(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象液に両親媒性物質の分子膜を浸漬し、該分子膜と反対の極性の電荷をもつ分析対象液中の脂質を前記分子膜に吸着させ、該脂質の吸着による前記分子膜の電位変化に基づいて、分析対象液中の脂質を分析することを特徴とする脂質分析方法。
【請求項２】
前記脂質の吸着による前記分子膜の電位変化に基づいて分析対象液中の脂質の濃度を測定することを特徴とする請求項１記載の脂質分析方法。
【請求項３】
基準電極（２３）と、分析対象の脂質の電荷と反対の極性を有する両親媒性物質の分子膜（２５）とを有するプローブ（２２）と、
前記プローブの基準電極と分子膜との間の電位差を検出する電圧検出手段（３５）と、
分析対象の脂質の濃度と前記プローブの出力電圧との関係を示すデータが予め記憶されている記憶手段（３７ａ）と、
分析対象液を前記プローブによって測定したときの出力電圧と、前記記憶手段に記憶されているデータとから、分析対象液中の脂質の濃度を算出する演算手段（３７）と、
前記演算手段の演算結果を出力する出力手段（３８）とを備えた脂質分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体中の脂質の濃度等を効率良く分析するための技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脂質は、比較的長い炭化水素鎖（疎水鎖）からなる非極性基と、エステル基、水酸基、リン酸基等の極性基（親水基）との２つの部分から構成された細胞内有機物の総称である。
【０００３】
この脂質の定性分析や定量分析を行う場合、従来では、液体やガスを用いたクロマトグラフを用いていた。
【０００４】
クロマトグラフは、各種の固体または液体を固定相とし、ガスまたは液体を展開剤（移動相）として試料を移動させて試料中の各成分の吸着性または分配係数の差を利用して分離する方法である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記クロマトグラフを用いた分析方法は、操作に熟練を有し、１サンプル当りの分析に数時間も要するという問題があった。
【０００６】
しかも、脂質のうち疎水鎖が長い脂質の大部分は、クロマトグラフを用いる際の測定条件が未知であり、その測定条件を調査するだけでも多大な時間と労力を要し、４級アンモニウム塩のような脂質はクロマトグラフ等の従来の分析機器ではこれまで検知すら困難であった。
【０００７】
本発明は、この問題を解決し、液体中の脂質の濃度等を効率良く分析できる脂質分析方法および脂質分析装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の請求項１の脂質分析方法は、
分析対象液に両親媒性物質の分子膜を浸漬し、該分子膜と反対の極性の電荷をもつ分析対象液中の脂質を前記分子膜に吸着させ、該脂質の吸着による前記分子膜の電位変化に基づいて、分析対象液中の脂質を分析することを特徴としている。
【０００９】
また、本発明の請求項２の脂質分析方法は、請求項１記載の脂質分析方法において、
前記脂質の吸着による前記分子膜の電位変化に基づいて分析対象液中の脂質の濃度を測定することを特徴としている。
【００１０】
また、本発明の請求項３の脂質分析装置は、
基準電極（２３）と、分析対象の脂質の電荷と反対の極性を有する両親媒性物質の分子膜（２５）とを有するプローブ（２２）と、
前記プローブの基準電極と分子膜との間の電位差を検出する電圧検出手段（３５）と、
分析対象の脂質の濃度と前記プローブの出力電圧との関係を示すデータが予め記憶されている記憶手段（３７ａ）と、
分析対象液を前記プローブによって測定したときの出力電圧と、前記記憶手段に記憶されているデータとから、分析対象液中の脂質の濃度を算出する演算手段（３７）と、
前記演算手段の演算結果を出力する出力手段（３８）とを備えている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面に基づいて本発明の実施形態を説明する。
図１は、実施形態の脂質分析装置２０の構成を示している。
【００１２】
図１において、脂質分析装置２０は、基準液や分析対象液を入れるための容器２１と、プローブ２２と、プローブ２２の電位差を検出する電圧検出器３５と、電圧検出器３５の出力をディジタル値に変換するＡ／Ｄ変換器３６と、Ａ／Ｄ変換器３６の出力に対する演算処理を行う演算装置３７と、演算装置３７の演算結果を出力する出力装置３８によって構成されている。
【００１３】
プローブ２２は、容器２１に入れた液体に漬けて使用するものであり、測定の基準電位を出力するための基準電極２３と、両親媒性物質の分子膜２６とを有している。
【００１４】
基準電極２３の表面は、液体内の脂質に反応しないように、塩化カリウム１００ｍ  ｍｏｌｅ／ｌを寒天で固定した緩衝層２４で覆われており、リード線２２ａが接続されている。
【００１５】
また、分子膜２５は、アクリル等の基材２６の表面に一面側を露呈させた状態で固定されており、分子膜２５の反対面には、基準電極２３の緩衝層２４と同等の緩衝層２７を介して電極２８が設けられ、この電極２８にはリード線２２ｂが接続されている。
【００１６】
分子膜２５は、無極性で疎水性を有する部分と有極性で親水性を要する部分とを有する両親媒性物質が、その親水性部分を表面側に向けた状態で膜をなすように一体化されたものであり、液に漬けたときにその膜の電位が液中の成分に応じて変化する。
【００１７】
分子膜２５の模式的な構造を図２に示す。図２において、各分子３１は、球状の親水基３１ａと、親水基３１ａから原子配列が長く延びる炭化水素鎖３１ｂとからなり、これらの各分子群が、その親水基３１ａ側が表面側に並ぶように、膜部材３２（後述の高分子と可塑剤からなる）の表面のマトリクス３３（表面構造、平面的な広がりをもつミクロな構造）の中に、一部はマトリクス内部に溶け込んだ形（例えば分子３１′）で収容されている。
【００１８】
ここで、分子膜２５の各分子３１の親水基３１ａの極性は、分析対象の脂質の親水基の極性と反対のものが必要である。
【００１９】
例えば、プラスの電荷の脂質を分析する場合には、マイナスの電荷を有するジオクチルフォスフェート（２Ｃ８ＰＯＯＨ）、オレイン酸（Ｃ１０ＣＯＯＨ）、リン酸ジフェニル、デジルアルコール等の脂質分子を用いる。逆にマイナスの電荷の脂質を分析する場合には、プラスの電荷を有するトリオクチルメチル  アンモニウム  クロライド（ＴＯＭＡ）、オレイルアミン等の脂質分子を用いる。
【００２０】
この分子膜２５は、上記の脂質分子、ベースとなる高分子および可塑剤とを所定の割合で混合して作製されたものである。例えば、高分子にはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を用い、可塑剤としてフタル酸ジオクチル（ＤＯＰ）、ジオクチルフェニルフォスフォネート（ＤＯＰＰ）あるいはリン酸トリクレシル（ＴＣＰ）を用いて上記の脂質分子と混合したもの８００ｍｇを、ＴＨＦ１０ｃｃに溶解し、平底の容器（例えば８５ｍｍφのシャーレ）に移し、それを均一な加熱された板上で約３０度Ｃに２時間保って、ＴＨＦを揮散させることで厚さ約２００μｍの分子膜を得ることができる。
【００２１】
なお、このプローブ２２を液体に漬ける際には、測定条件が変わらないように、基準電極２３と分子膜２５の間隔を一定にするが、支持材２９によって基準電極２３と基材２６とを一定の間隔で支持するようにしておいてもよい。
【００２２】
この分子膜２５を有するプローブ２２のリード線２２ａ、２２ｂは、電圧検出器３５に接続されている。
【００２３】
電圧検出器３５は、例えば差動増幅器によって構成され、基準電極２３の電位と分子膜２５の電位の差（電圧）を検出してＡ／Ｄ変換器３６に出力する。
【００２４】
Ａ／Ｄ変換器３６は電圧検出器３５の出力電圧をディジタル値に変換して演算装置３７に出力する。
【００２５】
演算装置３７は、マイクロコンピュータによって構成され、図示しない操作部等から記憶指示Ｍを受けるとＡ／Ｄ変換器３６の出力値をメモリ３７ａに記憶し、演算指令Ｃを受けるとメモリ３７ａの記憶値およびＡ／Ｄ変換器３６の出力値に基づいて、液体中の脂質の濃度分析等のための演算を行い、演算結果を出力装置３８に出力する。
【００２６】
出力装置３８は、表示器、プリンタあるいは他装置との通信装置等によって構成され、演算装置３７の演算結果を、表示出力、印刷出力あるいは他装置へ送信する。
【００２７】
なお、ここでは、分子膜２５が一つの場合について説明するが、特性の異なる複数の分子膜の測定値に基づいて、多変量解析の重回帰分析を用いて、脂質の分析を行うこともできる。
【００２８】
次に、この脂質分析装置２０を用いて液体中の脂質の濃度分析を行う方法を、図３のフローチャートに基づいて説明する。
【００２９】
先ず前段階として、分析対象液に成分が近く且つ分析対象となる脂質を含まない基準液と、分析対象の脂質がそれぞれ異なる既知量含まれている複数（例えば３種類）の濃度既知液とを作製し、基準液および各濃度既知液をそれぞれ同量ずつ各容器２１に入れる。
【００３０】
そして、始めに基準液にプローブ２２を漬けてその出力電圧Ｖ０を演算装置３２のメモリ３７ａに記憶させる（Ｓ１）。
【００３１】
次に、このプローブ２２を、最も低い濃度Ａ１の第１の濃度既知液に一定時間漬ける（Ｓ２）。
【００３２】
このとき、プローブ２２の分子膜２５には、図４のように、分子膜２５の電荷と反対の極性の電荷をもつ第１の濃度既知液内の脂質分子４０が吸着されるため、分子膜２５自体の電気的特性が変化する。
【００３３】
一定時間が経過してから、このプローブ２２を基準液に戻してその出力電圧Ｖ１をメモリ３７ａに記憶させる（Ｓ３）。
【００３４】
次に、このプローブ２２を、基準液から２番目に低い濃度Ａ２の第２の濃度既知液に一定時間漬けてから、基準液に戻してその出力電圧Ｖ２をメモリ３６ａに記憶させ、さらに、プローブ２２を、基準液から最も高い濃度Ａ３の第３の濃度既知液に一定時間漬けてから基準液に戻してその出力電圧Ｖ３をメモリ３７ａに記憶させる（Ｓ４〜Ｓ７）。
【００３５】
このように、濃度が低い方から順に測定された電圧Ｖ０〜Ｖ３を演算装置３６のメモリ３７ａに記憶させてから、演算装置３６に第１の演算指令Ｃａを入力すると、演算装置３６は次の演算を行って、基準液に対する各濃度既知液の相対電圧値Ｖａ、Ｖｂ、Ｖｃを求める（Ｓ８）。
【００３６】
Ｖａ＝Ｖ１−Ｖ０
Ｖｂ＝Ｖ２−Ｖ０
Ｖｃ＝Ｖ３−Ｖ０
【００３７】
そして、この相対電圧値Ｖａ、Ｖｂ、Ｖｃと各濃度既知液の濃度Ａ１、Ａ２、Ａ３とを用いて、次の演算を行って各濃度Ａ１、Ａ２、Ａ３についての係数Ｋａ、Ｋｂ、Ｋｃを算出する（Ｓ９）。
【００３８】
Ｋａ＝Ａ１／Ｖａ
Ｋｂ＝Ａ２／Ｖｂ
Ｋｃ＝Ａ３／Ｖｃ
【００３９】
次に、演算装置３６は、Ｋａ〜Ｋｃの平均値Ｋを求め、この係数Ｋを分析対象の脂質の濃度と電圧との関係を示す検量データとしてメモリ３７ａに記憶する（Ｓ１０）。
【００４０】
ここで、実際に電荷がマイナスの分子膜２５（２Ｃ１０系脂質からなる分子膜）を用いて電荷がプラスの脂質ＴＯＭＡ（４級アンモニウム塩）の濃度をｐｐｂ単位で測定したときのデータを図５に示す。
【００４１】
このデータは、脂質ＴＯＭＡの濃度が１ｐｐｂ（ａ）、３ｐｐｂ（ｂ）、１０ｐｐｂ（ｃ）、３０ｐｐｂ（ｄ）および１００ｐｐｂ（ｅ）における測定結果であり、脂質ＴＯＭＡの濃度と電圧の関係は、実線Ｑで示しているようにほぼ直線的（特に３ｐｐｂ以上の範囲では）に変化する。
【００４２】
つまり、前記した各濃度での比例係数Ｋａ〜Ｋｃはほぼ等しい。したがって、前記したように、Ｋａ〜Ｋｃの平均値Ｋ（図５でいえば実線Ｑの傾きに相当）を分析対象の脂質の濃度と電圧との関係を示す検量データとすることができ、この係数Ｋをメモリ３７ａに予め記憶しておくことで、濃度が未知の液体の脂質濃度を計算によって求めることができる。
【００４３】
また、前記したように、特性の異なる複数の分子膜によって前記同様に既知の脂質濃度の液体を測定し、各測定値を多変量とする重回帰分析を行なうことによっても、前記のような脂質の濃度と各分子膜の測定値との関係（検量データ）を求めることができ、この関係と分析対象液に対する各分子膜の測定値から分析対象液の脂質の濃度等を求めることも可能である。ただし、この場合でも、各分子膜は分析対象の脂質の極性と反対の極性を有するものを用いる。
【００４４】
実際に濃度を測定する場合には、前記濃度と電圧の関係を求めるために使用し６使ったプローブ２２を洗浄して分子膜２５に吸着した脂質を除去したものを用いる（Ｓ１１）。
【００４５】
この場合、最初に前記した基準液にプローブ２２を漬けて出力電圧Ｖ０′をメモリ３７ａに記憶させ、このプローブ２２を分析対象液に一定時間漬けて、前記図４で示したのと同様に、分析対象液内の脂質を分子膜２５に吸着させてから、基準液に戻してその出力電圧Ｖをメモリ３７ａに記憶させる（Ｓ１２〜Ｓ１４）。
【００４６】
ここで、第２の演算指令Ｃｂを入力すると、演算装置３６は、次の演算、
Ｖｘ＝Ｖ−Ｖ０′
を行ない、基準液に対する分析対象液の相対電圧Ｖｘを算出し、この相対電圧Ｖｘと、前記係数Ｋとを用いて、次の演算、
Ａｘ＝Ｋ・Ｖｘ
を行ない、分析対象液内の脂質の濃度Ａを求める（Ｓ１５、Ｓ１６）。
【００４７】
算出された濃度Ａは、分析者が確認できるように、出力装置３７によって表示出力、印刷出力あるいは他装置へ送信される（Ｓ１７）。
【００４８】
なお、前記説明では、濃度と電圧の関係を完全な比例関係として、一つの係数Ｋを用いて濃度を算出しているが、図５の破線Ｒのように、各測定点ａ〜ｅの各間を直線補間（あるいは曲線補間）した特性をメモリ３７ａに記憶しておいて、分析対象液を測定したときの電圧と破線Ｒの交点から分析対象液の脂質の濃度を求めるようにしてもよい。この場合には補間演算等が必要であるが、算出濃度の精度はより高くなる。
【００４９】
前記説明では、脂質が含まれている液体にプローブ２２を一定時間漬けて、液体中の脂質をプローブの分子膜２５に吸着させ、この吸着によるプローブの出力電圧の変化を基準液中で検出するようにしていたが、脂質を含む液体にプローブ２２を漬けた状態でプローブ２２の出力電圧の単位時間当りの変化率を求めて、その濃度を検出することも可能である。
【００５０】
この場合、例えば図６に示すように、濃度Ａ１の濃度既知液にプローブ２２を漬けてから、あるタイミングｔ１時のプローブ２２の出力電圧Ｖ１ａを求め、異なるタイミングｔ２時のプローブ２２の出力電圧Ｖ１ｂを求めて、単位時間当りの出力電圧の変化率ΔＶ１を
ΔＶ１＝（Ｖ１ｂ−Ｖ１ａ）／（ｔ２−ｔ１）
によって求める。
【００５１】
同様に、濃度Ａ２の濃度既知液についても、プローブ２２を漬けてから、あるタイミングｔ１時のプローブ２２の出力電圧Ｖ２ａを求め、タイミングｔ２時の出力電圧Ｖ２ｂを求めて、単位時間当りの出力電圧の変化率ΔＶ２を
ΔＶ２＝（Ｖ２ｂ−Ｖ２ａ）／（ｔ２−ｔ１）
によって求め、濃度Ａ３の濃度既知液についても、プローブ２２を漬けてから、あるタイミングｔ１時のプローブ２２の出力電圧Ｖ３ａを求め、タイミングｔ２時の出力電圧Ｖ３ｂを求めて、単位時間当りの出力電圧の変化率ΔＶ３を、
ΔＶ３＝（Ｖ３ｂ−Ｖ３ａ）／（ｔ２−ｔ１）
によって求める。
【００５２】
ただし、タイミング（ｔ１、ｔ２）は各濃度について全て同一である必要はない。また、この場合には、測定する濃度既知液を変える毎にプローブ２２の洗浄を行うものとする。
【００５３】
ここで、単位時間当りに分子膜２５に吸着する脂質の数は、液体中の脂質の濃度に比例し、分子膜２５に吸着する脂質の数に比例してプローブ２２の出力電圧が変化するから、この各変化率ΔＶ１〜ΔＶ３は、液体中の脂質の濃度に比例している。
【００５４】
したがって、この脂質による電圧の変化率に対する濃度の比は理論上一定であるが、測定のバラツキがある。
【００５５】
したがって、演算装置３６において前記同様に各濃度毎の比Ｊａ〜Ｊｃを、
Ｊａ＝Ａ１／ΔＶ１
Ｊｂ＝Ａ２／ΔＶ２
Ｊｃ＝Ａ３／ΔＶ３
によって求め、その平均値Ｊを算出しておく。
【００５６】
そして、分析対象液にプローブ２２を漬けてから前記同様にあるタイミングｔ１の出力電圧Ｖａと、異なるタイミングｔ２の出力電圧Ｖｂを求めて、単位時間当りの電圧変化率ΔＶｘを、
ΔＶｘ＝（Ｖｂ−Ｖａ）／（ｔ２−ｔ１）
によって算出し、この分析対象液の脂質の濃度Ａを、
Ａ＝Ｊ・ΔＶｘ
によって算出し、これを出力装置３７に出力してもよい。
【００５７】
なお、この場合にも、電圧の変化率に対する濃度の比を完全に一定であるとせずに、各濃度において得られた変化率の間を直線あるいは曲線で補間し、この補間データをメモリ３７ａに記憶しておき、分析対象液の測定で得られた変化率に対応する補間データを分析対象液の脂質の濃度Ａとするようにしてもよい。
【００５８】
また、前記説明では、脂質の濃度として液体の単位体積当りの分子数をｐｐｂ（ｐｐｍの１／１０００）単位で求めていたが、脂質の濃度として、単位体積当りの重量をｇ／ｃｍ3 単位で求めてもよく、モル濃度で求めてもよい。
【００５９】
また、プローブ２２の出力電圧の変化は、液体中の脂質の一つの親水基が、プローブ２３の分子膜２５の一つの親水基に対応して吸着されることによって生じるものであるから、濃度の単位を液体中の脂質の電荷密度とすることも可能である。
【００６０】
また、前記説明では、予め分析対象の脂質が既知でその濃度対電圧の関係を示すデータを求めておき、このデータを用いて分析対象液の脂質の濃度を求めていたが、前記したように、プローブ２２の出力電圧の変化は、液体中の脂質の一つの親水基が、プローブ２３の分子膜２５の一つの親水基に対応して吸着されることによって生じるものであるから、分析対象の脂質そのものが不明であっても、電荷密度の判定を行うことができる。
【００６１】
例えば、既知の脂質が既知の濃度で含まれている液体の電荷密度は濃度に比例しているから計算で求めることができ、前記説明の濃度に対する電圧の関係を電荷密度に対する電圧の関係に置き換えてそのデータを予めメモリに記憶しておき、そのデータと分析対象液に対して得られた電圧とから分析対象液の脂質の電荷密度を求めることができる。
【００６２】
また、分析対象の脂質の１分子当りの電荷数が判っていれば、モル濃度を求めることもでき、分析対象の脂質の分子量が判っていれば、単位体積当りの分子数（ｐｐｍ）を求めることができる。
【００６３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、分析対象液に両親媒性物質の分子膜を浸漬し、この分子膜と反対の極性の電荷をもつ分析対象液中の脂質を分子膜に吸着させ、この脂質の吸着による分子膜の電位変化に基づいて、分析対象液中の脂質の濃度分析等を行っている。
【００６４】
このため、従来の分析機器のように操作に熟練を必要せず、短時間に脂質の分析を行うことができる。また、測定条件が判らない脂質であっても、その親水基の電荷の極性さえ判れば、濃度分析等を行うことができ、従来の分析機器では困難であった４級アンモニウム塩等も容易に分析できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態の脂質分析装置の構成を示す図
【図２】分子膜の模式的な構造を示す図
【図３】実施形態の分析方法の手順を示すフローチャート
【図４】分子膜に対する分析対象液内の脂質の動きを説明するための図
【図５】脂質の濃度と測定値との関係を示すデータ
【図６】他の濃度分析方法を説明するための図
【符号の説明】
２０  脂質分析装置
２２  プローブ
２２ａ、２２ｂ  リード線
２３  基準電極
２４  緩衝層
２５  分子膜
２６  基材
２７  緩衝層
２８  電極
２９  支持材
３１  分子
３１ａ  親水基
３１ｂ  疎水鎖
３５  電圧検出器
３６  Ａ／Ｄ変換器
３７  演算装置
３７ａ  メモリ
３８  出力装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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