(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列順序およびこの目的（本発明の目的）のために構成された大きなデーターベースの統計分析によって決定された複数の配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を戦略的に組み立てることにより、目標とする遺伝子発現のレベルおよびパターンのために設計された配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなる化学合成人工プロモータ。
【請求項２】
配列番号１の化学合成人工プロモータを用いた植物における遺伝子の高レベル発現のテスト方法であって、植物プロトプラストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による形質転換および根、茎、完全な葉組織を含む植物組織のバイオリスティック（biolistic）形質転換を含み、さらに望ましいレベルの活性を示す天然のＣａＭＶ３５Ｓプロモータと比較するために一過性ＧＵＳアッセイを含む方法。
【請求項３】
活性の相対的レベルの上昇が、前記目的のために使用される植物の種もしくは外植片の型に依存する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対照植物として使用されるテスト植物が、タバコ、綿、キャベツ、イモ、またはその他の種であり、テスト部分が、根、新芽、葉、保存組織、またはその他の組織である請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異なる生物において導入遺伝子を高レベルに発現させるための、化学合成され、かつ理論的に設計されたプロモータ及び前記プロモータを設計する方法に関する。さらに、本発明は、天然のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータと比較して高レベルの活性であることを実証する前記プロモータのテストに関する。
【０００２】
本発明は、植物で高レベルに発現する様々な遺伝子のコンピュータ分析に基づいて、人工ＤＮＡ塩基配列を開発することに力点を置いている。本発明は、遺伝子上のシス（ｃｉｓ）で作用する人工的転写調節エレメントを開発する分野に新たな見地を提供する。高等生物の細胞で効率的な調節配列として機能するＤＮＡエレメントが、計算用生物学や生物情報科学から引き出された知識に基づいて、望ましいレベルの発現を達成するために設計され、そして合成され得ることをクレームすることは、本発明の誇りである。
【０００３】
【従来の技術】
植物遺伝子工学の主要な目的の１つは、植物等のような経済的に利益をもたらす発現系において、害虫耐性、ウイルス耐性、除草剤耐性、産出性向上、ストレス耐性、栄養性改善、産業上の価値を有するタンパク質の発現をはじめとした新しい特徴や形質を備えた遺伝子導入植物を開発することである。そのような望ましい特徴をコードする遺伝子の高レベルの発現には、多くの要因が寄与する。ここで、「発現」とは、転写、翻訳及び翻訳後の事象を含む。1細胞中でいずれか１つの転写物が多量であることは、転写の種々の事象に関係するが、それは、その遺伝子が発現されるためのプロモータの強度に依存する。従って、導入遺伝子の高レベルの発現が得られるための遺伝子導入植物の開発には、導入遺伝子が強いプロモータにより発現されること、転写が安定していること、それが効率的に翻訳されること、及び得られたタンパク質も植物細胞中で安定していることが絶対に必須である。これらの各ステップは、共同して導入遺伝子産物の発現レベルを高めることに寄与する。
【０００４】
プロモータは、シス作用エレメントのプールと定義でき、それに付随する遺伝子を発現させるために、プロモータは、トランス作用転写因子と調和して機能する。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連する付属タンパク質と効率的な結合部位を提供し、さらに操作可能状態にされた遺伝子の転写に寄与する。従って、前記したように、プロモータは、転写の時と効率を決定する高度に専門化したＤＮＡ塩基配列である。プロモータが、所与の生物（種々の生物）において、常にほぼ等しく操作可能であるとき（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ）、そのプロモータは構成プロモータに分類される。他のプロモータは、組織特異的なものか、もしくは誘導可能なものである。プロモータの強度は、転写事象の開始の頻度によって変化する。強度によって、プロモータはさらに、強弱に分類される。
【０００５】
植物遺伝子工学では、使用目的によって、異なる種類のプロモータが必要とされる。高レベルの発現のための構成プロモータは、商業上求められているタンパク質を高レベルで生成する遺伝子導入植物を開発するのに最も有用である。また、そのような高レベルの発現は、代謝径路を修飾するための、及び様々なストレスの状況に耐えるように植物を改良するための多くの状況においても望ましい。
【０００６】
これまでの研究報告では、遺伝子及びそれらの改良物における天然のプロモータエレメントの決定を主に取り扱っている。これらの例として、オデールら（Odel et al.）（ネイチャー（Nature）313:810-812 (1985)）によるＣａＭＶ３５Ｓプロモータの決定があるが、そこで著者らは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの強度と特性を示している。その後、ジェンセンら（Jensen et al.）（ネイチャー、321:669-674(1986)）、ジェファーソンら（Jefferson et al.）（ＥＭＢＯＪ．，6：390-3907（1987））、並びにサンダーら（Sander et al.）（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Research）、4:1543-1558(1987)）は、遺伝子導入植物の葉、茎、根、花から調製した抽出物中の３５ＳＣａＭＶプロモータから発現されたレポーター遺伝子ｍＲＮＡの測定可能なレベルを示した。前記ＣａＭＶ３５Ｓプロモータは、植物遺伝子工学の分野の研究者達の間で広く使用されてきた。モレリーら（Morelli et al.）（ネイチャー（1985）315:200-204）は、前記ＣａＭＶ３５Ｓプロモータは、ＮＯシンターゼプロモータと比較して、転写産物が１０倍多いことからわかるように、比較的高率で転写されると記載している。エーベルら（Abel et al）（サイエンス（Science）(1986)232:738-743）、ビーヴァンら（Bevan et al.）（ＥＭＢＯＪ(1985)4:1921-1926）、モレリーら（ネイチャー(1985)315:200-204）及びシャーら（Shah et al）（サイエンス(1986)233:478-481）は、前記３５ＳＣａＭＶプロモータは、適度に強く、本質的に活性であると記載している。従って、前記ＣａＭＶ３５Ｓプロモータは、遺伝子導入植物において多数の外来遺伝子を発現させるために使用されてきた。オデールら（ネイチャー313:810-812(1985)）は、前記３５Ｓプロモータからの転写開始は、ＴＡＴＡエレメントが含まれた近位の塩基配列によって決まり、一方、その転写速度は、ＤＮＡの３００ｂｐ上流に分散された塩基配列によって決定されると述べている。シンプソンら（Simpson et al）（ネイチャー323:551-554(1986)）は、この領域をエンハンサー領域（転写を活性化する塩基配列は、エンハンサーと呼ばれる）とした。
【０００７】
その後、他の研究者たちは、前記ＣａＭＶプロモータの改良に努めてきた。ケイら（Kay et al.）（サイエンス236:1299-1302(1987)）は、天然に存在するＣａＭＶ３５Ｓプロモータの大きな領域（253bp）を複製し、その活性の高さを報告した。オデールら（プラントモルキュラー．バイオロジー．（Plant Mol.Biol.）10:263-272(1988)）は、ノパリンシンターゼプロモータ中のエンハンサーとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモータの一部を使用することを報告した。ミツハラら(Mitsuhara et al)（プラントセルフィジオロジー．(Plant Cell Phisiol.37  (1):49-59(1996))は、異なるＣａＭＶ３５Ｓプロモータ塩基配列エレメントの多くの組み合わせを比較した。彼らは、ネイティブのエンハンサーエレメントの反復数を増やすことによって、レポーター遺伝子の発現を増大させた。ニーら（Ni et al. ）（ザプラントジャーナル（The Plant Journal）7(4):661-676(1995)）は、天然発生性オクトピン及びマンノピンシンターゼプロモータの部分を組み合わせて効率的なキメラプロモータを開発した。エリスら（Ellis et al.）（ＥＭＢＯ 6:11-16(1987)）は、天然のオクトピンシンターゼプロモータのフラグメントを用いてトウモロコシ(adh-l)遺伝子の活性を高めることを報告した。
他の開発として、植物の遺伝子の発現のための、その他の天然のプロモータエレメントの決定がある。これらの例としては、米国特許第5,378,619号に記載の発現を高めるためのゴマノハグサモザイクウイルスプロモータ、米国特許第4,962,028号記載のルビスコ（Rubisco）プロモータ、米国特許第5,106,739号記載のキメラＣａＭＶ増強マンノピンシンターゼプロモータ、米国特許第5,322,938号記載の増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、及び米国特許第5,391,725号記載の植物における器官特異的発現のためのグルタミンシンターゼプロモータの使用が挙げられる。
これまで、それ自体を使用するために、天然に存在するプロモータの塩基配列を決定したり、または、より高レベルの発現を達成するために天然のプロモータを部分的に交換もしくは再配列したりする試みがなされてきた。しかしながら、データベースに記録されている、遺伝子塩基配列の上流に存在する様々なＤＮＡ塩基配列のコンピュータ分析から得た知見に基づいて、人工プロモータを設計しようとする試みはなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物細胞中、さらには、バクテリア、酵母菌、下等な真核細胞及び動物細胞中に目的遺伝子を望ましいレベルで発現させることを目的とした合成プロモータを設計すること、特異的調節エレメントと組み合わせてそのようなプロモータを用いること、それを組織特異的、発生段階特異的、器官特異的、および／または、特異的な外部環境および／または適用因子によって誘導可能にするために、それを適宜修飾すること、ならびに、シス作用エレメントとトランス作用因子の間の相互作用の複合性を研究するための新しいアプローチを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、異なる生物での導入遺伝子の望ましいレベルの発現を達成するためのプロモータを設計するための遺伝子塩基配列データベースの分析、及び設計されたプロモータの合成方法に関する。さらに、本発明は、天然のＣａＭＶ３５Ｓプロモータとの比較において合成プロモータの活性レベルの高さをテストすること及び証明することに関する。なお、本発明において、配列番号は、配列表若しくは図に示す配列番号を意味する。なお、配列表および図に示す配列において、転写開始位置のヌクレオチドを＋１としている。
【００１０】
一例として、本発明は、植物において高レベルで発現する様々な遺伝子のコンピューター分析に基づいて、人工ＤＮＡ塩基配列を設計することを示す。本発明は、転写調節エレメントの合成分野に新たな見地を提供する。
【００１１】
前記例のプロモータは、最小プロモータ（配列番号：２、３および５）を表すＤＮＡ塩基配列、保存ドメインＩ及びそのサブドメインａ，ｂ及びc（配列番号：６），転写開始部位コンテクスト（配列番号：４）、保存ドメインＩＩ及びそのサブドメインａ，ｂ，ｃ及びd(配列番号：７，８，９および１０)、保存ドメインＩＩＩ（配列番号：１１）、ＴＡＴＡとＴＳの間の領域（配列番号：１２）、５‘末端側の翻訳されていないリーダー部位（配列番号：１３）、遺伝子上でシス作用する翻訳開始コドンコンテクスト（配列番号：１４及び１５）、及びタンパク質に安定性をもたらしうるＮ末端アミノ酸残基配列（配列番号：１６）を表すＤＮＡ塩基配列の決定を含む。このプロモータの例を、配列番号：１に示す。このような、様々な組織、及び広範囲の生物における効率的なプロモータ調節塩基配列として機能するＤＮＡエレメントがコンピューター生物学及び生物情報科学の知識に基づいて、設計され、及び合成され得ることをクレームすることは本発明の誇りである。生物学的活性があり、かつ効率的に機能する本発明のプロモータは、ほとんどの複雑な生物において発現するように合成され得る。
【００１２】
【発明の実施の形態】
一例として、本発明は、配列番号：１で示されているような、異なる生物における導入遺伝子の高レベルの発現のためのＤＮＡ塩基配列を含む化学合成されたプロモータ、及び前記プロモータの合成方法を提供する。さらに、本発明は、植物における高レベルの遺伝子発現をテストする方法を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、化学合成されたプロモータは、配列番号：２（高レベルの遺伝子発現のための配列、すなわち、強いプロモータ）、配列番号：３（低レベルの遺伝子発現のための配列、すなわち、弱いプロモータ）に示された最小ドメイン（ａ）、または下記の表1と表２とにそれぞれ示されているようなバリエーションの誘導体を含み、それらは−２６位から−４３位（＋１が、転写開始部位の最初のヌクレオチドを示すようにヌクレオチドが番号づけされている）の間に属し、人工的な合成プロモータとの関連においてＴＡＴＡコンテクストとして機能する。下記の表１は、配列番号：２の誘導体のバリエーションを示し、下記の表２は、配列番号：３の誘導体のバリエーションを示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
本発明の別の実施形態によれば、前記化学合成されたプロモータは、配列番号：４および下記の表３に示すバリエーションを含み、それらは−６位〜＋１位の間に属し、人工的な合成プロモータ中の転写開始部位のためのコンセンサス塩基配列として機能する。
【００１７】
【表３】
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【００１８】
本発明のさらに別の実施形態によれば、前記化学合成されたプロモータは、合成プロモータの−３９位〜−８４位の間に属する配列番号：５に示されている最小ドメイン（ｂ）をさらに含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態によれば、前記化学合成されたプロモータは、−８５位〜−１３０位の間に属する配列番号：６に示されている保存ドメインＩ及びそのサブドメインａ，ｂ及びｃをさらに含む。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、前記化学合成された人工プロモータは、−１３４位〜−３５０位の間に属する配列として、配列番号：７，８，９及び１０に示す配列を全て含む保存ドメインＩＩ、またはそのサブドメインであるドメインＩＩａ（配列番号：７）、ドメインＩＩｂ（配列番号：８）、ドメインＩＩｃ（配列番号：９）およびドメインＩＩｄ（配列番号：４）からなる群から選択された少なくとも一つのサブドメインを、さらに含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態によれば、前記化学合成された人工プロモータは、−２０９位〜−２３０位に属する配列番号：１１に示されている保存ドメインＩＩＩをさらに含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、前記化学合成されたプロモータは、＋１位〜−２６位に属し、ＴＡＴＡ配列と転写開始部位の間の典型的な配列として機能する配列番号：１２の配列をさらに含む。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、前記化学合成された人工プロモータは、＋１位〜＋８９位の間に属し、５‘末端の翻訳されていないリーダー部位及びその翻訳エンハンサー‘ＣＡＡ’型領域として機能する配列番号：１３の配列をさらに含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態によれば、前記化学合成された人工プロモータは、＋８３位〜＋１０２位に属する配列番号：１４の配列（遺伝子の高レベルの発現のための配列、すなわち、強いプロモータ）、＋８７位〜＋１０３位に属するＮｏ.配列番号：１５の配列（遺伝子の低レベルの発現のための配列、すなわち、弱いプロモータ）または下記の表４および表５に示すバリエーションの前記２つの配列の誘導体を含み、それらはＡＴＧ開始コドン付近のコンセンサス配列として機能する。下記の表４は、配列番号：１４の配列の誘導体のバリエーションを示し、下記の表５は、配列番号：１５の配列の誘導体のバリエーションを示す。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
【表５】
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【００２７】
本発明のさらに別の実施形態によれば、前記化学合成された人工プロモータは、配列番号：１６のアミノ酸配列もしくは下記の表６に示すバリエーションの前記アミノ酸配列の誘導体をコードする塩基配列をさらに含む。この塩基配列は、翻訳開始部位（ＡＧＴ）およびそれより下流の配列である。前記アミノ酸配列は、タンパク質若しくはペプチドのＮ末端側の４個のアミノ酸配列であり、細胞における導入遺伝子の高レベルの発現に必要である。配列番号：１６（図１６）において、ＡＡ１〜ＡＡ４は、タンパク質のアミノ酸1〜４を示す。
【００２８】
【表６】
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【００２９】
別の実施形態においては、本発明は、異なる生物において高レベルで遺伝子を発現させるためのプロモータを化学合成するための方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）工程を含む方法をさらに提供する。
（ａ）  目的遺伝子の発現を決定する特定の転写調節点および翻訳調節点の少なくとも一方の点付近の配列にもとづいて、遺伝子データベースを高度発現遺伝子および低度発現遺伝子に分類する工程。
（ｂ）  工程（ａ）で決定された高度発現遺伝子の保存ドメインを、最小プロモータ、保存ドメインＩ及びそのサブドメインａ，ｂ及びｃ、保存ドメインＩＩ及びそのサブドメインａ，ｂ，ｃ及びｄ、保存ドメインＩＩＩ、転写開始部位とＴＡＴＡ部位の間の領域、５‘末端の翻訳されていないリーダー部位、翻訳開始コドンＡＴＧコンテクスト及びＮ末端アミノ酸をコードする配列を含む重要なエレメントにおいて決定する工程。
（ｃ）  レポーター遺伝子もしくは目的遺伝子の望ましいレベルの発現を達成するために、上記工程（ｂ）に記載の決定された重要な塩基配列エレメントを、例えば、配列番号：１、もしくは他の組合わせ中に調整して入れることによって合成プロモータを設計する工程。
（ｄ）  配列番号：１の前記プロモータに例示されているように重複オリゴを合成し、図１７に示されているように前記オリゴを二本鎖ＤＮＡに集め、レポーター遺伝子もしくは発現のために選択された目的遺伝子で前記プロモータをクローニングすることによって、上記工程（ｃ）で得られたプロモータＤＮＡの合成を行う工程。
【００３０】
さらに別に実施形態によれば、目的遺伝子の高レベルの発現のための生物は、葉、茎、根及びイモの塊茎のような保存組織を含む植物または植物の異なる部分、広く異なる族に属する双子葉植物をはじめとした異なる門、及びバクテリアから選ばれる。
【００３１】
さらに別の実施形態によれば、様々な異なる組織及び細胞における前記プロモータからの目的遺伝子の一過性発現、ならびに遺伝子導入生物の異なる部分の安定発現の方法が達成される。
【００３２】
さらに別の実施形態によれば、前記人工プロモータからの一過性若しくは安定性遺伝子導入生物において、この場合の根のような特定の組織における優先的な発現を伴った構成的なものであってもよい。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、植物のプロトプラストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による形質転換および様々な組織のバイオリスティック（biolistic）な形質転換の少なくとも一方による植物細胞の一過性形質転換と、天然ＣａＭＶ３５Ｓプロモータからの発現とを、レポーター遺伝子アッセイにより比較する、前記化学合成プロモータからの高レベル発現をテストする方法を提供する。本発明の前記目的のために、前記高レベルの発現は、天然のＣａＭＶ３５Ｓプロモータからの活性よりも数倍高いことを意味する。
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、プロモータの活性レベルは、宿主植物種、もしくは前記目的のために使用される外植片の型に依存するであろう。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態によれば、対照植物として使用されるテスト植物は、タバコ植物全体、切除されたタバコの葉、単離されたタバコの葉細胞、キャベツの茎及びイモの塊茎である。しかしながら、発現は、バクテリウム属アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)においても証明された。
【００３６】
コンピューター分析は、ピーシー‐ジーン（ＰＣ―Ｇｅｎｅ）からのソフトウェア及びオックスフォードモレキュラーバイオロジーグループ(Oxford Molecular Biology Group)（スイス）のデータベースリリース１８−０を用いて行った。植物遺伝子だけが入力された植物データベースを、データベースＣＤＥＭ４６ＩＮから作製した。それは、13,393の核酸配列を有していた。植物において、高度に発現された３６の公知の遺伝子中のホモロジーを比較することによって確認されたＴＡＴＡ領域及びＴＡＧ領域における推定モチーフの類似性によって、前記データベースを２６２の転写され高度に発現される遺伝子に分類した。
【００３７】
ＴＡＴＡ領域付近の保存されたモチーフ（表１，表２）、転写開始部位（表3）及び翻訳開始コドンＡＴＧ（表４，表５）を、高度（表１，表３，表４）及び低度（表２，表５）に発現される遺伝子に決定した。その後、前記データーベースを、プロモータ領域中の可能な保存ドメイン、及びコード領域（リーディングフレーム）遺伝子のさらに上流に選別した。比較的低度に保存された領域に加えて高度に保存されたモチーフ配列、及び表１〜５に示されている範囲のそれらのバリエーションによって、人工的なプロモータを開発するために集められた特徴的な成分配列をつくった。最も高度に保存された個別のモチーフ配列を配列番号：２から配列番号：１６として決定し、それらを集めて配列番号：１のプロモータ調節塩基配列を得た。
【００３８】
配列番号：１に示されているように、多数の特徴的ドメイン及びバリエーションの範囲は、表１〜５にあるように、遺伝子の塩基配列データの統計分析によってプロモータの異なる領域において決定できる。
【００３９】
これらのドメインは、すなわち；
（i）  最小プロモータ領域（ａ）最小ドメインａ：ＴＡＴＡボックス。表1（高度に発現された遺伝子）及び表２（低度に発現された遺伝子）に集められたデータに示されている。
最小プロモータ領域（ｂ）最小ドメインｂ
（ii） ドメインＩ（サブドメインａ，ｂ及びｃ）
（iii）ドメインＩＩ（サブドメインａ，ｂ，ｃ及びｄ）
（iv）  最小プロモータと転写開始部位の間の領域
（v）  ドメインＩＩＩ
（vi）  5‘末端の翻訳されないリーダー領域
（vii） 翻訳開始コドンコンテクスト。表3（高度に発現された遺伝子）及び表４（低度に発現された遺伝子）に集められたデータに示されている。
（viii）Ｎ末端アミノ酸をコードする塩基配列。表5に集められたデータに示されている。
【００４０】
上記異なる領域は、プロモータの高レベルの活性を決定する際に共同して寄与すると予測されるが、プロモータの低レベルの活性には、それらの全てが必須であるわけではない。本発明は、個別のモチーフがまとめられて、機能的に効率的なプロモータ調節領域を組み立て得ることを示すが、表１〜５に示されているように、所与の位置での個別のヌクレオチドの発生のバリエーションは、これらのエレメントのいくつかを除く様々な組合わせが異なる限度で機能しうることを明らかにしている。
【００４１】
真核生物における最小プロモータは、転写開始領域に近位のＤＮＡ塩基配列である。それは、通常、転写開始部位の３０ヌクレオチド上流までに位置するイニシエーターシスエレメントを含む（アソウら、ジャーナル  オブ  バイオロ．ケミ）（Ａｓｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．269:26575-26583,1994）。最小プロモータは、主に、通常ＴＡＴＡエレメントと呼ばれる塩基配列からなる。遠位のシスエレメントと結合するトランス作用タンパク質による開始複合体の形成の調節、もしくはその安定性には、完全なＴＡＴＡボックスが必要である（ホリコシら、セル（Horikoshi et al., Cell） 54:665-669,1998）。ツーら（Zhu, et al.）（ザプラントセル7:1681-1689,1988）は、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）プロモータのための機能的なＴＡＴＡボックスとして、ＴＡＴＡＴＴＴＡＡを示した。ムクモトら（Ｍｕｋｕｍｏｔｏ  et  al.）（プラントモルバイオロ（Plant Mol Biol.）23:995:-1003）によるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の研究は、植物のＴＡＴＡボックスに必要な塩基配列としてＴＡＴＡＴＡＴＡを示した。最近まで、導入遺伝子の発現のための植物における最小プロモータとして、ＴＡＴＡＴＡＴＡが使用できるかどうかは知られていなかった。さらに、本研究で使われる、配列番号：２に記載されている最小ドメイン（ａ）は、これまでの研究で述べられていたものとは異なる。表１にまとめられているように、データベース中の全てのプロモータは、配列番号：２、もしくは統計学的に有意でない範囲内の変形を表す配列モチーフを有する。表１は、高度に発現される遺伝子中のＴＡＴＡの特徴、及び異なる遺伝子に記されているＴＡＴＡ領域の変形を示す。配列番号：２に示されている塩基配列ドメインは、Ｔ３（Ｔ／Ａ）ＴＮＴＣＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡＧ（但し、Ｔ３は、ＴＴＴを意味し、Ｎは、４つのヌクレオチドＡ，Ｔ，ＧもしくはＣのいずれかであることを意味する。以下同じ。）であり、それは、本研究の人工的に合成されるプロモータにおいて最小ドメイン（ａ）とされる。本発明で決定された塩基配列の位置が、転写開始部位の４０〜２８nt上流で変化し得ることがデータベースの分析から判明した。低度に発現する遺伝子は、ＮＴ３Ｎ４Ｔ２ＴＡＴＡＮＮＮＡＴ（配列番号：３）のようなＴＡＴＡコンセンサスを示しているが、それは配列番号：２のようなＴＡＴＡコンセンサスとは有意に異なり、かつ、高度に発現された遺伝子における特徴的配列として確認されている。このようにＴＡＴＡコンセンサス領域の配列とその転写開始部位からの距離を選択することによって、遺伝子発現のレベルを決定することもある。ムクモトら（プラント  モル  バイオロ 23:995-1003(1993)）、及びキース及びシュー（Keith and Chua）（ＥＭＢＯＪ.5:2419-2425(1986)）は、ＴＡＴＡエレメントの役割を実験的評価から引き出した。その結果から、ＴＡＴＡエレメント内に特定の重要なヌクレオチド位置を有する配列の要件が確立された。異なる位置における突然変異が、プロモータの活性をかなり低下させることが報告された。最適なＴＡＴＡコンセンサス配列は、効率的な転写開始のために転写開始部位から特定の距離をおいて位置づけられなければならない。転写開始部位からＴＡＴＡエレメントまでの距離が適��でなく、また、かなり変形したＴＡＴＡボックス配列は、発現を減少させうる（ツーら、プラントセル7:1681-1689(1995)）。ＴＢＰ調節因子及びＴＡＦ（ＴＢＰ関連因子）調節因子によるＴＡＴＡエレメントの効率的な認識は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の効率を決定する。本結果から、植物中の遺伝子を発現させるために使用できる異なる塩基配列を決定する。
【００４２】
最小プロモータ中の別の異なるドメインは、配列番号：５の配列で示される最小ドメイン（ｂ）であり、合成プロモータ中でのそれの位置は、配列番号：１の配列中に示されている。最小ドメイン（ｂ）において、ＣＣＡＡＴ，ＣＣＡＣＴ、ＣＡＣＡＡＴ、ＣＡＡＣＣＴ，ＣＣＣＡＡＴのような様々な保存塩基配列を決定した。これらは、観察された多様性を反映するために、Ｃ（Ｃ／Ａ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｃ）Ｔのように表される。これらの塩基配列は、−３９位から−８４位の間（すなわち、例えば転写開始部位＋１の上流）に存在することが比較的多く、データベース分析からわかるように−１５０のような、さらに上流に存在することもある。これらの塩基配列には、通常、ＴＧＡＣＧボックスが介在していることがデータベースからわかった。オデールら（ネイチャー、313:810-812(1985)）によるＣａＭＶウイルス３５Ｓプロモータの場合、及び他の特定の植物プロモータにおいては、ＣＣＡＡＴ及びＣＣＡＣＴは既に決定されており、ＣＡＴボックスと呼ばれている。しかしながら、本発明で決定された最小ドメイン（ｂ）は、これまでの研究で示されたものとは常に異なる。われわれが使用したように、合成プロモータを構成するコンテクストにおいてこれらの塩基配列を使用することは、プロモータの設計方法におけるユニークな発想であり、ここにクレームした。さらに、異なる植物遺伝子を比較することによって、それらの特異的な位置及びプロモータの中でのそれらのバリエーションを決定することも、合成プロモータを開発する際のユニークなアプローチである。最小ドメイン（ｄ）として下記の塩基配列（配列番号：５）及びその変形を見い出した。
【００４３】
5'CCACTTGACGCACAATTGAGCACAATACGCCACTTGACGCTACT3’
【００４４】
これは、センス並びにアンチセンスの両方向において、最小プロモータの一部として機能する。Ｃ（Ｃ／Ａ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｃ）Ｔ及びＴＧＡＣＧの混合物を原核生物または真核生物、及び特に植物細胞に使用することによって、構成された塩基配列の機能的な活性は、この発明の新規な一部をなす。
【００４５】
0004326068.tif 000008
【００４６】
それは、さらに、サブドメインとして、ドメイン（ａ），（ｂ）および（ｃ）に分類される。前記付属ドメインは、ヌクレオチド（ｎｔ）−８５位〜−１３０位の間に保存されるように決定されたが、植物遺伝子によっては、−２００ｎｔまで上流にも存在した。本発明で設計された付属ドメインは、特定の塩基配列の繰り返しエレメントを有する。これは、トランス作用転写因子のための複数の結合部位を提供することもある。これは、安定した転写複合体の形成、従って、効率的な転写を導くこともある。多くのプロモータにおいて、哺乳動物細胞のＥＧＦＲプロモータの場合のように、特定のエレメントが複数存在し、それらが多くのＧＣボックスを有することは公知である（ジョンソンら、ジャーナルオフバイオロケミ（Johnson et al., J. Biol. Chem） 263:5693-5699(1988)）。また、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの場合、ベンフィーピーエヌ及びクア、Ｎ‐Ｈ(Benfy. P.N and Chua N-H)、サイエンス250:959-966(1990)が、多数のＣＡＴボックス及びＧＡＴＡ型のエレメントの存在を報告している。
【００４７】
ドメインＩ(a)は、メンケンスら（Menkens et al., ＴＩＢＳ20:506-510(1995)）によって報告されたＧＣボックスとやや類似しているが、それとは異なり、転写バブルを開放し、最小プロモータにある転写複合体からの転写の再開を高めるために最小プロモータを活性形態に保つ動態において役割を果たしうることが、イエーン及びグラーラ(Yean and Gralla)（ヌクレイックアシッドリサーチ 24(14):2723-2729(1996)）によって示唆されている。本発明で設計されたドメインＩ(a)は、複製され、これまでの研究者が報告したいかなるものとも異なり、コンピュータ分析に基づいて、可能な限り効率的なドメインとして理論的に予測されたものである。発現を高めることに寄与し得るコピー数は、ここでは原理を証明するための例として３コピーを例にとったが、変えることが可能である。
【００４８】
また、ドメインＩ(b)は、ＧＡＴＡ型シス作用エレメントのトリマーにも設計される。前記ＧＡＴＡエレメントは、オデールら（ネイチャー313:810−812(1985)）が示しているように、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータと関連することが知られている。コンピュータ分析から、これは、高レベルの転写を達成するために他の塩基配列と組み合わせて用いることができる塩基配列であることが予測される。コピー数は、原理を証明するために3としたが、変えてもよい。
【００４９】
ドメインＩ(c)は、ＧＴＡＣＧＣ型エレメントの人工的二量体のさらに別の組合わせであり、通常−１２６〜−１１４の領域に存在するが、−９０〜−１２０ntの領域には通常あまり存在しないことがわかった。前記ＧＴＡＣＧＣ型のエレメントは、プリーズら（Please, et al.）（モルジンジント (1997)（ Mol.Gen. Gent. 254:258-266））によってＵボックスと表現されている。本発明においては、そのようなエレメントのうち、２つを単なる例として、本研究で設計されたプロモータ中に含めた。機能の改良に寄与するコピー数は変えてもよい。
【００５０】
３つの型のドメイン、すなわちa,b,cは、個別に、及びそれらの単一もしくは複数のコピーの組合わせが、センスまたはアンチセンス方向で互いに調和して作用し得ると予測される。我々が開発したデータセットの分析から、これらが、他の可能な数の反復、順列、組合わせにおいて、作用することも予測される。これらのドメインは、理論的分析によって決定され、高レベルの遺伝子の発現を目的とするプロモータ領域を設計するために本発明において使用された。従って、その設計された塩基配列は、塩基配列に関する限り新規であり、天然のプロモータとは類似しておらず、これまでの研究で類似のプロモータの公知例は報告されていない。
【００５１】
分析で決定された領域は、主に、ドメインＩＩ（ａ）と名づけられた２−８ｎｔ長の直列の反復を含む。それらは、主に−１３０〜−３５０ｎｔ領域に広がる。これらの反復は、プリンが豊富なエレメントを含むが、それは、本分析で初めて明らかになった。これらは、（Ａ／Ｇ）2-8（配列番号：７）、またはその相補的な（Ｔ／Ｇ）2-8ｎｔである。高度に発現する遺伝子のデータセットに示されているように、これらのエレメントは−２００ｎｔより上流に主に存在するが、−２００〜−１５０ｎｔに存在することもある。また、−１３０ｎｔ以前には、通常あまり存在しない。これらは、特異的な回文構造を有している場合もあれば、有していない場合もある。これらの型のエレメントは、互いに２〜２００ｎｔ離れていてもよい。これらのエレメントのコピー数は、１〜１０で変え得るが、コピー数が１５になることは通常あまりない。
【００５２】
高度発現遺伝子のデータセットにおいて典型的であり、かつ、この分析中に決定された、さらに別の塩基配列は、ドメインＩＩ（ｂ）と名づけられた、Ｃ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）Ｃ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）（配列番号：８）型エレメントである。これらのエレメントは、通常−２００位以上のプロモータの上流に存在するが、−２００〜−１５０ｎｔには通常あまり存在せず。また、遺伝子の下流に例外的に存在することもある。データベースにおけるこれらのエレメントの所在位置は、これらのエンハンサーエレメントが、センス並びにアンチセンス方向において作用し得ることを示唆している。
【００５３】
別の保存されたエレメントは、ＳＶ４０型のエンハンサーを含み、これらの役割は、植物プロモータ、動物プロモータ及びウイルス性プロモータ中で証明されている。しかしながら、人工的に設計されたプロモータの形態でのそれらの使用は、議論も報告もされていない。合成されたプロモータの形態で、機能的調整が達成されるように、そのようなエレメントを使用することは、新しい概念である。さらに、これらの塩基配列の他の変形例、及びドメインＩＩ（ｃ）と名づけられたＧＧＴＡＡＴＡＣ（配列番号：９）のような、これまでには報告されていない塩基配列が、本発明において前記プロモータを設計するために使用された。これらのエレメントは、通常−２００ｎｔ以後の上流に存在し、−１３０ｎｔより前には通常あまり発生しない。
【００５４】
別の１６塩基対回文配列、５'ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ３’（配列番号：１０）は、オクトピンエンハンサー型のエレメント及びその変形であり、それは回文配列のこともあるが、そうでないこともある。これらは、高度に発現された多数の植物遺伝子中に保存されることが本研究において確認され、ドメインＩＩ（ｄ）と名づけられた。このエレメントは、−２００bp上流付近に位置することがより一般的である。それは、センス及びアンチセンスの両方向において活性的になり得る。天然のocsエレメントの活性は、ゲルビンら（Gelvin.et al.）（プロク、ナショナル、アカデミックサイエンス、米国（ Proc.Natl. Acad. Sci. USA）85:2553-557(1998)）によって示されている。しかしながら、他のエレメントと関連づけてそれを使用することは、本発明の新規な局面である。
【００５５】
折れ曲がりＤＮＡエレメントは、動植物において基底プロモータと上流の活性化領域との間で共同作用をもたらす際に、重要な役割を果すことが示唆されてきた。今般、初めて、下記の潜在的な折れ曲がりＤＮＡエレメント（配列番号：１１）を、植物で高度に発現される遺伝子中に確認した。
【００５６】
５'ＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧ−３’
【００５７】
このエレメントは、合成プロモータとの関連で、ドメインＩＩＩと名づけた。この部位は、キム及びシンプロ（Kim &  Shimpro）（ニュークレイック  アシッド  リサーチ、24:4341-4348(1996)）によって示された動物プロモータで決定されたＹＹ１エレメントと驚くほど類似している。その著者らは、動物細胞中のそのエレメントが基底プロモータを活性化する潜在力を報告している。このエレメントは、基底プロモータと上流の活性化エレメントの間にもっとも多く存在する。この塩基配列は、通常上流の−２００位に見られる。植物でのこれらのエレメントの確認、ならびに合成プロモータの開発におけるこれらのエレメントの使用は、本発明の新規な一面である。
【００５８】
転写開始部位とＴＡＴＡボックスの間の領域も、また、高度に保存されており、多数の高度に発現された遺伝子を比較することによって確認された。この領域に位置する下記に示す配列（配列番号：１２）は、これまでに確認されていない。
【００５９】
５'ＧＧＡＧＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡ３’
【００６０】
前記配列は、どの公知のプロモータとも厳密には類似しておらず、高度に発現する遺伝子を分析し、低度に発現された遺伝子を有する塩基配列と比較することによって本発明者により純粋に決定された。その距離は、２０−４０ヌクレオチドの間で変わるが、通常約２６ｂｐ付近である。このＤＮＡ塩基配列は、融解温度（Ｔｍ）を低下させる機能を果すこともあり、従って、転写バブル形成を容易にし、転写効率を高めるものと予測される。その範囲において、低いＴｍ（ＡＴに富む）このエレメントまたはその変形の使用の少なくとも一方を使用することは、人工プロモータの開発において本発明による使用された新しい原理の一部である。
【００６１】
コザック（Kozak）（セル（Cell）、22:7-8(1980)）によって提案されたスキャニングモデルに記載のように、５‘末端の翻訳されていないリーダー部位もまた発現レベルを調節する。４０Ｓサブユニットは、真核細胞のｍＲＮＡの５’末端キャップ構造と結合する。翻訳開始効率は、リボソームによる平滑スキャニングや翻訳複合体を形成するためのＡＵＧコンテクストの効率的な認識に依存している。この領域における強いヘアピン形成は、いずれもリボゾームスキャニングに有害作用を及ぼし、翻訳効率を低下させ得る。植物遺伝子の翻訳されていないリーダー部位の塩基配列（５‘ＵＬ）における塩基配列の分析から、低度に発現された遺伝子が１００〜３００ｎｔの間の比較的長い５’ＵＬを示し、時にイントロンが介在する一方で、高度に発現された遺伝子は、たいていの場合７５〜９０ntの間で変化することがわかった。本発明者らは、‘ＣＡＡ’型の保存塩基配列を、５‘末端の翻訳されていないリーダー部位中に確認した。使用された代表的なデータ中の高度に発現された遺伝子中のＣＡＡの発生頻度は、３．６エレメントであったが、一方、低度に発現された遺伝子では、リーダー部位の配列の１００ヌクレオチドに対して、１．１エレメントであった。前記ＣＡＡ塩基配列は、ＴＭＶにおける翻訳エンハンサーとして認識されている（ガリー及びウォーボート（Gallie and Waubot）（ニュークレイックアシッドリサーチ20:4361-4368(1992)）が、植物遺伝子とそれらとの関連は、これまでに報告されていなかった。この研究で使用された５‘ＵＬは、８１ヌクレオチド長である。データによれば、高度に発現された遺伝子の５'ＵＬ中の‘Ｇ'の再現が悪いことを本発明者らは突き止めたため、５'ＵＬ中の‘Ｇ'を慎重にとり除いた。これによって、配列番号：１３に記載の効率的なスキャニングのための人工５'ＵＬを構成した。
【００６２】
また、翻訳開始コドンＡＵＧコンテクスト（リボゾームのＡＵＧでの停止と、開始複合体形成を決定する）を高度発現遺伝子及び低度発現遺伝子との間で比較した。不適切なコンテクストがあれば、リボゾームがＡＵＧを迂回する（コザック（ジャーナルオフモルバイオロ、196:947-950(1987)））。われわれは、発現に有意差を示す異なる植物遺伝子群に異なるコンテクストを確認した。その高度に発現された遺伝子は、ＡＴ（Ａ／Ｃ）ＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＮＣＣＮＣＮＡ（配列番号：１４）を示し、対照的に低度に発現された植物中の遺伝子は、ＧＡＮＡＴＧＮＧＮＮＧＮＮＡＮＡ（配列番号：１５）（表４，表５）を示す。配列番号：１５の配列では、ＡＴＧの直後がＧでない。このことによって、望ましいレベルの遺伝子発現を達成するために、ＡＵＧコンテクスト中の相違が重要性をもち得ることが示された。表４に示されているように高度に発現された遺伝子の分析は、先の塩基配列及びその近い変形が本質的に高レベルの遺伝子発現を可能にすることを示唆する。従って、遺伝子の高レベルの発現を目的とした人工プロモータは、表４の範囲で、配列番号：１４の配列もしくはその変形をもつことができる。
【００６３】
植物における高度発現遺伝子の最初の４つのコドン（翻訳開始部位からの４つのコドン）の分析から、新しい有意義な結果を、本発明者らは明らかにした。下記の表６にまとめられているように、高度発現さ遺伝子の中の最初の４つのコドンは、主としてタンパク質を安定させる特異的なアミノ酸をコードする。最初のトリプレットは、常にメチオニンであり、これはすでに知られている。第２のトリプレットは、主にアラニンをコードし、第３及び第４のトリプレットは、主に、セリンをコードする。メチオニン、アラニン及びセリンがＮ末端に存在することで半減期を長期化し、高度に発現されたタンパク質に安定性が付与される。これによって、容易にそれら（タンパク質）が豊富になる。本結果から、第１及び第２の位置のメチオニン及びアラニンそれぞれに続いて、植物細胞中に高度に発現された遺伝子の第３位、ときに第４位ではセリンが主なアミノ酸となる。遺伝子の高レベルの発現、もしくはタンパク質の高安定性を達成するために、Ｎ末端にこれらのアミノ酸のＤＮＡコドンを使用することは、本発明の新規な発見である。
【００６４】
コンピューター分析から出た前記情報を、遺伝子の高レベルの発現を目的とした合成プロモータを設計するために使用した。そのように設計されたプロモータの塩基配列は、天然のプロモータと類似していない。本発明は、望ましい状況下で発現する遺伝子のサブセットを用いてデータベースを開発し、これらの遺伝子に共通のシス作用エレメントのプールを決定し、そのようなエレメントを体系的にまとめ、導入遺伝子発現の望ましいレベルとパターンを達成することを基本とする。本研究においては、高度に発現する構成プロモータの開発を目的として設計されたプロモータの基本を証明する。多数のシスエレメント間の距離は、上限と下限の間で変化し得るが、公知のプロモータのいずれとも合致しない。例示されたプロモータの塩基配列は、配列番号：１に記載されている。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータのような複数の天然のプロモータは、酵母菌スキゾサクロマイセスポム（Schizosacchromyces pombe）のような関連のない生物において（グマンダー及びコーリ、モルジンジェネット．(Gmunder and Kohli, Mol.Gen.Genet, 220(1):95-101(1989))、及びゼノプスオオサイテス（Xenopus oocytes）のような動物組織（バラス（Ballas et al.）ら、ヌクレイックアシッドリサーチ 17(19):7891-7903）において機能することが示された。複数のバクテリアプロモータが、植物の葉緑体において発現し、逆も同じであることが報告されてきた（ブリクセイ（Brixey et al.）ら、バイオテクノロジーレター（Biotechnology Letters） 19:395-399(1997)）及びダニエルら（Daniell et al）（ネイチャー、バイオテクノロジー 16:345-348(1998)）。植物、動物及び酵母菌、すなわち、全ての真核生物における転写機構の複数の成分の構造的及び機能的保存が報告されている（ガッシュら（Gasch et al）、ネイチャー346:390-394(1990)及びフォーゲルら（Vogel et al.）、プラントセル5:1627-1638(1993)）。従って、説明したように、本発明で設計され、合成された前記人工プロモータは、植物、動物、バクテリア及び他の下等生物において外来遺伝子を発現するために使用することができる。従って、そのような人工的合成プロモータが多数の真核動物において発現が期待されるであろうという予測は論理的である。オデールら（ネイチャー313:810-812(1985)）に示されているように、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータのような強いプロモータは、茎、葉、根及び花などの植物の全ての部分において発現する。ここに挙げた実施例は、本発明で設計された前記プロモータが、高レベルの遺伝子発現のために、プロトプラスト；植物の全ての部分、すなわち、葉、茎、及び根；異なる植物種、例えば、タバコ、キャベツの茎、イモの塊茎、バクテリアの細胞において効率的に発現することを証明する。
【００６５】
図１７に示すように、人工的に設計されたプロモータ塩基配列を、プロモータを化学合成する目的で、それぞれの長さが約５０ヌクレオチドまでの１６の重複オリゴヌクレオチドに分割した。クローンニングしやすくするために、ユニークなＳａｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を、５‘末端及び３'末端にそれぞれ設けた。図１８に示すように、他の制限酵素部位も様々なエレメントに関する将来の研究を容易にするために、設計されたプロモータの塩基配列内に作った。個別のオリゴを、「ファルマシア（登録商標）ＬＫＢジーンアッセンブラーセシアル（Pharmacia（登録商標）  LKB  Gene  Assembler  Secial）」上に合成した。これらは、１０％変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて精製し、ポリアクリルアミドゲルからＭｉｌｌｉ  Ｑ水中に溶出させた。最後に、ＮＡＰ１０（ファルマシア（Pharmacia）社製）カラムを用いて脱塩した。オリゴマーの組立ては、シンら（ジャーナルオフバイオサイエンス（Singh et al., J. Bioscience）21(6):735-741(1996)）に記載の方法を用いて行った。組み立てられた産物を、ＳＫ＋ブルースクリプトプラスミドベクター（Stratagene）のＭＣＳ中にクローニングした。
【００６６】
全ての分子生物学のプロトコルは、サンブルック、フリッチ、マニアティス共著、マニュアルオンモレキュラークローニング（第二版）
（Manual  on  Molecular  Cloning  by  Sambrook，Fritsch  and  Mniatis）の教示に従った。クローンは、応用バイオシステムＤＮＡシーケンサーを用いて配列させた。プライマーをｕｉｄＡ遺伝子の前のコンテクストに導入するために設計した。そのプライマーの塩基配列を図１９に示す。ＸｂａＩ部位をプライマーの末端に設けた。下流のプライマーを、ｕｉｄＡ遺伝子中に約１５０ｂｐに位置するＭｆｅＩ部位から設計した。５‘末端のｕｉｄＡを含む１５０ｂｐフラグメントを、ｐＢＩ  １０１．１（クロンテック（Clontech））を鋳型として用いて増幅させた。それぞれの異なるコンテクストのためにそのようにして得られた１５０ｂｐまでのフラグメントをその後、アガロースゲルから切除し、ＥｃｏＲＶカットＳＫ＋ブルースクリプトプラスミドに結紮した末端に付着させた。次いでそのクローンを前述のように自動シーケンサーを用いて配列させた。
【００６７】
ｎｏｓターミネーターをもつｕｉｄＡ遺伝子（ＭｆｅＩ部位の下流）を含むｐＢＩ１０１の２．３ｋｂｐＭｆｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをアガロースゲルから精製した。これを、前記コンテクストを表す１５０ｂｐまでのフラグメントのＸｂａＩ−ＭｆｅＩに結紮した。前記コンテクストｕｉｄＡ構成を、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断されたＰＵＣ１９にクローニングした。クローンを、青／白を基本とした正の選択をし、内側部位で切断して確認した。そのようにゲルから切除された人工的に設計された合成プロモータ（ＡＳＰ）のＳａｌＩ−ＸｂａＩフラグメント（４３４ｂｐ）を、これらのクローンのそれぞれの前面で結紮した。ｕｉｄＡ遺伝子の前の合成プロモータを備えた構造をｐＡＳＰと名づけた。合成プロモータとＣａＭＶ３５Ｓプロモータを、タバコの葉細胞及びプロトプラスト、キャベツ及びイモの塊茎に、バイオリスティック（biolistic）やＰＥＧを仲介としたＤＮＡ導入によって比較した。公知の技術を用いた、ＧＵＳ発現を基礎にして一過性発現を測定した。タバコ植物の異なる部分での合成プロモータの発現効率をタバコの安定遺伝子導入植物を開発し、続けてアグロバクテリウムチュメファシエンスによって形質転換を行うことによって測定した。
【００６８】
【実施例】
本発明の詳細を、実施例を用いて以下に記すが、発明の範囲を超えない限りこれに限定されるものでない。
【００６９】
（実施例１）
タバコプロトプラストのＰＥＧ仲介形質転換による合成プロモータの一過性発現
膨張させたタバコ(Nicotiana  tabacum)の葉を、０．６２５％セルロースＲ２５０と０．６２５％マクロザイムＲ２５０をＫ３Ａ栄養培地中に含有する酵素混合物中で完全に分解することによって、プロトプラストを調製した（ネグリチウら（Negritiu et al.）、プラント.モル.バイオロ）8:363-373(1987)）。ネグリチウら前掲書同箇所に記載のフローティング方法によって、プロトプラストを単離した。１０5のプロトプラストを０．３ｍｌＰＴＮ溶液中に懸濁させた（ネグリチウら、プラントモルバイオロ8:363-373(1987)）。その後、５０μｇのＤＮＡ構成物（ｕｉｄＡ遺伝子を有する人工プロモータをもつ）を素早く添加し、続いて、２４％ＰＥＧ（８０００）を最終濃度が１０％になるまで添加した。２０分のインキュベーション後、等体積のＫ３Ａ培地を添加した。１０分後、合計体積をＫ３Ａ培地も含めて３．０ｍｌにした。前記プロトプラストを２８℃で２４時間暗室でインキュベートした。２４時間後、プロトプラストを球粒状にし、Ｗ5塩溶液で洗浄した（ネグリチウら、プラント.モル.バイオロ8:363-373(1987)）。最後に、プロトプラストをＧＵＳ抽出緩衝液に懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。該当するプロモータに付着したuidＡ遺伝子からのＧＵＳの発現を、ＭＵＧ、すなわち４−メチルウンベリフェリル配糖体と呼ばれる蛍光性基質の加水分解に基づいて調べた（ジェファーソン、プラント．モル．バイオロ．レポーター（Jefferson Plant. Mol. Biol. Reporter） 5(4):387-405(1987)）。その発現の結果を表７に記す。合成プロモータの発現は、タバコのプロトプラストにおいてネイティブの３５ＳＣａＭＶプロモータより３〜４倍高い。
【００７０】
【表７】
0004326068.tif 000009
【００７１】
（実施例２）
３５ＳＣａＭＶプロモータとタバコの葉におけるbiolistics仲介導入を用いた合成プロモータとの比較
ＣａＭＶ３５Ｓによって動かされる導入遺伝子（レポーター遺伝子、すなわち、ｕｉｄＡ）、もしくは合成プロモータ配列（本発明に記載）を含むＤＮＡの微注射仲介導入は、ヘリウムガス駆動biolistics銃（パーティクルガン）を用いて、タバコの葉において行った。３ｍｇの粒子（水中に懸濁）と、５μｇのＤＮＡ構成物（水５μｌ中に懸濁）、５０μｌの塩化カルシウム（２．５Ｍ保存溶液）及び２０μｌスペルミジン溶液（０．１Ｍ保存溶液）を混合させて、サイズ１μｍの金粉上に前記ＤＮＡを塗布した。その混合物を３分間振とうさせ、３０秒間簡単に遠心分離した。そのペレットを、２５０μｌのエタノール中でよく懸濁させ、再び１０秒間簡単に振とうした。そのペレットを６０μｌエタノール中に再び懸濁させた。その後、ＤＮＡが塗布されたそのような粒子にＰＤＳ１０００Ｈｅ機械（バイオラッドラバラトリー社（米国）（Biorad Laboratory, USA））を使用して、ＭＳ寒天培地上でタバコの葉盤に衝撃を与えた（打ち込んだ）。そのプレートを、光と温度をコントロールして、４８時間インキュベートした。ジェファーソン著プラント．モル．バイオロ．レス(4):387-405(1987)に記載のように、ＧＵＳアッセイを行った。表８に示した結果は、合成プロモータがタバコの葉においてｕｉｄＡ遺伝子をネイティブの３５ＳＣａＭＶプロモータより１６倍の高いレベルで発現させたことをはっきり示している。
【００７２】
【表８】
0004326068.tif 000010
【００７３】
（実施例３）
異なる植物におけるＣａＭＶ３５Ｓプロモータと合成プロモータとの一過性発現の比較
種々の植物種及び異なる外植片における合成プロモータの発現を比較するために、実施例２と同様の方法で、ＤＮＡをbiolistics法によって導入した。合成プロモータとＣａＭＢ３５Ｓプロモータの発現の比較には、綿の葉、イモの塊茎及びキャベツの茎を選択した。実施例２に記載のように、biolisticsを用いて一過性形質転換を行った。衝撃に続いて、ジェファーソン、アール．エー著プラント．モル．バイオロ．レプ(4):387-405(1987)に記載の通り、ＭＵＧ基質を用いてＧＵＳアッセイを行った。表９に示した結果は、合成プロモータが異なる植物種及び様々な外植片において、実質的に高いレベルで発現したことを示している。従って、本発明で設計された合成プロモータは、一過性形質転換に続き、種及び組織で、それぞれＣａＭＶ３５Ｓプロモータより２〜２０倍高いレベルで発現した。
【００７４】
【表９】
0004326068.tif 000011
【００７５】
（実施例４）
安定に形質転換されたタバコ植物の異なる部分における、設計された合成プロモータの発現
ｐＢＩ１０１．１（クロンテック（Clontech））のＳａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを合成プロモータuidＡ-Nosカセットに換えて植物発現カセットを作った。前記ベクターをヘルパープラスミッドｐAL4404を含む、通常使用されるアグロバクテリウムチュメファシエンス株LBA4404にエレクトロポレーションによって挿入した(ジュン、エスダブル及びフォード、ビージー（Jun, SW and Forde, BG）、ニュークレイックアシッドリサーチ17:8385(1987))。遺伝子導入タバコ（ニコチナタバキュームシーヴィープチハバナ（Nicotiana tabaccum cv petit havana））と、アグロバクテリウムチュメファシエンス株 LBA4404を有するタバコの葉盤とを４８時間暗室で共生培養によって発育させた。前記共生培養は、通常使用されるＭＳ（ムラシゲ及びスクーグ（Murashige and Skoog ）1962）固形寒天培地上で行った。葉盤を、２５０ｍｇ／Ｌのセホタキシム（バクテリアの成長を阻害するため）と１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加した再生培地（ＭＳ培地＋１．０ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン＋０．１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸）に移し、形質転換された細胞を選択した。前記選択は、６０μモルｍ-2ｓ-1ＰＡＲ（照光時間１６時間）で、培養室において２４±２℃で４週間行った。カナマイシンの存在下で再生された新芽を切除し、根培地（ＭＳ＋０．１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸＋５０μｇ／Ｌカナマイシン）に移した。６０μモルｍ-3ｓ-1ＰＡＲで２４±２℃の温度で２〜４週間培養した後、よく発達した根を有する新芽を得た。４−６葉段階の小植物で再生した２種の異なる生体外導入遺伝子を使い、葉、茎、及び根における合成プロモータの活性を調べた。ｕｉｄＡ遺伝子の発現を、ジェファーソン、プラントモルバイオロレプ(4):387-405(1987)に記載のＭＵＧを用いたＧＵＳアッセイによって調べた。その結果を表１０に示す。その合成プロモータは、Ｒｏタバコ植物の葉、茎及び根において高い活性を示す。しかし、非常に注目すべきことに、根におけるその活性が遺伝子導入小植物において少なくとも５倍であった。したがって、合成プロモータは、本質的に高いレベルで発現するが、それは根において特に優れていた。
【００７６】
【表１０】
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【００７７】
（実施例５）
バクテリウム属アグロバクテリウムチュムファシエンス（Bacterium Agrobacterium  tumefaciens）における、設計された合成プロモータの発現
合成プロモータが原核生物において発現することを証明するために、バクテリウム属アグロバクテリウムチュメファシエンスを例にとった。uidＡ合成プロモータを発現するｐＢＩＡＳＰ構成物とＣａＭＶ３５ＳプロモータからのｐＢＩ１２１（クロンテック）を、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムに移した(ジュン、エス．ダブル及びフォード．ビージー著、ニュークレイック．アシッド．リサーチ（Jun, SW and Forde, BG Nucl. Acids. Res. ）17:8385(1987))。そして、形質転換したばかりの細胞を、カナマイシン（50μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地上で２８℃で一晩成長させ、振とうさせた（２５０ｒｐｍ）。その後、その細胞を5分間１２０００ｒｐｍで遠心分離して採取した。続いてその細胞をＧＵＳ抽出緩衝液中に懸濁させ、超音波で溶菌した。その後残骸を、１２，０００ｒｐｍで１０分間４℃で球粒状にした。ジェファーソン、アール．エー．プラント．モル．バイオロ．レプ(4):387-405(1987)に記載のＧＵＳアッセイには上澄みを使用した。表１１の結果は、バクテリアにおける合成プロモータの活性を証明している。合成プロモータは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータと比較して、活性が１０倍であることが判明した。
【００７８】
【表１１】
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【００７９】
上記のように、本発明を、理解を容易にする目的で、図面及び実施例を用いて詳細に説明した。本発明において、特定の変更、修正が、表１から表６および請求項等に記載の統計分析の結果における変形の範囲で実行してもよいことは自明である。
【００８０】
【発明の効果】
本発明の人工合成プロモータを用いることにより、植物細胞等において、導入遺伝子を高レベルで発現させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の配列番号１の配列を示す図である。
【図２】本発明の配列番号２の配列を示す図である。
【図３】本発明の配列番号３の配列を示す図である。
【図４】本発明の配列番号４の配列を示す図である。
【図５】本発明の配列番号５の配列を示す図である。
【図６】本発明の配列番号６の配列を示す図である。
【図７】本発明の配列番号７の配列を示す図である。
【図８】本発明の配列番号８の配列を示す図である。
【図９】本発明の配列番号９の配列を示す図である。
【図１０】本発明の配列番号１０の配列を示す図である。
【図１１】本発明の配列番号１１の配列を示す図である。
【図１２】本発明の配列番号１２の配列を示す図である。
【図１３】本発明の配列番号１３の配列を示す図である。
【図１４】本発明の配列番号１４の配列を示す図である。
【図１５】本発明の配列番号１５の配列を示す図である。
【図１６】本発明の配列番号１６の配列を示す図である。
【図１７】本発明の一実施例において、配列番号１のプロモータを含む二本鎖ＤＮＡの合成のための重複オリゴの設計を示す図である。
【図１８】本発明の一実施例の合成プロモータ（配列番号１）の制限部位を示す図である。
【図１９】本発明の一実施例において、合成プロモータのＡＴＧコンテクストの導入のためのプライマー（配列番号１７）を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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