(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チモモナスにおける部位特異的挿入方法であって、
（ａ）チモモナスの代謝経路の副産物である乳酸を標的としている遺伝子部位であるチモモナス乳酸脱水素酵素遺伝子を含む２．５ｋｂのＤＮＡ断片を提供し、
（ｂ）該ＤＮＡ断片中の乳酸脱水素酵素遺伝子を分断し、
（ｃ）分断された該ＤＮＡ断片をキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼからなる群より選択されるオペロンならびにチモモナスにおける構造遺伝子の発現のためのプロモーターと結合させて、分断された乳酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え遺伝子を作製し、
（ｄ）分断された該ＤＮＡ断片をチモモナス由来のプラスミドベクターとライゲーションンし、および
（ｅ）分断された乳酸脱水素酵素遺伝子を含む分断された該ＤＮＡ断片との相同組換えを介して該チモモナスを形質転換する
ことを含む方法であり、
該組換え遺伝子が、組換えチモモナスにおけるＤ−乳酸の産生の排除、およびチモモナスのペントース糖を発酵する能力の増加を導くことを特徴とする方法。
【請求項２】
チモモナスにおける部位特異的挿入方法であって、該チモモナスが以下の制限酵素地図で示されるプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａとの相同組換えを介して形質転換される方法。
0004309612.tif 000003
【請求項３】
チモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）から前記プラスミドをキュアリングすることをさらに含む請求項１または２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
米国政府は、米国エネルギー省とミッドウエスト  リサーチ  インスティチュートとのあいだの契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７に基づいて、本発明に対して権利を有している。
【０００２】
［本発明の分野］
本発明は、チモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）における遺伝子挿入に関するものであり、詳細には、キシロースおよびアラビノースまたは双方を醗酵してエタノールにする組換え体チモモナス  モビリス株における特定の遺伝子産物の挿入不活性化（insertion inactivation）に関する。
【０００３】
［本発明の背景］
醗酵技術は、再生バイオマスセルロース基質をエタノールなどの燃料および薬物に変換するために有用である。典型的な基質は、３５〜４５％セルロース、３０〜４０％ヘミセルロースおよび１５％リグニンからなる。加水分解画分はグルコースポリマーを含有し、ヘミセルロース画分は主にキシロースを含有する。アラビノースもまた、スイッチグラス草（switchgrass grass）および穀物繊維（corn fiber）などのバイオマス材料において見出された重要な醗酵基質である。
【０００４】
Ｚ．モビリスは、低いｐＨ、嫌気培養で、かつ通常はリグノセルロースヒドロライセート（lignocellulose-hydrolysate）に結合する阻害化合物を含有する培地において、速くかつ効率的にグルコース基質をエタノールに変換するその能力に関して、広く報告されている。しかしながら、Ｚ．モビリスの使用において明らかに不利な点は、ペントース糖を醗酵しないことである。この不利な点を解消するために、先行技術は、キシロースおよびアラビノースの代謝を触媒する外因性遺伝子を用いることによるグルコース、ならびにキシロースもしくはアラビノース、または双方の混合物を醗酵する組換え体Ｚ．モビリス株に集中している。それらの株は、所望の酵素産物を発現することができる複数コピープラスミド（multiple-copy plasmids）の使用に基づく。
【０００５】
米国特許第５，５１４，５８３号明細書は、外因性遺伝子を有する形質転換したＺ．モビリスキシロース醗酵株（ＣＰ４／ｐＺＢ４およびｐＺＢ５）、ならびにキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ（xylulokinase）、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードし、チモモナスにより認識され該遺伝子の少なくとも１つの発現を制御する少なくとも１つのプロモーター（ＰｇａｐおよびＰｅｎｏ）をさらに含むプラスミドベクター（ｐＺＢ４およびｐＺＢ５）を開示する。その微生物は、唯一の炭素源としてのキシロースで増殖することができ、約８８％の最大理論収率で、キシロースを醗酵してエタノールにすることができる。その特許は、組み込まれた株を特許請求の範囲とする。
【０００６】
米国特許第５，７１２，１３３号明細書および同第５，７２６，０５３号明細書は、とりわけ、アラビノースからエタノールへの醗酵能を与えるＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ（L-ribulokinase）およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼならびにトランスケトラーゼをコードする外因性遺伝子を含有するＺ．モビリスアラビノース醗酵形質転換体（ＣＰ４／ｐＺＢ２０６）を開示する。プラスミドベクター（ｐＺＢ２０６）、ならびに、グルコースおよびアラビノースを含有する基質の醗酵のための形質転換体の使用方法もまた開示されている。その特許は、宿主ゲノムへの外因性遺伝子の組込みを特許請求の範囲とする。
【０００７】
米国特許第５，８４３，７６０号明細書は、キシロースイソメラーーゼ、キシルロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外因性遺伝子を含有し、該遺伝子の少なくとも１つの発現を制御しチモモナスに認識される少なくとも１つのプロモーターをさらに含むＺ．モビリスのキシロースおよびアラビノース醗酵形質転換体（２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１）を開示する。該微生物は、アラビノースおよび／またはキシロースの単独または組み合わせを炭素源として増殖することができ、該アラビノースおよびキシロースを醗酵してエタノールにすることができる。その形質転換体をプラスミドベクター（ｐＺＢ３０１、ｐＺＢ４０１、ｐＺＢ４０２およびｐＺＢ４０３）とともに使用する方法もまた、開示される。その特許は、宿主ゲノムへのそれらの外因性遺伝子の組込みを特許請求の範囲とする。
【０００８】
高率の特定のな産物形成および変換効率を達成することは、セルロース含有基質から燃料および薬物への商業的醗酵方法に不可欠である。エタノールが特定の産物であるＺ．モビリスのペントース醗酵組換え体株を用いると、副産物の乳酸、エネルギー形成の最終生産物およびキシリトールの形成は、変換効率を低下させる。したがって、エタノール製造に関するセルロースの変換効率を向上させるために、乳酸脱水素酵素の挿入不活性化など、Ｚ．モビリスにおける遺伝子の部位特異的挿入ための新しい代謝工学方法の開発が望まれている。
【０００９】
大腸菌において、外来遺伝子のゲノム挿入をもたらす古典的方法は、溶原化状態で安定に存在し得る特殊化したλファージクローニングベクターの使用を伴う。あるいは、遺伝子は、大腸菌の染色体配列に囲まれると、または遺伝子がトランスポゾンの許容部位にクローン化され得る場合は転位により、相同組換えを介して挿入され得る。転位はＺ．モビリスで説明されているが（Pappas, K. M., et al., (1997)チモモナス  モビリスでのトランスポゾン突然変異誘発および菌株構築、Journal of Applied Microbiology, Vol. 82, p.p.379-388）（Ｚ．モビリスにおける遺伝子分析のための栄養要求性または抗生物質耐性のＴｎ５またはｍｉｎｉ  Ｍμ転位）、転位は任意であり、そしてＺ．モビリスにおける相同組換えは立証されていない。さらには、Ｚ．モビリスにおける相同組換えを介した部位特異的挿入は説明されておらず、いかなるバクテリオファージもチモモナスから単離されていない。
【００１０】
前述の観点から、Ｚ．モビリスにおける部位特異的挿入方法の必要性がある。その方法の１つの実用的な適用は、排除すべき特定の副産物の形成経路における酵素をコードする遺伝子の挿入不活性化により特徴づけられる、安定な組換え体株の構築を介したＺ．モビリス醗酵における副産物形成の排除のためである。
【００１１】
［本発明の開示］
したがって、本発明の目的は、Ｚ．モビリスにおける部位特異的挿入方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、安定な組換え体株の構築を介してＺ．モビリス醗酵における副産物形成を排除する方法であって、排除すべき特定の副産物の形成経路におけるそれらの酵素をコードする遺伝子の挿入不活性化によって特徴づけられる方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、副産物の乳酸の形成を排除するために、Ｚ．モビリスの乳酸脱水素酵素遺伝子の挿入不活性化方法を提供することである。
【００１４】
関連技術に関する課題を解決するために、また本発明の目的にしたがって、本明細書において具体化され広く説明されるように、要するに本発明は、チモモナスにおける部位特異的挿入方法であって、チモモナス遺伝子断片を提供し、該断片をＤＮＡ配列で分断し、そして該分断断片による相同組換えを介して該チモモナスを形質転換することを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる利点は、以下の記載に一部説明されるであろうし一部はその記載のために明らかであり、または本発明の実施により知ることができる。本発明の利点は、特許請求の範囲にとくに指摘される方法により実現され達成され得る。
【００１６】
［発明の詳細な説明］
とくに別段の断りのない限り、本明細書において用いられるすべての技術的または科学的用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際は、本明細書に記載されるものと同類または同等のあらゆる方法および材料を使用し得るが、好ましい方法および材料をここに記載する。すべての米国特許は、引用することによって、本明細書において完全に説明されているかのように組み込まれる。
【００１７】
ここで、本発明の現在の好ましい実施態様に関する言及を詳細におこない、その例は添付の図面に示されている。下記実施例に関して、「プラスミド運搬株（plasmid-bearing strains）」は、関連技術の説明に示された米国特許記載のそれらの株およびベクターを意味する、またはそれらの株およびベクターに関連する。「Ｚ．モビリスゲノム、またはゲノムの」は、全体として、天然のプラスミドおよび染色体を含め、既定のＺ．モビリスに関する発現特性および潜在的に発現し得る特性すべてを指定する遺伝子を意味する。
【００１８】
［実施例］
以下の実施例は、Ｚ．モビリスにおける部位特的挿入のための相同組換え方法、および副産物形成に関連する遺伝子など、望まれない遺伝子の挿入不活性化方法の実用的用途を説明する。以下の実施例において、推定乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）遺伝子は、本発明の原理を説明するための標的領域であった。ｌｄｈは、ピルビン酸を、チモモナスのエタノール産生特異的醗酵における副産物である乳酸に変換する。相同組換えを用いることによるＺ．モビリスｌｄｈゲノムへのペントース代謝遺伝子（実施例２）の組込みは、抗生物質または他の選択圧力を用いることなく、表現型反応を安定させる。
【００１９】
大腸菌ＤＨ５αは、プラスミド構築用宿主として使用した。Ｚ．モビリスＡＴＣＣ３９６７６株およびその誘導体２０６Ｃ株（米国特許第５，８４３，７６０号明細書）は、Ｃ２５の構築の際の受容株として使用した。実施例２に関し、Ｃ２５株の構築は、２０００年５月１日に出願され、ともに係属している米国特許出願第０９／５６５，２３３号明細書に開示されている。
【００２０】
大腸菌株は、３７℃でＬＢ培地で培養された。Ｚ．モビリス株は、特段の定めのない限り、２０ｇ／Ｌグルコース、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースで補完したＲＭ（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4）において嫌気的に維持された。プラスミドを含有するすべての株は、テトラサイクリン（Ｔｃ）（（Ｚ．モビリスおよび大腸菌の液体に１０μｇ／ｍｌ；Ｚ．モビリスに関しては寒天に２０μｇ／ｍｌ；および大腸菌に関しては、寒天に１５μｇ／ｍｌ、またはアンピシリン（Ａｐ）１００μｇ／ｍｌ）の存在下で増殖された。
【００２１】
Ｚ．モビリス形質転換体の再生および選択のために、テトラサイクリンまたはナリジキシン酸（２０μｇ／ｍｌ）で補完した交配プレート（（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4および５０ｇ／Ｌ糖））を使用した。すべての寒天プレートは、１５ｇ／Ｌ寒天で作製された。
【００２２】
発表されたプロトコルSambrook et al.,(1989)Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y. または各試薬の製品の指示にしたがって、プラスミドＤＮＡ単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーションおよび形質転換、アガロース電気泳動法ならびにほかの組換えＤＮＡ技術は実施され、明記され、本技術分野において公知である。Ｚ．モビリスのゲノムＤＮＡは、２５０ｍｌの５０ｍＭ  トリス−５０ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁された３ミリリットルの一晩培養細胞を用いて抽出された。細胞は、３７℃で３０分間リゾチームで処理し、ついで、１００μｌの５％ＳＤＳ溶液およびリボヌクレアーゼ（最終濃度は２０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、さらに３０分間インキュベーションした。タンパク質を除去するために、フェノール／クロロフォルム抽出を２回実施した。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿法により回収した。
【００２３】
実施例１
以下の実施例は、相同組換えを介するチモモナスゲノムへの遺伝子の挿入および不活性化を説明する。この系は、テトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子挿入断片を有するチモモナスのｌｄｈ遺伝子（ｌｄｈ：：Ｔｃ）を基礎とする。ｌｄｈ：：Ｔｃカセットを含有するプラスミドは、Ｚ．モビリスを形質転換するために使用され、得られたＴｃ耐性形質転換体はサザンハイブリダイゼーションによって分析された。その結果は、ｌｄｈ：：Ｔｃカセットがチモモナスゲノムのｌｄｈ領域に挿入されたことを示した。したがって、チモモナスでの相同組換えに基づく遺伝子組込みの発明は、ｌｄｈ遺伝子の不活性化を生じるターゲッティング組込みを伴い、エタノール醗酵における乳酸副産物形成を排除した。
【００２４】
１ｋｂのｌｄｈ断片は、鋳型としてＺ．モビリスＡＴＣＣ３９６７６の全ＤＮＡを用いるＰＣＲによって調製した。ＰＣＲは、パーキンエルマー社（Perkin EElmer）のＰＣＲキットを用いて実行され、公知である。プライマーは、Yamano I.,(1993)Journal of Bacteriology, Vol.175, 3926-3933に公表された、Ｚ．モビリスＣＰ４のＤＮＡ配列に基づき設計された。ｌｄｈに対するプライマーは、
５'−TCGCGGATCCGTCTATGCGCGTCGCAATATTCAGTTCC−３'
５'−TCGCGGATCCGTCGCTTGTCTATTAAACAAGCGCATCCGGC−３'
であり、各プライマーの５'末端にはＢａｍＨＩ部位（下線部）が組み込まれた。ＰＣＲ産物（ｌｄｈ）は、ｌｄｈの構造遺伝子を含む長さ約９９５ｂｐであった。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩを用いて消化され、そしてＢａｍＨＩで消化することにより線状化されウシ腸由来ホスファターゼで処理することにより脱リン酸化されたｐＵＣ１９に、ライゲーションされた。ライゲーションしたＤＮＡは大腸菌ＤＨαを形質転換するために使用され、アンピシリン耐性形質転換体から得たプラスミドＤＮＡの制限分析により、予想されるプラスミドの存在を確認し、ｐＵＣ１９−ＬＤＨと命名した。Ｔｃｒ遺伝子はついで、ｐＵＣ１９−ＬＤＨのｌｄｈにおけるＮｃｏＩ部位に挿入された。Ｔｃr遺伝子に対して使用したプライマーは、
５'−CTAGGCGTATCACGAGGCCCTTT−３'
５'−CTAGGCGGACGCGATGGATATGT−３'
である。
【００２５】
Ｔｃr合成用に用いた鋳型はｐＢＲ３２２であった。Ｔｃr遺伝子のＰＣＲ産物は約１４００ｂｐであった。Ｔｃr遺伝子のＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９−ＬＤＨは、ＮｃｏＩで消化することにより線状化され、ともにクレノウ断片で処理されライゲーションされた。ライゲーション混合液は大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性形質転換体から得たプラスミドＤＮＡの制限分析により、予想されるプラスミドの存在を確認し、ｐＵＣ１０−ＫＤＨ−Ｔｃrと命名した。
【００２６】
Ａ．複製（シャトル）ベクターを用いるｌｄｈ不活性化
ついでｌｄｈ配列に囲まれたＴｃr遺伝子を、複製ベクターｐＺＢ１８６１（Ｃｍr、ｐＺＢ１８６誘導体）にクローン化した。ｐＺＢ１８６１は、Ｔｃr遺伝子を除去するためにＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩを用いてｐＺＢ１８６（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）を消化することによって構築され、ＢａｍＨＩ部位を含有するアダプターにライゲーションされた。アダプターの配列は、
５'−CGATGATATCGGATCCG−３'
３'−TACTATAGCCTAGGCGCGC−５'
である。
【００２７】
ライゲーション混合液は大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＣｍrＴｃs形質転換体を選択した。形質転換体から得たＤＮＡを分析し、ｐＺＢ１８６１と命名され、Ｔｃｒ遺伝子を欠き、かつ新規ＢａｍＨＩ部位を有するプラスミドを得た。ｌｄｈ−Ｔｃ断片は、ｐＵＣ１９−ｌｄｈ−Ｔｃr由来のＢａｍＨＩ断片として切り出され、ＢａｍＨＩで消化することにより線状化されウシ腸由来ホスファターゼで処理することにより脱リン酸化されたｐＺＢ１８６１にライゲーションされた。ライゲーションしたＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αを形質転換するために用い、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン耐性形質転換体から得たプラスミドＤＮＡの制限分析により、プラスミドの存在を確認し、ｐＺＢ１０１（またはｐＺＢ１８６１−ｌｄｈ−Ｔｃ）と命名した。得られたプラスミドｐＺＢ１０１（ＣｍrＴｃr）（図１）でＺ．モビリス３９６７６を形質転換した。プラスミドキュアリングのために、Ｔｃｒ形質転換体をＲＭＧ−Ｔｃチューブ（３０℃）に播種し、ついでＲＭＧチューブ（３７℃）に移して、プラスミドの脱落を促進する高温で組込み体（integrants）を選択した。約１０回移したのち（９０〜１００世代）、培養物をＲＭＧ−Ｔｃ１０（３０℃）に移し、潜在的なＴｃr組込み体の増殖を高めた。細胞を希釈し、ＲＭＧ−Ｔｃ２０プレートに塗布した。Ｔｃrコロニーは、ＲＭＧ−Ｔｃ２０およびＲＭＧ−Ｃｍ１００プレートの双方で選択された。数個のＴｃrＣｍrは、全およびプラスミドＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションにより、Ｔｃrマーカーの組込みについて分析した。ＤＩＧ−ＴｃrおよびＤＩＧ−ｌｄｈを含むプローブを用いた（プローブは下記実施例２に示す）。その結果により、ＴｃrＣｍｓコロニーすべてが、染色体におけるｌｄｈ遺伝子に組み込まれたＴｃrマーカーを含有することが示された。図２を参照のこと。
【００２８】
Ｂ．非複製（自殺）ベクターを用いるｌｄｈ不活性化
ｐＺＢ１０１は、Ｚ．モビリスの複製起点をプラスミドから除去するためにＡｖａＩおよびＢｓｓＨＩＩを用いて消化され、ついで大腸菌複製起点を含有するバックボーンにおける分子内部ライゲーション（intra-molecular ligation）を行なった。その過程で、大腸菌複製起点を含有するｐＺＢ１０１のＡｖａＩおよびＢｓｓＨＩＩ断片はゲル精製され、ついで、クレノウ断片を用いる処理により埋められた。ついで、分子内ライゲーションは自殺プラスミドを生じ、ｐＺＢ１２１と命名した。図３を参照のこと。Ｚ．モビリス３９６７６は、ＮｃｏＩを用いる消化により線状化した、スーパーコイル状ｐＺＢ１２１またはｐＺＢ１２１のいずれかを用いるエレクトロポレーションにより、形質転換された。組換え細胞は、２０μｇ／ｍｌのＴｃを含有する交配プレートから選択された。得られたコロニーは、ＲＭＧ−ＴｃプレートおよびＲＭＧ−Ｃｍプレートにレプリカをとられた。分析された２５０個のうちただ１つのコロニーが、ＴｃrＣｍsであった。サザンハイブリダイゼーションにより、単離体（isorate）＃３０に二重交差（double-crossover event）が確認された。
【００２９】
前記シャトルおよび自殺ベクター組込み体を用い、Ｄ−またはＬ−乳酸生産をエタノール醗酵において測定した。それらの試験は、Ｚ．モビリス野生株３９６７６および４つの組込み体（（２−１、２−２（シャトルベクター組込みより）および＃３０（自殺ベクター組込みより）を含む））に対して、１０％グルコースを含有するＲＭで、３０℃、ｐＨ６．０、５００ｍｌケモスタットにおいて実施した。ＨＰＬＣ分析およびベーリンガー  マンハイム  キット分析のために（下記実施例２において、より完全に説明する）、試料を定期的に採取した。その結果、３９６７６はＤ−乳酸を産生し、副産物の産生は組込み体のｌｄｈ遺伝子におけるＴｃrマーカーの組込みを介して排除されたことが示された（図４）。
【００３０】
前記実施例において、都合のよいＮｃｏＩ部位へのＴｃ耐性遺伝子挿入によるｌｄｈ組込みカセット（ldh integrative cassette）の構築が示された。しかしながら、制限部位のないｌｄｈ組込みカセットを構築することは、本発明の範囲内のものである。このように、ｌｄｈ遺伝子に所望の遺伝子を挿入するために、あるいはＰＣＲによって欠失／不活性化遺伝子をつくりだすために、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のＰＣＲ介在オーバーラップ伸長技術などのＰＣＲ融合方法（PCR fusing methodology）により、カセットは製造し得る。したがって、その産物は、不活性化したｌｄｈを有し乳酸を形成しないＺ．モビリス株を得るために使用し得る。
【００３１】
実施例２
以下の実施例は、ｌｄｈを介する相同組換えによりＣ２５ゲノムへのアラビノース同化酵素を導入し、その結果、乳酸副産物エネルギー代謝経路の乳酸脱水素酵素遺伝子の不活性化を生じることを実証する。
【００３２】
プラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーション（Zhang et al., 1995）により、Ｚ．モビリスまたは大腸菌細胞に形質転換した。下記プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、エレクトロポレーションによってＺ．モビリスまたは大腸菌を形質転換するために使用された。形質転換体は、グルコースおよびテトラサイクリンで補完した交配プレートで選択された。Ｔｃrコロニーは、キシロースまたはアラビノースで補完したＲＭ（ＲＭＳおよびＲＭＡ）における増殖によって、Ａｒａ+Ｘｙｌ+であることをさらに確認された。
【００３３】
相同領域として前記１ｋｂのｌｄｈ断片を用いることによってチモモナスゲノムにａｒａＢＡＤを組み込むという以前の試みは、成功しなかった。組換え頻度を上げるために、より広い相同領域が用いられた。ｌｄｈおよびフランキング領域を含む２．５ｋｂのＤＮＡ断片は、ＰｆｕＰＣＲを用いて増幅された。プライマーは、Yamano et seq.に公表された、Ｚ．モビリスＣＰ４のＤＮＡ配列に基づき設計された。公表された配列により、ＰＣＲから２．５ｋｂの断片が予想されたが、そうではなく３．４ｋｂの断片が得られた。３．４ｋｂの断片をＢａｍＨＩで消化したのち、２つの断片（２．５および０．９ｋｂ）が得られた。双方の断片は、ｌｄｈのみにアニーリングするように設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより試験された。２．５ｋｂの断片は正しいサイズのＰＣＲ産物を産出したのに対して、０．９ｋｂの断片は産出せず、前者がｌｄｈ配列を含有することを示した。したがって、２．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片（ｌｄｈＬと命名）はクローン化され、そしてＣ２５への遺伝子組込みのための相同領域として使用された。
【００３４】
ｌｄｈＬ断片ならびにジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したｌｄｈおよびａｒａプローブを、Ｐｆｕ（ストラタジーン社（Stratagene）製、ラ  ジョラ（La Jolla）、カリフォルニア州）またはＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（キアゲン社（Qiagen）製、バレンシア、カリフォルニア州）のいずれかを用いるＰＣＲにより増幅した。ＤＩＧ−ＵＴＰは、ベーリンガー  マンハイム、インディアナポリス、インディアナ州より購入した。ｌｄｈＬ、ｌｄｈおよびａｒａに対するＰＣＲ産物はそれぞれ、２．５、１および１．４である。以下のプライマー配列が用いられた。
ｌｄｈＬ：      ５'−TCGCGGATCCTCTATCCCTTTATTTTTCTATCCCCATCACCTCGG−３'
５'−TCGCGGATCCGCGGCTGACATACATCTTGCGAATATAGGG−３'
ＤＩＧ−ｌｄｈ：５'−TCGCGGATCCGTCTATGCGCGTCGCAATATTCAGTTCC−３'
５'−TCGCGGATCCGTCGCTTGTCTATTAAACAAGCGCATCCGGC−３'
ＤＩＧ−ａｒａ：５'−CTAACATGTTGACTCCTTCTCTAGACTTAGCG−３'
５'−GTTGAAACCGCTGGGCACCACGC−３'
クローニングの目的で、ｌｄｈ遺伝子の中央に位置するＮｃｏＩ部位にオリゴヌクレオチド５'−CATGCGCGGCCGCC−３'を挿入することにより、ＮｏｔＩ部位をｌｄｈＬに導入した。その新たなＮｏｔＩ部位は、ｌｄｈＬの各末端から約１．４および１．１ｋｂであった。ＮｏｔＩ部位を含有するｌｄｈＬのＢａｍＨＩ断片（２．５ｋｂ）を、ＢｃｌＩ部位でｐＺＢ１８６２にライゲーションした。最終的に、４．４ｋｂのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤは、ｐＺＢ２０６（米国特許第５，７１２，１３３号明細書および同第５，７２６，０５３号明細書）から単離され、組込みプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａを形成するために、ｌｄｈＬのＮｏｔＩ部位にクローン化された。図５を参照のこと。
【００３５】
３つのアラビノース同化遺伝子を含有するＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンは、相同組換えにより、Ｃ２５ゲノムのｌｄｈ部位に組み込まれた。Ｃ２５のゲノムにａｒａＢＡＤ遺伝子を組み込むために、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは大腸菌ＤＨ５αにおいて構築された。プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａはエレクトロポレーションによりＣ２５に転移された。Ｔｃ耐性形質転換体は、アラビノースにおける増殖に関して選択および試験された。形質転換体の増殖のあいだ、Ｐｇａｐ−ａｒａ−ＢＡＤは、相同組換えによるｌｄｈＬのｌｄｈＬ'−ａｒａＢＡＤ−ｌｄｈＬ′カセット（プラスミド由来）との置換によって、Ｃ２５の染色体に組み込まれることができた。
【００３６】
組換え体を質的に高めて単離するために、形質転換体にプラスミドキュアリングを実施した。プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、Ｚ．モビリスにおいて複製するであろう。しかしながら、Ｚ．モビリスは、最適以下の増殖条件（たとえば３７℃）で外来プラスミドを失う傾向がある。その特性を用いて、いくつかの転移体（transfers）に関し、Ｔｃ非存在下で３７℃でＣ２５形質転換体をサブカルチャーすることによって、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａのキュアリングを成し遂げた。各転移体由来の培養物は、プラスミドの脱落について定期的に監視された。第３の転移体までに１００％の細胞がＴｃsになり、プラスミドの脱落が示された。潜在的なＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込み体の増殖を質的に高めるために、第３、第４、第５および第６の転移体由来の培養物を３０℃でアラビノース含有ＲＭ（ＲＭＡ）に播種した。質的に高められた細胞は、ＲＭＧプレートに移されて、ＲＭＡ、ＲＭＸおよびＲＭＧＴｃプレート上にレプリカをとられた。以下に記載するように、Ｘｙｌ+Ａｒａ+Ｔｃsの表現型を有するいくつかの組込み体（ＡＸ）をさらに分析した。それらの組込み体は、唯一の炭素源として、キシロースまたはアラビノースのいずれかを使用することができた。
【００３７】
Ｃ２５のｌｄｈへのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みは、組込み体ＤＮＡに関して、ＤＩＧ標識化ａｒａおよびｌｄｈプローブを用いることにより、サザンハイブリダイゼーションによって確認された。図６（ａ）および（ｂ）を参照のこと。ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａ上にはただ１つのＰｓｔＩ部位が存在し、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤに位置する。したがって、ａｒａプローブを用いることにより、ＰｓｔＩ消化したプラスミド由来の１つのハイブリダイゼーションバンド（１２．９ｋｂ）が予想された。ゲノムに組み込まれたＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤに関しては、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤにおけるＰｓｔＩ部位およびＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの外側に位置する染色体上の付属のＰｓｔＩ部位により生じる２つのバンドが予想された。図７（ａ）から、結果は明らかに、全ＤＮＡ標本由来の２つのバンドがａｒａプローブにハイブリダイズすることを示し、そしてＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みを証明した。組込み体のプラスミドＤＮＡ由来のハイブリダイゼーションバンドの欠如は、組込みが、本来備わっているプラスミド上ではなく染色体上で生じたことを意味した。ｌｄｈがＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込みによって破壊されたことを示すために、同じＤＮＡを転移させ、ｌｄｈプローブにハイブリダイズした。予想したとおり、図７（ｂ）に示すように、組込み体に関するハイブリダイゼーションのパターンは、Ｃ２５を除いて、両ブロットにおいて正確に同一であった。完全なｌｄｈを有し、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込みのために使用された宿主株Ｃ２５由来の全ＤＮＡは、ただ１つのバンドを示した。その結果により、ａｒａＢＡＤがＣ２５のｌｄｈに組み込まれたことが確認された。
【００３８】
重要でない改変をしたZhang, et al., 1995およびDeanda et al., 1996にしたがい、Ｚ．モビリス組換え体およびコントロール株の無細胞抽出液を用いることにより、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシルロキナーゼ（ＸＫ）、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ＡＩ）、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ＲＫ）、Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（Ｌ−Ｒｅｐｉ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）およびトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）を分析した。無細胞抽出液は、後期対数期（３０℃、ＯＤ600約１．２）に培養物を回収し、音波処理緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で１回洗い、ついで音波処理することによって調製した。細胞屑を遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４５分間、４℃）により除去した。Ｌ−ＡＩ分析において、定期試料の容量は、半分（５０μｌ）、７０％Ｈ2ＳＯ4（１．５ｍｌ）および０．１２％カルバゾール（５０μｌ）に減少した。すべてのチューブは、７０％Ｈ2ＳＯ4の添加前後、吸光度を読むまで、２５℃の水槽で維持した。試料は、反応のあいだ、０、５、１０および２０分時に調べられた。
【００３９】
相同組換えで得られた組換え体は、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース上で増殖することができたが、組込まれた遺伝子の発現レベルは、酵素活性を測定することによって決定した。単離体Ｃ２５／ＡＸ１、Ｃ２５／ＡＸ１０１およびＣ２５／Ｇ８は、下記の安定性研究で決定されるように最も安定な組込み体であったので、酵素分析のために選択された。Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼに関する酵素分析の結果を図８に要約する。すべての分析に関し（キシルロキナーゼとともに、およびキシルロキナーゼを除いて）、コントロール（Ｃ２５および／または２０６Ｃ）と比較して、組込み体は顕著な活性を示した。現時点では、組込み体に関するＸＫの低い活性は、実験上の過失、分析の性質または双方が原因であると思われる。たいていの分析において（Ｌ−リブロキナーゼおよびキシロースイソメラーゼを除く）、組込み体は、プラスミド運搬株（２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１）よりも低い活性を示した。これは、遺伝子のコピー数に関連すると思われる。
【００４０】
安定性研究のために、培養物は、ＲＭＧを含有する試験管に播種され、３０℃で一晩インキュベーションされ、そして毎日、ＲＭＧ管に移された。播種材料は、１０世代毎に移されるよう管理された。ｐＨ調整せずに３０℃で糖に対する醗酵能を試験するために、細胞は、４０世代毎に、糖の混合液を含有するフラスコに播種するために使用された。バッチ醗酵研究は、操作容量として５００ｍｌを用い、Ｂｉｏ−ＳｔａｔＱケモスタット（Ｂ，ブラウン社（B, Braun）、アレンタウン、ペンシルベニア州の登録商標）において３０℃でｐＨ調整して実施した。ｐＨは、２Ｎ  ＫＯＨにより自動的に調整された。開始の糖濃度およびｐＨは、培養条件により、各バッチで様々であった。使用された糖すべてが試薬級であった。醗酵の間中、試料は定期的に採取され、糖、エタノールおよび副産物に関して、以前に記載されたように（Zhang 1995）ＨＰＬＣで分析された。細胞増殖を監視するために、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度が測定された。エタノール収率は、利用可能な全糖の量に基づいた。
【００４１】
相同組換えおよび転位の双方により開発された、染色体組み込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵Ｚ．モビリス株のいくつかは、非選択培地（ＲＭＧ）における安定性に関して検討された。それらの株をＲＭＧ培地で培養し、そして毎日、約１０世代ののち、順次移した。キシロースおよびアラビノースを醗酵してエタノールにする能力を試験するため、細胞は、４０世代毎に、１％グルコースおよび２％キシロースおよび２％アラビノースを含有するフラスコに播種するために使用された。エタノール生産率、ならびにキシロースおよびアラビノース利用率は、安定特性として使用した。２つの単離体は１６０世代のあいだ安定であった。３つの組込み株および１つのプラスミド運搬株は、ｐＨ５．５および３０℃で、４％グルコース、４％キシロースおよび２％アラビノースの混合物を含有する培地において、醗酵能に関してさらに試験された。図１０に示すように、３つの株すべては、グルコース、キシロースおよびアラビノースを７２時間で利用したが、プラスミド運搬株では６ｇ／Ｌのアラビノースが残留した。しかしながら、組込み株はキシリトールをプラスミド運搬株（１ｇ／Ｌ）よりも多く（４ｇ／Ｌ）産生した。２つの相同組換え体ＡＸ１株およびＡＸ１０１株は、乳酸脱水素酵素遺伝子が遺伝子組込みにより不活性化されたので、乳酸を産生しなかった。組込み株の生産率（理論上約８３％）は、プラスミド運搬株と極めて類似した。さらには、組込み株は、より高い細胞密度まで増殖した。おそらく原因は、７つの遺伝子を単コピーのみ有することと関連する、より少ない代謝負担である。
【００４２】
例示の実施態様に関して本発明を説明したが、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく改変がなされ得ることが、認識および理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
本明細書に組み込まれ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の少なくとも１つの実施の態様を示しており、詳細な説明とともに本発明の原則を説明する。
【図１】  図１は、シャトルベクターｐＺＢ１０１のマップ、および本発明のベクターｐＺＢ１０１の使用方法を示す図である。
【図２】  図２は、Ｔｃプローブを用いるプラスミドｐＺＢ１０２およびｐＺＢ１２１のサザン分析を示す。
【図３】  図３は、本発明のベクターの使用方法を示す図とともに自殺ベクターｐＺＢ１２１のマップである。
【図４】  図４は、野生型３９６７６株と比較した、本発明の方法により製造された２−１株、２−２株および＃３０株を用いる醗酵における乳酸の産生を示す。
【図５】  図５は、組込みプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａのマップである。ａｒａＢＡＤは、ｌｄｈＬのＮｏｔＩ部位に挿入され、ｌｄｈを分断する。構築は、Ｚ．モビリスの複製プラスミドｐＺＢ１８６２に基づく。プラスミドｐＺＢ１８６２は、参考文献として本明細書に組み込まれる米国特許第５，５１４，５８３号明細書および同第５，７１２，１３３号明細書に開示されるプラスミド、ｐＺＢ１８６の誘導体である。
【図６】  図６は、相同組換えから得られた染色体に組み込まれたキシロース／アラビノース醗酵Ｚ．モビリス株の、ＤＩＧ−ａｒａおよびＤＩＧ−ｌｄｈプローブを用いるサザン分析を示す。ＡＸ１、１３、２３、１０１、１０４および１０７は、ａｒａＢＡＤ組込み体である。Ｃ２５は宿主コントロールであり、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、ＤＨ５αから単離されたプラスミドコントロールである。λ／Ｈは、２３、９．４、６．６、４．３、２．３および２．０ｋｂの分子量マーカーである。
【図７】  図７は、染色体に組み込まれた株のＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼの酵素活性の棒グラフ結果を示す。２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１はプラスミドコントロールである。２０６Ｃは宿主コントロールである。Ｃ２５は、キシロース醗酵組込み体である。ＡＸ１およびＡＸ１０１は、相同組換えで得られた、乳酸脱水素酵素不活性化キシロース／アラビノース醗酵組込み体である。
【図８】  図８は、Ｔ＝３０℃でｐＨ調整なしのＲＭＧＸＡ（１：２：２％）における、染色体組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株のエタノール生産率の棒グラフ結果を示す。それらの株は、非選択培地において、様々な世代の培養物から播種された。
【図９】  図９は、３０℃でｐＨ調整した、１％グルコース、２％キシロースおよび２％アラビノースを含有するＲＭにおける、染色体組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株のキシロースおよびアラビノース利用率の棒グラフ結果を示す。それらの株は、非選択培地において、様々な世代の培養物から播種された。
【図１０】  図１０は、ｐＨ５．５および３０℃で、４％グルコース、４％キシロースおよび２％アラビノースを含有するＲＭにおける、染色体組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株の醗酵能の折れ線グラフ表示である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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