(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(1)で示されるデアミノノイラミン酸誘導体及びグルコースを有効成分として含有する、スフィンゴバクテリウム属に属する細菌が産生するデアミノノイラミニダーゼを誘導するための、デアミノノイラミニダーゼの誘導剤。
【化１】
0004336400.tif 000004
（Ｒは炭素数１〜１０のアルキル基、アラルキル基又はアリール基を示す。）
【請求項２】
Ｒが炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又は置換基を有していてもよいフェニル基もしくはウンベリフェリル基である、請求項１に記載の誘導剤。
【請求項３】
Ｒが炭素数１〜２のアルキル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基である、請求項２に記載の誘導剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤を含む培地において、スフィンゴバクテリウム属に属する細菌をデアミノノイラミニダーゼの生産条件下において培養する工程、および、培養により得られた培養物からデアミノノイラミニダーゼを採取する工程を少なくとも含む、デアミノノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項５】
下記の工程を少なくとも含む、請求項４に記載の製造方法。
（工程１）請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤を、スフィンゴバクテリウム属に属する細菌を含有する培養物に添加する。
（工程２）工程１で得られた培養物をデアミノノイラミニダーゼの生産条件下において培養する。
（工程３）工程２で得られた培養物からデアミノノイラミニダーゼを採取する。
【請求項６】
前記スフィンゴバクテリウム属に属する細菌が、スフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−４ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１１６）である、請求項４又は５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素の誘導剤及び酵素の製造方法に関する。より詳細には、デアミノノイラミニダーゼの誘導剤及び製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デアミノノイラミン酸(3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonic acid、あるいは2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid；以下、ＫＤＮともいう）は、複合糖質の構成成分として生物界に広く存在し、多様な存在様式をもつことが知られており、またＫＤＮを含有する糖質中のＫＤＮケトシド結合を切断する酵素（デアミノノイラミニダーゼ；以下、ＫＤＮａｓｅともいう）も知られている。ＫＤＮａｓｅは、ＫＤＮの構造・機能の解析や、ＫＤＮの検出に有用な試薬として期待されている。
【０００３】
ＷＯ９６／００７８１号公報には、ＫＤＮａｓｅ、その製造方法及びＫＤＮａｓｅ生産菌（スフィンゴバクテリウム  ｍＯＬ１２−４ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１１６））が開示されている。また当該公報中には、ＫＤＮオリゴ糖アルコール(KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3[KDNα2→(8KDNα2→)n→6]GalNAcol)を含有する培地でスフィンゴバクテリウム  ｍＯＬ１２−４ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１１６）を培養することにより、ＫＤＮａｓｅが誘導できることが記載されている。
【０００４】
しかし、ＫＤＮグリコシドを有効成分とするＫＤＮａｓｅの誘導剤、及びこれを用いるＫＤＮａｓｅの製造方法については開示されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＫＤＮオリゴ糖アルコールをさらに上回るＫＤＮａｓｅ誘導作用を有する誘導剤、及びこれを用いるＫＤＮａｓｅの製造方法が提供できれば、ＫＤＮａｓｅ生産菌を用いて極めて効率的かつ大量にＫＤＮａｓｅが製造でき、ＫＤＮａｓｅをより安価に提供することができる。
【０００６】
そこで、本発明が解決すべき課題は、新規なＫＤＮａｓｅの誘導剤、及びこれを用いるＫＤＮａｓｅの製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定のＫＤＮグリコシドが、上記ＫＤＮオリゴ糖アルコールを上回る顕著なＫＤＮａｓｅ誘導作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体を有効成分として含有する、ＫＤＮａｓｅの誘導剤（以下、本発明誘導剤という）を提供する。
【０００９】
【化２】
0004336400.tif 000002
（Ｒは炭素数１〜１０のアルキル基、アラルキル基又はアリール基を示す。）本発明誘導剤において、Ｒは、好ましくは、炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又は置換基を有していてもよいフェニル基もしくはウンベリフェリル基であり、これらの中でも炭素数１〜４のアルキル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基もしくはウンベリフェリル基が好ましい。さらに好ましくは、Ｒは、炭素数１〜２のアルキル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基である。
【００１０】
本発明誘導剤は、好ましくは、さらにグルコースを有効成分として含有する。
【００１１】
また、本発明は、本発明誘導剤を含む培地において、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物をＫＤＮａｓｅの生産条件下において培養する工程、および、培養により得られた培養物からＫＤＮａｓｅを採取する工程を少なくとも含む、ＫＤＮａｓｅの製造方法（以下、本発明製造方法という）を提供する。
【００１２】
本発明製造方法は、好ましくは、下記の工程を少なくとも含む。
（工程１）本発明誘導剤を、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物を含有する培養物に添加する。
（工程２）工程１で得られた培養物をＫＤＮａｓｅの生産条件下において培養する。
（工程３）工程２で得られた培養物からＫＤＮａｓｅを採取する。
【００１３】
本発明製造方法において、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物は、好ましくは、スフィンゴバクテリウム属に属する細菌である。スフィンゴバクテリウム属に属する細菌は、好ましくは、スフィンゴバクテリウム  ｍＯＬ１２−４ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１１６）である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。
＜１＞本発明誘導剤
本発明誘導剤は、下記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体を有効成分として含有する、ＫＤＮａｓｅの誘導剤である。
【００１５】
【化３】
0004336400.tif 000003
（Ｒは炭素数１〜１０のアルキル基、アラルキル基又はアリール基を示す。）
なお上記一般式(1)におけるＲは、炭素数１〜１０のアルキル基（具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル、オクチル基、ノニル基又はデシル基）、アラルキル基又はアリール基である限りにおいて特に限定されないが、以下に好ましいＲを例示する。
【００１６】
上記一般式(1)におけるＲが炭素数１〜１０のアルキル基であるもののなかでも、Ｒが炭素数１〜４のアルキル基（具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基）であるものが好ましく、Ｒが炭素数１〜２のアルキル基（具体的にはメチル基又はエチル基）であるものがより好ましく、Ｒがエチル基であるものが特に好ましい。
【００１７】
上記一般式(1)におけるＲがアラルキル基であるもののなかでも、Ｒがベンジル基であるものが好ましい。
【００１８】
上記一般式(1)におけるＲがアリール基であるもののなかでも、Ｒが置換基を有していてもよいフェニル基もしくはウンベリフェリル基であるものが好ましい。置換基としては、炭素数１〜４のアルキル基、ニトロ基などが挙げられ、置換基は複数であってもよく、複数の場合は互いに同一でも相違してもよい。Ｒがニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基であるものがより好ましい。
【００１９】
上記一般式(1)におけるＲがニトロフェニル基であるもののなかでも、Ｒがｐ−ニトロフェニル基であるものがより好ましい。
【００２０】
上記一般式(1)におけるＲがメチルウンベリフェリル基であるもののなかでも、Ｒが４−メチルウンベリフェリル基であるものがより好ましい。
【００２１】
なお、上記ＫＤＮ誘導体には、一般式(1)中のカルボン酸基が塩になっているものも包含される。
【００２２】
これらのＫＤＮ誘導体は、ＫＤＮと前記の「Ｒ」に該当する基とを、常法によりグリコシド結合させることにより製造することができる。具体的なＫＤＮ誘導体の製造法については、後述の実施例において詳述する。
【００２３】
本発明誘導剤は、上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体を有効成分として含有するが、さらにグルコースを有効成分として含有することが好ましい。すなわち本発明誘導剤は、上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体及びグルコースを有効成分として含有することが好ましい。
【００２４】
ここで、上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体及びグルコースを有効成分として含有する本発明誘導剤の提供形態は、必ずしも当該ＫＤＮ誘導体とグルコースとの混合物である必要はなく、例えば下記のような提供形態が例示される。
【００２５】
(A)上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体とグルコースとの混合物を調製し、これを本発明誘導剤として提供する形態。
【００２６】
(B)上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体とグルコースとを別々の容器に封入し、これらをセットで本発明誘導剤として提供する形態。
【００２７】
(C)上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体又はグルコースのみを、その使用の際にグルコース又は上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体を添加せしめる旨の表示をして、本発明誘導剤として提供する形態。
【００２８】
なお、上記一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体とグルコースとの混合物として本発明誘導剤を提供する場合の混合比は特に限定されないが、ＫＤＮ誘導体：グルコース＝１：１程度が好ましい。
【００２９】
本発明誘導剤は、上記ＫＤＮ誘導体及びグルコースの他、培養において許容可能な担体や添加剤を含んでいてもよい。
【００３０】
なお、ＫＤＮａｓｅ誘導の際に用いる本発明誘導剤の使用量については、後述の「＜２＞本発明製造方法」において詳述する。
【００３１】
＜２＞本発明製造方法
本発明製造方法は、上記の本発明誘導剤を含有する培地で、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物をＫＤＮａｓｅの生産条件下において培養する工程、及び、培養により得られた培養物からＫＤＮａｓｅを採取する工程を少なくとも含む、ＫＤＮａｓｅの製造方法である。
【００３２】
ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物のＫＤＮａｓｅ生産条件下での培養は、この微生物を本発明誘導剤を含まない培地で培養後、培養物に本発明誘導剤を添加して行ってもよいし、培養物を本発明誘導剤を含む培地に接種して行ってもよい。
【００３３】
本発明製造方法は、下記の工程を少なくとも含むことが好ましい。
（工程１）本発明誘導剤を、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物を含有する培養物に添加する。
（工程２）工程１で得られた培養物をＫＤＮａｓｅの生産条件下において培養する。
（工程３）工程２で得られた培養物からＫＤＮａｓｅを採取する。
【００３４】
ここで、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物は特に限定されないが、スフィンゴバクテリウム属に属する細菌であることが好ましく、スフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１１６）であることがより好ましい。
【００３５】
このスフィンゴバクテリウム  ｍＯＬ１２−４ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１１６）は、下記の酵素学的性質を有するＫＤＮａｓｅを生産する。
▲１▼作用：
ＫＤＮを含有する複合糖質もしくは糖質に作用し、ＫＤＮケトシド結合を加水分解して、ＫＤＮを含有しない複合糖質もしくは糖質又はＫＤＮが部分的に除去された複合糖質もしくは糖質と、遊離のＫＤＮとを生成する。
▲２▼基質特異性：
ＫＤＮを含有する複合糖質もしくは糖質には作用するが、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質における、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結合には作用しない。
【００３６】
このＫＤＮａｓｅは、さらに下記の性質を有する。
(i)至適反応ｐＨ：
ｐＨ６付近
(ii)安定ｐＨ範囲
２５℃においてｐＨ４〜９で安定
(iii)至適反応温度
２５℃付近
(iv)熱安定性
２５℃で少なくとも４８時間失活しない。
(v)阻害及び安定化
遊離のＫＤＮによって阻害される。ウシ血清アルブミン存在下で安定化される。
【００３７】
従って、本発明製造方法によって製造されるＫＤＮａｓｅは、上記の酵素学的性質を有するものであることが好ましい。
【００３８】
ＫＤＮａｓｅ生産条件とは、ＫＤＮａｓｅ生産能を有する微生物がＫＤＮａｓｅを生産する条件を意味し、使用する微生物によって適宜選択されるが、通常には、この微生物が資化可能な炭素源（グルコースなど）、窒素源（酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕、カゼインの加水分解物(casamino acids)などの有機窒素源、塩酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源、無機塩（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）などを含む培地中で、好気的な培養法（振盪培養、通気攪拌培養など）によって生育に適した温度で数時間〜数日間培養するという条件が挙げられる。
【００３９】
ＫＤＮａｓｅ生産条件下での培養における本発明誘導剤の使用量は、本発明誘導剤を使用しないときに比べ、産生されるＫＤＮａｓｅの量が増大するのに十分な量であればよく、通常には、培地中のＫＤＮ誘導体の濃度として０．０１〜１％(w/v)、好ましくは０．０１〜０．３％(w/v)である。
【００４０】
ＫＤＮａｓｅ生産条件下での培養における培地中のグルコースの量は、ＫＤＮａｓｅの誘導を増大させるのに十分な量であればよく、通常には、培地中の濃度で０．０１〜１％(w/v)、好ましくは０．０１〜０．３％(w/v)である。従って、本発明誘導剤に任意成分として含まれるグルコースは、培地中に十分量のグルコースが存在する場合には、なくてもよい。
【００４１】
その他、ＫＤＮａｓｅ生産条件下での培養における、ＫＤＮａｓｅ誘導のための、初期細胞密度、培養時間等の条件は、後記実施例２に示すように、通常に行われる実験手順によって設定することができる。
【００４２】
培養により得られた培養物からのＫＤＮａｓｅの採取は、ＷＯ９６／００７８１号公報に記載されたＫＤＮａｓｅの取得法に従って行うことができる。例えば、培養物から遠心分離などで収集した菌体から、超音波処理などによる破砕、あるいは浸透圧ショック等の適当な方法によって放出された酵素を含む画分を得、次いで、例えば、硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム等による塩析、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、電気泳動法などの公知の酵素精製法、さらにはＫＤＮ含有糖タンパク質（KDN-gp）を結合させたアガロースゲル等を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって目的とする精製度の酵素標品を得ることができる。
【００４３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００４４】
【調製例１】
ＫＤＮ誘導体等の調製
ＫＤＮオリゴ糖アルジトール画分（ＫＤＮ−ＯＳ）は、ニジマス卵巣液から、既報（J. Biol. Chem. 271, 2909-2913(1996)）の方法に従って調製した。ＫＤＮ、ｐ−α−ニトロフェニルＫＤＮ（ＫＤＮα２ｐＮＰ）及びα−４−メチルウンベリフェリルＫＤＮ（ＫＤＮα２ＭｅＵｍｂ）は、既報（Chem. Pharm. Bull. 37, 821-823(1989); Chem. Ber. 101, 1089-1094(1968); Chem. Pharm. Bull. 43, 1844-1848(1995)）の方法に従って合成した。α−メチルＫＤＮ（ＫＤＮα２Ｍｅ）、α−エチルＫＤＮ（ＫＤＮα２Ｅｔ）及びα−ベンジルＫＤＮ（ＫＤＮα２Ｂｎ）は、以下の様にして調製した（図１）。メチル 4,5,7,8,9-ペンタ-O-アセチル-2-クロロ-2,3-ジデオキシ-D-glycero-β-D-galacto-2-ノヌロピラノソネート(2, 1.0 g, 1.96 mmol) を、メタノール、エタノール及びベンジルアルコール(30 ml)にそれぞれ溶解し、攪拌しながら安息香酸ナトリウム(0.34 g, 2.36 mmol) を加えた。得られた懸濁液を室温で０．５〜３時間攪拌し、反応液をセライト(Celite)で濾過し、濾液をエバポレーターにより減圧乾固した。残渣を酢酸エチル(30 ml)に溶解し、この溶液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した後、エバポレーターにより減圧乾固した。残渣を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル(2:1, v/v)を用いてシリカゲル(Merck, Kieselgel 60, 70-230 mesh, ASTM, 80 g)カラムのクロマトグラフィーに付し、無色のアモルファス粉末として、3, 4及び5の化合物を得た。各生成物を、ｎーヘキサン／酢酸エチルから結晶化した。脱保護のために、各結晶をメタノール(10 ml)に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム(10 ml)を加えた。得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで水で希釈し、Dowex 50W-X8(H+)樹脂を用いて０℃で脱イオンした。濾液を凍結乾燥し、6, 7及び8の化合物を無色の粉末として得た。
【００４５】
得られた化合物の性質を以下の通り確認した。
【００４６】
メチル 2-デオキシ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸(6, KDNα2Me): 収率 98%. [α]D25 -29.2° (c = 1.0, CH3OH).元素分析 C10H18O9の計算値: C, 42.55; H, 6.43.測定値: 42.44; H, 6.48. IRデータ, νmaxfilm cm-1: 1720 (C=O). 1H-NMR (300 MHz, D2O) data:δ= 1.57 (1H, t, J = 12.0 Hz, 3-Hax), 2.64 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, 3-Heq), 3.31 (3H, s, 2-OCH3), 3.49 (1H, dd, J = 9.0, 9.5 Hz, 5-H), 3.57 (1H, ddd, J = 5.0, 9.0, 12.0 Hz, 4-H), 3.65 (1H, dd, J = 2.0, 9.5 Hz, 6-H), 3.66 (1H, dd, J = 6.5, 12.5 Hz, 9-H), 3.85 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 7-H), 3.88 (1H, ddd, J = 2.5, 6.5, 8.5 Hz, 8-H), 3.88 (1H, dd, J = 2.5, 12.5 Hz, 9'-H).
エチル 2-デオキシ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸(7, KDNα2Et): 収率 98%. [α]D25 -34.2°(c = 1.0, CH3OH).元素分析 C11H20O9の計算値: C, 44.59; H, 6.80.測定値: 44.64; H, 6.58. IRデータ, νmaxfilm cm-1: 1720 (C=O). 1H-NMR (300 MHz, D2O): δ= 1.14 (3H, t, J = 7.0 Hz, -CH2CH3), 1.57 (1H, dd, J = 11.5, 12.0 Hz, 3-Hax), 2.66 (1H, dd, J = 4.5, 12.0 Hz, 3-Heq), 3.46 (1H, dq, J = 9.0, 7.0 Hz, 2-OCHCH3), 3.48 (1H, t, J = 9.0 Hz, 5-H), 3.56 (1H, ddd, J = 4.5, 9.0, 11.5 Hz, 4-H), 3.65 (1H, dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 6-H), 3.66 (1H, dd, J = 3.0, 13.0 Hz, 9-H), 3.76 (1H, dq, J = 9.0, 7.0 Hz, 2-OCHCH3), 3.83 (1H, ddd, J = 1.5, 3.0, 9.0 Hz, 8-H), 3.85 (1H, dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 7-H), 3.88 (1H, dd, J = 1.5, 13.0 Hz, 9'-H).
ベンジル 2-デオキシ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸(8, KDNα2Bn): 収率 98%. [α]D25 -32.0°(c = 1.0, CH3OH).元素分析 C16H22O9の計算値: C, 53.63; H, 6.19.測定値: C, 53.64; H, 6.38. IRデータ, νmaxfilm cm-1: 1720 (C=O), 1600 (フェニル).1H-NMR (300 MHz, D2O): δ= 1.64 (1H, t, J = 12.0 Hz, 3-Hax), 2.70 (1H, dd, J = 4.5, 12.0 Hz, 3-Heq), 3.56 (1H, dd, J = 9.0, 9.5 Hz, 5-H), 3.61 (1H, ddd, J = 4.5, 9.0, 12.0 Hz, 4-H), 3.69 (1H, dd, J = 6.5, 11.5 Hz, 9-H), 3.70 ( 1H, dd, J = 2.0, 9.5 Hz, 6-H), 3.80 (1H, dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 7-H), 3.84 (1H, ddd, J = 2.0, 6.5, 9.0 Hz, 8-H), 3.88 (1H, dd, J = 2.0, 11.5 Hz, 9'-H), 4.49 (1H, d, J = 11.0 Hz, C6H5CH-), 4.73 (1H, d, J = 11.0 Hz, C6H5CH'-), 7.34-7.45 (5H, C6H5-).
【００４７】
【実施例１】
ＫＤＮ誘導体によるＫＤＮａｓｅの誘導
スフィンゴバクテリウム  ｍＯＬ１２−４ｓの細菌細胞を、１％(w/v)のカゼイン加水分解物(casamino acids、ギブコ製)及び１％(w/v)のグルコース(Glc)を含むＭ９液体培地中で２５℃で培養した。増殖期の菌体（細胞）を集め、Ｍ９液体培地で２回洗浄した。表１に示す添加物質をそれぞれ０．１％(w/v)の濃度で含む、それぞれ２．０ｍｌのＭ９液体培地に１×１０9個の細胞を接種し、２５℃で１２時間インキュベートし、細胞内ＫＤＮａｓｅ活性を測定した。細胞内ＫＤＮａｓｅ活性は、培養液を13,000rpm(14,000×ｇ)で１０分間遠心することにより集めた細胞を、0.1M NaClを含む0.1Mトリス−酢酸緩衝液(pH 6.0)の0.25ｍｌに懸濁し、超音波破砕した（20ワット、30秒間）。これを13,000rpm(14,000×ｇ)で１０分間遠心した後に得られた上清のＫＤＮａｓｅ活性を測定し、２ｍｌの培養液当たりのユニットとして算出した。なお、ＫＤＮａｓｅ活性は、基質として1.4nmolのＫＤＮα２ＭｅＵｍｂを、20μlの上清に加えて、25℃で30分間反応させ、反応後、2.5mlの85mMグリシン炭酸塩緩衝液(pH 9.3)と混合して、蛍光強度を測定した。１分間に１nmolのＫＤＮα２ＭｅＵｍｂを加水分解する酵素量を１ユニットと定義した。結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
表１  各種物質添加時のＫＤＮａｓｅ活性
────────────────────────────────
添加物質                    ＫＤＮａｓｅ活性（ユニット/2 ml培養液）
────────────────────────────────
ＫＤＮα２Ｍｅ＋Ｇｌｃ              ７．３
ＫＤＮα２Ｅｔ＋Ｇｌｃ            １１．０
ＫＤＮα２Ｂｎ＋Ｇｌｃ              ５．１
ＫＤＮα２ｐＮＰ＋Ｇｌｃ            ９．０
ＫＤＮα２ＭｅＵｍｂ＋Ｇｌｃ        ９．４
ＫＤＮ−ＯＳ＋Ｇｌｃ                ２．１
ＫＤＮ＋Ｇｌｃ                      ０．３
Ｇｌｃ                              ０．７
ＫＤＮα２Ｂｎ                      ０．２
ＫＤＮ−ＯＳ                        ４．５
ＫＤＮ                              ０．１
────────────────────────────────
注）ＫＤＮα２Ｍｅ、ＫＤＮα２Ｅｔ、ＫＤＮα２ｐＮＰ及びＫＤＮα２ＭｅＵｍｂの単独の添加時の活性は、０．３〜１．８であり、ＫＤＮα２Ｂｎとほぼ同じであった。
【００４９】
表１から、グルコースが存在するときに、一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体は、顕著なＫＤＮａｓｅ誘導活性を示すことが明らかである。また、グルコースは０．１％（w/v)の量が存在するだけで一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体のＫＤＮａｓｅ誘導活性が発揮されるので、一般の培養条件で炭素源として加えられるレベルのグルコースが存在する条件では、一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体のみをＫＤＮａｓｅ誘導剤として加えることで十分なことが分かる。さらに、このような条件では、ＫＤＮ−ＯＳに比べ一般式(1)で示されるＫＤＮ誘導体のＫＤＮａｓｅ誘導活性が顕著に高いことが分かる。
【００５０】
【実施例２】
ＫＤＮａｓｅ誘導条件の最適化
誘導剤としてＫＤＮα２ＭｅＵｍｂを用いた場合の、スフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓのＫＤＮａｓｅの誘導条件を検討した。
【００５１】
(a) 初期細胞密度
１％(w/v)のカゼイン加水分解物(casamino acids、ギブコ製)及び１％(w/v)のグルコース(Glc)を含むＭ９液体培地中で２５℃で培養した細胞を、種々の細胞密度で、０．１％(w/v)ＫＤＮα２ＭｅＵｍｂ及び０．１％(w/v)Ｇｌｃを含むＭ９液体培地に接種し、２５℃で１２時間インキュベートし、実施例１と同様の方法で細胞内ＫＤＮａｓｅ活性を測定した。結果を図２の(a)に示す。誘導の至適初期細胞密度は１．０×１０9細胞／ｍｌであった。
【００５２】
(b) 誘導剤濃度
１％(w/v)のカゼイン加水分解物(casamino acids、ギブコ製)及び１％(w/v)のグルコース(Glc)を含むＭ９液体培地中で２５℃で培養した細胞を、種々の濃度のＫＤＮα２ＭｅＵｍｂ及び０．１％(w/v)Ｇｌｃを含むＭ９液体培地に、１．０×１０9細胞／ｍｌの細胞密度で接種し、２５℃で１２時間インキュベートし、実施例１と同様の方法で細胞内ＫＤＮａｓｅ活性を測定した。結果を図２の(b)に示す。０．０１％(w/v)の濃度でＫＤＮａｓｅの誘導に効果的であった。
(c) 誘導時間
１％(w/v)のカゼイン加水分解物(casamino acids、ギブコ製)及び１％(w/v)のグルコース(Glc)を含むＭ９液体培地中で２５℃で培養した細胞を、０．１％(w/v)ＫＤＮα２ＭｅＵｍｂ及び０．１％(w/v)Ｇｌｃを含むＭ９液体培地に、１．０×１０9細胞／ｍｌの細胞密度で接種し、２５℃で種々の時間インキュベートし、実施例１と同様の方法で細胞内ＫＤＮａｓｅ活性を測定した。結果を図２の(c)に示す。６時間〜２４時間で効果的なＫＤＮａｓｅの誘導が得られた。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、ＫＤＮａｓｅ誘導作用の高いＫＤＮａｓｅの誘導剤及びそれを用いたＫＤＮａｓｅの製造方法が提供され、ＫＤＮａｓｅを効率よく製造することができる。なお、本発明誘導剤の有効成分であるＫＤＮ誘導体は、調製が容易であり、安価かつ大量に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＫＤＮ誘導体の合成スキームを示す。
【図２】  ＫＤＮａｓｅ誘導条件の一例を示す。
【図１】
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【図２】
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