(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群から選ばれる５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有する単離されたポリペプチド：
（ａ）SEQ ID NO:２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
（ｂ）（ａ）のフラグメント、ここで当該フラグメントは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するものとする。
【請求項２】
SEQ ID NO:２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
SEQ ID NO:２のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO:２のアミノ酸配列又はそのフラグメントから成る請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
SEQ ID NO:２のアミノ酸配列から成る請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
フサリウム（Fusarium）株から得られる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
フサリウム・ベネナトゥム（F. venenatum）株から得られる、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
高ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:１の核酸配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】
フサリウム株から得られる、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
フサリウム・ベネナトゥム株から得られる、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
超高ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:１の核酸配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１４】
フサリウム株から得られる、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
フサリウム・ベネナトゥム株から得られる、請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｅ．コリ（E. coli ）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１８５５に含まれているプラスミドｐＺＬ３−３の中に収容された核酸配列によりコードされる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１７】
SEQ ID NO:２の５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の少なくとも２０％の活性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る単離された核酸。
【請求項１９】
単離された核酸であって、SEQ ID NO:１の核酸配列内に少なくとも１個の突然変異を有する核酸配列を含んで成り、その突然変異した核酸配列がSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２０】
５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする単離された核酸であって、（ａ）高ストリンジェンシー条件下でＤＮＡをSEQ ID NO:１の配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズさせ；そして（ｂ）当該核酸を単離することにより製造された単離された核酸。
【請求項２１】
単離された核酸であって、（ａ）超高ストリンジェンシー条件下でＤＮＡをSEQ ID NO:１の配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズさせ；そして（ｂ）当該核酸を単離することにより製造された、請求項２０記載の単離された核酸。
【請求項２２】
適当な発現宿主内でポリペプチドの生産を指令する１又は複数のコントロール配列に作用可能式に連結された請求項１８記載の核酸を含んで成る核酸構築体。
【請求項２３】
請求項２２記載の核酸構築体を含んで成る組換発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２記載の核酸構築体を含んで成る組換宿主細胞。
【請求項２５】
突然変異された核酸を製造するための方法であって、（ａ）SEQ ID NO:１の核酸配列の中に少なくとも一つの突然変異を導入し、ここで当該突然変異された核酸配列はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし；そして（ｂ）この突然変異された核酸を回収する；ことを含んで成る方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法により製造された突然変異された核酸。
【請求項２７】
ポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）当該ポリペプチドをコードする請求項２６記載の突然変異された核酸を含んで成る株を培養して当該ポリペプチドを含んで成る上清液を生成し；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項２８】
請求項１記載のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）株を培養して当該ポリペプチドを含んで成る上清液を生成し；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１記載のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）当該ポリペプチドの生産のために適当な条件下で当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構築体を含んで成る宿主細胞を培養し；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項３２】
ポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で宿主細胞を培養し、ここで当該宿主細胞はSEQ ID NO:１の核酸配列内に少なくとも一の突然変異を有するSEQ ID NO:１の突然変異された核酸配列を含んで成り、ここで当該突然変異された核酸配列はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項３３】
請求項３２記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１記載のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で、当該ポリペプチドをコードする内因性核酸配列の第二エキソンに作用可能式に連結された調節配列、エキソン及び／又はスプライスドナー部位を含んで成る新規の転写ユニットが組込まれた相同組換細胞を培養し；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法により製造されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有する単離されたポリペプチド及びこのポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する。本発明は更に当該核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主細胞、並びに当該ポリペプチドの製造及び使用するための方法に関連する。
【０００２】
関連技術の説明
プロトポルフィリンIXと鉄分とのキレート錯体であるヘムはヘムタンパク質の補欠分子族として働く。プロトポルフィリンIXは４個のメチル基、２個のビニル基及び２個のプロピオン酸基で置換されたポルフィリン環から成り、それはヘムを形成するために鉄分を獲得する。グリシン及びスクシニル−ＣｏＡからのヘムの生合成は８段の酵素工程を包含する。この生合成経路における第一酵素は５−アミノレブリン酸シンターゼである。
【０００３】
アポタンパク質のヘムタンパク質への変換はヘム生合成経路により供されるヘムの有用率に依存する。アポタンパク質形態のヘムタンパク質はヘムと結合して活性ヘムタンパク質を生成する。この活性ヘムタンパク質は、タンパク質分解攻撃に対してヘムタンパク質をアポタンパク質よりも安定にするコンホメーションを獲得する。もし微生物により生産されるヘムの量が生産されるアポタンパク質と比べて少ないなら、アポタンパク質は蓄積し、そしてタンパク質分解を受け、活性ヘムタンパク質の収率を下げるであろう。
【０００４】
この問題を解消するため、Jensenはヘム又はヘム含有物質を発酵培地に添加してアスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）により生産されるペルオキシダーゼの収量を有意に高めることを示している（ＷＯ  ９３／１９１９５）。発酵培地へのヘム添加はヘムタンパク質の収量の有意な上昇をもたらすが、それは非合法であり、費用がかさみ、そして大量スケールで実施するのが困難である。
【０００５】
細胞のヘム生合成経路における遺伝子の過剰発現はこの問題の解決のための別のアプローチを供する。
【０００６】
アスペルギルス・ニドゥランス（A. nidulans ）からの５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子のクローニング及び配列決定が開示されている（Bradshawら、1993, Current Genetics 2233: 501-507）。
【０００７】
本発明の目的は５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有する新規のポリペプチド及びそれをコードする遺伝子の提供にある。
【０００８】
発明の概要
本発明は下記の群から選ばれる５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する：
（ａ）SEQ ID NO:２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で（ｉ）SEQ ID NO:１の核酸配列もしくは（ii）その相補鎖とハイブリダイズする核酸配列により、又は少なくとも１００個のヌクレオチドのそれらのサブ配列によりコードされるポリペプチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の対立形質変異体；及び
（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）のフラグメント、ここで当該フラグメントは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するものとする。
【０００９】
本発明は更に前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列並びに当該核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主細胞、並びに当該ポリペプチドを製造及び使用するための方法に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
「５−アミノレブリン酸シンターゼ活性」なる語は、本明細書では５−アミノレブリン酸の形成のためのグリシンとスクシニン−ＣｏＡとの縮合を触媒するシンターゼ活性と定義する。本発明の目的に関し、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性はWider de Xifraら、1971, Biochimica Biophysica Acta 235: 511-517 により発表され、Pavetoら、1989, Comp.Biochem.Physiol. 94B: 635-639により改良された手順に従って決定され、それではグリシン及びスクシニル−ＣｏＡの５−アミノレブリン酸への変換をpH７．５、２５℃で測定する。
【００１１】
第一の態様において、本発明はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性の度合いを有し、しかも５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する（以降、「相同ポリペプチド」と呼ぶ）。好適な態様において、この相同ポリペプチドは、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列と５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、更により好ましくは２個のアミノ酸、そして最も好ましくは１個のアミノ酸で相違するアミノ酸配列を有する。本発明の目的に関し、２本のアミノ酸配列間の同一性の度合いはＣｌｕｓｔａｌ法により（Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153）、同一性表の及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）ソフトウェアー（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を利用し、且つ下記のマルチプルアラインメントパラメーターを利用して決定する：１０のgap penalty 及び１０のgap length penalty。対合アラインメントパラメーターはKtuple＝１，gap penalty ＝３，windows ＝５及びdiagonals ＝５とした。
【００１２】
好ましくは、本発明のポリペプチドはSEQ ID NO:２のアミノ酸配列もしくはその対立形質変異体、又はそれらのフラグメントを含んで成り、ここで当該フラグメントは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するものとする。より好適な態様において、本発明のポリペプチドはSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含んで成る。別の好適な態様において、本発明のポリペプチドはSEQ ID NO:２のアミノ酸配列もしくはその対立形質変異体、又はそれらのフラグメントから成り、ここで当該フラグメントは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するものとする。より好適な態様において、本発明のポリペプチドはSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から成る。
【００１３】
SEQ ID NO:２のフラグメントは、当該アミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は複数個のアミノ酸が欠失したものである。好ましくは、フラグメントは少なくとも４６０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５００個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも５４０個のアミノ酸残基を含む。
【００１４】
対立形質変異体は同一の染色体座を占める任意の二以上の形態の遺伝子を意味する。対立形質変異体は突然変異を介して自然に生じ、そして集団内に多形態をもたらしうる。遺伝子突然変異はサイレントであっても（コードポリペプチドの変化なし）、又は改変したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものであってもよい。ポリペプチドの対立形質変異体とは遺伝子の対立形質変異体によりコードされるポリペプチドをいう。
【００１５】
相同ポリペプチドのアミノ酸配列はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列と、１もしくは複数個のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失及び／又は別のアミノ酸残基による１もしくは複数個のアミノ酸残基の置換により、相違する。好ましくは、アミノ酸変化はささいなもの、即ち、タンパク質のフォルディング及び／又は活性に有意な影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；わずかな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；わずかなアミノもしくはカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基の伸長；約２０〜２５残基までの小リンカーペプチド伸長；又は正味の電荷もしくはその他の機能を変えることにより精製を促進するわずかな伸長、例えばポリヒスチジントラクト、抗原エピトープもしくは結合ドメイン伸長とする。
【００１６】
保存性置換の例は塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群内での置換である。比活性を一般に改変しないアミノ酸置換は当業界において公知であり、そして例えばH.Neurath and R.L.Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New Yorkに記載されている。最もよく行われる交換はＡｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらの逆である。
【００１７】
第二の態様において、本発明は低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、そして最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下で、SEQ ID NO:１の核酸配列もしくはその相補鎖又はそれらのサブ配列であって５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列と上記の条件でハイブリダイズする核酸プローブにハイブリダイズする核酸配列（J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor, New York）によりコードされる５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関連する。SEQ ID NO:１のサブ配列は少なくとも１００ヌクレオチドであってよく、又は好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドであってよい。更に、このサブ配列は５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。このポリペプチドはその対立形質変異体又はフラグメントであってもよく、ここでこのフラグメントは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するものとする。
【００１８】
SEQ ID NO:１の核酸配列又はそのサブ配列、並びにSEQ ID NO:２のアミノ酸配列又はそのフラグメントが、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを当業界において周知の方法に従って様々な属又は種の株から同定及びクローニングする核酸プローブをデザインするために利用されうる。詳しくは、かかるプローブは注目の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション、しかる後のその中の対応の遺伝子の同定及び単離のためのサザンブロッティング手順のために利用されうる。かかるプローブは配列全体よりもかなり短くてよいが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、そしてより好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドの長さとすべきである。長めのプローブを利用してもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの双方を利用してよい。これらのプローブは一般に対応の遺伝子を検出するためにラベルされている（例えば、32Ｐ， 3Ｈ，35Ｓ、ビオチン又はアビジンで）。かかるプローブは本発明に包含される。
【００１９】
かくして、かかるその他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、上記のプローブとハイブリダイズし、且つ５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされうる。かかるその他の生物に由来するゲノム又はその他のＤＮＡはアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動により、又はその他の分離技術により分離されうる。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離されたＤＮＡをニトロセルロース又はその他の適当な担体材料に転写して固定することができる。SEQ ID NO:１と相同性であるクローン又はＤＮＡを同定するため、この担体材料はサザンブロットに利用する。本発明の目的にとって、ハイブリダイゼーションとは核酸配列がSEQ ID NO:１に示す核酸配列、その相補鎖、又はそれらのサブ配列に対応する核酸プローブに対し、低乃至超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを意味する。当該核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子はＸ線フィルムを利用して検出される。
【００２０】
好適な態様において、当該核酸プローブはSEQ ID NO:２のポリペプチド又はそのサブ配列をコードする核酸配列である。別の好適な態様において、この核酸プローブはSEQ ID NO:１である。別の好適な態様において、この核酸プローブはエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１８５５に含まれているプラスミドｐＺＬ３−３内に収容された核酸配列であり、ここでこの核酸配列はSEQ ID NO:２のポリペプチドをコードする。
【００２１】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドである長いプローブに関しては、低乃至超高ストリンジェンシー条件は４２℃にて、５×のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／mlの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、低、中並びに高及び超高ストリンジェンシーについてそれぞれ２５，３５又は５０％のホルムアルデヒド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと定義し、しかる後に標準のサザンブロッティング手順が続く。
【００２２】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに関し、担体材料は最後に３回、１５分づつ、２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳで好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、更により好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、そして最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で洗浄する。
【００２３】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短めのプローブに関しては、ストリンジェンシー条件はBolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390 ）に従う計算を利用して計算されたＴｍより５℃〜１０℃低い温度での０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．６、６mMのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１×のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１mMのピロリン酸ナトリウム、１mMの第一リン酸ナトリウム、０．１mMのＡＴＰ及び０．２mg／mlの酵母ＲＮＡ中でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄、しかる後のサザンブロット手順と定義する。
【００２４】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短めのプローブに関し、担体材料は６×のＳＣＣと０．１％のＳＤＳの中で１５分で１回、そして６×のＳＳＣを利用し、計算したＴｍより５℃〜１０℃低い温度で１５分づつ２回洗浄する。
【００２５】
第三の態様において、本発明はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫化学的同一性又は部分免疫化学的同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。この免疫化学特性は周知のアウターローニー二重免疫拡散手順による免疫学的交差反応同定試験により決定される。詳しくは、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性又は結合性であるポリクローナル抗体を含む抗血清を、Harboe and Ingild, N.H. Axelsen, J.Kroll, and B.Weeks 編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23 又はJohnstone and Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982（より詳しくは頁２７−３１）により発表の手順に従いウサギ（又はその他のげっ歯動物）を免疫することにより調製する。免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、特定の免疫化学技術を利用して同一の状況、例えば総合的な沈殿物の融合、同一の沈殿形態及び／又は同一の電気泳動度で抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同一性の更なる説明は、Axelsen, Bock, and Kroll, N.H. Axelsen, J.Kroll, and B.Weeks編 A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 10に記載されている。部分免疫化学的同一性を有するポリペプチドは特定の免疫化学技術を利用して部分的に同一の状況、例えば部分的な沈殿物の融合、部分的に同一の沈殿形態及び／又は部分的に同一の電気泳動度で抗血清と反応するポリペプチドである。部分的な免疫化学的同一性の更なる説明は、Bock and Axelsen,  N.H. Axelsen, J.Kroll, and B.Weeks 編 A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 11に記載されている。
【００２６】
抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は例えばE.Harlow and D.Lane 編 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New Yorkの方法に従い、調製及び利用されうる。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO:２の５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも１００％の活性を有する。
【００２８】
本発明のポリペプチドは任意の属の微生物から得られうる。
【００２９】
本発明のポリペプチドは細菌性ポリペプチドであってよい。例えば、このポリペプチドはグラム陽性菌ポリペプチド、例えばバチルス（Bacillus）ポリペプチド、例えばバチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis ）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus ）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus ）、バチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）又はバチルス・スリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）ポリペプチド；又はストレプトマイセス（Streptomyces）ポリペプチド、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）又はストレプトマイセス・ミュリヌス（Streptomyces murinus）ポリペプチド；又はグラム陰性菌ポリペプチド、例えばＥ．コリ又はシュードモナス（Pseudomonas ）種ポリペプチドであってよい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは真菌ポリペプチドであってよく、そしてより好ましくは酵母ポリペプチド、例えばカンジダ（Candida ）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces ）、ピチア（Pichia）、サッカロマイセス（Saccharomyces ）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces ）又はヤロウィア（Yarrowia）ポリペプチド；又は、より好ましくは糸状菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus ）、オーレオバシジウム（Aureobasidium ）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マグナポルセ（Magnaporthe ）、ムコール（Mucor ）、ミセリオフソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティックス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium ）、ピロマイセス（Piromyces ）、シゾフィルム（Schizophyllum ）、タラロマイセス（Talaromyces ）、サーモアスカス（Thermoascus ）、チェラビア（Thielavia ）、トリポクラジウム（Tolypocladium ）又はトリコデルマ（Trichoderma ）ポリペプチドであってよい。
【００３１】
好適な態様において、このポリペプチドはサッカロマイセス・カールスバージェンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis ）又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis ）ポリペプチドである。
【００３２】
別の好適な態様において、当該ポリペプチドはアスペルギルス・アキュレアトゥス（Aspergillus aculeatus ）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori ）、アスペルギルス・フェチドゥス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens ）、ヒュミコラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa ）、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehel）、ミセリオフソラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa ）、ペニシリウム・パープロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、トリコデルマ・ハージアヌム（Trichoderma harzianum ）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンジブラチアトゥム（Trichoderma longibrachiatum ）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）ポリペプチドである。
【００３３】
別の好適な態様において、当該ポリペプチドはフサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis ）、フサリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモルム（Fusarium culmorum ）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミヌム（Fusarium graminum ）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum ）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラトゥム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusarium roseum ）、フサリウム・サンブチヌム（Fusarium sambucinum ）、フサリウム・サルコクロムウ（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Fusarium sporotrichioides ）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum ）、フサリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides ）又はフサリウム・ベネナトゥム（Fusarium venenatum）ポリペプチドである。
【００３４】
より好適な態様において、フサリウム・ベネナトゥム細胞はフサリウム・ベネナトゥムＡ３／５であって、当初フサリウム・グラミネアルムＡＴＣＣ  ２０３３４として寄託されており、そして最近Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 及びO'Donnell ら1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67 によりフサリウム・ベネナトゥムに再分類されたものであるか、現在認知されている種名とは関係なくフサリウム・ベネナトゥムの分類学的均等物である。別の好適な態様において、このフサリウム・ベネナトゥム細胞はＷＯ  ９７／２６３３０に開示の通り、フサリウム・ベネナトゥムＡ３／５又はフサリウム・ベネナトゥムＡＴＣＣ  ２０３３４の形態学的突然変異体である。
【００３５】
上記の種に関し、本発明は完全及び不完全状態の双方、並びにその他の分類学的均等物、例えばアナモルフを、認知されている種名とは関係なく、包含することが理解されるであろう。当業者は適当な均等物の同一性を容易に認定できるであろう。例えば、フサリウムの分類学的均等物はD.L.Hawksworth, P.M.Kirk, B.C.Sutton, and D.N.Pegler (editors), 1995, Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi 、第８版 CAB International, University Press, Cambridge, England, pp.173-174により特定されている。
【００３６】
これらの種の株は多数の培養物寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) で公共的に容易に入手できる。
【００３７】
更に、かかるポリペプチドは、上記のプローブを利用し、自然（例えば土壌、堆肥、水等）から単離された微生物等、その他の起源から同定及び獲得できうる。自然環境から微生物を単離する技術は当業界において周知である。かくして核酸配列はその他の微生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得られうる。ポリペプチドをコードする核酸配列が一旦これらのプローブで検出できたら、その配列は当業者に公知の技術を利用することにより単離又はクローニングされうる（例えば、Sambrookら、1989、前掲を参照のこと）。
【００３８】
本明細書における定義に従うと、「単離された」ポリペプチドとは、他の非５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドを本質的に含まないポリペプチド、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる決定に従い、純度約２０％以上、好ましくは純度約４０％以上、より好ましくは純度約６０％以上、更により好ましくは純度約８０％以上、最も好ましくは純度約９０％以上、そして更に最も好ましくは純度約９５％以上のポリペプチドをいう。
【００３９】
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドには更に別のポリペプチドがこのポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端に融合した融合ポリペプチド又は切断可能融合ポリペプチドも含まれる。融合ポリペプチドは本発明の核酸配列（又はその一部）に別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を融合することにより作られる。融合ポリペプチドを作るための技術は当業界において公知であり、そして当該ポリペプチドをコードするコード配列を、イン・フレームで、且つ融合ポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターのコントロール下となるようにライゲーションすることを含む。
【００４０】
核酸配列
本発明は更に本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する。好適な態様において、この核酸配列はSEQ ID NO:１に記載のものである。別のより好適な態様において、この核酸配列はエッシェリヒア・コリＮＲＲＬ  Ｂ−２１８５５に含まれているプラスミドｐＺＬ３−３内に収容された配列である。本発明は更に、遺伝子コードの縮重によりSEQ ID NO:１とは相違する、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。本発明は更に５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するSEQ ID NO:２のフラグメントをコードするSEQ ID NO:１のサブ配列に関する。
【００４１】
SEQ ID NO:１のサブ配列はSEQ ID NO:１に包含される核酸配列であるが、但し５′及び／又は３′末端から１又は複数個のヌクレオチドが欠失しているものである。好ましくは、サブ配列は少なくとも１３８０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも１６２０ヌクレオチドを含む。
【００４２】
本発明は更にSEQ ID NO:１の核酸配列内に少なくとも一の突然変異を含んで成る突然変異核酸配列にも関連し、ここでこの突然変異核酸配列はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものである。
【００４３】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離及びクローニングするのに利用される技術は当業界において公知であり、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組合せが挙げられる。かかるゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有の構造的特徴を有するクローニングされたＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを利用することにより行うことができる。例えば、Innis ら、1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York を参照のこと。その他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が利用されうる。この核酸配列はフサリウムの株、又はその他のもしくは近縁の生物からクローニングし得、それ故、例えば、当該核酸配列のポリペプチドコード領域の対立形質又は種変異体であってよい。
【００４４】
本明細書における定義に従うと、「単離された核酸配列」とは他の核酸配列を本質的に含まない核酸配列、例えばアガロース電気泳動による決定に従い、純度約２０％以上、好ましくは純度約４０％以上、より好ましくは純度６０％以上、更により好ましくは純度約８０％以上、そしてより好ましくは純度約９０％以上の核酸配列を意味する。例えば、単離された核酸配列は、核酸配列をその天然の位置から、その再生を行う別の部位へと転位する遺伝子工学において利用される標準のクローニング手順により得られうる。このクローニング手順は当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切り出し及びクローニング、このフラグメントのベクター分子への挿入、及びこの核酸配列の多重コピー又はクローンを複製する宿主細胞への組換ベクターの組込みを包含しうる。この核酸配列はゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成体、合成起源、又は任意のそれらの組合せであってよい。
【００４５】
本発明は更にSEQ ID NO:１の核酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、更により好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９７％の相同性の度合いを有し、活性ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明の目的にとって、２本の核酸配列間の相同性の度合いはWilbur-Lipman 法により（Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730 ）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）ソフトウェアー（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を利用し、同一性表及び下記のマルチプルアラインメントパラメーターで決定する：Ktuple＝３，gap penalty ＝３及びwindows ＝２０）。
【００４６】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は当該ポリペプチドと実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要でありうる。ポリペプチドに対して「実質的に類似」とは、ポリペプチドの非天然形態を意味する。これらのポリペプチドはその天然起源から単離されたポリペプチドとは、多少の工学的態様で相違しうる。例えば、比活性、熱安定性、至適pH等の点で相違するポリペプチドの変異体を例えば部位特異的突然変異誘発により合成することが注目されうる。類似配列はSEQ ID NO:１のポリペプチドコード部、例えばそのサブ配列として紹介する核酸配列を基礎に構築するか、又は当該核酸配列によりコードされるポリペプチドとは別のアミノ酸配列を供しないが、酵素の生産を目的とする宿主生物のコドン用法に対応する配列を供するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を供しうるヌクレオチド置換の導入により構築されうる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えばFordら、1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107 を参照のこと。
【００４７】
かかる置換は分子の機能に本質的な領域の外側に施し、しかも活性ポリペプチドが供されるようにすべきことが当業者に明らかであろう。本発明は単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に本質的であり、それ故好ましくは置換に委ねられないアミノ酸残基は当業界において公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発に従って同定されうる（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照のこと）。後者の技術では、突然変異は分子内の全ての正に帯電した残基に導入し、そして得られる突然変異分子を５−アミノレブリン酸シンターゼ活性について試験し、当該分子の活性に本質的なアミノ酸残基を同定する。基質−酵素相互作用の部位は核磁気共鳴分析、結晶グラフィー又は光学親和ラベリングの如き技術による決定に従い、三次元構造の分析によって決定することもできる（例えば、de Vosら 1992, Science 255: 306-312; Smithら 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaverら 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照のこと）。
【００４８】
本発明は更に本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列であって、低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下で、SEQ ID NO:１の核酸配列又はその相補鎖と同一の条件下でハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸配列；又はその対立形質変異体及び本明細書において定義するそれらのサブ配列に関連する（Sambrookら、1989、前掲）。
【００４９】
本発明は更に、（ａ）ＤＮＡをSEQ ID NO:１の配列もしくはその相補鎖又はそのサブ配列であって５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするものと、低、中、高又は超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせ；そして（ｂ）この核酸配列を単離することにより製造された単離された核酸配列に関連する。
【００５０】
突然変異された核酸配列を製造するための方法
本発明は更に突然変異された核酸配列を製造するための方法であって、少なくとも一の突然変異をSEQ ID NO:１の核酸配列又はそのサブ配列に導入することを含んで成る方法に関連し、ここでこの突然変異された核酸配列はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するそのフラグメントをコードする。
【００５１】
一のヌクレオチドを別のヌクレオチドにスイッチするための核酸配列への突然変異の導入は当業界において公知の任意の方法を利用する部位特異的突然変異誘発により成し遂げられうる。特に有用なのは、注目のインサートの入ったスーパーコイル二本鎖ＤＮＡベクター及び所望の突然変異を含む２種の合成プライマーを使用する手順である。各々がベクターの対立鎖に相補性であるこのヌクレオチドプライマーはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを介して温度サイクル中に伸長する。プライマーの組込みにより、ゆらぎニックを含む突然変異プラスミドが作製される。温度サイクルの後、生成物をメチル化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで処理して親ＤＮＡ鋳型を消化し、そして突然変異含有合成ＤＮＡを選別する。当業界公知のその他の手順も利用してよい。
【００５２】
核酸構築体
本発明は更に、１又は複数のコントロール配列に作用可能式に連結された本発明の核酸配列を含んで成る核酸構築体に関連し、ここでこのコントロール配列はそれに適合する条件下で適当な宿主細胞内でこのコード配列の発現を指令するものである。発現とは、限定することなく、転写、後転写修飾、翻訳、後翻訳修飾及び分泌等のポリペプチドの製造に関与する任意の段階を含むものと理解されるであろう。
【００５３】
「核酸構築体」とは本明細書においては一本鎖又は二本鎖の核酸分子と定義され、それは天然遺伝子から単離されたものであるか、又は本来天然には存在しない状態で組合され、並んだ複数の核酸セグメントを含むように修飾されたものである。核酸構築体は、この核酸構築体が本発明のコード配列の発現に必要なコントロール配列全てを含むとき、用語発現カセットと同義である。「コード配列」とは本明細書においては、タンパク質生成物のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列の部分と定義する。コード配列の境界は一般にｍＲＮＡの５′末端にあるオープンリーディングフレームのすぐ上流に配置されたリボソーム結合部位（原核細胞）又はＡＴＧ開始コドン（真核細胞）並びにｍＲＮＡの３′末端にあるオープンリーディングフレームのすぐ下流に配置された転写ターミネーター配列により規定される。コード配列には、限定することなく、ＤＮＡ，ｃＤＮＡ及び組換核酸配列が挙げられうる。
【００５４】
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列は当該ポリペプチドの発現を供するよう様々な手段で操作してよい。ベクターへのその挿入前の核酸配列の操作は発現ベクターに依存して所望となりうるか又は必須とされうる。組換ＤＮＡ法を利用する核酸配列の修飾のための技術は当業界において周知である。
【００５５】
「コントロール配列」なる語は、本明細書において、本発明のポリペプチドの発現のために必要又は有利である全ての成分を含むように定義される。各コントロール配列は当該ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然でも外来のものであってもよい。かかるコントロール配列には、限定することなく、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターが挙げられる。最低限、コントロール配列はプロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。コントロール配列に、そのコントロール配列のポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特異的な制限部位の導入の目的のためにリンカーを施してよい。「作用可能式に連結」とは本明細書においては、コントロール配列がポリペプチドの発現を指令できるＤＮＡ配列のコード配列に対して適当な位置にそのコントロール配列が配置されている形態として定義される。
【００５６】
コントロール配列は適当なプロモーター配列、即ち、核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であってよい。このプロモーター配列はポリペプチドの発現を媒介する転写コントロール配列を含む。このプロモーターは選定の宿主細胞内で転写活性を示す任意の核酸配列、例えば突然変異、トランケート及びハイブリドプロモーターであってよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得し得る。
【００５７】
特に細菌宿主細胞内での本発明の核酸構築体の転写を指令するために適当なプロモーターの例は、Ｅ．コリｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・コエリカラー（S. coelicolor ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス・スブチリスレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・リシェニホルミスアルファーアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリケファシエンスアルファーアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リシェニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・スブチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子及び原核細胞ベーターラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroffら、1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731 ）から得られるプロモーター、並びにｔａｃプロモーター（DeBoerら、1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25 ）である。他のプロモーターは「Useful proteins from recombinant bacteria 」Scientific American, 1980, 242: 74-94;及びSambrookら、1989、前掲に記載されている。
【００５８】
糸状菌宿主細胞内での本発明の核酸構築体の転写を指令するために適当なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザトリオース三リン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニドゥランスアセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）、ＮＡ２−Ｔｐｉ（アスペルギルス・ニガー中性アルファーアミラーゼをコードする遺伝子から獲得されたプロモーター、及びアスペルギルス・オリザトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリド）、並びにそれらの突然変異体、トランケート及びハイブリドプロモーターである。
【００５９】
酵母宿主において、有用なプロモーターはサッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエガラクトキナーゼ遺伝子（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、及びサッカロマイセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子から得られる。酵母宿主細胞にとってのその他の有用なプロモーターはRomanos ら、1992, Yeast 8: 423-488に記載されている。
【００６０】
このコントロール配列は適当な転写ターミネーター配列、即ち、宿主細胞により転写を終止させるように認識される配列であってもよい。このターミネーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に作用可能式に連結されている。選定の宿主細胞内で機能的である任意のターミネーターが本発明において利用されうる。
【００６１】
糸状菌宿主細胞のための好適なターミネーターはアスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニドゥランスアントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガーアルファーグルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から獲得される。
【００６２】
酵母宿主細胞のための好適なターミネーターはサッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエチトクロームＣ（ＣＹＣ１）又はサッカロマイセス・セレビシエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から獲得される。酵母宿主細胞のためのその他の有用なターミネーターはRomanos ら、1992、前掲に記載されている。
【００６３】
このコントロール配列は適当なリーダー配列、即ち、宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。このリーダー配列はポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に作用可能式に連結されている。選定の宿主細胞において機能的な任意のリーダー配列が本発明において利用されうる。
【００６４】
糸状菌宿主細胞のための好適なリーダーはアスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニドゥランストリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００６５】
酵母宿主細胞のための適当なリーダーはサッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエアルファー因子、及びサッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）から獲得される。
【００６６】
コントロール配列はポリアデニル化配列、即ち、核酸配列の３′末端に作用可能式に連結されており、そして転写されると、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であってもよい。選定の宿主細胞内で機能的である任意のポリアデニル化配列が本発明において利用されうる。
【００６７】
糸状菌宿主細胞のための好適なポリアデニル化配列はアスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニドゥランスアントラニレートシンターゼ、フサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ及びアスペルギルス・ニガーアルファーグルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００６８】
酵素宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列はGuo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990 により発表されている。
【００６９】
コントロール配列は、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導入できうるポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム内でもとから連結されたシグナルペプチドコード領域を当初から含みうる。他方、このコード配列の５′末端はコード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード配列を含みうる。この外来シグナルペプチドコード領域は、このコード配列が通常にはシグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされうる。他方、この外来シグナルペプチドコード領域はポリペプチドの分泌を高めるため、天然シグナルペプチドコード領域と置き換えてよい。しかしながら、選定の宿主細胞の分泌経路へと発現ポリペプチドを誘導する任意のシグナルペプチドコード領域が本発明において利用されうる。
【００７０】
細菌宿主細胞のために有効なシグナルペプチドコード領域はバチルスＮＣＩＢ  １１８３７由来のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・ステアロサーモフィルスアルファーアミラーゼ遺伝子、バチルス・リシェニホルミススブチリシン遺伝子、バチルス・リシェニホルミスベーターラクタマーゼ遺伝子、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ，ｎｐｒＳ，ｎｐｒＭ）、又はバチルス・スブチリスｐｒｓＡ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。他のシグナルペプチドはSimonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137に記載されている。
【００７１】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域はアスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼ遺伝子又はヒュミコラ・ラヌギノーザ（H. lanuginosa ）リパーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００７２】
酵母宿主細胞のために有用なシグナルペプチドはサッカロマイセス・セレビシエアルファー因子及びサッカロマイセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコード領域はRomanos ら、1992、前掲に記載されている。
【００７３】
コントロール配列はプロペプチドコード領域、即ち、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするものであってもよい。得られるポリペプチドはプロ酵素又はプロポリペプチド（又は時折り、チモゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟活性ポリペプチドへと変換されうる。このプロペプチドコード領域はバチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ）、バチルス・スブチリス中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ）、サッカロマイセス・セレビシエアルファー因子遺伝子、リゾムコール・ミーヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、又はミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子（ＷＯ  ９５／３３８３６）から得られうる。
【００７４】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方がポリペプチドのアミノ末端にあるとき、このプロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣りに配置され、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣りに配置される。
【００７５】
宿主細胞の増殖を基準にポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することも所望されうる。調節配列の例は、調節化合物の存在等、化学又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現のオン・オフを引き起こすものである。原核系における調節システムにはｌａｃ，ｔａｃ及びｔｒｐオペレーターシステムが含まれるであろう。酵母においては、ＡＤＨ２システム又はＧＡＬ１システムが使用されうる。糸状菌においては、ＴＡＫＡアルファーアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・オリザグルコアミラーゼプロモーターが調節配列として使用できうる。調節配列のその他の例は遺伝子増幅を可能にするものである。真核系においては、これらにはメトトレキセートの存在下で増幅するジヒドロフォレートリダクターゼ遺伝子、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。このような場合、当該ポリペプチドをコードする核酸配列は調節配列に作用可能式に連結されているであろう。
【００７６】
本発明は更に本発明のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を改変するための核酸構築体に関連する。これらの構築体は内因性遺伝子の発現を改変するのに必要な最少限の成分を含みうる。一の態様において、この核酸構築体は好ましくは（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン及び（ｄ）スプライスドナー部位を含む。細胞への核酸構築体の導入により、この構築体は相同組換を介して細胞ゲノムの内因性遺伝子部位に挿入される。ターゲッティング配列は要素（ａ）〜（ｄ）の内因性遺伝子への組込みを指令し、その結果要素（ｂ）〜（ｄ）は内因性遺伝子に作用可能式に連結される。別の態様において、この核酸は（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、及び（ｆ）スプライスアクセプター部位を含み、ここでこのターゲッティング配列は要素（ａ）〜（ｆ）の組込みを指令し、かくして要素（ｂ）〜（ｆ）は内因性遺伝子に作用可能式に連結される。しかしながら、この構築体は追加の成分、例えば選択マーカーを含んでよい。
【００７７】
双方の態様において、これらの成分の導入は内因性遺伝子の発現が改変された新しい転写ユニットの製造をもたらす。本質的には、この新しい転写ユニットはターゲッティング構築体及び内因性遺伝子により導入された配列の融合生成物である。内因性遺伝子が改変されている一の態様において、遺伝子は活性化されている。この態様において、調節配列の挿入を介して親細胞の内因性遺伝子に通常天然に結合した調節領域を置換、中断又は妨害するために相同組換が利用され、これは対応の親細胞よりも高いレベルでの遺伝子の発現を及ぼす。この活性化遺伝子は当業界において周知の方法を利用して、この構築体の中に増幅可能な選択マーカー遺伝子を合体させることにより更に増幅されうる（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号を参照のこと）。内因性遺伝子が改変されている別の態様においては、遺伝子の発現が低下している。
【００７８】
ターゲッティング配列は内因性遺伝子内、遺伝子のすぐ隣り、上流遺伝子内、又は内因性遺伝子の上流且つ離れて存在してよい。１又は複数のターゲッティング配列を使用してよい。例えば、環状のプラスミド又はＤＮＡフラグメントは好ましくは単独のターゲッティング配列を採用し、一方線形のプラスミド又はＤＮＡフラグメントは好ましくは２本のターゲッティング配列を採用する。
【００７９】
この構築体の調節配列は１又は複数のプロモーター、エンハンサー、スカフォルド付加領域又はマトリックス付加部位、陰性調節要素、転写結合部位又はこれらの配列の組合せを含んで成ってよい。
【００８０】
この構築体は更にこの内因性遺伝子の１又は複数のエキソンを含んで成る。エキソンはＲＮＡへと複写され、そして成熟ｍＲＮＡ分子の中にエキソン配列が内因性遺伝子のコード領域とイン・フレームとなるように存在しているＤＮＡ配列と定義される。このエキソンは任意的に、１又は複数のアミノ酸をコードする及び／又は１個のアミノ酸を部分的にコードするＤＮＡを含む。他方、このエキソンは５′非コード領域に対応するＤＮＡを含む。内因性エキソンが１又は複数のアミノ酸及び／又は１個のアミノ酸の一部をコードする場合、この核酸構築体は、転写及びスプライシングにより、リーディングフレームが内因性遺伝子のコード領域とイン・フレームとなり、第二エキソンに由来するｍＲＮＡの一部の適当なリーディングフレームがそのままとなるようにデザインする。
【００８１】
この構築体のスプライス・ドナー部位は一のエキソンを別のエキソンからスプライシングするのを指令する。典型的には、第一エキソンは第二エキソンの５′側にあり、そしてこの第一エキソンの３′側で重複且つ隣接するスプライスドナー部位は第二エキソンの５′側上の第二エキソンに隣接するスプライスアクセプター部位を認識する。スプライスアクセプター部位は、スプライスドナー部位と同様、一のエキソンの別のエキソンからのスプライシングを指令する配列である。スプライスドナー部位と一緒に働くことにより、このスプライシング装備はイントロンの除去を及ぼすためにスプライスアクセプター部位を使用する。
【００８２】
発現ベクター
本発明は更に、本発明の核酸配列、プロモーター並びに転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換発現ベクターに関連する。上記の様々な核酸及びコントロール配列は、１又は複数の慣用の制限部位を、かかる部位での当該ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするために含みうる組換発現ベクターを作るように合体させてよい。他方、本発明の核酸配列は当該核酸配列又は当該配列を含んで成る核酸構築体を適当な発現用ベクターに挿入することにより発現されうる。発現ベクターの構築において、このコード配列はベクター内に、それが発現のために適当なコントロール配列と作用可能式に連結されるように配置する。
【００８３】
組換発現ベクターは組換ＤＮＡ手順に簡単にかけることができ、そして核酸配列の発現をもたらすことのできる任意のベクター（例えばプラスミド又はウィルス）であってよい。選定のベクターは一般にそのベクターを導入すべき宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。これらのベクターは線形又は閉環プラスミドであってよい。
【００８４】
当該ベクターは自己複製式ベクター、即ち、染色体外質として存在するベクターであって、その複製が染色体の複製とは独立したもの、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロソーム、又は人工染色体であってよい。このベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含みうる。他方、このベクターは、宿主細胞に導入したとき、ゲノムに組込み、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製するものであってよい。更に、単独のベクターもしくはプラスミド、又は２種以上のベクターもしくはプラスミドであって一緒に宿主細胞のゲノムの中に導入される総ＤＮＡを含むもの、又はトランスポゾンを使用してよい。
【００８５】
本発明のベクターは好ましくは１又は複数の選択マーカーであって、形質転換細胞の選択を容易にするものを含む。選択マーカーはその生成物が、殺生物剤又はウィルス耐性にする、重金属に耐性にする、原栄養性を独立栄養性にする遺伝子である。細菌選択マーカーの例はバチルス・スブチリスもしくはバチルス・リシェニホルミスに由来のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を授けるマーカーである。酵母宿主細胞のために適当なマーカーはＡＤＥ２，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹＳ２，ＭＥＴ３，ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主内で使用するための選択マーカーは、限定することなく、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートリダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オルチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓｃ（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）並びに他の種由来の均等物を含む群から選ばれうる。アスペルギルス細胞において利用するのに好ましいのはアスペルギルス・ニドゥランス又はアスペルギルス・オリザのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（S. hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子である。
【００８６】
本発明のベクターは好ましくは宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み又は細胞のゲノムとは独立の細胞へのベクターの自己複製を可能にする要素を含む。
【００８７】
宿主細胞ゲノムへの組込みのため、このベクターは当該ポリペプチドをコードする核酸配列又は相同もしくは非相同組換によるゲノムへのベクターの安定な組換のためのこのベクターの任意のその他の要素を頼りとしうる。他方、このベクターは宿主細胞のゲノムへの相同組換による組換を誘導するための更なる核酸配列を含みうる。この更なる核酸配列はベクターが宿主細胞ゲノムの中に染色体内の正確な位置において組込まれることを可能にする。正確な位置での組込みの傾向を高めるため、組込み要素は好ましくは十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００塩基対、好ましは４００〜１，５００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべきであり、それは相同組換の確率を高めるよう対応の標的配列と十分に相同性なものとする。組込み要素は宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同である任意の配列であってよい。更に、この組込み要素は非コード又はコード核酸配列であってよい。他方、このベクターは非相同組換により宿主細胞のゲノムに組込まれうる。
【００８８】
自己複製のため、このベクターは注目の宿主細胞内でベクターが自己複製できるようにする複製起点を更に含んで成ってよい。細菌の複製起点の例はＥ．コリ内での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７及びｐＡＣＹ１８４、並びにバチルス内での複製を可能にするｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞内で使用するための複製起点の例は２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１，ＡＲＳ４、並びにＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。複製起点はその機能を宿主細胞内で温度感受性にする突然変異を有するものであってよい（例えば、Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433 参照）。
【００８９】
複数の本発明の核酸配列のコピーを遺伝子生成物の生産性を高めるために宿主細胞に挿入してよい。核酸配列のコピー数の増大は当該配列の少なくとも一の追加コピーを宿主細胞ゲノムの中に組込むことにより、又は核酸配列に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含ませることにより得ることができ、ここでこの選択マーカー遺伝子の増幅コピー、それ故核酸配列の追加のコピーを含む細胞は適当な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択できるようになる。
【００９０】
上記の要素を本発明の組換発現ベクターの構築のためにライゲーションするのに利用する手順は当業者に周知である（例えば、Sambrookら、1989、前掲参照のこと）。
【００９１】
宿主細胞
本発明は更に、当該ポリペプチドの組換製造に好適に利用される本発明の核酸配列を含んで成る組換宿主細胞に関連する。本発明の核酸配列を含んで成るベクターは宿主細胞の中に、前述の通りかかるベクターが染色体組込み体として、又は自己複製式染色体外ベクターとして維持されるように導入する。「宿主細胞」とは、複製の間に起こる突然変異により親細胞とは同一でなくなった親細胞の任意の子孫を包含する。選定の宿主細胞はポリペプチドをコードする遺伝子及びその起源に著しく依存する。
【００９２】
宿主細胞の単細胞微生物、例えば原核細胞、又は非単細胞微生物、例えば真核細胞であってよい。
【００９３】
有用な単細胞は細菌細胞、例えばグラム陽性菌、例えばバチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス、バチルス・ロータス、バチルス・レンタス、バチルス・リシェニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンジェンシス；又はストレプトマイセス細胞、例えばストレプトマイセス・リビダンス又はストレプトマイセス・ミュリヌス、又はグラム陰性菌、例えばＥ．コリ又はシュードモナス種である。好適な態様において、この細菌宿主細胞はバチルス・レンタス、バチルス・リシェニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス又はバチルス・スブチリス細胞である。別の好適な態様において、バチルス細胞は好アルカリ性バチルスである。
【００９４】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115参照）、コンピテント細胞の使用（例えばYoung and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 参照）、エレクトロポレーション（例えばShigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 参照）、又はコンジュゲーション（例えばKoehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278参照）により行われうる。
【００９５】
宿主細胞は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は菌類細胞であってよい。
【００９６】
好適な態様において、宿主細胞は菌類細胞である。本明細書で用いる「菌類」とは、子嚢菌類（Ascomycota）、担子菌類（Basidiomycota ）、ツボカビ類（Chytridiomycota ）及び接合菌類（Zygomycota）（Hawksworthら、Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi 、第８版、1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより規定）並びに卵菌類（Oomycota）（Hawksworthら、1995、前掲、頁171 に記載）及び全ての不完全菌類（Hawksworthら、1995、前掲）の族が含まれる。
【００９７】
より好適な態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」とは、本明細書ではアスコスポロジェナス（ascosporgenous）酵母（エンドマイセタールス：Endomycetales ）、バシジオスポロジェナス（basidiosporogenous）酵母、並びに不完全菌類（ブラストマイセテス：Blastomycetes ）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来において変わりうるため、本発明の目的に関し、酵母はBiology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9, 1980 ）の定義に従う。
【００９８】
更により好適な態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ、ハンセヌラ、クルイベロマイセス、ピチア、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス又はヤロウィア細胞である。
【００９９】
最も好適な態様において、酵母宿主細胞はサッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ジアスタチカス、サッカロマイセス・ドウグラシイ、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ノルベンシス又はサッカロマイセス・オビフォルミス細胞である。他の最も好適な態様において、酵母宿主細胞はクルイベロマイセス・ラクチス細胞である。別の最も好適な態様において、酵母宿主細胞はヤロウィア・リポリチカ（Y. lipolytica ）細胞である。
【０１００】
別のより好適な態様において、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌細胞」には真菌類及び卵菌類の副分類の全ての糸状形態が含まれる（Hawksworthら、1995前掲により規定）。糸状菌はキチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複雑な多糖類から構成される菌糸体壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長により、そして炭素異化は専ら好気性である。対照的に、サッカロマイセスの如き酵母の栄養増殖は単細胞葉状体の出芽により、そして炭素異化は発酵的でありうる。
【０１０１】
更により好適な態様において、糸状菌宿主細胞は限定することなく、アクレモニウム、アスペルギルス、フサリウム、ヒュミコラ、ムコール、ミセリオフソラ、ニューロスポラ、ペニシリウム、チェラビア、トリポクラジウム又はトリコデルマの種の細胞である。
【０１０２】
最も好適な態様において、この糸状菌宿主細胞はアスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フェチドゥス、アスペルギルス・ジャポニカス、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザ細胞である。別の最も好適な態様において、糸状菌宿主細胞はフサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クルックウェレンス、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・グラミヌム、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポルム、フサリウム・レチキュラトゥム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サンブチヌム、フサリウム・サルコクロムウ、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロスム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナトゥム細胞である。更に最も好適な態様において、糸状菌親細胞はフサリウム・ベネナトゥム（Nirenberg 種nov.）細胞である。別の最も好適な態様において、糸状菌宿主細胞はヒュミコラ・インソレンス又はヒュミコラ・ラヌギノーザ細胞である。別の最も好適な態様において、糸状菌宿主細胞はムコール・ミーヘイ細胞である。別の最も好適な態様において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ細胞である。別の最も好適な態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム・パープロゲヌム細胞である。別の最も好適な態様において、糸状菌宿主細胞はチエラビア・テレストリス（Thielavia tervestris）細胞である。別の最も好適な態様において、トリコデルマ細胞はトリコデルマ・ハージアヌム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ロンジブラチアトゥム、トリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデ細胞である。
【０１０３】
菌類細胞は周知の態様でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を包含する方法により形質転換されうる。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のために適当な手順はＥＰ  ２３８０２３号及びYeltonら、1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474 に記載されている。フサリウム種を形質転換するために好適な方法はMalardier ら、1989, Gene 78: 147-156及びＷＯ  ９６／００７８７に記載されている。酵母は、Becker and Guarente, Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Itoら 1983, Journal of Bacteriology 153: 163;及びHinnenら 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920 に記載の手順を利用して形質転換されうる。
【０１０４】
製造方法
本発明は更に、本発明のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）株であってその野生型が当該ポリペプチドを生産できるものを培養して当該ポリペプチドを含んで成る上清液を生成し；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関連する。好ましくは、この株はフサリウム属であり、そしてより好ましくはフサリウム・ベネナトゥムである。
【０１０５】
本発明は更に本発明のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）宿主細胞を当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収する；ことを含んで成る方法に関する。
【０１０６】
本発明は更に本発明のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）宿主細胞を当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し、ここで当該宿主細胞はSEQ ID NO:１の核酸配列内に少なくとも１個の突然変異を有するSEQ ID NO:１の突然変異核酸配列を含んで成り、ここで当該突然変異核酸配列はSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし；そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収する；ことを含んで成る方法に関する。
【０１０７】
本発明は更に、本発明のポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）当該ポリペプチドをコードする内因性核酸配列の第二エキソンに作用可能式に連結された調節配列、エキソン及び／又はスプライスドナー部位を含んで成る新しい転写ユニットが組込まれている相同組換細胞をこのポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し；そして（ｂ）このポリペプチドを回収する、ことを含んで成る方法に関する。これらの方法は例えば米国特許第５，６４１，６７０号に記載の遺伝子活性化技術の利用を基礎とする。遺伝子活性化技術は、通常細胞の中で発現されない遺伝子の活性化、又は細胞内で極めて低レベルで発現される遺伝子の発現の増大を基礎とする。遺伝子活性化技術は調節配列、エキソン及び／又はスプライスドナー部位を細胞のゲノムＤＮＡ内に、その挿入が、調節配列、エキソン及び／又はスプライスドナー部位が内因性遺伝子に作用可能式に連結されてその発現を活性化するようになっている新しい転写ユニットの製造をもたらすような状況で挿入する方法を含む。
【０１０８】
本発明の製造方法において、細胞は当業界周知の方法を利用して当該ポリペプチドの製造のために適当な栄養培地の中で培養する。例えば、この細胞は振盪フラスコ培養、小スケール又は大スケール発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は固定状態発酵等）により、実験室又は産業用発酵槽の中で、当該ポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする適当な培地中及び条件下で培養してよい。培養は炭素及び窒素源並びに無機塩を含んで成る適当な栄養培地の中で当業界公知の手順を利用して実施する。適当な培地は商業的供給業者から入手するか、又は公開の処方に従って調製できうる（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）。もしこのポリペプチドが栄養培地の中に分泌されるなら、このポリペプチドは培地から直接回収できる。ポリペプチドが分泌されないのなら、それは細胞リゼートから回収できる。
【０１０９】
このポリペプチドはそれに特異的な当業界公知の方法を利用して検出できうる。このような検出方法には特異的な抗体の利用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失の利用が含まれうる。例えば、ポリペプチドの活性の決定のために酵素アッセイを利用できうる。５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の測定のための手順は当業界において公知である。前述の通り、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性はWider de Xifraら、1971、前掲により発表され、Pavetoら、1989、前掲により改良された手順に従って決定される。
【０１１０】
得られるポリペプチドは当業界に公知の方法により回収できうる。例えば、このポリペプチドは、限定することなく、遠心分離、濾過、抽出、スプレー乾燥、エバポレーション又は沈殿等の慣用の手順により栄養培地から回収できうる。
【０１１１】
本発明のポリペプチドは、限定することなく、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製等電点電気泳動）、示差溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出等の様々な手順により精製し得る（例えば、Protein Purification, J.C.Janson and Lars Ryden 編、VCH Publishers, New York, 1989）。
【０１１２】
用途
本発明は５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドを利用する方法にも関連する。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性が宿主細胞内でのヘムの生産の律速段階となっている宿主細胞により生産されるヘムタンパク質の収量を高めるため、この宿主細胞内の５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を過剰発現させることにより利用されうる。この方法は：（ａ）ヘムタンパク質を生産できる宿主細胞に、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の１又は複数のコピーを導入し、ここで当該核酸配列は当該ポリペプチドの発現を指令できる調節配列に作用可能式に連結されている；（ｂ）この細胞をヘムタンパク質及び当該ポリペプチドの生産に適する栄養培地の中で培養し；そして（ｃ）このヘムタンパク質を細胞の栄養培地から回収する、ことを含んで成る（ＷＯ  ９７／４７７４６号参照）。
【０１１４】
本発明は異種ポリペプチドの製造のためにも利用されうる。本方法は（ａ）呼吸欠陥細胞突然変異体に本発明のポリペプチドをコードする第一核酸配列及び第二核酸配列を含んで成る核酸構築体を導入し、ここでこの第一核酸配列は発現するとこの呼吸欠陥を補完し、そしてこの第二核酸配列は異種ポリペプチドをコードするものであり；（ｂ）この第一及び第二核酸配列を培養培地の中で、この第一及び第二核酸配列の発現に適する好気的条件下で培養し；そして（ｃ）この異種ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る（ＷＯ  ９８／４１６４０号参照）。
【０１１５】
本発明を以下の限定でない実施例により更に説明する。
【０１１６】
実施例
培地
５０×Ｖｏｇｅｌｓは１リットル当り１５０ｇのクエン酸ナトリウム、２５０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１０ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｇのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、２．５mlのビオチンストック溶液及び５．０mlの微量金属溶液から成る。
【０１１７】
微量金属溶液は１リットル当り１４．３ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ2 、１３．８ｇのＦｅＳＯ4 、８．５ｇのＭｎＳＯ4 及び３．０ｇのクエン酸から成る。
【０１１８】
ＲＡ胞子形成培地は１リットル当り５０ｇのコハク酸、１２．１ｇのＮａＮＯ3 、１ｇのグルコース、２０mlの５０×Ｖｏｇｅｌｓ及び０．５mlの１０mg／mlのＮａＭｏＯ4 ストック溶液、pH６．０から成る。
【０１１９】
ＹＥＧ培地は１リットル当り５ｇの酵母エキス及び２０ｇのグルコースから成る。
【０１２０】
ＹＥＰＧ培地は１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン及び２０ｇのグルコースから成る。
【０１２１】
ＳＴＣは０．８Ｍのソルビトール、２５mMのＴｒｉｓ、pH８、２５mMのＣａＣｌ2 から成る。
【０１２２】
ＳＰＴＣは４０％のＰＥＧ  ４０００、０．８Ｍのソルビトール、２５mMのＴｒｉｓ、pH８、２５mMのＣａＣｌ2 から成る。
【０１２３】
Ｍ４００培地（pH６．０）は１リットル当り５０ｇのマルトデキストリン、２ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、４ｇのクエン酸、８ｇの酵母エキス、２ｇの尿素、０．５mlの微量金属溶液及び０．５ｇのＣａＣｌ2 から成る。
【０１２４】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は１リットル当り０．０４ｇのＮａＢ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．８ｇのＮａ2 ＭｏＯ2 ・２Ｈ2 Ｏ及び１０ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏから成る。
【０１２５】
最少培地上層（pH６．５）は１リットル当り、６．０ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlのＣＯＶＥ微量金属溶液、２０mlの５０％のグルコース、２．５mlの２０％のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２０mlのビオチンストック溶液及び２０ｇの低融点アガロースから成る。
【０１２６】
ビオチンストック溶液は１００mlの５０％のエタノール中５mgのビオチンから成る。
【０１２７】
最少培地プレート（pH６．５）は６．０ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１．０mlのＣＯＶＥ微量金属溶液、２０ｇのＮｏｂｅｌ  Ａｇａｒ（Difco ）、２０mlの５０％のグルコース、２０mlのメチオニン（５０ｇ／ｌ）、２０mlのビオチン（２００mg／ｌ）、２．５mlの２０％のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び１．０mlのストレプトマイシンから成る。
【０１２８】
実施例１：フサリウム・グラミネアルム株ＡＴＣＣ  ２０３３４ゲノムＤＮＡ抽出
フサリウム・グラミネアルム（＝フサリウム・ベネナトゥム）株ＡＴＣＣ  ２０３３４を２５mlの０．５％の酵母エキス−２％のグルコース（ＹＥＧ）培地の中で７２時間、３０℃で２５０rpm において増殖させた。菌糸体をMiracloth （Calbiochem, La Jolla, CA）を介する濾過により集め、そして２５mlの１０mMのＴｒｉｓ−１mMのＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーで１回洗った。過剰のバッファーを菌糸体から排液し、次いでその菌糸体を液体窒素の中で凍結させた。凍結菌糸体を電気コーヒーグラインダーで微粉末へと粉砕し、そしてこの粉末をディスポーザブルプラスチック遠沈管中の２０mlのＴＥバッファー及び５mlの２０％ｗ／ｖのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に加えた。この混合物を数回静かに反転させて混合を確実にし、そして当容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出した。酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液）を０．３Ｍの最終濃度となるように加え、次いで２．５容量の氷冷エタノールを加えて核酸を沈殿させた。次いでこの核酸をこの遠沈管を１５，０００×ｇで３０分遠心分離することによりペレットにした。このペレットを３０分風乾してから０．５mlのＴＥバッファーに再懸濁した。ＤＮａｓｅフリーリボヌクレアーゼＡを１００mg／mlの濃度となるように加え、そしてこの混合物を３７℃で３０分インキュベーションした。次いでプロテイナーゼＫを２００mg／mlの濃度となるように加え、そしてこの混合物を更に１時間３７℃でインキュベーションした。最後に、この混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出し、そしてそのＤＮＡを酢酸ナトリウム及びエタノールで前述の通りに沈殿させた。このＤＮＡペレットを真空で風乾し、ＴＥバッファーに再懸濁し、そして４℃で使用するまで保存した。
【０１２９】
実施例２：プラスミドｐＧＡＧａ５の構築
プラスミドｐＧＡＧａ５はフサリウム株ＡＴＣＣ  ２０３３４ゲノムＤＮＡを含む増幅反応体からのＰＣＲフラグメントのライゲーションにより構築した。この増幅反応体は下記の成分を含む：５０ngのゲノムＤＮＡ、１００μＭづつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）、５０pmole のプライマーｈｅｍＡＤｅｇ５′  ５′−GTITGGTGYTCIAAYGAYTAYCT −３′（SEQ ID NO:３）及びｈｅｍＡＤｅｇ３′  ５′−CCNACNGCRTGNACYTCRTC−３′（SEQ ID NO:４）、２ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）並びに１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）。この反応体をPerkin-Elmer Thermal Cycler (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ ）で、９５℃で１分、５３℃で１分、７２℃で９０秒のサイクル３０回にプログラムしてインキュベーションした。４５０bpのＰＣＲ生成物を１．１％の低融点アガロースゲル（FMC, Rockland, ME ）を用い、４０mMのＴｒｉｓ−酢酸−１mMの二ナトリウムＥＤＴＡ（ＴＡＥバッファー）での電気泳動後に切り出すことにより単離し、そしてｐＣＲIIベクター（Invitrogen, San Diego, CA ）の中に、その製造業者の仕様書に従ってサブクローニングし、ｐＧＡＧａ５ができた。
【０１３０】
実施例３：フサリウムＤＮＡライブラリー及び５−アミノレブリン酸シンターゼ（ｈｅｍＡ）クローンの同定
フサリウム株ＡＴＣＣ  ２０３３４ゲノムＤＮＡライブラリーをバクテリオファージクローニングベクターλＺｉｐＬｏｘ（Life Technologies, Gaithersburg, MD ）を用い、その製造業者の仕様書に従って組換バクテリオファージのプレーティング及び精製のための宿主としてＥ．コリＹ１０９０ＺＬ細胞を、そして個々のｐＺＬ１−ｈｅｍＡクローンの切り出しのためにＥ．コリＤＨ１０Ｂｚｉｐを用い、構築した。実施例１に記載の通りにして調製した総細胞ＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉで部分消化し、そして１％のアガロースゲル上で５０mMのＴｒｉｓ−５０mMの硼酸−１mMの二ナトリウムＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファーによりサイズ分画した。４〜７kbのサイズ範囲で泳動したＤＮＡフラグメントを切り出し、そしてＰｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ試薬（BioRad Laboratories, Hercules, CA ）を利用してゲルから溶出させた。溶出させたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ−切断し且つ脱リン酸化したλＺｉｐＬｏｘベクターアームとライゲーションし、そしてそのライゲーション混合物を商業用のパッケージング抽出物（Stratagene, La Jolla, CA）を用いてパッケージングした。このパッケージングしたＤＮＡライブラリーをプレート培養し、そしてＥ．コリＹ１０９０ＺＬ細胞の中で増幅させた。未増幅ゲノムライブラリーは１×１０6pfu／ｍ）を含んだ。
【０１３１】
７×１０4 プラーク由来のバクテリオファージＤＮＡを二重環状Nytran Plus 膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH ）に移し、そして実施例３に記載のプラスミドｐＧＡＧａ５由来のフサリウム株ＡＴＣＣ  ２０３３４ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により調製した。この増幅反応体は下記の成分を含む：１×のＤＩＧプローブ合成混合物（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）、５０pmole のプライマーｈｅｍＡ５′３８  ５′−CCATACTTGTCGGCAAG −３′（SEQ ID NO:５）及びプライマーｈｅｍＡ３′４２３  ５′−GAACGACTACCTTGGC−３′（SEQ ID NO:６）、２ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー。この反応体をPerkin-Elmer Thermal Cycler で、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクル３０回にプログラムしてインキュベーションした。変性プローブをハイブリダイゼーションバッファーに２ng／mlの濃度で加え、そしてプレハイブリダイゼーションした膜と一夜インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは４２℃で５×ＳＳＣ、０．１％のサルコシル、０．０２％のＳＤＳ、１％のＧｅｎｉｕｓブロッキング剤（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）及び３０％のホルムアミドの中で実施した。膜を５×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳの中で２回洗い、次いで２×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳで２回洗った。各洗浄は室温で１５分実施した。洗浄した膜をKodak X-OMAT AR フィルムに約２時間室温で露出し、次いでKonica QX-70自動フィルムプロセッサーを用いて製造業者の仕様書に従って現像した。第一プラークを精製し、そして２回目にスクリーニングした。３つのクローンが同定され、そして製造業者の仕様書（Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）に従ってｐＺＬ誘導体へと切り出した。このｐＺＬ誘導体をｐＺＬ１−３，ｐＺＬ３−３及びｐＺＬ１２−１と命名し、そして３．８kbの領域を含むことが見い出された。
【０１３２】
実施例４：フサリウム５−アミノレブリン酸シンターゼ（ｈｅｍＡ）遺伝子の特性決定
実施例３に記載のｐＺＬ３−３を下記の手順に従うＤＮＡ配列決定にかけた。ＤＮＡ配列決定はApplied Biosystems Model 373A 自動ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA ）で、Ｍ１３リバース（−４８）及びＭ１３フォワード（−２０）プライマー（New England Biolabs, Beverly, MA）並びに配列決定するＤＮＡに固有なプライマーを用い、染料ターミネーター化学（Gieseckeら、1992, Journal of Virol.Methods 38: 47-60）によりプライマー歩行技術を利用して両鎖で実施した。
【０１３３】
クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列は２つの短い推定イントロンにより区切られた図１（SEQ ID NO:１）に示す１９２２ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを示した。このヌクレオチド配列は分子量６５kDa の５８８個のアミノ酸の推定タンパク質をコードする。
【０１３４】
フサリウム株ＡＴＣＣ  ２０３３４遺伝子生成物の推定アミノ酸配列を図１に示す（SEQ ID NO:２）。全体的に、この推定アミノ酸配列はアスペルギルス・ニドゥランスｈｅｍＡ遺伝子（Bradshowら、1993、前掲）と７３％の同一性を有し、サッカロマイセス・セレビシエＨＥＭ１遺伝子（Urban-Grimal, 1986, European Journal of Biochemistry 156: 511-519 ）と５７％の同一性を有した。これは、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153）により、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）ソフトウェアー（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を利用し、同一性表及び下記のマルチプルアラインメントパラメーターを利用して決定した：gap penalty 10, gap length penalty 10 。対合アラインメントパラメーターはKtuple＝１，gap penalty ＝３，windows ＝５、そしてdiagonals ＝５とした。
【０１３５】
実施例５：ｐΔＨｅｍＡの構築
プラスミドｐΔＨｅｍＡはｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳアレルを含むように構築した。
【０１３６】
プラスミドｐＪＲｏｙ４７をまず、ａｍｄＳマーカーの組換及び除去を促進するようにデザインされた２２４bpの直接反復配列の隣接するアスペルギルス・ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を含むように構築した。ｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs, Beverly, MA）をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、そしてQiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA ）を利用してゲル精製した。２種のオリゴヌクレオチドＢａｍ／Ｓｗａ／Ｓａｌリンカー３及びＢａｍ／Ｓｗａ／Ｓａｌリンカー４（以下に示す）を水に５０pmol／μｌの濃度となるように再懸濁し、混合し、５０℃で１０分加熱し、そしてゆっくりと冷やした。
Ｂａｍ／Ｓｗａ／Ｓａｌリンカー３：５′−GATCGATTTAAAT −３′（SEQ ID NO:７）
Ｂａｍ／Ｓｗａ／Ｓａｌリンカー４：５′−TCGAATTTAAATC −３′（SEQ ID NO:８）
【０１３７】
このオリゴヌクレオチドを上記のＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限処理したｐＮＥＢ１９３にライゲーションし、プラスミドｐＪＲｏｙ４３を作った（図２）。
【０１３８】
反復配列フラグメントを作るため、２通りのＰＣＲ反応を下記のプライマーペアーで実施した。
ペアー１：
反復オリゴ１：５′−GCGAATTCATATTTAAATGCCGACCAGCAGACGGCCCTCG−３′（SEQ ID NO:９）
反復オリゴ２：５′−GCGATATCATGATCTCTCTGGTACTCTTCG−３′（SEQ ID NO:１０）
ペアー２：
反復オリゴ３：５′−GCGATATCATCGACCAGCAGACGGCCCTCG−３′（SEQ ID NO:１１）
反復オリゴ４：５′−GCGTTTAAACATGATCTCTCTGGTACTCTTCG−３′（SEQ ID NO:１２）
【０１３９】
増幅反応体（５０μｌ）は下記の成分を含む：５０ngのｐＪａＬ４９３（ＷＯ  ９８／４１６４０）、５０pmolの反復オリゴ１及び５０pmolの反復オリゴ２、又は５０pmolの反復オリゴ３及び５０pmolの反復オリゴ４、５μｌの２．５mMのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）及び５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）。この反応体をPerkin-Elmer Model 480 Thermal Cycler で下記の通りにプログラムしてインキュベーションした：９５℃で１分、５５℃で１分及び７２℃で１分のサイクル２〜３０回、並びに４℃での浸漬サイクル。得られる２２４bpのフラグメントを１％のアガロースゲル上でＴＡＥバッファー中で泳動させ、そしてQiaquick Gel Extraction Kit を利用して精製した。次いでこれらのフラグメントをＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩで消化し、互いとライゲーションさせ、そして再びQiaquick Gel Extraction Kit を利用してゲル精製した。
【０１４０】
プラスミドｐＪＲｏｙ４３及び反復配列含有フラグメントを共にＳｗａＩ及びＰｍｅＩで消化し、そしてライゲーションさせてｐＪＲｏｙ４４を作った（図３）。
【０１４１】
次いでプラスミドｐＪＲｏｙ４４をＥｃｏＲＶで消化し、そしてQiaQuick Gel Extraction Kit を用いてゲル精製した。アスペルギルス・ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を含むブラント２．７kb  ＮｓｉＩ制限処理フラグメントをＥｃｏＲＶ消化ｐＪＲｏｙ４４にライゲーションして、ｐＪＲｏｙ４７を作った（図４）。
【０１４２】
ａｍｄＳマーカーの組換及び除去を促進するようにデザインされた２２４bpの直接反復配列の隣接するアスペルギルス・ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を含む３．２kbのフラグメントを、ｐＪＲｏｙ４７のＰｍｅＩ，ＳｃａＩ及びＳｗａＩによる制限処理により得た。このブラント末端型ＤＮＡフラグメントをQiaQuick Gel Extraction Kit を用いて精製した。
【０１４３】
精製したＤＮＡフラグメントを実施例４に記載のｐＺＬ３−３にクローニングし、ＮｒｕＩで制限処理し（開始コドンを含むｈｅｍＡ  ＯＲＦの１６１６bpのフラグメントの除去のため）、そしてライゲーションしてｐΔＨｅｍＡを作った（図５）。欠失を含むｈｅｍＡ遺伝子の領域をｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳアレルの種類を確認するために配列決定した。配列決定は、ｈｅｍＡ欠失がコード配列を除去し、そしてこの遺伝子のリーディングフレームを破壊することを示した。
【０１４４】
実施例６：ｐΔＨｅｍＡによるフサリウム・ベネナトゥムの形質転換
フサリウム株ＡＴＣＣ  ２０３３４（Wiebe ら、1991, Mycol.Research 95: 1284-1288）の形態学的突然変異体であるフサリウム・ベネナトゥムＣＣ１−３（ＭＬＹ−３）をｐΔＨｅｍＡで形質転換し、野生型ｈｅｍＡ遺伝子をｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳ欠失アレルで置換した。
【０１４５】
フサリウム・ベネナトゥムＭＬＹ−３の胞子は５００mlのＲＡ胞子形成用培地を含むフラスコに、２．５％のグルコース及び２．５mMの硝酸ナトリウムの添加された１×Ｖｏｇｅｌｓ培地由来の１０個のプラグを接種し、そして２８℃で１５０rpm 、２〜３回インキュベーションすることにより作製した。胞子はMiracloth (Calbiochem, San Diego, CA）で回収し、そしてSorvall RC-5B 遠心機（E.I.Dupont De Nemours and Co., Wilmington, DE ）の中で７０００rpm で２０分遠心分離した。ペレットにした胞子を無菌蒸留水で２回洗い、少容量の水に再懸濁し、次いでヘモサイトメーターを利用してカウントした。
【０１４６】
プロトプラストは１００mlのＹＥＰＧ培地に４×１０7 胞子フサリウム・ベネナトゥムＭＬＹ−３を接種し、そして２４℃で１５０rpm にて１６時間インキュベーションすることにより調製した。この培養物をSorvall RT 6000D (E.I.Dupont De Nemours and Co., Wilmington, DE ）で３５００rpm にて７分遠心分離した。ペレットを３０mlの１ＭのＭｇＳＯ4 で２回洗い、そして１５mlの５mg／mlのＮＯＶＯＺＹＭＥ  ２３４（商標）（バッチPPM 4356, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）の中で１ＭのＭｇＳＯ4 の存在下で再懸濁した。培養物を２４℃で１５０rpm 、プロトプラストが形成されるまでインキュベーションした。容量３５mlの２Ｍのソルビトールをこのプロトプラスト消化物に加え、そしてこの混合物を２５００rpm で１０分遠心分離した。このペレットを再懸濁し、ＳＴＣで２回洗い、そして２０００rpm で１０分遠心分離してプロトプラストをペレットにした。このプロトプラストをヘモサイトメーターでカウントし、そしてＳＴＣ：ＳＰＴＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１の溶液の中に２×１０7 プロトプラスト／mlの最終濃度となるように再懸濁した。このプロトプラストをNalgene Cryo  １℃ Freezing Container (VWR Scientific, Inc., San Francisco, CA）の中で速度制御凍結してから−８０℃で保存した。
【０１４７】
フサリウム・ベネナトゥムＭＬＹ−１の凍結プロトプラストを氷の上で融解した。形質転換をプロトプラストで、２×１０7 プロトプラスト／mlの濃度で実施した。２００μｌのプロトプラストを４０μｇのｐΔＨｅｍＡ＋５μｌのヘパリン（５mg／mlのＳＴＣ）と混合し、そして３０分氷の上でインキュベーションした。２mlのＳＰＴＣを加え、そしてこのプロトプラストを更に２０分室温でインキュベーションした。最少培地上層（５０ml）を形質転換反応体に加え、そしてこの反応体を５mMの５−アミノレブリン酸の添加された２枚の最少培地プレートでプレート培養した。５−アミノレブリン酸の独立栄養性が、室温で１２日間の５−アミノレブリン酸欠如最少培地での一次形質転換体の増殖により決定された。
【０１４８】
この形質転換は１００超のコロニーを供した。５−アミノレブリン酸欠如最少培地上での３０個の一次形質転換体のスクリーニングは、増殖が臨界的な株１９個をもたらした。その形質転換体１０個をサザン分析のために選んだ。
【０１４９】
１０個の形質転換体各々からのゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を実施例１に記載の通りに調製し、そしてＥｃｏＲＶで制限消化した。このフラグメントを１％のアガロースゲル電気泳動によりＴＡＥバッファーを用いて分離した。ＤＮＡをNytran Plus ナイロン膜に１０×ＳＳＣ中でＴｕｒｂｏＢｌｏｔ装置（Schleicher & Schuell, Keene, NH ）を利用し、その製造業者の仕様書に従って転写した。この膜を２時間、６５℃で、５×ＳＳＣ、０．１％のサルコシル、０．０２％のＳＤＳ、１％のＧｅｎｉｕｓブロッキング剤（Genius DIG Luminescent Detection Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）及び５０％のホルムアルデヒドの中で、Ｈｙｂａｉｄオーブン（Labnet, Woodbridge, NJ）内でプレハイブリダイゼーションした。欠失ｈｅｍＡ遺伝子の５′隣接領域に基づくＤＩＧ−ラベル化プローブは、以下のプライマー３−３２４３Ｕ及び３ｆｏｒ．１を利用し、ｐΔＨｅｍＡ由来のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅により調製した。
３−３２４３：５′−CCCTTCTAGGCAAGTCTATGG −３′（SEQ ID NO:１３）
３ｆｏｒ．１：５′−CCGCAGCATGGCCGCAACTTG −３′（SEQ ID NO:１４）
【０１５０】
増幅反応体（５０μｌ）は下記の成分を含む：５０ngのｐΔＨｅｍＡ、５０pmolの３−３２４３Ｕプライマー、５０pmolの３ｆｏｒ．１プライマー、５μｌのＤＩＧラベル化ｄＡＴＰ、１×ＤＩＧプローブ合成混合物（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）、及び５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）。反応体をPerkin-Elmer Model 480 Thermal Cycler で下記の通りにプログラムしてインキュベーションした：９５℃で５分、５５℃で２分、そして７２℃で５分のサイクル１回；９５℃で１分、５５℃で１分、そして７２℃で１分のサイクルを２〜３０回；そして４℃での浸漬サイクル。この反応生成物を１．５％のアガロースゲル上でＴＡＥバッファーを利用して単離し、３００bpの生成物バンドをゲルから切り出し、そしてQiaex II (Qiagen, Chatsworth, CA）を用い、その製造業者の仕様書に従って精製した。
【０１５１】
精製したプローブをまず水の中で４ng／mlにて沸騰湯浴の中で１０分加熱することにより変性させ、次いで上記のハイブリダイゼーション溶液を加えた。６５℃で一夜のハイブリダイゼーションの後、この膜を２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１０分室温で洗い、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１５分、６８℃で２回洗浄した。この洗浄した膜を２×ＳＳＣですすぎ、Genius DIG Luminescent Detection Kitを用い、その製造業者の仕様書に従って現像し、そしてKodak Xomat ARフィルムに約１時間露出させた。
【０１５２】
形質転換体のサザン分析は４種の形質転換体がｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳアレル（対立遺伝子）しか含まず、そして６種が野生型及びｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳアレルの双方を含むことを示した。ｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳアレルしか含まない４種の形質転換体のうち２種を胞子単離し、次いでサザン分析（前述の通り）にかけてｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳアレルの存在及び野生型アレルの欠如を確認した。サザン分析は双方の形質転換体がｈｅｍＡΔ::ａｍｄＳ遺伝子しか含まないことを示す。フサリウム・ベネナトゥム４６−３と称した一つの形質転換をｈｅｍＡ突然変異宿主株として選定した。
【０１５３】
実施例７：５−アミノレブリン酸の添加による致死ｈｅｍＡ欠失表現型の救済
ｈｅｍＡ欠失表現型を救済する５−アミノレブリン酸の能力を５−アミノレブリン酸の添加により決定した。
【０１５４】
５−アミノレブリン酸（Porphyrin Products, Logan UT）の２５０mMのストック溶液を水の中で調製し、０．２２ミクロンフィルター除菌し、−２０℃で暗所で保存し、そして使用直前に調製培地に添加又は注いだ。０．００５mg／ml〜０．３mg／mlの濃度に範囲する５−アミノレブリン酸を最少培地アガー又はＹＥＧ液体培地に加えた。フサリウム・ベネナトゥム４６−３をこれらの培地の中で２８℃で７日間培養した。ＹＥＧ液体培地を２００rpm で撹拌した。
【０１５５】
結果は、３０μＭ（５．０μｇ／ml）程に低い５−アミノレブリン酸の濃度で最少培地アガーに添加するだけで独立栄養表現を求済するのに十分であることを示した。液体ＹＥＧ培地中での増殖はやや高めの濃度を要した（１mMまで）。
【０１５６】
実施例８：ｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡの構築
プラスミドｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡを野生型ｈｅｍＡアレル及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）（Nove Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）として知られるサーモマイセス（ヒュミコラ）ラヌギノーザリパーゼをコードする異種遺伝子の発現を誘導する発現カセットを含むように構築した。詳しくは、その天然プロモーター及びターミネーターを含むフサリウム・ベネナトゥムｈｅｍＡ遺伝子を含む３．５kbのフラグメントを、ＢａｍＨＩでｐＺＬ３−３を消化し、そしてそのへこんだ末端をクレノウ酵素で埋めることにより得た。このブラント末端型ＤＮＡフラグメントをQiaQuick Gel Extraction Kit を利用してゲル精製した。
【０１５７】
ｐＪＲｏｙ５４はフサリウム・オキシスポルムＳＰ３８７プロモーター及びターミネーターにより誘導されるＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）遺伝子を含む発現カセットを含むように構築した。まず、プラスミドｐＮＥＢ１９３をブラントカッターＨｉｎｄIII で制限処理し、そしてQiaquick Gel Extraction Kit を利用してゲル精製した。次いでフサリウム・オキシスポルムＳＰ３８７プロモーター及びターミネーターで誘導されるブラント末端型ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）発現カセットをＷＯ  ９６／００７８７号に記載の通りにして得、そしてｐＮＥＢ１９３にライゲーションしてプラスミドｐＪＲｏｙ５４を得た（図６）。
【０１５８】
精製したフサリウム・ベネナトゥムｈｅｍＡ遺伝子を含む３．５kbのフラグメントをＰｍｅＩ消化ｐＪＲｏｙ５４にクローニングし、ｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡを作った（図７）。このプラスミドの配列決定はｈｅｍＡ遺伝子の存在を確証した。
【０１５９】
実施例９：ｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡの形質転換
形質転換を、実施例６に記載の手順を利用してフサリウム・ベネナトゥムから調製したプロトプラストで実施した。これらのプロトプラストを５０μｇのｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡで形質転換し、５−アミノレブリン酸欠如最少培地上にプレートし、そして室温でインキュベーションした。形質転換したコロニーが１０日間のインキュベーション後に認められた。７種の形質転換体がｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡで得られ、「ＤＮＡなし」のコントロールプレート、即ち、コントロールとしてのフサリウム・ベネナトゥム４６−３ではコロニーは出現しなかった。
【０１６０】
７種の形質転換体は５−アミノレブリン酸原栄養性であることが認められた。ＤＮＡを７種の形質転換体（ＨＬ１〜７と命名）から単離し、そして実施例６に記載の手順に従ってサザン分析にかけた。これらの結果はそれらがｈｅｍＡ欠失アレルの他に、インタクトｈｅｍＡ遺伝子の少なくとも１のコピーを含むことを示した。このデーターはｈｅｍＡ欠失表現型が野生型ｈｅｍＡ遺伝子による形質転換により求済されることを確証した。
【０１６１】
更に、形質転換体ＨＬ１〜７を７日間２８℃で２５mlのＭ４００培地を含む１２５mlの振盪フラスコの中で増殖させた。リパーゼ活性を下記の手順に従って測定した。アッセイ基質はストック基質（１０μｌのｐ−ニトロフェニルブチレート／mlのＤＭＳＯ）をＭＣバッファー（３mMのＣａＣｌ2 −０．１ＭのＭＯＰＳ  pH７．５）で使用直前に１：５希釈することにより調製した。標準ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）は１０００LU／mlの５０％のグリセロール−０．６６mMのＣａＣｌ2 −３３mMのＴｒｉｓ  pH７．５を含み、そして−２０℃で保存した。標準ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）を使用直前にＭＣバッファーで１／１００に希釈した。培養液サンプルをＭＣバッファーに希釈し、そして希釈した培養液サンプルのアリコート１００μｌを９６穴マイクロタイターディッシュに分注し、次いで希釈基質１００μｌを分注した。４０５nmでの吸収を時間の関数として記録した。培養液のリパーゼユニット／ml（LU／ml）をＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）標準品に基づき計算した。形質転換体は全て７日目のリパーゼ活性を示した。
【０１６２】
生物材料の寄託
以下の生物材料をブダペスト条約に従い、Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604 に寄託し、そして下記の受託番号が与えられた：
0004350892.tif 000002
【０１６３】
【表１】
0004350892.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  フサリウム・５−アミノレブリン酸シンターゼの核酸配列及び推定アミノ酸配列（SEQ ID NO:１及び２、それぞれ）。
【図２】  ｐＪＲｏｙ４３の制限地図。
【図３】  ｐＪＲｏｙ４４の制限地図。
【図４】  ｐＪＲｏｙ４７の制限地図。
【図５】  ｐΔＨｅｍＡの制限地図。
【図６】  ｐＪＲｏｙ５４の制限地図。
【図７】  ｐＪＲｏｙ５４ＨｅｍＡの制限地図。
【配列表】
0004350892.tif 000004
0004350892.tif 000005
0004350892.tif 000006
0004350892.tif 000007
【図１Ａ】
0004350892.tif 000008
【図１Ｂ】
0004350892.tif 000009
【図１Ｃ】
0004350892.tif 000010
【図１Ｄ】
0004350892.tif 000011
【図１Ｅ】
0004350892.tif 000012
【図１Ｆ】
0004350892.tif 000013
【図１Ｇ】
0004350892.tif 000014
【図１Ｈ】
0004350892.tif 000015
【図２】
0004350892.tif 000016
【図３】
0004350892.tif 000017
【図４】
0004350892.tif 000018
【図５】
0004350892.tif 000019
【図６】
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【図７】
0004350892.tif 000021