(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズ後焦点面に位相をπ遅らせる位相板を配置した透過型電子顕微鏡であって、
前記位相板は入射電子線の一部が通過する開口部を有し、該位相板により位相をπ遅らせることでコントラスト伝達関数を奇関数化し、差分コントラスト像を得るようにしたことを特徴とする差分コントラスト透過型電子顕微鏡。
【請求項２】
前記位相板は、半円の薄膜位相板が円形の孔を有する位相板支持体の上にのっている位相板であり、前記半円の薄膜位相板は電子線の位相をπ遅らせることを特徴とする請求項１記載の差分コントラスト透過型電子顕微鏡。
【請求項３】
前記位相板は一部が正方形に切り取られ、絞り孔全面を覆う薄膜位相板からなり、前記正方形の中心が絞り中心と重なるように配置されるとともに、低周波成分に関して差分コントラストが得られるように入射電子ビームの中心が前記正方形の４ケ所のへり近くに設定されていることを特徴とする請求項１記載の差分コントラスト透過型電子顕微鏡。
【請求項４】
前記位相板は、一部が円形に切り取られ、絞り孔全面を覆う薄膜位相板からなり、前記円形の中心が絞り中心と重なるように配置されるとともに、低周波成分に関して差分コントラストが得られるように入射電子ビームの中心が前記円形のへり近くに設定されていることを特徴とする請求項１記載の差分コントラスト透過型電子顕微鏡。
【請求項５】
請求項２記載の透過型電子顕微鏡で得られた画像をフーリエ変換し、得られたフーリエ変換像に位相板による位相遅れを元に戻す複素指数関数を乗ずることにより、位相差コントラスト像を再生することを特徴とする電子顕微鏡像のデータ処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は電子顕微鏡に関するものであり、更に、詳しくは、可視光顕微鏡において実現される微分干渉法と同等の性能を位相板による電子波の位相操作だけで実現するもので、電子顕微鏡像のコントラスト向上と立体的地形図像という新規表現を可能とする技術の原理と実験法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
顕微鏡には一般に結像方法の根本的に異なる４種類がある。i)明視野法、ii) 暗視野法、iii)位相差法、iv) 微分干渉法である。
電子顕微鏡において、このうち明視野法、暗視野法、位相差法は実現されてきたが、微分干渉法は実現されなかった。その理由は、可視光顕微鏡で用いられてきた実空間における入射波の複雑な操作（２波分岐と試料透過後の再結合）が、現行の電子光学レンズ系では技術的に困難であったからと考えられる。微分干渉法に近い方法としては、シュリーレン法（対物レンズ後方の焦点面に視野カット半円絞りを挿入）、別名単側波ホログラフィー［Ｌ．Reimer，Transmission Electron Microscopy,Physics of Image Formation and Microanalysis,Ed.4,Springer, New York,1997.］が知られているが、空間周波数成分の半分が捨てられることと、像解釈が複雑なため用いられてこなかった。
【０００３】
可視光顕微鏡における微分干渉法は透明な試料に対し入射波の位相変化を地形図的（立体的）に画像化するものである。透明試料に用いられる位相差法との違いは、微分干渉法が位相像そのものではなく、その微分（本来は有限変位の差なので差分と言うべき）を画像化するところにある。そのため、Wollaston プリズムを試料を挟んで２つ設置し、まず最初のプリズムで入射波を微小横変位した２つのビームに分け、試料透過後、第２のプリズムで２つの試料透過ビームを同一光軸上に重ね合わせその干渉を検出する。これにより、試料による位相変化（位相差）の横方向の差分が強度像に変換され、画像化される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
電子線は薄い試料の場合吸収はなく、ほとんど透過する。すなわち、電子顕微鏡の対象は一般に透明試料と考えてよい。そのため、電子顕微鏡の本来の結像法は位相差法か微分干渉法のはずだが、両者とも現在用いられていない。前者は原理は分かっているが、位相板の帯電問題があり、一方、後者は上記の実空間法と同等のことを行おうとすればbiprism （バイプリズム）とdeflector （偏向板）を複雑に組み合わせる必要があり、可視光学系のような単純な設定が困難であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
実空間の種々の操作は工夫をすればｋ空間の操作、すなわち対物レンズ後方の焦点面（回折面）における電子波の位相の操作で代替できることが多い。後方の焦点面（回折面）におけるZerinke 位相板の設置はその１つの例であった［永山、Danev の出願：特願2000-85493号］。もちろん、こうした操作が円滑に行えるためには、後方焦点面が明確に定義できる点光源照射系に限定されるが、この条件を満たす限り、微分干渉法と同等のことが後方焦点面に新型の位相板、すなわち焦点面の半分の視野を遮る半円のπ位相板（入射波の位相をπ遅らせる位相板）を設置することで実現できる。なお、位相板としては散乱の小さな軽元素を用いた非晶質薄膜、例えば非晶質炭素膜、非晶質アルミニウム膜、または非晶質ケイ素膜を用いるのが好ましい。
【０００６】
次に、その内容について図面を参照しながら説明する。
まず、位相板の設置場所は対物レンズの後方焦点面である。点光源から出た入射電子が対物レンズ直前で必ずしも平行照射でない場合は、入射波の焦点（最小錯乱円）は焦点面の上下にずれる。その場合はその焦点位置に位相板ホルダーを移動する可動機構を必要とする。その可動機構を前提として以後話をすすめる。
【０００７】
図１は本発明の半円位相板を示す図である。
後焦点面に挿入される位相板の標準の外形は図１のようになる。半円の薄膜位相板１が円形の位相板支持体２の上にのっている。ここで、１と２の合成系を位相板と呼ぶ。１のみを指すときは位相板薄膜、２のみを指すときは位相板支持体と呼ぶ。また位相板薄膜ののった方を上方と決めておく。
【０００８】
図２は位相板の平面図及び側面図である。
上方から見た位相板の平面図が図２（ａ）である。ここで、位相板が占める半円を位相板半円、そうでない半円を開口半円と名付ける。光軸の通る点３は透過入射波が焦点を結ぶ点（０次回折点）であるが、それは必ず開口半円側に来るように調整されている。位相板の側面図は図２（ｂ）に示した。位相板における２つの構成物の相対配置は図２から明らかである。
【０００９】
図３は半円位相板に依拠した回折面（焦点面）の座標系を示す図である。
ここで、理論展開との対応で位相板に図３のような座標系を定義する。透過入射波の焦点（０次回折点）を原点にとり、焦点面にフーリエ変換後のκ空間に対応する座標軸（ｋx 、ｋy ）を図のように置く。位相板半円はｋx ＜０側の半平面を図３のように覆う。ｋx 、ｋy は２次元空間周波数ベクトルκのｘ、ｙ成分でもある。ｋベクトルは焦点面上の実ベクトルｒと次の関係で結ばれている。
κ＝r ／λｆ                                                  ……（１）
ここで、λは電子波の波長、ｆは対物レンズの焦点距離である。
【００１０】
一様な組成で一様な厚さの薄膜を電子波が通過すると、次式に従って波の位相がずれる［D.Willasch,Optic 44(1975)17.］。
φ＝−π（ｈ／λ）（Ｖ／Ｕ0 ）（１＋２αＵ0 ）／（１＋αＵ0 ）……（２）
ここで、ｈは位相板薄膜の厚さ、Ｖは薄膜物質の内部ポテンシャル、Ｕ0 は加速電圧、αは定数（＝0.9785×10-6Ｖ-1）である。
【００１１】
図３において、光軸が限りなく薄膜のへりに近づいたとき、位相板の働きは次の数式で代弁される。
0004328044.tif 000002
ここで、散乱波のｋ空間像の半面に exp(iφ）がかかる。また、試料は弱物体（振幅変化、位相変化ともに小さい物体）を用いるとほとんどの入射波は散乱されずに焦点３を通過する。そして、位相板の効果は次のコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）による振幅と位相の変調となって現れる。
振幅ＣＴＦ：  2cos［γ( ｜κ｜）＋φ/2］exp(-isgn(k x ) φ/2) ……（４）
位相ＣＴＦ： -2sin［γ( ｜κ｜）＋φ/2］exp(-isgn(k x ) φ/2) ……（５）
ここで、sgn(k x ) は符号関数でsgn(k x ) ＝１（k x ≧０）、sgn(k x ) ＝−１（k x ＜０）である。γ（｜κ｜）は対物レンズの球面収差と焦点ズレによる空間周波数依存的な位相遅れであり、次式で表される［Ｌ．Reimer］。
γ（｜κ｜）＝２π（−λΔＺｋ2 ／２＋λ3 Ｃｓｋ4 ／４）      ……（６）
ここで、Ｃｓは球面収差係数、ΔＺは焦点ズレである。
【００１２】
位相板を取り去った場合（（３）式においてφ＝０）は、（４）、（５）式はそれぞれ次式になり、通常の電子顕微鏡に現れるＣＴＦが得られる。
振幅ＣＴＦ：  2cosγ（｜κ｜）                                ……（７）
位相ＣＴＦ： -2sinγ（｜κ｜）                                ……（８）
特に薄い試料ではほとんど振幅変化がないので、位相ＣＴＦが位相成分にかかり、強度像に変換され観測される。通常電子顕微鏡においてはこのsin 型のＣＴＦが種々の問題（低コントラスト、像の変調）を起こしてきた。
【００１３】
φについて、特にφ＝−πの場合が具体的応用において重要である。φ＝−πを（４）、（５）式に入れると、exp(ｉsgn(k x ) π/2) ＝ｉ sgn(k x )  となるので、式（４）と（５）は次のように簡単になる。
振幅ＣＴＦ：i2sgn(k x )sinγ（｜κ｜）                        ……（９）
位相ＣＴＦ：i2sgn(k x )cosγ（｜κ｜）                        ……（10）
これを図示したのが図４である。
【００１４】
図４は半円位相板の位相遅れをπ、球面収差係数３ｎｍ、焦点ハズレ０、加速電圧３００KVとしたときの差分電子顕微鏡のコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）のシミュレーション結果を示す図で、図４（ａ）は振幅にかかるＣＴＦ、図４（ｂ）は位相成分にかかる位相ＣＴＦを示している。
ここには通常電子顕微鏡のＣＴＦ（式（７）、（８））と比べ、３つの著しい特徴が見られる。１つはsin 関数とcos 関数との対応が入れ替わり、位相ＣＴＦに cosγ（｜κ｜）が現れること、２つ目は符号関数 sgn（κx ）がかかっていることである。これにより本来偶関数であった振幅と位相のＣＴＦが奇関数に変換される。３つ目は虚数単位ｉがかかっていることである。第１の特徴は位相ＣＴＦが位相差像と同じＣＴＦとなるため、位相物体の画像コントラストが向上することを意味する。第３の特徴は本質的でなく、フーリエ変換された実空間で実関数を得るための因子である。重要な特徴は第２に現れ、偶関数であったＣＴＦを奇関数に変え、それが差分コントラスト像を導く。以下、その部分を詳しく述べたい。
【００１５】
式（10）を２つの矩形関数の和
（−Π（ｋx / ｋc ＋ｋc / 2 ）＋Π (ｋx / ｋc −ｋc /2))で近似しよう。図５はこの近似位相ＣＴＦを用いたときの差分コントラストの表現を示す図であり、図４（ｂ）を異符号をもつ２つの矩形関数（Π（ｘ））で近似した。また、図４（ｂ）の最初の０点の周波数をｋc に対応させた。｜κ｜＞ｋc を０とした理由は、もとの関数では｜κ｜＞ｋc に現れる速い振動変調によりその部分の信号が、言わば平均化されゼロとなるからである。
【００１６】
図５（ｂ）は近似に用いた異符号短形関数（図５（ａ））のフーリエ変換であり、次式で与えられる。
ｉ(sinπｋc ｘ）2 ／πｋc ｘ                                  ……（11）
位相成分にかかるＣＴＦのフーリエ変換は実空間像の点拡がり関数を与える。従って、図５（ｂ）は点拡がり関数、すなわち無限小の点が像形成するときの像のボケ具合を表す。その働きは収差なしで、かつ正焦点の理想像（原像と呼ぼう）に対し、（11）式の関数が重畳（convolution ）されることと同等である。
【００１７】
式（11）は sinπｋc ｘ・ sinc(πｋc ｘ) と書ける。最初の sinπｋc ｘの働きは、 sinc 関数（ sinc(πｋc ｘ) ＝ sinπｋc ｘ／πｋc ｘ）を左右両方向にシフトさせ符号を変える。こうして図５（ｂ）に見るように、異符号の２つの関数の和となる。式（11）の sinc 関数をδ関数で近似すれば、式（11）は１／ｋc 離れた異符号のδ関数の和（12）式で表せる。
δ（ｘ＋１／ｋc ）−δ（ｘ−１／ｋc ）                      ………（12）
実際の像は、その近似式（（12）式）と原像との重畳となり、差分を与えることになる。
【００１８】
すなわち、原像が左右に１／２ｋc ずつ変位し、かつ異符号のため両者の差をとることに等しくなる。変位１／２ｋc は図４（ｂ）のＣＴＦの最初の０点の位置から定まるであろう。また、実際には sinc 関数の重畳であるから原像はその関数で決まる点拡がりを持ち、分解能が制限される。
【００１９】
以上が差分電子顕微鏡の原理である。差分という性質および位相ＣＴＦがcos γ（｜κ｜）へ交替（位相差法と同等の特性）するという性質は全てＣＴＦが奇関数に変換されたところから生まれた。そして、奇関数への変換は位相板の関数形である次式から起因しているのである。
【００２０】
0004328044.tif 000003
この差分コントラストの性質は可視光顕微鏡に見る微分干渉法と２点で共通している。i)差分である、ii) ＣＴＦが位相差像の場合と同じである。そして、このことにより、図８に見るように画像は立体的地形図表現となる。それ故、微分干渉法と名付けてもよいが、本発明がｋ空間における位相操作という全く新しい方法を採用している点で混乱を回避するため新しい命名、差分コントラスト法とした。
【００２１】
ここで、差分顕微鏡法の特性であるｋx 平面の符号変調を数値的に元に戻す操作を考えよう。それらは得られた画像のフーリエ変換像に次の関数の乗算操作を施すことにより得られる。
(1/2)exp(isgn(ｋx ）φ/2                                            ……（14）
この関数形が本来のＣＴＦ（４）、（５）に乗算されると、ＣＴＦは以下のように変わる。
振幅ＣＴＦ： cos（γ( ｜κ｜）＋φ/2）                              ……（15）
位相ＣＴＦ：−sin （γ( ｜κ｜）＋φ/2）                            ……（16）
このＣＴＦは図４と異なり、偶関数となるため特に差分効果は現れない。
特にφ＝−πを（15）、（16）へ代入すると、ＣＴＦは次のようになり偶関数となる。
振幅ＣＴＦ：  sin γ（｜κ｜）                                      ……（17）
位相ＣＴＦ：  cos γ（｜κ｜）                                      ……（18）
このＣＴＦはZerinke 位相板を用いた位相差法に現れるＣＴＦそのものである［永山、Danev の特願2000-85493号、R.Danev and K.Nagayama,Ultramicroscopy 88(2001) 243 ］。
従って同一試料につき通常法と復調演算を施した差分コントラスト法を組み合わせれば複素観測法［K.Nagayama,J.Pphys.Soc.of Jpn.68(1999)811,R.Danev and K.Nagayama,J.Pphys.Soc.of Jpn.70(2001)696)］をも実現できることになる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、発明の実施の形態について説明する。
ここで、差分電子顕微鏡法の具体的な実験効果を報告する。
図６は差分コントラスト法における焦点と半円形位相板薄膜との関係を示す図である。光軸が薄膜位相板のへりからかなり離れたとき（図６の３）は低周波成分に関して差分コントラストは期待できなくなる。この場合、フーリエ変換の成分は図６（ｂ）のように、成分ごとに異なるコントラストを示すことになる。図６（ｂ）は薄膜位相板のへりをｋy 軸自体にとったときの（ｋx ，ｋy ）座標とその中の各周波数成分のＣＴＦの現れ方の模式図である。領域４は通常法と同じコントラスト（位相の場合sin 型のＣＴＦ）、領域５のみが差分コントラスト（位相の場合cos 型のＣＴＦ）となる。従って、実用上は焦点３を薄膜のへりにできるだけ近付けることが望ましい。
【００２３】
半円位相板系の作成は次の手順で行った。まず、一様な厚さの非晶質炭素膜(300KVの場合−πのシフトと約60ｎｍの薄膜に相当) マイカ板上に真空蒸着法で作る。これを水中剥離し、水面上に浮かせる。この炭素薄膜をモリブデン製の単孔メッシュですくい取る。単孔の穴は全面が炭素膜で覆われる。その試料をフォーカスイオンビーム装置に入れ、炭素薄膜を部分的に切り取る。具体的には、図７（ａ）のように正方形の穴６を開けた。このようにしたのは薄膜が張力を以ており、もし図６（ａ）のように切り取ると張力が失われ、半円位相板のへりが曲がってしまい、直線のへりが実現できないためである。穴面積に比べ、正方形の切り取り部分が小さいときは、張力が維持され、正方形のへりは曲がらない。
【００２４】
この場合、ｋ空間の周波数成分のコントラストは次のようになる。図７（ｂ）に示すように、領域４は通常電子顕微鏡のコントラスト、領域５は差分コントラスト、そして領域７はZerinke 位相板と同じようなコントラストを示す。すなわち、φ＝−π／２のときは位相差コントラスト、φ＝−πのときは通常コントラストとなる。
【００２５】
ここで、図７（ａ）に示す位相板系（アパーチャー穴径５０μｍ、切り取り正方形の一辺２０μｍ）でφ＝−π（薄膜６０μｍ）を用いたときの差分コントラスト像（３００ｋＶ電子顕微鏡）の測定例を示す。
【００２６】
図８は尿細管細胞の細胞切片像を示す図で、上段は通常法による像、下段は同じ領域を差分コントラスト法でとった像を示している。この像はオスミウム固定による染色のみが施されている。一般にこの染色法は膜構造を保持する点では好都合だが、染色コントラストが弱く、図８上段の様に通常法では拡大に耐えない弱いコントラストを示している。同じ領域を差分コントラスト法でとったのが図８下段である。まず、２つの特徴が目につく。１つは非常に高いコントラスト、２つ目は立体的地形図像表現である。この両者は透明試料を可視の微分干渉顕微鏡で見たときの特徴と同じである。これにより、細胞像の微細構造について従来にない確かさと分解能で決定的な解釈が可能となる。なお、比較に際しては最初に差分コントラスト像をとっており、次に通常法をとった。従って、地形図表現は電子線照射によるエッチング効果ではないことが主張できる。
【００２７】
差分コントラスト用位相板としては、膜より安定でまた差分領域を広くとれる円形切り取りも可能である。図９（ａ）にその概略図を示した。円形に切り取られた領域８は焦点３をへりのぎりぎりに含むのがよい。図９（ｂ）にｋ空間のコントラスト分布を示した。領域４は通常像領域、領域５は差分コントラスト域、領域７はZerinke 位相板と同等のコントラスト領域である。
【００２８】
また、図７、図８で用いられる絞りの１．５倍の絞り孔を用い、正方形孔、円形孔を絞りの中心と重なるようにしてもよい（図１０）。この場合、正方形ではビーム中心を４ケ所のへり近くに、円形ではビーム中心を任意のへり近くに設定できる。ビーム中心の位置は変位の方向を決めるので、図１０（ａ）の正方形孔では像の明暗方向を４方向に、図１０（ｂ）の円形孔の場合は、像の明暗方向を任意に設定できることになる。
【００２９】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、対物レンズ後焦点面に配置された位相板による位相操作により、コントラスト伝達関数の振幅と位相を変調し、位相遅れを調整することにより奇関数化することができるので、位相物体の画像コントラストを向上させ、微分干渉法と同等の効果を生み出して差分コントラスト子顕微鏡像を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の半円位相板を示す図である。
【図２】  位相板の平面図及び側面図である。
【図３】  半円位相板に依拠した回折面（焦点面）の座標系を示す図である。
【図４】  差分電子顕微鏡のコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）のシミュレーション結果を示す図で、同図（ａ）は振幅にかかるＣＴＦ、同図（ｂ）は位相成分にかかる位相ＣＴＦである。
【図５】  近似位相ＣＴＦを用いたときの差分コントラストの表現を示す図である。
【図６】  差分コントラスト法における焦点と半円形位相板薄膜との関係を示す図である。
【図７】  薄膜の機械的安定性を考慮した差分コントラスト用位相板を示し、同図（ａ）は正方形の位相板薄膜を切り取た差分コントラスト用位相板、同図（ｂ）は対応する周波数依存コントラストを説明する図である。
【図８】  尿細管細胞の細胞切片像を示す図で、上段は通常法による像、下段は同じ領域を差分コントラスト法でとった像を示す図である。
【図９】  薄膜の機械的安定を考慮した差分コントラスト用位相板の他の例を示す図である。
【図１０】  差分方向従って立体像の明暗方向を４方向（図１０（ａ））、任意方向（図１０（ｂ））に選べるようにした位相板の例を示す図である。
【符号の説明】
１…半円形位相板薄膜、２…位相板支持体、３…光軸。
【図１】
0004328044.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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