(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子薬物と、粒径が0.1〜50μmであるカチオン化されたゼラチン微粒子とからなる経肺投与用医薬品組成物。
【請求項２】
該カチオン化されたゼラチンがアミノ基またはアンモニウム基をゼラチンに導入することによって得られる請求項１記載の経肺投与用医薬品組成物。
【請求項３】
該高分子薬物が、分子量500〜200,000である高分子薬物からなる群から選ばれた請求項１または２に記載の経肺投与用医薬品組成物。
【請求項４】
該高分子薬物がバゾプレッシン類、黄体形成ホルモン放出ホルモン類、成長ホルモン放出因子ホルモン類、ソマトスタチン誘導体類、オキシトシン類、ヒルジン誘導体類、エンケファリン類、副腎皮質刺激ホルモン類、ブラジキニン類、カルシトニン類、インスリン類、グルカゴン類、成長ホルモン類、黄体形成ホルモン類、インスリン様成長因子類、カルシトニン遺伝子関連ペプチド類、心房性ナトリウム利尿ペプチド誘導体類、インターフェロン類、エリスロポエチン、顆粒球コロニー形成刺激因子、マクロファージ形成刺激因子、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アンギオテンシン類、ワクチン類、及び抗体からなる群から選ばれた１種以上の高分子薬物である請求項1〜３のいずれか一項に記載の経肺投与用医薬品組成物。
【請求項５】
該カチオン化されたゼラチン微粒子の80重量％以上の粒径が0.5〜10μmである請求項１〜４のいずれか一項に記載の経肺投与用医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は経肺投与用医薬品組成物に関する。詳しくは、肺上皮からの高分子薬物の吸収を増大させる経肺投与用医薬品組成物に関する。更に詳しくは、カチオン化されたゼラチン微粒子とともに高分子薬物を投与することにより、高分子薬物の経肺吸収が増大する経肺投与用医薬品組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺上皮は表面積が大きく粘膜下に豊富な血管系が発達しており、さらにタンパク等の分解酵素活性も比較的低いため、近年生理活性ペプチド類、蛋白質等の高分子薬物を全身血流へ移行させるルートとして検討されており、これら薬物の経肺投与は注射に代わる非侵襲的な投与方法として注目を集めている。高分子薬物の非侵襲的な投与方法としては、他に経鼻、経眼、経皮、経直腸投与などが知られているが、経肺投与はこれらのルートと比較してさらに高分子量の薬物の吸収に有利であり、造血系サイトカインなどの分子量10,000以上の蛋白質などの投与にも有望である。
【０００３】
高分子薬物の経肺投与製剤は、液剤の形態で気管支内視鏡を用いた気管支内注入法でも投与可能であるが、通常は、肺局所での作用を目的とした吸入ステロイド剤等と同様に、吸入剤の形態をとりなんらかの吸入器によって肺胞に送達される。吸入剤の剤型として、吸入液剤、フロンまたは代替フロン製剤、粉末吸入剤の３つがある。吸入液剤は通常薬物の水溶液であり、ネブライザーにより霧化されて微少の液滴となって患者の自発呼吸下で吸入され、気道内に液滴の形で沈着する。フロンまたは代替フロン製剤は、フロンまたは代替フロンに加圧下で薬物が分散または溶解された製剤であり、加圧式定量噴霧吸入器（Metered Dose Inhaler; MDI)と呼ばれる加圧容器に充填されて用いられる。投与時は、加圧下のMDIから開放されるとフロンまたは代替フロンが気化し、溶解・分散していた薬物が通常薬物の微粒子粉末となって気道内に沈着する。また、粉末吸入剤は薬物を主とする微粒子粉末を例えば粉末状組成物として賦形剤などとともにブリスター等の容器に充填し、通常患者自身の吸気により適当な投与器から該容器内の微粒子粉末が粉末エアロゾル化されて吸入され、薬物粉末として肺内に沈着する。これらの吸入剤をそれぞれの吸入器を用いて実際に投与した場合、通常は製剤中薬物の10〜30重量％、工夫された吸入器でも50重量％程度しか気道内に沈着しない。通常気道内沈着分の薬物のみ吸収することから、治療上必要な血液中濃度を実現するためには製剤中の薬物量を増量する必要があり、このため特に高分子薬物の場合にはコスト面で問題が大きい。
【０００４】
経肺投与製剤で薬物の吸収を促進するための工夫はあまりなされていない。その理由には肺粘膜の透過性の高さと肺上皮の面積が大きいために、吸収促進の工夫なく高分子薬物が吸収できると考えられてきたことにある。その一方、山本ら（Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol.46, 14-18, 1994)は、いくつかの吸収促進剤や酵素阻害剤の共投与によりインスリンの肺からの吸収が向上したと報告している。しかし、同報告で用いている吸収促進剤や酵素阻害剤は、粘膜への障害性やコスト等の面で実用化には課題が多い。
【０００５】
Illumら（WO89/03207号明細書; 特表平3-503160号公報）は、スターチ、ゼラチン、アルブミンなどのマイクロスフェアとペプチド薬物からなる薬物送達組成物により、薬物の粘膜吸収を促進する高吸収性経粘膜用製剤を提供している。さらに同公報中には、生体接着性を有する、もしくは生体接着性高分子をコーティングしたマイクロスフェアで、何らかの手段で放出制御の工夫をすれば、高分子薬物のバイオアベイラビリティを増加させる旨記載されている。しかし、同公報等では、マイクロスフェアへのコーティング以外の生体接着性付与の方法や放出制御の具体的な方法についてはなんら記載されていない。
【０００６】
特公平3-17014号公報に記載されているように、ポリ乳酸のような合成生分解性高分子マイクロスフェアの生分解に基づく放出制御によって薬効持続化を図る技術が公知であるが、この方法ではマイクロスフェア自体の下気道粘膜への付着が考慮されていないために喉咽頭部へのクリアランスを防ぐことはできず、また高分子薬物の吸収性に与える影響については何ら具体的な記載はない。WO96/09814号明細書には、噴霧乾燥によりアルブミンをはじめとした水溶性材料の1〜10μmのマイクロパーティクルについて記載されているが、特公平3-17014号公報と同様にマイクロパーティクル自体の粘液線毛輸送によるクリアランスについては考慮されていない。WO93/25198号明細書では、生体接着性を有するヒドロキシプロピルセルロースもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースのマイクロスフェアにより薬効持続化を図る技術について記載されている。安全性の上から吸入用基剤としてより好ましい形態は下気道中で分解し、吸収しうる材料であるが、同明細書ではこの点については考慮されていない。さらにWO96/31198号明細書において、天然多糖ガムの吸入用組成物により、生体付着性かつ生分解性の多糖によるマイクロスフェアによる薬効持続化についての技術が開示されているが、下気道中での分解および吸収（生体吸収性）が疑われる材料が含まれること、およびその至適使用量が多いという安全面での問題点を有し、また高分子薬物の吸収性に与える影響については何ら具体的な記載はない。
【０００７】
しかるに吸収性の向上した経肺投与用医薬品組成物は機能の点からは生体接着性を有することが望ましいが、安全性の観点からは蓄積性が許容される範囲である必要がある。そこで生体接着性の微粒子（マイクロスフェア）により薬物の吸収向上を図る時、該微粒子構成材料に生体吸収性がない場合にはその分子量などの調節により低粘度化して蓄積されないように設計することが検討されている。一方、生体吸収性がある場合には蓄積されても生分解され吸収されるためその安全性はより高いと考えられ、生体吸収性生体接着性材料よりなる経肺投与用医薬品組成物が望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかして本発明の目的は、生分解性を有するカチオン化ゼラチンと高分子薬物からなる組成物の投与により、高分子薬物の経肺吸収を増大させる経肺投与用医薬品組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決するべく鋭意研究した結果、カチオン化ゼラチン微粒子（マイクロスフェア）と高分子薬物の組成物、好ましくは微粒子中に高分子薬物を封入した組成物において、該高分子薬物の経肺吸収が向上することを見出し本発明に到達したものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、高分子薬物と、カチオン化されたゼラチン微粒子とからなる経肺投与用医薬品組成物を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の薬物は高分子薬物であればいずれでもよいが、循環血中に入って作用する分子量500〜200,000である高分子薬物としては、たとえばバゾプレッシン類、黄体形成ホルモン放出ホルモン類、成長ホルモン放出因子ホルモン類、ソマトスタチン誘導体類、オキシトシン類、ヒルジン誘導体類、エンケファリン類、副腎皮質刺激ホルモン類、ブラジキニン類、カルシトニン類、インスリン類、グルカゴン類、成長ホルモン類、黄体形成ホルモン類、インスリン様成長因子類、カルシトニン遺伝子関連ペプチド類、心房性ナトリウム利尿ペプチド誘導体類、インターフェロン類、エリスロポエチン、顆粒球コロニー形成刺激因子、マクロファージ形成刺激因子、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アンギオテンシン類、ワクチン類、抗体などが挙げられる。
【００１２】
本発明の医薬品組成物の成分のうちカチオン化ゼラチン微粒子は、カチオン化の工程と微粒子生成工程を経て製造される。
【００１３】
カチオン化の工程は、生理条件下でカチオン化する官能基（カチオン性官能基）を導入する方法であればいずれでも良いが、温和な条件下でカルボキシル基等をカチオン化できることからアミノ基またはアンモニウム基を導入する方法が好ましい。例えばエチレンジアミン、N,N-ジメチル-1,3-ジアミノプロパンなどのなどのアルキルジアミンや、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジン、またはジエチルアミド塩化物などを反応させる方法がある。中でもエチレンジアミンを反応させる方法が簡便かつ汎用性があり好適である。またカチオン化反応は通常は微粒子生成工程の前に実施するが、微粒子生成工程後に実施してもよい。
【００１４】
カチオン化ゼラチンの微粒子生成工程は、例えば、油中でW/Oエマルジョン調製の後、水中に滴下して架橋させる方法(W/O形成法）がある。架橋させる方法として、カルボジイミド類やジエポキシ類を反応させる方法、加熱させる方法、紫外線等を照射する方法がある。また、微粒子が生成する限りは架橋反応はなくてもよく、ポリエチレングリコールなどを用いたコアセルベーション法、噴霧乾燥法、噴霧冷却法、超臨界流体沈殿法などの方法も適用できる。これらの中でも球形微粒子が簡便に得られる点でW/O形成法が好適である。W/O形成法による製造例を以下に示す。なお特に記載したもの以外は、試薬は和光純薬工業株式会社製のものを用いた。
【００１５】
製造例
カチオン化ゼラチンの製造
等電点9.0のゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）1.0ｇを50mLの0.1Mリン酸緩衝水溶液（pH5.0）に溶解させた。その溶液中へ280mgのエチレンジアミンを添加、さらに5.4gの1-エチル-3-(3ージメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を添加した。この混合溶液を12時間攪拌した後、水に対して2日間透析し、凍結乾燥して1.2gのカチオン化ゼラチン粉末を得た。
カチオン化ゼラチン微粒子の製造
得られたカチオン化ゼラチン粉末を100mg/mLとなるよう0.2mLの精製水に溶解させ、40℃に加温した状態で5mLのオリーブオイル中に添加、振動攪拌してW/Oエマルジョンを得た。得られたW/Oエマルジョンをプローブ型スーパーソニケーターにて超音波照射（7mm径、40μA、2分間）。その後直ちに氷冷してゼラチンをゲル化し、アセトンを加え1時間攪拌した。生成したゼラチン粒子を遠心処理して回収しアセトンで洗浄、10重量%となるよう、37.5μg/mLのグルタルアルデヒド水溶液中に分散し、4℃、40時間架橋反応させた。反応後グリシンで処理し、精製水で洗浄、その後の遠心処理により、平均粒子径3.0μm（90重量％が0.5〜10μm）の架橋カチオン化ゼラチン微粒子を回収した。
【００１６】
本発明で「カチオン化」とは、通常得られるゼラチン（等電点５または９）に、生理的条件下（この場合肺表面相当のpH6.8付近）でカチオン化するカチオン性官能基が化学反応で導入されることをいう。カチオン性官能基の導入によって、生体接着性が付与されること、さらに生体接着性だけでは説明できない吸収促進効果も発明者によって知見された（実施例参照）。本発明組成物は経肺投与用であるが、肺上皮と比較的同様の組織である鼻粘膜上皮でも同様の吸収促進作用を有すると考えられる。カチオン化の比率は高分子薬物の吸収性を向上させるためには高いほうが良く、カルボキシル基と反応させる場合、ゼラチンの全カルボキシル基のうちカチオン基を導入する比率は、少なくとも30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上である。
【００１７】
本発明におけるカチオン化ゼラチン微粒子の粒子径は0.1〜50μmであることが好ましく、80重量％が0.5〜10μmであると、高分子薬物の肺への沈着向上及び薬物の吸収向上の点からさらに好ましい。
【００１８】
本発明における高分子薬物は、カチオン化ゼラチン微粒子に封入されていても封入されなくてもよいが、通常は封入された状態で組成物が製造される。高分子薬物のカチオン化ゼラチンへの封入は、例えば、カチオン化ゼラチンを高分子薬物溶液中に膨潤させることで達成できる。
【００１９】
本発明において、高分子薬物とカチオン化ゼラチンの組成は必要な吸収量に応じていかようにも設定できるが、通常は、高分子薬物とカチオン化ゼラチンが重量比で0.1:99.9〜1.0:99.0であることが好ましい。
【００２０】
本発明の経肺投与組成物は賦形剤などとともに粉末状もしくは水等への分散液状の医薬品組成物に製造される。
【００２１】
本発明に用いられる賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、マンニトール、果糖、蔗糖、アラビノース、キシリトール、デキストロース、麦芽糖およびトレハロースおよびこれらの1水和物や、デキストラン、デキストリン等多糖類が挙げられる。この中でも乳糖が好ましい。
【００２２】
本発明の医薬品組成物に用いられる賦形剤以外の添加物としては例えば塩化ベンザルコニウムのような防腐剤やdl-メントール、l-メントールなどの矯味剤、芳香剤などが挙げられる。このような成分は、ごく微量、例えば組成物の10重量%未満で存在するのが好ましく、さらに5重量%未満で存在するのが好ましい。
【００２３】
【発明の効果】
かくして本発明により、生体内吸収性組成物が臨床の場に使用されることは高分子薬物を肺から血中へ効率的に吸収させることによる全身療法上その意義は高い。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は本発明を詳細に説明するために示すのであって、本発明を限定するものではない。
【００２５】
［実施例１］
サケカルシトニン経肺吸収におけるカチオン化ゼラチン微粒子の効果
本実施例は高分子薬物経肺吸収におけるカチオン化ゼラチン微粒子共投与の効果を、ラット気管支内投与後の薬効を指標に、微粒子非存在下、およびカチオン化していないゼラチン微粒子の共投与の場合と比較したものである。以下の3組成物について検討した。
なおサケカルシトニンはBachem AG製を用いた。
（１）サケカルシトニン溶液（対照組成物１）
（２）サケカルシトニン/ゼラチン微粒子分散液（対照組成物２）
（３）サケカルシトニン/カチオン化ゼラチン微粒子分散液（本発明組成物１）
＜対照組成物１＞はpH7.0等張リン酸緩衝液にサケカルシトニン溶解させて調製した。＜対照組成物２＞のゼラチン微粒子は等電点9のゼラチンを用いて、製造例中の「カチオン化微粒子の製造」と同じ工程で製造した（平均粒子径3.4μm）。＜本発明組成物１＞は製造例に示す工程で製造した（平均粒子径3.0μm)。
＜対照組成物２＞＜本発明組成物１＞ともpH7.0等張リン酸緩衝溶液で225単位/mLに調製したサケカルシトニン溶液0.1mL中に微粒子10.5mgを加え、0℃、3時間で膨潤させサケカルシトニンを微粒子に封入した。いずれも以下に示す投与量となるようpH7.0等張リン酸緩衝溶液で希釈するなどして調製した。
【００２６】
３組成物の経肺吸収評価は8週齢SDラット（各組成物につき8匹）を用いて実施した。投与はSchankerの方法として知られている気管支注入法にて実施し、どの組成物も3単位/0.2mL/kgラット体重となるように調製してペントバルビタール麻酔下に投与した。大腿静脈にカニュレーションを施し、投与前、投与後６時間まで経時的に採血し、血中のカルシウム濃度をオルトクレゾールフタレインコンプレキソン法（カルシウム  Ｃ−テストワコー：和光純薬工業(株)を使用）にて血中カルシウム濃度を測定した。血中カルシウムの減少率の経時変化を図１に示す。またサケカルシトニンのpH7.0等張リン酸緩衝溶液を0.5単位/kgラット体重を静脈注射にて投与したときの血中カルシウム濃度の経時変化を同様に測定し、各組成物の薬理学的利用率として求めた値を表１に示す。表１より（１）＜（２）＜（３）であり、本発明組成物がサケカルシトニンの経肺吸収を向上させている。
【００２７】
【表１】
0004387018.tif 000002
【００２８】
［実施例２］
サケカルシトニン経肺吸収におけるカチオン化ゼラチン微粒子の粒度の違いの効果
本実施例はカチオン化ゼラチン微粒子による高分子薬物の経肺吸収向上の効果発現のためには至適な粒子径が存在することを示したものである。
以下の４組成物を検討した。
（１）サケカルシトニン溶液（対照組成物１）
（２）サケカルシトニン/カチオン化ゼラチン微粒子分散液：平均粒子径3.0μm（本発明組成物１）
（３）サケカルシトニン/カチオン化ゼラチン微粒子分散液：平均粒子径53.1μm（本発明組成物２）
（４）サケカルシトニン/カチオン化ゼラチン微粒子分散液：平均粒子径102.1μm（対照組成物3）
＜対照組成物１＞および＜本発明組成物１＞は実施例１と同じである。＜本発明製剤２＞および＜対照製剤３＞は、以下のようにして製造した。
【００２９】
カチオン化ゼラチンを5mLのオリーブオイル中に添加、振動攪拌してW/Oエマルジョンを得た後、直ちに氷冷してゼラチンをゲル化し、アセトンを加え1時間攪拌した。生成したゼラチン粒子を遠心処理して回収しアセトンで洗浄、再度イソプロパノールに分散させ、適度な開口のふるいで粒子径をそろえた。その後10重量%となるよう、37.5μg/mLのグルタルアルデヒド水溶液中に分散し、4℃、40時間架橋反応させた。反応後グリシンで処理し、精製水で洗浄、その後の遠心処理によりを回収し、平均粒子径53.1および102.1μmの架橋カチオン化ゼラチン微粒子を得た。
【００３０】
各組成物は実施例と同様にサケカルシトニン封入し、ラットへ気管支内注入にて投与、血中カルシウム濃度を測定した。血中カルシウムの減少率の経時変化を図2に示す。また静脈注射時に対する薬理学的利用率を表2に示す。表２の結果より（１）≒（４）＜（３）＜（２）であり、カチオン化ゼラチン微粒子が100μm以下、特に10μm以下のときに吸収が向上している。
これは微粒子の粒子径減少に伴う表面積の増加により、サケカルシトニンの放出性が上がったためと考えられる。
【００３１】
【表２】
0004387018.tif 000003
【００３２】
［実施例３］
肺上皮細胞単層膜における高分子薬物透過におけるカチオン化ゼラチン微粒子の効果
本実施例はカチオン化ゼラチン微粒子が生体接着性以外の性質による高分子薬物吸収促進効果をもつことを示している。以下３製剤について評価した。
（１）サケカルシトニン溶液（対照組成物１）
（２）サケカルシトニン/ゼラチン微粒子分散液（対照組成物２）
（３）サケカルシトニン/カチオン化ゼラチン微粒子分散液（本発明組成物１）
いずれも実施例1と同じ組成物である。
【００３３】
肺II型上皮細胞株A-549（ATCCより購入）を5%ウシ胎児血清（Gibco Laboratories社）および各種抗生物質を含むDulbecco's Modified Eagles Medium（Sigma Chemical社）を用い、37℃-5%CO2インキュベーター内で単層培養した。上記３組成物はTranswellTM（Costar社）を用い、単層細胞の表面側に各組成物中のサケカルシトニンが5マイクロモル/Lとなる分だけ添加し、基底膜側に透過してきた120分後のサケカルシトニン量を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。各組成物での120分後の添加量に対するA-549細胞単層膜の透過量の割合を表3に示す。表３より（３）＞（２）＞（１）。肺上皮細胞単層膜上に生体接着性に関与する粘液層存在しないことから、本実施例では微粒子による耐酵素分解性およびその他の吸収促進作用が評価されており、本発明組成物が生体接着性以外の何らかの吸収促進作用を有していると考えられる。
【００３４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各組成物気管支内注入後の血中カルシウムレベルの経時変化。縦軸は血中カルシウムレベルを投与時を100として表示。横軸は各組成物投与後の時間。
【図２】粒子径の異なる各組成物を気管支内注入後の血中カルシウムレベルの経時変化。縦軸は血中カルシウムレベルを投与時を100として表示。横軸は各組成物投与後の時間。
【図１】
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【図２】
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