(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つサイトカイニン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、植物又は植物細胞に導入し、当該遺伝子を発現せしめることにより、植物又は植物細胞の成長を調節する方法。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つサイトカイニン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、植物又は植物細胞に導入し、当該遺伝子を発現せしめることにより、植物又は植物細胞の成長を調節する方法。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列に対して90％以上の相同を有し、且つサイトカイニン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、植物又は植物細胞に導入し、当該遺伝子を発現せしめることにより、植物又は植物細胞の成長を調節する方法。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つサイトカイニン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、植物又は植物細胞に導入し、当該遺伝子を発現せしめることにより、植物の不定芽形成を誘導する方法。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つサイトカイニン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、植物又は植物細胞に導入し、当該遺伝子を発現せしめることにより、植物の不定芽形成を誘導する方法。
【請求項６】
配列番号１に記載の塩基配列に対して90％以上の相同を有し、且つサイトカイニン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、植物又は植物細胞に導入し、当該遺伝子を発現せしめることにより、植物の不定芽形成を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はサイトカイニン生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子ならびにその利用方法、及びその取得方法に関するものである。
背景技術
サイトカイニンは重要な植物ホルモンの一種であり、細胞分裂の誘導、新たな芽の形成、腋芽の休眠打破、老化防止、果実の肥大促進など様々な効果を持っている。サイトカイニンはアデニンやアデノシンの６位の窒素原子にジメチルアリル基（イソペンテニル基）が結合した構造や、さらにそのイソペンテニル基が水酸化された構造を基本骨格として持っている。植物病原性を持つバクテリアには、サイトカイニン合成酵素をもつものが知られており、そのうち、アグロバクテリウムのサイトカイニン合成酵素ＩＰＴとＴＺＳに関しては、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）のジメチルアリル基をアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の６位の窒素原子に転移する活性があることが知られており、この反応がサイトカイニン合成の最も重要なステップであると考えられている。しかし、植物のもつサイトカイニン合成酵素と、これをコードする遺伝子は同定されていなかった。
発明の開示
そこで本発明は、サイトカイニンの合成を触媒する酵素をコードする遺伝子及びそれによりコードされる蛋白質、並びにその用途を提供しようとするものである。また、本発明は、これら遺伝子を同定する方法も提供しようとするものである。
本発明者らは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）よりサイトカイニンの合成を触媒する酵素をコードする新たな遺伝子を得る方法を見出し、サイトカイニンの合成を触媒する酵素をコードする新たな遺伝子を得た。
従って本発明は、サイトカイニンの合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。具体的には、植物では未報告であった、サイトカイニンのアデニン骨格のＮ６位の側鎖を導入する反応を触媒する酵素である。
より具体的には、本発明は、配列番号２，４，６，８，１０，１２または１４に記載のアミノ酸配列を有し、サイトカイニンの合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明は、また、配列番号２，４，６，８，１０，１２または１４において１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つサイトカイニンの合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号１，３，５，７，９，１１または１３に記載する核酸、特にＤＮＡ又はその部分とストリンジェント条件下でハイブリダイズし、且つサイトカイニンの合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、上記遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。この宿主は植物細胞であっても、植物体であってもよい。
本発明はまた、上記宿主を培養、栽培することによる、サイトカイニン合成に関与する蛋白質の製造方法を提供することができる。
本発明はまた、上記遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞の成長を調節する方法を提供することができる。即ち、本遺伝子を発現させることにより、不定芽の形成を促進、側芽の休眠打破、花や葉の老化・果実の成熟防止、花の日持ち性向上や光合成機能の維持、果実の肥大促進・落下防止、花成の制御等のサイトカイニンが関与する様々の生理作用を調節することができる。
発明の実施の形態
発明者らは、サイトカイニンの合成には、アデニン骨格のＮ６位のイソペンテニル（ジメチルアリル）側鎖を導入する反応を触媒する反応が律速段階であると推定した。サイトカイニン合成に関わるイソペンテニル基転移酵素をコードする遺伝子としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡにコードされるｉｐｔ（ｇｅｎｅ４）遺伝子とＴｉ−プラスミドのｖｉｒ領域に存在するｔｚｓ遺伝子、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のいくつかの種に存在するｐｔｚ遺伝子、ロドコッカス・ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｉｅｎｓ）のｉｐｔ遺伝子、エルウイニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）のｅｔｚ遺伝子などが知られている。これらのうち、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のｔｚｓとｉｐｔ，シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のｐｔｚ，ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）のｉｐｔ遺伝子産物は試験管内でＤＭＡＰＰ：ＡＭＰジメチルアリルトランスフェラーゼ活性を持つことが示されている。これらの他、多くの生物はＤＭＡＰＰからｔＲＮＡへとイソペンテニル基を転移する酵素を持っている。植物のサイトカイニンも、アデニン骨格のイソペンテニル化によって合成されるとすると、それを触媒する酵素は上に述べたイソペンテニル基転移酵素と共通の配列をもつ可能性が考えられた。そこで、まず、これらの遺伝子産物のアミノ酸配列を比較して、保存されたアミノ酸残基を見い出した。その配列は、ＧｘＴｘｘＧＫ［ＳＴ］ｘｘｘｘｘ［ＶＬＩ］ｘｘｘｘｘｘｘ［ＶＬＩ］［ＶＬＩ］ｘｘＤｘｘＱｘ［５７，６０］［ＶＬＩ］［ＶＬＩ］ｘＧＧ［ＳＴ］であった。ここで、ｘは任意のアミノ酸残基を、［］でくくったアミノ酸残基はその中のアミノ酸残基のどれか一つを、［ａ，ｂ］はａ以上ｂ以下の数の任意の種類のアミノ酸残基を示す。
ＴＡＩＲ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍを用いてシロイヌナズナのゲノム配列を検索し、このアミノ酸配列パターンをもつと考えられる遺伝子、あるいは推定遺伝子領域を見出した。その遺伝子は、
ＡＴ４ｇ２４６５０（ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域の番号）、
Ｔ２００１０＿２１０（ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域の番号）、
Ｔ１６Ｇ１２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣＯ６８８０９）ゲノムクローンの２９３７５−３０３０１  ｂｐ、
ＭＤＢ１９．１２（ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域の番号）、
ＭＶＩ１１．６（ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域の番号）、
Ｔ２６Ｊ１４．３（ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域の番号）、
Ｆ２Ｊ７．１２（ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域の番号）、
ＡＦ１０９３７６、
の８個の遺伝子であった。
これら８個の遺伝子・推定遺伝子のうち、ＡＦ１０９３７６はｃＤＮＡがクローン化されており、ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼｍＲＮＡと注釈されている。残りの７個の遺伝子のうち、Ｔ２００１０＿２１０、ＭＤＢ１９．１２、ＡＴ４ｇ２４６５０、ＭＶＩ１１．６、Ｔ２６Ｊ１４．３、Ｆ２Ｊ７．１２は全長のｃＤＮＡとしては分離されておらず推定遺伝子で、ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼであるだろうと注釈されている。Ｔ１６Ｇ１２（ａｃｃｅｓｓｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣＯ６８８０９）ゲノムクローンの２９３７５−３０３０１  ｂｐに関しては注釈すらされていない。
ＡＴ４ｇ２４６５０、Ｔ２００１０＿２１０、Ｔ１６Ｇ１２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣＯ６８８０９）ゲノムクローンの２９３７５−３０３０１  ｂｐに対応するｃＤＮＡ、ＭＤＢ１９．１２、ＭＶＩ１１．６、Ｔ２６Ｊ１４．３、Ｆ２Ｊ７．１２の遺伝子・推定遺伝子を各々ＡｔＩＰＴ４、ＡｔＩＰＴ３、ＡｔＩＰＴ５、ＡｔＩＰＴ７、ＡｔＩＰＴ８、ＡｔＩＰＴ１、ＡｔＩＰＴ６と記す。また、各々の塩基配列を、配列番号１，３，５，７，９，１１および１３に示し、そしてそれに対応するアミノ酸配列を配列番号２，４，６，８，１０，１２および１４に示した。
通常、シロイヌナズナのカルスは、培地中にサイトカイニンが存在する場合には葉と芽（以下シュートと呼ぶ）を形成するが、サイトカイニンが存在しなければ、全くシュートが形成されないか、あるいは、されてもその頻度は非常に低い。そこで、カルスに遺伝子を導入して発現させた時に、そのカルスがサイトカイニン非存在下でもシュートを効率よく形成するならば、導入した遺伝子はサイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン応答に関わる蛋白質をコードしていると考えられる。
あるいはまた、得られた遺伝子を大腸菌や酵母などの遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られた遺伝子がサイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン応答に関わる蛋白質をコードすることを確認することができる。
以上のことから、本発明において、はじめて植物由来のサイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を単離・同定することができた。
また、本発明において、植物のサイトカイニン合成酵素はＤＭＡＰＰのＤＭＡ基をＡＴＰとＡＤＰに転移させることも見出した。
本発明の遺伝子としては、例えば、配列番号２，４，６，８，１０，１２または１４に記載のアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質ももとの蛋白質と同様の活性を維持することが知られている。従って本発明は、配列番号２，４，６，８，１０，１２または１４に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有し、且つサイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成活性に関わる蛋白質をコードする修飾された遺伝子も本発明に属する。
ここで、この修飾の程度は、本件出願の前に周知技術となっている手段、例えば部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等により可能な程度である。サイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる活性を維持しながら修飾の対象となるアミノ酸の数は、例えば１００個以下、例えば５０個以下、好ましくは２５個以下、例えば１０個以下である。
本発明はまた、配列番号１，３，５，７，９，１１または１３に記載の塩基配列を有する核酸、又はその部分と、ストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができ、且つサイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなる遺伝子を提供する。ここでストリンジエント条件とは、例えば５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする条件をいう。なお適切なハイブリダイゼーションの温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、適宜選択して実施することができる。
上記ハイブリダイゼーションの対象としての遺伝子源としては、サイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる活性を有する蛋白質を有する植物、微生物などから調製されるｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー等を使用することができ、例えば、植物としてシロイヌナズナ、トウモロコシ、ポプラ、ベチュニア、タバコ、イネ、トマト、ユーカリ等が挙げられる。
このようにして得られる、サイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１，３，５，７，９，１１または１３に示す塩基配列に対して、５０％以上、６０％以上、好ましくは７０％以上又は８０％以上、例えば９０％以上の相同性を有する。
配列番号２，４，６，８，１０，１２または１４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする本遺伝子は、実施例に具体的に示すように、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとして、シロイヌナズナから得ることができる。
また、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望の修飾を導入したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする蛋白質の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
あるいはまた、配列番号２，４，６，８，１０，１２または１４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体を用いても、サイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる活性を有する蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物のサイトカイニン合成酵素、またはサイトカイニン合成に関わる活性を有する蛋白質をクローン化することもできる。
従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス・スプシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主微生物を用いることができる。
真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物である酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ベニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系、具体的にはＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／０細胞等が使用される。植物細胞としては、タバコやシロイヌナズナの培養細胞、ポプルス属、ユーカリ属、アカシア属等の培養細胞が使用できる。
さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。また、例えばヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｒｄ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）を用いることもできる。
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス（バキュロウィルス（昆虫での発現）、ワクシニアウィルス（動物細胞での発現）等）が使用できる。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーター及びターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、ｌａｃプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ａｄｈＩプロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーター等が使用される。
また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター等、動物細胞用プロモーターとしてはＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０のｅａｒｌｙおよびｌａｔｅプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。植物用プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、誘導型プロモーターとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ系遺伝子のプロモーター、ｈｓｐ８０プロモーター、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
また、発現ベクターには、以上の他にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メトトレキセート耐性）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８耐性）等）を含有しているものを用いるのも好ましい一態様である。なお、エンハンサーを使用する場合、例えばＳＶ４０のエンハンサー等を遺伝子の上流または下流に挿入する。
発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業者においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、１９９５年、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。培養物からのサイトカイニンの合成に関与する蛋白質の精製は、蛋白質を単離・精製するための常法に従って、例えば、限外ろ過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
現在の技術水準をもってすれば、さらに、このｃＤＮＡあるいは遺伝子を構成的なあるいは誘導型のプロモーターの制御下に連結し、アグロバクテリウムを用いるシステムあるいはパーティクルガン、エレクトロポーレーション等を用いるシステムで、この遺伝子を植物に導入し発現させることで、培地に外添した植物ホルモンによる人為調節によっても個体再生が困難な植物、例えば、バラなどにおいても、不定芽形成を促進することが可能である。さらに、サイトカイニンの合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御することで、サイトカイニンが植物体において示す様々な生理作用、例えば、側芽の伸長や老化防止、花形成時期、果実の肥大促進、果実の落下防止などを調節することが可能である。
実施例
以下、実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法は特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）に依った。
実施例１．サイトカイニン合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子のサーチと単離
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｔｚｓ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＸＯ３９３３−１，ＰＲＯＴＥＩＮ＿ＩＤ  ＣＡＡ２７５７２．１）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｉｐｔ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＢＯ２５１０９−１，ＰＲＯＴＥＩＮ＃ＩＤ  ＢＡＡ７６３４４．１）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）のｐｔｚ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＸＯ３６７９−１，ＰＲＯＴＥＩＮ＿ＩＤ  ＣＡＡ２７３１５．１）、ロドコッカス・ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）のｉｐｔ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｚ２９６３５−４，ＰＲＯＴＥＩＮ＿ＩＤ  ＣＡＡ８２７４４．１）、エルウイニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）のジメチルアリルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｚ４６３７５−２，ＰＲＯＴＥＩＮ＿ＩＤ  ＣＡＡ８６５１０．１）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡのδ−２−イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）トランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ１４００３−８３，ＰＲＯＴＥＩＮ＿ＩＤ  ＡＡＡ９７０６７．１）の遺伝子産物のアミノ酸配列を、アミノ酸配列比較ソフトウエアーＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．５．３のＣｌｕｓｔａｌＶを用いて解析した結果、保存配列ＧｘＴｘｘＧＫ［ＳＴ］ｘｘｘｘｘ［ＶＬＩ］ｘｘｘｘｘｘｘ［ＶＬＩ］［ＶＬＩ］ｘｘＤｘｘＱｘ［５７，６０］［ＶＬＩ］［ＶＬＩ］ｘＧＧ［ＳＴ］を見出した。ここで、ｘは任意のアミノ酸残基を、［］でくくったアミノ酸残基はその中のアミノ酸残基のどれか一つを、［ａ，ｂ］はａ以上ｂ以下の数の任意の種類のアミノ酸残基を示す。
次に、この保存されたアミノ酸配列パターンを持つと考えられる遺伝子、あるいは推定遺伝子領域を単離するため、ＴＡＩＲ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍを用いてシロイヌナズナのゲノムデータベースを検索した。その結果、国際ゲノムプロジェクトによる推定遺伝子領域番号であるＡＴ４ｇ２４６５０、Ｔ２００１０＿２１０、ＭＤＢ１９．１２、ＭＶＩ１１．６、Ｔ２６Ｊ１４．３、Ｆ２Ｊ７．１２、ＡＦ１０９３７６とＴ１６Ｇ１２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣＯ６８８０９）ゲノムクローンの２９３７５−３０３０１  ｂｐの８個の遺伝子が上記保存アミノ酸配列パターンを持つ遺伝子であることがわかった。
これら８個の遺伝子のうち、ＡＦ１０９３７６だけは、既にｃＤＮＡがクローン化されており、ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼｍＲＮＡと注釈されている。しかし、ＡＴ４ｇ２４６５０、Ｔ２００１０＿２１０、ＭＤＢ１９．１２、ＭＶＩ１１．６、Ｔ２６Ｊ１４．３、Ｆ２Ｊ７．１２は全長ｃＤＮＡは分離されておらず、ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼであるだろうと注釈されている。Ｔ１６Ｇ１２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣＯ６８８０９）ゲノムクローンの２９３７５−３０３０１  ｂｐに関しては、推定機能すら注釈されていない。すなわち、これら８個の遺伝子については、コンピューター上で、機能が推測されているだけであり、実験による機能解析は一切行われておらず、機能が知られていなかった。また、酵素活性が測定されたこともなく、基質が何であるかも同定されていない。
ＡＴ４ｇ２４６５０（ＡｔＩＰＴ４）、Ｔ２００１０＿２１０（ＡｔＩＰＴ３）、Ｔ１６Ｇ１２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣＯ６８８０９）ゲノムクローンの２９３７５−３０３０１  ｂｐに対応するｃＤＮＡ（ＡｔＩＰＴ５）、ＭＤＢ１９．１２（ＡｔＩＰＴ７）、ＭＶＩ１１．６（ＡｔＩＰＴ８）、Ｔ２６Ｊ１４．３（ＡｔＩＰＴ１）、Ｆ２Ｊ７．１２（ＡｔＩＰＴ６）、の塩基配列は、配列番号１，３，５，７，９，１１及び１３に示す。
また、それぞれがコードするアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４）およびＤＮＡデータベース（たとえばＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ））検索の結果得られた相同性のあるアミノ酸配列を含めて、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｃｌｕｓｔａｌｗ−ｅ．ｈｔｍｌ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０．）で分子系統樹を作製した。その結果、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４で示した配列は、真核生物あるいは細菌のＤＭＡＰＰ：ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼ、あるいはアグロバクテリウムなどのゴールを形成する植物病原菌のサイトカイニン合成に関わるイソペンテニルトランスフェラーゼとファミリーを形成していることが示された。さらに、配列番号２、１０、１２、１４に示したアミノ酸配列は１つのサブグループを形成した。このサブグループと近縁の遺伝子として、ペチュニア由来のＡＡＬ８３８１９（ＤＤＢＪアクセッション番号）、イネ由来のＢＡＢ８６３６４（ＤＤＢＪアクセッション番号）があった。また、配列番号４、６、８に示したアミノ酸配列も１つのサブグループを形成し、このサブグループにはミヤコグサ由来のＡＷ７２０３６３（ＤＤＢＪのアクセッション番号）、が位置付けられた。
実施例２．サイトカイニン合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子の植物での過剰発現
ｉ）植物への遺伝子導入ベクターの作成
ｐＢＩ３５Ｔ（ＷＯ  ０１／１６３３２）をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、マルチクローニングサイト、３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネーターを含むＤＮＡ断片を得、これをｐＧＰＴＶ−ＫＡＮ（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｒ  ｅｔａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，１１９５−１１９７，１９９２）のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理して生成する２つの断片のうち、長いほうの断片とライゲーションすることにより、ｐＴＫＯ１５を得た（図１）。また、同様に、このカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、マルチクローニングサイト、３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネーターを含むＤＮＡ断片を、ｐＧＰＴＶ−Ｂａｒ（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，１１９５−１１９７，１９９２）のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理して生成する２つの断片のうち、長いほうの断片とライゲーションすることにより、ｐＴＫＯ１６を得た。
ＡＦ１０９３７６の予測オープンリーディングフレームは、シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ、プライマーとしてプライマー３９８（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＣＣＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号１５）とプライマー３９９（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣ）（配列番号１６）、ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、９４℃、２分の後、（９４℃、１５秒；５３℃、３０秒；６８℃、２分４０秒）ｘ４０サイクルの条件でインキュベートすることによりＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡを精製後、ＳｍａＩで処理し、再びＤＮＡを精製した。これをｐＴＫＯ１５のＳｍａＩサイトにクローン化し、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子プロモーター（３５Ｓプロモーター）の下流にセンス方向にクローン化されたものを選び、ｐＴＫＯ１５−ＡＦ１０９３７６とした。
ＡｔＩＰＴ４は、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型に、プライマー４２１（ＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＧＴＧ−３’）（配列番号１７）とプライマー４０７（５’−ＧＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣ−３’）（配列番号１８）をプライマーとしてｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、９４℃、２分の後、（９４℃、１５秒；５３℃、２０秒；６８℃、１分）ｘ４２サイクルの条件でインキュベートすることにより増幅し、精製後ｐＴＫＯ１５のＳｍａＩサイトにクローン化した。３５Ｓプロモーターの下流にセンス方向にクローン化されたものをｐＴＫＯ１５−ＡｔＩＰＴ４とした。
ＡｔＩＰＴ３は、鋳型としてシロイヌナズナのゲノムＤＮＡ、プライマーとしてプライマー７０３（５’−ＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴ−３’）（配列番号１９）とプライマー７０５（５’−ＧＴＴＧＴＡＡＣＣＡＣＧＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＧＧＧＴＧ−３’）（配列番号２０）、耐熱性ＤＮＡ合成酵素としてＨｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、９２℃、１分の後、（９２℃、３０秒；５５℃、３０秒；７０℃，２分３０秒）を３５回繰り返した。これを精製後、ｐＴＫＯ１６のＳｍａＩサイトに平滑末端でクローン化し、ＡｔＩＰＴ３が３５Ｓプロモーターの下流にセンス方向にクローン化されたものを選び、ｐＴＫＯ１６−ＡｔＩＰＴ３とした。
ｐＴＫＯ１５をＳｍａＩとＫｐｎＩで切断後、キアゲン社ＱＵＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製した。ここに、プライマー８５２（５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＧＴＡＣ−３’）（配列番号２７）とプライマー８５３（５’−ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＴＣＧＡＧ−３’）（配列番号２８）をクローン化することにより、ｐＴＫＯ１５のマルチクローニングサイトの配列を変更した。ここで、プライマー８５２とプライマー８５３は互いに相補的な配列を持つ合成ＤＮＡであるので、この操作はｐＴＫＯ１５をＳｍａＩとＫｐｎＩで切断した断片、プライマー８５２、プライマー８５３の三者を、リガーゼ存在下に一般的条件下でインキュベートすることによりおこなった。この様にして作成したプラスミドをｐＨＭ４と名付けた。ｐＨＭ４とｐＴＫＯ１５の違いはマルチクローニングサイトの配列だけである。ｐＴＫＯ１５のマルチクローニングサイトにある、ユニークサイトは、ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ，ＡｓｃＩ，ＳｍａＩ，ＰａｃＩ，ＳｐｅＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｌＩである。
４μｇのｐＨＭ４を、２０ｕｎｉｔのＢａｍＨＩで切断した。その半量を、２００μＭのｄｅｏｘｙＡＴＰ，ｄｅｏｘｙＴＴＰ，ｄｅｏｘｙＣＴＰ，ｄｅｏｘｙＧＴＰ，１ｕｎｉｔ  ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の存在下、７０℃３０分インキュベートすることにより、末端の平滑化をおこなった。これを、２０ｕｎｎｉｔ  Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラ社）で３７℃１時間処理後、ＱＵＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＤＮＡを精製した。ここに、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡより、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、プライマー９１８（５’−ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴ−３’）（配列番号２９）とプライマー８７９（５’−ＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＴ−３’）（配列番号３０）を用いて増幅（９４℃，２０秒；５５℃，３０秒；７２℃，１分のサイクルを３５サイクル）したＤＮＡ断片をクローン化したものをクローン化し、ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ１とした。
ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ１の作製と同様の方法で、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡよりプライマーとしてプライマー５３３（５’−ＡＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＡＣＡＴＴＣＧＴＣ−３’）（配列番号３１）とプライマー８８１（５’−ＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧ−３’）（配列番号３２）を用いて増幅したＤＮＡ断片をクローン化したものをクローン化し、ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ８とした。
配列番号５に記載の翻訳開始点ＡＴＧより上流６６ｂｐｓから配列番号６の全コード領域を含む配列をプライマー８５６（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣ−３’）（配列番号３３）とプライマー８５７（５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡ−３’）（配列番号３４）を用いてＣｏｌｕｍｂｉａ野生株（宝酒造（株））より抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーには制限酵素サイトが含まれており、ＰＣＲ後ＸｈｏＩとＳｐｅＩで処理した。このＤＮＡ断片を植物での過剰発現用ベクターである、ｐＨＭ４にクローン化した。これをｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ５と名付ける。
ｉｉ）植物への遺伝子導入
シロイヌナズナのカルスに、アグロバクテリウムを用いてｐＴＫＯ１５，ｐＴＫＯ１５−ＡＦ１０９３７６，ｐＴＫＯ１５−ＡｔＩＰＴ４とｐＴＫＯ１６−ＡｔＩＰＴ３を導入した。アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入の方法は、Ａｋａｍａらの方法に従った（Ａｋａｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２，７−１１．）。遺伝子導入したカルスを、無サイトカイニン培地［ＧＭ培地（Ａｋａｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２，７−１１．）に５０μｇ／ｍｌカナマイシンサルフェート，１００μｇ／ｍｌセフォタキシン，１００μｇ／ｍｌバンコマイシンおよび０．３μｇ／ｍｌインドール酢酸］と有サイトカイニン培地（無サイトカイニン培地に０．５μｇ／ｍｌトランス−ゼアチンを加えたもの）の２種類の培地上で培養した。２週間後に観察したところ、ｐＴＫＯ１５で形質転換したカルスとｐＴＫＯ１５−ＡＦ１０９３７６で形質転換したカルスはどちらも無サイトカイニン培地ではシュートを形成せず、有サイトカイニン培地上でのみシュートを形成していた。これに対して、ｐＴＫＯ１５−ＡｔＩＰＴ４で形質転換したカルスは、無サイトカイニン培地、有サイトカイニン培地のどちらの培地上でもシュートを形成した。また、ｐＴＫＯ１６−ＡｔＩＰＴ３で形質転換したカルスも同様に無サイトカイニン培地、有サイトカイニン培地のどちらの培地上でもシュートを形成した。
また、ｐＨＭ４，ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ１，ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ８，ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ５おのおのを導入したシロイヌナズナのカルスを、０．２μｇ／ｍｌのインドール酪酸、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのクラフォランを含むサイトカイニンを含まない培地上で培養した。手法は、カルスにＡｔＩＰＴ４を導入した実施例と同じである。ｐＨＭ４を導入したカルスはシュート組織を形成しなかったが、ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ１，ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ８とｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ５を導入したカルスはシュート組織を形成した。
これらのことから、ＡｔＩＰＴ４とＡｔＩＰＴ３には、シュート誘導能力があり、サイトカイニン合成能力があることが示唆された。
また、ＡｔＩＰＴ１，ＡｔＩＰＴ５，ＡｔＩＰＴ８の過剰発現によりサイトカイニン応答を引き起こすことができることが示された。
ｉｉｉ）ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ５の植物体での過剰発現
ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ５を減圧浸潤アグロバクテリア感染法（荒木崇、秀潤社、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４、モデル植物の実験プロトコール、１０９ページ−１１３ページ）を用いてシロイヌナズナに形質転換した。得られた種子を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＭＳ寒天培地上にて栽培し、形質転換体を選抜した。これらの形質転換体を１／２濃度ＭＳ培地を加えたバーミキュライト上で栽培したところ、複数の個体において極めて多くの側芽を形成した（ｂｕｓｈｙになった）（図２）。コントロールとして栽培したｐＨＭ４形質転換体では、このような表現型は見られなかった。このことよりＡｔＩＰＴ５を過剰発現すると、頂芽優性が欠如し、側芽の形成を促進することが分かった。
実施例３．サイトカイニン合成に関与する蛋白質の酵素活性測定
ｉ）酵素活性測定用プラスミドの作成
実施例２で作成したｐＴＫＯ１５−ＡｔＩＰＴ４をＰＣＲ反応の鋳型、プライマーとしてプライマー４８０（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＧ−３’）（配列番号２１）とプライマー４８１（５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣ−３’）（配列番号２２）を用い、ＬＡ  ｔａｑ（宝酒造）を用いてコード領域を増幅した。これを精製後、ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで処理し、再びＤＮＡを精製した。このＤＮＡ断片をｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトの間にクローン化し、ｐＥＴ１６ｂ−ＡｔＩＰＴ４を作成した。
また、ｐＴＫＯ１５−ＡＦ１０９３７６をＰＣＲ反応の鋳型、プライマーとしてプライマー５５０（５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＣＣＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号２３）とプライマー５５１（５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣ−３’）（配列番号２４）、耐熱性ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、コード領域を増幅した。これをＮｄｅＩで処理し、ｐＥＴ１６ｂのＮｄｅＩサイトにクローニングし、ｐＥＴ１６ｂ−ＡＦ１０９３７６を作成した。
さらに、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型、プライマーとしてプライマー７４１（５’−ＴＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＧ−３’）（配列番号２５）とプライマー７４２（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡ−３’）（配列番号２６）、耐熱性酵素としてＬＡ  ｔａｑ（宝酒造）を用いてコード領域を増幅した。これを精製後、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩの間にクローン化し、ｐＥＴ１５ｂ−ＡｔＩＰＴ５を作成した。
ｉｉ）大腸菌抽出液の酵素活性の測定
先に述べたように、ＡｔＩＰＴ１，ＡｔＩＰＴ４，ＡｔＩＰＴ８，ＡｔＩＰＴ６はひとつのサブグループを形成し、ＡｔＩＰＴ３，ＡｔＩＰＴ５，ＡｔＩＰＴ７は別のサブグループを形成する。それぞれから１つの遺伝子について大腸菌で活性を測定した。
ｐＥＴ１６ｂ−ＡｔＩＰＴ４，ｐＥＴ１６ｂ−ＡＦ１０９３７６，またはｐＥＴ１５ｂ−ＡｔＩＰＴ５を導入した大腸菌ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を２０℃、１ｍＭ  ＩＰＴＧ存在下で１２時間培養した後、遠心で集菌し、ＯＤ６００＝１００となるようにバッファーＡ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，２０μｇ／ｍｌロイペプチン）を加えた後、凍結融解によって大腸菌を破砕した。これを、３０００００ｇで、１０分間遠心し、上清を回収した。これらの上清１０μｌと、６０μＭ  ＤＭＡＰＰ、５μＭ［３Ｈ］ＡＭＰ（７２２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１０μｌのバッファーＡを混合し、２５℃で３０分インキュベートした。その後、この反応液にＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）を５０ｍＭ、ウシ腸アルカリホスファターゼを２ユニット／３０μｌとなるように加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより脱リン酸化反応をおこなった。反応液をＣ１８逆相薄層クロマトグラフィー（移動相は５０％メタノール）で展開し、オートラジオグラフィーによって反応産物を検出した結果、ｐＥＴ１６ｂ−ＡｔＩＰＴ４とｐＥＴ１５ｂ−ＡｔＩＰＴ５をもつ大腸菌の抽出液を加えた反応液ではイソペンテニルアデノシンの生成を確認した。しかし、ｐＥＴ１６ｂ−ＡＦ１０９３７６を導入した大腸菌の抽出液にはイソペンテニルアデノシンの生成活性はみられなかった。
ｉｉｉ）精製蛋白質の酵素活性の測定
実施例３−（ｉ）と同様に、ＡｔＩＰＴ４をｐＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングして、実施例３−（ｉｉ）と同様に大腸菌から抽出液を調製した。これをｓａｍｐｌｅＡと呼ぶ。ＳａｍｐｌｅＡ  ８００μｌに、４００μｌのＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ懸濁液（沈殿にして１１０μｌのＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ，３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８），１５ｍＭイミダゾール、０．９Ｍ  ＮａＣｌ，７．５ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，３０μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を加える。この懸濁液をＳａｍｐｌｅＢと呼ぶ。ＳａｍｐｌｅＢを遠心し、上清（ＳａｍｐｌｅＣ）と沈殿に分ける。沈殿に洗い液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８），１０ｍＭイミダゾール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を加え、遠心により沈殿を回収する操作でＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅを４回洗う。このＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅは５００μｌの洗い液に懸濁した。これをＳａｍｐｌｅＤと呼ぶ。ＳａｍｐｌｅＤ  ５０μｌと、３Ｈラベルした０．２５μＭの各種核酸ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ、アデノシン、アデニンの内の一つを含む５０μｌの２×反応液（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２５ｍＭ，ＫＣｌ  ７５ｍＭ，ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ，ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ  １０μｇ／ｍｌ，ＰＭＳＦ  １ｍＭ，ＤＭＡＰＰ６６μＭ）と混合を行い、２３℃で３０分反応を行なった。この反応液に、７００μｌの酢酸エチルを加え、撹拌、遠心後、５５０μｌの酢酸エチル層を回収し、これに５００μｌの蒸留水を加えた。撹拌、遠心分離後、３５０μｌの酢酸エチル層を回収し、これに５００μｌの蒸留水を加えた。再び撹拌、遠心分離後、酢酸エチル層のうち５０μｌの酢酸エチル層に０．５ｍｌのＡＣＳＩＩ（ファルマシア）を加えて液体シンチレーションカウンターで放射能量を測定した。その結果、ＤＭＡＰＰのジメチルアリル基がＡＴＰとＡＤＰに効率よく転移することを見出した。したがって、ＡｔＩＰＴ４産物はジメチルアリル基をＡＴＰとＡＤＰに転移する活性を有していることを示すことができた。
精製した組換えＡｔＩＰＴ４蛋白質（２ｎｇ／ｍｌ）を用いて、０．４ｍＭ  ＤＭＡＰＰ存在下でＡＴＰに対するＫｍを測定したところ１８μＭであった。この値はｔｚｓのＡＭＰに対するＫｍ  １１．１μＭ（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０，６２１−６３７，１９９３）と匹敵するものであった。また、２００μＭのＡＴＰ存在下でＤＭＡＰＰに対するＫｍを測定したところ、６．５μＭであった。
同様に、ＡｔＩＰＴ１もジメチルアリル基とＡＴＰとＡＤＰに転移する活性を有する蛋白質をコードしていた。
ｉｖ）反応産物の同定
上記のＳａｍｐｌｅＤと等量の２Ｘ反応液（１ｍＭ  ＡＴＰと１ｍＭ  ＤＭＡＰＰを含む）を混合し、２５度で１時間反応させた。遠心後、上清を２等分し、一方を上述のようにウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。それぞれを３倍の体積量のアセトンで希釈した後、−８０度で３０分保持した後、１７、０００ｘｇで３０分間遠心し、蛋白質を除去した。上清を減圧下で乾固した後、メタノールに溶解した。その一部をＣｈｅｍｏｃｏｂｏｎｄ  ＯＤＳ−Ｗカラム（Ｃｈｅｍｃｏ社）で分画した。溶出は２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  １５分の後、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４から４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含む８０％のアセトニトリル水溶液の３０分の直線濃度勾配で行った。ウシ腸アルカリホスファターゼ処理していないサンプルは、Ｃｈｅｍｏｃｏｂｏｎｄ  ＯＤＳ−Ｗカラムクロマトグラフィーでは主に２つのピークを示した。このうち早く溶出されるピークの保持時間はＡＴＰの保持時間と一致した。遅く溶出されるピーク（ピークＡ）の保持時間はＡＴＰ、アデノシン、イソペンテニルアデノシンのいずれの保持時間とも一致しなかった。ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したサンプルのＣｈｅｍｏｃｏｂｏｎｄ  ＯＤＳ−Ｗカラムクロマトグラフィーも主に２つのピークを示した。このうち早く溶出されるピークの保持時間はアデノシンの保持時間と、遅く溶出されるピーク（ピークＢ）の保持時間はイソペンテニルアデノシンと一致した。
ピークＡとＢの画分を乾燥後、エタノールに溶解し、ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＪＭＳ−ＳＸ１０２またはＪＥＯＬ  ＭＳｔａｉｏｎ，ＪＯＥＬ  ＤＡＴＵＭ  Ｌｔｄ）により解析した。その結果、ピークＡの化合物に由来するシグナルは、トリリン酸基がイオン化を阻害するために得ることはできなかった。ピークＢの化合物に由来するシグナルはｍ／ｚ値３３６と２０４に観察され、前者はイソペンテニルアデノシンに対応し、後者はイソペンテニルアデノシンの分解物に対応した。以上から、ピークＡはイソペンテニルアデノシンのリン酸化された化合物であるイソペンテニルＡＴＰ（別称ｉＰＴＰ）であることが示唆された。
産業上の利用可能性
配列番号２、６、で示した遺伝子を大腸菌で発現させたところ、いずれにもサイトカイニン合成活性があった。また、配列番号２、４、６、１０、１２で示される遺伝子の酵素を植物中で過剰発現した場合にサイトカイニン応答を引き起こせた。また、配列番号２、１０、１２及び１４又は配列番号４、６及び８は、それぞれ分子系統上、極めて近い関係にあることが明らかとなった。したがって、これらはいずれもサイトカイニン合成酵素であると考えられる。従って、本発明の遺伝子、及びその類似遺伝子の発現制御により、細胞分裂、分化、腋芽の成長、栄養分の分配調節、老化抑制、生殖成長、種子の成長などを調節することが可能となった。また、植物の遺伝子であるため、これら遺伝子を導入した植物において発現する蛋白質の毒性等が現れるとは考えにくい。
サイトカイニン合成の基質としてＡＴＰを効率よく利用できることから、ＡＭＰを基質とする細菌由来のサイトカイニン合成遺伝子よりも、植物体内では良好に機能することが期待される。
【配列表】
0004334228.tif 000002
0004334228.tif 000003
0004334228.tif 000004
0004334228.tif 000005
0004334228.tif 000006
0004334228.tif 000007
0004334228.tif 000008
0004334228.tif 000009
0004334228.tif 000010
0004334228.tif 000011
0004334228.tif 000012
0004334228.tif 000013
0004334228.tif 000014
0004334228.tif 000015
0004334228.tif 000016
0004334228.tif 000017
0004334228.tif 000018
0004334228.tif 000019
0004334228.tif 000020
0004334228.tif 000021
0004334228.tif 000022
0004334228.tif 000023
0004334228.tif 000024
0004334228.tif 000025
0004334228.tif 000026
0004334228.tif 000027
0004334228.tif 000028
0004334228.tif 000029
0004334228.tif 000030
0004334228.tif 000031
0004334228.tif 000032
0004334228.tif 000033
0004334228.tif 000034
0004334228.tif 000035
0004334228.tif 000036
0004334228.tif 000037
0004334228.tif 000038
0004334228.tif 000039
0004334228.tif 000040
0004334228.tif 000041
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＴＫＯ１５の構造を示す図である。
図２は、ｐＨＭ４−ＡｔＩＰＴ５により形質転換したシロイヌナズナの再生した植物体の写真である。
【図１】
0004334228.tif 000042
【図２】
0004334228.tif 000043
0004334228.tif 000044