(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）生物からの核酸を増幅させる方法であって、ＭＡＣ核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡＣ核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓｌ遺伝子領域のうちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット、と接触させることを含んで成る方法であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、MSqv F4／MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqv R2, MSqv F2／MSqv R5, MAV19K F1／MAV19K R1, および rps1 F1／rps1 R1から成る群より選ばれ、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、および
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）
である前記方法。
【請求項２】
前記３つの遺伝子領域の各々に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットが用いられ、ここで、該オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、MSqv F4／MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqv R2, MSqv F2／MSqv R5, MAV19K F1／MAV19K R1, および rps1 F1／rps1 R1から成る群より選ばれ、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、および
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記MacSequevar 遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットが、 MSqv F4／MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqv R2 および MSqv F2／MSqv R5 から成る群より選ばれ、ここで、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、及び
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）
である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーのセットが MSqv F4／MSqv R5 であり、ここで、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、及び
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットが MAV19K F1／MAV19K R1 であり、ここで、
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、及び
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｍ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓｌ遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットが rps1 F1／rps1 R1であり、ここで、
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、及び
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）生物からの核酸を増幅させて検出する方法であって、
(i)   ＭＡＣ核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡＣ核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域のうちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット、と接触させ、ここで、該オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、MSqv F4／MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqv R2, MSqv F2／MSqv R5, MAV19K F1／MAV19K R1, および rps1 F1／rps1 R1から成る群より選ばれ、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、および
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）
であり；
(ii)  前記増幅した核酸を変性させて一本鎖核酸にし；そして
(iii) 前記増幅したＭＡＣ核酸の存否を検出する
ことを含んで成る方法。
【請求項８】
前記３つの遺伝子領域の各々に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットが用いられ、ここで、該オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、MSqv F4／MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqv R2, MSqv F2／MSqv R5, MAV19K F1／MAV19K R1, および rps1 F1／rps1 R1から成る群より選ばれ、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、および
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）
である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出が、増幅された遺伝子領域の各々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＡＣ生物の増幅に有用な診断キットであって、
(i)  MacSequevar 遺伝子領域に特異的なプライマーセット、ここで、該プライマーセットが、MSqv F4／MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqv R2, およびMSqv F2／MSqv R5から成る群より選ばれ、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、および
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）
であり；
(ii)  Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域に特異的なプライマーセット、ここで、該プライマーセットが、MAV19K F1／MAV19K R1であり、
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、および
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
であり；
(iii)  Ｍ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域に特異的なプライマーセット、ここで、該プライマーセットが、rps1 F1／rps1 R1であり、
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、および
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）
であり；および
(iv)  耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を含んで成る診断キット。
【請求項１１】
マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）の別の生物からＭ．アビウムを検出・識別する方法であって、ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （ここでＸはＧまたはＵである）を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触せしめ；そして前記試料中に存在する核酸と前記プローブとの間で形成された複合体の存否を検出することを含んで成る方法。
【請求項１２】
下記：
（１）MSqv F4, MSqv F2, MSqv R5, MSqv R2, MSqv-Av, MSqv P1.21c, MSqv-MAC, MSqv P1, MSqv 1.3cから選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド、およびMAV19K F1, MAV19K R1, MAV19K P1から選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド；
（２）MSqv F4, MSqv F2, MSqv R5, MSqv R2, MSqv-Av, MSqv P1.21c, MSqv-MAC, MSqv P1, MSqv 1.3cから選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド、およびrpsl F1, rpsl R1, rpsl P1から選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド；
（３）MAV19K F1, MAV19K R1, MAV19K P1から選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド、およびrpsl F1, rpsl R1, rpsl P1から選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド；または
（４）MSqv F4, MSqv F2, MSqv R5, MSqv R2, MSqv-Av, MSqv P1.21c, MSqv-MAC, MSqv P1, MSqv 1.3cから選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド、MAV19K F1, MAV19K R1, MAV19K P1から選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド、およびrpsl F1, rpsl R1, rpsl P1から選ばれる１以上のオリゴヌクレオチド
を含む組成物であって、ここで、
MSqv F4：5'-GTG CGC AAC AGC AAA TGA TTG CCA GAC A-3'（配列番号１）、
MSqv F2：5'-TGC ACA ACA GCA AAT GAT TGC CAG ACA C-3'（配列番号２）、
MSqv R5：5'-CCA CCA AGA TGG AGG GAC TCC ACA-3'（配列番号３）、
MSqv R2：5'-CCA ATA CTC AAA CAC CAC ACC CCA CCA CCA A-3'（配列番号４）、
MSqv-Av：5'-CCC TGA GAC AAC ACT GGG TCC GTC C-3'（配列番号５）、
MSqv P1.21c：5'-CCC TGA GAC AAC ACT CGG TCC GTC C-3'（配列番号６）、
MSqv-MAC：5'-CCC TGA GAC AAC ACT CGG TCG GTC C-3'（配列番号７）、
MSqv P1：5'-GCC CTG AGA CAA CAC TCG GTC AGT C-3'（配列番号８）、
MSqv 1.3c：5'-CCC TGA GAC AAC ACT CGG TCG ATC C-3'（配列番号９）、
MAV19K F1：5'-CGG CTG TTC GAG TGG CAA CAA GTC-3'（配列番号１０）、
MAV19K R1：5'-CCG TCG ATG ATG ACC TTG GTC CC-3'（配列番号１１）
MAV19K P1：5'-AGT CCG TCG GCG AGC AGC GG-3'（配列番号１２）、
rps1 F1：5'-CGG GAC AAG GTC GCC AAG GTC AAG A-3'（配列番号１３）、
rps1 R1：5'-GGG ATG TAG GCC GTC ACC TCA AC-3'（配列番号１４）、および
rpsl P1：5'-GAC CTT CCG AAG AGC GGA GTT CG-3'（配列番号１５）、
である前記組成物。
【請求項１３】
マイコバクテリウム・アビウムからの核酸に選択的にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプローブであって、ヌクレオチド配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （ここでＸはＧまたはＵである）を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
ＸがＧである、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium  avium）複合体（ＭＡＣ）生物に特異的な核酸プライマーおよびプローブ、並びに生物学的試料中の前記生物の検出および識別のための核酸増幅方法におけるそれらの使用に関する。本発明はＭＡＣを含んで成る種々の生物を検出・識別するための診断キットにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）は、その多くがＭ．アビウムまたはＭ．イントラセルラーレ（M. intracellulare）として分類される多数の生物から成る。加えて、それらがＭ．アビウムとＭ．イントラセルラーレの両方の性質を有するために、あるいはそれらが別のマイコバクテリウムとＭ．アビウムまたはＭ．イントラセルラーレのいずれかとの複合性質を有するために、正しく分類することができない多数の生物がＭＡＣの中に存在する〔Wayne 他、International J. Systematic Bacteriol., 43(3):482-489 (1993)〕。
【０００３】
マイコバクテリウム・アビウム複合体は少なくとも26の血清型から成る。それらの生物は初め、特異的に凝集させる抗血清の存在下でのそれらの凝集により定義された（それらの細胞壁表面抗原との免疫反応を通して）。Ｍ．アビウムは血清型１〜６、８〜11および21を含むと考えられ、そしてＭ．イントラセルラーレは血清型７、12〜17、19、20、25を含むと考えられている〔Wayne 他、Clin. Microbiol. Rev. 5:1-25 (1992) およびH. Saito他、J. Clin. Microbiol., 28:1694-1697 (1990)〕。
【０００４】
Frothingham 他〔J. Bacteriol., 175(10):2818-2825 (1993) 〕は、それらの生物を更に配列型（sequevar）に分類した。配列型分類は、ＭＡＣを代表する生物の参考株の16s-23s rRNA内部転写スペーサー領域を配列決定することにより得られた。遺伝子配列に基づくこの分類体系は、非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ株の中の広範囲の遺伝子多様性を明らかにした。Frothingham 他は、それらの参考株を、Ｍ．アビウム生物についてはMav-A からMav-D まで、Ｍ．イントラセルラーレについてはMin-A 、そしてアビウム階級区分にもイントラセルラーレ階級区分にも当てはまらない全てのＭ．アビウム複合体株についてはMAC-A からMAC-H までに分類した〔Frothingham 他、J. Infect. Diseases, 169:305-312 (1994) も参照のこと〕。
【０００５】
ＭＡＣの菌群により引き起こされる感染は、特にエイズ（AIDS）にかかっている個体（特に極端に低いCD4 数を有するそれらの個体）において、重要な臨床問題となっている。Yakrus他〔J. Clin. Microbiol., 28:926-929 (1990)〕は播種性疾患に最も頻繁に関連するＭＡＣ生物を同定した：Ｍ．アビウム血清型４（40％）、Ｍ．アビウム血清型８（17％）、型分類できないＭＡＣ（13％）、およびＭ．アビウム血清型１（９％）。
【０００６】
播種性ＭＡＣの実験室診断は慣例的には培養方法論に基づいている。ＭＡＣ培養方法は労力、材料および資財集中的であり、そして決定的診断には比較的長い時間を要する。このため、ＭＡＣ感染の検出にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験が有利であろう。
【０００７】
標的核酸のＰＣＲによる増幅は、標的ＤＮＡ配列の迅速且つ高感度の検出を可能にする。増幅された核酸は、非同位体検出方法を使って容易に検出される濃度に蓄積する。ＰＣＲ技術は理論上、実施者がただ１つの標的を含むかもしれない試料中の特定の標的核酸を同定できるようにする。
【０００８】
Kulski他〔J. Clin. Microbiol., 33:668 (1995)〕は、マイコバクテリウム属の仲間を検出するための並びにＭ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウムおよびＭ．イントラセルラーレを検出・識別するためのＰＣＲ技術の使用を研究した。この研究者らは、16s rRNA遺伝子の複数領域とMPB 70遺伝子の一領域を同時増幅させてＭ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウムおよびＭ．イントラセルラーレを検出・識別した。
【０００９】
Abed他〔Res. Microbiol., 146:405, 1995〕は、16s 〜23s rRNAスペーサー領域全体を増幅させ、そしてRAPDフィンガープリンティングの二次技術を使って11のマイコバクテリウム種に属する56の株を識別した。それらのＰＣＲプライマーは遺伝子間領域の外側に存し、それらの正および逆プライマーはそれぞれ16s rRNA遺伝子と23s rRNA遺伝子にターゲティングされた（特異的に向けられた）。
【００１０】
Barry 他（欧州特許公開No. 0395292 ）およびRossau他（欧州特許公開No. 0525095 ）は、全16s 〜23s 遺伝子間領域の増幅、および16s 〜23s 遺伝子間領域内の配列に対して特異的に向けられたプローブを使った細菌生物の診断試験を記載している。Abed他と同様、Barry 他とRossau他により使われたプライマーは16s または23s rRNAをコードする遺伝子中に存在する配列に対して特異的に向けられた。
【００１１】
Booth 他〔Infection and Immunity, 61(4):1509 (1993) 〕は、Ｍ．アビウム、Ｍ．ツベルクローシスおよびＭ．イントラセルラーレの19 kD （キロダルトン）タンパク質遺伝子間に高度の相同性を見出した。遺伝子レベルでのこの高度の相同性は、タンパク質レベルにも存続する。Nair他〔Molecular Microbiology, 6(11):1431 (1992) 〕は、Ｍ．イントラセルラーレ遺伝子が血清活性リポタンパク質をコードすることを証明した。このリポタンパク質は血清学的に活性な19 kD Ｍ．ツベルクローシスタンパク質のＭ．イントラセルラーレ相同体であると考えられた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ＭＡＣの存在を検出するためのアッセイをデザインする時、当業者らはＭＡＣを構成するが非ＭＡＣ生物と交差反応しない全ての生物を検出するプライマーとプローブの組合せを選択するために相当な努力を迫られる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、それらの生物の少なくとも２つの、好ましくは３つの遺伝子領域を同時増幅するために用いることができる、ＭＡＣ生物に特異的なプライマーおよびプローブを提供することにより、それらの課題を解決する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
一態様では、本発明はＭＡＣ生物からの核酸を増幅させる方法に関する。この方法は、ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡＣ核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域のうちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット、と接触させることを含んで成る。
【００１５】
別の態様では、本発明はＭＡＣ生物からの核酸を増幅させて検出する方法に関する。この方法は、ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、前記核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域のうちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット、と接触させることを含んで成る。次いで増幅生成物を変性せしめ、検出する。
【００１６】
更に別の態様では、本発明はマイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）の別の生物からＭ．アビウムを検出し識別する方法であって、ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （ここでＸはＣ以外の任意のヌクレオチドである）を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触せしめ、そして前記試料中に存在する核酸と前記プローブとの間で形成された複合体の存否を検出することを含んで成る方法に関する。
【００１７】
本発明の様々な他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明から明らかであろう。
非ＭＡＣマイコバクテリアと交差反応しない全てのＭＡＣ生物を検出する核酸同時増幅方法の開発は非常に興味をかき立てる。本出願人らは、ＭＡＣ生物からの核酸の増幅および／または検出に関する本発明に到達するまでに幾つかの障害を克服した。
【００１８】
本発明では、多重化方式において互いに適合でき、従ってＭＡＣ生物からの核酸を増幅するための同時増幅アッセイに用いることができる３つの遺伝子領域を同定した。それらの３つの遺伝子領域は、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物に見つかる MacSequevar（MSqv）遺伝子領域；Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質（MAV19K）遺伝子領域；およびＭ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓｌ（rpsl）遺伝子領域である。それらの領域の２つ以上に特異的なプライマーを使って、試料調製、増幅および／または検出の際の問題により起こる偽陰性結果の検出を可能にする内部陽性対照（ＩＰＣ）の存在下で、多重化方式で増幅を行うことができる。
【００１９】
本発明はＭＡＣ生物からの核酸を増幅する方法に関する。本発明の方法では、前記ＭＡＣ生物の核酸を含む疑いのある生物学的試料を、前記３つの遺伝子領域の２つ以上に特異的なプライマーセットと接触させることにより、ＭＡＣゲノムの特定の遺伝子領域が増幅される。好ましくは、それらの３つの遺伝子領域の全部に特異的なプライマーセットを使ってそれらの３つの遺伝子領域を同時増幅させる。該プライマーに加えて、試料中に存在するどんなＭＡＣ生物でも増幅されたその標的核酸を有するような条件下で、前記生物学的試料をＰＣＲ試薬、例えば４種類のヌクレオシド三リン酸および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる。本発明での使用に適するプライマーの例としては、第１表に示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２０】
【表１】
0004298814.tif 000002
【００２１】
着目の３遺伝子領域に特異的な別のプライマーセットは、当業者により容易に決定することができよう。
【００２２】
ＭＡＣの核酸が増幅されさえすれば、既知の検出方法を使って、増幅された標的核酸の存否を検出することができる。例えば、増幅された遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って、増幅された標的核酸を検出することができる。当業者らは、使用したプライマーセットを仮定すれば増幅された遺伝子領域を検出するのに適当であるオリゴヌクレオチドプローブを容易に同定することができる。本発明における使用に適当であるオリゴヌクレオチドプローブとしては、限定的でなくして第１表に記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、ＭＡＣの別の生物からＭ．アビウムを検出し識別する方法にも関する。これは、ＭＡＣ生物の核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （ここでＸはＣ以外の任意のヌクレオチドである）を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触せしめることにより達成される。好ましくは、ＸはＧまたはＵである。そのようなプローブは16s 〜23s rRNA遺伝子間領域に特異的であり且つＭ．アビウム特異的である。Ｃから別の任意ヌクレオチドへの一塩基置換は、プローブの特異性を変更し、Ｍ．アビウムに対して高特異的にする。
【００２４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使った核酸の増幅および検出のための一般原理と条件は非常に良く知られており、その詳細は米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）をはじめとする多数の文献中に提供されている。よって、上記技術の教示とその中に与えられる特別の教示を参照すれば、当業者は播種性Ｍ．アビウム複合体を検出するためにＭＡＣ生物の２以上の遺伝子領域を同時増幅させることによって本発明を実施するのは何ら難しくないはずである。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」という語は、１または複数のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子、例えばプライマー、プローブ、および検出しようとする核酸断片のことを言う。
【００２６】
「プライマー」という語は、天然に存在するにせよ合成的に製造されるにせよ、核酸鎖（すなわち鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導されるような条件（そのような条件には、別のＰＣＲ試薬の存在、並びに適当な温度およびｐＨが含まれる）下に置いた時に合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドのことである。
【００２７】
プライマーは、最大の増幅効率のために好ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含むことができる。それはＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成を開始させるのに十分な程長くなければならない。各プライマーの正確なサイズは、意図する使用目的、プライマーの濃度および配列、標的配列の複雑さ、反応温度、並びにプライマーの起源に依存して異なるだろう。本発明で使用するプライマーは通常12〜60ヌクレオチドであり、好ましくは16〜40ヌクレオチドを有するだろう。より好ましくは、各プライマーは18〜35ヌクレオチドを有する。
【００２８】
本発明に有用なプライマーは、既知の技術と装置、例えばABI DNA 合成装置（Applied Biosystemsから入手可能）またはBiosearch 8600シリーズもしくは8800シリーズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc,から入手可能）を使って調製することができる。この装置を使う手順は周知であり、例えば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載されている。生物学的源から単離された天然に存在するプライマーも有用であるかもしれない（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）。
【００２９】
本明細書中で用いる時、「プローブ」とは標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり且つ増幅された標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
本発明では、配列特異的プライマーおよびプローブが提供される。例えば、５′末端か３′末端のいずれかへのヌクレオチドの付加により（前記ヌクレオチドは標的配列に相補的であるかまたは非相補的である）、追加の配列特異的プライマーおよびプローブを調製できることは当業者に明白であろう。そのような組成物は本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明において使われるプライマーおよび／またはプローブは、所望により標識することができる。当該技術分野で既知の方法を使って、プライマーおよび／またはプローブを特異的結合リガンド（例えばビオチン）、酵素（例えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリホスファターゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色素原、蛍光助剤、燐光成分またはフェリチンで標識することができる。好ましくは標識は特異的結合リガンドである。より好ましくは標識はビオチンもしくはその誘導体、ストレプトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンである。
【００３２】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに不可欠であると考えられる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸のためのプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ補因子、および１または複数のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸（dNTP's）のことである。ＰＣＲに使われる他の任意の試薬および材料については後述する。それらの試薬は個別に、試験キットの一部分として、または試験装置の試薬室の中に、提供することができる。
【００３３】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型の複合体においてプライマーの３′−ヒドロキシ末端にデオキシヌクレオシド一リン酸分子を付加する酵素であるが、この付加は鋳型依存形式である。一般に、伸長生成物の合成は、新しく合成された鎖の５′から３′方向において、合成が終結するまで進行する。有用なＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウポリメラーゼ、逆転写酵素、および当業界で既知の他のものが挙げられる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはそれが熱に安定であることを意味する耐熱性であり、そして高い温度で、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に使われる高温において優先的に活性である。より詳しくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載のポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温において実質的に不活性でない。そのような温度は多数の反応条件、例えばｐＨ、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃度および当業界で既知の他の条件によって異なるだろう。
【００３４】
多数の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが技術の現状において報告されており、それらとしては、米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818 号（Gelfand 他）明細書中に詳述されたものが挙げられる。特に有用なポリメラーゼは様々なテルムス菌種、例えばテルムス・アクアティカス（Thermus  aquaticus）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）およびテルムス・フラブス（Thermus flavus）から得られるものである。他の有用な耐熱性ポリメラーゼは、テルモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、テルモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年７月27日公開）に記載のものをはじめとする様々な生物源から得られる。幾つかの有用な耐熱性ポリメラーゼが市販されており、例えばPerkin ElmerからAmpliTaq（商標）, Tth およびUlTma （商標）、StratageneからPfu 、並びにNew England Biolabs からVentおよびDeep-Vent が市販されている。生物体から天然ポリメラーゼを単離する技術、および組換え技術を用いて遺伝子操作された酵素を生産する技術も多数知られている。
【００３５】
ＤＮＡポリメラーゼ補因子とは、酵素の活性がそれに依存する非タンパク質化合物のことである。よって、補因子が存在しなければ酵素は触媒的に不活性である。多数の物質が既知の補因子であり、例えばその非限定例として、マンガンおよびマグネシウムの塩、例えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩が挙げられる。塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが好ましい。
【００３６】
ＰＣＲに更に必要であるのは、２以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えばdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびdUTPのうちの２以上である。好ましくは４種の一般的三リン酸（dATP, dCTP, dGTPおよびdTTP）が一緒に使用される。
【００３７】
本明細書中に記載のＰＣＲ試薬は、標的核酸の増幅を提供するのに適当な濃度で供給されそしてＰＣＲに使われる。増幅に必要であるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、補因子およびデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸の最小量並びに各々の最適範囲は当業界で周知である。ＤＮＡポリメラーゼの最小量は通常少なくとも約0.5 単位／100 μL 溶液であり、約２〜約25単位／100 μL 溶液が好ましく、約７〜約20単位／100 μL 溶液がより好ましい。与えられた増幅系には他の量が有用なことがある。「１単位」は、本明細書中では74℃で30分間の間に伸長核酸鎖の中に10ナノモルの全ヌクレオチド（dNTPs ）を取り込むのに必要とされる酵素活性の量として定義される。増幅に用いる各プライマーの最小量は少なくとも約0.075 マイクロモル濃度であり、約0.1 〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、他の量も当業界で既知である。補因子は通常約２〜約15ミリモル濃度の量で存在する。各dNTPの量は通常約0.25〜約3.5 ミリモル濃度である。
【００３８】
ＰＣＲ試薬は、任意の適当な緩衝剤（多数が当業界で既知である）を使って、約７〜約９の範囲内のｐＨを有する緩衝溶液中に、個別にもしくは種々に組み合わせてまたは全部一緒に供給することができる。
【００３９】
ＰＣＲにおいて使用できる他の試薬としては、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体が挙げられる。抗体は増幅前に前記ポリメラーゼを抑制するために使用することができる。本発明に有用な抗体は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、約50℃より低い温度でＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制し、そして高い温度で失活する抗体である。有用な抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片が挙げられる。好ましくは抗体はモノクローナルである。本発明において有用な抗体は、既知の方法、例えばHarlow他、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988)に記載された方法を使って調製することができる。
【００４０】
代表的なモノクローナル抗体は米国特許第5,338,671 号明細書（Scalice 他）に記載されている。常用の手順と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（Rockville, MD ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系HB 11126または11127 のいずれかを含む出発材料を使って、当業者は２つのモノクローナル抗体を容易に得ることができる。モノクローナル抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比約５：１〜約500 ：１の量で存在する。
【００４１】
ＭＡＣ生物からのものを包含する標的核酸は、様々な起源、例えば末梢血単核細胞（RBMC）、全血、呼吸系液体、リンパおよび糞便のいずれからも得ることができる。一般に、標的核酸はプライマーや他のＰＣＲ試薬との接触に利用できるようにする通常のやり方で抽出される。標的核酸が二本鎖であるなら、プライミングが起こる前に二本鎖を分離しなければならない。変性は熱処理、物理的処理または化学的処理といった任意の既知技術を使って行うことができる。
【００４２】
増幅は、好ましくは、反応混合物を所望の設定時間に渡り制御方式で温度循環させるように、連続した自動方式で行われる。この目的で多数の機器が開発されており、当業者に入手可能である。好ましくは、米国特許第5,229,297 号明細書に記載の化学試験パックのような、密閉した反応容器中で増幅が行われる。前記容器は米国特許第5,089,233 号明細書に記載の機器を使って処理される。
【００４３】
増幅された核酸は多数の既知の方法、例えば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載の方法で検出することができる。例えば、増幅された核酸はサザンブロッティング、ドットブロット技術、または標識プローブを用いる非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出技術を使って検出することができる。あるいは、適当に標識されたプライマーを使って増幅を行い、その標識の検出手順および検出装置を使って、増幅されたプライマー伸長生成物を検出することができる。
【００４４】
好ましい態様では、増幅された標的核酸は、検出用に標識されており且つ増幅された標的と直接的または間接的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを使って検出される。該プローブは可溶性であっても固体支持体に取り付けられてもよい。本発明において複数のプローブを用いる時、該プローブは固体支持体の異なる位置に取り付けることができる。あるいは、該プローブを混合物として固体支持体の同じ位置に取り付けることができる。別の好ましい態様では、標的核酸を増幅させるのに使われるプライマーのうちの１つまたは複数が、例えば特異的結合成分によって標識される。標識プライマーが中に取り込まれている生じたプライマー伸長生成物を、プローブを使って捕捉することができる。該プローブにハイブリダイズした増幅標的の検出は、当業界で周知である適当な検出装置および手順を使って標識付プローブの存在または増幅された標識付標的の存在を検出することにより行うことができる。標識によっては、検出装置を使わずに目で見ることができるものもある。
【００４５】
より好ましい態様では、標的核酸を増幅させるのに用いるプライマーの１つまたは複数がビオチンにより標識され、増幅されたビオチン化標的核酸が固体支持体に取り付けられたプローブにハイブリダイズせしめられる。次いで、それらを酸化剤（例えば過酸化水素）および適当な色素形成性組成物の存在下でストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させることにより、結合した標識が検出される。例えば、有用な色素形成試薬として、テトラメチルベンジジンおよびその誘導体、並びにロイコ色素、例えば米国特許第4,089,747 号明細書（Bruschi ）に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素が挙げられる。
【００４６】
好ましくは、増幅および検出は、汚染の危険性を減らすために、密閉容器中で実施される。工程中に反応容器を開けることなく、増幅と検出の両方を米国特許第5,229,297 号明細書に記載の密閉反応容器中で実施することができる。
【００４７】
本明細書中で時間に関して用いる時、「約」という語は時間限界の±10％を表し、そして温度に関して用いる時、「約」という語は±５℃を表す。
下記の実施例は本発明の幾つかの態様を例示するために与えられるのであって、本発明を限定するものであると解釈してはならない。
【００４８】
【実施例】
ＭＡＣ生物を検出するため並びにＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物を識別するために、下記のプライマーおよびプローブを使った。
【００４９】
【表２】
0004298814.tif 000003
【００５０】
【表３】
0004298814.tif 000004
【００５１】
プライマーとプローブは下記の標的遺伝子領域に対して作製した：
１）  MacSequevar 領域（MSqv）（16S-23S 遺伝子間領域）
２）  Ｍ．アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域（MAV19K）
３）  Ｍ．イントラセルラーレのリボソームタンパク質sl遺伝子領域（rpsl）
【００５２】
MSqv領域から選ばれたプライマー類は、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよびＭ．アビウムにもＭ．イントラセルラーレにも分類されない他の全てのＭＡＣ生物（非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物）からの核酸の特異的増幅を可能にする。増幅されさえすれば、MSqv P1.21c, MSqv-MAC, MSqv P1またはMSqv 1.3c プローブのうちの１つを使って、それらの生物の標的核酸を検出することができる。加えて、Ｍ．アビウムのみを検出するMSqv-Av プローブを使って、Ｍ．アビウムをＭ．イントラセルラーレからおよび他の非Ｍ．アビウムＭＡＣ生物から識別することができる。MAV19kプライマーおよびプローブはＭ．アビウムの核酸に特異的であり、一方rpslプライマーおよびプローブは非Ｍ．アビウムＭＡＣ生物、典型的にはＭ．イントラセルラーレの核酸に特異的である。
【００５３】
それらのプライマーおよびプローブは、既知の出発原料と手順を用いて、Applied Biosystems Model 380B 、標準ホスホロアミダイト化学を用いる３カラムＤＮＡ合成装置、およびＡＢＩ１μモルスケール・ファーストサイクルプロトコールを使って調製した。ヌクレオシド−３′−ホスホロアミダイトおよびヌクレオシド誘導化細孔制御ガラス支持体はApplied Biosystemsから入手した。プライマーは上記に示した配列を有した。２つのテトラエチレングリコールスペーサーに続いて１つの市販のデュポン社製ビオチンホスホロアミダイトにより、それらの５′末端を機能性にした。米国特許第4,914,210 号明細書に従って、２つのテトラエチレングルコールスペーサーに続いて１つのアミノジオール連結基によりプローブの３′末端を機能性にした。全ての精製は核酸精製カラムに続いて逆相HPLC技術を使って実施した。
【００５４】
ＰＣＲアッセイ条件：
ＰＣＲ増幅および検出はJohnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.プロセッサーを使って実施し、これは米国特許第5,089,233 号、同第5,380,489 号および同第5,229,297 号明細書に記載のパウチシステムを含んだ。標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅用のアニール／伸長温度を70℃で40秒間に設定し、そして変性温度を96℃で５秒間に設定する２段階ＰＣＲ法を使った。標的を増幅させるのに40サイクルを使い、その後で反応混合物を含むＰＣＲブリスターを103 ℃で２分間加熱してTaq ポリメラーゼを不活性化した。
【００５５】
ＰＣＲミックス：
・塩化マグネシウム（mM）                               4
・プライマー (μM)、各                                 0.4
・グリセロール濃度（％ v/v）                           9.5
・dNTP（合計mM）（dATP, dCTP, dGTPおよび
dTTP−各0.3 mM）                                     1.2
・バックグラウンド（子ウシ胸腺）ＤＮＡ（μｇ／反応）   5
・Taq mAb ブレンド（Taq に対するモル比）              55:1
・Taq ポリメラーゼ（単位／75μL 反応液）              12
・陽性対照標的（コピー／試験）                        10
・Tris-HCl（mM）                                      18
・塩化カリウム（mM）                                  54
・IV型ゼラチン（μｇ／ml）                           108
・EDTA（mM）                                           0.725
・Tween 20                                             0.02 ％
【００５６】
ＰＣＲミックス中で使われるモノクローナル抗体はテルムス・アクアティカスからのＤＮＡポリメラーゼに特異的であるTP1-12.2とTP4-9.2 の混合物であった。それらの抗体は米国特許第5,338,671 号明細書中に詳細に記載されている。
【００５７】
Ｔ．アクアティカスからの組換えＤＮＡポリメラーゼは既知の手順、例えば欧州特許公開EP-A-0 482 714に記載されたものを使って調製し、これは約250,000 単位／mgタンパク質の活性を有した。
【００５８】
標的のＰＣＲ増幅が完了したら、４〜７個の離れたプローブビーズスポットに結合させた別個の標的特異的捕捉プローブに増幅生成物をハイブリダイズせしめた。各スポットは約１ミクロンのポリスチレンビーズに共有結合で取り付けられた独特の捕捉プローブから成った。この捕捉プローブは、次のようにしてポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比95：５、平均直径１μｍ）の粒子に取り付けた。まず、前記粒子の水中懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（0.1 モル濃度、pH 6）で２回洗浄し、次いで固形分約10％になるように懸濁した。緩衝剤（0.1 モル濃度）中固形分3.33％に希釈された洗浄済粒子の試料（3.3 ml）を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（84mg／ml水、2.1 ml）および適当なプローブ（44.44 OD／mlナノ純水、983 μl ）と混合した。生じた懸濁液を断続的に混合しながら湯浴中50℃で約２時間加熱した後、遠心分離した。（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.0001モル濃度）を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.01モル濃度、pH 8）で粒子を３回洗浄し、そして固形分４％になるようにその中に再懸濁した。次いでそれらを固形分２％に希釈し、WO-A-92/16659 に記載の通りに調製した試験装置中でのヒートシール可能なポリエチレンポリエステルラミネート（コロナ放電により処理したもの）への適用のために0.2 ％のポリ〔メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート〕（重量比90：４：６）と混合した。
【００５９】
プローブへの生成物のハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）は58℃で起こった。ハイブリダイゼーション段階に続いて、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ (SA−HRP)接合体（ビオチン化生成物に結合する）を添加し、次いで洗浄段階を行い、そして最後にロイコ色素を添加した。機器を使って（反射密度、デルタDrとして）または目視での採点により、色素の強度を評価した。
【００６０】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液：
・３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（mM）  100
・NaH2PO4 （mM）                                   29
・NaCl（mM）                                       75
・４′−ヒドロキシアセトアニリド（mM）             10
・カゼイン（Sigma Technical Grade ）（mg／ml）      5 (0.5％)
【００６１】
洗浄配合物：
・NaH2PO4 （mM）                                   29
・NaCl（mM）                                      373
・デシル硫酸ナトリウム（mM）                       25
【００６２】
ロイコ色素分散液：
ビーズスポットの色を標準カラーチャートと比較することにより、目視カラースコアを決定した。目視カラースコアには、青色の強度に関する値（「８」は高陽性スコアであり、「０」は陰性スコアである）を与えた。「０」と「２」の間のカラースコアは陰性であると指定した。２より大きく且つ４より小さいカラースコアは、疑わしい（低）陽性であると見なした。４〜８のカラースコアは陽性であると指定した。
他の試薬および原料は商業源から入手したかまたは容易に入手可能な出発原料と常用手順を使って調製した。
【００６３】
実施例１：プライマーおよびプローブの選択
Ａ．副産物生成の最小化
多重プライマーセットを使った標的核酸の同時増幅はしばしば問題となる。プライマー二量体や他の「ゼロサイクル」人工産物のような副産物の形成という形で現れるプライマー相互作用が、増幅効率とアッセイ感度の低下を引き起こし得る。標的核酸に対する配列相同性と「オリゴ」（National BioSciences, Inc., Plymouth, MN）を使ったコンピューター分析に基づいて一端プライマーが選択されたら、様々なプライマーの組合せを試験して（標的の不在下で）検出可能な副産物の形成が起こるかどうかを調べた。一般に、プライマーの二つ一組の組合せを最初に標準ＰＣＲ条件下で試験して、どんなプライマー組合せがプライマー二量体または着目の特定生成物と競合し得る望ましくない他の副産物を生成しやすいかを調べた。
【００６４】
上述の二つ一組のプライマー組合せから得られた結果に基づいて、好ましいプライマーおよびプライマーペアを使って、ＰＣＲマスターミックスが望ましくない副産物を形成することなく長期間に渡り室温で保存できるかどうかを調べた。適切な塩類、グリセロール、Taq ポリメラーゼ、Taq 抗体、子牛胸腺ＤＮＡ、塩化マグネシウムおよびプライマーを含む完全ＰＣＲ混合物を調製した。次の各組合せにおいて複数のプライマーセットを使用した：Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1, IPC F1/R1またはMsqv F2/R5, MAV 19k F1/R1, IPC F1/R1。完全ＰＣＲミックスを精製済標的ＤＮＡの存在下または不在下で室温にて保存した（パウチ内で０，４および８時間）。
【００６５】
適当な時点で、パウチプロセッサーを使ってＰＣＲ反応を実施した。増幅生成物を１％アガロースゲル中で電気泳動し、次いで臭化エチジウム（Sigma Chemical, St.Louis, MO）でゲルを染色して、ＰＣＲ反応の増幅効率を同定した。Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1 および IPC F1/R1のプライマー組合せが、処理前にＰＣＲミックスを室温で２〜８時間インキュベートした時の副産物生成が最少〜無であった。
【００６６】
Ｂ．同時増幅用のプライマー組合せの選択
５種類の異なるアニール／伸長温度を使って、標的特異的生成物の形成を最大にし且つ副産物の形成を最小にする条件を決定した。単一のプライマーペアとして使用するにせよ他のプライマーペアと重ねて使用するにせよ、生成物検出スコアが同等であるプライマーセットを同定した（生成物のゲル電気泳動と臭化エチジウム染色に基づいて）（第２表）。好ましいプライマーセットは、最も広いアニール／伸長温度範囲に渡って強い生成物ゲルバンドを与えるものであった。各プロセッサーを様々なアニール／伸長温度に設定し、標的がもはや増幅されない温度を決定した。個々のプライマーのアニール／伸長温度効能と最も良く一致するプライマーの組合せを、更なる試験に選んだ。実施例１Ａに記載した通りにＰＣＲミックスを調製した。Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1, IPC F1/R1の多重プライマー組合せをMsqv F2/R5, MAV 19k F1/R1, IPC F1/R1と比較することにより、各アニール／伸長温度設定での同等のＰＣＲ（ゲルバンド）シグナルに関して、どちらのMsqv正プライマーが他方のものより強固な増幅を可能にするかを決定した。各多重化システムの４つの複製パウチを各パウチプロセッサーにかけた。
【００６７】
【表４】
0004298814.tif 000005
【００６８】
使用した標的はＭ．アビウム（Ａ４株、血清型４）20コピー／試験、10コピーＩＰＣ／試験であった。２つの選択できる多重化ＭＡＣアッセイシステムが第２表に示される：Msqv F4/R4, 19k F1/R1, IPC F1/R1と、Msqv F2/R5, 19k F1/R1, IPC F1/R1。
【００６９】
各系で標的を増幅できないアニール／伸長温度が72℃以上であること、あるいは、内部陽性対照が70℃より下でその標的を増幅しなかったことが証明された。ＭＡＣ特異的プライマー系は、広範囲のアニール／伸長温度（68℃〜71℃）に渡り十分に働いた。
【００７０】
実施例２：ＭＡＣアッセイの感度
ＰＣＲに基づくＭＡＣアッセイは、１遺伝子コピー感度を有することが証明された。Ｍ．アビウムおよびＭ．イントラセルラーレからの塩化セシウム精製済ＤＮＡ試料は、実施例２の実験のためにT. Hellyer氏（アーカンサス大学、Little Rock ）から提供された。それらの試料中に含まれるＤＮＡを吸光光度測定により定量し、そしてA260/A280 吸光度比を算出することによりその純度を決定した。1.8 以上の比は高純度のＤＮＡを表す。マイコバクテリア１ゲノムあたり10フェントグラムのＤＮＡの値に基づいて、ゲノムの数／μL 試料を推定した。このＭＡＣアッセイ用の全ての標的遺伝子は、ゲノムあたり１コピーの標的を含むような単一コピー遺伝子として見つかった。この精製ＤＮＡをTris−EDTA緩衝液, pH 8.5（担体として10μg/ml最終濃度の子ウシ胸腺担体ＤＮＡを含む）中に希釈した。1 ×107 〜1 ×108 ゲノム／μL のストック（標的）ＤＮＡを、このストック液20μL をＰＣＲに使用した時に試験１回あたりに生成する標的コピー数が10コピーであるように、0.5 コピー／μL に希釈した。ＭＡＣアッセイは、その時間の約60％に単一ゲノムコピーを検出することができ、そしてその時間のほぼ100 ％に３ゲノムコピーを検出することができた（ポアソン標本抽出分布を仮定して予想される通り）。
【００７１】
【表５】
0004298814.tif 000006
【００７２】
第３表は、陽性シグナルを生じる試験の百分率を、ＰＣＲ増幅を行った試料あたりの推定平均標的ＤＮＡコピー数と比較した多重化パウチアッセイの結果を示す（精製ＤＮＡは担体ＤＮＡを含むTris/EDTA 緩衝液中に希釈した）。Msqv P1, MAV19k P1およびIPC-1P（内部陽性対照）プローブビーズスポットを、パウチの検出ブリスター内の離れた所に配置した。ビオチン化生成物を標的特異的プローブピーズスポットに結合せしめた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ洗浄、非特異的結合ＨＲＰを除去するための第二の洗浄、そして最後にロイゴ色素洗浄を使って、結合生成物を検出した。ＰＣＲで増幅されたプローブ特異的生成物を含むビーズスポットの上で色素生成が起こった。精製された標的ＤＮＡはＭ．アビウム分離株 #177 、血清型２からのものであった。MSqv F4/R2とMAV19k F1/R1およびIPC プライマーを使って多重化ＰＣＲを実施した。Ｍ．アビウム分離株 177で１遺伝子コピー感度が観察された。
【００７３】
【表６】
0004298814.tif 000007
【００７４】
第４表は、MSqv P1, rpsl P1およびIPC-1P（内部陽性対照）プローブビーズスポットを、パウチの検出ブリスター内に離れて配置した。実験プロトコールは明らかな変更以外は第３表に示した実験のものと同じであった。精製標的ＤＮＡはKevin Nash氏（L.A. Childrens Hospital, Los Angeles, CA）により提供されたＭ．イントラセルラーレ血清型16（ATCC 13950）のものであった。精製ＤＮＡを完全生物体から抽出し、100 ℃で30分間加熱し、そして標準的フェノール／クロロホルム法を使ってＤＮＡを精製した。MSqv F4/R5とrpsl F1/R1およびIPC プライマーを使って多重化ＰＣＲを実施した。MSqvプライマー／プローブセットを使った時に１遺伝子コピー感度が観察されたが、rpslプライマーおよびプローブセットを使った時の感度はほぼ５分の１であった。
【００７５】
実施例３：複数の分離株から得られたＭ．アビウム標的ＤＮＡを使ったＭＡＣアッセイの感度
６つの患者分離株からのＭ．アビウム標的ＤＮＡを、２プライマーセット（MacSqvおよびMAV19k）を使って上述のＰＣＲプロトコールに従って増幅させ、次いで別々の標的特異的プローブビーズの上で生成物を捕捉した。CsCl精製済ＤＮＡはアーカンサス大学のT. Hellyer氏から提供された。各生物体からのＤＮＡを上述した通りに希釈し、パウチシステムにおいて試験した。第５Ａ表に示す通り、ＭＡＣアッセイシステムを使って各分離株について１遺伝子コピー感度が得られ、そして第５Ｂ表に示す通り、対応する３遺伝子コピー感度が得られた。
【００７６】
【表７】
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【００７７】
第５Ａ表から明らかなように、その時間の約60％に陽性結果が観察された（１遺伝子コピーについてのポアソン統計学により予測される通り）。どの場合でも、陽性シグナルを生じる試験の率は60％付近に集まっており、これは該アッセイが或る範囲のＭ．アビウム（血清型および患者分離株）に渡って１遺伝子コピー感度を示すことを指摘する。MSqvセットを使った時に分離株A8について100 ％陽性結果が観察されたことは、この試料が１遺伝子コピーよりもわずかに多くを含むかもしれないことを示す。
【００７８】
【表８】
0004298814.tif 000009
【００７９】
これらの実験条件は第５Ａ表のものと同じであった。使用した標的希釈液は第５Ａ表と同じ系列希釈からのであった。この場合、試験あたりほぼ３ゲノムコピー数では、100 ％陽性結果が観察された。100 ％陽性を生じなかった唯一のセットは、患者分離株A4を使ったMAV19kプライマー／プローブセットであった。
【００８０】
実施例４：包括試験（ＭＡＣの中の生物の同定）
ＭＡＣに入る各血清型からの数株を自家増殖させ、加熱により細胞を溶解させ、本発明者らの係属中の米国特許出願第08/306,870号明細書中に開示されたプライマー捕捉技術を使ってＤＮＡを精製した（モノマーおよびポリマー組成物並びにそれらの調製方法に関する米国特許第5,434,270 号と同第5,523,368 号明細書も参照のこと）。得られたＤＮＡを、個別に、またはMAV19k（もしくはrpsl）と組み合わせて、あるいは両者と内部陽性対照（IPC ）プライマーセットと組み合わせて、MacSqv正および逆プライマーセットの種々の組合せを使ったＰＣＲ増幅における標的として使用した。ＰＣＲ反応あたり10〜5000ゲノムコピー数の標的ＤＮＡレベルを使って試験を実施した。
【００８１】
ＭＡＣプライマーおよびプローブを試験するために用いた包括パネルを下記に記載する。ＭＡＣ生物をそれらの血清型番号に従って表にまとめる。対応する配列型も記載する。下記の表で用いる配列型の用語法は次の通りであった：“na"は配列型が決定されなかったことを示す。“Mav" はＭ．アビウムに該当する配列型を表す。“Min" はＭ．イントラセルラーレに該当する配列型を表す。“MAC" は“Mav" にも“Min" にも分類されなかったＭＡＣ配列型を表す。血清型１〜６、８〜11および21を有する生物はＭ．アビウムである。血清型７，12〜20および22〜26を有する生物は、Wayne 他（前掲）によるとＭ．イントラセルラーレか、またはＭ．アビウム種にもＭ．イントラセルラーレ種にも属さないＭＡＣ生物のいずれかであると推測された。
【００８２】
ＰＣＲ増幅および検出は、上述したプロセッサーと自臓式パウチシステムおよび条件を使って実施した。観察された目視カラースコアと一緒に第６表に示すようなビーズ固定化プローブを使って生成物を捕捉した。
【００８３】
【表９】
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【００８４】
第６表は、ＭＡＣ包括パネルを使った多重化増幅／検出試験フォーマットにおいて、MSqv F4/R5およびMav 19k プライマーをIPC プライマーと組み合わせた時に得られた結果を示す。MSqvプライマーセットと対応するプローブは、表に記載したＭＡＣパネル内の全生物の検出を可能にした。このMSqvプライマーセットは、MAV19kとIPC プライマーおよびプローブを使った多重化アッセイにおいてＭ．アビウム特異的プローブ（MSqv-Av ）を使った時に、パネル中のＭ．アビウム生物の包括検出も可能にした（データは示してない）。MAV19kセットは、Ｍ．アビウム生物のみの検出を可能にし、株1784-286の検出には失敗した。結果が単一パウチに基づいている株1784-286を除いて、全ての結果は二重反復パウチ試験結果に基づく。（第６表に相当する実験ではMAV19kにより株1784-286は同定されなかったが、多数の他の実験において同定された。）
【００８５】
【表１０】
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【００８６】
第７表は、MSqv F2/R5プライマーセットとMAV19k, rpslおよびIPC プライマーセットとを使って得られた同時増幅結果を示す。２より大きい全てのカラースコアは、指摘のプローブを使った時の陽性結果を表す。この多重化システムを使ってＭＡＣ複合体に含まれる生物を種のレベルで同定した時、MacSqvプライマーセット（およびMacSqv−MAC プローブ）はパネル内の全ての生物を同定する。rpslプライマーセット（およびプローブ）は先行研究者によりＭ．イントラセルラーレであると見なされた全ての生物を同定し、そしてMav19kプライマーセット（およびプローブ）はパネル内のＭ．アビウム生物を同定する。
【００８７】
多数のあいまいな株を指摘の包括パネル上に表した。例えば、Frothingham, 1993 （前掲）、Saito （前掲）およびWayne, 1993 （前掲）をＤＮＡ配列決定、Gen-Probe プローブ法、HPLCおよび／またはＭＡＣ参考株を種で分類するための生化学的方法に使用した時、Ｍ．アビウムにもＭ．イントラセルラーレにも上手く適合しない幾つかの株が存在した。従って、それらの株の多数を「ＭＡＣ」生物として特徴づけた。
【００８８】
下記の株はWayne, 1993 （前掲）によりHPLC分析を使ってＭ．イントラセルラーレとして同定された：12645, 23393, Melnick および1217。それらの同一株はたとえ上述の研究者らのやり方でGen-Probe Ｍ．イントラセルラーレプローブを使った時にGen-Probe 陰性であっても、第７表に記載のrpslプライマーおよびプローブセットを使ってＭ．イントラセルラーレとして同定された。
【００８９】
次の株は上述の研究者によりHPLC分析とGen-Probe を使ってＭ．イントラセルラーレとして同定された：W552, Darden, AT 545 Findley, CDC 1195。それらの株はrpslシステムによってもＭ．イントラセルラーレとして同定された。
【００９０】
残りのあいまいな株P-49と5154 O'Connor は、上述の研究者らにより正しく特徴づけることがまだできなかった。第７表では、それらの２つの株はＭＡＣ生物として特徴付けられる。Frothingham, 1993 （前掲）は、16s-23s 内部転写スペーサー領域を配列決定し、それらの２つの株の遺伝子配列がＭ．アビウムのものともＭ．イントラセルラーレのものとも似ていないことを発見した。
【００９１】
MAV19K系はＭ．アビウム生物のみを同定した。また、Ｍ．アビウム 1784-286 株は疑わしい結果を与えた（第６表において使った同一試料のストックであった）。全ての可視カラースコア値は、（特定のプローブビーズについての）２つのパウチ間の平均カラースコアに基づいている。星印（＊）は２つの複製物のカラースコア間に大きな偏差があることを示す。MSqv系はパネル上の全生物の検出を可能にした。
【００９２】
MacSqv, MAV 19k およびrpsLプライマー＆プローブを含む多重化アッセイを実施すると、種のレベルで、ＭＡＣ複合体に含まれる生物をＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、または非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣとして正しく同定することができる。
【００９３】
実施例５：包括試験（非ＭＡＣマイコバクテリアの核酸を使って測定）
多数のマイコバクテリアが高度のゲノム相同性を有する。これはＭＡＣ特異的プライマーおよびプローブをデザインするのにやりがいを起こさせる。ＭＡＣについてのＤＮＡアッセイは、Ｍ．アビウム複合体に含まれるそれらの生物体に対して高い特異性を持ち、且つ非ＭＡＣマイコバクテリアに対しては特異性がないものでなければならない。
【００９４】
【表１１】
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【表１２】
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【００９５】
* Daniel Amsterdam, Ph.D., Erie Country Medical Center, Bukkalo, NY から得た（その他の全生物体はKevin Nash, Ph.D., L.A. Children's Hospital, LosAngeles, CA から得た）。
【００９６】
第８表は、MSqv F4/R5, MAV 19k F1/R1 およびIPC プライマーを使って３×108 の非ＭＡＣマイコバクテリアからのＤＮＡ／mlをチャレンジした。３つのプローブ特異的ビーズスポットを検出ブリスター中の別々の場所に置いた。MAV 19k P1およびMsqv-Av はＭ．アビウム特異的であり、そしてMSqv P1 はＭＡＣ中の全ての生物に特異的である。プライマー／プローブ系はいずれも、Ｍ．アビウム複合体中に含まれるもの以外のどんなマイコバクテリアとも交差反応しなかった。Ｍ．ヘモフィルム（M. haemophilum）およびＭ．マルモエンセ（M. malmoense）の追加の株を使って、最初のパネル試験（MAC 080196）を繰り返した（MAC 080296）。rpslプライマー／プローブ系についての包括結果は、非ＭＡＣマイコバクテリアとの交差反応性を全く示さない。
【００９７】
【表１３】
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【表１４】
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【００９８】
第９表は、MSqv F4/R5, MAV19k F1/R1およびIPC プライマーを使って１mlあたり３×108 生物体（マイコバクテリア以外の）からのＤＮＡをチャレンジせしめた時に得られた結果を示す。非マイコバクテリアＤＮＡは検出されなかった（対照としてＭ．アビウムを使った）。
【００９９】
実施例６：ＭＡＣ特異的プローブ中に１塩基置換を作ることによるＭ．アビウム特異的プローブの作製
【０１００】
【表１５】
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【０１０１】
上記の表は、16s 〜23s rRNA遺伝子間領域中の５つの25 nt (nt ＝ヌクレオチド）MSqvプローブの配列と与えられた配列の標的特異性を表す。MSqv-Av はＭ．アビウム特異的であり、その他は全てＭＡＣ特異的である。MSqv-Av プローブがＭＡＣまたはＭ．イントラセルラーレを同定できないのは、MSqv-Av の３′末端から10 nt 上流のＣからＧへの（またはＣからＵへの）１塩基置換のためである。MSqv-Av プローブを２つの異なる場合において合成し、その新たな各合成をＭＡＣ生物のパネルに対して試験した。各場合において、１塩基（ＣからＧへの）置換は、前の広域（ＭＡＣ）特異的プローブをＭ．アビウム種生物からの標的ＤＮＡだけを認識する高特異的プローブに変更するのに十分なくらいプローブを変更した。この同じ場所の「Ｃ」を置き換えるのに「Ｕ」を使った第三の合成も、同様にアビウムのみの特異性をもたらした。このことは、132 位の「Ｃ」を、該プローブがＭ．アビウム種のみを同定する別の任意塩基に変更することにより、25 nt プローブ（例えばP1.21c）が十分に不安定化されることを示唆するだろう。この132 位の１塩基「Ｃ」は広域ＭＡＣパネルの同定の重要な鍵であり、この１塩基を「Ｃ」から別の塩基に変更すると、この25 nt プローブがＭ．アビウム特異的になる。
【０１０２】
【表１６】
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【０１０３】
第10表は、１塩基（残基132 の）置換がプローブ特異性を十分に変更することを表す。MSqv F4/R5プライマーセットとIPC プライマーセットを使って上述した通りにＰＣＲ増幅および検出を行った。MacSequevar プローブの識別番号（ＩＤ）がカラム項目として示される。対応する重要な塩基位置が示され、Frothingham Mav-A 配列型整列〔Frothingham, J. Infect. Diseases, 169:308 (1994)〕に従って表示される。パネル中の生物から得られた増幅生成物を、第10表に記載の様々なプローブ特異的ビーズスポットを使って検出した。IPC シグナルは全ての場合で陽性であった（示してない）。配列型Mav-A およびMav-B はＭ．アビウム対照として用いられ、一方パネル中の他の全ての生物はＭＡＣであった（Ｍ．アビウム以外の種）。残基137 および138 のところの１塩基または２塩基置換は、ＭＡＣ生物の広域パネル（Ｍ．アビウムを含む）を同定するプローブ特異性を変更しなかった。Frothingham 他（前掲）は、Mav 配列型と MAC（またはMin ）配列型との間で変異するのは残基137 〜139 のところであると説明し、残基132 のところのＭ．アビウムと他の種との間の変異は同定しなかった。
【０１０４】
上記の各カラムに示した１残基は132 位に見つかり、そして示される２残基はFrothingham 他（前掲）により記載されたようなＭ．アビウム（Mav-A ）配列型の137 位と138 位に見つかった（左から右に）。IPC 結果は示してないが、全ての場合に陽性IPC シグナルが観察された。
【０１０５】
残基132 に集中したプローブをデザインした。残基132 に「Ｃ」が置かれそして残基137 と138 に「ＣＧ」が置かれている25 nt プローブ（プローブ MSqv P1.21cのように）を使った時、プローブは試験パネル内のＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物の広域スペクトルとハイブリダイズする能力を保持している。しかしながら、残基137 と138 に同じ「ＣＧ」配置を維持しながら残基132 を「Ｇ」または「Ｕ」に変更すると（それぞれプローブMSqv-Av またはMSqv-Urasil のように）、プローブはＭ．アビウム生物とだけハイブリダイズし、ＭＡＣ中の他の生物とはハイブリダイズすることができない。それらの25 nt ＭＡＣ特異的プローブ（P1.21c, P1.3c, MAC）を使う時、132 位に塩基「Ｃ」を有することが重要である。この１塩基を別の塩基に変更すると（P1.21cからMAC-AvまたはMAC-Uracilへ切り換えるとわかるように) 、25 nt プローブはＭ．アビウム特異的になる。よって、MSqv-Av プローブを使って、別のＭＡＣ生物からＭ．アビウム生物を識別することができる。
【０１０６】
小型（88nt〜100 nt）生成物を増幅させることおよび種レベルで生物を同定するために小型プローブを使うことには、幾つかの有利な点がある。それらの利点としては、ＰＣＲ法を使用して小型の（約80〜100 nt）標的のほうが大型の標的よりも効率的に増幅できることが挙げられる。加えて、小型の標的は大型の標的よりも苛酷な試料調製操作によって断片化しにくい。従って、標的が小さければ、着目の遺伝子領域全体を増幅できる機会がより大きい。
【０１０７】
種レベルで生物を同定する方法は幾つかある。１つの方法は、十分な変異性を含むゲノムの大部分を増幅させることと、種特異的プローブをデザインすることを含んで成る。典型的には、単一のプライマーセットを使って１つの大きな遺伝子領域を増幅させ、そして複数の（種特異的）プローブを使って種特異的生成物を同定する（例えば、WO 96/00298 を参照のこと）。別の方法は、十分な変異性を含む１遺伝子領域を同定し、そして多重化（複合的）アッセイにおいて使用することができる複数の種特異的プライマーセットと種特異的プローブをデザインすることを伴う。更に別の方法は、複数の遺伝子領域を同定し、それを使って種特異的プライマーおよびプローブをデザインし、それを組み合わせて使用した時に、種レベルで生物を同定する多重化アッセイを含んで成る。この一例は上述したものである（例えば、Ｍ．イントラセルラーレを同定するために使われるrpsl遺伝子、Ｍ．アビウムを同定するために使われる MAV 19k遺伝子）。
【０１０８】
種レベルで生物を同定する時に単一プライマーセットを使うことは利点がある。多重化方式において複数のプライマーセットを使って標的を増幅させると、使用するプライマーの数に正比例してプライマー−プライマー相互作用のポテンシャルが増加する。プライマー−プライマー相互作用は、副産物生成のためにアッセイ感度の低下を引き起こし得る。プライマー−プライマー相互作用のポテンシャルは、単一の（MSqv）プライマーセットと、各々ＭＡＣかＭ．アビウムのいずれかを同定するための２つの特異的プローブを使うことによって、最少になる。本発明では、種レベルでＭＡＣ生物の３種の分類階級を同定するのに２つの標的特異的プライマーのみが必要となるのでプライマー相互作用のリスクが最少のままで、追加のプライマーセット（および対応するプローブ）を多重化システム（Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび広域ＭＡＣを同定するための）に導入することができる。
【０１０９】
今まで本発明を明確化と理解のために幾分詳細に記載してきたが、この開示を読めば本発明の真正な範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変更を行い得ることは当業者に明らかであろう。