(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
0004229990.tif 000020
（式中、Ｒ1は直鎖または分枝Ｃ3〜Ｃ6であり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は１個以上の官能基−ＯＨ，−ＣＯＲ4および−ＮＲ5Ｒ6により置換された直鎖または分枝低級炭化水素基であり、Ｒ4は−ＯＨまたは脱離基で、後者はＮ−オキシスクシンイミド、Ｎ−オキシ（スルホスクシンイミド）、イミダゾリル、ペンタフルオロフェノキシ、Ｎ−オキシベンゾトリアゾール、チオ（オキソ）チアゾリジニル、およびＯＲ8から選ばれ、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ−ＣＨ3および−ＣＨ2ＣＨ3から選ばれ、Ｒ8は直鎖または分枝低級炭化水素基であり、ａおよびｃは単結合であり、ｂは単結合または二重結合である）。
【請求項２】
【化２】
0004229990.tif 000021
および
【化３】
0004229990.tif 000022
から選ばれる請求項１記載の化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の少なくとも１種の化合物から誘導され、タンパク質性担体を更に含有する免疫原であって、
【化４】
0004229990.tif 000023
および
【化５】
0004229990.tif 000024
式中、ＢＴＧは牛チログロブリンである、
から選ばれる、上記免疫原。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ベンゾピラン誘導体ならびにこれら誘導体を抗カンナビノイド抗体の製造に使用する方法および生物学的液体試料中のテトラヒドロカンナビノール代謝生成物に対する改良免疫検定法の試薬としてこれら抗体を使用する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マリファナの使用が増大するにつれて、マリファナ植物の主要活性成分であるΔ9 −テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、更に詳しく言えば尿および血液試料中のＴＨＣ代謝生成物、を検出する検定法の開発がなされて来た。最も普通の商業的検定法は、標識したカンナビノイド誘導体を薬物の代謝産物に対する抗体と共に使用する方法を用いている。
【０００３】
実際には、テトラヒドロカンナビノール代謝生成物（グルクロニドおよび他の抱合生成物を含む）を含むと思われる血液または尿試料を、標識カンナビノイド誘導体の存在下に抗体と接触させる。試料中にテトラヒドロカンナビノール代謝物が存在する程度により、抗体の結合部位に対する結合の競合があり、結合したまま残る標識誘導体の量は、試料中のテトラヒドロカンナビノール代謝物との競合の度合に応じて減少するであろう。
【０００４】
幾つかの代表的免疫検定法がO'Connor等、J.Anal. Toxicol.５、１６８（１９８１）、Ｌａｗ等、J.Anal. Taxical.８、１４（１９８４），Childs等、J.Anal. Toxicol.８、２２０（１９８４）、および米国特許第４，８３３，０７３号明細書に記載されている。これら参考文献のすべてに記載されている検定法の基礎は、標識カンナビノイド誘導体の若干を検定試料中の代謝生成物により置き換えることである。標識誘導体が抗体により特異的に認識され、かつテトラヒドロカンナビノール代謝の種々な生成物によって容易に置き換えられるとき最良の検定結果が得られる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
テトラヒドロカンナビノール代謝物に対して広い特異性をもつ抗カンナビノイド抗体がこれら免疫検定法への使用にきわめて望ましい。この抗体はできるだけ多くの主要代謝生成物を認識できなければならない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は式、
【化１５】
0004229990.tif 000002
式中、Ｒ1 は１から９炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基であり、Ｒ2 およびＲ3 はそれぞれ直鎖または分枝低級炭化水素基で、この基は１個以上の下記官能基、
【化１６】
-ＯＨ,-ＣＯＲ4,-ＮＲ5Ｒ6,-ＳＨ,-Ｃ(=ＮＨ)-ＯＲ7,-ＣＨＯ，または＝Ｏ
により置換しうるが、ただしＲ2 またはＲ3 の少なくとも一つは上記官能基の少なくとも一つにより置換されることを条件とし、Ｒ4 は−ＯＨまたは脱離基であり、Ｒ5 およびＲ6 はそれぞれＨおよび直鎖または分枝低級炭化水素基からなる群から選ばれ、Ｒ7 は直鎖または分枝低級炭化水素基であり、ａ、ｂ、およびｃはそれぞれ単結合または二重結合であるが、ただしｂが二重結合であるときａとｃは二重結合でないことを条件とする、
を有する新規ベンゾピラン誘導体に関する。
【０００７】
更に本発明は上記化合物をテトラヒドロカンナビノール代謝物に対する新規抗体の製造に使用する方法ならびにこれら新規抗体を血液または尿試料中のテトラヒドロカンナビノール代謝物の検出のための免疫検定に使用する方法、および新規抗体の製造法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
単一のＴＨＣ免疫原を利用する従来の免疫化研究法は、その交差反応性に一層選択的な抗体を生ずる傾向がある。一般にこのような研究法は、より重要な代謝生成物、即ちΔ9 −１１−ノル−９−カルボキシ−ＴＨＣ（Δ9 −ＴＨＣ酸）、
【化１７】
0004229990.tif 000003
の検出に向けられる。
【０００９】
ＴＨＣ代謝生成物の検出により広い交差反応性が望まれる場合、例えば免疫検定に使用するための場合においては、このようなより広い交差反応性を達成する伝統的方法は、動物で単一免疫原に対するポリクローナル応答を発生させることであった。しかし、このような方法は、可能性の問題として広く交差反応する抗体を得るには至らず、単にこのような抗体を得る機会を増加させただけである。
【００１０】
ポリクローナル抗体とは対象的に、モノクローナル抗体はそれらの分子（抗原）認識において非常に特異的となる傾向がある。モノクローナル抗体のこの特性は、例えばＴＨＣ代謝物の検出の場合のように、広範囲の同様な、しかし同一ではない化合物を認識しうるモノクローナル抗体をつくり出したい場合に困難を生ずる。本発明は、就中、ＴＨＣの主要代謝物を認識するモノクローナル抗体を提供することによってこの問題を解決するものである。
【００１１】
本発明は下記の図を参照すると一層理解し易いであろう。
【００１２】
図１は、特に適当な化合物１−〔３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（化合物Ｘ）、ならびに化合物ＸＶの合成に関与する出発物質と中間体の式を示す。
【００１３】
図２は、特に適当な化合物１−〔３−（３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（化合物XII)、ならびに化合物ＸＶＩの合成に含まれる出発物質と中間体の式を示す。
【００１４】
後に更に詳しく説明する通り、本明細書に教示された新規免疫原および連続免疫処置を用いることにより、通常の期待とは著しく違って、本発明者等は抗カンナビノイドモノクローナルおよびポリクローナル抗体をつくることができた。これら抗体は大抵の重要なＴＨＣ代謝生成物（式II）に対してだけでなく、またＴＨＣの他の主要な代謝生成物に対してもきわめて交差反応性に富んでいる。このことは、本発明者等が以前にポリクローナル抗体について達成されたよりもすべての主要ＴＨＣ代謝物に対し広い交差反応性を有する個々のモノクローナル抗体を誘導するようにマウスのポリクローナル応答を操作した点で予想外のことである。また本発明者等はＴＨＣ代謝物に対し以前に開示されたものよりも良い交差反応性を有するポリクローナル抗体を得た。
【００１５】
本明細書中に開示された新規抗体の活性と優秀さは、ＴＨＣ代謝物に対する商業的免疫検定法（表２）ならびに臨床標品（表３）を用いて試験することにより証明された。
【００１６】
本明細書に記載された新規免疫処置法は、構造的に関連した多重エピトープに対する交差反応性の増加を望む場合に抗体の開発に広く適用できる。
【００１７】
本明細書中で用いた「低級炭化水素基」とは、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和Ｃ1 〜Ｃ6 炭化水素基、とりわけＣ1 〜Ｃ6 アルキルまたはＣ1 〜Ｃ6 アルケニル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、エテニルおよびプロペニル、を意味する。
【００１８】
「脱離基」は例えば適当な求核試薬によって置換あるいは開裂しうる基である。このような脱離基およびそれらの置換条件は当業者にとって公知である〔例えば、J. March, 「Advanced Organic Chemistry」、１７９頁および３１０〜３１６頁（１９８５）参照〕。一般に本発明において興味をもたれる脱離基Ｒ4 は官能基−ＣＯＲ4 のカルボニルへの付着点がヘテロ原子、例えばＯ，ＮまたはＳを介するものである。適当な求核試薬により容易に置換される脱離基の例はＮ−オキシスクシンイミド、Ｎ−オキシ（スルホスクシンイミド）、イミダリル、ペンタフルオロフェノキシ、Ｎ−オキシベンゾトリアゾール、およびチオ（オキソ）チアゾリジニルである。更にまた、本発明の教示に包含される脱離基はＯＲ8 （式中、Ｒ8 は直鎖または分枝低級炭化水素基である）（これらは普通アルキルエステルとして知られている）があり、その置換あるいは開裂は、すぐ上に述べた脱離基よりも幾分か厳しい条件により行なわれる。これら厳しい条件は当業者にとって公知である。（例えば、上記参考文献 J. March 参照) 。
【００１９】
Δ9 −ＴＨＣ酸（II）の外のＴＨＣの主要代謝物は次の通りである：
【化１８】
0004229990.tif 000004
【化１９】
0004229990.tif 000005
【００２０】
これら代謝生成物の構造によって示されるように、親分子の代謝の大部分は８位で、あるいは９位に付くメチル基のところで起こる。また別の代謝もベンゼン環に付くｎ−ペンチル鎖上で起こる。ＴＨＣの代謝は分子のベンゾピラン様の中心部分では殆ど起こらず、これは主要ＴＨＣ代謝物のすべてに共通している。更にＴＨＣ代謝物の多くはグルクロニドとして排泄され、１位（フェノール性の位置）で、あるいは８位か９位で（特に代謝物IIの場合）結合したとき特にそうである。１位にグルクロニドをもつ代謝物は１位で代謝されたとして分類される。
【００２１】
免疫原をつくる目的でカンナビノイド化合物を担体タンパク質に共有結合で接合するとき、担体タンパク質へのカンナビノイド分子上の結合部位は、その結果生ずる抗体の特異性を決定する。担体がカンナビノイド化合物への薬物の９位を経て結合されると、その位置に存在するエピトープは免疫系による検出から遮断されるであろう。９位で代謝された代謝物に対する抗体は発生しないようである。それは免疫系のＢ細胞（その抗原特異的受容体はさもなければカンナビノイド分子のこの部分によって刺激されることになるであろう）がこの位置での立体障害によってその刺激が妨げられるからである。１位エピトープは免疫系により認識されることができるようになり、代謝物の１位亜群に対する抗体が生成されるであろう。
【００２２】
同様に、担体を薬物へ１位を経て結合させると、１位に存在するエピトープは上記と同じ理由で免疫系により認識されることができない。１位に関連する代謝物に対する抗体は１位カンナビノイド接合免疫原から発生することはないようである。更にまた、９位エピトープは免疫系により認識されることができるようになり、代謝物の９位亜群に対する抗体が発生するようである。
【００２３】
本発明の一具体例において、本発明者等はカンナビノイド／ＴＨＣ分子のベンゾピラン中心を保有している新規ＴＨＣ誘導体を開発した。次にこれら基本分子を用いて免疫原をつくり出し、次にこの免疫原を用いてＴＨＣの主要代謝物のすべてに対して高い親和性をもつ交差反応性抗体を発生させる。
【００２４】
本発明に係るベンゾピラン誘導体は上に定義された式（Ｉ）を有する。
【００２５】
特に適当な具体例においては、Ｒ1 は直鎖または分枝Ｃ3 〜Ｃ6 であり、Ｒ2 は−ＣＨ3 であり、Ｒ3 は官能基−ＯＨ、−ＣＯＲ4 および−ＮＲ5 Ｒ6 の１個以上により置換された直鎖または分枝低級炭化水素基であり、Ｒ4 は−ＯＨまたは脱離基で、このものはＮ−オキシスクシンイミド、Ｎ−オキシ（スルホ−スクシンイミド）、イミダゾリル、ペンタフルオロフェノキシ、Ｎ−オキシベンゾトリアゾール、チオ（オキソ）チアゾリジニル、および−ＯＲ8 から選ばれ、Ｒ5 およびＲ6 はそれぞれＨまたは低級炭化水素基で、−ＣＨ3 または−ＣＨ2 ＣＨ3 が最も好ましく、Ｒ8 は直鎖または分枝低級炭化水素基であり、ａおよびｃは単結合である。
【００２６】
最も好ましくは、Ｒ1 は直鎖Ｃ3 〜Ｃ6 であり、Ｒ2 は−ＣＨ3 であり、Ｒ3 は１個以上の−ＯＨまたは−ＣＯＲ4 により置換された直鎖低級炭化水素基であり、Ｒ4 は−ＯＨ、Ｎ−オキシスクシンイミドおよび−ＯＲ8 からなる群から選ばれ、各Ｒ7 およびＲ8 はそれぞれ−ＣＨ3 および−ＣＨ2 ＣＨ3 から選ばれ、ａとｃは単結合である。
【００２７】
式Ｉを有する最も好ましい化合物は
【化２０】
0004229990.tif 000006
を包含する。
【００２８】
式Ｉを有する化合物は、化学合成の分野でよく知られた方法により製造できる。これらは、例えば適当な５−アルキル置換１，３−ジヒドロキシベンゼンを、適当に更に官能基化した、あるいは適当に更に置換した３−ケトアルカノエートエステル、例えばFahrenholtz 等によりJ. Amer. Chem. Soc.,１９６７、８９、５９３４〜５９４１に、あるいはArcher等によりJ. Org. Chem.,１９７７、４２、２２７７〜２２８４に例示された２−アセチルアルカンジオエートと最初に縮合させてクマリンを得、次にこのクマリンをそのエステル官能基のところで更に変換し（例えば酸への加水分解又はアルコールへの還元など）、そしてクマリン核のところで、置換ベンゾピランを得る。上記のこれら方法は前記Fahrenholtz によりまた前記Archerにより例示される。次に酸をこの分野でよく知られた方法により、活性化されたエステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含めてエステルに、あるいはアミド、例えばイミダゾリルアミド、に変換できる。このような縮合、例えばFahrenholtz （前記）により、またArcher（前記）により記述された一般的方法に、種々な５−置換１，３−ジヒドロキシベンゼンおよび更に置換された、あるいは官能基化された３−ケトアルカノエートを使用できる。この方法は後述の例１、例２、例７、例８および例９に詳しく示されている。
【００２９】
更に、式Ｉの化合物はクロマノン類、例えば適当に置換された３−クロマノン（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−オン）または適当に置換された４−クロマノン（２，３−ジヒドロ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、からこの分野で公知の方法により得られる。３−クロマノン類および４−クロマノン類の合成は、有機合成分野で公知であり、それらの合成に対して種々な一般的方法が知られている。例えば、Lockhart I.M. 「Chromenes, Chromanones, and Chromones,」The Chemistry of Heterocyclic Compounds,３１巻、Ellis,G.P.（編）、John Wiley & Sons, Inc.,  １９７７， Chapters III, IV およびＶ参照。代表例として、適当な４−クロマノン、例えば
下記構造（Ib) ：
【化２１】
0004229990.tif 000007
式中、Ｒ1 は上に定義したものと同じ意味を有する（例えば、Fahrenholtz 等、上記；Arnoldi, Synthesis, １９８４，８５６−８５９；Arnoldi 等, J. Med. Chem.,  １９９０，３３，２８６５〜２８６９）またフェノール性ヒドロキシを、例えばシリル化またはエーテル化により適当に保護する、を有する２，２−ジメチル−５−ヒドロキシ−７−Ｒ1 −１−ベンゾピラン−４−オンを、この分野でよく知られた方法により、その３位のところで適当な置換または非置換アルキル試薬でアルキル化し、続いてその４−ケト基のところで適当なWittig試薬を用いて、これもまたこの分野でよく知られた方法により、Wittig反応を行なうことにより、保護基の除去後４位にｅｘｏ二重結合をもつ、即ち式Ｉにおけるｃが二重結合である式Ｉの化合物を得ることができる。
【００３０】
もう一つの代表例として、フェノール性ヒドロキシを先ず保護した化合物（Ｉｂ）を、この分野でよく知られた方法により、アルキル鎖上に更に保護置換基をもつ適当なアルキルアルデヒドと縮合させることにより３位に二重結合を経て置換アルキル基をもつ４−クロマノンを得ることができる。この結果得られる化合物を、次に４−ケト基のところで適当なWittig試薬と反応させることにより、保護基の除去後に、３位および４位両方にｅｘｏ二重結合を有する、即ち式Ｉ中のａとｃが二重結合である、式Ｉのベンゾピランを得ることができる。
【００３１】
更にもう一つの例として、適当な４−クロマノン、例えば上記式（Ｉｂ）の化合物（式中、フェノール性ヒドロキシは適当に保護されている）を、この分野で公知の条件下で、その４−ケト基のところで適当なアルキル有機金属試薬、例えばメチルリチウムなどと反応させることにより、第三級アルコールを得、次にこれをこの分野で公知の方法により対応する３，４−デヒドロ化合物へ脱水することができる。次に、得られた化合物を、この分野で公知の方法により、その３，４−二重結合のところでエポキシ化し、そのエポキシドを適当なLewis 酸、例えば三フッ化ホウ素エーテレートなどによる触媒作用の下で転位させることにより４位アルキル基をもつ対応する３−クロマノンを得ることができる。この化合物を次に３−ケト基のところで適当なWittig試薬と反応させ、続いて保護基を除去することにより、３位にｅｘｏ二重結合を有する、即ち式Ｉ中のａが二重結合である、式Ｉの化合物を得ることができる。
【００３２】
上記の例は例示に過ぎず、適当な３−クロマノンおよび４−クロマノン、ならびにクマリン類を合成する他の別法も有機合成の当業者の頭に浮ぶであろう。
【００３３】
更に、該化合物のＣ−３またはＣ−４のところの置換基上にアミノ官能基をもつクマリン類（従って、ベンゾピラン類）も、対応するアミノ置換３−ケトアルカノエート（そのアミノ官能基は適当な基または基群により、例えば環状ビス−シリル化により、あるいは適当なカルバメートまたはアミドまたはフタルイミドに変換することにより保護できる）を用いることにより得られる。アミノ官能基をクマリンあるいはベンゾピランのＣ−３またはＣ−４におけるアルキル置換基上に、例えばヒドロキシアルキルクマリンまたはペンゾピランのアミン求核試薬による求核置換によって（アルキルヒドロキシを、例えばトシルまたはメシル基に変換することにより脱離基に変えて活性化する）導入する他の別法は当業者にとって自明である。
【００３４】
クマリンからベンゾピランへの変換も当業者にとって公知の方法により達成される。これらの方法は後述の図１および図２に例示されている。
【００３５】
ベンゾピランのＣ−３またはＣ−４のところのアルキル基置換上にアルデヒド（−ＣＨＯ）またはケト（−Ｃ（＝Ｏ）−）官能基を有するベンゾピラン類は、対応するヒドロキシ化合物から、適当な試薬、例えば二クロム酸ピリジニウムまたはクロロクロム酸ピリジニウムを用いて適当な溶媒、例えばジクロロメタン、中で酸化することにより得られるが、この場合ベンゾピランのフェノール性ヒドロキシを先ず適当な保護基により、例えば立体障害をもつシリル基、例えばtert−ブチルジフェニルシリル基、でシリル化することにより保護する。
【００３６】
更にまた、Ｃ−３またはＣ−４の置換基上にチオール（−ＳＨ）官能基をもつベンゾピラン類は、対応するヒドロキシアルキル化合物から、この分野で公知の方法により、例えばチオ尿素と反応させ続いて加水分解するか、またはヒドロキシ基をトシレートまたはメシレート基に変えて活性化し、続いて適当なチオール求核試薬、例えばチオ酢酸、と反応させ続いて加水分解することにより得られる。
【００３７】
Ｃ−３またはＣ−４における置換基上に−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＣＨ3 または−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＣＨ2 ＣＨ3 といったイミデート官能基をもつベンゾピラン類は、対応するニトリル（シアノ）化合物を適当なアルコール、例えばメタノールまたはエタノール、中ＨＣｌで処理することにより得られる。かわって、このようなニトリルは対応するヒドロキシアルキル化合物から、この分野で公知の方法により、例えば活性化剤、例えばトリフェニルホスフィン、の存在下シアン化物、例えばシアン化ナトリウム、との反応により、あるいはヒドロキシをトシレートまたはメシレートに変えて活性化し、続いてＤＭＳＯまたはＤＭＦといった適当な溶媒中シアン化ナトリウムとの反応により得ることができる。−ＳＨまたは−ＣＮ〔従って、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＣＨ3 または−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＣＨ2 ＣＨ3 〕基を導入する他の方法、例えば対応するハロゲン化物（−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉ）化合物の求核置換反応による方法、ならびにこのような官能基間の相互変換は化学合成の当業者にとって明白であろう。
【００３８】
抗体を誘発するために免疫原として使用する場合、式Ｉの化合物は任意に結合基を介して、Ｒ2 またはＲ3 のいずれかを介して、担体成分と結合させホストへの免疫原の供給を助ける。
【００３９】
本発明に係る特に適当な免疫原は下記の式（Ｉａ）、
【化２２】
0004229990.tif 000008
式中、Ｒ1 は上記の意味をもち、Ｒ2 ′は直鎖または分枝低級炭化水素基であり、Ｒ3 ′は直鎖または分枝低級炭化水素基で、このものは−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ5 −、−ＮＲ6 −、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−ＣＨ＝、−ＣＨ2 −によって置換され、Ｒ5 およびＲ6 は上記の意味を有し、Ｙは結合基または結合であり、Ｚは担体であり、ａ、ｂ、およびｃは上記の意味をもつ、
の構造を有する。
【００４０】
本明細書中で用いた「担体」という用語はホスト動物における免疫原応答を独立的に誘発する性質を有し、かつ式（Ｉ）の上記ベンゾピラン誘導体（「ハプテン」）へ共有結合で結合させうる物質を包含する。適当な担体物質は、例えばタンパク質、天然または合成重合体化合物、例えばポリペプチド、例えばポリリジンまたは他のアミノ酸の共重合体、多糖類などである。特に適当な担体物質はタンパク質およびポリペプチドであり、特にタンパク質がよい。
【００４１】
本発明に係る免疫原の調製に利用されるタンパク質材料の実体に特に制限はない。本発明の実施に有用な適当なタンパク質の例は哺乳動物血清タンパク質、例えばチログロブリン、血清アルブミン、グロブリンおよびヘモシアニン、例えばヒトガンマ−グロブリン、ヒト血清アルブミン、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ、牛チログロブリン（ＢＴＧ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化牛血清アルブミン、家兎血清アルブミンおよび牛ガンマ−グロブリンである。他のタンパク質生成物も当業者に示唆されるだろう。一般に、カンナビノイド代謝生成物あるいは誘導体に対する抗体を誘発させようとする動物ホストにとって異質のタンパク質を利用するのがよいが、必ずしも必要でない。
【００４２】
「担体」が一般に使用されるのは低分子量化合物（この場合ハプテン）をそれ自身で投与したとき普通は免疫原性でないからである。担体をハプテンに接合し、その接合体を免疫原として用いる場合、ハプテン単独による免疫処理によってはつくり出すことのできないそのハプテンに対する抗体を発生させることができる。これは「担体効果」として知られている。
【００４３】
「結合基」はこの分野で公知であり、ハプテンと担体分子との間に更に間隔をとるために常用される。結合基の使用は特定のハプテンと担体の対によって有利であることもあるいは必要であることもあればそうでないこともあり、適当な結合基の選択は当業者の裁量にある。例えば、米国特許第５，１４４，０３０号明細書（コラム１６、１行以下）および米国特許第５，２３７，０５７号明細書（コラム２）参照。典型的結合基は１から２０炭素原子および０〜１０ヘテロ原子（例えば、ＮＨ，Ｏ，Ｓ）を有し、直鎖でも分枝鎖でもよい。化学的に融和しうる原子の組み合わせだけが結合基となることができる、例えば担体およびハプテンと共有結合形成を可能にすることは当業者にとって公知である。
【００４４】
式Ｉａの免疫原は式Ｉの化合物からこの分野で公知の技術により担体へ共有結合カップリングによりつくられ、その正しい選択はベンゾピラン誘導体中のまた担体分子中の、カップリングに利用できる官能基の性質によって決まるであろう。タンパク質性担体に及ぼす有害な影響を最小にするように温和な条件下で、ハプテン（式Ｉの化合物）の十分な度合のカップリングを確保するためには、カップリングに先立ち、Ｒ3 が酸基で終る式Ｉの化合物（「ハプテン」）（式ＸＶおよびＸＶＩの化合物）を単離可能な活性形に変換することが望ましい場合が多い。ハプテン遊離酸の一つの特に適当な単離できる活性形はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、式ＸおよびXII の化合物）である。米国特許第４，３２９，２８１号明細書（コラム２〜３）参照。
【００４５】
更にまた、式Ｉのハプテンと担体との反応はカルボジイミドのようなカップリング剤を用いて行なうこともできる。例えば、カルボキシ置換基を有するハプテン（例えば、式ＸＶおよびＸＶＩの化合物）は、カルボジイミドの存在下でリジン残基のε−アミノ基のようなアルキルアミノ基をもつタンパク質と結合させることができる。このときカルボジイミドはこのようなハプテンのカルボキシ基を活性化し、それによってタンパク質のアミノ基と反応できるようにする働きがある。
【００４６】
別法として、この分野で周知の一代表例として、活性化されたカルボキシ基をもつハプテン、例えば、Ｎ−オキシスクシンイミジルカルボキシレート（これに限定しないが）をチログロブリンのようなタンパク質のリジン残基のε−アミノ基と反応させることができる。
【００４７】
更にまた、これも当分野で周知の手順により、イミデート基をもつハプテンをこのようなタンパク質のリジン残基のε−アミノ基と反応させることができる。
【００４８】
アルデヒド基をもつハプテンはリジン残基のε−アミノ基に直接結合させることによりイミン結合を形成させることができ、そしてこの結合は水素化シアノホウ素ナトリウムのような適当なボロハイドライドで対応するアルキルアミンへ還元することにより安定化できる。他方、アルデヒド基またはケト基を有するハプテンは結合基、例えばカルボキシメトキシルアミンのような適当なアルコキシアミンと結合させて対応するカルボキシ官能基をもつオキシムをつくり、これを例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換することにより活性化し、次いでこのものをタンパク質にカップリングさせることができる。上記化学過程は化学合成の分野においてもよく認識されている。
【００４９】
チオール官能基をもつハプテンはマレイミド基のようなチオール反応性基をもつタンパク質と反応させることができ、そしてこれは米国特許第５，２３７，０５７号明細書に例示されている通りである。
【００５０】
上記説明は単なる例示であり、このほかにハプテンをタンパク質またはポリペプチドへカップリングさせる種々な方法は当業者にとって公知である。例えば、米国特許第５，１４４，０３０号明細書（コラム１６）参照。
【００５１】
本発明のもう一つの具体例によると、式Ｉの化合物の少なくとも一つから誘導される免疫原を用いることにより、ホスト動物においてテトラヒドロカンナビノール代謝物に対し特異的な抗体の生成を誘導する（「誘発する」）。
【００５２】
抗体を誘発させるための種々な方法がこの分野で知られている。このような抗体を発生させる免疫原の合成に関する議論および手順が、例えば米国特許第５，１４４，０３０号、米国特許第４，４３８，２０７号、米国特許第４，８３３，０７３号および米国特許第５，２２３，４４１号明細書に記載されている。例えば、なるべくはフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントなどといった通常の補助剤を使用してホスト動物に免疫原を注射する。この目的に適したホスト動物として、例えば家兎、ウマ、ヤギ、モルモット、ラット、ウシおよびヒツジといった哺乳動物があげられる。この結果得られた抗血清は抗カンナビノイド抗体と呼ばれる抗体を含み、このものはテトラヒドロ−カンナビノール代謝生成物を選択的に複合体を形成するであろう。その抗血清が免疫検定に使用するのに適当かどうかは日常的実験の実施によって迅速に確かめることができる。
【００５３】
本発明による特に適当な具体例においては、各ホストを３種の異なる免疫原で連続的に免疫処置する。各免疫原はＴＨＣの異なる「代謝生成物」に相当している。重要なことは、動物の免疫系が１位または９位カンナビノイド、あるいはベンゾピラン様誘導体に各サイクルで１回以上暴露されないように、３種の選ばれた異なる免疫原（例えば、下記の式VIII、IX、およびＩａ、とりわけＸａまたはＸＩＩａの化合物）、
【化２３】
0004229990.tif 000009
で動物を連続して免疫化することにより、動物の免疫応答をすべての主要なＴＨＣ代謝生成物に共通の非代謝ベンゾピラン様領域に集中できることである。この連続的免疫処置により、高い交差反応性をもつモノクローナル抗体の製造をきわめて順調に行なうことのできるハイブリドーマ融合物が得られる。この研究法を後の例１７で実証する。
【００５４】
同様にして、ポリクローナル抗体も式Ｉの化合物を含む免疫原を用いることにより順調に誘発させることができる。選ばれた免疫原を用いるポリクローナル抗体の発生はこの分野で公知である〔例えば、Chase, M.W. The Production of Antiserum, Methods in Immunology and Immunochemistry，  １巻、１９７〜２０９（１９６７）参照〕。
【００５５】
式Ｉの新規化合物を含むここに記載の新規免疫原を用いることにより、本発明者等は以前に報告されたより主要ＴＨＣ代謝物に対し高度の交差反応性を有する抗体を一貫して製造できた。本発明者等は、式Ｉのベンゾピラン芯化合物を含む新規「切頭形カンナビノイド」免疫原、例えばベンゾピラン含有免疫原ＸａおよびＸＩＩａ、を含めることが、生ずる抗体の特異性をカンナビノイドの芯ベンゾピラン部分に向かって方向づけすることにより、これら抗体がすべての主要ＴＨＣ代謝物に対して広い交差反応性を確実にもつように作用することを示した。
【００５６】
本発明に係る抗体は、ＥＬＩＳＡ検定で測定したとき（代謝生成物IIの交差反応性を１００％の値とするよう定義する）６個すべての主要ＴＨＣ代謝生成物（即ち、代謝生成物II, III, IV,Ｖ, VIおよびVII)、併合（各個の代謝生成物と対照的に）、に対し少なくとも約８０％の平均交差反応性を有する。
【００５７】
本発明の特に適当な一具体例においては、代謝物IIが抗体に対し１００％の交差反応性をもっと定義して、この抗体は与えられたＴＨＣ代謝物の各々に対し代謝物IIと比較して下記の交差反応性を有する。
【表２】
0004229990.tif 000010
【００５８】
本明細書中に教示された手順により得られる抗体が、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定）ミクロタイタープレートにより検定したとき、主要ＴＨＣ代謝生成物に対して高い交差反応性をもつという事実を下記の表１で実証する。
【００５９】
表１中、「ＣＲ％」は一つの交差反応体（即ち、薬物）が他の交差反応体と比較して、９６−穴ミクロタイタープレートに固定された抗体を置換する能力の尺度である。ＣＲ％は例１７ｄに示したようにして計算した。「Ｄ％」は抗体がミクロタイター穴に結合するのを追い出す薬物の能力の直接の尺度である。
【００６０】
下記表１に示すように、本発明に係る２種の新規ベンゾピラン免疫原ＸａとＸＩＩａにより、単独で（表のセクション１、方法Ａ）あるいは本発明に係る他の免疫原と共に（表のセクション３、方法Ｂ）誘発された抗体は、一つの「完全三環式カンナビノイダル」免疫原（例えば、免疫原XIII、表のセクション２）で誘発された抗体あるいは２個の「完全三環式カンナビノイダル」免疫原（IXおよびVIII、表のセクション４）によって誘発された抗体よりも一貫して良いＣＲ％およびＤ％値を示している。
【００６１】
表１の一番下（セクション５）に、単一「完全三環式カンナビノイダル」免疫原、即ち免疫原VIIIを用いてマウスを免疫化したときの最良の結果を含めてある。上記の通り、方法Ａ、１個の免疫原で多重追加免疫を用いて誘発させた抗カンナビノイドモノクローナル抗体により示された交差反応性は、新規ベンゾピラン免疫原を用いる本明細書中に記載の多重免疫原媒介エピトープ選択法（方法Ｂ）から誘導された表１に示すクローンにより実証された反応性よりも劣る。
【００６２】
抗体プールをスクリーニングする際、主要ＴＨＣ代謝物（式IIの化合物）に対する交差反応性を第一の選択基準とした。
【００６３】
連続免疫処理スキームにおいて、「完全三環式カンナビノイダル」免疫原（IX) および（VIII) 二つだけを用いても、種々な代謝生成物に対し求める交差反応性の体制を有する対カンナビノイドモノクローナル抗体を生じなかった。二つの最も良いクローンを表１、セクション４に示す（クローン１７−４Ｆ１２と１７−５Ｇ１２）。これら二つのクローンは主要代謝生成物（II）に対し良好な交差反応性を示すが、他の代謝生成物に対しては中程度ないし弱い交差反応性を示すに過ぎない。下記表１セクション４参照。
【００６４】
更にまた、標準多重追加免疫による免疫化プログラムにおいて、ベンゾピラン免疫原（Ｘａ）または（ＸＩＩａ）いずれか単独での使用は、すべてのＴＨＣ主要代謝物に対し非常に良い、交差反応性を示すポリクローナル抗血清を与えることが注目される。表１、セクション１参照。これら結果は、ベンゾピランの「芯」をもつ化合物（即ち、代謝物IIから代謝物VII)の認識が、ここに開示された新規免疫原を用いる本発明方法に従いつくられる新規抗体に実際に誘発されつつあることを確証している。
【００６５】
本発明方法に従いつくり出された抗カンナビノイド抗体は、種々な免疫検定法においてテトラヒドロカンナビノール代謝物の検出に使用できる。このような免疫検定法は遊離溶液または固体相いずれかの放射線免疫検定法の形式をとることができるであろう。別法として、酵素免疫検定法を実施することもできるが、この場合にも遊離溶液または固体相いずれかの形式をとるであろう。固体相検定法は、抗体またはカンナビノイド標識いずれかを固定した膜または粒子のような固体支持体を用いて実施できる。そのように被覆できる粒子は、例えばラテックスビーズ、リポソーム、赤血球、ポリアクリルアミドビーズ、ポリスチレンビーズあるいは幾つかの他の適当な重合体のいずれかから作られたビーズを包含する。免疫検証は抗カンナビノイド抗体に対して方向づけられた第二の抗体を適用して、直接的でも間接的でもよい。
【００６６】
ＴＨＣに対する免疫検定法は一般にある限られた量の抗体に対し標識薬物および未標識薬物および臨床試料からの代謝生成物の間の競合的結合に基づいている。臨床試料からの遊離薬物または代謝物は抗体に対する標識薬物の結合を阻害するであろう。抗体に対する標識薬物の結合を臨床試料が阻害する程度は臨床試料中に存在する薬物の量の直接の測定値となる。
【００６７】
本発明の特に適当な一具体例においては、ＴＨＣあるいはその代謝物を含むと思われる試料を、抗体存在下ラテックス微粒子上に固定された既知量のカンナビノイド化合物と混合する。ラテックスが抗体により橋かけされる度合は臨床試料中に存在する薬物または代謝物の量に逆比例する。薬物または代謝物が多く存在する程起こる橋かけは少ない。標品を標準曲線との比較により定量的に陽性と確認することができる。
【００６８】
下記の表２は、本明細書に記載された三重連続免疫化法を用いることにより誘導された新規クローン（ＭｏＡｂ  １１Ａ６）がいかにカンナビノイドに対する実際の商業的検定法、ABUSCREEN TM  100  TEST ONLINETM Kit (Roche Diagnostics Systems Inc., ブランクブルグ、ニュージャージー州、ＵＳＡ）でよく働いているかを説明している。例２０はＲｏｃｈｅの商業的 ABUSCREENTM 100 TEST ONLINETM Kitに含まれる試薬を記述したものであるが、ただしその抗体を本発明に係る新規抗体により置き換えてある。Roche Diagnostic Systemsの現行の標識した微粒子を使用する検定で、幾つかの主要ＴＨＣ代謝物に対して得られた「実際の」交差反応性は表２に示す通りであるが、一方臨床試料の読み（そのすべてはＧＣ／ＭＳによりΔ9 −ＴＨＣ酸に対し陽性であった）は表３に示す。両方の表はまた単一免疫原（免疫原（VIII))による免疫化から誘導されたモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ  １１Ｅ．２）を用いた対応する結果も報告している。
【００６９】
表２中、ＭｏＡｂ  １１Ｅ．２はＩｇＡ（二量体）抗体であり、他方ＭｏＡｂ１１Ａ６はＩｇＧ（単量体）抗体である。ＭｏＡｂ  １１Ａ６を用いる場合現行の商業的検定法に含まれる微粒子を凝集させるためには、抗ＩｇＧ抗体（例えば、Biodesign Int., Kennebunk,  メイン州  ０４０４３，ＵＳＡから市販されている）を含めることが必要である。
【００７０】
表２中のデータは、実際の商業的検定法において、幾つかの主要ＴＨＣ代謝物に対する新規ＭｏＡｂ  １１Ａ６の交差反応性が現在の商業的ＭｏＡｂ  １１Ｅ．２により示される反応性よりもかなり高いことを示している。同様に、表３中の臨床結果は、ＭｏＡｂ  １１Ａ６を使用した場合試料中の検出されるカンナビノイドの相対的濃度がすべてにおいて高いことを示しているが、ただし本質的に濃度が同じである一つのケースは除外してのことである。平均値（即ち、検定法の「感度」）もＭｏＡｂ  １１Ａ６を用いた場合により高かった。これらの高い数値が重要なのは、新しい抗体がカンナビノイドの検定において陽性試料の「ピック・アップ・レート」を増加させる（即ち、より多数の陽性試料を正確に検出する）ことを意味するからである。
【００７１】
本明細書中に開示された抗体および新規化合物は、一つのキットの同じ容器あるいは異なる容器中の単独で、あるいは他の試薬と一緒に包装するのが便利である。例えば、キットは本発明に係る抗体、標識ＴＨＣ試薬あるいは標識ＴＨＣ代謝物試薬、および既知量のΔ9 −ＴＨＣ酸を含むことができる。
【表３】
0004229990.tif 000011
【表４】
表      ２  
0004229990.tif 000012
＊定義により、
§（VIII) 単独による免疫処置から得る。これはＩｇＡである。
¶（VII), (IX), および（Ｘａ）による「三重連続免疫処置」から得る。これはＩｇＧ。
【表５】
表      ３  
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§（VIII) 単独による免疫処置から得る。これはＩｇＡである。
¶（VIII), (IX),および（Ｘａ）による「三重連続免疫処置」から得る。これはＩｇＧである。
＠  主要代謝物（標準）Ｄ9 −１１−ノル−９−カルボキシ−ＴＨＣ（II）に対する値。
【実施例】
下記の例は、本発明に係る幾つかの新規ベンゾピラン誘導体の合成法、これら化合物を新規免疫原の発生に使用する方法、およびこれら免疫原をＴＨＣ検出検定に有用な新規抗体の発生に使用する方法を例示するものであるがこれらに限定されることはない。
【００７２】
一般的実験
下記の例に使用する無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジエチルエーテル（Ｅｔ2 Ｏ）は、アルゴン下でナトリウム−ベンゾフェノンケタールからの蒸留により得た。
【００７３】
無水塩化メチレン（ＣＨ2 Ｃｌ2 ）はアルゴン下で水素化カルシウムからの蒸留により得た。
【００７４】
分取用層クロマトグラフィー（ＰＬＣ）シリカゲルプレート、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）シリカゲルプレート、およびフラッシュ等級シリカゲルはＥＭ  Science から得た。
【００７５】
例  １
５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの合成
５−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸（Fahrenheltz 等、１９６７，J. Amer. Chem. Soc.,８９，５９３４−５９４１）３０ｇ（９４．２ミリモル）を無水ＴＨＦ６００ｍｌに溶かした溶液をアルゴン下氷−塩浴中で−１０℃に冷却した。かきまぜた溶液へ、ＢＨ3 ．ＴＨＦ（Albrich)のＩＭ溶液２１０ｍｌ（２．２当量）を、反応温度を約−６℃に保ちながら滴加した。添加終了時、反応物を冷却しつつ４時間かきまぜ、次に温度を０℃未満に保ちながら氷冷した２Ｎ  ＨＣｌ水溶液９００ｍｌで失活させた。得られた混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、有機相を半飽和食塩水で２回、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた固体をＥｔ2 Ｏとすりまぜ、濾過して１８．８ｇ（６５％）の５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンを灰色固体として得た。ＨＲＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ ，３０４．１６７５；実測値，３０４．１６７５。
【００７６】
例  ２
５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールの合成
ｉ）無水ＴＨＦ２０ｍｌ中５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン  ２００ｍｇ（０．６６ミリモル）の溶液へ、アルゴン下で還流しつつ、Ｅｔ2 Ｏ中臭化メチルマグネシウム（ＭｅＭｇＢｒ）（Aldrich)の３Ｍ溶液（無水Ｅｔ2 Ｏで２０ｍｌに希釈）１．０ｍｌ（〜４．５当量）を約２０分にわたり滴加し、反応物を還流煮沸した。無水Ｅｔ2 Ｏ  ８ｍｌおよび無水ＴＨＦ  １０ｍｌで希釈したＭｅＭｇＢｒ（Aldrich)の３Ｍ溶液更に２ｍｌ滴加し、反応物をアルゴン下で２時間還流煮沸した。加熱を止め、反応物を室温（ＲＴ）まで冷却し、過剰の冷ＩＮ  ＨＣｌで失活させ、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を減圧下で蒸発させ、残留物を５０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶離するＰＬＣに付し、回収された出発物質８５ｍｇ（４２．５％）および極性の小さい生成物帯からの求める生成物４２ｍｇ（１５％）を得た。この物質を１：１  ＣＨＣｌ3 −ＥｔＯＡｃで溶離するＰＬＣに再びかけて３２ｍｇのきれいな５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールを得た。ＨＲＥＩＭＳ：計算値Ｍ+ 、３１８．２１９５；実測値、３１８．２１９１。
【００７７】
ii) 別法による合成
無水Ｅｔ2 Ｏ  ６０ｍｌおよび無水ＴＨＦ  １５ｍｌで希釈したＭｅＭｇＢｒ（Aldrich)の１Ｍ溶液１５ｍｌをアルゴン下で還流下に煮沸させた。次に、乾燥ＴＨＦ  ６０ｍｌ中５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン  １．０ｇの溶液をこの反応混合物へ１時間にわたり滴加し、煮沸を計４時間続けた。反応混合物を室温に一晩冷却し、沸騰状態に戻し、煮沸を更に２時間続けた。次に加熱を止め、反応物を室温まで、次に氷浴中で冷却し、激しくかきまぜながら、氷冷１Ｎ  ＨＣｌ  １２０ｍｌを注意深く加えることにより失活させた。反応物は黄色に変化し、次に紫色がかって多量の固体沈殿を生じ、その後再び黄色に変り、溶液は澄んだ。次に氷冷６Ｎ  ＨＣｌ  ４０ｍｌを加え、混合物を氷浴中で１５分かきまぜた。次に冷却を止め、絶えずかきまぜながら混合物を室温に到達せしめ、生じた深黄色溶液をＥｔＯＡｃ（１×２００ｍｌ、１×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を半飽和ＮａＣｌ水溶液（３×１００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１×１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、減圧下で蒸発させることにより着色シロップを得た。残留物をＥｔＯＡｃ約２０ｍｌとかきまわして灰色固体を含む透明な、うすく着色した溶液を得た。混合物を濾過して２７４ｍｇの回収出発物質を得、濾液から溶媒を減圧下で除いて７６０ｍｇの生成物含有物質を得た。この物質を再び少量のＥｔＯＡｃとすりまぜ、再び濾過して更に１５９ｍｇの回収出発物質を固体として得た。濾液から溶媒を除いて６００ｍｇの残留物を得、これを１：１  ＣＨＣｌ3 −ＥｔＯＡｃで溶離するＰＬＣにかけた。プレートのおよそ中間の生成物帯を単離し、シリカを１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃで洗浄し、洗液を減圧下で蒸発させることにより２４３ｍｇの求める生成物、即ち５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノール、を得た。
【００７８】
例  ３
５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールの製造
無水ＤＭＦ（Aldrich)１０ｍｌ中５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノール  １．９６ｇ（６．１６ミリモル）の溶液へ、アルゴン下室温において、水素化ナトリウムの６０％分散液（Aldrich)２６０ｍｇ（〜１．０５当量）を加え、混合物をアルゴン下室温において発泡が止み、溶液が透明な黒ずんだ着色溶液となるまでかきまぜた。このかきまぜた溶液へ０．５５ｍｌ（〜１当量）のメトキシメチルクロリド（Aldrich,  ８５％純度のテクニカル品等）を、注射器により針先を溶液の表面下に入れて直接溶液中に加えた。反応混合物の色が消え、１分以内に沈殿を生じた。かきまぜを０．５時間続けた。次に溶液の半分を他の反応に使用するため注射器で抜いた。残り半分を飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液５０ｍｌとＥｔＯＡｃ  １００ｍｌとの混合物中に注入し、混合物をよく振りまぜ、十分量の水を加えて生じた固体を溶かし、透明な２相が得られるようにした。相を分離し、有機相を半飽和ＮａＣｌ水溶液（２×５０ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１×５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、減圧下で蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥することにより、１．０５ｇ（〜９４％）の求める生成物５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールを油状物として得た。このものは 1Ｈ−ＮＭＲにより高純度であることが示された。
【００７９】
もう一つの反応から採取された物質を３０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶離するＰＬＣにより更に再精製して５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールを得た。このものはすぐ前のパラグラフで述べたように単離された物質のスペクトルと同じＮＭＲスペクトルを有し、またＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、３６２．２４５７；実測値、３６２．２４４１を有した。
【００８０】
例  ４
５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸の製造
例３で注射器により抜き取った５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールを含む最終反応混合物の半分（フラスコに入っている）へ、更に２０ｍｌの無水ＤＭＦ（Aldrich)を加えた。このかきまぜた溶液へ４．０ｇの二クロム酸ピリジニウム（Aldrich)を一時に加え、黒ずんだ色の溶液をアルゴン下室温で約１４時間かきまぜた。次に反応混合物を２００ｍｌの水で希釈し、かきまぜ、そしてＥｔＯＡｃ（１×１５０ｍｌ、１×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を水（２×５０ｍｌ）、半飽和ＮａＣｌ水溶液（２×５０ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１×５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、減圧下に蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥し約０．９ｇの褐色を帯びたシロップを得た。この物質をフラッシュ等級シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーにかけ、先ずＣＨＣｌ3 で、次に５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3 で溶離した。生成物を含むフラクションを単離することにより、フラクションの主カットから、溶媒の蒸発と高真空下での乾燥の後に、２３２ｍｇの求める生成物５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸を得た。生成物フラクションの主カットの先行フラクションから溶媒を除去し、残留物を５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3 で溶離するＰＬＣにより更に精製し、その生成物帯から更に３２ｍｇの求める生成物５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸を得た。ＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、３７６．２２５０、実測値、３７６．２２４６。
【００８１】
例  ５
５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸の製造
アルゴン下ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（ＭＣＢ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）６０ｍｌ中５−（メトキシメトキシ）−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸  ０．５５ｇ（１．６５ミリモル）の溶液へ、パラ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（Aldrich)４．１６ｇ（１０当量）を加え、反応混合物を１時間還流煮沸した。反応混合物を氷−水浴で冷却し、次にＥｔＯＡｃ  ５００ｍｌと水１００ｍｌとの間に分配した。相を分離し、有機相を水（５×１００ｍｌ）、半飽和ＮａＣｌ水溶液（１×１００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１×１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、減圧下で蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥することにより着色固体を得た。この固体を再溶解させ、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3 で溶離するフラッシュ等級シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにかけた。生成物を含むフラクションを合わせ、溶媒を減圧下で除き、高真空下で乾燥後、１４３ｍｇの５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロバン酸をガラス／無定形固体として得た。ＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、３３２．１９８８；実測値、３３２．１９８５。
【００８２】
例  ６
ハプテン１−〔３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（Ｘ）の製造
ｉ）アルゴン下無水塩化メチレン中酸５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸６ｍｇ（０．０１８ミリモル）の溶液へ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Aldrich)１０．３ｍｇ（５当量）を、続いて１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）（Sigma)８．６ｍｇ（２．５当量）を加えた。アルゴン下に室温で４時間かきまぜた後のＴＬＣはごく痕跡量の出発物質が残存することを示した。反応混合物を５０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶離するシリカゲル板上のクロマトグラフィーに直接かけた。生成物帯を単離し、少量のＥｔＯＡｃで洗浄し、洗液から減圧下に溶媒を除き、残留物を高真空下で乾燥させることにより５ｍｇ（６５％）の１−〔３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオンをフォームとして得た。ＨＲ（＋）ＦＡＢ  ＭＳ：計算値（Ｍ＋Ｈ）、４３０．２２３０；実測値、４３０．２２６６。
【００８３】
ii) 別の合成法
アルゴン下氷水浴中で冷却した無水ＴＨＦ１５ｍｌ中酸５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸１００ｍｇ（０．３０ミリモル）の溶液へ、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（Fluka)１５０ｍｇ（３当量）を固体のまま一時に加えた。反応物を約０℃で約１時間かきまぜた。氷浴を除き、かきまぜた反応物を１．５時間にわたり室温まで温めた。次に反応物へ３４５ｍｇ（１０当量）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Aldrich)を固体のまま一時に加え、反応物をアルゴン下室温で１８時間かきまぜた。次に反応混合物を減圧下で蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃ１００ｍｌと０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液３０ｍｌとの間に分配した。相を分離し、有機層を０．１Ｎ  ＨＣｌ（２×３０ｍｌ）、水（１×３０ｍｌ）、５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ８（３×３０ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１×３０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、減圧下で蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥した。次にこの残留物を５０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ2 Ｃｌ2 で溶離するＰＬＣにかけた。上方の生成物帯を単離し、シリカをＥｔＯＡｃで洗浄した。洗液を減圧下で蒸発させ、高真空下で乾燥することにより４４ｍｇの求める生成物１−〔３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオンをガラス／無定形固体として得た。
【００８４】
例  ７
３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
アルゴン下蒸留（マグネシウムメトキシドから）メタノール５００ｍｌ中５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン  ４．０ｇ（１３．１４ミリモル）の溶液へ、１２．８ｇ（５２５．６ミリモル）のマグネシウム削り片を加えた。混合物を加温して反応を開始させた。次に反応物を一晩還流煮沸した。混合物を氷浴中で約０℃に冷却し、氷冷６Ｎ  ＨＣｌ水溶液３００ｍｌを用いて注意深く失活させた。メタノールを減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸留させた。得られた固体を、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンまでの勾配で溶離するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、生成物を含むフラクションから３．０６ｇ（７６％）の３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンを固体として得た。ＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、３０６．１８３１；実測値、３０６．１８２９。 1Ｈ−ＮＭＲにより示される  ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ比は１：２であった。
【００８５】
例  ８
５−ペンチル−２−〔１−（テトラヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ピラン−３−イル）エチル〕−１，３−ベンゼンジオール
アルゴン下無水Ｅｔ2 Ｏ  １６０ｍｌに溶かした臭化メチルマグネシウム（Ｅｔ2 Ｏ中３Ｍ）（Aldrich)１９．６ｍｌ（５．８７ミリモル）の沸騰溶液へ、３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン４．５ｇ（１４．６９ミリモル）の溶液を滴加し、反応物を一晩還流温度に保った。反応物を氷浴中で０℃に冷却し、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液で注意深く失活させた。次に混合物をＥｔ2 Ｏで抽出し、合わせた有機相を半飽和ＮａＣｌ水溶液（×２）、飽和ＮａＣｌ水溶液（×１）で洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸発させることにより、４．５ｇの５−ペンチル−２−〔１−（テトラヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ピラン−３−イル）エチル〕−１，３−ベンゼンジオールを得、これをそれ以上精製することなく次の工程で使用した。試料を精製し次の数値を示す物質を得た。ＨＲ  ＥＩＭＳ：計算値Ｍ+ 、３２０．２３５１；実測値、３２０．２３４８。
【００８６】
例  ９
ｒａｃ−３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノール
触媒量のパラ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（Aldrich)を含むトルエン４００ｍｌ中５−ペンチル−２−〔１−（テトラヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ピラン−３−イル）エチル〕−１，３−ベンゼンジオール９．４ｇの溶液をアルゴン下６０℃に２時間加熱した。反応物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（×２）、水（×２）、飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液で洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸発させた。得られた物質を大規模（extensive)クロマトグラフィーにより精製し、３．４ｇ（３５％）のｒａｃ−３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールを淡黄色無定形固体として得た。ＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、３２０．２３５１。実測値、３２０．２３７７。 1Ｈ−ＮＭＲにより示されるジアステレオ異性体の比は３：１であった。
【００８７】
例  １０
５−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル〕オキシ〕−３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールの製造
無水ＤＭＦ（Aldrich)６０ｍｌ中ｒａｃ−３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノール  ３．１７ｇ（８．７８ミリモル）の溶液を、無水ＤＭＦ（Aldrich)２０ｍｌ中水素化ナトリウム（Aldrich)３８３ｍｇ（１当量）の懸濁液へ加え、混合物をアルゴン下室温で０．５時間かきまぜた。次に２．２８ｍｌ（１当量）のｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（Aldrich)を注射器により加えた。室温で２時間かきまぜた後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、水、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸発させた。残留物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含むフラクションを合わせ、減圧下で蒸発させることにより２．２３ｇ（４５％）の５−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル〕オキシ〕−３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノールを淡黄色油状物として得た。ＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、５５８．３５３０；実測値、５５８．３５１６。
【００８８】
例  １１
５−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル〕オキシ〕−３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸の製造
無水ＤＭＦ（Aldrich)中５−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル〕オキシ〕−３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパノール２．２ｇ（３．９７ミリモル）と二クロム酸ピリジニウム（Aldrich)７．４７ｇ（１９．８６ミリモル）との混合物をアルゴン下室温で２０時間かきまぜた。反応物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を乾燥し、溶媒を減圧下で除いた。次に残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーの繰り返しにより精製し、１．１ｇ（４８％）の５−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル〕オキシ〕−３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸を淡黄色発泡体として得た。ＨＲ  ＥＩ  ＭＳ：計算値Ｍ+ 、５７２．３３２２；実測値、５７２．３３１５。 1Ｈ−ＮＭＲにより示されるジアステレオ異性体比は８：１であった。
【００８９】
例  １２
３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸の製造
無水ＴＨＦ中５−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル〕オキシ〕−３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸１．０ｇ（１．７５ミリモル）の溶液を、アルゴン下ＴＨＦ（Aldrich)中フッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液２．０９ｍｌ（２．０９ミリモル）で処理した。室温で１時間かきまぜ後反応物を減圧下で蒸発させ、残留物を５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3 で溶離するフラッシュ等級シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにかけた。生成物を含むフラクションを合わせ、減圧下で蒸発させて３９５ｍｇ（６７％）の３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸を黄褐色発泡体として得た。ＭＡ：Ｃ20Ｈ30Ｏ4 ・０．２Ｈ2 Ｏに対する計算値：Ｃ，７１．０６；Ｈ，９．０６；Ｏ，１９．２９。実測値：Ｃ，７０．９３；Ｈ，８．９５；Ｏ，１９．２７。
【００９０】
例  １３
ハプテン１−〔３−（３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（ＸＩＩ）の製造
無水ＣＨ2 Ｃｌ2 ２０ｍｌ中３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−プロパン酸２９７ｍｇ（０．８８ミリモル）の溶液へ、アルゴン下Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Aldrich)２４６ｍｇ（２．１４ミリモル）を加え、反応物を１５分かきまぜた。次に１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Sigma)４０８ｍｇ（２．１４ミリモル）を加え、反応物を室温で３時間かきまぜた。反応混合物をＣＨ2 Ｃｌ2 でその体積の５倍に希釈し、ＮａＣｌで飽和した。０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液で、次に飽和ＮａＣｌ水溶液、続いて飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液（×３）により洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸発させた。残留物を１：１  ＥｔＯＡｃ／ＣＨ2 Ｃｌ2 で溶離するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物フラクションを合わせ、減圧下で蒸発させ、高真空で乾燥させることにより、２９７ｍｇ（７８％）の１−〔３−（３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオンを白色発泡体として得た。ＨＲ（＋）ＦＡＢ  ＭＳ：計算値（Ｍ＋Ｈ），４３２．２３８６；実測値，４３２．２４１３。
【００９１】
例  １４
免疫原３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロピル−〔牛チログロブリン〕（Ｘａ）の製造
氷浴中で冷却した５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰｉ）ｐＨ７．５  １０．０ｍｌ中精製牛チログロブリン（ＢＴＧ）４７８ｍｇの溶液へ、絶えずかきまぜながらジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３０ｍｌを約３０〜４０分間にわたりゆっくり加え（滴下ロート）、７５％  ＤＭＳＯ／５０ｍＭリン酸塩緩衝液中のタンパク質溶液を得た。得られた溶液から、溶液のうち３．２ｍｌを取り除き、対照試料として保存した。約４４０ｍｇのＢＴＧを含む残りの溶液へ、ＤＭＳＯ約３ｍｌ中１−〔３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン  ４４ｍｇの溶液を一時に加えた。反応混合物をかきまぜながら一晩室温まで加温した。幾分混濁した反応溶液を透析管（SpectraPor 7; 分子量カットオフ  ５０，０００）に移した。ＢＴＧ対照も透析管に移した。両溶液を室温で各２ｌの７５％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５；５０％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５；２５％  ＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉｐＨ７．５；および５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５に対して順次透析した後、４℃で６×４ｌの５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５に対して透析した。この結果得られた保持液（retentate)を０．８μｍフィルターユニットに通して別々に濾過した。７５ｍｌの接合体（免疫原）Ｘａが５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５中の溶液として得られた。そのタンパク質濃度を標準としてＢＴＧ対照を用いて測定したところ（Coomassie Blue) タンパク質  ４．６ｍｇ／ｍｌであった。有効リジン修飾の程度は、ＢＴＧ対照に対して測定したとき約６９％であると測定された（トリニトロベンゼンスルホン酸〔ＴＮＢＳ〕法による）。
【００９２】
例  １５
免疫原３−（３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロピル−〔牛チログロブリン〕（ＸＩＩａ）の製造
上記例１４に示した免疫（Ｘａ）の製造と同様にして、５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５（２４ｍｌ）中精製ＢＴＧ７００ｍｇの溶液を氷浴中で冷却し、７２ｍｌのＤＭＳＯで約１．３３時間にわたりゆっくり希釈することによって７５％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５中のタンパク質溶液を得た。同様にして、少量のＢＴＧを用いてＢＴＧ対照を調製した。次にＤＭＳＯ約３ｍｌ中ハプテン１−〔３−（３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン７０ｍｇの溶液をタンパク質７００ｍｇへ一時に加え、反応物をかきまぜながら一晩室温まで加温した。次に例１４で述べた方法と同様にして、接合体およびＢＴＧ両方の透析を行なった。次に最終接合体保持液を濾過して５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５中免疫原（ＸＩＩａ）の溶液１１５ｍｌを得た。標準としてＢＴＧ対照を用いてタンパク質濃度を測定したところ（Coomassie Blue) ３．８ｍｇ／ｍｌであった。有効リジン修飾の程度は、ＢＴＧ対照に対して測定したとき約８８％であると測定された（ＴＮＢＳ法による）。
【００９３】
例  １６
「完全三環式カンナビノイダル」免疫原（VIII) 、（ＩＸ）、および（XIII) の調製
ａ．免疫原（VIII) ：〔９Ｒ，Ｓ−（６ａａ，１０ａｂ）〕−〔５−（６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕−ピラン−９−イル）−１−オキソペンチル〕−〔牛チログロブリン〕
５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ  ８．０）２２ｍｌおよびＤＭＳＯ  ６６ｍｌ中牛チログロブリン（ＢＴＧ）１．１０ｇの溶液へ室温で、ＤＭＳＯ  １４ｍｌ中、式、
【化２４】
0004229990.tif 000014
を有するカンナビノイド誘導体〔９Ｒ，Ｓ−（６ａａ，１０ａｂ）〕−１−〔５−（６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕−ピラン−９−イル）−１−オキソペンチルオキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（米国特許第４，８３３，０７３号明細書も参照）１．００ｇの溶液６．８ｍｌを加えた。この溶液を室温で一晩かきまぜた。得られた溶液を透析管に移し、ＤＭＳＯ量を次第に減らしながら６回液を取り替えてＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５に対して順次透析した後、５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５に対して、液を５回取り替えて透析した。同様にしてＢＴＧ対照を処理した。次に、複合体の透析から得られた保持液を遠心して少量の固体物質を除去し、上澄をデカンテーションして５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５中の免疫原（VIII) の溶液を得た。そのタンパク質濃度は約４．７ｍｇ／ｍｌであると測定された（Bio-Rad Coomassie Blue  タンパク質検定）。有効リジン修飾の程度は、ＢＴＧ対照に対して測定したとき、約９８％であると決定された（ＴＮＢＳ法）。
【００９４】
ｂ．免疫原（ＩＸ）：（６ａＲ−ｔｒａｎｓ）−４−〔（６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−６，６，９−トリメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−１−イル）オキシ〕−１−オキソブチル〕−〔牛チログロブリン〕
氷−水浴中で冷却した５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５  １３．３ｍｌおよびＤＭＳＯ３９．８ｍｌ中牛チログロブリン７００ｍｇの溶液へ、ＤＭＳＯ２．５ｍｌ中、式、
【化２５】
0004229990.tif 000015
を有するカンナビノイド誘導体（６ａＲ−ｔｒａｎｓ）−１−〔４−〔（６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−６，６，９−トリメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−１−イル）オキシ〕−１−オキソブトキシ〕−２，５−ピロリジンシオン  ９０ｍｇの溶液を加えた。反応物をかきまぜながら一晩室温まで加温した。次に例１４記載の方法と同様に接合体の透析を行なった。次に最終接合体保持液を濾過し、５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５中免疫原（ＩＸ）の溶液１１８ｍｌを得た。標準としてＢＴＧの対照試料を使用してタンパク質濃度を測定したところ（Coomassie Blue) ５．０ｍｇ／ｍｌであった。タンパク質に上の有効リジン修飾の程度（ＴＮＢＳ法）は、ＢＴＧ対照に対して測定したとき約９５％であると測定された。
【００９５】
ｃ．免疫原（XIII) ：〔９Ｒ，Ｓ−（６ａａ，１０ａｂ）〕−〔〔（６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕−ピラン−９−イル）メチル〕カルボニル〕−〔牛チログロブリン〕
５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3   ｐＨ８．０  ２８ｍｌ中牛チログロブリン（ＢＴＧ）１．４０ｇの氷浴で冷却した溶液へ、ＤＭＳＯ  ８４ｍｌをゆっくり加えて７５％ＤＭＳＯ−５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3   ｐＨ８．０中ＢＴＧの溶液を得、溶液を室温まで温めた。このタンパク質溶液へ、式、
【化２６】
0004229990.tif 000016
を有するカンナビノイド誘導体〔９Ｒ，Ｓ−（６ａａ，１０ａｂ）〕−１−〔２−（６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕−ピラン−９−イル）−１−オキソエチルオキシ〕−２，５−ピロリジンジオン１０７３ｍｇのＤＭＳＯ１６ｍｌ中の溶液４．５ｍｌを加え、溶液を一晩かきまぜた。得られた溶液を透析管に移し、ＤＭＳＯ量を次第に減らしつつＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５に対して順次透析した後（液を６回交換）、５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５に対し液を５回取り替えて透析した。次に接合体の透析から得た保持液を遠心して少量の固体物質を除去し、上澄をデカンテーションして５０ｍＭ  ＫＰｉｐＨ７．５中免疫原（XIII) の溶液を得た。そのタンパク質濃度は約３ｍｇ／ｍｌであると測定された（Bio-Rad Coomassie Blue  タンパク検定法）。ＢＴＧ対照に対して測定したとき、有効リジンの修飾の程度は約９８％であると決定された（ＴＮＢＳ法）。
【００９６】
例  １７
モノクローナル抗体の調製手順
ａ）免疫処置手順
８から１０週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Jackson Laboratories) に一連の３種の免疫原を連続して腹腔内に注射した。先ず、０日目に、比１：１で完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した９位結合カンナビノイド牛チログロブリン（ＢＴＧ）接合体、免疫原（VIII) 、１００ｍｇをマウスに注射した。２５日目に、１：１の比で不完全フロイントアジュバント中に乳化した１位結合カンナビノイド−ＢＴＧ接合体、免疫体（ＩＸ）、１００ｍｇで追加免疫した。細胞融合に先立ち、ＰＢＳ中に希釈したベンゾピラン−ＢＴＧ免疫原（Ｘａ）４００ｍｇ、２００ｍｇ、および２００ｍｇを用いて、それぞれ７２時間、４８時間および２４時間で最終追加免疫系列を投与した。
【００９７】
ｂ）融合法
免疫処置マウスから脾細胞を単離し、Fazekas de Groth  およびScheidegger の手順により（F. de St. Groth 等、１９８０、J.Immunological Methods,３５，１−２１およびG.Kohler等、１９７５、Noture（ロンドン）、２５６、４９５〜９７頁）５０％ポリエチレングリコールを使用して４：１の比でＮＳＯミエローマ細胞に融合させた。ＮＳＯ細胞を２５０，０００細胞／ｍｌで９６穴ミクロタイタープレートに塗布し、９％ＣＯ2 インキュベーター中３７℃でクローンが選別するのに十分な大きさになるまでインキュベーションした。
【００９８】
ｃ）ハイブリドーマのＥＬＩＳＡ分析
９６穴ミクロタイタープレートをＰＢＳ中に希釈したカンナビノイド−牛血清アルブミン（ＢＳＡ）接合体（ＸＩＶ）５ｍｇ／ｍｌ  ５０ｍｌで被覆し、室温で２時間インキュベーションした。軽く叩いて液体を流しにあけることによりプレートから液体を除き、プレートを吸収紙上にふき取った。｛ＰＢＳ／アジ化物｝中１％  ＢＳＡ１００マイクロリットルを各穴の中に分配し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを｛ＰＢＳ／．０１％ＴＷＥＥＮ  ２０｝で３回洗浄した。各プレートの穴に１％ＢＳＡ２５マイクロリットルを加え、続いて細胞融合の各穴からの細胞上澄２５ｍｌを加えた。プレートにカバーを施し、３７℃で１時間インキュベーションした。｛ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ  ２０｝を用いてプレートをプレートウォッシャーで３回洗浄し、各穴にアルカリ性ホスファターゼに接合された抗マウス抗体５０ｍｌを加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、次に上記のように洗浄した。ｐＨ９．８のジエタノールアミン緩衝液に溶かしたパラ−ニトロフェノールホスフェート１ｍｇ／ｍｌを加えることにより検定物を発色させた。この基質含有プレートを室温で３０分インキュベーションした。３Ｍ  ＮａＯＨ  ５０ｍｌをウェルに加え、酵素反応を停止させた。直ちにプレートを４０５ｎｍで読んだ。
【００９９】
ｄ）競合検定および交差反応性の分析
上記のように、ただし抗体を含む細胞上澄液の存在下に遊離薬物をプレートに加える点を除いて、競合検定を設定した。下記の式を用いて交差反応性を計算した。すべての計算は最大Ｏ．Ｄ．（光学密度）結合点の５０％における結合と置換に基いた。
【数１】
0004229990.tif 000017
式中、Ｃ．Ｆ．は検定に用いる交差反応体の異なる濃度を考慮するために用いた補正因子である。Ｃ．Ｆ．＝交差反応体ｎｇ／Ｄ9 −ＴＨＣ酸ｎｇ。「薬物」という用語は検定系に適用される交差反応体として定義される。
【０１００】
ｅ）腹水発生
８から１０週齢Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウスを、腹水に対する細胞の注射の７〜１４日前にプリスタン０．５ｍｌで初回抗原刺激を与えた。この分野でよく知られた方法により腹水を採取した（例えば、N.Hoogenraad, T.Helman, and J.Hoogenraad, 1983 J.Immunological Methods, ６１，３１７−３２０頁参照）。
【０１０１】
例  １８
カンナビノイド−ＢＳＡ接合体（ＸＩＶ）：〔９Ｒ，Ｓ−（６ａａ，１０ａｂ）〕−〔５−（６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）−１−オキソペンチル〕−〔牛血清アルブミン〕
氷−水浴中で冷却した〔５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５〕５ｍｌおよびＤＭＳＯ  １４ｍｌ中牛血清アルブミン（ＢＳＡ）２５０ｍｇの溶液へ、式、
【化２７】
0004229990.tif 000018
を有する〔９Ｒ，Ｓ−（６ａａ，１０ａｂ）〕−１−〔５−（６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）−１−オキソペンチルオキシ〕−２，５−ピロリジンジオン３．６ｍｇのＤＭＳＯ  １ｍｌ中の溶液を加えた。また米国特許第４，８３３，０７３号明細書を参照。溶液を室温で一晩かきまぜてから透析管に移し（分子量カットオフ１０，０００）、例１４記載の方法と同様にして透析した。次に最後の接合体保持液を濾過して５０ｍＭ  ＫＰｉｐＨ７．５中接合体（ＸＩＶ）の溶液４５ｍｌを得た。ＢＳＡの標準試料に対して測定したとき、タンパク質濃度は４．９ｍｇ／ｍｌであると測定された（Coomassie Blue  タンパク質検定）。
【化２８】
0004229990.tif 000019
【０１０２】
例  １９
ポリクローナル抗血清の調製法
生後６ヶ月から１年のヤギとヒツジを完全フロイントアジュバント中に乳化した免疫原接合体３ｍｇで０日目に免疫化した。その後の免疫処置は、不完全フロイント  アジュバント中で乳化した免疫原接合体１〜３ｍｇを４週間毎に与えることにより行なった。次にこの分野で公知の方法に従い（例えば、E.Harlow and D.Lane 「Antibodies : A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor, 1988, ９２〜１１４頁参照）、動物から血液を採り抗血清を調製した。
【０１０３】
用いた免疫原は表１に記載のものである。プレート被覆物はカンナビノイド−牛血清アルブミン（ＢＳＡ）接合体（ＸＩＶ）である。
【０１０４】
例  ２０
本例はカンナビノイドの市販試験キットABUSCREEN TM 100 TEST ONLINETM（Roche Diagnostics Systems Inc., Branchburg, ニュージャージー州，ＵＳＡ）に含まれる試薬を説明するものである。
【０１０５】
検定試薬
１．抗体試薬：検定カットオフ付近に望む使用特性をもつ最良の動的標準曲線を与えるように濃度を調節した二次抗体を含むカンナビノイド単クローン抗体（ＩｇＧ）。この抗体を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、０．５％塩化ナトリウム、０．０９％アジ化ナトリウムを含み、ｐＨ６．５に調節した抗体希釈剤で希釈する。
【０１０６】
２．微粒子試薬：１０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５および０．０９％アジ化ナトリウムを含む緩衝液中の接合カンナビノイド誘導体微粒子（キットで供給される）。
【０１０７】
３．試料希釈剤：５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ７．０、２．５％ＰＶＰ、２．０％塩化ナトリウムおよび０．０９％アジ化ナトリウムを含む緩衝液（キットで供給される）。
【０１０８】
その他の試薬
ABUSCREEN TM ONLINE TM  カンナビノイド校正パック。
上記試薬を使用する検定法は、ABUSCREEN TM 100 TEST ONLINETMの包装差込みビラに述べられた注意書に従って行う。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、特に適当な化合物１−〔３−（５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（化合物Ｘ）、ならびに化合物ＸＶの合成に関与する出発物質と中間体の式を示す。
【図２】図２は、特に適当な化合物１−〔３−（３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−７−ペンチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−１−オキソプロポキシ〕−２，５−ピロリジンジオン（化合物XII)、ならびに化合物ＸＶＩの合成に含まれる出発物質と中間体の式を示す。
【図１】
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【図２】
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