(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法であって、以下：
（ｉ）該キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインポリペプチドを選択する工程であって、ここで該ドメインの各々がＣ２Ｈ２ジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで該第１のドメインが第１の標的部位に結合し、そして該第２のドメインが第２の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程； ならびに
（ｉｉ）アミノ酸配列「ＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号１４）」又は「ＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１５）」の何れかからなるリンカーと、該第１のドメインおよび該第２のドメインとを融合する工程であって、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する行程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記近接した標的部位が１個のヌクレオチドにより分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記近接した標的部位が２個のヌクレオチドにより分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーのポリペプチドがＺｉｆ２６８およびＮＲＥからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対して２〜４フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインのポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質であって、該キメラジンクフィンガータンパク質が、以下：
（ｉ）該キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドであって、ここで該ドメインの各々がＣ２Ｈ２ジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで該第１のドメインが第１の標的部位に結合し、該第２のドメインが第２の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチド；ならびに
（ｉｉ）アミノ酸配列「ＲＱＫＤＧＥＲＰ」又は「ＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ」の何れかからなるリンカーと；
を含み、
ここで該第１のドメインおよび該第２のドメインが該リンカーと融合される、タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーのポリペプチドがＺｉｆ２６８およびＮＲＥからなる群から選択される、請求項９に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
【請求項１１】
前記Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求項９に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
【請求項１２】
前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項９に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
【請求項１３】
前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対して２〜４フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項１２に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
【請求項１４】
前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインのポリペプチドをさらに含む、請求項９に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、ＵＳＳＮ  ６０／０７６，４５４（１９９８年、３月２日出願、本明細書中においてその全体が参考として援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府に援助された研究および開発の下でなされた発明に関する陳述）
本明細書中に記載された研究は、それぞれ、国立衛生研究所、国立科学基金および国立癌研究所からの助成金ＰＯ１−ＣＡ４２０６３、ＣＤＲ−８８０３０１４およびＰ３０−ＣＡ１４０５１によって援助された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。本明細書中に記載される研究はまた、ハワードヒューズ医療研究所により援助された。
【０００３】
（発明の背景）
Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2ファミリーに属するジンクフィンガーは、真核生物に見出される最も一般的なＤＮＡ結合モチーフのうちの１つを構成し、そしてこれらのジンクフィンガーは、新規な配列特異性を有するＤＮＡ結合タンパク質の設計および選択について非常に魅力的な枠組みを提供した。多数の研究は、ジンクフィンガー−ＤＮＡ相互作用の特異性を探索し、そして系統的に変更するためにファージディスプレイ法または設計アイデアを使用した（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１０１〜１０４（１９９２）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２２５６〜２２６０（１９９３）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１〜６７３（１９９４）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９〜５６９５（１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１６３〜１１１６７（１９９４）；Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３４４〜３４８（１９９５）；ならびにＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７〜６６１（１９９７））。
【０００４】
構造に基づくコンピュータ設計を使用し、Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンクフィンガーと他のＤＮＡ結合ドメイン（他のジンクフィンガータンパク質を含む）とを連結し、伸長した部位を認識するハイブリッドタンパク質を生成した（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３〜９６（１９９５）；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３６１６〜３６２０（１９９７））。例えば、ジンクフィンガータンパク質をＧＡＬ４二量体化ドメインに連結し、新規なホモ二量体およびヘテロ二量体を開発しており（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：９６５〜９７０（１９９７））、そしてヌクレアーゼドメインに連結し、新規な制限酵素を生成している（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６〜１１６０（１９９６））。ジンクフィンガー／ホメオドメイン融合は、遺伝子治療における潜在的な適用について試験されている（Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１０２８〜１０３２（１９９６））。
【０００５】
３つのフィンガータンパク質にさらなるフィンガーを加えることによって（Ｒｅｂａｒ、（Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ）、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ−ＮＡ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）；Ｓｈｉ，Ｙ．（Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５））、または３つのフィンガーのタンパク質を２個タンデムに連結することによって（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５５２５〜５５３０（１９９７））、ジンクフィンガータンパク質のアフィニティーおよび特異性を増大させるいくつかの試みもまた存在する。しかし、ポリフィンガータンパク質についてのこれらの以前の設計戦略は全て、さらなるフィンガーを接続するための規範的な「ＴＧＥＫＰ」リンカー（アミノ酸配列トレオニン−グリシン−グルタミン酸−リジン−プロリン（配列番号１３）を有するリンカー）を使用し、アフィニティーにおいて比較的に適度な増大を生じた。従って、キメラジンクフィンガータンパク質に対して増強したアフィニティーおよび特異性を提供するリンカーを開発する必要性が存在する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は従って、可撓性リンカーを選択し、そしてアフィニティーおよび特異性の増強したキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために、構造に基づく設計を使用する方法を提供する。本発明はまた、アフィニティーおよび特異性の増強したキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために、５個以上のアミノ酸長の可撓性リンカーを有するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法を提供する。これらの方法を使用して作製されたジンクフィンガータンパク質は、フェムトモル濃度の範囲の結合アフィニティーを有し、そして例えば、単一の標的部位で高レベル（約７０倍を超える）の転写抑制を提供する。このようなジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現の調節（例えば、治療剤、診断剤として）および研究での適用（例えば、機能性ゲノム学）のために使用され得る。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：（ｉ）キメラジンクフィンガータンパク質の第１および第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドを選択する工程、ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第１のドメインが第１の標的部位に結合し、そして第２のドメインが第２の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程；（ｉｉ）第１および第２のドメインが第１の標的部位および第２の標的部位に個々に結合される場合、第１のドメインと第２のドメインとの間の物理的分離を決定するために、構造に基づく設計を使用する工程；（ｉｉｉ）第１のドメインと第２のドメインとの間の物理的分離よりも少なくとも１〜２Å長い可撓性リンカーを選択する工程；ならびに（ｉｖ）第１のドメインおよび第２のドメインと可撓性リンカーとを融合し、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する工程。
【０００８】
別の局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：（ｉ）キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドを選択する工程であって、ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで第１のドメインが第１の標的部位に結合し、そして第２のドメインが第２の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程；（ｉｉ）５個以上のアミノ酸長である可撓性リンカーを選択する工程；ならびに（ｉｖ）第１のドメインおよび第２のドメインと可撓性リンカーとを融合し、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する工程。
【０００９】
別の局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を提供し、このキメラジンクフィンガータンパク質は、以下を含む：（ｉ）キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドであって、ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第１のドメインが第１の標的部位に結合し、そして第２のドメインが第２の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチド；ならびに（ｉｉ）第１のドメインおよび第２のドメインが第１の標的部位および第２の標的部位に個々に結合される場合に、構造に基づくモデリングにより決定されるように、第１のドメインと第２のドメインとの間の物理的分離よりも少なくとも１〜２Å長い可撓性リンカー；ここで第１のドメインおよび第２のドメインは可撓性リンカーに融合される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を提供し、ここでキメラジンクフィンガータンパク質は、以下を含む：（ｉ）キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドであって、これらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第１のドメインが第１の標的部位に結合し、そして第２のドメインが第２の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質の第１のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドおよび第２のＤＮＡ結合ドメインのポリペプチド；ならびに（ｉｉ）５個以上のアミノ酸長である可撓性リンカー；ここで第１のドメインおよび第２のドメインは可撓性リンカーに融合される。
【００１１】
１つの実施態様において、本発明は、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を提供する。
【００１２】
１つの実施態様において、第１のドメインおよび第２のドメインは、ジンクフィンガーのポリペプチドである。別の実施態様において、このジンクフィンガーのポリペプチドは、Ｚｉｆ２６８およびＮＲＥからなる群から選択される。別の実施態様において、このジンクフィンガーのポリペプチドは、異種である。１つの実施態様において、第１のドメインは、ジンクフィンガーのポリペプチドであり、そして第２のドメインが異種ＤＮＡ結合ドメインのポリペプチドを含む。別の実施態様において、このキメラジンクフィンガータンパク質はさらに、調節ドメインのポリペプチドを含む。
【００１３】
１つの実施態様において、キメラジンクフィンガータンパク質は、近接した標的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する。別の実施態様において、このキメラジンクフィンガータンパク質は、近接した標的部位に対して約２〜４フェムトモル濃度のアフィニティーを有する。
【００１４】
１つの実施態様において、可撓性リンカーは、５個、８個、または１１個のアミノ酸長である。別の実施態様において、この可撓性リンカーは、配列ＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号１４）またはＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１５）を有する。
【００１５】
１つの実施態様において、標的部位は、１個または２個のヌクレオチドにより分離される。
【００１６】
１つの実施態様において、近接した標的部位は、０個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、５個または６個のアミノ酸長である。別の実施態様において、近接した標的部位は、１個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、７個、８個、または９個のアミノ酸長である。別の実施態様において、近接した標的部位は、２個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、１０個、１１個、または１２個のアミノ酸長である。別の実施態様において、近接した標的部位は、３個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、１２個以上のアミノ酸長である。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．緒言）
本発明は、キメラジンクフィンガータンパク質の２つのＤＮＡ結合ドメインを融合させるリンカーについての設計ストラテジーを提供する。これらのリンカーは、可撓性であり、そして以前に使用された正統なリンカーより長く、いかなる緊張も導入することなく、その標的部位へのキメラジンクフィンガータンパク質の結合を可能にする。その標的部位は、代表的には、「複合性の」標的部位であり、０〜５以上のヌクレオチドによって隔てられる２つの近接した標的部位からなる。各々の近接した標的部位は、キメラジンクフィンガータンパク質の１つのＤＮＡ結合ドメインによって認識される。このリンカー設計ストラテジーは、２つのＤＮＡ結合ドメインの間のリンカーについての最小の長さを決定するための構造に基づく設計を包含し、次いで、リンカーに対する可撓性のさらなる少なくとも約１〜２オングストロームを提供するために、リンカーにさらなるアミノ酸を付加する。本発明は、従って、それらの標的部位についてフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、キメラジンクフィンガータンパク質を提供し、これは、効率よく遺伝子発現を抑制する（例えば、単一の部位に標的化された場合、遺伝子発現は約７０分の１より低くなる）。
【００１８】
構造的および生化学的分析は、ジンクフィンガーペプチドに結合された場合、ＤＮＡがしばしばわずかにほどけていることを示す（ＰａｖｌｅｔｉｃｈおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８０９−８１７（１９９ｌ）；ＳｈｉおよびＢｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：３８４５−３８４８（１９９６）；ＮｅｋｌｕｄｏｖａおよびＰａｂｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６９４８−６９５２（１９９４））。モデリング研究は、理想的なＢ  ＤＮＡ上では正統なリンカーは、Ｚｉｆ２６８の好ましいドッキングを可能にするにはやや短すぎること（Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１１７１−１１８０（１９９６））；ＤＮＡは、Ｚｉｆ２６８複合体中で見られる様式においてジンクフィンガーと相互作用するためにわずかにほどけていなくてはならないことを示した。本質的には、ジンクフィンガーのらせんの周期性は、Ｂ−ＤＮＡのらせんの周期性とは完全には一致しないようである。より多くフィンガーが存在する（ペプチドおよびＤＮＡのらせんの周期性が、段階的にさらに相からはずれ得る）場合、ほどけた緊張はより重要な問題となり得るので、より長い、より可撓性のリンカーが、ポリフィンガータンパク質の設計において試験された（ＫｉｍおよびＰａｂｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：２８１２−２８１７（１９９８）を参照のこと、これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００１９】
本発明は、５アミノ酸以上のリンカーが、増強されたアフィニティーを有するキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために使用され得ることを実証する。例えば、８アミノ酸のリンカーは、１つの塩基対によって隔てられている近接した標的部位を認識するキメラジンクフィンガータンパク質のために使用された。１１アミノ酸のリンカーは、２つの塩基対によって隔てられている近接した標的部位を認識するキメラジンクフィンガータンパク質のために使用された。本発明のリンカーはまた、構造に基づくモデリングを用いて設計され得る。構造に基づくモデリングにおいては、各々のＤＮＡ結合ドメインポリペプチドの、そのＤＮＡ標的部位への結合を示すモデルが作製される。次いで、そのモデルは、ドメインが近接した標的部位に結合する場合に、そのドメインの物理的分離を決定するために使用される。ドメイン間の物理的分離は、リンカーまたはＤＮＡ結合ドメインに対する立体障害なしで、第１のドメインのＣ−末端アミノ酸を第２のドメインのＮ−末端アミノ酸と接続するために使用されるリンカーの最小限の長さを決定するために使用される。次いで、キメラジンクフィンガーに緊張を導入することを避ける、わずかに長い可撓性リンカーを作製するために、この長さは１〜２Å増加される。
【００２０】
コンピュータープログラムが、しばしば構造に基づくモデリングのために使用されるが、このモデルはまた、物理的にも作製され得る。構造に基づくモデリングのために使用されるコンピュータープログラムの例は、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｌＩ  （Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＳａｎＤｉｅｇｏ）およびＱｕａｎｔａ  ４．０  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を含む。これらのプログラムは、タンパク質についての適切な座標を提供する、ＤＮＡ結合タンパク質のＸ線結晶解析由来の情報をしばしば使用する。この情報はまた、公的に利用可能なデータベース（例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）から得られ得る。この情報はまた、その結晶構造が未知であるＤＮＡ結合タンパク質についての距離および座標を外挿するために使用され得る。Ｂ  ＤＮＡのモデルは、当該分野で周知である。関係のある座標（例えば、距離およびサイズ）は、製造者の指示書およびデフォルトのパラメーターを用いて、えり抜きのコンピューターモデリングプログラムとともに使用される。あるいは、カスタマイズされたパラメーターが使用され得る。構造に基づくモデリングは、例えば、ＫｉｍおよびＰａｂｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：２８１２−２８１７（１９９８）；ＰａｖｌｅｔｉｃｈおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８０９−８１７（１９９１）；Ｒｅｂａｒ、博士論文（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）（１９９７）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’Ｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５５２５−５５３０（１９９７）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３−９６（１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９７５２−９７５６（１９９５）；Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１９０−１９５（１９９８）；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３６１６−３６２０（１９９７）；ならびにＰｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：９６５−９７０（１９９７）において記載されるように行われ得、これらは、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される。２つの基本的な規準が、ＤＮＡ結合ドメインのどのアラインメントがＤＮＡを結合するキメラタンパク質における組み合わせのために潜在能力を有するかを示唆する：（１）ドメイン間の衝突の欠如、および（２）ドメインのカルボキシル末端領域およびアミノ末端領域の矛盾しない位置付け、すなわちドメインが方向付けられて、その結果１つのポリペプチドのカルボキシル末端領域が次のポリペプチドのアミノ末端領域に結合され得る。
【００２１】
２つのＤＮＡ結合ドメインを連結するために使用されるリンカーは、ＤＮＡ結合ドメインのそれらの各々の標的部位との相互作用を実質的に妨害しない任意のアミノ酸配列を含み得る。本発明のリンカーのための好ましいアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、バリン、およびスレオニンを含むがこれらに限定されない。一旦アミノ酸配列の長さが選択されたならば、リンカーの配列は、例えば、ファージディスプレイライブラリー技術（例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照のこと）によって、または、スカフォールド（例えば、ＧＴＧＱＫＰ（配列番号１９）およびＧＥＫＰ（配列番号２０）、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと；Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７−１０５（１９９１）もまた参照のこと）のような天然に存在するかもしくは合成のリンカー配列を使用することによって選択され得る。代表的には、本発明のリンカーは、リンカーアミノ酸配列を介して融合された、リンカーおよびＤＮＡ結合ドメインをコードする組換え核酸を作製することによって作製される。必要に応じて、リンカーはまた、ペプチド合成を用いて作製され得、次いで、ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインに結合する。
【００２２】
本発明のキメラジンクフィンガータンパク質は、２つ以上のＤＮＡ結合ドメインからなり、ここで少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーポリペプチドである。第２のＤＮＡ結合ドメインは、同一のドメインか、または異種のドメインのいずれかであるジンクフィンガー結合ドメインであり得る。適切なジンクフィンガータンパク質は、Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2ファミリー、例えば、ＳＰ−１、ＳＰ−１Ｃ、ＺＩＦ２６８、ＮＲＥ、Ｔｒａｍｔｒａｃｋ、ＧＬＩ、ＹＹｌ、またはＴＦＩＩＩＡ由来の任意のタンパク質を含む（例えば、Ｊａｃｏｂｓ、ＥＭＢＯ．Ｊ．１１：４５０７（１９９２）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）；Ｃｈｒｉｓｔｙら、ＰＮＡＳ  ８５：７８５７−７８６１（ｌ９８８）；ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７−６６１（１９９７）；Ｆａｉｒａｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４８３（１９９３）；Ｐａｖｅｌｔｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１７０１（１９９３）を参照のこと）。
【００２３】
第２のＤＮＡ結合ドメインはまた、例えば、制限酵素；核ホルモンレセプター；ホメオドメインタンパク質またはヘリックスターンヘリックスモチーフタンパク質（例えば、ＭＡＴ  １、ＭＡＴ  ２、ＭＡＴ  ａ１、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｐａｉｒｅｄ、Ｆｕｓｈｉ  ｔａｒａｚｕ、ＨＯＸ、Ｕｎｃ８６、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ２、Ｐｉｔ、λリプレッサー、およびｔｅｔリプレッサー）；Ｇａｌ  ４；ＴＡＴＡ結合タンパク質；ヘリックスループヘリックスモチーフタンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｍｙｏ  Ｄ、Ｄａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓ、Ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ（Ｔ３）、Ｅｌ２およびＥ４７）；ロイシンジッパー型タンパク質（例えば、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−Ｆｏｓ／ｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＢ）；ならびにβシートモチーフタンパク質（例えば、ｍｅｔ、ａｒｃ、およびｍｎｔリプレッサー）に由来する異種ＤＮＡ結合ドメインであり得る。別の実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、以下に記載のように、少なくとも１つ以上の調節ドメインに結合される。好ましい調節ドメインは、転写因子リプレッサードメインまたは転写因子アクチベータードメイン（例えば、ＫＲＡＢおよびＶＰ１６、コリプレッサードメインおよびコアクチベータードメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびＦｏｋ１のようなエンドヌクレアーゼ）を含む。ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい（または改変されていてもよい）。
【００２４】
キメラジンクフィンガータンパク質の発現はまた、ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系によって代表される系によって制御され得る（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、ＰＮＡＳ  ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９ｌ−４９６（ｌ９９８）；  Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（ｌ９９８）を参照のこと）。これらは、キメラジンクフィンガータンパク質の発現における低分子制御に影響し、従って、目的の標的遺伝子における低分子制御に影響する。この利点となる特徴は、細胞培養モデルにおいて、遺伝子治療において、そしてトランスジェニック動物および植物において使用され得る。
【００２５】
キメラＤＮＡ結合タンパク質の結合特異性は、これらのタンパク質を特に有用にする。なぜなら、これらのタンパク質は、公知のタンパク質の特性と異なったＤＮＡ結合特性を有するからである。このキメラタンパク質は、近接した標的部位を結合することを好み、従って、近接した標的部位を有する遺伝子の発現を調節するために使用され得る。これらのキメラジンクフィンガータンパク質は、フェムトモル濃度範囲、例えば、１００フェムトモル、１０フェムトモル以下で、いくつかの場合には２〜４フェムトモルまで低く、およびいくつかの場合には１フェムトモル濃度以下で、近接した標的部位に対してアフィニティーを有する。
【００２６】
本発明の方法を使用して作製されるジンクフィンガータンパク質は、治療的、診断的、ならびに細胞または動物モデル、および機能的遺伝学におけるような研究的適用を含む、多数の適用を有する。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現を調節するために使用され得、これは新規のヒトおよび哺乳動物の治療的適用（例えば、遺伝疾患、癌、真菌感染、原生動物感染、細菌感染、およびウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫障害などの処置）を可能にし、ならびに改変された表現型（疾患耐性、果実成熟、糖および脂質組成、収量、ならびに色を含む）を有する植物を発生させる手段を提供する。さらに、本発明のジンクフィンガータンパク質は、診断アッセイのために、そして機能的遺伝学アッセイのために使用され得る。
【００２７】
本明細書中に記載されるように、ジンクフィンガータンパク質は、本明細書中に記載される使用（例えば、真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子、細胞遺伝子、ウイルス遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ならびに細菌遺伝子）のいずれかのために、任意の適切な標的部位を認識するように設計され得る。一般的に、調節される適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促進因子、走化因子、癌活性化因子、レセプター、カリウムチャネル、Ｇタンパク質、シグナル伝達分子、および他の疾患関連遺伝子を含む。
【００２８】
転写因子機能における一般的なテーマは、プロモーターへの単純な結合および十分な近接さが、一般的に必要とされているすべてであるということである。プロモーターに対する正確な位置付け、方向、および限度内での距離は、大した問題ではない。この特徴は、ジンクフィンガータンパク質を構築するための部位の選択における顕著な可撓性を可能にする。従って、ジンクフィンガータンパク質によって認識される標的部位は、標的遺伝子中の任意の適切な部位であり得、この標的遺伝子は、ジンクフィンガータンパク質（必要に応じて調節ドメインに連結されている）による遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする。
【００２９】
好ましい標的部位は、転写開始部位に近接するか、その下流にあるか、またはその上流にある領域を含む。さらに、標的部位は、エンハンサー領域、リプレッサー部位、ＲＮＡポリメラーゼ停止部位、および特異的調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素症応答エレメント、核レセプター認識エレメント、ｐ５３結合部位）、ｃＤＮＡコード領域中または発現配列タグ（ＥＳＴ）コード領域中の部位に位置する。以下に記載されるように、代表的には、各々のフィンガーは２〜４塩基対を認識し、２フィンガーのジンクフィンガータンパク質は４〜７塩基対の標的部位に結合し、３フィンガーのジンクフィンガータンパク質は６〜１０塩基対部位に結合し、そして６フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、２つの近接した標的部位（各々の標的部位は６〜１０塩基対を有する）に結合する。
【００３０】
本発明のキメラジンクフィンガータンパク質を、単純なアッセイを使用してインビボで活性について試験し得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４））。インビボアッセイは、キメラジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミドを使用し、これは、キメラジンクフィンガータンパク質の標的部位を有する試験遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子を含むレポータープラスミドとともに同時発現される。これらの２つのプラスミドが、宿主細胞に一緒に導入される。細胞の第２の群は、コントロール群として働き、そして転写因子をコードするプラスミドおよび転写因子の結合部位を有さないレポーター遺伝子を含むプラスミドを受け取る。
【００３１】
レポーター遺伝子転写物の産生または関係するタンパク質の活性の量が測定される；レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ合成、または関係するタンパク質の活性の量がコントロール遺伝子のそれよりも大きかった場合、転写因子は転写の正のレギュレーターである。レポーター遺伝子ｍＲＮＡ合成、または関係するタンパク質の活性の量がコントロールのそれよりも小さかった場合、転写因子は転写の負のレギュレーターである。
【００３２】
必要に応じて、アッセイはトランスフェクション効率制御プラスミドを含み得る。このプラスミドは、レポーター遺伝子と独立した遺伝子産物を発現し、そしてこの遺伝子産物の量は、細胞が取り込んでいるプラスミドの数、および細胞に導入されたＤＮＡの効率を大ざっぱに示す。キメラジンクフィンガータンパク質はまた、当業者に公知の方法を用いて、インビボで内在性の遺伝子の調節のために試験され得る。
【００３３】
１つの実施態様において、本発明は、３フィンガーのＺｉｆ２６８ペプチドが、核ホルモン応答性エレメントを特異的に認識する（ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７（１９９７））、設計された３フィンガーのペプチド（「ＮＲＥ」と呼ばれる）に連結された融合物を提供する。ゲルシフトアッセイは、この６フィンガーのペプチド２６８／／ＮＲＥが、フェムトモル濃度範囲の解離定数で複合性の１８塩基対ＤＮＡ部位に結合することを示す。この融合タンパク質において使用されるわずかに長いリンカーは、ＤＮＡ結合アフィニティーにおいて劇的な改善を提供し、以前の研究で使用されてきた正統な「ＴＧＥＫＰ」リンカー（配列番号１３）よりもずっと良好に働く。組織培養トランスフェクション実験はまた、２６８／／ＮＲＥペプチドが、転写開始部位に密接する結合部位に標的化される場合に、７２倍の抑制をもたらす非常に効果的なリプレッサーであることを示す。このストラテジーを使用することおよびファージディスプレイを介して選択されるペプチドを連結することは、生物学的適用および遺伝子治療における使用のための、尋常でないアフィニティーおよび特異性を有する新規なＤＮＡ結合タンパク質の設計を可能にする。
【００３４】
新しい６フィンガーペプチドは、３フィンガーモジュールの２つを結合させるため、または３フィンガータンパク質にさらなるフィンガーを添加するために、従来の「ＴＧＥＫＰ」リンカー（配列番号１３）を使用する、以前に報告されたポリフィンガータンパク質よりもはるかにより強固に結合する。正統なリンカーを有するポリフィンガータンパク質は、Ｒｅｂａｒ（Ｒｅｂａｒ（博士論文）、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ−ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７））、Ｓｈｉ（Ｓｈｉ（博士論文）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５））、およびＬｉｕら（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５５２５−５５３０  （ｌ９９７））によって試験された。各々の研究は、（適切な伸長部位における）新しいポリフィンガータンパク質の結合を、もともとの３フィンガーペプチドの結合と比較した。正統なリンカーを使用した場合、４フィンガーペプチドは、対応する３フィンガーペプチドよりも６．３倍強固に結合し（Ｒｅｂａｒ（博士論文）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ−ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７））、５フィンガー構築物は、もともとの３フィンガーペプチドを超えてＫdの改善を示さず（Ｓｈｉ（博士論文）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５））、そして６フィンガーペプチドは、対応する３フィンガーペプチドよりも５８〜７４倍強固に結合した（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５５２５−５５３０（ｌ９９７））。
【００３５】
対照的に、本明細書中に記載するペプチドは（実施例の項を参照のこと）、もともとの３フィンガーペプチドよりも６，０００倍〜９０，０００倍強固に結合する。２６８／ＮＲＥおよび２６８／／ＮＲＥ構築物中で使用されるより長いリンカーは、より大きなフィンガーのセットがすべて正統なリンカーを用いて連結される場合に、蓄積する緊張をいくらか緩和しなければならないようである。おそらくこれは、ＤＮＡのらせんの周期性、およびジンクフィンガーの好ましいらせんの周期性におけるわずかなミスマッチを含み、特に４以上のフィンガーが正統なリンカーを介して連結される場合に、それらがわずかに見当はずれになることを引き起こす。
【００３６】
（ＩＩ．定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、別に特定しない限りは、それらに与えられた意味を有する。
【００３７】
用語「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」または「ジンクフィンガーポリペプチド」は、亜鉛によって安定化されているＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質をいう。個々のＤＮＡ結合ドメインは、代表的には、「フィンガー」として呼ばれる。１つのジンクフィンガータンパク質は、少なくとも１フィンガー、代表的には２フィンガー、３フィンガー、または６フィンガーを有する。各々のフィンガーは、２〜４塩基対のＤＮＡ、代表的には３または４塩基対のＤＮＡ（「部分配列」）を結合する。１つのジンクフィンガータンパク質は、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各々のフィンガーは、代表的には、約３０アミノ酸の、亜鉛がキレートしたＤＮＡ結合サブドメインを含む。これらのタンパク質の１つのクラス（Ｃ2Ｈ2クラス）を特徴付ける例示的なモチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）2-4−Ｃｙｓ−（Ｘ）12−Ｈｉｓ−（Ｘ）3-5−Ｈｉｓ（配列番号２１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）である。研究は、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの２つのシステイン残基とともに、亜鉛が配位する２つの不変のヒスチジン残基を含むα−ヘリックスからなることを実証した（例えば、ＢｅｒｇおよびＳｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７ｌ：１０８１−１０８５（１９９６）を参照のこと）。
【００３８】
「キメラ」ジンクフィンガータンパク質とは、少なくとも２つのＤＮＡ結合ドメインを有し、そのうちの１つは、ジンクフィンガーポリペプチドであり、可撓性リンカーを介して他のドメインと連結されているタンパク質をいう。これらの２つのドメインは、同じかまたは異種であり得る。両方のドメインが、同じジンクフィンガータンパク質であるか、または異種ジンクフィンガータンパク質であるかのいずれかであるジンクフィンガータンパク質であり得る。あるいは、１つのドメインが異種ＤＮＡ結合タンパク質であり得る。
【００３９】
「標的部位」は、ジンクフィンガータンパク質、または異種ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識される核酸配列である。ジンクフィンガータンパク質については、単一の標的部位は、代表的には約４〜約１０塩基対を有する。代表的には、２フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、４〜７塩基対の標的部位を認識し、３フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、６〜１０塩基対の標的部位を認識し、そして６フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、２つの近接した９〜１０塩基対の標的部位を認識する。
【００４０】
「部分部位」は、標的部位の部分配列であり、そして単一のフィンガーによって認識される標的部位の部分、例えば、２〜４塩基対の部分部位、代表的には３塩基の部分部位に対応する。標的部位は、少なくとも２、代表的には３、４、５、６、またはそれより多い部分部位（タンパク質の各フィンガーについて１つ）を含む。
【００４１】
用語「近接した標的部位」とは、０〜約５塩基対によって隔てられている重複しない標的部位をいう。
【００４２】
２つのＤＮＡ結合ドメイン間の「物理的分離」とは、２つのドメインがそれぞれの対応する標的部位に結合する場合の、２つのドメイン間の距離をいう。この距離は、リンカーの最小の長さを決定するために使用される。リンカーの最小の長さとは、ドメインまたはリンカーに立体的な障害を提供することなしに、２つのドメインが連結されることを可能にする長さである（最小リンカー）。最小よりも長い長さを提供するリンカーは、「可撓性リンカー」である。
【００４３】
「構造に基づく設計」とは、リンカーのそれぞれの標的部位に結合するＤＮＡ結合タンパク質の物理的モデルおよびコンピューターモデルを使用して、最小の長さのリンカーおよび可撓性リンカーを決定する方法をいう。
【００４４】
「Ｋd」とは、化合物の解離定数、すなわち、所定のアッセイ系を使用して測定される場合（例えば、米国特許第５，７８９，５３８号を参照のこと）、所定の条件下で（すなわち、［標的］＜＜Ｋdの場合）、その標的に対する化合物（例えば、ジンクフィンガータンパク質）の最大結合の半分を与える（すなわち、化合物分子の半分が標的に結合する）化合物の濃度をいう。Ｋdを測定するために使用されるアッセイ系を選択するべきであり、その結果、それはジンクフィンガータンパク質の実際のＫdの最も正確な測定を与える。ジンクフィンガータンパク質の実際のＫdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系が使用され得る。１つの実施態様において、本発明のジンクフィンガータンパク質についてのＫdは、本明細書中に記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）を使用して測定される。ジンクフィンガータンパク質の純度または活性について調整しない限りは、Ｋdの計算は、所定のジンクフィンガータンパク質の真のＫdの過小評価を生じ得る。
【００４５】
句「転写開始部位に近接した」は、転写開始部位の上流または下流のいずれかの約５０塩基以内にある標的部位をいう。転写開始部位の「上流」とは、転写開始部位の５’の約５０塩基より多い標的部位をいう（すなわち、遺伝子の非転写領域において）。
【００４６】
句「ＲＮＡポリメラーゼ停止部位」は、Ｕｐｔａｉｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１１７−１７２（１９９７）に記載される。
【００４７】
用語「異種」は相対的な用語であり、これは核酸の一部に関して使用される場合、天然では互いに同じ類縁中に見出されない２つ以上の部分配列を含む核酸を示す。例えば、組換え的に産生された核酸は代表的に、新たな機能的核酸を作製するように、合成的に配置された関連のない遺伝子由来の２つ以上の配列を有する（例えば、１つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）。従って、この２つの核酸は、この状況において互いに対して異種である。細胞に対して添加される場合、この組換え核酸はまた、この細胞の内因性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸とは、染色体中に組み込まれた非天然の（天然には存在しない）核酸、または非天然の（天然には存在しない）染色体外の核酸を含む。対照的に、天然に転座した染色体の断片は、本特許出願の文脈において異種と見なされない。なぜなら、この断片は、変異細胞に対してネイティブである内因性の核酸配列を含むからである。
【００４８】
「調節ドメイン」とは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガータンパク質）に連結される場合に、転写調節活性、ＤＮＡ修飾活性、タンパク質修飾活性などのような活性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインをいう。調節ドメインの例としては、タンパク質またはタンパク質のエフェクタードメイン（例えば、転写因子および補因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、核因子κＢサブユニットｐ６５、初期増殖応答因子１、および核ホルモンレセプター、ＶＰ１６、ＶＰ６４）、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセムラーゼなど））が挙げられる。アクチベーターおよびリプレッサーは、コアクチベーターおよびコリプレッサーを含む（例えば、Ｕｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８−５０２（１９９８）を参照のこと）。
【００４９】
「異種ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ジンクフィンガータンパク質ではないタンパク質（例えば、制限酵素、核ホルモンレセプター、ホメオドメインタンパク質（例えば、エングレイルドまたはアンテナぺディア（ａｎｔｅｎｏｐｅｄｉａ））、細菌性ヘリックスターンヘリックスモチーフタンパク質（例えば、λリプレッサおよびｔｅｔリプレッサー）、Ｇａｌ  ４、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ヘリックスループヘリックスモチーフタンパク質（例えば、ｍｙｃおよびｍｙｏ  Ｄ）、ロイシンジッパー型タンパク質（例えば、ｆｏｓおよびｊｕｎ）、およびβシートモチーフタンパク質（例えば、ｍｅｔリプレッサ、ａｒｃリプレッサ、およびｍｎｔリプレッサ）由来のＤＮＡ結合ドメインをいう。
【００５０】
「ヒト化」とは、代表的には、ポリペプチド配列の機能を実質的に改変することなく、既存のヒト配列を模擬するようにアミノ酸配列を改変することによって、ヒトにおける免疫反応性を最小化するように改変された非ヒトポリペプチド配列をいう（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、および公開されたＵＫ特許出願番号第８７０７２５２号を参照のこと）。ジンクフィンガータンパク質についての骨格配列は、好ましくは既存のヒトＣ2Ｈ2ジンクフィンガータンパク質（例えば、ＳＰ−１）から選択される。機能的ドメインは、好ましくは既存のヒト遺伝子（例えば、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット由来の活性化ドメイン）から選択される。可能であれば、認識ヘリックス配列を、ヒトゲノムを配列決定することによって提供された数千の既存のジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ認識ドメインから選択する。できる限り多く、ドメインを、同じ既存のタンパク質由来のユニットとして結合する。これらの工程の全ては、キメラジンクフィンガータンパク質中の新たな結合エピトープの導入を最小化し、そして操作したジンクフィンガータンパク質をより低い免疫原性にする。
【００５１】
「核酸」とは、一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連鎖を含む核酸を包含する。これらの核酸は合成的であり、天然に存在し、および天然に存在しない。これらの核酸は参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられ、この例は制限することを伴わない。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示された配列を内在的に包含する。この用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。ヌクレオチド配列は本明細書中において、慣習的な５’−３’方向で示される。
【００５２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中において、アミノ酸残基のポリマーをいうために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸のアナログまたは擬態物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに対して適用される。ポリペプチドは、例えば、炭水化物残基の添加により改変されて、糖タンパク質を形成し得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、糖タンパク質ならびに非糖タンパク質を含む。ポリペプチド配列は、本明細書中において、慣習的なＮ末端からＣ末端への方向で示される。
【００５３】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式において機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸擬態物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸であり、ならびに後に改変されたそれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物（すなわち、水素に結合するα炭素、カルボキシル基に結合するα炭素、アミノ基に結合するα炭素、およびＲ基に結合するα炭素（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニン、およびメチルスルホニウム））をいう。そのようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸擬態物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式において機能する化合物をいう。
【００５４】
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする改変された核酸をいうか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をいう。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。遺伝暗号の縮重が理由で、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、本明細書中のアミノ酸において、コドンによってアラニンが特定される全ての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、任意の対応する記載のコドンに改変され得る。そのような核酸の改変は「サイレントな改変」であり、これは保存的に改変された改変の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、核酸の全ての可能なサイレントな改変を記述する。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（これは通常、メチオニンついての唯一のコドンである）およびＴＧＧ（これは通常、トリプトファンについての唯一のコドンである）を除く）が、改変されて機能的に同一の分子を産生し得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントな改変が、各記載の配列中に内在する。
【００５５】
アミノ酸配列および核酸配列に関して、配列中の単一のアミノ酸もしくはヌクレオチド、または低い割合のアミノ酸もしくはヌクレオチドを、改変、付加、または欠失する個々の置換、欠失、あるいは付加は、「保存的に改変された改変体」を作製する。ここで、この改変は、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性の改変体および対立遺伝子に加えられ、そしてそれらを除外しない。
【００５６】
以下の群は各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
３）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
４）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
５）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；
６）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
７）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）；および
８）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５７】
（アミノ酸の特性の議論については、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００５８】
（ＩＩＩ．ジンクフィンガータンパク質の設計）
本発明のキメラジンクフィンガータンパク質は、可撓性リンカーを介して少なくとも第２のＤＮＡ結合ドメイン（これは、必要に応じて第２のジンクフィンガーポリペプチドである）に連結した、少なくとも１つのジンクフィンガーポリペプチドを含む。キメラジンクフィンガータンパク質は、２つより多いＤＮＡ結合ドメイン、ならびに１つ以上の調節ドメインを含み得る。本発明のジンクフィンガーポリペプチドは、選択した遺伝子中の選択された標的部位を認識するように操作され得る。代表的には、任意の適切なＣ２Ｈ２ＺＥＰ（例えば、ＳＰ−１、ＳＰ−１Ｃ、またはＺＩＦ２６８）由来の骨格を、操作したジンクフィンガーポリペプチドのための足場として使用する（例えば、Ｊａｃｏｂｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４５０７（１９９２）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）を参照のこと）。次いで、多くの方法を使用して、その標的に対して高アフィニティーを有するジンクフィンガーポリペプチドを設計および選択し得る。ジンクフィンガーポリペプチドを、標的遺伝子中の任意の適切な標的部位に対して、高アフィニティーで結合するように設計または選択し得る。同時係属中の米国特許第6,453,242号（１９９９年１月１２日出願）（ＴＴＣ代理人整理番号第０１９４９６−００１８００、本明細書中で参考として援用される）は、選択された標的部位に対するジンクフィンガーポリペプチドの設計、構築、および発現のための方法を、包括的に記載する。
【００５９】
当該分野において公知の任意の適切な方法（例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピューター／合理設計、アフィニティー選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築など）を使用して、ジンクフィンガーポリペプチドをコードする核酸を設計および構築し得る（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号；Ｗｕら、ＰＮＡＳ  ９２：３４４−３４８（１９９５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９−５６９５（１９９４）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３（１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ８９：７３４５−７３４９（１９９２）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３−９６（１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、ＰＮＡＳ  ９２：９７５２−９７５６（１９９５）；およびＬｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４：５５２５−５５３０（１９９７）；ＧｒｉｅｓｍａｎおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７−６６１（１９９７）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１−９９−１１１０３（１９９４）を参照のこと）。
【００６０】
好ましい実施態様において、同時係属中の出願ＵＳＳＮ （１９９９年１月１２日出願）（ＴＴＣ代理人整理番号第０１９４９６−００１８００）は、標的遺伝子を選択し、そして１〜６（またはそれ以上）のＤ型可能部位（下記の定義を参照のこと）を含有する遺伝子内に標的部位を同定する方法を提供する。次いで、これらの方法を使用して、予め選択された部位に結合するジンクフィンガーポリペプチドを合成し得る。標的部位の選択のこれらの方法は、標的セグメントにおける１つ以上のＤ型可能部位の存在が、Ｄ型可能部位を欠失する標的セグメントに結合するジンクフィンガーポリペプチドと相対的に、その部位に結合するように選択または設計されたジンクフィンガーポリペプチドにおいて、より高い結合アフィニティーについての潜在能力を付与するという認識を、一部前提条件とする。
【００６１】
Ｄ型可能部位または部分部位は、適切に設計された単一のジンクフィンガーが、３つの標的部位によりもむしろ４つの塩基に結合することを可能にする標的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーは、二本鎖標的セグメントの内の一本の鎖（標的鎖）上の塩基のトリプレットおよび他方の鎖上の第４の塩基に結合する（同時係属中の出願ＵＳＳＮ （１９９９年１月１２日出願）（ＴＴＣ代理人整理番号第０１９４９６−００１８００の図２を参照のこと）。４塩基の標的セグメントへの単一のジンクフィンガーの結合は、標的鎖の配列上およびジンクフィンガーのアミノ酸配列上の両方への束縛を課す。標的鎖内の標的部位は、「Ｄ型可能」部位モチーフ５’ＮＮＧＫ３’（ここで、ＮおよびＫは、慣習的なＩＵＰＡＣ−ＩＵＢあいまいコードである）を含むべきである。そのような部位への結合のためにジンクフィンガーは、−１位にアルギニン残基および＋２位でアスパラギン酸（または低い程度で好ましくは、グルタミン酸）を含むべきである。−１位のアルギニン残基は、Ｄ型可能部位中のＧ残基と相互作用する。ジンクフィンガーの＋２位でのアスパラギン酸（またはグルタミン酸）残基は、Ｄ型可能部位中のＫ塩基に相補的な反対の鎖の塩基と相互作用する。Ｄ型可能部位の名前を付与するのは、アスパラギン酸（記号Ｄ）と反対の鎖の塩基（第４の塩基）との間の相互作用である。Ｄ型可能部位の式から明らかなように、Ｄ型可能部位の２つのサブタイプが存在する：すなわち、５’ＮＮＧＧ３’および５’ＮＮＧＴ３’である。前者の部位について、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、Ｄ型可能部位に対して反対の鎖中のＣと相互作用する。後者の部位において、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、Ｄ型可能部位に対して反対の鎖中のＡと相互作用する。一般的に、ＮＮＧＧは、ＮＮＧＴより好ましい。
【００６２】
３つのフィンガーを有するジンクフィンガーポリペプチドの設計において、標的部位は、そのタンパク質のうちの少なくとも１つのフィンガー、および必要に応じて２つかまたは３つ全てのフィンガーが、Ｄ型可能部位を結合する潜在能力を有するように選択されるべきである。このような選択は、式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’を有する、より大きな標的遺伝子内から標的部位を選択することによって達成され得る。ここで、
各々のセット（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）は、（Ｎ、Ｎ）または（Ｇ、Ｋ）のいずれかであり；
（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）のうちの少なくとも１つは（Ｇ、Ｋ）であり、そして
ＮおよびＫは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢあいまいコードである。
【００６３】
換言すると、３つのセット（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）のうちの少なくとも１つはセット（Ｇ、Ｋ）であり、このことはこのセットの第１の位置がＧであり、そして第２の位置がＧまたはＴであることを意味する。（Ｇ、Ｋ）ではない３つのセット（もしあれば）のセットは（Ｎ、Ｎ）であり、これはこのセットの第１の位置が任意のヌクレオチドによって占められ得、そしてこのセットの第２の位置が任意のヌクレオチドで占められ得ることを意味する。例として、セット（ｘ、ａ）は（Ｇ、Ｋ）であり得、そしてセット（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）は両方とも（Ｎ、Ｎ）であり得る。
【００６４】
式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’において、ＮＮｘ  ａＮｙおよびｂＮｚｃのトリプレットは、ジンクフィンガーポリペプチドの３つのフィンガーによって結合される標的鎖上に塩基のトリプレットを示す。ｘ、ｙおよびｚのうちの１つのみがＧであり、このＧがＫに続く場合、標的部位は単一のＤ型可能部分部位を含む。例えば、ｘのみがＧであり、そしてａがＫである場合、この部位は、強調されたＤ型可能部分部位を有する以下、
【００６５】
【化１】
0004309051.tif 000002
と読める。ｘおよびｙの両方がＧであるがｚはＧでなく、そしてａおよびｂがＫである場合、この標的部位は、２つの重複するＤ型可能部分部位を以下のように有する：
【００６６】
【化２】
0004309051.tif 000003
（配列番号２２）
これは、ボールドで示される一方のそのような部位、およびイタリックのもう一方を有する。ｘ、ｙおよびｚの３つ全てがＧであり、そしてａ、ｂ、およびｃがＫである場合、この標的セグメントは、３つのＤ型可能部分部位を以下のように含み、
【００６７】
【化３】
0004309051.tif 000004
（配列番号２３）
このＤ型可能部分部位は、ボールド、イタリック、および下線によって示される。
【００６８】
従って、これらの方法は、標的遺伝子を選択すること、およびその遺伝子の可能な部分配列内で、上記の式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’と合致する標的部位について体系的に検索することによって進む。いくつかのこのような方法において、潜在的な標的遺伝子のいずれかの鎖上の１０連続している塩基のあらゆる可能な部分配列を評価して、それが上記の式に合致するか否かを決定し、そして合致する場合には、いくつのＤ型可能部位が存在するかを決定する。代表的には、そのような比較はコンピューターによって実施され、そしてこの式に合致する標的部位のリストが出力される。必要に応じて、そのような標的部位は、いくつのＤ型可能部位が存在するかに従って、種々のサブセットに出力され得る。
【００６９】
改変において、本発明の方法は、各々が独立に上記の式と合致する第１および第２の標的セグメントを同定する。そのような方法における２つの標的セグメントは、その標的遺伝子において互いの近接または隣接（すなわち、約０〜５塩基内）であることが強制される。隣接の標的セグメントの選択に基づくこのストラテジーは、それぞれ第１および第２の標的セグメントについて特異的である２つの成分のジンクフィンガーポリペプチドの連結によって形成されるジンクフィンガーポリペプチドの設計を可能にすることである。これらの原則は、拡大されて、任意の数の成分フィンガーを有するジンクフィンガーポリペプチドによって結合されるべき標的部位を選択し得る。例えば、９つのフィンガータンパク質についての適切な標的部位は、３つの成分セグメント（各々は上記の式と合致する）を有する。
【００７０】
上記の方法によって同定される標的部位は、他の判断基準によるさらなる評価に供され得るか、またはそのような部位について特異的なジンクフィンガーポリペプチドの設計または選択（もし必要であれば）および産生のために直接的に使用され得る。潜在的な標的部位を評価するためのさらなる判断基準は、遺伝子内での特定の領域に対するそれらの隣接度である。ジンクフィンガーポリペプチドをそれ自体で細胞性遺伝子を抑制するように使用する場合（すなわち、抑制部分へジンクフィンガーポリペプチドを連結することを伴わない）、最適な位置は、転写開始の部位、またはその上流５０ｂｐ内もしくは下流５０ｂｐ内であるように思われ、転写複合体の形成を阻害する（ＫｉｍおよびＰａｂｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７９５−２９６８００（１９９７））か、あるいは必須のエンハンサー結合タンパク質と競合するように思われる。しかし、ジンクフィンガーポリペプチドが機能的ドメイン（例えば、ＫＲＡＢリプレッサードメイン、またはＶＰ１６アクチベータードメインに融合される場合、結合部位の位置はかなりより柔軟であり、そして既知の調節領域の外側であり得る。例えば、ＫＲＡＢドメインは、ＫＲＡＢが結合する位置から少なくとも３ｋｂｐまでのプロモーターで転写を抑制し得る（Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ  ９１：４５０９−４５１３（１９９４））。従って、標的遺伝子と共に明白に生物学的に重要なセグメント（例えば、調節配列）を必ずしも含むかまたは重複する必要のない標的部位が選択され得る。標的セグメントをさらに評価するための他の判断基準としては、そのようなセグメントまたは関連のセグメントに結合するジンクフィンガーポリペプチドの事前の有効性、および／または所定の標的セグメントを結合するように新たなジンクフィンガーポリペプチドを設計することの容易さが挙げられる。
【００７１】
標的セグメントを選択した後、そのセグメントに結合するジンクフィンガーポリペプチドは、種々のアプローチによって提供され得る。最も単純なアプローチは、その標的部位に結合することが既に公知である既存のコレクションから、予め特徴付けられたジンクフィンガーポリペプチドを提供することである。しかし、多くの例において、そのようなジンクフィンガーポリペプチドは存在しない。新たなジンクフィンガーポリペプチドを設計する代替のアプローチもまた使用され得る。この代替のアプローチは、既存のジンクフィンガーポリペプチドのデータベース中の情報およびそれらの個々の結合アフィニティーを使用する。さらなるアプローチは、上記に議論した置換の法則に基づいてジンクフィンガーポリペプチドを設計することである。なおさらなる代替手段は、ファージディスプレイのような経験的プロセスによって所定の標的に対して特異性を有するジンクフィンガーポリペプチドを選択することである。いくつかのそのような方法において、ジンクフィンガーポリペプチドの各成分フィンガーは、他の成分フィンガーとは独立に設計または選択される。例えば、各フィンガーを異なる先に存在していたジンクフィンガーポリペプチドから獲得し得るか、または各フィンガーを別々の無作為化および選択に供し得る。
【００７２】
一旦、ジンクフィンガーポリペプチドが所定の標的セグメントに対して選択され、設計され、またはさもなければ提供されると、そのジンクフィンガーポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡが合成される。ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡを合成および発現するための例示的な方法を、以下に記載する。次いで、ジンクフィンガーポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、そのジンクフィンガーポリペプチドが結合する標的部位を含む標的遺伝子の発現を調節するため、またはその標的遺伝子の分析のために使用し得る。
【００７３】
（ＩＶ．本発明の方法を使用して作製されるジンクフィンガータンパク質の発現および精製）
可撓性リンカーを含むキメラジンクフィンガータンパク質およびこのようなキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸は、組換え遺伝学の分野で慣用的な技術を使用して作製され得る。本発明における使用の一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。さらに、本質的には、任意の核酸は、任意の種々の商業的供給源から注文される注文品であり得る。同様に、ペプチドおよび抗体は、任意の種々の商業的供給源から注文される注文品であり得る。
【００７４】
２つの別の方法が代表的に使用されて、新たに設計したＤＮＡ結合ポリペプチドおよび可撓性リンカーを発現するのに必要なコード配列が作製される。１つのプロトコルは、ＰＣＲに基づくアセンブリ手順であり、これは、（３フィンガーのジンクフィンガーポリペプチドを１つ作成するために）６つの重複オリゴヌクレオチドを利用する。３つのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスの間のＤＮＡ結合ドメインの部分をコードする「普遍」配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジンクフィンガー構築物について一定のままである。他の３つの「特異的な」オリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスをコードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスの主に１、２、３および６位で置換を含み、このことは、これらのオリゴヌクレオチドを、異なるジンクフィンガーの各々に対して特異的にする。
【００７５】
３フィンガーのジンクフィンガーポリペプチドを作製するために、ＰＣＲ合成が２つの工程で行われる。最初に、二本鎖ＤＮＡテンプレートが、低温度のアニーリング工程を用いる４つのサイクルのＰＣＲ反応において、６つのオリゴヌクレオチド（３つの普遍オリゴヌクレオチド、３つの特異的なオリゴヌクレオチド）を組み合わせることによって作製され、それにより、オリゴヌクレオチドがアニーリングされ、ＤＮＡ「足場」が形成される。この足場におけるギャップは、高忠実度の熱安定性ポリメラーゼ（ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼの組み合わせもまた十分である）によって充填される。構築の第２期において、ジンクフィンガーテンプレートは、設計された外部プライマーによって増幅されて、クローニングのためのいずれかの末端で制限部位をシャトルベクターに取り込むか、または発現ベクターに直接取り込む。
【００７６】
新たに設計したＤＮＡ結合タンパク質をクローニングする別の方法は、所望のキメラジンクフィンガータンパク質の特定の領域をコードする相補オリゴヌクレオチドをアニールすることに基づく。この特定のアプリケーションは、このオリゴヌクレオチドが、最終連結工程の前にリン酸化されることを必要とする。このことは、通常、アニーリング反応を設定する前に行われるが、リン酸化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）はまた、アニーリング後にも生じ得る。簡潔には、このタンパク質の定常領域をコードする「普遍」オリゴヌクレオチド（上記のオリゴ１、２および３）は、相補オリゴヌクレオチドとアニールされる。さらに、フィンガー認識ヘリックスをコードする「特異的」オリゴヌクレオチドは、それらのそれぞれの相補オリゴヌクレオチドとアニールされる。これらの相補オリゴは、上記のプロトコルで以前にポリメラーゼによって充填されている領域を充填するように設計される。共通のオリゴ１およびフィンガー３に対する相補オリゴは、選択されるベクターへのクローニングに使用される制限部位に特異的な突出する配列（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を残すように操作される。第２のアセンブリプロトコルは、以下の局面において開始プロトコルとは異なる：新たに設計されたＺＦＰをコードする「足場」は、全体的に合成ＤＮＡから構成され、それによりポリメラーゼ充填工程を排除し、さらにベクターにクローニングされるフラグメントは、増幅を必要としない。最後に、残った配列特異的突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）の設計は、挿入フラグメントの制限酵素消化の必要性を排除する。
【００７７】
新たに設計されたジンクフィンガーポリペプチドをコードする、得られたフラグメントは、発現ベクターに連結される。可撓性リンカーおよび第２のＤＮＡ結合ドメイン（必要ならば、ジンクフィンガーポリペプチド）をコードする配列もまたベクターに連結されて、キメラジンクフィンガータンパク質が作製される。代表的には、この可撓性リンカーは、２つのＤＮＡ結合ドメインの間の発現ベクターに連結されるオリゴヌクレオチドによってコードされる。第２のＤＮＡ結合ドメインは、上記のように作製され得るか、または当該分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲなど）を使用して、別の供給源からクローニングされ得るか、もしくは別の供給源から得られ得る。通常利用される発現ベクターとしては、改変されたｐＭＡＬ−ｃ２細菌発現ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，「ＮＥＢ」）または真核生物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
選択されたキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸は、代表的には、（例えば、Ｋdの決定のために）原核生物または真核生物細胞への形質転換についての中間ベクターに、複製および／または発現のためにクローニングされる。中間ベクターは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質またはタンパク質産物をコードする核酸の保存または操作のための、原核生物ベクター(例えば、プラスミド）、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸はまた、代表的には、植物細胞、動物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与のための発現ベクターにクローニングされる。
【００７９】
クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、キメラジンクフィンガータンパク質は、代表的には、転写を指向するためのプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）に記載される。ジンクフィンガータンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３））。このような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は当該分野で周知であり、そしてまた、市販されている。
【００８０】
キメラジンクフィンガータンパク質核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定のアプリケーションに依存する。例えば、強力な構成プロモーターは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、ジンクフィンガータンパク質が、遺伝子調節のためにインビボで投与される場合、構成プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかが使用され、これは、ジンクフィンガータンパク質の特定の使用に依存する。プロモーターはまた、代表的には、トランス活性化に応答するエレメント(例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント）および低分子制御系（例えば、ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系）を含み得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８）を参照のこと）。
【００８１】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的には、転写ユニットまたは発現カセットを含み、これは、宿主細胞（真核生物または原核生物のいずれか）における核酸の発現に必要な全てのさらなるエレメントを含む。従って、代表的な発現カセットは、例えば、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列、および例えば、転写物の効果的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要なシグナルに作動可能に連結されたプロモーターを含む。このカセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、および異種のスプライスされたイントロンシグナル（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｓｉｇｎａｌ）が挙げられ得る。
【００８２】
細胞に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、ジンクフィンガータンパク質の意図された使用（例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現）に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドの、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、および市販の融合発現系(例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺ）ようなプラスミドが挙げられる。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質「ＭＢＰ」である。このような融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質の精製のために使用される。エピトープタグもまた、発現をモニタリングするため、ならびに細胞および細胞成分局在化をモニタリングするために、組換えタンパク質に付加されて、単離の簡便な方法を提供する（例えば、ｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧ）。
【００８３】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば、真核生物発現ベクター(例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルスに由来するベクター）において使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ，ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および以下のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現についての効果を示した他のプロモーター。
【００８４】
いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー（例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ）を有する。高収率の発現系もまた、適切である（例えば、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下で配列をコードするジンクフィンガータンパク質とともに、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを使用する）。
【００８５】
代表的には、発現ベクターに含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における唯一の制限部位を含む。
【００８６】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞を産生し、次いでこれを、標準的な技術を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、１９９０）を参照のこと）。真核生物および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参照のこと）。
【００８７】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順はいずれも使用され得る。これらの手順としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム性および統合性の両方）、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順は、少なくとも１つの遺伝子を、選択されるタンパク質を発現し得る宿主細胞に首尾良く導入し得ることが必要であるのみである。
【００８８】
当業者に公知のタンパク質精製の任意の適切な方法は、本発明のキメラジンクフィンガータンパク質を精製するために使用され得る（Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、を参照のこと）。さらに、任意の適切な宿主（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など）が使用され得る。
【００８９】
１つの実施態様において、細菌株ＪＭ１０９においてマルトース結合タンパク質に融合したジンクフィンガータンパク質（ＭＢＰ−ジンクフィンガータンパク質）の発現は、アミロースカラム（ＮＥＢ）による簡単な精製を可能にする。高発現レベルのキメラジンクフィンガータンパク質は、ＩＰＴＧでの誘導によって得られ得る。なぜなら、ｐＭａｌ−ｃ２発現プラスミドにおけるＭＢＰ−ジンクフィンガータンパク質融合は、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーター（ＮＥＢ）の制御下にあるからである。ＭＢＰ−ジンクフィンガータンパク質融合プラスミドを含む細菌は、１０μＭ  ＺｎＣｌ2、０．０２％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ培地に播種され、そして３７℃にて振盪される。中期対数増殖期で、ＩＰＴＧを０．３ｍＭまで添加して、そしてこの培養物を振盪させる。３時間後、この細菌を遠心分離によって採取し、超音波処理によって破壊し、次いで不溶性物質を遠心分離によって除去する。ＭＢＰ−ジンクフィンガータンパク質を、アミロース結合樹脂上に捕捉し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび５０μＭ  ＺｎＣｌ2を含む緩衝液で十分に洗浄し、次いで本質的に同じ緩衝液中でマルトースを用いて抽出する（精製は、ＮＥＢからの標準的なプロトコルに基づく）。精製したタンパク質を定量し、そして生化学分析のために保存する。
【００９０】
精製したタンパク質の生化学的特徴（例えば、Ｋd）は、任意の適切なアッセイによって特徴付けられ得る。１つの実施態様において、Ｋｄは、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）によって特徴付けられる（Ｂｕｒａｔｏｗｓｋｉ＆Ｃｈｏｄｏｓｈ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２．２．１−１２．２．７頁（Ａｕｓｕｂｅｌ編、１９９６））。
【００９１】
（Ｖ．調節ドメイン）
本発明の方法を使用して作製されるキメラジンクフィンガータンパク質は、必要に応じて、遺伝子発現の調節のための調節ドメインと結合され得る。このキメラジンクフィンガータンパク質は、１つ以上の調節ドメインと、あるいは２つ以上の調節ドメインと共有結合され得るかまたは非共有結合され得、この２つ以上のドメインは、同じドメインの２つのコピーであるか、または２つの異なるドメインである。この調節ドメインは、例えば、融合タンパク質の一部としてアミノ酸リンカーを介して、キメラジンクフィンガータンパク質に共有結合的に連結され得る。このジンクフィンガータンパク質はまた、非共有二量体化ドメイン(例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質）を介して調節ドメインと結合され得る（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９（１９９１）、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８２２−８２６（１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）を参照のこと）。この調節ドメインは、任意の適切な位置でキメラジンクフィンガータンパク質と結合され得、この位置としては、このキメラジンクフィンガータンパク質のＣ末端またはＮ末端が上げられる。
【００９２】
本発明の方法を使用して作製されるキメラジンクフィンガータンパク質への付加のための通常の調節ドメインとしては、例えば、以下が挙げられる：転写因子由来の異種ＤＮＡ結合ドメイン；転写因子（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）由来のエフェクタードメイン；およびクロマチン関連タンパク質およびその変更因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）。
【００９３】
調節ドメインを入手し得る転写因子ポリペプチドは、調節された転写および基本の転写に関与するものを含む。このようなポリペプチドとしては、転写因子、そのエフェクタードメイン、コアクチベーター、サイレンサー、核ホルモンレセプターが挙げられる（例えば、転写に関与するタンパク質および核酸エレメントの概説については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ  ８４：８２５−３０（１９９６）を参照のこと；一般的な転写因子は、Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｄｃｏｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２５、補遺  ２：４６−９（１９９５）およびＲｏｅｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５−７１（１９９６）に概説される）。転写因子専用のデータベースもまた公知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：６３０（１９９５）を参照のこと）。核ホルモンレセプター転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４８５５−７４（１９９５）に記載される。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、Ｗｅｄｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９３：１７１−８５（１９９５）に概説される。核ホルモンレセプターによって転写調節を媒介するコアクチベーターおよびコリプレッサーは、例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；およびＵｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８−５０２（１９９８）に概説される。ＧＡＴＡ転写因子（これは、造血の調節に関与する）は、例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉｓｓら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）およびその関連するＴＡＦポリペプチド（これは、ＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０、およびＴＡＦ２５０を含む）は、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ＆Ｔｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）およびＨｕｒｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６９−７５（１９９６）に記載される。転写因子のＳＴＡＴファミリーは、例えば、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（１９９６）に概説される。疾患に関与する転写因子は、Ａｓｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９６）に概説される。
【００９４】
１つの実施態様において、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインは、転写リプレッサーとして使用される（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４５１４−４５１８（１９９４））。別の実施態様において、ＫＡＰ−１（ＫＲＡＢコリプレッサー）は、ＫＲＡＢとともに使用される（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２０６７−２０７８（１９９６））。あるいは、ＫＡＰ−１は、ジンクフィンガータンパク質ともに単独で使用され得る。転写リプレッサーとして作用する他の好ましい転写因子および転写因子ドメインとしては以下が挙げられる：ＭＡＤ（例えば、Ｓｏｍｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６３２−６６４２（１９９８）；Ｇｕｐｔａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１１４９−１１５９（１９９８）；Ｑｕｅｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：９６７−９７７（１９９８）；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：７３７−７４８（１９９７）；Ｌａｈｅｒｔｙら、Ｃｅｌｌ  ８９：３４９−３５６（１９９７）；およびＣｕｌｔｒａｒｏら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２３５３−２３５９（１９９７７）を参照のこと）；ＦＫＨＲ（横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：３５４２−３５４６（１９９８）；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４１１８−４１３０（１９９８））；ＥＧＲ−１（初期増殖応答遺伝子産物１；Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８２９８−８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８）；ｅｔｓ２リプレッサー因子リプレッサードメイン（ＥＲＤ；Ｓｇｏｕｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７８１−４７９３（１９０９５））；およびＭＡＤ  ｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ；Ａｙｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５７７２−５７８１（１９９６））。
【００９５】
１つの実施態様において、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメインは、転写アクチベーターとして使用される（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５９５２−５９６２（１９９７）を参照のこと）。活性化ドメインを補充し得る他の好ましい転写因子としては、以下が挙げられる：ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｓｅｉｐｅｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４９６１−４９６８（１９９６））；核ホルモンレセプター（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２（１９９７））；およびＥＧＲ−１（初期増殖応答遺伝子産物１；Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８２９８−８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））。
【００９６】
キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子調節に関与するポリペプチドを改変するほかのタンパク質はまた、キメラジンクフィンガータンパク質のための調節ドメインとして有用である。このような変更因子は、しばしば、例えばホルモンによって媒介される転写のスイッチのオンまたはオフに関与する。転写調節に関与するキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２：４５９−６７（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２８：２７９−８６（１９９３）、およびＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．５：１−７７（１９９５）に概説され、一方、ホスファターゼは、例えば、Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ＆Ｓｅｍｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９５）に概説される。核チロシンキナーゼは、Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３−６（１９９４）に記載される。
【００９７】
記載されるように、有用なドメインもまた、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー）の遺伝子産物およびそれらの関連因子および変更因子から入手され得る。癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，第２版、Ｔｈｅ  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５に記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８（１９９３）およびＣｒｅｐｉｅｕｘら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８（１９９４）に概説される。ｍｙｓ癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）に概説される。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、Ｔｈｅ  Ｆｏｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｎｇｅｌ＆Ｈｅｒｒｌｉｃｈ編（１９９４）に記載される。ｍａｘ癌遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９−１６．に概説される。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９−９８（１９９６）に概説される。ｍｏｓファミリーは、Ｙｅｗら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９−２５（１９９３）に概説される。
【００９８】
別の実施態様において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写アクチベーターとして使用される（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：４０８−４１１（１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５１９−３５２４（１９９８）を参照のこと）。別の実施態様において、ヒストンデアセチラーゼは、転写リプレッサーとして使用される（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉ＆Ｔｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２４４１９（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；およびＭａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３７８１−２３７８５（１９９８）を参照のこと）。
【００９９】
調節ドメインに加えて、しばしば、キメラジンクフィンガータンパク質は、精製、発現のモニタリング、または細胞および細胞成分の局在化のモニタリングの容易さのために、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、およびＦＬＡＧエピトープのような融合タンパク質として発現される。
【０１００】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願を、各々個々の刊行物または特許出願が詳細かつ個々に参照として援用することを示すように、本明細書中で参考として援用する。
【０１０１】
先に記載の発明を、理解を明瞭にする目的のための例示および例としていくらか詳細に記載してきたが、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずになされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者に容易に明らかである。
【０１０２】
（実施例）
以下の実施例は、例示のためにのみ提供され、限定のためではない。当業者は、本質的に類似の結果を得るように変更または改変し得る種々の重要ではないパラメーターを容易に認識する。
【０１０３】
（方法）
（プラスミド構築）。トランスフェクション研究において用いられるジンクフィンガー発現プラスミドを、Ｚｉｆ２６８ペプチドおよび／またはＮＲＥペプチドの所望のフィンガーをコードするＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅により構築した。これらのＤＮＡセグメントを、以下のオリゴヌクレオチド二重鎖を、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｂａＩ部位にサブクローニングすることにより構築されたｐＣＳのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位に挿入した：
【０１０４】
【化４】
0004309051.tif 000005
これらの発現プラスミドは、そのＮ末端で、Ｓ−ペプチドタグ（ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３４８〜３５６（１９９３）；ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ，ｉ．２１９：１６５〜１６６（１９９５））およびＳＶ４０ラージＴ抗原からの核局在化シグナル（Ｋａｌｄｅｒｏｎら，Ｃｅｌｌ  ３９：４９９〜５０９（１９８４））の両方を有するジンクフィンガーペプチドを作製するために設計した。レポータープラスミドを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて部位指向性変異誘発により構築した。変異誘発のためのテンプレートプラスミド（ｐＧＬ３−ＴＡＴＡ／Ｉｎｒ）の構築は、以前に記載されている（ＫｉｍおよびＰａｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７９５〜２９８００（１９９７））。全ての構築物のＤＮＡ配列を、ジデオキシ配列決定により確認した。
【０１０５】
（タンパク質の産生および精製）。Ｚｉｆ２６８、ＮＲＥおよび２６８／ＮＲＥのペプチドをコードするＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより増幅し、そしてｐＧＥＸ−６Ｐ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングした。このジンクフィンガータンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現し、そして製造業者のプロトコールに従ってアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。これらの構築物は、ＳペプチドタグもＳＶ４０核局在化シグナルも有さなかった。ＧＳＴを、引き続き、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での消化により除去した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いることにより評価した（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３〜９６（１９９５））。活性なジンクフィンガータンパク質の濃度を、記載のように（ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１〜６７３（１９９４））本質的に決定した。これらの２つの方法は、匹敵する結果を与え、これはタンパク質のほとんど全てが活性であったことを示した。
【０１０６】
（ゲルシフトアッセイ）。ＤＮＡ結合反応は、総容量１０ｍＬの、２０ｍＭのｂｉｓ−ＴｒｉｓプロパンｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２０ｍＭのＺｎＳＯ4、１０％のグリセロール、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、５ｍＭのＤＴＴ、および０．１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンの溶液中に適切なジンクフィンガーペプチドおよび結合部位を含んだ。全ての結合実験を、室温で実施した。結合部位のＤＮＡ配列は以下である：
【０１０７】
【化５】
0004309051.tif 000006
それぞれの場合、９−ｂｐの認識配列に下線を付している。ゲルシフトアッセイにおいて用いられる標識ＤＮＡを、クレノウ伸長またはキナーゼ反応により調製した。
【０１０８】
解離定数を決定するために、Ｚｉｆ２６８またはＮＲＥのペプチドの３倍階段希釈を、１時間、室温で標識化プローブＤＮＡ（０．４〜１．４ｐＭ）とインキュベートした。次いで、この反応混合物をゲル電気泳動に供した。放射活性シグナルをｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析により定量した；明確な解離定数を、記載された（ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１〜６７３（１９９４））ように決定した。
【０１０９】
ｏｎ−ｒａｔｅおよびｏｆｆ−ｒａｔｅもまた、ゲルシフトアッセイにより決定した。ｏｎ−ｒａｔｅ定数を決定する場合、結合反応を開始するために、標識したプローブＤＮＡ（最終濃度、約０．４ｐＭ）を室温でジンクフィンガーペプチド（最終濃度、５〜１０ｐＭ）に添加し、そしてアリコートを種種の時点（０〜２０分）でゲル電気泳動により分析した。時間ｔでの結合した割合をゲルのｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析により決定した。次いでこのデータを以下の式に適合した（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈTMプログラム（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）：
Ｆ＝Ｆfinal［１−ｅｘｐ（−ｋobs×ｔ）］
ここで、Ｆは、時間ｔでの結合した割合であり、Ｆfinalは、反応終了時点に結合した、計算した割合であり；そしてｋobsは、速度定数である（Ｈｏｏｐｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１１５３９〜１１５４７（１９９２））。ｏｎ−ｒａｔｅ定数を以下の式から計算した：
ｋon＝（Ｆfinal×ｋobs）／［Ｐ］
ここで、［Ｐ］は、ジンクフィンガータンパク質の濃度である。ｏｆｆ−ｒａｔｅ定数を、記載されたように本質的に決定した（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３６１６〜３６２０（１９９７））。タンパク質（最終濃度、１００ｐＭ）を標識化プローブＤＮＡと１時間プレインキュベートし、次いで、大過剰の非標識化プローブＤＮＡ（最終濃度、２０ｎＭ）を添加した。アリコートを種々の時点で取り出し、そしてゲル電気泳動により分析した。標識部位の割合を、１時間のプレインキュベーション期間の終わりに見出された割合に対して正規化した。正規化された、結合した割合の自然対数を時間に対してプロットし、そしてｏｆｆ−ｒａｔｅを傾きから決定した。速いｏｎ−ｒａｔｅおよびｏｆｆ−ｒａｔｅ測定のための全てのデータポイントを電気泳動の所用時間について補正した。
【０１１０】
（競合結合研究）。２６８／／ＮＲＥペプチド（最終濃度５ｐＭ）をまず、種々の量（０、０．０５、０．５、５、および５０ｎＭ）の非放射性の競合ＤＮＡと１時間インキュベートし、次いで標識したＮ／Ｚ部位（６〜８ｐＭ）を添加した。サンプルを２、２４、４８、９６、１９０および６００時間後にゲル電気泳動により分析した。速度比（Ｋｄｃ／Ｋｄ）を以下の式から算出した：
ｋdc／Ｋd＝｛［Ｃ］／［Ｐ］t｝×（Ｆo×Ｆ）／（Ｆo−Ｆ）（１−Ｆ）
ここで、ｋdcは、競合ＤＮＡへの結合に関する解離定数であり；Ｋdは、インタクトなキメラ部位に対する結合に関する解離定数であり；［Ｃ］は、競合ＤＮＡの濃度であり；［Ｐ］tは、タンパク質の総濃度であり；Ｆ0は、競合ＤＮＡの非存在下にいて、結合された割合であり、そしてＦは、競合ＤＮＡの存在下で結合された割合である。この式は、遊離のタンパク質の濃度がＤＮＡに結合するタンパク質の濃度より有意に小さいと仮定する。この基準は、Ｎ／Ｚ部位での２６８／／ＮＲＥペプチドのＫｄが３．８ｆＭであり、そして５ｐＭの融合ペプチドがこれらの競合実験に用いられるので、容易に満たされるはずである。
【０１１１】
サケ精子ＤＮＡを用いる競合実験は、２６８／／ＮＲＥまたはＺｉｆ２６８ペプチド（２００ｐＭ）、標識化Ｎ／Ｚ部位およびわずかな過剰モルの非標識Ｎ／Ｚ部位を含んだ。種々の量のサケ精子ＤＮＡを添加し、そしてサンプルをインキュベーション２、２４および４８時間後、ゲル電気泳動により分析した。速度比を算出する場合、サケ精子ＤＮＡのそれぞれの塩基が可能性のある（非特定の）結合部位の開始を示すと仮定した。
【０１１２】
（一過性の同時トランスフェクションアッセイ）２９３細胞を記載された（Ｃｅｐｅｋら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２０７９〜２０８８（１９９６））ようにグリセリンショックを用いるリン酸カルシウム沈降によりトランスフェクションした。トランスフェクション実験は、代表的に細胞を単層培養（６ウェルプレート）で、１０〜３０％コンフルエンシーで用い、そして以下のプラスミドを添加した：０．２ｍｇの発現が空のプラスミド（ｐＣＳ）またはジンクフィンガーペプチドをコードする発現プラスミド；０．２ｍｇのレポータープラスミド；１ｍｇの活性化因子プラスミド（ＧＡＬ４−ＶＰ１６）；０．１ｍｇのβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（ｐＣＭＶｂ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；および２．５ｍｇのキャリアプラスミド（ｐＵＣ１９）。トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を記載された（Ｋｉｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３６１６〜３６２０（１９９７）；ＫｉｍおよびＰａｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７９５〜２９８００（１９９７））ように測定した。２９３細胞において発現された全てのジンクフィンガーペプチドを、Ｓ．ＴａｇTMＲａｐｉｄ  Ａｓｓａｙキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３４８〜３５６（１９９３）；ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１６５〜１６６（１９９５））を用いることにより定量した。
【０１１３】
（結果）
ポリジンクフィンガーペプチドの構造に基づく設計。設計戦略は、任意の系の導入を回避するため接合部位でより長い（正準でない）リンカーを用いる、２つの３フィンガーペプチドの結合を含む。フィンガー間の妨害または衝突のいずれの危険性をさらに減じるため、このリンカーを設計し、そのためそれらは、個々の９ｂｐの結合部位間に挿入された１または２のさらなる塩基対を有する複合性の結合部位と適合し得た。本明細書において報告した研究は、核のホルモン応答エレメントの部分（５’−ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ−３’；配列番号９）（ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７〜６６１（１９９７））に対して強固にそして特異的に結合する、３フィンガーＺｉｆ２６８ペプチド（これは、５’−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ−３’部位；配列番号８を認識する）および３フィンガー「ＮＲＥ」ペプチド（ファージディスプレイを介して以前に選択されたＺｉｆ２６８改変体）を用いた。中心に１つのさらなる塩基対を有する複合性の標的部位は、配列５’−ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  Ｇ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ−３’（配列番号１０）を有し、そしてＮ／Ｚ部位と呼ばれる（Ｎは、ＮＲＥペプチドについての結合部位を意味し、そしてＺは、Ｚｉｆ２６８についての結合部位を意味する）。中心にさらなる２つの塩基対を有する部位は、配列５’−ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＧＴ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ−３’（配列番号１１）を有し、そしてＮ／／Ｚ部位と呼ばれる。
【０１１４】
モデルとして、Ｚｉｆ２６８複合体を有する構造に基づく設計（ＰａｖｌｅｔｉｃｈおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８０９〜８１７（１９９１）；Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１１７１〜１１８０（１９９６）は、それぞれの結合部位を認識し得るポリフィンガータンパク質を作製するための適切な長さのリンカーを決定するために用いられた（図１および２を参照のこと）。Ｎ／Ｚ部位で、最初のペプチドのαらせん末端のＬｅｕと次のペプチドの最初のβシートのＴｙｒ残基との間に８残基を有することが十分な可撓性を可能にするようであった。正準な「ＴＧＥＫＰ」リンカー（配列番号１３）は、この領域に４残基（すなわち、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ；配列番号２０）を有する。Ｎ／Ｚ部位では、ＬｅｕとＴｙｒとの間に１１残基を用いることが合理的であるようであった（図１Ａ）。それぞれのリンカー（図１Ａ）は、３フィンガーＺｉｆ２６８ペプチドのＮ末端およびＣ末端に天然に隣接する配列を含んだ。さらなる可撓性を可能にするため、グリシンを、より短いリンカー（正準リンカーよりなお４残基長い）に含め、そしてＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２４）配列を、より長いリンカー（正準リンカーより７残基長い）に含めた。結合部位の表記法に類似する表記法を用いて、より短いリンカーを有する融合タンパク質を、２６８／ＮＲＥと表示し、そしてより長いリンカーを有する融合タンパク質を２６８／／ＮＲＥと表記する。
【０１１５】
タンパク質−ＤＮＡ複合体の解離定数および半減期を決定するためにゲルシフトをアッセイする。Ｚｉｆ２６８、ＮＲＥおよび２６８／／ＮＲＥジンクフィンガーペプチドを発現し、そしてＥ．ｃｏｌｉから精製し、そしていくつかのセットのゲルシフト実験に用いた。実験の予備的なセットを、簡便に設計し、２つの３フィンガータンパク質が隣接９ｂｐ部位で結合し得るか否かを決定した（未結合のペプチドの結合における任意の妨害は、複合性の部位についてポリフィンガータンパク質のアフィニティーを減じ得る）。最初の実験は、直接並列されるＮＲＥ結合部位およびＺｉｆ２６８結合部位を有するＤＮＡフラグメント（ＮＺ部位と呼ばれる）を用いた（５’−ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ−３’；配列番号１２）。種々の量のＮＲＥペプチドをＺｉｆ２６８の存在下または非存在下で標識化ＮＥ部位とインキュベートした（図３）。３フィンガーＮＲＥペプチドは、実際に、遊離の部位に対してよりも、事前結合したＺｉｆ２６８を有するＶＺ部位に対してわずかにより強固に結合する。ＮＲＥペプチドの明確な解離定数（Ｋｄ）は、それが単独で結合する場合１８０ｐＭであるが、Ｚｉｆ２６８が隣接部位に事前結合する場合、６０ｐＭである。同様の結果がＮ／Ｚ部位で得られた。これらの実験は、隣接部位で結合したペプチド間に衝突が存在しないことを証明し、そしてある程度、穏やかな協同性の効果があり得さえすることを示唆する。ポリフィンガータンパク質のアフィニティーにおける以前の制限（Ｒｅｂａｒ（博士号論文），Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ−ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）；Ｓｈｉ，（博士号論文）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５５２５〜５５３０（１９９７））は、リンカー設計の問題に起因するようである。
【０１１６】
結合研究の第２のセットは、新しいリンカー設計の有効性を確認する。平衡滴定は、２６８／／ＮＲＥペプチドが個々の９ｂｐ部位についてよりも複合性部位について有意により高いアフィニティーを有することを示す（表１）。この融合タンパク質は、その結合部位についてＮＲＥペプチド（１８０ｐＭ）およびＺｉｆ２６８ペプチド（１４ｐＭ）のＫdＳと類似のＫdＳを有する単離された９ｂｐ部位と結合する。対照的に、２６８／／ＮＲＥ融合タンパク質は、複合性部位に非常に強固に結合するので、解離定数が小さ過ぎ、タンパク質滴定によって容易に決定できない。少なくとも０．４ｐＭの標識化プローブＤＮＡがこれらのゲルシフト実験において必要であり、これは＜１ｐＭのＫｄ値を正確に測定することを困難にした。これらの技術が困難と仮定して、２６８／／ＮＲＥペプチドの結合についてｏｎ−ｒａｔｅおよびｏｆｆ−ｒａｔｅを測定すること、および平衡結合定数（表１）を推定するためにこれらのｒａｔｅを用いることを決定した。３フィンガーペプチドを用いる並行する研究は、有用なコントロールを与えた。２６８／／ＮＲＥ、ＮＲＥおよびＺｉｆ２６８のペプチドについてのｏｎ−ｒａｔｅは、速く、そして拡散制御限界（１０８〜１０９Ｍ−１ｓ−１）に近かった（ｖｏｎ  ＨｉｐｐｅｌおよびＢｅｒｇ，Ｉ．２６４：６７５〜６７８（１９８９））。このｏｆｆ−ｒａｔｅは、大きな差異を示した：３フィンガーペプチドは、＜３９秒の半減期を有し、一方、２６８／／ＮＲＥペプチドは、ＮＺ部位で３７０次間の半減期を有する。コントロール研究は、２６８／／ＮＲＥペプチドが単一の９ｂｐ部位を有する、より不安定な複合体を形成することを示す（従って、Ｎ部位で、半減期＝１５０秒）。ＮＲＥフィンガーおよびＺｉｆ２６８フィンガーの両方は、ＮＺ部位で２６８／／ＮＲＥペプチドで観察される異常に安定な複合体を形成するように、そのそれぞれ９ｂｐの部分部位に結合するに違いない。
【０１１７】
並行する測定が実施され得る全ての場合、速度定数の比（ｋoff／ｋon）から算出したＫd値は、平衡研究から決定した値と良好に一致した（表１）。これは、直接滴定が実行不可能な場合において、Ｋdsを決定するための動態学的データを用いることにおける確実性を示した。計算は、２６８／／ＮＲＥペプチドがＮｚ部位で２．１×１０-15M（２．１ｆＭ）、Ｎ／Ｚ部位で３．７ｆＭ、そしてＮ／／Ｚ部位で３．０ｆＭのＫdを有する複合性の結合部位に対するフェムトモル濃度のアフィニティーを有することを示す（これらの３つのＫdsの一貫性はまた心強い、なぜなら、より長い可撓性のリンカーがこれらの任意の間隔と容易に適合させるはずであると予期されるからである）。このデータは、新しいリンカー設計がかなり有効であることを示す：２６８／／ＮＲＥ融合ペプチドは、個々の９ｂｐの部位に対してよりも複合性部位に対してはるかに強固に（５，０００〜９５，０００倍）結合し、そして本来の３フィンガーペプチドのいずれよりもはるかに強固に（６，０００〜９０，０００倍）結合する。
【０１１８】
【表１】
0004309051.tif 000007
競合実験をまた、６フィンガー２６８／／ＮＲＥペプチドのアフィニティーおよび特異性をさらに研究するために用いた（図４Ａ）。直接、９ｂｐのＮ部位およびＺ部位が融合ペプチドに対する結合について複合性Ｎ／Ｚ部位とどの程度十分に競合し得るかを実験の１セットで試験した。これらの実験では、種々の量の非放射活性のＮ部位またはＺ部位を、２６８／／ＮＲＥペプチドの限界量と混合した。インキュベーションの１時間後、わずかに過剰モル（融合タンパク質の総量に比べて）の標識したＮ／Ｚ部位を添加した。これらの条件下で、約７０％の標識化ＤＮＡが、競合ＤＮＡの非存在下でシフトされる。種々の時間点で採取したサンプルをゲル電気泳動により分析した。この実験における２６８／／ＮＲＥペプチドの濃度（５ｐＭ）は、Ｎ／Ｚ部位についてのペプチドの解離定数より数オーダーの規模で高いので、ほとんどすべてのペプチドは、競合ＤＮＡが添加されない場合、Ｎ／Ｚ部位に結合する。競合ＤＮＡの存在下でのシフトしたＮ／Ｚ部位の量の低下は、競合する部位に対する２６８／／ＮＲＥペプチドの結合を反映する。
【０１１９】
これらの実験における平衡には数１００時間を要し、そして精製されたタンパク質の安定性は、実際、重大な懸念となる（複合性部位は、最後に添加され、そして平衡には、長時間かかる。なぜなら、融合タンパク質は、それが最初に標識したＮ／Ｚ部位に衝突する前に、数百回または数千回、非放射活性のＺ部位に衝突し得るからである）。高濃度の非放射活性のＮ部位またはＺ部位での事前平衡の後、シフトしたＮ／Ｚ標識の画分が約６００時間までインキュベーション時間を徐々に増加させるにつれて、安定性を増加することが決定された。６００時間のインキュベーション後、標識化Ｎ／Ｚ部位の有意な画分が、非放射活性のＮ部位またはＺ部位の１０，０００倍モル過剰の存在下でさえシフトされる。特異性比（上記のように算出した）は、２６８／／ＮＲＥペプチドが少なくとも３，８００＋１，６００の率でＮ部位より複合性部位を優先し、そして融合ペプチドが少なくとも３２０＋４４の率でＺ部位よりも複合性部位を優先することを示す。これらの実験は、６フィンガーペプチドの顕著な特異性を直接確認するが、これらの値は、特異性比にごく低くしか拘束されない。このタンパク質サンプルは、これらの実験に必要とされる長いインキュベーション時間の間に、ある程度の活性を失う（遊離のタンパク質の活性は、これらの条件下で約２日の半減期を有する）、そして変性したタンパク質は、標識したＮ／Ｚ部位をシフトする機会を決して有さない。
【０１２０】
サケ精子ＤＮＡを用いる競合実験を、２６８／／ＮＲＥペプチドに対する特異的／非特異的結合定数の比を推測するために用いた（図４Ｂ）。これらの実験は、２６８／ＮＲＥペプチドが非特異的なＤＮＡに対して非常に効率的に識別し、そして８．８＋１．５×１０6の特異性比（ｋdns／ｋd）を示すことを示した。３フィンガーＺｉｆ２６８ペプチドを用いる並行する実験は、１．２＋０．１×１０5の特異性比を示す。競合物としてウシ胸腺ＤＮＡ、およびわずかに異なる条件を用いる以前の研究は、Ｚｉｆ２６８ペプチドについて０．３１×１０5の特異性比を示した（ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７〜６６１（１９９７））。同時に得た、６フィンガー２６８／／ＮＲＥ融合ペプチドのアフィニティーおよび特異性についてのデータは、それが非常に有効なリプレッサーとして働き得ることを示唆し、そして、それがインビボにおけるさらなる分析のための優れた候補物であることを確かに示した。
【０１２１】
２９３ヒト細胞株において一過性同時トランスフェクション研究を、新しいポリフィンガーペプチドがレポーター遺伝子からの転写を効果的に抑制し得るか否かを理解するために用いた。以前の研究では、Ｚｉｆ２６８ペプチドが、Ｚｉｆ２６８ペプチドがＴＡＴＡボックスまたは開始エレメント近接部位に結合する場合、基礎の転写およびＶＰ−１６活性化転写の両方を効果的に抑制し得ることが示されている（ＫｉｍおよびＰａｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７９５〜２９８００（１９９７））。本試験では、適切な結合部位（Ｚ、Ｎ、Ｎ／ＺおよびＮ／／Ｚ）が開始エレメント近接の匹敵する位置に組み込まれたルシフェラーゼレポーターおよび類似のプロモーター構築物が用いられた（図１Ｂ）。
【０１２２】
２６８／／ＮＲＥペプチドがＮ／Ｚ部位を含むプロモーターでＶＰ−１６活性化転写の７２倍の抑制を、およびＮ／／Ｚ部位を含むプロモーターで４７倍の抑制を示すことが決定された（図５Ａ〜５Ｄ）。２６８／ＮＲＥペプチドは、Ｎ／Ｚ部位で６８倍の抑制を示す。明らかに、これらの融合ペプチドは、適切な間隔を有する部位で非常に有効なリプレッサーである。３フィンガーペプチドを用いる並行実験は、抑制を示すが、それらが融合ペプチドよりもかなり有効性が低いことを示す。従って、ＮＲＥペプチドは、以下を示す：プロモーター内のＮ部位で１．９倍抑制；Ｎ／Ｚ部位で１．８倍抑制；Ｎ／／Ｚ部位で２．７倍抑制；そして単離されたＺ部位では抑制なし。Ｚｉｆ２６８ペプチドは、以下を示す：Ｚプロモーターから１３倍抑制；Ｎ／Ｚプロモーターから８．９倍抑制；Ｎ／／Ｚプロモーターから１５倍抑制；そして単離されたＮ部位では抑制なし。さらなる実験は、Ｎ／Ｚ部位で融合タンパク質で得られたかなり高い抑制レベルを達成するために共有結合が必要であることを証明する。
【０１２３】
従って、別々のポリペプチド鎖としてＺｉｆ２６８ペプチドおよびＮＰＥペプチドを（同時トランスフェクションアッセイにおいて両方の発現プラスミドを含むことにより）同時発現することは、Ｎ／Ｚ部位で単離されたＺｉｆ２６８ペプチドを有する場合に得られた８．９倍抑制に匹敵する（実験誤差内）レベルである、Ｎ／Ｚ部位でのわずか８．５倍の抑制を示す。これは、２６８／ＮＲＥ融合タンパク質および２６８／／ＮＲＥ融合タンパク質がＮ／Ｚ部位で示す６８倍および７２倍の抑制よりかなり低く、そしてこれらの「相乗的な」効果は共有結合を必要とすることが明白である。
【０１２４】
融合ペプチドにおけるさらなるフィンガーが、フィンガーの３つのみが特異的に結合し得る場合でさえ、ある程度の穏やかな抑制的効果を有し得ることは注目される。従って、６フィンガーペプチド（２６８／ＮＲＥおよび２６８／／ＮＲＥ）は、Ｚプロモーターから２１〜２３倍の抑制を示す。同様の（２２倍）抑制レベルがＮ／／Ｚ部位で２６８／ＮＲＥペプチドで得られる。モデリングは、リンカーがこの部位ですべての６フィンガーの特異的結合を可能にするには短すぎることを示唆する。これらの抑制レベルは、Ｚ部位で単離されたＺｉｆ２６８ペプチドで観察されるレベルより、一貫して、いくらか高い（１３倍抑制）。（２６８／／ＮＲＥペプチドがＺ部位に結合する場合）、以下の可能性がある：１）ＮＲＥフィンガーが自由であり、そしてさらに転写複合体のアセンブリを立体的に妨害しないか、または２）ＮＲＥフィンガーがＤＮＡと弱い非特異的な接触を形成し、これにより複合体の安定性をわずかに増強する。さらなる研究は、すべてのペプチドが匹敵するレベルで発現されることを示す。
【０１２５】
２９３細胞において発現されたジンクフィンガーペプチドは、Ｓ−ペプチドタグを有し、そしてペプチドの量は、Ｓ−タンパク質での活性化後、リボヌクレアーゼアッセイを用いることにより定量された（ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３４８〜３５６（１９９３）；ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１６５〜１６６（１９９５））。控えめな推測で、細胞におけるペプチドの発現レベルは、３フィンガーペプチドの解離定数より有意に高い（少なくとも１００倍）ことを示す。２６８／ＮＲＥおよび２６８／／ＮＲＥペプチドの４フィンガー改変体および５フィンガー改変体をコードするプラスミドもまた構築した。これらを組織培養トランスフェクション研究において試験し、そしてそれらは、代表的に、３フィンガーペプチドで観察されたレベルと６フィンガーペプチドで観察されたレベルとの中間の抑制レベルを示した（図５Ａ〜５Ｄ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、６個のフィンガーのペプチドである２６８／／ＮＲＥの構造に基づく設計を示す。Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ複合体およびテンプレートＢ−ＤＮＡ（連結で使用）の共結晶構造を、ホスフェートを重ね合わせることによって整列した（ＰａｖｌｅｔｉｃｈおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８０９〜８１７（１９９１）；Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１１７１〜１１８０（１９９６））。このモデルにおいて、２個の３フィンガーペプチドは、２ｂｐのギャップ（灰色で示される塩基）により分離された対応する９ｂｐ部位（白で示される塩基）に結合する。この下巻き（ｕｎｄｅｒｗｏｕｎｄ）ＤＮＡの１つのヘリックスターンが１１ｂｐを含むので、一方の３フィンガーペプチドの配向は、他方の３フィンガーペプチドの配向にほとんど正確に適合することに留意すること。
【図２】  図２は、ジンクフィンガーペプチドおよび本明細書中に記載されるトランスフェクション研究において使用されるレポーター構築物の模式的な描写である。図２Ａは、ジンクフィンガーのペプチドを示す。各フィンガーを丸で表す。Ｚｉｆ２６８ペプチド中のリンカーのアミノ酸配列（これは、規範的な「ＴＧＥＫＰ」リンカー（配列番号１３）を有する）を示し（配列番号１６）、そして３フィンガーペプチドを接続するために使用されるより長いリンカーを以下に示す（配列番号１７および１８）。各々の場合において、左のボックスは、ヘリックス領域を示し、そしてフィンガーの第２の保存されたＨｉｓ残基を含む：ジグザグ線は、次のフィンガーの第１のβシートを示し、これは、第１の保存されたＣｙｓ残基を含む。図２Ｂは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモーターを例示する。ＴＡＴＡボックス、開始コドン、およびジンクフィンガー結合部位（Ｎ／Ｚ＝配列番号１０；Ｎ／／Ｚ＝配列番号１１；Ｎ＝配列番号９；Ｚ＝配列番号８）のヌクレオチド位置を、転写開始部位（＋１）について番号付けする。
【図３】  図３は、ゲルシフトアッセイを示す。種々の量（０ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、および１ｎＭ）のＮＲＥペプチドを、遊離結合部位（レーン１〜４）で、または０．５時間０．１ｎＭのＺｉｆ２６８ペプチドと予めインキュベートした結合部位（レーン５〜８）とともに１時間インキュベートした。遊離ＤＮＡおよびタンパク質−ＤＮＡ複合体の位置を示す。
【図４】  図４は、競合結合研究を示す。図４Ａにおいて、２６８／／ＮＲＥペプチド（５ｐＭ）を、種々の量（０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭおよび５０ｎＭ）のコールド競合物ＤＮＡ（レーン３〜１４）と１時間予めインキュベートし、次いで、わずかにモル過剰（ペプチド濃度を超える）の標識したＮ／Ｚ部位（６０８ｐＭ）を、反応混合物に添加した。アリコートを、種々の時点でゲル電気泳動により分析した。そしてこのゲルは、室温で６００時間のインキュベーション時間後に結果を示す。図４Ｂにおいて、２６８／／ＮＲＥ（レーン２〜６）またはＺｉｆ２６８ペプチド（レーン７〜１１）を、標識したＮ／Ｚ部位と混合し、わずかにモル過剰（ペプチド濃度を超える）の標識していないＮ／Ｚ部位を添加し（その結果、７０％の標識した部位が、サケ精子ＤＮＡの非存在下で移動される）、そして種々の量のサケ精子ＤＮＡ（０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）を含んだ。インキュベーションの２４時間後、ゲル電気泳動によってサンプルを分析した。
【図５】  図５は、ジンクフィンガーのペプチドによるインビボでの転写抑制を例示するグラフ（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄ）を示す。リン酸カルシウム沈澱法を使用して、記載（Ｃｅｐｅｋら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２０７９〜２０８８（１９９６））されるようにヒト２９３細胞をトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を、４８時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性を対応するβガラクトシダーゼで除算し、相対的なルシフェラーゼ活性を得た。抑制レベル（倍数の抑制）を、１）空の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした細胞からの相対的なルシフェラーゼ活性を、２）ジンクフィンガー発現プラスミドを用いてトランスフェクトした細胞からの相対的なルシフェラーゼ活性により除算することによって得た。異なるレポーターに対するグラフにおいて、異なる目盛りを使用する。６８／ＮＲ、６８／ＮＲＥ、および６８／／ＮＲ、および６８／／ＮＲＥペプチドは、１個または２個の末端フィンガーを欠く、６つのフィンガーを有する融合タンパク質の改変体である。従って、６８／ＮＲペプチドは、ＮＲＥペプチドのフィンガー１およびフィンガー２に融合した（２つのリンカーの短い方を介して）Ｚｉｆ２６８ペプチドのフィンガー２およびフィンガー３を含む。このデータは、３つの独立した実験の平均を表し、そして平均の標準誤差を示す。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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