(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGFβ３より優先的にヒトTGF−βイソフォームTGF−β２に結合しTGF−β２を中和するヒト抗体抗原結合ドメインを含む単離された特異的結合抗体であって、前記ヒト抗体抗原結合ドメインが、
次に示すアミノ酸配列「EVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMDSLRAED TAVYYCGRTL ESSLWGQGTL VTVSS」のVHドメイン6H1 VH；並びに
次に示すアミノ酸配列「SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSSTHRGVF GGGTKLTVLG」の6B1 VL、
次に示すアミノ酸配列「DVVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYK ASTLESGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPRTFGQ GTKVDIKR」の6H1 VL、又は
次に示すアミノ酸配列「SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FAGSNSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCSSR DSSGNHVVFG GGTKLTVLG」の6A5 VL
から選択されるVLドメイン；
を含むことを特徴とする特異的結合抗体。
【請求項２】
前記VLドメインが、次に示すアミノ酸配列「SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSSTHRGVF GGGTKLTVLG」の6B1 VLである請求項１に記載の特異的結合抗体。
【請求項３】
ヒト抗体の抗原結合ドメインを含んで成る一本鎖Fv抗体分子を含む、請求項１又は２に記載の特異的結合抗体。
【請求項４】
前記ヒト抗体の抗原結合ドメイン及び抗体定常領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の特異的結合抗体。
【請求項５】
完全な抗体を含む、請求項４に記載の特異的結合抗体。
【請求項６】
前記抗体定常領域がIgG4アイソタイプである、請求項４又は５に記載の特異的結合抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の特異的結合抗体をコードする核酸。
【請求項８】
発現ベクターの一部である、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の特異的結合抗体の生産のための発現システムにおける請求項７又は８に記載の核酸の使用を含む方法。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１１】
適切な培養条件下で前記特異的結合抗体を生産することができる請求項10に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の特異的結合抗体を生産するための方法であって、該特異的結合抗体の生産のための適切な条件下で請求項10又は11に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項１３】
前記生産の後、前記特異的結合抗体を細胞培養物から単離することを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離の後、少なくとも１の付加的な構成物を含む組成物の調剤において前記特異的結合抗体を用いる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物であることを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載の特異的結合抗体と、医薬として許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１７】
個体に有害であるTGF−βの効果を打ち消すために個体を治療するための方法に用いるための、請求項１〜６のいずれかに記載の特異的結合抗体。
【請求項１８】
個体に有害であるTGF−βの効果を打ち消すために前記個体を治療するための薬剤の製造における請求項１〜６のいずれかに記載の特異的結合抗体の使用。
【請求項１９】
ヒトTGF−βのTGF−β２イソフォームへの、請求項１〜６のいずれかに記載の特異的結合抗体の結合を引きおこし、又はそれを許容することを含む試験管内で行う方法。
【請求項２０】
前記特異的結合抗体の結合が前記イソフォームを中和することを特徴とする請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
TGF−βの効果がヒト以外の個体に有害である病状を治療するための方法であって、請求項16に記載の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトトランスホーミング増殖因子β（TGFβ）のための特異的に結合するメンバー（特異的結合メンバー）並びにそれに関する材料及び方法に関する。特にそれは、抗体結合ドメインを含む特異的結合メンバー、例えばヒト抗体に関する。ヒトTGFβに対するヒト抗体は単離され、病気、特に線維症の病気及び免疫／炎症性の病気の治療に利用され得る。ファージ上に提示された抗体セグメントレパートリーからのアンチセルフ抗体の単離が記載されている（A．D．Griffithsら、EMBO J．12，725〜734，1993；A．Nissimら、EMBO J．13，692〜698，1994；A．D．Griffithsら、13，3245〜3260，1994；C．Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，10003〜10007 1993；WO93/11236）。しかしながら、本発明は、予想されないが有利な特性を有する抗体である、TGFβの特定のイソフォームに対する特異的抗体を提供する。
TGFβは、多くの細胞プロセス、例えば細胞増殖及び分化、胚の発達、細胞外マトリックス形成、骨の発達、創傷治癒、造血並びに免疫及び炎症応答に関連することが知られているサイトカインである（A．B．Roberts & M．Sporn 1990 pp 419〜472，Handbook of Experimental Pharmacology eds M．B．Sporn & A．B．Roberts，Springer Heidelberg；J．Massagueら、Annual Rev．Cell Biol．6，597〜646，1990）。
過剰な細胞外マトリックスの蓄積は、種々の線維症の病気に関連する。これにより、このような病気における有害な効果を防ぐためにTGFβ１及びTGFβ２のような制御剤の必要性があり、これはヒトTGFβに対するヒト抗体の１つの適用である。
TGFβによる免疫及び炎症応答の調節は、（ｉ）全てのＴ細胞サブセットの増幅の阻害、（ii）Ｂリンパ球の増殖及び機能の阻害、（iii）ナチュラルキラー細胞活性及びＴ細胞応答の下降制御、（iv）免疫細胞によるサイトカイン生産の制御、（ｖ）マクロファージ機能の制御及び（vi）白血球漸増及び活性化を含む。
TGFβに対する抗体の更なる適用は、これらの機能が制御されることを必要とする慢性関節リウマチのような免疫／炎症性の病気の治療においてであり得る。
同じ種のTGFβに特異的な抗体フラグメントを単離することが要求される課題である。動物は、通常、寛容と呼ばれる現象で自己抗原に対する抗体を作り出さない（G．J．Nossal，Science 245，147〜153，1989）。一般に、自己抗原のワクチン接種は循環する抗体を生産しない。それゆえ、ヒト自己抗原に対するヒト抗原を生じさせるのは困難である。更にヒトにワクチン接種するのは倫理的な問題もある。TGFβに特異的な非ヒト抗体を生じさせることに関してはいくつかの問題がある。TGFβは免疫抑制分子であり、そして更に、ヒトとマウスのTGFβ分子との間には配列の強い保存性がある。マウスとヒトとのTGFβ１は、埋まった残基においてアラニン（ヒト）がセリン（マウス）に変わっている１つのアミノ酸残基の差しかない（R．Derynckら、J．Biol．Chem．261，4377〜4379，1986）。マウスとヒトとのTGFβ２は３つの残基：残基５ａ（Ｔマウス、Ｓヒト）；残基60（Ｋマウス、Ｒヒト）及び残基94（Ｎマウス、Ｋヒト）において異なるだけである。これは、マウスにおいてヒトTGFβに対する抗体を生じさせるのを難しくする。更に、いずれの生じた抗体もエピトープの制限されたセットに対するものだけである。
中和性及び非中和性エピトープの両方に対するヒトTGFβ１及びヒトTGFβ２に結合するポリクローナル抗体が、ウサギ（Danielpowrら、Gronth Factors 2 61〜71，1989；A．Robertsら、Growth Factors 3，277〜286，1990）、チキン（R & D Systems，Minneapolis）及びシチメンチョウ（Danielpowrら、J．Cell Physiol．138，79〜86，1989）において発生させられている。部分的TGFβ配列を示すペプチドも、ウサギにおいて中和性ポリクローナル抗血清を生じさせるために免疫原として用いられている（WA Borderら、Nature 346，371〜374，1990；K．C．Flanders Biochemistry 27，739〜746，1988；K．C．Flanderら、Growth Factors 3，45〜52，1990）。更に、TGFβに対するマウスモノクローナル抗体の単離の報告は限られている。（ヒトTGFβ２と同一である）ウシTGFβ２での免疫化の後、TGFβ２に特異的な３つの非中和性モノクローナル抗体と、TGFβ１及びTGFβ２に特異的な１つの中和性抗体とが単離された（J．R．Daschら、J．Immunol．142，1536〜1541，1989）。他の報告において、ヒトTGFβ１での免疫化の後、TGFβ１に特異的であるか又はTGFβ１，TGFβ２及びTGFβ３と交差反応する中和性抗体が単離された（C．Lucasら、J．Immunol．145，1415〜1422，1990）。TGFβ２及びTGFβ３イソフォームの両方に結合する中和性マウスモノクローナル抗体は、Genzyme Diagnosticsから市販される。
本明細書は、ヒトTGFβ１に対するヒト抗体及びヒトTGFβ２に対するヒト抗体の最初の単離を開示する。ヒトTGFβ１に対するマウスモノクローナル抗体はR & Dシステムから利用できる。この抗体は、中和アッセイにおいてTGFβ１を弱く中和するだけである。中和性マウスモノクローナル抗体は、アミノ酸位置48〜60（TGFβ１，TGFβ２及びTGFβ３と反応性ある抗体）及びアミノ酸位置86〜101（TGFβ１に特異的な抗体；M．Hoefer & F．A．Anderer Cancer Immunol．Immunother．41，302〜308，1995）を含むヒトTGFβ１ペプチドで免疫化したマウスからも生じている。
ファージ抗体技術（WO92/01047；PCT/GB92/00883；PCT/GB92/01755；WO93/11236）は、ヒトTGFβに対するヒト抗体を直接、単離する能力を供する。出願WO93/11236においては、ファージディスプレイライブラリーからのアンチセルフ抗体の単離が開示され、TGFβに特異的な抗体がファージディスプレイライブラリーから単離され得ることを示唆している。
本願は、TGFβ分子についての種々の特異性の抗体が単離され得ることを示す。TGFβ１，TGFβ２及びTGFβ３は密接に関連したサイトカインの群である。それらは鎖間ジスルフィド架橋によりつながれた２つの112アミノ酸モノマーからなるダイマーである。TGFβ１は、27の主に保存性の変化によりTGFβ２と、22の主に保存性の変化によりTGFβ３と異なる。これらの差は３Ｄ構造に関するものである（M．Shlunegger & M．G．Grutter Nature．358，430〜434，1992）。本出願人らは、TGFβ１に本質的に特異的である抗体（TGFβ２と極めて低い交差反応性）；TGFβ２に本質的に特異的である抗体（TGFβ１と極めて低い交差反応性）；及びTGFβ１及びTGFβ２の両方に結合する抗体を単離した。従って、各々特有の結合特異性を有する３つの異なる型の抗体は、TGFβ分子上の異なるエピトープを認識しなければならない。これらの抗体は、バイオセンサーアッセイ（例えばBIACareTM）、ELISA及びラジオレセプターアッセイを用いる結合研究により評価されるように、TGFβ３と低い交差反応性を有する。最も広く研究された抗体6B1 IgG4は、バイオセンサーを用いて測定した、それらの相対解離定数により決定されるように、TGFβ２と比べて、TGFβ３と９％の交差反応性を示す。
TGFβイソホームは、最初は、不活性な潜在的な形態として細胞から送り出される（R．Pircherら、Biochem．Biophys．Res．Commun．136，30〜37，1986；L．M．Wakefieldら、Growth Factors 1，203〜218，1989）。これらの不活性形態は血漿中のプロテアーゼにより活性化されてTGFβの活性形態を作り出す。それは、細胞外マトリックスの析出及びTGFβの他の生物学的効果を促進するレセプターに結合するTGFβ２の形態である。TGFβの活性形態は、血漿中にあるTGFβで比較的低い割合である。それゆえ、TGFβに対する中和性抗体が線維症を防ぐのに最も有効であるために、抗体は、活性形態を認識するが潜在形態を認識しないべきである。実施例６において、本発明の好ましい抗体（“6B1 IgG4”）が活性であるTGFβ２を意識し、潜在的であるTGFβ２の形態を認識しないことが証明される。
ペプチドディスプレイライブラリーと該ペプチドディスプレイライブラリーから選択されたファージから同定されたTGFβ２の領域からのペプチドを用いる阻害研究との組み合わせを用いて、6B1 IgG4のエピトープを同定した。これは、実施例11及び14に記載されている。ペプチドライブラリーから同定された配列はRVLSLであり、TGFβ２のアミノ酸60〜64を示す（実施例11）。抗体6B1 IgG4は、Ｎ末端に３アミノ酸（CGG）伸長部を有するTGFβ２のアミノ酸56〜69に相当するペプチド（TQHSRVLSLYNTIN）に結合することも示されている。RVLSLは最小のエピトープであり、6B1 IgG4は更に隣接するアミノ酸に結合するようである。実際、エピトープが３次元であるなら、抗体が結合するであろう他の非隣接配列が存在し得る。6B1 IgG4は、TGFβ１のアミノ酸56〜69に相当するペプチド（CGG-TQYSKVLSLYNQHN）に極めて弱く結合することを示す。
実施例14の結果は、残基60〜64の領域におけるアミノ酸へのTGFβ２上の6B1 IgG4のエピトープのアサインメントを支持する。この例で用いたペプチド、残基56〜69は、アルファ・ヘリックスＨ３のアミノ酸に相当する（M．P．Schlunegger & M．G．Grutter  Nature 358 430〜434，1992；それはα３ヘリックスとしても知られている；S．Daopinら、Proteins Structure，Function and Genetics 17 176〜192，1993）。TGFβ2は、他のサブユニットからのフィンガー領域（残基24〜37及びアミノ酸91〜95の領域の残基を含むもの；図１及び２としても言及される）とのインターフェースを形成する１つのサブユニットのアルファ・ヘリックスＨ３（ヒールとしても言及される）とのヘッド・トゥ・ティルダイマーを形成する（S．Daopinら、前掲）。TGFβ２レセプターと相互作用する一次構造は、他の鎖の図１及び２の残基と一緒に、１つの鎖からのアルファ・ヘリックスＨ３のＣ末端のアミノ酸からなる（D．L．Griffithら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93 878〜883，1996）。TGFβ２のアルファ・ヘリックスＨ３内の6B1 IgG4のためのエピトープの同定は、6B1 IgG4がレセプター結合を防止しTGFβ２の生物活性を中和することで一貫している。
上述の通り、6B1 IgG4のためのエピトープが３次元的であるなら、抗体が結合し得る他の非隣接アミノ酸が存在し得る。
このTGFβ２の領域に対する抗体はTGFβ２に特異的でありその活性を中和し得ると初期に言われている。Flandersら（Development 113 183〜191，1991）は、成熟TGFβ２の残基50〜75に対するポリクローナル抗血清をウサギにおいて発生させることができ、ウエスタンブロットにおいてこれらの抗体はTGFβ２を認識したがTGFβ１を認識しなかったことを示した。初期の論文において、K．C．Flandersら（Biochemistry 27 739〜746，1988）は、TGFβ１のアミノ酸50〜75に対してウサギにおいて生じたポリクローナル抗血清はTGFβ１の生物活性を中和し得ることを示した。本願において単離された抗体6B1 IgG4はヒトTGFβ２の生物活性を中和するこの領域内のアミノ酸に対するヒト抗体である。このようなTGFβ２に対する中和性抗体がファージディスプレイ抗体レパートリーから直接、ヒトにおいて（倫理的理由のためペプチドでの免疫化を用いることができない場合）単離することができることは驚きである。
アルファ・ヘリックスＨ３の残基がTGFβ２のための中和性エピトープを形成するという知見は、ファージが提示する中和性抗体が、ウシ血清アルブミン又はキーホール・リンペット（Keyhole limpet）ヘモシアニンのような担体タンパク質に結合したこの領域からのペプチドに結合することによるファージ抗体レパートリーからの選択によって得ることができることを意味する。この試みは、担体タンパク質に結合したペプチドTQYSKVLSLYNQHN上での選択により、TGFβ１の生物活性を中和することができる抗体を選択することに適用され得る。このような試みは、Ｈ３アルファ・ヘリックス以外のTGFβイソフォームのレセプター結合領域からのペプチドに広げることが可能である。
TGFβに特異的な抗体は、イムノグロブリン遺伝子の種々のソース由来のライブラリーから：例えば免疫化又は非免疫化ホストからの、天然のイムノグロブリン可変ドメインのレパートリーから；及び合成CDR3sと組み合わせた生殖細胞系Ｖ遺伝子由来の合成レパートリーからの単離によって得ることができることが本発明により更に証明された。一本鎖Fv及び全IgG4形態におけるこれらの抗体の特性が記載される。
上述の通り、WO93/11236は、ヒトTGFβに対するヒト抗体はファージディスプレイライブラリーから単離することができることを示唆した。本明細書においては、WO93/11236においてアンチセルフ抗体がそれから単離されるファージディスプレイライブラリーは、特定のヒトTGFβイソフォームに特異的なヒト抗体のソースとして利用され得ることが示される。例えば、本願の実施例１においては、TGFβ１に特異的な抗体１Ａ−Ｅ５並びにTGFβ２に特異的な抗体２Ａ−Ｈ11及び２Ａ−Ａ９はWO93/11236の実施例５〜７及びNissimら（1994；前掲）に記載される“合成ライブラリー”から単離された。また、免疫化されていないヒトの抹消血液リンパ球（PBLs）由来のファージディスプレイライブラリー（WO93/11236の実施例１〜３）はTGFβ１に特異的な抗体1B2のためのソースであった。ヒト扁桃及び骨髄由来の抗体遺伝子を後に利用して作られるファージディスプレイライブラリーもヒトTGFβに特異的な抗体のソースを供した。これにより、ヒトTGFβ１は、それに対する抗体が“ラージ・ユニバーサル・ライブラリー”から単離され得るヒト自己抗原の一例である。改善された特性を有するヒトTGFβに対するヒト抗体は、鎖のシャッフリング、例えば１つのライブラリー由来の抗体のVHドメインを他のライブラリーのVLドメインと組み合わせ各々のVHドメインについてテストされたVLパートナーのプールを広げることにより得ることができる。例えば、TGFβ２に特異的な抗体6B1，6A5及び6H1はPBLライブラリーからの軽鎖と組み合わせた“合成ライブラリー”から単離された２Ａ−Ｈ11  VHドメインを利用する。
これにより、TGFβに特異的な抗体のVH及びVLドメインは、再配列したＶ遺伝子、例えばPBLs、扁桃及び骨髄中のもの由来のファージディスプレイライブラリーから、並びに合成CDRsと組み合わせたクローン化生殖細胞系Ｖセグメント由来のＶドメインから供される。TGFβ１又はTGFβ２に特異的である多様な範囲の抗体であることも示される。TGFβ１及びTGFβ２の両方に対する単離されている抗体は、主に、VH3ファミリーのVH生殖細胞系由来のＶ遺伝子を利用する、ラムダ及びカッパタイプの両方の広範囲の種々の軽鎖可変領域が用いられている。
単離された個々の抗体は、予期せぬことに、有利な特性を有する。例えば、TGFβ２に対する抗体（6H1，6A5及び6B1）は、スローオフ・レート（10-3ｓ-1のオーダーのオフレート定数ｋoff及び10-8Ｍ未満の解離定数）でTGFβ２に結合し、試験管内アッセイにおいてTGFβ２活性を中和し、生体内適用において潜在的であることが示されている。抗体6B1 IgG4は、哺乳動物組織において免疫組織化学においてTGFβ２に特異的に結合し、ヒト組織において他の抗原と交差反応しないことが示されている。これらの抗体の特性は、それらを、治療的適用に特に適したものにし得る。これらの抗体が同じ重鎖を分けあうという事実は、VHドメインは、異なる軽鎖で能力の差やエピトープの微細な変化はあるが、いくつかの異なる軽鎖で有効であり得ることを示す。実施例３及び４並びに表４及び５に示すように、6B1 IgG4は、ラジオレセプターアッセイ及びTF１増殖アッセイにおいてTGFβ２活性を中和することにおいて最も能力ある抗体である。しかしながらその特性は、それが共通のVHドメインを分けあう抗体6A5及び6H1と質的に同様であると予想することができる。これにより、実施例５に示される6A5一本鎖Fv及び6H1 IgG4での処理で観察される神経の瘢痕形成の減少は、6B1で再現されると予想されよう。TGFβ１に対する抗体（特に1B2及びその誘導体）も予期しない有利な特定を有する。鎖シャッフリング、スパイキング及び完全な抗体IgG4への転化により1B2から得られた抗体27C1/10Aは、試験管内瘢痕形成モデルにおいて有力であることが示されている。この抗体のVHドメインは親抗体7A3からの部位特異的“スパイキング”変異誘発により得られた。試験管内アッセイにおいて同様の特性を示す多数のスパイクしたクローンが得られた。27C1に比べて、VHのCDR3中にいくつかの変化があり得、例えば28Ａ−Ｈ11はそのうち２つが非保存性変換である14の位置のうち７つが異なる。これにより、結合特性に影響を与えずに、VH CDR3内の残基の50％までの変換があり得る。
ヒトTGFβ１及びヒトTGFβに特異的な抗体は、線維症の病気及び他の病気、例えばTGFβが過剰発現される慢性関節リウマチの治療のための動物モデルにおいて有効であることが示されている。TGFβに対する抗体は、糸球体腎炎（W．A．Borderら、Nature 346，371〜374，1990）；神経の瘢痕形成（A．Loganら、Eur．J．Neurosci．6，355〜363，1994）；皮膚の瘢痕形成（M．Shahら、Lancet 339，213〜214 1992；M．Shahら、J．Cell Science 107，1137〜1157，1994；M．Shahら、108，985〜1002，1995）；肺線維症（S．N．Giriら、Thorax 48，959〜966，1993）；動脈傷害（Y．G．Wolf，L．M．Rasmussen & E．Ruoslahti J．Clin．Invest．93，1172〜1178，1994）及び慢性関節リウマチ（WahlからJ．Exp．Medicine 177，225〜230，1993）の治療に有効であることが示されている。それゆえ、本願に開示されるような、バイオセンサーアッセイ（例えばBIACoreTM）、ELISA又はラジオレセプターアッセイを用いる結合研究により測定されるような、TGFβ３への見掛け上の低い交差反応性を有する）TGFβ１又はTGFβ２に対する抗体、即ちTGFβ３と比べてTGFβ１又はTGFβ２に優先的に結合する抗体は、これ及び他の条件、例えばTGFβ１及びTGFβ２の線維症促進効果を打ち消すことが要求される線維症条件に有利であるはずである。しかしながら、TGFβ３と強く交差反応する抗体は、慢性関節リウマチの動物モデルにおいて効果があった（Wahlら、1993、前掲）。
TGFβに対する抗体が治療の効能の裏付けを示したいくつかの他の病気の試験管内モデルがあるので、上述の状態に加えて、更なる適用がある。特に重要なのは、増殖性網膜症（R．A．Renaら（以下参照）、網膜剥離及びポスト緑内障（P．T．Khawら、Eye 8  188〜195，1994）ドレナージ手術を含む眼の線維症に関する眼の病気の治療のためのTGFβに対する抗体の使用であり得る、Connorら（J．Clin．Invest 83  1661〜1666，1989）は、眼の線維症のない合併症のない網膜剥離の患者と比べて、増殖性網膜症に関連する眼内線維症の患者からの硝子体吸引物中にはかなり高いレベルのTGFβ２が存在すること、並びにこのTGFβ２の生物活性はTGFβ２に対する抗体で中和できないことを示した。更に、Penaら（Invest．Ophthalmology．Vis．Sci．35：2804〜2808，1994）は、TGFβ２に対する抗体はTGFβ２により刺激されたコラーゲン収縮を阻害することを示した。線維芽細胞及び他の細胞による硝子体ゲルの収縮は、TGFβ２により媒介されると考えられる過程である増殖性網膜症において重要な役割を果たす。
TGFβ２が眼内線維症を促進する最も重要なTGFβイソフォームであることを示す他の証拠がある。TGFβ２は神経の網膜、網膜の色素、上皮−脈絡脈及びヒトの眼の硝子体中のTGFβの主要なイソフォームであることが示されており（PfefferらExp．Eye Res．59：323〜333，1994）、眼内レンズ移植での白内障抽出を行う眼からの試料中のヒト眼房水中で見い出されている（JampelらCurrent Eye Research 9：963〜969，1990）。形質転換されていないヒト網膜色素、上皮細胞は主にTGFβ２を分泌する（Kvanta Opthalmic Res．26：361〜367，1994）。
TGFβに対する抗体での治療のための可能性ある他の病気は、成人呼吸促進症候群、肝硬変、心筋梗塞、脈管形成後再狭窄、ケロイド瘢痕及び強皮症を含む。骨粗しょう症におけるTGFβ２の発現レベルの上昇（Erlenbacherら、J．Cell Biol．132：195〜210，1996）は、これがTGFβ２に対する抗体により潜在的に治療され得ることを意味する。
病気の治療のためのTGFβに対する抗体の使用は、線維症の病気（WO91/04748）；皮膚の瘢痕形成（WO92/11206）；マクロファージ欠損病（PCT/US93/00998）；マクロファージ病原体感染（PCT/US93/02017）；神経の瘢痕形成（PCT/US93/03068）；脈管障害（PCT/US93/03795）；白内障の防止（WO95/13827）のための特許出願の対象であった。本願に開示されるヒトTGFβに対するヒト抗体にこれらの病状において価値あるものであるはずである。
ヒトTGFβ１及びヒトTGFβ２の両方に対するヒト抗体は、一本鎖Fv及び完全な抗体の形態のいずれかにおいて神経の瘢痕形成及び糸球体腎炎の動物モデルにおいて線維症の治療に有効であり得る。これは、TGFβ２に対する抗体のいくつかの有効性のみが肺線維症モデルにおいて観察されているが（GiriらThorax 48，959〜966，1993前掲）、これらの適用における唯一の治療としてのTGFβ２に対してのみの抗体の有効性の最初の開示である。線維症の病気におけるヒトTGFβに対するヒト抗体の有効性は、動物モデルにおけるフィブロネクチン及びラミニンを含む細胞外マトリックスの構成物の蓄積の減少を測定することによって決定された。
動物モデル実験における神経の瘢痕形成の防止において本明細書に記載されるTGFβ２及びTGFβ１に対する抗体の効能の証拠は、これらの抗体がTGFβにより媒介される他の病状に有効であり得ることを意味する。比較のため、Danielpourら（Cell Physiol．138：79〜86，1989）によるTGFβイソフォームに対するシチメンチョウから単離された抗血清は、皮膚瘢痕形成（Shahら、J．Cell Science 108：985〜1002，1995）、神経瘢痕形成（Loganら、前掲）及び増殖性網膜症に関する試験管内実験（Connorら、前掲）の防止において有効であることが示されている。
用  語
特異的結合メンバー
これは、互いについて結合特異性を有する一対の分子のメンバーをいう。特異的結合対のメンバーは、天然由来のものでも全体的もしくは部分的に合成的に作られたものでもよい。分子の対の１つのメンバーは、分子の対の他のメンバーの特定の空間的及び極性の構成に特異的に結合しそれゆえそれに相補的であるその表面上の一定の領域又はキャビティーを有する。これにより、対のメンバーは互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対の型の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質である。本願は抗原−抗体型反応に関する。
抗  体
これは、天然でも部分的又は全体的に合成して作り出されてもよいイムノグロブリンをいう。その用語は、抗体結合ドメインである又はそれに相同である結合ドメインを有するいずれのポリペプチド又はタンパク質も含む。これらは天然のソースから得られるか又は部分的又は全体的に合成して作り出され得る。抗体の例はイムノグロブリンアイソタイプ及びそれらのアイソタイプサブクラス；抗原結合ドメイン、例えばFab，scFv，Fv，dAb，Fdを含むフラグメント；及びジアボディー（diabodies）である。
モノクローナル及び他の抗体であることが可能であり、組換えDNA技術を用いてもとの抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作り出すことも可能である。このような技術は、抗体のイムノグロブリン可変領域又は相補性決定領域（CDRs）をコードするDNAを、異なるイムノグロブリンの定常領域又は定常領域＋骨格領域に導入することに関連し得る。例えば、EP-A-184187，GB 2188638A又はEP-A-239400を参照のこと。ハイブリドーマ又は他の抗体を産生する細胞は、生産される抗体の結合特異性を変えても変えなくてもより遺伝子変異又は他の変換にかけられ得る。
抗体はいくつかの方法で修飾され得るので、用語“抗体”とは、いずれの特異的結合対もいずれの要求される特異性を有する結合ドメインを有する物質も含むとして解釈されるべきである。これにより、この用語は、天然であっても全体的又は部分的に合成であってもイムノグロブリン結合ドメインを含むいずれのポリペプチドも含む、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物及び相同体を含む。それゆえ、イムノグロブリン結合ドメインを含むキメラ分子も他のポリペプチドに融合された等価物も含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はEP-A-O120694及びEP-A-O125023に記載される。
完全な抗体のフラグメントは抗原に結合する機能を有し得ることも示されている。結合するフラグメントの例は、（ｉ）VL，VH，CL及びCH１ドメインからなるFabフラグメント；（ii）VH及びCH１ドメインからなるFdフラグメント；（iii）単一抗体のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；（iv）VHドメインからなるdAbフラグメント（Ward，E．S．ら、Nature 341，549〜546（1989））；（ｖ）単離したCDR領域；（vi）２つの連結したFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF（ab’）2フラグメント；（vii）VHドメイン及びVLドメインがその２つのドメインが抗原結合部位を形成するよう会合するのを許容するペプチドリンカーにより連結された一本鎖Fv分子（scFv）（Birdら、Science，242，423〜426，1988；Hustonら、PNAS VSA，85，5879〜5883，1988）；（viii）二特異的一本鎖Fvダイマー（PCT/US92/09965）及び（ix）遺伝子融合により作製された多価又は多特異的フラグメントである“ジアボディー”（WO94/13804；P．Holligerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90 6444〜6448，1993）である。
ジアボディーはポリペプチドのマルチマーであり、各々のポリペプチドは、イムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメイン及びイムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、その２つのドメインは（例えばペプチドリンカーにより）連結されているが互いに会合して抗原結合部位を形成できない：抗原結合部位は、マルチマー内の１つのポリペプチドの第１のドメインの、そのマルチマー内の他のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される。
二特異的抗体が用いられる場合、これらは、種々の方法（Holliger，P.及びWinter G，Current Opinion Biotechnol．4，446〜449（1993））で製造され得る。例えば化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製された慣用的二特異的抗体であっても上述の二特異的抗体フラグメントのいずれかでもあり得る。完全な抗体よりむしろscFvダイマー又はジアボディーを用いることが好ましい。ジアボディーは、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に削減して、可変領域のみを用いて、Fc領域なしで作製することができる。二特異的抗体の他の形態は、Traunekerら、Embo Journal，10，3655〜3659，（1991）に記載される一本鎖“Janusins”を含む。
二特異的な完全な抗体に対する二特異的ジアボディーは、それらは大腸菌内で直ちに作製され発現され得るので特に役立ち得る。適切な結合特異性のジアボディー（及び多くの他のポリペプチド、例えば抗体フラグメント）は、ライブラリーからのファージディスプレイ（WO94/13804）を用いて直ちに選択され得る。例えば抗原Ｘに対する特異性で、ジアボディーの１つのアームが一定でなければならないなら、他のアームを変えるライブラリーを作ることができ、適切な特異性の抗体が選択される。
抗原結合ドメイン
これは、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体の一部をいう。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる抗体の特定の部分にのみ結合し得る。抗原結合ドメインは１又は複数の抗体可変ドメインにより供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）及び抗体重鎖可変領域（VH）を含む。
特異的
これは、特異的結合対の１つのメンバーが、その特異的結合パートナー以外の分子へのいずれの大きな結合も示さないであろう状況をいうのに用いられ得る。その用語は、例えば抗原結合ドメインが、いくつかの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、この場合において、抗原結合ドメインを有する特異的結合メンバーは、そのエピトープを有する種々抗原に結合することができるであろう。
中  和
これは、分子の他の分子への結合が、該他の分子の生物学的エフェクター機能の廃棄又は阻害をおこす状況をいう。
機能的に等価な変異体形態
これは、他の分子（親）と構造的な差を有するが、いくつかの重要な相同性及び少くともいくつかの親分子の生物機能、例えば特定の抗原又はエピトープに結合する能力も保持する分子（変異体）をいう。変異体は、フラグメント、誘導体又は変異体の形態であり得る。変異体、誘導体又は突然変異体は、１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入による親分子の修飾により、又は他の分子の結合により得ることができる。これらの変換は、ヌクレオチド又はタンパク質のレベルで行うことができる。例えば、コードされたポリペプチドは、後に他のソースからのFc尾に連結されるFabフラグメントであり得る。あるいは、酵素フルオレセイン等のようなマーカーを結合させることができる。
含  む
これは、含む、即ち１又は複数の特徴又は構成物の存在を許容する意味で一般に用いられる。
本発明は、一般に、抗体抗原結合ドメインを含む特異的結合メンバーを提供する。より詳しくは、それは、TGFβ、特にイソフォームTGFβ２，TGFβ１、又はTGFβ１及びTGFβ２のための特異的結合メンバーを提供する。
本発明は、TGFβ１及び／又はTGFβ２に特異的であり、TGFβ３と低い交差反応性を有するヒト抗体抗原結合ドメインを含む特異的結合メンバーを提供する。その交差反応性は、次のアッセイ：バイオセンサー（例えばBIACoreMT）、ELISA及びラジオレセプターのいずれか又は全てを用いて測定されるものであり得る。本発明は、TGFβ３と比較してTGFβ１及び／又はTGFβ２に優先的に結合するTGFβ１及び／又はTGFβ２に特異的なヒト抗体抗原結合ドメインを含む特異的結合メンバーを提供する。
TGFβはヒトTGFβであり得る。
特異的結合メンバーは一本鎖Fv（scFv）のような抗体フラグメントの形態であり得る。Fab，Fab’，F（ab’）2，Fabc，Facb又はジアボディーのような他の型の抗体フラグメントも利用され得る（G．Winter & C．Milstein Nature 349，293〜299，1991；WO94/13804）。特異的結合メンバーは、完全な抗体の形態であり得る。完全な抗体は、抗体アイソタイプの形態のいずれか、例えばIgG，IgA，IgE、及びIgM並びにアイソタイプサブクラスの形態のいずれか、例えばIgG1もしくはIgG4であり得る。
特異的結合メンバーは、工学的に作られた抗体、例えばTGFβに対する１つの抗原結合アーム（即ち特異的結合ドメイン）及び異なる特異性に対する他のアームを有する二特異的抗体分子（又はF（ab’）2のようなフラグメント）の形態であり得る。実際、本明細書に記載されるTGFβ１及び／又はTGFβ２に対する特異的結合メンバーは、二特異的ジアボディー形態において組み合わせられ得る。例えば、TGFβ１に対する抗体31G9及びTGFβ２に対する6H1は組み合わされて両方の特異性を有する１つのダイマー分子を供し得る。
結合ドメインは、生殖細胞系列セグメント又は再配置した遺伝子セグメントによりコードされたVHドメインの一部又は全部を含み得る。結合ドメインは、VLカッパドメイン又はVLラムダドメインのいずれかの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、１又は複数の骨格及び／又はCDR’s内であり得る１又は複数のヌクレオチド変換（付加、欠失、置換及び／又は挿入）、例えば約25，20，15，10又は５又はそれら未満の変換、４，３，２又は１の変換を有する生殖細胞系列遺伝子の変化された又は変異形態によりコードされ得る。
結合ドメインは、次の生殖細胞系列にDP49生殖細胞系列；DP53生殖細胞系列；DP50生殖細胞系列；DP46生殖細胞系列；又はそれらの再配列した形態の１つのVH３遺伝子を含み得る。
本発明による抗TGFβ２特異的結合メンバーのための好ましいVHドメインは、その配列が図２（ａ）（ｉ）に示される6H1 VHのそれである。6H1は、本明細書に説明されるように種々のVLドメインと対を形成し得る。6H1 VHのアミノ酸変異体を用いることができる。
特異的結合メンバーは、１又は複数のイソフォームであるTGFβ、特にTGFβ１及び／又はTGFβ２の試験管内及び／又は生体内効果を中和し得る。
特異的結合メンバーは高アフィニティー抗体であり得る。好ましいアフィニティーは本明細書で他の場所で議論される。
結合ドメインは、図１（ａ）（ｉ）もしくは（ii）もしくは図１（Ｃ）（ｉ）に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機械的に等価な変異体のいずれかを有するVHドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図１（ａ）（ｉ）もしくは（ii）もしくは図１（Ｃ）（ｉ）に示されるヌクレオチド配列該ヌクレオチド配列の機能的に等価な変異体のいずれかによりコードされるVHドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図１（ａ）（iii）もしくは図１（ｂ）に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機械的に等価な変異体のいずれかを有するVLドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図１（ａ）（iii）もしくは図１（ｂ）に示されるヌクレオチド配列該ヌクレオチド配列の機能的に等価な変異体のいずれかによりコードされるVLドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図１（ａ）（ｉ）のアミノ酸の変異形態であって図３により供されるものの１つであるものを有するVHドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図２（ａ）（ｉ）もしくは（ii）に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機械的に等価な変異体のいずれかを有するVHドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図２（ａ）（ｉ）もしくは（ii）に示されるヌクレオチド配列該ヌクレオチド配列の機能的に等価な変異体のいずれかによりコードされるVHドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図２（ｂ）（ｉ）〜（ｖ）に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機能的に等価な変異体のいずれかを有するVLドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインは、図２（ｂ）（ｉ）〜（ｖ）に示されるヌクレオチド配列該ヌクレオチド配列の機能的に等価な変異体のいずれかによりコードされるVLドメインの一部又は全部を含み得る。
結合ドメインはTGFβ１及びTGFβ２での両方に特異的であり得る。結合ドメインはヒトTGFβ１及びヒトTGFβ２の両方に特異的であり得る。特異的結合メンバーはscFvの形態であり得る。
結合ドメインは、図４に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機能的に等価な変異体のいずれかを有するVLドメインの一部又は全部を含み得る。結合ドメインは図４に示すヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の機能的に等価な変異体のいずれかによりコードされるVLドメインの一部又は全部を含み得る。
特に、結合ドメインは、図のいずれかに示すアミノ酸配列と共に、１又は複数のCDR（相補性決定領域）を含み得る。好ましい実施形態において、結合ドメインは図に示される１又は複数のCDRs，CDR1，CDR2及び／又はCDR3、特に図19に示すもののいずれかを含む。好ましい実施形態において、結合ドメインは、示されるVH CDR3配列、特に図19に示される配列を含む。CDRsの機能的に等価な形態、特に１又は複数のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により示されるCDR配列から異なり、抗原に結合する能力及び任意的に本明細書に開示される本発明の特異的結合メンバーについての好ましい特徴の１又は複数を保持する変異体は本発明に含まれる。特異的結合メンバーは、図、特に図19のCDRsに隣接し、それらの間に示される骨格領域、又は示されるものの修飾型を含む異なる骨格領域の全部又は一部を含み得る。
第１抗体の１又は複数のCDR配列がその抗体でない、例えば他の抗体の配列の骨格内に置かれるいわゆる“CDR移植”はEP-B-0239400に開示される。
本発明は、TGFβに特異的に結合ドメインを有するポリペプチドであって、図１（ａ）、図１（ｂ）、図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図４のいずれかに示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機能的に等価な変異体のいずれかの実質的な一部又は全部を含むポリペプチドも提供する。そのポリペプチドは、図１（ａ）（ｉ）アミノ酸配列の機能的に等価な変異体であって図３に示す変異体の１つであるものであるアミノ酸配列の実質的な一部又は全部を含み得る。
その配列が本明細書に詳しく開示されるVH及びVLドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸変異体は、開示される通り、本発明により用いることができる。特定の変異体は、約20変異未満、約15変換未満、約10変換未満又は約５変換未満、４，３，２又は１であり得る１又は複数のアミノ酸配列変換（付加、欠失、置換及び／又は挿入）を含み得る。変換は、１もしくは複数の骨格領域及び／又は１もしくは複数のCDR’s中で行われ得る。
本発明による特異的結合メンバーは、TGFβ１及び／又はTGFβ２への結合についてTGFβ１及び／又はTGFβ２の両方に結合するいずれかの特異的結合メンバーと競合するものであり得、図に示す配列のいずれかの一部又は全部を含む。結合メンバー間の競合は、他の非タグ結合メンバーの存在下で検出できる１の結合メンバーへ特異的リポーター分子を標識し、同じエピトープ又はオーバーラップするエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にすることにより、試験管内で容易にアッセイすることができる。
TGFβ１のための好ましい特異的結合メンバーは、本明細書で他により詳細に議論されるように、TGFβ１への結合について抗体CS37と競合する。
TGFβ２についての好ましい特異的結合メンバーは、他により詳細に議論される抗体6B1とTGFβ２への結合について競合する。それらは、エピトープでRVLSL又はアミノ酸配列RVLSLを含むペプチド、特にα−ヘリックスコンホメーションを供する上述のペプチドに結合し得る。それらは、ペプチドTQHSRVLSLYNTINに結合し得る。これについてテストすることにおいて、この配列＋Ｎ末端のCGGの配列を用いることができる。本発明による特異的結合メンバーは、TGFβ２についての結合が、RVLSLを含むペプチド、例えば配列TQHSRVLSLYNTINのペプチドにより阻害されるようなものであり得る。これについてテストすることにおいて、この配列＋Ｎ末端のCGGのペプチドを用いることができる。
TQHSRVLSLYNTINは、本明細書に他に議論されるように、TGFβ２のαヘリックスＨ３（残基56〜69）に相当する。TGFβ１中の等価な領域は配列TQYSKVLSLYNQHNを有する。この領域に結合する抗TGFβ１抗体は、本発明に特に関心あるところであり、例えばファージディスプレイライブラリーに対して、この配列で（又はＮ末端のCGGで）ペプチドをパンニング（panning）することによって得ることができる。そのペプチドに結合する特異的結合メンバーは、それらの結合によって選択することができ、TGFβ１活性を中和することができる。TGFβ１への上述の特異的結合メンバーの結合は、（任意的にＮ末端にCGGを有する）ペプチドTQYSKVLSLYNQHNによって阻害され得る。
TGFβ２に特異的である本発明による特異的結合メンバーは、TGFβ２の潜在的な形態に結合しない又は実質的に結合しないことを示し得、即ちTGFβ２の活性形態に特異的である。6B1はこの特性を有することが実施例６に示される。
6B1は、それが以下の有利な特性を有するため、線維症障害の治療における治療的使用に特に適している。6B1は、一本鎖形態において2.3nM、そして完全な抗体の形態6B1 IgG4において0.89nMの解離定数で、TGFβ２に結合する（実施例13）。抗体6B1 IgG4は抗増殖アッセイ（IC50  ２nM；実施例７及び10）において及びラジオレセプターアッセイ（１nM未満のIC50；表６）においてTGFβ２の生物活性を中和する。その抗体は、TGFβ２のαヘリックスＨ３からのペプチドTQHSRVLSLYNTIN（TGFβ２56-69）に結合し、TGFβ１からの対応するペプチドをより弱く認識する。6B1は、TGFβ２の活性形態を認識するが潜在形態を認識せず（実施例６）、ICCにより哺乳動物組織中のTGFβ２を認識し、そして他のヒト組織に非特異的に結合したい（実施例12）。その抗体はTGFβ３に比べてTGFβ２に優先的に結合し、ここでTGFβ３との交差反応は、解離定数の比により決定して９％である。
6H1 VHドメイン、6H1及び6A5を含む本願に記載される他の抗体は同様の特性を有する。その解離定数は6B1 IgG4について２nM（実施例２）及び6A5一本鎖Fvについて0.7nM（表１）と決定された。6H1 IgG4は12〜15nMのIC50値でTGFβ２の生物活性を中和する（実施例７及び10）。6A5及び6H1は、一本鎖Fv形態において約１nM、そして完全な抗体IgG4形態において10nMもしくはそれ未満のIC50値で、ラジオイムノアッセイにおいてTGFβ２のレセプター結合を阻害する。6H1 IgG4及び6A5 scFvは神経の瘢痕形成の防止に有効であることが示された（実施例５）。
それゆえ、TGFβ２の心身に有害な存在を特徴とする病気の治療のための適切な特性を有するTGFβ２に対する第１ヒト抗体を提供する。このような抗体は好ましくは、TGFβ２を中和し、好ましくは、約100nM未満、より好ましくは約10nM未満、より好ましくは約5nM未満のTGFβ２についての解離定数を有する。その抗体は、TGFβ３と比べてTGFβ２に優先的に結合し、好ましくは（解離定数の比により測定して）TGFβ３と20％未満の交差反応性を有し、好ましくは、約10％未満の交差反応性を有する。その抗体は、好ましくは、TGFβ２の活性形態を認識するが潜在形態を認識しない。
TGFβ１に対する抗体のために、線維症の病気の治療に有効である抗体に要求される特性は同様である。このような抗体は好ましくはTGFβ１を中和し、約100nM未満、より好ましくは約10nM未満、より好ましくは約５nM未満のTGFβ１についての解離定数を有する。その抗体は、TGFβ３と比べて、TGFβ１に優先的に結合し、好ましくは（解離定数の比により測定して）TGFβ３と約20％未満の交差反応性を有し、より好ましくは約10％未満の交差反応性を有する。その抗体は、好ましくは、TGFβ１の活性形態を認識するが潜在形態を認識しない。抗体31G9は12nMの解離定数を有する（表５）。抗体CS37 scFv及び27C1/10A6 IgG4は、各々８nM及び９nMのラジオレセプターアッセイにおけるIC50値を示し、そのことは、低ナノモラー範囲の解離定数を示す。27C1/10A6 IgG4は神経の瘢痕形成モデルに有効であることが示された。1B2系統の抗体のTGFβ３との交差反応性は極めて低い（実施例９）。
抗体配列に加えて、特異的結合メンバーは、他のアミノ酸、例えばペプチドもしくはポリペプチドを形成するもの、又は抗原に結合する能力に加えて、分子に他の機能的特徴を与えるものを含み得る。例えば、特異的結合メンバーは、ラベル、酵素又はそのフラグメント等を含み得る。
本発明は、TGFβに特異的な結合ドメインを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、図１（ａ）、図１（ｂ）、図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の機能的に等価な変異体のいずれかをコードするヌクレオチド配列の実質的な部分又は全部を含むポリヌクレオチドも提供する。そのポリヌクレオチドは、TGFβに特異的な結合ドメインを有するポリペプチドをコードし得、ここでそのポリヌクレオチドは、図１（ａ）（ｉ）アミノ酸配列の機能的に等価な変異体であって、図３に示すものの１つであるものであるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の実質的な部分又は全てを含む。そのポリヌクレオチドは、TGFβに特異的な結合ドメインを有するポリペプチドをコードし得、ここでそのポリヌクレオチドは図１（ａ）、図１（ｂ）、図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図４のいずれかに示すヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の機能的に等価な変異体の実質的な部分又は全部を含む。そのポリヌクレオチドは、TGFβに特異的な結合ドメインを有するポリペプチドをコードし得、ここでそのポリヌクレオチドは、図１（ａ）（ｉ）アミノ酸配列の変異体であって図３に示すものの１つであるものをコードするヌクレオチド配列の実質的な部分又は全部を含む。
本発明は、少くとも１の上述のポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態における構成物も提供する。
本発明は、１又は複数の上述の構成物を含む組換え宿主細胞も提供する。
本発明による特異的結合メンバーは、コード化核酸からの発現によって作られ得る。それ自体供されるいずれかの特異的結合メンバーをコードする核酸は本発明の一態様を形成し、特異的結合メンバーを生産する方法であってそのためのコード化核酸からの発現を含む方法も本発明の一態様である。発現は、便利には、その核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成することができる。発現による生産の後、特異的結合メンバーは、いずれかの適切な技術を用いて単離及び／又は精製され、次に適切に用いられ得る。
本発明による特異的結合メンバー、コード化核酸分子及びベクターは、例えばそれらの天然の環境から、実質的に純粋又は均一な形態で単離及び／又は精製されて供され得るか、又は、核酸の場合、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸又は遺伝子源のないもしくは実質的にないもので供される。本発明による核酸は、DNA又はRNAを含み得、全体的又は部分的に合成であり得る。用語“単離”は、全てのこれらの可能性を含む。
その核酸は、図のいずれかに示すアミノ酸配列のいずれか又はいずれかの機能的に等価な形態をコードと得る。用いられるヌクレオチド配列は、図のいずれかに示されるもののいずれかであり得、又はその変異体、対立遺伝子又は誘導体であり得る。変換は、１又は複数のヌクレオチドの付加、置換、欠失又は挿入によりヌクレオチドレベルで行うことができ、ここでその変換は、遺伝コードの縮重により、アミノ酸レベルで反映されてもされなくてもよい。
種々の異なる宿主細胞におけるクローニングのためのシステム及びポリペプチドの発現は公知である。適切な宿主細胞は、バクテリア、哺乳動物細胞、イースト及びバキュロウイルスシステムを含む。異種ポリペプチドの発現のための当該技術で利用できる哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵母細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎細胞等を含む。一般的に、好ましいバクテリア宿主は大腸菌である。
大腸菌のような原核細胞における抗体及び抗体フラグメントの発現は当該技術において十分に確立されている。報告については、例えば
0004387458.tif 000002
を参照のこと。培養における真核細胞中の発現も、特異的結合メンバーの生産のためのオプションとして当業者に利用できる。例えばReff，M．E．（1993）Curr．Opinion Biotech．4：573〜576；Trill J．Jら（1995）Curr．Opinion Biotech 6：553〜560を参照のこと。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の適切な配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択し、又は作製することができる。ベクターは、適切なら、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、又はファージミドであり得る。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，Sambrookら、1989，Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導入及び遺伝子発現における核酸の操作、並びにタンパク質の分析のための多くの周知の技術及びプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubelら、John Wiley & Sons，1992に詳細に記載される。Sambrookら及びAuswbelらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
これにより、本発明の更なる態様は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。なお更なる態様は、前記核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。その導入は、いずれかの利用できる技術を用いることができる。真核細胞のために、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-Dextran、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション及びレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えばワクチニア、又は昆虫細胞のためにはバキュロウイルスを含み得る。バクテリア細胞のために、適切な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いるトランスフェクションを含み得る。
導入が行われた後、例えばその遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、その核酸からの発現を引きおこし又は許容することができる。
一実施形態において、本発明の核酸は宿主細胞のゲノム（例えば染色体）内に組み込まれる。組み込みは、普通の技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進することができる。
本発明は、上述の特異的結合メンバー又はポリペプチドを発現するために、発現システム内の上述の構成物を用いることを含む方法も提供する。
特異的結合メンバーの生産の後、それは、本明細書に開示される様式のいずれか、例えば組成物の製剤、医薬的もしくは診断的製品、例えば特異的結合メンバーに加えて、議論されるような、特異的結合メンバーの細胞への結合を決定するための１もしくは複数の試薬を含むキットに用いることができる。組成物は、特異的結合メンバーに加えて、少くとも１の構成物を含み得る。
本発明は、任意的に１又は複数の賦形剤と一緒に、上述の特異的結合メンバーを含む医薬品も提供する。
本発明は、TGFβの線維症促進効果を打ち消すことが有利である状態を治療するための薬剤の調製における上述の特異的結合メンバーの使用も提供する。その状態は、細胞外マトリックスの構成物の組織内の蓄積を特徴とする線維症状態であり得る。細胞外マトリックスの構成物はフィブロネクチン又はラミニンであり得る。
状態は、糸球体腎炎、神経の瘢痕形成、皮膚の瘢痕形成、眼の瘢痕形成、肺線維症、動脈傷害、増殖性網膜症、網膜剥離、成人呼吸促進症候群、肝硬変、ポスト心筋梗塞、ポスト脈管形成再狭窄、ケロイド瘢痕形成、強皮症、脈管障害、白内障、緑内障、増殖性網膜症からなる群から選択され得る。
状態は、神経の瘢痕形成又は糸状体腎炎であり得る。
本発明は、TGFβの効果を打ち消すことが有利である免疫／炎症病を治療するための薬剤の調製における上述の特異的結合メンバーの使用も提供する。例的な状態は、慢性関節リウマチ、マクロファージ欠損病及びマクロファージ病原体感染である。
本発明は、TGFβの線維症促進効果を打ち消すことが有利である状態を治療するために上述の特異的結合メンバーの治療に有効な量を患者に投与することを含む方法も提供する。線維症の状態は先に列記される。
本発明は、TGFβの線維症促進効果を防ぐことが有利である状態を防ぐために、上述の特異的結合メンバーの予防に有効な量を患者に投与することを含む方法も提供する。線維症状態は先に列記される。
本発明は、TGFβの効果を打ち消すことが有利である免疫／炎症病を防ぎ又は治療するために、予防及び／又は治療に有効な量の特異的結合メンバーを患者に投与することを含む方法も提供する。
これにより、本発明の種々の態様は、供される特異的結合メンバーの投与を含む治療の方法、上述の特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与のための薬剤の製造における、例えば医薬として許容される賦形剤と一緒に特異的結合メンバーを調剤することを含む医剤又は医薬組成物を作る方法における、上述の特異的結合メンバーの使用を提供する。
本発明によれば、供される組成物は、いずれかの哺乳動物、特にげっ歯動物、例えばマウス、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、ネコ又はヒトであり得る個体に投与され得る。投与は、好ましくは、“治療に有効な量”であり、これは被検体に有益であることを示すのに十分である量である。このような利益は、少くとも１の症状の少くとも１の改善であり得る。投与される実際の量並びに投与の比率及び時間経過は治療されるものの性質及び厳しさによる。治療の処方、例えば投与量等の決定は、一般的な実施者及び他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な投与量は、当該技術で公知である。Ledermann J．A．ら（1991）Int J．Cancer 47：659〜664；Bagshawe K．D．ら（1991）Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915〜922を参照のこと。
組成物は、治療される状態により同時に又は連続的に、単独で又は他の治療と組み合わせて投与され得る。
本発明による、及び本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に公知である他の材料を含み得る。このような材料は非毒性であり、活性成分の効能を妨害しないべきである。担体又は他の材料の正確な性質は、経口又は注入、例えば静脈内によるものであり得る投与の経路によるであろう。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態であり得る。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントのような固体担体を含み得る。液体医薬組成物は、一般に、水、ペトロレウム、動物もしくは植物油、鉱油又は合成油のような液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他のサッカライド溶液又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールが含まれ得る。
静脈内注入、又は感染の部位への注入のために、活性成分は、パイロ−ジエンを含まない適切なpH、張度及び安定剤を有する非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注入、Ringer’s注入、Lactated Ringer’s注入のような等張ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することができよう。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加物が含まれ得る。
本発明の更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本発明が十分に理解されるために、限定のためでなく例示のみのため、以下の実施例を供する。
以下の図面から引用される。
図１は、TGFβ１に特異的な抗体のDNA及びタンパク質配列を示す。図１（ａ）は、レパートリーから直接単離されたTGFβ１に対する抗体の抗体可変ドメインのアミノ酸及びコード化核酸配列を示す：図１（ａ）（ｉ）−1B2 VH（7A3 VHとしても知られる）；図１（ａ）（ii）−31G9 VH；図１（ａ）（iii）−31G9 VL。図１（ｂ）は、鎖シャッフリングにより単離されたTGFβ１に対する抗体の抗体軽鎖可変ドメインのアミノ酸及びコード化核酸配列を示す：図１（ｂ）（ｉ）−7A3 VL；図１（ｂ）（ii）−10A6 VL。図１（ｃ）（ｉ）は、CDR3スパイキング実験から単離されたTGFβ１に対する抗体からの27C1 VHについてのアミノ酸及びコード化核酸配列を示す。
図２は、TGFβ２に特異的な抗体のDNA及びタンパク質配列を示す。図２（ａ）は、レパートリーから直接単離されたTGFβ２に対する抗体の可変ドメインについてのアミノ酸及びコード化核酸配列を示す：図２（ａ）（ｉ）−２Ａ−Ｈ11 VH（6H1 VHとしても知られる）；図２（ａ）（ii）−２Ａ−Ａ９ VH（11E6 VHとしても知られる）。図２（ｂ）は、鎖シャッフリング後に単離されたTGFβ２に特異的な抗体の抗体可変ドメインのアミノ酸及びコード化核酸配列を示す：図２（ｂ）（ｉ）−6H1 VL；図２（ｂ）（ii）−6A5 VL；図２（ｂ）（iii）−6B1 VL；図２（ｂ）（iv）−11E6 VL；（ｖ）図２（ｂ）（ｖ）−14F12 VL。
図３は、“スパイキング”変異誘発により1B2から得たクローンのVH CDR3のタンパク質配列を示す。1B2 VH CDR3からの差はボールドで示される。
図４は、TGFβ１とTGFβ２との間の交差反応性のあるVT37のVH及びVLドメインのDNA及びタンパク質配列を示す。
図５は、ベクターvhcassette２からの重鎖VHリーダーの領域内のDNA配列及びコードされたアミノ酸配列を示す。制限酵素HindIII，SfiＩ，PstＩ，BstEII，BamHＩ及びEcoRＩは示される点を切断する。
図６は、ベクターpG4D100（スケールしていない）のマップを示す。多重クローン部位（MCS）：5’−HindIII−PacＩ−BamHＩ−（XanＩ）−（PmlＩ）−（NheＩ）−AscＩ−（BssHII）−XhoＩ−PmeＩ−BsiWＩ−３’。括弧内に示される制限部位は特有でない。
図7は、ベクターvlcassettel（vlcassette CAT1）のための軽鎖VLリーダーの領域内のイントロン及びコードされたアミノ酸の配列を含むDNA配列を示す。制限酵素HindIII，ApaLＩ，SacＩ，XhoＩ及びBamHＩは示される部位を切断する（リーダー内のApaLＩ）。
図８は、ベクターpLN10（スケールしていない）のマップを示す。多重クローン部位（MCS）：5’−HindIII−（SphＩ）−（PstＩ）−SalＩ−XbaＩ−BamHＩ−３’（1224-1259）。括弧内に示される制限部位は特有でない。
図９は、ベクターpKN100（スケールしていない）のマップを示す。多重クローン部位（MCS）：5’−MluＩ−（AvaＩ）−HindIII−（SphＩ）−（PstＩ）−SalＩ−XbaＩ−BamHＩ−３’。括弧内に示される部位は特有でない。
図10は、scFvの異なる２nM濃度における赤白血病細胞系TF１の増殖を用いるアッセイにおける一本鎖Fv抗体によるTGFβ２の中和率（％）を示す。
図11は、抗体の異なるnM濃度における赤白血病細胞系TF１の増殖を用いるアッセイにおける完全なIgG4抗体によるTGFβ２活性の中和を示す。
図12は、組み込んだ蛍光強度を用いて検出されたフィブロネクチン（図12（ａ））及びラミニン（図12（ｂ））の析出により測定した神経の瘢痕形成への抗体での動物の治療の効果を示す。そのグラフは、個々の動物のデータの点の散乱プロットを示す。棒グラフは、その群の平均の組み込まれた蛍光強度を示す。
図13は、TGFβイソフォーム及び非特異的抗原との6B1 IgG4及び6A5 IgG4の交差反応性を測定するためのELISAの結果を示す。図13（ａ）は、各々の抗原についての非特異的抗原及びTGFβのOD 405nmのプロッティングのパネルへの6B1 IgG4の交差反応性を示す：１−インターロイキン１；２−ヒトリンホトキシン（TNFβ）；３−ヒトインスリン；４−ヒト血清アルブミン；５−ssDNA；６−オキサゾロン−ウシ血清アルブミン；７−キーホールリンペット（Keyhole limpet）ヘモシアニン；８−チキン卵白トリプシンインヒビター；９−キモトリプシノーゲン；10−シトクロムＣ；11−GADPH；12−オブアルブミン；13−ニワトリ卵リソザイム；14−ウシ血清アルブミン；15−TNFα；16−TGFβ１；17−TGFβ２；18−TGFβ３；19−PBSのみ。図13（ｂ）は、同じ抗原のパネルに対する抗体6A5 IgG5についてのOD 405nmを示す。図13（ａ）及び図13（ｂ）の両方について、PBS中10μｇ／mlの濃度においてプレートをコートするために抗原１〜15を用いた。TGFβをPBS中0.2μｇ／mlでコートした。各々の抗原100μｇをウェル当りに用い、各々のIgGのための各々の抗原を重複してテストした。IgGサンプルを、２％のマーベル（marvel）−PBSでブロックした後、２時間、37℃でコートした抗原とインキュベートした。標識した第２抗体は、コンジュゲートしたマウス抗ヒトFc１アルカリホスファターゼであり、結合した第２抗体を検出するのに用いた基質は405nmの吸光度を読んで１mg／mlのPNPPであった。
図14は、TGFβ１特異的抗体CS37のVLドメインのためのアミノ酸及びコード化核酸配列を示す。
図15は、ELISAプレート上にコートされたペプチドTGFβ２56-69又はペプチドTGFβ１56-69のいずれかとコンジュゲートしたBSAへの6B1 IgG4の結合を検出するELISAからのデータを示す。6B1 IgG4を、種々の濃度（μｇ／ml）でインキュベートし、検出剤の添加後、405nmの吸光度を測定した。OD 405nmの結果を、BSA-TGFβ２56-69（“β２ペプチド”−ダイヤモンド形）及びBSA-TGFβ１56-69（“β１ペプチド”−四角）について種々の濃度でプロットする。
図16は、種々の濃度（nM IgG）における完全な抗体6H1 IgG4，6B1 IgG4及びGenzymeからのマウスモノクローナル抗体によるTF１細胞へのTGF−β２抗増殖効果の中和率（％）を示す。
図17は、種々の濃度（nM IgG）における完全な抗体6H1 IgG4，6B1 IgG4及びGenzymeからのマウスモノクローナル抗体によるTF１細胞へのTGF−β１抗増殖効果の中和率を示す。
図18は、種々の濃度（nM IgG）における完全な抗体6H1 IgG4，6B1 IgG4及びGenzymeからのマウスモノクローナル抗体によるTF１細胞へのTGF−β３抗増殖効果の中和率を示す。
図19は、イタリックのCDR配列を示すTGFβ２に対する抗体の領域のアミノ酸及びコード化DNA配列を示す：図19（ｉ）２Ａ−Ｈ11 VH（6H1 VHとしても知られる）；図19（ii）6B1 VL；図19（iii）6A5 VL及び図19（iv）6H1 VL。
図20は、ベクターp6H1 VH−ガンマ４（7263bp）を示す。6H1 VHをコードする遺伝子はHindIII−ApaＩ制限フラグメントとして挿入される。
図21は、ベクターp6B1ラムダ（10151bp）を示す。6B1 VLをコードする遺伝子は、EcoRＩ−BstBＩ制限フラグメントとして挿入される。
図22は、ベクターp6B1ガンマ４gs（14176bp）を示す。6B1 IgG4の重及び軽鎖をコードする遺伝子は一本鎖ベクター内に組み合わせられる。
図23は、実施例６に記載される競合ELISA実験の結果を示す。TGFβ２との一晩のインキュベーションの後、プレートを以下の溶液１〜４（図中のそれに相当する数字）で処理した：１〜400μｌ Hams Ｆ12／DMEM（ブランク試薬）、２〜400μｌ Hams Ｆ12／DMEM＋４μｇ 6B1 IgG4抗体（陽性対照）、３〜400μｌ  PC３非処理ならし培地＋４μｇ 6B1 IgG4抗体（潜在TGFβ2サンプル）、４〜400μｌ  PC３酸活性化ならし培地＋４μｇ 6B1 IgG4抗体（活性TGFβ2サンプル）。
本明細書に言及される全ての文献は引用により組み込まれる。
実施例のリスト
実施例１−TGFβ１に特異的な抗体、TGFβ２に特異的な抗体並びにTGFβ１及びTGFβ２に特異的な抗体の単離。
実施例２−完全な抗体を発現する細胞系の作製。
実施例３−試験管内アッセイを用いて評価した抗体によるTGFβ活性の中和。
実施例４−レセプターに結合するTGFβの抗体による阻害。
実施例５−TGFβに対する抗体を用いる神経の瘢痕形成の防止。
実施例６-TGFβ2の活性又は潜在形態への6B1 IgG4の結合の測定。
実施例７−細胞増殖へのTGFβイソフォームの阻害効果のTGFβ２に対する抗体による中和。
実施例８−ラジオレセプターアッセイで測定したレセプターへの他のTGFβイソフォームの結合の、TGFβ２に対する抗体による阻害。
実施例９−可能性ある治療的使用のためのTGFβ１抗体の評価。
実施例10−グルタミンシンターゼ選択システムを用いる6B1 IgG4のための高発現細胞系の作製及び中和アッセイでの評価。
実施例11−ペプチドファージディスプレイライブラリーを用いる抗体6B1のためのTGFβ２上のエピトープの決定。
実施例12−免疫細胞化学（ICC）による組織への6B1 IgG4の結合の決定。
実施例13−TGFβ２への結合のための6B1 IgG4及び一本鎖Fvの速度論パラメータの決定。
実施例14−6B1 IgG4へのTGFβ２の残基56〜69に相当するペプチドの結合。
実施例１
TGFβ１及びTGFβ２に結合する抗体の単離及びキャラクタリゼーション
１．ネイティブ及び合成ファージ抗体レパートリーの選択によるヒトTGFｂ−１に対する抗体の同定及びキャラクタリゼーション
抗体レパートリー
以下の抗体レパートリーを用いた：
１．免疫化していないヒト由来の末梢血液リンパ球（PBL）ライブラリー（Marks，J．D．，Hoogenboom，H．R．Bonnert，T．P．，McCafferty，J．，Griffiths，A．D．& Winter，G．（1991）J．Mol．Biol．222，581〜597）。
２．固定した軽鎖と一緒のクローンしたヒト生殖細胞系VH遺伝子及び合成CDR3s由来の合成ライブラリー（Nissim，A．，Hoogenboom，H．R．，Tomlinson，I．M．，Flynn，G．，Midgley，C．，Lane，D．及びWinter，G．（1994）EMBO J．13，692〜698）。
３．免疫化していないヒトの扁桃由来の扁桃ライブラリー。扁桃Ｂ細胞を、Addenbrookes Hospital（Hills Road，Cambridge，U．K．）により供された新しく除去した（２時間、処理した）完全な扁桃から単離した。各々の扁桃を以下の通り処理した。扁桃を５mlのPBSを含むペトリ皿におき、外科用メスで解離させて細胞を遊離させた。その懸濁液を新鮮なチューブに移し、大きなデブリスを５分重力で沈降させた。次に細胞懸濁液を50mlポリプロピレンチューブ（Falcon）中10mlのLymphoprep上に重層し、室温で20分、1000×ｇで遠心し（ブレーキなし）、その界面の細胞をガラスビペットで収集した。これらを37℃でRPMIで培地中50mlの最終容量に希釈し、室温で15分、500×ｇで遠心した。その上清を吸引し、その細胞をRPMIで更に２回、洗った。
“Quick prep TM mRNA Kit”（Pharmacia Biotech，Milton Keynes，U．K．）を用いてペレット化した細胞からポリアテニル化RNAを調製した。１つの扁桃（約１×106細胞）からの完全なアウトプットを、１つのOligo（dT）−Cellulose Spunカラムを用いて処理し、相伴うプロトコルに記載されるのと全く同様に処理した。MRNAを記載されるようにエタノール沈殿させ、40mlのRNaseを含まない水に再度懸濁した。
cDNA合成反応を、以下の通り“First-Strand cDNA Synthsis Kit”（Pharmacia Biotech，Milton Keynes，U．K．）を用いてセット・アップした。
RNA                 20μｌ（使用前に10分、67℃に加熱）
第１鎖緩衝液        11μｌ
DTT溶液             １μｌ
pd（N）6プライマー    １μｌ
静かに混合した後、その反応物を１時間、37℃でインキュベートした。
ヒトVH遺伝子を、４つのJH正プライマー（JH１−２，３，４−５，６；Marksら、（1991前掲）の等モル混合物と一緒に、９つのファミリーベースの逆プライマー（VH  ｌｂ／７ａ−６ａ  back Sfi，5’末端にSfiＩ部位を導入するもの、表１）を用いて、扁桃cDNAから増幅した。これにより、９回の最初のPCR増幅を行った。各々の反応混合物（50μｌ）は、２μｌのcDNAテンプレート、25pmolの逆プライマー、25pmolの正プライマー、250μＭのdNTPs，1．5mMのMgCl2，50mMのKCl，10mMのTris-HCl pH8.3及び2.5ｕのTaqポリメラーゼ（Boehringer）を含んでいた。その反応混合物に鉱油（パラフィン）を重層し、Techeサーマルサイクラーを用いて30回くり返した（94℃で１分、55℃で１分、72℃で１分）。その産物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで精製し、“Geneclean”（Bio 101tnc．）を用いてゲルから単離し、15μｌの水に再度懸した。その増幅したVH遺伝子を、PCRアセンブリー（Marksら、1991前掲）により（Gly4，Ser）3リンカー（Huston，J．S．ら1988 Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85：5879〜83）と一緒にPBLs由来のヒトVL遺伝子（Marksら、1991前掲）と組み換えた。VH−リンカー・−VL抗体構成物をファージミドベクターpCANTAB6（McCafferty，J．ら、1994 Appl．Biochem．Biotech．47：157〜173）のSfiＩ及びNotＩ部位にクローンして６×107のクローンのライブラリーを供した。
４．扁桃、骨髄及び末梢血液リンパ球を含むリンパ組織由来の大きな一本鎖Fvライブラリー
ポリアデニル化RNAを、“Quickprep mRNAキット”（Pharmacia）を用いて43の非免疫化ドナーの種々のリンパ球系組織のＢ細胞から調製した。第１鎖cDNAを、合成を初めるためのランダムプライマーを用いて、“第１鎖cDNA合成”キット（Pharmacia）を用いてmRNAから合成した。Ｖ−遺伝子を、先に記載（Marksら、前掲）されるように、VH，Ｖκ及びＶλのためのファミリー特異的プライマーを用いて増幅し、次にPCRアセンブリーにより（Gly4，Ser）3scFvリンカーと一緒に組み換えた。VH−リンカーVL抗体構成物を、ファージミドベクターpCANTAB6のSfiＩ及びNotＩ部位にクローンした。連結、エレクトロポレーション及び細胞のプレーティング・アウトを、以前に記載されるように行った（Marksら、1991前掲）。用いたベクター及び挿入物の量をかさ上げすることにより、並びに多重エレクトロポレーションを行うことにより、以前に記載されるより約1000倍大きいライブラリーを作った。これは、BstNＩフィンガープリンティングが極めて多様であることを示す約1.3×1010の個々の組換え体を有すると計算されたscFvレパートリーを作った。
ａ．ファージ抗体ライブラリーの誘導
先の４つの異なるファージ抗体レパートリーを、TGFB−１に対する抗体について選択した。VH合成（Nissimら、1994前掲）、扁桃、“大きな”scFv及びPBL（Marksら、1991前掲）レパートリーを、ファージミド粒子を救済するために、以下の通り各々処理した。２ｌのコニカルビーカー中500mlの予め温められた（37℃）２YTAG（100μｇ  １mlアンピシリン及び２％グルコースが供された２YT培地）に、適切なライブラリーのグリセロールストック（−70℃）培養物からの約３×1010細胞を接種した。その培養物を、OD600nmが0.7に達するまで（約２時間）、十分なエレーション下で37℃で増殖させた。M13K07ヘルパーファージ（Stratagene）を、約10の感染の多重度（moi）（１のOD600nmが培養物１ml当り５×108細胞と等しいと仮定）に培養した。その培養物を、37℃で15分、静止して、次に同じ温度で軽いエレーション（200rpm）下で45分、インキュベートした。その培養物を遠心し、その細胞ペレットから上清をとった。その細胞を、500mlの２YTAK（100μｇ／mlのアンピシリン及び50μｇ／mlのカナマイシンが供された２YT培地）中に再度懸濁し、その培養物を十分なエレーション（300rpm）下で30℃で一晩、インキュベートした。ファージ粒子を精製し、３回のポリエチレングリコール（PEG）沈殿により濃縮し（Sambrook，J．，Fritsch，E．F．，& Maniatis，T．（1990），Molecular Cloning-A Laboratory Manual．Cold Spring Harbour，New York）、そしてPBSで1012誘導単位（tu）／mlに再度懸濁した（アンピシリン耐性クローン）。
ｂ．TGFβ−１へのファージ抗体ライブラリーのパンニング（panning）
４つのレパートリーから誘導されたファージを、TGFβ−１上で各々別個にパンニングした。75nm×12nmイムノチューブ（Nunc；Maxisorp）に、４℃で一晩、PBS中の２mlの組換えヒトTGFβ−１（0.5μｇ／ml，Genzyme）でコートした。PBSで３回、洗った後、チューブを３％ MPBS（３％‘Marvel’スキムミルク粉末、１×PBS）で満たし、ブロッキングのために37℃で２時間、インキュベートした。その洗浄をくり返し、３％ MPBS ２ml中のファージミド粒子（1013tu）を加え、そしてチューブを１時間、37℃で静止してインキュベートした。そのチューブをPBST（0.1％）で20回、洗浄し、次にPBSで20回、洗浄した。結合したファージ粒子を、２mlの100mM−トリエチルアミンを加え、10分間、室温でチューブを静止してインキュベートすることによりチューブから溶出した。その溶出した材料を、１mlの１Ｍ  Tris−HCl（pH7.4）を含むチューブに、ピペッティングすることによって直ちに中和した。ファージを４℃で保存した。1.5mlの溶出したファージを用いて20mlの指数増殖中の大腸菌TG１（Gibson，T．J．（1984）．Ph D thesis．University of Cambridge，UK．）に感染させた。感染した細胞を２YTブイヨン中で軽いエレーション下で37℃で１時間、増殖させ、次に243mm×243mm皿（Nunc）中の２YTAG培地上にプレートした。プレートを30℃で一晩、インキュベートした。そのプレートからコロニーを２YTブイヨン10ml中にはぎとり、−70℃での保存のため15％（ｖ／ｖ）グリセロールを加えた。
TGFβ−１上の４つのレパートリーの各々のパンニングの第１回目からのグリセロールストック培養物を、第２回目のパンニングのためのファージミド粒子を誘導するためにヘルパーファージを用いて各々救済した。250μｌのグリセロールストックを用いて50ml  ２YTAGブイヨンに接種し、そしてOD600nmが0.7（約２時間）に達するまで、十分なエレーション下で37℃で250mlコニカルフラスコ中でインキュベートした。M13K07ヘルパーファージ（moi＝10）を培養物に加え、次に37℃で15分、静止して、次に同じ温度で軽いエレーション（200rpm）下で45分、インキュベートした。その培養物を遠心し、そしてその細胞ペレットから上清をとった。その細胞を50mlの予め温めた２YTAK中に再度懸濁し、そしてその培養物を十分なエレーション下で30℃で一晩、インキュベートした。ファージ粒子を精製し、PEG沈殿（Sambrookら、1990前掲）により濃縮してPBS中に1013tu/mlに再度懸濁した。
３のレパートリーの各々の第１回目のパンニングから誘導されたファージを選択し、パンニングチューブを１mlだけのTGFβ−１（0.5μｇ／ml，Genzyme）でコートし、チューブに加えたファージの量を同様に減らした以外は本質的に上述のように２回目を行った。更なる洗浄の後、結合したファージを１mlの100mMトリエチルアミンを用いてチューブから溶出し、先に記載されるように、0.5mlの１Ｍ−Tris HCl（pH7.4）を加えることにより中和した。ファージ増殖及びパンニングの過程を３回にわたってくり返し、４回目の選択を行った。
ｃ．イムノアッセイのための単一選択されたクローンの増殖
第３回及び第４回目の選択からの個々のコロニーを用いて、100μｌの２YTAGを、96ウェル組織培養プレート（Corning）の個々のウェルに接種した。プレートを、適度に振とう（200rpm）しながら、30℃で一晩、インキュベートした。15％までのグリセロールを各々のウェルに加え、そしてこれらのマスタープレートを、分析に用いるまで−70℃で保存した。
ｄ．抗−TGFβ−１ scFvを同定するためのELISA
TGFβ−１に特異的なクローンを、ファージ上に提示されたscFv又は可溶性scFvを用いて、ELISAにより同定した。
ｉ．ファージELISA
マスタープレートからの細胞を用いてウェル当り100μｌの２YTAGを含む新しい96ウェル組織培養プレートに接種した。これらのプレートを、６〜８時間又はウェル中の細胞が指数的に増殖する（OD600：0.2−1.0）まで、37℃でインキュベートした。M13K07を各々のウェルに10のmoiまで加え、15分、静止して、次に45分、静かに振とう（100rpm）しながら、両方とも37℃でインキュベートした。そのプレートを10分、2000rpmで遠心し、その上清を溶出した。各々の細胞ペレットを100μｌの２YTAK中に再度懸濁し、30℃で一晩インキュベートした。
各々のプレートを2000rpmで遠心し、各々のウェルからの100μｌの上清を回収し、１時間、室温で静止して、20μｌの18％ M6PBS（18％スキムミルク粉末、６×PBS）中でブロックした。合間に、PBS中0.2μｇ／mlのTGFβ−１の50μｌ又はPBS単独50μｌ（非コート対照プレート）のいずれかで４℃で静止して一晩、ブロックしたフレキシブルマイクロタイタープレートをPBSで３回、洗い、３MPBS中で37℃で静止して２時間、ブロックした。次にこれらのプレートをPBSで３回、洗浄し、TGFβ−１−コート又は非コートプレートの両方の各々のウェルに50μｌのプレブロックしたファージを加えた。そのプレートを１時間、37℃で静止してインキュベートした後、ファージを注ぎ落とした。そのプレートを、PBST中で２分、３回、次にPBS中で２分、３回、全て室温でインキュベートすることにより洗浄した。
TGFβ−１コートした及びコートしていないプレートの両方の各々のウェルに、50μｌの、３MPBS中ヒツジ抗fd抗体（Pharmacia）10，000倍希釈物を加え、そのプレートを１時間、37℃で静止してインキュベートした。各々のプレートを上述の通り洗い、３MPBS中5000倍希釈のロバ抗ヒツジアルカリホスファターゼコンジュゲート（Sigma）50μｌを加え、37℃で１時間、静止してインキュベートした。
プレートを先に記載されるように洗い、次に0.9％ NaClを２回そそいだ。色原基質pNPP（Sigma）又はAmpakシステム（Dako）のいずれかを用いて、アルカリホスファターゼ活性を視覚化した。各々のクローンにより形成された吸光度シグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、405nm（pNPP）又は492nm（Ampak）のいずれかで光学密度を測定することにより評価した。TGFβ−１−コートされたプレート上で作られたELISAシグナルは非コートプレート上のそれの少くとも２倍でなるなら、更なる分析のためにクローンを選択した。
ii．可溶性ELISA
マスタープレートからの細胞を用いてウェル当り100μｌの２YTAGを含む新しい96ウェル組織培養プレートに接種した。これらのプレートを８時間、30℃でインキュベートし、次に10分間、2000rpmで遠心して、上清を溶出した。各々の細胞ペレットを、10mMのIPTG（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含む100μｌの２YTA（100μｇ／mlのアンピシリンが供された２YT培地）中に再度懸濁し、30℃で一晩、インキュベートした。
各々のプレートを2000rpmで遠心し、各々のウェルからの100μｌの上清を回収し、室温で１時間、静止して20μｌの18％ M6PBS中でブロックした。合間に、50μｌのPBS中0.2μｇ／mlのTGFβ−１又は50μｌのPBS単独のいずれかで４℃で静止して一晩、ブロックしたフレキシブルマイクロタイタープレートをPBSで３回、洗い、３％ MPBSで37℃で静止して２時間、ブロックした。次にこれらのプレートをPBSで３回、洗い、TGFβ−１−コートした又は非コートのプレートの両方の各々のウェルに50μｌのプレブロックした可溶性scFvを加えた。そのプレートを１時間、37℃で静止してインキュベートし、その後、scFv溶液を注ぎ落とした。そのプレートを、PBST（１％ Tweenを含むPBS）中で２分、３回、次にPBS中で２分、３回、全て室温でインキュベートすることにより洗浄した。
TGFβ−１コートした及びコートしていないプレートの両方の各々のウェルに、50μｌの、３MPBS中抗−mycタグネズミ9E10（Munro，S．& Pelham，H．R．B．（1986）Cell 46，291〜300）200倍希釈物を加え、そのプレートを１時間、37℃で静止してインキュベートした。各々のプレートを上述の通り洗い、３MPBS中5000倍希釈のヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート（Pierce）50μｌを加え、37℃で１時間、静止してインキュベートした。プレートを先に記載されるように洗い、次に0.9％ NaClを２回そそいだ。色原基質pNPP（Sigma）又はAmpakシステム（Dako）のいずれかを用いて、アルカリホスファターゼ活性を視覚化した。各々のクローンにより形成された吸光度シグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、405nm（pNPP）又は492nm（Ampak）のいずれかで光学密度を測定することにより評価した。TGFβ−１−コートされたプレート上で作られたELISAシグナルは非コートプレート上のそれの少くとも２倍でなるなら、更なる分析のためにクローンを選択した。
iii．特異性ELISA
上述のように、非コートウェルよりTGFβ−１に結合するとして同定されたクローンを、細かい特異性について更に分析した。50ml Falconチューブ中５mlの培地に各々のクローンを接種し、ELISAに用いるファージ又は可溶性scFvを作り出すまで増殖させた以外は、上述の通り、ファージ上に提示された又は溶液中のscFvを用いて、特異性ELISAを行った。マイクロタイタープレートウェルを、0.2μｇ／mlのTGFβ−１，0.2μｇ／mlのTGFβ−２，10μｇ／mlのウシ血清アルブミン（BSA）又はPBS（非コートウェル）のいずれか50μｌでコートした。ファージ（又は可溶性scFv）及びマイクロタイタープレートの両方をプレブロックした後、各々のクローンからの50μｌのブロックしたファージ（又は可溶性scFv）を、TGFβ−１，TGFβ−２，BSA又は非コートウェルのいずれかでコートされたウェルに加えた。上述の通り、色原基質pNPP（Sigma）又はAmpakシステム（Dako）のいずれかを用いてアルカリホスファターゼ活性を視覚化した。TGFβ−１コートしたウェル中で作られたELISAシグナルがTGFβ−２，BSA又は非コートウェルでのシグナルより少くとも５倍大きいなら、TGFβ−１に特異的であると考えた。
iv．BIACoreTMによる特異性測定
抗体は、適切な抗原でコートしたBIACoreTMセンサーチップへの相対的結合により、（R & D Systems Abingdonから得た）TGFβ２と比べてTGFβ１に特異的であることも示した。TGFβ１及びTGFβ２を、製造元の説明に従ってバイオセンサーCM５センサーチップ（Pharmacia）に結合したアミンにより固定化した。一本鎖Fvフラグメント（35μｌ；実施例４に記載の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製）を、５μｌ/分の流速で固定化した抗原上に注入した。結合したTGFβの量を、この期間にわたる共鳴単位（RUs）の全増加量として評価した。31G9 scFvについて、TGFβ１チップで1059RUsの増加が見い出され、そしてTGFβ２チップで72RUsが見い出された。これにより、結合は、TGFβ２よりTGFβ１でかなり強い。
ｅ．TGFb１−特異的ScFv抗体の配列決定
TGFβ−１特異的抗体のヌクレオチド配列を、各々のクローンからの挿入されたDNAを増幅するためのベクター特異的プライマーを最初に用いることにより決定した。２YTAG寒天プレート上の個々のコロニーからの細胞を、プライマーpUC19reverse及びfdtetseqを用いて挿入されたDNAのポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅のためのテンプレートとして用いた（表１）。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分、そして72℃で２分の30サイクル、次の72℃で10分からなる。そのPCR産物を、最終容量50μｌのH2Oに、PCR Clean-up Kit（Promega）を用いて精製した。２〜５μｌの各々の挿入調製物を、Taq Dye−ターミネーターサイクルシーケンシングシステム（Applied Biosystems）を用いて配列決定するためのテンプレートとして用いた。プライマーmycseq10及びPCR−Ｌ−Linkを用いて各々のクローンの軽鎖を配列決定し、PCR−Ｈ−Link及びpUC19reverseを用いて重鎖を配列決定した（表１）。
ｆ．開始TGFβ−１特異的ScFv抗体の配列決定及びソース
４つの異なるTGFβ−１特異的抗体を、上述の４つのライブラリーを用いて選択物から単離した。各々のクローン名、その起源並びにその重及び軽鎖ジャームライン（germline）を以下に示す。クローン１−Ｂ２及び31−Ｇ９のVHドメイン遺伝子の完全な配列決定を、ScFv31−Ｇ９からのVLドメインと一緒に図１（ａ）に供する。
0004387458.tif 000003
これにより、これらの最初の単離物を、合成CDRsと一緒に、クローンしたジャームラインＶ遺伝子からの非免疫化ヒト及び合成ライブラリーの異なるソースの両方天然のＶ遺伝子由来のライブラリーから得た。
２．最初のTGFβ−１特異的ScFv抗体のアフィニティー成熟
ａ．TGFβ−１−特異的ScFv抗体１−Ｂ２の軽鎖シャッフリング
ｉ．レパートリーの作製
クローン１−Ｂ２の重鎖を、PBL及び大きな（扁桃由来の）scFvレパートリー由来の軽鎖の完全なレパートリーで組換えた。１−Ｂ２重鎖を、プライマーHuJh４−５For（表１）及びpUC19reverseを用いてPCRにより増幅した。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分そして72℃で１分の30サイクル、次の72℃で10分からなる。そのPCR産物を１％アガロース−TAEゲルを通して分離し、増幅されたVHを示すバンドを切除し、そしてGeneclean Kit（Bio 101）を用いてアガロースゲルから溶出した。
PBL及び扁桃軽鎖を、プライマーfdtetseq及びRL１，２＆３の混合物を用いてPCRにより増幅した（表１）。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分、及び72℃で１分の30サイクル、次の72℃で10分からなる。PCR産物を、１％アガロース−TAEゲルを通して分離し、増幅されたVLを示すバンドを切除し、そしてGeneclean Kit（Bio 101）を用いてアガロースゲルから溶出した。
約50ngの増幅した１−Ｂ２重鎖及び50ngの増幅したPLL由来のもしくは増幅した扁桃由来の軽鎖を組み合わせ、担体として25μｇのグリコーゲンを用いて、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。その沈殿したDNAをマイクロフュージでの13,000rpmでの遠心によりペレット化し、空気乾燥させて、26μｌのH2O中に再度懸濁した。これを、反応緩衝液を１×，dNTP’sを200μＭ及び５ユニットのTaqポリメラーゼを加えた後、アセンブリー増幅に用いた。増幅条件は、94℃で１分、60℃で１分、及び72℃で１分30秒の20サイクル、次の72℃で10分からなる。各々のアセンブリー10μｌを、プライマーfdtetseq及びpUC19reverseでの‘プル・スルー（pull-through）’増幅におけるテンプレートとして用いた。増幅条件は、94℃で１分、60℃で１分、及び72℃で１分30秒の25サイクル、次の72℃で10分からなる。
プル・スルー増幅産物を、１％アガロース−TAEを通して分離し、プル・スルーVH−VLを示すバンドを切除し、Geneclean Kitを用いて溶出した。これを制限エンドヌクレアーゼSfiＩ及びNotＩ（NEB）で消化し、先にSfiＩ及びNotＩで消化したファージミドベクターpCantab６に連結した（Amersham連結システム）。その連結産物を用いてエレクトロコンピテントTG１細胞を形質転換し、２YTAGプレート上にプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。約１×105の個々のクローンを、PBL由来軽鎖との１−Ｂ２重鎖の軽鎖シャッフルから作り、そして約１×106を、扁桃由来軽鎖とのシャッフルで作った。
ii．軽鎖シャッフルレパートリーの選択
TGFβ−１−特異的抗体について２つの軽鎖シャッフルレパートリーを選択した。最初のライブラリーについて先に記載されるように、各々のレパートリーからファージミド粒子を回収した。回収したファージを最終容量100μｌの３MPBSで１時間、プレブロックした。約1011tuのファージを第１回目の選択に用い、109〜1010を次の選択に用いた。第１回目の選択のために、最終濃度100nMまでのビオチン化TGFβ１を、プレブロックしたファージに加え、１時間、37℃で静止してインキュベートした。
各々の選択のために、100μｌのDynabeads懸濁液（Dynal）を、磁石で分離し、そのビーズを回収して、１mlの３MPBSで２時間、プレブロックした。そのビーズを磁石で回収し、ファージミド／ビオチン化TGFβ−１混合物に再度懸濁し、反転させながら15分、室温でインキュベートした。ビーズを磁石上に捕獲し、PBSTで４回、洗い、PBSで３回洗った。各々の洗浄の後、ビーズを磁石上に捕獲し、次の洗浄において再度懸濁した。最後に、ビーズの半分を10μｌの50mM DTT（ビーズのもう半分はバックアップとして４℃で保存し、５分、室温でインキュベートした。次に完全なビーズ懸濁液を用いて５mlの指数的に増殖中のTG１細胞に感染させた。これを15分、静止して37℃でインキュベートし、次に45分、適度に振とうしながらインキュベートし、２YTAGプレートにプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。
コロニーを、10mlの２YTブイヨンにプレートにはぎとり、15％（ｖ／ｖ）グリセロールを−70℃での保存のために加えた。各々のプレート削り物の250μｌアリコートを用いて２YTAGに接種し、先に記載されるように、ファージミド粒子を救済した。各々のレパートリーのために、上述の１回目の選択と本質的に同一の、ビオチン化TGFβ−１を用いる３回の選択を行った。選択におけるビオチン化TGFβ−１の濃度を50nMに減らした扁桃由来軽鎖レパートリーの第３回目の選択を除いて、全ての選択は100nM TGFβ−１で行った。
iii．軽鎖シャッフルレパートリーからのTGFβ−１−特異的ScFv抗体の同定
TGFβ−１に特異的なScFv抗体を、ファージ及び可溶性ELISAの両方によって同定し、そして先に記載のように配列決定した。３つの新しいTGFβ−１−特異的scFv抗体を同定し、PBL由来の軽鎖を有する２つ及び扁桃由来の軽鎖を有する１つを同定した。３つ全てが上述の1B2重鎖配列（DP49）を有していた。その配列を以下に要約し、各々のVLドメイン遺伝子の完全な配列を図１（ｂ）に供する。
0004387458.tif 000004
これにより、PBLライブラリー由来のVHドメイン1B2は、PBL及び扁桃ライブラリーの両方由来のVLドメインと組み合わせることができる。
ｂ．TGFβ−１−特異的ScFv抗体1B2のCDR3‘スパイキング”（Spiking）’
i．‘スパイクした’レパートリーの作製
84量体の変異原性オリゴヌクレオチドプライマー、1B2 mutVHCDR3を最初に合成した（表１を参照のこと）。このプライマーを10％で‘スパイク’した；即ち、各々のヌクレオチド位置において非親ヌクレオチドが組み込まれるであろう10％の可能性がある。１−Ｂ２重鎖を、プフイマーpUC19reverse及び1B2 mutVHCDR3を用いるPCRにより増幅した。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分、及び72℃で１分の30サイクル、次の72℃で10分からなる。PCR産物を１％アガロース−TAEゲルを通して分離し、増幅されたVHを示すバンドを切り取り、そしてGeneclean Kit（Bio 101）を用いてアガロースゲルから溶出した。
親1B2軽鎖を、プライマーfdtetseq及びRL3を用いるPCRによって増幅した（表１）。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分及び72℃で１分の30サイクル、次の72℃で10分からなる。そのPCR産物を１％アガロース−TAEゲルを通して分離し、増幅されたVLを示すバンドを切り取り、そしてGeneclean Kit（Bio 101）を用いてアガロースゲルから溶出した。
約50ngの増幅した‘スパイクした’１−Ｂ２重鎖及び50ngの増幅した親1B2軽鎖を組み合わせ、担体として25μｇのグリコーゲンを用いて、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。その沈殿したDNAを、マイクロファージで13,000rpmでの遠心によりペレット化し、空気乾燥させて、26μｌのH2O中に再度懸濁した。これは、反応緩衝液を１×，dNTP’sを200nM，５ユニットのTaqポリメラーゼを加えた後、アセンブリー増幅に用いた。増幅条件は、94℃で1分、65℃で4分の25サイクルからなる。各々のアセンブリーの５μｌを、プライマーfdtetseq及びpUC19reverseと共に、‘プル・スルー’増幅におけるテンプレートとして用いた。増幅条件は、94℃で１分、55℃で２分、及び72℃で１分の30サイクル、次の72℃で10分からなる。
プル・スルー増幅産物を、１％アガロース−TAEを通して分離し、プル・スルー‘スパイク’VH−VLを示すバンドを切りとり、Geneclean Kitを用いて溶出した。これを、制限エンドヌクレアーゼSfiＩ及びNotＩ（NEB）で消化し、先にSfiＩ及びNotＩで消化したファージミドベクターpCantab６に連結した（Amersham ligation system）。その連結産物を用いてエレクトロコンピテントTG１細胞を形質転換し、２YTAGプレートにプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。この１−Ｂ２ VH CDR3のVH CDR3‘スパイキング’から、約４×106の個々のクローンを作った。
ii．1B2 CDR3スパイクレパートリーの選択
１μｇ／mlのTGFβ−１での１回のパンニング、次の上述の方法を用いる50nMでのビオチン化TGFβ−１での２回の選択により、新しいTGFβ−１−特異的scFv抗体についてレパートリーを選択した。
iii．1B2 CDR3スパイクレパートリーからのTGFβ−１−特異的ScFv抗体の同定
TGFβ−１に特異的なScFv抗体を、ファージ並びに可溶性及びファージELISAの両方によって同定し、上述のように配列決定した。クローン27C1を、スパイクしたレパートリーから単離した。それは本質的にクローン1B2と同一であったが重鎖CDR3において３つの差があった。クローン27C1の完全な配列を図１（ｃ）に示す。27C1 VHドメインを完全な抗体27C1/10A6 IgG4の作製において10A6 VLドメインと組み合わせた（実施例２）。この抗体の特性は、実施例２〜６により詳細に記載される。27C1に加えて、VHドメインのCDR3中で７〜14アミノ酸まで異なる大量の他の抗体を単離した（図３）。これらは、同様に、TGFβ２と比べてTGFβ１に優先的に結合する。
３．ネイティブ及び合成ファージ抗体レパートリーの選択によりヒトTGFβ−２に対する抗体の同定及びキャラクタリゼーション
ａ．ファージ抗体ライブラリーの誘導
２つの異なるファージ抗体レパートリーを、TGFβ−２に対する抗体について選択した。VH合成（Nissimら、1994）及び扁桃（先に記載のように作製した）レパートリーを、ファージミド粒子を救済するためにTGFβ−１について記載されるように各々処理した。
ｂ．TGFβ−２上のファージ抗体ライブラリーのパンニング
２つのレパートリーから誘導されたファージを、コーティング抗原として0.5μｇ／mlのTGFβ−２を用いた他はTGFβ−１について先に記載されるようにTGFβ−２上で各々別個にパンニングした。
ｃ．TGFβ−２−特異的ScFv抗体の同定及び配列決定
第３及び第４回目の選択からの個々のコロニーを、TGFβ−１でなく0.2μｇ/mlのTGFβ−２でコートしたフレキシブルマイクロタイタープレートを用いた他はTGFβ−１について先に記載されるようにファージ及び可溶性ELISAの両方によりスクリーニングした。TGFβ−２−コートプレート上で発生したELISAシグナルが非コートプレート上のそれの少くとも２倍であるなら、更なる分析のためにクローンを選択した。特異性ELISAのために、TGFβ−１について先に記載されるように、TGFβ−２コートウェル内で形成されたELISAシグナルがTGFβ−１，BSA又は非コートウェルのいずれか上のシグナルより少くとも５倍大きいなら、クローンをTGFβ−２に特異的であると考えた。
ｄ．最初のTGFβ−２−特異的ScFv抗体の配列及びソース
４つの異なるTGFβ−２特異的抗体を、上述の２つのライブラリーを用いて選択物から単離した。各々のクローン名、その起源並びにその重及び軽鎖ジャームラインを以下に示す。２Ａ−Ｈ11及び２Ａ−Ａ９のVHドメイン遺伝子の完全な配列を図２（ａ）に示す。
0004387458.tif 000005
これにより、ヒトTGFβ２に結合するヒト抗体は、合成CDRsと一緒に、非免疫化ヒトの天然のＶ遺伝子及びクローンされたジャームラインＶ遺伝子からの合成ライブラリーの両方の異なるソースから単離された。
４．TGFβ−２特異的scFv抗体２Ａ−Ｈ11及び２Ａ−Ａ９の軽鎖シャッフリング
ａ．レパートリーの作製
クローン２Ａ−Ｈ11及び２Ａ−Ａ９の重鎖を、TGFβ−１−特異的scFv抗体１−Ｂ２について先に記載されるように、PBL由来の軽鎖の完全なレパートリー及び大きな（扁桃由来の）scFvレパートリーで組換えた。PBL軽鎖レパートリーとの組換えから生じた両方のレパートリーは約１×105であり、扁桃軽鎖レパートリーとの組換えから生じたものは約１×106であった。
ｂ．軽鎖シャッフルレパートリーの選択
軽鎖シャッフルレパートリーを、TGFβ−１軽鎖シャッフルレパートリーの選択について先に記載されるように、ビオチン化TGFβ−２を用いてTGFβ−２−特異的抗体について選択した。全ての第１回目及び第２回目の選択について、100nMのビオチン化TGFβ−２の濃度を用いた。PBL由来軽鎖シャッフルレパートリーの第３回目の選択について、100nM及び１nMの濃度のビオチン化TGFβ−２を用いた。扁桃由来軽鎖シャッフルレパートリーの第３回目の選択について、50nMの濃度のビオチン化TGFβ−２を用いた。
ｃ．軽鎖シャッフルレパートリーからのTGFβ−２−特異的ScFv抗体の同定
TGFβ−２に特異的なScFv抗体を、先に記載のように、ファージ及び可溶性ELISAの両方により同定し、配列決定した。５つの新しいTGFβ−２−特異的scFv抗体を同定した。その配列を以下に要約する。各々のクローンの完全な配列を図２（ｂ）に示す。
0004387458.tif 000006
ｄ．ELISAによる特異性決定
上述のように、非コートウェルよりTGFβ−２に結合するとして同定されたクローンを、細かい特異性について更に分析した。50ml Falconチューブ中の５mlの培地に各々のクローンを接種し、ELISAに用いるファージ又は可溶性scFvを作り出すために増殖させた他は、上述のように、ファージ上に提示された又は溶液中のscFvを用いて特異性ELISAを行った。マイクロタイタープレートウェルを、0.2μｇ／mlのTGFβ−１，0.2μｇ／mlのTGFβ−２，10μｇ／mlのウシ血清アルブミン（BSA）又はPBS（非コートウェル）のいずれか50μｌでコートした。ファージ（又は可溶性scFv）及びマイクロタイタープレートの両方をプレブロックした後、各々のクローンからの50μｌのブロックしたファージ（又は可溶性scFv）を、TGFβ−１，TGFβ−２，BSA又は非コートウェルのいずれかでコートしたウェルに加えた。上述のように、アルカリホスファターゼ活性を、色原性基質pNPP（Sigma）又はAmpakシステム（Dako）のいずれかを用いて視覚化した。TGFβ−２コートしたウェル内で形成されたELISAシグナルがTGFβ−１，BSA又は非コートウェルのいずれかのシグナルより少くとも５倍大きいなら、クローンをTGFβ−２に特異的であると考えた。関連しない抗原との交差反応性を、完全な抗体の形態における抗TGFβ２抗体についてより広範囲に決定した。実施例２を参照のこと。（R & Dシステム、Abingdonから得た）TGFβ１及びTGFβ３との6B1 IgG4及び6A5 IgG4の交差反応性が極めて低いことも示された。
ｅ．BIACoreTMによる特異性決定
その抗体は、適切な抗原でコートされたBIACoreセンサーチップへの相対的な結合により、TGFβ１に比べてTGFβ２に特異的であることも示された。TGFβ１及びTGFβ２を、製造元の説明に従って、Biosensor CM５センサーチップ（Pharmacia）に結合したアミンにより免疫化した。一本鎖Fvフラグメント（35μｌ；免疫化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製）を、５μｌ／分の流速で、免疫化抗原に注入した。結合したTGFβの量を、この期間にわたる共鳴単位（RUs）の全増加量として評価した。一本鎖Fvフラグメント6H1，6A5及び14F12について、これらのフラグメントは、TGFβ１コートセンサーチップについて各々全部で686，480及び616を供し、TGFβ２コートチップについて各々77，71及び115を供した。
５．高アフィニティー抗TGFβ−１生物中和剤との結合
ａ．優れた特性を示す抗TGFβ１及び抗TGFβ２ scFv由来の軽鎖での高アフィニティー抗TGFβ１ scFv由来の重鎖の組換え
scFv抗体１−Ｂ２のCDR3をスパイキングすることにより得られた抗体（セクション２ｂ）は高アフィニティーでTGFβ−１に結合する。高アフィニティー中和性抗体を得る可能性を改善するために、有望な特性及び特に試験管内でTGFβ−２の活性を中和することができる特性を有するscFvクローン由来のVLsと共に、高アフィニティー抗TGFβ−１由来のVHsを鎖シャッフリングすることを決定した。
プライマーpUC19reverse及びPCR−Ｈ−Linkを用いて、TGFβ−１の選択（セクション２ａ．ii）の後、CDR3スパイクした１−Ｂ２クローンのレパートリーから、重鎖をPCRにより増幅した。（表１）。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分及び72℃で１分の30サイクル及び次の72℃で10分からなる。そのPCR産物を１％アガロース−TAEゲルを通して分離し、増幅されたVHを示すバンドを切除し、そしてGeneclean Kit（Bio 101）を用いてアガロースゲルから溶出した。
プライマーfdtetseq１及びPCR−Ｌ−Linkを用いて、各々の抗TGFβ−１特異的中和剤（７−Ａ３，１０−Ａ６及び14−Ａ１；セクション２ａ．iii）及び各々の抗TGFβ−２特異的中和剤（6H1，6A5，6B1，11E6及び14F12；セクション４ｃ）により、軽鎖を別個に増幅した（表１）。VH増幅について記載されるのと同じPCR条件を用いた。次に、各々のVL PCR産物を、上述のように１％アガロース−TAEゲルを通して別個に精製した。精製した産物を、（分析用アガロースゲルから評価して）ほぼ等モル量で最終的に混合してVL‘プール’を供した。
約50ngの増幅した重鎖及び50ngの増幅したプールした軽鎖を組み合わせて、担体として25μｇのグリコーゲンを用いて酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。その沈殿したDNAを、マイクロファージで13,000rpmで遠心することによりペレット化し、空気乾燥させて23μｌのH2O中に再度懸濁した。これを、反応緩衝液、200nMまでのdNTP及び５ユニットのTaqポリメラーゼの添加の後のアセンブリー増幅に用いた。増幅条件は94℃で１分、55℃で１分及び72℃で２分の20サイクル、及び次の72℃で10分からなる。５μｌのアセンブリーを、プライマーfdtetseq及びpUC19reverseでの50μｌ‘プル・スルー’増幅におけるテンプレートとして用いた。増幅条件は94℃で１分、55℃で１分及び72℃で２分の30サイクル、及び次の72℃で10分からなる。
そのプル・スルー増幅産物を１％アガロース−TAEを通して分離し、プル・スルーVH−VLを示すバンドを切除し、そしてGeneclean Kitを用いて溶出した。これを、制限エンドヌクレアーゼSfiＩ及びNotＩ（NEB）で消化し、Amersham連結システムを用いて、先にSfiＩ及びNotＩで消化したファージミドベクターpCantab６（McCaffertyら、1994前掲）に連結した。その連結産物を用いてエレクトロコンピテントTG１細胞を形質転換し、２YTAGプレート上にプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。約３×106の個々のクローンのレパートリーを生成した。
ｂ．鎖シャッフリングしたレパートリーの選択
鎖シャッフリングしたレパートリーを、上述（セクション１ｂ）のように、TGFβ−１（１μｇ／ml）の１回のパンニングにより選択した。
ｃ．TGFβ−１特異的scFv抗体の同定
TGFβ−１に特異的なScFv抗体を、ファージELISAにより同定し、上述（セクション１ｄ．ｉ及び１ｅ）のように配列決定した。新しいTGFβ−１特異的scFv抗体を同定した。５つの新しい高アフィニティークローンを単離した−31G9 VH及び7A3 VLを含むCS32；31G9 VH及び6H1 VLを含むCS39；31G9 VH（図１（ａ）（iii）及び残基２においてValのかわりにIleに置換した11E6 VL（図14に供されるVL配列）を含むCS37；残基１においてGlnのかわりにGluで、残基５においてGluのかわりにGlnで置換した31G9重鎖及び14F12 VLを含むCS35；並びに残基３においてGlnのかわりにThrで、残基５においてGlnのかわりにGluで、残基27においてPheのかわりにLeuで、残基56においてAsnのかよりにIleで、そして残基105においてGlnのかわりにArgで置換された31G9 VH及び6A5 VLを含むCS35。
ｄ．TGFβ１及びTGFβ２に結合する一本鎖Fvフラグメントについてのオフ・レート決定
本実施例に記載される一本鎖FvフラグメントのTGFβ１又はTGFβ２への結合についてのオフ・レート（off-rates）を、Karlssonらに記載されるように決定した（R．Karlssonら、J．Immunol．Methods 145，229〜240，1991）。得られた結果を、決定されたそれについての解離定数と一緒に、表２に示す。これらの結果は、高アフィニティー抗体が単離されたことを示す。
６．Large ScFvレパートリーの選択による、ヒトTGFβ−１及びTGFβ−２の両方と交差反応するがTGFβ−３とは交差反応しない抗体の同定及びキャラクタリゼーション
ａ．ライブラリーのパンニング及び結合物の同定
結合体
（先に記載の）大（large）ScFvライブラリーを誘導し、ファージミド粒子を救済し、そして以下の変更と共に先に記載されるようにパンニングした。第１回目のパンニングについて、（普通の２mlではなし）0.5ml PBS中の1012tuのライブラリーファージを用い、第２回目について、0.5ml PBS中の3.5×109のファージを用いた。イムノチューブを、第１回目及び第２回目の選択の両方について、0.5mlのPBS中の10μｇのTGFβ−２でコートした。第２回目の選択からの個々のコロニーを、0.2μｇ／ml TGFβ−１を用いてELISAによりスクリーニングした。TGFβ−１に結合するクローンを、TGFβ−２，TGFβ−３、BSA及びPBS上で更にスクリーニングした。TGFβ−１及びTGFβ−２コートウェル中に作られたELISAシグナルが両方とも、TGFβ−３，BSA及び非コートウェル上のシグナルより少くとも５倍大きいなら、クローンをTGFβ−１及びTGFβ−２の両方に特異的であると考えた。
ｃ．TGFβ−１／TGFβ−２交差反応性ScFv抗体の同定
TGFβ−１及びTGFβ−２の両方に特異的な一本鎖scFv抗体を先に記載されるように、ファージ及び可溶性ELISAの両方により同定し、配列決定した。抗体遺伝子VT37のVLドメインの完全な配列を図４に示す。この一本鎖Fv抗体の解離定数を、TGFβ１について４nM及びTGFβ２について７nMまでのBIACoreTMを用いる分析によって評価した。TGFβ３についての交差反応性も決定した。8.3μｇ／mlの精製したVT37 scFvを、TGFβ１（500RUsコート）；TGFβ２（456RUsコート）又はTGFβ３（5500RUsコート）でコートしたBIACoreTMセンサーチップ上をを通過させた。VT37 scFv結合についての相対的な応答は：TGFβ１−391RU結合；TGFβ２−261RU結合又はTGFβ３−24RU結合であった。これにより、この抗体はTGFβ１及びTGFβ２に強く結合するが、TGFβ３への結合はバックグラウンド上で検出できなかった。
実施例２
完全な抗体を発現する細胞系の作製
IgG4抗体を発現する細胞系の作製のために、VHドメインのためのヒトガンマ４定常領域又はVLドメインのためのヒトカッパもしくはラムダ定常領域を発現するベクター内にクローンした。
完全な抗体を作製するために、（TGFβ1に特異的な）27C1/10A6IgG4，27C1 VH DNAを、実施例１において上述の単離されたクローンから調製した。VH遺伝子を、94℃で１分、55℃で１分、72℃で1.5分のサイクルのオリゴヌクレオチドVH３ Backs fiEu及びVHJH６ ForBam（表１）を用いて、PCRにより増幅した。SfiＩ及びBamHＩでの消化の後、VH遺伝子を、SfiＩ及びBamHＩで消化したベクターvhcassette２（図５）にクローンした。連結したDNAを大腸菌TG１に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを得、正確な挿入物を含むものをDNA配列決定により同定した。
これらのコロニーからのプラスミドDNAを調製し、そのDNAをHindIII及びBamHＩで消化した。HindIII−BamHＩ制限フラグメントを、HindIII及びBamHＩで消化したヒトIgG4重鎖発現ベクターpG4D100（図６）に連結し、そのDNAをエレクトロポレーションにより大腸菌TG１に移入した。そのVH遺伝子挿入物の配列を、DNA配列決定により再び確認した。
軽鎖のために、実施例１で単離された10A6のVL遺伝子を、オリゴヌクレオチドDelta BamHＩでの部位特異的変異誘発（Amersham RPN1523）を用いて、その内部BamHＩ部位を除去するために最初に変異誘発した（表１）。結果として生ずるVLD BamHＩ遺伝子を、オリゴヌクレオチドＶλ３／４Back EuApa及びHuＪλ２−３For EuBamを用いてPCRによって増幅した（表１）。ApaLＩ及びBamHＩでの増幅した挿入物の消化の後、VL遺伝子を、ApaLＩ及びBamHＩで消化したベクターvlcassette CAT1（図７）にクローンした。連結したDNAを大腸菌TG１に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを得、そして正確な挿入物を含むものを、DNA配列決定により同定した。
これらのコロニーからのプラスミドDNAを調製し、そのDNAをHindIII及びBamHＩで消化した。リーダー配列及びVLドメインを含むHindIII−BamHＩ制限フラグメントを、HindIII及びBamHＩで消化されたヒトラムダ軽鎖発現ベクターpLN10に連結した。エレクトロポレーションの後、大腸菌中の形質転換体を、DNA配列決定により確認した。
pG4D100-27C1クローン及びpLN10-10A6クローンからプラスミドDNAを調製した。次にこのDNAを、エレクトロポレーション（290Ｖ；960μＦ）によりDUKXB11チャイニーズハムスター卵母（CHO）細胞に同時移入した。次のその細胞を、非選択培地（α−MEM＋ヌクレオシド）中で２日間、増殖させた。次に細胞を選択培地（ヌクレオシドのないα−MEM＋１mg／ml G418）に移し、96ウェルプレート中で増殖させた。次に、コロニーを24ウェルプレートに移し、サンプルを、アセンブルしたヒトIgG4抗体についてサンドイッチELISAにより、及び（実施例１のような）ELISAにおけるTGFβ１への結合によりアッセイした。サンドイッチELISAのために、ヤギ抗ヒトIgGをELISAプレート上にコートし、捕獲されたヒトIgG4を、ヤギ抗ヒトラムダ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いて検出した。次に、高発現細胞系を、メトトレキセートの存在下での選択を用いて挿入された遺伝子の増幅により得た（R．J．Kaufman Methods Enzymol．185 537〜566，1990）。
（TGFβ２に特異的な）完全な抗体6H1 IgG4を、上述の27C1/10A6 IgG4の作製と同様に作製した。6H1 VH遺伝子（実施例２）を、オリゴヌクレオチドVH3 Back SfiEu及びVHJH１−２FOR BamでPCR増幅を行ったことを除いて上述の27C1と同様にpG4D100にクローンした。6H1 VL遺伝子（実施例２）を、オリゴヌクレオチドVK２ Back EuApa及びHuJK３FOR EuBamでPCR増幅を行ったことを除いて上述の通りvlcassette CAT1にサブクローンした。しかしながら、6H1 VLはカッパ軽鎖であるので、HindIII−BamHＩフラグメントを、HindIII及びBamHＩで消化したヒトがカッパ軽鎖発現ベクターpKN100（図９）にサブクローンした。次に、高発現細胞系を上述のように単離した。（（実施例２のように）ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖コンジュゲートを用いて及びELISAにおけるTGFβ２への結合により検出された）アセンブルしたヒトIgG4抗体についてのサンドイッチELISAにより、培養プレートから、抗体を発現するクローンを同定した。
完全な抗体6A5 IgG4及び6B1 IgG4を作製するために、pG4D100中の同じ6H1 VH構成物を、これらの抗体は全て同じVH遺伝子を有するので、6H1 IgG4のかわりとして用いた。6B1及び6A5遺伝子を、PCR増幅をヌクレオチドＶλ３ back EuApa及びHuＪλ２−３For EuBamで行ったことを除いて、10A6軽鎖について上述されるように、vlcassette CAT1に各々サブクローンした。次に、HindIII−BamHＩ制限フラグメントを、上述のようにpLN10にサブクローンした。（（実施例２のような）ヤギ抗−ヒトカッパ軽鎖コンジュゲートを用いて及びTGFβ２への結合により検出した）アセンブルしたヒトIgG4抗体についてのサンドイッチELISAにより、培養プレートから、抗体を発現するクローンを同定した。
完全な抗体構成物の特性
完全な抗体の精製
関連するIgGを生産するCHO細胞からの無血清上清を、精製剤に8000rpmで遠心することにより透明にした。その上清を、各々25又は120mgの結合能力を有する１又は５mlのいずれかの大きさのPharmaciaからのHiTrap Protein A Sepharoseプレ充填アフィニティーカラムに適用した。各々のIgGは、１の精製から次のものへの材料のいずれの持ちこしを避けるために専用のカラムを有する。そのカラムを、上清を適用する前に１×PBSの10カラム容量でリン酸緩衝塩類溶液で平衡化した。全ての上清を、カラムのサイズにより、再び、２〜４ml／分の流速でカラムに適用し、そのカラムを１×PBSの10カラム容量で洗っていずれの非特異的に結合する材料をも除去した。その結合したタンパク質の溶出を、氷酢酸でpH3.3に調節した0.1Ｍ酢酸ナトリウムを用いて行った。その溶出した材料を、1.5ml容量の８画分に収集し、280nmの吸光度を測定し、この値に0.7をかけてmg／mlの値を得ることによりタンパク質の量を決定した。次にこれを、1.5ml画分当り0.5mlの１Ｍ Tris HCl pH9.0で中和し、そのタンパク質含有画分をプールし、IgGを緩衝液交換するために１×PBSに対して断片した。そのカラムを、１×PBSの10カラム容量を流すことにより中性pHにもどし、再び必要となるまで防腐剤として20％エタノール中に保存した。
次に、サンプルを10〜15％ SDS-PAGE（Phast system，Pharmacia）に流し、銀染色した。これは、IgG調製の純度の評価を許容した。これは、染色したゲル上の一対のみの他の主要なバンドと共に、約80〜90％であると通常見い出された。
ELISAによる結合特異性
IgG4抗体6B1及び6A5は、TGFβ１及びTGFβ３への極めて低い交差反応性でTGFβ２に結合することが示され、特定範囲の非特異的抗原インターロイキン−１；ヒトリンホトキシン（TNFb）；ヒトインスリン；ヒト血清アルブミン；一本鎖DNA；オキサゾロン−ウシ血清アルブミン；キーホール・リンペットヘモシアニン；チキン卵白トリプシンインヒビター；キモトリプシノーゲン；シトクロムｃ；グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ；オブアルブミン；ニワトリ卵リゾチーム；ウシ血清アルブミン及び腫瘍壊死因子ａ−（TNFa）（図13（ａ）及び（ｂ））との交差反応は検出できなかった。同様に、抗体6B1，6A5及び6H1 IgG4はBIACoreTMセンサー上にコートしたTGFβ２に強く結合したが、TGFβ１又はTGFβ３コートしたチップにはあまり結合しなかった。
BIACoreTMによる完全な抗体の結合特性
上述の抗体のアフィニティー定数を、Karlssonら（J．Immunol．Methods 145，299〜240，1991（前掲））の方法を用いてBIACoreTMにより決定し、TGFβ１についての27C1/10A6 IgG4について約５nM、そしてTGFβ２についての6H1 IgG4について２nMであることを見い出した。抗体27C1/10A6 IgG4は、Biosensorチップ上にコートしたTGFβ２とのいくらかの交差反応性も示したが、その解離定数は、TGFβ１と比べてTGFβ２について約10倍又はそれ超である。BIACoreTMセンサーチップ上にコートしたリゾチームとの大きな交差反応はなかった。
TGFβ１及びTGFβ２へのIgG4抗体によるラジオレセプター結合の中和及び阻害は実施例３及び４に記載される。
実施例３
細胞増殖へのTGFβ１及びTGFβ２の阻害効果の抗体による中和
実施例１及び２に記載される抗体の中和活性を、Randallら（1993）（J．Immunol．Methods 164，61〜67）に記載されるように、TGFβのためのバイオアッセイの改良型においてテストした。このアッセイは、赤白血病細胞系TF１のインターロイキン−５誘導性増殖を阻害するTGFβ1及びTGFβ2の能力並びに特異的TGFβ抗体でのこの阻害を逆転できることに基づく。
方  法
細胞及び保守
ヒト赤白血病細胞系TF１を、37℃の５％ CO2を含む加湿インキュベーター内で、５％胎児ウシ血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及び２mg／mlのrhGM-CSFが供されたRPMI1640培地中で増殖させた。培養物が２×105／mlの密度に達した時にそれを継代し、５×105／mlの密度に希釈した。
サイトカイン及び抗体
rhGM−（SF及びrhIL−５を、R & Dシステムから得て、rhTGFβ2をAMS Biotechnologyから得た。ウサギ抗TGFβ2抗体をR & Dシステムから得て、マウス抗TGFβ1,2,3をGenzymeから得た。他のTGFβ2に対する抗体は、実施例１及び２に記載される通りであった。
TGFβ2による増殖の阻害の滴定
投与量応答曲線の作製のためのTGFβ2の２倍希釈物（800pM−25pM）を、５％胎児ウシ血清及び抗生物質を含む100μｌのRPMI1640培地中の滅菌マイクロタイタープレート上で調製した。全ての希釈物は少くとも４回重複で行った。試薬及び細胞のみの対照についての上述の媒地100μｌを含む更なるウェルも含まれる。
TF１細胞を、無血清RPMI1640媒地中で２倍、希釈し、2.5×105／mlの密度で、５％胎児ウシ血清、100Ｕ／mlペニシリン及び100μｇ／mlストレプトマイシン及び４μｇ／ml  rhIL−５が供されたRPMI1640培地中に再度懸濁した。100μｌのアリコートを先に調製した一連の希釈物に加え、37℃の５％ CO2を含む加湿インキュベーター中で48時間、そのプレートをインキュベートした。
40μｌのCell Titer 96基質（Promega）を加え、そのプレートを更に４時間、インキュベーターにもどし、そして最後に490nmの吸光度を測定することにより、細胞増殖を比色的に測定した。次に、細胞のみのウェルと比較したTGFβ2の各々の濃度についての阻害割合を計算した。
抗TGFβ2抗体によるTGFβ2阻害活性の中和についてのアッセイ
TGFβ2の中和を、上述のような100μｌの培地中の各々の精製した抗体の２倍希釈物を作ることにより決定した。TGFβ2を、上述の滴定で50％阻害を供する濃度に等しい最終濃度を供するように各々の抗体希釈物に加えた。各々の希釈物を４回重複で調製した。抗体のみ、細胞のみ及び試薬対照について更なるウェルを調製した。細胞調製及び細胞増殖の測定を、上述の通り行った。
結  果
TGFβ2は、50pMの濃度で50％だけTF１細胞の増殖を阻害することが示された。この濃度を、全ての中和実験について用いた。
これらのアッセイは、TGFβ2活性が、両方のScFvフラグメント（図10）について及び完全なIgG4抗体（図11）について投与量依存的に中和されることを示した。50％阻害を供する抗体の濃度をグラフから決定し、これを表４に示す。
実施例４
ラジオレセプターアッセイで測定したレセプターに結合するTGFβの抗体による阻害
異なるクローンからの一本鎖Fvフラグメント及び完全なIgG4抗体を発現させて精製し、レセプターへのTGFβの結合を阻害するそれらの能力を、ラジオレセプターアッセイにおいて測定した。
scFvの精製
ポリヒスチジン尾を含むScFvsを、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。適切なプラスミドを含むバクテリアクローンを、２％グルコース及び100μｇ／mlアンピシリンを含む２TY培地（２TYAG）50mlに接種し、30℃で一晩、増殖させる。次の日に、その培養物を500mlの予め温めた２YTAGに加え、30℃で１時間、増殖させる。その細胞を遠心により収集し、アンピシリン及び１mM IPIGを含む500mlの２TYに加え、30℃で４時間、増殖させる。次に細胞を遠心により収集し、30mlの氷冷50mM Tris HCl pH8.0，20％（ｗ／ｖ）スクロース、１mM EDTA中に再度懸濁する。15分、４℃で反転させて混合した後、その混合物を４℃で15分、12Ｋrpmで遠心する。その上清を除去して、約１mlのNTA−アガロース（Qiagen 30210）を加え、４℃で30分、混合する。そのアガロースビーズを50mMリン酸ナトリウム、300mM NaClで更に洗い、小さなカラムに充填する。50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaClで更に洗った後、10mMのイミダゾールpH7.4 scFvを50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl，250mMイミダゾールpH7.4で溶出する。0.5ml画分を収集し、タンパク質含有画分をA280nmを測定することにより同定した。プールした画分を濃縮し、Superdex 75カラム（Pharmacia）でのPBS中のゲルろ過により、scFvを更に精製した。
完全な抗体の精製
完全なIgG4抗体を、実施例２に記載されるように精製した。
TGF−βについてのラジオレセプターアッセイ
TGF−βの中和を、125−Ｉ標識TGF−βの、そのA549ヒト肺癌細胞上のレセプターへの結合を阻害するscFv及びIgGsの能力により測定する。
A549細胞（ATCC CCL 185）を、10％胎児ウシ血清（PAA）、２mMグルタミン（Sigma Ｇ−7513）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma Ｐ−0781）、MEM非本質的アミノ酸（Sigma Ｍ−7145）が供された高グルコースDulbecco’s modified Eagle’s培地（Sigma Ｄ−6546）中で増殖させる。
細胞を、24ウェルクラスタープレートのウェルに、１〜２×105細胞／ml／ウェルで種つけし、無血清DMEM中で24時間、増殖させる。細胞単層を、無血清DMEMで２回洗い、0.1％（ｖ／ｖ）BSAを含む0.5ml結合培地（DMEM/Hams Ｆ12（Sigma Ｄ−6421）を各々のウェルに加えた。
20pMにおける125Ｉ−TGF−β１又は−β２（70〜90TBq/mmol；Amersham International）のアリコートを、室温で１時間、結合培地中で抗体と共にプレインキュベートする。次に0.5mlのTGF−β１抗体の重複サンプルを、その細胞単層に加え、１〜２時間、37℃でインキュベートする。対照ウェルは、TGF−βのみを含む。結合していないTGF−βを、0.1％ BSAを含むHank’s平衡塩類溶液で４回洗うことにより除去する。細胞を、0.8mlの25mM Tris HCl pH7.5，10％グリセロール、１％ Triton Ｘ−100中に、室温で20分、溶かす。各々のウェルの内容物を除去し、125Ｉをガンマカウンターで測定する。scFv又はIgG各々の能力を、50％だけTGF−βの結合を阻害するのに必要な抗体組み込み部位の濃度により測定する（IC50；表５）。これにより、IC50値は10nM未満であり、いくつかの場合には１nM未満であり、このことは極めて能力ある抗体であることを示す。
実施例５
損傷したラットの中枢神経系におけるTGFβ１及びTGFβ２に対する抗体による瘢痕形成の防止
Loganら（1994）（Eur．３ Neuroscience ６，355〜363）は、CNS損傷のラットモデルにおける、線維状瘢痕組織の沈積及び病変を縁取るグリア境界膜の形成への、TGFβ1に対する中和性シチメンチョウ抗血清の緩和効果を示した。同じラットモデルにおけるTGFβ1及びTGFβ2の両方に対する中和性工学的処理ヒト抗体の効果を研究するために研究を組み立てた。本研究に用いる抗体の誘導は、実施例１及び２に記載される。
方  法
動物及び手術
５の雌のSprague-Dawleyラット（250ｇ）のグループを、ｉ．ｐ．注入で麻酔した。その麻酔したラットは、右後頭皮質に作られた定位的に規定された外傷を有しており（Loganら、1992，Brain Res．587，P216〜227）、その側脳室を外科的にカニューレを挿入し、同時に外面化した（Loganら1994前掲）。
TGFβの中和
動物に、Loganら（1994、前掲）に記載されるように人工の脳脊髄液のビヒクル中に希釈した５μｌの精製した抗体TGFβ抗体（表３）を毎回脳室内に注入した。外傷後14日に、全ての動物を灌流固定し、イムノフルオレセンス染色により外傷部位の組織化学的評価のため、７mmポリエステルワックスセクションを処理した。
蛍光免疫組織化学及び像分析
その創傷部位内の形態学的変化を、フィブロネクチン及びラミニンに対する抗体での免疫蛍光染色の後、抗−種FITCコンジュゲートで検出した（Loganら1994前掲）。これらの変化を、Biorad MRC500レーザー走査システムにつないだLeitz共焦顕微鏡を用いる像分析により、半定量的に評価した。その外傷に沿って中央の道の普通の位置で読みとりを行った。
結  果
CNS損傷の部位におけるTGFβに対する抗体の効果
各々の抗体についての特異的相対的蛍光の定量を図12ａ及びｂに示す。ラミニンは、フィブロネクチンが創傷の中心の線維状組織のマトリックスを形成するのと一緒に、創傷の境界に沿って外側のグリア境界（glial limitans）の形成の基準である。これらの２つのタンパク質の像分析の定量は、創傷部位における瘢痕形成の程度が測定されることを許容する。
塩類溶液対照（図12ａ，ｂ）と比較して、抗TGFβ抗体処理した脳において創傷のフィブロネクチン及びラミニンイムノ局在化のかなりの減少がある。これにより、このことは、これらの操作されたTGFβ1及びTGFβ2上のエピトープに対するヒト抗体が、その創傷部位内の細胞マトリックスタンパク質フィブロネクチン及びラミニンの沈析を防ぐことにより、別個に及び一緒にの両方でCNSへの損傷の効果を緩和することを示す。以前に、Loganら（1994前掲）は、TGFβ1に対するポリクローナルシチメンチョウ抗血清の有効性を示した。これは、このモデルで有効であることが示されているTGFβ2に対するいずれかの抗体の最初の報告である。
実施例６
TGFβ2の活性又は潜伏形態への6B1 IgG4の結合の測定
TGFβ2を合成し、生物学的に不活性な又は潜伏性の複合体として排他的に分泌させる（Pircherら、（1986）Biochem．Biophys．Res．Commun．158，30〜37）。潜伏性の複合体は、潜伏性−関連ペプチド（LAP）と非共有結合で会合したTGFβ2ジスルフィド結合ホモダイマーからなる。TGFβ2の活性化は、それが処理された前駆体から遊離した時におこる。活性TGFβ2は、LAPと可逆的に解離及び再会合することができ、このことは、各々その生物活性のオン及びオフに変わる。
培養したPC−３腺癌細胞（Ikedaら（1987）Biochemistry 26，2406〜2410）は、抗体6B1 IgG4によるTGFβ2の活性又は潜伏形態に結合することの測定のための便利なソースを供するほとんど排他的に潜伏性のTGFβ2を分泌することを示した。
方  法
細胞培養
PC−３前立腺の腺癌細胞を、10％ FBSの補給下でコンフルエンスまで増殖させた。その細胞をPBSで3回洗い、細胞を、1.4×10-5Ｍタモキシフェンを供した無血清Hams Ｆ12／DMEM中で更に７日、培養した（Brownら（1990）Growth Factors 3，35〜43）。その培地を除去し、遠心により透明にし、２つの15mlアリコートに分けた。１つのアリコートを、pH＝3.5になるまで滴下して加えることにより５Ｍ HClで15分、酸性化し、次に５ＭのNaOH／１Ｍ HEPES pH7.4を少し加えることにより中和した。この手順は、定量的に潜在性のTGFβ2を活性化する。
競合ELISA
ELISAプレートの16のウェルを、４℃で、PBS中200ng／mlのTGFβ2100μｌで一晩、コートした。そのプレートをPBS Tweenで３回、洗い、PBS中３％ Marvel 200μｌで37℃でブロックした。
以下のサンプルを、１時間、室温でインキュベートした。
400μｌ Hams Ｆ12／DMEM（試薬ブランク）
400μｌ Hams Ｆ12／DMEM＋４μｇ 6B1 IgG4抗体（陽性対照）
400μｌ  PC３酸活性化ならし培地＋４μｇ 6B1 IgG4抗体（活性TGFβ2サンプル）
400μｌ  PC３非処理ならし培地＋４μｇ 6B1 IgG4抗体（潜伏性TGFβ2サンプル）
ELISAプレートを、ブロッキング溶液のない状態にし、上述の溶液の１つを４回重複でセンシタイズ（sensitised）したウェルに加え、室温で２時間、インキュベートした。そのプレートをPBS/Tweenで３回、洗い、ウェルを、１％ Marvel/PBS中１：5000に希釈したヤギ抗ヒトIgG γ鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート100μｌで再び満たした。１時間後、そのウェルをPBS/Tweenで３回洗い、結合した抗体を、405nmの吸光度によりｐ−NPP基質で示された。
結  果
この実施の結果を図23に示す。
この結果は、活性化TGFβ２とのプレインキュベーションが、ELISAプレーチ上に結合したTGFβ２への6B1の結合を阻害し、他方潜伏形態はそうでないことを明らかに示す。これは、6B1 IgG4のみがTGFβ２の活性形態に結合することを証明する。
実施例７
細胞増殖へのTGFβイソフォームの阻害効果の、TGFβ２に対する抗体による中和
（実施例２で精製された）6B1 IgG4，6H1 IgG4及びマウスモノクローナル抗体（Genzyme；J．R．Daschら；前掲）の中和活性を、実施例３に記載されるTF１細胞増殖アッセイにおけるTGFβイソフォーム、TGFβ１，TGFβ２及びTGFβ３の各々について測定した。TGFβイソフォームの濃度は各々のアッセイにおいて100pMであった。
図16に示すように、6B1 IgG4は、約２nMのIC50でTGFβ２を強く中和する（表６）。これは、Genzymeからのマウスモノクローナルについて10nM及び6H1 IgG4について12nMに相当する。6B1 IgG4も6H1 IgG4もTGFβ１を大きく中和しない（図17）。しかしながら、6B1（IC50約11nM）及び6H1 IgG4（約20nM）の両方によるTGFβ３の大きな中和はない（図18）。これは、Genzymeモノクローナルの中和能力よりかなり低い（IC50約0.1nM）。
6B1 IgG4及び6H1 IgG4の両方は、TGFgβ３活性の中和より強いTGFβ２活性の中和剤である。TGFβ３活性の中和は、抗体によるこれら２つのイソフォームの相対的結合（実施例２）及びラジオレセプターアッセイにおける相対的結合（実施例８）から予測されるであろうより大きい。
実施例８
ラジオレセプターアッセイで測定したレセプターへの他のTGFβイソフォームの結合の、TGFβ２に対する抗体による阻害
レセプターへのTGFβイソフォームの結合を阻害する6B1 IgG4の能力を、実施例４に記載されるようにラジオレセプターアッセイで測定した。
6B1 IgG4は、0.05nMのIC50で125Ｉ−TGFβ２の結合を阻害した。125Ｉ−TGFβ１の結合の大きな阻害はなかったが、125Ｉ−TGFβ３については、6B1 IgG4は、約４nMのIC50で結合を阻害した。これは、このアッセイにおける6B1 IgG4の能力及びTGFβ２活性の中和についてのその選択性を示す。このアッセイにおけるTGFβ３との交差反応は２％未満である。
これにより、6B1 IgG4は、TGFβ３の結合と比較して、そのレセプターへのTGFβ２の結合を優先的に阻害する。
実施例９
治療的使用のためのTGFβ１抗体の評価
実施例１で単離した抗体を、そのレセプターへのTGFβ１結合を阻害する能力の試験管内測定及び試験管内結合特性により、潜在物治療価値について評価した。
実施例４（表５）において、CS32は、A549細胞上のレセプターへの125Ｉ−TGFβ１の結合の、テストした抗体の最も強い阻害を示した。CS32と実施例１セクション５ｃの実験に記載されるように単離した更なる抗体（CS35，CS37及びCS38）との間で更なる比較を行った。これは、CS37が、CS32について40nMであるのと比較して、約８nMのIC50で、このアッセイにおいてこれらの抗体のうち最も優れた能力であることを示した。CS32についてのIC50値は、そのアッセイの性質が絶対的IC50値がアッセイ条件により種々であり得るので、先のアッセイの値より高い（表５）。
抗体１Ａ−Ｅ５及び１AH−６（実施例１、セクション１ｆ）並びにそれら由来の抗体は、このラジオレセプターアッセイにおいてTGFβ活性を中和することにおいて1B2由来の抗体よりかなり低い能力であった。
これにより、CS37は、そのレセプターへの125Ｉ−TGFβ１の結合の阻害により評価して、最も能力ある抗体候補であった。
抗TGFβ１抗体によるTGFβ３への結合の評価
抗体14A1及び10A6（実施例１、セクション２（ａ）（iii））は、マイクロタイタープレートを0.2μｇ／ml TGFβ１；0.2μｇ／ml TGFβ２；0.2μｇ／ml TGFβ３；10μｇ／mlウシ血清アルブミン（BSA）又はPBS（非コートウェル）のいずれか50μｌでコートしたことを除いて実施例１、セクション１（ｄ）（iii）に記載されるのと同じ特異性ELISAを用いて、TGFβ２及びTGFβ３よりTGFβ１に優先的に結合することが示された。TGFβ１コートされたウェル内で作られたシグナルはTGFβ２及びTGFβ３上のシグナルより少くとも５倍大きかったので、そのクローンはTGFβ１に特異的であることが示された。
これらの抗体と同じ1B2系列由来の抗体、例えば27C1/10A6 IgG4（10A6と同じVLを含むもの、27C1 VHはCDR3残基の変異誘発により調製した）は、TGFβ３に対して同じ交差反応性を有するはずである。
実施例10
グルタミンシンターゼ選択システムを用いる6B1 IgG4のための高発現細胞系の作製及び中和アッセイにおける評価
p6H1 VHガンマ４の作製
6B1 VHを、オリゴヌクレオチドＰ16及びＰ17を用いるPCRにより6H1 pG4D100（実施例２）から増幅した。このDNAを、オリゴヌクレオチドＰl0及びＰ17を用いる、シグナル配列、スプライス部位及びイントロンを含むM13VHPCR１（R．OrlandiらProc．Natl．Acad．Sci．USA 86 3833〜3837，1989）からの1586bp DNAフラグメントでのPCRにより連結したそのPCR産物を、HindIII及びApaＩで切断し、HindIII−ApaＩ切断pGamma４（Lonza Biologics plc）にクローンした。正確な挿入を有するプラスミドを同定し、p6H1 VHがgamma４をデザインした（図20を参照のこと）。VH遺伝子及びフランキング領域をこの段階で配列決定した。
6B1 ΔBam pLN10の作製
6B1のVL遺伝子を、pCANTAB6（実施例１）中の6B1 scFvのクローンから増幅し、pUC119内にサブクローンした。次に、VL遺伝子を、内部BamHＩ部位を除去するための、DNA配列を変えるがタンパク質配列を変えない試験管内変異誘発により変異させた。Amersham International plc．からのキットを用いて、オリゴヌクレオチドLam Delta BamHＩ（表１）を用いて試験管内変異誘発を行った。その変異したVL遺伝子を、プライマーＶλ３back EuApa及びHuＪλ２−３For EuBamを用いて増幅し、ApaIL−BamHＩフラグメントとしてベクターvlcassette CAT1にサブクローンした。次にVL遺伝子をHindIII−BamHＩフラグメントとしてベクターpLN10（図８）にクローンして、ベクター6B1 ΔBam pLN10を作った。
p6B1λの作製
6B1 Ｖλ遺伝子を、オリゴヌクレオチドＰ22及びＰ26を用いてp6B1ΔBam pLN10からPCRにより増幅した。Ｃλ遺伝子を、オリゴヌクレオチドＰ25及びＰ19を用いて、pLN10-10A6（実施例２）から、PCRにより増幅した。２つのDNAを、オリゴヌクレオチドＰ22及びＰ19を用いて、PCRをオーバーラップすることによって連結し、その産物をBstBＩ及びEcoRＩで切断し、BstBＩ−EcoRＩ切断pMR15.1（Lonza Biologics plc）にクローンした。正確な挿入を有するプラスミドを同定し、p6B1λにデザインした（図21）。
最終的発現ベクターp6B1 gamma４gsの作製
p6H1 VHガンマ４及びp6B1λをBamHＩ及びNotＩで消化し、フラグメントを精製して一緒に連結した。要求される形状のプラスミドを形質転換体から同定し、p6B1 gamma４gs（図22）とデザインした。
p6B1 gamma４gsでのNSOの移入
6B1 IgG4を分泌する安定な移入物を、グルタミン無含有（Ｇ−）培地内での増殖を許容するグルタミンシンセターゼ（gs）遺伝子を含むNSOミエローマ細胞p6B1に導入することにより選択した。（C．R．BebbingtonらBiol Technology 10 169〜175，1992）。40μｇのp6B1がガンマ４gsを、PvuＩでの消化により直鎖化した。そのDNAを1.5×107のNSO細胞にエレクトロポレートした。次に細胞をＧ＋DMEM／10％ FCSに加え、50μｌのアリコートを、６×96ウェルプレートに分配し、24時間、回復させた。次にその培地を、150μｌのＧ−DMEM／10％ FCSを加えることにより、選択的にした。３週間後に、gs+移入物を、ヒトIgG4λ抗体を分泌する能力についてELISAによりスクリーニングした。最も高い生産体を広げて、更に分析した。この分析から、5D8を候補生産細胞系として選択した。5D8を限定的希釈により１回、クローンして細胞系5D8-2A6を供した。
TF１中和アッセイにおける細胞系5D8-2A6由来の6B1 IgG4の評価
6B1 IgG4を、実施例２に記載されるように、無血清培地中で増殖させたGS/NSO細胞系5D8-2A6から精製した。6B1 IgG4抗体を、実施例３に記載されるように、TF１中和アッセイでアッセイした。このアッセイにおいて1.8nMのIC50値を得た。次の5D8-2A6細胞系由来の6B1 IgG4の調製物のアッセイは、0.65〜２nMの範囲のIC50の値を示した。これらは、CHO細胞から生産された6B1 IgG4について得られた値に相当し、CHO細胞系由来の6H1 IgG4について得られた値（15nMのIC50）に比べ勝るとも劣らない。本実施例において6B1 IgG4及び6H1 IgG4についてのIC50について得られた値は、アッセイにおける並びに抗体の発現及び精製における改良のため、実施例３で得られたものより信頼でき、これを表４に示す。しかしながら、IC50値は、アッセイの正確な条件により種々であると予想され得る。
これにより、6B1 IgG4は、TGFβ２の潜在的な中和を供し、治療として用いるのに適している。
実施例11
ペプチドファージディスプレイライブラリーを用いる抗体6B1のためのTGFβ２上のエピトープの決定
抗体6B1を、エピトープマッピングにより更にキャラクタライズした。これは、6B1に特異的に結合するペプチド配列を選択するためのペプチドファージディスプレイライブラリーを用いることにより行った。次にこれらのペプチド配列をTGFβ２のアミノ酸配列と比較した。6B1に結合するペプチド配列とTGFβ２アミノ酸配列の適合部分との相関関係は、6B1が結合するTGFβ２のエピトープを示す。“エピトープ”とは、特異的抗体が結合する抗原の表面の部分である。
本実施例において、用いたペプチドライブラリーは、１×1013の独立したクローンのファージディスプレイライブラリーを供するために、Fischら（I．Fischら（1996）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93 7761-7766）により記載されるように作製した。抗体6B1に結合するペプチドを提示するファージを、パンニングによりこのライブラリーから選択した。これは、実施例１に記載されるように行った。
４mlのPBS中10μｇ／mlの精製された6B1 IgG4抗体を、４℃で一晩、インキュベートすることによりプラスチックチューブ（Nunc；maxisorp）上にコートした。洗浄及びMPBSでのブロッキングの後（実施例１を参照）、４mlの３％ PBS中５×1013のファージを含むペプチドライブラリーのアリコートをチューブに加え、1.5時間、室温でインキュベートした。そのチューブをPBST（0.1％）で10回、次にPBSで10回、洗った。結合したファージ粒子を、100mMトリエチルアミン４mlを加え、室温で10分、静止してそのチューブをインキュベートすることにより、チューブから溶出した。次にその溶出したファージを、２mlの１Ｍ−Tris HCl（pH7.4）及び10mlの２YTブイヨンを含むチューブに加えた。次に、そのファージを20mlの指数増殖中の大腸菌TG１細胞に加え、37℃で１時間、100rpmで振とうしながら増殖させた。その感染した細胞を、243mm×243mm皿（Nunc）中の15μｇ／mlのテトラサイクリンが供された２YT寒天培地上にプレートした。プレートを18時間、30℃でインキュベートした。コロニーを、−70℃での保存のため、15％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む10mlの２TYブイヨンにプレートからはぎとった。
第１回目の選択からの細胞250mlを用いて、２リッターコニカルフラスコ内の500mlの（15μｇ／mlのテトラサイクリンを含む）２YTブイヨンに接種し、280rpmで振とうしながら30℃で一晩、増殖させた。次にこの培養物の２mlアリコートをとり、遠心して全ての細胞を除いた。このファージ上清１mlを、上述の２回目の選択のために用いた。ファージ増殖及びパンニングのパターンを３回目及び４回目の選択にわたってくり返した。
４回目の選択からの個々のコロニーを用いて96ウェル組織培養プレートの個々のウェルに、（15μｇ／mlのテトラサイクリンを含む）100μｌの２YTブイヨンに接種し30℃で100rpmで静かに振とうしながら一晩増殖させた。グリセロールを15％の最終濃度（ｖ／ｖ）で加え、これらのマスタープレートを−70℃で連結保存した。
これらのクローンをELISAにおいて抗体6B1に特異的に結合するクローンについてスクリーニングした。そのマスタープレートからの細胞を用いてウェル当り（15μｇ／mlのテトラサイクリンを含む）100μｌの２YTブイヨンを含む96ウェル組織培養プレートに接種し、30℃で100rpmで静かに振とうしながら、一晩、増殖させた。次にそのプレートを2000rpmで遠心した。各々のウェルからの100μｌのファージ上清を回収し、各々を２×PBS中の４％スキムミルク粉末100μｌと混合した。次にこれらの各々100μｌをファージELISAによりアッセイした。PBS中の10μｇ／mlの精製した6B1 IgG4抗体を、４℃で一晩、インキュベートすることによりフレキシブルマイクロタイタープレート上にコートした。10μｇ／mlの無関係なIgG4抗体をコートした対照プレートも調製した。実施例１に記載されるようにELISAを行い、色原基質pNPP（Sigma）で視覚化した。
分析した全てのクローンの約20％が6B1コートプレートに結合した。無関係の抗体でコートしたELISAプレートに結合した分析したクローンはなかった。それゆえ、結合は抗体6B1の結合部位に特異的であることが明らかであった。
6B1に結合したクローンを、Fischらにより記載されるようにDNA配列決定することにより分析した。全部で31の異なるクローンを配列決定した。これらを、Macベクターソフトウェアを用いて、TGFβ２の配列との可能な適合について分析した。これらのクローンのうち、12はTGFβ２の配列とほとんど適合せず、10は全く類似性がなかった。しかしながら、アミノ酸位置56〜69の間のTGFβ２配列の領域への合理的な適合を示した４つの異なるクローン（そのいくつかは１回超、選択されている）があった。表８は、6B1への結合について合理的であると思われるこれらのクローンの各々のエキソンのアミノ酸配列を示す。
TGFβ２の配列に正確に適合するこれらのクローンも、そのペプチドクローン間の単一な明らかな共通配列もなかった。しかしながら、その配列の注意深い検査は、TGFβ２の残基60〜64との適合を示した（表８）。位置64におけるＬでの４つのクローンの並びは、位置60のＲにおける２つのクローン、位置61のＶにおける１つのクローン、位置62のＬにおける２つ及び位置Ｓにおける３つのクローンを示した。これは、TGFβ２のヒール領域を形成するαヘリックスの部分を形成する残基60〜64に相当する配列RVLSLを提供する。この構造を認識する抗体は、ヘリックス中のいずれのアミノ酸残基とも接触しないと予想されるであろうので、この配列に似たペプチドは、接触しないヘリックスの部分に相当する位置においてかなりの配列変異を有し得た。認識されるαヘリックスはTGFβ２のレセプター結合領域の部分を形成すると確信される（D．L．Griffithら（1996）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93 878〜883）。
実施例12
哺乳動物組織におけるTGFβ２への6B1 IgG4の結合の免疫組織化学による測定及び交差反応性の欠如
サイトカインを発現するホルマリン固定組織断片中のTGFβ２を検出するために、その組織断片を全体的にプロテアーゼプロナーゼＥで処理する。この消化ステップは、抗原を暴露し、おそらく潜伏性TGFβ２を活性化して活性TGFβ２を供する。6B1 IgG4は、TGFβ２の活性形態のみを検出する（実施例６）。
6B1 IgG4及び免疫組織化学的方法を用いて、TGFβ２の分布を、ホルマリン−パラフィンワックスにしずめたラットの通常の腎臓、及びプロテアーゼＥ消化の後の実験的に損傷させたラット脳組織において決定した。
アセトン固定後の通常のヒト組織の凍結クリオスタットセクション中の6B1 IgG4の反応性も、これらの組織中の他の抗原へのいずれかの結合があるか否かを決定するために、確認した。
方  法
ラット組織
パラフィンにしずめたラット組織からワックスをとり、一連のアルコールを通して再び水和した。次にその断片を正確に８分間、0.1％プロナーゼＥで処理し、次に水で洗った。Vector LaboratoriesからのVectastain ABC（アビジン−ビオチン−複合体）でのプロトコルの後、500ng／mlの6B1 IgG4を用いて、その断片において、TGFβ２を検出した。腎臓断片上で、結合した抗体は、アルカリホスファターゼと共に局在化し、ラット脳組織上にペルオキシダーゼを用いた。
ヒト組織
以下のヒト組織サンプル：副腎、大動脈、血液、大腸、小腸、大脳、腎臓、リンパ節、肝臓、肺、脾臓、膵臓、骨格筋、心筋、甲状腺、神経、皮膚、眼を用いた。
クリオスタットセクション及びスミアを、Sigma Immunoprobeキットを用いてFITCで標識した6B1 IgG4抗体の適用の前に、アセトンで15分、固定した。その標識した抗体を、４℃で18時間、インキュベートし、次に関節的アルカリホスファターゼ法（抗−種酵素コンジュゲート抗体を加えた抗−FITC抗体での検出）を用いて検出した。例えば内在性アルカリホスファターゼ活性が抑制され得る場合、ペルオキシダーゼ検出法を用いた。この場合にはプロナーゼ消化は用いなかったので、この手順は、抗体が交差反応する抗原のみを検出するであろう。
結  果
ラット組織
ラット腎臓は、頂端及び基底外側の両方に存在する細管において陽性染色を示し、このことは、その組織中におけるTGFβ２の存在を証明する。
損傷後５日の損傷したラットの脳は、ニューロン、星状細胞及び通常の脳中にはないマクロファージの陽性染色を示した。これは、TGFβ２が損傷後のラットの脳において発現されることを示す。
ヒト組織
上に列記した組織の固定したクリオスタットセクションを用いて、いずれの組織の特異的染色も観察されなかった。それゆえ、6B1 IgG4はこれらの組織における抗原と交差反応せず、治療に用いた場合に、免疫組織化学的方法により検出した組織セクションにおいて活性TGFβ２のみに結合するであろう。
実施例13
TGFβイソフォームへの6B1一本鎖Fv及び6B1 IgG4の結合の速度論分析
表面プラスモン共鳴（SPR）を用いて固定化されたリガンドと被検体との間のリアル・タイムの相互作用を検査し、このデータから速度論定数を導くことができる。表面上に固定化された抗原、及び被検体としての抗体と共に、BIACore 2000システム（Pharmacia Biosensor）を用いてこれを行った。
そのシステムは、デキストランマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出するために表面プラスモン共鳴の光学特性を利用する。抗原は、セットした量においてデキストランマトリックスに共有結合し、抗体を含む溶液として、これが結合した表面上を通過し、抗体は抗原に結合し、そして局所的なタンパク質濃度の検出可能な変化があり、それゆえSPRシグナルが増加する。表面を緩衝液で洗った時、抗体に抗原から解離し、次にSPRシグナルが減少するので、会合及び解離の速度、並びに所定の時間に抗原に結合した抗体の量を全て測定することができる。SPRシグナルの変化を共鳴単位（RU）として記録し、センサーグラムのｙ軸に沿って時間に関して示す。
BIACoreチップの表面上の固定化されたリガンドの密度は、作ったセンサーグラムから速度論データを導く時に重要である。それは、ごく少量の被検体抗体がチップ表面の飽和のために必要とされるように、極めて低いことが必要である。簡単のため、チップ表面の密度にRU’sを引用し、TGFβ２又はTGFβ３（25KDa）のようなリガンドについての理想的量は、そのリガンドの表面への固定化の間にセットしたベースラインに対して400〜600RU’sである。正確な密度を得るために加えられなければならないTGFβの実際の量は、研究により決定されなければならないが、正確な濃度が見い出された後に再現可能である。
チップ表面のデキストランマトリックスへのリガンドの固定化は、タンパク質中のリシン側鎖上のアミン基、及びデキストランマトリックス中のカルボキシル基により容易になる。デキストラン中のカルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（NHS）及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）で活性化され、次に酸性溶液中の抗原は、その表面に結合し、そして最後に、いずれの非反応カルボキシル基もエタノールアミンでブロックされる。
リガンドの固定化は、BIACore 2000により自動化され、全てのステップは、そのチップのデキストラン表面上のオートサンプラー内又はフローセル内で行われる。免疫化手順及びサンプルの分析を通して用いた緩衝液は、界面活性剤（Pharmacia Biosensor）を含むHepes緩衝塩類溶液（HBS）である。チップは、金の薄層上にデキストランコーティングを有する。100mMのNHS及び400mMのEDCを、オートサンプラーにより混合し、次に固定した容量を、フローセル表面上に注入する。この後、適切な緩衝液中の抗原を注入する。TGFβの場合、10mMのアセテート中のTGFβ２（AMS）又はTGFβ３（R & D systems）の25〜30μｇ／ml溶液を用いることにより、正確な密度の表面を供した。リガンドの注入の後、チップを、１Ｍエタノールアミンを用いてブロックする。結合したTGFβの全量を、この期間にわたって共鳴単位の全増加量から評価した。
速度論パラメータを決定するために、抗体サンプルの一連の希釈物を、約500μｇ／mlから１μｇ／ml未満まで、通常、２倍希釈でHBS中に作る。抗体を抗原表面に注入した後、その表面をHBSで洗い、次に100mMのHClのパルスで結合した抗体をはぎとることにより再生する。より高濃度の抗体において、チップ表面上の抗原は飽和し、そのオフ・レートは、解離相における緩衝液での洗浄に基づいて決定される。オン・レートの決定のために、より低濃度の抗体が用いられ、センサーグラムの直線的結合相を供し、ｋon測定できる。
希釈のセットを、同じ抗体の別個の調製に基づいてくり返した。
速度定数ｋon及びｋoffを得るためにセンサーグラムをあつかったため、BIAevaluationソフトウェアパッケージを用いる。計算に用いる各々の結合曲線のために、その条件が速度定数の決定に適することに注意を払った。
6B1 IgG4を、実施例２のように、実施例10のGS/NSO細胞系から精製した。6B1一本鎖Fvを大腸菌内で細胞内で発現させ、（W094/18227の方法を用いて）試験管内で再び折りたたみ、精製して均一な産物を供した。ｋon及びｋoffの値を、TGFβ２及びTGFβ３の両方への結合について6B1 IgG4について、及びTGFβ２への結合について一本鎖Fv 6B1について決定した。ｋoffをｋonを割ることにより、解離定数を計算した。これらの速度パラメータの値を表７に示す。
これにより、6B1 scFv及び6B1 IgG4は、各々TGFβ２について2.3nM及び0.89nMの解離定数を示し、（TGFβ３及びTGFβ２についての6B1 IgG4の解離定数の比により判断して）TGFβ３と９％の交差反応性であった。比較のため、早期の研究においては、標準誤差はより大きく、その値はより正確でない場合、TGFβ２についてのKd値は6A5 scFvについて0.7nM（表２）、そして6H1 IgG4について２nM（実施例２）であると決定された。同じ6H1 VHドメインを分けあうTGFβ２に対する全ての抗体についてのKd値は低く、10nM未満であった。
実施例14
6B1 IgG4への残基56〜69に相当するペプチドの結合
残基RVLSLの周囲のTGFβ２のアミノ酸に相当するペプチドを合成し、そのエピトープを、ペプチドディスプレイライブラリー（実施例11）からのファージの選択から同定した。
17量体ペプチドCGG-TQHSRVLSLYNTIN（TGFβ２56-69；Cambridge Research Biochemicalsにより合成）は、その中心にRVLSL（残基60〜64）を有するTGFβ２の残基56〜69を含む。CGGN末端伸長部は、担体タンパク質へのペプチドの結合を容易にするためのシステイン残基のスペーサーである。TGFβ１からの残基56〜69に相当するペプチド（TGFβ１56-69；CGG-TQYSKVLSLYNQHNも合成した。対照として、無関係のペプチドGPEASRPPKLHPGを用いた。
6B1 IgG4のためのTGFβ２上のエピトープがアミノ酸RVLSLを含むことを確認するために、２つの試みを用いた。
（ｉ）ELISAによる、BSAに結合したTGFβ２56-69及びTGFβ１56-69に結合する6B1 IgG4の能力の評価。
（ii）BIACoreセンサーチップ上にコートされた6B1 IgG4に結合するペプチドの能力の評価。
（ｉ）ELISAによる、BSAに結合したTGFβ２56-69及びTGFβ１56-69に結合する6B1 IgG4の能力の評価。
BSAにコンジュゲートした合成ペプチドTGFβ１56-69及びTGFβ２56-69への6B1 IgG4の結合を、ELISAアッセイにおいて評価した。これを、リゾチームに対する抗体からのVLを含む軽鎖と組み合わせたヘプタンNIPに対する抗体からのVHを含む重鎖を有する処理された抗体である対照抗体2G6 IgG4の結合と比較した。
方  法
ペプチドTGFβ１56-69及びTGFβ２56-69の各々２mgを、Imject Activated Immunogen Conjugationキット（Pierce）を用いてBSAにコンジュゲートした。
イムノソープマイクロタイタープレート（Nunc）に、100μｌ／ウェルで、PBS中のコンジュゲートしたペプチド（列Ａ−Ｄ TGFβ１56-69、列Ｅ−Ｆ TGFβ２56-69）10μｇ／mlを一晩、コートした。そのウェルを、PBS-tueenで３回、洗い、以下のもの：コラム１−試薬対照として各々のウェル中に100μｌのPBS；コラム２、列Ａ，Ｂ，Ｅ及びＦ−200μｌの6B1 IgG4  10μｇ／ml；コラム２、列Ｃ，Ｄ，Ｇ及びＨ−200μｌの2G6 IgG4  10μｇ／mlを加えた。
100μｌのPBSを全ての残りのウェルに入れた。抗体の２重希釈物を作るために、コラム２中の各々のウェルから100μｌをとり、コラム３の次のウェルに移した。そのサンプルを混合し、100μｌをとり、コラム４の次のウェルに加えた。この手順を、プレートごとにくり返し、最後の100μｌは捨てた。次にそのプレートを18時間、４℃でインキュベートした。
PBS-tueenでの３回の洗浄の後、PBS中に１：1000に希釈したヒトIgG γ鎖に特異的なヤギF（ab’）2フラグメントのアルカリホスファターゼコンジュゲート100μｌでウェルを満たした。PBS-tueenで更に３回洗った後、結合した抗体を20分、ｐ−NPP基質に露出した。
結  果
6B1 IgG4は、両方のコンジュゲートしたペプチド（図15）に結合するが、TGFβ１56-69で得られたELISAシグナルは、等濃度の6B1 IgG4でTGFβ２56-69で得られたものよりかなり低かった。TGFβ２56-69と比べてTGFβ１56-69で等しいシグナルを得るためには、約８〜10倍高い濃度の6B1 IgG4が要求される。いずれのペプチド−BSAコンジュゲートでの対照2G6 IgG4抗体で得られたシグナルはなかった。それゆえ、6B1 IgG4はTGFb56-69と強く結合するがBSAに結合したTGFβ１56-69により弱く結合する。
（ii）BIACoreセンサーチップ上にコートされた6B1 IgG4に結合するペプチドの能力の評価。
TGFβ２56-69への6B1 IgG4の結合を、BIACoreセンサーチップ上にコートされた6B1 IgG4へのペプチドの結合により確認した。Pharmacia BIACore 2000を用いる表面プラスモン共鳴による結合特性の決定は実施例13に記載した。6B1 IgG4でコートされたBIACoreセンサーチップを作る方法は、6B1 IgG4を酢酸緩衝液pH3.5中５μｇ／mlで結合することを除いて、実施例13に記載されるTGFβでの結合の方法と同じであった。5000RUの表面は、6B1 IgG4を25μｌを用いて作った。
そのペプチド20μｌを、サンプル間の結合したペプチドを除去するために、酸パルスを用いて、表面の再生と共に、１mg／mlで6B1表面に適用した。結合の量は、注入前の絶対RU値のベースライン応答をセッティングし、次にこれを、注入が完了した後20秒の値から引いてRUの相対的応答を供することにより評価した。これは、6B1表面への結合の量であると考えられる。
得られた結合を表９に示す。無関係のペプチドの結合のレベルは極めて低かった。TGFβ56-69は6B1 IgG4に低レベルで特異的に結合することが明らかになった。しかしながら、TGFβ２56-69ペプチドは特異的かつ極めて強く6B1 IgG4に結合した。
ELISA及びBIACoreにおけるTGFβ１ペプチドへの6B1 IgG4の低レベルの結合は、14のTGFβアミノ酸のうち10がTGFβ２ペプチドと同一であるなら、予想されないことではない。しかしながら、6B1 IgG4は、それがTGFβ１56-69ペプチドに結合するよりかなり強くTGFβ２56-69に結合する。しかしながら、これらのTGFβ１及びTGFβ２ペプチドの間の識別のレベルは、ネイティブのイソフォームでのラジオレセプター（表６）及び中和アッセイ（表６及び図16及び17）で見られるよりかなり低い。これらのアッセイにおいては、6B1 IgG4はTGFβ２を強く中和するが、TGFβ１生物活性には少しの効果しかない。このより大きな識別は、おそらく、ネイティブのイソフォームにおけるペプチドの残基の情況を反映する。
結  論
これらの結果は、残基60〜64の領域のアミノ酸へのTGFβ２上の6B1 IgG4のエピトープのアサインメントを支持する。この実施例に用いたペプチド、残基56〜69はαヘリックスＨ３のアミノ酸に相当する（M．P．Schlunegger & M．G．Grutter，Nature 358 430〜434，1992）。TGFβ２は、他のサブユニットからの（残基24〜37及びアミノ酸91〜95の領域中の残基を含む；図１及び２にも示される）フィンガー領域とのインターフェースを形成する１つのサブユニットの（ヒールとしても呼ばれる）αヘリックＨ３とヘッド・ツウ・テイルダイマーを形成する（S．Daopinら、Proteins：Structure，Function and Gehetics 17 176〜192，1993）。TGFβ２レセプターと相互作用する一次構造の特徴は、他の鎖の図１及び２の残基と一緒に、１つの鎖からのαヘリックスＨ３のＣ末端のアミノ酸からなることが提唱されている（D．L．Griffithら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93，878〜883，1996）。TGFβ２のαヘリックスＨ３内の6B1 IgG4のためのエピトープの同定は、6B1 IgG4がレセプター結合を防止し、TGFβ２の生物活性を中和することで一貫している。
6B1 IgG4についてのエピトープが三次元であるなら、抗体が結合し得る他の非隣接エピトープが存在し得る。
このTGFβ２の領域に対する抗体がTGFβ２に特異的でありその活性を中和し得る初期の証拠がある。Flandersら（Development 113，183〜191,1991）は、ポリクローナル抗血清が、成熟TGFβ２の残基50〜75に対してウサギ内で発生させることができ、そしてこれらの抗体はウェスタン・ブロットにおいてTGFβ２を認識するがTGFβ１を認識しないことを示した。初期の論文において、K．C．Flandersら（Biochemistry 27 739〜746，1988）は、TGFβ１のアミノ酸50〜75に対してウサギ内で生じたポリクローナル抗血清は、TGFβ１の生物活性を中和することができることを示した。我々が単離してキャラクタライズした抗体6B1 IgG4は、ヒトTGFβ２の生物活性を中和するこの領域中のアミノ酸に対するヒト抗体である。このようなTGFβ２に対する中和性抗体が、ファージディスプレイ抗体レパートリーから直接、（倫理的な理由のためペプチドでの免疫化を用いることができない場合の）ヒトにおいて単離することができることは驚くべきことである。
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表９．BIACoreチップ上に固定化された6B1 IgG4へのTGFβからのペプチドの結合
【図１（ａ）（ｉ）】
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【図１（ａ）（ｉｉ）】
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【図１（ａ）（ｉｉｉ）】
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【図１（ｂ）（ｉ）】
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【図１（ｂ）（ｉｉ）】
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【図１（ｃ）（ｉ）】
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【図２（ａ）（ｉ）】
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【図２（ａ）（ｉｉ）】
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【図２（ｂ）（ｉ）】
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【図２（ｂ）（ｉｉ）】
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【図２（ｂ）（ｉｉｉ）】
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【図２（ｂ）（ｉｖ）】
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【図２（ｂ）（ｖ）】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３（ａ）】
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【図１３（ｂ）】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９（ｉ）】
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【図１９（ｉｉ）】
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【図１９（ｉｉｉ）】
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【図１９（ｉｖ）】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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