(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第一段階として、ニトリラーゼ活性を有する生物学的材料を調製し、ｂ）第二段階として、該生物学的材料をポリアゼチジンポリマー、ポリエチレンイミンポリマー及びアルデヒドから選択される化学薬剤を用いて合成シリカ、珪藻土、シリカゲル及びグルテンから選択される固体担体に固定化し、ｃ）第三段階として、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩を得るために、このように固定化され、乾燥菌体１ｋｇにつき１時間当たり少なくとも０．６ｋｇの２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を生産するニトリラーゼ活性を有する生物学的材料に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをさらし、ｄ）第四段階として、場合により、段階ｃ）で得られた塩を対応する酸に転化してもよく、そしてｅ）第五段階として、段階ｃ）またはｄ）で得られた生成物を濃縮することを特徴とする、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの酵素加水分解による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸及び／または２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩の連続的な製造方法。
【請求項２】
ニトリラーゼ活性がアルカリゲネス・ファエカリス（Alcaligenes faecalis）のニトリラーゼから得られることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
宿主微生物において発現されるニトリラーゼをコードする遺伝情報を用いることを特徴とする、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
宿主微生物がエシェリキア・コリ（Escherichia coli）または属バシラス（Bacillus）、コリネバクテリア（Corynebacterium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、クルイベロマイセス（Kluyveronyces）、ペニシリウム（Penicillium）及びアスペルギルス（Aspergillus）のメンバーから選択されることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ニトリラーゼ活性が番号ＣＢＳ ９９８−９６でＣＢＳに寄託されたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３中にクローン化された遺伝子によりコードされるニトリラーゼから得られることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ニトリラーゼがシャペロンタンパク質と同時発現されることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
シャペロンタンパク質がエシェリキア・コリ（Escherichia coli）のＧｒｏＥＳＬであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項８】
固体担体が１μｍないし５００μｍの間の粒度を有し、そして生物学的材料の重量で０．０１ないし２００％の量で該菌体が添加されることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
化学薬剤の存在下で生物学的材料及び固体担体を混合してペーストを得、それを押出し、次に乾燥させることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
生物学的材料及び化学薬剤を混合し、次に薄層の形態で固体担体上に置くことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも６０％のＨＭＴＢＡ、好ましくは少なくとも８０％のＨＭＴＢＡを含有し、残りがＨＭＴＢＳであるＨＭＴＢＳ及びＨＭＴＢＡの混合物を対応するアンモニウム塩の電気透析解離により得ることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
３区画を有する両極性膜を用いた電気透析器において解離を実施することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
２区画を有する両極性膜を用いた電気透析器において解離を実施することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
アンモニウム塩溶液を加熱することによりＨＭＴＢＳ及びＨＭＴＢＡの混合物を得ることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
遊離した水酸化アンモニウムを蒸留し、濃縮し、そしてＨＣＮ合成に再循環させることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ニトリラーゼ活性を有する酵素またはニトリラーゼ活性を有する酵素を発現する宿主微生物をポリアゼチジンポリマー、ポリエチレンイミンポリマー及びアルデヒドから選択される化学薬剤を用いて合成シリカ、珪藻土、シリカゲル及びグルテンから選択される固体担体に固定化した調製物を充填した１つまたはそれより多い反応器（３、４）であって、場合により、１つまたはそれより多い電気透析手段（９）、最終生成物の濃縮のための手段（６、１２）を含んでなる本発明の方法を実施するためのプラント。
【請求項１７】
番号ＣＢＳ ９９８−９６でＣＢＳに寄託されたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸（ＨＭＴＢＡ）及び／またはそのアンモニウム塩（ＨＭＴＢＳ）の新規な製造方法に関する。
発明の背景
２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸及びその塩は飼料製造会社によるそれらの使用を容易にする液状形態であるという利点を有するので、それらはメチオニンの代替え品として動物栄養物中に長い間使用されている。
化学経路による２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸の製造は長い間知られている。欧州特許第ＥＰ−１４２ ４８８号及び第１４３ ０００号は２段階の方法による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−ヒドロキシブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）の加水分解を記述している。第一段階は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを塩酸または硫酸のような強い無機酸と接触させることである。次の段階において、水での希釈後に、より高い温度で加水分解を完了する。次に、ケトン、好ましくはメチルイソブチルケトンのような水とあまり混和しない有機溶媒で２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸を抽出し、そして次に溶媒を蒸発により除く。工業的に用いられるこのタイプの方法は、それにもかかわらずいくつかの不都合な点がある。特に、それは投入されたニトリルのモル量に少なくとも等しいモル量の除去しなければならない硫酸アンモニウムを生成し、従って、産業廃棄物を生じ、それは環境保護政策に反する。また、この方法は再生処理しなければならない多量の溶媒の使用も必要とする。
米国特許第３，７７３，９２７号及び第４，３５３，９２４号に記述されたもののような他の方法は、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−ブチロニトリルを塩酸で加水分解し、次に、形成された塩化アンモニウムを分離して媒質を濃縮することである。得られる塩は先の塩と同様に除去することが困難であり、そしてさらに、得られる酸は濃い色を有する。
上記のように、硫酸媒質中で加水分解を実施することからなるメチルチオ−ヒドロキシプロピオニトリルの化学加水分解の方法は欧州特許第３３０ ５２１号に記述されている。混合物を水酸化アンモニウムである程度中和し、続いて２相を分離する。有機相は２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の大部分を含み、そして水相は生成された硫酸アンモニウムの大部分を含む。有機溶液が含有する水の蒸発後に、溶解した硫酸アンモニウムを回収するためにそれを濾過する。次に、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を少量の水で希釈し、そして少量の硫酸で安定させる。水溶液からは、水の除去後に、直ちに販売できる硫酸アンモニウムを得ることができる。この方法は有機溶媒の使用に関して先行する類似技術の方法の不都合な点をある程度克服するが、無機塩の排出に関連する問題をいかようにも解決しない。
２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の塩に関する特許の中に、カルシウム及び／またはアンモニウム塩に関する米国特許２，７４５，７４５号、第２，９３８，０５３号及び第３，１７５，０００号を挙げることができる。２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの加水分解により得られる混合物を水酸化または炭酸カルシウムで処理する。次に、硫酸カルシウムを沈殿させ、水酸化アンモニウムを遊離し、それは２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩を形成する。ここでも再び、問題は残存する硫酸カルシウムを除去することである。
上に引用した最初の文献におけるような加水分解及び有機溶媒での抽出、続いて水酸化アンモニウムでの有機溶液の中和を実施することからなる方法も国際特許出願ＷＯ９６／０１８０８に記述されている。先に記述した大部分の方法におけるように、この方法は投入されたニトリルの１モル当たり少なくとも１モルの硫酸または塩化アンモニウムの形成をもたらし、そして多量の有機溶媒の再生処理を必要とする。従って、工業的に都合のよい費用で２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩の溶液を得ることは可能ではない。
ニトリル基のカルボキシル基への加水分解のための触媒としてのニトリラーゼの使用は１９９７年３月２０日に出願された米国特許出願第０８／８０９，１８４号に記述されている。しかしながら、これらのニトリラーゼを合成する微生物の不十分な活性を考えれば、この方法を工業規模で用いることはできない。
発明の要約
今回、いくつかの特定の段階を用いることにより、溶媒を用いず且つ無機塩を付随して生成せずに、高収率で、工業規模で酵素経路により２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸及び／またはそのアンモニウム塩を得ることが可能であることが本発明の方法により見いだされた。
従って、本発明の主題は
ａ）第一段階として、ニトリラーゼ活性を有する生物学的材料を調製し、
ｂ）第二段階として、生物学的材料を固定化し、
ｃ）第三段階として、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩を得るために、固定化された生物学的材料に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをさらし、
ｄ）第四段階として、ｃ）で得られる塩を場合により対応する酸に転化してもよく、そして
ｅ）第五段階として、ｃ）またはｄ）で得られる生成物を濃縮する
ことを特徴とする、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの酸素加水分解による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸（ＨＭＴＢＡ）及び／または２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩（ＨＭＴＢＳ）の製造方法である。
図面の説明
以下の記述中において本発明はより詳細に説明され、そのために添付する図面を参照とする。
図１は任意の段階ｄ）に用いる電気透析隔室（ｃｅｌｌ）の概念図を表し；図１Ａは３区画を有する両極性膜を用いた電気透析隔室を表し；図１Ｂは２区画を有する両極性膜を用いた電気透析隔室を表す。
図２は本発明の方法を実施するためのプラントの概念図である。
図３はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１ないし５の制限地図を表す。
図４は本発明のニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする（図でｎｉｔＢと称する）ＤＮＡ配列を含有する１１３０ｂｐのフラグメントをシークエンスするための方法を表す。番号は表示Ｍ１３ＦＷＤ及びＭ１３ＲＥＶと同様にシークエンシングのために用いるプライマーの素性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をさす。
図５はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３の制限地図を表す。
図６はエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２＋ｐＸＬ２２３１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３＋ｐＸＬ２２３１における本発明のＤＮＡ配列の発現を示す１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動を表す。各レーンは１０μｇの量の可溶性タンパク質並びに等容量の粗原料及び不溶性画分に相当する。
図７はエシェリキア・コリ株ＤＨ５α／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３、ＤＨ５α／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６、ＤＨ５α／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６＋ｐＸＬ２０３５、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ７６における本発明の基準ＤＮＡ配列の発現を示す１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動を表す。各レーンは１０μｇの量の可溶性タンパク質並びに等容量の粗原料及び不溶性画分に相当する。
図８はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４の制限地図を表す。
図９はシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）株Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）、アルカリゲネス・ファエカリス（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ８７５０（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４）、アルカリゲネス・ファエカリスＡＴＣＣ８７５０（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、アルカリゲネス・ファエカリスＡＴＣＣ８７５０（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）における本発明のＤＮＡ配列の発現を示す１０％ ＳＤＳ−ＰＡゲルでの電気泳動を表す。各レーンは１０μｇの量の可溶性タンパク質並びに等容量の粗原料及びおそらく不溶性である画分に相当する。
図１０はプラスミドｐＣＧＬ１０８７の制限地図を表す。
図１１はプラスミドｐＯＳ４８．７の制限地図を表す。
発明の詳細な説明
２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法の第一段階はニトリラーゼ活性を有する生物学的材料を調製することを含んでなる。生物学的材料は酵素溶液それ自体またはニトリラーゼ活性を有する全もしくは破壊細胞を含むことができる。
都合よくは、ニトリラーゼを発現する微生物を用いる。具体的には微生物、特に属アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）またはゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）の微生物、好ましくはアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ロードコッカス種ＨＴ２９−７（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＨＴ２９−７）、ゴルドナ・テラエ（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｔｅｒｒａｅ）、より好ましくは米国特許出願第０８／８０９，１８４号に記述された株からニトリラーゼを得ることができる。
都合よくは、親微生物のニトリラーゼをコードする遺伝情報を宿主微生物中に導入することにより得られるニトリラーゼ活性を発現する微生物を用いる。特に、エシェリキア・コリにおいて、組換え株の性能を高めるためにシャペロンタンパク質Ｇｒｏ ＥＳＬの同時発現を用いることが可能である。この目的のために、あらゆる適切な発現ベクター、特にプラスミドベクターを用いる。
次に、この場合に用いるヌクレオチド配列を細胞宿主におけるその発現を可能にするシグナルの制御下に置く。用いる細胞宿主をグラム陽性もしくはグラム陰性バクテリアのような原核生物系または例えば酵母、真菌のような真核生物系またはあらゆる他の系から選択することができる。用いる細胞宿主に従って、ポリペプチドの発現を制御するシグナルを選択する。この目的のために、選択した宿主内で自律複製するベクターまたは選択した宿主の組込みベクター中にニトリラーゼをコードするＤＮＡを挿入することができる。当業者により一般的に用いられる方法に従ってそのようなベクターを調製し、そして得られた構築物をエレクトロポレーションのような標準法により適切な宿主中に導入することができる。
宿主微生物として、特にアルカリゲネス・ファエカリス、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、または属バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ）の微生物を挙げることができる。
エシェリキア・コリにおける発現のために好ましいベクターはプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６である。
本方法の第二段階は生物学的材料を固定化することを含んでなる。この固定化は固体担体の存在下で都合よく実施され、そしてそれにより大きさ、形状及び力学抵抗を制御することができる固体粒子を得ることができる。また、それによりポリアゼチジンポリマー及び他の架橋剤も同時に使用できる。
この固定化工程は全細胞または透過性にした細胞を含むことができる。また、それは無細胞酵素溶液にも適用できる。固定化のために用いる酵素はニトリラーゼである。
固定化工程は生物学的試剤及び担体のアミン（ＮＨ2、ＮＨ）、カルボキシル（ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）またはアミド（ＣＯＮＨ2）官能基と反応する化学薬剤により、特に１μｍないし５００μｍ、好ましくは１０μｍないし２００μｍの間の粒度を有する固体担体上に活性のある生物学的材料を固定化することを含んでなる。また、これらの化学薬剤により生物学的材料及び担体を水に不溶にすることもできる。得られる素材は非常に可鍛性であり、そして所望する形状及び大きさの粒子を得るためにそれを造形することができる。次に、乾燥することによりこれらの粒子の凝集及び硬度を得る。
固定化される生物学的材料は場合により重量で０ないし２００％の量で存在する不活性の生物学的材料を含有してもよい。この不活性の生物学的材料はタンパク質（アルブミンもしくはゼラチン）または多糖（キトーサン、ｋ−カラギーナンもしくはアルギン酸塩）であってもよい。
生物学的材料が置かれる不活性担体及びポリマーは親水性または疎水性の多孔質または非孔質の有機または無機粒子からなることができる。これらの粒子の中には、何等の限定を伴うものでないが、イオン交換樹脂、アルミナ、合成シリカまたは珪藻土及びシリカゲル、ゼオライト、木炭、グルテンのような水不溶性タンパク質、並びに澱粉のような多糖を挙げることができる。
生物学的材料の重量で０．０１ないし２００％、好ましくは１０ないし１００％の量で不活性担体を添加することができる。
生物学的材料の不溶化のために用いる化学薬剤は、アミン（ＮＨ2、ＮＨ）、カルボキシル（ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）またはアミド（ＣＯＮＨ2）官能基と反応するポリマーまたは二官能性化された分子であってもよい。ポリアゼチジンポリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ポリアミドポリマー、イソシアネートポリマー、アルギン酸ゲル、ｋ−カラギーナンゲル、ヘキサメチレンジアミンのようなアミン、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド、アジピン酸のようなカルボン酸及びイソシアネートを挙げることができる。
固定化工程は１つまたはそれより多いこれらの化学薬剤を含むことができる。生物学的材料に、そして担体に対して重量で１ないし５０％の間の濃度で化学薬剤を添加する。高い活性を維持し、そして内部拡散のあまり多くの問題がない十分に固体の粒子を得るためには５ないし３０％の間の量が好ましい。
架橋処理の期間は０．５ないし２４時間の間である。
工程温度は通例４ないし６５℃の間である。２０ないし４０℃の間の温度が好ましい。固定化工程中に用いる温度は用いる生物学的材料の安定性にも非常による可能性がある。
固定化段階中のｐＨ５ないし１１の間に保たれる。６ないし１０の間のｐＨが好ましく、アルカリ性ｐＨ値が好ましい。また、ｐＨは生物学的材料の耐性の結果としても選択され、そして当業者により容易に決定される。
生体触媒の形成はあらゆる系、特に固定層におけるその使用を可能にするはずである。
一つの配合方法は押出であってもよい。これを実施するために、１つまたはそれより多い化学薬剤を添加することにより生物学的材料及び担体を架橋する。処理後に、遠心分離によるかまたは凝集及び濾過により不溶性素材を回収する。少なくとも１０％の乾燥物質レベルが好ましい。次に、その素材を押出す。この方法を用いて、好ましくは、０．３ないし０．５ｍｍの間の直径及び１ないし１０ｍｍの間の長さを有するバーミセリを得る。これらのバーミセリを球にする（ｓｐｈｅｒｏｎｉｚｅｄ）ことができる。次に、得られた粒子を乾燥させる。
別の配合方法は噴霧被覆であってもよい。これを実施するために、生物学的材料を１つまたはそれより多い化学薬剤と混合する。反応後に、混合物を薄層の形態で担体上に噴霧する。この方法を用いて、０．１ないし２ｍｍの間の平均直径を有する粒体を得る。
次に、架橋中に形成されるイミン官能基を還元するために、場合により、得られた粒子をホウ水素化ナトリウムのような還元剤の溶液中に浸してもよい。
得られる粒子は固定層、流動層または撹拌反応器において用いるために十分に固体であり且つ摩耗に対して耐性である。
本発明の方法の第三段階は固定された生物学的材料を１つまたはそれより多いカラムまたは反応器において用いることを含んでなる。この段階の目的は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルから２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩を連続的に生成できることである。カラムまたは反応器に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの純粋もしくは希釈溶液または２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルと２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩を含有する混合物を供給する。
好ましくは１０ないし６０℃の間の温度で且つ５ないし９の間のｐＨでカラムまた反応器を用いる。
本発明の第一の態様として、用いる系は相互に連続して連結された２本またはそれより多いカラムを含むことができ、第一のカラムの上面に２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−ブチロニトリル水溶液を供給し、反応混合物中のこの化合物の溶解度に限定される量で２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル溶液を別のカラムに同時に供給する。この系は段階的系と呼ばれる。
本発明の第二の態様として、循環ループで相互に並列に連結された１本またはそれより多いカラムを用いる。このプラントでは、水溶液の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをループに連続的に供給し、そしてループ中の一定容量を維持するために反応媒質を連続してポンプで入れる。この系はループ系と呼ばれる。
本発明に用いる反応器の型は固定層、流動層または連続撹拌層型のものであってもよい。固定層型反応器は固定化された細胞粒子が受ける可能性がある摩耗の問題を減らすので、好ましくはそれらを用いる。微生物をそのまま用いる場合、好ましくは、目的の生成物から微生物を連続的に分離するための限外濾過モジュールに連結された撹拌反応器を用いる。
任意の段階である第四段階は２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩を対応する酸に転化することを含んでなる。この段階を２つの方法により、すなわち、２もしくは３区画の電気透析器を用いる電気透析によるか；または液／液抽出を続けてもよい水溶液の加熱により実施することができる。
電気透析の方法により、２または３区画の電気透析器を用いることができる。
「区画」は２枚の膜の間もしくは両極性膜と等極性膜の間のいずれかまたは２枚の隣接する等極性膜の間にある空間を意味すると理解される。「隔室」は一組の２または３区画を意味すると理解される。スタック（ｓｔａｃｋ）は５ないし３００の間の隔室を含んでなる。電気透析器はスタックからなり、そしてもちろん陽極及び陰極を含んでなる。
本発明の枠組み内に用いることができる等極性膜をそれらの製造方法により２つの大きい群に分けることができる。
例えば、イオン交換樹脂から製造し、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン等のような結合剤と混合した不均質膜を用いることができる。このようにして形成されたセットは例えばポリエステルまたはポリアクリロニトリル織物の緯糸を被覆することができる。
また、化学または放射線化学グラフトにより不活性担体上に官能基を導入することにより得られる均質膜を用いることも可能である。最も一般に用いられる化学法は、通例、スチレン／ジビニルベンゼンまたはスチレン／ブタジエンのような、芳香環を含んでなるポリマーのラテックスを機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｉｎｇ）することを含む。このようにして機能化されたラテックスを次に不均質膜と同様に緯糸を被覆するために使うことができる。放射線化学法は、通例、放射線の影響下でポリエチレンまたはポリテトラフルオロエチレンシートのような不活性担体上にスチレンのような芳香族化合物をグラフトすることを含んでなる。次に、化学法におけるように芳香環を機能化する。
陽イオン交換膜は強酸基、最も多くの場合でスルホン酸基、または弱酸基、多くの場合でカルボン酸基を含んでなる。より頻度は低いが、酸性基はＰＯ2-、ＨＰＯ2-、ＡｓＯ32-、ＳｅＯ3-であってもよい。
陰イオン交換膜は強塩基基、最も多くの場合で第四級アンモニウム基、または弱塩基基、最も多く場合でアミン基を含んでなる。より頻度は低いが、塩基性基は第四級ホスホニウム基またはスルホニウム基であってもよい。
本発明の方法では、陽イオン膜は好ましくは強酸基、とりわけ、好ましくはスルホン酸基を含んでなる。陰イオン膜は好ましくは強塩基基、とりわけ、第四級アンモニウム基を含んでなる。
両極性膜は片方が陽イオン、もう片方が陰イオンの２枚の膜の組立である。膜が適切な電場を受けると、膜の界面の溶媒和の水はＨ+とＯＨ-イオンに解離し、それらはそれぞれ陽イオン面を横切ることにより陰極に向かって、そして陰イオン面を横切ることにより陽極に向かって移動する。例としてＡｑｕａｌｙｔｉｃｓ、Ｔｏｋｕｙａｍａ  ＳｏｄａまたはＦｕＭａ Ｔｅｃｈにより販売される両極性膜を挙げることができる。
電気透析器の陽極は電気透析に通常用いられる材料、例えば、貴金属または貴金属酸化物で被覆されたグラファイト、ニッケルまたはチタン、特に白金黒付チタンを含んでなることができる。陰極も電気透析に通常用いられる材料、例えば、グラファイト、ステンレス鋼またはニッケルを含んでなることができる。
処理される水溶液を電気透析器に供給する。また、陽極に陽極液の溶液、そして陰極に陰極液の溶液を循環させることも必要である。単一の電解質溶液を用いてもよい。本発明の方法では、単一の電解液循環路が実際に適している。電解質溶液の役割は十分な伝導度を保証することである。好ましくは、この伝導度はセンチメートル当たり２０ミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍ）に等しいかまたはそれより大きく、この下限は本方法を実施するために重要であるとみなされない。
用いる電解質は塩、酸または塩基のようなイオン化する化合物である。好ましくは、非電気分解活性（ｎｏｎｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ）化合物から電解質を選択する。従って、例えば、硫酸塩のような中性塩、硫酸のような酸及び水酸化ナトリウムのような塩基を用いることが好ましい。
用いる電流密度は通例０．２から１．５ｋＡ／ｍ2までの範囲であり、好ましくは０．４から１ｋＡ／ｍ2までの範囲である。
本発明の方法を実施する温度は膜の安定性と適合する範囲に置かれる。好ましくは３０から６０℃までの範囲の温度で本方法を実施する。
電気透析器は異なるように作動することができる。それは連続して作動することができ、処理される溶液は連続的にスタックを横切り；得られる処理のレベルが必要とする場合、次に、いくつかの段階を連続して配置する。また、それはバッチで作動することもでき、処理される溶液は所望する処理レベルが得られるまでタンクで再循環する。最後に、それは一部再循環して直接通過により作動することができる。
本発明の第一の変形として、図１Ａに図式的に表されるように、３区画を有する両極性膜を用いた電気透析隔室において２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸及び水酸化アンモニウムへのアンモニウム塩の解離が起こることができる。
本方法を実施するために適当な電気透析装置は、それぞれ陽イオン膜（ＭＣ）、両極性膜（ＭＢ）及び陰イオン膜（ＭＡ）により境界を定められる異なる区画を含む。これらの区画は分離される化合物を枯渇した塩区画（Ｓ）、塩から再生された酸及び塩基がそれぞれ濃縮される塩基区画（Ｂ）及び酸区画（Ａ）に分かれる。
アンモニウム塩を塩区画中に入れる。電場の作用下で、アンモニウムイオンはそれが存在する区画（Ｓ）を離れて、陽イオン交換膜（陽イオン膜）を横切って陰極に向かって移動し、そして電場の作用下で水の解離が起こる両極性膜の陰イオン面からのＯＨ-イオンと化合する。
同時に、カルボン酸（２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸）イオンはそれらが存在する区画（Ｓ）を離れて、陰イオン交換膜（陰イオン膜）を横切って陽極に向かって移動する。次の区画（Ａ）中に入った後、それらは両極性膜の陽イオン面からのＨ+イオンの供給によりプロトンを付加される。３つの隣接する区画（Ｂ）、（Ａ）及び（Ｓ）は電気透析隔室を形成する。
本発明の第二の変形として、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸の再生を図１Ｂに示されるような２区画を有する両極性膜を用いる電気透析隔室において実施することができる。これら２つの区画はそれぞれ陽イオン膜及び両極性膜により境界を定められる。これらの区画は塩／酸（Ｓ／Ａ）及び塩基（Ｂ）区画に分かれる。
アンモニウム塩を塩／酸区画中に入れる。電場の作用下で、アンモニウムイオンは陽イオン交換膜（陽イオン膜）を横切ってそれが存在する区画（Ｓ／Ａ）を離れることにより陰極に向かって移動し、そして電場の作用下で水の解離が起こる両極性膜の陰イオン面からのＯＨ-イオンと化合する。
同時に、区画Ｓ／Ａは両極性膜の陽イオン面からのＨ+イオンの供給により酸性化されるようになる。２つの隣接する区画（Ｂ）及び（Ｓ／Ａ）は電気透析隔室を形成する。
この配置はより低いエネルギー消費という利点があり、そして所望する塩／酸比率を変えることを可能にする。
電気透析器の優れた操作を得るためには、塩基区画の電気伝導度は（３区画配置の場合の酸区画のものと同様に）適切であるべきであり、そして支持電解質の添加によりそれを調整することができる。従って、硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩を添加することにより水酸化アンモニウム溶液の伝導度を増加することができる。
本発明の好ましい変形として、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウムを用いる。
本発明の枠組み内に予想することができる好ましい態様として、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩と２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロ−ニトリルの混合物を３区画電気透析隔室の塩区画中に入れる。塩は上記のように２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチレートに解離され、陽極に向かって移動し、そこでそれは２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に転化され、アンモニウムイオンは陰極に向かって移動し、そこでそれは水酸化アンモニウムに転化され、そして塩区画中には水及び未転化の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルが残り、それらは加水分解カラムに向かって再循環される。
加熱法を用いて、ＨＭＴＢＳに富んだ水溶液を加熱し、そしてそのようにして遊離された水酸化アンモニウムを取り出すことでアンモニウム塩、遊離酸平衡を変えることにより酸を回収する。ストリッピング処理をしてまたはせずに真空下でまたは大気圧で加熱することによりこれを実施することができる。平衡の移動を促進するために圧力下でのＣＯ2の使用を予見することができる。ＨＭＴＢＳとＨＭＴＢＡの混合物がＨＭＴＢＡとＨＭＴＢＳの合計に対して５ないし９９．９％のＨＭＴＢＡ、好ましくは１０ないし５０％のＨＭＴＢＡの量で得られる。これらの溶液の粘度は２５℃で１２００ないし３０ｍｍ2・ｓ-1（１２００ないし３０ｃＳｔ）の間、好ましくは２００ないし５０ｍｍ2・ｓ-1（２００ないし５０ｃＳｔ）の間である。
ある程度水と混和できるかまたは水と混和しない溶媒生成物を用いた酸の抽出により水溶液を分解することができる。分離のために多数の可能な溶媒が存在する。好ましい溶媒はＣ5ないしＣ8ケトン、特にメチルイソブチルケトン、イソプロピルエーテルのようなエ−テル、イソプロパノールのようなアルコール、エステル、トリオクチルアミンのような第三級アミンである。本発明の枠組み内で、好ましい溶媒はアセトン、ＭＩＢＫ、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、イソブチルもしくはプロピルエーテル、ＴＨＦまたはトリオクチルアミノンである。有機相に対する水相の比率は重要ではない。しかしながら、効能の程度の理由のためにそれは１：１の最小比率以下に下がるべきではなく、そして採算性の理由のためにそれは１：３の比率以上に上がるべきではない。１：１．５ないし２．０の比率が好ましい。
あらゆる型の液−液抽出技術でバッチでまたは連続的に抽出を実施することができる。同または向流混合−デカント装置のカスケード、遠心抽出器、充填またはプレートカラム等が例である。
必要な場合、水酸化アンモニウムの完全な枯渇が得られるまで、所望するだけ何回でも、遊離酸を枯渇した水溶液を再び処理することができる。
ＨＭＴＢＳを単離するために有機層を処理に供する。好ましくは、溶媒の気化によるかまたは湯での抽出によりこれを実施する。可能性のあるＨＭＴＢＡの劣化を避けるために、真空を用いることにより熱処理をできるかぎり低く保つことができる。
これら２つのアンモニウム塩解離方法では、水酸化アンモニウム水溶液が生成される。水酸化アンモニウムを濃縮するために後者を処理することができる。圧力を用いてまたは用いずに１またはそれより多い段階で水酸化アンモニウムを蒸留及び濃縮することが好ましい。予備ストリッピング段階を予見することができる。濃縮された水酸化アンモニウム溶液を２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの合成に関与するシアン化水素酸の合成に戻すことができる。
第五段階として、ＨＭＴＢＳ及び／または遊離酸の水溶液を濃縮する。好ましくは、水の蒸発によりこれを実施する。
本発明の主題は本発明の方法を実施するプラントでもある。そのようなプラントは図２に図式的に示され、そして反応器３中にそれぞれＭＴＰＡシアンヒドリン及び水を入れることを意図する導管１、２を含んでなる。反応器３は再循環を有する固定層であり、それは固定化された酵素または株が充填されている。溶液の一部を反応器３から取り出し、仕上反応器４中に送る。仕上反応器４は固定化された酵素または株が充填された固定層型のものである。次に、濃縮されたＨＭＴＢＳ溶液を導管５により反応器４の流出口で回収する。
この濃縮されたＨＭＴＢＳ溶液を所望する最終生成物のタイプにより２つの完全に別個の処理に供することができる。
高い割合のＨＭＴＢＳを含有する生成物を回収することが所望される場合、導管５からの溶液をエバポレーター６中に運び、それにより生成物を濃縮することができ、そして主にＨＭＴＢＳからなり、少量の遊離酸を含有する濃縮溶液を導管８で回収する。過剰の水及びごく少量の水酸化アンモニウムを導管７により排出する。
高い割合の遊離酸を含有する生成物を回収することが所望される場合、導管５からの濃縮されたＨＭＴＢＳ溶液を両極性電気透析系９に運ぶ。この装置において、電気透析により水酸化アンモニウムが多かれ少なかれ酸から分離される。主に遊離酸からなり、ほとんどまたは全くＨＭＴＢＳを含有しない濃縮溶液を得るために、アンモニウムを枯渇した混合物を導管１１で回収し、次に、エバポレーター１２で濃縮する。水酸化アンモニウムに富んだ溶液を導管１０により取り出す。ストリッピング１５により水酸化アンモニウムを回収する。
この水酸化アンモニウム流出液を蒸留１６により濃縮することができ、水を１８で回収する。濃縮された水酸化アンモニウム溶液１７をＨＣＮの合成に戻すことができる。
以下の実施例は本発明を例示し、そしてそれを限定しないと解釈されるべきである。
実施例
実施例１：ニトリラーゼの精製及びＮ末端シークエンシング
ニトリラーゼを４段階で精製した。精製の要約を表１に示す。
アルカリゲネス・ファエカリス細胞をベンゾニトリル（０．５ｇ／ｌ）の存在下で最小培地中３０℃で２４時間培養した。培養物の遠心分離後、ペレットをＴＧバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５）に溶解した。細胞懸濁液を超音波で処理し、次に遠心分離して粗抽出物を得た。次に、粗抽出物を３０％飽和までの硫酸アンモニウムで処理した。得られた沈殿物をＴＧバッファーに再懸濁し、次に、２リットルの同じバッファーに対して１晩透析した。得られた溶液を次にＴＧバッファーで先に平衡化したＱセファロースファーストフロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）ＨＲ２６／１０陰イオン交換カラム上に添加した。次に、０から１ＭまでのＮａＣｌ勾配で活性を溶出させた。活性画分を次にＴＧバッファーで先に平衡化したＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５陰イオン交換カラム上に添加した。０から１ＭまでのＮａＣｌ勾配によりニトリラーゼを溶出させた。最後に、活性を含有する画分を合わせ、次に、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍに調整した。次に、この溶液を１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を補足したＴＧバッファーで先に平衡化したフェニルセファロースＨＲ５／５疎水性相互作用カラム上に添加した。次に、１Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウムの勾配で活性を溶出させた。
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操作条件：
［ニトリル］＝５０ｍＭ；リン酸バッファー１００ｍＭ ｐＨ７．０；３０℃
タンパク質の分子量をゲル濾過により測定した。それは約２６０ｋＤａであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、４３ｋＤａの単一バンドが観察された（９５％純度）。従って、それはおそらくαが４３ｋＤａの重さであるα6構造のタンパク質であった。
実施例２：アルカリゲネス・ファエカリスＡＴＣＣ８７５０ニトリラーゼのクローニング
実施例１に示されるＮＨ2末端配列はアルカリゲネス・ファエカリスＪＭ３ニトリラーゼ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２４７−２５１）のＮ末端の配列と完全な一致を示し、一方、バクテリアのニトリラーゼのＮ末端は１４残基に対して３５ないし５７％の一致を示した。本発明者等はＡＴＣＣ８７５０株から精製された本発明のニトリラーゼがＫｏｂａｙａｓｈｉ等により記述されたものに類似すると仮定した。次に、クローニング方法はＫｏｂａｙａｓｈｉ等により示された配列から決定された２個のヌクレオチドプローブを用いてＡＴＣＣ８７５０株のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応によりこのニトリラーゼの遺伝子を増幅することを含んだ。
２個のプローブを合成し、片方はＫｏｂａｙａｓｈｉ等により示された配列の５’部分と、そしてもう片方は３’部分とハイブリダイズすることができる：
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プライマーＰＣＲＡＦ１はＡＴＧ開始コドンの上流に酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩの制限部位を導入できるようにする１２ヌクレオチドを５’に含んでなる。プライマーＰＣＲＡＦ２により酵素ＢａｍＨＩの制限部位を導入することができる。Ａｕｓｕｂｅｌ等により記述されたＣＴＡＢ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．編集、２．４．１−２．４．５）によりアルカリゲネス・ファエカリスＡＴＣＣ８７５０株のゲノムＤＮＡを抽出し、１００ｎｇを各ＰＣＲ反応に用いた。増幅の特異性を変えるために、１００μｌの全サンプル容量中で２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡｕｓｕｂｅｌ等において示されたように様々なＭｇＣｌ2濃度を試験した。さらに２つの反応を１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び５％ ＤＭＳＯまたは５％ホルムアミドで実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーモサイクラーを以下の順序：９５℃で５分、３０サイクル（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４５秒）、そして７２℃で４分でプログラムを作成した。異なる増幅産物を０．８％アガロースゲルで分析した。大きさが１．１５ｋｂの予想される大きさに相当する顕著なバンドが全ての反応で増幅されたが、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び５％ＤＭＳＯでより明確に増幅された。それ故、これらの条件下での反応生成物を次の段階のために保持した。サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、フェノール−クロロホルム抽出後にエタノールで沈殿させた。懸濁液に溶解したペレットを４０ユニットのＥｃｏＲＩ酵素及び４０ユニットのＢａｍＨＩ酵素と共に３７℃で２時間インキュベートした。０．７％アガロースゲルで泳動した後、１．１５ｋｂのバンドを切り出し、抽出し、常法を用いてＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩにより開いたベクターｐＢＳＫ-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）中にクローン化した。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１ないし５と称する５個の別個のクローンを（図３に示すような）酵素ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｐＭＩ及びＢｇｌIIでのプラスミドＤＮＡの酵素消化により分析した。得られたパターンはＫｏｂａｙａｓｈｉ等により記述された配列でこの方法により得られるプラスミドの理論上の制限パターンに一致した。株ＸＬ１Ｂｌｕｅ（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３）を番号ＣＢＳ ９９８−９６でＴｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（ＣＢＳ）に寄託した。
実施例３：ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する１１３０ｂｐフラグメントのシークエンシング
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３中にクローン化されたインサートは研究所で製造されたＤＮＡ調製物（Ｗｉｚｚａｒｄ  Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて会社
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によりシークエンスされた。当業者に知られている常法により実施されたこのフラグメントのシークエンシングの方法を図４に示す。（図４で番号６２３ないし６２９及び６８１ないし６８２により同定される）１０個の内部ヌクレオチドプライマーをアルカリゲネス・ファエカリスＪＭ３ニトリラーゼの配列（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等）に基づいて合成した。この組にユニバーサルプライマー「リバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）」及び「Ｍ１２フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）」を補足した。各領域をＤＮＡ鎖に対して少なくとも１回読んだ。
得られたＤＮＡ配列は公開された配列に比べて２つの違いがあり：一つは転写ターミネーターとして働くと考えられる構造中、そしてもう一つはｎｉｔＢと呼ばれるニトリラーゼ遺伝子中で、置換Ａｓｎ279→Ａｓｐをもたらす。次に、これら２つの領域を２個の特異的プライマー７１０及び６８２（図４参照）を用いてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１、２、４、５で研究所においてシークエンスした。ターミネーター中の（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等によるナンバリングに従って）位置１４１２のＣ→Ｔ変異は全てのクローンで見いだされた。これは２つのアルカリゲネス・ファエカリス株を区別する突然変異である。位置１１３８のＡ→Ｇ変異はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３においてのみ存在する。従って、これはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ中に導入された突然変異である。
実施例４：エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）におけるニトリラーゼの発現
クローン化されたＤＮＡ配列が精製されたニトリラーゼ遺伝子であることを確かめるために、ｎｉｔＢ遺伝子を以下に記述する方法によりＴ７ファージ（ＰＴ７）φ１０遺伝子プロモーターの制御下に置いた。すなわち、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４の１．１３ｋｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩインサートをベクターｐＸＬ２４３２中にクローン化してそれぞれ図５に示されるベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３を生ぜしめた。親ベクターｐＸＬ２４３２は複製起点（ＯＲＩ）及びカナマイシン（Ｋａｎ）耐性中の選択マーカーを含有するＡｃｃＩ及びＥｃｏＲＩ部位間のプラスミドｐＥＴ９（Ｓｔｕｄｉｅｒ等、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、６０−８９）の領域と発現カセット、リプレッサー遺伝子ｌａｃＩ及びコピー数を調節する遺伝子ＲＯＰを含有するプラスミドｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩ部位間の領域の間のハイブリッドである。
以下の方法により誘導条件下で培養を実施した。すなわち、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２を含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３を含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びプラスミドｐＸＬ２４３２を含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で３７℃で１６時間培養し（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）、次に、同じ培地中同じ温度で１／１００に希釈した。培養物が０．５ないし１の間のＯＤ600に達すると、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加した。６時間培養した後、バクテリアを集めた。１２μｇ／ｍｌ培地の量でテトラサイクリンを培養培地に添加することにより、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２及びｐＸＬ２２３１を含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３及びｐＸＬ２２３１を含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）並びにプラスミドｐＸＬ２４３２及びｐＸＬ２２３１を含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養するために同様の方法を選択した。（２４／０４／１９９０の出願第ＦＲ９０／０５１８５号に開示された）ベクターｐＸＬ１６３５から得られるプラスミドｐＸＬ２２３１はＩｎｃＰ不和合性群に属し、それ故、プラスミドＣｏｌＥ１の複製起点を保有するプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２及び１３と和合性である。その選択マーカーはテトラサイクリン耐性であり、それはエシェリキア・コリの分子シャペロンをコードするＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ遺伝子（Ｆａｙｅｔ等、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：４３５−４４５）を含有する２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを保有する。細胞の超音波処理後の粗画分、並びに遠心分離後のペレット及び上清におけるニトリラーゼの発現を１０％ ＳＤＳ−ＰＡゲルで分析した。結果は図６に示され、それにより少なくとも１つのプラスミドがｎｉｔＢインサートを含有する細胞の抽出物における高いニトリラーゼ（ＮｉｔＢ）発現レベルが示されるが、しかしながら、プラスミドｐＸＬ２２３１の存在により可溶性画分中のニトリラーゼポリペプチドの量を増やすことができるがこのタンパク質は本質的に不溶性形態である。
図６において、Ｍは分子量マーカーを表し；これらはｋＤａの単位で示される。さらに、レーンは以下の意味を有する。
-Ａ、Ｄ、ＧはそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐ／ＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２／ＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３／ＸＬ２４３２の粗画分を表し；
-Ｂ、Ｅ、Ｈはこれらの同じ株からそれぞれ得られた上清を表し；
-Ｃ、Ｆ、Ｉはこれらの同じ株からそれぞれ得られたペレットを表し；
-Ｊ、Ｎ、ＱはＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＸＬ２２３１＋ｐ／ＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２／ＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３／ＸＬ２４３２からそれぞれ得られた粗画分を表し；
-Ｋ、Ｑ、Ｒはこれらの株からそれぞれ得られた上清を表し；そして
-Ｌ、Ｐ、Ｓはこれらの株からそれぞれ得られたペレットを表す。
株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２＋ｐＸＬ２２３１をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１２６と称した。株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３＋ｐＸＬ２２３１をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１２７と称した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１２６、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１２７、及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＬ２４３２に相当するＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６６の培養物のニトリラーゼ活性を以下のように測定した。すなわち、培養容量（５０ｍｌ）及びＩＰＴＧの最終濃度（０．１ｍＭ）を改変して、上記の方法により培養を実施した。培養物を遠心分離し、細胞ペレットを１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー ｐＨ７に溶解した。５００μｌのこの懸濁液を５００μｌの２００ｍＭ ＨＭＴＢＮ溶液 ｐＨ７に添加してＨＭＴＢＮの加水分解を実施した。この混合物の１００μｌを９００μｌの０．１Ｎリン酸と一定間隔で１ないし４時間混合することにより加水分解の反応速度論を得た。生成されたＨＭＴＢＡの量を米国特許出願シリーズ第０８／８０９，１８４号に記述されたようにＨＰＬＣにより分析した。結果を表２に示す。
0004350801.tif 000005
発現されるニトリラーゼポリペプチドの可溶化を高めるために、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３７を以下のように構築した。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理したプラスミドｐＤＳＫ５１９（Ｋｅｅｎ等、１９８８、Ｇｅｎｅ  ７０：１９１−１９７）の５．９ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメントをＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼで処理したプラスミドｐＨＰ４５ΩＳｐ（Ｐｒｅｎｔｋｉ及びＫｒｉｓｃｈ、１９８４、Ｇｅｎｅ  ２９：３０３−３１３）から取り出した２０５６ｂｐ ＨｉｎｄIIIフラグメントと連結することによりプラスミドｐＸＬ２３９１を得た。次に、プラスミドｐＸＬ２３９１をＳｍａＩ及びＳａｃＩで消化し、ＨｉｎｄIIIで消化したプラスミドｐＸＬ２２３１から取り出してＫｌｅｎｏｗで処理し、そしてＳａｃＩで消化したＧｒｏＥＳＬオペロンを保有する２．３ｋｂインサートをそこに挿入した。従って、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３７はプラスミドｐＸＬ２２３１より高いコピー数を有するプラスミドＲＳＦ１０１０の誘導体であり、起点ＣｏｌＥ１を保有するプラスミドと和合性であり、そしてストレプトマイシンに対する抵抗性のマーカーを保有している。このプラスミドを株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２中に導入して株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１７１を生ぜしめた。上に記述したものと同様の方法によるが、テトラサイクリンを１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで置き換えて実施した培養物の活性を測定し、表３に報告する。
0004350801.tif 000006
実施例５：エシェリキア・コリＤＨ５αにおけるニトリラーゼの発現
Ｐｔｒｐプロモーター及びリボソーム結合部位ＲＢＳｃII（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌｌ等、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６１：１５−２０）を含有するｐＸＬ２１５８の０．６ｋｂ ＳｃａＩ−ＮｄｅＩフラグメントをｐＢＣＡＴ３（図３参照）中にクローニングすることによりプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６を構築した。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６及び／またはプラスミドｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌｌ等）を含有する株ＤＨ５αで以下の方法で発現を実施した。すなわち、前培養を０．４％のカザアミノ酸、１００μｇ／ｍｌのトリプトファン、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＭ９グルコース培地（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｈ．１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）中で３７℃で１６時間インキュベートする。ｐＸＬ２０３５を含有する株にはカナマイシンを５０ｍｇ／ｌの量で添加した。飽和した培養物を同じであるがトリプトファンを含まない培地中で１／１００希釈し、３７℃で８ないし１６時間インキュベーションした後発現が生じた。
異なる株の抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を先の実施例に記述したように実施し、それを図７に示す。
この図において、Ｍは分子量マーカーを表し；これらはｋＤａ単位で示される。さらに、レーンは以下の意味を有する。
-Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｃは株ＤＨ５α＋ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ／３、／６、／６＋ｐＸＬ２０３５、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ７６からそれぞれ得られた粗画分を表し；
-Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｂはこれらの同じ株からそれぞれ得られた上清を表し；そして
-Ｊ、Ｇ、Ｄ、Ａはこれらの同じ株からそれぞれ得られたペレットを表す。
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６により、顕著に不溶性の４３ｋＤａポリペプチドのわずかな蓄積を達成することができた。プラスミドｐＸＬ２０３５からのＧｒｏＥの同時発現は過剰発現を減らしたが、株ＤＨ５α（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６＋ｐＸＬ２０３５）の３連続継代培養後に、選択した株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ７６はニトリラーゼポリペプチドの発現の最初のレベルに戻り、後者は実質的に完全に可溶性である。上記及び先の実施例における方法により実施された培養物の活性のアッセイを表４に示す。
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これらのデータから、ＧｒｏＥの同時発現によりニトリラーゼの発現を増大できること及び連続継代培養による通常の株選択も組換え体の活性の増大に寄与することが示される。
実施例６：シュードモナス・プチダ及びアルカリゲネス・ファエカリスにおけるニトリラーゼの発現
シュードモナス・プチダ及びアルカリゲネス・ファエカリスにおいてニトリラーゼを生産するために実施例５に記述した発現系を用いた。ｎｉｔＢ遺伝子を含有するｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６の１．１４ｋｂ ＮｄｅＩ−ＸｂａＩフラグメントをベクターｐＸＬ１２８９のＮｄｅＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。ベクターｐＸＬ１２８９はグラム陰性バクテリアにおける多宿主複製起点（ｏｒｉＶ）を保有し、そしてｐＸＬ５３４（Ｌａｔｔａ等、１９９０、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９：１２９−１３７）のＰtrpプロモーター及びＲＢＳIIを保有する１２０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメント、ｃｏｂＡ遺伝子（Ｃｒｏｕｚｅｔ等、１９９０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５９６８−５９７９）をコードするＮｄｅＩ−ＸｂａＩインサート並びにｐＸＬ５３４（Ｌａｔｔａ等、１９９０、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９：１２９−１３７）のＴrrmBターミネーターを含有する５００ｂｐ ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩインサートを含むｐＫＴ２３０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ等、１９８１、Ｇｅｎｅ  １５：２３７−２４７）の誘導体である。従って、得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４は、カナマイシンに対する耐性を与える遺伝子（Ｋａｎ）及びＰｔｒｐ：ＲＢＳｃIIの制御下にｎｉｔＢ遺伝子を含有するｐＫＴ２３０の誘導体である（図８参照）。
エシェリキア・コリＤＨ５α株へのこのプラスミドの導入中に、特種なクローンが選択され：それはＳＤＳ−ＰＡゲルでの分子量が４３ｋＤａの代わりに４４ｋＤａであるニトリラーゼを発現した。このクローンにより保有されるプラスミドはｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４と同じ制限パターンを示し、それをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４と称した。最後に、以下の改変を含んで、すなわち、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６の１３６ｂｐ ＳｔｕＩ−ＢｓｍＩフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４のＳｔｕＩ−ＢｓｍＩで置き換えて、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４と同じ方法によりプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３を構築した。従って、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３は位置２７９でＡｓｎ残基を有するニトリラーゼＮｉｔＢを発現した。
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４、２３及び２４をエレクトロポレーションによりシュードモナス・プチダＧ２０８１株中に導入した。株Ｇ２０８１はナリジキシン酸及びリファンピシンに対する自然耐性の選択により株ＫＴ２４４０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ及びＴｉｍｍｉｓ、１９８１、Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄ及びＧｏｅｂｅｌ、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中、４７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）から得られる。ベクターｐＫＴ２３０をコントロールプラスミドとして用いた。
次に、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４及びｐＫＴ２３０をシュードモナス・プチダ株から取り出してエレクトロポレーションによりアルカリゲネス・ファエカリスＡＴＣＣ８７５０株（＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１）中に導入した。
株Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）、Ｇ２０８１（ｐＫＴ２３０）をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４）、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＫＴ２３０）と共に５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で３０℃で一晩培養した。これらの前培養物を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＭ９培地中で１／１００に希釈し、３０℃で２０時間インキュベートした。
細胞の超音波処理後の粗画分、遠心分離後のペレット及び上清におけるニトリラーゼの発現を１０％ ＳＤＳ−ＰＡゲルで測定した。結果を図９に示す。株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＫＴ２３０）及びＧ２０８１（ｐＫＴ２３０）には、粗抽出物のみを添加した（それぞれレーンＡ及びＩ）。この図において、Ｍは分子量マーカーを表し；これらはｋＤａ単位で示される。さらに、レーンは以下の意味を有する。
-Ｂ、Ｄ、Ｆは株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４）、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）からそれぞれ得られた粗画分を表し；
-Ｃ、Ｅ、Ｇはこれらの同じ株からそれぞれ得られた上清を表し；
-ＨはＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）から得られたペレットを表し；
-Ｊ、Ｌ、Ｏは株Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）からそれぞれ得られた粗画分を表し；
-Ｋ、Ｎ、Ｐはこれらの同じ株からそれぞれ得られた上清を表し；そして
-ＱはＧ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）から得られたペレットを表す。
この実験から、シュードモナス・プチダ株は多量の３種の可溶性ニトリラーゼポリペプチドを発現すること、及び４４ｋＤａのニトリラーゼポリペプチドのみがアルカリゲネス・ファエカリス株により過剰発現されることが示される。実施例４に記述された方法により実施された、これらの培養物の活性のアッセイから、株Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２３）、Ｇ２０８１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）及びＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２４）がＨＭＴＢＮに対するニトリラーゼ活性を有することが示される。
実施例７：コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるニトリラーゼの発現
ＰｃｓｐＢプロモーター（Ｐｅｙｒｅｔ等、１９９３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１０９）を用いて株ＣＧＬ１０１０（＝ＡＴＣＣ１４７５２）においてニトリラーゼの発現を実施した。ＰｃｓｐＢプロモーターを含有する５３０ｂｐフラグメントを以下のプライマーＫＳ１及びＫＳ２：
0004350801.tif 000008
を用いてプラスミドｐＣＧＬ８１５（Ｐｅｙｒｅｔ等）から増幅した。
ＳａｌＩで消化した後、増幅された５３０ｂｐフラグメントをプラスミドｐＢＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）中にクローン化し、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶで開いてプラスミドｐＣＧＬ１０８４を生ぜしめた。以下の２個のオリゴヌクレオチドＫＳ８及びＫＳ９：
0004350801.tif 000009
をハイブリダイズさせることによりＥｃｏＮＩ／ＮｄｅＩアダプターを調製した。
ニトリラーゼ遺伝子をプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６から１．１ｋｂ ＮｄｅＩ−ＸｂａＩフラグメントの形で取り出した。それをｐＣＧＬ１０８４中に挿入し、上記のＥｃｏＮＩ／ＮｄｅＩアダプターを用いてＥｃｏＮＩ及びＸｂａＩで開いてプラスミドｐＣＧＬ１０８６を生ぜしめた。次に、ＰｃｓｐＢ::ｎｉｔＢを含有するｐＣＧＬ１０８６のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ部位でベクターｐＣＧＬ４８２（Ｐｅｙｒｅｔ等）中にクローン化し、プラスミドｐＣＧＬ１０８７を生ぜしめた。従って、プラスミドｐＣＧＬ１０８７（図１０参照）はエシェリキア・コリにおいて認識されるｐＡＣＹＣ１８４の複製起点を含有するｐＢＩ１（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ等、１９８４、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２２３７−２２４６）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性を与える遺伝子及びＰｃｓｐＢ::ｎｉｔＢ融合物に基づくシャトルベクターである。
プラスミドｐＣＧＬ１０８７及びｐＣＧＬ４８２をＢｏｎｎａｍｙ等、１９９０（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２６３−２７０）により記述されたようにエレクトロポレーションによりＣＧＬ１０１０中に導入した。５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを補足した３．７％ Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ注入培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）中３０℃で２０時間培養した後、実施例４に記述されたように培養サンプルに対してニトリラーゼ活性のアッセイを実施した。結果から株ＣＧＬ１０１０（ｐＣＧＬ１０８７）はニトリラーゼ活性を有し、一方、株ＣＧＬ１０１０（ｐＣＧＬ４８２）はなかったことが示される。
実施例８：ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるニトリラーゼの発現
ＰｔｉｐＡのプロモーター（Ｈｏｌｍｅｓ等、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３１８３−３１９１）を用いてプラスミドｐＩＪ６０２１（Ｔａｋａｎｏ等、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６６：１３３−１３７）を用いてストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４株（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、１９８５、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ）においてニトリラーゼの発現を実施した。
ＴｆｉＩ消化による１４０ｂｐ ＴｆｉＩフラグメントの欠失、Ｋｌｅｎｏｗでの処理及びベクターの自己連結によりプラスミドｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、１９８５、Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１１９）を改変した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで開いてｎｉｔＢ遺伝子を含有するｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３の１．１５ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクローン化した。このようにして得られたプラスミドｐＯＳ４８．４はｎｉｔＢ遺伝子とＢａｍＨＩ部位の間に位置する唯一のＴｆｉＩ部位を有した。ＢａｍＨＩでの消化及びＫｌｅｎｏｗでの処理後にプラスミドｐＨＰ４５Ωｈｙｇ（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ等、Ｇｅｎｅ、投稿中）から取り出された２．３ｋｂ Ωｈｙｇフラグメントを挿入するためにこの部位を用いた。Ωｈｙｇフラグメントはストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子（Ｚａｌａｃａｉｎ等、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：１５６５−１５８１）を含有し、ストレプトマイセス・リビダンスにハイグロマイシン耐性を与える。このようにして得られたプラスミドｐＯＳ４８．５を用いてニトリラーゼ遺伝子及びそれに続くｈｙｇ遺伝子を含有する３．４５ｋｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、それをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで開いたプラスミドｐＩＪ６０２１（Ｔａｋａｎｏ等）中にクローン化した。プラスミドｐＩＪ６０２１はストレプトマイセスにおいてのみ複製することを考えて、２００ｍｇ／ｌのハイグロマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）に対して耐性のクローンを選択することにより常法（Ｈｏｐｗｏｏｄ等）によりライゲーション混合物をストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４に形質転換した。これらのクローンのプラスミドＤＮＡを常法（Ｈｏｐｗｏｏｄ等）により取り出し、そしてそれらの制限パターンは実際に予想される構築物に相当し、それをｐＯＳ４８．７（図１１参照）と称した。
ｐＯＳ４８．７を含有する２種のストレプトマイセス・リビダンス株及びプラスミドｐＩＪ６０２１を含有するクローンを５ｍｇ／ｌのカナマイシン選択を用いて５０ｍｌのＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ）中３０℃で７２時間培養し、次に、チオストレプトンを５ｍｇ／ｌの濃度で添加し、記述された条件（Ｈｏｐｗｏｏｄ等）に従って培養をさらに１８時間続けた。培養物を集め、実施例４に記述された条件下で実施された活性アッセイにより、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４株（ｐＯＳ４８．７）がＴＫ２４株（ｐＩＪ６０２１）と異なりニトリラーゼ活性を発現したことが示される。
実施例９：他のニトリラーゼでのＨＭＴＢＮの加水分解
Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉ等、１９９５に記述されたコマモナス・テストステロニ種（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ｓｐ．）ニトリラーゼの一次配列は本発明に記述されるニトリラーゼの一次配列と３１％の一致を示した。コマモナス・テストステロニのニトリラーゼを発現するエシェリキア・コアの組換え株ＴＧ１（ｐＸＬ２１５８、ｐＸＬ２０３５）をＬｅｖｙ−Ｓｃｈｉ等により記述された条件下で培養し、細胞ペレットを５０ｍＭ ＨＭＴＢＮを含むｐＨ７の１００ｍＭリン酸バッファー中３０℃でインキュベートした。測定された活性は２．３ｋｇ／時．ｋｇ ＣＳであった。本発明のニトリラーゼのように、コマモナス・テストステロニのニトリラーゼはＨＭＴＢＮを加水分解することができる。
さらに、プラスミドｐＢＣＡＴ１２及びｐＢＣＡＴ１３で実施例４に示されたデータから、アルカリゲネス・ファエカリスＡＴＣＣ８７５０ニトリラーゼ上のＡｓｎ２７９→Ａｓｐ２７９置換によりＨＭＴＢＮに対する活性を維持できることが示される。
実施例１０：担体の供給
５ｇの乾燥細胞をｐＨ７．０に調整した２０ｇの水に添加した。次に、示した担体（ＣＥＬＩＴＥ ５４５、Ｐｒｏｌａｂｏ、Ｆｒａｎｃｅ）の量を添加し、完全に均質化した後、全乾燥質量に基づいて１５％のグルタルアルデヒド続いて１０％のポリエチレンイミン（ＳＥＤＩＰＵＲ、ＢＡＳＦ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することにより懸濁液を架橋させた。懸濁液を室温で１時間撹拌した。
次に、０．００１％の陰イオン凝集剤、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ Ａ１００を添加することにより懸濁液を凝集させた。架橋された素材を濾過により回収した。
次に、全乾燥質量に基づいて１０％のポリアゼチジン（ＫＹＭＥＮＥ ５５７、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を添加することによりこの素材を再び架橋させた。次に、まだ湿った素材を直径０．５ｍｍのオリフィスを通して押出し、乾燥させた。
次に、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願第０８／８０９，１８４号に記述された方法により、得られた粒子の活性を測定した。
0004350801.tif 000010
細胞に対する担体の添加は活性を著しく高めた。
水にある程度可溶性のコムギグルテン（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）または水に完全に可溶性のゼラチン（ＳＢＩ、Ｆｒａｎｃｅ）でＣＥＬＩＴＥを置き換えることにより実験を繰り返した。
0004350801.tif 000011
この実施例からＣＥＬＩＴＥでグルテンを置き換えることができることも示す。一方、ゼラチン（完全に可溶性）を添加する場合、上記の技術（押出）による触媒の形成は不可能である。
実施例１１
ＬＢ培地中の好気培養により調製された実施例４の１０ｇのエシェリキア・コリＢＩＯＣＡＴ１７１を５００ｇの１００ｍＭリン酸バッファー ｐＨ７．０中１０ｇのＣＬＡＲＣＥＬ ７８（ＣＥＣＡ、Ｆｒａｎｃｅ）と混合した。均質化後、６ｇの２５％グルタルアルデヒドを添加し、懸濁液を室温で１５分間撹拌した。次に、６ｇの２５％グルタルアルデヒドに加えて２ｇのポリエチレンイミンを添加した。全部を室温で１時間撹拌した。０．２％のＳＵＰＥＲＦＬＯＣ Ａ１００の溶液（ＣＹＴＥＣ、Ｆｒａｎｃｅ）５ｍｌを添加することにより混合物を凝集させた。素材を濾過し、得られたペーストを１２．５％のポリアゼチジン（ＫＹＭＥＮＥ ５５７、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）１６ｇと混合し、次に、直径０．５ｍｍのオリフィスを通して押出した。得られたバーミセリをオーブン中３５℃で乾燥させ、次に、５０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ１０．０中に調製した１％ ＮａＢＨ4浴中に３０分間浸す。次に、生体触媒を蒸留水で洗浄した。触媒を５００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０中５℃または室温で保存した。
３ｃｍの内径及び４５ｃｍの高さを有するサーモスタットを備えたカラムに１００ｇの生体触媒を充填した。このカラムを再循環ループによりポンプに連結した。反応器の全容量は４３０ｍｌであった。ループをヒドロキシメチルチオ酪酸のアンモニウム塩の２５％溶液で満たした。２０ｌ／時の毎時流速でカラムの上面から下向きに溶液を供給した。カラムのジャケット中及び熱交換器中を循環する水により温度を３５℃に保つことができた。脱イオン水を８０ｇ／時の流速で、そして２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−ブチロニトリルを２０ｇ／時でループに添加した。反応媒質の過剰容量をループの容量が一定のままであるようにカラムの底から蒸発させた。このようにして、９５％のニトリル転化率で連続的な流れを得た。さらに、反応器の流出口で得られた２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸のアンモニウム塩の水溶液の濃度は２５％であった。
実施例１２
用いる電気透析器は２ｄｍ2の有効表面積を有する９隔室のスタックを含み、それらの各々は以下のように設計された２区画からなった：
-塩／酸区画：Ｔｏｋｕｙａｍａ  Ｓｏｄａからの陽イオン交換膜Ｎｅｏｓｅｐｔａ ＣＭＢにより陰極側で、そしてＡｑｕａｌｙｔｉｃ両極性膜の陽イオン面により陽極側で境界が定めされる、及び
-塩基区画：陽イオン膜により陽極側で、そして両極性膜の陰イオン面により陰極側で境界が定められる。
陽極は白金黒付チタンであった。陰極はステンレス鋼であった。
電解液は４０℃で１００ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する硫酸ナトリウム水溶液を含んだ。電極での循環速度は２ ｘ １００ｌ／時であった。容量は５ｌであった。
「塩基」区画を最初５リットルの１％硫酸アンモニウム溶液で満たした。
「塩／酸」区画を最初２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のアンモニウム塩の１．４４ｍｏｌ／ｌの溶液５リットルで満たした。
溶液の再循環速度を最初塩／酸区画では１３０ｌ／時に、そして塩基区画では１９０ｌ／時に固定した。
電気透析を４０℃の平均温度でバッチ形態（再循環での操作）で実施した。強度を９Ａ、すなわち、０．４５ｋＡ／ｍ2の電流密度に設定した。
１５５分の操作後に、塩／酸区画の伝導度は５９から７．８ｍＳ／ｃｍに変化した。
塩／酸区画は酸形態で１００％の１．３５ｍｏｌ／ｌの２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸を含有した。
誘導電流収率は７１％、エネルギー消費は形成された酸１ｋｇ当たり０．５３ｋＷｈと概算された。
実施例１３
電気透析器は実施例１２のものと同一の配置を有する８隔室のスタックを含んだ。
「塩基」区画を最初５．２７リットルの１％硫酸アンモニウム溶液で満たした。
「塩／酸」区画を最初２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のアンモニウム塩の１．３９ｍｏｌ／ｌの溶液４．８５リットルで満たした。
溶液の再循環速度を最初塩／酸区画では６０ｌ／時に、そして塩基区画では１５０ｌ／時に固定した。
電気透析を４０℃の平均温度でバッチ形態（再循環での操作）で実施した。強度を９Ａ、すなわち、０．４５ｋＡ／ｍ2の電流密度に設定した。
１７２分の操作後に、塩／酸区画の伝導度は５９から９．５ｍＳ／ｃｍに変化した。
塩／酸区画の最終容量は４．６７リットルであった。
その組成は
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸：１．２４ｍｏｌ／ｌ
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸アンモニウム：０．１４８ｍｏｌ／ｌ
からなった。
転化率は８６％であった。最終生成物は酸形態で８９％であった。
誘導電流収率は７４％であった。エネルギー消費は形成された酸１ｋｇ当たり０．５８ｋＷｈと概算された。
実施例１４
実施例１３のものと同様の装置を用いた。
「塩基」区画を最初５．４６リットルの１％硫酸アンモニウム溶液で満たした。
「塩／酸」区画を最初２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のアンモニウム塩の１．２４ｍｏｌ／ｌの溶液５．２３リットルで満たした。
溶液の再循環速度を最初塩／酸区画では９０ｌ／時に、そして塩基区画では１５０ｌ／時に固定した。
電気透析を４０℃の平均温度でバッチ形態（再循環での操作）で実施した。強度を１４Ａ、すなわち、０．７ｋＡ／ｍ2の電流密度に設定した。
１０５分の操作後に、塩／酸区画の伝導度は５７．６から９．８ｍＳ／ｃｍに変化した。
塩／酸区画の最終組成は以下のものであった：
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸：１．２８ｍｏｌ／ｌ
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸アンモニウム：０．１４ｍｏｌ／ｌ
生成物は酸形態で９０％であった。
実施例１５
実施例１３のものと同様の装置を用いた。
実施例１４の最後で得られた塩基区画の中身で実験を実施した。
「塩／酸」区画の最初２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のアンモニウム塩の１．４４ｍｏｌ／ｌの溶液５．２リットルで満たした。
溶液の再循環速度を最初塩／酸区画では５０ｌ／時に、そして塩基区画では１５０ｌ／時に固定した。
電気透析を４２℃の平均温度でバッチ形態（再循環での操作）で実施した。強度を１９Ａ、すなわち、０．９５ｋＡ／ｍ2の電流密度に設定した。
５３分の操作後に、塩／酸区画の伝導度は５９から２７ｍＳ／ｃｍに変化した。
塩／酸区画の最終容量は４．８５リットルであった。
組成は以下のものであった：
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸：０．８７ｍｏｌ／ｌ
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸アンモニウム：０．５６ｍｏｌ／ｌ
転化率は５６％であった。最終生成物は酸形態で６１％であった。
誘導電流収率は８３％であった。エネルギー消費は形成された酸１ｋｇ当たり０．７ｋＷｈと概算された。
実施例１６
約１．５ＭのＨＭＴＢＳ溶液２００．１ｇを回転エバポレーター中でバッチで濃縮した。浴の温度は４５＋／−５℃であった。圧力を約２．５ ｘ １０3Ｐａ（２５ｍｂａｒ）に調節した。蒸溜器中の温度は蒸溜の開始時の２５℃から終了時の４０℃まで変化した。３時間後に４１．９ｇの黄色の粘性媒質を回収し、その特性は以下のもの：
0004350801.tif 000012
であった。
力価を調整した（Ｈ2Ｏでの希釈）後、特性が以下のもの：
0004350801.tif 000013
である生成物を得た。
電位差計測定により以下の質量配分を得た：
0004350801.tif 000014
モノマーまたはダイマー／（モノマー＋ダイマー）の面積の比率をＨＰＬＣにより測定した。
モノマー／（モノマー＋ダイマー）        １００
ダイマー／（モノマー＋ダイマー）（＊）      ０
（＊）ダイマーは検出されなかった。
実施例１７
約１．５ＭのＨＭＴＢＳ溶液２００．０ｇを回転エバポレーター中でバッチで濃縮した。浴の温度は１２１／−５℃であった。圧力を約９．５ ｘ １０4Ｐａに調節した。蒸溜器中の温度は蒸溜の開始時の１００℃から終了時の１１３℃まで変化した。３時間後に４１．５ｇの褐色の粘性媒質を回収し、その特性は以下のものであった：
0004350801.tif 000015
力価を調整した（Ｈ2Ｏでの希釈）後、特性が以下のもの：
0004350801.tif 000016
である生成物を得た。
電位差計測定により以下の質量配分を得た：
0004350801.tif 000017
モノマーまたはダイマー／（モノマー＋ダイマー）の面積の比率をＨＰＬＣにより測定した。
モノマー／（モノマー＋ダイマー）  ９５．０
ダイマー／（モノマー＋ダイマー）    ５．０
実施例１８
４０．０ｇのＨ2Ｏを実施例１７に記述した媒質１００．０ｇに添加した。媒質を７５．０ｇのイソプロピルエーテルで抽出した。相の分離後、２５．６ｇのＨＭＴＢＡを蒸発後の有機相中に回収し、その特性は以下のものであった：
0004350801.tif 000018
実施例１９：先の実施例に記述した溶液の老化
0004350801.tif 000019
実施例１６及び１７の溶液は４０日の保存後にそれらのダイマーの含有量が変化しなかった。
【図１Ａ】
0004350801.tif 000020
【図１Ｂ】
0004350801.tif 000021
【図２】
0004350801.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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