(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄シアノ錯体分解能を有する新菌株クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  ＡＮ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９２）。
【請求項２】
新菌株クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） ＡＮ−１株（ＦＥＲＭＰ−１７７９２）により、アルカリ性条件下で鉄シアノ錯体を分解する鉄シアノ錯体含有排水処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属する細菌であって、弱アルカリ性の生育条件下で、シアン化合物分解能を有する新規な微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シアン化合物には、シアン化物と金属シアノ錯体と称される化合物群が含まれる。前記シアン化物は、「遊離シアン」とも呼ばれているもので、一般式Ａｎ（ＣＮ）ｘで表され、Ａには水素（Ｈ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、アンモニウム（ＮＨ4 ）、カルシウム（Ｃａ）などがあり、シアン化合物の中で最も毒性の高い形態である。又、前記金属シアノ錯体は、シアン化水素の金属塩と金属とが過剰のシアン化物イオン（ＣＮ- ）と結合したもので、一般式Ａｎ［Ｍ（ＣＮ）ｘ］で表される。ここで、Ｍには銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、カドミウム（Ｃｄ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）などの金属が該当し、溶液中に溶存、あるいは懸濁状で存在している。
【０００３】
前記シアン化合物は、産業排水等に含まれていることがあり、浄化処理で取り除かれるべき性質の物質である。溶液（排水）中でのシアン化合物の存在形態に関しては、排水処理分野で多くの研究が行われており、その形態は大部分が前記遊離シアンと前記金属シアノ錯体であることが報告されている。
これらのシアン化合物を含有する排水の処理方法としては、アルカリ塩素法、オゾン酸化法、電解酸化法、紺青法（難溶性錯化合物沈殿法）、酸分解燃焼法、煮詰法（煮詰高温燃焼法）、湿式加熱分解法、及び、吸着法などが知られている。しかし、これらの処理方法においては、安定性の高い金属シアノ錯体、例えば鉄、コバルト、銀、金のシアノ錯体については適用することができない場合があった。又、反応条件が過酷である点、大規模な設備が必要である点、これらの処理を施した結果生じる生成物が、更に処理を要するものであることがある点で問題があった。
そこで、前述した問題を回避しつつ環境を修復する技術として、生物機能を利用して浄化処理を行なう、所謂、バイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）が注目されており、前記シアン化合物分解能を有する微生物の検索が行なわれている。
【０００４】
現在、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムなどの前記遊離シアンの微生物分解に関しては、遊離シアンの分解菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．などの微生物が単離、同定されたという報告がある。
【０００５】
そして、前記金属シアノ錯体に関しては、ニッケル−シアノ錯体（［Ｋ2 Ｎｉ（ＣＮ）4 ］）の分解微生物として、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍが報告されている。又、鉄シアノ錯体であるフェロシアン化カリウム（［Ｋ4 Ｆｅ（ＣＮ）6 ］）の分解菌としては、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｉｃｚｙｎｓｋｉが報告されている（いずれもＫｎｏｗｌｅｓ  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：２２３−２３１，（１９９８））。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記鉄シアノ錯体の分解に関する報告は、すべて真菌によるものであって、放線菌を含めた細菌による分解例は報告されていない。従って、前記鉄シアノ錯体分解菌の生育ｐＨ域は弱酸性域に限られている。
ここで、前記鉄シアノ錯体を含む排水の処理について考えると、弱酸性条件下では、前記鉄シアノ錯体は難溶性の塩を形成して存在しているので、前記排水中の鉄シアノ錯体は、前記処理の過程で、流路や処理槽に沈殿し易い。そのため、前記鉄シアノ錯体分解菌を用いて排水処理を行なうとしても、分解効率が低かったり、その効率を上げるために激しく攪拌する等の操作が必要となる。
よって、実質的には、前記鉄シアノ錯体分解菌を、前記鉄シアノ錯体を含む排水の処理に適用することは困難であった。
【０００７】
従って、本発明の目的は、上記欠点に鑑み、鉄シアノ錯体を分解することが出来る新規微生物を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記課題を解決すべく、大気を対象としてスクリーニングを行なって、アルカリ性の生育条件においてもシアン化合物分解能を有する新規微生物を分離することに成功し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、アルカリ性の生育条件においてもシアン化合物を分解可能なクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の新規微生物、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  ＡＮ−１株である。このＡＮ−１は、アルカリ性条件下で鉄シアノ錯体分解能力を有するため、鉄シアノ錯体含有排水をアルカリ性条件下で処理するのに用いることができる。
【００１０】
発明者らは、以下の様にして、本発明に係る新規微生物を単離した。
フラスコに入れた滅菌フェロシアン液体培地を大気中に放置し、この培地中で生育した微生物を、滅菌フェロシアン寒天平板培地上に接種した後、３０℃で培養し、形成されたコロニーを分離した。
尚、前記フェロシアン寒天培地及びフェロシアン液体培地の前記組成及び調製方法は、以下に示す通りである。
【００１１】
【表１】
0004326109.tif 000002
＊ＮａＯＨ溶液、ＨＣｌ溶液で培地をｐＨ７．２（±０．２）に調整して、蒸留水で全量を１リットルにする。Ｋ4 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］・３Ｈ2 Ｏ以外の成分を１２０℃、２０分間オートクレーブ殺菌した後に、フィルタ滅菌したＫ4 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］・３Ｈ2 Ｏ溶液を添加する。
【００１２】
【表２】
0004326109.tif 000003
＊ＮａＯＨ溶液、ＨＣｌ溶液で培地をｐＨ７．２（±０．２）に調整して、蒸留水で全量を１リットルにする。Ｋ4 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］・３Ｈ2 Ｏ以外の成分を１２０℃、２０分間オートクレーブ殺菌した後に、フィルタ滅菌したＫ4 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］・３Ｈ2 Ｏ溶液を添加する。
【００１３】
更に、滅菌したフラスコに滅菌したフェロシアン液体培地１００ｍｌを分注し、前述の分離した菌株を１白金耳接種し、３０℃で１週間、振とう培養（１５０〜１７０ｒｐｍ）した。
培養後、培養液中のフェロシアン（全シアン）含有量は、「低質土壌のＣＮ含有量測定方法（環水管１２７号１４．２項）」に記載されている「シアンの蒸留前操作方法（土壌中の全シアンの加熱蒸留方法）」に従って、培養物（培養液、菌体）全量を蒸留し、得られた蒸留液を全自動シアン測定装置（アナテック・ヤナコ製Ｔ−ＣＮ５０１）に供試し、フェロシアン（全シアン）含有量を測定して求めた。
この様にして、前記フェロシアン液体培地中のフェロシアンを分解する菌株を選抜した結果、フェロシアン分解能を有する菌株が得られ、これをＡＮ−１株と命名した。
なお、フェロシアンの分解率は以下の式により求めた。
フェロシアン分解率＝培養後のフェロシアン含有量／無菌振とう後のフェロシアン含有量×１００（％）
【００１４】
前記ＡＮ−１株をＳＣＤ寒天平板上に塗抹して３０℃で１日間培養し、純粋培養であることを確認した後に、下記の菌学的性質を有するＡＮ−１株の分類学上の位置を、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー  第１版」（Ｂｅｒｇｅｒｙ´ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８４））」を参照にして検索した。
前記ＡＮ−１株の菌学的性質を、表３に記す。
【００１５】
【表３】
0004326109.tif 000004
【００１６】
この結果、前記ＡＮ−１株は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であると判定された。しかし、公知のクレブシエラ属菌に属し、鉄シアノ錯体の分解可能を有するものは、今までに報告が無く、この点で、前記ＡＮ−１株は、公知の菌株と区別される新菌株である。
クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株と判定された本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９２号として寄託されている。
【００１７】
尚、ＳＣＤ寒天培地の組成は、以下の表４に示す通りである。
【００１８】
【表４】
0004326109.tif 000005
【００１９】
本発明にかかるクレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株は、細菌に分類される新規微生物である。一般的に、細菌は、中性から弱アルカリ性のｐＨ域で生育するものであり、発明者らは、後述する生育試験によって、前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株も、中性から弱アルカリ性の生育条件で、前記鉄シアノ錯体を分解して生育できることを明らかにしている。従って、この菌株をシアン化合物を含む排水の処理に用いる場合、液性を弱アルカリ性として、難溶性の前記鉄シアノ錯体を排水中に溶存した状態とし、効率よく分解することが出来る。更に、前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株は、生育中に、培養液のｐＨを上昇させることができるので、前記鉄シアノ錯体を可溶化して、前記鉄シアノ錯体の分解に適した環境を自ら作り出すこともできる。
上述の如く、前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株は、中性から弱アルカリ性のｐＨ域で、シアン化合物、特に鉄シアノ錯体を分解可能であるので、バイオレメディエーションによる排水処理に用いるのに適した微生物といえる。又、土壌中でのシアンの存在形態は、大部分が鉄とシアンの錯体であるフェロシアンであることが知られているため、本発明に係るクレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株を用いて土壌中のフェロシアンを分解除去することによって、シアン化合物に汚染された土壌を浄化することが出来ると考えられる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明に係る微生物を用いたフェロシアン分解の実験例について説明する。
クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株を下記の条件で培養し、培地中のフェロシアン（全シアン）含有量を測定し、培養開始前後のフェロシアン（全シアン）含有量より分解率を求めた。
フェロシアンの分解率は以下の式により求めた。
フェロシアン（全シアン）分解率＝ＡＮ−１株を添加培養後のフェロシアン含有量／無菌振とう後のフェロシアン含有量×１００（％）
【００２１】
滅菌した試験管に滅菌したフェロシアン液体培地１０ｍｌを分注し、ここにクレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株を１白金耳接種して、３０℃で振とう培養（１５０〜１７０ｒｐｍ）した。培養開始から１週間後に、この培地の一部を分取し、培地中のフェロシアン（全シアン）含有量を、前述した「低質土壌のＣＮ含有量測定方法（環水管１２７号１４．２項）」に記載されている「シアンの蒸留前操作方法（土壌中の全シアンの加熱蒸留方法）」に従って測定した。
この結果を、表５に示す。
【００２２】
【表５】
0004326109.tif 000006
【００２３】
表５に示すように、前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株は、フェロシアン分解活性を有し、フェロシアンの初期濃度が夫々１０、５０、１００ｐｐｍであった培地において、培養開始から１週間後に、夫々４０、２４、９％分解していた。
【００２４】
又、このときの培地ｐＨの変化をみると、フェロシアンの初期濃度が１０．５ｐｐｍで初発ｐＨが６．６であったものが、前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株の培養開始から一週間で、ｐＨ８．２まで上昇していた（表６参照）。
【００２５】
【表６】
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【００２６】
前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株は、中性から弱アルカリ性域でフェロシアンを分解している。このとき、前記培地中のフェロシアンは、前記培地に溶解した状態で存在していると考えられる。
このように、前記クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株は、可溶化したフェロシアンを分解することが出来るので、工業排水等の浄化処理に使用する菌株として好適である。
従って、本発明にかかる新規微生物であるクレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株を用いることにより、排水中のフェロシアンを効率的に分解することが可能である。
また、土壌中でのシアンの存在形態の大部分が、鉄シアン錯体であるフェロシアンであることが知られている。従って、本発明の新規微生物クレブシエラ・ニューモニエ  ＡＮ−１株を用いて、他の浄化方法に見られるような過酷な処理を行なうことなく、土壌中のフェロシアンを分解することも出来ると考えられる。