(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンキリンポリペプチドとＲｂとの結合に対するガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法において、Ｒｂの存在下でガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめ、そして遊離のガンキリンポリペプチド又はＲｂを検出する、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ガンキリンポリペプチド含有物が、ガンキリンポリペプチドを発現する細胞の溶解物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガンキリンポリペプチドとNFκBとの結合に対するガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法において、ＮＦκＢの存在下でガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめ、遊離のガンキリンポリペプチド又はNFκBを検出する、ことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記ガンキリンポリペプチド含有物が、ガンキリンポリペプチドを発現する細胞の溶解物である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は新規蛋白質ガンキリン（gankyrin）、その製造及びその利用に関する。
背景技術
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma；ＨＣＣ）は東洋及び南アフリカにおける最も普通に見出される癌の１種である。過去１０年間にＨＣＣ患者の診断及び治療は大きな進展があり、その結果、切除可能な症例が増加している（Arii, S.et al., Primary liver cancer in Japan, Springer-Verlag（1992）243-255；The liver cancer Study Group of Japan, Primary liver cancer in Japan, Springer-Verlag（1992）445-453）。しかしながら、その著しい進展にも拘らず、生存率は低いままである。生存期間の延長に対する主たる障害の１つは腫癌を巨視的に完全に除去した後の肝内再発のようである（The Liver Cancer Study Group of Japan, Ann.Surg.（1990）211, 277-287；Belghiti,J.et al.,Ann.Surg.（1991）214,114-117）。
これに関して、肝内再発及び生存期間の延長に影響する予後判定因子を決定するために大きな努力が払われてきた。今まで、本発明者らはＨＣＣの幾つかの遺伝子の発現を分析した（Mise, M. et al., Hepatology（1996）23, 455-464；Furutani, M.et al., Hepatology（1996）24, 1441-1445；Furutani, M.et al., Cancer Lett.（1997）111, 191-197）。その結果得られたｋａｎ−１（胆汁酸ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ）ｍＲＮＡを新規な予後判定因子として同定した。この因子の発現は、予後不良例のHCC中で減少する（Furutani, M.et al., Hepatology（1996）24, 1441-1445）。
この他にも、門脈併発、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル、腫瘍サイズ、腫瘍の数のごとき従来からの臨床予後因子に予測価値を付加するＨＣＣの新規な分子マーカーが求められている（The liver Cancer Study Group of Japan, Primary liver Cancer in Japan, Springer-Verlag（1992）445-453；The liver Cancer Study Group of Japan, Ann.Surg.（1990）211, 277-287；The liver Cancer Study Group of Japan, Cancer（1994）74, 2772-2780；Franco, D.et al., Gastroenterology（1990）98. 733-738；Calvet, X.et al., Hepatology（1990）12, 753-760）。
発明の開示
本発明者は、ＨＣＣにおいて発現が増加する分子マーカーを同定するために、ＨＣＣ患者の切除肝のcDNAから健常人の肝臓cDNAをサブトラクト（subtract）した。その結果、アンキリンリピートモチーフ（ankyrin repeat motif）のみからなり、in vitroおよびin vivoのアッセイ系で癌原性を示す新規な遺伝子、ガンキリンを単離した。
従って本発明は、新規なガンキリンポリペプチド、それをコードする遺伝子系、該ポリペプチドの製造方法、及び該ポリペプチドに対する抗体、並びにそれらの用途を提供する。
上記の課題を解決するため、本発明は、配列番号：２に示す１４位のＡｌａから２２６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：２に示す１４位のＡｌａから２２６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：２に示す１位のＭｅｔから２２６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列から成り、ガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：２に示す１位のＭｅｔから２２６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的性質を有するポリペプチドを提供する。ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより与えられる条件である。
本発明はまた、配列番号：２に示す１４位のＡｌａから２２６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするDNA、配列番号：２に示す１４位のＡｌａから２２６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドをコードするDNA又は配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的性質を有するポリペプチドにシグナル配列が付加されたシグナル付加ポリペプチドを提供する。ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより与えられる条件である。
本発明はまた、配列番号：４に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：４に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：４に示す１位のＭｅｔから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列から成り、ガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：４に示す１位のＭｅｔから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：３に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的性質を有するポリペプチドを提供する。ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより与えられる条件である。
本発明はまた、配列番号：４に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号：４に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドをコードするＤＮＡ又は配列番号：３に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的性質を有するポリペプチドにシグナル配列が付加されたシグナル付加ポリペプチドを提供する。ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより与えられる条件である。
本発明はまた、配列番号：６に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：６に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：６に示す１位のＭｅｔから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列から成り、ガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：６に示す１位のＭｅｔから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的性質を有するポリペプチドを提供する。ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより与えられる条件である。
本発明はまた、配列番号：６に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号：６に示す１４位のＡｌａから２３１位のＭｅｔまでのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列から成り、且つガンキリンの生物学的活性を維持しているポリペプチドをコードするＤＮＡ又は配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的性質を有するポリペプチドにシグナル配列が付加されたシグナル付加ポリペプチドを提供する。ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより与えられる条件である。
本発明はまた、前記のポリペプチドと他のペプチド又はポリペプチドとから成る融合ポリペプチドを提供する。
本発明はまた、前記のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
本発明はまた、前記のＤＮＡを含んで成るベクターを提供する。
本発明はまた、前記のベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はまた、前記のポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から目的ポリペプチドを採取することを特徴とする方法を提供する。
本発明はまた、前記のポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を提供する。この抗体は好ましくはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
本発明はまた、前記の抗体と、ガンキリンポリペプチドが含まれると予想される試料とを接触せしめ、前記抗体とガンキリンポリペプチドとの免疫複合体の生成を検出又は測定することを含んで成るガンキリンポリペプチドの検出又は測定方法を提供する。
本発明はまた、配列番号：１に示される塩基配列のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列中の連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。前記連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは翻訳開始コドンを含む。
本発明はまた、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有してなるガンキリンポリペプチドの発現阻害剤を提供する。
本発明はまた、ガンキリンポリペプチドとＲｂとの結合に対するガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法において、Ｒｂの存在下でガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめ、そして遊離のガンキリンポリペプチド又はＲｂを検出する、ことを特徴とする方法を提供する。前記ガンキリン含有物は、例えばガンキリンを発現する細胞の溶解物である。
本発明はまた、ガンキリンポリペプチドとＮＦκＢとの結合に対するガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法において、ＮＦκＢの存在下でガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめ、遊離のガンキリンポリペプチド又はＮＦκＢを検出する、ことを特徴とする方法を提供する。前記ガンキリン含有物は、例えばガンキリンを発現する細胞の溶解物である。
【図面の簡単な説明】
図１はヒトのＸ染色体上のガンキリン遺伝子の位置を示す模式図である。
図２は、ヒトリンパ球中の染色体上のガンキリン遺伝子をイン・サイチュー・ハイブリダイゼーション法により蛍光染色して検出したことを示す写真である。
図３は、５人の肝癌患者（１〜５）の正常肝組織（Ｎ）及び肝癌組織（Ｔ）からのｍＲＮＡをヒトガンキリンｃＤＮＡをプローブとしてノザン法により検出した結果を示す電気泳動図である。
図４は、種々のヒト細胞系のｍＲＮＡをヒトガンキリンｃＤＮＡをプローブとしてノザン法により検出した結果を示す電気泳動図である。
図５は、種々の正常組織中のｍＲＮＡをヒトガンキリンｃＤＮＡをプローブとしてノザン法により検出した結果を示す電気泳動図である。
図６は、３人の肝癌患者（１〜３）の正常肝組織（Ｎ）及び肝癌組織（Ｔ）からの細胞溶解物中のガンキリンポリペプチドを、抗ガンキリンポリペプチド抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した結果を示す電気泳動図である。
図７は、種々のヒト細胞系からの細胞溶解物中のガンキリンポリペプチドを、抗ガンキリンポリペプチド抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した結果を示す電気泳動図である。
図８のＡは、インビトロ翻訳されたガンキリン遺伝子生成物を図６と同様にして検出した結果を示し、Ｂはインビトロ翻訳されたガンキリン遺伝子生成物（未標識）を図６と同様にして検出した結果を示す電気泳動図である。
図９は、ガンキリンポリペプチドとＧＳＴとの融合ポリペプチドを大腸菌で発現させ、種々の抗体により検出した結果を示す電気泳動図である。
図１０は、ガンキリンポリペプチドとＨＡとの融合ポリペプチドを２９３細胞において発現させ、種々の抗体により検出した結果を示す電気泳動図である。
図１１は、ガンキリンポリペプチドとＨＡとの融合ポリペプチドを２９３細胞において発現させ、種々の抗体により検出した結果を示す電気泳動図である。
図１２は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の種々の細胞周期におけるｍＲＮＡをマウスガンキリンｃＤＮＡをプローブとしてノザン法により検出した結果を示す電気泳動図である。
図１３は、種々の濃度で増殖したＮＩＨ／３Ｔ３細胞のｍＲＮＡを、図１２と同様にして検出した結果を示す電気泳動図である。
図１４は、マウスにおける部分的肝切除後の肝再生過程における肝組織のｍＲＮＡを、図１２と同様にして検出した結果を示す電気泳動図である。
図１５は種々の蛋白質中のアンキリンリピートの位置と反復数を示す図である。
発明の実施の形態
本発明によれば、ガンキリンポリペプチドとは、ガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。ガンキリンの生物学的活性とは癌原性であり、その具体的な作用は実施例４に示すとおり、細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の増加、マウスにおける造腫瘍能及びアポトーシス誘導の抑制である。
本発明のガンキリン遺伝子又はそのcDNAは、肝癌細胞又は肝癌組織を取得源としてスクリーニングを行い、遺伝子又はそのcDNAを得ることができる。遺伝子又はそのcDNAのスクリーニング方法又は単離方法としては、サブトラクション法（Nucleic Acids Research（1988）16, 10937）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Cell（1979）16, 443-452）等、発現量の変化する遺伝子を選択的にスクリーニングできる方法を用いることができる。
本発明のガンキリンポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、正常肝組織から調製したｃＤＮＡライブラリーと、肝癌組織から調製したｃＤＮＡライブラリーとのサブトラクション法により、肝癌組織では転写されているが正常組織では転写されていないｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを選択することにより得られる。
例えば、サブトラクション法は、肝癌組織又は正常肝組織から得られたｃＤＮＡをプライマーにより増幅する。正常肝組織を増幅するためのプライマーは標識化合物、例えばビオチンで標識する。次いで、過剰量の正常肝組織由来の二本鎖ｃＤＮＡと少量の肝癌組織由来の二本鎖ｃＤＮＡとを混ぜ、熱変性することにより一本鎖にして、これを二本鎖にもどす。肝癌組織由来のｃＤＮＡのうち、正常肝組織にも発現していたものは、そのほとんどが過剰に存在する正常肝組織由来のｃＤＮＡと二本鎖を形成し、標識を持つようになる。
しかしながら、肝癌組織に由来するｃＤＮＡ同士が二本鎖を形成すると、標識を持たない。そこで、標識を有するｃＤＮＡ二本鎖ＤＮＡを除去すれば、肝癌組織に特異的なｃＤＮＡが得られる。この操作を繰り返すことにより肝癌組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。この具体的な方法は、実施例１に示す。さらに得られたcDNA断片や全長のcDNAをプローブとして用いて、ガンキリンポリペプチドを発現する細胞又は組織及びガンキリンポリペプチドを発現しない細胞又は組織のmRNAに対してノーザンブロッティングを行うことにより、選択した遺伝子のmRNAが特異的に発現していることを確認することができる。
上記のように得られたcDNA又はcDNA断片をプローブとして、cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより異なる細胞、組織、臓器又は種からガンキリン遺伝子を得ることができる。また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、ガンキリン遺伝子産物のポリペプチドをコードする翻訳領域を決定でき、このポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてジェノミックDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、染色体DNAを単離することができる。
cDNAライブラリーやジェノミックDNAライブラリー等のDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）に記載の方法により調製してもよいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。
本発明の遺伝子もしくはDNAは、その塩基配列又はその一部が明らかな場合、それをプライマーとしてPCR法を用いることにより得ることができる。
本発明のガンキリンポリペプチドはまた、配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つガンキリンの生物学的活性を有するポリペプチドを含む。
ストリンジェントな条件としては、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントの条件とは、例えば５０℃、２×SSC、０．１％ＳＤＳである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳが挙げられる。
上記のハイブリダイズするＤＮＡは好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又はジェノミックＤＮＡであってよい。配列番号：２に示したアミノ酸配列、配列番号：１に示した塩基配列について、既知DNAデータベース（GenBank、EMBL）及び蛋白質データベース（SWISS-PLOT）に含まれる全ての配列に対して相同性検索を行った結果、一致するものは見いだせなかった。このことから本発明の遺伝子とその遺伝子産物であるポリペプチドは新規な分子であることが明らかとなった。
実施例１に示すごとく、本発明の新規なガンキリンポリペプチドのｃＤＮＡとハイブリダイズする遺伝子は、本発明においてヒト以外の動物、例えばラット、マウス等にも広く分布し、またヒトの種々の組織にも分布していることが判明した。従って、上記の天然由来のＤＮＡは、例えば実施例１においてヒトガンキリンポリペプチドのｃＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡが検出される組織由来のｃＤＮＡやジェノミックＤＮＡであってもよい。
本発明はまた、上記のごとく配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸とハイブリダイズし且つガンキリンの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。このＤＮＡも、前記の方法により発現させることができる。このようなガンキリンポリペプチドを得るために、ガンキリン遺伝子の塩基配列に所望の変異を導入するには合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用することができる（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1984）81, 5662-5666、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research（1982）10, 6487-6500、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1982）79, 6409-6413）。
また、ガンキリンポリペプチドをコードするｃＤＮＡやジェノミックＤＮＡの他、合成ＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するガンキリンをコードするＤＮＡが挙げられ、例えば配列番号：１で表される塩基配列を有するＤＮＡが用いられる。これらのＤＮＡは、それ自体公知の遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
後述の実施例１で得られたプラスミドpBS-t4-11を保持する形質転換体大腸菌はEscherichia coli DH5a（pBS-t4-11）と命名され、平成9（１９９７）年９月２９日に工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に寄託番号ＦＥＲＭ  BP−６１２８として寄託されている。
本発明のガンキリンポリペプチドとしては、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するガンキリンポリペプチド等が挙げられる。具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するガンキリンの他、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。
また、本発明にはガンキリンの生物学的活性を有し、且つ配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと相同なポリペプチドも含まれる。相同なポリペプチドとは配列番号：２のアミノ酸配列とは、一般に少なくとも20個、好ましくは３０個の連続したアミノ酸残基で、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%以上、アミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチドを意味する。
本発明のガンキリンポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態が異なっている。しかしながら、得られたガンキリンポリペプチドが天然のガンキリンポリペプチドと実質的に同質の活性を有するものである限り本発明に含まれる。ガンキリンポリペプチドと実質的に同質の活性としては、後述の実施例４に記載される癌原性、例えば細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の増加、マウスにおける造腫瘍能及びアポトーシス誘導の抑制が挙げられる。実質的に同質とは、癌原性等が性質的に同質であることを示す。
本発明のガンキリンポリペプチドの部分ペプチドとしては、例えばガンキリンの分子のうち、疎水性プロット解析から推定される疎水性領域や親水性領域の１つあるいは複数の領域を含む部分ペプチドが挙げられる。これらの部分ペプチドは１つの疎水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよいし、１つの親水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよい。
本発明のガンキリンポリペプチドの部分ペプチドは、自体公知のペプチド合成法に従って、あるいは本発明のガンキリンポリペプチドを適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
また反応後は通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶を組合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
前記のように構築したＤＮＡは、公知の方法により発現させ、ガンキリンポリペプチドを取得することができる。哺乳類細胞を使用する場合、常用される有用なプロモーター／エンハンサー、発現される遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
また、その他にガンキリンポリペプチド発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV 40）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）の哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、SV 40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列、発現させる遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Nature（1098）341, 544-546；FASEB J.（1992）6, 2422-2427）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）に従えばよい。
ガンキリンポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. BacterioI.（1987）169, 4379）を使用すればよい。
複製起源としては、SV 40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
本発明において、ガンキリンポリペプチドの製造のために、任意の産生系を使用することができる。ガンキリンポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（1）哺乳類細胞、例えばCHO（J. Exp. Med.（1995）108, 945）、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、（2）両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature（1981）291, 358-340）、あるいは（3）昆虫細胞、例えばsf9、sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特にDHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1980）77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1968）60, 1275）を好適に使用することができる。
植物細胞としては、Nicotiana tabacum由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギウス属（Aspergillus）属、例えばアスペルギウス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりガンキリンポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、撹拌を加える。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でガンキリンポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡをヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。このＤＮＡが挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁からガンキリンポリペプチドを得る。トランスジェニックヤギから産生されるガンキリンポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的とするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望のガンキリンポリペプチドを得る（Susumu, M. et al., Nature（1985）315, 592-594）。
さらに植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.（1994）24, 131-138）。宿主への発現ベクターの導入方法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法（Virology（1973）52, 456-467）やエレクトロポレーション法（EMBO J,（1982）1, 841-845）等が用いられる。また、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research（1981）9, r43-r74）。
このようにして得られたガンキリン遺伝子産物がガンキリンの生物学的活性を有していることは、例えば次ぎのようにして確認することができる。例えば、後述の実施例４に記載されている方法を用い、ガンキリンポリペプチド産生細胞を軟寒天中で培養する。ガンキリンポリペプチド発現細胞は軟寒天中でコロニー形成能が増加している。また、ガンキリンポリペプチド発現細胞をマウスに移植する。ガンキリンポリペプチド発現細胞はマウス体内で造腫瘍能を示す。また、ガンキリンポリペプチド発現細胞をアポトーシス誘導条件下におく。ガンキリンポリペプチド発現細胞はアポトーシス誘導を抑制する。
上記で得られたガンキリンポリペプチドは、細胞内外、宿主から単離し実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ガンキリンポリペプチドの分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析等を適宜選択、組み合わせればガンキリンポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
なお、ガンキリンポリペプチドを精製前又は精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼが用いられる。
本発明のガンキリンポリペプチドは、スクリーニング方法に使用されるために有用である。すなわち、Ｒｂ（DeCaprio, J.A.et al., Cell（1989）58, 1085-1095）の存在下でガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめ、そして遊離のガンキリンポリペプチド又はＲｂを検出又は測定する、ことからなるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はガンキリンアンタゴニストのスクリーニング方法；又は、ＮＦκＢ（Baeuerle, P.A.et al., Cell（1988）53, 211-217）の存在下でガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめ、そして遊離のガンキリンポリペプチド又はＮＦκＢを検出又は測定する、ことからなるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はガンキリンアンタゴニストのスクリーニング方法において使用されるために有用である。
これらのスクリーニング方法に用いられるガンキリンポリペプチドは組換え型、天然型のいずれであっても使用し得る。また、Rb又はＮＦκＢとの結合性を維持している限り、ガンキリンポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。ガンキリンポリペプチド含有物としては、ガンキリンポリペプチドを発現する細胞の溶解物が挙げられる。
すなわち、本発明は、Ｒｂの存在下で、ガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめた場合と、ガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含まない試料を接触せしめた場合の、検出又は測定された遊離のガンキリンポリペプチド又はＲｂを比較することから成るガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法に係わる。
本発明はまた、ＮＦκＢの存在下で、ガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料とを接触せしめた場合と、ガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物と、ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含まない試料を接触せしめた場合の、検出又は測定された遊離のガンキリンポリペプチド又はＮＦκＢを比較することから成るガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法に係わる。
これらのスクリーニング方法において、遊離のガンキリンポリペプチド、Ｒｂ又はＮＦκＢを検出又は測定するためには、例えばガンキリンポリペプチド、Ｒｂ又はＮＦκＢを標識化合物、例えばビオチン、アビディン、放射性同位元素、例えば〔125Ｉ〕、〔35Ｓ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕、蛍光物質、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼを用いて標識し、これを検出又は測定することができる。これらの標識化合物はすでに公知であり、通常の方法に従って標識することができる。また、遊離のガンキリンポリペプチド、Ｒｂ又はＮＦκＢを検出又は測定するためには、ガンキリンポリペプチド、Ｒｂ又はＮＦκＢに対する抗体を用いて行うことができる。
具体的には、ガンキリンポリペプチドを支持体、例えばビーズ、プレートに固定し、Ｒｂ又はＮＦκＢの存在下でガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料を加え、インキュベートの後、溶液中に含まれるＲｂ又はＮＦκＢを抗体により検出又は測定すればよい。また、遊離のRb又はＮＦκＢを検出又は測定するために、プレートに固定したガンキリンポリペプチドに結合したRb又はＮＦκＢを検出又は測定してもよい。
その際、ガンキリンポリペプチドを他のペプチド又はポリペプチドと遺伝子工学的に融合させた融合ポリペプチドを用いることができる。融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしてはＨＡ（ヘモグルアチニン）、ＦＬＡＧ等が挙げられ、遊離のガンキリンポリペプチドをこれら融合に付される他のペプチド又はポリペプチドに対する抗体を用いて検出又は測定することができる。したがって、ガンキリンポリペプチドを他のペプチド又はポリペプチドと遺伝子工学的に融合させた融合ポリペプチドは、本発明において有用である。
本発明のスクリーニング方法で使用されるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含むと予想される試料としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出液、植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液が挙げられる。これらの試料は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
本発明のスクリーニング方法は、癌原性を有するガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを検出又は測定することができるため有用である。
ガンキリンポリペプチドは、本発明においてＲｂ又はＮＦκＢと相互作用することが見いだされた。ガンキリンポリペプチドは癌原性を有することから、ガンキリンポリペプチドとＲｂ又はＮＦκＢとの結合を調節するガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストは医薬品として有用である。
具体的には、上記のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発明のガンキリンポリペプチド又はガンキリンポリペプチド含有物を、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁し、プレートに固定することによりガンキリンポリペプチド標品を調製する。
緩衝液としては、ガンキリンポリペプチドの結合を阻害しないものであれば何でもよく、例えばpH６〜８のリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＰＢＳ、ＨＢＳＳが用いられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、ウシ血清アルブミンのタンパク質、ＣＨＡＰＳやＴｗｅｅｎ８０TM、ジギトニン等の界面活性剤を加えることもできる。さらに、タンパク質分解酵素によるガンキリンポリペプチドの分解を抑えるために、ＰＭＳＦ、ペプスタチン、ロイペプチン等のタンパク質分解酵素阻害剤を添加することもできる。
次いで、該ガンキリンポリペプチド標品に、放射性同位元素により標識したＲｂ又はＮＦκＢと適当な濃度の試料を同時に添加し、約０〜５０℃（望ましくは約４〜３７℃）で、約０．５〜２４時間（望ましくは約０．５〜３時間）反応させる。反応後、適量の緩衝液で洗浄したのち該ガンキリンポリペプチド標品に残存する放射線量をガンマカウンター又は液体シンチレーションカウンターで測定する。このとき、ガンキリンポリペプチド標品に対する非特異的な結合を測定するために、ガンキリンポリペプチドと相互作用しない別のポリペプチドを同様に標識して添加したガンキリンポリペプチド標品を調製する。また、試料を含まない緩衝液を添加したガンキリンポリペプチド標品をネガティブコントロールとする。
試料を含むときの残存放射線量から非特異的結合量を差し引いた値が特異的結合量である。反応液に試料を添加しない場合に比べて、この特異的結合量を低下させる試料をガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの候補物質として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストは、スクリーニング方法を用いて試料、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出液、植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液をスクリーニングすることができる。これらの試料は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
これらのガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストは、ガンキリンポリペプチドとRb又はＮＦκＢとの結合を阻害する物質である。本発明のスクリーニング方法を用いて得られるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの構造の一部を、付加、欠失あるいは置換により変換される物質も本発明のスクリーニング方法を用いて得られるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに含まれる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られるガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストをヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
例えば必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えばガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニズトを生理学的に認められる単体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤とともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状単体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油のような天然産出植物油を溶解又は懸濁させるの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
ガンキリンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０kgとして）においては、１日あたり約０．１から１００mg、好ましくは約１．０から５０mg、より好ましくは約１．０から２０mgである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０kgとして）においては、１日あたり約０．０１から３０mg、好ましくは約０．１から２０mg、より好ましくは約０．１から１０mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体は、公知の手段を用いてモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体として得ることができる。
モノクローナル抗体は、ガンキリンポリペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるガンキリンポリペプチドは、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のガンキリンポリペプチドが好ましい。これらのヒト、マウス又はラットガンキリンポリペプチドは、本明細書に開示される遺伝子配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるガンキリンポリペプチドは、本明細書に記載された全てのガンキリンポリペプチドの生物学的活性を有するガンキリンポリペプチドを使用できる。また、ガンキリンポリペプチドの断片も用いることができる。ガンキリンポリペプチドの断片としては、例えばガンキリンポリペプチドのカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書で「抗ガンキリンポリペプチド抗体」とはガンキリンポリペプチドの全長又は断片に特異的に反応する抗体を意味する。
ガンキリンポリペプチド又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入して本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞内外又は、宿主から目的のガンキリンポリペプチド又はその断片を公知の方法で得、このガンキリンポリペプチドを感作抗原として用いればよい。また、ガンキリンポリペプチドを発現する細胞又はその溶解物を感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えばサルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与し、以降フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、ガンキリンポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としてポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Kearney, J. F. et al., J. Immunol.（1979）123, 1548-1550）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１（Yelton, D. E. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、ＮＳ−１（Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immuno.（1976）6, 511-519）、ＭＰＣ−１１（Margulies, D. H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、ＳＰ２／０（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、ＦＯ（de St. Groth, S. F. and Scheidegger, D., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、Ｓ１９４（Trowbridge, I. S., J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、Ｒ２１０（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでガンキリンポリペプチド、ガンキリンポリペプチド発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、ガンキリンポリペプチドへの結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭63-17688）。
さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるガンキリンポリペプチド、ガンキリンポリペプチド発現細胞又はその溶解物を免疫して抗ガンキリンポリペプチド抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてガンキリンポリペプチドに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（oncogene）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる。例えば、組換え型抗体は、抗ガンキリンポリペプチド抗体遺伝子をハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明には、この組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、抗ガンキリンポリペプチド抗体を産生するハイブリドーマから、抗ガンキリンポリペプチド抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５′−Ampli FINDER RACE Kit（Clontech）およびポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction；ＰＣＲ）を用いた５′−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認する。
目的とする抗ガンキリンポリペプチド抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを既に含む発現ベクターに組み込んでもよい。抗体Ｃ領域としては、Ｖ領域と同じ動物種由来の抗体Ｃ領域を用いてもよいし、Ｖ領域と異なる動物種由来の抗体Ｃ領域を用いてもよい。
本発明で使用される抗ガンキリンポリペプチド抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主細胞を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
本発明で使用される抗体は、ガンキリンポリペプチドに結合するかぎり、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976；Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.（1989）178, 476-496；Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.（1989）178, 497-515；Lamoyi, E., Methods Enzymol.（1986）121, 652-663；Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol.（1986）121, 663-669；Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol.（1991）9, 132-137参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖又は、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖又は、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。
また、抗体断片は、一部の配列が変異、置換、欠失又は挿入を受けた抗体断片であってよい。これら抗体断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体断片も包含される。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ガンキリンポリペプチド抗体を使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体は、公知の技術を使用してキメラ抗体又はヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。例えば、本明細書に記載したガンキリンポリペプチドの産生のためのプロモーター／エンハンサーを用いることができる。
本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができ、本明細書に記載したガンキリンポリペプチドの産生のための産生系を用いることができる。例えば、抗ガンキリンポリペプチド抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ、例えばそれらのトランスジェニック動物を用いることができる（Glaser, V., SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。さらに、植物を使用する場合、例えばタバコ、例えばニコティアナ  タバカム（Nicotiana tabacum）を用いることができる（Ma, J. K. et al., Eur. J. Immunol.（1994）24, 131-138）。
これらの動物又は植物に上記のように抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。
上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体Ｈ鎖又はＬ鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい。あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies：A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Pharmacia）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、得られた抗体をＰＢＳで適当に希釈した後、２８０nmの吸光度を測定し、種およびサブクラスにより吸光係数は異なるが、ヒト抗体の場合１mg／mlを１．４０Dとして算出する。
また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（pH９．６）で１μｇ／mlに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明の抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは濃度標準品として既知の濃度のヒトＩｇＧ  １００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model ３５５０（Bio-Rad）を用いて４０５nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を濃度標準ヒトＩｇＧの吸光度より算出する。
また、抗体の濃度測定には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）を使用することができる。
本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体の活性の評価は、通常知られた方法を使用することができる。ガンキリンポリペプチドを固定したプレートに125Ｉ標識抗ガンキリンポリペプチド抗体を添加し、公知の方法に従い洗浄して、放射活性を測定することにより、抗ガンキリンポリペプチド抗体の活性を評価することができる（Antibodies：A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
また、本発明で使用される抗ガンキリンポリペプチド抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。
例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、抗ガンキリンポリペプチド抗体を固相化したプレートにガンキリンポリペプチドを添加し、次いで目的の抗ガンキリンポリペプチド抗体を含む試料、例えば、抗ガンキリンポリペプチド抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えばアルカリフォスファターゼ等で標識した抗ガンキリンポリペプチド抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。ガンキリンポリペプチドとしてガンキリンポリペプチドの断片、例えばそのC末端からなる断片あるいはN末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体と試料中に含まれるガンキリンポリペプチドが含まれると予想される試料とを接触せしめ、前記抗体とガンキリンポリペプチドとの免疫複合体を検出又は測定することから成るガンキリンポリペプチドの検出又は測定方法を実施することができる。
具体的には、例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、抗ガンキリンポリペプチド抗体を固相化したプレートにガンキリンポリペプチドを含む試料を添加し、次いで抗ガンキリンポリペプチド抗体を加える。
酵素、例えばアルカリフォスファターゼ等で標識した抗ガンキリンポリペプチド抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで試料中のガンキリンポリペプチドの存在を評価することができる。ガンキリンポリペプチドとしてガンキリンポリペプチドの断片、例えばそのC末端からなる断片あるいはN末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗ガンキリンポリペプチド抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）を使用することができる。
本発明のガンキリンポリペプチドの検出又は測定方法は、ガンキリンポリペプチドを特異的に検出又は測定することができるため、ガンキリンポリペプチドを用いた種々の実験等に有用である。
本発明には、本発明の遺伝子と選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド（DNA又はRNA）又はヌクレオチド誘導体、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が含まれる。本発明は例えば、配列番号：１に示される塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列中の連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：８を有するものである。また例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：９を有するものである。
ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、DNA又はmRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、DNA又はmRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１に示される塩基配列に選択的に安定にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。選択的に安定にハイブリダイズするとは、少なくとも20個、好ましくは30個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有するものを示す。
本発明の1つの態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号：８に示される塩基配列を有する。また、本発明の1つの態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号：９に示される塩基配列を有する。
本発明において使用されるオリゴヌクレオチド誘導体がデオキシリボヌクレオチドの場合、各々の構造は式Ｉに示したとおりである。
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ここで、Xは独立して酸素（O）、イオウ（S）、低級アルキル基あるいは一級アミン又は二級アミンのいずれであってもよい。Yは独立して酸素（O）あるいはイオウ（S）のいずれでもよい。Bはアデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、主としてヒトガンキリン遺伝子のDNA又はmRNAの相補的オリゴヌクレオチドである。Rは独立して水素（H）又はジメトキシトリチル基あるいは低級アルキル基である。nは7-28である。
好ましいオリゴヌクレオチド誘導体としては、修飾されていないオリゴヌクレオチドだけではなく、下に示すごとく、修飾されたオリゴヌクレオチドでもよい。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
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これらのオリゴヌクレオチド修飾体は、次の通り常法により得ることができる。化1のX及びYがOであるオリゴヌクレオチドは市販のDNA合成装置、例えばApplied Biosystems製によって容易に合成される。合成方法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等で得ることができる（Atkinson, T. & Smith, M. in. Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, ed. Gait, M. J. IRL Press, 35-81（1984）、Caruthers, M. H. Science（1985）230, 281、Kume, A. et al., J. Org. Chem.（1984）49. 2139、Froehler, B. C. et al., Tetrahedron Lett.（1986）27, 469、Garegg, P. J. et al., ibid（1986）27, 4051、Sproat, B. S. et al., in Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, ed. Gait, M. J. IRL Press, 83-115（1984）、Beaucage, S. L. & Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett.（1981）22, 1859-1862、Matteucci, M. D. & Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett.（1980）21, 719-722、Matteucci, M. D. & Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc（1981）103, 3185-3191）。
Xが低級アルコキシ基であるリン酸トリエステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリゴヌクレオチドをトシルクロリドのDMF/メタノール/2,6-ルチジン溶液で処理することにより得ることができる（Moody, H. M. et al., Nuclein Acids Res.（1989）17, 4769-4782）。
Xがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる（Dorman, M. A. et al., Tetrahedron Lett.（1984）40, 95-102、Agarwal, K. L. & Riftina, F. Nucleic Acids Res.（1979）6, 3009-3024）。
XがSであるホスホロチオエート修飾体は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法（Stein, C. A. et al., Nucleic Acids Research（1988）16, 3209-3221）あるいはテトラエチルチウラム  ジスルフィドを用いて、固相合成法により得ることができる（Vu, H. & Hirschbein, B. L. Tetrahedron Lett.（1991）32, 3005-3008）。
X、Yが共にSであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイトに変換し、イオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる（Brill, W. K-D. J. Am. Che. Soc.（1989）111, 2321-2322）。
Xが一級アミンあるいは二級アミンであるホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホスホネートを一級あるいは二級アミンで処理することにより固相合成法により得ることができる（Froehler, B. et al., Nucleic Acids Res.（1988）16, 4831-4839）。あるいは、アミダイトをtert-ブチルハイドロパーオキサイドで酸化しても得ることができる（Ozaki, H. et al., Tetrahedron Lett.（1989）30, 5899-5902）。
精製及び純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うことができる。分子量の確認は、Electrospray Ionization Mass Spectrometry又はFast Atom Bonbardment-Mass Spectrometryで行うことができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体はヒトガンキリンポリペプチドをコードするDNA又はmRNAの塩基配列にハイブリダイズする配列を有するものであっれば、その合成法や由来はいずれでもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、後述の実施例７に示す通りヒトガンキリンポリペプチドの産生細胞に作用して、ヒトガンキリンポリペプチドをコードするDNA又はmRNAに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、mRNAの分解を促進したりして、ヒトガンキリンポリペプチドの発現を抑制することにより、結果的にヒトガンキリンポリペプチドの作用を抑制する効果を有する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体により抑制されるヒトガンキリンポリペプチドの作用としては、後述の実施例７に記載される細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の抑制が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、0.1〜100mg/kg好ましくは0.1〜50mg/kgの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはガンキリンポリペプチドの発現を阻害し、したがってガンキリンポリペプチドの生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するガンキリンポリペプチドの発現阻害剤は、ガンキリンの生物学的活性、すなわち癌原性を抑制することができ、癌や過増殖性疾患の治療剤として有用である。
実施例
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．サブトラクション法によるｃＤＮＡのクローニング
サブトラクション法（Nakayama, H.et al., Develop.Growth Differ.（1996）38, 141-151）を用いて、肝癌に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡをクローニングした。
５５歳男性の手術標本から原発性肝癌取扱い規約（日本肝癌研究会編）に規定されるステージ３の肝癌組織と正常肝組織とを採取した。各々の組織からＴＲＩｓｏｌ試薬（GIBCO BRL製）を使用して全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡからｃＤＮＡ合成キット（Pharmacia製）を使用してｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーで二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ついで、このｃＤＮＡを制限酵素Ｒｓａ  Ｉで消化後、リンカーアダプター（Nakayama, H.et al., Develop.Growth Differ.（1996）38, 141-151）を付加し、ＰＣＲ法によりプライマー（Nakayama, H.et al., Develop.Growth Differ.（1996）38, 141-151）を用いてこれらのｃＤＮＡを増幅した。なお、正常肝組織由来のｃＤＮＡをPCR法で増幅する際、末端をビオチンで標識したプライマーを用いた。
過剰量の正常肝組織由来の二本鎖ｃＤＮＡを、少量の肝癌組織由来二本鎖ｃＤＮＡに混ぜて、熱変性で一本鎖にした後に、二本鎖へアニーリングした。肝癌組織由来ｃＤＮＡのうち正常肝組織にも発現していたものは、そのほとんどが大量に混在する正常肝由来の対応するｃＤＮＡと二本鎖を形成し、ビオチン標識を持つようになる。しかし肝癌組織に特異的な分子は、肝癌組織由来のｃＤＮＡ同士で二本鎖を形成しビオチン標識を持たない。そこでビオチン標識を持つｃＤＮＡ二本鎖を除去し、肝癌組織に特異的なｃＤＮＡ分子を濃縮した。
濃縮した肝癌組織に特異的なｃＤＮＡ分子をＰＣＲ法を用いて増幅し、同様の操作を繰り返して計５回濃縮を行った。こうして、ヒト肝臓組織由来の肝癌組織に特異的な２５０bpのｃＤＮＡ断片を得た。全長ｃＤＮＡを単離するため、ヒトの胎盤、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞系、及びラットの胎盤から常法にしたがいｃＤＮＡライブラリーを作製し、λＺＡＰIIファージベクター（Strategene製）に連結した。上記の２５０bpのヒトｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、高ストリンジェント条件下に前記ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
すなわち、ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ml変性ＤＮＡ、１０％硫酸デキストラン）中で、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで０．１×ＳＳＣ、１．０％ＳＤＳ、６５℃の条件で洗浄した（Sambrook, J.et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press（1989））。その結果、678bpのORFを含む1542bpのヒトcDNAを得た。
このcDNA中の６７８bpのORFをＰＣＲ増幅し、これをプローブとして、低ストリンジェント条件下にラット胎盤及びマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞系のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。すなわち、ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ml変性ＤＮＡ、１０％硫酸デキストラン）中で３７℃にてハイブリダイズさせ、次いで１×ＳＳＣ、１．０％ＳＤＳ、３７℃の条件で洗浄した（Sambrook, J.et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press（1989））。
その結果、ラット及びマウス由来のｃＤＮＡを単離した。これらのｃＤＮＡの塩基配列を常法により決定し、それらの塩基配列からアミノ酸配列を決定した。ヒト、ラット、マウスの推定アミノ酸配列を１文字標記により記載して比較した結果を次の表１に示す。このアミノ酸配列を有するポリペプチドをガンキリン（gankyrin）と命名した。ヒトガンキリン遺伝子とマウスガンキリン遺伝子は塩基配列レベルで９０％の相同性を有し、アミノ酸配列レベルで９３％の相同性を有していた。また、ヒトガンキリン遺伝子とラットガンキリン遺伝子は、塩基配列レベルで９１％の相同性を有し、アミノ酸配列レベルで９４％の相同性を有していた。
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なお、ヒトガンキリンの塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。マウスガンキリンの塩基配列を配列番号：３に、アミノ酸配列を配列番号：４に示す。ラットガンキリンの塩基配列を配列番号：５に、アミノ酸配列を配列番号：６に示す。なお、ガンキリンのアミノ酸配列において１位のアミノ酸Ｍｅｔから１３位のアミノ酸Ｌｅｕまではシグナル配列であることが推測された。
得られたヒトガンキリンポリペプチドのアミノ酸配列は５．５個のアンキリンリピート（ankyrin repeat）（Lambert, S.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,（1990）87, 1730-1734）を有していた。この様子を次の表２に示す。
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この表において、上の３行は典型的なアンキリンの配列を示し、下の６行は本発明のガンキリンポリペプチドのアミノ酸配列中のアンキリンリピートを示す。
また、図１５には、種々の蛋白質中のアンキリンリピートの存在位置及びリピート数を示す。
ガンキリン遺伝子の染色体上の位置を決定するため、蛍光in situハイブリダイゼーション（in situ hybridization）を行った。すなわち、ヒトの血液から単離したリンパ球を、１０％ウシ胎児血清及びフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を補充した最少必須培地（ＭＥＭ）中で３７℃にて６８〜７２時間培養した。このリンパ球培養物を０．１８mg／mlのＢｒｄＵ（Sigma製）で処理することにより細胞集団の細胞周期を同調させた。細胞周期を同調させた細胞を無血清培地で３回洗浄した。細胞周期の停止を解除し、２．５μｇ／mlのチミジン（Sigma製）を含有するＭＥＭ中で３７℃にて６時間再培養した。細胞を集め、そして低張圧処理、固定及び空気乾燥を含む標準的方法を用いて染色体標本スライドを作製した。
約８．０kbのガンキリン遺伝子挿入部を有するファージＤＮＡ（Sambrook, J.et al., Moleculor Cloning前出）を、BRL BioNickラベルキットを用い、指示書にしたがってｄＡＴＰ及びビオチン−１６−ｄＣＴＰにより１５℃にて１時間ニックトランスレーションを行うことによりビオチン標識した（Herg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9509-9513（1992））。
これをプローブとして用いて、蛍光イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization；ＦＩＳＨ）を行った（Herg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9509-9531（1992）；Herg et al., Chromosoma, 102：325-332（1993））。
すなわち、まずスライドを５５℃にて１時間処理し染色体をスライドグラスに固着させた。ＲＮａｓｅ処理の後、スライドを２×ＳＳＣ中７０％ホルムアミドにより７０℃にて２分間変性し、次にエタノールにより脱水した。５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン及びヒトcot I ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション混合物中で７５℃にて５分間、プローブを変性した。反復配列を抑制するために３７℃にて１５分間インキュベートした後、前記の変性処理したスライド上に前記のプローブを添加した。一夜ハイブリダイゼーションを行った後、スライドを２×ＳＳＣ中５０％ホルムアミドにより３７℃にて洗浄し、さらに１×ＳＳＣ中で６０℃にて洗浄した。
蛍光標識ＦＩＴＣ−結合アビジン（Vector Laboratories製）によりビオチンを検出した後、ＤＮＡを染色する蛍光試薬であるＤＡＰＩ（Sigma製）を用いて染色し、染色体上にＧ／Ｑ−バンドパターンを生じさせた。この方法を用いることにより、DNAを染色する蛍光試薬で染色体に特有な濃淡バンドパターンを作成することができ、染色体の帰属と染色体地図（位置）の作成が可能となる。
微弱な光を検出可能なTVカメラである冷却CCDカメラ（cooled charge-coupled deviceカメラ）（Photometrics製）を用いて２１のmetaphase（分裂期）像を写真にとった。ＦＩＳＨシグナルとＤＡＰＩバンド形成染色体とを重ねることにより、ＦＩＳＨマップデータを染色体バンドに帰属させた（Hery et al., Methods in Molecular Biology：In situ hybridization protocols（K. H. A Choo. ed）, p.35-49（1994）, Human Press, Clifton, NJ.）。
使用した条件下で、このプローブについて、ハイブリダイゼーション効率は約８１％であった。すなわち、検査して１００個の分裂図（mitotic figure）中８０個が１対の染色体上にシグナルを示した。特定の染色体を同定するためにＤＡＰＩバンド形成を用いたので、プローブからのシグナルはX染色体の長腕（long arm）に帰属された。さらに、１０枚の写真をまとめることにより詳細な位置決定を行った。結果を図１に示す。使用した条件下でＦＩＳＨ検出により検出されるその他の遺伝子座は存在しなかったので、プローブＴ４−１１は染色体Ｘ領域ｑ２１．３−ｑ２２．２に位置付けられた。
得られたin situハイブリダイゼーションの結果（蛍光染色）を図２に示す。
実施例２．ガンキリン遺伝子の組織発現レベルの検討
ガンキリン遺伝子の発現を調べるため、種々の組織及び細胞をＴＲＩｚｏ１試薬（GIBCO BRL製）中でホモジナイズした。全ＲＮＡ（２０μｇ）を変性し、そして２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１．０％のアガロースゲル中での電気泳動により分離した。
ゲルをＨｙｂｏｎｄＮ+ナイロン膜（Amersham製）にブロットし、そして迅速ハイブリダイゼーション緩衝液（Rapid-hyb buffer, Amersham製）中で２時間、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ−ラベルｃＤＮＡ断片（２５０bpのヒトガンキリンｃＤＮＡ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液中６５℃にて３０分間からなるストリンジェント条件下でフィルターを洗浄し、そして次に−８０℃にてフィルムに露出した。フィルターを細長く切り、そして内部標準としての１８Ｓ  ｒＲＮＡ用のプローブと再度ハイブリダイズさせた。オートラジオグラムを走査デンシトメーター（アトー社製）により定量することによりＲＮＡの発現レベルを評価した。
肝癌組織（Ｔ）及び肝非癌組織（Ｎ）からのサンプルの結果を図３に示す。下方は内部標準の結果を示し、上方はヒトガンキリンｃＤＮＡプローブにより検出した結果を示す。ガンキリンｍＲＮＡは肝癌組織のみで過剰発現していることが示された。
肝臓以外のヒト癌組織についての結果（陽性数／被験数）を下に示す。
ＲＣＣ（腎細胞癌）            ０／２０
精巣癌                        ０／５
卵巣癌                        ０／５
胃癌                          ４／４
上記の結果、被験癌組織中、胃癌の組織にも、ガンキリンｍＲＮＡが過剰発現されていた。
種々の細胞系、すなわち、ヒト細胞系ＨｅｐＧ２（レーン１）、Ｈｅｌａ（レーン２）、Ｋ５６２（レーン３）、ＮＣ６５（レーン４）、ＮＥＣ８（レーン５）、Ｔ２４（レーン６）、及びＩＭＲ９０（レーン７）の結果を図４に示す。幾つかの細胞系においてガンキリンｍＲＮＡは発現されていた。
種々のヒト正常組織、すなわち、肝臓（レーン１）、脾細胞（レーン２）、膵臓（レーン３）、心臓（レーン４）、副腎（レーン５）、甲状腺（レーン６）、胎盤（レーン７）、卵巣（レーン８）、睾丸（レーン９）、腎臓（レーン１０）、及び肺（レーン１１）の結果を図５に示す。図５に示す通り、ヒト正常組織でのガンキリンｍＲＮＡの発現はわずかであった。
以上の結果、癌組織におけるガンキリンｍＲＮＡの特異的な高発現が確認された。
実施例３．ガンキリンポリペプチドに対する抗体の調製及び免疫組織化学的分析
抗ガンキリンポリペプチド抗体の調製のため、ガンキリンのＣ−末端領域に対応するペプチドMet-Glu-Gly-Cys-Val-Ser-Asn-Leu-Met-Val-Cys-Asn-Leu-Ala-Tyr（配列番号：７）を合成した。このペプチドをキーホールリンペットヘモシアニンに連結し、そしてウサギに免疫感作した。免疫感作から１４、４２及び５６日後に再度ウサギを免疫感作し、抗血清を得た。
得られた抗血清を固相化した上記ペプチドを用いてアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体を得た（Fmoc Chemistry, Research Gevetic Inc.）。本抗体のガンキリンポリペプチドに対する反応性・特異性は、ウエスタンブロット解析により確認した。すなわち、ガンキリン遺伝子発現プラスミドをＴＮＴ発現系（Promega製）に加え翻訳生成物（ガンキリンポリペプチド）を得た。この際、〔35Ｓ〕メチオニンを系に添加することにより〔35Ｓ〕メチオニン標識ヒトガンキリンポリペプチドを合成した。同じ条件を用いて非標識ガンキリンポリペプチドも合成した。
〔35Ｓ〕メチオニン標識および非標識ヒトガンキリンポリペプチドをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（条件は後述）し、非標識体の泳動パターンをウエスタンブロット法にて解析した。すなわち、非標識体泳動ゲルをイモビロン転写膜（Immobilon transfer membrane）（Millipore製）に転写し、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝液中でブロックした。次に、上記ブロッティング膜をＴｒｉｓ緩衝液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０及びＢＳＡ中に１：２０００〜１：１００００に希釈した本ポリクローナル抗体と４℃にて１６時間インキュベートした。
ブロッティング膜を、Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中で室温にて繰り返し洗浄した。そして、二次抗体としてのホースラディッシュパーオキシダーゼ標識した抗ウサギイムノグロブリン抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。これを洗浄の後、電気化学発光試薬（Amersham製）により発色せしめた。
一方、標識体泳動ゲルについてはオートラジオグラフィーにより、ガンキリンポリペプチドの泳動位置を確認した。その結果、標識体のオートラジオグラフィーバンドに一致して、非標識体のウエスタンブロットのバンドが得られ、本ポリクローナル抗体がガンキリン遺伝子産物を認識することが示された。
また、同時に行った、鋳型DNAを含まないTNT発現系やルシフェラーゼcDNA発現産物の本ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析ではこのような特異的なバンドは得られなかったことから、本ポリクローナル抗体のガンキリンポリペプチドに対する特異性が確認された。図８のＡに、インビトロ翻訳された標識ガンキリン遺伝子生成物の結果を示す。鋳型（−）（レーン１）、陽性対照（〜６０kDaに相当するルシフェラーゼｃＤＮＡ）（レーン２）、ガンキリン（レーン３）。インビトロで翻訳されたガンキリン遺伝子産物（未標識）を抗ガンキリンポリペプチド抗体を用いるウエスタンブロットにより分析した結果を図８のＢに示す。各レーンは、鋳型（−）（レーン１）、陽性対照（〜６０kDaに相当するルシフェラーゼｃＤＮＡ）（レーン２）、ガンキリン（レーン３）を示す。
３人の肝癌患者の肝非癌組織（Ｎ）及び肝癌組織（Ｔ）の溶解物中のガンキリンポリペプチドを上記と同様にアフィニティー精製した抗ガンキリンポリペプチド抗体を用いてウエスタンブロット法にて検出した結果を図６に示す。実施例２で示したmRNAレベルと同様、非癌部肝臓に比し、肝癌組織中により多くのガンキリンポリペプチドが検出された。
ヒト細胞系、すなわちＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣカタログ1994（American Type Culture Collection））（レーン１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣカタログ1994（American Type Culture Collection））（レーン２）、Ｔ２４（ＡＴＣＣカタログ1994（American Type Culture Collection））（レーン３）、ＮＣ６５（Hoehn, W.and Schroeder, F.H., Invest.Urol.（1978）16, 106）（レーン４）、ＮＥＣ８（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、細胞・遺伝子カタログ第２版、平成７（１９９５）年）（レーン５）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣカタログ1994（American Type Culture Collection））（レーン６）、２９３（ＡＴＣＣカタログ1994（American Type Culture Collection））（レーン７）及びＣＯＳ−７（ＡＴＣＣカタログ1994（American Type Culture Collection））（レーン８）の全細胞溶解物のガンキリンポリペプチドを、上記と同様にアフィニティー精製した抗ガンキリンポリペプチド抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した結果を図７に示す。その結果、全ての株化細胞においてガンキリンポリペプチドの発現が確認された。
全細胞抽出物及び組織抽出物を、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．４、４００mM  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１％ Triton Ｘ−１００、１％デオキシコール酸、５mM  ＥＤＴＡからなる放射性同位元素標識免疫沈降法用の改変緩衝液中で溶解した３〜５×１０6個の細胞から調製し、そして次に短時間超音波処理してＤＮＡを剪断した。すべての抽出液に、使用直前に１５mM  β−グリセロールホスフェート、２mMピロリン酸ナトリウム、１mM  Ｎａ3ＶＯ4からなるホスファターゼ阻害剤及びアプロチニン、ロイペプチン及びフェニルメチルスルホニルフルオリドからなるプロテアーゼ阻害剤を添加した。
サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いたゲルをイモビロン転写膜（Immobilon transfer membrane）（Millipore製）に転写し、そして５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝液中でブロックした。次に、上記ブロッティング膜をＴｒｉｓ緩衝液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０及びＢＳＡ中に１：２０００〜１：１００００に希釈した上記一次抗血清又は抗体と４℃にて１６時間又は室温にて１時間インキュベートした。ブロッティング膜を、Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中で室温にて繰り返し洗浄した。そして、二次抗体としてのホースラディッシュパーオキシダーゼ標識した抗ウサギイムノグロブリン抗体又は抗マウスイムノグロブリン抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。これを洗浄の後、電気化学発光試薬（Amersham製）により発色せしめた。
実施例４．ガンキリンポリペプチドの特徴づけ
ヒトガンキリンポリペプチドをコードする６７８bpのｃＤＮＡ（実施例１）を、ｐＭＫＩＴ−ＮＥＯ哺乳類発現ベクター（新細胞工学実験プロトコールＰ．２５９、東大医科研編、秀潤社）に、センス方向及びアンチセンス方向に連結した。このベクター中のＳＲαプロモーターは、挿入されたＤＮＡからのＲＮＡの合成を構成的に指令することができる。ｐＭＫＩＴ−ＮＥＯベクターは、形質転換体の選択に適当なネオマイシン耐性遺伝子を有する。
３０μｇのプラスミド構成物をリン酸カルシウム法によりＮＩＨ３Ｔ３細胞（Jainchill, J.F.et al., J.Virol（1969）4, 549-553）にトランスフェクトした。トランスフェクトして４８時間後、培地に１０００μｇ／mlの濃度でＧ４１８を添加した。個々のコロニーを単離し、さらなる解析のために増殖せしめた。こうして、５個のセンスクローン、５個のアンチセンスクローン、及び５個の対照クローンを樹立し、これらのクローンをインビトロ増殖、形態、細胞周期及び造腫瘍性（tumorigenicity）により特徴付けた。
増殖曲線から倍化時間を決定した。下層（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、０．６％寒天）及び上層（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、０．３％寒天）から成る２層の軟寒天中で細胞を培養した。３５mm軟寒天プレートに５×１０3個の細胞を接種し、３７℃にて４〜５週間インキュベートした後細胞をカウントした。細胞数１５個以上から成るコロニーの数の５クローンの平均は、対照クローンで２５±２、センスクローンで１２３±１であった。したがって、ガンキリンポリペプチドを発現する細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の増加が示された。
４週令の雌性ヌードマウス（Flanagan, S.P.Genet.Res.（1966）8, 295-309）皮下に１×１０6個の細胞を移植することによりＮＩＨ３Ｔ３細胞系での造腫瘍性を試験した。モック構成物を含有する５種類のクローン性細胞系及びセンスヒトガンキリン構成物を含有するクローン性細胞系のそれぞれを、３匹のマウス（合計１８匹のマウス）に１×１０6細胞／マウスを皮下移植した。皮下移植の後３ケ月間にわたり腫瘍の形成を観察した。腫瘍の測定は、同一の観察者による２つの直角方向に、直線キャリパーを用いて行った。また、細胞周期の解析のためフローサイトメトリーを用いた。
その結果、対照ベクターを含む細胞を接種した場合腫瘍の形成は４クローン中０クローン（腫瘍形成なし）であったのに対して、センスベクターを含む細胞クローンを接種した場合の腫瘍形成は４クローン中３クローンであった。したがって、ガンキリンポリペプチド発現細胞をマウスに移植すると造腫瘍能を示すことが明らかになった。なお、腫瘍を形成しなかった１クローンは他の３クローンよりガンキリンmRNAの発現レベルが低かった。
培養ヒト腎癌細胞株２９３は培地中より血清を除くことにより、アポトーシスが誘導され死細胞が増加する。この細胞系を用い、ガンキリン遺伝子のアポトーシス誘導に対する作用を検討した。実験に先立ち、１０μｇの上記のｐＭＫＩＴ−ＮＥＯベクターを用い、各遺伝子をリン酸カルシウム共沈法により２９３細胞にトランスフェクトし、G418選択培地にてそれぞれの遺伝子を安定に導入された複数個のクローンを得、以降の実験に供した。
なお、この際、３回のトランスフェクション実験のG418選択培地より得られたコロニーフォーカス数の平均値は、対照クローンで５６±４、センスクローンで７０±４、そしてアンチセンスクローンで２３±３であった。したがって、ガンキリンポリペプチドが細胞増殖促進ないしアポトーシス誘導抑制に作用していることが示された。
各２９３細胞クローンを用い、２×１０5細胞を６０mmの組織培養用ペトリ皿（Ｎｕｎｃ  ＧｍｂＨ）にそれぞれ播き込んだ。血清を除去した後、細胞をトリプシン処理し、浮遊細胞と付着細胞の数、およびトリパンブルー染色により死細胞数をカウントし、全細胞数に対する死細胞数の割合を求めた。
また、アポトーシス細胞数の解析には組織化学的方法を用いた。すなわち、各クローン細胞をカバーグラス上で４８時間６０％飽和密度に達するまで増殖させ、血清除去後、ＡｐｏｐＴａｇアポトーシス検出キット（Oncor製）によりアポトーシス細胞を染色し、光学顕微鏡撮影を行い全接着細胞数に対するアポトーシス細胞の割合を計測した。
上記２実験において、全細胞数に対するトリパンブルー染色全細胞数の比率（％）と、全細胞数に対するアポトーシス細胞の数の比率（％）はそれぞれ、対照クローンでは３３±５％と４５±５％であり、センスクローンでは５９±６％と３０±２％であった。したがって、ガンキリン遺伝子産物によるアポトーシスおよび細胞死が抑制されることが示された。
各クローン、２×１０6個の細胞を１０cmのペトリ皿に播手した。そしてインキュベートした後に血清を除去しアポトーシスを誘導した。アポトーシス細胞の顕著な特徴である、ヌクレオソーム間での遺伝子DNA断片化を解析するため、所定の時間後に上記細胞を穏やかに剥がし取り、付着細胞と一緒に上清に集めた。細胞を、０．２５％のＮＰ−４０及び０．１mg／mlのＲＮａｓｅを含有するＴＢＥ（４５mM  Ｔｒｉｓ−硼酸塩、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）０．２５mlに再懸濁した。
３７℃にて３０分間のインキュベーションの後、抽出物を１mg／mlのプロテイナーゼＫによりさらに３０分間、３７℃で処理した。次に、３０μｌの抽出物を０．５μｇ／mlの臭化エチジウムの存在下で１．７％アガロースゲル電気泳動を行った。その結果、センスガンキリン遺伝子を導入した細胞では対照細胞に比し、ヌクレオソーム間DNA断片化による梯子状の電気泳動パターンが減少していた。したがって、これら３実験よりガンキリン遺伝子産物がアポトーシス誘導に対し抑制的に働くことが示された。これは他のいくつかの癌原性遺伝子に認められる特徴であり、ガンキリン遺伝子が癌原性遺伝子であることを支持している。
実施例５．ガンキリンポリペプチドの相互作用
サイトメガロウィルスのエンハンサー／プロモーターを有し且つインフルエンザウィルスＨＡ（ヘモグルアチニン）エピトープの塩基配列を有するｐＣＭＶ４−３ＨＡ′ベクター（Brockman, J.A.et al, Moleculor and Cellulor Biology（1995）15, 2809-2818）に、実施例１で得たヒトガンキリンｃＤＮＡを連結して、ガンキリンとインフルエンザウィルスＨＡからなる融合ポリペプチドを発現するプラスミドｐＣＭＶ４−３ＨＡ＋gankyrinを作製した。
さらに、ベクターｐＧＥＸ（Pharmacia製）にヒトガンキリンコード配列を挿入することによりＧＳＴ（グルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ）とガンキリンからなる融合ポリペプチドを発現するプラスミドｐＧＥＸ−gankyrinを作製した。
１０μｇのｐＣＭＶ４−３ＨＡ＋gankyrinを用いてリン酸カルシウム法により２９３細胞を一時的にトランスフェクトした。大腸菌にｐＧＥＸ−gankyrinを導入し、そして１mM  ＩＰＴＧによりＧＳＴ−ガンキリン融合ポリペプチドの生産を誘導した。４℃での遠心分離により細胞を回収し、そしてTriton−Ｘ１００を含むＰＢＳ中での音波処理により細胞を溶解した。この細胞溶解物を、２９３細胞形質転換体からの全細胞抽出物と混合し、そして４℃にて１６時間インキュベートした。
ＧＳＴ融合ポリペプチドをグルタチオン−Sepharose ４Ｂ（Pharmacia製）上に集め、そして抗Ｒｂ抗体、抗ＮＦκＢｐ５０抗体、及び抗ＮＦκＢｐ６５（いずれもSanta Crutz製）を用いるウエスタンブロット法により分析した。
細胞抽出物及び免疫沈澱の調製は次のようにして行った。５０mM  ＨＥＰＥＳ（pH７．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＧＴＡ、１mM  ＤＴＴ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤及びフォスファターゼ阻害剤を含有するＩＰ緩衝液に細胞を懸濁し、音波処理し、そして次に４℃にて１０分間１００００×ｇで遠心分離した。抗ＨＡ抗体、抗Ｒｂ抗体、抗ＮＦκＢｐ５０抗体又は抗ＮＦκＢｐ６５抗体によりプレコートされたプロテインＡ−Sepharose ＣＬ４Ｂ（Pharmacia製）を用いて、４℃にて１６時間、上清を沈降せしめた。
ビーズ上の免疫沈降した蛋白質をＩＰ緩衝液により１０回洗浄した。２×ＳＤＳサンプル緩衝液中の沈澱をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そして抗ＨＡ抗体、抗Ｒｂ抗体、抗ＮＦκＢｐ５０抗体又は抗ＮＦκＢｐ６５抗体を用いるウエスタンブロット法により分析した。
次に結果を示す。
インビトロで細胞の溶解物を用いた結果を図９に示す。ＧＳＴのみあるいはＧＳＴとガンキリンの融合ポリペプチドを大腸菌で発現させ、これを回収した。ヒト２９３細胞の溶解物と先に得られたＧＳＴのみあるいはＧＳＴ−ガンキリン融合ポリペプチドを混ぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させこれを電気泳動した。
電気泳動したゲルをニトロセルロース膜に転写し（Ａ）抗Ｒｂ抗体、（Ｂ）抗ｐ５０抗体および（Ｃ）抗ｐ６５抗体で検出した結果を示す。（Ａ）において、レーン左から、ヒト２９３細胞の溶解物のみ、ヒト２９３細胞の溶解物と大腸菌で発現させた上記ＧＳＴポリペプチドをまぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させたもの、および、ヒト２９３細胞の溶解物と大腸菌で発現させた融合ポリペプチドをまぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させたものの結果を示す。
（Ｂ）において、レーン左から、ヒト２９３細胞の溶解物のみ、ヒト２９３細胞の溶解物と大腸菌で発現させたＧＳＴポリペプチドをまぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させたもの、および、ヒト２９３細胞の溶解物と大腸菌で発現させた融合ポリペプチドをまぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させたものの結果を示す。（Ｃ）において、レーン左から、ヒト２９３細胞の溶解物のみ、ヒト２９３細胞の溶解物と大腸菌で発現させたＧＳＴポリペプチドをまぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させたもの、および、ヒト２９３細胞の溶解物と大腸菌で発現させた融合ポリペプチドをまぜ、グルタチオン結合セファロースで沈降させたものの結果を示す。
細胞のインビボ実験を図１０に示す。ＨＡと融合させたガンキリンを発現するヒト２９３細胞の溶解物を（Ａ）抗Ｒｂ抗体、（Ｂ）抗ｐ５０抗体あるいは（Ｃ）抗ｐ６５抗体で免疫沈降し、次いで抗ＨＡ抗体で検出するとＨＡ融合ガンキリンポリペプチドが検出された。（Ａ）において、ガンキリン遺伝子を含まないベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン１）又は抗Ｒｂ抗体（レーン２）で沈降させ、それを電気泳動して抗ＨＡ抗体で検出したもの、ガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン３）又は抗Ｒｂ抗体（レーン４）で沈降させ、それを電気泳動して抗ＨＡ抗体で検出したものの結果を示す。
（Ｂ）において、レーンは、ガンキリン遺伝子を含まないベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン１）又は抗ｐ５０抗体（レーン２）で沈降させ、それを電気泳動して抗ＨＡ抗体で検出したもの、ガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン３）又は抗ｐ５０抗体（レーン４）で沈降させ、それを電気泳動して抗ＨＡ抗体で検出したもの、およびガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を電気泳動したもの（レーン５）を抗ＨＡ抗体で検出したものの結果を示す。
（Ｃ）において、レーンは、ガンキリン遺伝子を含まないベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン１）又は抗ｐ６５抗体（レーン２）で沈降させ、それを電気泳動して抗ＨＡ抗体で検出したもの、ガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン３）又は抗ｐ６５抗体（レーン４）で沈降させ、それを電気泳動して抗ＨＡ抗体で検出したもの、およびガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物（レーン５）を電気泳動したものを抗ＨＡ抗体で検出したものの結果を示す。
細胞のインビボ実験の結果を図１１に示す。ＨＡとガンキリンからなる融合ポリペプチドを発現するヒト２９３細胞の溶解物を抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、（Ａ）抗Ｒｂ抗体あるいは（Ｂ）抗ｐ６５抗体で検出すると各々Ｒｂあるいはｐ６５が検出された。
（Ａ）において、レーンは、ガンキリン遺伝子を含まないベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を電気泳動して抗Ｒｂ抗体（レーン１）で検出したもの、ガンキリン遺伝子を含まないベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン２）又は抗ＨＡ抗体（レーン３）で沈降させ、それを電気泳動して抗Ｒｂ抗体で検出したもの、ガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン４）又は抗ＨＡ抗体（レーン５）で沈降させ、それを電気泳動して抗Ｒｂ抗体で検出したものの結果を示す。
（Ｂ）において、レーンは、ガンキリン遺伝子を含まないベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を、非特異的イムノグロブリン（レーン１）又は抗ＨＡ抗体（レーン２）で沈降させ、それを電気泳動して抗ｐ６５抗体で検出したもの、ガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物を非特異的イムノグロブリン（レーン３）又は抗ＨＡ抗体（レーン４）で沈降させ、それを電気泳動して抗ｐ６５抗体で検出したもの、およびガンキリン遺伝子を含むベクターで形質転換したヒト２９３細胞の溶解物（レーン５）を電気泳動したものを抗ｐ６５抗体で検出したものの結果を示す。
これらの結果、ガンキリンポリペプチドは細胞内（in vivo）でRb又はＮＦκＢと相互作用することが示された。
実施例６．細胞周期とガンキリン遺伝子発現
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を７２時間にわたる血清飢餓（serum starvation）により細胞周期を初期Ｇ１期に固定し、そして血清の再添加により細胞周期を同調させた。細胞を溶解し、ｍＲＮＡを抽出して、ガンキリンｃＤＮＡをプローブとして検出を行った。すなわち、マウスガンキリンのコーディング領域のｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲ法により増幅した後、32Ｐを用いてランダムプライミングで標識したものをプローブとして用い、ノーザンブロット法にてｍＲＮＡを検出した。
各々の細胞手段の細胞周期解析にはフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた。すなわち、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含有しないＰＢＳにて細胞を洗浄し、トリプシン処理を行った。次いで、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで細胞を洗浄して回収し、サンプルバッファーでもう一度洗浄して再懸濁した後、７０％エタノールで細胞を固定した。これをＰＩ（Ｐｒｏｐｉｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ）で染色してフローサイトメーターで測定した。
図１２に結果を示す。図１２において、各レーンは血清再添加後、１時間（レーン１）、３時間（レーン２）、６時間（レーン３）、９時間（レーン４）、１２時間（レーン５）、１５時間（レーン６）、１８時間（レーン７）、２１時間（レーン８）、２４時間（レーン９）、２７時間（レーン１０）、３０時間（レーン１１）及び３３時間（レーン１２）の結果を示す。１〜９時間（レーン１〜４）はＧ１期であり、１２〜１８時間（レーン５〜７）はＳ期であり、２１〜２４時間（レーン８〜９）はＧ２＋Ｍ期であり、２７時間（レーン１０）以後再びＧ１期にもどる。
種々の細胞濃度で増殖した細胞中に発現しているｍＲＮＡの検出の結果を図１３に示す。この図において、細胞濃度１×１０6細胞／１００mmディッシュ（レーン１）、２×１０6細胞（レーン２）、３×１０6細胞（レーン３）及び４×１０6細胞（レーン４）の結果を示す。
部分的肝切除を行った後のマウスの肝再生過程で発現するｍＲＮＡの検出結果を図１４に示す。部分的肝切除前（レーン１）、並びに部分的肝切除から１時間後（レーン２）、６時間後（レーン３）、２４時間後（レーン４）、４８時間後（レーン５）、７２時間後（レーン６）及び１６８時間後（レーン７）の結果を示す。
細胞周期を同調したＮＩＨ３Ｔ３細胞にてガンキリンのｍＲＮＡを調べると、ガンキリンは細胞周期にしたがい発現が変化した。また、部分肝切除マウスの肝でも同様に細胞周期にしたがい発現が変化した。これらのことからガンキリンは細胞周期の進行に伴い、G1期からS期に発現が亢進することが示され、細胞周期制御との関連が示唆された。
実施例７．アンチセンス鎖による肝癌細胞抑制効果
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いて、ヒトガンキリン・アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体（配列：CCTGTCGCTTTACCTCCCCA）（配列番号：８）及び（TACCTCCCCACACACAGATT）（配列番号：９）の肝細胞増殖抑制効果を調べた。培養液として２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０（ニッスイ）を用いた。
１mlの培養液を入れた３５mm培養皿を一晩３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで保存し、これに０．２５％トリプシン処理とピペッティングにより単一細胞にしたＨｅｐＧ２細胞を１×１０2個ずつ加えた。２４時間後、ガンキリン遺伝子の開始コドンを含むヒトガンキリンアンチセンスオリゴヌクレオチド（０、２．５及び１０μｇ／ml）を含む１mlの培養液と交換し、さらに４日間培養した。３０個以上の細胞塊をコロニーとして定義し、倒立顕微鏡下でそれぞれの個数を数えた。すなわち、蒸留水を加えた対照を１００％として、センスオリゴヌクレオチドを添加した場合のコロニー数は９５±７％であるのに対してアンチセンスヌクレオチドを添加した場合にはコロニー数は７０±５％に減少した。
ヒトガンキリンアンチセンスオリゴヌクレオチドはコロニーの形成に対する抑制効果を示した。この結果、ガンキリン遺伝子の開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは肝癌細胞株ＨｅｐＧ２の細胞増殖を抑制することが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明のガンキリンポリペプチドは細胞のコロニー形成能の増加、マウスにおける造腫瘍能及びアポトーシス誘導の抑制等の作用を示すことから、癌原性を有することが示された。ガンキリンポリペプチドおよびそれをコードするDNAは、発癌の作用機序の解明のために有用である。また、ガンキリンポリペプチドを使用したスクリーニング方法、ガンキリンポリペプチドに対する抗体、それを用いたガンキリンポリペプチドの検出又は測定方法およびガンキリンポリペプチドをコードするDNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドも同様に発癌の作用機序の解明のために有用である。
特許協力条約第13規則の２の寄託された微生物への言及及び寄託機関
寄託機関  名  称：工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１−３
微生物（1） 表  示：Escherichia coli DH5α〔pBS-t4-11〕
寄託番号：FERM BP-6128
寄託日：1997年９月29日
配  列
配列：１
配列の長さ：７８０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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0004229475.tif 000007
配列：２
配列の長さ：２２６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
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配列：３
配列の長さ：６９６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
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配列：４
配列の長さ：２３１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
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配列：５
配列の長さ：６９６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
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配列：６
配列の長さ：２３１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
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配列：７
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列：８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Synthetic ＤＮＡ
配列
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配列：９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Synthetic ＤＮＡ
配列
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配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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