(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも
１）ムスカリン作動性作用を示す化合物であるオキソトレモリン−Ｍ、
２）Ｃｌ−アデノシン、および
３）医薬用賦形剤
からなり、同時に、別個にまたは連続的に投与してムスカリン様作用の超相加的増強を示す、老年性痴呆の治療のための複合製剤。
【請求項２】
老年性痴呆の治療のための医薬の製造のための請求項１に記載の複合製剤の使用。
【請求項３】
請求項１に記載の老年性痴呆の治療のための複合製剤の製造方法において、
１）ムスカリン作動性作用を示す化合物であるオキソトレモリン−Ｍ、
２）Ｃｌ−アデノシン、および
３）医薬用賦形剤
を慣用方法で処理して医薬投与形態とすることからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリン作動性ニューロンの破壊およびコリン欠損を伴う神経変性疾患の結果としての痴呆〔Thogiら, Neurosci.Lett. 177 (1994) 1939-1942〕の処置のための医薬複合製剤に関する。これらの複合製剤はムスカリン受容体刺激によって誘導されるＣａ2+-依存性シグナル伝達の増強によってコリン欠損を補償する。このような増強は、協調的なアデノシン作用、すなわち細胞外アデノシン濃度を増大させる物質とムスカリン受容体アゴニストまたはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥ阻害剤）の組合せにより明瞭に達成できる。
【０００２】
【従来の技術】
これまで老人性痴呆の治療のために主として追究されてきた薬理学的戦略は、受容体における内因性アセチルコリン（ＡＣｈ）の濃度を上昇させるムスカリン作動性アゴニストもしくはＡＣｈＥ阻害剤の投与によるムスカリン受容体の活性化の維持である。コリン作動性神経系の絶えざる破壊に対し、適切な細胞機能に十分なＡＣｈレベルの上昇がＡＣｈＥの阻害によって現実に達成できるかどうかは疑問である。さらに、ＡＣｈＥ阻害剤は、特異性を欠くと同時に、かなりの副作用を発揮する。したがって、ムスカリン受容体を介する不十分なＡＣｈ濃度の作用の他の機構による増強が望ましく、これが適当な複合療法の開発の基盤となり得るものと考えられる。
【０００３】
ＡＣｈは神経細胞機能のみでなくグリア細胞（星状グリア細胞）機能にも影響することが知られている〔Messamoreら, Neuroreport, 5 (1994) 1473-1476〕。病的なグリア細胞の反応が痴呆の病態生理において重要な役割を果たしていることは明白であるから〔Akiyamaら, Brain Res. 632 (1993) 249-259〕、培養星状グリア細胞がビトロモデル系として選択された。ムスカリン受容体誘導の細胞内Ｃａ2+放出に対する作用は動的蛍光造影法を用いて検討された。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
Ｃｌ−アデノシンは、ラットの培養星状グリア細胞において、ムスカリン作動性細胞内Ｃａ2+の放出を濃度依存性様式で増強することが今回見出された（図１〜３、表１および２参照）。すなわち、１μＭのＣｌ−アデノシンの存在下においても、ＡＣｈによって誘導される細胞内Ｃａ2+の放出の約３０倍もの増強が測定された。この作用はニコチン性ＡＣｈ受容体アンタゴニストによっては阻害されないが、ムスカリン受容体アンタゴニストによれば遮断可能であった（表３）。Ｃｌ−アデノシンはまた、ムスカリン作動性アゴニストのオキソトレモリン−Ｍによって誘導される細胞内Ｃａ2+の放出も増強する（表４）。
【０００５】
Ｃｌ−アデノシンの増強作用を証明する実験の大部分（ｎ＞200）は、１００ｎＭのＡＣｈ濃度で実施されている。この低濃度ではＡＣｈそれ自体は不活性である。Ｃｌ−アデノシンそれ自体も試験した濃度範囲（３ｎＭ〜３μＭ）にわたり不活性である。１００ｎＭのＡＣｈに協調してＣａ2+シグナルを誘導するのに必要なＣｌ−アデノシン濃度を測定するための用量−作用実験においては、Ｃｌ−アデノシンのマイクロモル濃度で増強効果が認められる。閾値濃度は１μＭである。Ｃｌ−アデノシンは、その受容体親和性において内因性アデノシンに相当し〔Dalyら, LifeSci. 28 (1981) 2083-2097〕、これは生理的なナノモル濃度範囲〔Ballarinら, Acta Physiol.Scand. 142 (1991) 97-103〕から１μＭへの細胞外アデノシンレベルの上昇がムスカリン受容体における閾値下ＡＣｈ濃度を同様に十分有効にすることを意味するものである。
【０００６】
これらの実験の結果から、痴呆においてムスカリン受容体を介して誘導されるコリン作動性機能に対する有害作用は細胞外アデノシン濃度の上昇によって改善できることがわかる。後者はアデノシン吸収阻害剤たとえばプロペントフィリンの併用投与によって可能であると思われる〔Parkinsonら, Gem. Pharmacol. 25 (1994) 1053-1058〕。細胞外アデノシン濃度の薬理学的上昇はまた、望ましくない副作用の危険を低下させる低用量のＡＣｈＥ阻害剤またはムスカリン受容体アゴニストの併用療法における任意の使用を可能にするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明はしたがって、少なくとも、
１）アセチルコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物（いわゆるＡＣｈＥ阻害剤）またはムスカリン作動性作用を示す化合物、
２）内因性細胞外アデノシンのレベルを上昇させる化合物、および
３）医薬用賦形剤
からなり、神経変性疾患に同時に、別個にまたは連続的に投与してムスカリン様作用の超相加的増強を示す複合製剤に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ＡＣｈＥ阻害剤作用を有する既知の化合物は、たとえば９−アミノ−１,２,３,４−テトラヒドロアクリジン（タクリン, Cognex）および１−ベンジル−４−〔（５,６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン（Ｅ2020, Aricept）である。既知のムスカリンアゴニストはたとえばミラメリンである。
【０００９】
内因性細胞外アデノシンのレベルを上昇させる化合物は、たとえば式Ｉ
【化２】
0004374440.tif 000002
（式中、Ｒ1は、
ａ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる３〜８個の炭素原子を有するオキソアルキル、
ｂ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる１〜８個の炭素原子を有し、ヒドロキシル基は一級、二級もしくは三級アルコール官能基であるヒドロキシア  ルキル、または
ｃ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる１〜６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ2は、
ａ) 水素原子、または
ｂ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる１〜４個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ3は、
ａ) 水素原子、
ｂ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる１〜６個の炭素原子を有するアルキル、
ｃ) １〜６個の炭素原子を有し、その炭素鎖は酸素原子によって中断されているアルキル、または
ｄ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる３〜８個の炭素原子を有するオキソアルキルである）
のキサンチン誘導体および／または式Ｉの化合物の生理学的に許容しうる塩である。
【００１０】
式Ｉの化合物としては、好ましくは、
Ｒ1は、
ａ) 直鎖状もしくは分岐状の炭素鎖からなる４〜６個の炭素原子を有するオキソアルキル、または
ｂ) ３〜６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ2は、１〜４個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ3は、
ａ) １〜４個の炭素原子を有するアルキル、または
ｂ) ３〜６個の炭素原子を有するオキソアルキル
である化合物が使用される。
【００１１】
とくに好ましくは、１−（５−オキソヘキシル）−３−メチル−７−ｎ−プロピルキサンチン（プロペントフィリン）が使用される。
【００１２】
例示として、式Ｉの以下の化合物を挙げることができる。
１−（５−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキシル）−３−メチルキサンチン、
７−（エトキシメチル）−１−（５−ヒドロキシ−５−メチルヘキシル）−３−メチルキサンチン、
１−（５−オキソヘキシル）−３,７−ジメチルキサンチン
７−（２−オキソプロピル）−１,３−ジ−ｎ−ブチルキサンチン、または
１−ヘキシル−３,７−ジメチルキサンチン。
【００１３】
式Ｉのキサンチン誘導体の適当な生理学的に許容しうる塩は、たとえばアルカリ金属、アルカリ土類金属または生理学的に許容しうる有機アンモニウム塩基の塩を含むアンモニウム塩である。
【００１４】
式Ｉの化合物は、既知の方法（米国特許第4,289,776号、米国特許第4,833,146号、米国特許第3,737,433）で標準条件下に製造される。
これらの反応の出発物質は既知であるかまたは文献により既知の方法で容易に製造できる。「超相加的」の語は個々の作用の総和よりも大きな作用を意味するものと理解すべきである。
好ましい複合製剤は、プロペントフィリンおよび１−ベンジル−４−〔（５,６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジンを含有する。
【００１５】
本発明の複合製剤は、たとえば痴呆とくに老年性痴呆の処置に適している。
本発明の複合製剤は、その構成成分が並べて配置されており、したがって同一のヒトまたは動物の生体に同時に、別個にまたは連続的に投与できる組み合せのパックまたは組成物も包含する。
【００１６】
本発明はさらに、
１）アセチルコリンエステラーゼ阻害作用を有するかまたはムスカリン作動性作用を示す化合物、
２）内因性細胞外アデノシンのレベルを上昇させる化合物、および
３）医薬用賦形剤
を慣用方法で処理して医薬投与形態とすることからなる複合製剤の製造方法に関する。
【００１７】
本発明の複合製剤は、カプセル（一般に医薬用賦形剤を含まないマイクロカプセルを包含する）、錠剤（コートされた錠剤および丸剤を包含する）または坐剤のような医薬剤形の形態の用量単位として提供することが可能で、カプセルを用いる場合にはカプセル材料が賦形剤の機能を果たすとみなされ、内容物はたとえば粉末、ゲル、エマルジョン、分散液または溶液として提供できる。しかしながら、計算量の活性化合物をそれぞれ所望の医薬用賦形剤とともに含有する２種の活性化合物成分１)および２)による経口処方の調製がとくに有利かつ簡単である。経直腸治療に適当な処方（坐剤）も使用できる。同様に軟膏もしくはクリームの形態における経皮適用あるいは本発明の配合物を含有する溶液の注射（腹腔内、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内）もしくは輸液の非経口投与または経口投与も可能である。活性化合物に加え、軟膏、ペースト、クリームおよび散剤には慣用の賦形剤たとえば動物および植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、タルク、酸化亜鉛、ラクトース、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含有させることができる。
【００１８】
錠剤、丸剤または顆粒剤の本体は、たとえば、圧縮、浸漬もしくは流動床法またはパンコーティングのような慣用方法により調製することが可能であり、賦形剤および他の慣用の補助剤たとえばゼラチン、アガロース、デンプン（たとえば馬鈴薯、トモロコシまたは小麦デンプン）、セルロースたとえばエチルセルロース、シリカ、各種糖類たとえばラクトース、炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウムを含有させることができる。コーティング溶液は、通常、糖および／またはデンプンシロップから構成され、多くの場合、さらにゼラチン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、合成セルロースエステル、界面活性剤、可塑剤、色素および先行技術に相当する類似の添加物を含有させる。医薬剤形の製造には、任意の慣用の流動性調節剤、滑沢剤もしくはグライダントたとえばステアリン酸マグネシウムおよび放出剤を使用することができる。
【００１９】
製剤は、好ましくはコーティング／核錠または多層錠の形態とし、活性成分２はコーティング層もしくは核錠中または１つの層内に、一方、活性成分１は核錠中もしくはコーティング層または他の層内に含有させる。活性化合物成分はまた遅延放出型に調製するかもしくは放出遅延材料に吸着させるか、または放出遅延材料（たとえば、セルロースまたはポリスチレン樹脂たとえばヒドロキシエチルセルロースベースの材料）中に包含させることができる。活性化合物の遅延放出はまた、慣用の腸溶性コーティングによる層またはコンパートメントを提供することによっても達成できる。
【００２０】
使用される用量はもちろん、様々なファクターたとえば処置される生体（すなわちヒトまたは動物）、年齢、体重、健康の一般状態、症状の重篤度、処置される疾患、考えられる併発疾患（あれば）、他の医薬との併用処置の本質、または処置の頻度に依存する。用量は一般的に１日に数回、好ましくは１日あたり１〜３回投与される。使用される個々の活性化合物の量はそれぞれの個々の活性化合物の推奨される１日用量をベースとして、複合製剤中では推奨される１日用量の１０〜１００％、好ましくは２０〜８０％、とくに好ましくは５０％とされる。本発明の複合製剤による適当な治療はたとえば、
１）プロペントフィリン１００mg〜６００mg、好ましくは２００mg〜４００mg、とくに好ましくはプロペントフィリン３００mg、および
２）１−ベンジル−４−〔（５,６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン２mg〜２０mg、好ましくは５mg〜１０mg
から構成される本発明の複合製剤の個々の用量の投与から構成され、この場合の量はもちろん個別の用量の回数および処置すべき疾患には依存し、個々の用量は数回の同時に投与される用量単位から構成させることができる。
【００２１】
【実施例】
薬理学的実施例
培養星状グリア細胞
培養大脳皮質星状グリア細胞は、雌親からエーテル麻酔下に屠殺して採取した１９〜２０日齢 Wistar ラットの胚の大脳皮質に由来する。脳の調製後、皮質組織をピペットで吸引し、１５％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に取る。レンズ組織を通してろ過したのち、細胞懸濁液をガラススライド（ポリエチレンイミンでコーティング）に移植し、インキュベーター内で標準条件下に培養ボトル中で培養し、１週に２回培地を交換する。約７日後に、細胞を収穫し、トリプシン処理（神経細胞を除去するため）後、５×１０4細胞／cm2の濃度で再移植し、さらに６〜８日培養したのち実験を開始する。これらの培養体は９５％以上が星状グリア細胞からなり、星状グリア細胞標識ＧＦＡＰ（酸性グリア原線維タンパク質）に対する免疫反応陽性であった。
【００２２】
細胞内Ｃａ2+濃度およびその実験的影響の測定のための蛍光造影実験
実験開始時（再移植後６〜８日）に、培養星状グリア細胞にＣａ2+蛍光標識を負荷し、ＢＨＫＲ（重炭酸塩化ＨＥＰＥＳ緩衝クレブス−リンゲル溶液）中、３７℃で１時間、５μＭフラ−２−アセトキシメチルエステル（Molecular Probes）とインキュベートして特異化した。負荷後、培養星状グリア細胞を含有するガラススライドを測定チャンバー内に移し、蛍光造影測定ステーションに付属する倒立蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert 100, Zeiss Fluar 40×対物レンズ）に装着した。ここでチャンバーに、実験期間中（通常20〜30分）温度を制御した（37℃）ＢＨＫＲを流速600μl／分で絶えず灌流した。測定は Fucal 蛍光造影システム（T.I.L.L.Photonics GmbH, Planegg）を用いて実施し、３４０および３８０nmでの２励起波長による励起後に４２０nmの波長以上の発光蛍光をＣＣＤカメラ（CS 90, Theta System, Grobenzell）を用いて測定し、相当するＣａ2+濃度を計算した。測定は１２秒間隔で、各場合、灌流培地への各種試験物質の添加前、添加中および添加後に実施した。細胞内Ｃａ2+濃度の変化は、各場合、適切に確認された様々の測定ウインドウ内の特定された個々の細胞レベルで測定された。
【００２３】
様々な試験物質（Ｃｌ−アデノシンの存在下または不存在下におけるアセチルコリンまたはオキソトレモリン）は、通常灌流メジウムに１分間の期間添加した。誘導された細胞内Ｃａ2+の上昇は一過性であったので、結果の表および曲線に示した細胞内Ｃａ2+濃度の変化は各場合に測定されたピーク値をベースとした。
【００２４】
【表１】
0004374440.tif 000003
【００２５】
表１は、星状グリア細胞内でＡＣｈによって誘導される細胞内Ｃａ2+濃度の上昇の用量-作用曲線が１μＭのＣｌ−アデノシンの同時作用によりかなり左側にシフトすることを示している。この場合、等しく大きいＣａ2+シグナルを生成させるためには、ＡＣｈレベルは１００ｎＭでありさえすればよい。協同的アデノシン作用の不存在下には３０倍高いＡＣｈ濃度（３μＭ以上）が必要になる。この協同的作用に必要な臨界的アデノシンの増大はアデノシン吸収遮断剤のロペントフィリンでの治療によって薬理学的に達成される範囲内である。
【００２６】
【表２】
0004374440.tif 000004
【００２７】
表２は、１００ｎＭ ＡＣｈの存在下、Ｃａ2+の移動に必要なＣｌ−アデノシン濃度を示す。
【００２８】
【表３】
0004374440.tif 000005
【００２９】
アンタゴニスト不存在下に１００ｎＭアセチルコリンおよび１μＭ Ｃｌ−アデノシンにより達成された細胞内Ｃａ2+上昇％（対照値＝100％）の平均値±ＳＥＭ。対照値として、９８.４±６.４ｎＭの細胞内Ｃａ2+上昇が測定された（ｎ＝125）。
表３は、Ｃｌ−アデノシンによって増強されるＡＣｈ作用はムスカリン性受容体を介して誘導される代表的なＡＣｈ作用であり、これはムスカリン性受容体遮断剤によって拮抗されるが、ニコチン性受容体遮断剤によっては拮抗されないことを示している。
【００３０】
【表４】
0004374440.tif 000006
【００３１】
表４はＣｌ−アデノシンがスカリン受容体アゴニストによって誘導されるＣａ2+シグナルも増強することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に記載の蛍光造影実験の結果を示す。単独で適用された１００ｎＭ ＡＣｈおよび１μＭ Ｃｌ−アデノシンは不活性である。それらの組合せは培養星状グリア細胞内における細胞内Ｃａ2+の劇的な上昇を招来する。Ｃａ2+を含まない培地内で実施された同じ実験では、ＡＣｈとＣｌ−アデノシンが一緒に適用される場合、培養星状グリア細胞内において低いがなお著しい細胞内Ｃａ2+の上昇が示される。
【図２】実施例に記載の蛍光造影実験を示す。星状グリア細胞中ＡＣｈによって誘導される細胞内Ｃａ2+の上昇の用量-作用曲線は、１μＭのＣｌ−アデノシンの同時作用においてかなり左にシフトする。この場合等しく大きいＣａ2+シグナルを生成させるには、ＡＣｈレベルは１００ｎＭでありさえすればよい。強調的アデノシン作用の不存在下には３０倍高いＡＣｈ濃度（３μＭ以上）が必要になる。
【図３】実施例に記載の蛍光造影実験の結果を示す。１００ｎＭ ＡＣｈの存在下にＣａ2+の移動に必要なＣｌ−アデノシン濃度が測定される。
【図１】
0004374440.tif 000007
【図２】
0004374440.tif 000008
【図３】
0004374440.tif 000009