(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質及びヒト皮膚線維芽細胞をコラーゲン溶液に添加し、形成するコラーゲンゲルの強度を応力緩和試験、クリープ試験及び動的粘弾性試験のいずれか１つ以上により測定し、次いで被検物質無添加の場合のコラーゲンゲル強度と対比することを特徴とする当該被検物質の老化による皮膚タルミ改善作用の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体の皮膚タルミ改善作用の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
老化における典型的な顔面の形態変化であるシワやタルミを予防・改善するのに有効な物質を発見あるいは製造することは、社会における重要な課題の一つである。このうち、シワ改善物質としてはレチノイン酸等数種の物質が知られているが、タルミ改善物質については全く知られていない。
【０００３】
その原因の一つとしてタルミ改善物質の評価方法として唯一知られているin vivo評価法は、費用、時間、手間等がかかり、評価能率の点で非常に問題があることが挙げられる。このような事情から、簡便、安全かつ正確に皮膚タルミ改善物質を評価する方法の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的はin vitroで簡便かつ正確に皮膚のタルミ改善作用を評価できる方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は真皮結合組織に多量に存在するコラーゲンに着目し、真皮結合組織のモデルとして知られているコラーゲン埋包培養におけるゲル強度と皮膚のタルミとの関係について検討してきたところ、当該ゲル強度を向上させる物質は皮膚のタルミを改善させる作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、被検体及び哺乳類由来の線維芽細胞をコラーゲン溶液に添加し、形成するコラーゲンゲルの強度を応力緩和試験、クリープ試験及び動的粘弾性試験のいずれか１つ以上により測定し、次いで被検体無添加の場合のコラーゲンゲル強度と対比することを特徴とする当該被検体の老化による皮膚タルミ改善作用の評価方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
皮膚は表皮、真皮、皮下組織の３層に主に分けられ、それらのうち真皮は皮膚の構造を維持する上で極めて重要であり、コラーゲンやエラスチンといった線維により強固かつ柔軟に造られ、真皮結合組織を形成している。これらコラーゲンやエラスチンといった結合組織の線維を構成するタンパク質は、線維芽細胞により合成／分解されている。線維芽細胞はこれらコラーゲン等の線維と相互作用することにより結合組織の状態をコントロールしている。
【０００８】
通常の線維芽細胞培養条件下、線維芽細胞をコラーゲンゲル中に埋包して培養するとコラーゲンゲルは収縮し、ゲル強度を増す。線維芽細胞の存在しないコラーゲンのみのゲルや、リンパ球など浮遊性の細胞を埋包したゲルでは収縮は全く起こらず、ゲル強度にも変化はない。コラーゲンゲル埋包培養は一般に真皮結合組織のモデルとされている（Review: E. Bell et al. J. Invest. Dermatol.,８１，２ｓ（１９８３）等）。当該コラーゲンゲル埋包培養を利用したデータとしては、老齢者由来の線維芽細胞埋包コラーゲンゲルと若年者由来の線維芽細胞埋包コラーゲンゲルとを対比し、老齢者の場合は若年者の場合に比べてゲルの収縮が低下していることが知られている（M. Yamato, et al. Mech. Ageing Dev.,６７，１４９（１９９３））。
【０００９】
しかしながら、かかる細胞埋包コラーゲンゲルの強度と皮膚のタルミとの関係について検討した報告はなく、これらの間に相関性があることを見出したのは本発明者がはじめてである。
【００１０】
本発明に使用される動物細胞としては、コラーゲンゲルを収縮させる作用のある細胞であれば正常又はトランスフォームされたものでも、皮膚弛緩症等の患部由来のものでも、正常組織由来のものでも、いかなる組織のものでもいずれも利用できるが、正常の皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞、歯肉線維芽細胞、軟骨細胞、肝細胞、血管内皮細胞等がより好ましい。更には皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞がより好ましい。
【００１１】
細胞由来の動物としては哺乳類が好ましく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウシ、サル、ニワトリ、ウマ等が挙げられるが、この中でヒト、マウス、ラット、ウサギがより好ましい。これらの細胞は初代培養のものでも継代を繰り返したあとのin vitro老化させた細胞であってもよく、また、胎児由来のものであっても老齢者由来のものであってもよい。これらの細胞は組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品を購入して用いてもよい。
【００１２】
本発明に使用されるコラーゲンとしては、動物由来のコラーゲンであればいずれでもよいが、動物としては哺乳類が好ましく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ等由来のコラーゲンがより好ましい。これらのコラーゲンは組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品（例えば新田ゼラチン社製、typeI-A）を購入して用いてもよい。
【００１３】
本発明に使用されるコラーゲンゲルは公知の方法に準じて作製できる。コラーゲンゲル作製時のコラーゲンの濃度は特に制限されないが、０．１〜５．０mg／mlが好ましく、０．５〜３．０mg／mlがより好ましい。この際埋包される動物細胞の密度は特に制限されないが、１，０００〜５，０００，０００cells／mlが好ましく、５，０００〜５００，０００cells／mlがより好ましい。作製されるコラーゲンの形状はいずれの形状でもよいが、円形の培養プレートで作製した円柱型が好ましい。
【００１４】
被検体はコラーゲンゲル作製時のコラーゲン溶液中に添加すればよい。
【００１５】
本発明のコラーゲンゲルの強度の測定法は応力緩和試験、切断試験、クリープ試験、引っ張り試験等いずれでもよいが、応力緩和試験、クリープ試験がより好ましい。また、動的粘弾性試験を行ってもよい。本発明において、コラーゲンゲルの作製時から強度の測定時までの培養期間は特に制限されないが、１日〜６０日がより好ましい。
【００１６】
被検体添加コラーゲンゲルの強度を被検体無添加の場合と対比することにより、当該被検体のタルミ改善作用が評価できる。すなわち、被検体無添加の場合に比べて被検体添加の場合のゲル強度が上昇していれば、その被検体には皮膚のタルミを改善する作用があると評価できる。
【００１７】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
コラーゲンゲルの応力緩和試験によるゲル形成強度の評価
コラーゲンゲルは文献「J. Cell Science,１０２，３１５（１９９２）」又は「J. Invest. Dermatol.９３，７９２（１９８９）」に準じた方法で作製した。すなわち、氷冷下コラーゲン溶液（新田ゼラチン社製、typeI-A（３．０mg／ml，pH＝３））にＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Bagle Medium low glucose）濃縮溶液、中和液（２５０mM  ＨＥＰＥＳ含有０．０５Ｍ  ＮａＯＨ水溶液）、ＦＣＳ（５％、Fatal Calf Serum）、精製水を加えて十分に攪拌し、中和した後、最後にヒト皮膚線維芽細胞（ヒト包皮、１歳、由来）の懸濁液を加えて、十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、１２穴プレートに各穴３mlずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化させた。この際の細胞密度を１万個／ml、５万個／ml、１５万個／mlの３種の濃度として比較検討した。またコラーゲン濃度は１．５mg／mlに調製した。２４時間後ゲルの周囲を剥離し、培地を加えて培養し、１０日培養後に測定を行った。
【００１９】
ゲルの形成強度試験は物性測定機器（Rheometer 2002DD、不動工業社製）を用いて応力緩和時間を測定した。アダプターは、収縮したゲルの直径（最小８mm程度）を考慮し直径５mmのものを使用した。応力は５ｇ、応力緩和測定時間は９０秒とした。
ゲルを短時間（数秒間）キムワイプ（ワイパーＳ２００）に触れさせて余分な水分を除き、直ちに測定を開始した。測定は温度２０〜２２℃、湿度３５〜４５％の条件下で行った。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
0004225588.tif 000002
【００２１】
表１より、細胞密度が高くなるにつれコラーゲンゲルの緩和時間は増大し、ゲル強度が増加していることがわかる。また、緩和率は細胞密度が高くなるにつれ低下することからもゲル強度が増加していることが明らかである。
【００２２】
実施例２
コラーゲンゲル形成強度試験とタルミの相関性
老齢者由来と若齢者由来の皮膚線維芽細胞についてコラーゲンゲル形成強度について評価した。
実施例１と同様氷冷下コラーゲン溶液に中和液、ＤＭＥＭ濃縮溶液、ＦＣＳ、精製水を加えて、十分に攪拌中和した後、最後にヒト皮膚線維芽細胞（老齢者由来：６４歳から７５歳、ｎ＝５、若齢者由来０歳から２０歳、ｎ＝５）の懸濁液を加えて十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、１２穴プレートに各穴３mlずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化させた。この際の細胞密度は５万個／mlとし、また、コラーゲン濃度は１．５mg／mlに調製した。２４時間後ゲルの周囲を剥離し、培地を加えて培養し、１０日培養後に測定を行った。
ゲルの形成強度試験は実施例１と同様に測定した。結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
0004225588.tif 000003
【００２４】
表２より、若齢者由来のものより老齢者由来の細胞の方がコラーゲンゲルの緩和時間は減少し、ゲル強度が低下していることがわかる。また、緩和率は若齢者由来のものより老齢者由来の方が増加することからもゲル強度が低下していることが明らかである。
【００２５】
更に、１０歳代から７０歳以上までのヒト（ｎ＝２００）の顔面部のタルミスコアをパネラー５人により評価した。タルミスコアは以下の基準でつけた。結果を表３に示す。
【００２６】
スコア０：全く弛んでいない
スコア１：微かに弛んでいる感じがする
スコア２：やや弛んでいる
スコア３：弛んでいる
スコア４：非常に弛んでいる
【００２７】
【表３】
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【００２８】
表３より明らかなように、若齢者よりも老齢者の方がタルミの程度が高いことがわかる。
表２及び表３よりコラーゲンゲルの強度と皮膚のタルミには負の相関性、すなわちゲル強度の低下とタルミの程度に相関が得られていることは明らかである。
【００２９】
実施例３
コラーゲンゲルの形成強度試験による被験物質の評価
実施例１と同様氷冷下コラーゲン溶液に中和液、ＤＭＥＭ濃縮溶液、ＦＣＳ、精製水を加えて十分に攪拌中和した後、最終濃度０．０１％（乾燥固形換算重量％）の被験物質（各種植物エキス及びコントロールとしてその抽出溶媒であるエタノール、ブチレングリコール）を加え、最後にヒト皮膚線維芽細胞の懸濁液を加えて、十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、１２穴プレートに各穴３mlずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化させた。この際の細胞密度は５万個／mlとし、また、コラーゲン濃度は１．５mg／mlに調製した。２４時間後ゲルの周囲を剥離し、培地を加えて培養し、１０日培養後に測定を行った。
ゲルの形成強度試験は実施例１と同様に測定した。結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
表４より明らかなように、種々の植物エキスによりコラーゲンゲルの緩和時間は増大し、ゲル強度が増加していることがわかる。また、緩和率が種々のエキスを加えることにより低下することからもゲル強度が増加していることが明らかである。
【００３２】
一方、上記被検物質について皮膚に長期間の塗布を行い、皮膚のタルミ改善作用を市販の皮膚粘弾性測定機（Custometer  ＳＥＭ４７４（Courage & Khazaka)）により評価したところ、表４のデータと正の相関性が確認された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便、安全かつ正確に皮膚タルミ改善物質を評価することができる。