(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
厚さ方向に、細胞を含有する液体を通過させたときに、前記細胞を捕捉し、支持する細胞支持層を有する細胞支持基材であって、
前記細胞支持層は、平均孔径が１００〜１０００μｍの複数の巨大孔と、平均孔径が５〜１００μｍの複数の連通孔とを備え、
前記複数の連通孔は、前記細胞支持層の前記液体を通過させる際の上流端および前記巨大孔の内面から離間するに従って、孔径が減少するように形成されていることを特徴とする細胞支持基材。
【請求項２】
前記連通孔の孔径は、前記細胞の径より大きい孔径から小さい孔径まで分布している請求項１に記載の細胞支持基材。
【請求項３】
厚さ方向に、細胞を含有する液体を通過させたときに、前記細胞を捕捉し、支持する細胞支持層を有する細胞支持基材であって、
前記細胞支持層は、平均孔径が１００〜１０００μｍの複数の巨大孔と、平均孔径が５〜１００μｍの複数の連通孔とを備え、
前記連通孔の孔径は、前記細胞の径より大きい孔径から小さい孔径まで分布していることを特徴とする細胞支持基材。
【請求項４】
前記巨大孔は、前記細胞支持層の上流端に開放しているものを含んでいる請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞支持基材。
【請求項５】
前記巨大孔は、指状構造をなすものである請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞支持基材。
【請求項６】
前記細胞支持層の下流側に、前記連通孔の平均孔径よりも小さい平均孔径の多孔質のスキン層を有する請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞支持基材。
【請求項７】
前記複数の連通孔は、隣接する連通孔同士が相互に連通して、三次元的な孔の連続集合体を構成するものである請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞支持基材。
【請求項８】
前記細胞支持層は、伸縮性を有するものである請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞支持基材。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞支持基材を有し、
該細胞支持基材で前記細胞を支持し、培養することを特徴とする培養装置。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞支持基材を有し、
該細胞支持基材に液体を通過させ、該細胞支持基材で支持した前記細胞の代謝・合成機能により前記液体を処理することを特徴とする液体処理装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞を支持する細胞支持基材、および、この細胞支持基材を用いた培養装置、さらには、液体処理装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の培養を行う方法として、マイクロキャリアー法、ホロファイバー法、多孔質担体法、マイクロカプセル法などが知られている。
【０００３】
これらの中でも特に、三次元多孔質構造を有する担体に、細胞の懸濁液を注入もしくは含浸することにより、細胞を固定化し、培養する方法が注目されている。
【０００４】
前記細胞支持担体を用いて灌流培養するためには、液体培地の流路を確保する必要がある。このため、前記担体に直径１．５mmの培地流路用細管を３mmピッチで開けたり（井嶋ら  人工臓器  ２３巻  ４６３頁（１９９４））、前記担体を２mm角のブロック片にする（大島ら  アーティフィシャル  オーガンズ  ２１巻
１１６９頁（１９９７））などの工夫が行われている。
【０００５】
しかし、重力による自然沈降での細胞播種をこれらの方法を用いて行った場合には、細胞の固定化率は１０〜３０％と極めて低い。従って、これらの方法では、細胞を効率よく固定化できず、実用的でない。
【０００６】
また、細胞充填後の担体に、遠心による加速度を与えて担体中で細胞を外方へ移動させ、細胞の固定化率を高める工夫も行われている。この方法では、固定化率は８０％にまで高められている。
【０００７】
しかしながら、この方法では、細胞を固定化するまでに長時間を要し、しかも、操作が煩雑となるので、実用的ではない。
【０００８】
従って、細胞を簡単に、短時間で効率よく、しかも高密度で固定化し、培養できる技術は、現在のところ存在していない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細胞を短時間で効率よく、しかも高密度に支持できる細胞支持基材、および、この細胞支持基材を用いた培養装置、さらには、液体処理装置を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（１０）の本発明により達成される。
【００１１】
（１）  厚さ方向に、細胞を含有する液体を通過させたときに、前記細胞を捕捉し、支持する細胞支持層を有する細胞支持基材であって、
前記細胞支持層は、平均孔径が１００〜１０００μｍの複数の巨大孔と、平均孔径が５〜１００μｍの複数の連通孔とを備え、
前記複数の連通孔は、前記細胞支持層の前記液体を通過させる際の上流端および前記巨大孔の内面から離間するに従って、孔径が減少するように形成されていることを特徴とする細胞支持基材。
【００１２】
（２）  前記連通孔の孔径は、前記細胞の径より大きい孔径から小さい孔径まで分布している上記（１）に記載の細胞支持基材。
【００１３】
（３）  厚さ方向に、細胞を含有する液体を通過させたときに、前記細胞を捕捉し、支持する細胞支持層を有する細胞支持基材であって、
前記細胞支持層は、平均孔径が１００〜１０００μｍの複数の巨大孔と、平均孔径が５〜１００μｍの複数の連通孔とを備え、
前記連通孔の孔径は、前記細胞の径より大きい孔径から小さい孔径まで分布していることを特徴とする細胞支持基材。
【００１４】
（４）  前記巨大孔は、前記細胞支持層の上流端に開放しているものを含んでいる上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞支持基材。
【００１５】
（５）  前記巨大孔は、指状構造をなすものである上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞支持基材。
【００１６】
（６）  前記細胞支持層の下流側に、前記連通孔の平均孔径よりも小さい平均孔径の多孔質のスキン層を有する上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の細胞支持基材。
【００１７】
（７）  前記複数の連通孔は、隣接する連通孔同士が相互に連通して、三次元的な孔の連続集合体を構成するものである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の細胞支持基材。
【００１８】
（８）  前記細胞支持層は、伸縮性を有するものである上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞支持基材。
【００１９】
（９）  上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞支持基材を有し、
該細胞支持基材で前記細胞を支持し、培養することを特徴とする培養装置。
【００２０】
（１０）  上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞支持基材を有し、
該細胞支持基材に液体を通過させ、該細胞支持基材で支持した前記細胞の代謝・合成機能により前記液体を処理することを特徴とする液体処理装置。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を添付図面に示す好適実施例に基づいて説明する。
【００２９】
図１は、本発明の細胞支持基材の実施例の断面を示す模式図、図２は、本発明の培養装置の実施例を示す回路図である。
【００３０】
図１に示すように、細胞支持基材４は、細胞を支持する細胞支持層７と、スキン層８とを有している。
【００３１】
細胞支持基材４では、通過する液体は、原則として、細胞支持層７からスキン層８へ流れる。以下、細胞支持基材４において、細胞支持層７が存在する側を「上流端」といい、これに対向する面、すなわちスキン層８が存在する側を「下流端」という。
【００３２】
細胞支持層７には、大きい孔径を有する複数の巨大孔５と小さい孔径を有する複数の連通孔６とが形成されている。
【００３３】
巨大孔５は、例えば円柱状、円錐状等の指状構造をしており、細胞支持基材４中に分布して存在している。そして、巨大孔５の長手方向は、細胞支持基材４を通過する液が流れる方向とほぼ等しい。また、巨大孔５は、細胞支持基材４を貫通していない。
【００３４】
巨大孔５は、細胞支持基材４を通過する液体の流路となる。さらには、細胞支持基材４に細胞懸濁液を流した場合には、該細胞が通過する通路になると考えられる。
【００３５】
上流端４１側に存在する巨大孔５の中には、上流端４１の端面に開放しているものもある。この開放した巨大孔５では、上流端４１の端面と巨大孔５の内面が連続している。この開放した巨大孔５により、細胞懸濁液を上流側から流した場合に、細胞支持基材４の深部にまで細胞が入りやすくなる。
【００３６】
開放している巨大孔５の開口部の平均孔径は、目的細胞の大きさや種類（性質）によって異なり、特に限定されないが、細胞の充填性の観点からは、１００〜２０００μm 程度が好ましく、５００〜１５００μm 程度がより好ましい。
【００３７】
巨大孔５の孔径は、上流端４１から下流端４２の方向に行くに従って、小さくなっていく傾向を有していることが好ましい。このような傾向を有していると、細胞支持基材４が支持する目的細胞を細胞支持層７に、より均等に分布させることが可能になる。
【００３８】
巨大孔５の平均孔径は、特に限定されないが、１００〜１０００μm 程度が好ましく、１００〜５００μm 程度がより好ましい。平均孔径がこの範囲の下限値を下回ると、細胞支持基材４内を細胞懸濁液が円滑に流れなくなる、もしくは、目的細胞を深部まで導入することが困難となる場合があるからである。一方、上限値を超えると、細胞支持層７の実質的な体積が減少して、目的細胞の担持力が減少する場合があるからである。
【００３９】
連通孔６は、隣接する連通孔６同士が相互に連通して、三次元的な孔の連続集合体を構成するものである。
【００４０】
連通孔６は、細胞支持基材４を通過する液体の流路となると同時に、後述するような特徴により、目的細胞（支持すべき細胞）を捕捉する。
【００４１】
この連通孔６は、基本的には、上流端４１の端面および巨大孔５の内面（以下、これらを総称して「表面」という）から内部（奥部）に向かって、すなわち表面から離間するに従って、孔径が減少するように形成されている。
【００４２】
また、連通孔６の孔径は、細胞充填時に細胞の通路として適切な程度の目的細胞の径より大きい孔径から、細胞を捕捉するのに適切な程度の目的細胞の径より小さい孔径まで分布している。
【００４３】
従って、連通孔６の表面に近い部分では、細胞は通過し易く、すなわち捕捉されにくく、奥部に行くに従って捕捉され易くなる。
【００４４】
但し、連通孔６の孔径が減少する度合いは、細胞支持層７の場所ごとにある程度相違していることが好ましい。これにより、目的細胞が捕捉される場所は、前記表面から一定の距離のところに集中せず、細胞支持基材４中の広い範囲に分布、特に均一に分布するようになる。このために、連通孔６が目的細胞を捕捉した後も、連通孔６を通過する液体の流路が確保され、細胞支持後も細胞支持基材４中を液体が万遍なく、かつ速やかに通過できるようになると考えられる。さらには、より多くの目的細胞を細胞支持基材４中で均一に支持すること、すなわち細胞支持基材４が目的細胞を高密度で担持することが可能となると考えられる。
【００４５】
連通孔６の平均孔径は、特に限定されないが、５〜１００μm であることが好ましく、１０〜７０μm であることがより好ましい。平均孔径がこの範囲の上限値を超えると、目的細胞の捕捉率が下がる場合があり、下限値を下回ると、目的細胞が連通孔６の奥まで入って行かない、あるいは、細胞を支持した後、通過する液体の流路を十分に確保できない場合があるからである。
【００４６】
連通孔６の最大孔径は、特に限定されないが、前記と同様の理由から、３０〜２００μm であることが好ましく、５０〜１５０μm であることがより好ましい。ここで、最大孔径とは、存在する全ての連通孔６のうちの最大孔径という意味ではなく、孔径分布の中から偏差５％以上のものを除外した上での最大孔径をいう。
【００４７】
連通孔６の最小孔径は、特に限定されないが、前記と同様の理由から、０．１〜１０μm であることが好ましく、１〜１０μm であることがより好ましい。ここで、最小孔径とは、存在する全ての連通孔６のうちの最小孔径という意味ではなく、孔径分布の中から偏差５％以下のものを除外した上での最小孔径をいう。
【００４８】
細胞支持層７に用いられる材質は、多孔質で、細胞を支持可能なものであればよい。細胞の捕捉され易さの観点からは、伸縮性を有するものが好ましい。また、液体を通過させる観点からは、親水性・保水性を有するものが好ましい。さらに、安定性の観点からは、支持する細胞によって代謝されにくいものが好ましい。このような材質としては、天然産生物、合成樹脂発泡体などが挙げられる。合成樹脂発泡体としては、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。
【００４９】
以上のような細胞支持層７で非常に高い細胞捕捉率が得られるが、さらにスキン層８を設けることによって、細胞支持層７で捕捉されなかった微量の細胞があったとしても、この細胞の漏出を防止することができる。
【００５０】
スキン層８は、多孔質体で構成されている。このスキン層８の平均孔径は、連通孔６の平均孔径よりも小さいことが好ましい。スキン層８の平均孔径を連通孔６の平均孔径よりも小さくすると、細胞の漏出をさらに効果的に防止できるようになり、より確実に細胞支持基材４に目的細胞を支持させることが可能になる。
【００５１】
スキン層８の平均孔径は、特に限定されないが、０．２〜３５μm 程度であることが好ましく、１〜１０μm 程度であることがより好ましく、１〜５μm 程度であることがさらに好ましい。平均孔径がこの範囲の上限値を超えると、細胞の漏出を効果的に防止できない場合があり、下限値を下回ると、通過する液体の流路を十分に確保できない場合があるからである。
【００５２】
スキン層８の厚さは、特に限定されないが、１０μm 〜２mm程度が好ましく、１００μm 〜１mm程度がより好ましい。厚さがこの範囲の上限値を超えると、スキン層８の孔径によっては、細胞支持基材４を液体が速やかに通過しなくなる場合があり、下限値を下回ると、前記スキン層８の機能が十分に発揮されない場合があるからである。
【００５３】
スキン層８には、細胞支持層７に使用可能な材質と同様のものが好適に用いられる。
【００５４】
スキン層８は、細胞支持層７と一体的に形成されていてもよく、また、別部材が細胞支持層７に接合されていてもよい。
【００５５】
細胞支持層７とスキン層８が一体化された細胞支持基材４は、製造が容易であり、細胞支持層７とスキン層８の接合強度を高めることができる。
【００５６】
スキン層８が接合された細胞支持基材４では、孔径のコントロールが容易である。
【００５７】
なお、細胞支持基材４は、細胞支持層７とスキン層８との間や、スキン層８の下流側に少なくとも１つの他の層を有してもよい。
【００５８】
また、スキン層８は、細胞支持層７から分離したものとなっていてもよい。すなわち、スキン層８は、細胞支持層７の下流側で、細胞支持層７とある程度距離が離れたところに設けられていてもよい。
【００５９】
さらに、細胞支持基材４は、スキン層８を有していなくともよい。
特に、支持できる細胞数を上げるために、複数の細胞支持基材４を後述する細胞支持モジュール３などに重ねて収納するような場合などには、最下流に位置する細胞支持基材４以外はスキン層を設けないことにより、上流側から下流側までの各細胞支持基材４は、より均等に目的細胞を担持できるようになる。従って、細胞支持モジュール３の担持できる細胞数を向上させることができる。
【００６０】
細胞支持基材４は、円柱状である。細胞支持基材４を円柱状にすると、目的細胞を細胞支持基材４内に、より均一に担持させることが可能になる。なお、細胞支持基材４は、円柱状以外の任意の形状とすることも可能である。細胞支持モジュール３を充填する場所によっては、かかる場所に適した形状とすることにより、より好適に使用することが可能となる。
【００６１】
細胞支持基材４の厚さは、特に限定されないが、０．１〜３００mm程度が好ましく、０．５〜１０mm程度がより好ましい。厚さが、この範囲の上限値を超えると、目的細胞の充填性が悪くなる場合があり、下限値を下回ると、目的細胞の捕捉率が低くなる場合があるからである。
【００６２】
細胞支持基材４には、動物細胞、植物細胞、細菌などの細胞（遺伝子操作、細胞融合等がなされた形質転換細胞も含む）を支持させることが可能である。特に、この細胞支持基材４を用いると、従来高密度培養が困難であった動物細胞（その中でも特に、肝細胞、肺細胞、腎細胞、卵巣細胞、膵ランゲルハンス島細胞、神経細胞、下垂体細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞等の臓器を構成する細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞など、培養する際に被付着体が必要な付着性動物細胞）を容易に、しかも高い捕捉率で支持・培養することが可能となる。また、浮遊性細胞である造血幹細胞、ストローマ細胞等についても、従来技術より遥かに容易かつ高い捕捉率で支持・培養が可能となる。
【００６３】
細胞支持基材４に目的細胞の懸濁液を通過させると、かかる液が細胞支持層７を通過する際に、目的細胞が連通孔６に捕捉され、支持される。すなわち、細胞支持基材４には、目的細胞の懸濁液を上流側から通過させるだけで、目的細胞を捕捉、担持させることができる。
【００６４】
このように、細胞支持基材４を用いると、容易に細胞を担持させることができる。しかも、細胞を支持する際に特別な操作を必要としないので、短時間で細胞を支持することができる。また、短時間で大量の細胞を担持できるので充填作業の効率もよい。
【００６５】
細胞支持基材４に液体を通過させる方法としては、例えば、細胞懸濁液を上流側から重力で自然流下させる方法、シリンジポンプなどの定流速ポンプ、アスピレーターなどを用いる方法が挙げられる。
【００６６】
そして、このような細胞支持基材４は、例えば、培養装置、液体処理装置等に用いることができ、この場合には、細胞の培養や、細胞を用いた処理が容易に可能となる。
【００６７】
以下、この細胞支持基材４を用いた培養装置１について説明する。
図２に示すように、培養装置１は、灌流系とガスを加えるガスラインとを有している。灌流系は、リザーバー２１と、ポンプ２２と、ガス付加装置２３と、細胞支持モジュール３とを有している。ガスラインの一端はガスボンベ２４に接続され、他端はガス付加装置２３に接続されている。
リザーバー２１は、培養装置１内を灌流する培地等の灌流液を貯留する。
【００６８】
ポンプ２２は、培養装置１の灌流系内で灌流液を循環させるものであり、例えばローラポンプが使用される。
【００６９】
ガス付加装置２３は、内部に例えば中空糸膜を有し、この膜を介してガスボンベ２４から供給される酸素（または酸素を含む混合ガス）を灌流液に付与する。これにより、酸素付加された灌流液が、後述する細胞支持モジュール３中の細胞支持基材４に支持された細胞に接触し、該細胞に酸素を供給する。なお、ガスボンベ２４から供給される気体は酸素に限られず、例えば、二酸化炭素、窒素、エチレン等またはこれらの混合気体など他の気体をガス付加装置２３に供給してもよい。
【００７０】
細胞支持モジュール３には、前述した細胞支持基材４が少なくとも１つ収納（充填）されている。この収納した細胞支持基材４中に細胞が支持されている。そして、ここで細胞は、生存、増殖、代謝・合成等の処理など種々の活動を行う。
【００７１】
なお、必要に応じ、細胞支持モジュール３の内部の細胞支持基材４の下流側に、メッシュ、紙、織布、不織布、多孔質膜、多孔板、各種フィルター（例えばメンブランフィルターなど）などの濾材を設置してもよい。これにより、細胞支持モジュール３内での液流をより円滑にすることが可能となるとともに、細胞支持モジュール３の下流へ細胞が漏出するのをさらに確実に防止できる。
【００７２】
そして、これらが灌流系を構成することにより、培養装置１内の密閉性が高まり、培養装置１内に雑菌等が侵入するのを防止することができる。
【００７３】
以下、培養装置１の作用（使用方法）について説明する。
まず、細胞を支持した細胞支持基材４を細胞支持モジュール３に充填する。なお、充填してから、細胞支持基材４に細胞を支持させてもよい。
【００７４】
次に、ポンプ２２を作動させると、リザーバー２１内に貯留された灌流液が、培養装置１内を灌流する。
【００７５】
リザーバー２１を出た灌流液は、まず、ガス付加装置２３において酸素が付与される。また、このとき同時に、二酸化炭素などの灌流液中に溶解していた不要な気体が排出される。
【００７６】
この酸素が付与された灌流液が細胞支持モジュール３に到達し、細胞支持基材４を通過することにより、細胞支持基材４内に担持された細胞が生命活動を行うために必要な酸素、さらには栄養素が細胞に供給される。
【００７７】
その後、細胞支持モジュール３を通過した灌流液は、再びリザーバー２１内に貯留される。
【００７８】
このように、灌流液が細胞支持基材４を通過することにより、細胞支持基材４内に担持された細胞に酸素、栄養素等が供給され、目的細胞を培養することが可能となる。
【００７９】
培養装置１は、さらに、培養中もしくは培養後に、細胞支持基材４内に担持された細胞が産生したタンパク質、糖、ホルモン、その他化学物質等の産生物を、灌流液から回収するための機構を備えていてもよい。この機構としては、例えば、灌流系の途中あるいは灌流系からの分岐路、バイパス路等に、前記産生物を吸着、濾別等により除去し得るフィルター（産生物除去手段）を設けたものや、リザーバー２１内の灌流液を定期的に洗浄、濾過等の処理あるいは交換する方法などが挙げられる。
【００８０】
このような機構を備えることにより、培養の継続を維持もしくは培養を促進することができる。
【００８１】
また、図２に示す装置は、液体処理装置１’として使用することもできる。すなわち、細胞支持基材４で支持した細胞の代謝・合成機能を利用して、細胞支持基材４を通過する液体を処理することができる。
【００８２】
例えば、細胞支持基材４に肝細胞などの臓器を構成する細胞を支持させることにより、液体処理装置１’を人工肝臓などの人工臓器として機能させることができる。
この場合、灌流液には血漿、血液等の被処理液を用いることが可能である。
【００８３】
また、細胞支持基材４に固定化細胞を支持させることにより、液体処理装置１’で特定の物質を合成・分解・処理することもできる。すなわち、液体処理装置１’をバイオリアクターとして機能させることも可能である。
また、このとき、支持した細胞により処理された液体を得ることもできる。
【００８４】
以上、本発明を図示の実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８５】
例えば、目的細胞を固定した細胞支持基材４を、静置培養に供してもよい。
さらには、目的細胞を固定した細胞支持基材４を前述以外の他の用途、例えばウイルス生産などに用いてもよい。
【００８６】
【実施例】
以下、本発明を具体的実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
【００８７】
１．細胞支持基材の製造
［１．１］細胞支持基材の材料の調整。
【００８８】
まず、溶剤であるＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に、ポリウレタン（ＰＵ）を濃度が１１重量％となるように加え、さらにそこに、核剤としてポリウレタン１００重量部に対し３０重量部となるように塩化カルシウム（ＣａＣｌ2 ）を加えた。
【００８９】
次に、この溶液を攪拌した。攪拌速度は１０００rpm 、攪拌時間は６時間、水浴温度は４０℃以下であった。
【００９０】
攪拌後、８時間以上静置してから、この溶液を８００ｇ計り取り、これをプラネタリーミキサーのタンクに入れた。さらにそこに、孔形成剤として前記溶液中に含まれるポリウレタンと同重量のメチルセルロース（ＭＣ）を加え、混練した。混練速度は６０rpm 、湯浴温度は６０℃であった。
【００９１】
［１．２］細胞支持基材の製型。
混練直後の細胞支持基材の材料を、減圧条件下におき、脱泡（脱気）した。
【００９２】
次に、この脱泡した細胞支持基材の材料を、不織布で作製した箱型の容器に、厚さが１５mmとなるように入れ、上面を不織布でカバーした。
【００９３】
次に、これを５０℃の湯浴に入れ、２時間程度浸漬し、凝固させた。さらにその後、湯浴温度を室温（水浴）とし、そこで１６時間以上浸漬して、凝固をさらに促進させた。
【００９４】
このとき、核剤と孔形成剤が溶け出すことにより巨大孔と連通孔が形成されたと考えられる。
【００９５】
［１．３］細胞支持基材の洗浄およびスライス。
前記凝固させた細胞支持基材の材料を不織布からはがし、流水下でロール絞りにて洗浄した。
【００９６】
次に、これを６０℃で乾燥した。
乾燥後、この材料をスライス機で横に均等に３分割することにより、巨大孔および連通孔を有し、全体としてスポンジ状の多孔質体である細胞支持層と、スキン層とを有する細胞支持基材を得た。
【００９７】
２．巨大孔、連通孔、スキン層の解析
［２．１］肉眼による細胞支持基材の観察。
【００９８】
前記分割により細胞支持基材が２種類（不織布に接していた面を有するものと、不織布に接していた面を有さないもの）得られたが、その中から不織布に接していた面を有する細胞支持基材を取り出し、肉眼で観察した。
【００９９】
その結果、不織布に接していた面は表面が非常に密かつ平滑であり、特に肉眼で認識できる孔は発見できなかった。一方、この面と対向する面、すなわち、スライス前の材料においてカッター（刃）が入ることにより形成された面（前記材料において内部に存在していたところ）は、表面が粗く凹凸があり、肉眼で観察できるほどの孔（巨大孔）が多数、表面全体にわたって形成されていた。
【０１００】
以上の結果から、不織布に接していた面にはスキン層が形成され、これに対向する面には多数の巨大孔が開放していたことが分かった。
これを確認すべく、以下の測定を行った。
【０１０１】
なお、以下、不織布に接していた面を「下流端」といい、これに対向する面を「上流端」という。
【０１０２】
［２．２］デジタルスコープによる巨大孔の解析。
前記細胞支持基材をスライス機で横方向に８分割した。
【０１０３】
次に、端面をデジタルスコープ（キーエンス社製「ＶＨ−６３００」）で観察した。倍率は１００〜５００倍であった。なお、すべての断片においてランダムに５ヶ所を観察した。
【０１０４】
その結果、明らかに大きな孔（巨大孔）と明らかに小さな孔（連通孔）の２種類の孔が細胞支持基材に形成されていることが確認された。また、各断片の画像を比較すると、巨大孔の大きさは、上流側から下流側へ行くに従って徐々に小さくなっていることが確認された。また、巨大孔の数は、上流側から下流側へいくに従って増加していることが確認された。
【０１０５】
さらに、上記デジタルスコープによる観察において画像解析を行った。そして、各断片の上流側の端面１cm2 あたりに形成された巨大孔の数と巨大孔の平均半径をそれぞれ測定した。その結果を図３に示す。なお、図３中、断片の番号は、上流側から下流側へ数が大きくなるように付した。また、１〜７番目の断片は、細胞支持層を構成していた部分であり、８番目の断片は、スキン層を構成していた部分であった。
【０１０６】
図３の結果に示されるように、巨大孔の数は、細胞支持層においては上流側から下流側に行くに従って増加しているが、スキン層では激減していることが分かった。これにより、巨大孔は、下流端に貫通していないことが推察された。
【０１０７】
また、巨大孔の平均半径は、上流側から下流側へ行くに従って漸減していることが分かった。
【０１０８】
さらに、この細胞支持基材の上流端に開放している巨大孔の開口部の平均孔径は、９５２μm であった。
さらに、巨大孔の平均孔径は、５３０μm でった。
【０１０９】
これらの結果に基づいて、各断面１cm2 あたりにおける巨大孔の占有面積を求めた。
【０１１０】
その結果を図４に示す。
図４の結果に示されるように、巨大孔の占有面積は、上流側から下流側の２つ手前の断片までは均等に分布していたが、スキン層の１つ手前の断片では激減し、スキン層下流側の端面ではほとんどゼロであった。従って、巨大孔は下流端に貫通していないことが確認された。
【０１１１】
［２．３］電子顕微鏡による連通孔の解析。
前記細胞支持基材の上流端の表面から、横方向に３分割し、その中間層を上流側の表面から、０．５mm角の大きさの立方体状の断片を切り出した。
【０１１２】
次に、マグネトロン・スパッタリング（日本電子社製「ＪＵＣ−５０００」）を用い、切り出した断片の上流側の端面に金蒸着を行った。
【０１１３】
そして、この金蒸着を行った端面を走査型電子顕微鏡（「日本電子社製「ＪＳＭ−８４０」）で観察した。倍率は２０〜１５０倍であった。
【０１１４】
なお、得られた電子顕微鏡写真を図５に示す。図５は、細胞支持基材が横方向にスライスされた切り口の写真である。
【０１１５】
図５においては、写真中央の右寄りに巨大孔が形成されている。
この写真に示されるように、巨大孔の表面から、写真中の外方向に至るまで、多数の連通孔が形成されていることが確認された。しかも、巨大孔の表面から内部に行くに従って、孔が小さくなっていく、すなわち連通孔の孔径が減少していることも確認された。
【０１１６】
次に、この写真を前述の画像解析装置に取り込み、画像解析を行った。そして、連通孔の孔占有面積分布を測定した。
この測定は、以下のようにして行った。
【０１１７】
［イ］図７（図７と図５の写真は同じものである）に示す写真において、四角い枠Ａの中をそれぞれサンプリングした。このサンプリングは、巨大孔周辺（巨大孔表面から０〜０．５mm程度の範囲）で４箇所行った。
【０１１８】
［ロ］次に、サンプリングした４箇所について、それぞれ、その中に存在する連通孔の孔径をすべて測定した。
【０１１９】
［ハ］次に、孔径の範囲（大きさ）ごとに連通孔の数を分類・集計した。さらにそこから、連通孔の孔径の範囲ごとに、孔占有面積を求めた。
【０１２０】
［ニ］さらに、４箇所の孔占有面積の値を平均して、最終的な孔占有面積の値を各孔径の範囲ごとに求めた。
【０１２１】
［ホ］また、図７中の巨大孔から離れた部分（巨大孔表面から０．５〜２mm程度の範囲）である四角い枠Ｂの中についても４箇所サンプリングし、前記と同様の測定を行い、最終的な孔占有面積の値を求めた。
【０１２２】
このようにして測定した巨大孔周辺および巨大孔から離れた部分の孔占有面積を図８に示す。
【０１２３】
図８の結果に示されるように、巨大孔周辺の連通孔では、巨大孔から離れた連通孔に比べて、孔径が大きいものが多く分布していた。すなわち、連通孔周辺では、大きい孔径の連通孔の割合が多く、巨大孔から離れたところでは、小さい孔径の連通孔の割合が増加していた。
【０１２４】
これにより、巨大孔の表面から内部に向かって連通孔の孔径が減少していることが確認された。
【０１２５】
さらには、これらの結果より、巨大孔周辺の連通孔では、大きい孔径のものが多く分布しているので、細胞が通過し易く（細胞が奥へ移行し易い）、巨大孔から離れた連通孔では、中小の孔径のものが多く分布しているので、細胞の通路（細胞を連通孔の奥まで到達させる通路）となる連通孔と細胞が捕捉される（詰まる）連通孔とがバランスよく分布していると考えられる。
【０１２６】
また、これらを集計した結果、連通孔の最大孔径は５１〜１４２μm になっていることが分かった。さらに、連通孔の最小孔径は０．５〜１０μm となっていることが分かった。そしてさらに、連通孔の平均孔径は２０μm 前後であることが分かった。
【０１２７】
また、サンプリング部分を変えて同様の測定を行ったところ、値は微妙に異なったが、同様の傾向を示す結果が得られた。これにより、連通孔の孔径が減少する度合いは、細胞支持層の場所ごとにある程度相違していることが確認された。
【０１２８】
［２．４］電子顕微鏡によるスキン層の観察。
前記細胞支持基材の下流端、すなわちスキン層の表面を、前記と同様に電子顕微鏡で観察した。
【０１２９】
その結果、前記［２．３］と同じ倍率で観察したところ、スキン層に存在する孔の孔径は、連通孔の平均的な孔径よりも明らかに小さいことが確認された。
【０１３０】
さらに、この写真を前述の画像解析装置に取り込み、画像解析を行った。そして、スキン層の平均孔径を測定した。
その結果、平均孔径は１０．５５μm であった。
【０１３１】
３．細胞支持基材による細胞の支持
［３．１］支持する細胞の調整。
【０１３２】
体重１８０〜２５０ｇのウイスター系ラットから、コラゲナーゼ灌流法（セグレン  ピー  オー著、メソッズ  イン  セル  バイオロジー（Seglen P O, Methods in Cell biology ）、１３巻、２９頁（１９７６）参照）により、実質肝細胞（平均径３０μm ）を得た。得た肝細胞の生存率は８５％以上であった。
【０１３３】
［３．２］培地の調整。
純水１リットルに基本培地としてウィリアムズＥ培地（ギブコ・ビー・アール・エル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製）を１０ｇを溶解させ、さらにそこに以下の物質を、以下の濃度で添加することにより液体培地を調整した。
【０１３４】
インスリン                              ：１０μg/ml
エプターマルグロースファクター（ＥＧＦ）：５０ng/ml
プロラクチン                            ：２０mU/ml
リノレン酸                              ：５μg/ml
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ                      ：０．１μM
Ｈ2ＳｅＯ3                              ：３nM
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                      ：５０pM
ペニシリンＧ                            ：１００unit/ml
ストレプトマイシン                      ：１００μg/ml
【０１３５】
［３．３］細胞支持基材の準備。
前記［１．細胞支持基材の製造］と同様にして製造した細胞支持基材の材料を、直径３０mm、厚さ５．７mmの円盤上（容積４cm3 ）に切り抜いて、細胞支持基材を得た。この細胞支持基材の一方の面は、不織布に接していた部分であり、厚さ０．９mm のスキン層を有しているものであった。
【０１３６】
次に、この細胞支持基材を、外周面からの液漏れがないように平膜固定用の容器に装填し、前記［３．２］で調整した培地で湿潤させた。
【０１３７】
［３．４］細胞支持基材の細胞捕捉率の測定。
前記細胞支持基材を装填した平膜固定用の容器に５０mlリザーバーを取り付け、前記［３．１］で調整した肝細胞の懸濁液（細胞密度１．０×１０6 cells/ml）を４０ml、自然流下で流し、細胞支持基材に肝細胞を充填、支持させた（充填細胞数４．０×１０7 cells（細胞支持基材１cm3 あたり１．０×１０7 cells））。充填に要した時間は、３分であった。
【０１３８】
次に、前記［３．２］で調整した培地を６ml/minの流速で１０分間流し、漏出した細胞数を測定した。この測定は光学顕微鏡による顕微観察により行った。そして、この測定値から細胞漏出率と細胞捕捉率を求めた。
【０１３９】
また、充填細胞数を１．２×１０8cells（細胞支持基材１cm3 あたり３．０×１０7cells）にして同様の測定を行った。
【０１４０】
さらに、充填細胞数を２．０×１０8cells（細胞支持基材１cm3 あたり５．０×１０7cells）にして同様の測定を行った。
これらの結果を下記表１、表２に示す。
【０１４１】
【表１】
0004222658.tif 000002
【０１４２】
【表２】
0004222658.tif 000003
【０１４３】
表１、表２の結果に示されるように、本発明の細胞支持基材は、非常に多量の細胞を支持することができ（高い密度で細胞を支持できる）、さらに、高い細胞捕捉率を有していることが確認された。
【０１４４】
［３．５］細胞支持状態の確認。
前記［３．４］により肝細胞を支持した細胞支持基材を前記スライス機で縦方向に均等に３分割したものおよび横方向に均等に３分割したものを作製し、それらの各断面を前記と同様に電子顕微鏡で観察した。各所で撮影した写真のうちの一枚を図６に示す。なお、倍率は３５０倍であった。
【０１４５】
これらの結果から、肝細胞は一箇所に集中することなく、全体にわたってまんべんなく存在していた。これにより、目的細胞が捕捉される場所は、細胞支持基材中の一定の場所に集中しているわけではなく、広い範囲に分布していることが確認された。
【０１４６】
４．培養装置
［４．１］肝細胞の培養。
【０１４７】
前記［３．細胞支持基材による細胞の支持］と同様にして、最終細胞充填密度が１×１０7cells/cm3となるように肝細胞を細胞支持基材に充填、支持させた。
これを図２に示す構成の培養装置にて培養した。
【０１４８】
灌流液には前記［３．２］で調整した培地と同様のものを５０ml用い、流速６ml/minで灌流させた。また、灌流液に酸素を付与するため、酸素（Ｏ2 ）９５％、二酸化炭素（ＣＯ2 ）５％の混合ガスを流速２００ml/minでガス付加装置に流した。使用したガス付加装置の中空糸膜の膜面積は、０．０３m2であった。
【０１４９】
培地は、１２時間ごとに半量ずつ交換した。
その結果、５日後でも肝細胞は生存し、活動していることが確認された。これにより、本発明の細胞支持基材を用いた培養装置を用いると、従来は培養が困難であった付着性動物細胞ですら十分に培養できることが確認された。
【０１５０】
［４．２］培養装置における肝細胞の固定化率。
前記［３．細胞支持基材による細胞の支持］と同様にして、最終細胞充填密度が１×１０7cells/cm3となるように肝細胞を細胞支持基材に充填、支持させた。これを前記［４．１］と同様の培養装置に充填した。
【０１５１】
そして、流速５ml/minで２４時間、前記［４．１］と同様にして灌流液を灌流させた。なお、灌流液には前記［３．２］で調整した培地と同様のものを５０ml用いた。
【０１５２】
そして、灌流後の培地について、前記［３．４］と同様の測定を行うことにより、この培養装置を稼働させた後の細胞の固定化率を求めた。
【０１５３】
その結果、固定化率は９９．９％以上であり、非常に優れた固定化率を有していることが確認された。
【０１５４】
５．人工肝臓
さらに、前記［４．１］と同様の装置を人工肝臓としても機能させた。
【０１５５】
灌流液には、前記［３．２］で調整した培地を用いた。また、灌流液は、１２時間ごとに半量ずつ交換した。
【０１５６】
この装置の人工肝臓としての能力を調べるため、ＥＬＩＳＡ法（酵素抗体法）にて交換した前記培地中のアルブミンの濃度を測定し、肝細胞が合成したアルブミンの量を調べた。
【０１５７】
この測定結果に基づき求められた肝細胞を支持した細胞支持基材１cm3 あたり（肝細胞１×１０7cellsあたり）のアルブミン合成量の経時的変化を図９に示す。
【０１５８】
図９に示すように、処理開始後５日間、細胞支持基材により支持された肝細胞がアルブミンを合成したことが確認された。
これにより、この装置は人工肝臓として機能することが確認された。
【０１５９】
なお、人工肝臓として用いた当該装置について、前記［４．２］の結果を考慮すると、前記と同様の非常に高い固定化率を有することが推測される。
【０１６０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、簡単な操作で、しかも短時間に細胞を支持することができる。
【０１６１】
さらには、高い捕捉率、固定化率で目的細胞を支持することができる。
また、細胞支持基材内部に均一に、しかも高密度で細胞を支持することが可能になる。
【０１６２】
また、通常の細胞はもとより、従来は培養が困難であった付着性動物細胞も培養することができる等、その適用範囲や応用分野が広い。
【０１６３】
以上より、培養装置や人工臓器のような液体処理装置への適用が可能であり、特に、高性能、高効率で、安全性の高い培養装置や液体処理装置を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞支持基材の実施例の断面を示す模式図である。
【図２】本発明の培養装置の実施例を示す回路図である。
【図３】本発明の実施例における細胞支持基材の各断片の上流側端面上に存在する巨大孔の数と巨大孔の平均半径とを示すグラフである。
【図４】図３と同一の各断片の上流側端面上に存在する巨大孔の占有面積を示すグラフである。
【図５】顕微鏡写真である。
【図６】顕微鏡写真である。
【図７】図５の写真におけるサンプリング領域を示す図である。
【図８】本発明の実施例における細胞支持基材において巨大孔周辺および巨大孔から離れた部分の孔径ごとの孔占有面積を表したグラフである。
【図９】本発明の実施例における人工肝臓においてアルブミン合成量の経時的変化を表したグラフである。
【符号の説明】
１          培養装置
１’        液体処理装置
２１        リザーバー
２２        ポンプ
２３        ガス付加装置
２４        ガスボンベ
３          細胞支持モジュール
４          細胞支持基材
４１        上流端
４２        下流端
５          巨大孔
６          連通孔
７          細胞支持層
８          スキン層
【図１】
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【図２】
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【図３】
0004222658.tif 000006
【図４】
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【図５】
0004222658.tif 000008
【図６】
0004222658.tif 000009
【図７】
0004222658.tif 000010
【図８】
0004222658.tif 000011
【図９】
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