(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０発現細胞を封入しているカプセルであって、該カプセル内へ通過するプロドラッグ分子を透過可能な多孔性の膜を具備し、該プロドラッグ分子が、前記細胞により発現されるシトクロムＰ４５０により活性な代謝物に変換されるカプセル。
【請求項２】
請求項１に記載のカプセルであって、カプセル素材が、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアンモニウムから形成される複合体を含むカプセル。
【請求項３】
請求項１または２に記載のカプセルであって、前記シトクロムＰ４５０発現細胞が、シトクロムＰ４５０を構成的に発現する安定な細胞株であるカプセル。
【請求項４】
癌疾患または他の関連の疾患もしくは障害を治療するために使用される、請求項１〜３の何れか１項に記載のカプセル。
【請求項５】
請求項４に記載のカプセルであって、治療的に効果的な量の該カプセルおよびシトクロムＰ４５０により活性化されるプロドラッグが、同時にまたは時間を隔てて、それを必要とする患者に投与されるカプセル。
【請求項６】
請求項５に記載のカプセルであって、該カプセルが、標的細胞内および/または標的細胞部位に注射および/または移植により投与され、前記プロドラッグが、全身および/または局所的に投与されるカプセル。
【請求項７】
請求項４〜６の何れか１項に記載のカプセルであって、標的細胞が乳房腫瘍および/または膵臓腫瘍の細胞であるカプセル。
【請求項８】
請求項５〜７の何れか１項に記載のカプセルであって、前記プロドラッグが、シクロホスファミドおよび/またはイフォスファミド(ifosfamide)であるカプセル。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルを含む薬学的組成物。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０により活性化されるプロドラッグを更に含む、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の薬学的組成物であって、前記カプセルおよび前記プロドラッグが異なる形態で製剤化される薬学的組成物。
【請求項１２】
標的器官および/または標的器官の隣への注射および/または移植に適した形態にあるカプセル、および全身および/または局所的投与に適した形態にあるプロドラッグを含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
乳癌組織または膵臓癌組織へのおよび/または乳癌組織または膵臓癌組織の隣への移植に適した形態にあるカプセルを含む、請求項１０〜１２の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
プロドラッグとしてシクロホスファミドおよび/またはイフォスファミド(ifosfamide)を含む、請求項１０〜１３の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
癌疾患または他の関連の疾患もしくは障害を治療するために使用される、請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルおよびシトクロムＰ４５０により活性化されるプロドラッグ。
【請求項１６】
腫瘍細胞を除去するのに有用な薬学的組成物を製造するための、請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルの使用。
【請求項１７】
薬学的組成物を製造するための、請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルおよびシトクロムＰ４５０により活性化されるプロドラッグの使用。
【請求項１８】
ヒトを除く被検体の癌疾患または他の関連の疾患もしくは障害を治療する方法であって、治療的に効果的な量の請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルおよびシトクロムＰ４５０により活性化されるプロドラッグを、同時にまたは時間を隔てて、それを必要とするヒトを除く被検体に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記カプセルが、標的細胞内および/または標的細胞部位に注射および/または移植により投与され、前記プロドラッグが、全身および/または局所的に投与される方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の方法であって、標的細胞が乳房腫瘍および/または膵臓腫瘍の細胞である方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の方法であって、前記プロドラッグが、シクロホスファミドおよび/またはイフォスファミド(ifosfamide)である方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、無害な癌のプロドラッグを細胞毒性代謝物に転換することができるシトクロムP450遺伝子をコードする複製欠損レトロウイルスベクターに関する。さらに本発明は、様々な癌を治療し、または腫瘍を除去するための医薬の調製のためのこのようなレトロウイルスベクターの使用に関する。
発明の背景
腫瘍を治療するために用いられる抗癌剤は、多くの場合全身投与され、患者の全身にわたって分布する。癌を治療するために必要とされるこのような薬物の大量の全身投与は、患者にとって好ましくない副作用を伴う。
この問題を回避するために、細胞毒性になる前に、体内で代謝または活性化されなければならない癌のプロドラッグが用いられてきた。残念なことに、高レベルの適切な活性化酵素を含有するヒトの腫瘍は稀である。プロドラッグを活性化する主要な部位は肝臓であり、離れた部位の腫瘍に十分な量の活性化された薬物を確実に与えるためには、肝臓で産生される活性化されたプロドラッグの量を極めて多量にしなければならず、結局患者に有害な副作用をもたらすことになる。
活性化された薬物の全身濃度が高いというこれらの問題を回避し得る戦略の一つは、腫瘍部位中またはその近傍で直接プロドラッグを活性化する手段を供することであろう。該戦略では、腫瘍細胞または腫瘍部位の細胞を遺伝的に形質転換して、癌のプロドラッグを代謝するために必要な大量の酵素を産生させる必要があると思われる。レトロウイルスは、DNAの形態のレトロウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、このため被感染細胞の全ての娘細胞は治療用遺伝子を担持するレトロウイルスベクターを保有するので、レトロウイルスベクターは遺伝子を安定に細胞に供給するのに最適である。さらなる利点は、ほとんどのレトロウイルスが分裂中の細胞だけに感染するということであり、それ故腫瘍細胞への理想的な遺伝子輸送担体である。
レトロウイルスベクターによって運ばれる様々な細胞毒性遺伝子が、これまでに試験されてきた。これらの遺伝子は、高用量レベルでも薬力学的且つ毒性学的に不活性であるが、インビボで高度に活性な代謝物に転換され得る物質を変化させる酵素をコードする(Connors.T.A.(1995),Gene Therapy 2:702-709)。
癌の化学療法において、適切にデザインされたプロドラッグが、高レベルの活性化酵素を有する動物の腫瘍を治療するのに有効であることが見出されている(Connors,T.およびWhisson,M.(1966),Nature 210:866 867、およびCobb,L.ら,(1969),Biochemical Pharmacology 18:1519-1527)。しかし、適切に高レベルの活性化酵素を含有するヒトの腫瘍は稀であることが分かったので(Connors,T.(1986),Xenobiotica 16:975-988)、臨床結果は芳しくなかった。ウイルスにより誘導された酵素によるプロドラッグ療法(VDEPT;virally directed enzyme prodrug therapy)、およびさらに一般的な遺伝子により誘導された酵素によるプロドラッグ療法(GDEPT;gene directed enzyme prodrug therapy)も、腫瘍特異的なプロドラッグの活性化によって腫瘍細胞を破壊することを目的とする点で関連する。しかし、この場合には、酵素をコードする遺伝子は悪性細胞に特異的に標的化されているか、または特異的なプロモーターの制御下にある。
これまでプロドラッグ療法に対する努力の多くは、自殺遺伝子(suicide gene)としてヒト単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)を用いることに注力されてきた。プロドラッグであるガンシクロビル(GCV;ganciclovir)とHSV-tk酵素との組み合わせが、GDEPT用の好適なシステムとしてして推奨されてきたが(Culver,K.ら,(1992),Science 256:1550-1552、Ram,Z.ら,(1993),Cancer Research 53:83-88、およびChen,S.Shine,H.ら,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.91:3054-3057)、決して最適な組み合わせではないことを示唆する理論的な考察が多数存在する。第一に、これはS期特異的な薬剤であり、休止している細胞には何ら効果がない。これはGCV一リン酸は寿命が短く、毒性効果を与えるためには細胞がS期に入る時点で存在していなければならないからである。HSV-tkはGCVをリン酸化して一リン酸型にし(哺乳類の酵素によっては、行い得ない反応)、これはその後細胞の酵素によってリン酸化されて三リン酸型になり、DNA中に取り込まれる。第二に、活性な薬物は三リン酸であるため、自由に拡散してバイスタンダー効果を引き起こすとは思われない。しかし、インビトロおよびインビボ(代謝協同が関与しているかもしれないが)の両者でバイスタンダー効果が観察されており、後者の場合、いくつかの効果は免疫成分が関与する間接的なものかもしれない(Bi,W.,Parysek L.ら,(1993),Human Gene Therapy 4:725-731、Vile,R.およびHart,I.(1993),Cancer Research 53:3860-3864,およびFreeman,S.,Abboud,C.ら,(1993),Cancer Research 53:5274-5283)。欠点の一つは、バイスタンダー効果は細胞−細胞間接触に依存するということである。これは、形質導入された細胞と周囲の細胞との間に存在する近接部によって形成され、リン酸化されたガンシクロビルの輸送を可能にするギャップジャンクションの存在によるかもしれない。
最近、ラットシトクロムP450 2B1型をコードする遺伝子をトランスフェクトされた後、シクロフォスファミドで処理された細胞を用いて、興味深い結果が報告されている(Chen.S.,Shine.Hら,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.91:3054-3057)。
発明の目的
本発明の目的は、シトクロムP450をコードしている遺伝子を担持し、様々な癌の標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはX線誘導性プロモーターの転写調節下にあるシトクロムP4遺伝子治療に有用な組換えレトロウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞株中にトランスフェクトすることができる新規複製欠損レトロウイルスベクターを提供する。
発明の概要
それ故、本発明は、とりわけ以下のもの：
標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはX線誘導性プロモーターの調節下にあるシトクロムP450遺伝子を担持する複製欠損レトロウイルスベクター；
ベクターがU3-R-U5構造の5’LTR領域；コード配列および非コード配列から選択された一以上の配列；および完全または部分的に欠失したU3領域であって、標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはX線誘導性プロモーターを含有するポリリンカー配列によって置換され、RおよびU5領域が続いているU3領域を具備する3’LTR領域を具備し、少なくとも一つのコード配列がシトクロムP450をコードしていることを特徴とする上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
標的細胞特異的な制御要素またはプロモーターが、WAP、MMTV、β−ラクトグロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーター、炭酸脱水酵素IIおよびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含む膵臓特異的な制御要素およびプロモーター、免疫グロブリンおよびMMTVリンパ球特異的制御要素およびプロモーターを含むリンパ球特異的な制御要素およびプロモーター、グルココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるかまたは乳腺に対して発現を指令するMMTV特異的な制御要素およびプロモーターからなる群の一以上の要素から選択される上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
前記LTR領域が、MLV、MMTV、MSV、SIV、HIV、HTLV、FIV、FeLV、BLV、およびMPMVのLTRからなる群の少なくとも一つの要素から選択されている上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
前記レトロウイルスベクターがBAGベクターまたはpLXSNベクターをベースとする上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
前記レトロウイルスベクターが実施例１の記載のように調製されたpLX2B1である上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
前記レトロウイルスベクターが実施例２の記載のように調製されたpc3/2B1である上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
レトロウイルスの組込みに関与するレトロウイルス配列が改変され、または少なくとも部分的に欠失している上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
前記制御要素またはプロモーターがトランス作用分子によって調節され得る上記の複製欠損レトロウイルスベクター；
前記パッケージング細胞株が、前記レトロウイルスベクターをパッケージするために必要なタンパク質をコードするレトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構造物を少なくとも一つ含有している上記の複製欠損レトロウイルスベクターをトランスフェクトされた前記パッケージング細胞株；
パッケージング細胞株が齧歯類、イヌ、ネコ、またはヒト由来の細胞株であり、ヒト組織と組織適合性がある上記のパッケージング細胞株；
パッケージング細胞株がpsi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317、およびGP+envAM-12からなる群から選択される上記のパッケージング細胞株；
適切な条件下で上述した任意のパッケージング細胞株を培養した後、産生された組換えレトロウイルス粒子を任意に単離することにより産生される組換えレトロウイルス粒子；
上記の組換えレトロウイルス粒子、または上記のパッケージング細胞株を具備する薬学的組成物；
前記パッケージング細胞株によって産生された組換えレトロウイルス粒子を通過させることができる多孔性の膜に封入された上記のパッケージング細胞株；
セルロース硫酸およびポリジメチルジアリルアンモニウムによって形成された複合体中に封入されている上記のパッケージング細胞株；
上記の組換えレトロウイルス粒子、上記のパッケージング細胞株、または上記の封入されたパッケージング細胞株、およびシトクロムP450によって活性化され得る癌のプロドラッグを同時にまたは時間をおいて、本方法を必要としている患者に治療的有効量投与することを具備する腫瘍細胞の除去法；
腫瘍細胞が乳癌または膵臓癌細胞である上記の方法；
組換えレトロウイルス粒子、パッケージング細胞株、もしくは封入されたパッケージング細胞株が注射によって投与され、または腫瘍中に、もしくは腫瘍部位に移植することによって投与される上記の方法；
腫瘍細胞を除去するのに有用な薬学的組成物を調製するための上記の組換えレトロウイルス粒子、上記のパッケージング細胞株、または封入されたパッケーージング細胞株の使用；
標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはX線誘導性プロモーターの転写調節下にあるシトクロムP450遺伝子を担持する、ヒトゲノム中に組み込まれたレトロウイルスプロウイルス；および
標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはX線誘導性プロモーターの転写調節下にあるシトクロムP450遺伝子を含有するヒト細胞
を単独で、または組み合わせて具備する。
発明の詳細な説明
シトクロムP450は、広範囲にわたる基質の酸化を触媒する広範なモノオキシゲナーゼ群を形成する。シトクロムP450は、ある種の細菌、酵母、および高等生物によって産生され、生体異物、生物活性化反応、および種々の内在性化合物の解毒において役割を果たしている。
シトクロムP450は、広く使用されている癌のプロドラッグであるシクロフォスファミド(CPA)およびイフォスファミド(ifosfamide)の水酸化を触媒し、活性で毒性な型にする。通常、患者の内在性シトクロムP450遺伝子の発現は肝臓に限局し、全身投与されたCPAの抗腫瘍効果は、その後の肝臓からの毒性薬物の代謝物の全身的な分布に依存する。活性化された薬物は、腫瘍だけでなく、骨髄および腎臓などの患者の他の正常な組織にも影響を与えるので、毒性の問題が生じる。
腫瘍細胞中にシトクロムP450遺伝子を選択的に直接導入し、該細胞中で過剰発現させるという治療法によって、この問題を回避できるかもしれない。該形質導入された腫瘍細胞から産生された毒性代謝物は、周囲の形質転換されていない細胞に、濃度勾配依存的に影響を与える。シトクロムP450/CPAシステムのさらなる利点は、周囲の細胞に対する細胞毒性効果が細胞の複製に依存しないということである。これは、産生された活性な代謝物の一つが、細胞サイクルのフェイズとは無関係に、ストランド間にクロスリンクを生じせしめるからである。その後、DNA合成の間に、このストランド間のクロスリンクは細胞死をもたらす。
レトロウイルスベクターは、今まで着手されてきた臨床試験で遺伝子輸送担体として最も一般的に用いられてきたものである。しかし、これらの試験のほとんどは、患者の細胞を単離し、培養して改変した後、患者に戻すというエクスビボ(ex vivo)アプローチであった。
癌を治療するためには、患者から細胞(腫瘍細胞または正常細胞の何れか)を単離し、それらをインビトロで、シトクロムP450をコードする遺伝子を担持する組換えレトロウイルス粒子に感染させた後、患者の腫瘍の近傍にそれらを戻すことが適当であろう。しかし、各患者の細胞を単離し、培養し、遺伝子構築物を形質導入してから、偶発的な因子による感染を起こさずに、上手く戻さなければならないため、このアプローチは非常に手間がかかる。このようなアプローチに要するコストおよび時間は、実用の妨げとなっている。
あるいは、P450をコードする遺伝子を担持する組換えレトロウイルス粒子で、あるタイプの細胞を感染させた後、多くの異なる患者を治療するために、これらを使用するという同種異系(allogenic)のアプローチも考えることができる。このようなアプローチは、免疫拒絶の問題を克服することができるとすれば、より実用的である。しかし、多くの腫瘍はエクスビボ遺伝子治療には適していない。
理想的には、シトクロムP450をコードする遺伝子は、インビボで腫瘍細胞中に、または腫瘍近傍の細胞に導入されなければならない。
インビボでの遺伝子の輸送は、新たな多くの問題をもたらす。まず、安全性に関する問題点について、特に述べなければならない。
安全性および純粋な実用性という双方の見地から、最終的なインビボ遺伝子治療における最大の関心事は、発現のターゲッティングである。ベクターが担持する治療用遺伝子が、全ての組織および細胞で、無差別に発現されるべきでなく、必要な標的細胞中でのみ発現されるべきことは明らかである。導入される遺伝子が、特異的な腫瘍細胞を除去するようにデザインされた遺伝子を活性化するプロドラッグであるときには、このことは特に重要である。
このようなランダムな組込みは、原癌遺伝子(proto-oncogene)の活性化を引き起こして、新たな癌を生じさせ得るので、プロウイルス型のレトロウイルスゲノムが被感染細胞のゲノム中へ実質的にランダムに組込まれることは、重大な倫理的問題をもたらす。現在用いられているような全ての複製欠損レトロウイルスが、細胞増殖の制御に関与する細胞遺伝子中またはその近傍に取り込まれる確率は、無視できるほど小さいことに、多くの研究者は賛同するであろう。しかし、単一の感染事象から複製能をもったレトロウイルス群が爆発的に増大して、このような表現型的な組込み(phenotypic integration)が十分現実的になるような組込み現象を最終的に引き起こすことも一般的に仮定できる。
レトロウイルスベクターシステムは、複製能をもったウイルスが存在する可能性が最小になるように最適化されている。しかし、レトロウイルスベクターシステムの成分間の組換え現象によって、病原性の可能性があり、且つ複製能を有するウイルスが発生し得るということは充分に実証されており、多くのベクターシステムの作成においては、組換えのリスクが最小になるように構築されている(Salmons B.およびGunzburg,W.H.(1993),Human Gene Therapy 4(2):129-41)。
レトロウイルスベクターシステムは、二つの成分：
(1)レトロウイルスベクター自身が、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子が治療用遺伝子に置き換えられている改変されたレトロウイルス(ウイルスプラスミド)である。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の置換は、効果的にウイルスの機能を喪失させるので、該喪失したウイルスタンパク質を該改変されたレトロウイルスに提供する、システム中の第二の成分によって、改変されたレトロウイルスを救出しなければならない。
(2)大量のウイルスタンパク質を産生するが、複製能をもったウイルスを産生する能力が欠如した細胞株。該細胞株は、パッケージング細胞株として知られており、改変されたレトロウイルスベクターをパッケージングすることができる遺伝子を担持する一以上のプラスミドでトランスフェクトした細胞株からなる。
組換えレトロウイルス粒子を作成するために、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクトする。これらの条件下で、挿入された治療用遺伝子を含む改変されたレトロウイルスゲノムは、レトロウイルスベクターから転写され、改変されたレトロウイルス粒子にパッケージングされる。次に、これらの組換えレトロウイルス粒子は、腫瘍細胞に感染させるのに用いられ、その間に、ベクターゲノムおよび全ての細胞毒性遺伝子は、標的細胞のDNA中に組込まれる。細胞中にウイルスタンパク質が存在していないので、このような組換えウイルス粒子に感染した細胞は、新しいベクターウイルスを産生することはできないが、治療薬を担持するベクターのDNAが細胞のDNA中に組込まれているので、感染された細胞中で発現することができる。
担持された細胞毒性遺伝子をターゲッティングさせ得る多数のレトロウイルスベクターシステムが、これまで記載されてきた(Salmons B.およびGunzburg,W.H.(1993),Human Gene Therapy 4(2):129-41)。これらのアプローチの多くは、予め規定した細胞種のみで感染現象が起こるように限定すること、または特定の腫瘍細胞種に対して、連結された異種性の治療用遺伝子の発現を誘導するための異種性プロモーターを用いることの何れかを含む。プロモーターが通常活性で、または／およびさらに制御可能であるような細胞の中だけで、連結された遺伝子の発現を誘導しなければならない異種性プロモーターを用いる。これらのプロモーターは、予め、レトロウイルスベクターの本体に、治療用遺伝子とともに、gag、polまたはenv遺伝子と置換して挿入される。
これらの遺伝子の両側に存在するレトロウイルスLTRは、レトロウイルスプロモーターを担持し、これは多くの異なる細胞種の中で発現を誘導し得るという点で、一般的に非特異的である(”Retroviruses-Strategies of replication(Swanstrom,R.およびVogt,P.K.,Eds.)の中のMajors,J.(1990):Springer-Verlag,Berlin:49-92)。LTRプロモーターと組織特異的なプロモーターのような上述の異種性内部プロモーター間でのプロモーター干渉作用(interference)が報告されている。さらに、レトロウイルスのLTRは、独立に、またはレトロウイルスプロモーターとともに、レトロウイルスの組込み部位近傍の細胞遺伝子の発現に影響を与え得る強力なエンハンサーを有することが知られている。この機構は、動物内での腫瘍生成に関与していることが示されている(van Lohuizen,M.およびBerns,A.(1990),Biochim.Biophys.Acta 1032:213-235)。これら二つの観察は、レトロウイルスプロモーターが、標的細胞中で機能的に不活性化される自己不活性化ベクター(SIN;Self-Inactivating-Vectors)の開発を促した(WO94/29437)。さらに、これらのベクターの改変には、LTR領域内にプロモーター遺伝子カセットを挿入して、ダブルコピーベクター(WO89/11539)を作り出すことが含まれる。しかし、これらの両ベクターでは、ベクター本体、またはLTR領域の何れかに挿入された異種性プロモーターは、治療用遺伝子に直接連結されている。
欠失した3’LTRを担持する以前記載した上記のSINベクター(WO94/29437)では、さらにパッケージング細胞株中でベクター構築物の発現を誘導するレトロウイルス5’LTRプロモーター(U3欠如5’LTR)の代わりに、サイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターのような異種性プロモーターを用いている。3’LTRには、異種性ポリアデニル化シグナルも含まれている(WO94/29437)。
本発明の目的は、治療成分としてシトクロムP450遺伝子を含有する安全なレトロウイルスベクターを構築することである。該新規ベクターは、異種性の構成的、誘導性、または組織特異的なプロモーターおよび／または、標的細胞内で、感染後複製されて5’LTRに転移される(translocate)3’LTR中の制御要素を担持する。このため、感染細胞中では、導入されたプロモーターは、ベクターの本体に挿入されているシトクロムP450遺伝子の発現を制御する。該ベクターは、自己不活性化は行わないが、代わりにプロモーター・コンバージョンを行い、プロモーター・コンバージョン・ベクター(Promoter Conversion vector)からProConベクターと名付けられている。ProConシステムの原理および利点は、WO9607748に、より詳細に記載されている。
プロモーター・コンバージョンは自己不活性化を起こさないので、レトロウイルスベクターは、標的細胞内で転写活性を示す。さらに両LTRの多くは、標的細胞中の異種性プロモーター／エンハンサー配列からなる。このため、標的細胞に組み込まれたベクターが、従来のベクターに記載されているような(Xu,L.,Yee,J.K.ら、(1989)、Virology 171:331-341)長期間にわたる不活性化を受ける可能性が少なくなり、内在性レトロウイルス配列との組換えによって、複製能を有する病原性ウイルスが作り出される可能性も減少し、システムの安全性が増加するであろう。
本発明によれば、レトロウイルスベクター構築物の5’LTRは改変されておらず、パッケージング細胞中でのウイルスベクターの発現は、正常なレトロウイルスU3プロモーターによって誘導される。正常なレトロウイルスポリアデニル化が起こり、3’LTRには異種性ポリアデニル化シグナルは含まれなくなる。パッケージング細胞が組み替えウイルスを産生している間、(おそらくウイルスによる正常なポリアデニル化の制御も関与する)正常なウイルスプロモーターを通じたウイルスの正常な生理的制御がインビボで長期間にわたって続くので、インビボ遺伝子治療法を開発する上で、このことは重要である。
上述した他の目的を達するために、本発明は、U3-R-U5構造の5’LTR領域；シトクロムP450遺伝子として知られている遺伝子群から選択される一以上のコード配列；および完全または部分的に欠失したU3領域を具備する3’LTRであって、該欠失したU3領域が異種性プロモーターによって置換され、その後にRおよびU5領域が続いている3’LTRを具備するプロモーター・コンバージョンを行うレトロウイルスベクターを提供する。
前記プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター／エンハンサーのように構成的、グルココルチコイドホルモン(例えば、MMTVプロモーター)または標的細胞特異的などのように誘導性であり得る。
標的細胞特異的な制御要素およびプロモーターは、任意の遺伝子の一以上の要素から選択されるが、本実施態様では、炭酸脱水酵素IIおよびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含むプロモーター、炭酸脱水酵素IIおよびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含むリンパ球特異的制御要素およびプロモーター、乳漿酸性タンパク質(WAP)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、β−ラクトグロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーターのリンパ球特異的制御要素、免疫グロブリンおよびMMTVリンパ球特異的制御要素およびプロモーターを含む膵臓特異的な制御要素およびプロモーター、グルココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるか、または乳腺に対する発現を誘導するMMTV特異的な制御要素およびプロモーターから選択され得る。他のプロモーターには、例えばCD4、CD34およびIL2プロモーターが含まれる。前記制御要素およびプロモーターは、好ましくは前記レトロウイルスベクターの発現を制御する。
乳腺への特異性を与えるのに必要なWAPプロモーターの領域は、320bpのXhoI/XbaI制限断片(-413〜-93)であるように思われる(Kolb,A.F.,Gunzburg,W.H.,Albang,R.Brem,G.,Erfle,V.,およびSalmons,B.(1995),Biochem.Bihphys.Res.Commun.217,1045-1052)。さらにある実験は、MMTVが示す乳腺特異的な発現(Kolb,A.F.,Gunzburg,W.H.,Albang,R.,Brem,G.Erfle,V.,およびSalmons,B.(1995),Biochem.Bihphys.Res.Commun.217,1045-1052)の制御に、0.6KbのPstI MMTVプロモーター断片(Salmons,B.,Groner,B.,Calberg Baca,C.M.,およびPonta,H.(1985),Virology 144:101-114)が役割を果たしているらしいということを示している。
LTR領域は、マウス白血病ウイルス(MLV)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、マウス肉腫ウイルス(MSV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ネコ白血病ウイルス(FELV)、ウシ白血病ウイルス(BLV)およびメイソン−ファイザーサルウイルス(MPMV)のLTRからなる群の少なくとも一つの要素から選択される。
レトロウイルスベクターは、LXSNベクター(Miller,A.D.およびRosman,G.J.(1989),Biotechniques 7:980-990),pBAG(Price,J.,Turner,D.ら,(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:156-160)、または両者のハイブリッドの何れかをベースにすることが好ましい。
治療用遺伝子のコード配列は、任意のシトクロムP450遺伝子であり得るが、最も好ましいのは、Fuji-Kuriyama,Y.,Mizukami,Y.ら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2793-2797に明記されている2B1型ラットシトクロムP450である。
本発明のさらなる実施態様では、第一の成分として上記のレトロウイルスベクター、および該レトロウイルスベクターをパッケージングするのに必要なタンパク質をコードするレトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構築物を少なくとも一つ含有するパッケージング細胞株を具備するレトロウイルスベクターシステムが与えられる。
パッケージング細胞株は、好ましくはΨ-2、Ψ-Crypt、Ψ-AM、GP+E-86、PA317、およびGP+envAM-12、または他のエンベロープに被覆されたウイルスの表面タンパク質を発現させ得る組換え構築物がさらにトランスフェクトされた任意のこれらの細胞株からなる群の一要素から選択される。
本発明には、本発明のレトロウイルスベクターから得られるmRNAも含まれる。
パッケージング細胞株では、レトロウイルスベクターの発現は、U3領域に含有される正常な非選択的レトロウイルスプロモーターによって制御される。しかし、ベクターが標的細胞に侵入するとすぐにプロモーター・コンバージョンが起こり、ProConベクター中に挿入された組織特異的または誘導性の好ましいプロモーターから、P450遺伝子が発現される。様々な異なる細胞種の選択的なターゲッティングを与えるならば、システムには実質的に任意の組織特異的プロモーターを含有させ得るのみならず、さらに、コンバージョン現象後のレトロウイルスベクターの構造および特性は、ウイルスのものとは全く似ていない。もちろん、これは安全性の見地から非常に重要なことである。
これらのベクターシステムは、インビトロまたはインビボの何れかで、腫瘍または正常細胞を感染させるのに用いることができる組換えウイルスを作成するのに使用し得るであろう。
精製または濃縮された組換えレトロウイルスは、まず組換えレトロウイルスを含有する培地に、十分な量の調剤用緩衝液を添加することによって保存して、水性懸濁液を形成させることができる。調剤用緩衝液は、水の中に糖質、高分子量の構造添加物(structural additive)、および緩衝成分を含有する水溶液である。該水溶液は、一以上のアミノ酸を含有してもよい。
組換えレトロウイルスは、精製した形態で保存することもできる。より具体的には、調剤用緩衝液を添加する前に、濾紙を通過させることによって上記の未精製組換えレトロウイルスを清澄にした後、クロスフロー濃縮システム(Filtron Technology Corp.,Nortborough,MA)等によって濃縮してもよい。ある実施態様では、該濃縮物にDNアーゼを添加して、外来DNAを消化する。次に、該消化物を分別濾過(diafiltrate)して過剰な培地成分を除去し、より好ましい緩衝化された溶液中に組換えレトロウイルスを確立させる。次に、該分別濾過物をセファデックスS-500ゲルカラムに通し、精製された組換えレトロウイルスを溶出させる。成分が所望の最終濃度になり、且つ組換えレトロウイルスの希釈が最小限になるように、該溶出液に十分な量の調剤緩衝液を加えた後、好ましくは-70℃で、または即座に乾燥させて水性懸濁液を保存する。上述したように、調剤用緩衝液とは、水の中に糖質、高分子量の構造添加物、および緩衝成分を含有する水溶液である。該水溶液は、一以上のアミノ酸も含有し得る。
未精製組換えレトロウイルスは、イオン交換カラムクロマトグラフィーによっても精製し得る。一般的には、未精製組換えレトロウイルスは、フィルターを通過させることによって清澄にして、高度にスルホン化されたセルロースマトリックスを含有するカラムに該濾過液をかける。高い塩濃度の緩衝液を使用することによって、組換えレトロウイルスをカラムから精製された型で溶出させる。次に、分子排除カラムに該溶出液を通過させることによって、該高い塩濃度の緩衝液をより好ましい緩衝液に交換する。次に、上述のように、精製された組換えレトロウイルスに十分量の調剤用緩衝液を添加し、水性懸濁液を即座に乾燥させるか、または好ましくは-70℃で保存する。
未精製または精製された型の水性懸濁液は、凍結乾燥によって、または室温での蒸発によって乾燥させることができる。具体的には、凍結乾燥にはガラス転移温度以下、または該水性懸濁液の共融温度以下に水性懸濁液を冷却し、該冷却した懸濁液から昇華によって水を除去して凍結乾燥したレトロウイルスを形成させるステップが含まれる。一度凍結乾燥すれば、組換えレトロウイルスは安定であり、以下でより詳細に議論されているように、-20℃〜25℃で保存し得る。
蒸発法では、水は室温で蒸発によって、水性懸濁液から除去される。水は、噴霧乾燥によって除去することもできる。
前述したように、調剤に用いられる水溶液は、糖質、高分子量の構造添加物、緩衝成分および水から構成されている。該溶液は、一以上のアミノ酸も含有し得る。これらの成分の組み合わせは、凍結および凍結乾燥、または蒸発による乾燥時に、組換えレトロウイルスの活性を保持するように作用する。
高分子量の構造添加物は、凍結時にウイルスが凝集するのを防ぐのに役立ち、凍結乾燥または乾燥した状態において構造的な支持を与える。本発明においては、構造添加物は、分子量が5,000を超える場合「高分子量」であると考える。好適な高分子量構造添加物は、ヒト血清アルブミンである。アミノ酸が存在する場合、さらに水性懸濁液の冷却および融解時に、ウイルスの感染性を保持するように機能する。またアミノ酸は、冷却した水性懸濁液を昇華する間および凍結乾燥状態の間に、ウイルスの感性性が、さらに保持されるように機能する。
緩衝成分は、pHを比較的一定に維持することによって、溶液を緩衝化するように作用する。所望のpH範囲(好ましくは7.0と7.8の間)によって、様々な緩衝液を使用し得る。
組換えレトロウイルスを調剤するための水溶液は、WO-A2-96121014に詳細に記載されている。
さらに、該水溶液は、調剤された最終的な組換えレトロウイルスを適切な等浸透圧塩濃度に調節するために用いられる中性の塩を含有することが好ましい。
凍結乾燥された、または脱水されたレトロウイルスは、様々な物質を用いて、再び溶液に戻すことができるが、水を用いて溶液に戻すことが好ましい。ある実施例では、最終調剤を等張にする薄い塩溶液も用い得る。さらに、溶液に戻されたレトロウイルスの活性を増大させることが知られている成分を含有する水溶液を用いることも有用であるかもしれない。このような成分には、IL-2のようなサイトカイン、プロタミンサルフェートのようなポリカチオン、または該溶液に戻されたレトロウイルスの形質導入効率を増加させる他の成分が含まれる。凍結乾燥もしくは脱水された組換えベクターは、任意の適量の水で、または該凍結乾燥もしくは脱水されたサンプルを実質的に、好ましくは完全に可溶化させることができる、溶液に戻すための因子で溶液に戻してもよい。
組換えレトロウイルス粒子は、例えば、臓器などの部位中、または腫瘍部位を含むきわめて様々な部位に投与し得る。他の実施態様では、組換えレトロウイルスは、経口、静脈内、頬／舌下、腹腔内、または皮下に投与し得る。一日の投与量は、正確な投与様式、投与される形態、投与がなされる適応症、対象となる患者、対象となる患者の体重、さらに担当医の選択および経験による。
本明細書に記載した投与経路は、針、カテーテル、または関連用具を用いる直接的な投与によって、簡単に達成し得る。特に、ある本発明の実施態様では、一以上の調剤を直接投与してもよい。
本発明のある実施態様では、パッケージング細胞は、カプセル内に封入されている。効果的な治療のためには、ウイルスを産生する細胞は、移植後、標的臓器中で長期間生存しなければならず、この期間中ウイルスが製造されて、パッケージング細胞から放出されなければならない。それによって、ウイルスを産生するパッケージング細胞は、実際に、投与部位に位置する小さなウイルス産生工場になるであろう。これによって、インビボで組み替えウイルスは効率的に供給され得るであろう。あるいは、ヒト由来または他の動物種由来の正常な感染細胞を封入または移植してもよく、腫瘍魂の近傍または内部に位置し得る小さなプロドラッグ変換工場となる。
該アプローチが長期間効率的であるためには、(1)(特に細胞が異なる種のものである場合(レトロウイルスベクター産生細胞の場合には通常異なるが)には)通常ウイルス産生細胞または被感染細胞を除去するであろう宿主の免疫系から細胞を保護すること、および(2)長期間、細胞がインシチュで生存すること(血管形成が必要であろう)に依存する。
移植の前に、ウイルスを産生するパッケージング細胞を適切にカプセル化(半透膜のミクロカプセル中に)することによって、移植されたパッケージング細胞からベクターウイルスを継続的に産生することができることが見出された。さらに、このようなカプセルは宿主に良好に移植、血管形成され、宿主の免疫反応または炎症反応を惹起しないことが見出された。カプセル膜の半透性とともに、これらの発見により、長期間レトロウイルスベクターをインビボで供給することが可能となった。
ウイルスを産生するパッケージング細胞、およびウイルスに感染した細胞または正常な細胞をセルロースベースの素材中にカプセル化するためのカプセル化技術が開発されてきた。この技術を用いると、1010個の細胞、但し好ましくは105〜107個の細胞を電解質複合体(例えば、アルギネートおよびポリリシン、またはより好ましくは、セルロース硫酸およびポリジメチルジアリル塩化アンモニウム)、または他の多孔性構造物(ポリアミド、ポリスルホンなど)の中にカプセル化される。得られたカプセルは、0.01〜5mmの間の異なる直径を有し得るが、好ましくは0.1〜1mmである。従って、カプセルは異なる数の細胞を含有するように作ることができる。カプセルは半透性で、ウイルスまたはプロドラッグ分子を通過させ得る程度には大きいが、免疫系の細胞が前記細胞に近づくのを防ぐことによって、これらの細胞に対する免疫応答を著しく減らす程度には小さい孔を有する。標準条件の湿度、温度、および二酸化炭素濃度で、通常の細胞培養液(その性質は、カプセル化した細胞に依存する)中に、該カプセルおよびカプセル化した細胞を採集する。
適切な期間培養した後(通常1時間以上で、30日を超えない)、カプセルを含有している細胞は、直接またはシリンジを用いる注射の何れかによって、様々な領域中に、外科的に移植することができる。
カプセル化した細胞を移植した後、種々の時間において、宿主をシクロフォスファミドまたはイフォスファミドで、局所的または全身的に処置し得る。シトクロムP450を発現するウイルスに感染した細胞は、これらのプロドラッグを、DNAのアルキル化およびクロスリンクを生じせしめる活性な代謝物に転換する。シトクロムP450遺伝子を担持し、発現している細胞(カプセル化された感染した細胞、またはカプセル化されたパッケージング細胞など)もこの転換を触媒するであろう。本発明のある実施態様では、これらのカプセル化された被感染細胞またはパッケージング細胞は、ゆっくり分裂している細胞、またはマイトマイシンC、低量の放射線、もしくは細胞の複製を阻止する他の手段で処理された細胞の何れかであり、それ故細胞がプロドラッグの毒性効果の影響を受けるのを防ぐ。
以下の実施例では、本発明をさらに説明する。しかし、当業者には自明な変更、およびさらに他の修飾および置換が明らかであろうが、これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
本実施例は、ラットシトクロムP450 2B1遺伝子を含有する腫瘍内感染用のレトロウイルス発現ベクターの構築を記載する。
図１に示されている発現ベクターpLX2B1は、プラスミドpLX125およびpSW1(Kedzie,K.M.,Escobar,G.Y.,Grimm,S.W.,He,Y.A.,Pepperl,D.J.,Regan,J.W.,Stevens,J.C.,およびHalpert,J.R.(1991),J.Biol.Chem.266(33):2215-2)から得られた断片を連結することによって構築した。pLX125は、PCT/EP96/04447に記載されているように調製した。
HpaIでプラスミドpLX125を直鎖状にして、ウシ腸フォスファターゼを用いて、生じた平滑末端を脱リン酸化した。1％のアガロースゲル上で分離して、切りだし、Qiaquickプロトコール(Qiagen)を用いて調製することによって該DNAを精製した。エタノールで沈殿させた後、DNAを再び水に戻した。
SmaIおよびHincIIでクローニングベクターpSW1を消化して、平滑末端化された二つの断片を得た。消化混合物は、1％のアガロースゲル上で分離した。ラットシトクロムP450 2B1 cDNA(Fuji-Kuriyama,Y,Mizukami,Y.et al(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2793-2797)を含有する最も短い断片(1.5kb)を切りだし、Qiaquick DNA抽出プロトコールを用いて溶出し、エタノール沈殿して、再び水に戻した。
7.6fmolのpLX125、および24fmolのpSW1のSmaI/HindII断片を混合して、T4リガーゼ(Boehringer)を用いて、12℃で3日間ライゲーションを行った。65℃でリガーゼを10分間不活性化させ、10倍量のブタノールでDNAをブタノール沈殿させた。該沈殿させたDNAを水に戻して、DH10B-bacteria(Gibco)中へエレクトロポレーションを行った。アンピシリン耐性コロニーを選択して、DNAを調製し、SspBI/SalI、BamHI/SspBI、PvuIおよびBamHIで試験消化した。正しい最終のプラスミドをpLX2B1と名付けた(図１参照)。
リポフェクション
リポフェクションの一日前に、3×106個のレトロウイルスパッケージング細胞PA317(Miller,A.D.およびButtimore,C.(1986),Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)を10cmのペトリ皿または培養皿に播種した。感染の日に、4μgのpLX2B1を300μLの無血清培地と混合した。平行して、45μLのリポフェクタミン(Lipofectamine；Gibco BRL)を300μLの無血清培地に混合した。プラスミドを含有する該溶液をリポフェクタミン−ミックスに添加して、45分間インキュベートした。35分後、細胞を6mLの無血清培地で一度洗浄し、2.4mLの無血清培地をリポフェクタミン−ミックスに添加し、得られた1mLを調製した細胞上に加えた。5時間後、20％のFCSを含有する3.5mLのダルベッコの修正イーグル培地を添加した。次の日、該細胞をトリプシン消化して、1:20に希釈し、100mmの皿に播種した。24時間後、該培地をネオマイシン類縁体G418を含有する培地に代えた。細胞群を単離して、シトクロムP450の発現を分析した。
これらの細胞群の上清を用いて、標的CK細胞に感染させた。5×106個の細胞からの上清を含有する1mLのウイルスを0.45μmのフィルターを通して濾過し、8μg/mLのポリブレン(polybrene)存在下で、1×106個の標的CK細胞に添加した。4時間後、10％のウシ胎児血清を含むダルベッコの修正イーグル培地mLを添加した。
翌日細胞をトリプシン処理して、希釈し、24時間後に、さらに400μg/mLのG418を含有する選択培地中に加えた。2週間後、G418耐性コロニーを単離して、シトクロムP450 2B1活性の試験を行った。2×104個の細胞を3cmの皿の上に播種して、0〜5mMの異なる濃度のイフォスファミドに晒した。対照、非感染細胞に比べて、シトクロムP450 2B1レトロウイルスに感染した細胞の感度が高いことが観察された。
カプセル化
得られたレトロウイルスベクターを産生するパッケージング細胞をWO97/01357の実施例２に記載されているようにカプセル化する。
移植
得られたカプセルは、「鍵穴(”key hole”)」手術によって、移植した、または自然発生したBALB/cまたはGRマウスの腫瘍の近傍または腫瘍中に導入する。直径1mmの約6個のカプセルを各手術部位に挿入する。手術部位を一縫合によって閉じる。次に20mg/mLを100μL直接腫瘍内に注射することによって局所的に、または全身濃度がkg体重当たり130mgのCPAおよびkg体重当たり40〜60mgのIFOを腹腔内に注射することによって、最長10週間シクロフォスファミドまたはイフォスファミドでマウスを処置する。この間、腫瘍のサイズおよび肉眼的な外観を毎日モニターする。その後、マウスを殺して、挿入したカプセルを含有する組織および腫瘍を取り出し、光学顕微鏡および電子顕微鏡用の組織学的切片を調製する。これらの切片は、カプセルが良好に移植され、血管が形成されていることを明確に示し、細胞性免疫応答の指標であるリンパ球が存在している様子は全くない。これらの切片は、カプセル中の細胞が死亡または壊死している徴候も示さない。対照的に腫瘍は壊死を示し、試験期間後、明らかに肉眼的にサイズが縮小していた。
実施例２
本実施例は、構成的にラットシトクロムP450 2B1を発現する安定な細胞株の構築について記載する。
プラスミドpcDNA3(Invitrogen)およびpSW1(Kedzie,K.M.,Escobar,G.Y.,Grimm,S.W.,He,Y.A.,Pepperl,D.J.,Regan,J.W.,Stevens,J.C.,およびHalpert,J.R.(1991),J.Biol.Chem.266(33):2215-21)から得られた断片を連結することによって発現ベクターpc3/2B1を構築した。
XhoI/XbaIでプラスミドpcDNA3を消化して、ウシ腸フォスファターゼを用いて、生じた付着末端化された断片を脱リン酸化した。1％のアガロースゲル上で分離して、切りだし、Qiaquickプロトコール(Qiagen)を用いて調製することによって該ベクターバックボーンのDNAを精製した。エタノールで沈殿させた後、DNAを再び水に戻した。
XhoIおよびXbaIでクローニングベクターpSW1を消化して二つの断片を得た。消化混合物を1％のアガロースゲル上で分離した。ラットシトクロムP450 2B1 cDNA(Fuji-Kuriyama,Y,Mizukami,Y.et al(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2793-2797)を含有する最も短い断片(1.5kb)を切りだし、Qiaquick DNA抽出プロトコールを用いて溶出し、エタノール沈殿して、再び水に戻した。
8.3fmolのpcDNA3バックボーン、および24.8fmolのpSW1のXhoI/XbaI断片を混合して、T4リガーゼ(Boehringer)を用いて、12℃で1日間、ライゲーションを行った。65℃でリガーゼを10分間不活性化させ、10倍量のブタノールでDNAをブタノール沈殿させた。該沈殿させたDNAを水に戻して、DH10B-bacteria(Gibco)中へのエレクトロポレーションを行った。アンピシリン耐性コロニーを選択して、DNAを調製し、EcoRI、BamHI、EcoRVおよびXhoIで試験消化した。正しい最終プラスミドをpc3/2B1と名付けた。
リポフェクション
リポフェクションの日の前に、3×106個のネコの腎臓細胞を100mmの皿に播種した。トランスフェクションの日に、4μgのpc3/2B1を100μLの無血清培地と混合した。平行して、15μLのリポフェクタミンを100μLの無血清培地に混合した。プラスミド含有溶液をリポフェクション−ミックスに添加して、45分間インキュベートした。35分後、細胞を2mLの無血清培地で一度洗浄し、800μLの無血清培地をリポフェクタミン−ミックスに添加し、得られた1mLを調製した細胞上に加えた。6時間後、10％のFCSを含有する1mLのDMEM(Glutamax)を添加した。次の日、該細胞をトリプシン消化して、10倍希釈し、100mmの皿に播種した。24時間後、該培地をネオマイシン培地に代えた。14日後、ネオマイシン耐性クローンを単離して、ベクターの存在および活性について試験した。
シトクロムP450を発現しているネコの腎臓細胞は、野生型細胞に比べて、イフォスファミドまたはシクロフォスファミドに対して10倍高い感度を示した。
ネコの腎臓野生型細胞のみならず、膵臓腫瘍由来のRin5細胞に対するバイスタンダー効果を実証することができた。これは、シトクロムP450 2B1ネコ腎臓細胞クローンを非産生ネコ腎臓野生型細胞またはRin5ラット膵臓腫瘍由来細胞の何れかとともに共培養し、イフォスファミドを添加することによって示された。非生産CKおよびRin細胞は、シトクロムP450 2B1ネコ腎臓細胞によって産生され、放出されるイフォスファミドの毒性代謝物によって死滅する。あるシトクロムP450 2B1ネコ腎臓細胞クローンを用いる滴定実験により、0.25mMという低量のイフォスファミドがこれらの細胞に特異的な毒性効果を引き起こし、1〜2mMで全ての細胞が死滅することが示された。PCR分析によって、シトクロムP450 2B1ネコ腎臓細胞クローンがP450 2B1遺伝子構築物DNAを獲得したことが示された。さらに、シトクロムP450 2B1による7-ペントキシレゾルフィン(7-pentoxyresorufin)の酵素的脱アルキル化を用いて、さらに該クローンの生化学的分析を行ったところ、該遺伝的に改変された細胞がシトクロムP450 2B1を産生していることが明らかとなった。
これらの細胞を含有するカプセルは、実施例１に記載したように、マウスの腫瘍部位の近傍に移植した。シクロフォスファミドまたはイフォスファミドで処理した後、上述のように処置の効力を評価した。
ラットシトクロムP450-2B1をコードする遺伝子を含有するレトロウイルス発現ベクターは、以下の実施例４に記載されているように調製することもできる。
実施例３
まず、制限酵素XhoIで、プラスミドpLX125を部分消化して、3547位で直鎖状になっているベクターを作る。該直鎖状のプラスミドをさらに、制限酵素SspBIで消化して、pLX125のポリリンカー中の短い断片を除去した。調製用ゲルでは、正しく切断されたベクター断片は、最大のバンドとして現れた。Quiaex protocol(Qiagen)を用いて、該バンド中のDNAをゲルから溶出して、精製した。
ラットシトクロムP450 2B1遺伝子を作成するために、溶液D(4Mグアニジウムチオシアナート、25mMクエン酸ナトリウムpH7、0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム、0.1M 2-メルカプトエタノール)で、ラット肝臓癌細胞株HTCの細胞を溶解させ、水を飽和させた同量のフェノールおよび1/5量のクロロフォルム／イソアミルアルコール(49:1)中の1/15量の3M酢酸ナトリウムを添加することによって抽出した全RNAを加えて、混合物全体を激しく混ぜ合わせた。15分氷上に置いた後、該抽出物を20分、4℃、10,000gで遠心した。等量のイソプロパノールにより、水相中のRNAを-20℃で30分間沈殿させ、4℃、10,000gで遠心した。該沈殿を70％エタノール中で洗浄し、15分間室温に放置した。4℃、10,000gで5分遠心した後、沈殿を真空乾燥機中で乾燥して、0.5％のSDS溶液中に再び溶解させた。
cDNA合成のプロトコール(Pharmacia)を用いて、抽出したRNAを逆転写した。生じたcDNAをPCRのテンプレートとして用いた。プライマーは、左側のプライマー(5’-AAGCCTGTACACTGGAGAGCATGCAG-3’)中にSspBI制限部位(下線)が含まれ、右側のプライマー(5’-CGATTACTCGAGACCTGGCTGCCTCA-3’)中にXhoI部位(下線)が含まれるようにデザインした。両プライマーには、適切な制限酵素によって高い効率で切断されるように、5’末端に塩基を付加した。1562bpの産物をXhoIおよびSspBIで消化して、三つの断片を得た。
シトクロムP450の遺伝子を含有する該最長の断片(1545bp)をXhoI/SspBIで消化したプラスミドpLX125に連結した。
2B1型ラットシトクロムP450を構成的に発現する安定な細胞系は、以下の実施例５に記載されているように調製することもできる。
実施例４
2B1型ラットシトクロムP450からmRNAを作成するために、4週齢の雌のラットを殺して、肝臓を取り出し、液体窒素に入れて即座に凍結させた。凍結させた肝臓を、滅菌、濾過したGTC緩衝液(6Mグアニジウムイソチオシアナート、5mMクエン酸ナトリウム、0.1M2-メルカプトエタノール、0.5％N-ラウリルサルコシルナトリウム)中に入れ、室温でホモゲナイズした。RNAを単離するために、肝臓抽出物を塩化セシウム(5.7M塩化セシウム、0.1M EDTA)のクッション上に置いて、20℃、32,000rpmで一晩スウィング−アウトローターの中で遠心した。上清を完全に除去した後、沈殿したRNAを氷冷した10mM Tris pH7.5の中に再溶解し、-20℃で一晩、1/15倍量の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍量のエタノールで沈殿させた。RNAを8000rpm、4℃で40分間回転して沈降させ、乾燥した沈殿を滅菌した水に再懸濁した。
cDNA合成のプロトコール(Pharmacia)を用いて、該抽出したRNAを逆転写した。得られたcDNAを以下のPCRのテンプレートとして用いた。プライマーは、左側のプライマー(5’-CGTGCGGAATTCGGCGGATTCAGCAT-3’)中にEcoRI制限部位(下線)が含まれ、右側のプライマー(5’-ATAACGGATATCACCTGGCTGCCTCA-3’)にEcoRVI部位が含まれるようにデザインした。両プライマーには、切断酵素が高い効率となるように、5’末端に塩基を付加した。1588bpの増幅産物をEcoRIおよびEcoRVで消化して、三つの断片を得た。
シトクロムP450の遺伝子を含有する該最長の断片(1572bp)をEcoRIおよびEcoRVで消化したプラスミドpcDNA3(Invitrogen)に連結した。
実施例５
WAPプロモーターの転写制御下にあるラットシトクロムP450遺伝子を含有するProConベクターの構築
cDNA合成のプロトコール(Pharmacia)を用いて、実施例４で調製された抽出したRNAを逆転写した。得られたcDNAをPCRのテンプレートとして用いる。プライマーは、左側のプライマー(例えば、5’-AAGCCGGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3’)中にBamHI制限部位(下線)が含まれ、右側のプライマー(例えば5’-CGATTAGGATCCCTGCCTCA-3’)にBamHI部位(下線)が含まれるようにデザインした。適切な制限酵素によって高い効率で切断されるように、両プライマーには5’末端に塩基を付加した。1562bpの産物をBamHIで消化して、シトクロムP450の遺伝子を含有する得られた断片をBamHIで消化したプラスミドpWAP.6に連結した(PCT出願番号PCT/EP96/03922参照)。
シトクロムP450の遺伝子を含有する該最長の断片(1572bp)をEcoRIおよびEcoRVで消化した1588bpの増幅産物に連結した