(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載の１位のアミノ酸から190位のアミノ酸までのアミノ酸配列をＮ−末端領域とし、そして配列番号：10に記載の191位のアミノ酸から893位のアミノ酸までのアミノ酸配列をＣ−末端領域とするキメラ熱安定性DNAポリメラーゼにおいて、46位のGlyがAspにより置換されており、323位のAspがAlaにより置換されており、325位のGluがAlaにより置換されており、且つ730位のPheがTyrにより置換されている熱安定性DNAポリメラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の熱安定性DNAポリメラーゼをコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
【請求項４】
熱安定性DNAポリメラーゼの製造方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、熱安定性DNAポリメラーゼの発現を促進する条件下で培養し；そして
（ｂ）前記宿主細胞から熱安定性DNAポリメラーゼを単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項５】
核酸増幅又は配列決定反応への請求項１に記載の熱安定性DNAポリメラーゼの使用。
【請求項６】
請求項１に記載の熱安定性DNAポリメラーゼ、及び１又は複数の非イオン性ポリマー界面活性剤を含んで成る核酸配列決定用又は核酸増幅用組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の熱安定性DNAポリメラーゼを含んで成る、プライマー延長反応を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、それらの合成方法、及びそれらの使用方法に関する。前記酵素は、多くの組換えＤＮＡ技法、特に核酸配列決定、及びポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを形成するためにデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の鋳型−指令された（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）重合を触媒する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、種々のインビトロＤＮＡ合成用途、例えばＤＮＡ配列決定及びＤＮＡ増幅に使用される。典型的には、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチド類似体の組込みに対して強く識別する。この性質が、ＤＮＡ複製及び修復の同一性に寄与する。しかしながら、ヌクレオチド類似体の組込みは、多くのＤＮＡ合成用途、特にＤＮＡ配列決定のために有用である。
【０００３】
引用により本明細書に組込まれるＳａｎｇｅｒなど．，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４；５４６３−５４６７により初めに記載された鎖終結（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法を用いるＤＮＡ配列決定反応は、合成の終結のために異例な基質、すなわちジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）に頼る。この鎖終結方法においては、ＤＮＡポリメラーゼの従来の基質（ｄＮＴＰ）及び鎖終結性の異例な基質（ｄｄＮＴＰ又はラベルされたｄｄＮＴＰ）の両者が、反応に存在する。合成は、ｄｄＮＴＰが組込まれるまで進行する。鎖−終結ｄｄＮＴＰが適切な割合で組込まれることを保証するためには、ｄｄＮＴＰの組込みに対する、これまでに利用されたＤＮＡポリメラーゼの固有の識別能が、過剰のｄｄＮＴＰを供給することによって克服された。
【０００４】
色素−ターミネーター配列決定、すなわち鎖終結法の変法は、合成を終結し、そして同時に、合成されたＤＮＡをラベルするために、蛍光色素、たとえばフルオレセイン又はローダミンによりラベルされたｄｄＮＴＰを使用する。ｄｄＮＴＰ上での色素ラベルの存在は、異例な基質の導入に対するＤＮＡポリメラーゼによる識別性を悪化せしめる。
典型的には、鎖終結方法による配列決定は、プライマー延長の反復された段階、続くプライマー延長生成物−鋳型複合体の熱変性を用いて実施される。サイクル配列決定として言及されるこの態様は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて熱サイクラーにおいて実施される。サイクル配列決定を実施するためのキットは、たとえばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから市販されている。
【０００５】
種々の生物に由来する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、文献に多数記載されており、そして当業者に良く知られている。特定の例としては、サーマス属の種々の種（アメリカ特許第５，４６６，５９１号を参照のこと）、特に、アメリカ特許第４，８８９，８１８号；第５，３５２，６００号；及び第５，０７９，３５２号に記載されるサーマス・アクアチカスからのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）；並びにアメリカ特許第５，３７４，５５３号及び第５，４２０，０２９号に記載されるサーマトガ・マリチマからのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ）を挙げることができる（前記特許のすべては、引用により本明細書に組込まれる）。
【０００６】
ＤＮＡポリメラーゼは典型的には、１又は複数の関連するエキソヌクレオチド分解活性を有する。たとえば、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡの５′−末端（５′→３′エキソヌクレアーゼ活性又は５′−ヌクレアーゼ活性として言及される）、及び一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３′−末端（３′→５′エキソヌクレアーゼ活性として言及される）からのヌクレオチドのエキソヌクレオチド分解除去を触媒する。対照的に、サーマス属からのＤＮＡポリメラーゼは、５′−ヌクレアーゼ活性のみを有する。
【０００７】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの関連する活性の総説は、Ａｂｒａｍｓｏｎ，１９９５，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔａｇｉｅｓ（Ｉｎｎｉｓなど．ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見出される。ＤＮＡ配列決定への使用のためには、関連するエキソヌクレオチド分解活性；すなわち５′−ヌクレアーゼ活性又は３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のいづれかを欠いているＤＮＡポリメラーゼが好ましい。５′−ヌクレアーゼ活性を欠いている多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの変異形が、アメリカ特許第５，４６６，５９１号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。
【０００８】
ヨーロッパ特許出願第０６５５５０６号（引用により本明細書に組込まれる）は、ジデオキシヌクレオチドを組込む増強された能力を有する変異誘発されたＤＮＡポリメラーゼを記載する（また、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第５，６１４，３６５号も参照のこと）。その変異は、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸５２６に対応する点変異である。そのような変異の例は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸６６７における変異を包含する。
【０００９】
Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ、すなわち５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に有さず、そしてＦ６６７Ｙ変異を組込むＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変異形は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴによりＤＮＡサイクル配列決定キットの成分として市販されている。Ｆ６６７Ｙ変異は、ｄｄＮＴＰに対する識別における有意な低下をもたらす。この性質は、色素−ターミネーター配列決定反応から得られた配列決定データを非常に改良し、そして個々の配列決定反応のために必要とされるｄｄＮＴＰの量を減じる。
【００１０】
しかしながら、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳの使用は、標準的ローダミン色素ファミリーによりラベルされたｄｄＮＴＰと共に使用される場合、配列決定トレースにおけるピークの高さの不均等性に関する問題を排除しない。色素−ターミネーターサイクル配列決定反応におけるＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いて得られたピークの高さのパターンの分析が、Ｐａｒｋｅｒなど．，１９９６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１（４）：６９４−６９９（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。
【００１１】
当業者に知られている、分子生物学及び核酸化学の従来の技法は、文献に十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ．ｅｄｓ．，１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）（すべては、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。そこに引用されるすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
【００１２】
【発明の要約】
本発明は、これまで記載された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して有意に改良された性質を有する変異キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。前記ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定反応に使用される場合、実質的な改良点を付与する。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、次の好都合な性質の組合せを提供する：
−ｄｄＮＴＰの改良された組込み；
−特に、サイクル配列決定反応において色素−ラベルされたｄｄＮＴＰと共に使用される場合、ＤＮＡ配列決定トレースにおけるピークの高さの改良された均等性；
−色素−ラベルされたｄｄＮＴＰのピロリン酸分解の速度の抑制；及び
−ｄＩＴＰの改良された組込み。
【００１３】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、組換え発現系において高いレベルで容易且つ効果的に発現され得、それにより、酵素の商業的製造を促進する。本発明のＤＮＡポリメラーゼが有する前記性質の組合せは、文献においてこれまで記載された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも有意な利点を表わす。
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインに由来するＮ−末端領域、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインに由来するＣ−末端から成る。
【００１４】
前記Ｎ−末端領域は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１３８に対応するサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域を少なくとも含み、そしてサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの完全な５′−ヌクレアーゼドメインまでを含むことができる。前記Ｃ−末端領域は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインの他に、Ｎ−末端領域に存在しないサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインの部分に対応するＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインの部分を含む。
【００１５】
従って、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ−末端領域及びＣ−末端領域から成り、ここで前記Ｎ−末端領域は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１〜ｎから成り、ここでｎはＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１３８−２９１に対応する、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域内のアミノ酸位置であり、そして前記Ｃ−末端領域は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸ｍ＋１〜８９３から成り、ここでＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるアミノ酸ｍは、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ及びサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼが図におけるように整列される場合、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼにおけるアミノ酸ｎに対応する。
【００１６】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチドを組込むＤＮＡポリメラーゼの能力を高める、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来するＤＮＡポリメラーゼにおけるＦ７３０Ｙ変異により修飾される。
１つの態様においては、キメラＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ、又は好ましくは不活性化する少なくとも１つの点変異を含む。その変異は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインに由来するＮ−末端に、又は存在するなら、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインに由来するＣ−末端領域の部分に存在することができる。
【００１７】
適切な変異は、ＤＮＡポリメラーゼにおける５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ、又は好ましくは不活性化するそれらの変異（単一のアミノ酸置換又は欠失変異）である。従って、Ｎ−末端領域が、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼにおける５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じるか又は排除する少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失により修飾され、又は前記Ｃ−末端領域が、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおける５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じるか、又は排除するＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸ｍ＋１〜２９１である領域内での少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失により修飾される。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼ活性に対して決定的であるアミノ酸位置は、本明細書に記載されるように、良く知られている。１又は複数のそれらの決定的位置でのアミノ酸の置換、又は１又は複数のそれらの決定的位置でのアミノ酸の欠失は典型的には、５′−ヌクレアーゼ活性の低下をもたらす。好ましくは、キメラＤＮＡポリメラーゼは、５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じるか、又は不活性化する変異を含む。
【００１９】
１つの態様において、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する３′→５′−エキソヌクレアーゼドメインを含むＣ−末端領域は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減じるか、又は好ましくは不活性化する少なくとも１つの点変異を含む。
ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性に対して決定的であるアミノ酸位置は、本明細書に記載されるように良く知られている。１又は複数のそれらの決定的位置でのアミノ酸の置換、又は１又は複数のそれらの決定的位置でのアミノ酸の欠失は、典型的には、３′→５′−ヌクレアーゼ活性の低下をもたらす。好ましい態様においては、Ｃ−末端領域は、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を不活性化する、Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異を含む。
【００２０】
１つの態様において、Ｎ−末端領域は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する。好ましい態様においては、Ｎ−末端領域は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０から成り、そしてＣ−末端領域はＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−８９３から成る。Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０ＤＮＡポリメラーゼと称する特に好ましい態様においては、Ｎ−末端領域はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０から成り、そしてＧ４６Ｄ変異を含み、そしてＣ−末端領域は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−８９３から成り、そしてＤ３２３Ａ，Ｅ３２５Ａ及びＦ７３０Ｙ変異を含む。
【００２１】
本発明のもう１つの観点は、本発明の変異キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする精製されたＤＮＡ（キメラ遺伝子）、前記ＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、及び前記組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。サイレントヌクレオチド変化によってのみ異なる（すなわち、同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。
【００２２】
本発明の好ましい態様においては、精製されたＤＮＡは、Ｇ４６Ｄ変異をコードするよう修飾されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド１−５７０、及びＤ３２３Ａ，Ｅ３２５Ａ及びＦ７３０Ｙ変異をコードするよう修飾されたＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド５７１−２６７９から成る。
本発明のもう１つの観点は、本発明の精製されたＤＮＡを用いて、本発明の変異キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造するための方法に関する。組換え発現ベクターは、宿主細胞において発現され、そしてその発現されたタンパク質は宿主細胞から精製される。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明は、変異キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び前記酵素を製造するための手段を提供する。本発明の理解を促進するために、多くの用語が下記に定義される。
用語“細胞”、“細胞系”、及び“細胞培養物”は、交換可能的に使用され得、そしてすべてのそのような名称は子孫を包含する。従って、用語“形質転換体”又は“形質転換された細胞”は、形質転換された一次細胞、及びトランスファーの数に関係なくその細胞に由来する培養物を包含する。すべての子孫は、意図的な又は偶然な変異のために、ＤＮＡ含有率においては、正確には同一ではない。初めに形質転換された細胞においてスクリーンされる場合、同じ官能性を有する変異子孫が、形質転換体の定義に包含される。
【００２４】
用語“制御配列”とは、特定の宿主生物においての作用可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を意味する。たとえば、原核生物のために適切である制御配列は、プロモーター、任意には、オペレーター配列、リボソーム結合部位、正のレトロレギュレーション要素（引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第４，６６６，８４８号を参照のこと）、及びおそらく他の配列を包含する。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２５】
用語“発現クローン”とは、作用可能な連鎖で所望のコード配列及び制御配列を含むＤＮＡ配列を意味し、その結果、それらの配列により形質転換された宿主は、コードされたタンパク質を生産することができる。用語“発現系”とは、発現クローンにより形質転換された宿主を意味する。形質転換をもたらすためには、発現クローンがベクター上に含まれ得るが、しかしながら、その対応するＤＮＡはまた、宿主染色体中に組込まれてもよい。
用語“遺伝子”とは、回収できる生物活性ポリペプチド又は前駆体の生成のために必要な制御及びコード配列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。
【００２６】
用語“作用可能に連結される”とは、制御配列がコード配列によりコードされるタンパク質の発現を誘導するよう機能するであろうようなコード配列の位置を意味する。従って、配列を制御するために、“作用可能に連結される”コード配列は、そのコード配列が制御配列の指令下で発現され得る配置を意味する。
【００２７】
用語“オリゴヌクレオチド”とは、本明細書において使用される場合、複数のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。その正確な大きさは、多くの要因に依存し、すなわちオリゴヌクレオチドの究極的な機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、たとえば適切な配列のクローニング及び制限酵素処理を包含する任意の適切な方法、及び次の方法による直接的な化学合成により調製され得る：Ｎａｒａｎｇなど．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎなど．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅなど．，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１  ８５９−１８６２のジエチルホスホラミジット方法；及びアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法（それらの文献は、引用により本明細書に組込まれる）。合成方法の総説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５−１８７（引用により本明細書に組込まれる）に提供される。
【００２８】
用語“プライマー”とは、本明細書において使用される場合、プライマー延長が開始される条件下で配置される場合、合成の開始の点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。核酸鎖に対して相補的であるプライマー延長生成物の合成は、適切な温度で、適切な緩衝液において、必要な４種の異なったヌクレオシド三リン酸及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で開始される。“緩衝液”は、補因子（たとえば二価の金属イオン）、及び所望するpHに調節された塩（適切なイオン強度を提供するために）を包含する。
【００２９】
遺伝子配列の非コード鎖にハイブリダイズする（同等には、コード鎖のサブ配列である）プライマーは、本明細書においては、“上流”プライマーとして言及される。遺伝子配列のコード鎖にハイブリダイズするプライマーは、本明細書において、“下流”プライマーとして言及される。
用語“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”とは、特定のヌクレオチド配列で又はその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する、典型的には細菌起源の酵素を意味する。
【００３０】
用語“熱安定性酵素”とは、本明細書で使用される場合、熱に対して安定であり、そして高温反応最適条件を有する酵素を意味する。本発明の熱安定性酵素は、６０〜９０℃の温度でプライマー延長を最適に触媒し、そして典型的には、サイクル配列反応及びポリメラーゼ連鎖反応増幅において使用される温度サイクル条件下で使用できる（引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第４，９６５，１８８号に記載される）。
本明細書において使用される場合、アミノ酸配列における“点変異”とは、単一のアミノ酸の置換又は単一のアミノ酸の欠失のいづれかを意味する。点変異は好ましくは、コードＤＮＡにおける適切なコドン変化によりアミノ酸配列中に導入される。
【００３１】
配列における個々のアミノ酸は、本明細書においてＡＮとして表わされ、ここでＡは配列におけるアミノ酸についての標準の一文字記号であり、そしてＮは前記配列における位置である。アミノ酸配列内の変異は、本明細書においてＡ1 ＮＡ2 として表わされ、ここでＡ1 は変異誘発されていないタンパク質配列におけるアミノ酸についての標準の一文字記号であり、Ａ2 は変異誘発されたタンパク質配列におけるアミノ酸についての標準の一文字記号であり、そしてＮはアミノ酸配列における位置である。
【００３２】
たとえば、Ｇ４６Ｄ変異は、アミノ酸位置４６でのグリシンからアスパラギン酸への変更を表わす。そのアミノ酸位置は、変異を包含する領域が由来するタンパク質の完全な長の配列に基づいて番号付けされる。従って、本発明においては、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼに由来するタンパク質の領域における変異が、完全な長さのサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ配列に従って番号付けされ、そしてＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する領域における変異が完全な長さのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ配列に従って番号付けされる。ＤＮＡ配列におけるヌクレオチド及び点変異の表示は類似する。
【００３３】
本明細書において使用される場合、“キメラ”タンパク質とは、そのアミノ酸配列が少なくとも２つの異なったタンパク質からのアミノ酸配列のサブ配列の融合生成物を表わすタンパク質を意味する。キメラタンパク質は、好ましくは、アミノ酸配列の直接的な操作により生成されないが、しかしむしろ、キメラアミノ酸配列をコードする“キメラ”遺伝子から発現される。本発明のキメラタンパク質は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼに由来するアミノ−末端（Ｎ−末端）、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来するカルボキシ−末端（Ｃ−末端）から成る。
【００３４】
前記Ｎ−末端領域は、Ｎ−末端（アミノ酸位置１）から内部アミノ酸に延長する領域を意味する。同様に、前記Ｃ−末端領域は、内部アミノ酸からＣ−末端に延長する領域を意味する。本発明のキメラタンパク質においては、Ｎ−末端領域はＮ−末端（アミノ酸位置１）からＣ−末端領域の開始点（これは、Ｃ−末端に延長する）に延長する。従って、一緒に取られる場合、Ｎ−末端及びＣ−末端領域は、完全なアミノ酸配列を包含する。
【００３５】
ＤＮＡポリメラーゼに関連するエキソヌクレオチド分解活性（３′→５′エキソヌクレアーゼ活性及び５′−ヌクレアーゼ活性、また５′→３′エキソヌクレアーゼ活性としても言及される）、及びそれらの活性を測定する方法は、当業界において知られている。本明細書において使用される場合、活性は、変異誘発されていない酵素に存在する活性の、約２０％以下、好ましくは、約１０％以下、そしてより好ましくは約１％以下に減じられる場合、“実質的に減じられる”。活性は、酵素の典型的な又は好ましい使用のために無視できるレベルに減じられる場合、“不活性化され”、又は“実質的に不活性化される”。
【００３６】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
本発明の典型的な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ−末端領域がサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端領域から成り、そしてＣ−末端領域がＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端領域から成るキメラＤＮＡポリメラーゼである。サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのＮ−末端領域は、５′−ヌクレアーゼドメインの一部又はすべてを包含する。Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼからのＣ−末端領域は、５′−ヌクレアーゼドメインの一部を含むか、又はおそらく全く含まず、且つ完全な３′→５′エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。
【００３７】
キメラタンパク質のＣ−末端領域により包含されるＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインの一部は、キメラタンパク質のＮ−末端領域により包含されないサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのその一部に対応するであろう。
キメラＤＮＡポリメラーゼはさらに、ＤＮＡポリメラーゼがｄｄＮＴＰを組込む効率を高めるＦ７３０Ｙ変異を含む。キメラＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはまた、５′−ヌクレアーゼ活性を有意に減じるか又は排除する１又は複数の点変異、及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有意に減じるか又は排除する１又は複数の点変異を含む。
【００３８】
１．キメラタンパク質ドメイン
サーマス属の種からのＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼは、全体の構造において類似する。それらのＤＮＡポリメラーゼにおいては、エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ活性は、タンパク質の別々の領域（活性ドメイン）に存在する。代表的なサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのおおまかな活性ドメインは、下記表に示されている（また、アメリカ特許第５，４２０，０２９号を参照のこと）。
【００３９】
５′−ヌクレアーゼ活性をコードする相同活性ドメイン、及びＤＮＡポリメラーゼ活性をコードするそれらのドメインは、ほぼ同じ長さである（図１及び２を参照のこと）。Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をコードする領域と、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるその対応する領域との間の長さの差異は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の欠失に対応する。
【００４０】
【表１】
0004350815.tif 000002
【００４１】
有意なアミノ酸類似性が、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼとＴｍａＤＮＡポリメラーゼとの間に存在する。たとえば、欠失パラメーター値を有するＧＡＰコンピュータープログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いての、代表的なサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列比較は、そのアミノ酸配列がその完全なアミノ酸配列又は５′−ヌクレアーゼドメインのいづれかに対して約４４％同一であり、そして６６％類似する。
【００４２】
全体の構造の及び配列の類似性のために、キメラ酵素はＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに存在する全体の構造及び活性ドメインを保存する。実質的な変化は、キメラ酵素のＮ−末端領域のアミノ酸配列がサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼのその対応する領域のアミノ酸配列であることである。従って、本発明のキメラ酵素は、その５′−ヌクレアーゼドメインがサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのその対応するドメインにより置換されている変異誘発されたＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに対応する。その“対応するドメイン”とは、本明細書において、図に提供されるように、アミノ酸配列の整合性により定義される。
【００４３】
図１及び２は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び７種の代表的なサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列整合性を提供する。７種の代表的なサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼは、本明細書において使用される略語、及び５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列のための配列番号と共に下記表に列挙される。
【００４４】
【表２】
0004350815.tif 000003
【００４５】
それらのＤＮＡポリメラーゼ内のアミノ酸及び領域の対応は、アミノ酸配列整合から得られる。本明細書で使用される場合、アミノ酸は、それらが図１及び２の配列整合で配列される場合、“対応する”。従って、対応とは、配列間で同一である（保存される）アミノ酸及び同一ではないが、しかし全体の配列相同性を最大にするために整合されるアミノ酸の両者を意味する。
【００４６】
サーマス属の多くのさらなる種が同定されており、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及びＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）のような寄託機関から入手できる。下記で論ぜられるように、ＤＮＡポリメラーゼ及びコード遺伝子は、寄託された菌株から回収され、そして通常の手段で配列決定され得る。たとえばＧＡＰプログラムを用いてのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ配列とサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ配列とのアミノ酸配列の通常の配列整合は、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼへのサーマスＤＮＡポリメラーゼ配列の使用を可能にするであろう。
【００４７】
本発明のキメラタンパク質においては、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼからの領域の最初のアミノ酸が、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ配列の最後のアミノ酸に対応するアミノ酸に続くアミノ酸により開始し、そしてＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ配列の残り（アミノ酸８９３まで）を含むであろう。完全なＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの配列は、配列番号１０として提供される。
【００４８】
好ましくは、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのアミノ酸配列は、２種のアミノ酸配列が同一であるか又は類似する点で、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼからのアミノ酸配列に連結される。たとえば、好ましい態様は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼからのアミノ酸１−１９０及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−８９５から成る。Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９０は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９０に対応し、そしてキメラ酵素のＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ部分は、次のアミノ酸、すなわちアミノ酸１９１から開始する。
【００４９】
２種のＤＮＡポリメラーゼが同一である領域においては、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからの最後のアミノ酸の同定は、前記領域内で任意である。たとえば、アミノ酸１９１及び１９２はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおいて同一である（そして、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ内で保存される）ので、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０を含むキメラタンパク質は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９１又は１−１９２を含むキメラタンパク質から区別がつかない。実施例に記載される本発明の態様は、酵素の最初の起源の観点から、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０を含むものとして言及される。
【００５０】
図１及び２に提供される配列の整合におては、１つのアミノ酸の長さのギャップが位置５４〜５５及び２２５〜２２６でＴｍａ  ＤＮＡ配列中に挿入され、７種のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの内のそれらの位置で追加のアミノ酸を含む５種との整合が可能にされた。従って、それらの５種のサーマス・スペーシスに存在するそれらの２個のアミノ酸については、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに対応するアミノ酸が存在しない。当業者は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるギャップと整合されるアミノ酸を末端とする、それらの５種のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの１つからのＮ−末端領域を含む適切なキメラタンパク質が、構成され得ることを十分に理解し、ここで前記Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ由来の領域は、前記ギャップに続く最初のアミノ酸で開始する。
【００５１】
キメラＤＮＡポリメラーゼの決定的な観点は、それが、完全な長さのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるおおよそのコドン１３３−１３７で存在する少なくとも代替的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）リボソーム結合部位を通して、そして好ましくは、メチオニン１４０開始コドンを通して、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ配列をコードする領域が、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのその対応する領域をコードする遺伝子配列により置換されているキメラ遺伝子によりコードされることである。
【００５２】
この代替的リボソーム結合部位及び開始コドンの完全な長さのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における存在は、アミノ酸１４０で開始する切断されたＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの選択的発現をもたらす。下記に記載されるように、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のこの領域の置換は、完全な長さのキメラタンパク質の効果的な発現に対して決定的である。従って、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼにおいては、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのＮ−末端領域が、少なくともアミノ酸１３７までの、そして好ましくはアミノ酸１４０までのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの領域を置換する。
【００５３】
Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１３７に対応する個々のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域が、図に提供されるように、アミノ酸配列整合から得られる。たとえば、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１３７に対応するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの領域はアミノ酸１−１４２であり（図１及び２を参照のこと）、そしてＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのＭ１４０に対応するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＬ１４５である。
【００５４】
従って、Ｎ−末端領域がＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼからである態様は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの少なくともアミノ酸１−１４２、及び好ましくはアミノ酸１−１４５を含んで成るであろう。同様に、Ｎ−末端領域が他のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからである態様のためには、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１３７及び１４０に対応するサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域が、図に提供される配列整合から得られる。
【００５５】
当業者は、マイナーな変異、付加又は欠失が、酵素の機能特性を変更しないＤＮＡポリメラーゼ中に導入され得、そしてそのような変異誘発された酵素が、変異誘発されていない酵素に対して事実上、同等であることを理解するであろう。たとえば、いくつかのＮ−末端アミノ酸のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおける欠失が酵素の機能性を変更しないことは知られている。同様に、多くのアミノ酸位置での置換変異が実質的に影響を有さないように思えることは知られている。本発明のためには、酵素の機能性を変更しないマイナーな変異を含むＤＮＡポリメラーゼは、変異誘発されていないＤＮＡポリメラーゼに等しいと思われる。
【００５６】
２．５′−ヌクレアーゼドメインにおける点変異
１つの態様において、キメラＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアーゼ活性を減じるか又は排除する１又は複数の点変異（単一アミノ酸置換又は欠失の変異）を含む。キメラタンパク質の５′−ヌクレアーゼドメインはサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ及びほとんどの態様においては、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する部分を含むので、５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ又は排除する変異は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ由来の部分又はＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ由来の部分中に導入され得る。
【００５７】
アミノ酸配列の整合に基づいて、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ，II及びIII との相同性に従って、Ａ，Ｂ及びＣと称するグループに分類されている（たとえば、Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１５）：４０４５−４０４７（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。Ｔｍａ  及びサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼに関係するＡ  ＤＮＡポリメラーゼのメンバーである。Ａ  ＤＮＡポリメラーゼ間に保存され、そしてＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼのために必須であるアミノ酸が同定されている（たとえば、Ｇｕｔｍａｎなど．１９９３，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：４４０６−４４０７（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。
【００５８】
Ａ  ＤＮＡポリメラーゼにおける、５′−ヌクレアーゼ活性のために必須であるアミノ酸の保存のために、１つのＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおける必須のアミノ酸の同定は、図１及び２に提供されるような配列整合に基づいて他の種類のＡ  ＤＮＡポリメラーゼにおける必須のアミノ酸の同定を可能にする。必須のアミノ酸は、本明細書に提供される配列との通常の配列整合から追加のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼにおいて同定され得る。
【００５９】
５′−ヌクレアーゼ活性のために必須であるものとして同定されているアミノ酸は、星印により図１及び２に示されている。個々のＤＮＡポリメラーゼ内の必須のアミノ酸の位置は、その整合性からーられる。たとえば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ配列（配列番号２）を参照すれば、それらの必須のアミノ酸は次の通りである：Ｄ１８，Ｒ２５，Ｇ４６，Ｄ６７，Ｆ７３，Ｒ７４，Ｙ８１，Ｇ１０７，Ｅ１１７，Ｄ１１９，Ｄ１２０，Ｄ１４２，Ｄ１４４，Ｇ１８７，Ｄ１８８，Ｄ１９１及びＧ１９５。
【００６０】
追加の必須のアミノ酸が未来において同定されるかどうかは、驚くべきではない。本明細書に記載されるようなそれらのアミノ酸位置での変異が５′−ヌクレアーゼ活性の低下又は排除をもたらすので、そのような変異は本発明への使用のために適切である。
【００６１】
一般的に、５′−ヌクレアーゼ活性を減じ又は排除するためには、それらのアミノ酸位置の１又は複数の位置が、欠失され、又は異なった性質を有するアミノ酸に変異誘発される。たとえば、酸性アミノ酸、たとえばＡｓｐ（Ｄ）は、塩基性（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）、中性（Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ）又は極性であるが、しかし荷電されていないアミノ酸（Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｙｓ，Ｔｙｒ，Ａｓｎ又はＧｌｎ）に変更されるであろう。好ましいＧ４６Ｄ変異は、極性であるが荷電されていないＧｌｙの代わりに酸性Ａｓｐを置換する。一般的に、Ａｌａ又はＧｌｙに対する変異が、タンパク質構造の変形を最少にするために好ましい。
【００６２】
アミノ酸の電荷特性を保存する置換変異はまた、５′−ヌクレアーゼ活性を弱めることができる。たとえば、アメリカ特許第５，４７４，９２０号（引用により本明細書に組込まれる）は、５′−ヌクレアーゼ活性を減じるか又は排除するＴａｑ  ＤＮＡ配列における３種の変異を記載する。１つの変異、すなわちＲ２５Ｃ（塩基性から、極性であるがしかし荷電されていないものへ）は異なった性質を有するアミノ酸への変化をもたらすけれども、２つの変異、すなわちＦ７３Ｌ（中性から中性）及びＲ７４Ｈ（塩基性から塩基性）は、性質の変更をもたらさない。
【００６３】
それにもかかわらず、すべての３種の変異は、５′−ヌクレアーゼ活性を弱める。５′−ヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす、個々の必須のアミノ酸位置での特定の変異は、ＤＮＡポリメラーゼを変異誘発し、そしてその得られる活性を測定することによって、通常決定され得る。敏感且つ便利なアッセイが、アメリカ特許第５，４６６，５９１号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【００６４】
好ましい態様においては、キメラＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアーゼ活性を少なくとも１０００倍減じる、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるＧ４６Ｄ変異に対応する変異を含む（アメリカ特許第５，４６６，５９１号を参照のこと）。
アミノ酸における変異は、コード遺伝子配列に適切な変異を組込むことによって達成される。ＤＮＡ配列におけるそのような変異は、下記にさらに記載されるように、当業界において良く知られている技法を用いて実施される。
【００６５】
３．３′→５′エキソヌクレアーゼドメインにおける点変異
１つの態様においては、キメラＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼドメインは、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を減じるか又は排除する１又は複数の点変異（単一アミノ酸置換又は欠失の変異）を含む。キメラタンパク質の３′→５′エキソヌクレアーゼドメインは、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ由来の部分内に含まれる。従って、適切な変異は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ又は排除する変異である。
【００６６】
Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のための必須の３種のアミノ酸“モチーフ”、及び個々のモチーフ内の必須のアミノ酸が同定されている（アメリカ特許第５，４２０，０２９号を参照のこと）。前記決定的アミノ酸が下記に列挙されている。Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼを減じる１又は複数のそれらのアミノ酸の変異が、本発明のＤＮＡポリメラーゼに使用され得る。
【００６７】
【表３】
0004350815.tif 000004
追加の決定的アミノ酸が未来において同定されるかどうかは驚くべきではない。本明細書に記載されるようなそれらのアミノ酸位置での変異は３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の低下又は排除をもたらすので、そのような変異は本発明への使用のために適切である。
【００６８】
５′−ヌクレアーゼ活性の低下について上記に記載されるように、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の低下又は排除は、１又は複数のそれらの必須のアミノ酸位置での置換又は欠失変異、好ましくは異なった性質を有するアミノ酸への置換変異により達成される。好ましい態様においは、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼドメインが、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を、共に実質的に排除するＤ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異により変異誘発される。
アミノ酸配列における変異は、コード遺伝子配列に適切な変異を組込むことによって達成される。ＤＮＡ配列におけるそのような変異は、下記にさらに記載されるように、当業界において良く知られている技法を用いて実施される。
【００６９】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの利点
本発明のキメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、文献に記載される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも有意な改良点を示す。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、次の性質の組合せを提供する：
−特に、サイクル配列決定反応において色素−ラベルされたｄｄＮＴＰと共に使用される場合、ＤＮＡ配列決定トレースにおけるピークの高さの改良された均等性；
−色素−ラベルされたｄｄＮＴＰのピロリン酸分解の速度の低下；及び
−ｄＩＴＰの改良された組込み。
−さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、組換え発現系において、容易且つ効果的に、高レベルに発現され得、それにより、酵素の商業的製造を促進する。
【００７０】
本発明のＤＮＡポリメラーゼにより占有される性質の組合せは、特に色素−ターミネーターサイクル配列決定反応において有用であり、そして有意に改良された結果を提供する。それらの性質の個々は下記に論ぜられる。
【００７１】
１．ｄｄＮＴＰの改良された組込み
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰの組込みの効率を高めることが知られているＦ７３０Ｙ変異を含む。
比較すれば、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳは、類似する変異（Ｆ６６７Ｙ）を含むＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変異誘発された形である。Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳはまた、ｄｄＮＴＰの組込みの高められた効率を示すが、しかし本発明のＤＮＡポリメラーゼにより示されるいくつかの他の性質を欠いている。
【００７２】
２．ＤＮＡ配列決定トレースにおけるピークの高さの改良された均等性
本発明のＤＮＡポリメラーゼの好都合な性質は、色素−ターミネーターサイクル配列決定反応に使用される場合、それが配列決定トレース（また、クロマトグラム又はエレクトロフェログラムとしても言及される）における均等なピークの高さをもたらすことである。不均等なピークの高さは、ベース・コーリング（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）の精度を低め、そして変異及び多型現象検出をより困難にする。
【００７３】
色素−ターミネーターサイクル配列決定反応におけるピークの高さの不均等性は、これまで解決されていない問題である。たとえば、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳは、変異誘発されていないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりもより効果的にｄｄＮＴＰを組込むが、色素−ターミネーター配列決定反応において得られるピークの高さのパターンは不均等である（Ｐａｒｋｅｒなど．，１９９６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１（４）：６９４−６９９（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。
【００７４】
その不均等性は、配列内容に基づくピークの高さの依存性に少なくとも起因する。たとえば、Ａに続くＧから得られるピークの高さは、非常に小さく、正確なベース・コールを困難にする。逆に言えば、Ｇに続くＡから得られるピークの高さは非常に高い。特に問題のあるパターンは、Ａ又はＣの後のＧ，Ａ又はＣの後のＡ、及びＴの後のＴを包含し、これらは非常に低いピークの高さをもたらすことがある。非常に高いピーク、たとえばＧの後のＡからの結果は、単独ではほとんどの問題はないが、しかし隣接する低いシグナルを判読しにくくする。
【００７５】
実施例に示されるように、サイクル配列決定反応への本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの使用は、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いて得られるよりも有意により均等なピークの高さをもたらす。ピークの高さにおける改良された均等性は、基本コーリングの精度の有意な上昇をもたらし、そして変異及び多型現象検出を容易にする。
【００７６】
３．色素−ラベルされたｄｄＮＴＰのピロリン酸分解の速度の低下
ＤＮＡポリメラーゼは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の付随した開放を伴って、プライマーの３′−ヒドロキシル末端上へのデオキシヌクレオチドの鋳型−依存的組込みを触媒する。この重合反応は可逆的である。ＤＮＡポリメラーゼはまた、逆反応、すなわちＰＰｉの存在下でのＤＮＡの分解であるピロリン酸分解を触媒する。その反応は下記に要約される：
ＤＮＡn ＋ｄＮＴＰ←−−→ＤＮＡn+1 ＋ＰＰｉ
【００７７】
また、ピロリン酸ホスホヒドロラーゼとしても知られている無機ピロホスファターゼ（ＰＰアーゼ）は、オルトホスフェートの２つの分子への無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の加水分解を触媒する。ＰＰアーゼは、ＲＮＡ及びＤＮＡ合成においてインビボで活性役割を演じる。ＰＰｉを分解することによって、その酵素は、合成のために全体の平衡性を変える。
【００７８】
ピロリン酸分解は、ＤＮＡ配列決定反応に対しては有害なものである。ＤＮＡ配列決定反応における精度は、正確なバンド位置に依存し、わずか１個のヌクレオチドのサイズ減少が、ゲル人工産物、たとえば減じられた又は欠失したバンドをもたらすことがある。ピロリン酸分解は、プライマー延長生成物の３′−末端からの塩基の除去をもたらす。さらに、ｄｄＮＴＰ−終結フラグメントからの組込まれた末端ｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオシド−リン酸）の除去は、影響される位置でのシグナル強度の低下、及びエレクトロフェログラムにおける減じられた又はミッシングするピークを導びく続く延長を可能にする。
【００７９】
従って、配列決定反応においてピロリン酸分解反応を最少にすることが所望される。前記反応へのＰＰアーゼの添加は、ＰＰｉを分解することによって合成のための全体の平衡性を変える。配列決定反応を改良するためへのＰＰアーゼの使用は、Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１４）：８３２２−８３２８；及びＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／１２１１１に記載されている（それらは、引用により本明細書に組込まれる）。Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを含むＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）からの市販のサイクル配列決定キットは、ピロリン酸分解を減じるためにＰＰアーゼを含む。
【００８０】
驚くべきことには、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いるサイクル配列決定反応は、色素−ラベルされたｄｄＮＴＰターミネーターのピロリン酸分解によりほとんど影響されない。実施例に記載されるように、０〜２０単位の範囲のＰＰアーゼ濃度で実施されるサイクル配列決定反応は、実質的に同一の結果をもたらした。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サイクル配列決定反応におけるＰＰアーゼの必要性を非常に減じ又は排除するように見える。
【００８１】
４．ｄＩＴＰの改良された組込み
典型的なサイクル配列決定反応においては、Ｇ／Ｃに富む領域における圧縮を軽減するためにｄＩＴＰがｄＧＴＰの代わりに使用される。ＤＮＡ中へのｄＩＴＰの組込みは、変性温度を低め、そして二次構造体の変性を促進する。ＤＮＡポリメラーゼは異例なヌクレオチドであるｄＩＴＰに対して識別するので、適切な組込みを得るためには、ｄＩＴＰの相対的濃度は、反応において実質的に高められるべきである。
【００８２】
たとえば、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳのために最適化される反応条件においては、ｄＩＴＰは、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの濃度よりも５倍高い濃度で存在する。
対照的に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ｄＩＴＰをより効果的に組込み、より均等なｄＮＴＰ濃度を伴ってのその反応の実施を可能にする。実施例に記載されるように、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの濃度よりもわずか約２〜３倍高いｄＩＴＰ濃度が、本発明のＤＮＡポリメラーゼのために最適である。
【００８３】
５．発現の効率
上記のように、本発明のキメラ酵素は、変異誘発されたＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに対応し、ここでその５′−ヌクレアーゼドメインはサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのその対応するドメインにより置換されている。前記酵素は変異誘発されたＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対応するキメラ遺伝子から発現され、ここで５′−ヌクレアーゼドメインをコードする遺伝子の領域はサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のその対応する領域により置換されている。そのキメラ遺伝子の有意な利点は、それがＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からであるよりもより一層、効果的に組換え発現系においての完全な長さのＤＮＡポリメラーゼの発現を可能にすることである。
【００８４】
完全な長さの天然のＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列を含む組換え発現系からのその完全な長さのＤＮＡポリメラーゼの発現は、タンパク質の切断された形の選択的発現のために問題がある（アメリカ特許第５，４２０，０２９号を参照のこと）。Ｍｅｔ１４０Ｔｍａとして言及される切断されたタンパク質は、完全な長さのタンパク質のアミノ酸１４０−８９３から成り、そして位置１４０でのメチオニンでの翻訳開始に起因するように見える。コドン１３３−１３７での推定上のリボソーム結合部位の存在は、切断されたタンパク質が内部メチオニンでの翻訳開始に起因することをさらに示唆する。Ｍｅｔ１４０Ｔｍａ切断タンパク質の選択的発現は、完全な長さのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの発現及び精製における有意な困難性を提供する。
【００８５】
キメラＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、完全な長さのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中のおよそコドン１３３−１３７に存在する代替的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）リボソーム結合部位までに少なくとも対応する領域、そして好ましくは、内部開始コドン、すなわちコドン１４０までの対応する領域にサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列を含む。従って、リボソーム結合部位及び好ましくはＭｅｔ１４０Ｔｍａの翻訳を担当する開始コドンを含む領域までのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のその対応する領域により置換される。サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のその対応する領域は、切断されたタンパク質の不所望の内部開始を提供しない。結果として、キメラＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換え発現系は、もっぱら完全な長さのキメラＤＮＡポリメラーゼを発現する。
【００８６】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの調製
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼに由来する部分、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する部分から成るキメラ酵素である。そのキメラ酵素は、キメラ遺伝子、すなわちキメラ酵素をコードし、そしてサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に由来する部分及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に由来する部分から成るＤＮＡから調製される。キメラ遺伝子は、下記に詳細に記載されるように、分子生物学の分野において良く知られている標準の遺伝子操作技法を用いて、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から生成される。
【００８７】
Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、アメリカ特許第５，４２０，０２９号及び第５，４６６，５９１号に記載される。Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、及びそのコードされたタンパク質の完全なアミノ酸配列が、そこに記載されている。前記’０２９号特許の例５は、プラスミドｐＴｍａ０１（１９９０年１１月７日にＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８４７１の寄託番号下でＥ．コリＤＧ１０１，ｐＢＳＭ：Ｔｍａ  Ｘｍａ７−１として寄託される；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ  Ｎｏ．９８７６４として再寄託される）及びｐＴｍａ０４（１９９０年１１月７日にＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８４７２下でＥ．コリＤＧ１０１，ｐＢＳＭ：Ｔｍａ  Ｘｍａ１１−１δ  Ｂａ／Ｂｇ１として寄託される；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ  Ｎｏ．９８７６５として再寄託される）により開始する完全な長さのＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼを含む種々のプラスミド、たとえばプラスミドｐＴｍａ１２−１及びｐＴｍａ１３の構成を記載する。それらの発現ベクターのいづれかが、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の源として適切である。
【００８８】
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及びそのコードされたタンパク質のアミノ酸配列を包含する、多くのサーマス・スペーシスからのＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は記載されている。多くのそれらの遺伝子は、公開されているプラスミドから得ることができる。追加のサーマス・スペーシスからの遺伝子は、アメリカ特許第５，０７９，３５２号；第５，４５５，１７０号；第５，４０５，７７４号及び第５，４６６，５９１号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される方法を用いて宿主生物から得られる。
【００８９】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、アメリカ特許第５，０７９，３５２号及び第５，４６６，５９１号に記載される。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列、及びそのコードされたタンパク質の完全なアミノ酸配列がそこに記載されている。前記’３５２号特許の例Ｖ−VII は、プラスミドｐＦＣ８３（１９８７年５月２９日に寄託されたＡＴＣＣ  ６７４２２；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ  Ｎｏ．９８７６３として再寄託された）及びｐＦＣ８５（１９８７年５月２９日に寄託されたＡＴＣＣ  ６７４２１；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ  Ｎｏ．９８７６２として再寄託された）により開始する完全な長さのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む種々の発現プラスミド、たとえばプラスミドｐＬＳＰ１，ｐＬＳＧ２，ｐＳＹＣ１５７８，ｐＬＳＧ５及びｐＬＳＧ６の構成を記載する。それらの発現ベクターのいづれかが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の源として適切である。
【００９０】
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を得るための方法、及び前記遺伝子を含む発現プラスミドが、アメリカ特許第５，６１８，７１１号及び第５，４６６，５９１号に記載される。
ＴＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を得るための方法、及び前記遺伝子を含む発現プラスミドが、アメリカ特許第５，４５５，１７０号及び第５，４６６，５９１号に記載される。
【００９１】
Ｔｓｐｓ１７  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を得るための方法、及び前記遺伝子を含む発現プラスミドが、アメリカ特許第５，４０５，７７４号及び第５，４６６，５９１号に記載される。
Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ａｋｈｍｅｔｚｊａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｖａｋｈｉｔｏｖ，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０（２１）：５８３９（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【００９２】
Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、参照された特許に記載される方法を用いてＡＴＣＣ  ４３２８０から回収され得る（また、１９８４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２：１４９−１５３（１９８４）も参照のこと）。
Ｔｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ｋｗｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７（２）：２６４−２７１に記載されており；そしてそのヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６２５８４として入手できる。
【００９３】
さらなるサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、次のＡＴＣＣ寄託から、上記引用される特許に記載される技法を用いて回収され得る：ＡＴＣＣ４３８１４及び４３８１５（Ａｌｆｒｅｄｓｓｏｎ，１９８６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１３１３−１３１６を参照のこと）；ＡＴＣＣ  ２７９７８（Ｒａｍａｌｅｙ，１９７０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１４：５５６−５６２；１９７３；前記、１０３：５２７−５２８を参照のこと）；ＡＴＣＣ  ３１６７４（アメリカ特許第４，４４２，２１４号及び第４，４８０，０３６号を参照のこと）；ＡＴＣＣ  ３５９４８（Ｔ．ルベル（Ｔ．ｒｕｂｅｒ），Ｌｏｇｉｎｏｖａ，１９８４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３４：４９８−４９９を参照のこと）。すべての文献は引用により本明細書に組込まれる。
【００９４】
さらなるサーマス・スペーシスは、次のＤｅｕｒｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）寄託から、上記引用される特許に記載される技法を用いて回収され得る：ＤＳＭ：１２７９（Ｌｏｇｉｎｏｖａ，など．，１９７５，Ｉｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＫ  Ｓｅｒ．Ｂｉｏｌ．：３０４−３０７を参照のこと）；ＤＳＭ：５７９；ＤＳＭ：６２５（ＮＵＭ：２２４８）（Ｄｅｇｒｙｓｅなど．，１９７８，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８９：１９６）；ＤＳＭ：１２７９（ＮＵＭ：３８４４）（Ｌｏｇｉｎｏｖａなど．，１９８４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：４９８−４９９を参照のこと）；及びＤＳＭ：６２５（ＮＵＭ：１００２）（Ｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ，１９６９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：２８９−２９７を参照のこと）。すべての文献は、引用により本明細書に組込まれる。
【００９５】
記載されるさらなるサーマス・スペーシスは、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓなど．，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６（２）：４０３−４０８を参照のこと）；Ｔ．シルベヌス（Ｔ．ｓｉｌｖａｎｕｓ）及びＴ．クリアロフィラス（Ｔ．ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｅｎｒｅｉｒｏなど．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４５（４）：６３３−６３９を参照のこと）；Ｔ．スコトダクタス（Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）（Ｔｅｎｒｅｉｒｏなど．，１９９５，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４６（４）：３１５−３２４を参照のこと）；及びＴ．ルベル（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）（Ｓｈａｄｒｉｎａなど．，１９８２，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ  ５１（４）：６１１−６１５を参照のこと）を包含する（前記すべての文献は引用により本明細書に組込まれる）。
【００９６】
本明細書に提供される案内に従って、及びよく知られた技法のみを用いて、当業者は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から、種々の宿主システムのいづれかにおいて本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを発現するために適切なキメラ遺伝子を含むいづれかの数の発現ベクターを調製することができるであろう。
【００９７】
好ましい態様においては、本発明のキメラ遺伝子は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼからのアミノ酸１−１９０及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼからのアミノ酸１９１−８９３から成り、ここで前記両領域は関連するエキソヌクレアーゼ活性を排除するために適切に変異誘発される。この好ましい態様は、上記の寄託されたプラスミドから得られた又は宿主生物から回収された、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から直接的に構成され得る。しかしながら、そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼは、１９９７年５月２８日に寄託番号第９８４４３号としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５から最とも容易に構成され得る。
【００９８】
プラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−８９３から成るキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む。ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５によりコードされるキメラタンパク質は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ部分においてＧ４６Ｄ変異を含む。ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５のキメラ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号９として提供される。
【００９９】
適切な発現系は、キメラ遺伝子を適切な発現ベクター中にサブクローニングし、コードされたタンパク質の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を弱めるか又は排除する１又は複数の点変異を導入し、そしてＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ部分にＦ７３０Ｙ変異を導入することによって、ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５から構成される。５′−ヌクレアーゼドメインにＧ４６Ｄ変異、３′→５′エキソヌクレアーゼドメインにＤ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異、及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ部分にＦ７３０Ｙ変異を含むキメラタンパク質をコードする、好ましい発現系の構成は、実施例に記載される。
【０１００】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０をコードするｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５のヌクレオチド配列は、アメリカ特許第５，４６６，５９１号に記載されるプラスミドｐＲＤＡ３−２に関連し、そして従って、そこに記載されるＧ４６Ｄ変異を含むアミノ酸配列をコードする。ｐＲＤＡ３−２及び従って、ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５のヌクレオチド配列はまた、サイレントである、すなわちコードされたアミノ酸配列を変更しない生来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列（配列番号９）に対する追加の変異を含む。
【０１０１】
遺伝子コードの冗長性のために、典型的には多数のＤＮＡ配列が、いづれか一定のアミノ酸配列をコードし、そしてこの場合、同等である。下記に説明されるように、発現ベクターが挿入されるであろう宿主細胞の好ましいコドン使用に基づいて、発現ベクターへの使用のための１又はもう１つの同等のＤＮＡ配列を選択することが所望される。本発明は、キメラ酵素をコードするすべてのＤＮＡ配列を包含することが意図される。従って、本発明のキメラ遺伝子は、野生型サース種及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からの配列のみを含むことに制限されないが、しかし本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼをコードするいづれかのＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１０２】
本発明の酵素の生成は、組換え発現クローンを用いて実施される。組換え発現クローンの構成、発現クローンによる宿主細胞の形質転換、及び発現を促進する条件下での形質転換された宿主細胞の培養は、当業界において良く理解されている分子生物学の技法を用いて、宿主の手段で実施され得る。それらの段階の個々のための方法は、下記に一般的に記載される。好ましい方法は、実施例に詳細に記載される。
【０１０３】
作用可能な発現クローンは、発現ベクターにおける適切な制御配列により作用可能な連鎖におけるコード配列を置換することによって構成される。ベクターは、宿主細胞において自律的に複製し、又は宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込むように企画され得る。得られるクローンは適切な宿主を形質転換するために使用され、そしてその形質転換された宿主がコード配列の発現のために適切な条件下で培養される。発現されたタンパク質は、多くの場合、タンパク質の回収及び精製は必要ではないが、培地又は細胞から単離される。
【０１０４】
コード配列及び適切な制御配列を含む適切なクローンの構成は、当業界において良く知られている標準の連結及び制御技法を用いる。一般的に、単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成されたオリゴヌクレオチドが、切断され、修飾され、そして所望する形で再連結される。適切な制限部位は、通常利用できない場合、発現クローンの構成を促進するためにコード配列の末端に付加され得る。
【０１０５】
部位特異的ＤＮＡ切断は、当業界において一般的に理解され、そして市販の制限酵素の製造業者により規定される条件下で、適切な制限酵素（又は複数の酵素）により処理することによって実施される。たとえば、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの製品カタログを参照のこと。一般的に、約１μｇのプラスミド又は他のＤＮＡが、約２０μｌの緩衝溶液における１単位の酵素により切断され；下記例においては、過剰の制限酵素が一般的に、ＤＮＡの完全な消化を確保するために使用される。
【０１０６】
特定の酵素のために最適である温度での約１〜２時間のインキュベーション時間が典型的である。個々のインキュベーションの後、タンパク質はフェノール及びクロロホルムによる抽出により除かれ；この抽出の後、エーテル抽出、及びエタノールによる沈殿により水性画分からのＤＮＡの回収が伴なう。所望により、切断されたフラグメントのサイズ分離が、標準の技法を用いて、ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により実施され得る。たとえば、Ｍａｘａｍなど．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｚｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８０，６５：４９９−５６０を参照のこと。
【０１０７】
一本鎖“オーバーハング”末端を有する制限−切断されたフラグメントは、５０mMのトリス（pH７．６）、５０mMのＮａＣｌ，１０mMのＭｇＣｌ2 ，１０mMのＤＴＴ及び５〜１０μＭのｄＮＴＰの溶液において２０℃〜２５℃で約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いて、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼの大きなフラグメント（クレノウ）により処理することによって、ブラント末端化（二本鎖末端）され得る。
【０１０８】
クレノウフラグメントは５′突出末端でフィルインし、そして４種のｄＮＴＰが存在する場合でさえ、突出する３′一本鎖をチューバックする。所望により、選択的修復が、前記突出する末端の性質により指図される制限内に１又は複数の選択されたｄＮＴＰを供給することによって実施され得る。クレノウによる処理の後、その混合物がフェノール／クロロホルムにより抽出され、そしてエタノール沈殿される。類似する結果が、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて達成され得る。なぜならば、Ｓ１ヌクレアーゼによる適切な条件下での処理は核酸のいづれかの一本鎖部分の加水分解をもたらすからである。
【０１０９】
連結は、次の標準の条件及び温度下で１５〜３０μｌの体積において実施される：２０mMのトリス−Ｃｌ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 ，１０mMのＤＴＴ，３３μｇ／mlのＢＳＡ，１０〜５０mMのＮａＣｌ、及び40μＭのＡＴＰ及び０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０℃）（相補的一本鎖末端を有するフラグメントの連結のための）又は１mMのＡＴＰ及び０．３−０．６単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１４℃）（“ブラント末端”連結のための）のいづれか。相補的末端を有するフラグメントの分子間連結は通常、３３〜１００μｇ／mlの合計ＤＮＡ濃度（５〜１００nMの合計末端濃度）で実施される。分子間ブラント末端連結（通常、任意には、２０〜３０倍モル過剰のリンカーを用いる）が１μＭの合計末端濃度で実施される。
【０１１０】
ベクターの構成においては、ベクターフラグメントが、５′リン酸を除去し、そしてベクターの再連結及び再構成を妨げるために細菌又はウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ又はＣＩＡＰ）により通常処理される。ＢＡＰ及びＣＩＡＰ消化条件は、当業界において良く知られており、そして公開されたプロトコールは市販されているＢＡＰ及びＣＩＡＰ酵素を通常付随する。核酸フラグメントを回収するためには、調製物がフェノール−クロロホルムにより抽出され、そしてエタノール沈殿され、ホスファターゼが除去され、そしてＤＮＡが精製される。他方では、所望しないベクターフラグメントの再連結は、適切な制限部位が利用できる場合、連結の前又は後、制限酵素消化により阻止され得る。
【０１１１】
下記に示される構成においては、プラスミド構成のための正しい連結は、その連結混合物により適切な宿主、たとえばＥ．コリ株ＤＧ１０１（ＡＴＣＣ  ４７０４３）又はＥ．コリ株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ  ５３６０６）をまず形質転換することによって確認される。好結果をもたらす形質転換体は、当業界において理解されているように、アンピシリン、テトラサイクリン又は他の抗生物質耐性により、又は他のマーカーを用いることにより、プラスミド構成の態様に依存して選択される。
【０１１２】
次に、形質転換体からのプラスミドが、任意には、クロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９７２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０：６６７）に続いて、Ｃｌｅｗｅｌｌなど．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６２：１１５９の方法に従って調製される。他方では、プラスミドＤＮＡが、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｃｕｓ  ５（２）のページ１１の“塩基−酸”抽出法を用いて調製され得、そしてひじょうに純粋なプラスミドＤＮＡが、ＤＮＡのＣｓＣｌ／臭化エチジウム超遠心分離により前記プロトコールの段階１２〜１７を置換することによって得られる。
【０１１３】
単離されたＤＮＡは、制限酵素消化により分析され、そして／又はＳａｎｇｅｒなど．，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３のジデオキシ方法（Ｍｅｓｓｉｎｇなど．，１９８１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：３０９によりさらに記載されるような）により、又はＭａｘａｍなど．，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５：４９９の方法により配列決定される。
【０１１４】
制御配列、発現ベクター及び形質転換方法は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞のタイプに依存する。一般的に、原核、酵母、昆虫、又は哺乳類細胞が宿主として使用される。原核宿主は一般的に、組換えタンパク質の生成のために最とも効果的且つ便利な宿主であり、そして従って、タンパク質の発現のために好ましい。
【０１１５】
組換えタンパク質を発現するために最とも頻繁に使用される原核生物は、Ｅ．コリである。しかしながら、Ｅ．コリ以外の微生物株、たとえばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、たとえばバシラス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ），プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種々の種、及び他の細菌株が、タンパク質の組換え発現のためにまた使用され得る。そのような原核システムにおいては、宿主又はその宿主と適合する種に由来する複製部位及び制御配列を含むプラスミドベクターが典型的には、使用される。
【０１１６】
ほとんどの細菌プロモーターの制御下での構造体の発現のためには、ＧＣＳＣ＃６１３５としてのＥ．コリＧｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得られたＥ．コリＫ１２株ＭＭ２９４が、宿主として使用され得る。ＰL ＮRBS 又はＰL ＴJRBS制御配列を有する発現ベクターのためには、Ｅ．コリＫ１２株ＭＣ１００λ溶原菌、すなわちＮ7 Ｎ53ｃＩ８５７  Ｓｕｓ  Ｐ80（ＡＴＣＣ  ３９５３１）が使用され得る。１９８７年４月７日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ５３６０６）に寄託されたＥ．コリＤＧ１１６、及び１９８５年３月２９日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ５３０７５）に寄託されたＥ．コリＫＢ２はまた、有用な宿主細胞である。Ｍ１３ファージ組換え体のためには、ファージ感染に対して敏感なＥ．コリ株、たとえばＥ．コリＫ１２株ＤＧ９８（ＡＴＣＣ  ３９７６８）が使用される。ＤＧ９８株は、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託された。
【０１１７】
たとえば、Ｅ．コリは典型的には、Ｂｏｌｉｖａｒなど．，１９７７，Ｇｅｎｅ  ２：９５により記載されるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む。それらの薬物耐性マーカーは、所望するベクターの構成において保持されるか、又は破壊され得、そしてその結果、所望する組換え体の存在の検出を助けることができる。
【０１１８】
通常使用される原核制御配列、すなわちリボソーム結合部位配列と共に、任意にはオペレーターを有する転写開始のためのプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇなど．，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌなど．，１９８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７）、及びλ−由来のＰL プロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅなど．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）並びに遺伝子Ｎリボソーム結合部位（ＮRBS ）を包含する。移植可能な制御システムカセットが、１９８７年１２月８日に発行されたアメリカ特許第４，７１１，８４５号に示されている。
【０１１９】
このカセットは、ＮRBS 配列の３′側の６個の塩基対内での切断を可能にする少なくとも１つの制御部位を有する第３ＤＮＡ配列の上流に位置するＮRBS に操作可能的に連結されるＰL プロモーターを含んで成る。１９８６年１０月８日に公開されたヨーロッパ特許公開第１９６，８６４号においてＣｈａｎｇなど．により記載されるホスファターゼＡ（ｐｈｏＡ）システムがまた有用である。しかしながら、原核生物と適合できる、いづれかの利用できるプロモーターシステムが、本発明の発現ベクターを構成するために使用され得る。
【０１２０】
細菌の他に、真核微生物、たとえば酵母がまた、粗換え宿主細胞としても使用され得る。サッカロミセス  セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわちパン酵母の実験室用菌株が最ともしばしば使用されるが、但し、多くの他の菌株も通常利用できる。複製の２ミクロン起点を有するベクターが通常であるが（Ｂｒｏａｃｈ，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３０７）、酵母発現のために適切である他のプラスミドベクターも知られている（たとえば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅなど．，１９８０，Ｇｅｎｅ  １０：１５７；及びＣｌａｒｋｅなど．，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３００を参照のこと）。
【０１２１】
酵母ベクターのための制御配列は、解糖酵素の合成のためのプロモーターを含む（Ｈｅｓｓなど．，１９６８，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄなど．，１９７８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：４９００；及びＨｏｌｌａｎｄなど．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５）。当業界において知られているさらなるプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３）、及び他の解糖酵素、たとえばグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。
【０１２２】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、及びマルトース及びガラクトース使用を担当する酵素のためのプロモーター領域である（Ｈｏｌｌａｎｄ、前記）。
ターミネーター配列はまた、コード配列の３′末端で配置される場合、発現を増強するために使用され得る。そのようなターミネーターは、酵母由来の遺伝子におけるコード配列に続く３′未翻訳領域に見出される。酵母適合性プロモーター、複製の起点、及び他の制御配列を含むいづれかのベクターが、酵母発現ベクターの構成への使用のために適切である。
【０１２３】
前記コード配列はまた、複数細胞生物に由来する真核宿主細胞培養物においても発現され得る。たとえば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃｒｕｚ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）を参照のこと。有用な宿主細胞系は、ＣＯＳ−７，ＣＯＳ−Ａ２，ＣＶ−１、ネズミ細胞、たとえばネズミ骨髄腫Ｎ５１及びＶＥＲＯ，ＨｅＬａ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。
【０１２４】
そのような細胞のための発現ベクターは、哺乳類細胞と適合するプロモーター及び制御配列、たとえばＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）からの通常使用される初期及び後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓなど．，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３）、又は他のウィルスプロモーター、たとえばポリオーマ、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）又は鳥類肉腫ウィルスに由来するプロモーター、又は免疫グロブリンプロモーター及び熱ショックプロモーターを包含する。ＢＰＶベクターシステムを用いて哺乳類系においてＤＮＡを発現するためのシステムが、アメリカ特許第４，４１９，４４６号に開示される。
【０１２５】
このシステムの修飾がアメリカ特許第４，６０１，９７８号に記載される。哺乳類宿主システム形質転換の一般的な観点がアメリカ特許第４，３９９，２１６号（ＡL ｘｅｌ）により記載されている。“エンハンサー”領域はまた、発現の最適化においても重要であり；それらは一般的に、プロモーター領域の上流に見出される配列である。複製の起点は、必要とされる場合、ウィルス源から得られる。しかしながら、染色体中への組込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製のための通常の機構である。
【０１２６】
植物細胞はまた、宿主としても使用され得、そして植物細胞と適合できる制御配列、たとえばノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒなど．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：５６１）が利用できる。バキュロウィルスベクターにより供給される制御システムを利用する、昆虫細胞使用の発現系がまた記載されている（Ｍｉｌｌｅｒなど．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６），Ｓｅｔｌｏｗなど．，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２９７）。昆虫細胞に基づく発現は、スポドプテラフルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｄｉａ）において達成され得る。それらのシステムはまた、組換え酵素の生成においても好都合である。
【０１２７】
使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に対して適切な標準の技法を用いてなされる。Ｃｏｈｅｎ，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０により記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、実質的な細胞壁バリヤーを含む、原核生物又は他の細胞のために使用される。アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による感染（Ｓｈａｗなど．，１９８３，Ｇｅｎｅ  ２３：３１５）が、一定の植物細胞のために使用される。哺乳類細胞のためには、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。酵母の形質転換は、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど．，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６及びＨｓｉａｏなど．，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３８２９の方法に従って実施される。
【０１２８】
コードされたタンパク質のアミノ酸配列を修飾しないで、宿主細胞のコドン使用とより適合できる配列を供給するために本発明の酵素をコードするＤＮＡの配列を修飾することが所望される。初期５〜６のコドンに対するそのような修飾は、発現効率を改良することができる。発現効率を改良するために修飾されているが、しかし同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、同等であり、そして本発明により包含されると思われる。
【０１２９】
種々の部位特異的プライマー指図された変異誘発方法が利用でき、そして当業界において良く知られている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、第２版、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５．５１，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、部位特異的変異誘発を行なうために用いられ得る。
【０１３０】
当業界において現在、標準であるもう１つの技法においては、所望する変異をコードする合成オリゴヌクレオチドが、変異誘発プライマーの延長生成物の構成のために鋳型として作用する、一本鎖ベクター、たとえばｐＢＳＭ１３＋誘導体に含まれる相補的核酸配列の合成を方向付けるためにプライマーとして使用される。変異誘発されたＤＮＡを用いて、宿主細胞が形質転換され、そして形質転換された細菌の培養物がプレートされ、そして同定される。
【０１３１】
修飾されたベクターの同定は、選択された形質転換体のＤＮＡのニトロセルロースフィルター又は他の膜へのトランスファー、及び修飾された配列への正確なハイブリダイゼーションを可能にするが、しかし元の変異誘発されていない鎖とのハイブリダイゼーションを妨げる温度でのキナーゼ処理された合成変異誘発プライマーによりハイブリダイズされた“リフト（ｌｉｆｔ）”を包含する。プローブとハイブリダイズするＤＮＡを含む形質転換体が次に培養され（ＤＮＡの配列が一般的に、配列分析により確認される）、そして修飾されたＤＮＡの貯蔵として作用する。
【０１３２】
タンパク質が組換え宿主細胞において発現されると、そのタンパク質の精製が所望される。種々の精製方法が、本発明の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製するために使用され得る。例としては、アメリカ特許第４，８８９，８１８号；第５，３５２，６００号及び第５，０７９，３５２号に記載されるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法；アメリカ特許第５，６１８，７１１号及び第５，３１０，６５２号に記載されるサーマスサーモフィリス（Ｔｔｈ）からＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法；及びアメリカ特許第５，３７４，５５３号及び第５，４２０，０２９号に記載されるＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法を挙げることができる。それらのＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法はまた、アメリカ特許第５，４６６，５９１号にも記載される。上記特許のすべては、引用により本明細書に組込まれる。
【０１３３】
好ましい方法においては、ＤＮＡポリメラーゼの発現は、中温菌の細菌宿主細胞である。Ｅ．コリにおいて実施される。Ｅ．コリ宿主タンパク質は感熱性であるので、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、粗溶解物を熱不活性化することによって実質的に富化され得る。この段階は、他の細胞溶解物タンパク質とのＤＮＡポリメラーゼのイオン性相互作用を減じるために、十分量の塩（典型的には、０．２〜０．４Ｍの硫酸アンモニウム）の存在下で行なわれる。
精製されたＤＮＡポリメラーゼの活性は、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７（引用により本明細書に組込まれる）に記載のようにしてアッセイされる。
【０１３４】
長期安定性のために、精製されたＤＮＡポリメラーゼ酵素は、１又は複数の非イオン性ポリマー界面活性剤を含む緩衝液に貯蔵されるべきである。そのような界面活性剤は一般的に、約１００〜２５０，０００、好ましくは約４，０００〜２００，０００ドルトンの範囲の分子量を有し、そして約３．５〜約９．５、好ましくは約４〜８．５のpHで酵素を安定化するものである。そのような界面活性剤の例は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｌｉｎｇ  Ｃｏ．，１７５  Ｒｏｃｋ  Ｒｏａｄ，Ｃｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，ＮＪ（ＵＳＡ）により出版されたＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｎｌｓｉｆｉｅｒｓ  ＆  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８３）の２９５〜２９８ページに特定されるものを包含する（その開示は、引用により本明細書に組込まれる）。
【０１３５】
好ましくは、界面活性剤は、エトキシル化された脂肪アルコールエーテル及びラウリルエーテル、エトキシル化されたアルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、変性されたオキシエチル化された及び／又はオキシプロピル化された直鎖アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合物、及びフェノール性脂肪アルコールエーテルから成る群から選択される。より特定には、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｔｏｎ，ＤＥ）からのＴｗｅｅｎ  ２０TM、すなわちポリエトキシエチル化された（２０）ソルビタンモノラウレート、及びＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）からのＩｃｏｎｏｌTMＮＰ−４０、すなわちエトキシル化されたアルキルフェノール（ノニル）が好ましい。
【０１３６】
本発明の熱安定性酵素は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが必要であるか又は所望されるいづれかの目的のために使用され得る。好ましい態様においては、酵素はＤＮＡ配列決定のためである（Ｉｎｎｉｓなど．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９４３６−９４４０；引用により本明細書に組込まれる）。
次の例は、例示的であって、本発明の範囲を限定するものではない。それらの例において、すべての百分率は、特にことわらない限り、固体の場合、重量によってであり、そして液体の場合、体積によってである。
【０１３７】
【実施例】
例１．発現系の構成
発現系は、当業界において良く知られている従来の技法を用いて、ヌクレオチド配列、配列番号９を有する遺伝子を含む寄託されたプラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５から構成される。下記により詳細に記載される、関与する段階は、次の通りである。
−ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５に含まれるＤＮＡポリメラーゼコード配列を、ｐＤＧ１６０発現ベクター中にサブクローン化し、プラスミドｐＴＭＡ２５をもたらす。
【０１３８】
−Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異を、部位特異的プライマー指図された変異誘発によりｐＴＭＡ２５に付加し、プラスミドｐＴＭＡ３０をもたらす。
−次に、ｐＴＡＭ３０からの変異誘発された遺伝子コード配列を、コドン１−２８３が欠失されるようにｐＤＧ１８４発現ベクター中にサブクローン化し、プラスミドｐＴＭＡ３１をもたらす。
−Ｆ７３０Ｙ変異を、部位特異的プライマー指図された変異誘発によりｐＴＭＡ３１に付加し、プラスミドｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕をもたらす。
【０１３９】
−Ｆ７３０Ｙ変異を含むｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕からの変異誘発されたコード配列のフラグメントを、その対応する変異誘発されていないフラグメントを置換するためにｐＴＭＡ３０中にサブクローン化し、プラスミドｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕をもたらす。
【０１４０】
個々の変異誘発又はサブクローニング段階に続いて、Ｅ．コリ株ＤＧ１１６宿主細胞を、プラスミド構造体により形質転換する。アンピシリン耐性（プラスミド含有）コロニーを、標準方法を用いて、所望するプラスミドの存在についてスクリーンする。典型的には、第１のコロニーを、ゲル電気泳動サイズ分別により予測されるサイズのプラスミドの存在について選択する。候補体コロニーを、１又は複数の制限酵素による消化に続いて、予測されるフラグメントパターンを示すプラスミドについてさらにスクリーンする。最終的に、突然誘発された部位及び連結接合部分を配列決定し、意図された配列を確認する。
【０１４１】
プラスミドｐＤＧ１６０は、アメリカ特許第５，６１８，７１１号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。プラスミドｐＤＧ１６０は、バクテリオファージλＰL プロモーター及び遺伝子Ｎリボソーム結合部位（アメリカ特許第４，７１１，８４５号、引用により本明細書に組込まれる）、ポリリンカー中にクローン化された配列がλＰL プロモーターの制御下で発現され得るように配置された制限部位ポリリンカー及び遺伝子Ｎリボソーム結合部位、及びバシラス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ−トキシン遺伝子からの転写ターミネーター（アメリカ特許第４，６６６，８４８号を参照のこと、引用により本明細書に組込まれる）を含んで成るクローニング及び発現ベクターである。プラスミドｐＤＧ１６０はまた、そのプラスミドを、コピー数のために感温性にする変異誘発されたＲＮＡII遺伝子を担持する（アメリカ特許第４，６３１，２５７号を参照のこと、引用により本明細書に組込まれる）。
【０１４２】
それらの要素は、プラスミドｐＤＧ１６０をひじょうに有用で且つ強力な発現ベクターにするために強力して作用する。３０〜３２℃で、プラスミドのコピー数は低く、そして感温性リプレッサー遺伝子、たとえばｃＩ８５７を担持する宿主細胞においては、ＰL プロモーターは機能しない。しかしながら、３７〜４１℃で、プラスミドのコピー数は３０〜３２℃でのコピー数よりも５０倍高く、そしてｃＩ８５７リプレッサーが不活性化され、ＰL プロモーターの機能を可能にする。プラスミドｐＤＧ１６０はまた、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）マーカーも担持する。要約すると、プラスミドｐＤＧ１６０は、ＡｍｐＲマーカー、ＰL プロモーター及び遺伝子Ｎリボソーム結合部位、ポリリンカー及びＢＴｃｒｙＰＲＥ（ＢＴ陽性逆調節要素、アメリカ特許第４，６６６，８４８号）を、ＣｏｌＥ１  ｃｏｐtsベクターに含んで成る。
【０１４３】
プラスミドｐＤＧ１８４は、アメリカ特許第５，４２０，０２９号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。プラスミドｐＤＧ１８４は、挿入された遺伝子の開始コドンでＮｃｏＩ部位を含むよう修飾された、ｐＤＧ１６０の誘導体である。前記プラスミドの残りは、ｐＤＧ１６０からであり、機能的に変更されていない。
【０１４４】
Ｉ．サブクローニングＩ
プラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５からのＤＮＡポリメラーゼコード配列を、ｐＤＧ１６０発現プラスミド中に次の通りにしてサブクローン化する：
Ａ．プラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５、すなわち５３４７個の塩基対（bp）のプラスミドを、位置２０８４（コード配列の最初のヌクレオチドから出発して番号付けされた）で切断するＮｓｐＶによる消化により線状化する。
Ｂ．ＮｓｐＶ消化に起因する線状化されたプラスミドを、ヌクレオチド（ｎｔ）位置１６６１，１９８９，２０３９及び２６８６で切断するＢａｍＨＩによりさらに消化する。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３′末端を含む６０２bpのＮｓｐＶ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ゲル精製する。
【０１４５】
Ｃ．別の反応において、ＮｓｐＶ消化に起因する線状化されたプラスミドを、位置２６２９及び５３４２で切断するＨｉｎｄIII によりさらに消化する。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５′末端を含む２０８９bpのＮｓｐＶ／ＨｉｎｄIII フラグメント（ｎｔ５３４３−２０８４）をゲル精製する。
Ｄ．プラスミドｐＤＧ１６０を、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そしてウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）により処理し、５′リン酸を除去し、そしてベクターの連結及び再構成を阻止する。他方では、その消化されたベクターフラグメントを、ゲル精製する。
【０１４６】
Ｅ．段階Ｂ及びＣからの単離されたフラグメントを、段階Ｄからの消化されたｐＤＧ１６０プラスミドと共に、合計のＤＮＡ１μｌ当たり１０〜４０ngの濃度で２：２：１の比で組合し、そして連結し、８２１８bpのプラスミドをもたらす。
Ｆ．連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞（上記に記載される）を形質転換し、そしてｐＴＭＡ２５と称する所望するプラスミドを含む形質転換体コロニーを、スクリーニングにより同定する。
【０１４７】
II．変異誘発Ｉ：Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ
Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａアミノ酸変異をもたらす、ｐＴＭＡ２５の配列のコードするＤＮＡポリメラーゼにおける変異を、部位−特異的プライマー指図された変異誘発を用いて行なう。後での操作における便利さのために、ＢｇｌII制限酵素切断部位を排除し、そしてＳｐｅＩ制限酵素切断部位を創造する追加の変異誘発を行なう。それらの追加の変異は、コードされたアミノ酸配列が変更されないように行なわれる。
【０１４８】
次のプライマーが変異誘発に使用される：
−プライマーＰ１：下記表に記載されるような変異を有する、配列番号９のヌクレオチド９５８−９８８に対応する変異誘発性上流プライマー。
−プライマーＰ２：プライマーＰ１の逆補体から成る変異誘発性下流プライマー。
−プライマーＰ３：ＸｂａＩ部位（ヌクレオチド６２１−６２６）を包含する、配列番号９のヌクレオチド６０８−６２７に対応する上流プライマー。
−プライマーＰ４：ＳａｃＩ部位の一部（ヌクレオチド１３１８−１３２３）を包含する、配列番号９のヌクレオチド１３１９−１３３９に対応する下流プライマー。
【０１４９】
変異誘発性上流プライマーＰ１の配列は、配列番号９のコード鎖のヌクレオチド９５８−９８８から成るが、但し、下記表に示される変更は伴わない。コドン３２３（ヌクレオチド９６７−９６９）における変更は、ＢｇｌII部位の排除をもたらした。コドン３２６（ヌクレオチド９６６−９７８）及び３２７（ヌクレオチド９７９−９８１）における変更は、コードされたアミノ酸の配列に影響を及ぼさないが、しかしＳｐｅＩ部位の創造をもたらす。
【０１５０】
【表４】
0004350815.tif 000005
【０１５１】
変異誘発は、下記に記載のようにして実施される。すべての増幅は、当業界において良く知られている条件下でＰＣＲにより実施される。たとえば、増幅は、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ登録商標  ＤＮＡポリメラーゼを有するＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて、実施され得る。
Ａ．コード配列の領域を、プライマーＰ３及びＰ２を用いて、精製されたｐＴＭＡ２５から増幅し、そしてその得られる３８１bpの増幅された生成物をゲル精製する。
【０１５２】
Ｂ．コード配列の領域を、プライマーＰ１及びＰ４を用いて、精製されたｐＴＭＡ２５から増幅し、そしてその得られる３８２bpの増幅された生成物をゲル精製する。
Ｃ．段階Ａ及びＢからの増幅された生成物を組合し、９５℃で熱変性し、アニーリングし、そして標準の技法を用いて、ＤＮＡポリメラーゼにより延長する。
Ｄ．段階Ｃからのアニーリングされ、そして延長された複合ＤＮＡを、プライマーＰ３及びＰ４を用いて再増幅し、そしてその得られる７３２bpの増幅された生成物をゲル精製する。
Ｅ．段階Ｄからの増幅されたＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＳａｃＩにより消化する。
【０１５３】
Ｆ．プラスミドｐＴＭＡ２５をＸｂａＩ及びＳａｃＩにより消化し、そしてウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）により処理し、５′リン酸を除去し、そしてベクターの再連結及び再構成を阻止する。
Ｇ．段階Ｅからの消化されたＤＮＡを、段階Ｆからの消化されたプラスミドと、３：１の比で組合し、そして連結する。
Ｈ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞を形質転換し、そしてｐＴＭＡ３０と称する、所望するプラスミドを含む形質転換体コロニーを、スクリーニングすることにより同定する。
【０１５４】
III ．サブクローニングII
次に、ｐＴＭＡ３０からの配列をコードする変異誘発された遺伝子を、コドン１−２８３が欠失されるようにｐＤＧ１８４発現ベクター中にサブクローン化する。ここで使用されるヌクレオチド位置数は、プラスミド内の位置を言及し、ここで位置１はＰL プロモーターの上流のＥｃｏＲＩ部位により定義される。サブクローン化は次の通りにして行なわれる。
【０１５５】
Ａ．８２１８bpのプラスミドであるプラスミドｐＴＭＡ３０を、ヌクレオチド位置４４４３で切断するＭｌｕＩ；位置１２１０，４７６１，５７６９及び５８７４で切断するＢｓｐＨＩ；及び位置７８２７で切断するＡｆｌIIにより消化する。所望するフラグメントの、単離を促進するために、ＡｆｌII消化を行ない、所望する３２３３bpのＢｓｐＨＩ／ＭｌｕＩフラグメントにサイズ的に類似する３５５４bpのＢｓｐＨＩ／ＢｓｐＨＩフラグメントをさらに分解する。前記消化は、３２３３，１９５２，１６０１，１００８，３１８及び１０５bpの長さを有する６種のフラグメントを生成した。前記プラスミドのヌクレオチド１２１１−４４４３に対応する３２３３bpのＢｓｐＨＩ／ＭｌｕＩフラグメントを、ゲル電気泳動により単離する。
【０１５６】
Ｂ．５４７４bpプラスミドのプラスミドｐＤＧ１８４を、位置１６９９で切断するＭｌｕＩ、及び位置２８４で切断するＮｃｏＩにより消化する。その消化されたフラグメントを、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）により処理し、５′リン酸を除去し、そしてベクターの再連結及び再構成を阻止する。他方では、４０５９bpのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離する。
【０１５７】
Ｃ．段階Ａからの単離されたフラグメントを、段階Ｂからの消化されたｐＤＧ１８４プラスミドと共に、合計ＤＮＡ１μｌ当たり１０〜４０ngの濃度で、１：１の比で組合し、そして連結し、７２９２bpのプラスミドをもたらす。
Ｄ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞を形質転換し、そしてｐＴＭＡ３１と称する所望するプラスミドを含む形質転換体コロニーを、スクリーニングにより同定する。
【０１５８】
IV．変異誘発II：Ｆ７３０Ｙ
コードされたアミノ酸配列変異においてＦ７３０Ｙ変異をもたらすｐＴＭＡ３１の配列をコードするＤＮＡポリメラーゼにおける追加の変異を、部位−特異的−指図された変異誘発を用いて行なった。前記変異誘発は、上記に記載される方法に類似する方法を用いて実施された。
次のプライマーが変異誘発に使用された。
−プライマーＦＲ１：下記表に記載されるような変異を有する、配列番号９のヌクレオチド２１７３−２２０２に対応する変異誘発性上流プライマー。
【０１５９】
−プライマーＦＲ２：プライマーＦＲ１の逆補体から実質的に成るが、しかし配列番号９のヌクレオチド２１７２−２２００に対応する変異誘発性下流プライマー。
−プライマーＦＲ３：ＢｓｔＸＩ部位の上流に位置する、配列番号９のヌクレオチド１９５２−１９７２に対応する上流プライマー。
−プライマーＦＲ４：ＸｍａＩ部位の下流に位置する、配列番号９のヌクレオチド２４１５−２４３３に対応する下流プライマー。
変異誘発性上流プライマーＦＲ１の配列は、配列番号９のコード鎖のヌクレオチド２１７３−２２０２から成るが、但し、下記表に示される変更は存在しない。コドン７２９（２１８５−２１８７）における変更は、コードされたアミノ酸の配列に影響を及ぼさないが、しかしＨｐａＩ部位の創造をもたらす。
【０１６０】
【表５】
0004350815.tif 000006
【０１６１】
変異誘発を、下記に記載のようにして実施した。
Ａ．コード配列の領域を、プライマーＦＲ３及びＦＲ２を用いて、精製されたｐＴＭＡ３１から増幅し、そして得られる２４９bpの増幅された生成物をゲル精製した。
Ｂ．コード配列の領域を、プライマーＦＲ１及びＦＲ４を用いて、精製されたｐＴＭＡ３１から精製し、そして得られる２６１bpの増幅された生成物をゲル精製した。
【０１６２】
Ｃ．段階Ａ及びＢからの増幅された生成物を組合し、９５℃で熱変性し、アニーリングし、そして標準の技法を用いてＤＮＡポリメラーゼにより延長した。
Ｄ．段階Ｃからのアニーリングされ、そして延長された複合ＤＮＡを、プライマーＦＲ３及びＦＲ４を用いて再増幅し、そして得られる４８２bpの増幅された生成物をフェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、そしてＥｔＯＨにより沈殿せしめた。
Ｅ．段階Ｄからの増幅されたＤＮＡをＢｓｔＸＩ及びＸｍａＩにより消化し、そして所望される３３７bpのＤＮＡフラグメントを、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ  １００カラム（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、より小さなフラグメントから分離した。
【０１６３】
Ｆ．プラスミドｐＴＭＡ３１を、ＢｓｔＸＩ及びＸｂａＩにより消化した。
Ｇ．段階Ｅからの消化されたＤＮＡを、段階Ｆからの消化されたプラスミドと共に３：１の比で組合し、そして連結した。
Ｈ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞を形質転換した。変異誘発の間に導入されるユニークＨｐａＩ部位を包含する領域を増幅するプライマーＦＲ３及びＦＲ４を用いて、プラスミドＤＮＡを増幅し、前記増幅された生成物をＨｐａＩにより消化し、そして前記消化生成物をゲル電気泳動により分析することによって、コロニーを、所望する変異誘発されたプラスミドの存在についてスクリーンした。ｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕と称する所望するプラスミドを含むコロニーを選択し、そしてその遺伝子配列をＤＮＡ配列決定により確かめた。
【０１６４】
その得られる発現系は、Ｄ３２３Ａ，Ｅ３２５Ａ及びＦ７３０Ｙ変異により変異誘発された、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８４−８９３から成る、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼと称するＤＮＡポリメラーゼを発現する。
【０１６５】
Ｖ．サブクローニングIII 
Ｆ７３０Ｙ変異を含むｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕からの変異誘発されたコード配列のフラグメントを、ｐＴＭＡ３０中にサブクローン化し、その対応する変異誘発されたフラグメントを置換し、プラスミドｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕をもたらした。ここで使用されるヌクレオチド位置数は、プラスミド内の位置を言及し、ここで位置１は、λＰL プロモーターの上流のＥｃｏＲＩ部位により定義される。サブクローニングを、次の通りにして実施した。
【０１６６】
Ａ．７２９２bpのプラスミドであるプラスミドｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕を、ヌクレオチド位置３５１７で切断するＭｌｕＩ、及び位置４１２で切断するＳｐｅＩにより消化した。プラスミドのヌクレオチド４１３〜３５１７に対応する３１０５bpのＭｌｕＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、ゲル電気泳動により単離した。
【０１６７】
Ｂ．８２１８bpのプラスミドであるプラスミドｐＴＭＡ３０を、ヌクレオチド位置４４４３で切断するＭｌｕＩ、及び位置１３３８で切断するＳｐｅＩにより消化する。プラスミドフラグメントのヌクレオチド４４４４−１３３８に対応する５１１３bpのＭｌｕＩ／ＳｐｅＩフラグメントをゲル電気泳動により単離する。
Ｃ．段階Ａからの単離されたフラグメントを、段階Ｂからの単離されたフラグメントと共に、合計ＤＮＡ１μｌ当たり１０〜４０ngの濃度で１：１の比で組合し、そして連結する。
【０１６８】
Ｄ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞を形質転換した。変異誘発の間に導入されるユニークＨｐａＩ及びＳｐｅＩ部位を包含する領域を増幅するプライマーを用いてプラスミドＤＮＡを増幅し、その増幅された生成物をＨｐａＩ又はＳｐｅＩにより消化し、そして前記消化生成物をゲル電気泳動により分析することによって、コロニーを、所望する８．２kbのフラグメントの存在についてスクリーンした。プラスミドＤＮＡを、スクリーンにおいて予測される消化パターンを示すプラスミドを含むコロニーから調製し、そしてＨｐａＩ，ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩによる消化、続く、消化されたＤＮＡのゲル分析によりさらに分析した。ｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕と称する所望するプラスミドを含むコロニーを選択し、そしてその遺伝子配列をＤＮＡ配列決定により確かめた。
【０１６９】
得られる発現プラスミドｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕は、バクテリオファージλＰL プロモーター及び遺伝子Ｎリボソーム結合部位、並びにバシラススリンギエンシスデルタ−トキシン遺伝子からの陽性逆調節要素（ＰＲＥ、転写ターミネーター）の制御下にある。プラスミドはまた、プラスミドをコピー数のために感温性にする変異誘発されたＲＮＡII遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子を担持する。
【０１７０】
例２．組換えＤＮＡポリメラーゼの発現
この例は、実質的に例１に記載されるようなプラスミドｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕を有するＥ．コリＫ１２株ＤＧ１１６細胞の発現系を用いて、Ｆ７３０Ｙ
Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの発現及び精製を記載する。
発現系細胞の初期増殖を、種フラスコにおいて実施した。大規模発酵を、種培養物により接種された１０ｌの発酵フラスコにおいて実施した。使用される培地及びプロトコールは、次の通りである。
【０１７１】
種培地は、ＩＸ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｖｏｇｅｌ塩（９．６mMのクエン酸、５７mMのＫ2 ＨＰＯ4 ，１６．８mMのＮａＮＨ4 ＨＰＯ4 ，０．８mMのＭｇＳＯ4 ）＋２５mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２mMのＭｇＳＯ4 ，１０μｇ／mlのチアミン−ＨＣｌ，０．２％のグルコース、０．２５％のカサミノ酸及び１００μｇ／mlのアンピシリン及びメチシリンから成った。培地は無菌貯蔵溶液から配合し、次に使用の前、フィルター殺菌した。
【０１７２】
発酵培地は、ＩＸ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｖｏｇｅｌ塩（９．０mMのクエン酸、５７mMのＫ2 ＨＰＯ4 ，１６．８mMのＮａＮＨ4 ＨＰＯ4 ，０．８mMのＭｇＳＯ4 ）＋２５mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２mMのＭｇＳＯ4 ，１０μＭのＭｎＳＯ4 ，６．９μＭのＺｎＣｌ2 ，８．４μＭのＣｏＣｌ2 ，８．３μＭのＮａＭｏＯ4 ，６．８μＭのＣａＣｌ2 ，７．４μＭのＣｕＣｌ2 ，８．１μＭのＨ3 ＢＯ3 ，１μＭのＦｅＣｌ3 ，０．５ml／ｌのＭａｃｏｌｌ  Ｐ２０００消泡剤、１０μｇ／mlのチアミン−ＨＣｌ，１．６％のグルコース、２．０％のカサミノ酸、及び１００μｇ／mlのアンピシリンから成った。上記成分（消泡剤まで）を、１２１℃で２０分間、現場殺菌し、そして残りを、接種の直前、殺菌された貯蔵溶液から添加した。
【０１７３】
種培養物を、０．１mlの凍結された発現系細胞により接種された種培養物の１００mlフラスコにおいて増殖した。接種に続いて、その培養物を３０℃で一晩、振盪した。全フラスコ培養物を用いて、１０ｌの発酵培養物を接種した。
発酵を次のようにして実施した。初期温度は３０℃であり、pHは４ＮのＮＨ4 ＯＨ及び氷酢酸により６．９±０．１で調整され、そして溶解される酸素は、３００rpm の初期最少値から必要とされるような撹拌速度を調節することによって、３０％で調整された。エアレーション速度を、５ｌ／分で一定して維持した。培養物が２．５OD（６８０nm）に達した場合、約６〜７．５時間後、温度を３８．５℃に、０．４℃／分の速度で、ＤＮＡポリメラーゼの合成を誘発するために変えた。発酵を、約２４時間の合計実験時間まで、一晩続けた。細胞ペーストを、交差流濾過及び遠心分離により収穫し、そして−２０℃で凍結した。
【０１７４】
例３．組換えＤＮＡポリメラーゼの精製
この例は、上記発酵からの発現されたＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの精製を記載する。前記精製は、下記変性を伴って、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２７５−２８７に記載のようにして実質的に実施した。
【０１７５】
次の標準略語を使用する。
ＰＥＩ＝ポリエチレンイミン
ＴＬＣＫ＝Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン−ＨＣｌ
ＰＥＩは、特にＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から入手できる。ＴＬＣＫは、中でも、Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手できる。
【０１７６】
発酵からの約１５０ｇの凍結された（−７０℃）細胞を、１０mMのＥＤＴＡ，１mMのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２mMのＰｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ（Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ），１μｇ／mlのＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、及び１mMのＴＬＣＫを含む溶解緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５）に融解した。細胞を、１０，０００psi でＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒに５回通すことにより溶解した。その溶解物を、５．５×細胞の最終体積（湿量）に、溶解緩衝液により希釈した。得られる溶解物を画分Ｉと命名した。
【０１７７】
硫酸アンモニウムを画分Ｉに徐々に添加し、０．２Ｍの濃度にした。次に、画分Ｉを次のようにしてＰＥＩ−沈殿せしめた。
ＰＥＩ滴定を用いて、核酸を沈殿せしめるのに必要な最少量のＰＥＩを決定した。１０μｌの個々の試験沈殿物を、標準のマイクロウェルプレートにおいて０．５μｇ／mlの臭化エチジウム１００μｌに添加した。対照は、ＰＥＩを含まない適切に希釈された溶解物から成った。プレートをＵＶ光により照射し、そして核酸の少なくとも９９％を除去するために必要とされるＰＥＩの濃度を決定した。
【０１７８】
ＰＥＩを撹拌しながらゆっくり添加し、０．４％（滴定から決定されるような濃度）にした。ＰＥＩ処理された溶解物を、８，０００RPM （１１，３００×ｇ）で３０分間、５℃でＪＡ−１０ローター（５００mlボトル）において遠心分離した。上清液（画分II）をデカントし、そして保持した。
硫酸アンモニウムを画分II上清液に添加し、０．４Ｍの濃度とした。次に、画分IIを次のようにして熱処理した。
【０１７９】
熱処理は３ｌのＢｒａｕｎ発酵器において行なわれた。撹拌速度は２５０rpm であった。温度を７５℃に６分間にわたって上げ、１５分間維持し、次にできるだけ早く、発酵器において３０℃に冷却した。ＰＥＩ沈殿からの熱処理された画分II上清液を発酵器から除去し、そして少なくとも３０分間、氷上に保持し、次に上記のようにして遠心分離した。上清液（画分III ）をデカントし、そして維持した。
【０１８０】
画分III を次のようにして、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーにかけた。２５０mlのラジアル流カラム（Ｓｅｐｒａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により充填した。画分III を５０mMのトリス（pH７．５）、１０mMのＥＤＴＡ溶液により希釈し、硫酸アンモニウムの濃度を０．３Ｍに減じ、そして次に、カラムに適用した。
【０１８１】
カラムを１５〜２０分間、次の４種の緩衝液の個々により（３〜４カラム体積）、洗浄した（５０ml／分の流速）：（１）５０mMのトリス、pH７．５，１０mMのＥＤＴＡ，０．３Ｍの硫酸アンモニウム、１mMのＤＴＴ；（２）２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，１mMのＤＴＴ；（３）２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，２０％ｖ／ｖのエチレングリコール、１mMのＤＴＴ；及び（４）２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，２０％ｖ／ｖのエチレングリコール、１mMのＤＴＴ，２．０Ｍの尿素。ＤＮＡポリメラーゼを含む尿素溶離物（画分IV）を、約３〜１８分の尿素溶出から単一のプールとして集めた。全フェニルセファロースカラム段階を、２時間以内に完結した。
【０１８２】
画分IVを次のようにしてヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにゆだねた。画分IV（約７５０ml）を、ＫＣｌ（３Ｍの原液から）において０．０５Ｍにし、そして次に、２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，０．０５ＭのＫＣｌ，１mMのＤＴＴ溶液により平衡化された１００mlのラジアル流ヘパリンセファロースカラム上に負荷した。
【０１８３】
負荷の後、カラムを平衡化緩衝液、次に２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，０．１０ＭのＫＣｌ，１mMのＤＴＴ溶液により３０分間、洗浄した（２０ml／分の流速）。最終的に、ＤＮＡポリメラーゼを、２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，０．１０〜０．５ＭのＫＣｌ、及び１mMのＤＴＴ溶液における１２カラム体積グラジエントにおいて溶離し、それぞれ１６mlの７５の画分を集めた。ヘパリンセファロースカラム段階を、３時間以下で完結した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そして低い純度である、ＤＮＡポリメラーゼを含むいくつかの初期画分をプールから除去した（画分Ｖ）。
【０１８４】
画分Ｖを、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ３０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）上で２０mlに濃縮した。その濃縮物を、３×貯蔵緩衝液（６０mMのトリス、pH８．０，０．３mMのＥＤＴＡ，０．３mMのＫＣｌ，３mMのＤＴＴ）に対して４℃で一晩、透析した。グリセロールを透析物に添加し、５０％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の最終濃度の原液にした。Ｔｗｅｅｎ２０TMを添加し、０．２％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の最終濃度の原液にした。
【０１８５】
殺菌された水を添加し、調製物の体積を元の溶解物の体積の３倍にし、画分Ｖ、すなわち貯蔵安定性のＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの調製物を生成した。
画分VIを、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７（引用により本明細書に組込まれる）に実質的に記載されるようにして、ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイした。
【０１８６】
例４．延長速度
Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの延長速度を、鋳型−限定されたプライマー延長アッセイを用いて測定した。アッセイを、延長速度がＤＮＡポリメラーゼ濃度に無関係な条件下で、過剰のＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。
【０１８７】
本発明のキメラ酵素、すなわちＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを、上記プラスミドｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕から発現されたＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼに比較した。Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼは、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を不活性化するＤ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異及びＦ７３０Ｙ変異を組込むＵＩＴｍａTM  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）の変異誘発されたバージョンである。
【０１８８】
Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼ及びＦ７３１Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼが５′−ヌクレアーゼ活性を不活性化するよう変異誘発されているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼからの５′−ヌクレアーゼドメインを含むが、ところがＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼはＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの最初の２８３個のアミノ酸をミッシングしていることにおいて主に異なる。従って、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼは、５′−ヌクレアーゼドメインの欠失の結果として５′−ヌクレアーゼ活性を欠いている。
【０１８９】
ＤＮＡポリメラーゼ調製物を最初、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７に記載のようにしてアッセイし、その単位濃度を決定し、そして前記酵素が過剰に存在するよう、必要とされる酵素の量を決定した。それらのアッセイに基づけば、下記延長速度アッセイにおいて１単位のＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼ又は３．５単位のＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼの使用が、延長速度が酵素濃度に無関係であることを確かめるために十分であることが決定された。酵素の単位の定義は、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９、前記に定義される通りである。
【０１９０】
延長速度は、５μｌのＤＮＡポリメラーゼ（上記単位量を含むように、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９、前記に記載のようにして希釈された）を含む反応混合物５０μｌ、及び５０mMのＢｉｃｉｎｅ，pH８．３，２５℃；２．５mMのＭｇＣｌ2 ；１mMのβ−メルカプトエタノール；２００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１００μＭの〔α−33Ｐ〕ｄＧＰ（０．８μCi／反応）；及びプライマーＤＧ４８、すなわち（配列番号11；5'-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC)にプレアニーリングされたＭ１３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）鋳型ＤＮＡ０．０７５ｐモルを含む反応緩衝液４５μｌにおいて、７５℃で３分間、アッセイされた。反応は、６０mMのＥＤＴＡ１０μｌの添加により停止され、そして０℃で貯蔵それた。
【０１９１】
停止された反応の一部２５μｌを、キャリヤーとして５０μｇ／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む２mMのＥＤＴＡ溶液１mlにより希釈した。ＤＮＡを２０％のトリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）及び２％ピロリン酸ナトリウム溶液１mlの添加により沈殿せしめ、そして０℃で１５分間インキュベートした。沈殿されたＤＮＡをＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上で集め、そして５％トリクロロ酢酸及び２％ピロリン酸ナトリウムにより、次に５％トリクロロ酢酸により、次に９５％エタノール５mlにより広範に洗浄し、乾燥せしめ、そして計数した。
１分当たりに組込まれる〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて決定した。下記に示されるデータは、２つの反応の平均を表わす。
【０１９２】
【表６】
0004350815.tif 000007
【０１９３】
データは、上記アッセイにより測定される場合、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼがＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３１  ＤＮＡポリメラーゼよりも４１％早い延長速度を有することを示す。２種の酵素間の差異の観点から、データは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼからの５′−ヌクレアーゼドメインのＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼにおける存在が、Ｇ４６Ｄ変異により不活性化されるけれども、有意に早い延長速度をもたらすことを示す。
一連の時点からの延長生成物を、変性アガロースゲル電気泳動によりさらに分析し、その結果が酵素の延長速度の上昇を示すことを確かめた。
【０１９４】
例５．色素ターミネーターサイクル配列決定
この例は、色素−ラベルされた、ジデオキシ−ターミネーターサイクル配列決定へのＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの適用を示す。比較のために、サイクル配列決定反応をまた、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ、すなわちＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼにおけるＦ７３０Ｙ変異に対して類似する、エキソヌクレアーゼ活性を欠き、そしてＦ６６７Ｙ変異を組込んでいるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変異形を用いて実施した。
【０１９５】
サイクル配列決定反応を、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを有するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）の試薬及びプロトコールを用いて実施した。このキットにおける別の試薬のパッケージが、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳのためのＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの容易な置換を可能にした。このキットにおいては、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳは、ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼと組合されて供給される。
【０１９６】
Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを用いる反応のためには、キットのＤＮＡポリメラーゼ／ピロホスファターゼ混合物が、１０単位のＦ７３０ＹＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ及び２０単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼにより置換された。ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼは、同時続続アメリカ特許第５，６６５，５５１号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
キットと共に供給される、陽性の対照鋳型、すなわちｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋）及びプライマー、 -２１Ｍ１３が使用された。反応を、推薦される熱サイクルプロトコール（２５サイクル：９６℃で１０秒；５０℃で５秒；及び６０℃で４分）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）において実施した。
【０１９７】
延長生成物を、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）からのＣｅｎｔｒｉ−ＳｅｐTMカラムを用いての回転カラム精製により、組込まれていない色素ターミネーターについて精製し、そして前記プロトコールに推薦されるようにして、真空遠心分離機において乾燥せしめた。サンプルを、回転せしめ、９０℃に３分間、加熱し、変性し、そして次に、予備電気泳動された４８cm（ウェルから読取りまで）の４％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上に負荷し、そして電気泳動せしめ、そして製造業者の説明書に従って、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ３７７  ＤＮＡ配列決定機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）上で分析した。
【０１９８】
得られる配列決定トレースは、図に示される。図３，４、及び５は、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを用いてのサイクル配列決定反応からの配列決定トレースを提供し、そして図６，７及び８は、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いてのサイクル配列決定反応からの配列決定トレースを提供する。基本コーリングは、プライマーからの１０番目のヌクレオチドで開始するよう設定された。
【０１９９】
Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの使用が、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いて得られる結果に比較される場合、ピークの高さの全体的な均等性において有意な改良点をもたらすことが、配列トレースの比較から明白である。特に、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＤＮＡ配列の情況のために、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳが使用される場合、ひじょうに低いピークの高さをもたらすそれらの塩基、たとえばＡ又はＣの後のＧ、Ａ又はＣの後のＡ、及びＴの後のＴのピークの高さを有意に高める。
【０２００】
同様に、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＤＮＡ配列の情況のために、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳが使用される場合、ひじょうに高いピークの高さをもたらすそれらの塩基、たとえばＧの後のＡのピークの高さを有意に低める。ピークの高さの均等性は、配列決定の精度の上昇に寄与する。
【０２０１】
配列決定の精度、すなわち２回の重複された反応について平均された、正しく配列決定された塩基の割合が、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ分析ソフトウェアにより、自動化された基本コーリングの結果から計算された。その結果は、下記表に要約される。典型的には、配列決定誤差は、プライマーに続く領域、及びプライマーから遠くの末端領域において最とも有力である。従って、プライマーに続く最初の１０個のヌクレオチドは無視され、そして精度が、続く５０個のヌクレオチド、次の５００個のヌクレオチド、及び最終的に２つの末端領域（それぞれ、長さ１００個のヌクレオチド）について別々に計算された。
【０２０２】
【表７】
0004350815.tif 000008
【０２０３】
前記結果は、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼが配列決定の精度において実質的な改良性；目立ったことには、より長い読取りの長さ（５６０個以上のヌクレオチド）でそのような改良性を提供することを示す。Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ヌクレオチド５１〜５５０からの５００個のヌクレオチド領域及びヌクレオチド５５１〜６６０からの最初の末端領域において完全に誤差を排除した。さらに、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いての６５０個のヌクレオチドから、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを用いての少なくとも７５０個のヌクレオチドまでの少なくとも１００個のヌクレオチドを、少なくとも９７％の精度で配列決定できる標的物の長さを延長した。
【０２０４】
例６．色素プライマーサイクル配列決定
この例は、色素プライマー配列決定への本発明のＤＮＡポリメラーゼの適用を示す。
サイクル配列決定反応を、２５mMのトリス−ＨＣｌ（pH９．１）及び３．５mMのＭｇＣｌ2 から成る緩衝液において実施する。４種の個々の反応、すなわち４種のジデオキシターミネーターの個々についての反応を実施する。それらの４種の反応の個々についての反応条件を、下記に記載する：
【０２０５】
１．ジデオキシ−ＡＴＰ反応（５μｌ）：
１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
１００μＭのｃ７ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、
０．５μＭのｄｄＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．１μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．４ｐモルのＪＯＥ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
１単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び
５単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０６】
２．ジデオキシ−ＣＴＰ反応（５μｌ）：
１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
１００μＭのｃ７ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．５μＭのｄｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．１μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．４ｐモルのＦＡＭ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
１単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び
５単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０７】
３．ジデオキシ−ＧＴＰ反応（１０μｌ）：
１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
１００μＭのｃ７ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．５μＭのｄｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．２μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．８ｐモルＴＡＭＲＡ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
２単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び
１０単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０８】
４．ジデオキシ−ＴＴＰ反応（１０μｌ）：
１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
１００μＭのｃ７ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．５μＭのｄｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
０．２μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．８ｐモルのＲＯＸ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
２単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び
１０単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０９】
４種の反応の個々を、予備加熱された（７５℃）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラーに配置し、そして９６℃で１５秒間、５５℃で１秒間、及び７０℃で１分間の１５サイクル、続いて、９６℃で１５秒及び７０℃で１分間の１５サイクルにゆだねる。４種の反応物をプールし、そして９５％エタノール１００μｌ及び３Ｍの酢酸ナトリウム（pH５．３）２．０μｌの４℃での１５分間にわたっての添加により沈殿せしめる。
【０２１０】
プールされた反応物を１５分間、微量遠心分離し、沈殿物を集め、上清液を除去し、そしてペレットを乾燥せしめる。ペレットを、脱イオン化されたホルムアミド／５０mMのＥＤＴＡ（pH８．０）５／ｌ（ｖ／ｖ）６μｌに再懸濁し、９０℃で２分間、加熱し、そして予備−電気泳動された４％ポリアクリルアミド／６Ｍの尿素ゲル上に負荷し、そして電気泳動し、そして製造業者の説明書に従って、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ３７７  ＤＮＡ配列決定機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）上で分析する。
【０２１１】
例７．ピロホスファターゼの効果
上記例５に記載される色素−ターミネーター反応において、２０単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ（ＰＰアーゼ）を前記反応物に添加し、ピロリン酸分解の効果を低めた。この量のＰＰアーゼが、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いる反応のために有益であることが決定された。次の実験を、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、サイクル配列決定反応の結果に対するＰＰアーゼ濃度の効果を決定するために実施した。
【０２１２】
色素−ターミネーターサイクル配列決定反応を、上記例５に実質的に記載のようにして実施した。但し、ＰＰアーゼ濃度は反応間で変更された。反応当たり０，０．５，１及び２０単位のＰＰアーゼ濃度を試験した。標的ＤＮＡ，ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）、及び使用されるプライマーＭ１３（−２１）は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）からのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔからであった。すべての反応は、二重反復して行なわれた。
【０２１３】
個々の配列決定反応の結果を、配列決定トレースの直接的な比較により比較した。その結果は、４種ＰＰアーゼ濃度間の明白な差異を示さなかった。配列決定トレースピークの高さ及びバックグラウンドは、少なくとも５００個の塩基対の読取りに匹敵した。従って、そのデータは、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼの使用が、添加されるＰＰアーゼを伴わないで、サイクル配列決定反応の実施を可能にすることを示す。
【０２１４】
例８．最適ｄＩＴＰ濃度
上記例５で使用される、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを有するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）が、５：１：１：１の比でｄＩＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を供給する。ｄＩＴＰの高められた濃度は、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳにより所有される低いｄＩＴＰ組込み効率を補足する。
【０２１５】
例５に記載されるサイクル配列決定反応において生成されるＧシグナルピークの強さの分析は、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼがｄＩＴＰをより高い効率で組込み、そして従って、ｄＩＴＰ濃度が低められるべきであることを示唆した。さらなる反応を実施し、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを用いての色素−ターミネーターサイクル配列決定反応への使用のためのｄＩＴＰの最適濃度を決定した。
【０２１６】
反応を、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを有するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔを用いて、例５に実質的に記載のようにして実施した。前記キットにより供給されるｄＮＴＰ混合物の代わりに、１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ，ＴＥ緩衝液（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８，０．１mMのＥＤＴＡ）中、広範囲のｄＩＴＰ濃縮物を含むｄＮＴＰ混合物を使用した。例５に記載されるように、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼ／ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ混合物を、キットにより供給されるＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ／ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ混合物と置換した。
【０２１７】
最適ｄＩＴＰ濃度を、配列トレース及び処理されていないシグナル強度データの両者の比較により決定した。それらの実験に基づいて、ｄＩＴＰ濃度が好ましくは、１５０〜２５０μＭに低められたことが決定された。その結果は、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼがＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳよりも有意により効果的にｄＩＴＰを組込むことが決定された。
他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対するＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを比較するためのさらなる実験（結果は示されていない）はまた、Ｆ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼが、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関して、ｄＩＴＰ組込みの有意に高められた効率を有することも示唆した。
【０２１８】
寄託
次の寄託が下記の日に行なわれた：
【表８】
0004350815.tif 000009
【０２１９】
この寄託は、ブダペスト条件下での特許手続き及び規則のために微生物の寄託の国際認識に基づいてブダペスト条件の規定下で、American Type Calture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD20852, U.S.A. に、ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, U.S.A.により行なわれた。これは、寄託の日から３０年間、生存培養物の維持を保証する。
【０２２０】
生物は、ブダペスト条件下でＡＴＣＣにより入手され、そして出願人とＡＴＣＣとの間の同意を必要とし、そしてＡＴＣＣは、関連するアメリカ特許の発行に基づいて、又はいづれかのアメリカ又は外国特許出願の公衆への公開に基づいて、どちらが最初であろうと、培養物の子孫の永久的且つ自由な利用性を保証し、そしてＢ５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２及びそれに従ってのＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒの規則（８８６ＯＧ６３８に特に関する３７Ｃ．Ｆ．Ｋ．§１．１４を包含する）に従って権利を与えられるＵ．Ｓ．Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓによる決定により前記子孫の利用性を保証する。
【０２２１】
本出願の譲受人は、寄託上の培養物が適切な培養下で培養される場合、死亡し、又は失なわれ又は破壊される場合、それはすぐに、同じ培養物の生存検体により、通知に基づいて交換されるであろう。寄託された菌株の利用性は、その特許法に従っていづれかの政府の権力下で許可される権利に違反して本発明を実施するためのライセンスとして解釈されるべきではない。
【０２２２】
ＲＯＣＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｉｎｃ．，１１４５  Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ａｖｅｎｕｅ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４５０１，Ｕ．Ｓ．Ａ．は、アメリカ特許出願番号第６０−０２３３７６からの優先権を主張する外国特許出願に前述の寄託された生物学的材料を照会するために公認されたＦ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ  ＲＯＣＨＥ  ＡＧ，１２４Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，ＣＨ−４０７０  Ｂａｓｌｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを有し、そして寄託された材料が公衆に利用され得る、無条件で且つ変更できない同意を与えている。
【０２２３】
【配列表】
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0004350815.tif 000011
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【０２２４】
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【０２２５】
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【０２２６】
0004350815.tif 000017
0004350815.tif 000018
【０２２７】
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【０２２８】
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【０２２９】
0004350815.tif 000023
0004350815.tif 000024
【０２３０】
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0004350815.tif 000026
【０２３１】
0004350815.tif 000027
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【０２３２】
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【０２３３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーマス属の７つの種からのＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列整合を示す。５′−ヌクレアーゼ活性に対して決定的であるアミノ酸は星印により示される。
【図２】図２は、図１の続きであって、同じようにＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列整合を示す。
【図３】図３は、例５に記載されるようなＦ７３０Ｙ  Ｔｍａ３０  ＤＮＡポリメラーゼを用いてのサイクル配列決定反応からの配列決定トレースを示す。
【図４】図４は、図３の続きであって、同じように配列決定トレースを示す。
【図５】図５は、図４の続きであって、同じように配列決定トレースを示す。
【図６】図６は、例５に記載されるようなＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いてのサイクル配列決定反応からの配列決定トレースを示す。
【図７】図７は、図６の続きであって、同じように配列決定トレースを示す。
【図８】図８は、図７の続きであって、同じように配列決定トレースを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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