(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
開口を有する管の形態の支持体、およびフィルターおよび／または吸着剤として微孔質エレメントを含んでなるフィルターデバイスの製造方法であって、該微孔質エレメントが、以下の工程：
ａ）該開口へ物質を加えること；および
ｂ）その物質の少なくとも一部を多孔質形態に凝固させること
を含んでなる製造過程によって該支持体内において該開口の横断面上に形成される、方法。
【請求項２】
物質が液相で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液相が溶媒中のポリマーの溶液または懸濁液であり、多孔質形態での凝固がポリマーに対する非溶媒の作用により引き起こされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリマーが、ポリビニルエステル、部分的に脱アシル化されたポリビニルエステル、セルロース誘導体、ポリアミド、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリマーが、親水性および疎水性セグメントの両方をその分子内に含んでいる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ポリマーが、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリ（ビニルアルコール−コ−酢酸ビニル）、エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンアクリル酸エステルコポリマー、エチレンアクリルアミドコポリマー、アクリル酸酢酸ビニルコポリマー、アクリルアミド酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸ジアミンモノアミドと酢酸ビニルのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール−コ−スチレン）、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸）およびそのグリセリンエステル誘導体、アクリルアミドアクリル酸エステルコポリマー、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、ギ酸、酢酸、２，２，２−トリクロロエタノール、トルエン、テトラヒドロフランおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
溶媒が少なくとも２つの揮発性の非溶媒からなる、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒が、室温でまたは真空下で除くことが可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凝固が、溶媒および／または非溶媒を蒸発させることによって達成される、請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
非溶媒が、水、炭素原子数１〜４のアルコール、アンモニア、酢酸エチル、アセトン、エチレンジアミン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
液相がヒドロコロイドである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
ヒドロコロイドが、低融点アガロース、デンプン、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロコロイド溶液の層を四ホウ酸ナトリウムによる架橋に付す、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
凝固したヒドロコロイドを乾燥および／または架橋させる、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
液相が１またはそれ以上のモノマーの溶液または懸濁液であり、凝固が該モノマーを重合させることによって引き起こされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
モノマーが溶媒中に存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
モノマーが１またはそれ以上の架橋用モノマーを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
該モノマーがジアミンおよびポリエポキシドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
モノマーがビニルエステル、アクリル酸およびその誘導体からなる群から選択され、重合がフリーラジカルの作用の下で引き起こされる、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーを析出させるために、使用する溶媒と混和する非溶媒を混合させる、請求項３〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
物質に、使用する溶媒と混和しない非溶媒を浸透させる、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
非溶媒がシリコーンオイル、水または空気である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
物質に、可逆性ヒドロゲル、または２０℃を超える温度で水に不溶性である 液体を浸透させる、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
物質が熱可塑性ポリマーであり、凝固が 加熱または溶媒の作用による焼結よって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ポリマーが、スチレンマレイン酸コポリマーまたはポリ酢酸ビニルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
物質が、さらに０．０１μｍ〜５００μｍのサイズの多孔質または非孔質の固体微粒子を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
該微粒子が、 最終の微孔質エレメントの吸着特性を改変する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記吸着特性が、イオン交換クロマトグラフィー、シリカゲルの吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーに有用な改変を有する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該微粒子が、イオンを閉じ込めることができる、固体の支持体に選択的に結合することができる、あらかじめ選択された抗原決定基に結合することができる、またはリガンドであることができる、エフェクター分子を含む、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
該分子が、アミノ酸または核酸配列、酵素、毒素、レセプター、結合部位、成長因子、細胞分化因子、サイトカイニン、ホルモン、または抗代謝物質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該分子が、アミノ酸、核酸またはその類縁体もしくは誘導体の配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
イオンを閉じ込めることができる分子が、カルモジュリン、メタロチオネイン、その断片、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンのうちの少なくとも１つに富むアミノ酸配列である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
該あらかじめ選択された抗原決定基に結合することができるエフェクター分子が、抗体または断片またはその誘導体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
固体の支持体に選択的に結合することができる分子が、ＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｌｅｘ−Ａである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
リガンドがＮｉ−ＮＴＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記 物質が開口の横断面上に自己支持的な層を形成する、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
支持体が中空で水分不浸透性である、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
支持体が、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミド、ガラス、セラミック、水晶、窒化ケイ素、またはそれらの混合物、またはそれらの、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料から形成される、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
微孔質エレメントがその管の一端またはその端の近くで生成する、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
その管の少なくとも一断面が、小さい横断面と大きい横断面の端を有する円錐状の形態であり、微孔質エレメントが小さい方の横断面の端またはその近くで生成する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
物質を開口に加える工程が、該物質を含有する液体を毛管作用によって管の中を上昇させることにより行なわれる、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
管の内壁が親水性コーティングで被覆されている、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
微孔質エレメントに隣接する管の端が親水性コーティングされずに保たれている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
コーティングが、有機溶媒中の１またはそれ以上のポリビニルエステルまたはポリ（スチレン−コ−マレイン酸）のポリオール誘導体の溶液を管の内壁に塗布し、有機溶媒を蒸発させることにより形成される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
支持体の開口の直径が０．０２ｍｍ〜４ｍｍである、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
物質を保持体に加える、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
保持体が微孔質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
微孔質保持体が、お互いに連結した固体粒子を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
微孔質保持体が、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミド、ガラス、セラミック、水晶、窒化ケイ素、またはそれらの混合物、ステンレススチール、またはそれらの、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料から形成される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
微孔質保持体が、ディスク、格子、大孔径の膜、支持繊維を有する膜、織布または不織布の性質を有する膜、ネット、プレート、棒および／または先端が切り取られた円錐の形態である、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
微孔質保持体の上に少なくとも１つの微孔質膜を配置する工程をさらに含む、請求項４８〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
微孔質膜が、（再生された）セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から形成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該保持体 が凝固後に取り除かれる、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれかに記載の方法にしたがって得られるフィルターデバイス。
【請求項５６】
物質が、微孔質保持体の外側表面の少なくとも１部分に付着している、請求項４８〜５１のいずれかの方法に従って得られるフィルターデバイス。
【請求項５７】
微孔質保持体が、その孔において、流体がフィルターエレメントを流れることが可能な流路を形成する空間が残るように物質を含んでいる、請求項５５または５６に記載のフィルターデバイス。
【請求項５８】
微粒子の平均直径が、孔の平均直径の５０％未満である固体の微粒子を含んでなる、請求項２７〜３７のいずれかの方法にしたがって得られるフィルターデバイス。
【請求項５９】
請求項５５〜５８のいずれかに記載の複数の本発明のフィルターデバイスを含んでなる多重流路フィルターデバイス。
【請求項６０】
マイクロ濾過、固体−液体分離、溶液の清浄化、原核および真核細胞の回収、細胞断片および破片の除去および精製、断片、ウイルスおよびプラスミドの固定化、タンパク質、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチドの吸着／固定化のための、または粒状物質の保持体としての、請求項５５〜５９のいずれかに記載のフィルターデバイスの使用。
【請求項６１】
アフィニティークロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィー のため、結合試験のため、多成分が結合した複合体の分離、試料のスクリーニングのため、または微粒子の脱離を防止するための、請求項５５〜５９のいずれかに記載のフィルターデバイスの使用。
【請求項６２】
核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、またはポリサッカライド、タンパク質、有機化合物、またはそれらの誘導体もしくは類縁体含む化合物の調製および／または検出のための、請求項６０または６１に記載の使用。
【請求項６３】
該化合物が天然または非天然の供給源に由来する、請求項６２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、微孔質エレメントの新規の製造方法およびその方法によって得ることができる微孔質エレメントに関する。本発明はさらに固体微粒子を提供し、該固体微粒子は好ましくは微孔質エレメントの吸着特性を改変する。さらに、支持体および/または保持体に連結する微孔質エレメントならびにその製造方法も記載する。本発明はさらに、上記微孔質エレメントを含むフィルターエレメントに関する。さらに、本発明は、上記微孔質またはフィルターエレメントを含むキット、診断用および医薬用組成物に関する。さらに、本発明は、上記微孔質およびフィルターエレメントの、有機および無機化合物のマイクロ濾過、クロマトグラフィー、吸着／固定化における使用、並びにそのような化合物の調製および／または検出のための使用に関する。
分析化学の分野において、迅速で、回収率が高く、試料汚染のいかなる可能性も最低限にするという方法で中〜少容量の試料を取り扱うことができる装置に対する要請が高まっている。そのほかに望ましい特性としては、コストが安く、製造が容易で、慣用的な装置との適用についての適合性がある。マイクロ濾過などのための従来の装置は、あらかじめ形成されたフィルター材を必要としている。ナイロン、メタクリルレート等の合成ポリマー、またはニトロセルロースまたは酢酸セルロース等の半合成ポリマーは、数十年間に渡って使用されてきた。フィルター材の大部分は、合成のまたは天然の繊維のウェブから形成される不織布である。繊維は、バインダーによって互いに結合していることもしていないこともある。一般的に、ディスクを不織布からカットして試料チューブなどの内部に配置する。従来の方法に関する問題点には、あらかじめカットされたフィルターディスクとフィルターチューブの壁との不充分な接触によって小さな隙間ができ、流した液体試料が漏れるということがある。
このような状況においては、フィルターディスクを接着剤でフィルターチューブに付けることができる；さらにまたは別の方法として、フィルターディスクを局所的な加熱または超音波処理によってフィルターチューブ内へ溶接することができる。フィルターディスクを接着剤によりフィルターチューブに付ける場合、接着剤はその物質のフィルター特性に対して制御ができないような影響を及ぼすことがある。フィルターディスクを局所的な加熱または超音波処理によってフィルターチューブ内へ溶接する場合もそうである。フィルターエレメントの全体としてのサイズが小さくなれば、上記した問題は大きくなる。したがって、口径が数μｍ程度に小さい開口を有する満足のゆくフィルターエレメントを製造することは、これまで技術的に不可能であった。
粒状の吸着性微粒子を含む吸着フィルターを使用する場合、液体の処理中、さらに輸送中にも位置が変わること（dislocation）の問題が起こり得るであろう。したがって、微粒子は、フィルターエレメントの多孔質の両側の、例えば、フリット、ネット、環状のまたは溝状の保持体等の２つのconfining（閉じ込め用）多孔質材料の間に保持される。テフロンまたはガラスの繊維の間に包埋される場合でさえ、上部の多孔質保持体と下部の支持用フリット、ネット、または溝状のエレメントは必要であろう。
このように、本発明の根元的な技術的課題は、微孔質エレメントを製造するための費用効果の高い方法を提供することであり、その方法は、分析用またはマイクロ調製用の液体クロマトグラフィーの大部分の方式に、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シリカゲルの吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィーなどに、結合試験については多重成分が結合している複合体の分離に、試料のスクリーニングに、または微粒子の位置が変わることを防止するために応用でき、選択された適当な技術の適用、生物学的適合性の表面を提示することによるペプチド、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリサッカライド、またはそれらの誘導体のような生体高分子の非特異的な損失の回避、および高価な微粒子を非常に少ない量で使用することによるコストの抑制によって改善され単純化することができる。さらに分離された物質のフィルターからブロッティング膜への移動は、デッドボリュームの問題を有することなく可能である。その技術的課題の解決手段は、請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することによって達成される。
したがって、本発明は微孔質エレメントを製造するための方法に関し、その方法は、以下の工程、
ａ）物質を与えること；および
ｂ）その物質の少なくとも一部を多孔質形態に凝固させること
を含む。
本発明において、「多孔質形態に凝固」なる語は、生成物が空隙を含むことを意味する。
本発明の方法の好ましい態様では、物質は液相として存在する。該液相は、好ましくは溶媒中のポリマーの溶液または懸濁液であり、多孔質形態での凝固は好ましくはポリマーに対する非溶媒の作用により起こす。
本発明の目的にからすると、「ポリマー」なる語は、同一かまたはそうでない小さな単純な分子の組合わせからそれ自身ができている大きな分子（即ちホモポリマーおよびコポリマー）から構成された天然または人工の物質を意味する。本発明のポリマーには樹脂も含まれる。
好ましい態様では、ポリマーは、ポリビニルエステル、部分的に脱アシル化されたポリビニルエステル、セルロース誘導体、ポリアミド、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、該ポリマーは親水性および疎水性セグメントの両方をその分子内に含んでいる。
本発明の方法の特に好ましい態様では、ポリマーは、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリ（ビニルアルコール−コ−酢酸ビニル）、エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンアクリル酸エステルコポリマー、エチレンアクリルアミドコポリマー、アクリル酸酢酸ビニルコポリマー、アクリルアミド酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸エチレンジアミンモノアミドと酢酸ビニルのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール−コ−スチレン）、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸）およびそのグリセリンエステル誘導体、アクリルアミドアクリル酸エステルコポリマー、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
本発明の方法の別の好ましい態様では、溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、ギ酸、酢酸、２，２，２−トリクロロエタノール、トルエン、テトラヒドロフランおよびそれらの混合物からなる群から選択される。
さらに好ましい態様では、溶媒は、少なくとも２つの揮発性の非溶媒からなる。好ましくは、該溶媒は室温でまたは真空下で除くことができる。
本発明のさらに好ましい方法では、凝固は、溶媒および／または非溶媒を蒸発させることによって達成する。好ましくは、非溶媒は、水、炭素原子数１〜４のアルコール、アンモニア、酢酸エチル、アセトン、エチレンジアミン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
本発明の方法のさらに別の態様では、液相はヒドロコロイドである。
好ましい態様では、ヒドロコロイドは、低融点アガロース、デンプン、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
さらに好ましい態様では、ヒドロコロイド溶液の層を四ホウ酸ナトリウムによる架橋に付す。
別の好ましい態様では、凝固したヒドロコロイドを乾燥および／または架橋させる。
本発明の方法の別の態様では、液相は１またはそれ以上のモノマーの溶液または懸濁液であり、凝固は該モノマーを重合させることによって起こす。
好ましい態様では、モノマーは溶媒中に存在する。好ましくは、モノマーには、１またはそれ以上の架橋用モノマーが含まれる。
特に好ましい態様では、該モノマーにはジアミンおよびジエポキシドが含まれる。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、モノマーは、ビニルエステル、アクリル酸およびその誘導体からなる群から選択され、重合はフリーラジカルの作用の下で起こす。
本発明の更なる態様では、物質は、流路形成流体（Channel-spearing fluid）または可逆性ヒドロゲル、または２０℃以上で水に対して不溶性である４０００ダルトンまたはそれ以上のポリプロピレングリコールなどの液体によって浸透させる。好ましくは、流路形成流体は、シリコーンオイル、水または空気である。
本発明の方法の別の態様では、物質は熱可塑性ポリマーであり、例えば加熱または溶媒の作用による焼結（sintering）よって凝固を起こさせる。好ましくは、ポリマーは、スチレンマレイン酸コポリマーまたはポリ酢酸ビニルである。
本発明の方法の更なる態様では、物質には、好ましくは０．０１μｍ〜５００μｍのサイズの固体微粒子がさらに含まれる。サイズ、多孔性および吸着特性に関して、１つの多孔質エレメントが、層状に固定化されていてもよい異なる種類の微粒子から構成されていてもよい。吸着性粒子などの微粒子は、商業的に入手できる。あるものは、リン酸カルシウム、シリカゲルまたはケイ素の酸化物、アルミニウム、チタン、ジルコニウムなどの無機材料から作られるか、またはイオン交換クロマトグラフィーのための陰イオンおよび陽イオン性の基または逆相および疎水性相互作用クロマトグラフィーのための疎水性の基を与える有機ポリマーの表面層を有する微孔質の無機のコアからなる。微粒子は、それらが、タンパク質、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリサッカライドおよび他の有機物質のアフィニティークロマトグラフィーの特異的な結合の要求を満たすように誘導体化することができる。例えば抗体、アビジンおよびレクチンに加えて、共有結合またはタグ結合などの非共有結合により、これら物質自身を使用してアフィニティーマトリックスを形成することができる。
好ましい態様では、物質および微粒子は、低粘度の非溶媒中の懸濁液として存在する。
前記物質および前記微粒子は、例えば貧溶媒中での非常に希薄な溶液からの蒸発により、またはポリマー溶液なしで代わりに部分的溶融ポリマーのみを使用して１３０℃までの中程度の温度で焼結させることにより凝固させることができる。
本発明の上記方法の好ましい方法では、前記微粒子は、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シリカゲルの吸着クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーに有用な最終の微孔質エレメントの吸着特性を改変する。
本発明の方法の更なる態様では、微粒子をあらかじめ選択された特性を有するように設計する。即ち、微粒子は、例えばエフェクター分子含んでいてもよい。そのような分子の例には、造影剤として使用するのに適当な分子を作る、イオンを封鎖するように設計されたアミノ酸配列、および例えばアフィニティークロマトグラフィーおよび固相イムノアッセイにおいて使用するための微粒子の固定化を助長するように設計された配列が含まれる。そのような分子の別の例は生物学的に活性なエフェクター分子、即ち、生物学的および／または酵素的活性に適したコンフォメーションを有するタンパク質、例えば酵素、毒素、レセプター、結合部位、成長因子、細胞分化因子、サイトカイニン、ホルモン、または抗代謝物質などである。
好ましい態様では、前記微粒子は、イオンを封鎖することができる、固体の支持体に選択的に結合することができる、あらかじめ選択された抗原決定基に結合することができる、またはリガンドであることができる、エフェクター分子を含んでいる。例えば、前記分子は、酵素または間接的に検出可能な部分および／またはアミノ酸、核酸またはその類縁体もしくは誘導体の配列を含んでいてもよい。
好ましくは、イオンを封鎖することができる前記分子は、カルモジュリン、メタロチオネイン、その断片、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンのうちの少なくとも１つに富むアミノ酸配列であり、あらかじめ選択された抗原決定基に結合することができる前記エフェクター分子は、抗体または断片またはその誘導体である。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体並びにＦab、ＦｖまたはscＦｖ断片などの抗体断片である。モノクローナル抗体は、例えば
0004387462.tif 000002
にはじめて記載されている技術によって製造することができる。その文献にはマウスメラノーマ細胞と免疫された哺乳類由来の脾臓細胞との融合が記載されている。さらに、抗原に対する抗体またはその断片は、例えばHarlowおよびLane,“Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載されている方法を使用することにより得ることができる。これらの抗体は、例えば所望の抗原の免疫沈降および免疫局在、並びに例えば組換え生物におけるそのような抗原の存在の監視、およびその抗原と相互作用する化合物の同定に使用することができる。例えば、BIAcoreシステムで用いられるような表面プラスモン共鳴を本発明の微孔質エレメントと組合わせて、ファージ抗体選択の効率を上げて、その抗原のエピト−プに結合するファージ抗体の単一のライブラリーからアフィニティーの大きい増加を得ることができる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7（1996）, 97-105; Malmborg. J. Immunol. Methods 183（1995）, 7-13）。
さらに、固体の支持体に選択的に結合することができる前記分子は、例えばＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｌｅｘ−Ａ、ＭＢＰおよびそのリガンド例えばＮｉ−ＮＴＡであり得る。
本発明の方法の更なる態様では、物質は自己支持的であって支持体に加えられる。
本発明の「支持体」は、例えば、好ましくは自己支持的な層をその開口の横断面上に形成するように物質を加えるのに適した開口の形状であり得る。
好ましくは、支持体は、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミド、ガラス、セラミック、水晶、窒化ケイ素、またはそれらの混合物、またはそれらの、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料から形成される。
好ましい態様では、支持体は管の形態であり、微孔質エレメントはその管の一端またはその端の近くで形成する。好ましくは、その管の少なくとも一断面は、小さい横断面と大きい横断面を有する円錐状の形態であり、微孔質エレメントは小さい方の横断面の端またはその近くで形成する。
本発明の方法の好ましい態様では、溶液を開口に加える工程は、溶液を毛管作用によって管の中を上昇させることにより行う。
管の内壁は、親水性コーティングで被覆することができるが、微孔質エレメントに隣接する管の端は親水性コーティングされずに保たれているかまたはそうでなくてもよい。好ましくは、コーティングは、有機溶媒中の１またはそれ以上のポリビニルエステルの溶液を管の内壁に塗布し、有機溶媒を蒸発させ、生じたポリビニルエステルの層をその表面で部分的に加水分解することにより形成する。
支持体の口径は、０．０２ｍｍ〜４ｍｍであり得る。
本発明の方法の別の態様では、物質を保持体に加える。
好ましくは、保持体は微孔質である、および／または固体粒子はお互いに連結している。
好ましい態様では、微孔質保持体は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミド、ガラス、セラミック、水晶、窒化ケイ素、またはそれらの混合物、ステンレススチール、またはそれらの、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料から形成される。
前記微孔質保持体は、好ましくはディスク、格子、大孔の膜、支持繊維を有する膜、織布または不織布の性質を有する膜、ネット、プレート、棒および／または先端が切り取られた円錐の形態である。
微孔質エレメントは支持体の中で生じさせるのが有利である。
上記方法の好ましい態様では、支持体は中空で水分不浸透性である。
本発明の方法の好ましい態様では、微孔質保持体の上に少なくとも１つの微孔質膜を配置する工程をさらに含む。好ましくは、微孔質膜は、（再生された）セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、テフロン（登録商標））から形成されている。
本発明の方法の別の好ましい態様では、前記保持体および／または前記支持体は凝固後に取り除かれる。
さらに、本発明は、上に記載した本発明の方法にしたがって得ることができる微孔質エレメントに関する。好ましくは、本発明の微孔質エレメントは、ディスク、格子、支持繊維を有する膜、織布または不織布の性質を有する膜、ネット、プレート、棒および／または先端が切り取られた円錐の形態である。
本発明はまた、本発明のまたは本発明にしたがって得ることができるフィルターエレメントに関する。
好ましくは、ポリマーは、本発明のフィルターエレメントの微孔質保持体の外側表面の少なくとも１部分に付着している。本発明のフィルターエレメントの微孔質保持体はその孔にポリマーを、流体がフィルターエレメントを流れることが可能な流路を形成する空間が残るように含むことができることが有利である。
本発明のフィルターエレメントの特に好ましい態様では、微粒子の平均直径は、孔の平均直径の５０％未満である。
本発明の別の態様は、複数の本発明のフィルターエレメントを含んでなる多重流路フィルターエレメントに関する。この態様は、試料の高処理スクリーニングに特に適しており、通常、大量の試料を分析する必要のある例えば法医学分析、高処理の核酸調製、診断的応用のための試料調製または薬物スクリーニングへの応用に使用することができる。
更なる態様では、本発明は、上記フィルターエレメントの微孔質エレメントを含むキットに関する。本発明のキットは、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリサッカライド、またはそれらの誘導体のような生体分子の調製または精製に適した化合物および／または装置をさらに含むことができる。さらに、例えばシリンジまたは中空針などの装置も本発明のキットに含むことができる。
さらに、本発明は、本発明の微孔質エレメントまたはフィルターエレメントを含む診断用組成物に関する。例えば、家庭、診療所または医師の手術において使用するのに適し、迅速で、適当な浸透性材料を必要とする分析結果を与えることを意図する分析用装置の製造において。そのような装置の原理は、例えばＥＰ−Ａ−０ ２９１ １９４、ＥＰ−Ａ−０ ２２５ ０５４、ＥＰ−Ａ−０ １８３ ４４２およびＥＰ−Ａ−０ １８６ ７９９に記載されている。さらに、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、組合せ的な核酸またはペプチドライブラリーの、高処理スクリーニングに使用することができる。
さらに、本発明は、上記の微孔質エレメントまたはフィルターエレメントを含む医薬組成物に関する。例えば、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、医薬組成物の投与した活性成分の放出に使用することができる。
本発明はさらに本明細書に記載した微孔質エレメントまたはフィルターエレメントの、いずれかの種類のマイクロ濾過、固体−液体分離、溶液の清浄化、原核および真核細胞の回収、細胞断片および破片の除去および精製、断片、ウイルスおよびプラスミドの固定化、タンパク質、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチドの吸着／固定化のため、または粒状物質の保持体として、アフィニティークロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィーにおける使用など、結合試験のための多成分が結合した複合体の分離のため、試料のスクリーニングのための、または微粒子の位置が変わることを防止するための使用を提供する。さらに、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、例えば、有臭および毒性物質などの望ましくない物質の放出および／または存在を減少させるためのフィルターエレメントとして使用することができる。このため、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、例えば微粒子中に含まれた炭などの適当な吸着性物質を含む。さらに、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、デンプングラフトポリマーの製造に使用することができる。これらの生成物は、デンプン骨格とラジカル連鎖機構の原理にしたがってグラフトされた合成モノマーの側鎖格子（side lattice）を有している。今日入手可能なデンプングラフトポリマーは、高粘度でデンプン１ｇあたり水１０００ｇに達する改善された結合および保持能力によって特徴付けられる。ここ２、３年、これらの超吸収材は、主に衛生学の分野、例えばおむつやシーツなどの製品、並びに農業分野、例えば種子ペレットに使用されている。
本発明の使用の特に好ましい態様では、微孔質またはフィルターエレメントを、核酸、タンパク質、有機化合物、またはペプチド模擬体またはＰＮＡなどのそれらの誘導体もしくは類縁体が含まれる化合物の調製および／または検出に使用する。該化合物は、天然または非天然の供給源から得られるものであり得る。天然の供給源には生物、即ちそのような生物の細胞および組織、並びに自然環境から得られる試料が含まれる。非天然の供給源には、in vitroで生成した、および化学的に合成された酵素生成物が含まれる。本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、例えば、細胞が含むＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および他の細胞成分に由来するいずれかの所望の化合物の分離、精製および／または検出に適していることは、当業者には直接的に明らかである。さらに、そのような化合物の集合体および複合体を分離および同定するすることが可能である。天然の供給源、例えば細胞、体液、空気、水および土壌の試料に由来するそのような化合物の分離および精製以外にも、合成によって製造された化合物の精製のために本発明の微孔質およびフィルターエレメントを使用することが考えられる。
本発明の微孔質およびフィルターエレメントの更なる使用には、特異的な結合パートナーの分析または検出における使用が含まれる。この目的のため、少なくとも１つの結合パートナーに結合することができると考えられる少なくとも１つの試薬を本発明の微孔質エレメントに含有させる、つまり例えば微粒子と連結させる。次いで、単独または上記態様のいずれかの微孔質エレメントを、その試薬に対する少なくとも１つの結合パートナーを含んでいると予想される試料と接触させる。次いで、特異的な結合パートナーを微孔質エレメントから解離させて、当業者に既知の方法により検出することができる。このように、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、例えばそれらのリガンドに結合したレセプターの分離および／または検出、およびいわゆる「リガンドトラップ」の調製に使用することができる。さらに、複合体即ち例えばレセプターリガンド複合体が本発明の微孔質エレメントにトラップされたら、該レセプターとそのリガンドとの結合を妨害する化合物を同定するために、化合物の更なる試料を該微孔質エレメントに接触させる。次に、in vivoで示される該化合物の作用によって、この化合物を結合パートナーの１つに対するアンタゴニストまたはアゴニストとして使用することができる。さらに、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、核酸またはタンパク質、例えば添加する組換えレセプタータンパク質などと特異的な複合体を形成することができる限外濾過液中の低分子量リガンドに関する医薬品のスクリーニングに使用することができ、好ましくは、遊離のリガンドの除去のために本発明の多重カラム多重流路フィルタープレートを用いる。本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、ＭＡＬＤＩ法を含む質量分析法などの既知の分析技術による更なる分析のため付着した膜マトリックスまたは標的プレートへの複合体形成リガンドのブッロッティング移動のために用いることができる。本発明の微孔質およびフィルターエレメントを使用する分析は、低コストでそして高い処理能力で行うことができるので、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、核酸およびタンパク質のゲル電気泳動のような装置、または２ハイブリッドシステムのような特異的な結合パートナーの検出のためのシステムに代わり得ることがさらに期待される。
このように、本発明の微孔質およびフィルターエレメントは、組合せ的核酸またはペプチドライブラリー（即ち、例えば固相ＰＣＲの使用のための）の高処理スクリーニングで使用することもできる。
本発明の微孔質および/またはフィルターエレメントを製造するための方法は、上記の態様のいずれか１つの組み合わせで行うことができる。例えば、液相をその孔に加えて自己支持的な液層を開口の横断面上に形成させ；液層の少なくとも一部を多孔質形態に凝固させる工程を含む、固体の水分不透過性支持体の開口内で微孔質エレメントを生成させることによって。したがって、微孔質エレメントは液体前駆体からin situで生成する。液体前駆体は、支持体の開口の形状に合った形状を容易にとることができる。ばりなどのような開口のいずれかの欠陥もこれで補われる。凝固すると、支持体の孔内にぴったりと合った、開口の壁の周りと完全に接触した微孔質エレメントが得られる。
好ましくは、支持体は、プラスチック、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリエステル、ポリイミド、またはそれらの混合物から形成する。プラスチックと、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料も含まれる。
通常、支持体は、好ましくは環状の横断面を有する管の形状をしており、微孔質エレメントがその管の一端でまたはその近くで生じる。試料の添加を容易にするため、およびより大容量の試料に対する便宜のため、好ましくは少なくともその管の一断面が小さい横断面の端と大きい横断面の端とを有する円錐形態であり、微孔質エレメントは小さい方の横断面の端にかまたはその近くに生じる。例えば、支持体は、エッペンドルフピペットでよく使用されるようなピペットチップである。形成した微孔質エレメントの、ずれ（slipping）など位置が変わることを防ぐため、管は、リングまたは溝を有する表面のような、構造を持った内側表面を有していてもよい。
複数、例えば数百個までの支持体を平行な向きに並べて多重流路のフィルターエレメントを形成させることも考えられる。多重流路のフィルターエレメントによって、数百の試薬に対して生物学的試料を同時に試験することが可能になるであろう。別法として、支持体は、例えば平行な開口または先細の開口の形態をした複数の孔を含むことができる。多重流路のエレメントを光学的に調べる場合、カーボンブラックのような不透明剤を支持体材料に含有させ、隣接する流路からの干渉を防ぐのが便利である。
液相を支持体の開口に加えるのにいくつかの可能性がある。管状の支持体に言及して様々な方法が例示されるであろうがそれらには限られない。一般に液相は溶液であるので、「液相」および「溶液」なる語は、文脈の前後関係から特に必要でない限りは互換的に使用し得る。便利なことに、開口への溶液の添加は、毛管作用によって溶液を管の中を上昇させることにより達成する。支持体（例えば管状の）を溶液に浸した後に再び引き上げる。溶液の表面張力のために液層が開口の横断面の上で開口内に残るであろう。例えば溶液の粘度が高すぎる場合は、溶液を孔に加えるための別の方法を用いてもよい。溶液の上昇力は、管の他方の端を一時的に密閉し、管をわずかに加熱した後、管の開いている方の端を溶液に浸し、管を室温に冷却することにより増加させることができ、これにより中に閉じ込められた空気の体積の減少によって溶液が管の中に引っ張られる。別法として、溶液を管の他方の端から入れ、遠心により最終的な位置にもって行くことができる。好ましくは、微孔質エレメントが形成される端またはその近くをキャップでまたは弾力性プレートに押し付けることにより密閉する。キャップまたは弾力性プレートは、好ましくは、中の空気を逃がすことを可能にするための微細な溝または微細な孔を有している。次いで、この配置物を、キャップまたは弾力性プレートによって少なくとも部分的に保持されている方の管の端へ溶液が移動する間、遠心にかける。キャップまたは弾力性プレートは、凝固の前または後で、特に溶液または溶液の一部の凝固前にはずすことができる。
当業者は、疎水性材料でできた容器に入れられた水性の試料は、沈んで底に集まるよりはむしろ壁に水滴状に付着しやすいという問題にしばしば直面する。この現象を回避するために、本発明のフィルターエレメントのための支持体として働く管の内壁を、親水性コーティングで被覆することができる。親水性コーティングは、水性試料が支持体の管の壁へ付着するのを防ぐであろう。さらに、支持体の壁への吸着のために生体高分子の吸着損失がない。管の内壁が親水性コーティングで被覆されている場合、微孔質エレメントに隣接する管の端を、好ましくは親水性コーティングされないようにしておく。これは、微孔質エレメントに隣接した管の端から出た試料の液体が隣のフィルターエレメントに侵入するのを防ぐ。複数のフィルターエレメントを並べて多重流路のフィルターエレメントを形成する本発明の態様においては特にそうである。
親水性コーティングは、有機溶媒中の１またはそれ以上のポリビニルエステルの溶液を管の内壁に塗布し、有機溶媒を揮発させ、場合によりポリビニルエステルの生じた層をその表面で部分的に加水分解することにより便利に調製する。適当なポリビニルエステルには、ポリ酢酸ビニル（分子量約５０００００が一般的に適当である）、ポリプロピオン酸ビニルおよびポリステアリン酸ビニルが含まれる。
ポリビニルエステルの層の部分的な加水分解は、ポリビニルエステルの層を水酸化ナトリウムなどのアルカリ性水溶液と接触させることにより行う。管の内壁の一部だけにポリビニルエステルの溶液を塗布することにより、例えば管をポリビニルエステルの溶液に部分的に浸すことにより、その微孔質エレメントに隣接した端を親水性コーティングされないようにすることができる。加水分解の後、微孔質エレメントは、ピリビニルエステルの溶液と接触させなかった方の管の端またはその近くで生じる。別法として、管の内壁全体をポリビニルエステルで被覆し、その一部分のみを加水分解することができる。
別法として親水性コーティングは高分子量の、例えば分子量４０００またはそれ以上のポリプロピレングリコールを使用することによって生成させることができる。そのようなポリエチレングリコールは、冷水中で適度に良好な溶解性を示すが、温水中では溶解度が低い。したがって、ポリプロピレングリコールの冷却水溶液（例えば０〜４℃の）を管の中に入れた後、温度を例えば約２０℃に上げる。溶液から析出したポリプロピレングリコールは、管の内壁に対して高い親和性を示し、薄い層としてそこへ沈積する。次いで、過剰のポリプロピレングリコール溶液を除く。ある場合には、さらに化学的に架橋させるのが有利であろう。
本発明の方法を使用すれば、直径０．０２ｍｍ〜４ｍｍ、特に０．２〜２．０ｍｍの開口を有するフィルターエレメントを製造することができる。
微孔質エレメントを生成させることによる、フィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、例えば固体の水分不透過性支持体の開口内で行うことができ、溶媒中の合成または半合成ポリマー（樹脂）の溶液を得；その溶液を、自己支持的な液層がその開口の横断面の上に形成するように開口に与え；溶媒と混和できる非溶媒を層内に拡散させそれにより樹脂が沈殿して微孔質エレメントを形成させる工程を含む。
好ましくは、樹脂は以下からなる群から選択される：ポリビニルエステル、部分的に脱アシル化されたポリビニルエステル、セルロース誘導体、ポリアミド、およびその混合物。ポリビニルエステルのなかでは、ポリ酢酸ビニル、ポリプロピオン酸ビニル、ポリステアリン酸ビニルおよびポリ桂皮酸ビニルエステル；セルロース誘導体では、ニトロセルロースおよびプロピオン酸セルロースが挙げられる。適当なポリアミドは、ナイロン６／６である。
ある種の場合には、樹脂は好ましくは親水性および疎水性の部分を分子内に含んでいる。適当な樹脂には、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリ（ビニルアルコール−コ−酢酸ビニル）、エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンアクリル酸エステルコポリマー、エチレンアクリルアミドコポリマー、アクリル酸酢酸ビニルコポリマー、アクリルアミド酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸ジアミンモノアミドと酢酸ビニルのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール−コ−スチレン）、アクリルアミドアクリル酸エステルコポリマー、およびそれらの混合物からなる群から選択される。特に、アクリルアミドとアクリル酸ヘキシル、アクリル酸プロピル、またはアクリル酸ドデシルとのコポリマーが有用である。
好ましくは、溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、ギ酸、酢酸、２，２，２−トリクロロエタノールおよびその混合物から選択される。
好ましくは、非溶媒は、水、炭素原子１〜４を有するアルコール、アンモニア、酢酸エチル、アセトン、エチレンジアミン、およびそれらの混合物から選択される。非溶媒は液体でも気体でもよい。
非溶媒は、様々な方法により樹脂溶液の液層に拡散させる。液体の非溶媒を樹脂溶液の液層とその片側または両側から接触させる。例えば、樹脂溶液の層が位置する管の端を液体の非溶媒に浸すことにより接触させる。さらにまたは別法として、非溶媒を管の他方の端から入れる。気体状の非溶媒を使用する場合は、支持体と樹脂溶液の層の配置物を、非溶媒の蒸気で飽和しているかまたはほぼ飽和の雰囲気に置く。析出は、気体の非溶媒を最初に加え、部分的に凝固させた後に液体の非溶媒を加えることによる、２つの連続的な工程で達成することもできる。
微孔質エレメントの上と下の平らな表面は、析出中の樹脂溶液中の非溶媒の終濃度が約５０重量％に上がったときに得られる。上の平らな表面は、フィルターエレメントのより均一な濾過能力を可能にする。下の平らな表面は、例えば吸着した物質がその上で移動するブロッティング膜とのむらのない接触をもたらす。
樹脂／溶媒／非溶媒の典型的な組合せは、例えば樹脂としてポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ニトロセルロース、プロピオン酸セルロース、またはポリ酢酸ビニル、溶媒としてジメチルスルホキシドおよび非溶媒として水；または樹脂としてポリアミド（ナイロン６，６のような）、溶媒として２，２，２−トリクロロエタノールおよび非溶媒としてアセトンである。
理論に縛られることなく、本発明の微孔質エレメントの生成では以下の機構が関与していると信じられる：非溶媒を樹脂溶液の層内に拡散させると、樹脂の溶解度が徐々に下がる。溶解度の限界に達すると、樹脂は、個々の場所で溶液から析出し始める。最初に析出した場所で樹脂の析出が進行する。遂には、溶媒／非溶媒は、樹脂の固体マトリックスにおける、大きな相互連結したエンクレーブに閉じ込められる。相互連結したエンクレーブは、最終の微孔質エレメントの液体透過性流路を形成する。親水性および疎水性セグメントの両方を含む合成樹脂を使用する場合は、疎水性セグメントは、樹脂溶液中の非溶媒の濃度が増加するにつれて、お互いに向かって押し進められお互いと接触し合うようになる。析出した樹脂の結晶性の疎水性骨格の形成をもたらす、隣り合う分子鎖の疎水性セグメント間の相互作用があるであろう。親水性部分は溶媒／非溶媒で満たされたエンクレーブの方に配向するであろう。したがって、液体透過性流路が主に親水性である微孔質エレメントが得られる。これは、生体適合性という利点をもたらす。「生体適合性」なる語は、生物高分子、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリサッカライドまたはそれらの誘導体などの三次元構造が維持されることを意味する。ポリマーの表面が水酸基、アミドまたはエーテル基に富んでいれば、相間力による破壊は少ない。
微孔質エレメントの吸着特性を改変するために、合成樹脂の溶液に固体の微粒子をさらに含有させることができる。微粒子には二酸化ケイ素、シリカゲル、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ガラス、炭素またはグラファイトが含まれよう。さらに、粒子は、リン酸カルシウム、ポリリン酸亜鉛などの無機材料からなっていてもよい。別の種類の粒状の微粒子は、有機ポリマーのミクロ層を有する微孔質シリカゲルなどの無機のコアからなる。粒子の孔および表面は、巨大分子が孔内を通るのを制限するように改変することができる（「侵入制限材料（Restricted access material）」）。さらに、微粒子は、硬化樹脂の粉末、またはセファデックスという商品名で入手できるような高度に架橋したポリサッカライドなどの有機材料からなっていてもよいが、有機材料を選択するに際しては使用する溶媒に可溶であってはならないという点に注意しなければならない。粒子は、非孔質でも多孔質でもよいが、好ましくは孔径が１ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の多孔質が好ましい。一般に、粒子は、５ｎｍ〜８０ｍｍ、特に０．５ｍｍ〜３０ｍｍの大きさであるが、多孔質微粒子は好ましくは１ｍｍ以上の大きさであり、非孔質微粒子は好ましくは１ｍｍ以下の大きさである。微粒子は、その吸着特性が特定の要件を満たすように前処理、例えば誘導体化することができる。固相抽出またはタンパク質、抗体、ペプチド、炭化水素、核酸のアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーに使用されているような、いずれの商業的に入手可能な吸着粒子も有用である。高速液体クロマトグラフィーに適した材料は特に有用である。例えば、特異的抗体、レクチン、アビジン、レセプター−タンパク質、酵素などのタンパク質、、合成ペプチド、核酸またはオリゴヌクレオチドを、共有結合またはリンカーにより微粒子に結合することができる。吸着粒子は、粒状の形状、例えば球形をしている。微粒子は、フィルターエレメントあたり、例えば５０ｍgまで、好ましくは１００ｎg〜２０ｍgの量で使用することができる。
最終の微粒子含有フィルターエレメントにおいて、閉じ込められた微粒子の内側または外側表面は、加えた液体試料が近づくことができ、液体試料に含まれる分析物の吸着／固定化が起こり得る。
さらに、微孔質エレメントを生成させることによるフィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、固体の水分不透過性支持体の開口の中で行うことができ、その方法は、その中にスラリー化された固体微粒子を含んでいるヒドロコロイドの水溶液を得；開口の横断面の上に自己支持的な液層が形成されるようにその溶液を開口に加え；ヒドロコロイド溶液の凝固を起こさせ；そして、場合により凝固したヒドロコロイドの溶液の該層の乾燥および架橋のいずれかまたはその両方を行う工程を含む。
好ましくは、ヒドロコロイドは、低融点アガロース、デンプン、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ヒドロコロイドの水溶液は、好ましくは溶液の１〜１０重量％、特に２〜５重量％のヒドロコロイドを含む。ヒドロコロイドとしてポリビニルアルコールを使用する場合は、溶液の０．２重量％までの四ホウ酸ナトリウム、または溶液の５０重量％までのジメチルスルホキシドを加えるのが時として有利である。
これらのヒドロコロイドは、冷水中では溶解度が低いが、加熱により分散またたは溶解する。好ましくは、加熱したヒドロコロイド溶液を担体の孔に加える。冷却すると、ヒドロコロイドが凝固する。
１つの別法では、凝固したヒドロコロイド溶液を次に乾燥する。乾燥は、配置物を約４０℃に加熱することにより促進させることができる。あるいは、熱感受性の材料を用いる場合は特に、配置物を五酸化リンなどの乾燥剤の上に置いて密閉したチャンバーに入れることにより乾燥を行う。最終的な含水量は、好ましくは水蒸気分圧１ｍｂａｒ未満である。
乾燥すると、ヒドロコロイド溶液の凝固層は収縮する。上記微粒子の非存在下では、ヒドロコロイド溶液の凝固層は収縮して支持体の内壁から離れ、その結果、有用なフィルターエレメントが得られないだろう。本発明によれば、乾燥中に孔形成剤として働くヒドロコロイドの水溶液中に微粒子が与えられる。したがって、ヒドロコロイド溶液の層の、支持体の壁への周りに沿った完全な接触が維持され、微粒子間の多数の顕微鏡的亀裂が乾燥により形成される。さらに、微粒子は、そのように得られた層の吸着特性を制御または改変するように作用する。顕微鏡的亀裂は、最終の微孔質エレメントの液体透過性流路として働く。ヒドロコロイド溶液の重量で計算して５〜５０％の割合の微粒子が一般的に有用である。
凝固したヒドロコロイドの得られた層を、乾燥の代わりにまたは乾燥の後に架橋させることができる。このため、微孔質エレメントを架橋剤、例えばホウ酸、四ホウ酸ナトリウム、塩化酸化リン、エピクロロヒドリン、１，４−ブタンジオールエーテルなどのビスオキシランで処理する。ポリビニルアルコールは、ゲル化のためにアルカリ性のｐＨを適用することにより、四ホウ酸ナトリウムで架橋することができる。乾燥および架橋はいずれも、最終の微孔質エレメントの機械的安定性と耐溶媒性を増加させる効果を有する。
好ましい方法では、その中にスラリー化された固体微粒子を含有する水性のヒドロコロイド溶液、特に低融点アガロースの水溶液を固体の水分不透過性支持体の開口に加えて自己支持的な液層をその開口の横断面の上に形成させ、次いで、以下に詳細に説明するように保持器具で層を保持しながら、流路形成非溶媒をその液層に浸透させ、次いで、保持器具を取り外してヒドロコロイド溶液を凝固させる。最後に、凝固したヒドロコロイド層を好ましくは架橋させる。
有用な微粒子は、本発明の第１の態様に関連して上に記載されたものである。さらに、デキストランで被覆された微粒子、例えばデキストラン被覆炭、デキストラン被覆ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）など、または多孔質支持体に吸着された生物学的構造体、例えばリボソーム、ヌクレオソーム、クロモソーム、シナプトソーム、ファージ、プラスミド、多孔質または非孔質の支持用ビーズにあらかじめ吸着されたものすべてが挙げられる。微粒子は、好ましくは０．５ｍｍ〜３０ｍｍの大きさである。
さらに、微孔質エレメントを生成させることによるフィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、固体の水分不透過性支持体の開口内で行うことができ、その方法は、溶媒中のモノマーまたはモノマーの混合物の、場合により架橋用モノマーを含む溶液を得、その溶液を開口へ加えて自己支持的な液層をその開口の横断面の上に形成させ、モノマーを重合させる工程を含む。
好ましくは、モノマーはエチレン性不飽和モノマー、例えば酢酸ビニルまたはその他のビニルエステル、アクリル酸およびその誘導体などである。好ましいアクリル酸誘導体には、アクリル酸アミド、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリル酸ジアミンモノアミド；アクリル酸エステル、例えばアクリル酸ブチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸オクタデシル、アクリル酸ビニル、２，３−エポキシプロピルアクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、および３−スルホプロピルアクリレートが含まれる。
架橋用モノマーは、２またはそれ以上のエチレン性不飽和部位を有しているモノマーである。好ましい架橋用モノマーは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）である。架橋用モノマーの存在は、最終の微孔質エレメントの機械的安定性と耐溶媒性を増加させる。
溶媒としては、使用するモノマーの性質によって、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、ギ酸、酢酸、２，２，２−トリクロロエタノール、またはそれらの混合物が有用である。
好ましい方法では、好ましくは架橋用モノマーとともに、その中にスラリー化された固体微粒子を含むアクリル酸またはその誘導体の水溶液を、固体の水分不透過性支持体の開口に加えて自己支持的な液層をその開口の横断面の上に形成させ、次いで、以下に詳細に説明するように保持器具で層を保持しながら、流路形成非溶媒をその液層に浸透させ、次いで保持器具を取り外し、アクリル酸（誘導体）を重合させる。
全モノマーに対して計算して１〜１０重量％の割合の架橋用モノマー、例えばＮ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）が一般に有用である。
さらに、親水性および疎水性のモノマーの混合物も有用である。この場合、成長している分子鎖の疎水性モノマーの重合した単位間に相互作用があり、形成したポリマーの結晶性の疎水性骨格の形成をもたらすであろう。親水性モノマーの単位は、溶媒で満たされたエンクレーブの方向に配向するであろう。したがって、液体透過性流路が主に親水性である微孔質エレメントが得られる。
時として、モノマーまたはモノマーの混合物は溶媒に溶けるが、ポリマーが成長するにつれて、選択された溶媒おいて徐々に不溶性になり、最終的にその溶液から析出する。溶媒の混合物は、ある場合には有用であろう。形成したポリマーを析出させるためにまたは形成したポリマーの析出を完全にするために、重合の後に非溶媒をポリマー溶液の層内に拡散させることができる。さらに、ｎ−ドデカノールまたはポリプロピレンオキシドのような孔形成（porogenic）液を重合させている間に存在させることができる。重合によって、使用した溶媒で膨潤したポリマーゲルを生じることもある。
エチレン性不飽和モノマーの重合は、一般にフリーラジカルの作用の下で起こす。フリーラジカルは、通常の熱分解性開始剤、またはフリーラジカル開始剤と還元剤の組合せから発生させる。通常、開始剤をモノマー溶液に加える。開始剤の濃度は、モノマー溶液の支持体の開口への添加に十分なポットライフを与えるように調整する。Ｎ，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンと過硫酸塩の組合せは、開始剤として特に好ましい。別法では、開始剤または開始剤／還元剤の水溶液を、モノマー溶液の液層の片側または両側で接触させて使用する。リボフラビンなどの光開始剤も重合を開始するのに有用である。
エチレン性不飽和モノマーの代わりに、重付加または重縮合を受けることができるモノマーまたはモノマー混合物を使用することができる。なかでも有用なモノマーは、ジアミンとポリエポキシドの組合せ、例えばエチレンジアミンと１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどである。更なる例には、ポリプロピレンオキシドジアミンおよび１，４−ブタンジオール、それぞれと１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルが含まれる。
この態様は、モノマー溶液の粘度が、対応する濃度での同じモノマーのポリマー溶液と比較して低いという利点を有する。より低い粘度は、溶液の支持体の開口への添加を容易にする。
微孔質エレメントの吸着特性を改変するために、モノマー溶液に固体微粒子をさらに含有させることができる。有用な微粒子は、上に記載されている。
微粒子を使用する場合、過剰のヒドロコロイド溶液、樹脂溶液またはモノマー溶液をそれぞれ置換するために、支持体の開口における微粒子を含む液層に流路形成非溶媒を浸透させることは時として有利である。流路形成非溶媒は、使用する溶媒に混和しないものでなければならない。浸透は、微孔質フィルターからなる保持器具で層を保持しながら、微粒子を含有する層を介して、流路形成非溶媒を押しまたは引くことにより行うことができる。ヒドロコロイド溶液、樹脂溶液、またはモノマー溶液はそれぞれ、微粒子間の大きな裂け目から移動して微粒子が接触している点で蓄積する。流路形成非溶媒は裂け目をフリーな状態に保ち、流路を生成する。保持器具は、ヒドロコロイドの凝固またはモノマーの重合または樹脂の析出の前に取り外す。凝固／重合／析出すると、微粒子はそれらの接触点で次々に連結する。流路形成非溶媒を適当な液体による洗浄によって除く。流路形成非溶媒としては、シリコーンオイルが好ましい。
上に記載した態様の２またはそれ以上の組合せもまた可能である。例えば、微粒子を含有する層を１の態様にしたがって調製し、次いで他の１つの態様にしたがって、そこで樹脂が析出する樹脂溶液を浸透させることができる。
さらに、本発明の微孔質およびフィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、微粒子の懸濁液を得；懸濁液を少なくとも１つの微孔質保持体に加え；そして懸濁液の少なくとも一部を多孔性の形態に凝固させる工程を含む。
微粒子はお互いに連結させることができ、微孔性を維持して少なくとも１つの微孔質保持体に連結することができる。
微孔質エレメントを生成させることによるフィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、その溶液中に懸濁した微粒子を含んでいる、溶媒中の合成または半合成樹脂の溶液を得；その溶液を少なくとも１つの微孔質保持体に加え、溶媒と混和する非溶媒をその層に拡散させてそれにより合成樹脂を析出させて微孔質エレメントを形成させる工程を含む。
好ましくは、樹脂は、ポリビニルエステル、部分的に脱アシル化されたポリビニルエステル、セルロース誘導体、ポリアミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ポリビニルエステルのなかではポリ酢酸ビニル、ポリプロピオン酸ビニル、ポリステアリン酸ビニルおよびポリ桂皮酸ビニルエステル；セルロース誘導体のなかではニトロセルロース、およびプロピオン酸セルロースが挙げられる。適当なポリアミドは、ナイロン６／６である。
ある場合には、樹脂は好ましくは親水性および疎水性セグメントの両方を分子内に含んでいる。適当な樹脂には、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリ（ビニルアルコール−コ−酢酸ビニル）、エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンアクリル酸エステルコポリマー、エチレンアクリルアミドコポリマー、アクリル酸酢酸ビニルコポリマー、アクリルアミド酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸ジアミンモノアミドと酢酸ビニルのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール−コ−スチレン）、アクリルアミドアクリル酸エステルコポリマー、およびそれらの混合物が含まれる。特に、アクリルアミドと、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸プロピルまたはアクリル酸ドデシルとのコポリマーが有用である。
好ましくは、溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、ギ酸、酢酸、２，２，２−トリクロロエタノール、およびそれらの混合物から選択される。
好ましくは、非溶媒は、水、炭素原子１〜４を有するアルコール、アンモニア、酢酸エチル、アセトン、エチレンジアミン、およびそれらの混合物から選択される。非溶媒は液体でも気体でもよい。
非溶媒を樹脂溶液の液層に拡散させる様々な方は、管の形態を有する支持体に言及して例示されるであろうが、そこで例示されるものに限られない。液体の非溶媒は、樹脂溶液の液層とその片側または両側から接触させることができる。例えば、樹脂溶液の層が位置する方の管の端を液体の非溶媒に浸すことによる。さらに、または別法として、非溶媒を管の反対側の端から入れてもよい。気体の非溶媒を使用する場合は、支持体と樹脂溶液の層の配置物を、非溶媒の蒸気で飽和しているかまたはほぼ飽和の雰囲気に置く。析出は、最初に気体の非溶媒を加え、部分的に凝固させた後、次いで液体の非溶媒を加えることによる、２つの連続的な工程によって達成することもできる。
微孔質エレメント上と下の平らな表面は、析出の間に樹脂溶液中の非溶媒の終濃度が約５０重量％に上がったときに得られる。上の平らな表面は、フィルターエレメントのより均一な濾過性能を可能にする。下の平らな表面は、例えば吸着された物質がその上で移動するブロッティング膜とのむらのない接触をもたらす。
樹脂／溶媒／非溶媒の典型的な組合せは、例えば樹脂としてポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ニトロセルロース、プロピオン酸セルロースまたはポリ酢酸ビニルのいずれか、溶媒としてジメチルスルホキシドおよび非溶媒として水；または樹脂としてポリアミド（ナイロン６，６のような）、溶媒として２，２，２−トリクロロエタノールおよび非溶媒としてアセトンである。
理論に縛られることを意図することなく、本発明の第１の態様に従う微孔質エレメントの生成では、以下の機構が関与すると考えられる：
非溶媒が樹脂溶液の層内に拡散すると、樹脂の溶解度が徐々に下がる。溶解度の限界に達すると、樹脂は個々の場所で溶液から析出し始める。樹脂の析出が、析出が始まった場所で進行する。遂には、溶媒／非溶媒が、樹脂の固体マトリックスにおける大きな相互連結したエンクレーブに閉じ込められる。相互連結したエンクレーブは、最終の微孔質エレメントの液体透過性流路を形成する。親水性および疎水性セグメントの両方を含む合成樹脂を使用する場合は、疎水性セグメントは、樹脂溶液中の非溶媒の濃度が増加するにつれて、お互いに向かって押し進められお互いと接触し合うようになる。析出した樹脂の結晶性の疎水性骨格の形成をもたらす、隣り合う分子鎖の疎水性セグメント間の相互作用があるであろう。親水性部分は溶媒／非溶媒で満たされたエンクレーブの方に配向するであろう。したがって、液体透過性流路が主に親水性である微孔質エレメントが得られる。これは、生体適合性という利点をもたらす。「生体適合性」なる語は、生物高分子、例えばタンパク質などの三次元構造が維持されることを意味する。ポリマーの表面が水酸基、アミドまたはエーテル基に富んでいる場合、相間力による破壊は少ない。
微孔質エレメントの吸着特性を改変するために、合成樹脂の溶液は固体の微粒子をさらに含有する。微粒子には二酸化ケイ素、シリカゲル、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ガラス、炭素またはグラファイトが含まれる。さらに、微粒子は、リン酸カルシウム、ポリリン酸亜鉛などの無機材料からなっていてもよい。別の種類の粒状微粒子は、有機ポリマーのミクロ層を有する微孔質シリカゲルのような無機のコアからなる。粒子の孔および表面は、巨大分子が孔を通るのを制限するように改変することができる（「侵入制限材料（restricted access material）」）。さらに、微粒子は、硬化樹脂の粉末、またはセファデックスという商品名で入手できるような高度に架橋したポリサッカライドなどの有機材料からなっていてもよいが、有機材料を選択するに際しては使用する溶媒に可溶性であってはならないという点に注意しなければならない。微粒子は非孔質でも多孔質でもよいが、好ましくは孔径が１ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の多孔質が好ましい。一般に微粒子は、５ｎｍ〜５００μｍ、特に０．５μｍ〜３０μｍのサイズであるが、多孔質微粒子は、好ましくは１μｍ以上のサイズであり、非孔質微粒子は、好ましくは１μｍ以下のサイズである。微粒子は、その吸着特性が特定の要件を満たすように前処理、例えば誘導体化することができる。固相抽出またはタンパク質、抗体、ペプチド、炭化水素、核酸に対するアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーに使用されているような、いずれの商業的に入手可能な吸着粒子も有用である。高速液体クロマトグラフィーに適した材料は特に有用である。例えば、例えば特異的抗体、レクチン、アビジン、レセプター−タンパク質、酵素などのタンパク質、合成ペプチド、核酸またはオリゴヌクレオチドを、共有結合によりまたはリンカーを介して微粒子に結合させることができる。吸着粒子は、例えば球形および／または不均一な表面の粒状の形状をしており、必ずしも繊維状ではない。
最終の微粒子含有フィルターエレメントでは、閉じ込められた微粒子の外側または内側の表面は、加えた液体試料が近づくことができ、液体試料に含まれる分析物の吸着／固定化が起こり得る。
さらに、微孔質エレメントの生成によるフィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、その中にスラリー化された固体微粒子を含んでいるヒドロコロイドの水溶液を得；その溶液を少なくとも１つの微孔質保持体に加え；ヒドロコロイド溶液を凝固させ；場合により、凝固したヒドロコロイドの溶液の乾燥および架橋のいずれかまたはその両方を行う、工程を含む。
好ましくは、ヒドロコロイドは、低融点アガロース、デンプン、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物から選択される。ヒドロコロイドの水溶液は、好ましくは溶液の１〜１０重量％、特に２〜５重量％のヒドロコロイドを含む。ヒドロコロイドとしてポリビニルアルコールを使用する場合は、溶液の０．２重量％までの四ホウ酸ナトリウム溶液、または溶液の５０重量％までのジメチルスルホキシドの添加が時として有利である。
これらのヒドロコロイドは、冷水中では溶解度が低いが、加熱すると分散またたは溶解する。好ましくは、加熱したヒドロコロイド溶液を担体の開口に加える。冷却すると、ヒドロコロイドが凝固する。
１つの別法では、凝固したヒドロコロイド溶液を次に乾燥する。配置物を約４０℃に加熱することにより乾燥を促進させることができる。あるいは、熱感受性の材料を用いる場合は特に、配置物を五酸化リンなどの乾燥剤の上に置いて密閉したチャンバーに入れることにより、乾燥を達成させることができる。最終的な含水量は、好ましくは水蒸気分圧１ｍｂａｒ未満である。
乾燥すると、ヒドロコロイド溶液の凝固層は収縮する。上記微粒子の非存在下では、ヒドロコロイド溶液の凝固層は収縮して支持体の内壁から離れ、その結果有用なフィルターエレメントが得られないだろう。本発明によれば、ヒドロコロイドの水溶液中に微粒子が与えられ、乾燥中に孔形成剤として働く。したがって、微粒子間の多数の顕微鏡的亀裂が乾燥により形成される。さらに、微粒子は、そのように得られた層の吸着特性を制御または改変するように作用する。顕微鏡的亀裂は、最終の微孔質エレメントの、液体透過性流路として働く。ヒドロコロイド溶液の重量で計算して５〜５０％の割合の微粒子が、一般に有用である。
凝固したヒドロコロイドの得られた層を、乾燥の代わりにまたは乾燥の後で架橋させることができる。このため、微孔質エレメントを、架橋剤、例えばホウ酸、四ホウ酸ナトリウム、塩化酸化リン、エピクロロヒドリン、または１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのビスオキシランで処理する。ポリビニルアルコールは、ゲル化のためのアルカリ性ｐＨを適用することにより、四ホウ酸ナトリウムで架橋させることができる。乾燥および架橋は両方とも、最終の微孔質エレメントの機械的安定性と耐溶媒性を増加させる効果を有する。
好ましい方法では、その中にスラリー化された固体微粒子を含有する水性のヒドロコロイド溶液、特に低融点アガロースの水溶液を微孔質保持体に加え、次いで、以下に詳細に説明するように保持器具で層を保持しながら、流路形成非溶媒をその液層に浸透させ、次いで保持器具を取り外してヒドロコロイド溶液を凝固させる。最後に、凝固したヒドロコロイド層を好ましくは架橋させる。
有用な微粒子は、本発明の第１の態様に関連して上に記載されたものである。さらに、デキストランで被覆された微粒子、例えばデキストラン被覆炭、デキストラン被覆ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）など、または多孔質支持体に吸着された生物学的構造体、例えばリボソーム、ヌクレオソーム、クロモソーム、シナプトソーム、ファージ、プラスミド、多孔質または非孔質の支持用ビーズにあらかじめ吸着されたものすべてが挙げられる。微粒子は、好ましくは０．５μｍ〜５００μｍの大きさである。
さらに、微孔質エレメントを生成させることによる、フィルターエレメントを製造するための本発明の方法は、溶媒中のモノマーまたはモノマー混合物の、場合により架橋用モノマーを含む溶液を得；その溶液を少なくとも１つの微孔質保持体へ加え；そして、モノマーを重合させる工程を含む。
好ましくは、モノマーはエチレン性不飽和モノマー、例えば酢酸ビニルまたはその他のビニルエステル、アクリル酸およびその誘導体などである。好ましいアクリル酸誘導体には、アクリル酸アミド、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリル酸ジアミンモノアミドなど；アクリル酸エステル、例えばアクリル酸ブチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸オクタデシル、アクリル酸ビニル、２，３−エポキシプロピルアクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、および３−スルホプロピルアクリレートが含まれる。
架橋用モノマーは、エチレン性不飽和の２またはそれ以上の部位を有するモノマーである。好ましい架橋用モノマーは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）である。架橋用モノマーの存在は、最終の微孔質エレメントの機械的安定性と耐溶媒性を増加させる。
溶媒としては、使用するモノマーの性質によって、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、ギ酸、酢酸、２，２，２−トリクロロエタノール、またはそれらの混合物が有用である。
好ましい方法では、好ましくは架橋用モノマーとともに、その中にスラリー化された固体微粒子を含む、アクリル酸またはその誘導体の水溶液を、微孔質保持体に加え、以下に詳細に説明するように保持器具で層を保持しながら流路形成非溶媒を液層に浸透させ、次いで保持器具を取り外してアクリル酸（誘導体）を重合させる。
、全モノマーに対して計算して１〜１０重量％の割合の架橋用モノマー、例えばＮ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）が通常有用である。
また、親水性および疎水性のモノマーの混合物も有用である。この場合、成長している分子鎖の疎水性モノマーの重合単位間に相互作用があり、形成したポリマーの結晶性の疎水性骨格の形成をもたらすであろう。親水性モノマーの単位は、溶媒で満たされたエンクレーブの方に配向するであろう。したがって、液体透過性流路が主に親水性である微孔質エレメントが得られる。
時として、モノマーまたはモノマーの混合物は溶媒に溶けるが、ポリマーが成長するにつれて、選択された溶媒おいて徐々に不溶性になり、最終的にその溶液から析出する。溶媒の混合物は、ある場合には有用であろう。形成したポリマーを析出させるためにまたは形成したポリマーの析出を完全にするために、重合の後に非溶媒をポリマー溶液の層内に拡散させることができる。さらに、ｎ−ドデカノールまたはポリプロピレンオキシドのような孔形成（porogenic）液を重合させている間に存在させることができる。重合は、使用した溶媒で膨潤したポリマーゲルを生じることもある。
エチレン性不飽和モノマーの重合は、一般的にフリーラジカルの作用の下で起こす。フリーラジカルは、通常の熱分解性開始剤、またはフリーラジカル開始剤と還元剤の組合せから生じる。通常、開始剤をモノマー溶液に加える。開始剤の濃度は、モノマー溶液の微孔質保持体への添加に十分なポットライフを与えるように調整する。Ｎ，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンと過硫酸塩の組合せは、開始剤として特に好ましい。別法では、開始剤または開始剤／還元剤の水溶液を、モノマー溶液の液層の片側または両側で接触させて使用する。リボフラビンなどの光開始剤も重合を開始するのに有用である。
エチレン性不飽和モノマーの代わりに、重付加または重縮合を受けることができるモノマーまたはモノマー混合物を使用することができる。なかでも有用なモノマーは、ジアミンとポリエポキシドの組合せ、例えばエチレンジアミンと１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどである。更なる例には、ポリプロピレンオキシドジアミンおよび１，４−ブタンジオール、それぞれと１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルが含まれる。
この態様は、モノマー溶液の粘度が、対応する濃度での同じモノマーのポリマー溶液と比較して低いという利点を有する。より低い粘度は、溶液の微孔質保持体への添加を容易にする。
微孔質エレメントの吸着特性を改変するために、モノマー溶液に固体微粒子をさらに含有させることができる。有用な微粒子は、上に記載されている。
微粒子を使用する場合、過剰のヒドロコロイド溶液、樹脂溶液またはモノマー溶液をそれぞれ置換するため、微粒子を含有する液層に流路形成非溶媒を浸透させることは時として有利である。流路形成非溶媒は、使用する溶媒に混和しないものでなければならない。浸透は、微孔質フィルターからなる保持器具で層を保持しながら、微粒子を含有する層を介して、流路形成非溶媒を押しまたは引くことにより行う。ヒドロコロイド溶液、樹脂溶液、またはモノマー溶液はそれぞれ、微粒子間の大きな隙間から移動して微粒子が接触しているところで貯留する。流路形成非溶媒は隙間をフリーな状態に保ち、流路を生成させる。保持器具は、ヒドロコロイドの凝固またはモノマーの重合または樹脂の析出の前または後に取り外す。凝固／重合／析出すると、微粒子はそれらの接触点で次々に連結する。流路形成非溶媒を適当な液体による洗浄によって除く。流路形成非溶媒としては、シリコーンオイルが好ましい。
上に記載した態様の２またはそれ以上の組合せもまた可能である。例えば、微粒子を含有する層を１の態様にしたがって調製し、次いで他の１つの態様にしたがって、そこで樹脂が析出する樹脂溶液を浸透させることができる。
これに関連して、上に記載した態様に従う様々な方法は、少なくとも１つの微孔質膜を微孔質保持器具上に配置する工程をさらに含んでいてもよい。微孔質膜は、好ましくは（再生された）セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から形成されている。
本発明の様々な態様においては、非常に少ない容量の液体を取り扱うことが含まれる。凝固前の溶媒の望ましくない蒸発は、すべての操作を溶媒飽和の雰囲気で密閉した系において行えば回避できる。好ましくは温度を精密に制御する。
本発明はさらに、上で記載した様々な態様によって得られ、少なくとも１つの微孔質保持体と、微粒子を包埋し少なくとも１つの微孔質保持体に連結している多孔質形態ポリマーとを含んでいる少なくとも１つの微孔質エレメントを含む、フィルターエレメントに関する。
本発明の好ましい態様によれば、微孔質保持体は、好ましくはお互いに連結した固体粒子を含み、好ましくはディスク、格子、大口径膜、支持繊維を有する膜、織布または不織布の性質を有する膜、ネット、プレート、棒および／または先端が切り取られた円錐の形態をしており（膜の形態の場合は微孔質保持体は、お互いに連結した微粒子を含むことができる）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミド、ガラス、セラミック、水晶、ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの混合物、ステンレススチール、またはそれらの、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料から形成されている。
これに関連して、（微孔質の）鋳型において微孔質エレメントを製造し、場合によりそれを例えばカットして適当な大きさに合わせた後、それを上におよび以下に記載された望ましい方法で加工し使用することができるということが挙げられる。
本発明の有利な態様によれば、ポリマーは、微孔質保持体の外側表面の少なくとも１部分に結合している。さらにまたは別法として、微孔質保持体は、その孔において、流体がフィルターエレメントを流れることが可能な流路を形成する空間が残るようにポリマーを含むことができる。この場合、微粒子の平均直径は、好ましくは孔の平均直径の５０％未満である。
本発明の特に創作的な態様に従えば、少なくとも１つの微孔質膜を微孔質保持体上に配置する。微孔質膜は好ましくは（再生された）セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）またはＰＴＦＥから形成されている。
本発明はさらに、その態様に従えばポリマーが樹脂を含むような態様に関する。この樹脂は、ポリビニルエステル、部分的に脱アシル化されたポリビニルエステル、セルロース誘導体、ポリアミド、およびその混合物からなる群から；またはポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンアクリル酸エステルコポリマー、アクリルアミド酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸ジアミンモノアミドと酢酸ビニルのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール−コ−スチレン）、アクリルアミドアクリル酸エステルコポリマー、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。
別法として、ポリマーは、場合により脱アシル化または架橋された、凝固したヒドロコロイド溶液を含むことができる。ヒドロコロイドは、好ましくは低融点アガロース、デンプン、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される。
別法として、ポリマーは、ビニルエステル、アクリル酸およびその誘導体からなる群から選択されるモノマーの重合生成物；またはジアミンとジエポキシドの重合生成物を含むことができる。
本発明の好ましい態様によれば、微孔質エレメントを支持部材に配置する。支持部材は管の形状をしていてもよい。これに関連して、管の少なくとも一部分は、小さい横断面と大きい横断面の端を有する円錐の形態をとることができ、微孔質エレメントは小さい方の横断面の端にかまたはその近くに位置することができる。
本発明の有利な態様によれば、微孔質保持体の外側と内側の表面を、親水性コーティングで被覆する。
管の内壁は、親水性コーティングで被覆することができるが、その場合、微孔質エレメントの隣にある管の端が親水性コーティングされないように保つのが都合よいこともある。
本発明の様々な特に創作的な態様によれば、微孔質エレメントは以下の形態をとることができる：
・ディスク、
・格子、
・支持繊維を有する膜、
・織布または不織布の性質を有する膜、
・ネット、
・プレート、
・棒、または
・先端が切り取られた円錐。
最後に、本発明は、上に記載した様々な態様によって得られる複数のフィルターエレメントを含む多重流路フィルターエレメントに関する。
本発明の別の態様では、非常に少ない容量の液体を扱うことが含まれる。凝固前の溶媒の望ましくない蒸発は、すべての操作を溶媒飽和の雰囲気で密閉した系系において行えば回避できる。好ましくは温度を精密に制御する。
本発明はさらに、上で記載した様々な態様によって得られるフィルターエレメントに関する。本発明のフィルターエレメントは、分析用またはマイクロ調製用液体クロマトグラフィーの大部分の方式、例えばアフィニティークロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シリカゲルの吸着クロマトグラフィーなど、並びに多成分が結合した複合体の分離も可能にする結合試験に適用することができる。
本フィルターエレメントは、数百個の試料を平行して低コストでスクリーニングすることができるので、生物工学、分子生物学および医療用の生化学的診断に特に有用であろう。
以下の利点が達成された。即ち本方法は、液体を処理している間およびさらに輸送している間の微粒子の位置が変わることを防ぎ、上記の選択された適当な技術を適用することにより、改善または単純化されている。そのことに加えて、さらに本方法は、小型化をさらに進めるための道を開き、生体適合性の表面を提示することにより生体高分子の非特異的な損失を回避し、高価な微粒子材料を非常に少ない量で使用することによりコストを抑える。分離された物質のフィルターからブロッティング膜への移動が、デッドボリュームに関する問題を有することなく可能である。低コストでの製造により、フィルターを１回限りで使用することが可能になり、汚染の危険を回避できる。既知のまたは標準的な吸着特性を有する微粒子を使用することが可能になることで、予想可能な吸着特性を有するフィルターエレメントの製造が可能になり、品質管理が容易になる。
これらのおよびその他の態様は、本発明の記載および実施例によって開示され、または本発明の記載および実施例から自明であり、そして本発明の記載および実施例に包含される。例えば、本発明にしたがって用いられる方法、使用および化合物のいずれかに関連する更なる文献は、例えば電子的装置を使用して公共のライブラリーから探し出すことができる。例えばインターネット上で、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlのもとで入手可能な公的なデータベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。更なるデータベースおよびアドレスは当業者に知られており、例えばhttp://www.lycos.comを使用して得ることができる。過去の調査および最新事情に有用な、生物工学における特許情報の調査および特許情報の関連情報源の調査は、Berks, TIBTECH 12（1994）, 352-364において得られる。
以下の図面に図解で示された例示的な態様を引用して、本発明を以下により詳細に記載する：
第１図は、本発明の一態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示し；
第２図は、流路形成非溶媒の操作様式を示し；
第３図は、本発明の第１の態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示し；
第４図は、本発明の第２の態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示し；
第５図は、本発明の第３の態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示し；そして
第６図は、本発明の第４の態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示す。
第１図は、本発明の一態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示す。フィルターエレメントは、その内壁に親水性コーティング（２）を有する水分不透過性支持体（１）を含む。フィルターエレメントはさらに、析出した樹脂、凝固したヒドロコロイドまたは重合したモノマーのマトリックス（４）内に微粒子（３）を含んでいる。
第２図は、流路形成非溶媒の操作様式を示している。横断面で示した流路形成非溶媒（６）は、微粒子（５）間の大きな隙間をフリーの状態に保つ。樹脂、ヒドロコロイドまたはモノマー（７）の溶液は微粒子の接触点に蓄積する。
第３図は、本発明のさらなる態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示す。フィルターエレメントは、微孔質保持体１と、微粒子３を包埋し微孔質保持体１に連結した多孔質形態ポリマー２を含む微孔質エレメントを含んでいる。この関係においては、第３図は、ポリマー２が微孔質保持体１の上部表面に付いているところを示している。
第３図からははっきりと分からないけれども、ポリマー２は、ポリビニルエステル、部分的に脱アシル化されたポリビニルエステル、セルロース誘導体、ポリアミド、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）、およびそれらの混合物からなる群から選択される樹脂を都合よく含むことに言及する。樹脂は、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンアクリル酸エステルコポリマー、アクリルアミド酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸ジアミンモノアミドと酢酸ビニルとのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール−コ−スチレン）、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸）およびそのグリセリンエステル誘導体、アクリルアミドアクリル酸エステルコポリマー、およびそれらの混合物からなる群から選択することもできる。あるいは、ポリマー２には、場合により乾燥または架橋された、凝固したヒドロコロイド溶液が含まれる。ヒドロコロイドは、低融点アガロース、デンプン、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。最後にポリマー２には、ビニルエステル、アクリル酸とその誘導体からなる群から選択されるモノマーの重合生成物、またはジアミンとジエポキシドの重合生成物も含まれ得る。
微孔質エレメントは、第３図に示されるように、液体前駆体からin situで作ることができる。液体前駆体は、水分不透過性支持部材４の内側表面の形状並びに微孔質保持体１の形状に合った形状を容易にとることができる。ばりなど、不透過性支持部材４の開口のいずれの欠陥もこれにより補われる。凝固すると、支持体部材４の開口の中にぴったりと合った、その壁の周りに沿って完全に接触した微孔質エレメントが得られる。
好ましくは、支持部材４は、プラスチック、例えばポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミドなど、ガラス、セラミック、水晶、窒化ケイ素、またはそれらの混合物から形成される。プラスチックと、ガラス、二酸化ケイ素、炭素またはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料も含まれる。
第３図からわかるように、支持部材４は、管、好ましくは環状の横断面を有する管の形態であり、微孔質エレメントがその管の一方の端にまたはその近くに生じる。試料の添加を容易にするためおよびより大容量の試料に適応させるため、好ましくは少なくともその管の断面は、小さい横断面と大きい横断面とを有する円錐形であり、微孔質エレメントは小さい方の横断面の端にかまたはその近くに生じる。例えば、支持部材４は、エッペンドルフピペットでよく使用されるようなピペットチップである。形成した微孔質エレメントの位置が変わること、例えばずれなどを防ぐため、管は、リングまたは溝のような構造を持った内側表面を有していてもよい。
複数、例えば数百個までの支持部材４を平行に並べて、多重流路フィルターエレメントを形成することも考えられる。多重流路フィルターエレメントは、数百の試薬に対して生物学的試料を同時に試験することを可能にするであろう。あるいは、支持部材４は、例えば平行な穴または先細の穴の形態をした複数の開口部分を含むことができる。多重流路エレメントを光学的に調べる場合、カーボンブラックのような不透明剤を支持部材の材料に含有させて、隣接する流路からの干渉を防ぐのが便利である。
液相を支持部材４の開口に加えるのにいくつかの可能性がある。管状の支持部材４に言及して種々の方法が例示されるであろうがそれらには限られない。一般に液相に関して、「液相」および「溶液」なる語は、文脈から特に必要でない限りは互換的に使用し得る。便利なことに、開口への溶液の添加は、毛管作用によって達成される。例えば管状の、支持部材４を溶液に浸し、再び引き上げる。溶液の表面張力のために、液層がその開口の横断面の上に開口に残るであろう。例えば溶液の粘度が高すぎる場合は、溶液を開口に加えるための別の方法を用いてよい。溶液の上昇力は、管の他方の端を一時的に密閉し、管をわずかに加熱した後、管の開いている方の端を溶液に浸し、管を冷却して室温にすることにより増加させることができる。これにより、溶液が、中に閉じ込められた空気の体積の減少によって管の中へ引っ張られる。別法として、溶液を管の他方の端から入れ、遠心により最終的な位置にもって行くことができる。好ましくは、微孔質エレメントが形成される端またはその近くをキャップでまたは弾力性プレートに押し付けることにより密閉する。キャップまたは弾力性プレートは、好ましくは中の空気を逃がすための微細な溝または微細な孔を有している。次いで、この配置物をを遠心にかける。その間、キャップまたは弾力性プレートによって少なくとも部分的に保持される方の管の端へ、溶液が移動する。キャップまたは弾力性プレートは、凝固の前または後で、特に溶液または溶液の一部の凝固前に取り外すことができる。
当業者は、疎水性の材料でできた容器に入っている水性の試料は、流れ落ちて底に集まるよりもむしろ、壁に水滴状に付着しやすいという問題にしばしば直面する。この現象を回避するために、本発明のフィルターエレメントのための支持部材４として働く管の内壁を、親水性コーティング５で被覆することができる。親水性コーティング５は、水性の試料が支持部材４の管の壁に付着するのを防ぐ。さらに、支持部材４の壁への吸着に起因する生体高分子の吸着損失もない。管の内壁が親水性コーティング５で被覆する場合、その微孔質エレメントに隣接する管の端を、好ましくは親水性コーティング５で被覆されないように保つ。これは、微孔質エレメントに隣接した管の端から出てきた試料液が、隣のフィルターエレメントに侵入するのを防ぐ。複数のフィルターエレメントを並べて多重流路フィルターエレメントを形成する本発明の態様においては特にそうである。
親水性コーティング５は、有機溶媒中の１またはそれ以上のポリビニルエステルの溶液を管の内壁に塗布し、有機溶媒を揮発させ、その表面で生じたポリビニルエステルの層を部分的に加水分解することにより便利に調製する。適当なポリビニルエステルには、ポリ酢酸ビニル（分子量約５０００００が一般に適当である）、ポリプロピオン酸ビニルおよびポリステアリン酸ビニルが含まれる。
ポリビニルエステルの層の部分的加水分解は、ポリビニルエステルの層を水酸化ナトリウムなどのアルカリ性水溶液と接触させることにより行う。管の内壁の部分だけにポリビニルエステルの溶液を塗布することにより、例えば管をポリビニルエステルの溶液に浸すことにより、その微孔質エレメントに隣接した管の端が親水性コーティング５で被覆されないように保つことができる。加水分解の後、微孔質エレメントを、ポリビニルエステルの溶液と接触させなかった方の管の端またはその近くに生成させることができる。別法として、管の内壁全体をポリビニルエステルで被覆し、その一部分のみを加水分解することができる。
別法として、親水性コーティング５は、高分子量の、例えば分子量４０００またはそれ以上のポリプロピレングリコールを使用することによって生成させることができる。そのようなポリプロピレングリコールは、冷水中で適度に良好な溶解性を示すが、温水中では溶解度が低い。したがって、ポリプロピレングリコールの冷却水溶液（例えば０〜４℃の）を管の中に入れた後、温度を例えば約２０℃に上げる。溶液から析出したポリプロピレングリコールは、管の内壁に対して高い親和性を示し、薄い層としてそこへ沈積する。次いで、過剰のポリプロピレングリコール溶液を除く。ある場合には、さらに化学的に架橋させるのが有利なこともある。
第４図は、本発明の一態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示す。フィルターエレメントは、微孔質保持体１と微粒子３を包埋し微孔質保持体１に連結した多孔質形態ポリマー２を含んでいる。この関係において、第４図は、ポリマー２が微孔質保持体１の底の表面に付いているところを示している。
微孔質エレメントが管の形態を有する水分不透過性支持部材４中に配置されていることは、第４図からわかるであろう。管の一断面は、小さい横断面と大きい横断面の端を有する円錐形であり、微孔質エレメントは小さい方の横断面の端にかまたはその近くに位置する。
第５図は、本発明の別の態様にしたがって得られるフィルターエレメントを示す。微孔質保持体１はお互いに連結した固体微粒子を含むことが第５図に示されている。
第５図からははっきりとは理解することができないけれども、微孔質保持体１は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、プロピレン／エチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）、ポリエステル、ポリアミド、ガラス、セラミック、水晶、ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの混合物、ステンレススチール、またはそれらの、ガラス、二酸化ケイ素、炭素もしくはセラミックの繊維もしくはフレームとの複合材料からから形成されているのが有利であるということが挙げられよう。これに関連して、微孔質保持体１は、ディスク、格子、大きい孔の膜、支持繊維を有する膜、織布または不織布の性質を有する膜、ネット、プレート、棒および／または先端が切り取られた円錐の形態にすることができる。膜の形態をしている場合、微孔質保持体１はお互いに連結した微粒子を含むことができる。
これに関連して、（微孔質の）鋳型において微孔質エレメントを製造し、場合によりそれを例えばカットして適当な大きさに合わせた後、それを上におよび以下に記載された望ましい方法で加工し使用することができるということが挙げられよう。
第５図は、微孔質保持体１は、その孔において、流体がフィルターエレメントを流れることが可能な流路を形成する空間が残るようにポリマー２を含むことができることを示している。これに関連して、微粒子３の平均直径は孔の平均口径の５０％未満である。
微孔質膜６を微孔質保持体１の上面に配置する。第５図からでははっきりと分からないけれども、微孔質膜６は（再生された）セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）またはテフロンから形成されるのが有利であることが挙げられよう。
第６図は、本発明の更なる態様にしたがって得られたフィルターエレメントを示している。第６図において、微孔質膜６は、微孔質保持体１の底面に配置される。
本発明は、以下の実施例によってさらにここに説明されよう。
実施例１〜４のマイクロフィルターは、耐有機溶媒性は低いが、より製造しやすい。実施例５および６のマイクロフィルターは、酵素、抗体またはレセプタータンパク質などの不安定な巨大分子が微粒子に結合している場合に特に有用である。温度、酸性度および張性に関して生物学的適合性のある条件下で凝固が起こる。実施例７のマイクロフィルターは、共有結合的な固定化に特に有用である。
これに関連して、実施例１２および１３のマイクロフィルターは、酵素、抗体またはレセプタータンパク質などの不安定な巨大分子が微粒子に結合している場合に特に有用である。温度、酸性度および張性に関して生物学的適合性のある条件下で凝固が起こる。実施例１４のマイクロフィルターは、共有結合的な固定化に特に有用である。実施例１５のマイクロフィルターは、有用溶媒を用いる場合に有用である。
実施例１：
不透過性エレメントの生物学的適合性表面の製造および非溶媒の拡散による微孔質エレメントの製造
アセトン中の３％（W/v）のポリ酢酸ビニル（ＭＷ５０００００、Cat. No.38793-2；Aldrich, Steinheim G）の溶液を１ｍLのピペットチップ（Cat. No. 00 30 001.311 Eppendorf, Hamburg G）の内壁に加え、ブロッティングペーパー上に排出させる。室温で揮発させ７０℃に一晩加熱した後、チップを水中の１Ｎ−ＮａＯＨ１ｍLで満たし、部分的な反応を２４℃で３０分間行った。最後に、チップを洗浄し乾燥した。さらに、エチレン含量４４mol％のポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）（Cat. No.41,410-7；Aldrich, Steinheim G.）１ｇをジメチルスルホキシド４ｍLにより１００℃にて溶解させることにより、液相を調製した。４０℃で容量３μLの液相を取った。ピペットチップの小さい方の口を閉じた後、水をチップに蒸気として導入した。１時間後、水５０μLを、凝固している液相の上に直接加えて、更なる拡散析出（diffusional precipitation）を得た。得られたフィルターエレメントの流速は、５．３μL／分（口径０．８ｍｍ；５００mbar）であった。
実施例２：
微孔質ビーズを封入した樹脂の析出による製造
シリカゲル上の逆相材料１００μg（Ｃ18、孔径３０nm、５μｍビーズ；Vidac, hesperia, CA, USA）をポリマー溶液とともに音波処理した（実施例１参照）。次いで、この液相を実施例１に記載されたようにさらに処理した。流速は、１μL／分であった（口径０．８ｍｍ；１bar）。逆相材料の代わりに、吸着材として二酸化ケイ素（ヒュームドシリカ、１４nmのサイズ；Cat. No.S-5505, Sigma, Deisenhofen G.）を用いた場合、流速は２４０nL／分であった。
実施例３：
異なるタイプの微粒子の混合物を封入した半合成ポリマーの析出による製造
混合物は次の３つの異なるタイプの多孔質微粒子から調製した。シリカゲルをベースとする陰イオン交換物質（Adsirbex-SAX, Cat. No.19845, Merck, Darmstadt G.）１００ｍg、陽イオン交換物質（Adsirbex-SCX, Cat. No.19846）１００ｍg、逆相ＲＰ８（Cat. No.9362）１００ｍg。１ｍLのジメチルスルホキシドとともに音波処理し遠心した後、湿った沈殿物に、９５℃で調製したジメチルスルホキシド中の１５％プロピオン酸セルロース（平均ＭＷ２００，０００；Cat. No.18462-4；Aldrich, Steinheim G.）６００μLを加えた。生物学的適合性表面修飾を施した修飾Comfortip（Cat. No. 30061; Eppendorf, Hamburg G）を微孔質保持体器具に押し付けて保持させ、３５μLの液体で満たし、８０μLのシリコーンオイル層を載せ、最後に２００μLの蒸留水の層を載せた。水相が最終的にマイクロフィルターを通るまで陽圧（少なくとも２bar）をかけた。流速は、１０μL／分（口径１．５mm、長さ１２mm；７mbar）であった。
実施例４：
ナノリットルレンジでの半合成ポリマーの析出による製造
ジメチルスルホキシド中のプロピオン酸セルロース（ＭＷ２００，０００）の２０％溶液（W/v）の容量２００nLを、ゲル充填用チップ（Cat. No. 00 30 001.222; Eppendorf, Hamburg G）中に入れた。口をシリコーンオイルで一時的に閉じ、非溶媒を蒸気として他方の側から導入した。流速は、１．５μL／分であった（口径８０μｍ；１００mbar）。
実施例５：
０℃の流路形成非溶媒存在下での可逆性ヒドロゲルの架橋による製造
水中の５％（W/v）ポリ（ビニルアルコール）（ＭＷ１２４，０００〜１８６，０００、加水分解率９９％；Cat.No.Aldrich, 36 306-5；Steinheim G.）の溶液を１００℃で調製し、溶液４ｍLをｐＨ４．７の５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム１ｍLと混合し、０℃に冷却した。酵素含有ＳＡＸ粒子（Adsorbex-SAX, Merck, Darmstadt G.）１ｇを加えた。この液相４０μLを、生物学的適合性表面を有する修飾Comfortipに充填した。チップを微孔質保持器具に押し付けて（実施例７参照）、５０μLのシリコーンオイル層を載せた。陽圧をかけた後、シリコーンオイルの粒状ベッドへの移動が達成した。架橋を達成するために、５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウムのｐＨ８．６の溶液の最後の層を、Comfortipに強制的に通した。流速は０．５μL／分であった（口径１．３mm；７mbar）。
実施例６：
流路形成非溶媒存在下での可逆的ヒドロゲルの使用による製造
１ｇのＤＥＡＥ−Ｓｉ３００、１０μｍサイズ（Cat.No.43536；Serva, Heidelberg G.）を２％アガロース溶液５ｍLと４０℃で混合した。アガロース（低融点調製用アガロース；Cat.No.162-0017；Bio-Rad Munich, G）は、３％スクロース溶液中に９０℃で溶解させておいた。次いで、液相１００μLを、前に記載した生物学的適合性の表面コーティングを有する修飾standartip（Standartip Cat. No. 30.003.004; Eppendorf, Hamburg G）に吸収させた。実施例７に記載するように、standartipを微孔質保持器具に押し付けて保持した。４０℃で２００μLのシリコーンオイルの上層を添加した後、１５０μLが微孔質保持器具を通過するまで陽圧をかけた。器具を取り外した後、６℃で凝固を達成させた。最後に５００μLのスクロース溶液の濾過によりシリコーンオイルを排出させた。濾過速度は７μL／分であった（口径０．５mm；７mbar）。
実施例７：
流路形成非溶媒存在下での重縮合による製造
シリカゲル１００ｍg（Lichrosorb Si 100, サイズ7μｍ Cat. No.9340, Merck, Darmstadt G.）を５００μLのモノマー溶液（体積で、５体積の１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（Cat. No.22,089-2；Aldrich, Steinheim G）、１体積のジメチルスルホキシドおよび１体積のエチレンジアミン）とともに音波処理した。液相３５μLを修飾Comfortip（Cat. No. 00361；Eppendorf, Hamburg G）内に取った。充填されたComfotipを、厚さ３mmのろ紙
0004387462.tif 000003
の上に配置した微孔質の金属ふるい（Cat. No.12550812; Bischoff, Leonberg）からなる保持器具に押し付けて保持した。シリコーンオイル８０μLの層を液相の上に載せた後、シリコーンオイルの３０μLがCormfortipを流れるまで陽圧（少なくとも１bar）をかけた。保持器具から取りはずした後、密閉した系の中で硬化させることにより凝固を達成させた。最後にマイクロフィルターを蒸留水および適当な緩衝液で洗浄した。流速は３２μL／分であった（口径１．３ｍｍ；１bar）。
逆相材料の代わりに、吸着材として非孔質の二酸化ケイ素（１〜５μｍ、Cat. No.S-56631, Sigma, Deisenhofen G.）を用いた場合、流速は１μL／分であった（口径１．５ｍｍ；容量１０μL、Comfortip１bar）。
実施例８：
不浸透性エレメントの生物学的適合性表面の製造および非溶媒の拡散による微孔質エレメントの製造
３％（W/v）ポリ酢酸ビニル（分子量５００，０００、Cat. No.38793-2；Aldrich, Steinheim G）の溶液を１００μLのフィルターチップ（Cat. No.00 30 087.010; Eppendorf, Hamburg G）の内側表面に加え、ブロッティングペーパーに排出させた。室温で蒸発させ７０℃に一晩加熱した後、チップに水中の１ＮＮａＯＨ１ｍLを充填し、部分的な反応を２４℃で３０分間行った。最後にチップを洗浄し乾燥した。さらに、エチレン含量４４mol％のポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）（Cat. No.41,410-7;Aldrich, Steinheim G）１ｇをジメチルスルホキシド４ｍLに１００℃で溶解させることにより、溶液を調製した。シリカゲル上の逆相物質（Ｃ１８、口径３０ｎｍ、５μｍビーズ；Vidac, Hesperia, CA, USA）１００ｍgをポリマー溶液とともに音波処理した。容量３０μLの懸濁液を４０℃で取った。フィルターチップの小さい方の口を閉じた後、水をチップに蒸気として導入した。１時間後、水５０μLを凝固している液相に直接加え、さらに拡散析出させた。
実施例９：
微孔質保持体への微粒子の封入
ポリ（ビニル酢酸）１ｇと酢酸１９ｍLを用いて、ポリ（酢酸ビニル）（Cat. No. 38793-2; Aldrich, Steinheim G）の溶液を調製した。粒子１ｇと溶液４ｍＬを用いて微粒子（チバクロンブルーF3GA; Si 300ポリオール, 5μｍ; Cat.No. 43532; Serva, Heidelberg G）の懸濁液を得た。懸濁液を、吸引ポンプ装置の上に平らに保持した多孔性テフロン膜の上に配置したポリプロピレンフリットのディスク（多孔性０）に加えた。濾過が完了したら、多孔質形態ポリマーの形成のため水を加えた。
このように形成された微孔質エレメントを挿入し、ラジアル圧縮下で支持体に保持した。
実施例１０：
異なる種類の微粒子の混合物が封入された半合成ポリマーの析出による製造
混合物を次の３つの異なる種類の多孔性微粒子から調製した：シリカゲルベースの陰イオン交換樹脂（Adsorbex-SAX, Cat. No. 19845; Merek, Darmstadt G）１００ｍg；陽イオン交換樹脂（Adsorbex-SCX, Cat. No. 19846）１００ｍg；および逆相ＲＰ８（Cat. No. 9362）。ジメチルスルホキシド１ｍLとともに音波処理した後、湿った沈殿物に、９５℃で調製したジメチルスルホキシド中の１５％プロピオン酸セルロース（平均分子量200,000;Cat. No. 18462-4; Aldrieh, Steinheim, G）６００μLを加えた。生物学的適合性表面修飾を施した１００μLの修飾フィルターチップ（Cat. No.00 30 067.010; Eppendorf, Hamburg G）を２０μLの液体で満たし、３０μLのシリコーンオイルの層を載せ、最後に５０μLの蒸留水の層を載せた。水相が最終的にマイクロフィルターを通るまで陽圧をかけた。
実施例１１：
保持体として統合された支持ウェブを有する、あらかじめ組み立てられた複合膜を使用する微孔質エレメントの製造
１ｇのポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）（Cat. No.41409-3; Aldrich, Steinheim G）をジメチルスルホキシド９ｍLで溶解させた。シリカゲル（20μｍ, 60nm;Merek, Darmstadt G）１ｇをその中で懸濁させた。懸濁液３ミリを６０℃まで加温し、膜（ポリプロピレンウェブ上の再生セルロース; Cat. No.U 3880; Sigma, Deisenhofen G）の上に均一に散布し、平らなフリット上で吸引濾過装置に平らに広げた。濾過を完了した後、凝固のため最後に水を加えた。中空支持体に挿入するため、ディスクを裁断機でカットした。
実施例１２：
０℃の流路形成非溶媒存在下での可逆性ヒドロゲルの架橋による製造
水中の５％（w/v）ポリ（ビニルアルコール）（MW 124 000-186 000, 加水分解率99%; Cat. No. Aldrich, 36 306-5; Steinheim G）の溶液を１００℃で調製し、溶液４ｍLをpH４．７の５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム１ｍLと混合し、０℃に冷却した。最後に、酵素含有SAX粒子（Adsorbex-SAX, Merck, Darmstadt G）１ｇを加えた。この懸濁液１００μLを生物学的適合性表面を有する１ｍLの修飾フィルターチップ（Cat. No. 00 30 067.037: Eppendorf, Hamburg G）に充填した。チップにシリコーンオイルの層１００μLを載せた。陽圧をかけた後、シリコーンオイルの粒子ベッドへの移動が達成された。架橋を達成させるために、最後にｐＨ８．６の５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム溶液の層を微孔質エレメントへ強制的に通した。
実施例１３：
流路形成非溶媒の存在下での可逆性ヒドロゲルを用いる製造
１０μｍサイズのＤＥＡＥ−Ｓｉ３００（Cat. No. 43536; Serva, Heidelberg G）１ｇを、２％アガロース溶液５ｍLと４０℃で混合した。アガロース（低融点調製用アガロース；Cat. No. 162-0017; Bio-Rad, Munich, G）は、３％スクロース溶液中９０℃で溶解させておいた。次いで、実施例８に記載の通り、液相１００μLを生物学的適合性表面コーティングを有する１ｍL修飾フィルターチップ（Cat. No. 00 30 067.037; Eppendorf,Hamburg G）に取った。４０℃でシリコーンオイルの上層５００μLを加えた後、４００μLが微孔質保持体を通るまで陽圧をかけた。６℃で凝固を達成させた。最後にスクロース溶液５００μLの濾過により、シリコーンオイルを排出させた。
実施例１４：
流路形成非溶媒存在下での重縮重による製造
１００ｍgのシリカゲル（Lichrosorb Si 100, 7μｍサイズ; Cat. No. 9340; Merck, Darmstadt, G）を５００μLのモノマー溶液（体積で、５体積の１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（Cat. No. 22,089-2; Aldrich, Steinheim G）、１体積のジメチルスルホキシドおよび１体積のエチレンジアミン）とともに音波処理した。液相３５μLを１０μLの修飾フィルターチップ（Cat. No. 00 30 067.002; Eppendorf, Hamburg G）に取った。シリコーンオイルの層７０μLを液相の上に載せた後、シリコーンオイル３０μLがフィルターチップを流れるまで陽圧をかけた（少なくとも１bar）。閉じた系内で寝かせることにより、凝固を達成させた。最後に、フィルターエレメントを蒸留水および適当な緩衝液で洗浄した。
実施例１５：
流路形成非溶媒存在下での重合による製造
ＨＰＬＣ水準のシリカゲルタイプの陰イオン交換物質（ＤＥＡＥ−Ｓｉ３００、１０μｍ；Cat. No. 43536; Serva, Heidelberg G）１００ｍgを５００μLの氷冷モノマー溶液（重量で、２６％アクリルアミド；０．７％ビスアクリルアミド；pＨ８．８の１７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ；０．０５％テトラメチルエチレンジアミン（Cat. No.8133; Sigma,Deisenhofen）；０．０８％過硫酸ナトリウム）とともに音波処理した。
更なる工程は、シリコーンオイルによるフラッシング（flushing）工程の間の温度を０℃〜２℃の間に保つことを除いては実施例１４に記載の通りに行った。最後に、４５℃で硬化させることにより凝固を達成させた。
実施例１６：
乾燥手段による流路の再形成によるヒドロゲルと微粒子を用いる製造
４０℃にて、アガロース（Bio-Rad, Munich G）の２％（w/v）溶液１ｍLを、微孔質酸化チタン（YMC-Gel, TIAOS 20 NP;YMC Europe, Schermbeck G）と混合し音波処理した。同じ温度で、液体５０μLを生物学的表面コーティングを与えられたフィルターチップ内に取った（実施例８）。スウィング・アウト・ローター内で低速遠心（８０回転／分）を用いて、微粒子が丁度露出し始めるときに流れが止まるように圧力を調整した。凝固は、６℃で達成させた。乾燥を室温で行い、最後に、Ｐ2Ｏ5により１ｍｂにて行った。
実施例１７：
非共有結合的に互いに結合したオリゴヌクレオチドと特異的巨大分子からなる多分子複合体の分離
標識したオリゴヌクレオチドプローブを核抽出物とインキュベーションし、８μLを、緩衝液４０μLで洗浄したポリアクリルアミド−ＤＥＡＥマイクロフィルター（実施例１５）で濾過した。遊離のオリゴヌクレオチドは保持され、数分以内に複合体形態が溶出液中に得られた。
実施例１８：
多重カラム多重流路プレートの製造
ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）（Cat.No. 41, 408-5, Aldrich,Steinheim, G.）の５％溶液を、２種類の非溶媒の混合物、即ち７０体積のｎ−プロパノール、３０体積の水および１０体積のジメチルスルホキシドを使用して還流下に調製した。１６〜２４μｍのサイズのＮｉ−ＮＴＡシリカ（Cat.No. 30710;QIAGEN GmbH, Hilden, G.）１ｇをポリマー溶液４ｍLに懸濁した。支持体として、３８４ウェルプレート（GENETIX Well, Cat.No. X 5005; Dunn, Thelenberg, G.）を出発材料としてＣＡＭによって３８４−チャネルプレートを製造しておいた。直径１．５ｍｍの流路の開口している方の端を、厚さ１ｃｍの柔軟な微孔質保持シートに対して圧力をかけることにより閉じた。３５μLのアリコートを各流路に充填した。この組立て物の毛管活性のために、過剰の流体はすべて、溶液が粒子ベッドの上端部分と一直線に並ぶまで排出される。その後、保持体を取りはずし、室温で１時間、蒸発および凝固させた。最後に蒸留水５０μLを５時間かけて加えた。
実施例１９：
細胞破片をふるいにかけるまたは巨大粒子を捕捉するために適用できる、２層に配列された２種類のサイズの低融点ポリマー画分を焼結することによる微孔質フリットの製造
ポリ酢酸ビニル（ＭＷ５００，０００、Cat.No. 38, 793-2; Aldrich, Steinheim, G.）の球形粒子の粉末をふるいにかけて分けた。４０ｍgのフィルター粒子画分（１００〜２００μｍ）および２００ｍgの粗目の画分（２００〜５００μｍ）を、出口に栓をしたＱＩＡＧＥＮスピンカラムの中へ層状に重ねた。１３０℃で１時間加熱し、さらに１時間冷却した後に、粒子がお互いに並びにスピンカラムのポリプロピレン壁にしっかりと結合したフィルターエレメントが得られた。懸濁液をカラムで濾過したときの捕捉許容量はシリカ（LiChroprep Si 100,25-40μｍ, Cat.No. 1.13904.1000; Merck,Darmstadt, G.）８ｍgであった。
実施例２０：
親水性および疎水性鎖部分を含む低融点熱可塑性コポリマーを焼結することによるフリット−シリンジの製造
ＭＷ１，９００の粉末状ポリ（スチレン−コ−マレイン酸）（Cat.No. 44,235-6; Aldrich, Steinheim, G.）５０ｍgを天然ゴムストッパー（Omnifix-F 1ｍL；Braun; Melsungen, G.）を設けたシリンジのＬｕｅｒオリフィスにプレスした。１２０℃で１時間加熱した後１時間冷却し、フリット−シリンジを得た。製造されたフリット−シリンジの得られた流速は、１００ｍｂａｒで３ｍL／分であった。
実施例２１：
ポリアクリルアミドと３つの異なる種類の吸着粒子を使用する、多機能フリット−シリンジの製造
アクリルアミド（Cat.No.A 3553; Sigma, Deisenhofen, G.）４．５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド（Cat.No. M 7279; Sigma, Deisenhofen, G.）０．５ｇおよびジメチルスルホキシド（Cat.No. D 8779; Sigma, Deisenhofen, G.）３．０ｍLを用いて、モノマー溶液を５０℃で調製した。モノマー溶液を次の３つの異なる種類の微孔質粒子の混合物の懸濁に使用した：シリカゲルベースの陰イオン交換物質（Adsorbex-SAX, Cat. No. 19845; Merek,Darmstadt, G.）２５０ｍg、陽イオン交換物質（Adsorbex-SCX, Cat.No. 19846）２５０ｍg、および逆層ＲＰ８（Cat. No. 9362）２５０ｍg。次いで、この懸濁液２５０μLを微孔質保持器具を設けた１ｍLのシリンジ（Omnifix-F; Braun, Melsungen,G.）に加えた。さらに、あらかじめ真空下で注意深く脱気した脱気シリコーンオイル（DC 200流体, 10 cst, Cat.No.35132; Serva, Heidelberg,G.）を上層として加えた。最後に、シリンジのピストンを挿入し、圧縮された粒子ベッドへ押し下げた。５０℃で５時間置くことにより、重合を達成させた。最後に、フィルター−シリンジを数体積の蒸留水で洗浄し、乾燥させ、数体積のヘプタンでさらに洗浄した。
実施例２２：
低分子量のリガンドとの急速結合試験、染料および他の不純物の急速除去のための多機能性フリット−シリンジの応用
１ｍLあたりに以下の成分を含む試験溶液を調製した：14Ｃ標識希薄トレーサーを含むウシ血清アルブミン（NEN, Dreieich, G.）１００μｇ、ナイルブルー（Cat.No. 22,255-0; Sigma, Deisenhofen）３μｇ、メチルオレンジ（Cat.No.11,451-0; Sigma, Deisenhofen, G.）５μｇ、およびpＨ７．２のリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭ。５０μLの試験溶液を、４００μLの空気をあらかじめ入れたフリット−シリンジに吸い取り、１０秒以内に排出した。この時間の間に、溶液中のタンパク質が完全に回収され、染料が完全に除去されることが分かった。
実施例２３：
シリコーンオイルによる微孔質粒子のミクロ孔からのポリマーの排除を達成するシリカ含有ポリマー膜の製造
１６〜２４μｍのサイズの１ｇのＮｉ−ＮＴＡシリカ（Cat.No. 30710; QIAGEN, Hilden, G.）を、静かな撹拌と音波処理により、９ｍLのシリコーンオイル（DC 200流体, 10 cst, Cat.No. 35132;Serva, Heidelberg, G.）で懸濁させた。吸引を制御しながら、５０μLの懸濁液を１００μLのフィルターチップ（Cat.No. 0030067.010;Eppendorf, Hamburg, G.）内に加えた。流体を粒子ベッドの上部にフラッシュしたとき、ジメチルスルホキシド中のポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）（Cat.No. 41, 408-5; Aldrich, Deisenhofen, G.）の１０％溶液を５０μLの容量で加え、次いで水５０μLを加えた。乾燥させた後、ヘプタン３００μLをシリコーンオイルの痕跡を洗い流すために使用した。
実施例２４：
一時的な流路形成物質としての焼結ポリ酢酸ビニルフリットの使用による熱安定性、耐溶媒性エポキシドフリットの製造
実施例１９に記載の通り、１３０℃での焼結のため、ポリ酢酸ビニルのフィルター粒子画分（１００〜２００μｍ）２０ｍgを使用してフリットカラムを調製した。泡の包含を防ぐため、新たに混合した接着剤
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を圧力によって導入した。４０℃で１日反応させて凝固させた。最後に、下端０．５ｍｍを切り取り、酢酸エチル１００ｍLを用いてポリ酢酸ビニルを２４時間振盪しながら通す。フリットのフリー内部体積は約９０％であり、流速は３００μL／秒であった。
実施例２５：
ポリ（スチロール−コ−マレイン酸）のポリオールエステル誘導体の塗布によるポリマー表面上の親水性の濡れやすい表面の製造
乾燥ジメチルホルムアミド（Cat.No. 40258; Fluka, Buchs, CH）中の１０％ポリ（スチレン−コ−マレイン酸）（Cat.No. 44,235-6; Aldrich,Steinheim, G.）の溶液を調製し、０．３体積の乾燥グリセリン（Cat.No.49770; Fluka, Buchs, CH）を加えた。エステル化するために、反応混合物を、水分排除下に１１０℃に６時間保った。生成物溶液１ｍLを蒸留水２０ｍLで希釈することによりコーティング溶液を調製した。ピペットチップを室温で一晩コーティング溶液に浸し、最後に２０体積の蒸留水で洗浄した。
実施例２６：
エタノールとの接触によるＴＨＦで溶解したポリマーの析出による、遠心用の膜の製造
スピンカラムを、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（Cat. No. 79654; QIAGEN GmbH, Hilden, G）からフィルター膜を取り外すことにより調製しておいた。テトラヒドロフラン（Cat. No. 87371; Fluka, Deisenhofen, G）中のポリスチレン（分子量８００〜５，０００;Cat. No. 23637; Polysciences inc.,Eppelheim, G）の溶液を、ポリスチレン５ｇとＴＨＦ４５ｇを還流下で加熱することにより調製した。溶液１２μLを、ピペットでスピンカラムに移し、スピンカラムをエタノール
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に深さ５ｍｍに浸した。１０分後、エタノール５００μLをピペットでカラムに移し、カラムをエタノール浴から取りだした。非溶媒をカラムに押し通すためにカラムに陽圧をかけた。カラムをエタノールで２回洗浄し、室温で乾燥させた。得られたフィルターエレメントの水の流速は、１００μL／分であった（Heraeus Biofuge 13中3.000g）。
実施例２７：
エタノールとの接触によるトルエンに溶解させたポリマーの析出による重力流出用の膜の製造
トルエン（Cat. No. 89681; Fluka, Deisenhofen, G）４２．５ｇ中のポリスチレン（分子量800-5,000; Cat. No. 23637; Polysciences inc.,Eppelheim G）７．５ｇを還流下に加熱して１５％溶液を調製した。この溶液１２μLをピペットでスピンカラムに移し、スピンカラムをエタノール中に５ｍｍの深さで浸した。１０分後にエタノール５００μLをピペットでカラムに移し、カラムをエタノール浴から離した。更なるポリマーの析出と可溶性成分の除去のために非溶媒をカラムに押し通すため、カラムに陽圧をかけた。カラムをエタノールで２回洗浄した後、室温で乾燥させた。これらカラムの流速は、１００μL／分（重力流出）であった。
実施例２８：
エタノールとの接触によるＤＭＦに溶解させたポリマーの析出による高速遠心用の安定な膜の製造
均一な溶液を得るために、ポリスチレン（分子量800〜5.000; Cat. No. 23637; Polysciences inc.,Eppelheim G）５ｇをジメチルホルムアミド（Cat. No. 41644;Fluka, Deisenhofen, G）４５ｇとともに還流下に加熱した。この溶液１０μLをスピンカラムの出口に加えた。次いで、スピンカラムをエタノール浴に２ｍｍの深さで１５秒間、次いで８ｍｍの深さで１０分間浸した。カラムを浴から離し、析出を完了させ溶媒を除去するためエタノール５００μLをカラムに加えた。カラムをエタノールで処理し、実施例２６に記載の通りに陽圧をかけた。得られたフィルターカラムは、１０，０００ｇまでの遠心において破壊することなく安定であった。
実施例２９：
水との接触によるＤＭＳＯに溶解したポリマーの析出による親水特性を有する膜の製造
ジメチルスルホキシド中の１０％ポリ（メチルメタクリレート）（分子量15,000, Cat No.20,033-6; Aldrich, Steinheim, G）の溶液１２μLをスピンカラムの内側表面に加えた。次いで、カラムを水浴に、２ｍｍの深さで５秒間次いで１０ｍｍの深さで１時間浸した。カラムを水浴から離した後、水５００μLをピペットでカラムに移し、カラムにゆっくりと流した。カラムを蒸留水で２回洗浄して水溶性の含有物を除去し、オーブン中５０℃で乾燥した。製造された多孔質カラムの得られた流速は、２５０μL／分であった（重力流出）。
実施例３０：
水との接触によるＤＭＳＯに溶解したポリマーの析出による混合膜の製造
ジメチルスルホキシド中の、ポリ（ビニルアルコール−コ−エチレン）（Cat.No.41,407-7; Aldrich, Steinheim, G）の５％溶液およびポリ（メチルメタクリレート）の５％溶液の１２μLの容量をピペットでスピンカラムの出口に移した。カラムを水に２ｍｍの深さで浸すことにより、水を重合溶液の底から与えた。１０秒後、カラムを１０ｍｍの深さで水に浸し、３時間膜を硬化させた。次いで、水５００μLを３０分間かけてカラムに加えた後、カラムを水浴から離し、２ｍLのコレクションチューブ（Cat. No.19562; QIAGEN GmbH, Hilden, G）に入れた。遠心機中２，５００〜１０，０００ｇの遠心によって水を膜に流した。その後、水をピペットでさらに２回移し、遠心によって膜に強制的に通した。得られた流速は、２５０μL／分であった（Heraeusマイクロ遠心気中10,000g）。
実施例３１：
ＤＮＡ結合手段のための水との接触によるＤＭＳＯに溶解したポリマーの析出によるシリカ含有膜の製造
１５〜２５μｍサイズのＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｓｉ ６０（Cat. No. 9336; Merek, Darmstadt,G）１ｇを、ジメチルホルムアミド中の５％ポリスチレン（分子量800〜5,000）溶液４ｍＬと混合し、還流下に加熱することにより調製した。この混合物の１５μＬを、ピペットでスピンカラムの出口に移し、カラムを水に深さ２ｍｍで５秒間浸した。１０秒後、カラムを水に１０ｍｍの深さで浸し、２時間膜を硬化させた。次いで、水５００μＬを１０分間かけてカラムに加えた後、カラムを水浴から離して２ｍLのコレクションチューブに入れた。２，５００〜１０，０００ｇの遠心により水を膜に流した。その後、水をさらに２回ピペットで移し、遠心により膜に強制的に通した。濾過速度は、１５０μL／分であった（Heraeusマイクロ遠心気中11,000g）。
実施例３２：
タンパク質精製手段のための水との接触によるＤＭＦに溶解したポリマーの析出によるＮｉ−ＮＴＡシリカ含有膜の製造
１６〜２４μｍサイズのＮｉ−ＮＴＡシリカ（Cat. No. 30710; QIAGEN, Hilden, G）１ｇを、静かに撹拌し音波処理しながら、ジメチルホルムアミド中の１０％ポリスチレン（分子量800〜5,000）溶液４ｍＬと混合した。この混合物の１５μＬをピペットでスピンカラムの出口に移し、カラムを水に深さ２ｍｍで５秒間浸した。１０秒後、カラムを水に１０ｍｍの深さで６０分間浸した。次いで、水５００μＬを５分間かけてカラムに加えた後、カラムを水浴から離して２ｍLのコレクションチューブに入れた。２，５００〜１０，０００ｇでの遠心により水を膜に流した。その後、水をさらに２回ピペットで移し、遠心により膜に強制的に通した。濾過速度は、２００μL／分であった（Heraeusマイクロ遠心気中11,000g）。
実施例３３：
濾過手段のための、水との接触によるＤＭＦに溶解したポリマーの析出によるシリカゲル含有２層膜の製造
次の２種類の混合物を調製した：ジメチルホルムアミド中のポリスチレン（分子量800〜5,000）の５％溶液１０ｍＬを、激しく撹拌し音波処理することにより、２５〜４０μｍサイズのＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｓｉ １００（Cat. No. 13904; Merck, Darmstadt, G）２ｇと混合し、第２の混合物をジメチルホルムアミド中のポリスチレン（分子量800〜5,000）の５％溶液１０ｍＬを、４０〜６３μｍサイズのＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｓｉ ６０（Cat. No. 13905; Merck, Darmstadt, G）２ｇと混合することにより調製した。第１の溶液１２μＬをピペットでスピンカラムの出口に移し、スピンカラムを水に深さ１ｍｍで１０秒間浸した。次いで、スピンカラムを水から離し、第２の溶液５０μＬをピペットで第１の溶液の上部へ注意深く移した。スピンカラムを水浴中へ移し、深さ１０ｍｍで４時間浸した。５００μＬの水をピペットでカラムに移した後、カラムをコレクションチューブに置き、水を遠心（２，５００〜１０，０００ｇ）により強制的に通した。
水による洗浄を２回繰り返し、膜を１３，０００ｇで５分間遠心することにより乾燥させた。
実施例３４：
シリカ含有膜（実施例３１）上のカオトロピック結合および低塩濃度による溶出によるプラスミドＤＮＡの精製
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pＨ８．５）中のプラスミドＤＮＡの溶液（濃度１μｇＤＮＡ／μL）は、ＱＵＩＡＧＥＮプラスミドミニ精製プロトコルにしたがって、ＬＢ−Ｍｉｌｌｅｒ培地でプラスミドｐＵＣ２１を含む大腸菌を培養し、プラスミドＤＮＡを他の細胞成分から分離することにより調製した。
２００ｍgのアガロースゲルスライスをエッペンドルフチューブに移し、４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（pＨ５．１）６００μLを加えた。時折撹拌しながら、５０℃で１０分間インキュベーションすることにより、ゲルを完全に結合緩衝液に溶解した。ゲルスライスが完全に溶解した後、ＤＮＡ溶液２０μL（２０μｇ）を加え、均一な溶液を得るために溶液を混合した。次いで、イソプロパノール２００μLを加え、混合物を５秒間撹拌した。実施例３１のスピンカラムをコレクションチューブ内に置き、調製した溶液７５０μLをピペットでカラムに移した。マイクロ遠心機で１３，０００ｇにて遠心した後、カラムに残りの溶液を入れ、再び遠心した。次いで、４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（pＨ５．１）５００μLを加え、スピンカラムを１３，０００ｇで１分間再び遠心し、洗浄および遠心操作を７０％エタノール７５０μLで繰り返した。次いで、流出分（flow through）を捨て、カラムをさらに１３，０００ｇで１分間遠心した。カラムを清浄な１．５ｍLのマイクロ遠心チューブに入れ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（pＨ８．５）１００μLをカラムに加え、ＤＮＡをフルスピードでの１分間の遠心により溶出させた。溶出量を増加させるため、さらに１００μLをカラムに加えて遠心を繰り返した。
カラムから溶出したＤＮＡの、分光法およびアガロースゲルにより定量した量は、８〜１０μｇであった。
実施例３５：
Ｎi−ＮＴＡシリカ含有膜（実施例３２）でのアフィニティー結合および低pＨでの溶出によるＨｉｓタグ結合したタンパク質の分離
６×Ｈｉｓタグ結合させたマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（pQE16, Cat. No.33163; QIAGEN GmbH, Hilden, G）を発現するｑＱＥベクターを、ＱＩＡexpressionist,０３/９７,タンパク質発現ハンドブック；ＱＵＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ；１９９７のプロトコルにしたがって、大腸菌Ｍ１５株（ｐＲＥＰ４）に形質転換した。形質転換体の単一のコロニーを、１００μｇ／ｍLアンピシリン（Cat. No. 10045; Fluka, Deisenhofen, G）および２５μｇ／ｍLカナマイシン（Cat. No. 60615; Fluka, Deisenhofen, G）を含む１．５ｍLの培地中に取り、３７℃で一晩培養した。一晩培養した培地１ｍLを、上記の抗生物質を含む１００ｍLの新鮮な培地に移した。光度計で測定してＯＤ600が０．５〜０．７に達したら、ＩＰＴＧ（Cat. No. 15502; Sigma, Deisenhofen, G）を終濃度１ｍＭになるように添加することによりタンパク質発現を誘導した。細胞をさらに４時間培養させた後、マイクロ遠心チューブに移した。次いで、細胞をペレットとして回収するため、５，０００ｇで１０分間の遠心を開始した。次の工程では、細胞を１０ｍLの変性溶解（denaturing lysis）緩衝液（８Ｍ尿素（Cat. No. 51458; Fluka,Deisenhofen, G）、０．１ＭＮａＨ2ＰＯ4（Cat. No. 71507; Fluka, Deisenhofen, G）、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Cat. No. 63362; Fluka, Deisenhofen, G）（pＨ８．０）中、撹拌することにより溶解させた。実施例３２のカラムを、変性溶解緩衝液で平衡化した後、製造したタンパク質溶液（６×Ｈｉｓタグ結合させたマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ２００μｇを含む）４００μLをカラムに加えた。カラムを２ｍLのコレクションチューブに置き、５，０００ｇでの遠心によりタンパク質溶液をカラムに流し、流出分を捨てた。変性溶解緩衝液６００μLをピペットでカラムに移すことにより、スピンカラムを洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心し、流出分を捨てた。変性洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ2ＰＯ4、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pＨ６．３））で洗浄操作を繰り返した。スピンカラムを１．５ｍLのエッペンドルフチューブに入れ、１００μLの変性溶出緩衝液（８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ2ＰＯ4、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pＨ４．５）をピペットで移し、次いで５，０００ｇで２分間マイクロ遠心することにより溶出を行った。溶出を２回繰り返し，得られたタンパク質濃度をBradford法にしたがって測定した。一回の溶出画分２０μLを、１ｍLの染料溶液
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と混合し、室温で５分間インキュベーションし、Beckman光度計（波長５９５ｎｍ）で測定した。スピンカラムから得られたタンパク質総量の結果は、４０μｇであった。
実施例３６：
真空集合体での２層膜（実施例３３）による細菌リゼートの濾過
培養細胞ペレットは、ＬＢ−Ｍｉｌｌｅｒ培地において、プラスミドｐＴＺ１９Ｒを含む大腸菌を培養し、６００ｎｍにおける吸光度が１〜１．５に達した後、細菌培養液２５ｍLを遠心し（３，０００ｒｐｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ遠心機、Ｊ２−２１型、５０ｍLのファルコンチューブ用の入口ＪＡ−１７を有する）、上清を除くことにより調製した。得られた細菌ペレットを再懸濁用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍLのＲＮａｓｅＡ（Cat. No. 19101;QIAGEN GmbH, Hilden, G）（pＨ８．０）に再懸濁し、細胞の凝集体をすべて懸濁させた。細菌懸濁液を、１．５ｍLのエッペンドルフチューブにピペットで移すことにより３００μLずつに分けた。３００μLの溶解緩衝液（２００ｍＭＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（Cat. No. 71725: Fluka, Deisenhofen, G））を加え、チューブを静かに振盪させることにより溶液を混合した。冷却した中和緩衝液（３Ｍ酢酸カリウム（Cat.No. 60035; Fluka,Deisenhofen, G））（pＨ５．５）３００μLを加え、溶液を急速に、但し静かに混合し、チューブを氷の上での１０分間のインキュベーションにより冷却した。
２層膜カラム（実施例３３）を、ＱＩＡｖａｃ ６ｓ真空チャンバー（Cat. No. 19503; QIAGEN, Hilden, G）のｌｕｅｒアダプター（Cat. No. 19541;QIAGEN GmbH, Hilden, G）の上部に配置し、リゼートをピペットでカラムに移した。低圧（１００ｍｂａｒ）をかけ、不溶性の成分を含まない透明な濾液を得、細胞破片から分離した。
濾液のＤＮＡ含量を、アガロースゲルにより測定した。
実施例３７：
シリカと低融点ポリマーの混合物の焼結による、シリカ含有フィルター膜の製造
シリカ（LiChroprep Si 60, 5μｍサイズ; Cat. No. 9336; Merck, Darmstadt, G）とポリ酢酸ビニル（分子量12.800, Cat. No. 43,043-9; Aldrich, Steinheim, G）の混合物１０ｍgを調製し、モルタル中で乳棒によりホモジナイズした。スピンカラムを栓で閉じた。混合物３０ｍgを閉じたスピンカラムに詰め、スピンカラムを１００℃に２時間加熱した。次いで、カラムを室温に冷却し、栓をスピンカラムからはずした。
流速は、１００μL／分であった（重力流出）。
実施例３８：
シリカとポリマー溶液の混合物を加熱することによるシリカ含有フィルター膜の製造
スピンカラムを栓で閉じ、２５ｍgのシリカ（LiChroprep Si 60, 5μｍサイズ; Cat. No. 9336; Merck, Darmstadt, G）を詰めた。トルエン中のポリ（メチルメタクリレート）（Cat No. 20,033-6, Aldrich, Steinheim, G）の２０％溶液を、還流化で１５分間加熱することにより調製した。溶液の６０μLをピペットで、詰めたスピンカラムに移し、カラムを１００℃に３時間加熱した。得られたカラムの流速は、１５０μL／分であった（Heraeusマイクロ遠心で２，０００g）。
実施例３９：
高圧条件下でのＤＮＡ結合手段用フィルター装置上のポリマー溶液の析出によるフィルター強化シリカ膜の製造
膜を有するスピンカラムを、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Cat. No. 31016; QIAGEN GmbH, Hilden, G）からＮｉ−ＮＴＡシリカ粉末を取り出すことにより準備し、ポリスチレン（ＭＷ８００〜５，０００）の５％溶液４ｍL中の１ｇのＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｓｉ ６０（１５〜２５μｍサイズ、Cat. No. 9336; Merck, Darmstadt, G）の混合物を、実施例３１に記載の通り調製した。次いで、カラムをコレクションチューブに入れ、水１００μLをピペットで膜に移し、水を２，０００ｇ、１分間の遠心により強制的に流した。ポリマー−およびシリカ−含有混合物７５μLをピペットでカラムに移した。カラムを水に１ｃｍの深さで浸した。水５００μLを高圧装置によってカラムに強制的に流した。これらのカラムは１４，０００ｇまでの遠心に対して安定であり、実施例３４に記載のように測定したＤＮＡ許容量は５μｇであった。
実施例４０：
高圧条件下での組換えタンパク質の精製手段用濾過装置上でのポリマー溶液の析出によるフィルター強化シリカ膜の製造
膜を有するスピンカラムを実施例１４に記載のように調製し、ポリスチレン（ＭＷ８００〜５，０００）の１０％溶液４ｍL中の１ｇのＮｉ−ＮＴＡシリカ（１６〜２４μｍサイズ）（Cat. No.30710; QIAGEN, GmbH, Hilden, G）の混合物を実施例３２に記載のように調製した。
次いで、カラムをコレクションチューブに入れ、水１００μLをピペットで膜に移し、水を２，０００ｇでの１分間の遠心により強制的に膜に流した。７５μLの、ポリマー−およびＮｉ−ＮＴＡシリカ−含有混合物をピペットでカラムに移し、カラムを水に１ｃｍの深さに１時間浸した。水５００μLを高圧装置によってカラムに強制的に流した。Ｎｉ−ＮＴＡシリカを有する得られたカラムは、１４，０００ｇまでの遠心に対して安定であり、これらカラムの、実施例３５に記載のように検出したタンパク質結合許容量は６０μｇであった。
本発明は、本発明の個々の態様の単なる説明を意図して記載された本発明の具体的な態様により範囲を限定されず、機能的に均等な、いずれかの方法、微孔質およびフィルターエレメントおよびその使用は本発明の範囲内に入る。実際、本明細書に示され記載されたものに加え、さらに本発明の様々な修飾が、上の記載および添付の図面から当業者には明らかとなろう。その修飾は、添付したクレームの範囲内に入ると解釈される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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