(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料からの材料の直接的抽出方法であり、
試料を供給すること；
選択された領域での活性化に基づいてのみ、その選択された領域に、試料への接着特性を与える性質を有する移送フィルムを供給すること；
試料を移送フィルムと並置すること；
試料からの抽出のために材料の少くとも１部分を同定すること；
試料に隣接する移送フィルム内の量を活性化するために、移送フィルム上に、予め選択された光線直径および予め選択された１ｍ秒以下のパルス時間幅を有する短いパルスの放射光線を向けて、その結果、パルス持続時間に依存して、予め選択された光線の直径より小さい移送フィルムの活性化部分が、試料の材料の少くとも１部分に接着すること；
試料から移送フィルムを分離するが、移送フィルムと試料の材料の少くとも１部分との接着は保持し、その結果、試料の材料の少くとも１部分は試料の１部分を残したまま抽出されること、の工程を含んでなる方法。
【請求項２】
目的とする成分上もしくは内に溶融ポリマーを押し込むのに十分な膨張および駆動力を創り出すために、溶融に関係する大容量膨張を熱可塑性ポリマーに与え、強い結合を急速に得ることを含む、移送フィルムを供給する工程、をさらに含んでなる請求項１記載の試料からの材料の直接的抽出方法。
【請求項３】
移送フィルムを供給する工程は、熱可塑性樹脂の最表面に不活性支持基体を供給し、それは溶融に関係する大容量膨張が所望の目的物から離れるのを防止するが、膨張ポリマーにより創り出される内部圧力を生じさせ、目的とする成分上もしくは内に溶融ポリマーを押し込んで、目的物との強い結合を得ることを含む、ことをさらに含んでなる請求項２記載の試料からの材料の直接的抽出方法。
【請求項４】
移送フィルムの活性化領域を増加させるために、予め選定されるパルス時間幅を増加すること、
をさらに含んでなる請求項１記載の試料からの材料の直接的抽出方法。
【請求項５】
移送フィルムの活性化領域を減少させるために、予め選択されるパルス時間幅を減少すること、
をさらに含んでなる請求項１記載の試料からの材料の直接的抽出方法。
【請求項６】
試料からの材料の直接的抽出方法であり、
試料を供給すること；
選択された領域での活性化に基づいてのみ、その選択された領域に、試料への接着特性を与える性質を有する移送フィルムを供給すること；
試料を移送フィルムと並置すること；
抽出されるべき試料の材料の少くとも１部分を同定すること；
移送フィルム上に、予め選択された光線直径を有する光線を向けることは、試料に隣接する移送フィルムを活性化するために溶融し、膨張し、そして結合を形成させ、その結果、移送フィルムの活性化部分が、試料の材料の少くとも１部分に接着すること；
試料から移送フィルムを分離するが、移送フィルムと試料の材料の少くとも１部分との接着は保持し、その結果、試料の材料の少くとも１部分は試料の１部分を残したまま抽出されること、の工程を含んでなる方法であって：
試料の材料の少くとも１部分の接着のために、予め選定された光線直径を有する移送フィルムの量を活性化するためにパルスのパルス持続時間を１ｍ秒以下に調節すること；および
試料の材料の少くとも１部分が移送フィルムに接着していることおよびその結合の空間的範囲を画像面で測定するために、光線を向ける間に、試料と移送フィルム間の光学的界面を観察すること、
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項７】
試料の材料の少くとも１部分の接着のために、予め選択された光線直径より小さい移送フィルムの領域を活性化するためにパルス持続時間を調節する、請求項６記載の材料の直接的抽出方法。
【請求項８】
単一の下位閾値パルスが試料のいかなる箇所に移送フィルムを活性化するのにも不十分であるようにパルスエネルギーを低下させる；および
移送フィルムが抽出されるべき材料の少くとも１部に結合するまで、そのような一連の下位閾値パルスを並置する移送フィルムに付与する、請求項６記載の材料の直接的抽出方法。
【請求項９】
試料からの材料の直接的抽出方法であり、
試料を供給すること；
選択された領域での活性化に基づいてのみ、その選択された領域に、試料への接着特性を与える性質を有する移送フィルムを供給すること；
試料から離れた移送フィルムの一面に支持体を供給すること；
試料を、移送フィルムのもう１つの面で移送フィルムと並置すること；
試料からの抽出のために材料の少くとも１部分を同定すること；
試料に隣接する移送フィルム内の量を活性化するために、移送フィルム上に、予め選択された光線直径および予め選択された１ｍ秒以下のパルス時間幅を有するパルスの放射光線を向けて、その結果、移送フィルム内の活性化量は支持体にさからっており、移送フィルムのもう１つの面のその活性化量は、予め選択された光線の直径より小さい移送フィルムの領域を試料の材料の少くとも１部分に接着させること；
試料から移送フィルムを分離するが、移送フィルムと試料の材料の少くとも１部分との接着は保持し、その結果、試料の材料の少くとも１部分は試料の１部分を残したまま抽出されること、の工程を含んでなる方法。
【請求項１０】
試料からの材料の直接的抽出方法であり、
試料を供給すること；
選択された領域での活性化に基づいてのみ、その選択された領域に、試料への接着特性を与える性質を有する移送フィルムを供給すること；
移送フィルムが試料と小さい間隔をおくように試料を移送フィルムと並置すること；
試料からの抽出のために材料の少くとも１部分を同定すること；
試料に隣接する移送フィルム内の量を活性化するために、移送フィルム上に、予め選択された光線直径および予め選択された１ｍ秒以下のパルス時間幅を有するパルスの放射光線を向けて、その結果、予め選択された光線の直径より小さい移送フィルムの活性化部分が、試料の材料の少くとも１部分に進出し、そしてちょうど接触すること；
移送フィルムと試料の材料の少くとも１部分との間の接触を観察すること；
移送フィルムと試料との間に接着を生じさせるために試料との接触にさらなるパルスの放射光線を向けること、および試料から移送フィルムを分離するが、移送フィルムと試料の材料の少くとも１部分との接着は保持し、その結果、試料の材料の少くとも１部分は試料の１部分を残したまま抽出されること、の工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、レーザー捕獲微小切出し（ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）（ＬＣＭ）、すなわち試料が顕微鏡下に視覚化され、ついで移送材料層で上掛けされ、その移層材料はレーザーで活性化されると、さらなる処理のために試料内の特定の目的成分に接着し、抽出する方法、に関する。特に、この開示は活性化するレーザー光線に大きさが等しいか、もしくはそれより小さい試料を抽出することに焦点を当てる。本発明の目的は、直径が約１０μｍより小さい組織、もしくは他の試料内の目的物の信頼しうる微小切出しのための方法および装置を提供することである。
【０００２】
発明の背景
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｕｎｄｅｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ（顕微鏡の可視化における細胞材料の単離）という発明の名称で１９９７年４月１７日に公表されたＷＯ９７／１３８３８において、その２０頁、２４行から次のような記述がなされている：
【０００３】
移送される組織の大きさは、オペレーターのニーズ次第で、レーザー光線の直径およびパルス持続時間を変えることにより変動されうる。６０〜７００μｍの直径範囲で高度に再現可能な移送は、隣接の非腫瘍性細胞の侵入なしに、小さい（１００μｍ〜１mm）病変部を容易に獲得しうる。非常に基礎的で、臨床的な研究において、数百〜数千の細胞の獲得が、信頼しうる拡大および統計的に有意の分析のために十分な遺伝子材料を供給するのに必要である。しかしながら、レーザー光線は１つの細胞の直径よりも小さく集中されうるので、目的とする単一の細胞もしくはその部分さえもの移送が、本発明の実施において可能であると考えられる。
【０００４】
続く本出願において、上述の「可能であると考えられる」移送の解決を示す。
第１の微小切出しの特許は、熱可塑性ポリマーが付着される硬質不活性基体を記述し、圧力プレートとして使用され得たが、ＬＣＭの最初の実施は、独立した（ｓｅｌｆｓｔａｎｄｉｎｇ）フィルムを使用し、そのフィルムを試料上に穏やかに押すことにより組織の表面にフィルムは付着された。注目する組織断片の上方のフィルムは、ついで１００μｍ直径の光線により加熱されＣＯ2 レーザーからのパルスにより溶融された。レーザーパルスの時間幅（１００ｍ秒〜６３０ｍ秒）は、ポリマーが組織に流入し、乾燥試料内の空気間隙に取って代ることにより強い結合を形成するために十分に長い時間、安定した状態の温度上昇に、放射されたフィルムが達するように選ばれた。この系で通常用いられる６３０ｍ秒パルスは、安定状態の温度が到達された後に、溶融ポリマー（パルスの終わりまで溶融のままである）がレーザーパルスの間に確実に組織に流入するのに十分な時間を保証するために、それほど長いように意図的に選ばれた。次の研究において、ポリマー表面と組織との間の不規則な間隔のために、１００ｍ秒パルスによる移送はもっと長いパルスによるよりも再現性が小さかったけれども、同等の移送が、このシステムと１００ｍ秒パルスにより達成され得たことが示された。このＬＣＭシステムによる実施において、目的はポリマーの比較的低い表面をその融点よりも少し高く加熱することであった。ＣＯ2 レーザーが付与されるパワーレベルは、要求される２つの閾値パワーの要因内に保持された（２５−５０mWの範囲は１００μｍ厚さのＥＶＡポリマーフィルム上に１００μｍの箇所に付与した）。このように、溶融ポリマーにより捕獲された組織は、通常９０〜１００℃のピーク温度に〜５００ｍ秒さらされた。この方法を用いて、捕獲試料中のＤＮＡ，ＲＶＡもしくはタンパクへの損傷は、次の分子分析によって観察されなかった。
【０００５】
短いパルスは、適切な結合強さを確保するためにＬＣＭにおいて避けられた。ＥＶＡにもとづく熱可塑性接着剤（たとえば熱い接着剤）の数多くの製造者からの情報は、ＥＶＡ接着剤を使用することは１秒よりも多い圧力下で溶融接合を維持することを要求することを提案した。最初のＣＯ2 レーザーＬＣＭ設計において、圧力プレート（透明でレーザおよび可視光を吸収しない）の使用は、ＣＯ2 レーザー波長（９−１１μｍ）を透過する材料の珍しさおよび費用のために実際的でなかった。続いて熱可視性ポリマーに溶解する強い吸収性近赤外（〜０．８μｍ）染料の導入は移送フィルムを、吸収性熱可塑性フィルムの１０μｍより小さい小直径に透明基体によって容易に集中されうるパルス赤外レーザーダイオード（〜０．８μｍ）により集中的に溶融されるようにした。
発明の要約
レーザー捕獲微小切出しは、移送ポリマーフィルムが、抽出のために試料から視覚され、そして選択された細胞材料の上に横たわって、基体上に置かれるところで生じる。移送ポリマーフィルムは、溶融量が直接に照射されたポリマーに限られるようにするのに十分短いパルスで集中的に活性化（溶融）される。本発明は周囲の非照射ポリマーへの熱拡散を減少させるために短いパルスを用い、該ポリマーが溶融するのに十分に加熱されるのを防止し、一方集中されたレーザー光線により直接照射された小さい集中量で直接吸収による十分な熱を供給する。この方法は、前述の接触ＬＣＭもしくは非接触ＬＣＭの両方に使用され得、集光レンズ側（すなわち光線は組織の前にポリマーを通過する）またはエピ照射（すなわちレーザーはポリマーの前に組織を通過する）のいずれかを使用する。それは、追加の不活性基体を用いておよび用いないで、レーザーがポリマーの前に組織を通過する配置で使用されうる。好適な配置において、それは、溶融ポリマーの膨張を下にある組織目的物に押し込むために、周囲の未溶融熱可塑性ポリマー（および上にある付着基体）の慣性的もしくは弾性的制限を用いる。短いパルスのプロトコールを利用して、目的とされ、そして抽出された材料は、光学回折制限が近づくけれども、励起光線と等しいか、それより小さい直径を有する。
【０００６】
さらなる精密、集中化のために、一連の短い「下位閾値」パルスがレーザー光線内の特定の目的物（すなわち、レーザーパルスの中心に位置されるレーザー光線の直径よりも小さい目的物）とちょうど接触する同一のもしくは直接に隣接する点に付与される。これは、大量のポリマーがレーザーパルスにより吸収する熱可塑性フィルムの頂部から底部に溶融されるとき、組織に向って比例した量を膨張するという事実を利用する。このポリマー膨張の量は、目的物との結合が得られるまで、単一のパルスで、捕獲を達成するのに必要な平均パルスパラメータを見積ることにより、または単一のパルス捕獲に要求される約半分のレーザパルスを用いて、一連のパルスを付与することにより、ポリマーと目的物の間の分離の最初の量を含む所望の目的物量に調和されうる。本発明の目的は、レーザーパルスの間および続く冷却まで、溶融熱可塑性ポリマーと接触させることにより生じる、目的試料中における最大の精密さ、最大の効率及び最小の熱滞在で、２０μｍより小さく再現性のあるＬＣＭ移送領域をもたらす方法を提供することである。
【０００７】
本発明者は、もっと小さな移送箇所の大きさ（直径１０μｍ未満）を得るための信頼しうる方法は１ｍ秒より小さくレーザーのパルス幅を減少させること、およびレーザーのピークパワーを調節することを含むことを見出した。これらのパルス幅およびパワーは組織細胞中のマクロ分子への損傷を最小化する。
本発明者は、活性化しうる材料の試料への接触および接着は観察しうる現象を創り出すことを、本願の出願時点で注目する。使用者は、膨張させ、接触させ、そして接着領域を形をつくるためにさえも、パルス時間幅およびパワーを調節する間に試料への所望の接着を実際に観察しうる。
具体的態様の詳細な説明
図１Ａに関して、従来の接触ＬＣＭが示される。図１Ａに関して、観察者は目Ｅで、顕微鏡Ｍを通してスライドＰ上の試料Ｓを視覚化する。試料Ｓの照明は、白熱顕微鏡光Ｌおよび二色性鏡Ｄにより生じる。照明は、透明な支持体Ｂ（ポリエステルフィルムのような硬質もしくは強いが可とう性材料の、不活性、非吸吸収状層でありうる。−前者は硬質の透明成分になり、後者は２つもしくはそれより多いもっと可とう性のテープＴと組み合わされる）および透明な移送層Ｔにより生じる。
【０００８】
移送層Ｔは、固体から液体への相転位に関連して大きな容積増加を伴う、低温溶融熱可塑性ポリマーであり（たとえばエチレンビニルアセテート）、特定波長のレーザーＺからの放射１６に連結するために染色（たとえば、目に見えない近赤外波長で）されうる。試料Ｓのそのような部分がＬＣＭに対して同定されるとき、レーザーＺは活性化され、そして移動層Ｔは選択された組織で試料Ｓを接着するために活性化される。レーザーＺからのレーザー光線１６はレンズ１４を通って二色性鏡Ｄの上へ、そして次に透明な支持体プレートＢを通って移送層Ｔ上に進む。
【０００９】
図１Ｂに変わって、接触ＬＣＭの詳細が示される。レーザー１６が示され、透明な支持体Ｂを通過し、移送層Ｔ（光線を吸収するが可視光を吸収しない）を通る。移送層Ｔは、ここでは試料Ｓと接触して示される。移送層Ｔの全露出面積よりも小さい面積の移送層の励起は可能であることが図４Ａ〜４Ｅに関連して理解されよう。したがって接着カラムＣが示され、１つの細胞ほどに小さくありうる選ばれた細胞群を抽出するために試料中に突き出ている。
【００１０】
このＬＣＭにおいて、透明支持体Ｂは機能を有することが理解されよう。特に、そして移送層を支持することにより、透明な支持体プレートＢは溶融熱可塑性ポリマーの膨張に抵抗するのに十分強い、上に横たわる基体を形成する。移送層Ｔの周囲の非活性化材料の慣性的もしくは弾性的制限を伴う、上に横たわる基体は溶融ポリマーを組織試料に流入させる。この上に横たわる基体についての好ましい要件は、１）顕微鏡の視覚化のために要求される可視光および熱可塑性ポリマを活性化するために使用される赤外線レーザの両方に透明であること、２）隣接する溶融した、レーザー吸収性熱可塑性ポリマーからの熱がそれを溶融しないほど十分に高い融点を有すること、および３）隣接するレーザーで活性化された熱可塑性ポリマーの膨張により生じる圧力下で変形が認められないほど十分に堅いこと（すなわち、これらの一時的な力の下で、剛体にみえる）である。
【００１１】
接触ＬＣＭの場合を一般的に説明したが、図２Ａおよび２Ｂは非接触ＬＣＭの場合を説明する。
図２Ａはいわゆるエピ照射が用いられることを除いて図１Ａと本質的に同一である。したがって、レーザーＺはスライドＰの下であることがわかる。
図２Ｂに関して位、レーザー光線１６がスライドＰ、試料Ｓおよび空間的間隔２０を通過することがわかる。その後に、レーザー光線１６は層を活性化するために移送層Ｔを通る。後述するように、接着カラムＣはこの空間的間隔２０に及び、再び選択された材料Ｇに留まる。さらに、この選択された材料への留め（ｆａｓｔｅｎｉｎｇ）は正確な光線直径よりも小さい直径を有するカラムにより構成される。このように、後述する方法を用いて、活性化された材料はレーザー光線１６について「集中」され得、この光線直径が１０μｍ未満に減少してさえ、レーザー光線（直径）の面積よりも小さい面積（もしくは移送目的物直径）を実際に占める。
【００１２】
図３に関して、温度の熱的モデルは移送層Ｔを構成するポリマー（ＥＶＡ）において輪郭を示す。移送層Ｔの上にあるのは透明支持体プレートＢであることがわかる。移送層Ｔの下にあるは試料Ｓを有するガラススライドＰである。光線の直径は３０μｍである。
重要な説明は、ポリマーが溶融されていると記述されている暗くされた領域の外観に関してなされうる。読者は、接触が選択された部分で溶融フィルムおよび試料の間でなされる前に、空気界面が試料とフィルムの間に存在することがわかるであろう。その空気一試料界面は通常、非常にでこぼこな表面であり、試料に光入射を強く散乱させる、大きい屈折率不適合を有する。
【００１３】
試料への溶融熱可塑性ポリマーの接触および接着が生じると、屈折率不適合は非常に減少し（ポリマーおよび試料は空気とよりも、もっとほとんど同一の屈折率を有する）、したがって接触点で試料の透過像に目にみえて明らかな変化が生じる。特に、散乱は減少し、試料の接触され、接着された部分は「比較的明るく」なる。このように、溶融移送フィルムの付着が生じるので、容易に目にみえる界面が観察者にとって存在する。
【００１４】
この外観の変化はフィルムが試料とすでに「接触」しているところでさえ存在することが強調されるべきである。通常の場合、試料の表面は非常にでこぼこである。でこぼこな表面の「高い」箇所での、フィルムと試料との接触はなお非常に感知しうる光散乱を生じさせる。加熱および接着が生じると、結合の足跡は観察するのが比較的容易である。このように、開示される方法において、その操作は生じるままに結合を観察することができる利点を有する。
【００１５】
この方法を用いて、その箇所の大きさはここでの開示を用いて視覚的に調節されうる。たとえば、精密切出しが要求されるところでは、観察者は、その箇所が選択された領域よりもいつでも大きくなることは決してないことを視覚的に確かめることができる。あるいは、試料から望まれる材料が空間的分離により、もしくはそれを囲む「無害」の材料により、本質的に単離される。ところで、溶融領域は拡げられる。いずれの場合も、ここで述べられる接触は収集工程の間、観察者を案内する貴重な目でみえる界面を提供する。
【００１６】
この微小切出しの間、試料収集者を案内する特徴的な、暗い領域を図４に関して示される。
ＯＤ〜０．３および厚さ〜５０μｍを有する近赤外吸収性ポリマーフィルムを用いるＬＣＭの典型的な実施において、レーザー照射箇所の中心内に安定した状態で接近するために要求されるパルス持続時間は１００μｍ光線に対して〜１００ｍ秒、６０μｍ光線に対して〜４０ｍ秒、３０μｍ光線に対して〜１０ｍ秒、１０μｍ光線に対して〜１ｍ秒、そして５μｍ光線に対して約５００ｕ秒である。２００μ秒もの短い高パワーの近レーザーダイオートパルスを付与しうる特別のＬＣＭを用いて、本発明者は、ＬＣＭで従来用いられている安定状態パルスに比較して短いパルスの操作のいくつかの新規な特徴を定量的に示したが、それは本発明の主題である。
【００１７】
１０μｍの光線については、１．０ｍ秒より短いパルスは、パワー×パルス持続時間の積（もしくは付与される合計エネルギー）に依存するＥＶＡ応答（膨張およい結合）をもたらす。この短いパルス体制において、ポリマー加熱および結合形成の効率は最適である。もっと長いパルスでは、もっと多い合計熱量（もしくはパルス持続時間と吸収されるパワとの積である吸収されたレーザーエネルギー）が供給されなければならず、もっと大きな移送サイズならびに温度×組織中の分子がさらされる時間のもっと大きい積分（すなわち上昇温度での時間）をもたらす。一般に、この「短時間」体制より長いパルス持続時間について、信頼しうる移送はもっと大きく、そしてマクロ分子の熱的滞在はもっと長い。同様に５μｍ光線に関して、０．５ｍ秒より少ないレーザーパルスは当量の合計エネルギーで同等の移送を与える（「効率的」移送に要求されるパワーおよびパルス持続時間は相互の逆数として変動する。）
【００１８】
目的とする組織中のマクロ分子により経験される熱的滞在の長さは、同一のピーク温度をもたらすもっと短いパルスを使用することにより減少されうる。移送される組織のサイズでは、組織試料とともにフィルムを溶融するのに十分な温度に上昇されるフィルムの領域の直径により決定される。長いパルスについて（すなわち、ＧｏｌｄｓｔｅｉｎらによりＡｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３７：７３７８，１９９８年に記載されている安定状態において）移送サイズはレーザー光線のパワーによって、およびＬＣＭ移送フィルムフィルムの熱的特性（熱容量および拡散）により、決定される。下の表は、光線直径に等しく設定された移送サイズを有する従来の安定状態についてのパラメーターを要約する（４０μｍ厚さのポリマー、５μｍ厚さの組織断片を用いて）。
【００１９】
表１：３０−１００μｍ移送のために用いられる従来のＬＣＭパラメーター
光線直径    移送サイズ  レーザーパワー  レーザーパルス接続時間
３０μｍ    ３０μｍ    １５mW          ２５msec*
６０μｍ    ６０μｍ    ３０mW          ５０msec*
１００μｍ  １００μｍ  ４０mW          １００msec*
*  より大きい、もしくはに等しい
もっと高いパワーについて：移送サイズおよび対応するピークポリマー温度は増加する。しかしながら、上の表１に示されるパルス幅の増加について、移送箇所の直径もピーク温度もパルス幅によっては有意に変動しない。ＬＣＭ移送フィルムが独立したフィルムを用いるよりも不活性基体に付着するはずであるとき、
１）基体は定められた付着力を可能にする圧力プレートとして作用し、
２）非活性化表面に対して活性化ポリマーの比較的低いもしくは組織結合表面を再現性よく定め、剛体を正確に配置させ、
３）硬質基体表面にわたる、そして不活性化周囲と組合されて、ポリマー膨張を防止し、したがって固体熱可塑性フィルムは溶融ポリマーを下にある組織の方向に、そしてその中に膨張させ、ポリマーと組織との間の接触表面領域ならびに強い結合を再現可能にもたらす。
【００２０】
換言すると、フィルムが集中的にフィルムを溶融するのに十分な吸収されるパワーを有するレーザーで照射される場合はいつでも、溶融フィルムは膨張（その熱膨張係数のために、そして容量は固体が液体に転移するのに関係して増加する）しようとするが、フィルム支持体の堅さおよびフィルムの非加熱部分より制限される。いったん、活性化ポリマーの「低部」表面が溶融すると、膨張は溶融フィルムを組織の方へ、そして中に向ける。このようにフィルムは目的物と直接に接触する必要はない。フィルムの溶融部分の底部表面はレーザーパルスの間に押出され、微細な目的物と融合もしくは結合し、ならびにポリマー膨張のこの帯域により描かれる容積内のこの目的物はフィルムおよびその基体に捕獲もしくは結合される。１）短かく、小さい光線パルス、２）選択されたポリマーの溶融にもとづく大きな膨張、ならびに３）膨張の制限および目的物への再指向、の組合わせは、１０μｍより小さい目的物の信頼しうる捕獲を可能にする。もっと長いパルスに関しては（最初のＣＯ2 の場合のように）、ポリマーは上方に、ならびに下へ膨張することができ、いったん溶融ポリマーが組織（もしくは目的物の表面のぬれ）に接触すると、重力もしくは表面張力により流動するであろう。しかしながら、有効な結合を創り出すもっと短いパルスについては、ポリマーの速い流動を目的物内（最初に接触しているか否かにかかわらず）に押し込む高い局地的な圧力が望まれる。溶融ポリマーの膨張はこの圧力を創り出す。もし溶融量が目的物の方向を除くすべての面で硬質材料で制限されるならば、そのような結合はｍ秒よりも少ない時間でなされ得、きわめて強い。支持体（基体層）は「集光レンズ側」照射を用いるときに特に重要である。それは、フィルムの頂部が表面の前にまず溶融し、そして「制限する」不活性基体のない最初の膨張が目的物から離れる方向にあり、いったん頂部から底部への溶融が生じると、流動を組織の方向に向ける圧力は有意に減少されるであろう。このように頂部表面でポリマー膨張の制限のない結合は、強くなく、短い時間で確実には形成されない。
【００２１】
これらの結合が、目的物とガラススライドの間の最初の結合より強い限り、いったん基体がスライドから分離されると、目的物はフィルム表面に移送され、スライド上の隣接する成分から分離されよう（もし目的とされない隣接成分が目的とされる成分に接触および付着していると、これらの分離は、目的とされた成分のガラススライドへの付着の強度が目的とする成分への付着の強さを超えることをさらに要求する）。通常、一連のレーザー結合は、基体、熱可視性ポリマー層および捕獲される目的物の、スライドおよびその上に残す微量成分からの分離の前にスライドの注目領域から相当する目的物群を集めて形成される。
好適な態様
いかなる外観もしくは照射形態（たとえば集光レンズ側照射もしくはエピ照射）を有する、存在するいかなるＬＣＭ試料もしくはフィルムをも使用されうる。１）短く、小さい光線パルス、２）選択されたポリマーの溶融にもとづく大きな量の膨張（たとえば〜１０％）、および３）膨張の制限および目的物への再指向、の組合わせは１０μｍより小さい目的物の信頼しうる捕獲を可能にする。もっと長いパルスに関しては（最初のＣＯ2 の場合のように）、ポリマーは上方に、ならびに下へ膨張することができ、いったん溶融ポリマーが組織（多孔質目的物）と接触すると、重力もしくは表面張力により流動するであろう。付着されたポリマーの溶融量を小さい光線直径（＜２０μｍ）に制限するために従来のＬＣＭ」におけるよりも幾分高いパワーでもっと短かいレーザーパルスが要求される。これらの比較的短いパルスについて、ポリマーの速い流動を目的物内（最初に接触しているか否かにかかわらず）に押し込む高い局地的な圧力が望まれる。溶融ポリマーの大きな膨張はこの圧力を創り出す。もし溶融量が目的物の方向を除くすべての面で硬質材料で制限されるならば、そのような結合はｍ秒よりも少ない時間でなされ得、きわめて強い。支持体（基体層）は「集合レンズ側」照射を用いるときに特に重要である。この場合、フィルムの頂部は底部表面の前にまず溶融し、そして「制限する」不活性基体のない最初の膨張が目的物から離れる方向にある。一番上の空気へのこの流体路は、いったん頂上から底部への溶融が生じると、組織の方向に圧力強制流動を実質的に減少する。このように結合は強くなく、短い時間で確実には形成されない。
【００２２】
従来の長いパルスのＬＣＭと異なり、１ｍ秒より未満のパルス幅で、フィルムはレーザーパルスの間、レーザー光線の端から２μｍよりも大きい距離で熱的平衡に接近しない。その結果、熱損失は最小化される。したがって、適切なエネルギーが付与され、活性化しうる層により吸収されるとき、レーザーにさらされる領域のフィルムのみがレーザーパルスの間に溶融点まで加熱し、組織への接触および溶融を拡げる。短いパルス（１ｍ秒未満）については、レーザーパルスはそんなに短いので、レーザーパルスにさらされる領域の外側でフィルムの温度がその融点まで増加するには時間が不十分である。この領域は溶融点未満にとどまり、組織まで溶融しない。このように、短かいパルスについて、移送領域サイズは熱拡散により増加されず、組織移送サイズはレーザー箇所直径により主に決定される。短いパルスに関して、比較的長いパルスの従来のＬＣＭ体制と異なり、レーザーのパルス幅が増加するにつれて、移送箇所サイズは、増加することが観察され、異なった熱拡散体制で操作していることが示される。下の表は光線直径に等しい移送サイズを有する新規な短いパルスＬＣＭ（４０μｍ厚さのポリマー、５μｍ厚さの組織断片を使用）に関するパラメーターを要約する：
表２：最小サイズの移送のために要求される短いパルスＬＣＭパラメータ（５μｍ厚さの目的物について、５および１０μｍ直径）
光線直径  移送サイズ  レーザーパワー  パルス持続時間  エネルギー
１０μｍ  １０μｍ    ３０mW          １msec          ３０μＪ
１０μｍ  １０μｍ    ４３mW          ０．７msec      ３０μＪ
１０μｍ  １０μｍ    ６０mW          ０．５msec      ３０μＪ
５μｍ    ５μｍ      ３０mW          ０．３msec      ９μＪ
５μｍ    ５μｍ      ４５mW          ０．２msec      ９μＪ
５μｍ    ５μｍ      １８mW          ０．５msec      ９μＪ
重要なことに、組織へのＥＶＡポリマー（たとえばＤｕｐｏｎｔ Ｅｌｖａｘ ２００Ｗ，４１０，２０５Ｗおよび４３１０）の結合は、０．３ｍ秒ほどの短い熱的滞在で再現しうる移送を可能にするのに十分な強度で確実に得られる。このように、溶融ポリマーが短いパルスで数μｍ直径領域に制限されうるばかりでなく、組織への信頼しうる結合がこのように短い溶融滞在でなされうる。
【００２３】
上の表で実験的測定は、レーザーパルス持続時間が照射量からの有意の熱拡散のための時間と関連する臨界的時間未満に保持されるとき、同一パルスエネルギーに対して等しい移送を示す。示されるように、あるパルス時間幅（１０μｍ直径箇所について＜＜１ｍ秒、そして５μｍ直径箇所について０．５ｍ秒）未満で、所定の小さな移送サイズを創り出すために要求されるレーザーエネルギーは本質的に一定（たとえば、レーザー波長０．４のＯＤを有する４０μｍ厚さの活性化しうるＥＶＡフィルムを用いて、５μｍ移送に対して９μジュール）。一般的に、ＬＣＭの好適な態様は、熱可逆性結合を形成するのに要求されるピーク温度が最小化されるように低融点を有する熱可塑性ポリマー（たとえば低ビニルアセテート％のＥＶＡ）を使用する。
【００２４】
上の表２からわかるように、使用される短いパルス体制において、所定の小さな移送サイズを創り出すのに要求されるレーザーエネルギーは本質的に一定である（たとえば、レーザー波長０．４のＯＤを有する４０μｍ厚さの活性化しうるＥＶＡフィルムを用いて、５μｍ移送に対して９μジュール）。これらのいかなるパルスも等しいサイズの微小成分を捕獲するのに用いられうるが、特定の最適化計画を示唆するいくつかの固有の物理的差異がある。一般に、比較的短かく、高いパワーのパルス（たとえば、５μｍ，４５mWおよび０．２ｍ秒であり、９μジュールを有する）は、比較的長い相当するパルス（５μｍ，１８mWおよび０．５ｍ秒、ならびに９μジュールを有する）のそれよりも熱可塑性ポリマー内でもっと高いピーク温度を創り出す。溶融ポリマー内の温度増加は、比較的低い、一時的粘度を創り出し、目的物の容積内の最も細い空隙に比較的有効なポリマー注入をもたらす。しかしながら、もっと短かく、高いパワーのパルスは、さらに、溶融ポリマーが目的物と最初に接触する瞬間、ならびにポリマーが冷却および固化するとき（パルスの終了および下にあるガラスを通じる熱流動による急冷の後に）、の間の短かい期間中、捕獲された目的物における比較的高いピーク熱滞在と関連する。一方、少し比較的長く、低いパワーのパルスは、もっと低いピーク温度およびもっと長い時間でそうする同一の吸収エネルギで同一の最大量の溶融ポリマーおよび膨張量をもたらし、ピーク熱損傷を最小化しうるが、目的物との強い機械的結合を創り出す、もっと長い時間を与える。一般に、ＬＣＭの好適な態様は、低融点の熱可塑性樹脂（たとえば、低ビニルアセテート％を有するＥＶＡ）を使用するので、熱可塑性結合を形成するのに要求されるピーク温度は最小化される。酵素機態の保存が要求されるタンパクのような熱的に敏感な材料とともに作業するとき、表２の好適な「等しい」レーザーパラメーターは挙げられる最長の効率的パルスである。
【００２５】
目的物のうまくいく結合のために要求されるのは、１）頂部から底部表面に活性化しうるポリマーのレーザー光線軸に沿って溶融すること、ならびに２）目的物表面に対してこの軸にもとづき、そして目的物の空隙空間内での熱可塑性樹脂の膨張、である。従来のＬＣＭは溶融ポリマー内で確実な安定した温度分布を得ることのできる比較的長いパルスを利用し、レーザー光線直径（表１：３０〜１００μｍ）におおよそ等しい厚さのポリマーを使用した。比較的小さい目的物移送を可能にするために潜在的熱拡散を最小化する短いパルスを用いるとき、レーザパルスの間フィルムの頂部から底部への熱流動は、さらに減少する。照射容積の頂部から底部のレーザー誘導熱勾配は活性化するレーザー波長で活性化しうるポリマーの厚さおよびその光学的密度（明光度）の両方とともに増加する。このように、特に短いパルスのＬＣＭについて、活性化しうるポリマーフィルムは厚さおよび光学的密度に関して注意深く設計されなければならない。前述したように（ＢｏｎｎｅｒらのＳｃｉｅｎｃｅ２７８：１４３１，１９９７年および特許…）、近赤外レーザー波長でのエチレンビニルアセテートのような熱可塑性ポリマーの吸光度は、ポリマーに非常に溶融しうるナフタロシアニンのような、添加された強い近赤外吸収分子の濃度により正確に制御されうる。使用されるレーザー波長で熱可塑性ポリマーフィルムの吸光度は使用されるフィルム厚さとともに染料濃度を変えることによりＯＤ＜０．４３に保持されるべきである。さらに、小さな箇所で頂上から底部に溶融されるとき、比較的薄いフィルムは、比較的小容量の溶融ポリマー、およびしたがって比較的小さいポリマー膨張容量とそれぞれ関連する。このように比較的薄いポリマーフィルムは本質的にもっと大きな精密捕獲−特にもっと薄い目的物試料について、をする。一方、非活性化ポリマー表面と目的物表面との最初の分離間隙、または目的物の厚さのいずれかが増加すると、有効な結合および関連する移送を創り出すために必要な膨張距離も増加する。このような場合、ポリマーの厚さは増加されなければならず、そして染料濃度は減少される。
【００２６】
追加的な好適な態様は、少し低目のパワーでの短いパルスＬＣＭ（単一パルスで丁度光線サイズに等しい試料における対象物を移送するのに必要なパワーの２つのファクター内で）を用いるが、一連のパルスを伴う（１秒につき２〜３パルスのくりかえしで）。このパルスの系列は、パルス列が停止する地点でポリマーがスライド上の目的物細胞もしくは微小対象物と接触もしくは結合するまで、ポリマー膨張の前進運動を増加させる。この過程で、最初の短いパルスはポリマーを集中的に溶融させ、熱膨張と周りの固体材料の慣性的および弾性的制限の組合せにより表面から外へ追い出される。個々のパルスは短かく、そして小さな伸びの冷却／固化は非常に速い（＜＜１ｍ秒）ので、短い冷却の後に、固体の小さい台が形成され、ポリマー表面から拡張する。各々の追加パルスは、目的物の方に次第に比較的小さい増加で、ポリマーを拡張する。このように、最小の可能な移送が、ポリマーを拡張して組織と接触させるのに必要な数のパルスを与えることにより確実になされうる。接触の後の追加パルスは、ポリマーの膨張を、レーザー光線のサイズまで組織に入らせる。
【００２７】
ＬＣＭの間、顕微鏡観察下で、目的物領域の光学的な明るさは接触ポリマーによって組織表面の屈折率適合のために観察されるので、組織と接触させる最初のパルスは容易に決定されうる。このように、移送は実際の光線サイズよりも小さい割合で確実に得られうる（たとえば、５μｍ光線で、〜１μｍの対象物を目的物とし、移送することが可能である。）。
【００２８】
第３の好適な短パルスＬＣＭ法は、全体の不規則な形状の単一細胞（試料内の目的対象物）を、単一細胞よりも少し小さい光線を用いて捕獲されるのを可能にするために、目的物試料との最初の接触の後で、追加の多数の閾値より上のパルスを使用する。ポリマーは多孔質の乾燥組織内を流動するので、閾値に近い短いパルスで、ポリマーは所定の細胞内の隣接のマクロ分子構造に沿って選択的に流動し、細胞内の領域をこえて拡張する前に十分にその細胞を充たすのに役立つ。このように、短かく閾値に近いパルスは、個々の細胞もしくは細胞核のような密に連結された構造を、たとえそれが不規則な形状でレーザー光線の形状と一致しなくても、標的とすることができる。
【００２９】
短いパルスのＬＣＭの精度もしくはここで述べられる捕獲成分の最小サイズは、組織断片のような密な試料に対してであり、その中に所望の目的物が望ましくない目的物にすぐに隣接している。その直径よりもっと広く分離された比較的小さい粒子を捕獲するときに、もっと大きな精度さえ達成されうると理解される（たとえば、希釈された細胞学細胞プレパラートもしくは染色体の固まり）。この場合、比較的小さな、純粋な目的物成分は、最も近い、望ましくない成分と結合することなく顕微鏡スライド上で成分および囲りの空隙空間を包むポリマー膨張により捕獲されうる。このように１μｍほどの小さい成分が顕微鏡的に標的にされ、高い純度で捕獲されうる（たとえば表２の５μｍレーザーパルスによって）。ＬＣＭ捕獲の最終的な分析は顕微鏡的視覚化および標的化のために用いられる光と活性化するレーザーの波長により制限されると考えられるけれども、サブミクロン粒子がこの方法で標的化され、捕獲されうる（すなわち、複合混合物から精製されて）環境がある。たとえば、特定の蛍光マーカーは、特定のサブミクロン粒子をそれらの構造を分解することなしに同定しうる。もしこれらの粒子が顕微鏡スライド上で十分に低い密度で拡散されると（平均間隔約５μｍ）、短パルスＬＣＭはそれらを標的化し、そして捕獲しうる。さらに、残る試料スライトおよび移送表面のあとの移送像は捕獲過程を調べて、定量化しうる。
【００３０】
本発明者は生物的適用に関して上述のＬＣＭ法を説明した。これらの方法は顕微鏡的に観察しうるいかなる試料にも適用しうる。たとえば、その方法が顕微鏡的に識別しうる成分の分離もしくは成分の収集を果たす、成分の不均一な収集がその上に使える。このように、組織、細胞学試料、細胞小器官、染色体、ウイルスに付着される選択的に活性化される移送フィルムを用いる顕微鏡にもとづく分離法が開示される。さらに、ＬＣＭ法を使用して単離されるべき部分集合（ｓｕｂｓｅｔｓ）への顕微鏡により同定しうる非生存物体がさらに分離されうる。
【００３１】
レーザー捕獲微小切出しのための凸面形状接着フィルム系という名称で、特許が発行されている、米国出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．０８／８８３，８２１号は引例によりここに組み入られる。この開示において、レーザー捕獲微小切出しによる収集される試料の並行（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）収集および集中化のための選択的に活性化される接着剤を有する凸面表面の使用が示される。この開示において、本発明者はレーザー捕獲切出しによる非常に小さい、もしくはまれな成分の収集を示すことを識者は理解するであろう。これらの２つの開示の組合わせは、顕微鏡的試料から群中の特に小さい成分の単離および収集を可能にする。したがって、収集される群の移送はさらなる分析のためにいかなる精密な場所にも生じうる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  レーザー捕獲微小切出しについての模式図であり、活性化するレーザー光線は選択された組織の微小切出しのために顕微鏡の集光レンズ側を通過する。
【図１Ｂ】  ＬＣＭの位置の詳細であり、励起レーザー光線、ならびに選ばれた組織にもっと正確に接触ＬＣＭの標的を向けるために、光線よりも小さい領域を励起する能力、を示す。
【図２Ａ】  非接触ＬＣＭの模式図であり、エピ照射を使用して（すなわちレーザーはポリマーの前に組織を通過する）、活性化フィルムを間隙を越えて選択された組織に及ばせる。
【図２Ｂ】  ＬＣＭの位置の詳細であり、励起レーザー光線、ならびに選ばれた組織にもっと正確に非接触ＬＣＭの標的を向けるために、光線よりも小さい領域を励起する能力、を示す。
【図３】  層を通過する光線とともにＥＶＡ（エチレンビニルアセテート）層の図を示す。
【図４Ａ】  図３のＥＶＡの連続的な半径側面図であり、放射の持続時間の増加とともに光線の大さをこえて半径プロフィールの拡がりを示し、輪郭線の間隔はレーザー光線パワーの増加とともに増加し、２０mWレーザー光線について輪郭線当り２５℃が示される（４０mW光線は同一形状の５０℃輪郭線を生じるであろう）ことが理解される。
【図４Ｂ】  図３のＥＶＡの連続的な半径側面図であり、放射の持続時間の増加とともに光線の大さをこえて半径プロフィールの拡がりを示し、輪郭線の間隔はレーザー光線パワーの増加とともに増加し、２０mWレーザー光線について輪郭線当り２５℃が示される（４０mW光線は同一形状の５０℃輪郭線を生じるであろう）ことが理解される。
【図４Ｃ】  図３のＥＶＡの連続的な半径側面図であり、放射の持続時間の増加とともに光線の大さをこえて半径プロフィールの拡がりを示し、輪郭線の間隔はレーザー光線パワーの増加とともに増加し、２０mWレーザー光線について輪郭線当り２５℃が示される（４０mW光線は同一形状の５０℃輪郭線を生じるであろう）ことが理解される。
【図４Ｄ】  図３のＥＶＡの連続的な半径側面図であり、放射の持続時間の増加とともに光線の大さをこえて半径プロフィールの拡がりを示し、輪郭線の間隔はレーザー光線パワーの増加とともに増加し、２０mWレーザー光線について輪郭線当り２５℃が示される（４０mW光線は同一形状の５０℃輪郭線を生じるであろう）ことが理解される。
【図４Ｅ】  図３のＥＶＡの連続的な半径側面図であり、放射の持続時間の増加とともに光線の大さをこえて半径プロフィールの拡がりを示し、輪郭線の間隔はレーザー光線パワーの増加とともに増加し、２０mWレーザー光線について輪郭線当り２５℃が示される（４０mW光線は同一形状の５０℃輪郭線を生じるであろう）ことが理解される。
【図１Ａ】
0004387594.tif 000002
【図１Ｂ】
0004387594.tif 000003
【図２Ａ】
0004387594.tif 000004
【図２Ｂ】
0004387594.tif 000005
【図３】
0004387594.tif 000006
【図４Ａ】
0004387594.tif 000007
【図４Ｂ】
0004387594.tif 000008
【図４Ｃ】
0004387594.tif 000009
【図４Ｄ】
0004387594.tif 000010
【図４Ｅ】
0004387594.tif 000011