(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させる５’調節エレメントであるＤＮＡであって、
転写方向に向かって
配列番号１により表されるＤＮＡ配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、トウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターと同等の機能を有する配列からなる第１のＤＮＡ配列と、
配列番号２により表されるＤＮＡ配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、コメアクチンの第１のイントロンと同等の機能を有する配列からなる第２のＤＮＡ配列
を含むことを特徴とする前記ＤＮＡ。
【請求項２】
第１のＤＮＡ配列が配列番号１により表されるＤＮＡ配列から構成されることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
第２のＤＮＡ配列が配列番号２により表されるＤＮＡ配列から構成されることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列の間に中性ＤＮＡフラグメントを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
単子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させる５’調節エレメントであるＤＮＡであって、配列番号３により表されるＤＮＡ配列又は前記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する相同配列を含むことを特徴とする前記ＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３により表されるＤＮＡ配列から構成されることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
コーディング配列と、単子葉植物細胞又は単子葉植物で機能することが可能な５’及び３’位異種調節エレメントを含むキメラ遺伝子であって、５’調節エレメントが請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする前記キメラ遺伝子。
【請求項８】
コーディング配列が選択マーカーをコードする遺伝子、形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子、及び形質転換単子葉植物の農学的品質を改良する遺伝子から選択されることを特徴とする請求項７に記載のキメラ遺伝子。
【請求項９】
形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子が、所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子、所定の昆虫に対する耐性を付与する遺伝子、及び所定の疾病に対する耐性を付与する遺伝子から選択されることを特徴とする請求項８に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１０】
所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子が、ビアラフォスに対する耐性を付与するＢａｒ遺伝子、ＥＰＳＰＳを標的とする除草剤に対する耐性を付与する適当なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子、グリホセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、及びＨＰＰＤを標的とする除草剤に対する耐性を付与するＨＰＰＤをコードする遺伝子から選択されることを特徴とする請求項９に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１１】
所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子が、ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子及びＨＰＰＤをコードする遺伝子から選択されることを特徴とする請求項１０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１２】
ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子が二重突然変異ＥＰＳＰＳ及びＣＰ４から選択されることを特徴とする請求項１１に記載のキメラ遺伝子であって、二重突然変異ＥＰＳＰＳは、１０２と１０６の２つの突然変異を有し、かつ、ＥＰＳＰＳ活性を有するＥＰＳＰＳである前記キメラ遺伝子。
【請求項１３】
ＥＰＳＰＳ又はＨＰＰＤをコードする配列の前にトランジットペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１１又は１２に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１４】
前記トランジットペプチドが最適化トランジットペプチドであることを特徴とする請求項１３に記載のキメラ遺伝子であって、最適化トランジットペプチドは、転写方向に向かって、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列の一部と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子の第２のトランジットペプチドをコードする配列を含むものである前記キメラ遺伝子。
【請求項１５】
転写方向に向かって３’調節配列に機能的に結合したトランジットペプチド／着目タンパク質融合タンパク質をコードする配列に機能的に結合した請求項１から６のいずれか一項に記載の５’調節配列を含むことを特徴とする前記キメラ遺伝子。
【請求項１６】
着目タンパク質が請求項１０から１２のいずれか一項に記載の所定の除草剤に対する耐性を付与する酵素であることを特徴とする請求項１５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１７】
トランジットペプチド／着目タンパク質融合タンパク質をコードする配列が、ＯＴＰ／二重突然変異ＥＰＳＰＳ融合タンパク質をコードする配列及びＯＴＰ／ＣＰ４融合タンパク質をコードする配列から選択されることを特徴とする請求項１５に記載のキメラ遺伝子であって、二重突然変異ＥＰＳＰＳは、１０２と１０６の２つの突然変異を有し、かつ、ＥＰＳＰＳ活性を有するＥＰＳＰＳである前記キメラ遺伝子。
【請求項１８】
請求項７から１７のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子以外に少なくとも１個の複製起点を含むことを特徴とする植物細胞又は植物の形質転換用クローニング又は発現ベクター。
【請求項１９】
プラスミドであることを特徴とする請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項７から１７のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を組み込むことを特徴とする植物細胞の形質転換方法。
【請求項２１】
請求項７から１７のいずれか一項に記載の少なくとも１個のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする植物細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の細胞を含むことを特徴とする形質転換植物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の細胞から再生されることを特徴とする請求項２２に記載の形質転換植物。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の形質転換植物の栽培及び／又は交配により得られることを特徴とする請求項２２に記載の形質転換植物。
【請求項２５】
請求項２２から２４のいずれか一項に記載の形質転換植物の種子。
【請求項２６】
特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含むキメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を含む圃場の表面における雑草の駆除方法であって、前記キメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を実質的に変化させずに、前記雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を圃場の前記表面に施用することからなり、前記キメラ遺伝子が請求項１０から１７のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子であることを特徴とする前記方法。
【請求項２７】
請求項１０から１７のいずれか一項に記載の特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含むキメラ遺伝子で形質転換した植物の栽培方法であって、前記形質転換植物の栽培に適した圃場の表面に前記形質転換植物の種子を播き、前記形質転換種子又は植物を実質的に変化させずに、雑草が存在している場合には雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を前記圃場の前記表面に施用した後、植物が所望成熟度に達したら栽培植物を収穫し、場合により収穫した植物から種子を分離することを特徴とする前記方法。
【請求項２８】
栽培物の播種前、発芽前又は発芽後に特定除草剤を施用することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は着目タンパク質をコードする調節配列に異種の配列を単子葉植物細胞で発現させる新規５’調節配列に関する。本発明は更に前記調節配列と、着目タンパク質をコードする異種配列と、単子葉植物細胞で着目タンパク質を発現させる３’調節配列を含むキメラ遺伝子にも関し、更に前記キメラ遺伝子と、植物細胞及び植物の形質転換に必要な手段を含む形質転換単子葉植物にも関する。
【０００２】
植物で着目タンパク質をコードする配列を発現させる種々のプロモーターが公知であり、文献に記載されており、遺伝子工学により改変した植物の商業規模の開発が既に可能になっている。このようなプロモーターとしては植物で天然に発現される遺伝子のプロモーター配列、特に細菌、ウイルス又は植物起源のプロモーターが挙げられ、例えばリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの小サブユニットの遺伝子（ＵＳ４，９６２，０２８）や、例えばカリフラワーモザイクの遺伝子（ＵＳ５，３５２，６０５）等の植物ウイルス遺伝子のプロモーターが挙げられる。植物で異種遺伝子を発現させるプロモーターは特に以下の特許及び特許出願に記載されている。ＵＳ５，０８６，１６９、ＥＰ０３５３９０８、ＵＳ５，１３９，９５４、ＵＳ５，３７８，６１９、ＵＳ５，５６３，３２８、ＵＳ５，５８９，５８３、ＵＳ５，６３３，３６３、ＵＳ５，６３３，４３９、ＵＳ５，６３３，４４０、ＵＳ５，６３３，４４７、ＵＳ５，６３３，６１８、ＵＳ５，６３９，９４８及びＵＳ５，６３９，９５２。
【０００３】
しかし、これらのプロモーターの所定のもの、より特定的には植物起源のプロモーターは単子葉植物で非機能的である。
【０００４】
トウモロコシ等の単子葉植物では非機能的であるが、タバコ、セイヨウアブラナ又はダイズ等の双子葉植物で異種遺伝子を発現させるために特に有効なプロモーターとしては、例えば特許出願ＥＰ０５０７６９８に記載されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種のヒストンプロモーターが公知である。
【０００５】
コメアクチンプロモーターは単子葉植物で異種遺伝子を発現させることが知られているプロモーターである（ＵＳ５，６４１，８７６）。しかし、単子葉植物で異種配列を発現させるために機能的な新規５’調節配列を同定するという問題が残っている。
【０００６】
本発明は単子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させる５’調節エレメントである新規ＤＮＡ配列に関し、前記ＤＮＡ配列は、転写方向に向かってトウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターの配列の機能的フラグメントである第１のＤＮＡ配列と、コメアクチンの第１のイントロンの配列の機能的フラグメントである第２のＤＮＡ配列を含む。
【０００７】
トウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターの配列は特にＢｒｉｇｎｏｎら（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２：１００７−１０１５，１９９３）により記載されている。これはトウモロコシのヒストンＨ３Ｃ４をコードする配列のＡＴＧに対して−７〜−１０２９位の塩基に対応する約１ｋｂのトウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターのＡｌｕＩフラグメントである。
【０００８】
コメアクチンの第１のイントロンの配列は特にＵＳ５，６４１，８７６に記載されている。
【０００９】
機能的フラグメントとは、本発明によると、トウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターの配列又はコメアクチンの第１のイントロンの配列に由来し、元の配列の機能を再現する任意ＤＮＡ配列を意味する。
【００１０】
本発明の１実施態様によると、トウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターの配列の機能的フラグメントは配列番号１により表されるＤＮＡ配列又は前記配列の相同配列を含む。トウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターの配列の機能的フラグメントは配列番号１により表されるＤＮＡ配列から構成されることが好ましい。
【００１１】
本発明の１実施態様によると、コメアクチンの第１のイントロンの機能的フラグメントは配列番号２により表されるＤＮＡ配列又は前記配列の相同配列を含む。コメアクチンの第１のイントロンの機能的フラグメントは配列番号２により表されるＤＮＡ配列から構成されることが好ましい。
【００１２】
本発明の５’調節エレメントであるＤＮＡ配列は、第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列の間に一般に本発明の配列の構築に必要な中性ＤＮＡフラグメントを更に含んでいてもよい。このようなフラグメントとしては、３０塩基対まで、好ましくは２０塩基対までを含むＤＮＡフラグメントが挙げられる。中性ＤＮＡフラグメントとは、本発明によると、本発明の配列の第１及び第２のＤＮＡ配列の夫々の機能を実質的に変えないＤＮＡフラグメントを意味する。
【００１３】
本発明の好適実施態様によると、本発明のＤＮＡ配列は配列番号３により表されるＤＮＡ配列又は前記配列の相同配列を含む。本発明の配列は配列番号３により表されるＤＮＡ配列から構成されることがより好ましい。
【００１４】
「相同」とは、本発明によると、配列番号１、２又は３により表される基準ＤＮＡ配列の機能を再現しながら、前記配列に対して１個以上の配列改変をもつＤＮＡ配列を意味する。これらの改変は通常の突然変異技術又はハイブリダイゼーションによる前記配列の製造で使用可能な合成オリゴヌクレオチドを選択することにより得られる。相同度は基準配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％であると有利である。
【００１５】
本発明はコーディング配列と、単子葉植物細胞で機能することが可能な５’及び３’位異種調節エレメントを含むキメラ遺伝子（又は発現カセット）にも関し、５’調節エレメントは上記に定義した本発明のＤＮＡ配列を含む。
【００１６】
「植物細胞」とは、本発明によると、単子葉植物に由来し、カルス等の未分化組織、胚等の分化組織、単子葉植物部分、単子葉植物又は種子を構成することができる任意細胞を意味する。
【００１７】
「単子葉植物」とは、本発明によると、光合成が可能な任意分化多細胞生物、より特定的には例えばコムギ、オオムギ、エンバク、コメ、トウモロコシ、モロコシ、サトウキビ等の動物又はヒト食用又は非食用栽培植物を意味する。
【００１８】
本発明によると、本発明のプロモーター調節配列と共に、プロモーターとコーディング配列の間に配置された他の調節配列も使用してもよく、このような配列は１本鎖又は２本鎖のトランジットペプチドをコードし、場合によっては中間配列により分離され、即ち出願ＥＰ０５０８９０９に記載されているように、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列の一部と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列の一部から構成されるプラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子の第２のトランジットペプチドをコードする配列を転写方向に向かって順次含む。トランジットペプチドとしては、Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎらにより記載されているタバコのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナルペプチドも挙げることができる。
【００１９】
終結調節又はポリアデニル化配列としては、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｎｏｓターミネーター等の細菌起源又は例えば出願ＥＰ０６３３３１７に記載されているようなヒストンターミネーター等の植物起源の対応する任意配列を使用することができる。
【００２０】
本発明のキメラ遺伝子のコーディング配列は、植物細胞又は単子葉植物で発現させることが所望される着目タンパク質をコードする任意配列を含むことができる。
【００２１】
このような配列としては、形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子や、形質転換単子葉植物の農学的品質を改良する遺伝子等の選択マーカーをコードする遺伝子が挙げられる。
【００２２】
選択マーカーをコードする遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子、除草剤（ビアラフォス、グリホセート又はイソキサゾール）耐性遺伝子、ＧＵＳ酵素等の容易に同定可能な酵素をコードする遺伝子、色素をコードする遺伝子又は形質転換細胞における色素生産を調節する酵素を挙げることができる。このような選択マーカー遺伝子は特に特許出願ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８に記載されている。
【００２３】
形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子としては、所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子、所定の昆虫に対する耐性を付与する遺伝子、所定の疾病に対する耐性を付与する遺伝子等を挙げることができる。このような遺伝子は特に特許出願ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８に記載されている。
【００２４】
終結調節又はポリアデニル化配列としては、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｎｏｓターミネーター等の細菌起源又は例えば出願ＥＰ０６３３３１７に記載されているようなヒストンターミネーター等の植物起源の対応する任意配列を使用することができる。
【００２５】
本発明は植物細胞及び形質転換単子葉植物に所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を発現させるのに特に適している。所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子としては、ビアラフォスに対する耐性を付与するＢａｒ遺伝子、グリホセートとその塩等のＥＰＳＰＳを標的とする除草剤に対する耐性を付与する適当なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（ＵＳ４，５３５，０６０、ＵＳ４，７６９，０６１、ＵＳ５，０９４，９４５、ＵＳ４，９４０，８３５、ＵＳ５，１８８，６４２、ＵＳ４，９７１，９０８、ＵＳ５，１４５，７８３、ＵＳ５，３１０，６６７、ＵＳ５，３１２，９１０、ＵＳ５，６２７，０６１、ＵＳ５，６３３，４３５、ＦＲ２７３６９２６）、グリホセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（ＵＳ５，４６３，１７５）、又はイソキサゾール、特にイソキサフトール（ＦＲ９５  ０６８００、ＦＲ９５  １３５７０）、ジケトニトリル（ＥＰ４９６６３０、ＥＰ４９６６３１）又はトリケトン、特にスルコトリオン（ＥＰ６２５５０５、ＥＰ６２５５０８、ＵＳ５，５０６，１９５）等のＨＰＰＤを標的とする除草剤に対する耐性を付与するＨＰＰＤをコードする遺伝子を挙げることができる。このようなＨＰＰＤを標的とする除草剤に対する耐性を付与するＨＰＰＤをコードする遺伝子は、参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９６／３８５６７及び１９９７年１１月７日付けで出願された未公開特許出願ＦＲ９７  １４２６４に記載されている。
【００２６】
ＥＰＳＰＳを標的とする除草剤に対する耐性を付与する適当なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子としては、特許出願ＦＲ２７３６９２６に記載されている１０２と１０６の２つの突然変異をもつ植物、特にトウモロコシのＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（以下、二重突然変異ＥＰＳＰＳと言う）、又は特許ＵＳ５，６３３，４３５の配列番号２及び３により表されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから単離されたＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（以下、ＣＰ４と言う）が特に挙げられる。
【００２７】
ＨＰＰＤを標的とする除草剤に対する耐性を付与するＨＰＰＤをコードする遺伝子としては、特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのＨＰＰＤ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＨＰＰＤが特に挙げられる。
【００２８】
ＥＰＳＰＳ又はＨＰＰＤ、より特定的には上記遺伝子をコードする遺伝子の場合には、これらの酵素をコードする配列の前にトランジットペプチド、特に参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とする特許ＵＳ５，５１０，４７１又はＵＳ５，６３３，４４８に記載されている最適化トランジットペプチドと呼ばれるトランジットペプチドをコードする配列を配置すると有利である。
【００２９】
本発明の好適実施態様によると、本発明のキメラ遺伝子は転写方向に向かって３’調節配列に機能的に結合したトランジットペプチド／着目タンパク質融合タンパク質をコードする配列に機能的に結合した上記に定義したような本発明の５’調節配列を含み、キメラ遺伝子の各エレメントは上記に定義した通りであり、着目タンパク質は好ましくは所定の除草剤に対する耐性を付与する酵素、より好ましくは上記に定義したＥＰＳＰＳ又はＨＰＰＤ型酵素である。
【００３０】
トランジットペプチド／ＥＰＳＰＳ、より特定的にはＯＴＰ／二重突然変異ＥＰＳＰＳ融合タンパク質をコードする配列は特に特許ＵＳ４，９４０，８３５、ＵＳ５，６３３，４４８及びＦＲ２７３６９２６に記載されている。
【００３１】
ＯＴＰ／ＣＰ４融合タンパク質については、当業者は特許ＵＳ５，６３３，４３５に記載されているＣＰ４をコードする配列を利用し、特許ＵＳ４，９４０，８３５、ＵＳ５，６３３，４４８及びＦＲ２７３６９２６又は下記実施例に記載する操作方法に従って対応する遺伝子を構築することができる。本発明は転写方向に向かって３’調節配列に機能的に結合したＯＴＰ／ＣＰ４融合タンパク質をコードする配列に機能的に結合しており、植物細胞で異種遺伝子の発現を確保するのに適した５’調節配列を含むキメラ遺伝子にも関する。５’調節エレメントは上記に定義した本発明の５’調節エレメントだけでなく、当業者に公知又は今後公知となる単子葉又は双子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させるのに適した全調節エレメント、特に上記調節エレメントを含む。
【００３２】
トランジットペプチド／ＨＰＰＤ融合タンパク質をコードする配列は特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載されている。
【００３３】
本発明は更に、植物細胞又は単子葉植物の形質転換用クローニング又は発現ベクターにも関し、植物細胞及び形質転換植物は上記に定義したようなキメラ遺伝子を少なくとも１個含む。本発明のベクターは上記キメラ遺伝子以外に少なくとも１個の複製起点を含む。このベクターは本発明のキメラ遺伝子の導入により形質転換されたプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスから構成することができる。このような植物細胞又は単子葉植物の形質転換用ベクターは当業者に周知であり、文献に広く記載されている。本発明の植物細胞又は植物の形質転換用ベクターはプラスミドが好ましい。
【００３４】
本発明は更に、少なくとも１個の核酸フラグメント又は上記に定義したようなキメラ遺伝子の組み込みによる植物細胞の形質転換方法にも関し、形質転換は本発明のベクターを用いて任意の適当な公知手段により得られる。
【００３５】
このような方法としては、ＤＮＡ配列を結合した粒子を細胞又は細胞組織に打ち込む方法がある。また、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドに挿入したキメラ遺伝子を植物導入手段として使用する方法もある。更に、マイクロインジェクションやエレクトロポレーション等の方法を使用してもよいし、ＰＥＧによる直接沈殿を利用してもよい。
【００３６】
当業者は植物細胞又は植物に種類に応じて適当な方法を選択できる。
【００３７】
本発明は更に、少なくとも１個の本発明の上記キメラ遺伝子を含む形質転換植物細胞又は植物にも関する。
【００３８】
本発明は更に、形質転換細胞を含む植物、特に形質転換細胞から再生された植物に関する。再生は種の種類に依存する任意の適当な方法により得られる。
【００３９】
植物細胞の形質転換及び単子葉植物の再生方法については、特にその開示内容を参考資料として本明細書の一部とするＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，Ｗ．Ｊ．ら（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｉｚｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｔｉｌｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．２，６０３−６１８，Ｊｕｌｙ  １９９０）と以下の特許及び特許出願：ＵＳ５，１７７，０１０、、ＵＳ５，１８７，０７３、ＥＰ２６７，１５９、ＥＰ６０４６６２、ＥＰ６７２７５２、ＵＳ４，９４５，０５０、ＵＳ５，０３６，００６、ＵＳ５，１００，７９２、ＵＳ５，３７１，０１４、ＵＳ５，４７８，７４４、ＵＳ５，４８４，９５６、ＵＳ５，５０８，４６８、ＵＳ５，５３８，８７７、ＵＳ５，５５４，７９８、ＵＳ５，４８９，５２０、ＵＳ５，５１０，３１８、ＵＳ５，２０４，２５３、ＵＳ５，４０５，７６５、ＥＰ４４２１７４、ＥＰ４８６２３３、ＥＰ４８６２３４、ＥＰ５３９５６３、ＥＰ６７４７２５、ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８を挙げることができる。
【００４０】
本発明は更に上記再生植物の栽培及び／又は交配により得られる形質転換植物と、形質転換植物の種子にも関する。
【００４１】
本発明のキメラ遺伝子が特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含む場合には、本発明は本発明の前記キメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を含む圃場の表面における雑草の駆除方法にも関し、前記方法は前記特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする前記配列を含む本発明のキメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を実質的に変化させずに、前記雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を圃場の前記表面に施用することからなる。
【００４２】
本発明は更に上記特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含む本発明のキメラ遺伝子で本発明により形質転換した植物の栽培方法にも関し、前記方法は、前記植物の栽培に適した圃場の表面に前記形質転換植物の種子を播き、前記形質転換種子又は植物を実質的に変化させずに、雑草が存在している場合には雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を前記圃場の前記表面に施用した後、植物が所望成熟度に達したら栽培植物を収穫し、場合により収穫した植物から種子を分離することからなる。
【００４３】
上記２種の方法において、特定除草剤の施用は本発明によると栽培物の播種前、発芽前及び発芽後にいずれに実施してもよい。
【００４４】
除草剤耐性酵素は適当なＥＰＳＰＳが有利であり、その場合には、除草剤はグリホセート又はその塩であり、あるいは酵素はＨＰＰＳであり、除草剤はイソキサゾール、特にイソキサフトール、ジケトニトリル又はトリケトン、特にスルコトリオンから選択される。
【００４５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これにより発明の範囲を制限するものではない。
【００４６】
１．ＨＰＰＤをコードする配列をもつキメラ遺伝子の構築：
下記プラスミドを作製し、Ｍｃ  Ｅｌｒｏｙ  Ｄ．ら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：２５７−２６８（１９９０））により記載されているライスアクチン遺伝子の第１のイントロン（ＡｃｔＩ）の非翻訳５’領域に結合したトウモロコシヒストンＨ３Ｃ４プロモーターを含む発現カセットを構築してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＯＴＰ−ＨＰＰＤ遺伝子を発現させる。
【００４７】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５
プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５は改変多重クローニング部位を含むプラスミドｐＵＣ−１９の誘導体である。下記相補的オリゴヌクレオチド１及び２を６５℃で５分間ハイブリダイズした後、３０分間かけて３０℃までゆっくりと冷却する。
【００４８】
オリゴ４：  ５’ＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴ  ＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡ  ＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡ  ＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣ  ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡ  ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣ  ＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣ  ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧ  ＣＡＴＧＣ  ３’
オリゴ５：  ５’ＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡ  ＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧ  ＣＧＣＧＣＣＴＴＡＡ  ＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴ  ＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣ  ＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣ  ＴＡＧＡＧＧ  ３’
【００４９】
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで２本鎖にし、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により推奨されている標準条件を使用して各オリゴの３’末端を伸長する。得られた２本鎖オリゴを次に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端にしておいたプラスミドｐＵＣ−１９に連結する。こうして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのプラスミドベクターに発現カセットを導入し易くするように多重クローニング部位を含むクローニングベクターが得られる（図１）。
【００５０】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−２０１０：
プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５へのｐＲＰＡ−ＲＤ−１５９の「Ｈ４Ａ７４８プロモーター−ＯＴＰ−二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子」配列の挿入。
【００５１】
プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５を制限酵素ＳａｃＩで消化し、子牛腸アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で脱リン酸化する。（ＦＲ２７３６９２６に記載されている）プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１７３を制限酵素ＳａｃＩで消化し、ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを精製し、先に作製したプラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５に連結する。得られたクローンは二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子の両側に複数の固有制限部位を含む。
【００５２】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１００２
単子葉植物で使用するための発現カセットＯＴＰ−ＨＰＰＤの構築。プラスミドｐＲＰ−Ｐは特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載されているように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤに結合した最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）と、ノパリンシンターゼのポリアデニル化部位を順次含む。プラスミドｐＲＰ−Ｐのエレメントは以下の通りである。
【００５３】
−特許ＵＳ５，５１０，４７１及びＵＳ５，６３３，４４８に記載されている最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）。このＯＴＰはＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓのリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｗａｋｓｍａｎ  Ｇ．ら，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：７１８１）の小サブユニットのトランジットペプチドの１７１ｂｐと、Ｚｅａ  ｍａｙｓのリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｌｅｂｒｕｎら，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４３６０）の小サブユニットの成熟部分の６６ｂｐと、Ｚｅａ  ｍａｙｓのリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｌｅｂｒｕｎら，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４３６０）の小サブユニットのトランジットペプチドの１５０ｂｐから順次構成される。従って、全体で３８７ｂｐである。
【００５４】
−特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤのコーディング領域。
−ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）の遺伝子のターミネーター（ｐＴｉ３７から単離したｎｏｓ遺伝子のポリアデニル化ゾーン，２５０ｂｐ；Ｂｅｖａｎ  Ｍ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：３６９−３８５）。
【００５５】
プラスミドｐＲＰ−Ｐを制限酵素ＢｓｔＥＩＩで消化し、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理してフラグメントを平滑末端にした後、制限酵素ＮｃｏＩで消化する。約１．５ｋｂのコーディング領域ＯＴＰ−ＨＰＰＤを含むＤＮＡフラグメントが得られ、これを精製する。先に得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−２０１０を制限酵素ＢｌｐＩで消化し、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理して平滑末端フラグメントを得た後、制限酵素ＮｃｏＩで消化する。プラスミドベクター配列、非翻訳５’領域に結合したＨ３Ｃ４プロモーター及びコメアクチン遺伝子の第１のイントロンを含むＤＮＡフラグメントが得られ、これを精製し、ＮＯＳポリアデニル化部位を精製する。２つの精製ＤＮＡフラグメントを連結し、非翻訳５’領域に結合したトウモロコシヒストンＨ３Ｃ４プロモーター（Ｂｒｉｇｎｏｎら）とコメアクチン遺伝子の第１のイントロン（ＡｃｔＩ）（Ａｃｔ１  ５’ＵＴＲ＋イントロン１）を含む発現カセットＯＴＰ−ＨＰＰＤを生成し、ＮＯＳポリアデニル化部位（ＮＯＳポリＡ）を含むコーディング領域ＯＴＰ−ＨＰＰＤの発現を制御する（図２）。
【００５６】
２．二重突然変異ＥＰＳＰＳをコードする配列をもつキメラ遺伝子の構築：
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１０１０：
単子葉植物で使用するための発現カセットＯＴＰ−二重突然変異ＥＰＳＰＳの構築。
【００５７】
プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１０９は非翻訳５’領域に結合したトウモロコシヒストンＨ３Ｃ４プロモーター（Ｂｒｉｇｎｏｎら）とＭｃ  Ｅｌｒｏｙ  Ｄ．ら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：２５７−２６８，１９９０）に記載されているコメアクチン遺伝子の第１のイントロン（ＡｃｔＩ）により制御される大腸菌のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含む。このプラスミドの模式図を図３に示す。プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１０９を制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ベクター配列とＧＵＳ遺伝子とＮＯＳポリアデニル化部位を含む大きいＤＮＡフラグメント（約５ｋｂ）を精製する。プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−２０１０を制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、非翻訳５’領域に結合したＨ３Ｃ４プロモーターとコメアクチン遺伝子の第１のイントロン（ＡｃｔＩ）を含むＤＮＡフラグメント（約１．６ｋｂ）を精製する。２つの精製ＤＮＡフラグメントを連結し、非翻訳５’領域に結合したトウモロコシヒストンＨ３Ｃ４プロモーター（Ｂｒｉｇｎｏｎら）とコメアクチン遺伝子の第１のイントロン（ＡｃｔＩ）を含む発現カセットＯＴＰ−二重突然変異ＥＰＳＰＳを生成し、ＮＯＳポリアデニル化部位を含むコーディング領域ＯＴＰ−二重突然変異ＥＰＳＰＳの発現を制御する。
【００５８】
３．ホスフィノトリシン耐性キメラ遺伝子（ｂａｒ遺伝子）の構築：
ｂａｒ遺伝子によりコードされるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は除草剤ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を不活化させる酵素である。ＰＰＴはグルタミン合成を阻害し、細胞に迅速なアンモニア蓄積を誘発し、死をもたらす（Ｔａｃｈｉｂａｎａら，１９８６）。
【００５９】
選択物質としてのホスフィノトリシンに対する耐性を導入するために使用したプラスミドは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から市販されているアンピシリン耐性遺伝子を含む２４６２ｂｐのベクターｐＳＰ７２（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータベース登録番号Ｘ６５３３２）にキメラ遺伝子ｐＤＭ３０２を挿入することにより得られる。
【００６０】
４７００ｂｐのプラスミドｐＤＭ３０２はＣａｏ，Ｊ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  １１：５８６−５９１（１９９２）に記載されている。
【００６１】
このプラスミドの各エレメントは以下の通りである。
【００６２】
−Ｍｃ  Ｅｌｒｏｙ  Ｄ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：２５７−２６８（１９９０）に記載されているコメアクチン遺伝子の８４０ｂｐから構成されるプロモーター。
【００６３】
−８０ｂｐから構成されるコメアクチン遺伝子の第１のエキソン。
−４５０ｂｐから構成されるコメアクチン遺伝子の第１のイントロン。
−Ｗｈｉｔｅ  Ｊ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．１８：１８６２（１９９０）により記載されているプラスミドｐＩＪ４１４０４から切り出した６００ｂｐのｂａｒ遺伝子のコーディング領域。
【００６４】
−ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）の遺伝子のターミネーター（ｐＴｉ３７から単離したｎｏｓ遺伝子のポリアデニル化ゾーン，２５０ｂｐ；Ｂｅｖａｎ  Ｍ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：３６９−３８５）。
【００６５】
４．トウモロコシ細胞の形質転換：
粒子射撃法を使用して遺伝子構築物を導入する。プラスミドをＱｉａｇｅｎカラムで精製し、Ｋｌｅｉｎ法（Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３，１９８７）によりＭ１０タングステン粒子上に共沈殿させる。
【００６６】
次に、金属粒子とプラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１００２と上記実施例３のプラスミドの混合物をＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，Ｗ．Ｊ．ら（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｉｚｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｔｉｌｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．２，６０３−６１８，Ｊｕｌｙ  １９９０）により記載されているプロトコールに従ってトウモロコシ胚形成細胞に打ち込む。
【００６７】
５．再生及び選択物質としてのｂａｒ遺伝子の利用
打ち込んだカルスを緑色セクターが出現するまでグルホシネート上で選択する。次に、グルホシネート耐性陽性カルスを体細胞胚に成長させた後、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，Ｗ．Ｊ．ら（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｉｚｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｔｉｌｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．２，６０３−６１８，Ｊｕｌｙ  １９９０）により記載されている操作条件に従って発芽を助長する条件下におく。幼植物を温室に移し、種子を生産する。
【００６８】
６．形質転換植物の子孫の分析：
上記のようにして得られた形質転換植物はイソキサフトール等のイソキサゾールに対する耐性を付与するＯＴＰ／ＨＰＰＤをコードする異種遺伝子を含む部分トランスジェニックであると予想される。これらの形質転換植物は花粉を放出し、非トランスジェニック野生トウモロコシの胚珠を受精させた。得られた種子をイソキサフトール処理後に砂上で選択する。
【００６９】
選択プロトコールは以下の通りである。
【００７０】
フォンテーヌブロー砂８００ｍｌを１５×２０ｃｍ寸法の舟形容器に入れる。次に、これらの舟形容器に散水し、水１リットル当たりＱｕｉｎｏｌｉｇｏ（Ｌａ  Ｑｕｉｎｏｌｅｉｎｅ）５ｍｌから構成される栄養溶液を加えることにより水和状態に保つ。舟形容器にトウモロコシ種子２０個を播いた後、１ｈａ当たり活性物質１００ｇ（舟形容器当たり活性物質３００μｇ）の割合でイソキサフトールで噴霧処理する。その後、舟形容器を温室で栽培する。播種から１４日後に植物毒性を調べる。上記条件によると、非形質転換植物は１００％の植物毒性を示すが、形質転換植物は植物毒性を示さない。
【００７１】
本発明により形質転換したトウモロコシの子孫２０個と、コメアクチンの第１のイントロンをコードする配列をトウモロコシａｄｈ  Ｉイントロンをコードする配列で置換した対応遺伝子で形質転換したトウモロコシの子孫２０個を使用して比較試験を行った。１ｈａ当たり活性物質２００ｇ（舟形容器当たり活性物質６００μｇ）の割合で非常に高用量のイソキサフトールの噴霧処理後に次の結果が得られる。
【００７２】
本発明のコメアクチンイントロン：２０個中８個が耐性。
トウモロコシａｄｈ  Ｉイントロン：２０個中３個が耐性。
【００７３】
上記結果から明らかなように、トウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターを本発明のコメアクチンの第１のイントロンと結合すると、同一のトウモロコシＨ３Ｃ４プロモーターを従来技術の別のイントロンと結合した場合に比較して、形質転換単子葉植物における着目タンパク質の発現が実質的に改善される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５の模式図である。
【図２】  プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１００２の模式図である。
【図３】  プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１０９の模式図である。
【配列表】
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0004365025.tif 000003
0004365025.tif 000004
0004365025.tif 000005
【図１】
0004365025.tif 000006
【図２】
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【図３】
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