(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-グルカナーゼを産生する微生物であるバシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とするβ-グルカン分解活性を有する酵素。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列の３２〜３０８位に対応するアミノ酸配列を含むことを特徴とするβ-グルカン分解活性を有する酵素。
【請求項４】
請求項２または３のいずれかに記載の酵素をコードしている遺伝子。
【請求項５】
食品工業において膜および装置を洗浄する際にグルカンおよび／またはリケナンを除去するための、請求項２または３のいずれかに記載のβ-グルカン分解活性を有する酵素の使用。
【請求項６】
食品工業において膜および装置を洗浄する際にグルカンおよび／またはリケナンを除去するための方法であって、請求項２または３のいずれかに記載のβ-グルカン分解活性を有する酵素を使用することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(技術分野)
本発明は、１,３-および１,４-β-グルコシド結合によって交互に結合している混合グルカンを、オリゴサッカリドに加水分解切断することができる酵素、ならびに、この酵素を生成する微生物に関する。
【０００２】
(背景技術)
上記のような酵素は、エンド-１,３-１,４-β-Ｄ-グルカン-４-グルカノヒドロラーゼ(ＥＣ ３.２.１.７３；リケナーゼ)またはエンド-１,３-β-Ｄ-グルコシダーゼ(ＥＣ ３.２.１.３９；ラミナリナーゼ)のクラスに属する。本発明のために本明細書においては、このような種類の酵素をβ-グルカナーゼまたはベータ-グルカナーゼと呼ぶ。
【０００３】
上記した種類のポリマー性混合グルカンは、実質的に全ての穀物産物中に異なる量で存在する。これらを切断することができる酵素が、特に、食品、飲料および動物飼料工業において、織物工業において、ならびに、デンプンの加工において必要とされている[R.Borrissの「β-グルカン切断酵素」、H.Ruttloffの「工業用酵素」中、第11.5章、Behr's Verlag、ハンブルグ (1994)]。β-グルカナーゼの最も重要な応用分野の１つは、飲料および醸造工業における応用であり、ここでこれらの酵素は、麦芽や大麦のβ-グルカンを分解するために使用される。
【０００４】
この目的で使用される酵素は、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)(例えば、ドイツ特許出願公開Ｎo.226 012に記載されている)またはバシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)に由来するのが普通であるが、他の微生物、例えばアクロモバクター・ルナタス(Achromobacter lunatus)、アトロバクター・ルテウス(Athrobacter luteus)、アスペルギラス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギラス・ニガー(Aspergillus niger)、ディスポロトリチュム・ジモルホスポラム(Disporotrichum dimorphosporum)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、ペニシリウム・エメルソニー(Penicillium emersonii)、ペニシリウム・フニクロサム(Penicillium funiculosum)またはトリコデルマ・レーセイ(Trichoderma reesei)に由来するβ-グルカナーゼも知られている。醸造工業における使用が意図されている商業製品が、例えばセレフロ(CerefloR)(製造元：Novo Nordisk A/S)の名称で市販されている。
【０００５】
これまで知られているβ-グルカナーゼは、弱い酸性ないし中性の範囲にpＨ最適値を持つので、これらの使用は、このpＨ値で実施される方法に制限されている。本発明が指向する課題は、β-グルカナーゼの応用分野を広げること、および、アルカリ性条件下で実施される工業過程において使用するための、このような条件下で充分に安定であるβ-グルカナーゼを開発することであった。
【０００６】
(発明の開示)
本発明は、冒頭に記載したグルカン分解活性を有するバシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)ＤＳＭ９９５６から得られる酵素、β-グルカナーゼを産生する微生物バシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６、ならびに、本発明に到達する研究の過程において同定および配列決定したバシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６由来のβ-グルカナーゼをコードしている遺伝子(配列番号２)に関する。
【０００７】
所望により、この遺伝子を既知の方法により他の細菌中にクローン化し、そこでβ-グルカナーゼを発現させることができる。従って、本発明は、本質的に微生物学的方法によって得られるこの遺伝子を含有する宿主生物にも関する。
【０００８】
(発明を実施するための最良の形態)
バシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６由来のβ-グルカナーゼ遺伝子の配列から導かれる、該微生物から得られる本発明のβ-グルカナーゼのアミノ酸配列(配列番号１)が、図１に一文字表記で示されている。
【０００９】
シグナルペプチド[これは、微生物の細胞壁を通って移送された後にシグナルペプチダーゼによって切断され、文献(M.E.Louw, S.J.Reid, Watson, Appl.Microbiol.Biotech. 39 (1993), 507-513)からの既知データとの比較により、３１アミノ酸からなると推定される]を含むバシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６由来のβ-グルカナーゼは、３０８アミノ酸からなる。
【００１０】
対応する微生物はグラム陽性であり、その細胞形態は桿状である(幅が約０.７〜０.９μｍであり、長さが約２.５〜４.０μｍである)。この微生物は、出願人により、１９９５年４月１３日にＤＳＭ(Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig)に寄託されており、番号ＤＳＭ９９５６を付与されている。
【００１１】
本発明のβ-グルカナーゼは、バシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６由来のβ-グルカナーゼに対して、７０％以上、より具体的には７５〜９９％の相同性を有するのが好ましい。同じことが基礎遺伝子に当てはまる。
【００１２】
本発明の酵素は、食品工業において、より具体的には飲料および醸造工業において、より具体的にはこれら工業において膜および他の装置を洗浄する際にグルカンおよび／またはリケナンを除去するために使用するのが好ましい。
【００１３】
また本発明は、本発明のβ-グルカナーゼを用いて、食品工業、より具体的には醸造工業において膜および他の装置を洗浄する際にグルカンおよび／またはリケナンを除去するための方法に関する。
【００１４】
実施例
実施例１
バシラス・アルカロフィラスＣ／Ｍ２-３からの染色体ＤＮＡをＳau３Ａで部分的に消化し、４〜８kbの大きさのフラグメントの分画をゲル電気泳動によって単離した。大腸菌(Ｅ.coli)-バシラスのシャトルベクターであるプラスミドpＭＫ４[M.A.Sullivanら、Gene 29 (1984), 21-26]のＢamＨ１部位に連結した後、これをコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞中に導入した。β-グルカナーゼ活性を有する組換えクローンを、０.２％リケニンを含むＬＢプレート(pＨ８.５)上でコンゴ・レッド(Congo Red)を用いて着色することによって同定した。
【００１５】
β-グルカナーゼを、大腸菌ＤＨ５α pＭＫ４において、クローンの細胞上清から精製した。細胞を含まない上清を２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.５)に対して透析した後、透析液をＱ-セファロース(Q-Sepharose; Pharmacia)に固定し、２５mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.５またはpＨ９.０)中の０〜１Ｍ ＮaＣlの直線勾配液で溶離した。
【００１６】
グルカン分解活性の検出および測定は、Ｍ.Ｌever[Anal.Biochem. 47 (1972), 273-279およびAnal.Biochem. 81 (1977), 21-27]が記載している方法の修飾法に基づいた。５０mＭグリシン緩衝液(pＨ９.０)中のβ-グルカン(Sigma No. G6513)の０.５重量％溶液を、この目的に用いた。この溶液(２５０μl)を、グルカン分解活性の試験をすべき物質を含む溶液(２５０μl)に添加し、４０℃で３０分間インキュベートした。次いで、１mＭの硝酸ビスマスおよび１mＭの酒石酸ナトリウムカリウムを含有する０.５Ｍ ＮaＯＨ中のｐ-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド(ＰＡＨＢＡＨ)の１重量％溶液(１.５ml)を添加し、その後に、この溶液を７０℃に１０分間加熱した。冷却(２分間／０℃)の後、４１０nmでの吸光を、例えばユビコン(UvikonR)９３０光度計を用い、グルコース検量線を用いて室温でブランク値に対して測定した。ブランク値は、グルカン溶液をＰＡＨＢＡＨ溶液の後に添加することを除き、測定溶液と同じ方法で調製した溶液であった。１Ｕは、このような条件下で１分間あたりに１μモルのグルコースを生成する酵素量に相当する。
【００１７】
このようにして得た酵素の比活性は、１mgのタンパク質あたり４３９０mＵに達したが、その一方、出発溶液の活性は、１５２のファクターで低かった。この酵素は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において、均質なバンドとして着色された(銀着色)。
【００１８】
内部標準としてマーカータンパク質(シトクロムｃ、ウマミオグロビン、キモトリプシノーゲン、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン)を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、バシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６由来のβ-グルカナーゼの分子量を約３０,０００であると概算した。
【００１９】
等電点電気泳動(pＨ３〜９)において、β-グルカナーゼの等電点は、活性着色によりpＨ５.２にあることがわかった。
【００２０】
実施例２(pＨプロフィール)
種々のpＨ値でのグルカン分解活性の測定を、デイビス(Davies)汎用緩衝液[１Ｌの蒸留水中に、２１.０１ｇのクエン酸・Ｈ2Ｏ、１３.６１ｇのＫＨ2ＰＯ4、１９.０７ｇのＮa2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、１２.１１ｇのトリスおよび７.４６ｇのＫＣl；５０mlのこの保存溶液を、０.４Ｎ ＮaＯＨを用いて所望のpＨに調整し、蒸留水を用いて２００mlにした]において、４０℃で、３０分間のインキュベート後に行った。図２に示すpＨプロフィール(相対グルカン分解活性をpＨに対してプロットした)から明瞭にわかるように、この酵素は、pＨ６〜１０.５のところで最も活性であった。最適値はpＨ９にある。
【００２１】
実施例３(温度プロフィール)
バシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６から得られるβ-グルカナーゼのグルカン分解活性の温度依存性を、グリシン／ＮaＯＨにおいて、pＨ９で、１５分間のインキュベート後に測定した。この緩衝液は１℃あたりpＨ約０.０３３の温度依存性を有しているので、試験溶液のpＨ値を適合させた。図３(酵素の相対グルカン分解活性を温度Ｔに対してプロットした)に示すように、グルカン分解活性の最大値は６０℃にある。
【００２２】
配列表
一般的情報：
出願人：
名称：コグニス・ゲゼルシャフト・ヒュア・ビオテクノロギー・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
通り：ヘンケルシュトラーセ６７番、ゲボイデＹ２０
市：デュッセルドルフ
州：ノルトライン−ヴェストファーレン
郵便番号：４０５８９
電話番号：０２１１−７９７６７６３
ファックス番号：０２１１−７９８７６０７
発明の名称：  バシラス由来の新規なβ−グルカナーゼ
配列の数：  ２
連絡先：
名宛人：コグニス・ゲゼルシャフト・ヒュア・ビオテクノロギー・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
通り：ヘンケルシュトラーセ６７番、ゲボイデＹ２０
市：デュッセルドルフ
州：ノルトライン−ヴェストファーレン
郵便番号：４０５８９
コンピューター解読書式：
媒体型：フロッピー・ディスク
コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
オペレーティング・システム：ＭＳウィンドウズ
ソフトウエア：ＭＳ ＷＯＲＤ ９７
【００２３】
配列番号１の情報：
配列の特徴：
長さ：３０８アミノ酸
型：アミノ酸
トポロジー：未詳
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル配列：ＮＯ
配列：配列番号１：
0004222723.tif 000002
0004222723.tif 000003
【００２４】
配列番号２の情報：
配列の特徴：
長さ：９２７塩基対
型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源：
株名：バシラス・アルカロフィラスＤＳＭ９９５６
配列：配列番号２：
0004222723.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のβ-グルカナーゼのアミノ酸配列(一文字表記)を示す図である。
【図２】  本発明のβ-グルカナーゼのグルカン分解活性のpＨプロフィールを示す図である。
【図３】  本発明のβ-グルカナーゼのグルカン分解活性の温度プロフィールを示す図である。
【図１】
0004222723.tif 000005
【図２】
0004222723.tif 000006
【図３】
0004222723.tif 000007