(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３１で表される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる分離され精製された成長因子であって、当該配列同一性は配列番号３１のうち少なくとも３０を超える連続したアミノ酸から算出されたものである成長因子。
【請求項２】
配列番号３１で表される配列からなる請求項１記載の分離され精製された成長因子。
【請求項３】
配列番号１で表される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヒト成熟ニュールツリンからなり、当該配列同一性は配列番号１のうち少なくとも３０を超える連続したアミノ酸から算出されたものである、請求項１記載の分離され精製された成長因子。
【請求項４】
薬学的に受容可能な担体中にある請求項３記載の分離され精製された成長因子。
【請求項５】
組み換えＤＮＡ技術により生成された請求項１記載の分離され精製された成長因子。
【請求項６】
単量体ポリペプチドからなる請求項１記載の分離され精製された成長因子。
【請求項７】
ホモダイマーポリペプチドからなる請求項６記載の分離され精製された成長因子。
【請求項８】
還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥから決められた１０−１５ｋＤの見かけの分子量を有する請求項７記載の分離され精製されたタンパク質。
【請求項９】
以下の性質：（ａ）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決められた２０−３０ｋＤの見かけの分子量と；
（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ未満の上方頸部神経節のＥＣ50と；
（ｃ）タンパク質は卵巣細胞から得られた細胞中に存在が確認され又は該細胞から得られうることと；
（ｄ）タンパク質は１．０ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４緩衝液中ではなく、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４緩衝液中でヘパリン  アガロースマトリックスと結合することとを有するタンパク質からなる分離され精製された成長因子。
【請求項１０】
該因子は配列番号１で表される成熟ヒト成長因子のアミノ酸配列からなる、請求項９記載の分離され精製された成長因子。
【請求項１１】
薬学的に受容可能な担体中にある請求項１０記載の分離され精製された成長因子。
【請求項１２】
配列番号７で表されるプレ−プロ  ニュールツリン（pre-pro neurturin）または、配列番号７と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列からなる分離され精製されたタンパク質であって、当該配列同一性は配列番号７のうち少なくとも３０を超える連続したアミノ酸から算出されたものであるタンパク質。
【請求項１３】
該プレ−プロ  ニュールツリンは配列番号７で表されるヒト  プレ−プロ  ニュールツリンである請求項１２記載の分離され精製されたタンパク質。
【請求項１４】
配列番号１５で表されるニュールツリンのプレ（pre）領域若しくは配列番号１５と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列からなるニュールツリンのプレ（pre）領域であるシグナルペプチドであって、当該配列同一性は配列番号１５の全長から算出されたものであるであるシグナルペプチドからなる分離され精製されたタンパク質。
【請求項１５】
該プレ領域は配列番号１５で表されるヒト  プレ領域である請求項１４記載の分離され精製されたタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１９で表されるニュールツリンのプロ（pro）領域若しくは配列番号１９と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列からなるニュールツリンのプロ（pro）領域であるペプチドであって、当該配列同一性は配列番号１９のうち少なくとも３０を超える連続したアミノ酸から算出されたものであるペプチドからなる分離され精製されたタンパク質。
【請求項１７】
該プロ領域は配列番号１９で表されるヒト  プロ領域ある請求項１６記載の分離され精製されたタンパク質。
【請求項１８】
配列番号１で表されるニュールツリンの配列と７０％と８５％との間の配列一致及び、配列番号１５６で表されるヒトＧＤＮＦの配列と４０％と８５％との間の配列一致を有するアミノ酸配列からなるニュールツリンファミリー構成因子である、分離され精製された成長因子。
【請求項１９】
該因子は、配列番号３３との少なくとも６２．５％の配列一致若しくは配列番号３４との少なくとも４０％の配列一致若しくは配列番号３５との少なくとも４０％の配列一致を有する保存領域アミノ酸配列からなる請求項１８記載の分離され精製された成長因子。
【請求項２０】
該因子は、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応により識別され及び／又は得られたヌクレオチド配列によりコード化される請求項１８記載の分離され精製された成長因子。
【請求項２１】
請求項１８記載の分離され精製された成長因子であって、該因子は、該因子を配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５からなる群から選択された配列で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識し結合しうる抗体と反応することにより識別され及び／又は得られることを特徴とする成長因子。
【請求項２２】
請求項１又は３に記載された成長因子をコード化するヌクレオチド配列からなる分離され精製された核酸。
【請求項２３】
配列番号１で表されるヒトニュールツリンアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列からなる請求項２２記載の分離され精製された核酸。
【請求項２４】
配列番号９で表されるヒトニュールツリン  ヌクレオチド配列からなる請求項２２記載の分離され精製された核酸。
【請求項２５】
請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンをコード化するヌクレオチド配列からなる分離され精製された核酸。
【請求項２６】
配列番号７で表されるヒト  プレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列からなる請求項２５記載の分離され精製された核酸。
【請求項２７】
配列番号１１で表されるヒトプレ−プロ  ニュールツリン  ヌクレオチド配列からなる請求項２６記載の分離され精製された核酸。
【請求項２８】
請求項１４に記載されたニュールツリンのプレ領域をコード化するヌクレオチド配列からなる分離され精製された核酸。
【請求項２９】
配列番号１５で表されるヒトプレ領域アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列からなる請求項２８記載の分離され精製された核酸。
【請求項３０】
配列番号１７で表されるヒトプレ領域ヌクレオチド酸配列からなる請求項２９記載の分離され精製された核酸。
【請求項３１】
請求項１６に記載されたニュールツリンのプロ領域をコード化するヌクレオチド配列からなる分離され精製された核酸。
【請求項３２】
配列番号１９で表されるヒトニュールツリン  プロ領域アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列からなる請求項３１記載の分離され精製された核酸。
【請求項３３】
配列番号２０で表されるヒトニュールツリン  プロ領域ヌクレオチド配列からなる請求項３２記載の分離され精製された核酸。
【請求項３４】
（ａ）配列番号７で表されるプレ−プロ  ヒト成長因子に対するアミノ酸配列をコード化する核酸配列と；
（ｂ）配列番号１で表される成熟ヒト成長因子に対するアミノ酸配列をコード化する核酸配列と；
（ｃ）配列番号１で表される成熟ヒト成長因子を認識し結合する抗体と交差反応するアミノ酸配列をコード化する核酸配列と；
からなる群より選択された核酸配列に相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする分離され精製された核酸。
【請求項３５】
請求項１又は３に記載された成長因子をコード化する核酸配列に操作可能に結合された発現制御因子からなる組み換えＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項３６】
該ベクターはｐＣＭＶ−ＮＴＮ−３−１である請求項３５記載のベクター。
【請求項３７】
該ベクターはｐＥＴ−ＮＴＮである請求項３５記載のベクター。
【請求項３８】
請求項３５記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３９】
該宿主細胞は哺乳動物の細胞である請求項３８記載の宿主細胞。
【請求項４０】
該宿主細胞はＤＧ４４細胞若しくはその誘導体である請求項３９記載の宿主細胞。
【請求項４１】
該宿主細胞はＤＧ４４ＣＨＯ５−３（Ｇ４１８）（ｐＣＭＶ−ＮＴＮ−３−１）である請求項４０記載の宿主細胞。
【請求項４２】
該宿主細胞はＤＧ４４ＣＨＯ５−３（５０ｎＭＭＴＸ）（ｐＣＭＶ−ＮＴＮ−３−１）である請求項４０記載の宿主細胞。
【請求項４３】
該宿主細胞はバクテリアの細胞である請求項３８記載の宿主細胞。
【請求項４４】
該宿主細胞はバクロウイルス発現系である請求項３８記載の宿主細胞。
【請求項４５】
（ａ）ＤＮＡ配列を発現するのに必要な制御因子を含む発現ベクター中に、請求項１又は３に記載された成長因子をコード化するＤＮＡ配列をサブクローニングする段階と；
（ｂ）該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階と；
（ｃ）宿主細胞培養の中で宿主細胞を培養する段階と；
（ｄ）宿主細胞培養から成長因子及び／又はＤＮＡを収穫する段階と；からなる組み換えＤＮＡ方法。
【請求項４６】
該宿主細胞は哺乳動物の細胞、バクテリアの細胞又はバクロウイルスの発現系である請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
請求項１又は３に記載された成長因子を認識して結合することのできる分離され精製された抗体。
【請求項４８】
治療効果のある量の請求項１又は３に記載された成長因子を含むことを特徴とする細胞変性若しくは不全を予防若しくは治療するための医薬を製造する方法。
【請求項４９】
該成長因子は、配列番号１で表される成熟ヒト  ニュールツリンからなる請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
該細胞変性は、末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳障害、急性脊髄障害、神経系腫瘍、多発性硬化症、及び感染からなる群より選択された条件から生じるニューロンの変性からなる請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該細胞の変性若しくは不全は、好酸球減少、好塩基球減少、リンパ球減少、単球減少、好中球減少、貧血、血小板減少、及びそのための茎細胞不全からなる群より選択された造血細胞の変性若しくは不全からなる請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
請求項２２に記載されたＤＮＡからなる合成物を含むことを特徴とする細胞の変性若しくは不全を予防若しくは治療するための医薬を製造する方法。
【請求項５３】
該細胞の変性はニューロンの変性からなる請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該ニューロンの変性は、末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳障害、急性脊髄障害、神経系腫瘍、多発性硬化症、及び感染からなる群より選択された条件から生じる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
細胞の変性若しくは不全は造血細胞の変性若しくは不全からなる請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
造血細胞の変性若しくは不全は、好酸球減少、好塩基球減少、リンパ球減少、単球減少、好中球減少、貧血、血小板減少、及びそのための茎細胞不全からなる群より選択された条件から生じる請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
請求項１または３に記載された成長因子を発現する細胞を含むことを特徴とする請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
該成長因子は、配列番号１で表される成熟ヒト  ニュールツリンからなる請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
該細胞の変性は、末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳障害、急性脊髄障害、神経系腫瘍、多発性硬化症、及び感染からなる群より選択された条件から生じるニューロンの変性からなる請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
該細胞の変性若しくは不全は、好酸球減少、好塩基球減少リンパ球減少、単球減少、好中球減少、貧血、血小板減少、及びそのための茎細胞不全からなる群より選択された造血細胞の変性若しくは不全からなる請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
請求項４７記載の精製された抗体を試料中に存在する成長因子と反応させ、該成長因子との該抗体の結合を検出することよりなる患者からの試料中の成長因子の存在を検出する方法。
【請求項６２】
請求項４７記載の抗体を含む、患者からの試料中の成長因子の存在を検出するキットであって、当該抗体は、請求項１又は３に記載された成長因子を認識して結合し、当該成長因子を検出することができ、容器に充填されていることを特徴とするキット。
【請求項６３】
試料中の、請求項１に記載されたアミノ酸をコード化するｍＲＮＡの存在を検出及び／又は定量することからなる患者からの試料中の成長因子の存在を検出する方法であって、（ａ）〜（ｃ）の段階を含む検出方法、
（ａ）当該アミノ酸の配列をコードする核酸配列からなるポリヌクレオチドを提供する段階、
（ｂ）ポリヌクレオチドが試料由来のｍＲＮＡとハイブリダイズできる条件で、ポリヌクレオチドをサンプルとインキュベートする段階、及び
（ｃ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成複合体の存在を検出する段階。
【請求項６４】
該検出及び／又は定量する段階は：（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸であって、当該配列同一性は、少なくとも３０を超えるアミノ酸から算出されたものであるアミノ酸をコード化する核酸配列からなるポリヌクレオチドを提供する段階と；
（ｂ）該ポリヌクレオチドが試料からのｍＲＮＡとハイブリッド形成できる条件の下で該ポリヌクレオチドを該試料と共にインキュベートする段階と；
（ｃ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成複合体の存在を検出する段階とからなる請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
請求項１又は３に記載のアミノ酸をコード化する核酸配列からなるポリヌクレオチドを含む患者からの試料中の成長因子の存在を検出する、容器に充填されたキット。
【請求項６６】
試料中の請求項１又は３に記載されたアミノ酸をコードするｍＲＮＡの存在を検出及び／又は定量することを含む患者からの試料中の成長因子の存在を検出する方法であって、該検出及び／又は定量する段階は以下の（ａ）〜（ｄ）の段階を含む検出方法、
（ａ）患者から得られた試料中で逆転写法を使用してｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成する段階と、
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法のためのプライマーであり、当該アミノ酸の配列をコード化するｃＤＮＡ内にある目標ＤＮＡ配列に側接触する二つのオリゴヌクレオチドを提供する段階と、
（ｃ）目標ＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する段階と、
（ｄ）増幅された目標ＤＮＡ配列の存在を検出する段階とからなる方法。
【請求項６７】
ポリメラーゼ連鎖反応法のためのプライマーであり、請求項１２に記載されたアミノ酸をコード化するｃＤＮＡ内にある目標ＤＮＡ配列に側接触する二つのオリゴヌクレオチドからなる患者からの試料中の成長因子の存在を検出する容器に充填されたキット。
【請求項６８】
請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなるニュールツリン遺伝子における変化を検出する方法であって、細胞中の無垢ニュールツリン遺伝子の存在を検出し、無垢の遺伝子が存在しない場合は遺伝子の変化があることを示す、ニュールツリン遺伝子の変化を検出する方法。
【請求項６９】
さらに以下の（ａ）〜（ｃ）の検出段階を含む請求項６８に記載の方法、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法のためのプライマーであり、請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなるニュールツリン遺伝子内にある目標ＤＮＡ配列を増幅することのできる二つのオリゴヌクレオチドを提供する段階、
（ｂ）目標ＤＮＡ配列を増幅する段階及び、
（ｃ）無垢のニュールツリン遺伝子からの増幅されたＤＮＡ配列の存在若しくは不存在を検出する段階。
【請求項７０】
該検出段階は増幅された目標ＤＮＡ配列を直接に配列決定することからなる請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
該目標ＤＮＡ配列は請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなるプレ−プロ  ニュールツリン遺伝子のエクソンに側接触若しくはエクソン内に存在する核酸配列からなる請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
細胞内の請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるニュールツリン遺伝子の変化を検出するキットであって、ポリメラーゼ連鎖反応法のためのプライマーであり、ニュールツリン遺伝子内にあるＤＮＡ配列を増幅することのできる二つのオリゴヌクレオチドが容器内に充填されたキット。
【請求項７３】
検出は：
（ａ）請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなる無垢のニュールツリン遺伝子とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドを提供する段階と、
（ｂ）該オリゴヌクレオチドが無垢のニュールツリン遺伝子とハイブリッド形成することができる条件の下で該オリゴヌクレオチドを該試料と共にインキュベートする段階と；
（ｃ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成複合体の存在若しくは不存在を検出する段階とからなる請求項６７記載の方法。
【請求項７４】
該オリゴヌクレオチドは、請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなるプレ−プロ  ニューツリン遺伝子のエクソンを含む請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなるニュールツリン遺伝子中の変化を検出するキットであって、無垢のニュールツリン遺伝子とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドを含む、容器に充填されたキット。
【請求項７６】
該オリゴヌクレオチドは、請求項１２に記載されたプレ−プロ  ニュールツリンアミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなるプレ−プロ  ニュールツリン遺伝子のエクソンを含む請求項７５記載のキット。
【請求項７７】
請求項１又は３に記載された成長因子を細胞に投与することからなる培養培地中の細胞の成長及び／又は分化を促進する方法。
【請求項７８】
該細胞は造血細胞若しくはその茎細胞である請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
該細胞はニューロンの細胞若しくはその茎細胞である請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
効果的な量の請求項１又は３に記載された成長因子を含むことを特徴とする患者の腫瘍細胞を処理するための医薬の製造方法。
【請求項８１】
該腫瘍細胞は神経芽細胞腫の細胞である請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
請求項２２に記載されたＤＮＡを含むことを特徴とする患者の腫瘍細胞を治療するための医薬の製造方法。
【請求項８３】
該腫瘍細胞は神経芽細胞腫の細胞である請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
請求項１又は３に記載された成長因子をコードするヌクレオチドに対する分離され精製されたニュールツリン  アンチセンス・ポリヌクレオチドであって、当該アンチセンスのポリヌクレオチド配列は、当該成長因子をコードする自然発生ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡポリヌクレオチド配列に相補的であり、かつストリンジェントな条件下で自然発生ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、コードされた当該成長因子のポリペプチドの転写及び／又は翻訳を阻害するものであるニュールツリン  アンチセンス・ポリヌクレオチド。
【請求項８５】
該ポリヌクレオチドは１５から３０の延長ヌクレオチドからなる請求項８４記載の分離され精製されたニュールツリン  アンチセンス・ポリヌクレオチド。
【請求項８６】
該ポリヌクレオチドは、リン酸トリエステル（phosphotriester）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホラミデート（phophoramidate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホルムアセタール（formacetal）、ジチオエート（dithioate）、モリフォリノ（morpholino）及びペプチド核酸類似体からなる群より選択された少なくとも一の結合からなる請求項８５記載の分離され精製されたニュールツリン  アンチセンス・ポリヌクレオチド。
【請求項８７】
細胞中の請求項１又は３に記載された成長因子の発現により媒介される疾病状態の治療のための医薬の製造方法であって、抑制効果をもたらす量の分離され精製された請求項８４に記載されたアンチセンス・ポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドの配列は、当該成長因子をコードする自然発生ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡポリヌクレオチド配列に相補的であり、かつ自然発生ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、コードされた当該成長因子のポリペプチドの転写及び／又は翻訳を阻害するものである、医薬の製造方法。
【請求項８８】
該ポリヌクレオチドは１５から３０の延長ヌクレオチドからなる請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
該ポリヌクレオチドは、リン酸トリエステル（phosphotriester）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホラミデート（phophoramidate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホルムアセタール（formacetal）、ジチオエート（dithioate）、モリフォリノ（morpholino）及びペプチド核酸類似体からなる群より選択された少なくとも一の結合からなる請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
該疾病状態は肥満である請求項８７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
政府助成金について
本発明は助成金番号NS24679およびCA53524の政府助成を受けて行われた。政府は本発明に関与する権利を有する。
発明の背景
（1）  発明の分野
一般論として本発明は栄養因子または成長因子に関するものであり、具体論としては新種の成長因子ニュールツリン（Neurturin）に関する。
（2）  関連技法の解説
複合有機体における組織の発達と維持には細胞の増殖、分化、生存、および機能の過程で精密な管理が要求される。これらの過程を管理する主要なメカニズムは「成長因子」として知られるポリペプチドの作用に依存している。こうした構造的に多様な分子は特殊な細胞表面のレセプタを介してこのような作用をもたらす。
近年、成長因子がいくつかのクラスに分類されることが明らかとなった。つまり、アミノ酸配列の近似性に依存するファミリーまたは上位ファミリーである。認識されたこうしたファミリーの例には、繊維母細胞成長因子ファミリー、神経栄養ファミリー、および形質変換成長因子−ベータ（tgf-β）ファミリーなどがある。
特に重要なのは「神経栄養因子」と称するこうした成長因子で、ニューロンの分化、成長および生存を促進し、神経系もしくは神経刺激組織に存在している。神経成長因子（NGF）は最初に認識と性格定義が行われた神経栄養因子である（Levi-Montalciniほか、J. Exp. Zool. 116:321, 1951参照により本文に採用）。NGFは非共有結合ホモダイマーとして存在する。この因子は、交感神経系で神経堤由来の感覚性基底前脳コリン性ニューロンの生存と成長を促進する。交感神経系ニューロン内で、この物質は生体内において軸索増殖物を生成し、また生体内において軸索および樹枝状突起の増殖を促進する。NGFの生理的作用として、抗体中和を管理する機能があるらしいことが生体内実験によって早くから知られていたし（Levi-Montalcini and Booker, Proc Nat’l Acad Sci 46:384-391, 1960; Johnsonほか、Science 210: 916-918, 1980参照により本文に採用）、これらの研究成果は、NGF欠如の遺伝子導入マウスに遺伝子のターゲット化実施による分析を行って裏付けられた（Crowleyほか、Cell 76:1001-12, 1994参照により本文に採用）。NGFは認識作用とニューロンの可塑性に影響を及ぼし、多様な物理的、化学的、ウイルス性、または免疫性の傷害が原因となって損傷を受けたニューロンの生存を促進する（Snider and Johnson, Ann Neurol 26:489-506, 1989; Hefti, J Neurobiol 25:1418-35, 1994参照により本文に採用）。NGFは内分泌系を対象として、また免疫、炎症の進行過程で広範囲にわたって影響を与え合うことでも知られている。（Scully and Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995の観察による；Otten and Gadient, Int. J. Devl Neurosci 13:147-151, 1995参照により本文に採用）。例えば、NGFは肥満細胞の生存を促進する。（Horigomeほか、J Biol Chem 269:2695-2707, 1994参照により本文に採用）。
発見されることになる本ファミリー第2の構成要素であった脳由来神経栄養因子（BDNF）の発見およびクローニングによって、NGFが神経栄養因子ファミリーの原形であることが明らかになった（Liebrockほか、Nature 341:149-152, 1989参照により本文に採用）。BDNFのNGFに対する関係は、NGFモノマーの3種の体内二硫化物を構成する6種のシステインすべてが維持されていることによって明白である（Barde, Prog Growth Factor Res 2:237-248, 1990参照により本文に採用）。2つの因子の保存度のよい部分のBDNFが提供する情報を利用することによって、この神経栄養ファミリーの追加構成要素（NT-3、NT-4/5）がいくつかのグループによって迅速に発見されることになる（Klein, FASEB J 8:738-44, 1994参照により本文に採用）。それらの分布および作用に関する情報と、それらが欠乏した場合の生理的結果（遺伝子ターゲット化による）はニューロン発達についての我々の知識を大いに高めることになった（観察についてはJelsmaほか、Curr Opin Neurobiol 4:717-25, 1995; Lindsayほか、Trends Neurosci 17:182-90, 1994; およびJohnsonほか、Curr Biol 4:662-5, 1994参照により本文に採用）。例えば、各種ニューロトロフィンが非重複性ニューロン個体（運動性ニューロン、知覚ニューロンの下位個体など）を主な対象として作用し、NGFについて当初説明されたのと同様の方法で非重複性ニューロン個体の生存と代謝を調整していることが現在明らかになっている。ニューロトロフィンが確認されたことによって、ニューロンが成長過程でそのニューロトロフィンの生存条件を変更できるという証拠が累積してきたため、神経栄養仮説の精密な再構成も可能になった（観察についてはDavies, Curr Biol 4:273-6, 1994参照により本文に採用）。
最近、神経栄養因子NGFファミリーのレセプタの存在確認によって、神経栄養因子への信号導入メカニズムの理解が進んだ。チロシン・キナーゼ・レセプタ、NGFレセプタとして知られるtrkA、BDNFとNT-4/5の信号動作の仲介をするレセプタtrkB、およびNT-3の効果を伝達するtrkCによって、こうしたニューロトロフィンによって利用される信号導入経路の分析が可能になった（観察についてはTuszynskiほか、Ann Neurol 35:S9-S12, 1994参照により本文に採用）。NGFによる信号動作に関与するものに、リン酸化trkAレセプタと直接的に影響を与え合うタンパク（e.g. Shc, PLCγ 1, PI-3 kinase)、SNTのようなその他のtrkA基質（Rabinほか、Mol Cell Biol 13:2203-13, 1995参照により本文に採用）、および下流のキナーゼ・エフェクター（例、ras、raf1、MEK、およびMAPキナーゼ）がある。特異的成分が、軸索生成への条件としてのShcおよびPLCγ1のようなNGFの特異的作用（Loebほか、J Biol Chem 269:8901-10, 1994; Stephensほか、Neuron 12:691-705, 1994参照により本文に採用）、および生存条件としてのPI-3キナーゼに関連する場合がある（Yao and Cooper, Science 267:2003-6, 1995参照により本文に採用）。NGFに関連した分子以外に、組織的には無関係の神経栄養因子も最近発見されている。このなかには、非ニューロン機能の結果として原始分離された他の要素とともに、毛様態神経栄養因子（CNTF）（Linほか、Science 246:1023-5, 1989参照により本文に採用）、IGF-I（Kanjeほか、Brain Res 486:396-398, 1989参照により本文に採用）白血病抑止因子（Kotzbauerほか、Neuron 12:763-773, 1994参照により本文に採用）のような「神経栄養的機能」に基づいてまず最初に分離された因子がある。
グリア由来神経栄養因子（GDNF）は、NGFとは組織的に関連しないこうした神経栄養因子のひとつである。したがって、GDNFは因子のいずれかの下位ファミリーに属していることが現在まで知られなかった特異的因子であった。GDNFの発見、精製およびクローニングは、パーキンソン氏病で変性する中脳ドパミン起因性ニューロンの生存に不可欠な因子を検索したことによって実現した。GDNFはラットのB49グリア細胞で調整された培地から精製された（Linほか、Science 260:1130-2, 1993参照により本文に採用）。配列分析によって、GDNFが変性成長因子β（TGF-β）の上位ファミリーの遠縁であり、ほぼ20%の共通性の根拠は主として7種のシステイン残基の特異的配列に求めることができることが明らかにされた（Linほか、Science 260:1130-2, 1993参照により本文に採用）。したがって、GDNFはTGF-β上位ファミリー内における新種の下位ファミリーの代表的存在と考えられる。
GDNFには、TGF-β上位ファミリーの他の因子と同様、前駆体分子が存在し、一定の信号配列と、通常RXXXサイトに固着し134アミノ酸成熟タンパクGDNFを放出する各種サイズの前部位が存在する。したがって、GDNFは前駆体タンパクとして合成される。
後続処理によって約35-40kDの成熟したグリコシル化ホモダイマーが生成される。7種のうち6種のシステインが連鎖内ジスルフィド結合を生成し、水素連結のシスチン結節されたβシートを接合し、システィン結節と称する硬直組織を生成するが（McDonaldほか、Cell 73:421-4, 1993参照により本文に採用）、この組織もニューロトロフィンの性格を持っていることは興味がある。残余のシスティンはもうひとつのモノマーとジスフィド結節を作り生物学的活性があるヘテロダイマーとモノダイマーを形成する。この組成はドデシル硫化ナトリウム（SDS）のような変性剤、熱およびpH極限値に対するGDNFの強い耐性の根拠とも考えられる。
バクテリアで生成した組み換えGDNFは、なかんずく中脳神経培養基におけるドパミン起因ニューロンの生存および形態学的分化を促進する（Linほか、Science 260:1130-2, 1993参照により本文に採用）。これら初期の体外実験は現在では体内の各種モデルに拡張され、それによってGDNFが成熟した齧歯類動物の脳に存在するMPTPまたは軸索切断を誘因とするドパミン起因ニューロンの病変を強力に保護し再生させる効果を持つことが実証されている（Tomacほか、Nature 373:335-9, 1995 and Beck et al., Nature 373:339-41, 1995参照により本文に採用）。GDNFは結節性知覚副交感神経の体外生存を促進し、にわとりの交感神経ニューロンのNGF喪失による死亡を防止することができるが、このためにはドパミン起因ニューロンへの影響に必要とされるそれ以上の大量の投与が必要となる（Ebendalほか、J Neurosci Res 40:276-84, 1995参照により本文に採用）。注目すべきことに、GDNFは運動性ニューロンによって後退移行され、運動性ニューロンの生存を促進することが知られており、このことは、GDNFで治療を受けた動物が、未治療の動物またはCNTF、BDNF、NT-3、NT-4/5など他の栄養因子で治療を受けた動物に比べて病変への反応としての運動性ニューロンの喪失が著しく少ない事情を説明している（Hendersonほか、Science 266:1062-4, 1994; Yan et al., Nature 373:341-4, 1995; and Oppenheimほか、Nature 373:344-6, 1995参照により本文に採用）。総体的に、GDNFは他の因子に比べて運動性ニューロンの生存を促進するより強力な因子であり、これらの病変に対する反応としてのニューロン萎縮を防止し、それによってGDNFを運動性ニューロン疾患の有望な治療物質として位置づける唯一の因子であった。
ニューロンの変性と死をもたらすのは、発達、老化の過程であり、生涯の病理学的事件の結果としてである。現在では一般的に、胎児の生存および発達や成人期の組織の健全性と可塑性などの分野で、神経栄養因子がニューロン因子の数多くの側面を調整するものと信じられている。慢性神経変性疾患と同様急性神経系障害の特徴は組織破壊と、可能性として疾患由来のアポプトシスであるため、神経栄養因子がこれらの症状に何らかの役割を演じていることが考えられる。実際、膨大な証拠によって、神経栄養因子が、現在ヒト社会を直撃している社会的、経済的に恐らく最も破壊的なこうした神経変性症状の治療にとり貴重な治癒効果を持つ物質となるかもしれない可能性が示唆されている。ただし、多様な神経栄養因子が選択的に多様なレセプタを経由し、各種のニューロン細胞に作用するため、神経系の各種の急性・慢性疾患の診断と治療に使用するためには神経栄養因子ファミリーの新種を常時確認する必要がある。
発明の要約
従って要約すれば、本発明はニューロンの生存と成長を促進するような十分に精製された因子の識別と分離を意図している。かくして発明者は、本文でニュールツリンと称する新奇なタンパク成長因子の発見に成功したのである。この成長因子は、各種哺乳類における相同配列間では最低85%の配列一致を示すのに対し、鳥類のような非哺乳類では配列の相同がわずか65%であることを示すと考えられている。本文でニュールツリンタンパクと称するものには配列番号（SEQ ID NO）：１（図5；図7、アミノ酸残基96〜197）に述べるヒト配列および、配列番号（SEQ ID NO）：2（図5；図8、アミノ酸残基96〜195）に述べるマウス配列がある。
ニュールツリンはチャイニーズハムスターの卵巣細胞のDG44CHO-pHSP-NGFI-B細胞（以下CHO細胞と呼ぶ）の調整済培地にて識別され採取された。またこれらの細胞から分離されたこの因子の分子量は約20-30kDと推定される。この分子量は、非還元状態下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および、約10ng/ml未満の上方頚部神経節のアッセイのEC50で測定して求めた。チャイニーズハムスターの卵巣細胞から分離されたタンパクは、ホモダイマータンパクで、そのモノマーは約10-15kDの分子量を持つと推定される。
ニュールツリンはCHO細胞による調整済培地から分離された因子の部分的消化の後に得られる断片断片を基にしても識別することができる。この調整済培地にアミノ酸残基の一部が存在することは以前は確定されていなかった。このような断片には、N末端基断片、Ser-Gly-Ala-Arg-Pro-Xaa-Gly-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Val-Ser-Val-Ser（うちXaaは未知アミノ酸）配列番号（SEQ ID NO）：３、内部のアミノ酸断片、Xaa1-Cys-Ala-Gly-Ala-Xaa2-Glu-Ala-Ala-Val（うちXaa1は未知アミノ酸、Xaa2はSerまたはCys）配列番号（SEQ ID NO）：４、Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa3-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val（うちXaa1およびXaa2は未知、Xaa3はGlnまたはGlu）配列番号（SEQ ID NO）：５、およびTyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg配列番号（SEQ ID NO）：６がある。
ニュールツリンの前駆形状は分化して、成熟タンパクと前駆領域を含むヒト前駆形状を形成し、ヒトの成熟ニュールツリン配列は配列番号（SEQ ID NO）：７に記述した通りである（図7、アミノ酸残基1〜197）。マウスの前駆形状は配列番号（SEQ ID NO）：8の記述にしたがっている（図8、アミノ酸残基1〜195）。
この発明はまた、配列番号（SEQ ID NO）：1のアミノ酸配列に記述するようなヒトニュールツリンをコード化するヌクレオチド配列および、配列番号（SEQ ID NO）：2に記述するようなマウスニュールツリンのアミノ酸配列を呈示する。
ヒトニュールツリンの配列は、配列番号（SEQ ID NO）：9のヌクレオチドによるコーディングによっても識別され（図7、核酸286〜591）、マウスの配列も、配列番号（SEQ ID NO）：10（図8、核酸286〜585）のヌクレオチド配列によるコーディングによっても識別され得る。この発明はさらに、配列番号（SEQ ID NO）：7のアミノ酸配列に記述するようなヒトのプレ−プロ  ニュールツリン（pre-pro Neurturin）および、配列番号（SEQ ID NO）：8のアミノ酸配列に記述するようなマウスのプレ−プロ  ニュールツリンをコード化するヌクレオチド配列を呈示している。ヒトプレ−プロ  ニュールツリン配列は、配列番号（SEQ ID NO）：11のヌクレオチド配列によるコーディングで識別され（図7、核酸1〜核酸591）、マウスのニュールツリン配列は配列番号（SEQ ID NO）：12（図8、核酸1〜核酸585）のヌクレオチド配列によるコーディングで識別される。
発現ベクターおよび、安定した形質転換が行われた細胞も呈示する。形質転換細胞はニュールツリンの生成法に使用することができる。
もう１つの実施例では、本発明は、ニュールツリンを必要とする患者に対し治療効果のある量のニュールツリンを投与することによって、ニューロンの変性を予防または治療する方法を呈示している。患者の治療は、ニュールツリンまたはDNA配列を発現する形質転換細胞を患者に移植することによっても可能である。これにより、患者またはニュールツリンの中で培養され増殖された患者の細胞へニュールツリンのコード化を行うことができる。
他の実施例では、腫瘍細胞の治療法を呈示している。その方法として、細胞の成熟と分化を起こすため、有効量のニュールツリンまたはDNA配列をコード化するニュールツリンからなる組成を投与することである。
また他の実施例では、本発明は、分離され精製されたニュールツリンアンチセンス・ポリオクレオチドを呈示している。
さらに他の実施例では、ハイブリッドの汎成長因子を呈示している。ハイブリッド・ポリペプチドは、ニュールツリンのタンパクとほぼ同一の第１配列および、ニュールツリン以外のTGF-β上位ファミリーの一部とほぼ同一の第２配列から構成されている。汎成長因子はニュールツリンの活性領域およびニュールツリン以外の最低１個の成長因子から構成されている。
本発明はまた、ニュールツリンの組成と検出方法を呈示している。１つの方法はニュールツリン抗体に基づくもので、もう１つの方法は組換えDNA技術を用いて、ニュールツリンのmRNAを検出することに基づくものである。
したがって、本発明で達成されたことが明らかになったいくつかの利益で注目に値する点は、ある種の細胞、特にニューロンの萎縮や退化、壊死の現状を維持し予防することができる新しい成長因子ニュールツリンの呈示、成長因子のニュールツリン-GDNFファミリーの構成因子を検出できる新しい方法を利用できるようにすることによる、このファミリーのその他の因子の呈示、組換え技術と分離により、細胞からニュールツリンを採取する方法の呈示、細胞退化、特にニューロンの退化をもたらす疾病の予防または治療方法の呈示、患者のニュールツリンレベルを検出しモニターできる方法の呈示、ニュールツリン遺伝子における変性を検出できる方法の呈示などである。
図の説明
図1は、CHO（チャイニーズハムスターの卵巣）の細胞からニュールツリンを調製するための精製方法を示す。
図2は、ニュールツリンの精製過程でモノSカラムから溶離した分留の特性を示し、（a）SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上の各分留の電気泳動および、シルバー染色法によるタンパクの視覚化および、（b）上方頚部神経節の生存アッセイの各分留に見られる神経親和性活動を示している。
図3は、培養組織中の上方頚部神経節細胞の生存を維持するニュールツリンの能力を示し、（a）神経成長因子（NGF）によって維持された陽性対照細胞、（b）抗NGF抗体によって処理された陰性対照細胞で生存減衰を示すもの、（c）抗NGFとニュールツリン（約3ng/ml）によって処理された細胞でニューロンの生存を示すものを示している。
図4は、上方頚部神経節生存アッセイでニュールツリンの濃度反応効果を示している。
図5は、ボックス内に示す同一アミノ酸残基と、成熟した成長因子、ヒトのニュールツリン（hNTN）、マウスのニュールツリン（mNTN）、ラットのGDNF（rGDNF）、マウスのGDNF（mGDNF）および、ヒトのGDNF（hGDNF）とのアミノ酸配列の相同性を示している。
図6は、21日目のラットの胎児および成熟ラットから得られたRNAサンプルのRT/PCR分析で得られたニュールツリンのmRNAとGDNFのmRNAの組織分布を示している。
図7は、ヒトのプレ−プロ  ニュールツリンのcDNAおよびコード化されたアミノ酸配列を示している（配列番号（SEQ ID NO）：11）。これは核酸1〜57（配列番号（SEQ ID NO）：17）からのプレ（pre）領域、核酸58〜285（配列番号（SEQ ID NO）：20）からのプロ（pro）領域、核酸286〜591（配列番号（SEQ ID NO）：9）からのヒトのニュールツリン、そして核酸1〜169（配列番号（SEQ ID NO）：27）と170〜594（配列番号（SEQ ID NO）：28）からの2つのエクソンのコード化配列部分を定義する核酸169と170との間のスプライス部位を表している。
図8は、マウスのプレ−プロ  ニュールツリン（配列番号（SEQ ID NO）：20）のcDNAおよびコード化されたアミノ酸配列を示す。これは核酸1〜57（配列番号（SEQ ID NO）：18）からのプレ領域および核酸58〜285（配列番号（SEQ ID NO）：21）からのプロ領域、核酸286〜585（配列番号（SEQ ID NO）：10）からのマウスのニュールツリン、そして核酸1〜169（配列番号（SEQ ID NO）：29）および170〜588（配列番号（SEQ ID NO）：30）からの2つのエクソンのコード化配列部分を定義する核酸169との170の間のスプライス部位を表している。
図9はマウスのCDNA配列で、5’の非コード化部位（配列番号（SEQ ID NO）:13）と3’（91ｃｍ）の非コード化部位（配列番号（SEQ ID NO)：14）を内包し、それぞれが前駆ニュールツリンのコード化部位に隣接している配列を示す。
図10は、平板培養の24時間後、NTN、GDNF、BDNF、NGFおよびAMOで処理されたE18ラットの結節性神経節ニューロンの生存率を表している。
図11は、平板培養の24時間後、NGF、NTNおよびGDNFで処理されたE15ラットの後根神経節細胞の生存率を表している。
図12は、交感神経系ニューロン内におけるニュールツリンまたはGDNFによるMAPキナーゼのERK-1およびERK-2アイソフォームの活性化を表している。この場合（a）燐酸化MAPキナーゼ特定の抗体または、（b）燐酸化および非燐酸化MAPキナーゼの両方を認識する抗体が利用される。
図13は、Lan-5ヒト神経芽腫細胞の顕微鏡写真で、（A）は無処理（B）は３日間50ng/mlのニュールツリンで処理されたものを示す。
図14は、ニュールツリンおよび神経芽腫細胞系におけるMAPキナーゼ活動の活性化を示す。ここで神経芽腫細胞系とは（a）SK-NSH神経芽腫（ナイーブ）、（b）NGP神経芽腫（RA tx）および、（c）SY5Y神経芽腫（RX tx）を指す。
図15は、後根神経節ニューロン中のニュールツリン逆輸送を示す。この方法として、標識のない100倍の過剰ニュールツリンまたは標識のない100倍の過剰GDNFの存在または不在のなかで、125I放射性同位元素による標識付きニュールツリンかGDNFを使用する。
図16は、クラスタル法を用いて一列に並べたTGF-βの上位ファミリー構成因子の配列を示す。最初の基準枠であるシステインから配列の末端まで、形質転換成長因子β１（TGF-β1）、形質転換成長因子β２（TGFβ2）、形質転換成長因子β３（TGFβ3）、インヒビンβA（INHβA）、インヒビンβB（INHβB）、結節遺伝子（NODAL）、骨形態発生タンパク2および4（BMP2 and BMP4）、ショウジョウバエデカペンタプレジック（decapentaplegic）遺伝子（dpp）、骨形態発生タンパク5−8（BMP5、BMP6、BMP7およびBMP8）、ショウジョウバエ60A遺伝子ファミリー（60A）、骨形態発生タンパク3（BMP3）、Vg1遺伝子、成長分化因子1および3（GDF1およびGDF3）、ドルサリン（dorsalin）（drsln）、インヒビンα（INHα）、MIS遺伝子（MIS）、成長因子9（GDF-9）、グリア由来神経栄養成長因子（GDNF）、およびニュールツリンの順に配列されている。
図17はクラスタル法を用いて一列に並べたTGF-βの上位ファミリー因子の配列を示すもので、最初の基準枠であるシステインから第4基準枠システイン形質転換成長因子β1（TGFβ1）を含まずその直前まで、形質転換成長因子β2（TGFβ2）、形質転換成長因子β3（TGFβ3）、インヒビンβA（INHβA）、インヒビンβB（INHβB）、結節遺伝子（NODAL）、骨形態発生タンパク2および4（BMP2 and BMP4）、ショウジョウバエデカペンタプレジック遺伝子（dpp）、骨形態発生タンパク5−8（BMP5、BMP6、BMP7およびBMP8）、ショウジョウバエ60A遺伝子ファミリー（60A）、骨形態発生タンパク3（BMP3）、Vg1遺伝子、成長分化因子1および3（GDF1およびGDF3）、ドルサリン（drsln）、インヒビンα（INHα）、MIS遺伝子（MIS）、成長因子9（GDF-9）、グリア由来神経栄養成長因子（GDNF）およびニュールツリンの順に配列されている。さらに、
図18はクラスタル法を用いて一列に並べたTGF-βの上位ファミリー因子の配列を示す。第4の基準枠システインから配列の末尾まで、変態成長因子β1（TGFβ1）、変態成長因子β2（TGFβ2）、変態成長因子β3（TGFβ3）、インヒビンβA（INHβA）、インヒビンβB（INHβB）、結節遺伝子（NODAL）、骨形態発生タンパク2および4（BMP2 and BMP4）、ショウジョウバエデカペンタプレジック遺伝子（dpp）、骨形態発生タンパク5−8（BMP5、BMP6、BMP7およびBMP8）、ショウジョウバエ60A遺伝子ファミリー（60A）、骨形態発生タンパク3（BMP3）、Vg1遺伝子、成長分化因子1および3（GDF1およびGDF3）、ドルサリン（drsln）、インヒビンα（INHα）、MIS遺伝子（MIS）、成長因子9（GDF-9）、グリア由来神経栄養成長因子（GDNF）、およびニュールツリン（NTN）の順に配列されている。
好適な実施例の説明
本発明は、新種の成長因子ニュールツリンの識別、分化および配列に基づいている。驚くべきことには、この物質が細胞の生存、特にニューロンの生存を促進することが判明した。本発明以前は、ニュールツリンは未知の存在で、確然とした生物学的に活性を示す１つの物質として識別されてもいず、純粋の形で単離されてもいなかった。
発明者は、CHO細胞の調整済培地からニュールツリンを発見し分離することに成功した。ニューロン生存促進の活性は、最初にCHO調整済培地の部分的に精製された調製物質を用いて識別された。一定の細胞系の調整済培地の調製は本技術の分野ではよく知れれている。（例ReidによるMethods in Enzymology Vol. LVIII, Cell Culture，、Jakoby＆PastanによるEds., Academic Press, San Diego, pp 161-164, 1979; FreshneyによるCulture of Animal Cells in A Manual of Basic Technique, 2d Ed., Wiley-Liss, NY, p. 84, 1987参照により本文に採用）。したがって本実施例では、CHO細胞は、精製された形でニュールツリンを識別し採取するのに用いられる調整済培地であったが、この技術に熟練した者なら、ニュールツリンを発現するどんな細胞も採取源になり得ることを即座に理解するであろう。ニュールツリンを発現する細胞のいくつかを例11で採り上げている。発明者は、ニュールツリンを発現すると識別されたどのような細胞も、調整済培地を得るのに使用でき、そこからニュールツリンを分離できると考えている。
CHO細胞の調整済培地からニュールツリンを分離する場合、最初の調整済み未精製培地は遠心分離および／またはろ過によって細胞屑を除去して採取できる。純度をさらに高めるには、本技術の熟練者は、本技術で周知の数々の方法の１つを用いて、アフィニティクロマトグラフィイ、イオン交換クロマトグラフィ、予備電気泳動法などにより、生物学的サンプルからニュールツリンを分離し精製することができるが、これらの方法は単独でも組み合わせて用いてもよい。ニュールツリンの細胞生存促進効果は細胞の生存を評価する適切なシステムで決定することができる。発明者は、異なる多様な組織においてニュールツリンが生存を促進すると信じる。この信念は、他の成長因子によって知られている事実に基づき、またニュールツリンが数々の組織において発現され、その組織の生存促進に効果があるという観察にも基づいている。本文に報告した研究では、交感神経ニューロン生存アッセイ（交感神経頚部神経節＝SCG）を用いてニューロン活性を評価した。このアッセイは広く特徴づけられている（Martinほか、J Cell Biol 106:829-844, 1989; Deckwerth and Johnson, J Cell Biol 123:1207-1222, 1993参照により本文に採用）（図3参照）知覚ニューロンに及ぼすニュールツリンの生存促進効果も示している（図10参照）。
SCGアッセイを簡単に述べると、ラットの胎児の上位頚部神経節から採取した細胞を、神経成長因子（NGF）を含む培地で5日間37℃で培養することが含まれる。培地は次に、NGFを含まず抗NGF抗血清を含む培地と交換される。NGFの除去によってニューロンは普通24-72時間で死滅する。7-8日目に顕微鏡下でニューロンの生存を観察して評価した。ニューロンの最大生存率の尺度のひとつは、ニューロン細胞体にも軸索にも変性が見られないことである。細胞体の変性は、ニューロン細胞体のサイズの縮小、膜の不規則な膨張、小胞の含有、または屈折性の欠失などで示される。軸索領域は、腫脹とブレブ（小気泡）が軸索の束に沿って現れた場合に解体の兆候を示すものと見られされた。生存の判定には、NGF（陽性対照）が存在する場合または不在の場合のニューロン成長と、NGF抗血清（陰性対照）との比較が用いられた。
活性の定量化は「生存単位」の算出によって行った。サンプル中の総生存単位は、サンプルのアリコート（部分）の最小量と定義された。これは同サンプルの総量を最大限生存数で除して算出した。例えば、600mlの分量がヘパリン・アガロース・カラムとこの溶離物から溶離されるとき、12.5μｌが最大量を促進した最少量であった。したがって、ヘパリン・アガロース・カラムからの溶離物中の生存単位は48,000であった。特定活性は生存単位を総タンパク量（mg）で除して算出した。本文では、ニュールツリンの内因性の活性は、最大か最大の半分量の生存を促進するpg/mlまたはpMの濃度単位で示している。図5の通り、精製ニュールツリンタンパクの濃度反応曲線は、EC50として表現されたニュールツリンの内因性活性度が約1.5ng/mlまたは約50pMで、EC100は約3ng/mlまたは約100pMであることを表している。
生存単位は、0.5mlの培養アッセイの中で約1200のニューロンを用いるアッセイで測定され、培養期間は分留を加えた後48時間であった。48時間後に観察で生存のアセスメントを行った。図4に示した内因性の活性は、約2700のニューロンと72時間の培養期間を用いるアッセイにより決定した。生存のアセスメントは、ニューロンの固定化と生存ニューロン数をカウントして行った。活性度の半減期によって査定されるように、ニュールツリンの安定性はニューロン数の増加とともに低下するため、内因性の活性の測定値は、固有活性度測定によって予測された値よりも低くなることが予見できる。固有活性度測定値も固有活性度によって予測値よりも低くなることが予想される。これは生存の測定を48時間後でなく72時間後に行ったためである。
ニュールツリンの精製については以下の例1で詳しく説明している。調整済培地の開始物質は、DG44チャイニーズハムスターの卵巣細胞DG44CHO-pHSP-NGFI-Bの誘導体から調製した（Dayほか、J Biol Chem 265:15253-15260, 1990参照により本文に採用）。発明者はまた、DG44チャイニーズハムスターの卵巣細胞のその他の誘導体の調整済培地からも、ニュールツリンを部分的に精製した形で分離した。これらの細胞も、DG44CHO-pHSP-NGFI-B細胞や、親のDG44チャイニーズハムスターの卵巣細胞と同様に使用でき、また他種動物からの卵巣細胞や、ニュールツリンを発現することが知られている組織（例10参照）などの他の組織からの細胞も同じく使用できる。調整済培地を調製するには、血清を全く含まない培地に細胞を2日間入れた後、調整済培地を採取し、培地を補給しなおす。このサイクルを繰り返し、CHO細胞の各バッチから調整済培地を5回採取する。採取した培地から細胞屑を除くため遠心分離機にかける。
CHO細胞の調整済培地からニュールツリンを精製する第一の手順は、ヘパリン・アガロース・カラムとカラムから採取された部分的に精製されたニュールツリンの溶離物へ、調整済培地を導入することであった。この手順の結果、タンパクの内因性の活性および精製が111倍も増加した。培地をカラムへ加えるため用いた緩衝液には0.5MのNaClが含まれている。このNaClの濃度で、ニュールツリンをヘパリン・アガロース基質へ結合させる。発明者は、ニュールツリンとヘパリン・アガロース基質の等電点を根拠として、LIFおよびCNTFはヘパリン・アガロース基質に結合されないか、あるいは0.5MNaClを含む緩衝液により基質から洗い落とされると信じる。したがって、このステップでは、LIFやCNTFなどの成長因子からニュールツリンを単離することを期待している。カラムの洗浄後、1.0MNaClを使用するカラムからニュールツリンを溶離させた。
精製を高めるため、溶離物質を希釈し、ＳＰセファロース▲Ｒ▼（SP SEPHAROSE▲Ｒ▼）高性能イオン交換樹脂（Pharmacia, Piscataway, NJ）が入っているカラムへ移入した。このカラムから溶離した物質を、Cu++で負荷されたキレーティング  スーパロース（Chelating Superose）HR 10/2カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）上で高速タンパク液クロマトグラフィ（FPLC）を使って精製した。Cu++スーパロース（Ｃｕ++ superose）カラムから溶離した抽出物分留を、モノＳ（Mono S）HR 5/5カチオン交換カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）へ入れ、FPLCの精製をさらに高める。モノ（Mono）Ｓ分留内のタンパクの構成は、非還元性SDS-PAGEと銀染色を用いて分析した。
精製の各ステップにおいてカラムから採取された分留に対し、ニューロン生存アッセイを用いた生物学的活性のアッセイ並びに、ブラッドフォード色素拘束法（Anal Biochem 72:248-254, 1976参照により本文に採用）を用いたタンパクの内容のアッセイを行った。試薬はバイオラド・タンパクアッセイ色素試料（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）を使用した。
上記のステップを使用した段階的精製を表1に示した。
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この分析の結果ならびに分留のニューロン生存アッセイの結果、約25kDの分子量を有するタンパクが交感神経ニューロン生存活性とともに精製されたことが明らかになった。
CHO細胞による調整済培地から分離された精製物質は、CHO細胞による調整済培地中のタンパクのアミノ酸タンパクの配列の一部を決定するのに使用され、続いて異なる種における配列を決定する基準として使用された。N末端基アミノ酸の配列決定には自動タンパク/ペプチド・シーケンサーが用いられ、最初の16個のアミノ酸は（位置6は不確定）、Ser-Gly-Ala-Arg-Pro-Xaa-Gly-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Val-Ser-Val-Serであると考えられる。（うちXaaは不明アミノ酸を表す）（配列番号（SEQ ID NO）：3）。内部アミノ酸の断片は、プロテアーゼ酵素による消化および配列が決定された後、精製物質から得た。こうして採取した断片は以下の通りであった。（1）（1、2、6の位置は不確実）Xaa1-Cys-Ala-Gly-Ala-Xaa2-Glu-Ala-Ala-Val、うちXaa1は不明アミノ酸、Xaa2はSerまたはCysであった（配列番号（SEQ ID NO）：4）。（2）（1、2、4、10、17および22の位置は不確定）Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa3-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val、うちXaa1およびXaa2は不明、Xaa3はGlnまたはGlu）（配列番号（SEQ ID NO）：5）。（3）Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg（配列番号（SEQ ID NO）：6）。これらの部分アミノ酸配列に基づき、DNAのプローブおよびプライマーを行い、異なる哺乳類からのcDNAクローンを得るのに用いることができる。これは哺乳類間における配列の恒存率の高さに基づいている。ヒトのcDNAおよびアミノ酸の推定配列を図7に示し、マウスのcDNAおよびアミノ酸の推定配列を図8に示した。
マウスのcDNAクローンは1.0kbで、585個のクレオチド（配列番号（SEQ ID NO）：12）の開放読取り枠を有し、マウスのプレ−プロ  ニュールツリンタンパクをコード化する（配列番号（SEQ ID NO）：8、図8）。さらに非コード化領域は、図9に示すごとく、コード化領域の5’と3’の両端で認識された（配列番号（SEQ ID NO）：13、5’の非コード化領域、核酸-348〜-1；配列番号（SEQ ID NO）：14、3’の非コード化領域、核酸589〜675）。マウスのニュールツリン配列は他の種からの相同部分を識別するためのPCRプライマーを得るため用いることができる。ヒトゲノムのDNAからのヒト192ヌクレオチド断片をこの方法で増幅し、さらにヒトゲノムライブラリーの選別に使用して、ヒトニュールツリンゲノムの位置を持つクローンを得た。ヒトcDNAの配列をこれらのクローンの配列から推定した。（図7、ヒトプレ−プロ  ニュールツリンのcDNA配列）。
本文でニュールツリンに言及するのは、本文でその特徴付けおよび記述を行ったニュールツリンと起源は異なっても著しく相同で、生物学的に同じ成長因子が含まれていると解釈されることを意図している。このような著しく相同な成長因子はどんな組織や種にも特有であると考えられ、同様に生物学的活性も、種々の生物学的アッセイで特徴付けることが可能である。本文においてニュールツリンを論じたわけは、プレ−またはリーダーまたはシグナル配列領域および、本文で定義したニュールツリンを含むプレ−プロ成長因子が含まれるいると解釈されることを意図している。
「生物学的に同様」という表現は、本発明の構成により同じ成長特性の一部または全部を類似の方法で実証することができることを意味するものである。このことは、必ずしも本文のCHO細胞で調整された培地から分離されたニュールツリンまたは、組換えにより生成されたヒトもしくはマウスのニュールツリンと同じ程度に実証できることを意味しない。
「著しく相同」の意味は、ヒト・マウスニュールツリンの他の任意の種からのニュールツリンとの相同の程度が、ニュールツリンと既述のあらゆるTGF-β上位ファミリーかGDNFとの相同の程度よりも大きいということである。（TGF-β上位ファミリーの相同性の解説についてはKingsley, Genes and Dev 8:133-46, 1994を参照により本文に採用）。
「配列の識別」または「パーセント識別」とは、２つの配列間の同じ残基のパーセント（%）を表すことを意図しており、ヒト以外のニュールツリンでパーセント識別を決定する場合はヒトニュールツリンを指し、非ニュールツリン成長因子でパーセント識別を決定する場合はニュールツリンを指し、また非ニュールツリン成長因子とGDNFでパーセント識別を決定する場合はヒトニュールツリンを指す。この場合、レーザーゲン（Lasergene）バイオコンピューティング・ソフトウエア（DNASTAR, INC, Madison, WI）を使用する多重配列クラスタル法（Higgins et al, Cabios 8:189-191, 1992）で、２つの配列を一列に並べる。この方法で多重の配列を次第に数珠つなぎ（アラインメント）に並べてゆく。一連のペア方向のアラインメントから算出された類似スコアを用いて、この過程で大きさを増していく一連のアラインメント集団が集められる。好適な配列アラインメントは好適なアラインメントのスコアを見出して得ることができ、そのスコアはアラインメント内の独立した残基間の合計スコアの平均である。これは、一定の進化期間にわたって2つの関連タンパク間で起こる一定のアミノ酸変化の確率を表す残基量表から決定することができる。列のアラインメントのギャップを広げて伸ばすことによるペナルティはスコアに加えられる。本プログラムで使用するデフォルトパラメータは以下の通りである。多重アラインメントのギャップペナルティ＝10；多重アラインメントのギャップ長ペナルティ＝10；ペア方向アラインメントのｋ−ツプル（k-tuple）値＝1；ペア方向アラインメントのギャップペナルティ＝3、ペア方向アラインメントのウインドー値＝5；ペア方向アラインメントで保存された対角線＝5。アラインメント・プログラムに使用される残基量表はPAM250である（Dayhoffほか、in Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Ed., NBRF, Washington, Vol. 5, suppl. 3, p. 345, 1978）。
パーセント保存は、同一の残基パーセントを、2つの残基の保存置換（PAM250残基重量で0.3以上の対数確率値を有すると定義される）を表すパーセント位置に加算することにより、上記のアラインメントから算出される。「保存」とは、非ヒトニュールツリンでパーセント保存を決定する場合はヒトニュールツリンを指しており、非ニュールツリン成長因子でパーセント保存を決定する場合はニュールツリンを指しており、またGDNFを有する非ニュールツリン成長因子のパーセント保存を決定する場合はヒトGDNFを指している。
この条件を満たす保存的なアミノ酸の変化は以下の通りである。R-K; E-D、Y-F、L-M; V-I、Q-H。成熟ヒトと成熟ラットニュールツリン（それぞれhNTN, mNTN）間の識別（identitiy）（I）と保存（conservation）（C）、ならびに、上記のhNTN, mNTNの各々と、成熟ヒト、成熟ラット、成熟マウスのGDNF（それぞれhGDNF、rGDNFおよびmGDNF）間の識別（I）と保存（C）の計算を表2に示す。
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成熟マウスと成熟ヒトニュールツリンタンパク間との相同の程度は、配列の識別性が約90%であり、ヒト以外の哺乳類のすべてのニュールツリンのヒトニュールツリンとの相同性は、配列の識別性が約85%以上であると考えられている。鳥類などの非哺乳類では、ヒトニュールツリンとの相同性が約65%以上の配列同一であると考えられている。比較方法としてニュールツリンとGDNFを比較すると、成長因子のニュールツリン-GDNFファミリーのファミリー構成因子間の変動を理解できる。ヒトとマウスのニュールツリンは約40%の配列の識別性をもち、ヒト、マウスおよびラットのGDNFの配列保存は約50%である。同様に、異なるファミリー構成因子は、ニュールツリンの配列同一性の約40%、GDNFの配列同一性の約40%の配列同一性をもち、ニュールツリンとの同一性は約30%から85%までの範囲にあり、GDNFとの同一性は約30%から85%の範囲にあると考えられている。したがって、1つの種からの一定の非ニュールツリンおよび非GDNFファミリー因子は、ヒトニュールツリンおよびヒト以外の哺乳類ニュールツリン間の配列に比べる場合、同種からのニュールツリンおよびGDNFの配列との方が配列同一性が少ないが、ヒトニュールツリンとGDNF上記（上記のKingsley）を除くTGF-β上部ファミリー因子のその他の既知因子との間の配列と比べた場合、配列同一性がはるかに大きいことを示すことが期待されている。プレ−プロ  ニュールツリンの場合、ヒト以外の哺乳類の種のプレ−プロ  ニュールツリンの相同性は、ヒトのニュールツリンと約85%以上の配列同一性を持つアミノ酸配列のニュールツリン部分によって確認することができる。非哺乳類の種のプレ−プロ  ニュールツリンの相同性は、ヒトニュールツリンと約65%以上の相同性をもつアミノ酸配列のニュールツリン部分によって確認することができる。
ニュールツリンには、融合タンパクやニュールツリン断片、バイブリッドや一時異変形を含むハイブリッドおよびニュールツリンの一時変異形も含めることができる。ハイブリッドや一時変異形では、ある種のアミノ酸が削除されるか置き換えられる。ニュールツリンにはまた、ハイブリッドや一時変異形がニュールツリンの生物学的活動を維持する限り、１つ以上のアミノ酸が一時変異アミノ酸か異常アミノ酸、グリコソレーション（glycosolation）などの一時変異形に置き換えられるなどの一時変異も含めることができる。これは生物学的活性の維持により、ニューロンの生存率が促進されることを意味する。しかしこれは必ずしも、CHO細胞による調整済培地または組換えで生成されたヒトまたはマウスニュールツリンの細胞調整済培地から分離されたニュールツリンの効能と同じレベルの活性度を意味するものではない。
「実質的に相同」という意味には、本文に記載するニュールツリン抗体との相互反応性により分離することができるあらゆるニュールツリン、またはゲノムDNA、mRNA、cDNAを含むコード化ヌクレオチド配列の補足的な配列を、ゲノムもしくは副ゲノムヌクレオチドまたはニュールツリンのcDNAかその断片との補完的配列のハイブリダイゼーションにより分離することができるあらゆるニュールツリンを含める。またこの技術に習熟した者なら、変性DNA配列がヒトニュールツリンをコード化することができること、且つニュールツリンの対立遺伝子変種と同様、これらの配列を本発明に含めることを意図していることを理解されるであろう。プレ−プロ  ニュールツリンの場合、プロ領域のコーディング配列に位置するイントロンから得られる交互にスプライシングされたタンパク生成物が存在するかもしれない。イントロンはマウスとヒトのプレ−プロ  ニュールツリン配列のアミノ酸57内の位置に相応するCDNA核酸169と170間の配列に相応する位置のゲノム配列に存在すると思われる（図７および図８参照）。
したがって、この位置の交互スプライシングは、本文で識別したヒトとマウスのプレ−プロ  ニュールツリン（それぞれ配列番号（SEQ ID NO）：11および配列番号（SEQ ID NO）：12）配列とは、1つ以上のアミノ酸の追加および／または除去により識別されたアミノ酸の部位において、異なる配列を生み出すかもしれない。本文中で使用した用語「プレ−プロ  ニュールツリン」には、すべての交互スプライシングのプレ−プロ  ニュールツリンを含めることを意図している。
発明者は本文中でいかなる理論によっても影響されていないが、本文に識別されているヒトおよびマウスのタンパクならびに他の組織および種からの相同体が、TGF-β上位ファミリーの他の因子として知られるものと矛盾しない方法で、生物学的にアクティブな形のダイマーとして存在する可能性があると思われている。
ホモダイマーの他に、ニュールツリンダイマーのモノマー単位を使用して、ニュールツリンから得られる最低1個のモノマー単位を含む安定した成長因子のヘテロダイマーあるいはヘテロマルチタイマーを構築することができる。この構築は、ニュールツリンのホモダイマーをその構成モノマー単位に分離させ、第2ホモダイマー成長因子のモノマー単位のあるところで、再び結合させることにより行うことができる。この第2ホモダイマー成長因子は、多様な成長因子から選択することができる。例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5などのGDNFやNGFファミリー構成因子、またはTGF-βの上位ファミリー、血管内皮成長因子またはCNTF/LIFファミリーなどが第2ホモダイマー成長因子として挙げられる。
成長因子は特定の受容体に作用すると考えられている。例えば、TGF-βおよびアクチビン（activins）の受容体が確認されており、Ser/Thrキナーゼ・トランスメンブレンタンパクのファミリーを構成する（Kingsley, Genes and Dev 8:133-146, 1994; Bexk et al Nature 373:339-341, 1995参照により本文に採用）。NGFファミリーではNGFは、末梢知覚および交感神経ニューロンならびに基底前脳ニューロンにおいてTrkA受容体に結合する。BDNFとNT-4/5は、trkB受容体に結合する。さらにNT-3は、主としてCNS（中枢神経系）中に明確に分布するtrkC受容体に結合する（Tuszynskiほか、Ann Neurol 35:S9-S12, 1994）。発明者は、GDNF、ニュールツリンおよび成長因子ファミリーの未知因子が、他の成長因子ファミリーで示されたような明確な分布をもつ特殊な受容体を通じて活動していると考えている。したがって、ニュールツリンのヘテロダイマーもしくはヘテロマルチマー、およびその他の成長因子を1つ以上組成することにより得られる成長因子は、異なる組織分布をもつ最低2つの明確な受容体タイプに結合できると考えられる。こうして得られたヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーは、細胞の拡大スペクトルを示すことが予想されている。ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーは細胞に作用するか、より大きな効能を提供することが可能である。また、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーは、ホモダイマーまたはホモマルチマーには見られない相乗効果を提供することも可能である。例えば、異なるクラスの因子の組み合わせは、神経膠細胞の長期の生存を促進することが明らかにされたのに対し、同じクラス内の単一の因子やその組合わせは短期の生存しか促進しなかった（Barresほか、Development 118:283-295, 1993）。
ヘテロダイマーは多くの方法で構成することができる。例えば、解離／展開試薬などの使用により解離／展開を起こすホモダイマーを混合して、コンディショニング（前処理）をほどこす。次にモノマーの再結合とヘテロダイマー形成を可能にするコンディショニングにさらす。解離／展開試薬には、タンパクの解離を促進することが知られるあらゆる試薬が含まれる。代表的な試薬には、塩酸化グアニジン、尿素、チオシアン酸カリウム、HCl緩衝液など、pH値を下げる試薬、さらにアセトニトリルまたはアルコール（プロパノール、イソプロパノールなど）など極性がある水混和性の有機溶剤などがある。さらに、二硫化結合で電子対結合されたホモダイマーについては、TGF-βファミリー因子の場合と同じく、解離／展開および再結合を促進することが知られているジチオールトレイトールやβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を、解離／展開や再結合／再重複に用いることができる。
またヘテロダイマーも、ニューロトロフィンで行ったように、形質転換された細胞がヘテロダイマーを生成するような方法で、2つ以上の因子で細胞のトランスフェクションを行なって作ることができる（HeymachおよびSchooter, J Biol Chem 270:12297-12304, 1995）。
ヘテロダイマーを作る別の方法は、ニュールツリンホモダイマーと第二成長因子からのホモダイマーを組み合わせ、混合物を37℃で培養することである。
ホモダイマーからヘテロダイマーを生成する場合、予備的な非変性ポリアクリルアミド・ゲルからの溶離などの本技術に熟達した者が利用できる方法を用いて、ホモダイマーからヘテロダイマーを分離することができる。別の方法として、モノSカチオン交換カラムまたは段階的免疫親和性カラムなどの高圧カチオン交換クロマトグラフィーを用いて、ヘテロダイマーを精製することができる。
成熟タンパクの配列のN末端にあるシグナル配列をもつ細胞内で、多くのタンパクが合成されることが本技術分野ではよく知られている。そのようなリーダー配列を運ぶタンパクは、タンパクのプレ部分と呼ばれる。タンパクのプレ部分はタンパクの細胞処理の間に分裂する。プレリーダー配列のほかに、多くのタンパクが、成熟タンパクの安定した前駆物質であるタンパク上の領域を示す明確なプロ配列を含んでいる。プレ領域およびプロ領域の両方で合成されたタンパクは、プレ−プロタンパクと呼ばれる。他のTGF-βファミリー因子および本文で決定された配列で起きることが知られている処理イベントをかんがみ、発明者は細胞内で合成されるニュールツリンタンパクの形は、プレ−プロ  ニュールツリンであると信じる。プレ−プロ  ニュールツリンはN末端の19個のアミノ酸シグナル配列を含むと考えられている（ヒトプレシグナル配列、配列番号（SEQ ID NO）：15、図7、アミノ酸1〜19は配列番号（SEQ ID NO）：17によってコード化される。
図7、核酸1〜57；マウスプレシグナル配列、配列番号（SEQ ID NO）：16、図8、アミノ酸1〜19は配列番号（SEQ ID NO）：18によってコード化される。図8、核酸1〜57）。リーダー配列の全長はシグナル配列として作用するためには必ずしも必要な配列ではないことが知られており、したがって、ニュールツリンのプレ領域の定義にはその断片（普通はN末端断片）が含まれていない。これはシグナル配列として機能できる性質を有し、ミトコンドリア、ゴルジ、血漿メンブレンやその他このような１つ以上の細胞器官のメンブレンへの翻訳・挿入を容易にすることを意味する。
シグナル配列のあとには、成熟ニュールツリンのN末端のアミノ酸配列直前のRXXRタンパク分解処理部位を含むプロ領域が続く。（ヒトプロ領域配列、配列番号（SEQ ID NO）：19、図7、アミノ酸20〜95は核酸配列、配列番号（SEQ ID NO）：20によってコード化。図7、核酸58〜285;マウスのプロ領域、配列番号（SEQ ID NO）：22、図8、アミノ酸19〜95は核酸配列、配列番号（SEQ ID NO）：21によってコード化。図8、核酸58〜285）プレ領域およびプロ領域はともに、ヒトプレ−プロ配列（配列番号（SEQ ID NO）：23，図7，アミノ酸1〜95は配列番号（SEQ ID NO）：25によりコード化、核酸１〜285）および、マウスプレ−プロ配列（配列番号（SEQ ID NO）：24，図8,アミノ酸1〜95配列番号（SEQ ID NO）：26でコード化。核酸1〜285）として識別したプレ−プロ配列を構成する。プレ領域配列およびプロ領域配列ならびにプロ−プロ領域配列は、本文に定義のプレ−プロ  ニュールツリンの内部に包含されている配列に基づいて、非ヒト哺乳類および非哺乳類の種として識別し採取することが可能である。
上記の標識を利用して、分泌された成熟ニュールツリン分子は約11.5kDと推測され、TGF-βファミリーの他の構成因子からの類推によって、二硫化物でつながった約23kDのホモダイマーを形成していると見られる。予測された約23kDのタンパクは、ホモダイマーであるCHO細胞で調整された培地から精製された25kDのタンパクと一致している。発明者は、ニュールツリン発現ベクター（pCMV-NTN-3-1）でトランスフェクションを行ったチャイニーズハムスターの卵巣細胞の調整済培地から、約11.5kDのタンパクを検出した。その方法には、モノマーであると考えられるSDS-PAGEを還元条件の下で用いた。
プレおよび／またはプロ領域のヌクレオチド配列も、他の成長因子またはタンパクのコード配列でキメラ遺伝子を構成するのに用いることができる。同様にキメラ遺伝子は、他の成長因子またはタンパクの遺伝子のプレおよび／またはプロ領域をコード化する配列に結合されたニュールツリンのコーディング配列からも構成することができる。（Boothほか、Gene 146:303-8, 1994; Ibanez, Gene 146:303-8, 1994; Storiciほか、FEBS Letters 337:303-7, 1994; ShaほかJ Cell Biol 114:827-839, 1991参照により本文に採用）。こうしたキメラタンパクは、活性タンパク種の生成または発現の変更を示す可能性がある。
本発明の好適なニュールツリンは、CHO細胞で調整された培地中に識別され、同培地から精製され分離された。また好適なニュールツリンには、組換えDNA技術によって調製されるニュールツリンもある。「純粋な形」、「精製された形」または「実質的に精製された形」とは、ニュールツリン組成にはニュールツリン以外の他のタンパクが実質的には存在しないことを意味する。
組換え型ヒトニュールツリンは、適切に形質転換された宿主細胞の中でニュールツリンをコード化するDNA配列を発現することによって生成することができる。本技術分野で周知の方法を用いて、ニュールツリンをコード化するDNAを発現ベクターに結合し、宿主細胞内へ形質転換する。こうして形質転換された細胞によるニュールツリンの発現に適した条件を設定することができる。
適切な発現ベクターならどんなベクターも組換え型ヒトニュールツリンの生成に使用することができる。一例をあげると、哺乳類の発現ベクターpCB6（Brewer, Meth Cell Biol 43:233-245, 1994）や、E.コイルpET発現ベクターなどがあるが、特にpET-30a（Studierほか、Methods Enzymol 185:60-89, 1990参照により本文に採用）はよく知られている。本文では上記のベクターを用いている。哺乳動物とバクテリア細胞内の発現に好適なその他の発現ベクターで、本分野で知られているのは、イーストか昆虫の細胞で使用するための発現ベクターである。また、バクロウイルス発現系を使うこともできる。
ニュールツリンはモノマー単位で発現させることもできる。またはそのようなモノマー形を還元状態下の調整によって生成することができる。このような事例では、タンパクの再結合と復元は、タンパク類の解離／結合を促進することで知られている上記因子の１つを使用してこれを達成することができる。例えば、モノマー形をまずジチオトレイトールによって培養し、次に酸化グルタチオン二ナトリウム塩による培養、続いて尿素などの再結合試薬を含む緩衝液による培養で生成する。
CHO細胞による調整済培地から精製されたニュールツリンのN末端の配列と内部断片からの類推によって成熟マウスの配列を推定し、この配列からヒト遺伝子から得た配列を用いて成熟ヒト形を予測した。
成熟ヒト形のアミノ酸配列を図5に示した（hNTN,配列番号（SEQ ID NO）:1）。
CHO細胞による調整済培地から精製された物質は、成熟ニュールツリンであると考えられ、ダイマーか他のマルチマーかとして存在しており、他の方法で糖化されているか化学的に変更されていることも考えられる。上述のように、マウスおよびヒト核酸配列が示唆するのは、ニュールツリンが初めにプレ−プロポリペプチドとして翻訳されたこと、そしてシグナル配列およびこの分子のプロ領域のタンパク分解処理が、本文中で「成熟ニュールツリン」と称され、CHO細胞による調整済培地から採取され、かつ相同形のヒトおよび非ヒト種内に存在する、と記載されている成熟配列を生成することである。したがって本発明は、ヒトおよび非ヒト種に由来するあらゆる「成熟ニュールツリン」配列を含み、かつニュールツリン遺伝子から翻訳可能なあらゆるプレ−プロ  ニュールツリポリペプチドを含む。
プレ−プロ  ニュールツリンポリペプチドのコーディング配列は、クローンの5’末端においてメチオニンをコード化する最初のATGコドンで開始されると考えられる（図９のポジション1）。このクローンの5’末端は、精製ニュールツリンから得たアミノ酸配列をコード化する配列と同じ読取り枠内に存在する。最初のコドンの下流には、プレ−プロ領域用のコーディング配列を含む大きな読取り枠内があり、その後に成熟マウスのニュールツリン用のコーディング配列が続く。
マウスニュールツリンゲノムクローンの配列分析によって、cDNAクローンからのプレ−プロ  ニュールツリンのヌクレオチド169と170との間に、0.5kbのイントロンを確認した。このイントロンはプレ−プロ  ニュールツリンタンパクのプレ領域のコーディング配列内に存在する。したがって、マウスのニュールツリン遺伝子は少なくとも2つのエクソンを含むと考えられ、その１つがスプライシング部位の上流にコーディング配列を含み、もう１つも下流にコーディング配列を含んでいると考えられる（図８、配列番号（SEQ ID NO）：29，配列番号（SEQ ID NO）：30）。GDNF遺伝子の相同部位にはイントロンがあることが知られており、GDNFの交互スプライシング形をRT-PCR実験によって検出した（Suter-Crazzolara & Unsicker, Neuroreport 5: 2486-2488, 1994参照により本文に採用）。この交互形は、当初報告されたスプライシング部位の3’端の78bpにある第二コーディング・エクソン内のスプライシング部位を用いて得られる。交互にスプライシングされた形は、当初報告された形から26個のアミノ酸を削除することにより、GDNFタンパクをコード化する。２つの形が異なった組織内で異なった比率で表現される。マウスのP1脳とP1肝臓cDNAsを用いたRT-PCRおよびRACE実験では、ニュールツリンの交互スプライシング形は検出されなかった。しかしながら、ニュールツリン遺伝子の交互スプライシング部位が異なった組織内で利用できる可能性が存在している。
ヒトニュールツリンのcDNAのコーディング配列は、ヒトニュールツリンゲノムクローンの配列から推定された。ヒトcDNAのコーディング配列は、マウスのcDNA配列と同じく、コーディング配列のヌクレオチド169と170との間のイントロンによって切断される。したがって、ヒトニュールツリン遺伝子は少なくとも2つのエクソンを含み、その１つがスプライシング部位の上流にコーディング配列を含み、もう１つは下流にコーディング配列を含むと考えられる（図７、配列番号（SEQ ID NO）：27，配列番号（SEQ ID NO）：28）。スプライシング部位は、ヒトおよびマウス遺伝子のイントロンおよびエクソンが交差する接点に保存されている。
こうして推定したヒトニュールツリンのアミノ酸配列から、位置286と339の間にN末端の配列が横たわることを早期に予測し、また位置385と417との間、位置474と533との間、および位置547と576との間に、内部配列が横たわることを予測した。位置592-594にあるTGA停止コドンは読取り枠を終了させる。
精製プレ−プロ  ニュールツリンの予測長は、ヒトプレ−プロ  ニュールツリンの場合、197個のアミノ酸残基（配列番号（SEQ ID NO）：７）であり、マウスのプレ−プロ  ニュールツリンの場合、195個のアミノ酸残基（配列番号（SEQ ID NO）：８）である。このポリペプチドの予測分子量はマウスの場合、22.2kDで、ヒト場合、22.4kdである。精製ニュールツリンの予測長は、100個のアミノ酸残基であり、予測モノマー分子量は11.5kDである。しかし、N-結合の糖付加部位はなく、ヒトニュールツリンの位置18、26、80、86および95にあるアミノ酸残基で、潜在的O-連結の糖付加部位が発現する。これらの部位の１つか組合わせた部位は分子の分子量を増加させるだろう。プレ−プロ  ニュールツリン配列には異なる開裂部位が存在するかもしれない。成熟マウスのニュールツリンのアミノ酸配列（図５、配列番号（SEQ ID NO）：２）は、精製チャイニーズハムスターニュールツリンのN-末端のアミノ酸配列のアラインメントから予測される。４残基RRAR開裂部位（アミノ酸92-95）は、成熟マウスニュールツリンの予測N-末端アミノ酸のすぐ前に発見される。このRRAR配列はRXXR共通配列に一致する。この共通配列ではTGF-βの上位ファミリー構成因子がふつう開裂する。推測によるこのRRAR開裂配列はヒトニュールツリンに保存される。しかし、この配列で開裂される場合、成熟ヒトニュールツリンは、成熟したマウスのニュールツリンに比べて、アミノ酸のN-末端に2個の残基を余分にもつことが予測される。ニュールツリンには、RXXR共通配列（例えばアミノ酸90-93の配列RRRR）に一致する配列が他にもあり、この開裂にかかわるプロテアーゼの特異性が完全には理解されていないため、ある条件下ではニュールツリンがRRAR配列以外の部位で開裂される可能性があり、成熟ニュールツリンタンパクは、マウスの配列（プレ−プロタンパク）の場合ポジション101、ヒト配列の場合ポジション103にあるシステイン残基に先行する部位に、可変数のアミノ酸をもつ可能性がある。このような交互の開裂部位は、異なった生物間と同じ生物の異なった組織間では、異なった利用の仕方がなされるであろう。TGF-βファミリー構成因子の成熟形にある７個の保存システインの第1番目に先行するN-末端アミノ酸は、長さにも配列にも著しく変動がある。さらに、10個の残基からなるアミノ酸配列を、最初に保存されたシステイン残基の2個上流に挿入することによって、1つのファミリー構成因子ドルサリンのよく知られた生物学的活動が影響を受けることはない（Basler, K., Edlund, T., Jessell,T.M., and Yamada, T.,（1993）Cell 73:687-702）。したがって、マウスのシステイン101、ヒトのシステイン103に先行する異なった長さの配列を含むニュールツリンタンパクは、生物学的な活性を維持することが予想される。
発明者は本文で少なくとも、生物学的活性を示すニュールツリン配列はヒトニュールツリン（図７、配列番号（SEQ ID NO）：31）の場合、システイン103で始まりシステイン196で終わり、マウスのニュールツリン（図7、配列番号（SEQ ID NO）：32）の場合、システイン101で始まりシステイン194で終わる配列を含むと考えている。したがって、本発明の請求範囲には、配列番号（SEQ ID NO）：31を含むアミノ酸配列および、配列番号（SEQ ID NO）：32を含むアミノ配列、ならびにこれらのアミノ配列をコード化する核酸配列を含める。
本発明には、ヒトとマウスのニュールツリンをコード化する配列を含む核酸配列を含める（図5）。また本発明の請求範囲には、ニュールツリンをコード化する核酸配列と実質的に同じ配列が含まれている。例えば、このような実質的に同じ配列は、周知の標準的手法に従って、E.コイルのなどの一定の宿主細胞の中でより容易に発現するコドンで置き換えられるかもしれない。そのような変更された核酸配列も本発明の請求範囲の中に含められるであろう。
本技術に熟練した者は特定の核酸配列を変更することができる。したがって、プレ−プロ  ニュールツリンのアミノ配列、またはプレ領域またはプロ領域、またはニュールツリンのコード化を行うすべての核酸配列を同様に変更することができる。したがって本発明にはまた、このようなすべての核酸配列（または適宜、核酸配列の補体と呼ばれる）とハイブリダイゼーションを行い、また細胞生存作用を促進するポリペプチドのコード化を行う核酸配列が含まれる。本発明にはまた、ニューロンの生存促進作用を有し、ニュールツリンに結合する抗体によって識別されるポリペプチドのコード化を行う核酸配列も含まれる。
また、本発明には、本発明の請求範囲に含めた核酸配列のいずれにも機能的に結合する発現規制因子からなるベクターを含める。また本発明には、本発明の範囲に含めた核酸配列のいずれにも機能的に結合する発現規制因子からなるベクターによって形質変換されたあらゆる変種の宿主細胞を含める。
また本文には、ニュールツリンを生成する方法も述べている。標本は様々な細胞タイプからの調節済培地からの分離によって調製することができる。ただし当該細胞タイプがニュールツリンを生成することを条件とする。２番目に好適な方法として、ニュールツリンをコード化する核酸配列を分離し、配列を適切な規制配列と共に適切なベクターおよび細胞タイプ内へクローニングを行い、かつニュールツリンを生成するための配列を発現させることによる、組換え型利用の方法がある。
４つの神経栄養因子--神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDGF）、ニューロトロフィン（neurotrophin）-3（NT-3）、およびニューロトロフィン-4/5（NT-4/5）--から成る哺乳類の遺伝子ファミリーを確認した。これらの因子は約60のパーセントの核酸配列相同性を共有する（Tuszynski＆Gage, Ann Neurol 35:S9-S12, 1994参照により本文に採用）。ニュールツリンタンパクは神経成長因子のNGFファミリーに対しては顕著な相同性を示さない。ニュールツリンは成長因子のTGF-β上位ファミリーと20%未満の相同性を共有するのみである。しかし、ニュールツリンはGDNFと約40%の配列の相同性を示す。特に、ニュールツリンにもGDNFにもある７個のシステイン残基の位置は正確に保存される。発明者は本発明で、タンパクをコード化し、ニュールツリンおよびGDNFに対して著しいアミノ酸配列相同性を有し、かつ同じか異なる組織および同じか異なる生物学的活性に対して選択性を有する成長因子として機能する他の未確認遺伝子が存在するかもしれないと考える。影響を受ける組織および／または引き起こされる反応に関しては、異なったファミリー構成因子による異なった受容体の優先的な活性化から、異なった多様な活動が生じる可能性がある。これは神経成長因子のNGFファミリー構成因子で起こることが知られている（上記Tuszynski and Gage, 1994）。
ファミリー構成因子のタンパク生成物の中に、アミノ酸配列の実質的な保存を示す特定遺伝子ファミリーの構成因子の影響として、DNAレベルにおいて配列が相当保存されている。これはGDNFおよびニュールツリンが属する遺伝子ファミリーの他の構成因子を確認するための新しい方法の基礎を形成する。そのような識別に用いられる方法は、１つのファミリー構成因子から得られる核酸プローブを使用するクロスハイブリダイゼーションである。この方法では、遺伝子ファミリーの異なる構成因子から得た核酸配列を用いて、安定したハイブリッドの二重構造分子を形成することができる。または異なったファミリー構成因子から核酸配列を増幅することができる。（Kaisho et al., FEBS Letters 266:187-191, 1990参照により本文に採用）。異なったファミリー構成因子からの配列は、プローブと同じではないかもしれないが、プローブとのハイブリダイゼーションには、プローブ配列に十分類似していると考えられる。代替方法として、ファミリー構成因子をさらに確認するため、1つのファミリー構成因子からのプライマーを使用するPCRを使用することができる。
上記方法では、これまで１つのファミリー構成因子であるGDNFしか知られていなかったため、他の遺伝子ファミリー構成因子の確認に成功していない。しかし、ニュールツリンが本文で確認されたことで、この遺伝子ファミリーの保存部位から配列を含むユニークで新しいプローブとプライマーを生成することができる。特に、新しいプローブとプライマーを構築する基礎として使用できる３つの保存領域が本発明で確認された。本発明で利用可能になった新しいプローブとプライマーにより、この強力な新しい方法が可能になり、いまでは他の遺伝子ファミリー構成因子を成功裡に識別することができるようになった。この新しい方法を用いて、GDNFとニュールツリンの分子中の保存領域に基づくDNAまたはRNAのプローブを調製することにより、配列の相同なGDNFとニュールツリンに関連した遺伝子の選別を行うことができる。したがって、本発明の実施例の１つには、ヌクレオチド配列に固有またはそれらの配列に由来するプローブとプライマーが含まれる。上述の配列はこのような保存領域および識別方法のコーディングを行う。これはGDNF-ニュールツリン遺伝子ファミリーの構成因子をさらに識別するためである。保存領域のアミノ配列には以下の配列が含まれる。Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr（うちXaa1はSerまたはThr、Xaa2はGluまたはAsp）（配列番号（SEQ ID NO）：33）；Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys-Xaa6-Xaa7-Ala（うちXaa1はThrまたはGlu,Xaa2はValまたはLeu,Xaa3はLeuまたはIle,Xaa4はAlaまたはSer,Xaa5はAlaまたはSer,Xaa6はGluまたはAsp,Xaa7はAlaまたはSer）;（配列番号（SEQ ID NO）：34）;Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa1-Ala-Xaa2-Xaa3-Asp-Xaa4-Xaa5-Ser-Phe-Leu-Asp（このうちXaa1はThrまたはValまたはIle,Xaa2はTyrまたはPhe,Xaa3はGluまたはAsp,Xaa4はGluまたはAsp,Xaa5はValまたはLeu）（配列番号（SEQ ID NO）：35）。上記の保存配列または上記の保存配列の断片のためのコーディング配列を含むヌクレオチド配列はプローブとして使用することができる。模範的なプローブおよびプライマー配列には、アミノ配列をコード化する次のような核酸配列がある：配列番号（SEQ ID NO）：33、配列番号（SEQ ID NO）：36、配列番号（SEQ ID NO）：37、配列番号（SEQ ID NO）：38、配列番号（SEQ ID NO）：39、配列番号（SEQ ID NO）：40、配列番号（SEQ ID NO）：41。次の核酸配列は特に好適である。配列番号（SEQ ID NO）：42、配列番号（SEQ ID NO）：43、配列番号（SEQ ID NO）：44、配列番号（SEQ ID NO）：45、配列番号（SEQ ID NO）：46、配列番号（SEQ ID NO）：47、配列番号（SEQ ID NO）：48。
核酸配列の保存領域から得られた新しいプローブを使用するハイブリダイゼーションは、還元状態の刺激の強い条件下で行なわれるだろう。刺激の強い条件の決定に係わる要素は、本技術でよく知られている（例えばSambrookほか、Molecular Cloning, 2nd Ed., 1989参照により本文に採用）。選別用の核酸の供給源には、哺乳類またはcDNAライブラリーから得られるゲノムDNAライブラリーが含まれる。このライブラリーは、好適なベクター内へクローニングされた哺乳類の細胞から得られるRNAを用いて構築される。
PCRプライマーは低めのアニーリング（焼き戻し）温度のPCR条件下で利用される。アニーリングによりGDNFとニュールツリン以外の遺伝子ファミリー構成因子からの配列の増幅が可能である。選別用の核酸の供給源には、哺乳類からの好適なベクター内へクローニングされた哺乳類からのDNAライブラリー、哺乳類の細胞より得られたRNAから転写されたcDNA、そして哺乳類から採取されたゲノムDNAが含まれる。
ハイブリダイゼーションまたはPCRアッセイに基づいて識別されたDNA配列の配列を行った後、配列をGDNFおよびニュールツリンと比較する。すると本文に記述するのと同じ方法で、新しい因子の全配列をコーディングするDNA配列を得られる。また、ゲノムDNAまたはゲノムクローンのライブラリーも鋳型として使用できる。なぜならGDNFおよびニュールツリンのイントロン／エクソン構造は保存されており、成熟タンパクのコーディング配列はイントロンによって中断されないからである。
ニュールツリンは特定のニューロンタイプの生存を促す能力に基づいて精製されてはいるが、この因子は他のニューロン細胞タイプにも作用する。例えばニュールツリンは、結節性知覚神経節ニューロンの生存を促進するものとして本文では説明している（例３参照）。またニュールツリンは、非ニューロン細胞の生存を促進するかもしれない。事実、今日まで分離されたすべての成長因子は、多くの異なる細胞タイプに作用するものとして示されてきた（例えばScully＆Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1005; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25:1418-1435, 1994参照で引用）。NGF（神経成長因子）は、交感神経ニューロン、いくつかのタイプの知覚ニューロン、および中枢神経ニューロンのある固体群に作用することが知られている。ニュールツリンに対してより密接な関係をもつGDNFは、ドパミン作用性ニューロン、交換神経性ニューロン、運動性ニューロン、その他いくつかの知覚ニューロンにも作用することが明らかにされている（Henderson et al, supra, 1994; Miles et al, J Cell Biol 130:137-148, 1995; Yan et al, Nature 373:341-344, 1995; Lin et al, Science 260:1130-1132, 1993; Trupp et al, J Cell Biol 130:137-148, 1995; Martin et al, Brain Res 683:172-178, 1995; Bowenkampほか、J Comp Neurol 355:479-489, 1995参照により本文に採用）。したがって、末梢交感神経知覚ニューロン以外にも、ニュールツリンは多種多様な中枢神経ニューロンおよび末梢神経ニューロンの細胞タイプに作用する可能性がある。
ニュールツリンはまた、非ニューロン細胞に作用して、それらの生存、成長または機能を促進するらしいことが考えられる。このように期待する根拠は、既知成長因子の活動である。NGFは原始型の神経栄養因子であるが、ラット新生児に注入すると、この成長因子は宿主細胞に作用して宿主細胞を増殖させる（Aloe, J Neuroimmunol 18:1-12, 1988）。さらに、宿主細胞はtrk受容体を発現し、かつNGFがあたかも宿主細胞分泌促進物質であり、生存促進因子であるようにNGFに反応する。（Horigome et al., J Biol Chem 269:2695-2707, 1994参照により本文に採用）。さらにTGF-β上位ファミリーの構成因子は、異なった機能と胚形成起源の多くの細胞タイプに作用する。
発明者は本文にて、ニュールツリンが血液や骨髄、新生児の肝臓、マスト細胞など、いくつかの非ニューロン組織に発現することを確認した。これはニュールツリンが造血、炎症およびアレルギーにある種の役割を果していることを表す。
NGFファミリーの神経栄養因子は、因子特有の親和性の高い受容体を経由して作用すると考えられる（上記、Tuszynski and Gage, 1994）。受容体の結合には、受容体部位で作用するタンパクの特定部分だけが必要とされる。そのような特定部分または不連続断片は、作用剤として機能することが考えられる。作動剤ではそれらの物質が受容体を活性化して、細胞の生存や成長を促進する作用をひき出す。またニュールツリンに対する拮抗剤として機能することも考えられ、そこではその因子はレセプターに結合しても、生存や成長は促進しなかったり、あるいは生存や成長を促進したりする。作動剤としてのそのような部分／断片および、拮抗剤としての部分／断片も本発明の範囲に含める。
合成による汎成長因子も、ニュールツリンの活性領域を他の１つ以上の成長因子の活性領域と結合させることによって構築することができる。（例えば、Ilagほか、Proc Nat’l Acad Sci 92:607-611, 1995参照により本文に採用）。これらの汎成長因子はニュールツリンと他の1つ以上の成長因子を結合した作用を有することが予想される。汎成長因子はそれ自体で強力な特効薬となる成長因子であると考えられ、幅広い退行型の病気や病状を治療するのに役に立つ。活性領域を親因子から得ることにより、これらの病気・病状はあらゆる親因子による治療が可能であろう。また、そのような汎成長因子は親因子の活性以上の相乗効果を発揮するかもしれない（上記Barresほか）。
本発明の範囲に含まれる汎成長因子には、少なくとも2つの成長因子の断片部分から構成されるキメラまたはハイブリッドポリペプチドを含めることができる。TGF-β上位ファミリーの成長因子は構造的に関連しており、高度に保存された配列の標識をもち、ファミリー構成因子の識別に役立つ。特に、7個の基準的枠組みのシステイン残基は上位ファミリー構成因子中でほとんど不変である（Kingsley, Genes & Dev 8:133-146, 1994参照により本文に採用）（図17参照）。したがって、キメラのポリペプチド分子は、乗換点までニュールツリン分子部分と実質的に同じ配列、ならびに、もう片方のTGF-β上位ファミリー構成因子部分と実質的に類似する配列で、片方のTGF-β上位ファミリー構成因子の対応乗換え点の反対側にのびる配列から構成することができる。ニュールツリンのそのような部分は、好適には、約10〜約90個、より好適には約20〜約80個、最も好適には約30〜約70の隣接するアミノ酸の鎖であり。非ニュールツリンTGF-β上位ファミリー構成因子は、好適には約10〜約90個、より好適には約20〜約80、最も好適には約30〜約70個の隣接するアミノ酸の鎖である。例えば、3番目のシステイン残基と4番目の基準的枠組みのシステイン残基との間には、特定の乗換え点があるかもしれない。このような模範的な１つの構造は、5’末端にヒトニュールツリン配列から成る配列を含む。この配列は、残基１から第３基準枠組みシステイン残基39を経て残基68までが含まれるが、第４基準枠組みシステイン残基69は含まれない。ハイブリッド構造の3’末端は、例えばGDNFのような他のTGF-β上位ファミリー構成因子に由来する配列を構成するだろう。このTGF-β上位ファミリー因子はニュールツリンに密接に関連している。GDNFをもう片方のTGF-βファミリー因子として使用して、乗換え点からのハイブリッド構造を構成することができる。その構造は、ヒトGDNFの第4基準枠組みシステイン残基101で始まり、ヒトGDNFの3’末端の残基134まで継続する配列から構成されるだろう。二番目の模範的なハイブリッド構造は、構造の5’末端で始まるヒトGDNFの残基１〜100から成り、ヒトニュールツリンの残基69〜102に継続的に結合させることができる。ニュールツリンおよびGDNFを有する上記構造体は、特定のTGF-βファミリー構成因子を有する事例のみを意図したものだが、この因子は以下に述べる因子他を含むファミリー構成因子から選択される。形質転換成長因子β１（TGFβ１）、形質転換成長因子β２（TGFβ２）、形質転換成長因子β３（TGFβ３）、インヒビンβＡ（INHβＡ）、インヒビンβＢ（INHβＢ）、結節性遺伝子（NODAL）、骨形態発生タンパク類２および4（BMP2とBMP4）、ショウジョウバエ・デカペンタプレジック（Drosophila decapentaplegic）遺伝子（dpp）、骨の形態発生タンパク類5-8（BMP5、BMP6、BMP7およびBMP8）、ショウジョウバエ60A遺伝子ファミリー（60A）、骨形態発生タンパク3（BMP3）、Vg1遺伝子、成長分化因子１と3（GDF1とGDF3）、ドルサリン（drsln）、インヒビンα（INHα）、MIS遺伝子、成長因子9（GDF-9）、グリア由来神経営養成長因子（GDNF）およびニュールツリン（NTN）（図18参照）。なお、乗換え点は、第１および第７基準枠組みシスティン分子と、特定の片方ファミリー構成因子との間に存在する残基のいずれでも有り得る。
特定のキメラ分子を構成するには、ニュールツリンの一部と、もう片方の部分つまり非ニュールツリン成長因子をPCRを用いて増幅し混合して、PCR反応用の鋳型として使用する。この反応にはキメラ分子の２つの構成部分の一方からの前向きプライマーと、もう片方からの逆向きプライマーを使用する。そこで例えば、前向きと逆向きのプライマーを選んで増幅を行うが、それには最初のプライマーから、選択した第３および第４基準システイン残基の間に存在する選択乗換え点までのニュールツリンの一部のニュールツリンプラスミッドを鋳型として使用する。次に、ニュールツリン配列の短い重複部分をもつ前向きプライマーと、逆向きプライマーを用いて、もう片方の部分、つまり対応乗換え点から3’末端までのTGF-β上位ファミリーの非ニュールツリン成長因子を増幅する。鋳型には非ニュールツリンTGF-βファミリー因子のコーディング配列を含むプラスミドを使用する。2つのPCR反応から得られた生成物をゲルで精製し、混合してPCR反応を行う。PCR反応はアリコートを鋳型として、非ニュールツリン成長因子のニュールツリンの前向きプライマーおよび逆向きプライマーを用いて行う。次にこの生成物をキメラ分子生産のため発現ベクターへクローニングする。
キメラ成長因子は細胞の成長と発達の促進に有効なことが予想され、ニューロン特有の細胞の機能低下や変性、壊死の予防に使用できることが期待される。また、キメラのポリペプチドは、キメラポリペプチドを構成する完全な因子の同一受容体の拮抗剤として作用する可能性があり、また上述の受容体で作用するその他の成長因子の拮抗剤としても作用する可能性がある。またこのようなポリペプチドは、食糧、可燃エネルギー源、および粘性を高める溶質として使用することもできる。
また本発明には、細胞変性患者を有効量のニュールツリンで治療する治療法または調剤、あるいは治療的に有効な量のニュールツリンを投与することを含む方法を含めている。これらの組成および方法は多くの変性疾患の治療に有効である。細胞変性がニューロンの変性に係わる場合、次のような疾病がある。末梢（ニューロパシー）神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経系腫瘍、多発性硬化症、末梢神経外傷か負傷、神経毒由来傷害、糖尿病また腎不全のような代謝不全症など。細胞変性が骨髄細胞変性に係わる場合、好酸球減少および／または好塩基球減少などの血球欠乏症を含む以下のような疾病がある。リンパ球減少、単球減少、好中球減少、貧血、血小板減少、上記疾病のいずれにも共通する茎細胞欠乏など。また、上記の細胞と組織の機能低下も治療可能である。
本組成と方法は、他の非ニューロン組織内の変性を防止するのみでなく、生存の促進にも有効であろう。本技術の熟練者なら周知の様々なアッセイを使用して特定の細胞タイプの生存や機能の促進にニュールツリンが有効か否かをただちに判断できるはずである。
ある条件の下では、発現ニュールツリンの量を調整するか減少させるのが望ましいかもしれない。例えば、発明者は、移植遺伝子によるマウスニュールツリンの過剰発現は皮下および肝臓に多量の脂肪の蓄積による肥満をもたらすことを発見した。ヒトにおけるニュールツリンのそのような生産過剰は新陳代謝を変えてしまい、過剰の脂肪組織を生成してしまうと考えられている。このような病状の場合、組織に存在するニュールツリンの量を調整するか減少させることが望ましい。ニュールツリンを調節ないし減少させる治療法として、ニュールツリン抗体（ポリクローンか単クローンのいずれか）の投与、ニュールツリン発現を調整させるアンチセンスポリヌクレオチドの使用、拮抗性を有するハイブリッドかキメラの使用などがある。
したがって、本発明のもう１つの側面には、単離し精製されたニュールツリンアンチセンス・オリゴノヌクレオチドを生産し、細胞のニュールツリン発現のレベルを減らすための方法を利用するがある。これは1つ以上のニュールツリンアンチセンス・オリゴノヌクレオチドの投与からなる。「ニュールツリンアンチセンス・オリゴノヌクレオチド」とは、ヌクレオチド配列を持ち、塩基対の組合せを通じて、特定の相補的核酸配列と相互作用するオリゴノヌクレオチドを意味する。この相補的核酸配列はニュールツリンの発現が抑制されるような仕方でニュールツリンの発現にかかわる。好適には、ニュールツリンの発現にかかわる特定の核酸配列には、ニュールツリンをコード化するゲノムDNA分子かmRNA分子がある。このゲノムDNA分子には、ニュールツリン遺伝子の規制領域、ニュールツリン遺伝子のプレ領域またはプロ領域、ニュールツリンタンパクのコーディング配列などが含まれる。したがって、ニュールツリンアンチセンス・オリゴノヌクレオチドおよび生産方法に関連して用いられるヌクレオチド配列に「相補的であること」という用語は、ヌクレオチド配列に対して十分相補的であるため、生理的条件下で細胞内の当該配列へのハイブリダイゼーションを可能にすることを意味する。ニュールツリンアンチセンス・オリゴノヌクレオチドは好適には、オリゴノヌクレオチドが約８〜約100個のヌクレオチドを含む配列からなり、より好適には、約15〜約30個のヌクレオチドから構成されることである。またニュールツリンアンチセンス・オリゴノヌクレオチドには、まざまな一時変異を含む誘導体を含めることができる。この誘導体により、変異したヌクレオシドの相互結合、変異さた核酸塩基、および／または糖などの核小体の分解に対して抵抗力が与えられる（Uhlmann＆Peyman, Chemical Reviews 90:543-584, 1990; Schneider＆Banner, Tetrahedron Lett 31:335, 1990; Milligan et al, J Med Chem 36:1923-1937, 1993; Tseng et al, Cancer Gene Therap 1:65-71, 1994; Miller et al, Parasitology 10:92-97, 1994参照により本文に採用）。そのような誘導体には以下のような主要な一時変異が含まれるがこれに限定されない。りん酸トリエステル、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホラミデート（phosphoramidate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホルムアセタール、モルフォリノ（morpholino）、ペプチド核酸類似体とジチオ酸塩の繰り返しユニット。本発明のニュールツリンアンチセンス・ポリヌクレオチドは、肥満の治療や組織異常増殖の抑制などのニュールツリンの過剰発現、またはニュールツリンの不適切な発現などの治療に使用することができる。また、そのような治療は細胞の体外処置を含む場合もある。
本発明の治療法ないし調製は、医学上適切な経路で実施できる。例えば、その経路には静脈、皮下、筋内、経皮、硬膜下腔内、大脳内などがあり、または体外処置プロトコルで細胞に投与することもできる。投与は注射のように迅速な場合と、一定の期間に及ぶ輸液とか低速放出剤による投与のいずれかに分かれる。中枢神経系で組織を処置するために、投与は脳脊髄液（CSF）の中に注射か注入を使用することができる。ニュールツリンを中枢神経系の細胞に投与する場合、投与は血液脳関門を越えてニュールツリンの浸透を促進することができる１種以上の薬剤を同時に使用することができる。
ニュールツリンはまた、好適な処方上または薬理的特長を供与する薬剤に結合させることができる。例えば、ニュールツリンは、本技術で周知のどんな薬物とも結合し、抗体など血液脳関門を越えたトランスフェリン受容体への浸透または移送を促進することが知られている。ニュールツリンは静脈注射によって投与することができる。（Fridenほか、Science 259:373-377, 1993参照により本文に採用）。さらに、ニュールツリンをポリエチレングリコールのような高分子に安定した結合を行い、溶離度、安定性、半減期などの望ましい特性、その他薬学的に有利な特性を獲得することができる。（Davisほか、Enzyme Eng 4:169-73, 1978; Burnham, Am J Hosp Pharm 51:210-218, 1994参照により本文に採用）。
一般に本組成は製薬過程に採用されている。こうした調製は製薬技術でよく知られている方法で行われている。1つの一般的な調製法では、生理的食塩水を賦形剤として利用するが、その他の薬学的に妥当な担体も検討されている。例えば、その他の非毒性塩の生理的濃縮剤、５パーセントのグルコース溶液、無菌水などを使用することができる。また、適当な緩衝液が組成に存在することも望ましいかもしれない。このような溶液は、必要に応じて凍結乾燥させたうえ無菌アンプルに保存し、無菌水の添加によっていつでも再形成し、ただちに注射できるように用意することができる。主要な溶液は水である、代わりに非水を溶液として用いる場合もある。また、処置を必要とする組織に埋め込むことができる固形や、生物学的に対応する準固形のマトリクスにニュールツリンを組み入れることもできる。
また、担体には薬学的に許容される他の賦形剤を用いて、薬剤のpH、容量オスモル濃度、粘性、透明度、カラー、無菌性、安定性、溶離速度、臭気の変更あるいは維持を行うこともできる。同様に、担体に他の薬学的に許容できる賦形剤をさらに採り入れ、血液脳関門を越えて徐放、吸収または浸透を変更したり維持することができる。そのような賦形剤は、単独投与か複数投与のいずれかによる非経口投与、継続的または周期的な注入によって脳脊髄液中に直接注入を行うべく調剤する場合に、一般に慣習的に使用される。
投与量の定式化の薬物力学的パラメータおよび使用される投与経路に応じて、投与量を繰り返すことができる。
また、ニュールツリンを含むある種の調剤には経口投与も検討されている。そのような調製薬は、固形状の適当な担体と共に調製され、カプセルに入れられることが望ましい。好適的な担体、賦形剤および希釈剤には、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ガムアカシア、りん酸カルシウム、アルギン酸塩、けい酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウム、ステアリン酸、水、ミネラルオイル、その他の類似物質。そのほか調製薬には、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤または芳香剤を用いることもある。薬剤の調製においては、本技術でよく知られている手順をもちいて、患者へ投与を行った後、急速な放出、持続的な放出、徐々の放出など有効成分の放出スピードを調節するように調製することができる。また、調製薬にはタンパク分解による変性を減少させる物質や、例えば表面活性剤などのように吸収を促進する物質も使用することができる。
特定の投与量は、患者のおおよその体重、身体の表面積または身体の体積に従って計算される。また、投与量は選択された投与経路を考慮しても計算される。治療のための適切な投与量を決定するのに必要な計算の精度の向上は、本技術に熟練した者により日常的に行われている。このような計算は、標的細胞のアッセイ準備に関し本文で開示した実施例に照らして、過度の実験でなければ本技術に熟練した者１人で行うことができる。正確な投与量は標準の投与量対反応の実験と関連して決定する。実際の処方は医師によってなされ、治療される患者の病状、投与される薬剤の選択、年齢、体重、および各患者の反応度、患者の症状の程度など、情況を適切に考慮して決定されることは理解されるであろう。
本発明の１つの実施例として、ニュールツリンを患者のベクターまたは細胞に治療的に移植することにより投与することである。ベクターまたは細胞は生物学的に活性を示すニュールツリンまたはニュールツリンの前駆体の形を生み出すことができる。ニュールツリンまたはニュールツリンの前駆体は体内で生物学的に活性を示すニュールツリンを生成できる細胞である。１つの方法では、ニュールツリンを分泌する細胞を半透過性のメンブレンに包んで患者に移植される。細胞は一般にニュールツリンかニュールツリンの前駆体を発現する細胞を用いてもよく、ニュールツリンまたはニュールツリンの前駆体を発現させるため形質転換された細胞を用いてもよい。患者がヒトである場合、ヒト起源の細胞であること、またニュールツリンがヒトのニュールツリンであることが望ましい。しかし、本文に記載する調製薬と方法は、獣医学的治療にもヒトの治療にも応用することができ、本文に使用される用語の「患者」は人間および動物の患者を意図している。
細胞は体外で増殖することが可能で、例えば患者への移植に使用することができる（Muenchほか、Leuk & Lymph 16:1-11, 1994参照により本文に採用）。細胞の成長と分化を引き出すためにニュールツリンを細胞に投与することができる。したがって、この発明の別の実施例では、移植用の細胞の体外増殖を促進させるため、ニュールツリンを使用することができる。本方法では、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子、幹細胞因子およびインタロイキンなどの因子を含むバイオリアクタ培養法を使用し、赤血球、単球、好中球、およびリンパ球のための造血先祖細胞を増大させた（Verfaillie, Stem Cells 12:466-476, 1994参照により本文に採用）。これらの幹細胞はヒトドナーの骨髄、または、ヒト末梢血液、へその緒の血球から分離することができる。増殖させた血球は、特殊な病状の結果、または悪性疾患治療のための大量投与化学療法の結果、これらの血球が欠乏している患者の治療に使用される（George, Stem Cells 12（Suppl 1）:249-255, 1994参照により本文に採用）。化学療法後の細胞移植の場合、化学療法の前に骨髄細胞を採取し、悪性細胞を取り除く機能を有する方法を使用して体外で細胞を増殖させ、化学療法後に増殖させた細胞を患者に移植することによって、自系移植を行うことができる（詳細については、Rummel & Van Zant, J Hematotherapy 3:213-218, 1994参照により本文に採用）。ニュールツリンは発達中の動物の血液、骨髄および肝臓など先祖細胞の増殖と分化が起こる組織に発現するため、ニュールツリンが造血幹細胞の増殖および、成熟した造血細胞の分化を調整する機能を有することができると信じられる。したがって、細胞の体外増殖に使用される培養系へニュールツリンを付加することによって、細胞数の増殖または分化の速度が刺激され、移植に必要な細胞を生み出すこれらの増殖系の効率を向上させる。
また、神経系での前駆体細胞の体外増殖にもニュールツリンを使用することができると思われる。細胞の移植は現在、例えばパーキンソン氏病における場合と同様、ニューロンの一定数が変性のため失われる疾病の療法として研究されている（Bjorklund, Curr Opin Neurobiol 2:683-689, 1992参照により本文に採用）。ニューロン前駆体細胞を動物、ヒトドナーまたはヒト胎児の組織から採取し、次にニュールツリンまたは他の成長因子を使用して培養で増すことが可能である。またこれらの細胞を患者に移植することができ、患者の体内で変性のため失われた細胞部分に代って機能する。ニューロトロフィンは、例えば交感神経神経芽細胞のNT-3刺激などのニューロンの前駆体細胞の生存と増殖を刺激することが実証された（Birren et al., Develop 119:597-610, 1993参照により本文に採用）、ニュールツリンはまた、神経系の発達期間に同様の方法で機能することがわかり、ニューロン細胞の体外増殖に役立つかもしれない。
多くの病状において、患者のニュールツリンレベルを測定することが望ましいであろう。ニュールツリンの識別およびニュールツリンが組織の数によって表現されるという本報告は、ニュールツリンの存在が細胞の成育および生存に関連して、正常な生理学的機能を補助するという結論の根拠を提供している。事実、他の神経栄養因子はニューロンと非ニューロン組織の機能においてある種の役割を果たすことが知られている。（詳細についてはScully＆Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Otten and Gadient, Int J Devl Neurosciences 13:147-151, 1995を参照により本文に採用）。また、内因栄養的に作られたニュールツリンも、ある種の病状において何等かの役割を果すかもしれない。特に神経変性状態や疾患などにおける細胞変性がある場合はそうである。他の神経栄養因子は疾病の間に変化することが知られている。例えば多発性硬化症の場合、脳脊髄液におけるNGFタンパクのレベルが疾病の急性段階で増加する（Bracci-Laudiero et al., Neuroscience Lett 147:9-12, 1992参照により本文に採用）。さらに全身性紅斑性狼瘡の場合、炎症性のエピソード（症状の出現）と、血清中のNGFレベルとの間には相関関係がある（Bracci-Laudiero et at., NeuroReport 4:563-565, 1993参照により本文に採用）。
ニュールツリンが血球、骨髄およびマスト細胞の中で発現するとすれば、ニュールツリンのレベルが様々な病状で変異することが考えられ、ニュールツリンレベルの定量化が臨床的に有益な情報を提供するであろうことは否定できない。さらに変性的病状の処置において、ニュールツリンを含む組成を投与することができ、さらに血清、脳脊髄液または任意の必要な組織の部分においてニュールツリンの一定目標レベルを達成することは望ましいに違いない。したがって患者のニュールツリンのレベルをモニターできることは有益であろう。以上の理由で、本発明は患者からのサンプルからニュールツリンの存在を検出する方法も提供する。
本文に使用される用語「検出」とは、患者内のニュールツリンの存在を検出することで、以下の項目を含めることを意図している。患者内のニュールツリン量の測定または患者内でニュールツリン量を発現する能力、またニュールツリンをその他の成長因子から見分けること、変性的疾病の予後の見通しと回復の見込み、病状の目安としての一定期間にわたるニュールツリンレベルのモニター実施および患者のための最適の治療を目的とした生活規則などである。
患者内のニュールツリンの存在を検出するため、患者からサンプルを採取する。サンプルは組織生検サンプルか血液、プラズマ、血清、CSFのサンプルまたは類似のものでもよい。ニュールツリンは例10に示すように様々な組織の中で発現される。これらの組織のいずれからもニュールツリンを検出するサンプルを採取することができる。末梢部分のニュールツリンレベルを評価するとき、サンプルが血液、プラズマまたは血清のサンプルであることが望ましい。中枢神経系のニュールツリンのレベルを評価するとき、望ましいサンプルは脳脊髄液から採取されるサンプルである。
いくつかの例では、ニュールツリン遺伝子が患者体内か、患者の組織か細胞系で何らかの影響を受けていないかどうか調査することが望ましい。「無垢のニュールツリン遺伝子」とは、遺伝子に点変異、削除、挿入、染色体折損、染色体の配列換え、その他の変化が起きていないことを意味する。このような変化によってニュールツリンの生産が変更されたか、その生物学的活性や安定性などが変えられ、疾病か細胞変性状態につながるものを指す。したがって、本発明の1つの実施例では、ニュールツリン遺伝子のいかなる変更も検出し、特徴付ける方法を提供している。この方法の内容は、ニュールツリンcDNA、ゲノムDNAないしその断片またはその誘導体を含むオリゴヌクレオチドを供与することである。「オリゴヌクレオチドの誘導体」とは、抽出された配列が、オリゴヌクレオチドが抽出された配列と実質的に同じであることを意味し、この場合、抽出された配列は、ニュールツリン遺伝子とハイブリダイセイションを行うために、オリゴヌクレオチドが抽出された起源配列と十分に補完的な配列を有する。抽出されたヌクレオチド配列は必ずしも物理的にヌクレオチド配列から抽出されるとは限らず、化学合成、DNA複製、逆転写過程または転写などの方法でも生成することができる。
通常は、患者のゲノムDNAは患者からの細胞サンプルから分離され、例えばTaqIやAluIなどの１つ以上の制限エンドヌクレアーセで消化される。本技術でよく知られているサザンブロット法を用いて、このアッセイでは、患者ないし患者の特定組織に正常なニュールツリン遺伝子または異常ニュールツリン遺伝子のいずれが存在するかを判定する。
ニュールツリン遺伝子とのハイブリダイゼーションには、一本鎖のDNAを採取するための染色体DNA変性が伴うだろう。そのほかにも、ニュールツリン遺伝子配列に関連した遺伝子プローブによる一本鎖のDNAへの接触、さらに、最低ヒトニュールツリン遺伝子の一部を含む染色体DNAを検出するハブリダイズされたDNAプローブを確認することが伴うであろう。
本文で使用される用語「プローブ」とは、プローブ配列が標的部位において配列と相補であるため、目標配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドから成る構造を指している。また、プローブとしての使用に適したオリゴマーは最低約8-12個の連続したヌクレオチドを有し、このヌクレオチドは標的配列に対して相補性をもつ。好適には最低約20個までのヌクレオチドをもつ。
本発明のニュールツリン遺伝子プローブは、DNAかRNAオリゴノヌクレオチドであることが予想され、例えば、切り出し、転写または化学合成など本技術で知られているいずれの方法によっても生成することができる。プローブは、例えば放射性または蛍光ラベルまたは酵素のマーカーのような本技術で知られている任意の検出可能なラベルによって標識化することができる。プローブの標識化はPCR、ランダム・プライミング、末端のマーク付け、ニック翻訳などの技術で知られるいずれかの方法によっても達成することができる。また、この技法に熟練した者であれば、ハイブリダイゼーションを決定するのにラベル化されたプローブを使わない他の方法を使用しも可能なことを認識するであろう。ハイブリダイゼーションを検出するのに使用することができる方法の例にはサザンブロット法、蛍光による現場での（in situ）ハイブリダイゼーション、およびPCR増幅による１本鎖の立体配座多型現象などがある。
ハイブリダイゼーションは通常、25〜45℃、より好適には32〜40℃、最も好適には37〜38℃で実行される。ハイブリダイゼーションに必要な時間は約0.25〜約96時間までで、より好適には約１〜約72時間、最も好適には約４〜約24時間までである。
また、PCR法、およびニュールツリン遺伝子内で側接触するか存在するプライマーを使用することによってもニュールツリン遺伝子異常を検出することができる。PCR方法は本技術でよく知られている。簡潔に言えば、この方法は２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実行されるが、こうしたオリゴヌクレオチドプライマーはニュールツリン遺伝子内部に存在する標的配列に側接触し、標的配列を増幅する核酸配列にハイブリダイズすることができる。本文に使用される用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、約８〜約30個の塩基の長さをもつDNAかRNAの短い鎖を指す。上流および下流プライマーは、通常約20〜約30個の塩基対の長さで、側接触領域にハイブリッド形成をしてヌクレオチド配列を模写する。重合は、デオキシヌクレオチド三リン酸塩かヌクレオチド類似体が存在する場合、DNAポリメラーゼによる触媒作用を受けて、二本鎖のDNA分子を生産する。次に、二重鎖は、物理的、化学的または酵素の作用を利用する変性法により切り離される。一般的に、物理的変性法では通常約80℃〜105℃で約１分〜約10分間核酸の加熱を行う。この過程は必要な数のサイクルに見合うよう繰り返される。
プライマーは増幅されるDNA鎖に実質的に相補的であるように選択される。したがって、プライマーは、鋳型の正確な配列を表す必要はないが、増幅されるDNA鎖と選択的にハイブリダイズするために十分相補的でなければならない。
PCR増幅の後に、ニュールツリンまたはプレ−プロ  ニュールツリンまたはその断片を包含するDNA配列を、続いて直接配列し、本文で明らかにされている配列と比較分析する。これは活動、発現レベルまたは同様のものを変えるかもしれない変異を確認するためである。
別の実施例として、ニュールツリンの検出法を呈示するこれはニュールツリン遺伝子を発現する組織の分析を根拠としている。以下の例10で確認された組織と同様のある種の組織は、ニュールツリン遺伝子を発現することが判明した。同方法では、ポリヌクレオチドを、通常ニュールツリン遺伝子を発現する組織のサンプルからのmRNAにハイブリダイズされる。サンプルは、ニュールツリン遺伝子か特定の細胞のニュールツリン遺伝子に異常を持つと疑われる患者から入手される。ポリヌクレオチドには配列番号（SEQ ID NO）：11または誘導体またはその断片が含まれる。ニュールツリンタンパクをコード化するmRNAの存在を検出するため、患者からサンプルを採取する。サンプルは血液または組織生検サンプルからも得られる。サンプルはそこに含まれる核酸を抽出するため処理してもよい。サンプルから採取された核酸はゲル電気泳動か他のサイズ分離機にかけられる。
サンプルのmRNAを、ハイブリッド二本鎖を形成するプローブとして機能するDNA配列と接触させる。既述のマークされたプローブの使用によって生成する複式の検出が可能になる。
ニュールツリンタンパクをコード化するcDNAまたはcDNAの誘導体をプローブとして使用する場合、非常に厳格な条件を作り出して疑陽性を防ぐことができる。疑陽性とは実際には完全で機能しているニュールツリン遺伝子が存在しない場合に起こる、ニュールツリンヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションおよび見かけの検出のことである。ニュールツリンcDNAから得られる配列を使用する場合は、さほど厳しくない条件を用いることができる。しかしこの方法では擬陽性が起こりがちなのであまり勧められない。ハイブリダイゼーションの厳格さはハイブリダイゼーションおよび洗浄過程においていくつかの要素で決定される。例えば、温度、イオン濃度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度などである。これらの要素は例えば、Sambrookほかで概説されている。（上記、Sambrookほか、1989）。
ニュールツリンタンパクをコード化するmRNAのサンプルの検出の精度を増加させるため、逆転写過程／重合連鎖反応（RT/PCR）の技法を使用して、ニュールツリンタンパクをコード化するmRNAから転写されるcDNAを増幅することができる。RT/PCR法は本技術でよく知られている（例10と図６を参照）。
RT/PCR法は以下の通り実行することができる。総細胞RNAは、例えば、標準のグアニジウム（guanidium）イソチオシアン酸法によって分離でき、総RNAが逆転写される。逆転写過程方法では、逆転写酵素と3’末端プライマーを使用して、RNAの鋳型上でDNAの合成を行うことができる。通常は、プライマーにはオリゴ（dT）配列が含まれる。次に、このようにして生成されたcDNAを、PCR法とニュールツリン固有のプライマーを使用して増幅する。（Belyavskyほか、Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987参照により本文に採用）。
ポリメラーゼ連鎖反応法は上記の通り実行されるが、使用されるのは増幅されるDNAセグメント２ヶ所の側結合領域を実質的に相補する２つのオリゴヌクレオチドプライマーである。
増幅に続いて、PCR生成物は電気泳動された後、エチジウムブロミド染色法またはリン酸造影法によって検出される。
本発明はさらに、患者から採取されるサンプル中のニュールツリンタンパクの存在を検出する方法を提供する。本技術で知られているタンパク検出方法のいずれも使用することができる。そのような方法には、免疫拡散法、免疫電気泳動、免疫化学法、バインダー配位子分析評価、免疫組織化学技法、凝集および補体測定法などがあるが、これらに限られない。（例として、Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991参照により本文に採用）。望ましいのは、バインダー配位子免疫検定法で、内容はニュールツリンタンパクのエピトープと抗体を反応させること、およびマークされたニュールツリンまたはその誘導体を競争的に置き換えることである。
本文で用いられたように、ニュールツリンタンパクの誘導体にはポリペプチドを含めることを意図しており、ポリペプチド中ではある種のアミノ酸は削除、置換、変異で異常なアミノ酸に変化しており、そこではニュールツリン誘導体は生物学的にニュールツリンに相当し、またポリペプチド誘導体はニュールツリンタンパクに対立する抗体と交差反応する。「交差反応」とは、抗体が、その生成を誘発した抗原以外の抗原と反応することである。
多数の競合的・非競合的タンパク結合イミュノアッセイは本技術ではよく知られている。そのようなアッセイで用いられる抗体は、例えば凝集テストでの使用のためにマークされない場合や、様々なアッセイ法での使用のためにマークされることもある。使用できるマークの例として、放射性核種、酵素、フルオレッサー（fluorescers）（蛍光剤）、ケミルミネセッサー（chemiluminescers）（化学発光剤）、酵素基質、補因子、酵素抑制剤、粒子、染料などがあり、ラジオオミュノアッセイ（RIA）法、酵素イミュノアッセイ法（例：酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法）、蛍光免疫検定などを用いてマークする。
本技術で知られているいずれの方法によっても、ニュールツリンタンパクに対応するポリクローン抗体または単クローン抗体またはそのエピトープをイミュノアッセイ法に使用することができる。「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原のデターミナント（決定基）のことである。１個のエピトープは、エピトープ特有の空間立体配座の中の３個のアミノ酸によって構成される。一般にエピトープはそのような５個以上のアミノ酸から成る。アミノ酸の空間立体配座を決定する方法は本技術で知られており、例えばエックス線結晶学と二次元核磁気共鳴などがある。
タンパクに対応する抗体を調製する１つの方法には、配列を化学的に合成して、合成した配列を通常ウサギかマウスなどの適切な動物に注入し、タンパクのすべてまたは一部のアミノ酸配列を選択、調製することが含まれる（例11参照）。
オリゴペプチドはニュールツリンタンパクに対応する抗体を生成するための候補として選択することができる。これはオリゴペプチドが親水性領域に存在するため、成熟タンパクの中で露出しているという事実にもとづいている。
本文に記述した1ヶ所以上の保存部位を内包するオリゴペプチドに対して、ニュールツリン抗体を使用することもできる。その場合、抗体は他のファミリー構成因子と交差反応させるような仕方で行う。こうした抗体は他のファミリー構成因子の確認や分離に使用することができる。
ニュールツリンタンパクまたはそのエピトープの調製のための方法には、化学合成、組換え体DNA技法または生物サンプルからの分離その他がある。例えば、固相ペプチドの化学合成は、古典的なメリーフィールド（Merrifeld）法（Merrifeld, J Am Chem Soc 85:2149, 1963参照により本文に採用）、または迅速自動化複合ペプチド合成装置を用いたFMOC法などで行うことができる（DuPont Company, Wilmington, DE）（Caprino and Han, J Org Chem 37:3404, 1972参照により本文に採用）。
ポリクローナル抗体は、ウサギか他の動物に抗原を注入し、続いて適切な間隔をおいたブースター注入を行うことにより免疫性を与えて調製できる。その方法は通常ELISAまたはバイオアッセイを用いて、動物から採取された血清のアッセイをニュールツリンタンパクに対して行う。これはニューロンまたは他の細胞におよぼすニュールツリンの作用をブロックする能力に基づくものである。鳥類、例えば、にわとり、七面鳥などを使用するときには、卵の卵黄から抗体を単離できる。単クローン抗体の調製はMilsteinとKohlerの方法にしたがって行うことができる。これは骨髄腫やリンパ腫細胞などの腫瘍細胞を絶え間なく複製することによって免疫マウス脾細胞を溶断する方法である。（Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology:Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981参照により本文に採用）。次にこうして形成されたハイブリドーマ細胞抗体のクローン生成を行う。その方法には、ELISA、RIA、バイオアッセイなどで生成された抗体をアッセイする限界希釈法やスーパネート（supernates）がある。
標的タンパクを認識し限定結合する抗体のユニークな能力によって、タンパクの過剰発現を処置する方法が得られる。したがって本発明の別の面は、ニュールツリンタンパクの過剰発現が関与する疾病を予防する方法や、ニュールツリンタンパクに対して特異抗体をもつ患者を治療する方法を提供することである。
ニュールツリンタンパクに特異性を示すポリクローン抗体またはモノクローン抗体などの特異抗体は、本技術で知られる既述の適切な方法によって生成することができる。例えば、ネズミまたはヒト単クローン抗体はハイブリドーマ技術によって生成することができる。その他、ニュールツリン  タンパク、その断片で免疫学的に活性のあるもの、抗イデオティピック（idiotypic）抗体、その断片などを動物に投与することにより、ニュールツリンタンパクを識別できそれに結合できる抗体を生産する方法もある。こうした抗体はどのようなクラスの抗体からも得られ、例としてIgG、IgA、IgM、IgD、IgE他があり、鳥類の場合、IgYおよび抗体のどのようなサブクラスからも得られる。
本発明の好適な実施例は以下に続く例に記述されている。本請求の範囲に含まれるその他の実施例は、本文に開示されているような請求の範囲の検討または発明の実施により、本技術に熟練した者には明らかにされるであろう。この特許請求の範囲およびその実施例はともに模範例としての開示のみを意図しており、請求範囲と発明のスピリットをあらわすものに過ぎない。実施例を以下に示し続いて請求の範囲を示す。
例１
本例はCHO細胞による調整済培地からのニュールツリンの分離と精製を例示する。
CHO細胞による調整済培地の準備：
DG44チャイニーズハムスターの卵巣細胞の誘導体、DG44CHO-pHSP-NGFI-B（CHO）細胞を使用した（Dayほか、J Biol Chem 265:15253-15260, 1990参照により本文に採用）。前出のように、発明者はまた、DG44チャイニーズハムスター卵巣細胞の他の誘導体から部分的に精製されたneurturinを得た。CHO細胞は150cm2フラスコ（Corning Inc., Corning NY）内の20ml培地に維持された。この培地は10%のウシ胎児の血清（Hyclone Laboratories, Logan, UT）、2mM l-グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび25nMメトトレキセートを含有する最低必須培地（Minimum Essential Medium, MEM）アルファ（Gibco-BRL No.12561, Gaithersburg, MD）である。通過と増殖を改善するため、当該融合フラスコからの培地を吸引した。細胞は10mlリン酸塩緩衝食塩水（PBS）（濃度：KH2PO4 0.144g/l、Na2HPO4 0.795g/l、NaCl 9.00g/l）にて洗浄し、次に、フラスコを２〜３分間、2mlの0.25%トリプシンでPBSの中で培養した。続いて、細胞をフラスコ表面から振り落とし8mlの培地を加えたあと、ピペットで何度か粉砕した。次に、細胞を５分の１か10分の１に分け、CO2 5%を含む大気中で37℃で３〜４日間培養して癒合させた。
次に、培養細胞を850cm2のローラーボトルの中で増殖させた（Becton Dickinson, Bedford, MA）。150cm2の融合フラスコのトリプシン化を行い、上述のMEM培地からメトトレキセートを除いた変更培地240mlが含まれるローラーボトル（1本の）に移植した。水素イオン濃度（pH）の維持は、5%のCO2を含有する空気でおおうか、または培地を25mM HEPES（pH7.4）で（Sigma, St. Louis, MO）調製することにより行った。ローラーボトルは１分間に0.8〜1.0の回転数で回転させた。細胞は4日で融合状態に達した。
調製培地を採集するため、無血清CHO細胞（SF-CHO）培地を使用した。SF-CHOは1:1 DME/F12を主成分とする培地を用いて準備した。それには1:1（v/v）DMEM（Gibco-BRL product No. 11965, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）をHamのF12（Gibco-BRL product No. 11765）と混合して調製した。最終的なSF-CHO培地には以下のような因子が存在する。15mM HEPES（pH7.4）（Sigma, St. Louis, MO）、0.5mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA, Sigma, St. Louis MO）、25μg/mlのヘパリン（Sigma, St. Louis, MO）、1Xインシュリントランスフェリン亜セレン酸塩剤（ウシのインシュリン5μg/ml、ヒトのトランスフェリン5μg/ml、ナトリウム亜セレン酸塩5ng/ml）（Sigma, St. Louis, MO）、2mMl-グルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシン。融合ローラーボトルから培地を取り出し、細胞を30mlSF-CHO培地で１回洗浄して血清タンパクを取り除いた。次に、細胞を80mlSF-CHO培地中で37℃で16〜24時間培養して、血清タンパクをさらに取り除いた。こうして80mlの培地を取り除き廃棄した。SF-CHO培地120mlをフラスコに加え、細胞を37℃で培養した。その後は、48時間毎に120mlを採取し、同量のSF-CHO培地と取り替えた。採取した培地を集めて、ポリプロピレン製円錐管の中で４℃で遠心分離して細胞くずを取り除き、上澄みは-70℃で保存された。培地は10日間で5回集められ、ローラーボトル１本当り合計約600mlの調整済培地を得た。
精製の各段階でカラムから集められた分留の生物学的活性を調べるため、ニューロン生存アッセイを行った。タンパクの含有量についてはブラッドフォード法（染色結合アッセイ）（Anal Biochem 72:248 et seq., 1976参照により本文に採用）。調整済培地の開始量（一般に50リットル）中のタンパクの総質量（mg）を決定した。
上頚部神経節生存アッセイ：
前述した上頚部神経節生存アッセイ法（Martinほか、J of Cell Biology 106:829-844; Deckwerth and Johnson, J Cell Bio 123:1207-1222, 1993参照により本文に採用）を用いて、CHO調整済培地の開始材料の神経親和性活動および様々な段階における精製を評価した。上頚部神経節（SCG）からの交感神経ニューロンの初代培養を準備した。その方法としてまず受胎後20〜21日目のラットの胎児（E20-E21）から得た組織を解剖した。SCGをl-グルタミン培地（Cat #11415-023 Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）と共にLeibovitzのL15培地に入れ、LeibovitzのL15培地の中で1mg/mlのコラゲナーゼ（Cat #4188 Worthington Biochemical, Freehold, NJ）で37℃で30分間消化させた。次にトリプシン低圧下凍結乾燥および放射線照射により30分間消化させた（Type TRLVMF Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ）。続いて、一部変更されたHanksのバランスド  ソルト  ソリューション（Balanced Salt Solution）（平衡食塩水）（Cat #H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）に再懸濁した。消化の停止に用いた材料は以下の通りである。Earleの塩を含みl-グルタミンを含まないMEM培地を含むAM50（Cat#11090-016 Gibco-BRL）、10%のウシ胎児血清（Cat#1115 Hyclone Laboratories、Logan、UT）、2mM l-グルタミン（Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、20μM FuDr（F-0503 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、20μMウリジン（Cat #3003 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、100U/mlのペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および50ng/ml 2.5SNGF。シラン化され炎でつや出ししたパスツールピペットを用いて細胞を解離させ、単独細胞として溶液に懸濁させた。次に、ナイテックス（nitex）フィルタ（サイズ3-20/14、Tetko Inc., Elmsford, NY）を用いて懸濁液をろ過させた後、非ニューロン細胞数を減らすため、細胞を上記の通りAM50培地に入れ、100mmのファルコン（Falcon）またはプリマリア（Primaria）培養皿（Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ）で再び平板培養した。空電解された。２時間後に、互いに付着していないニューロン細胞を含む培地を取りだし、シラン化され炎でつや出ししたパスツールピペットを用いて再び粉砕した。単独細胞の浮遊液を、あらかじめ二層のコラーゲンでコーティングされた（第１層ではコラーゲンがアンモニアと化合しており、第２層ではコラーゲンが空気乾燥させられた）24ウエル培養プレート（Costar, Wilmington, MA）上で平板培養した。こうした層は30分から2時間付着が可能であった。生存可能な特定数の細胞（１ウエル当りの細胞数は約1200〜約3000個）または特定割合の神経節（通常、１神経節当り得られる細胞量の25%）を各ウエルに移し平板培養した。細胞カウントを行う場合は、上述の通り24ウエル培養プレートに置くか、または代替方法として2ウエルのチャンバスライド上に置いてもよい（Nunc, Naperville, IL）。次に、倍養液を５〜６日間37℃で5% CO2/95%空気とAM50培地で培養した。同培地をNGFを欠く培地および0.05%のヤギ抗NGFと交換することによって、培養ニューロンの壊死を招いた（ウエル中の最終タイターは1:10）。このようにしてNGFを枯渇させることにより24〜72時間後にニューロンの壊死が起こった。NGF除去の時点で、部分的または完全に精製された因子のアリコートまたは適切な対照を培養に加えて、ニューロンの壊死を防ぐ能力を決定した。
ニューロンの壊死を防ぐカラム分留、ゲル溶離液または精製因子の能力評価は、位相差顕微鏡の下で倍養液を直接観察することにより行った。生存可能なニューロンは完全な軸索を維持し位相が明るいままで残っていたが、壊死したニューロンはしなびて位相は暗く、不規則な細胞膜を持ち、軸索は断片になっていた（図3）。生存ニューロンの正確な数量化が必要な場合には、PBSの中で培養を4%のパラホルムアルデヒドか10%のホルマリンで固定し、ゲンチアナ・バイオレット溶液で染色した（Huntoon Formula Harleco E.M. Diagnostics Systems, Gibbstown, NJ）。24ウエル培養皿を使用する場合は、10%ホルマリンを含有する各ウエルに１μｌのゲンチアナ・バイオレット溶液を加えた。そして位相差顕微鏡下で細胞のカウントを行った。２ウエルのチャンバスライドを使用する場合は、培養を固定し、ゲンチアナ・バイオレットで染色した後、水で脱色し、続いて対トルエン濃度の高いエタノール中で培養を脱水させた。そしてトルエンベースのスライド用溶液で固めて顕微鏡用のスライドを作った。ニューロンに透明な核小体および核が存在し、ゲンチアナ・バイオレットで明瞭に染色された場合はそのニューロンは生存していると判定した。
72時間後のニューロンの壊死を図３（Ｂ）で示した。また、同図には（Ａ）神経成長因子で維持された陽性対照細胞、（Ｃ）ニューロンの生存を示す抗NGFおよびニュールツリン（約3ng/ml）で処置された細胞も示した。
活性度は「生存ユニット」の計算で数量化した。サンプル中の総生存ユニットはサンプルのアリコートの最少量と定義され、それはサンプルの総ボリュームを最大生存で割って算出した。比活性度は生存ユニットを総タンパク（mg）で除して算出した。
「生存ユニット」は、約1200の個の生存可能なニューロンを0.5mlの培養アッセイの中で、48時間培養させた後、分留を加えるというアッセイにより算出した。生存は48時間後に顕微鏡下で観察した。図４で示す本質的な活性度は、約2700個のニューロンおよび72時間の培養期間のアッセイで決定した。生存の評価は、ニューロンを固定した後、生存ニューロンの数を数えて行った。活性度の半減期から予想されるように、ニュールツリンの安定度は、ニューロンの数が増加するに従って減少するので、固有活性度の測定値は、「比活性度」の測定値から予測される数値よりも低いことが予想される。また、固有活性度の測定値は、生存が48時間でなく72時間後に測定されたため、比活性度によって予測される活性度よりも低いことが予想される。
これらの活性ユニットのアッセイの再現性を確保するため、最初のニューロン倍養を再現可能な細胞濃度で培養する必要があった。これはニューロンの密度が増加するに従い、活性度の安定性が著しく減少するからである。細胞濃度の範囲は、１ウエル当り約1200〜2700個であった。アッセイ培地中の可溶ヘパリンの存在は、生存活性度の短期の（3日以内）安定性にはなんら影響がなかった。
ニュールツリンの精製：
プールされた調整済培地を0.2μｌ孔ボトルトップフィルタ（セルロースアセテートメンブレン、Corning Inc., Corning, NY）でろ過した。ろ過には標準的な50リットルの調整済培地を用いて、25リットルのバッチで処理した。各25リットルのバッチを、1分間20mlの速度で５×５cmカラムへ導入した。このカラムには150mM NaClを含む25mM HEPES（pH7.4）緩衝液で中和された100mlのヘパリンアガロース（Sigma, St. Louis, MO）が含まれていた。次に、0.5M NaCl（20ml/min）を含む約1000mlの25mM HEPES（pH7.4）緩衝液でカラムを洗浄し、続いて1.0M NaClを含む25mM HEPES（pH7.4）緩衝液で培地を溶離させた。1.0M NaCl溶離緩衝液に交換した後、最初の50mlの緩衝液は捨てられ、その後、300mlの分留１本を採取した。
ヘパリン−アガロース・カラムから溶離されたプール物質を、1:1（v/v）の割合で、0.04%のツイーン20（TWEEN 20）を含む25mM HEPES（pH7.4）緩衝液を用いて希釈して0.5M NaClの濃度を得、これを16mlのSP SEPHAROSE▲Ｒ▼ハイ  パフォーマンス（High Performance）イオン交換樹脂（Pharmacia, Piscataway, NJ）を含む1.5cmｘ9cmカラムへ導入した。このイオン交換樹脂は0.5M NaClと0.02%のTWEEN 20を含む25mM HEPES（pH7.4）緩衝液で中和されていた。次に、カラムを0.5M NaClと0.02%のTWEEN 20を含む25mM HEPES（pH7.4）緩衝液160mlで洗浄し、続いて1.0M NaClと0.02%のTWEEN 20を含む25mM HEPES（pH7.4）緩衝液で、２ml／分のフローレートで溶離させた。カラムからの最初の7mlの溶離を捨てた後、50mlの分留１本を採取した。
SP SEPHAROSE▲Ｒ▼カラムから溶離された物質を、高速タンパク液体クロマトグラフィ（FPLC）を使用して、Cu++で電荷の付与されたChelating Superose HR 10/2カラム上で分留させた（Pharmacia, Piscataway, NJ）。カラムは、準備しておいた10mlの水で洗浄し、3mlの2.5mg/ml CuSO4・5H2Oで電荷付加し、10mlの水で洗浄し、且つ1.0M NaClおよび0.02%のTWEEN20を含む10mlの25mM HEPES（pH7.4）緩衝液で中和した。溶離物質を、1.0M NaCl含有の25mM HEPES（pH7.4）緩衝液で満たされたコラムへ1.0ml／分の速度で導入した。結合タンパクを、1.0M NaCl含有の25mM HEPES（pH7.4）緩衝液の中でグリシンの濃度を一定の率で増加させながら（0-300mM）、1.0ml／分の速度で溶離させた。濃度の勾配は、LCC-500制御装置とP-500ポンプを使用するPharmacia FPLC装置によって作りだし、0-300mMのグリシン濃度勾配40mlを1.0ml/分の速度で得た。その結果、グリシンの濃度勾配を１分当り7.5mM増加させることができた。SCG生存促進のため1mlの分留１本を採取しアッセイを行った。活性度のピークは分留17-20、すなわち勾配の初めから17-20分後または17-20mlのところで観測された。
インラインUVモニターによる280nMの吸光度測定値では、ほとんどのタンパクが分留17-20の生存活性度以前に溶離したことを示した。したがって、重要な精製はこのステップで達成された。25kDバンドは生存活性度で準精製された。
Cu++ superoseカラムからの総合溶離分留は、0.02%のTWEEN 20含有の25mM HEPES緩衝液（pH7.4）を使用して0.45M NaClに希釈され、Mono S HR 5/5陽イオン交換カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）に導入され、FPLCの精製をさらに進めた。カラムのpH値は、0.02%のTWEEN 20を含む45M NaCl含有の25mM HEPES緩衝液（pH7.4）で維持した。結合タンパクはNaClの濃度を一定の率で増加させながら（0.45-1.0M）で溶離させた。濃度勾配は上記のように35mlsの0.45M-1.0M NaClから1.0ml/分で作り出され、その結果、濃度は１ミリリットル当りまたは１分当り0.0157Mで増加した。1.0ml分留13本（分留1-13）を、続いて0.5ml分留44本（断片14-53）を採取した。SCGアッセイにおける活性のピークは分留26-29において見られた。SCG生存アッセイにて各分留を0.5mlの培養当り0.1〜1.0μｌの範囲でアッセイした。
各断片の１パーセント（5μｌ）を、非還元性の14%のSDSポリアクリルアミド・ゲルへ移し、25℃、750Ｖ／時で電気泳動させた。タンパクは銀染色法よって視覚的に観察可能となった。結果を図２に示す。ゲル上のレーンＭに示されるマーカーは、（分子量の重い方から軽い順に）20ngのウシの血清アルブミン、炭酸脱水酵素、B-ラクトグロブリン、およびリゾチームを表す。
25kDバンドが分留25-30に現れ、28kDタンパクは勾配の前期で溶離され、18kDは勾配の後期で溶離された。図２は各断片における生存活性度を示す。生存活性度は、分留25-30の25kDタンパクの存在と見かけの強度に一致していることが明らかである。
25kDバンドが生存促進活動の原因となっていることを示すために、25kDタンパクを電気泳動の後ポリアクリルアミド・ゲルから溶離させて、SCGアッセイで生存活性度のアッセイを行った。前述のように、非還元性の14%のSDS-ポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで、150μｌのSP SEPHAROSE▲Ｒ▼1.0M NaCl分留を電気泳動させた後、レーンを12スライスに切り分け、各スライスを25℃で18時間、25mM HEPES（pH7.4）、0.5M NaCl、0.02%のTween-20を含んでいる緩衝液の中で、前後運動による拡散で破砕させ溶離させた。BSAを溶離物質に最終濃度が200μg/mlになるまで加え、次に、アクリルアミド・ゲル断片を取り除くため、溶離液を0.45ミクロンのフィルタを通してろ過した。次にサンプルを濃縮させ精製させるため、ろ過液をSP SEPHAROSE▲Ｒ▼カラムに加えた。サンプルを溶離させる前に、カラムを、１ml当り0.5M NaCl、0.02%のTween-20および200μgのBSAを含む400μｍｌの25mM HEPES緩衝液（pH7.4）で一度、１ml当り0.02%のTween-20と200μgのBSAを含む400μｌlの25mM HEPES緩衝液（pH7.4）で一度、洗浄した。次に、カラムを再び、１ml当り0.5M NaCl、0.02%のTWEEN 20および200μgのBSAを含む400μｌの25mM HEPES緩衝液（pH7.4）で洗浄した。サンプルを、１ml当り1.0M NaCl、0.02%のTween-20および200μｇのBSAを含む25mM HEPES緩衝液（pH7.4）で溶離させた。続いてサンプルの生存活性度を分析した。25kDバンドに対応するスライスだけが生存活性の証拠を示した。CHO細胞で調整された培地から精製された25kDタンパクはホモダイマーであると考えられる。
上述の精製過程により、50リットルのCHO細胞による調整済培地から得られた収穫量は、標準的に1-1.5mgであった。全体的な回収は、10-30%であると見積もられ、約39万倍の精製がもたらされた。
例２
本例は、SCGアッセイにおけるニュールツリンおよび成長因子のTGF-βファミリーのいくつかの構成因子の特徴づけならびに、抗GDNF抗体のニュールツリンとの相互反応性の不在を示す。
精製タンパクのSCGアッセイでは、同因子の濃度が約3ng/mlまたは約100pMのとき活性度が最高になり、拡散性ペプチド成長因子についてはEC50は約1.5ng/mlまたは約50pMの予想範囲にあることを示した（図４）。
TGF-βファミリーの構成因子のあるものは交感神経系ニューロンの神経ペプチド遺伝子発現に影響を及ぼすが、他のものは異なるニューロン個体群の生存を促進する。ニュールツリン（タンパクのこのファミリーの遠縁因子である）は、交感神経系ニューロンのほぼ完壁な生存を３日間促進させることができる。さらに、SCG細胞の培養をさらに進めることによって、ニュールツリンが、NGFの除去後、少なくとも10日間これらのニューロンを維持し続け得ることが明らかになった。
我々はSCGアッセイで、TGF-β１、アクチビン（activin）、BMP-２、BMP-４、BMP-６およびGDNFを含む、TGF-βファミリーの他のいくつかの構成因子をテストして、これらの因子の生存促進能力を調べた。これらの因子の中では、GDNFだけが生存促進の活性を有していた。しかし、GDNFの生存促進の活性はニュールツリンよりもはるかに弱く、3日間の生存アッセイでは2-4nMのEC50を示した。このアッセイでテストされたGDNFはrhGDNFで、prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J.から入手したE.コイルから生成した。また、GDNFの活性の持続時間もニュールツリンの活性より短く、３日間以上生存を維持させるGDNF（50ng/ml）の能力はいちじるしく縮小された。これらの実験は、GDNFがニュールツリン受容体に対する作用剤である可能性を示唆している。さらに、アクチビンおよびBMP-2に生存促進能力がないのとは対照的に、これらのニューロンに神経伝達物質関連の遺伝子発現を誘導する高度な活性がある（Fann and Paterson, Int J Dev Neurosci 13:317-330, 1995; Fann and Patterson, J Neurochem 61:1349-1355, 1993）ことは、アクチビンやBMP-２が別の受容体または情報伝達系路を通じてシグナルを伝達していることを示唆している。
抗GDNF抗体の部分精製ニュールツリンとの相互作用性を決定するため、例１に説明したごとく、解剖され平板培養されたSCGニューロンを、6日目に抗NGFのみ存在するなかで、または抗GDNFおよび抗NGF（E.コイル由来のrhGDNFに対するやぎのIgG抗体，R & D Systems, Minneapolis, Minn）が存在するなかで、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、または30ng/mlのGDNF（Prepro Tech, Inc, Rocky Hill, N. J．）によって処置した。ニュールツリンの部分的に精製した1.0M SP Sepharose分留を約375pg/ml、750pg/ml、1.5ng/mlおよび3ng/mlの濃度でアッセイに使用した。この分留は、抗NGFのみ存在する場合、および抗NGFと抗GDNFが存在する中でテストした。抗GDNF抗体は30ng/mlまでの濃度でGDNFの生存促進活動を阻止したが、ニュールツリンの生存促進活動は阻止しなかった。
例３
本例では、結節性神経節生存アッセイで知覚ニューロンへのニュールツリンの効果を示す。
結節性神経節を使用して知覚ニューロンに対するニューロトロフィンの作用を調べるため、SP Sepharoseカラムで部分的に精製されたCHO細胞の調整済培地をアッセイした。生存アッセイは上頚部神経節に関して先に述べたアッセイを修正したものである。最初に解離した結節性神経節の培養組織は、E18スプラグ  ダウレイ（Sprague Dawley）子ネズミからの組織を細切して準備した。組織が細切されるにつれ結節性神経節を2mM l-グルタミンと共にライボビッツ（Leibovitz）のL15に置いた（Cat# 11415-023, GIBCO-BRL. Gaithersburg, MD）。次に、ライボビッツのL15培地において37℃で30分間１mg/mlのコラゲナーゼによって蒸解し（Cat#4188, Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey）、続いてトリプシン中で30分間消化させた（凍結乾燥および照射が行われたtype TRLVMF, Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ）あと、変更Hank’s Balanced Salt Solution（Cat #H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）で0.25%の最終濃度へ再懸濁した。消化の停止に用したのは、アーレ（Earle）の塩を含み１−グルタミンを含まないMEM培地（#11090-016 GIBCO-BRL）、AMO-BDNF100、10%のウシ胎児血清（Cat#1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT）、2mM l-グルタミン（Cat#G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）、20μMのFuDr（F-0503, Sigma Chemical Co.）、20μMのウリジン（Cat #3003, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および100ngの脳由来ニューロトロフィン因子（BDNF, Amgen, Thousand Oaks, CA）などである。AMO-BDNF100培地の中でシラン化され炎でつや出ししたパスツールピペットを用いて、細胞を単独細胞の懸濁液として溶離させ、続いて非ニューロン細胞を排除するため100mmのファルコン（Falcon）またはプリマリア（Primaria）の培養皿（Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ）にあらかじめ平板培養させた。２時間後に、結合していないニューロン細胞を含む培地をこれらの皿から取り除き、シラン化され炎でつや出しされたパスツールピペットを使用して再び粉砕した。単独細胞の浮遊液を、あらかじめ二層のコラーゲンでコーティングされた（第１層ではコラーゲンがアンモニアと化合しており、第２層ではコラーゲンが空気乾燥させられた）24ウエル培養プレート（Costar, Wilmington, MA）上で平板培養した。こうした層は30分から2時間付着が可能であった。生存可能な特定数の細胞（１ウエル当りの細胞数は約1200〜約3000個）または特定割合の神経節（通常、１神経節当り得られる細胞量の25%）を各ウエルに移し平板培養した。E18ラット胎児10体からの神経節を2.5mlsの培地に溶離させ、この懸濁液100μｌを各ウエルに加えた。細胞を、37℃で30分間微生物培養器で5%CO2/95%の空気で付着させた。ウエルにはAMO-BDNF100を一晩中培地与えた。
翌日、細胞を20分間、３回洗浄したが、各回ともAMO培地にはBDNFがなかった。ウエルにこの培地0.5mlを単独でまたはこの培地に50ng/mlのNGF、100ng/mlのBDNF（Amgen, Thousand Oaks, CA）、100ng/mlのGDNF（Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N.J）か、3ng/mlのニュールツリンかのいずれかを含むものを与えた。細胞を37℃、5% CO2/95%エアー培養基で３日間培養したあと、10%のホルマリンで固定し、ゲンチアナ・バイオレット（１μｌ／ml 10%フォルマリン）で染色し、カウントを行った。前述のように生存が確認された。
図10は、72時間後のニューロンの死を示す。BDNFで培養された結節性ニューロンのニューロンの生存は先に報告した（Thalerほか、Develop Biol 161:338-344, 1994参照により本文に採用）。これはこうしたニューロンの生存の規格として使用され、100%の生存値が与えられた。栄養（AMO）を全く与えられなかった結節性神経節は、50ng/ml NGF中で培養されたニューロンと同じく20%〜30%の生存率を示した。3ng/mlニュールツリンを含みBDNF（100ng/ml）を含まない培地で培養されたニューロンは、BDNF（100ng/ml）を含む培地で培養されたニューロンと同様の生存率を示した。GDNFは100ng/mlの濃度のとき、BDNF（100ng/ml）に比べて結節性ニューロンの生存をはるかに促進した。GDNFに関する同様の発見が、にわとりの知覚ニューロンについて最近報告されている（Ebendalほか、J Neurosci Res 40:276-284 1995参照により本文に採用）。
例４
この例は後根神経節生存アッセイによるニュールツリンの知覚ニューロンへの影響を示す。
E15ラットの胎児からの後根神経節を使用したのを除いて、後根神経節細胞（DRG）は例３の方法に従って調製しいた。72時間経過時のニューロンの壊死は図11で示す。DRGニューロンの生存は、50ng/mlの濃度の神経成長因子（NGF）の存在下での生存を100%とする生存値で標準化した。抗NGF抗体の存在下で培養されたニューロンは約14%の生存率を示した。GDNF（50ng/ml）またはニュールツリン（6ng/ml）を含み、それぞれ抗NGFを含む培地で培養されたニューロンは、約34%の生存を示した。したがってGDNFおよびニュールツリンはDGR細胞の生存の維持において遜色のない効率を示した。
例５
本例では、CHO細胞の調整済培地から分離されたニュールツリンの部分アミノ酸配列の決定を示す。
精製されたニュールツリン約１μｇのサンプルからN末端アミノ酸配列を得るため、活性のピークを含むMono S分留26-29を、ミクロコン（microcon）-3濃縮装置（Amicon, Inc., Beverley, MA）を用いた遠心超ろ過で25μｌに濃縮し、14%の非還元性SDSポリアクリルアミド・ゲルに移した。続いて電気泳動による分離を行った後、タンパクをPVDFメンブレン（Bio-Rad, Hercules, CA）に電気ブロットし、0.1%のクーマジー（Coomassie）ブルーで染色した。25kDバンドを切り取り、自動シーケンサの反応カートリッジに挿入した（Model 476, Applied Biosystems（Foster City, CA）。自動シーケンサーの最初の2-3サイクルでエドマン分解によるフェニルチオヒダントインアミノ酸（PTH-aa）の回収は、４ｐモル（ｍｏｌ）の配列収量を示した。４ｐモル（ｍｏｌ）はSDSゲル上に置いた推定タンパク量の約10%であった。
N-末端の配列決定は、各50リットルの精製サンプル２組から２回実行した。最初の実行では、総量1.5mlのプール分留3本中のタンパク１μｇを、5%のメタノールを含む10mM CAPSpH11.0の電気ブロットバッファ（Sigma, St. Louis, MO）を使用して25μｌに濃縮し、２時間25℃、100Vで電気ブロットを行った。アミノ酸配列は13サイクルのエドマン分解から得られ、配列収穫量は上記と同様４ｐモノ（moles）だった。
２番目の実行では、総量2.0mlのプール分留4個本中のタンパク1.5μｇを、25mMのトリアミノメタン、192mMのグリシン、0.04%のSDSおよび17%のMeOHの電気ブロットバッファを使用して25μｌに濃縮し、12時間４℃、36Vで電気ブロットを行った。配列収量は15ｐモル（moles）で、16サイクル後の配列はSGARPXGLRELEVSVSであった（配列番号（SEQ ID NO）：３）。16サイクル後に得られた配列は、最初の実行で得られた短い配列に対応した。配列のアミノ酸残基のうち3つについては確定ができなかった（N-末端からの残基１、６および11）。タンパクデータベースの検索では著しく相同な配列は検出されず、精製因子が新種のタンパクであることを示唆した。
この初期のN末端のアミノ酸配列データでは、変性オリゴノヌクレオチドをPCRプライマーか選別ライブラリのプローブとして使用するcDNAクローンの分離を実現できなかった。これらのアプローチを容易にするため、タンパクをさらに精製して、タンパク分解断片から内部アミノ酸配列が得られた。ニュールツリンから内部アミノ酸配列を得るため、前述のクロマトグラフィーの最初の３ステップだけを使用して、50リットルのCHO細胞による調整済培地をさらに精製した。ただし、Cu++キレーティングSuperoseカラムの溶離に使用した濃度勾配は異なり、0-60のmMグリシン（4ml）、60mMのグリシン（10ml）、60-300のmMグリシン（32ml）を使用した。ニュールツリンを含む分留No. 20-23を超ろ過（Amicon microcon 3, Amicon, Beverley, MA）によって25μｌに濃縮し、非還元性のポリアクリルアミドゲルSDS上に移した。電気泳動の後、ゲルをクーマジー（Coomassie）ブルーで染色し、25kDニュールツリンバンドを切り取った。ニュールツリンをゲル・スライス内でエンドプロテイナーゼLys-Cで消化させ、溶離されたタンパク分解断片を逆位相のHPLCによって精製した。溶離ペプチドのHPLC分離時に１つのピークだけが観察されたが、自動シーケンサーを使用して、溶離ペプチドから１ｐモルシグナルレベルで23サイクルにわたりアミノ酸配列情報を得た（内部断片P2，配列番号（SEQ ID NO）：５）。
消化させる前の上記サンプル10%で行ったアミノ酸分析では、7.6%のリジンと19.5%のアルギニンから成るゲル・スライス中に150ｐモルのタンパクが存在すること示した。Lys-C消化からの単独の低いピークは、ペプチドの消化と溶離の効率が悪いことを示した。同じゲル・スライスをトリプシンと共に再消化させ、溶離ペプチドをHPLCで分離した。2つのピークがHPLC上で観察され、結果としてのN末端と前出の内部アミノ配列（4-5 pモルシグナルレベル、内部断片P1，配列番号（SEQ ID NO）：４および内部断片P3，配列番号（SEQ ID NO）：６）と異なる２つ追加の10の残基アミノ配列の解明につながった。ペプチドの本来の部位での消化、溶離、精製、およびペプチド配列は、エール大学のW. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratoryで本実験の標準プロトコルに従って実行された。
例６
以下の例はマウスとヒトニュールツリンcDNAクローンの分離と配列解析を例示する。
逆転写されたmRNAからのcDNA配列を増幅するため、様々な長さの確実なアミノ酸配列データに対応する変性オリゴノヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるプライマーとして合成し使用した。前向きプライマー（M1676; 5’-CCNACNGCNTAYGARGA，配列番号（SEQ ID NO）：50）は、ペプチド配列P2 Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa3-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val（Xaa1およびXaa2は未知,Xaa3はGlnまたはGlu）（配列番号（SEQ ID NO）：５）に対応する。逆向きプライマー（M1677; 5’-ARYTCYTGNARNGTRTGRTA（配列番号（SEQ ID NO）：52）は、ペプチド配列P3（Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg）（配列番号（SEQ ID NO）：６）に対応する。これらのプライマーを用いて、E21ラットおよび成熟マウス脳から得られたcDNA鋳型からの69ヌクレオチド生成物を増幅するのに使用した。PCRパラメータは：94℃で30秒；55℃で30秒；72℃で１分間を35サイクルを用いた。生成物をブルースクリプト（Bluescript）KSプラスミドにサブクローニングして配列決定した。すべてのヌクレオチド配列決定を、Applied Biosystems社の自動シーケンサーModel #373（Applied Biosystems, Foster City, CA）でメーカーの指示に従い、蛍光染料ターミネーター技術を使用して行った。配列決定のためのプラスミドDNAは、メーカーの指示に従いウイザード  ミニプレップ（Wizard Miniprep）キット（Promega社、Madison、WI）を使用して生成した。増幅された生成物の配列は、PCRプライマーより内部のアミノ酸配列データを正しく予測した。
増幅された配列に対応するプライマーを変性プライマーと共に用いて、cDNA末端（RACE）技法（Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993）の高速増幅を行った。これにはメーカーの指示にしたがい、マラソン（Marathon）RACEキット（CLONTECH、Palo Alto、CA）を使用したが、メーカーの指示と異なるのは、スーパースクリプトII（SuperscriptII）の逆転写酵素（Gibco-BRL）を使用して最初のcDNA鎖の合成を50℃で実行したことだった。簡潔に述べると、二本鎖のアダプタ・オリゴノクレオチドを、生後１日目のラットの脳のmRNAから合成された二本鎖のcDNAの末端に結合させた。繰り込まれた前向きニュールツリンPCRプライマー（M1676; 5’-CCNACNGCNTAYGARGA，配列番号（SEQ ID NO）：50 and 1678; 5’-GACGAGGGTCCTTCCTGGACGTACACA,配列番号（SEQ ID NO）：53）をキット（AP1,AP2）供給の結合アダプタに対応するプライマーと組み合わせて使用し、ニュールツリンcDNAの3’末端を２つの連続したPCR反応によって増幅した（初回：M1676およびAP1,94℃で30秒、55℃で30秒、続いて72℃で２分を35サイクル使用で；２回目：M1678およびAP2,94℃で30秒および68℃で２分を35サイクル使用で）。結合cDNAを鋳型として使用した２つの連続したPCR反応で、ラットのニュールツリンcDNAの5’末端を得た。１回目の反応はプライマーM1677（配列番号（SEQ ID NO）：52）とAP1を用いた。パラメータは94℃を30秒、55℃を30秒；次に、72℃を２分、35サイクル使用。２回目の反応は、M1679 5’-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT（配列番号（SEQ ID NO）：54）およびAP2を用いて、94℃で30秒、68℃を２分を35回くり返すパラメータで行った。これらの反応の結果、ニュールツリンcDNAの5’末端の上部欠損形が生成されたが、これは明らかに逆転写過程における時期尚早なcDNAの終了の結果である。これらの5’および3’RACE生成物をプラスミッド  ブルースクリプト（Bluescript）KSにサブクローンし、配列決定を行った。これらの3’と5’末端RACE生成物の配列は、ラットニュールツリンの部分的なcDNA配列220ntとなった。ラットの部分的なcDNA配列に対応するプライマー（#467921 5’-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG，配列番号（SEQ ID NO）：55；and M1679（配列番号（SEQ ID NO）：54）を用いて（PCRパラメータ：94℃で30秒および68℃で１分、これを35サイクル）、ラットニュールツリンcDNA配列と相同のマウスゲノムDNAからの101ヌクレオチドPCR生成物を増幅するのに使用した。
次に、これらのプライマーを、P1バクテリオファージベクターのマウス129/Svライブラリーからネズミ科ニュールツリンゲノムクローンを得るのに使用した（library screening service of Genome Systems, Inc., St. Louis, MO）。ニュールツリン遺伝子を含むこのP1クローンからのA1. 6kb Nco I断片をプライマー（#465782; 5’-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTGGACGTACACAGCCGCTAYCAYAC，配列番号（SEQ ID NO）：56）とのハイブリダイゼーションで確認した。このNco I断片は、N-末端およびCHOの細胞の調整済培地から分離された活性タンパクの配列決定から得られる生体アミノ配列に対応するコーディング配列の鎖を含むことが判明した。このヌクレオチド配列は精製されたタンパクのN末端のアミノ酸配列で始まり、11.5kDの予測分子量をもつ100アミノ酸タンパクをコード化する。タンパクと核酸データベースの検索によって、ニュールツリンがグリア由来神経栄養因子（GDNF）と約40%まで一致する新種のタンパクがであることを確認した。GDNFは、中脳のドーパミン性ニューロンの生存を促進し、TGF-β上位ファミリーの遠い親戚の構成因子として精製されクローン化された。このTGF-β上位ファミリーには現在までのところ、様々な増殖・分化活性をもつ25を超す異なった遺伝子が存在している。GDNFはTGF-βファミリーの他のどの因子と比べても、その共通性は20%未満であるが、７つのシステイン残基をファミリー全体にわたって保存し、TGF-β２の水晶構造測定で観察された保存型システイン結節構造の基礎であると信じられる。ニュールツリンもこれらの７つのシステイン残基を含むが、GDNFのようにTGF-βファミリーの他の因子と比較しても相同性は20%未満である。したがって、ニュールツリンおよびGDNFは、成長因子の下位ファミリーを表し、TGF-β上位ファミリーの残りの因子から相当離れているように見える。
マウスのニュールツリンcDNAの全長配列を測定するため、5’および3’RACE PCRを上記のようにラットで実行したが、この場合、新生マウスの脳からのマウスゲノム配列とcDNAから予想された繰り込みプライマーを使用した。3’末端用の最初の反応のプライマーには：M1777 5’-GCGGCCATCCGCATCTACGACCGGG（配列番号（SEQ ID NO）：；57）、およびAP1を用いて、94℃で30秒；65℃で15秒、68℃で2分を35回繰り返すパラメータで行った。2番目の反応にはプライマー#467921（配列番号（SEQ ID NO）：55）とAP2を使用し、94℃で30秒；65℃で15秒、68℃で２分を20回くり返した。5’末端は最初の反応プライマーM1759に5’-CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGGT（配列番号（SEQ ID NO）：58）およびAP1を使用して、94℃で30秒；65℃で15秒、68℃で２分を35サイクルの条件で行った。２番目の反応にはプライマーM1785、5’-GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTAGATGCG（配列番号（SEQ ID NO）：59）およびAP2を使用したが、条件は94℃で30秒；65℃で15秒、68℃で２分を20サイクル。両セットのPCR反応には5%のDMSOを含めた。マウスの5’と3’RACE生成物をプラスミッドブルースクリプトKSにサブクローンし、配列を決定した。RACE生成物を使用し、1.0kbのマウスニュールツリンcDNA配列を組み立てることができる。このcDNA配列には、24kDの分子質量のタンパクをコード化する585ヌクレオチドの開放読取り枠が含まれる。図７にこのマウスcDNA全長配列を示す（配列番号（SEQ ID NO）：12）。TGF-βファミリー因子に関して起こることが知られる処理上の出来事と違わず、24kDのニュールツリンタンパクには、アミノ末端19アミノ酸シグナル配列が含まれ、次に、続いてRXXRタンパク分解処理部位を含むプロドメインが続く。この処理部位はCHO細胞による調整済培地からの精製タンパクの配列を決定する際に得るN末端アミノ酸配列の直前にある。これらのランドマークを使用し、11.5kD成熟ニュールツリン分子が11.5kDであると予測し、またTGF-βファミリーの他の構成因子からの類推で、23kDのホモダイマーに結合された二硫化物を構成することが予測される。さらに、このホモダイマはSDS-PAGE分析で予測されているようにCHO細胞調整済培地から精製されたタンパクの質量25kDとも一致する。
ヒトゲノムクローンの分離には、マウスの配列から予測されたプライマー（#467524; 5’-CGCTACTGCGCAGGCGCGTGCGARGCGGC，配列番号（SEQ ID NO）：60 and #10005, 5’-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA，配列番号（SEQ ID NO）：61）を使用して、ヒトゲノムDNAからの192ヌクレオチド断片を増幅した（PCRパラメータ：最初のタンパクの変成：95℃で１分30秒、94℃で30秒、60℃で15秒、68℃で60秒を35回サイクル）。PCR生成物の配列は、マウスのニュールツリンがヒトと同相であることを示した。次にプライマーを、P1ベクター（library screening service, Genome Systems, Inc.）で構成されたヒトゲノムライブラリーの選別に使用した。こうして、ヒトニュールツリンゲノム遺伝子座を含む2つのクローンが得られた。
同じ手法を用いて、前出のマウスの配列で述べたように、ヒトの配列を予測した。オリゴ（小数発振）（#30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGACGAG,配列番号（SEQ ID NO）：62）をプローブとして使用し、サザンブロット分析法を用いて、ヒトニュールツリンコーディング配列を含むP1クローン（Clones）の制限断片を識別した。これらの制限断片（Eag I，Pvu II，Hind III，Kpn I）をブルースクリプトKSプラスミッドにサブクローンし、配列を決定した。ヒトゲノム断片のサブクローニングと配列決定の結果は以下の通りだった。Eag I断片のサイズは約6kbで、3’Eag I部位が停止コドンから60bp下流に位置していることがわかった。Pvu II断片のサイズは約3.5kbで、3’Pvu II部位は停止コドンから250bp下流に位置していることがわかった。Hind III断片のサイズは約4.8kbで、3’Hind III部位は停止コドンから3bp下流に位置していることがわかった。Kpn I断片のサイズは約4.2kbで、3’Kpn I部位は停止コドンから3.1bp下流に位置していることがわかった。
第２の暗号化エクソンの配列は、サブクローンされたこれらの断片を用いて決定された。また、第２エクソンの3’側に位置する250bpからも配列を得た。さらに、暗号化エクソンの5’側に位置する1000bpからも配列を得た。これらの側面配列から、前向プライマー30341（5’-CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3’，配列番号（SEQ ID NO）：71）および、逆向プライマー30331（5’-GCCAGTGGTGCCGTCGAGGCGGG-3’，配列番号（SEQ ID NO）：72）を設計した。これは第２エクソンの全暗号化配列が、PCR（ピーシーアール法）により増幅されるためである。
第１暗号化エクソンのマッピングは上記の制限部位に関連しては行われなかったが、Eag Iの断片に内包された。このエクソン配列は、サブクローンを行ったEag 1断片から、ATGイニシエーション・コドンを含むマウスのプライマー、466215（5’-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3’，配列番号（SEQ ID NO）：73）を用いて得られた。第１暗号化エクソンの以降の配列は、プライマー466215で得た配列から設計された逆向プライマー、20215（5’-CCACTCCACTGCCTGAWATTCWACCCC-3’，配列番号（SEQ ID NO）：74）を用いて得られた。前向プライマー、20205（5’-CCATGTGATTATCGACCATTCGGC-3’，配列番号（SEQ ID NO）：75）は、プライマー20215で得られた配列から設計された。プライマー20205と20215は、第１暗号化エクソンの暗号化配列の側面に並び、PCRを用いてこの暗号化配列の増幅に使用することが可能である。
例７
本例はニュールツリンcDNAを内包する発現ベクターの製剤を示すものである。
組換え体ニュールツリンを哺乳動物の細胞で発現させるため、ニュールツリンベクター、pCMV-NTN-3-1が構築された。ニュールツリンcDNAの585ヌクレオチド転写解読枠は、ニュールツリン暗号化配列（5’-GCGACGCGTACCATGAGGCGCTGGAAGGCAGCGGCCCTG，配列番号（SEQ ID NO）：63）の最初の27個のヌクレオチドを含むプライマーおよび、最後の5つのコドンおよびストップ・コドン（5’-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC，配列番号（SEQ ID NO）：64）を含むプライマーを用いるPCR法で、生後１日目のマウスの脳のmRNAの逆転写をテンプレートとして使用して増幅された。使用されたPCRパラメータは（PCRパラメータ：94℃で30秒；60℃で15秒；68℃で2分を35サイクル、反応には5%のDMSOを含める）であった。PCR生成物は、PCRによる突然変異がないことを確認するため、BSKSのEco RV部位へサブクローンされ、配列決定が行われた。次にMlu I（5’末端）およびBam H1（3’末端）を用いてニュールツリン暗号化配列はこのベクターから切除され、哺乳類発現ベクターpCB6（Brewer, C.B. Methods in Cell Biology 43:233-245, 1994）中のCMV IEプロモーター／エンハンサーの下流へ挿入され、これらの部位を用いたpCMV-NTN-3-1ベクターが生成された。
E.コイル内における組換えタンパクの発現のため、マウスニュールツリンの成熟した暗号化部位がPCRで増幅された。増幅には成熟暗号化配列（5’-GACCATATGCCGGGGGCTCGGCCTTGTGG）（配列番号（SEQ ID NO）：65）の最初の７つのコドンを含むプライマー、および最後の５つのコドンと停止コドン（5’-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC）（配列番号（SEQ ID NO）：66）を含むプライマーを使用し、その方法としてネズミ科のニュールツリン遺伝子を含む断片をテンプレートとして、以下のPCRパラメータ（PCRパラメータ：94℃で30秒；60℃で15秒；68℃で90秒を25サイクル、反応には5%のDMSOが加えられた）が使用された。増幅された生成物は、BSKSのEco RV部位へサブクローンされ、ヌクレオチド配列を確認した後、この断片はNde 1部位（5’末端）およびEco R1部位（3’末端）を用いて、発現ベクターpET-30a（Novagen, Madison, WI）へ移転された。pET-ニュールツリン（pET-NTN）ベクターは、成熟マウスのニュールツリンタンパクの最初のアミノ酸の前にあるイニシエータメチオニンを暗号化する。これはCHO細胞調整済培地から精製されたニュールツリンのN-末端アミノ酸配列から予想されたものである。
例８
本例は、ニュールツリン発現ベクターpCMV-NTN-3-1を有するNIH3T3細胞の一時的なトランスフェクションならびに、例７のゲノム配列の生成物が生物学的に活性であることを示すものである。
クローンされたNurturing cDNAにより生物学的に活発なニュールツリン合成が十分行われることを示すため、トランスフェクションのリポフェクトアミン（lipofectamine）法を用いて、pCMV-NTN-3-1プラスミドをNIH3T3細胞へ一時的に導入した。トランスフェクションの前に、NIH3T3細胞を１ウェル（直径34.6mm）当たり40万細胞の濃度で６ウェルのプレート（Corning, Corning, NY）で24時間平板培養した。DNAリポソーム複合体をメーカーのプロトコルに従って調製し細胞に加えた。その方法として、1.5μｇ CMV-ニュールツリンプラスミドDNA（Qiagen（Chatsworth, CA）のtip-500カラムを用いて同社のプロトコルに従い分離し精製した）および、10μｌのlipofectamine試薬（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）並びに、５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび5ng/mlの亜セレン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を含む1:1 DME/F12培地を使用した。DNAリポソーム複合体をウェル当たり1mlの培地に加えた５時間後に、20%の子牛血清を含む1ml DME培地を各ウェルに加えた。DNAリポソーム複合体を加えた24時間後に、上記の培地2mlを子牛血清10%、グルタミン2mM、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μ/mlおよびヘパリン25ug/mlを含む1ml DME培地と置き換えた。細胞をさらに24時間培養した後、調整済培地を採取し、遠心分離機にかけて細胞破片を除去して、冷凍した。
対照として、1.5μｇ CMV-ニュールツリンプラスミドの代わりに1.5μｇ CMV-ネオ（neo）発現プラスミド（cDNA挿入を含まない）を用いて、NIH3T3細胞のトランスフェクションを上述のように行った。対照プラスミドかCMV-ニュールツリンプラスミドでトランスフェクションされたNIH3T3細胞から得た調整済培地のアッセイは、NGFを枯渇させた時点でSCG培地に直接加えることにより行った。CMV-ニュールツリントランスフェクション細胞から得た0.25mlの調整済培地を加えることにより、交感神経ニューロンの70%の生存率を向上させた。この調整済培地0.45mlを付加すれば、90%以上の生存率が実現したかもしれない。対照トランスフェクションNIH3T3細胞の調整済培地には、生存を促進するような顕著な活動は認められなかった。
例９
本例はニュールツリンcDNAで安定した形質転換が行われたチャイニーズハムスター卵巣細胞の調製法を示す。
ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ（DHFR）（UrlaubほかCell 3: 405-412, 1983を参照により本文に採用）を欠失しているチャイニーズハムスター卵巣細胞の誘導体であるDG44細胞の同時トランスフェクションを、発現プラスミド（pCMV-NTN-3-1）およびDHFR発現プラスミド（HLD）を用いて行った（McArthur, and Stanners, J. Biol. Chem. 266: 6000-6005, 1991参照により本文に採用）。
１日目に、10%のウシ胎児血清（FCS）を含有したHamのF12培地の中で、10cm培養プレート当たり1x106個のDG44細胞を培養した。この濃度は最大許容濃度であり、これを超えた場合、５日目に選択培地を加える前に細胞が増殖し過ぎる恐れがある。
２日目に、リン酸カルシウム法（10ug DNA/10cmプレート）（Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987参照により本文に採用）を用いて、pCMV-NTNとDHFR発現プラスミドの比率を9:1とする細胞のトランスフェクションを行った。
３日目に、トランスフェクション細胞をHam’s F12培地で洗浄し、Ham’s F12へ10%のFCSを与えた。
５日目に、細胞はMEMアルファ培地で洗浄され、10%のFCSおよび400ug/mlのG418を内容とする選択培地を与えられた。細胞を選択培地に保存し、４日毎に栄養を与えた。トランスフェクション後約14日目にコロニーが形成され始めた。次に選択培地で繁殖するコロニーを、24のウェル付き培養プレートに移し、翌日トリプシン化を行って細胞を拡散させた。組換えタンパク発現用の細胞を選別するため、24のウェルまたは６つのウェル付き培養プレートで細胞を稠密培養させた。10本のクローン系でニュールツリンの発現を調べ、SCG生存アッセイを用いて２本の高度な発現系を検出した。これらのクローン系を拡大し、これらの選択細胞系における発現を50nMのメトトレキセート（MTX）の中での選別により増幅した。MTX中での選別のため、細胞は150cm2フラスコの選択培地で50%の密度にまで増殖した。培地は50nM MTX濃縮体を含むMEMアルファに変更された（MTX増幅中にG418を用いる必要はなかった）。50nM MTXに移した後、大多数の細胞は死亡し、抵抗力の強い細胞コロニーが１〜２週間で出現した。この時点で細胞をトリプシン化してコロニーを拡散させ、細胞が稠密化した時点で細胞を分割した。細胞は間もなく以前と同様の成長率に達した。組換えタンパクの発現を目的として、選択細胞の選別が行われた。50nM MTX中での選別後、２〜３倍の発現の増加が観察された。冷凍ストックが、オリジナルの選別および50nMのMTX中での選別から得られた細胞系用として保存された。MTXの増加とともに、目標レベルの発現が得られるまで選別をさらに続けてもよい。
上記の方法を用いて、DG44CHO5-3（G418）（pCMV-NTN-3-1）およびDG44CHO5-3（50nM MTX）（pCMV-NTN-3-1）と識別された細胞を分離した。DG44CHO5-3（50nM MTX）（pCMV-NTN-3-1）変種からの細胞は、１リットルの調整済培地当たり約100μｇの生物学的に活性を示すタンパク量を発現した。これは例１の方法によるSCGアッセイ中の調整済培地の直接アッセイにより決定した。
例10
本例はpJDM1926発現ベクターの調製および、ベクターで安定した形質転換が行われたE.コイルの調製を示す。
成熟ネズミ科のニュールツリンタンパク（すなわち最初のCys枠の残基の上流（PGARP）にある5個のアミノ酸）をコード化するニュールツリンcDNA断片を、Nde IおよびBam H1の部位でpET発現ベクターpET-30aの中へクローンを行った。発現レベル改善のため、ヌクレオチドの配列を変えた。これはバクテリアの好むコドンが自然発生のネズミ科のコドンに置き換えられるためである。E.コイルを好むコドンニュールツリンを以下の配列番号（SEQ ID NO）：79に述べる。
0004222629.tif 000004
これらの操作によるアミノ酸の配列には変化はない。この人工のニュールツリン遺伝子を構築するため、一連の重複オリゴヌクレオチド４個を合成した。
M2021：
0004222629.tif 000005
オリゴヌクレチドは成熟したニュールツリンの配列に対応した。線状の配列を形成するため、これらのプライマーを互いにアニールさせて線状の配列を作り、クレナウ（Klenow）断片で延長し、キナーゼおよび結さつを行い、pBS-KSプラスミドを得た。M2021およびM2033を使用して、これらの結さつ反応はPCR反応でのテンプレートとして使用された。反応には次のようなパラメータを用いた（94℃で30秒、72℃で60秒を30サイクル）。PCR生成物（配列番号（SEQ ID NO）：79に対応）をBSKSプラスミドのEcoRV部位へサブクローンして配列を行い、突然変異が存在しないことを確認した。つぎにNdeIおよびBam H1を用いて、ニュールツリン配列をこのベクターから切除し、バクテリア発現ベクターPET30a（Novagen, Madison, WI）のｎNde I（5’）およびBam H1の（3’）部位へクローンを行った。オリゴヌクレオチドM3199（5’-TAGCCTTGTCGTCGTCGTCATGATGATGATGATGGTGCA，配列番号（SEQ ID NO）：84）およびM3197（5’-TATGCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGGC，配列番号（SEQ ID NO）：85）をNde I部位へクローンすることにより、６個のHis残基の後にエンテロキナーゼ部位が続くヒスチジン標識を、開始メチオニン上流に置いた。この結果、６個のヒスチジン残基の後にエンテロキナーゼ部位が直接続くアミノ酸末端標識を有するニュールツリンタンパクが生成された。
この結果得られたプラスミド（pJDM1926）をE.コイル変種BL21（DE3）へ導入した。ニュールツリンを生成するため、このプラスミドを宿すバクテリアを16時間培養したあと採取し、6Mグアニジン-HCl, 0.1M NaH2PO4, 0.01Mトリス（Tris）（pH8.0）を用いて溶解させ、Ni-NTA樹脂（Qiagen）上のクロマトグラフィーを介して、これらの溶解生成物から組換えニュールツリンタンパクを精製した。３カラム量の緩衝液E（8Mの尿素，0.1M NaH2PO4, 0.01Mトリス，pH4.5）を用いてタンパクを溶離させた。次に濃度の低い尿素を含有する再生緩衝液（0.1MのNaH2PO4, 0.01Ｍトリス，pH8.3, 0.15M Nacl, 3mMシステイン，0.02% Tween-20, 10%グリセロール）中での透析により、ニュールツリンを再生した（4Mで16時間、2Mで16時間、1Mで72時間、0.5Mで16時間の順に）。続いて、ブラッドフォード法（Bio Rad）を用いてニュールツリンの濃度を決定し、４℃で保存した。
例11
本例はさまざまな組織内におけるニュールツリンの発現を示す。準数量的なRT/PCR（Estusほか、J Cell Boil 127 :1717-1727, 1994，を参照により本文に採用）を用いて、ラットの胎児組織（E10，受胎後10日目）、新生児組織（P1，生後１日目）、および成体組織（生後３ヶ月以上）における、ニュールツリンおよびGDNFの発現の調査を行った（Estusほか、J Cell Biol 127:1717-1727, 1994参照により本文に採用）。各種の組織からRNAの試料を採取、またα−32ｐ−dCTPをPCR中へ組入れた後のオートラジオグラフィおよびポリアクリルアミド・ゲル（図６）上の電気泳動により、またはアガロース・ゲル上の電気泳動後のDNAのエチジウムブロマイド染色（表３および４）のいずれかの方法により、PCR生成物を検出した。前向プライマーCAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG（配列番号（SEQ ID NO）：67）および、逆向プライマーTAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT（配列番号（SEQ ID NO）：68）を用いて、101個の塩基対のニュールツリン断片を得、また前向プライマーAAAAATCGGGGGTGYGTCTTA（配列番号（SEQ ID NO）：69）、および逆向プライマーCATGCCTGGCCTACYTTGTCA（配列番号（SEQ ID NO）：70）を用いて、194個の塩基対のGDNF断片を得た。
調査した胎児初期（受胎後10日目、E10）には、ニュールツリンもGDNF mRNAも認められなかった。新生児期（誕生１日目、P1）には、両転写が多くの組織で発現されたが、ほとんどの組織でニュールツリンの発現がGDNFよりはるかに多く認められる傾向にあった（表３を参照）。
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表３に示すごとく、ニュールツリンとGDNFの組織分布に相違が見られた。肝臓と胸線には特にGDNFを認めなかったが、ニュールツリン発現を認めた。また座骨神経にはニュールツリンを認めなかったがGDNFを認めた。
動物成体の多くの組織にニュールツリンとGDNF mRNAを認めたが、この２つの遺伝子に関しては発現の組織固有パターンに大きな違いが見られた（表４、図５）。
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表４に示すごとく、ニュールツリンは脳および脊髄並びに血液および骨髄に発現されたことが分かったが、GDNFは認められなかった。しかし脳および血液内でのニュールツリンの発現レベルは新生児組織で認められたよりも低かった。
ニュールツリンは新しく分離されたラットの腹膜のマスト細胞できわめて多く発現されたが、GDNFはほとんどまたは全く発現されなかった。
例12
本例は、ニュールツリンペプチドでウサギに免疫性を与えることにより、ニュールツリンに対する抗血清の調製を示すものである。
成熟ネズミ科のニュールツリンタンパクのアミノ酸73-87に対応するペプチド配列を合成し、前述のごとく、キーホール・カサガイ・ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin, KLH）に結合させた（Harlow and Lane, Antibodies: a laboratory manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY. p.72-81を参照により本文に採用）。KLHに結合されたペプチドをCaltag, Incに提出し、２匹のウサギの免疫が行われた。免疫は皮下注射で７〜10カ所に行った。初回投与として、0.5mlの生理食塩水に懸濁され、0.5mlのフロイント完全アジュバントで乳化された150μｇのKLH結合ペプチドを注射した。初回投与の４週間後にブースター投与を行い、その後は100μｇのKLH結合ペプチドおよびフロインドの不完全アジュバントを使用した以外は、７日毎に合計５回上記のような注射を行った。５回目のブースター投与の１週間後に血清試料を採取した。
５回目の注射の後２匹のウサギから採取した20mlの血清を合わせて精製した。精製には、メーカーのプロトコル（Pharmacia Biotech）に従い、上記のペプチドを臭化シアン活性化Sepharose 4Bに結合することにより、ペプチド・アフィニティ・カラムを準備した。血清を10mMトリス緩衝液（pH7.5）で10倍に希釈し、４℃で16時間軽く揺すって5mgの結合ペプチドを含む0.5mlのペプチド・アガロース・マトリックスと混合させた。マトリックスをカラムに入れ、5mlの10mMトリス（pH7.5），150mM NaClで洗浄し、0.4M NaCl 5mlを含む10mMトリス（pH7.5）緩衝液で洗浄し、且つ5.5mlの100mMグリシン（pH2.5）緩衝液で溶離させた。溶離後ただちに1.0Mトリス（pH8.0）緩衝液の10分の１量を溶出液に加え、酸度を低下させた。グリシン溶出液を10mMトリス（pH7.5）NaClに対して一泊透析した。
組換えニュールツリンタンパクが特に確認されたことを実証するため、ウェスタン・ブロット法でアフィニティ精製された抗体を使用した。DG44CHO5-3（G418）（pCMV-NTN-3-1）細胞から採取した10mlの調整済培地を、例１に述べたごとくSP Sepharose上で精製し、タンパクをトリシン（tricine）緩衝液装置内の還元SDS-PAGEゲル上で電気泳動させた（Schagger and von Jagow, Analytical Biochemistry 166 :368-379, 1987）。タンパクは、25mMトリス，192mMグリシン、0.04%のSDS、17%のメタノールの中で、４℃で16時間ニトロセルローズメンブレンに電気ブロットされた。メンブレンはアフィニティ精製された抗ニュールツリンペブチド抗体、続いてセイヨウワサビ・ペルキシダーゼ結合のヒツジの抗ラビットIgCで培養された（上記、Harlow and Lane, p. 498-510）。化学発光をより強力に放つ結合抗体が認められた（ECL kit, Amersham, Buckinghamshire, England）。抗ニュールツリン抗体は、DG44CHO5-3（pCMV-NTN-3-1）細胞の調整済培地の中に約11.5kDのタンパクバンドを１本認識した。これらの抗ニュールツリン抗体を使用して、DG44CHO5-3（G418）（pCMV-NTN-3-1）細胞からの10ml調整済培地内にニュールツリンタンパクを認めることができたが、ニュールツリン発現ベクターで形質転換を行わなかったDG44細胞で調整された10mlの調整済培地にはタンパクを認めることができなかった。
例13
本例はGDNF／ニュールツリン遺伝子の他の下位ファミリー構成因子を示すものである。
TGF-β上位ファミリーには現在25以上の異なる遺伝子因子がある（詳細についてはKingsley, Genes and Development 8: 133-146, 1994を参照により本文に採用）。各ファミリー構成因子は、互いに様々な程度の相同性を示し、上位ファミリー内の幾つかの亜族はClustal Vプログラムを用いた系統発生的分析（Higginsほか、Comput Appl Biosci 8: 189-191, 1992、を参照により本文に採用）、並びに系統発生的系統樹のブートストラップ分析（Felsenstein, Evolution 39: 783-791, 1985、を参照により本文に採用）による定義が可能である。ニュールツリンはのGDNFと約40%同じであるが、TGF-β上位ファミリーの他の構成因子との同一性は20%未満である。GDNF／ニュールツリン下位ファミリーには多く保存されているが、TGF-β上位ファミリーには保存されていないニュールツリンの数カ所の配列部位を識別することが可能である（図５）。これらの保存部位は、以前は不可能だった分離が今では可能な遺伝子を含む下位ファミリーの特徴を有する傾向にある。分離は、ニュールツリン遺伝子の発見および配列決定から識別された保存配列部位を使用することにより可能である。配列が多く保存されているニュールツリンおよびGDNF間の部位を用いることにより、プローブまたはプライマーとして使用できる変性オリゴヌクレオチドを設計することができる。識別された保存部位のアミノ酸配列は以下の通りである。Val-Xaa1-Xaa2［-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr、うちXaa1はSerまたはThrで、Xaa2はGluまたはAspである（配列番号（SEQ ID NO）：33）。Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys-Xaa6-Xaa7-Ala、うちXaa1はThrまたはGlu、Xaa2はValまたはLeu、Xaa3はLeuまたはIle、Xaa4はAlaまたはSer、Xaa5はAlaまたはSer、Xaa6はGluまたはAsp、Xaa7はAlaまたはSer（配列番号（SEQ ID NO）：34）。Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa1-Ala-Xaa2-Xaa3-Asp-Xaa4-Xaa5-Ser-Phe-Leu-Asp、このうちXaa1はThrまたはValまたはIle、Xaa2はTyrまたはPhe、Xaa3はGluまたはAsp、Xaa4はGluまたはAsp、Xaa5はValまたはLeu（配列番号（SEQ ID NO）：35）。上記の保存配列または上記の保存配列の断片のための暗号化配列を含むヌクレオチド配列をプローブとして使用することが可能である。これらの部位から設計が可能な典型的なプローブおよびプライマーは以下の通りである。プライマー1: GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA（配列番号（SEQ ID NO）：42）。このプライマー１は次のアミノ酸配列を暗号化する:Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr（うちXaa1はSerまたはThr、Xaa2はGluまたはAsp）（配列番号（SEQ ID NO）：43）。プライマー2: TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC（配列番号（SEQ ID NO）：43）。プライマー２は次のアミノ酸配列を暗号化する:Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala（うちXaa1はAlaまたはSer、Xaa2はAlaまたはSer、Xaa3はGluまたはAsp、Xaa4はSerまたはAla）（配列番号（SEQ ID NO）：36）。プライマー３（逆向）：GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA（配列番号（SEQ ID NO）：44）。このプライマー３は次のアミノ酸配列を暗号化する:Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala（このうちXaa1はAlaまたはSer、Xaa2はAlaまたはSer、Xaa3はGluまたはAsp、Xaa4はSerまたはAla、）（配列番号（SEQ ID NO）：37）。プライマー４（逆向）: TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA（配列番号（SEQ ID NO）：45）。このプライマー4は次のアミノ酸配列を暗号化する:Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa1-Ala-Xaa2-Xaa3-Asp-Xaa4（うちXaa1はIleまたはThrまたはVal、Xaa2はTryまたはPhe、Xaa3はGluまたはAsp、Xaa4はGluまたはAsp）（配列番号（SEQ ID NO）：38）。プライマー��（逆向）: TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC（配列番号（SEQ ID NO）：46）。このプライマー5は次のアミノ酸配列を暗号化する:Ala-Xaa1-Xaa2-Asp-Xaa3-Xaa4-Ser-Phe-Leu-Asp（うちXaa1はTyrまたはPhe、Xaa2はGluまたはAsp、Xaa3はGluまたはAsp、Xaa4はValまたはLeu）（配列番号（SEQ ID NO）：39）。プライマー6: GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG（配列番号（SEQ ID NO）：47）。このプライマー6は次のアミノ酸配列を暗号化する：Glu-Xaa1-Xaa2Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys（うちXaa1はGluまたはThr、Xaa2はLeuまたはVal、Xaa3はIle or Leu（配列番号（SEQ ID NO）：40）。プライマー7: GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA（配列番号（SEQ ID NO）：48）。このプライマー７は次のアミノ酸配列を暗号化する:Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys-Xaa6（このうちXaa1はGluまたはThr、Xaa2はLeuまたはVal、Xaa3はIleまたはLeu、Xaa4はSerまたはAla、Xaa5はSerまたはAla、Xaa6はGluまたはAsp）（配列番号（SEQ ID NO）：41）。
上記の配列は、ゲノムクローンの選別ライブラリー用プローブとして、またはゲノムDNAかゲノムクローンのライブラリーから、または多様な組織のRNAテンプレートを用いた逆転写cDNAから得た遺伝子断片の増幅用プライマーとしても用いることができる。ゲノムDNAまたはゲノムクローンのライブラリーはテンプレートとしても使用できるが、その理由は、ニュールツリンおよびGDNFのイントロン／エクソン構造は保存されており、成熟タンパクのコード化配列はイントロンによって遮断されないからである。
変性オリゴヌクレオチドを、保存アミノ酸配列の暗号化に可能なヌクレオチド配列を全て含むオリゴヌクオチドの混合物として合成することができる。変性混合物内の各種オリゴヌクレオチドの数を減少させるため、４種の全ヌクレオチドが存在する位置で、イノシン塩基を合成物へ組み込むことが可能である。イノシン塩基は４つの通常DNA塩基の各々と塩基対を形成する。このイノシン塩基の対はATおよびGC塩基対より安定性が少ないが、普通塩基（AG, AC,TG,TC）間の不釣り合いに比べると安定性がある。
ファミリー構成因子を単離するため、上記のプライマー末端にT4ポリオヌクレオチド・キナーゼを用いて、32Pの標識付けが可能である。また標準的方法に従ってヒトのゲノムクローンのライブラリーにハイブリダイゼーションを行うことができる。
ファミリーの構成遺伝子を単離する好適な手順は、ゲノムDNAをテンプレートとして用いるポリメラーゼ連鎖反応で、上記の変性プライマーの各種組合せをプライマーとして使用することである。例えば、プライマー２（配列番号（SEQ ID NO）：43）とプライマー4（配列番号（SEQ ID NO）：45）を組み合わせて、PCRで1ugのヒトのゲノムDNAと用いることができる（使用パラメータ：94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で60秒を繰り返す）。これらのPCR条件は模範例のみであるが、本技術に熟達した者であれば、緩衝液培地などでの温度や塩分濃度を変えるなど、広範な好適条件を使用することや最適化が可能なことをただちに理解するはずである。好適な方法として、ニュールツリン遺伝子のこの部位の増幅に必要だと認められる場合に限り、5%の最終濃度が得られるまでDMSOをPCR反応に付加することである。アガロースゲル上で実行される場合、PCR反応は規模にして125〜150の塩基対の生成物を含んでいることが必要である。その理由はGDNFと平行に並んだ時、ニュールツリン配列に１つのアミノ酸のギャップが導入されるからであり、従ってファミリー構成遺伝子間の間隔は、プライマー2および4の保存配列間でわずかに異なるかもしれない。塩基対が125〜150個のPCR生成物は、GDNF、ニュールツリンおよび事前に分離できなかったファミリー構成因子を含む多重増幅遺伝子生成物を含んでいることが必要である。これらの生成物の配列を識別するには、ゲルで精製を行い、ブルースクリプトプラスミド（ストラタゲン（Stratagene））内へ結さつを行い、続いてXL1-ブルー（blue）E.コイルの宿主株（Stratagene）へと形質転換を行う。独立したサブクローンを含むバクテリアのコロニーを選択して分離し、ニトロセルローズの２つに分かれた同型フィルターに培養してもいい。増幅部位にあるユニークなGDNFまたはユニークなニュールツリン配列を検出するため、オリゴヌクレオチド・プローブで同型フィルターの各々を覆うことができる。GDNFへもニュールツリンへもハイブリダイセーションされないサブクローンの配列を行い、もし以前分離されなかったファミリー構成因子をコード化することが分かったら、ニュールツリンで行ったように配列を用いて標準長のcDNAクローンおよびゲノムクローンを分離することができる（例７）。同様の方法を用いて、TGF-β上位ファミリーの新遺伝子（GDF-3およびGDF-9）を、以前識別された遺伝子間の相同性を基準として分離した（McPherron, J Biol Chem 268: 3444-3449, 1993，を参照により本文に採用）。
ファミリー構成員遺伝子を分離する最適な方法は、上記のPCR手順を選別方法として応用し、ファミリー構成因子の各独立ゲノムクローンをライブラリーから分離することであると発明者は信じる。これは成熟したニュールツリンの暗号化部位にもGDNFの暗号化部位にも、エクソンはただ１つしかないからである。例えば、もしプライマー２および４との上記のPCR反応が、ヒトのゲノムDNAをテンプレートとして適切なサイズの生成物を生み出せば、P1ベクター内のゲノムクローンの集合体をテンプレートとして使用し、かつニュールツリンのヒトのゲノムクローンの分離法など、本技術分野でよく知られる方法に従って同様の反応を生ぜしめることが可能である（例７）。このライブラリー中のニュールツリン遺伝子を含む集合体はすでに識別されており、GDNFを含む集合体は、GDNF固有のプライマーによる選別を行えば容易に識別できる。従って、これらの集合体から得た変性プライマーを用いて、適度のサイズの生成物を生み出す非ニュールツリン、非GDNFの集合体は以前の非隔離ファミリー因子として容易に確認することができる。こうした集合体から発生したPCR生成物は自動シーケンサーを使用して直接的に配列決定されることが可能で、またゲノムクローンの単離もGenome Systems社提供の標準的手法でクローンの集合体の下位分割と選別を進めることによって可能である。
例14
本例はニュールツリンを過剰発現する移転遺伝子由来マウスの調製過程を示す。
代謝の変化と脂肪組織の蓄積におけるニュールツリンの潜在的な役割を測定するため、移転遺伝子由来マウスの産出によって得られた多様な組織上のニュールツリンの過剰発現の結果を評価した。同マウスではミオゲニン（Myogenin）プロモーターを介して筋組織でニュールツリンが発現された。ネズミ科のミオゲニンプロモーター（Nt -1565から+18まで）（Edmondsonほか、Mol. Cell. Biol. 12:3665-3677, 1992）および、ヒトの成長ホルモンの3’スプライスおよびポリアデニレーション信号（Nt 500から2650まで）の間に存在するBam H1部位へネズミ科のニュールツリンcDNAがクローンされた構成体が生成した。構成体が正しく生み出されたことを確認するため、この構成体のヌクレオチド配列決定が行われた。Xba IおよびKpn Iを用いて、プラスミドのバックボーンをミオゲニン／ニュールツリン/GH断片から切り離し、断片をゲルで精製した。ゲルで精製された断片を、標準的手順によりB157マウスの卵母細胞へ注入した（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Hogan, B., Beddington, R., Constantini, F. and Lacy, E., Eds.; Cold Spring Harbor Press, 1994参照により本文に採用）。ミオゲニン／ニュールツリンの移植遺伝子（MyoNTN）を有する先駆者マウスをPCR法で判別し、移植遺伝子系繁殖のため交配させた。先駆者マウス10匹を入手し、このうちの3匹から移植遺伝子系を得た。
ニュールツリンが発現されたかどうかを測定するため、MyoNTN F1マウス数匹を犠牲にしてバイオアッセイを行った。移植遺伝子系動物の新生児マウスの後足から筋肉を切除して調べ、SCGアッセイ中に生存を促進するニュールツリンが含まれていることがわかったが、非移植遺伝子系新生児の筋肉には含まれていなかった。組織学的分析では、皮下脂肪がより多く含まれていること（図12）、および肝臓に脂肪が蓄積されていること（図13）が明らかになった。これはニュールツリンの過剰発現が動物の代謝に影響を与えることにより、脂肪組織が過剰に生成されたことを示唆している。
例15
本例は、交感神経ニューロンのニュールツリンまたはGDNF処理による有糸分裂促進活性タンパクキナーゼ（MAPキナーゼ）を示すものである。
MAPキナーゼ経路の活性化がNGFの栄養効果に関連することが明らかになった（Cowleyほか、Cell 77:841-852, 1994）。そこで、リン酸化MAPキナーゼ特有の抗体、並びにリン酸化および非リン酸化アイソフォームを認識できる抗体（非リン酸化アイソフォームはゲル上に乗せられたERK-1およびERK-2の総量の調節の役目をする）を用いて、MAPキナーゼ（MAPK）の細胞外の信号調節キナーゼ・アイソフォームERK-1およびERK-2を交感神経ニューロン内で活性化させるためのニュールツリンおよびGDNFの能力をテストした。
上頚部神経節から得たニューロンの一次解離培養生成物を前述の例２に従って準備した。６日目の培養生成物からNGFを12時間枯渇させ、その後ニュールツリン，GDNFまたはNGFで処理した。処理の５分後に、培養生成物をラエムリ（Laemmli）試料緩衝液中で直接溶解させ、５分間煮沸してSDS-PAGEにさらし、その後、例５で用いられたようなPVDFメンブレンへ移した。MAPK活性化の決定には、ホスホプラス（PhosphoPlus）MAPK抗体キット（New England BioLabs）をメーカーの使用説明書に従って使用して、ウェスタンブロット法でりん酸塩固有のMAPK抗体（図１４（ａ））のプローブを行い、続いてリン酸化および非リン酸化されたERK-1およびERK-2（図１４（ｂ））を認識する対照MAPK抗体のストリッピングと再プローブを行った。
レーン１は2ngのリン酸化ERK-2タンパク（P-ERK-2）、レーン２は2ngの非リン酸化ERK-2タンパクを示す。レーン３〜６は因子（対照）のない50ng/mlのNGF、50Ng/mlのニュールツリンまたは50ng/mlのGDNFで処理された交感神経ニューロンからの溶解生成物を示す。
リン酸化MAPキナーゼ固有の抗体は、ニュールツリン，GDNFまたはNGFで処理した後、リン酸化ERK-1およびERK-2を検出した（図１４（ａ））。これはNGFと同じく、ニュールツリンおよびGDNFが交感神経ニューロンのMAPキナーゼのERK-1およびERK-2アイソフォームを活性化させたことを示す。これらの結果はこの新しい因子の下位ファミリーが、特異な種類のレセプタタンパクと相互作用することにより、NGFおよび他のニューロトロフィンに用いられる特異なシグナル形質導入経路に同様に作用することを示唆している。
例16
本例は、ニュールツリンによる処理によって起きる神経芽細胞腫の細胞の分化ならびに、ニュールツリンおよびGDNFによるMAPキナーゼの活性化を示すものである。
神経芽細胞腫の細胞系は、10%のウシ胎児血清で補充され、かつ週２回継代接種されたRPMI組織培地に、低密度で培養維持された。細胞は１日目に5x103/cm2の濃度で６つのウェル付きプレートに平板培養された。２日目およびその後３日間、50ng/mlのニュールツリンで細胞を処理した後、３日目に顕微鏡下で調べた。未処理細胞は丸く破裂形状を示していたが、処理細胞は細胞の成熟と分化を示す多くの軸索をもつ神経細胞様形状を発生させていた（図１５（ａ）及び（ｂ））。
神経芽細胞腫の細胞におけるMAPキナーゼ活性に対するニュールツリンの影響を評価するに当たり、細胞（NSH神経芽細胞腫，NGP神経芽細胞腫，またはSY5Y神経芽細胞腫の細胞）を６個のウェル付きプレートに平板培養し、無垢細胞では２〜３日を要するさまざまな実験用の稠密度に達するようにした。非無垢細胞を、稠密以下の濃度でレチン酸（10μM）を使い３日間処理した。因子による刺激に先立ち、細胞を低濃度（0.5%）の血清培地で２時間培養した。SDS-PAGE用のSDSラエムリ緩衝液に指示因子を加え、続いて例15のごとくホスホ-MAPK抗体に対する免疫ブロットを行った５分後に、細胞を採取した。
図１６（ａ），（ｂ）および（ｃ）に示すごとく、ニュールツリン（NTN）およびGDNF並びにNGFは、SK-NSH神経芽細胞腫の（無垢）細胞、NGP神経芽細胞腫（GA tx）細胞、および神経芽細胞腫SY5Y（RX tx）細胞内で、MAPキナーゼのERK-1およびERK-2アイソフォームを活性化した。比較の方法としては、３種の細胞タイプがキナーゼ活性化剤PMAで処理された後ただちにMAPキナーゼアイソフォームのリン酸化を示した。
これらの結果は、ニュールツリンおよびGDNFが腫瘍細胞の分化促進に効果的であり、従って腫瘍の新療法、特に神経芽細胞腫の新療法となり得ることを示唆している。
例17
本例は後根神経節（DRG）ニューロン内のニュールツリンの逆移行を示している。
ニュールツリンおよびGDNFを、マーシャロニス（Marchalonis）の方法を用いてNa125Iおよびラクトペロキシダーゼでよう化し、同様の特定活性（0.6x105 cpm/ng）を得た（Biochem Journal 113:299-305, 1969を参照により本文中に挿入）。以下の量を使用して室温で反応を行った。36λの0.2M NaPO4緩衝液（pH6.0）中の１μｇまたは５μｇのタンパク、5-10λのＮａ125 I（Amersham, 1mCi/10λ）、1M NaPO4緩衝液（pH6.0）中の１λの1:103希釈H2O2（30%）。0.42M NaClおよび0.1M NaI（pH7.5）を含む150λの0.1M NaPO4緩衝液を加え、反応は15分後に終了した。
Sprague-Dawley成熟雄ラット（250-300g）に麻酔をかけた。坐骨神経を露出し、30秒間強い圧力をかけ、神経を部分的に潰した。１〜５λ（1-5x106cpm）の放射線標識したタンパクを、標識のない100倍の過剰タンパクが存在する中で、神経に直接注入した。14時間後に緩衝生理食塩水により心臓経由でラットの潅流を行い、続いて10%フォルマリンで固定し、同側および反対側L5-L3 DRGを除去した。ベックマン（Beckman）ガンマカウンターを使用してカウントし、液浸による固定を行った。次にDRGをアルコールで脱水し、サリチル酸メチルでクリアしてパラフィンで包埋した。10マイクロメートルの連続切片の標本を作り、脱パラフィン処理を行い、Kodak NTB-2エマルジョンでコーティングを行い、現像前に４℃で４〜５週間露出した。放射能写真の顕微鏡下の観察で、感覚ニューロン内に放射能の蓄積が予想通り観察された。
成熟ラットの坐骨神経内へ125I-neurturinを注入したところ、14時間後に標識付けしたタンパクの特有の蓄積が認められた（図17）。100倍の標識表示のない過剰GDNFまたは標識表示のない過剰ニュールツリンでこの蓄積を妨害することが可能である。このことはニュールツリンとGDNFが同じレセプタを求めて競合することを強く示唆している。
変種の供託。以下の変種はブダペスト条約に従い、American Type Culture Collection（12301 Parklawn Drive, Rockville, MD）に供託されている。生存能力試験をパスした後、表示の受入れ番号が割り当てられ、必要な供託料が支払われた。特許出願中の当該培養組織へのアクセスは、37 CFR（連邦規制基準）1.14および35 USC（合衆国法典）122の規定により、コミッショナーにより同培養組織を入手する権限を有するとみなされる者に対して許可される。当該培養組織の一般による利用可能性に対するあらゆる制約は、出願に基づいた特許が下りた時点で全て撤廃される。さらに指定供託金は、供託日から30年間、または供託の最終要請日後5年間、または米国特許が効力を有する期間のうち、いずれか最長の期間保管される。培養組織の生存能力が失われた場合、または不注意で培養組織が破壊された場合、またはプラスミド含有変種の場合でプラスミドが失われた場合、生存能力のある培養組織と取り換えるものとする。本文に記載する供託物は、便宜のみを目的に意図されたものであり、ここに説明した観点からは本発明の実施に必要なものではない。なお、これらの供託物を参照することにより本文に採用した。
0004222629.tif 000008
上記にかんがみて、本発明でいくつかの利点が得られ、かつ他にも有益な結果が得られることを理解できるであろう。
発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法および構成を様々に変えることが可能であるゆえに、意図により、上記の説明に含まれ且つ添付の図で示した全ての事項は実例的なものと解釈されるべきであり、制約を目的とするものではない。
SEQUENCE LISTING
（1）一般情報：
（i）出願人氏名: JOHNSON JR. EUGENE M
MILBRANDT. JEFFREY D
KOTZBAUER. PAUL T
LAMPE. PATRICIA A
（ii）発明の名称：ニュールツリンおよび関連成長因子
（iii）配列の数：１６９
（iv）通信住所：
（A）住所：HOWELL & HAFERKAMP, L.C.
（B）通り：7733 FORSYTH BOULEVARD. SUITE 1400
（C）市：ST. LOUIS
（D）州：MISSOURI
（E）国：US
（F）ZIP: 63105-1817
（v）コンピュータ読み取り形式：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：パテントインリリース＃１．０バージョン＃１．３０
（vi）出願データ：
（A）出願番号：ＷＯ  ＰＣＴ／ＵＳ９６１４０６５
（B）出願日：１９９６年８月２７日
（C）分類：
（viii）弁護人／代理人情報：
（A）名称：HOLLAND. DONALD R
（B）登録番号：35.197
（C）参照／名簿番号：９６５０２９
（ix）通信情報：
（A）電話：（314）727-5188
（B）テレファックス：（314）727-6092
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
0004222629.tif 000009
0004222629.tif 000010
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１００アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
0004222629.tif 000011
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴と表す記号：改良部位（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ）
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他の情報：／記＝”いずれかのアミノ酸”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
0004222629.tif 000012
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴と表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／記＝”いずれかのアミノ酸”
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴と表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他の情報：／記＝”セリン又はシスライン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
0004222629.tif 000013
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴と表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／記＝”いずれかのアミノ酸”
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴と表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：／記＝”いずれかのアミノ酸”
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴と表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１７
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン又はグルタミン酸”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
0004222629.tif 000014
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
0004222629.tif 000015
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
0004222629.tif 000016
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１９５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
0004222629.tif 000017
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３０６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９
0004222629.tif 000018
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３００塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
0004222629.tif 000019
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：５９１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１
0004222629.tif 000020
0004222629.tif 000021
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：５８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２
0004222629.tif 000022
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３４８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３
0004222629.tif 000023
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４
0004222629.tif 000024
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５
0004222629.tif 000025
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６
0004222629.tif 000026
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７
0004222629.tif 000027
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８
0004222629.tif 000028
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：７６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１９
0004222629.tif 000029
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０
0004222629.tif 000030
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１
0004222629.tif 000031
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：７６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２
0004222629.tif 000032
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３
0004222629.tif 000033
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４
0004222629.tif 000034
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５
0004222629.tif 000035
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６
0004222629.tif 000036
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７
0004222629.tif 000037
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８
0004222629.tif 000038
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９
0004222629.tif 000039
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０
0004222629.tif 000040
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１
0004222629.tif 000041
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２
0004222629.tif 000042
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：／記＝”セリン又はトレオニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３
0004222629.tif 000043
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：／記＝”バリン又はロイシン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／記＝”ロイシン又はイソロイシン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１１
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１４
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４
0004222629.tif 000044
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：／記＝”トレオニン又はバリン又はイソロイシン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他の情報：／記＝”チロシン又はフェニルアラニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１１
（Ｄ）他の情報：／記＝”バリン又はロイシン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５
0004222629.tif 000045
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：／記＝”セリン又はアラニン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６
0004222629.tif 000046
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他の情報：／記＝”アラニン又はセリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：／記＝”セリン又はアラニン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７
0004222629.tif 000047
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：／記＝”イソロイシン又はトレオニン又はバリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他の情報：／記＝”チロシン又はフェニルアラニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８
0004222629.tif 000048
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：／記＝”チロシン又はフェニルアラニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他の情報：／記＝”バリン又はロイシン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９
0004222629.tif 000049
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸又はトレオニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：／記＝”ロイシン又はバリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／記＝”イソロイシン又はロイシン”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０
0004222629.tif 000050
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸又はトレオニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：／記＝”ロイシン又はバリン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／記＝”イソロイシン又はロイシン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他の情報：／記＝”セリン又はアラニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１１
（Ｄ）他の情報：／記＝”セリン又はアラニン”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：改良部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他の情報：／記＝”グルタミン酸及びアスパラギン酸”
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１
0004222629.tif 000051
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２
0004222629.tif 000052
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３
0004222629.tif 000053
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４
0004222629.tif 000054
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５
0004222629.tif 000055
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６
0004222629.tif 000056
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７
0004222629.tif 000057
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８
0004222629.tif 000058
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９
0004222629.tif 000059
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０
0004222629.tif 000060
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１
0004222629.tif 000061
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２
0004222629.tif 000062
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３
0004222629.tif 000063
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４
0004222629.tif 000064
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５
0004222629.tif 000065
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６
0004222629.tif 000066
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７
0004222629.tif 000067
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８
0004222629.tif 000068
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９
0004222629.tif 000069
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０
0004222629.tif 000070
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１
0004222629.tif 000071
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２
0004222629.tif 000072
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３
0004222629.tif 000073
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４
0004222629.tif 000074
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５
0004222629.tif 000075
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６
0004222629.tif 000076
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７
0004222629.tif 000077
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８
0004222629.tif 000078
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９
0004222629.tif 000079
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０
0004222629.tif 000080
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１
0004222629.tif 000081
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２
0004222629.tif 000082
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３
0004222629.tif 000083
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４
0004222629.tif 000084
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５
0004222629.tif 000085
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６
0004222629.tif 000086
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７
0004222629.tif 000087
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８
0004222629.tif 000088
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３０６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９
0004222629.tif 000089
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０
0004222629.tif 000090
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１
0004222629.tif 000091
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２
0004222629.tif 000092
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３
0004222629.tif 000093
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４
0004222629.tif 000094
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５
0004222629.tif 000095
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６
0004222629.tif 000096
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７
0004222629.tif 000097
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８
0004222629.tif 000098
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９
0004222629.tif 000099
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０
0004222629.tif 000100
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１
0004222629.tif 000101
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２
0004222629.tif 000102
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３
0004222629.tif 000103
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４
0004222629.tif 000104
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５
0004222629.tif 000105
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６
0004222629.tif 000106
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７
0004222629.tif 000107
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８
0004222629.tif 000108
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９
0004222629.tif 000109
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１００の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００
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（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１
0004222629.tif 000111
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２
0004222629.tif 000112
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３
0004222629.tif 000113
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４
0004222629.tif 000114
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５
0004222629.tif 000115
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６
0004222629.tif 000116
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７
0004222629.tif 000117
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８
0004222629.tif 000118
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：６１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９
0004222629.tif 000119
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０
0004222629.tif 000120
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１
0004222629.tif 000121
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２
0004222629.tif 000122
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３
0004222629.tif 000123
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４
0004222629.tif 000124
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５
0004222629.tif 000125
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６
0004222629.tif 000126
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７
0004222629.tif 000127
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８
0004222629.tif 000128
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９
0004222629.tif 000129
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０
0004222629.tif 000130
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１
0004222629.tif 000131
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２
0004222629.tif 000132
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３
0004222629.tif 000133
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４
0004222629.tif 000134
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５
0004222629.tif 000135
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６
0004222629.tif 000136
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７
0004222629.tif 000137
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８
0004222629.tif 000138
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９
0004222629.tif 000139
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０
0004222629.tif 000140
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１
0004222629.tif 000141
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２
0004222629.tif 000142
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３
0004222629.tif 000143
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４
0004222629.tif 000144
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５
0004222629.tif 000145
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６
0004222629.tif 000146
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７
0004222629.tif 000147
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８
0004222629.tif 000148
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９
0004222629.tif 000149
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０
0004222629.tif 000150
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１
0004222629.tif 000151
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２
0004222629.tif 000152
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３
0004222629.tif 000153
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４
0004222629.tif 000154
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５
0004222629.tif 000155
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６
0004222629.tif 000156
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７
0004222629.tif 000157
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８
0004222629.tif 000158
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９
0004222629.tif 000159
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０
0004222629.tif 000160
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１
0004222629.tif 000161
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２
0004222629.tif 000162
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３
0004222629.tif 000163
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４
0004222629.tif 000164
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５
0004222629.tif 000165
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６
0004222629.tif 000166
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：９５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：関係なし
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７
0004222629.tif 000167
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８
0004222629.tif 000168
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９：
0004222629.tif 000169
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１４４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０：
0004222629.tif 000170
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１４２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１：
0004222629.tif 000171
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１５２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２：
0004222629.tif 000172
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：１５０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３：
0004222629.tif 000173
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３１２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４：
0004222629.tif 000174
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：３０６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５：
0004222629.tif 000175
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６：
0004222629.tif 000176
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７：
0004222629.tif 000177
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４５６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８：
0004222629.tif 000178
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：４５０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９：
0004222629.tif 000179
【図１】
0004222629.tif 000180
【図２】
0004222629.tif 000181
【図３】
0004222629.tif 000182
【図４】
0004222629.tif 000183
【図５】
0004222629.tif 000184
【図６】
0004222629.tif 000185
【図７】
0004222629.tif 000186
【図８】
0004222629.tif 000187
【図９】
0004222629.tif 000188
【図１０】
0004222629.tif 000189
【図１１】
0004222629.tif 000190
【図１２】
0004222629.tif 000191
【図１３Ａ】
0004222629.tif 000192
【図１３Ｂ】
0004222629.tif 000193
【図１４】
0004222629.tif 000194
【図１５】
0004222629.tif 000195
【図１６】
0004222629.tif 000196
【図１７】
0004222629.tif 000197
【図１８】
0004222629.tif 000198