(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）−（３５）に示される、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に用いられるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むヒトチトクロムＰ４５０分子種の検出および定量用キット：
（１）プライマー対；ＣＹＰ１Ａ１遺伝子の５８９−６１０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび６８５−６６４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；６１６−６４１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（２）プライマー対；ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の８６０−８８０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチドおよび９５１−９３１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチド、プローブ；８８４−９０９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（３）プライマー対；ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の１１５５−１１７４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２０のオリゴヌクレオチドおよび１２２８−１２０７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；１１７６−１２０３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（４）プライマー対；ＣＹＰ２Ａ６／７遺伝子の１７３−１９３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチドおよび２５４−２３６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数１９のオリゴヌクレオチド、プローブ；１９５−２１８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチド、
（５）プライマー対；ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の２０−４８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数１９のオリゴヌクレオチドおよび１７１−１４６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、プローブ；４０−６９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３０のオリゴヌクレオチド、
（６）プライマー対；ＣＹＰ２Ａ７遺伝子の８６１−８８４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチドおよび１０００−９７８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；８８９−９１３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２５のオリゴヌクレオチド、
（７）プライマー対；ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子の５１３−５３１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数１９のオリゴヌクレオチドおよび５８７−５６４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチド、プローブ；５３３−５６０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（８）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の３５２−３７２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチドおよび４２５−４０７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数１９のオリゴヌクレオチド、プローブ；３７５−４００領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（９）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の６５９−６８２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチドおよび９３７−９１５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；９１３−８８８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（１０）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ１８遺伝子の１３９４−１４１４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチドおよび１４７３−１４５１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；１４２０−１４４４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２５のオリゴヌクレオチド、
（１１）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の８５８−８８０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチドおよび９４３−９２１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；９１３−８８７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２７のオリゴヌクレオチド、
（１２）プライマー対；ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の７２０−７４０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチドおよび９１２−８９１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；７４８−７７５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（１３）プライマー対；ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の１０７０−１０８８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数１９のオリゴヌクレオチドおよび１１４６−１１２３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチド、プローブ；１０９６−１１１７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、
（１４）プライマー対；ＣＹＰ２Ｆ１遺伝子の５８５−６０６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび７４４−７２３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；６０８−６３５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（１５）プライマー対；ＣＹＰ２Ｊ２遺伝子の４６０−４８２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチドおよび５９２−５７１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；４８５−５０８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチド、
（１６）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ３／４遺伝子の８５０−８７２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチドおよび１０１４−９９３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；８７６−９０５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３０のオリゴヌクレオチド、
（１７）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の８２５−８５４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３０のオリゴヌクレオチドおよび９７３−９４８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、プローブ；９４６−９１８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２９のオリゴヌクレオチド、
（１８）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の６８４−７０５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび８８１−８５９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；８５０−８２２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２９のオリゴヌクレオチド、
（１９）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ７遺伝子の６８４−７０５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび８８１−８５９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；８５０−８１９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３２のオリゴヌクレオチド、
（２０）プライマー対；ＣＹＰ４Ａ１１遺伝子の６４０−６６３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチドおよび８０５−７８４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；６６６−６９１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（２１）プライマー対；ＣＹＰ４Ｂ１遺伝子の９７４−９９５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび１０８１−１０６１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチド、プローブ；９９７−１０２４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（２２）プライマー対；ＣＹＰ４Ｆ２遺伝子の１０９２−１１１３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび１２７６−１２５６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチド、プローブ；１１８２−１２０５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチド、
（２３）プライマー対；ＣＹＰ４Ｆ３遺伝子の１０７３−１０９４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび１２６７−１２４６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；１１８８−１２１２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２５のオリゴヌクレオチド、
（２４）プライマー対；ＣＹＰ４Ｆ８遺伝子の１２７８−１２９９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび１３９０−１３７１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２０のオリゴヌクレオチド、プローブ；１３４１−１３７０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３０のオリゴヌクレオチド、
（２５）プライマー対；ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子の１１５８−１１７９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび１４１５−１３９６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２０のオリゴヌクレオチド、プローブ；１２０９−１２３４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（２６）プライマー対；ＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子の１１６７−１１８９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチドおよび１４２９−１４０７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；１２０９−１２３９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３１のオリゴヌクレオチド、
（２７）プライマー対；ＣＹＰ１７遺伝子の１２００−１２２１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび１２９４−１２７２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチド、プローブ；１２３０−１２５５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（２８）プライマー対；ＣＹＰ１９遺伝子の４１４−４３５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび４８７−４６７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチド、プローブ；４３７−４６５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２９のオリゴヌクレオチド、
（２９）プライマー対；ＣＹＰ２７遺伝子の１７１−１９３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチドおよび２９２−２７１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；１９７−２２４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（３０）プライマー対；ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の７６６−７８３領域に特異的にハイブリダイズする塩基数１８のオリゴヌクレオチドおよび９６１−９４１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチド、プローブ；７８５−８１２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（３１）プライマー対；ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子の１１４６−１１６８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２３のオリゴヌクレオチドおよび１２２８−１２０７領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；１１７５−１２０２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（３２）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の７８３−８０４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび９２６−９０５領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；８６３−８９４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３２のオリゴヌクレオチド、
（３３）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の７６６−７８９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２４のオリゴヌクレオチドおよび９１０−８９１領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２０のオリゴヌクレオチド、プローブ；８６３−８９０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２８のオリゴヌクレオチド、
（３４）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の７４８−７６９領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび９４３−９２２領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチド、プローブ；８６３−８９４領域に特異的にハイブリダイズする塩基数３２のオリゴヌクレオチド、
（３５）プライマー対；ＣＹＰ４Ａ１１遺伝子の２０９−２３０領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２２のオリゴヌクレオチドおよび２８８−２６８領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２１のオリゴヌクレオチド、プローブ；２４１−２６６領域に特異的にハイブリダイズする塩基数２６のオリゴヌクレオチド、
（但し、上記オリゴヌクレオチドは、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温後、１サイクル９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の条件でＲＴ−ＰＣＲした時に、上記ハイブリダイズするものである。）。
【請求項２】
下記（１）−（３５）から選ばれるプライマー対とプローブとのセットの少なくとも１つを含む請求項１に記載のキット：
（１）配列番号３６および３７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１に示される配列からなるプローブとのセット
（２）配列番号３８および３９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２に示される配列からなるプローブとのセット
（３）配列番号４０および４１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３に示される配列からなるプローブとのセット
（４）配列番号４２および４３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号４に示される配列からなるプローブとのセット
（５）配列番号４４および４５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号５に示される配列からなるプローブとのセット
（６）配列番号４６および４７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号６に示される配列からなるプローブとのセット
（７）配列番号４８および４９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号７に示される配列からなるプローブとのセット
（８）配列番号５０および５１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号８に示される配列からなるプローブとのセット
（９）配列番号５２および５３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号９に示される配列からなるプローブとのセット
（１０）配列番号５４および５５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１０に示される配列からなるプローブとのセット
（１１）配列番号５６および５７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１１に示される配列からなるプローブとのセット
（１２）配列番号５８および５９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１２に示される配列からなるプローブとのセット
（１３）配列番号６０および６１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１３に示される配列からなるプローブとのセット
（１４）配列番号６２および６３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１４に示される配列からなるプローブとのセット
（１５）配列番号６４および６５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１５に示される配列からなるプローブとのセット
（１６）配列番号６６および６７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１６に示される配列からなるプローブとのセット
（１７）配列番号６８および６９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１７に示される配列からなるプローブとのセット
（１８）配列番号７０および７１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１８に示される配列からなるプローブとのセット
（１９）配列番号７２および７３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号１９に示される配列からなるプローブとのセット
（２０）配列番号７４および７５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２０に示される配列からなるプローブとのセット
（２１）配列番号７６および７７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２１に示される配列からなるプローブとのセット
（２２）配列番号７８および７９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２２に示される配列からなるプローブとのセット
（２３）配列番号８０および８１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２３に示される配列からなるプローブとのセット
（２４）配列番号８２および８３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２４に示される配列からなるプローブとのセット
（２５）配列番号８４および８５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２５に示される配列からなるプローブとのセット
（２６）配列番号８６および８７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２６に示される配列からなるプローブとのセット
（２７）配列番号８８および８９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２７に示される配列からなるプローブとのセット
（２８）配列番号９０および９１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２８に示される配列からなるプローブとのセット
（２９）配列番号９２および９３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号２９に示される配列からなるプローブとのセット
（３０）配列番号９４および９５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３０に示される配列からなるプローブとのセット
（３１）配列番号９６および９７に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３１に示される配列からなるプローブとのセット
（３２）配列番号９８および９９に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３２に示される配列からなるプローブとのセット
（３３）配列番号１００および１０１に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３３に示される配列からなるプローブとのセット
（３４）配列番号１０２および１０３に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３４に示される配列からなるプローブとのセット
（３５）配列番号１０４および１０５に示される配列からなるプライマー対と、配列番号３５に示される配列からなるプローブとのセット。
【請求項３】
プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
（１）−（３５）に示されるセットが、それぞれ以下のＰ４５０分子種の検出および定量用である請求項１乃至３のいずれかに記載のキット：
（１）のセット；ＣＹＰ１Ａ１
（２）のセット；ＣＹＰ１Ａ２
（３）および（３０）のセット；ＣＹＰ１Ｂ１
（４）のセット；ＣＹＰ２Ａ６／７
（５）のセット；ＣＹＰ２Ａ６
（６）のセット；ＣＹＰ２Ａ７
（７）および（３１）のセット；ＣＹＰ２Ｂ６
（８）および（３２）のセット；ＣＹＰ２Ｃ８
（９）および（３３）のセット；ＣＹＰ２Ｃ９
（１０）のセット；ＣＹＰ２Ｃ１８
（１１）および（３４）のセット；ＣＹＰ２Ｃ１９
（１２）のセット；ＣＹＰ２Ｄ６
（１３）のセット；ＣＹＰ２Ｅ１
（１４）のセット；ＣＹＰ２Ｆ１
（１５）のセット；ＣＹＰ２Ｊ２
（１６）のセット；ＣＹＰ３Ａ３／４
（１７）のセット；ＣＹＰ３Ａ４
（１８）のセット；ＣＹＰ３Ａ５
（１９）のセット；ＣＹＰ３Ａ７
（２０）および（３５）のセット；ＣＹＰ４Ａ１１
（２１）のセット；ＣＹＰ４Ｂ１
（２２）のセット；ＣＹＰ４Ｆ２
（２３）のセット；ＣＹＰ４Ｆ３
（２４）のセット；ＣＹＰ４Ｆ８
（２５）のセット；ＣＹＰ１１Ｂ１
（２６）のセット；ＣＹＰ１１Ｂ２
（２７）のセット；ＣＹＰ１７
（２８）のセット；ＣＹＰ１９
（２９）のセット；ＣＹＰ２７。
【請求項５】
（ａ）ヒトチトクロムＰ４５０遺伝子を含む検体を調製する工程、
（ｂ）上記検体について、請求項１〜４のいずれかに記載の（１）〜（３５）に示されるプライマー対とプローブとのセットの少なくとも１つを含むキットを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を行って検体中のヒトチトクロムＰ４５０分子種をコードする遺伝子を増幅させる工程、および
（ｃ）上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応の間に加水分解されるプローブを検出および測定する工程
を含むことを特徴とするヒトチトクロムＰ４５０分子種の検出および定量方法。
【請求項６】
加水分解されるプローブの検出および測定が、励起光照射による蛍光の発色程度の検出および測定によりなされる請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明は、ヒトＰ４５０の各分子種を検出および定量する方法およびそのために利用できるプローブおよびキットに関する。
背  景  技  術
チトクロムＰ４５０は、医薬品有効成分化合物などの化学物質の代謝に関与する酵素のひとつである。該チトクロムＰ４５０には、多数の分子種が存在することが知られている。現在、ヒトでは約３０種の分子種が確認されている。これらの各分子種は、その酵素活性に個体差はあるものの、分子種毎にそれぞれ、種々の医薬品有効成分化合物（例えば、三環系抗うつ剤、抗てんかん剤、ベンゾジアゼピン系製剤、β−遮断剤、バルビタール系就眠制催眠剤などの医薬品の有効成分化合物、ジメチルニトロソアミンなど）、ベンゼンなどの有機溶剤、環境中の低分子発癌性物質などの代謝に関与することが報告されている（例えばＹｏｏ，Ｊ．Ｓ．Ｈ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．，Ｃ．，Ｗａｄｅ，Ｄ．，＆  Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｓ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７，３３７８−３３８３など参照）。
新薬を開発する上で、該新薬を投与した際におけるヒトチトクロムＰ４５０（以下、本明細書において単に「Ｐ４５０」という）の各分子種の動き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、Ｐ４５０の各分子種の発現量の変動が判らないと、該新薬と併用され得る併用薬剤、その他の摂取物による新薬の効力、副作用などの増減及び該併用薬剤自体の効力、副作用などの増減が予測できず、新薬の安全性を確認することができないからである。
従って、新薬開発などの医薬品分野においては、Ｐ４５０の各分子種に関する情報、殊にこれら各分子種に関する情報を得るために各分子種を区別して測定する技術が、要望されている。このような各分子種を区別して測定する技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用、新薬の特殊病態時における生体への影響などが容易に把握でき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られている。その内でも、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲなどは、微量のｍＲＮＡの検出、定量に利用され、その威力を発揮している。
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６（１０），９８６（１９９６），ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。この方法は、特定の蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｖｅ）を用いて核酸を測定する方法である。この方法はより詳しくは、以下の原理を利用している。即ち、例えば５’末端にリポーター色素および３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブを、ターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行わせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。この蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量および検出できる。
この方法によれば、従来のＰＣＲを利用した検出、定量法のように、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析するなどの複雑な工程は不要となり、短時間で多種のサンプルを同時に検査できる利点がある。
一般に、臨床検査センターなどで臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について限られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率良く行い得る手法の開発が要望されている。上記リアルタイム定量検出法は、この要望に合致するものとして期待できる。
本発明者らは、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法に着目し、これがヒトＰ４５０の各分子種の検出に利用できれば、同じ装置を用いて同一のＰＣＲ条件で各分子種を区別して検出および定量できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
しかるに、現在知られている化学物質の代謝に関与するＰ４５０の分子種は、前述したとおり約３０種にも及び、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部分を有さず、しかも同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、各ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得るプライマー対としてのオリゴヌクレオチドを検索すること自体困難であると考えられた。また、このようなプライマー対に挟まれた特定領域内に、同一ＰＣＲ条件下でこれらのプライマーよりも早くターゲット遺伝子とハイブリダイズし得、しかも唯一の分子種に対してのみ特異的であるプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるが、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せは必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られている全てのＰ４５０分子種について、これらの遺伝子を区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験などが必要であると予想された。
発  明  の  開  示
本発明の目的は、Ｐ４５０の各分子種をコードする遺伝子をＰＣＲにより測定する方法、特にリアルタイム定量、検出法を利用して測定する方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、上記方法に利用できるプローブおよびプライマー対を提供することにある。
本発明者は、上記目的を達成するために、Ｐ４５０の各分子種について更に多大な実験、研究を繰返し行った。その結果、Ｐ４５０の特定の２９の分子種遺伝子に対して特異的なプライマー対およびプローブのセット、即ちこれら各分子種をコードする遺伝子を区別して検出、測定することができる各プライマー対とプローブとのセットを見出すに成功した。本発明はこの知見を基礎として完成されたものである。
本発明は、Ｐ４５０分子種の検出および定量に用いられるプローブであって、下記（１）−（２９）に示す各遺伝子の所定領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプローブを提供する。
（１）ＣＹＰ１Ａ１遺伝子の６１６−６４１の領域
（２）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の８８４−９０９の領域
（３）ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の１１７６−１２０３の領域または７８５−８１２領域
（４）ＣＹＰ２Ａ６／７遺伝子の１９５−２１８の領域
（５）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の４０−６９の領域
（６）ＣＹＰ２Ａ７遺伝子の８８９−９１３の領域
（７）ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子の５３３−５６０の領域または１１７５−１２０２領域
（８）ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の３７５−４００の領域または８６３−８９４領域
（９）ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の９１３−８８８の領域または８６３−８９０領域
（１０）ＣＹＰ２Ｃ１８遺伝子の１４２０−１４４４の領域
（１１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の９１３−８８７の領域または８６３−８９４領域
（１２）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の７４８−７７５の領域
（１３）ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の１０９６−１１１７の領域
（１４）ＣＹＰ２Ｆ１遺伝子の６０８−６３５の領域
（１５）ＣＹＰ２Ｊ２遺伝子の４８５−５０８の領域
（１６）ＣＹＰ３Ａ３／４遺伝子の８７６−９０５の領域
（１７）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の９４６−９１８の領域
（１８）ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の８５０−８２２の領域
（１９）ＣＹＰ３Ａ７遺伝子の８５０−８１９の領域
（２０）ＣＹＰ４Ａ１１遺伝子の６６６−６９１の領域または２４１−２６６領域
（２１）ＣＹＰ４Ｂ１遺伝子の９９７−１０２４の領域。
（２２）ＣＹＰ４Ｆ２遺伝子の１１８２−１２０５の領域
（２３）ＣＹＰ４Ｆ３遺伝子の１１８８−１２１２の領域
（２４）ＣＹＰ４Ｆ８遺伝子の１３４１−１３７０の領域
（２５）ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子の１２０９−１２３４の領域
（２６）ＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子の１２０９−１２３９の領域
（２７）ＣＹＰ１７遺伝子の１２３０−１２５５の領域
（２８）ＣＹＰ１９遺伝子の４３７−４６５の領域
（２９）ＣＹＰ２７遺伝子の１９７−２２４の領域
本発明は、特に、オリゴヌクレオチドが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである前記プローブ；オリゴヌクレオチドが２０−４０の範囲の塩基長を有するものである前記プローブ；オリゴヌクレオチドが配列番号１−配列番号３５に示される配列のいずれかを含むものである前記プローブ；並びにオリゴヌクレオチドが配列番号１−配列番号３５に示される配列のいずれかからなるものである前記プローブを提供する。
また、本発明は、フォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むＰ４５０の分子種の検出および定量用キットであって、上記プライマー対およびプローブが下記（１）−（３５）に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキットを提供する。
（１）プライマー対；ＣＹＰ１Ａ１遺伝子の５８９−６１０領域および６８５−６６４領域、プローブ；６１６−６４１領域
（２）プライマー対；ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の８６０−８８０領域および９５１−９３１領域、プローブ；８８４−９０９領域
（３）プライマー対；ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の１１５５−１１７４領域および１２２８−１２０７領域、プローブ；１１７６−１２０３領域
（４）プライマー対；ＣＹＰ２Ａ６／７遺伝子の１７３−１９３領域および２５４−２３６領域、プローブ；１９５−２１８領域
（５）プライマー対；ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の２０−４８領域および１７１−１４６領域、プローブ；４０−６９領域
（６）プライマー対；ＣＹＰ２Ａ７遺伝子の８６１−８８４領域および１０００−９７８領域、プローブ；８８９−９１３領域
（７）プライマー対；ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子の５１３−５３１領域および５８７−５６４領域、プローブ；５３３−５６０領域
（８）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の３５２−３７２領域および４２５−４０７領域、プローブ；３７５−４００領域
（９）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の６５９−６８２領域および９３７−９１５領域、プローブ；９１３−８８８領域
（１０）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ１８遺伝子の１３９４−１４１４領域および１４７３−１４５１領域、プローブ；１４２０−１４４４領域
（１１）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の８５８−８８０領域および９４３−９２１領域、プローブ；９１３−８８７領域
（１２）プライマー対；ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の７２０−７４０領域および９１２−８９１領域、プローブ；７４８−７７５領域
（１３）プライマー対；ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の１０７０−１０８８領域および１１４６−１１２３領域、プローブ；１０９６−１１１７領域
（１４）プライマー対；ＣＹＰ２Ｆ１遺伝子の５８５−６０６領域および７４４−７２３領域、プローブ；６０８−６３５領域
（１５）プライマー対；ＣＹＰ２Ｊ２遺伝子の４６０−４８２領域および５９２−５７１領域、プローブ；４８５−５０８領域
（１６）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ３／４遺伝子の８５０−８７２領域および１０１４−９９３領域、プローブ；８７６−９０５領域
（１７）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の８２５−８５４領域および９７３−９４８領域、プローブ；９４６−９１８領域
（１８）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の６８４−７０５領域および８８１−８５９領域、プローブ；８５０−８２２領域
（１９）プライマー対；ＣＹＰ３Ａ７遺伝子の６８４−７０５領域および８８１−８５９領域、プローブ；８５０−８１９領域
（２０）プライマー対；ＣＹＰ４Ａ１１遺伝子の６４０−６６３領域および８０５−７８４領域、プローブ；６６６−６９１領域
（２１）プライマー対；ＣＹＰ４Ｂ１遺伝子の９７４−９９５領域および１０８１−１０６１領域、プローブ；９９７−１０２４領域。
（２２）プライマー対；ＣＹＰ４Ｆ２遺伝子の１０９２−１１１３領域および１２７６−１２５６領域、プローブ；１１８２−１２０５領域
（２３）プライマー対；ＣＹＰ４Ｆ３遺伝子の１０７３−１０９４領域および１２６７−１２４６領域、プローブ；１１８８−１２１２領域
（２４）プライマー対；ＣＹＰ４Ｆ８遺伝子の１２７８−１２９９領域および１３９０−１３７１領域、プローブ；１３４１−１３７０領域
（２５）プライマー対；ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子の１１５８−１１７９領域および１４１５−１３９６領域、プローブ；１２０９−１２３４領域
（２６）プライマー対；ＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子の１１６７−１１８９領域および１４２９−１４０７領域、プローブ；１２０９−１２３９領域
（２７）プライマー対；ＣＹＰ１７遺伝子の１２００−１２２１領域および１２９４−１２７２領域、プローブ；１２３０−１２５５領域
（２８）プライマー対；ＣＹＰ１９遺伝子の４１４−４３５領域および４８７−４６７領域、プローブ；４３７−４６５領域
（２９）プライマー対；ＣＹＰ２７遺伝子の１７１−１９３領域および２９２−２７１領域、プローブ；１９７−２２４領域
（３０）プライマー対；ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の７６６−７８３領域および９６１−９４１領域、プローブ；７８５−８１２領域
（３１）プライマー対；ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子の１１４６−１１６８領域および１２２８−１２０７領域、プローブ；１１７５−１２０２領域
（３２）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の７８３−８０４領域および９２６−９０５領域、プローブ；８６３−８９４領域
（３３）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の７６６−７８９領域および９１０−８９１領域、プローブ；８６３−８９０領域
（３４）プライマー対；ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の７４８−７６９領域および９４３−９２２領域、プローブ；８６３−８９４領域
（３５）プライマー対；ＣＹＰ４Ａ１１遺伝子の２０９−２３０領域および２８８−２６８領域、プローブ；２４１−２６６領域
特に本発明は、前記プローブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである上記キットを提供する。
上記キットを構成するプライマー対とプローブとのセットの好ましいものとしては、下記（１）−（３５）から選ばれるセット、即ち各配列番号に示される配列を含むプライマー対とプローブとのセットを挙げることができる。より好ましいセットは、各配列番号に示される配列からなるプライマー対とプローブとのセットである。
（１）配列番号３６および３７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１に示される配列を含むプローブとのセット
（２）配列番号３８および３９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２に示される配列を含むプローブとのセット
（３）配列番号４０および４１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３に示される配列を含むプローブとのセット
（４）配列番号４２および４３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号４に示される配列を含むプローブとのセット
（５）配列番号４４および４５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号５に示される配列を含むプローブとのセット
（６）配列番号４６および４７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号６に示される配列を含むプローブとのセット
（７）配列番号４８および４９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号７に示される配列を含むプローブとのセット
（８）配列番号５０および５１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号８に示される配列を含むプローブとのセット
（９）配列番号５２および５３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号９に示される配列を含むプローブとのセット
（１０）配列番号５４および５５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１０に示される配列を含むプローブとのセット
（１１）配列番号５６および５７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１１に示される配列を含むプローブとのセット
（１２）配列番号５８および５９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１２に示される配列を含むプローブとのセット
（１３）配列番号６０および６１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１３に示される配列を含むプローブとのセット
（１４）配列番号６２および６３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１４に示される配列を含むプローブとのセット
（１５）配列番号６４および６５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１５に示される配列を含むプローブとのセット
（１６）配列番号６６および６７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１６に示される配列を含むプローブとのセット
（１７）配列番号６８および６９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１７に示される配列を含むプローブとのセット
（１８）配列番号７０および７１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１８に示される配列を含むプローブとのセット
（１９）配列番号７２および７３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号１９に示される配列を含むプローブとのセット
（２０）配列番号７４および７５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２０に示される配列を含むプローブとのセット
（２１）配列番号７６および７７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２１に示される配列を含むプローブとのセット
（２２）配列番号７８および７９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２２に示される配列を含むプローブとのセット
（２３）配列番号８０および８１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２３に示される配列を含むプローブとのセット
（２４）配列番号８２および８３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２４に示される配列を含むプローブとのセット
（２５）配列番号８４および８５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２５に示される配列を含むプローブとのセット
（２６）配列番号８６および８７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２６に示される配列を含むプローブとのセット
（２７）配列番号８８および８９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２７に示される配列を含むプローブとのセット
（２８）配列番号９０および９１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２８に示される配列を含むプローブとのセット
（２９）配列番号９２および９３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号２９に示される配列を含むプローブとのセット
（３０）配列番号９４および９５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３０に示される配列を含むプローブとのセット
（３１）配列番号９６および９７に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３１に示される配列を含むプローブとのセット
（３２）配列番号９８および９９に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３２に示される配列を含むプローブとのセット
（３３）配列番号１００および１０１に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３３に示される配列を含むプローブとのセット
（３４）配列番号１０２および１０３に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３４に示される配列を含むプローブとのセット
（３５）配列番号１０４および１０５に示される配列を含むプライマー対と、配列番号３５に示される配列を含むプローブとのセット
上記各セットは、それぞれ以下のＰ４５０分子種の検出および定量用である。
（１）のセット；ＣＹＰ１Ａ１
（２）のセット；ＣＹＰ１Ａ２
（３）および（３０）のセット；ＣＹＰ１Ｂ１
（４）のセット；ＣＹＰ２Ａ６／７
（５）のセット；ＣＹＰ２Ａ６
（６）のセット；ＣＹＰ２Ａ７
（７）および（３１）のセット；ＣＹＰ２Ｂ６
（８）および（３２）のセット；ＣＹＰ２Ｃ８
（９）および（３３）のセット；ＣＹＰ２Ｃ９
（１０）のセット；ＣＹＰ２Ｃ１８
（１１）および（３４）のセット；ＣＹＰ２Ｃ１９
（１２）のセット；ＣＹＰ２Ｄ６
（１３）のセット；ＣＹＰ２Ｅ１
（１４）のセット；ＣＹＰ２Ｆ１
（１５）のセット；ＣＹＰ２Ｊ２
（１６）のセット；ＣＹＰ３Ａ３／４
（１７）のセット；ＣＹＰ３Ａ４
（１８）のセット；ＣＹＰ３Ａ５
（１９）のセット；ＣＹＰ３Ａ７
（２０）および（３５）のセット；ＣＹＰ４Ａ１１
（２１）のセット；ＣＹＰ４Ｂ１
（２２）のセット；ＣＹＰ４Ｆ２
（２３）のセット；ＣＹＰ４Ｆ３
（２４）のセット；ＣＹＰ４Ｆ８
（２５）のセット；ＣＹＰ１１Ｂ１
（２６）のセット；ＣＹＰ１１Ｂ２
（２７）のセット；ＣＹＰ１７
（２８）のセット；ＣＹＰ１９
（２９）のセット；ＣＹＰ２７
本発明は、更に下記（ａ）−（ｃ）工程を含むＰ４５０分子種の検出および定量方法、特に（ｃ）工程における加水分解されるプローブの検出および測定が、励起光照射による蛍光の発色の検出および発色程度の測定によりなされるＰ４５０分子種の検出および定量方法を提供する。
（ａ）Ｐ４５０遺伝子を含む検体を調製する工程、
（ｂ）上記検体について、前記プライマー対とプローブとのセットの少なくとも１つを含む本発明キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行って検体中のＰ４５０の分子種をコードする遺伝子を増幅させる工程、および
（ｃ）上記ポリメラーゼ連鎖反応の間に加水分解されるプローブを検出および測定する工程。
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４））、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
また、本明細書において遺伝子なる語は、２本鎖ＤＮＡおよびそれを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖である各１本鎖ＤＮＡを包含する。更に該遺伝子の発現に関連するｍＲＮＡおよびこれに相補的なｃＤＮＡも包含する。ヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる。
本発明測定方法は、より好ましくは、レポーター色素とクエンチャー色素とで標識したプローブを用いたリアルタイム検出法によって実施される。
このリアルタイム検出法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各種分子種の遺伝子を分別定量できるものであり、その確立は、臨床分野、医薬品分野において非常に有益である。例えば、本発明方法によって、医薬品開発における動態試験において重要な位置を占めるＰ４５０のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に定量することができる。これによって、医薬品などの化学物質に曝露された場合のＰ４５０の各分子種の動向を知ることができる。特に、新薬開発に当たっては、Ｐ４５０による代謝の動向を調べることが義務づけられており、従来、このＰ４５０による代謝の動向は、Ｐ４５０の各分子種の発現量を、それぞれ別個に、煩雑で手間と時間のかかる方法によって測定して検討されていた。しかるに、本発明は、このＰ４５０の各分子種の発現量を、非常に簡便且つ迅速に、同一条件下に定量可能な技術を提供するものであり、この技術は、特に新薬開発分野において極めて有用である。
また、手術で摘出した組織、バイオプシーにより摘出した組織中のＰ４５０分子種のｍＲＮＡ発現を見る上でも、本発明方法は有効である。即ち本発明方法によれば、迅速且つ多種の試料を容易に処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡを利用して所望の検出が可能な利点がある。
更に、特定のＰ４５０分子種においては、肝臓、腎臓などでの酵素誘導などによる発現量の変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の発現量は小さく、測定には多くの血液を必要とする。本発明者の設計した前記特定のプライマー対とプローブとを用いた本発明測定方法によれば、少量の検体サンプルを利用して、一般的な機器を用いて容易且つ迅速に、Ｐ４５０の各種分子種の検出および定量が可能である。それ故、本発明測定方法によれば、上記血液などを検体としてその中のＰ４５０分子種をコードする遺伝子を検出および定量することができ、これによって該分子種の発現量を予測することが可能である。
本発明プローブおよびプライマー
本発明プローブおよびプライマーは、上述した通り、Ｐ４５０遺伝子の各分子種の特定領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドから選択される。
ここで「ハイブリダイズし得る」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件下で上記特定領域とハイブリダイズし得ることをいう。該条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行う条件である。
このハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、一般には、前記特定領域のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するものであるが、この分野においては、例えば２０程度のヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブは、鋳型鎖との間に１−２個程度の少数のミスマッチが存在しても鋳型鎖とハイブリダイズすることができ、従ってＰＣＲ用プライマーとしてまたは検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って、本発明プライマーおよびプローブには、このような少数のミスマッチを有するヌクレオチド配列のものも包含される。但し、このようなミスマッチはできるだけないものが好ましい。
本発明プローブおよびプライマーに共通する要件としては、約５０−４００塩基対の長さの増幅生成物を与えること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）およびＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことなどを挙げることができる。また、本発明プローブに要求される他の要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙げることができる。同様に、プライマーに要求される他の要件はＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。
これらの要件を充足するプライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５−５０個、好ましくは２０−４０個の範囲にあるのがよい。これらプライマーおよびプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
プライマーおよびプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおりであり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１−３５（プローブ）および配列番号３６−１０５（プライマー）に示される。
本発明において利用されるプローブおよびプライマーは、これら各配列番号に示されるヌクレオチド配列を有するものであるのが好ましいが、特にこれに限定されず、これらのヌクレオチド配列を基本として、前記したように少数のミスマッチを有するものであることもできる。
Ｐ４５０の各分子種のｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に以下の登録番号で登録されている。
（１）ＣＹＰ１Ａ１遺伝子；ＮＭ＿０００４９９
（２）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子；ＡＦ１８２２７４
（３）ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子；ＮＭ＿０００１０４
（４）ＣＹＰ２Ａ６／７遺伝子；ＡＦ１８２２７５／ＮＭ＿０００７６４
（５）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子；ＡＦ１８２２７５
（６）ＣＹＰ２Ａ７遺伝子；ＮＭ＿０００７６４
（７）ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子；ＡＦ１８２２７７
（８）ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子；ＮＭ＿０００７７０
（９）ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子；Ｍ６１８５７
（１０）ＣＹＰ２Ｃ１８遺伝子；Ｍ６１８５６
（１１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子；ＮＭ＿０００７６９
（１２）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子；ＮＭ＿０００１０６
（１３）ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子；ＡＦ１８２２７６
（１４）ＣＹＰ２Ｆ１遺伝子；ＮＭ＿０００７７４
（１５）ＣＹＰ２Ｊ２遺伝子；ＮＭ＿０００７７５
（１６）ＣＹＰ３Ａ３／４遺伝子；ＮＭ＿０００７７６／ＡＦ１８２２７３
（１７）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子；ＡＦ１８２２７３
（１８）ＣＹＰ３Ａ５遺伝子；ＮＭ＿０００７７７
（１９）ＣＹＰ３Ａ７遺伝子；ＮＭ＿０００７６５
（２０）ＣＹＰ４Ａ１１遺伝子；ＮＭ＿０００７７８
（２１）ＣＹＰ４Ｂ１遺伝子；ＮＭ＿０００７７９
（２２）ＣＹＰ４Ｆ２遺伝子；ＮＭ＿００１０８２
（２３）ＣＹＰ４Ｆ３遺伝子；ＮＭ＿０００８９６
（２４）ＣＹＰ４Ｆ８遺伝子；ＮＭ＿００７２５３
（２５）ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子；ＮＭ＿０００４９７
（２６）ＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子；ＮＭ＿０００４９８
（２７）ＣＹＰ１７遺伝子；ＮＭ＿０００１０２
（２８）ＣＹＰ１９遺伝子；ＮＭ＿０００１０３
（２９）ＣＹＰ２７遺伝子；Ｍ６２４０１
本明細書において、各分子種の特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配列に従うものである。
本発明プローブおよびプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）などを用いて容易に合成することができる。得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジなどを用いて精製することもできる。
リアルタイム定量、検出
以下、本発明プライマー対およびプローブを利用したＰ４５０分子種のＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述する。
本発明のリアルタイム検出用プローブは、その一端、例えば５’−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３’−末端にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合にレポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものである。レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）などが挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
本発明プローブは、前記特定配列のオリゴヌクレオチドにレポーター色素およびクエンチャー色索を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５’側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、３’側には、下に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。
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本発明方法は、前述した本発明プライマー対およびプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６（１０），９８６（１９９６）参照）など、特にリアルタイム検出法（例えばＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ，ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｅｒ１  ，Ｊｕｎｅ  １９９６参照）に従い実施することができる。
該方法は、特に本発明が対象とするＰ４５０の各分子種の発現量の測定方法として、該Ｐ４５０分子種のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを測定する場合に有用である。この場合、特定分子種を発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行うこともできる。
ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましく採用できる。
検出も、基本的には常法に従って、例えばアルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行うことができる。
本発明方法の実施によって、Ｐ４５０分子種の遺伝子を容易且つ迅速に、しかも各分子種毎に区別して測定、検出することができる。
Ｐ４５０分子種の検出および定量用キット
本発明は更に、上記方法の実施のためのキットをも提供する。このキットは上記プライマー対およびプローブを含んでなる。本発明キットには、対照として使用することのできる既知の核酸、該核酸を測定するためのプライマー対およびプローブを更に含んでいてもよい。
本発明方法によれば、Ｐ４５０をその分子種毎に分別して検出および定量することができる。しかも本発明方法によれば、Ｐ４５０の各分子種を迅速に、精度よく定量することができる。従って、本発明方法の利用によって、新薬の他剤との相互作用、配合禁忌などに関連するヒトの基礎データーを効率よく得ることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例および実施例を挙げる。
試験例１  リアルタイム検出法による検量線の作成
（１）試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行うことができる。
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ）がＰＣＲで増幅した特定のＰ４５０分子種由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間に物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望のｃＤＮＡの定量が可能となる。
本試験では、プローブの５’末端側にリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを結合させて使用した。これら各色素の結合およびこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献に記載の方法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６（１０），９８６（１９９６））に従って行った。
また、各プライマーおよびプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）および規定の試薬を用いて合成した。
検体ＲＮＡとしては、ＣＹＰ４Ｂ１およびＣＹＰ２Ｆ１を肺から、ＣＹＰ１Ｂ１を小腸から、ＣＹＰ３Ａ７を胎児の肝臓プールから、ＣＹＰ４Ｆ８を前立腺から、ＣＹＰ１９を胎盤から、ＣＹＰ１１Ｂ１，ＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１７を副腎から、それぞれ単離し精製して全ＲＮＡの形態で利用した。その他の分子種の場合は、成人肝臓プールから精製した全ＲＮＡを検体として利用した。尚、これらの全ＲＮＡは、いずれもクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）より購入した。
全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／ｍＬに調製した。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ，ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマーおよび２００ｎＭ  ＴａｑＭａｎプローブを含むＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して実施した。
ＰＣＲ条件としては、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行う条件を採用し、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
下記表１に示す各分子種に対して各配列番号に示される配列のプライマー対およびプローブを用いて行った上記試験の結果（検量線）を表２に示す。
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表２より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、ＣＹＰ３Ａ４については、１．２８ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の分子種についても１．２８ｐｇから４０００ｐｇ全ＲＮＡを定量限界とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上であった。但し、ＣＹＰ４Ａ１１のみ０．９６であった。
試験例２  設計したプライマーおよびプローブのセットについてのＰ４５０分子
種特異性の確認
（１）試験方法
この試験は、本発明方法によってＰ４５０の各分子種を特異的に分別できることを明らかにするためのものであり、以下の通り実施した。即ち、副腎、肝臓、胎児肝臓、小腸、腎臓、肺、脳、前立腺、精巣、子宮および胎盤の各組織でのＰ４５０の各分子種の発現を、試験例１と同様にして、本発明方法によって調べ、得られた結果を、文献に報告されている結果と対比した。
尚、内部標準としてはＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド−３−リン酸デハイドロゲナーゼ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用い、試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ（３回繰り返し）にて行った。
各組織の全ＲＮＡプールは、クローンテック社より購入した。
全ＲＮＡの濃度は、検量線の作成のために用いた組織においては２００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量とし、その他は１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量とした。
結果を下記表３および表４に示す。尚、各表には各全ＲＮＡの由来の特徴（プール人数、年齢、性別、人種、死亡原因）を併記する。表中、「ＮＤ」は定量限界以下であることを示す。
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各表の結果を、下記文献１−５に報告されている従来の方法に従って得られた各結果と対比したところ、ほぼ相関するものであることが明らかとなった。また、文献では見つからなかった分子種についても本発明方法によって検出でき、その結果は、それぞれ組織特異的な発現パターンを示し、他の分子種とのパターンの重複は認められず、このことから、本発明方法によればＰ４５０分子種を分別定量できることが明きらかとなった。
文献１；Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２７，８０４−８０９（１９９９）
文献２；Ｅｘｐ．Ｔｏｘｉｃ．Ｐａｔｈｏｌ．，５１，４１２−４１７（１９９９）
文献３；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５２，３７９−３８３（１９９６）
文献４；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５７，１４０７−１４１３（１９９９）
文献５；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８４，４２９−４４５（１９９９）
産業上の利用可能性
本発明によれば、ヒトＰ４５０の分子種を同一ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速にしかも分別して検出、定量する方法および該方法に利用されるプローブおよびプライマー対が提供される。本発明方法は、臨床分野、医薬品分野において有益である。
【配列表】
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