(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の落射照明光を選択的に標本に照射することにより、標本の光学的操作と蛍光観察を同時に可能にした落射蛍光顕微鏡において、
前記標本に対する観察光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第１の落射照明光学系光路と、
前記観察光学系光路の前記第１の落射照明光学系光路と同一の交点で前記観察光学系光路と交差する方向に配置された第２の落射照明光学系光路と、
前記観察光学系光路に、前記第１および第２の落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に配置された第３の落射照明光学系光路と
を具備したことを特徴とする落射蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記観察光学系光路と前記第３落射照明光学系光路との交点に、波長分別手段を挿脱可能に配置したことを特徴とする請求項１記載の落射蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記観察光学系光路に、さらに前記第１および第２の落射照明光学系光路および前記第３落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に第４の落射照明光学系光路を配置したことを特徴とする請求項１または２記載の落射蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は落射蛍光顕微鏡に係り、特に、細胞生理学分野において細胞操作の手段として用いられるレーザートラップ法やＣａｇｅｄ試薬解除法を採用した落射蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
落射蛍光顕微鏡による落射蛍光観察は、生物学の分野において、細胞内部の特定の物質の形態観察を行う為の手段として、現在広く一般的に行われている方法である。
【０００３】
ところで、最近、特に細胞生理学の分野においては、顕微鏡の落射照明手段を利用した細胞内部物質の操作方法として、レーザートラップ法やＣａｇｅｄ試薬解除法が広く採用されている。
【０００４】
ここで、レーザートラップ法（光ピンセット法）は、標本中の任意の物質にレーザー光を照射して光学的に捕捉する方法であり、細胞内のタンパク質が運動する際の力量を測定する手段として用いられ、照射手段としては、赤外レーザーが使用される。一方、Ｃａｇｅｄ試薬解除法は、生理活性を持つ分子にＣａｇｅｄ試薬を結合して活性を抑制した状態で細胞内に投与し、光を照射することで結合を解除させてその分子の活性を回復させる方法であり、照射手段としては、紫外光が使用される。
【０００５】
このように、これらレーザートラップ法やＣａｇｅｄ試薬解除法を採用する落射蛍光顕微鏡では、通常の落射蛍光照明の他に、細胞操作のための各種の光源が必要になってくる。
【０００６】
しかして、従来、一般的に用いられている落射蛍光顕微鏡として、図１２に示すように対物レンズ１０１と接眼レンズ１０２を結ぶ観察光学系光路１０３中にバリアフィルターＢＡとともに配置される第１ダイクロイックミラーＤＭ１に対して蛍光観察用の励起光源１０４を配置するとともに、これら第１ダイクロイックミラーＤＭ１と励起光源１０４の間に第２ダイクロイックミラーＤＭ２を配し、この第２ダイクロイックミラーＤＭ２と励起光源１０４の間にバンドパスフィルタＢＰを配置し、第２ダイクロイックミラーＤＭ２から直交する光路上に標本操作用光源１０５を配置したものがある。
【０００７】
また、特開平８−２３４１１０号公報には、落射蛍光顕微鏡として、図１３に示すように、観察光学系光路１０７に蛍光観察用の励起光源１０８から励起光を導入する第１ダイクロイックミラーＤＭ１と、レーザー光源１０９からレーザートラップのレーザー光を導入する第２ダイクロイックミラーＤＭ２を２段に配置したものが開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、図１２に示した従来のものは、励起光源１０４を、励起波長を切換えて蛍光観察を行うことを考えると、バンドパスフィルタＢＰは勿論のこと、第１ダイクロイックミラーＤＭ１をも交換しなければならないが、このとき、第１ダイクロイックミラーＤＭ１とバンドパスフィルタＢＰは、別々に配置されているので、これらを各別に交換しなければならず、このための作業が煩雑で面倒になるという問題がある。
【０００９】
一方、特開平０８−２３４１１０号公報に開示されているものは、第１ダイクロイックミラーＤＭ１が、第２ダイクロイックミラーＤＭ２よりも標本側に配置される場合、例えば、レーザー光源１０９のレーザー波長域を紫外域に切換えてＣａｇｅｄ試薬解除用として使用すると、第２ダイクロイックミラーＤＭ２を反射したレーザー光を確実に標本側に導入するためには、第１ダイクロイックミラーＤＭ１およびバリアフィルタＢＡとして、レーザー光源１０９からのレーザー波長を透過する特性を有していなければならず、その度に第１ダイクロイックミラーＤＭ１およびバリアフィルタＢＡを最適なものに取り替えるなどの面倒な作業が必要となり、実現性がうすい。現実的に見てレーザー光源１０９は、レーザートラップ用の赤外領域以外の使用目的には対応できず、汎用性に乏しい。また、第２ダイクロイックミラーＤＭ２は観察光学系光路１０７の中に固定されているので、通常の蛍光観察においては問題はないが、１分子レベルの測光を行うような微弱蛍光観察においては光量ロスの要因となり好ましくない。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、落射照明光学系の独立した光路を複数有し、各々の落射照明光路の用途が限定されない、汎用性に富んだ落射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の一観点によれば、複数の落射照明光を選択的に標本に照射することにより、標本の光学的操作と蛍光観察を同時に可能にした落射蛍光顕微鏡において、前記標本に対する観察光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第１の落射照明光学系光路と、前記観察光学系光路の前記第１の落射照明光学系光路と同一の交点で前記観察光学系光路と交差する方向に配置された第２の落射照明光学系光路と、前記観察光学系光路に、前記第１および第２の落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に配置された第３の落射照明光学系光路とにより構成している。
【００１２】
これにより、例えば第１の落射照明光学系光路にＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源、第２の落射照明光学系光路に励起光照射用の水銀ランプを、さらに第３の落射照明光学系光路にレーザートラップ用のレーザー光源または励起光照射用の水銀ランプをそれぞれ配して、これら第１乃至第３の落射照明光学系光路を選択し、Ｃａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源、励起光照射用の水銀ランプおよびレーザートラップ用のレーザー光源を組み合わせることにより、Ｃａｇｅｄ解除と蛍光観察によるＣａｇｅｄ試薬解除実験や蛍光観察とレーザートラップによる微小物体の捕捉および微小力計測などのレーザートラップ実験を選択的に行うことができる。
【００１３】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記観察光学系光路と前記第３落射照明光学系光路との交点に、波長分別手段を挿脱可能に配置していることが望ましい。
【００１４】
これにより、レーザートラップを行わず通常の蛍光観察のみを行う場合、例えば、ダイクロックミラーなどの波長分別手段を観察光路から除外することにより、微弱蛍光観察時の光量ロスを除外した観察像を得ることができる。また、波長分別手段を観察光路に挿入することにより、例えば第３の落射照明光学系光路に配したレーザートラップ用のレーザー光源または励起光照射用の水銀ランプによるレーザートラップ用レーザーと蛍光観察用の励起光を選択的に観察光学系光路に導入できるので、この場合も、必要に応じてレーザートラップ実験やＣａｇｅｄ試薬解除実験を選択的に行うことができ、汎用性に富んだ実験系を構成することができる。
【００１５】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記観察光学系光路に、さらに前記第１および第２の落射照明光学系光路および前記第３落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に第４の落射照明光学系光路を配置してもよい。
【００１６】
これにより、例えば第１の落射照明光学系光路に励起光照射用のレーザー光源、第２の落射照明光学系光路に励起光照射用の水銀ランプを、さらに第３の落射照明光学系光路にレーザートラップ用のレーザー光源を配し、さらに、第４の落射照明光学系光路にＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源を配し、第１乃至第２の落射照明光学系光路を選択し、励起光源の水銀ランプおよびレーザー光源を選択的に使用し、レーザートラップ用のレーザーとＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザーを使用することで、細胞内の任意のタンパク質に紫外レーザーを照射してＣａｇｅｄ試薬を解除し、活性化したタンパク質に赤外レーザーを照射してトラップし、微小計測を行うような操作が可能となり、細胞内物質の挙動を分子レベルで解析する細胞生理学の分野において非常に有効な実験系を構築することが可能となる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１８】
（第１の実施の形態）
図１および図２は、本発明が適用される倒立型の落射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。図において、１は観察すべき標本で、この標本１の下方に対物レンズ２を配置し、この対物レンズ２を通る観察光学系光路の光軸３１上に破線で示すキューブターレットＣＴを設けている。
【００１９】
このキューブターレットＣＴは、光軸３１に対して４５°の斜度を持つダイクロイックミラーＤＭ１を有するキューブＣＶ１と、光軸３１に対して４５°の斜度を持つダイクロイックミラーＤＭ１′、バリアフィルタＢＡ１′および励起フィルタＥＸ１′を有するキューブＣＶ１′を備えていて、光軸３１に対して垂直平面内を図示しない回転軸を中心に回転することにより、キューブＣＶ１またはキューブＣＶ１′を選択的に光軸３１の交わる点Ｏ１に位置合わせさせるようにしている。
【００２０】
なお、図１に示すキューブターレットＣＴは、２つのキューブしか表示されていないが、キューブＣＶ１，ＣＶ１′と同一構成、同一形状のキューブを少なくとも４つ挿脱することができ、ターレットの回転と図示しない位置決め機構により、任意のキューブのダイクロイックミラーの反射面を光軸３１の交わる点Ｏ１に合わせることができる。例えば、図２では、キューブターレット内部ＣＴにダイクロイックミラーＤＭ１″、バリアフィルタＢＡ１″を有するキューブＣＶ１″を挿入した例を示しており、後述するレーザー光源３および水銀光源６の波長を変えた場合に適用できるようにしている。また、キューブＣＶ１′は、光軸３１に挿入された時にダイクロイックミラーＤＭ１′の反射面が後述する水銀光源６の方に向くようにダイクロイックミラーＤＭ１′を保持している。
【００２１】
そして、キューブターレットＣＴの点Ｏ１から光軸３１に対して垂直方向の第１の落射照明光学系光路の光軸３２上にリレーレンズ５、コレクタレンズ４およびレーザー光源３を同一直線上に配置し、また、点Ｏ１から光軸３１に対して垂直で、さらに点Ｏ１からレーザー光源３への方向に対して垂直方向の第２の落射照明光学系光路の光軸３３上にリレーレンズ８、コレクタレンズ７および水銀光源６を同一直線上に配置している。
【００２２】
キューブターレットＣＴの下方には、破線で示すスライダーＳＶを後述する光軸３４に沿って移動可能に設けている。
【００２３】
このスライダーＳＶは、光軸３２に対して４５°の斜度を持つダイクロイックミラーＤＭ２、バリアフィルタＢＡ２および励起フィルタＥＸ２を有するキューブＣＶ２と、このダイクロイックミラーＤＭ２と平行に配置したダイクロイックミラーＤＭ２′を有するキューブＣＶ２′を、ダイクロイックミラーＤＭ２により光軸３２が反射される方向（光軸３４の方向）に並べて設けている。これらキューブＣＶ２とＣＶ２′は、スライダーＳＶに挿脱可能になっている。また、スライダーＳＶのキューブＣＶ２の真下には、結像レンズ１５を配置し、キューブＣＶ２′の真下には、結像レンズ１６を配置している。
【００２４】
そして、スライダーＳＶを光軸３４方向に沿って移動することで、キューブＣＶ２のダイクロイックミラーＤＭ２の反射面またはキューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′の反射面を選択的に光軸３１と交わる点Ｏ２に位置合わせさせるようにしている。
【００２５】
なお、スライダーＳＶ上のダイクロイックミラーＤＭ２，ＤＭ２′の切り換え停止位置は、図示しない位置決め機構により設定される。
【００２６】
そして、スライダーＳＶの点Ｏ２から反射された第３の落射照明光学系光路の光軸３４上には、リレーレンズ１１、コレクタレンズ１０および水銀光源９を配置している。また、リレーレンズ１１とコレクタレンズ１０の間の光軸３４上には、光軸３４と交わる点Ｏ３に、スライダーＳＶ′を挿脱可能に配置し、このスライダーＳＶ′を介して光軸３４に対し垂直方向にコレクタレンズ１３およびレーザー光源１２を配置している。
【００２７】
この場合、スライダーＳＶ′には、全反射ミラー１４を設けており、スライダーＳＶ′の図中矢印方向への移動により、全反射ミラー１４の反射面を点Ｏ３に挿脱し、レーザー光源１２からの光束を光軸３１と交わる点Ｏ２方向へ導くことができるようにしている。なお、スライダーＳＶ′の挿脱位置は、図示しない位置決め機構により自動的に設定される。
【００２８】
一方、スライダーＳＶ下方の光軸３１上には、光路分割のためのハーフプリズム１７、光軸３１を接眼部へと導く全反射ミラー１８を配置している。
【００２９】
結像レンズ１５又は１６を透過した観察光は、ビームスプリッタ１７によって２分割される。ビームスプリッタ１７で反射した光は撮影光路に導かれ、写真撮影装置又はＴＶカメラの受光面Ｐｈ上で結像する。
【００３０】
また、ビームスプリッタ１７を透過した光は全反射ミラー１８で反射され、観察光路に導かれる。観察光路上の中間結像点Ａでいったん結像した後、リレーレンズＲ１でリレーされて点Ｂで再び結像し、この像が接眼レンズＯｃによって観察される。
【００３１】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００３２】
いま、レーザー光源３にＣａｇｅｄ試薬解除用の波長３３７ｎｍのＮ2   レーザーを使用し、水銀光源６に励起光照射用で蛍光観察用の波長４８８ｎｍの光を取り出すための水銀光を使用し、水銀光源９に励起光照射用で蛍光観察用の波長５３２ｎｍの光を取り出すための水銀光を使用し、レーザー光源１２にレーザートラップ用の波長１０６４ｎｍのＩＲレーザーを使用するものとする。
【００３３】
まず、図１に示すように、キューブターレットＣＴのキューブＣＶ１を光軸３１上に位置させるとともに、スライダーＳＶのキューブＣＶ２を観察光学系光路の光軸３１に挿入し、スライダーＳＶ′を光軸３４から取り外す。
【００３４】
この状態で、レーザー光源３の波長３３７ｎｍのＣａｇｅｄ試薬解除用のＮ2 レーザーが、コレクタレンズ４、リレーレンズ５を介してキューブＣＶ１のダイクロイックミラーＤＭ１に入射される。ここで、ダイクロイックミラーＤＭ１に波長が４００ｎｍ以下の光を反射し、４００ｎｍを超える光を透過する図３に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、レーザー光源３のＮ2   レーザーは、ダイクロイックミラーＤＭ１で反射し、対物レンズ２を通して標本１の観察視野内の所定位置に照射され、Ｃａｇｅｄ試薬解除が行われる。
【００３５】
一方、この状態では、スライダーＳＶのキューブＣＶ２のダイクロイックミラーＤＭ２が光軸３１と交わる点Ｏ２に位置され、スライダーＳＶ′が光軸３４から外れているので、水銀光源９の波長５３２ｎｍの水銀光が、コレクタレンズ１０、リレーレンズ１１を介して、ダイクロイックミラーＤＭ２′に入射される。ここで、ダイクロイックミラーＤＭ２′に波長が８００ｎｍ以下の光を透過し８００ｎｍを超える光を反射する図４に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、水銀光源９からの光は、ダイクロイックミラーＤＭ２′を透過し、キューブＣＶ２の励起フィルタＥＸ２に入射され、さらに、この励起フィルタＥＸ２に励起光波長５１０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の光を透過する図５に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起光のみが透過し、ダイクロイックミラーＤＭ２に入射される。さらに、ダイクロイックミラーＤＭ２に、波長が５７０ｎｍ以下の光を反射し、５７０ｎｍを超える光を透過する図５に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起フィルタＥＸ２からの励起光は、ダイクロイックミラーＤＭ２で上方に反射し、ダイクロイックミラーＤＭ１を透過して対物レンズ２を介して標本１の観察視野に照射される。
【００３６】
そして、励起光の照射により、標本１から蛍光が発すると、この蛍光は、対物レンズ２を通り、ダイクロイックミラーＤＭ１、ＤＭ２を介してキューブＣＶ２のバリアフィルタＢＡ２に入射される。ここで、バリアフィルタＢＡ２に、波長５９０ｎｍ以下の光を反射し、５９０ｎｍを超える光を透過する図５に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、蛍光は、透過して、ハーフプリズム１７、全反射ミラー１８を通して蛍光観察が行なわれる。
【００３７】
これにより、Ｃａｇｅｄ試薬解除及び蛍光観察を同時に行なうことができる。
【００３８】
ここで、Ｃａｇｅｄ試薬解除及び蛍光観察を同時に行なう際に使用されるダイクロイックミラーＤＭ１，ＤＭ２の特性に関してまとめると次のようになる。
【００３９】
すなわち、ダイクロイックミラーＤＭ１としては、レーザー光源３からのレーザー光（波長が４００ｎｍ以下）を反射する一方、水銀光源９からの励起光や標本１から発せられる光（波長が４００ｎｍ超）を透過するものが使用される（図３参照）。また、ダイクロイックミラーＤＭ２としては、水銀光源９からの励起光（波長が５７０ｎｍ以下）を反射する一方、標本１から発せられる光（波長が５７０ｎｍ超）を透過するものが使用される（図５参照）。
【００４０】
次に、図２に示すように、キューブターレットＣＴを図示矢印方向に回転して、キューブＣＶ１′を光軸３１上に位置させ、また、スライダーＳＶの切り換えにより、キューブＣＶ２′を光軸３１に挿入し、さらに、スライダーＳＶ′を切り換えて全反射ミラー１４を光軸３４に挿入する。
【００４１】
この状態で、水銀光源６の蛍光観察用の波長４８８ｎｍの水銀光が、コレクタレンズ７、リレーレンズ８を介してキューブＣＶ１′の励起フィルタＥＸ１′に入射される。ここで、励起フィルタＥＸ１′に波長が４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下の光を透過する図６に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起光のみがダイクロイックミラーＤＭ１′に入射され、さらに、ダイクロイックミラーＤＭ１′として波長が５００ｎｍ以下の光を反射し５００ｎｍを超える光を透過する図６に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起フィルタＥＸ１′の励起光は、ダイクロイックミラーＤＭ１′で上方に反射し、対物レンズ２を介して標本１の観察視野に照射される。
【００４２】
そして、励起光の照射により標本１から蛍光が発すると、この蛍光は、対物レンズ２を通りダイクロイックミラーＤＭ１′を透過して、キューブＣＶ１′のバリアフィルタＢＡ１′に入射される。ここで、バリアフィルタＢＡ１′に波長５１５ｎｍ以下の光を反射し、５１５ｎｍを超える光を透過する図６に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、蛍光は、透過して、スライダーＳＶのダイクロイックミラーＤＭ２′に入射される。この時の蛍光の波長は８００ｎｍ以下なので、ダイクロイックミラーＤＭ２′を透過し、ハーフプリズム１７、全反射ミラー１８を通して蛍光観察が行なわれる。
【００４３】
一方、スライダーＳＶ′が光軸３４上に挿入されていることで、レーザー光源１２にレーザートラップ用の波長１０６４ｎｍのＩＲレーザーが、コレクタレンズ１３を通って全反射ミラー１４に入射し、ここで全反射され、キューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′に入射される。すると、ダイクロイックミラーＤＭ２′の分光透過率特性により上方に反射し、キューブＣＶ１′のバリアフィルタＢＡ１′に入射されるが、このバリアフィルタＢＡ１′の分光透過率特性により透過し、さらに、ダイクロイックミラーＤＭ１′の分光透過率特性により透過し、対物レンズ２に入射される。
【００４４】
すると、対物レンズ２に入射されたレーザー光は、集光され、標本１上の所定位置にレーザースポットとして照射され、この照射されたレーザー集光点の近傍において、標本１中の微小物体を光学的に捕捉することができる。
【００４５】
これにより、蛍光観察及びレーザートラップによる微小物体の捕捉・微小力計測等を同時に行なうことができる。
【００４６】
ここで、蛍光観察及びレーザートラップによる微小物体の捕捉・微小力計測等を同時に行なう際に使用されるダイクロイックミラーＤＭ１′，ＤＭ２′の特性に関してまとめると次のようになる。
【００４７】
すなわち、ダイクロイックミラーＤＭ１′としては、水銀光源６からの励起光（波長が５００ｎｍ以下）を反射する一方、レーザー光源１２から送られてくるレーザー光や標本１から発せられる光（波長が５００ｎｍ超）を透過するものが使用される（図６参照）。また、ダイクロイックミラーＤＭ２′としては、レーザー光源１２からのレーザー光（波長が８００ｎｍ以下）を反射する一方、標本１から発せられる光（波長が８００ｎｍ超）を透過するものが使用される（図４参照）。
【００４８】
従って、このような構成とすれば、第１の落射照明光学系光路のＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源３からのレーザー光をキューブＣＶ１のダイクロイックミラーＤＭ１を介して標本１側に導入し、同時に、第３の落射照明光学系光路の励起光照射用の水銀ランプ９からの励起光をキューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′およびキューブＣＶ２のダイクロイックミラーＤＭ２を介して標本１側に導入することにより、Ｃａｇｅｄ試薬解除及び蛍光観察によるＣａｇｅｄ試薬解除実験を行うことができ、一方、第２の落射照明光学系光路の励起光照射用の水銀ランプ６からの励起光をキューブＣＶ１′のダイクロイックミラーＤＭ１′を介して標本１側に導入し、同時に、第３の落射照明光学系光路のレーザートラップ用のレーザー光源１２からのレーザー光をキューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′を介して標本１側に導入することにより蛍光観察及びレーザートラップによる微小物体の捕捉・微小力計測などのレーザートラップ実験を選択的に行うことができるようになり、標本操作をともない、これら２種類の実験が選択的に可能で、汎用性のある落射蛍光顕微鏡が提供できる。
【００４９】
なお、この第１の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶと同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６をスライダーＳＶに取り付けずに、どちらか一方を顕微鏡本体の光軸上の所定位置に固定するようにしてもよい。
【００５０】
（第２の実施の形態）
図７は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５１】
この場合、図７は、図１の構成からレーザー光源１２、コレクタレンズ１３、全反射ミラー１４、スライダーＳＶ′、ダイクロイックミラーＤＭ２′、キューブＣＶ２′を除去したもので、その他は、図１と同様である。
【００５２】
このように構成した第２の実施の形態は、端的に言えば図１の構成からレーザー光源１２を取り外し、キューブＣＶ２′を外したものである。
【００５３】
このため、スライダーＳＶ′を切り換えて結像レンズ１６を光軸３１に挿入し、また、キューブターレットＣＴのターレットを回転し、キューブの入っていない部分を光軸３１の位置に合わせるか、もしくは、キューブＣＶ１を外すことによって観察光学系の平行光束光路中（対物レンズ２から結像レンズ１６の間）に余分な光学素子の入らない状態を作り出せば、簡易的な操作のみで通常の倒立型顕微鏡に切り換えることができる。
【００５４】
このようにすれば、単一の励起光のみを標本に照射する通常の蛍光観察では使用しないダイクロイックミラーやバリアフィルタを観察光路から取り除くことにより、使われないキューブが観察光路に入っているが故に、ある範囲の波長帯の蛍光は観察光路から反射され、除去されてしまうような予期せぬ不具合を未然に防ぐことができる。また、余分な光学素子を除去することで、微弱蛍光観察時の光量ロスを未然に防ぎ、その他蛍光観察と他の検鏡法とを組み合わせた観察像の劣化も防ぐことが出来る。
【００５５】
なお、図７に示す構成で、レーザートラップを使用したい場合には、図７のスライダーＳＶのキューブＣＶ２を、図８に示すようにキューブＣＶ２′に変更し、また、水銀光源９に代えてレーザー光源１２を用いればよい。
【００５６】
このような構成にすれば、レーザートラップ及び蛍光観察が同時に行えるとともに、上述したと同様な効果を期待することができる。また、このような実施の形態においては、使用したい光源に合わせてスライダーＳＶに取り付けるキューブを他のものに変えてもよい。
【００５７】
なお、この第２の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶと同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６をスライダーＳＶに取り付けずに、どちらか一方を顕微鏡本体の光軸上の所定位置に固定するようにしてもよい。
【００５８】
（第３の実施の形態）
図９は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５９】
この場合、図９は、図１に示すスライダーＳＶに代え、スライダーＳＶを延長して結像レンズ１９を新たに加えたスライダーＳＶ″を設けたもので、その他は、図１と同様である。
【００６０】
このように構成した第３の実施の形態は、スライダーＳＶ″を切り換えることにより、図示しない位置決め機構によりキューブＣＶ２，ＣＶ２′および結像レンズ１９を観察光学系の平行光束光路中に挿入することができる。
【００６１】
このようにすれば、第１の実施の形態で述べた効果を何ら損なうことなく、さらに第２の実施の形態で述べた効果を得ることができる。すなわち、簡単に述べると簡易的切り換えのみで、様々な光束の選択的使用が可能で、通常の倒立型顕微鏡としての使用も可能な倒立型顕微鏡を提供できる。
【００６２】
また、この第３の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶ″と同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６，１９はスライダーＳＶ″に取り付けられている必要はなく、例えば、結像レンズ１５，１６，１９のうち、いずれか一つを顕微鏡本体の光軸上に固定し、他の２つを除外しても良い。
【００６３】
（第４の実施の形態）
図１０は、本発明の第４の実施の形態の概略構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付している。
【００６４】
この場合、図１０は、図２の構成の対物レンズ２と点Ｏ１との間の観察光学系光路の光軸３１上に点Ｏ４を設け、この点Ｏ４が光軸の反射点となるようにダイクロイックミラーＤＭ１を有するキューブＣＶ１を配置し、このダイクロイックミラーＤＭ１により反射された第４の落射照明光学系光路の光軸３５上にリレーレンズ２２、コレクタレンズ２１、レーザー光源２０を同一直線上に配置している。その他は、図２と同様である。
【００６５】
このように構成した第４の実施の形態では、レーザー光源２０として、Ｃａｇｅｄ試薬解除用の波長３３７ｎｍのＮ2   レーザー光源を用いると、レーザー光源２０より発振されたレーザー光は、コレクタレンズ２１、リレーレンズ２２を通って、上述したダイクロイックミラーＤＭ１の特性により上方に反射され、標本１の観察視野内の所定位置を照射する。
【００６６】
つまり、このようにすることで、蛍光観察、レーザートラップ使用時にＣａｇｅｄ試薬解除を追加できるようにし、第１の実施の形態で説明した各光学素子の波長特性を利用して３つの光源を同時に使用することができる。
【００６７】
これにより、励起光を照射し、細胞内部の蛍光観察を行いながら、細胞内の任意のタンパク質にＮ2   レーザーを照射して、Ｃａｇｅｄ試薬を解除し、活性化したタンパク質にＩＲレーザーを照射して光学的に捕捉し、微小力計測を行なうようなことが可能になり、細胞内物質の挙動を分子レベルで解析する細胞生理学の分野において非常に有効である。つまり、このように専門分野の探求においては、様々な光源を同時にいくつも使用したいことが多々あるが、図１０のような構成をとることにより、上述した学問的メリットの大きい装置を提供することができる。
【００６８】
なお、第４の実施の形態ではレーザートラップ用のダイクロイックミラーＤＭ２′は、その他の光軸上のダイクロイックミラーの中で一番下に配置されているが、どの位置に配置されていてもよい。また、光軸上のダイクロイックミラーは追加してもよい。キューブＣＶ１は、単独で存在するが、なんらかの機構を用いてキューブＣＶ１の位置に複数のキューブが挿脱できるようにしてもよい。
【００６９】
また、この第４の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶと同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６をスライダーＳＶに取り付けずに、どちらか一方を顕微鏡本体の光軸上の所定位置に固定するようにしてもよい。
【００７０】
（第５の実施の形態）
前述した各実施の形態が正立型顕微鏡にも適用可能である旨は既に述べた通りである。そこで、本発明をその正立型顕微鏡で構成した場合の一実施形態を図１１を参照して説明する。
【００７１】
図１１は、本発明を正立型顕微鏡で構成した実施の形態の概略構成を示している。図において、１は観察すべき標本であり、この標本の上方に、対物レンズをはじめとする落射照明および観察光学系が配置されている。
【００７２】
ここに示した結像レンズ１５より対物レンズ側にある落射照明光学系の構成要素に付した記号は、図１において示した構成要素の記号に対応して同一の構成要素であることを示している。すなわち、第１の実施の形態で示した図１の倒立型顕微鏡における落射照明光学系をおおよそ反転した態様で構成されている。
【００７３】
結像レンズ１５の上方には光路分割プリズムＰｒが配置され、この光路分割プリズムＰｒを透過した観察光は、写真装置やＴＶカメラ等の撮像面Ｐｈ上で結像される。一方、光路分割プリズムＰｒを反射した観察光は、接眼レンズＯｃの手前で結像され、接眼レンズＯｃを通した目視観察を行うようにしている。
【００７４】
このように構成した実施の形態の動作は、前述の第１の実施の形態で示した動作と全く同じであり、すなわち、正立型顕微鏡においても同様の効果を得ることができる。
【００７５】
以上、各実施の形態で述べたことをまとめると以下の通りとなる。
本発明の落射蛍光顕微鏡は、複数の落射照明光を選択的に標本に照射することにより、標本の光学的操作と蛍光観察を同時に可能にした落射蛍光顕微鏡において、前記標本に対する観察光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第１の落射照明光学系光路と、前記観察光学系光路の前記第１の落射照明光学系光路と同一の交点で前記観察光学系光路と交差する方向に配置された第２の落射照明光学系光路と、第１のダイクロイックミラーを有するキューブおよび第２のダイクロイックミラーを有するキューブを備え、前記観察光学系光路と前記第１および第２落射照明光学系光路との交点に所望のキューブを挿脱可能に配置する第１の可動体と、前記観察光学系光路に、前記第１および第２の落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に配置された第３の落射照明光学系光路と、第３のダイクロイックミラーを有するキューブを備え、前記観察光学系光路と前記第３の落射照明光学系光路との交点にそのキューブを挿脱可能に配置する第２の可動体とにより構成している。
【００７６】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記第１のダイクロイックミラーは、前記第１の落射照明光学系光路からの光を前記標本の方へ反射する一方、前記標本から発せられる蛍光を透過するものであることが望ましい。また、前記第２のダイクロイックミラーは、前記第２の落射照明光学系光路からの光を前記標本の方へ反射する一方、前記標本から発せられる蛍光を透過するものであることが望ましい。また、前記第３のダイクロイックミラーは、前記第３の落射照明光学系光路からの光を前記標本の方へ反射する一方、前記標本から発せられる蛍光を透過するものであることが望ましい。
【００７７】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記第１の可動体は例えばキューブターレットである。また、前記第２の可動体は例えばスライダーである。
【００７８】
前記落射蛍光顕微鏡は、前記第１の落射照明光学系光路を形成するレーザー光源をさらに具備していてもよい。また、前記落射蛍光顕微鏡は、前記第２の落射照明光学系光路を形成する水銀光源をさらに具備していてもよい。また、前記落射蛍光顕微鏡は、前記第３の落射照明光学系光路を形成するレーザー光源および水銀光源のうちの少なくとも一方をさらに具備していてもよい。
【００７９】
前記落射蛍光顕微鏡は、前記第３の落射照明光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第４の落射照明光学系光路をさらに具備していてもよい。この場合、前記落射蛍光顕微鏡は、前記第３の落射照明光学系光路と前記第４の落射照明光学系光路との交点に全反射ミラーを挿脱可能に配置するスライダーをさらに具備していてもよい。
【００８０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、落射照明光学系の独立した光路を複数有し、これら落射照明光学系光路を選択し、Ｃａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源、励起光照射用の水銀ランプおよびレーザートラップ用のレーザー光源などを組み合わせることにより、各々の落射照明光路の用途が限定されない、汎用性に富んだ落射蛍光顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ１の分光透過率特性を示す図。
【図４】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ２′の分光透過率特性図。
【図５】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ２、励起フィルタＥＸ２、バリアフィルタＢＡ２の分光透過率特性図。
【図６】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ１′、励起フィルタＥＸ１′、バリアフィルタＢＡ１′の分光透過率特性図。
【図７】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図８】第２の実施の形態を一部変形した概略構成を示す図。
【図９】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１０】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１１】本発明の第５の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１２】従来の落射蛍光顕微鏡の一例の概略構成を示す図。
【図１３】従来の落射蛍光顕微鏡の他の例の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…標本、
２…対物レンズ、
３…レーザー光源、
４…コレクタレンズ、
５…リレーレンズ、
６…水銀光源、
７…コレクタレンズ、
８…リレーレンズ、
９…水銀光源、
１０…コレクタレンズ、
１１…リレーレンズ、
１２…レーザー光源、
１３…コレクタレンズ、
１４…全反射ミラー、
１５，１６…結像レンズ、
１７…ハーフプリズム、
１８…全反射ミラー、
１９…結像レンズ、
２０…レーザー光源、
２１…コレクタレンズ、
２２…リレーレンズ、
３１，３２，３３，３４，３５…光軸、
ＢＡ１′，ＢＡ１″，ＢＡ２…バリアフィルタ、
ＣＴ…キューブターレット、
ＣＶ１，ＣＶ１′，ＣＶ１″，ＣＶ２，ＣＶ２′…キューブ、
ＤＭ１，ＤＭ１′，ＤＭ２，ＤＭ２′…ダイクロイックミラー、
ＥＸ１′，ＥＸ２…励起フィルタ、
Ｏｃ…接眼レンズ、
Ｐｈ…受光面、
Ｐｒ…光路分割プリズム、
Ｒ１…リレーレンズ、
ＳＶ，ＳＶ′，ＳＶ″…スライダー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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