(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定すべきハプテン化合物が下式（Ｉ）
【化１】
0004288750.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質の残基、ペプチド残基、若しくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを表す。）で示されるホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物、または、下式（II）
【化２】
0004288750.tif 000009
（式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質の残基、ペプチド残基、若しくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを表す。）で示される２−ヒドロキシ−５−（ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン構造を有する化合物であるハプテン化合物を測定するための免疫学的測定方法において、ハプテン−蛋白質複合体を構成する蛋白質がカゼインあるいはスキムミルクであるハプテン−蛋白質複合体を不溶性担体と接触させることにより、ハプテン−蛋白質複合体を物理的に吸着させてプレコートした免疫反応容器を用い、（１）この免疫反応容器に試料およびハプテン化合物に対するモノクローナル抗体の順で、あるいは、試料およびハプテン化合物に対するモノクローナル抗体を予め別の容器でインキュベーションさせておいた反応液を入れてインキュベートすることにより免疫反応容器にプレコートしたハプテン−蛋白質複合体に対するモノクローナル抗体を反応させて、抗原抗体反応複合体を形成させる工程と、（２）前記ハプテン化合物に反応するモノクローナル抗体を抗原として、それに反応する酵素標識抗体を前記免疫反応容器に入れてインキュベートすることにより、前記免疫反応容器にプレコートしたハプテン−蛋白質複合体と反応した前記モノクローナル抗体に対する酵素標識抗体を反応させて結合させる工程とを含むことを特徴とする、ハプテン化合物の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハプテン化合物を測定するための免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハプテン化合物を測定するための酵素免疫学的測定方法としては、「酵素免疫学的測定方法（第３版）」（石川栄治編集、医学書院、１９８７年）等により既に公知である、ハプテン化合物に対する抗体を不溶性担体に吸着させたマトリックスを利用した競合反応を利用した方法等により測定することができる。しかしながら、このような酵素免疫学的反応はハプテン化合物を測定するための方法として非常に有用であるが、抗原と抗体をインキュベーションする時間は通常、数時間であり、長時間を要する場合も少なくなかった。そこで、抗原抗体反応を促進する方法として、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリグルコシルメタクリレートのような水溶性高分子を抗原抗体反応液中に存在させる方法が知られている。
しかしながら、このような水溶性化合物は、蛋白質の非選択的な分画手法として利用されているように、蛋白質を析出させる効果をも有していることから、これらの水溶性高分子化合物は、抗原抗体反応を促進する効果はあるものの、非特異的な吸着反応等をも促進してしまうといった問題があった。
【０００３】
脂質過酸化二次生成物（以下、「脂質過酸化物」と略すこともある）は、高度不飽和脂肪酸残基が過酸化を受け、更に、過酸化分解することにより生ずる産物で、脂質過酸化物は、生体においては様々な病体に関与していること、食品においては、その価値を低下させることが知られている。このような脂質過酸化物としては、マロンジアルデヒド（略語：ＭＤＡ）、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（略語：ＨＮＥ）あるいはアクロレイン（略語：ＡＣＲ）と言った物質が知られている。これらの物質は、非常に反応性に富むため、生体内の修飾され得る物質（被修飾物質）と反応し、脂質過酸化物を形成する。このような被修飾物質としては、アミノ酸、ペプチド、蛋白質あるいは核酸等があるが、特に蛋白質が挙げられ、蛋白質に脂質過酸化物が付加した場合、蛋白質の劣化が生じ、これらの蛋白質が前述した生体における病態あるいは食品における劣化の一因となっている。また、アドバンスド・グリケーション・エンド・プロダクト（以下、「ＡＧＥ」と略すこともある）は、還元糖のアルデヒド基とアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質が非酵素的に反応することにより最終的に生じる産物で、▲１▼蛍光性、▲２▼褐色化、▲３▼分子内・分子間架橋および▲４▼生物学的認識のうち少なくともどれか一つの特性を有するものであり、これらの物質の中で、反応性に富むものは、生体内の修飾され得る物質（被修飾物質）と反応し、ＡＧＥ付加物を形成することが報告されている。このような物質としてはメチルグリオキサール（略語：ＭＧ）等があり、被修飾物質としては、やはり、蛋白質が挙げられ、蛋白質にＡＧＥが付加した場合、蛋白質の劣化が生じ、これらの蛋白質と生体における病態との関連性が研究されている。
【０００４】
本発明者らは、このような蛋白質の修飾反応について鋭意研究した結果、例えば、これらに代表されるカルボニル化合物−蛋白質複合体としては、ジヒドロピリジン構造、２−ヒドロキシ−５−（ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン（マイケル付加体構造）、ホルミルデヒドロピペリジン構造、アルグピリミジン構造等を有する蛋白質複合体が生じることを報告し、前記の構造に特異的なモノクローナル抗体を開発した［（１）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ  第３５９巻（１９９５年）第１８９〜１９１頁、（２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｃｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９１巻（１９９４年）２６１６〜２６２０頁、（３）日本油化学会誌  第４７巻（１９９８年）第２９〜３７頁、（４）日本農芸化学会誌  第７１巻（１９９７年）第３１１頁など）。
【０００５】
従って、これらの脂質過酸化物付加化合物、あるいは、ＡＧＥ付加化合物は、生体内においては酸化、あるいは、糖化ストレス、食品においてはその劣化の指標となり得ることから、それらの量を測定することは非常に重要である。
【０００６】
このような物質の測定方法としては、特開平９−７２９０７号公報に、カルボニル化合物の測定方法が開示されている。しかしながら、前記の技術は、測定に用いる抗体がポリクローナル抗体であり、特定のカルボニル化合物に由来する生体分子の修飾構造を特異性高く測定するための方法ではなく、例えば、酸化、糖化ストレスを厳密に評価するには適していなかった。また、前記の開示されている技術は、抗原抗体反応を効率よく、短時間で測定することを目的としたものではなかった。さらに、免疫学的測定方法としては、サンドイッチタイプの測定方法が知られているが、ハプテン−蛋白質複合体の測定には、原理的に不向きであった。
従って、ハプテン化合物を簡易に、特異性高くしかも短時間で測定するための手段の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ハプテン化合物を簡易に、特異性高く、しかも短時間に測定するための方法を提供することにある。特に、カルボニル化合物−蛋白質複合体、さらに詳しくは、ホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物あるいは、２−ヒドロキシ−５−（ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン構造を有する化合物等を簡易に、特異性高く、しかも短時間に測定するための方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、検討した結果、ハプテン化合物を簡易に、特異性高く、しかも短時間で測定する免疫学的測定方法を見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の［１］〜［４］である。
［１］ハプテン化合物を測定するための免疫学的測定方法において、
ハプテン−蛋白質複合体を不溶性担体と接触させることにより、ハプテン−蛋白質複合体を物理的に吸着させてプレコートした免疫反応容器を用い、
（１）この免疫反応容器に試料およびハプテンに対するモノクローナル抗体の順で、あるいは、試料およびハプテンに対するモノクローナル抗体を予め別の容器で反応させておいた反応液を入れてインキュベートすることにより、免疫反応容器にプレコートしたハプテン−蛋白質複合体に対するモノクローナル抗体を反応させて、抗原抗体反応複合体を形成させる工程と、
（２）前記ハプテンに反応するモノクローナル抗体を抗原として、それに反応する酵素標識抗体を前記免疫反応容器に入れてインキュベートすることにより、前記免疫反応容器にプレコートしたハプテン−蛋白質複合体と反応した前記モノクローナル抗体に対する該酵素標識抗体を反応させて結合させる工程
とを含むことを特徴とするハプテン化合物の免疫学的測定方法である。
【０００９】
［２］ハプテン−蛋白質複合体を構成する蛋白質がカゼインあるいはスキムミルクである前記の免疫学的測定方法。
【００１０】
［３］測定すべきハプテン化合物がカルボニル化合物−蛋白質複合体である前記の免疫学的測定方法。
【００１１】
［４］測定すべきハプテン化合物が下式（Ｉ）
【００１２】
【化３】
0004288750.tif 000002
【００１３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質の残基、ペプチド残基、若しくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを表す。）
で示されるホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物、または下式（II）
【００１４】
【化４】
0004288750.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質の残基、ペプチド残基、若しくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを表す。）
で示される２−ヒドロキシ−５−ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン構造を有する化合物である前記の免疫学的測定方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明でハプテン化合物とは、免疫原性はないが抗体との反応性の有るものをいい、例えば、単純ハプテン、複合ハプテン等が挙げられる。
本発明に使用するハプテン−蛋白質複合体の蛋白質としては、通常使用される各種蛋白質が挙げられる。具体的には、例えば、α−、β−あるいはγ−カゼイン（ＣＡＳ）、スキムミルク（ＳＭＬ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ゼラチン、カギアナカサガイのヘモシアニン等が挙げられる。好ましくは、α−、β−あるいはγ−カゼイン、スキムミルクが挙げられる。
本発明に使用するハプテン−蛋白質複合体は、前記の低分子化合物のハプテンを蛋白質に結合することが可能な一般的な方法で調製することができる。例えば、ハプテン化合物に由来するエピトープ構造（ここで、エピトープとは抗原決定基を意味するが）を蛋白質上に与えることが出来るような化合物が、それ自体を蛋白質と混合するだけで反応する場合、例えば種々のアルデヒドやマイケル付加体を形成するような低分子化合物は、低分子化合物と蛋白質を目的の低分子化合物と蛋白質の反応を妨害しない適当な緩衝液中あるいはイオン交換水中で両者を反応させればよい。このような緩衝液としては、例えばリン酸塩、炭酸塩等の緩衝液が挙げられる。
低分子化合物が水溶性でない場合には、少量の有機溶媒、例えば、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等の水に馴染みが良い有機溶媒に溶解して使用することも可能である。
緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。
緩衝液の濃度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されないが、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの緩衝液である。
【００１７】
また、低分子化合物それ自身がハプテン化合物であって、ハプテン化合物がそれ自体では蛋白質と反応しない場合、ハプテン−蛋白質複合体を調製するために、例えば、ハプテン化合物に反応性を有する官能基を導入し、蛋白質の反応性基であるアミノ基やカルボキシル基にハプテンを結合すると良く、これらの方法は既に公知である。これら反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の減少率で検出することが可能である。
アミノ酸の減少率は、例えば、反応前後の試料のアミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより求めることができる。アミノ酸の減少率としては、使用する修飾物により異なるが、修飾に関与するアミノ酸の減少率が１０％以上、好ましくは２０％以上減少することが望ましい。
【００１８】
このようなアミノ酸減少率となる反応条件は、例えば、４〜４５℃で１〜９６時間が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０℃で２〜４０時間である。
前述のようにハプテン化合物と蛋白質を反応させることにより、本発明のハプテン−蛋白質複合体を得ることができる。
【００１９】
本発明による免疫学的測定方法は、ハプテン化合物と特異的に反応し、しかも、抗原抗体反応の均一性が重要であることから、測定対象となるハプテン化合物に対するモノクローナル抗体が必要であるが、既に公知である方法で目的となるハプテン化合物に対するモノクローナル抗体を調製すればよい。このハプテン化合物に対するモノクローナル抗体と測定対象物を含む試料を同時に、あるいは、前もって、ハプテン化合物に対するモノクローナル抗体と測定対象物を含む検体を混合した後に、上記測定対象であるハプテン−蛋白質複合体を吸着させた不溶性担体と反応させ、ＢＦ分離を行い、ハプテンに対するモノクローナル抗体を抗原としてそれに反応する酵素標識抗体を反応させ、担体に固定された酵素標識体の濃度を酵素−基質反応に由来する生成物を光学的に測定することによって行うことができる。
【００２０】
ここで、ハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体は、ハプテン−蛋白質複合体を不溶性担体に接触させて物理的に吸着させることにより調製することができる。物理的吸着方法としては、例えば、ハプテン−蛋白質複合体液を不溶性担体に適当量加えて静置し、ハプテン−蛋白質複合体を不溶性担体に物理吸着させることにより調製することができる。このようなハプテン−蛋白質複合体を不溶性担体に吸着させるために使用するハプテン蛋白質複合体液の濃度は１ｎｇ／ｍｌ以上であればよいが、抗原濃度を必要以上に高くしても不経済であり、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌである。緩衝液は、リン酸塩、トリスあるいは炭酸塩の緩衝液を利用できる。
緩衝液のｐＨは該吸着反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。
緩衝液の濃度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されないが、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの緩衝液である。吸着するときの温度は、０〜５５℃、好ましくは４〜４０℃である。吸着に必要な時間は数分でよい。
【００２１】
このようなハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体は、前もって調製しておいたものを使用しても良いし、測定直前にハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体を調製しても良い。また、非特異的な反応を抑制するためのブロッキング処理を行っても良いが、ハプテン−蛋白質複合体が同時にブロッキング剤の役目もするため特に必要はない。
【００２２】
試料とモノクローナル抗体液をハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体と反応させる方法としては、次の２通りの方法がある。
第１の方法は、試料、モノクローナル抗体液の順でハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体に分注して反応させる方法。
第２の方法は、試料とモノクローナル抗体液を予め別の容器で反応させた後に、この混合液をハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体に分注して反応させる方法。
前記の第１の方法または第２の方法のどちらの方法でもよい。
用いるモノクローナル抗体液としては、モノクローナル抗体を抗原抗体反応を妨害しない緩衝液に溶解したものであればよく、例えば、リン酸塩、トリスあるいは炭酸塩の緩衝液を利用できる。緩衝液のｐＨは該抗原抗体反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。緩衝液の濃度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されないが、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの緩衝液である。また、用いるモノクローナル抗体液には、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白質を含有していることが望ましく、反応に関与しない蛋白質であれば特に限定されないが、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白質等が挙げられる。さらに、糖類や界面活性剤を含んでいてもよく、糖類としてはスクロース、グルコース、トレハロース等が挙げられ０．１〜１０％の濃度で、界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（例えば、和光純薬工業（株）社製  Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられ、０．０１〜５％の濃度で含んでいてもよい。用いるモノクローナル抗体の濃度は、それぞれの測定系、ハプテン化合物等により異なるが、目的の測定範囲の標準曲線が得られる濃度であれば良く、試験を行うことにより決定されるが、少なすぎても多すぎても目的の標準曲線は得られず、０．０１〜１０μｇ／ｍｌが適当である。
【００２３】
また、前記のハプテン化合物としては、カルボニル化合物−蛋白質複合体が挙げられる。具体的には、アセトアルデヒド−蛋白質複合体、４−ヒドロキシ−２−ノネナール−蛋白質複合体、アクロレイン−蛋白質複合体、マロンジアルデヒド−蛋白質複合体、メチルグリオキサール−蛋白質複合体等が挙げられる。  またさらに、測定すべきハプテン化合物としては、下記の式（Ｉ）
【００２４】
【化５】
0004288750.tif 000004
【００２５】
で示されるホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が挙げられる。ここで、式ＩのＲ1、Ｒ2は蛋白質中のリジン残基に結合する蛋白質の残基あるいはペプチド残基若しくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを表す。Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈの場合は、即ちリジン残基のアミノ酸残基を示す。換言すれば、式（Ｉ）で示される化合物は、リジン基を含有する蛋白質、ペプチドあるいはリジンのアミノ酸とアクロレインとの反応物である。またはさらに測定すべきハプテン化合物としては、式（II）
【００２６】
【化６】
0004288750.tif 000005
【００２７】
で示される２−ヒドロキシ−５−（ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン構造を有する化合物が挙げられる。式（II）でここで、式ＩのＲ1、Ｒ2は蛋白質中のヒスチジン残基に結合する蛋白質の残基あるいはペプチド残基若しくはＲ1＝Ｒ2＝Ｈを表す。Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈの場合は、即ちヒスチジン残基のアミノ酸残基を示す。換言すれば、式（II）で示される化合物は、ヒスチジン基を含有する蛋白質、ペプチドあるいはヒスチジンのアミノ酸と４−ヒドロキシ−２−ノネナールとの反応物である。
【００２８】
試料、モノクローナル抗体液およびハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体を反応させた後、ＢＦ分離を行うが、ハプテン−蛋白質複合体吸着不溶性担体を洗浄できればよく、洗浄液としては、抗原抗体反応複合体が崩壊しない緩衝液であれば特に限定されないが、界面活性剤を含有した緩衝液が一般的であり、０．０１〜５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）を含有したｐＨ６〜９の１０〜１００ｍＭリン酸緩液やトリス緩衝液が用いられる。
【００２９】
前記のハプテン化合物に反応するモノクローナル抗体を抗原として反応する酵素標識抗体としては、用いるモノクローナル抗体と反応するものであれば特に限定されないが、一般的にモノクローナル抗体はマウス由来であるためマウスのイムノグロブリンに対する抗体である。また、標識される酵素は、一般的な酵素免疫学的測定方法に利用される酵素であれば制限はないが、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が適当である。このような酵素標識抗体は自製しても良いが、市販のものを容易に入手できる。反応液としては、得られた酵素標識抗体液を適当に希釈して用いることができ、希釈液としては、抗原抗体反応を妨害せず、酵素にダメージを与えない緩衝液に溶解したものであればよく、例えば、リン酸塩、トリスあるいは炭酸塩等の緩衝液を利用できる。
緩衝液のｐＨは該抗原抗体反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。緩衝液の濃度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されないが、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの緩衝液である。また、酵素標識抗体反応液は、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白質を含有していてもよく、反応に関与しない蛋白質であれば特に限定されないが、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白質等が望ましく挙げられる。さらに、糖類や界面活性剤を含んでいてもよく、糖類としてはスクロース、グルコース、トレハロース等が挙げられ０．１〜１０％の濃度で、界面活性剤としてはポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられ、０．０１〜５％の濃度で含んでいてもよい。
【００３０】
抗原抗体反応を行う温度条件としては、温度として１〜５５℃、好ましくは４〜４０℃である。また、本発明による免疫学的測定方法を利用すれば、測定に要する時間は、非常に短時間で良い。
【００３１】
ＢＦ分離を行った後、用いた酵素標識抗体に由来する酵素反応に用いる発色液を入れることにより、発色させ、反応停止液で反応を停止させる。最終的に発色液の吸光度を測定することにより目的を達することができ、その場合、既知の濃度である標準液を用いて同様の操作を行うことにより得られた標準曲線と試料を用いて得られた吸光度を比較することにより、試料中のハプテン化合物の濃度を測定することができる。これらの反応液及び測定に用いる装置は既に市販されているものを利用すればよい。
【００３２】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明の免疫学的測定方法を用いることによりハプテン化合物を、簡易に、特異性高く、しかも短時間で測定できる。従って、臨床診断、分析等において有用であり、低分子化合物の疾患・病態との関連性の解明のための一助となることが期待される。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
〔調製例１〕ハプテン−蛋白質複合体の調製
２ｍＭのアクロレイン（略語：ＡＣＲ）に１ｍｇのカゼイン（略語：ＣＡＳ）あるいはスキムミルク（略語：ＳＭＬ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解した溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を即座に加え、３７℃で２時間反応させて、ハプテン−蛋白質複合体、すなわちＡＣＲとＣＡＳあるいはＡＣＲとＳＭＬのコンジュゲート（略語：それぞれ、「ＡＣＲ−ＣＡＳ」、「ＡＣＲ−ＳＭＬ」）を調製した。自動アミノ酸分析装置〔ＪＥＯＬ  ＪＬＣ−５００、日本分光（株）製〕で反応前後のアミノ酸を調べたところ、ＡＣＲ−ＣＡＳ、ＡＣＲ−ＳＭＬの両者とも、リジン（以下、「Ｌｓｙ」と略すこともある。）が２０％以上減少していた。同様に、５ｍＭの４−ヒドロキシ−２−ノネナール（略語：ＨＮＥ）を用いて、ＨＮＥとＣＡＳあるいはＨＮＥとＳＭＬのコンジュゲート（略語：それぞれ、「ＨＮＥ−ＣＡＳ」、「ＨＮＥ−ＳＭＬ」）を調製した。得られたハプテン−蛋白質複合体をアミノ酸分析したところ、ヒスチジン（略語：Ｈｉｓ）が１５％以上減少していた。
【００３４】
〔調製例２〕ハプテン−蛋白質複合体吸着プレートの調製
調製例１により得られたＡＣＲ−ＣＡＳ、ＡＣＲ−ＳＭＬ、ＨＮＥ−ＣＡＳおよびＨＮＥ−ＳＭＬ液の蛋白質濃度をイオン交換水で希釈し、１０μg／mlとした。この液を９６穴イムノプレート（ヌンク社製，Ｆ１６，マキシソープ）に１５０μｌ／ウエル分注し、室温で固定化した。固定化後、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、略語：ＰＢＳ）で洗浄した。このようにして、ＡＣＲ−ＣＡＳ、ＡＣＲ−ＳＭＬ、ＨＮＥ−ＣＡＳおよびＨＮＥ−ＳＭＬが固定化された免疫反応容器を調製した。
【００３５】
〔試験例１〕ＥＬＩＳＡ試験方法１
調製例２で調製した免疫反応容器のウエルに最初に試料（５０μｌ／ウエル）、次に０．１％カゼイン含有１０ｍＭＰＢＳで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物、または２−ヒドロキシ−５−（ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン構造を有する化合物に特異的なモノクローナル抗体液（５０μｌ／ウエル）を入れて、室温で反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体（バイオラッド社）を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで２０００倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」と略す。）を入れて、室温で任意時間反応させた。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μｌ／ウエル）（以下、「反応停止液」と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、スペクトラマックス２５０）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。なお、測定は全て二重測定で行い、試料としては、調製例１に従い、２ｍＭのＡＣＲあるいは５ｍＭのＨＮＥをヒト血清アルブミンと反応させて調製したハプテン−蛋白質複合体をＰＢＳに４８時間（透析外液は、１２時間毎に交換）透析して得られた液をＰＢＳで希釈したものを用いた。
【００３６】
〔試験例２〕ＥＬＩＳＡ試験方法２
調製例２で調製した免疫反応容器のウエルに、予め試料（１２０μｌ／ウエル）および１μｇ／ｍｌの０．１％カゼイン含有ＰＢＳで調製したホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物または２−ヒドロキシ−５−（ペンチルテトラヒドロフラン−４−イル）ヒスチジン構造を有する化合物に特異的なモノクローナル抗体液（１２０μｌ／ウエル）をポリプロピレン製テストチューブで反応させた液を入れて、室温で反応させた。ウエルを洗浄後、酵素標識抗体溶液（１００μｌ／ウエル）を入れて、室温で任意時間反応させた。ウエルを洗浄後、発色液（１００μｌ／ウエル）を入れて室温で１５−２０分間反応させた。反応停止液（５０μｌ／ウエル）を入れることで発色反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。なお、測定は全て二重測定で行い、試料としては、調製例１に従い、２ｍＭのＡＣＲあるいは５ｍＭのＨＮＥをヒト血清アルブミンと反応させて調製したハプテン−蛋白質複合体をＰＢＳに４８時間（透析外液は、１２時間毎に交換）透析して得られた液をＰＢＳで希釈したものを用いた。
【００３７】
〔実施例１〕ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間の検討
調製例１で調製したハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間について検討した。ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化については調製例２に従った。ＥＬＩＳＡ試験は試験例１に従って実施した。なお、試料およびモノクローナル抗体液の反応時間は６０分、酵素標識抗体の反応時間は６０分とした。結果を図１に示した。図中、ＡＣＲ−ＣＡＳは、ＡＣＲ−ＣＡＳを固定化抗原として用い、ＡＣＲが付加したヒト血清アルブミンを試料として測定した結果を示す。以下、同様に、ＡＣＲ−ＳＭＬはＡＣＲ−ＳＭＬを固定化抗原として用い、ＡＣＲが付加したヒト血清アルブミンを試料として測定した結果を、ＨＮＥ−ＣＡＳはＨＮＥ−ＣＡＳを固定化抗原として用い、ＨＮＥが付加したヒト血清アルブミンを試料として測定した結果を、ＨＮＥ−ＳＭＬはＨＮＥ−ＳＭＬを固定化抗原として用い、ＨＮＥが付加したヒト血清アルブミンを試料として測定した結果を示す。図２〜５も同様である。
【００３８】
図１に示されるように、本発明によるハプテン結合蛋白質の不溶性担体への固定化時間は３分以降で一定となった。従って、本発明によるハプテン結合蛋白質は、不溶性担体に極めて短時間で吸着することが示された。
【００３９】
〔実施例２〕試料およびモノクローナル抗体液の免疫反応容器分注後の反応時間の検討１
本発明の免疫学的測定方法を用い、試料およびモノクローナル抗体液の免疫反応容器分注後の反応時間を検討した。実験条件は、試料およびモノクローナル抗体液の免疫反応容器分注後の反応時間以外は試験例１に従って実施した。なお、ハプテン−蛋白質複合体のイムノプレートへの固定化時間は３分、酵素標識抗体の反応時間は６０分として試験を実施した。結果を図２に示した。
【００４０】
図２に示されるように、本発明の免疫学的測定方法によれば、試料およびモノクローナル抗体液の免疫反応容器分注後の反応時間は１０分以降で一定となった。従って、本発明の免疫学的測定方法では、試料およびモノクローナル抗体液の免疫反応容器分注後の反応時間は１０分程度で良いことが明らかとなった。
【００４１】
〔実施例３〕試料のインキュベーション時間の検討２
本発明の免疫学的測定方法を用い、試料とモノクローナル抗体液を別の容器で反応させる場合の両者の反応液の免疫反応容器との反応時間を検討した。試験は、試験例２に従い、ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間は３分、試料とモノクローナル抗体液を別の容器で反応させる時間を６０分、酵素標識抗体の反応時間を６０分とした。結果を図３に示した。
【００４２】
本結果から明らかなように、試料とモノクローナル抗体液の反応液の免疫反応容器との反応時間は３分以降、一定となった。
【００４３】
〔実施例４〕試料のインキュベーション時間の検討３
本発明の免疫学的測定方法を用い、試料とモノクローナル抗体液を別の容器で反応させる時間を検討した。試験は、試験例２に従い、ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間は３分、試料とモノクローナル抗体液を別の容器で反応させた反応液を免疫反応容器に分注後の反応時間を３分、酵素標識抗体の反応時間を６０分とした。結果を図４に示した。
【００４４】
〔比較例１〕
本発明の免疫学的測定方法を用い、試料としてポリクローナル抗体を別の容器で反応させる時間を検討した。試験例２では、ホルミルデヒドロピペリジン構造に特異的なモノクローナル抗体を用いるかわりに、ホルミルデヒドロピペリジン構造に対する特異的なポリクローナル抗体を用いて試験を行った以外は実施例４と同様にして試験を行った。結果を図４に示す。
図４の結果から明らかなように、試料としてポリクローナル抗体を用いた場合に比べて、モノクローナル抗体を用いた場合では、明らかに短時間で反応が一定になることがわかる。
【００４５】
〔実施例５〕；酵素標識抗体液の反応時間の検討
本発明の免疫学的測定方法を用い、酵素標識抗体液の反応時間を検討した。試験は、試験例２に準じて、ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間は３分、試料のモノクローナル抗体をポリプロピレン製テストチューブで反応させる時間を３分、その反応液を免疫反応容器に分注した後の反応時間は３分として試験を実施した。結果を図５に示した。
図５に示されるように酵素標識抗体の反応時間は７分で一定となった。
【００４６】
〔実施例６〕；免疫学的測定方法による標準曲線の作製−１
本発明の免疫学的測定方法を用い、標準曲線を作製した。標準としては、アクロレインとＮα−アセチルリジンとを付加反応させて調製したホルミルデヒドロピペリジン−Ｎα−アセチルリジンとし、ハプテン−蛋白質複合体としては、調製例１で得られたＡＣＲ−ＣＡＳを用いて、調製例２に従って免疫反応容器を調製し、試験例２に従って試験を実施した。なお、ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間は３分、試料とモノクローナル抗体をポリスチレン製テストチューブで反応させる時間を３分、その反応液を免疫反応容器に分注した後の反応時間は３分、酵素標識抗体の反応時間を７分として試験を実施した。
結果を図６のＡに示した。
【００４７】
〔比較例２〕；免疫学的測定方法による標準曲線の作製−２
ハプテン−蛋白質複合体の不溶性担体への固定化時間、試料とモノクローナル抗体をポリスチレン製テストチューブで反応させる時間、その反応液を免疫反応容器に分注した後の反応時間を全て３０分（Ｂ）、６０分（Ｃ）１２０分（Ｄ）とする以外は実施例６に準じて試験を行い、標準曲線を同様に得た。結果を図６のＢ、ＣおよびＤに示した。
【００４８】
〔実施例７〕；同時再現性試験−１
本発明の免疫学的測定方法を用い、試料中のアクロレイン付加体を測定し、同時再現性を検討した。試験は、実施例６と同様の条件で、試料としては人の尿を用いた。結果を表１および表２のＡに示した。なお、表１には検体１、表２は検体２の結果を示す。
【００４９】
〔比較例３〕；同時再現性試験−２
試料中のアクロレイン付加体を測定し、同時再現性を検討した。試験は、比較例２と同様の条件で、試料としては人の尿を用いた。結果を表１および表２に示した。なお、表中、Ｂ〜Ｄは、比較例２に示すＢ、ＣおよびＤ法により測定したことを示す。なお、表１には検体１、表２は検体２の結果を示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
以上の結果から明らかなように、図６、表１および表２の結果から、本発明の免疫学的測定方法によれば、長時間で測定を行った免疫学的測定方法と全く同等の性能を示す免疫学的測定方法を提供することができる。従って、短時間で測定を完了することができる免疫学的測定方法を提供することができる。
本発明の実施例では、比較例と比べて、特異性高く、しかも短時間で測定結果が得られる免疫学的測定方法であることがわかる。
従って、医学分野や食品分野等の研究において、有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ハプテン−蛋白質複合体の固定化時間を検討したグラフである。
【図２】本発明による免疫学的測定方法の試料とモノクローナル抗体液の免疫反応容器分注後の反応時間を検討したグラフである。
【図３】本発明による免疫学的測定方法の別の容器で試料とモノクローナル抗体液を反応させる場合の、試料とモノクローナル抗体液の反応液を免疫学的反応容器に分注後の反応時間を検討したグラフである。
【図４】本発明による免疫学的測定方法の別の容器で試料と抗体液を反応させる場合の、試料と抗体液の反応時間を検討したグラフである。
【図５】本発明による免疫学的測定方法の酵素標識抗体液の反応時間を検討したグラフである。
【図６】本発明による免疫学的測定方法の標準曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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