(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４２７）株により産生されるテレフタル酸分解酵素組成物から単離された、下記特性を有するテレフタル酸分解酵素Ａ。
Ａ．分子量およびサブユニット構造：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた分子量は１３６ＫＤａであり、２つのサブユニット構造を有する。１つは５２ＫＤａの分子量を有するユニット（α鎖）で、もう１つは１６ＫＤａの分子量を有するユニット（β鎖）である。質量分析から求められた分子量はそれぞれ１２８ｋＤａ、４７ｋＤａ、１７ｋＤａである。
Ｂ．補酵素：
ＮＡＤＨを必要とする。
Ｃ．Ｎ末端側アミノ酸配列：
α：  Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
β：  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（Ｇｌｎ）−（Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−（Ａｒｇ／Ｓｅｒ）−Ｉｌｅ
（アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。）
Ｄ．部分アミノ酸配列：
α１：  （Ｌｙｓ）−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ
α２：  （Ｌｙｓ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ
（アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。）
Ｅ．等電点：
等電点は５．３である。
Ｆ．至適ｐＨ、至適温度：
至適ｐＨは７．４から８、至適温度は２０〜３０℃である。
Ｇ．基質特異性：
テレフタル酸二ナトリウム、２，５−ジカルボキシピリジンを分解する。
Ｈ．金属イオン、キレート試薬による影響：
０．５ｍＭ塩化鉄（ＩＩ）を添加することにより活性は上昇し、２価鉄イオン以外の各種金属イオンにより強く阻害される。また、各種キレート剤により阻害される。
【請求項２】
（１）テレフタル酸を炭素源として含む培地においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株を培養し、（２）該菌株を破砕して得られた破砕液（粗酵素液）を、（３）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させ（緩衝液としては１０％グリセリンおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭの３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５を使用）、（４）該緩衝液の塩濃度を塩化ナトリウムにより高め、その塩化ナトリウム濃度が０．２５〜０．３３Ｍの緩衝液でイオン交換樹脂より脱離することにより得られるフラクションから得る、請求項１に記載のテレフタル酸分解酵素Ａの単離方法。
【請求項３】
（１）テレフタル酸を炭素源として含む培地においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株を培養し、（２）該菌株を破砕して得られた破砕液（粗酵素液）を、（３）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させ緩衝液としては１０％グリセリンおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭの３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５を使用）、（４）該緩衝液の塩濃度を塩化ナトリウムにより高め、その塩化ナトリウム濃度が０．１０以上０．２５Ｍ未満の範囲でイオン交換樹脂より脱離することにより得られるフラクションから得る、テレフタル酸分解酵素分画物Ｂの製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の分解酵素Ａを用いてテレフタル酸を分解する３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法によって得られた分解酵素分画物Ｂを併用する、請求項４記載の３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の分解酵素Ａと請求項３に記載の方法によって得られた分解酵素分画物Ｂとを含む、テレフタル酸分解酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、テレフタル酸分解酵素組成物およびそれを用いたテレフタル酸の分解方法に関する。より詳しくは新規なアミノ酸配列を有するテレフタル酸分解酵素およびそれを用いてテレフタル酸を分解する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
テレフタル酸はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）に代表される芳香族ポリエステルの原料として工業的に大量に生産され、ポリマー製造などに主に利用されている。テレフタル酸より製造されるＰＥＴは繊維、フィルムやボトルなどに成型、加工され大量に消費されている。
【０００３】
使用されたＰＥＴボトルなどは分別回収などにより再利用するシステムが構築されつつあるが、中には海洋に漂うＰＥＴボトルのように、野原や森林、海洋など自然界に廃棄されてしまうものも少なくない。この場合、ＰＥＴの光分解や微生物分解の過程でテレフタル酸を生成することが十分考えられるが、テレフタル酸は自然界においてはやや難分解性である事が知られている。
【０００４】
テレフタル酸を分解する微生物あるいはテレフタル酸を微生物により分解する方法は従来から検討されている。具体的には特開平１０−４２８６４号公報に記載のシュードモナス属細菌により分解する方法や、特開平１０−３２７８４８号公報に記載のアルカリゲネス属細菌、ロドコッカス細菌により分解する方法が開示されている。これらの菌はとりわけ水酸化ナトリウムによるポリエステル繊維の減量加工工程より排出される廃液中のテレフタル酸を分解・浄化するのに有効であると開示されている。また、米国特許第５１２４４７９号記載のシュードモナス属細菌の変異株を用いてテレフタル酸より３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸を製造する方法が開示されている。しかしながら、本発明に示すようなテレフタル酸分解酵素に関しては記載がなく検討もされていない。
【０００５】
酵素によるテレフタル酸の分解経路については、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ菌より単離されたテレフタル酸１，２−ジオキシゲナーゼシステムに関して報告（Ｓｃｈｌａｅｆｌｉ，  Ｈａｎｓ  Ｒ．  らＪ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  （１９９４），  １７６（２１），  ６６４４−５２）がされている。この中ではテレフタル酸分解活性を有する酵素（テレフタル酸１，２−ジオキシゲナーゼ）はテレフタル酸を補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と酸素の存在下、テレフタル酸から１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸（ＤＣＤ）に変換され、生成したＤＣＤはＤＣＤデヒドロゲナーゼによりプロトカテク酸に変換される経路が開示されている。また、上記テレフタル酸１，２−ジオキシゲナーゼは２つのサブユニット構造を有し、そのＮ末端側のアミノ酸配列についても記載がなされている。
【０００６】
しかしながら、種々の工業廃液中に含まれるテレフタル酸を分解・浄化するという観点からすると、上記文献で開示されている酵素システムではプロトカテク酸という芳香族化合物が生成するため廃液処理工程への負荷を低減せしめるには不十分であり、紫外吸収を持たない脂肪族系の化合物に変換するのが好ましいと思われるが、このような酵素は見つかっていない。
【０００７】
本発明の主な目的は、新規なテレフタル酸分解酵素を提供することにある。また本発明の他の目的は、酵素を用いたテレフタル酸の分解により３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記テレフタル酸を分解する酵素について、テレフタル酸を資化しうる菌およびそれより得られる分解酵素について鋭意検討した結果、既知の分解酵素テレフタル酸１，２−ジオキシゲナーゼとは、アミノ酸配列に関して相同性が無く、またこれまで報告されている反応様式とは異なる新規酵素であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、次のとおりのものである。
１．  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４２７）株により産生されるテレフタル酸分解酵素組成物から単離された、下記特性を有するテレフタル酸分解酵素Ａ。
Ａ．分子量およびサブユニット構造：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた分子量は１３６ＫＤａであり、２つのサブユニット構造を有する。１つは５２ＫＤａの分子量を有するユニット（α鎖）で、もう１つは１６ＫＤａの分子量を有するユニット（β鎖）である。質量分析から求められた分子量はそれぞれ１２８ｋＤａ、４７ｋＤａ、１７ｋＤａである。
Ｂ．補酵素：
ＮＡＤＨを必要とする。
Ｃ．Ｎ末端側アミノ酸配列：
α：  Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
β：  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（Ｇｌｎ）−（Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−（Ａｒｇ／Ｓｅｒ）−Ｉｌｅ
（アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。）
Ｄ．部分アミノ酸配列：
α１：  （Ｌｙｓ）−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ
α２：  （Ｌｙｓ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ
（アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。）
Ｅ．等電点：
等電点は５．３である。
Ｆ．至適ｐＨ、至適温度：
至適ｐＨは７．４から８、至適温度は２０〜３０℃である。
Ｇ．基質特異性：
テレフタル酸二ナトリウム、２，５−ジカルボキシピリジンを分解する。
Ｈ．金属イオン、キレート試薬による影響：
０．５ｍＭ塩化鉄（ＩＩ）を添加することにより活性は上昇し、２価鉄イオン以外の各種金属イオンにより強く阻害される。また、各種キレート剤により阻害される。
２．  （１）テレフタル酸を炭素源として含む培地においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株を培養し、（２）該菌株を破砕して得られた破砕液（粗酵素液）を、（３）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させ（緩衝液としては１０％グリセリンおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭの３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５を使用）、（４）該緩衝液の塩濃度を塩化ナトリウムにより高め、その塩化ナトリウム濃度が０．２５〜０．３３Ｍの緩衝液でイオン交換樹脂より脱離することにより得られるフラクションから得る、上記１に記載のテレフタル酸分解酵素Ａの単離方法。
３．  （１）テレフタル酸を炭素源として含む培地においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株を培養し、（２）該菌株を破砕して得られた破砕液（粗酵素液）を、（３）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させ緩衝液としては１０％グリセリンおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭの３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５を使用）、（４）該緩衝液の塩濃度を塩化ナトリウムにより高め、その塩化ナトリウム濃度が０．１０以上０．２５Ｍ未満の範囲でイオン交換樹脂より脱離することにより得られるフラクションから得る、テレフタル酸分解酵素分画物Ｂの製造方法。
４．  上記１に記載の分解酵素Ａを用いてテレフタル酸を分解する３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸の製造方法。
５．  上記３に記載の方法によって得られた分解酵素分画物Ｂを併用する、上記４記載の３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸の製造方法。
６．  上記１に記載の分解酵素Ａと上記３に記載の方法によって得られた分解酵素分画物Ｂとを含む、テレフタル酸分解酵素組成物。
【００１０】
本発明の分解酵素による反応生成物は、３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸であり、これをもとにヒドロキシテレフタル酸を容易に合成することが可能である。また、従来公知の酵素による反応とは異なり、副生成物としてプロトカテク酸を含まないため、反応生成物の精製が容易である。また、本発明の分解酵素を利用することにより、廃テレフタル酸を利用して生成物の化合物を製造することや、上記酵素を固定化したバイオリアクターなどへの利用が可能となり得る。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のテレフタル酸分解酵素は、好気性細菌であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属の中のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株により生産することができる。この菌は、通常自然界に広く存在するものと考えられる。
【００１２】
本発明によれば、この菌はテレフタル酸を炭素源として生育、増殖することが可能であることが見いだされた。また、テレフタル酸ジメチルなどのエステル類も資化することが可能である。上記菌によって分解あるいは資化されるテレフタル酸は、液体培地や寒天培地などの培地中に溶解しているほうが菌による資化にとって好ましいため、ナトリウム塩などの金属塩やアンモニウム塩などのオニウム塩の形態であることが好ましい。
【００１３】
この菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株を増殖せしめる方法としては、培地として通常の微生物実験に用いられる培地であればいかなるものを用いても構わないが、好ましくはテレフタル酸を培地組成に含んでおり、必要に応じて無機塩などのミネラルを含む培地で生育させることが酵素の生産にとって好ましい。より好ましくは無機塩として硫酸アンモニウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの金属塩を含むものが良い。炭素源としてはテレフタル酸以外にも必要に応じてグルコースやペプトン、麦芽汁、酵母エキス、肉汁などを用いてもかまわない。培地のｐＨを一定に保つため、緩衝液を利用することが好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液や３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液などを利用できるがこれらに限定されない。また、生育温度としては２０〜３５℃の範囲で生育させるのが好ましく、培地のｐＨとしては６〜７の範囲が好ましい。
【００１４】
この菌により生産されるテレフタル酸分解酵素は、菌体のいずれの部位にあってもかまわないが、好ましくは菌の内部にあるものを精製の対象とする。テレフタル酸分解酵素を抽出する過程においては好ましくは培養により増殖した菌体を破砕し得られた液全体より単離することが好ましい。このような方法で得られる菌体の破砕液や培養後の液は不純物として様々なタンパク質や老廃物を含むため、精製することが好ましい。
【００１５】
テレフタル酸分解酵素を精製する方法としては特に制限されないが、好ましくは以下の方法により単離される。具体的にはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するイオン交換樹脂、とりわけセルロースやデキストランなどの多糖誘導体が好ましいが、たとえばファルマシア社製のＤＥＡＥセファデックスを充填したカラムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーによりその酵素の比活性が高められた酵素画分を得ることが出来る。このとき用いる緩衝液としてはリン酸緩衝液や３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液が好ましいがこれらに限定されない。緩衝液の濃度としては、０．０１Ｍから０．２Ｍが好ましく、より好ましくは０．０２〜０．１Ｍである。
【００１６】
操作は低温で行うことが好ましく、具体的には４℃前後で行うことが好ましい。また酵素の安定性を維持する目的でグリセリンやジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの添加剤を利用してもかまわない。イオン交換樹脂に吸着した酵素は、緩衝液中の塩濃度を高めることにより脱離し、回収することができる。このとき用いる塩としては、塩化ナトリウムや硫酸アンモニウムなどが好ましく利用される。塩濃度を高める方法はステップワイズ式でもグラジエント式でもよいが、酵素の純度、比活性を高める目的としてはグラジエント式が好ましい。
【００１７】
精製操作を行うにあたって、テレフタル酸分解酵素の活性はテレフタル酸の減少を追跡することにより測定し得る。テレフタル酸の定量は、高速液体クロマトグラフィーなどの方法により分析することが出来る。
【００１８】
テレフタル酸分解酵素を抽出する具体的な好ましい態様は次のとおりである。テレフタル酸及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株を含む培地において、培養により増殖した上記菌体を遠心分離操作により採集しこれを破砕する。得られた破砕液（粗酵素液）を、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させる。このとき緩衝液として、１０％グリセリンおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭの３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）を用いることができる。ついで、４℃前後において、グラジエント式によって、塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いてイオン交換樹脂に吸着した酵素を脱離させ、テレフタル酸分解酵素群を得る。
【００１９】
このような方法により得られるテレフタル酸分解酵素群は、下記に示す２つの酵素活性を有するものを含むものである。１つは補酵素ＮＡＤＨと酵素分画物Ｂの存在下、テレフタル酸を分解する活性を有するもの（酵素Ａ）と、もう１つはＮＡＤＨの存在下でチトクロームＣを還元する活性を有するもの（酵素分画物Ｂ）である。前者は酵素反応の性質からオキシゲナーゼと思われ、後者は酵素活性の性質からレダクターゼと思われる。本発明で開示しているこれらの酵素は、上記酵素Ａと酵素分画物Ｂが共存するときにテレフタル酸分解活性が最も発現されやすく、どちらか一方でもその活性を欠いた場合はテレフタル酸分解能力が有意に低下する特徴を有する。共存する好ましい割合としては、酵素Ａが１モルに対し、酵素分画物Ｂは０．１〜１０モルである。なお、酵素Ａ、酵素分画物Ｂはそれぞれ、上記条件においてその塩化ナトリウム濃度が０．１０以上０．２５Ｍ未満（酵素Ｂ）及び０．２５〜０．３３Ｍ（酵素Ａ）の範囲で分画された成分中に主に含まれる。
【００２０】
本発明によれば、テレフタル酸を酵素Ａと酵素分画物Ｂの共存下で反応させた生成物は、３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸であり、紫外可視吸収波長を持たないものが得られる。これまで公知のテレフタル酸１，２−ジオキシゲナーゼとＤＣＤレダクターゼの組み合わせではテレフタル酸からプロトカテク酸が得られるものと記載されているが、本酵素群の生成物はプロトカテク酸とは異なるものであり、酵素反応の反応機構として新規な酵素であるといえる。
【００２１】
また本発明における酵素群はプロトカテク酸を分解する活性は認められないため、公知のテレフタル酸１，２−ジオキシゲナーゼとＤＣＤレダクターゼの組み合わせにプロトカテク酸を分解する何らしかの不純物が混入したものとは考えられず、新規な反応機構を有する酵素群であることがいえる。
【００２２】
本発明の酵素の精製を進めるに従って、上記方法によれば上記酵素Ａは赤い色を有する画分として得られ、酵素分画物Ｂは黄色を呈する画分として得られる。酵素溶液が着色している理由としては、この酵素は金属あるいはポルフィリンなどの補欠因子族を含む酵素であるものと推定される。
【００２３】
酵素Ａは精製を進めることにより、単一な酵素として単離することができる。この単一な酵素Ａは以下の性状を有する。
Ａ．分子量およびサブユニット構造
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた分子量は１３６ＫＤａであり、２つのサブユニット構造を有する。１つは５２ＫＤａの分子量を有するユニット（α鎖）で、もう１つは１６ＫＤａの分子量を有するユニット（β鎖）である。質量分析から求められた分子量はそれぞれ１２８ｋＤａ、４７ｋＤａ、１７ｋＤａである。
Ｂ．補酵素
ＮＡＤＨを必要とする。
Ｃ．アミノ酸配列
α鎖とβ鎖のＮ末端側のアミノ酸配列およびα鎖の２つの部分配列を後掲の表３に示す。アミノ酸配列的には既報の配列と相同性は無く、新規酵素であることがわかった。
【００２４】
アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。
Ｄ．等電点
等電点は５．３である。
Ｅ．至適ｐＨ、至適温度
至適ｐＨは７．４から８、至適温度は２０〜３０℃である。
Ｆ．基質特異性
テレフタル酸二ナトリウム、２，５−ジカルボキシピリジンを分解する。
Ｇ．金属イオン、キレート試薬による影響
０．５ｍＭ  塩化鉄（ＩＩ）を添加することにより活性は上昇し、２価鉄イオン以外の各種金属イオンにより強く阻害される。また、各種キレート剤により阻害される。
【００２５】
本発明におけるテレフタル酸分解酵素群、及びそれに含まれる新規酵素Ａ及びＢは、テレフタル酸を含む排水の分解・浄化に利用し得る。またテレフタル酸を原料として酵素反応により生成する化合物を製造することや、本酵素を固定化したバイオリアクターなどへの利用が可能となり得る。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の目的を損なわない範囲において、これらに限定されない。
テレフタル酸分解活性の測定
テレフタル酸の分解酵素の分解活性は、その反応液のテレフタル酸の減少量を高速液体クロマトグラフィーで追跡した（定量し、算出された）。酵素反応の条件は以下の通りである。
【００２７】
酵素溶液５０μｌ、下記化合物を含むバッファー溶液２００μｌを混合し、３０℃で１５分間反応させた。反応溶液中の各化合物の最終濃度は以下の通りである。
【００２８】
０．１ｍＭ            ＮＡＤＨ
０．１ｍＭ            テレフタル酸二ナトリウム
０．０２ｍＭ          ＦｅＣｌ２
バッファーには５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−水酸化カリウム（ＫＯＨ）緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５）を用いた。
【００２９】
反応後、２５０μｌのメタノールと１００ｍＭリン酸の混合溶媒（８０／２０の混合比）を加え、失活させたのち、遠心分離で得られた上清を高速液体クロマトグラフィーでテレフタル酸残存量を測定した。高速液体クロマトグラフィーは日立製作所製のＬ−７０００シリーズ型装置を用い、カラムには資生堂ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８（ＵＧ１２０，  ５μｍ  サイズφ４．６ｍｍ×２５０ｍｍを、溶媒にはメタノール／２０ｍＭリン酸水溶液＝４０／６０を用いた。検出は紫外吸収（２４０ｎｍ）で行った。
全タンパク質量の測定
牛アルブミンタンパクを標準タンパクとし、ＢＣＡ法を用いた測定結果より重量を算出した。
酵素の比活性
酵素の比活性は酵素活性を蛋白質量で割った値を用いた。全酵素活性は１ｍｏｌのテレフタル酸を３０℃、１分で分解する活性を１ｋａｔとして計算した。
【００３０】
酵素の比活性は以下の計算式で算出した。
【００３１】
【数１】
酵素の比活性＝（全酵素活性；ｋａｔ）／（全蛋白質量；重量）
全菌体数の測定
日立製のＵ−１１００型紫外可視吸光光度計で測定した。測定波長は６６０ｎｍで行った。
【００３２】
［実施例１（テレフタル酸分解菌の単離）］
テレフタル酸を炭素源として生育可能な選択培地を用いて、産業排水などの９０サンプルから集積培養を行った。単離に用いた培地の成分を以下に示す。水はイオン交換水を用いた。
【００３３】
０．２％        （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％          テレフタル酸ニナトリウム塩
０．０１％        酵母エキス
０．００１％      ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００１％    ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０００１％    ＭｇＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０００１％    ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０００１％    ＺｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
５０ｍＭ          リン酸カリウムバッファー  ｐＨ＝６．０
その中で分解活性の高い菌を単離しスクリーニングを行った。その結果、もっとも分解活性の高い菌を単離した。その結果、本菌は、生理学的特性からＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉであると同定された。この菌の特徴を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004229619.tif 000002
［実施例２（テレフタル酸分解酵素の単離）］
単離されたＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１株の菌体を得るため、丸菱バイオエンジ（株）社製３０Ｌ容のジャーファーメンターで培養を実施した。培地には実施例１で用いた培地のテレフタル酸濃度を０．２％に高めたものを用いた。培養液は２０Ｌ用い３０℃で通気攪拌培養を行った。培養後の菌体数は（Ａ６６０）は０．７であった。培養液はすべて遠心分離を行い、菌体を採集した。その結果、菌体が濃縮された液（菌体数（Ａ６６０）＝４０）３５０ｍｌを得た。
【００３５】
この菌体が濃縮された液１５０ｍｌに、以下の化合物を添加した。
【００３６】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ、最終濃度が１ｍＭ）
ＤＮＡ分解酵素（最終濃度０．１ｍＭ）
４−アミジノフェニルメタンスルホン酸フルオリド（最終濃度０．０１ｍＭ）
α−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（最終濃度０．０１ｍＭ）
ｐｅｐｓｔａｔｉｎ（最終濃度０．０１ｍＭ）
これを氷冷下ＨＥＡＴ  ＳＹＳＴＥＭ社製ａｓｔｏｒａｓｏｎ  ＵＬＴＲＡ  ＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＲホモジェナイザーで破砕し、破砕液を得た。これを遠心分離で不溶部を除去し、粗酵素液（１２０ｍｌ）を得た。
【００３７】
次に粗酵素液をイオン交換クロマトで精製した。ＤＥＡＥセファロース（ファルマシア社製ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を緩衝液（１０％グリセリンおよび１ｍＭのＤＴＴを含むＭＯＰＳ−水酸化カリウム（ＫＯＨ）緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５））中で減圧下脱気、平衡化処理を行った。これに粗酵素液を添加し、４℃で１時間保持し、セファロース樹脂に酵素を吸着させた。これの全量をカラムに充填した（φ２．０ｃｍ×２０ｃｍ）。このカラムに３００ｍｌの上記緩衝液を添加、洗浄し（４℃、流速３１ｍｌ／ｈｒ）、不要なタンパク質を除去した。ついで塩濃度を高めることにより、吸着した酵素を脱離させた。塩濃度上昇には０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む上記緩衝液１５０ｍｌをグラジエントさせることで高めた。操作はすべて４℃で行い、カラムより出た画分はフラクションコレクターにより７．１ｍｌずつ分画した。分画されたフラクションについて、全タンパク質量およびテレフタル酸分解活性を測定した結果、塩濃度０．２５Ｍから０．３３Ｍの画分にテレフタル酸分解活性を有する赤色の画分を得た。また赤色の画分よりも塩濃度が低い領域（０．１以上０．２５Ｍ未満）で黄色い色を有するフラクションを得ることが出来た。
【００３８】
このとき得られた赤色のフラクションをさらに疎水クロマトにより精製した。フェニルセファロース（ファルマシア社製Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）を緩衝液（ＭＯＰＳ−ＫＯＨ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５、１０％グリセリン、１ｍＭのＤＴＴおよび１Ｍの硫酸アンモニウムを含むもの）中で脱気、平衡化し、上記赤色フラクション（７０ｍＬ）を０．８８Ｍの硫酸アンモニウムの存在下吸着させた。これをカラムに充填し（φ０．９ｃｍ×１６ｃｍ）、１５０ｍｌの硫酸アンモニウムを含む上記緩衝液で洗浄し、硫酸アンモニウム濃度を０．４Ｍ、０．２Ｍ、０Ｍと下げていくことにより（各５０ｍｌ添加）酵素を脱離、フラクション（各３．５ｍＬ）を回収した。流速は６８ｍＬ／ｈｒであった。酵素活性を調べて分解活性の高かったフラクションを集め、ゲルろ過による精製を行った。
【００３９】
ファルマシア社製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０をカラム（φ１．０ｃｍ×３０ｃｍ）として用い、上記フラクション０．９ｍｌを添加しゲルろ過クロマトを実施した。緩衝液には０．１Ｍの塩化ナトリウムを含むＭＯＰＳ−ＫＯＨ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５、１０％グリセリンおよび１ｍＭのＤＴＴを含むもの）を用いた。その結果、比活性が３４０にまで高められた酵素Ａを得た。
【００４０】
酵素の精製段階と、その比活性についてまとめたデータを表２に示す。
【００４１】
【表２】
0004229619.tif 000003
各クロマトグラフィーで得られた酵素についてその純度を調べるため、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。結果を図１に示す。
【００４２】
ゲルろ過クロマトを行うことにより、ゲルろ過後の酵素Ａは不純物のバンドが消失し、サブユニット構造による２つの分子鎖のバンドが確認された。
【００４３】
［実施例３（テレフタル酸分解酵素（オキシゲナーゼ様画分）の諸性質）］
実施例２によりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ４−７−１菌体より精製された酵素Ａの諸性質を調べた。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
0004229619.tif 000004
以上の結果から、今回精製された酵素ＡのＮ末端側のアミノ酸配列は公知のテレフタレート１，２−ジオキシゲナーゼと相同性はなく、新規酵素であると判断された。
【００４５】
なお、至適ｐＨの測定には、ＭＯＰＳ−ＫＯＨ緩衝液のほかに、リン酸緩衝液、トリス（ジヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液を用いた。
【００４６】
Ｎ末端側のアミノ酸配列は、アプライドバイオシステムズジャパン（株）マイクロシーケンスアナリシスシステム：ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ４７６Ａ  で分析をし、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ６１０Ａ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｒ．  １．２で解析を行った。また、部分アミノ酸配列はｌｙｓｙｌ  ｅｎｄｐｅｐｔｉｄａｓｅで消化した後、Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製されたペプチド断片について、Ｎ末端側のアミノ酸配列と同様に分析、解析を行った。
【００４７】
［実施例４（酵素Ａと黄色いフラクションの共反応）］
実施例２により単離された酵素Ａについて、下記の実施条件により１）〜３）について調べた。結果を表４に示す。
（実施条件）
１）実施例２のＤＥＡＥセファロースカラムによる精製で得られた黄色いフラクションの存在下で反応させた場合の酵素活性
酵素Ａ１２．５μｌ、黄色画分１２．５μｌ、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ＝７．５  ２５μｌ、基質のバッファー溶液２００μｌを混合し、３０℃で１５分間反応させた。基質のバッファー溶液の最終組成は以下の通りである。
【００４８】
０．１ｍＭ        ＮＡＤＨ
０．１ｍＭ        テレフタル酸ナトリウム
０．０２ｍＭ      ＦｅＣｌ２
５０ｍＭ          ＭＯＰＳ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ＝７．５
反応後、２５０μｌのメタノールと１００ｍＭリン酸の混合溶媒（８０／２０の混合比）を加え、失活させたのち、遠心分離で得られた上清を高速液体クロマトグラフィーでテレフタル酸残存量を測定した。
２）熱により失活させた黄色いフラクションの存在下での酵素活性
黄色いフラクションを１００℃で１０分間加熱処理し、失活したものを用いた以外は上記１）の方法と同様に行った。
３）熱により失活させた酵素Ａと、失活してない黄色いフラクションが共存する場合の酵素活性
酵素Ａを１００℃で１０分間加熱処理し、失活したものを用いた以外は上記１）の方法と同様に行った。
【００４９】
【表４】
0004229619.tif 000005
以上より、実施例２で単離された酵素Ａは黄色いフラクション（酵素分画物Ｂ）の共存下でテレフタル酸を最も高く分解することから、テレフタル酸の分解には両方の活性がそろうことにより最大の効果が得られることがわかった。
【００５０】
また、上記１）（酵素Ａ＋黄色いフラクション）の反応前と反応後の紫外可視吸収スペクトルを測定した。結果を図２に示す。
【００５１】
反応前の紫外可視吸収スペクトルは基質であるテレフタル酸の吸収（２４０ｎｍ付近）、酵素タンパク質の吸収（２２０および２８０ｎｍ付近）、補酵素ＮＡＤＨの吸収（２２０ｎｍ付近）が重なって見られた。
【００５２】
酵素反応と共にテレフタル酸が分解するにつれて２４０ｎｍの吸収の減少、補酵素ＮＡＤＨが消費されること（すなわちＮＡＤＨが酸化型のＮＡＤ＋に変化すること）による３４０ｎｍの減少が確認された。しかしその他の吸収スペクトルの変化は見られなかった。公知文献に記載のごとく、プロトカテク酸が生成する場合は、２５８ｎｍ付近に吸収極大の増加が観察されるが、本発明の酵素ではそのような変化は見られなかった。
【００５３】
［実施例５（酵素の反応における各種化合物の影響）］
実施例２により単離された酵素Ａ、酵素Ｂを用いて、下記の実施条件により、各金属イオン、キレート試薬の影響を調べた。結果を表５に示す。
（実施条件）
１）  テレフタル酸分解酵素活性
酵素Ａ１２．５μｌ、黄色画分１２．５μｌ、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ＝７．５  ２５μｌ、基質のバッファー溶液２００μｌを混合し、３０℃で１５分間反応させた。基質のバッファー溶液の最終組成は以下の通りである。
【００５４】
０．１ｍＭ          ＮＡＤＨ
０．１ｍＭ          テレフタル酸ナトリウム
５０ｍＭ          ＭＯＰＳ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ＝７．５
０．５ｍＭ〜１ｍＭ  各キレート試薬、金属イオン
【００５５】
【表５】
0004229619.tif 000006
テレフタル酸分解活性はＦｅＣｌ２により約２．７倍に増加したが、ＦｅＣｌ２以外の金属イオンでは強く阻害される。また、ＮａＮ３以外の各種キレート剤によっても阻害される。
【００５６】
［実施例６（反応生成物）］
実施例２と同様の操作を実施することにより得られた粗酵素液をイオン交換クロマトで精製した。ＤＥＡＥセファロース（ファルマシア社製ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を緩衝液（１ｍＭのＤＴＴを含むＭＯＰＳ−水酸化カリウム（ＫＯＨ）緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５））中で減圧下脱気、平衡化処理を行った。これの全量をカラムに充填した（φ２．０ｃｍ×２０ｃｍ）。４℃下で、これに粗酵素液４０ｍｌを添加し、セファロース樹脂に酵素を吸着させた。このカラムに２００ｍｌの上記緩衝液を添加、洗浄し（４℃、流速６０ｍｌ／ｈｒ）、不要なタンパク質を除去した。ついで塩濃度を高めることにより、吸着した酵素を脱離させた。塩濃度上昇には０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む上記緩衝液４２０ｍｌをグラジエントさせることで高めた。操作はすべて４℃で行い、カラムより出た画分はフラクションコレクターにより４ｍｌずつ分画した。分画されたフラクションについて、全タンパク質量およびテレフタル酸分解活性を測定した結果、塩濃度０．２５Ｍから０．３３Ｍの画分にテレフタル酸分解活性を有する赤色の画分を得た。また赤色の画分よりも塩濃度が低い領域（０．１以上０．２５Ｍ未満）で黄色い色を有するフラクションを得ることが出来た。
【００５７】
得られた赤色画分１ｍｌ、黄色画分１ｍｌ、基質溶液８ｍｌを混合し、３０℃で２時間反応させた。基質の溶液の最終組成は以下の通りである。
【００５８】
１ｍＭ            ＮＡＤＨ
１ｍＭ            テレフタル酸ナトリウム
０．０２ｍＭ      ＦｅＣｌ２
これより生成物として３，４−ジヒドロキシ−１，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸を得た。この生成物の１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）と１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ）は次の通りであった。また、プロトカテク酸は１Ｈ−ＮＭＲで６．８２，７．３３，７．３８（ｐｐｍ）にピークを持つが、反応溶液中からはこれらのピークは検出されなかった。
【００５９】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：４．９９（１Ｈ），５．８７（１Ｈ），６．４６（１Ｈ），６．５１（１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：７３．０１，７５．５６，１２６．６１，１２８．５１，１３３．００，１３６．９８，１７４．３７，１８１．４２
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、新規テレフタル酸分解酵素を提供することができる。本発明の酵素を用いることにより、テレフタル酸を紫外吸収の低い化合物に変化させることや、本発明の酵素を固定化したバイオリアクターなどへの応用が期待される。
【００６１】
【配列表】
<110> 国立大学法人  京都工芸繊維大学
<110> 帝人株式会社
<120> テレフタル酸分解酵素組成物およびそれを用いた３，４-ジヒドロキシ-１，５-シクロヘキサジエン-１，４-ジカルボン酸の製造方法
<130> P35682
<150> JP2001-84663
<151> 2001-3-23
<160> 6
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<400> 1
Asn Val Ile Pro Ile Lys LeuAla Arg Arg Ala Ser Val Ala Trp Pro
1            5                10                 15
Glu Glu Gly LeuThr Arg Val Pro
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 13, 14, 19
<400> 2
Ala Ala Leu Asp IleHis Gln Ala Ile Ala Arg Ala Xaa XaaGlu Tyr
1              5               10                 15
Val Arg Xaa Ile
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 1
<400> 3
Xaa Asp Ser Tyr His Ala Ser Ile Leu His Leu PhePhe Thr ThrPhe
1              5                 10                 15
Gln Leu Asn Arg
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 1
<400> 4
Xaa Leu Arg Val Ala Thr Leu His GlyLeu Val Phe Gly Ser Phe
1              5                 10                 15
Ser Asp Asp Val Ala
20
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni
<220>
<221> UNSURE
<222> 9
<400> 5
Met Gln Glu Ser IleIle Gln TrpXaa Gly Ala Thr Asn ThrArg Val
1              5                10                15
Pro
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni
<400> 6
Met Ile Asn GluIle Gln IleAla Phe Asn Ala Ala Tyr Ala LysThr
1             5                10                15
Ile Asp Ser Asp Ala Met GluGln
20
【図面の簡単な説明】
【図１】  アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による測定結果。
【図２】  実施例４の１）における酵素反応前と反応後の紫外可視吸収スペクトル。
【図１】
0004229619.tif 000007
【図２】
0004229619.tif 000008