(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株。
【請求項２】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体、培養物、又は子実体。
【請求項３】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体。
【請求項４】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株が、菌糸体、培養物、又は子実体である、請求項３に記載の熱水抽出液若しくはその乾燥体又はアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ストレス負荷回復促進用医薬組成物及び新規マツタケ株に関する。本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
背景技術
マツタケには種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、例えば、特公昭５７−１２３０号公報及び特許第２７６７５２１号明細書には、マツタケに含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。前記特公昭５７−１２３０号公報には、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、及びエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示されている。また、前記特許第２７６７５２１号明細書には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量＝１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。
更に、本発明者は、マツタケ熱水抽出液、マツタケのアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が、免疫増強活性を有することを既に見出している（特願２０００−３７４号）。
ところで、ストレスは、心身症などの社会生活適応障害を引き起こすだけでなく、生活習慣病などの発症及び進行の引き金にもなりうることが知られている。ストレスに晒されたときの心身変化に対しては、対症療法的に抗不安薬（精神安定剤）や漢方薬が処方されているものの、ストレスに伴う免疫機能変化に対する有効な対処方法は現在模索中といえる。本発明者が知る限りにおいて、ストレス負荷から開放された後、自発的な免疫力の回復を促進する作用（すなわち、ストレス負荷回復促進作用）を示す食品も知られていないし、食品中に前記ストレス負荷回復促進作用を示す物質が存在することも知られていない。
本発明者は、マツタケについて、既に知られている前記の抗腫瘍活性又は免疫増強活性以外の更に別の生理活性を鋭意探索したところ、マツタケには、前記ストレス負荷回復促進作用を示す活性成分が含まれていることを新たに見出した。また、本発明者が発見した新規マツタケ株の生理活性を鋭意探索したところ、前記ストレス負荷回復促進作用を強く示す活性成分を含む新規マツタケ株を新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
発明の開示
従って、本発明は、マツタケ［Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｍａｔｓｕｔａｋｅ（Ｓ．Ｉｔｏ  ＆  Ｉｍａｉ）Ｓｉｎｇ．］、マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、又はマツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、ストレス負荷に対する回復促進用の医薬組成物に関する。
また、本発明は、マツタケ、マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、又はマツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、ストレス負荷に対する回復促進用の機能性食品に関する。
また、マツタケ、マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、又はマツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体と、オーラル衛生用組成物の担体とを含有する、ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物に関する。
また、本発明は、マツタケ、マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、又はマツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体を、ストレス負荷に対する回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷に対する回復促進方法に関する。
また、本発明は、マツタケ、マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、又はマツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体の、ストレス負荷に対する回復促進用医薬組成物、ストレス負荷に対する回復促進用機能性食品、あるいは、ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するための使用に関する。
また、本発明は、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株、あるいは、その菌糸体、培養物、又は子実体に関する。
更に、本発明は、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、
（１）マツタケ［例えば、マツタケの菌糸体、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、又は子実体］、
（２）マツタケの熱水抽出液［例えば、マツタケの菌糸体、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、又は子実体の熱水抽出液］又はその乾燥体、あるいは、
（３）マツタケのアルカリ溶液抽出液［例えば、マツタケの菌糸体、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、又は子実体のアルカリ溶液抽出液］又はその乾燥体
の少なくとも１つを、有効成分として含有し、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤を含有する。
本発明の有効成分である、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を調製するのに用いる前記マツタケとしては、例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体（すなわち、培養菌糸体）、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、若しくは子実体を挙げることができる。ストレス負荷回復促進作用を強く示す活性成分を含む点で、本発明の新規マツタケ株であるマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株［Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｍａｔｓｕｔａｋｅ（Ｓ．Ｉｔｏ  ＆  Ｉｍａｉ）Ｓｉｎｇ．ＣＭ６２７１］を用いることが好ましい。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分として用いることのできるマツタケの菌糸体としては、培養により得られる菌糸体を使用する場合には、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち、培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもできるし、更には、前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。また、天然の菌糸体を使用する場合には、例えば、天然の菌糸体をそのまま使用することもできるし、あるいは、天然の菌糸体から適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもできるし、更には、前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分として用いることのできるマツタケの培養物（Ｂｒｏｔｈ）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち、培養菌糸体）と培地との混合物の状態でそのまま使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した培養物（Ｂｒｏｔｈ）乾燥物の状態で使用することもできるし、更には、前記培養物（Ｂｒｏｔｈ）乾燥物を粉砕した培養物（Ｂｒｏｔｈ）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分として用いることのできるマツタケの子実体としては、例えば、天然の子実体又は培養により得られる子実体をそのままで、あるいは、前記子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、前記子実体から適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもできるし、更には、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
マツタケの熱水抽出液は、例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体（すなわち、培養菌糸体）、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、若しくは子実体を、熱水で抽出することにより得ることができる。
熱水抽出に用いる熱水の温度は、マツタケに含有されるストレス負荷回復促進作用を示す成分が、熱水抽出液中に充分に抽出されることのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、６０〜１００℃であることが好ましく、８０〜９８℃であることがより好ましい。
菌糸体又は子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、マツタケの状態（すなわち、子実体、菌糸体、又は培養物のいずれの状態であるか、あるいは、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１〜６時間であり、２〜３時間であることが好ましい。
得られた熱水抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることもできるし、あるいは、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、更に、抽出液中の低分子画分を除去してから、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることもできる。例えば、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることができる。あるいは、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることができる。更には、熱水抽出液（例えば、不純物が混在する熱水抽出液、前記熱水抽出液を遠心分離して得られる上清、あるいは、前記上清の透析物などを含む）から、適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した乾燥体の状態で、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることができる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分である、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体の製法は、例えば、先に説明した、マツタケの熱水抽出液の製造方法に準じた方法により実施することができる。すなわち、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、マツタケの熱水抽出液の前記製造方法と同様の方法により、調製することができる。例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体（すなわち、培養菌糸体）、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、若しくは子実体を、アルカリ溶液で抽出することにより得ることができる。
アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。前記アルカリ溶液のｐＨは、８〜１３であることが好ましく、９〜１２であることがより好ましい。アルカリ溶液抽出は、０〜３０℃で実施することが好ましく、０〜２５℃で実施することがより好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、中和処理を実施してから、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることもできるし、あるいは、中和処理を実施することなく、そのまま、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることもできる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、マツタケ［例えば、マツタケの菌糸体、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、又は子実体］、マツタケの熱水抽出液［例えば、マツタケの菌糸体、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、又は子実体の熱水抽出液］又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液［例えば、マツタケの菌糸体、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、又は子実体のアルカリ溶液抽出液］又はその乾燥体を、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分である、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体は、ストレス負荷に対する回復促進活性を有する。
従って、本発明における有効成分である、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ストレス負荷に対する回復促進が必要な対象に、有効量で投与することができる。
また、本発明における有効成分である、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体は、ストレス負荷に対する回復促進用医薬組成物、ストレス負荷に対する回復促進用機能性食品、あるいは、ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。
一般に、動物に対して、単発的に、あるいは、或る期間に亘ってストレスを与えると、通常、その動物における免疫能は低下するが、前記ストレス負荷から解放されると、自発的な免疫力の回復が起こる。本明細書における「ストレス負荷に対する回復促進活性（ストレス負荷回復促進活性）」とは、ストレス負荷から開放した後、免疫力回復期における免疫力の回復を、自発的な回復よりも促進する活性を意味する。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の投与時期は、ストレス負荷により一時的に低下した免疫力を、その投与により回復促進可能である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ストレス負荷の前、ストレス負荷中、及び／又はストレス負荷から開放した後の免疫力回復期に投与することができる。
なお、本発明における前記「ストレス負荷回復促進活性」は、本発明者が先に見出した前記の単なる「免疫増強活性」とは異なる。すなわち、「免疫増強活性」とは、そのような活性を有する有効成分を投与した場合に、投与前の状態（ストレスの負荷がなく、免疫力が通常の状態であることもできるし、あるいは、ストレス負荷により、免疫力が低下している状態であることもできる）と比較して、免疫力の向上がみられる活性を一般に意味し、従って、免疫力それ自体を向上させる活性である。一方、本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、前述のように、免疫力回復期における免疫力の回復を促進する活性であって、従って、免疫力の回復速度を向上させる活性である。本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物を投与すると、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物を投与しない場合と比較して、免疫力の回復速度が上昇する。
更には、「免疫増強活性」においては、そのような活性を有する有効成分を投与すると、直接的に、免疫力の向上がみられるのに対して、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分である、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を、予め、ストレスを負荷する前に対象動物に投与しておくと、ストレス負荷中及び免疫力回復期中に、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を投与しなくても、免疫力回復期において免疫力の回復が促進される。この点においても、「免疫増強活性」と本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、異なる活性である。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、これに限定されるものではないが、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケ、マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、あるいは、マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を、添加剤（例えば、食品添加剤）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤等に添加することができる。
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）］に平成１２年９月１４日より寄託しているものである。このマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより、菌糸体継代株を得たものであり、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で維持している。
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の子実体の形態は、今関六也・本郷次雄編の「原色日本新菌類図鑑（Ｉ）」、保育社（大阪）、昭和６２年発行、プレート（Ｐｌａｔｅ）１５及び７７頁記載のマツタケ子実体に合致するものであった。本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の継代は、エビオス寒天斜面培地で実施することができる。前記菌株の菌糸体を大量培養する場合には、液体培地に摂取し、例えば、静置培養、振とう培養、又はタンク培養により実施することができる。
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体をエビオス寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、大きなコロニーを形成する。走査型電子顕微鏡で観察すると、太さ１〜２μｍの枝状の菌糸体が無数に存在し、菌糸体側部に数μｍ程の突起物が時々みられる。なお、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、もっぱら菌糸体の形状で継代維持又は培養することが可能であるが、子実体の形状となることもある。
以下、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌学的性質について説明する。
（１）麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、麦芽エキス寒天培地においては、白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。接種３０日目のコロニー径は約４ｃｍである。
（２）ポテト・グルコース寒天培地、ツアペック寒天培地、サブロー寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、及びフェノールオキシダーゼ反応検定用培地における培養的・形態的性質
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、ポテト・グルコース寒天培地、ツアペック寒天培地、サブロー寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、又はフェノールオキシダーゼ反応検定用培地のいずれの培地においても、接種１ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんど見られない。
（３）ＹｐＳｓ寒天培地における培養的・形態的性質
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、ＹｐＳｓ寒天培地においては、白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約５ｍｍである。
（４）グルコース・ドライイースト寒天培地における培養的・形態的性質
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、グルコース・ドライイースト寒天培地においては、白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約２ｍｍである。
（５）最適生育温度及び生育の範囲
滅菌処理した液体培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス；ｐＨ７．０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、５〜３５℃の種々の温度でそれぞれ培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、重量を測定した。その結果、菌体重量は５〜１５℃の範囲で直線的に増加し、１５〜２５℃の範囲で緩やかに増加した。２７．５℃以上ではほとんど増殖しなかった。最適生育温度は１５〜２５℃である。
（６）最適生育ｐＨ及び生育の範囲
液体培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス）のｐＨを１ｍｏｌ／Ｌ塩酸又は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムで調製して、ｐＨが３．０〜８．０の範囲の種々の培地を調製して生育ｐＨ値を調べた。各培地をフィルター滅菌し、培地１０ｍＬを滅菌済１００ｍＬ容三角フラスコに分注した。本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種後、２２℃で培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、重量を測定した。その結果、菌体の生育限界はｐＨ３．０〜７．０の範囲にあり、最適生育ｐＨは４．０〜６．０であった。
（７）対峙培養による帯線形成の有無
エビオス寒天平板培地に、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）と、後述の表１に示す１３種類のマツタケ株の各ブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）とを、約２ｃｍ間隔に対峙して植菌し、２２℃で３週間培養した後、両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判定した。
その結果、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、表１に示す１３種類のマツタケ株のいずれの株に対しても、明確な帯線を形成しなかった。なお、マツタケでは、異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、表１に示す１３種類のマツタケ株間についても、明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。
（８）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（Ｏｈｔａら，Ｔｒａｎｓ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３１，３２３，１９９０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、２２℃で培養し、４２日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、重量を測定したところ、菌体４４１ｍｇが得られた。
前記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、２８種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体重量を測定した。
その結果、菌体重量が多かった糖質関連物質から菌体重量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下のとおりである：
小麦デンプン＞トウモロコシデンプン＞デキストリン＞メチルβグルコシド＞セロビオース＞マンノース＞フラクトース＞アラビノース＞ソルビトール＞グルコース＞ラクトース＞グリコーゲン＞マンニトール＞リボース＞マルトース＞トレハロース＞ガラクトース＞ラフィノース＞メリビオース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。
なお、セルロース、ダルチトール、シュークロース、キシロース、メチルαグルコシド、イヌリン、イノシトール、又はソルボースでは菌の発育はほとんどみられなかった。
次に、前記菌根菌用合成培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、１５種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体重量を測定した。
その結果、菌体重量が多かった窒素関連物質から菌体重量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下のとおりである：
コーンスティープリカー＞大豆ペプトン＞ミルクペプトン＞硝酸アンモニウム＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞アスパラギン＞リン酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸ナトリウム＞肉エキス＞酵母エキス＞カザミノ酸＞クロレラ＞トリプトーン＞硝酸カリウム。
更に、前記合成培地中のミネラル及びビタミン類の内、特定一成分を除去した培地に、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体重量を測定した。
その結果、塩化カルシウム・二水和物、硫酸マンガン（ＩＩ）・五水和物、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸コバルト・七水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸ニッケル・六水和物、塩酸チアミン、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、塩酸ピリドキシン、塩化カーニチン、アデニン硫酸・二水和物、又は塩酸コリンのいずれか１つの欠損によっては、菌体重量にはほとんど影響なかった。一方、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化鉄（ＩＩ）、又はリン酸二水素カリウムのいずれか１つを培地から除くと、菌体重量は顕著に減少した。すなわち、マグネシウム、鉄、リン、及びカリウムは、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の増殖に必須と考えられる。
（９）ＤＮＡの塩基組成（ＧＣ含量）
本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＧＣ含量は、４９．９％である（後述の分析例２参照）。
（１０）ＲＡＰＤ法により生成するＤＮＡパターン
６種類の異なるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー（１０ｍｅｒ；具体的な塩基配列については、後述の分析例１を参照のこと）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法により生成するＤＮＡパターンについて、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株と、４４種類のマツタケ株（具体的な菌株名については、後述の分析例１を参照のこと）とを比較したところ、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、４４種類のマツタケ株のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の乾燥物粉末の調製
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株菌糸体を、滅菌処理した培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス，ｐＨ６．０）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ１０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で４週間培養を行なった。得られた培養物を濾布濾過し、菌糸体を分離した後、蒸留水で充分に洗浄した。−６０℃に凍結した後、凍結乾燥機（ＭＩＮＩＦＡＳＴ  ＭＯＤ．ＤＯ．５；Ｅｄｗａｒｄｓ社）を用いて凍結乾燥することにより、乾燥菌糸体１０．１ｇを得た。得られた菌糸体を、ホモブレンダー（Ｗｏｎｄｅｒ  Ｂｌｅｎｄｅｒ；大阪ケミカル社）を用いて粉砕することにより、乾燥物粉末９．８ｇを得た。
実施例２：マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液及びアルカリ溶液抽出液の各乾燥物粉末の調製
前記実施例１と同様の手順により調製したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株菌糸体の乾燥物粉末１５ｇを、１Ｌ容のビーカーに移し、純水６００ｍＬを加えた後、スターラー撹拌下、９３〜９８℃のウオーターバス中で３時間抽出した。抽出終了後、室温まで冷却し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間）により、上清を得た。
沈殿部には純水３００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。この操作を計３回行ない、全ての上清を合わせて、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で２日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、熱水抽出液の乾燥物粉末３．２ｇを得た。
熱水抽出を実施した後に残った沈澱部に、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液４００ｍＬを加えた後、スターラー撹拌下、２５℃で１時間抽出した。抽出終了後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間）により、上清を得た。
沈殿部には１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液４００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。２つの上清を合わせ、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸にてｐＨを７．０に調整した後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で２日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、アルカリ溶液抽出液の乾燥物粉末５．１ｇを得た。
実施例３：岩手県産マツタケ子実体の乾燥物粉末の調製
市販の岩手県産マツタケ子実体［黒潮市場（東京都新宿区北新宿）にて購入］２５０ｇを、凍結乾燥機（ＭＩＮＩＦＡＳＴ  ＭＯＤ．ＤＯ．５；Ｅｄｗａｒｄｓ社）を用いて乾燥した後、ホモブレンダー（Ｗｏｎｄｅｒ  Ｂｌｅｎｄｅｒ；大阪ケミカル社）を用いて粉砕することにより、乾燥物粉末３５ｇを得た。
実施例４：岩手県産マツタケの熱水抽出液及びアルカリ溶液抽出液の各乾燥物粉末の調製
前記実施例３と同様の手順により調製した市販の岩手県産マツタケ子実体の乾燥物粉末２０ｇを、１Ｌ容のビーカーに移し、純水８００ｍＬを加えた後、スターラー撹拌下、９３〜９８℃のウオーターバス中で３時間抽出した。抽出終了後、室温まで冷却し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間）により、上清を得た。
沈殿部には純水５００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。この操作を計３回行ない、全ての上清を合わせて、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で２日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、熱水抽出液の乾燥物粉末１．０ｇを得た。
熱水抽出を実施した後に残った沈澱部に、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液５００ｍＬを加えた後、スターラー撹拌下、２５℃で１時間抽出した。抽出終了後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間）により、上清を得た。
沈殿部には１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液５００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。２つの上清を合わせ、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸にてｐＨを７．０に調整した後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で２日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、アルカリ溶液抽出液の乾燥物粉末５．１ｇを得た。
実施例５：長野県産マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、長野県産マツタケ子実体を用いたこと以外は、前記実施例４の手順をそのまま繰り返すことにより、マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末１．５ｇを得た。
比較例１：アガリクス・ブラゼイ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、市販のアガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）子実体を用いたこと以外は、前記実施例４の手順をそのまま繰り返すことにより、アガリクス・ブラゼイ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末３．６ｇを得た。
比較例２：霊芝子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調整
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、市販の霊芝子実体［Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ（Ｆｒ．）Ｋａｒｓｔ］を用いたこと以外は、前記実施例４の手順をそのまま繰り返すことにより、霊芝子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末２．４ｇを得た。
比較例３：シイタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、市販のシイタケ子実体［Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓｉｎｇ．］を用いたこと以外は、前記実施例４の手順をそのまま繰り返すことにより、シイタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末１．４ｇを得た。
分析例１：マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＲＡＰＤ法による同定
本分析例では、６種類の異なるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー（１０ｍｅｒ）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法によりそれぞれ生成する本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＤＮＡパターンを、複数の公知マツタケ株の各ＤＮＡパターンと比較した。
比較用の公知マツタケ株としては、表１に示す１３種類を使用した。前記実施例１と同様にして、乾燥菌糸体を得、更にそれを粉砕することにより、乾燥物粉末を得た。各マツタケ株の菌糸体収量（培地１００ｍＬ当たりの乾燥菌体重量，１０本の平均値）と、各マツタケ株の由来（樹立施設）についても、併せて表１に示す。
0004336104.tif 000002
前記ＰＣＲ用プライマーとしては、
プライマーＲＡＰＤ１（配列表の配列番号１で表される塩基配列：ＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡ）；
プライマーＲＡＰＤ２（配列表の配列番号２で表される塩基配列：ＡＧＣＧＣＣＡＴＴＧ）；
プライマーＲＡＰＤ３（配列表の配列番号３で表される塩基配列：ＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧ）；
プライマーＲＡＰＤ４（配列表の配列番号４で表される塩基配列：ＴＧＣＧＴＧＣＴＴＧ）；
プライマーＲＡＰＤ５（配列表の配列番号５で表される塩基配列：ＧＡＣＴＡＧＣＣＴＣ）；及び
プライマーＲＡＰＤ６（配列表の配列番号６で表される塩基配列：ＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣ）
を化学合成により調製し、使用した。
ＲＡＰＤ法に使用するＤＮＡは、市販のＤＮＡ調製キット（Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、その取り扱い説明書［Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｒｃｈ，１９９９，ＱＩＡＧＥＮ，Ｋ．Ｋ．，東京）］に準じて、以下の手順により調製した。
すなわち、余分な水分を除去した各マツタケ菌株の菌糸体（約１００ｍｇ）をチューブに入れた後、液体窒素で凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。サンプルの入ったチューブを解凍した後、緩衝液ＡＰ１（４００μＬ）とＲＮアーゼＡストック溶液（ＲＮａｓｅ  Ａ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）４μＬとを加え、ボルテックスミキサーを用いて内容物を充分に混和させた。次いで、前記チューブを６５℃のウオーターバスに入れ、１０分間インキュベートした。なお、前記インキュベーション中、チューブを２〜３回反転させて混和させた。反応終了後、前記反応物に緩衝液ＡＰ２（１３０μＬ）を加え、氷冷下で５分間放置した。次いで、チューブ内容物をカラム（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ）に装入し、前記カラムを２ｍＬ容の試験管に入れて、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。遠心分離後、カラムを通過して試験管底にたまった溶液を別の試験管に移し、液量を測定した。この際、試験管底にある細胞片には絶対触れないようにした。
続いて、カラム通過液と同量の１００％エチルアルコールと、半分量の緩衝液Ａｐ３とを試験管に加え、よく混和させた。前記溶液６５０μＬを別のカラム（ＤＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ）に装入し、前記カラムを２ｍＬ容の試験管に入れて、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離後のカラムに緩衝液ＡＷ（５００μＬ）を装入し、前記カラムを２ｍＬ容の試験管に入れて、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、試験管底の溶液を廃棄した。前記カラムに緩衝液ＡＷ（５００μＬ）を装入し、前記カラムを２ｍＬ容の試験管に入れて、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、試験管底の溶液を廃棄した。次に、新しい試験管を用意し、前記洗浄処理したカラムをセットし、６５℃に保温した緩衝液ＡＥ（１００μＬ）を装入し、室温で５分間おいた後、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、試験管底のＤＮＡ溶液を回収した。同じ操作をもう一度繰り返し、合計約２００μＬのＤＮＡ溶液を回収した。得られたＤＮＡの内、２０μＬを１％アガロースゲル電気泳動にかけ、ＤＮＡの回収量及び純度を確認した。
ＰＣＲは、表２に示す反応溶液（全容量＝２５μＬ）中において、９４℃の変性工程（３０秒間）、３６℃の結合工程（１分間）、及び７２℃の伸長工程（２分間）からなるサイクルを４５サイクル実施する条件［但し、第１回目のサイクルの前に、９４℃の予備的な変性工程（２分間）を実施し、更に、最後の第４５回目のサイクルの後に、最終的な伸長工程（２分間）を実施する］で行なった。なお、表２に示す反応溶液は、Ｅｘ  ＴａｑＴＭバッファー、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ、及びＴａｑ  Ｓｔａｒｔ抗体を混合して２〜３秒後に、蒸留水、１０×Ｅｘ  ＴａｑＴＭバッファー、ｄＮＴＰ、及びプライマーを添加し、最後にＤＮＡ溶液を添加することにより調製した。
0004336104.tif 000003
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法により分離して得られるＤＮＡパターンを、図１〜図４に示す。図１は、表１における菌番号１〜６で表される比較用菌株のＤＮＡパターンを示し、図２は、表１における菌番号７〜１１で表される比較用菌株のＤＮＡパターンを示し、図３は、表１における菌番号１２〜１３で表される比較用菌株のＤＮＡパターンと、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＤＮＡパターンとを示し、図４は、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＤＮＡパターンを示す。
図１における丸付き数字「１」〜「６」、図２における丸付き数字「７」〜「１１」、及び図３における丸付き数字「１２」〜「１３」は、表１における菌番号１〜１３に、それぞれ対応する。例えば、図１における丸付き数字「１」で示すレーンは、表１における菌番号１の菌株、すなわち、ＩＦＯ  ６９１５株の結果を示す。また、図３における丸付き数字「１４」で示すレーンは、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の結果を示す。
図１〜図３における記号「ＲＡＰＤ１」〜「ＲＡＰＤ６」は、プライマーＲＡＰＤ１〜ＲＡＰＤ６を意味する。
図４における各レーン１〜６は、それぞれ、各プライマーＲＡＰＤ１〜ＲＡＰＤ６を用いた場合の本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の結果を示す。
また、図１〜図４における記号「Ｍ」は、ＤＮＡ分子量マーカーを意味する。前記の各電気泳動では、同じＤＮＡ分子量マーカー（１ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ，カタログ番号１５４１５−０１８，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，米国）を用いた。図４において、矢印Ａで示すバンドは４０７２ｂｐのＤＮＡ断片であり、矢印Ｂで示すバンドは３０５４ｂｐのＤＮＡ断片であり、矢印Ｃで示すバンドは２０３６ｂｐのＤＮＡ断片と１６３６ｂｐのＤＮＡ断片とが重なっているものであり、矢印Ｄで示すバンドは１０１８ｂｐのＤＮＡ断片であり、矢印Ｅで示すバンドは、５１７ｂｐ、５０６ｂｐ、３９６ｂｐ、３４４ｂｐ、及び２９８ｂｐの各ＤＮＡ断片が重なっているものである。
図１〜図４に示すように、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、表１に示す１３種類の比較用マツタケ株のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。
また、具体的なＤＮＡパターンは図示しないが、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、表１に示す１３種類の比較用マツタケ株以外の３１種類のマツタケ株、すなわち、ＭＡＦＦ  ４６００３１、ＭＡＦＦ  ４６００３３、ＭＡＦＦ  ４６００３４、ＭＡＦＦ  ４６００３５、ＭＡＦＦ  ４６００３６、ＭＡＦＦ  ４６００３７、ＭＡＦＦ  ４６００３８、ＭＡＦＦ  ４６００４０、ＭＡＦＦ  ４６００４１、ＭＡＦＦ  ４６００４２、ＭＡＦＦ  ４６００４６、ＭＡＦＦ  ４６００５０、及びＭＡＦＦ  ４６００９６（以上、農林水産省農業生物資源研究所）、ＣＭ  ６２７−３、ＣＭ  ６２７−５、ＣＭ  ６２７−６、及びＣＭ  ６２７−７［以上、呉羽化学工業（株）］、並びにＩＦＯ  ６９２９、ＩＦＯ  ６９３１、ＩＦＯ  ６９３２、ＩＦＯ  ６９３４、ＩＦＯ  ６９１６、ＩＦＯ  ６９１７、ＩＦＯ  ６９１８、ＩＦＯ  ６９１９、ＩＦＯ  ６９２１、ＩＦＯ  ６９２２、ＩＦＯ  ６９２３、ＩＦＯ  ６９２４、ＩＦＯ  ６９２６、及びＩＦＯ  ６９２８［以上、（財）発酵研究所］のＤＮＡパターンとも異なっていた。
分析例２：マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＧＣ含量
前記実施例１と同様にして得られたマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体（湿重量＝１．０ｇ）の入った５０ｍＬ容の三角フラスコに、１ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（メルク社，ドイツ）のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）溶液２０ｍＬを加え、ときどき振盪しながら、６５℃で２時間反応させた。１００℃で１０分間の熱処理により酵素を失活させた後、３７℃まで冷却し、ザイモリアーゼ（生化学工業）を適当量（約１ｍｇ）加え、更に、３７℃で４時間反応させた。次いで、Ｔｒｉｓ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）緩衝液４０ｍＬを加え、６０℃で溶菌処理してＤＮＡ抽出液を調製した。
前記抽出液に等量のフェノールを添加して撹拌した後、遠心分離してフェノール層を除去した。得られた上清から、エチルアルコール沈澱法により粗ＤＮＡを回収した後、７０〜９０％エチルアルコールで洗浄した。得られた沈澱をクエン酸緩衝液５ｍＬに再溶解し、ＲＮアーゼ処理を実施した。次に、ＲＮアーゼ処理溶液にフェノールを少量添加し、撹拌した後、遠心分離にてフェノール層を除去した。上清から再度、エチルアルコール沈澱法により粗ＤＮＡを回収し、７０〜９０％エチルアルコールで洗浄した後、２回目のＲＮアーゼ処理を実施した。ＲＮアーゼ処理後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有酢酸緩衝液０．５ｍＬを添加し、イソプロパノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心分離にて回収した。これを再度、７０〜９０％エチルアルコールで洗浄し、最終的にクエン酸緩衝液１ｍＬに溶解し、精製ＤＮＡ溶液とした。
得られた精製ＤＮＡ溶液１００μＬを１００℃で１０分間熱処理した後、氷冷し、ヌクレアーゼＰ１により５０℃で１時間処理し、ヌクレオチドに分解した。ＧＣ含量は、高速液体クロマトグラム（ＬＣ−６Ａ；島津製作所）により定量した。標準品として、ＧＣキット（ヤマサ醤油）を使用し、カラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＡＱ−３１２（直径＝６．０ｍｍ，長さ＝１５０ｍｍ）を使用し、移動相として、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸アンモニウム溶液（ｐＨ約４．５）を使用した。注入量は１０μＬとし、検出は、波長２７０ｎｍで実施し、ピーク同定は、絶対保持時間法により行なった。定量法としては、修正百分率法を使用した。
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のＧＣ含量は、４９．９％であった。
評価例１：ストレス負荷に対する回復促進活性の評価
（１）マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液及びアルカリ溶液抽出液の評価
本評価例では、前記実施例２でそれぞれ調製したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末とを３．２：５．１の比率で混合した混合物を評価用サンプルとし、この評価用サンプルをマウスに４週間経口投与した後、拘束ストレスを１８時間負荷し、ストレス解放後のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を測定することにより、前記サンプルの影響を検討した。
具体的には、日本ＳＬＣから購入した８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群＝５〜１０匹）に、評価用サンプルの水溶液（前記実施例２でそれぞれ調製したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末とを３．２：５．１の比率で混合した後、蒸留水に溶解した溶液）を４週間に亘って、通常の飼育用ケージ中で経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）した。続いて、マウスを前記飼育ケージから取り出し、空気抜けの穴を開けた５０ｍＬ容のキャップ付きポリプロピレン製遠心用チューブ（カタログ番号２３４１−０５０；テクノグラス社）にマウスを１匹ずつ閉じ込めた。このチューブ中に閉じ込められたマウスは、身動きができない状態となった。次に、それらのチューブを飼育用ケージに戻し、１８時間その状態で放置することにより、拘束ストレスを与えた。１８時間のストレス負荷の後、チューブからマウスを取り出し、飼育用ケージに戻し、普通の環境下で飼育した。
前記拘束ストレスを開放してから、所定日数［０日（解放直後）、１日、３日、５日、７日、及び１４日］経過後に、マウスを屠殺し、以下の手順に従って、試験管内でＮＫ感受性の腫瘍細胞株ＹＡＣ−１に対するリンパ節細胞の細胞傷害活性を測定することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を評価した。
すなわち、マウスから脾臓及び腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）、２０ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及び３０μｇ／ｍＬゲンタマイシンをそれぞれ添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整して得た細胞懸濁液をエフェクター細胞として用いた。
一方、標的細胞として用いたＹＡＣ−１細胞は、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で継代維持したものである。前記ＹＡＣ−１細胞に放射性クロム酸ナトリウム（アマーシャムジャパン）を加え、３７℃で２０分間反応させた。未結合の放射性クロム酸ナトリウムを、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄することにより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を５×１０４個／ｍＬに調整した。
先に調整した前記エフェクター細胞懸濁液又はその２倍希釈系列と、前記放射性クロム標識腫瘍細胞懸濁液とを、それぞれ０．１ｍＬずつ試験管に加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。なお、この際、後述する特異的傷害率を算出するために、放射性クロム標識腫瘍細胞と培地とを試験管に加えた懸濁液、そして、放射性クロム標識腫瘍細胞と界面活性剤（トリトン；最終濃度＝０．０５％）とを試験管に加えた懸濁液についても、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。反応終了後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地１．５ｍＬを試験管に更に加え、ミキサーで充分に混合した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，５分間，４℃）することにより、上清を得た。得られた上清の放射能活性をガンマカウンターを用いて測定した。
特異的傷害率（Ｓ．Ｌ．：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、式：
［Ｓ．Ｌ．］＝｛（Ｂ−Ｂｆ）／（Ｂｍａｘ−Ｂｆ）｝×１００
［式中、Ｓ．Ｌ．は、特異的傷害率（単位＝％）であり、Ｂは、実験群における上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｆは、自然遊離群（すなわち、放射性クロム標識腫瘍細胞単独培養群）における上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｍａｘは、最大遊離群（すなわち、トリトン処置した放射性クロム標識腫瘍細胞群）における上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
から算出し、エフェクター細胞１０７個当たり３０％の腫瘍細胞を傷害する細胞数、すなわち、「３０％傷害単位（Ｌｙｔｉｃ  Ｕｎｉｔｓ  ３０％；ＬＵ３０）」でＮＫ細胞活性を表示した。
結果を図５に示す。なお、対照（健常群）試験として、評価用サンプル水溶液の代わりに、蒸留水を４週間に亘って経口投与したこと、そして、１８時間の拘束ストレスを与えなかったこと以外は、前記操作をそのまま繰り返した。また、比較試験として、評価用サンプル水溶液の代わりに、蒸留水を４週間に亘って経口投与したこと以外は、前記操作をそのまま繰り返した。
図５において、折れ線ａ（白四角）は、対象（健常群）試験（非ストレス）の結果を示し、折れ線ｂ（黒丸）は、本発明による評価用サンプル（マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との３．２：５．１の比率の混合物）水溶液を投与した場合の結果を示し、折れ線ｃ（黒三角）は、比較試験（蒸留水投与及びストレス負荷）の結果を示す。また、図５において、折れ線ｂにおける前記黒丸の肩に示す記号「＋」は、ｐ＜０．０１（折れ線ｃにおける黒三角で示される結果に対して）であることを示し、折れ線ｃにおける前記黒三角の肩に示す記号「＊」は、ｐ＜０．０１（折れ線ａにおける白四角で示される結果に対して）であることを示す。
図５の折れ線ｂ，ｃに示すように、拘束ストレスを負荷すると、ＮＫ細胞活性は顕著に低下する。折れ線ｃに示すように、拘束ストレス解放後、そのまま放置してもＮＫ細胞活性は緩やかに回復するが、折れ線ｂに示すように、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との３．２：５．１の比率の混合物を添加しておくことにより、ＮＫ細胞活性の回復が有意に早まった。
（２）マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の乾燥物粉末、岩手県産マツタケ子実体の乾燥物粉末、及び岩手県産マツタケ子実体の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との混合物の評価
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との３．２：５．１の比率の混合物の代わりに、前記実施例１で調製したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の乾燥物粉末（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、実施例３で調製した市販の岩手県産マツタケ子実体の乾燥物粉末（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、及び前記実施例４で調製した市販の岩手県産マツタケ子実体の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との１．０：５．１の比率の混合物（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を使用したこと以外は、前記評価例１（１）の手順を繰り返した。
結果を表３に示す。表３において、記号「＊」は、ｐ＜０．０１（蒸留水投与に対して）であることを示す。
0004336104.tif 000004
（３）各種マツタケ株の乾燥物粉末の評価
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との３．２：５．１の比率の混合物の代わりに、前記実施例１で調製したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の乾燥物粉末（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）と、前記分析例１で使用した表１に示す１３種類のマツタケ株の乾燥物粉末（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）とを使用したこと以外は、前記評価例１（１）の手順を繰り返した。
結果を表４及び図６〜図９に示す。
表４において、記号「＊」は、ｐ＜０．０１（蒸留水投与に対して）であることを示す。
図６〜図９において、折れ線ａ（黒四角）は、対照試験（ストレス負荷なし）の結果を示し、折れ線ｂ（白四角）は、比較試験（蒸留水投与及びストレス負荷）の結果を示す。
図６において、折れ線ｃ（黒三角）は、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の結果を示し、折れ線ｄ（黒菱形）は、マツタケ株ＩＦＯ  ６９１５の結果を示し、折れ線ｅ（黒丸）は、マツタケ株ＩＦＯ  ６９２５の結果を示す。
図７において、折れ線ｆ（黒三角）は、マツタケ株ＩＦＯ  ６９３０の結果を示し、折れ線ｇ（黒菱形）は、マツタケ株ＩＦＯ  ６９３５の結果を示し、折れ線ｈ（黒丸）は、マツタケ株ＣＭ  ６２７−２の結果を示し、折れ線ｉ（白丸）は、マツタケ株ＣＭ  ６２７−４の結果を示す。
図８において、折れ線ｊ（黒三角）は、マツタケ株ＩＦＯ  ３０６０４の結果を示し、折れ線ｋ（黒菱形）は、マツタケ株ＩＦＯ  ３０６０５の結果を示し、折れ線ｌ（黒丸）は、マツタケ株ＩＦＯ  ３０６０６の結果を示し、折れ線ｍ（白丸）は、マツタケ株ＭＡＦＦ  ４６００３９の結果を示す。
図９において、折れ線ｎ（黒三角）は、マツタケ株ＫＴ  ００１の結果を示し、折れ線ｐ（黒菱形）は、マツタケ株ＩＦＯ  ６９２０の結果を示し、折れ線ｑ（黒丸）は、マツタケ株ＩＦＯ  ６９３３の結果を示す。
0004336104.tif 000005
表４に示すように、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の乾燥物粉末、及び表１に示す１３種類のマツタケ株の乾燥物粉末のいずれも、ＮＫ細胞活性の回復を促進したが、中でも、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の乾燥物粉末が、最も優れた回復促進活性を示した。
また、表１に示す１３種類のマツタケ株以外の３１種類のマツタケ株、すなわち、ＭＡＦＦ  ４６００３１、ＭＡＦＦ  ４６００３３、ＭＡＦＦ  ４６００３４、ＭＡＦＦ  ４６００３５、ＭＡＦＦ  ４６００３６、ＭＡＦＦ  ４６００３７、ＭＡＦＦ  ４６００３８、ＭＡＦＦ  ４６００４０、ＭＡＦＦ  ４６００４１、ＭＡＦＦ  ４６００４２、ＭＡＦＦ  ４６００４６、ＭＡＦＦ  ４６００５０、及びＭＡＦＦ  ４６００９６（以上、農林水産省農業生物資源研究所）、ＣＭ  ６２７−３、ＣＭ  ６２７−５、ＣＭ  ６２７−６、及びＣＭ  ６２７−７［以上、呉羽化学工業（株）］、並びにＩＦＯ  ６９２９、ＩＦＯ  ６９３１、ＩＦＯ  ６９３２、ＩＦＯ  ６９３４、ＩＦＯ  ６９１６、ＩＦＯ  ６９１７、ＩＦＯ  ６９１８、ＩＦＯ  ６９１９、ＩＦＯ  ６９２１、ＩＦＯ  ６９２２、ＩＦＯ  ６９２３、ＩＦＯ  ６９２４、ＩＦＯ  ６９２６、及びＩＦＯ  ６９２８［以上、（財）発酵研究所］の乾燥物粉末（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を使用したこと以外は、前記評価例１（１）の手順を繰り返したところ、これらのマツタケ株においても、ＮＫ細胞活性の回復が確認されたが、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の回復促進活性を越えるものはなかった。
（４）長野県産マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末、及び各種キノコの熱水抽出液乾燥物粉末の評価
前記実施例５で調製した長野県産マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末、あるいは、前記比較例１〜３でそれぞれ調製したアガリクス・ブラゼイ子実体、霊芝子実体、又はシイタケ子実体の各熱水抽出液乾燥物を評価用サンプルとしたこと以外は、前記評価例１（１）の操作をそのまま繰り返した。なお、投与量は、いずれも、２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであった。
結果を表５に示す。表５において、記号「＊」は、ｐ＜０．０１（蒸留水投与に対して）であることを示す。
0004336104.tif 000006
産業上の利用可能性
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物によれば、ストレス負荷に対する回復を促進することができる。
配列表フリーテキスト
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１〜配列番号６の配列で表される塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、プライマーＲＡＰＤ１〜プライマーＲＡＰＤ６である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
0004336104.tif 000007
0004336104.tif 000008
【図面の簡単な説明】
図１は、表１に記載の菌番号１〜６で表される公知のマツタケ株に関して、ＲＡＰＤ法により得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図２は、表１に記載の菌番号７〜１１で表される公知のマツタケ株に関して、ＲＡＰＤ法により得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図３は、表１に記載の菌番号１２〜１３で表される公知のマツタケ株及び本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株に関して、ＲＡＰＤ法により得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図４は、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株に関して、ＲＡＰＤ法により得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図５は、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との３．２：５．１の比率の混合物におけるストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
図６は、本発明のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株及び各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
図７は、別の各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
図８は、更に別の各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
図９は、更に別の各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
【図１】
0004336104.tif 000009
【図２】
0004336104.tif 000010
【図３】
0004336104.tif 000011
【図４】
0004336104.tif 000012
【図５】
0004336104.tif 000013
【図６】
0004336104.tif 000014
【図７】
0004336104.tif 000015
【図８】
0004336104.tif 000016
【図９】
0004336104.tif 000017