(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され精製されたＴＮＦ−a転換酵素（ＴＡＣＥ）ポリペプチドであって、以下の（ａ）−（ｅ）：
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号４；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２１５からアミノ酸４７７までのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１８からアミノ酸６７１までのアミノ酸配列；及び
（ｅ）前記（ａ）−（ｄ）のいずれかと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列であって、当該アミノ酸配列からなるポリペプチドはＴＮＦ−αを２６ｋＤ型から１７ｋＤ型へ転換することが可能である、前記アミノ酸配列
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸２１５ないし４７７のアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸１８ないし４７７のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸１８−Ｘａａを含む、ここにおいて、Ｘａａはアミノ酸６７１ないし８２４からなるグループから選択されるアミノ酸である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項６】
ＴＮＦ−αを２６ｋＤ型から１７ｋＤ型へ転換することが可能である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項７】
約８０ｋＤの分子量を有する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項８】
非グリコシル型である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項９】
組換え型である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含むＴＡＣＥポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１１】
以下の（ａ）−（ｃ）：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５２−２４７２を含む核酸；
（ｂ）前記（ａ）の核酸と少なくとも８０％同一であり、そして、ＴＮＦ−αを２６ｋＤ型から１７ｋＤ型へ転換することが可能であるポリペプチドをコードする核酸；及び
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）で定義された核酸に、遺伝子コードの結果縮重し、そして、生物学的に活性なＴＡＣＥをコードする核酸
からなるグループから選択される、単離された核酸。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の少なくとも１つの核酸の発現を指示する発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０ないし１１のいずれか１項に記載の核酸を含む、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ＴＡＣＥポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞を当該ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法によって産生された、単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項１６】
治療に使用するための、請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチド。
【請求項１７】
分子のＴＡＣＥ阻害活性を検出するための方法であって、
前記分子を基質並びに請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドと混合し、そして、基質切断の量を測定する、
ここにおいて、基質はアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号５）を含む、
ことを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＴＮＦ−α切断を阻害する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、試験化合物並びに当該ポリペプチドによって切断される基質と混合し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドによる前記基質の切断を試験化合物が阻害するか否かを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のポリペプチドのＴＮＦ−α切断活性を検出するための方法であって、当該ポリペプチドを基質とインキュベートし、そして基質切断の量を測定する、ことを含む、前記方法。
【請求項２０】
ＴＡＣＥポリペプチドが、当該ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸の発現を指示する少なくとも１つの発現ベクターを含む組換え細胞によって提供される、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
基質がＴＮＦ−αである、請求項１７ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
基質が膜結合性ＴＮＦ−αである、請求項１７ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドの、腫瘍、炎症又は受精疾患を治療するための医薬の製造における使用。
【請求項２４】
ＴＡＣＥポリペプチドが、腫瘍細胞増殖、炎症又は受精に関与する細胞表面サイトカイン、サイトカインレセプターおよび付着性タンパク質を修飾、または除去する、請求項２３に記載のＴＡＣＥポリペプチドの使用。
【請求項２５】
請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドのＴＮＦ−αタンパク質分解活性を阻害する化合物の、血清又は組織中のＴＮＦ−αの増加したレベルによって特徴付けられる疾患を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項２６】
請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドのＴＮＦ−αタンパク質分解活性を阻害する化合物の、全身性炎症応答症、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ神経疾患、再灌流傷、感染性疾患、自己免疫、アレルギー、アトピー性疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患又は悪液質を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項２７】
請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドのＴＮＦ−αタンパク質分解活性を阻害する化合物の、全身性炎症応答症、再灌流傷、心血管疾患、ＨＩＶ感染およびＨＩＶ神経疾患等の感染性疾患、産科若しくは婦人科の障害、炎症性疾患、自己免疫、アレルギー、アトピー性疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患、悪液質、先天性疾患、皮膚学の疾患、神経学の疾患、腎性の疾患、毒性、あるいは代謝性疾患、ここにおいて治療される疾患は、血清又は組織中のＴＮＦ−αの増加したレベルによって特徴付けられる、を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項２８】
請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドに結合する、単離され精製された抗体。
【請求項２９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の単離され精製された抗体。
【請求項３０】
請求項１−９及び１５のいずれか１項に記載のＴＡＣＥポリペプチドの活性を阻害する、単離され精製された抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、精製され単離されたＴＮＦ−α転換酵素（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）、当該酵素をコードする核酸、組換えＴＮＦ−α転換酵素（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）の製造方法、当該酵素を含む薬剤組成物、並びに当該組成物の種々の分析および治療における使用に関する。
背景技術
腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）−α（ＴＮＦ−α、又はカケクチンとしても知られている）は、多様な細胞型に種々の効果を誘導することのできる哺乳類のタンパク質である。ＴＮＦ−αは、当初腫瘍細胞の溶解を引き起こす能力によって同定され、単核食細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞およびＮＫ細胞等の活性化細胞によって産生される。ＴＮＦ−αには２種類の型、即ち、相対質量２６，０００（２６ｋＤ）のＩＩ型細胞膜タンパク質、およびタンパク質分解によって細胞結合タンパク質から生成された可溶性１７ｋＤ型とがある。ＴＮＦ−αは、グラム陰性細菌に対する宿主応答の主要な仲介因子である。グラム陰性細菌の細胞壁に由来するリポ多糖（ＬＰＳ、エンドトキシンとも言う）は、ＴＮＦ−α合成の潜在的な刺激因子である。ＴＮＦ−αの過剰生産または非制御生産の結果生じうる有害な影響は、非常に深刻であるため、ＴＮＦ−αの血清レベルをコントロールまたは制御するために相当の努力が払われてきた。血清ＴＮＦ−αレベルを効果的にコントロールするための努力の重要な部分は、ＴＮＦ−α生合成機構の理解である。
ＴＮＦ−αが分泌される機構は、以前は解明されていなかった。Ｋｒｉｅｇｌｅｒら（Ｃｅｌｌ，５３：４５（１９８８））は、ＴＮＦ−α”分泌”は２６ｋＤ膜結合分子の未知のタンパク質分解酵素またはプロテアーゼによる転換に起因すると推量した。Ｓｃｕｄｅｒｉら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４３：１６８（１９８９））は、ヒト白血球細胞からのＴＮＦ−αの遊離は、１種またはそれ以上のセリンプロテアーゼ、例えば、白血球エラスターゼまたはトリプシンに依存すると提唱した。セリンプロテアーゼ抑制因子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ｐ−トルエンスルフォニル−Ｌ−アルギニンメチルエステルは、濃度依存的にヒト白血球ＴＮＦ−αの遊離を抑制することが見いだされた。Ｓｃｕｄｅｒｉらは、アルギニンメチルエステルは酵素の活性中心のアルギニン結合部位を競合し、それにより加水分解を阻害すると提唱した。抑制因子のリジンまたはフェニルアラニン類似体は、アルギニンメチルエステルを模倣できなかった。しかしながら、この化合物が２６ｋＤ  ＴＮＦを切断するプロテアーゼを抑制することによって機能するということは、全く示されていない。より最近では、メタロプロテアーゼ抑制因子がＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦの遊離を阻止することが報告されている。Ｍｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：２１８（１９９４）；Ｇｅａｒｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：５５５（１９９４）；およびＭｃＧｅｅｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：５６８（１９９４）参照。
大部分の（全てではないが）プロテアーゼが特定のアミノ酸配列を認識する。いくつかのプロテアーゼは、切断された結合のＮ末端に位置する残基を主に認識し、いくつかのプロテアーゼは、切断された結合のＣ末端に位置する残基を認識し、そしていくつかのプロテアーゼは、切断された結合の両側の残基を認識する。メタロプロテアーゼ酵素は、結合金属イオン、一般にはＺｎ2+を用いてペプチド結合の加水分解を触媒する。メタロプロテナーゼは、結合部破壊（マトリックスメタロプロテナーゼ）、血圧制御（アンギオテンシン転換酵素）およびペプチド−ホルモンレベルの制御（中性エンドペプチダーゼ−２４．１１）に関与している。
発明の概要
本発明は、単離され精製されたポリペプチドとしての生物学的に活性なＴＮＦ−α転換酵素（”ＴＡＣＥ”）に関する。さらに、本発明は、ＴＡＣＥをコードする単離された核酸、およびＴＡＣＥをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターに関する。ＴＡＣＥをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターによって感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）された、または形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）された宿主細胞、並びに当該宿主細胞をＴＡＣＥの発現を促す条件下で培養することによってＴＡＣＥを産生するための方法も、本発明の範囲に含まれる。ＴＡＣＥの精製によって、ＴＡＣＥに対する抗体、特にモノクロナール抗体も本発明の側面の一つである。さらに、ＴＡＣＥを用いたそれに対する潜在的な抑制因子をスクリーニングするためのアッセイ方法、並びに細胞結合型ＴＮＦ−αまたは他の分子によって仲介される疾患の治療のための治療用薬剤にＴＡＣＥを用いる方法も、本発明に含まれる。また、ＴＡＣＥをそれに対する抑制因子の設計に用いる方法も本発明の側面である。
本発明の、単離され精製されたメタロプロテナーゼは、ＴＮＦ−αを２６ｋＤ細胞結合型から１７ｋＤ型に転換することができ、約６６ｋＤから約９７ｋＤの間の分子量を有する。ＴＡＣＥのｃＤＮＡ配列は配列番号１に示してある。単離され精製されたＴＮＦ−α転換酵素（”ＴＡＣＥ”）は、配列番号２のアミノ酸残基１８−８２４を含む。
ＴＡＣＥの抑制は、ＴＮＦ−αの血清および他の細胞外空間への遊離を抑制する。従って、ＴＡＣＥ抑制因子は、ＴＮＦ−αの過剰生産または非制御生産によって特徴付けられる状態を治療するのに臨床的有用性を有する。ある病的症状に特に有用なＴＡＣＥ抑制因子は、ＴＮＦ−β（リンホトキシンとしても知られている）血清レベルに影響を与えずに、ＴＡＣＥを選択的に抑制するであろう。ＴＮＦ−αの過剰生産または非制御生産は、例えば以下のようなある種の症状及び疾患と関連してきた：例えば、全身性炎症応答症、再灌流傷、心血管疾患、ＨＩＶ感染およびＨＩＶ神経疾患等の感染性疾患、産科若しくは婦人科の障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、炎症性疾患／自己免疫、アレルギー性／アトピー性疾患、悪性、器官移植拒絶もしくは移植片対宿主疾患を含む移植、悪液質、先天性の、皮膚学の、神経学の、腎性の毒性、並びに代謝性／特発性疾患等である。
ＴＡＣＥの抑制因子は、膜結合性ＴＮＦ−αの切断を阻害し、そして血清および組織中のＴＮＦ−αレベルを減少させるであろう。本発明はそのような態様まで含み、哺乳類中の細胞膜からのＴＮＦ−αの切断を抑制する方法を含む。当該方法は、配列番号２の１８から６７１ないし８２４までのアミノ酸配列を有する酵素のＴＮＦ−αタンパク質分解を抑制する化合物の有効量を、当該動物に投与することを含む。さらに、本発明は、ＴＮＦ−αの過剰生産または非制御生産によって特徴付けられる疾患を有する哺乳類を治療するための方法であって、配列番号２の１８から８２４までのアミノ酸配列を有する酵素のＴＮＦ−αタンパク質分解を抑制する化合物の有効量を含む組成物を、当該哺乳動物に投与することを含む方法を含む。そのような抑制因子は、重要な臨床上の有用性を有し、上記列挙したＴＮＦ−α関連疾患を治療するための潜在的な（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）治療学となりうるであろう。ＴＡＣＥの単離および精製は、当該酵素の抑制因子およびＴＮＦ−関連疾患の治療の開発への試みにおいて、重要な進歩を提供するであろうし、そして実際、ある種の病理障害のための治療剤としてＴＡＣＥ自体の使用を導くことができるであろう。例えば、ＴＮＦ−αに加えて、他のサイトカイン、並びにサイトカイン受容体および数種の付着性タンパク質も、ＴＡＣＥまたは関連プロテアーゼによって細胞表面から遊離され得る。腫瘍細胞増殖、炎症または受精に関与する、細胞表面のサイトカイン、サイトカイン受容体および付着性タンパク質を修飾または除去するために、ＴＡＣＥを投与してもよい。
発明の詳細な説明
ヒトＴＮＦ−α転換酵素（”ＴＡＣＥ”）をコードするｃＤＮＡが単離され、配列番号１に開示されている。このヒトＴＡＣＥをコードするｃＤＮＡの発見により、ＴＡＣＥをコードする核酸配列を含む発現ベクター；発現ベクターによって感染または形質転換された宿主細胞；単離され精製されたタンパク質としての生物学的に活性なヒトＴＡＣＥ；並びにＴＡＣＥと免疫反応性の抗体、の構築が可能となる。
本発明の単離され精製されたＴＡＣＥポリペプチドは、ある分子のＴＡＣＥ抑制活性を検出するのに有用である。日常的な慣用された技術を用いるそのような方法において、ＴＡＣＥ抑制活性が未知の分子を基質と混合し、ＴＡＣＥポリペプチドと共にインキュベートする。そして、基質切断の量をクロマトグラフィーによって決定することができる。
さらに、本発明のＴＡＣＥポリペプチドは、ＴＡＣＥ抑制因子の構造に基づく設計に有用である。このような設計は、当該ＴＡＣＥポリペプチドの三次元構造を決定し、基質の可能性のある結合部位についての三次元構造を分析し、予測される反応部位を取り込んだ分子を合成し、そして分子のＴＡＣＥ抑制活性を決定するという工程を含むであろう。
ＴＡＣＥと免疫反応性の抗体、そして特にＴＡＣＥに対するモノクローナル抗体が、本発明によって今や利用可能となった。そのような抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＡＣＥ活性を抑制するのに、そして試料中のＴＡＣＥの存在を検出するのに有用であろう。
本明細書中において、”ＴＡＣＥ”はＴＮＦ−αの２６ｋＤ細胞膜結合型（細胞内領域、膜領域および細胞外領域を含む）をＴＮＦ−αタンパク質のＣ末端１５６残基を含む可溶性１７ｋＤ型に転換することのできる一群のポリペプチドを意味する。ＴＡＣＥは、配列番号２の１８ないし８２４のアミノ酸配列を有するタンパク質、並びに配列番号２の１８ないし８２４のアミノ酸配列と高い類似性を有し（少なくとも８０％、より好ましくは９０％の相同性）、かつ生物学的に活性なタンパク質も含む。さらに、ＴＡＣＥは、配列番号１のヌクレオチド５２−２４７２の生物学的に活性な遺伝子産物を意味する。さらに、用語”ＴＡＣＥ”に含まれるものとしては、膜結合タンパク質（細胞内領域、膜領域および細胞外領域を含む）、並びに主にタンパク質の細胞外部分を含み、生物学的活性を維持し、そして分泌されうる可溶性若しくは短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質もある。そのような可溶性タンパク質の具体的な例は、配列番号２のアミノ酸１８−６７１の配列を含むものがある。短縮版は、タンパク質の細胞外部分より短いものであって、例えば、配列番号２のアミノ酸１８−４７７を含むか、または、触媒領域の実質的に全て、即ち、配列番号２のアミノ酸２１５−４７７を含むものである。
本発明の単離され精製されたＴＡＣＥは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定されたように、約６６ｋＤと約９７ｋＤの間の分子量を有する。より具体的には、ＴＡＣＥはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されたように約８０ｋＤの分子量を有することが見いだされた。
本明細書で用いられる用語”単離され精製された”は、例えば、組換え宿主細胞培養物の精製産物として、または非組換え源由来の精製産物として、ＴＡＣＥが他のタンパク質またはポリペプチドとの本質的に会合していないことを意味する。本明細書で用いられる用語”実質的に精製された”は、ＴＡＣＥを含む混合物であって、他のタンパク質またはポリペプチドと本質的に会合していないが、特異的な抗体を用いて除去することが可能な既知のタンパク質が存在し、そして実質的に精製されたＴＡＣＥは生物学的活性を維持しているものを意味する。用語”精製ＴＡＣＥ”は、ともに本明細書中に記載されているように、ＴＡＣＥの”単離され精製された”型、またはＴＡＣＥの”実質的に精製された”型のいずれかを意味する。
用語”生物学的に活性な”は、ＴＡＣＥに関する場合、ＴＡＣＥがＴＮＦ−αの２６ｋＤ細胞型を１７ｋＤ型に転換できることを意味する。
”ヌクレオチド配列”は、個別の断片の形態をとるか、あるいは、より大きい核酸構築物の構成成分としてのポリヌクレオチド分子を意味し、このポリヌクレオチド分子は少なくとも一旦実質的に純粋な形態をとり（すなわち、混入している内因性物質を含まない）かつ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概要が記載されている方法）による同定、操作および回収を可能とさせる量もしくは濃度で、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡから取得されている。このような配列は、真核生物遺伝子内に典型的に存在する内部非翻訳配列もしくはイントロンにより遮断されていない読みとり枠の形態で提供されることが好ましい。非翻訳化ＤＮＡの配列は、読みとり枠から５’側または３’側のいずれに存在してもよく、この場合、同配列はコーディング領域の操作もしくは発現を妨害しない。
本明細書中の”ＴＡＣＥ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）”は、天然のＴＡＣＥと実質的に相同であるが、一つまたはそれ以上の欠失、挿入もしくは置換により、天然のＴＡＣＥ（ヒト、ネズミ、または他の種の哺乳動物）とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異型アミノ酸配列は、好ましくは天然ＴＡＣＥアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは、少なくとも９０％同一である。この同一性のパーセンテージは、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）により記載されＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュタープログラム、第６．０版を用いて配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）により改訂されたＮｅｅｄｌｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアラインメント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８４４３，１９７０）を利用するものである。ＧＡＰプログラムにとって好ましい欠如（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメーターには以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドについて一成分から成る比較マトリックス（同一については１の値を含み、非同一については０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．３５３−３５８，１９７９に記載されたＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー及び各ギャップおける各記号について０．１０のペナルティー；及び（３）末端ギャップについてはペナルティー無し。
変異体は保存的に置換された配列を含んでもよく、これは所与のアミノ酸残基が類似の物理化学的特徴を有する残基によって置き換えられてもよいことを意味している。保存的置換は当該技術分野においてよく知られており、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換の如き一つの脂肪族残基の他の残基との置換、又はＬｙｓとＡｒｇ間；ＧｌｕとＡｓｐ間；又はＧｌｎとＡｓｎ間の如き一つの極性残基との置換が含まれる。そのような変異体を作成し、使用するために、慣用された手法および方法を用いることができる。他のかかる保存的置換、例えば類似の疎水的性質を有する全縁領域の置換が周知であり、日常的に行われる。天然に生じるＴＡＣＥ変異体も本発明に含まれる。そのような変異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはＴＡＣＥタンパク質のタンパク質分解の結果得られ、ＴＡＣＥのタンパク質分解機能は維持されているようなタンパク質である。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、配列番号４に示された天然に得られるタンパク質の可溶型のような、短縮されてはいるが（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）生物学的に活性なＴＡＣＥタンパク質を生じることができる。タンパク質分解に起因する変異体は、例えば、ＴＡＣＥタンパク質からの１つまたはそれ以上の末端アミノ酸（一般には、１−５の末端アミノ酸）のタンパク質分解除去による、種々の型の宿主細胞における発現におけるＮ−またはＣ−末端での相違を含む。
上述したように、本発明は、組換えおよび非組換え双方の、単離され精製された、または均質なＴＡＣＥポリペプチドを提供する。所望の生物学的活性を保持した、天然のＴＡＣＥタンパク質の変異体および誘導体は、天然ＴＡＣＥポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異によって得ることができる。天然のアミノ酸配列の変換は、多数の慣用されている技術のいずれを用いて行ってもよい。変異配列、および天然配列の断片への結合を可能にする近接した制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の位置に突然変異を導入することができる。結合の後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸配列挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
また、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法を用いて、置換、欠失または挿入によって予め定められたコドンを変異させることができ、変異遺伝子を提供することができる。上記変異をもたらす好例となる方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７，１９８７）により；及び米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されている。なお、これらは参考文献として援用される。
グリコシル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、脂質基、リン酸基、アセチル基等の他の化学的部分と共有結合性又は凝集性複合体を形成することによってＴＡＣＥを修飾してＴＡＣＥ誘導体を作ることもできる。ＴＡＣＥの共有結合誘導体は、ＴＡＣＥアミノ酸側鎖上の又はＴＡＣＥポリペプチド若しくはその細胞外ドメインのＮ末端もしくはＣ末端における官能基に当該化学的部分を連結することによって調製することができる。本発明の範囲内に入るＴＡＣＥの誘導体には、Ｎ末端若しくはＣ末端融合等の組換え培養での合成による如き、ＴＡＣＥまたはその断片と他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合性又は凝集性複合体が含まれる。例えば、この複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）はＴＡＣＥポリペプチドのＮ末端においてシグナル又はリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセス属のα因子リーダー）を含んでもよい。このシグナル又はリーダーペプチドは、翻訳時又は翻訳後に、この複合体をその合成部位から細胞膜又は細胞壁の内側もしくは外側の部位に移動させる。
ＴＡＣＥポリペプチド誘導体は、ＴＡＣＥの精製及び同定をしやすくするために付加されたペプチドを含んでもよい。かかるペプチドは、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号及びＨｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８に記載されたポリＨｉｓ又は抗原性同定ペプチドが含まれる。
本発明はさらに、天然パターンのグリコシル化を有するか又は有さないＴＡＣＥポリペプチドを包含する。酵母又は哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−７細胞）内で発現されるＴＡＣＥは、発現系の選択に依存して、分子量およびグリコシル化パターンにおいて天然ＴＡＣＥポリペプチドに類似していても有意に相違していてもよい。大腸菌等の細菌発現系内でのＴＡＣＥポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を与える。グリコシル基は、慣用された方法、特にグリコペプチダーゼを用いた方法によって除去することもできる。一般に、グリコシル化されたＴＡＣＥは、モル過剰量のグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ともにインキュベートしてもよい。
アミノ酸残基若しくは配列の種々の付加又は置換、又は生物活性に必要ではない、末端残基若しくは内部残基の欠失をコードする同等なＤＮＡ構築物も本発明に含まれる。例えば、ＴＡＣＥ細胞外領域内のＮ−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を排除し、哺乳動物及び酵母発現系内でより炭水化物が少ない類縁体を発現させることができる。真核性ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒである）によって特徴付けられる。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列への適切な置換、付加又は欠失は、Ａｓｎ側鎖における炭化水素残基の結合を妨げるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって置き換えられるように選んで１個のヌクレオチドを変化させれば、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化させるのに十分である。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を不活性化する既知の方法には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ２７６，８４６に記載された操作が含まれる。なお、これらは参照として本明細書中に援用される。
別の例では、生物活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を変化させてＣｙｓ残基を欠失させるか又は他のアミノ酸と置き換わらせて、復元に際して誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を阻止することができる。他の同等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性の存在する酵母系内での発現を増進するために、近接する二塩基性アミノ酸残基の修飾によって調製される。ＥＰ２１２，９１４は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活性化するために、部位特異的突然変異誘発法を用いることを開示している。残基を欠失、付加又は置換してＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ及びＬｙｓ−Ａｒｇペアを変化させることによってこれら隣接する塩基性残基の存在を排除し、ＫＥＸ２プロテアーセプロセッシング部位を不活性化する。Ｌｙｓ−Ｌｙｓペアリングは、ＫＥＸ２開裂をかなり受けにくいので、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの転化は、ＫＥＸ２部位の不活性化への保存的で好ましいアプローチに相当する。
本発明の範囲内に入る核酸配列には、温和な又は厳格なストリンジェンシー条件下で本明細書中に開示した天然ＴＡＣＥヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ生物学的に活性なＴＡＣＥをコードする単離されたＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。温和なストリンジェンシー条件は当該技術分野において通常の知識を有するものに周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．  Ｖｏｌ．１，ｐｐ１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）に定義されているように、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のプレ洗浄溶液と、約５０℃−６０℃、５ＸＳＳＣ，一晩、好ましくは５５℃のハイブリダイゼーション条件の使用が含まれる。厳格なストリンジェンシー条件には、より高温のハイブリダイゼーションと洗浄が含まれる。当業者は、プローブの長さ等の因子に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を、必要なように調節できることを認識するであろう。
１以上のコドンが同じアミノ酸をコードできる遺伝子コードの既知の縮重により、ＤＮＡ配列が配列番号１に示した配列とは異なるものであっても、なお配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＡＣＥタンパク質をコードすることができる。かかる変異体ＤＮＡ配列は、沈黙突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅の間に生じるもの）の結果生じるものも、また天然配列の故意の突然変異誘発の産物であることもある。
本発明は、よって、生物学的に活性なＴＡＣＥをコードする、以下のものから選択された同等な単離されたＤＮＡ配列を提供する：（ａ）天然の哺乳動物ＴＡＣＥ遺伝子のコード領域；（ｂ）配列番号１に示されたヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｃ）温和なストリンジェンシー条件下で（ａ）のＤＮＡにハイブリダイゼションでき、かつ生物学的に活性なＴＡＣＥをコードするＤＮＡ；並びに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義したＤＮＡに対して遺伝子コードの結果縮重しており、かつ生物学的に活性なＴＡＣＥをコードするＤＮＡ。本発明は、かかるＤＮＡ配列によりコードされるＴＡＣＥタンパク質も包含する。
配列番号１のＤＮＡ配列と同等なＤＮＡは、配列番号２の１８−Ｘａａ（Ｘａａは、６７１−８２４のいずれかのアミノ酸である）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする二本鎖の天然ＤＮＡ配列に、温和な条件下又は厳格な条件下でハイブリダイズするであろう。そのようなＤＮＡによってコードされるＴＡＣＥタンパク質の例は、制限されるわけではないが、ＴＡＣＥ断片（可溶性または膜結合性）、並びに不活性化Ｎ−グリコシル化部位、不活性化ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位、又は保存的アミノ酸置換を含む上述したようなＴＡＣＥタンパク質を含む。他の哺乳動物種に由来するＤＮＡであって、配列番号１のｃＤＮＡの相補体に温和な若しくは厳格な条件下でハイブリダイズするであろうＤＮＡによってコードされるＴＡＣＥタンパク質も包含される。
あるいは、ＴＡＣＥ結合性タンパク質、例えば本発明の抗ＴＡＣＥ抗体等を、カラムクロマトグラフィーマトリックス等の固相、またはＴＡＣＥをその表面に発現する細胞を同定し、分離し、または精製するのに適当な同様の基質に結合させることができる。ＴＡＣＥ結合性タンパク質の固相接触表面への接着は、任意の方法によって行うことができる。例えば、磁性ミクロスフェアをＴＡＣＥ結合性タンパク質でコーティングして、磁界中のインキュベーション用容器中に保持する。細胞混合物の懸濁液を表面にＴＡＣＥ結合性タンパク質を有する固相と接触させる。表面にＴＡＣＥを有する細胞が固定されたＴＡＣＥ結合性タンパク質に結合し、そして非結合細胞は洗浄除去される。このようなＴＡＣＥ発現細胞を溶液から、精製し、スクリーニングし、または分離するのに、このアフィニティー結合法が有用である。陽性として選択された細胞を固相から遊離する方法は当該技術分野において知られており、例えば酵素の使用を含む。このような酵素は、好ましくは細胞に非毒性および無害であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するものである。
あるいは、ＴＡＣＥ発現細胞を含む可能性のある細胞の混合物を、初めにビオチニル化ＴＡＣＥ結合性タンパク質とインキュベートすることができる。インキュベーション時間は、ＴＡＣＥへの十分な結合を確保するために、典型的には少なくとも継続して１時間である。そして、得られた混合物をアビジンコートしたビーズを充填したカラムに通し、ビオチンのアビジンへの高い親和性によりＴＡＣＥ結合細胞がビーズへ結合する。アビジンコートしたビーズの使用は当該技術分野において知られている。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９（１９８６）参照。慣用された方法を用いて、非結合物質の洗浄および結合細胞の遊離を行う。
上述した方法において、適当なＴＡＣＥ結合性タンパク質は、抗−ＴＡＣＥ抗体、並びにＴＡＣＥに高い親和性結合可能な他のタンパク質である。好ましいＴＡＣＥ結合性タンパク質は、例えば実施例４に記載されているように得られた抗−ＴＡＣＥモノクローナル抗体である。
ＴＡＣＥポリペプチドは、共有結合性もしくは非共有結合性ダイマーもしくはトリマー等のオリゴマーとして存在してもよい。オリゴマーは異なるＴＡＣＥポリペプチド上のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合によって連結される。本発明の一つの態様においては、ＴＡＣＥを抗体（例えば、ＩｇＧ１）のＦｃ領域に、ＴＡＣＥの生物学的活性を妨害しない形式で融合させることによって、ＴＡＣＥダイマーが生成できる。このＦｃポリペプチドを好ましくは（細胞外領域のみを含む）可溶性ＴＡＣＥのＣ末端に結合させる。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃ領域を含む）に融合した異種起源のポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的な調製は、例えばＡｓｈｋｅｎｅｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，１９９１）及びＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，１９９０）により記載されており、これらは参考文献として援用される。ＴＡＣＥ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入する。ＴＡＣＥ：Ｆｃ融合タンパク質は抗体分子とほぼ同様に会合することができ、鎖間ジスルフィド結合をＦｃポリペプチド間で形成すると、二価のＴＡＣＥが得られる。抗体の重鎖と軽鎖の両方で融合タンパク質を形成する場合には、４つものＴＡＣＥ細胞外領域でＴＡＣＥオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、二つの可溶性ＴＡＣＥ領域をペプチドリンカーと結合させることも可能である。
ＴＡＣＥをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターは、周知の方法を用いて行うことができる。発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウィルス又は昆虫遺伝子から誘導されたもの等の、適当な転写または翻訳ヌクレオチド配列に機能可能なように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたＴＡＣＥ  ＤＮＡを含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がＴＡＣＥ配列に対して機能的に関係をもつときは、機能可能なように連結している。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、当該プロモーターヌクレオチド配列がＴＡＣＥ  ＤＮＡ配列の転写を制御するのであれば、ＴＡＣＥ  ＤＮＡ配列に機能可能なように連結されている。通常は複製起点により付与される、所期の宿主細胞内で複製する能力、並びに形質転換体を同定する選択遺伝子を、発現ベクター内に更に組み込んでもよい。
さらに、ＴＡＣＥに本来存在しない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列をＴＡＣＥ配列とインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合させて、ＴＡＣＥが初めはシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図する宿主細胞内で機能性であるシグナルペプチドはＴＡＣＥポリペプチドの細胞外分泌を増進する。シグナルペプチドは、細胞からのＴＡＣＥの分泌の際にＴＡＣＥポリペプチドから切断されてもよい。
ＴＡＣＥポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８５）に記載されている。本明細書中に開示したＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを用いてＴＡＣＥポリペプチドを産生させるために、無細胞翻訳系を用いることもできるだろう。
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌又は桿菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュウドモナス、ストレプトミセス及びスタフィロコッカス属に入る他の種々の種が含まれる。大腸菌等の原核宿主細胞内では、ＴＡＣＥポリペプチドは、原核宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ−末端Ｍｅｔは、発現された組換えＴＡＣＥポリペプチドから切り離してもよい。
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要求量を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ（ＡＴＣＣ３７０１７）等市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２を用いて発現ベクターを構築するために、適切なプロモーター及びＴＡＣＥ  ＤＮＡ配列が、当該ｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２３３−３（スウェーデン、ウプサラのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びｐＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ）が含まれる。
組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般に用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，１９７８；及びＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．8:4057，1980；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，p.412，1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰLプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含まれる。
また、ＴＡＣＥポリペプチドを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）から発現させてもよい。ピキア（Pichia）、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ又はクルイベロミセス（Kluyveromyces）の如き酵母の他の属も用いることができる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多いであろう。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら，J. Biol. Chem. 255:2073，1980）又は他の解糖酵素（Hessら，J. Adv. Enzyme Reg. 7:149，1968；及びHollandら，Biochem. 17:4900，1978）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman，ＥＰＡ−７３，６５７またはＦｌｅｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０７：２８５−１９５（１９９１）；およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５−１３９（１９９０）に更に記載されている。もう１つの代用物は、Russellら（J. Biol. Chem. 258:2674，1982）及びBeierら（Nature 300:724，1982）により記載されたグルコース被抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製の起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。
酵母α因子リーダー配列を用いて、ＴＡＣＥポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Kurjanら，Cell 30:933，1982；Bitterら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330，1984；米国特許第４，５４６，０８２号；及びＥＰ３２４，２７４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も、当業者に知られている。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有するようにその３’末端の近くで修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進するであろう。
酵母形質転換手順は、当業者が知られている。かかる手順の１つは、Hinnenら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929，1978に記載されている。Hinnenらの手順は、選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、０．６７％酵母窒素原基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“リッチ”培地中で生育させてもよい。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えＴＡＣＥポリペプチドを発現することもできるであろう。昆虫細胞内での異種起源タンパク質の産生のためのバキュロウィルス系についての総説が、LuckowとSummers，Bio/Technology 6:47（1988）により記載されている。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Gluzmanら，Cell 23:175，1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞系、及びアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）からMcMahanら（EMBO J. 10:2821，1991）により記載された通りに誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから切り取ることができる。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。ウィルス初期及び後期プロモーターは特に有用である。というのは、いずれもウィルスの複製起点を含有することもできる断片としてウィルスゲノムから容易に得ることができるからである（Fiersら，Nature 273:113，1978）。ＳＶ４０ウィルス複製起点部位内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ｂｐ配列が含まれる限り、より小さな又はより大きなＳＶ４０断片も用いることができる。
哺乳動物宿主細胞内で用いる好例となる発現ベクターは、Okayama及びBerg（Mol. Cell. Biol. 3:280，1983）により開示された通りに構築することができる。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞内の哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的にCosmanら（Mol. Immunol. 23:935，1986）により記載された通りに構築することができる。有用な高発現ベクターである、Cosmanら，Nature 312:768，1984に記載されたＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、及び１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１，４１５号に記載されている。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。これらベクターをレトロウィルスから誘導してもよい。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）についてのシグナル配列；Cosmanら，Nature 312:768（1984）に記載されたインターロイキン−２レセプターについてのシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されたインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド；及びＥＰ４６０，８４６に記載されたII型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチドの如き、異種起源シグナル配列を付加してもよい。
本発明の単離され精製されたＴＡＣＥタンパク質では、上記のような組換え発現系により産生させることも天然に存在する細胞から精製することもできる。このＴＡＣＥタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析で単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質なまでに精製される。ＴＡＣＥタンパク質を産生する１つの方法は、ＴＡＣＥをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ＴＡＣＥの発現を促進する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に依存して、ＴＡＣＥタンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。当業者には知られているように、組換えＴＡＣＥを精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びＴＡＣＥが培養培地中に分泌されるかどうかといった要因に従って変動するであろう。例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系用いる場合は、培養培地をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon超濾過装置を用いて濃縮してもよい。濃縮工程後は、濃縮液をゲル濾過培地の如き精製マトリックスに適用することができる。また、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は支持体を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に普通に用いられる他のタイプであってもよい。また、カチオン交換工程を用いてもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、ＴＡＣＥを更に精製することができる。上述の幾つか又は全ての精製工程をいろいろに組み合わせることも知られており、実質的に均質な組換えタンパク質を提供するために適用できる。
組換えにより発現されたＴＡＣＥに加えて、活性化された単核細胞系、ＴＨＰ−１からＴＡＣＥを単離及び精製してもよい。ＴＨＰ−１は典型的にＨＬ−６０細胞よりも多くのＴＮＦ−αを産生し、ＴＡＣＥの好ましい供給源である。ＴＡＣＥの他の供給源を用いてもよく、ＴＡＣＥはＴＮＦ−αを産生する他のタイプの細胞においても見いだされるかもしれない。ＴＡＣＥの供給源がいったい同定されると、初めに所望により供給細胞をＴＮＦ−αを産生するように刺激することによって、ＴＡＣＥを単離し精製してもよい。刺激は必要ではないかもしれないが、当該技術分野において周知の方法を用いて行うことができる。次に、細胞を回収し、洗浄し、そしで慣用された方法を用いて細胞膜を単離する。細胞膜を単離するのに特に好ましい方法は、Ｍａｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７３１：１１５（１９８３）に記載された方法第３番である；但し、ジチオスレイトールはＴＡＣＥ活性を阻害することが調べられたので、この方法においてジチオスレイトールは含めるべきではない。次に、膜調製物を非イオン性界面活性剤の希釈溶液中に懸濁させ、短時間ホモジェナイズすることによって、細胞膜に由来するタンパク質を溶解させることができる。次に、慣用された方法を用いてリン脂質を抽出することができる。
ＴＡＣＥ結合性タンパク質を含むアフィニティーカラムを用いて、発現されたＴＡＣＥポリペプチドをアフィニティー精製することも可能である。ＴＡＣＥを慣用技術、例えば高塩類溶出緩衝液中でアフィニティーカラムから除き、次いで使用のために低塩類緩衝液中で透析するか、あるいは、用いたアフィニティーマトリックスに応じてｐＨもしくは他の成分を変化させる。実施例４は、本発明のＴＡＣＥを用いてＴＡＣＥに対するモノクローナル抗体を生成させる操作が記載されている。
細胞培養で産生した組換えタンパク質は、通常、宿主細胞をまず崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチドなら細胞沈殿物から、可溶性ポリペプチドなら上清から抽出した後、１又は２以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる慣用された方法により崩壊させることができる。
好ましくは、精製を簡易化するために、形質転換酵母宿主細胞を用いてＴＡＣＥを分泌細胞として発現させる。酵母宿主細胞発酵物から分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  ２９６：１７１，１９８６）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。Ｕｒｄａｌらは、組換えヒトＩＬ−２の精製のための予備的（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
標的ＴＡＣＥｍＲＮＡ配列（二本鎖を形成）または二本鎖ＤＮＡヘリックス状のＴＡＣＥ配列（三本鎖を形成）に結合可能な、一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む、アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドを、本発明に従って作成することができる。本発明のアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドはＴＡＣＥ  ｃＤＮＡのコーディング領域の断片を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４−約３０のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作成する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８に記載されている。
標的核酸配列へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合は、複合体の形成をもたらし、それは、当該二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の早期終結を含むいくつかの手段の一つにより又は他の手段により、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を遮断する。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＴＡＣＥタンパク質の発現を遮断することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖リン酸ジエステル主鎖（又はＷＯ９１／０６６２９に記載されたような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定である（即ち、酵素分解に抵抗する）が、標的ヌクレオチドに結合できる配列特異性を保持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたもの等の有機部分、及び標的核酸配列に対するそのオリゴヌクレオチドの親和性を高めるポリ−（Ｌ−リシン）の如き、他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）等の介在物質、及びアルキル化剤又は金属錯体を、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに付けて当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的オリゴヌクレオチド配列への結合特異性を変化させてもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、例えば、ＣａＰＯ4媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含むいずれかの遺伝子移入方法により、又はエプスタイン−バーウィルスの如き遺伝子移入ベクターを用いることにより、導入することができる。好ましくは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、そのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適するレトロウィルスベクターに挿入してから、細胞をその挿入配列を含有するレトロウィルスベクターとｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで接触させることにより導入する。適するレトロウィルスベクターには、限定されるわけではないが、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ，Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されるレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／２６６を参照のこと）が含まれる。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合性分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することができる。適するリガンド結合性分子には、限定されるわけではないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合性分子の複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、リガンド結合性分子のその対応する分子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨げることがないか、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合型が細胞内に入るのを実質的に遮断することがないものである。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているようにオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成により導入することができる。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは、内因性リパーゼにより細胞内で解離される。
単離され精製されたＴＡＣＥまたはその断片、そして特にＴＡＣＥの細胞外領域は、ある種の細胞表面タンパク質のレベルを制御するための治療剤として有用でありうる。ＴＮＦ−αに加えて、他のサイトカイン、さらにサイトカインレセプター及び数種の接着性タンパク質も、ＴＡＣＥ又は関連するプロテアーゼによって、細胞表面から遊離されうる。ＴＡＣＥまたはその断片、そして特にＴＡＣＥの細胞外領域は、腫瘍細胞増殖、炎症または受精に関与する、細胞表面サイトカイン、サイトカインレセプターおよび接着性タンパク質を修飾、または除去するために投与することができる。治療剤として使用される場合、ＴＡＣＥを既知の方法に従って薬剤組成物に処方することができる。ＴＡＣＥを単一の活性物質として、もしくは他の既知の活性物質と一緒にかのいずれかの状態で、混合剤として、薬学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、保存料（例えば、チメロサル（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、及び／または担体と組み合わせることができる。適切な担体およびそれらの製剤法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。それに加え、そのような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体形成しているか、もしくは例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等の重合性化合物内に取り込まれているか、あるいは、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層のベシクル、赤血球ゴーストまたはスフェロプラスト内に取り込まれたＴＡＣＥを含むことができる。このような組成物は、ＴＡＣＥの物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遊離速度およびｉｎ  ｖｉｖｏでの浄化速度に影響を及ぼすであろう。
ＴＡＣＥは、当該技術分野において知られている種々のメタロプロテアーゼアッセイの任意のものを用いて分析することができる。一般に、ＴＡＣＥは、ＴＮＦ−αの天然の切断部位を示すペプチド基質を用いて分析することができる。例えば、ＴＡＣＥによる基質の切断を検出するために、基質は切断部位の一方に蛍光基をそして切断部位のもう一方に蛍光制御基を付加させることができる。切断により制御（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が排除され、検出可能な信号が提供される。あるいは、切断の際により強く吸収するような比色（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）遊離基を基質に付加させてもよい。あるいはまた、基質に、基質の切断部位にチオエステル基を合成付加し、ＴＡＣＥによる切断の際に、チオール基が残り慣用された方法により簡単に検出することができる。特に、試料中のＴＡＣＥ活性を検出するための好ましい方法は下記の実施例１に記載されている。ＴＡＣＥ活性を検出するための他の方法も、過度の実験を伴うことなく用いることができる。
以下実施例１にさらに記載されているように、ＴＡＣＥの定量アッセイも用いることができる。当該アッセイは、ペプチド基質を約１ｍＭでＴＡＣＥと３７℃で一定時間インキュベートし；酸もしくは金属キレート剤を添加することによって反応を停止し、そしてＨＰＬＣ分析によって切断の量を決定することを含む。
本発明の側面の範囲内において、ＴＡＣＥ並びにＴＡＣＥのアミノ酸配列に基づくペプチドは、ＴＡＣＥに特異的に結合する抗体の調製に使用することができる。そのような抗体調製の具体例は本明細書中の実施例４に記載されている。用語”抗体”は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体，Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片等のそれらの断片、並びに組換えにより作成された任意の結合パートナーを意味する。抗体は、約１０7Ｍ-1より大きいかまたは同等のａＫａでＴＡＣＥに結合する場合、特異的に結合する、と定義する。結合パートナーまたは抗体の親和性は慣用技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）に記載された方法によって、容易に決定することができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキン、ウサギ、マウスもしくはラット等の種々の供給源から、当該技術分野において周知の方法を用いて容易に生成することができる。一般に、精製ＴＡＣＥ、またはＴＡＣＥのアミノ酸配列に基づくペプチドであって適切に結合されたものを、典型的には非経口注射によって宿主動物に投与する。ＴＡＣＥの免疫原性は、アジュバント、例えば、フロイトの完全または不完全アジュバントの使用により増強することができる。追加免疫の後、血清の少量のサンプルを収集し、ＴＡＣＥまたはＴＡＣＥペプチドへの反応性を試験する。そのような測定に有用な種々のアッセイの例は、以下に記載されているものを含む：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８；並びに向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、ラジオ免疫沈降法、エンザイムイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチアッセイ等がある。米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号参照。
モノクローナル抗体は、周知の方法を用いて容易に調製することができる。例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号および第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭａｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．），１９８０参照。簡単には、マウス等の宿主動物を、少なくとも１回、そして好ましくは約３週間の間隔をおいて少なくとも２回、単離され精製されたＴＡＣＥまたは複合化ＴＡＣＥペプチドを、所望によりアジュバントの存在下で、腹腔内注射する。次いでマウスの血清を慣用されたドットブロット技術又は抗体捕捉（ＡＢＣ）によって分析し、どの動物が融合させるのに最適か決定する。約２−３週間後、マウスをＴＡＣＥまたは複合化ＴＡＣＥペプチドで、静脈内に追加免疫を行う。後にマウスを犠牲にし、脾臓細胞を確立された方法に従って、Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）等の商業的に入手可能なミエローマ細胞と融合させる。簡単に述べると、ミエローマ細胞を培地中で数回洗浄し、マウス脾臓細胞と、およそ脾臓細胞３に対してミエローマ細胞１の割合で融合させる。融合化剤は当該技術分野で用いられている適当な試薬、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でよい。融合細胞の選択的な増殖を可能にする培地を含むプレートに融合物を播種する。次いで融合細胞を約８日間増殖させることができる。得られたハイブリドーマからの上清を収集し、初めにヤギ抗マウスＩｇでコーティングしたプレートに添加する。洗浄後、125Ｉ−ＴＡＣＥ等の標識を各ウェルに添加し、インキュベーションを行う。陽性ウェルは続いてオートラジオグラフィーによって検出できる。陽性クローンは大量培養により増殖させることができ、続いて上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製する。
本発明のモノクローナル抗体は以下の文献に記載されたような別の技術を用いて作成することもできる。Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｓｓら．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９（１９９０）これは、参考文献として本明細書中に援用される。同様に、特異的な結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込む組換えＤＮＡ技術用いて、結合パートナーを構築することもできる。そのような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：３９４（１９８９）に記載されている。
他のタイプの”抗体”は、本明細書中に提供された情報を当該技術分野における知識の状態とを組み合わせて用いることによって提供できる。例えば、ＴＡＣＥに特異的に結合できるヒト化抗体も本発明の範囲に含まれる。
ＴＡＣＥに対する抗体は一旦単離去され精製されると、確立されたアッセイプロトコールを用いて試料中のＴＡＣＥの存在を検出するために用いることができる。さらに、本発明の抗体は、治療上、ＴＡＣＥに結合させｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその活性を抑制するために用いることができる。
本発明の精製されたＴＡＣＥは、ＴＡＣＥの抑制因子、および、よって、過剰のＴＮＦ−α遊離の抑制因子の発見を促進するであろう。精製ＴＡＣＥポリヌクレオチドをその潜在的な抑制因子のスクリーニングに用いることは重要であり、汚染物による反応の妨害の可能性を実質的に除去することができる。そのような分子のＴＡＣＥ抑制活性を検出するためのスクリーニングアッセイは、典型的には、潜在的な抑制分子を適当な基質と混合し、少なくとも実質的に精製されたＴＡＣＥを混合物とともにインキュベートし、そして、例えば上述されたように基質切断の量を測定する、ことを含む。アッセイで使用するための種々の適当な基質を設計することができ、好ましくはペプチジル基質を用いることができ、当該基質はアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号５）含む。
さらに、ＴＡＣＥポリペプチドはＴＡＣＥ抑制因子の構造に基づく設計にも使用できる。そのような構造に基づく設計は、”合理的薬物設計（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｒａｇ  ｄｅｓｉｇｎ）”としても知られている。例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴または相同モデル（これらはいずれも周知の技術である）によって、ＴＡＣＥポリペプチドを三次元的に解析することができる。ＴＡＣＥの構造情報を分子モデルソフトウェアシステムに用いて、抑制因子設計および抑制因子−ＴＡＣＥ相互作用を助力することも、本発明に包含される。そのようなコンピューター補助モデルおよび薬物設計は、化学的配座分析、分子の静電位、タンパク質折り畳み等の情報を用いることができる。例えば、メタロプロテナーゼのクラス特異的抑制因子の設計の大部分は、触媒性亜鉛原子をキレートするか結合する試みに集中している。合成抑制因子は通常、特定のプロテアーゼの特異性ポケットに適合するように設計された一群の他の基に結合している、負に荷電した部分を有するように設計される。本発明の特定の方法は、可能性のある基質の結合部位に関するＴＡＣＥの三次元構造を分析し、予測される反応部位を取り込んだ新規な分子を合成し、そして上述したように新規分子をアッセイする、ことを含む。
以下の実施例は、本発明の態様を説明するために提供されるが、後述する請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するものとみなしてはならない。以下の実施例において、特に規定しない限り、全ての方法は慣用化されたものである。
実施例１
ＴＮＦ−α転換酵素の精製
本実施例は、ＴＡＣＥを精製する方法を記載する。ＴＡＣＥは、ＴＮＦ−αを産生するように刺激されたヒト単球細胞系、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ２０２）の細胞膜から単離され精製された。ＴＨＰ−１は、より一般に用いられているヒト単球細胞系であるＨＬ−６０細胞よりもＴＮＦ−αを多く産生するため選択された。約１，２００億の細胞をＫｒｏｎｈｅｉｍら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９：６９８（１９９２）（本明細書中に、参考文献として援用される）に既述された方法を用いて刺激した。刺激の２時間後、細胞を遠心分離により回収した。回収した細胞をＨａｎｋｓの平衡塩類溶液で少なくとも２回洗浄し、細胞沈殿物１ｍｌあたり１．２５ｍｌのホモジェナイズ用バッファーを用いて、Ｍａｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７３１：１１５（１９８３）に記載された方法第３番（但し、ジチオスレイトールは用いない）に従って、原形質膜を単離した。ジチオスレイトールを用いるＭａｅｄａら（上述）の標準的な方法は、ＴＡＣＥ活性を有する化合物を得ることができないことがわかった（後述するＴＡＣＥ活性に関する分析）。次に、１％オクチルグリコシド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および３０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液中に膜調製物を再懸濁し、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒで短時間（２回、各回５秒）ホモジェナイズすることにより、細胞膜を溶解した。次に、４倍量の氷冷した（０℃）アセトンを加えることによりリン脂質を抽出した；４℃で３０分インキュベーションした後、アセトン抽出した物質を、１５００ｒｐｍで１０分間Ｈ１０００Ｂローター中で遠心分離した。
クロマトグラフィー
沈殿した物質を４５０ｍｌの緩衝液Ａ（緩衝液Ａは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１％オクチルグリコシド（重量対容量パーセント）を含む）に溶解し、ＤＥＡＥ−セファロース  ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１２０ｍｌカラムに４ｍｌ／分で装填した。次いでカラムを３６０ｍｌの緩衝液Ａを用いて６ｍｌ／分で洗浄し、緩衝液Ａ中のＮａＣｌの増加する勾配（０−０．３Ｍ）を６ｍｌ／分で４０分間にわたって適用することにより、タンパク質を抽出した。ＴＡＣＥは、約５０−約１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で抽出された。
ＴＡＣＥは当初この時点で、アミノ末端に８アミノ酸の”ｆｌａｇ”（Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４（１９８８））配列に融合させた２６ｋＤの組換えＴＮＦ−αを切断する能力によって検出された。ヒトＴＮＦ−αをコードする遺伝子は、ｆｌａｇ配列をコードするＤＮＡにスプライシングし、この構築物をｐＰＬ３ベクター（Ｃ．Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：４２９（１９８７））に挿入した。次に、タンパク質を大腸菌のプロテアーゼ欠損株（Ｒ．Ｔ．Ｌｉｂｂｙら、ＤＮＡ，６：２２１（１９８７）中で発現させた。これは、細菌による前駆体の分解を防ぐために必要であることが見いだされた。培養培地の除去の後、細菌を３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁し、懸濁液を約３０秒間音波処理した。次に、物質をＳＳ３４ローター中２０．０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清画分を捨て、沈殿物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中の８Ｍ尿素に再懸濁した。物質をドウンスホモジェナイザー（ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で２５ストローク  ホモジェナイズし、ＳＳ３４ローター中２０．０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次いで、ＴＮＦ−α前駆体を含む上清画分を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に対して４回透析した。
次いでこの物質を、ＴＡＣＥと３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。ＴＡＣＥは、１ｍＭ  Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍｇ／ｍｌ  α１−プロテアーゼ抑制因子（いずれも商業的に入手可能）で処理されているＤＥＡＥ−セファロースから溶出されたものである。得られた１７ｋＤ産物のＮ末端は、真正のＴＮＦ−αのそれであることが見いだされた。このように、ＴＡＣＥを初めに同定した後、当該酵素はＴＮＦ−αのセグメントＬｅｕ73−Ａｌａ74−Ｇｌｎ75−Ａｌａ76−↓−Ｖａｌ77−Ａｒｇ78−Ｓｅｒ79−Ｓｅｒ80（配列番号５）を表す８残基ペプチドも切断することがみいだされた。（↓）は、切断部位を示す。この観察に基づいて定量アッセイが確立された。ペプチド１ｍＭを酵素と３７℃で一定の定められた時間、０．１ｍＭジクロロイソコウマリン、１ｍＭ  メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μＭベスタチンおよび１ｍｇ／ｍｌ  α１−プロテアーゼ抑制因子（Ｓｉｇｍａ）（いずれも商業的に入手可能）の存在下でインキュベートした。次に、酸または金属キレート剤の添加によって反応を停止させた。混合物をＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムに充填し、０−３０％アセトニトリル勾配を用いて１５分間にわたって溶出させることにより、存在するＴＡＣＥの量を反映する、このペプチドの切断の量を測定した。
０．０５−０．２５ＭのＮａＣｌでＤＥＡＥカラムから溶出された物質は、出発物質より約４倍高い比活性を有した。溶出物質を音波処理し、そして小麦麦芽アグルチニン−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに２時間、４℃で振盪した。使用前に、５カラム容量の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％オクチルグリコシドおよび１０％グリセロールを含む）を用いて小麦麦芽アグルチニンを洗浄した；この樹脂１ｍｌを、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって定められた、試料中のタンパク質２ｍｇ毎に使用した。２時間後、樹脂を７倍容量の緩衝液Ｂで洗浄し、そして、５カラム容量の緩衝液Ｂプラス０．３Ｍアセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ）で、各カラム容量の適用の間に３０分の間隔をおきながら、物質を溶出した。
ＴＡＣＥ活性を有する画分は、出発物質よりも約１０倍高い比活性を有した。これらの画分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて約５ｍｌに濃縮し、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｃは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１％オクチルグリコシドおよび１０％グリセロールを含む）で３倍に希釈した。希釈された物質を音波処理し（１０秒間のバーストを３回）、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に０．５ｍｌ／分で装填した。次に、カラムを１０ｍｌの緩衝液Ｃを用いて０．５ｍｌ／分で洗浄し、そして、緩衝液Ｃ中の０−０．２５Ｍ  ＮａＣｌ勾配を用いて０．５ｍｌ／分で３０分間にわたって物質を溶出させた。ＴＡＣＥ活性（この段階および続いて、プロテアーゼ抑制因子の非存在下で、既述されたペプチド基質とともにインキュベートすることによって検出された）は約０．１５Ｍ  ＮａＣｌで溶出された。
活性を有するＭｏｎｏＱ画分中のＮａＣｌ濃度を、物質を緩衝液Ｃ中に少なくとも１０倍希釈することによって減少させ、次いで物質をヒドロキシアパタイト（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ｃｅｒａｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＨＳ４０）のカラムに０．５ｍｌ／分の速度で充填した。３カラム容量の緩衝液Ｃで洗浄した後、０−５０Ｍ  リン酸ナトリウム勾配を用いて１ｍｌ／分で３０分間にわたってタンパク質を溶出させた。ＴＡＣＥは、約１５ｍＭ  リン酸ナトリウムで溶出された。
ヒドロキシアパタイトカラムから溶出されたＴＡＣＥを、次に、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて約１００μｌに濃縮し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＳＥＣ−４００サイズ分けカラム（３０ｃｍ）に装填した。カラムを０．５ｍｌ／分で流れる緩衝液Ｃによってタンパク質を抽出した；ＴＡＣＥは約２８分に流出された。
サイズ分けカラムから溶出されたＴＡＣＥを、緩衝液Ｄ（緩衝液Ｄは、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６）、１％オクチルグリコシドおよび１０％グリセロールを含む）で３倍に希釈し、Ｒｅｄ１２０−アガロース（Ｓｉｇｍａ）の１ｍｌカラムに０．２５ｍｌ／分で装填した。１０ｍｌの緩衝液Ｄでカラムを洗浄後、緩衝液Ｄ中の０−１Ｍ  ＮａＣｌ勾配を用いて０．２５ｍｌ／分で６０分間にわたってタンパク質を溶出させた。ＴＡＣＥは、０．２−０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出された。各溶出画分の５％をＳＤＳ−アクリルアミドゲル（１０％）に泳動し、銀染色は、活性を有する画分中の主なタンパク質は、ゲル上の６６と９７ｋＤマーカー（Ｎｏｖｅｘ）のほぼ中間点、約８０ｋＤまで泳動されることを示した。
約８０ｋＤのタンパク質を含む画分のプールに、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０．２％（容量対容量パーセント）まで加え、次いで混合物をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＤを用いて、２．１×５ｃｍ  Ｃ４カラムに約１００μｌ／分で注入した。０．１％ＴＦＡ中の０−１００％  アセトニトリル勾配を用いて１００μｌ／分で１００分間にわたってタンパク質を溶出させた。１分の画分を収集し、各画分の５−１０％をＮｏｖｅｘ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）上で泳動した。約７０％アセトニトリルで溶出され、約８０ｋＤのタンパク質を含む画分をプールし、蒸発乾固させた。
ペプチドの生成および配列決定
次に、この画分のプールを２００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解させ、試料中のタンパク質の量の約１／５０に相当する量のエンド−ＬＹＳ−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。物質を３７℃で一晩インキュベートし、次に、同量のエンド−ＬＹＳ−Ｃの新鮮なアリコートを、さらに３時間、３７℃で加えた。
物質を毛細管に装填することにより得られたペプチドを分離した。Ｃ１８カラムを２０μｌ／分で、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの上昇勾配（０．５％／分）で２００分にわたって溶出した。ＡＢＩ４７６またはＡＢＩ４９４自動配列決定装置を用いてペプチドの配列決定を行った。
実施例２
単離され精製されたＴＡＣＥの調製
本実施例は、前述の方法を用いて得られた精製ＴＡＣＥをさらに精製する方法を記載する。ＴＨＰ−１細胞から得られた精製ＴＡＣＥは、少量のヒト  リソソム８５ｋＤシアロ糖タンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８４：６０４−６１１（１９９２））およびヒト  リソソーム  アルファ−マンノシダーゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００：２３９−２４５（１９９４）を含む可能性がある。これらは、標準的なイムノソルベント法、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，第２版），ｐｐ．１６７−１７２に記載された方法を用いて除去することができる。本実施例２に記載された方法に従って、単離され精製されたＴＡＣＥを得ることができる。
実施例３
ヒトＴＡＣＥのクローニング
本実施例は、ヒトＴＡＣＥをコードするＤＮＡ配列を単離する方法を記載する。ランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリーは、商業的に入手可能な細胞系ＴＨＰ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から慣用された方法を用いて作成された。複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｃｏｏｎａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０，１９８７）増幅を以下のプライマーを用いて行った。
0004326022.tif 000002
プライマー（１）は、ペプチド（２）の最初のアミノ酸に基いており、５’末端にリジンをコードするトリプレットが付加されている。プライマー（２）は、相同なメタロプロテナーゼ、ウシ  レプロリジン１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｚ２１９６１）に見いだされる、保存されたアミノ酸配列  Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＥＣＤＣＧ）配列番号８に対するアンチセンスである。
一本鎖ｃＤＮＡは、前述した混合オリゴヌクレオチドを用いて標準的なＰＣＲ条件下で増幅させた。ＰＣＲ反応産物をゲル電気泳動で分画し、約１８０塩基対のＤＮＡバンドを単離し、商業的に入手可能なｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴにサブクローニングした。配列決定により、クローンがアミノ酸Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＧＩｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列、およびＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＥＣＤＣＧ）（配列番号８）をコードするヌクレオチド配列を含むことが明らかになった。このクローンは、”３０ＣＤクローン”と名付けられた。３０ＣＤクローンの配列決定がされ、この配列に基づいてプライマーが生成された。次に、プライマーを用いてヒトＫＢ細胞から作成されたファージライブラリー中のＴＡＣＥ  ｃＤＮＡが検出された。このライブラリーを３０ＣＤ配列に基づくプローブを用いて慣用された条件下でスクリーニングした。陽性のハイブリダイズしたプラークを単離し、これらのクローンの配列決定を行った。配列決定により、配列番号１に示されたヒトＴＡＣＥの全長ｃＤＮＡが提供された。ヒトＴＡＣＥは、Ｎ−末端１７アミノ酸シグナルペプチドを含む、８２４アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質であることが見いだされた。シグナルペプチドのあとに６５４アミノ酸の細胞外領域、２３アミノ酸の膜貫通領域、および１３０アミノ酸の細胞質領域が続く。選択的スプライシングを受けた変異体がクローニングされ配列決定されて、細胞質領域の５’末端において５０ｂｐの断片が欠失しており、そして細胞質領域の６アミノ酸をコードする読み枠がずれる点以外、ＴＡＣＥと同じアミノ酸配列を含むことが見いだされた。この変異体のアミノ酸配列は配列番号４に示されており、ｃＤＮＡは配列番号３に示されている。
実施例４
ＴＡＣＥに対する抗体の調製
本実施例は、ＴＡＣＥに対するモノクローナル抗体を生成するための方法を記載する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１０μｇの実施例１の単離され精製されたＴＡＣＥ、あるいはＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩ  Ｃｏｒｐ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）の存在下において、ＴＡＣＥのアミノ酸配列に基づくペプチドを用いて、３週間間隔で２回腹腔内投与する。次いで、マウス血清を慣用されたドットブロット技術または抗体捕捉（ＡＢＣ）によって分析し、どの動物が融合させるのに最適か決定する。３週間後、無菌ＰＢＳに懸濁した３μｇのヒトＴＡＣＥまたはＴＡＣＥペプチドを用いて、マウスを静脈内に追加免疫を行う。３日後マウスを犠牲にし、確立された手法に従って脾臓細胞をＡｇ８．６５３ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ）と融合する。簡単には、Ａｇ８．６５３細胞を無血清培地中で数回洗浄し、マウス脾臓細胞と、脾臓細胞３対ミエローマ細胞１の割合で融合させる。融合化剤は、５０％ＰＥＧ：１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）である。ＤＭＥＭ培地を加えたＨＡＴを含む２０枚の９６ウェル平底面プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に融合物を播種し、８日間増殖させる。得られたハイブリドーマからの上清を回収し、初めにヤギ抗−マウスＩｇでコートした９６ウェルプレートに６０分間加える。洗浄の後、各ウェルに125Ｉ−ＴＡＣＥを加え、室温で６０分間インキュベートし、４回洗浄する。次いで、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  Ｓフィルムを用いた−７０℃におけるオートラジオグラフィーによって、陽性クローンを検出できる。陽性クローンを大量培養し、次いで、上清をプロテインＡカラムで精製する（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
配列表
（2）配列情報 SEQ ID NO:1:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 2475 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル: NO
（iv）アンチセンス: NO
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY: CDS
（B）存在位置: 52..2472
（xi）配列: SEQ ID NO:1:
0004326022.tif 000003
0004326022.tif 000004
0004326022.tif 000005
0004326022.tif 000006
0004326022.tif 000007
0004326022.tif 000008
（2）配列情報 SEQ ID NO:2:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 807 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: SEQ ID NO:2:
0004326022.tif 000009
0004326022.tif 000010
0004326022.tif 000011
0004326022.tif 000012
（2）配列情報 SEQ ID NO:3:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 2097 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル: NO
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY: CDS
（B）存在位置: 52..2094
（xi）配列: SEQ ID NO:3:
0004326022.tif 000013
0004326022.tif 000014
0004326022.tif 000015
0004326022.tif 000016
0004326022.tif 000017
（2）配列情報 SEQ ID NO:4:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 681 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: SEQ ID NO:4:
0004326022.tif 000018
0004326022.tif 000019
0004326022.tif 000020
0004326022.tif 000021
（2）配列情報 SEQ ID NO:5:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 8 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:5:
0004326022.tif 000022
（2）配列情報 SEQ ID NO:6:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 17 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（iii）ハイポセティカル: NO
（xi）配列: SEQ ID NO:6:
0004326022.tif 000023
（2）配列情報 SEQ ID NO:7:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 17 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（iii）ハイポセティカル: NO
（xi）配列: SEQ ID NO:7:
0004326022.tif 000024
（2）配列情報 SEQ ID NO:8:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 6 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:8:
0004326022.tif 000025
（2）配列情報 SEQ ID NO:9:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 11 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:9:
0004326022.tif 000026