(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸であって、以下：
（a）配列番号１９で表されるヌクレオチド配列、
（b）配列番号１９におけるヌクレオチド１３〜ヌクレオチド２１５１のヌクレオチド配列、または
（c）ヌクレオチド１１６〜ヌクレオチド２５７、ヌクレオチド９１８〜ヌクレオチド１１２０またはヌクレオチド１９６２〜ヌクレオチド２０７７のイントロン領域を除く、配列番号１９で表されるヌクレオチド配列、
から選択される配列を含む核酸。
【請求項２】
請求項１記載の核酸の異種発現によって適切な宿主細胞中で製造することができる、組換えタンパク質。
【請求項３】
宿主特異的な糖鎖形成を含む、請求項２記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
真核微生物における発現によって製造される、請求項２記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
菌類における発現によって産生される、請求項２記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
請求項１記載の核酸のヌクレオチド配列から導き出されるアミノ酸配列を持つ、請求項２記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を持つ異種タンパク質を宿主細胞で分泌発現させることを目的とする、バラ科植物のヒドロキシニトリルリアーゼのシグナルペプチドをコードする請求項１記載の核酸の使用。
【請求項８】
バラ科植物のヒドロキシニトリルリアーゼのシグナルペプチドをコードする請求項１記載の核酸を使用し、それを宿主細胞で分泌発現させることによって製造することができる、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を持つ融合タンパク質または異種タンパク質。
【請求項９】
請求項１記載の核酸配列およびクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ遺伝子の配列を含む配列番号２１記載の核酸配列と、前記核酸配列から導き出される配列番号２２記載のアミノ酸配列とを持つ、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｃ末端が切り詰められているか、またはＮ末端およびＣ末端領域の配列が異なる機能を持つ近縁タンパク質の配列で置換されている請求項２記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
（Ｒ）−または（Ｓ）−シアノヒドリンの製造を目的とする請求項２〜６又は請求項８〜１０のいずれか1 つに記載のタンパク質を使用する方法。
【請求項１２】
有機系、水性系または二相系またはエマルジョンの状態で、脂肪族、芳香族または複素芳香族アルデヒドおよびケトンを、シアノ基供与体の存在下に、請求項２〜６又は請求項８〜１０のいずれか1 つに記載のタンパク質と反応させることを特徴とする、（Ｒ）−または（Ｓ）−シアノヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡ配列を含有する新規遺伝子、同遺伝子に由来しヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する組換えタンパク質およびそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体触媒法は化学工業にとってきわめて重要になっている。また、生物学的触媒を使った化学反応の実施は、キラルまたはプロキラルな成分との化学反応で２つのエナンチオマーのうちの一方を選択的に変換または生成するという、酵素によく見られる性質を利用することが可能な応用分野では、とりわけ興味深い。酵素が持つこの有利な性質を利用するには、その酵素を工業的に必要な量および十分に高い反応性で入手できること、ならびに実際の工業プロセス条件下で安定であることが必須条件になる。シアノヒドリンは特に興味深いキラル化合物群である。例えばシアノヒドリンは、医薬活性物質、ビタミンまたはピレスロイド化合物などの生物活性物質の製造に使用されるα−ヒドロキシ酸、α−ヒドロキシケトン、β−アミノアルコールの合成に重要である。シアノヒドリンは、ケトンまたはアルデヒドのカルボニル基へのシアン化水素酸の付加によって製造される。例えば（Ｓ）−シアノヒドリンなどのキラル化合物の工業的生産はパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の酵素（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを利用することによって可能になっており、例えばＷＯ９７／０３２０４、ＥＰ  ０  ９５１  ５６１およびＥＰ  ０  ９２７  ７６６などに記載されている。しかし工業的応用にはＲ−エナンチオマーが重要である興味深い化合物もたくさんある。今までのところは、実室規模でしか使用できないプロセスが、いくつかの生成物の製造に関して記述されているに過ぎない。例えばＥＰ  ０  ２７６  ３７５、ＥＰ  ０  ３２６  ０６３、ＥＰ  ０  ５４７  ６５５）。この場合は、バラ科の植物、例えばアーモンドの仁から得られる酵素調製物が、主に使用された。最近になって、サクラ属植物の重要性がますます増大したので、サクラ属植物をより詳細に研究する試みがなされた。Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ  １９９９，Ｖｏｌ．１１９，ｐｐ．１５３５〜１５４６などの専門書には、サクラ属植物は多数のＲ−ＨＮＬイソ酵素を含有しうることが開示されている。これらのイソ酵素は当該植物の様々な組織に異なるレベルで発現される。アーモンドと近縁関係にあるアメリカザクラには、現在までに５種類の異なるイソ酵素が同定され、それらの遺伝子が配列決定されている。アーモンドイソ酵素は今までのところ１つだけがＰｌａｎｔａ（１９９８）２０６：３８８〜３９３に記載されており、このイソ酵素は花芽にもっとも強く発現される。前記Ｒ−ＨＮＬイソ酵素の遺伝子は既に単離され、そのｃＤＮＡが配列決定されている。しかし、このような遺伝子の（機能的）異種発現の成功は、専門書にも特許文献にも報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
大規模での工業的応用も今までのところ実施されていないが、その主な理由は、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を持つアーモンド仁由来の酵素調製物を十分な量かつ妥当な費用で入手することが、今まで不可能だったことにある。
【０００４】
そこで、Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼを工業的応用に必要な量で提供できるような基礎を確立することが、本発明の目的だった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この目的は、アーモンドのＲ−ＨＮＬ調製物に相当する酵素を適当な組換え微生物株を使った遺伝子工学的手法によって製造する方法を探索することによって達成された。Ｒ−ＨＮＬ活性を持つ上記組換え酵素は、この方法により、十分な量で工業的に入手できるようになるはずである。
【０００６】
様々なイソ酵素遺伝子中の特定の領域が高度に保存されていることは、上記の文献に記載されているＤＮＡ配列から導き出すことができる。本発明ではこれを、ア-モンドＲ−ＨＮＬのＰＣＲ増幅用のプライマーを作成する際の根拠として利用する。このようなプライマーを使えば、例えばアーモンド仁から単離したＤＮＡをテンプレートにして、アガロースゲル電気泳動による分析で明瞭な特異的バンドを示すＤＮＡ種をＰＣＲによって増幅することが可能になる。本発明により、ｍｄｌ遺伝子のサイズと一致するバンドが見出された（Ｐｌａｎｔａ（１９９８）２０６：３８８〜３９３）。次に、アメリカザクラで知られている全てのイソ酵素について適当なプライマーを作成し、対応するＰＣＲ産物を得る。この領域のＤＮＡを適当な分取用アガロースゲルから単離し、ＰＣＲ生成断片を大腸菌でクローニングするための標準的ベクターにクローニングする。選択した一連のクローンの配列解析を行ったところ、サクラ属植物の上記既知Ｒ−ＨＮＬ遺伝子に相同なクローンの存在が明らかになったが、この方法で得られるクローンまたは遺伝子の配列は、既知の配列または公表された配列とはいくつかの配列位置で異なり、それが重要な機能的相違をもたらしている。結果として、アーモンド花から得られるｃＤＮＡの既知配列を利用したプライマーの組み合わせを使ったにもかかわらず、ＨＮＬ遺伝子の新規変異体が思いがけず見出された。これらの新規遺伝子を配列決定し、ゲノムＤＮＡ配列を決定した。
【０００７】
したがって本発明は、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡ配列を含有する新規遺伝子であって、アメリカザクラおよびアーモンドに由来するｍｄｌ遺伝子の５'領域のＤＮＡ配列に基づくプライマー１および／またはアメリカザクラまたはアーモンドに由来するヒドロキシニトリルリアーゼイソ酵素の一つのＤＮＡ配列の３'領域に基づくプライマー２の組み合わせにより、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含有する生物から得られるＤＮＡをテンプレートにしてＤＮＡポリメラーゼを使った増幅を行い、クローニングすることによって調製することができる遺伝子に関する。
【０００８】
例えばアーモンドＭＤＬ１遺伝子およびアメリカザクラｍｄｌ５遺伝子の配列相同性に基づいて遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを作成することができ、その結果、増幅およびクローニング後に、新規遺伝子であるＨＮＬ５遺伝子が得られる。
【０００９】
ＰＣＲ増幅によって調製されるアーモンドＨＮＬ５遺伝子は、例えば図１に記載のヌクレオチド配列を持ち、このヌクレオチド配列もまた本発明の主題である。また本発明は、図１に記載の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％同一なヌクレオチド配列を持つＨＮＬ５遺伝子に関する。
【００１０】
新規ＨＮＬ５遺伝子は公表されたアーモンドＭＤＬ１遺伝子の配列とは７塩基対で相違している。
【００１１】
また、例えばアメリカザクラｍｄｌ１遺伝子の配列相同性に基づいて遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを作成することができ、その結果、増幅およびクローニング後に、新規遺伝子であるＨＮＬ１遺伝子が得られる。
【００１２】
ＰＣＲ増幅によって調製されるＨＮＬ１遺伝子は、例えば図８に記載のヌクレオチド配列を持ち、このヌクレオチド配列もまた本発明の主題である。また本発明は、図８に記載の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％同一なヌクレオチド配列を持つＨＮＬ１遺伝子に関する。
【００１３】
同様に、本発明によれば、例えばアーモンドＭＤＬ１遺伝子の配列および／または既知のアメリカザクラｍｄｌ１、ｍｄｌ２、ｍｄｌ３およびｍｄｌ４遺伝子の配列に基づいて、さらなる遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを作成することができる。これによって、増幅およびクローニング後に、例えばＨＮＬ２、ＨＮＬ３またはＨＮＬ４などのさらなる新規遺伝子が得られるが、これらの新規遺伝子は全ての本発明の主題である。
【００１４】
ゲノムクローンとそのゲノムＤＮＡは、様々な宿主細胞における異種発現（例えば誘導性発現または構成的発現）によって酵素調製物を得るための基礎となる。
【００１５】
また、本発明新規遺伝子のゲノムＤＮＡの配列解析から、これらの新規遺伝子によってコードされるタンパク質はシグナル配列またはシグナルペプチドを持つことがわかる。これにより、適切な宿主細胞における異種タンパク質の分泌発現も可能になる。この場合は、クローン化した新規遺伝子の一つのタンパク質をシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現させるために、特別な発現ベクターを使用する。
【００１６】
したがって本発明はさらに、アーモンドＨＮＬ遺伝子（例えばＨＮＬ１、ＨＮＬ２、ＨＮＬ３、ＨＮＬ４およびＨＮＬ５）のゲノムＤＮＡ配列の異種発現によって適切な宿主細胞中で製造することができる組換えタンパク質に関する。この場合、好適な宿主細胞の例は微生物である。真核微生物が好ましく、真菌は特に好ましい。サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がその例である。
【００１７】
例えば、ＨＮＬ５遺伝子のヌクレオチド配列から導き出されるアーモンドヒドロキシニトリルリアーゼＨＮＬ５のアミノ酸配列を図３に記載し、ＨＮＬ１遺伝子のヌクレオチド配列から導き出されるアーモンドヒドロキシニトリルリアーゼＨＮＬ１のアミノ酸配列を図９に記載する。
【００１８】
また本発明は、例えばバラ科植物などのヒドロキシニトリルリアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞における異種タンパク質の分泌発現に使用すること、およびそのようにして得られるタンパク質に関する。
【００１９】
したがって本発明はさらに、例えばバラ科植物などのヒドロキシニトリルリアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用し、そのＤＮＡ配列を適切な宿主細胞で分泌発現させることによって製造することができる融合タンパク質または異種タンパク質に関する。
【００２０】
この場合も好適な宿主細胞の例は微生物である。細菌または真核微生物が好ましく、サッカロミセス・セレビシェまたはピキア・パストリスなどの真菌は特に好ましい。
【００２１】
例えば、アーモンドＨＮＬ５遺伝子の配列とクロコウジカビオキシダーゼ遺伝子の配列とを含み、ＨＮＬ活性を持つ、分泌ハイブリッドタンパク質（ＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸ）をコードするＤＮＡ断片の核酸配列を、図４に記載する。ヌクレオチド配列（図４）から導き出されるＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列を図５に記載する。図６は、アーモンドＨＮＬ５タンパク質とＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列を比較したものである。
【００２２】
本発明の組換えタンパク質を得るには、例えばアーモンドＭＤＬ１の既知遺伝子および／またはＰ．  ｓｅｒｏｔｉｎａ  ｍｄｌ１、ｍｄｌ２、ｍｄｌ３、ｍｄｌ４およびｍｄｌ５との相同性を示すクローンを、さらに処理する。
【００２３】
ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を持つ組換えタンパク質を得るには、適当な遺伝子（例えばＨＮＬ５遺伝子）を例えばピキア・パストリス用またはサッカロミセス・セレビシェ用の発現ベクターに組み込む。ゲノムＤＮＡはＰＣＲによってあらかじめスプライスしておいてもよい。細菌および真核生物における適当な遺伝子の異種発現用の発現プラスミドを構築するために、基本断片を作成することが好ましい。この目的のために、様々な発現ベクターへの組み込みを目的として本発明遺伝子をコードするＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼを使った切断によって得ることができるプラスミドを構築する。したがって、本発明の遺伝子を使用すれば、例えば誘導性プロモーター系または構成的に発現されるプロモーター系を用いる異種宿主での発現によって、機能的ＨＮＬを製造することができる。例えば、多数の形質転換体の中から、Ｒ−ＨＮＬ活性を持つ組換えタンパク質を過剰発現させるピキア・パストリスなどの組換え株を見つけることができる。誘導発現後には、Ｒ−ＨＮＬ活性を持つタンパク質の大部分を、上記の株の培養上清中に見出すことができる。
【００２４】
このようにして、アーモンド（アーモンド仁）に検出することができるＲ−ＮＨＬ活性に匹敵するＲ−ＨＮＬ活性を持つ組換えタンパク質を、工業的応用に適した量で製造することが初めて可能になった。
【００２５】
意外にも、例えば本発明のＨＮＬ１〜５遺伝子に由来し、Ｐａｍ−ＨＮＬ１〜５と呼ばれる、Ｒ−ＨＮＬ活性を持つ組換えタンパク質は、シアノヒドリン製造用の反応混合物における生体触媒として、アーモンドから単離される酵素調製物との比較で実質的により優れた性質を持ち、したがってシアノヒドリンの生体触媒合成にとりわけ有利に使用できることが、明らかになった。
【００２６】
また、本発明の組換えタンパク質の配列のＣ末端を切り詰めるか、Ｎ末端またはＣ末端領域の配列を異なる機能を持つ近縁タンパク質の配列で置換することもできる。したがって本発明はこの方法によって改変されたタンパク質にも関する。
【００２７】
特に、本組換えタンパク質は宿主特異的な糖鎖形成を持ち、その結果、本組換えタンパク質は天然タンパク質よりも実質的に安定であるという特徴を持つ。本発明の組換えタンパク質に特有の利点は、天然酵素と比較して安定性が実質的に高く、ゆえに高いエナンチオマー純度を達成するために必要な量が天然酵素より実質的に少なくてすむことからもたらされる。例えば、本発明の組換えタンパク質を使用した場合、同等なエナンチオマー純度（ｅｅ値）を達成するために必要な量は、天然タンパク質の必要量の１／１０に過ぎないことが、比較実験からわかる。
【００２８】
したがって本発明はさらに、（Ｒ）−または（Ｓ）−シアノヒドリンの製造に本発明の組換えタンパク質（ＨＮＬ）を使用することに関する。
【００２９】
（Ｒ）−または（Ｓ）−シアノヒドリンの製造に使用される出発物質は、基質としてのアルデヒドまたはケトン、シアノ基供与体および本発明の組換えタンパク質である。
【００３０】
アルデヒドとは、この場合、脂肪族、芳香族または複素芳香族アルデヒドを意味する。脂肪族アルデヒドとは、この場合、飽和または不飽和の脂肪族直鎖、分枝鎖または環状アルデヒドを意味する。好ましい脂肪族アルデヒドは直鎖アルデヒド、特に炭素原子数２〜３０、好ましくは炭素原子数２〜１８で、飽和またはモノもしくはポリ不飽和の直鎖アルデヒドである。この場合、アルデヒドはＣ−Ｃ二重結合とＣ−Ｃ三重結合の両方を持つことができる。さらに上記脂肪族、芳香族または複素芳香族アルデヒドは無置換であってもよいし、反応条件下で不活性な基、例えば無置換のまたは置換されたアリールまたはヘテロアリール基（フェニル、フェノキシまたはインドリル基など）、ハロゲン、ヒドロキシ、ヒドロキシ−Ｃ1〜Ｃ5アルキル、Ｃ1〜Ｃ5アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ5アルキルチオ、エーテル、アルコール、カルボン酸エステル、ニトロまたはアジド基などによって置換されていてもよい。芳香族または複素芳香族アルデヒドの例は、ベンズアルデヒドまたは様々な置換基を持つベンズアルデヒド（例えば３，４−ジフルオロベンズアルデヒド、３−フェノキシベンズアルデヒド、４−フルオロ−３−フェノキシベンズアルデヒド、ヒドロキシベンズアルデヒド、メトキシベンズアルデヒドなど）、さらにはフルフラール、メチルフルフラール、アントラセン−９−カルバルデヒド、フラン−３−カルバルデヒド、インドール−３−カルバルデヒド、ナフタレン−１−カルバルデヒド、フタルジアルデヒド、ピラゾール−３−カルバルデヒド、ピロール−２−カルバルデヒド、チオフェン−２−カルバルデヒド、イソフタルアルデヒドまたはピリジンアルデヒド、チエニルアルデヒドなどである。ケトンはカルボニル炭素原子が不均等に置換されている脂肪族、芳香族または複素芳香族ケトンである。脂肪族ケトンとは、飽和または不飽和の直鎖、分枝鎖または環状ケトンを意味する。ケトンは飽和ケトンでも、モノ不飽和またはポリ不飽和ケトンでもよい。また、ケトンは無置換でもよいし、反応条件下で不活性な基、例えば無置換のまたは置換されたアリールまたはヘテロアリール基（フェニルまたはインドリル基など）、ハロゲン、エーテル、アルコール、カルボン酸エステル、ニトロまたはアジド基などで置換されていてもよい。芳香族または複素芳香族ケトンの例はアセトフェノン、インドリルアセトンなどである。
【００３１】
本発明に適したアルデヒドおよびケトンは既知であるか、常法によって製造することができる。
【００３２】
基質は本発明のＨＮＬの存在下にシアノ基供与体を使って変換される。
【００３３】
適切なシアノ基供与体はシアン化水素酸、シアン化アルカリ金属または一般式Ｉ：
Ｒ1Ｒ2Ｃ（ＯＨ）（ＣＮ）
のシアノヒドリンである。式Ｉにおいて、Ｒ1およびＲ2は互いに独立して水素または無置換炭化水素基であるか、またはＲ1およびＲ2は全体として炭素数４〜５のアルキレン基であり、Ｒ1とＲ2は同時には水素でないものとする。炭化水素基は脂肪族基または芳香族基であり、脂肪族基が好ましい。Ｒ1およびＲ2は炭素数１〜６のアルキル基であることが好ましく、シアノ基供与体はアセトンシアノヒドリンであることが極めて好ましい。
【００３４】
シアノ基供与体は既知の方法で製造することができる。市販されているシアノヒドリン（特にアセトンシアノヒドリン）もある。シアン化水素酸（ＨＣＮ）、ＫＣＮ、ＮａＣＮまたはアセトンシアノヒドリンをシアノ基供与体として使用することが好ましく、シアン化水素酸は特に好ましい。
【００３５】
また、反応直前にシアン化水素酸をその塩の一つ（例えばＮａＣＮまたはＫＣＮなど）から遊離させ、それを反応混合物に非溶解状態でまたは可溶型として添加することもできる。
【００３６】
変換は有機系、水性系または二相系で実施するか、またはエマルジョン状態で実施することができる。使用される水性系は本発明のＨＮＬを含有する水溶液または緩衝液である。クエン酸Ｎａ緩衝液、リン酸緩衝液などがその例である。
【００３７】
使用してよい有機希釈剤は、水混和性が全くないか無視できる程度しかないハロゲン化または非ハロゲン化脂肪族もしくは芳香族炭化水素、アルコール、エーテルまたはエステル、またはそれらの混合物である。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテルおよび酢酸エチルまたはそれらの混合物を使用することが好ましい。この場合、有機希釈剤には本発明のＨＮＬをそのままの状態で存在させるか、または固定化することができるが、非固定化ＨＮＬを使って二相系またはエマルジョン状態で変換を行うこともできる。
【００３８】
実施例１：
アーモンド（アーモンド仁）からのゲノムＤＮＡの単離
乾燥アーモンド（Ｆａｒｍｇｏｌｄ、バッチ番号Ｌ４５３２、１９９９年産）をナイフで細断し、液体窒素を使って乳鉢の中で凍結させ、液体窒素下に乳棒ですり潰して微粉末を得た。凍結アーモンド粉末０．１グラムを、６５℃の温かい「破砕緩衝液」（１００ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に調節、１．４％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡ）と直接混合した。１５分間撹拌した後、不溶の細胞残渣を遠心分離（７０００ｇで１０分間）によって除去し、上清を等量の１０Ｍ酢酸アンモニウムと混合した後、氷上で１０分間インキュベートした。１０，０００ｇで１５分間遠心分離した後、上清をフェノール／クロロホルム（１／１、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と平衡化したフェノール）で２回抽出した。２倍量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４／１）でさらに１回抽出した後、等量のイソプロパノールでＤＮＡを上清から沈殿させ、遠心分離によって除去し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾した。次に、そのＤＮＡを６８℃の水２００μｌに２０分間溶解し、エタノール沈殿によって精製した（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９）。遠心分離の後、ＤＮＡペレットを風乾し、水５０μｌに溶解した。
【００３９】
実施例２：
既知のバラ科ｍｄｌ遺伝子に相同なアーモンドＤＮＡのゲノムＤＮＡ区分の増幅とクローニング
サクラ属植物には互いに高度に相同な配列を持つ多数のヒドロキシニトリルリアーゼイソ酵素を見出しうることが知られているので（ＨｕおよびＰｏｕｌｔｏｎ，１９９９）、アメリカザクラｍｄｌ５遺伝子およびアーモンドＭＤＬ１遺伝子（Ｓｕｅｌｖｅｓら，１９９８）の配列相同性に基づく以下の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを作成した：
プライマー１：５'−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣ
ＡＡＴＧＴＣＡＧ−３'
プライマー２：５'−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＡＡＴ
ＡＴＴＡＴＧ−３'。
増幅は、「Ｈｏｔｓｔａｒ  Ｋｉｔ」マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）に従って１×ＰＣＲ緩衝液中に１．２Ｕの「Ｈｏｔｓｔａｒ」Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）、テンプレートとして５０ｎｇのアーモンドゲノムＤＮＡ、各２００ｎｇのプライマー１および２、５μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックスを含む５０μｌの混合物で行った。９５℃で１５分間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９５℃で１分、６４℃で３０秒、７２℃で１分）を行い、完全な産物を得るために７２℃で５分の最終インキュベーションを行った。このＰＣＲにより、約２．１６ｋｂの大きさ（アガロースゲル電気泳動を使った分析によって決定）のＤＮＡ断片が生成した。このＰＣＲ産物を「Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）により、同梱のマニュアルに従って精製し、「Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を使って、ＰＣＲに使用した２つのプライマーから出発するプライマーウォーキング法で配列決定した。得られた全長２１６２塩基対のＰＣＲ断片のＤＮＡ配列を図１に示す。約０．５μｇの精製ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断し、プラスミドベクターｐＢＳＳＫ（−）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州ラホーヤ）にＥｃｏＲＩ切断部位を介してクローニングした。得られた組換え分子のインサート（対応するプラスミドをｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｇと名づけた）を上記の方法で配列決定したところ、クローニングされた断片の配列は、上記２つのプライマー（１および２）を使って得た上記ＰＣＲ産物の配列と１００％同一だった。
【００４０】
実施例３：
プライマー１および２を使ったＰＣＲ増幅によって得られるアーモンドゲノムＤＮＡ断片の配列解析
ＰＣＲ増幅し配列決定したＤＮＡ区分の領域には、３つのイントロンが阻止されたオープンリーディングフレームが見出された。これら３つのイントロンは「ＧＴ．．．．．ＡＧ」というイントロンコンセンサス配列を利用して同定された。読み枠は＋１３位のＡＴＧコドンで始まり、＋２１５１位の停止コドンで終わる。コード領域のために、１３〜１１５位（エキソンＩ）、２５８〜９１７位（エキソンＩＩ）、１１２１〜１９６１位（エキソンＩＩＩ）および２０７８〜２１５０位（エキソンＩＶ）を一つに繋いだ。組み立てられたＤＮＡ配列は５５９アミノ酸のタンパク質をコードし、分子量計算値は６１ｋＤａ、またはＮ末端加工型の場合は５７．９ｋＤａである。ペプチド質量はＧＣＧプログラムパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、米国ウィスコンシン州）を使って計算した。このタンパク質をＰａｍＨＮＩ５と名づけた。オープンリーディングフレーム（イントロン無し）について推定されるタンパク質配列を図３に示す。既知のバラ科ヒドロキシニトリルリアーゼに対する特徴的な相同性を決定することもでき（ブラスト（Ｂｌａｓｔ）プログラム、ＧＣＧパッケージ、バージョン１０．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、米国ウィスコンシン州）、アーモンドＭｄｌ１（９９％同一、Ｓｕｅｌｖｅｓら，１９９８）およびアメリカザクラＭｄｌ５（９４％同一、ＨｕおよびＰｏｕｌｔｏｎ，１９９９）の公表された配列に対する相同性がもっとも高かった。この相同性を使ってＳ２７とＬ２８の間に切断部位を持つ切断可能なシグナル配列が同定された。このタイプの切断部位は、植物から精製された天然タンパク質のＮ末端配列決定により、２つのアメリカザクライソ酵素Ｍｄｌ１およびＭｄｌ４に検出することができた（Ｚｉｈｕａ  ＨｕおよびＪｏｎａｔｈａｎ  Ｅ．  Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１１９，１５３５〜１５４６，１９９９）。バラ科植物に存在する様々なＨＮＬイソ酵素の配列はアメリカザクラについてのみ知られている。アメリカザクラＭｄｌ５配列に対する相同性が最も高いので、アーモンド由来の新規ＨＮＬ遺伝子をＨＮＬ５とした。ＰＲＯＳＩＴＥ配列モチーフデータベースで配列モチーフを検索したところ（ＧＣＧパッケージ、バージョン１０．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、米国ウィスコンシン州）、１３ヶ所のＮ−グリコシル化可能部位の存在が明らかになった（図３に示す）。
【００４１】
実施例４：
ＰＣＲスプライシングによるイントロンを含まないアーモンドＨＮＬ５遺伝子の取得
オーバーラップしたプライマーを用いる特別なＰＣＲ法を使って、４回の連続するＰＣＲ反応により、コード領域を互いに連結した（図２参照）。第１ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ１−１およびＰＣＲ１−２）では、それぞれプライマー対ＰａｍＨＮＬ５ｂ／ＰａｍＨＮＬ５ｃ（ＰＣＲ１−１）およびＰａｍＨＮＬ５ｄ／ＰａｍＨＮＬ５ｅ（ＰＣＲ１−２）を使ってエキソンＩＩおよびＩＩＩを増幅した。１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中の５０μｌＰＣＲ混合物は、各１００ｐｍｏｌの適当なプライマー、２．５Ｕの「Ｈｏｔｓｔａｒ」Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、５μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックス、テンプレートとして１０ｎｇのプラスミドｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｇを含有した。以下のプログラムを実行した：９５℃で１５分、次に９５℃で１分、６８℃で３０秒および７２℃で１分を３０サイクル、最後に完全な産物を製造するために７２℃で５分。アガロースゲルでの電気泳動による分離の後、Ｑｉａｅｘｌｌキットを使ってＰＣＲ１−１およびＰＣＲ１−２の産物をゲルから溶出させた。
【００４２】
第２ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ２）では、ＰＣＲ１−１の産物約５０ｎｇを各１００ｐｍｏｌのプライマーＰａｍＨＮＬ５ａ２およびＰａｍＨＮＬ５ｃで増幅して、上記第１ＰＣＲ産物を伸長させた。以下のプログラムを実行した：９５℃で１５分、次に９５℃で１分、６８℃で３０秒および７２℃で１分を３０サイクル、最後に完全な産物を製造するために７２℃で５分。他の条件はＰＣＲ１の場合と同じにした。電気泳動による分離の後、このＰＣＲ産物を同様にアガロースゲルで精製し、溶出させた。
【００４３】
第３ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ３）では、オーバーラップした末端を利用して、プライマーレスＰＣＲにより、ＰＣＲ１−２とＰＣＲ２の産物を互いに連結した（９４℃で１分、６８℃で３０秒および７２℃で１．５分を５サイクル、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中の５０μｌ混合物にＰＣＲ１−１およびＰＣＲ２の２つの産物それぞれ約１００ｎｇ、ｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックス５μｌおよび「Ｈｏｔｓｔａｒ」Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）２．５Ｕ）。
【００４４】
アーモンド  ｈｎｌ５コード遺伝子の全長が完成し、完成した産物を、各１００ｐｍｏｌのプライマーＰａｍＨＮＬ５ａ１およびＰａｍＨＮＬ５ｆを用いる第４ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ４）で増幅した。これらのプライマーはＰＣＲ３反応混合物に直接添加した。以下のプログラムを実行した：９５℃で１分、６３℃で３０秒、７２℃で１．５分を２０サイクル、最後に７２℃で５分。他の条件はＰＣＲ１の場合と同じにした。
【００４５】
最終ラウンドのＰＣＲで得た産物を分取用アガロースゲルで分画し、サイズが１．６〜１．８ｋｂのＤＮＡを「Ｑｉａｅｘｌｌ」キット（Ｑｉａｇｅｎ）でゲルから溶出させ、プラスミドｐＢＳＳＫ（−）にＥｃｏＲＩ切断部位を介してクローニングした。正しい制限パターンを持つクローンを選択し、配列決定した。コード領域の配列は、ゲノムＤＮＡ配列のエキソンと１００％同一だった。このクローンをｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｏｒｆと名づけた。
オリゴヌクレオチドプライマー：
【００４６】
【外１】
0004350930.tif 000002
実施例５：
細菌および真核生物におけるアーモンドＨＮＬ５遺伝子の異種発現用の発現プラスミドを構築するための基本断片の作成
この実験の目的は、様々な発現ベクターへの組み込みを目的としてアーモンドＨＮＬ５をコードするＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼ切断によって得ることができるプラスミドを構築することにあった。ここでは、ＰＣＲ増幅により、適当なプライマーを使って、ｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｏｒｆに含まれるアーモンド  ＨＮＬ５遺伝子の末端に、適切な配列を付加した。プラスミドｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｏｒｆのインサートを、プライマーＰＣＲＨＮＬ５−ａおよびＰＣＲＨＮＬ５−ｅを用いるＰＣＲによって増幅した（テンプレートとして１０ｎｇのプラスミドｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｏｒｆのＤＮＡ、４００ｎｇのプライマーＰＣＲＨＮＬ５−ａ、２００ｎｇのプライマーＰＣＲＨＮＬ５−ｅ）。ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に５μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックスおよび１．２Ｕの「Ｈｏｔｓｔａｒ」Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む５０μｌ混合物で行った。以下のプログラムを実行した：９５℃で１５分、次に９５℃で１分、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を３０サイクル、最後に完全な産物を製造するために７２℃で５分。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断した後、得られたＤＮＡ断片をベクターｐＢＳＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）にクローニングし、配列決定によって確認した。得られたプラスミドをｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｅｘと名づけた。
オリゴヌクレオチドプライマー：
【００４７】
【外２】
0004350930.tif 000003
実施例６：
ピキア・パストリスにおけるＨＮＬ５遺伝子の異種発現用の発現コンストラクトの構築
プラスミドｐＢＳＰａｍＨＮＬ５ｅｘのＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、分取用ゲル電気泳動によってＨＮＬ断片をベクター部分から分離した。Ｑｉａｅｘｌｌキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＨＮＬ断片ＤＮＡを溶出させた後、当該断片をプラスミドｐＨＩＬＤ２およびｐＧＡＰＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）にＥｃｏＲＩ切断部位を介してクローニングした。プロモーターに対するインサートの向きが正しいことを、対照切断片を使ってチェックした。それぞれ正しい向きのインサートを持つクローンを１つずつ選択し、保存した。ベクター部分から組み込まれたＨＮＬ断片への移行が正しいことを、配列決定によって確認した。形成されたピキア・パストリスにおける発現用の上記２つのプラスミドを、ｐＨＩＬＤＰａｍＨＮＬ５ａ（誘導性発現用）およびｐＧＡＰＰａｍＨＮＬ５ａ（構成的発現用）と名づけた。
【００４８】
実施例７：
ピキア・パストリスにおけるアーモンドＨＮＬ５遺伝子の誘導性発現
プラスミドｐＨＩＬＤＰａｍＨＮＬ５ａのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで切断し、ピキア・パストリスＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に形質転換した。形質転換はＰｉｃｈｉａ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のプロトコールに従って行った。１００個のヒスチジン原栄養クローンをＰｉｃｈｉａ発現キットのプロトコールに従って液体培地（５００ｍｌ振盪培養）で培養し、メタノールで４８時間誘導した。細胞を遠心分離によって取り出し、破砕緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）で光学密度（ＯＤ600）が５０．０になるように懸濁し、「ガラスビーズ法」（Ａｕｓｕｂｅｌら著「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９９９））に従って「Ｍｅｒｃｋｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ」ホモジナイザー（Ｂｒａｕｎ、ドイツ連邦共和国メルスンゲン）で破砕した。培養上清と細胞溶解液の両方をＨＮＬ酵素活性を（ＷＯ９７／０３２０４と同様の）標準的活性測定法により、マンデロニトリルラセミ体を基質として測定した。これらの振とうフラスコ実験で培養上清中に最もよい活性を示した２つのクローン（ピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ３７およびピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ４）を選択し、保存した。メタノール資化性のタイプを分析したところ、ピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ３７については表現型Ｍｕｔ□（良好なメタノール資化）、ピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ４については表現型Ｍｕｔs（遅いメタノール資化）が得られた。
【００４９】
実施例８：
ピキア・パストリスにおけるアーモンドＨＮＬ５遺伝子の構成的発現
プラスミドｐＧＡＰＰａｍＨＮＬ５ａをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。形質転換はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（米国カリフォルニア州サンディエゴ）のＰｉｃｈｉａ発現キットのプロトコールに従って行った。形質転換体は１００ｍｇ／ｌのゼオシンを含むＹＰＤ完全培地プレートから選択した。１００個のゼオシン耐性クローンをそれぞれ５００ｍｌのＹＰＤ完全培地で培養し、３０℃で９６時間振とう培養した。細胞を遠心分離によって除去し、培養上清のＨＮＬ活性を決定した。培養上清中に最もよい活性を示すクローンを保存し、ピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ２と名づけた。
【００５０】
実施例９：
アーモンドＨＮＬ５遺伝子で形質転換したピキア・パストリス株（メタノール誘導性発現系）を用いる実験室用バイオリアクターでのＨＮＬ生産
ピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ３７を標準的な実験室用バイオリアクター（総容量４２Ｌ）にて、三段階培養法で生育させた。この培養法は、基本的に組換えパラゴムノキＨＮＬの生産について記述された方法（Ｈａｓｓｌａｃｈｅｒ，Ｍ．、Ｓｃｈａｌｌ，Ｍ．、Ｈａｙｎ，Ｍ．、Ｂｏｎａ，Ｒ．、Ｒｕｍｂｏｌｄ，Ｋ．、Ｌｕｃｋｌ，Ｊ．、Ｇｒｉｅｎｇｌ，Ｈ．、Ｋｏｈｌｗｅｉｎ，Ｓ．Ｄ．、Ｓｃｈｗａｂ，Ｈ．著「熱帯ゴムノキパラゴムノキ由来のヒドロキシニトリルリアーゼの微生物宿主における高レベル細胞内発現（Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｎｉｔｒｉｌｅ  ｌｙａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｔｒｅｅ  Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｈｏｓｔｓ」  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）  １１，６１〜７１，１９９７）に従って、バイオマスを形成させるための第１対数増殖期および第２直線増殖期、ならびに組換えアーモンド  ＨＮＬ酵素を形成させるための後続の発現期からなった。詳しく述べると以下の条件に従った。まず、２０リットル分を計量して１５リットルの水に溶解した化学物質１〜８をバイオリアクターに投入し、リアクターごと１２１℃で１時間滅菌した。２９℃に冷却した後、培地のｐＨをアンモニア（化学物質９、まず滅菌注入ビンに投入）でｐＨ５．０に調節した。次に、滅菌ろ過した約２００ｍｌの微量元素溶液（化学物質１０〜１８、２０Ｌ分）を注入ビンからバイオリアクターに投入した。このようにして準備したバイオリアクターに、Ｐｉｃｈｉａ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のマニュアルに記載されている条件に従って振とうフラスコ中３０℃で培養しておいた２リットルの前培養物を接種した。培養は２９℃の一定温度で行なった。曝気（空気１５〜最大４０リットル／分）および撹拌機回転数（２５０〜５００ｒｐｍ）の制御により、Ｏ2分圧を飽和濃度の３０％より高い値に維持した。２１時間後にバイオマスは乾燥細胞量（ＤＣＭ）約２２ｇ／ｌの領域まで成長していた。この時点から、滅菌グリセロールを一定量に小分けして１５分間隔で計量供給し始め、１時間あたり１３０ｇのグリセロールを加えた。この第２直線的増殖期では、４２時間で約７０ｇ／ｌ  ＤＣＭというバイオマス濃度に到達することができた。次に、メタノールを計量供給して発現を誘導することにより、第３期を開始した。この場合、培養ブロスのメタノール含量は、０．８〜１重量％の間に調節した。誘導開始時と２日間の誘導後に、それぞれ滅菌微量元素溶液（化学物質１０〜１８、２０Ｌ分を約２００ｍｌの水に溶解したもの）を追加した。１１０時間の誘導期間後に、１１０Ｕ／ｍｌ培養ブロスという酵素量を得ることができた。細胞を例えば遠心分離などによって除去すると、生体触媒変換に直接使用できる粗製酵素調製物を得ることができる。
【００５１】
培養培地の調製には以下の化学物質を使用した（１リットルあたりの量）：
１．８５％オルトリン酸  ２１ｍｌ
２．ＣａＳＯ4  ０．９ｇ
３．Ｋ2ＳＯ4  １４．３ｇ
４．ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １２．２ｇ
５．ＫＯＨ
（化学物質１〜５は分析用試薬）
６．グリセロール（工業用試薬）  ５０ｍｌ
７．脱イオン水（家庭用、導電率５．５〜９．１μＳ／ｃｍ）
８．消泡剤  １０％Ａｃｅｐｏｌ  ８３Ｅ（Ｃａｒｌ  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ハンブルク）  １ｍｌ
９．２５％アンモニア（工業用試薬）
微量元素およびビタミンＨ（全て分析用試薬）：
１０．ビオチン  ０．８ｍｇ
１１．ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ２４．０ｍｇ
１２．ＫＩ  ０．３２ｍｇ
１３．ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ  １２．０ｍｇ
１４．Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ  ０．２ｍｇ
１５．Ｈ3ＢＯ3  ０．０８ｍｇ
１６．  ＣｏＣｌ2  ２．０ｍｇ
１７．ＺｎＳ０4・７Ｈ2Ｏ  ８０ｍｇ
１８．Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２６０ｍｇ。
【００５２】
実施例１０：
アーモンドＨＮＬ５遺伝子をクロコウジカビグルコースオキシダーゼのＮ末端部分およびＣ末端部分との融合タンパク質として発現させるためのクローンの構築
この構築は、形成される融合タンパク質が異種シグナル配列によって分泌経路に送り込まれるように設計した。
【００５３】
１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に各１００ｐｍｏｌのプライマーＧｌｕｃｏｘ２およびＧｌｕｃｏｘｃｔ、テンプレートとして１０ｎｇのプラスミドｐＰａｍＨＮＬ５ｏｒｆ、５μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックスおよび１．２Ｕの「Ｈｏｔｓｔａｒ」Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む５０μｌ混合物でのＰＣＲで、ＨＮＬ５遺伝子のＣ末端およびＮ末端をグルコースオキシダーゼ由来の配列で置き換え、それぞれ短縮した（プログラム：９５℃１５分、（９５℃１分、６８℃１分、７２℃２分）×３０、最後に７２℃１０分）。最後に、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中にテンプレートとして第１ＰＣＲの産物０．１μｌ、各１００ｐｍｏｌのプライマーＧｌｕｃｏｘ１およびＧｌｕｃｏｘｃｔ、２μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックスならびに２．５ＵのＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・マンハイム）を含む５０μｌ混合物で行った第２ＰＣＲ（プログラム：９５℃５分、（９５℃１分、６８℃０．５分、７２℃３分）を３０回、最後に７２℃３分）で、遺伝子の５'領域を完成させた。
上記ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ切断後のプラスミドｐＨＩＬＤ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に、ＤＮＡ断片の両端を同時に導入されたＥｃｏＲＩ切断部位を使って組み込んだ。ベクターからインサートへの移行領域を配列決定することによってプラスミドｐＨＩＬＤ２のａｏｘプロモーターに対するインサートの向きが正しいクローンを確認し、保存した。このようにして構築したプラスミドをｐＨＩＬＤＰａｍＨＮＬ５ｇｏｘと名づけた。Ｎｏｔ１で直線状にしたプラスミドｐＨＩＬＤＰａｍＨＮＬ５ｇｏｘのＤＮＡをピキア・パストリス  ＧＳ１１５株に形質転換すると共に、プロテアーゼ欠損株ピキア・パストリス  ＳＭＤ１１６８にも形質転換した。各混合物から、いくつかのヒスチジン原栄養クローンを振とうフラスコで培養し、培養上清のＨＮＬ活性を決定した（標準測定法）。これらの実験は実施例７の説明と同様に行った。一部のクローンの培養上清にＨＮＬ活性を見出すことができたことから、クロコウジカビｇｏｘ遺伝子のシグナル配列は、ピキア・パストリスで発現させた場合に、異種ＨＮＬ５タンパク質を分泌経路に送り込む能力を持つと言うことができる。
使用したオリゴヌクレオチドプライマー
【００５４】
【外３】
0004350930.tif 000004
ＨＮＬ活性を持つ分泌ハイブリッドタンパク質（ＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸ）のＤＮＡ断片の核酸配列を図４に記載し、そこから導き出されるアミノ酸配列を図５に示す。アーモンドＨＮＬ５とハイブリッドタンパク質ＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸのアミノ酸配列の比較を図６に示す。
【００５５】
実施例１１：
ＨＮＬ活性を持つ組換えタンパク質（実施例９に述べたように組換え株ピキア・パストリスＰａｍＨＮＬ５−ａ３７を使って生産したもの）をエンドグリコシダーゼ消化による糖鎖形成分析にかけた。この目的のために、１００ｍｌの培養上清を限外ろ過（Ｂｉｏｍａｘ  ３０，０００ＮＭＷＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）によって１０倍に濃縮した。試料１〜２はＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−グリコシダーゼＦキット、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・マンハイム）で処理した。試料４〜５にはＲｏｃｈｅ製アーモンド由来ＨＮＬ調製物を使用し、試料６および７については、濃縮培養上清をエンドグリコシダーゼＨ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｃｓ、ドイツ・マンハイム）で処理した。混合物は全て、総体積１０μｌで行った。
標準物質：Ｎ−グリコシダーゼＦキットの分子量標準物質（５μｌ＝５μｇ）
試料１：上記キットのプロトコールに従って２．４Ｕの酵素で処理した２ＵのＰａｍＨＮＬ５
試料２：上記キットのプロトコールに従って２．４Ｕの酵素で処理した２ＵのＰａｍＨＮＬ５。ただし変性緩衝液を使用せず、熱変性を行わなかった。
試料３：無処理の２ＰａｍＨＮＬ５
試料４：上記キットのプロトコールに従って２．５ＵのＮ−グリコシダーゼＦで処理したアーモンド由来Ｒｏｃｈｅ製９Ｒ−ＨＮＬ調製物（グレードＩＩＩ）（１０．３Ｕ／ｍｇ）０．２５Ｕ
試料５：無処理のＲｏｃｈｅ製調製物（グレードＩＩＩ）（１０．３Ｕ／ｍｇ）０．２５Ｕ
試料６：２．４ＵのＰａｍＨＮＬ５を、変性を行わずに２０ｍＭリン酸緩衝液中３７℃で１２時間、５０ｍＵのエンドグリコシダーゼＨと共に培養した。
試料７：２．４ＵのＰａｍＨＮＬ５を、２０ｍＭリン酸緩衝液、０．２％ＳＤＳ、０．４％メルカプトエタノール中、３７℃で１２時間、５０ｍＵのエンドグリコシダーゼＨと共に培養した。
【００５６】
グリコシダーゼによる処理の後、試料を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００５７】
これらの結果（図７参照）から、ＰａｍＨＮＬ５に結合しているオリゴ糖の大部分は、ＰａｍＨＮＬ５タンパク質を変性させなくても、エンドグリコシダーゼＨによって除去できることがわかる。オリゴ糖の切断除去により、７０〜１００ｋＤａ超のサイズ範囲に見えたタンパク質スメアが、非グリコシル化ＰａｍＨＮＬ５タンパク質の分子量計算値に一致する約６０ｋＤａの明瞭なバンドになる。Ｒｏｃｈｅ調製物には相当するタンパク質バンドが存在しないか、無視できる程度にしか存在しない。また、無処理タンパク質調製物とエンドグリコシダーゼＦで処理した調製物との間に有意な相違を認めることもできない。この知見から、組換えＰａｍＨＮＬ５酵素はアーモンドから得られる酵素物質とはまったく異なると断定することができる。
【００５８】
実施例１２：
アーモンドＨＮＬ１遺伝子のコード領域を含むゲノムＤＮＡ断片のクローニング
プライマーｍａｎｄｌｐ２ｆ（５'−ＡＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣ−３'）およびｅｃｐａｍＨＮＬ１ｅ（５'−ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＴＧＣＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣ−３'）を用いるＰＣＲによって、アーモンド  ＨＮＬ１遺伝子のコード領域を含むゲノムＤＮＡ断片を、アーモンドゲノムＤＮＡ（調製法については実施例１参照）から増幅した。増幅は、標準ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）中に１．２単位の「Ｈｏｔｓｔａｒ」ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）、各１０ｐｍｏｌの上記２つのプライマー、２μｌのｄＮＴＰミックス（各５ｍＭ）および１００ｎｇのアーモンドゲノムＤＮＡを含む５０μｌ反応液で行った。以下のＰＣＲプログラムを使用した：９５℃で１５分、次に９４℃で１分、４５℃で１分および７２℃で１分２０秒を１０サイクル、続いて９４℃で１分、６４℃で１分および７２℃で１分２０秒を３０サイクル、そして７２℃で５分の最終伸長工程。得られたＤＮＡを分析したところ、このＰＣＲはサイズが異なる多数のＤＮＡ断片をもたらすことがわかった。増幅されたＤＮＡを分取用アガロースゲルで分離した。約２．１ｋｂのＨＮＬ１遺伝子に予想されるサイズを持つバンドのＤＮＡを上記アガロースゲルから単離した（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）。得られたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによる消化後に、クローニグベクターｐＢＳＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州ラホーヤ）に、ＥｃｏＲＩ切断部位を介してクローニングした。適当なインサートを持つ５つのクローンを単離し、そのインサートをプライマーウォーキング法によって配列決定した。このようにして得たコンセンサス配列に相当するクローンを選択し、含まれているプラスミドをｐＳＫｐａｍＨＮＬ１＿５＿３と名づけた。アーモンドＨＮＬ１遺伝子のＤＮＡ配列を確認し、プライマーｍａｎｄｌｐ３ｆ（５'  ＡＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧ−３'）およびｐａｍＨＮＬ１ｅｎｄ（５'−ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＧＡＡＴＣ−３'）を使って別のゲノムＤＮＡ断片を増幅することによって、最終的に決定した。増幅は、標準ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）中に２．５単位の「Ｈｏｔｓｔａｒ」ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）、各１０ｐｍｏｌの上記２つのプライマー、２μｌのｄＮＴＰミックス（各５ｍＭ）および５０ｎｇのアーモンドゲノムＤＮＡを含む５０μｌの反応液で行った。以下のＰＣＲプログラムを使用した：９５℃で１５分、次に９４℃で１分、５５℃で３０秒および７２℃で２分を５サイクル、次に９４℃で１分、６８℃で３０秒および７２℃で２分を３０サイクル、そして７２℃で７分の最終伸長工程。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分画したところ、単一のＤＮＡバンドが検出された。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）を使って精製し、プライマーウォーキング法によって直接配列決定した。そのＤＮＡ配列を図８に記載する。推定イントロンは、それらの一般的５'および３'スプライス部位およびアメリカザクラＨＮＬ１遺伝子に対する相同性によって同定した。イントロン領域を明らかにするために３つのイントロン領域にあるヌクレオチドを小文字で示す。プラスミドｐＳＫｐａｍＨＮＬ１＿５＿３にクローニングされたインサートは同じ配列を持つ。アーモンドＨＮＬ１タンパク質のタンパク質配列を上記ＤＮＡ配列のコード領域から導き出した。これを図９に記載する。
【００５９】
実施例１３：
オクタナール０．５ｇ（３．９ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６ｍｌに溶解し、実施例９で得た組換えＲ−ＨＮＬを含む酵素水溶液（ｐＨ３．８）を加えた。シアン化水素酸０．３３ｍｌ（８．４ｍｍｏｌ）を添加した後、得られた混合物をエマルジョンが形成されるように磁気撹拌機を使って室温で激しく撹拌し、シクロデキストリンカラムによるＧＣで、反応を追跡した。３時間の反応時間後に、シアノヒドリンが８１．１％ｅｅおよび変換率４８％で生成した。
【００６０】
実施例１４：
組換えＲ−ＨＮＬ（３４単位／ｍｍｏｌアルデヒド）を含む酵素水溶液８０ｍｌ（３４単位／ｍｍｏｌアルデヒド）を２００ｍＭリン酸カリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）１０ｍｌで希釈し、あらかじめ１０℃に冷却しておいた２−クロロベンズアルデヒド４２．２ｇ（３００ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル４２ｍｌの溶液に加えた。次に、その反応混合物に、シアン化水素酸１９．６ｍｌ（５０１ｍｍｏｌ）を９５０ｒｐｍで撹拌しながら４０分以内に計量供給した。シアノヒドリンを塩化アセチルで誘導体化した後、シクロデキストリンカラムによるＧＣを使って反応の経過を追跡した。
【００６１】
【表１】
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比較例：
Ｒ−オキシニトリラーゼ溶液（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１０、２１８７単位／ｍｌ）０．２５〜１ｍｌを５０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で４ｍｌに希釈し、必要に応じてその酵素溶液のｐＨを数滴のクエン酸溶液でｐＨ４．０に調節した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル３ｍｌおよび２−クロロベンズアルデヒド０．８ｇ（５．６９ｍｍｏｌ）の溶液を上記の溶液に加え、次にシアン化水素酸４４５μｌ（１１．３８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温にて磁気撹拌機により９００ｒｐｍで撹拌した。
【００６２】
生成した（Ｒ）−シアノヒドリンの変換率およびエナンチオマー純度はＧＣで分析した。この目的のために、反応溶液の試料を遠心分離し、有機相５０μｌをジクロロメタンで希釈した。塩化アセチルで誘導体化した後、シクロデキストリンカラムによるガスクロマトグラフィー分析を行った。
【００６３】
【表２】
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この比較実験により、実施例１３と同様に本発明の組換えタンパク質を使用した場合、同等なエナンチオマー純度（ｅｅ値）を達成するのに必要な量は、天然タンパク質の必要量のわずか１／１０であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＣＲ増幅によって得られるアーモンドＨＮＬ５遺伝子のヌクレオチド配列である。
【図２】図２はイントロンを含まないアーモンドＨＮＬ５遺伝子のコード領域をＰＣＲによって作成する方法を表す模式図である。
【図３】図３はＨＮＬ５遺伝子のヌクレオチド配列から導き出されるアーモンドヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ５）のアミノ酸配列である。
【図４】図４はアーモンドＨＮＬ５遺伝子の配列とクロコウジカビグルコースオキシダーゼ遺伝子の配列とからなる、ＨＮＬ活性を持つ分泌ハイブリッドタンパク質（ＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸ）をコードするＤＮＡ断片の核酸配列である。
【図５】図５は核酸配列（図４）から導き出されるハイブリッドタンパク質ＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸのアミノ酸配列である。
【図６】図６はアーモンドＨＮＬ５とハイブリッドタンパク質ＰａｍＨＮＬ５ｘＧＯＸのアミノ酸配列の比較である。
【図７】図７はＳＤＳ  ＰＡＧＥによるＨＮＬ調製物の分析である。
【図８】図８はＰＣＲ増幅によって得られるアーモンドＨＮＬ１遺伝子のヌクレオチド配列である。
【図９】図９はＨＮＬ１遺伝子のヌクレオチド配列から導き出されるアーモンドヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ１）のアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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