(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸又はイソフェルラ酸であるハイドロキシシンナム酸誘導体又はこれの薬学的に許容される塩を痴呆の予防及び治療に有効量で含有する痴呆予防及び治療用の組成物。
【請求項２】
デクルシノールをさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
本発明は、化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール、これらの薬学的に許容される塩又はこれらを含むトウキ抽出物を含有する痴呆予防及び治療用の組成物に関する。
【０００１】
【化１】
0004350910.tif 000002
前記の式において、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2は−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ又は
【０００２】
【化２】
0004350910.tif 000003
である。
【０００３】
（発明の背景）
近年、老齢人口の急激な増加に伴って、アルツハイマー病のような老化と関連した老人性痴呆(senile dementia)の発生が深刻な社会問題になってきている。
【０００４】
アルツハイマー病は老人性痴呆の中で一番重要な疾患であり、ベータアミロイド(Ａ(1-42)の脳内蓄積とそれによる神経毒性が発病の非常に重要な原因として知られている(Selkoe, Annu. Rev. Neurosci., 17, 489-517(1994))。現在まで、アルツハイマー病の予防及び治療のためにアルツハイマー病の原因物質として知られているベータアミロイドの毒性が遮断できる物質を開発しようとする努力が進行してきたが、未だ有効な治療剤が開発されていない。
【０００５】
本願発明者らは、痴呆予防の薬剤の開発に努めた結果、韓国において心臓、肝臓、脾臓の疾患の治療に使用されてきたトウキの抽出物が、痴呆予防や治療についての予期しない高い活性を有することを見出した。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の目的は、痴呆予防及び治療用の薬学組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、痴呆予防及び治療の効果が有る機能性食品組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の一態様では、痴呆の予防及び治療に有効量のフェルラ酸又はイソフェルラ酸であるハイドロキシシンナム酸誘導体、これの薬学的に許容される塩、又はこれらを含むトウキ抽出物を含有する痴呆予防及び治療用の薬学組成物が提供される。
【０００９】
上記治療用の組成物はデクルシノールをさらに含有することができる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、下記の化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体又はこれの薬学的に許容される塩を含有する痴呆予防及び治療用の薬学組成物が提供される。
【００１１】
【化３】
0004350910.tif 000004
前記の式において、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2は−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ又は
【００１２】
【化４】
0004350910.tif 000005
である。
【００１３】
前記の化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体としては、フェルラ酸(ferulic acid)、イソフェルラ酸(isoferulic acid)、クロロゲン酸(chlorogenic acid)、カフェー酸(caffeic acid)等が挙げられる。
【００１４】
また、本発明の薬学組成物は、更にデクルシノール又はこれの薬学的に許容される塩を含有することができる。
前記のフェルラ酸及びデクルシノールは、文献(伝統薬物から新薬開発研究法、ソウル大学校天然物科学研究所発行)の方法によりトウキから分離して得るか、又は文献(Merck Index等)の方法により合成するか、又は商業的に入手することもできる。前記の化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体及びデクルシノールは、通常の方法により、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩及びカルシウム塩のような無機塩、アンゲリカ酸(angelic acid)、リジン、エタノールアミン、Ｎ,Ｎ'―ジベンジルエチレンジアミン及び(−トコフェロール科の有機塩、及びトリテルペンアルコール(triterpene alcohol)又は植物ステロール(plant sterols)、例えば、サイクロアテノル(cycloartenol)科のエステル(“オリザノール(oryzanol)”)等、当業界で公知された様々な薬学的に許容される塩の形態で製造されることができる。
【００１５】
また、本発明では、化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体及びデクルシノールを含むトウキ抽出物を含有する痴呆予防及び治療用の薬学組成物が提供される。本発明のトウキの例としては、前記化合物を含有する朝鮮トウキ(Angelica gigas Nakai)、日トウキ(Angelica acutiloba Kitagawa)、中国トウキ(Angelica sinensis Diels)等が挙げられる。
【００１６】
本発明のトウキ抽出物は、アルコール等の適切な溶媒を用いた通常の方法により製造することができる。例えば、トウキの根茎にメタノール、エタノール等の低級アルコール、好ましくは８０％のメタノールを加え、５乃至８０℃、好ましくは３０乃至５５℃で１５分乃至４８時間、好ましくは３０分乃至１２時間抽出して得られる。このようにして得られたトウキ抽出物はフェルラ酸とデクルシノールを含み、これらの含量は抽出物の総重量に対して各々０.０１乃至０.９ｗｔ％及び０.１乃至１０ｗｔ％である。さらに、抽出溶媒として、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶媒を用いることもでき、得られた抽出物を減圧乾燥させて粉末状に作っても良い。
【００１７】
化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はこれらを含むトウキ抽出物は、ベータアミロイド(１-４２)をマウスの脳室内へ直接投与することで、記憶力が減少したアルツハイマー疾患マウスのモデルにおいてアルツハイマー病に対する予防及び治療の効果を示し、その効果は投与量に比例して増加する。
【００１８】
前記のようなアルツハイマー病のマウスモデルでは、行動学的に受動回避反応及びＹ−迷路検査において記憶減少の効果が観察される。ところが、本発明のハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はこれらを含むトウキ抽出物を予防的に投与したマウスでは、脳室内へのベータアミロイド(１-４２)の投与による記憶減少が効果的に防止される。
【００１９】
マウスの脳室内にベータアミロイド(１-４２)を投与することで誘発される組織学的な変化を免疫化学染色法で調査すると、小膠細胞(microglia)のマーカー(marker)であるＯＸ-４２に対する免疫化学染色が大脳皮質で一時的に増加してから正常に回復されることが確認できる。また、ベータアミロイド(１-４２)の投与によりアセチルコリン合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)の濃度が減少する。
【００２０】
しかしながら、脳室内にベータアミロイド(１-４２)を投与する前に本発明のハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はこれらを含むトウキ抽出物を投与したマウスでは、この物質を投与していない場合に比べて小膠細胞のＯＸ-４２の増加程度が非常に格段に減少する。また、ベータアミロイド(１-４２)の投与によるChAT濃度の減少が防止される。
【００２１】
即ち、本発明のハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はこれらを含むトウキ抽出物は、ベータアミロイドによる神経毒性の誘発に重要な役割をする小膠細胞の活性を抑制することで脳組織を保護することができ、かつベータアミロイドによるChATの減少を防止して脳保護作用を示すことで痴呆予防及び治療の効果を示す。
【００２２】
前記のような有効性にも拘らず、化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール及びこれらを含むトウキ抽出物は、ラットを使用した試験において急性毒性等の毒性を全く示すことがなく、肝機能における副作用を見られない。
【００２３】
化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール及びこれらを含むトウキ抽出物を通常の方法により適切の担体又は賦形剤と混合するか、又は稀釈剤で稀釈して痴呆治療用の薬学組成物を製造することができる。適合した担体、賦形剤及び稀釈剤の例としては、ラクトーズ、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギナート、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルハイドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物類が挙げられる。前記の薬学組成物は充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤等をさらに含むことができる。本発明の組成物は哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続又は遅延された放出が提供できるように当業界でよく知られている方法を用いて製剤化されることができる。製剤の形状は錠剤、丸薬、粉末、におい袋(sachet)、エリキシル(elixir),懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾール、軟質又は硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末等の形態でも良い。
【００２４】
本発明の薬学組成物は、経口、経皮、皮下,静脈又は筋肉を含む複数の経路を通じて投与されることができる。化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール、トウキ抽出物の通常の１日投与量はそれぞれ０.５乃至５０mg/kg体重、０.３乃至３０mg/kg体重、５乃至５００mg/kg体重の範囲である。それらは一度に投与されてもよく、また、分割して投与されてもよい。しかし、活性成分の実際の投与量は投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び患者の重症度等の様々な関連因子に鑑みて決定されるべきであり、よって、前記の投与量が本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
一方、化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はトウキ抽出物は、痴呆予防又は治療の目的から食品に添加されることができる。従って、本発明はさらに有効量の化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はトウキ抽出物を含む、痴呆予防又は治療の効果を示す食品組成物を提供する。食品は様々な食料品、飲料品、ガム類、茶類、ビタミン複合体、及び健康食品を含む。
【００２６】
痴呆予防食品の開発のために、化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール又はトウキ抽出物を食品の製造時に原料物質に添加するか、又は調理した食品に適宜混合して痴呆予防又は治療の効果が有る食品を製造することができる。この場合、最終的に製造された食品や飲料中における化学式Ｉのハイドロキシシンナム酸誘導体、デクルシノール、トウキ抽出物の含量はそれぞれ０.０５乃至１０％、０.０５乃至１０％、１乃至４０％の範囲でも良い。
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。但し、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
また、下記の実施例において、固体混合物中の固体、液体中の液体、及び液体中の固体に対する下記の百分率は各々重量/重量、体積/体積及び重量/体積を基にしている。また、特別の言及が無い限り全ての反応は室温で行った。
【００２８】
参考例１：脳室内への注射
ベータアミロイド(１-４２)のマウスへの投与は、文献(Laursen & Belknap, J. Pharmacol, Methods, 16, 355-357(1986))に記載された方法に従って行った。詳しくは、２６ゲージの注射針を取り付けた５０μlハミルトン注射器に、１.８５μgのベータアミロイド(１-４２)を含む５μgのリン酸バッファ塩を注入し、針先をマウスの頭頂(bregma)に挿入してベータアミロイド(１-４２)溶液を脳室内へ投与した。対照群のマウスには、ベータアミロイド(１-４２)の代わりにベータアミロイド(４２-１)を同量で注射した。投与後、１-２日後に受動回避検査を実施し(１日：訓練、２日：検査)、３-４日にはＹ−迷路実験を実施した(３日：訓練、４日：検査)。
【００２９】
参考例２：受動回避検査(passive avoidance test)
受動回避検査を通じて学習及び記憶保持能力を評価した。受動回避検査は文献(Song等, J. Neurochem., 71, 875-878(1998))に記載された方法により次のように実施した。
【００３０】
試験においては、明るい部屋と暗い部屋とからなる受動回避箱を使用した。暗い部屋の床には電気衝撃が実験動物に与えられるように設計されている。先ず、マウスを明るい部屋に置いて、マウスが暗い部屋へ入ると、直ちに０.２５mAで１秒間電気衝撃を与えた。訓練後２４時間が経った後、マウスを明るい部屋に置いて暗い部屋へ入るまでの時間を測定して受動回避反応時間とした。最大の制限時間は３００秒とした。つまり、３００秒を超えるまでに暗い部屋へ入らない場合、受動回避反応時間を３００秒と決定した。
【００３１】
参考例３：Ｙ−迷路試験
Ｙ−迷路試験を通じて自発的な交叉行動量(alternation behavior)を評価した。Ｙ−迷路試験は文献(Starter等, Psychopharmacology, 94, 491-495(1988))に記載された方法により次のように実施した。
【００３２】
Ｙ−迷路はＹ字状の３つの通路からなっている。１つの通路の端にマウスの頭部が向くように置き、８分間自由に３つの通路で往来させた。交叉回数はマウスが連続して３つの通路を通過した時に一度交叉したものとした。自発的な交叉行動量は交叉回数と通路を通過した全回数(number of armentries)の百分率で計算した。
【００３３】
実施例１：トウキ抽出物の製造
細かく切った朝鮮トウキの根茎１kgに８０％のメタノール２Ｌを加え、その混合物を４０℃で２時間抽出する過程を2回繰り返した。抽出物を集め、減圧還流冷却管を用いてメタノールと水分を蒸発させた後、減圧乾燥器で完全に乾燥させてトウキ抽出物２９０ｇを得た。本実施例で得られたトウキ抽出物は、ＨＰＬＣを使用した成分分析の結果、デクルシノール及びフェルラ酸を各々０.５重量％及び０.０７重量％づつ含有していることがわかった(図１ａ及び図１ｂ)。この時、ＨＰＬＣ分析は次の条件で行った。
【００３４】
デクルシノール
カラム：Si60(７μm、２５０mm×４mm)；溶媒：ｎ-へキサン：EtoAc=１:１；流速：１.０ml/分；検出器：ＵＶ３４０nm
フェルラ酸
カラム：RP-18(７μm、２５０mm×４mm)；溶媒：MeOH：水=１:３.５；流速：１.０ml/分；検出器：ＵＶ２５８nm
また、日トウキ及び中国トウキを用いて前記と同一の方法により抽出物を収得しており、ＨＰＬＣ分析の結果、これらの抽出物がフェルラ酸とデクルシノールを含むことが確認できた。
【００３５】
実施例２：トウキ抽出物の痴呆予防の効果
４-５週齢のマウス(体重２０-２５ｇ)４０匹を各群ごとに１０匹づつ４つの群に分けた。実施例１で得られたトウキ抽出物を各々０.０８％(ｗ/ｖ)、０.１％(ｗ/ｖ)の濃度で水に溶解した。その溶液を２つの群のマウスに水の代わりに４週間摂取させており、その結果、１匹当り毎日約８mlが投与された。他の２つの群のマウスには普通の水を４週間供給した。その後、参考例１の方法により、トウキ抽出物を投与していない群中の一群(対照群)のマウスにはベータアミロイド(４２-１)を、残りの３つの群のマウスにはベータアミロイド(１-４２)(Ａ(1-42)を各々１.８５μgづつ脳室内へ投与した。脳室内への注射後に参考例２と同様に受動回避実験を実施した。１０匹から平均値を求めており、その結果は図２ａに示されている。
【００３６】
図２ａに示すように、ベータアミロイド(１-４２)投与群は対照群に比べて受動回避反応時間が有意に減少した(Ｐ＜０.０５)。また、トウキ抽出物を０.０８％又は０.１％の濃度で投与した群で受動回避反応はベータアミロイド(１-４２)投与群に比べて有意に増加した(Ｐ＜０.０５)。
【００３７】
一方、０.１％濃度のトウキ抽出物を１、２、４週間投与することを除いては前記と同一の実験を繰り返して図２ｂと同じ結果を得ており、ここで、受動回避反応時間はトウキ抽出物の２週間及び４週間投与群でベータアミロイド(１-４２)投与群に比べて有意に増加した(Ｐ＜０.０５)。
【００３８】
実施例３：フェルラ酸の痴呆予防の効果
トウキ抽出物中の一成分であるフェルラ酸の痴呆予防の効果を次のように確認した。
【００３９】
４-５週齢のマウス(体重２０-２５ｇ)５０匹を各群ごとに１０匹づつ５つの群に分けた。フェルラ酸を０.００２％(ｗ/ｖ)、０.００４％(ｗ/ｖ)及び０.００６％(ｗ/ｖ)の濃度で各々水に溶解した。その溶液を３つの群のマウスに水の代わりに４週間摂取させており、その結果、１匹当り毎日約８mlが投与された。他の２つの群のマウスには普通の水を４週間供給した。その後、参考例１の方法により、フェルラ酸を投与していない群中の一群(対照群)のマウスにはベータアミロイド(４２-１)を、残りの４つの群のマウスにはベータアミロイド(１-４２)を各々１.８５μgづつ脳室内へ投与した。脳室内への注射後に参考例２と同様に受動回避実験を実施した。１０匹から平均値を求めており、その結果は図３ａに示されている。
【００４０】
図３ａに示すように、ベータアミロイド(１-４２)のみを投与した群は対照群に比べて受動回避反応時間が有意に減少した。しかし、フェルラ酸を予防的に４週間投与した実験群では、投与したフェルラ酸に容量依存的に受動回避反応時間の減少が防止された。
【００４１】
一方、フェルラ酸溶液を０.００６％(ｗ/ｖ)の濃度で１、２、３、４週間投与することを除いては前記と同一の実験を繰り返して図３ｂと同じ結果を得ており、投与期間が増加するにつれて受動回避反応に対するフェルラ酸の効果が増加した。
【００４２】
同一の動物を使用して参考例３と同様にＹ−迷路実験を行った結果、ベータアミロイド(１-４２)のみを投与した群に比べて、フェルラ酸を投与した群で交叉行動量が投与期間に比例して増加した(図４ａ)。しかし、この時の自発性運動量を示す通路通過の全回数は各群でほぼ同じであった(図４ｂ)。このような結果は、フェルラ酸溶液の効果が運動に影響を与えるのではなく、記憶に影響を与えて示されるのである。
【００４３】
一方、フェルラ酸とその異性質体であるイソフェルラ酸を各々０.００６％(ｗ/ｖ)の濃度で４週間投与したことを除いては前記と同様に実施した結果、イソフェルラ酸投与群の受動回避反応時間がフェルラ酸投与群とほぼ同じに増加しているので、イソフェルラ酸がフェルラ酸と同一の痴呆予防の効果を示すことが図５から確認できた。
【００４４】
実施例４：デクルシノールの痴呆予防の効果
トウキ抽出物中の一成分であるデクルシノールの痴呆予防の効果を次のように確認した。
【００４５】
４-５週齢のマウス(体重２０-２５ｇ)４０匹を各群ごとに１０匹づつ４つの群に分けた。デクルシノールをマウスが各々一日に７.５mg/kg及び１５mg/kgの容量で摂取することができるように、コーンオイル(corn oil)に溶解した後に混合して４週間２つの群のマウスに各々投与した。他の２つの群のマウスには飼料に同量のコーンオイルを混合して４週間投与した。その後、参考例１の方法により、デクルシノールを投与していない一群(対照群)のマウスにはベータアミロイド(４２-１)を、残りの３つの群のマウスにはベータアミロイド(１-４２)を各々１.８５μgづつ脳室内へ投与した。脳室内への注射後に参考例２と同様に受動回避実験を実施し、参考例３と同様にＹ−迷路実験を実施した。１０匹から平均値を求めており、その結果は図６Ａ乃至図６Ｃに示されている。
【００４６】
図６Ａに示すように、デクルシノールを投与したマウスではベータアミロイド(１-４２)による受動回避反応時間の減少が防止された。
また、Ｙ−迷路実験においても、デクルシノールにより交叉行動量が増加したが(図６Ｂ)、一般的な運動量を示す通路通過の全回数は全体的にほぼ同じであるので(図６Ｃ)、デクルシノールの効果が運動に影響を与えるのではなく、記憶に影響を与えて示されることが分かる。
【００４７】
一方、フェルラ酸とデクルシノールとの間に上昇作用があるかを調べるために、マウスにフェルラ酸０.００２％(ｗ/ｖ)、デクルシノール２mg/kg又はこれらの混合物を投与することを除いては前記と同様に実施した。また、フェルラ酸０.００３％(ｗ/ｖ)、デクルシノール３mg/kg又はこれらの混合物を投与して同一の実験を繰り返した。２つの実験において、全て実施例３と同様に０.００６％のフェルラ酸を投与したグループを比較群として使用した。
【００４８】
その結果、各々は有効でない低容量のフェルラ酸とデクルシノールとの混合物を使用した場合、有効な効果が示された(図７ａ及び図７ｂ)。これは、２つの物質間に相乗効果があることを示す。
【００４９】
実施例５：フェルラ酸の脳細胞保護作用の確認
(１)ベータアミロイド注射１日後のＯＸ-４２の免疫細胞化学染色
４-５週齢のマウス(体重２０-２５ｇ)を３つの群に分けてその中の一群にフェルラ酸を飲水に０.００６％(ｗ/ｖ)の濃度で混合して４週間投与した。他の２つの群のマウスには普通の水を４週間供給した。その後、参考例１の方法により、フェルラ酸を投与していない一群(対照群)のマウスにはベータアミロイド(４２-１)を、他の２つの群のマウスにはベータアミロイド(１-４２)を各々１.８５μgづつ脳室内へ投与した。
【００５０】
ベータアミロイドの投与１日後に、マウスをナトリウムペントタールで麻酔した後、麻酔したマウスの腹部を切除し、左側の心室内部へ４％のパラホルムアルデヒドを潅流して固定した後、脳を切り取った。
【００５１】
Cho等の方法(J. Comp. Neurol., 369: 264-276(1996))により切取られた脳から薄片を作製した後、ＯＸ-４２抗体(Halan(Sera-Lab))の１：５００稀釈液を用いて梨状皮質(pyriform cortex)と扁桃陽核(amygdaloid nucleus)でＯＸ-４２を免疫化学染色した。その後、薄片を直立顕微鏡下で２００倍と４００倍の倍率で観察した。
【００５２】
その結果は図８ａ乃至図８ｆに示されており、図８ａ乃至図８ｃは２００倍、図８ｃ乃至図８ｆは４００倍の倍率で各々観察したのである。同図から分かるように、ベータアミロイド(１-４２)のみを注射した群(図８ｂ及び図８ｅ)ではＯＸ-４２が対照群(図８ａ及び図８ｄ)に比べて格段に増加したが、フェルラ酸の投与後にベータアミロイド(１-４２)を注射した群(図８ｃ及び図８ｆ)では格段に減少した。
【００５３】
(２)ベータアミロイド投与５日後のChATの免疫細胞化学染色
マウスを前記(１)と同様に３つの群に分けてフェルラ酸及び/又はベータアミロイドを投与し、５日が経過した後にコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)に対する抗体(Chemicon社)の１：７５０稀釈液を使用することを除いては前記(１)の方法と同一に実施してアセチルコリン神経細胞が分布する中隔核(septal nucleus)でアセチルコリン合成酵素であるChATを免疫細胞化学染色法により染色した。
【００５４】
その結果、ベータアミロイド(１-４２)のみを投与した群(図９ｂ)ではChATが対照群(図９ａ)に比べて減少したが、フェルラ酸の投与後にベータアミロイド(１-４２)を注射した群(図９ｃ)では減少が抑制された。
【００５５】
実施例６：フェルラ酸の神経細胞損傷防止の効果
Wie等の方法(Neurosci. Lett., 225: 93-96(1997))により、マウスの大脳皮質細胞から神経膠細胞を培養した後、これを基質としてマウスの大脳神経細胞を培養した。
【００５６】
前記のように製造された神経細胞培養物を３つの群に分けた後、一群には何の処理をせず(対照群)、他の２つの群にはベータアミロイド(１-４２)を２５μMの濃度で処理し、この中の一群にはベータアミロイドを投与する３０分前にフェルラ酸を１００μMの濃度で処理した。
【００５７】
神経細胞の損傷の程度は、前記Wie等の方法により、損傷及び破壊された培養細胞から細胞外の培養液中に放出乳酸脱水素酵素(LDH)の濃度を測定することで確認した。ベータアミロイドの投与後の２４時間及び４８時間の時点で各々細胞培養液のサンプルを取ってマイクロプレートリーダ(microplate reader)でＬＤＨの濃度を測定した。
【００５８】
図１０に示すように、ベータアミロイド投与群は対照群に比べてＬＤＨの分泌が格段に増加したが、ベータアミロイドとフェルラ酸を投与した群ではＬＤＨの分泌が格段に減少した。この結果から、フェルラ酸がベータアミロイド(１-４２)による神経細胞の損傷を抑制することが確認できる。
【００５９】
実施例７：トウキ抽出物の経口毒性試験
４週齢のスプレーグドーリー(Sprague-Dawley)ラットの雌雄各２０匹を温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、照度１５０-３００ルクス(Lux)の動物室内で１週間飼育した後、雌雄各５匹づつを含む４つの群に分けた。
【００６０】
実施例１から得られた朝鮮トウキの抽出物をコーンオイルに溶解した後、４グループのラットに各々３００、１０００、３０００、及び１００００mg/kgの容量で１回経口投与した。投与後の７日間、一般症状の変化及び死亡動物の有無を観察した。また、投与の７日目にラットを致死させて解剖した後、内部の臓器を目視検査した。投与の当日から毎日体重の変化を測定して朝鮮トウキの抽出物による動物の体重減少現象を観察した。
【００６１】
その結果、朝鮮トウキ抽出物のＬＤ50値は雄の場合に３７２２mg/kg、雌の場合に２８０４mg/kgと示された。生存動物に対する剖検を実施したところ、１０００mg/kg以下の投与群では何の病変肉眼所見もなかった。体重の場合、１０００mg/kg以下の投与群では体重減少が起らなかった。
【００６２】
製剤例
実施例１から得られた朝鮮トウキの抽出物１００mg、牛乳カルシウム４５mg、微細結晶性セルロース１２２mg、イソフラボン１５mg、銀杏の葉の抽出物２.５mg、酸棗仁の抽出物２mg、ビタミンＢ1０.２５mg、ビタミンＢ2０.３mg、ビタミンＤ3０.００２５mg及びステアリン酸マグネシウム２.５mgを完全に混合し、硬質のゼラチンカプセルに充填して硬質のゼラチンカプセル剤を製造した。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は朝鮮トウキの抽出物の中で、デクルシノールとフェルラ酸の存在を確認したＨＰＬＣクロマトグラフィーである。
【図２】（ａ）は濃度を異ならせてトウキ抽出物を投与したマウスにおける受動回避反応の結果を示すグラフであり、（ｂ）は投与期間を異ならせてトウキ抽出物を投与したマウスにおける受動回避反応の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は濃度を異ならせてフェルラ酸を投与したマウスにおける受動回避反応の結果を示すグラフであり、（ｂ）は投与期間を異ならせてフェルラ酸を投与したマウスにおける受動回避反応の結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は投与期間を異ならせてフェルラ酸を投与したマウスを用いたＹ−迷路試験において、交叉行動量(％)及び通路通過の全回数を各々示すグラフである。
【図５】フェルラ酸又はイソフェルラ酸を投与したマウスにおける受動回避反応の結果を示すグラフである。
【図６Ａ】濃度を異ならせてデクルシノールを投与したマウスにおける受動回避反応の結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】濃度を異ならせてデクルシノールを投与したマウスにおけるＹ−迷路試験時における交叉行動量(％)を示すグラフである。
【図６Ｃ】濃度を異ならせてデクルシノールを投与したマウスにおける通路通過の全回数を示すグラフである。
【図７】（ａ）及び（ｂ）はフェルラ酸とデクルシノールを投与したマウスを用いた受動回避反応で観測されたフェルラ酸とデクルシノールの相乗効果を示すグラフである。
【図８】（ａ）〜（ｆ）はベータアミロイド(１-４２)注射１日後のマウスの梨状皮質と扁桃陽核でＯＸ-４２の免疫化学染色の結果を示すグラフである。
【図９】（ａ）〜（ｃ）はベータアミロイド(１-４２)注射５日後のマウスの中隔核でコリンアセチルトランスフェラーゼ(ＣｈＡＴ)の免疫化学染色の結果を示すグラフである。
【図１０】フェルラ酸の投与がベータアミロイド(１-４２)の投与による乳酸脱水素酵素(LDH)の濃度増加に与える影響を確認したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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