(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相抗体に対してアレルゲンを反応させ、生成した抗原抗体複合体に酵素で標識した抗体を反応させ、前記酵素に反応する基質を加えて生じた酵素反応生成物を検出する酵素免疫測定法において、
前記固相抗体とアレルゲンとの反応および前記抗原抗体複合体と酵素標識抗体との反応における各反応温度を２３℃以下とし、かつ各反応時間を６時間以上としたことを特徴とする高感度酵素免疫測定法。
【請求項２】
測定対象のアレルゲンが、１０ｎｇ／ｍｌ以下の低濃度のアレルゲンである請求項１に記載の高感度酵素免疫測定法。
【請求項３】
測定対象のアレルゲンが、０．１〜５ｎｇ／ｍｌの低濃度のアレルゲンである請求項１に記載の高感度酵素免疫測定法。
【請求項４】
固相抗体とアレルゲンとの反応および前記抗原抗体複合体と酵素標識抗体との反応における各反応温度を２〜１０℃とし、かつ各反応時間を１２時間以上とした請求項１〜３のいずれかに記載の高感度酵素免疫測定法。
【請求項５】
検出される酵素反応生成物の測定値の変動係数が１０以下であり、かつ理論値より算出される酵素反応生成物の回収率が８０〜１１０％である請求項１〜４のいずれかに記載の高感度酵素免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、高感度酵素免疫測定法に関し、詳しくは測定対象抗原がアレルゲンであるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による高感度酵素免疫測定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法のうち、酵素標識を特徴とする酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）は、放射性同位体元素を用いている放射免疫測定法（ＲＩＡ法）に比べて廉価で危険な廃棄物を伴わず、測定の感度と精度の面でも遜色のないことが知られている。
【０００３】
また、ＥＩＡ法のうち固相を用いる場合はＥＬＩＳＡ法（Enzyme−Linked  Immunosorbent  Assay）と称されるが、その中には競合法やサンドイッチ法などの改良された測定方法がある。
【０００４】
標識酵素を用いた酵素免疫測定法において、細菌などの微生物の定量について測定精度及び測定感度を向上させると共に反応時間を短縮させて迅速な測定を行ない、さらに安定した測定を行うことができるようにする固相抗体と測定対象との反応温度として１１〜３０℃の条件を採用し、さらに標識酵素を加えて反応させる温度条件を１１〜２２℃にすることが知られている（特許文献１、特許文献２）。
このような菌類などの微生物については、１．０×１０4個／ｍｌ程度以上の検出ができればよいと考えられ、それより低濃度の定量測定が要求されることはないものと考えられる。
【０００５】
また、免疫測定法の高感度化を進めるためには、固相抗体と測定対象物質の反応条件を数時間とし、測定対象物質と酵素標識抗体との反応条件を長時間とした方がよいとの記載がある（非特許文献１）。
【０００６】
実際にアレルゲンを測定する際に求められる測定精度は、厚生労働省のガイドラインや文部科学省の学校衛生基準によると、ダニ数１００匹／ｍ２以下またはこれと同等のアレルゲン量以下が衛生的基準値であり、ダニ１００匹に相当するアレルゲン量は１０μｇであるから、比較的高感度で正確な定量が求められている。
【０００７】
このようにアレルゲンを測定する免疫測定法においては、測定対象域１ｍ２の塵埃中のダニ数１００匹以下のアレルゲンを正確に定量できる精度が求められるが、通常、その程度のアレルゲンの測定について従来の測定方法においても支障は少ない。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−３０７０３０号公報
【特許文献２】特開平５−３０７０３６号公報
【０００９】
【非特許文献１】石川栄治著、「超高感度免疫測定法」、１９９４年、学会出版センター発行（第１２９頁等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、アレルゲン除去剤、アレルゲン除去方法またはアレルゲン低減化剤の研究開発を行う上では、その効力評価や効力比較などを行なう場合に、前記の衛生的基準値よりも相当に小さなスケールで精密に検討を要する必要があり、また１ｍ２を確保できない対象区域についても極微量のアレルゲンを測定する方法や手段についても確立されていないという問題点がある。
【００１１】
また、抗原と抗体の濃度が低い条件では、免疫測定ができるまで反応が起こるには長時間を要するが、できるだけ早く反応を起こさせるには温度条件はできるだけ高温にすることが常識であるが、それでは定量の正確性は損なわれてしまう。
【００１２】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、高感度酵素免疫測定法としてアレルゲンを測定対象抗原としてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用する場合、可及的に低濃度の抗原に対しても測定できるようにし、しかも正確に定量できる高感度酵素免疫測定法とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、この発明においては、固相抗体に対してアレルゲンを反応させ、生成した抗原抗体複合体に酵素で標識した抗体を反応させ、前記酵素に反応する基質を加えて生じた酵素反応生成物を検出する酵素免疫測定法において、前記固相抗体に対するアレルゲンの反応条件と、前記抗原抗体複合体に対する酵素標識抗体の反応条件における各反応温度を２３℃以下とし、かつ各反応時間を６時間以上としたことを特徴とする高感度酵素免疫測定法としたのである。
【００１４】
上記したように構成されるこの発明の高感度酵素免疫測定法は、後述の試験結果からも明らかなように、固相抗体に対するアレルゲンの反応条件と、前記抗原抗体複合体に対する酵素標識抗体の反応条件における各反応温度を２３℃以下の低温に調整し、かつ各反応時間を６時間以上の長時間に設定することにより、従来の２３℃を超えるような比較的高温で１〜３時間という短時間の反応では検出が困難であった１０ｎｇ／ｍｌ以下のような低濃度のアレルゲンに対しても検出が可能であると共に、正確に定量することができる高感度酵素免疫測定法になる。
【００１５】
測定対象のアレルゲンは、特にその種類を限定されることがなく、また測定対象の濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍｌ以下の低濃度、さらには０．１〜５ｎｇ／ｍｌの低濃度アレルゲンを測定可能であり、かつそのような範囲より高濃度でも問題なく測定可能である。
【００１６】
また酵素反応生成物が、発色性または発光性の酵素反応生成物であれば、吸光度や発光強度を測定して抗原量を定量することができる。
【００１７】
また、固相抗体に対するアレルゲンの反応条件、および抗原抗体複合体に対する酵素標識抗体の反応条件は２〜１０℃であり、かつ１２時間以上であることが、吸光度の測定結果の変動係数を１０以下とし、かつ理論値より算出される回収率を８０〜１１０％の範囲にし、正確な定量結果を得るために好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
この発明は、酵素免疫測定法における固相抗体に対するアレルゲンの反応条件と、前記抗原抗体複合体に対する酵素標識抗体の反応条件における各反応温度を２３℃以下とし、かつ各反応時間を６時間以上としたことにより、１０ｎｇ／ｍｌ以下という可及的低濃度の抗原に対しても、これを正確に定量することが可能になり、特に変動係数１０以下、理論値より算出される回収率を８０〜１１０％の範囲という正確な定量ができる酵素免疫測定法であるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
この発明の高感度酵素免疫測定法は、一般的にサンドイッチＥＬＩＳＡ法と称される測定法を改良した方法であり、抗原の一種である蛋白質のアレルゲンと特異的に反応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を担体に固定して固相とし、このような固相抗体と、  これに特異的に反応する抗原とが反応することにより抗原抗体複合体を形成させる。このように固相抗体と抗原であるアレルゲンとの反応を以下に一次反応と称する。
【００２０】
さらにこの抗原抗体複合体に対して、抗原と特異的に反応し、かつ酵素を結合させた抗体、好ましくは抗原と特異的に反応し、かつ酵素を結合させたモノクローナル抗体（以下、酵素標識抗体とする。）を反応させ、抗原に固相抗体と酵素標識抗体が結合させた抗原抗体複合体を形成させる。このように抗原抗体複合体と酵素標識抗体との反応を以下に二次反応と称する。
【００２１】
そして、酵素に反応する基質を加えて生じた酵素反応生成物を検出し、例えば酵素の発色基質を反応させて発色させ、この発色の吸光度を測定して抗原量の定量を正確に行う測定方法である。
【００２２】
この発明の高感度酵素免疫測定法は、通常の酵素免疫測定と同様に実施することができる。例えば、担体としてマイクロウェルプレートなどを用い、これに被検体に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板を用いることができ、通常、反応のために振とうする必要はない。
【００２３】
この発明におけるアレルゲンは、抗体と反応してアレルギー症状を引き起こす物質（抗原）そのものを指すが、その抗原を含んだ物質であってもよく、また測定対象のアレルゲンの種類は、特に限定されない。このようなアレルゲンの具体例としては、ダニ、植物の花粉、動物（皮塵、昆虫など）、食品、微生物（カビその他の真菌など）その他周知のアレルゲンが挙げられる。一般的に、室内環境でのアレルゲン量は、ダニアレルゲン量を基準に判断されている。
【００２４】
固相抗体と測定対象物質中の抗原の反応、測定対象物質中の抗原と酵素標識抗体の反応における両反応条件は、２３℃以下好ましくは２０℃以下の温度条件に調整され、かつ６時間以上好ましくは１２時間以上の反応時間に設定する。
【００２５】
この反応条件によって、抗原濃度が数ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１０ｎｇ／ｍｌ以下の濃度の抗原液であっても実測値から算出した変動係数が１０以下となり、かつ理論値と実測値から算出した回収率が８０％以上１１０％以下の正確な測定結果を得ることができる。
【００２６】
この発明の高感度酵素免疫測定法においてより正確な定量を行なうためには、固相抗体とアレルゲンとの反応、および前記抗原抗体複合体と酵素標識抗体との反応における各反応の温度を２〜１０℃とし、かつ反応時間を１２時間以上とすることが好ましい。
【実施例】
【００２７】
［実施例１〜２４、比較例１〜４８］
精製ダニ抗原Ｄｅｒｆ２（アサヒビール社製）をリン酸緩衝液にて既知濃度の抗原液を調製した。この既知濃度の抗原液について、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により抗原量の測定を行なった。
【００２８】
なお、上記のリン酸緩衝液は、ｐＨ７．３のものであり、０．１重量％ウシ血清アルブミン及び０．０５重量％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有するものである。以下に同じ組成のリン酸緩衝液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）と記す。
【００２９】
まず、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体（アサヒビール社製）をプレート（Ｆ１６ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＮＯ  ＭＯＤＵＬＥプレート：ＮＵＮＣ社製）に１ウェルあたり１００μｌずつ添加して４℃で１日以上静置してプレートに固相化させた。
【００３０】
固相化させた後のウェル中の液を捨て、ブロッキング試薬である１重量％ウシ血清アルブミンとリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を１ウェルあたり２００μｌずつ添加し、３７℃、６０分間反応させた。この反応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にてプレートを洗浄した。
【００３１】
洗浄後、上記既知の抗原液を１ウェルあたり１００μｌずつ滴下し、表１に示す反応条件（一次反応）にて所定時間だけ反応させた。この反応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にてプレートを洗浄した。
【００３２】
洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体（アサヒビール社製）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて２００μｇ／ｍｌになるように溶解したものをさらにリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて１２００倍に希釈した液を１ウェルあたり１００μｌずつ添加し、表１中の反応条件（二次反応）で反応を行なった。この反応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にてプレートを洗浄した。
【００３３】
洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１３ｍｌにオルト‐フェニルジアミンジヒドロクロライド（２６ｍｇ  Ｔａｂｌｅｔ、ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．製）と過酸化水素水１３μｌを加え、これを１ウェルあたり１００μｌずつ添加して３７℃、約５分間反応させた。その後、直ちに２ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４を１ウェル当たり５０μｌずつ添加して反応を停止させた。
【００３４】
［温度条件と反応時間の条件別の吸光度の測定試験］
実施例１〜２４、比較例１〜４８の各反応温度条件および反応時間条件における酵素免疫測定方法について、上記の反応停止後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定し、既知抗原濃度毎の吸光度と反応時間の関係を図１〜１２に示した。
【００３５】
【表１】
0004260872.tif 000002
【００３６】
反応条件１〜４のように、温度条件が２５℃以上に高い場合は反応時間が２時間以上という比較的短時間で、吸光度は一定になるのに対し、反応条件５〜１２のように温度条件２０℃以下の場合は、３時間以下では不安定であるが６時間から吸光度が一定となっている。このことから反応条件１〜４のような高温条件では２時間以上、反応条件５〜１２のような２０℃以下では６時間以上の反応時間が必要である。
このように実施例の反応条件５〜１２のような２〜２０℃という低温反応条件では、反応時間は長く要するが、抗原濃度０．１〜６．２５ｎｇ／ｍｌの吸光度は、６時間を越えても安定しており、特に２〜１０℃では２４時間までは一次反応および二次反応共に特に安定していて、低濃度の抗原量を測定可能であることがわかる。
一方、比較例1〜２４である反応条件１〜４のように温度条件が２５℃以上である場合は、反応時間が３時間を越えると、高濃度の測定対象に比べて低濃度の吸光度は不安定であり、６．２５ｎｇ／ｍｌ以下の抗原濃度の試料について吸光度は特に不安定になった。
【００３７】
［実施例２５〜２９、比較例４９〜５１］
精製ダニ抗原Ｄｅｒｆ２（アサヒビール社製）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて既知濃度の抗原液を調製した。この既知濃度の抗原液をＤｅｒｆ２としてサンドイッチＥＬＩＳＡ法による抗原量の測定を行った。
【００３８】
先ず、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体（アサヒビール社製）をプレート（Ｆ１６ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＮＯ  ＭＯＤＵＬＥプレート：ＮＵＮＣ社製）に１ウェルあたり１００μｌずつ添加して４℃にて１日以上静置させてプレートに固相化させた。
【００３９】
固相とした後、プレートのウェル中の液を捨て、ブロッキング試薬として１重量％ウシ血清アルブミンとリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）の混合液を１ウェルあたり２００μｌずつ添加し、３７℃、６０分間反応させた。反応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にてプレートを洗浄した。
【００４０】
洗浄後、上記既知の抗原液を１ウェルあたり１００μｌずつ滴下し、表２の反応条件（一次反応）で反応を行った。反応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にてプレートを洗浄した。
【００４１】
洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体（アサヒビール社製）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて２００μｇ／ｍｌになるように溶解したものをさらにリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて１２００倍に希釈した液を１ウェルあたり１００μｌずつ添加し、表２の反応条件（二次反応）で反応を行った。反応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）にてプレートを洗浄した。
【００４２】
洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１３ｍｌにオルト‐フェニルジアミンジヒドロクロライド（２６ｍｇ  Ｔａｂｌｅｔ、ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．製）と過酸化水素水１３μｌを加えたものを１ウェルあたり１００μｌずつ添加して３７℃、約５分間反応させた。その後直ちに、２ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４を１ウェル当たり５０μｌずつ添加して反応を停止させた。
【００４３】
［既知濃度抗原液測定の正確性確認試験］
実施例２５〜２９、比較例４９〜５１の各反応温度条件および反応時間条件における酵素免疫測定方法について、上記の反応停止後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果（抗原量、標準偏差、変動係数、回収率）を表３〜１０に示した。
【００４４】
【表２】
0004260872.tif 000003
【００４５】
【表３】
0004260872.tif 000004
【００４６】
【表４】
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【００４７】
【表５】
0004260872.tif 000006
【００４８】
【表６】
0004260872.tif 000007
【００４９】
【表７】
0004260872.tif 000008
【００５０】
【表８】
0004260872.tif 000009
【００５１】
【表９】
0004260872.tif 000010
【００５２】
【表１０】
0004260872.tif 000011
【００５３】
反応条件１３、１４、１５において２５℃以上の温度条件では抗原濃度０．５ｎｇ／ｍｌ未満では、変動係数が１０以上になって、回収率も８０〜１１０％の範囲にはなく、あまり正確に定量ができていないことがわかる。
また、反応条件１６〜２０のように２５℃未満の温度条件では０．５ｎｇ／ｍｌ未満（好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ未満０．１ｎｇ／ｍｌ以上）であっても変動係数は１０以下であり、回収率も８０％以上１１０％以下であることから正確に定量できていることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】温度条件３７℃での１次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図２】温度条件３７℃での２次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図３】温度条件２５℃での１次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図４】温度条件２５℃での２次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図５】温度条件２０℃での１次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図６】温度条件２０℃での２次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図７】温度条件１５℃での１次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図８】温度条件１５℃での２次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図９】温度条件１０℃での１次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図１０】温度条件１０℃での２次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図１１】温度条件２℃での１次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【図１２】温度条件２℃での２次反応の反応時間と吸光度との関係を示す図表
【要約】
【課題】  可及的低濃度の抗原に対して、これを正確に定量することを可能にするサンドイッチＥＬＩＳＡ法とすることである。
【解決手段】一次抗体である固相抗体に対して測定対象の１０ｎｇ／ｍｌ以下の低濃度アレルゲンを反応させ、このとき反応したアレルゲンに対して酵素で標識した二次抗体を反応させた後、前記酵素に反応する発色性または発光性の基質を加えて得られる酵素反応生成物を検出する酵素免疫測定法において、前記一次抗体に対するアレルゲンの反応条件、およびアレルゲンに対する二次抗体の反応条件を２３℃以下、かつ６時間以上に調整する。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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