(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の遺伝子組換え体系統を含む試料における遺伝子組換え体の存在比を定量するための定量的検知方法であって、
(i)  前記試料中の遺伝子組換え体に由来するDNA試料中に存在する可能性のある遺伝子組換え体に特異的なDNA配列、および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性DNA配列を同一分子上に含む分子を標準分子として、前記DNA試料中の前記特異的なDNA配列および内在性DNA配列に対してそれぞれ定量的PCRを行なうこと、
(ii)  前記定量的PCR反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定すること、
(ii)  前記定量的PCR反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記内在性DNA配列の分子数を決定すること、
(iii)  以下の式(I)に従って前記試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定すること、
を含む、前記方法。
（試料中の遺伝子組換え体の存在比）＝100x［（試料中の遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数）/（試料中の内在性DNA配列の分子数）］/（定量比）（％）    （Ｉ）
（式中、（定量比）は各組遺伝子換え体系統について以下の式(II)により予め計算される値の組のうちの任意の値である。）
（定量比）＝（各遺伝子組換え体系統中の組換え体に特異的なDNA配列の分子数）／（遺伝子組換え体中の内在性DNA配列の分子数）      （II））
【請求項２】
１以上の遺伝子組換え体の系統を含む試料中における各遺伝子組換え体系統の存在比を定量するための定量的検知方法であって、
(i)  前記試料中の遺伝子組換え体に由来するDNA試料中に存在する可能性のある各遺伝子組換え体系統に特異的なDNA配列、および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性DNA配列を同一分子上に含む分子を標準分子として、前記DNA試料中の前記各遺伝子組換え体系統に特異的なDNA配列および前記内在性DNA配列に対してそれぞれ定量的PCRを行なうこと、
(i)  前記定量的PCR反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する各組換え体系統に特異的なDNA配列の分子数を決定すること、
(ii)  前記定量的PCR反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記内在性DNA配列の分子数を決定すること、
(iii)  以下の式(III)に従って前記試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定すること、
を含む、前記方法
（試料中の各遺伝子組換え体系統の存在比）＝100x［（試料中の各遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数）／（試料中の内在性DNA配列の分子数）］／（定量比）（％）        （III）
（式中、（定量比）は以下の式(II)により計算される。
（定量比）＝（各遺伝子組換え体系統中の組換え体に特異的なDNA配列の分子数）／（遺伝子組換え体中の内在性DNA配列の分子数））。
【請求項３】
定量的PCRによる試料中に存在する組換え体系統に特異的なDNA配列の分子数および前記試料中に存在する内在性DNA配列の分子数を決定することが、
（i）試料中に存在する可能性のある遺伝子組換え体系統に特異的なDNA配列、および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性DNA配列に関して、前記DNA試料中の前記遺伝子組換え体に特異的なDNA配列および前記内在性DNA配列に対してそれぞれ定量的PCR反応を行なうこと、
（ii）PCR中に増幅の指標となるシグナルをモニターし、そのシグナルが(i)で定めた閾値に達したときのPCRサイクル数を測定する。次に、得られたサイクル数を予め作製された検量線を用いて反応開始時の分子数に換算すること、
を含み、前記検量線が、PCR開始時の増幅対象DNA配列の分子数とその増幅の指標となるシグナルとの関係を表すものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
DNA配列の増幅の指標となるシグナルが蛍光であって、前記蛍光が蛍光標識プローブに由来し、前記蛍光がPCRによるDNA配列の増幅に伴う前記プローブの分解に起因して変化するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検量線が、
（ａ）  所定の分子数の標準分子に対して、遺伝子組換え体系統特異的DNA配列領域または前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性DNA配列領域を特異的に増幅するためのプライマーを用い、前記内在性DNA配列または遺伝子組換え体系統特異的DNA配列領域の増幅に伴って蛍光量を増加させるプローブの存在下でPCRを行なうこと、
（ｂ）  各分子数の前記標準分子を反応開始時の鋳型DNAとする反応について、それぞれ蛍光量を一定のサイクル数毎にモニターすること、
（ｃ）  蛍光量の増加がサイクル数に対して指数関数関係にある領域で、蛍光量増加（ΔRn）の閾値を設定すること、
（ｄ)  PCRサイクル数を縦軸にとり、反応開始時の増幅対象DNA配列領域分子数を横軸にとり、この閾値に達するPCRサイクル数を反応開始時のDNA鋳型分子数に対してプロットすること、
によって得られたものである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
配列番号73または74記載の配列を含む組換えDNA分子。
【請求項７】
配列番号75または76記載の配列を含む組換えDNA分子。
【請求項８】
請求項６〜７のいずれか１項に記載の組換えDNA分子を含む、細胞中で自己複製可能な組換えDNA分子。
【請求項９】
受託番号FERM BP-7319の大腸菌が保持するプラスミドpMul4である請求項８に記載の組換えDNA分子。
【請求項１０】
受託番号FERM BP-7320の大腸菌が保持するプラスミドpMul5である請求項８に記載の組換えDNA分子。
【請求項１１】
受託番号FERM BP-7321の 大腸菌が保持するプラスミドpMulSLである請求項８に記載の組換えDNA分子。
【請求項１２】
受託番号FERM BP-7322の大腸菌が保持するプラスミドpMulSL2である請求項８に記載の組換えDNA分子。
【請求項１３】
標準分子が請求項６〜１２のいずか１項に記載の組換えDNA分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１５または１６に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを内在性DNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１８または１９に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２１または２２に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項１７】
配列番号２４または２５に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２７または２８に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項１９】
配列番号３０または３１に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２０】
配列番号３３または３４に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２１】
配列番号３６または３７に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２２】
配列番号３９または４０に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２３】
配列番号４２または４３に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２４】
配列番号４５または４６に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを内在性DNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２５】
配列番号４８または４９に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１７に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを内在性DNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２７】
配列番号２０に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２８】
配列番号２３に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項２９】
配列番号２６に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３０】
配列番号２９に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３１】
配列番号３２に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３２】
配列番号３５に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３３】
配列番号３８に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３４】
配列番号４１に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３５】
配列番号４４に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３６】
配列番号４７に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを内在性DNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３７】
配列番号５０に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを遺伝子組換え体に特異的なDNA配列の分子数を決定するためのプローブとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３８】
配列番号７７または７８に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを内在性DNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項３９】
配列番号７９または８０に記載の配列を3’末端配列とするオリゴヌクレオチドを内在性DNA配列の分子数を決定するためのプライマーとして使用する、請求項１または２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用した遺伝子組換え体の検出方法に関する。特に、本発明は、ＰＣＲ法を利用した遺伝子組換え体特異的ＤＮＡ配列の分子生物学的検知方法に関する。より具体的には、種々の組換えＤＮＡ配列を含む種々の遺伝子組換え体系統を含む集団からの、各遺伝子組換え体系統の存在比を検知する方法に関する。さらに、本発明はそのような遺伝子組換え体の分子生物学的検知方法において使用される標準分子に関する。
世界的に遺伝子組換え技術を利用して開発された遺伝子組換え体の実用化が進んでいる。既に実用化されている遺伝子組換え体としては、インターフェロン生産菌等に代表される遺伝子組換え微生物や、害虫抵抗性トウモロコシ等に代表される遺伝子組換え農作物が知られている。例えば、これまでに開発された遺伝子組換え農作物においては、導入遺伝子として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来ＣｒｙＩＡ（ｂ）タンパク質コード領域（以下ｃｒｙＩＡ（ｂ）という）等の害虫抵抗性遺伝子、またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質コード領域（以下ｐａｔという）等の除草剤耐性遺伝子などが使用されている。そして、これらの導入遺伝子は、該農作物中で発現可能となるように、様々なＤＮＡ配列と組合せた発現ユニットとして導入されている。
ここで使用可能なＤＮＡ配列としては、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓｉｃ  ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター（以下ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターという）、トウモロコシ由来ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＥＰＣ）のプロモーター、トウモロコシのカルシウム依存タンパク質キナーゼ（ＣＤＰＫ）のプロモーターなどのプロモーター、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１Ｓ遺伝子の６番目のイントロンを含む領域（Ａｄｈ１−Ｓ  ＩＶＳ６）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１Ｓ遺伝子の２番目のイントロンを含む領域（Ａｄｈ１−Ｓ  ＩＶＳ２）、ＰＥＰＣの９番目のイントロン９番目のイントロン（ＰＥＰＣ＃９）、トウモロコシ熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）のイントロン部などのイントロン、及び、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来ノパリンシンターゼターミネーター（以下ＮＯＳターミネーターという）、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓターミネーター等のターミネーターが挙げられる。実際に流通している遺伝子組換え農作物としては、トウモロコシではＮｏｖａｒｔｉｓ社のＢｔ１１系統の後代品種や、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＥｖｅｎｔ１７６系統の後代品種、Ｍｏｎｓａｎｔｏ社のＭＯＮ８１０系統の後代品種、Ｍｏｎｓａｎｔｏ社のＧＡ２１系統の後代品種、Ａｖｅｎｔｉｓ社のＴ２５系統の後代品種等が挙げられる。またダイズではＭｏｎｓａｎｔｏ社のＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統の後代品種等が挙げられる。これらに導入された組換えＤＮＡ配列の構成は図１に示すとおりである。
遺伝子組換え体は、一般に産業上好ましい形質を元の生物に対して付与する目的で開発されるものである。その主な手法は、元来そのような形質を有する他の生物から、該形質を発現する遺伝子を単離し、該遺伝子を対象生物に発現可能な形で導入するというものである。従って、遺伝子組換え体由来のＤＮＡ中には、このような導入された組換えＤＮＡ配列が含まれている。
例えば遺伝子組換え農作物は、先に述べた害虫抵抗性のほか、除草剤耐性その他、農作物として好ましい形質を付与する目的で開発されるものであり、害虫抵抗性や除草剤耐性等に関わる遺伝子を元の農作物中で発現可能な形で導入することによって作出される。従って遺伝子組換え農作物由来のＤＮＡ中には、このような導入された組換えＤＮＡ配列が含まれている。
しかし、このような農作物が実際に商品化されるときは、遺伝子組換え農作物の後代交配種であることが多い。このため、導入した組換えＤＮＡ配列がそのような商業農作物中に安定に存在することを確認する必要がある。
また、欧州共同体（ＥＵ）により遺伝子組換え体およびその加工食品の表示に関わる規則（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ．ＥＣ／２５８／９７，Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ．１１３９／９８）が定められ、日本国においても遺伝子組換え農作物およびその加工品の表示に関する制度が定められたことを契機として、食品関連業界等では、食品原料農作物や食品中の組換え体の有無と含量に関する情報を必要としている。
これらのことから、食品、飼料およびこれらの原料農作物中の遺伝子組換え体の有無や、含量、特に原料中の存在比を確認する技術が必要とされている。また、複数の系統の遺伝子組換え体が含まれると予想される場合には、それらを別々に検知し、かつそれらの存在比を系統毎に明らかにできる技術が望まれる。即ち遺伝子組換え体を各系統別に高感度かつ定量的に検知するための実用的な技術開発が望まれている。
遺伝子組換え体を検知する技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２３０，１３５０−１３５４（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２３９，４８７−４９１（１９８８））を利用した分子生物学的技術が有効であるとする例は数多く報告されているが、これらは、遺伝子組換え体の有無を定性的に判別するものであり、試料中の遺伝子組換え体の存在比に関する情報を与えるものではない（例えば、Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ．，Ｖｏｌ．２０３，３３９−３４４（１９９６）、Ｍｉｔｔ．Ｇｅｂｉｅｔｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｈｙｇ．，Ｖｏｌ．８７，３０７−３６７（１９９６）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｒｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｖｏｌ．９３，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ  ２，３５−３８（１９９７）、Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ．，Ｖｏｌ．２０５，４４２−４４５（１９９７）、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｅｒｎａｈｒｕｎｇｗｉｓｓｅｎｓｃａｆｔ  Ｖｏｌ．３６，１５５−１６０（１９９７）、ＢＧＶＶ  Ｈｅｆｔｅ  １，１１５−１１７（１９９７）、Ｍｉｔｔ．Ｇｅｂｉｅｔｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｈｙｇ．，Ｖｏｌ．８８，１６４−１７５（１９９７）、Ｍｉｔｔ．Ｇｅｂｉｅｔｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｈｙｇ．，Ｖｏｌ．８８，５１５−５２４（１９９７）、Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．７，７６７−７７４（１９９８）、Ｌｅｂｅｎｓｍ．−Ｗｉｓｓ．ｕ．−Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３１，６６４−６６７（１９９８）、Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ．，Ｖｏｌ．２０６，２０３−２０７（１９９８）、Ｚ．  Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ．，Ｖｏｌ．２０６，２３７−２４２（１９９８）、Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ．，Ｖｏｌ．２０７，２６４−２６７（１９９８）、ＢｉｏＳｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．７，１４６１−１４６４（１９９８）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｒｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｖｏｌ．９５，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ２，４４−４８（１９９９）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｒｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｖｏｌ．９５，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ  ２，４８−５１（１９９９）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｒｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｖｏｌ．９５，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ  ２，５２−５６（１９９９）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｒｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｖｏｌ．９５，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ  ７，２７５−２７８（１９９９）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．４，９２３−９２８（１９９９）、ＧＩＴ  Ｌａｂｏｒ−Ｆａｃｈｚｅｔｓｃｈｒｉｆｔ，２／９９，１５６−１６０（１９９９）、Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．４，１７−２１（１９９９）、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．２０９，７７−８２（１９９９）、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．３９３，１７７−１７９（１９９９）、Ｆｏｏ���  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｏｌ．１０，３３９−３４９（１９９９）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．１２，５０３８−５０４３（１９９９）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｈｙｇｉｅｎｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．２，１３７−１４３（２０００）を参照せよ）。
試料中の遺伝子組換え体の存在比に関する情報を与えうる既存の技術報告も、ダイズ、トウモロコシからの組換えＤＮＡ配列断片の定量的検知技術に関する報告として既に幾つか存在する。
例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｒｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｖｏｌ．９５，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ  ２，５７−５９（１９９９）や、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０９，８３−８７（１９９９）において、競合ＰＣＲによる組換えダイズの定量的検知技術が報告されている。しかし、検知対象は遺伝子組換えダイズ１系統のみに限定されている。さらに、競合ＰＣＲを用いるため、比較的定量精度に劣る面があり、加えて内部標準を用いないために、試料から抽出したＤＮＡ溶液の純度や収量が定量結果に影響しうる。
また、Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ，Ｖｏｌ．２０７，Ｎｏ．３，２０７−２１３（１９９８）においては競合ＰＣＲによる遺伝子組換えトウモロコシの定量的検知技術が報告されているが、上記と同様に検知対象は遺伝子組換えトウモロコシ１系統のみに限定されている。さらに、上記と同様に、競合ＰＣＲを用いていることや、内部標準を用いていないことが定量結果の信頼性を不十分なものにしている。
Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｏｌ．１０，３５３−３５８（１９９９）では、競合ＰＣＲによる遺伝子組換えトウモロコシと遺伝子組換えダイズの定量的検知技術が報告されているが、いずれも１系統のみの検知にとどまっており、さらに上記と同様に競合ＰＣＲを用いていることや、内部標準を用いていないことが定量結果の信頼性を不十分なものにしている。
競合ＰＣＲよりも定量精度に優れたＤＮＡ配列の定量分析法としては、蛍光プローブ等を用いた定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ、インラインＰＣＲ等とも呼ばれる）が知られており、これを利用した組換えＤＮＡ配列の定量的検知技術に関する報告も既にいくつか存在する。
例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．１２，５２６１−５２６６（１９９９）において、蛍光プローブを用いた定量的ＰＣＲによる組換えダイズ、トウモロコシの定量が可能であることが報告されている。この報告においては、さらに、内部標準法を採用しており定量結果の信頼性が向上している。しかしながら、検知対象は、遺伝子組換えダイズについて１系統、遺伝子組換えトウモロコシについて１系統のみに限定されている。
また、Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｏｌ．１０，３８５−３８９（１９９９）においても、蛍光プローブを用いた定量的ＰＣＲによる遺伝子組換えダイズの定量的検知技術と、競合ＰＣＲによる遺伝子組換えダイズの定量的検知技術の２通りが報告されている。この報告においても、内部標準法を採用しており定量結果の信頼性が向上している。また、前述の報告とは異なり、標準分子として内部標準用ＤＮＡ配列を含むプラスミドＤＮＡと検知対象ＤＮＡ配列を含むプラスミドＤＮＡを使用しているが、これらが別個に供給されるため、プラスミドＤＮＡの希釈の仕方や、反応系への添加量の違いが定量結果に影響する可能性が残されている。また、検知対象は遺伝子組換えダイズ１系統に限定されている。Ｃｈｅｍｉｅ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒ  ｕｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ．Ｖｏｌ．５０，Ｊａｈｒｇ．，Ｈｅｆｔ１，６−８（１９９９）も上記報告と同様である。
さらに、現在標準物質として流通している遺伝子組換え体がトウモロコシで２系統、ダイズで１系統に過ぎないという事実のため、多くの分析者は上記以外の系統を分析することは極めて困難な状況にある。
また、組換えＤＮＡ配列から生産されるタンパク質をＥｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｖｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて測定することで、遺伝子組換え体の含量を定量する技術も報告されているが（Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｏｌ．１０，３６７−３７４（１９９９））、これも特定の１系統のみを定量的に検知する技術である。
発明の開示
以上に示した通り、既に報告されている遺伝子組換え体の定量的検知技術は、ごく限られた系統のみを定量的に検知する技術であったり、定量精度に欠ける技術である。
ところが、一方で一般に流通する農作物は流通段階で種々の品種が混合された状態であるが故、これらの特定の１系統のみを検知する技術を用いても、試料中の遺伝子組換え体の存在比を定量的に議論することはきわめて困難である。例えば、日本国内を流通する遺伝子組換えトウモロコシの場合は、２０００年７月現在で、７系統にのぼるため、試料中の特定の１系統の遺伝子組換えトウモロコシを定量するだけでは、分析は不十分である。従って、定量精度に欠ける技術が定量分析法として不十分であることは言うまでもないが、特定の一系統のみを定量的に検知する技術も実用性に欠けるものであると言える。
検知対象となる系統数を制限する要因の一つに、分析用標準試料が十分に供給されていないことが挙げられる。各々の特定系統の遺伝子組換え体のみを含み、それ以外の系統を一切含まないような純粋な標準試料の入手は極めて困難であり、現在一般の分析者に標準試料として供給される遺伝子組換え体はトウモロコシで２系統、ダイズで１系統にすぎない。現に先に挙げた先行する定量的検知技術に関する報告では、検知対象が全て標準試料が入手できる系統に限定されている（このことは先に挙げた文献、例えばＦｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｏｌ．１０，３８５−３８９（１９９９）においても指摘されている）。つまり、標準試料の入手可能性が上記した検知技術の適用可能範囲を限定する結果を招いている。
更には、各々の遺伝子組換え体の系統に導入された組換えＤＮＡ配列は、系統間でその種類やゲノムあたりのコピー数が異なることから、これらの効果を厳密に勘案することなく単に特定の系統のみが試料中に含まれると仮定して分析を行った場合、実際の遺伝子組換え体の存在比とはかけ離れた分析結果を得ることがある。すなわち、仮に全ての遺伝子組換え体の系統が分析用標準試料として提供されたとしても、組換えＤＮＡ配列の系統間での多様性を勘案しうるような手段を考案しない限り、実用的な遺伝子組換え体の定量的検知技術とみなすことはできない。
以上に示したごとく、遺伝子組換え体を高感度かつ定量的な実用的検知技術の開発が望まれており、盛んに技術開発が試みられているものの、試料の一般的流通形態や標準試料の入手可能性並びに組換えＤＮＡ配列の系統間における多様性が、組換えＤＮＡ配列および／または遺伝子組換え体の分子生物学的検知技術の開発並びに普及を困難にしている。
従って、本発明の目的は複数の遺伝子組換え体の系統の組換えＤＮＡ配列の系統間における多様性を厳密に勘案しつつ、複数の遺伝子組換え体の系統を含む集団中における遺伝子組換え体全体の存在比を正確に定量できる、遺伝子組換え体の分子生物学的な定量的検知方法を提供することである。
特に、本発明の目的は、複数の遺伝子組換え体の系統の組換えＤＮＡ配列の系統間の多様性を厳密に勘案しつつ、複数の遺伝子組換え体の系統を含む集団中における各系統の集団中の個別の存在比を正確に定量できる、遺伝子組換え体の分子生物学的な定量的検知方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、上記の定量的検知方法に使用し得る、複数の遺伝子組換え体の系統の組換えＤＮＡ配列の系統間における多様性を厳密に勘案しつつ定量できるよう設計された、標準試料としての組換えＤＮＡ分子、特に、容易に無限供給できる特徴を有した組換えＤＮＡ分子を提供することである。
本発明者らは、同一分子中に５種類の遺伝子組換えトウモロコシ系統特異的ＤＮＡ配列と、２種類の系統特異的ではないが遺伝子組換え体に頻用されるＤＮＡ配列を含み、さらに１種類のトウモロコシ内在性遺伝子のＤＮＡ配列をも含む分子、および、同一分子中に１種類の遺伝子組換えダイズ系統特異的ＤＮＡ配列と、１種類のダイズ内在性遺伝子のＤＮＡ配列を含む分子、さらには、同一分子中に１種類の遺伝子組換えダイズ系統特異的ＤＮＡ配列と、１種類のダイズ内在性遺伝子のＤＮＡ配列を含み、さらに２種類の系統特異的ではないが遺伝子組換え体に頻用されるＤＮＡ配列をも含む分子を作製し、これらをＰＣＲ法における標準分子として使用することにより、従来の組換えＤＮＡ配列の定性的および定量的検知方法を著しく改善することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
１以上の遺伝子組換え体系統を含む試料における遺伝子組換え体の存在比を定量するための定量的検知方法であって、
（ｉ）前記試料中の組換え体に由来するＤＮＡ試料中に存在する可能性のある遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列、および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含む分子を標準分子として、前記ＤＮＡ試料中の前記特異的なＤＮＡ配列および内在性ＤＮＡ配列に対してそれぞれ定量的ＰＣＲ反応を行なうこと、
（ｉｉ）前記定量的ＰＣＲ反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数を決定すること、
（ｉｉ）前記定量的ＰＣＲ反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記内在性ＤＮＡ配列の分子数を決定すること、
（ｉｉｉ）以下の式（Ｉ）に従って前記試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定すること、
を含む、前記方法である。
（試料中の遺伝子組換え体の存在比）＝
１００ｘ［（試料中の遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数）／（試料中の内在性ＤＮＡ配列の分子数）］／（定量比）（％）          （Ｉ）
（式中、（定量比）は各遺伝子組換え体系統について以下の式（ＩＩ）により予め計算される値の組のうちの任意の値である。
（定量比）＝（各遺伝子組換え体系統中の組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数）／（遺伝子組換え体中の内在性ＤＮＡ配列の分子数）      （ＩＩ））
特に、本発明は、
１以上の遺伝子組換え体の系統を含む試料中における各遺伝子組換え体系統の存在比を定量するための定量的検知方法であって、
（ｉ）前記試料中の遺伝子組換え体に由来するＤＮＡ試料中に存在する可能性のある、各遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列、および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含む分子を標準分子として、前記ＤＮＡ試料中の前記各遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列および前記内在性ＤＮＡ配列に対してそれぞれ定量的ＰＣＲ反応を行なうこと、
（ｉ）前記定量的ＰＣＲ反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する各遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列の分子数を決定すること、
（ｉｉ）前記定量的ＰＣＲ反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記内在性ＤＮＡ配列の分子数を決定すること、
（ｉｉｉ）以下の式（ＩＩＩ）に従って前記試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定すること、
を含む、前記方法である。
（試料中の各遺伝子組換え体糸統の存在比）＝１００ｘ［（試料中の各遺伝子組換え体に対応する組換えＤＮＡ配列の分子数）／（試料中の内在性ＤＮＡ配列の分子数）］／（定量比）（％）        （ＩＩＩ）
（式中、（定量比）は上述の式（ＩＩ）により計算される。）
また本発明の組換えＤＮＡ分子は、遺伝子組換え体系統に特異的な組換えＤＮＡ配列、および、前記遺伝子組換え体に対応する生物種に共通の１以上の内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。特に、本発明の組換えＤＮＡ分子は２以上の遺伝子組換え体系統の各々に特異的な組換えＤＮＡ配列、および、前記遺伝子組換え体に対応する２以上の非組換え体に共通の１以上の内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。
発明を実施するための最良の形態
以下では、遺伝子組換え体の例として遺伝子組換え農作物について本発明を説明するが、本発明を適用し得る対象としては、農作物に限定されず、遺伝子組換え動植物全般、遺伝子組換え微生物等のその他の遺伝子組換え体を除外するものではない。本発明の一つの実施態様においては、様々な遺伝子組換え体を特異的に検知するために、被検植物由来の核酸からＰＣＲ法によって組換えＤＮＡ配列を検知する。従って、まず遺伝子組換え体系統特異的ＤＮＡ配列を検知するためのプライマー対や、系統特異的ではないが遺伝子組換え体に頻用されるＤＮＡ配列を検知するためのプライマー対、遺伝子組換え体・非遺伝子組換え体を問わず該農作物に特異的に存在するＤＮＡ配列を検知するためのプライマー対などを設計する必要がある。
また、上記被検植物体試料は、ゲノムＤＮＡ等の、その植物体由来の核酸を抽出できるものであればよく、例えば、生の種子や、乾燥種子、コーングリッツ、ダイズ粉などの加工品などが挙げられる。このような試料は必要に応じて破砕するなどして用いることができる。
本発明においては、１または２以上の遺伝子組換え体系統が存在する可能性のある試料について、試料中の組換えＤＮＡ配列の分子数、試料中の内在性遺伝子の分子数、および、各遺伝子組換え体について計算された定量比に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比、特に試料中の各遺伝子組換え体系統の個別の存在比を算出することができる。
本発明においては以下の手順により、遺伝子組換え体の存在比が算出される。
（ｉ）試料中に存在する可能性のある遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含む分子を標準分子として定量的ＰＣＲ反応を行なうこと、
（ｉ）前記定量的ＰＣＲ反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数を決定すること、
（ｉｉ）前記定量的ＰＣＲ反応の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記内在性ＤＮＡ配列の分子数を決定すること、
（ｉｉｉ）以下の式（Ｉ）に従って前記試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定すること、
を含む、前記方法である。
（試料中の遺伝子組換え体の存在比）＝
１００ｘ［（試料中の遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数）／（試料中の内在性遺伝子の分子数）］／（定量比）（％）（Ｉ）
（式中、（定量比）は各遺伝子組換え体系統について以下の式（ＩＩ）により予め計算される値の組のうちの任意の値である。
（定量比）＝（各遺伝子組換え体系統中の遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数）／（遺伝子組換え体中の内在性ＤＮＡ配列の分子数）  （ＩＩ））
特に、各遺伝子組換え体系統の個別の存在比を検知する場合には、式（Ｉ）に代えて、以下の式（ＩＩＩ）が使用される。
（試料中の各遺伝子組換え体系統の存在比）＝１００ｘ［（試料中の各遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列の分子数）／（試料中の内在性ＤＮＡ配列の分子数）］／（定量比）（％）          （ＩＩＩ））
ここで、本明細書においては「ＤＮＡ配列」の語は「ＤＮＡ配列またはその部分領域」と互換的に使用される。従って、例えば「遺伝子組換え体系統特異的ＤＮＡ配列」とは、遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列の全長または１以上のその部分領域を意味する。他の文脈においても同様である。また「遺伝子配列」の意味についても同様である。
本明細書においては、「遺伝子組換え体」は外来遺伝子が導入された生物個体全体、外来遺伝子が導入された生物個体の一部、例えば、その器官、組織片、および、細胞（培養細胞を含む）、そのような生物個体に由来する種子、花粉、胚をも含む。
また、「定量的ＰＣＲ」とは、一般には増幅反応開始時の鋳型ＤＮＡ量を定量するための、ＰＣＲを利用した一連の反応をいう。定量的ＰＣＲには、基準となる内在配列を使用する内部標準法、増幅反応において競合する分子を使用する競合法が含まれるが、本発明においては、内部標準法が使用され、かつ各配列の分子数を正確かつ簡便に決定するために標準分子と呼ばれる基準となる鋳型ＤＮＡ配列を用いたＰＣＲを使用し、反応の任意の時点で反応の進行状況、すなわち増幅の程度がモニターされる。従って、本明細書において、「定量的ＰＣＲ」とは、増幅反応開始時の鋳型ＤＮＡ量を定量するためのＰＣＲであって、反応の任意の時点で増幅対象の分子について増幅のモニターが可能であるＰＣＲをいう。定量を行なうためには、一般には、そのようなＰＣＲと、反応開始時の鋳型ＤＮＡ分子数とその増幅の指標となるシグナルとを関連付ける検量線とが組み合わされる。この検量線は分子数が知られた標準分子を用いて作製することができる。
本発明に使用し得る試料ＤＮＡ、プライマー、プローブ、ＰＣＲ反応条件、および、組換えＤＮＡ配列の分子数、内在性遺伝子の分子数、定量比の算出方法を以下に詳細に説明する。
被検植物体試料由来の核酸は、好ましくは該植物体試料のゲノムＤＮＡである。被検植物体試料からの核酸の抽出方法は特に制限されず、ＰＣＲに供し得る品質が得られる方法であればどのような方法も使用することができる。例えばＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）等の市販のキットを用いることができる。また、必要に応じて方法を改変することもできる。
このような方法により抽出した核酸は、ＰＣＲ法の鋳型として用いるのに適した状態、例えば、緩衝液に溶解させた状態にしておくことが好ましい。また、得られた核酸の純度は、公知の方法によって評価することが出来、例えば、２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより純度の検定を行うことが出来る。この場合に、２６０ｎｍ／２３０ｎｍの値が２よりも大きく、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの値が１．８から２．０であることが、ＰＣＲ法を行う上で好ましい。
さらに、調製したＤＮＡ溶液がＰＣＲ法に十分な程度に精製されており、かつ分解を受けていないことを確認するために、該植物体ゲノムに内在的に含まれている遺伝子に対するプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅が起こることを確認してもよい。
以上のようにして得られる被検植物体由来の核酸を用いてＰＣＲ法を行うが、ここで用いるプライマーは、組換えＤＮＡ配列の全部もしくは一部を含む領域を増幅しうるプライマー対である。これにより、組換えＤＮＡ配列の構造に応じて、該組換えＤＮＡ配列を特異的に検知することができる。このようなプライマー対は、検知しようとする遺伝子組換え体に応じて以下のようにして設計することができる。
ここで、検知の対象となる遺伝子組換え体は、先に述べたような遺伝子組換え体であり、その種類は特に制限されない。どのような遺伝子組換え体であっても、導入された組換えＤＮＡ配列の構成が明らかとなれば、検知の対象とすることが出来る。このような遺伝子組換え体は、必ずしも遺伝子導入を行った世代である必要はなく、その後代品種であっても良い。
まず、検知しようとする遺伝子組換え体に含まれる組換えＤＮＡ配列の塩基配列を入手する。この塩基配列は組換えＤＮＡ配列の全配列である必要はなく、増幅の対象となる領域の近辺の塩基配列であればよい。このような塩基配列の多くは公知の文献から入手することができる。公知の文献から塩基配列が入手できないものであっても塩基配列の一部についての情報があれば、常法により自ら実験的に塩基配列を知ることもできる。系統特異的なプライマー対の設計に当たっては、複数の種類のＤＮＡ配列にまたがる領域（例えば、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターからｃｒｙＩＡ（ｂ）にまたがる領域など）を選定すると一般に特異性の高いものを選択することが容易となる。各プライマー対は増幅対象となるＤＮＡ配列を特異的に増幅できる限りにおいて、どのようなものであっても構わないが、増幅断片が８０ｂｐから２００ｂｐであることが好ましく、更に各プライマーのＧＣ含量が４０％から６０％であることがより好ましく、更に各プライマーが分子内高次構造を取らないこと、プライマー同士が連続した３塩基以上の塩基対を形成しないことが特に好ましい。
例えば、先に述べたＢｔ１１系統の後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統の後代品種、ＭＯＮ８１０系統の後代品種、ＧＡ２１系統の後代品種、Ｔ２５系統の後代品種、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統の後代品種をそれぞれ特異的に検知する場合には、図１に示すような領域からプライマーを設計することができる。
また、定量的ＰＣＲ法によりプライマー対が増幅する領域の反応開始時の分子数を定量出来ることが既に公知となっている。既に幾通りかの定量的ＰＣＲ法が知られているが、多くの場合、プライマー対に挟まれた領域の配列に相補的なプローブを作製する必要がある。プローブは増幅によって生じた分子数に対応したシグナルを生成するものであればよく、例えば、ＰＣＲの際，ＤＮＡ２本鎖形成反応および２本鎖から１本鎖への乖離反応、または核酸の伸長反応を検知し得る適切な物質を使用することができる。一般にはプローブとして蛍光標識された核酸が使用される。特に、プローブはＰＣＲによる増幅反応においてポリメラーゼの伸長反応に使用される条件下で鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、ＤＮＡ鎖の伸長、すなわち鋳型ＤＮＡの増幅に伴って蛍光量を変化させるものであって、その変化が増幅の程度の指標となることが好ましく、特に、鋳型ＤＮＡの増幅に伴って分解され、蛍光物質を遊離し、その結果反応混合物中の蛍光量を増加させ、かつその蛍光量の増加が増幅の程度の指標となるものであることが好ましい。このようなプローブを使用することにより、ＰＣＲ反応における増幅の様子をリアルタイムで簡便にモニターすることができる。そのような蛍光標識プローブは当業者によく知られたものであり、そのような性質を有す適切な配列の蛍光標識プローブを合成することもできる。さらに、プローブは対応するプライマー対よりも１０℃程度Ｔｍ値が高いこと、全長が１８塩基から２５塩基程度であること、末端にＧを有さないことなどが好ましい。本発明の方法の一つの実施態様では、増幅に伴って分解され、それによって蛍光量が増加し、その蛍光量の増加が増幅の指標となるプローブが使用される。
以上のようにして設計されるプライマー対を用い、被検植物体試料由来の核酸を鋳型として、定性的ＰＣＲを行うことができる。また、以上のように設計されるプライマー対とプローブを用い、被検植物体試料由来の核酸を鋳型として、定量的ＰＣＲを行うことができる。この場合の反応液は、当業者であれば容易に調製することができるため、特に制限しないが、例えば、鋳型となる核酸、プライマー対、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、ＤＮＡポリメラーゼ等をそれぞれ適切な量で使用して調製することが出来る。例えば、試料からの抽出ＤＮＡを５０ｎｇ程度使用し、プライマーの最終濃度０．２〜０．５μＭ程度とし、反応系の全量を２５μｌとして反応を行なうことができる。ＰＣＲの温度条件についても、特に限定されず、例えば、９５℃で１０分間保持した後、以後９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４０サイクルの反復を行い、４０サイクル終了後に７２℃で７分保持したのち、４℃に保持することができるが、当業者であれば容易に最適条件を設定する事ができるため、各段階の温度および時間は適宜変更される。また、このような反応は公知の装置を用いて行うことが出来る。
試料中の組換えＤＮＡ配列の分子数は定量的ＰＣＲを行なうことによって得ることができる。定量的ＰＣＲは、単に増幅対象ＤＮＡ配列の初期量を測定するだけでは、その値が直接遺伝子組換え体の含量を示さないことが知られている。例えば、図１で示したとおり、遺伝子組換え体に導入されたＤＮＡ配列群は系統間で極めて多種多様であるうえ、該植物体ゲノムあたりの導入コピー数に関しても多様であるため、単純に存在比を計算することができない。例えば、ｃｒｙＩＡ（ｂ）のコード領域は、Ｅｖｅｎｔ１７６系統にもＢｔ１１系統にもＭＯＮ８１０系統にも導入されているが、それぞれの開発元によればＥｖｅｎｔ１７６系統にはゲノムあたり２コピー以上が導入されており、Ｂｔ１１系統には１コピーが、ＭＯＮ８１０系統には１コピー以上が導入されているとのことである。加えて、ＰＣＲ法は反応系中の夾雑物による反応阻害を受けやすい。
従って、本発明では、試料中の組換えＤＮＡ配列の分子数は、例えば、予め既知量の標準分子を内部標準として用いて定量的ＰＣＲを行なうことにより検量線を作製し、試料についても同様の定量的ＰＣＲを行ない、前記検量線を用いて決定する。
内在性ＤＮＡ配列の分子数についても同様な方法で決定することができる。一方、純粋な遺伝子組換え体について、予めそれらの遺伝子組換え体中の組換えＤＮＡ配列の分子数と内在性ＤＮＡ配列の分子数を定量的ＰＣＲによって測定し、測定値の比として「定量比」が定義される。この定量比は、遺伝子組換え体の各系統に導入されている組換えＤＮＡ配列の分子数や種類の違いに依存して各々固有の値をとるため、式（１）を用いた遺伝子組換え体の存在比への定量値の変換は、組換えＤＮＡ配列の系統間における多様性を厳密に勘案しうるものである。本発明の方法は、このような定量比を使用することにより、試料ＤＮＡ溶液中に含まれうるＰＣＲ阻害因子などの反応系そのものに対する攪乱因子や、ＤＮＡ抽出時の収量の差異などによる定量値の誤りを回避することを可能とする。
この定量比は、試料中に含まれる可能性のある全ての遺伝子組換え体系統について算出されていることが好ましいが、一部のみについて定量比が得られていてもよい。定量比の値はＰＣＲの増幅対象領域や遺伝子組換え体の系統に依存して固有の値を取るため、一度定量比の値を知ることができれば、以後はこの値を係数として用いることにより、増幅対象ＤＮＡ配列の反応初期量と、内部標準配列の反応初期量からもとの試料における遺伝子組換え体の存在比を知ることができる。
このような内部標準としては、例えば、トウモロコシが共通に有する特異的な内在性ＤＮＡ配列、特に内在性遺伝子配列や、ダイズが共通に有する特異的な内在性ＤＮＡ配列、特に内在性遺伝子配列を用いておこなってもよく、人工的に構築した標準分子を用いてもよい。
本発明の方法に適した標準分子は、１以上の遺伝子組換え体系統に特異的な、好ましくは２以上の遺伝子組換え体系統の各系統に特異的な１以上の組換えＤＮＡ配列、および、対応する生物種に共通する１以上の内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含む組換えＤＮＡ分子である。また、遺伝子組換え体系統の各系統に特異的ではないが、遺伝子組換え体に汎用される１以上の組換えＤＮＡ配列、および、対応する生物種に共通する１以上の内在性ＤＮＡ配列を同一分子上に含む組換えＤＮＡ分子も本発明に利用することができる。本発明の組換えＤＮＡ分子は、上記の配列以外に適切な宿主内で複製させるための種々の配列、あるいは、この標準分子を有する宿主を選抜するためのマーカー遺伝子、その他を更に含んでいてもよい。必要であれば適切な制限酵素を使用することにより、あるいはＰＣＲ法によって一部を増幅することにより、この組換えＤＮＡ分子から標準分子として使用し得る最小領域のみを得ることもできる。しかしながら、本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＰＣＲに供する分子数を容易に制御できるという特性を有していなければならない。例えば、本発明の組換えＤＮＡ分子の全塩基配列が既知である、または、分子量が既知である場合、あるいはＰＣＲに供する組換えＤＮＡ分子の分子数を制御することができる。組換えＤＮＡ分子の塩基配列や分子量は必要に応じて測定することも可能である。
内在性ＤＮＡ配列としては、前述したように例えば、トウモロコシが共通に有する特異的な内在性遺伝子配列またはその部分領域や、ダイズが共通に有する特異的な内在性遺伝子またはその部分領域を利用することができる。遺伝子組換え体に共通する組換えＤＮＡ配列としては、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列、Ｎｏｓターミネーター配列またはこれらの一部等を利用することができる。各組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列としては、例えば各々の系統に導入された遺伝子に由来するＤＮＡ配列を利用することができる。
このような標準分子は、当業者によく知られた分子生物学的技術を用いて構築することができる。例えば、制限酵素切断断片を順次クローニングすることによって構築してもよく、ｔａｉｌｅｄプライマーを用いたＰＣＲ産物の統合を繰り返すことによって構築してもよい。好ましくは、この標準分子は適切な宿主、例えば微生物、動物細胞、植物細胞内で自己複製可能な組換えＤＮＡ分子として構築される。標準分子がプラスミドとして構築される場合は、スーパーコイル形成がＰＣＲの反応系を不安定にさせる場合があるので、制限酵素で切断して直線状分子として使用することが好ましい。この場合、増幅対象のＤＮＡ配列を切断することがない限り、どのような制限酵素で切断してもよい。
特に、本発明の一つの実施態様では、この標準分子は、内在性ＤＮＡ配列として、ダイズのｌｅ１遺伝子配列の一部分を有し、検出すべき組換えＤＮＡ配列としてＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的ＤＮＡ配列を有する。本発明の別の実施態様では、この標準分子は内在性ＤＮＡ配列としてトウモロコシのｚＳＳＩＩｂ遺伝子配列の一部を有し、検出すべき組換えＤＮＡ配列としてＧＡ２１、Ｔ２５、ＭＯＮ８１０、Ｅｖｅｎｔ１７６、Ｂｔ１１の各系統に特異的なＤＮＡ配列、すなわち、ｍ−ｅｐｓｐｓ−ＮＯＳターミネーター配列領域、ｐａｔ−３５Ｓターミネーター領域、ａｄｈ１−１Ｓ−ｃｒｙＩＡ（ｂ）配列領域、ｃｒｙＩＡ（ｂ）−ＰＥＰＣ＃９配列領域、ｃｒｙＩＡ（ｂ）−ＮＯＳターミネーター配列領域を有する。これらの実施態様においては、標準分子は大腸菌内で自己複製可能なＤＮＡ分子である。
本発明における定量的ＰＣＲおよび、それによる目的ＤＮＡ配列の分子数の決定はより具体的には、例えば以下のように行なうことができる。
（ｉ）検量線の作成
種々の分子数の標準分子、遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列または前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性ＤＮＡ配列を特異的に増幅するためのプライマーを用い、前記内在性ＤＮＡ配列または遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列の増幅に伴って蛍光量を増加させるプローブの存在下でＰＣＲを行なう。各分子数の標準分子を反応開始時の鋳型ＤＮＡとする反応について、それぞれ蛍光量を一定のサイクル数毎にモニターする（図１４（Ａ）、（Ｂ））。次に蛍光量の増加がサイクル数に対して指数関数関係にある領域で、蛍光量増加（ΔＲｎ）の閾値を設定する。例えば、図１４ではΔＲｎは１０−１に設定されている。次に、ＰＣＲサイクル数を縦軸にとり、反応開始時の鋳型ＤＮＡ分子数を横軸にとり、この閾値に達するＰＣＲサイクル数を反応開始時のＤＮＡ鋳型分子数に対してプロットして検量線を得ることができる（図１５）。
（ｉｉ）試料ＤＮＡのＰＣＲ
ＤＮＡ試料中に存在する可能性のある、遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列、および前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性ＤＮＡ配列に関して、前記ＤＮＡ試料中の前記遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列および前記内在性ＤＮＡ配列に対してそれぞれ定量的ＰＣＲ反応を行なう。遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列は各遺伝子組換え体系統に特異的であっても、二以上の遺伝子組換え体系統に共通であってもよい。この場合、各遺伝子組換え体に特異的なＤＮＡ配列および内在性ＤＮＡ配列に対するＰＣＲは同一反応混合物中で行ってよく、別個の反応混合物中で行ってもよいが、鋳型ＤＮＡ分子が両反応で同一であることが保証される必要がある。
（ｉｉｉ）遺伝子組換え体系統に特異的なＤＮＡ配列、および内在性ＤＮＡ配列の分子数の決定
上述のようにそれぞれの配列についてＰＣＲを行ない、増幅の指標となるシグナルをモニターし、そのシグナルが（ｉ）で定めた閾値に達したときのＰＣＲサイクル数を測定する。次に、得られたサイクル数を（ｉ）で作成した検量線を用いて反応開始時の分子数に換算する。
すでに（ｉ）の検量線が得られている場合は、その検量線を用いて上述の（ｉｉ）以降の手順を行えばよい。
試料中の組換え体特異的ＤＮＡ配列の分子数、内在性ＤＮＡ配列の分子数、および各組換え体系統について定量比が得られたならば、前述の式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）に従って、試料中の遺伝子組換え体の全体に対する存在比あるいは各系統別の存在比を計算することができる。式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）において、定量すべき組換えＤＮＡ配列として遺伝子組換え体の系統特異的ＤＮＡ配列を選択してもよく、系統特異的ではないが遺伝子組換え体に頻用されるＤＮＡ配列を選択してもよい。
前者を選択した場合は、試料中の各系統の存在比を正確に知ることが出来るので、全ての遺伝子組換え体系統について分析を繰り返した後に、得られた各系統ごとの試料中における存在比を加算することで、試料中における総体としての遺伝子組換え体の存在比を正確に定量する事ができる。このような方法は、多くの場合、分析試料が流通段階で複数系統の混合物であるという流通実態に対して好適な分析法であるといえる。
後者を選択した場合には、同時に複数の系統のおよその存在比を知ることが出来るので、少ない試験回数で試料中における総体としての遺伝子組換え体のおよその存在比を簡便に定量する際には好適な標準試料として使用することが出来る。この場合、式（Ｉ）における定量比としては、試料中に存在する可能性のある遺伝子組換え体系統について計算される定量比のうち任意の値を選択することができるが、これらのうちの最小の定量比を用いるのが好ましい。これにより、遺伝子組換え体の存在比として、可能性のある最大値を見積もることができるからである。
（実施例）
以下実施例により、詳しく本発明を説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、次に示す試料、試薬及び装置を使用した。
（１）試料
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）は、次の６品種の乾燥種子を用いた。
遺伝子組換えトウモロコシ  ：Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系
統後代品種、
ＭＯＮ８１０系統後代品種、Ｔ２５系統後代
品種、
ＧＡ２１系統後代品種
非遺伝子組換えトウモロコシ：Ｄａｉｒｙｌａｎｄ  １４１２
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）は、次の２品種の乾燥種子を用いた。
遺伝子組換えダイズ        ：Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後
代品種
非遺伝子組換えダイズ      ：Ｍｕｒａｙｕｔａｋａ種
コメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）は、次の品種の乾燥種子を用いた。
非遺伝子組換えコメ        ：Ｋｉｎｕｈｉｋａｒｉ種
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）は、次の品種の乾燥種子を用いた。
非遺伝子組換えコムギ      ：Ｈａｒｕｙｕｔａｋａ種
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）は、次の品種の乾燥種子を用いた。
非遺伝子組換えオオムギ    ：Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種
（２）試薬
試料からのＤＮＡ抽出には以下の試薬を使用した。
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）
ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）
ＤＮＡの電気泳動には以下の試薬を使用した。
酢酸（試薬特級）（和光純薬：Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
アガロース粉末”ＬＯ３「ＴａＫａＲａ」”（ＴａＫａＲａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
フィコール４００（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ブロムフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
キシレンシアノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ＤＮＡマーカー”λＨｉｎｄＩＩＩ消化物”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
ＤＮＡマーカー”１ｋｂラダー”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
ＤＮＡマーカー”１００ｂｐラダー”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
定性的ＰＣＲには以下の試薬を使用した。
ＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
×１０  ＰＣＲ  バッファーＩＩ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
プラスミド作製・精製には以下の試薬を使用した。
ＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
×１０  ＰＣＲ  バッファーＩＩ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＤＮＡポリメラーゼ”ＫＯＤ”（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
×１０  ＰＣＲ  バッファーＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）
酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
トリプトン  ペプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
ＮａＣｌ（試薬特級）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
アガー粉末（Ｓｙｏｅｉ  Ｋａｎｔｅｎ  Ｌｔｄ．）
Ｄ［−］−α−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）
エタノール（試薬特級）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
２−プロパノール（試薬特級）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
制限酵素”ＨｉｎｄＩＩＩ”（ＴａＫａＲａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
制限酵素”ＢａｍＨＩ”（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
制限酵素”ＳｍａＩ”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
制限酵素”ＳｒｆＩ”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
フェノール（試薬特級）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
クロロホルム（試薬特級）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
イソアミルアルコール（試薬特級）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
定量的ＰＣＲには、以下の試薬を使用した。
ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
（３）装置
試料からのＤＮＡ抽出には以下の装置を使用した。
粉砕器”Ｍｕｌｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ  ＭＢ３０１”（Ｙａｓｕｉ  Ｋｉｋａｉ  Ｃｏ．）
粉砕器”ＤＭ−６”（Ｙｕ  Ｃｈｉ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
タッチミキサー”Ｔｕｂｅ  ｍｉｘｅｒ”（Ｙａｍａｔｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
超純水製造装置”ＣＰＷ−２００”（ＡＤＶＡＮＴＥＣ  Ｔｏｙｏ  Ｋａｉｓｙａ  Ｌｔｄ．）
インキュベーター”Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｉｎｄｅｒ  ＳＤ  ｍｉｎｉ”（ＴＡＩＴＥＣ  Ｃｏ．）
遠心機”ｈｉｍａｃ  ＣＴ１３”（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｋｏｋｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
遠心機”ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ２”（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｋｏｋｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
遠心機”ＡｌｌｅｇｒａＴＭ  ６ＫＲ”（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）
分光光度計”ＤＵ７４００”（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）
ＤＮＡの電気泳動には以下の装置を使用した。
電気泳動装置”Ｍｕｐｉｄ  ２”（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
画像解析装置”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＩｍａｇｅｒＲ  ＦＸ”（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）
定性的ＰＣＲには以下の装置を使用した。
サーマルサイクラー”ＰＴＣ−２００”（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）
サーマルサイクラー”ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
プラスミド作製・精製には以下の装置を使用した。
振とう培養機”Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ  Ｓｈａｋｉｎｇ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ＡＴ２４Ｒ”（Ｔｈｏｍａｓ  Ｋａｇａｋｕ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
サーマルサイクラー”ＰＴＣ−２００”（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）
サーマルサイクラー”ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
遠心機”ｈｉｍａｃ  ＣＴ１３”（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｋｏｋｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
遠心機”ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ２”（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｋｏｋｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）
定量的ＰＣＲには以下の装置を使用した。
定量的ＰＣＲ装置”ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
定量的ＰＣＲ装置”ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
（４）その他
プライマーの合成はＧｒｅｉｎｅｒ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．に委託した。
プローブの合成はＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．に委託した。
ＤＮＡ塩基配列の確認はＧｒｅｉｎｅｒ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．に委託した。
実施例１  ＤＮＡの抽出
トウモロコシ、ダイズ、コメ、コムギ、オオムギからのＤＮＡ抽出は以下の手順で行った。先ず粉砕器”ＤＭ−６”（Ｙｕ  Ｃｈｉ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で試料を粉末状に粉砕した後に、粉砕物を５００−１，０００ｍｇを計量し、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）をプロトコール通り使用して粉砕物からＤＮＡを抽出した。
一粒のトウモロコシや、ダイズからＤＮＡを抽出する際には、先ず１％ＳＤＳ溶液で表面をよく洗浄したのち、粉砕器”Ｍｕｌｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ  ＭＢ３０１”（Ｙａｓｕｉ  Ｋｉｋａｉ  Ｃｏ．）を用いて粉砕し、粉砕物を全量ＤＮＡ抽出に供した。この場合のＤＮＡ抽出はＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）をプロトコール通り使用して行った。
実施例１２、実施例１３、実施例１４において後述する擬似混入試料からのＤＮＡ抽出については以下の手順で行った。ここではトウモロコシの場合を例にとるが、ダイズについても同様の方法で行う。先ず遺伝子組換えトウモロコシと非遺伝子組換えトウモロコシをそれぞれ１％ＳＤＳ溶液で洗浄した後、乾燥させた。その後別々に粉砕器”ＤＭ−６”（Ｙｕ  Ｃｈｉ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて粉砕した後、各々の粉砕物を各１ｇずつ計量し、遺伝子組換えトウモロコシと非遺伝子組換えトウモロコシを粉砕器”ＤＭ−６”（Ｙｕ  Ｃｈｉ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて混合した。混合された試料から５００−１，０００ｍｇを計量し、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）をプロトコール通り使用して粉砕物からＤＮＡを抽出した。
全ての抽出ＤＮＡ溶液からそれぞれ１μＬを１μＬの１０×ｌｏａｄｉｎｇバッファー（２０％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ）と混合したのち電気泳動に供し、抽出過程での分解が起こっていないことを確認した。即ち、電気泳動は電気泳動装置”Ｍｕｐｉｄ  ２”（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用し、１００ｍＬ当たり５０μｇのエチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含む０．８％アガロースゲルを用いてＴＡＥバッファー（０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．０４Ｍ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）中で１００Ｖ、１５分の条件で行った。電気泳動後のゲル中のＤＮＡの状態を画像解析装置”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＩｍａｇｅｒＲ  ＦＸ”（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）にて確認した。
また、全ての抽出ＤＮＡ溶液からそれぞれ１μＬを吸光度測定に供し、濃度ならびに純度の確認を行った。即ち、４９μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で５０倍希釈した試料の２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を分光光度計”ＤＵ７４００”（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、１Ａ２６０Ｕｎｉｔ＝５０μｇ／ｍｌとして算出した。
全ての抽出ＤＮＡは、−２０℃で保存した。
実施例２  検知すべき領域の選定（プライマー対・プローブの設計）
各遺伝子組換え体系統後代品種から抽出したＤＮＡを鋳型として、表１に示したシークエンス用プライマーから組換えＤＮＡ配列のシークエンスを決定した。
0004291568.tif 000002
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１〜１４：ＰＣＲプライマー
遺伝子組換え体系統特異的ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマー対は、導入されているＤＮＡ配列において、複数の種類のＤＮＡ配列にまたがる領域を増幅するように設計した。即ち、Ｂｔ１１系統後代品種については、ｃｒｙＩＡ（ｂ）−ＮＯＳターミネーター間、およびａｄｈ１−Ｓ  ＩＶＳ６−ｃｒｙＩＡ（ｂ）間、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種については、ｃｒｙＩＡ（ｂ）−ＰＥＰＣ＃９間、ＭＯＮ８１０系統後代品種については、ｈｓｐ７０−ｃｒｙＩＡ（ｂ）間、Ｔ２５系統後代品種については、ｐａｔ−３５Ｓターミネーター間、ＧＡ２１系統後代品種については、ｍ−ｅｐｓｐｓ−ＮＯＳターミネーター間、およびＯＴＰ−ｍ−ｅｐｓｐｓ間、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種については、ＣＰＴ４−ＣＰ４−ｅｐｓｐｓ間を増幅するようにプライマーを設計した。
また系統特異的ではないが遺伝子組換え体に頻用されるＤＮＡ配列を増幅するためのプライマー対は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター配列内部または、ＮＯＳターミネーター配列内部を増幅するようにプライマーを設計した。
さらに、当該生物が持つ特異な内在性遺伝子のＤＮＡ配列として、トウモロコシについてはｚＳＳＩＩｂ遺伝子の内部配列を、ダイズについてはｌｅ１遺伝子の内部配列を選定し、これらのシークエンスをゲノムデータベース検索により取得してプライマーを設計した。
各プライマー対の間には、プライマーのＴｍ値より１０℃程度高いＴｍ値を持つプローブを設計した。（表２Ａおよび表２Ｂ）
0004291568.tif 000003
0004291568.tif 000004
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、７７、７８、７９、８０：ＰＣＲプライマー
配列番号１７：トウモロコシｚＳＳＩＩＢ用のプローブ
配列番号２０：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター用のプローブ
配列番号２３：ＮＯＳターミネーター用のプローブ
配列番号２６：Ｅｖｅｎｔ１７６用のプローブ
配列番号２９：Ｂｔ１１用のプローブ
配列番号３２：ＧＡ２１用のプローブ
配列番号３５：Ｔ２５用のプローブ
配列番号３８：ＭＯＮ８１０用のプローブ
配列番号４１：Ｂｔ１１用のプローブ
配列番号４４：ＧＡ２１用のプローブ
0004291568.tif 000005
0004291568.tif 000006
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号４５，４６、４８、４９：ＰＣＲプライマー
配列番号４７：ダイズｌｅ１用のプローブ
配列番号５０：Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ用のプローブ
実施例３  プライマー対の特異性の確認（定性的ＰＣＲ）
実施例２で設計したプライマー対が、定性的ＰＣＲにおいて目的とする配列のみを特異的に検知することができるかどうか確認を行った。
トウモロコシ試料としてはＢｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種、Ｔ２５系統後代品種、非遺伝子組換えトウモロコシＤａｉｒｙｌａｎｄ  １４１２を、ダイズ試料としてはＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種、非遺伝子組換えダイズＭｕｒａｙｕｔａｋａ種を用い、それぞれの試料から実施例１に従って計８種類のＤＮＡを抽出した。
また、実際の分析試料にはトウモロコシやダイズ以外の主要穀物が混在している可能性もあるため、コメ（Ｋｉｎｕｈｉｋａｒｉ種）、コムギ（Ｈａｒｕｙｕｔａｋａ種）、オオムギ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種）からも実施例１に従って計３種類のＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲの鋳型として、上記した合計１１種類のＤＮＡ、陰性対照として蒸留水を使用して定性的ＰＣＲを実施した。反応はサーマルサイクラー”ＰＴＣ−２００”（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。また、この実験において、ＰＣＲ反応溶液の各々のプライマー終濃度は全て０．５μＭとなるように調製した。鋳型となる試料からの抽出ＤＮＡは反応系あたり２５ｎｇとなるように調製し、ＰＣＲ用酵素はＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、反応系あたり０．６２５Ｕｎｉｔとなるよう調製した。反応バッファーは×１０ＰＣＲバッファーＩＩ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を２．５μＬ用い、ＭｇＣｌ２は反応系あたり１．５ｍＭ、ｄＮＴＰは２００μＭとなるよう調製した。反応系の液量は２５μＬとなるよう蒸留水の液量を調整した。
反応条件は、９５℃で１０分間保持した後、以後９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４０サイクルの反復を行い、４０サイクル終了後に７２℃で７分保持したのち、４℃に保持した。
反応終了後、反応液のうち５μＬを分取し１μＬの１０×ｌｏａｄｉｎｇバッファーと混合し、電気泳動装置”Ｍｕｐｉｄ  ２”（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて、ＴＡＥバッファー中で、１００Ｖ、１５分の条件で３％アガロースゲルによる電気泳動を行ったのち、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で１５分間染色した後、ＰＣＲ増幅産物の有無を画像解析装置”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＩｍａｇｅｒＲ  ＦＸ”（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によって確認した。
実験結果の一例を図２に示す。Ｔ２５系統後代品種検知用に設計されたプライマー対が、Ｔ２５系統後代品種のみを特異的に検知し、他の試料とは交差反応しないことが確認された。
同様にして確認された全ての試験結果を表３にまとめた。表３に示すように、全てのプライマー対が対象とする遺伝子組換え体系統の後代品種のみ特異的に検知できることが確認された。
0004291568.tif 000007
実施例４  プライマー対およびプローブの特異性の確認（定量的ＰＣＲ）
実施例２で設計したプライマー対およびプローブが、定量的ＰＣＲにおいて目的とする配列のみを特異的に検知することができるかどうか確認を行った。
実施例３と同様に、トウモロコシ試料としてはＢｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種、Ｔ２５系統後代品種、非遺伝子組換えトウモロコシＤａｉｒｙｌａｎｄ  １４１２を、ダイズ試料としてはＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種、非遺伝子組換えダイズＭｕｒａｙｕｔａｋａ種を用い、それぞれの試料から実施例１に従って計８種類のＤＮＡを抽出した。
また、実際の分析試料にはトウモロコシやダイズ以外の主要穀物が混在している可能性もあるため、コメ（Ｋｉｎｕｈｉｋａｒｉ種）、コムギ（Ｈａｒｕｙｕｔａｋａ種）、オオムギ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種）からも実施例１に従って計３種類のＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲの鋳型として、上記した合計１１種類のＤＮＡ、陰性対照として蒸留水を使用して定量的ＰＣＲを実施した。反応は、定量的ＰＣＲ装置”ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。また、この実験において、ＰＣＲ反応溶液の各々のプライマー終濃度は全て０．５μＭ、プローブの終濃度は全て０．２μＭとなるように調製した。鋳型となる試料からの抽出ＤＮＡは反応系あたり５０ｎｇとなるように調製し、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；以下マスターミックスという）は反応系あたり１２．５μＬとなるよう調製した。反応系の液量は２５μＬとした。
反応条件は、反応液を５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃３０秒、５９℃１分を１サイクルとして４０サイクルの反復を行い、４０サイクル終了後は２５℃に保持した。
反応の過程では各反応ウェル中の蛍光量を経時的に計測し続けた。従って反応終了後に反応ウェルごとの蛍光量の経時的な変化を解析することで蛍光量の増加があったウェルを特定することができる。蛍光量はＰＣＲ増幅に伴うプローブの分解によって増加するので、蛍光量の増加が認められたウェル中では、ＰＣＲ増幅が起こりかつプローブが分解されていることになる。
実験結果の一例を図３に示す。ＮＯＳターミネーター検知用に設計されたプライマー対およびプローブが、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種のみを特異的に検知し、他の試料とは交差反応しないことが確認された。
同様にして確認された全ての試験結果を表４にまとめた。表４に示すように、全てのプライマー対およびプローブが対象とする遺伝子組換え体系統の後代品種のみ特異的に検知できることが確認された。
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実施例５  標準分子の作製（トウモロコシ）
実施例２にて選定された検知すべき領域の統合は図４に模式的に示す手順に従って行った。
即ち、表５に示したｔａｉｌｅｄプライマーを用いて対応する遺伝子組換え体系統から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを順次行い、分子末端に別の検知すべき領域と相補的な配列を有するＰＣＲ産物を得た。
ＰＣＲは、鋳型となるトウモロコシＤＮＡを１０ｎｇ、ｔａｉｌｅｄプライマーを各０．５μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ”ＫＯＤ”（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を０．１５６Ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰを１６０μＭ、ＭｇＣ１２を１．５ｍＭ、×１０ＰＣＲバッファーＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を２．５μＬ混合したものに蒸留水を加えて、全量２５μＬの反応系とした。
反応条件は、９８℃で１分間保持した後、以後９８℃３０秒、５４℃３０秒、７４℃１分を１サイクルとして３５サイクルの反復を行い、３５サイクル終了後に７４℃で２分保持したのち、４℃に保持した。
得られたＰＣＲ産物は隣接させたい領域を増幅させたＰＣＲ産物とともにＰＣＲを利用した統合反応に供した。即ち、先に増幅した各々のＰＣＲ産物を０．２５μＬずつ、ＤＮＡポリメラーゼ”ＫＯＤ”（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を０．１５６Ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰを１６０μＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、×１０ＰＣＲバッファーＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を２．５μＬに蒸留水を加えて、全量２４．５μＬの反応系として、まずプライマーなしのＰＣＲ増幅を行った。
反応条件は、９８℃で１分間保持した後、以後９８℃３０秒、５６℃３０秒、７４℃１分を１サイクルとして８サイクルの反復を行ったところで反応を止めた。
その後、最外部のプライマーをそれぞれ０．５μＭ加えた後、再度ＰＣＲ増幅を行って、２つの領域が統合された増幅産物を得た。
この２回目の反応条件は、９８℃で１分間保持した後、以後９８℃３０秒、５６℃３０秒、７４℃１分を１サイクルとして３５サイクルの反復を行い、３５サイクル終了後に７４℃で２分保持したのち、４℃に保持した。
同様の統合反応を繰り返し、図５および図６に示す分子を得た。図５に示す分子は、塩基番号１番から１５１番にｚＳＳＩＩｂ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＦ０１９２９７）増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号１５２番から２５２番にＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号２７５番から４２５番にＮＯＳターミネーター増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号４４１番から５８１番にＧＡ２１系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号５８２番から７３０番にＴ２５系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号７３１番から８４３番にＭＯＮ８１０系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号８４４番から９５１番にＥｖｅｎｔ１７６系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号９５２番から１１０２番にＢｔ１１系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列が統合されている。この領域の配列を配列番号５７に示した。図５の分子の塩基配列を配列番号７３に記載した。
また、図６に示す分子は、塩基番号１番から１５１番にｚＳＳＩＩｂ増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号１５２番から２５２番にＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号２７５番から４２５番にＮＯＳターミネーター増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号４４１番から５７３番にＧＡ２１系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号５７４番から７２２番にＴ２５系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号７２３番から８３５番にＭＯＮ８１０系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号８３６番から９４３番にＥｖｅｎｔ１７６系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号９４４番から１０７１番にＢｔ１１系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列が統合されている。図６の分子の塩基配列を配列番号７４に示した。
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＜配列表フリーテキスト＞
配列番号５１〜７２：ＰＣＲプライマー
配列番号７３〜７４：トウモロコシ遺伝子組換え体の定量的検出のための標準分子の増幅領域
配列番号７５：ダイズ遺伝子組換え体の定量的検出のための標準分子の増幅領域
上記の統合分子は、ＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による再増幅の後、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）を用いてプラスミドベクターにライゲーションし、大腸菌宿主ベクター系を用いて容易な無限供給を可能とした。
即ち、上記した統合分子１μＬを鋳型として、実施例３と同一の条件でＰＣＲ増幅を行ったのち、反応液１μＬとキットに含まれるプラスミドベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ  １μＬ、塩溶液バッファーを１μＬを混合し、室温で５分間静置したのち、反応液の２μＬをキットに含まれる大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’Ｃｅｌｌｓと混合し氷上で５分静置後４２℃３０秒のヒートショックを加えて形質転換を行った。
形質転換体を含む溶液１００μＬをＬＢ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）プレート（１Ｌあたりの組成：トリプトン  ペプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０ｇ、酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５ｇ、ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）５ｇ、アガー粉末（Ｓｙｏｅｉ  Ｋａｎｔｅｎ  Ｌｔｄ．）１５ｇ、Ｄ［−］−α−アミノベンジルペニシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）５０ｍｇ）に撒き、３７℃一晩静置して形質転換体を得た。
得られた形質転換体はそれぞれのコロニーについてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、正しい形質転換体を選択した。即ち、Ｍ１３フォワードプライマー、Ｍ１３リバースプライマーを各０．５μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を０．６２５Ｕｎｉｔ、反応バッファーは×１０ＰＣＲバッファーＩＩ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を２．５μＬ用い、ＭｇＣｌ２は反応系あたり１．５ｍＭ、ｄＮＴＰは２００μＭとなるよう調製した。これに蒸留水を加えて、全量２５μＬの反応系とし、この溶液に爪楊枝で拾い上げたコロニーを懸濁した。
反応条件は９５℃で５分間保持した後、以後９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃９０秒を１サイクルとして３５サイクルの反復を行い、３５サイクル終了後に７２℃で９０秒保持した後、４℃に保持した。
得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、設計と合致する増幅産物が認められたコロニーについて４０ｍＬのＬＢ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）液体培地（１Ｌあたりの組成：トリプトン  ペプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０ｇ、酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５ｇ、ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）５ｇ、Ｄ［−］−α−アミノベンジルペニシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）５０ｍｇ）中で３７℃一晩培養した。
大量培養した大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いてプラスミドを抽出した。プラスミドの抽出はキット添付のプロトコールに従った。
得られたプラスミドは塩基配列に誤りのないことを確認し標準分子とした。（ｐＭｕｌ４およびｐＭｕｌ５：図７）。このプラスミドｐＭｕｌ４を保持する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ−ＡＳＮ−ｐＭｕｌ４およびプラスミドｐＭｕｌ５を保持する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ−ＡＳＮ−ｐＭｕｌ５はいずれも通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、郵便番号３０５−８５６６）（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に平成１２年１０月１２日付で寄託され、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１９およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７３２０の受託番号が付されている。
これらの分子を定量的ＰＣＲに使用する際には、制限酵素ＢａｍＨＩで切断、直鎖化した分子を用いた。以後の実施例中ではｐＭｕｌ４のＢａｍＨＩ消化物（ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物）を標準分子として用いた。
実施例６  標準分子の作製（ダイズ）
実施例５と同様に、実施例２にて選定された検知すべき領域の統合は図４に模式的に示す手順に従って行った。
即ち、表５に示したｔａｉｌｅｄプライマーを用いて対応する遺伝子組換え体系統から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを順次行い、分子末端に別の検知すべき領域と相補的な配列を有するＰＣＲ産物を得たのち、得られたＰＣＲ産物は隣接させたい領域を増幅させたＰＣＲ産物とともにＰＣＲを利用した統合反応に供した。
上記に関わる詳細な実験条件は全て実施例５の条件に準じた。
統合反応の結果、図８、図９に示す分子を得た。図８に示す分子は、塩基番号１番から１２１番にＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号１２２番から２３９番にｌｅ１（ＧＥＮＢＡＮＫ  アクセッション番号  Ｋ００８２１  Ｍ３０８８４）増幅対象ＤＮＡ配列が統合されている。図８の分子の塩基配列を配列番号７５に記載した。
また、図９に示す分子は、塩基番号１番から１２１番にＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号１２２番から２３９番にｌｅ１増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号２４０番から４１９番に４２５番にＮＯＳターミネーター増幅対象ＤＮＡ配列、塩基番号４２８番から５２８番にＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター増幅対象ＤＮＡ配列が統合されている。図９の分子の塩基配列を配列番号７５に記載した。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号７５、７６：ダイズ遺伝子組換え体の定量的検出のための標準分子の増幅領域
実施例５と同様に、上記の統合分子は、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）を用いてプラスミドベクターにライゲーションし、大腸菌宿主ベクター系を用いて容易な無限供給を可能とした。形質転換体から得られたプラスミドは塩基配列に誤りのないことを確認し標準分子とした（ｐＭｕｌＳＬおよびｐＭｕｌＳＬ２：図１０、図１１）。このプラスミドｐＭｕｌＳＬを保持する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ−ＡＳＮ−ｐＭｕｌＳＬおよびプラスミドｐＭｕｌＳＬ２を保持する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ−ＡＳＮ−ｐＭｕｌＳＬ２は、いずれも通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、郵便番号３０５−８５６６）（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６  郵便番号３０５−８５６６）に平成１２年１０月１２日付けで寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３２１およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７３２２が付されている。
これらの分子を定量的ＰＣＲに使用する際には、制限酵素ＢａｍＨＩで切断、直鎖化した分子を用いた。以後の実施例中では、以後の実施例中ではｐＭｕｌＳＬのＢａｍＨＩ消化物（ｐＭｕｌＳＬ  ＢａｍＨＩ消化物）を標準分子として使用した。
実施例７  定性分析の陽性対照としての使用
Ｂｔ１１系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種の各１ｇより抽出したＤＮＡを等量混合し、ＤＮＡ濃度が２０ｎｇ／μＬとなるよう調製した。このＤＮＡ溶液をトウモロコシ擬似混入試料として、試料中の遺伝子組換えトウモロコシの有無を、標準分子を陽性対照とした定性的ＰＣＲにより確認した。
実験機器、反応液の組成等の実験条件は実施例３に準じた。定性的ＰＣＲは表２に示した全てのプライマー対について実施した。ＰＣＲの鋳型としては、上記にて調製したＤＮＡ溶液、陽性対象として実施例５に示した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物、陰性対照として蒸留水を使用した。標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物は反応系あたり５００分子となるよう添加した。
反応終了後は、実施例３と同様に、反応液のうち５μＬを分取し、３％アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、エチジウムブロミド染色後、ＰＣＲ増幅産物の有無を画像解析装置によって確認した。
実験の結果、図１２に示すように、試料中に遺伝子組換えトウモロコシとしてＢｔ１１系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種が含まれることが確認された。また、標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物が定性分析の陽性対照として好適に使用できることが確認された。
特にＧＡ２１系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種については現在標準試料が市販されていないため、一般の分析者は陽性対照を入手することが出来ないものである。
実施例８  定量比の決定（予備試験−トウモロコシ）
トウモロコシは雑種強勢のハイブリッドであるため、正確な定量比を得るためには遺伝的に均質なＦ１種子集団乃至これと同等の種子集団を必要とする。従って、最初に予備試験としてこれらの種子の遺伝的均質さを定量的ＰＣＲにより確認した。
この予備実験の試料としてＢｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種についてはそれぞれのＦ１種子を用いた。Ｔ２５系統後代品種についてはＦ１種子が入手できなかったため、Ｆ２種子を用いた。
以下に実験の詳細を記述する。
上記した５品種それぞれについて８粒の種子一粒ずつ個別にＤＮＡを抽出し、実施例５に示したｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物を標準試料として抽出ＤＮＡ中の検知すべき領域（実施例２にて選定したもの）の分子数を測定した。即ち、トウモロコシ内在性遺伝子ｚＳＳＩＩｂ増幅対象ＤＮＡ配列については、上記した５品種各々から抽出されたＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲを行うことにより、試料中の同領域の分子数を測定し、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの増幅対象ＤＮＡ配列については、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、Ｔ２５系統後代品種の各々から抽出されたＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲを行うことにより、試料中の同領域の分子数を測定した。同様にして、ＮＯＳターミネーターの増幅対象ＤＮＡ配列についてはＢｔ１１系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種の各々から抽出されたＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲを行うことにより、試料中の同領域の分子数を測定した。得られた測定値は式（ＩＩ）に従い定量比として算出した（図１３）。
この実験は、定量的ＰＣＲ装置”ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ”（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。また、この実験において、ＰＣＲ反応溶液の各々のプライマー終濃度はＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用、ＮＯＳターミネーター定量用、ｚＳＳＩＩｂ定量用ともに０．５μＭ、プローブの終濃度は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用、ＮＯＳターミネーター定量用、ｚＳＳＩＩｂ定量用ともに０．２μＭとなるように調製した。鋳型となる試料からの抽出ＤＮＡは反応系あたり５０ｎｇとなるように調製し、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；以下マスターミックスという）は反応系あたり１２．５μＬとなるよう調製した。反応系の液量は２５μＬとし、同一の反応を常に４回併行で実施し得られた測定値から平均測定値を算出した。
反応条件は、反応液を５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃３０秒、５９℃１分を１サイクルとして４０サイクルの反復を行い、４０サイクル終了後は２５℃に保持した。
ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを定量するために、標準組換えＤＮＡ配列として反応系あたり２５０分子、１０００分子、５００００分子となるように３段階の濃度に調製した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物または、試料として各一粒の試料より抽出したＤＮＡ溶液（全８点／品種）または、陰性対照としてサケ精巣ＤＮＡ溶液の計１２種類のＤＮＡ溶液を別々の反応チューブにとり、これら反応チューブに上記終濃度となるように、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用プライマー対とＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用プローブ、マスターミックスを混合し、反応液とした。
同様に、ＮＯＳターミネーターを定量するために、標準組換えＤＮＡ配列として反応系あたり２５０分子、１０００分子、５００００分子となるように３段階の濃度に調製した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物または、試料として各一粒の試料より抽出したＤＮＡ溶液（全８点／品種）または、陰性対照としてサケ精巣ＤＮＡ溶液の計１２種類のＤＮＡ溶液を別々の反応チューブにとり、これら反応チューブに上記終濃度となるように、ＮＯＳターミネーター定量用プライマー対とＮＯＳターミネーター定量用プローブ、マスターミックスを混合し、反応液とした。
同様に、内在性遺伝子ｚＳＳＩＩｂを定量するために、標準組換えＤＮＡ配列として反応系あたり２５０分子、１０００分子、５００００分子となるように３段階の濃度に調製した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物または、試料として各一粒の試料より抽出したＤＮＡ溶液（全８点／品種）または、陰性対照としてサケ精巣ＤＮＡ溶液の計１２種類のＤＮＡ溶液を別々の反応チューブにとり、これら反応チューブに上記終濃度となるように、ｚＳＳＩＩｂ定量用プライマー対とｚＳＳＩＩｂ定量用プローブ、マスターミックスを混合し、反応液とした。
反応の過程ではＰＣＲ増幅に伴うプローブの分解を蛍光量の増加として経時的に計測し続けた。従って、定量スタンダードとして反応に供した３点（×４回反復）の試料について（サイクル数−蛍光量）のグラフ（図１４）を作製すれば、反応開始時のサンプル中の増幅対象ＤＮＡ配列の分子数と、反応チューブから放出される蛍光量が一定量に達するまでに要した時間との相関式を得ることが出来る（図１５）。これを検量線とすることで、反応開始時の定量サンプル中におけるＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの増幅対象ＤＮＡ配列の分子数並びに、ＮＯＳターミネーターの増幅対象ＤＮＡ配列の分子数、ｚＳＳＩＩｂの増幅対象ＤＮＡ配列の分子数を知ることが出来る（表６）。
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図１３に示されたように、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、ＧＡ２１系統後代品種については８粒の種子から得られたＤＮＡについてほぼ一定の定量比が算出され、試料が遺伝的に均質なＦ１集団であることが確認された。しかしながら、Ｆ１種子が入手できなかったＴ２５系統後代品種については予想通り導入されたＤＮＡ配列の有無についてメンデル則に従う分散が認められた。そこで、Ｔ２５系統後代品種についてはＦ１集団と同等の遺伝子構成を持つことが確認された種子（図１３中に矢印で示したもの）だけを選別し、この集団を遺伝的に均質なＦ１種子集団と同等の種子集団として以降の実験で用いることとした。
実施例９  定量比の決定（予備試験−ダイズ）
実施例８と同様に、ダイズについても予備試験を実施した。予備試験の試料としてＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種のＦ１種子を用いた。
実施例８と同様に、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種のＦ１種子８粒について一粒一粒からＤＮＡを抽出し、実施例６に示したｐＭｕｌＳＬ  ＢａｍＨＩ消化物を標準試料として抽出ＤＮＡ中の検知すべき領域（実施例２にて選定したもの）の分子数を測定した。
即ち、抽出されたＤＮＡを鋳型とした定量的ＰＣＲを、ダイズ内在性遺伝子ｌｅ１の増幅対象ＤＮＡ配列、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的ＤＮＡ配列それぞれについて行うことにより、試料中のそれぞれの領域の分子数を測定した。実験の結果得られた測定値は式（ＩＩ）に従い定量比として算出した（図１６）。
なお、実験機器、反応液の組成等の実験条件は実施例８に準じた。ただし、プライマー、プローブはダイズ内在性遺伝子ｌｅ１の増幅対象ＤＮＡ配列、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的増幅対象ＤＮＡ配列それぞれに対応したものを用いた。
実験の結果、図１６に示されたように、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種については８粒の種子から得られたＤＮＡについてほぼ一定の定量比が算出され、試料が遺伝的に均質なＦ１集団であることが確認された。従って、この集団を以降の実験で用いることとした。
実施例１０  定量比の決定（トウモロコシ）
予備試験の結果として得られた遺伝的に均質なＦ１種子集団乃至これと同等の種子集団を用いて定量比を決定する本試験を実施した。即ち、各品種について、これら遺伝的に均質な集団から抽出されたＤＮＡを鋳型として予備試験と同様の方法を用いて実施例５に示したｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物を標準試料として抽出ＤＮＡ中の検知すべき領域（実施例２にて選定したもの）の分子数を定量した。
本試験においては、予備試験で定量した増幅対象ＤＮＡ配列だけでなく品種特異的増幅対象ＤＮＡ配列についても実施した。これら品種特異的増幅対象ＤＮＡ配列については各々対応する品種について試料中の対象領域の分子数を測定した。
なお、実施例９と同様に、プライマー、プローブを定量する対象ごとに変更した以外は、実験機器、反応液の組成等の実験条件は実施例８に準じた。
予備試験と同様に、得られた測定値は式（ＩＩ）に従い定量比として算出した。即ち、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの増幅対象ＤＮＡ配列、ＮＯＳターミネーターの増幅対象ＤＮＡ配列、品種特異的増幅対象ＤＮＡ配列の分子数を、それぞれ同一の試料において測定したｚＳＳＩＩｂ増幅対象ＤＮＡ配列の分子数で除することにより、各々の固有の定量比を得た。（表７）
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なお、内在性遺伝子ｚＳＳＩＩＢ増幅用プライマーについては、対照増幅配列長が短い２組のプライマー（ＳＳＩＩｂ  ２−５’／ＳＳＩＩｂ  ２−３’、ＳＳＩＩｂ  ３−５’／ＳＳＩＩｂ  ３−３’）も設計した。これらを内在性遺伝子増幅用プライマーとして用いた場合の定量比についても求めた（表８、表９）。
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実施例１１  定量比の決定（ダイズ）
ダイズについても予備試験の結果として得られた遺伝的に均質な種子集団を用いて定量比を決定する本試験を実施した。即ち、各品種について、これら遺伝的に均質な集団から抽出されたＤＮＡを鋳型として予備試験と同様の方法を用いて実施例６に示したｐＭｕｌＳＬ  ＢａｍＨＩ消化物を標準試料として抽出ＤＮＡ中のダイズ内在性遺伝子ｌｅ１の増幅対象ＤＮＡ配列、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的ＤＮＡ配列についてそれぞれの分子数を測定した。
なお、実施例９と同様に、プライマー、プローブを定量する対象ごとに変更した以外は、実験機器、反応液の組成等の実験条件は実施例８に準じた。
予備試験と同様に、得られた測定値は式（ＩＩ）に従い定量比として算出した。即ち、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統特異的ＤＮＡ配列の分子数を、同一の試料において測定したダイズ内在性遺伝子ｌｅ１の増幅対象ＤＮＡ配列の分子数で除することにより、固有の定量比を得た。（表８）
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実施例１２  擬似混入試料を用いた定量
各々の遺伝子組換え体系統の粉砕物を非遺伝子組換え系統の粉砕物に混合し、擬似混入試料を作成した。これら擬似混入試料について、実際に遺伝子組換え体の存在比の定量を実施し、定量分析法の能力を確認した。
即ち、遺伝子組換え体系統、および非遺伝子組換え体系統の種子を用い、実施例１に記載した方法で擬似混入試料を作製し、それらからＤＮＡを抽出した。擬似混入試料として、トウモロコシについては、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、Ｔ２５系統後代品種それぞれについて、０．１％、１％、５％（重量比）となるように作製された合計１２種類の混合物を用意した。
これら擬似混入試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、実施例５で作製した標準分子を制限酵素ＢａｍＨＩで切断、直鎖化した分子（ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物）を用いて、定量的ＰＣＲを行うことでそれぞれの擬似混入試料について内在性遺伝子の増幅対象ＤＮＡ配列部分配列と組換えＤＮＡ配列の増幅対象ＤＮＡ配列部分配列の分子数を測定し、実施例１０、実施例１１で決定した定量比を用いて遺伝子組換え体の存在比を求めた。
いずれの対象を定量する際も、ＰＣＲ反応溶液の各々のプライマー終濃度は０．５μＭ、定量用プローブの終濃度は０．２μＭとなるように調製した。鋳型となる試料からの抽出ＤＮＡは反応系あたり５０ｎｇとなるように調製し、マスターミックスは反応系あたり１２．５μＬとなるよう調製した。反応系の液量は２５μＬとし、同一の反応を常に４回併行で実施し得られた測定値から平均測定値を算出した。
反応条件は、反応液を５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃３０秒、５９℃１分を１サイクルとして４０サイクルの反復を行い、４０サイクル終了後は２５℃に保持した。
各増幅対象ＤＮＡ配列を定量するために、標準組換えＤＮＡ配列として反応系あたり１０分子、５０分子、２５０分子、１０００分子、５００００分子となるように５段階の濃度に調製した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物または、試料として０．１％、１％、５％擬似混入試料より抽出したＤＮＡ溶液または、陰性対照としてサケ精巣ＤＮＡ溶液の計９種類のＤＮＡ溶液を別々の反応チューブにとり、これら反応チューブに上記終濃度となるようにプライマー対と定量用プローブ、マスターミックスを混合し、反応液とした。
反応の過程ではＰＣＲ増幅に伴うプローブの分解を蛍光量の増加として経時的に測定し続けた。従って、標準組換えＤＮＡ配列として反応に供した５点（×４回反復）の試料について（サイクル数−蛍光量）のグラフを作製すれば、反応開始時の試料中の増幅対象ＤＮＡ配列の分子数と、反応チューブから放出される蛍光量が一定量に達するまでに要した時間との相関式を得ることが出来る。これを検量線とすることで、反応開始時の試料中における各増幅対象ＤＮＡ配列の分子数を知ることが出来る（表９）。
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得られたＤＮＡ配列の分子数に関する測定値は、実施例１０、実施例１１で決定された定量比の値と式（Ｉ）を用いて試料中における遺伝子組換え体の存在比に変換することが出来る。変換を施した結果を表８に示す。いずれの場合も遺伝子組換え体系統後代品種を重量比で０．１％乃至１％乃至５％含むような擬似混入試料が良好に定量できることが示された。
実施例１３  標準分子を用いた遺伝子組換え体存在比の定量（１）
３系統の遺伝子組換えトウモロコシを含む擬似混入試料を準備し、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターとトウモロコシが持つ特異な内在性遺伝子であるｚＳＳＩＩｂをターゲットとした定量的ＰＣＲを行い、この試料中の遺伝子組換えトウモロコシ存在比を定量した。標準物質として、実施例５に示したｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物を用いた。
ここで使用したトウモロコシ擬似混入試料は、遺伝子組換えトウモロコシとして、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種の粉砕物を各１％（重量比）ずつ、非遺伝子組換えトウモロコシ品種としてＤａｉｒｙｌａｎｄ  １４１２の粉砕物を９７％（重量比）となるように混合したもの（１％ｍｉｘ）、および、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種の粉砕物を各５％（重量比）ずつ、非遺伝子組換えトウモロコシ品種としてＤａｉｒｙｌａｎｄ  １４１２の粉砕物を８５％（重量比）となるように混合したもの（５％ｍｉｘ）である。
なお、この実験においては、実際の分析状況を模して、実験時に分析者が、これら３種の系統の遺伝子組換え体がそれぞれどの程度試料中に存在するかといった情報を事前に一切知り得ていない状況を想定した。
この場合も、ＰＣＲ反応溶液の各々のプライマー終濃度は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用、ｚＳＳＩＩｂ定量用ともに０．５μＭ、プローブの終濃度は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用、ｚＳＳＩＩｂ定量用ともに０．２μＭとなるように調製した。鋳型となる試料からの抽出ＤＮＡは反応系あたり５０ｎｇとなるように調製し、マスターミックスは反応系あたり１２．５μＬとなるよう調製した。反応系の液量は２５μＬとし、同一の反応を常に４回反復で実施し得られた測定値から平均測定値を算出した。
反応条件は、反応液を５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃３０秒、５９℃１分を１サイクルとして４０サイクルの反復を行い、４０サイクル終了後は２５℃に保持した。
ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを定量するために、標準組換えＤＮＡ配列として反応系あたり１０分子、５０分子、２５０分子、１０００分子、５００００分子となるように５段階の濃度に調製した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物または、試料としてトウモロコシ擬似混入試料より抽出したＤＮＡ溶液または、陰性対照としてサケ精巣ＤＮＡ溶液の計７種類のＤＮＡ溶液を別々の反応チューブにとり、これら反応チューブに上記終濃度となるように、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用プライマー対とＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター定量用プローブ、マスターミックスを混合し、反応液とした。
同様に、内在性遺伝子ｚＳＳＩＩｂを定量するために、標準組換えＤＮＡ配列として反応系あたり１０分子、５０分子、２５０分子、１０００分子、５００００分子となるように５段階の濃度に調製した標準分子ｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物または、試料としてトウモロコシ擬似混入試料より抽出したＤＮＡ溶液または、陰性対照としてサケ精巣ＤＮＡ溶液の計７種類のＤＮＡ溶液を別々の反応チューブにとり、これら反応チューブに上記終濃度となるように、ｚＳＳＩＩｂ定量用プライマー対とｚＳＳＩＩｂ定量用プローブ、マスターミックスを混合し、反応液とした。
反応の過程ではＰＣＲ増幅に伴うプローブの分解を蛍光量の増加として経時的に計測し続けた。従って、定量スタンダードとして反応に供した５点（×４回反復）の試料について（サイクル数−蛍光量）のグラフを作製すれば、反応開始時のサンプル中の増幅対象ＤＮＡ配列の分子数と、反応チューブから放出される蛍光量が一定量に達するまでに要した時間との関係を検量線とすることで、反応開始時の定量サンプル中におけるＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの増幅対象ＤＮＡ配列の分子数並びに、ｚＳＳＩＩｂの増幅対象ＤＮＡ配列の分子数を知ることが出来る（表１０）。
ここで定量装置として用いたＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、９６点の試料について同時に反応を行うことが出来るため、上記した試験は１回の定量的ＰＣＲを行うことで達成される。
得られたＤＮＡ配列の分子数に関する測定値は、実施例１０で決定された定量比の値と式（Ｉ）を用いて試料中におけるＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを有する遺伝子組換えトウモロコシの存在比に変換することが出来る。但し、この実験においては、いずれの系統の遺伝子組換え体がどの程度試料中に存在するかといった情報を事前に知り得ていないので、３種類の定量比の全てについて個別に計算し、換算値として表現することになるが、一回の定量的ＰＣＲによって試料中の遺伝子組換え体の存在比を知ることができた（表１０）。
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実施例１４  標準分子を用いた遺伝子組換え体存在比の定量（２）
実施例１３で定量に供したトウモロコシ擬似混入試料と同一の試料について、３種類の系統特異的なＤＮＡ配列とトウモロコシが持つ特異な内在性遺伝子であるｚＳＳＩＩｂをターゲットとした定量的ＰＣＲを行い、この試料中の遺伝子組換えトウモロコシ存在比を系統ごとに定量したのち、得られた各々の定量値を加算して、試料中の遺伝子組換え体の存在比を求めた。実施例１３と同様に、標準物質として、実施例５に示したｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物を用いた。
この実験においても、実際の分析状況を模して、実験時に分析者が、これら３種の系統の遺伝子組換え体がどの程度試料中に存在するかといった情報を事前に一切知り得ていないという状況を想定した。
反応液の組成、反応条件、解析方法は実施例１３と同様とし、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの定量の代わりに、Ｂｔ１１系統後代品種特異的配列の定量、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種特異的配列の定量、ＭＯＮ８１０系統後代品種特異的配列の定量をそれぞれ実施した。即ち、この実験においてはｚＳＳＩＩｂを含め、合計４種類の増幅対象ＤＮＡ配列について各々定量的ＰＣＲを実施した。従ってこの試験ではＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を計３回稼働させて実施した。
各々の増幅対象ＤＮＡ配列の反応開始時のサンプル中における分子数と、反応チューブから放出される蛍光が一定量に達するまでに要した時間との関係を検量線とすることで、反応開始時の定量サンプル中における増幅対象となった系統特異的ＤＮＡ配列の分子数並びに、ｚＳＳＩＩｂの増幅対象領域の分子数を知ることができた（表１１）。
実施例１３と同様に、得られたＤＮＡ配列の分子数に関する測定値は、実施例１０で決定された定量比の値と式（Ｉ）を用いて試料中における遺伝子組換えトウモロコシの各系統の存在比に変換することが出来る。この実験では系統に特異的なＤＮＡ配列を定量しているため、実施例１３に示したような値の幅が生じる余地はない。従って、分析のために複数回の定量的ＰＣＲ装置の稼働を要するものの、上記した方法によって試料中の遺伝子組換え体の存在比をより正確に知ることができた（表１１）。
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本発明の方法により、複数の遺伝子組換え体系統が存在していると考えられる試料において、組換え体系統の有無、および存在比が未知であるその試料中の組換え体の存在比を簡便に調べることができ、かつ集団中の組換え体の存在比を正確に定量することができ、特に特定の遺伝子組換え体系統の存在比が未知である試料中でその特定の組換え体系統の存在比を正確に定量できる。特に、本発明の方法は、組換えＤＮＡ配列の定量に供する領域と当該生物種の内在性遺伝子のＤＮＡ配列を同一分子中に有する標準分子を使用する。この標準分子には常に定量に供する領域が導入形態に応じた整数比で存在することから、上記式（ＩＩ）記載の定量比を再現良く求めることができ、従って、本発明の方法は試料中で特定の組換え体系統の存在比を正確に定量できる。
また、定量比が決定された以後の分析においては標準試料としての純粋な遺伝子組換え体は不要となるため、一般の分析者による標準試料の入手に関わる困難が解消される。
さらに、本発明の遺伝子組換え体検知用標準分子が供給されることにより、広い適用範囲を有した正確な分析法が広く利用可能となる遺伝子組換え体の分子生物学的分析法の実用性向上につながる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、各遺伝子組換え体の系統に導入された組換えＤＮＡ配列の構成と、分子生物学的分析用プライマーの設計位置を示す。遺伝子組換え体の系統特異的ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマー対は、複数の種類のＤＮＡ配列にまたがる領域を増幅するよう設計された。系統特異的ではないが遺伝子組換え体に頻用されるＤＮＡ配列を増幅するためのプライマー対は、該当する全ての系統に反応し得るよう設計された。
図２は、Ｔ２５系統後代品種検知用に設計されたプライマー対の特異性確認試験結果を示す。Ｔ２５系統後代品種以外の試料から抽出されたＤＮＡに対しては、増幅反応は認められず、Ｔ２５系統後代品種から抽出されたＤＮＡに対してのみ増幅産物が認められた。増幅産物の分子量は、設計と一致する。
図３は、ＮＯＳターミネーター検知用に設計されたプライマー対およびプローブの特異性確認試験結果を示す。実験は１１種類の鋳型ＤＮＡについて行った。図１に示すようにＮＯＳターミネーターは、Ｂｔ１１系統後代品種、Ｅｖｅｎｔ１７６系統後代品種、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種に導入されている。実験の結果、これら３品種から抽出された鋳型ＤＮＡについてのみ、増幅産物が認められ、これら以外の鋳型ＤＮＡを反応に供した場合は増幅産物が認められなかったため、設計通りの特異性が確認された。
図４は、ＰＣＲ産物の統合の模式図を示す。
図５は、トウモロコシ用標準分子の塩基配列を示す。図中に統合された各増幅対象ＤＮＡ配列の位置を示す。実験に使用したプライマーが結合する部分、プローブが結合する部分についてもそれぞれ図中に示した。
図６は、別のトウモロコシ用標準分子の塩基配列を示す。図中に統合された各増幅対象ＤＮＡ配列の位置を示す。実験に使用したプライマーが結合する部分、プローブが結合する部分についてもそれぞれ図中に示した。
図７は、プラスミドｐＭｕｌ４およびｐＭｕｌ５の模式図を示す。ｐＭｕｌ４では図５に示したＤＮＡがベクターに挿入されている。ｐＭｕｌ５では図６に示したＤＮＡ配列がベクターに挿入されている。
図８は、ダイズ用標準分子の塩基配列を示す。図中に統合された各増幅対象ＤＮＡ配列の位置を示す。実験に使用したプライマーが結合する部分、プローブが結合する部分についてもそれぞれ図中に示した。
図９は、ダイズ用標準分子の塩基配列を示す。図中に統合された各増幅対象ＤＮＡ配列の位置を示す。実験に使用したプライマーが結合する部分、プローブが結合する部分についてもそれぞれ図中に示した。
図１０は、プラスミドｐＭｕｌＳＬの模式図を示す。ベクターに挿入されている配列は図８に示したＤＮＡ配列である。
図１１は、プラスミドｐＭｕｌＳＬ２の模式図を示す。ベクターに挿入されている配列は図９に示したＤＮＡ配列である。
図１２は、トウモロコシ擬似混入試料中に含まれる遺伝子組換えトウモロコシを確認した。（Ａ）試料中からＢｔ１１系統後代品種、（Ｂ）ＧＡ２１系統後代品種、ＭＯＮ８１０系統後代品種、が検出された。陽性対照としてｐＭｕｌ４  ＢａｍＨＩ消化物を用いた。
図１３は、トウモロコシ種子一粒から抽出したＤＮＡを用いて定量的ＰＣＲを行い、式（ＩＩ）に従って定量比を確認した結果を示す。図中の矢印はＴ２５系統後代品種のＦ１種子が示すと予想される値を指している。
図１４は、トウモロコシ標準組換えＤＮＡ配列に対する定量的ＰＣＲ過程における（サイクル数−蛍光量）のグラフを示す。
図１５は、トウモロコシ標準組換えＤＮＡ配列に対する定量的ＰＣＲで得られた検量線を示す。検量線は図１４から導かれる。
図１６は、ダイズ種子一粒から抽出したＤＮＡを用いて定量的ＰＣＲを行い、式（ＩＩ）に従って定量比を確認した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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