(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有するラクトバチルス・アシディファリナリウス（Lactobacillus acidifarinarius）であって、下記の菌学的性質を有することを特徴とする新規ラクトバチルス属細菌。
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １５〜３７℃
（８）生育ｐＨ  ３．５〜８．０
（９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。
（10）細胞壁    L-Lys-D-Asp型
（11）ＧＣ含量  ５１．２−５１．７ｍｏｌ％
(12) ＭＹＰ寒天培地での２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
【請求項２】
配列番号１または２で表される塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有し、請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なDNAプライマーまたはプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ラクトバチルス属細菌であるラクトバチルス・アシディファリナリウス（Lactbacillus acidifarinarius）（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７７）および本菌に特異的なプライマー、新規ラクトバチルス属細菌の同定方法および新規ラクトバチルス属細菌の検出方法に関するもので、主として世界的に有名なパネトーネ（イタリアンケーキ）の製造に極めて有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
世界的に有名なイタリアンケーキであるところのパネトーネの製造は、古来、イタリアのミラノを中心とした地方で伝承的に引き継がれており、その根源はアルプス山麓のコモ湖周辺であるといわれている。その元種は不安定であり、伝統的な植え継ぎ方法で培養されていて、その醗酵作用とケーキ独特の風味・食感・長期間の日持ち等が良好であることの原因については明らかでない。もちろんこの元種には何らかの微生物の作用が関与し、醗酵作用とその独特の風味、食感、長期保存性の原因をなしていると考えられている。
【０００３】
この件に関しては、上記パネトーネ元種中の微生物中特に重要な醗酵作用をするものの１つとして、サンフランシスコサワーパンの製造に関係があるとの報告が既になされているサッカロミセス・イグジグース（Saccharomyces exiguus）がある（特公昭５８−５８０７０号公報）。また、上記パネトーネ元種中に独特の風味を与えるものとして乳酸菌であるところのラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）が存在するという報告がある。この乳酸菌はサンフランシスコサワーパンにおいても重要なものであり、Ｄｒ．スギハラ（Applied  Microbiology ２１、４６５〜４５９（１９７１））によってその微生物的性質が詳しく報告されている。さらに舟橋はラクトバチルス・サンフランシスエンシスと生成乳酸の旋光性が異なる乳酸菌を上記元種中に発見し、この乳酸菌については新菌種ラクトバチルス・コモエンシス（L. comoensis）として報告している（特公平４−４８６９号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、イタリアンケーキの特殊な味、香り、食感、日持ちの良さに関与する微生物は上記のもののみではなく、他に何らかの微生物の作用があると本発明者等は推察していた。そして本発明者等の研究の結果、その微生物が何であるかを見出すことができた。それは乳酸菌の一種ではあるが、未だに報告されていない乳酸菌であることが分かった。
【０００５】
本発明の第１の目的は、上記のごとき経過から、上記のサッカロミセス・イグジグース、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス、ラクトバチルス・コモエンシスの他にイタリアンケーキであるところのパネトーネ独特の風味、香り、食感、日もち性の良さを左右する元種中の微生物である新菌種を提供することである。
【０００６】
さらに、本発明の第２の目的は、見出した新規ラクトバチルス属細菌について菌種レベルで特異的に同定できるプライマーもしくは検知できるプローブを合成し、これを用いて新規ラクトバチルス属細菌を迅速、簡便に解析することができるようなプライマーまたはプローブを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記パネトーネの元種に存在する微生物が何であるかを研究中、生理・生化学的性状および１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の特異配列により、これらのものの一つは新規ラクトバチルス属細菌であることを見出し本発明を成すに至った。
さらに本発明者等は、新規ラクトバチルス属細菌であるところのラクトバチルス・アシディファリナリウスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行い、本菌に特異的な塩基配列に従い合成した配列番号１および２のＤＮＡプライマーで本菌を特異的に検出できることを見出し、本発明を成すに至った。これを用いることで、生理・生化学的性状の確認など煩雑な操作を行うことなく検体から抽出した本菌由来のＤＮＡを使ったＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に新規ラクトバチルス属細菌の同定・解析を行う事が可能となった。
【０００８】
すなわち本発明の請求項１記載の発明は、配列番号１または２で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有する新規ラクトバチルス属細菌であるところのラクトバチルス・アシディファリナリウス（Lactobacillus  acidifarinarius  受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７７）であって、下記の菌学的性質を有することを特徴とする。
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １５〜３７℃
（８）生育ｐＨ  ３．５〜８．０
（９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。
（10）細胞壁    L-Lys-D-Asp型
（11）ＧＣ含量  ５１．２−５１．７ｍｏｌ％
(12) ＭＹＰ寒天培地での２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
【００１０】
本発明の請求項２記載の発明は、配列番号１または２で表される塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有し、請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なDNAプライマーまたはプローブである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における新規ラクトバチルス属細菌であるところのラクトバチルス・アシディファリナリウスの性質は以下の通りである。
（１）形態的性質
ＭＹＰ培地での２４時間培養で２．０〜５．０×０．４μｍの長桿菌で単一または連鎖状に存在する。胞子は形成せず、非運動性で、グラム陽性である。
ＭＹＰ培地の組成は下記の通りである。
マルトース                １０ｇ
酵母エキス                １０ｇ
ペプトン                  ５ｇ
肉エキス                  ２ｇ
酢酸ナトリウム3水和物    ２ｇ
硫酸マグネシウム          ２００ｍｇ
硫酸マンガン              １０ｍｇ
硫酸第一鉄                １０ｍｇ
塩化ナトリウム            １０ｍｇ
Tween  80                 ０．２５ｇ
水                        １０００ｍｌ
１N  HClでpH５．０に調整
【００１４】
（２）培養的性質
(1)ＭＹＰ寒天平板培地
ＭＹＰ寒天培地はＭＹＰ培地１０００ｍｌにさらに寒天12ｇを添加されてなる培地である。
２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
(2)ＭＹＰ培地（液体培地）
３０℃、２日培養で菌体が増殖して培地が白濁し、綿毛状の沈殿を生ずる。
(3)ＭＹＰ寒天培地（穿刺培養）
穿刺によって一様に生育、表面にも生育する。
【００１５】
（３）生理・生化学的性質
(1)生育温度  １５〜３７℃、４５℃では生育せず
(2)生育ｐＨ域  ３．５〜８．０
(3)酸素との関係
通性嫌気性。酸素存在下でも嫌気的条件でも生育できる。
(4)生育必須物質
上記ＭＹＰ培地中、不飽和脂肪酸を必須要求する。
(5)糖類醗酵性
フラクトース、ガラクトース、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノース、グルコン酸ナトリウムからは酸及びガスを生成する。しかしセロビオース、ラクトース、マンノース、メレジトース、メリビオース、ラフィノース、ラムノース、サリシン、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンニトール、でんぷんからは酸及びガスを生成しない。
(6)リトマスミルク：不変
(7)硝酸塩の還元：陰性
(8)ゼラチンを液化しない
(9)脱窒反応：陰性
(10) ウレアーゼ：陰性
(11) カタラーゼ：陰性
(12) オキシダーゼ：陰性
(13) インドール生成：陰性
(14) 硫化水素：陰性
(15) でんぷんを加水分解しない
(16) ＶＰ反応：陰性
(17) グルコース及びマルトースからの生成物
L(+)−乳酸、D(+)−乳酸、エタノール
【００１６】
上記の菌はグラム陽性、無胞子、通性嫌気性、カタラーゼ陰性の桿菌であり、糖から乳酸とエタノールを生成することから、絶対ヘテロ醗酵型（obligatoryheterofermentative)のラクトバチルス属に属するものと考えられる。
【００１７】
またラクトバチルス・アシディファリナリウスの分類学的位置を確認する為に、16SrRNA遺伝子の塩基配列データと既知種の配列データとを比較し系統解析を行った。系統樹の作成方法は次の通りである。まず細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌からＤＮＡを抽出する方法は様々であるが、一般的には細胞をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法やガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す処理方法などが用いられる。また抽出用の試薬も市販されている。しかしながらＰＣＲ法にてゲノムＤＮＡを鋳型として用いる場合、ＤＮＡを必ずしもインタクトな状態で抽出する必要はない。よって試料のコンタミネーションの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行う事のできる方法を選ぶ事ができる。
【００１８】
次にＰＣＲ法により１６ＳｒＲＮＡをコードする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ法は基本的には反対鎖とハイブリッド形成し、かつ鋳型ＤＮＡ上の標的領域に隣接する２つのプライマーを利用して特定の遺伝子配列を酵素合成する方法である。鋳型ＤＮＡの変成、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長というサイクルを繰り返す事により特定の遺伝子配列を含む断片を指数的に増幅する事ができる。
【００１９】
次に、ＰＣＲ法で得られた増幅断片を精製する。増幅したＤＮＡはスピンカラム（spin column）を用いて精製する方法が好ましい。
【００２０】
次に精製した増幅断片の塩基配列を決定する。ＤＮＡの塩基配列を決定する方法には、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの合成反応を塩基特異的に停止させるジデオキシ法と、塩基特異的な化学修飾を用いる化学分解法がある。現在はＤＮＡシークエンス法の中でも操作が簡単でキット類も市販されているジデオキシ法によって、ダイレクトにシークエンスする方法が一般的であり、すでにＤＮＡシークエンサーにより自動化されている。
【００２１】
最後に、増幅したＤＮＡの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、ラクトバチルス・アシディファリナリウスの分類学的位置を特定する。分子進化系統樹解析ソフトがインターネット等でも公開されており利用する事が可能である（CLUSTAL  W：DDBJ等）。
【００２２】
以上ラクトバチルス・アシディファリナリウスの分類学的位置を特定した結果、本菌は分類学上他種とは別の独立したクラスターを形成しており、これまで報告されているどの種にもあてはまらなかった。
【００２３】
上記の理由から本発明者等は本菌を新規ラクトバチルス属細菌とみなし、ラクトバチルス・アシディファリナリウスと命名した。なおラクトバチルス・アシディファリナリウスの菌学的性質および新規ラクトバチルス属細菌として命名した準拠については以下に示す通りである。同定の方法は「乳酸菌実験マニュアル」（朝倉書店）に従った。また分類同定の基準としてバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジーＶｏｌ．２（１９８６）を参照した。
【００２４】
こうした特性を有するラクトバチルス・アシディファリナリウスは、例えばパン製造に用いられるパネトーネ元種から公知の方法により単離する事ができる。すなわち元種を滅菌した生理食塩水にて段階的に希釈し、ＭＹＰ寒天培地などの分離用寒天培地に混釈、培養する方法である。上記により得られたラクトバチルス・アシディファリナリウスはＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７７として平成１３年１１月２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託している。
【００２５】
またラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析にはＰＣＲ法などの手段が必要となる為、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いた。
【００２６】
プライマー設計の際には本菌に近縁の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を収集し、塩基配列の整列（アライメント）を実施した。アライメントにはインターネットで公開されているアライメントソフト（CLUSTAL Ｗ：DDBJ）を利用する事ができる。その結果、大腸菌のナンバリングシステムにおけるポジションでフォワード：65‐79、リバース：250‐232にラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的な箇所があったので、この領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。
【００２７】
このようにして得られたプライマーである配列表に示した配列番号１および２記載の塩基配列を有するものはラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、本菌の同定、解析を行う為のプライマーとして使用する事ができる。
【００２８】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成できる。その特異性は以下の実施例に示す近縁種のＤＮＡに対するプライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として特異性に問題はなかった。
【００２９】
本発明のプライマーは、このようにラクトバチルス・アシディファリナリウスへの特異性を有するため、培地に形成したコロニーを釣菌、培養した菌体からDNAを抽出し、本プライマーとの反応性を調べる事によって菌の簡易同定を行う事ができる。例えばまず培養液１ｍｌを遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法などによってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行う事により、菌に特異的なDNA配列（ＰＣＲ産物）を得る事ができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無により本菌を同定する事ができる。
【００３０】
また本発明のプライマーを用いれば培養を行うことなく各種サワー種およびその他生地中における本菌の同定を行う事が可能である。この場合は極少量のサンプルを１．５ｍｌのエッペンチューブにとり、塩化ベンジル法にて直接ＤＮＡを抽出、その後は上記と同様の方法により本菌の同定を行う。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明の内容をさらに具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
本菌の培養方法
培地には目的に応じて寒天培地及び液体培地が使用できる。ラクトバチルス・アシディファリナリウス菌体の培養には、前述のＭＹＰ培地が最適である。酢酸ナトリウム添加は生育の促進に有効である。また、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化ナトリウムなどの無機塩類の添加も生育促進に有効である。
本菌は不飽和脂肪酸を必須要求するので、オレイン酸、ツイーン８０などの添加が必要である。培養温度は１５℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３０℃で、ｐＨ３．５〜８．０、好ましくはｐＨ４．０〜８．０である。具体的に本菌について実施例で説明すれば、パネトーネ元種１ｇを滅菌した０．８５％塩化ナトリウム水溶液５０ｍｌ中に懸濁した。その後段階的に希釈を行い、シャーレに１ｍｌずつ採り、その後溶解した寒天培地（１０ｐｐｍのシクロヘキシミドおよび１０ｐｐｍのアジ化ナトリウムを加えたもの）を流し込み混和した。寒天が固まった後、シャーレを３０℃で４〜５日間培養し形成したコロニーを分離した。分離した菌株の同定は本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウス特異的プライマーを用いて行った。
【００３２】
（実施例２）
本菌の系統解析
本菌の系統解析は次のように行った。塩化ベンジル法にて本菌より抽出したＤＮＡより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ反応により増幅した。得られたＰＣＲ産物をPCR Kleen spin Columns (BIO-RAD)を用いて精製した後、 １２種のプライマーを用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応は BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (ABI) を用いて行い、ABI PRISM 310 Automatic sequencer を用いて塩基配列を読み取った。各プライマーによって得られた配列データはオーバーラップ部分をつなげて連続したＤＮＡ配列データとした。データはCLUSTAL X（DDBJ）を用いて多重アライメントを行い、この結果に基づいて系統樹を作成したところ新規ラクトバチルス属細菌であるとの結果が得られた。
得られた系統樹を図１に示す。
【００３３】
(実施例3)
ラクトバチルス・アシディファリナリウス特異的プライマーの作成
プライマー設計の際にはラクトバチルス・アシディファリナリウスおよび本菌の近縁菌であるL. brevis、L. plantarum、L. hilgardii、L. collinoides、L. vermiformおよびE. coliの16SrRNA遺伝子配列をアライメントし、ラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的な領域をターゲットとしてPCRプライマーを設計した（表１に本菌種と近縁種とのアライメントの結果得られた特異箇所を示す）。
【００３４】
【表１】
0004350925.tif 000002
【００３５】
その結果、表２に示したように配列番号１および２の塩基配列を有するラクトバチルス・アシディファリナリウスの特異的プライマーが設計できた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーの合成を行った。
【００３６】
【表２】
0004350925.tif 000003
【００３７】
プライマーの特異性の確認
上記のように設計したプライマーの特異性を、本菌および近縁種であるL. brevis 、L. collinoides、L. plantarumおよび近縁種以外のL. farciminis 、L. casei、L. sanfranciscensis 、L. kimuchii 、L. fermentumの基準株について、プライマーのPCR反応によるバンド形成能を指標として確認した。
【００３８】
各菌の培養は以下のように行った。
各菌はMYPもしくはMRS培地（Difco）にて２４時間培養した。培養液１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンチューブに採取後遠心分離し、塩化ベンジル法にてＤＮＡを抽出した後でＰＣＲ反応を行った。
【００３９】
ＰＣＲ反応は以下のように行った。
10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP mixture、1.2μM(PrimerF,PrimerRともに)、1.0u Taq DNA polymerase(Takara EX)、D.W.19.7μl、10ng鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine Model PTC-200,MJ RESERCH,INC）により、９４℃２分の後、９４℃４５秒、６５℃２分、７２℃２分を２９回サイクル、さらに７２℃１０分のＰＣＲ反応を行った。
【００４０】
上で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーと各菌株のＤＮＡとの結合能を確認してプライマーの特異性を判定した。１％AgaroseLO3（宝酒造株式会社製）でミューピットにより１００Ｖ３０分間電気泳動し、Ethidium Bromideで染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果プライマーはラクトバチルス・アシディファリナリウスにのみ特異的にバンドを形成した。結果をまとめて表３に示す。
【００４１】
【表３】
0004350925.tif 000004
【００４２】
（実施例４）
特異的プライマーによるラクトバチルス・アシディファリナリウスの同定
本発明のプライマーは、このようにラクトバチルス・アシディファリナリウスへの特異性を有するため、これを用いて分離した菌の菌種同定およびパネトーネ元種中のラクトバチルス・アシディファリナリウスの存在を迅速に確認した。
まず培養菌体またはごく少量のパネトーネ元種サンプルから塩化ベンジル法によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより本菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得た。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動した結果、バンドが形成されており、培養物中でのラクトバチルス・アシディファリナリウスを同定する事ができた。
【００４３】
各菌の特異的プライマーを用いたパネトーネ元種中に存在する菌の調査
国内３箇所で使用されているパネトーネ元種について菌の調査を行った。調査はL. brevis、L. farciminis、L. casei、L. sanfranciscensis、L. plantarum、L. kimuchii、L. fermentumおよび本菌それぞれの特異的プライマーを用いて、PCR法により各菌の存在を調査した。
その結果、表４に示すように、パネトーネ元種３種類ともにL.sanfranciscensisおよびL. acidifarinariusの特異的プライマーを使用した場合のみでバンドが認められ、この２種類の菌が複数のパネトーネ元種中に存在することが明らかとなった。
【００４４】
【表４】
0004350925.tif 000005
【００４５】
（実施例５）
新規ラクトバチルス属細菌であるラクトバチルス・アシディファリナリウスを添加したパネトーネの製造
酵母であるサッカロミセス・イグジグース、乳酸菌であるラクトバチルス・サンフランシスコおよびラクトバチルス・コモエンシスを含む小麦粉生地に、別に培養しておいたラクトバチルス・アシディファリナリウスを添加して元種とした。この元種を醗酵させ、その他原料を添加、成形、醗酵、焼成、冷却工程を経てパネトーネを製造した。その結果、保存性が良く、風味および食感に優れたパネトーネが製造できた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスは、イタリアンケーキであるところのパネトーネ元種中から分離・発見された新規ラクトバチルス属細菌である。本研究の結果、パネトーネ元種中には舟橋らが報告したサッカロミセス・イグジグース、ラクトバチルス・サンフランシスコ、ラクトバチルス・コモエンシス３菌種だけでなく、本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウスを含めた計４種類の微生物が存在することにより、パネトーネ独特の風味、食感と長期間の日持ち性が生ずるものであることがわかった。これまで従来のイタリア北部の伝承的な秘法によって作られていたパネトーネが、本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウスの利用により広く世界の国々で作られるようになるという段階に来たことは、本菌の持つ大きな効果ということができる。
本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウスは、下記の菌学的性質を有することを特徴とするものであり、これら性質により他の菌と区別できるという顕著な効果を奏する。
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １５〜３７℃
（８）生育ｐＨ  ３．５〜８．０
（９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。
（10）細胞壁    L-Lys-D-Asp型
（11）ＧＣ含量  ５１．２−５１．７ｍｏｌ％
(12) ＭＹＰ寒天培地での２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
【００４８】
また本発明の請求項２記載の発明は、配列番号１または２で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有し、新規ラクトバチルス属細菌であるところの請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なDNAプライマーまたはプローブである。本菌特異的プライマーまたはプローブを作成したことにより、生理・生化学的性状の確認など煩雑な操作を行うことなく検体から抽出した本菌由来のDNAのPCR反応により、培養液中、元種および生地中に本菌が存在するかどうかが迅速、簡便かつ高精度に調査できるようになった。本発明のプライマーまたはプローブは、今後様々なサワー種を調査するにあたり大変有用であるということができる。
【００５１】
【配列表】
0004350925.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規ラクトバチルス属細菌の系統樹を示す説明図である。
【図１】
0004350925.tif 000007