(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を分析する方法において、胆汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型がジアフォラーゼにより酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに戻る際に還元される電子伝達能を有する化合物、および該化合物から電子が移送される電極を用いて酵素サイクリングシグナル増幅反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
胆汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型がジアフォラーゼにより酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに戻る際に還元される電子伝達能を有する化合物、および該化合物から電子が移送される電極を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を分析する酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【請求項３】
請求項１記載のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を分析する方法において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型がジアフォラーゼにより酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに戻る際に還元される電子伝達能を有する化合物から電子が移送される電極であって、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素および／またはジアフォラーゼを固定化した、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型分析用の電極。
【請求項４】
１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス属由来である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス属由来である請求項２に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【請求項６】
１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス属由来である請求項３に記載の電極。
【請求項７】
１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】
１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である請求項２または５に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【請求項９】
１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である請求項３または６に記載の電極。
【請求項１０】
電極がカーボン電極である請求項１、４または７に記載の方法。
【請求項１１】
電極がカーボン電極である請求項２、５または８に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【請求項１２】
電極がカーボン電極である請求項３、６または９に記載の電極。
【請求項１３】
胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩からなる群から選ばれる胆汁酸塩である請求項１、４、７または１０に記載の方法。
【請求項１４】
胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩からなる群から選ばれる胆汁酸塩である請求項２、５、８または１１に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【請求項１５】
電子伝達能を有する化合物がキノン類、フラビン類、フェノール類、フェロセン類、シアン化鉄類、フェニレンジアミン類からなる群から選ばれる化合物である請求項１、４、７、１０または１３に記載の方法。
【請求項１６】
電子伝達能を有する化合物がキノン類、フラビン類、フェノール類、フェロセン類、シアン化鉄類、フェニレンジアミン類からなる群から選ばれる化合物である請求項２、５、８、１１または１４に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【請求項１７】
電子伝達能を有する化合物がアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群から選ばれる化合物である請求項１、４、７、１０または１３に記載の方法。
【請求項１８】
電子伝達能を有する化合物がアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群から選ばれる化合物である請求項２、５、８、１１または１４に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体成分、食品成分、細菌等の微生物検査等に有用な酵素的分析法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す。）またはその還元型（以下ＮＡＤＨと略す。）は生体成分中含量の多い補酵素であり、生体中では多くの酸化還元反応に関与している。これらＮＡＤ（あるいはＮＡＤＨ）を分析する方法としてはそれぞれ２６０ｎｍあるいは３４０ｎｍ付近に吸収極大を示すためこれらの吸収を分光学的に測定する方法が知られているが、本方法は感度が低い。一方これらの補酵素を高感度に分析するための手段として酵素的サイクリングシグナル増幅法が知られている（Ｔ．Ｓｌａｔｅｒ他，ＡｒｃｈＩｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｉｍ，７２巻、４２７〜４４７頁、１９６４年；Ｃ．Ｂｅｒｎｏｆｓｋｙ等、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５３巻、４５２〜４５８頁、１９７３年；Ａ．Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ等、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，１４８巻、１１９〜１２４頁、１９８５年）。
【０００３】
この分析法は酵素的サイクリング反応によるＮＡＤまたはＮＡＤＨの酸化還元反応に伴って発色するシグナルを、その反応の繰り返しによって増幅させ、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを高感度に検出する方法である。すなわち、以下にその反応を示したように、ＮＡＤは、アルコール脱水素酵素とその基質であるエタノール存在下でアルコール脱水素酵素によるエタノールからアセトアルデヒドへの酸化反応に補酵素として働き、その際にＮＡＤＨに還元される。この還元型ＮＡＤは、テトラゾリウム系色原体とジアフォラーゼ存在下に再びＮＡＤに酸化されるが、同時にテトラゾリウム系色原体が還元されて呈色したホルマザン色素が生成される。ＮＡＤはこのような条件下で酸化還元反応を繰り返し受けてシグナル強度は反応時間と共に大きくなる。ＮＡＤＨが被検液中に存在する場合でも同様の原理によりサイクリング反応が進行する。
【０００４】
この酵素サイクリング系によるＮＡＤ（ＮＡＤＨ）の高感度検出系は、直接生体成分中の検出に応用できるが、この他にアルカリホスファターゼの酵素活性分析（Ｆ．Ｊ．Ｄｈａｈｉｒ他、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８巻（２）、２２７〜２３２頁、１９９２年）、特にアルカリホスファターゼの酵素活性測定を利用した免疫測定系においては非常に優れた分析方法として位置付けられている（石川英二他編、免疫測定法、３巻、５８〜６０頁、医学書院刊）。
【０００５】
従来、酵素サイクリング酵素としては、パン酵母由来のアルコール脱水素酵素（Ｔ．Ｓｌａｔｅｒ他，ＡｒｃｈＩｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｉｍ，７２巻、４２７〜４４７頁、１９６４年）、ザイモモナス属由来のアルコール脱水素酵素（特願平４−６０７４３号）、好熱性微生物由来のアミノ酸脱水素酵素が知られていた（特願平４−２９８９２４）。
【０００６】
しかしながら、ＮＡＤあるいはＮＡＤＨ分析の目的で酵素サイクリング反応に酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、耐熱性アルコール脱水素酵素や耐熱性アミノ酸脱水素酵素等を使用した場合、サイクリング反応により感度良く分析できるものの単位時間当たりのサイクル数には限度があった。また、より微量のＮＡＤあるいはＮＡＤＨを検出する場合には上記脱水素酵素の利用では対応できていないのが現状である。更に高感度を達成するためには、脱水素酵素の基質例えばアルコールデヒドロゲナーゼの場合はエチルアルコールを高濃度（１００〜３００ｍＭ）反応系に用いなければならず、同時に使用する他の酵素の安定性へ悪影響を及ぼす危険性があった。また、殆どの酵素サイクリング反応は水溶液中で行われ、着色した生成物濃度を分光光度計で比色分析する方法が一般的であり、高精度の分析機器の使用が必須であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、さらに高感度で、かつ高精度で簡便かつ迅速にＮＡＤおよびまたはＮＡＤＨ濃度を複雑な分析機器を要することなく検出する酵素サイクリング試薬を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記課題を解決するためＮＡＤまたはＮＡＤＨ濃度を検出する酵素サイクリングシグナル増幅反応系において、酵素サイクリング反応に１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素（以下１２αＨＳＤと省略する。）とジアフォラーゼ（以下ＤＩと省略する。）および電子伝達体を用いＮＡＤまたはＮＡＤＨ濃度を高感度で、かつ高精度に電極上で検出できることを見出し、本発明に到達した。つまり、１２αＨＳＤがその基質である胆汁酸塩を酸化する際に、補酵素ＮＡＤはＮＡＤＨに還元される。そのＮＡＤＨおよび初めから存在したＮＡＤＨがＤＩにより酸化されてＮＡＤに戻る際に、電子伝達体が還元されて、その電子伝達体が電極へ電子を移送する。そして、この酵素サイクリング反応を繰り返すことにより、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを電極上で高感度検出することが可能となる。
【０００９】
１２αＨＳＤとＤＩを使用して過剰量のＮＡＤ存在下に胆汁酸を分析する方法は既に公知である（Ｎ．Ｔａｍａｓａｋａ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ  Jａｐｏｎｉｃａ，２３巻（６）、６４６〜６５１頁、１９８８年）が、本酵素を用いてＮＡＤやＮＡＤＨを高感度に発色法により検出できることは全く予測できるものではなく、また電極上で該酵素による酵素サイクリングによるシグナル増幅反応も全く予測できるものではなかった。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を分析する方法において、胆汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型がジアフォラーゼにより酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに戻る際に還元される電子伝達能を有する化合物、および該化合物から電子が移送される電極を用いて酵素サイクリングシグナル増幅反応を行うことを特徴とする方法、（２）胆汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型がジアフォラーゼにより酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに戻る際に還元される電子伝達能を有する化合物、および該化合物から電子が移送される電極を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を分析する酵素サイクリングシグナル増幅反応系、（３）上記１記載のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を分析する方法において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型がジアフォラーゼにより酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに戻る際に還元される電子伝達能を有する化合物から電子が移送される電極であって、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素および／またはジアフォラーゼを固定化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび/またはその還元型分析用の電極、に関する。
【００１１】
さらには、（４）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（１）に記載の方法、（５）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（２）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、（６）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（３）に記載の電極、（７）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である（１）または（４）に記載の方法、（８）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である（２）または（５）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、（９）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である（３）または（６）に記載の電極、（１０）電極がカーボン電極である（１）、（４）または（７）に記載の方法、（１１）電極がカーボン電極である（２）、（５）または（８）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、（１２）電極がカーボン電極である（３）、（６）または（９）に記載の電極、（１３）胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩からなる群から選ばれる胆汁酸塩である（１）、（４）、（７）または（１０）に記載の方法、（１４）胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩からなる群から選ばれる胆汁酸塩である（２）、（５）、（８）または（１１）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、（１５）電子伝達能を有する化合物がキノン類、フラビン類、フェノール類、フェロセン類、シアン化鉄類、フェニレンジアミン類からなる群から選ばれる化合物である（１）、（４）、（７）、（１０）または（１３）に記載の方法、（１６）電子伝達能を有する化合物がキノン類、フラビン類、フェノール類、フェロセン類、シアン化鉄類、フェニレンジアミン類からなる群から選ばれる化合物である（２）、（５）、（８）、（１１）または（１４）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。（１７）電子伝達能を有する化合物がアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群から選ばれる化合物である（１）、（４）、（７）、（１０）または（１３）に記載の方法、（１８）電子伝達能を有する化合物がアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群から選ばれる化合物である（２）、（５）、（８）、（１１）または（１４）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、に関する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。この発明の酵素的測定法におけるＮＡＤおよびＮＡＤＨの検出は、これらの両方あるいはいずれか一方を含有する検体と、緩衝液、１２αＨＳＤ、水可溶性の胆汁酸塩、ＤＩ、アミノフェノール類，フェロセン類またはベンゾキノン類等の電子伝達体、界面活性剤等で構成されるカーボン電極に作用させ生じる電流を測定すればいい。
【００１３】
本発明で使用される１２αＨＳＤとしては、微生物由来の酵素が用いられる。市販の酵素（旭化成工業社製、カタログ番号；Ｔ−２９）を使用してもいいし、バチルス・スフェリクスＢ０８６５（日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年１１月１８日に受託番号：ＦＥＲＭＰ−１７０５７として寄託されている）を液体培養し得られる菌体より抽出精製したものを用いることができる。菌の培養及び精製は下記のように行った。０．０５％コール酸ナトリウム、２％ペプトン、１％酵母エキス、０．３％塩化ナトリウム、０．１％リン酸２ナトリウム、０．０５％塩化マグネシウム、０．０２％塩化カルシウム、０．０１％消泡剤（シリコンＫＭ７２）の組成の滅菌培地２０リットルに同一培地で前培養（３０℃、２０時間）したバチルス・スフェリクスＢ０８６５の培養液１００ｍｌを移植し、２５０回転、２０リットル／分の通気条件で１８時間培養した。得られた培養液を５０００回転、１５分間遠心分離して菌体を得た。
【００１４】
菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５  １リットルに分散し、氷冷下で１５分間超音波処理して酵素を抽出後、１５０００回転、２０分間遠心分離して酵素粗抽出液９６５ｍｌを得た。次いでこれに等量の飽和硫安液を加え４℃で１昼夜放置し遠心分離（１５０００回転、２０分間）して得られた沈殿を１５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解した後、セファデックスＧ２５カラムで脱塩した。この酵素液を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラム（内径５ｘ高さ１３ｃｍ）に通し酵素を吸着させた後、５００ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５でカラムを洗浄し、次いで３００ｍｌの０．１Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．２Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍｌの０．３Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．４Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を順次通液した。活性画分２８０ｍｌを集め３リットルの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で透析した後、凍結乾燥して１９２ｍｇ（１２５単位／ｍｇ重量）の１２αＨＳＤを得た。
【００１５】
この酵素の測定試薬中の使用量は、４〜２４単位、より好ましくは６〜１０単位である。なお、酵素活性１単位はｐＨ８．０、３７℃で１分間にＮＡＤ存在下デオキシコール酸を１マイクロモル脱水素する酵素量として定義される。本酵素の活性測定は下記のように行った。すなわち０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．０  ０．１ｍｌ、１０ｍＭ  ＮＡＤ  ０．０５ｍｌ、０．２５％ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ  ＤＩ  ０．０２５ｍｌ、２％トリトンＸ１００  ０．０５ｍｌ、精製水０．２２５ｍｌからなる反応液０．５ｍｌを３７℃で予備加温して１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８で希釈した酵素液２０マイクロリットルを添加して正確に５分間酵素反応を行った。しかる後０．５％ＳＤＳ  ２．５ｍｌ添加して反応を止め５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１６】
また、この酵素の基質としてはデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、コール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩等のいずれをも使用でき、その使用量は０．０２〜２マイクロモル、好ましくは０．１〜０．４マイクロモルである。
ＤＩについては、特にその由来に制限はないが、細菌由来の酵素が好ましく、市販の酵素を使用できる（バチルス・メガテリウム由来酵素：旭化成工業株式会社；カタログ番号Ｔ−０６、クロステリジウム・エスピー由来酵素：東洋紡績株式会社；コードＤＡＤ−３０１、バチルス・ステアロサーモフィルス由来酵素：生化学工業株式会社；カタログ番号１００４３６）。その測定試薬中の使用量は２〜１２単位、好ましくは４〜８単位／ｍｌである。なお、酵素活性１単位はｐＨ８．０、３７℃で１分間にニトロテトラゾリウムブルー存在下ＮＡＤＨを１マイクロモル脱水素する酵素量として定義した。ＤＩの酵素活性測定は下記に示す方法で行った。すなわち、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）０．５ｍｌ、０．２５％ニトロテトラゾリウムブルー０．１ｍｌ、１％ウシ血清アルブミン０．１ｍｌ、１０ｍＭ  ＮＡＤＨ  ０．１ｍｌ、精製水０．２ｍｌからなる反応液１ｍｌを３７℃で予備加温しこれに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８で希釈した酵素液１００マイクロリットルを添加し正確に１０分後に０．１Ｍ塩酸２ｍｌを加えて酵素反応を止め、生成したホルマザン色素を５５０ｎｍで比色定量した。
【００１７】
測定試薬に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、燐酸緩衝液、各種グッド緩衝液、エタノールアミン緩衝液等の中性からアルカリ性のものを使用できる。ｐＨ範囲としては６．０〜１０．０、好ましくは７．０〜９．０程度であり、特に好ましくは８から８．５である。その濃度は１０〜１０００ｍＭ、好ましくは２５〜４００ｍＭ程度である。
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤またはイオン性界面活性剤を用いることができ、中でもトリトンＸ−１００等のポリオキシエチレン・フェニルアルキルエーテル系の界面活性剤が好ましく、その測定試薬中の濃度は０．０１〜５％、より好ましくは０．０５〜２％程度である。
【００１８】
本発明の具体的なＮＡＤまたはＮＡＤＨの分析方法は以下のように行うことができる。すなわち、緩衝液、界面活性剤、上記酵素１２αＨＳＤ、ＤＩ、水可溶性胆汁酸塩から構成されるカーボン電極を作製する。用いる酵素類は緩衝液中に溶解させてもいいし電極表面に固定化してもいいが、固定化した方が効率よく分析できる。固定化はグルタルアルデヒドのような架橋性試薬を用いて直接行ってもいいし、アミノ基を有する合成ポリマーやアルブミンのような蛋白質を介してもいい。酵素活性を最大限に発現する条件を適宜選ぶことができる。使用する電極の材料としては金、白金、カーボンペースト、グラッシーカーボン等から適宜選ぶことができるがカーボン電極が好ましい。酵素以外の反応に必要な成分（緩衝液、水可溶性胆汁酸塩類、電子伝達体、界面活性剤等）は電極に酵素類を固定化する際に同時に含浸させることもできる。このようにして得られた電極をＮＡＤあるいはＮＡＤＨを含む試料液に浸し、一定電圧を印加して電極間に生じる電流を測定することにより濃度を容易に決定することができる。
【００１９】
使用する電子伝達体としては、１，４−ベンゾキノン、トルキノン、１，４−ナフトキノン、ビタミンＫ３、パラメチルアミノフェノール、２，５−ジクロロベンゾキノン、デュロキノン、２，５−ジメチルベンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン等のキノン類、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等のフラビン類、４−アミノフェノール、４−メチルアミノフェノール、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等のフェノール類、ヒドロキシメチルフェロセン、１ーヒドロキシエチルフェロセン等のフェロセン類、フェロシアン化カリウムのシアン化鉄類、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミンのフェニレンジアミン類が使用できるが、中でもアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類が好ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】
次に実施例、比較例、参考例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら制限されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
鏡面仕上げした直径３ｍｍのグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ製：１１−２０１２）上に４０００単位／ｍｌＤＩ（旭化成工業社製：カタログ番号Ｔ−０６）と１２０００単位／ｍｌバチルス・スフェリクス由来１２αＨＳＤの混合溶液１マイクロリットルと２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液０．５マイクロリットルを塗布し、室温（２５℃）で２時間静置してＤＩ、１２αＨＳＤ同時固定電極を作製した。この酵素電極を作用電極、飽和カロメル電極（ＢＡＳ製：１１−２０５５）を参照電極、白金電極（ＢＡＳ製：１１−２２３０）を対向電極としてポテンシオスタット（ＢＡＳ製：ＢＡＳ−１００Ｂ）に接続し、３０℃での測定を行った。予めサンプルホルダーに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭコール酸ナトリウム、０．１ｍＭヒドロキシメチルフェロセンを含む２００マイクロリットルを上記の固定化酵素電極を浸漬した後０．２ボルトを３０分間印加した。しかる後終濃度で１００ｎＭになるようにＮＡＤＨを加え、３０℃で５分後の電流値を測定した結果、５６ｎＡの電流（水を検体にして同様の操作によって生じる電流値との差）が得られた。
【００２２】
【実施例２】
実施例１に示した酵素固定化電極を用いて実施例１と同様の操作により、２０、４０、６０、８０、１００ｎＭ濃度のＮＡＤを被検液として用い分析した。図１に示したように高感度でＮＡＤを精度良く定量分析することができた。
【００２３】
【実施例３】
実施例１に示した組成の中でコール酸ナトリウムの代わりに、基質をタウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、またはグリコデオキシコール酸ナトリウムを用いて得られた電流値は表１の通りであった。
【００２４】
【表１】
0004364331.tif 000002
【００２５】
【比較例１】
実施例１の１２αＨＳＤの代わりにアルコール脱水素酵素（シグマ社製）１００単位を使用、コール酸の代わりにエタノールを使用し同様の操作によりＮＡＤの酵素サイクリングによる定量を行った。但しエタノール濃度は３００ｍＭ使用した。実施例１と同じ１００ｎＭ  ＮＡＤＨでは全く電流値増加は観察されなかった。０．１ｍＭ  ＮＡＤＨを用いたとき１１０ｎＡの電流値が得られた。
【００２６】
【参考例１】
１２５マイクロリットルの０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８、１００マイクロリットルの０．５％ニトロテトラゾリウムブルー、５０マイクロリットルの５％トリトンＸ−１００、５０マイクロリットルの８ｍＭコール酸ナトリウム、４０マイクロリットルのＤＩ（７９０単位／ｍｌ）、３０マイクロリットルの１２αＨＳＤ（４８０単位／ｍｌ）、１０５マイクロリットルの精製水からなる５００マイクロリットルの分析試薬を３７℃で予備加温し、２０マイクロリットルの１００ｎＭ  ＮＡＤを添加し１０分後に５００マイクロリットルの１％ＳＤＳで反応を止めた。しかる後５５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果ＮＡＤＨ無添加試薬のみの吸光度は０．０７３、ＮＡＤＨを添加した時の吸光度は０．２４２であった。１０分間の酵素サイクリング回数は５２８０であった。
【００２７】
【参考例２】
参考例１の１２αＨＳＤの代わりにアルコール脱水素酵素（シグマ社製）２５単位を使用、コール酸の代わりにエタノールを使用し参考例１と同様の操作によりＮＡＤの酵素サイクリングによる定量分析を行った。その結果１ｍＭエチルアルコール使用時で１０分間のサイクリング回数は２５０、３００ｍＭエチルアルコール使用時で回転数は８５０であった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、酵素サイクリング用酵素として１２αＨＳＤを用いることにより極めて高感度にＮＡＤあるいはＮＡＤＨを定量分析することができ、高感度分析が要求される臨床検査分野や食品分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素サイクリング法によるＮＡＤの検量線を示すグラフ。
【図１】
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