(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）を添加することを特徴とする、血球からのメディエーター遊離反応に供する血液の処理方法；
（１）Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）及び／又はクエン酸
（２）１〜５０Ｕ/ｍｌのヘパリン
（３）水溶性媒体中でカルシウム、マグネシウム及びマンガンから選ばれる１種以上の２価陽イオンを溶出しうる金属塩であって、（１）に対して１〜２００倍のモル濃度比の２価陽イオンを溶出しうる金属塩。
【請求項２】
金属塩が、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩よりなる群から選ばれる１種以上を含む、請求項１記載の処理方法。
【請求項３】
メディエーターが、ヒスタミン、ロイコトリエン、ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）あるいは、サイトカインである、請求項１又は２記載の処理方法。
【請求項４】
ＥＤＴＡ及び／又はクエン酸の濃度がメディエーター遊離反応時に１〜５０ｍＭである、請求項１〜3のうちいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項５】
２価陽イオンを溶出しうる金属塩の濃度が、メディエーター遊離反応時に１〜２００ｍＭである、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項６】
下記（１）〜（３）よりなる、血球からのメディエーター遊離反応に供する血液の処理用組成物；
（１）Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）及び／又はクエン酸
（２）１〜５０Ｕ/ｍｌのヘパリン
（３）水溶性媒体中でカルシウム、マグネシウム及びマンガンから選ばれる１種以上の２価陽イオンを溶出しうる金属塩であって、（１）に対して１〜２００倍のモル濃度比の２価陽イオンを溶出しうる金属塩。
【請求項７】
金属塩が、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩よりなる群から選ばれる１種以上を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
メディエーターが、ヒスタミン、ロイコトリエン、ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）、あるいは、サイトカインである請求項６又は７記載の組成物。
【請求項９】
ＥＤＴＡ及び／又はクエン酸の濃度がメディエーター遊離反応時に１〜５０ｍＭである、請求項６〜８のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
２価陽イオンを含む金属塩の濃度が、メディエーター遊離反応時に１〜２００ｍＭである、請求項６〜９のうちいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、および水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩により血液を処理することで、血液細胞を分離することなく、血液細胞反応の決定を再現性良く行うことができる血液の処理方法及び処理用組成物を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中に含まれる血球として知られているのは、赤血球、好塩基球、好中球、好酸球、リンパ球、単球などであり、これらの細胞は、生体に必要な酸素の運搬及び免疫反応や炎症反応などの生体の防御反応に携わることが良く知られている。
【０００３】
免疫反応や炎症反応は、血球それ自身の貧食作用に代表される細胞自身による外敵や組織への直接の細胞反応や血球が保有していたメディエーターを放出する反応を通じ、そのメディエーターがその他の細胞または、組織に作用することにより行われることが知られている。これら血液中の細胞（血球）から放出されるメディエーターとして、インターロイキン類、例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）を始めとするサイトカイン類や、ヒスタミン、ロイコトリエン、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）、ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＰ）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＰＯ）、ｃｈａｒｃｏｔ−ｌｅｙｄｅｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  （ＣＬＣ）等が知られている。これらメディエーターの血球からの放出は、時として過剰となり、気管支喘息、慢性関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、糖尿病などの症状を引き起こすことが知られている。従ってこれらの物質量を決定することは、上記の疾患患者の病態を調べることや、治療に用いる薬剤の選択、さらに、疾患の基礎研究の分野において大変重要とされている。
【０００４】
これら、血液中のメディエーター量を測定するための従来の問題点として、再現性がないこと、及び、その操作が簡便でないことが挙げられる。血液中のメディエーターは、その量が極めて微量であるうえ、血液中に存在する多量多雑なタンパク、または、血球成分が測定の精度に悪影響を及ぼすことが知られており、これを回避するためにメディエーターと、その他のタンパク、血球成分を分離して測定する操作を数段階にわたって必要としていた。メディエーターのなかで、ヒスタミン、ロイコトリエンを例として血球からのメディエーターを遊離させる方法を説明すると、血液から白血球を分離して測定する方法として、特許公開番号特開平６−２０５６９５が挙げられる。試験管に被検者からＥＤＴＡ採血した血液と磁石粒子に固着化した抗好塩基球モノクローナル抗体を加え室温で５分間反応を行わせ、好塩基球を血液から分離する。磁性粒子をアビジン固層化マイクロプレートに移し、アレルギーの特異抗原をマイクロプレートのウエル内に分注し、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。そのヒスタミンの定量方法として、反応液にビオチン標識ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体を加え、洗浄後、アビジン固層化抗体に結合した、ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合体の酵素活性を求めヒスタミン量を測定する方法が開示されている。
【０００５】
また、別な方法としては、血液から白血球を分離して測定するために、ＥＤＴＡ添加条件で採血を行い、４％デキストランを加え赤血球を沈殿させ、白血球浮遊液を分離し、遠心を行い、タイロイド反応液（１２４ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、０．６４ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．０３％ヒト血清アルブミン）に浮遊させ、遠心、浮遊を繰り返し行い、白血球の洗浄を行う。その浮遊液に、アレルギーの特異抗原液を加え反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。反応後遠心し、上清を採取し、上清中のヒスタミン遊離量を蛍光法、ＲＩＡ法、ＨＰＬＣ法にて測定を行う方法がよく知られている。
【０００６】
また、別のメディエーターであるロイコトリエンの測定方法では、血液から白血球を分離し、カルシウムイオノフォアーを加え反応を行い、好塩基球からロイコトリエンを遊離させる。そして、プロスタグランジンを含む氷冷アセトニトリル／メタノール／酢酸液を加え反応を停止し、−２０℃で１時間放置後、遠心を行い、反応液中のロイコトリエン量をＨＰＬＣにて測定する方法が知られている。
【０００７】
このように、血球から放出されるメディエーターであるロイコトリエンの測定方法において、ロイコトリエン自身の吸収特性として、２８０ｎｍ付近の吸収を持っているにも関わらず、ロイコトリエンの血中濃度が微量で有り、なおかつ、血中に含まれるタンパクも２８０ｎｍ付近の吸収を持っているために全血中のロイコトリエン量を血液から標的細胞を分離することなく測定することは不可能である。従って、血球から放出されるロイコトリエン量を測定するためには、血中からの標的細胞の分離操作が必要となる。
【０００８】
以上の通り、血球から遊離するメディエーターを測定する方法のほとんどは、血液から血漿、血清や標的細胞を分離する操作が必要である。これは、血液中には、アルブミン、グロブリン、抗体などのタンパクや、ナトリウム、カリウムなどの無機物、糖や脂質などの有機物を含んでいるために、測定対象物を定量しようとする際に用いられる検出系である蛍光法や比色法や発光法における、ブランク値上昇の要因や血中の夾雑物によって反応が阻害されることによる反応特異性（感度）の低下が引き起こされる為である。このように、メディエーターの測定において、目的とするメディエーターと他の血液成分を分離するために数段階にわたる分離操作を必要とするのが一般的で、極めて複雑かつ煩雑な方法であった。
【０００９】
また一方、血液と目的とするメディエーターの分離をより簡便化させた方法として、特開平３−１９９４８による全血を用いて血球からヒスタミンを遊離させる方法が知られている。具体的には、ヘパリン採血した血液２５μｌとアレルゲン溶液２５μｌをグラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、３７℃で９０分反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。ヒスタミンが吸着しているマイクロプレートを洗浄後、蛍光法にて測定を行う方法が開示されている。しかしながら、この方法では、血液成分と目的のメディエーターとの分離が不十分であるため、再現性が悪く、診断に必要とする充分な感度が得られていない。
【００１０】
以上の通り、細胞反応の決定を再現性良く行う際には、目的とする物質とそれ以外の成分を分離しなければならず、被検者から採血した際に、採血管１本１本を遠心し血球を沈降させることによる分離操作や、遠心によって得られた血漿及び血清の他容器への分注操作、あるいは、血球特異的抗体を用いた血液から血球の分離作業が必要とされるなど、操作上大変な手間がかかるとともに測定者の作業時間が伸び、それに伴う、コストをあげる要因ともなっていた。
【００１１】
また、例え、血液成分と目的物質との分離操作を簡略化させた方法があったとしても、血液中の成分の影響により、再現性が悪く、データのバラツキから、その結果と患者の病態とは異なる結果が得られることがあるため、これら細胞反応の決定方法として、血液成分と目的物質の分離ステップを簡略化しうる、簡便かつ再現性の良い血液処理方法が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
細胞反応の決定方法として、簡便かつ再現性の良い血液処理方法を樹立できれば、正確な測定値が得られ、結果として、被検者の病態を正しく反映するとともに、異常値に対する再検査の必要も無くなる。また、測定操作の簡便化ができ、検査センターなどの実施者のコストも大幅に改善できる。このように、再現性向上と簡便化は、この分野の検査を進めていくうえでの必然の要求である。従って、本発明の目的は、血液中の細胞反応の決定方法において、再現性が良く、簡便化が可能となる血液の処理方法及びその処理用組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記問題に対して、鋭意研究を行った結果、血液に、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価金属イオンを溶出しうる金属塩を添加することで、前記課題を解決しうることを見出し本発明に至った。
【００１４】
即ち、本発明は、血液に、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を添加することを特徴とする、細胞反応のための血液処理方法、及び処理用組成物を提供する。
本発明で用いられる血液とは、全血を生理的塩類溶液にて１〜１０倍希釈した血液で有ればよいが、好ましくは全血が望ましい。
【００１５】
本発明におけるキレート剤とは、水溶液中の２価金属イオンと結合する能力を持つ物質で、血液中にモル濃度比として、キレート剤１分子に対して２〜１０倍分子のカルシウムが存在する場合に、室温条件下で１時間以内に血液凝固が起こる物質である。例としては、ＥＤＴＡ、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロ三酢酸、などが挙げられるが、好ましくは、市販されている採血管に含まれているＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−２Ｋが好ましく、さらに好ましくは、ＥＤＴＡ−２Ｎａが好ましい。その血液細胞反応時の濃度は、１〜５０ｍＭであれば良く、好ましくは１．５〜１４ｍＭ、より好ましくは２〜３．５ｍＭが好ましい。
【００１６】
本発明におけるキレート能を有しない抗血液凝固剤とは、血液中に１〜１０ｍＭのカルシウムの存在下、または非存在下において、血液凝固が起こらない抗凝固剤のことであり、例えば、２ｍＭのカルシウムの存在下、室温で１時間以内に血液凝固が起こらない抗血液凝固剤である。抗血液凝固剤の例としては、ヘパリン、プラスミン、ヒルジン、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンボモジュリン、プロスタグランジン、Ｃｈｉｃａｇｏ  ｂｌｕｅ、Ｇｅｒｍａｎｉｎ、血液凝固因子に対する抗体、血液凝固因子に対するレセプター等が挙げられる。血液凝固因子としては、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子などが有り、それに対する抗体またはレセプターなら何でも良い。これら抗血液凝固剤として、好ましくはヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウムなどが挙げられるが、さらに好ましくは、ヘパリンナトリウムが挙げられる。その血液細胞反応時の濃度は、１〜５０Ｕ/ ｍｌ、好ましくは５〜３０Ｕ/ ｍｌが望ましい。ここで、１Ｕとは、日本薬局方に定められた１単位と同等量とする。
【００１７】
また、本発明における２価陽イオンとは、カルシウムイオン（Ｃａ2+）、マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）、マンガンイオン（Ｍｎ2+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）、カドミウムイオン（Ｃｄ2+）、及び銅イオン（Ｃｕ2+）等が挙げられるが、好ましくはカルシウムイオン、あるいは、マグネシウムイオンが好ましい。
水溶液中で２価陽イオンを生じさせうる金属塩としては、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が挙げられる。例えば、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＣｄＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＣａＳＯ4 、ＭｇＳＯ4、ＭｎＳＯ4、ＺｎＳＯ4、ＣｄＳＯ4、ＣｕＳＯ4、Ｃａ（ＮＯ3）2、Ｍｇ（ＮＯ3）2、Ｍｎ（ＮＯ3）2、Ｚｎ（ＮＯ3）2、Ｃｄ（ＮＯ3）2、Ｃｕ（ＮＯ3）2、ＣａＣＯ3 、ＭｎＣＯ3、ＣｄＣＯ3 、ＣａＨＰＯ4、ＭｇＨＰＯ4、Ｚｎ3（ＰＯ4）2等が挙げられるが、好ましくは、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2が望ましい。その血液細胞反応時の濃度は、１〜２００ｍＭが望ましく、キレート剤とのモル濃度比は、キレート剤１分子に対して金属塩が１〜２００倍が良く、好ましくはキレート剤１分子に対して１〜５０倍が望ましい。
【００１８】
本発明で用いられる細胞反応とは、細胞上のタンパク発現反応、細胞からのタンパク等の有機化合物放出反応であり、細胞に何らかの刺激を与えた時、または、何ら刺激を与えていない状態で、細胞の代謝の中で放出されたものであっても構わない。ここで言う細胞の刺激とは、外部から物質を添加し、細胞上の物質との結合、あるいは細胞内への浸透により、細胞内の情報伝達系を活性化することである。情報伝達系としては、タンパク質のリン酸化やプロテアーゼ活性化、または、イノシトール３リン酸による細胞内カルシウム濃度上昇作用があげられる。細胞に何らかの刺激を与えた時の例としては、好塩基球からのヒスタミンやロイコトリエンの放出において、好塩基球上のＦｃεＲＩレセプターに結合したアレルギー特異的ＩｇＥ抗体の２分子とアレルゲンが結合し、アレルギー特異的ＩｇＥ抗体を架橋することにより、細胞内の情報伝達系であるリン酸化酵素が活性化され、細胞内へのカルシウム流入を引き起こし、ヒスタミンなどのメディエーターが放出される例が挙げられる。
【００１９】
また、刺激されていない状態で放出される例としては、好塩基球からのインターロイキン４、インターロイキン８の放出が挙げられる。そして、放出される有機化合物としては、血液細胞から放出されたメディエーターが挙げられる。メディエーターとしては、好塩基球からのヒスタミン、ロイコトリエン、インターロイキン類、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）、好酸球からのＭａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）、Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＰ）、Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｒｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ（ＥＤＮ），Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＰＯ）、Ｃｈａｒｃｏｔ−ｂｅｙｄｅｎｃｒｙｓｔａｌ（ＣＬＣ）、トロンボキサンなどが挙げられるが、好ましくは、好塩基球から遊離されるヒスタミン、ロイコトリエン、ＰＡＦ、インターロイキンが望ましい。
【００２０】
血液の処理方法としては、３つの組成物すなわち、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を添加する順序は問わず、いずれの順序で添加しても、再現性良く細胞反応を決定することを可能にするものである。
例えば、採血時にキレート剤のみを添加しておき、細胞反応時にキレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を加えても良いし、採血時にキレート能を有しない抗血液凝固剤を添加しておき、細胞反応時にキレート剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を加えても良い。また、採血時にキレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩のすべてを添加し、これを用いて細胞反応を行っても良い。
【００２１】
この時のキレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩の添加方法としては、粉末であっても、適当な緩衝液中に溶解されていても良い。適当な緩衝液とは、Ｐｉｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液などで、細胞の安定化のための至適なｐＨに調整されていることが好ましく、その範囲は５〜１０、好ましくは６〜９に調整されることが望ましい。また、必要に応じて塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウムの塩や防腐剤としてアジ化ナトリウムを加えても良い。
【００２２】
添加する際の容器の材質に関しては、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスティック、ステンレス、チタン等の金属、ガラス及びゴム等何でも用いることができる。容器の色に関しては、透明、半透明、褐色等何でも用いることができる。
【００２３】
具体的な方法として、抗血液凝固剤としてヘパリンを添加した血液に、キレート剤であるＥＤＴＡ及び金属塩として塩化カルシウムを添加し、この組成液に被験者において疑われるアレルゲンを添加し、血液細胞からヒスタミン等のメディエーターを放出させる。そして、その放出されたヒスタミン等を既知の測定法にて直接測定するだけで良い。
【００２４】
ここで言う、アレルゲンとは、アレルギー反応を引き起こす原因物質であり、特異的ＩｇＥ抗体量測定試薬として市販されているアレルゲンやアレルゲン抽出物として市販されているものなど通常検査で用いられているアレルゲンであれば何でも良い。例えば、スギ、カモガヤなどの花粉や、牛乳、卵白などの食物、菌類などが挙げられる。
【００２５】
別の使用例においては、キレート剤であるＥＤＴＡを用い、ＥＤＴＡ採血された血液に、抗凝固剤であるヘパリン及び、金属塩として２価の重金属を添加する。そして、この組成液に上述のごとく、アレルゲンを添加し、血液細胞からメディエーターを放出させ、これを既知の測定法で測定すれば良い。さらに、別の例では、被検者から採血し、その血液にキレート剤であるＥＤＴＡ、抗凝固剤であるヘパリン及び、金属塩として２価の重金属を添加し、この組成液に上述のごとく、アレルゲンを添加し、血液細胞からメディエーターを放出させ、これを既知の測定法で測定すれば良い。
【００２６】
決定方法とは、細胞反応によって放出された有機化合物の量を定量する方法や目視などにより確認する方法である。有機化合物量を定量する方法には、支持体に固着させた担体に目的とする有機化合物を補足させ、検出系により測定する方法や有機化合物をカラムにより分離した後に検出系によって測定する方法が挙げられる。目視により確認する方法とは、細胞反応後の血球の状態を目視により確認する方法である。決定方法として好ましくは、有機化合物を定量する方法が望ましく、より好ましくは、支持体に固着させた担体に有機化合物を補足させる方法が望ましく、さらに好ましくは、有機化合物に特異的な吸着体を用いて測定する方法が望ましい。
【００２７】
ここで言う支持体とは、血球からメディエーターを遊離させる反応を行う容器であり、マイクロプレート、試験管、磁性ビーズなどが挙げられる。支持体の材質に関しては、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスティック、ステンレス、チタン等の金属、ガラス及びゴム等何でも用いることができ、また、支持体の色に関しては、褐色、透明、半透明など何でも良い。
【００２８】
また、固着させた担体とは、有機化合物に対して特異的に吸着する物質のことであり、有機化合物に対する抗体やレセプター、グラスファイバーなどが挙げられる。
検出系とは、有機化合物量を測定する方法であり、比色法、蛍光法、発光法、放射活性法などが挙げられ、ＥＩＡ法やＲＩＡ法及び特異的に吸着する担体を用いて測定する方法である。
【００２９】
ここで言うＥＩＡ法とは、メディエータに対する抗体を支持体に固定化し、標識酵素の活性によりメディエーター量を測定する酵素免疫測定方法である。例えば、ＥＩＡ法を用いた細胞反応によって放出された有機化合物の決定方法として、好塩基球から放出されるヒスタミンの測定では、市販されているキットの方法によって測定できる。例えば次のように行う。被検者からヘパリン採血した血液とアレルギー特異的抗原溶液と反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。遊離したヒスタミンとアシル化試薬を反応させ、ヒスタミンをアシル化する。次に、ヒスタミンの定量方法として、抗アシル化ヒスタミン抗体を固層化したマイクロプレートにアシル化したヒスタミンと酵素標識したヒスタミンを添加し反応を行い、標識酵素活性を測定することによって抗アシル化ヒスタミン抗体に結合した酵素標識ヒスタミン量を求め、そこから、アシル化ヒスタミン量を求める方法である。
【００３０】
また、他のヒスタミン測定方法では、特開平６−２０５６９５によると、血液１０ｍｌにＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液４０ｍｌを加え、血液を希釈した後、試験管に５００μｌずつ分注し、これに、好塩基球と反応するモノクローナル抗体を固着させた磁性粒子５０μｌを加え、室温で５分間反応を行い、モノクローナル抗体と好塩基球の結合反応を行う。続いて磁石でビーズを集め上清を除いた後、緩衝液にて１回洗浄を行う。そして、磁性粒子をアビジン固層化マイクロプレートに移し、アレルギー特異的抗原溶液と反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。その時に、反応液にビオチン標識ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体を同時に加えておく。洗浄後、アビジン固層化抗体に結合したビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合体の酵素活性を求めヒスタミン量を測定する方法が開示されている。
【００３１】
また、他の有機化合物であるロイコトリエンは、市販されているキットの方法による抗ロイコトリエン抗体を用いたＥＩＡ法によって測定可能である。また、他の血球から放出される有機化合物であるインターロイキン３は、市販されているキットの方法によって測定できる。例えば、次のように行う。抗インターロイキン３抗体を固層化したマイクロプレートに血漿又は血清を添加し反応を行い、固層化抗体とインターロイキン３を結合させる。反応液を洗浄後、酵素標識抗インターロイキン３抗体を加え、反応を行い、インターロイキン３と酵素標識抗インターロイキン３を結合させる。そして標識抗体の酵素活性を測定することによってインターロイキン３の量を測定する方法である。また、他のインターロイキンであるインターロイキン６では、特開平１−２７１８６２よれば、抗−インターロイキン６モノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに血清を加え、室温で２〜３時間放置し、固層化抗体とインターロイキン６を結合させる。反応液を除去後、洗浄を行った後、ビオチン化抗インターロイキン６ポリクロナル抗体を加え３７℃１時間反応を行い、インターロイキン６とビオチン化抗体を結合させる。次に、酵素標識ストレプトアビジンを加え、３７℃３０分放置し、ビオチン化抗体と酵素標識ストレプトアビジンを結合させ、反応液を除去後、３回以上洗浄を行った後、定量系として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを加え、遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定する方法が開示されている。
【００３２】
ここで言うＲＩＡ法とは、放射性標識体を用いた免疫測定法である。例えば、ＲＩＡ法を用いた細胞反応によって放出された有機化合物の決定方法として、好塩基球から放出されるヒスタミンの測定では（臨床検査  vol.26 no.2 1982/2) 、例えば、次のように行う。ＥＤＴＡ添加条件にて採血後、遠心によって血漿を分離する。アシル化試薬チューブに血漿又は標準ヒスタミンとアシル化緩衝液を加え、血漿中のヒスタミンをアシル化する。次に125Ｉ標識ヒスタミンを加え抗ヒスタミン抗体固層化チューブ内で反応させる。反応後、反応液を除去し、抗ヒスタミン抗体チューブに結合した放射能を測定することにより血漿中のヒスタミン量を求める方法が報告されている。
【００３３】
他の有機化合物であるロイコトリエンの測定においては、試料または標準の非標識ロイコトリエン、抗ロイコトリエン抗体、3Ｈ標識ロイコトリエンを４℃、５〜２４時間反応させた後、デキストランチャーコールと氷中１０分間反応させる。遠心後、上清を分取し、放射活性を測定することによりロイコトリエンの量を求める。
【００３４】
また、他の有機化合物であるＰＡＦの測定は、試料または標準の非標識ＰＡＦ、抗ＰＡＦ抗体、125Ｉ標識ＰＡＦと２次抗体を室温で、５〜２４時間反応させた後、遠心分離で得られた沈殿物の放射活性を測定することによりＰＡＦの量を求める。
好酸球から遊離する有機化合物であるＥＣＰの測定方法については、市販されているキットでは次のように行われる。抗凝固剤存在下で採血を行い、遠心によって血漿又は血清に分離し、標準ＥＣＰ及び検体を５０μｌずつ試験管にとり、125Ｉ標識ヒトＥＣＰとウサギ抗ヒトＥＣＰ抗体を５０μｌずつ加え、室温で１晩インキュベートする。これにヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体２ｍｌを加え室温で３０分インキュベート後、遠心にて上清を除去し、沈殿物のγカウンターを測定することによりＥＣＰ量を測定する方法が知られている。
【００３５】
ここで言う、有機化合物をカラムにより分離した後に検出系によって測定する方法とは、イオン性、疎水性、親和性などのメディエーターの物性を利用し、樹脂を充填したカラムにより、メディエーターを分離する方法であり、ＨＰＬＣ法が挙げられる。
ＨＰＬＣ法を用いた有機化合物の決定方法として、例えば、特開平６−２０５６９５によるヒスタミンの測定法があげられる。例えば、次のように行う、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに試料を通じ、ヒスタミンを分離した後に、０．１％オルトフタルアルデヒドとＮａＯＨを加え、ヒスタミン−オルトフタルアルデヒド結合反応を行いヒスタミンを蛍光体として、ＨＣｌを加え、反応を停止し、蛍光強度を測定することによってヒスタミン遊離量を測定する方法が報告されている。また、他の有機化合物であるロイコトリエンの測定においては、血液から白血球を分離し、カルシウムイオノフォアーを加え好塩基球からロイコトリエンを放出させ、プロスタグランジンを含む氷冷アセトニトリル／メタノール／酢酸液で反応を停止し、−２０℃で１時間放置後、遠心、逆層クロマトグラフィでロイコトリエンの分離を行って、ロイコトリエンの吸収特性である２８０ｎｍの吸収を測定し、ロイコトリエン量を測定する方法である。
【００３６】
ここで言う有機化合物を特異的に吸着する担体とは、グラスファイバー、抗体、酵素、レセプター、レクチンなどが挙げられる。
有機化合物を特異的に吸着する担体を用いて測定する方法としては特開平３−１９９４８が挙げられ、血球から遊離されるヒスタミンの測定において、ヘパリン採血した血液とアレルゲンをグラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、好塩基球からヒスタミンを放出させ、グラスファイバーに結合したヒスタミン量を蛍光法にて測定する方法が開示されている。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３８】
【実施例１】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ＥＤＴＡナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウム（同人化学社製）を添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム（和光純薬工業社製）、７０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、２．５ｍＭ酢酸カリウム（和光純薬工業社製）、１０Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウム（ヘキスト・マリオン・ルセル社）及び、０．００５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）を含むＰｉｐｅｓ緩衝液（同人化学社製）（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液（ＤＡＫＯ社製）２５μｌをグラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、３７℃９０分間反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させた。反応後、マイクロプレートを洗浄し、界面活性剤を２００μｌ添加し３７℃６０分反応させ、グラスファイバーに付着した血液中の夾雑物を洗浄する。その後、水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）で調整した０．０５％オルトフタルアルデヒド溶液（和光純薬工業社製）を７５μｌ分注し、蛍光体を形成した後、０．６％過塩素酸（和光純薬工業社製）７５μｌを分注して反応を停止し、蛍光強度を測定しヒスタミン標準液よりヒスタミン量を求めた。試験は５回行い、標準偏差を平均値で割った値を１００倍し、Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）（％）を求めた。その結果ＣＶ値は７．８％であった。
【００３９】
【実施例２】
ＥＤＴＡナトリウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は９％、８．５％、９．７％、であった。
【００４０】
【比較例１】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１２３％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、実施例１の結果と合わせ、ＣＶ値が７．８〜９％と低下した。ばらつきの程度を表すＣＶ値が有意に低下する結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの添加によって、細胞反応の再現性が向上した。
【００４１】
【実施例３】
塩化カルシウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に１、１００、２００ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は８．５％、８．５％、８．３％であった。
【００４２】
【比較例２】
塩化カルシウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に０ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。  その結果ＣＶ値は、１５０％であり、カルシウム濃度１〜２００ｍＭの範囲では、実施例１の結果と合わせ、ＣＶ値が７．８〜８．５％へと低下した。この結果から明らかなように、カルシウム濃度１〜２００ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００４３】
【実施例４】
ヘパリンナトリウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に１、２０、５０Ｕ／ｍｌである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．３％、８．０％、８．４％であった。
【００４４】
【比較例３】
ヘパリンナトリウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に０ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、１４３％であり、ヘパリンナトリウム濃度１〜５０Ｕ／ｍｌの範囲では、実施例１の結果と合わせ、ＣＶ値が７．８〜８．４％へと低下した。この結果から明らかなように、ヘパリン濃度１〜５０Ｕ／ｍｌの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００４５】
【実施例５】
ＥＤＴＡナトリウムが、クエン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．２％であった。
【００４６】
【実施例６】
ＥＤＴＡナトリウムが、シュウ酸ナトリウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．１％であった。実施例１、実施例５、実施例６、比較例１の結果から、キレート剤が、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウムであっても、ＣＶ値が７．８〜８．２％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００４７】
【実施例７】
ヘパリンナトリウムが、プラスミン（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．９％であった。
【００４８】
【実施例８】
ヘパリンナトリウムが、トロンビン（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．６％であった。実施例１、実施例７、実施例８、比較例２の結果から、キレート能を有しない抗血液凝固剤が、ヘパリンナトリウム、プラスミン、トロンビンであっても、ＣＶ値が７．８〜８．９％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００４９】
【実施例９】
塩化カルシウムが、塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．７％であった。
【００５０】
【実施例１０】
塩化カルシウムが、塩化マンガン（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．９％であった。実施例１、実施例９、実施例１０、比較例３の結果から、２価陽イオンがカルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオンであっても、ＣＶ値が７．８〜９．９％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００５１】
【実施例１１】
塩化カルシウムが、硫酸カルシウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．３％であった。
【００５２】
【実施例１２】
塩化カルシウムが、炭酸カルシウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．５％であった。実施例１、実施例１１、実施例１２、比較例３の結果から、金属塩が塩化物、硫酸塩、炭酸塩であっても、ＣＶ値が７．８〜９．５％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００５３】
【実施例１３】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヒスタミン遊離反応時にＥＤＴＡナトリウム濃度が１ｍＭ、ヘパリンナトリウム濃度が１０Ｕ／ｍｌになるように、ＥＤＴＡナトリウムとヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値が８．０％であり、実施例１のＣＶ値７．８％と同等の結果が得られた。この結果から明らかなように、キレート剤、キレート能を有さない抗血液凝固剤を血液に同時に添加しても、細胞反応の再現性が向上した。
【００５４】
【実施例１４】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヒスタミン遊離反応時にヘパリンナトリウム濃度が１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ（％）が８．０％であり、実施例１のＣＶ値７．８％と同等の結果が得られた。この結果から明らかなように、血液にキレート能を有さない抗血液凝固剤を添加し、緩衝液にキレート剤と金属塩を添加しても、細胞反応の再現性が向上した。
【００５５】
【実施例１５】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対しＥＤＴＡナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウムを添加した血液５０μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウム及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ溶液５０μｌをプラスチックチューブに分注し、３７℃９０分間反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除去した後、遊離したヒスタミンとアシル化試薬を反応させ、ヒスタミンをアシル化する。抗アシル化ヒスタミン抗体を固層化したマイクロプレートにアシル化したヒスタミンと酵素標識ヒスタミン２００μｌを添加し５度で１８時間反応を行い、洗浄後、酵素基質２００μｌを加え２５度で反応を行い、３０分後、反応停止液５０μｌを加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＣＶ値は９．２％、８．８％、９．５％であった。
【００５６】
【比較例４】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液５０μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液５０μｌを用いて実施例１５と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１４０％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、ＣＶ値が８．８〜９．５％と低下した。この結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００５７】
【実施例１６】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対しＥＤＴＡナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウムを添加した３種類の血液それぞれ５０μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウム及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ溶液２５μｌをチューブに分注し、３７℃、９０分間反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除去した後、アシル化試薬チューブに遊離したヒスタミン５００μｌと標準ヒスタミンμｌとアシル化緩衝液５０μｌを加え、遊離したヒスタミンをアシル化する。次に125Ｉ標識ヒスタミン１ｍｌを加え抗ヒスタミン抗体固層化チューブ内で４度、１６時間反応させる。反応後、反応液を除去し、抗ヒスタミン抗体チューブに結合した放射能を測定した。その結果、ＣＶ値は、９．３％、９．０％、９．５％であった。
【００５８】
【比較例５】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１６と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１４０％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、ＣＶ値が９〜９．５％と低下した。この結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００５９】
【実施例１７】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるロイコトリエンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対しＥＤＴＡナトリウム濃度がロイコトリエン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウムを添加した３種類の血液それぞれ２５μｌとロイコトリエン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０Ｕ／ｍｌヘパリン及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ溶液２５μｌをチューブに分注し、３７℃、９０分間反応を行い、好塩基球からロイコトリエンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除去した後、プロスタグランジンを含む氷冷アセトニトリル／メタノール／酢酸液で反応を停止し、−２０℃で１時間放置後、遠心、逆層クロマトグラフィでロイコトリエンの分離を行って、ロイコトリエンの吸収特性である２８０ｎｍの吸収を測定し、ロイコトリエン量の測定を行った。その結果、ＣＶ値は、それぞれ、８．１％、８．８％、９．３％であった。
【００６０】
【比較例６】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるロイコトリエンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとロイコトリエン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１７と同様の方法にてロイコトリエンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１２０％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、実施例１７の結果と合わせ、ＣＶ値が８．１〜９．３％と低下した。この結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、血液細胞反応の決定方法において、血液、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩からなる群より組み合わせた組成物を用いた血液処理により、血液を分離することなく細胞機能を再現性よく測定できることを示したものである。従って本発明の効果は、細胞機能検査の再現性を高めることができる効果、操作の簡便化による作業者の作業時間軽減及びそれに伴うコストを低下させる効果が期待される。