(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動法で用いられる試料に希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を標識剤として標識する標識方法。
【請求項２】
電気泳動法が、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする請求項１に記載の標識方法。
【請求項３】
電気泳動法が、スラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法、アガロースゲル法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）法、または免疫電気泳動法であることを特徴とする請求項１に記載の標識方法。
【請求項４】
ブロッティング操作が併用されることを特徴とする請求項３に記載の標識方法。
【請求項５】
試料が、蛋白質、核酸、糖質、または脂質であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の標識方法。
【請求項６】
試料がアミノ酸であることを特徴とする請求項２に記載の標識方法。
【請求項７】
希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を標識した試料の電気泳動法による分析検出法。
【請求項８】
電気泳動法が、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする請求項７に記載の分析検出法。
【請求項９】
電気泳動法が、スラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法、アガロースゲル法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）法、または免疫電気泳動法であることを特徴とする請求項７に記載の分析検出法。
【請求項１０】
ブロッティング操作が併用されることを特徴とする請求項９に記載の分析検出法。
【請求項１１】
試料が、蛋白質、核酸、糖質、または脂質であることを特徴とする請求項７から１０のいずれかに記載の分析検出法。
【請求項１２】
試料がアミノ酸であることを特徴とする請求項８に記載の分析検出法。
【請求項１３】
電気泳動法による検出方法が時間分解の検出方法であることを特徴とする請求項８に記載の分析検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、希土類蛍光錯体を用いた標識方法と分析検出法に関するものである。
【背景技術】  従来より、生物の機能を細胞レベルで明らかにするために、生体内のタンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、糖質、神経伝達関連物質などの解析、分析が行われている。その手段として、質量分析計を組み合わせた高速液体クロマトグラフィー等が行われてきたが、その理論段数はキャピラリー電気泳動に及ばない。そのことは、例えばオリゴヌクレオチドの分離分析において、キャピラリー電気泳動では１，０００，０００、高速液体クロマトグラフィーでは３０，０００程度であることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。さらに加えて、分析に必要なサンプルの絶対量が高速液体クロマトグラフィーと比較して微量である（高速液体クロマトグラフィーでは数ｍｌ、キャピラリー電気泳動法ではｐｌレベルである）ので分離分析にはキャピラリー電気泳動法が利用される。また、キャピラリー電気泳動はヒューマンゲノムプロジェクトで使用されているように、その高分解能には定評があり、最近ではタンパク質、アミノ酸などの分析にも多く利用される。
しかし、多くの場合、検出はサンプルの吸光度を測定しているため、検出限界がおおむね悪く、試料の種類により検出限界が異なる欠点がある。それらの欠点を解消するために、蛍光物質をアミノ酸に標識して測定している例がある（例えば、非特許文献２参照）が、その標識方法は複雑であり、また、検出に高出力のレーザーを利用しているので、実際の測定には使用が困難である。その他のアミノ酸の測定は、例えば、紫外部の吸収を強くするために誘導化したアミノ酸、具体的には誘導化試薬としてフェニルイソチオシアネートを用いたフェニルチオヒダントイン−アミノ酸及び、ダンシルクロリドを利用したダンシル−アミノ酸の吸収を利用して測定するものが広く利用されている（例えば、非特許文献３参照）。しかし、その検出限界はｍＭ程度である。
ペプチドやタンパク質の分析もキャピラリー電気泳動を利用して行われている。ペプチド分析ではほとんどの場合、タンパク質を酵素により分解したものであり、ペプチドの分離を向上するために、多くの労力を割いている。また、その検出に専ら吸収の方法が用いられている。また、タンパク質の分離分析は、吸収の方法で検出しているが、吸収で検出する場合には例えば、ポリマーを充填したキャピラリーゲル電気泳動を利用する場合には、充填するゲルやポリマーの吸収により、測定限界が悪くなる場合がある。また、最近になって、レーザー励起による蛍光を測定してタンパク質を分析した例などが見られる（例えば、非特許文献４参照）。その際には、分析対象物となるタンパク質は３−（２−ｆｕｒｏｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ（ＦＱ）により標識されているが、標識剤の導入順序などの複雑な前処理が存在しするので、簡便な分離方法としては適していない。
以上のことを整理すると、キャピラリー電気泳動は優れた分離能をもつことが示されているが、その検出においては、濃度にしてｐｐｍ以下例えば１０−９Ｍやｐｐｂの超微量分析にまで到達したものは少ない。そこで、新しい生体関連物質に対しての標識剤の開発が期待される。その一つとして、希土類蛍光錯体を利用した標識剤は（１）蛍光強度が強い（２）蛍光寿命が長い（３）溶液中で安定であるなどの特徴を持った優れた標識剤としての特徴を持つ。
ところで、蛍光を発する蛍光金属錯体を生体物質に標識して分析しようとする試みは１９７５年にユーロピウムキレートを抗体に標識したのが初めてである（例えば、非特許文献５参照）。その後、生体物質の検出に必要な条件、蛍光寿命が長いこと、強い蛍光性、水溶液中で安定であること等を満たすユーロピウム錯体の研究開発が行われることに伴い、ＬＫＢシステムと呼ばれる標識の方法が（米）Ｗａｌｌａｃ社により開発された。しかし、この方法では、タンパク質に標識はできるが、標識されたヨウロピウム自身は蛍光を持たず、また、溶液中からの未反応のヨウロピウムのお影響を強く受けることや、標識の際の反応経路が多いこと、固相化できないなどの欠点があり、そのままでは利用できなかった。その後、それらの欠点を克服するために、蛍光性ユウロピウム錯体４，７−ｂｉｓ（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ−２，９−ｄｉｅａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＰＤＡ）が合成され、ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒシステムと呼ばれる方法が開発された。
この方法を利用して時間分解イムノアッセイを実行した例がある（例えば、非特許文献６参照）が、蛍光強度がＬＫＢに比べて弱いという欠点があり、高感度測定は達成できなかった。それらの欠点を補うために、多くの金属錯体が合成された（例えば、非特許文献７，８参照）が、蛍光強度が弱い、あるいは、生体分子との結合が弱いなどの欠点が存在し、高感度検出できる標識剤の合成ができなかった。
近年になって、新たに合成された希土類蛍光錯体を利用して生化学物質の高感度分析、特に、タンパク質をイムノアッセイにより分析する際の標識剤が利用されてきた（例えば、非特許文献９，１０参照）。具体的には、ハイブラリゼーションアッセイや２つの違った標識剤を利用してイムノアッセイを行った例などがある。詳しく述べると、ハイブラリゼーションアッセイは核酸がその相補的配列と２本鎖を作ることを利用してＤＮＡやＲＮＡの検出定量に広く用いられている。さらには、この文献では蛍光のエネルギー転移を利用することによってＢ／Ｆ分離を不要としている。また、タンパク質や抗原の分析では、ヨウロピウムとサマリウムの錯体を利用して、ヒト血清中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）とカリシオエンブリオニック抗原、Ｃａｒｃｉｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）を同時に高感度分析を行った例などがあり、その有用性は実証されている。これらの方法で、希土類蛍光錯体を利用することによって、従来の有機色素より、約１００倍程度の検出限界を得ている。
このような高感度を提供する標識剤を利用して、生体分子を従来の分離技術、高速液体クロマトグラフィーを利用して分離した例が報告されている（例えば、非特許文献１１参照）。また、アミノ酸に標識することによって、高速液体クロマトグラフィーを用いて分離しようと試みた例もあるが、その分離は完全でない。そこで、高速液体クロマトグラフィーより大きい理論段数を持つキャピラリー電気泳動法を利用した分離分析が期待されるが、これまでは、サンプルの分離後に金属錯体を導入し、蛍光を検出する方法であった（例えば、非特許文献１２参照）。この方法では、検出部の構造が複雑になり、また、配位子と結合する金属を完全に制御することが難しいので、定量分析には向いていない。つまり、金属の状態は、多くの場合、高電圧下での分析では、錯体を構成している希土類金属が不安定になり、蛍光を発しない場合や蛍光強度が弱くなっていた。
さらに、金属錯体を構成する金属イオンが、キャピラリーの内壁に強く吸着することによって、分離能が損なわれてしまう現象があり、上記文献では、金属を分離の後に導入することにより、蛍光を検出している。このことによる欠点は、まずテルビウムなどの水和金属イオンの弱い蛍光を避けることが難しいこと、反応を完全に制御できないことから、定量分析に向かないと言う欠点がある。以上のことから、標識剤としては高感度であるにもかかわらず、電気泳動の方法と組み合わせることによる高感度分析が提供されていないのが現状であった。
また、発明者らは、ユウロピウム（Ｅｕ）と４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−クロロスルホ−ｏ−テルフェニル（ＢＨＨＣＴ）とからなる希土類金属錯体などを用いた分析方法を提案している（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、ここで提案されている希土類蛍光錯体は、金属が配位子から抜けやすく蛍光が減少するなど十分ではなく、より最良のものが求められてもいる。
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｈｏｒｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，第５５８号  １９９１年  ｐｐ２８０
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２巻  ｐｐ５６２‐ｐｐ５６４
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｏｒｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５４５巻  ｐｐ３５０（１９９１年）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，第８９４巻  ｐｐ２９１−２９６（２０００年）
【非特許文献５】Ｔｕｔｏｒｉａｌｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，ｐｐ３１３（１９７６年）
【非特許文献６】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０巻  ｐｐ１０６９‐１０７４（１９８８年）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１１５巻  ｐｐ１１０３２‐１１０４０（１９９３年）
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ，１７９巻  ｐｐ２３３‐２４０（１９９５年）
【非特許文献９】蛋白質核酸酵素，４８巻第１１号  ｐｐ１５５０‐１５５８（２００３年）
【非特許文献１０】マテリアルインテグレション，１７巻第３号  ｐｐ４５‐ｐｐ４９（２００３年）
【非特許文献１１】Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２３巻第２号  ｐｐ７３‐７８（２００２年）
【非特許文献１２】ＨＲＣ−Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，第２０巻  ｐｐ６３８−６４２（１９９７年）
【特許文献１】特開２００１−３５６１２８号公報
【発明の開示】
本願発明は、以上の通りの背景から、電場の強弱に寄らず安定した蛍光強度を示し、電気泳動法で用いられる分析対象物の生体物質（試料）を比較的簡便に標識できる標識方法と、生体物質（試料）の高感度な分析を可能とする分析検出法を提供することを課題としている。
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、電気泳動法で用いられる試料に希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を標識剤として標識する標識方法を提供する。
そして、第２には、上記の標識方法において、電気泳動法がキャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする標識方法を提供する。
また、本願発明は、第３には、上記の標識方法において、電気泳動法がスラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法、アガロースゲル法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）法、または免疫電気泳動法であることを特徴とする標識方法を、第４には、ブロッティング操作が併用されることを特徴とする標識方法を提供する。
さらに、本願発明は、第５には、試料が蛋白質、核酸、糖質、または脂質であることを特徴とする標識方法を、第６には、上記第２の標識方法において、試料がアミノ酸であることを特徴とする標識方法をも提供する。
そして、本願発明は、第７には、希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を標識した試料の電気泳動法による分析検出法を提供する。
また、本願発明は、第８には、上記の分析検出法において、電気泳動法がキャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする標識方法を提供する。
さらに、本願発明は、第９には、上記の分析検出法において、電気泳動法がスラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法、アガロースゲル法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）法、または免疫電気泳動法であることを特徴とする標識方法を、第１０には、ブロッティング操作が併用されることを特徴とする分析検出法を提供する。
また、本願発明は、第１１には、試料が蛋白質、核酸、糖質、または脂質であることを特徴とする分析検出法を、第１２には、上記第８の分析検出法において、試料がアミノ酸であることを特徴とする分析検出法をも提供する。
そして、本願発明は、第１３には、上記第８の分析検出法において、電気泳動法による検出方法が時間分解の検出方法であることを特徴とする分析検出法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１における標識蛋白質の泳動像の観察結果である。
図２は、実施例１において、泳動像からバンドの移動度を計測し、分子量の対数に対してプロットしたグラフである。
図３は、実施例２におけるキャピラリーゲル電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質の分析結果である。
図４は、実施例２におけるキャピラリーゲル電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質の分析結果において、ピークの位置について、そのキャピラリー電気泳動での移動時間と、それぞれの分子量との相関関係をプロットしたグラフである。
図５は、実施例３におけるキャピラリーゲル電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識されたストレプトアビジンの高感度検出結果である。
図６は、実施例３におけるキャピラリーゲル電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識されたストレプトアビジンの高感度検出結果において、ピークの強度について、その濃度との相関関係をプロットしたグラフである。
図７は、実施例４におけるキャピラリーゲル電気泳動ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識された蛋白質のより高い電場中での分離分析結果である。
図８は、実施例５におけるＩｇＧ蛋白のＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動での分離分析結果である。
図９は、実施例５におけるＩｇＧ蛋白のＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動での分離分析結果について、実施例２で得られた検量線を用いて回帰したグラフである。
図１０は、実施例６におけるパルスフィールド時間分解キャピラリー電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋で標識した実施例２における蛋白質の分析結果である。
図１１は、実施例７におけるＩｇＧ蛋白のｎａｔｉｖｅキャピラリーゲル電気泳動での分離分析結果である。（ａ）がＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識した抗体のみのｎａｔｉｖｅキャピラリーゲル電気泳動の結果でピーク１がそのピークである。（ｂ）は抗原抗体複合体をキャピラリーゲル電気泳動で分離分析した結果であり、ピーク１がＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識した抗体のピークで、ピーク２はＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識した抗体と子牛胎児血清中の未標識抗原との抗原抗体複合体のピークである。
図１２は、実施例７で得られた子牛胎児血清中の抗原の濃度とｎａｔｉｖｅキャピラリーゲル電気泳動で得られた抗原抗体によるピークの強度との相関から得られた検量線を用いて作成した回帰直線のグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  本願発明は前記のとおりの特徴をもつものであるが、以下に、発明を実施するための最良の形態を説明する。
本願発明は、電気泳動法で用いられる試料に希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を標識剤として標識する標識方法を提供するものである。
ここで、希土類蛍光錯体を構成する配位子であるＤＴＢＴＡは、２，２’，２’’，２’’’−｛［（４，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｙｌ］−２，２’，６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ−６，６’’−ｄｉｙｌ｝ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄとして表され、希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋は下記式で表される。
0004320342.tif 000002
この希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋は、例えば、本発明者らによって提案された方法（国際公開番号：ＷＯ２００３／０７６９３８）によって製造される。
電気泳動法としては、例えば１００μｍ以下のキャピラリー内で行うキャピラリー電気泳動法であることが好ましい。キャピラリーを用いる場合、非常に高い電場（１００〜５００Ｖｃｍ−１）を印加しても流れる電流は小さく、電気泳動を行う場合で大きな問題となっていたジュール熱の発生を最小限に抑えることが可能である。また、キャピラリーは内容積に対して表面積の比率が大きいため、発生するジュール熱を効率良く拡散することも可能であり、短い分析時間で高い分離効率が得られるものである。また、キャピラリー電気泳動法以外では、中空キャピラリーを用いたキャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動等の電気泳動法であってもよい。
本願発明の標識方法においては、スラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法、アガロースゲル法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）法、または免疫電気泳動法が挙げられ、膜電気泳動法としてはセルロースアセテート膜電気泳動法等も考慮される。また、ブロッティング操作を併用してもよい。
これらのうち、特にキャピラリー電気泳動は、スラブゲル電気泳動法と比較して、迅速な分析、ジュール熱の分散等の点で優れているので好ましい。
本願発明の標識方法においては、電気泳動法で用いられる試料を希土類蛍光錯体で標識するには、電気泳動試料を含む可能性のある被検試料と、希土類蛍光錯体とを、接触させることにより実施することができる。例えば、希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋と試料をそれぞれｐＨ９．０〜９．５の炭酸緩衝溶液に溶解し、両者を混合して反応させることで電気泳動試料を標識することができる。
試料としては、蛋白質、核酸、糖質、脂質、アミノ酸であることが好ましい。アミノ酸の場合には、電気泳動法がキャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動であることがこの好ましい。
また、本願発明では、標識剤に適する分離分析のための電気泳動条件を提供することにより、上記のとおりの希土類蛍光錯体ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を標識した試料の高感度な分析を可能とする分析検出法を提供するものである。
このような電気泳動法としては、上記のとおり、例えば１００μｍ以下のキャピラリー内で行うキャピラリー電気泳動法であることが好ましい。キャピラリーを用いる場合、非常に高い電場（１００〜５００Ｖｃｍ−１）を印加しても流れる電流は小さく、電気泳動を行う場合で大きな問題となっていたジュール熱の発生を最小限に抑えることが可能である。
また、キャピラリーは内容積に対して表面積の比率が大きいため、発生するジュール熱を効率良く拡散することも可能であり、短い分析時間で高い分離効率が得られるものである。また、キャピラリー電気泳動法以外では、中空キャピラリーを用いたキャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動等の電気泳動法であってもよい。
さらに、本願発明では、電気泳動法として、例えばスラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法、アガロースゲル法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）法、または免疫電気泳動法が挙げられ、膜電気泳動法としてはセルロースアセテート膜電気泳動法等も考慮される。また、ブロッティング操作を併用してもよい。
これらのうち、特にキャピラリー電気泳動は、スラブゲル電気泳動法と比較して、迅速な分析、ジュール熱の分散等の点で優れているので好ましい。
試料としては、蛋白質、核酸、糖質、脂質、アミノ酸であることが好ましい。アミノ酸の場合には、電気泳動法がキャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリーＳＤＳ電気泳動、ミセル導電電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、またはＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動であることがこの好ましい。
本願発明の分析検出法は、電場中、例えば数ｋＶの電圧下で用いて、その蛍光が失われず、安定な金属錯体ＤＴＢＴＡをタンパク質に標識してキャピラリー電気泳動を行うことによって、分離分析が可能となる。また、この錯体は上記のように通常の平板ゲル電気泳動でも使用可能である。
キャピラリーの内壁は通常マイナスに電荷を帯びているが、これを内壁処理することによって、電荷をなくし、錯体を構成している金属が内壁と相互作用するのが緩和される。
従来の吸収や蛍光による検出法は、特に内部充填するポリマー、緩衝液による吸収やバックグランド蛍光のため、特に高感度分析を行うという点ではその検出限界がｍＭ程度までしか上がらなかった。そこで、さらに、標識剤の優れた特徴を生かすために、キャピラリー電気泳動においては、時間分解の方法を用いることで、標識剤からのシグナルをより効率よく測定することができるものである。このことにより、例えば、充填されているゲル、ポリマーなどの分子篩い物質からのバックグラウンドシグナルを軽減し、また、緩衝液や狭雑物からの蛍光を避けての測定が可能とされる。すなわち、ポリマーや緩衝液からの蛍光の寿命が１０ナノ秒以下なので、それらを除去して測定することで検出感度を上げることができるものである。ここで、分子篩い物質とは、キャピラリー内部に充填するゲル、ポリマーなどのサンプルの泳動に篩い効果を出すための充填剤を示すものである。
本願発明の分析検出法によれば、金属錯体が従来持つ高い量子効率を生かし、検出限界を約１００倍程度まで可能な高感度分析となる。これは金属錯体のストークスシフトが大きいことによる起因も併せた効果である。
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって発明が限定されることはない。
【実施例】＜実施例１＞
＜ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質の調製＞
本願発明に用いた蛋白質は、２ｍｇ／ｍｌとなるよう１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９，１）に溶解した。ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋は、１ｍｇ／ｍｌとなるよう１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９，１）に溶解し、上記蛋白質溶液と体積比で１：１となるよう混合し、室温で３時間反応させた。反応後、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−２５カラムを用いたゲルろ過で未反応のＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を除去し、標識蛋白質画分を調製した。
＜スラブゲルによるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質の分析＞
Ｌａｅｍｍｌｉの系でＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。分離ゲルは、１２〜１７．５％のグラジエントゲルを用いた。泳動後、ゲルにＵＶトランスイルミネーターによってＵＶ光を照射し標識蛋白質の泳動像を観察したところ、Ｅｕ３＋錯体特有の赤色の蛍光を有するバンドを確認した。この結果を図１に示す。
この泳動像からバンドの移動度を計測し、分子量の対数に対してプロットしたところ、良好な直線関係が得られた。この結果を図２に示す。
＜実施例２＞
＜キャピラリーゲル電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質の分析＞
実施例１で調製したＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質のサンプルを印加電圧４０００Ｖ（電場強度１００Ｖ／ｃｍ）でＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動を行った。分離には、交換が可能な５％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液を利用した。５％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液は市販のヒドロキシエチルセルロースを緩衝溶液、この場合には通常、蛋白質の分離分析で利用されるＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ，ｐＨ８．３を利用して重量％で５％になるように作成したものである。検出には時間分解キャピラリー電気泳動システムを利用し、３５０ｎｍ励起で６１０ｎｍ検出で、遅延蛍光検出が１００μｓｅｃで行った。この結果を図３に示す。
図３におけるそれぞれのバンドの帰属は１：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，８ｎＭ，ＭＷ＝１４，３００  ２：ｂ−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，６．６ｎＭ，ＭＷ＝１８，３００  ３：Ｔｌｙｐｓｉｎｏｇｅｎ，５．４ｎＭ，ＭＷ＝２４，０００  ４：Ａｌｂｕｍｉｎ，ｅｇｇ，２．８ｎＭ，ＭＷ＝４５，０００  ５：ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ），２ｎＭ，ＭＷ＝６６，０００である。
ピークの位置について、その移動度を計算し、それぞれの分子量との相関を調べたところ、良好な直線関係が得られた。この結果を図４に示す。
＜実施例３＞
＜キャピラリーゲル電気泳動によるＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識されたストレプトアビジンの高感度検出＞
ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識ストレプトアビジン（Ｓ−Ａｖｉｄｉｎ）のサンプルを印加電圧４０００Ｖ（電場強度１００Ｖ／ｃｍ）でＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動を行った。分離には、交換が可能な１％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液を利用した。５％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液は市販のヒドロキシエチルセルロースを緩衝溶液、この場合には通常、蛋白質の分離分析で利用されるＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ，ｐＨ８．３を利用して重量％で５％になるように作成したものである。検出には時間分解キャピラリー電気泳動システムを利用し、３５０ｎｍ励起で６１０ｎｍ検出で、遅延蛍光検出が１００μｓｅｃで行った。この結果を図５に示す。
ピークの強度について、その濃度との相関関係は良好な直線が得られた。この結果を図６に示す。また、検出限界は５×１０−１１Ｍ（Ｓ／Ｎ比＝３．９）であった。
＜実施例４＞
＜キャピラリーゲル電気泳動ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識された蛋白質の高い電場での分離分析＞
実施例１で調製したＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質のサンプルを印加電圧１００００Ｖ（電場強度２５０Ｖ／ｃｍ）でＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動を行った。分子篩いの濃度、検出条件は実施例２と同じである。この結果を図７に示す。
図７におけるそれぞれのバンドの帰属は１：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＭＷ＝１４，３００  ２：ｂ−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＭＷ＝１８，３００  ３：Ｔｌｙｐｓｉｎｏｇｅｎ，ＭＷ＝２４，０００  ４：Ａｌｂｕｍｉｎ，ｅｇｇ，ＭＷ＝４５，０００  ５：ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ），ＭＷ＝６６，０００である。
＜実施例５＞
＜ＩｇＧ蛋白のＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動＞
ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識されたＩｇＧを還元剤で処理し、実施例２と同じ条件で分離分析したところ、長鎖と軽鎖のバンドが確認できた。この結果を図８に示す。
これを実施例２で得られた検量線を用いて回帰したところ、それらの分子量は長鎖がおよそ４４０００、軽鎖がおよそ３００００であった。この結果を図９に示す。
図９におけるそれぞれのバンドの帰属は１：軽鎖２：長鎖である。
＜実施例６＞
＜パルスフィールド時間分解キャピラリー電気泳動＞
実施例１で調製したＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識蛋白質のサンプルを矩形波により分離分析を行った。泳動方向に対して順方向に６６００Ｖ、逆方向に３３００Ｖの電圧を１２．５Ｈｚで印加し、キャピラリーゲル電気泳動で分離分析を行った。分離には、交換が可能な６％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液を利用し、検出には時間分解キャピラリー電気泳動システムを利用し、３５０ｎｍ励起で６１０ｎｍ検出で、遅延蛍光検出が１００μｓｅｃで行った。６％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液は市販のヒドロキシエチルセルロースを緩衝溶液、この場合には通常、蛋白質の分離分析で利用されるＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ，ｐＨ８．３を利用して重量％で６％になるように作成したものである。この結果を図１０（ａ）（ｂ）に示す。（ａ）はパルスフィールド時間分解キャピラリー電気泳動での結果を表し、（ｂ）は対照実験として行った直流波（３３００ＶＤＣ）による結果を表している。
図１０（ａ）（ｂ）におけるそれぞれのピークでＢＳＡのピークであるピーク１がパルスフィールド時間分解キャピラリー電気泳動ではよく分離が行われていることが分かった。
以上の結果から分子量の大きい蛋白質分子を分離する際には矩形波による分離分析、つまりパルスフィールド時間分解キャピラリー電気泳動を行うことでより分離が進むことが分かる。
＜実施例７＞
＜イムノアッセイとｎａｔｉｖｅ時間分解キャピラリー電気泳動＞
Ｓ１００蛋白質を抗原として利用してイムアッセイを行い、時間分解キャピラリーゲル電気泳動で子胎児血清中での分析した。Ｓ１００抗体をＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋で標識し、子牛胎児血清中Ｓ１００蛋白質（抗原）を定量した。Ｓ１００抗体をＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋で標識方法は実施例１で示した方法と同様である。分離分析にはＳＤＳ、還元剤を使用せず、抗原抗体をそのまま分離分析するｎａｔｉｖｅキャピラリー電気泳動により分析を行った。分離には、交換が可能な５％（Ｗ／Ｗ）のヒドロキシエチルセルロース緩衝溶液を利用し、検出には時間分解キャピラリー電気泳動システムを利用し、３５０ｎｍ励起で６１０ｎｍ検出で、遅延蛍光検出が１００μｓｅｃで行った。キャピラリーの長さはこの実験の場合３３ｃｍで、印加電圧は３３００Ｖ（１００Ｖ／ｃｍ）であった。その他の緩衝液などは実施例２と同じである。抗原抗体反応は子牛胎児血清中に添加したＳ１００蛋白質（抗原）に対して標識したＳ１００抗体を混ぜ、１時間反応させた。この結果を図１１（ａ）（ｂ）、図１２に示す。
図１１（ａ）がＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識した抗体のみのｎａｔｉｖｅキャピラリーゲル電気泳動の結果でピーク１が標識した抗体のピークである。（ｂ）は子牛胎児血清中で抗原抗体複合体を作成し、それをキャピラリーゲル電気泳動で分離分析した結果であり、ピーク１がＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識した抗体のピークで、ピーク２はＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識した抗体と子牛胎児血清中の未標識抗原との抗原抗体複合体のピークである。さらに、子牛胎児血清中へ添加するＳ１００蛋白質の濃度を変えて測定した。その結果の検量線が図１２である。時間分解キャピラリー電気泳動の方法を用いてｎａｔｉｖｅの方法で抗原を測定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】  本願発明によれば、電場の強弱に寄らず安定した蛍光強度を示し、電気泳動法で用いられる分析対象物の生体物質（試料）を比較的簡便に標識できる希土類蛍光金属錯体を標識剤とする標識方法が提供される。また、この標識剤に適する分離分析のための泳動条件を提供することにより、生体物質（試料）の高感度な分析を可能とする分析検出法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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