(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
0004326590.tif 000028
ここで、各Ｔ、Ｇ、ＡおよびＣはヌクレオチドを表す；
を含む構築物によりコードされるリボザイム、およびＨＩＶ−１複製を阻害または抑制する薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記ＨＩＶ−１複製を阻害または抑制する当該薬剤が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ｔａｔタンパク阻害剤、インテグラーゼ阻害剤または免疫治療剤である組成物。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の薬学的組成物であって、当該薬剤が組換え抗ＨＩＶ−１抗体、ジドブジン（ＡＺＴ）、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４ｔ、ネビラピン、デラビルジン、ラミブジン（３−ＴＣ）、ロビリド、サクイナビア（saquinavir）、インターロイキン２、インターフェロンα、インターフェロンγ、またはインターロイキン１２である組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の薬学的組成物であって、当該薬剤が組換え抗ＨＩＶ−１抗体である組成物。
【請求項５】
治療において使用するための請求項１〜４の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
本出願を通じて、種々の刊行物をかっこ内において著者及び年で引用する。完全な表示は、実験の部の後にアルファベット順に列記した。これらの刊行物の開示は、全体として、本発明と関連のある分野の状況をより完全に説明するために本出願に参照文献として含まれる。
本発明の背景
レトロウイルス
レトロウイルスは、これらのゲノム物質としてＲＮＡを有するウイルスである。これらは、これらのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡコピーをホスト細胞ゲノムに安定に同化させ、これらを複製するためにホスト細胞を使用する（Miller, 1992、及びBrown, 1987）。ウイルスゲノムは、ウイルスのプロウイルス性ｃＤＮＡ型の両末端（５’及び３’）で、ロングターミナルリピート（Long Terminal Repeat）（ＬＴＲ）より構成される。５’から３’までのプロセッシングで、ＬＴＲはＲと称される短い配列によって結合されたＵ３及びＵ５配列より構成される。転写は５’ＬＴＲ内で開始され、３’ＬＴＲのポリアデニル化部位で停止される。ＬＴＲに隣接するのは、逆転写酵素によって正及び負の螺旋ＤＮＡの合成をプライミングするのに必要な短い配列である。スプライスドナー及びアクセプター配列はゲノムの範囲内にも存在し、これらは、サブゲノムＲＮＡ種の産生に関係する。５’ＬＴＲに直接隣接するのは、ウイルス性ＤＮＡをビリオンに被包するのに必要な配列である。これは、Ｐｓｉパッケージング配列と呼ばれる。これは、ウイルス性ＲＮＡをパッケージすることを可能にする必須の、特異的シグナルである。ウイルス性ＲＮＡの集団は、gag、pol及びenv複製遺伝子よりなる。これらはそれぞれ、コアータンパク（gag）、酵素インテグラーゼ、プロテアーゼ及び逆転写酵素（pol）及びエンベロープタンパク（env）をコードする。
細胞のレトロウイルス感染は、ウイルスの糖タンパクが細胞の受容体（Ａ）と相互作用することにより開始される（図１参照）。吸着及び脱外被に続いて、ウイルス性ＲＮＡは標的細胞に侵入し、逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡに変換され、酵素がビリオン内にもたらされる（Ｂ）。ｃＤＮＡは、環状型を選択し（Ｃ）、二本鎖ｃＤＮＡに変換され、次いでインテグラーゼの作用によってホスト細胞のゲノムＤＮＡに同化される（Ｄ）。一度同化されると、プロウイルスｃＤＮＡは５’ＬＴＲ内のプロモータから転写される（Ｅ）。転写されたＲＮＡは、ｍＲＮＡとして作用し、翻訳され、ウイルスタンパクを産生するか（Ｆ）、又は発生期のウイルスＲＮＡとして残される。このウイルス性ＲＮＡは、ビリオンへのそのパッケージングのために必須のＰｓｉパッケージング配列を包含する（Ｇ）。一度ウイルスが産生されると、これは形質膜から出芽することによって細胞から放出される（Ｈ）。一般に、レトロウイルスは、ホスト細胞の溶解を引き起こす。ＨＩＶはこの例外である。プロウイルス性ｃＤＮＡはホストゲノムに安定に同化して存続し、ホストＤＮＡによって複製され、この結果、後代細胞もウイルスを受け継ぐ。可能な抗ウイルス剤はこれらの複製を制御するポイントの何れかを標的にしうる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＨＩＶはレトロウイルス綱に属し、その複製は、先に概説したとおりである。ＨＩＶの、Ｔリンパ球、単球及びマクロファージを含めた細胞への侵入は、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパクと標的細胞表面のＣＤ４受容体との相互作用によって一般に起こる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、異なった患者で（又は同じ患者でさえも）高度に変化し得、ワクチンの製造が非常に困難である（Brown, 1987及びPeterlinら1988）。この変異性は、疾患の進行と関連があるように思われる。ＨＩＶの主要な特色は、ｉ）（レンチウイルス属の他の構成要素に対するように）これは、プロウイルスがホスト細胞のゲノムに同化した後、休眠状態にありうる潜伏期を有すること、及びii）これがＴリンパ球標的細胞に対して細胞変性であることである。ＨＩＶは、プロウイルスが潜んでいる細胞が活性化された後、複製を開始する。ウイルスの複製が付随する細胞の活性化のための刺激は、まだ明確に同定されていない（Brown, 1987及びPeterlinら、1988）。全てのレトロウイルスに対するのと同様に、gag、pol及びenv遺伝子産物は構造的及び酵素的タンパクに翻訳される。ＨＩＶの場合、追加の調節因子がある。特に、tat及びrev遺伝子産物は、調節タンパクに翻訳され、転写エンハンサーとして作用し、高レベルの遺伝子発現を誘導する。Nifは、ウイルスの複製レベルをを調節するために供される他の調節遺伝子である（Jones, 1989, Greene, 1990及びEpstein, 1991）。
ＨＩＶの複製は、活性化された細胞及び増殖している細胞で最も高くなる。細胞の活性化は、核転写物の結合を導き、細胞エンハンサーはＨＩＶＬＴＲに対する因子として行動し、このことは転写のレベルを増加させることになる。全てのレトロウイルス対するのと同様に、パッケージング領域（Ｐｓｉ）は、ゲノムＲＮＡの被包に必要な、ＨＩＶゲノムに存在するシス−作用性ＲＮＡ配列である。コアーに取り込まれるgagタンパク、pol酵素及びウイルス性ＲＮＡの形成は、ＨＩＶ複製サイクルの最終段階である。このコアーは膜を得、細胞膜を通して出芽することにより細胞から出ていく（Peterlinら、1988, Jones, K.A., 1989, Greene, 1990及びEpstein， 1991）。
今日まで、ＨＩＶの複製を抑制するための多くの医薬が研究されている。図１に示した複製段階を標的にした幾つかの医薬について以下に説明する。
（Ａ）標的細胞へのウイルスの吸着
可溶性ＣＤ４が、高い割合でウイルス受容体を占め、この結果ウイルスが細胞膜に結合できなくなるという試みに使用されている。しかし、今日まで、これが有効な治療戦略となることが見出されていない（Stevensonら、1992）。硫酸化多糖は、細胞−ウイルス融合をさえぎることにより、ＨＩＶ感染の可能性を阻害する能力を示している（mcClureら、1992）。ＨＩＶの抗体自身、ホスト細胞受容体又はＨＩＶエンベロープ決定因子、並びにＣＤ４と複合体形成されたエキソトキシン（Stevensonら、1992）は、ウイルス細胞内への侵入をさえぎる他の可能な方法である。
（Ｂ）逆転写酵素によるｃＤＮＡの産生
アジドチミジントリホスフェート（ＡＺＴ）のような化学品が、in vitroで逆転写酵素を阻害することが見出されている。ＡＺＴは、現在、ＡＩＤＳ患者及び彼らが骨髄移植を受けた場合に、残ったＨＩＶから骨髄を保護する試みとして、後者に日常的に投与されている（Miller, 1992）。
（Ｃ）細胞質から核へのｃＤＮＡの移送
核孔を通るｃＤＮＡの移送又は核移送自身を妨げることができるが、これは有効であることがまだ見出されていない。
（Ｄ）ホストゲノムへのｃＤＮＡの同化
ホスト細胞ゲノムへのプロウイルスｃＤＮＡの同化をブロックすることもできる（Stevensonら、1992）。今日まで、効果が証明された候補化合物は存在しない。
（Ｅ）プロウイルスの転写
５，６−ジクロロ−１−ベータ−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾールは、転写延長を妨害することが知られている（Stevensonら、1992）。センスTAR類似体も、tatタンパクに結合し、これによってＨＩＶを活性化する能力を阻害することによって転写に影響を与えうる（Miller, 1992及びSullengerら、1990）。
（Ｆ）ＨＩＶｍＲＮＡの翻訳
ウイルスＲＮＡに結合することによってアンチセンスＲＮＡがウイルスの複製を阻害しうる（Sczakielら、1992）。ｍＲＮＡへの結合がなされ、翻訳を阻害しうる。発生期のウイルスＲＮＡへの結合は、ウイルスへのＲＮＡのパッケージングの発生を阻害するように作用しうる。
（Ｇ）ウイルスのパッケージング及び成熟したビリオンの産生
プロテアーゼは、ＨＩＶポリタンパクの特異的開裂を誘導する。この活性は、成熟した感染細胞の産生に必須である。α，α−ジフルオロケトン類のような幾つかの化合物が、ＨＩＶプロテアーゼを阻害することが見出されており、組織培養である程度の抗ウイルス活性を示した。しかし、ほとんどのプロテアーゼ阻害剤は、短い血清半減期、迅速な胆汁クリアランス、及び貧弱な経口での利用性を示した。
リボザイム
リボザイムは、ＲＮＡを開裂し、ターンオーバーを示す酵素ＲＮＡである。リボザイムの幾つかのクラスでは、相補的配列アームの添加により、これらは特異的な標的ＲＮＡと対をなすこと、及びＲＮＡのホスホジエステル骨格に沿った特異的部位での開裂を誘導することができるようになる（Haseloffら、1988；Rossiら、1992；Hampel、1990；Ojwang、1992）。ハンマーヘッドリボザイムは、小さく簡単であり、種々のフランキング配列モチーフに取り込まれる場合、部位特異的な開裂を維持する能力を有する（Haseloffら、1988；Rossiら、1992）。これらの特徴は、これを遺伝子抑制に非常に適したものにさせる。
本発明の概要：
本発明は、天然に存在しない合成オリゴヌクレオチド化合物であって、ヌクレオチドの配列が、保存触媒領域を定義するヌクレオチド、及びヌクレオチドの配列が、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内で、予め決められた標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチドを含有するものに向けられる。好ましくは、該ウイルスパッケージング配列は、レトロウイルスパッケージング配列であり、一態様では、ＨＩＶ−１Ｐｓｉパッケージング配列である。ＲＮＡウイルスは、ＨＩＶ−１、フェリン白血病ウイルス、フェリン免疫不全ウイルス、又は表７及び８に列記されたウイルスの１つでありうる。保存触媒領域は、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアーピンリボザイム、肝炎デルタリボザイム、ＲＮＡａｓｅＰリボザイム、グループＩイントロン、グループIIイントロンから誘導されうる。本発明はまた、多重リボザイム、及びリボザイムと、ＲＮＡウイルスに対して標的化されたアンチセンスの組み合わせ、更にポリTAR、RRE又はTARデコイを含めたこのような組み合わせに向けられる。アンチセンス及びポリTAR、RRE又はTARデコイを有するか、又は有しないベクター又はリボザイムも望まれる。更に、in vivo及びex vivoの両方での治療方法および使用方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
図１．  典型的なレトロウイルスの複製サイクル
（Ａ）ウイルスが標的細胞上の細胞表面受容体に結合し、ゲノムＲＮＡが融合及びウイルスの脱外皮に続いて標的細胞に侵入する。
（Ｂ）逆転写が起こり、ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡへの変換が起こる。
（Ｃ）ｃＤＮＡは核に遭遇し、環状の形態に変換される。
（Ｄ）次に、ｃＤＮＡがホスト細胞ゲノムに同化される。
（Ｅ）ウイルスＲＮＡ及びｍＲＮＡを産生するプロウイルスの転写。
（Ｆ）翻訳によりウイルスタンパクが産生される。
（Ｇ）ウイルスコアーが、ウイルスによりコードされるタンパクから形成され、ウイルスＲＮＡがパッケージングされる。
（Ｈ）コアーが膜を得、細胞膜を通して出芽することによって細胞から出ていく。
図２．  Ｍｏ−ＭＬＶＰｓｉパッケージング領域内のリボザイム標的部位。
Ｍｏ−ＭＬＶ５’領域は、pMLV-1（本文中で定義される。）のBalI/BalIフラグメント（nt212からnt747）を表す。矢印は、リボザイム標的部位を表し、その全てがＧＵＣ残基である。
図３．  モロニーネズミ白血病ウイルス
ＭｏＭＬＶのゲノムは、複製遺伝子gag、pol及びenv、及び５’及び３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲｓ）よりなる。Ｐｓｉパッケージング部位は、ウイルスＲＮＡをビリオンにパッケージングするのに必要である。
図４．  抗−Ｍｏ−ＭＬＶ及び抗−ＨＩＶパッケージング部位構築物
標準的な発現構築物は、pSV2neoをベースとし、デザインされたリボザイムの１つ又はneorのSma I部位に挿入された、Ｐｓｉパッケージング配列に相補的なアンチセンス配列（抗−Ｐｓｉ）を有するneor遺伝子の上流のSV40プロモータよりなる。
図５．  標的とされるＨＩＶパッケージング配列
図は、ＨＩＶゲノムの簡略化した図であり、リボザイム９がＰｓｉパッケージング部位内の配列に対してターゲッティングされる。
図６．  in vitroで生成されたＭｏ−ＭＬＶパッケージング領域ＲＮＡの、リボザイムによるin vitro開裂
レーン１は、HinfIで消化されたpBR322マーカーＤＮＡである。レーン２は、約５５０kbの物質である。レーン３、５、７及び９は、in vitroで生成されたRz243、Rz274、Rz366及びRz-M7単独である。以下のリボザイムを標的物質ＲＮＡに付加した。レーン４、Rz243；レーン６、Rz274；レーン８、Rz366；レーン１０、Rz-M7。開裂反応は、サンプルを１０mMトリスＣｌ、ｐＨ７．５で２分間８０℃で加熱した後、１０mMＭｇＣｌ、５０mMトリスＣｌ、ｐＨ７．５中、３７℃で３０分行った。
図７．  リボザイム又はアンチセンス構築物で感染させた細胞系から得たＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
ウイルス構築物で感染させた３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞から得たゲノムＤＮＡ（１０μｇ）：レーン１、pSV243；レーン２、pSV274；レーン３、pSV366；レーン４、pSV-M7；レーン５、pSVAs-Psi；及びレーン６、pSV2neoベクター単独をHindIII/NruIで消化し、０．６％アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルターにブロットし、32Ｐ−標識されたneor遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。矢印の先は、neor遺伝子単独（１．３４kb）及びneor遺伝子に、単一リボザイム（１．３４kb）、多重Ｒｚ（１．９８kb）、又はアンチセンス（１．８９kb）を合わせたものの推定サイズを示す。
図８．  リボザイム／アンチセンス構築物の発現を試験するためのＲＮａｓｅ保護分析
一連の感染された細胞から得た１０μｇの全ＲＮＡを、32Ｐ−標識されたリボプローブを用いてリボザイム又はアンチセンス構築物の発現を分析した。レーン１、HinfIで消化されたpBR322の、サイズマーカー末端標識ＤＮＡフラグメント；ライン２、酵母ＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化されるRzM7リボプローブ；レーン３、酵母ＲＮＡでハイブリダイズされ、次いでＲＮａｓｅで消化されないRzＭ７リボプローブ；レーン４〜８、pSV243；pSV274；pSV366；pSV-M7で感染されたそれぞれの細胞とハイブリダイズされ、ＲＮａｓｅで消化されるRz243、Rz274、Rz366、Rz-M7及びAs-Psiのリボプローブ；レーン９〜１３、Rz-M7、Rz243、Rz274、Rz366及びAs-Psiのみのリボプローブ。Ｍｏ−ＭＬＶの複製の抑制の最もよい抑制を示す核構築物の１つのクローンをアッセイに使用する。
図９．  異なったＭｏ−ＭＬＶ産生３Ｔ３細胞から誘導されるウイルスＲＮＡのドットブロットのオートラジオグラフ
１：１，１：５及び１：１０希釈でのウイルスＲＮＡ調製物を、先に説明したＭｏ−ＭＬＶＰｓｉパッケージング領域に相補的な32Ｐ−標識されたリボプローブでプローブした。レーン１、酵母ＲＮＡ；レーン２〜７、pSV243、pSV274、pSV366、pSV-M7、pSVAsPsi及びpSV2neoでトランスフェクションされた３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞の上清から得たＲＮＡ。ウイルスＲＮＡのレベルは、in vitroでＲＮＡ標的分子を開裂するのに効果的なリボザイム及びアンチセンスにより低下されることがわかった。
図１０．  長期間のアッセイでのｐ２４レベル
ヒストグラムチャートは、ＨＩＶパッケージング部位を標的とするリボザイム構築物である、リボザイム９（Rz-9）に対する８、１３及び２２日目のｐ２４レベルによって測定されるＨＩＶ複製のデータを示す。Rz-2及びRz-MはＨＩＶのtat遺伝子を標的とする２つのリボザイムである。Rz-Mは、tat内の異なった部位を標的とする多重リボザイムを含む幾つかのリボザイムである。これはRz-2によって標的化された部位を含む。
図１１．  抗−ＨＩＶ−１tatリボザイムは、ジーンバンク（LOCUS:HIVSF2CG）から得たＨＩＶ−１  ＳＦ２単離物の配列データに従ってデザインされた。標的部位は、ＧＵＣ（Rz 1）、ＧＵＡ（Rz 1）、ＧＵＣ（Rz 3）及びＣＵＣ（Rz 4）である。
図１２．  tat保存配列
図１３．  ウイルス性tat標的配列の比較
図１４．  Rz2（a,d,f）での保護を示す感染されたクローンＴ細胞系（Sup T1）。ベクター（pSV2neo、neo-a）及びランダムコントロール（Ran a,b,c,d,e,f）を含有するクローン細胞系。
図１５Ａ〜１５Ｃ．  レトロウイルス構築物及びこれらの結果としての発現の概略的表示（共通の尺度で表示していない。）。１５Ａ、リボザイム構築物RRz2；１５Ｂ、アンチセンス構築物RASH5；１５Ｃ、ポリマーTAR構築物R20TAR。親レトロウイルスベクターをかっこ内に記載した。詳細は本文を参照。
図１６Ａ〜１６Ｃ．  形質導入されたPBLs中でのレトロウイルス構築物の発現。リボザイム（図１６Ａ）、アンチセンス（図１６Ｂ）及び20TAR ＲＮＡ（図１６Ｃ）の発現を、対応する32Ｐ−標識プローブを用いてノーザン分析で試験した。詳細は本文参照。
図１７Ａ〜１７Ｃ．  形質導入されたPBLs中でのＨＩＶ−１IIIBの複製の阻害。形質導入され、選択されたPBLsを物質及び方法で説明したように試験し、分析した。プロットされたデータは、５ドナー（図１７Ａ、リボザイム構築物及び図１７Ｂ、アンチセンス構築物）と、２ドナー（図１７Ｃ、ポリマーTAR構築物）の平均である。
図１８Ａ〜１８Ｃ．  臨床的単離物８２Ｈによる感染に対する形質導入されたPBLsの耐性。PBLsは、物質及び方法で説明したように８２Ｈで感染されたリボザイム構築物（図１８Ａ）、アンチセンス構築物（図１８Ｂ）及びポリマーTAR構築物（図１８Ｃ）で形質導入された。データのプロットは、２ドナーの平均である。
図１９．  形質導入されたPBLsの増殖アッセイ。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示した。PBLのみ、形質導入されていないPBLs；ＬＸＳＮ、R-20TAR、LNHL、RASH-5、LNL6及びRRz2、対応するレトロウイルスで形質導入されたPBLs。
図２０．  CEM T4 Ｔ−細胞系がウイルスで形質導入され、G418選別にかけた。貯蔵された集団には、ランダム同化体及び可変構築物を有する細胞を含み、次にその発現レベルをＨＩＶ−１で試験した。
図２１Ａ〜２１Ｂ．  RzMは、tatに向けられた多重リボザイムであり、RRzpsi/Mは、パッケージング／多重リボザイムと供に、tatにも向けられたリボザイムである。
図２２は、所定日数にわたるng/mLでの、ＨＩＶ−１IIIBウイルスで感染されたSup T1細胞に対するp24のレベルを示す。
図２３は、ＨＩＶ−１ tat遺伝子をターゲッティングする単一リボザイムであるRz2と組み合わせたBM１２による、１５日目のＨＩＶ−１複製の阻害を示す。
本発明の詳細な説明：
本発明は、天然に存在しない合成オリゴヌクレオチド化合物であって、ヌクレオチドの配列が、保存触媒領域を定義するヌクレオチド、及びヌクレオチドの配列がＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の予め決められた標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを具備したものに向けられる。好ましくは、ウイルス性パッケージング配列は、レトロウイルスパッケージング配列であり、一態様ではＨＩＶ−１  Ｐｓｉパッケージング配列である。ＲＮＡウイルスは、ＨＩＶ−１、フェリン白血病ウイルス、フェリン免疫不全ウイルス又は表６から７に列記したウイルスの１つでありうる。保存触媒領域は、ハンマーヘッドリボザイム、（Haseloffら、米国特許第５，２４９，７９６；Rossiら、米国特許第５，２４９，７９６参照）、ヘアピンリボザイム（Hampelら、１９８９年９月２０日に提出された欧州出願第８９２２７４２４参照）、肝炎デルタリボザイム（Goldbergら、１９９１年４月４日刊行の、ＲＣＴ国際出願第ＷＯ９１／０４３１９及び９１／０４３２４）ＲＮＡａｓｅＰリボザイム（Altmanら、米国特許第５，１６８，０５３参照）、グループＩイントロン（Cechら、米国特許第４，９８７，０７１参照）又はグループIIイントロン（Pyle, 1993参照）から誘導されうる。
一態様では、化合物は、下記構造（配列識別番号：１）を有しうる。
0004326590.tif 000002
但し、各Ｘは、ヌクレオチドであって、同じであるか、又は異なっており、その糖、ホスフェート又は塩基が修飾又は置換されうるものを表し、各Ａ、Ｃ、Ｕ及びＧは、リボヌクレオチドであって、その糖、ホスフェート又は塩基が未修飾であるか、又は修飾若しくは置換されうるものであり、３’−ＡＡＧ．．．．ＡＧＵＣＸ−５’は保存触媒領域を定義し、各（Ｘ）nＡ及び（Ｘ）nは、ヌクレオチドの配列が、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の予め決められた標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを定義し、各＊はこれらの両側に位置するヌクレオチド間の塩基対を表し、各実線はこれらの両側に配置された核酸間の原子価結合を提供する化学結合を表し、波線の各々は、独立にこれらの両側に配置された核酸間の原子価結合を提供する化学結合を表すか、又はこのような何れの化学結合も存在しないことを表し、ａはヌクレオチドの数を定義する整数であるが、ａは０又は１であるという条件が付き、０である場合、（Ｘ）aの５’に配置されたＡは（Ｘ）aの３’に配置されたＸに結合される。ｍ及びｍ’の各々は、１以上の整数をあらわし、（Ｘ）bはオリゴヌクレオチドを表し、ｂは２以上の整数を表す。
この他には、化合物は以下の構造（配列識別番号：２）を有する。
0004326590.tif 000003
但し、３’−ＡＡＧ．．．．ＡＧＵＣＸ−５’は保存触媒領域を定義し、ｍは２から２０の整数を表し、ヌクレオチド（Ｘ）mは化合物内の何れかの他のヌクレオチドと対を形成するワトソン−クリック塩基である。
他の態様では、下記構造（配列識別番号：３）を有する請求の範囲第１項に記載の化合物が提供される。
0004326590.tif 000004
但し、３’（Ｘ）P4．．．．（Ｘ）P1は、保存触媒領域を定義し、（Ｘ）F4及び（Ｘ）F3はヌクレオチドの配列がＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の予め決められた領域とハイブリダイズできるヌクレオチドを定義し、各実線は、これらの両側に配置されたヌクレオチド間の原子価結合を提供する化学結合を表し、Ｆ３はオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの数を定義する整数を表わすが、Ｆ３は３以上であるという条件が付き、Ｆ４はオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの数を定義する整数を表わすが、Ｆ４は３から５であるという条件が付き、（Ｘ）P1及び（Ｘ）P4の各々は（Ｘ）P4が（Ｘ）P1の３〜６塩基と塩基対を形成するような予め決められた配列を有するオリゴヌクレオチドを表わし、Ｐ１はオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの数を定義する整数を表すが、Ｐ１は３から６であり、Ｐ１とＦ４の合計が９に等しいという条件が付き、（Ｘ）P2及び（Ｘ）P3の各々は（Ｘ）P2が（Ｘ）P3の少なくとも３の塩基と塩基対を形成するような予め決められた配列を有するオリゴヌクレオチドを表わし、波線の各々は、独立に、これらの両側に配置されたヌクレオチド間の原子価結合を提供する化学結合を表すか、又はこのような化学結合の何れも存在しないことを表し、（Ｘ）L2は存在しても又は存在しなくてもよいヌクレオチドを表すが、（Ｘ）L2が存在する場合、Ｌ２は３以上の整数を表すという条件が付く。
他の態様では、ヌクレオチドの配列が保存触媒領域を定義するヌクレオチドは、肝炎デルタ保存領域から得られる。この他には、ヌクレオチドの配列が保存触媒領域を定義するヌクレオチドはその３’末端で配列ＮＣＣＡを包含する。
本発明はまた、同じか又は異なりうる予め決められた標的配列を標的にする同じであるか、又は異なっている保存触媒領域を有する多重化合物又はリボザイムに向けられる。一態様では、同じであるか、又は異なりうる２以上のドメインを含有する天然に存在しない合成オリゴヌクレオチド化合物であって、各ドメインが、ヌクレオチドの配列が保存触媒領域を定義するヌクレオチド、及びヌクレオチドの配列がＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の予め決められた標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチドを含有するものである。この化合物はまた、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の、オリゴヌクレオチド化合物と同じであるか、又は異なりうる予め決められた配列とハイブリダイズできるアンチセンス核酸化合物に共有結合される。
好ましい一態様では、ヌクレオチドは、ＭｏＭＬＶの２４３、２７４、３６６又は５５３標的配列及びＨＩＶＰｓｉパッケージング部位の７４９部位にハイブリダイズできる。ヌクレオチド化合物は、原子価結合され、ＲＮＡウイルスゲノムの異なった遺伝を標的にする、少なくとも１つの追加の天然に存在しない合成オリゴヌクレオチド又はアンチセンス分子を更に含有しうる。ＲＮＡウイルスがＨＩＶである場合、ＨＩＶゲノムの異なった領域は、ロングターミナルリピート、５’非翻訳領域、スプライスドナー−アクセプター部位、プライマー結合部位、３’非翻訳領域、gag、pol、プロテアーゼ、インテグラーゼ、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、又はtev領域よりなる群から選択されうる。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチド化合物は、ＭｏＬＶの２４３、２７４、３６６又は５５３標的部位又はこれらの組合せ、及びＨＩＶＰｓｉパッケージング領域の７４９部位とハイブリダイズでき、第二の追加の化合物は、ＨＩＶtat領域の５７９２、５８４９、５８８６、又は６０４２標的部位及びこれらの組合せとハイブリダイズできる。追加の標的は、ＨＩＶゲノム内（配列識別番号：４〜７）、特に、tat配列内及びpsiパッケージング領域内（ＨＩＶ−１  ＳＦ２）、
0004326590.tif 000005
又は表IIIに見出されうる。本明細書で使用される特別なリボザイム配列は、Rz-2、Rz-M及びRz-ψである。抗−ＨＩＶリボザイム配列Rz-2（単一抗−tat）は、
0004326590.tif 000006
Rz-M（多重抗−tat）は、
0004326590.tif 000007
Rz-ψ（単一抗−ＨＩＶψ）は、
0004326590.tif 000008
である。
リボザイムによるＨＩＶの開裂は、可能性として有用なアプローチである。治療的には、これは以下の幾つかの重要な特徴を有する。
ｉ）特異性
ii）相対的に多くの可能な部位を標的にする能力
iii）細胞に対する毒性の欠如
iv）リボザイム分子のターンオーバー
ｖ）種々の利用可能な輸送方法
vi）種々の産生方法の可能性
ａ）化学合成（これは短い分子である。）、ｂ）in vitroでの翻訳による生化学的産生、及びｃ）in vivoにおいてプロモータで進行される同化された構築物からの産生
本発明は、抗−パッケージング部位（Ｐｓｉ）リボザイムをＨＩＶ複製を阻害する。この活性は、Ａ、Ｅ、Ｆ及びＧのレベルで作用する。この部位の切断は、ｉ）標的細胞へのウイルスの侵入、ii）ウイルスＲＮＡの産生、iii）ウイルスタンパクへのウイルスｍＲＮＡの翻訳、及びiv）ビリオンへのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに関する阻害効果を有する。
ＰＳＩパッケージング配列
Ｐｓｉパッケージング配列は、ビリオンへのウイルスＲＮＡの特異的被包に必要なシス作用性ウイルスゲノム配列である（Aronoffら、1991）。ウイルス粒子へのＲＮＡのパッケージングが高特異性を示し、これは、Ｐｓｉ部位によって伝えられるように思われることが知られている。Ｍｏ−ＭＬＶ及びＨＩＶ−１の両方に対するＰｓｉパッケージング部位の配置は、機能的欠失、即ち幾つかの配列を除去すること、及びウイルスＲＮＡのパッケージングの方法が係属するかどうかを観測することによって同定された。配列は、レトロウイルスの５’非翻訳領域内にあり、パッケージングされていないＲＮＡｓに存在しないことが示されている。本発明によって、我々は、ＲＮＡがパッケージングされたものとして容易に認識されるためには、パッケージング配列がさらされ、接近でき、認識されなければならないことを導き出した。Ｍｏ−ＭＬＶ及びＨＩＶ−１パッケージングシグナルの両方の研究から、これらの各々の場合に、保存された安定な二次構造があることが示された（Alfordら、1992及びHarrisonら、1992）。我々の観点では、これらの特性は、Ｐｓｉパッケージング部位をリボザイム作用のための誘引性標的にする。レトロウイルスパッケージング配列に対するアンチセンスを使用する研究で、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）がＰｓｉ配列での妨害によってトランスジェニック動物内で阻害されることが先に示された（Hanら、1991）。
モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）
Ｍｏ−ＭＬＶは、腫瘍形成性を有しないネズミの野生型レトロウイルスである（図３）（Teichら、1985）。これは挿入突然変異源による長い潜伏期を有する白血病をマウスに起こす。我々は、抗−ウイルスリボザイムの効力に対する本質的な証拠を評価するための第一段階としてＭｏ−ＭＬＶを使用した。Ｍｏ−ＭＬＶは、図１に概説した手順に沿って複製を進行し、パッケージングがＰｓｉパッケージング部位を介して起こる典型的なレトロウイルスである。本発明の一態様では、Ｐｓｉパッケージング部位に対して標的化され、発現べくター内でクローニングされた抗−Ｍｏ−ＭＬＶリボザイムを、組織培養中でのウイルス産生を減少するこれらの能力に対して試験した。
ＨＩＶ−１、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）での活性粒子は、Ｔ−リンパ球の細胞死を導く（McCune、1991；Levy、1993）。これらの細胞は、免疫応答に対する極めて重要な寄与をしているものである。何れかの抗−ＨＩＶアプローチにおいて、免疫系がこれらの細胞を失うことによりその能力を失う前に、ウイルスの複製を実質的に低下させるか、又は阻害することが不可欠である。現在、ＡＩＤＳに対する効果的な治療は存在しない。しかし、ウイルスタイターを低下することによって、疾患の進行を遅らせ、阻止さえもしうることが期待される。抗−ＨＩＶ−パッケージング配列リボザイムの開発は、ウイルスの産生を実質的に阻害するか、又は停止さえする実行可能な方法であると思われる。
抗−ＨＩＶ−gagリボザイムは、先に開発されており、このリボザイムを発現する細胞で、gag−ＲＮＡ及びｐ２４のレベルを低下できることが示されている（Sarverら、1990）。ハンマーヘッドリボザイムは、E.coli中で、ＨＩＶ−１インテグラーゼＲＮＡを開裂し、インテグラーゼタンパクの翻訳をブロックすることが見出されている（Sioudら、1991）。Ｕ５中でＨＩＶ−１ＲＮＡも開裂するリボザイム、ＨＩＶの５’非翻訳領域又はtatは、ＨＩＶ−１からＴ細胞を保護しうることも、研究で示されている（Dropulicら、1992、Ojwangら、1992、Loら、1992、及びWeerasingheら、1991）。
本発明の他の好ましい態様では、抗−ＨＩＶリボザイムは、Ｐｓｉパッケージング部位を標的とし、抗−Ｍｏ−ＭＬＶ構築物に対するのと同様の発現ベクター内でクローニングされる。これらの構築物を、組織培養中でウイルスの産生を低下させるこれらの能力に対しても試験した。
発現構築物の輸送
標的細胞へ発現構築物を導入する主要な手段は、電気穿孔法、リポソームで媒介される遺伝子移入及びレトロウイルスで媒介される遺伝子移入を含めた形質導入である。
定義
本明細書で使用される「Ｐｓｉパッケージング部位」は、ウイルスＲＮＡのビリオンへの被包に関係する５’ＬＴＲに直接に最も近接した領域をいう。
本明細書で使用される「相補的アーム」は、標的ＲＮＡの特異的領域に結合しうるコアーのハンマーヘッドリボザイムに付着する配列をいう。
本明細書で使用される「リボザイム」は、標的ＲＮＡを開裂することができるハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタ、ＲｎａｓｅＰ、グループＩイントロン又はグループIIイントロンである。ハンマーヘッドリボザイムは、Haseloff及びGerlachの刊行物（Haseloffら、1988）及び引き続きの多くの研究室による論文の主題である。
説明
本発明は、ウイルス性疾患、特にＡＩＤＳの治療であって、病原がその遺伝物質としてＲＮＡを有し、このＲＮＡがビリオンにパッケージングされるものに関する。アプローチは、ウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに必要な識別部位であるＰｓｉパッケージング部位でウイルスＲＮＡを破壊することによってウイルスの複製を阻害することである。この部位での切断は、ｉ）標的細胞へのウイルスの侵入、及びこれに続くプロウイルスのホストゲノムへの同化、ii）ウイルスＲＮＡの産生、iii）ウイルスｍＲＮＡのウイルスタンパクへの翻訳、及びiv）ウイルスゲノムＲＮＡのビリオンへのパッケージングに関して阻害効果を有する。
本発明の一態様では、注目のヌクレオチド配列を含有する幾つかの発現構築物を提供する。好ましい発現構築物では、細胞（これは、Ｍｏ−ＭＬＶ又はＨＩＶ−１に感染された細胞でありうる。）に導入されたときにＲＮＡの転写を司ることができ、リボザイムを取り囲む相補的アームによってＭｏ−ＭＬＶ又はＨＩＶ−１ＲＮＡに結合することができるリボザイム発現構築物が提供される。これらの相補的アームは短く、これはリボザイム配列に存在し、該配列は、ＲＮＡを切断するように作用し、これによってＲＮＡ分子の作用を妨害するする。
本発明は、幾つかの方法で試験を行う。一組の実験では、in vitroでのＭｏ−ＭＬＶウイルスＰｓｉパッケージング配列の、リボザイムで媒介される開裂と、Ｍｏ−ＭＬＶ複製のin vivoでの抑制の間の直接的関係が示される。この結果に到達するために、以下の３つの主要なステップがある。
ｉ）リボザイムで媒介されるin vitroでの開裂の例示。ii）リボザイムを含有する構築物のＭｏ−ＭＬＶ感染細胞へのトランスフェクション。iii）ａ）構築物の同化、ｂ）リボザイム構築物の発現、ｃ）ウイルス複製のレベルに関するリボザイム構築物の発現の影響。
ＨＩＶに対する同様のステップは、以下の通りである。
ｉ）リボザイム構築物の設計及び構築。ii）構築物を含むリボザイムのヒトＴリンパ球細胞系へのトランスフェクション。iii）ａ）構築物の同化、ｂ）リボザイム構築物の発現、ｃ）ウイルス複製のレベルに関するリボザイム構築物の発現の影響。
本発明は、ｉ）標的細胞に侵入するウイルスＲＮＡを切り取ることによって、非感染細胞へのウイルスの侵入を阻害するため、及びii）感染された細胞から出ていく機能性ウイルスのレベルを減少するためのウイルス抑制剤として作用する。両ケースにおいて、これは最初のケースでは侵入ポイントで、第二のケースでは排出ポイントでウイルスＲＮＡを切断するように作用する。後者のケースでは、切断はウイルス性及びｍＲＮＡの両方を切断することによりＲＮＡレベルを低下する。Ｐｓｉパッケージング部位での特異的な切断は、ウイルスＲＮＡのパッケージングを阻害するのに役立つ。
幾つかの考察が、抗−ウイルス性リボザイムの作用に対する標的を選択するために使用される。本発明で使用された基準は以下の通りである。
ｉ）標的は機能的に重要でなければならない。ii）標的部位の異なったＨＩＶ−１単離物の内、高程度の配列保存性がなければならない。iii）ハンマーヘッドリボザイムの場合、ＧＵＣ又はＧＵＡのようなリボザイム標的配列は、配列又は関連したトリプレットＧＵＵ、ＣＵＣ等に存在することが好ましい（Perrimanら、1992）。iv）標的配列は、容易に接近できるべきである。例えば、広範囲の二次構造は欠いているべきである（Rossiら、1992）。
上記基準に適合したＰｓｉパッケージング部位は、リボザイムによって開裂される標的として選択される。この部位は、ｉ）レトロウイルス複製サイクルの本質的機能、ii）相対的な接近性（パッケージングが起こるために他の成分を認識し、これに接近できなければならないＲＮＡの部位である。）、及びiii）同じウイルスの異なった株の中での保存された性質を有する。
Ｍｏ−ＭＬＶ及びＨＩＶの両方の異なった株で、各ウイルスのＰｓｉパッケージング配列に配列及び構造の強固な保存が存在することが観測されている。ＨＩＶとＭｏ−ＭＬＶのパッケージング部位の間の構造又は配列の明確な保存はないが、各ウイルスのパッケージング部位の同一の機能により、類似性がなければならないと仮定することは妥当である。ウイルスＲＮＡの二次構造を試験し、リボザイムの作用に影響されうる様に思われるＰｓｉ配列を選択した。Zuker’s FOLDRNAプログラムを使用し、Ｐｓｉパッケージング配列のに塩基対領域の位置決めをした。選択された部位は、ＧＵＣ塩基配列も有していた。
本発明で使用される構築物は、ネオマイシン耐性遺伝子（neor）の３’非翻訳領域に挿入されたリボザイムを使用した。塩基の構成は図４に示されている。このような構成は同化及び発現の評価を可能にする。前者は、サザン分析で決定され、後者は、Ｇ４１８毒性に対する細胞の耐性、及びＲＮＡｓｅ保護アッセイによって決定した。使用されるデザインの更なる利点は、より大きなneor遺伝子メッセンジャーの３’末端内に小さなリボザイム配列を有するキメラＲＮＡが、リボザイムを細胞内で安定に保つように作用するようであるということである。後者は、安定性を有さない場合に、リボザイムの影響が最小となるであろうから、極めて重要な点である。
ディスカッション
本発明は、リボザイムが、レトロウイルスによって引き起こされる疾患から動物、特にヒトを保護するために使用されうる方法の基板を与える。本発明の基本的原理は、大きな遺伝子に、標的レトロウイルスのパッケージング部位に対するリボザイムを取り込むことにある。キャリアー遺伝子は選択可能である（本発明の場合）か、又は選択不可能でありうる。大きなキャリアー遺伝子の発現は、より安定なキメラリボザイムＲＮＡ分子を提供する。ＤＮＡ構築物は、細胞を保護するためになにもされていない細胞集団にトランスフェクションされるか、又はウイルスタイターを下げるためにウイルスに感染させた集団に取り込ませうる。更なる態様では、リボザイム発現構築物は、導入の効率を増加させるために、レトロウイルスによって媒介される遺伝子輸送でも導入される。本発明の第三の態様は、抗−パッケージング部位にリボザイムを運ぶレトロウイルスである。レトロウイルスベクターがＭｏＭＬＶをベースとする場合、ＨＩＶのパッケージング部位を標的にするリボザイムは、２つのレトロウイルスに対する配列が相違するので、ＭｏＭＬＶパッケージング部位を開裂しないであろう。
治療において、適用には、ex vivoでＴリンパ球に、又はex vivoで造血幹細胞に構築物を導入することを含む。１つの好ましいアプローチは、リボザイム構築物を、両栄養性Ｍｏ−ＭＬＶのようなレトロウイルスベクターを介してリンパ球又は幹細胞に取り込ませることである。造血前駆細胞及び真の幹細胞は、これらが骨髄に存在し、抹消血に移動しうるので、遺伝子治療の標的となりうる。前駆細胞は骨髄細胞及びリンパ球細胞の両方になり得、幹細胞は全ての細胞系列の細胞になりうる。治療は、照射し、ＨＩＶ感染した造血系を破壊し、次いで、リボザイムを含有した幹細胞が患者に注入される。結果として、患者の細胞がＨＩＶに対して耐性になる。
本発明はまた、他のリボザイム又はミニザイム、アンチセンス配列との組み合わせ治療を含めたin vivo又はex vivoの何れかでの組み合わせ治療に向けられる。加えて、本発明には、IgG1b12抗体のような中和抗体；ジドブジン（ＡＺＴ）、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４ｔのようなヌクレオシド類似体；ネビラピン（nevirapine）、デラビルジン（delavirdine）、ラミブジン（Lamivudine）（３−ＴＣ）、ロビリド（loviride）のような非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；サキナビル（saquinavir）のようなプロテアーゼ阻害剤；tatタンパク阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、又は、インターロイキン２、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターロイキン１２のような免疫治療剤のようなＨＩＶ−１複製を阻害するように作用する他の抗ウイルス剤が含まれる。
本発明はまた、ヌクレオチド配列を含有したＲＮＡ又はＤＮＡ又はこれらの組合せを含有したトランスファーベクターであって、転写に際して、上記化合物を与えるものに向けられる。トランスファーベクターは、ＨＩＶロングターミナルリピート、アデノウイルスに関連したトランスファーベクター、Ｍｏ−ＭＬＶ、又は両栄養性レトロウイルスベクターである。トランスファーベクターは、in vivoで特別な器官又は細胞、又は細胞内の特定領域にオリゴヌクレオチド化合物を向ける配列を更に含有する。細胞の特定の領域に配置する例には、パッケージングシグナルの使用が含まれる（Sullengerら、1993）。本発明はまた、適切なキャリアーに上記化合物又はトランスファーベクターを含有する組成物に向けられる。キャリアーは、薬学的、獣医学的、又は農学的に許容しうるキャリアー又は賦形剤である。組成物は更にTARデコイ、ポリTAR又はRREデコイを含有する。
原核生物又は真核生物ホスト内での本発明のＤＮＡ配列の産生に対して、本発明のプロモータ配列は、原核生物性、真核生物性又はウイルス性である。適切なプロモータは、誘導可能で、抑制的で、又はより好ましくは、構成的である。適切な原核生物性プロモータの例には、Ｔ４ポリメラーゼを認識しうるプロモータ（Malik, Sら、J. Molec. Biol. 195:471-480(1987);Hu, Mら、Gene, 42:21-30(1986);）、Ｔ３、Ｓｐ６、及びＴ７(Chamberlin, Mら、Nature 288:227-231(1970);Beiley, J.N.ら、Proc. Natl. Acd. Sci.(USA)80:2814-2818(1983);Davanloo, Pら、Proc. Natl. Acd. Sci.(USA)81:2035-2039(1984);)；バクテリオファージラムダのＰr及びＰLプロモータ（The Bacteriophage Lamda, Hersey, A.D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, NY(1973);Lambda II、Hendrix, R.W., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1980))：E. coliのtrP, recR,、ヒートショック、及びlacZプロモータ；バクテリオファージラムダのintプロモータ；pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモータ、及びpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモータ等が含まれる。原核生物性プロモータは、Glick, B.R.,(J. Ind. Microbiol. 1:277-282));Canatiempo, Y(Biochime 68:505-516(1986));Watson, J.D.ら、J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288(1982))によって概説されており、ヘルペスウイルスのＴＫプロモータ、（McKnight, S., Cell. 31:355-365(1982))；SV40初期プロモータ（Benoist, C.ら、Nature(London)290:304-310(1981)、及び酵母ga14遺伝子プロモータ（Johnston, S.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)79:6971-6975(1982)；Silver, R.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)81:5951-5955(1984))の概説がある。
感受性真核細胞又は全ての動物内で、レトロウイルスの感染を阻害するのに使用されるベクターの調製に対しては、上述のように真核性プロモータが使用されなければならない。好ましいプロモータ及びポリアデニル化シグナルのような追加の調節要素は、感染が阻害されるレトロウイルスの細胞のタイプで最大の発現が得られるものである。従って、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＬＶ−１及びＨＩＬＶ−２、並びにモロニーネズミ白血病ウイルス、全ての感染したリンパ球細胞、及びリボザイム構築物を単独で、又はこれらのウイルスの１（又はこれ以上）のパッケージング配列に相補的なアンチセンスＲＮＡと組み合わせて、効果的に発現するための転写制御ユニット（プロモータ及びポリアデニル化シグナル）が選択され、これらにより造血、特にリンパ球様細胞（又は組織）で効果的な発現が提供される。以下に例示されるように、好ましいプロモータは、任意に成長ホルモンポリアデニル化シグナル（３３）と連結して使用されるサイトメガロウイルス即時型初期プロモータ（３２）、及びリンパ球様レトロウイルスと使用するためのモロニー−MuLV LTRのプロモータである。モロニー−MuLV LTRのプロモータの所望の特性は、レトロウイルスが有するのと同じ組織親和性を有することである。ＣＭＶプロモータはリンパ球に発現される。他のプロモータには、ＶＡ１及びｔＲＮＡプロモータが含まれる。メタロチオネインプロモータは誘導性の利点を有する。SV40初期プロモータは、in vitroにおいて、骨髄細胞内で高レベルの発現を示す。
本発明はまた、化合物を製造する方法であって、（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの組合せよりなるトランスファーベクターに、化合物に対応するヌクレオチド配列を結紮すること、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド配列をＲＮＡポリメラーゼで転写すること、及び（ｃ）化合物を回収することのステップを含有する方法に向けられる。
本発明はまた、上記化合物、又は転写の際に上記化合物を与えるヌクレオチド配列を含有する原核生物性または真核生物性ホスト細胞に向けられる。該細胞は、動物細胞、全ての造血細胞系列の前駆細胞、より成熟した細胞及び完全に成長した細胞を与える造血幹細胞、全ての造血細胞系列の成熟した細胞を与える前駆細胞、特別な造血系列を与えるコミットされた前駆細胞（committed progenitor cell）、Ｔリンパ球前駆細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、骨髄前駆細胞、又は単球／マクロファージ細胞でありうる。
本発明はまた、造血幹細胞、前駆細胞、コミットされた前駆細胞、Ｔリンパ球前駆細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、骨髄前駆細胞、又は単球／マクロファージ細胞を保護するための上記化合物の使用に向けられる。更に、本発明の方法は、患者内のＨＩＶに対する抑制／治療又は保護をする方法であって、上記トランスファーベクターを造血細胞へ導入し、これによって細胞をＨＩＶに対して耐性にし、これによってＨＩＶに対する抑制／治療又は保護をすることを具備した方法である。導入は、ex vivoであり、細胞は骨髄切除（myeloablation）を伴うか、又は伴わない自己細胞又は異種細胞である。本発明の一態様では、３つのシグナル及び１つの多重ハンマーヘッドリボザイムが、Ｍｏ−ＭＬＶＰｓｉパッケージング部位内の異なった部位を標的にするようにデザインされ、１つのリボザイムは、ＨＩＶＰｓｉパッケージング部位内の部位を標的にするようにデザインされる（図２参照）。Ｍｏ−ＭＬＶは作用の本質を決定するためのレトロウイルスの例として選択される。これらの原理は、ＨＩＶを含めた他のレトロウイルスに適用されるであろう。試験もＨＩＶ−１に対して行った。
本発明において、ヒト以外の動物及びこれらの子孫には、天然に存在しないオリゴヌクレオチド化合物を発現又は保持する少なくとも幾つかの細胞が含有される。ヒト以外のトランスジェニック動物は、米国特許第４，７３６，８６６、５，１７５，３８３、５，１７５，３８４、又は５，１７５，３８５に開示されたように、その全ての胚及び体細胞が、胚段階において、前記動物、又はこれらの祖先に発現しうる形態で導入された天然に存在しないヌクレオチド化合物を含有する。（Van Brunt, 1988; Hammer, 1985; Gordonら、1987; Pittiusら、1988; Simonsら、1987; Simonsら、1988）も参照。
本発明はまた、細胞をウイルス感染に対して耐性にする方法であって、細胞を上記の天然に存在しないヌクレオチドで処理することを具備した方法を包含する。好ましくは、処理は、ex vivoで行う。加えて、本明細書中で使用されるアンチセンス及びリボザイムの語には、修飾されたヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ペプチド核酸等を有する化合物が含まれる。これらは、ex vivoでの処理又は局所的処理に使用されるであろう。
本発明の天然に存在しないオリゴヌクレオチド化合物の効果的な量は、一般に、局所的適用のためのクリーム、無菌注射組成物、又は非経口投与のための他の組成物のような投与量形態で、約１nMから約１mMの濃度を包含する。局所的処方に関しては、約５０μＭから約５００μＭの間の天然に存在しないオリゴヌクレオチド化合物を使用することが一般に好ましい。ヌクレオチド誘導体を含有する組成物（この誘導体には、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート誘導体のような化学的に修飾された基を含有する。）は、ナノモル濃度で活性でありうる。このような濃度は毒性を防止するためにも使用される。
本発明の化合物を使用した疾患の治療に関する治療戦略は、一般に、アンチセンスの参考文献（Chrisley, 1991）に開示されたようなアンチセンスアプローチに関するものと同様である。特に、使用される化合物の濃度、方法、投与の方法、及び関係する処方は、アンチセンスの適用に対して使用されるものと同じでありうる。
本明細書で使用される「効果的な量」は、与えられた症状及び投与管理を行った動物に所望の効果をもたらす量をいう。組成物は、治療に有効な適切な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリアーと共に効果的な量を含有する。このような組成物は液体であるか、又は凍結乾燥された製剤、さもなければ乾燥された製剤であり、種々のバッファー含有物（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテートホスフェート）、ｐＨ及びイオン強度、表面への吸収を防止するためのアルブミン又はゼラチンのような添加物、界面活性剤（例えば、ツウィーン（Tween）２０、ツウィーン８０、プルロニック（Pluronic）Ｆ６８、胆汁酸塩）、安定化剤（例えばチメローサル（Thimerosal）、ベンジルアルコール）、増量物質又は張度修飾剤（ラクトース、マンニトール）、天然に存在しないオリゴヌクレオチド化合物へのポリエチレングリコールのようなポリマーの共有結合物、金属イオンとの錯体、又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン等のようなポリマー化合物へ、又はこれら上へ物質を取り込むもの、又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、一層又は多層の小包、赤血球影又はスフェロプラストを含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、in vivoでの放出速度、及びin vivoでのオリゴヌクレオチドの排泄の速度に影響を与える。他の成分が任意に添加さえる。該成分は、例えばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド、即ちポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニンのようなアミノ酸；ＥＤＴＡのようなキレート剤；及びマンニトール又はソルビトールのような糖アルコールである。一様な放出を保つことができる組成物には、脂肪親和性のデポー剤（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）が含まれる。ポリマー（例えば、ポリオキサマー又はポリオキサミン）でコーティングされた粒状組成物、及び組織特異的な受容体、リガンド又は抗原に向けられた抗体と結合された天然に存在しない化合物、又は組織特的受容体のリガンドに結合された天然に存在しない化合物も本発明に包含される。更に、特異的なヌクレオチド配列が、本発明の天然に存在しないオリゴヌクレオチド化合物を標的にするために、核、プラスチド、細胞質又は特異的なタイプの細胞に加えられうる。本発明の組成物の他の態様では、非経口、肺、鼻腔及び経口を含めた種々の投与形態のための、粒子の形態の保護コーティング剤、プロテアーゼ阻害剤又は透過性増強剤が含有される。
適切な局所製剤には、ゲル、クリーム、溶液、エマルジョン、炭水化物ポリマー、これらの生分解性マトリックス；蒸気、ミスト、エアロゾル又は他の吸入剤が含まれる。天然に存在しないオリゴヌクレオチド化合物は、水、ワックス、テューインガムを含めたフィルム又は固体キャリアーにカプセル化されうる。上皮層を越えて移動する輸送を補助する透過性増強剤はまた、当分はで公知であり、ジメチルスルホキシド及びグリコールが含まれるがこれに制限されない。
リボヌクレオチド、及デオキシリボヌクレオチド誘導体又は修飾は周知であり、商業的に入手可能なＤＮＡ合成機に適合しうる（Saenger, 1984、特に159-200ページ参照）。ヌクレオチドは塩基、糖及びモノホスフェート基を含有する。従って、核酸誘導体、置換又は修飾は塩基、糖又はモノホスフェートのレベルで行われる。
大量の修飾された塩基が天然に見いだされ、広範囲の修飾塩基が合成により製造されている（Sanger, 1984及びＣＲＣHandbook of Biochemistry参照）。適切な塩基には、イノシン、５’−メチルシトシン、５’−ブロモウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン及び他のこのような塩基がある。例えば、アミノ基及び環窒素がアルキル化されうる。例えば、グアニンのＮ1及びＮ7及びシトシンのＣ5ような環窒素原子又は炭素原子のアルキル化；チオケト基によるケトの置換；炭素＝炭素二重結合の飽和、ウリジン類似体へのＣ−グリコシル結合の導入がある。例えば、チオケト誘導体は６−メルカプトプリン及び６−メルカプトグアニンである。
塩基は、種々の基、例えばハロゲン、ヒドロキシ、アミン、アルキル、アジド、ニトロ、フェニル等で置換されうる。塩基は、アミノ酸側鎖又はリンカー（これは、他の化学基（chemical entity）、例えば酸性又は塩基基を含んでいてもよく、また含んでいなくてもよい。）又は他の化学種で置換される。例えば、グアニン（Ｇ3）は、チロシンで置換され、シトシン（Ｃ１）又はアデニン（Ａ１１）は同様にヒスチジンで置換されうる。
ヌクレオチドの糖部分はまた、当分野で周知の方法によって修飾される（Saenger, 1984）。本発明は、このような修飾が化合物の開裂活性を損なわない限り、ヌクレオチドの糖部分に対する種々の修飾を包含する。例えば、修飾された糖の例には、二級ヒドロキシル基の、ハロゲン、アミノ又はアジド基での置換；２−メチル化；配座変形体、例えば、Ｏ2’−ヒドロキシル基は、グリコシルＣ1’−Ｎ結合に対してシス−配向されており、アラビノヌクレオチドを提供し、炭素Ｃ1’での配座異性体はα−ヌクレオシドを与える等が含まれる。更に、グルコースのようなヘキソース、アラビノースのようなペントースをリボース以外の糖として使用しうる。
ヌクレオチドのホスフェート部分も、当業者に周知である誘導体化又は修飾を受ける。例えば、酸素は窒素、硫黄又は炭素誘導体で置換され、それぞれホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオレート、及びホスホネートを与える。酸素の窒素、硫黄又は炭素誘導体での置換は、橋かけした位置又は橋かけしていない位置で行われる。ホスホジェステル及びホスホロチオェート誘導体が、可能性として細胞受容体と結合することにより、細胞に効率よく進入しうるということ（特に長さが短い場合）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含めた研究から確立された。メチルホスホネートは、おそらく、これらの電気的中性によって細胞に容易に取り込まれる。
ホスフェート部分は、ペプチド核酸で完全に置き換えうる（Hanveyら、1992; Nielson, 1991;及びEgholm, 1992）。他の置換は当業者に周知である。例えば、シロキサンブリッジ、カーボネートブリッジ、アセトアミドブリッジ、カルバメートブリッジ、チオエーテルブリッジ等がある（Uhlmann及びPeymann, 1990）。
以下の実施例は、特許請求される本発明の例示のためのものである。本発明は、以下の実験の詳細のセクションで説明される。これらのセクションは、本発明の理解を助けるために記載されるのであって、後述の請求の範囲に記載される本発明をなんら限定することを目的とするものではなく、また限定するものと解釈してはならない。
実施例１
インビトロでのＭｏ−ＭＬＶ  Ｐｓｉパッケージング配列のリボザイムに触媒される切断
標的部位が真に切断可能であることを証明するために、細胞培養でリボザイム試験を行う前にインビトロ切断反応を実施した。
ＧＵＣ塩基の存在、およびズーカー（Zuker）のフォールドＲＮＡ（FOLDRNA）プログラム（Zukerら，1981）から得られる提唱されたＲＮＡ二次構造内の部位の潜在的な近づきやすさにより、Ｍｏ−ＭＬＶパッケージング領域の４つの部位を選択した。これらの部位は、ウイルス転写体の５’末端からのこれらのヌクレオチドの距離に基づき、２４３、２７４、３６６および５５３と呼んだ（図２）。これらのヌクレオチドの位置は、ＲＮＡ腫瘍ウイルス（RNA Tumor Viruses）に報告されている（Coffin, 1985）。２つの型のリボザイムを設計した：個別に部位２４３、２７４および３６６を標的とする、長さ１２ヌクレオチドのアームを有する３つの単独リボザイム、並びに４つ全ての部位を標的とする、各標的部位の間の配列の長さの介在するアームを有する１つの多重リボザイム。部位および全体の設計は図２に示される。
単独リボザイムは、突出したＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ末端を有する人工二本鎖挿入体をｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中にクローン化することにより作成した。生じたプラスミドは、ｐＧＥＭ２４３、ｐＧＥＭ２７４およびｐＧＥＭ３６６である。多重リボザイムは、標準的インビトロ突然変異誘発プロトコールの変法により作成した（Warrilowら，1992）。このプラスミドをｐＧＥＭ−Ｍ７と呼んだ。クローニングの成功と配列の完全さはＤＮＡ配列決定により確認した。
ｐＭＬＶ−１から得たＭｏ−ＭＬＶのＢａｌＩ−ＢａｌＩ断片中のＰｓｉパッケージング配列（Coffin, 1985）は、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクターにクローン化して、インビトロのリボザイム切断の基質として転写した。リボザイムまたは基質のいずれかを作成するためのランオフ（Run-off）転写混合物（５０μl）は、１μgの線状化プロテイナーゼＫ処理ＤＮＡ鋳型、３０mMジチオトレイトール、４００μMの各ｒＮＴＰ、４０mMトリス−Ｃｌ（ｐＨ８，０）、２mMスペルミジン、６mM  ＭｇＣｌ2、５０mM ＮａＣｌ、１μlの［a-32Ｐ］−ＵＴＰ（４００〜８００Ci/ミリモル、１０mCi/ml）、１単位のＲＮａｓｉｎおよび１０単位のＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を含有した。３７℃で１時間インキュベーション後、１０単位のＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（プロメガ（Promega））を添加して、この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出後、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量のエタノールを添加することにより、ＲＮＡ転写体を沈降させた。切断反応のために、リボザイムと基質（１：１モル比）を８０℃で２分間、プレインキュベートし、続いて５０mMトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）および１０mM ＭｇＣｌ2の存在下で３７℃で３０分間インキュベーションを行った。等体積の停止混合物（８Ｍ尿素、５０mM ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノール）の添加により反応を停止し、８Ｍ尿素を含有する変性６％ポリアクリルアミドゲルで解析し、続いてオートラジオグラフィーを行った。
Ｍｏ−ＭＬＶのプロウイルスパッケージング配列の異なる部位を標的とする改変リボザイムは、インビトロで選択部位で標的ＲＮＡを切断することが証明された。
大多数のリボザイム作製体について、ほとんど等モル量の32Ｐ標識Ｐｓｉ転写体を32Ｐ標識リボザイムＲＮＡとインキュベートすると、穏やかな物理的条件（３７℃、１０mM ＭｇＣｌ2および５０mMトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５））で基質の効率的な切断が導かれた。これらの消化物の代表的な例は、図６に示される。Ｒｚ２７４およびＲｚ３６６により生成された、切断されたＰｓｉ断片の大きさは、切断の予測された部位の位置と一致して、各々６２nt＋４７３ntおよび１５４nt＋３８１ntのバンドが得られた。多重リボザイム（Ｒｚ−Ｍ７）は、予測されたように４つの断片（５０nt、９２nt、１８７ntおよび２４０nt）、並びに幾つかの部分切断断片を生成した（図３）。Ｒｚ２４３については、３７℃で目に見える切断はなく、適切な大きさの断片を生じる弱い切断が５０℃で見られた（データは示していない）。リボザイム２４３を除いて、これらの結果は、効率的な部位特異的リボザイム介在性切断を示した。
実施例２
抗Ｍｏ−ＭＬＶパッケージング部位（Ｐｓｉ）作製体
効率的なインビトロ切断の証明に続いて、改変リボザイム並びにＰｓｉパッケージング領域に相補的な長いアンチセンス配列を、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターに結合したｎｅｏr遺伝子の３’非翻訳領域中にクローン化した（図４）。ｎｅｏrは、ネオマイシンまたはネオマイシン類似体Ｇ４１８をリン酸化して不活性化する酵素をコードする原核生物遺伝子である。後者（Ｇ４１８）は、哺乳動物細胞にとって毒性であり、外来ｎｅｏr遺伝子の発現が細胞を生存を可能にする。ｎｅｏr遺伝子に結合したＳＶ４０プロモーターを有する作製体は、哺乳動物発現ベクターｐＳＶ２ｎｅｏ内であり、図４に模式的に示してある。
リボザイム挿入体およびアンチセンスコントロールは、平滑末端連結反応によりｎｅｏrの３’未翻訳領域のＳｍａＩ部位中にクローン化した。生じたベクターは、各々ｐＳＶ２４３、ｐＳＶ２７４、ｐＳＶ３６６、ｐＳＶＭ７およびｐＳＶａｓ  Ｐｓｉ（アンチセンス作製体）と名付けた。
実施例３
３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ産生細胞株への作製体のトランスフェクション
種々のｐＳＶ２ｎｅｏをベースとする作製体を、リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコール（Chenら，1987）を用いて３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞中にトランスフェクションした。５００μg/mlのＧ４１８の存在下で９〜１２日後に形成したコロニーを、陽性コロニーとした。各作製体について、クローニングシリンダーを使用して４〜７コロニーを単離した。これらのコロニーは、増殖させ、液体Ｎ2に保存し、そしてさらなる測定のために使用した。５００μg/mlのＧ４１８中で１０〜１４日の選択後、各作製体について幾つかの安定なクローン細胞株を樹立した。トランスフェクションしたＤＮＡ発現作製体の組み込みを確認するために、幾つかのトランスフェクションした細胞株からゲノムＤＮＡを調製して、サザン解析を行った。制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＮｒｕＩを使用して、ゲノムＤＮＡを消化して、ｎｅｏr遺伝子＋挿入体（リボザイムまたはアンチセンス）を含有する断片を作成した。次に作製体の存在は、ｎｅｏr特異的プローブを使用して測定することができた。図７に示されるサザン解析から、リボザイムおよびアンチセンス作製体両方でトランスフェクションしてＧ４１８中で選択した細胞は、ｎｅｏr遺伝子＋適切なリボザイムまたはアンチセンス配列を含有することが明らかである。ｎｅｏrプローブとハイブリダイズするＨｉｎｄIII−ＮｒｕＩ断片の大きさは、各場合に予測された大きさ（すなわち、ｎｅｏr遺伝子単独では１．３kb；ｎｅｏr＋単独リボザイムでは１．３８kb；ｎｅｏr＋多重リボザイムでは１．９８kb；ｎｅｏr＋アンチセンス配列では１．８９kb）であることが判った。
リボザイムまたはアンチセンス作製体の発現は、陽性トランスフェクション体中のＧ４１８耐性により予測した。これは、ＲＮａｓｅ保護測定法を使用してトランスフェクションした細胞中でさらに試験した。グアニジウムチオシアネート法を用いていくつかの細胞株から総ＲＮＡを抽出し、次に８０％脱イオン化ホルムアミド、１００mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）、３００mM酢酸ナトリウム（ｐＨ６．４）、１mMＥＤＴＡを含有する溶液中の対応する32Ｐ−標識リボプローブ（５×１０4cpm）でハイブリダイズし、続いてハイブリダイズしたＲＮＡをＲＮａｓｅで消化した（５μg/mlのＲＮａｓｅ Ａと１０単位/mlのＲＮａｓｅＴ１）。リボザイムが発現されない場合は、相補的なリボプローブは結合することができなかったであろう。次にＲＮＡは１本鎖のままにとどまり、ＲＮａｓｅにより完全に消化されたであろう。次に反応混合物を電気泳動により分離した。図８に示すように、測定により、すべてのリボザイムとアンチセンスが予想通り発現されることが明らかになった。保護された断片は、６５塩基対（単一リボザイム）、５８８塩基対多重リボザイムおよび５２４塩基対（アンチセンス）である。
実施例４
Ｍｏ−ＭＬＶ複製を抑制する作製体の能力
異なる作製体でトランスフェクションした安定な３Ｔ３  Ｍｏ−ＭＬＶクローン細胞株の樹立後、Ｍｏ−ＭＬＶ複製のレベルを評価するためにＸＣプラーク測定法を使用した。ＸＣ測定法は、Ｍｏ−ＭＬＶ産生細胞はＸＣ細胞の融合を引き起こすことができるという観察に基づく、Ｍｏ−ＭＬＶの合胞体プラーク測定法（syncitial plaque assay）である。標的細胞に対するウイルスの結合を増強するための感染の間８μg/m1のポリブレン（シグマ（Sigma））が存在することを除き、Ｍｏ−ＭＬＶを（Gautschら、1976）に記載されているように力価測定した。異なるＭｏ−ＭＬＶ産生細胞株の培養物からの上清を、非感染のマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に加え、感染の１時間前に８μg/mlのポリブレンで前処理した。増殖培地中で２０時間インキュベーション後、感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２×２mm2の格子のプレート中でＸＣとともに３〜４日間同時培養を行った。次にプレートをメタノールで固定し、１％メチレンブルー＋０．１％ゲンチアンバイオレットで染色し、顕微鏡で合胞体プラークについてスキャンした。用量応答曲線の直線の部分内で測定が行われたことを確認するために、１プレート当たり３．５×１０5細胞を、連続２倍希釈したウイルスで感染させ、２４時間後、ＸＣ細胞との混合培養物に継代した。表１の結果は、３つの独立した実験から得られた。ｐＳＶ２ｎｅｏベクター含有細胞に関連してＲｚ２７４、Ｒｚ３６６、Ｒｚ−Ｍ７およびＡｓ−Ｐｓｉを含有する細胞から７４％〜７７％の合胞体プラーク形成の阻害が見られたが、Ｒｚ２４３含有細胞については明らかな阻害は証明されなかった。これらのデータは、インビトロの切断結果（図６）（ここで、Ｒｚ２４３は、使用した条件下で基質を効率的に切断するようではなかった）と一致する。
これらの示唆的効果は、ウイルスＲＮＡドットブロッティング（ＮＩＨ３Ｔ３ウイルス産生細胞の１６時間培養物の上清１mlを、微量遠心分離機で遠心分離（１２，０００rpm、１０分、４℃）して清澄化した）を用いて確認した。ウイルスＲＮＡを、８％  ＰＥＧ８０００と０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で沈殿させた。フェノール−クロロホルム抽出後、ＲＮＡを、アルカリ移動溶液中の陽性荷電のナイロン膜（ゼータプローブ（Zeta-Probe）、バイオラッド（Bio-Rad））にブロットした（Reedら、1985）。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ溶液、０．５％ＳＤＳ、１００mg/ml変性ニシン精子ＤＮＡ、およびｐＧＥＭ−ＰｓｉのＴ７プロモーターから転写した32Ｐ−標識リボプローブ中で、４２℃で一晩行った。ウイルスＲＮＡをドットシンチレーション計測により定量した。リボザイムまたはアンチセンストランスフェクション３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞からの上清中のウイルスＲＮＡを測定し、ｐＳＶ２ｎｅｏ−トランスフェクション３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞からの上清中のウイルスＲＮＡと比較した。図９と表２から明らかなように（Ｒｚ２４３発現細胞を除く）、リボザイムまたはアンチセンスを発現するすべての細胞株から産生したウイルスＲＮＡの量は、合胞体測定法で見られる量と同様な量だけ実質的に低下した。
これらのリボザイム作製体をＭｏ−ＭＬＶ感染細胞にトランスフェクション後、効率的なインビトロ切断を示したリボザイムのみが、インビボでＭｏ−ＭＬＶ複製を抑制する（約７０〜８０％）能力を示した。これらの結果は、インビトロ切断とインビボのリボザイム介在ウイルス抑制の間の正相関を証明している。
前述の実験は、ウイルス力価を低下させるためにＨＩＶ  Ｐｓｉパッケージング配列上の部位を標的とするために設計したリボザイムのさらなる試験の基礎となった。
0004326590.tif 000009
0004326590.tif 000010
実施例５
抗ＨＩＶパッケージング部位作製体
リボザイムターゲティングのためにＨＩＶ−１（ＨＩＶＳＦ２、Levy, 1984）Ｐｓｉパッケージング領域（ＨＩＶゲノムの５’末端からヌクレオチド７３５〜ヌクレオチド７６５）中の１つのＧＵＡ部位を選択した。前述の作製体のように、合成リボザイム挿入体を、平滑末端連結によりｐＳＶ２ｎｅｏベクターのｎｅｏr遺伝子の３’非翻訳領域中のＳｍａ１部位にクローン化した。ＤＮＡ配列決定により、クローニングの成功とと配列の完全性が確認された。この作製体をｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−Ｐｓｉと呼んだ。図４はこの作製体の模式図を示す。
実施例６
Ｔリンパ球へのｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−Ｐｓｉ作製体のトランスフェクション
抗ＨＩＶパッケージング部位作製体であるｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−Ｐｓｉを、ヒトＴリンパ腫細胞株であるＳｕｐＴ−１細胞内に電気穿孔法により導入した。指数増殖している細胞を採取し、生存細胞の数を色素排除法により数えた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＣＳを含有しないが１０mMブドウ糖と０．１mMのジチオスレイトールを含有するＲＰＭＩ培地に、１×１０7生存細胞／mlの密度で再懸濁した。細胞懸濁液の０．４mlと１０μgのｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−ＰｓｉプラスミドＤＮＡを、０．４cmキュベット（バイオラッド（Bio-Rad））中で１回の電気穿孔に使用した。細胞とＤＮＡ混合物を、ジーンパルサー（Gene Pulser）（バイオラッド（Bio-Rad））から９６０μＦ、２００Ｖの単一パルスをかけた。ショック後、キュベットを室温で１０分間インキュベートし、次に細胞を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地１０mlに移し、インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）中に入れた。電気穿孔の４８時間後、細胞を、８００μg/mlＧ４１８補足培地中で選択した。９〜１２日後、陽性コロニーを単離し、ＨＩＶ保護測定法で使用されるクローン単離物として増殖させた。
実施例７
ＨＩＶ刺激に対して保護を与えるリボザイム発現作製体の能力の評価
細胞培養での抗ＨＩＶ  Ｐｓｉリボザイム作製体の効果を評価するために、２つの測定（ｐ２４抗原と合胞体形成）を行った。ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原測定法は、マイクロウェルストリップ上にコーティングされたＨＩＶコア抗原に対するマウスモノクローナル抗体を用いる酵素免疫定量法である。ＨＩＶ−１合胞体測定法は、ＨＩＶ−１は標的Ｔリンパ球と相互作用して融合を起こし合胞体（多くの核を含有する大きな細胞）を形成するという観察に基づく。クローンリボザイム−作製体発現細胞および対照を、０．１〜１の感染多重度（m.o.i.）でＨＩＶ−１（ＳＦ２）で感染させた。２時間後細胞を洗浄し、１０mlの新しい培地を加えた。３〜４日毎に、合胞体と生存細胞の数を数えた。合胞体形成については、リボザイムを含まない対照と同じ結果を示すには、大体２対数高用量が必要であった（表３）。さらに、リボザイムの存在は、合胞体形成に遅れを引き起こした（表４）。
別の実験プロトコールで、細胞をペレットにし、Ｐ２４測定のために上清の一部を取った。代表的結果を図１０に示す。この実験で刺激後２２日までｐ２４レベルの阻害があった。感染後８日目と１３日目に、ベクターのみを含有する細胞と比較してｐ２４産生の８０％以上の阻害があり、一方２２日目には約６０％レベルの阻害が観察された。
これらの結果は、ＨＩＶ複製は、Ｔリンパ球への、Ｐｓｉパッケージング部位に対するリボザイムの添加により阻害することができるという証拠を提供する。
0004326590.tif 000011
0004326590.tif 000012
各培養物中の合胞体の数は、４つの低倍率視野で数え、平均を取った：−、合胞体なし；＋、１〜５の合胞体；＋＋、６〜１０の合胞体；＋＋＋、１０を超える合胞体。
偽は、感染しなかったＳｕｐＴ１細胞である。
実施例８
我々はまた、他（ψを標的とした以外に）のリボザイム作製体の効果を評価した。予想外にも我々は、ＨＩＶ−１のｔａｔ遺伝子（Ｒｚ２）内の配列を標的とする単一のリボザイムも、ＨＩＶ−１複製を阻害するのに有効であることを見いだした。我々は、ｔａｔのこの領域の配列保存を調べ、異なるＨＩＶ−１単離物の中でもこれが高度に保存された領域であることを見つけた（図１２を参照）。これらは、ＨＩＶ−１リボザイム標的部位としてのｔａｔ配列についての最初に実験である。文献中の報告は図１３に記載されており、図で注目したｔａｔ標的部位が他の研究者により部位１（Crisellら、1993）、および部位３（Loら、1992およびZhouら、1992）として標的とされている。
要約
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、以下の多くの組換えレトロウイルスにより形質導入した：ＲＲｚ２（ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏr）の３’領域内に挿入されたＨＩＶｔａｔ遺伝子転写体を標的とするリボザイムを有するＬＮＬ６−ベースのウイルス）、ＲＡＳＨ−５（ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターの下流のＨＩＶ−１の５’リーダー領域に対するアンチセンス配列を含有するＬＮＨＬ−ベースのウイルス）、およびＲ２０ＴＡＲ（モロニーネズミ白血病ウイルス長い末端反復配列（ＬＴＲ）により指令されるＨＩＶ−１  ＴＡＲ配列の２０のタンデムコピーを有するＬＸＳＮベースのウイルス）。Ｇ４１８選択後、形質導入したＰＢＬを、ＨＩＶ−１実験室株IIIＢと初代臨床単離体で刺激した。結果は、異なるドナーからのＰＢＬを形質導入することができ、これがＨＩＶ−１感染に対する耐性を与えることを示した。各作製体について、対応する対照ベクターで形質導入したＰＢＬに比較して約７０％のｐ２４レベルの低下が観察された。分子的解析は、レトロウイルスＬＴＲから形質導入したすべての遺伝子の構成的発現を示したが、アンチセンス作製体については内部ＨＣＭＶプロモーターから検出可能な転写体を見られなかった。ＰＢＬ中の形質導入および以後のトランス遺伝子発現は、ＣＤ４+／ＣＤ８+の表面発現（フローサイトメトリーで測定した）または細胞増殖（［3Ｈ］チミジン摂取測定法で測定した）にも影響を与えなかった。これらの結果は、これらの抗ＨＩＶ−１遺伝子治療薬が有用である可能性と、このＰＢＬ測定系の臨床的価値を示している。
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）とその関連疾患の原因物質であることが同定されている（Barre-Sinoussi, Fら、1983;Gallo, R.C.ら、1984）。現在この疾患の充分有効な治療法はなく、ＨＩＶ複製を阻害する遺伝子操作の使用が、ＡＩＤＳ治療に対する新規で有望な方法と思われる。ＨＩＶ−１複製の面に介入する可能な遺伝子治療的法には、ＨＩＶ−１  ＲＮＡを触媒的に切断して不活性化するためのリボザイム発現；ＨＩＶ  ＲＮＡの逆転写、プロセシングおよび翻訳を阻害するためのアンチセンスＲＮＡ発現；優性の抑制活性を有する突然変異体ＨＩＶ構造または制御遺伝子の発現；およびＨＩＶ−１転写、プロセシングおよびパッケージングを阻害するためのＲＮＡおとり（decoy）の発現、の使用がある。
現在まで発表されている報告では、レトロウイルスベクターは、トランス遺伝子および遺伝子治療用抗ＨＩＶ−１剤の導入のための選択された送達方法である。これらのベクターは、ＣＥＭ、ＳｕｐＴ１およびＭＯＬＴ−４（Sarver, N.ら、1990;Weerachingee, M.ら、1991;Yu, M.ら、1993;Yamada, O.ら、1994;Rhodes, A.とJames W.、1991;Sczakiel, G.ら、1992;Lisziewicz, J.ら、1991、1993;Trono, D.ら、1989;Malim, M.H.ら、1992）のようなヒト造血Ｔリンパ球細胞株（これらは、インビトロ測定法で無制限に増殖する可能性を有するなどのいくつかの好ましい特徴を有するが、形質転換細胞であるという欠点を有する）中で試験されている。従ってヒト初代細胞（例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ））中で抗ＨＩＶ遺伝子治療薬の効果を試験することが必要である。これらの細胞でＨＩＶ感染の主要な標的細胞はＣＤ４+亜集団であり、ＡＩＤＳ患者の中で主に欠乏しているのはこの細胞集団である。しかし現在、抗ＨＩＶ遺伝子治療法について初代ＰＢＬ測定法が使用されているという報告はない。
我々は、ｉ）リボザイム、アンチセンスおよびＲＮＡ  ＴＡＲおとりなどの抗ＨＩＶ剤を試験するため、そしてii）実験室および臨床的ＨＩＶ−１単離体を用いるＰＢＬ形質導入、Ｇ４１８選択およびＨＩＶ−１刺激の条件を確立するために、ヒトＰＢＬについて包括的実験を行った。この実験は、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子を標的としたリボザイムを発現するレトロウイルス作製体；ＨＩＶ−１の５’リーダー領域に相補的なアンチセンス配列；または２０ＴＡＲ  ＲＮＡおとりによる初代ＰＢＬの形質導入は、ＨＩＶ−１感染に対して実質的な耐性を与えることを証明する。この測定系は、抗ＨＩＶレトロウイルス作製体の以前の測定法の改良であり、現在のＴ細胞株測定法を補完するのに役立つ。この系を用いることにより、我々はＨＩＶ遺伝子治療に臨床的関係のある重要なデータを得た。
材料と方法
細胞株：パッケージング細胞株ψ２（Mann, R.ら、1983）とＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９０７８）を、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥ）中で培養した。ＨＡＴ培地中で６週間毎にＰＡ３１７細胞を選択した（５〜７日間）。ψＣＲＥとψＣＲＩＰ（Danos, O.とMulligan, R.C.、1988）を、ＤＭＥ＋１０％コウシ血清（ＢＣＳ）中で増殖させた。
レトロウイルスベクター作製：ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子転写体（ＨＩＶ−１  IIIＢのヌクレオチド５８６５〜ヌクレオチド５８８２、ＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡ）を標的とする化学合成したシュモクザメ（hammerhead）リボザイムを、ネオマイシン耐性遺伝子の３’非翻訳領域内のＬＮＬ６ベクター（Bender, M.A.ら、1987）のＳａｌＩ部位にクローン化した（図１５Ａ）。この作製体をＲＲｚ２と名付けた。アンチセンス作製体については、ｇａｇ遺伝子（ヌクレオチド７８〜ヌクレオチド６２８）のＲ、Ｕ５および５’部分の一部を含有するＨＸＢ２クローンの５５０塩基対ＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩ部位でヒトＨＰＲＴ  ｃＤＮＡを除去することによりｐＮＨＰ−１ベクターから得たＬＮＨＬベクター（図１５Ｂ）のＢａｍＨＩ部位にアンチセンス配向でクローン化した（Yee, J.K.ら、1987）。得られるアンチセンス作製体をＲＡＳＨ５と呼んだ。ＬＸＳＮベクター（Miller, A.D.ら、1989）内のＸｈｏＩとＢａｍＨＩ部位に２０ＴＡＲ断片（２０タンデムコピー）を挿入することによりポリマー性ＴＡＲ作製体を作成し、Ｒ２０ＴＡＲ（図１５Ｃ）と呼んだ。作製体の配列の完全性と配向を、ＤＮＡ配列決定または制限酵素マッピングにより確認した。
両性（amphotropic）レトロウイルスの産生：パッケージング細胞株ψ２とＰＡ３１７細胞が関与するトランス感染により、レトロウイルスＬＮＬ６とＲＲｚ２と作成した。約８０％コンフルエントなψ２細胞を、カルシウム沈殿法を用い、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥ培地（ＤＭＥ増殖培地）中で１４時間インキュベートして、１０μｇの作製体ＤＮＡでトランスフェクションした。次にこの培地を除去し、新しいＤＭＥ増殖培地で置換し、３７℃で５％ＣＯ2中で一晩インキュベートした。次にトランスフェクションしたψ２細胞から外生（ecotropic）ウイルス上清を集め、４μg/mlのポリブレンの存在下でＤＭＥ増殖培地中でサブコンフルエント（６０〜８０％）なＰＡ３１７細胞を感染するのに使用した。３７℃で５％ＣＯ2中で２４時間インキュベートした後、感染されたＰＡ３１７細胞をトリプシン処理し、７５０μg/mlのＧ４１８を含有するＤＭＥ増殖培地中に１：２０に分割した。コロニーが形成するまで培地を３〜４日毎に交換した。各作製体から１０〜２９コロニーを採取し、拡大させてウイルス力価の測定（ネオマイシン耐性コロニー測定法）と複製コンピタントレトロウイルス（ＲＣＲ）測定（Miller, A.D.とRosma, G.J.、1989）を行った。ψＣＲＥをトランスフェクションしψＣＲＩＰ細胞を感染することにより、レトロウイルスＬＮＨＬ、ＲＡＳＨ５、ＬＸＳＮおよびＲ２０ＴＡＲが産生された。各作製体の２０〜９６コロニーを単離して力価測定とＲＣＲ測定を行った。
ヒトＰＢＬの形質導入：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ドナーの白血球パック（leukopack）からフィコール−ハイペーク（Fycoll-Hypaque）勾配遠心分離による調製した。マイクロセレクターフラスコ（MicroCELLector Flask）（アプライドイミューンサイエンス（Applied Immune Science））を用いて製造業者の説明書に従ってＣＤ８+細胞を欠乏させて、ＣＤ４+細胞を濃縮した。ＣＤ４+濃縮ＰＢＬ（５×１０5細胞/ml）を、１０％ＦＢＳと２０単位/mlヒト組換えインターロイキン２で補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ増殖培地）中の５μg/mlの植物性血球凝集素（ＰＨＡ、シグマ（Sigma））または１０ng/mlのＯＫＴ３モノクローナル抗体（ヤンセン−シラーク（Janssen-Cilag））で４８〜７２時間刺激した。４μg/mlのポリブレン（感染多重度０．５を使用した）の存在下でプロデューサー（producer）細胞を含まないレトロウイルスストックに１８時間、細胞を暴露させて、刺激したＰＢＬを形質導入した。形質導入の４８時間後、１０〜１４日間３００〜５００μg/mlのＧ４１８を含有するＲＰＭＩ増殖培地中で選択した。次に、Ｇ４１８を含まない新しいＲＰＭＩ増殖培地中で１週間回収期間後、ＰＢＬをＨＩＶ−１で刺激した。
ＨＩＶ−１感染：ＨＩＶ−１実験室株IIIＢと臨床的単離体８２Ｈの感染力価（ＴＣＩＤ５０）を、ヒトＰＢＬについて前述のように測定した（Johnson, V.A.ら、1990）。５／１０5形質導入ＰＢＬに、１００  ＴＣＩＤ５０  ＨＩＶウイルスを３７℃で２時間感染させ、次にＲＰＭＩ−１６４０で細胞を２回洗浄し、細胞を５mlのＲＰＭＩ増殖培地に再懸濁した。３〜４日毎に、上清の一部を採取してｐ２４抗原のＥＬＩＳＡを行った（コールター（Coulter））。
ＲＮＡ解析：総細胞ＲＮＡを、グアニジウムチオシァネート法を用いて形質導入したＰＢＬから抽出した（Chirgwin, J.J.ら、1979）。１５μgのＲＮＡを、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分画し、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ（Hybond-N））に移し、ｎｅｏr−リボザイム、アンチセンスおよびＴＡＲ発現のために、それぞれ32Ｐ−標識ｎｅｏr−特異プローブ、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２の５５０塩基対ＢａｍＨＩ断片または２０ＴＡＲ断片とハイブリダイズさせた。
形質導入したＰＢＬのＦＡＣＳ解析：１×１０5の結合したＰＢＬを、ＣＤ４またはＣＤ８特異的フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合モノクローナル抗体（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））または対照抗体（ＦＩＴＣ−マウスＩｇＧ１、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））と４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄後、細胞をベクトンディッキンソン・ファクスキャン（Becton Dickinson FACScan）で解析した。
増殖測定：ＰＢＬを前述のように形質導入した。Ｇ４１８中で選択し新しいＲＰＭＩ増殖培地中で回収後、トリパンブルー排除試験で生存活性を測定し、細胞数を１×１０6生存細胞/mlに調整した。３重測定ウェル（コーニング（Corning）２４ウェルプレート）に１×１０6細胞を加え、１μCi  ６−［3Ｈ］−チミジン（５Ci/ミリモル、アマシャム（Amersham））を各ウェルに加えた。４８時間培養後、細胞を真空下でガラスファイバーフィルターに移し、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、３×５mlび氷冷１０％トリクロロ酢酸（w/v）で沈殿させた。フィルターをエタノールで洗浄し、β−シンチレーション計測を行った。統計解析は、Student’s  t検定を用いて行った。
結果
種々のトランス遺伝子を含有する高力価両性レトロウイルスの作成。トランス遺伝子（リボザイム、アンチセンスまたはポリマー性−ＴＡＲ）を発現する３つの異なるレトロウイルスを、異なるベクター骨格に基づいて作製した。ＲＲｚ２は、ＬＮＬ６ベクター中のＭｏ−ＭＬＶ長い末端反復配列（ＬＴＲ）により指令されるｎｅｏr遺伝子の３’非翻訳領域に、抗ＨＩＶｔａｔリボザイム遺伝子を挿入して作成した（図１５Ａ）。ｎｅｏrとリボザイム遺伝子の両方を含有するキメラＲＮＡ転写体は、このレトロウイルスから予測される。ＲＡＳＨ５レトロウイルス（図１５Ｂ）では、アンチセンス配列はウイルスＬＴＲまたは内部ヒトＣＭＶプロモーターから転写することができた。Ｒ２０ＴＡＲ作製体では、ポリマー性−ＴＡＲはウイルスＬＴＲから発現される（図１５Ｃ）．３つのレトロウイルス作製体と対応する対照ベクターを用いて、両性プロデューサー細胞株を作成した。ウイルスの力価は、標準物質プロトコール（Miller, A.D.とRosma, G.J.ら、1989）による測定により１０5〜５×１０6cfu/mlの範囲内であった。一般に、形質導入実験では＞１０6cfu/mlのレトロウイルス力価を使用した。すべてのウイルスストックを試験し、ＲＣＲがないことを確認し、−８０℃に保存した。
ＰＢＬのレトロウイルス形質導入。レトロウイルス形質導入のためのＰＢＬの刺激を最適化するために、ＰＨＡまたはＯＫＴ３抗体に対するＣＤ４+濃縮ＰＢＬの応答を比較した。細胞の倍加時間、生存活性および形質導入能力において、培養物に差は観察されなかった。ＯＫＴ３抗体はヒトでの使用が認められているため、この実験でＯＫＴ３抗体を使用した。次に刺激したＰＢＬを、感染多重度０．５を用いて両性レトロウイルスで形質導入した。相対的形質導入効率の測定は、Ｇ４１８選択を生き延びた細胞の数に基づく。全形質導入効率は、ドナー血液パックに依存して２〜７％変動することが見いだされた。
形質導入したＰＢＬのＧ４１８選択は、ＰＢＬ測定法内の決定的に重要な工程であることがわかった。完全な選択を行うために、２工程法を使用した。ＰＢＬの各バッチで、Ｇ４１８毒性用量測定法を確立し、同時に最初の７〜９日間に形質導入したＰＢＬに、ベースラインＧ４１８濃度の３００μg/mlを適用した。この最初の期間後、Ｇ４１８濃度を毒性用量測定法で測定されたものに調整した。試験した１０人のドナーについて、Ｇ４１８毒性用量は、１０5細胞/mlの初期細胞濃度を用いて、３００〜５００μg/mlの範囲であることがわかった。形質導入と選択後、ＰＢＬをＧ４１８を含まない新しい培地中で１週間培養した。以後のＨＩＶ−１刺激測定法のために、細胞生存活性を向上させ細胞数を増加させる（Ｇ４１８で見られたものと比較して３〜５倍の増加が見られた）ためにこの回収工程は重要である。
形質導入したＰＢＬ中のトランス遺伝子の発現。形質導入したＰＢＬ中のリボザイム、アンチセンスまたはＴＡＲ配列の発現を評価した。図１６Ａ〜１６Ｃは、ノーザン解析の代表的パターンを示す。ＲＲｚ２とＬＮＬ６形質導入細胞（図１６Ａ）では、ｎｅｏr−リボザイムまたはｎｅｏrメッセージを含有するスプライスした転写体およびスプライスしていない転写体が、ｎｅｏr特異的プローブ（３．２kbと２．４kb）を用いて検出された。優勢なＲＮＡ種はスプライスしていない転写体であった。ブロットをリボザイム特異的プローブとハイブリダイズすると、ＲＲｚ２  ＲＮＡにのみ同じパターンが観察された。ＲＡＳＨ５形質導入ＰＢＬでは、５’ＬＴＲ（スプライスしたものおよびスプライスしていないもの）からの２つの転写体が、５５０塩基対プローブを用いて検出され、予測されたサイズであることが確認された（４．８kbと４．０kb）（図１６Ｂ）。しかし、内部ＣＭＶプロモーターから予測される短い転写体は発現されず、この作製体ではＣＭＶプロモーターが閉じられていたことを示していた。Ｒ２０ＴＡＲベクターは、ＬＸＳＮ中のスプライスドナーの不活性化のために、予測したようにＴＡＲプローブとハイブリダイズする５’ＬＴＲから、スプライスしていない４．６kbの転写体を生成した（図１６Ｃ）。
ヒトＰＢＬ中のＨＩＶ−１複製の阻害。ＨＩＶ−１遺伝子治療法の研究に対するＰＢＬ測定系の妥当性を解析するために、研究室株（IIIＢ）と初代臨床的単離体（８２Ｈ）の両方を用いて、形質導入されたＰＢＬについてＨＩＶ刺激実験を行った。感染は２重測定で行い、ＰＢＬの３〜５回の独立したバッチで繰り返した。培養上清中のｐ２４抗原レベルを測定することにより、種々の時点でＨＩＶ−１複製を追跡した。ＨＩＶ−１  IIIＢ株を用いる刺激実験では、リボザイム（図１７Ａ）、アンチセンス（図１７Ｂ）およびＴＡＲおとり（図１７Ｃ）を発現するＰＢＬ中で、対応する対照ベクターで形質導入したＰＢＬに比較してｐ２４産生は著しく低下していた（７０％）。形質導入したが選択していないＰＢＬでも程度の小さい阻害（７０％に比較して４０％）が観察された。形質導入され選択されたＰＢＬはまた、初代ＨＩＶ−１単離体の感染に対する耐性についても評価した。初代ＨＩＶ−１単離体８２Ｈは、患者のＰＢＭＣから直接得られ、Ｔ細胞指向性で合胞体誘導性単離体として性状解析された。IIIＢについては、８２Ｈ複製（ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡで測定）は、ＨＩＶ−１  IIIＢ感染ＰＢＬで見られたレベルと同様のレベルで阻害された（図１８Ａ〜１８Ｃ）。これらの結果は、レトロウイルスベクターを介してヒトＰＢＬ中に移されたこれらのトランス遺伝子は初代造血細胞中でＨＩＶ−１複製を阻害することができることを示している。
形質導入したＰＢＬの解析。ＰＢＬ増殖への形質導入と作製体発現の影響を調べるために、［3Ｈ］−チミジン摂取測定法を、すべての形質転換し選択したＰＢＬについて行った。形質導入していない正常なＰＢＬと比較すると、トランス遺伝子作製体とベクター形質導入ＰＢＬ中で明らかな有害作用はなかった（Ｐ＜０．０２）；（図１９）。さらに、ＦＡＣＳ解析は、形質導入後もＣＤ４表面マーカーは変化しないことを明らかにした（表５）。これは、ＨＩＶ−１刺激測定法で観察された阻害作用は、形質導入されたＰＢＬについてのＣＤ４受容体の数の低下に帰因するものではないことを証明した。
0004326590.tif 000013
図２０は、ウイルスで形質導入しＧ４１８選択を行ったＣＥＭ  Ｔ４  Ｔリンパ球細胞株の結果を示す。プールした集団は、ランダムに取り込んだ細胞と種々の作製体発現レベル（これらは次にＨＩＶ−１で刺激される）を含有する。
図２１Ａ〜２１Ｂは、ＲｚＭ（ｔａｔに対する多重リボザイム）およびＲＲｚｐｓｉ／Ｍ（パッケージング部位とｔａｔの両方に対するリボザイム）の結果を示す。
考察
インビボでＨＩＶ−１複製を阻害するのに遺伝子治療法を最終的に使用するためには、このような遺伝子治療法はまず実験系で試験しなければならない。現在までこれらの実験系は、主にヒトＴリンパ球細胞株を使用しており、初代ＰＢＬについてのデータは発表されていない（Yu, M.ら、1994）。前臨床データを作成するために、遺伝子治療薬を初代造血細胞で試験することが重要である。これらの細胞は、ＨＩＶ−１感染と複製の主要な標的であり、増殖特性、インビトロの操作に対する応答およびＨＩＶ−１感染に対する反応性において、細胞株とＰＢＬの間で大きな差がある。それはＨＩＶ−１遺伝子治療のＣＤ４+ＰＢＬ集団である。これらの理由のために、我々はＰＢＬ測定系を確立するためにこの実験を行った。
この実験では、リボザイム、アンチセンスまたはＴＡＲおとり遺伝子を発現する３つの異なるレトロウイルスベクターを、ヒトＰＢＬでの抗ウイルス効果について試験した。これらは異なるレトロウイルスベクターで作成されたが、これらは3Ｈ−チミジン取り込み測定とＦＡＣＳ解析で測定すると、ＨＩＶ−１保護測定法において明らかな毒性は示さず同様のレベルで有効であることが証明された。これらの観察結果は、ＨＩＶ−１遺伝子治療の標的としてのＰＢＬの使用可能性を示している。
ＰＢＬを測定系または治療の標的細胞として使用するために、いくつかの点を注意すべきである。まずＰＢＬの効率的な形質導入を達成するために高ウイルス力価が必須である。これは、形質導入されたＰＢＬをＧ４１８で選択することが好ましい臨床的目的には特にそうである。我々は、高力価の治療用レトロウイルス（＞１０6cfu/ml）で形質導入した選択されたおよび選択されていないＰＢＬの両方を試験した。阻害の程度は選択されたＰＢＬより低いが、選択されていないＰＢＬもＨＩＶ−１感染に対して耐性であり、Ｇ４１８選択のない生体外（ex vivo）形質導入したＰＢＬを使用することが可能であることを示唆した。しかしＧ４１８選択は、低い力価のウイルスを、遺伝子治療のインビトロ試験について使用することを可能にする。我々は、完全な選択が容易に達成される２工程Ｇ４１８選択法を開発した。これらの方法は、インビトロ培養の時間を最少にし、従ってＴ細胞集団に対する修飾を少なくさせるのに有用である。我々の実験では、ＰＢＬをインビトロで連続的に２週間培養しても、表面マーカー（ＣＤ４+とＣＤ８+）も大きな影響を与えなかった。この期間の長さ（２週間）は、治療目的のＰＢＬの生体外操作には充分である。
レトロウイルスベクターのデザインは、効率的な遺伝子移動と発現にとってもう１つの重要な面である。この試験で使用した３つのベクターデザインの間で直接の比較はできないが、２つの観察結果が注目される。まず、ウイルスＬＴＲ（しかし、１つの作製体のＣＭＶ内部プロモーターからではない）により制御されるすべてのトランス遺伝子は、ヒト初代造血細胞中で構成的に効率的に発現された。第２に、リボザイム遺伝子がレトロウイルスベクター中のｎｅｏrのような遺伝子の３’非翻訳領域中に挿入される方法は、Ｔ細胞株と同様にＰＢＬ中でも効率的であると思われる。これらの観察結果は、遺伝子治療の設計において将来の改良のために有用かも知れない。結論としてヒト初代ＰＢＬの形質導入と生体外でのＨＩＶ−１感染からのその保護は、本明細書に開示のプロトコールを用いることにより達成することができる。これはインビトロで遺伝子治療薬の評価の有用な系を提供するだけでなく、ＣＤ４+リンパ球を標的にしたＨＩＶ−１遺伝子治療法の基礎をなすであろう。
実施例９：生体外ＡＩＤＳ遺伝子治療のための抗ＨＩＶ−１抗体ＢＭ１２と遺伝子治療薬の組合せ使用
ＨＩＶ−１感染の抑制に対する遺伝子治療法には、リボザイム、アンチセンスまたはＴＡＲおとりまたはトランス優性ウイルスタンパク質に、比較的有効な送達系（特に、レトロウイルスベクター）が組合せて使用される。ＡＩＤＳ遺伝子治療法の現在提唱され方法には、患者からの骨髄または末梢血の除去、生体外および遺伝子移動（レトロウイルス形質導入）、次に同種または自家移植である。生体外操作の間に、患者の骨髄細胞または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中に存在する潜伏ＨＩＶの活性化を避けるような手段がとらなければならない。現在生体外培養でのＨＩＶ−１複製を排除または阻害するために、ＨＩＶ−１遺伝子治療臨床的プロトコールの一部に、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターであるネビラピン（nevirapine）とＣＤ４−シュードモナス（pseudomonas）外毒素（ＣＤ４−ＰＥ４０）が含まれている。しかし、これらの化合物を使用する欠点は、薬剤耐性の誘導と細胞毒性の誘導の可能性である。この実験は、Ｔ細胞培養中のｔａｔ遺伝子を標的とする抗ＨＩＶ−１リボザイムの発現と組合せた、組換え抗ＨＩＶ−１抗体ＢＭ１２（Burtonら、Science（November 11, 1994）266:1024-1027）の使用を示す。結果は、抗体のみまたはリボザイム発現のみの培養物と比較して、リボザイム発現性Ｔ細胞の培養物にＢＭ１２抗体を加えた時、ＨＩＶ−１複製の阻害が増強されることを示した。これは、ａ）ＨＩＶ−１複製を抑制する生体外操作の治療可能性を強調し（遺伝子治療法プロトコールとＢＭ１２抗体を組合せるとウイルス複製が低下する）、およびｂ）ＨＩＶ遺伝子治療法でキメラ遺伝子を作製するためのＢＭ１２の核酸配列の使用の可能性を証明する。生体外操作後、遺伝的に修飾した細胞を患者に導入して、ｉ）ＨＩＶ−１複製を阻害し、ii）ＨＩＶ−１誘導病原性から細胞を保護するであろう。両方とも、ＡＩＤＳの進行に影響を与えることが予想される。
ＳｕｐＴ１細胞株でのＨＩＶ−１  IIIＢ複製に及ぼすＢＭ１２とリボザイム発現の組合せ効果
抗ＨＩＶ−１抗体ＢＭ１２は、ＨＩＶ−１複製に及ぼすリボザイムとの組合せ効果の可能性について試験されている。Ｒｚ２（ＨＩＶ−１  ｔａｔ遺伝子を標的とする単一リボザイム）とＳＶ２ｎｅｏベクター発現ＳｕｐＴ１細胞を、ＨＩＶ−１  IIIＢウイルスで２時間感染させ、次に洗浄した。細胞をＢＭ１２抗体を含有する培地（０、０．５、５、５０μｇのＢＭ１２抗体/ml）中に再懸濁し、３７℃で５％ＣＯ2でインキュベートした。培地の試料を、ｐ２４測定のために３、５、９、１２および１５日目に採取した。合胞体生成により測定した細胞変性作用（ＣＰＥ）を、３、６、９、１２日に追跡した。ＣＰＥ読み値は、リボザイム発現とＢＭ１２抗体の組合せは、合胞体生成から感染細胞の最大の保護を与えることを示した。ｐ２４解析の結果は、添付の図２２と２３に示すＣＰＥ読み値と一致した。以下の表６は、１５日目のｐ２４のデータを要約する。
0004326590.tif 000014
表７
動物レトロウイルス
ＡＩＤＳ−関連ウイルス（ＡＲＶ）
トリ赤芽球症ウイルス
トリ白血病ウイルス（またはリンパ系白血病ウイルス）
トリ骨髄芽球症ウイルス
トリ細網内内皮症ウイルス
トリ肉腫ウイルス
ヒヒ内在性ウイルス
ウシ白血病ウイルス
ウシレンチウイルス
ウシ合胞体ウイルス
ヤギ脳炎−関節炎ウイルス（ヤギ白質脳症ウイルス）
トリ骨髄球腫ウイルス
アカダイショウレトロウイルストリ合胞体ウイルス
アヒル感染性貧血ウイルス
シカ腎ウイルス
ウマ皮膚線維肉腫
ウマ伝染性貧血ウイルス
エシュ（Esh）肉腫ウイルス
ネコ免疫不全症ウイルス
ネコ白血病ウイルス
ネコ肉腫ウイルス
ネコ合胞体形成性ウイルス
フジナミ肉腫ウイルス
テナガザル白血病ウイルス（または、サルリンパ腫ウイルスまたはサル骨髄性白血病ウイルス）
キンケイウイルス
ヒト免疫不全症ウイルス１（ＨＩＶ−１）
ヒト免疫不全症ウイルス２（ＨＩＶ−２）
ヒトＴリンパ球性イルス１（ＨＴＬＶ−１）
ヒトＴリンパ球性ウイルス２（ＨＴＬＶ−２）
ヒトＴリンパ球性ウイルス３（ＨＴＬＶ−３）
リンパ球増殖性疾患ウイルス
骨髄芽球関連ウイルス
骨髄球種症ウイルス
ミンク細胞フォーカス誘導性ウイルス
骨髄球種症ウイルス１３
ミンク白血病ウイルス
ネズミ乳癌ウイルス
メーゾンファイザーサルウイルス
マウス肉腫ウイルス
骨髄性白血病ウイルス
骨髄球種症ウイルス１３
進行性肺炎ウイルス
ラット白血病ウイルス
ラット肉腫ウイルス
ラウス関連ウイルス０
ラウス関連ウイルス６０
ラウス関連ウイルス６１
細網内内皮症関連ウイルス
細網内内皮症ウイルス
細網内内皮症ウイルス−トランスフォーミング
シナキジウイルス
ラウス肉腫ウイルス
サルフォーミーウイルス
サル免疫不全症ウイルス
脾臓フォーカス形成性ウイルス
リスサルレトロウイルス
脾臓壊死ウイルス
ヒツジ肺腺腫症ウイルス／癌ウイルス
サル肉腫関連ウイルス（羊毛サル（Wooly Monkey）白血病ウイルス）
サル肉腫ウイルス（羊毛サル（Wooly Monkey）ウイルス）
表８：
パッケージング配列の表：
１．細網内内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）
ゲノム：Wilhelmsenら、J. Virol. 52:172-182(1984)。
塩基１〜３１４９；Shimotohnoら、Nature 285:550-554(1980）。
塩基３１５０〜３６０７。パッケージング配列（ψ）：０．６７６kbpのＫｐｎＩ部位とプロウイルスの５１末端に対する０．８２０kbpの間の１４４−塩基。
J. EmbretsonとH. Temin J. Virol. 61(9):2675-2683(1987)。
２．ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）
ゲノム：Galloら、Science 224:500-503(1984)パッケージング配列（ψ）：５’ＬＴＲとｇａｇ遺伝子開始コドンの間の１９塩基対。A. Lever, J. ViroL. 63(9)4085-4087(1989)。
３．モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）
ゲノム：Shinnickら、Nature 293:543-548(1981)。
パッケージング配列（ψ）：ｇａｇタンパク質のコード配列のスプライス部位とＡＵＧ部位の間の３５０ヌクレオチド。R. Mann, R. MulliganおよびD. Baltimore, Cell 33:153-159(1983)。第２パッケージング配列（ψ＋）：Ｕ５領域の５’半分でのみ。J. MurphyとS. Goff, J. Virol. 63(1):319-327(1989)。
４．トリ肉腫ウイルス（ＡＳＶ）
ゲノム：Neckameyerと-Wang J. Virol. 53:879-884(1985)。
パッケージング配列（ψ）：プロウイルスの左（ｇａｇ−ｐｏｌ）末端から３００と６００塩基の間の１５０塩基対。P. ShankとM. Linial, J. Virol. 36(2):450-456(1980)。
５．ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
ゲノム：Schwartzら、Cell 32:853-869(1983)。パッケージング配列（ψ）：ｇａｇ開始コドンの前１２０塩基（ＰＢ部位開始）〜２２塩基までの２３０塩基対。S. KawaiとT. Koyama(1984), J. Virol. 51:147-153。
６．ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）
ゲノム：Couezら、J. Virol. 49:615-620(1984)、塩基１〜３４１；Riceら、Virology 142:357-377(1985)、塩基１〜４６８０；Sagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. 82:677-681(1985)、完全ＢＬＶプロウイルス。パッケージング配列（ψ）：本発明者らは、これは塩基約３４０のプライマー結合部位の末端と塩基約４１〜８のｇａｇの開始コドンの間にあると予測する。
参照文献
0004326590.tif 000015
0004326590.tif 000016
0004326590.tif 000017
0004326590.tif 000018
0004326590.tif 000019
0004326590.tif 000020
配  列  表
（１）一般情報
（i）出願人：シモンズ，ジョフリー  Ｐ．
サン，ランカン
（ii）発明の名称：レトロウイルスをパッケージングする配列発現構築物をターゲッティングするリボザイム及びこの様な構築物を含有する組換えレトロウイルス
（iii）配列の数：１１
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：クーパー＆ダンハム  ＬＬＰ
（B）通り：１１８５アベニュー・オブ・ジ・アメリカズ
（C）市：ニューヨーク
（D）州：ニューヨーク
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：１００３６
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１．２４
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：１９９５年１月１８日
（C）分類：
（vi）先の出願データ：
（A）出願番号：０８／３１０，２５９
（B）出願日：１９９４年９月２１日
（viii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：ホワイト，ジョン  Ｐ．
（B）登録番号：２８，６７８
（C）参照／ドケット番号：４３８４６−Ｂ／ＪＰＷ／ＮＰＬ
（ix）電信情報：
（A）電話：２１２−２７８−０４００
（B）テレファックス：２１２−３９１−０５２５
（２）配列認識番号１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号１
0004326590.tif 000021
（２）配列認識番号２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号２
0004326590.tif 000022
（２）配列認識番号３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号３
0004326590.tif 000023
（２）配列認識番号４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号４
0004326590.tif 000024
（２）配列認識番号５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１１４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号５
0004326590.tif 000025
（２）配列認識番号６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号６
0004326590.tif 000026
（２）配列認識番号７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１７０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列認識番号７
0004326590.tif 000027
【図１】
0004326590.tif 000029
【図２】
0004326590.tif 000030
【図３】
0004326590.tif 000031
【図４】
0004326590.tif 000032
【図５】
0004326590.tif 000033
【図６】
0004326590.tif 000034
【図７】
0004326590.tif 000035
【図８】
0004326590.tif 000036
【図９】
0004326590.tif 000037
【図１０】
0004326590.tif 000038
【図１１】
0004326590.tif 000039
【図１２】
0004326590.tif 000040
【図１３】
0004326590.tif 000041
【図１４】
0004326590.tif 000042
【図１５Ａ】
0004326590.tif 000043
【図１５Ｂ】
0004326590.tif 000044
【図１５Ｃ】
0004326590.tif 000045
【図１６Ａ】
0004326590.tif 000046
【図１６Ｂ】
0004326590.tif 000047
【図１６Ｃ】
0004326590.tif 000048
【図１７Ａ】
0004326590.tif 000049
【図１７Ｂ】
0004326590.tif 000050
【図１７Ｃ】
0004326590.tif 000051
【図１８Ａ】
0004326590.tif 000052
【図１８Ｂ】
0004326590.tif 000053
【図１８Ｃ】
0004326590.tif 000054
【図１９】
0004326590.tif 000055
【図２０】
0004326590.tif 000056
【図２１Ａ】
0004326590.tif 000057
【図２１Ｂ】
0004326590.tif 000058
【図２２】
0004326590.tif 000059
【図２３】
0004326590.tif 000060