(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺生体組織検査を行うことなく、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いて、男性患者の前立腺の腺癌を検出することを目的とする分析方法であって、
−全遊離ＰＳＡ、すなわち切断型および非切断型のレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−全遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる２〜１２％の参照値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる２〜１２％の参照値よりも大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前立腺生体組織検査を行うことなく、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いて、男性患者の前立腺の腺癌を検出することを目的とする分析方法であって、
−非切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる２〜１２％の参照値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる２〜１２％の参照値よりも大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項３】
参照値が５〜８％であることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前立腺生体組織検査を行うことなく、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いて、男性患者の前立腺の腺癌を検出することを目的とする分析方法であって、
−全遊離ＰＳＡ、すなわち切断型または非切断型のレベルを測定し、
−非切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−全遊離ＰＳＡに対する非切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる８８〜９８％の参照値以上の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる８８〜９８％の参照値よりも低い値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項５】
参照値が９３〜９５％であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前立腺生体組織検査を行うことなく、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いて、男性患者の前立腺の腺癌を検出することを目的とする分析方法であって、
−全ＰＳＡ、すなわち複合型および遊離型（切断型および非切断型）のレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−全ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる０．１〜２％の参照値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる０．１〜２％の参照値よりも大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項７】
参照値が０．４〜１％であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前立腺生体組織検査を行うことなく、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いて、男性患者の前立腺の腺癌を検出することを目的とする分析方法であって、
−複合型ＰＳＡのレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−複合型ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる０．１〜２．２％の参照値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる０．１〜２．２％の参照値より大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項９】
参照値が０．６〜１．２％であることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前立腺生体組織検査を行うことなく、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いて、男性患者の前立腺の腺癌を検出することを目的とする分析方法であって、
−非切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−全ＰＳＡのレベルを測定し、
−非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、これを第一の比率と称し、
−全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比率を算出し、これを第二の比率と称し、かつ、
−以下の四つのケース、すなわち、
・前記第一の比率が、第一の参照値または識別値以下の値を有し、かつ、前記第二の比率が第二の参照値または識別値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合、
・前記第一の比率が、１〜１８％の第一の参照値以上の値を有し、かつ、前記第二の比率が１０〜２０％の第二の参照値以上の値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合、
・前記第一の比率が、１〜１８％の第一の参照値以下の値を有し、かつ、前記第二の比率が１０〜２０％の第二の参照値以上の値を有する場合、すなわちその患者が、前立腺の腺癌である高い確率を有し、かつ、良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状である低い確率を有する場合、
・前記第一の比率が、１〜１８％の第一の参照値以上の値を有し、かつ、前記第二の比率が１０〜２０％の第二の参照値以下の値を有する場合、すなわちその患者が、良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状である高い確率を有しており、かつ、前立腺の腺癌である低い確率を有する場合、
を区別する、
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項１１】
第一の参照値が、５〜８％であり、かつ、第二の参照値が１３〜１７％であることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第一の参照値が、６．３％であり、かつ、第二の参照値が１５％であることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前立腺の腺癌を患っている高い確率が、８０〜９５％であり、前立腺の良性の病状を患っている低い確率が、５〜２０％であり、かつ、前立腺の良性の病状を患っている高い確率が、８０〜９５％であり、前立腺の腺癌を患っている低い確率が、５〜２０％であることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前立腺の腺癌を患っている高い確率が、８４〜８７％であり、前立腺の良性の病状を患っている低い確率が、１３〜１６％であり、かつ、前立腺の良性の病状を患っている高い確率が、８２〜８５％であり、前立腺の腺癌を患っている低い確率が１５〜１８％であることを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか一項にに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１または２または３、あるいは請求項４または５、あるいは請求項６または７、あるいは請求項８または９、あるいは請求項１０または１１または１２または１３または１４のいずれか一項からなる方法の、少なくとも二つの方法の組合せを用いる、患者の前立腺の腺癌または良性の病状を検出するための分析方法。
【請求項１６】
血液または血清中の全ＰＳＡ濃度が２ｎｇ／ｍｌより大きい場合に実施されることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
−以下のパラメーター、すなわち切断型遊離ＰＳＡ、非切断型遊離ＰＳＡ、複合型ＰＳＡおよび全ＰＳＡの二つの存在を検出し、そのレベルを定量し、
−以下の比率の値、すなわち
・全遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡ、
・非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡ、
・全遊離ＰＳＡに対する非切断型遊離ＰＳＡ、
・全ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡ、または
・複合型ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡ
の値を求め、かつ
−男性患者の前立腺の腺癌の検出のために、この比率を参照値と比較する
ことからなることを特徴とする、請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法を用いた方法。
【請求項１８】
患者の血液、血清、尿または精液から誘導されたタンパクが、予め移動に処されることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記移動が、二次元電気泳動によって行われることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
全ＰＳＡのレベルが、予めアッセイされることを特徴とする、請求項１７ないし１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ウェスタンブロッティングにより可視化された後に化学発光により検出が行われることを特徴とする、請求項１７ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織検査を行うことなく、患者における前立腺ガンまたは良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の存在を検出することを可能にするスクリーニングまたは診断の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
前立腺特異的抗原（一般にＰＳＡと称する）は、欧米で６人中１人に関与する前立腺ガンの主なマーカーである。このカリクレインファミリーのプロテアーゼは、主に前立腺上皮によって分泌され、精液中に０．５から５ｍｇ／ｍｌの濃度で見出され、患者の血清中には１００万倍低い濃度で存在する。この血清ＰＳＡレベルは、前立腺ガンの際に顕著に増大し、良性障害、例えばＢＰＨ、急性前立腺炎等の際には適度に増大する。
【０００３】
しかしながら、種々の病状間の重複する領域が、感度と特異性を実質的に欠く原因である。従って、腺に制限されたガンの３０ないし４５％（早期および潜在的に治癒できる段階を構成する）が、４ｎｇ／ｍｌという通常の閾値を用いた場合に検出できず、その一方で、４人中３人の患者が誤って疑われる。
【０００４】
さらに、最近になって、血清中においてＰＳＡがα-１-抗キモトリプシン(antichymostrypsin)（ＡＣＴ）のようなプロテアーゼインヒビターと結合すること、および、全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比率を用いることにより、診断特異性を改善することができることが示された。
【０００５】
それゆえ、この従来技術は、患者における前立腺ガンの発達を診断可能にする技術が存在することを示す。かくして、国際特許出願公開第９７／１２２４５号公報は、生体組織検査をすることなく前立腺の腺癌を診断することを可能にする方法を請求する。この方法は、患者の血清または血液において、ＰＳＡの全量を測定することからなる。この値が２．５〜２０ｎｇ／ｍｌである場合には、遊離ＰＳＡの濃度も測定される。次いで、この全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡ比が算出される。この比率が７％未満であれば、この診断は前立腺の腺癌とされる。
【０００６】
しかしながら、前立腺癌の診断のための７％という閾値の使用は、Leinらによる刊行物“Relation of free PSA/total PSA in serum for differentiating between patients with prostatic cancer and benign prostate hyperplasia: which cutoff should be used?”に記載されているように、多くの著者によって議論されている。機関誌Cancer Investigation, 16(1),45-49,1998において公表されたこの刊行物では、前記比率によりＢＰＨから前立腺の癌または腺癌を系統的に分類することが困難であることが示されている。
【０００７】
さらに、１９９７年５月１４日のJAMA−Vol.277, No.18に公表されたCatalona等による刊行物“Prostate Cancer Detection in Men With Serum PSA Concentrations of 2.6 to 4.0ng/ml and Benign Prostate Examination”は、４ｎｇ／ｍｌ未満の濃度は、前立腺の癌の早期診断を行うために考慮に入れるべきであることを示している。
【０００８】
さらに、精液においては、ＰＳＡは、その分子の種々のフラグメントを結びつける５つのジスルフィド結合が存在することから、その三次元凝集に影響しない内部切断部位を有するかもしれない。かくして切断されたＰＳＡは、その酵素活性、および、プロテアーゼインヒビターに結合する能力を失う。しかしながら、血清においては、切断された形態は、当該分野における従来技術においては一般に言及されていない。
【０００９】
切断形態は、これまで前立腺の良性の病状の場合には報告されてなく、切断形態の値は、診断目的では探求されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、提案する診断方法は、２ｎｇ／ｍｌより大きな全ＰＳＡ濃度領域におけるテストの効力の欠損を補うことを可能にする。最後に、癌またはＢＰＨ患者の血清ＰＳＡの分子形態が、遊離型、複合型および切断型の全てのＰＳＡ形態を観察するために、化学発光検出と組み合わせて、二次元電気泳動によってマップされている。
【００１１】
かくして、癌患者の血清プロフィールは比較的一様であるが、ＢＰＨのものは、切断形態の比率、および僅かにより塩基性のスポットの比率が比較的大きい。
【００１２】
それゆえ、ＢＰＨの場合における全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比の増加が、酵素的に不活性化およびＡＣＴに結合不可である切断型ＰＳＡの存在に関連するものであるか、あるいは不活性な前駆物質形態に対応する僅かに塩基性の遊離ＰＳＡに関係するものであることが確立された。
【００１３】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明は、前立腺生体組織検査を行うことなく、ヒトの男性患者の前立腺の腺癌の診断を目的とする第一の分析方法に関するものであり、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いるものであって、
−全遊離ＰＳＡ、すなわち切断型または非切断型のレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡの全体または一部のレベルを測定し、
−全遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる参照値または識別値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる参照値よりも大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする。
【００１４】
本発明は、前立腺生体組織検査を行うことなく、男性患者の前立腺の腺癌の診断を目的とする第二の分析方法に関するものであり、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いるものであって、
−非切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡの全体または一部のレベルを測定し、
−非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる参照値または識別値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる参照値よりも大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする。
【００１５】
これら二つのケースでは、参照値は２〜１２％、好ましくは５〜８％である。
【００１６】
本発明は、前立腺生体組織検査を行うことなく、男性患者の前立腺の腺癌の診断を目的とする第三の分析方法に関するものであり、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いるものであって、
−全遊離ＰＳＡ、すなわち切断型または非切断型のレベルを測定し、
−非切断型遊離ＰＳＡの全体または一部のレベルを測定し、
−全遊離ＰＳＡに対する非切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる参照値または識別値以上の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる参照値よりも低い値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする。
【００１７】
この第三のケースでは、参照値は８８〜９８％、好ましくは９３〜９５％である。
【００１８】
本発明は、前立腺生体組織検査を行うことなく、男性患者の前立腺の腺癌の診断を目的とする第四の分析方法に関するものであり、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いるものであって、
−全ＰＳＡ、すなわち複合型および遊離型（切断型または非切断型）のレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡの全体または一部のレベルを測定し、
−全ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる参照値または識別値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる参照値よりも大きな値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする。
【００１９】
この第四のケースでは、参照値は０．１〜２％、好ましくは０．４〜１％である。
【００２０】
本発明は、前立腺生体組織検査を行うことなく、男性患者の前立腺の腺癌の診断を目的とする第五の分析方法に関するものであり、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いるものであって、
−複合型ＰＳＡのレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡの全体または一部のレベルを測定し、
−複合型ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、かつ、
−以下の二つのケース、すなわち、
・前記比率が、前立腺の腺癌患者に見られる参照値または識別値以上の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記比率が前立腺の良性の病状を患っている患者に見られる参照値未満の値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
を区別する
ことからなることを特徴とする。
【００２１】
この第五のケースでは、参照値は０．１〜２．２％、好ましくは０．６〜１．２％である。
【００２２】
本発明は、前立腺生体組織検査を行うことなく、男性患者の前立腺の腺癌の診断を目的とする第六の分析方法に関するものであり、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液のサンプル中に存在するＰＳＡ（前立腺特異的抗原）タンパクを用いるものであって、
−非切断型遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−切断型遊離ＰＳＡの全体または一部のレベルを測定し、
−遊離ＰＳＡのレベルを測定し、
−全ＰＳＡのレベルを測定し、
−非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率を算出し、これを第一の比率と称し、
−全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比率を算出し、これを第二の比率と称し、かつ、
−以下の四つのケース、すなわち、
・前記第一の比率が、第一の参照値または識別値以下の値を有し、かつ、前記第二の比率が第二の参照値または識別値以下の値を有する場合、すなわちその患者が前立腺の腺癌を患っている場合
・前記第一の比率が、第一の参照値または識別値以上の値を有し、かつ、前記第二の比率が第二の参照値または識別値以上の値を有する場合、すなわちその患者が良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている場合
・前記第一の比率が、第一の参照値または識別値以下の値を有し、かつ、前記第二の比率が第二の参照値または識別値以上の値を有する場合、すなわちその患者が、前立腺の腺癌である高い確率を有し、かつ、良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状である低い確率を有する、
・前記第一の比率が、第一の参照値または識別値以上の値を有し、かつ、前記第二の比率が第二の参照値または識別値以下の値を有する場合、すなわちその患者が、良性前立腺過形成のような前立腺の良性の病状である高い確率を有しており、かつ、前立腺の腺癌である低い確率を有する、
を区別する、
ことからなることを特徴とする。
【００２３】
第六のケースでは、第一の参照値は、１〜１８％、好ましくは５〜８％、さらに正確には実質的に６．３％であり、第二の参照値は、１０〜２０％、好ましくは１３〜１７％、さらに正確には実質的に１５％である。
【００２４】
好ましくは、この第六のケースにおいて、前立腺の腺癌を患っている高い確率とは、８０〜９５％、好ましくは８４〜８７％であり、前立腺の良性の病状を患っている低い確率とは５〜２０％、好ましくは１３〜１６％であり、その一方、前立腺の良性の病状を患っている高い確率とは８０〜９５％、好ましくは８２〜８５％であり、前立腺の腺癌を患っている低い確率とは、５〜２０％、好ましくは１５〜１８％である。
【００２５】
また、本発明は、上記の少なくとも二つの方法の組合せを用いた、患者の前立腺の腺癌または良性の病状の診断分析方法に関する。
【００２６】
種々の実施態様に従って、血液または血清中の全ＰＳＡ濃度が２ｎｇ／ｍｌより大きい場合に実施される。
【００２７】
最後に、本発明は、上記方法の一つを用いた処理に関連し、この処理は、
−切断形態または非切断形態の遊離ＰＳＡの存在を検出および定量し、かつ、  −参照値と比較して、全遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率の値を調べることからなる。
【００２８】
患者の血液、血清、尿または精液から誘導されたタンパクは、予め移動(migration)に処される。
【００２９】
好ましくは、前記移動は、二次元電気泳動によって行われる。
【００３０】
全ＰＳＡのレベルは、事前にアッセイされる。
【００３１】
最後に、そして、好ましくは、ウェスタンブロッティングにより可視化された後に化学発光により検出が行われる。
【００３２】
添付の図面は、説明用の例として示されたものであって、特徴を制限するものではない。これらは、本発明をより明確に理解するためのものである。
【００３３】
本発明は、以下の方法で、１００μｌのサンプルを処理することにより、前立腺癌またはＢＰＨのような前立腺の良性の病状を診断する方法に関する。
−１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２．３％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液５０μｌの添加；
−沸騰水バスにおける５分間の加熱；
−８．３Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％の３-[(３-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]-１-プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、１００ｍＭのＤＴＴ、２％のServalyte4-9(Serva, Heidelberg, Germany)、０．１ｇ／ｌのOrange G水溶液ＱＳ３５０μｌにおける希釈；
−５００μｌの希釈サンプルを用いた、ｐＨ＝３〜１０の間の非線形固定化ｐＨ勾配を有する乾燥Immobilineストリップ(strip)（Pharmacia, Uppsalla, Sweden）の、室温で６〜７２時間、パラフィン油の下でテストチューブにおける再水和；
−一次元での分離を実施するために、６０００Ｖでほぼ１０％で、１５℃および１００ｋＶ／ｈ以上という提供元の推奨に従って、Multiphore IIシステム（Pharmacia）を用いて、前記Immobilineストリップにおいて、等電点に関して、サンプル中のタンパクの移動および集束(focusing)；
−−３０℃における集束されたImmobilineストリップの凍結；
−１．５ＭのTris（ヒドロキシメチル）アミノメタン、６Ｍ尿素が添加された塩酸ｐＨ＝８．８、２％ＳＤＳ、３０％グリセロール、５０ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーおよび１０ｍｇ／ｍｌのＤＴＴを含む溶液において１５分間Immobilineストリップを平衡化；
−１．５ＭのTris（ヒドロキシメチル）アミノメタン、６Ｍ尿素が添加された塩酸ｐＨ＝８．８、２％ＳＤＳ、３０％グリセロール、５０ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーおよび４８０ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミドを含む溶液において１５分間Immobilineストリップを平衡化；
−湿ったブロッティングペーパー上にImmobilineストリップを置くことによって過剰な平衡化溶液を５〜１０分間水切り；
−１６ｘ２０ｃｍのポリアクリルアミドゲル、Ｃ＝２．８％、Ｔ＝１２％の上にImmobilineストリップの堆積；
−２５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９２ｍＭのグリシン、１％のＳＤＳ、ｐＨ＝８．４を含むバッファーにおける０．５％溶融アガロース溶液を用いたImmobilineストリップの被覆；
−第二次元での分離を実施するために、提供元の推奨に従って、Protean II xiシステム（Bio-Rad, Hercules, United States of America）を用いて、ポリアクリルアミドゲルにおいてImmobilineストリップに先に集束されたタンパクの分子量に関して移動；
−１６〜２４時間、４００ｍＡで、１０ｍＭの３-［シクロヘキシルアミノ］-１-プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）溶液、１０％メタノール、ｐＨ＝１１において、Trans-ブロットシステム（Biorad）を用いて、二次元ゲルからImmobilon-P膜（Millipore, Bedford, United States of America）にタンパクの転移；
−ＴＮＴＭ溶液（１５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍｌ／ｌのTween20、ｐＨ＝８．０、５％凍結乾燥スキムミルクを含む）を用いて、膜上のフリーのままの結合部位の１時間にわたる保護；
−ＴＮＴＭ溶液において１０μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗体クローン１３Ｃ９Ｅ９Ｄ６Ｇ８(Bio-Merieux)を含む希釈物における前記膜の１時間にわたるインキュベーション；
−ＴＮＴＭ溶液における１０分間の３回にわたる膜の洗浄；
−ＴＮＴＭ溶液中のセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した１／５０００希釈のヤギポリクローナル抗体抗マウスＦｃ（Jackson ImmunoReserch, West Gove, United States of America）において前記膜の１時間にわたるインキュベーション；
−ＴＮＴＭ溶液で１０分間、２度にわたり膜を洗浄；
−０．１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、塩酸ｐＨ＝７．６を含む溶液における１０分間にわたる膜の洗浄；
−提供元の推奨に従って、セイヨウワサビペルオキシダーゼの化学発光基質Super Signal Ultra(Pierce, Rockford, United States of America)を用いて可視化；
−４０９６レベルのグレーのスケールを用いて、FluorS Multi-Imagerシステム(Bio-Rad)を用いて、１分から１時間にわたって放射された光の検出；
−MultiAnalystソフトウェア(Bio-Rad)を用いて切断および非切断遊離ＰＳＡ形態の定量；
−全遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率、または、全遊離ＰＳＡに対する非切断型遊離ＰＳＡの比率、または、非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率、または、全ＰＳＡに対する切断型ＰＳＡの比率、または複合型ＰＳＡに対するＰＳＡの比率を算出；
−上記参照値に従って前立腺癌の診断の決定。
【００３４】
それゆえ、本発明は、前立腺の腺癌の診断方法だけでなく、前立腺の腺癌患者を例えば良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）のような前立腺の良性の病状患者から区別することを可能にする方法に関する。
【００３５】
かくして、図１に明示されているように、黒丸と白丸が示されている。黒丸は、癌のケースを示し、白丸はＢＰＨに関連する。癌のケースとＢＰＨのケースの間に完全な混在があることが分かる。それゆえ、全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比率を用いて、癌またはＢＰＨが存在するか否かを実際に算出ことは困難である。しかしながら、重要な点に注意すべきである。すなわち、癌とＢＰＨのケースの大多数（後述）は、全ＰＳＡが２．１ｎｇ／ｍｌの濃度より上である。これは、試験された患者の７５の血清の内７４のケースに見られた。患者３５のみが１．２７ｎｇ／ｍｌ未満の値を有する。一般的な規則に従って、この閾値以下において、癌またはＢＰＨケースはあまりないと考えるのが論理的である。２ｎｇ／ｍｌ未満の全ＰＳＡ濃度を有する患者は、健康的だと考えられる。分析されたケースの総数があまりに小さくて有意でないために、ＢＰＨを有する者の危険性は、定量できない。
【００３６】
本発明は、それゆえ、癌とＢＰＨとを識別することからなる。二次元電気泳動が、図２に示されているように実施される。異なるサイズの三つのタンパクまたはポリペプチドが、この電気泳動において観察される。最初に、最上部に、実質的に３４ｋＤのタンパクが、約２０％存在する。これは、非切断型ＰＳＡタンパクに対応する。
【００３７】
以下、二つの集団、すなわち、本質的に２６ｋＤと２１ｋＤ、約２０％が存在し、これらはＰＳＡの切断形態に対応する。遊離ＰＳＡの切断および非切断形態の間には、ある比率が存在し、これは、癌とＢＰＨとを識別するために用いることができる。
【００３８】
かくして、図３の場合に、患者はＢＰＨを患っており、彼の血清は２．１ｎｇ／ｍｌ、正確には３．９ｎｇ／ｍｌの全ＰＳＡを含んでいた。この全ＰＳＡ濃度を図１にプロットした場合、このレベルでは、ＢＰＨのケースと癌のケースの両方が存在することが観察される。全遊離ＰＳＡ、すなわち切断または非切断型ＰＳＡを測定し、切断型遊離ＰＳＡも測定した場合、全遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡの比率が算出され、この比が参照値よりも大きいまたは小さい場合に、患者が癌または前立腺の良性の病状を患っていることを診断可能にすることがわかった。
【００３９】
係る値は、既に記載したとおりであり、係る診断方法も以下に適用される：
・全遊離ＰＳＡ濃度に対する非切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率、または
・非切断型遊離ＰＳＡ濃度に対する切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率、または
・全ＰＳＡ濃度に対する切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率、または最後に
・複合型ＰＳＡ濃度に対する切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率。
【００４０】
これらの比率の関係を用いることも可能である；例えば図６のケースで、（非切断型遊離ＰＳＡ濃度に対する切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率）に対する（全ＰＳＡ濃度に対する遊離ＰＳＡ濃度の比率）の関係を用いる。
【００４１】
一般的に、これらの方法の一つは、血液または血清における全ＰＳＡ濃度が２ｎｇ／ｍｌ以上である場合に実施される。
【００４２】
それゆえ、この方法は、患者の血液、血清、尿または精液に由来するタンパクを移動させること、存在を検出すること、および、切断型または非切断型の遊離ＰＳＡを定量すること、および得られた結果から、その患者が健康であるか、前立腺の腺癌を患っているか、前立腺の他の良性の病状を患っているかについて決定することからなる。
【００４３】
前記移動は、一般的に二次元電気泳動によって行われ、化学発光によって検出され、ウェスタンブロッティングにより可視化される。しかしながら、切断型遊離ＰＳＡに特異的または非切断型遊離ＰＳＡもしくは結合型ＰＳＡに特異的であり、前記形態の検出の前に移動を必要としない抗体を用いる技術を考えることができる。
【００４４】
得られた全ての結果を、以下の表にまとめる。
【表１】
0004364437.tif 000002
0004364437.tif 000003
0004364437.tif 000004
【００４５】
これは、７５人の異なる患者の血清の比較研究である。
【００４６】
上記表を明確に理解するために、全ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）および切断型ＰＳＡ（ｃＰＳＡ）の濃度はｎｇ／ｍｌで表示されていることに注意すべきである。比率は、パーセントで示されている。
【００４７】
この表は、
−全ＰＳＡの濃度、以下、参照ＴＰＳＡと称する、
−例えばＡＣＴのようなプロテアーゼインヒビターに結合したＰＳＡの濃度、以下、参照ｂＰＳＡと称する、
−遊離ＰＳＡの濃度、以下、ｆＰＳＡと称する、
−非切断型遊離ＰＳＡの濃度、以下、参照ｎｃＰＳＡと称する、および
−切断型遊離ＰＳＡの濃度、以下、参照ｃＰＳＡと称する
の間に存在する比率を素早く視認することを可能にする。
【００４８】
非切断型ＰＳＡ（ｎｃＰＳＡ）の濃度は、右手のカラムに用いられていることに注意すべきである。記載されていない場合でも、以下の式から容易に求めることができる。
ｎｃＰＳＡ＝ｆＰＳＡ−ｃＰＳＡ
【００４９】
ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比率が考慮される場合、この比率は少しも特徴的でないことが観察される。かくして、最初の６人の患者のうち、患者１および５のみが、特徴のある比率を有し、これは、ＢＰＨのケースから癌のケースを識別可能にする。
【００５０】
別のケースでは、前記比率は１１．００から１４．５９の間である。それゆえ癌とＢＰＨとの間の識別は可能ではない。これは、別の患者の血清でも同じである。例えば、患者８と９、１２と１５等の間を識別することは非常に困難である。
【００５１】
特に目立つ例は、ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比率が常に１１未満である、ＢＰＨ患者２２、４０および５２のケースであり、一方、患者２６、３１、４９および６３は癌を患っており、常に２２よりも大きな比率を有する。これらの１１と２２の値の間には、診断に関して不明瞭な領域がある。しかしながら、多くの血清が、この領域にある（すなわち、上記７人の患者のケース以外）。この領域の血清の数は３１であり、これが、有効な確かさで診断されなかった３８の血清の全てである。これは、実質的に５０．６７％のエラーを示す。ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比の使用は、この場合、ＢＰＨと癌との間の識別に不適切である。
【００５２】
これは、明らかに、この技術の限界を示す。
【００５３】
一方で、ｃＰＳＡ／ｂＰＳＡ、ｃＰＳＡ／ＴＰＳＡ、ｎｃＰＳＡ／ｆＰＳＡ、ｃＰＳＡ／ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ間に存在する比率を用いた場合、最初の６人の患者の血清を参照すると、ＢＰＨ患者１および２と癌患者３ないし６に関して比率の間に大きな差異が存在することが観察された。
【００５４】
それゆえ、ＰＳＡの切断および／または非切断形態を用いるこれらの比率は、顕著に患者の実際の状態を代表する。
【００５５】
かくして、表から分かる例の内容において、ｃＰＳＡ／ＴＰＳＡ比率に関して、ＢＰＨの場合、この比率は常に１．２％以上であり、癌の場合、この比率は常に０．５４％未満である。
【００５６】
ｃＰＳＡ／ｂＰＳＡ比率に関して、ＢＰＨの場合、この比率は常に１．３４％より大きく、癌の場合、この比率は常に０．６３％未満である。
【００５７】
ｎｃＰＳＡ／ｆＰＳＡ比率に関して、ＢＰＨの場合、この比率は常に８９．２％未満であり、癌の場合、この比率は常に９５．８８％より大きい。
【００５８】
ｃＰＳＡ／ｆＰＳＡ比率に関して、ＢＰＨの場合、この比率は常に１０．８％より大きく、癌の場合、この比率は常に４．１２％未満である。
【００５９】
最後に、ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比率に関して、ＢＰＨの場合、この比率は常に１２．１１％より大きく、癌の場合、この比率は常に４．３％未満である。
【００６０】
三人の癌患者３、４および６についての比率が、ＢＰＨ患者１および２についての比率によって定められた範囲内にあることから、代表的でない比率は、比率ｎｃＰＳＡ／ＴＰＳＡ、ｎｃＰＳＡ／ｂＰＳＡおよびｆＰＳＡ／ＴＰＳＡからなる。
【００６１】
このため、前立腺癌と比較して前立腺の良性の病状を識別するために、種々の比率、ｃＰＳＡ／ＴＰＳＡ、ｃＰＳＡ／ｂＰＳＡ、ｎｃＰＳＡ／ｆＰＳＡ、ｃＰＳＡ／ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡの組合せ、あるいはこれらの比率の全てを用いることが特に有利である。
【００６２】
患者２２、４０および５２について考慮する場合、ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比率が、それぞれ７．１３−８．６２−１１．６５であることが観察される。患者２６、３１、４９および６３に関して、ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比率は、それぞれ、０．８６−０．９７−０．００−０．００である。
【００６３】
この比率は、それゆえ、医師が実施を望む診断に完全に適する。
【００６４】
図５を参照すると、６．５％のｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比に対応する水平の直線のより上では、二つのケースを除いて、実際に全てのＢＰＨケースが示されていることに注意すべきである。これらは患者７および１９であり、彼らについての比率は、１．３７と４．６４であり、これは３３の内の２つのケース、すなわちエラーは実質的に６％であって、上記通常のｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比よりも顕著に低い。
【００６５】
６．５％のｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比に位置するこの参照の水平直線より下において、二つのケースを除いて事実上全ての癌のケースが表されていることも観察される。これらは患者１４および２４であり、彼らのこの比は１３．７４および２４．８０であり、４２の内の２つのケース、すなわちエラーは本質的に４．７７％である。
【００６６】
図６は、さらに鮮やかである。二つの直線があり、一つは垂直、他方は水平であり、交差している。垂直な直線は、１５．１％のｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比の値に対応し、水平な直線は６．２％のｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比の値に対応している。４つのケースが考えられる、すなわち：
・ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比が６．２％以下の値を有し、ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比が、１５．１％以下の値を有する場合に、患者は前立腺の腺癌を患っている。
・ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比が６．２％より大きい値を有し、ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比が、１５．１％より大きい値を有する場合に、患者は、良性の前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている。
・ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比が６．２％以下の値を有し、ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比が、１５．１％より大きい値を有する場合に、患者は、前立腺の腺癌を患っている確率が高く、良性の前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている確率が低い。
・ｃＰＳＡ／ｎｃＰＳＡ比が６．２％より大きな値を有し、ｆＰＳＡ／ＴＰＳＡ比が、１５．１％以下の値を有する場合に、患者は、良性の前立腺過形成のような前立腺の良性の病状を患っている確率が高く、前立腺の腺癌を患っている確率が低い。
【００６７】
参照値が６．２％および１５．１％に与えられていても、これらの図面は、別のパネルの血清または異なる数の血清によって変化してもよい。それゆえ、好ましくは、第一の参照値が、１〜１８％、好ましくは５〜８％の範囲であり、第二の参照値が１０〜２０％、好ましくは１３〜１７％の間とされる。
【００６８】
上記の確率に関して、上記第三のケースにおいて、前立腺の腺癌を患っている高い確率は、８４〜８７％の間であり、前立腺の良性の病状を患っている低い確率は、１３〜１６％の間である。かくして、全体で１４の内の２つのケースのＢＰＨがある。しかしながら、これらの第三および第四のケースについては、他のサンプルを用いた場合、より広い範囲、例えば高い確率について８０〜９５％、低い確率について５〜２０％が見出されうることから、上記の値は広げられるかもしれない。
【００６９】
第四のケースでは、前立腺の良性の病状を患っている高い確率は８２〜８５％の間であり、前立腺の腺癌を患っている低い確率は１５〜１８％の間である。これは、全体で１２のケースの内２つの癌のケースに対応する。
【００７０】
しかしながら、これらの第三および第四のケースについては、他のサンプルを用いた場合、より広い範囲、例えば高い確率について８０〜９５％、低い確率について５〜２０％が見出されうることから、上記の値は広げられるかもしれない。
【００７１】
３つの独立した変量を利用できる：
・Ａ＝ｂＰＳＡ、すなわちインヒビター（ＡＣＴ等）に複合または結合したＰＳＡ
・Ｂ＝ｎｃＰＳＡ、すなわち非切断型遊離ＰＳＡ
・Ｃ＝ｃＰＳＡ、すなわち切断型遊離ＰＳＡ
但し、濃度はＡ＞＞Ｂ＞＞Ｃである。
【００７２】
結果的に、種々の比率は以下のように記述され、以下の近似を導きうる：
【数１】
0004364437.tif 000005
【００７３】
それゆえ、比率１、２および４は同じタイプの応答を導くことが分かる。比率１は、上記の、当該技術分野の従来技術において既に記載されており、多くの誤診を導き、結果的に比率２および４にも関心を向けることができない。
【００７４】
比率６、７および８は、同一の応答に到達することができるといえる、正確な数学的関係によって関連づけられる。
【００７５】
比率３および５は、先の比率とは異なる等価応答を導く。
【００７６】
比率３および５ないし８は、それゆえ、代表的である。
【００７７】
いくつかの戦略が、切断型または非切断型遊離ＰＳＡをアッセイするために存在する。
【００７８】
切断されたＰＳＡは、以下の特徴を有する。第一に、種々のフラグメントを連結する５つのジスルフィド結合が存在することから、内部断片化部位は、分子の三次元凝集に影響しない。第二に、還元後、これらのジスルフィド結合が壊され、種々のＰＳＡフラグメントが引き離される。第三に、断片化がＰＳＡのコンホメーションを変更し、その酵素活性およびプロテアーゼインヒビターに対する結合能力を失わせる。
【００７９】
Ｉ−サンプル還元後の切断形態のアッセイ
断片化または切断および還元後に、内部ＰＳＡ領域が暴露され、全長ＰＳＡでは近づくことができなかったエピトープが現れる。切断部位の前後に位置する切断および還元型ＰＳＡまたはペプチドは、係るエピトープを有する。これらのペプチドまたは切断および還元型ＰＳＡを用いた免疫化は、所望のエピトープに対する抗体を得ることを可能にする。分析されるサンプルを還元した後では、係る抗体を用いた試験により、切断型ＰＳＡを特別にアッセイできる。
【００８０】
かくして、切断および還元型ＰＳＡ免疫原が得られ、特徴決定が行われた。切断部位の前後に位置するペプチドが合成された。切断および還元型ＰＳＡを用いた免疫化をマウスに行った。切断型ＰＳＡのエピトープ特性に特異的な１０種のモノクローナル抗体クローンが得られた。
【００８１】
II−サンプルを還元しない切断された形態のアッセイ
切断型ＰＳＡは不活性であり、活性の欠損に重要な構造上の変更を含み得る。ＰＳＡを用いたマウスの免疫化は、これらの構造的エピトープに対する抗体を得ることを可能にし得る。これらの抗体を用いた試験は、切断型ＰＳＡを直接的および特異的にアッセイする。
主として切断型の不活性ＰＳＡは、供給元から得られた。
【００８２】
III−サンプル還元後の非切断型ＰＳＡのアッセイ
サンプルの還元後、切断されたＰＳＡは断片化するが、非切断型ＰＳＡのアミノ酸鎖は完全なまま残る。Ｃ末端およびＮ末端ペプチドは、Ｃ末端部またはＮ末端部に対する抗体の検出を実施すること、または、免疫化後にそれらを得ることを可能にする。サンプルの還元後、Ｃ末端部に対する抗体とＮ末端部に対する抗体を用いたサンドウィッチが、全長ＰＳＡの認識を可能にした。
【００８３】
ＰＳＡのＣ末端およびＮ末端ペプチドが得られた。これらのペプチドは、精液ＰＳＡを用いて行われたマウスにおける免疫化を証明するため、あるいは直接的にマウスを免疫化するために用いられた。抗体は、非切断型還元ＰＳＡを認識し、切断型還元ＰＳＡを認識しない対を定義するために検出された。
【００８４】
以下の表に記載されているように予想される特徴を有するいくつかの抗体の対を用いた。
【表２】
0004364437.tif 000006
【００８５】
IV−非還元条件下における非切断型ＰＳＡのアッセイ
非切断型ＰＳＡは、切断型ＰＳＡとは異なる一部の構造エピトープを含みうる（セクションIIを参照）。断片化部位と重複するペプチドは、かかるエピトープを提示しうる。これらのペプチドまたは非切断型ＰＳＡを用いたマウスの免疫化により、これらのエピトープに対する抗体を得ることが可能となる。これらの抗体を用いた試験は、非切断型ＰＳＡを直接および特異的にアッセイする。
【００８６】
このペプチドは合成された。主として切断型ＰＳＡを用いた免疫化を、マウスに行った。
【００８７】
V−酵素的に活性なＰＳＡのアッセイ
血清中の非切断型ＰＳＡは、酵素的に活性であり得る。かくして、切断型ＰＳＡは酵素的に不活性であり、その逆はないことが示された。活性ＰＳＡに対し高い親和性を有する阻害ペプチドは、天然配列の修正および／またはファージディスプレイによって設計することができる。かくして設計されたペプチドは、酵素的に活性なＰＳＡを選択的に捕捉し、かくしてそのアッセイを実行するために用いることができる。
【００８８】
以下のプロトコルは、非切断型ＰＳＡの特異的アッセイを可能にする。これは、以下の操作を実施することからなる：
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、ｐＨ＝６．２中に２０μｇ／ｍｌの抗体１００μｌを用いてＥＬＩＳＡマイクロプレートを被覆する。
・室温で一晩インキュベートする。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、０．５％Tween20、ｐＨ＝６．２の３００μｌを用いて３回洗浄する。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、３％ウシ胎児血清、ｐＨ＝６．２の２００μｌを用いて１時間保護する。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、０．５％Tween20、ｐＨ＝６．２の３００μｌを用いて３回洗浄する。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、３％ウシ胎児血清、ｐＨ＝６．２に１００ｎｇ／ｍｌとなるまでＰＳＡを希釈する。
・３７℃で１時間１０μｌのＰＳＡをインキュベーションする。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、０．５％Tween20、ｐＨ＝６．２の３００μｌを用いて３回洗浄する。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、３％ウシ胎児血清、ｐＨ＝６．２に１／１０００まで希釈された抗ビオチニル化ＰＳＡ抗体３Ａ１Ｂ５の１００μｌを３７℃で１時間インキュベートする。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、０．５％Tween20、ｐＨ＝６．２の３００μｌを用いて３回洗浄する。
・０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2、３％ウシ胎児血清、ｐＨ＝６．５を含む０．２Ｍトリスバッファーに１／５００まで希釈されたストレプトアビジン−アルカリホスファターゼの１００μｌを３７℃で１時間インキュベートする。
・０．２Ｍトリスマレイン酸塩バッファー、０．５％Tween20、ｐＨ＝６．２の３００μｌを用いて３回洗浄する。
・１００μｌのｐＮＰＰ基質を用いて３７℃で１５分間可視化する。
・１Ｎの水酸化ナトリウム１００μｌを用いて反応をブロッキングする。
・６３０ｎｍにおけるバックグラウンドノイズを差し引いて、４０５ｎｍにおいて分光光度計で読みとる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ２．１〜３０ｎｇ／ｍｌの間の全ＰＳＡ濃度（ｘ軸）と、全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比率（ｙ軸）に関する種々の患者の血清の配置を比較する表を示す。この表は、P.J.Van Canghらによる論説“Free to total Prostate-Specific Antigen (PSA) ratio is superior to total-PSA in differentiating Benign Prostate hyperplasia from prostate cancer”, Vol.156, 1964-4968, Dec. 1996から得られるものである。黒点は癌のケースを示し、白点はＢＰＨのケースを示す。
【図２】  ｘ軸に等電点、およびｙ軸に分子量に関して、種々の形態のＰＳＡの移動を実施した二次元電気泳動を示す。
【図３】  ＢＰＨ患者の血清の二次元電気泳動を示す。この血清は３．９ｎｇ／ｍｌのＰＳＡを含む。
【図４】  腺癌患者の血清の二次元電気泳動を示す。この血清は４０００ｎｇ／ｍｌのＰＳＡを含む。
【図５】  １〜３４ｎｇ／ｍｌの全ＰＳＡ濃度（ｘ軸）と、非切断型遊離ＰＳＡ濃度に対する切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率（ｙ軸）に関する、種々の患者の血清の配置を比較する表を示す。白い四角は、癌のケースを示し、黒丸はＢＰＨのケースを示す。
【図６】  全ＰＳＡ濃度に対する遊離ＰＳＡ濃度の比率（ｘ軸）と、非切断型遊離ＰＳＡに対する切断型遊離ＰＳＡ濃度の比率（ｙ軸）に関する、種々の患者の血清の配置を比較する表を示す。白い四角は、癌のケースを示し、黒丸はＢＰＨのケースを示す。
【図１】
0004364437.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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