(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異プレセニリンタンパク質をコードする発現可能な導入遺伝子をゲノム中に含む第1の非ヒトトランスジェニック動物および変異アミロイド前駆体タンパク質をコードする発現可能な導入遺伝子をゲノム中に含む第2の非ヒトトランスジェニック動物を交配することによってＦ1世代非ヒトトランスジェニック動物を作製し、
前記Ｆ1世代から両方の前記発現可能な導入遺伝子をゲノム中に含み、増強されたアルツハイマー病関連アミロイド蓄積を生ずる非ヒトトランスジェニック動物を選抜することを含む、
増強されたアルツハイマー病関連アミロイド蓄積を有する非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法であって、
前記変異プレセニリンタンパク質をコードする発現可能な導入遺伝子がプレセニリンM146Lをコードし、前記変異アミロイド前駆体タンパク質をコードする発現可能な導入遺伝子がK670N、M671L変異を含むアミロイド前駆タンパク質APP695アイソフォームをコードする、
前記方法。
【請求項２】
少なくとも一方の非ヒトトランスジェニック動物が導入遺伝子に関してホモ接合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一方のトランスジェニック動物において少なくとも一つの導入遺伝子の内在性遺伝子ホモログが発現していない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
変異アミロイド前駆体タンパク質をコードする導入遺伝子が、ヒト化変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
非ヒトトランスジェニック動物がげっ歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
げっ歯類がマウスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
変異プレセニリンをコードする発現可能な導入遺伝子をゲノム中に有する第1の非ヒトトランスジェニック動物と、変異プレセニリンタンパク質をコードする発現可能な導入遺伝子をゲノム中に有する第２の非ヒトトランスジェニック動物とを交配することによってＦ1世代非ヒトトランスジェニック動物を作製し；
前記Ｆ1世代から、両方の前記発現可能な導入遺伝子を有し、増強されたアルツハイマー病関連アミロイド蓄積を生じる非ヒトトランスジェニック動物を選抜すること、によって作製される、
増強されたアルツハイマー病関連アミロイド蓄積を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、
前記変異プレセニリンをコードする発現可能な導入遺伝子がプレセニリンM146Lをコードし、前記変異アミロイド前駆体タンパク質をコードする発現可能な導入遺伝子がK670N、M671L変異を含むアミロイド前駆タンパク質APP695アイソフォームをコードする、
前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
少なくとも一方の非ヒトトランスジェニック動物が導入遺伝子に関してホモ接合である、請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
少なくとも一方の非ヒトトランスジェニック動物において、少なくとも１つの導入遺伝子の内在性ホモログが発現していない請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
非ヒトトランスジェニック動物がげっ歯類である、請求項７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
げっ歯類がマウスである、請求項１０に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
K670N、M671L変異を含むアミロイド前駆タンパク質APP695アイソフォームをコードする発現可能な導入遺伝子、および、プレセニリンM146Lをコードする第2の発現可能導入遺伝子をゲノム中に含むトランスジェニックマウス。
【請求項１３】
少なくとも一つの導入遺伝子がホモ接合である、請求項１２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
少なくとも１つの導入遺伝子の内在性ホモログが発現していない、請求項１２に記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、組み込んだ導入遺伝子の発現によって生ずる表現型の調節方法を含む、トランスジェニック動物モデルの作製および使用に関する。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病のためのモデルを含む神経変性疾患モデルの改良およびそれによって作製された動物に関する。
発明の背景
トランスジェニック動物は正常および病態過程の双方を研究するためのモデル系として用いられている。一般に、変異のある、または無い外来遺伝子が動物宿主系に導入され、その導入遺伝子によって生ずる表現型が観察される。他の遺伝的操作をベクターまたは宿主系において、観察される表現型につながる遺伝子発現（表現型発現）を改善するために行うことができる。遺伝子は種々の誘導可能な、または構成的プロモーターの制御下で導入され、過剰発現されてもよく、内在性相同遺伝子が発現不可能にされる等であってもよい。［PCT出願WO 92/11358;米国特許第5,221,778号］。しかし、これらの操作によっても、望みの表現型は必ずしも発現されない（例えば、PS遺伝子導入に関して本明細書中の以下を参照せよ）。更に、米国特許5,602,299および5,221,778に記載されたように、バックグラウンドを変えるための種々の育種プログラム、さらなるトランス活性化導入遺伝子の挿入、導入遺伝子をホモ接合にし、または宿主を２コピーの導入遺伝子を有するが、異なる部位に挿入されているようにすることが開発されてきた。しかしながら、ここでもまた、これらの方法は必ずしもそのモデル系を望みの表現型により似せるように表現型発現を改善しない。従って、トランスジェニック動物の表現型の改善および／または調節のためにさらなる方法が必要とされる。
トランスジェニックモデル系は神経変性疾患を研究するために必要であり、根本にある疾患病理学および治療プロトコルをテストするための両方のために必要とされる。アルツハイマー病（AD）は、特定の脳領域における細胞外アミロイド（主としてβ-アミロイド（Ａβ）からなる）堆積物および神経細胞内濃縮体（intraneuronal tangle）（大部分は細胞骨格タンパク質タウからなる）が存在することを特徴とする、進行性痴呆を伴う神経変性疾患である。その症状には漸進的な記憶の欠失、食事のような日常的な作業遂行能力の後退、混乱、見当識障害、患者が自分自身の世話をできなくなること、そして最終的な死が含まれる。米国健康支援協会（American Health Assistance Foundation）は現在400万人を越えるアメリカ人がADにかかっていると考えられ、毎年100,000人のアメリカ人がADのために死亡し、250,000の新たなADの症例が診断されていると報告している。さらに、65歳以上のアメリカ人の10人に1人はADにかかっており、85歳以上のほぼ半分はこの病気である。
ADは一般に患者において、その60代、70代およびそれ以上と関連しているが、家族性アルツハイマー病（FAD）は患者の30代、40代で報告されている。FADはADの遺伝的常染色体優性型である。FADの遺伝的原因はADと同じであるとは考えられていないが、FAD表現型は病理学的にADと類似しているようにみえる。すべてのAD症例の10％はFADであると報告されている。
FADに苦しむ患者のオートプシー（autopsy）により大部分β−アミロイド（Ａβ）によってできた神経炎性のプラークおよび大部分タウタンパク質の堆積からなる神経原線維濃縮体（neurofibrillary tangle）の存在が示された（HardyとDuffによる総説、1993）。βアミロイドは40-42アミノ酸ペプチドで、より大きなアミロイド前駆体タンパク質（APP）のタンパク質分解性開裂によって作り出される。APPは残基700から残基722番にわたる単一のトランスメンブレンドメインを有するトランスメンブレンタンパク質である。APP遺伝子は21番染色体上に位置し、18個のエクソンを含んでいる。別のスプライシングから生じるAPPアイソマーは563から770残基長にわたるポリペプチドの組を形成する。β-アミロイド断片はエクソン16の3’半分およびエクソン17の5’半分によってコードされており、ここはAPPのトランスメンブレンドメインもコードしている。APPから開裂されるβ-アミロイドの大部分は40アミノ酸残基長であり、Ａβ1-40と称される。
Ａβ1-40の産生に対してより少ない量で産生されるβ-アミロイドの他の形態は42-43アミノ酸残基長のペプチドである。これはＡβ1-42（43）と称される。このペプチドはFAD過程の初期に選択的に堆積する。in vitroで行なわれた実験により、このペプチドが、Ａβ1-40よりも速く不溶性の凝集体を形成することが示された。よって、患者においてＡβ1-42（43）の増大した産生はFADへの遺伝的前段階として起こり、その病態を開始するものと考えられる。βアミロイドの両方の型は共に不溶性であるため、脳内の神経に堆積する。
ADの遺伝的原因は21番染色体上のAPP遺伝子、14番染色体上のプレセリニン１（presenilin 1）（PS1）遺伝子、1番染色体上のプレセリニン２（PS2）遺伝子の変異を含む［Goateら、1991；Sherringtonら、1995；Levy-Lahadら、1995］。ADを引き起こす既知の全ての変異は、APPのプロセッシングを変化させ、より多くのアミロイド形成的Ａβ（Ａβ42（43））が作り出されることが示されている。このことにより、異常なAPPプロッセシングおよびＡβ42（43）の生成がFADの初期の原因的病因論の基礎をなすかもしれないという仮説が生じていた［Youkin,1995; Scheuner, 1996; Caiら、1993; Citronら、1992；Suzukiら、1994］。
FADに苦しむ何人かの患者において、APP遺伝子のエクソン１７中のコドン717（転写物の770番）におけるミスセンス点突然変異がβ-アミロイドの形成増大に関与していること、従ってFADに関与していることが決定された［PCT出願PCT/GB92/00123］。その後まもなく、FADに苦しむ患者において同じコドン中に他の点突然変異が発見された［Hardy, 1993］。
FAD治療のために設計された医薬用薬剤を研究するための動物モデルを開発しようとして、そのゲノム中にヒトAPP遺伝子のミスセンス点突然変異を有するトランスジェニックマウスが開発されてきた［Hsiaoら、1996: Gamesら、1995；米国特許5,612,486；PCT出願WO 92/06187; WO 93/14200;WO 96/06927］。変異したAPP遺伝子がそれらの脳内で発現されるため、これらのトランスジェニックマウスはFADのモデルとして働く可能性がある。APP遺伝子の（変異を伴うまたは伴わない）過剰発現モデルも開発されてきた［PCT出願WO 94/24266; WO 96/06927;欧州特許出願EP 0 653 154 A2］。
これらのAPP遺伝子トランスジェニックマウスのいくつかは、１歳またはそれ以上でFADと似た病態を作り出すことが示されている［Hsiaoら、1996およびGamesら、1995］。PDAPPマウス［Gamesら、1995］はV717F変異を伴うAPPミニ遺伝子を発現する（変異は置換アミノ酸を伴うアミノ酸位置として略記されていることに注意せよ。）。Tg2576マウス［Hsiaoら、1996］は、しばしばスウェーデン変異（Swedish mutation）とも呼ばれるK670N、M671L変異を含むAPP695アイソフォームを発現する（APP770番号づけ）。AD型病態に加えて、Tg2576は「Ｙ」迷路における自発的交替および水迷路における空間記憶によって測定されるように知覚障害を示し、このことはAPPの操作が病態に加えて知覚機能に影響を与えることを示すものである。
しかしながら、他のAPP遺伝子トランスジェニックマウスはFAD病態を作り出さないか軽い病態しか示さない。軽い病態の例としては例えば、Neveら、1996を参照せよ。病態を示さないAPPのマウスの例は、たとえばHsaioら、
0004260892.tif 000002
1996；Malherbeら、1996；Muckeら、1994を参照せよ。病態を示さないまたま軽い病態しか示さない更なるAPP遺伝子トランスジェニックマウスの総説についてはGreenbergら、1996を参照せよ。
上記の解析により、これらのアルツハイマーモデルは、アルツハイマー関連病態を開始するために充分な量のＡβを脳内で産生することができない点で限定されるという欠点があることを示唆している。従って、充分な量のＡβを脳内で加速的な様相で産生するトランスジェニックモデルおよびそのようなトランスジェニック体を作製する方法が必要とされている。
近年、他の遺伝子、プレセリニンＩ（PSI）およびプレセニリンII（PS2）と称される遺伝子（それぞれ14番染色体および１番染色体に位置する）における変異もFADを引き起こすことが示されている［Crutsら、1996］。研究により、これらのプレセニリン変異を有する個体の周辺細胞は非-変異PS遺伝子を有する個体において産生されているよりも多量のＡβ1-42（43）を産生していることが明らかにされた［Scheunerら、1996］。これらの変異プレセニリン遺伝子によって作られる病因の形態には非変異（野生型）PS1またはPS2遺伝子によって産生される量に対してより多くのＡβ1-42が産生されることが関与していることが示唆されている。現在、Ａβ1-42（43）の産生増大を引き起こす機構は分かっていない。
PS1に変異を有するトランスジェニックマウスはAD型の病態を現さないようにみえるが、Ａβ42（43）の上昇を示す（本明細書中の実施例を参照せよ）。この型のＡβは高度にアミロイド形成的でありAD脳内においてアミロイド体積の初期コアを形成する［Mannら、1996；Jarrettら、1993］。PS1およびPS2は両方ともAPPプロセッシングに影響を与えることが知られている［Scheunerら、1996、本明細書中の実施例を参照せよ］。プレセニリンとタンパク質輸送に関与するC.elegansタンパク質（SPE4）の配列ホモロジーはプレセニリンがAPPの区画化と輸送を支配しているかもしれないこと［L’HemaultとArduengo, 1992］、および変異プレセニリンはＡβ42（43）の上昇したレベルを生じさせる経路にAPPを向けさせるかもしれないことを示唆するものである。このようなやり方で、生合成経路が相互作用的であると考えることができる。
上述のトランスジェニック動物はアルツハイマー病の現在のモデルを提供するものである。しかし、本明細書中、上で論じたように、これらのモデルの多くは、ヒトにおいて見られる完全な病態が見られない、またはPSモデルに見られるようにＡβ1-42（43）のレベルの上昇以外の病態が見られないという点で不完全である。さらに、このモデルは一般にマウスの齢を要求し、病態は９か月まで見られず、一般にはそれ以降まで見られない［Hsaioら、1996］。このことは、動物を長期間の間維持しなければならないことを意味する。維持費用は多くの研究者がこれらのモデルを使用することを困難にしている。
従って、より早い齢においてADの病態の全範囲を示す、またはその病態の選択した特徴を示す、または、さらに他の遺伝子に基礎をおく状態を有するトランスジェニックモデルを得ることは有用であろう。この方法により導入遺伝子の発現によって起こる表現型の調節が可能となるはずである。病態がより早期に（加速されて）起こるADのモデルを得ることはさらに有用であろう。特に、アミロイド蓄積が増強され加速されているモデルが有用であろう。
発明の概要と利点
本発明はアルツハイマー病（AD）の増強され、加速された病態を有するトランスジェニック動物モデルを調製する方法およびその方法によって作製されたトランスジェニック動物を提供する。本方法は、それぞれがAD病態と関連した望みの同じ表現型の異なる側面に関する発現可能な導入遺伝子を有する第１および第2のトランスジェニック親を交配することによってＦ1世代を作製することを含む。このＦ1世代の子孫はスクリーニングされそれぞれの親のトランスジェニック動物からの導入遺伝子を有しアルツハイマーに関する増強された病態を生じる個体が選抜される。
好ましい実施態様では、AD-関連病態はアミロイド蓄積に関するものである。ある実施態様では、変異プレセニリン導入遺伝子および変異アミロイド前駆体タンパク質の遺伝子が使用される。さらなる実施態様においては、変異プレセニリン導入遺伝子はPS1 M146L変異であり、変異アミロイド前駆体タンパク質導入遺伝子はスウェーデン変異（K670N、M671L変異（APP770番号づけ）を含むAPP695アイソフォーム）である。
本発明はまたトランスジェニック動物モデルの表現型を調節する方法および調節された表現型を有するトランスジェニック生物も提供する。Ｆ1世代は、それぞれがトランスジェニック動物の望みの表現型に関する同じ生合成経路、および／または相互作用する生合成経路において異なる段階の、発現可能な異なる導入遺伝子を有した第１および第2のトランスジェニック親を交配することによって作製される。その子孫はスクリーニングされ、各トランスジェニック親の導入遺伝子を有し、それによって調節された表現型が与えられている子孫がＦ1世代中から選抜される。
本発明の方法は同じ動物内で発現すると調節された表現型を生じる２つの発現可能導入遺伝子のスクリーニング方法を提供する。この方法においてはＦ1世代が、考えている表現型に関する同じ生合成経路または相互作用する生合成経路の異なるステップの発現可能な導入遺伝子をそれぞれが有する第１および第２のトランスジェニック親の交配によって作製される。それぞれのトランスジェニック親からの導入遺伝子を有し、調節された表現型を生じさせている子孫がＦ1世代の中から同定される。調節された表現型を有する子孫が同定されると、２つの発現可能導入遺伝子を有するトランスジェニック動物が作製されている可能性がある。
図面の説明
以下の詳細な説明を添付の図面との関連で考慮して参照することにより本発明の他の利点は容易に評価でき、よりよく理解できであろう：
図１Ａ−Ｃはトランスジェニックマウスにおける初期の行動変化を示すグラフである。マウスは12-14週にて対称「Ｙ」迷路中で自発的交替についてテストされた。交替行動（alteration performance）はK670N、M671L変異を含むAPP695アイソフォームを有する親および2重トランスジェニックマウスにおいてはM146Lおよび非-トランスジェニック同腹仔と比較して減少していた（図１Ａ）。
「Ｙ」迷路の中のマウスの行動性は２重トランスジェニックマウスにおいては全ての他の遺伝型に対して上昇していた（図１Ｂ）。各マウスについての「Ｙ」迷路行動測定の頻度プロットは頻度分布において右シフトを示した（図１Ｃ）。２重トランスジェニックマウス（破線；ｎ＝２１）および同一の平均および標準偏差（図１Ｂ）を有していた非トランスジェニック＋M146Lマウス（実線；ｎ＝６３）の頻度分布（図１Ｂを参照せよ）。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、原始／最初のトランスジェニック動物世代から調節された表現型を有するトランスジェニック動物後継世代を作製する方法を提供する。この調節は最初のトランスジェニック動物で観察された元の表現型の増強あるいはその表現型の減少のいずれでもあり得る。調節とは、導入遺伝子によって現される特徴的な表現型がより明白であること、より初期にまたは遅く現れることを意味し；親の系統よりも多いまたは少ないタンパク質が産生される等を意味する。ここで、より初期、あるいは加速されたとは、観察される表現型が親系統における表現型よりも寿命中で少なくとも１月以上早く見られることを意味する。また、遅い出現に関しても同様である。
例えば、ヒトの疾病モデルのための調節された表現型は、最初のトランスジェニック動物両親系統その他よりも、その疾病のより多くの特徴を有することを含むヒトの病状をより正確に反映する、疾病と関連する病態を示すであろう。また、調節された表現型はヒトの疾病の病態の、より早いまたは遅い開始を反映することができるであろう。
特に、本方法は互いに相補すべく特に選抜した第１および第２のトランスジェニック親を交配することによりＦ1世代を作り出す。相補とは、調節すべき表現型または表現型の側面に関する同じ生合成経路または相互作用する生合成経路の異なる段階／側面で発現可能な異なる導入遺伝子をトランスジェニック親が有することを意味する。一般には、側面の語は調節されるべき表現型の重要な要素／一面／特徴を記載するために用いられる。一般に生合成経路とは、この分野で知られいているように使用される。しかしながら、表現型を作製する際には観察される表現型を作り出すためにしばしば一つの生合成経路が別の生合成経路と相互作用しなければならず、そのためこの用語は相互作用して観察される表現型を提供する特異的ないくつかの生合成経路を含めるべくより広い概念で用いることができる。
一般に、導入遺伝子が変異を有しているときは、その変異で呼ばれる。変異は非-変異体アミノ酸に続く配列中のその位置、続いて置換アミノ酸によって略記される。
導入遺伝子はヒトの健康状態が研究される場合は一般にヒトの遺伝子である。導入遺伝子（一般にはcDNAの形態）は非変異（しばしば「野生型」と呼ばれる）ヒト遺伝子でも変異ヒト遺伝子でもあり得る。さらに、非変異導入遺伝子は変異を発現させるためにこの分野で知られたように処理されることも可能である。
調節された表現型を有するＦ1世代の子孫は例えば疾患モデルにおける治療モダリティーのテストあるいは病原感受性のための動物モデルにおいて利用される。
さらに、一方の親は直接ヒト導入遺伝子を有する代わりに、導入遺伝子に近くなるような遺伝子ターゲッティングによって改変された相同な内在性遺伝子を有していてもよい。すなわち、内在性遺伝子が「ヒト化」および／または変異されているものである［Reaumeら、1996］。動物とヒトの配列が実質的に相同である場合は「ヒト化」遺伝子は必要ないことに注意を要する。トランスジェニック親は過剰発現配列を有していてもよく、その配列は必要に応じて非変異または変異配列でも、ヒト化されていてもそうでなくてもよい。従って、導入遺伝子の語はこれらの全ての可能性を指すために使用されるものである。
加えて、各トランスジェニック親からの導入遺伝子を有する子孫から細胞を単離することができ、その細胞はこの分野で知られているように初代細胞培養物または細胞株を樹立するために使用される。
適切な場合は、親系統は導入遺伝子に関してホモ接合であろう。加えて、適切な場合には、導入遺伝子に相同なゲノム中の内在性非導入遺伝子は非発現性であろう。非発現性とは内在性遺伝子が発現しないであろうこと、およびこの非発現性が子孫に遺伝し得ることを意味する。例えば、内在性相同遺伝子はこの分野で知られた方法によって「ノックアウト」することができる。また、導入遺伝子の１つを受け取った親系統は、内在性相同遺伝子に、その遺伝子を非発現性にする変異を有していることもあり得る。
本発明の方法はまた、どの導入遺伝子の組み合わせが表現型を調節するかを決定するためのスクリーニング手順も提供する。これらの組み合わせは単一のトランスジェニック動物に取り込まれて調節された表現型を作り出すことができる。すなわち、そのゲノム中に２以上の導入遺伝子が取り込まれているが、交配によって確立されたものではなく、トランスジェニック動物作製のための標準的な方法によって操作されている、操作されたトランスジェニック動物が求められることがある。例えば、２以上の導入遺伝子が同じベクター上で同じプロモーターの制御下にあって求められている調節された表現型を有するはずのトランスジェニック動物が求められることがある。しかしながら、トランスジェニック動物作製の費用および労力のために、操作すべき最も適当な候補を決定するためのスクリーニングが必要である。
本発明のスクリーニング方法においては、考慮している表現型または表現型の側面に関する同じまたは相互作用する生合成経路において異なる段階／側面で発現可能な異なる導入遺伝子をそれぞれ有する第１および第２のトランスジェニック親を交配することによってＦ1世代が作られる。Ｆ1世代の子孫がテストされ、各トランスジェニック親からの導入遺伝子を有する子孫が選抜され、調節された表現型について観察される。
トランスジェニック親はこの技術分野で知られているように作製される。本発明は、本明細書において上述したような、遺伝子ターゲティングされた導入遺伝子、または過剰発現変異または非変異導入遺伝子を含めた、導入遺伝子を有するトランスジェニック親系統を提供するものであり、適切な場合は導入遺伝子を有するノックアウト系統も提供するものである。安定で、遺伝され、発現可能な、動物の核DNA内への導入遺伝子の取り込みを提供するどんな方法も使用することができる。これらのトランスジェニック動物はこの技術において知られ、米国特許5,614,396 5,487,992 5,464,764, 5,387,742, 5,347,075, 5,298,442, 5,288,846, 5,221,778, 5,175,384, 5,175,383, 4,873,191, 4,736,866およびBurkeとOlson［1991］、Capecchi［1989］、Daviesら［1992］、Dickinsonら［1993］、DuffとLincoln［1995］、Huxleyら［1991］、Jakobovitsら［1993］、Lambら［1993］、PearsonとChoi［1993］、Rothstein［1991］、Schedlら［1993］、Straussら［1993］に記載されている、標準的な方法を用いて構築される。さらに、特許出願WO 94/23049、WO 93/14200、WO 94/06908、WO 94/28123も情報を提供する。
より具体的には、動物の親系統を作製すべく導入遺伝子を発現可能なように動物に導入するために、この技術分野で知られたどんな技法を使用してもよい。そのような技法には以下のものが含まれるが、これらに限定するものではない；前核マイクロインジェクション（米国特許4,873,191）；レトロウイルスを媒介にした生殖細胞系列への遺伝子導入［Van der Puttenら、1985］；胚性幹細胞における遺伝子ダーゲッティング［Thompsonら、1989および米国特許5,614,396］；胚のエレクトロモレーション［Lo, 1983］；および精子に媒介された遺伝子導入［Lavitranoら、1989］。こうした技法の総説に関してはGordon［1989］を参照せよ。
本明細書中で以下の実施例において示したような本発明の例において、蓄積されたアミロイドというＡβ関連表現型の顕著で加速された表現型を有する、アルツハイマー病（AD）のためのトランスジェニック動物が、本発明の方法を用いて作製されている。この動物はげっ歯類であり、好ましい実施態様ではマウスである。
本明細書中、上で議論したように、ADの病態は異常なアミロイド産生と関連している。従って、このトランスジェニックモデルではアミロイド蓄積という表現型に関連する生合成経路に関与する遺伝子が用いられている。
ADのためのモデルに関する好ましい実施態様では、第１の親動物は変異プレセニリン導入遺伝子のための発現可能導入遺伝子を有するものであり［Crutsら、1996;Duffら、1996］、第２の親動物は変異アミロイド前駆体タンパク質の発現可能遺伝子を有するものである［米国特許5,612,486; 5,602,299; 5,525,714; 5,604,131; 5,387,742; 5,515,508; PCT特許出願WO 93/14200; WO 96/06927; WO 94/12627; WO 93/02189; WO 92/06187; 欧州特許出願EP0 451 700 A1; EP 0 653 154 A2; Neveら、1996;Hsiaoら、1996;Aliら、1996］。APP遺伝子はターゲッティングされたヒト化非変異配列でも変異配列でもあり得、これらは過剰発現されることもされないこともあり得る。さらに、過剰発現する動物の非変異または変異配列も利用することができる。マウスおよびヒトにおけるプレセニリン遺伝子（PS1およびPS2）は本質的に相同な配列を有しており、そのため、初めにヒト化することなく、親系統を作り出すために標的とした変異が利用できる。
より具体的には、変異プレセニリン導入遺伝子はM146Lであり、変異アミロイド前駆体タンパク質（APP）導入遺伝子はK670N、M671L変異を有するAPP695アイソフォームに対するものである。しかしながら、蓄積されたＡβという、発現されるアミロイド関連AD表現型に関して相補性／相互作用性を与える、どんな変異プレセニリンまたは変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子、またはその後発見されたホモログも利用することができる。さらなる実施態様においては、APPの過剰発現C-末端断片が使用され、またはPDAPPマウス［Gamesら、1995］、および他のAPPマウス［Sommerら、1996；Lambら、1993；Reaumeら、1996］が利用できる。
本発明の方法を用いて、K670N、M571変異を有するAPP695アイソフォームの変異APP導入遺伝子を有する親マウスと、M146L変異PS1導入遺伝子を有する親マウスとの交配によるＦ1子孫が育てられ、病理組織学および行動表現型との関連で調べられる。これらの動物において、変異APPの発現に追加された変異PS1の発現はＡβの堆積速度を加速するが、おそらくPS1変異に動かされたＡβ1-42（43）の上昇によるものであろう。２重トランスジェニックマウスはＡβを含む堆積物形成を加速させた（表１）。抗体4G8（40番残基または42番残基の何れかで終わるヒト及びマウスＡβの双方を染色する）で染色された切片では、26から32週齢、通例は29週齢で殺したどの2重トランスジェニックマウスにおいても多数の堆積物が標識された。同腹の齢が一致している単一トランスジェニックK670N、M671LまたはM146Lマウス、および非トランスジェニック同腹仔の対応する領域はＡβ堆積物に関して陰性であった。陽性に染色されるＡβ堆積物は13週齢で明確になり、その時点から数とサイズが増加し、2重トランスジェニックマウスにおいてＡβ蓄積過程を加速する、調節された表現型を示す。
これらの研究において全てのマウスは12-14週齢で行動テストバッテリー（behavioral test battery）にかけられた。全てのマウス群は知覚および運動機能テストにおいて類似性を示した。体重はどの遺伝子型についても同様であった。しかしながら、対称「Ｙ」迷路における自発的交替行動についてテストされると、アーム侵入の総数において相違が観察された。この行動のインデックスは遺伝子型によって改変されていた。2重トランスジェニックマウスはK670N、M671LまたはM146Lまたは非トランスジェニック同腹仔に比較して行動性が増していた。従って、12週齢くらいの初期に、この行動性測定に対してPS1とAPP変異の相乗効果がある。
これらの結果は、プレセニリン変異はK670N、M671LマウスにおいてAD表現型の進行を相乗的に加速し、調節された表現型を与えることを明確に証明するものである。このデータは、K670N、M671L導入遺伝子により発現される変異APPのプロセッシングに変異プレセニリンが影響を与え、Ａβ産物、原線維性プラーク形成を増加させ、マウスの寿命中の早期に行動に影響を与えることを示すものである。これらのマウスにおけるAD表現型の急速な進行はアミロイド毒性の機構的論点を述べる際に利点となろうし、AD表現型の選択した側面と相互作用すると思われる薬剤の効力をテストする際に利点となるであろう。
上記の議論は、改変された表現型を有するトランスジェニック動物を開発する方法のための実際上の基礎を提供する。本発明で使用する方法および本発明の有用性は以下の非制限的実施例および添付の図によって示すことができる。
実施例
一般的方法：
免疫組織学における一般的方法：この技術分野で知られた標準的手法は、特に述べない限り、Stitesら（編集）Basic and Clinical Immunology（第８版）,Appleton & Lange, Norwalk, CT（1994）およびJohnstone & Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982にだいたい従った。
分子生物学における一般的方法：この技術分野で知られた標準的な分子生物学的方法は、特に述べない限り、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989, 1992）、およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland（1989）にだいたい従った。
同腹仔の遺伝型タイピング：
得られた子孫は離乳した動物の尾の先を切断し、PromegaゲノムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、変性DNAをナイロン膜に転写し、APPまたはPS1を認識するDNAプローブで重複する２つのサンプルをハイブリダイズさせることによって遺伝型を決定した。
知覚および運動機能テスト：全ての同腹仔について、12-14週の間に体重を測った。平らな表面の上でマウスを尾で持ち、マウスをゆっくり下げながら前肢が表面方向へ伸ばされるか見ることによって各マウスの前肢プレーシング応答（forelimb placing response）を調べた。マウスを肢を上にして持ち35cmの高さから敷き藁の柔らかい表面に落としたときに示す立ち直り反射を前庭機能（vestibular function）を調べるために用いた。プライエル反射（耳翼の後方へのぴくぴくする動き）を引き出すために大きな金属クリック音を聴覚テストのために用いた。自発性発作（spontaneous seizure）のテストは各マウスを尾で30秒間保持することによるストレスによって行なった。次にマウスをケージに戻し、30分の間隔を置いて発作行動（seizure activity）について観察した。運動協調性をLalondeとThifault（1994）によって記載されたコートハンガーテスト（coat hanger test）を用いて調べた。
行動性テスト：３か月齢のマウスをHsiao［1996］およびMauriceら［1996］に記載されたものと類似のプロトコルを用いた自発的交替のテストのために用いた。マウスを白色のアクリルでできた対称「Ｙ」迷路の中央に置き、８分間にわたって一連のアーム侵入を記録した。交替パーセンテージは３本の全てのアームへの侵入を含む３つ組（すなわち、ABC、ACB、CAB等）の数を可能な交替の最大数（侵入したアームの総数−２に相当する）で割って、100を掛けたものである。
統計的解析のために、同じ遺伝子型同腹仔を平均し、それぞれの仔についての価をANOVAと続くNewman-Keulsによって比較して、それぞれのグループ間の違いを決定した（各遺伝子型についてｎ＝11-12匹の同腹仔；33匹の非トランスジェニックマウス、30匹のM146L、22匹のK670N、M671Lおよび20匹の2重トランスジェニックマウス）。
免疫組織学的プロトコル：2重トランスジェニックマウス（ｎ＝６）、単一トランスジェニックマウスK670N、M671L（ｎ＝５）およびM146L（ｎ＝３）および非トランスジェニックマウス（ｎ＝４；すべて26-32週齢）、および1匹の15ヶ月齢の親K670N、M671Lマウスを犠牲にした。脳の半球を0.9％食塩水中でゆるやかに30分間振盪し、４％パラホルムアルデヒドで24時間浸漬固定し、15％シュークロース／PBS中で低温保護し、続いて30％シュークロース／PBS中で一晩浸漬した。25μm水平切片を滑走式ミクロトームで調製した。
標準的プロトコルを用いて、免疫組織化学を浮遊切片上で行なった。Ａβ残基17-24を認識する一次抗体（4G8、Senetek, Maryland Heights, MO, 1:1000）およびGFAP（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, 1:1000）を用いた。GFAP染色切片をスライド上にマウントしコンゴーレッドでカウンター染色した（Sigma Accustainアミロイド染色キット、St. Louis, MO）。コンゴーレッド染色を干渉偏光照明（cross-polarized illumination）を用いて評価した。偏光器を回転させたときに緑／赤複屈折の堆積物のみをコンゴーレッド陽性堆積物としてカウントした。さらなる切片を核の蛍光をマスクするためマイヤーのヘマトキシリン（Mayer’s hematoxylin）中で10分間の後１％チオフラビンＳで染色した。プラークのカウントはすべて総倍率40倍で3つの異なる背腹面それぞれについて行なった。
結果
K670N、M671L変異を有するAPP695アイソフォーム（APP770番号付け）を有する親マウスと変異PS1導入遺伝子M146Lを有する親マウスとの交配からの子孫を組織病理学および行動表現型との関連で調べた。これらの動物において、変異APPの発現に加えて変異PS1の発現がＡβの堆積速度を加速するが、これはおそらくPS-1変異によって動かされるＡβ1-42（43）上昇のためであろう。APP導入遺伝子を発現している全ての動物は行動テスト、自発的交替において欠陥を示すが、これはＡβの堆積と相関せず、このことはこれらの知覚障害は目に見えるアミロイド堆積物の毒性成分と完全には関連していないことを示唆する。
交配による最初の同腹仔を26-32週齢で犠牲にした。これらの動物の組織病理学は2重トランスジェニックマウスは単一トランスジェニック同腹仔に対してＡβを含む堆積の形成を加速することを示した。抗体4G8（残基40または残基42で終わるヒトおよびマウスＡβの双方を染める）による切片染色は26-32週齢で犠牲にしたどの2重トランスジェニックマウス（６匹のマウス、それぞれについて３つの切片を全て調べた）においても沢山の堆積物を標識した。この堆積物は偏光した光の下でみるとコンゴーレッドでも染まる。齢の一致したK670N、M671LおよびM146L同腹仔および非トランスジェニック同腹仔の対応する領域はＡβ堆積物に関して陰性であった（表１）。
チオフラビンＳ陽性堆積物は2重変異マウスの皮質および海馬のみに見られ、皮質のより腹側部においてわずかに密度が低かった。脳の他の領域には堆積物は見られなかった。いくつかの堆積物はコンゴーレッドで染色し、干渉偏光光下で見た場合にマルタ十字に似ている。同様な構造がヒトAD脳に見られる。チオフラビンＳ堆積物の数はコンゴーレッドまたはＡβ免疫組織化学で見られる数を一貫して上回ったが、その値は2重変異マウスの中では高度に相関していた（チオフラビンＳとコンゴーレッドに関してはｒ＝0.93およびチオフラビンＳとＡβ免疫組織化学に関してはｒ＝0.81）。この高い相関は、3つの測定が堆積の同じ過程を反映しており、それが各マウスにおいて僅かに変動していることを示唆するものである。チオフラビンＳに関するより高い絶対値は、この技法により堆積物が容易に同定できることを意味する。
2重トランスジェニックマウスにおける、この3種の方法全てについての堆積物陽性反応は、それらが原線維性Ａβアミロイドからなっていることを明確に示すものである。対照として、15ヶ月齢の親K670N、M671Lマウスを犠牲にし、26-32週齢のマウスと並行して処理した。このマウスはＡβ、コンゴーレッドおよびチオフラビンＳで陽性に免疫染色される堆積物を有していた。
スライドをダリア原線維酸性タンパク質（GFAP）に対するモノクローナル抗体で染色したときに堆積物を取り囲む反応性の星状細胞が見られる。星状細胞は2重トランスジェニックマウスの大脳皮質内にクラスターで見られる。26-32週齢のK670N、M671Lマウス、M146L同腹仔または非トランスジェニック同腹仔においては反応性星状細胞は、あってもごくわずかである。コンゴーレッドによる2重染色は反応性星状細胞のこれらのクラスター中心のアミロイド堆積物を明らかにした。星状細胞クラスターは海馬にも存在していたが、マウス脳のこの領域における高いGFAPベース含量のために新皮質におけるほどは識別できなかった。同様なクラスターは15か月齢の親K670N、M671Lマウスにおいて明確であった。
4匹のより若い2重トランスジェニックマウスを13週齢（ｎ＝２）または15週齢（ｎ＝２）で犠牲にした。13週齢マウスはＡβ免疫組織化学またはコンゴーレッド染色で評価したところＡβ堆積物を有していなかった。15週齢マウスは切片あたり平均して１つの堆積物を有していたが、チオフラビンＳ染色堆積物は13週齢および15週齢2重トランスジェニックマウスの双方において視認された。チオフラビンＳ堆積物のいくつかは数本の糸のようなプロフィールのみからなっていた。この堆積物は非常に小さく、26-32週齢マウスにおける（切片あたり平均７７；表１）よりも相当数が少なかった（切片あたり５未満）。従って、Ａβ堆積は13週齢までに明確になり、そのとき以降数とサイズが増大する。
これらの研究におけるマウスをすべて、12-14週齢で知覚及び運動機能および行動テストバッテリーにかけた。マウスのグループの全部が、ワイヤーハングテスト（wire hag test)(力及び協調運動性）、立ち直り反射（前庭）、プライエル応答（聴覚）および前肢プレーシング応答（視覚及び運動性）を含む知覚及び運動機能テストにおいて同様に行動した。体重は全ての遺伝子型に関して同様であった。
しかし、対称「Ｙ」迷路においてマウスを自発的交替行動に関してテストしたところ違いが観察された。交替行動は遺伝子型によって改変された（図１Ａ；ANOVA：F（3,43）=5.64, p<0.005）。交替のパーセンテージは2重トランスジェニックマウスおよびK670N、M671Lマウスの両方において、M146Lまたは非トランスジェニック同腹仔に比較して顕著に低かった（p<0.05； Neman-Keulのポストhoc比較）。これらの結果は、APP変異を発現しているマウスは交替行動障害を非常に早期に有していることを示すものである。この行動障害は変異APPの過剰発現、または可溶性ヒトＡβの上昇したレベルによって引き起こされたものかもしれない。この欠陥は、目に見える繊維源性Ａβ堆積物の形成によるものではないことは重要である。なぜなら、12週齢2重変異マウスにおいてはこれらは存在しないか希であり、32週まででさえそうであり、これらの堆積物はK670N、M671Lマウスにおいて見られないからである。
「Ｙ」迷路交替テストにおける第2の測定は、アーム侵入の総数である。この行動性のインデックスもまた遺伝子型によって影響された（図１Ｂ；ANOVA：F（3, 43）=3.73, p<0.02）。2重トランスジェニックマウスは単一トランスジェニックK670N、M671L、M146Lマウスまたは非トランスジェニックマウスに比べて行動性が増加していた（p<0.05；Newman-Koulのポストhoc比較）。K670N、M671Lマウスはこの測定では他の2つの遺伝子型と有意に相違しなかった。図１Ｃは2重トランスジェニックマウスの行動性スコアに関する頻度分布の右方向シフトを明らかにしており、このことは新たに隔離された（outlying）動物の結果ではないことを示している。したがって、12週くらいの早期にPS1とAPP変異の相乗効果がこの行動測定に存在している。
これらの結果は、プレセリニン変異はK670N、M671Lマウスにおいて相乗的な様式でAD表現型の進行を加速することを明確に示している。このデータは変異プレセニリンはK670N、M671L導入遺伝子から発現している変異APPのプロセッシングに影響を与え、原線維性プラーク形成を促進しマウスの寿命中の早期に行動に影響を与えることを示している。これらのマウスにおけるAD表現型の急速な進行はアミロイド毒性の機構的論点を述べる際に、そして、おそらくはAD表現型の選択した側面と相互作用すべく計画された薬剤の効力をテストする際に利点となるであろう。
本出願を通して、米国特許および他国の特許を含む種々の刊行物は著者および発行年および特許番号により参照される。刊行物の完全な引用は以下に掲げる。これらの刊行物および特許の開示は、そっくりそのまま、本発明が属する技術の状況をより完全に記述するために本明細書に引用により含まれるものとする。
本発明は例示的に記載されており、使用した用語は説明用の語という性質を意図したものであって、制限的性質を帯びたものではない。
明らかに、本発明の多くの改変および変法が上記の教示に照らして可能である。従って、付属の請求項の範囲内で、具体的に記載したものとは違うように本発明が実施されるかもしれないことは言うまでもない。
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参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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