(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミンおよびアスコルビン酸を含む被検試料に含まれるドーパミンの濃度を測定するために用いられる修飾電極であって、
前記修飾電極は、導電性の基板を有し、
前記基板の表面が、（化１）で示されるジチオビスアルキルアミン
【化１】
0004366791.tif 000010
によって修飾されている、修飾電極。
【請求項２】
前記ジチオビスアルキルアミンが、（化２）で示される２，２’−ジチオビスエタンアミンである、請求項１に記載の修飾電極。
【化２】
0004366791.tif 000011
【請求項３】
前記基板が金または銅からなる、請求項１に記載の修飾電極。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドーパミンおよびアスコルビン酸を含む被検試料、特に、ヒトに代表される生物の血液、尿、汗、唾液、涙液、分泌液等の体液中に含まれるドーパミンおよびアスコルビン酸を含む被検試料に含まれるドーパミンの濃度を測定するために用いられる修飾電極に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ドーパミンは生体内にあって神経伝達物質として知られており、生体中の循環器系、神経系、泌尿器系などあらゆる器官で生体反応を制御する物質として注目されている。ドーパミンの、生きたまま（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での生体局所におけるその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）検出、ならびに生体外・試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での検出は極めて重要である。
【０００３】
このような目的のために、少なくとも作用電極と対極からなる電極系を用いてドーパミンを電気化学的に検出する試みが提案されている。例えば、特開平９−１２７０５６号公報には、炭素電極を作用電極とし、対極と参照電極から構成される電極系を用いたドーパミンの検出方法が開示されており、擬似体液であるリンゲル液中における、ドーパミンの電解による定量的な検出が例示されている。
【０００４】
しかしながら、ドーパミンをｉｎ  ｖｉｖｏで検出しようとすると、体液中には、ほとんどの場合、ドーパミン濃度の１０００倍以上のアスコルビン酸が含まれており、アスコルビン酸の酸化還元反応も同時に起こるため、ドーパミンとアスコルビン酸を分離して検出することは極めて困難であるという問題がある（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．誌第４１巻（１９８３年）第１７６９頁またはＥｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ誌第２巻（１９９０年）第１７５頁参照）。これは、ドーパミンとアスコルビン酸の酸化還元電位が接近していることが原因である。表面が化学修飾されていない炭素電極あるいは金電極でのドーパミンの酸化は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対し０．１Ｖから０．４Ｖにかけて起こり、アスコルビン酸の酸化は、０．２Ｖから０．６Ｖにかけて起こる。
【０００５】
このような課題を取り除くために、アダムス（Ａｄａｍｓ）らは、アニオン性ポリマー膜で被覆した金電極を用いることを提案している（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．誌第３４巻（１９８５年）第１５１頁参照）。この場合、（化３）で示される、電解質中でプラスに荷電したドーパミンがアニオン性ポリマー膜を被覆した電極に静電的に引き付けられるので、ドーパミンの酸化還元電位をアスコルビン酸に比べて十分マイナスにすることができる。そのためアニオン性ポリマー膜修飾電極の電位を、ドーパミンが酸化され、かつアスコルビン酸が酸化されない電位に固定すると、ドーパミンを選択的に酸化することができ、アスコルビン酸の存在下でのドーパミンの選択的な検出が可能である。その他、特開平８−２１８１９号公報も先行技術文献として挙げることができる。
【０００６】
【化３】
0004366791.tif 000002
【０００７】
【発明が解決しょうとする課題】
しかし、この方法では、アニオン性ポリマー膜中でのドーパミンの拡散速度が遅いので、応答が遅いという問題がある。この応答速度の遅さについては、アニオン性ポリマー膜修飾電極の電位をプラス側に上げることにより改善が可能であるが、それによりドーパミンとともにアスコルビン酸の酸化も起こるようになる。ドーパミンの酸化生成物はアスコルビン酸の酸化触媒であるので、アスコルビン酸の酸化反応速度はドーパミンの酸化生成物の触媒作用の影響を受け、アスコルビン酸に由来する酸化電流は、ドーパミンの酸化生成物が存在しない場合に比べて増加する。この場合、ドーパミンを定量するには、合計の酸化電流からアスコルビン酸の酸化に由来する分を差し引くことが必要となるが、触媒作用による酸化電流の増加分は、アスコルビン酸濃度だけでなくドーパミン濃度にも依存するので見積もることは困難であるため、合計の酸化電流の測定からドーパミンを定量することは困難である。
【０００８】
本発明は、前記従来の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、体液のようにアスコルビン酸を含む被検試料であっても、被検試料中のドーパミンを速い応答速度で容易に定量することのできる修飾電極を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成する本発明は、ドーパミンおよびアスコルビン酸を含む被検試料に含まれるドーパミンの濃度を測定するために用いられる修飾電極であって、前記修飾電極は、導電性の基板を有し、前記基板の表面が、（化３）で示されるジチオビスアルキルアミン
【化３】
0004366791.tif 000003
によって修飾されている、修飾電極である。
前記ジチオビスアルキルアミンが、（化４）で示される２，２’−ジチオビスエタンアミンであることが好ましい。
【化４】
0004366791.tif 000004
前記基板が金または銅からなることが好ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、導電性の基板を有し、前記基板表面をカチオン性化合物で化学修飾した修飾電極を、ドーパミンおよびアスコルビン酸検出用の修飾電極として用いる。
【００２０】
本発明の修飾電極によると、被検試料中でプラスに荷電したドーパミンとカチオン性化合物との間で静電的な反発エネルギーが生じるので、ドーパミンの酸化還元電位が、アスコルビン酸よりもプラス側にシフトする。したがって、修飾電極の電位を０Ｖ付近からプラス方向に掃引すると、まずアスコルビン酸が酸化され、次にドーパミンが酸化される。したがって、ドーパミンとアスコルビン酸の酸化を分離して行うことができ、また、アスコルビン酸の酸化は、ドーパミンの酸化生成物による触媒作用を受けることがないので、アスコルビン酸の酸化に由来する酸化電流をアスコルビン酸の濃度に比例した値とすることができるため、アスコルビン酸に由来する酸化電流の見積が容易である。よって、修飾電極の電位をアスコルビン酸、ドーパミンともに酸化される電位に設定して酸化電流を測定し、得られた酸化電流からアスコルビン酸の酸化に由来する分を差し引くことにより、ドーパミンの酸化に由来する分を分離することができるため、ドーパミンの定量が可能となる。また、修飾電極の電位をドーパミンの酸化還元電位よりも十分にプラスにすることにより、応答速度を向上させることができる。さらに、アスコルビン酸に由来する酸化電流から、アスコルビン酸も定量することができる。
【００２１】
ここで、基板の材料としては、例えば、金、銅、銀、ニッケル、亜鉛、錫などの金属材料、黒鉛などのカーボン材料、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェンなどの導電性高分子、インジウム錫複合酸化物、アンチモン錫複合酸化物などの導電性セラミックス等を用いることができる。この中で、カチオン性化合物との密着性の点から金属材料を用いることが好ましく、さらに金または銅を用いることが好ましい。
【００２２】
基板の形状は、特に限定されないが、例えば、板、箔、薄膜、線、粉末、粉末成形体、粉末焼結体等を用いることができる。
【００２３】
カチオン性化合物としては被検試料中でプラスに荷電することによりカチオン性を示すものであれば良く、ポリビニルピリジンあるいはポリ−４−ビニル−アルキルピリジニウムなどのピリジン基あるいはピリジニウム基を有する化合物、アニリン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、アミノアルキルピリジン、アルキルアミン、チオアルキルアミンなどのイミノ基、アミノ基、あるいはアンモニウム基を有する化合物を用いることができる。特に、金属材料からなる基板を用いる場合は、基板との密着性に優れるチオール基を有する、チオアルキルアミンが好ましい。チオアルキルアミンの例としては、チオエタンアミン、チオプロパンアミン、チオブタンアミン、チオヘキサンアミン、チオラウリルアミン、ジチオビスエタンアミン、ジチオビスプロパンアミン、ジチオビスブタンアミン、ジチオビスヘキサンアミン、ジチオビスラウリルアミンなどがあげられる。
【００２４】
また、前記チオアルキルアミンがジチオビスアルキルアミンであることが好ましい。ジチオビスアルキルアミンを用いると、チオール基が基板の表面側に、アミノ基が外側に向いた状態の自己集積性単分子膜を基板上に形成することができる。このようにすると、アミノ基が外側に向いているので被検試料中でさらに良好なカチオン性を示すとともに、チオール基が基板の表面側に向いているので、金属材料からなる基板を用いた場合に、カチオン性化合物と基板との密着性がさらに向上する。
【００２５】
また、前記ジチオビスアルキルアミンのアルキル基はエチル基以上で、かつヘキシル基以下の長鎖アルキルであることが好ましい。エチル基以上にすると、均一な自己集積性単分子膜を容易に得ることができ、かつヘキシル基以下にすると、アルキル鎖が短いので電極反応にともなう電子移動速度が速くなり、検出の応答速度を速くすることができる。
【００２６】
さらに、前記ジチオビスアルキルアミンが、２，２’−ジチオビスエタンアミンであることが好ましい。２，２’−ジチオビスエタンアミンを用いると、基板上に均一な自己集積性単分子膜を集積することができるとともに、アルキル鎖が短いため、電極反応にともなう電子移動速度を速くし、検出の応答速度をさらに速くすることができる。
【００２７】
カチオン性化合物を導電性の基板表面へ化学修飾する方法としては、カチオン性化合物を溶解した溶液を導電性の基板に直接塗布する方法、この溶液を他の基板表面に塗布して膜を形成し、次にこの膜を導電性の基板に転写する方法、この溶液を他の溶液表面に展開してカチオン性化合物の単分子膜もしくは累積膜を形成し、この単分子膜もしくは累積膜を導電性の基板表面に転写する方法、または真空蒸着法により導電性の基板上にカチオン性化合物の薄膜を直接形成する方法等があげられ、カチオン性化合物の溶解性、熱安定性に応じて選択することができる。
【００２８】
【実施例】
次に、本発明の具体例を説明する。
【００２９】
（実施例１）
［修飾電極の作製］
図１は、本発明の修飾電極の一実施例の断面図である。
【００３０】
導電性の基板となる直径１．６ｍｍの金線１１を用い、それを絶縁体である直径５ｍｍのポリイミド樹脂棒１２の中心に、金線１１の両端がポリイミド樹脂棒１２より露出するように埋め込んだ後、金線１１の一端の断面とポリイミド樹脂棒１２の一端の面が同一面となるように金線１１の一端を切断した。露出した金線１１の断面を、直径が１．０μｍのアルミナ粉、直径が０．０６μｍのアルミナ微紛で研磨した後、０．０５Ｍの硫酸水溶液中で、水素発生電位および酸素発生電位間で電解処理を行い、比較用の電極（Ａ）を作製した。次に、同様に電極（Ａ）を作製した後、２，２’−ジチオビスエタンアミン（以下、ＣＹＳＴと略称する。）５ｍＭを溶解したエタノール溶液に浸漬した後、４０℃の温風で乾燥して、カチオン性化合物１３であるＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極（Ｂ）を作製した。さらに、同様に電極（Ａ）を作製した後、（化６）で示される６，６’−ジチオビスヘキサンアミン（以下、ＤＴＨと略称する。）５ｍＭを溶解したエタノール溶液に浸漬した後、４０℃の温風で乾燥して、カチオン性化合物１３であるＤＴＨで化学修飾した修飾電極（Ｃ）を作製した。
【００３１】
【化６】
0004366791.tif 000005
【００３２】
［被検試料の調整］
リン酸２水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）０．１Ｍ、リン酸水素２ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）０．１Ｍを脱イオン水に溶解したｐＨ７．２の緩衝溶液に、アスコルビン酸を０．１５ｍＭ、ドーパミンを０．１５ｍＭ溶解し、被検試料（１）を調整した。
【００３３】
［センサの作製］
容積が２０ｃｃの電解室を両側に２個有する、ガラス製のＨ形セルを用いて、片方の電解室に、作用電極となる電極（Ａ）、修飾電極（Ｂ）または（Ｃ）と、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極とを配置し、もう一方の電解室に対極となる白金巻線を配置して、センサとなる電解セルを構成した。電解室間は、多孔質のガラス焼結板で仕切った。
【００３４】
電解セルに被検試料（１）を入れた後、窒素ガスを通じて溶存酸素を除去したのち、セルを密閉状態に保ち電解を行った。
【００３５】
［電解検出方法］
作用電極の電位を参照電極に対し、マイナス０．２Ｖからプラス０．４Ｖまで掃引して電解を行い、この際流れる電解電流を測定した。作用電極の電位の掃引方法は、矩形波ポーラログラフ法（Ｈｅｉｔｈ  Ｂ．ＯｌｄｈａｍおよびＪａｎＣ．Ｍｙｌａｎｄ著Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９４年）第４１６頁参照）により行った。電位の掃引条件は、矩形波高＝２５ｍＶ、ステップ電圧＝４ｍＶ、周波数＝１５Ｈｚとした。
【００３６】
矩形波ポーラログラフ法を用いたのは、電気二重層容量の充放電電流の影響を除去して検出感度を上げるためである。アスコルビン酸、ドーパミンの濃度が高くなり、電気二重層容量の充放電電流値に較べ十分に大きな酸化電流値が得られる場合は、作用電極の電位を直線的に増加させる単掃引法を用いてもよい。
【００３７】
［検出結果］
電極（Ａ）、ＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極（Ｂ）、ＤＴＨで化学修飾した修飾電極（Ｃ）をそれぞれ用いて、矩形波ポーラログラフ法で得られた電流−電圧曲線を図２に示す。
【００３８】
修飾電極（Ｂ）および（Ｃ）では、アスコルビン酸に由来する酸化電流ピークが＋０．０５Ｖ付近に得られ、＋０．２Ｖ付近にドーパミンの酸化に由来する電流ピークが得られた。しかし、カチオン性化合物の化学修飾がない電極（Ａ）では単一の電流ピークしか得られず、アスコルビン酸とドーパミンとを分離して検出することができなかった。
【００３９】
ＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極（Ｂ）の方が、ＤＴＨで化学修飾した修飾電極（Ｃ）よりも大きな酸化電流ピークが得られたのは、ＣＹＳＴ分子のアルキル鎖が炭素数２のエチル基であるのに対し、ＤＴＨ分子のアルキル鎖が炭素数６のヘキシル基であり、電解酸化によりＣＹＳＴ分子あるいはＤＴＨ分子を介してアスコルビン酸あるいドーパミン分子から基板の金へ電子が移動する際、より短いアルキル鎖を有するＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極（Ｂ）の方が電子移動が速くなるためである。
【００４０】
よって、導電性の基板として金を用い、カチオン性化合物としてＣＹＳＴまたはＤＴＨを基板表面に化学修飾することにより、ドーパミンとアスコルビン酸の共存する被検試料中で、ドーパミンとアスコルビン酸を分離して検出することができた。
【００４１】
（実施例２）
［修飾電極の作製］
導電性の基板として金線を用い、エタノール溶液中の、カチオン性化合物であるＣＹＳＴの濃度を１０ｍＭとした以外は、実施例１と同様にして、ＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極を作製した。
【００４２】
［被検試料の調整］
リン酸２水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）０．１Ｍ、リン酸水素２ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）０．１Ｍを脱イオン水に溶解したｐＨ７．２の緩衝溶液に、アスコルビン酸を０．１ｍＭ、ドーパミンをそれぞれ０、６、４５、１０９、１２９μＭ溶解して、被検試料（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）、（２ｄ）、（２ｅ）を調整した。また上記緩衝溶液に、アスコルビン酸／ドーパミンを１５／１５、２３／３１、５５／６４、９０／１００、１４９μＭ／１３３μＭ溶解して、被検試料（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）、（３ｄ）、（３ｅ）を調整した。
【００４３】
［センサの作製］
作製したＣＹＳＴ化学修飾電極を作用電極として、実施例１と同様のセルを用いてセンサを作製した。
【００４４】
［電解検出方法］
実施例１と同様に、矩形波ポーラログラフ法を用いて、電解電流を測定した。
【００４５】
［検出結果］
被検試料（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）、（２ｄ）、（２ｅ）について得られた電流−電圧曲線を図３に、被検試料（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）、（３ｄ）、（３ｅ）について得られた電流−電圧曲線を図４に示す。
【００４６】
図３に示すように、被検試料（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）、（２ｄ）、（２ｅ）の場合、＋０．０５Ｖ付近にアスコルビン酸の酸化に由来する電流ピークが得られ、＋０．２Ｖ付近にドーパミンの酸化に由来する電流ピークが得られた。アスコルビン酸の酸化電流はドーパミンの酸化生成物の触媒作用の影響を受けることなく、アスコルビン酸の濃度が被検試料（２ａ）〜（２ｅ）のいずれについても同じであることに対応して、アスコルビン酸の酸化に由来する電流ピークの高さは同じであった。一方、ドーパミンの濃度が被検試料（２ａ）〜（２ｅ）の順に高くなるように調製されていることに対応して、ドーパミンの酸化に由来する電流ピークは被検試料（２ａ）〜（２ｅ）の順に増加した。よって、既知のドーパミン濃度の試料について測定を行い、あらかじめ検量線を作成しておくことにより、ドーパミンの酸化に由来する電流ピークの高さから、アスコルビン酸の存在下であっても被検試料中のドーパミン濃度を容易に定量することができる。
【００４７】
また、図４に示すように、被検試料（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）、（３ｄ）、（３ｅ）の場合、アスコルビン酸の濃度もドーパミンと同様に、被検試料（３ａ）〜（３ｅ）の順に高くなるように調整されていることに対応して、電流ピークは被検試料（３ａ）〜（３ｅ）の順に増加した。よって、アスコルビン酸についても、ドーパミンと同様に、アスコルビン酸の酸化に由来する電流ピークの高さから濃度を定量することができる。
【００４８】
（実施例３）
［修飾電極の作製］
導電性の基板として、直径１．６ｍｍの無酸素銅線を用い、それ以外は実施例２と同様にして、ＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極を作製した。
【００４９】
［被検試料の調整］
リン酸２水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）０．１Ｍ、リン酸水素２ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）０．１Ｍを脱イオン水に溶解して、ｐＨ７．２の緩衝溶液を用意した。この緩衝溶液にアスコルビン酸のみを０．０１３Ｍ溶解した溶液（ＡＡ）、および緩衝溶液にドーパミンのみを０．００８３Ｍ溶解した溶液（ＤＡ）を調製した。緩衝溶液、溶液（ＡＡ）、溶液（ＤＡ）ともに、Ｎ2ガスを通じることで溶存酸素を予め除去した。
【００５０】
［センサの作製］
液の注入口が上部にあり、容積５０ｃｃの電解室を１つ有するガラスセルを用い、その電解室に、作用電極として、作製した修飾電極を、液密に可動となるように配置し、さらに白金巻線対極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を配置した。上部の注入口より、被検試料として緩衝溶液を２５ｍｌ注入した。
【００５１】
［電解検出方法］
作用電極を３００ｒｐｍの回転数で回転しながら、＋０．３Ｖの一定電位を印加した。＋０．３Ｖは、アスコルビン酸、ドーパミンともに電解酸化が起こる電位である。被検試料に対して、溶液（ＡＡ）２０μｌの添加（図４中のａ）、溶液（ＤＡ）３０μｌの添加（図４中のｂ）を４０秒毎に交互に行い、この際流れる電解電流を測定した。
【００５２】
［測定結果］
得られた電流−時間曲線を図５に示す。
【００５３】
溶液（ＡＡ）および溶液（ＤＡ）の添加により電流が急峻に増加した後、すぐに定常電流が得られた。定常電流の増加量は、溶液（ＡＡ）または溶液（ＤＡ）の一回あたりの添加量に対して一定であった。すなわち、アスコルビン酸の酸化電流が、ドーパミンの酸化生成物による触媒作用の影響を受けることなく、アスコルビン酸、ドーパミンともに、それぞれの濃度変化に対応した酸化電流応答を、速い応答速度で得ることができた。
【００５４】
ここで得られた定常電流（Ｉ1）は、被検試料中のアスコルビン酸濃度（ＣAA）およびドーパミン濃度（ＣDA）に比例し、それぞれの比例定数をａ1およびｂ1とすると、
【００５５】
【数１】
0004366791.tif 000006
【００５６】
と表すことができる。ａ1およびｂ1は、あらかじめ既知の濃度のドーパミンまたはアスコルビン酸のみを含む試料について定常電流の測定を行い、検量線を作成することにより、検量線の傾きから求めることができる。次に、比例定数すなわち検量線の傾きが変化するような条件、例えば温度を変化させて、同じ被検試料について同様の測定を行う。得られた定常電流をＩ2とすると、このときの比例定数をａ2およびｂ2として、
【００５７】
【数２】
0004366791.tif 000007
【００５８】
と表される。（数１）および（数２）を解くと、ＣAAおよびＣDAは、
【００５９】
【数３】
0004366791.tif 000008
【００６０】
【数４】
0004366791.tif 000009
【００６１】
と表され、ＣAAおよびＣDAを算出することができる。よって、検量線の傾きが変化するように条件を変化させて、少なくとも２条件以上で定常電流を測定することにより、被検試料中のドーパミン濃度およびアスコルビン酸濃度を容易に定量することができる。
【００６２】
【発明の効果】
本発明を用いることにより、体液のようにアスコルビン酸を含む被検試料であっても、被検試料中のドーパミンを速い応答速度で容易に定量することができ、また、被検試料中のアスコルビン酸についても定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の修飾電極の一実施例の断面図
【図２】本発明の実施例１における、比較用の電極、ＣＹＳＴで化学修飾した修飾電極およびＤＴＨで化学修飾した修飾電極の電流−電位応答を示す図
【図３】本発明の実施例２における、アスコルビン酸濃度が一定で、ドーパミン濃度を変化させた複数の被検試料中での、修飾電極の電流−電位応答を示す図
【図４】本発明の実施例２における、アスコルビン酸濃度およびドーパミン濃度を変化させた複数の被検試料中での、修飾電極の電流−電位応答を示す図
【図５】本発明の実施例３における、修飾電極により測定した酸化電流の時間変化を示す図
【符号の説明】
１１  金線（導電性の基板）
１２  ポリイミド樹脂棒
１３  カチオン性化合物
【図１】
0004366791.tif 000012
【図２】
0004366791.tif 000013
【図３】
0004366791.tif 000014
【図４】
0004366791.tif 000015
【図５】
0004366791.tif 000016