(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
注目の遺伝子を発現する原核細胞であって、下記の特徴を有する前記細胞：
ｉ）当該細胞が、その染色体上に、 反対方向に転写される前記の注目遺伝子の２コピーを有すること；並びに、
ii）項目ｉ）に係る注目遺伝子の２コピー間に位置する任意のDNA セグメントが、当細胞の増殖に必須でないDNA 配列のみを含んでいること。
【請求項２】
注目の遺伝子を発現する原核細胞を作成するための方法であって、下記の特徴を有する細胞の作成を含む前記方法：
ｉ）当該細胞が、その染色体上に、反対方向に転写される前記の注目遺伝子の２コピーを有すること；並びに、
ii）項目ｉ）に係る注目遺伝子の２コピー間に位置する任意のDNA セグメントが、当細胞の増殖に必須でないDNA 配列のみを含んでいること。
【請求項３】
前記遺伝子が、当該細胞から分泌されるポリペプチドを発現することができる遺伝子である、請求項１の原核細胞。
【請求項４】
前記遺伝子が酵素をコードする、請求項１又は３の原核細胞。
【請求項５】
前記原核細胞がバチルス菌細胞である、 請求項１、３又は４のいずれかの原核細胞。
【請求項６】
前記遺伝子の２コピー間に位置する前記DNA セグメントの長さが、少くとも10bpである、請求項１又は３〜５のいずれかの原核細胞。
【請求項７】
前記遺伝子の２コピー間に位置する前記DNA セグメントが、抗生物質耐性マーカー遺伝子を含んでいない、請求項１又は３〜６のいずれかの原核細胞。
【請求項８】
前記遺伝子が、当該細胞から分泌されるポリペプチドを発現することができる遺伝子である、請求項２の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が酵素をコードする、請求項２又は８の方法。
【請求項１０】
前記原核細胞がバチルス菌細胞である、請求項２、８又は９のいずれかの方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の２コピー間に位置する前記DNA セグメントの長さが、少くとも10bpである、請求項２又は８〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記遺伝子の２コピー間に位置する前記DNA セグメントが、抗生物質耐性マーカー遺伝子を含んでいない、請求項２又は８〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
注目のポリペプチドを生産及び単離するための方法であって、下記の過程を含んで成る前記方法：
ｉ）注目の遺伝子によってコードされる注目のポリペプチドの発現を可能にする適当な条件下で、請求項１又は３〜７のいずれかの原核細胞を培養すること；並びに、
ii）その注目のポリペプチドを単離すること。
【請求項１４】
少くとも２ｇポリペプチド（乾燥物）／kg培地の量で注目ポリペプチドが発現される条件下で、項目ｉ）の原核細胞の培養を行う、請求項１３の注目ポリペプチドの生産及び単離の方法。
【請求項１５】
項目ｉ）の原核細胞の培養を、 >10ｍ3 の容量規模の発酵工程で行う、請求項１３の注目ポリペプチドの生産及び単離の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
注目する遺伝子を発現する原核細胞であって、その染色体上にその遺伝子の少くとも２コピーを含有する原核細胞。
【０００２】
発明の背景：
工業的な規模で注目するタンパク質を生産するために、マルチコピー生産性の原核細胞、すなわち注目する遺伝子の２以上のコピーを含有する細胞が利用されている。
好ましいマルチコピー生産細胞は、発酵中、注目する遺伝子の各コピーが安定に維持されている細胞である。
【０００３】
更に環境への関心から、染色体上に抗生物質耐性遺伝子が組み込まれていない生産細胞、従って抗生物質が含まれていない発酵培地中で、注目する遺伝子のコピーを安定に維持し得る生産細胞が、益々求められている。
【０００４】
EP284126は、前記の安定性の問題を解決するために、宿主細胞の生命維持に必要（必須）な内在性DNA によって隔てられた注目遺伝子の少くとも２コピーが染色体上に組み込まれた原核細胞を作成する方法を記載している（EP284126の請求項１を参照すること）。
【０００５】
前記の必須DNA のために、発酵中の細胞集団において、注目遺伝子の各コピーが安定に維持される。注目遺伝子の２コピー間での相同組換えによって、この必須DNA が除かれると、その細胞は必須DNA を失い、その結果死滅するだろう。
従って、注目遺伝子のコピーを含有する安定な細胞集団を維持することが可能となる。
【０００６】
この方法では、どのDNA 領域が細胞の生命にとって必須であるかを知る必要がある。あるいは、コピー間に必須DNA が存在する確率を高くするために、注目遺伝子が、染色体上の非常に離れた場所に組み込まれる必要がある（EP284126の図２参照のこと）。これは、比較的に労力を要する方法であり、そして不確実な方法である。
【０００７】
発明の要旨：
本発明が解決しようとする課題は、注目遺伝子を発現する原核細胞であって、その染色体上に注目遺伝子の少くとも２コピーを含有する原核細胞を提供することである。
【０００８】
更に、この原核細胞は、
ａ）発酵中に染色体上に当該遺伝子の２コピーを保持することができるという意味で安定であること；そして
ｂ）当該遺伝子の２コピーを、その２コピー間に、例えばEP284126に記載された様な細胞増殖に必須であるDNA セグメントを有することなく安定に維持することができること、
が必要である。
【０００９】
本発明は、発酵中に、細胞の染色体上に、反対方向に転写される２コピーの遺伝子を安定に維持することが可能であること（図１参照）、並びに、その反対方向に転写される２コピーの遺伝子が、その２コピー間に、細胞増殖に必須であるDNA セグメントを有することがなくても、安定に維持され得ることを見い出したことに基づいている。
【００１０】
従って、１点目として、本発明は、注目遺伝子を発現する原核細胞であって、
ｉ）当細胞が、染色体上に、 反対方向に転写される注目遺伝子の２コピーを有すること；そして
ii）ｉ）の注目遺伝子の２コピー間に位置する任意のDNA セグメントが、その細胞増殖に必須でないDNA 配列のみを含んでいること、
を特徴とする前記の原核細胞に関する。
【００１１】
２点目として、本発明は、注目遺伝子を発現する原核細胞を作成する方法であって、
ｉ）当細胞が、染色体上に、 反対方向に転写される注目遺伝子の２コピーを有すること；そして
ii）ｉ）の注目遺伝子の２コピー間に位置する任意のDNA セグメントが、その細胞増殖に必須でないDNA 配列のみを含んでいること、
を特徴とする細胞を作成することを含む前記方法に関する。
【００１２】
３点目として、本発明は、注目するポリペプチドの生産及び単離のための方法であって、
ｉ）注目遺伝子によってコードされる注目ポリペプチドの発現を可能にする適切な条件下で、本発明の１点目に係る原核細胞を培養すること；そして
ii）その注目ポリペプチドを単離すること、
を含んで成る前記方法に関する。
【００１３】
本文記載の原核細胞の利点の１つは、当遺伝子の２コピーが反対方向に転写され、そのために、それらの遺伝子コピーが同方向に転写される場合に比べて、相同組換えを介して当細胞から当遺伝子の１コピーが失なわれる危険性が最小化されることである（図１参照）。
【００１４】
このことは、当原核細胞の別の利点を意味し、すなわち、当遺伝子の２コピー間に、当細胞の増殖に必須なDNA セグメントを有することなく、その２コピーの遺伝子を安定に組み込むことが可能である。
【００１５】
従って、EP284126に記載された様に、染色体上の非常に離れた位置に、注目遺伝子の各コピーを組み込む必要がない（EP284126の図２参照）。従って、EP284126に記載された細胞の作成に比べて、（本文記載の）原核細胞の作成は、比較的により簡単となる。本文記載の原核細胞の好ましい作成方法の詳細に関して、以下を参照すること。
【００１６】
更に、当分野では、細胞増殖に必須である前記DNA セグメントは、抗生物質耐性マーカー遺伝子のことであり、これが、注目遺伝子の２以上のコピーを有する原核細胞を作成するために利用されてきた（例えばEP166628及びWO94/14968参照) 。
【００１７】
従って、本文記載の原核細胞の作成方法の更なる利点は、当細胞に抗生物質耐性遺伝子を導入及び含有させることなく、当該遺伝子の２コピーから遺伝子発現する原核細胞を作成する簡単な方法が提供されることである。
【００１８】
定義：
本発明の各事項に用いられる用語を以下の通り定義する。
用語「当該遺伝子」とは、当該細胞内で、その遺伝子発現によってポリペプチドが作られる遺伝子(DNA配列）を指す。従って、その遺伝子の配列は、開始コドン（通常ATG, GTG又はTTG)から始まり、そして停止コドン（通常TAA, TAG又はTGA)で終るオープンリーディングフレームとして規定される。
【００１９】
この遺伝子を発現するために、当遺伝子と共に、当細胞内での当遺伝子の発現に必要な、当分野で既知の要素が必要である。これらの標準的な要素には、プロモーター、リボソーム結合部位、停止配列、並びに当分野に既知のその他の要素が含まれる。
【００２０】
用語「反対方向に転写される当遺伝子の２コピー」とは、当遺伝子が収束的方向に又は分散的方向に転写されること、すなわち各々が相互に反対方向に配置されることを指す。
【００２１】
本発明の原核細胞に関連して、用語「当細胞が、その染色体上に、反対方向に転写される注目遺伝子の２コピーを有する」とは、当該原該細胞が、本発明の１点目に記載した通りの位置に、注目遺伝子の２コピーを少くとも有することを指す。当原核細胞は、注目遺伝子の２コピーの他に、更に多くの当遺伝子のコピーを、染色体上に有することもできる。
【００２２】
前記の更に多くのコピーとは、当染色体の異なる場所に本発明に係る位置で存在する当遺伝子の更なる２コピーであってもよいし、あるいは当染色体の異なる部分上に位置する単一コピー／複数コピーであってもよい。
【００２３】
用語「当細胞増殖に必須でないDNA 配列のみを含むDNA セグメント」とは、そのDNA セグメントが、当細胞の染色体から排除（除去）された場合でも、それが除去される前と比べて、同様な増殖条件下で、実質的に同等の増殖速度で増殖することができるというDNA セグメントを指す。
【００２４】
反対に、DNA セグメントが「当細胞増殖に必須である」とは、そのDNA セグメントが当細胞から除去された場合、それが除去される前と比べて、同様な増殖条件下で、実質的に同等の増殖速度で増殖することができないことを指す。
【００２５】
この必須DNA セグメントは、親（野生型）の染色体配列の一部分（例えばEP284126に記載のもの）でもあり得るし、あるいは当該染色体上に導入され得る選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性マーカー遺伝子でもあり得る（例えばEP166628; WO9414968 参照）。
例示として本発明の態様を以下に記す。
【００２６】
発明の詳細な説明：
本発明の１つの態様では、本発明に係る注目遺伝子は、当該細胞から分泌されるポリペプチドを発現する遺伝子である。
好ましくは、当遺伝子は、シグナルペプチドを含んで成る融合ポリペプチド、及び分泌される成熟ポリペプチドをコードするものでよい。このシグナルペプチドは当分野に周知である。
【００２７】
本発明の別の態様では、当遺伝子は酵素をコードする。この酵素は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、及び当分野で既知のその他の酵素でよい。
本発明の更に別の態様では、当該原核細胞は、グラム陽性原核細胞、例えばバチルス菌又はストレプトミセス菌である。
【００２８】
好ましいバチルス菌は、例えばBacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus circulans 、及びBacillus thuringiensisなどの菌種である。
【００２９】
本発明の更に別の態様では、当該遺伝子の２コピー間に位置する当該DNA セグメントは、少くとも10bpの長さであり、より好ましくは10bp〜6000bpの長さであり、更により好ましくは75bp〜4500bpの長さである。
【００３０】
本発明の更に別の態様では、当該遺伝子の２コピー間に位置する当該DNA セグメントは、更に、選択可能なタンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP) をコードする遺伝子を含まない。この様な選択可能なタンパク質を、注目遺伝子の２以上のコピーを有する原核細胞を作成するために、用いることができる（この様な選択可能なタンパク質について、DK0792/97 及びWO99/01562を参照すること）。
【００３１】
本発明の更に別の態様では、本発明の１点目の原核細胞、又は本発明の２点目の方法において、注目遺伝子の２コピー間に位置するDNA セグメントは、抗生物質耐性マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、又はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含まない。
この様な抗生物質耐性マーカー遺伝子を有さない本発明の細胞の例として、例えば実施例３及び４を参照すること。
【００３２】
本発明の２点目に係る方法及び本文記載のその態様を、原核細胞の染色体中にDNA セグメント／断片を導入するための、特に相同組換えによって染色体中にDNA セグメントを導入するための、当分野に既知の任意の技術に従って実施することができる。好ましい方針は、注目する前記DNA セグメントと温度感受性の複製起点とを含有するプラスミドによって細胞を形質転換することである。そのプラスミドの複製を許容しない温度で当細胞を培養し、そして細胞内で相同組換えによって、そのプラスミドと染色体とを組み換える。
【００３３】
この様な方法の詳細について、EP 0 284 126; EP 166 628; WO 94/14968; Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.“Molecular Cloning. A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratories, 1982; Ausubel, F. M., et al. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus"を参照すること。
【００３４】
本発明の２点目に係る方法及びそれに関する本文記載の態様を実施するための一般的な方針を、実施例（実施例３及び４）で開示する。
相同組換えに基づく好ましい方針を図２に示す。当方針の実際の例として実施例４を参照すること。
【００３５】
本文の実施例及び図２に記載した方法の利点は、注目遺伝子の２コピーが、正確な機構によって、宿主染色体の同一遺伝子座に組み込まれることであろう。当該遺伝子に特に十分に適合した遺伝子座が知られている場合には、このことは望ましい。
【００３６】
従って、遺伝子発現する原核細胞を作成する本発明の方法の１つの態様では、注目遺伝子の２コピーを、正確な機構によって、宿主染色体の同一遺伝子座内に組み込む。
【００３７】
本発明の３点目に係る注目ポリペプチドを生産及び単離する方法において、過程ｉ）の特定の培養、及び過程ii) の注目ポリペプチドの特定の単離を、当業者に既知の任意の標準的な方法に従って実施できる。
【００３８】
前記載通り、本文記載の原核細胞の利点は、発酵中に当該細胞が、染色体上に当該遺伝子の２コピーを維持することができるという意味で安定であることである。
従って当該細胞は、大規模な工業発酵に特に適する。
この様な大規模な工業発酵は、ａ）注目ポリペプチドを比較的高収率で生産すること、又はｂ）大規模発酵工程を利用すること、という特徴を有し得る。
【００３９】
従って、本発明の３点目である注目ポリペプチドの生産及び単離の方法の態様として、過程ｉ）の原核細胞の培養を、注目ポリペプチドが、少くとも２ｇポリペプチド（乾燥物）／kg培地、好ましくは少くとも３ｇポリペプチド（乾燥物）／kg培地、最も好ましくは少くとも５ｇポリペプチド（乾燥物）／kg培地の量で発現する条件下で行う。
【００４０】
更に、本発明の３点目である注目ポリペプチドの生産及び単離の方法の態様として、過程ｉ）の原核細胞の培養を、 >10ｍ3 、好ましくは >25ｍ3 、より好ましくは >50ｍ3 、最も好ましくは>100ｍ3 の容量規模の発酵工程で行う。
【００４１】
材料と方法：
インビトロのDNA 操作、細菌の形質転換などは、分子生物学における標準的な方法に従って行う（Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.“Molecular Cloning. A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratories, 1982; Ausubel, F. M., et al. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990)。特に言及していない場合、供給業者の取扱説明書に従ってDNA 操作用の酵素を使用した。
使用した培地(TY, BPX及びLBアガー）は、EP0506780 に記載されている。LBPSG アガーは、リン酸塩（0.01Ｍ K3PO4）、グルコース(0.4％）及びスターチ(0.5％）を補充したLBアガーである。
【００４２】
実施例１：B. licheniformisの染色体からのαアミラーゼ(amyL)プロモーターの除去
1A. プラスミド作成
Jorgensen et al. (1990) の記載通りに、B. licheniformisのαアミラーゼ(amyL)遺伝子を、2.4kb の SphＩ-HindIII断片としてクローニングして、プラスミドpDN1981(図３）を作成した。「kan 」は、pUB110由来のカナマイシン耐性遺伝子を表し、「PamyL 」はαアミラーゼのプロモーター領域を表す（Jorgensen, P. L., Hansen, C. K., Poulsen, G. B., Diderichsen, B. (1990). In vivo genetic engineering: homologous recombination as a tool for plasmid construction. Gene 96, 37-41)。
【００４３】
pSJ2433(図４）は、前記配列の最初の450bp (UPS PamyLと表示する）を有し、それがpUC19 にクローン化されたものであり（Yanish-Perron et al., 1985 (Yanish-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985). Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119))、以下の通り作成した。pDN1981 のDNA を  鋳型として、プライマーLWN4739 及びLWN4740 によってPCR 増幅を行い、生成した0.5kb 断片をEcoRＩ及びHindIII で切断し、EcoRＩ及びHindIII で切断したpUC19 と連結し、そしてそれをエレクトロポレーション法で大腸菌SJ2 (Diderichsen et al., 1990 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990). Cloning of aldB, which encodes α-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis))内に導入し、アンピシリン耐性（AmpR 200μg/ml) で選択した。「bla 」は、pUC19 のアンピシリン耐性遺伝子を表す。
【００４４】
２つの形質転換体をSJ2433及びSJ2434として保存した。挿入配列の全配列の決定を行っていないが、両末端のDNA 配列を決定して、挿入配列を確認した。
【００４５】
0004350894.tif 000002
【００４６】
pDN1981 上のαアミラーゼ(amyL)遺伝子から得た0.5kb の PstＩ- Kpn Ｉ断片（‘amyL' と表示する）を、 PstＩ及び KpnＩで切断したpSJ2433 に連結し、そしてエレクトロポレーション法で大腸菌SJ6 (Diderichsen et al., 1990)に形質導入し、AmpR 200μg/mlで選択することにより、pSJ2433 からpSJ2454(図５）を作成した。
【００４７】
pSJ1327(図６）は、pC194 (Horinouchi and Weisblum, 1982. (Horinouchi, S., and Weisblum, B. (1982). Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies chloramphenicol resistance. J. Bacteriol., 173, 559-567)) に由来するcat 遺伝子が、pUC19 誘導体中のポリリンカー部分に挿入されたものである。クロラムフェニコール耐性を付与するcat 遺伝子を、pDN1600 から1.0kb のBamHＩ-BglII断片として切り出し、BamHＩで切断したpDN3000 (Diderichsen et al., 1990)に連結し、そして大腸菌SJ6 に形質導入し、AmpR(200μg/ml) で選別した。
【００４８】
pSJ2643(図７）は、pSJ2454 中で、amyL由来の２つのセグメント間にcat 遺伝子が挿入されたものである。cat 遺伝子を、pSJ1327 から1.1kb の NheＩ-XbaＩ断片として切り出し、 NheＩで切断したpSJ2454 に連結し、そしてエレクトロポレーション法で大腸菌SJ6 に形質導入し、クロラムフェニコール耐性（CamR、６μg/ml) で選択して、pSJ2643 を作成した。「Plac」は、pUC19 に由来するβガラクトシダーゼのプロモーターを表す。
【００４９】
pSJ2650(図８）は、温度感受性のバチルス菌プラスミド上にUPS PamyL-cat-‘amyL' を有するものである。pSJ2643 を XbaＩ及びHindIII で切断し、その2.0kb 断片を単離し、pSJ980（図９；米国特許5,698,415)由来の5.1kb の NheＩ-HindIII断片に連結し、そしてB. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990) のコンピテント細胞に形質導入し、LBPSG プレート(WO96/23073)上でクロラムフェニコール耐性(CamR)及びカナマイシン耐性(KanR)、各々６μg/ml及び10μg/mlで選択して、pSJ2650 を作成した。「repF」はpE194 由来の複製タンパク質の遺伝子を表し、「+ori pE194」はpE194 の複製起点を表し、そして「erm 」はpE194 のエリスロマイシン耐性遺伝子を表す。これはまた「erm C 」とも表す。
【００５０】
1B. B. licheniformisの形質転換
米国特許5,698,415 の実施例６に記載のB. licheniformis菌株は、その染色体上に、amyLプロモーター変異体から発現されるαアミラーゼ(amyL)遺伝子を１コピー有するものであり、これを宿主菌株に用いた。pSJ2650 を、プロトプラスト形質転換法によってこの菌株に導入し（Akamatzu and Sekiguchi, 1984 (Akamatsu, T., Sekiguchi, J. (1984). An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem., 48, 651-655)) 、30℃でエリスロマイシン耐性 (ErmR、２μg/ml) を選択した。２週間培養した後、再増殖した菌を単離した。３つの菌体SJ3034, SJ3035及びSJ3036を保存した。
【００５１】
1C. 染色体組込み及び切出し
菌体SJ3035及びSJ3036を、６μg/mlクロラムフェニコール及び５μg/mlエリスロマイシンを含むプレート上で50℃で画線培養した。各菌体から得た８個のアミラーゼ陰性コロニーを、プライマーLWN4726 及びLWN3825 を用いたPCR 増幅によって検査したところ、その全てで、適正サイズの増幅断片が得られた。この増幅断片は、cat 遺伝子内の NcoＩ部位から、amyL遺伝子内の KpnＩ部位から157bp 下流の位置までの総計1007bpである。この断片は、pSJ2650 が、‘amyL' の相同性を介して組み込まれた場合のみに生成する。
【００５２】
0004350894.tif 000003
【００５３】
各コロニーを、抗菌剤を含まないTY培地 (WO91/09129) 10ml中で、30℃で二晩連続培養し、それらを、６μg/mlクロラムフェニコールを含むプレート上にまき、30℃で一晩培養してから、そのレプリカを、６μg/mlクロラムフェニコール±５μg/mlエリスロマイシンを含むプレート上で培養し、そしてエリスロマイシン感受性と推定されたコロニーを、同様のプレート上で画線培養した。
【００５４】
クロラムフェニコール耐性且つエリスロマイシン感受性である３つの菌体を単離した：
SJ3035コロニー１由来のSJ3047
SJ3035コロニー２由来のSJ3048
SJ3036コロニー１由来のSJ3049。
【００５５】
cat 遺伝子が、amyLプロモーター領域内に組み込まれたことを、サザン分析で確認した。
amyL遺伝子領域の制限酵素地図は以前に作成されており、amyLプロモーターは、3.35kbのHindIII 断片及び1.9kb の ClaＩ断片上に位置することが分かった。
cat 遺伝子によるamyLプロモーターの置換から、正味835bp の挿入体が得られるであろう。cat 遺伝子では、追加のHindIII 部位又は ClaＩ部位が挿入されることはない。
従って、SJ3047〜49から染色体DNA を抽出し、HindIII 及び ClaＩで別々に切断し、アガロースゲル上で分離し、吸引ブロッティングによりイモビロンＮ膜に転写し、そしてニックトランスレーション法により32P 標識したpSJ1325 (cat遺伝子を有するpUC19 プラスミド）で探索した。
【００５６】
SJ3047及びSJ3048では、予想通り、4.2kb のHindIII 断片とのハイブリダイゼーションが認められたが、SJ3049ではいくらかより大きい断片とのハイブリダイゼーションが認められた。SJ3047及びSK3048では、再び予想通りに、2.7kb の ClaＩ断片とのハイブリダイゼーションが認められた。
従って、アミラーゼ陰性である菌体SJ3047及びSJ3048では、希望通り、前記のamyLプロモーターがcat 遺伝子で置換されている。
【００５７】
実施例２：改良されたαアミラーゼ(amyL)プロモーターの単離
2A. プラスミド作成
米国特許5,698,415 には、B. licheniformisのamyLプロモーターに由来するプロモーター変異体が開示されている。上記特許の請求項１には、その様なプロモーター変異体としてN2-N9 の配列がATGTATCAである配列断片を開示している。amyLプロモーター領域をカバーする長いPCR プライマー中に希望する変異を組込むことによって（#28902) 、その様なプロモーター変異体を作成した。もう一方のPCR プライマーLWN3216 は、AmyLのシグナルペプチドをコードする領域内の PstＩ部位を含む位置から上流の部位である。これらのプライマーによって、amyLプロモーター変異体断片をPCR 増幅することができる。
【００５８】
0004350894.tif 000004
【００５９】
B. licheniformis菌SJ3047の染色体内に組み込むために適している形でamyLのDNA によって挟まれた前記プロモーター変異体を含んでいる移動性且つ温度感受性のプラスミドを、以下の様に作成した。
PCR 増幅の鋳型として、BglII で切断したpDN1981 を用いた。45℃のアニーリング温度で、プライマー#28902及びプライマーLWN3216 を用いた。適正サイズのPCR 産物を得て、 SphＩ及び PstＩで切断し、pSJ2643 の3.6kb の SphＩ-PstＩ断片に連結し、その連結反応液をEcoRＩ及びHindIII で切断し、その断片混合液から単離した1.1kb 断片を、pSJ2739(図10; WO96/23073“DNA integration by transposition" に記載されている）由来の4.4kb のEcoRＩ-HindIII断片に連結した。この連結反応液によってB. subtilis DN1885のコンピテント細胞を形質転換し、37℃でエリスロマイシン耐性を選択した。制限酵素地図の作成によって、その組換えプラスミドを分析し、そしてpSJ4199 と表す当プラスミド（図11）内のamyLプロモーター領域のDNA 配列を、プライマーLWN3207 を用いて決定し、そして希望配列の保有を確認した。「oriT (pUB110) 」は、接合による当プラスミドの移動に必要な、pUB110のシス作用配列を表す。WO96/23073を参照すること。「PamyL 4199」はamyLプロモーターの変異体を表す。
【００６０】
当amyLプロモーター変異体によって、プラスミドpDN1981 中のamyLプロモーターを置換した。当変異体を、pSJ4199 から0.2kb の SphＩ-PstＩ断片として切り出し、pDN1981 由来の5.0kb の SphＩ-PstＩ断片に連結した。この連結反応液でB. subtilis DN1885を形質転換し、カナマイシン耐性（10μg/ml）を選択した。２つの形質転換体を、SJ4277 (DN1885/pSJ4277; 図12）及びSJ4278 (DN1885/pSJ4278）として保存した。「rep 」はpUB110の複製タンパク質遺伝子を表す。
【００６１】
2B. B. licheniformis内への移動及び染色体組込み
プラスミドpSJ4199 で、B. subtilis PP289-5 (dal-, pLS20, pBC16; WO96/23073 、実施例４）のコンピテント細胞を形質転換し、そしてエリスロマイシン(5μg/ml）及びテトラサイクリン(5μg/ml）耐性を、D-アラニン(100μg/ml）含有プレート上で30℃で選択した。２つの形質転換体SJ4237及びSJ4238を保存した。
【００６２】
本質的にWO96/23073の実施例11の記載通りに、これらの各ドナー菌体との接合により、それらのプラスミドをB. licheniformisに移動させた。トランス接合体は、ほとんど独占的にテトラサイクリン感受性である。各ドナー菌体に由来する１つのトランス接合体：SJ4258 (SJ4237由来）及びSJ4259 (SJ4238由来）を保存した。 両者ともpSJ4199 を含んでいる。
【００６３】
クロラムフェニコール(6μg/ml）及びエリスロマイシン(5μg/ml）を補充したLBPSG プレート上で、一晩50℃で前記の菌体を画線培養した。各菌体からアミラーゼ陽性コロニーを得た。3-4 連続して移動させるために、各菌体由来の４コロニーを、抗菌剤を含まないTY培地に接種し、プラスミドの複製、切り出し及び欠失を可能にした。各トランス接合菌体から、アミラーゼ陽性且つエリスロマイシン感受性コロニーを得て、SJ4270 (SJ4258由来）及びSJ4271 (SJ4259由来）として保存した。
【００６４】
2C. プロモーター変異体菌体の検査
フラスコ振とう培養実験により、プロモーター変異体の効率を検査した。この実験では、各組込み菌体によるαアミラーゼ生産を、コントロール菌体（当プロモーターの欠失によりSJ3047が得られる基となる菌体）によるαアミラーゼ生産と比較した。この培養を、二対一組で、BPX 培地(EP 0 506 780)中で、37℃で７日間行い、2, 5及び７日目にαアミラーゼ活性を測定した。
【００６５】
コントロール菌体において測定された最大活性に対する相対活性を示す。
0004350894.tif 000005
菌体SJ4270及びSJ4271内に存在する当プロモーター変異体により、それらのαアミラーゼ生産は、コントロール菌体に比べて明らかに向上する。
【００６６】
実施例３：分散的に転写される２つの発現カセットを有する菌体の作成
amyL遺伝子の完全なコピーが、pSJ4199 内のUPS PamyL セグメントとPamyL4199 プロモーターとの間に挿入され、従ってそのプラスミド上の２つのamyLプロモーターが反対方向に読まれる様に、プラスミドを設計した。
【００６７】
プラスミドpSJ4388(図13）及びpSJ4339 を作成した。これらは、UPS PamyL とPamyL4199 セグメントとの間に数個の余分の制限部位が導入されていること以外、組み込みプラスミドpSJ4199 とほぼ相同である。プラスミドpSJ4278 を鋳型として、プライマー#113123 及びLWN3216 によりPCR 増幅を行った。
0004350894.tif 000006
【００６８】
0.19kbの増幅断片を得て、精製し、そして SphＩ及び PstＩで切断した。それを、pSJ2643 の3.5kb の SphＩ-PstＩ断片に連結し、その連結反応液をEcoRＩ及びHindIII で切断し、その1.13kb断片を精製し、そしてEcoRＩ及びHindIII で切断したpSJ2739 に連結した。この連結反応液でコンピテントな菌体DN1885を形質転換し、そして30℃でエリスロマイシン耐性(5μg/ml）を選択した。３つの形質転換体を得た。菌体SJ4338 (DN1885/pSJ4338) は、制限部位分析から適正であると認められたプラスミドを有し、DNA 配列の決定から、そのamyLプロモーター領域が適正であると確認された。
【００６９】
次に、前記の組込みプラスミド内に、完全なamyL遺伝子を挿入することによってプラスミドpSJ4372 及びpSJ4373(図14）を作成した。従って、pSJ4277 を BclＩ及びBglII で（更に希望しない断片を除くために NcoＩで）切断し、2.8kb 断片を精製した。これを、BglII で切断したpSJ4338 に連結し、その連結反応液でコンピテントなDN1885細胞を形質転換し、そして30℃でエリスロマイシン耐性を選択した。制限部位分析から、アミラーゼ陽性形質転換体SJ4372 (DN1885/pSJ4372) 及びSJ4373 (DN1885/pSJ4373) を得た。
【００７０】
3B. B. licheniformisへの移動及び染色体組込み
続いて、これらのプラスミドを、接合性ドナー宿主菌体PP289-5 に導入し、菌体SJ4378及びSJ4379 (両者ともPP289-5/pSJ4373; ErmR , Tet R , Dal - ) を得た。
前記通りに、接合により、プラスミドpSJ4373 を、B. licheniformis SJ3047 に移動させた。
２日後にトランス接合体 (SJ4378ドナーによるもの４体、SJ4379によるもの９体) が出現した。
４つの菌体、SJ4378ドナー由来のSJ4395及びSJ4396、並びにSJ4379ドナー由来のSJ4397及びSJ4398を保存した。
【００７１】
これらの菌体を、エリスロマイシン(5μg/ml）含有のLBPSG プレート上で50℃で画線培養し、次に各菌体毎に10コロニーをTY培地10mlに接種し、30℃で一晩増殖させた。これらの培養液を、LBPSG プレート上に単一コロニーになる様にまき、そのプレートを30℃で一晩インキュベーションし、そのレプリカを、エリスロマイシン(5μg/ml）含有のLBPSG プレート上に作成し、一晩インキュベーションした後に、エリスロマイシン耐性及びアミラーゼ表現型を評価した。ほとんどのコロニーはエリスロマイシン感受性であったが、アミラーゼ陰性であった。しかし１つの培養液に由来する菌体が、エリスロマイシン感受性で、アミラーゼ陽性として単離された。これをSJ4414として保存した。
【００７２】
3C. ２コピー菌体の検査
BPX 振とうフラスコ培養によって、２つの別々の実験において、２コピー菌体SS4414の能力を、SJ4270（対応する１コピー菌体）の能力と比較した。
BPX 振とうフラスコで、抗菌剤を添加することなく、37℃で７日間培養を行い、αアミラーゼ活性を測定した。各実験毎に、それらの活性を、１コピー菌体の活性と比較して表示する。
【００７３】
実験Ａ
0004350894.tif 000007
【００７４】
実験Ａ及びＢから、２コピー菌体SJ4414の収率は、対応する１コピー菌体SJ4270に比べてより高いことが示された。
更に、SJ4414をLBPSG プレート上にまいた。全ての単一コロニー（低pHのものを含む各フラスコから約30個）がアミラーゼ陽性であった。このことは、組込まれた２コピーが安定に維持されていることを示した。
【００７５】
実施例４：２連続過程による染色体への遺伝子挿入
前述した作成経路の代りとして、任意の発現カセットの簡単なクローニング及び組込みを可能にする温度感受性且つ移動可能なベクター対を設計及び作成した。第１のベクターは、宿主細胞の染色体内の隣接するセグメントに相同な２つの領域を含む。その領域間に、 当ベクターは、マルチリンカー部位及び、「中立」DNA の大きな（例えば5kb)セグメントを含む。第２のベクターは、「中立」DNA の大きなセグメントのみを含むが、このセグメントの中間に、第１のベクターと比べて逆方向に挿入されたマルチリンカー部位を有す。
これらのベクター及びその使用方針を、図15の概略図で説明する。
以前に定義した表記の他に、「セグメントＡ」は、大きな「中立」DNA セグメントの一方の半分を示し、「セグメントＢ」は、このセグメントのもう一方の半分を示し、そして「GFP 」は、緑蛍光タンパク質を発現する遺伝子を示す。
【００７６】
生産菌体への組込みに適する「中立」DNA として、Bacillus subtilis 168 pps 遺伝子領域（アクセス番号：GenBank/EMBL Z34883)由来の２つのセグメントの混合物を選択した。これを、国際ゲノム配列決定プログラムで用いられたB. subtilis 菌体であるSJ2692から得た。一方のセグメントは、遺伝子pps2の内部に完全に存在し、もう一方のセグメントは、pps4の内部に完全に存在する。これらは、制限酵素部位をほとんど含まないので、且つクローン化されても任意の遺伝子産物をコードすることが予想されないので、選択された。
【００７７】
4A. 第一発現カセットコピーの組込みのためのベクターの作成
プラスミドpSJ4459(図16）を以下の通り作成した。
SJ2692由来の染色体DNA を、プライマー#119882 及び#119883 によってPCR 増幅した。
0004350894.tif 000008
【００７８】
増幅した2.6kb 断片をEcoRＩ及びHindIII で切断し、そしてEcoRＩ及びHindIII で切断したpUC19 に連結した。エレクトロポレーション法により、この連結反応液で大腸菌SJ2 を形質転換し、IPTG/X-galプレート上でアンピシリン耐性(200μg/ml）を選択した。４つの白色コロニーを選び、そのプラスミドを調製した。その全てが適正なものであり、EcoRＩ, HindIII, SphＩ及び NheＩで切断することができた。１つの菌体をSJ4459 (SJ2/pSJ4459)として保存した。「z34883 10-12.5」はpps2由来の増幅断片を表す。
【００７９】
プラスミドpSJ4461(図17）を以下の通り作成した。
SJ2692由来の染色体DNA を、プライマー#119884 及び#119885 によってPCR 増幅した。
0004350894.tif 000009
【００８０】
増幅した2.8kb 断片をEcoRＩ及びHindIII で切断し、そしてEcoRＩ及びHindIII で切断したpUC19 に連結した。エレクトロポレーション法により、この連結反応液で大腸菌SJ2 を形質転換し、IPTG/X-galプレート上でアンピシリン耐性(200μg/ml）を選択した。４つの白色コロニーを選び、そのプラスミドを調製した。３つのものが適正なものであり、HindIII, XbaＩ, BglII, SalＩ, SacII, NotＩ, Mlu Ｉ, Nhe Ｉ, Nco Ｉで切断することができた。１つの形質転換体をSJ4461 (SJ2/pSJ4461)として保存した。「z34883 25.2-28.0」はpps4由来の増幅断片を表す。
【００８１】
プラスミドpSJ4498(図18）を以下の通り作成した。
プラスミドpSJ4459 をEcoRＩ及び NheＩ（更に希望しない部分を除くために BsaＩ）で切断し、その2.6kb のEcoRＩ-NheＩ断片をアガロースゲルにより精製した。この断片を、EcoRＩ及び XbaＩで切断したpSJ4461 に連結し、この連結反応液で大腸菌SJ6 を（エレクトロポレーション法により）形質転換し、そしてアンピシリン耐性(6μg/ml）を選択した。１つの菌体をSJ4498 (SJ6/pSJ4498)として保存した。
【００８２】
プラスミドpSJ4505(図19）を以下の通り作成した。
pSJ4498 を SphＩ及びHindIII で切断し、その5.4kb 断片をゲルにより精製した。これを、pSJ2643(前記、図７）に由来する3.2kb の SphＩ-HindIII断片に連結し、この連結反応液で大腸菌SJ6 を（エレクトロポレーション法により）形質転換し、そしてアンピシリン耐性(6μg/ml）を選択した。１つの形質転換体をSJ4505 (SJ6/pSJ4505)として保存した。
【００８３】
第二の遺伝子コピーの挿入を視覚的に選択するために、第一の組込みベクター内の２つのpps 遺伝子セグメント間に、緑蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挿入した。この系による注目遺伝子の第一の挿入により、当該細胞がGFP 陽性となるが、注目遺伝子の第二のコピーの適切な挿入により、当該細胞は再びGFP 陰性となるだろう。緑蛍光タンパク質を発現するプラスミドはpSJ4574(図20）であり、これは、特許出願DK 0792/97の実施例１及び図３；並びにWO99/01562に記載されている。「bioST 」はGFP 遺伝子を表し、そして「PamyQ 」はBacillus amyloliquefaciensのαアミラーゼ遺伝子に由来するプロモーターを表す。
【００８４】
プラスミドpSJ4581(図21) を以下の通り作成した。
pSJ4574 を PstＩで切断し、その0.95kb断片をゲルにより精製した。この断片を、 NsiＩで切断したpSJ4505 に連結し、この連結反応液で大腸菌SJ2 を（エレクトロポレーション法により）形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml）を選択した。１つの形質転換体をSJ4581 (SJ2/pSJ4581)として保存した。
【００８５】
プラスミドpSJ4587(図22）を以下の通り作成した。
pSJ4581 をEcoRＩ及びBglII で切断し、その6.9kb 断片をゲルにより精製した。これを、pSJ2739(前記、図10）に由来する5.0kb のEcoRＩ-BglII断片に連結し、この連結反応液でB. subtilis DN1885のコンピテント細胞を形質転換し、そして30℃でエリスロマイシン耐性(5μg/ml）を選択した。１つの形質転換体をSJ4587 (SJ6/pSJ4587)として保存した。
【００８６】
プラスミドpSJ4465(図23）を以下の通り作成した。
PCR 反応において、プラスミドpSJ4459 を鋳型として、プライマー#119882 及び#119886 により、アニーリング温度60℃にて、10回の増幅サイクルを行った。
0004350894.tif 000010
【００８７】
増幅した2.6kb 断片をEcoRＩ及びHindIII で切断し、そしてEcoRＩ及びHindIII で切断したpUC19 に連結した。エレクトロポレーション法により、この連結反応液で大腸菌SJ2 を形質転換し、IPTG/X-galプレート上でアンピシリン耐性(200μg/ml）を選択した。６つの白色コロニーを選び、そのプラスミドを調製した。その内３つが適正なものであり、EcoRＩ, HindIII, SphＩ, Nhe Ｉ, SacII, SalＩ及びBglII で切断することができた。１つの菌体をSJ4465 (SJ2/pSJ4465)として保存した。
【００８８】
プラスミドpSJ4471(図24）を以下の通り作成した。
PCR 反応において、プラスミドpSJ4461 を鋳型として、プライマー#119887 及び#119888 により、アニーリング温度60℃にて、10回の増幅サイクルを行った。
0004350894.tif 000011
【００８９】
増幅した2.8kb 断片を XbaＩ及びHindIII で切断し、そして XbaＩ及びHindIII で切断したpUC19 に連結した。エレクトロポレーション法により、この連結反応液で大腸菌SJ2 を形質転換し、IPTG/X-galプレート上でアンピシリン耐性(200μg/ml）を選択した。12の白色コロニーを選び、そのプラスミドを調製した。その内１つが適正なものであり、 XbaＩ, HindIII, NotＩ, Mlu Ｉ, Nhe Ｉ及び NcoＩで切断することができた。この菌体をSJ4471 (SJ2/pSJ4471)として保存した。
【００９０】
プラスミドpSJ4499(図25）を以下の通り作成した。
プラスミドpSJ4465 をEcoRＩ及び NheＩ（更に希望しない部分を除くために BsaＩ）で切断し、その2.6kb のEcoRＩ-NheＩ断片をアガロースゲルにより精製した。この断片を、EcoRＩ及び XbaＩで切断したpSJ4471 に連結し、この連結反応液で大腸菌SJ6 を（エレクトロポレーション法により）形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml）を選択した。１つの適切な菌体をSJ4499 (SJ6/pSJ4499)として保存した。
【００９１】
プラスミドpSJ4507(図26）を以下の通り作成した。
pSJ4499 をEcoRＩ及びHindIII で切断し、その5.4kb 断片を精製し、pSJ2739 に由来する4.3kb のEcoRＩ-HindIII断片に連結した。この連結反応液でB. subtilis DN1885のコンピテント細胞を形質転換し、そして30℃でエリスロマイシン耐性(5μg/ml）を選択した。１つの形質転換体をSJ4507 (SJ6/pSJ4507)として保存した。
【００９２】
4C. Bacillus licheniformisのαアミラーゼamyLをコードする遺伝子の、第一及び第二組込みベクターへの挿入
プラスミドpSJ4457(図27) を作成した。これは、amyLプロモーター変異体の上流にわずかな余分の制限部位があること以外は、前述したpSJ4277(図12) とほぼ同一である。pSJ4338(実施例3A、図13）から精製した0.2kb の SphＩ-PstＩ断片を、pDN1981 の5kb の PstＩ-SphＩ断片に連結し、この連結反応液でDN1885を形質転換し、そしてカナマイシン (10μg/ml) 耐性を選択することにより、当プラスミドを作成した。１つの形質転換体をSJ4457 (DN1885/pSJ4457) として保存した。
【００９３】
プラスミドpSJ4608(図28) は、第一コピー組込みベクター内にamyL遺伝子が挿入されたものであり、以下の通りに作成した。
pSJ4457 をBglII 及びHindIII で切断し、その1.9kb 断片をゲルで精製した。この断片を、pSJ4587 由来の11.2kbのBglII-HindIII 断片に連結し、この連結反応液でコンピテントなDN1885細胞を形質転換し、そして30℃でエリスロマイシン耐性(5μg/ml）を選択した。アミラーゼ陽性且つGFP 陽性の１つの形質転換体をSJ4608 (DN1885/pSJ4608) として保存した。
【００９４】
プラスミドpSJ4606(図29) は、第二コピー組込みベクター内にamyL遺伝子が挿入されたものであり、以下の通りに作成した。
pSJ4457 をBglII 及び BclＩで切断し、その1.9kb 断片をゲルで精製した。この断片を、BglII で切断した pSJ4507に連結し、この連結反応液でコンピテントなDN1885細胞を形質転換し、そして30℃でエリスロマイシン耐性(5μg/ml）を選択した。希望した方向にamyL遺伝子が挿入された１つの形質転換体をSJ4606 (DN1885/pSJ4606) として保存した。
【００９５】
4D. 第一組込みベクターのBacillus licheniformisへの移動及び染色体への組込み
プラスミドpSJ4608 を、接合ドナー宿主菌体PP289-5 のコンピテント細胞に導入し、D-アラニン(100μg/ml）を補充したLBPSG プレート上で、エリスロマイシン(5μg/ml）及びテトラサイクリン(5μg/ml）耐性を選択し、そして１つの形質転換体をSJ4611 (PP289-5/pSJ4608)として保存した。
【００９６】
プラスミドpSJ4608 を、前記通りに接合により、B. licheniformis SJ3047(実施例１に記載）に移動させた。アミラーゼ陽性且つGFP 陽性のトランス接合体を、エリスロマイシン(5μg/ml）含有のLBPSG プレート上で50℃で一晩画線培養した。６つのアミラーゼ陽性且つGFP 陽性コロニーを各々TY培地10mlに接種し、30℃で振とうした。これらの培養液を、30℃でLBPSG プレート上に単一コロニーになる様にまき、そのレプリカを、エリスロマイシン(5μg/ml）含有のLBPSG プレート上に作成した。エリスロマイシン感受性且つアミラーゼ陽性と推定されるコロニーを再度単離した。当プレート上で約一週間後に、GFP 陽性表現型が明確に視認できた。アミラーゼ陽性、GFP 陽性且つエリスロマイシン感受性の２つの菌体を、SJ4629及びSJ4630として保存した。
【００９７】
4E. 第二組込みベクターのBacillus licheniformisへの移動及び染色体への組込み
プラスミドpSJ4606 を、接合ドナー宿主菌体PP289-5 のコンピテント細胞に導入し、D-アラニン(100μg/ml）を補充したLBPSG プレート上で、エリスロマイシン(5μg/ml）及びテトラサイクリン(5μg/ml）耐性を選択し、そして１つの形質転換体をSJ4609として保存した。
【００９８】
プラスミドpSJ4606 を、接合により、SJ4609からB. licheniformis菌体SJ4629及びSJ4630に移動させた。各受容菌から２つのトランス接合体を、エリスロマイシン(5μg/ml）含有のLBPSG プレート上で50℃で一晩画線培養した。各受容菌から50℃で出現した12個のコロニーを各々TY培地10mlに接種し、30℃で振とうした。この増殖をもう一度繰り返した。次にこれらの培養液を、30℃でLBPSG プレート上に単一コロニーになる様にまき、そのレプリカを、エリスロマイシン(5μg/ml）含有のLBPSG プレート上に作成した。
エリスロマイシン感受性且つGFP 陰性のコロニーを、24個の培養液中12個から得た。
いくつかの菌体を、SJ4669, SJ4670及びSJ4671（受容菌体SJ4629由来の個別のTY培地から）、並びにSJ4672, SJ4673及びSJ4674（受容菌体SJ4630由来の個別のTY培地から）として保存した。
【００９９】
4F. ２コピー菌体の検査
検査のために、菌体SJ4270（単一コピー菌体）、SJ4629及びSJ4630(GFPをも発現し、そしてpps 遺伝子セグメントが挿入されている単一コピー菌体）、並びに２コピー菌体SJ4669〜SJ4674を、37℃一週間BPX 振とうフラスコで培養し、そしてαアミラーゼ活性を測定した。その収率を、コントロールの１コピー菌体SJ4270の収率に対する割合％で表す。
【０１００】
0004350894.tif 000012
菌体SJ4630による非常に低い収率は、おそらく、後に検出された汚染菌混入のせいであったのであろう。
【０１０１】
菌体SJ4671は、サザン分析（後述）から、目的通りに、反対方向に挿入された２コピーのamyL遺伝子を有することが確認された。この菌体を研究用発酵槽で発酵させて、更に分析を行った。発酵４日目に、SJ4671の培養サンプルを、染色されたアミロペクチンを含むLBPGプレート上にまき、アミラーゼの表現型を検査した。出現した800 個のコロニーの全てが、同程度にアミラーゼ陽性であった。このことは、当菌体の安定性を反映している。
それらのコロニーの内10コロニーをBPX 振とうフラスコに接種し、コントロールとして、凍結保存したSJ4671をプレートにまいたものを用い、以下の結果を得た（７日間、37℃）。
【０１０２】
0004350894.tif 000013
この実験におけるSJ4671の収率は、最初の実験におけるSJ4671の収率の102%であった。
従って、発酵後に取り出した単一コロニーは全て、元のSJ4671の収率と同等の収率を呈する。このことは、当菌体の安定性を反映している。
【０１０３】
4G. サザン分析
菌体SJ3047, SJ4270, SJ4629、及びSJ4671を含む２コピー菌体から染色体DNA を抽出し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。調製したDNA を、HindIII で、又はHindIII 及び KpnＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離したそれらのDNA 断片を、吸引ブロッティング法によりImmobilon-N (Millipore) 膜に転写した。この膜を、ビオチン化プラスミドpDN1981 DNA で探索し、New England Biolabs 社のNE-Blot Photope キット及びPhotope Detection キットを用いて検出した。
プローブとして用いたプラスミドpDN1981 は、Termamyl遺伝子全長、pUB110の起点及びrep 遺伝子、並びにカナマイシン耐性遺伝子を含むものである。
【０１０４】
ブロットの結果から、菌体SJ3047から、予想通り、4.2kb のHindIII 断片が検出された。菌体SJ4270から、3.3kb のHindIII 断片が検出された。菌体SJ4629から、9.6kb のHindIII 断片が検出された。菌体SJ4671から、10.6kbのHindIII 断片が検出された。最後に、HindIII 及び KpnI の両方で切断した菌体SJ4671のDNA から、5.2kb, 4.2kb及び1.3kb の断片が検出された。
このハイブリダイゼーションパターンは、希望した 2コピー菌体から予想された通りであり、このことから菌体SJ4671が適切なものであることが確認される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１：
Ａ部分は、細胞の染色体上に位置し、同方向に転写される２つの遺伝子を示す。交差線により示す通り、同一なDNA 配列の相同組換えによって、当該細胞から前記遺伝子の１コピーが失なわれ得る。
Ｂ部分は、細胞の染色体上に位置し、分散する方向に転写される２つの遺伝子を示す。この状況では、その２つの遺伝子間に直接的に同一な配列が存在しない。従って、一方の遺伝子コピーの損失を招くその２つの遺伝子間の相同組換えの危険性が、 劇的に低下する。
Ｃ部分は、 細胞の染色体上に位置し、収束する方向に転写される２つの遺伝子を示す。Ｂの場合と同様に、その２つの遺伝子間で相同組換えが起きない。
【図２】図２：
この図は、本発明の原核細胞を作成するための好ましい方針を示す。
Ａ部分：
DNA セグメント「ＡＢＣ」及び「ＤＥＦ」は、細胞内の染色体上にある。
DNA セグメント「ＡＢＣ」、「１２３」、「４５６」、「ＸＸＸ」（注目遺伝子）及び「ＤＥＦ」を、好ましくは温度感受性プラスミドにより、細胞内に導入する。
Ｂ部分：
DNA セグメント「ＡＢＣ」及び「ＤＥＦ」の間で相同組換えがなされた後、当染色体は、「ＡＢＣ」、「１２３」、「４５６」、「ＸＸＸ」及び「ＤＥＦ」を有する。
次にセグメント「１２３」、「ＸＸＸ」及び「４５６」を有する新しいプラスミドを、当細胞に導入する。ただしその遺伝子「ＸＸＸ」は、Ａ部分と比べて反対方向に転写される。
Ｃ部分：
DNA セグメント「１２３」及び「４５６」の間で相同組換えがなされた後、当染色体は、「ＡＢＣ」、「１２３」、「ＸＸＸ」、「４５６」、「ＸＸＸ」及び「ＤＥＦ」を有する。ただし注目の遺伝子「ＸＸＸ」は反対方向に転写される。ここに示した特定例では、 それらが分散方向に転写される。
【図３】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図４】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図５】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図６】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図７】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図８】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図９】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図１０】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図１１】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図１２】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図１３】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図１４】図３〜１４：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例１〜３で使用したプラスミドを示す。
従って、これらのプラスミドの更なる説明のために、 実施例１〜３を参照すること。
【図１５】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図１６】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図１７】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図１８】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図１９】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２０】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２１】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２２】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２３】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２４】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２５】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２６】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２７】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２８】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図２９】図１５〜２９：
これらの図は、本発明の原核細胞を、本発明の原核細胞作成方法に従って作成するために、実施例４で使用した方針及びプラスミドを示す。
従って、これらの図の更なる説明のために、実施例４を参照すること。
【図１】
0004350894.tif 000014
【図２】
0004350894.tif 000015
【図３】
0004350894.tif 000016
【図４】
0004350894.tif 000017
【図５】
0004350894.tif 000018
【図６】
0004350894.tif 000019
【図７】
0004350894.tif 000020
【図８】
0004350894.tif 000021
【図９】
0004350894.tif 000022
【図１０】
0004350894.tif 000023
【図１１】
0004350894.tif 000024
【図１２】
0004350894.tif 000025
【図１３】
0004350894.tif 000026
【図１４】
0004350894.tif 000027
【図１５】
0004350894.tif 000028
【図１６】
0004350894.tif 000029
【図１７】
0004350894.tif 000030
【図１８】
0004350894.tif 000031
【図１９】
0004350894.tif 000032
【図２０】
0004350894.tif 000033
【図２１】
0004350894.tif 000034
【図２２】
0004350894.tif 000035
【図２３】
0004350894.tif 000036
【図２４】
0004350894.tif 000037
【図２５】
0004350894.tif 000038
【図２６】
0004350894.tif 000039
【図２７】
0004350894.tif 000040
【図２８】
0004350894.tif 000041
【図２９】
0004350894.tif 000042