(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジベンゾフラン、ビフェニルの中の少なくとも１つの生物難分解性有機化合物を、Nocardioides sp. H-1（FERM P-18744）で特定されるジベンゾフラン及びビフェニルを分解する微生物を用いて分解することを特徴とする生物難分解性化合物の分解方法。
【請求項２】
ジベンゾフラン、ビフェニルの中の少なくとも１つの生物難分解性有機化合物に、別に培養したNocardioides sp. H-1（FERM P-18744）で特定されるジベンゾフラン及びビフェニルを分解する微生物を添加し、前記生物難分解性有機化合物を分解することを特徴とする生物難分解性有機化合物の分解方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１つに記載の分解方法によって、前記生物難分解性有機化合物によって汚染された物質を浄化することを特徴とする浄化方法。
【請求項４】
処理対象となるジベンゾフラン、ビフェニルの中の少なくとも１つの生物難分解性化合物質で汚染された土壌を滅菌する工程と、滅菌後の前記土壌に別途培養されたNocardioides sp. H-1（FERM P-18744）で特定されるジベンゾフラン及びビフェニルを分解する微生物を添加する工程と、前記土壌に栄養源および酸素を供給する工程と、を含む浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に生物分解性が困難であるといわれている生物難分解性化合物を特定の微生物を用いて分解する分解方法、その分解方法を利用した物質の浄化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、土壌・地下水などの環境汚染について、より広範かつ詳細な調査が進むにつれて、様々な物質による汚染が顕在化し、その対策が求められている。
【０００３】
このような汚染物質として、重油や掘削油のような油類の他にダイオキシン類、ＰＣＢ、ハロゲン化炭化水素、フェノール類などの有機化学物質があげられ、これら有機化学物質に汚染されている場合には、これら有機化学物質を分離したり、分解して浄化する必要がある。
【０００４】
この浄化に用いられる手法は、物理化学的手法と、生物化学的手法に大別することができる。物理化学的手法としては酸化剤を添加して酸化処理する方法、還元剤を添加して脱ハロゲン化反応等により毒性の低減を図る方法、高温により熱分解する方法、洗浄液により汚染物質を抽出して分離する方法等がある。しかし、このような物理化学的手法では、加熱や薬剤添加により汚染物質だけでなく浄化対象物質の性状を大きく変えてしまうという問題があり、また一般的に薬剤や設備費等のコストが高くなるという問題もある。
【０００５】
一方、生物活動を適切に利用し環境の汚染物質濃度の低減を図る方法は、バイオレミディエーションと呼ばれ、環境に与える負荷が小さいこと、通常微生物および微生物の活性を高めるための栄養源を添加するのみであるため低コストで浄化が可能であるというメリットがある。
【０００６】
ここで、この微生物を用いた環境浄化の手法であるバイオレミディエーションとしては、汚染現場に存在する微生物を酸素、栄養源等の添加により活性を高めて浄化を促進するバイオスティミュレーションと、汚染物質に対して優れた浄化能を有する微生物を外部から添加して浄化を行うバイオオーギュメンテーションをあげられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、環境汚染の原因となる化学物質には多種多様のものがあり、中には、微生物による分解が難しい物質もある。
【０００８】
例えば、ジベンゾフラン等の芳香族化合物は、一般に生物難分解性であり、これらの分解能を有する微生物の報告例は少ない。また、汚染物質としてよく取り上げられるダイオキシンについても、白色不朽菌など、菌体外酵素を生成してこれを分解する菌の報告もあるが、それ自体を資化し得る微生物の報告は希有である。
【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、生物難分解性化合物を特定の微生物を用いて効率的に分解する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ベンゼン環を有する難分解性物質を分解する能力を有する微生物を鋭意探索した結果、Nocardioides属の一部の菌にベンゼン環を有する生物難分解性化合物を資化し増殖し得る微生物を発見し、これを用いることにより生物難分解性化合物を分解し、これらに汚染された物質の浄化を効率的に行うことができることを見出した。すなわち、Nocardioides属の微生物は、生物難分解性化合物によって汚染された土壌、排水、地下水、底質、飛灰等の浄化に好適に使用できる。
【００１１】
本発明に係る分解方法は、ジベンゾフラン、ビフェニルの中の少なくとも１つの生物難分解性有機化合物を、Nocardioides sp. H-1（FERM P-18744）で特定されるジベンゾフラン及びビフェニルを分解する微生物を用いて分解することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る分解方法は、ジベンゾフラン、ビフェニルの中の少なくとも１つの生物難分解性有機化合物に、別に培養したNocardioides sp. H-1（FERM P-18744）で特定されるジベンゾフラン及びビフェニルを分解する微生物を添加し、前記生物難分解性有機化合物を分解することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る浄化方法は、上記分解方法によって、前記生物難分解性有機化合物によって汚染された物質を浄化することを特徴とする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
【００２０】
まず、本発明者らは、ダイオキシン類で汚染された神奈川県引地川および埼玉県綾瀬川および大阪府能勢町の河川水、底泥および土壌を採取した。そして、採取した試料について、次のような培養を行った。
【００２１】
水試料は、スクリューキャップ付きＬ字試験管に試料５ｍＬおよびＲＭ２無機塩合成培地３ｍＬを添加した。また、底泥および土壌についてはＲＭ２無機塩合成培地を添加してよく混合した後に上澄み液をＬ字試験管に８ｍＬ入れた。
【００２２】
次に、これらに、難分解性有機化学物質の代表として２％ジベンゾフランを含有したヘプタメチルノナン溶液０．５ｍＬを添加して３０℃、１２０ｒｐｍの条件下で３日間振とう培養を行った。
【００２３】
これを３回植えつぎ、濁度（６６０ｎｍの吸光度）の上昇および溶液に変色が見られたものを選択し、これらの培地をＳＰ寒天培地、ポリミキシンＢ添加ＳＰ寒天培地およびジベンゾフランを塗布したＲＭ２無機塩合成寒天培地に塗布して３０℃で７日間培養した。
【００２４】
これにより出現したコロニーを釣菌し、ジベンゾフランを塗布したＲＭ２無機塩合成寒天培地に植え継ぐことを２回繰り返すことによりクリーンアップを行ってジベンゾフラン資化性を有する菌株を得た。
【００２５】
ここで、培養に用いた各培地および添加溶液の組成を以下に示す。
【００２６】
表１は、ＲＭ２無機塩合成培地の組成を示す。
【表１】
0004203546.tif 000002
【００２７】
表２は、ＲＭ２無機塩合成培地に用いる微量元素溶液組成を示す。
【表２】
0004203546.tif 000003
【００２８】
表３は、ＲＭ２無機塩合成培地に用いるビタミン溶液組成を示す。
【表３】
0004203546.tif 000004
【００２９】
表４は、ＳＰ培地組成を示す。
【表４】
0004203546.tif 000005
【００３０】
以下に上述のようにして得られた菌株Nocardioides sp. H-1  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７４４（受託番号）の性状を示す。
【００３１】
＜形態上の性質＞
分離菌は好気性でグラム陽性、ＳＰ寒天培地上で薄い乳白色の滑らかなコロニーを形成する。また光学顕微鏡による観察では約１〜２μｍの桿菌で運動性はみられない。
【００３２】
＜生理学的試験結果＞
分離菌の生育ｐＨ範囲はｐＨ５〜８で、至適ｐＨは７であった。Catalase試験、Oxidase試験、炭水化物の資化、加水分解試験等の生理活性試験結果を表５に示した。なお、比較のため、近縁種と考えられるNocardioides simplexとN.nitrophenolicusについて報告されている性状を併記した。
【表５】
0004203546.tif 000006
【００３３】
なお、表５には示されていないが、Elastin、Sodium Citrate、Erythritol、D-Arabinose、L-Xylose、Adonitol、Galactose、L-Sorbose、Dulcitol、Inocitol、Solbitol、α-Methyl-D-Mannoside、α-Methyl-D-Glucoside、N-Acetyl-Gulcosamine、Amygdaline、Lactose、Melibiose、Inuline、Melezitose、D-Raffinose、Glycogene、Xylitol、β-Gentiobiose、D-Lyxose、D-Tagatose、D-Fucose、L-Fucose、D-Arabitol、L-Arabitol、Gluconate、2-Keto-Gluconate、5-Keto-Gluconateの資化・加水分解試験は全株で陰性を示した。
【００３４】
このように、今回得られた菌株は、生理学的にNocardioides simplexや、N.nitrophenolicusとは、異なっていることが分かった。
【００３５】
＜ＤＮＡ相同性の確認＞
１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子塩基配列解析の結果によると、分離菌はN.simplexともっとも近縁であると考えられたため、N.simplexおよびその近縁種のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行った。その結果、N.simplexとは４８％の相同性を示したが、他の４菌種とは３０％以下の低い値を示した。また、N.nitrophenolicusとの相同性は５１％であった。
【００３６】
これらの結果より、本発明により分離された菌株はN.simplexおよびN.nitrophenolicusに遺伝的に比較的近い新種であることが分かった。
【００３７】
＜浄化への適用＞
実浄化にあたってはこの菌株もしくは同属の近縁種で同等の分解性を有する菌が汚染物質中に存在する場合には栄養塩および酸素等の供給を行うことによってNocardioides属の活性を高め、浄化を促進することができる。また、汚染物質にこの菌株もしくは同属の近縁種で同等の分解性を有する菌が確認できない場合には、本菌株を大量培養して汚染物質中に添加することができる。その際の添加方法としては液体培地に懸濁させた状態もしくは担体等に付着させた状態のいずれの方法でもよいが、他の菌体との競合を避け、Nocardioides属を優先的に生育させることが望ましい。担体としては活性炭やポリウレタンフォーム等の一般的な生物処理に使用される担体のほかにゲル中に固定化する方法なども好適である。さらに、汚染物質が排水の場合には通常の生物処理装置の後段に本属を優先的に生育させた反応器を配置する方法なども採用できる。
【００３８】
汚染物質の種類によらず他の微生物が優先的に生育し得る環境中では本属との接触前に汚染物質を熱処理もしくは薬品処理、紫外線処理、オゾン処理、ろ過（孔径１μｍ以下、より望ましくは０．４５μｍ以下）などの方法によって汚染物質中の競合細菌濃度を低下させておくことが望ましい。
【００３９】
熱処理を行う場合の温度としては蛋白質の変性が起こる６０℃以上（より望ましくは８０℃以上）の加熱を行うことが望ましく、薬品による殺菌を行う場合には３％以上の過酸化水素水溶液や６０％以上のエタノール水溶液を用いることが適当である。またこれらの殺菌方法を併用することもできる。
【００４０】
栄養剤としては窒素源およびリン源の添加が挙げられるが、汚染物質中にこれらの栄養源が十分に存在する場合には添加の必要がない場合もある。
【００４１】
窒素源としては硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸、硝酸カルシウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など窒素元素を含む化合物を幅広く使用することができる。また、汚染物質が土壌のような固形物の場合には、徐々に分解し、アンモニウムイオンを放出するような緩効性窒素源を利用することもできる。これらの緩効性窒素源としてはイソブチルアルデヒド加工尿素、アセトアルデヒド加工尿素、ホルムアルデヒド加工尿素、リン酸グアニル尿素等が容易に入手できる。
【００４２】
リン源としてはリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等のリン酸塩等、リン元素を含む化合物を広く用いることができる。また汚染物質中で徐々にリン酸を放出するような緩効性リン酸肥料が容易に入手できるためこれらを用いることも有効である。
【００４３】
なお、初期に菌数を増加させ、処理効果を持続させるという観点で言えば、即効性の栄養源と緩効性栄養源を混合して用いることも有効である。また、窒素およびリンの添加量は対象とする汚染有機物質の量によって決定され、菌体構成元素の理論式から求められる割合であるＣ：Ｎ：Ｐ＝１００：５：１以上の割合で窒素およびリンを添加することが望ましい。この状態で静置することにより汚染物質の分解は促進されるが、菌体の至適温度が３０℃付近であること、好気性の菌株であることを考慮すると、冬場には保温を行い、酸素を供給するため対象汚染物質が液体の場合にはエアーパージ、固体の場合には混合操作等を行うことが望ましい。また、酸素供給には過酸化水素含有薬剤や市販の固体酸素供給剤等を添加することも有効である。
【００４４】
汚染区域における浄化処理は、例えば図１に示すように、まず汚染区域について、滅菌処理を行う（Ｓ１１）。また、並行して、分解菌（Nocardioides sp. H-1）を培養しておく（Ｓ１２）。そして、滅菌処理を行った汚染区域に培養菌を添加する（Ｓ１３）とともに、栄養源、酸素を供給する（Ｓ１４）。これによって、汚染区域（土壌、地下水等）において、分解菌が優先的に増殖し、処理対象となっている生物難分解性化合物が分解される。
【００４５】
また、水系の汚染に対しては、通常の活性汚泥処理などの処理を経た処理水について、活性炭などを用いた吸着処理を行い難分解性化合物を濃縮し、これを上述の分解菌を用いて分解処理することも考えられる。
【００４６】
【実施例】
（実施例１）
Ｌ字型に作成したスクリューキャップ付き試験管（容量約２０ｍＬ）にＲＭ２無機塩培地約８ｍＬを加え、Nocardioides sp. H-1を接種した。ここに２％ジベンゾフラン含有ヘプタメチルノナン０．５ｍＬを添加し、１２０ｒｐｍ，３０℃の条件下で振とう培養を行った。この時の溶液におけるＯＤ６００の変化を測定することによりジベンゾフラン資化能の測定を行った。
【表６】
0004203546.tif 000007
【００４７】
その結果、明らかな菌体の増殖が確認され、本菌株がジベンゾフラン資化、分解能を有することが確認された。
【００４８】
（実施例２）
実施例１と同様にジベンゾフランをビフェニルに変えて同一条件下での測定を行った。
【表７】
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【００４９】
その結果、本菌株は反応は遅いものの、ビフェニルも資化、分解可能であることが確認された。
【００５０】
（実施例３）
容量５００ｍＬの綿栓付き三角フラスコにＳＰ培地約２００ｍＬを入れ、オートクレーブで滅菌した後、Nocardioides sp. H-1を接種し、１２０ｒｐｍ，３０℃の条件下で振とう培養を行った。十分な菌体濃度の上昇が確認された後に３０００ｒｐｍの遠心分離器で沈降させ、滅菌したＲＭ２無機塩培地で二回洗浄を行い集積菌を得た。次に容量７００ｍＬのバイアル瓶に滅菌したＲＭ２培地２００ｍＬを加え、先に集積した菌株を懸濁させた後にｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−１，３−ジクロロプロペンをそれぞれ１．５ｍｇ／Ｌとなるように添加し、密栓して１００ｒｐｍ，３０℃の条件下で３日間振とうを行った。その後溶液の一部を採取してＧＣ−ＭＳによる定量を行った。また、比較として同様にNocardioides sp. H-1で調整して１２０℃，１５分の条件で滅菌したものにｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−１，３−ジクロロプロペンをそれぞれ１．５ｍｇ／Ｌとなるように添加し、反応させたものについても測定を行った。
【表８】
0004203546.tif 000009
【００５１】
その結果、塩素化された生物難分解性物質であるジクロロプロペンの分解性も非常に良いことが確認された。
【００５２】
以上のように、本菌株は多環芳香族化合物および塩素化された物質まで幅広い生物難分解性物質を分解、資化し得ることが明らかとなった。この菌を用いることにより様々な生物難分解性物質を分解処理できる。
【００５３】
【発明の効果】
以上説明したように、Nocardioides属の一部の菌を用いることにより生物難分解性化合物を効率的に分解し、物質の浄化を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  処理の一例を示す図である。
【図１】
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