(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚由来の角層試料から角質細胞の分散物を調製し、こうして調製された角質細胞の成熟度の評価方法であって、
（Ａ）該角質細胞におけるコーニファイドエンベロップを、該コーニファイドエンベロップの疎水性領域を選択的に染色できる色素で染色し、該コーニファイドエンベロップの染色性を評価の指標とすること、または
（Ｂ）該角質細胞におけるコーニファイドエンベロップを、該コーニファイドエンベロップの構成タンパク質の抗原性を検出し、検出された抗原性を評価の指標とすること、のいずれか一方または両方と、
（Ｃ）該角質細胞における核成分を、核を選択的に染色できる色素で染色し、該角質細胞中の有核細胞の出現頻度を評価し、その結果とを組み合わせること、を特徴とする該評価方法。
【請求項２】
該疎水性領域を選択的に染色できる色素がナイルレッドである請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
抗原性が抗ヒトインボルクリン抗体を使用して検出される請求項１記載の評価方法。
【請求項４】
皮膚由来の角層試料が非侵襲的な方法により皮膚から取得されたものである請求項１記載の評価方法。
【請求項５】
皮膚由来の角層試料が培養された表皮角化細胞に由来するものである請求項１記載の評価方法。
【請求項６】
該角質細胞の分散物として、可溶性成分を除去するように調製されたものを、該（Ａ）および／または（Ｂ）に従う評価に使用し、そして該角質細胞の分散物として、可溶性成分を除去するが、核成分は残存するように調製されたものを該（Ｂ）および／または（Ｃ）に従う評価に使用することを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項７】
皮膚由来の角層試料から調製された角質細胞分散物におけるコーニファイドエンベロップの疎水性領域を選択的に染色できる色素および該コーニファイドエンベロップの構成タンパク質に対する抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種の試薬ならびに角質細胞における核成分を選択的に染色できる色素を含んでなる、角質細胞の成熟度を評価するためのキット。
【請求項８】
該疎水性領域を選択的に染色できる色素がナイルレッドであり、該抗体がヒトインボルクリンに対する抗体であり、そして該核成分を選択的に染色できる色素がプロピジウム  アイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）である請求項７記載のキット。
【請求項９】
皮膚由来の角層試料から調製された角質細胞分散物におけるコーニファイドエンベロップの疎水性領域を選択的に染色できる色素および該コーニファイドエンベロップの構成タンパク質に対する抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種の試薬ならびに角質細胞における核成分を選択的に染色できる色素を含んでなる、角質細胞の成熟度を評価するためのキットであって、
（Ａ）該角質細胞におけるコーニファイドエンベロップを、該コーニファイドエンベロップの疎水性領域を選択的に染色できる前記色素で染色し、該コーニファイドエンベロップの染色性を評価の指標とすること、または
（Ｂ）該角質細胞におけるコーニファイドエンベロップを、該コーニファイドエンベロップの構成タンパク質の抗原性を前記抗体で検出し、検出された抗原性を評価の指標とすること、のいずれか一方または両方と、
（Ｃ）該角質細胞における核成分を、核を選択的に染色できる前記色素で染色し、該角質細胞中の有核細胞の出現頻度を評価し、その結果とを組み合わせること、を特徴とする該評価方法に使用するためのキット。
【請求項１０】
該疎水性領域を選択的に染色できる色素がナイルレッドであり、該抗体がヒトインボルクリンに対する抗体であり、そして該核成分を選択的に染色できる色素がプロピジウム  アイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）である請求項９記載のキット。
【請求項１１】
皮膚由来の角層試料が非侵襲的な方法により皮膚から取得されたものである請求項９記載のキット。
【請求項１２】
皮膚由来の角層試料が培養された表皮角化細胞に由来するものである請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、皮膚の角層を構成する角質細胞の成熟度の評価方法に関する。より具体的には、本発明は化粧法または皮膚科学分野において有用な、肌質の評価方法、ならびに該評価方法に用いるキットに関する。
背景技術
肌質（または皮膚の状態）を的確に把握することは、より健康な皮膚を維持するための的確なスキンケアをするうえで重要である。そのため、化粧品によるスキンケアを実施するに際し、例えば、美容技術者による問診などを通じて、化粧品の使用者の肌質が評価されてきた。また、肌質の客観的な評価を目的として、各種の計測機器を使用して、観察または測定されるパラメーターにより、皮膚の状態または機能を評価することも行われている。
このようなパラメーターの代表的なものとしては、皮膚表面のレプリカを拡大して皮溝や皮丘を観察する皮膚表面形態、角層の伝導度（コンダクタンス）測定による角層水分量、経表皮水分喪失量（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｗａｔｅｒ  ｌｏｓｓ；ＴＥＷＬ）の測定による角層バリアー機能などが挙げられる。
また、角層の保湿能の指標として天然保湿因子（ｎａｔｕｒａｌ  ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＭＦ、具体的には種々の遊離アミノ酸など）を定量したり、角層中のサイトカインの定量により肌質を評価する方法も応用されつつある。角層は、表皮角化細胞が終末分化して形成された角質細胞と、それをとりまく細胞間脂質から構成される。細胞間脂質は、セラミド、コレステロール、脂肪酸などを成分としてラメラ構造を形成し、角層バリアー機能において重要な役割を演じていることが明らかになってきている。これは、角層バリアー機能が低下する種々の皮膚疾患や、肌荒れなどの皮膚トラブルを伴う場合において、細胞間脂質が形態的にまた組成的にも乱れていることにより裏付けられている。
一方、角質細胞は、ケラチン線維を主成分とし、それを包むコーニファイドエンベロップ（以下、ＣＥと称する場合あり）から構成される。ＣＥは、表皮角化細胞が分化するにしたがって産生される複数のＣＥ前駆体タンパクが、酵素トランスグルタミナーゼにより架橋され不溶化して形成される。さらに、その一部には、セラミドなどが共有結合し、疎水的な構造をとることで、細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し角層バリアー機能の基礎を形成することが示唆されている。
ＣＥは、皮膚組織または培養皮膚細胞などを、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤およびメルカプトエタノールなどの還元剤を含む溶液中で煮沸し、遠心分離などの手段により可溶性成分を除去した不溶性画分を得ることにより調製できる。これを顕微鏡で形態観察することにより、その性状を評価することができる。Ｍｉｃｈｅｌらは、角層の最外層に比較して角層の深部においては、脆弱な構造のＣＥが多いことを報告している（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９１：１１−１５，１９８８）。また、乾癬や葉状魚鱗癬などでは最外層においても脆弱なＣＥが認められるとしている（Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２２：１５−２１，１９９０）。
さらにまた、角質細胞はその成熟過程において、上述のようにＣＥの形成・成熟を果たすが、それとともに、核が消失する。肌あれや乾癬に代表される炎症性皮膚疾患においては、核の消失がスムーズに進行せず、角質細胞が未成熟のまま最外層に至る場合には、これを不全角化あるいは錯角化（ｐａｒａｋｅｒａｔｏｓｉｓ）と称されてきた。こうして、有核の角質細胞を検出することにより、不全角化を評価する方法が広く一般的に行われてきた。かかる評価結果は、ひとつの有用な指標として、皮膚疾患の診断や、肌荒れの評価、医薬品などの治療効果や化粧料などの改善効果の指標として用いられてきた。しかし、核の残存の意味するところは必ずしも明確ではなく、特にバリアー機能との関連での科学的な説明はされていなかった。
発明の開示
本発明者らは、角層バリアー機能、殊に、体内からの水分の蒸散や外界からの異物の混入を防ぐ機能の主体をなすと考えられている脂質とＣＥとの関連性、あるいはＣＥの性状に注目して研究してきた。そして、適当に調製した角質細胞を評価することにより、ＣＥの疎水性の獲得、抗原性の消失などの変化がＣＥ成熟にしたがって生じることを確認した。また、従来から不全角化の指標として広く用いられてきた角層中の有核細胞の出現と、ＣＥ抗原性の変化を適当に調製した角質細胞を用いて同時に評価する方法を確立し、ＣＥ抗原性の評価が、有核細胞の出現の評価を加味することによって肌の状態をさらに細分類できることを確認した。本発明は、かような知見に基くものである。
したがって、本発明によれば、皮膚由来の角層試料から角質細胞の分散物を調製し、こうして調製された角質細胞の性状の評価方法が提供される。
このような評価方法は、（Ａ）該角質細胞におけるコーニファイドエンベロップを、その疎水性領域を選択的に染色できる色素で染色し、該コーニファイドエンベロップの染色性を評価の指標とすること、或いは
（Ｂ）該角質細胞におけるコーニファイドエンベロップを、該コーニファイドエンベロップの構成タンパク質の抗原性を検出し、検出された抗原性を評価の指標とすること、或いは
（Ｃ）該（Ａ）に従う指標または（Ｂ）に従う指標を組み合わせるか、またはこれらの指標のいずれか一方または両方と該角質細胞における核成分を選択的に染色できる色素で染色し、該角質細胞中の有核細胞の出現頻度を評価し、その結果とを組み合わせることを特徴とする。
また、本発明に従えば、上記評価方法に都合よく用いられるキットも提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明に従って、角質細胞またはＣＥの性状が評価される皮膚由来の角層試料は、身体のいずれの部分に由来する試料でもよく、また、かような試料（組織もしくは細胞）の培養物であってもよい。該試料の由来する身体の部位または領域の典型例としては、顔面の頬、額、手甲および体幹などを挙げることができる。
このような試料は、所謂、外科的手段等の侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、殊に肌質の評価を目的とする場合には、非侵襲的な方法により皮膚から取得されるものであることが好ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されているテープストリッピングや擦過法等を挙げることができる。
ＣＥの疎水性領域（特に、生物組織における）を選択的に染色できる色素としては、各種疎水性領域の染色に使用されている色素であって、本発明の目的に沿うものであれば、いずれも使用することができる。このような色素の具体的なものとしては、ナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）、スダンＩＩＩ（Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ）を挙げることができる。特にナイルレッドを好適に使用することができる。ナイルレッドは、その還元型であるナイルブルーとの混合物であってもよい。このような混合物には、ナイルブルーの水溶液中でナイルブルーの一部が自然に酸化されてナイルレッドに転化している状態のものも包含される。
他方、角質細胞における核成分を選択的に染色できる色素としては、本発明の目的に沿うものであれば、いずれも使用することができる。このような色素の具体的なものとしては、プロピジウム  アイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）、エチジウム  ブロミド（ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、アクリジン  オレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの蛍光色素、ヘマトキシリン、メチルグリーン、メチレンブルー−ローダミンＢ（３：１）混液などの色素を用いることができる。特に、感度よく有核細胞を検出する目的で、種々の蛍光色素を好適に使用することができる。
ＣＥの構成タンパク質の抗原性を検出するための対象となるタンパク質としては、インボルクリン、ロリクリン、フィラブリンなどのタンパク質やタンパク質間の架橋結合であるイソペプチド、シュウドイソペプチドを挙げることができる。これらの中でも、インボルクリン、ロリクリン、フィラブリンの抗原性の検出が好適である。これらの抗原性は、これらのタンパク質またはペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。検出方法は、上記タンパク質またはペプチドへの抗体の結合を検出できる方法であれば、いかなる方法であってもよいが、組織標本中の酵素、構造タンパク質などの抗原物質を標識または染色するのに使用されている蛍光抗体法、酵素抗体法が好適である。抗体の蛍光標識としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などを使用するのがよい。例えば、上記二種の蛍光標識は、蛍光波長が異なるので、二重染色により二種の抗原物質の抗原性を同じ試料中で同時に検出するのに使用することもできる。本発明に従う抗原性の検出には、かような二重染色による場合も包含される。
さらに、角層試料から調製された角質細胞分散物は、上記疎水性領域を選択的に染色できる色素による染色と、上記抗体の蛍光標識を用いる染色（蛍光抗体法ともいう）とを順次、行うか、或いは上記核成分を選択的に染色できる色素による染色と、上記抗体の蛍光標識を用いる染色とを順次、行うことができる。なお、色素による染色と上記抗体の蛍光標識を用いる染色は、抗体の蛍光標識を用いる処理を先行させるのが好ましい。
蛍光抗体法では、検出すべき抗原に対する抗体を直接蛍光標識したものを使用してもよいが、特に、抗原に対する抗体に対する抗体、すなわち第二抗体が蛍光標識された、所謂、間接法によるのが検出感度が高いとの観点から好ましい。
本発明に従う角質細胞またはＣＥの性状の評価方法によれば、例えば、抗原性の検出方法により角層試料におけるＣＥのインボルクリンが有意に検出できる場合は、有意量（または識別可能な程度）までには、脂質がインボルクリンに共有結合していないか、あるいは架橋反応が十分でなく抗原性を保持していることを意味し、角層試料におけるＣＥは未熟な状態にあると評価できる。逆に、例えば、インボルクリンが有意には検出できない場合には、脂質のインボルクリンへの共有結合がかなり生じているか、あるいは架橋反応が十分に進み抗原性が消失しており、ＣＥは成熟した状態にあると評価できる。また、例えば、ナイルレッドで強陽性に染色されるＣＥが角層試料中に検出（または観察）される場合には、ＣＥは強靭な状態であると評価できる。逆に、ナイルレッドによる染色性に多様性が認められる場合には、ＣＥ形成過程にばらつきがあると評価できる。以上の評価は培養した表皮角化細胞におけるＣＥ形成過程にも同様に適用できる。
他方、例えば、プロピジウム  アイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）で核成分が染色され、核が検出される場合には、角質細胞の成熟にともなう核の消失が十分には進行していないと評価できる。逆に、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで核が検出されない場合には、角質細胞の成熟にともなう核の消失が進行していると評価できる。
上記評価結果は、被検試料が由来する（すなわち、被験者の）皮膚の肌質とも相関性があることが認められた。例えば、抗原性を検出した結果、角層試料中にインボルクリン陽性ＣＥが検出できる場合には、被験者の検出対象部位の角層バリアー機能は低く、肌荒れが生じているものと評価できる。
さらに付言すれば、評価対象部位の角層試料から得られた角質細胞中に、上述の異常なＣＥを認めた場合や、角質細胞の成熟度が十分でない場合には、肌荒れなどの何等かの皮膚トラブルを有する可能性が高いものと評価できる。異常なＣＥや有核角質細胞の出現頻度は、一般に顕微鏡下でその数をカウントしたり、画像解析により数値化してもよい。このようにして評価した異常なＣＥや有核角質細胞の検出頻度または出現頻度を、健常な皮膚を有することが知られているヒトの対応するＣＥと比較する。
加えて、同一人において、一定のスキンケア手段が施される前後の皮膚に由来するＣＥにおける異常ＣＥの検出頻度または有核角質細胞の出現頻度との比較を行なうこともできる。この場合、例えば、スキンケア手段が施された後の異常ＣＥの検出頻度や有核角質細胞の出現頻度が、それ以前の対応する検出頻度や出現頻度よりも有意に小さいときは、当該スキンケア手段は肌質の改善に有効であるものと評価できる。したがって、本発明によれば、皮膚に対して施されたスキンケア手段の評価方法も包含される。かかるスキンケア手段としては、スキンケアクリーム、スキンケアローションなどの皮膚への施用を具体的なものとして挙げることができるが、それらに限定されない。
本発明に従う、肌質の評価方法のより具体的な態様を示せば、以下の工程を含んでなる。
（１）被験者の評価対象部位の皮膚由来の角層試料を用意する工程、
（２）用意した角層試料から角質細胞の分散物を調製する工程、
（３）角質細胞におけるコーニファイドエンベロップの性状を、その疎水性領域を染色できる色素により染色して、染色の程度を判定する工程、
（４）コーニファイドエンベロップにおける構成タンパク質の抗原性を、該タンパク質に対する抗体により免疫染色して染色の程度を判定する工程、
（５）前記（３）（４）で得られた判定結果を、被験者以外の対応する角層試料について工程（１）〜（４）と同様の工程を介して得られた判定結果と比較する工程。上記工程（３）と（４）は順序を逆に行うこともできる。
また、本発明によれば、別法として、上記（３）に代え、角質細胞における核成分を、核を染色できる色素により染色して、有核角質細胞の出現頻度を評価または決定する工程（３）′を実質することもできる。
上記の角質細胞の分散物を調製する工程（３）は、可溶性成分を除去、好ましくは徹底的に除去するように行う。この方法は、限定されるものでないが、適当な界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））と一般的に還元剤としても知られているジチオスレイトールとを含む緩衝溶液を用い、可溶性成分が除去されるまで加熱下にインキュベートすることにより実施できる。加熱は、１００℃までであることができる。
他方、工程（３）′を実施する場合には、角質細胞中の一定の可溶性成分は除去されるが、核成分は残存するような条件を選ぶのが好ましい。このような条件は、当該技術分野で既知であり、例えばＴａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，３８、３１−２８（Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９８７）を参照できる。簡潔に述べれば、上記のジチオスレイトールを用いることなく、必要があれば、ＳＤＳと異なる種類の界面活性剤とＳＤＳとの混合物を用いて、角層試料を処理することにより上記工程（３）′を実施することができる。
本発明によれば、肌質を評価するためのキットも提供される。
該キットには、皮膚由来の角層試料の角質細胞におけるコーニファイドエンベロップの疎水性領域を選択的に染色できる色素および該コーニファイドエンベロップの構成タンパク質に対する抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種の試薬が含まれ、場合によって角質細胞における核成分を選択的に染色できる色素が含まれていてもよい。
典型的には、上記色素としては、ナイルレッドが、そして上記抗体としてはインボルクリンおよびロリクリンに対する抗体の少なくとも一種および、これらの各抗体に対する蛍光標識（それぞれＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣによる）抗体の少なくとも一種が含められる。また、任意成分である核成分を染色するための色素としては、好ましくはプロピジウム  アイオダイドを含めることができる。これらの色素および各抗体は市販されているものをそのまま使用することができる。
場合により、本発明に従うキットには、角層試料を用意するための粘着性テープ、角層試料から角質細胞の分散物またはＣＥを調製するための試薬類（後述する実施例を参照のこと）および操作説明書等を含めることもできる。
こうして、本発明によれば、特に、非侵襲的な方法により採取できる角層試料を使用して、角質細胞またはＣＥの性状を評価し、延いては被験者の肌の状態（または質）を客観的かつ正確に評価できる。
以下、実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：皮膚から直接取得した角層試料の評価
（角層試料の用意およびＣＥの調製）
肌荒れなどの皮膚トラブルを有する被験者の顔面（頬）および上腕に、セロハンテープを貼付して直ちに剥離した。テープに付着した角層に、ジチオスレイトール、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むトリス塩酸緩衝液を加えて、１００℃にて１０分間加熱した。不溶物を、４０００ｇ１０分間の遠心により集めた。さらに溶出液添加と加熱を３回繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去した。こうして得られた不溶物をＣＥとした。
（ＣＥ染色例）
上述の方法で調製した被験者の上腕内側（無処置群）、ＳＤＳ惹起肌荒れ群およびテープストリッピング肌荒れ群由来の角層試料における各ＣＥをそれぞれスライドグラスに滴下し、風乾させた後、冷アセトン中で固定した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液にて水和させた後、マウス抗ヒトインボルクリン抗体（ＮＯＶＯＣＡＳＴＲＡ社）を１次抗体として反応させた。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を２次抗体として反応させた。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、ナイルレッド染色液を反応させ、封入し、蛍光顕微鏡にて観察した。観察画像をＣＣＤカメラを介してコンピュータに取り込み、印刷するとともに、画像解析ソフト（Ｍａｃ  Ｓｃｏｐｅ）を用いて、インボルクリン陽性ＣＥ、ナイルレッド陽性ＣＥなどを鑑別した。
肌荒れに悩む人の顔面由来のＣＥに上述の染色を施した結果を図１（図面代用写真）に、皮膚トラブルを有していない健常な上腕内側にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処置あるいはテープストリッピングにより実験的肌荒れを惹起した角層由来のＣＥに染色を施した結果を図２（図面代用写真）に示す。
また、上記実験的肌荒れのＳＤＳ処置群およびテープストリッピング群）を無処置群（それぞれ３ないし４検体）におけるインボルクリン陽性ＣＥの割合を対比して表１に示す。
0004366075.tif 000002
実施例２：培養角化細胞の評価
（ＣＥ形成促進効果）
ヒト表皮角化細胞を、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの方法（Ｃｅｌｌ：６：３３１−３３４，１９７５）にしたがって、培養した。増殖培地（１０％ウシ胎児血清、ヒドロコルチゾン０．５μｇ／ｍｌ、インスリン５μｇ／ｍｌ、コレラトキシン１０−１０Ｍ、上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、アデニン１．８ｘ１０−４Ｍを含むＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓＦ１２（３：１））にて培養しコンフルエントに達した後に、ケラチノサイトの分化を促しバリアー形成を促進することが知られているオレイン酸、あるいはリノール酸（Ｈａｎｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １００：７０５−７１２，１９９７、Ｋｏｍｕｖｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １１１：４２９−４３３、１９９８）を含む培養液（０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ）に置換して、さらに１週間培養を続けた。培養終了後に、ジチオスレイトール、ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液を加えて、１００℃にて１０分間加熱した。不溶物を、４０００ｇ１０分間の遠心により集めた。さらに溶出液添加と加熱を繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去した。こうして得られた不溶物をＣＥとした。得られたＣＥを、前述の例に記載した方法により、抗ヒトインボルクリン抗体処理およびナイルレッド染色を行った。その結果を表２に示す。
0004366075.tif 000003
実施例３：角質細胞における核成分の検出
（角層試料の用意および角質細胞の調製）
角層試料からの角質細胞の分散は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（上述）の方法にしたがって実施した。すなわち、被験部位の皮膚に、セロハンテープを貼付して直ちに剥離した。テープに付着した角層に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ドデシルジメチルアミンオキシド（Ｃ１２ＤＭＡＯ）混液を加えて、５０℃にて２４時間加熱した。分散した角質細胞を、４０００ｇ１０分間の遠心により集めた。さらにＳＤＳ−Ｃ１２ＤＭＡＯ混液による洗浄を３回繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去し、角質細胞を調製した。
（角質細胞におけるＣＥと核の染色）
上述の方法で調製した角質細胞を、スライドグラスに滴下し、風乾させた後、冷アセトン中で固定した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液にて水和させた後、マウス抗インボルクリン抗体（ＮＯＶＯＣＡＳＴＲＡ社）を１次抗体として反応させた。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を２次抗体として反応させた。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ溶液を反応させて核を染色し、封入し、蛍光顕微鏡にて観察した。観察画像をＣＣＤカメラを介してコンピュータに取り込み、印刷し、インボルクリン陽性角質細胞、核陽性角質細胞を同定してカウントした。
尋常性乾癬の皮疹部および無疹部より角層を採取して、上述の評価結果の画像を図３に示す。また、集計結果を表３に示す。
0004366075.tif 000004
尋常性乾癬では、皮疹が限局した部位に発症し、皮疹部ではバリアー機能が著しく低下し、無疹部ではほぼ健常であることが知られている。したがって、皮疹部において、ＣＥの未熟・成熟、核の有無のそれぞれ異なる角質細胞が存在したことは、ＣＥ成熟と核の消失がそれぞれ異なった制御を受けている可能性を示している。従来、有核細胞の検出をもって不全角化を評価していたが、本明細書記載の評価法により、不全角化をさらに細かく評価することが可能となった。
産業上の利用可能性
本発明に従えば、皮膚由来の角層試料から、それらに含まれる角質細胞の性状、延いては、該角質細胞の健全性等を、詳細に評価することができる。したがって、肌質それ自体ならびに美容技術（もしくは美容業）または皮膚科学分野における、皮膚に適用される手段の評価に都合よく使用できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、肌荒れに悩む人の顔面から調製した角質細胞におけるＣＥにインボルクリン免疫染色（ＦＩＴＣ標識）およびナイルレッド染色を施した組織細胞の状態を示す図面に代わる蛍光顕微鏡にて観察した写真（Ａ）および位相差観察像（Ｂ）である。白枠三角の指示する部位がインボルクリン陽性の未熟ＣＥを示し、白塗り三角の指示する部位がナイルレッド陽性の成熟ＣＥを示す。
図２は、健常人の上腕内側にＳＤＳ処置または繰り返しテープストリッピング置換により実験的肌荒れを惹起し、こうして調製したＣＥにインボルクリン免疫染色（ＦＩＴＣと標識）およびナイルレッド染色を施した組織細胞の状態を示す図面に代わる蛍光顕微鏡にて観察した写真である。（Ａ）は、対象部位で、（Ｂ）はＳＤＳによる肌荒れ部位で、そして（Ｃ）はテープストリッピングによる肌荒れ部位の観察結果である。白枠三角の指示する部位がインボルクリン陽性の未熟ＣＥを示す。健常部位においては認められなかった未熟ＣＥが肌荒れ部位では出現している。
図３は、実施例３による蛍光観察像の写真を上図に、そして位相差観察像の写真を下図に示す。写真中、（Ａ）は、インボルクリン（−）核（−）、（Ｂ）はインボルクリン（＋）核（−）、（Ｃ）はインボルクリン（＋）核（＋）、をそして（Ｄ）はインボルクリン（−）核（＋）の角質細胞を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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