(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの管が同軸上に配置された３重管構造をもち、
最内側の管はミクロスケール又はナノスケールの高速液体クロマトグラフの分離用キャピラリカラムの先端部であり、
内側から２番目の管は前記キャピラリカラムから溶出される溶出液に添加剤溶液を合流させる添加剤供給管であり、
最外側の管は前記溶出液中の移動相とは異なる第２移動相が流れる第２移動相供給管であり、
それにより前記溶出液、添加剤及び第２移動相を含む液滴を形成して先端から滴下させるプローブ。
【請求項２】
３つの管が同軸上に配置された３重管構造をもち、
最内側の管はミクロスケール又はナノスケールの高速液体クロマトグラフの分離用キャピラリカラムの先端部であり、
内側から２番目の管は前記溶出液中の移動相とは異なる第２移動相が流れる第２移動相供給管であり、
最外側の管は前記キャピラリカラムから溶出される溶出液に添加剤溶液を合流させる添加剤供給管であり、
それにより前記溶出液、添加剤及び第２移動相を含む液滴を形成して先端から滴下させるプローブ。
【請求項３】
前記添加剤溶液はマトリクス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析法で分析を行なうための試料作成用のマトリクス化合物用溶液である請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記第２移動相は前記溶出液中の移動相と混合することによって前記液滴中の移動相の組成を一定にするものである請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項５】
前記多重管のうち前記液滴と接触する最も外側の管が疎水性材料で構成されている請求項１から４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
前記疎水性材料はフッ素樹脂である請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
キャピラリカラムを備えたミクロスケール又はナノスケールの高速液体クロマトグラフと、
前記キャピラリカラムの先端に一体的に構成されたプローブであって、３つの管が同軸上に配置された３重管構造をもち、最内側の管は前記キャピラリカラムの先端部であり、内側から２番目の管は前記キャピラリカラムから溶出される溶出液に添加剤溶液を合流させる添加剤供給管であり、最外側の管は前記溶出液中の移動相とは異なる第２移動相が流れる第２移動相供給管であり、それにより前記溶出液、添加剤及び第２移動相を含む液滴を形成して先端から滴下させるプローブと、
前記第２移動相供給管に第２移動相を供給する第２移動相供給流路と、を備えた試料前処理装置。
【請求項８】
キャピラリカラムを備えたミクロスケール又はナノスケールの高速液体クロマトグラフと、
前記キャピラリカラムの先端に一体的に構成されたプローブであって、３つの管が同軸上に配置された３重管構造をもち、最内側の管は前記キャピラリカラムの先端部であり、内側から２番目の管は前記溶出液中の移動相とは異なる第２移動相が流れる第２移動相供給管であり、最外側の管は前記キャピラリカラムから溶出される溶出液に添加剤溶液を合流させる添加剤供給管であり、それにより前記溶出液、添加剤及び第２移動相を含む液滴を形成して先端から滴下させるプローブと、
前記第２移動相供給管に第２移動相を供給する第２移動相供給流路と、を備えた試料前処理装置。
【請求項９】
前記添加剤溶液はマトリクス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析法で分析を行なうための試料作成用のマトリクス化合物用溶液である請求項７又は８に記載の試料前処理装置。
【請求項１０】
前記第２移動相は前記溶出液中の移動相と混合することによって前記液滴中の移動相の組成を一定にするものである請求項７又は８に記載の試料前処理装置。
【請求項１１】
前記多重管のうち前記液滴と接触する最も外側の管が疎水性材料で構成されている請求項７から１０のいずれか一項に記載の試料前処理装置。
【請求項１２】
前記疎水性材料はフッ素樹脂である請求項１１に記載の試料前処理装置。
【請求項１３】
前記プローブにより滴下された液滴を捕集するプレートと、
前記プレート又は前記プローブを少なくとも上下方向に移動する支持機構と、
前記プローブの先端部と前記プレートとの距離を測定する距離測定手段と、
前記プローブからの液滴滴下時に前記距離測定手段の測定結果に基づいて前記プローブ先端と前記プレートとの距離が予め設定された距離となるように前記支持機構の移動を制御する制御部と、
をさらに備えた請求項７から１２のいずれか一項に記載の試料前処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフなどの送液機構から溶出される試料液を液滴として先端部からマイクロプレートやサンプルプレートなどのプレート上に滴下するためのプローブと、そのプローブを含む試料前処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、高速液体クロマトグラフの分離カラムで分離した試料成分の溶出液を、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry：マトリクス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型質量分析）用サンプルプレートに自動的に滴下して分画捕集を行なう場合、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）用分離カラムで測定対象成分の分離を行い、分離カラムの先端に配管を介してＵＶ検出器に接続していた（特許文献１参照。）。【０００３】
通常、ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートに滴下させる液滴量は、多くても２μＬであり、このような微量の液滴を滴下させるためには、液体クロマトグラフは流量スケールとして１ｍＬ／ｍｉｎの通常の流量ではなく、５μＬ／ｍｉｎのミクロスケールや２００ｎＬ／ｍｉｎのナノスケールを用いる。これは、１ｍＬ／ｍｉｎで１μＬごとに滴下させようと思うと、０．００１ｍｉｎごとのスポットとなり、実質上不可能だからである。【０００４】
通常の流量スケールでは内径が０．３ｍｍ程度の配管が使われるが、流量スケールと配管内径に比例関係を保たせ、分離カラムで分離された成分の拡散を最小限に留めるためには、配管内径はさらに小さくなり、ミクロスケールでは１．５μｍ、ナノスケールでは６０ｎｍの配管内径になる。
しかし、実際にはコンタミネーション（異物）の混入による配管の閉塞を考慮し、内径が２０〜５０μｍの配管を用いている。例えば内径が５０μｍの配管を用いる場合、配管の長さが５００ｍｍのときの配管容量は１μＬになる。
【０００５】
その配管容量の大きさは、通常スケールで考えた場合、１ｍＬ／ｍｉｎの流量に対して５ｍＬの配管容量に相当するものであり、その多大な配管容量のため、分離カラムで分離された目的成分は拡散してしまう。ナノスケールでの分析を行なった場合には、配管容量の影響はより顕著である。【０００６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた場合、高速液体クロマトグラフで分離させることにより、理想的には１つの目的成分が１ウエル上に滴下されることが要求される。
このような要請はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用の試料を作成する場合に限らず、高速液体クロマトグラフからの溶出液に反応液などの添加剤を添加する場合にも同様に存在する。
【特許文献１】特開２００４−１８４１４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
分離カラムの後ろにＵＶ検出器を備えた場合は、ミクロスケールの分析ではＵＶ検出器で確認されるピーク幅よりも広いピーク幅でウエル上にスポットされてしまう。ナノスケールの分析に適用した場合、ウエル上のピークの広がりはさらに数倍に広がり、高速液体クロマトグラフで分離させた意味がなくなってしまっていた。
本発明は配管容量による拡散を防ぐことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のプローブは、複数の管が同軸上に配置された多重管構造をもち、最内側の管はミクロスケール又はナノスケールの高速液体クロマトグラフの分離用キャピラリカラムの先端部であり、外側の管の１つがそのキャピラリカラムから溶出される溶出液に添加剤溶液を合流させる添加剤供給管であり、それにより前記溶出液と前記添加剤を含む液滴を形成してこのプローブの先端から滴下させるものである。【０００９】
本発明の試料前処理装置は、キャピラリカラムを備えたミクロスケール又はナノスケールの高速液体クロマトグラフと、前記キャピラリカラムの先端に一体的に構成されたプローブであって、複数の管が同軸上に配置された多重管構造をもち、最内側の管は前記キャピラリカラムの先端部であり、外側の管の１つがそのキャピラリカラムから溶出される溶出液に添加剤溶液を合流させる添加剤供給管となっており、前記溶出液と前記添加剤を含む液滴を形成してこのプローブの先端から滴下させるプローブと、前記添加剤供給管に添加剤を供給する添加剤供給流路とを備えたものである。【００１０】
添加剤溶液としては種々のものを使用することができるが、好ましい一例は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析法で分析を行なうための試料作成用のマトリクス化合物用溶液である。【００１１】
多重管構造の一例は３重管構造であり、その場合、内側から２番目の管を添加剤供給管とし、最外側の管を溶出液中の移動相とは異なる第２移動相が流れる第２移動相供給管とするか、内側から２番目の管を溶出液中の移動相とは異なる第２移動相が流れる第２移動相供給管とし、最外側の管を添加剤供給管とすることができる。この場合、形成される液滴は溶出液、添加剤及び第２移動相を含むものとなる。【００１２】
このような３重管構造のプローブを備えた試料前処理装置の形態は、その第２移動相供給管に第２移動相を供給する第２移動相供給流路をさらに備えたものとなる。
例えば、高速液体クロマトグラフを用いてタンパク質の分析を行なう場合、移動相として水とアセトニトリルの溶液をグラジエント方式の送液機構により組成を変化させながら送液している。この高圧グラジエント分析では、移動相の組成が水成分を多く含んだ状態からアセトニトリルを多く含んだ状態へと遷移していく。液滴をプローブ先端部に形成し、その液滴が一定の大きさになったときにプローブ又はサンプルプレートを上下動させて液滴とサンプルプレートを接触させて液滴を移動させる装置では、分注開始直後と分注終了直前では液滴中の成分が異なり、分注開始直後は水成分が多く含まれ、分注終了直前ではアセトニトリルが多く含まれるために、プローブ先端部に形成される液滴の表面張力が変化して、均一な大きさの液滴が形成されない。【００１３】
また、プローブ先端部においてキャピラリカラムからの溶出液にマトリクス液を添加して先端部より分注する場合、プローブ部のマトリクス添加管の材質として、液滴がマトリクス添加管を這い上がってこないようにフッ素樹脂など疎水性物質が用いられていることが多い。その場合、分注開始直後は液滴が水成分を多く含んでいるためにマトリクス添加管の内径側に液滴が形成されるが、分注終了直前の液滴にはアセトニトリルが多く含まれるためにマトリクス添加管の外径側に液滴が形成され、液滴の体積が一定である場合、分注開始直後と分注終了直前とではプローブ先端部に形成される液滴の外形が異なったものとなる。すなわち、プローブ先端部に形成される液滴のサンプルプレート方向への高さが異なるために、プローブ先端とサンプルプレートとの距離を滴下する際に一定に保つセンサを備えていても、特に液滴量が微量である場合には液滴がサンプルプレートと接触せず、液滴をサンプルプレートに移動させることができないことがある。【００１４】
そのため、本発明の好ましい形態は、前記第２移動相は前記溶出液中の移動相と混合することによって前記液滴中の移動相の組成を一定にするものである。
これにより、移動相の組成変化による液滴の外形の変化を抑制することができ、安定した分注動作を行なうことが可能となる。【００１５】
マトリクス液の溶媒としては、水：アセトニトリル＝１：１の飽和溶液がよく用いられる。プローブ先端部において、分離カラムからの溶出液にマトリクス液を添加して先端部より分注する場合、分注開始直後の移動相組成が水成分を多く含んだ状態であれば、マトリクス液と混合されることで飽和マトリクス液中のマトリクスがプローブ先端に析出し、安定な分注動作の阻害となり、また、マトリクス中への測定対象成分の浸入によるキャリーオーバーが問題となる。しかし、上記のようにプローブ先端部に形成される液滴中の移動相組成を一定に保つようにすれば、プローブ先端部でのマトリクスの析出を防止することもできる。【００１６】
本発明の他の好ましい形態は、前記多重管のうち前記液滴と接触する最も外側の管が疎水性材料で構成されているものである。これにより、液滴がプローブ先端部の外側表面に付着するという不具合を防止することができ、均一な液滴をサンプルプレート上にスポットすることができる。疎水性材料の一例はフッ素樹脂である。【００１７】
分画動作の前にプローブ先端を手動で洗浄する操作は煩わしく、作業性も悪い。そのため、本発明のプローブの他の好ましい形態は、前記多重管はその最外側に前記添加剤溶液からの析出物を溶解する洗浄液をこのプローブの先端部に送ることのできる洗浄液供給管を備えている。【００１８】
この洗浄液供給管を備えたプローブを備えた試料前処理装置の形態は、前記洗浄液供給管に洗浄液を供給する洗浄液供給流路をさらに備えたものとなる。
このように、洗浄液供給管を備えれば、プローブ先端部に析出したマトリックス化合物を自動で除去することができるようになる。【００１９】
洗浄液がプローブに残留した場合、それを布で取り除くこともできるが、その際に布がプローブに触れるためプローブ位置がずれてしまい、滴下位置が正確でなくなってしまうことがある。
そこで、試料前処理装置の好ましい形態は、洗浄液供給流路に洗浄液と切り替えて乾燥用の気体を供給する気体供給流路をさらに備えている。プローブ先端から気体を噴出させて、洗浄後にプローブ先端部に残った洗浄液をその気体により乾燥させて蒸発させるようにすれば、液滴の滴下位置がずれることがなく、引き続き行なわれる生体試料の分画を均一に行なうことができる。【００２０】
本発明の試料前処理装置のさらに好ましい形態は、前記プローブにより滴下された液滴を捕集するプレートと、前記プレート又は前記プローブを少なくとも上下方向に移動する支持機構と、前記プローブの先端部と前記プレートとの距離を測定する距離測定手段と、前記プローブからの液滴滴下時に前記距離測定手段の測定結果に基づいて前記プローブ先端と前記プレートとの距離が予め設定された距離となるように前記支持機構の移動を制御する制御部とをさらに備えたものである。
このように、プローブ先端部とプレートとの距離を測定する手段を設けて、その距離を一定の距離に接近させることができるようにすれば、プローブとＭＡＬＤＩプレートの距離が離れすぎたり接触したりすることを防ぐことができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、プローブ内にキャピラリカラムをプローブの先端まで延在させたことにより、分画する目的成分が配管による拡散の影響を受けることなく、ＭＡＬＤＩプレートにスポットすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
図１は本発明を適用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用前処理装置の一実施例を概略的に示す図である。
高速液体クロマトグラフの分析流路に移動相を供給する送液機構として、流路切換えバルブ５１、送液ポンプ４８、ミキサ５２を備えている。この送液機構は、流路切換えバルブ５１により流路を切り換えながら、Ａ液とＢ液を送液ポンプ４８により吸入してミキサ５２に送って混合し、それらの溶液を移動相として分析流路に供給するグラジエント方式の送液機構である。Ａ液、Ｂ液は例えば水とアセトニトリルである。本発明の送液機構はグラジエント方式に限られず、単一の移動相を使用する方式でもよい。【００２３】
分析流路としてはキャピラリカラム２を用いており、キャピラリカラム２の移動相入り口側には、インジェクションポート４６が設けられている。キャピラリカラム２はプローブ１まで延在し、プローブ１と一体的に構成されている。
試料はインジェクションポート４６に注入されるとキャピラリカラム２で分離され、プローブ１の先端から溶出してサンプルプレート３６上に滴下される。【００２４】
Ｊ１は添加剤溶液としてマトリクス液を送液する配管１６とプローブ１とを合流させる３方ジョイントである。配管１６はポンプ４９を備え、マトリクス液をプローブ１に供給する。
マトリクスとなる化合物としては、ニコチン酸、２−ピラジンカルボン酸、シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、５−メトキシサリチル酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸、ジアミノナフタレン、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、ジシラノール、コハク酸、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、グリセリン等を使用することができる。
【００２５】
Ｊ２は第２移動相を送液する配管１７とプローブ１とを合流させる３方ジョイントである。配管１７は第２移動相を供給する送液機構として、流路切換えバルブ５４、送液ポンプ５０、ミキサ５６を備えている。【００２６】
第２移動相用の送液機構は、上記と同じグラジエント方式の送液機構であってもよいが、ここでは単一の移動相を供給するものとする。【００２７】
プローブ１の先端部は３重管構造となっており、キャピラリカラム２からの溶出液と、３方ジョイントＪ１で合流したマトリクス液、及び３方ジョイントＪ２で合流した第２移動相がプローブ１の先端で混合されて液滴となって、サンプルプレート３６に滴下される。【００２８】
図２はこの実施例のプローブ部の構造を詳細に示す断面図である。
上流側の第１Ｔ型３方ジョイントＪ１の直交しないジョイントａ,ｂの２つを高速液体クロマトグラフからの溶出液が送液されるキャピラリカラム２が貫通する。上流側のジョイントａはメイルナットなどの配管部品１０ａを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ１２などを用いる。【００２９】
Ｔ型３方ジョイントＪ１の直交するジョイントｃにはマトリクス液が送液される配管１６が接続され、メイルナットなどの配管部品１０ｃで密封する。キャピラリカラム２が突出しているジョイントｂには、キャピラリカラム２の外側にキャピラリ４をかぶせてメイルナットなどの配管部品１０ｂを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ２２などを用いる。【００３０】
下流側のＴ型３方ジョイントＪ２には、上流側のジョイントａからキャピラリカラム２とキャピラリ４の二重キャピラリが挿入され、メイルナットなどの配管部品２０ａを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ３２などを用いる。二重キャピラリカラム２,４と直交するジョイントｃには第２移動相を供給する管１７が接続され、メイルナットなどの配管部品２０ｃで密封する。最も下流側のジョイントｂでは、二重キャピラリカラム２、４のキャピラリ４の外側に配管８をかぶせて、メイルナットなどの配管部品２０ｂを用いて密封する。【００３１】
プローブ１の先端部はキャピラリカラム２，４及び配管８により３重管構造となっており、最内側の流路であるキャピラリカラム２を高速液体クロマトグラフからの溶出液が流れ、その外側の流路をマトリクス液が流れ、最外側の流路を第２移動相が流れる。これらの液体はプローブ１の先端で混合されて液滴となり、所定の液滴量となったところでサンプルプレート３６に滴下される。【００３２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析を行なう生体試料は高速液体クロマトグラフで分離され、本装置でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用サンプルプレート３６に滴下して分画される。マトリクスがプローブ先端で高速液体クロマトグラフの移動相と混合され、サンプルプレート３６に滴下されていく。【００３３】
一例として、高速液体クロマトグラフの流量が２００ｎＬ／ｍｉｎ（０．１％ＴＦＡ水−０．１％ＴＦＡアセトニトリル  グラジエント）、キャピラリカラム２の外径が３５０μｍ、内径が７５μｍ、長さが１００ｍｍ、マトリクス流量が２００ｎＬ／ｍｉｎ、マトリクス液が１０ｍｇ／ｍＬ ＣＨＣＡ溶液、スポット間隔が３０秒とする。ここでＴＦＡとはトリフルオロ酢酸である。【００３４】
このような場合、キャピラリカラム２による目的成分のピーク幅が３０秒だとすると、スポット間隔も３０秒になり、目的成分は拡散することなく、１ウエル又は２ウエルの範囲で１成分ずつプレート上にスポッティングされていく。
したがって、ＭＡＬＤＩによるイオン化を各目的成分１つ１つについて効率よく行なえ、イオン化効率のよくない成分でも検出が可能となる。【００３５】
図３は同実施例においてプローブ先端から液滴を滴下させるための分画装置の一例を示す概略構成図である。
この分画装置は、高速液体クロマトグラフからの溶出液を滴下するプローブ１と、プローブ１の先端部の側方に配置され、プローブ１の先端とサンプルプレート３６との間の距離を測定する距離測定手段としての近接センサー３５と、プローブ１先端部の下方に配置され、プローブ１から滴下される液滴６を捕集するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用のサンプルプレート３６と、サンプルプレート３６を搭載して上下方向と平面内方向に移動するステージ３７と、ステージ３７の動作を制御する制御装置３８とを備えている。【００３６】
近接センサー３５としては、例えば、超音波センサーや渦電流センサーを用いることができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析では、必要とされる試料液の量が１μＬ以下と非常に微量であることが多いため、近接センサー３５の検出距離は１〜１．５ｍｍ程度である。
サンプルプレート３６はステージ３７に搭載されて上下方向及び平面内方向に移動させられる。通常、サンプルプレート３６は、例えば、１９２個又は３８４個の滴下位置が定められており、それらの滴下位置にプローブ１より試料成分を含む液滴６を滴下する。【００３７】
制御装置３８はステージ３７の移動を制御するが、その制御としては以下の２つが挙げられる。
（１）ステージ３７を水平面内で移動させてサンプルプレート３６上の所定の滴下位置に正確に液滴が滴下されるように位置決めを行なう平面内制御。
（２）液滴の滴下時にプローブ１の先端にできた液滴６とサンプルプレート３６の滴下位置が接触するようにステージ３７を制御してサンプルプレート３６をプローブ１に接近させる上下方向制御。【００３８】
ステージ３７にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用のサンプルプレート３６に代えてＦＴ−ＩＲ用のサンプルプレートを搭載しても、同様の効果を得ることができる。
プローブ１から滴下する液滴量は任意に変更することができる。
また、近接センサー３５の検出点はオペレータが任意に設定することができる。また、サンプルプレート３６の初期位置も任意に変更することができる。【００３９】
通常、生体試料の分離分析を行なうＨＰＬＣはグラジエント法により分析が行なわれ、移動相組成の初期値としては有機溶媒濃度の低い値が選択され、移動相成分として水の割合が高くなる。水は表面張力が大きいため、移動相中の水の割合が高いとプローブ先端部から出てくる液滴がプローブの外側を伝って上ってくる傾向が強くなる。【００４０】
物質の疎水性・親水性を評価するひとつの目安として接触角を用いることができ、接触角が大きいほど疎水性が強い。
疎水性材料の好ましい例はフッ素樹脂である。そのようなフッ素樹脂としては、四フッ化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ）を初めてとして、それを改質した種々のフッ素樹脂を用いることができる。そのような改質フッ素樹脂としては、四フッ化エチレン−六フッ化プロピレン樹脂（ＦＥＰ）、四フッ化エチレン−パーフルオロアルコキシエチレン共重合体樹脂（ＰＦＡ）のほか、四フッ化エチレン−エチレン共重合体樹脂（ＥＴＦＥ）なども用いることができる。【００４１】
一般にプローブの材料として用いられているものの中で最も接触角の大きいＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）は約８８度であるのに対し、ＦＥＰの接触角は約１２０度である。この実施例では液滴と接触する最も外側の管としてのキャピラリ４としてＦＥＰチューブを用いるようにすれば、疎水性に優れ、高速液体クロマトグラフからの移動相とマトリクス液との混合液の液滴がキャピラリ４の外側に伝わりにくく、プローブ１の先端部に均一な液滴を形成することが可能となるので、その液滴はステージの上昇によりサンプルプレート３６と接触し、サンプルプレート３６上に均一に分画されていく。なお、キャピラリカラム２は溶融石英製、プローブ最外側の配管８はステンレス製である。【００４２】
次に、第２移動相を改良した実施例を説明する。
グラジエント分析では、分注開始直後と分注終了直前では液滴中の成分が異なる。例えば、分注開始直後は水成分が多く含まれ、分注終了直前ではアセトニトリルが多く含まれるようなグラジエント分析では、プローブ先端部に形成される液滴の表面張力が変化して、均一な大きさの液滴が形成されない。【００４３】
また、プローブ先端部において分離カラムからの溶出液にマトリクス液を添加して先端部より分注する場合、プローブ部のマトリクス添加管の材質として、液滴がマトリクス添加管を這い上がってこないようにフッ素樹脂などの疎水性物質を用いており、分注開始直後は液滴が水成分を多く含んでいるためにマトリクス添加管の内径側に液滴が形成されるが、分注終了直前の液滴にはアセトニトリルが多く含まれるためにマトリクス添加管の外径側に液滴が形成され、液滴の体積が一定である場合、分注開始直後と分注終了直前とではプローブ先端部に形成される液滴の外形が異なったものとなる。すなわち、プローブ先端部に形成される液滴のサンプルプレート方向への高さが異なるために、プローブ先端とサンプルプレートとの距離を滴下する際に一定に保つセンサを備えていても、特に液滴量が微量である場合には液滴がサンプルプレートと接触せず、液滴をサンプルプレートに移動させることができないことがある。【００４４】
図４にポンプ４８によって送液される移動相（第１移動相）と第２移動相の組成の時間的変化を示す。（Ａ）は第１移動相の組成の時間的変化を示す図であり、（Ｂ）は第２移動相の組成の時間的変化を示す図である。
第２移動相を供給する第２移動相供給流路は図５に示されたものである。第２移動相を送液する配管１７は第２移動相を供給する送液機構として、流路切換えバルブ５４、送液ポンプ５０、ミキサ５６を備えている。【００４５】
第２移動相用の送液機構は、流路切換えバルブ５１により流路を切り換えながら、Ａ液とＢ液を送液ポンプ４８により吸入してミキサ５２に送って混合し、それらの溶液を移動相として分析流路に供給するグラジエント方式の第１移動相供給流路２の送液機構と同じものである。ミキサ５６で混合されるＡ液とＢ液の溶液の混合比は、分離用の第１移動相を作成するミキサ５２で混合されるＡ液とＢ液の溶液の混合比の逆となるように調整される。
【００４６】
図４（Ａ）に示されるように、第１移動相は分注開始直後はＡ液（水）の溶液中に占める割合がほとんどであるが、Ｂ液の割合は時間とともに直線的に増加していく。それに対し、（Ｂ）に示されるように、第２移動相は分注開始直後はＢ液（アセトニトリル）の溶液中に占める割合がほとんどであるが、Ａ液の割合は時間とともに直線的に増加していく。
第２移動相は、第１移動相と第２移動相の混合液の組成が常時、Ａ液：Ｂ液＝１：１となるようにその組成が調節されている。【００４７】
例えば、分注開始後ある時間が経過したときに第１移動相の組成がＡ液９０％、Ｂ液１０％であったとすると、第２移動相の組成はＡ液１０％、Ｂ液９０％となるように調節されている。したがって、プローブ１先端部において混合された溶出液と第２移動相中の水とアセトニトリルの混合比は、水：アセトニトリル＝１：１となる。【００４８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析において、分注される液滴量は微量である上に一定であることが前提であるため、前述のように液滴内の移動相の組成が変化するとプローブ先端に形成される液滴の形状が変化してしまう。分注開始直後のプローブ先端と液滴先端との距離は大きくなり、分注終了直前にはその距離は小さくなってしまうので、特に分注の液滴設定量が小さい場合にはその距離の差は顕著になり、予め設定したプローブとプレートの間の距離では、液滴をプレートに移動させることができないことがある。【００４９】
この実施例では、プローブ先端に形成される液滴内の移動相組成を一定にするようにしたので、プローブ先端に形成される液滴の大きさ（高さ）を一定にすることができ、安定した分注動作を行なうことができる。【００５０】
次に、参考例を図６と図７により説明する。
分画動作の前にプローブ先端を手動で洗浄する操作は煩わしく、作業性も悪いため、マトリクス液を添加した場合のプローブ先端への析出物を自動で洗浄するようにすることが望ましい。そこで、プローブの最外側の管に空気及び洗浄液を切り換えて流せるようにする。
図６において、移動相を送るポンプ４８、試料を注入するインジェクションポート４６の流路に沿ってキャピラリカラム２が接続されている。
【００５１】
分析流路としては図１で説明した実施例と同じようにキャピラリカラム２を用いており、キャピラリカラム２の移動相入り口側には、インジェクションポート４６が設けられている。キャピラリカラム２はプローブ１まで延在し、プローブ１と一体的に構成されている。【００５２】
プローブ１はＴ型３方ジョイントＪ１、Ｊ２を備え、上流側のジョイントＪ１は移動相を送液するキャピラリカラム２とマトリクス液を送液する管１６とを接続させ、下流側のジョイントＪ２は空気及び洗浄液としてのアセトンを供給する管１８を接続させ、プローブ１の出口側の先端部は３重管構造を形成している。
試料はインジェクションポート４６に注入されるとキャピラリカラム２で分離され、プローブ１の先端から溶出してサンプルプレート３６上に滴下される。【００５３】
移動相に添加するマトリクス化合物としては第１実施例で説明したものを使用することができる。このようなマトリクス化合物を溶解する洗浄液は、アセトン、アセトニトリルなどの有機溶剤である。【００５４】
マトリクス液は、ポンプ４９によってＴ型３方ジョイントＪ１でキャピラリカラム２と接続されている管１６中を送液され、キャピラリカラム２の外側を流れてプローブ１の先端部から試料成分を含む移動相と同時に滴下される。【００５５】
空気供給管１９及び洗浄液供給管１８はＴ型３方ジョイントＪ３によって合流し、その共通の流路となっている配管１７は３方Ｔ型ジョイントＪ２によって移動相が流れるキャピラリカラム２及びマトリクス液が流れる管と接続され、空気及び洗浄液はマトリクス液が流れる管のさらに外側を流れるようになっている。【００５６】
ここではマトリクス液として、例えば、ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を水とアセトニトリルの混合溶液で溶解した飽和溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を使用し、洗浄液としては、例えばアセトンを使用する。【００５７】
空気供給管１９にはバルブ２８が取り付けられており、バルブ２８の開閉によって空気の供給が制御される。洗浄液供給管１８にはポンプ５０が設けられており、ポンプ５０が動作することで洗浄液のアセトンが洗浄液供給管１８を流れてプローブ１に供給される。【００５８】
液体クロマトグラフからの移動相を滴下する際は、サンプルプレート３６に移動相と同時にマトリクス液がプローブ１の先端より滴下される。液体の滴下後はマトリクス化合物がプローブ１の先端部に析出することがあるため、洗浄液供給管１８より洗浄液のアセトンをプローブ１の先端部に供給し、プローブ１の先端部を洗浄する。プローブ１先端部の洗浄後、洗浄液がプローブ１の先端部に残留しないように、バルブ２８を開いて空気をプローブ１先端部に供給し、プローブ１の先端部に残留した洗浄液を蒸発させる。【００５９】
図７はこの参考例のプローブを詳細に示す断面図である。
上流側の第１のＴ型３方ジョイントＪ１の直交しないジョイントａ,ｂの２つを高速液体クロマトグラフからの移動相が送液される一番細いキャピラリカラム２が横断している。上流側のジョイントａはスリーブ１２を介し、メイルナットなどの配管部品１０ａを用いて密封されている。
【００６０】
Ｔ型３方ジョイントＪ１の直交するジョイントｃにはマトリクス液が送液される配管１６が接続され、メイルナットなどの配管部品１０ｃで密封されている。一番細いキャピラリカラム２が出ているジョイントｂでは、キャピラリカラム２にキャピラリ４が被せられ、スリーブ２２を介してメイルナットなどの配管部品１０ｂを用いて密封されている。【００６１】
下流側のＴ型３方ジョイントＪ２には、上流側のジョイントａからキャピラリカラム２,４が挿入され、スリーブ３２を介してメイルナットなどの配管部品２０ａを用いて密封されている。キャピラリカラム２,４と直交するジョイントｃには空気及び洗浄液のアセトンを供給する管１８が接続され、メイルナットなどの配管部品２０ｃで密封されている。最も下流側のジョイントｂでは、キャピラリカラム２,４に配管８が被せられ、メイルナットなどの配管部品２０ｂを用いて密封されている。【００６２】
Ｔ型３方ジョイントＪ２の側方に位置するＴ型３方ジョイントＪ３には、ジョイントａから空気供給管１９が挿入され、ジョイントｂからＴ型３方ジョイントＪ２と接続する配管１７が挿入され、ジョイントｃから洗浄液供給管１８が挿入されて、それぞれの管２４，１８，２６がメイルナットなどの配管部品３０ａ，３０ｂ，３０ｃを用いて密封されている。【００６３】
空気供給管１９にはバルブ２８が設けられており、バルブ２８が開閉することにより空気のプローブ１先端部への供給のオン／オフが切り換えられる。洗浄液供給管１８にはポンプ５０が設けられており、ポンプ５０の動作のオン／オフによってアセトンが配管１７を通ってプローブ１先端部に供給されるオン／オフが切り換えられる。
【００６４】
マトリクス液は脂溶性物質であるマトリクス化合物を溶媒で高濃度に溶解した溶液であるため、液体クロマトグラフで試料を分離して溶出させマトリクス液を同時に添加して滴下させながら分画を続けていると、プローブ先端部においてマトリクス液が大気と接して溶媒が蒸発し、プローブ先端でマトリクス化合物が析出する。【００６５】
そこで、分析終了後又は次の分析前にポンプ５０を作動させてアセトンを例えば２００μＬ送液し、プローブ１の先端部をアセトンで洗浄する。ポンプ５０より送り出されたアセトンは乾燥蒸発用ガスラインと接続させるためのＴ型ジョイントＪ３を経由してプローブ１の２重管と３重管の間を流れてプローブ１先端部に固着したマトリクス化合物を洗い流す。その後、乾燥蒸発用ガスバルブ２８を開き、残留したアセトンを蒸発させる。
【００６６】
この参考例のように、空気供給管１９と洗浄液供給管１８とをＴ型ジョイントを用い手接続した場合には、アセトンなどの洗浄液がガスバルブ２８側に逆流しないよう流路抵抗を調節するのが好ましい。例えば、空気供給管１９として内径０．１ｍｍで長さが１００ｍｍ程度の配管を使用する。
Ｔ型ジョイントＪ３の代わりに３方電磁弁を用いてもよく、その場合には洗浄液がガスバルブ２８側に逆流を考慮しなくてもすむ。
【００６７】
この参考例では、洗浄液流路を備えてプローブ先端部に洗浄液を送るようにしたので、プローブ先端部に析出したマトリクス化合物を自動で除去することができるようになる。
実施例では３重管構造のプローブを持つ高速液体クロマトグラフを示したが、２重管又は３重管以外の多重管構造のプローブであっても、本発明を適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
高速液体クロマトグラフなどの送液機構から溶出される試料液を液滴として先端部からマイクロプレートなどのプレート上に滴下させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用の試料などの試料を調整する前処理に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】試料前処理装置の一実施例を概略的に示す流路図である。
【図２】同実施例のプローブの構造を詳細に示す断面図である。
【図３】支持機構及び距離測定手段に関する一実施例を示す概略図である。
【図４】第１移動相と第２移動相の組成の時間的変化を示し、（Ａ）は第１移動相の組成の時間的変化を示す図であり、（Ｂ）は第２移動相の組成の時間的変化を示す図である。
【図５】試料前処理装置の他の実施例を概略的に示す流路図である。
【図６】試料前処理装置の参考例を概略的に示す流路図である。
【図７】同参考例のプローブの構造を詳細に示す断面図である。
【符号の説明】
【００７０】
１      プローブ
２      キャピラリカラム
４      キャピラリ
８      配管
１０ａ,１０ｂ,１０ｃ,２０ａ,２０ｂ,２０ｃ,３０ａ,３０ｂ,３０ｃ    配管部品
１２,２２,３２    スリーブ
１６      マトリクス供給管
１８      第２移動相供給管
３６      サンプルプレート
４６      インジェクションポート
４８，４９，５０    ポンプ
５１，５４      流路切換えバルブ
５２，５６      ミキサ
Ｊ１,Ｊ２    Ｔ型３方ジョイント
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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