(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡであって、
前記蛋白質がβ−プリメベロシダーゼ活性を示し、
配列番号：１に示すアミノ酸配列の内、２９番アミノ酸から５０７番アミノ酸が前記蛋白質の成熟体に相当する、ＤＮＡ。
【請求項２】
ＤＮＡが配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を含むものである請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ＤＮＡが、植物由来のものである請求項１又は２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
植物が茶である請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターによって形質転換された組換え体。
【請求項７】
組換え体が大腸菌又は酵母である請求項６記載の形質転換された組換え体。
【請求項８】
請求項６又は請求項７記載の組換え体を培養し、培養物からβ−プリメベロシダーゼを得ることを特徴とするβ−プリメベロシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物のβ−プリメベロシダーゼ遺伝子に関する。β−プリメベロシダーゼは二糖配糖体であるβ−プリメベロシドに作用して茶の香気成分とプリメベロースを生成する反応を触媒する酵素である。
【０００２】
【従来の技術】
植物の香気成分に関する研究において、ゲラニオールやリナロール等のアルコール系香気前駆体として二糖配糖体のβ−primeveroside（６−Ｏ−β−Ｄ−xylopyranosyl−β−Ｄ−glucopyranoside）あるいはその類似体の存在が確認され、また、その他の前述した他のアルコール系香気成分の前駆体としても二糖配糖体のβ−primeverosideとその類似体の存在が明らかになってきている。
【０００３】
本発明者らは、これらの二糖配糖体に特異的に作用する酵素の存在について、先に茶香気成分生成酵素であるβ−プリメベロシダーゼを研究し、当該酵素を単離し、その性質を明らかにした。（特開平８−１４０６７５）
【０００４】
しかしながら、本酵素の塩基配列などは明確にされてなく、更に遺伝子を単離し、その利用については全く研究がなされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、茶由来のβ−プリメベロシダーゼ遺伝子を単離し、当該酵素をより安価に提供する手段を提供することにある。本発明により植物由来のβ−プリメベロシダーゼの幅広い利用を図ることができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
【０００８】
前記ＤＮＡとして具体的には、以下に示すＤＮＡが挙げられる。即ち、配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。又は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、β−プリメベロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明のＤＮＡは、上述した蛋白質をコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、本発明を完成するに際しては、後に述べるようにして、茶ｃＤＮＡライブラリーから単離することができたものである。しかしながら、本発明によりその塩基配列が明らかであるので、配列番号：１又は２に示す配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。
【００１０】
また、この配列に基づいて作製される合成オリゴヌクレオチドプローブ又はオリゴヌクレオチドプライマーを用い、自体公知の方法で茶染色体ＤＮＡライブラリーから、又はＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって取得することもできる。
【００１１】
以下に、茶ｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲによって本発明のＤＮＡの一部を取得し、それをプローブに用いたハイブリダイゼーションによって、本発明のＤＮＡを取得する方法及び得られたＤＮＡを用いて遺伝子組換え法により大腸菌、酵母よりβ−プリメベロシダーゼを生産する方法について、実施例を参照しながら例示する。
【００１２】
なお、一般に生理活性を有する蛋白をコードするアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。本発明は、当然のことながらこのような修飾が加えられ、かつβ−プリメベロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片も含まれる。
【００１３】
即ち、配列表の配列番号：１において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、β−プリメベロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明の範囲に含まれる。そのような改変されたＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡ又はこれを有する細胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞から、例えば配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することによっても、改変されたＤＮＡを得ることができる。
【００１５】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、相同性が高い核酸同士、例えば70〜90％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件等が挙げられる。
【００１６】
さらに、茶染色体から、本発明のＤＮＡ又はその一部をプローブに用いて、常法によってβ−プリメベロシダーゼ遺伝子を取得し得るが、茶染色体由来のβ−プリメベロシダーゼ遺伝子は、イントロンを含むことも予想される。このようなイントロンで分断されているＤＮＡも、茶β−プリメベロシダーゼをコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
更に、得られたβ−プリメベロシダーゼ遺伝子は、適当なベクターに組み入れた後、大腸菌、酵母、培養細胞、植物体などに形質転換され、スクリーニングすることにより、β−プリメベロシダーゼを生産することのできる形質転換体を選択できる。
【００１８】
このようにして得られた形質転換体は、栄養培地で培養することにより高いβ−プリメベロシダーゼ活性を有するペプチドを安定的に生産する。形質転換体の培養は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれば良く、例えばグルコース、ラクトース、マルトースなどが使用される。また窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどが使用される。培養温度はβ−プリメベロシダーゼを生産する範囲であればよいが、大腸菌、酵母の場合、通常10〜42℃程度である。本発明のβ−プリメベロシダーゼを大腸菌、酵母で発現するためには、好ましくは10〜20℃程度である。
【００１９】
培養時間は、β−プリメベロシダーゼの生産量が最大になるくらいの時間培養すれば良く、通常は12〜72時間である。培地のpHは、菌が生育し、β−プリメベロシダーゼが安定に生産されれば良く、好ましくはpH６〜８である。
【００２０】
本発明の茶由来プリメベロシダーゼ遺伝子はその存在が明らかであるにもかかわらず、活性確認は非常な困難であった。本発明は、成熟タンパク質を融合タンパク質発現系を用いて、特定条件下で培養を行うことによって活性体として発現できることを明らかにした。
【００２１】
生産されたβ−プリメベロシダーゼは、目的に応じて様々な処理を施すことができる。β−プリメベロシダーゼが菌体内にある場合には、濾過や遠心分離などによって菌体を採取し、機械を用いた物理的方法やリゾチームなどによる酵素的方法によって菌体を破壊し、抽出する。またこのようにして得られたβ−プリメベロシダーゼは、必要に応じて塩析、濃縮、精製など行うこともできる。
【００２２】
なお、本明細書において特に明記しない限り、β−プリメベロシダーゼ活性の活性測定は以下のようにして行った。
【００２３】
▲１▼  β−プリメベロシダーゼ活性
酵素活性はｐ−ニトロフェニル−β−プリメベロシド（pNP-Pri)を基質として遊離するｐ−ニトロフェノール（pNP)を分光光度計で測定することにより調べた。酵素活性は１分間に１マイクロモルのpNPを遊離する酵素量を１ユニットと定義した。
【００２４】
具体的は測定サンプル300μリットルと20mMクエン酸緩衝液（pH6.0）1100μリットルと同緩衝液に10mMで溶かしたｐNP-Pri 300μリットルを混合して37℃でインキュベートした。30、60、90、120分後にそれぞれ反応液340μリットルを分取し、１M 炭酸ナトリウム水溶液を170μリットル加え反応を停止させ分光高度計により405ｎmの吸光度を測定した。
【００２５】
基質となるpNP-プリメベロシドは、例えばpNP-グルコシド（メルク社製）とキシロオリゴ糖（和光純薬社製）を酵素キシロシダーゼ（シグマ社製）を用いて反応させ、pNP-グルコシドにキシロースをβ-1,6結合で１残基転移させることにより合成できる。
【００２６】
▲２▼  β−グルコシダーゼ活性
酵素活性はｐ−ニトロフェニル−β−グルコシドを基質として、▲１▼のβ−プリメベロシダーゼ活性測定法に準じて行った。
【００２７】
【実施例】
実施例１  粗酵素液の調製
新鮮な茶葉（ヤブキタ種）をドライアイスで冷却したアセトン中にて破砕した後、残査を−20℃のアセトンでろ液がほとんど無色になるまで洗浄し乾燥させアセトンパウダーとした。
【００２８】
このアセトンパウダーを１リットルの0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.0）に懸濁させ４℃にて３時間攪拌し酵素を抽出した。抽出物を遠心分離して残査を除去した後、上清に等量のアセトンを加え攪拌後4℃に一晩放置した後蛋白画分を沈殿させた。次いで遠心分離により沈殿物を集めクエン酸緩衝液に溶解後、硫安塩析を行った。40〜80%飽和硫安画分の析出を20mMクエン酸緩衝液に溶解し同緩衝液で透析を行った。
【００２９】
実施例２  β−プリメベロシダーゼの精製
酵素活性はｐ−ニトロフェニルーβープリメベロシド（pNP-Pri)を基質として遊離するｐ−ニトロフェノール（pNP)を分光光度計で測定することにより調べた。酵素活性は１分間に１マイクロモルのpNPを遊離する酵素量を１ユニットと定義した。
【００３０】
透析後酵素画分を20mMクエン酸緩衝液で平衡化したCM-トヨパール650カラム（東ソー社製）に流し、吸着画分を0-0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出し回収した。回収した酵素画分を限外ろ過膜（アミコンPM-10、グレース・ジャパン社製）とセントリコン（Centricon10、グレース・ジャパン）で濃縮した後、20mMクエン酸緩衝液で平衡化したMono S HR（ファルマシア・バイオテク社製）に流し吸着した酵素画分を0-0.2MのNaClを含む同緩衝液で溶出し回収した。
【００３１】
実施例３  茶プリメベロシダーゼのアミノ酸配列の決定
精製されたプリメベロシダーゼをトリプシンで部分分解し逆相クロマトグラフィーによって分離、精製を行いペプチド断片を得た。得られたペプチド断片のアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサーにより決定し以下のアミノ酸配列を得た。
【００３２】
【配列番号：３】
【００３３】
実施例４  茶プリメベロシダーゼ遺伝子クローンの単離
ヤブキタ種茶葉よりRNA抽出キット（ファルマシア  バイオテク）により全RNAを抽出し、オリゴｄTカラムによりポリ（A）＋RNAを調製し、λZAPII−ｃDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）に従いλベクターを用いてｃDNAライブラリーを構築した。このλベクターをin vitro excision によりファージミッドへ切り出しプラスミド状のcDNAライブラリーを調製した。
【００３４】
次いでペプチド断片のアミノ酸配列を基に合成したオリゴヌクレオチドプローブB
GLU1：
【００３５】
【配列番号：４】
【００３６】
とpBluescriptSK+ベクター上の−20プライマー
【００３７】
【配列番号：５】
【００３８】
をPCRプライマーとし、上記で作製したプラスミド状のcDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行い、DNAフラグメントを得た。このフラグメントをプローブとしてヤブキタ種λZAPII−ｃDNA ライブラリーよりDIG System（ベーリンガーマンハイム）を用いてポジティブクローンを得た。15個のポジティブクローンでインサートDNAの長さが最長のものを選択しin vivo excionによりファージミッドpBluescriptSK+を調製しインサートDNAの塩基配列を決定した。その結果、決定したアミノ酸配列を含む 全長 ５０７アミノ酸からなるオープンリーディングフレーム（ORF）を含む遺伝子断片が得られたことが明らかとなった。
【００３９】
実施例５
▲１▼  茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（１）
クローニングされた遺伝子がプリメベロシダーゼ遺伝子であるか否かを確認するために、得られたcDNAの発現を試みた。いくつかの植物由来酵素遺伝子で大腸菌において活性発現が報告されているので、大腸菌での発現を試みた。507アミノ酸残基をコードする部分を含む遺伝子断片を鋳型としプライマーNN1：
【００４０】
【配列番号：６】
【００４１】
とMM2：
【００４２】
【配列番号：７】
【００４３】
でPCRにて増幅しフラグメントを得た。得られたフラグメントはORFの上流にBamHIサイトを下流にSalIサイトを導入してある。フラグメントを制限酵素BamHIとSalIで切り出した後、発現ベクターｐKK233-3（ファルマシア バイオテク）のBamHI、SalIサイトに挿入しｐKK233-3Priを得た。次いでｐKK233-3Priで大腸菌JM105を形質転換した。形質転換された大腸菌を100mlのLB培地に接種し37℃で135分間培養し、終濃度 0.1 mMのIPTGを加えさらに21時間培養した。培養後菌体を遠心分離で回収し、4mlのカラム緩衝液（20mM Tris・HCl、200mMNaCl、１ｍM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol、pH7.4）に再懸濁し、Branson Sonifier 250にて超音波破砕した。遠心により上清を可溶性画分、沈殿を不溶性画分とした。
【００４４】
プリメベロシダーゼ活性測定のために可溶性画分300μリットルと20mMクエン酸緩衝液（pH6.0）1100μリットルと同緩衝液に10mMで溶かしたｐNP-Pri 300μリットルを混合して37℃でインキュベートした。30、60、90、120分後にそれぞれ反応液340μリットルを分取し、１M 炭酸ナトリウム水溶液を170μリットル加え反応を停止させ分光高度計により405ｎmの吸光度を測定しｐNPの遊離を観察した。その結果、酵素活性は観察されなかった。
【００４５】
▲２▼  茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（２）
得られたｃDNAクローンのアミノ酸配列をタンパク側から求められたアミノ末端配列とを比較したところ、茶プリメベロシダーゼは前駆体構造をとっている可能性が示唆された。得られたｃDNA中のオープンリーディングフレームから推測されるアミノ酸組成を解析すると、開始コドンから28番目のアミノ酸までは疎水性のアミノ酸に富んだ領域でシグナル配列状の領域であることが予想された。そこで、この部分が発現を阻害している可能性を考え、この部分を欠失させた遺伝子断片を作製した。プライマー ＭＭ１：
【００４６】
【配列番号：８】
【００４７】
と前述のＭＭ２：
【００４８】
【配列番号：９】
【００４９】
をプライマーとしてクローニングされた遺伝子を鋳型としてPCRにより成熟体部分をフラグメントとして増幅した。増幅したフラグメントをBamHIとSalIで切断し融合蛋発現ベクターｐQE30（Quiagen社製）、ｐRSETA(Invitorgen社製)、ｐGEX４(ファルマシアバイオテク社製)のBamHIとSalIサイトに挿入したベクターｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐGEX４ΔPriで大腸菌JM109をそれぞれ形質転換した。形質転換した大腸菌を100mlのLB培地に接種し37℃で135分間培養し、終濃度 0.1 mMのIPTGを加えさらに21時間培養した。培養後菌体を遠心分離で回収し、前述の方法で可溶性画分を調製しプリメベロシダーゼ活性を測定した。その結果いずれの場合においても活性は見出されなかった。
【００５０】
▲３▼  茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（３）
発現が確認できなかったのは培養液に加えた発現誘導に必要なIPTG（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）濃度が適切でない可能性が考えられたのでｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐGEX４ΔPriで形質転換されたJM109を、前述の培養で誘導時にIPTGを終濃度0.1、１、9mMで加えて培養し菌体を回収後可溶性画分を調製し活性を調べた。その結果、可溶性画分には活性は認められなかった。
【００５１】
▲４▼  茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（４）
以上▲１▼〜▲３▼の遺伝子発現の試みの結果からプリメベロシダーゼの発現は通常の方法では困難なことが明らかとなった。発現が困難な理由として菌体内で合成された酵素が不活性な形で不溶性画分に存在している可能性が考えられた。発現ベクターｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐGEX４ΔPriでは挿入された遺伝子はそれぞれ、54kDa、54kDa、81kDaの融合蛋白として発現する。そこで不溶性画分をSDS-PAGEにより解析したところ、それぞれの不溶性画分で融合蛋白に相当するサイズの蛋白がIPTGの誘導によって観察されることが分かった。したがって、遺伝子は発現しているものの不活性な形で不溶性画分に移行しているものと考えられた。
【００５２】
以上の結果を熟慮した結果、IPTG誘導後の大腸菌を通常の37℃ではなくより低温の25℃以下で培養することにより、発現遺伝子産物の不活化を防ぐことができると考えた。そこで大腸菌の遺伝子の発現をIPTG誘導後の培養温度を通常よりも低い温度ととして遺伝子の発現を試みた。ベクターｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐGEX４ΔPriで形質転換されたJM109をLB培地100mlに接種して培養し、終濃度0.1mMのIPTGを加えた後25、22℃で一晩培養あるいは18℃で13時間培養し菌体を回収し前述の方法で可溶性画分を調製し活性を測定した。その結果、活性は確認されなかった。
【００５３】
▲５▼  茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（５）
次に別の融合蛋白発現ベクターであるｐMALc（New England, Biolabs社製）を用いて発現を試みた。前述と同様に成熟体部分をPCRで増幅してｐMALcベクターのBamHI、SalIサイトに挿入しｐMALcΔPriを作製し大腸菌JM109を形質転換した。形質転換した大腸菌を100mlのLB培地に接種し37℃で135分間培養し、終濃度 0.1 mMのIPTGを加えさらに21時間培養した。培養後菌体を遠心分離で回収し、前述の方法で可溶性画分を調製しプリメベロシダーゼ活性を測定した。その結果いずれの場合においても活性は見出されなかった。融合蛋白である分子量94kDaの蛋白は不溶性画分中に観察されたのでこの場合も発現した蛋白がおそらくフォールディングの不良で不活性なまま不溶性画分に移行したものと考えられた。
【００５４】
そこで、終濃度0.1mM IPTG添加後の培養温度を通常よりもより下げた22℃と18℃、さらには10℃とし24時間培養した。その結果、それぞれの可溶性画分に融合蛋白質の存在が確認され、活性も確認された。また、当該可溶性画分についてβ−グルコシダーゼ活性を測定したが、その活性は認められなかった。
【００５５】
▲６▼  茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（６）
酵母においても発現を試みた。発現ベクターとしてpYES2(Invitrogen社）を用い、まず前駆体をコードする遺伝子断片をプライマーNN1：
【００５６】
【配列番号：１０】
【００５７】
とMM3：
【００５８】
【配列番号：１１】
【００５９】
を用いてPCRでフラグメントとして増幅し、pYES2のBamHIとXhoIサイトに挿入したpYES2Priを作製し、これにより酵母INVSc1株を形質転換した。形質転換された酵母をYPG培地にて30℃で24時間培養し菌体を回収後、前述と同様の方法で超音波破砕し可溶性画分を調製し活性を測定したが活性は検出できなかった。次に成熟体部分をプライマーＭＭ１：
【００６０】
【配列番号：１２】
【００６１】
とMM3：
【００６２】
【配列番号：１３】
【００６３】
でPCRにて増幅しフラグメントとして回収後、pYES2のBamHIとXhoIサイトに挿入したpYES2Priを作製し、これにより酵母INVSc1株を形質転換した。形質転換された酵母をYPG培地にて通常の培養温度30℃より低い20,10℃で72時間培養し菌体を回収後、前述と同様の方法で超音波破砕し可溶性画分を調製し活性を測定した。その結果可溶性画分に活性を検出できた。また、当該可溶性画分についてβ−グルコシダーゼ活性は認められなかった。
【００６４】
以上の結果、茶由来プリメベロシダーゼ遺伝子の発現が困難だったのは大腸菌という発現系が適切でなかったためではなく、この遺伝子そのものの活性発現が困難であったためと考えられる。
【００６５】
【発明の効果】
このようにこの茶由来プリメベロシダーゼ遺伝子の発現による活性確認には非常な困難性があり、成熟体蛋白をかぎられた従来の融合蛋白として、通常培養を行わない条件で活性体として検出できることが判明した。
我々は鋭意検討の末、茶由来プリメベロシダーゼの発現に適した特殊な条件を初めて見出すことができ、その条件下でプリメベロシダーゼ遺伝子がプリメベロシダーゼ活性を発現することを困難の末示した。
以上の結果、茶プリメベロシダーゼの遺伝子配列とアミノ酸配列が始めて明らかとなった。
【００６６】
【配列表】
0004311799.tif 000002
0004311799.tif 000003
0004311799.tif 000004
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