(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0004270753.tif 000064
［式中、
Ｘは-C≡C-又は-C=C- であり、
Ｙは-(CH2)k - 又は-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｋ＝０〜２０、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
Ｚは-NH-又は-CO-であるか、あるいは
Ｘは-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
Ｚは-NH-又は-CO-である。］
で表わされる５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質を含有するニコチン免疫原。
【請求項２】
キャリヤー蛋白質が巻き貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、非毒性突然変異ジフテリアトキソイドＣＲＭ197 、髄膜炎菌からの外膜蛋白複合体（ＯＭＰＣ）、熱に不安定な大腸菌（Escherichia coli) のＢサブユニット及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa) （ｒＥＰＡ）からの組換えエキソプロテインより成る群から選ばれる、請求項１記載のニコチン免疫原。
【請求項３】
式
【化２】
0004270753.tif 000065
［式中、
Ｘは-C≡C-又は-C=C- であり、
Ｙは-(CH2)k - 又は-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｋ＝０〜２０、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
Ｚは-NH-又は-CO-であるか、あるいは
Ｘは-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
Ｚは-NH-又は-CO-である。］
で表わされる５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質。
【請求項４】
キャリヤー蛋白質が巻き貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、非毒性突然変異ジフテリアトキソイドＣＲＭ197 、髄膜炎菌からの外膜蛋白複合体（ＯＭＰＣ）、熱に不安定な大腸菌（Escherichia coli) のＢサブユニット及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa) （ｒＥＰＡ）からの組換えエキソプロテインより成る群から選ばれる、請求項３記載の５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質。
【請求項５】
薬剤として使用するための請求項３又は４記載の５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質。
【請求項６】
請求項４又は５記載の５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質及び薬学的に容認された賦形剤を含有する薬学的調合物。
【請求項７】
アジュバントを更に含有する、請求項６記載の薬学的調合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニコチン免疫原、５−又は６−ニコチニル−リンカー蛋白質及びこれを薬剤として使用する方法及び５−又は６−ニコチニル−リンカー蛋白質を含有する薬学的調合物、及び害の減少（harm reduction) を達成するためにタバコ製品によるニコン依存症を予防及び( 又は) 治療する免疫学的処置法に関する。
【０００２】
発明の背景
タバコ依存から免れたい、世界中の膨大な数のタバコ使用者／喫煙者のために、彼らが彼らの目標に到達するのを助けるか又は少なくとも害の減少をもたらすのを助ける製品に多大な需要がある。
【０００３】
１つの研究は、投与された／吸い込まれたニコチンに強く結合し、ニコチンの作用を遮断する抗体を、ニコチンが中枢神経系に到達する前に個体（individual) において誘発することができるワクチン／免疫原を開発することである。この考えは、個体がニコチン投与／喫煙の期待される刺激効果を体験することができなければ、タバコ製品を投与する興味、たとえばかぎタバコをかぐ（moist snuff)、又は紙巻タバコに火をつける興味がなくなる（消失／阻止）であろうことにある。
【０００４】
相補的な研究は、投与された／吸い込まれたニコチンに穏やかに又は弱く結合し、中枢神経系でニコチンの作用を増加／延長させる抗体を個体において誘発することができる免疫原を開発することにある。この考えは、個体が延長された期間、ニコチン投与／喫煙の期待される刺激効果を体験するならば、タバコ製品をあらためて投与する興味、たとえばかぎタバコをかぐ、又は紙巻タバコに火をつける興味が後に延ばされるであろうし、そしてタバコ製品が消費されることによる医学的重要性が減少するであろうことにある。
【０００５】
上記の２つの研究では、害の減少を導く免疫応答を個体において誘発する免疫原が使用される。
【０００６】
先行技術において、ニコチンに対する抗体を用いる免疫検定法を開示する文献があるが、このような抗体はその医学用途に関して何ら示唆されていなかった（たとえばＣａｓｔｒｏＡ．及びＭｏｎｊｉＮ．，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８６，５１，３９３−４０４参照）。
【０００７】
ニコチン依存症をワクチンで治療する考えは、新しいものではない。というのは依存を引き起こすであろう薬品に対するワクチンの製造が先行技術に開示されていたからである（たとえばモルフィンによって例示された欧州特許（ＥＰ−Ｂ１）第０４９６８３９号明細書及びコカインによって例示された国際特許出願公開（ＷＯ）第９６／３００４９号公報参照）。
【０００８】
ニコチン分布を変えるための能動免疫化を開示する文献が、最近出版された（Ｈｉｅｄａ  Ｙ．等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．及びＥｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．１９９７，２８３，１０７６−１０８１）。実験で使用された免疫原は巻き貝（keyhole limpet) ヘモシアニンに結合された（±）−６−（カルボキシメチル−ウレイド）−ニコチンである。
【０００９】
最近、国際特許出願（ＷＯ）第９８／１４２１６号が公開された（１９９８年９月４日）。この特許出願はニコチン分子を主体とする多数のハプテン−キャリヤー結合体（conjugate)を請求し、そして化合物の通常の構造特徴は、ハプテン分子のすべてが末端カルボン酸基────これはその後キャリヤーに結合される────を含有するものであると考えられる。推定されるドラッグ乱用の治療に関する生体内試験は開示されていなかった。
【００１０】
発明の説明
本発明は、式
【００１１】
【化４】
0004270753.tif 000002
【００１２】
［式中、
Ｚが-NH-である場合、
Ｘは-NH-CO- 又は-NH-又は-C≡C-又は-C=C- 又は-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)k - 又は-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n -
( 式中、ｋ＝０〜２０、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
但し、Ｙが-(CH2)5-であり、Ｚが-NH-である場合、Ｘは-NH-CO- ではない、
そしてＺが-CO-である場合、
Ｘは-NH-CO- 又は-C≡C-又は-C=C- 又は-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｍ＝０
〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
そしてＹが-(CH2)k -(式中、ｋ＝０〜２０）である場合、
Ｘは-C≡C-又は-C=C- であり、
Ｚは-CO-である。］
で表わされる５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質を含有するニコチン免疫原に関する。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様において、５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質はｋ＝１〜８、ｍ＝０〜３、そしてｎ＝０〜３の化合物から選ばれる。
【００１４】
５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質の別の名称は、５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−又は３−ピリジニル−リンカー- キャリヤー蛋白質及び５−（Ｎ−メチル−２−ピロリジニル）−２−又は３−ピリジニル−リンカー- キャリヤー蛋白質である。
【００１５】
本発明の５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質のキャリヤー蛋白質は、ヒトにおける抗体を誘発するのに適するハプテンに結合した、薬学的に容認された蛋白質から選択することができ、そしてこのキャリヤー蛋白質はたとえば巻き貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、非毒性突然変異ジフテリアトキソイドＣＲＭ197 、髄膜炎菌からの外膜蛋白複合体（ＯＭＰＣ）、熱に不安定な大腸菌（Escherichia coli) のＢサブユニット及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa) （ｒＥＰＡ）からの組換えエキソプロテインより成る群から選ばれる。
【００１６】
さらに本発明は、式
【００１７】
【化５】
0004270753.tif 000003
【００１８】
［式中、
Ｚが-NH-である場合、
Ｘは-NH-CO- 又は-NH-又は-C≡C-又は-C=C- 又は-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)k - 又は-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n -
( 式中、ｋ＝０〜２０、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
但し、Ｙが-(CH2)5-であり、Ｚが-NH-である場合、Ｘは-NH-CO- ではない、
そしてＺが-CO-である場合、
Ｘは-NH-CO- 又は-C≡C-又は-C=C- 又は-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｍ＝０
〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
そしてＹが-(CH2)k -(式中、ｋ＝０〜２０）である場合、
Ｘは-C≡C-又は-C=C- であり、
Ｚは-CO-である。］
で表わされる５- 又は６- ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質に関する。
【００１９】
また本発明のこの観点において、キャリヤー蛋白質はたとえば巻き貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、非毒性突然変異ジフテリアトキソイドＣＲＭ197 、髄膜炎菌からの外膜蛋白複合体（ＯＭＰＣ）、熱に不安定な大腸菌（Escherichia coli) のＢサブユニット及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa) （ｒＥＰＡ）からの組換えエキソプロテインより成る群から選ばれてよい。
【００２０】
さらに、本発明は薬剤、たとえばワクチン中の免疫成分として使用するための新規５- 又は６- ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質に関する。
【００２１】
本発明の上記式の化合物から除かれる１つの化合物は、ＣａｓｔｒｏＡ．及びＭｏｎｊｉＮ．（上記文献）によってすでに開示されている。すなわちキャリヤー蛋白質が牛血清アルブミンであり、リンカーが−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2 ）5 −ＮＨ−である６- ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質である。しかしこの化合物の医学用途は示唆されなかった。
【００２２】
更に、本発明は５−又は６−ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質及び薬学的に容認された賦形剤を含有する薬学的調合物に関する。
【００２３】
本発明の免疫原性化合物の投与に必要とされる薬学的調合物中の賦形剤は、公知の薬学的に容認された賦形剤、たとえば生理食塩水又はその他の適当な賦形剤、たとえば欧州又は米国薬局方に記載されたものから選ぶことができる。
更に、本発明の薬学的調合物はアジュバントを含有していてよく、当然のことながらこのアジュバントはヒトに使用することが薬学的に容認されていなければならず、たとえばリン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムである。
さらに、本発明は、個体への害の減少を達成するためにタバコ製品によるニコチン依存症を予防及び( 又は) 治療する免疫学的処置法において、式
【００２４】
【化６】
0004270753.tif 000004
【００２５】
［式中、
Ｚが-NH-である場合、
Ｘは-NH-CO- 又は-NH-又は-C≡C-又は-C=C- 又は-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)k - 又は-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n -
( 式中、ｋ＝０〜２０、ｍ＝０〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
但し、Ｙが-(CH2)5-であり、Ｚが-NH-である場合、Ｘは-NH-CO- ではない、
そしてＺが-CO-である場合、
Ｘは-NH-CO- 又は-C≡C-又は-C=C- 又は-CH2- であり、
Ｙは-(CH2)m -C6H10-(CH2)n - 又は-(CH2)m -C6H4-(CH2) n - ( 式中、ｍ＝０
〜６、そしてｎ＝０〜６）であり、
そしてＹが-(CH2)k -(式中、ｋ＝０〜２０）である場合、
Ｘは-C≡C-又は-C=C- であり、
Ｚは-CO-である。］
で表わされる５- 又は６- ニコチニル−リンカー- キャリヤー蛋白質をニコチン分子に結合する抗体を誘発する抗体誘発量で上記個体に投与することを特徴とする、上記免疫学的処置法に関する。
【００２６】
特定の個体に関して、抗体を誘発する量は試行錯誤試験での刺激効果の主観的体験によって経験的に見出されるか又は製造業者又は医者によって示唆されるであろう。
【００２７】
本発明のこの観点の好ましい実施態様において、上記個体においてニコチン分子に結合する抗体の力価を増加させるために、投与を時折繰り返す。
【００２８】
その他の哺乳類が治療されねばならない場合、たとえ本発明が機能したとしても、この個体はヒトであるのが好ましい。当然のことながら、これは実験動物を試験目的で使用する場合が例となるであろう。
【００２９】
本発明は、次の図面の説明、化合物及び免疫原の合成及び本発明の特定の実施態様を表わす実験を参照することによって一層明らかになるであろう。しかし請求項に定義された本発明の範囲はこれらによって限定されない。
【００３０】
図面の簡単な説明
図１：ＧＫ５−ＫＬＨで最初のボーラス免疫処置(bolus immunization)して７日又は９日後に集められた免疫ラットからの血清でＥｌｉｚａ測定。
【００３１】
図２：ＧＫ５−ＫＬＨでブースター（追加抗原）免疫処置(booster immunization)して１−４日後に集められた免疫ラットからの血清でＥｌｉｚａ測定。
【００３２】
図３：免疫ラットからの血清のＥｌｉｚａ力価測定。ＧＫ６０−ＫＬＨで免疫されたラットからの特異抗体の力価は１：４０００である。その他の免疫原を用いる免疫は同様な結果を生じる。
【００３３】
図４：競合Ｅｌｉｚａ。プロトコル２を用いて免疫処置された免疫原ＧＫ８４−ＫＬＨは、ニコチン及びノルニコチンに対して、その他の使用される競合物に対するよりも約１００倍特異的である抗体を生じる。
【００３４】
図５：コントロールラットにおいて、ＶＴＡＤＡニューロンからの電気生理学的単個細胞記録。ＤＡ細胞は、ニコチン投与後の放電率(firing rate) 及びバースト放電(burst firing)の増加をもって応答した。
【００３５】
図６：免疫ラットにおいて、ＶＴＡＤＡニューロンからの電気生理学的単個細胞記録。ＤＡ細胞は、免疫化後ニコチンの活性化効果にあまり敏感性を生じない。
【００３６】
図７ａ：免疫原ＧＫ８４−ＫＬＨを用いる能動免疫は、コントロールに比べて中隔側坐核中でニコチン誘発されたドパミン放出をほとんど完全に抑制する。
【００３７】
図７ｂ：免疫原ＧＫ８０−ＫＬＨを用いる能動免疫は、コントロールに比べてニコチン投与後に中隔側坐核中でドパミン流出の著しい増加を生じる。
【００３８】
図７ｃ：ニコチン誘発されたドパミン産出での免疫原ＹＨ６−ＫＬＨを用いる免疫効果は３週間以上安定である。* p=0.05; **p=0.01; *** p=0.001 。
【００３９】
化合物及び免疫原の合成の説明
ニコチン免疫原を反応式１にしたがって３段階で製造する：
Ｉ．（Ｓ）−ニコチンから６−アミノニコチン（１）の製造、
ＩＩ．種々のニコチンリンカー分子の製造、
ＩＩＩ．種々のニコチン免疫原（ニコチン- リンカー- キャリヤー蛋白質）の製造。
３段階の詳細な実施は、以下の通りである。
Ｉ．６−アミノニコチン（１）の製造。
【００４０】
Tschitschibabin 及びKirssanow Chem.Ber. 1924,57B, 1163-1168 によって報告された方法にしたがって（Ｓ）−ニコチンから６−アミノニコチン（１）を合成する。
ＩＩ．種々のニコチンリンカー分子の製造（反応式２−８）。
【００４１】
６−又は５−アミノニコチンをリンカーとしてのアミン誘導体でカップリングする一般的方法（反応式２−３）：Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ、３．０当量）を、ＣＨ2 Ｃｌ2 （１−２ｍｌ／ｍｍｏｌ）中に６−アミノニコチン（１．０当量）、アミノ保護されたアミノ酸［７−（ｔ．−ブチルオキシカルボニルアミノ）−ヘプタン酸又はトランス−４−（ベンジル−オキシカルボニルアミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸1 ］（１．０当量）及びトリピロリジノブロモ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ，１．０当量）を有する混合物に添加する。反応混合物を環境温度で２０〜２４時間攪拌する。混合物を濃縮し、残留物をクロマトグラフィー分離して、６−アセチル化された６−アミノニコチン誘導体２及び３を３２〜３８％の収率で生じる。
1 ＯＫａｎｏ，Ａ．；Inaoka，Ｍ．；Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｓ．；Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｉｓｏｄａ，Ｓ．；Ｍｏｒｏｉ，Ｒ．；Ａｂｉｋｏ，Ｙ．；Ｈｉｖａｔａ，Ｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７２，１５，２４７−２５５。
７−（ｔ．−ブチルオキシカルボニルアミノ）−Ｎ−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル］ヘプタンアミド（２）。
【００４２】
残留物をクロマトグラフィー分離して［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（３０：１）］、（２）（３２％）が得られる。分析試料は、イソ−ヘキサン／ＥｔＯＨから結晶化によって得られる；融点（ｍｐ）９２−９３℃；
【００４３】
【外１】
0004270753.tif 000005
【００４４】
トランス−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノメチル）−Ｎ−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル］シクロヘキサンカルボキシアミド（３）
残留物をクロマトグラフィー分離して［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（２０：１）］、（２）（３８％）が得られる。分析試料は、イソ−ヘキサン／ＥｔＯＨから結晶化によって得られる；
【００４５】
【外２】
0004270753.tif 000006
【００４６】
７−アミノ−Ｎ−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル］ヘプタンアミド（４：ＹＨ１５）
ＴＦＡ（５ｍｌ）をＣＨ2 Ｃｌ2 （０．１０ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）中に（２）を有する溶液に添加し、混合物を環境温度で２時間攪拌する。この溶液を飽和Ｋ2 ＣＯ3 水溶液で中和し、ＣＨ2 Ｃｌ2 （３×１５ｍｌ）で抽出する。一緒にされた有機相を水洗し、乾燥し（Ｋ2 ＣＯ3 ）、濾過して、濃縮する。粗生成物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（５０：５０：１）］によって精製し、油状物として（４）０．０６ｇ（７４％）が得られる。
【００４７】
【外３】
0004270753.tif 000007
【００４８】
トランス−４−（アミノメチル）−Ｎ−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル］シクロヘキサンカルボキシアミド（５；ＹＨ６）
乾燥アセトニトリル（１０ｍｌ）中に（３）（０．１４ｇ，０．３ｍｍｏｌ），Ｍｅ3 ＳｉＣｌ（０．２４ｇ，２．５５ｇ）及びＮａＩ（４．５ｍｇ，２．７ｍｍｏｌ）を有する混合物を窒素下で３時間環境温度で攪拌する。揮発物を蒸発させ、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）及びエーテル中にＨＣｌを有する飽和溶液（１ｍｌ）を添加する。混合物を１５時間攪拌し、ついで濃縮する。残留物を水（５ｍｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×７ｍｌ）で抽出する。一緒にされた有機相を乾燥し（Ｋ2 ＣＯ3 ）、濾過して、濃縮する。粗生成物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（５０：５０：１）］によって（５）０．０３ｇ（２８％）が得られる；
【００４９】
【外４】
0004270753.tif 000008
【００５０】
６−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル］ヘキサンニトリル（６）
乾燥トルエン（２０ｍｌ）中に６−アミノニコチン（０．６２ｇ，３．５ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（８０％鉱油、０．１６ｇ，５．２５ｍｍｏｌ）を有する攪拌混合物を２時間還流し、ついで室温に冷却する。６−ブロモヘキサンニトリル（０．６５ｇ，３．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を還流温度で一晩放置する。溶剤を蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー分離［シリカゲル、ＣＨＣｌ3/ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（１８：３：０．１）］して、（６）０．４０ｇ（４１％）が得られる；ＩＲ（フィルム）：２２７０ｃｍ-1；-1Ｈ-
【００５１】
【外５】
0004270753.tif 000009
【００５２】
６−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル］ヘキサンアミン（７：ＹＨ７）
化合物６（０．２３ｇ，０．８３ｍｍｏｌ）を乾燥エーテル（８ｍｌ）中にＬｉＡｌＨ4 （０．０７ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を有する懸濁液に窒素下で添加する。この混合物を室温で５時間攪拌し、２０時間還流下で加熱する。飽和Ｎａ2 ＳＯ4 水溶液（２ｍｌ）を添加し、固形アルミニウム錯体を濾過し、エーテルで洗浄する。有機相を乾燥し（Ｋ2 ＣＯ3 ）、濾過して、濃縮する。 粗残留物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（３５：３５：２）］によって精製し、（７）０．１３ｇ（５５％）が得られる；
【００５３】
【外６】
0004270753.tif 000010
【００５４】
トランス−ベンジル−４−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニルカルバモイル］シクロヘキサンカルボキレート（８）
ＤＩＥＡ（０．５１ｍｌ，３ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ3 （２０ｍｌ）中に６−アミノニコチン（０．２７ｇ，１．５ｍｍｏｌ）、４−（ベンジルオキシカルボニル）シクロヘキサンカルボン酸2 （０．４３ｇ，１．６ｍｍｏｌ）及びＰｙＢｒＯＰ（０．７７ｇ，１．６ｍｍｏｌ）を有する混合物に添加する。反応混合物を環境温度で５分間攪拌し、ついで２４時間還流下で加熱する。クロロホルムを減圧蒸発させ、残留物をエーテルで抽出する。一緒にされたエーテル抽出物を水でついでブラインで洗浄し、ついで乾燥し（Ｋ2 ＣＯ3 ）、濾過して、減圧で濃縮する。残留物をクロマトグラフィー分離し［シリカゲル、ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ（９５：５）］、（８）（０．４４ｇ，７０％）が得られる。分析試料はイソヘキサンから結晶化して得られる；
【００５５】
【外７】
0004270753.tif 000011
【００５６】
2 ＷｅｌｌｍａｒＵ．等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９６，１５，１０５９−１０７６。
トランス−４−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニルカルバモイル］シクロヘキサンカルボン酸（９：ＧＫ５）
炭素上に担持されたパラジウム（１０％、０．０４ｇ）をＥｔＯＨ（７ｍｌ）中に（８）（０．１５ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及びシクロヘキサン（０．１５ｍｌ）を有する混合物に添加する。攪拌された反応混合物を１５分間還流加熱し、濾過して、濃縮する。残留物を分取ＴＬＣ（シリカゲル、ＭｅＯＨ）によって精製し、ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＥｔＯＨ（９５：５）に溶解し、濾過し、濃縮して、（９）（０．０９ｇ，７５％）を生じる。
【００５７】
【外８】
0004270753.tif 000012
【００５８】
７−（ｔ．−ブチルオキシカルボニルアミノ）−Ｎ−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル］ヘプタンアミド（ＳＧ１７）
ＰｙＢｒＯＰ（０．９ｇ，１．９ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．６ｍｌ）を乾燥ＣＨ2 Ｃｌ2 （５ｍｌ）中に５−アミノニコチン3 （０．３ｇ，１．７ｍｍｏｌ）及び７−（ｔ．−ブチルオキシカルボニルアミノ）ヘプタン酸（０．５ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を有する攪拌された溶液に０℃で添加する。この混合物を０℃で３０分間、ついで室温で２時間攪拌する。溶剤を蒸発させ、ＥｔＯＡｃを残留物に添加する。混合物を飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液及びブラインで洗浄し、乾燥し（Ｋ2 ＣＯ3 ）、濾過して、減圧で濃縮する。残留物をクロマトグラフィー分離し［ＳｉＯ2 、ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ（４：１）］、淡い黄色油状物としてＳＧ１７ ０．５９ｇ（８７％）が得られる；
【００５９】
【外９】
0004270753.tif 000013
【００６０】
７−アミノ−Ｎ−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル］ヘプタンアミド（ＳＧ１８）
ＴＦＡ（２．０ｍｌ，２６．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ2 Ｃｌ2 （３５ｍｌ）中にＳＧ１７（０．４８ｍｌ，１．２ｍｍｏｌ）を有する攪拌された溶液に０℃で添加する。攪拌された溶液を室温に到達させ、６時間後この溶液を飽和Ｋ2 ＣＯ3 水溶液の添加によってｐＨ〜８にする。混合物を減圧下で完全に蒸発乾固する。残留物をクロマトグラフィー分離し［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（４：１：０．５）］、黄色油状物としてＳＧ１８ ０．２５ｇ（６９％）が得られる；
【００６１】
【外１０】
0004270753.tif 000014
【００６２】
いくつかのリンカーの製造（反応式４）
トランス−（４−プロプ−２−イニルシクロヘキシル）メタノール（ＧＫ９１）  リチウムアセチリドエチレンジアミン錯体（７．４ｇ，７２．５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ４０ｍｌに懸濁させ、ＤＭＳＯ（３０ｍｌ）中にトランス−４−（ヒドロキシメチル）シクロへキシルメチルトルエン−４−スルホネート（８．０ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）を有する溶液を５℃で添加する。混合物を２時間環境温度で攪拌し、冷水（２００ｍｌ）で冷却し、セライトのパッドを通して濾過する。得られた溶液をエーテル（４×５０ｍｌ）で抽出する。一緒にされた有機相を水及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、濾過して、減圧で濃縮し、ＧＫ９１３．５ｇ（８６％）が得られる。これを更に精製することなく次の工程に使用する；
【００６３】
【外１１】
0004270753.tif 000015
【００６４】
この化合物の一部を３，５−ジニトロベンゾエートに変える。ｍｐ１０６−１０８℃（イソヘキサンから）；
【００６５】
【外１２】
0004270753.tif 000016
【００６６】
トランス−４−プロプ−２−イニルシクロヘキサンカルボン酸（ＧＫ６８）
２ＭＨ2 ＳＯ4 （１０ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）中に三酸化クロム（１．１８ｇ，１１．８ｍｍｏｌ）を有する溶液を、アセトン（２０ｍｌ）中のＧＫ９１ ０．９ｇ（〜５．９ｍｍｏｌ）を添加しながら、０℃で保つ。反応混合物を１時間０℃で、ついで２時間、室温で攪拌する。過剰の酸化剤を固体Ｎａ2 ＳＯ3 （０．８ｇ，６．３ｍｍｏｌ）で分解する。エーテル（〜１００ｍｌ）を添加し、混合物をブライン（３×５０ｍｌ）で抽出する。有機相を乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ3 ）、濾過して、濃縮する。残留物をイソヘキサンから結晶化し、無色の結晶としてＧＫ６８０．７４ｇ（７５％）が得られる。ｍｐ８４−８６（イソヘキサンから）；
【００６７】
【外１３】
0004270753.tif 000017
【００６８】
トランス−４−プロプ−２−イニルシクロヘキサンカルボン酸メチルエステル（ＧＫ７０）
Ｇｋ６８（０．７ｇ，４．２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍｌ）及びオルトギ酸（１ｍｌ）の混合物に溶解させる。Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ２（０．２ｇ）を添加し、反応混合物を一晩環境温度で攪拌する。樹脂を濾過し、溶剤を減圧で蒸発させる。残留物をバルブツーバルブ（ｂｕｌｂｔｏ ｂｕｌｂ）蒸留（１７５℃、１３ｍｍ）によって精製し、油状物としてＧＫ７００．７１ｇ（９３％）が得られる；
【００６９】
【外１４】
0004270753.tif 000018
【００７０】
トランス−（４−プロプ−２−イニルシクロヘキシル）メチルトルエン−４−スルホネート（ＧＫ８７）
ピリジン（３０ｍｌ）中にＧｋ９１（３．０４ｇ，２０ｍｍｏｌ）を有する溶液を０℃に冷却し、ｐ−トルエンスルホニルクロライド（４ｇ、２１ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を２時間０℃で、ついで一晩環境温度で攪拌する。ピリジンを減圧で蒸発させ、残留物をエーテルに溶解し、１ＭＨＣｌ、Ｈ2 Ｏ、ＮａＨＣＯ3 及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、濾過して、蒸発させる。固体残留物をイソヘキサンから再結晶させて、ＧＫ８７５．５７ｇ（９１％）が得られる。
【００７１】
【外１５】
0004270753.tif 000019
【００７２】
トランス−（４−プロプ−２−イニルシクロヘキシル）メチルアミン（ＧＫ８８）
ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）中にＧＫ８７（１．５３ｇ，５ｍｍｏｌ）を有する溶液を−１５℃でＮＨ3 で飽和し、ついで密閉容器中で１００℃で３時間加熱する。ＭｅＯＨを減圧で蒸発させる。残留物を１ＭＨＣｌ（５０ｍｌ）に溶解し、ＣＨ2 Ｃｌ2 （３×２０ｍｌ）で抽出し、ビス（トランス−（４−プロプ−２−イニルシクロヘキシルメチル）アミン塩酸塩を除く。水相を固体ＮａＯＨでｐＨ１２にアルカリ性化し、エーテル（３×２０ｍｌ）で抽出する。一緒にされた有機抽出物をＫＯＨで乾燥し、濾過し、減圧で濃縮して、ＧＫ８８０．４ｇ（５３％）が得られる。
【００７３】
【外１６】
0004270753.tif 000020
【００７４】
６−ブロモヘキシルアンモニウムブロマイド4 （ＳＧ２０）
ＨＢｒ４８％（１０５ｍｌ）中に６−アミノ−１−ヘキサノール（４．３ｇ，３７．０ｍｍｏｌ）を有する混合物を９５℃で１１時間攪拌する。溶液を減圧で濃縮し、帯褐色の吸湿性粉末としてＳＧ２０８．５ｇ（８９％）（粗製ＳＧ２０のｍｐ：１２８−１３２℃）が得られる；
【００７５】
【外１７】
0004270753.tif 000021
【００７６】
７−オクチンアミン5 （ＳＧ２６）
乾燥ＤＭＳＯ（２ｍｌ）中にＳＧ２０（３．０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を有する溶液を乾燥ＤＭＳＯ（３６ｍｌ）中にリチウムアセチリド及びエチレンジアミン錯体（７．０ｇ，７６．０ｍｍｏｌ）を有する攪拌されたスラリーに４５分間かけて８℃で滴加する。８℃で３時間後、このスラリーをブラインの冷溶液（約３００ｍｌ）中に徐々に注ぐ。溶液をヘキサン（３×１５０ｍｌ）で抽出し、一緒にされた有機相をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、濾過して、室温で減圧濃縮して、淡い黄色油状物としてＳＧ２６１０ｇ（６９％）が得られる；ＩＲ（フィルム）Ｖmax ２１１４，３２９６ｃｍ-1；
【００７７】
【外１８】
0004270753.tif 000022
【００７８】
5 ＮｏｖｉｓＳｍｉｔｈ、Ｗ．及びＢｅｕｍｅｌ、Ｏ．Ｆ．Ｓｙｔｈｅｓｉｓ，１９７４，４４１−４４２。
６−ブロモニコチン及び５−ブロモニコチンと末端アルキンのカップリングに関する一般的方法（反応式５）
Ｅｔ3 Ｎ５ｍｌ中で６−ブロモニコチン6 （又は５−ブロモニコチン7 ）（０．２４ｇ，１ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニル−ホスフィン）パラジウムジクロライド（０．０１４ｇ，０．０２ｍｍｏｌ）及びＣｕＩ（０．００４ｇ，０．０２ｍｍｏｌ）を有する混合物をＮ2 で脱酸素化する。アセチレン化合物（１．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１２０℃で４０分間（５−ブロモニコチンに対しては４時間）密閉容器中で加熱する。Ｅｔ3 Ｎを減圧で蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液で洗浄し、２ＮＨＣｌ２０ｍｌで抽出する。酸性水相をＥｔＯＡｃ（４×２０ｍｌ）で抽出する。水相を固体ＮａＨＣＯ3 で飽和させ、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍｌ）で抽出する。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4 ）、濾過して、減圧で濃縮する。残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製する。
【００７９】
【外１９】
0004270753.tif 000023
【００８０】
メチル４−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）エチル］ベンゾエート（ＧＫ４７）
メチル４−エチニルベンゾエートを下記文献８にしたがって製造する。精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、アセトン／イソヘキサン（１：２）］；収率７８％；ｍｐ１０２−１０４℃（イソヘキサン）；
【００８１】
【外２０】
0004270753.tif 000024
【００８２】
メチル７−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）ヘプト−６−イノエート（ＧＫ７９）
メチル６−ヘプチノエートを下記文献９にしたがって製造する。精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、アセトン／イソヘキサン（１：２）］；収率７３％；
【００８３】
【外２１】
0004270753.tif 000025
【００８４】
メチル７−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）ヘプト−６−イノエート（ＧＫ７７）
メチル６−ヘプチノエートを下記文献９にしたがって製造する。精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、アセトン／イソヘキサン（１：２）］；収率６０％；
【００８５】
【外２２】
0004270753.tif 000026
【００８６】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）プロプ−２−イニル］シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル（ＧＫ７８）
精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、アセトン／イソヘキサン（１：２）］；収率８７％；
【００８７】
【外２３】
0004270753.tif 000027
【００８８】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロプ−２−イニル］シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル（ＧＫ７５）
精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、アセトン／イソヘキサン（１：２）］；収率５８％；
【００８９】
【外２４】
0004270753.tif 000028
【００９０】
２−（３−ヒドロキシ−３−メイルブト−１−イニル）−５−（１−メチル−２−ピロリジニル）ピリジン（ＧＫ５５）
精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、アセトン／イソヘキサン（１：１）］；収率９０％；
【００９１】
【外２５】
0004270753.tif 000029
【００９２】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロプ−２−イニル］シクロヘキシルメチルアミン（ＧＫ８９）
精製：カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ：ＮＨ3 で飽和されたＭｅＯＨ（１５：１）］；収率９０％；
【００９３】
【外２６】
0004270753.tif 000030
【００９４】
８−［（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル］オクト−７−インアミン（ＳＧ２９）
反応混合物を６時間加熱する。精製：カラムクロマトグラフィー［ＳｉＯ3 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（５：１：０．１）］；収率０．３６％（８６％）（回収された５−ブロモニコチンに対して）；ＩＲ（フィルム）Ｖmax ２２３２ｃｍ-1；
【００９５】
【外２７】
0004270753.tif 000031
【００９６】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）プロプ−２−イニル］シクロヘキシルメチルアミン（ＧＫ９０）
Ｅｔ3 Ｎ１５ｍｌ中で６−ブロモニコチン（０．４７ｇ，２ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム［（ｄｂａ）3 Ｐｄ2 ］（０．０１８ｇ，０．０２ｍｍｏｌ）、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン（ｄｐｐｐ）（０．０３２ｇ，０．０８ｍｍｏｌ）及びＣｕＩ（０．００８ｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を有する混合物をＮ2 で脱酸素化し、ＧＫ８８（０．３２６ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を１２０℃で６時間、密閉容器中で加熱する。Ｅｔ3 Ｎを減圧で蒸発させる。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、希ＮａＨＣＯ3 水溶液で洗浄し、２ＮＨＣｌ４０ｍｌで抽出する。酸性水相をＥｔＯＡｃ（４×２０ｍｌ）で抽出する。水相を固体ＮａＨＣＯ3 でｐＨ１２にアルカリ性化し、ＥｔＯＡｃ（５×３０ｍｌ）で抽出する。一緒にされた有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4 ）、濾過して、減圧で濃縮する。残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製する［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ：ＮＨ3 で飽和されたＭｅＯＨ（１５：１）］；ＧＫ９００．４３ｇ（７１％）を生じる；
【００９７】
【外２８】
0004270753.tif 000032
【００９８】
トランス−３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）アクリル酸メチルエステル（ＧＫ５９）
ＭｅＣＮ５ｍｌ中に５−ブロモニコチン（０．２４１ｇ，１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）2 （０．０１１ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、トリ−ｏ−トリルホスフィン（０．０６０ｇ，０．２ｍｍｏｌ）及びＥｔ3 Ｎ（０．１７ｍｌ，１．２５ｍｍｏｌ）を有する混合物をＮ2 で脱酸素化し、メチルアクリレート（０．１１２ｍｌ，１．２５ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を１１０℃で一晩密閉容器中で加熱する。ＭｅＣＮを減圧で蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液で洗浄し、２ＮＨＣｌ２０ｍｌで抽出する。酸性水相をＥｔＯＡｃ（４×２０ｍｌ）で抽出する。水相を固体ＮａＨＣＯ3 で飽和させ、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍｌ）で抽出する。一緒にされた有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4 ）、濾過して、減圧で濃縮する。残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製する［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（４０：１）］；収量０．２ｇ（８０％）；
【００９９】
【外２９】
0004270753.tif 000033
【０１００】
メチル４−［（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）エチニル］ベンゾエート（ＹＨ１９）
５−ブロモニコチン（０．４４ｇ，１．８２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）2 （６０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）、Ｐｈ3 Ｐ（０．１９ｇ，０．７２ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（３０ｍｇ）及びＥｔ3 Ｎ（３０ｍｌ）を有する混合物を、３０分間室温で攪拌する。メチル４−エチニルベンソエート8 （０．３２ｇ，２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩還流する。反応混合物を室温に到達させ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （１２０ｍｌ）で希釈し、Ｈ2 Ｏで洗浄する。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ4 ）、濾過して、濃縮する。残留物をカラムクロマトグラフィー［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（５０：１）］によって精製して、ＹＨ１９０．３７ｇ（６４％）が得られる。分析試料をＥｔＯＨ／イソヘキサンから再結晶させる；
【０１０１】
【外３０】
0004270753.tif 000034
【０１０２】
エステル加水分解に関する一般的方法（反応式６）
４−［（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）エチニル］安息香酸（ＧＫ４９）
５０％ＭｅＯＨ水溶液（１０ｍｌ）中にＧＫ４７（０．１８５ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）及びＫＯＨ（０．０９７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を有する混合物を３０分間還流下に加熱する。反応混合物をＨＯＡｃでｐＨ８に酸性化し、溶剤を減圧で蒸発させる。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製する（シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨ１０％〜５０％の勾配）。溶剤を減圧で蒸発させる。残留物をＣＨＣｌ3 ／ＥｔＯＨ（９５：５）に溶解し、濾過して、減圧で蒸発させ、ＧＫ４９０．１７ｇ（９６％）が得られる；
【０１０３】
【外３１】
0004270753.tif 000035
【０１０４】
７−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）ヘプト−６−イノン酸（ＧＫ８１）
この化合物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（５：１）］によって精製する；収率９３％；
【０１０５】
【外３２】
0004270753.tif 000036
【０１０６】
７−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）ヘプト−６−イノン酸（ＧＫ８０）
この化合物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（５：１）］によって精製する；収率７９％；
【０１０７】
【外３３】
0004270753.tif 000037
【０１０８】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）プロプ−２−イニル］シクロヘキサンカルボン酸（ＧＫ８３）
この化合物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１０：１）］によって精製する；収率８０％；
【０１０９】
【外３４】
0004270753.tif 000038
【０１１０】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロプ−２−イニル］シクロヘキサンカルボン酸（ＧＫ８２）
この化合物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１０：１）］によって精製する；収率８５％；
【０１１１】
【外３５】
0004270753.tif 000039
【０１１２】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロピル］シクロヘキサンカルボン酸（ＧＫ９５）
この化合物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１０：１）］によって精製する；収率９３％；
【０１１３】
【外３６】
0004270753.tif 000040
【０１１４】
トランス−３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）アクリル酸（ＧＫ６２）
この化合物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＥｔＯＨ（１：１）］によって精製する；収率８２％；
【０１１５】
【外３７】
0004270753.tif 000041
【０１１６】
４−［（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）エチニル］安息香酸（ＹＨ２０）
ＫＯＨ（１６８ｍｇ、３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のＹＨ１９（０．３２ｇ，１ｍｍｏｌ）に添加する。攪拌された混合物を２時間還流し、ついで室温に冷却する。ＨＯＡｃを添加してｐＨ８とし、揮発性物を蒸発させる。残留物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（５：１）］によって精製して、ＹＨ２００．１９ｇ（６２％）が得られる。
【０１１７】
【外３８】
0004270753.tif 000042
【０１１８】
４−（３−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−５−イルエチル）安息香酸（ＹＨ２４）
ＫＯＨ（１３０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）をＹＨ２２（０．１２ｇ，０．３７ｍｍｏｌ）、Ｈ2 Ｏ（３ｍｌ）及び１，４−ジオキサン（３ｍｌ）を有する溶液に添加する。２時間還流後、混合物のｐＨをＨＯＡＣの添加によって８に調整する。揮発性物を蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（２：１）］によって精製して、ＹＨ２４７０ｍｇ（６１％）が得られる。
【０１１９】
【外３９】
0004270753.tif 000043
【０１２０】
三重結合の水素化に関する一般的方法（反応式７）
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）プロピル］シクロヘキサンカルボン酸（ＧＫ８４）
ＥｔＯＨ４０ｍｌ中のＧＫ８３（０．１５３ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を１時間炭素に担持された１０％パラジウム０．１ｇを介して室温で及び大気圧で水素化する。触媒を濾過して、ＥｔＯＨで洗浄する。溶剤を減圧で蒸発させ、残留物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１０：１）］によって精製し、ＧＫ８４０．０７ｇ（４５％）が得られる。
【０１２１】
【外４０】
0004270753.tif 000044
【０１２２】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロピル］シクロヘキシルメチルアミン（ＧＫ９３）
精製：カラムクロマトグラフィー［アルミナ、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ、メタノール１０％〜５０％の勾配］；収率７８％；
【０１２３】
【外４１】
0004270753.tif 000045
【０１２４】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロピル］シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル（ＧＫ９４）
精製：カラムクロマトグラフィー［アルミナ、アセトン／イソヘキサン（１：２）］；収率７９％；
【０１２５】
【外４２】
0004270753.tif 000046
【０１２６】
トランス−４−［３−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル）プロピル］シクロヘキシルメチルアミン（ＧＫ９６）
精製：分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＮＨ3 で飽和されたＭｅＯＨ（１５：１）］；収率８１％；
【０１２７】
【外４３】
0004270753.tif 000047
【０１２８】
８−［５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニル］オクタンアミン（ＧＫ３０）
ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）中にＳＧ２９（０．２ｇ，０．７ｍｍｏｌ）を有する溶液を室温で及び大気圧で１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を介して水素化する。１５分後、触媒を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄する。揮発性物質を減圧で蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー分離［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（５：１：０．１）］して、無色油状物としてＳＧ３００．１６ｇ（７６％）が得られる。
【０１２９】
【外４４】
0004270753.tif 000048
【０１３０】
４−［２−（５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニル）エチル］安息香酸（ＧＫ５４）
ＭｅＯＨ２０ｍｌ中のＧＫ４９（０．０９ｇ，０．２９ｍｍｏｌ）を室温及び大気圧で炭素上に担持された１０％パラジウム０．０３ｇを介して６時間水素化する。触媒を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄する。揮発性物質を減圧で蒸発させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー［ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（５：１）］によって精製して、ＧＫ５４０．０５２ｇ（５７％）が得られる。
【０１３１】
【外４５】
0004270753.tif 000049
【０１３２】
メチル４−（３−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−５−イルエチル］ベンゾエート（ＹＨ２２）
ＭｅＯＨ１０ｍｌ中にＹＨ１９（０．１５ｇ，０．４６８ｍｍｏｌ）及びＰｄ（Ｃ）（１０％、２０ｍｇ）を有する混合物を大気圧及び室温で１日間水素化する。触媒をセライトによって濾過して除去し、濾液を濃縮する。残留物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（６０：１）］によって精製して、ＹＨ２２０．１５ｇ（９５％）が得られる。
【０１３３】
【外４６】
0004270753.tif 000050
【０１３４】
２−エチニル−５−（１−メチル−２−ピロリジニル）ピリジン（ＧＫ５８）
ＧＫ５５（０．３ｇ，１．２３ｍｍｏｌ）及び鉱油中の６０％分散液としてＮａＨ（０．０１ｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を乾燥トルレン（５０ｍｌ）に溶解する。攪拌された溶液を留出物の沸点が１１０℃に達するまで徐々に蒸留する（留出物約２５ｍｌが集められる）。トルエンの残留物を減圧で蒸発させる。残留物をクロマトグラフィー分離し［ＳｉＯ2 、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１０：１）］、褐色油状物としてＧＫ５８０．２ｇ（８７％）が得られる。
【０１３５】
【外４７】
0004270753.tif 000051
【０１３６】
ＧＫ５６及びＧＫ６０の合成（反応式８）
５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−ピリジニルプロピオール酸（ＧＫ６０）
ＴＨＦ（２０ｍｌ）中にＧＫ５８（０．１７５ｇ，０．９４ｍｍｏｌ）を有する溶液を−７８℃に冷却し、ＢｕＬｉ（１．６Ｍヘキサン溶液、０．６２ｍｌ，０．９４ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を０．５時間−７８℃で攪拌し、ついでＣＯ2 ガスを添加する。−７８℃さらに１時間後、反応混合物を室温に加温すさせる。ＴＨＦを減圧で蒸発させ、残留物を分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１：１）］によって精製する；収量０．２０ｇ（９０％）；
【０１３７】
【外４８】
0004270753.tif 000052
【０１３８】
５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−３−ピリジニルプロピオール酸（ＧＫ５６）
ＧＫ６０の合成に関して記載した方法にしたがってこの化合物を３−エチニル−５−（１−メチル−２−ピロリジニル）ピリジン7 から合成し、分取ＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１：１）］によって精製した後ＧＫ５６が８０％収率で得られる；
【０１３９】
【外４９】
0004270753.tif 000053
【０１４０】
ＩＩＩ．種々のニコチン免疫原（ニコチン- リンカー- キャリヤー蛋白質）の調製（反応式９）
巻き貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）へのカルボン酸のカップリングに関する一般的方法
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の溶液（９当量）及び蒸留Ｈ2 Ｏ( ５００μＬ）を、蒸留Ｈ2 Ｏ( ５００μＬ）中に酸（１当量）を有する混合物に添加する。１０分後、蒸留Ｈ2 Ｏ（１ｍｌ）中にＫＬＨ（酸と同一の量（ｍｇ））を有する混合物を添加する。反応混合物を０℃で１０分間、ついで環境温度で一晩保つ。反応混合物のｐＨを反応の間ｐＨ４．５−６で保つ。蛋白質結合体をカラムクロマトグラフィー［Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍ、（ＰＤ−１０カラム）、蒸留Ｈ2 Ｏで溶離］によって精製し、ついで凍結乾燥する。
ＫＬＨへのアミンのカップリングに関する一般的方法
ＫＬＨ（酸と同一の量（ｍｇ））及びＨ2 Ｏ( １ｍｌ）の混合物を、Ｈ2 Ｏ( ５００μＬ）中にアミン（１０ｍｇ）を有する混合物に０℃で添加する。Ｈ2 Ｏ( ５００μＬ）中にＥＤＣ（９当量）を有する溶液を、反応混合物に添加し、混合物を０℃で１０分間、ついで環境温度で一晩保つ。反応混合物のｐＨを反応の間ｐＨ４．５−６で保つ。蛋白質結合体をカラムクロマトグラフィー［Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍ、（ＰＤ−１０カラム）、蒸留Ｈ2 Ｏで溶離］によって精製し、ついで凍結乾燥する。
反応式１．ニコチン免疫原の製造
【０１４１】
【化７】
0004270753.tif 000054
【０１４２】
反応式２．６−アミノニコチン−リンカー分子の合成
【０１４３】
【化８】
0004270753.tif 000055
【０１４４】
反応式３．５−アミノニコチン誘導体の合成
【０１４５】
【化９】
0004270753.tif 000056
【０１４６】
反応式４．いくつかのリンカーの合成
【０１４７】
【化１０】
0004270753.tif 000057
【０１４８】
反応式５．５−又は６−ブロモニコチンへの不飽和誘導体のパラジウム触媒によるカップリング反応
【０１４９】
【化１１】
0004270753.tif 000058
【０１５０】
反応式６．エステルの加水分解
【０１５１】
【化１２】
0004270753.tif 000059
【０１５２】
反応式７．三重結合の水素化
【０１５３】
【化１３】
0004270753.tif 000060
【０１５４】
反応式８．ＧＫ５６及びＧＫ６０の合成
【０１５５】
【化１４】
0004270753.tif 000061
【０１５６】
反応式９．ニコチン−リンカー−ＫＬＨ誘導体（ニコチン免疫原）の合成
【０１５７】
【化１５】
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【０１５８】
実験の説明
材料及び方法
動物
雄性ウスター（Ｗｉｓｔｅｒ）ラットを標準実験室条件下で２〜３匹一組で飼い、食餌及び水に無制限に近づけ１２ｈｒ明暗サイクル（０６００ｈｒでの明るさ）下で維持される。
【０１５９】
免疫処置方法
３つの免疫処置プロトコルを使用する：
１．動物を５日間毎日免疫処置し、２日間休み、ついで再び５日間毎日免疫処置する。各免疫注射は、生理食塩水０．１ｍｌ中の抗体１０μｇ（ニコチン−リンカー- ＫＬＨ接合体）を含有し、胴体の背部首領域に皮下投与（ｓ．ｃ．）する。コントロールには、生理食塩水０．１ｍｌ中のＫＬＨ１０μｇ又は生理食塩水０．１ｍｌのみを注射する。
２．動物は、ボラス注射で抗体（ニコチン−リンカー- ＫＬＨ結合体）１００μｇ及びフロインド完全アジュバントを用いて免疫処置され、１１又は１４日目に抗体（ニコチン−リンカー- ＫＬＨ結合体）１００μｇ及びフロインド不完全アジュバントを含有するブースター注射を行う。これらの注射は０．４ｍｌで腹腔内に行われる。コントロールにはフロインド完全アジュバント中のＫＬＨ１００μｇ又はフロインド完全アジュバントのみを注射する。ブースター注射中にフロインド不完全アジュバントをフロインド完全アジュバントの代わりに使用する。
３．ニコチン自己管理された動物をボラス注射で抗体（ニコチン−リンカー- ＫＬＨ結合体）１００μｇ及びフロインド完全アジュバントを用いて免疫処置され、７又は８日目に抗体（ニコチン−リンカー- ＫＬＨ接合体）１００μｇ及びフロインド不完全アジュバントを含有するブースター注射を行う。これらの注射は０．４ｍｌで腹腔内に行われる。
【０１６０】
Ｅｌｉｓａ（エライサ）
Ｅｌｉｓａプレート（Ｓｉｇｍａ又はＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）をニコチン−リンカーＢＳＡ結合体で被覆する。必要に応じて、このプレ−トをＰＢＳ中に３％ＢＳＡを有する溶液を用いて塞ぐ。広範な洗浄後、血清を種々の希釈（１：１〜１：３９０６２５）で添加し、プレートを３７℃でインキュベートする。プレートを再び洗浄し、２番目の抗体、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗- ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の添加後、更に３７℃でインキュベートする。酵素基質ｐ−ニトロフェニルリン酸塩（ｐ−ＮＰＰ）（Ｓｉｇｍａ）は４０５ｎｍで分光光度で読み取ることができる着色された最終生成物を産生する。
【０１６１】
競合Ｅｌｉｓａ
競合Ｅｌｉｓａを血清の一元希釈（１：３１２５）を使用する以外は、通常のＥｌｉｓａのように行われる。ニコチン、コチニン、ノルニコチン、ニコチン−Ｎ−オキシド及びナイアシンそれぞれを競合物として使用する。
ＶＴＡ中のドパミンニューロンの電気生理学的単一細胞記録
実験の間、外科的な麻酔状態を維持する必要がある場合にさらに投与される薬用量と共に抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）を用いてラットを麻酔する。体温を温度自動調節で調節された加熱パッドを用いて３７℃で保つ。気管カニューレ及び頸静脈カテーテルを、動物がＤａｖｉｄＫｏｐｆ定位装置中で載せられる前に挿入する。穴を記録域の上、すなわちラムダから測定されるＡｐ＋３．０及びＭＬ±０．７ｍｍにあける（Ｐａｘｉｎｏｓ及びＷａｔｓｏｎ、１９８６）。電極をオメガドットガラスキャピラリーから引き、２Ｍ酢酸ナトリウム中のＰｏｎｔａｍｉｎｅＳｋｙＢｌｕｅ（２％）で満たす。チップを顕微鏡下で細分し、１３５Ｈｚで測定された約２．０ＭΩのインピーダンスを生じる。推定されるＤＡニューロンが前もって組織化学的に同定されたＤＡニューロンの特性（Ｇｒａｃｅ及びＢｕｎｎｅｙ、１９８３；Ｗａｎｇ、１９８１）、すなわち２．０ｍｓ以上続く典型的な三相スパイク（triphasic spike)波形及び１〜１０Ｈｚの基礎放電（ｂａｓａｌｆｉｒｉｎｇ）率で脳表面から７．５−８．５ｍｍに見出される。細胞外作用電位を増幅し、判別し、オシロスコープ及びオーディオモニターで記録する。判別されたスパイクをＣａｍｂｒｉｄｇｅＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓｄｅｓｉｇｎ１４０１ｉｎｔｅｒｆａｃｅを介して、Ｓｐｉｋｅ２ソフトウエアーを有するＡＳＴＢｒａｖｏＬＣ４／６６ｄコンピューターに供給する。ＤＡニューロンの一時の放電パターンの分析を、オフラインで当社の研究所で開発された慣用の分析スクリプトを用いて行う。バースト放電（ｂｕｒｓｔｆｉｒｉｎｇ）、放電率及び種々の係数を２５０の連続インタースパイク（ｉｎｔｅｒ−ｓｐｉｋｅ）間隔の間で算出する。バーストの開始を、８０ｍｓよりも短い間隔として及びバースト終了を１６０ｍｓを超える次の間隔で限定する（Ｇｒａｃｅ及びＢｕｎｎｅｙ、１９８４）。バースト放電をバースト中のスパイクとスパイク総数の間の百分率として定量化する。種々の係数を標準偏差とインタースパイク間隔の平均値の間の百分率として定義する（Ｗｅｒｎｅｒ及びＭｏｕｎｔｃａｓｔｌｅ、１９６３）。
【０１６２】
ニコチンを各段階で薬用量を倍にして投薬量範囲３〜１００μｇ／ｋｇ（累積薬用量）で静脈内に投与する。ニコチン注射を３−５分ごとに行う。各実験の最後に、５μＡの負電流を電極によって１０分間流し、記録部位を印す（Ｌｏｄｇｅ等、１９７４）。動物を抱水クロラールの過剰投与量で殺害し、脳を２５％ショ糖中の５％ホルムアルデヒド中で保存し、その後厚さ５０μｍの断片にミクロトーム上でスライスし、記録部位の組織学的証明にニュートラルレッドで着色する。ＶＴＡ内にある記録部位のみがこのプロトコルで容認される。
【０１６３】
電圧電流法
ドパミンの電圧電流測定をパルジリン(pargyline) で前処理されたラットで行い、抱水クロラール麻酔下で保つ。炭素繊維電極の活性部分は厚さ１２μｍ及び長さ５００μｍである。電極をＧｏｎｏｎ（１９８８）によって記載されているように調製し、処理する。電極をＮＡＣshell に関して座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）：ＡＰ＝＋１．６及びＭＬ＝±０．８に位置づける（Ｐａｘｉｏｎｓ及びＷａｔｓｏｎ、１９８６）。電極のチップを大脳皮質表面下６．５−７．０ｍｍに置き、示差正常パルス(differential normal puls)電圧電流法を使用して、前記パラメーターと共に毎分ボルタンモグラムを記録する（Ｇｏｎｏｎ等、１９８４及びＧｏｎｏｎ、１９８８）。安定なベースラインを観察する場合、動物に生理食塩水を静脈内注射し、その後ニコチンを増加する量で（６、１２、２４及び４８μｇ／ｋｇ）を１０分毎に投与する。
【０１６４】
例
現在、１６個の異なるニコチン免疫原を試験管内法及び生体内法の双方で免疫原性に関してテストする。
【０１６５】
例１
Ｅｌｉｓａ
プロトコル２にしたがってＧＫ５−ＫＬＨで免疫処置されたラットを使用する。Ｅｌｉｓａ試験用血液サンプルを最初のボラス免疫処置７又は９日後に集める。Ｅｌｉｓａ抗体力価は１：１００〜１：１５０００に及ぶ（図１参照）。血液サンプルをブースター免疫処置後１〜４日目に再度集める。この第二免疫処置は１：３０００〜１：１５５００の力価を生じる（図２参照）。
【０１６６】
例２
免疫処置プロトコル２を用いてＧＫ５−ＫＬＨで免疫処置後、実験動物からの血清を集め、その特異抗体力価は主として１：５００〜１：３０００（Ｅｌｉｓａ法で測定される）である。アドジュバントを含有する免疫処置プロトコル２は特異抗体のより高い力価、主として１：３０００〜１：１５０００を生じる（図３参照）。すべてのテストされたニコチン免疫原、たとえばＧＫ５−ＫＬＨ、ＧＫ６０−ＫＬＨ、ＹＫ６−ＫＬＨ、ＧＫ８４−ＫＬＨ及びＧＫ８０−ＫＬＨをプロトコル２を用いて免疫処置する。この力価は少なくとも１ヶ月間安定である。
【０１６７】
例３
競合Ｅｌｉｓａ
競合Ｅｌｉｓａを免疫処置されたラットからの血清サンプルで行う。ニコチン、代謝産物コチニン、ノルニコチン、ニコチン−Ｎ−オキシド及びナイアシン（非代謝産物）を競合物として使用する。競合物濃度は６×１０-10 〜６×１０-6Ｍに及ぶ。プロトコル２を用いて免疫処置後、免疫原はコチニン、ニコチン−Ｎ−オキシド及びナイアシンに対するよりもニコチンに対して特異的である抗体を生じる（図４参照）。ほとんどの場合、ニコチン及びノルニコチンに対する特異性は類似する。コチニンは主要なニコチン代謝産物（８０％）であり（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ等、１９９４）、したがってニコチン抗体はコチニンに対するよりもニコチンに対して大きい特異性を有することが重要である。一方、ニコチンの０．４％しかノルニコチンへ代謝されない（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ等、１９９４）という事実からみれば、ニコチン及びノルニコチンに対する特異性での類似性は顕著な役割を果さないはずである。
【０１６８】
例４
電気生理学
ラット腹側被蓋域ドパミンニューロンからの電気生理学的単細胞記録から、ニコチンが静脈内投与された場合（３−４８μｇ／ｋｇ）、コントロール（ＫＬＨ免疫処置された）ラット中のドパミン細胞は変動係数によって評価されるように平均放電率及びバースト放電（図５参照）における増加及び放電パターンの緩和（deregularization) で一般に応答する。テストされたラット６匹のうちの５匹はニコチンに応答する。その変化は６μｇ／ｋｇほど低いニコチン薬用量ですでに明らかである。ラット６匹のうちの３匹で、活性化は薬剤の投与後直ちにニューロン性活性の一時の（すなわち＜１分）、しかし顕著な増加を伴う。これらの他に、ニコチン投与前にバーストを示さない２つの細胞はニコチン投与（６μｇ／ｋｇ）後に急激なパターンに変わる。
【０１６９】
これとは対照的に、免疫処置プリトコル１を用いてＧＫ５−ＫＬＨで免疫処置されたラット４匹のうち１のみがドパミンニューロン性活性の増加でニコチンに応答する。さらに、ニューロン性活性の一時の増加は観察されないず、ニコチンの極めて高い薬用量を投与したとしても急激でない放電パターンの急激な放電パターンへの変化も観察されない（図６参照）。
【０１７０】
一般に、したがって免疫処置されたラットは、腹側被蓋域ドパミンニューロン活性へのニコチンの活性化作用にあまり敏感性を示さない。特に、免疫処置されたラットはニコチン様非免疫処置されたラットのように低い薬用量（すなわち＜１２μｇ／ｋｇ）によって活性化されず、そして細胞はコントロール動物に見られるように、ニコチンの全身(systemic)注射に応じて即座の活性化にも応答しない。
【０１７１】
結論として、これらの実験から、タバコ１又は２本を吸うことによって摂取されたヒトと同等の少量のニコチン量を投与した後、使用された免疫原はメソリンビック(mesolimbic)ドパミンニューロン中でバースト放電の急性刺激を大いに予防するのに有効であることが実証される。すべての蓋然性において、たとえば脳の報償システムへのタバコの一服の急性効果が喫煙において増強単位に相当することから、この化合物はまったく有望であるようにみえる。
【０１７２】
例５
電圧電流法
コントロールで、ニコチン投与は中隔側坐核でＤＡ−産生の薬用量依存増加を生じる。これに反して、能動免疫は、ＤＡ−流出へのニコチン作用を変化させる中隔側坐核（図７ａ，ｂ及びｃ）。免疫原、すなわちニコチン性ハプテンの特性にしたがって、ドパミン産生へのニコチンの作用はベースラインレベルに抑制することができるか（図７ａ）又はそれよりむしろ逆説的にいっても増加させることができる（図７ｂ）。ニコチンでの急性実験３週間前にすでに免疫が生じる研究（図７ｃ）で、動物はメソリンビックドパミンシステム、すなわち第一報酬経路への高い薬用量でさえニコチンの中枢作用にまだ著しい減少を示す。これはニコチンの自己抑制及びその依存傾向を決定的に立証する。
【０１７３】
実験の説明に開示された文献
【０１７４】
【外５０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＥｌｉｚａＧＫ５−ＫＬＨ測定を示す。
【図２】  図２は、ＥｌｉｚａＧＫ５−ＫＬＨ（ブースター（追加抗原）免疫）測定である。
【図３】  図３は、免疫ラットからの血清のＥｌｉｚａ力価測定である。
【図４】  図４は、競合Ｅｌｉｚａである。
【図５】  図５は、コントロールラットでのＶＴＡＤＡニューロンからの電気生理学的単個細胞記録である。
【図６】  図６は、免疫ラットでのＶＴＡＤＡニューロンからの電気生理学的単個細胞記録である。
【図７ａ】図７ａは、免疫原ＧＫ８４−ＫＬＨを用いる能動免疫による中隔側坐核中でのニコチン誘発されたドパミン放出の効果的抑制を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、免疫原ＧＫ８０−ＫＬＨを用いる能動免疫によるニコチン投与後の中隔側坐核中でのドパミン流出の増加を示す。
【図７ｃ】図７ｃは、３週間以上安定な、ニコチン誘発されたドパミン産出での免疫原ＹＨ６−ＫＬＨによる免疫効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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