施例ではレクチンプローブとして、ラクトサミン構造を強く認識するＲＣＡ１２０、ネガティブコントロールとして糖結合能を持たないＢＳＡを使用した。蛍光標識レクチンプローブは蛍光色素であるＣｙ３を用いて蛍光標識して調製した。レクチンは０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）中に終濃度１ｍｇ／ｍＬになるよう溶解した後、１ｍＬ当たり１．０ｍｇのＣｙ３粉末と混合させ、１時間、適時攪拌しながら暗所で反応させた。反応後は限外ろ過フィルターキットを用いて未反応のＣｙ３色素を除去した。
（２）スライドガラスへのＧＴＭＳコーティング
ＧＴＭＳコートスライドは実施例５（２）に記述した方法で行った。
（３）糖ペプチドアレイの作製
（２）で作製したＧＴＭＳコートスライドガラス（図３）に対して糖ペプチドをスポットして糖ペプチドアレイを作製した。マイクロアレイスポッターとして日本レーザ電子社製ＳＴＡＭＰＭＡＮを使用し、先端直径０．４０ｍｍのスタンプピンを使用してスポットを行ことで、直径約０．５ｍｍのスポットをスライドガラス上に配置した。
本実験では固定化した糖ペプチドサンプルは、マウス肝臓の可溶性画分からレクチンカラムを用いて精製した糖タンパク質画分をトリプシンによりペプチド断片化後、ＨＰＬＣにより分画・分取した糖ペプチドを用いた。スライドガラスへの糖ペプチドの固定化操作に際しては以下の条件をマイクロアレイスポッター付属のコンピューターに記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させた。まずスタンプピンを９６穴ＰＣＲ用マイクロタイタープレート内の固定化試料溶液中に１秒間浸した後に引き上げ、スライドガラス表面の所定の位置に１秒間接触させた。この動作を１スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液から横１列に６点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄を行った。洗浄工程ではスタンプピンの針先を０．０５％ＳＤＳ溶液に２秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で１５秒間乾燥させ、さらに精製水に２秒間浸した後に、バキューム装置内で１５秒間乾燥、最後にエタノールに２秒間浸してからバキューム装置内で１５秒間の乾燥操作を行った。
（４）非スポット面のブロッキング
（５）プローブ溶液の添加とスキャン
（６）スキャン画像の数値化
上記（４）〜（６）の操作については、Ｃｙ３−ＲＣＡ１２０プローブとＣｙ３−ＢＳＡプローブを用い、実施例３（４）〜（６）に記述した方法に従い、実験操作を行った。【０１１３】２．結果と考察
本実験の結果、糖ペプチドをアレイ化することで、糖ペプチドに付加した糖鎖の構造情報を、ハイスループットかつ容易に得られることが示された。糖ペプチドアレイの作成方法としては、１）精製糖ペプチドを固定化する、２）クルードの糖ペプチドを固定化する、３）ＨＰＬＣで分離した糖ペプチドフラクションを固定化する、などが考えられる。今回の実験ではＨＰＬＣで分離した各フラクションをアレイ化したものを作製でき、有用であることを示すことができた。【０１１４】  従来、ＨＰＬＣで分画したフラクションのうち、どこに糖ペプチドが含まれているかという情報を得ることは、ＵＶ吸収や蛍光等でモニターできないために容易ではなかった。本実験の結果、各糖ペプチドフラクションを固定化したアレイを用いることで、どのフラクションにどのような糖鎖構造を持った糖ペプチドがあるのかを容易に知ることが可能となることが分かった。【０１１５】  本法を利用することで、解析対象の糖鎖を持つ糖ペプチドがどのフラクションに含まれているのかといった情報を迅速に得ることができるため、多数のフラクションから効率的に糖鎖の含まれるフラクションのみを選出し、質量分析など他の解析へと供すること等が可能になる。また解析対象の糖ペプチドの糖鎖構造情報や、どのようなレクチンが結合するかという情報がない場合、トリプシン消化前の糖タンパク質の状態でレクチンアレイを用いた分析を行い、糖鎖プロファイリングを行うことで、当該糖タンパク質に結合するレクチンを数十種類のレクチンの中から絞り込むことが出来る。このような情報が得られることで、従来多数のレクチンを用いて総当り的に行っていたレクチンブロットなどの操作が簡略化され、大幅に時間と労力を節約できるなどの利点がある。【０１１６】〔実施例７〕  レクチンアレイに対し、クルード生体試料をプローブとして用いた実験（図１４）
１．材料と方法
レクチンアレイを用いて糖タンパク質混合物、特に生体由来混合試料のプロファイリングを行うことで、生体内の糖タンパク質の糖鎖付加状態を解析する。【０１１７】  マウス肝臓より抽出・精製した糖タンパク質サンプルとマウス脳より抽出・精製した糖タンパク質サンプルをＣｙ３標識化してプローブとした後に、４０種レクチンの固定化されたレクチンアレイと接触させて、マウス抽出糖タンパク質混合物全体の糖鎖プロファイルを観察した。
アレイ作製時に要した材料・操作は、実施例３と同じであるため記述を省略する。【０１１８】２．結果と考察
マウス脳由来糖タンパク質プローブ（図１４Ａ）と肝臓由来糖タンパク質プローブ（図１４Ｂ）では、明らかに異なった糖鎖プロファイルが観察された。特にシアル酸認識のレクチン群で、両プローブ間に顕著な相違が見られた。脳では糖タンパク質に対するシアル酸の付加が少ないことが知られており、この事実は実験結果の傾向と一致した。このようにクルード系を用いた実験では、試料全体の糖鎖付加情報を迅速・簡便に得ることができるため、血液成分や臓器等の、個体間や病態間での糖鎖構造の差を一斉比較解析する目的での使用に適している。【０１１９】  次に先の実験で用いた脳由来糖タンパク質プローブに対し、競合阻害糖としてラクトースを１０ｍＭ加え、糖鎖プロファイルを観察した（図１４Ｃ）。その結果、競合阻害により蛍光シグナルのパターンに変化が観察され、主にラクトサミン認識レクチンのシグナルの減弱が観察された。この実験で示したように、よりクルードな試料に対するレクチンアレイによる糖鎖プロファイリングにおいても、様々な阻害糖の添加実験を併用し、獲得される情報を絞り込んだ上で比較解析することで、より簡便かつ迅速に個体間の比較解析を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】  本発明により、レクチン−糖鎖間の相互作用を溶液中で平衡状態のまま観察する方法が初めて実用化された。この技術は従来のレクチンブロットのような相互作用の有無（０か１か）ではなく、中間部分の情報、すなわち結合の強度情報を輝度値から得ることができる（例えば０から６段階）。このことはｎ種のレクチン−糖鎖間の相互作用において、従来は２ｎ通りであった情報量が６ｎ通りへと格段に増したことを意味する。この技術は今後さらに高密度化、高精度化していくことにより糖鎖構造解析、及び関連するその他の糖鎖工学諸分野の発展に大きな貢献をもたらすことが期待される。さらには、様々な用途に向けレクチン−糖鎖間の相互作用解析用のアレイを作製することで、血液・体液・組織抽出物等の原液または希釈溶液からの診断・判定への利用や、糖タンパク質製品の品質管理等への応用が期待される。
【図１】
0004374447.tif 000003
【図２】
0004374447.tif 000004
【図３】
0004374447.tif 000005
【図４】
0004374447.tif 000006
【図５】
0004374447.tif 000007
【図６】
0004374447.tif 000008
【図７】
0004374447.tif 000009
【図８】
0004374447.tif 000010
【図９】
0004374447.tif 000011
【図１０】
0004374447.tif 000012
【図１１】
0004374447.tif 000013
【図１２】
0004374447.tif 000014
【図１３】
0004374447.tif 000015
【図１４】
0004374447.tif 000016