(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の遺伝子検体のｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内における、下記（１）〜（４）にて表される塩基の別から選ばれる１種又は２種以上を遺伝子多型マーカーとして、当該遺伝子マーカーのヘテロ接合性の消失を特定して、ヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法。
（１）ｐ５３遺伝子の下流域約１０Kb〜１６Kbの範囲を表す配列番号１で表される塩基配列の４６９１番目の塩基のアデニンとグアニンとの別、
（２）同４７３１番目の塩基のグアニンとシトシンとの別、
（３）同４９０６番目の塩基のアデニンとグアニンとの別、
（４）同２６４９番目の塩基のアデニンとグアニンとの別。
【請求項２】
ヒト由来の遺伝子検体のｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内における、下記（１）〜（４）にて表される塩基の別から選ばれる１種又は２種以上を遺伝子多型マーカーとして認められるヘテロ接合性の消失、及び、ｐ５３遺伝子の内部における遺伝子多型マーカーにおけるヘテロ接合性の消失を特定して、ヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法。
（１）ｐ５３遺伝子の下流域約１０Kb〜１６Kbの範囲を表す配列番号１で表される塩基配列の４６９１番目の塩基のアデニンとグアニンとの別、
（２）同４７３１番目の塩基のグアニンとシトシンとの別、
（３）同４９０６番目の塩基のアデニンとグアニンとの別、
（４）同２６４９番目の塩基のアデニンとグアニンとの別。
【請求項３】
前記の遺伝子欠失を検出する方法の（１）〜（４）にて表される塩基の別について、
（１）ｐ５３遺伝子の下流域約１０Kb〜１６Kbの範囲を表す配列番号１で表される塩基配列の４６９１番目の塩基のアデニンとグアニンとの別は、制限酵素ＢｓａＪＩ感受性の有無によって特定され、
（２）同４７３１番目の塩基のグアニンとシトシンとの別は、制限酵素ＭａｅIII 感受性の有無によって特定され、
（３）同４９０６番目の塩基のアデニンとグアニンとの別は、制限酵素ＨａｅIII 感受性の有無によって特定され、
（４）同２６４９番目の塩基のアデニンとグアニンとの別は、制限酵素ＨｇａＩ感受性の有無によって特定される、請求項１又は２に記載のヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法。
【請求項４】
ヒト由来の遺伝子検体が、その個体の正常細胞がｐ５３遺伝子内部における多型マーカーがホモ接合性を示す個体の遺伝子検体である、請求項２又は３に記載のヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法。
【請求項５】
ヘテロ接合性の消失を特定する手段が、平滑末端一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法である、請求項１乃至４のいずれかの請求項記載のヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法。
【請求項６】
ヒト遺伝子検体由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法により検出された遺伝子欠失を癌の存在の指標にする、請求項１乃至５のいずれかの請求項記載のヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子欠失の検出方法に関する技術分野の発明である。より具体的には、有力な癌抑制遺伝子の一つとして知られているｐ５３遺伝子の下流域近傍に認められる遺伝子多型を指標とするヘテロ接合性の消失を単独で、又はｐ５３遺伝子内の遺伝子多型を指標とするヘテロ接合性の消失と組み合わせて用いて特定することにより、遺伝子検体由来細胞における遺伝子欠失、特に癌化にかかわる遺伝子欠失を検出することが可能な検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
多くの癌細胞に認められる異常の一つに遺伝子欠失がある。特定の癌には特定の遺伝子欠失のパターンが存在し、共通して欠失が認められる領域には癌抑制遺伝子の存在が示唆される。
例えば、１７番染色体短腕（１７ｐ）は、各種の癌において最も高頻度に欠失が認められる染色体であり、そこには癌で最も高率に異常が観察される癌抑制遺伝子の一つとして知られているｐ５３遺伝子が存在する。
このｐ５３遺伝子に認められる異常のほとんどが、対立染色体の欠失と残存アレルにおける突然変異である。
【０００３】
ｐ５３遺伝子において高頻度に認められる遺伝子欠失は、遺伝子変異に比べると特定が容易であり、臨床検体を用いた解析に応用が期待されている。
特定染色体領域の遺伝子欠失を特定する解析法として、ＬＯＨ(Loss of heterozygosity-ヘテロ接合性の消失：以下、ＬＯＨとも記載する) 解析が知られている。これは細胞の父方及び母方に由来する、２つのアレルの一方のアレルの欠失を調べるもので、癌細胞の染色体の特定領域の欠失を解析するため行われる。従来より行われてきたＬＯＨ解析法には、多型マーカーを用いたサザンブロット法を用いた方法や，ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いた方法等がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の癌抑制遺伝子ｐ５３内部において、癌の診断等に用いられ得る多型マーカーがすでにいくつか認められており、これらの多型マーカーは現実に癌診断手段として応用されつつある。
しかしながら、これらのｐ５３内部の多型マーカーを用いて、遺伝子欠失を特定可能な検体、すなわち正常細胞においてヘテロ接合性を示す検体は、全検体の６０％程度であり、残りの４０％は正常細胞においてホモ接合性を示し、所望するＬＯＨ解析をすることができない。
【０００５】
そこで、より多くの検体を解析するための別の多型マーカーの開発が急務である。
本発明が解決すべき課題は、ｐ５３遺伝子における遺伝子欠失に直接的に関連する、この遺伝子近傍の領域に存在する遺伝子多型マーカーを見出し、この多型マーカーを用いた、癌等に深く関連する遺伝子欠失の検出手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題の解決に向けて鋭意検討を重ねた。その結果、ｐ５３遺伝子の下流域近傍に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内において、ｐ５３遺伝子の欠失に対応し得る多型マーカーを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明者は本願において、以下の発明を提供する。
【０００７】
まず、ヒト由来の遺伝子検体のｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内における、下記（１）〜（４）にて表される塩基の別から選ばれる１種又は２種以上を遺伝子多型マーカーとして、当該遺伝子マーカーのヘテロ接合性の消失を特定して、ヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法を提供する。
（１）ｐ５３遺伝子の下流域約１０Kb〜１６Kbの範囲を表す配列番号１で表される塩基配列の４６９１番目の塩基のアデニンとグアニンとの別。
（２）同４７３１番目の塩基のグアニンとシトシンとの別。
（３）同４９０６番目の塩基のアデニンとグアニンとの別。
（４）同２６４９番目の塩基のアデニンとグアニンとの別。
【０００８】
さらに、ヒト由来の遺伝子検体のｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内における、上記の（１）〜（４）にて表される塩基の別から選ばれる１種又は２種以上を遺伝子多型マーカーとして認められるヘテロ接合性の消失、及び、ｐ５３遺伝子の内部における遺伝子多型マーカーにおけるヘテロ接合性の消失を特定して、ヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法を提供する。
【０００９】
さらに、ヒト由来の遺伝子検体のｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内における、上記の（１）〜（４）にて表される塩基の別について、
（１）ｐ５３遺伝子の下流域約１０Kb〜１６Kbの範囲を表す配列番号１で表される塩基配列の４６９１番目の塩基のアデニンとグアニンとの別は、制限酵素ＢｓａＪＩ感受性の有無によって特定され、
（２）同４７３１番目の塩基のグアニンとシトシンとの別は、制限酵素ＭａｅIII 感受性の有無によって特定され、
（３）同４９０６番目の塩基のアデニンとグアニンとの別は、制限酵素ＨａｅIII 感受性の有無によって特定され、
（４）同２６４９番目の塩基のアデニンとグアニンとの別は、制限酵素ＨｇａＩ感受性の有無によって特定される、上記のヒト由来細胞における遺伝子欠失を検出する方法を提供する。
【００１０】
さらに、ヒト由来の遺伝子検体が、その個体の正常細胞がｐ５３遺伝子内部における多型マーカーがホモ接合性を示す個体の遺伝子検体である、上記いずれかのヒト由来細胞の遺伝子欠失を検出する方法を提供する。
【００１１】
さらに、ＬＯＨを特定する手段が、平滑末端一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法である、上記いずれかのヒト由来細胞の遺伝子欠失を検出する方法を提供する。
【００１２】
さらに、ヒト由来の遺伝子検体の遺伝子欠失を検出する方法により検出された遺伝子欠失を癌の存在の指標にする、上記いずれかのヒト由来細胞の遺伝子欠失を検出する方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明に関わる遺伝子検体の遺伝子欠失を検出する方法（以下、本発明方法ともいう）において、ＬＯＨを特定する対象となるｐ５３遺伝子は、上述したように、第１７染色体短腕（１７ｐ１３）に存在し、１１のエキソンにより３９３アミノ酸，分子量の５３Ｋのタンパク質をコードしている。様々な癌でこの領域にＬＯＨが認められ、ｐ５３遺伝子が癌抑制遺伝子として関与していることが明らかになっている。この遺伝子は４量体の状態で特定のＤＮＡ配列に結合することにより、種々の遺伝子の発現調節を行っていることが知られている。ｐ５３遺伝子に変異の生じた癌では細胞の異常増殖が起こり、アポトーシスも誘導されず、ＤＮＡ修復も障害されるために新たな癌関連遺伝子の異常が蓄積する可能性が推測されている。
【００１５】
そして、このｐ５３遺伝子には、すでに少なくとも３か所に遺伝子多型が見出されている。
なお、本発明において「遺伝子多型」とは、ヒト染色体における遺伝子多型を意味するものであり、遺伝子が、その塩基配列において個体毎に異なる塩基を有することが多い特異的な部位を保有していることを意味する。平均して数百塩基に１個程度そのような遺伝子多型が存在するといわれており、遺伝子を解析してこの遺伝子多型を特定することにより、父方由来の染色体（アレル）と母方由来の染色体（アレル）とを区別することができる。すなわち、父方と母方由来の遺伝子とが、特定の遺伝子多型部位において異なる塩基を有すること（ヘテロ接合性）を特定することで、両者の遺伝子を分別することができる。
【００１６】
そして、１個体の正常細胞において検出された特定の遺伝子多型に対するヘテロ接合性が、その個体の特定の検体において失われており、その検体において父方由来の遺伝子と母方由来の遺伝子のうち、一方が消失している場合（ホモ接合性として特定される場合）には、その検体において、その特定の遺伝子多型部位を含む遺伝子座が一方のアレルにおいて欠失していること（アレルの消失という）を示すことになる。
【００１７】
従って、この遺伝子多型を利用し、ヘテロ接合体における一方のアレルの消失（ＬＯＨ）を測定すれば、遺伝子の欠失（上の例においては，その検体において癌抑制遺伝子ｐ５３遺伝子が欠失している）を特定することができる。
【００１８】
遺伝子多型は、通常は特定の塩基配列のみを切断する制限酵素に対する感受性（遺伝子多型マーカー，単に多型マーカーともいう）によって特定され得る。すなわち、遺伝子多型となっている特定部位の塩基配列が特定の制限酵素で切断されるか否かで、その特定部位の塩基が特定の塩基に置き変わっているか否かを特定することが可能である。
【００１９】
今のところｐ５３遺伝子において見出され、日本人において比較的ヘテロ接合体である頻度が高く、診断における利用価値が高い遺伝子多型として、▲１▼ｐ５３遺伝子のイントロン１領域における制限酵素ＨａｅIII 感受性の有無，▲２▼ｐ５３遺伝子のエクソン４領域における制限酵素ＢｓｔＵＩ感受性の有無，及び▲３▼ｐ５３遺伝子のイントロン７領域における制限酵素ＡｐａＩ感受性の有無、の３種類が知られている。
【００２０】
前述したように、これらのｐ５３遺伝子内部の多型マーカーを用いて、遺伝子欠失を特定可能な検体、すなわち正常細胞においてこれらの多型マーカーがヘテロ接合性を示す検体は、日本人由来の遺伝子検体の約６０％程度であり、残りの約４０％はホモ接合性を示し、所望するようにＬＯＨ解析をすることができない。
【００２１】
さらに悪いことには、上記以外のｐ５３遺伝子内部の多型マーカーを見出し得たとしても、連鎖してしまい、その新たなｐ５３遺伝子内部の多型マーカーを用いて、所望のヘテロ接合性を見出すことは困難になる。
【００２２】
本発明者は、このｐ５３遺伝子の下流域近傍の特定遺伝子であるNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内に、ｐ５３遺伝子のＬＯＨに直接関連する遺伝子多型を見出した。
【００２３】
このｐ５３遺伝子の近傍であり、かつ、ｐ５３遺伝子のＬＯＨに直接関連する遺伝子多型は、既存のｐ５３遺伝子内の遺伝子多型マーカーと連鎖せず、しかも、これらの遺伝子多型を指標にすることで、独立に特定個体のヘテロ接合性を見出すことができる。
【００２４】
このNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子は、通常はＮａ+ とＫ+ の細胞内濃度を調節する蛋白のサブユニットの一つをコードする遺伝子である（Danielle Malo,Erwin Schurr,Robert Levinson and Philippe Gros(1990)Assignment of Na,K-ATPase β2-subunit Gene(atpb-2) to Mouse Chromosome 11.Genomics 6:697-699）。本遺伝子がヒト１７番染色体短腕に存在することは以前から知られていたが、本発明者らは、このNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子が、ｐ５３遺伝子の下流約１０〜１６kbという極めて近接した位置に存在することを見出した。
【００２５】
本発明方法において、ＬＯＨを特定する指標となる遺伝子多型マーカーは、このNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内に存在する遺伝子多型に対応するが、具体的な遺伝子多型及びこれに対応する遺伝子多型マーカーの態様については、後述する実施例において開示する。
【００２６】
本発明方法においては、ｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内の遺伝子多型マーカーの個体毎のヘテロ接合性をその個体の正常細胞において特定することなしに、所望する検体の遺伝子欠失を検出することができる。
【００２７】
本発明方法において、ＬＯＨの特定の手段として用いる遺伝子多型マーカーに対してヘテロ接合を示す個体の遺伝子検体においては、仮に、癌化等により遺伝子欠失が認められる場合においても、正常細胞と腫瘍細胞が混在するのが常であり、腫瘍細胞が存在しない場合は、その遺伝子検体はヘテロ接合性を示し、しかも双方のアレルに由来するシグナルの比率は正常細胞と同様である。腫瘍細胞が存在する場合には、その腫瘍細胞の正常細胞に対する混在の度合い〔腫瘍細胞混入度（Tumor Cellularity ）：後述する〕に応じて、欠失したアレルに由来するシグナルの減弱が認められる。
【００２８】
本発明方法において、遺伝子多型マーカーのヘテロ接合性を、個体すなわち被験者の正常細胞において特定して、この被験者における遺伝子検体中のヘテロ接合性の消失を特定すること、すなわち、被験者の正常細胞のヘテロ接合性と、例えば、癌診断の対象物となる遺伝子検体における、ＬＯＨを特定することで、癌細胞においてしばしば見られる遺伝子欠失を特定して、癌化等に深く関連する遺伝子欠失の検出を行うことができる〔この場合のヘテロ接合性の特定対象として用いられる被験者の正常細胞としては、生殖細胞以外の正常細胞（特に、末梢血由来の白血球細胞や手術標本の正常組織）が用いられる〕。
【００２９】
また、本発明方法においては、上記のように正常細胞のヘテロ接合性を特定することなしに、遺伝子検体における遺伝子欠失を検出することが可能である。
すなわち、本発明方法において、遺伝子検体におけるヘテロ接合性が保たれている場合には、その遺伝子検体由来細胞において、遺伝子欠失が認めらないことを示しており、逆に全くヘテロ接合性が認められない場合には、遺伝子検体を提供する個体の遺伝子が、特定に用いた遺伝子多型マーカーに対して、元々ホモ接合であることを示し、これら以外の場合には、その遺伝子検体由来細胞において、何らかの遺伝子欠失が認められることを示している。
【００３０】
このように、本発明方法では、遺伝子検体において、▲１▼ヘテロ接合性が保たれているか、▲２▼ヘテロ接合性が全く認められないか、又は▲３▼ヘテロ接合性に減弱変化が認められるかを特定するだけで、遺伝子検体提供者の正常細胞におけるヘテロ接合性を予め特定することなしに、その遺伝子検体由来細胞の遺伝子欠失を検出することが可能であり、この態様の本発明検出方法は、検査が簡便であるという点において優れている。
【００３１】
なお、本発明において、「遺伝子検体」とは、ＬＯＨを検出すべき遺伝子を含み得る全ての対象を意味し、例えば癌化の検出の根拠として本発明方法を用いる場合には、生検の対象となっている組織や細胞、又はこれらから得られる遺伝子本体、あるいは尿，膵液，十二指腸液等の体液から抽出したＤＮＡ等が挙げられる。具体的な遺伝子検体の選択は、その遺伝子欠失の検出の対象に応じて適宜行うことができる。さらに、「遺伝子検体由来細胞」とは、その遺伝子検体が由来する細胞本体を意味するものであり、上記のように、遺伝子検体が細胞を意味する場合には、遺伝子検体と遺伝子検体由来細胞とは同義になる。
【００３２】
ＬＯＨの特定方法としては、通常公知の方法、例えばサザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や，ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧＧＥ(denaturing gradient gel electrophoresis) 法、ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimide modification) 法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism) 法，以下本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社(1993)等を参照のこと〕が、簡便かつ正確にＬＯＨを特定し得るという点においてＳＳＣＰ法を選択することが好ましい。
【００３３】
このＳＳＣＰ法は、標的とする遺伝子多型部位を含む近傍の遺伝子（通常，遺伝子多型部位を含んだ１００〜２００bp程度の範囲の遺伝子領域）を、標識を付したＰＣＲプライマーを用いて増幅して、このＰＣＲ法により得られたＰＣＲ産物（通常は２本鎖ＤＮＡ）を、熱変性等の変性手段により一本鎖に変性して、この一本鎖ＤＮＡを、上記標識を指標として解析する遺伝子解析法である。
【００３４】
ＳＳＣＰ法を、ＬＯＨの解析に応用する場合には、解析する遺伝子多型部位を含む近傍の遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する。そして、これにより得られたＰＣＲ産物を、一本鎖に変性後、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、配列の違いを一本鎖ＤＮＡにおける高次構造の差異による移動度の変化として解析することができる。
【００３５】
この解析は、通常ＰＣＲ産物に付加された標識を指標にするか、若しくは核酸を染色することにより行われる。例えば、予め標識されたＰＣＲプライマーを用いて，ＰＣＲ産物におけるこのプライマー標識を指標にすることも可能であり、得られたＰＣＲ産物に対して事後的に標識を付することも可能である。
【００３６】
これらの標識に用いる標識物質は、遺伝子解析において用いられ得る通常公知の標識から選択して用いることが可能であり、例えば放射性物質，蛍光物質，化学発光物質，ビオチン（酵素標識アビジンで検出する）等を適宜選択することができる。標識方法も、これらの個々の標識物質の種類に応じた標識手段を用いることができる。
【００３７】
例えば、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端を、予めＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTM（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社製）で蛍光標識化したものをＰＣＲプライマーとして用いて、得られたＰＣＲ産物を、AlFred蛍光シーケンサーで解析して、特定の遺伝子多型部位におけるＬＯＨを特定することができる。
また、核酸を染色する場合、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光染色や銀染色法等の染色法を用いることができる。
【００３８】
このような解析の結果、遺伝子検体由来細胞及び／又は正常細胞に由来するＤＮＡのピークやバンドが、両方のアレル由来の数を示す場合には、その個体は、その遺伝子多型において「ヘテロ接合性」であるが、遺伝子検体のＤＮＡ由来のピークやバンドが、２つのアレル由来のシグナル強度のバランスが崩れた場合、ヘテロ接合性の消失とみなし、ＬＯＨと判定する。
【００３９】
なお、このＳＳＣＰ法において、ＰＣＲ法によって得られるＰＣＲ産物を平滑末端化することにより、このＳＳＣＰ法によるＬＯＨの特定感度を一層向上させることが可能である。
【００４０】
すなわち、通常ＰＣＲ産物は２本鎖ＤＮＡ断片として得られるが、使用するTaq ＤＮＡポリメラーゼの性質により、ＤＮＡの末端に余分な塩基が付加される傾向があり、付加されたＤＮＡ断片と付加されなかったＤＮＡ断片とで、ＤＮＡ鎖長が不均一となっている場合が多い。ゆえに、このＰＣＲ産物を一本鎖に変性後解析しても、ＤＮＡ断片に由来する検出ピークは分裂し、多重となってしまう傾向が強く、ＬＯＨの検出感度を低下させることになる。
【００４１】
この通常のＳＳＣＰ法の欠点を克服するために、予め得られたＰＣＲ産物を平滑末端化した後に、これを解析すると検出ピークは単一化し、遺伝子変異を起こしたＤＮＡ断片の識別感度を著しく向上させることができる。
【００４２】
この平滑末端化を行う手段としては、例えばKlenowフラグメントやＴ４ＤＮＡポリメラーゼのような、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し，かつ一本鎖部分を修復し得る酵素で、ＰＣＲ産物を処理することも可能であり、二本鎖ＤＮＡ末端を平滑末端化する制限酵素でＰＣＲ産物を処理して一本鎖部分を含む末端部を取り除くことも可能である。
【００４３】
かかる平滑末端化工程を含むＳＳＣＰ法を、平滑末端一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（Ｂｌｕｎｔ  Ｅｎｄ−ＳＳＣＰ法）という。
本発明方法によれば、上記したｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内の遺伝子多型マーカーにより、被験者の遺伝子検体におけるＬＯＨを特定することが可能であり、その遺伝子検体由来細胞における遺伝子欠失、例えば、大腸癌，膵臓癌，膀胱癌等の各種の癌の検出や、癌化傾向の検出等に利用することができる。
【００４４】
また、このNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内の遺伝子多型マーカーと、ｐ５３遺伝子内部の遺伝子多型マーカーを組み合わせることにより、一層、遺伝子多型を利用して，その遺伝子検体由来細胞において、癌化等に深く関連する遺伝子欠失を検出し得る、ヘテロ接合である被験者の率をさらに向上させることができる。
【００４５】
すなわち、たとえｐ５３遺伝子内部の遺伝子多型において、被験者の遺伝子検体が「ホモ接合性」を示しても、ｐ５３遺伝子の下流域に存在するNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内の遺伝子多型において「ヘテロ接合性」を示す場合は、この遺伝子検体に、ｐ５３遺伝子外の遺伝子多型におけるＬＯＨが認められ、ｐ５３遺伝子の欠失を間接的に特定することが可能であることにより、遺伝子検体由来細胞において、癌化等に深く関連する遺伝子欠失を検出し得る被験者の率をさらに向上させることができる。
【００４６】
いいかえれば、ｐ５３遺伝子内部又はNa/K-ATPase beta2 subunit 遺伝子内に存在する、好ましくはお互いに重複しない複数個の遺伝子多型について、それぞれＬＯＨを特定して，その特定結果を組み合わせることにより、遺伝子検体由来細胞における遺伝子欠失を検出することができる。つまり、それぞれの遺伝子多型のうち、いずれか一つが「ヘテロ接合性」を示せば、仮に他がホモ接合性を示しても、癌化等の遺伝子欠失について、「陽性」と判断し得る症例をさらに向上させることが可能である。
【００４７】
なお、従来は、遺伝子中の遺伝子多型マーカーを見出す方法として、いわば虱潰しにヒト遺伝子の制限酵素に対する感受性の有無を比較することにより、遺伝子多型マーカーを見出す方法や、多型が認められる反復配列を探索する方法等が採られていた。
【００４８】
しかしながら、前者の方法では、制限部位が存在する領域における遺伝子多型のみしか検出することが困難である、という問題がある。そして、後者の方法では、多型が認められる反復配列が認められる頻度が１塩基置換の多型ほど多くはなく、所望するＬＯＨを的確に検出可能な反復配列の多型を見出すことが相対的に困難である、という問題が認められるだけではなく、遺伝子の増幅操作の際に、反復数の異なるＰＣＲ産物が生じ、これがＬＯＨの検出の際のノイズになり、検出感度が低くなりがちである、という点においても問題を有する。
【００４９】
そこで、本発明者は、遺伝子多型マーカーを検索する際に、複数の遺伝子検体に由来する、特定領域のＤＮＡの塩基配列を直接検討することにより、飛躍的に簡便、かつ、的確に遺伝子多型マーカーを検出することが可能であることを見出した。
【００５０】
すなわち、本発明者は、特定の遺伝子領域を増幅した、複数の遺伝子検体に由来するＤＮＡ断片の混合物において、同一箇所が異なる塩基により規定される部位を選んで、この部位を遺伝子多型マーカーとする、遺伝子多型マーカーの検出方法を提供する。
【００５１】
特定の遺伝子領域の増幅法は、ＰＣＲ法に代表される通常公知の増幅法を任意に選択することが可能であるが、LongＰＣＲ法(Barnes,W.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,pp2216-2220(1994))を選択して、増幅用プライマーに挟まれた遺伝子領域を増幅することで、ＰＣＲの操作の回数を減少させることが可能であり、好ましい。増幅用プライマーは、遺伝子多型を検出する既知の配列から、その塩基配列を選択することが可能である。
【００５２】
この試験に供する遺伝子検体数は、遺伝子多型マーカーが顕在化するのに十分な遺伝子検体数を確保することが好ましい。
かかる遺伝子増幅法により増幅された、複数の遺伝子検体に由来する遺伝子増幅物において、この遺伝子増幅物の塩基配列の検討により、同一箇所が異なる塩基により規定される部位（例えば、遺伝子増幅物のｎ番目の塩基が、Ａによっても、Ｇによっても規定される部位）を遺伝子多型マーカーとして検出することが可能である。
【００５３】
ここで遺伝子増幅物の塩基配列の検討をするために用いられる、遺伝子の塩基配列の決定法は、通常公知の塩基配列決定法を用いることができる。
例えば、マキサム−ギルバート法(Maxam,A.M.,and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560(1977))，ゲノミック・シークエンス法(Church,G.M. and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,1991(1984))，マルチプレックス法(Church,G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Science,240,185(1988))，サイクルシークエンス法(Murray,V.,Nucleic Acids Res.,17,8889(1989))．ジデオキシ法(Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977))等を用いて、所望する領域の遺伝子増幅産物の塩基配列を決定して、これから得られる塩基配列の情報により、遺伝子多型マーカーを検出することができる。
【００５４】
また、これらの原理を応用した、市販の塩基配列自動解析装置や、塩基配列決定用キットを用いて、所望する領域の遺伝子増幅産物の塩基配列を決定することも可能である。
【００５５】
この遺伝子多型マーカーの検出法を、本発明者は、ＳＨＩＰＳ（Sequencing Highly Informative Polymorphic Site）法と名付け、後述する実施例においても利用した検出法である。
【００５６】
このＳＨＩＰＳ法には、▲１▼特定領域の遺伝子多型の有無及びその塩基配列までを含めて、詳細に検索することができること、▲２▼LongＰＣＲ法と組み合わせることにより、ＰＣＲを行う回数を減らすことが可能であることと、シーケンスプライマーを連続して使用することができるために、効率的な遺伝子の検索が可能であること、▲３▼多型と塩基配列を、直接確認することが可能であり、制限酵素切断部位等の情報が直ちに得られること、▲４▼重複する塩基の濃淡で、多型性の頻度をある程度推測することが可能であり、また、多型の頻度が高いほど容易に検出することが可能である、等の利点が挙げられる。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてさらに具体的に説明するが、これらの実施例が本発明の技術的範囲を限定するものではない。
１．atpb2 遺伝子の同定とｐ５３遺伝子との距離の測定
ｐ５３遺伝子近傍のゲノムＤＮＡを得るため、コスミドベクターを用いたヒトゲノムライブラリーよりスクリーニングされた、ｐ５３遺伝子を含むクローンを解析した。その結果、同クローンのヒトゲノムインサートの一方の側にはｐ５３遺伝子が、他方の側はｃＤＮＡ塩基配列既知のatpb2 遺伝子が存在していた。そして、塩基配列の情報から、ｐ５３遺伝子とatpb2 遺伝子は、ゲノム上で、互いに３’末端が向き合う方向で存在していることが判明した。
【００５８】
なお、このatpb2 遺伝子は、前述したように、Ｎａ+ とＫ+ の細胞内濃度を調節する蛋白のサブユニットの一つ（Ｎａ+ ／Ｋ+ ＡＴＰase beta2 subunit ）の遺伝子である（J.Biol.Chem.15;264:4613-4618,1989 ）。atpb2 遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列〔(Julio Avila et al.,Gene,208,pp221-227(1998)）において報告されている〕を確実に把握することは、目的の遺伝子多型マーカーを検索するのに必須となるため、翻訳領域を含む５４９０塩基を独自に配列決定し（第１図，配列番号１：第１図において、「Ｅｘ」で表されている７遺伝子領域は、それぞれ、atpb2 遺伝子におけるエクソンである）、その遺伝子構造を明らかにした（第２図：第１図において示したエクソン領域と、それ以外のイントロン領域を模式化した図面である）。
【００５８】
ｐ５３遺伝子とatpb2 遺伝子の間の距離は、コスミドベクターに挿入することが可能な最大サイズ（約４０Kb）以下であるが、より正確な距離を求めることを目的として、LongＰＣＲを行った。
【００５９】
すなわち、ｐ５３遺伝子の３’末端と、atpb2 遺伝子の３’末端に、プライマー〔ｐ５３遺伝子側：５’ＧＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧ（配列番号２）、atpb2 遺伝子側：５’ＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＡＡＣ（配列番号３）を設定し、コスミドクローン及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、LongＰＣＲで、遺伝子を増幅させたところ、上記の両遺伝子間の距離は、約１０．５Kbと判明した（第３図：第３図において、ｐ５３領域とatpb2 領域の間に挿入されている、LongＰＣＲ領域が、この約１０．５Kbに相当する領域である。この距離は、第３図に示した電気泳動図により、明らかになった）。
【００６０】
なお、これらの遺伝子の塩基配列の決定には、Amersham社のThermo Sequenase Cycle Sequenceing KITと33Ｐ−Labeled Primerを用いて行った。また、LongＰＣＲについては、Clone Tech社のAdvantage Genomic ＰＣＲ  ＫＩＴを用いた。
【００６１】
２．ＳＨＩＰＳ法によるatpb2 遺伝子内の多型マーカーの検索
前述のように、高頻度に多型性を示す遺伝子多型マーカーを検索するために、本発明者らは、ＳＨＩＰＳ法と名付けた遺伝子解析法を確立した。この遺伝子解析法は、複数人のＤＮＡを混和して、塩基配列が既知の領域について、LongＰＣＲ−直接塩基配列決定を行うもので、遺伝子多型の存在する領域では、その多型頻度に応じた濃度で、塩基の重複が生じることを利用して、遺伝子多型マーカーを特定する、遺伝子解析法である。
【００６２】
atpb2 遺伝子における遺伝子多型の検索に、ＳＨＩＰＳ法を適用するに当たっては、日本人１３人の末梢血液由来のゲノムＤＮＡを混合した試料に対し、上記１．により得られた、atpb2 遺伝子のゲノム塩基配列情報を基にして、ＳＨＩＰＳを行った。
【００６３】
本実施例において、ＳＨＩＰＳ法を行うに際しては、バンドのシグナルを、均一、かつシャープに出すことを目的として、33Ｐで標識されたdideoxy nucleotideを用いるThermo Sequenase Radiolabelled Terminator Cycle Sequencing Kit（Amershanm 社製）を用いた。多型マーカーが認められたＰＣＲ産物のプライマーの塩基配列は、Forward が、５’ＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＴＴＣＧＣ（配列番号４）であり、Reverse が、５’ＴＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＴＴＣＣ（配列番号５）である。また、塩基配列決定用プライマーも、これらのプライマーを用いた。
【００６４】
前者（Forward ）の塩基配列決定用プライマーで、制限酵素ＢｓａＪＩにより認識される遺伝子多型〔第１図及び第４図（第４図の電気泳動像において、コスミドＤＮＡにおいては一通りのバンドしか認められないが、混合ＤＮＡにおいては２通りのバンドが認められる、電気泳動像の白丸で示した箇所が多型部位である。第５図において同様である）：エキソン７の５’末端から下流へ４１４塩基目、すなわち、配列番号１に示すatpb2 遺伝子の塩基配列の４６９１塩基目のアデニンとグアニンとの別〕が、後者（Reverse ）の塩基配列決定用プライマーで、制限酵素ＨａｅIII により認識される遺伝子多型（第１図及び第５図：エキソン７の５’末端から下流に６２９塩基目、すなわち、配列番号１に示すatpb2 遺伝子の塩基配列の４９０６塩基目のアデニンとグアニンとの別）が見出された。
【００６５】
また、この塩基配列の確認作業中に、低頻度ながら、多型性を示す制限酵素ＭａｅIII より認識される遺伝子多型が見出された（第１図及び第６図：エキソン７の５’末端から下流へ４５４塩基目、すなわち、配列番号１に示すatpb2 遺伝子の塩基配列の４７３１塩基目のグアニンとシトシンとの別）。
【００６６】
このように、ＳＨＩＰＳ法（複数人のＤＮＡを混和して、塩基配列が既知の領域について、LongＰＣＲ−直接塩基配列決定を行う方法）は、目的領域内に存在するヘテロ接合性の頻度が高い、遺伝子多型マーカーの検索に有効であることが確認された。
【００６７】
３．ゲノムＤＮＡの抽出
末梢血液ＤＮＡの抽出、及びＬＯＨ解析用の癌組織と正常組織のＤＮＡの抽出は、これらの出発物を、プロテアーゼＫで消化後、フェノールクロロホルム抽出を行う、デイビスら(Basic Method in Molecular Biology, Elsevir Science Publishing社出版）や菅野ら（Lav.Invest.68,361,1993) の方法で行った。
【００６８】
４．ＰＣＲ
抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型）を、０．２５μg ／２５μL 、Forward 及びReverse のオリゴヌクレオチドプライマーを、各０．５μM 、各ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を２００μM 、Tris-HCl緩衝液(pH8.3) を１０mM、ＫＣｌを５０mM、ＭｇＣｌ2 を１．５mM、ＴａｑＤＮＡpolymerase(Perkin-Elmer 社) を０．６２５units/２５μL となるように、反応液を調製し、以下の条件でＰＣＲを行った。
最初の変性条件は、９４℃で５分間、その後の反応は９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを４０回繰り返し、最後は７２℃で７分間の反応を行った。
【００６９】
５．Blunt-End ＳＳＣＰ
通常のＰＣＲでは、ＰＣＲの産物の３’末端に、１塩基余計なアデニンがつくものとつかないものとの混合物になっている。そのため、これを、そのままＳＳＣＰ法にかけると、１種類の塩基配列しかないのに、あたかも２種類存在しているように見えたり、バンド（蛍光シーケンサーを用いた場合にはピーク）の鋭敏性が低下したりする。そのため、３’側の余分な塩基を、Klenow fragment で除去することにより、ＰＣＲ産物を平滑化した上で、ＳＳＣＰを行うと、明瞭なバンド（ピーク）が得られ、変異又は多型の検出が容易になる（Blunt-End ＳＳＣＰ法）。
【００７０】
具体的には、前記４．において得られたＰＣＲ産物５μL に、０．５units のKlenow fragment を加え、３７℃で３０分間処理した後、ＳＳＣＰ解析を行った。
ＳＳＣＰ解析は、Klenow fragment 処理したＰＣＲ産物（１μL ）を、１０μL のＳＳＣＰ用ローディング液に加えて、８０℃で５分間加熱変性後、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行った。
【００７１】
ローディング液の組成は、２０mM  ＥＤＴＡ、０．０５％  ブロムフェノールブルー及び９０％  ホルムアミドである。ポリアクリルアミドゲルは、トリスグリシン緩衝液（２５mMトリス．１９２mMグリシン）を含む、１０％アクリルアミド（ビスアクリルアミド：アクリルアミド＝１：３０）ゲルを用いた。電気泳動は、１８℃，２００Ｖ定電圧で、６時間行った。バンドの検出は、第一化学薬品の「２Ｄ−銀染色試薬・II」で行った。
【００７２】
前記２．の項で決定した、ゲノムＤＮＡの塩基配列情報を基に、atpb2 遺伝子のエキソン４を、プライマー〔Forward ：５’−ＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＧ（配列番号６）、Reverse ：５’−ＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡ（配列番号７）〕を用いて、ＰＣＲによる遺伝子増幅後、Blunt-End ＳＳＣＰを行ったところ、新たに、制限酵素ＨｇａＩに関する多型マーカーの存在が認められた（第１図，第７図及び第８図：エキソン４の５’末端から５０塩基目、すなわち、配列番号１に示すatpb2 遺伝子の塩基配列の２６４９塩基目のアデニンとグアニンとの別）。
【００７３】
６．ヘテロ接合性の頻度の測定
各々の遺伝子多型マーカーのヘテロ接合性の頻度を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により検討した。使用したプライマー配列を以下に示す。
▲１▼ＢｓａＪＩとＭａｅIII マーカー：
Forward ：５’−ＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＡＣＣＴＣＡＧ（配列番号８）
Reverse ：５’−ＡＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＴ（配列番号９）
【００７４】
▲２▼ＨａｅIII マーカー：
Forward ：５’−ＴＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧ（配列番号１０）
Reverse ：５’−ＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号１１）
【００７５】
▲３▼ＨｇａＩマーカー：５．において用いたプライマーと同じプライマー
各々のＰＣＲ産物は、それぞれのマーカーに対応した制限酵素で切断し、切断されたアレルを「＋アレル」、切断されなかったアレルを「−アレル」とした（第１表，第２表−ａ，第２表−ｂ）。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
【表２】
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【００７８】
【表３】
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【００７９】
観察されたヘテロ接合体の頻度は、ＨａｅIII が０．４６（ｎ＝１９６アレル）、ＭａｅIII が０．０２（ｎ＝２０２アレル）、ＢｓａＪＩが０．４４（ｎ＝１９８アレル）及びＨｇａＩが０．４６（ｎ＝１８６アレル）であった（第１表）。
【００８０】
ヘテロ接合性の頻度が高い、ＨａｅIII ，ＢｓａＪＩ及びＨｇａＩマーカーにいて、ｐ５３遺伝子内部の３種の多型マーカーのいずれか１種類以上がヘテロ接合性を示す症例（第２表−ａ）と、すべてがホモ接合性を示す症例（第２表−ｂ）とに分類して検討した。
【００８１】
ｐ５３遺伝子内部の多型マーカーが、ヘテロ接合性を示す、日本人の集団において観察されたヘテロ接合性の頻度は、ＨａｅIII が０．５７（ｎ＝９８アレル），ＢｓａＪＩが０．５４（ｎ＝１００アレル），ＨｇａＩが０．５２（ｎ＝９６アレル）であるのに対して、ｐ５３遺伝子内の多型マーカーが、ホモ接合性を示す日本人集団において、観察されたヘテロ接合性の頻度は、ＨａｅIII が０．３５（ｎ＝９８アレル），ＢｓａＪＩが０．３５（ｎ＝９８アレル），ＨｇａＩが０．４０（ｎ＝９０アレル）であり、ｐ５３遺伝子の内部のマーカーとは、連鎖が認められないことが判明した。
【００８２】
これらの事実から、atpb2 遺伝子内の多型マーカーは、ｐ５３遺伝子領域のＬＯＨ解析を行うにあたって、ｐ５３遺伝子内の多型マーカーと併用することで、これまで、ｐ５３遺伝子内部の多型マーカーがホモ接合であったために、ＬＯＨ解析が不可能であった症例に対しても、ＬＯＨ解析を行うことが可能になることが、明らかになった。
【００８３】
７．ＬＯＨ解析
正常組織と、大腸癌組織由来のゲノムＤＮＡを対象に、atpb2 遺伝子多型マーカーのBlunt-End ＳＳＣＰにより、ＬＯＨ解析を行った（プライマーは、前記５．と同じものを使用した）。銀染色後に、スキャナーで画像を取込み、Kodak 社の１ＤAnalysisソフトウエアでシグナル強度を解析した。
【００８４】
ｐ５３遺伝子領域に、ＬＯＨが認められる、大腸癌患者の大腸癌組織検体５例を、atpb2 遺伝子のエキソン４内の、ＨｇａＩ多型マーカーについて解析したところ、５例とも、この多型マーカーにおけるＬＯＨが認められた〔第９図：第９図において、横軸の１〜５の数字は遺伝子検体（大腸癌患者）番号であり、Ｎは、その患者の大腸癌の回りの正常組織を表し、Ｔは、その患者の大腸癌の組織（正常組織と癌組織が混在している）である。また、縦軸の数字は、銀染色した場合の２つのアレルのシグナル強度比について、正常組織を１とした場合の残存アレルの比率を示し、これが１を割る場合には、遺伝子検体内に、多型マーカーのヘテロ接合性が消失した細胞核が存在することを示すものである（ヘテロ接合性が消失している細胞が１００％の場合には、０になるが、前述のように、癌組織には、正常の組織も混在しているので、完全に０にはなり難い）。
【００８５】
これにより、ｐ５３遺伝子による多型マーカーで、ＬＯＨが認められた遺伝子検体においては、その近傍にあるatpb2 遺伝子における多型マーカーにおいても、同様にＬＯＨが認められ、atpb2 遺伝子上の本発明に係わる多型マーカーは、腫瘍マーカーとして極めて有用であることが明らかになった。
【００８６】
８．腫瘍細胞の混入度とヘテロ接合性の消失との相関の解析
ALFred蛍光自動シーケンサーを使用して、遺伝子検体のＤＮＡに含まれるatpb2 遺伝子の欠如したＤＮＡの含まれる割合を、腫瘍細胞の混入度（Tumor Cellularity ）として定量的に測定をすることが可能か否かについて検討した。
【００８７】
すなわち、前述したBlunt-End ＳＳＣＰ法を用い、atpb2 遺伝子のエキソン４の多型部位を対象として、Cy-5ラベルの蛍光プライマーと、ALFred蛍光自動シーケンサー（ファルマシア社製）により、ＬＯＨを検出した。
【００８８】
なお、ここで用いたプライマーの塩基配列は、
センス側：５’−ＡＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡ（配列番号１２）
アンチセンス側：５’−ＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＴＧ（配列番号１３）
であり、センス側プライマーの５’末端が、Cy-5で標識されている。
【００８９】
同じ多型部位においてヘテロ接合性を示す、正常細胞由来のＤＮＡに対して、Ａ２ allele がホモ接合性を示す、末梢血リンパ球由来のＤＮＡをatpb2 遺伝子が欠失した腫瘍細胞のＤＮＡと仮定して、この腫瘍細胞ＤＮＡの混入度が１０％ずつ増加するような遺伝子検体を、段階的に調製した（第１０図参照：それぞれの曲線が各々の検体のヘテロ接合性を示す）。
【００９０】
そして、Ｘ軸に腫瘍細胞の混入度、Ｙ軸にＡ１アレルとＡ２アレルの比（Ａ１／Ａ２比）をとると、Ａ１／Ａ２比には、腫瘍細胞の混入度の増加に対して負の相関関係が認められた（第１１図）。
この結果により、本発明方法によって、遺伝子欠失が認められる腫瘍細胞の比率を定量的に解析可能であることが判明した。
【００９１】
【発明の効果】
本発明により、有力な癌抑制遺伝子の一つとして知られているｐ５３遺伝子の下流域近傍に認められる遺伝子多型を指標とするヘテロ接合性の変化を単独で、又はｐ５３遺伝子内の遺伝子多型を指標とするヘテロ接合性の変化と組み合わせて用いて検出することにより、特に癌の存在の有無を突き止めることが可能な検出方法が提供される。
【００９２】
【配列表】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】atpb2 遺伝子の塩基配列と共に、遺伝子多型部位、エキソン領域、開始コドン及び終止コドンを示した図面である。
【図２】atpb2 遺伝子の構成と遺伝子多型部位を示した図面である。
【図３】ｐ５３遺伝子とatpb2 遺伝子領域の遺伝子多型部位と制限酵素部位、そしてその間をLongＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図と、これらに関する制限酵素地図を、それぞれ関連付けて示した図面である。
【図４】atpb2 遺伝子における制限酵素ＢｓａＪＩにより認識される遺伝子多型を、ＳＨＩＰＳ法により解析した図面である。
【図５】atpb2 遺伝子における制限酵素ＨａｅIII により認識される遺伝子多型を、ＳＨＩＰＳ法により解析した図面である。
【図６】atpb2 遺伝子における制限酵素ＭａｅIII により認識される遺伝子多型を、ＳＨＩＰＳ法により解析した図面である。
【図７】atpb2 遺伝子のエキソン４内の制限酵素ＨｇａＩ遺伝子多型多型マーカーについて、ホモ接合性の遺伝子検体と、ヘテロ接合性の遺伝子検体において、Blunt-End ＳＳＣＰ解析を行った結果を示す図面である。
【図８】atpb2 遺伝子のエキソン４内の制限酵素ＨｇａＩ多型マーカー部位周辺の塩基配列（ＨｇａＩ＋とＨｇａＩ−）を示す図面である。
【図９】ｐ５３遺伝子領域に、ＬＯＨが認められる遺伝子検体を、atpb2 遺伝子のエキソン４内の、ＨｇａＩ多型マーカーについて、ＬＯＨ解析した結果を示す図面である。
【図１０】腫瘍細胞混入度を段階的に調製した遺伝子検体におけるヘテロ接合性を検討した結果を示す図面である。
【図１１】腫瘍細胞の混入度と、両方アレルの比の関係を検討した結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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