(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬と、検体とを、ｐＨ値が７．５〜１１の条件下で接触させる測定系に、キレート剤を共存させることを特徴とする、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解する夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防止する方法。
【請求項２】
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と、その還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解する夾雑物質とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１の液状試薬に、キレート剤を共存させることを特徴とする、前記夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防止する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬に関する。本発明の防止方法によれば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、その液状試薬の他の成分又は検体中に存在する夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を有効に防止することができる。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野において、適切な治療を行うためには正確に疾病を診断することが必要である。生体試料中の多数の生理活性物質、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、α−オキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、尿素窒素（ＵＮ）、又はクレアチニン（ＣＲＥ）などを精度良く、迅速簡便に測定することが望まれ、種々の試験法、試薬及び分析機器が開発されてきた。近年では多数の検体を短時間で処理し、自動的に測定結果を得ることが主流となり検査装置、試薬の両面で高度な性能が求められている。実際に病院や検査センター等での測定では自動分析機による測定が主流となっている。
【０００３】
前記の生体試料中の生理活性物質の測定は、すべて酵素反応を利用して測定することができる。酵素反応を利用する測定法としては、（１）一定の測定条件下で生成された生成物量を測定する方法、（２）補酵素の変化量を測定する方法、及び（３）基質の減少量を測定する方法の３つに大別することができる。特に（２）の補酵素の変化量を測定する方法が汎用されており、その補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、すなわち、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと称することがある）又は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと称することがある）と、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+ と称することがある）又は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+ と称することがある）とを適用した各種脱水素酵素による反応系が多く利用されている。基本的な反応式を示すと次のようになる。
【０００４】
【化１】
0004260245.tif 000002
【０００５】
従来、これらの試薬は、酵素等を含むものについてはその保存性を考慮して凍結乾燥の状態で供給され、使用時に緩衝液等で溶解して用いるようになっていた。しかしながら、近年はその調製の手間を省くために、当初から溶液状態のいわゆる液状試薬が広く普及してきた。特に、液状試薬の場合には、そこに含まれる酵素等の各組成成分の安定化が重要である。当然、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類もその対象であり、安定化方法に関する報告も多い。例えば、ホウ酸を添加する方法（特開昭６２−１９８６９７号公報）やアルカリ金属を添加する方法（特開平７−２２９１９２号公報）等が開示されている。
【０００６】
補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の溶液での安定性は、一般に還元型がアルカリ性溶液中で安定であり、酸化型は酸性溶液中で安定であることが知られている。実際に、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用した測定試薬で、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）や還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を含有する溶液が液状試薬であればそのｐＨはアルカリ性のものが多く、その他の組成成分の組み合わせが工夫されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、本発明者が見いだしたところによれば、例えば、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）が安定なアルカリ性の条件下において、共存する酵素活性が低下しないにもかかわらず、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量のみが極端に低下するという問題が発生することがある。生理活性物質測定系において、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量が低下すると目的とする生理活性物質の正確な測定値が得られなくなってしまう。その一般的な原因を本発明者が探求したところ、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を分解する夾雑物質が、種々のルートから測定系に混入してくることが分かった。
【０００８】
生体試料中の生理活性物質測定方法において、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を用いる測定系では酵素反応を利用するので、多くの場合、補酵素と酵素とを共存させる。補酵素と共存させる酵素は、動物組織や細菌等から精製された標品である場合がほとんどである。補酵素と共存させる酵素中にＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量を低下させ、本来の反応を阻害する物質が夾雑酵素として存在していると、生理活性物質を測定する場合に、正確な値が得られないことになる。
例えば、試薬の性能評価において、その試薬の測定上限の性能を評価する目的で、測定対象の生理活性物質が極端に高値の検体を測定する場合がある。通常の生体試料（血清等）それ自体では測定上限を評価するための検体としては十分ではないので、目的の生理活性物質を添加して人為的に高値となるように検体を調製するか、あるいは目的に合う市販の管理血清を検体として使用することになる。特に市販の管理血清は、目的物質のみならず同時に数種類の生理活性物質を有しているものが一般的である。また、その調製は、ベースとなる血清に動物組織や細菌等から精製された標品を測定目的物質として添加する。ここで、添加された標品中にＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量を低下させ、反応の場で酵素反応を阻害する物質が夾雑していた場合には、目的の生理活性物質の正確な測定値が得られないこととなる。
【０００９】
本発明者は、後述する参考例１に示すように、自動分析機によるＧＰＴ測定において、反応を阻害する夾雑物質を含む検体及び夾雑物質を含まない検体（添加されたＧＰＴは同程度の活性のもの）を同一の液状試薬で測定した。その結果、夾雑物質含有検体では、直線性が１０００ｕ／ｌ程度までしか認められないが、夾雑物質不含検体では直線性が２０００ｕ／ｌ程度まで認められた。このことは、本来なら、高値検体として測定されなければならない検体において、反応を阻害する夾雑物質が存在する場合には、所望の値が得られないことを示している。測定物質の正確な値が得られないと、生理活性物質を各種疾病の診断の指標としている医療分野に与える影響は甚大である。
【００１０】
補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用した酵素法による生理活性物質測定は、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の変化量を波長３４０ｎｍの吸光度変化量として検出して測定する。更に詳述すれば、自動分析機においては、酵素反応によるＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の吸光度の減少を利用して、あらかじめ設定した測光時間時間内で、一定の間隔で測定された吸光度から反応の速度（傾き）を求め、更に単位時間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の分子吸光係数から生理活性物質の値を算出する。又は、標準液を用いる場合は、標準液と検体との吸光度の差により目的の生理活性物質の値を算出する。ここでＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の存在量が保存中の含量の低下によって不足していたり、反応の場に共存する夾雑物質により酵素反応が阻害を受けると、正確な反応速度や、吸光度が得られないため、算出された値も不正確となる。
【００１１】
本発明者は上記のようなニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含んだ測定系において、従来使用されてきた凍結乾燥品の試薬ではなく、近年使用されるようになった液状試薬を用いた場合に、反応阻害が生じる点に着目し、その原因を追求した。その主要因は、吸光度変化の指標となるＮＡＤＨが夾雑物質として存在するヌクレオチドピロフォスファターゼにより、ＮＭＮＨ（還元型ニコチンアミドモノヌクレオチド）へ分解されることにあると考えられる。ＮＭＮＨもＮＡＤＨと同様に３４０ｎｍに最大吸収をもつため、吸収特性の面からは区別することができない。更に、ＮＭＮＨは、各種脱水素酵素とは反応しないために、本来所望の酵素反応が阻害を受けてしまうことも判明した。
【００１２】
この点に関して、後述する参考例２に示すように、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と動物由来の酵素とを含む液状試薬を保存した場合に、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）が経時的に分解されＮＭＮＨが生成することを確認した。また、前記参考例１のＧＰＴ測定例においても、夾雑物質含有検体と、安定な液状試薬として供給されている弱アルカリ性のＮＡＤＨ含有液状試薬（ｐＨ９．２）とを共存させておくと、経時的にＮＡＤＨが分解されてＮＭＮＨが生成することが確認された。
【００１３】
更に、参考例１において、自動分析機の測定で得られる一定間隔で測定された吸光度変化（いわゆるタイムコース）をグラフ化すると、ＧＰＴの反応阻害が生じる夾雑物質含有検体と、反応阻害が生じない夾雑物質不含検体では明らかに差があった。すなわち、ＧＰＴの反応阻害が生じない夾雑物質不含検体では、酵素反応が終了した時点での吸光度が一定であったのに対して、反応阻害が生じる夾雑物質含有検体では、希釈列が高濃度になるほど反応終了時の吸光度が上昇していった。反応終了時の吸光度の上昇は、希釈列が高濃度になるに従って、ＮＡＤＨが分解して生じるＮＭＮＨの生成量が多くなることを示している。
【００１４】
夾雑物質として存在すると思われるヌクレオチドピロフォスファターゼの反応の至適ｐＨは、弱アルカリ性にあると考えられる。すなわち、従来の凍結乾燥品から液状試薬に移行し、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の安定化のために、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を含む溶液のｐＨがアルカリ性になったことにより、従来には全く予期することができなかった前記のような新たな問題が発生しているのである。
【００１５】
従って、本発明の目的は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、その液状試薬の他の成分や検体中に存在する夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を有効に防止する手段を提供することにある。例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を安定に供給することができる条件下、例えばアルカリ性の環境で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが、精製された各種酵素と共存した場合の含量低下や、目的の生理活性物質である酵素標品が高濃度で添加された検体（例えば、市販管理血清）を測定する場合に、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止し、且つ、その酵素測定系での主要酵素反応の反応阻害を起こさずに、目的とする生理活性物質を正確に測定する手段を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬と、検体とを、ｐＨ値が７．５〜１１の条件下で接触させる測定系に、キレート剤を共存させることを特徴とする、夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防止する方法に関する。
また、本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と、その還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解する夾雑物質とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１の液状試薬に、キレート剤を共存させることを特徴とする、前記夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防止する方法にも関する。
更に、本明細書では、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類とキレート剤とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１である液状試薬を開示する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む任意の液状試薬に適用することができる。すなわち、任意の「生理活性物質」の測定に用いる液状試薬、特に生体試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、細胞もしくは組織抽出液、唾液、汗）に存在する臨床検査の対象となる任意の物質、例えば、各種の酵素の測定に用いる液状試薬に適用することができる。測定対象物質としては、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、α−オキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、尿素窒素（ＵＮ）、又はクレアチニン（ＣＲＥ）などを挙げることができる。いずれの項目もニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用した測定系で測定することが可能なため、本発明を好適に適用することができる。
【００１８】
ここで「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬」とは、測定に使用するまで、夾雑物質を含む酵素や他の添加成分と共に比較的長期間にわたって保存される保存用液体試薬を意味するだけでなく、保存時には、夾雑物質を含む酵素や他の添加成分と共存しないが、測定時に、夾雑物質を含む検体とアルカリ性条件下で（例えば、２試薬系測定試薬など多試薬系測定試薬の第１試薬と）接触する液状試薬も含まれる。
【００１９】
本発明は、ｐＨがアルカリ性に維持された液状試薬に適用する。具体的にはｐＨ７．５〜１１（好ましくは８．５〜１０）の範囲である。
ｐＨ値が７．５より低いと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の保存安定性が不十分であったり、またｐＨ値が１１より高いと反応の雰囲気調整が難しくなったり、分析装置への影響等が懸念され好ましくない。
【００２０】
本発明で用いることのできるキレート剤は、金属イオンに配位し、水溶性キレート化合物を与える多座配位子であり、具体的には、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸塩（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸塩（ＨＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン−ビス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＤＰＯ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）等及びこれらの塩を挙げることができる。
【００２１】
本発明方法においては、前記のキレート剤を液状試薬に添加するか、あるいは酵素反応測定時にその測定系に単独で添加することもできる。例えば、保存用液状試薬中に夾雑物質が存在する場合には、保存用液状試薬中に前記キレート剤を添加する必要がある。また、保存用液状試薬中には夾雑物質が存在せず、酵素反応の実施時に、例えば、検体に含まれている夾雑物質が測定系に混入してくる場合には、前記キレート剤を、保存用液状試薬に予め含有させておくこともできるし、保存用試薬とは別に、前記キレート剤を、その測定系に添加することもできる。特に、２試薬系測定試薬などの場合には、第１試薬と検体とをアルカリ性条件下で一定時間接触させてから、その混合液を第２試薬と中性条件下で接触させ、酵素反応を実施する場合が多い。従って、夾雑物質が検体に含まれている場合には、少なくともアルカリ性条件下での第１試薬との接触時にキレート剤を存在させる必要があり、キレート剤を予め保存用液状試薬（例えば、保存用液状第１試薬）に含有させておくか、あるいはキレート剤を別途、検体と共に反応系に添加することもできる。
【００２２】
本発明において使用するキレート剤の濃度は、夾雑物質（おそらくヌクレオチドピロフォスファターゼ）によって還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解されることを実質的に防止することのできる濃度である。個々の測定系や液状試薬におけるキレート剤の濃度は、本発明が適用される測定系や液状試薬において夾雑物質として共存するヌクレオチドピロフォスファターゼの由来や共存量に依存するため、適用される測定系や液状試薬に使用されるキレート剤の種類に基づいて、当業者が適宜決定することができる。
【００２３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と前記に示したキレート剤の組合せとしては、特に限定されないが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む溶液の環境において、夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する効果のあるキレート剤を適宜選択して使用することができる。また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止するために上記のキレート剤を数種混合して添加することもできる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を分解する夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）の由来によって分解反応の至適ｐＨは異なり、また防止効果のあるキレート剤の種類も異なる。従って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の種類とその環境及び夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）の由来により、効果のあるキレート剤の一種類又は数種類を選択し、具体的な添加量も、使用する個々の測定系に応じて適宜決定することができる。
【００２４】
例えば、安定化された液状試薬を用いるＧＰＴ測定系において、使用するＮＡＤＨを含む溶液のｐＨは、一般にアルカリ性である。更に、ＮＡＤＨを利用するＧＰＴの測定は、ほとんどの場合ＬＤＨを共役酵素としている。従って、液状試薬の場合、ＮＡＤＨはアルカリ性の条件下でＬＤＨと長期間（例えば半年以上）共存することとなる。この場合、ＮＡＤＨと共存させるＬＤＨは、その由来が動物組織や細菌である。動物組織や細菌から精製されたＬＤＨ中にヌクレオチドピロフォスファターゼが夾雑酵素として存在していた場合には、ＮＡＤＨ溶液の長期間の保存中にＮＡＤＨが分解されＮＭＮＨが生成される。ＮＭＮＨはＮＡＤＨと同様に３４０ｎｍに吸収があるために吸光度上では区別することができないので見かけ上ＮＡＤＨの量が維持されているように見えてしまう。この試薬でＧＰＴ活性の測定を行うと、実際のＮＡＤＨ量が少ないために、所望の測定値が得られない。そこで、夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）が共存しているＮＡＤＨ溶液中にキレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを添加するとＮＡＤＨの分解反応を防止することができる。この時のＥＤＴＡ・２Ｎａ添加濃度は０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上で夾雑物質による反応阻害を防止する効果があり、特に１〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。５０ｍｍｏｌ／ｌを超えると、ＮＡＤＨの分解反応の防止には効果があるものの、主要酵素反応であるＧＰＴの反応が影響を受け、ＧＰＴ活性値が低くなる傾向があるため好ましくない。
【００２５】
また例えば、ＬＤＨ測定系において検体としてＬＤＨ測定系に阻害を与える市販の直線性管理用血清を使用する場合、液状試薬でありそのｐＨがアルカリであるＮＡＤＨを含む測定用試薬にキレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを添加すると阻害を防止することができる。この時のＥＤＴＡ・２Ｎａ添加濃度は０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上で夾雑物質による反応阻害を防止する効果があり、特に１〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。５０ｍｍｏｌ／ｌを超えるとＮＡＤＨの分解反応の防止には効果があるものの、ＬＤＨの反応が影響を受け、ＬＤＨ活性値が低くなる傾向があるため好ましくない。
【００２６】
また、本発明においては、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の溶液中に、前記のキレート剤の他に、必要により、生理活性物質測定用試薬に一般に添加される成分、例えばアジ化物等の防腐剤、及び界面活性剤等を適宜添加することができる。すでに、本発明は安定化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬で用いる方法であるため、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含有している溶液中には安定化のためにさまざまな添加物が添加されている。
【００２７】
生理活性物質測定用試薬として凍結乾燥品の試薬が用いられていた頃とは異なり、最近では当初から溶液状態で供給される液状試薬の必要性が増し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、安定化された液状試薬で供給されるようになった。ところが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を安定化し、液状試薬の形で供給しなければならなくなったため、溶液の環境が凍結乾燥品が主流だった頃とは異なっている。そのために、以前にはなかった不都合が生じることになった。
【００２８】
本発明は、液状試薬が主流になったことを契機として明らかになった問題点に着目し、その解決方法として見いだしたものである。液状試薬になったことがきっかけとなり夾雑酵素によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解が生じてしまう場合がある事実にはこれまで着目されていなかった。そこで、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が分解する原因を解明し、原因となる夾雑物質の影響を回避する方法を見いだしたことで、生理活性物質を正確に測定することが可能になった。液状試薬で提供される生体試料液中の生理活性物質測定用試薬に、安定化の目的ではなく、夾雑物質の影響の回避の目的でキレート剤を添加することは従来にはなかった手法である。
【００２９】
【作用】
本発明によるキレート剤の添加でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する機構は、キレート剤の添加によるヌクレオチドピロフォスファターゼの反応阻害によるものと考えられる。ヌクレオチドピロフォスファターゼは、２分子のリボヌクレオチドが結合したピロリン酸の部分のエステル結合に作用する加水分解酵素であり、ＮＡＤＨを基質とした場合、ＮＡＤＨをＮＭＮＨに分解しＡＭＰ（アデノシン一リン酸）が生成する。ヌクレオチドピロフォスファターゼは、その由来により反応の至適ｐＨが異なり、また夾雑酵素として精製された酵素標品に混在している場合、その混在量も様々である。
本発明による作用機構の詳細は、現在のところ完全には明らかではないが、本発明によるキレート剤の添加によって還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止することができたことから、夾雑酵素（おそらくヌクレオチドピロフォスファターゼ）が金属要求酵素であるものと考えられる。実際に、植物、腎・肝の細胞顆粒・膜、蛇毒又は細菌等のヌクレオチドピロフォスファターゼが報告されており、それぞれ性質が異なり、基質特異性、至適ｐＨ、及び金属要求性等は様々である。
【００３０】
また、ヌクレオチドピロフォスファターゼは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類だけではなく、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）等が共存した場合でも、一定の条件が整えば反応が進行し、反応阻害を起こす可能性が充分考えられる。従って、補酵素等にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用する酵素反応以外の場合でも、前記のようなリボヌクレオチドが結合した構造をもつ基質（補酵素）が関与する測定系又はその測定系に用いる液状試薬においても、ヌクレオチドピロフォスファターゼの反応阻害としてキレート剤を添加する方法は有効である。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例及び参考例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加効果》
（１）対照試験
以下に示したＧＰＴ測定用液状試薬を用い、ＧＰＴの反応阻害が生じる市販の管理血清（商品名：ハイレベルチェック・Ｅ；国際試薬社製）を検体として用いた。具体的には、前記管理血清を生理食塩水で希釈して１０段階希釈列（１／１０〜１０／１０）検体を調製した（１０／１０は非希釈検体）。日立７１５０型自動分析機により、検体（１５μｌ）と以下に示す試薬１（３００μｌ）を混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（１００μｌ）を添加した。
下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経過後から５分間経過後までの４分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＧＰＴ活性値を下記式より算出した。また、検体の代わりに生理食塩水を使用してコントロール試験を行った。なお、試薬１及び試薬２に含まれるＧＴＡ緩衝液は、β，β’−ジメチルグルタル酸、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールの等モル濃度溶液をＨＣｌあるいはＮａＯＨで所望のｐＨに調製した緩衝液である。
【００３２】
使用した液状試薬の組成、測定パラメータ及びＧＰＴ活性値の計算式は以下のとおりである。
（ａ）試薬１（ｐＨ９．０）
ＧＴＡ緩衝液              ２０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン              ２００ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ                  ０．２５ｍｍｏｌ／ｌ
ＬＤＨ                    ５０００ｕ／ｌ
（ｂ）試薬２（ｐＨ  ６．０）
ＧＴＡ緩衝液              １００ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン              １０００ｍｍｏｌ／ｌ
α−ケトグルタル酸        ６０ｍｍｏｌ／ｌ
【００３３】
（ｃ）測定パラメータ（日立７１５０型）
ＡＳＳＡＹ  ＣＯＤＥ            ［ＲＡＴＥ  Ａ］：［３０−５０］
ＳＡＭＰＬＥ  ＶＯＬＵＭＥ      ［１５］
Ｒ１  ＶＯＬＵＭＥ              ［３００］
Ｒ２  ＶＯＬＵＭＥ              ［１００］
ＷＡＶＥ  ＬＥＮＧＴＨ          ［４０５］［３４０］
ＡＢＳ．ＬＩＭＩＴ（INC／DEC）  ［４０００］［ＤＥＣＲＥＡＳＥ］
（ｄ）ＧＰＴ活性値の計算式：
ＧＰＴ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×１０3 
上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であり、εは分子吸光係数（６．３）であり、Ｖは全反応液量であり、そしてｖは試料液量である。
【００３４】
（２）本発明試薬による試験
本発明試薬として、上記の試薬１にＥＤＴＡ・２Ｎａを１ｍｍｏｌ／ｌの量で添加した試薬を調製し、同一の検体（１０段階希釈列及びコントロール試験としての生理食塩水）について対照試薬での測定と同様の操作で測定し、ＧＰＴ活性値を求めた。
【００３５】
（３）結果
それらの結果を、表１、並びに図１（対照試験）及び図２（本発明）に示す。
【表１】
0004260245.tif 000003
【００３６】
【実施例２】
《ＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加効果》
（１）対照試薬
以下に示した組成のＬＤＨ測定用液状試薬を用い、ＬＤＨの反応阻害が生じる市販の管理血清（商品名：ハイレベルチェック・Ｅ；国際試薬社製）を検体として用いた。具体的には、前記管理血清を生理食塩水で希釈して１０段階希釈列を調製した（１０／１０は非希釈検体）。日立７１７０型自動分析機により、検体（１０μｌ）と以下に示す試薬１（１８０μｌ）とを混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（９０μｌ）を添加した。下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経過後から５分間後まで４分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＬＤＨ活性値を下記式より算出した。また、前記検体の代わりに生理食塩水を使用してコントロール試験を行った。
【００３７】
使用した液状試薬の組成、測定パラメータ及びＬＤＨ活性値の計算式は以下のとおりである。
（ａ）試薬１（ｐＨ９．０）
ＧＴＡ緩衝液              ２０ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ                  ０．３ｍｍｏｌ／ｌ
（ｂ）試薬２（ｐＨ６．０）
ＧＴＡ緩衝液              １００ｍｍｏｌ／ｌ
ピルビン酸リチウム塩      ６ｍｍｏｌ／ｌ
【００３８】
（ｃ）測定パラメータ（日立７１７０型）
分析法／測光ポイント    ［レートＡ］［１０］［２０］［３４］
波長（副／主）          ［４０５］［３４０］
検体量（標準）          ［１０］
試薬分注量（Ｒ１）      ［１８０］
試薬分注量（Ｒ３）      ［９０］
反応限界吸光度          ［４０００］
（試薬２は、パラメータ上では自動分析機の特性上「Ｒ３」で表されている）
（ｄ）ＬＤＨ活性値の計算式
ＬＤＨ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×１０3 
上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であり、εは分子吸光係数（６．３）であり、Ｖは全反応液量であり、そしてｖは試料液量である。
【００３９】
（２）本発明試薬による試験
本発明試薬として、上記の試薬１にＮＴＡを１０ｍｍｏｌ／ｌの量で添加した試薬を調製し、同一の検体（１０段階希釈列及びコントロール試験としての生理食塩水）について対照試薬での測定と同様の操作で測定し、ＬＤＨ活性値を求めた。
【００４０】
（３）結果
それらの結果を、表２（試薬２の添加から１分間経過後から４分後までの３分間の測定に基づく）、並びに図３（対照試験）及び図４（本発明）に示す。
【表２】
0004260245.tif 000004
【００４１】
【参考例１】
（１）ＧＰＴの測定
自動分析機によるＧＰＴの測定において、同一の液状試薬を用いて、反応を阻害する夾雑物質を含む検体及び反応を阻害する夾雑物質を含まない検体を以下に示すＧＰＴ測定用試薬で測定し、以下に示す計算式でＧＰＴの活性値を求めた。
豚心臓由来ＧＰＴ（ベーリンガーマンハイム社）を生理食塩水に溶かし、３０００ｕ／ｌとしたものを標準（夾雑物質不含検体）とした。これに夾雑物質を含む豚腎臓由来γ−ＧＴＰ（シグマ社）を４０００ｕ／ｌとなるよう添加したものを夾雑物質含有検体とした。なお、夾雑物質含有検体及び夾雑物質不含検体のいずれにおいても、添加されたＧＰＴの活性は、同程度の活性であった。
各検体を、実施例１（１）に記載の方法と同様に、生理食塩水で希釈して１０段階希釈列（１／１０〜１０／１０）検体を調製した（１０／１０は非希釈検体）。日立７０７０型自動分析機により、検体（１５μｌ）と試薬１（３００μｌ）とを混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（１００μｌ）を添加した。下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経過後から５分間後まで４分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＧＰＴ活性値を下記式より算出した。また、前記検体の代わりに生理食塩水を使用してコントロール試験を行った。
【００４２】
使用した液状試薬の組成、測定パラメータ及びＧＰＴ活性値の計算式は以下のとおりである。
（ａ）試薬１（ｐＨ９．０）
ＧＴＡ緩衝液              ２０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン              ２００ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ                  ０．３５ｍｍｏｌ／ｌ
ＬＤＨ                    ５０００ｕ／ｌ
（ｂ）試薬２（ｐＨ６．０）
ＧＴＡ緩衝液              １００ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン              １０００ｍｍｏｌ／ｌ
α−ケトグルタル酸        ６０ｍｍｏｌ／ｌ
【００４３】
（ｃ）測定パラメータ（日立７０７０型）
分析法                  ［レートＡ］［１０］［２０］［３４］
測光ポイント            ［１９］−［３１］
波長（副／主）          ［４０５］［３４０］
反応限界吸光度          ［４０００］［減少］
検体量（標準）          ［１０］
試薬分注量  第１試薬    ［３００］
試薬分注量  第３試薬    ［１００］
（試薬２は、パラメータ上では自動分析機の特性上第３試薬で表されている）
【００４４】
（ａ）ＧＰＴ活性値の計算式
ＧＰＴ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×１０3 
上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であり、εは分子吸光係数（８．３）であり、Ｖは全反応液量であり、そしてｖは試料液量である。
【００４５】
結果を表３に示す。
【表３】
0004260245.tif 000005
【００４６】
夾雑物質含有検体では、直線性の１０段階希釈列で直線性が１０００ｕ／ｌ程度までしか認められないが、夾雑物質不含検体では直線性が２０００ｕ／ｌ程度まで認められる。
【００４７】
（２）ＮＡＤＨからＮＭＮＨへの分解
前記参考例１（１）において使用した夾雑物質含有検体を、ＮＡＤＨ含有液状試薬（０．３ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＨを含む３０ｍｍｏｌ／ｌのＧＴＡ緩衝液：ｐＨ＝９．２）と共存させておいた場合の経時変化を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認した。ＨＰＬＣ測定条件は以下のとおりである。
0004260245.tif 000006
結果を図５に示す。図５において、曲線１は、ＮＡＤＨ含有液状試薬と夾雑物質含有検体とを共存させない場合であり、曲線２は、ＮＡＤＨ含有液状試薬と夾雑物質含有検体を混合した直後の場合であり、曲線３は、混合から２時間後の場合であり、曲線４は、混合から６時間後の場合であり、そして曲線５は、混合から１０時間後の場合である。また、図５の横軸の時間（分）は、ＨＰＬＣにおける溶出の時間である。
【００４８】
（３）吸光度変化（タイムコース）
前記参考例１（１）において使用した夾雑物質含有検体及び夾雑物質不含検体のそれぞれの１０段階希釈列（１／１０〜１０／１０）検体について実施例１（１）に記載の操作と同様の操作を行った。
結果を示す図６（夾雑物質含有検体）及び図７（夾雑物質不含検体）から明らかなように、夾雑物質不含検体では、酵素反応が終了した時点での吸光度が一定であったが、夾雑物質含有検体では、希釈列が高濃度になるほど反応終了時の吸光度が上昇していった。反応終了時の吸光度の上昇は、希釈列が高濃度になるほど、ＮＡＤＨが分解して生じるＮＭＮＨの生成量が多いことを示している。
【００４９】
【参考例２】
《保存液状試薬におけるＮＡＤＨからＮＭＮＨへの分解》
３０ｍｍｏｌ／ｌのＧＴＡ緩衝液（ｐＨ９．２）に０．３ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＨを溶解し、豚心臓由来ＬＤＨの３ロット（ロットＡ，ロットＢ，ロットＣ）をそれぞれ２．５ｍｇ／ｍｌ（ＬＤＨ活性として約１０００ｕ／ｍｌ相当）の量で添加した溶液を２５℃で一週間放置した後、ＮＭＮＨの生成量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により前記参考例１と同じ条件下で測定した。結果を表４に示す。ＮＭＮＨの生成量は、ＨＰＬＣで得られたＮＡＤＨのピーク面積に対するＮＭＮＨのピーク面積の割合で示した。
【００５０】
【表４】
0004260245.tif 000007
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、その液状試薬の他の成分又は検体中に存在する夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を有効に防止することができる。例えば、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と共に夾雑物質を含む保存用液状試薬において、その液状試薬の保存中に前記補酵素が夾雑物により分解されることを防止することができる。また、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、検体由来の夾雑物により補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が分解され、測定系の反応から不正確な測定値が誘導されることを防止することもできる。更に、本発明により、生理活性物質を測定する液状試薬で、測定系での主要酵素反応が阻害されることなく目的の生理活性物質を正確に測定することができ、長期間安定で且つ正確な測定値が得られる液状試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書の実施例１において実施したＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加の効果を示す実験における対照試験の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図２】本明細書の実施例１において実施したＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加の効果を示す実験における本発明の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図３】本明細書の実施例２において実施したＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加の効果を示す実験における対照試験の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図４】本明細書の実施例２において実施したＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加の効果を示す実験における本発明の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図５】本明細書の参考例１において得られたＧＰＴ測定の反応の場においてＮＭＮＨが生成していることがＨＰＬＣにより確認された結果を示すグラフである。
【図６】本明細書の参考例１のＧＰＴ測定において、夾雑物質含有検体を測定した場合のタイムコースを示すグラフである。
【図７】本明細書の参考例１のＧＰＴ測定において、夾雑物質不含検体を測定した場合のタイムコースを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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