(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１（式中、Ｒ１は低級アルキル基を表す。ＡはＣＨ２を表す。Ｄは−ＮＲ３−で表される基（該式中、Ｒ３はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）を表す。ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表す。Ｚは酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｘ１及びＸ２は、同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ８ＣＯＯで表される基（該式中、Ｒ８は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ９ＳＯ３で表される基（該式中、Ｒ９は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）で表されることを特徴とする化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体。
【化１】
0004265134.tif 000018
【請求項２】
試料中に含まれると予想される核酸の有無又は量を測定する方法であって、請求項１に記載の化合物を用いることを特徴とする方法。
【請求項３】
前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物である請求項２の測定法。
【請求項４】
特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドと一般式１で表わされる化合物を化学結合で結合した核酸プローブ。
【請求項５】
一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴマーである請求項４の核酸プローブ。
【請求項６】
ＤＮＡオリゴマー中のリン部分からリンカーを介して前記化学結合を形成したことを特徴とする請求項５の核酸プローブ。
【請求項７】
一般式１で表わされる化合物が、標的核酸と一本鎖ＤＮＡプローブとの相補結合部分にインターカレーションすることにより蛍光特性が変化することを特徴とする請求項６の核酸プローブ。
【請求項８】
試料中に含まれる少なくとも一種類以上の特定核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法であって、請求項５の核酸プローブを用いることを特徴とする標的核酸の測定法。
【請求項９】
試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、二種類以上の標的ＲＮＡを同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、請求項１に記載の一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法。
【請求項１０】
試料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試料に既知量の標準核酸を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測定した既知量の標準核酸の蛍光強度と比較する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、請求項１に記載の一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法。
【請求項１１】
前記他のインターカレーター性蛍光色素の少なくとも１つがオキサゾールイエローである請求項９又は１０の測定法。
【請求項１２】
測定におけるインターカレーター性蛍光色素の励起波長が４５０から５００ｎｍである請求項１１の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、新規な蛍光色素、その製造方法、該色素を化学結合で結合した核酸プローブ、そしてこれを使用することを特徴とする核酸の測定方法に関するものである。本願発明は、詳しくはストークスシフトが大きく、しかも二本鎖核酸存在時に蛍光強度が著しく増大する新規蛍光性色素、その製造方法、該色素を化学結合で結合した核酸プローブ、そしてこれを使用することを特徴とする核酸の測定方法に関するものである。
【０００２】
なお、本願発明の測定法は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩基配列を含む標的ＲＮＡの定性又は定量分析方法に関するものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用で、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量に有用な測定法である。
【０００３】
【従来の技術】
一般的に、生体成分の分析には高い特異性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配列を有する核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体を形成する性質が利用される。
【０００４】
特定塩基配列を有する標的核酸の定量には、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を得る手段が重要であり、更に臨床診断等の目的においては、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であることから、該手段は極微量核酸を増幅する工程が必要となる。
【０００５】
特にウイルス感染症の診断では、臨床試薬中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために信号強度を向上し高感度化する目的から、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法等によって標的核酸を増幅しておく方法が試みられている。また、ＲＮＡの増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法（例えば特許第２６５０１５９号公報参照）や３ＳＲ法（例えば欧州公開特許第３７３９６０号公報参照）と呼ばれる方法も知られている。
【０００６】
標的核酸の特定塩基配列に相補的な核酸配列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するようにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブ（例えば特開平８−２１１０５０号公報参照）は、標的核酸と相補結合を形成することで測定可能な蛍光信号を発するため、相補結合の形成の有無、及び相補結合体の定量を可能とするものであり、相補結合していないプローブを反応系から分離する必要がないために、増幅された試料を反応容器から取り出す必要がなく、増幅産物の飛散等に由来する偽陽性を惹起しないという利点がある。
【０００７】
そして核酸プライマー及び核酸ポリメレースの作用により、特定塩基配列から成るＲＮＡを一定温度にて増幅する工程を、この核酸プローブ共存下で実施することによって、標的ＲＮＡの増幅とその分析を一定温度条件下で、担体を使用することなく、しかも、密閉条件で行う方法も開発されている。（特願２０００−１４４００号公報参照）。
【０００８】
インターカレーター性蛍光色素は、二本鎖核酸にインターカレーションし、インターカレーションによって遊離状態とは蛍光特性が変化する物質である。この様な性質を持つ化合物としては、エチジウムブロミド、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ等が知られている。更に、これらの化合物をリンカーで結合して、二量化することにより得られるエチジウムダイマー、ＹＯＹＯ等も、二本鎖核酸にインターカレートし蛍光増感を示すことが知られている。従って、識別可能な蛍光特性の変化を引き起こす二種類以上のインターカレーター性蛍光色素を用いて複数の核酸を同時に増幅し、増幅産物を同時に測定することができれば、産業上、有意義な用途が数多く考えられる。例えば、一つの試料中に含まれる複数の標的核酸を同時に検出したり、既知量の標準核酸を標的核酸と同時に増幅することで、増幅反応等の正否の判定、又は、標的核酸の定量を可能とすることが例示できる。
【０００９】
しかしながら、インターカレーター性蛍光色素の種類には限りがあり、それらが発する蛍光は、極大波長を中心とした幅を持ったスペクトルとして観察され、かつ、その蛍光量子収率は、一般的に蛍光色素によって異なる。従って、蛍光スペクトルが互いに重なり合うインターカレーター性蛍光色素では、特定の波長における蛍光強度を精密に測定することは困難である。また、インターカレーター性蛍光色素を励起するための光源には、レーザーや、発光ダイオード等が考えられるが、これも種類に制限があり、至適な励起用光源の組み合わせから考えた場合、蛍光スペクトルが互いに重ならない二種類以上のインターカレーター性蛍光色素を選択する事は非常に困難であった。例えば、公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローやチアゾールオレンジ等のシアニン系色素において、二つの蛍光スペクトルが重なり合わないためには、両者の蛍光極大波長の差が約１００ｎｍ以上なければならないが、シアニン系蛍光物質の蛍光極大波長と励起極大波長の差は２０から４０ｎｍ程度であり、また、両者を蛍光測定が可能なように励起するためには、二つの励起光源が必要となって、該測定を実施するうえでの制約となる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の第１の目的は、核酸検出において二本鎖核酸にインターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差が大きい（すなわちストークスシフトの大きい）新規なインターカレーター性蛍光色素であって、従来公知のインターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが重なり合わないという特徴を有する化合物を提供することにある。また本願発明の第２の目的は、該蛍光色素を化学結合で結合した新規な核酸プローブを提供することにある。そして本願発明の第３の目的は、該核酸プローブを用いた核酸の測定法（定性、定量法）であって、試料の中に含まれる一種以上の標的核酸を増幅し、分離操作を行うことなしに、増幅産物を密閉容器内で測定する方法を提供し、標的核酸の存在の有無、及び量を高精度に決定する測定法、特に、二種類以上の標的核酸の同時測定等を可能とする測定法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
特定の条件を満たす近接した二つの化合物の一方を励起すると、他方にエネルギートランスファーが起こり、エネルギーを受け取った化合物（アクセプター）が蛍光を発することは広く知られている。本願発明者らは、このエネルギートランスファーを分子内で効率的に起こす物質について研究を重ね、核酸検出において核酸二本鎖にインターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差が大きい、すなわちストークシフトの大きい新規な蛍光色素を見い出すに至った。このようにして前記目的を実現すべく完成された本願請求項１の発明は、従来はその構造、合成法、蛍光特性等が全く知られていない、新規な前記一般式１（式中、Ｒ1は低級アルキル基を表す。Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（該式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（該式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（該式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（該式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表す。Ｚは酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで表される基（該式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）で表されることを特徴とする化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体である。
【００１２】
本願請求項２の発明は、前記請求項1に記載の化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体の製造方法である。
【００１３】
本願請求項３の発明は、試料中に含まれると予想される核酸の有無又は量を測定する方法であって、前記請求項1に記載の化合物を用いることを特徴とする。本願請求項４の発明は、請求項３の発明に係り、前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物である測定法である。
【００１４】
本願請求項５の発明は、特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドと前記一般式１で表わされる化合物を化学結合で結合した核酸プローブである。本願請求項６の発明は、前記請求項５の発明に係り、前記一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴマーである核酸プローブである。本願請求項７の発明は、前記請求項６の発明に係り、ＤＮＡオリゴマー中のリン部分からリンカーを介して前記化学結合を形成したことを特徴とする。本願請求項８の発明は、前記請求項７の発明に係り、前記一般式１で表わされる化合物が、標的核酸と一本鎖ＤＮＡプローブとの相補結合部分にインターカレーションすることにより蛍光特性が変化することを特徴とする。
【００１５】
本願請求項９の発明は、試料中に含まれる少なくとも一種類以上の特定核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法であって、前記請求項６の核酸プローブを用いることを特徴とする。
【００１６】
本願請求項１０の発明は、試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、二種類以上の標的ＲＮＡを同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法である。本願請求項１１の発明は、試料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試料に既知量の標準核酸を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測定した既知量の標準核酸の蛍光強度と比較する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法である。
【００１７】
本願請求項１２の発明は、前記請求項１０又は１１の発明に係り、前記他のインターカレーター性蛍光色素の少なくとも１つがオキサゾールイエローであることを特徴とする。そして本願請求項１３の発明は、前記請求項１２の発明に係り、測定におけるインターカレーター性蛍光色素の励起波長が４５０から５００ｎｍであることを特徴とする。以下、本願の各発明を詳細に説明する。なお本願明細書では、特に断らない限り「低級」なる用語は炭素数が１〜６個の直鎖又は分枝した炭素鎖を意味する。
【００１８】
一般式１において、低級アルキル基としては、具体的には例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル（アミル）基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル（アミル）基、ヘキシル基等を例示できる。また一般式１において、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基としては、例えばフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、３−フルオロプロピル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、３−クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基等を例示できる。そして一般式１において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示できる。
【００１９】
前記一般式１で表される本願発明の化合物（芳香族化合物誘導体、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体）を具体的に説明するために、一般式１において用いられる各種記号について、その好適な具体例を挙げて詳細に説明する。
【００２０】
Ｒ1は低級アルキル基を表す。かかるアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜４個の直鎖状又は分枝状のアルキル基で、より好ましくはメチル基、エチル基であるが、中でもメチル基はＲ1として最も好ましい低級アルキル基である。
【００２１】
Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子である。Ａ及びＤは、好ましくは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、又は酸素原子である。Ａ及びＤは、更に好ましくは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）である。
【００２２】
前記Ｑは、ハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）で、好ましくは、ハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であるが、ハロゲン原子であることが最も好ましい。
【００２３】
前記ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表すが、好ましくは同一又は相異なって、２〜４の整数であり、特に好ましくは同一又は相異なって、２又は３である。
【００２４】
前記Ｒ2は、水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、好ましくは水素原子又は低級アルキル基であり、特に好ましくは水素原子、メチル基、エチル基である。中でも水素原子が最も好ましい。
【００２５】
前記Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、好ましくは水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基、又は、２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基、２−ブロモエチル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基等のハロゲン原子で置換された低級アルキル基である。Ｒ3は、より好ましくは水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基、又は、２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基等のヨード原子で置換された低級アルキル基等である。中でも、水素原子、又は、メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基が最も好ましい。
【００２６】
前記Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基である。Ｒ4及びＲ5は、好ましくは、同一又は相異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基、２−ブロモエチル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基等である。Ｒ4及びＲ5は、より好ましくは、同一又は相異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基等である。Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基であることが最も好ましい。
【００２７】
前記Ｒ6は、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等であり、更に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基である。
【００２８】
前記Ｒ7は、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても良いフェニル基であり、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、フェニル基、ｐ−メチルフェニル基等であり、更に好ましくはメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
【００２９】
前記Ｚは、酸素原子又は硫黄原子であり、好ましくは硫黄原子である。
【００３０】
前記Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）である。Ｘ1及びＸ2は、好ましくは、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）である。Ｘ1及びＸ2は、更に好ましくは、同一又は相異なって、ハロゲン原子である。
【００３１】
前記Ｒ8は、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等で、更に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基である。
【００３２】
前記Ｒ9は、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても良いフェニル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基等で、更に好ましくはメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
【００３３】
上記一般式１で表される本願発明の化合物において、好ましい例としては、Ｒ1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子又は低級アルキル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数であり、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換されていても良い低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であるものが例示できる。更に好ましい化合物として、Ｒ1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑは、ハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）又は酸素原子であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であるものが例示できる。そしてより好ましい化合物として、Ｒ1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）である化合物が例示でき��。
【００３４】
上記具体的な一般式１の化合物のうちでも、Ｒ1がメチル基又はエチル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子；メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7はメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9はメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基を表す。）であるものが特に好ましい。
【００３５】
一般式１で示される化合物は、不斉炭素を含む化合物も含む。即ち、本願発明の一般式１で示される化合物は、光学活性体、ラセミ体、ジアステレオマー等の各種光学異性体の混合物及びそれらの単離されたものを含む。
【００３６】
また、一般式１の化合物にはアミン残基が存在するが、これらのアミン誘導体は酸付加体を形成する場合がある。その結果、一般式１で示される化合物は、そのような塩、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、燐酸等の鉱酸、蟻酸、酢酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸等との酸付加体塩を含むものである。また更には、一般式１で示される化合物は、各種水和物、溶媒和物や結晶多形の物質も含むものである。
【００３７】
次に、前記一般式１で表される化合物の製造方法について説明する。本願発明化合物は、種々の方法により製造できるが、以下の製造方法は例示であって、本願発明の製造方法を限定するものではない。なお、反応式中において、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を表すものである。
【００３８】
第１の製造法は、下記反応式１（式中、Ｒ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表す。Ａ1及びＤ1は、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。）によるものである。
【００３９】
前記一般式１の化合物（上記反応式１における化合物ＩＩ）は、化合物４と化合物５を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。化合物４は、化合物３と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することに製造することが出来る。化合物３は、化合物２を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物２は、相当するジヨード化合物と化合物１をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あるいは無溶媒で、室温ないし２００℃で、数分から３０時間反応することで製造することができる。
【００４０】
以上、反応式１の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４１】
【化２】
0004265134.tif 000002
第２の製造法は、下記反応式２（式中、Ｒ1、Ａ1、Ｄ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の意味を表す。）によるものである。
【００４２】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＩ）は、化合物９を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物９は、化合物７と化合物２を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにり製造することが出来る。化合物７は、化合物５と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あるいは無溶媒で、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。また、化合物９は、化合物１０と化合物５を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することによっても製造することが出来る。化合物１０は、化合物２と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。
【００４３】
以上、反応式２の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４４】
【化３】
0004265134.tif 000003
第３の製造法は、下記反応式３（式中、Ｒ1、Ａ1、Ｄ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは、前記と同一の意味を表す。）によるものである。
【００４５】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＩ）は、化合物７と化合物３を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式３の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４６】
【化４】
0004265134.tif 000004
第４の製造法は、下記反応式４（式中、Ｒ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表す。Ａ2及びＤ2は、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。）によるものである。
【００４７】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＩＩ）は、化合物１４を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１４は、化合物１３と化合物１を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。
【００４８】
化合物１３は、４−メチルキノリンから化合物１２を経て既知の方法に準じて合成出来る。（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６４，１９９（１９４２））。
【００４９】
以上、反応式４の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５０】
【化５】
0004265134.tif 000005
第５の製造法は、下記反応式５（式中、Ｒ1、Ａ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは前記と同じ意味を表す。Ｄ3は、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）を表す。Ｄ4は、式：−ＮＲ10−で表される基（式中、Ｒ10は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）を表す。Ｘ3は、ハロゲン原子、又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。Ｒ11は、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）によるものである。
【００５１】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＶ）は、化合物１７を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１７は、化合物１６とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式５の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５２】
【化６】
0004265134.tif 000006
第６の製造法は、下記反応式６（式中、Ｒ1、Ｒ11、Ａ、Ｄ3、Ｄ4、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前記と同じ意味を表す。）によるものである。
【００５３】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＶ）は、化合物Ｖとアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式６の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５４】
【化７】
0004265134.tif 000007
第７の製造方法は、下記反応式７（式中、Ｒ1、Ｒ11、Ｄ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の意味を表す。Ａ3は、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）を表す。Ａ4は、式：−ＮＲ10−で表される基（式中、Ｒ10は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）を表す。）によるものである。
【００５５】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＶＩＩ）は、化合物１９を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１９は、化合物１８とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式７の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５６】
【化８】
0004265134.tif 000008
第８の製造方法は、下記反応式８（式中、Ｒ1、Ｒ11、Ａ3、Ａ4、Ｄ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の意味を表す。）によるものである。
【００５７】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＶＩＩ）は、化合物ＶＩとアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式８の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５８】
【化９】
0004265134.tif 000009
以上に説明した各反応式中の各工程で得られる生成物は、必要ならば公知の精製法、例えばクロマトグラフィー、再結晶法、沈殿法又は蒸留法等を、単独又は適宜組み合わせて行うことにより、精製又は単離する事ができる。また、場合によっては、各工程で得られる生成物は単離精製操作を行わずに次の反応に供することも可能である。
【００５９】
一般式１で表わされる化合物は、励起波長帯が幅広いエチジウムブロマイド（フェニルフェナンスリジン）誘導体と、６６０ｎｍ付近に蛍光極大を持つチアゾール誘導体又は６３０nm付近に極大を持つオキサゾール誘導体をリンカーで結合した構造を有するものである。従って、該化合物に励起光を照射すると、まず、エチジウム誘導体が励起される。励起されたエネルギーは、いわゆる蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってチアゾール又はオキサゾール誘導体に移動する。そしてこの結果励起されたチアゾール又はオキサゾール誘導体が蛍光を発するのである。
【００６０】
エチジウムブロマイドは、５３５ｎｍ付近に極大吸収波長を持つ化合物であるが、その吸収スペクトルは、幅広いピークを示す。従って一般式１で表わされる化合物は、幅広い波長で励起することが可能である。チアゾール誘導体等が発する蛍光はシャープなピークを有するため、一般式１で表わされる化合物を励起した場合には、チアゾール誘導体等が発する該シャープなピークの蛍光が観察される。従って、一般式１で表される化合物を用いることにより、試料中に含まれると予想される核酸の有無又は量を測定することが可能となる。
【００６１】
例えば、一般式１の化合物は、二本鎖核酸と混合することにより、二本鎖核酸の相補鎖間にインターカレーションし、顕著な蛍光増感を示す（一般式１の化合物と二本鎖核酸との混合水溶液の蛍光は、一般式１のみの水溶液の蛍光強度と比較して顕著に大きい）。従って、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物が存在する試料中に添加するだけで、前記核酸の有無を知ることができる。また既知量の二本鎖核酸について比較試験を行えば、試料中に存在する前記核酸の量を定量することもできる。
【００６２】
また例えば、一般式１の化合物を、特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）と化学結合で結合して核酸プローブとすることができる。該核酸プローブでは、一般式１の化合物を、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとの相補結合部分にインターカレーション可能に結合することが特に好ましい。この核酸プローブは、前記一本鎖オリゴヌクレオチドと結合しているため、標的核酸に対する十分な特異性を有しており、しかも、試料中の標的核酸との相補結合部分に一般式１の化合物がインターカレーションし、その結果、顕著な蛍光増感を示すため、標的核酸と未結合の核酸プローブを除去する操作を行うことなく、密閉容器中で標的核酸を測定することが可能となる。なお、一般式１の化合物を、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとの相補結合部分にインターカレーション可能に結合する方法は特に限定されないが、オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）オリゴマー中のリン部分から適当なリンカーを介して化学結合させることが好ましい。ここで、リンカーについても特に限定されないが、例えば、アミノ基で修飾したＤＮＡオリゴマーに、公知の二架橋性リンカーであるＳＰＤＰ（Ｓ-ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐａｎｙｌ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を結合しておき、一方で一般式１の化合物には、ＳＨ基と反応性の官能基を結合した化合物を結合させておき、両者を反応させる等すればよい。
【００６３】
前記本願発明の核酸プローブは、標的ＲＮＡの増幅工程を行う際に反応液中に共存させることが可能である。従って、この核酸プローブを用いれば、標的ＲＮＡの増幅から測定までを、密閉容器中で、一段階で行うこと（最初に必要な試薬を容器中に投入することにより、後に試薬を加えたり、不要な試薬を除去する操作を行うことなく標的ＲＮＡの測定を行うこと）が可能である。ここで、増幅工程自体は、例えば特許第２６５０１５９号公報に記載されたもの、例えば欧州公開特許第３７３９６０号公報に記載されたもの、そして更には、例えば特開平８−２１１０５０号公報に記載されたものを採用することができる。
【００６４】
一般式１の化合物の蛍光スペクトルは、従来公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローの蛍光スペクトルと重なり合わない。このように、一般式１の化合物と、これとは蛍光スペクトルが重なり合わない従来公知のインターカレーター性蛍光色素を用いることにより、従来は困難であった二種類以上の標的ＲＮＡの測定等が可能になる。オキサゾールイエローは、４８８ｎｍに吸収極大、５１０ｎｍに蛍光極大を持つことが知られている。これに対して一般式１の化合物もまた４８８ｎｍで励起することが可能であるが、その蛍光は６６０ｎｍに極大を持つスペクトルとして観察され、両者の蛍光極大波長には１５０ｎｍの差があるために互いの蛍光スペクトルは重なり合わない。また一般式１の化合物とオキサゾールイエローの組み合わせでは、ともに４７０ｎｍ付近で励起することが出来るため、励起光源として、安価で、小型の発光ダイオード共用できるという利点もある。
【００６５】
上記した、一般式１の化合物と従来公知のインターカレーター性蛍光色素を使用する測定法は、両色素を一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）に結合した核酸プローブを用いるものである。具体的には、試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を同時に増幅する工程を、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定することからなる。ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせである。また具体的には、試料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試料に既知量の標準核酸（標準核酸は、標的ＲＮＡとは配列が異なる）を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に増幅する工程を、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測定した既知量の標準核酸について、同様の試薬を用いて同様の測定を行ったときの蛍光強度（増幅工程の進行に伴う蛍光強度の増大を示した増幅曲線）等と比較することからなる。ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせである。これら測定法は、血清、血漿、体液、尿、糞便、等の生物学的試料、更には食品、室内、土壌、河川水、海水等の環境中の微生物を含むと予想される試料や、これらから核酸成分を抽出した抽出試料について実施可能である。
【００６６】
増幅の方法は限定的ではないが、ＲＮＡを原料として、ＲＮＡを産生する反応が、概ね一定温度で進行する方法が好ましい。
【００６７】
前記したように、従来公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローは、一般式１の化合物と同一波長帯で励起可能で、かつ、蛍光波長が異なるため、前記測定法を実施するうえで好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。一般式１の化合物とオキサゾールイエローを組み合わせて使用する場合には、４５０から５００ｎｍの励起波長を用いれば、単一の励起光源で両者を同時に励起できるという利点もある。
【００６８】
前記測定法のうち、同時に二種類以上の標的核酸を測定する測定法では、例えば複数のウイルス、微生物等に由来する複数のＲＮＡ、一つのＲＮＡ上の複数の特定の配列を標的核酸とすることで、短時間のうちにこれらの有無や存在量を測定することが可能となる。また前記測定法のうち、試料に既知量の標準核酸を加え、標的核酸と標準核酸を同時に増幅し測定する前記測定法では、標的核酸が存在しているにもかかわらず、増幅反応が、例えば反応用酵素の失活、基質及びプライマー類の分解等の理由で進行しないために測定できないという、いわゆる偽陰性の問題を回避して、高い信頼性が要求される臨床診断に適用可能な測定法を提供することができる。なお標準核酸を試料に直接添加した後、該試料から核酸成分を抽出した抽出試料を増幅反応に供することにより、増幅反応の正否のみならず、抽出工程の正否及び効率を決定することも可能である。
【００６９】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を実施例により更に詳細に説明するが、これらの実施例は本願発明の一例であり、本願発明を限定するものではない。
【００７０】
実施例１
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式９に示す。
（１）反応式９中の化合物１の合成
３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン（１．２ｇ）の酢酸（７ｍｌ）溶液に、無水酢酸（３．３ｍｌ）を加え、１．５時間撹拌した。水（２６ｍｌ）を加えた後、氷冷下、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を滴下した。生じた固体を減圧濾過後、水洗し乾燥した。得られた粗生成物を熱エタノールに溶かし、室温下放置した。生じた固体を濾過して、目的とする化合物１を０．７８ｇ得た。
【００７１】
なお化合物１は淡褐色固体であり、ＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７２】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
２．０５（ｂｓ、３Ｈ）、２．１３（ｂｓ、３Ｈ）、７．４２−７．９５（ｍ、６Ｈ）
８．１０−８．５０（ｍ、３Ｈ）、８．５５−８．８２（ｍ、２Ｈ）
１０．３０（ｂｓ、２Ｈ）
（２）反応式９中の化合物２の合成
得られた化合物１（５００ｍｇ）を１，３−ジヨードプロパン（１０ｍｌ）に懸濁し、１５５℃で６時間撹拌した。放冷後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物を熱メタノールに溶かし、室温下放置した。生じた固体を濾過して、目的とする化合物２を３２０ｍｇ得た。
【００７３】
なお化合物２は淡褐色固体であり、ＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７４】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．３６−２．４５（ｍ、２Ｈ）
３．２６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３（ｓ、３Ｈ）
４．６７（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７２−７．８２（ｍ、５Ｈ）
７．８８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．１２（ｄｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ）
８．４２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ）
８．９２（ｓ、１Ｈ）、９．０３（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
９．０９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、１０．５（ｓ、１Ｈ）、１０．８（ｓ、１Ｈ）
（３）反応式９中の化合物４の合成
まず、既知の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６４，１９９（１９４２））に準じて化合物３を合成した。化合物３（７４ｍｇ）のＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−１，３−プロパンジアミン（０．２ｍｌ）を加え、室温下１時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする化合物４を６０ｍｇ得た。
【００７５】
なお化合物４はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．４８−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１（ｍ、２Ｈ）、２．１１（ｓ、６Ｈ）
２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）
２．２８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）
３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．４７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）
６．４９（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．１１（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．５９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．８４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．９５（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．０９（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．１５（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．４７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
（４）一般式１の化合物（反応式９中の「化合物１」）の合成
化合物４（２０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に化合物２（２２ｍｇ）を加え、１３０℃で１時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮し、粗生成物５を得た。得られた粗生成物５を４７％臭化水素水に溶かし、１７０℃で１時間撹拌した。反応後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、目的とする一般式１の化合物を６ｍｇ得た。
【００７７】
なお一般式１の化合物（反応式９中の「化合物１」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．７９−１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１（ｍ、２Ｈ）
２．０５−２．１４（ｍ、２Ｈ）、２．１５（ｓ、３Ｈ）、２．２３−２．４２（ｍ、８Ｈ）
３．０４（ｓ、６Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．３５−４．４５（ｍ、２Ｈ）
４．５２−４．６０（ｍ、２Ｈ）、５．９１（ｓ、１Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ）
６．４２（ｄ、１Ｈ）、６．５４（ｓ、１Ｈ）、７．０４（ｄ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、１Ｈ）
７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５−８．１５（ｍ、１３Ｈ）
８．３２（ｄ、１Ｈ）、８．４２（ｄ、１Ｈ）、８．５４（ｄ、２Ｈ）
【００７９】
【化１０】
0004265134.tif 000010
実施例２
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式１０に示す。
（１）反応式１０中の化合物６の合成
前記化合物２（２０６ｍｇ）を４７％ＨＢｒ水溶液（６ｍｌ）に溶かし、１．５時間撹拌した。放冷後、減圧濃縮した。得られた粗生成物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に懸濁した後、生じた固体を濾過して、目的とする化合物６を２１５ｍｇ得た。
【００８０】
なお化合物６はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
２．３３−２．４３（ｍ、２Ｈ）、３．５６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）
４．５７（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．４６（ｓ、１Ｈ）
７．３８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５（ｓ、１Ｈ）
７．６２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．６８−７．７４（ｍ、２Ｈ）、７．７４−７．８０（ｍ、３Ｈ）
８．６８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
（２）反応式１０中の化合物７の合成
前記化合物３（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする化合物７を１２ｍｇ得た。
【００８２】
なお化合物７はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８３】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．６６−１．７６（ｍ、２Ｈ）、１．９９−２．０７（ｍ、２Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）
２．４１（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．４７（ｓ、３Ｈ）
２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）
４．５２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．５７（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．０１−７．０７（ｍ、２Ｈ）、７．１４（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．３０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８−７．５５（ｍ、２Ｈ）
７．６２（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−７．７４（ｍ、２Ｈ）
７．８８（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．５５（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）
（３）一般式１の化合物（反応式１０中の「化合物２」）の合成
化合物７（１２ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（０．０７ｍｌ）及び化合物６（１４ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。
【００８４】
得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９７／３）で精製し、目的とする一般式１の化合物を４ｍｇ得た。
【００８５】
なお一般式１の化合物（反応式１０中の「化合物２」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３０−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８８（ｓ、３Ｈ）、１．９１−２．０１（ｍ、４Ｈ）
２．０７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）
２．１４（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）２．２８（ｔ、２Ｈ）
２．３３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．３１−４．３８（ｍ、２Ｈ）
４．５５（ｔ、２Ｈ）、５．９２（ｓ、１Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）
６．３６（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．０５（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．２３−７．３３（ｍ、３Ｈ）
７．４６−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．６３−７．７３（ｍ、４Ｈ）、７．８１（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）
７．９３（ｔ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．１０（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３５（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．４３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５３（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．５８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
【００８７】
【化１１】
0004265134.tif 000011
実施例３
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式１１に示す。
（１）反応式１１中の化合物８の合成
前記化合物６（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、目的とする化合物８を９ｍｇ得た。
【００８８】
なお化合物８はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３８（ｔ、２Ｈ）、１．８５−２．００（ｍ、５Ｈ）、２．１０−２．１８（ｍ、２Ｈ）
２．２０−２．３８（ｍ、７Ｈ）、４．４０（ｔ、２Ｈ）、５．９４（ｓ、１Ｈ）
６．２７（ｓ、１Ｈ）、６．４１（ｓ、１Ｈ）、７．２８−７．３６（ｍ、２Ｈ）
７．５１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−７．７８（ｍ、３Ｈ）
８．５９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）
（２）一般式１の化合物（反応式１１中の「化合物２」）の合成
化合物８（９ｍｇ）のＤＭＦ（１．２ｍｌ）溶液に、前記化合物３（１０ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物５をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９７／３）で精製し、目的とする一般式１の化合物（反応式１１中の「化合物２」）を５ｍｇ得た。
【００９０】
【化１２】
0004265134.tif 000012
実施例４
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式１２に示す。
（１）反応式１２中の化合物１０の合成
Ｎ−メチル−１，３−プロパンジアミン（２ｇ）と二炭酸ジ−ｔ−ブチル（１．１ｇ）をメタノール（１６ｍｌ）に溶解し、室温下１時間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより目的とする化合物１０を１４０ｍｇ得た。
【００９１】
なお化合物１０はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｐｐｍ）
１．４４（ｓ、９Ｈ）、１．７０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）２．４４（ｓ、３Ｈ）
２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１７−３．２４（ｍ、２Ｈ）
３．１７−３．２４（ｍ、２Ｈ）、３．４２（ｂｓ、１Ｈ）、５．０８（ｂｓ、１Ｈ）
（２）反応式１２中の化合物１１の合成
得られた化合物１０（１４０ｍｇ）と前記化合物６（４０ｍｇ）をＤＭＦ（１．８ｍｌ）に溶解し、室温下３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製することにより目的とする化合物１１を２９ｍｇ得た。
【００９３】
なお化合物１１はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３４−１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．９０（ｓ、３Ｈ）、１．９１−１．９８（ｍ、２Ｈ）
２．１０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２８（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）
２．８３（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６（ｂｓ、１Ｈ）
４．３７−４．４５（ｍ、２Ｈ）、５．９３（ｓ、１Ｈ）、６．２７（ｓ、１Ｈ）
６．４０（ｓ、１Ｈ）、７．３０−７．３８（ｍ、２Ｈ）
７．５２（ｄｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、３Ｈ）
８．５９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．６５（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
（３）反応式１２中の化合物１２の合成
得られた化合物１１（２９ｍｇ）をメタノール（２ｍｌ）に溶かし、４７％ＨＢｒ水溶液（１ｍｌ）を加えた。室温下１時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする化合物１２を１５ｍｇ得た。
【００９５】
なお化合物１２はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．２９−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８０−２．０１（ｍ、４Ｈ）
２．１３（ｔ、２Ｈ）、２．２２−２．３５（ｍ、５Ｈ）
４．３５−４．４８（ｍ、２Ｈ）、５．９４（ｓ、１Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）
６．４３（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３５（ｍ、２Ｈ）
７．４８−７．５２（ｍ、１Ｈ）、７．６８−７．８０（ｍ、３Ｈ）
８．５７−８．６７（ｍ、２Ｈ）
（４）一般式１の化合物（反応式１２中の「化合物３」）の合成
化合物１２（１５ｍｇ）及び前記化合物３（１９ｍｇ）を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶かし、室温下で２３時間反応した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする一般式１の化合物３を６ｍｇ得た。
【００９７】
なお一般式１の化合物（反応式１２中の「化合物３」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８３−２．０５（ｍ、９Ｈ）
２．１１（ｔ、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２４−２．３３（ｍ、２Ｈ）
２．３６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）
４．３１−４．４１（ｍ、２Ｈ）、４．６０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）
５．９４（ｓ、１Ｈ）、６．２３（ｓ、１Ｈ）、６．３８（ｓ、１Ｈ）
６．４６（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．０９（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．２４−７．３６（ｍ、３Ｈ）、７．４４−７．５４（ｍ、２Ｈ）
７．５６−７．７７（ｍ、７Ｈ）、７．８０−７．８６（ｍ、１Ｈ）
７．９２（ｔ、１Ｈ）、８．０６−８．１４（ｍ、１Ｈ）
８．３８（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５（ｄ、１Ｈ）
８．５６（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
【００９９】
【化１３】
0004265134.tif 000013
実施例５  二本鎖核酸の検出１
実施例１で合成した一般式１の化合物（反応式９における「化合物１」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行った。用いた二本鎖核酸の核酸配列は、ｄＴ３０ｍｅｒが配列番号１、ｄＡ３０ｍｅｒが配列番号２に記載した通りのものである。
【０１００】
一般式１の化合物（反応式９における「化合物１」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０  ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４８８nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、２．５であった。
【０１０１】
次に、一般式１の化合物（反応式９における「化合物１」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０  ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、それぞれ５３．６４及び１０４．７であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。図1に測定された蛍光スペクトルを示す。
【０１０２】
実施例６  二本鎖核酸の検出２
実施例２で合成した一般式１の化合物（反応式１０における「化合物２」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行った。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と同一である。
【０１０３】
一般式１の化合物（反応式１０における「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０  ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５ＭＥＤＴＡ（０．３μＭ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４８８8nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、３．５であった。
【０１０４】
次に、一般式１の化合物（反応式１０における「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌをＨ2Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０  ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、それぞれ、３８．３及び７６．０であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。図２に測定された蛍光スペクトルを示す。
【０１０５】
実施例７
以下に示す方法で、一般式１の化合物を合成した。この反応を下記反応式１３に示す。
（１）化合物（１３）の合成
化合物（１）（０．２０ｇ）とジヨードヘキサン（１．８ｍｌ）をニトロベンゼン１．８ｍｌに懸濁し、１６０℃２．５時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを添加し、析出した固体を熱メタノールに溶かし、エーテルを加え、氷冷下放置した。生じた固体をろ過して、目的とする化合物（１３ａ）を０．１７１ｇ得た。得られた化合物（１３ａ）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【０１０６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２４（ｍ、２Ｈ）１．６２（ｍ、２Ｈ）、
１．９２（ｍ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、
３．１９（ｔ、２Ｈ）、４．５４（ｍ、２Ｈ）、７．７−９．２（ｍ、１３Ｈ）、
１０．５２（ｓ、１Ｈ）、１０．８０（ｓ、１Ｈ）。
【０１０７】
同様に、化合物（１）（０．１０ｇ）とジヨードヘプタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１３ｂ）を０．１１３ｇ、化合物（１）（０．１ｇ）とジヨードオクタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１３ｃ）を０．１３９ｇ得た。
（２）化合物（１４）の合成
得られた化合物（１３ａ）（１１７ｍｇ）と３−アミノプロパノール（０．１６ｍｌ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、１２０℃  ３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９０／１０）で精製することにより目的とする化合物（１４ａ）を１２８ｍｇ得た。得られた化合物（１４ａ）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【０１０８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２５（ｍ、２Ｈ）、１．５５（ｍ、２Ｈ）、
１．７７（ｍ、２Ｈ）、１．９２（ｍ、２Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）、
２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．７５−３．００（ｍ、４Ｈ）、
３．４８（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、２Ｈ）、
７．６０−９．２０（ｍ、１３Ｈ）、１０．６２（ｓ、１Ｈ）、
１１．１９（ｓ、１Ｈ）。
【０１０９】
同様に、化合物（１３ｂ）  （１１３ｍｇ）から、目的とする化合物（１４ｂ）を４０ｍｇ、化合物（１３ｃ）（１３９ｍｇ）から、目的とする化合物（１４ｃ）を５６ｍｇ得た。
（３）化合物（１５）の合成
得られた化合物（１４ａ）（１２８ｍｇ）と１当量の化合物（３）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶かし、１３０℃２．５時間加熱した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒酢酸エチル／酢酸／水＝６０／３０／２０）で精製することにより目的とする化合物（１５ａ）を３５ｍｇ得た。
【０１１０】
同様に、化合物（１４ｂ）（４０ｍｇ）から、目的とする化合物（１５ｂ）を７ｍｇ、化合物（１４ｃ）から、目的とする化合物（１５ｃ）を８ｍｇ得た。
（４）化合物（１６）の合成
得られた化合物（１５ａ）に４８％ＨＢｒ水溶液（１．５ｍｌ）を加えた。１４５℃、１時間撹拌した後、減圧濃縮した。エタノールで共沸し、残さ（化合物（１６ａ）；１．４ｍｇ）を得た。
【０１１１】
同様に、化合物（１５ｂ）から、化合物（１６ｂ）  を含む残さ  ８ｍｇ、化合物（１５ｃ）から、化合物（１６ｃ）を含む残さ  ８ｍｇを得た。
【０１１２】
【化１４】
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実施例８
以下に示す方法で、本発明の核酸プローブを合成した。この反応を下記反応式１４に示す。
【０１１３】
ＤＮＡオリゴマー（化合物（１７））（３７ｎｍｏｌ）を蒸留水  １００μｌ、ＤＭＦ  ３００μｌ  に溶解し、ジチオスレイトールのＤＭＦ溶液（１Ｍ）４０μｌを添加した。１時間後、反応液１３３μｌを採取し、化合物（１６ｃ）のＤＭＦ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ及び、トリエチルアミン１１０μｌを添加した。反応液を室温下一晩静置した後、減圧濃縮した。残さをｎ―ブタノール−水で分配した。水層をブタノール濃縮した後、エタノールを添加し、−７８℃で３０分静置した。析出した固体を遠心分離により集めた。得られた沈殿をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、東ソー製）により精製し、目的の化合物（１８）を０．９４ｎｍｏｌ得た。
【０１１４】
【化１５】
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実施例９
実施例７で合成した一般式１の化合物（反応式１３における化合物（１６ｃ））を用いて、二本鎖核酸の検出を行った。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と同じである。
（１）一般式１の化合物（反応式１３における化合物（１６ｃ））の２５μＭ溶液  ６０μｌに、×２０  ＳＳＣ（３０μｌ）、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（１．２μｌ）及び、蒸留水（４８４．８μｌ）を加えた。
（２）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ＴＥ  バッファー  ６μｌを添加した。
（３）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ｄＴ３０ｍｅｒの１２．５μＭ溶液３μｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの１２．５μｌ溶液３μｌを添加した。
（４）（２）及び（３）の反応液を７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。
（５）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定した。
【０１１５】
図３に測定された蛍光スペクトルを示す。（２）の反応液の蛍光波長６５４ｎｍにおける蛍光強度（図中の（１））は５．７９であり、（３）の反応液の蛍光強度（図中の（２））は、５８．２６であった。２本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。
【０１１６】
実施例１０
実施例８で合成した本発明の核酸プローブ（反応式１４における化合物（１８））を用いて、標的核酸（ＤＮＡ）の検出を行った。プローブの核酸配列は、配列番号３、標的核酸の核酸配列は、配列番号４に記載したとおりのものである。
（１）本発明の核酸プローブ（反応式１４における化合物（１８））の２．５μＭ  溶液  １０μＭ溶液  ３１．５μｌに、蒸留水  ２６０．８μｌ、２０×  ＳＳＣ  １５．８μｌ、及び、０．５μＭ  ＥＤＴＡ  ０．６μｌを添加した。
（２）（１）の反応液を１４７μｌ  採取し、ＴＥバッファー  ３μｌ添加した。
（３）（１）の反応液を１４７μｌ  採取し、標的核酸の５０μＭ  溶液  ３μｌを添加した。
（４）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を４１℃で測定した。
【０１１７】
図４に測定された蛍光スペクトルを示す。（２）の反応液の６５６ｎｍにおける蛍光強度（図中の（１））は、１．８であり、（３）の反応液の蛍光強度（図中の（２））は、５．７であった。標的核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。
【０１１８】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本願発明によれば、従来知られていないインターカレーター性蛍光色素であって、核酸検出において二本鎖核酸にインターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差が大きい（すなわちストークスシフトの大きい）新規な化合物が提供される。この化合物は、二本鎖核酸と接触させたり、一本鎖オリゴヌクレオチドと結合して核酸プローブとすることにより、従来から実施されている核酸の測定に供することが可能である。
【０１１９】
特に本願発明の化合物を適当なリンカーを介して一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した核酸プローブ等では、特定の配列を有する核酸と該一本鎖オリゴヌクレオチドが相補結合を形成した場合にのみ蛍光増感が起こるため、未結合の核酸プローブを分離する操作を行う必要がなく、従って均一系での簡便な一段階の操作による核酸測定方法を実施することができる。
【０１２０】
また本願発明の化合物は、従来公知のインターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが重なり合わないという特徴を有する。このため、本願発明の化合物と従来から知られているインターカレーター性蛍光色素を用いて製造した２種類以上の核酸プローブを用いることにより、試料の中に含まれる二種以上の標的核酸を増幅し、分離操作を行うことなしに、増幅産物を密閉容器内で測定する方法、即ち二種類以上の標的核酸の同時測定等を可能とする測定法を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例5における化合物１の蛍光スペクトルである。図中（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４８８ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８８ｎｍでの結果である。
【図２】実施例６における化合物２の蛍光スペクトルである。図中、（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４８８ ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８８ｎｍでの結果である。
【図３】実施例９における化合物（１６ｃ）（２．５μＭ）の蛍光スペクトルである。図中（１）は、二本鎖核酸なし、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．２５μＭ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．２５μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果である。
【図４】実施例１０における化合物（１８）（１μＭ）の蛍光スペクトルである。図中（１）は、標的核酸なし、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）は、標的核酸（１μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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