(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化１】
0004298201.tif 000026
〔式中、
Ｑは、担体であり、
Ｓ1は、スペーサーであり、
Ｌは、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−であり、
Ａは、チオエーテルまたはセレノエーテル結合であり、
Ｔは、化学結合または置換若しくは未置換のアルキル若しくはアルケニルであり、
Ｘは、−(ＣＨ2)kＣＨ3、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｈ、−(ＣＨ2)kＰＯ3Ｈ2、−(ＣＨ2)kＮ(Ｊ)2または−(ＣＨ2)kＰ(Ｊ)2であり、
ｋは、０〜２の整数であり、
Ｊは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、
Ｙは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2であり、
ｉは、０〜４の整数である。〕
で示される金属キレート化複合物を含んでなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体前駆体。
【請求項２】
Ａが、チオエーテル結合である請求項１に記載の吸着体前駆体。
【請求項３】
担体を、アガロース、セルロース、メタクリレートコポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチック、金、酸化鉄、ポリアクリルアミド、核酸、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリアミノ酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン（streptavidin）、ペプチド、ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素および多糖類からなる群から選択する請求項１または２に記載の吸着体前駆体。
【請求項４】
Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、水素または−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、請求項１における定義と同じである請求項１〜３のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項５】
Ａが、チオエーテル結合であり、Ｔが、−ＣＨ2−であり、Ｘが、−ＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、−ＣＯＯＨであり、ｉが１である請求項１〜４のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項６】
Ｓ1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる２５原子以下の鎖からなる請求項１〜５のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項７】
Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる１５原子以下の鎖により定義され、Ｔが、−(ＣＨ2)n−〔式中ｎは、０〜６である。〕である請求項１〜６のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項８】
Ｓ1が、アミン結合を含まない請求項１〜７のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項９】
ＡおよびＴが、アミノ酸から誘導されている請求項１〜８のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項１０】
アミノ酸が、シスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、システイン酸からなる群から選ばれるアミノ酸、またはこれらのエステルである請求項９に記載の吸着体前駆体。
【請求項１１】
次式：
【化２】
0004298201.tif 000027
【化３】
0004298201.tif 000028
【化４】
0004298201.tif 000029
【化５】
0004298201.tif 000030
〔式中、Ｑは、請求項１における定義と同じであり、Ａｃは、アセチルである。〕
からなる群から選ばれる請求項１〜１０のいずれかに記載の吸着体前駆体。
【請求項１２】
金属および請求項１〜１１のいずれかに記載の吸着体前駆体を含む金属キレートを含んでなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項１３】
金属を、Ｎｉ、Ｈｇ、Ｇａ、Ｃｕ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｔｉ、Ｉｎ、Ｚｎ、Ｔｃ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ａｕ、ＰｂおよびＢｉからなる群から選択する請求項１２に記載の吸着体。
【請求項１４】
金属を、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ａｕ、ＧａおよびＮｉからなる群から選択する請求項１３に記載の吸着体。
【請求項１５】
金属が、ニッケル、鉄またはガリウムである請求項１４に記載の吸着体。
【請求項１６】
コンパウンドの精製または検出方法であって、該方法は、コンパウンドと請求項１２〜１５のいずれかに記載の吸着体とを接触させることを含む方法。
【請求項１７】
コンパウンドが、少なくとも２つのヒスチジン残基を有するポリペプチドである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
コンパウンドが、少なくとも６つのヒスチジン残基を有するポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
コンパウンドが、タンパク質、リンタンパク質、ペプチド、ホスホペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、薬、または金属キレートに対し親和力を有する合成若しくは天然生成物である請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、金属キレート化複合物、その製造方法およびタンパク質を精製、検出または結合するためのその使用方法に向けられ、特に、向上した結合特異性および安定性を有するニトリロ三酢酸誘導体、該ニトリロ三酢酸誘導体の製造方法、およびタンパク質を精製、検出または結合するための該ニトリロ三酢酸誘導体の使用方法に向けられている。
【０００２】
（背景技術）
金属キレートアフィニティークロマトグラフィーは、かなり以前からタンパク質を精製するための技術として使用されている。初期にこの方法で使用されている樹脂は、単純キレート化剤、例えばアガロース支持物に連結されたイミノ二酢酸（ＩＤＡ）であった（Porath ら Nature, 258: p.598-599, 1975）。これは、様々な金属、例えばＣｕ2+、Ｚｎ2+およびＮｉ2+で装填される。これらの樹脂は、天然源からタンパク質およびペプチドを選択的に捕獲することが見出された（Porath および Olin, Biochemistry, 22: 1621, 1983; Lonnerdal および Keen, J. Appl. Biochem., 4: 203, 1983; Sulkowski, Protein Purification: Micro to Macro, p.149-162, R. Burgess 編, Liss New York より発行, NY, 1987）。分子生物学技術の出現により、金属キレートクロマトグラフィーは、６-ヒスチジン標識を使用するタンパク質の精製においてより重要な役割を帯びた。例えば Dobeli ら, 米国特許第5,284,933号を参照されたい。ポリヒスチジン標識は、固定化ニッケルと非常に強く結合し、これらの組換分子の同定および精製のために使用することができる。三座キレート化剤ＩＤＡは、これらの標識化タンパク質に対し全く選択的であるが、ニッケルは、樹脂からゆっくりと浸出し、その容量を減少させ、タンパク質のいくらかのダウンストリーム使用を妨げることが見出された。
【０００３】
さらに最近、ニトリロ三酢酸樹脂として知られている四座キレート化剤が、６つの配位部位を有する金属との使用のために開発された。この樹脂は、タンパク質含有ポリヒスチジンの精製のために好ましい樹脂となっている。なぜならそれは、非常に少ない金属浸出および良好な選択性を有するからである。しかしながらこの選択性を得るために、多量の努力が必要である。例えば、この樹脂が、タンパク質と選択的に結合するかどうかを定めるために、イミダゾールの様々な量を添加する必要があり、この樹脂のタンパク質に対する容量は、望ましい結果を達成するために最適化されなければならない (Janknecht ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: p.8972-8976, 1991, Schmitt ら, Molecular Biology Reports, 88: p.223-230, 1993)。
【０００４】
米国特許第4,877,830号において Dobeli らは、一般式：
【化９】
0004298201.tif 000002
〔式中は、ｘは、２、３または４であり、担体マトリックスは、アフィニティーまたはゲルクロマトグラフィーに使用されるマトリックス、例えば架橋デキストラン、アガロースまたはポリアクリルアミドであり、スペーサーは、好ましくは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−または−Ｏ−ＣＯ−である。〕により表される、タンパク質精製のために適当なニトリロ三酢酸樹脂を記載している。Dobeli ら, 米国特許第4,877,830号第2欄第23〜27行。これらの樹脂は、次式：
【化１０】
0004298201.tif 000003
〔式中、Ｒは、アミノ保護基であり、ｘは、２、３または４である。〕
で示されるＮ-末端保護化合物とブロモ酢酸とをアルカリ媒体中において反応させ、次いでこの保護基を開裂させ、該生成物と活性化樹脂とを反応させることにより製造される。例えば Hochuli ら, Journal of Chromatography, 411 (1987) p.177-184 を参照されたい。
【０００５】
米国特許第5,625,075号において Srinivasan らは、多数の硫黄および窒素原子を有する金属放射性核種キレート化化合物を記載している。これらのキレート化化合物は、２つの窒素原子および３つの硫黄原子、２つの窒素原子および４つの硫黄原子、または３つの窒素原子および３つの硫黄原子を組み込んでいる。
これらの化合物は、いくつかのニトリロ三酢酸誘導体含有樹脂に対する向上した特異性を提供するが、タンパク質含有ポリヒスチジンに対するより大きな結合特異性を有するキレート化化合物の要求がまだ存在する。
【０００６】
（発明の概要）
本発明の目的は、金属キレート化複合物および金属キレートを提供することであり、これは、比較的安定であり、タンパク質またはポリペプチドを精製、検出または結合するために優れた結合特異性を与える。また本発明の目的は、そのような複合物の製造方法および使用方法を提供することである。
【０００７】
それゆえ簡単に言えば、本発明は、次式：
【化１１】
0004298201.tif 000004
〔式中、
Ｑは、担体であり、
Ｓ1は、スペーサーであり、
Ｌは、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−または−Ｃ(＝Ｏ)−であり、
Ａは、エーテル、チオエーテル、セレノエーテルまたはアミド結合であり、
Ｔは、化学結合または置換若しくは未置換のアルキル若しくはアルケニルであり、
Ｘは、−(ＣＨ2)kＣＨ3、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｈ、−(ＣＨ2)kＰＯ3Ｈ2、−(ＣＨ2)kＮ(Ｊ)2または−(ＣＨ2)kＰ(Ｊ)2であり、
ｋは、０〜２の整数であり、
Ｊは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、
Ｙは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2であり、
ｉは、０〜４の整数である。〕
で示される金属キレート化複合物に向けられている。
【０００８】
本発明は、さらに、金属および本発明の金属キレート化複合物を含む金属キレートに向けられている。
本発明は、さらに、金属キレートに対し親和力を有するポリペプチドまたは他のコンパウンドの精製方法または検出方法に向けられている。この方法は、コンパウンドと金属キレートとを接触させることを含み、この金属キレートは、金属および本発明の金属キレート化複合物を含む。
【０００９】
本発明は、さらに、モノカルボキシル化またはジカルボキシル化アミンの製造方法に向けられている。この方法は、還元剤の存在下でアミンおよびオキソ酸を組み合わせることを含む。このアミンは、式：Ｒ2Ｒ3ＮＨ〔式中、Ｒ2は、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、Ｒ3は、水素、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。〕で示される。
他の目的および特徴は、いくらかは明らかであり、いくらかは以下で示される。
【００１０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
キレート化剤および樹脂の間の結合は、ポリヒスチジン標識化タンパク質に対する樹脂の選択性のための重要なパラメーターであることを私達は見出した。通常のニトリロ三酢酸樹脂は、正電荷アミン結合を有し、この結合は、固定化金属により提供される配位部位へのタンパク質の結合を邪魔し得る、あらゆる負電荷分子のための結合部位として機能する。酸素、硫黄、セレンおよびアミドは、向上したキレート化性質を与え得る金属に対し親和力を有し、正電荷アミン結合を有するありきたりの四座キレート化剤よりもしっかりと金属を結合する。さらに、ニトリロ窒素および担体との間における非電荷原子の使用は、タンパク質の非特異的結合を減少させると思われる。
【００１１】
本発明の金属キレート化複合物は、金属イオンとの比較的安定なキレートを形成することができる。得られるキレートを、タンパク質、リンタンパク質、ペプチド、ホスホペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、薬、並びに金属キレートに対し親和力を有する合成および天然生成物、例えばクラスター化ヒスチジンまたはポリヒスチジンのような分子の分離または精製のために使用する場合に、有利には、このキレート化複合物中のエーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、セレノエーテル（−Ｓｅ−）またはアミド（−ＮＲ1(Ｃ＝Ｏ)−または−(Ｃ＝Ｏ)ＮＲ1−〔式中Ｒ1は、水素またはヒドロカルビルである。〕）結合の存在は、得られるキレートの特異性に寄与する。
【００１２】
一般に本発明のキレート化複合物は、以下の構造：
【化１２】
0004298201.tif 000005
〔式中、
Ｑは、担体であり、
Ｓ1は、スペーサーであり、
Ｌは、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−または−Ｃ(＝Ｏ)−であり、
Ａは、エーテル、チオエーテル、セレノエーテルまたはアミド結合であり、
Ｔは、化学結合または置換若しくは未置換のアルキル若しくはアルケニルであり、
Ｘは、−(ＣＨ2)kＣＨ3、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｈ、−(ＣＨ2)kＰＯ3Ｈ2、−(ＣＨ2)kＮ(Ｊ)2または−(ＣＨ2)kＰ(Ｊ)2、好ましくは−(ＣＨ2)kＣＯＯＨまたは−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｈであり、
ｋは、０〜２の整数であり、
Ｊは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、
Ｙは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2、好ましくは−ＣＯＯＨであり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2、好ましくは−ＣＯＯＨであり、
ｉは、０〜４の整数、好ましくは１または２である。〕
で示される複合物（１）に相当する。
【００１３】
一般に担体Ｑは、あらゆる固体、溶解性物質または連結のために誘導化することができる化合物を含み得る。固体（または不溶性）担体を、アガロース、セルロース、メタクリレートコポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチック、金、酸化鉄およびポリアクリルアミドを含む群から選ぶことができる。しかし担体Ｑは、複合物の残りを担体Ｑと連結させるために誘導化することができるあらゆる不溶性または固体の化合物であり得る。好ましい固体担体は、アガロースまたは高処理量スクリーニングマイクロタイタープレート（microtiterplate）である。溶解性担体は、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリアミノ酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン（streptavidin）、ペプチド、ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素または他のあらゆる検出分子、薬、小さい有機化合物、多糖類、および複合物の残りを担体Ｑと連結させるために誘導化することができるあらゆる他の溶解性化合物を含む。タンパク質または多糖類が、好ましい担体である。
【００１４】
担体と側面を接するスペーサーＳ1は、飽和または不飽和、置換または未置換、線状または環式、直鎖または分枝であり得る原子鎖を含む。典型的に、スペーサーＳ1を定める原子鎖は、約２５原子以下からなる。別の様式で述べれば、スペーサーの主鎖は、約２５原子以下からなる。スペーサーＳ1を定める原子鎖は、より好ましくは約１５原子以下、さらに好ましくは約１２原子以下からなる。スペーサーＳ1を定める原子鎖は、典型的に炭素、酸素、窒素、硫黄、セレン、ケイ素およびリンからなる群、好ましくは炭素、酸素、窒素、硫黄およびセレンからなる群から選ばれる。さらにこの鎖の原子は、水素原子以外、例えばヒドロキシ、ケト（＝Ｏ）またはアシル、例えばアセチルにより置換されているか、または未置換であり得る。従って鎖は、任意に、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビル領域の間に１つまたはそれ以上のエーテル、チオエーテル、セレノエーテル、アミドまたはアミン結合を含み得る。例示のスペーサーＳ1は、メチレン、アルキレンオキシ（−(ＣＨ2)aＯ−）、アルキレンチオエーテル（−(ＣＨ2)aＳ−）、アルキレンセレノエーテル（−(ＣＨ2)aＳｅ−）、アルキレンアミド（−(ＣＨ2)aＮＲ1(Ｃ＝Ｏ)−）、アルキレンカルボニル（−(ＣＨ2)aＣＯ−）およびこれらの組合せ〔式中、ａは、一般に１〜約２０、Ｒ1は、水素またはヒドロカルビル、好ましくはアルキルである。〕を含む。１つの実施態様においてスペーサーＳ1は、親水性中性構造であり、ポリペプチドの精製中に帯電し得るアミン結合若しくは置換基または他の結合若しくは置換基を含有しない。
【００１５】
上記のようにリンカーＬは、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−または−Ｃ(＝Ｏ)−であり得る。Ｌが−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−である場合、キレート化複合物は、次式：
【化１３】
0004298201.tif 000006
〔式中Ｑ、Ｓ1、Ａ、Ｔ、Ｘ、ＹおよびＺは、先の定義と同じである。〕
に相当する。この実施態様においてエーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、セレノエーテル（−Ｓｅ−）またはアミド（−ＮＲ1(Ｃ＝Ｏ)−または−(Ｃ＝Ｏ)ＮＲ1−〔式中Ｒ1は、水素またはヒドロカルビルである。〕）結合は、置換または未置換アルキルまたはアルケニル領域により分子のキレート化位置から離されている。化学結合以外の場合にＴは、好ましくは、置換若しくは未置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル、または置換若しくは未置換Ｃ2〜Ｃ6アルケニルである。より好ましくは、Ａは−Ｓ−であり、Ｔは−(ＣＨ2)−であり、ｎは、０〜６、典型的に０〜４の整数、より典型的に０、１または２である。
【００１６】
Ｌが−Ｃ(＝Ｏ)−である場合、キレート化複合物は、次式：
【化１４】
0004298201.tif 000007
〔式中Ｑ、Ｓ1、ｉ、ＹおよびＺは、先の定義と同じである。〕
に相当する。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様では、組合せにおける連鎖−Ｓ1−Ｌ−は、炭素、酸素、硫黄、セレン、窒素、ケイ素およびリンからなる群、より好ましくは炭素、酸素、硫黄および窒素のみからなる群、さらに好ましくは炭素、酸素および硫黄のみからなる群から選ばれる約３５原子以下の鎖である。非特異的結合の公算を減少させるために、存在する場合に窒素は、好ましくはアミド部分の形態である。さらに、炭素鎖の原子が水素以外のもので置換されている場合、炭素鎖原子は、好ましくはヒドロキシまたはケトで置換されている。好ましい実施態様においてＬは、アミノ酸、例えばシスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、システイン酸、またはこれらのエステル、例えばこれらのメチル若しくはエチルエステルから誘導される部分（時おり、断片または残基と称される。）を含む。
【００１８】
本発明の例示キレート化複合物は、次式のものを含む：
【化１５】
0004298201.tif 000008
【化１６】
0004298201.tif 000009
【化１７】
0004298201.tif 000010
【化１８】
0004298201.tif 000011
【化１９】
0004298201.tif 000012
【化２０】
0004298201.tif 000013
【化２１】
0004298201.tif 000014
〔式中Ｑは、担体であり、Ａｃは、アセチルである。〕
【００１９】
結合部分中において正電荷アミン結合の代わりに中性エーテル、チオエーテル、セレノエーテルまたはアミド結合を使用することにより、好結果が得られる。酸素、硫黄およびセレン原子およびアミドは、向上したキレート化性質を提供し得る金属に対し親和力を有し、正電荷のアミン結合を有するありきたりの四座キレート化剤よりもしっかりと金属を結合する。さらに、ニトリロ窒素および担体の間における非電荷原子の使用は、タンパク質の非特異的結合を減少させると思われる。結合部分Ｌ中において、アミンまたは他の帯電部分の代わりにＳ、Ｏ、Ｓｅまたはアミドを使用することは、タンパク質精製用の複合物の安定性および特異性を向上させる傾向がある。
【００２０】
１つの実施態様において本発明のキレート化複合物（１）を、一般式：
【化２２】
0004298201.tif 000015
〔式中、Ａ、Ｔ、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｉは、先の定義と同じである。〕
を有する複合物から誘導することができる。
【００２１】
好ましくは複合物（２）は、次式：
【化２３】
0004298201.tif 000016
〔式中ｎは、１または２である。〕
の１つにより表される。
【００２２】
式中、Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つは、カルボン酸部分を含む構造（２）に相当する複合物を、アミンの還元アルキル化により製造することができる。一般にモノカルボキシル化およびジカルボキシル化アミンを、式：Ｒ2Ｒ3ＮＨ〔式中、Ｒ2は、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、Ｒ3は、水素、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。〕で示されるアミンと、オキソ酸、例えばグリオキシル酸とを、還元剤、例えばピリジン-ボランコンプレックス、ジメチルボラン、トリメチルボランまたはナトリウムシアノボロハイドライドの存在下で反応させることにより製造することができる。アミンが、アミノ酸、例えばシスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、システイン酸、またはこれらのエステル、例えばこれらのメチル若しくはエチルエステルである場合、反応は、都合よくニトリロ三酢酸誘導体を生ずる。例えばシスチンのニトリロ酢酸誘導体を、シスチン、オキソ酸、例えばグリオキシル酸、および穏やかな還元剤を組み合せることにより製造することができる。アルコールを、好ましくは溶液の浄化を助けるために含めることができる。代わりに該技術分野で知られている他の方法を、複合物（２）の製造のために使用することができ、これはハロアルキル酸を含む。
【００２３】
複合物（２）を、複合物を形成するために、該技術分野で既知のあらゆる方法で化学スペーサーＳ1をリンカーＬに共有的に結合させ、次いで担体をスペーサーＳ1と反応させることにより固定化し、複合物（１）の担体-スペーサーキレートコンプレックスを形成することができる。別の実施態様では担体Ｑを、まずスペーサーＳ1と反応させて、担体-スペーサーコンプレックスを形成する。その後に担体-スペーサーコンプレックスを、リンカーＬを通じてキレートコンプレックスに結合させ、複合物（１）を形成する。
いくつかの場合で、分子のキレート化部分に結合させる前に担体ＱをＳ1で活性化することが有利である。Ｑがアガロース樹脂である場合、Ｑを、エピクロロヒドリン、テトラブチルジグリシジルエーテルまたは担体を活性化することができるあらゆる物質を使用して活性化することができる。
【００２４】
金属キレートを、本発明のキレート化複合物（１）または複合物（２）に金属または金属酸化物を添加することにより形成することができる。例えば本発明の金属キレート（固定化形態）は、次式：
【化２４】
0004298201.tif 000017
〔式中、Ｑ、Ｓ1、Ａ、ｉ、Ｊ、ｋ、Ｔ、Ｘ、ＹおよびＺは、上記の定義と同じであり、Ｍは、キレートを形成することができるあらゆる金属または金属酸化物を含む。〕
により表される。好ましい金属および金属酸化物は、Ｎｉ、Ｈｇ、Ｇａ、Ｃｕ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｔｉ、Ｉｎ、Ｚｎ、Ｔｃ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ａｕ、ＰｂおよびＢｉを含む。Ｆｅ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＡｕおよびＮｉは、ほとんどの用途のために好ましい。一般に、所定の用途のために好ましい金属Ｍは、複合物（１）または（２）のキレート化部分の特異的結合能力、および結合または精製されるコンパウンドに依存している。例えばＸ、ＹおよびＺが−ＣＯＯＨである場合にＭは、ポリヒスチジン連鎖でタンパク質を精製するために最適には、Ｎｉである。コンパウンドが、リンタンパク質、ホスホペプチド質またはホスフェート含有分子である場合、Ｍは、最適にはＦｅまたはＧａである。
【００２５】
（定義）
本明細書において記載される「ヒドロカルビル」部分は、もっぱら炭素および水素元素のみからなる有機化合物または基である。これらの部分は、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分を含む。これらの部分は、置換または未置換であっても良く、好ましくは置換または未置換アルキルである。これらの部分は、他の脂肪族または環式ヒドロカルビル基、例えばアルクアリール（alkaryl）、アルケンアリールおよびアルキンアリールにより置換されているアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分も含む。他の明記が無い限り、これらの部分は、１〜２０個の炭素原子を含む。
【００２６】
他の明記が無い限り、本明細書中で記載されるアルキル基は、好ましくは主鎖中に１〜６個の炭素原子、および２０個までの炭素原子を有する低級アルキルである。これらは、直鎖、分枝鎖または環式であり得、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシルなどを含む。これらは、脂肪族または環式ヒドロカルビル基により置換されていても良い。
他の明記が無い限り、本明細書中で記載されるアルケニル基は、好ましくは主鎖中に２〜６個の炭素原子、および２０個までの炭素原子を有する低級アルケニルである。これらは、直鎖または分枝鎖であり得、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ヘキセニルなどを含む。これらは、脂肪族または環式ヒドロカルビル基により置換されていても良い。
【００２７】
他の明記が無い限り、本明細書中で記載されるアルキニル基は、好ましくは主鎖中に２〜６個の炭素原子、および２０個までの炭素原子を有する低級アルキニルである。これらは、直鎖または分枝鎖であり得、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル、ヘキシニルなどを含む。これらは、脂肪族または環式ヒドロカルビル基により置換されていても良い。
他の明記が無い限り、本明細書中で記載されるアリール部分は、６〜２０個の炭素原子を有し、フェニルを含む、これらは、本明細書中で定義した様々な置換基により置換されているヒドロカルビルであり得る。フェニルが、より好ましいアリールである。
【００２８】
本明細書中で記載する置換ヒドロカルビル部分は、炭素以外の少なくとも１種の原子により置換されているヒドロカルビル部分であり、炭素鎖の原子が、ヘテロ原子、例えば窒素、酸素、ケイ素、リン、ホウ素、硫黄またはハロゲン原子により置換されている部分を含む。これらの置換基は、ヒドロキシ以外であり、低級アルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ）、ハロゲン（例えばクロロまたはフルオロ）、エーテル、アセタール、ケタール、エステル、ヘテロアリール（例えばフリルまたはチエニル）、アルカンオキシ、アシル、アシルオキシ、ニトロ、アミノおよびアミドを含む
【００２９】
本明細書中で記載されているアシル部分は、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルまたはヘテロアリール部分を含む。これらは、一般式：−Ｃ(Ｏ)Ｘ〔式中、Ｘは、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルアミノまたはヒドロカルビルチオを含み得る。〕で示される。
本発明で使用されるタンパク質は、抗体、酵素、ヘモグロビン、ホルモン、ポリペプチドおよびペプチドを含み、無傷の分子、その断片またはその機能同等物であり得、遺伝子処理されていても良い。
本発明で使用される抗体は、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体の両方を含み、無傷の分子、その断片であり得、遺伝子処理されていても良い。
本発明の好適な実施態様には、以下のものが含まれる。
〔１〕  次式：
【化１】
0004298201.tif 000018
〔式中、
Ｑは、担体であり、
Ｓ1は、スペーサーであり、
Ｌは、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−または−Ｃ(＝Ｏ)−であり、
Ａは、エーテル、チオエーテル、セレノエーテルまたはアミド結合であり、
Ｔは、化学結合または置換若しくは未置換のアルキル若しくはアルケニルであり、
Ｘは、−(ＣＨ2)kＣＨ3、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｈ、−(ＣＨ2)kＰＯ3Ｈ2、−(ＣＨ2)kＮ(Ｊ)2または−(ＣＨ2)kＰ(Ｊ)2であり、
ｋは、０〜２の整数であり、
Ｊは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、
Ｙは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ、−Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ2、−Ｎ(Ｊ)2または−Ｐ(Ｊ)2であり、
ｉは、０〜４の整数である。〕
で示される金属キレート化複合物。
〔２〕  Ｌが、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−であり、Ａが、チオエーテル結合であり、ＴおよびＸが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔３〕  担体を、アガロース、セルロース、メタクリレートコポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチック、金、酸化鉄、ポリアクリルアミド、核酸、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリアミノ酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン（streptavidin）、ペプチド、ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素および多糖類からなる群から選択する上記〔２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔４〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、水素または−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔５〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔６〕  Ｓ1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約２５原子以下の鎖からなる上記〔２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔７〕  Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約２５原子以下の鎖からなる上記〔２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔８〕  Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約１５原子以下の鎖により定義され、Ｔが、−(ＣＨ2)n−〔式中ｎは、０〜６である。〕である上記〔２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔９〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、水素または−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔８〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１０〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔８〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１１〕  Ｌが、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−であり、Ａが、エーテル結合であり、ＴおよびＸが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１２〕  Ｓ1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約２５原子以下の鎖からなる上記〔１１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１３〕  Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約２５原子以下の鎖からなる上記〔１１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１４〕  Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約１５原子以下の鎖からなり、Ｔが、−(ＣＨ2)n−〔式中ｎは、０〜６である。〕である上記〔１１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１５〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、水素または−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔１４〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１６〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔１４〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１７〕  Ａが、セレノエーテル結合である上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１８〕  Ａが、アミド結合である上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔１９〕  担体を、アガロース、セルロース、メタクリレートコポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチック、金、酸化鉄、ポリアクリルアミド、核酸、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリアミノ酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン（streptavidin）、ペプチド、ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素および多糖類からなる群から選択する上記〔１８〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２０〕  Ｓ1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約２５原子以下の鎖からなる上記〔１８〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２１〕  Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約２５原子以下の鎖からなる上記〔１８〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２２〕  Ｓ1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約１５原子以下の鎖からなり、Ｔが、−(ＣＨ2)n−〔式中ｎは、０〜６である。〕である上記〔１８〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２３〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、水素または−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２４〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２２〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２５〕  Ｌが、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−であり、ＡおよびＴが、アミノ酸から誘導されている上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２６〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２５〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２７〕  Ｌが、−Ａ−Ｔ−ＣＨ(Ｘ)−であり、ＡおよびＴが、シスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、システイン酸からなる群から選ばれるアミノ酸、またはこれらのエステルから誘導されている上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２８〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２７〕に記載の金属キレート化複合物。
〔２９〕  Ｌが、シスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸およびシステイン酸からなる群から選ばれるアミノ酸部分を含む上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔３０〕  Ｘが、−(ＣＨ2)kＣＯＯＨであり、Ｙが、−ＣＯＯＨであり、Ｚが、水素または−ＣＯＯＨであり、ｋが、上記〔１〕における定義と同じである上記〔２９〕に記載の金属キレート化複合物。
〔３１〕  Ｌが、−Ｃ(＝Ｏ)−である上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔３２〕  次式：
【化２】
0004298201.tif 000019
【化３】
0004298201.tif 000020
【化４】
0004298201.tif 000021
【化５】
0004298201.tif 000022
【化６】
0004298201.tif 000023
【化７】
0004298201.tif 000024
【化８】
0004298201.tif 000025
〔式中、Ｑは、上記〔１〕における定義と同じであり、Ａｃは、アセチルである。〕
からなる群から選ばれる上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物。
〔３３〕  金属および上記〔１〕に記載の金属キレート化複合物を含む金属キレート。
〔３４〕  金属を、Ｎｉ、Ｈｇ、Ｇａ、Ｃｕ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｔｉ、Ｉｎ、Ｚｎ、Ｔｃ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ａｕ、ＰｂおよびＢｉからなる群から選択する上記〔３３〕に記載の金属キレート。
〔３５〕  金属を、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＡｕおよびＮｉからなる群から選択する上記〔３３〕に記載の金属キレート。
〔３６〕  金属が、ニッケルである上記〔３３〕に記載の金属キレート。
〔３７〕  コンパウンドの精製または検出方法であって、該方法は、コンパウンドと金属キレートとを接触させることを含み、該金属キレートは、金属および上記〔１〕に記載のキレート化複合物を含む方法。
〔３８〕  コンパウンドが、少なくとも２つのヒスチジン残基を有するポリペプチドである上記〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕  コンパウンドが、少なくとも６つのヒスチジン残基を有するポリペプチドである上記〔３７〕に記載の方法。
〔４０〕  コンパウンドが、タンパク質、リンタンパク質、ペプチド、ホスホペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、薬、または金属キレートに対し親和力を有する合成若しくは天然生成物である上記〔３７〕に記載の方法。
〔４１〕  モノカルボキシル化またはジカルボキシル化アミンの製造方法であって、該方法は、還元剤の存在下でアミンおよびオキソ酸を組み合わせることを含み、該アミンは、式：Ｒ2Ｒ3ＮＨ〔式中、Ｒ2は、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、Ｒ3は、水素、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。〕で示される方法。
〔４２〕  オキソ酸が、グリオキシル酸である上記〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕  還元剤が、ピリジン-ボランコンプレックス、ジメチルボラン、トリメチルボランまたはナトリウムシアノボロハイドライドである上記〔４１〕に記載の方法。
〔４４〕  アミンが、アミノ酸である上記〔４１〕に記載の方法。
〔４５〕  アミンが、シスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、システイン酸からなる群から選ばれるアミノ酸、またはこれらのエステルである上記〔４１〕に記載の方法。
〔４６〕  アミンが、シスチン、システイン、システイン酸またはこれらのエステルである上記〔４１〕に記載の方法。
【００３０】
（実施例）
以下の実施例により、本発明を説明する。
実施例１
固相カルボキシメチル化により不溶性担体に連結されているＮ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)-L-システインの製造
エピクロロヒドロリン活性化 Sepharose(商標) の製造：
Sepharose(商標) CL 4B (Pharmacia Biotech) ５０ｍｌを、ガラス吸込フィルター内で水１００ｍｌにより３回洗浄した。それを、攪拌機および温度計を取り付けた３つ口フラスコ内に移した。水３０ｍｌおよび１０Ｎの水酸化ナトリウム４ｍｌを攪拌しながら添加し、次いでエピクロロヒドリン８ｍｌを添加した。混合物を、４６℃で２時間加熱した。活性化樹脂を、脱イオン水８００ｍｌを使用して中性ｐＨに洗浄した。
【００３１】
Ｎ,Ｎ-ビス-カルボキシメチル-L-システインアガロースの製造：
１Ｎの水酸化ナトリウム１８５ｍｌ中 L-システイン１６.３ｇの溶液を、三角フラスコ内のエピクロロヒドリン活性化樹脂４８ｍｌに添加し、２２℃で１８時間穏やかに混合した。混合物を、水２００ｍｌで５回洗浄した。遊離アミンに対する Kaiser 試験 [Kaiser, E. ら, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)] は、深い青色を与えた。三角フラスコ内の上記湿潤樹脂４７.６ｍｌを、１Ｎの水酸化ナトリウム５０ｍｌおよび１Ｎの炭酸水素ナトリウム２５ｍｌ中ブロモ酢酸８.０ｇの溶液と、２２℃で７２時間穏やかに混合した。次いでこの樹脂を、脱イオン水１００ｍｌで３回洗浄した。湿潤樹脂１６ｇを、０.２Ｍの酢酸ナトリウム５０ｍｌおよび無水酢酸２.５ｍｌと、２２℃で４５分間穏やかに攪拌した。この樹脂を、水１００ｍｌで３回洗浄した。Kaiser 試験は、かすかな青色を与えた。この樹脂を、同じ体積の３０％エタノール中４℃で貯蔵した。
【００３２】
ニッケル装填および容量分析：
上記のように製造したＮ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)-システイン樹脂を、まずニッケルをキレート化する樹脂の能力を測定して試験した。樹脂約２.５ｍｌを、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ニッケル１０ｍｌを用い、５０ｒｐｍで振盪させながら４℃で一晩、定温放置した。この樹脂を、よく混合し、１×１０ｃｍのカラム内に入れ、余分のニッケル溶液を樹脂から流れ出させた。結合していない硫酸ニッケルを、２０〜３０倍カラム体積の脱イオン水を使用して樹脂から洗い落とした。残っている水を樹脂から排出させた。同じ体積の水を、樹脂に添加し、よく混合し、次いでこのスラリーを、４℃での貯蔵のためにカラムから取り出した。充填床樹脂の１ｍｌ当量物を、酸加水分解し、次いでＩＣＰによりニッケル含有量について分析した。この樹脂は、樹脂１ｍｌあたりニッケル５.２μｍｏｌを結合した。
【００３３】
タンパク質結合および特異性の試験：
ポリヒスチジン含有タンパク質の特異的タンパク質結合のための使用試験を、充填床樹脂１.５ｍｌを含有する０.５×７.６ｃｍのカラムで行った。樹脂を、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、塩化ナトリウム０.５Ｍおよびイミダゾール１０ｍＭ（ｐＨ８.０）(平衡緩衝液）で平衡させた。ポリヒスチジン標識を有する細菌性アルカリ性ホスファターゼ含有未加工大腸菌抽出物５ｍｌを、カラムに装填した。この未加工抽出物を、CelLytic-B (Sigma Chemical Company) を使用して、凍結大腸菌細胞ペーストから新しく製造した。カラムを、１０倍カラム体積（１５ｍｌ）の平衡緩衝液で洗浄し、未結合タンパク質を除去した。結合物質を、１０倍カラム体積（１５ｍｌ）のリン酸ナトリウム５０ｍＭ、塩化ナトリウム０.５Ｍおよびイミダゾール３２０ｍＭ（ｐＨ８.０）で溶出した。溶出物質のピーク画分をプールした。溶出物質を、ナトリウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）による精製、アルカリ性ホスファターゼ活性化および Bradford タンパク質検定によるタンパク質含有量について検定した。検定結果は、このユニークなキレート樹脂を使用するこの一工程分離手順からの溶出タンパク質は、本質的に均一な細菌性アルカリ性ホスファターゼを与えることを示した。
【００３４】
実施例２
Ｎ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)-L-シスチンの製造
Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラキス(カルボキシメチル)-L-シスチンの製造：
L-シスチン（２４.０３ｇ、０.１ｍｏｌ）を、０.０５Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９.０）２.０Ｌを含有するビーカーに入れ、磁気攪拌バーで混合した。グリオキシル酸（一水和物）（３６８.２ｇ、４ｍｏｌ）を、この溶液に混合しながら添加した。この溶液は、シスチン１ｍｍｏｌあたり緩衝液２０ｍｌおよびシスチン１ｍｏｌあたり４０ｍｏｌのグリオキシル酸を含有した。氷水浴を、ビーカーのまわりに置き、溶液を１５〜２５℃の間に冷却した。混合物のｐＨを、５Ｎの水酸化ナトリウムで９.０に調節した。氷浴を取り外し、ビーカーを室温に放置した。８Ｍのボラン-ピリジンコンプレックス（２５０ｍｌ）を添加した（シスチン１ｍｏｌあたり２０ｍｏｌ）。エタノールを、２０〜５０％の間の最終濃度まで添加し、溶液を浄化した。溶液を、室温で２時間攪拌して反応を完了させた。反応が完了するまで、ＨＰＬＣにより反応を監視した。反応混合物を、より大きな容器に注ぎ、３倍体積の水で希釈した。塩酸（１０Ｎ）をゆっくりと添加し、ｐＨを１.０未満に調節した。反応混合物を３０〜６０分攪拌した。次いで反応混合物のｐＨを、５Ｎの水酸化ナトリウムを使用して約６.５に調節した。
【００３５】
Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラキス(カルボキシメチル)-L-シスチンの精製：
粗Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラキス(カルボキシメチル)-L-シスチン反応混合物を水で希釈して、導電率を５ｍｍｈｏ未満に低下させた。ｐＨを、１Ｎの水酸化ナトリウムで７.０〜８.５の間に調節した。次いで混合物を、脱イオン水中シスチン出発物質１ｍｍｏｌあたり１０ｍｌの樹脂を使用して平衡させている DEAE-Sephadex(商標)-HCO3 (Pharmacia Biotech) カラムに適用した。カラム装填が完了した時に、カラムを、４倍カラム体積の脱イオン水で洗浄した。次いでカラムを、４倍カラム体積の０.１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で洗浄した。精製生成物を、カラムから０.５ＭのＴＥＡＢで溶出した。プール物質を、粘着性固体が形成されるまで、Rotovap 内で乾燥した。次いでそれを、最小体積の水中に溶解させた。それからこの物質を完全に乾燥した。次いで水再懸濁および乾燥工程を、もう一度繰返した。最終固体を、水４００ｍｌに溶解させた。
【００３６】
遊離酸への転化：
脱イオン水で平衡させた Amberlite IR H+ 樹脂を、粗物質に添加した（シスチン１ｍｍｏｌあたり樹脂２５ｍｌ）。ｐＨを、ｐＨ紙により監視した。遊離酸の転化後、樹脂を濾過により取り出した。濾液を、完全に乾燥するまで、Rotovap 内で乾燥した。
【００３７】
Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラキス(カルボキシメチル)-L-シスチンのＮ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)-L-システイン  テトラキス(カルボキシメチル)シスチンへの還元：
粗テトラキス(カルボキシメチル)-L-シスチン（２３.６５ｇ、０.０５ｍｏｌ）を、１ｇあたり水５ｍｌで水中に溶解させた。溶液のｐＨを、１Ｎの水酸化ナトリウムで９.０〜９.２に調節した。次いでトリス(カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）１４.３４ｇ（０.０５ｍｏｌ）を添加し、全てのＴＣＥＰが溶解するまで攪拌した。次いでこれを、１０分間定温放置した。還元を、ＨＰＬＣにより追跡した。完全還元（一般に２０分未満）後にｐＨを、１Ｎの塩酸で５.０〜６.０に調節した。この時点で、生成物を使用することができ、または生成物を凍結乾燥することができる。収率は、シスチンの出発量に基づき５０〜７５％の間であった。
【００３８】
実施例３
アガロースに共有結合されているＮ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)-L-システインの製造および分析
樹脂のエピクロロヒドリン活性化：
Sepharose(商標) 6B (Pharmica Biotech) １Ｌを、脱イオン水で良く洗浄した。樹脂を、同じ体積の０.８Ｍ水酸化ナトリウム中に懸濁させた。それを、混合しながらエピクロロヒドリン１００ｍｌと組み合わせた。物質を、混合しながら室温で２時間定温放置した。樹脂を、３倍体積の０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、次いで６倍体積の脱イオン水で洗浄した。
【００３９】
樹脂アミノ化：
エピクロロヒドリン活性化樹脂を同じ体積（１樹脂体積）の２Ｍ水酸化アンモニウム中に懸濁させ、室温で一晩穏やかに混合することにより、アミノ Sepharose(商標) 6B を製造した。この樹脂を、３倍体積の０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で洗浄した。この樹脂を、６倍体積の脱イオン水で洗浄した。
【００４０】
アミノ Sepharose(商標) 6B のブロモアセチル化：
洗浄したアミノ Sepharose(商標) 6B 樹脂を水に添加し、５０％の樹脂スラリーを製造した。ｐＨを、１ＮのＨＣｌで約５.８〜６.０に調節した。この樹脂スラリーを、室温で維持し、次の反応を低減光条件で行った。０.２Ｍのイミダゾール中ブロモ酢酸０.１５ｍｏｌ（ｐＨ５.８）を、スラリーに添加した。次いで樹脂を穏やかに混合しながら、固体１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＡＣ）０.７５ｍｏｌを添加した。この樹脂スラリーを、ｐＨ６.０を維持しながら室温で４時間穏やかに混合した。未反応アミンを、アセチル化によりブロックした。無水酢酸６.５ｍｌを樹脂スラリーに添加し、次いで３０分間穏やかに混合した。次いでこの樹脂を、５倍体積のリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）で洗浄した。
【００４１】
ブロモアセチル化樹脂に連結しているビス(カルボキシメチル)システイン：
次の反応を低減光条件で行った。洗浄したブロモアセチル化樹脂ケークを、１樹脂体積の０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）中に懸濁させ、５０％の樹脂スラリーを製造した。このスラリーを、窒素で１０分間泡立たせ、脱気した。実施例２に記載するように製造したビス(カルボキシメチル)システイン１５ｍｍｏｌを添加し、ｐＨを、１Ｎの水酸化ナトリウムで７.５に調節した。次いでそれを、室温で少なくとも２時間混合した。β-メルカプトエタノール（１４.３Ｍ、樹脂１Ｌあたり１.５ｍｌ）をスラリーに添加し、定温放置を室温で少なくとも３０分間続けて、未反応ブロモアセチル基をブロックした。次いで樹脂を、３倍体積のリン酸塩緩衝化塩水、次いで５倍体積の脱イオン水で洗浄した。
【００４２】
ニッケル装填および容量分析：
上記のように製造したＮ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)-L-システインを、実施例１に記載するように、ニッケルをキレート化する物質の能力をまず測定して試験した。この樹脂は、樹脂１ｍｌあたりニッケル１２.０μｍｏｌを結合した。
タンパク質結合および特異性の試験：
この樹脂によるポリヒスチジン含有タンパク質の特異的タンパク質結合のための使用試験を、実施例１に記載するように行った。検定結果は、このユニークなキレート樹脂を使用するこの一工程分離手順からの溶出タンパク質は、本質的に均一な細菌性アルカリ性ホスファターゼを与えることを示した。
【００４３】
実施例４
不溶性担体アガロースに連結されているアミノエチルアミド-Ｎ,Ｎ-ビス-(カルボキシエチル)-L-システイン酸の製造および分析
L-システイン酸メチルエステルの製造：
L-システイン酸１ｇ、ジオキサン中４Ｎの塩酸８ｍｌおよび乾燥メタノール３０ｍｌの混合物を、瓶に入れた。この瓶に蓋をし、室温で約９６時間貯蔵した。この透明溶液の薄層クロマトグラフィー［Analtech シリカゲルプレート、ｎ-ブタノール：酢酸エチル：酢酸：水（１：１：１：１）、塩素／ヨウ化カリウム-デンプン試薬（Stewart. J. M および Young. J. D、Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, p.120 (1984)）］は、９５％を超えるシステイン酸からエステルへの転化率を示した。溶媒を減圧下で除去し、粘着性固体１.０５ｇを得た。質量分析は、主要Ｍ1+イオンに対し１８４.３のｍ／ｚを与えた。このイオンの断片化は、１２３.９のＭ1+イオンを与えた。これは、カルボキシメチル基１つの損失を表す。この固体を、さらなる精製無しで次の工程に使用した。
【００４４】
アミノエチルアミド-Ｎ,Ｎ-ビス-(カルボキシメチル)-L-システイン酸の製造：
トリエチルアミン（１０ｍｌ）を、瓶内のＤＭＦ１２.５ｍｌ中上記システイン酸メチルエステル０.８ｇの混合物に添加し、透明溶液を得た。この混合物に、ブロモ酢酸４.４ｇを添加し、次いでｐＨが約１０になるまでトリエチルアミン約１５ｍｌを添加した。溶液は、固体塊になった。室温で１ヶ月後、追加のブロモ酢酸１.５ｇおよびＤＭＦ１５ｍｌを混合物に添加した。混合物のｐＨを、トリエチルアミンで約１０に調節した。質量分析は、２９８.２である主要Ｍ-1イオンのｍ／ｚを与えた。
【００４５】
２４時間後に上記反応混合物を濾過し、固体をジメチルホルムアミド２０ｍｌで洗浄した。エチレンジアミン（３５ｍｌ）を、茶色濾液に添加し、溶液を６０℃で１８時間加熱した。透明茶色溶液を、オイル状にまで減圧下で蒸発させた。水５０ｍｌを添加し、再びオイル状に蒸発させた。最後の工程をもう１度繰返した。次いで水６.１Ｌを茶色オイルに添加し、溶液を、DEAE Sephadex(商標) (Pharmica Biotech) カラム１００ｍｌに装填した。このカラムを、水８００ｍｌで洗浄した。生成物を、水および０.１Ｎの塩酸それぞれ１Ｌを用いる線状勾配で溶出した。流量は１分あたり２ｍｌであった。５ｍｌの画分を集めた。黄色生成物含有画分を検定した。薄層クロマトグラフィー［Analtech シリカゲルプレート、ｎ-ブタノール：酢酸エチル：酢酸：水（１：１：１：１）、塩素／ヨウ化カリウム-デンプン］を基礎にして、生成物含有画分をプールし、減圧下で乾燥状態に蒸発させて、淡黄色泡沫固体２９５ｍｇを得た。質量分析は、３２８.５である主要Ｍ+1のｍ／ｚを与えた。
【００４６】
アミノエチルアミド-Ｎ,Ｎ-ビス-(カルボキシメチル)-L-システイン酸アガロースの製造：
上記のように製造したアミノエチルアミド-Ｎ-ビスカルボキシメチルシステイン酸を、水３ｍｌに溶解させ、ガラス瓶に移した。この瓶に、０.５Ｍの炭酸ナトリウム１０ｍｌ、次いで実施例３に記載するように製造した湿潤エピクロロヒドリン活性化 Sepharose(商標) CL 4B ８ｇを添加した。混合物を、６０℃で２４時間穏やかに振盪した。樹脂を濾過し、水５０ｍｌで５回洗浄した。この樹脂を、３０％の２００プルーフエタノール２０ｍｌ中に４℃で貯蔵した。
【００４７】
ニッケル装填および容量分析：
上記のように製造したアミノエチルアミド-Ｎ,Ｎ-ビス-(カルボキシメチル)-L-システイン酸樹脂を、実施例１に記載するように試験した。この樹脂は、樹脂１ｍｌあたりニッケル１５.６μｍｏｌを結合した。
タンパク質結合および特異性の試験：
この樹脂によるポリヒスチジン含有タンパク質の特異的タンパク質結合のための使用試験を、実施例１に記載するように行った。検定結果は、このユニークなキレート樹脂を使用するこの一工程分離手順からの溶出タンパク質は、本質的に均一な細菌性アルカリ性ホスファターゼを与えることを示した。
【００４８】
実施例５
溶解性化合物（ウシ血清アルブミン）に連結されているＮ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)システインの製造および試験
溶解性キレートの製造：
ウシ血清アルブミン（２７２ｍｇ、ＢＳＡ）を、１０ｍｇ／ｍｌで、０.１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.２）に溶解させた。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０.５ｍｌ中のブロモ酢酸ＮＨＳエステル（５７ｍｇ、０.２４ｍｍｏｌ）を、この溶液に添加し、攪拌しながら室温で２時間定温放置した。反応混合物を、平衡させた Sephadex(商標) G-50 (Pharmacia Biotech) カラムで脱塩し、０.１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.２）中で流した。カラムを、２８０ｎｍの吸収により監視した。２８０ｎｍの吸収を有する画分を組み合わせた。次いでそれらを、アルゴンで３分間穏やかに泡立たせた。Ｎ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)システイン（３９ｍｇ、０.１２ｍｍｏｌ）を、０.１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８.０）中に溶解させ（実施例３のように製造）、次いでＢＳＡ溶液に添加し、次いでこの溶液を、アルゴンで泡立たせた。反応混合物を、４℃で一晩定温放置した。カップリング効率を、５,５'-ジチオ-ビス-２-ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）の反応により監視し、効率は、少なくとも９５％であると測定された。混合物を、１０ｍＭの３-(Ｎ-モルホリノ)プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）および０.１５Ｍの塩化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７.０）で溶出した、Sephadex(商標) G-50 (Pharmacia Biotech) カラムで脱塩した。溶解性ＢＳＡキレートを、１０ｍＭのＭＯＰＳおよび０.１５Ｍの塩化ナトリウムの緩衝液（ｐＨ７.０）中の０.０１Ｍの硫酸ニッケルで装填した。最終溶液を、Sephadex(商標) G-50 (Pharmacia Biotech) カラムで脱塩した。脱塩した青色ＢＳＡニッケルキレートは、２８０ｎｍおよび３９０ｎｍで吸収ピークを有した。これは、ニッケルが、共役にキレート化されていることを示す。
【００４９】
Ｎ,Ｎ-ビス(カルボキシメチル)システインに共有結合されている溶解性ウシ血清アルブミン担体の使用試験：
上記のように製造したＢＳＡキレートを、０.１Ｍの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９.６）中で一晩、５μｇ／ｍｌを使用して、ポリスチレンマイクロタイターウェルに吸着させた。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳを用いて、０.０５％の Tween 20 により３回洗浄した。このプレートをＭＯＰＳ中０.０１Ｍの硫酸ニッケル（ｐＨ７.０）を用いて室温で３０分間定温放置することにより、結合ＢＳＡキレートをニッケルで装填した。このプレートを、水で３回洗浄した。モデル融合タンパク質、Ｎ-末端ポリヒスチジン標識含有細菌性アルカリ性ホスファターゼを、ＭＯＰＳ緩衝液中の様々な濃度のＢＳＡニッケルキレートマイクロタイターウェル内で定温放置した。このプレートを、ＭＯＰＳ緩衝液で３回洗浄して、未結合タンパク質を除去した。アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質を、アルカリ性ホスファターゼ酵素基質を用いるマイクロタイターウェルの定温放置により検出した。検定は、アルブミンニッケルキレートに対するポリヒスチジン融合タンパク質の、キレート特異的結合のかなりの量を示した。