(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットの活性を阻害する核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有してなる核酸構築物を提供する工程、
ｂ）ベクターに該核酸構築物を挿入する工程、
ｃ）該ベクターにより、植物、組織培養物、または植物細胞を形質転換し、ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットの活性が低下した植物、組織培養物、または植物細胞を得る工程、および
ｄ）該植物を生育させる、または該組織培養物若しくは該植物細胞から植物を再生する工程、
を含み、ここで耐乾性植物が生産される、植物に耐乾性を付与する方法。
【請求項２】
該核酸がファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットに相補的な２５以上の連続する核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ）ファルネシルトランスフェラーゼポリぺプチドのβサブユニットをコードするアンチセンス核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有してなる核酸構築物を提供する工程、
ｂ）ベクターに該核酸構築物を挿入する工程、
ｃ）該ベクターにより、植物、組織培養物、または植物細胞を形質転換する工程、および
ｄ）該植物を生育させる、または該組織培養物若しくは該植物細胞から植物を再生する工程、
を含み、ここで耐乾性植物が生産される、植物に耐乾性を付与する方法。
【請求項４】
該アンチセンス核酸が、図１〜３に示される配列番号：１に相補的な２５以上の連続する核酸を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該プロモーターが孔辺細胞特異的プロモーターである、請求項１または３記載の方法。
【請求項６】
該プロモーターが、図５および６に示される配列番号：３を有するｅｒａ−１プロモーターである、請求項１または３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
多くの高等植物は、それらの生活環のある段階で相対含水量の少なくとも一過性の減少に遭遇し、結果として、多くの乾燥防御機構を進化させてきた。しかしながら、水分不足における変化が長引く場合、植物の生長と発育とへの影響は甚大になりうる。乾燥、寒冷または塩ストレスによる含水量の減少は、植物生長および農業における作物生産性を順に限定する植物細胞を回復できない障害を与えうる。
【０００２】
植物は、様々な形態学的変化および生理学的変化を伴って、有害な、乾燥、塩分および寒冷条件に応答する。これらのストレスに対する植物耐性機構の我々の理解は断片的であるが、植物ホルモンであるアブシジン酸（ＡＢＡ）は、環境刺激と植物応答との間の必須のメディエーターであることが提案されている。ＡＢＡ量は、水分不足に応答して増加し、外因的に投与されたＡＢＡは、水ストレスにより通常誘導される応答の多くを模倣する。一度ＡＢＡが合成されると、葉の気孔の閉鎖を引き起こし、それにより蒸散を介する水分損失を減少させる。
【０００３】
ＡＢＡを細胞応答に導く遺伝子の同定は、作物種における耐乾性を増強するためのこれらのレギュレーターを開発する可能性を広げる。原則として、これらのＡＢＡシグナル伝達遺伝子は、至適な植物生長と発育とを可能にする適当な制御エレメントと組み合わされうる。したがって、これらの遺伝子は、一過性の環境的な傷害に耐えるための作物の遺伝子の仕立てを可能にするだけでなく、さらに、伝統的な作物が生育できる環境を広げるであろう。
【０００４】
さらに、植物生長と植物発育とを制御する遺伝子機構はほとんど知られていない。植物の老化および生長習性などの他の代謝機構にさらに影響する遺伝子は、広く多様な作物および園芸植物に有用でありうる。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、配列番号：１を含有した、ファルネシルトランスフェラーゼをコードする単離核酸に関する。また、本発明により包含される核酸は、配列番号：１の機能的同等物をコードする、かかるハイブリダイズ配列である。本発明は、さらに、これらの核酸によりコードされる産物のインヒビターを用いる、植物の耐乾性の増強方法に関する。さらに、本発明は、光合成生物における調節機能の制御；例えば、かかる生物における、生長習性、開花、種子生産、種子の発芽および老化の制御などに関する。
【０００６】
また、本発明は、ファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆターゼ）タンパク質またはその機能的同等物をコードする単離もしくは組換え核酸における改変による、植物の耐乾性の増強方法に関する。Ｆターゼをコードする遺伝子（ＥＲＡ１）にハイブリダイズする核酸も、かかるハイブリダイズ核酸が該Ｆターゼタンパク質の機能的同等物をコードする場合、本発明に包含される。また、本発明は、作物植物におけるストレス耐性を改良するための、ＥＲＡ１遺伝子およびその機能的同等物の遺伝子操作による、植物の耐乾性の増強方法に関する。ＥＲＡ１遺伝子機能の欠損は、成熟植物レベルで耐乾性増強を与える。Ｆターゼ活性の欠損を伴うｅｒａ１変異体の性質は、例えば、ファルネシル化の阻害が植物におけるＡＢＡ応答を増強することを説明する。
【０００７】
さらに、本発明は、ファルネシルトランスフェラーゼ活性の阻害による、光合成生物における老化の阻害に関する。得られた光合成生物は、青々としたままであり、組織生存能が長期間維持される。したがって、より青々とした植物および老化の減少を提供する方法は、本発明の一部である。
【０００８】
さらに別の態様において、植物の生長習性および開花誘導を改良する方法が提供される。特定の環境条件下でのＥＲＡ１遺伝子機能の欠損は、植物に生じる側生枝の数の減少と花房あたりの花数の増加とをもたらす。
【０００９】
また、本発明は、本新規調節配列に連結したＤＮＡ配列の発現の組織パターンを制御する方法を提供するための、植物細胞の遺伝子工学に有用な調節配列に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、植物の生長、生殖および老化を改変する、単離された核酸ならびにこれらの核酸によってコードされたタンパク質に関する。特に、本発明の構築物は、配列番号：１を含有したファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆターゼ）ポリペプチドまたはその機能的同等物をコードする単離された核酸、およびこれらの核酸によってコードされたＦターゼポリペプチドまたはＦターゼタンパク質を含む。特に、本発明は、配列が配列番号：２であるタンパク質に関する。
【００１１】
さらに、本発明は配列番号：１を含有した単離された核酸もしくはその機能的同等物または両方の相補体に作動可能に連結されたプロモーター（ＥＲＡ１プロモーター）を含有した核酸構築物を含む。植物に取り込まれたとき、ＥＲＡ１プロモーターは、植物の孔辺細胞で調節され、気孔を通して水の損失に影響することができる。このプロモーターは、配列番号：３を含有した核酸からなる（Ｆｉｇｕｒｅ  ３）。
【００１２】
これらの構築物を取り込んでいる、トランスジェニック植物、種子、植物細胞および組織もまた、本発明の一部である。したがって本発明の一側面として、ａ）配列番号：３を含有した調節領域またはその機能的部分と、遺伝子産物をコードする構造遺伝子を含有したDNA と、ポリアデニル化領域を含む3'非翻訳領域とを含有したDNA 構築物で植物細胞を形質転換する工程；該細胞から、植物、光合成生物または組織培養物を再生する工程；ならびに該植物、光合成生物または組織培養物を、該プロモーターが該構造遺伝子の転写を誘導し、かつ該遺伝子産物が発現されるような状態におく工程：の工程を含む、植物の細胞中における遺伝子産物をコードする遺伝子の発現により、主に孔辺細胞で作用するプロモーターの制御下で、遺伝子産物を製造する方法を提供する。
【００１３】
この開示に関して「調節領域」または「プロモーター」という用語は、通常は構造遺伝子のコード配列の上流（5'側）にあって、RNA ポリメラーゼおよび／または転写が正しい部位で始まるために必要な他の因子類の認識および結合部位を提供することにより、該コード領域の発現を制御するDNA の配列をいう。「機能的部分」または「機能的断片」という用語は、Ｆターゼタンパク質の活性に関して記載された条件下にＥＲＡ構造遺伝子の転写を誘導する能力を保っている、本発明のプロモーターの切形型配列をいう。
【００１４】
本明細書に記述される構築物と方法は、限定されるものではないが、被子植物（単子葉植物と双子葉植物）、裸子植物、胞子生成または栄養生殖植物、および藍色植物（ラン藻類）を含む藻類を含めて、あらゆるタイプの植物および他の光合成生物に適用できる。とりわけ好ましい植物は、トウモロコシ、コムギ、綿、米、キャノーラ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、バレイショ、トマト、ブロッコリー、ニンジン、レタス、りんご、プラム、オレンジ、レモン、バラなどの商業的に価値のある作物を与える植物である。
【００１５】
さらに、本発明の構築物と方法は、いかなる植物部分、プロトプラストまたは光合成生物に由来する組織培養物にも適応させることができる。「植物部分」という用語は、再生植物を生じさせることのできる植物の一部を含むものとする。好ましい植物部分としては、根および苗条ならびにそれらの分裂組織部分が挙げられる。本発明に包含される他の植物部分は：葉、花、種子、上胚軸、胚軸、子葉、子葉節、外植片、花粉、胚珠、分裂または胚組織、プロトプラストなどである。トランスジェニック植物は、組織培養物またはプロトプラストを含む、これらの植物部分のいずれからも、および外植片からも再生できる。方法は植物の種によって変わるだろう。
【００１６】
本発明は、光合成生物のＦターゼおよびその部分をコードする単離された核酸（ＤＮＡとＲＮＡの両方）を含有した組成物および構築物に関する。本発明は、さらにＦターゼプロモーターをコードする単離された核酸を含有した組成物および構築物に関する。特に、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｐｓｉｓ）由来のＦターゼのβサブユニットをコードするＥＲＡ１遺伝子と、ＥＲＡ１遺伝子の転写を調節する調節配列とを単離し、配列を決めた。光合成生物由来のＦターゼをコードする核酸およびこれらの核酸のホモログまたはアナログが本発明に包含される。
【００１７】
本発明は、さらに（ａ）配列番号：１の配列を有する核酸のような、Ｆターゼタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸、または（ｂ）前述の部分（例えば、機能的なＦターゼタンパク質をコードするのに必要な最少ヌクレオチドを含有した部分にハイブリダイズする能力によって；またはＦターゼのアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする能力（例えば、配列番号：２、またはその機能的同等物をコードする；例えば、配列番号：２に対して少なくとも８０％の配列類似性を有する植物細胞に取り込まれる時、配列番号：１と同じ様式で生長習性、種子の発芽、および光合成生物中の代謝を促進するポリペプチド）によって特徴づけられる単離されたおよび／または組換え核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いる方法に関する。Ｆターゼの機能的同等物は、それゆえに、配列番号：２でコードされたポリペプチドと少なくとも８０％の類似アミノ酸配列および類似の特性を有するか、あるいは実質的に同じように機能する。配列番号：２のようなＦターゼポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸は、二本鎖または一本鎖でありうる。配列番号：１の配列を有するＤＮＡのようなＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、示された鎖またはその相補鎖へのハイブリダイゼーションを含む。
【００１８】
一態様として、配列番号：２などのＦターゼとその機能的同等物との間のアミノ酸配列類似率は、少なくとも約60％（≧60％）である。好ましい態様では、Ｆターゼポリペプチドとその機能的同等物との間のアミノ酸配列類似率が少なくとも約75％（≧75％）である。より好ましくは、Ｆターゼポリペプチドとその機能的同等物の間のアミノ酸配列類似率が少なくとも約80％、さらに好ましくは、連続的なアミノ酸が比較された時少なくとも約90％である。
【００１９】
これらの基準を満たす単離および／または組換え核酸は、天然に存在するＥＲＡ１遺伝子の配列およびその一部と同じ配列を有する核酸または該天然遺伝子の変異体を含有する。そのような変異体としては、１以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換によって相違する変異体、１以上のヌクレオチドが修飾されている修飾核酸（例えばDNA またはRNA 類似体）、および１以上の修飾ヌクレオチドを含有する突然変異体が挙げられる。
【００２０】
DNA またはRNA を含むそれら核酸は、例えば非相補配列を有する核酸のハイブリダイゼーションを許さないように選択された高ストリンジェンシー条件または中ストリンジェンシー条件でのハイブリダイゼーションによって検出され、単離されうる。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー条件」とは、ある特定核酸のもう一つの核酸へのハイブリダイゼーションを許す温度および緩衝液濃度の条件を指す技術用語であり、ここに第一の核酸は第二の核酸と完全に相補的であってもよいし、第一と第二の核酸が完全ではないある程度の相補性を共有してもよい。例えば、完全に相補的な核酸を相補性の低いものと識別する一定の高ストリンジェンシー条件を使用できる。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェンシー条件」と「中ストリンジェンシー条件」は、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel, F.M. ら編，Vol.1 ，Supplement 29 ，1995までの増補を含む）の2.10.1〜2.10.16 頁（特に2.10.8〜11を参照されたい）と6.3.1 〜６頁とに説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決める正確な条件は、イオン強度、温度およびホルムアミドなどの不安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ率、他の非同一配列内での配列の一部分の発生頻度などといった要因にも依存する。したがって高または中ストリンジェンシー条件は実験的に決定できる。
【００２１】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション法では、（１）洗浄に低イオン強度と高温の使用、50℃で0.015M NaCl/0.0015M クエン酸ナトリウム，pH7.0 （0.1 ×SSC ）と0.1 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）など；（２）ハイブリダイゼーション中に42℃で50％（容積／容積）ホルムアミドと５×デンハルト液（0.1 ％重量／容積  高純度ウシ血清アルブミン／0.1 ％重量／容積  フィコール／0.1 ％重量／容積  ポリビニルピロリドン）、pH6.5 の50mMリン酸ナトリウム緩衝液および５×SSC の使用、または（３）0.2 ×SSC および0.1 ％SDS 中における42℃での洗浄を伴う、50％ホルムアミド、５×SSC 、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8 ）、0.1 ％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子DNA （50μg/ml）、0.1 ％SDS および10％デキストラン硫酸による42℃でのハイブリダイゼーションの使用が可能である。中ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションに50％ホルムアミドの代わりに25％ホルムアミドを使用する他は類似している。
【００２２】
ハイブリダイゼーション条件を、ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼーションが初めて観察されるレベルまで変化させることにより、与えられた配列を試料中の最も類似する配列とハイブリダイズさせる条件を決定できる。
【００２３】
典型的な条件は、Krause, M.H.およびS.A. Aaronson （1991）Methods in Enzymology ，200 ：546-556 に記述されている。また、Current Protocols in Molecular Biology（前掲）中の、中または低ストリンジェンシー条件に関する洗浄条件の決定法が記述されている、特に2.10.11 頁を参照されたい。洗浄は、通常、ハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するために条件が設定される工程である。一般に、ある任意の選択されたSSC 濃度に関して、相同ハイブリダイゼーションだけが起こる最低温度から、ハイブリダイズする核酸間の１％のミスマッチは、融解温度Tmの１℃低下をもたらす。一般に、SSC 濃度が二倍になると、Tmの約17℃上昇をもたらす。これらの指針を使用することにより、求めているミスマッチのレベルに応じて、中または低ストリンジェンシーに関して洗浄温度を実験的に決定できる。
【００２４】
（ａ）配列番号：１として描かれた核酸のようなＦターゼポリペプチドをコードする核酸、（ｂ）配列番号：１の相補体、（ｃ）または（ａ）もしくは（ｂ）の部分〔（ｃ）  ｏｒ  ａ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  （ａ）  ｏｒ  （ｂ）〕（例えば、高または中ストリンジェンシー条件下）にハイブリダイズする能力によって特徴づけられる単離および／または組換え核酸は、さらに、日周（ｄｉｕｒｎａｌ）光サイクル下の側生の枝分かれの調節、またはＡＢＡに対する応答の調節、または老化の調節のようなＦターゼポリペプチドの少なくとも１つの機能的な特徴を持つタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００２５】
酵素アッセイ、相補性試験、または他の適した方法も、配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプチドまたはこのポリペプチドの機能的同等物などのポリペプチドをコードする核酸の同定および／または単離の手順で使用されうる。ハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドの抗原性の性質は、イムノブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイなどのＦターゼポリペプチドに結合する抗体を使用する免疫学的方法によって決定されうる。ＲＡＧＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を含むＰＣＲ方法論もＦターゼ様タンパク質およびポリペプチドをコードする核酸の存在を選抜および検出するため、並びにゲノムＤＮＡからのそのような核酸をクローニングするのを助けるために使用されうる。これらの目的に対するＰＣＲ法は、Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．によって開示されている。
【００２６】
本明細書で述べられた核酸は、細胞、組織、植物の部分、植物および他の光合成生物中に取り込まれるタンパク質またはポリペプチドの生産についての発明の方法で使用される。一態様として、Ｆターゼポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を含むＤＮＡ、または配列番号：２の配列を持つＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡは、適する宿主細胞中のコードされたポリペプチドの発現のためのベクターに取り込まれる。Ｆターゼサブユニットまたはその機能的同等物からなる、コードされたポリペプチドは、ファルネシルトランスフェラーゼ活性の能力がある。本明細書で使われる「ベクター」という用語は、連結された他の核酸を輸送できる核酸分子をいう。
【００２７】
前記核酸の２０以上の連続的なヌクレオチドからなるプライマーとプローブも本発明の部分として含まれている。したがって、本発明のひとつの核酸は、Ｆターゼタンパク質をコードするＤＮＡもしくは転写されたｍＲＮＡのヌクレオチドの特異的な配列と同一または相補的である約２０から約２００以上のヌクレオチドの特異的な配列を含有する。これらのプローブとプライマーとは、他の光合成生物由来のＦターゼをコードする核酸を同定および単離するのに使用されうる。
【００２８】
本明細書にいう「単離された」核酸とは、その供給源（例えばそれは細胞内またはライブラリーなどの核酸混合物中に存在する）のゲノムDNA または細胞RNA の核酸から分離された核酸であり、さらなるプロセシングを受けていてもよい。「単離された」核酸としては、本明細書中に記述する方法、類似する方法または他の適当な方法で得られる核酸が挙げられ、本質的に純粋な核酸、化学合成法によって製造される核酸、生物学的方法と化学的方法の組み合わせによって製造される核酸、単離された組換え核酸などが含まれる。本明細書にいう「組換え」核酸とは、組換えDNA 法によって製造された核酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）および／または制限酵素を用いたベクターへのクローニングなどの人工的な組換え法による方法で生成される核酸を含む。また「組換え」核酸は、天然の細胞機構によって起こる組換え事象から得られるが、目的の組換え事象が起こりうるようにまたはそのような組換え事象が起こりやすくなるように設計された核酸を細胞に導入した後、選択されるものでもある。ある機能を持つポリペプチドをコードする単離された核酸の一部は、例えば、Ｊａｓｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９５２，５０１号明細書の方法などによって同定および単離されうる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、センス鎖を含有した標的分子に完全にまたは部分的に相補的であって、かつ該標的分子とハイブリダイズできるアンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドである。標的は、DNA またはそのＲＮＡ対応物でありうる（すなわち、そこでＤＮＡのＴ残基はＲＮＡ対応物のＵ残基である）。アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドは、細胞に導入されると、センス鎖によってコードされる遺伝子またはセンス鎖から転写されるｍＲＮＡの発現を阻害しうる。アンチセンス核酸は標準的な技術で製造できる。例えば、Ｓｈｅｗｍａｋｅｒら、米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照のこと。
【００３０】
特定の一態様として、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドは、配列番号：１の鎖の相補鎖の配列を有する核酸にハイブリダイズできる標的核酸（ＤＮＡかＲＮＡのどちらか）に全体的にもしくは部分的に相補的であり、かつそれとハイブリダイズできる。例えば、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドは、配列番号：１のオープンリーディングフレームの鎖に示される配列を持つ標的核酸もしくはＦターゼの機能的同等物をコードする核酸に、またはハイブリダイゼーションを可能にするのに十分であるこれらの核酸の一部に相補的でありうる。一部分、例えば、１６ヌクレオチドの配列は、タンパク質の発現を阻害するのに十分でありうる。配列番号：１に相補的な２５以上の連続的なヌクレオチドを含有した断片もまた使用されうる。すなわち、ＥＲＡ１遺伝子の、５’もしくは３’非翻訳領域に相補的な、または翻訳開始コドンをオーバーラップする（５’非翻訳および翻訳領域）アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチド、あるいは機能的同等物をコードする遺伝子もまた有効でありうる。もう１つの態様として、アンチセンス核酸は、全体的にもしくは部分的に相補的であり、Ｆターゼポリペプチドをコードする標的核酸にハイブリダイズできる。
【００３１】
本発明のアンチセンス核酸の他にも、遺伝子または転写のＤＮＡ：ＲＮＡ複合体中の二本鎖核酸に結合して安定な三重らせん含有核酸または三本鎖核酸を形成することにより、Ｆターゼポリペプチドをコードする遺伝子またはその機能的同等物の転写および／または発現を阻害するオリゴヌクレオチドを構築できる。Frank-Kamenetskii ，M.D.およびMirkin，S.M.（1995）Ann. Rev. Biochem. 64 ：65-95 。このような本発明のオリゴヌクレオチドは、三重らせん形成の塩基対形成規則と、Ｆターゼの遺伝子またはｍＲＮＡのヌクレオチド配列とを用いて構築される。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥＲＡ１遺伝子の転写の阻害、該遺伝子によって転写されるｍＲＮＡへの結合によるなど、多くの方法でＦターゼ−型活性をブロックできる。
【００３２】
本発明は、本明細書で述べられた新規な核酸によってコードされたタンパク質またはポリペプチドにも関する。本発明のタンパク質およびポリペプチドは、単離および／または組み換えられうる。本明細書にいう「単離された」タンパク質またはポリペプチドは、細胞中に存在するものを超えた状態にまで精製されたタンパク質またはポリペプチドである。より好ましい態様として、それらは少なくとも１０％純粋；すなわち実質的に精製される。「単離された」タンパク質またはポリペプチドは、以下に述べる方法、類似した方法または他の適した方法によって得られるタンパク質またはポリペプチドを含み、かつ本質的に純粋なタンパク質もしくはポリペプチド、化学的な方法により生産されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的方法と化学的方法との組合せによって生産されるタンパク質もしくはポリペプチド、および単離された組換えタンパク質もしくはポリペプチドを含む。本明細書にいう「組換え」タンパク質またはポリペプチドは、組換え核酸の発現によって生産されるタンパク質またはポリペプチドである。
【００３３】
好ましい態様としては、少なくとも一つのＦターゼの機能特徴を持つタンパク質またはその一部；例えば、正常な側生の枝分かれ、小さな花／花房、種子の発芽、または気孔の開口のような触媒活性作用、および結合機能および／または抗原性の機能（例えば、天然由来のＦターゼにも結合する抗体の結合）などが挙げられる。このように、これらのタンパク質は、植物起源のＦターゼとして述べられ、例えば、天然由来のＦターゼ、それらのタンパク質の変異体（例えば突然変異体）および／またはそれらの一部を含む。このような変異体は、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失若しくは置換により異なる変異体、または１以上の残基が修飾された修飾ポリペプチド、および１以上の修飾残基を含有した変異体が挙げられる。
【００３４】
また、本発明は、前記に記載のＦターゼの単離および／または組換え部分、とりわけ、Ｆターゼタンパク質のβサブユニットに関する。該酵素が有する全機能もしくは部分機能を有するか、または（全体的に、部分的に、または非機能的なもののみ）を混合して合わせた場合、１以上の他のポリペプチドを任意に会合させて、本発明のＦターゼの少なくとも１つの機能的な特徴を有する機能性タンパク質を再構築する、前記酵素の部分が作製されうる。
【００３５】
ＡＢＡにより誘導される多数の遺伝子が同定されている。このことは、有害な環境条件に対するＡＢＡにより誘導された耐性が複雑な多遺伝子事象であることを示唆する。したがって、ＡＢＡに対する応答性の増加による異なる環境条件下での植物の生存能を改善する、単一の遺伝子の同定と作物植物への導入とは、新規であり、極めて有用である。
【００３６】
ＡＢＡ調節される植物のプロセスのより広範な制御物質となりうる遺伝子を同定するために、多くの植物種に、遺伝子スクリーニングを適用して、植物のホルモンに対する応答を変える変異を単離した。
【００３７】
アラビドプシス種子におけるＡＢＡ（ｅｒａ）への応答の増強を与える変異は、通常野生型（対照；すなわち天然）の種子発芽を許容する濃度のＡＢＡでの種子発芽のそれらの阻害能により同定された。これらのうち、１つのトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）系〔ｅｒａ１−１、生態型  ワッシリュースキヤ（Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ）〕と２つのニュートロン生成変異体〔ｅｒａ１−２およびｅｒａ１−３、生態型  コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）〕を含む、ｅｒａ１変異体クラスは、このクラスが通常の後吸収下で発芽効率の減少を示したため、さらに興味深かった。ＡＢＡ応答性を増強する変異は、原則として、より休眠状態であるべきである。ｅｒａ１対立遺伝子における休眠は、４日の冷却期間により、解消される；ｅｒａ１発芽の効率は、種子を冷却した時間の長さにより増加する。多くの植物種において、休眠状態を破って発芽をさせることは、春化および長期間、湿性低温環境への曝露を要求する（Ｂａｓｋｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｓｋｉｎ、１９７１）。ｅｒａ変異体の発芽プロファイルは、ＡＢＡ誘導休眠状態の増加に反映しうるであろう; 結果的に、これらの種子は、発芽するために、より長い春化を要求する。この見解は、ＡＢＡ生合成（ａｂａ１−１）および非感受性変異体（ａｂｉ１−１およびａｂｉ３−６）の両方でｅｒａ１の二重変異体の構築物にサポートされる。すべてのケースにおいて、二重変異体は、ｅｒａ１に比べて休眠状態を減らし、ｅｒａ１種子で観察された休眠状態の増加は、ＡＢＡ合成または感受性に依存したことを示唆した。
【００３８】
ＡＢＡ応答変異体のスペクトルを広げることを除き、ＡＢＡ感受性のネガティブレギュレーターを同定するために、超感受性スクリーニングも用いた。すなわち、これらの遺伝子機能の阻害は、ＡＢＡ応答を増強する。これらの遺伝子の１つ（ＥＲＡ１）がクローニングされ、βサブユニットのヘテロ２量体タンパク質であるファネシルトランスフェラーゼ（Ｆターゼ）をコードすることが示された（Ｃｕｔｌｅｒら、１９９６）。Ｔ−ＤＮＡ挿入によるｅｒａ１−１変異は、挿入物に隣接する植物ゲノム領域の単離を可能にする。隣接領域をプローブとして用い、野生型のｃＤＮＡとゲノムクローンを単離した。これらの配列解析は、３．５ｋｂのゲノムＤＮＡを包含する遺伝子を記する。前記遺伝子は、Ｆｉｇｕｒｅ  １Ａ〜 1Ｃにおいて下線を付された１３イントロンを含み、ｅｒａ１−１中のＴ−ＤＮＡ挿入部位は、イントロン８にある。Ｅｒａ１ｃＤＮＡで検索した野生型ＤＮＡ、ｅｒａ１−２およびｅｒａ１−３のサザン（ＤＮＡ）解析は、両方の早期ニュートロン対立遺伝子がＥＲＡ１座にまたがる欠失を含むことを表わした。早期ニュートロン変異は、アラビドプシスにおける小さな欠失を誘導し（Ｓｈｉｒｌｅｙら、１９９２）、そして、ＥＲＡ１座にまたがる１４ｋｂプローブを用いた、つづくゲノム解析により、ｅｒａ１−２欠失の大きさが約７．５ｋｂであり、ｅｒａ１−３欠失がわずかに大きいことを決定した。したがって、全３つのｅｒａ１対立遺伝子は、同一の座でＤＮＡ破壊を含み、ＥＲＡ座の同一性を確認した。
【００３９】
ＥＲＡ１遺伝子における最も長いオープンリーディングフレーム（４４０アミノ酸）の概念的な翻訳は、酵母、エンドウおよび哺乳類のプロテインファルネシルトランスフェラーゼβサブユニット遺伝子に対して高い配列類似性を有するタンパク質（Ｆｉｇｕｒｅ  ２および４）を呈示した〔Ｇｏｏｄｍａｎら，１９８８；Ｃｈｅｎら，１９９１；Ｙａｎｇら，１９９３〕。ファルネシルトランスフェラーゼは、２量体化し、ＣＯＯＨ末端のＣａａＸモチーフ、該モチーフ中、Ｃはシステイン残基ａａは通常脂肪族アミノ酸であり、Ｘは、システイン、セリンメチオニンまたはグルタミン残基を示してもよい（ＳｃｈａｆｅｒおよびＲｉｎｅ，１９９２）を含むタンパク質へのファルネシルピロリン酸（１５炭素）の付着を触媒する酵素を形成するαサブユニットとβサブユニットとからなる。両方の植物βサブユニット遺伝子は、酵母および動物βサブユニット遺伝子には存在しないＣＯＯＨ末端付近に約５０アミノ酸の領域を含む。
【００４０】
酵母および哺乳類系において、Ｆターゼは、膜局在のための幾つかのシグナル伝達タンパク質を修飾する。これは、Ｆターゼを介するタンパク質標的への親油性ファルネシル側鎖の付着により達成される。ファルネシル基の付着は、標的の全疎水性度における変化を引き起こし、タンパク質は、通常、他のシグナル伝達分子と相互作用する膜に該タンパク質自体をつなぎとめるようにされる。ｅｒａ１変異体におけるファルネシル化活性の欠損が種子のＡＢＡへの応答増強を導くことは、アラビドプシスにおける標的タンパク質がＡＢＡシグナルを弱めるために、膜に局在されなけらればならないことを示唆する。したがって、アラビドプシスにおけるファルネシル化は、ＡＢＡ感受性のネガティブレギュレーターの正常な機能に要求されるように思われる。
【００４１】
つづく研究は、アラブドプシスにおけるＥＲＡ１遺伝子機能の欠損が成熟植物レベルで環境ストレス耐性の増強を付与することを示した。例えば、標準的な研究室条件（２４時間光、１５０μＥ  ｍ-2秒-1、３０％湿度）の下、土壌で生育させた野生型植物とｅｒａ１変異植物との比較は、変異植物が生存能を維持するために、野生型植物ほど頻繁に水を要求しなかったことを示した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５）。変異植物と野生型植物とを開花がおこるまで生育させた場合、水やりを止め、ストレスの徴候に関して、以後の日毎に植物を観察した。水分損失は、野生型植物に比べ変異植物において顕著に減少した（Ｆｉｇｕｒｅ  ６および７）。
【００４２】
ｅｒａ変異体の耐乾性の観察された増加がＥＲＡ１遺伝子機能に関連するかどうかを決定するため、（ＥＲＡ１プロモーターの５ｋｂ断片をプロモーターのないＧＵＳ  Ｔ−ＤＮＡプラスミドに挿入することにより作製された）レポーターＧＵＳ遺伝子とのＥＲＡ１プロモーター融合物を含むトランスジェニック植物を構築した。トランスジェニック植物の解析は、アラビドプシスの表皮組織にＥＲＡ１が転写的に発現され、この発現が孔辺細胞特異的であることを示した。また、ＥＲＡ１の発現は、植物の分裂組織および根毛に顕著であった。ＥＲＡ１の孔辺細胞発現は、これらの細胞が植物による水蒸散の主要なレギュレーターである、変異体の耐乾性と一致する。ＥＲＡ１調節された気孔のコンダクタンスは、孔辺細胞におけるＥＲＡ１遺伝子の発現を要求するであろう。それゆえに、ＥＲＡ１遺伝子機能の欠損は、順に、より乾燥応答性の孔辺細胞の調節を導くＡＢＡに対して、より応答する孔辺細胞をもたらす。したがって、高等植物、特に作物植物におけるＦターゼ発現または活性の改良は、植物における気孔コンダクタンスと蒸散率とに甚大な影響を有するであろう。
【００４３】
アラドプシスにおけるｅｒａ１変異の性質は、ファルネシル化の阻害が植物におけるＡＢＡ応答と作物種におけるこの酵素活性の変化とを促進するであろう。作物植物におけるＦターゼ活性の阻害は、多くの方法を介して達成されうる。例えば、多様な作物種における同属ＥＲＡ１遺伝子のアンチセンス技術を用いて、Ｆターゼ活性を減少し、そうして耐乾性を増大させる。ＥＲＡ１アンチセンスＲＡＮを孔辺細胞に特異的に生産することにより、ｅｒａ変異体表現型を模倣するであろうレベルまで、合成されるＦターゼの量を減少することができる。ＥＲＡ１プロモーターは、苗条分裂組織から根毛までの多くの範囲の異なる組織の多くで調節される。特定の組織における発現を可能にするＥＲＡ１プロモーターのエレメントを決定することにより、孔辺細胞などの１つの組織または細胞型のみに対するアンチセンスＥＲＡ１の発現を仕立てることが可能になる。
【００４４】
植物におけるＦターゼ活性を阻害する別法は、トランスジェニック植物におけるファルネシル化の特異的ペプチドインヒビターの生産である。哺乳類および酵母系において、特異的なタンパク質へのファルネシル基の付着を可能にするカルボキシル末端標的配列（ＣａａＸ、式中、Ｃ＝システイン、ｘ＝脂肪族性アミノ酸、Ｘ＝任意アミノ酸）は、明らかに定義されている。これらの標的配列を模倣するペプチドが作製されており、これらの系における内因性標的タンパク質のファルネシル化を阻害することが示されている。さらに、ＣＡＩＭは、アラビドプシスにおいて、イン・ビボでファルネシル化される。したがって、類似のインヒビターは、高等植物に適用され、イン・ビボで競合的にＦターゼを阻害することができる。また、ＣａａＸペプチドのＤＮＡ配列を合成し、それを孔辺細胞特異的プロモーターに融合することにより、トランスジェニック植物におけるインヒビターペプチドの発現を介して、これがなされうる。両方の方法において、適当なプロモーターを用い、アンチセンスＦターゼまたはペプチドインヒビターが特異的に標的にされ、制御されうる。
【００４５】
したがって、本発明は、配列番号：１に対するアンチセンスを含有もしくはコードした核酸または前記アンチセンスの機能的同等物を含有した核酸に作動可能に連結したプロモーターを含有した核酸構築物を調製する工程；ベクターに前記核酸構築物を挿入する工程；前記ベクターにより、植物、組織培養物または植物細胞を形質転換する工程；該植物を生育させる、または前記組織培養物または植物細胞から植物を再生する工程を含み、ここで、耐乾性植物を生産する、耐乾性植物の生産方法を提供する。核酸が、配列番号：１に相補的な２５〜２００以上の連続的なヌクレオチド、配列番号：１の２５以上の連続的なヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドもしくはその相補鎖、またはファルネシルトランスフェラーゼのペプチドインヒビターをコードする核酸からなる群より選ばれた、この方法を用いうる。
【００４６】
ＡＢＡに対して極めて感受性のある気孔調節に加え、ｅｒａ植物は、また、乾燥条件下で老化の遅れを示し、これは、ファルネシル化が、アラビドプシスにおいて乾燥誘導性の応答の多くを負に調節することを示す。通常の研究室条件下で生育させたｅｒａ植物は、黄変するのに長い時間かかる。変異植物は、野生型が老化を起こして枯死した後も、長い間、緑で生き生きとしたままである。ｅｒａ変異植物の脱離した葉は、野生型植物の脱離した葉ほど速く黄色くならない（Ｆｉｇｕｒｅ  ８）。発育的に同一である同じくらいの大きさの葉を、野性型およびｅｒａ植物から取り、寒天を含有するペトリ皿上に置いた（実施例７参照のこと）。通常、野生型の葉は、約５日後にクロロフィルを失い始め、結局色が抜ける。変異植物の葉は、２倍長く緑のままでいる。葉は、定常的に寒天と接触しているので、該葉は乾燥のストレスを受けず、ｅｒａ１変異体の老化の低下が乾燥誘導性の現象でないことを示した。
【００４７】
さらに、１０時間  昼／１６時間  夜のサイクル下では、植物のライフサイクルは、野生型植物（３ヶ月）の２倍になり得る。したがって、クロロフィル代謝回転および老化シグナルは、ｅｒａ１変異体において変わるようである。例えば、野生型植物および変異植物は、植木鉢で水を十分に与えた条件下で、野生型植物の葉は老化（花がつく時期）し始めるであろう発育の段階まで生育した。このとき、発育的に類似の葉を、老化誘導性マーカー遺伝子について、ノーザンブロット解析によりアッセイした（実施例８）。野生型植物において、通常、転写が老化中に誘導される２つの遺伝子ＳＡＧ１２およびＳＡＧ１３は、ｅｒａ１変異体において誘導されなかった（Ｆｉｇｕｒｅ  ９）。さらに、ＣＡＢ転写は維持される（Ｆｉｇｕｒｅ  ９）。これらを合わせた結果は、ｅｒａ１変異体における老化誘導プログラムが野生型植物に比べて遅延し、水ストレスが環境的要因でない条件下でさえ、植物におけるファルネシル化活性の欠損が老化の誘導の遅延を引き起こすことを示す。
【００４８】
老化および水分損失に対する影響に加え、ｅｒａ１変異体は、日周的な光サイクル下で生育させた場合、枝分かれおよび開花習性において差異を示す。連続的な（２４時間光／日）光の下、変異体の枝わかれのパターンは、野生型植物のそれとは異ならない。しかしながら、暗期を与えた場合、変異体は、野生型植物ほど多くの側生枝を生じない。測定すると、１野生型植物当たり３．６の側生枝であるのに比べて、ファルネシル化活性を失った植物は、１植物当たり２．４の枝しか生じなかった。これは、１植物当たり、側生枝の３０％の減少を表す。
【００４９】
開花も、同様にＦターゼ活性の欠損により影響される。Ｆターゼ活性を欠く植物は、１つの植物当たり、野生型植物（１０〜１５芽／花序）より多くの花をつける（２５〜３０芽／花序）。したがって、平均、野生型植物よりも２倍多くの花芽が変異体に存在する。
【００５０】
機能変異体のｅｒａ１欠損の、植物発育全体におけるこれらの多面発現性影響は、ＥＲＡ１遺伝子が、一群の植物の発育機能の同調的レギュレーターでありうることを示す。
【００５１】
これまで、ＡＢＡシグナル伝達における役割を含む、高等植物におけるファルネシル化に対する機能は知られていなかった。Ｆターゼは、トマトおよびエンドウ等の多くの高等植物に見出されているため、この酵素は種の境界を越えて機能を有することが明らかである。さらに、ファルネシルトランスフェラーゼ標的ペプチドの過剰産生、またはファルネシル化インヒビターの使用は、哺乳類および酵母系におけるＦターゼを完全に不活性化する。したがって、類似のインヒビターを、インビボでＦターゼを不活性化するために高等植物に適用し得る。適当なプロモーターを用いる両方の場合において、アンチセンスＦターゼまたはペプチドインヒビターは、特異的に標的とされ得、制御され得る。
【００５２】
ファルネシル化欠損変異体は、外因性のオーキシンに対して超感受性でもある。これらの変異体が、枝分かれの減少と、分裂組織の構成におけるわずかな変化を示すことは、オーキシン調節の変化により説明され得る。したがって、この変異体において他のホルモン機能が影響をうけ、これは、ＡＢＡ経路に加え、他のホルモンにより調節される経路が、Ｆターゼ活性により制御されることを示す。これらの結果は、ＥＲＡ1 遺伝子が、異なるホルモンシグナル伝達分子の調節に同調する分子メカニズムを提供することを示す。
【００５３】
本発明によれば、本発明の範囲に含まれる植物は、植物界の高等および下等植物である。成熟植物、実生および種子は、本発明の範囲に含まれる。成熟植物は、実生以外の発育におけるいかなる段階の植物をも含む。実生は、非常に若く、発育の初期段階の未熟植物である。植物部分、プロトプラストおよび組織培養物も、本発明により提供される。
【００５４】
トランスジェニック植物は、本発明の範囲に含まれ、ｅｒａ１変異により特徴づけられる表現型を有する。トランシジェニック植物の種子は、本発明によりに提供され、本発明の構築物を含む植物をより多く繁殖させるのに使用し得る。
【００５５】
ＡＢＡ仲介シグナル伝達を必要とする環境の悪条件に対する植物の応答を増強するために、多くの作物植物におけるＥＲＡ１機能を阻害し得る。高等植物におけるファルネシル化の制御は、このホルモンに対する、胚組織および葉菜組織の両方の応答を調節する（カットラー（Ｃｕｔｌｅｒ）ら、１９９６））。増大した感受性は、かわりに、環境ストレスに対する植物の保護の増大を付与する、ストレス条件に対する組織のより速い応答に転化される。これは、単一の遺伝子、ＥＲＡ１の制御しか必要としないため、この酵素の合成または活性を制御することにより、種々の植物におけるファルネシル化を制御することが可能であるはずである。さらに、本明細書に記載の実験により、ＡＢＡ応答を制御する遺伝子を操作することによりＡＢＡシグナル伝達経路を改変することは、有害な水ストレス条件に対する植物の応答を改善することが可能であることが明らかに示される。
【００５６】
本発明のトランスジェニック植物を作出するために、Ｆターゼをコードする遺伝子、またはその機能的同等物をコードする核酸を含有する構築物と、プロモーターとを、当業者に知られ用いられる方法によりベクターに組み込む。プロモーターは、配列番号：３の全部または一部を含有しうる。構築物は、ターミネーター等の、コード配列に作動可能に連結されるいかなる他の必要なレギュレーターをも含む。また、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ジョブリング（Ｊｏｂｌｉｎｇ），Ｓ．Ａ．およびゲールケ（Ｇｅｈｒｋｅ），Ｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２〜６２５）またはメイズクロロティック斑ウイルス（ＭＣＭＶ）リーダー（ロンメル（Ｌｏｍｍｅｌ），Ｓ．Ａ．ら、（１９９１）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２〜３８５）等の５’リーダー配列を含むことは有益である。当業者は、種々の異なる目的のために他のリーダー配列を適用することを認識するだろう。
【００５７】
また、ターゲティング配列も、有用であり、本発明の構築物に組み込まれ得る。ターゲティング配列は、通常、コード核酸配列のペプチド産物を、プラスチド等の細胞内の所望の位置に仕向けるペプチドに翻訳され、ペプチドの移送が終了した後、または移送と同時に、ペプチドから分離する。本発明に有用なターゲティング配列の例示としては、限定されないが、酵母ミトコンドリア前配列（シュミッツ（Ｓｃｈｍｉｔｚ）ら、（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：７８３〜７９１）、タバコの病原関連遺伝子（ＰＲ−１）由来のターゲティング配列（コーネリセン（Ｃｏｒｎｅｌｌｉｓｅｎら、（１９８６）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：３７〜４０）、液胞ターゲティングシグナル（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｍ．Ｊ．およびレーケル（Ｒａｉｋｈｅｌ），Ｎ．Ｖ．（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：６１３〜６１６）、ＥＲまたはゴルジのもの等の分泌経路配列（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｍ．Ｊ．（１９９１）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３）が挙げられる。細胞小器官内配列も、また、内部部位、例えば、葉緑体のチラコイドに有用であり得る。セグ（Ｔｈｅｇ），Ｓ．Ｍ．およびスコット（Ｓｃｏｔｔ），Ｓ．Ｖ．（１９９３）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：１８６−１９０。
【００５８】
５’リーダー配列に加えて、ターミネーター配列も、通常、前記構築物に組み込まれる。植物構築物において、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、一般に発現プラスミドの一部であり、ポリＡ終結配列を含む。使用される終結領域は、比較的互換性があるようであるので、一般に都合のよいものになるだろう。Ａ．ツメファシエンスのＴｉ−プラスミド由来の、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域は、本発明の構築物でのかかる使用に好適である。
【００５９】
本発明の核酸および構築物を導入して、改変されたゲノムを有するトランスジェニック植物を生産するために、いかなる好適な技術をも使用し得る。メイズ等のイネ科の植物には、マイクロインジェクタイル射撃法（例えば、サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ），Ｊ．Ｃ．らの米国特許第５，１００，７９２号明細書（１９９２）を参照のこと）を使用し得る。この態様では、ヌクレオチド構築物または該構築物を含むベクターを小粒子上にコーティングし、次いで、それを標的組織（細胞）に、高速弾道貫通により導入する。ベクターは、該ベクターが導入される植物細胞における外来ＤＮＡの発現を可能にするいかなるベクターでもあり得る。次いで、形質転換細胞を、植物の再生に適した条件下で培養すると、トランスジェニック植物の生産をもたらす。
【００６０】
本構築物を保持するトランスジェニック植物は、限定されないが、抗生物質耐性若しくは除草剤耐性等の適当な表現型マーカー、または開花誘導の時期を天然植物の成長と比較した視覚的な観察を含む種々の方法を用い、目的の表現型について調べられる。
【００６１】
核酸構築物を植物に挿入する他の公知の方法としては、アグロバクテリウム仲介形質転換（例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｒ．Ｈ．ら、米国特許第５，１６４，３１０号明細書（１９９２）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、カルビン（Ｃａｌｖｉｎ），Ｎ．、米国特許第５，０９８，８４３号明細書（１９９２）を参照のこと）、レーザービームを用いる導入（例えば、カスヤ（Ｋａｓｕｙａ），Ｔら、米国特許第５，０１３，６６０号明細書（１９９１）を参照のこと）またはポリエチレングリコール等の試薬を用いる導入（例えば、ゴールズ（Ｇｏｌｄｓ），Ｔ．ら、（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：９５−９７を参照のこと）等が挙げられる。一般に、植物細胞は、ウィルスベクター、エピソームベクター、Ｔｉプラスミドベクター等の種々のベクターにより、周知の方法に従って形質転換されてもよい。核酸の植物細胞への導入方法は、本発明の本質を構成するものではない。
【００６２】
本発明の方法は、培養や再生を必要としないイン・プランタまたは種子形質転換技術と共に使用し得る。これらの技術の例示は、ベッヒトールド（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ），Ｎ．ら（１９９３）  ＣＲ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｐａｒｉｓ／Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３１６：１１８−９３；チャン（Ｃｈａｎｇ），Ｓ．Ｓ．ら、（１９９０）  アラビドプシス研究に関する第４回国際会議の要旨集（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウィーン、２８頁；フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ），Ｋ．Ａ．およびマークス（Ｍａｒｋｓ），Ｄ．Ｍ  （１９８７）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０８：１−９；レドックス（Ｌｅｄｏｕｘ），Ｌ．ら、（１９８５）  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆ．  Ｓｅｒｖ．  ２２：１−１１；フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ），Ｋ．Ａ．（１９９２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （コンツ（Ｋｏｎｃｚ），Ｃ．、チュア（Ｃｈｕａ）、Ｎ−Ｈ、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ），Ｊ．）  ２７４〜２８９頁；チー（Ｃｈｅｅ）らの米国特許第５，３７６，５４３号明細書に記述されている。
【００６３】
転写開始領域は、構成発現または調節発現を提供してもよい。ＥＲＡ１プロモーターに加えて、植物において機能的である多くのプロモーターが利用できる。
【００６４】
植物の遺伝子発現のための構成的プロモーターとしては、限定されないが、アグロバクテリウム由来のオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、またはマンノピンシンターゼプロモーター、カリフラワーモザイクウィルス（３５Ｓ）プロモーター、ゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ）プロモーター、およびタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）プロモーターが挙げられる。また、植物での構成遺伝子発現は、グルタミンシンターゼプロモーター（エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、（１９９０）  ＰＮＡＳ  ８７：３４５９−３４６３）、メイズスクロースシンセターゼ１プロモーター（ヤン（Ｙａｎｇ）ら、（１９９０）  ＰＮＡＳ  ８７：４１４４−４１４８）、ＲｉプラスミドのＴＬＤＮＡのＲｏｌ−Ｃ遺伝子由来のプロモーター（サガヤ（Ｓａｇａｙａ）ら、（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３０：６４９−６５４）、およびｐＲＶＣ−Ｓ−３Ａプロモーターの師部特異的領域（アオヤギ（Ａｏｙａｇｉ）ら、（１９８８）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：１７９−１８５）によっても提供され得る。
【００６５】
熱ショックプロモーター、リブロース−１，６−ビスリン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、組織特異的プロモーター等を、植物遺伝子の調節発現に使用し得る。発育調節性プロモーター、ストレス誘導性プロモーター、創傷誘導性プロモーターまたは病原体誘導性プロモーターも有用である。
【００６６】
調節領域は、ＲＵＢＰカルボキシラーゼｓｓｕプロモーター、分化シグナル、または代謝産物等の場合のように、光等の物理的な刺激に対して応答性であり得る。センスまたはアンチセンス方向の発現の時期および量は、生じた表現型に対して明確な効果を有し得る。したがって、外来ＤＮＡの方向に結合する選択されたプロモーター、およびゲノムにおけるベクターの組み込み部位は、誘導された遺伝子の影響を決定するだろう。
【００６７】
調節プロモーターの具体例としては、限定されないが、低温Ｋｉｎ１プロモーターおよび低温ｃｏｒ６．６プロモーター（ワン（Ｗａｎｇ）ら、（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：６０５；ワン（Ｗａｎｇ）ら、（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：６１９−６３４）、ＡＢＡ誘導プロモーター（マルコッテ・ジュニア（Ｍａｒｃｏｔｔｅ  Ｊｒ．ら、（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６９−９７６）；キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌｉａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の誘導性ｈｓｐ７０熱ショックプロモーター（フリーリング（Ｆｒｅｅｌｉｎｇ），Ｍ．ら、（１９８５）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２９７−３２３）等の熱ショックプロモーター、Ｂ．ナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）由来の低温誘導性プロモーター（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｔ．Ｃ．ら、（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９１７）、エタノールにより誘導されるアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ナガノ（Ｎａｇａｎｏ），Ｒ．Ｔ．ら、ミフリン（Ｍｉｆｌｉｎ），Ｂ．Ｊ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｕｒｖｅｙｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、３８４〜４３８頁、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード  １９８６）、アラビドプシス由来の師部特異的スクロースシンターゼＡＳＵＳ１プロモーター（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４：３６７−３７７）、ＡＣＳ１プロモーター（ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ）−ポーサダ（Ｐｏｕｓａｄａ）ら、（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：８９７−９１１）、メイズ由来の２２ｋＤａゼインタンパク質プロモーター（ウンガー（Ｕｎｇｅｒ）ら、（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：８３１−８４１）、エンドウのｐｓ１レクチンプロモーター（ド  ペーター（ｄｅ  Ｐａｔｅｒ）ら、（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：８７７−８８６）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のｐｈａｓプロモーター（フリッシュ（Ｆｒｉｓｃｈ）ら、（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：５０３−５１２）、ｌｅａプロモーター（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｔ．Ｌ．（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１４０１−１４１０）、トマト由来のＥ８遺伝子プロモーター（コーデス（Ｃｏｒｄｅｓ）ら、（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１０２５−１０３４）、ＰＣＮＡプロモーター（コスギ（Ｋｏｓｕｇｉ）ら、（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ７：８７７−８８６）、ＮＴＰ３０３プロモーター（ウェターリングズ（Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ）ら、（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ８：５５−６３）、ＯＳＥＭプロモーター（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ７：９１３−９２５）、ジャガイモ由来のＡＤＰ  ＧＰプロモーター（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）−ローバー（Ｒｏｂｅｒ）ら、（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：６０１−６０４）、大麦由来のＭｙｂプロモーター（ウィッセンバッハ（Ｗｉｓｓｅｎｂａｃｈ）ら、（１９９３）    Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ���：４１１−４２２）、およびアラビドプシス由来のプラストシアニンプロモーター（ボースト（Ｖｏｒｓｔ）ら、（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４：９３３−９４５）が挙げられる。
【００６８】
ベクターは、宿主細胞のタイプに適した方法（例えば、形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクション）によって細胞に導入され得る。本開示の目的のために、本明細書では「〜で形質転換された」「形質転換体」「形質転換」「〜でトランスフェクトされた」および「トランスフェクション」という用語はすべて、当業者に公知の多くの方法の一つによる、細胞への核酸の導入をいう。例えば、原核細胞の形質転換は、一般に、細胞を「コンピテント」にして外来ＤＮＡを取り込むようにするためにその細胞を塩化カルシウムで処理した後、かかるのＤＮＡをそのコンピテント細胞と混合することによって達成される。また、原核細胞は、組換えバクテリオファージベクターで感染させ得る。
【００６９】
核酸は、個々の細胞タイプに応じて、ウイルス感染、細菌を介した転移（例えばアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ送達系）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、マイクロインジェクション、リポフェクション、核酸被覆粒子の射撃または他の技術によって高等生物の細胞に導入し得る。トウモロコシやモロコシ等の穀類には、例えばサンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ），Ｊ．Ｃ．らの米国特許第５，１００，７９２号明細書（１９９２）に記述されているようなマイクロプロジェクタイル射撃法を使用し得る。植物細胞の形質転換に有用な他のプロトコルは、ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら、１９９２に記述されている。細胞の形質転換またはトランスフェクションに好適なプロトコルは、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９にも見出される。本発明の核酸構築物は、上述のような特定の植物部分に、本明細書に記述する形質転換およびトランスフェクション技術によって組み込み得る。
【００７０】
形質転換植物細胞の同定を助けるために、本発明の構築物は、植物選択可能マーカーをコードする遺伝子を含むようにさらに操作される。有用な選択可能マーカーとしては、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する酵素が挙げられる。同様に、ＧＵＳ（β- グルクロニダーゼ）等の色変化によって、またはルシフェラーゼ等のルミネッセンスによって同定できる化合物の生成を与える酵素も有用である。
【００７１】
例えば、アンチセンスＦターゼは、配列番号：３を含有したＤＮＡに連結されたＥＲＡ１遺伝子の補体を、宿主細胞の一部となるウィルスのゲノムに組み込むことにより産生され得る。宿主細胞の感染により、アンセンスの転写を可能にする系の構成要素が宿主細胞に存在する。
【００７２】
本発明のプロモーターによって制御されるアンチセンス遺伝子を含む細胞またはプロトプラストが得られる場合、該細胞またはプロトプラストを全植物に再生させる。次いで、形質転換細胞を植物の再生に適した条件下で培養すると、トランスジェニック植物の生産をもたらす。再生工程の方法論の選択は、重大な問題ではなく、好適なプロトコルは、多種多様な植物、組織および他の光合成生物について利用できる。例えば、ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）  Ｓ．Ｂ．およびシルパールールト（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）  Ｒ．Ａ．編、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、補巻１（１９９５）  クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、米国マサチューセッツ州ボストン）を参照されたい。
【００７３】
本構築物を保持するトランスジェニック植物は、限定されないが、上述のような抗生物質耐性または除草剤耐性等の適当な表現型マーカー、またはそれらの生長を同じ条件で天然植物の生長と比較した視覚的な観察を含む種々の方法を用いて、目的の表現型について調べられる。
【００７４】
本明細書において使用されるように、トランスジェニック植物という用語は、ここに記述するように導入された、野生型（天然）植物または既知の変異体には本来存在しないＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれか、または天然に存在するＤＮＡの付加的なコピー若しくは逆方向コピーを含む植物を含む。トランスジェニック植物は、単離核酸が導入されているもの、およびかかる変化を維持し、種子、栄養生殖、細胞、組織またはプロトプラスト培養等から生成されたそれらの子孫を含む。
【００７５】
かかるトランスジェニック植物としては、一態様として、被子植物、単子葉類と双子葉類の両方、であるトランスジェニック植物が挙げられる。トランスジェニック植物としては、ＤＮＡが導入されたもの、および種子、栄養生殖、細胞、組織またはプロトプラスト培養等から生成したそれらの子孫が挙げられる。
【００７６】
種子は、再生植物から、または再生された植物とそれと同じ種の適当な植物との間の交雑種から得られうる。一方、植物部分をかかる植物部分の再生に適した条件下に培養することによって、前記植物を栄養繁殖させ得る。
【００７７】
本発明のさらに別の側面では、変化する環境条件に対する組織培養物またはプロトプラストの応答を変化させる、ＥＲＡ１プロモーターに作動可能に連結された改変ＥＲＡ１核酸、またはアンチセンスを含有するＤＮＡを含む、植物の組織培養物およびプロトプラストが提供される。
【００７８】
本発明の方法は、培養や再生を必要としないインプランタまたは種子形質転換技術と共に使用し得る。これらの技術の例は、ベッヒトールド（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ），Ｎ．ら（１９９３）  ＣＲ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｐａｒｉｓ／Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３１６：１１８−９３；チャン（Ｃｈａｎｇ），Ｓ．Ｓ．ら、（１９９０）  アラビドプシス研究に関する第４回国際会議の要旨集（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウィーン、２８頁；フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ），Ｋ．Ａ．およびマークス（Ｍａｒｋｓ），Ｄ．Ｍ  （１９８７）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０８：１−９；レドックス（Ｌｅｄｏｕｘ），Ｌ．ら、（１９８５）  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆ．  Ｓｅｒｖ．  ２２：１−１１；フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ），Ｋ．Ａ．（１９９２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （コンツ（Ｋｏｎｃｚ），Ｃ．、チュア（Ｃｈｕａ）、Ｎ−Ｈ、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ），Ｊ．）  ２７４〜２８９頁；チー（Ｃｈｅｅ）らの米国特許第５，３７６，５４３号明細書に記述されている。
【００７９】
態様
本発明の構築物および方法は、特に、水ストレスの段階下での植物組織の乾燥の防止における商業的価値のある多くの用途を有する。Ｆターゼのインヒビターを取り込んだ作物植物の遺伝子操作、または内因性植物Ｆターゼをコードする遺伝子の不活性化は、かかる植物が一過的な環境ストレスに耐えることを可能にするであろうし、これらの植物が生育し得る環境を広げ得る。したがって、寒冷、塩分および乾燥ストレスに対する作物植物の耐性を改良することは、かかる悪条件下での植物の収穫量を向上し得る。
【００８０】
また、本明細書に記載の技術は、植物の収穫時期と収穫量とを変えるために使用し得る。例えば、Ｆターゼの過剰発現により、トウモロコシおよび他の穀類等の作物の乾燥時間がより速くなりうるだろう。トウモロコシを乾燥させることは、大量のプロパンガスの使用を必要とする。田畑で自然に乾燥する干し草等の作物の乾燥時間は短縮され、それは、おそらく雨が該作物を劣化させることを少なくするであろう。
【００８１】
さらに、植物におけるファルネシル化の阻害は、葉を青々とした状態でより長く維持し得、かつ果実を未熟なままで維持し得るように、該植物の老化プログラムを制御するためにも使用し得る。例えば、ＥＲＡ１のアンチセンス構築物またはＣａａＸボックスインヒビタータンパク質構築物が、老化誘導プロモーターの制御下に配置される場合、老化プログラムが開始されると、植物は、同時に老化を阻害するであろうファルネシル化のインヒビターを誘導するであろう。結果として、植物は青々としたままか、果実が未熟なままとなるだろう。したがって、植物は、葉菜部分、花または果実等の産物を、より長期で生産し続けうるであろう。したがって、園芸栽培者は、同じ品種の野生型植物が同じ条件下で老化するが、青々としたままで、かつ生長し続ける植物を生産することができるであろう。切り花は、より長く維持されうるだろう。あるいは、市場にとって農産物の寿命が極めて重要となる青果産業のための重要な産物、果実は未熟なまま維持されうるだろう。
【００８２】
さらに、果実と野菜とにおけるＦターゼの阻害は、しおれを低減し得る。したがって、移送および船便輸送中の産物のしおれが、低減されうるだろう。商店の棚の果実および野菜も、それらを新鮮で風味よく維持するために霧吹きをさほど要求しないだろうし、キュウリ、リンゴおよびオレンジ等の産物に、それらが干からびないようにワックスすることをさほど要求しないであろう。
【００８３】
また、水やりがより少ないことは、作物、または果実と野菜とに対するカビおよび細菌の攻撃が低減されるだろうことを意味するだろう。例えば、土壌から植物の葉と果実とへの植物病原体の飛散により生じる、田畑での植物の病気は、阻害されうるだろう。
【００８４】
園芸分野において、多くの乾燥耐性品種が、造園のためおよび観賞用鉢植え植物としての使用のために生産されうるだろう。特に価値のあるものは、家屋およびオフィスの内部または外部の観賞用の鉢植え用に使用され、たまの水やりで生き延び得る植物の品種であろう。これは、忘れられた植物が日中、すぐに干からびる乾燥した夏の何ヵ月かの間は特に、園芸愛好家にとって、かなりの恵みになるであろう。さらに、木々の下と他の日陰地域とにおいて生育する植物は、乾燥条件と光の制限とをしばしば経験する。本明細書で提供される技術は、これらの条件下でより良好に生存しうる植物の品種を提供することができる。
【００８５】
さらなる態様では、園芸栽培者は、横方向への枝分かれ数および／または開花数が、明／暗サイクルにより制御され得る植物の多くの用途を見いだし得る。より長く、枝分かれしていない茎が市場上での有利さを与えるであろう植物の例としては、バラ、カーネーション、ユリ等が挙げられる。植物の花数または花芽数を増やす能力も、大いに価値のある利点である。これらの形質は、また、農作物の収穫をも容易にするような方法で収穫量を向上させ得る点で、多くの作物にとって有用である。
【００８６】
本明細書で提供される構築物および方法の別の利点は、ＥＲＡ１プロモーターが、葉の孔辺細胞において活性であるということである。ＥＲＡ１遺伝子プロモーターの一部は、ＥＲＡ１遺伝子に対するアンチセンス核酸に融合し得るので、Ｆターゼ活性は孔辺細胞においてのみ減少する。
【００８７】
さらなる態様は、乾燥耐性形質の、植物、植物細胞および植物組織における形質転換の選択可能なマーカーとしての使用である。植物における形質転換を検出する１つの方法は：（ａ）配列番号：１に対するアンチセンスを含有した核酸にまたは該アンチセンスの機能的同等物を含有する核酸に作動可能に連結したプロモーターを含有した核酸構築物を組み込むステップ；（ｂ）植物、植物細胞または植物組織に該核酸構築物を挿入するステップ；（ｃ）気孔が形成されるまで、植物を生育または植物細胞若しくは植物組織から植物を再生させるステップ；および（ｄ）植物または再生植物を、植物が乾燥ストレスをうける条件下におくステップ；からなり、ここで、非形質転換植物と比較した、乾燥条件下における植物の生存が形質転換の指標である。したがって、この技術は、選択可能な遺伝子マーカー、すなわち、特に植物の選択と形質転換スキームとを組み合わせる際の可視マーカーとして使用し得る。
【００８８】
さらに、トランスジェニック植物にストレスを与えることに訴えることなく、Ｆターゼ機能を欠損した植物の枝分かれ習性および／または開花習性は、野生型植物のそれとは実質的に異なり、良好な形質転換のためのマーカーとして使用し得る。この方法は、イン・プランタ形質転換技術が適用されている場合に、特に有用であろう。日周光条件下において、トランスジェニック植物の苗条は、非形質転換苗条のそれよりも、横方向の枝分かれが少ないであろう。これにより、選択可能な抗生物質マーカーを使用せずに、Ｆターゼ活性の効果的な低減が示される。
【００８９】
実施例
実施例１：変異誘発条件
本研究に使用したアラビドプシス植物を、連続的な光の下、土壌、または寒天を含むペトリ皿中で、他に記載（ハーグン（Ｈａｕｇｈｎ）およびソーマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）  １９８６）のようにして生育させた。アラビドプシスの２つの別個の野生型を使用した：ミエロビッツのコロンビア〔Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ’ｓ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ（Ｃｏｌ）〕（レルヘ・シーズ（Ｌｅｌｈｅ  Ｓｅｅｄｓ）、ドリッピング・スプリングズ（Ｄｒｉｐｐｉｎｇ  Ｓｐｒｉｎｇｓ）、テキサス州）およびワシリュウスキヤ〔Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ（Ｗｓ）〕（ＡＢＲＣ、オハイオ州立大学〔Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）〕。Ｔ−ＤＮＡ変異誘発種子をスクリーニングすることにより単離された変異体は、Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ系（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）であった。これらは、オハイオ州立アラビドプシス種子ストック・コレクション（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ  ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＢＲＣストック・ナンバー  ＣＳ２６０６−２６５４）から得た。Ｔ−ＤＮＡ種子コレクションは、１００の変異誘発された親由来の１２００の第４世代（Ｔ４）子孫の４９プールを含有したものであった。変異誘発された親は、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む飽和アグロバクテリウム培地中で、野生型種子（Ｔ１）を一晩インキュベートすることにより得られた。種子を、水中で洗浄し、鉢に植えた。Ｔ２世代種子を、各植物から得て、カナマイシン耐性（Ｔ−ＤＮＡ上に保持される）について試験した。カナマイシン耐性植物は、Ｔ３世代に発育させた。Ｔ４世代植物は、ストック・センターに提供した。各プールを、別個にスクリーニングした。
【００９０】
高速中性子照射種子をスクリーニングすることにより単離した変異体は、Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ’ｓ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ系であった。変異誘発した野生型種子（Ｎ１）に、６０Ｇｙの高速中性子を照射し、次世代に生育させた。Ｎ２種子を、１３８７  Ｎ１の親から生じた約１１，０００の種子のプールとして得た。これらのプールのうち１０個について、ＡＢＡ超感受性変異体について、別々にスクリーニングした。最初のスクリーニングでは、種子を４℃で保存し、吸収を行わずにプレーティングした。すべての次の再スクリーニングのために、種子を、４℃で１週間、０．３μＭ  ＡＢＡ上で吸収させ、明所で２２℃にて５〜７日後、子葉の出現を評価した。
【００９１】
実施例２：遺伝学的解析
変異株を、野生型に３回、戻し交配した。Ｔ−ＤＮＡ変異体をＷｓに、高速中性子変異体をＭＣｏｌに、戻し交配した。ｅｒａ表現型の分離の後、Ｆ２種子を両０．３μＭ  ＡＢＡに播種し、４℃で４日間吸収させた。吸収後、プレートを、室温の明所に移した。発芽を、一週間、後吸収した実生中における膨張した子葉の有無として判定した。分離後、各変異体に同型接合性の株を交配し、変異表現型の１つを有する株を同定することにより二重変異体を確認した。本研究に使用したａｂｉ３対立遺伝子は、ａｂｉ３−６（ナンバラ（Ｎａｍｂａｒａ）ら、１９９４）であり、ａｂｉ１はａｂｉ１−１（クーンネーフ（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ）ら、１９８２）である。ｅｒａ１−２対立遺伝子を、ｅｒａの親として使用した。分離解析により、ｅｒａ１が、ａｂｉ１の非感受性を一部抑制することが示されたため、まず、Ｆ２植物について、３ｍＭ  ＡＢＡに対する非感受性をスクリーニングし、これらの植物のＦ３種子の３ｍＭ  ＡＢＡに対する感受性について評価した。推定される二重変異体は、Ｆ４世代において試験された子孫であり、Ａｂｉ１とＥｒａ１との両方についてＤＮＡ多型により確認した。ｅｒａ１  ａｂｉ３二重変異体のために、Ｆ２種子を非感受性（０．３μＭ  ＡＢＡ）についてスクリーニングし、成熟植物を、隆起した心皮および成熟していない未熟な種子について評価した（ナンバラ（Ｎａｍｂａｒａ）ら、１９９４）。推定される二重変異株を、Ａｂｉ３とＥｒａ１との両方についてＤＮＡ多型により確認した。
【００９２】
実施例３：ＤＮＡおよびＲＮＡ解析
ＤＮＡ抽出方法（デラポルタ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ）ら、１９８３）およびＲＮＡ抽出方法（バーウォード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）ら、１９８９）は、記載の通りとした。高ストリンジェンシーのサザンを、６５℃で他に記載のようにして行なった（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）。ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのすべては、ゲルマン・バイオトレース（Ｇｅｌｍａｎ  ＢｉｏＴｒａｃｅ）ＮＴ膜上で、製造者仕様書（ゲルマン・サイエンシズ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））に従って行なった。Ｔ１２Ｗ変異体（ｅｒａ１−１）におけるＴ−ＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の挿入結合部位をクローニングするために、Ｔ１２Ｗ  ＤＮＡのライブラリーをγ−ＺＡＰＩＩ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で作製した。ＥｃｏＲ１で消化し、右端（ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）（ＲＢ）Ｔ−ＤＮＡでプローブしたＴ１２Ｗ  ＤＮＡのゲノムサザンブロットでは、３つのバンド（１３Ｋｂ、７．０Ｋｂおよび８．０Ｋｂ）が生じた。他の制限酵素による次の解析では、前記７Ｋｂおよび８ＫｂのバンドがＴ−ＤＮＡの挿入点を含み、植物ＤＮＡを隣接すると確認された。これらの断片を、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによりクローニングし、該ＤＮＡを、プレップ・セル（Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて分画した。ＲＢをプローブとして用い、プールした画分のサザン解析により前記７Ｋｂおよび８Ｋｂの断片を含む画分を同定した。これらのプールを、γ−ＺＡＰＩＩアームに、製造者の説明書（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に従ってライゲートした。４０，０００の組換え体のライブラリーをスクリーニングした。５つのポジティブプラークを同定し、クローン化挿入断片の切り出されたプラスミド型を、製造者（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に従って単離した。ＲＢプローブとハイブリダイズするｐＬ４ＢおよびｐＬ７と称する２つのプラスミドを、さらにキャラクタライズした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用い、ｐＬ４Ｂ由来の２．３Ｋｂ  Ｅｃ  ｏＲＩ  ＢａｍＨＩ断片をサブクローニングして、かつｐＳＣ１０と称し、ｐＬ７由来の１．３Ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＢａｍＨＩ断片をサブクローニングして、かつｐＳＣ１１と称した。これらの２つのプラスミドは、隣接植物ゲノムＤＮＡに付着された約１．２ＫｂのＴ−ＤＮＡを含む。ｐＳＣ１０を、アラビドプシス  ｃＤＮＡライブラリー、ＰＲＬ２  ｌ−ＺｉｐＬｏｘ（ＡＢＲＣ、Ｓｔｏｃｋ  ＣＤ４−７）をスクリーニングするためのプローブとして使用した。５つのポジティブｃＤＮＡを同定し、最も長いｃＤＮＡ挿入断片、ｐＺＬ２３を、さらに２００，０００のＰＲＬ２ファージをスクリーニングするのに使用した。このスクリーニングから、より長いｃＤＮＡ挿入断片、ｐＺＬ５１、（１．３５  Ｋｂ）を単離した。これらのクローンを、シークエンスし、部分消化されたＥｃｏＲ１野生型コロンビアゲノムＤＮＡから作製された、３０，０００のγ−ＺＡＰＩＩプラークをスクリーニングするのに使用した。このライブラリーの構築は、消化したＤＮＡを分画しないことを除き、上述の通りとした。４つのポジティブクローンを同定した。挿入断片を切り出し、ｐＺＬ５１クローンを包含する６Ｋｂの領域を完全にシークエンスした。このゲノム挿入断片、およびｌ−ＦＩＸ  ランスバーグ・エレクタ（Ｌａｎｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ）ゲノムライブラリーから、類似の方法により単離した１４Ｋｂのゲノム挿入断片（ＡＢＲＣ  Ｓｔｏｃｋ  ＣＤ４−８）を、高速中性子変異体（ｅｒａ１−２、ｅｒａ１−３）における欠失の大きさを調べるためのプローブとして使用した。
【００９３】
実施例４：プロテインファルネシルトランスフェラーゼアッセイ
野生型および変異植物の無細胞抽出物をＦターゼ源とし、かつ合成ヘプタペプチドを反応の基質として用い、ファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆターゼ）アッセイを行なった。ペプチドは、ゲネムド・バイオテクノロジーズ・インク（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。ペプチドの適当な配列は、ランダル（Ｒａｎｄａｌｌ）ら（１９９３）のデータを基にした；これらは、ＧＧＣＣＡＩＭ（−ＣＡＩＭ）およびＧＧＣＣＡＩＬ（−ＣＡＩＬ）であった。ペプチドの溶液を、１０ｍＭ  ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）を含む１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製し、ＤＭＳＯ無しの１０ｍＭ  ＤＴＴに希釈した。トランスフェラーゼアッセイ用のＦターゼの供給源は、３週齢の植物の芽由来の可溶性タンパク質抽出物とした。野生型植物および変異植物の両方について、１ｇ（生重量）の芽を集め、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ  アプロチニンおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む緩衝液中でホモジナイズした。細胞の残渣と膜とを4 ℃、１０，０００ｇで１０分間および１００，０００ｇで３０分間、遠心分離により除去した。上清を取っておき、全可溶性タンパク質の定量を、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）（１９７６）に従って行なった。可溶性抽出物を３０℃で、ペプチド基質と 3Ｈ−ファルネシルピロリン酸塩（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とともに、４０分間インキュベートした。各反応混合物は、下記成分：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ  ＤＴＴ、５０μＭ  ペプチド、０．５μＭ  ［ 3Ｈ］ＦＰＰおよび１００μｇ／ｍｌの可溶性タンパク質抽出物を、最終容量２５μｌで含んだ。対照として、１つの反応物は、５分間煮沸しておいた可溶性抽出物を含んだ。ＥＤＴＡを終濃度５０ｍＭで加えることにより反応を終わらせた後、シリカゲル６０薄層クロマトグラフィープレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））にスポットした。プレートを、ｎ−プロパノール−水（７：３  ｖ／ｖ）により、４〜５時間、展開した。プレートを乾燥させ、Ｅｎ 3Ｈａｎｃｅ（ニュー・イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ））を噴霧し、コダックＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムに、−７０℃で４日間曝した。
【００９４】
実施例５：ＥＲＡ１−ＧＳＵ遺伝子構築物およびトランスジェニック植物
ＥＲＡ１プロモーターの５ＫｂのＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩゲノム断片を、プロモーターのないＧＵＳ  Ｔ−ＤＮＡプラスミド（ｐＢＩ１２１）に挿入することにより、ＥＲＡ１−ＧＳＵ融合構築物を作製した。この構築物をアグロバクテリウムＬＢ４４０４株で形質転換した。アグロバクテリウムを、（０．８  Ｏ．Ｄ．単位、５９５ｎｍ）まで成育させた後、水中で十分に洗浄し、細胞を１０％グリセロール中に再懸濁し、ついで、エレクトロポレーター内で、２００オーム、２５μＦ、２．５キロボルトで、パルスを与えた。次に、細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地にプレーテングし、２８℃で２日間成育させた。アンピシリン耐性形質転換体を、つづく植物形質転換実験に使用した。トランスジェニック植物を、植物を飽和アグロバクテリウム培地（０．８  Ｏ．Ｄ．単位、５９５ｎｍ）で減圧浸透させることにより作製した。野生型の植物を、標準的な実験室条件下（２５℃、１５０μＥ  ｍ-2  秒-1、湿度、定常的な光）で、それらが約５週で最初の抽だい（ｂｏｌｔｓ）を生じるまで生育させた。茎を取り出し、植物をアグロバクテリウムの溶液中に浸し、減圧下（２０ミリバール）に５分間置いた。減圧を解除した後、植物を土壌に移し、標準的な実験室条件下で回復させた。植物は新しい花と種子をつけ、種子を２か月後に収穫し、２週間乾燥した。個々の植物からの種子を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む最小培地ＭＳプレートに植えた。若いカナマイシン耐性の苗木を同定し、２週間後に土壌に移し、種子のために生育させた。これらの種子を発芽させ、蛍光性ＧＵＳ基質イマジーン・グリーン（Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）（モレキュラー．プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州）を用い、ＧＵＳ活性について実生を試験した。実生をＧＵＳ−緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ナトリウムサルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）、４ｍＭ  イマジーン・グリーン（Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）に２〜４時間、暗所で室温にて懸濁させることにより、アッセイを行なった。赤いクロロフィル自己蛍光バックグラウンドにおいて黄色になるポジティブの蛍光シグナルのための青色励起光を用い、顕微鏡下（２５Ｘ）、実生を直接観察した。
【００９５】
実施例６：乾燥実験
６個の単一の野生型および６個のｅｒａ１−２の実生を、４週間、定常光の下、定常的に水やりをして、生育した（２５℃、１５０μＥ  ｍ-2  秒-1、７０％湿度、定常光）。次いで、土壌からの水分蒸発を遅らせるために植木鉢を錫箔で覆い、植物と植木鉢とを計量した。このとき、もはや植物に水を与えず、毎日、各植木鉢を計量した。実験の最後に、植物を取り出し、植木鉢をさらに２週間乾燥させた後、計量して乾燥した土および植木鉢の重量を測定した。この重量を各試料から差し引いた。
【００９６】
実施例７：脱葉における老化関連−変化
野生型コロンビアおよびｅｒａ１−２変異体における、成熟したロゼットの葉のクロロフィル含量を、これらのアラビドプシス植物から脱葉した後に比較した。植物を、定常光（１５０μアインシュタイン／ｍ2 ・秒）および温度（２２℃）下で生育させ、発育年齢（発芽後３週間）の類似物とした。このとき、発芽後発育したいくつかの植物の５番目の葉を取り出し、ペトリ皿中、無機塩類を含む０．８％寒天上に置いた。皿を密封し、２２℃で、定常的な光（１５０μアインシュタイン／ｍ2 ・秒）の下に、１２日間置いた。写真を撮り、色の比較を０、３、６、９および１２日目に行なった。
【００９７】
実施例８：老化葉の選択された遺伝子における転写物量の測定
植物を定常的な光（１５０μアインシュタイン／ｍ2 ・秒）および温度（２２℃）下で類似した発育年齢（発芽後４週間）まで生育させ、このとき、発芽後に発育した第５番目のロゼットの葉を、変異体（ｅｒａ１−２）および野生型植物から取った。３つの遺伝子（ＣＡＢ、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３）の発現について、ノーザンブロット解析によりこれらの葉をアッセイした（植物の抽だい後、０、４、８日）。ＣＡＢ遺伝子は、光合成のための採光に関与するアラビドプシスクロロフィル結合タンパク質をコードする。ＣＡＢは、葉の緑色に必要であり、植物中でのクロロフィル代謝回転の良好なマーカーである。野生型植物中のＣＡＢは、いったん老化が誘導されると、転写物量の低下を示す。ｅｒａ１−２変異体の老化葉では、転写物量の低下は観察されない。ＳＡＧ１２およびＳＡＧ１３は、老化中の分化発現によりクローン化されたアラビドプシス遺伝子である（ＳＡＧは、老化活性化遺伝子を表わす）。両遺伝子の転写は、野生型アラビドプシス植物の老化の開始中に誘導される。これらの遺伝子は、ｅｒａ１−２変異体では、同じ発育条件下では誘導されなかったことがわかった。
【００９８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｆｉｇｕｒｅ  １Ａは、ＥＲＡ１遺伝子の核酸配列（配列番号：１）を示し、該配列中、イントロンは下線が付され、開始コドン（ＡＴＧ）は、ヌクレオチド位置１〜３である。
【図２】  Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｂは、ＥＲＡ１遺伝子の核酸配列（配列番号：１）を示し、該配列中、イントロンは下線が付されている。
【図３】  Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｃは、ＥＲＡ１遺伝子の核酸配列（配列番号：１）を示し、該配列中、イントロンは下線が付されている。
【図４】  Ｆｉｇｕｒｅ  ２は、ＥＲＡ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）である。
【図５】  Ｆｉｇｕｒｅ  ３Ａは、ＥＲＡ１プロモーターの核酸配列（配列番号：３）を示す。
【図６】  Ｆｉｇｕｒｅ  ３Ｂは、ＥＲＡ１プロモーターの核酸配列（配列番号：３）を示す。
【図７】  Ｆｉｇｕｒｅ  ４は、エンドウ（配列番号：４）と、酵母（配列番号：５）とラット（配列番号：６）とに由来するβサブユニットファルネシル化ドメインと共に並記した、アラビドプシス〔Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ〕（Ａｒａｂ．）由来のβサブユニットファルネシル化ドメイン（配列番号：２）である。アラビドプシスの配列と同一である残基をドットで示す。ダッシュは、空白を示す。アラビドプシス遺伝子のアミノ酸の位置を右側に示す。
【図８】  Ｆｉｇｕｒｅ  ５は、極度の乾燥条件下において、野生型（対照；すなわち、天然）植物（左）と比較したｅｒａ１−形質転換アラビドプシス植物（右）の写真である。
【図９】  Ｆｉｇｕｒｅ  ６は、不活性化または変異Ｆターゼ活性を有するアラビドプシス植物〔Ｍ．コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、ｅｒａ１〜２〕と対照（Ｍ．Ｃ．対照、ｅｒａ１〜２対照）との含水量を比較したグラフである。
【図１０】  Ｆｉｇｕｒｅ  ７は、不活性化または変異Ｆターゼ活性を有するアラビドプシス植物〔Ｍ．コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、ｅｒａ１〜２〕と対照（Ｍ．Ｃ．対照、ｅｒａ１〜２対照）との水分損失率を比較したグラフである。
【図１１】  Ｆｉｇｕｒｅ  ８は、対照（野生型）とｅｒａ−２変異植物とに由来する葉の老化の比較である。
【図１２】  Ｆｉｇｕｒｅ  ９は、対照（野生型）とｅｒａ−２変異植物とに由来する葉における転写量の比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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