(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）導電性基板の表面にＤＮＡ断片がその一端で固定されてなるＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、そして（２）上記の工程（１）で測定された電流値を、上記のＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法。
【請求項２】
（１）導電性基板の表面にＤＮＡ断片がその一端で固定されてなるＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、（２）上記と同一の構成のＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片を含まない水性液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れるバックグラウンド電流値を測定する操作を含む工程、そして（３）上記の工程（１）で測定された電流値を、前記のＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合し、かつ工程（２）で測定された電流値と比較する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法。
【請求項３】
ＤＮＡ分析素子として、ＤＮＡ断片の固定部位以外の表面に電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基板の表面への接触を妨げるマスク処理が施されているＤＮＡ分析素子を用いることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の検出方法。
【請求項４】
マスク処理が、導電性基板の表面にＤＮＡ断片をその一端で固定させた後、２−メルカプトエタノールにて表面処理をする方法によって行われたことを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
ＤＮＡ分析素子として、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片がその一端で結合しているＤＮＡ分析素子を用いることを特徴とする請求項１乃至３の内の何れかの項に記載の検出方法。
【請求項６】
電気化学活性縫い込み型インターカレータとして、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いることを特徴とする請求項１乃至３の内の何れかの項に記載の検出方法。
【請求項７】
各工程における電流値の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行うことを特徴とする請求項１もしくは２に記載の検出方法。
【請求項８】
（１）導電性基板の表面にＰＮＡ断片がその一端で固定されてなるＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、そして（２）上記の工程（１）で測定された電流値を、上記のＰＮＡ分析素子に固定されているＰＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法。
【請求項９】
（１）導電性基板の表面にＰＮＡ断片がその一端で固定されてなるＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、（２）上記と同一の構成のＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片を含まない水性液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れるバックグラウンド電流値を測定する操作を含む工程、そして（３）上記の工程（１）で測定された電流値を、前記のＰＮＡ分析素子に固定されているＰＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合し、かつ工程（２）で測定された電流値と比較する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法。
【請求項１０】
ＰＮＡ分析素子として、ＰＮＡ断片の固定部位以外の表面に電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基板の表面への接触を妨げるマスク処理が施されているＰＮＡ分析素子を用いることを特徴とする請求項８もしくは９に記載の検出方法。
【請求項１１】
マスク処理が、導電性基板の表面にＰＮＡ断片をその一端で固定させた後、２−メルカプトエタノールにて表面処理をする方法によって行われたことを特徴とする請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
ＰＮＡ分析素子として、既知の塩基配列を有するＰＮＡ断片がその一端で結合しているＰＮＡ分析素子を用いることを特徴とする請求項８乃至１０の内の何れかの項に記載の検出方法。
【請求項１３】
電気化学活性縫い込み型インターカレータとして、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いることを特徴とする請求項８乃至１０の内の何れかの項に記載の検出方法。
【請求項１４】
各工程における電流値の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行うことを特徴とする請求項８もしくは９に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子診断の手段の一つとして重要な、遺伝子多型の検出方法、および異常遺伝子断片の変異を解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に病気は、遺伝性素因に環境因子が作用して発症すると考えられているが、遺伝子技術の進展に伴って多くの疾患が遺伝性あるいは外因性の遺伝子異常を伴うことが解明されている。遺伝子診断とは、これらの遺伝子内に生じた異常（塩基置換、塩基欠損、塩基挿入、塩基点変異、塩基転位等）を診断することであり、その対象は、生殖細胞の遺伝子に異常がある遺伝性疾患のみではなく、外界からの作用によって体細胞の遺伝子内に生じた異常により引き起こされる疾患も含む。
【０００３】
遺伝子診断の分野の研究の方向としては、一つには、未知の異常遺伝子の探究・同定がある。ポジショナルクローニング（患者の家族のＤＮＡを抽出して異常の程度を連鎖解析によって調べることで変異遺伝子の染色体上の座位を決定する方法）が確立されたため、現在では、病因遺伝子の確実な同定が可能となり、家族歴の明らかな遺伝性疾患のみでなく、これまで遺伝よりも環境因子の作用する割合が多いと思われていた疾患（糖尿病、高血圧症等）の遺伝子診断が可能となっている。
もう一つは、既知となった異常遺伝子を有する多数の患者を対象とした迅速・正確な診断法の開発である。遺伝病としては、現在２０００種類以上が知られているが、その中でも、小児高尿酸血症、鎌状赤血球貧血症、フェニルケトン尿症等は代表的な疾患である。この種の疾患に対して、新生児や胎児を対象とするマススクリーニング法が確立され、早期発見の実が上がっているが、将来的な遺伝子治療に向かって有効な診断法の開発は重要である。
【０００４】
遺伝子診断法として、遺伝子断片の変異を検出するＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism：一本鎖ＤＮＡ高次構造多型）法をはじめとした種々の変異解析法が知られている。図１に、従来法であるＳＳＣＰ法を示す。二本鎖の正常遺伝子断片（１１ａ）および二本鎖の異常遺伝子断片（１１ｂ）を変性処理（３１）すると、何れの遺伝子断片も解離して、それぞれ一本鎖の正常遺伝子断片（２１ａ）、一本鎖の異常遺伝子断片（２１ｂ）となる（図１の（Ａ））。図中の「×」印は、変異した塩基の位置を示す。異常遺伝子断片（１１ｂ）は、特定の遺伝子異常の患者から得られたＤＮＡ断片を意味する。これらの遺伝子断片（２１ａおよび２１ｂ）をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動に付すると、それぞれの遺伝子断片はその塩基配列に依存した独自の高次構造をとっているために、高次構造の違いに応じてそれぞれ異なる移動度を示す（図１の（Ｂ））。従って、この移動度を検出することによって遺伝子の微妙な変異を確認することができる。
【０００５】
しかし、ＳＳＣＰ法では、一本鎖ＤＮＡ断片の塩基の変化が必ずしもその移動度の変化と結びつかないことがある。特に塩基の変化がＤＮＡ断片の末端付近で起きている場合には、その高次構造の変化が少ないため、塩基の変化を伴わないＤＮＡ断片の移動度と何れかの塩基の変化を伴うＤＮＡ断片の移動度との差が極めて小さくなる結果、これら二つのＤＮＡ断片の識別が困難であるという問題点を有する。
【０００６】
ＳＳＣＰ法以外の方法として、遺伝子の変化を、一本鎖の正常遺伝子断片と一本鎖の異常遺伝子断片とのハイブリダイゼーションによって得られる特殊ＤＮＡ構造を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を検出することによって確認する方法がいくつか知られている。特表平９−５０１５６１号公報には、特殊ＤＮＡ構造を有する二本鎖ＤＮＡ断片を蛍光外顕微鏡によって検出する方法が開示されている。また、該二本鎖ＤＮＡ断片を温度勾配ゲル電気泳動によって二本鎖の安定性の違いによる移動度の差異を利用して検出する方法も知られている。
ここで、特殊ＤＮＡ構造とは、正常ＤＮＡ構造が「フルマッチ構造」（完全な二本鎖を形成している構造）をいうのに対して、「ミスマッチ構造」（正常遺伝子断片と異常遺伝子断片とが二本鎖を形成してはいるが、その二本鎖が非塩基対形成部分を一つ有している構造）、「バルジ構造」（これらの遺伝子断片が二本鎖を形成してはいるが、その二本鎖が非塩基対形成部分を複数有している構造）等を意味する。完全な二本鎖を形成していない構造を、広く、ミスマッチ構造と呼ぶこともできるが、本明細書においては、上記のように分けることとする。
【０００７】
しかし、上記の蛍光外顕微鏡を用いる方法では、標識として用いるフルオレセイン等の蛍光物質の褪色が起こり易いという問題点を有する。電気泳動を利用する方法では、測定ごとに条件設定を行わなければならず、迅速性に欠けるという問題点を有する。ラジオアイソトープ法も利用されてはいるが、安全性の点で問題が残る。従って、遺伝子のあらゆる変化を簡便に、かつ高感度に検出するには、特殊ＤＮＡ構造を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を迅速、かつ高感度に検出できる方法の開発が求められる。
【０００８】
特開平９−２８８０８０号公報には、電気化学的な方法を用いる「フルマッチ構造」を有する二本鎖ＤＮＡ断片を検出する方法が開示されている。この方法では、固相担体に既知のＤＮＡ断片が固定されてなるＤＮＡプローブおよび電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いることによって、既知のＤＮＡ断片に完全な相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出することができる。この方法は、蛍光法に見られる褪色がなく、ラジオアイソトープ法における安全性の問題を解消できることに加え、試料ＤＮＡ断片の標識が不要である点で非常に優れた方法である。
【０００９】
特開平１１−２３６３９６号公報には、ＤＮＡは負電荷を持つ分子であるが、そのＤＮＡの代わりに、負電荷を持たず、かつＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）を模倣した分子であるＰＮＡ（peptide nucleic acid）が開示されている。
【００１０】
ＰＮＡは、いわゆるアンチセンス分子の一つとして知られているものである。アンチセンス分子は、遺伝子が発現する際に、一本鎖になるＤＮＡの塩基配列の転写領域もしくはＲＮＡの塩基配列の翻訳領域に高選択的に結合して、その領域の機能を制限するように働く分子であり、遺伝子治療の分野ではアンチセンス医薬品として知られている。ＰＮＡは、核酸と同様にその分子中に核酸塩基を有し、相補的な塩基配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズして二本鎖を形成する（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。ＰＮＡは、機能的には核酸とほとんど変わりないが、その構造は全く異なり、Ｎ−(２−アミノエチル）グリシンを単位とするポリアミドを基本骨格としており、その分子中に糖およびリン酸を含まない。核酸塩基は、ポリアミド骨格に、通常、メチレンカルボニル基を介して結合している。下記に、ＰＮＡの代表的な構造をＤＮＡの構造と共に示す。
【００１１】
【化１】
0004320104.tif 000002
【００１２】
ＰＮＡは、電気的には中性であり、塩の存在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有する機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡと核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのため、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬への応用が期待されている分子である（特表平６−５０９０６３号の明細書）。
【００１３】
特開平１１−３３２５９５号公報には、固相担体表面にＰＮＡ断片をその一端で固定してなるＰＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブを用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰＮＡプローブは、アビジン−ビオチン法によって、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップにＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡプローブを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴シグナルを測定することによって行なわれている。また、ＰＮＡプローブ、およびラジオアイソトープで標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトープ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上させることができる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、一本鎖の正常遺伝子断片と一本鎖の異常遺伝子断片とで形成される遺伝子多型を検出するために有用な部分相補性核酸断片を検出する方法を提供することにある。また、本発明は、ＰＮＡ特有の性質を利用して、上記部分相補性核酸断片を検出する方法を提供することにもある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）導電性基板の表面にＤＮＡ断片がその一端で固定されてなるＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、そして（２）上記の工程（１）で測定された電流値を、上記のＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にある。
【００１６】
本発明はまた、（１）導電性基板の表面にＤＮＡ断片がその一端で固定されてなるＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、（２）上記と同一の構成のＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片を含まない水性液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れるバックグラウンド電流値を測定する操作を含む工程、そして（３）上記の工程（１）で測定された電流値を、前記のＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合し、かつ工程（２）で測定された電流値と比較する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にもある。
【００１７】
本発明の、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）ＤＮＡ分析素子として、ＤＮＡ断片の固定部位以外の表面に電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基板の表面への接触を妨げるマスク処理が施されているＤＮＡ分析素子を用いる。
（ロ）マスク処理が、導電性基板の表面にＤＮＡ断片をその一端で固定させた後、２−メルカプトエタノールにて表面処理をする方法によって行われた。
（ハ）ＤＮＡ分析素子として、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片がその一端で結合しているＤＮＡ分析素子を用いる。
（ニ）電気化学活性縫い込み型インターカレータとして、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いる。
（ホ）各工程における電流値の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【００１８】
本発明はさらに、（１）導電性基板の表面にＰＮＡ断片がその一端で固定されてなるＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、そして（２）上記の工程（１）で測定された電流値を、上記のＰＮＡ分析素子に固定されているＰＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にある。
【００１９】
本発明はさらにまた、（１）導電性基板の表面にＰＮＡ断片がその一端で固定されてなるＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、（２）上記と同一の構成のＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片を含まない水性液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れるバックグラウンド電流値を測定する操作を含む工程、そして（３）上記の工程（１）で測定された電流値を、前記のＰＮＡ分析素子に固定されているＰＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合し、かつ工程（２）で測定された電流値と比較する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にもある。
【００２０】
本発明の、ＰＮＡ分析素子を用いる検出方法の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）ＰＮＡ分析素子として、ＰＮＡ断片の固定部位以外の表面に電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基板の表面への接触を妨げるマスク処理が施されているＰＮＡ分析素子を用いる。
（ロ）マスク処理が、導電性基板の表面にＰＮＡ断片をその一端で固定させた後、２−メルカプトエタノールにて表面処理をする方法によって行われた。
（ハ）ＰＮＡ分析素子として、既知の塩基配列を有するＰＮＡ断片がその一端で結合しているＰＮＡ分析素子を用いる。
（ニ）電気化学活性縫い込み型インターカレータとして、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いる。
（ホ）各工程における電流値の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の部分相補性核酸断片の検出方法では、一本鎖の正常遺伝子断片と一本鎖の異常遺伝子断片とのハイブリダイゼーションによって得られるハイブリッドＤＮＡの検出に、電極型センサ法（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回分析化学討論会予稿集、ｐ１３７−１３８（１９９６年））を利用する。
この電極型センサ法は、出力端子を備えかつＤＮＡ断片が固定された電極に、試料核酸断片を電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて接触させ、電流値を測定することによって、相補性を有する試料核酸断片を検出する方法である。
【００２２】
以下、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法を中心に説明するが、特に断らない限りＰＮＡ分析素子を用いる場合についても同様とする。本明細書において、次のように定義する。
「ＰＮＡ断片」には、合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片化したものを含まない。
「ＤＮＡ分析素子」とは、導電性基板の表面に多数のＤＮＡ断片がその一端部にて固定された分析素子をいう。
「マスク処理」とは、マスク処理用化合物を含む溶液を未処理のＤＮＡ分析素子表面の全体に滴下し、必要であれば乾燥させ、そして固定することをいう。
「ハイブリッドＤＮＡ」とは、ＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰＮＡ」とは、ＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「結合」とは、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子がハイブリッドＤＮＡ構造内に挿入された状態、あるいはハイブリッドＤＮＡ構造外でハイブリッドＤＮＡに静電的に相互作用している状態をいう。
「部分相補性核酸断片」とは、ＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片にの塩基配列に対して部分的に相補性を示す核酸断片であって、部分的に非相補性を示すものをいう。従って、完全に相補性を示す核酸断片および完全に相補性を示さない核酸断片は、部分相補性核酸断片の対象とはならない。
【００２３】
図２に、本発明の部分相補性核酸断片の検出方法の代表例を模式的に示す。以下、本発明の検出方法についてＤＮＡ分析素子を用いる場合を中心に詳述するが、特に断らない限り、ＰＮＡ分析素子を用いる場合も同様とする。
本発明の検出方法は、次の三工程よりなる。
工程Ａ；導電性基板（４１）の表面に一本鎖のＤＮＡ断片（一本鎖の正常遺伝子断片）（５１）を固定し、ＤＮＡ分析素子（６１）とする。ここに、試料核酸断片として、正常遺伝子断片（７１ａ）の特定の一塩基に対して非塩基対を形成する塩基を含む塩基配列を有する異常遺伝子断片（７１ｂ）、あるいは正常遺伝子断片（７１ａ）の特定の二つの塩基に対してそれぞれ非塩基対を形成する塩基を含む塩基配列を有する異常遺伝子断片（７１ｃあるいは７１ｄ）が溶解あるいは分散してなる試料液をそれぞれ接触させ、そして（６１）に（７１ｂ）、（７１ｃ）および（７１ｄ）（「×」印は、変異した塩基の位置を示す）をそれぞれ結合させると、ミスマッチ構造を有するハイブリッドＤＮＡ（９１ｂ）、バルジ構造を有するハイブリッドＤＮＡ（９１ｃあるいは９１ｄ）がそれぞれ得られる。（９１ｃ）および（９１ｄ）は、何れも二個の非塩基対形成部分を持つ。これらに、電気化学活性縫い込み型インターカレータ（１００）を接触させ、そして結合させると、（９１ｂ）、（９１ｃ）あるいは（９１ｄ）に、（１００）がそれぞれ結合した複合体（１０１ｂ）、（１０１ｃ）、（１０１ｄ）が得られる。次いで、これらに電位を印加し、該インターカレータと導電性基板との間に流れる電流量を測定する。
工程（Ｂ）；試料核酸断片として正常遺伝子断片（７１ａ）を用いて、工程（Ａ）と同様の操作を行うことにより、フルマッチ構造を有するハイブリッドＤＮＡ（９１ａ）が得られる。ここに、該インターカレータ（１００）を接触させ、そして結合させると、複合体（１０１ａ）が得られる。工程（Ａ）と同様にして、その電流値を測定する。
工程（Ｃ）；工程（Ａ）で測定された電流値と、工程（Ｂ）で測定された電流値を比較する。
従って、工程（Ａ）、（Ｂ）あるいは（Ｃ）によって、異常遺伝子断片（７１ｂ）（あるいは（７１ｃ）、（７１ｄ））が、正常遺伝子断片（７１ａ）と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出することができる。図２には、異常遺伝子断片が塩基置換を有する場合を示すが、塩基欠損、塩基挿入等の塩基変化の場合についても、同様の検出方法が利用できる。
【００２４】
また、本発明の検出方法は、上記の工程（Ａ）乃至（Ｃ）に加えて、工程（Ｄ）を含む検出方法にもある。工程（Ｄ）は、試料核酸断片は接触させずに、ＤＮＡ分析素子に該インターカレータのみを接触させることによって、バックグラウンド電流値が得る工程である。即ち、上記の工程（Ａ）および（Ｂ）で得られる電流値は、それぞれバックグラウンド電流値に対して変化した電流値である。
【００２５】
［導電性基板］
導電性基板は、疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてなる基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板および電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。
電気絶縁性の担体の材質としては、何れも、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
疎水性の導電性基板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく用いることができるが、電極を用いることが特に好ましい。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることがが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
【００２６】
導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてなる基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体の凹凸を軽減することができる。また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体も好ましく用いることができる。
【００２７】
電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置されたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載の、核酸が未固定のシリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線導電性基板のように、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであってもよい。
【００２８】
［ＤＮＡ断片］
本発明の検出方法は、ＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡ（遺伝子多型）を検出し、さらに試料核酸断片の変異の態様を解析することを本来の目的とする一次スクリーニング法である。従って、ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片および試料核酸断片としては、それらの内の何れか一方が正常遺伝子断片であって、他方が異常遺伝子断片であることが好ましい。ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片および試料核酸断片の何れが正常遺伝子断片であってもよいが、ＤＮＡ断片としては正常遺伝子断片を用いることが好ましい。
【００２９】
正常遺伝子断片としては、生物の試料から抽出した塩基変異の認められないＤＮＡ、遺伝子操作等によって作製した塩基変異の伴わないＤＮＡ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳動による分離操作等で精製したＤＮＡ断片を用いることが好ましい。これらのＤＮＡ断片は、熱処理、アルカリ処理等によって、上記分離操作の前もしくは後に一本鎖のＤＮＡ断片に解離させる。また、生物の試料から抽出した塩基変異の認められないＤＮＡから得られる一本鎖のＤＮＡ断片と同一の塩基配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを化学合成し、これを用いることもできる。
【００３０】
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。ＤＮＡ断片は、３乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。ＤＮＡ断片として、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれに、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定させるため、そのような複数の種類のＤＮＡ断片を用いることも好ましい。
【００３１】
ＤＮＡ断片の固定方法としては、公知の方法を用いることができる。ＤＮＡ断片の導電性基板への固定方法は、ＤＮＡ断片の種類および導電性基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素, Vol. 43, No.13, 2004-2011(1998)）。合成ヌクレオチドを固定する場合には、導電性基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための反応性基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した導電性基板に共有結合させる方法を用いることができる。例えば、導電性基板の表面が金で蒸着処理されている場合には、ＤＮＡ断片の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、ＤＮＡ断片を導電性基板に固定する。該ＤＮＡ断片にメルカプト基を導入する方法は、文献（M.Maeda et al., Chem.Lett., 1805-1808(1994)およびB.A.Connolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484(1985)）に記載されている。導電性基板の表面がグラシーカーボンで塗布処理されている場合には、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、導電性基板の表面にカルボン酸基を導入し、ＤＮＡ断片をアミド結合により導電性基板表面に固定することができる。実際の固定化方法については、文献（K.M.Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323(1993)）に詳細が記載されている。ＤＮＡ断片は、予め調製されたハイブリッドＤＮＡであってもよい。ハイブリッドＤＮＡを金で蒸着処理された導電性基板に固定する場合には、ハイブリッドＤＮＡの片方の鎖の５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）にメルカプト基を導入しておく。そして、ハイブリッドＤＮＡを固定後に二本鎖を解離させ、一本鎖を固定することもできる。
共有結合のための反応性基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。導電性基板としてガラスやシリコンを用いる場合には、その表面処理には、公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。
【００３２】
ＤＮＡ断片の固定は、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれの上に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散されてなる水性液を点着することによって実施することが好ましい。点着するＤＮＡ断片の濃度は、数ｐＭ乃至数ｍＭの範囲にあることが好ましく、数ｐＭ乃至数ｎＭの範囲にあることが特に好ましい。点着量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１０ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うことも好ましい。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片が複数の導電性基板上に固定される。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
点着によって固定されたＤＮＡ断片の量は、導電性基板表面１ｍｍ2当たり１０-20乃至１０-12モルの量の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の固定量は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）等の機器分析の手段により決定することができる。
【００３３】
［ＰＮＡ断片］
本発明で好ましく用いられるＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００３４】
【化２】
0004320104.tif 000003
【００３５】
上記式中、Ｂ11は、リガンドであって、天然の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩基類似体を表す。Ｂ11は、天然に見出される位置、即ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリンについては、９位において、チミン、ウラシルもしくはシトシンを含むピリミジンについては、１位において結合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が導入された化合物）をいう。また、Ｂ11は、核酸塩基を含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノイル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。
典型的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片への結合親和性を増加させることが知られている（特開平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５）。
さらに、Ｂ11は、ＤＮＡインターカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あるいは放射性標識であってもよい。
Ｂ11は、核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に好ましい。
【００３６】
Ｒ11は、水素原子、もしくは天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基を示す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ13Ｒ14基、メルカプト基、および炭素原子数が１乃至６のアルキル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていてもよい。Ｒ13およびＲ14は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキルチオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしくは水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基は、Ｒ11が結合している炭素原子の水素原子と一緒になって脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【００３７】
Ｌ11は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＲ12−基であることが好ましく、−ＣＯ−基であることが特に好ましい。Ｒ12は、水素原子、炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のアルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい。
【００３８】
ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよびｃは、何れも１であることが好ましい。
【００３９】
本発明で用いるＰＮＡ断片は、下記一般式(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式中、Ｂ11およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ11、ｄを表す。
【００４０】
【化３】
0004320104.tif 000004
【００４１】
ＰＮＡ断片は、ペプチドと同様に液相法や固相法によって合成することができ、合成されたものは市販もされている。ＰＮＡの合成法については、特表平６−５０９０６３号の明細書、米国特許２７５８９８８号の明細書、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1987(1992)、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 9677-9678(1992)などに詳細が記載されている。
【００４２】
ＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片の量は、導電性基板１ｍｍ2当たり１０-15乃至１０-10モルの量の範囲にあることが好ましい。導電性基板の表面にＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着させても、通常、その点着量と実際に固定される量とでは異なるためである。
【００４３】
ＤＮＡ断片が１０-10モル以上の量で導電性基板に固定されている場合には、ＤＮＡ断片は、導電性基板上で密集状態にあり、１０-12モルより少ない場合には、導電性基板の表面にＤＮＡ断片が結合していない部分、即ち、すき間部分が生じていると推定される。このすき間部分の発生によって、ＤＮＡ断片の多くは、導電性基板の表面上に倒れた状態で結合しているものと考えられる。ＤＮＡ断片と試料核酸断片との効率よいハイブリダイゼーションのためには、ＤＮＡ断片が導電性基板の表面に対して、可能な限り垂直方向に伸張した状態で固定されていることが望ましい。また、電気化学活性縫い込み型インターカレータは、このすき間部分に接触し、非特異的に吸着する結果、バックグラウンド電流値を上げるとものと推定される。従って、本発明で用いるＤＮＡ分析素子は、下記のマスク処理が施されていることが好ましい。
【００４４】
［マスク処理］
マスク処理は、マスク処理用化合物を含む溶液をＤＮＡ分析素子の表面に点着することによって実施することができる。マスク処理用化合物は、０．５乃至２ｍＭの範囲で用いることが好ましく、０．８乃至１．５ｍＭの範囲で用いることが特に好ましい。マスク処理用化合物を点着後、所定の温度（好ましくは、室温）で数時間放置することが好ましい。点着後、必要であればインキュベーションを行ってもよい。マスク処理がなされたＤＮＡ分析素子は、数日間保存することが可能で、また数回であれば繰り返し使用することもできる。
【００４５】
マスク処理用化合物は、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有していてもよい鎖状分子に、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部もしくはその近傍に、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が結合している化合物である。該鎖状分子は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基を介して、導電性基板の表面に固定される。
一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有するとは、親水性基が必ずしも鎖状分子の末端に位置していなくてもよいことを示すが、端部に親水性基を有することが好ましい。親水性基は、一個であっても、複数個であってもよい。導電性基板の表面に結合可能な反応性基は、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に結合していることが好ましい。途中に環状基を有していてもよい鎖状分子は、マスク処理用化合物から誘導された分子である。
マスク処理用化合物としては、先に導電性基板に固定されているＤＮＡ断片よりも直鎖の長さが短い化合物であって、直鎖の炭素原子数が１乃至６のアルキレン基の一方の末端に親水性基を有しかつ他方の末端に導電性基板と結合する反応性基を有する化合物であることが好ましい。
【００４６】
導電性基板の表面に結合可能な反応性基としては、メルカプト基、スルフィド基、ジスルフィド基、チオカルボニル基およびチオカルボン酸基からなる群より選ばれる基を挙げることができる。導電性基板の表面にアミノ基、アルデヒド基、カルボン酸基等の反応性基を導入する処理を予め施している場合には、該反応性基としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、アミド基、カルボン酸基、アルデヒド基、エポキシ基および過オキシ酸基からなる群より選ばれる基を挙げることもできる。上記の該反応性基としては、メルカプト基、チオカルボニル基もしくはスルフィド基であることがさらに好ましく、メルカプト基であることが特に好ましい。
【００４７】
親水性基は、水酸基、カルボン酸基、アミド基、リン酸基もしくはスルホン酸基であることが好ましく、水酸基であることが特に好ましい。但し、導電性基板の表面に結合可能な反応性基とは、互いに異なるものであることが好ましい。
環状基は、環構成炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、あるいはＮ、Ｓ、ＯおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１０の複素環基であることが好ましい。環状基は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が共同して環状基を形成している基であってもよい。後者の好ましい例として、イミダゾール−２−チオン基を挙げることができる。
【００４８】
よって、マスク処理用化合物としては、メルカプトメタノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノール、Ｎ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンもしくは文献に記載のイミダゾール−２−チオン誘導体（A.J.Arduengo et al., J.Am.Chem.Soc., 1990, 112, 6153-6154）であることが好ましく、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノールであることがさらに好ましく、２−メルカプトエタノールであることが特に好ましい。上記のマスク処理用化合物は、そのナトリウム、カリウム等の塩であってもよく、また、そのアルキレン鎖が特定の置換基によって置換されていてもよい。その特定の置換基としては、炭素原子数が１乃至６の炭化水素基（好ましくは、メチル基、エチル基、フェニル基等）であることが好ましい。
ＤＮＡ断片の固定方法に応じて、マスク処理用化合物を選択することが望ましい。二種類以上のマスク処理用化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００４９】
［ハイブリダイゼーション］
ハイブリダイゼーションは、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、ＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片を接触させることによって実施する。ＤＮＡ分析素子への試料核酸断片の接触は、ＤＮＡ分析素子上に試料核酸断片を含む水性液を滴下する方法、あるいは試料核酸断片を含む水性液中にＤＮＡ分析素子を浸漬する方法の何れによっても実施できる。このとき、試料核酸断片を含む水性液中にインターカレータを含めてもよい。または、ハイブリダイゼーションの終了後に形成されたハイブリッドＤＮＡにインターカレータを接触させてもよい。この場合には、未反応の試料核酸断片を除去しておくことが好ましい。一本鎖の試料核酸断片あるいは試料中に含まれる二本鎖の試料核酸断片に、インターカレータが非特異的に結合するのを避けるため、ハイブリダイゼーション終了後に未反応の試料核酸断片を除去してから、インターカレータを接触させることが望ましい。洗浄は、界面活性剤（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩衝液）との混合溶液を用いて行うことが好ましい。インターカレータは、１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲にて用いることが好ましい。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、一塩基変異の検出を目的とする場合には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００５１】
ハイブリッドＤＮＡに結合する該インターカレータの量は、図２に示すように、特殊ＤＮＡ構造に依存して異なる。この結合量は、二本鎖形成において非塩基対形成部分が増加するに伴い減少する。
【００５２】
［試料核酸断片］
試料核酸断片は、ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片の少なくとも一個の塩基に対して非塩基対を形成する塩基配列を有する断片である。試料核酸断片としては、ＤＮＡ分析素子に固定する好ましいＤＮＡ断片が正常遺伝子断片であることに対応して、異常遺伝子断片を用いることが好ましい。異常遺伝子断片は、その対象となる正常遺伝子断片の少なくとも一個の塩基に対して非塩基対を形成する塩基配列を有する断片である。このような塩基配列を有するものであれば、如何なる種類の塩基変異（塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等）を伴うものであってもよい。異常遺伝子断片としては、遺伝子異常の生物の試料から抽出したＤＮＡ、遺伝子操作等によって作製した下記の異常遺伝子と同一の塩基配列を有するＤＮＡ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳動による分離操作等で精製したＤＮＡ断片を用いることが好ましい。これらのＤＮＡ断片は、熱処理、アルカリ処理等によって、上記分離操作の前もしくは後に一本鎖のＤＮＡ断片に解離させる。また、下記の異常遺伝子と同一の塩基配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを化学合成し、これを用いることもできる。
【００５３】
異常遺伝子としては、遺伝性疾患、外因性の遺伝子異常による疾患あるいは遺伝性素因に環境因子が作用した疾患に由来するものの何れであってもよい。例えば、遺伝性疾患よりも環境因子の作用する割合が多いと思われていた疾患（糖尿病、高血圧症等）、既知の遺伝病（小児高尿酸血症、鎌状赤血球貧血症、フェニルケトン尿症等）等を挙げることができる。
【００５４】
試料核酸断片の接触量については、導電性基板１ｍｍ2当たり１０-18乃至１０-10モルの量の範囲にあることが好ましく、１０-18乃至１０-12モルの量の範囲にあることが特に好ましい。対照として用いる試料核酸断片の接触量は、上記試料核酸断片と同一であることが好ましい。
【００５５】
［電気化学活性縫い込み型インターカレータ］
電気化学活性縫い込み型インターカレータは、ハイブリッドＤＮＡにインターカレートし、かつ電気化学活性を有する分子であれば何れのものも使用することができる。但し、ハイブリッドＤＮＡの塩基対形成部分を定量的に認識できることが要求されるため、ＤＮＡの溝結合性型のものは好ましくない。
【００５６】
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータは、酸化還元活性を有する物質であることが好ましい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体、ビオローゲン化合物等であることが好ましく、フェロセン化合物であることが特に好ましい。インターカレータ部分としては、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等であることが好ましく、ナフタレンジイミドであることが特に好ましい。よって、該インターカレータとしては、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（S.Takenaka et al., J.Chem.Soc.,Commun., 1111(1998)）であることが特に好ましい。
【００５７】
【化４】
0004320104.tif 000005
【００５８】
また、下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００５９】
【化５】
0004320104.tif 000006
【００６０】
但し、Ｘは下記式で表されるフェロセン誘導体である。
【００６１】
【化６】
0004320104.tif 000007
【００６２】
【化７】
0004320104.tif 000008
【００６３】
【化８】
0004320104.tif 000009
【００６４】
【化９】
0004320104.tif 000010
【００６５】
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータには、酸化還元活性部分とインターカレータ部分とを繋ぐリンカー部分がある。前記式で表される１，４−ジプロピルピペラジニル基がこのリンカー部分に相当する。このピペラジニル基の代わりに、四級化されたイミノ基を導入することもできる。四級化されたイミノ基を導入した下記式で表されるインターカレータは、反応系のｐＨに関わらすカチオン性となるために、ハイブリッドＤＮＡあるいはハイブリッドＰＮＡの結合がより強くなる。四級化されたイミノ基を導入したインターカレータは、ＰＮＡ分析素子を用いる場合に特に有効である。リンカー部分に相当する基としては上記記載のものに限定されない。例えば、ピペラジニル基の代わりに、Ｎ−アルキル基（アルキル基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることが好ましく、メチル基、エチル基もしくはｎ−プロピル基であることが特に好ましい）を導入することも好ましい。リンカー部分に相当する基の構造の違いより、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
【００６６】
【化１０】
0004320104.tif 000011
【００６７】
縫い込み型インターカレータとして上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、そのナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、二塩基おきに配列してハイブリッドＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミド誘導体の二つのフェロセン分子が、それぞれハイブリッドＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡからの解離速度が極めて遅くなり、ハイブリッドＤＮＡとナフタレンジイミド誘導体との安定な複合体を形成することができる。また、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッドＤＮＡへの結合がインターカレーションモードであることは、一般的にハイブリッドＤＮＡにインターカレータを接触させたときに、粘度の変化が認められることにより確認される。例えば、ウイルスＳＶ４０に代表される閉環状プラスミドは、インターカレーションが起こると、超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知られている。一方、インターカレータは、一本鎖ＤＮＡ断片に対しては結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに解離して遊離のインターカレータとなる。
【００６８】
［応答電流の測定］
電流量の測定は、ハイブリッドＤＮＡが固定されている導電性基板と電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基との間を流れる電流量が測定できる方法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリックボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグラフィ、ポテンショスタット等を用いること好ましく、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを用いることが特に好ましい。カウンタ電極とハイブリッドＤＮＡが固定された導電性基板とを電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成させて、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定することが好ましい。
【００６９】
本発明の検出方法は、前述したように、ＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡ（遺伝子多型）を検出し、試料核酸断片の変異の態様を解析することを本来の目的とする一次スクリーニング法である。そこで、ＤＮＡ断片として特定の正常遺伝子断片、試料核酸断片として異常遺伝子断片を使用すれば、本発明の検出方法によって異常遺伝子断片の塩基変異の定量も可能である。例えば、正常遺伝子断片について既知の数の塩基置換を伴う塩基配列を有する異常遺伝子断片であって、置換数が互いに異なる三点以上の異常遺伝子断片をスクリーニングすることによって、塩基置換度と電流値との関係が定められるので、未知の数の塩基置換を伴う異常遺伝子断片を試料とすれば、その電流値から塩基置換度を求めることができる。その塩基置換度から遺伝子多型の予測をすることも可能である。遺伝子多型の検出は、遺伝的リスク診断の可能性を示す。例えば、原発性ＩＶ型高脂血症（高グリセリド血症）の異常遺伝子を保有する患者の染色体ＤＮＡを試料核酸断片として用いれば、その多型から、発病の有無を診断することも可能である。
【００７０】
本発明の検出方法において、電流値の変化の割合がハイブリッドＤＮＡに結合した電気化学活性縫い込み型インターカレータの量のみに依存し、導電性基板上のハイブリッドＤＮＡの形成量に依存するものではないことは、後述する実施例５で確認することができる。
【００７１】
【実施例】
〈実施例系１〉
実施例２乃至４において使用する、正常リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子のセンス鎖であるｄ（ＧＴＣＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡ）をオリゴヌクレオチド「ＷＴ＋」、そのアンチセンス鎖であるｄ（ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴ）をオリゴヌクレオチド「ＷＴ−」、正常ＬＰＬ遺伝子の４４７番目のセリン（ＴＣＡ）が終止コドン（ＴＧＡ）に変化したために異常をきたした患者の遺伝子のセンス鎖であるｄ（ＧＴＣＧＧＡＧ*ＴＧＡＡＧＡ）をオリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋」、およびそのアンチセンス鎖であるｄ（ＣＡＧＣＣＴＣ*ＡＣＴＴＣＴ）をオリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ−」と略する。但し、右上に＊印を有する塩基は、変異遺伝子が有する、正常遺伝子とは異なる塩基を意味する。
【００７２】
［実施例１］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片としてモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
面積が２ｍｍ2の金電極を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１時間浸積し、超純水で洗浄後、濃硝酸に浸し、１５分間攪拌した。この金電極を超純水で洗浄後、金電極表面に、アデニンの２０量体である試料ＤＮＡ断片のその５’末端にメルカプトヘキシル基を結合させたオリゴヌクレオチド（ＨＳ−ｄＡ20）（１０ピコモル／μＬ）の水溶液１．０μＬを点着し、２時間放置後、超純水で洗浄したｄＡ20およびＨＳ−ｄＡ20の合成については、特開平９−２８８０８０号公報およびB.A.Connolly,Nucleic Acids Res., 13, 4484(1985)の記載の方法に従って行った。点着前のＨＳ−ｄＡ20の水溶液および点着後に回収されたＨＳ−ｄＡ20の水溶液を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に付し、クロマトグラフィのピークの変化量から金電極への固定量を決定した。ＨＳ−ｄＡ20は、ほぼ定量的に金電極に修飾された。
（２）電極のマスク処理
上記（１）で得たＤＮＡ分析素子表面に、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）の水溶液１μＬを滴下し、該電極にキャップをして２時間放置した。次いで、超純水で洗浄した。
（３）試料ＤＮＡ断片の調製
下記式（ＩＩＩ）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
で表される試料ＤＮＡ断片ｄＴ9ｄＡｄＴ10は、上記公報に記載の方法に従って合成した。
（４）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成
下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミドについても、上記公報に記載の方法に従って合成した。
【００７３】
【化１１】
0004320104.tif 000012
【００７４】
（５）ＤＮＡ分析素子と試料ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション
上記（３）の試料ＤＮＡ断片ｄＴ9ｄＡｄＴ10（２０ピコモル／μＬ）の水溶液１μＬをＤＮＡ分析素子に滴下し、２０℃で３０分間放置した。
（６）電流量の測定
恒温セルを用いて、２０℃に保ち、前記（４）のフェロセン化ナフタレンジイミド（５０μＭ）を含む電解質溶液（０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合液）中に、上記（５）で得られたハイブリダイゼーション電極（作用極）、白金（対極）および銀／塩化銀参照電極を浸して三電極を形成させ、４２℃にてデファレンシャルパルスボルタモグラフィー（ＤＰＶ２）を測定した(図３の−□−）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶ１を測定した(図３の−○−)。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ２のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１のピーク電流値と比べて高い値を示し、その変化量は２２．２％であった。
【００７５】
［試料ＤＮＡ断片としてモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ｂ）］
試料ＤＮＡ断片を、下記式（ＩＶ）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
で表されるｄＴ8ｄＡ4ｄＴ8に変えた以外は、実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子と当該ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、そのＤＰＶ４を測定した（図４の−□−）。ｄＴ8ｄＡ4ｄＴ8は前記公報に記載の方法に従って合成した。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶ３を測定した（図４の−○−）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ４のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ３のピーク電流値と比べて、１５．１％変化した。
【００７６】
［試料ＤＮＡ断片としてモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ｃ）］
試料ＤＮＡ断片を、チミンの２０量体（ｄＴ20）に変えた以外は、部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ａ）と同様にして、ＤＮＡ分析素子と当該ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、そのＤＰＶ６を測定した（図５の−□−）。但し、ｄＴ20は前記公報に記載の方法に従って合成した。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶ５を測定した（図５の−○−）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ６のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ５のピーク電流値と比べて３７．３％変化した。
部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ｃ）（フルマッチ構造の検出）の電流値の変化の割合は、前記記載の検出（１Ａ）（ミスマッチ構造の検出）および（１Ｂ）（バルジ構造の検出）の電流値の変化の割合に対するコントロール値となる。
【００７７】
本実施例より、試料ＤＮＡ断片として、上記式（ＩＩＩ、（ＩＶ）で表される化合物およびｄＴ20を用いる限りにおいては、非塩基対形成部分の増加（塩基置換度の増加）に従い、電流値の変化の割合が減少することが分かる。
【００７８】
［実施例２］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（２Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
ＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオチド「ＷＴ−」の５’末端にメルカプトヘキシル基を有するＨＳ−ｄ（ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴ）（１０ピコモル）の水溶液を用いた外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製した。オリゴヌクレオチド「ＷＴ−」は、前記の公報に記載の方法に従って合成した。
（２）試料ＤＮＡ断片の調製
ＬＰＬ異常遺伝子を有する患者のモデル遺伝子として、「Ｓ４４７Ｘ＋」を前記の公報に記載の方法に従って合成した。
（３）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
上記（１）で得られたＤＮＡ分析素子、および上記（２）の試料ＤＮＡ断片を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行い、２０℃にてそのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ８）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ７）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ８のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ７のピーク電流値と比べて６．３％変化した。
【００７９】
［試料ＤＮＡ断片として、正常ＬＰＬ遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（２Ｃ）］
試料ＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオチド「ＷＴ＋」を用いる以外は、実施例４と同様にしてそのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１０）。オリゴヌクレオチド「ＷＴ＋」は、前記の公報に記載の方法に従って合成した。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ９）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１０のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ９のピーク電流値と比べて６５．４％変化した。この変化の割合が、上記記載の検出（２Ａ）のコントロール値に相当する。
【００８０】
実施例２より、二本鎖ＤＮＡ断片がミスマッチ構造を有する場合には、電流値の変化の割合がかなり減少することが分かる。
【００８１】
［実施例３］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（３Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ−」の５’末端にメルカプトヘキシル基を有するＨＳ−ｄ（ＣＡＧＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴ）（１０ピコモル／μＬ）を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製した。オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ−」は、前記の公報に記載の方法に従って合成した。
（２）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
ＤＮＡ分析素子として上記（１）のＤＮＡ分析素子、および試料ＤＮＡ断片として「ＷＴ＋」を用いる以外は実施例１と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１２）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１１）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１２のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１１のピーク電流値と比べて９．７％変化した。
【００８２】
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（３Ｃ）］
オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋」を用いた以外は上記検出（３Ａ）と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製し、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１４）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１３）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１４のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１３のピーク電流値と比べて２９．４％変化した。
この変化の割合が上記検出（３Ａ）のコントロール値である。実施例３においても、実施例１および２と同様な結果が認められた。
【００８３】
［実施例４］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ遺伝子異常の患者のＤＮＡ断片を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（４Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
オリゴヌクレオチド「ＷＴ−」（２ピコモル／μＬ）を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製した。
（２）試料ＤＮＡ断片の調製
ＬＰＬ遺伝子異常の患者の白血球（１ｍＬ）より精製した染色体ＤＮＡを用い、ＰＬＰ遺伝子部をＰＣＲ増幅（４０サイクル）して、オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋／Ｓ４４７Ｘ＋」を得た。この試料ＤＮＡ断片は、透析によって精製を行い、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
（３）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
上記（１）のＤＮＡ分析素子および上記（２）の試料ＤＮＡ断片（５ピコモル）を用いた以外は実施例１と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１６）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１５）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１６のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１５のピーク電流値と比べて１．４％減少したが、実際にはほとんど変化が認められなかった。
【００８４】
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ遺伝子異常の患者のＤＮＡ断片を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（４Ｂ）］
（１）試料ＤＮＡ断片の調製
正常ＬＰＬ遺伝子を有するヒト白血球（１ｍＬ）より精製した染色体ＤＮＡを用い、ＬＰＬ遺伝子部（「ＷＴ＋」に相当する部分）をＰＣＲ増幅（４０サイクル）して、オリゴヌクレオチド「ＷＴ＋／ＷＴ＋」を得た。試料ＤＮＡ断片として、このオリゴヌクレオチド「ＷＴ＋／ＷＴ＋」、および上記の実施例８で得られたオリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋／Ｓ４４７Ｘ＋」を１対１の割合で混合したもの（「ＷＴ＋／Ｓ４４７Ｘ＋」）を調製した。この試料ＤＮＡ断片は、透析によって精製を行い、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
（２）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
上記（１）で得られた試料ＤＮＡ断片（５ピコモル）用いた以外は実施例８と同様の操作を行い、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１８）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１７）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１８のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１７のピーク電流値と比べて１６．４％変化した。
【００８５】
［試料ＤＮＡ断片として、正常ＬＰＬ遺伝子のＤＮＡ断片を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（４Ｃ）］
試料ＤＮＡ断片として、実施例９で得られたオリゴヌクレオチド「ＷＴ＋／ＷＴ＋」（５．０ピコモル）を用いた以外は実施例３と同様の操作を行い、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ２０）。この試料ＤＮＡ断片は、予め透析によって精製を行った。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１９）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ２０のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１９のピーク電流値と比べて３８．４％変化した。
この変化の割合が、前記の検出（４Ａ）および上記の検出（４Ｂ）のコントロール値に相当する。
【００８６】
上記実施例１〜４の結果を下記第１表にまとめて示す。
【００８７】
【表１】
0004320104.tif 000013
【００８８】
実施例１〜４の結果より、ミスマッチ構造もしくはバルジ構造のような特殊ＤＮＡ構造を有する二本鎖ＤＮＡ断片は、試料ＤＮＡ断片の一例として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を使用しても充分に検出できることが確認された。また、試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ遺伝子異常の患者の実際のＤＮＡを用いても、上記の検出が可能であることが分かる。即ち、ＬＰＬ遺伝子正常体では、電流値が約３８％増加したのに対して、ＬＰＬ遺伝子異常体（ヘテロ接合体：染色体上に二つのＬＰＬ遺伝子が存在し、その一方に変異が生じているもの）では約１６％増加し、ＬＰＬ遺伝子異常体（ホモ接合体：染色体上に二つのＬＰＬ遺伝子が存在し、その両方に変異が生じているもの）では増加が認められなかった。このことは、ＬＰＬ遺伝子の多型を調べることによって、ＬＰＬ遺伝子に関わる遺伝病の遺伝子診断が可能であることを示している。
【００８９】
［実施例５］電流値の変化の割合が、二本鎖ＤＮＡ断片に結合したインターカレータの量に依存することの確認
ハイブリダイゼーションおよび電流値の測定は、同一の温度（２０℃）で実施したが、その温度を１５、２５、３５および４５℃のそれぞれに変えた以外は実施例１と同様にして、それらのＤＰＶを測定し、４５０ｍＶにおける各ピーク電流値を求めた（図６の−△−）。２０℃の場合のピーク電流値（実施例１）についても併せて示す。
【００９０】
試料ＤＮＡ断片をｄＴ8ｄＡ4ｄＴ8に変えた以外は上記と同様にして、各ピーク電流値を求めた（図６の−○−）。但し、３０℃における電流値も測定した。
【００９１】
図６より、試料ＤＮＡ断片としてｄＴ20を用いた場合には、温度が３０℃より高くなるとピーク電流値の減少が認められ、ｄＴ8ｄＡ4ｄＴ8を用いた場合には、２０℃付近よりピーク電流値の減少が認められた。ｄＡ20とｄＴ20との二本鎖ＤＮＡ断片の溶液中での融解温度は４２℃であることが知られているが、前者の結果は、この事実と良い一致を示す。前者では、形成される二本鎖ＤＮＡ断片はフルマッチ構造となることから、二本鎖構造が安定であり、３０℃付近までは、この二本鎖ＤＮＡ断片にフェロセン化ナフタレンジイミドが安定に結合するのに対し、後者では、二本鎖ＤＮＡ断片がバルジ構造をとり、フルマッチ構造よりは安定性が低下することから、該ナフタレンジイミドが安定に結合できるのは二本鎖の解離が少ない２０℃付近までであると考えられる。従って、ピーク電流値は、二本鎖ＤＮＡ断片への該ナフタレンジイミドの結合量に対応し、電極上の二本鎖ＤＮＡ断片の形成量に対応するものではないことが分かる。また、上記と同様の関係は、温度の変化に対する吸光度の変化の様子を測定した実験においても認められた（データ非表示）。よって、低温（２０℃前後）下でハイブリダイゼーションおよび電気化学測定を行う限りにおいて、二本鎖の形成量に依存した電流値の変化は認められないため、正確に二本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。
【００９２】
〈実施例系２〉
［実施例６］
［試料ＤＮＡ断片としてＤＮＡ−（Ａ）4ＧＴＡＧＡＧを用いる検出−１−］
（１）ＰＮＡ断片の合成
下記式で表されるＰＮＡ断片：ＰＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）2（Ｔ）4を、文献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society,114,1895-1897(1992)および114,9677-9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔはチミンを、Ｃはチトシンを表す。ＰＮＡ断片をＤＮＡ断片と区別するために、以下、ＰＮＡ−、ＤＮＡ−を付して示す。
【００９３】
【化１２】
0004320104.tif 000014
【００９４】
（２）ＰＮＡ分析素子の作製
表面にメルカプト基を有する面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られる、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極に、１００ピコモル／１μＬのＰＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）2（Ｔ）4の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時間放置してＰＮＡ分析素子を作製した。
（３）試料ＤＮＡ断片の調製
試料ＤＮＡ断片として、ＤＮＡ−（Ａ）4ＧＴＡＧＡＧを特開平１０−２８８０８０号公報に記載の方法に従って調製した。
（４）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
４−１  バックグラウンド値の測定
実施例１で合成したフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータ（５０μＭを含む０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液に、３８℃にて、前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子を浸漬し、１００乃至７００ｍＶの範囲で電圧を印加し、デファレンシャル・パルス・ボルタンメトリ（ＤＰＶ）を測定した。次いで、印加電圧４６０ｍＶでの応答電流値（バックグラウンド値）測定したところ、−１．３μＡであった。測定は、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳおよびスキャン速度１００ｍＶ／秒にて行った。
【００９５】
４−２  相補性ＤＮＡ断片の検出
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子の上に、前記（３）で得たＤＮＡ−（Ａ）4ＧＴＡＧＡＧ（７０ピコモル）を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液２μＬを滴下し、２５℃にて３０分間インキュベートした。次いで、インキュベート後のＰＮＡ修飾電極の表面を０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、未反応のＤＮＡ−（Ａ）4ＧＴＡＧＡＧを除去した。そして、上記のバックグラウンド値の測定と同様の操作を行って、応答電流値（ＰＮＡと試料ＤＮＡ断片との複合体の電流値）を測定したところ、−１．７μＡであった。また、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、３１％であった。
【００９６】
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子を用いる代わりに、ＤＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）2（Ｔ）4を含む水溶液を滴下して作製したＤＮＡ分析素子を用いる以外は、上記と同様にして、バックグラウンド値および応答電流値を測定したところ、それぞれ、−２．５μＡ、−３．０μＡであった。また、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、２０％であった。
【００９７】
［試料ＤＮＡ断片としてＤＮＡ−（Ａ）4（Ｇ）2ＡＧＡＧを用いる検出−２−］
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子の上に、試料ＤＮＡ断片：ＤＮＡ−（Ａ）4ＧＴＡＧＡＧの代わりに、特開平１０−２８８０８０号公報に記載の方法に従って調製した試料ＤＮＡ断片：ＤＮＡ−（Ａ）4（Ｇ）2ＡＧＡＧを用いる以外は上記（４）と同様にしてハイブリダイゼーションおよび電流量の測定を行ったところ、バックグラウンド値は、−１．３μＡ、応答電流値は、−２．７μＡ、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、１０８％であった。
【００９８】
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子を用いる代わりに、ＤＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）2（Ｔ）4を含む水溶液を滴下して作製したＤＮＡ分析素子を用いる以外は、上記と同様にして、バックグラウンド値および応答電流値を測定したところ、それぞれ、−２．５μＡ、−３．５μＡであった。また、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、４０％であった。
【００９９】
実施例６の検出−１−より、ＰＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）2（Ｔ）4とＤＮＡ−（Ａ）4ＧＴＡＧＡＧとで形成されるミスマッチ構造を有する二本鎖断片の確認が可能であり、ＰＮＡ分析素子を用いてもＤＮＡ分析素子を用いる場合（検出−２−）と同様に、部分相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。また、検出の感度については、ＰＮＡ分析素子を用いる場合にはバックグラウンド値をより低下させることができるため、ＤＮＡ分析素子を用いる場合に比べてより高くなることが分かる。
【０１００】
【発明の効果】
本発明の検出方法では、ＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリダイゼーションによって形成されたハイブリッドＤＮＡの構造に依存して、ハイブリッドＤＮＡへの電気化学活性縫い込み型インターカレータの結合量が異なることより、試料核酸断片が、ＤＮＡ断片に部分相補性を有する核酸断片であることを検出できる。ＤＮＡ断片をＰＮＡ断片に代えても、ＰＮＡ断片に部分相補性を有する核酸断片を検出することが可能である。ＰＮＡ断片は、ＤＮＡ断片に比べると試料核酸断片に対する結合力がより強いため、試料核酸断片との相補性をより厳密に認識できる。
また、本発明の検出方法は、低温下で行われる迅速かつ簡便な方法であり、正常遺伝子断片を固定した導電性基板を使用すれば、対応する異常遺伝子断片の如何なる遺伝子変異の検出にも使用することができる。従来法であるＳＳＣＰ法では、特に非塩基対形成部分がハイブリッドＤＮＡの末端部に存在する場合にはその検出が困難であったが、本発明の方法では充分に可能である。従って、本発明は、医学、生物学等での遺伝子変異の解析に有力な手法を提供できるものであり、遺伝病のリスク診断にその利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来技術であるＳＳＣＰ法を模式的に示した図である。
【図２】本発明の部分相補性ＤＮＡ断片の検出方法の代表的な模式図である。
【図３】ＨＳ−ｄＡ20とｄＴ9ｄＡｄＴ10とをハイブリダイゼーションした場合のデファレンシャルパルスボルタモグラフィおよびＨＳ−ｄＡ20のデファレンシャルパルスボルタモグラフィである。
【図４】ＨＳ−ｄＡ20とｄＴ8ｄＡ4ｄＴ8とをハイブリダイゼーションした場合のデファレンシャルパルスボルタモグラフィおよびＨＳ−ｄＡ20のデファレンシャルパルスボルタモグラフィである。
【図５】ＨＳ−ｄＡ20 とｄＴ20とをハイブリダイゼーションした場合のデファレンシャルパルスボルタモグラフィおよびＨＳ−ｄＡ20のデファレンシャルパルスボルタモグラフィである。
【図６】ＨＳ−ｄＡ20とｄＴ20とのハイブリダイゼーションおよび電気量の測定における温度の変化に対するピーク電流値の変化の様子を示したグラフ、およびＨＳ−ｄＡ20とｄＴ8ｄＡ4ｄＴ8とのハイブリダイゼーションおよび電気量の測定における温度の変化に対するピーク電流値の変化の様子を示したグラフである。
【符号の説明】
１１ａ  正常遺伝子断片
１１ｂ  異常遺伝子断片
２１ａ  一本鎖の正常遺伝子断片
２１ｂ  一本鎖の異常遺伝子断片
３１  変性処理
４１  導電性基板
５１  ＤＮＡ断片
６１  ＤＮＡ分析素子
７１ａ  ＤＮＡ断片に相補性を示す試料核酸断片
７１ｂ、７１ｃ、７１ｄ  ＤＮＡ断片と一個以上の非塩基対形成部分を形成する試料核酸断片
８１  ハイブリダイゼーション
９１ａ  フルマッチ構造のハイブリッドＤＮＡ
９１ｂ  ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡ
９１ｃ、９１ｄ  バルジ構造のハイブリッドＤＮＡ
１００  電気化学活性縫い込み型インターカレータ
１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃ、１０１ｄ  ハイブリッドＤＮＡと電気化学活性縫い込み型インターカレータとで形成される複合体
【図１】
0004320104.tif 000015
【図２】
0004320104.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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