(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（Ｉ）で表されることを特徴とするエステル：
0004387464.tif 000014
式中：
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素原子、メチル基を表し、
Ａは、以下の基を表し：
0004387464.tif 000015
Ｒ4及びＲ5は同一であるか又は異なるものであり、それぞれ以下のかたちの分子鎖を表す：
0004387464.tif 000016
式中：
Ｂは以下の基であり：
0004387464.tif 000017
Ｃは以下の基であり：
0004387464.tif 000018
指数ｍ、ｎ、ｐ及びｑはそれぞれ０〜４の範囲にある整数であるが、ただし、それらの合計ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは０〜４の範囲にある整数に限定される。
【請求項２】
Ｒ4及びＲ5が水素を表すことを特徴とする請求項１記載のエステル。
【請求項３】
基Ｒ4及びＲ5のうち少なくとも１つが水素を表すことを特徴とする請求項１記載のエステル。
【請求項４】
基Ｒ4又はＲ5の一方が水素を表し、他方が２，５−ジヒドロキシベンゾイル基を表すことを特徴とする請求項３記載のエステル。
【請求項５】
アルファ−トコフェロール、ベータートコフェロール、ガンマートコフェロール、ゼータ  １−トコフェロール、ゼータ  ２−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、イータートコフェロール、イプシロンートコフェロール及びトコールのエステルからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のエステル。
【請求項６】
以下の式（ＩＩ）を満たすエステル。
0004387464.tif 000019
【請求項７】
以下の式（ＩＩＩ）を満たすエステル。
0004387464.tif 000020
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のエステルの少なくとも１つを化粧用有効成分として含有することを特徴とする化粧用組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のエステルの少なくとも１つを薬用有効成分として含有することを特徴とする薬用組成物。
【請求項１０】
さらに化粧学的又は薬学的若しくは皮膚科学的に許容される少なくとも１つの油を含有する脂肪相を含むことを特徴とする請求項８又は９記載の組成物。
【請求項１１】
前記油は、ホホバ油、マカダミア油、リムナンセス（Limnanthes）種子油、鉱油、並びに、トリグリセリド、又は、これらの混合物からなる群より選択される請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
エステル濃度が、最終組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の範囲にあることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
エステル濃度が、最終組成物の全重量に対して０．１重量％〜１重量％の範囲にあることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3がそれぞれメチル基を表し、
Ａが以下の基を表し：
0004387464.tif 000021
Ｒ4及びＲ5が上述した意味を持つものである、請求項１に記載の化学式Ｉに相当するアルファ−トコフェロールエステルの少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ６、Ｂ１２、Ｅ、Ｃ、ＰＰ、レチノイン酸、レチナール、レチノール及びそのエステル、サリチル酸及びその誘導体、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、トコフェロール及びそのエステル、アジアチン酸（asiatic acid）、マデカシン酸（madecassic acid）及びそのグリコシド含有エステル、アジアチコサイド（asiaticoside）、センテラ・アジアチカ（Centella asiatica）の抽出物、シーゲスベッキア・オリエンタリス（Siegesbeckia orientalis）の抽出物、プロアントシアニド（proantocyanide）オリゴマー及びそのエステル、アスコルビン酸の誘導体、エリソルビン酸、微量成分（oligoelement）、アルファ−ヒドロキシル化酸及びそのエステル、アミノ酸、セラミド、フォトセラミド（photoceramide）、エクジステロイド及びそのエステルからなる群より選択される少なくとも１つの他の有効成分を含有することを特徴とする請求項８〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化学式Ｉのエステルは、ビタミンＡと組み合わせて使用されることを特徴とする請求項８〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのエステルを含む化粧剤。
【請求項１８】
皮膚に対するフリーラジカルの有害な作用を回避し又は減少させ、吹き出物及び皮膚のチクチク感やヒリヒリ感を防止し又は治療し、ケラチン生成細胞の分化を促進し、表皮の標準保湿作用を回復させ、肌のきめの細かさを改善し、皮膚の老化作用を遅らせるか又は治療し、しわの発生や皮膚のたるみを遅らせるか又は治療し、過剰な色素沈着を薄くし、皮膚の老化によるしみを治療するための化粧用組成物であって、請求項１７に記載の化粧剤を含む組成物。
【請求項１９】
ラジカルや炎症に対する作用を持つか又は皮膚神経終末に対する麻酔作用を持つ皮膚科学用薬用組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのエステルを薬用有効成分の１つとして含有する組成物。
【請求項２０】
最終組成物の０．００１重量％〜５重量％の範囲にある濃度で前記化学式Ｉのエステルを含有することを特徴とする請求項１８又は１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規物質であるトコフェロールエステル、化粧品及び医薬品、特に皮膚科学でのその使用に関するものであり、更に、それを含有する化粧用又は薬用、特に皮膚科学用の組成物にも関する。
先行技術の要約
アルファ−トコフェロール又はビタミンＥは、通常ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロール等の他の化合物とともに、多数の植物中に自然な状態で見出されることが知られている。
アルファ−トコフェロールは、本質的に、ビタミンＥ欠乏症の克服のために、又は、特に筋肉の衰えを克服するための栄養剤として用いられる。
また、抗酸化剤としても用いられるが、有効用量が多い。
本発明の要約
本発明においては、極めて驚くべきことで予想外のことであるが、新規のトコフェロールエステル、並びに、この新規トコフェロールエステルが、ラジカルや炎症に対して、また、ケラチン生成細胞の分化の改善、皮膚の保湿の改善、肌のきめの細かさの改善、抗老化作用、色素脱失作用、及び、皮膚神経終末に対する麻酔作用において強力な活性を発揮する事実を見出した。
すなわち、本発明は、ラジカルや炎症、老化に対して、また、色素脱失、ケラチン生成細胞の分化の改善、皮膚の保湿、肌のきめの細かさについて良好な活性を有し、かつ、特に局部又は全身適用による皮膚神経終末に対する麻酔作用をも有する有効物質であって、化粧用、薬用及び特に皮膚科学用組成物の調製において価値のある有効成分を構成するものを供給するという新規の技術的課題を解決しようとするものである。
本発明は、この新規の技術的課題を、非常に簡便でかつ工業的規模での使用に適した手段により満足に解決するものである。
本発明の詳細な説明
すなわち第一の側面において、本発明は、下記化学式（Ｉ）で表されることを特徴とするエステルに関する：
0004387464.tif 000002
式中：
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素原子、メチル基を表し、
Ａは、以下の基を表し：
0004387464.tif 000003
Ｒ4及びＲ5は同一であるか又は異なるものであり、それぞれ以下のかたちの分子鎖を表す：
0004387464.tif 000004
式中：
Ｂは以下の基であり：
0004387464.tif 000005
Ｃは以下の基であり：
0004387464.tif 000006
指数ｍ、ｎ、ｐ及びｑはそれぞれ０〜４の範囲にある整数であるが、ただし、それらの合計ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは０〜４の範囲にある整数に限定される。
本発明の一態様において、上記エステルは、Ｒ4及びＲ5が水素を表すことを特徴とする。
本発明の一態様において、上記エステルは、基Ｒ4及びＲ5のうち少なくとも１つが水素を表すことを特徴とする。
本発明の一態様において、上記エステルは、基Ｒ4又はＲ5の一方が水素を表し、他方が２，５−ジヒドロキシベンゾイル基を表すことを特徴とする。
本発明の一態様において、上記エステルは、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、ゼータ  １−トコフェロール、ゼータ  ２−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、イータ−トコフェロール、イプシロン−トコフェロール及びトコールのエステルからなる群より選択されることを特徴とする。
本発明の一態様において、本発明は、以下の式（ＩＩ）を満たすエステルに関する。
0004387464.tif 000007
本発明の一態様において、本発明は、以下の式（ＩＩＩ）を満たすエステルに関する。
0004387464.tif 000008
以下では上記式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のエステルを、それぞれ式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）のアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステル、あるいは、「ジエステルＡ1」及び「ジエステルＡ2」という。
第二の側面において、本発明は、上述した式（Ｉ）のエステルの少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする化粧用又は薬用組成物、特に皮膚科学用組成物にも関する。
一態様において、上記組成物は、上述したエステルの少なくとも２つを混合物の状態で有効成分として含有することを特徴とする。
一態様において、上記組成物は、上記エステルが上記組成物の脂肪相に存在するものであることを特徴とする。
別の態様において、上記組成物は、上記脂肪相が化粧学的又は薬学的若しくは皮膚科学的に許容される少なくとも１つの油、特に、ホホバ油、マカダミア油、リムナンセス（Limnanthes）種子油、特にリムナンセス・アルバ・ベンス（Limnanthes alba Benth）からのもの（Meadowfoam）、鉱油、並びに、トリグリセリド、特にカプリル酸及び／若しくはカプリン酸に基づくトリグリセリド、又は、これらの混合物からなる群より選択される油を含有するものであることを特徴とする。
一態様において、上記組成物は、上記式Ｉのエステルの濃度が、最終組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の範囲、好ましくは０．０１重量％〜１重量％の範囲にあることを特徴とする。
特別な一態様において、上記組成物は、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3がそれぞれメチル基を表し、
Ａが以下の基を表し：
0004387464.tif 000009
Ｒ4及びＲ5が上述した意味を持つものである上記化学式Ｉに相当するアルファ−トコフェロールエステルの少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする。
別の態様において、上記組成物は、少なくとも１つの他の有効成分、特に、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ６、Ｂ１２、Ｅ、Ｃ、ＰＰ、レチノイン酸、レチナール、レチノール及びそのエステル、サリチル酸及びその誘導体、特にその塩又はエステル、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、トコフェロール及びそのエステル、特にトコフェロールリン酸エステル、アジアチン酸（asiatic acid）、マデカシン酸（madecassic acid）及びそのグリコシド含有エステル、アジアチコサイド（asiaticoside）、センテラ・アジアチカ（Centella asiatica）の抽出物、シーゲスベッキア・オリエンタリス（Siegesbeckia orientalis）の抽出物、プロアントシアニド（proantocyanide）オリゴマー、特にブドウ種子から得られたもの、及びそのエステル、特にパルミチン酸及びステアリン酸エステル、アスコルビン酸の誘導体、特にそのリン酸エステル及びその塩、エリソルビン酸、微量成分（oligoelement）、特に塩の状態のもの、具体的にはアスパラギン酸塩又はマグネシウム、セレン、亜鉛若しくは銅の塩化物の状態のもの、アルファ−ヒドロキシル化酸、特にリンゴ酸、乳酸及び酒石酸、及びそのエステル、特にステアリルアルコール等の脂肪族アルコールとのエステル、アミノ酸、特にセリン、スレオニン、シトルリン及びＮＭＦ（天然保湿成分（Natural Moisturizing Factor）:K.Sakamoto,Cosmet.Toilet.（1984）99（3）109-117）を構成するアミノ酸、セラミド、特に単独又は混合物で用いる２、３又は６セラミド、フォトセラミド（photoceramide）、特に小麦から抽出されたもの、並びに、エクジステロイド、特にエクジステロン、及びそのエステルからなる群より選択されるものを含有することを特徴とする。
別の特別な態様において、上記組成物は、上記式Ｉのエステルを、ビタミンＡ、好ましくはパルミチン酸エステル等のエステルの形態のものと組み合わせて使用することを特徴とする。
第三の側面において、本発明は、好ましくは上記化粧用組成物に配合された、少なくとも１つの上述した式Ｉのエステルの化粧剤としての使用にも関する。
化粧剤としてのそれの使用においては、上記式（Ｉ）のエステルは、皮膚に対するフリーラジカルの有害な作用を回避し又は減少させ、吹き出物及び皮膚のチクチク感やヒリヒリ感を防止し又は治療し、ケラチン生成細胞の分化を促進し、表皮の標準保湿作用を回復させ、肌のきめの細かさを改善し、しわの発生や皮膚のたるみ等の皮膚の老化作用を遅らせるか又は治療し、過剰な色素沈着、特に皮膚の老化によるしみを薄くするために用いられる。
フリーラジカルの有害な作用には、酸素から構成されるフリーラジカルによる特に有害な作用、すなわち皮膚構成物質、特にケラチン生成細胞等の細胞の膜脂質の過酸化物化が含まれる。酸素から構成されるこのフリーラジカルは、温度、日光、及び、自動車の排気ガスも含めた産業汚染物質の複合作用により、その濃度が汚染大気中でますます増加している。このフリーラジカルは皮膚の老化を加速させるが、その作用を、本発明のエステルを用いることで防止し又は治療し若しくは緩和することができる。
第四の側面において、本発明は、ラジカルや炎症に対する作用を持つか又は皮膚神経終末に対する麻酔作用を持つ薬用組成物、特に皮膚科学用組成物調製のための、上述した式Ｉのエステルの少なくとも１つの使用にも関する。
一態様において、上記組成物は最終組成物の０．００１重量％〜５重量％、好ましくは０．０１重量％〜１重量％を含有する。
第五の側面において、本発明は、特に最終組成物の０．００１重量％〜５重量％の範囲、好ましくは０．０１重量％〜１重量％の範囲にある濃度で上記式Ｉのエステルを含有する組成物として、上述した式Ｉのエステルの少なくとも１つを化粧学的に有効な量で人間の皮膚に局部的に適用することを特徴とする化粧的処置方法にも関する。
第六の側面において、本発明は、特に最終組成物の０．００１重量％〜５重量％の範囲、好ましくは０．０１重量％〜１重量％の範囲にある濃度で上記式Ｉのエステルを含有する組成物として、上述した式Ｉのエステルの少なくとも１つを治療上有効な量で人間の皮膚に局部的に適用することを特徴とする治療的処置方法にも関する。この治療的な用途において、本発明は、ラジカルや炎症に対する作用、又は、皮膚神経終末に対する麻酔作用を得ることを可能にする。
以上の記載から理解できるように、本発明の組成物は、化粧品、皮膚科学又は薬学での使用が許容される全ての剤型で調剤できる。特に、クリーム、ローション、エマルション又は実際にローションによって構成されうる。
以下に各種実施例を用いて本発明を詳述するが、これらは単に例示のために掲げたものであるので、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。更に、添付した１の図面を参照する。
添付した１の図面の説明
添付した１の図面は、本発明のＤＨＢＴが試験濃度で抑制可能な細胞毒性を生み出すフリーラジカルの発生成分として用いた過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）濃度を横軸に沿ってプロットし、標準ヒトケラチン生成細胞即ちＫＨｎに対するニュートラルレッド試験により得られた細胞生存の百分率を縦軸に沿ってプロットしたグラフである。
実施例では、特に記載したもの以外は、百分率は重量基準で示し、温度は室温であって、気圧は大気圧であった。温度が記載されている時は、セ氏で表す。
実施例１：アルファ−トコフェロールと２，５−ジヒドロキシ安息香酸のエステルの合成
この反応は、２，５−ジヒドロキシ安息香酸をアルファ−トコフェロールと反応させて、上記化学式Ｉを持つエステルを形成させることに基づくものである。その式中、Ａは以下の基を表し：
0004387464.tif 000010
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれメチル基を表し；
Ｒ4及びＲ5は上述した意味を持つ。
より具体的には、このエステルの合成は以下のように行った。
半月型の攪拌機、温度計、冷却器及びディーンシュターク装置を備えた２リットルのフラスコに、アルファ−トコフェロール１７２．３ｇ（０．４モル）、キシレン６００ｇ及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸１２３．２ｇ（０．８モル）を満たした。
９６％硫酸５６ｇを２５℃で加えることにより、発熱反応が生じた。
得られた液体を約７時間のあいだ蒸留した。５０℃に冷却し、約１０００ｇが乳化した後、クロロホルム２５００ｇを加えてクロロホルム抽出を行った。
有機相を炭酸ナトリウムの２％水溶液５００ｇと水１５００ｇで洗浄した。この混合物を静置して、水相を分離した。
クロロホルム主体の有機相を蒸留して、８９％収率でアルファ−トコフェロールエステル２０３．４ｇを得た。アルファ−トコフェロールエステルは暗褐色の粘性液体という状態であった。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて面積比から判断すると、この液体は、トコフェロール６．３％、アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸のエステル４９％、及び、他の物質３４％からなるものであった。
精製方法
半月型の攪拌機、温度計及び冷却器を備えた２リットルのフラスコに、先の工程で得られたアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルを含有する粘性液体１８０ｇを、トルエン６００ｇとともに満たした後、粉末状の活性炭を投入した。
活性炭と接触させて数時間が経過した後、活性炭をろ別してこの液体をきれいにし、トルエンを留去した。これによりアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステル１１６ｇを得た。収率は６４％であった。アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルは褐色の粘性液体という状態であった。
更なるＨＰＬＣ分析により、アルファ−トコフェロール１０．４％、アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステル５４％、及び、他の物質３１％であることが分かった。この分析は、エステルがアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸のエステルであることを確認した。
アルファ−トコフェロールを用いて示したこの実施例は、他のトコフェロールを用いて困難なく実施可能であることが理解できよう。
実施例２：純粋なアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸モノエステルの製造
アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸モノエステルは、４０℃〜６０℃の範囲という低めの温度で、２時間〜４時間という短めの反応時間をかけて反応を行うこと以外は、実施例１に記載の合成条件を用いて好収率で得ることができる。
このような条件下で得られた主な反応生成物は、クロロホルム溶液という状態のアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸のジエステル及びモノエステルの混合物である。これを以下ではＳＣという。これらのエステルは以下の方法を用いて分離できる。
Ａ−アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸モノエステルの精製
上で得られた１００ｍｇ／ｍＬのクロロホルム溶液ＳＣから、溶離液系としてヘキサン及び酢酸エチルの混合物（容積比で８０／２０）と、例えばＭｅｒｃｋ  Ｆ２５４プレートを用いて、分取シリカクロマトグラフィーを行った。３２０ｎｍでのＵＶ吸収により確認したフラクションを採取した。これを濃縮して乾燥した。アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸モノエステルから構成されるｒｆが０．６の生成物を得た。
アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸モノエステルは淡いベージュ色の粘性液体という状態であって、短波及び長波のＵＶ下で蛍光を発し、クロロホルム及びエタノールに可溶であった。
その実験式はＣ36Ｈ54Ｏ5であって、分子量は５６６ｇであった。
そのＵＶスペクトルは以下のλｍａｘに特徴がある：３３０ｎｍ、２８６ｎｍ、２７７ｎｍ。
電子衝撃質量分析（７０ｅＶ）により、以下のＭ+特性フラグメントが得られた：５６６、４３０、４１６、３０１。
その展開した化学式は以下のようであった：
0004387464.tif 000011
Ｂ−アルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステルの精製方法
１００ｍｇ／ｍＬの上記クロロホルム溶液ＳＣから、溶離液系としてヘキサン及び酢酸エチルの混合物（容積比で２０／８０）を用いて、例えばＭｅｒｃｋ  Ｆ２５４プレート上で分取シリカクロマトグラフィーを行った。３２０ｎｍでのＵＶ吸収により確認した大部分のフラクションを採取して、これを濃縮し減圧下乾燥した。
２種類のアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステルの混合物、すなわち第二の２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルが第一のエステルのオルト置換基を構成するというジエステルであって、上記式（ＩＩ）の「ジエステルＡ1」と言及したもの、及び、第二の２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルが第一のエステルのメタ位の置換基であるジエステルであって、上記式（ＩＩＩ）の「ジエステルＡ2」と言及したもの、から構成されるｒｆが０．４５の生成物を得た。
それぞれ式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を持つアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステルの混合物の特徴は以下のようである：ｒｆが０．４５の淡い黄土色の粘性液体、短波及び長波のＵＶ下での蛍光、クロロホルム及びエタノールに可溶。実験式はＣ43Ｈ58Ｏ8で分子量は７０２、ＵＶスペクトルは３３８ｎｍ、２８６ｎｍ及び２７７ｎｍにλmaxを持つ。電子衝撃質量分析（７０ｅＶ）は、以下のＭ+特性フラグメントを与えた：７０２、６７０、６６２、６４７、５６６、４３０、４１６、３０１。
例えば、ジエステルＡ1及びＡ2は、以下の条件での溶離溶媒を用いてＣ−１８シリカプレート（ＭＥＲＣＫ製のＦ２５４▲Ｒ▼）上でその混合物をクロマトグラフィーにかけて分離できる：以下の体積比のメタノール／水／酢酸／テトラヒドロフラン：８８．４／７．６／３．９２／０．０８。
シリカカラムを用いて工業的な分取クロマトグラフィーによりこれら２つのジエステルを分離する目的では、溶離液としてヘキサンと酢酸エチルの９５／５混合物を用いることが好ましい。
ジエステルＡ1は、分子イオン（７０２）付近のフラグメントイオンの相対強度が以下のようである：７０２（１０）、６７０（７０）、６６２（１４）、６４７（２２）。
ジエステルＡ2は、分子イオン（７０２）付近のフラグメントイオンの相対強度が以下のようである：７０２（３）、６７０（２５）、６６２（２８）、６４７（４８）。
実施例３：フリーラジカルの細胞毒性に対するアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルの保護作用の研究
１．試験原理
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた各種濃度のアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸（以下では「ＤＨＢＴ」という）について、培養培地に存在する過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）により生じた各種濃度の酸素含有フリーラジカルに曝した標準ヒトケラチン生成細胞（ＫＨｎ）の培養株で試験を行った。
各試験濃度について、いわゆる「ニュートラルレッド」試験で細胞生存率を評価した。
この試験は、本質的に比較することからなる、すなわち：
−過酸化水素は投入していないが、処置培養株と同じくＤＭＳＯに溶かしたＤＨＢＴは投入した参考培養株（コントロール）；
−過酸化水素は投入せず、ＤＨＢＴの溶媒であるＤＭＳＯのみを、ＤＨＢＴで処置した培養株のものと同量で投入した培養株（ＤＭＳＯ参考）。
ＤＭＳＯに溶かして実際に試験に用いたＤＨＢＴは、実施例１で得られたアルファ−トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルの混合物であった。
２．試験手順
ａ）ケラチン生成細胞の由来
健康な皮膚から外科手術により採取した標準ヒトケラチン生成細胞（ＫＨｎ）を用いた。
ｂ）培養条件
上記ＫＨｎを完全無血清培地（ＳＦＭ）（以下ではＳＦＭｃという。Ｇｉｂｃｏ製）で保持した。細胞を連続的に７度培養して、その７度目に、ＫＨｎ細胞（Ｐ７という）を集めた。
ｃ）処理条件
無血清培地であるＧｉｂｃｏ製のＫ−ＳＦＭ培地の９６ウェル培養プレートにウェルあたり１０００ＫＨｎの割合でＰ７ＫＨｎ細胞を接種してから２４時間後に、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ及び１００μＭという各種濃度の過酸化水素（Ｈ2Ｏ2、Ｓｉｇｍａ、番号Ｈ−１００９）で処理した。更に、上記濃度のＨ2Ｏ2のそれぞれに関して、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬという３種類の濃度のトコフェロールゲンチジン酸で処理した。
ＫＨｎ細胞を各種物質とともに、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ製、番号：１４１７５−０５３）中、３７℃で１時間培養した。培養後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄して、リソソームの活性を明らかにすることによる生死判断試験を構成するニュートラルレッド試験を行った。
ｄ）ニュートラルレッド試験
この試験のため、ダルベッコりん酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ製、番号：１４１９０）で細胞を洗浄した。
この後、ウェルあたり２００μＬで、ＳＦＭｃ培地中１．２５％（ｖ／ｖ）のニュートラルレッド溶液（水中０．４％の母液）と細胞を３７℃で３時間培養した。
生存している細胞のみが赤色を帯びる。従って、光学密度という観点から測定した赤色の強度は、生存細胞の数に直接依存する。
培養後、細胞をＰＢＳで洗浄した。
その後、５０％エタノール＋１％酢酸の混合物１００μＬを各ウェルに加えた。
プレートを１５分間攪拌した。
次いで光学密度を分光測光法により５４０ｎｍで測定した。
細胞生存率は以下の式を用いて、百分率で表示する。
0004387464.tif 000012
式中、ＤＨＢＴ濃度の各値に関して、ＤＯTBは「コントロール」培養株の光学密度であり、ＤＯPHは過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を含む培養株の光学密度である。
３．結果
得られた結果を以下の表Ｉにまとめる。
0004387464.tif 000013
更に、添付した１の図面に同じ結果を曲線としてプロットした。
本発明のＤＨＢＴが試験濃度で抑制可能な細胞毒性を生起するフリーラジカルの発生成分として用いる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の濃度を横軸に沿ってプロットする一方、標準ヒトケラチン生成細胞即ちＫＨｎに対するニュートラルレッド試験で得られた細胞生存の百分率を縦軸に沿ってプロットした。
丸による曲線は、過酸化水素は含むがＤＨＢＴは投入しなかった培養株に対応する。四角形による曲線は、ＤＭＳＯに溶かした本発明のＤＨＢＴを０．１μｇ／培地１ｍＬの濃度で投入した培養株に対応する。三角形による曲線は、ＤＭＳＯに溶かした本発明のＤＨＢＴを１μｇ／培地１ｍＬの濃度で投入した培養株に対応する。最後に、バツ印による曲線は、本発明のＤＨＢＴを１０μｇ／培地１ｍＬの濃度で投入した培養株に対応する。
ＤＭＳＯ参考に対応する培養株はＤＨＢＴが投入されておらず、その溶媒であるＤＭＳＯのみが投入されていることに注意されたい。
表Ｉ及び添付した１の図面にプロットした曲線からは、過酸化水素を２５μＭ以上で用いると、細胞生存率が約１００％から急速に落ち込むので、過酸化水素がケラチン生成細胞にとって毒性であることが分かる。
しかしながら、過酸化水素と１０μｇ／ｍＬという濃度の本発明のＤＨＢＴとで細胞を処理すると、過酸化水素の毒性はその濃度が７５μＭになるすなわち濃度が３倍大きくなるまで観察されない。このことはケラチン生成細胞がフリーラジカルの攻撃に対する実質的な耐性を獲得し、この耐性が上記濃度のＤＨＢＴにより達成されることを証明している。
すなわちこのテストは、抗ラジカル作用が、具体的に言うと薬用組成物、特に皮膚科学用組成物、若しくは化粧用組成物を製造するために、又は、化粧剤として、特に有効であることを明らかにしている。
加えて、酸素含有フリーラジカルが皮膚脂質を過酸化物化することを考えれば、本発明は、皮膚の老化作用を効果的に予防し又は治療することを可能にする。特に、フリーラジカルに起因する上記効果、具体的には、大気汚染により生じる上記効果。
以下に化粧用又は薬用、特に皮膚科学用組成物の様々な実施例を掲げて本発明を説明するが、単に例示のために掲げるので、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。
実施例では、濃度はグラムで計算した。
実施例４：抗しわ用クリーム
このクリームは以下の有効成分を用いて調製した：
−実施例１の精製トコフェロールエステル．．．．．．．．．．．．０．１ｇ
−ホホバ油．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｇ
−ゴマ油．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３ｇ
−パルミチン酸エステル形のビタミンＡ．．．．．．．．．．．．．０．０１ｇ
−グリセロール．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｇ
−水＋防腐剤＋界面活性剤＋芳香剤．．．．．．．．．．．合計１００ｇ
このクリームは以下のようにして調製した。まず、ホホバ油とゴマ油を混合した中にトコフェロールエステルを溶かした後、ビタミンＡのパルミチン酸エステルとグリセロールを加え、最後に、界面活性剤系を含んだ水相を加え、混合物を攪拌して均一にした。
以上により得られたクリームは、数週間にわたって夜に塗布すると、肌のきめを細やかにし、肌の色を明るくし、しわの外観を消失させる。
実施例５：エマルションタイプの抗老化用組成物
この組成物は以下の有効成分から調製した：
−実施例２で製造したトコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステルの混合物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．０２５ｇ
−商品番号ＴＥＦＯＳＥ６３▲Ｒ▼として市販されているポリエチレングリコール６とポリエチレングリコール３２のステアリン酸エステル．．．．１５ｇ
−パルミチン酸セチル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３ｇ
−セチルアルコール．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３ｇ
−２−ヘキシル−１−ドデカノール．．．．．．．．．．．．．．５ｇ
−グリセリン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３ｇ
−２％カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）９８０▲Ｒ▼ゲル．．．．．５ｇ
−精製水＋防腐剤＋芳香剤．．．．．．．．．．．．．．合計１００ｇ
このエマルションを調製するには、まず、トコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステルの混合物を脂肪相と混合して、完全に溶解させた。なお、上記脂肪相は、グリセリン、ポリエチレングリコールのステアリン酸エステル、パルミチン酸セチル、セチルアルコール及びオクチルドデカノールから構成されるものである。その後、精製水を攪拌下で加えてエマルションを形成させ、カルボポールを加えてエマルションをゲル化した。
エマルション又はクリーム形成性組成物が得られたが、これは抗老化用ケアークリームとして数週間にわたり局部に塗布する。
実施例６：皮膚科学用ローションタイプの組成物
皮膚科学用組成物を以下の有効成分から得た：
−実施例２で得られたトコフェロール２，５−ジヒドロキシ安息香酸ジエステルの混合物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５ｇ
−無水エタノール．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３５ｇ
−芳香性精製水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．合計で１００ｇ
まずジエステルを無水エタノールに混合した後、ローションが得られるように攪拌しながら精製水を加えることで、上記組成物を調製した。
このローションを皮膚に塗布すると、抗老化作用を呈し、皮膚のきめを細やかにし、肌の色を明るくした。
【図１】
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