(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４つのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、前記すべてのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であり、
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変されたチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞に、ヒトアンチトロンビンＩＩＩをコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体により得られることを特徴とする、組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ組成物。
【請求項２】
４つのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が、それぞれヒトアンチトロンビンＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列の９６、１３５、１５５、および１９２位のアスパラギン残基に結合する糖鎖である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＣＨＯ細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
形質転換体がＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８３またはＦＥＲＭ−１００８８である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒトアンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、３３〜４６４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒトアンチトロンビンＩＩＩが、配列番号１で表される塩基配列において、９７〜１３９２番目の塩基配列からなるＤＮＡがコードするポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項１６】
医薬が、血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
４つのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、前記すべてのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法であって：
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変されたチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞にヒトアンチトロンビンＩＩＩをコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にアンチトロンビンＩＩＩ組成物を生成蓄積させ、該培養物から該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を単離することを特徴とする製造方法。
【請求項１８】
４つのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が、それぞれヒトアンチトロンビンＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列の９６，１３５，１５５、および１９２位のアスパラギン残基に結合する糖鎖である、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
ＣＨＯ細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞である、請求項１７または１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２１】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２３】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２４】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２５】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２６】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２８】
形質転換体がＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８３またはＦＥＲＭ−１００８８である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２９】
ヒトアンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、３３〜４６４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３０】
ヒトアンチトロンビンＩＩＩが、配列番号１で表される塩基配列において、９７〜１３９２番目の塩基配列からなるＤＮＡがコードするポリペプチドである、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
血栓形成は血流を停止させる危険性を伴う。血栓の形成による血流の遮断は致死要因となるため、生体は、血液凝固に対するいくつかの制御調節機構を有している。すなわち、セリンプロテアーゼによる活性化凝固因子の直接的な不活性化［Ｔｈｅ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＶｏｌｕｍｅＩ（Ｍａｃｈｏｖｉｃｈ Ｒ．，ｅｄ．）ｐｐ．１−２１，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９８２］、活性化プロテインＣによる第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の分解に基づく調節機構（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｖｏｌｕｍｅ７（Ｓｐａｅｔ Ｔ．Ｈ．，ｅｄ．）ｐｐ２５−５４，Ｇｒｕｎｅ ＆ Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４）及び血中各種セリンプロテアーゼインヒビターによる活性化凝固因子の阻害機構である。さらに、活性化第Ｘ因子依存的に第ＶＩＩ因子の活性化を阻害する組織因子インヒビターの存在も明らかとなっている（日本血栓止血学会誌，２，５５０，１９９１）。これらの中で最も重要な機構としては、血中各種セリンプロテアーゼインヒビターによる活性化凝固因子の阻害機構である。
血中にはセリンプロテアーゼに対する種々のインヒビターが存在し、その量は全血漿蛋白質の１０％にも及んでいる。これらインヒビターのうち、アンチトロンビンＩＩＩ（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ）、α１プロテイナーゼインヒビター（α１ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、α２マクログロブリン（α２ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）及びヘパリンコファクターＩＩ（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒ ＩＩ）の４つのインヒビターが血液凝固の制御に重要であることが知られている。これらインヒビターの中でも、アンチトロンビンＩＩＩが特に重要であり、血漿中の抗トロンビン活性の７０％を占めている。
アンチトロンビンＩＩＩは、４３２アミノ酸よりなる分子量約５９，０００〜６５，０００の糖蛋白質であり、分子内に３個のジスルフィド結合、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ１２８、Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９５、Ｃｙｓ２４７−Ｃｙｓ４３０を有している［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１８４５，（１９８３）］。この結合により、Ｃ末端側に大きなループ構造が形成されており、このループ構造の中に活性中心であるＡｒｇ３９３−Ｓｅｒ３９４結合が存在している（第１図）。ヒトのアンチトロンビンＩＩＩの等電点は５．１１である。アンチトロンビンＩＩＩには、Ｎ末端から９６番目、１３５番目、１５５番目および１９２番目のアスパラギン（それぞれＡｓｎ９６、Ａｓｎ１３５、Ａｓｎ１５５、Ａｓｎ１９２と表記する）の４箇所にＮ−グリコシド結合糖鎖が付加している。ヒト血漿中に存在するアンチトロンビンＩＩＩは、４本のＮ−グリコシド結合糖鎖を有するα型、Ａｓｎ１３５への糖鎖の付加がなく３本の糖鎖しか有さないβ型の２種類のアイソフォームが存在するが［Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ ３２，１４３（２００２）］、ヒト血漿中のアンチトロンビンＩＩＩのうち９０〜９５％がα型、残りの５〜１０％がβ型である。
アンチトロンビンＩＩＩに付加されているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖は、Ｎ−アセチルグルコサミン、シアル酸、ガラクトース及びマンノースから構成されている（第２図）。ヒト血漿中に存在するアンチトロンビンＩＩＩは、その糖鎖構造にフコースの修飾を受けていないことが一つの特徴となっている。
アンチトロンビンＩＩＩは血液凝固阻害剤として開発され、先天性アンチトロンビンＩＩＩ欠乏に基づく血栓症及びアンチトロンビンＩＩＩ低下を伴う汎発性血管内血液凝固症候群の治療に世界で広く用いられている。
アンチトロンビンＩＩＩなどの血液製剤は、プールされたヒト血漿を原材料として製造されている。プール血漿は、国内では日本赤十字社血漿分画センターにおいて、６ヶ月間の貯留保管を終えた約５０００人から１００００人分の血漿を混合することにより作製、供給されている。実際に、血液製剤、たとえば乾燥濃縮人血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤クロスエイトＭ（日本赤十字社）の１ロット分を製造するためには、上述のプール血漿より得られたクリオプレシピテート数バッチ分が必要であり、約８００００人分の血漿が使用されている（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４８，２７，２００２）。
プール血漿は献血者から提供される血液を原料とするが、日本の献血者におけるヒトパルボウイルスＢ１９陽性率は推定０．６ないし０．８％と報告されている（日本輸血学会誌４２，２３１，１９９６）。したがって、上述のクロスエイトＭの１ロット分中には、概算で４８０から６４０人分のヒトパルボウイルスＢ１９陽性の血液が混入していることとなる。ヒトパルボウイルスＢ１９は、エンベロープを持たない直系１８ないし２６ｎｍの小型ウイルスで、６０℃にて３０分間の加熱処理、ｐＨ３程度の酸処理、クロロホルム処理、界面活性剤処理などを行っても耐性を有するため（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，１１４，１９９３）、通常のウィルス除去方法では除去することが出来ない。このため、ヒトパルボウイルスＢ１９の除去には、専用に開発された孔径数ないし数十ナノメートルのウイルス除去膜でろ過する工程等が必要となる。しかしながら、多くの血漿分画製剤の製造工程においては、このような小さい膜孔径を用いるろ過工程、すなわちナノフィルトレーション工程を導入するのは困難とされている（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４８，２７，２００２）。ヒトパルボウイルスＢ１９は、伝染性紅斑の原因とされ、健常人で抗Ｂ１９抗体を持たない場合、一般的には一過性の風邪様症状を呈するのみであるが、場合により、慢性溶血性貪血を引き起こすとされる。また、免疫不全な患者では、時に重篤な急性赤芽球癆を引き起こすといわれる。さらに、抗Ｂ１９抗体を持たない妊婦では流産に至る場合や、胎児が水腫を起こすことがあり、子宮内死亡胎児の１５％がＢ１９のＤＮＡ検査結果が陽性だったという報告もある（Ｌａｎｃｅｔ ３５７，１４９４，２００１）。乾燥濃縮人血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤クロスエイトＭ（日本赤十字社）において、本製剤の投与による一過性のヒトパルボウイルスＢ１９感染が疑われた事例が一例、平成９年９月に報告されている（日本小児血液学会誌１１，２８９，１９９７）。
ノイアート（三菱ウエルファーマ社製）やアンスロビンＰ（アベンティスベーリング社製）などのアンチトロンビンＩＩＩ血液製剤の製造原料には、Ｂ型肝炎ウイルス陰性、Ｃ型肝炎ウイルス陰性、ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ型陰性であるプール血漿を用いるが、原料におけるヒトパルボウイルスＢ１９の有無は確認されない。
アンチトロンビンＩＩＩ血液製剤の製造工程において、温度６０℃で１０時間のウイルス不活化処理、すなわちパスツリゼーション処理を行っているが、タンパク質であるアンチトロンビンＩＩＩが変性する、ＡＩＤＳウイルス、ヒトパルボウイルス、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の原因となるプリオンなどを完全に除去することができない、などの問題がある。
以上のように、血液製剤を用いる場合、ウイルス感染のリスクがあること、現在の技術ではそのリスクを完全に排除することができないなどの欠点がある。したがって、安全性の向上したアンチトロンビンＩＩＩ製剤が求められる現状がある。
そのため、ヒト血漿を原料とせず、ヒトアンチトロンビンＩＩＩを供給するために遺伝子組換え体への切り替えが考えられている。しかしながら、遺伝子組換え技術を用いて作製した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの活性は血漿等の天然材料から得られたアンチトロンビンＩＩＩの活性に及ばない。これは、遺伝子組換え体に付加される糖鎖構造が血漿から取得されたアンチトロンビンＩＩＩと異なることに起因していると考えられており、具体的には、遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに付加するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合しているため、ヘパリンとの親和性が低くなり十分な抗血液凝固活性が発揮されないことが想定されている［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８，１７５８８（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５，８８８１（１９９６）］。これまでに、ベイビー・ハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８，１７５８８（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５，８８８１（１９９６）］、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞（ＷＯ０２／０２７９３）、あるいはトランスジェニックヤギ（ＵＳ２００３０９６９７４）で生産した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに関する報告があるが、いずれの場合にも遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端側Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している。生産された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの、フコースが結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める割合は、宿主細胞ごとに異なっているが、３９〜９５％と見積もられている。培養方法の改良などの様々な工夫により、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖へフコースが結合している糖鎖の割合を下げる試みがなされているが、天然由来のアンチトロンビンＩＩＩと同等の糖鎖構造を有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの生産には未だ成功していない。
【発明の開示】
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）遺伝子組換えにより改変された宿主にアンチトロンビンＩＩＩをコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物を生成蓄積させ、該培養物から該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することを特徴とする、アンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法。
（２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である、（１）記載の製造方法。
（３）宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞である（１）または（２）記載の製造方法。
（４）宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた宿主細胞である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（５）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、（３）または（４）に記載の製造方法。
（６）ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（５）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（７）ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（５）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（８）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（５）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（９）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（５）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
（１０）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである（３）または（４）に記載の製造方法。
（１１）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（１０）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１２）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（１０）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（１３）形質転換体がＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８４、ＦＥＲＭ−１００８８またはＦＥＲＭ ＢＰ−１００８９である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１４）宿主細胞が、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｇ）胚性幹細胞；
（ｈ）受精卵細胞；
（ｉ）植物細胞；
（ｊ）酵母。
（１５）アンチトロンビンＩＩＩ組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有し、かつＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１６）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である、（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１７）アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１８）アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１９）アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の製造方法。
（２０）アンチトロンビンＩＩＩが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードするポリペプチドである、（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２１）アンチトロンビンＩＩＩが、哺乳動物由来である、（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の製造方法。
（２２）（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、アンチトロンビンＩＩＩ組成物。
（２３）（２２）記載のアンチトロンビンＩＩＩ組成物を有効成分として含有する医薬。
（２４）医薬が、血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、予防薬又は治療薬である、（２３）に記載の医薬。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１０月９日に出願された日本国特許出願２００３−３５０１６４号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書及び／または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法及び該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を含有する医薬に関する。
本発明において、アンチトロンビンＩＩＩとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）あるいは（ｆ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）あるいは（ｏ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ） 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ） 配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ） 配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ） 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ） 配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ） 配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ） 配列番号４で表されるアミノ配列からなる蛋白質；
（ｈ） 配列番号５で表されるアミノ配列からなる蛋白質；
（ｉ） 配列番号６で表されるアミノ配列からなる蛋白質；
（ｊ） 配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質；
（ｋ） 配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質；
（ｌ） 配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質；
（ｍ） 配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質；
（ｎ） 配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質；
（ｏ） 配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質。
また、アンチトロンビンＩＩＩのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡをいい、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、具体的には、配列番号１、２または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性と実質的に同一の活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質をいう。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の公知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつヘパリン結合活性と実質的に同一の活性を有する蛋白質とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号４、５または６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質との相同性が少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である蛋白質であることをいう。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、実質的にＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖をいい、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合するフコースの含有率が０％であることをいう。本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物としては、具体的には、後述の４に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度である場合をいう。実質的に検出できないとは、測定の検出限界以下であることをいう。
アンチトロンビンＩＩＩなどの糖蛋白質に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが、いずれの場合にも以下の構造式（Ｉ）に示す共通のコア構造を有することが知られている。
【化１】
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構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、反対側が非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型糖鎖、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有する複合型糖鎖、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型と複合型の両方の枝を持つハイブリッド型糖鎖などがあげられる。
アンチトロンビンＩＩＩ分子には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合するアミノ酸残基としてＮ末端から９６番目、１３５番目、１５５番目および１９２番目の４カ所のアスパラギン残基が存在する。これらすべての残基にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合しているアンチトロンビンＩＩＩ（α型）、または９６番目、１５５番目および１９２番目のアスパラギン残基にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合しているアンチトロンビンＩＩＩ（β型）がある。
アンチトロンビンＩＩＩに結合するＮ−グリコシド結合糖鎖としては、具体的には、上述のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖をあげることができる。
アンチトロンビンＩＩＩ分子に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、アンチトロンビンＩＩＩに結合する３本または４本のＮ−グリコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明の製造方法で得られるアンチトロンビンＩＩＩ組成物は、天然由来のアンチトロンビンＩＩＩの生物活性と質的に同等であれば、単一の糖鎖構造を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子から構成されていてもよい。天然由来のアンチトロンビンＩＩＩとは、血漿等の天然材料から得られたアンチトロンビンＩＩＩをいう。
そのようなアンチトロンビンＩＩＩ組成物としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端に位置するＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖であれば、いかなるものも包含される。非還元末端の糖鎖の構造は多様性があっても構わない。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物中の糖鎖構造の解析は、アンチトロンビンＩＩＩ分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離きせた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］で分析することにより決定することもできる。
本発明の製造方法においては、遺伝子組換えにより改変された宿主細胞を用いることができる。
遺伝子組換えにより改変された宿主細胞とは、人為的に遺伝子を組み換える操作により細胞の性質を変化させた宿主細胞をいう。人為的に遺伝子を組み換える操作としては、遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法、酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法、酵素についての突然変異を導入する手法、酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法、などがあげられる。また、遺伝子が組み換えられた細胞を人為的に選択してくる方法も人為的に遺伝子を組み換える操作に包含される。
本発明において、宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、これらの細胞の具体的な例としては、後述の２．に記載のものがあげられる。動物細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。
上述の宿主細胞としては、以下の（ａ）または（ｂ）などの性質を有する宿主細胞があげられる。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（ＦＸ）などがあげられる。
本発明において、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼとしては、下記（ａ）あるいは（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｃ）、（ｄ）あるいは（ｅ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
本発明において、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼとしては、下記（ａ）あるいは（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｃ）、（ｄ）あるいは（ｅ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼなどがあげられる。
本発明において、α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）あるいは（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）あるいは（ｊ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｆ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｇ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｊ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
また、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１１または１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１１または１２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号７、９、１１または１２で表される塩基配列からなるＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号７、９、１１または１２で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号８で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質、配列番号１０で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質、および配列番号１３または１４で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号８、１０、１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、配列番号８、１０、１３または１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性またはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するためには、それぞれ配列番号８、１０、１３または１４で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質であることをいう。
また、上述の酵素活性が欠失した宿主細胞、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞に、アンチトロンビンＩＩＩ分子をコードするＤＮＡを導入することによって、本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を欠失させるように該遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、あるいは該酵素の機能を欠失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加といった塩基配列の改変を行うことをいい、改変したゲノム遺伝子の発現または機能を完全に抑制することをノックアウトするという。ゲノ厶遺伝子がノックアウトされた具体的な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから欠失された例があげられる。標的となる遺伝子の開始コドンを含むエクソンのゲノム領域を染色体上から除くことでノックアウト状態とすることができる。
このような細胞を取得する方法としては、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素活性を欠失させる手法として、
（ａ）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法；
などがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等をあげることができる。
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞をいう。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、「親株細胞」とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上の濃度である。
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｇ／ｍｌである。
ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞、すなわち親株細胞とは、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子を改変させるための手法を施す前の細胞を包含する。ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞としては、特に限定はないが、例えば、以下の細胞が好例としてあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のＮＳ０細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳ０細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳ０細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（以下、ＡＴＣＣと表記する）に登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２，５５５（１９８６）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のシリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞の親株細胞としては、Ｐｒｏｃ Ｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ．５６，１０６２（１９６３）や、Ｎａｔｕｒｅ．２０３，１３５５（１９６４）の文献に記載されているＢＨＫ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＢＨＫ−２１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
本発明のアンチトロンビンＩＩＩを生産する細胞としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞にアンチトロンビンＩＩＩをコードする遺伝子を導入した形質転換株であるＭｓ７０５ ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ２７株、α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞にアンチトロンビンＩＩＩをコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼをコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞にアンチトロンビンＩＩＩをコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ１ ＧＭＤＫＯ株等があげられる。
Ｍｓ７０５ ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ２７株は平成１５年９月９日付けで、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株およびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ１ ＧＭＤＫＯ株は平成１６年８月１０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８８およびＦＥＲＭ ＢＰ−１００８３としてそれぞれ寄託されている。
また、本発明の天然由来のアンチトロンビンＩＩＩ組成物と同等の生物活性を有する変異体（以下、アンチトロンビンＩＩＩ変異体と称す）である配列番号４で示されるアミノ酸配列の１３５番目のアスパラギンをグルタミンに置換した変異体を生産する細胞としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞に配列番号４０記載のアンチトロンビンＩＩＩ変異体をコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ ＡＦＭＳ７０５株、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼをコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞に配列番号４０記載のアンチトロンビンＩＩＩ変異体をコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ６ ＧＭＤＫＯ株があげられる。
ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ ＡＦＭＳ７０５株およびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ６ ＧＭＤＫＯ株は平成１６年８月１０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−１００８９およびＦＥＲＭ ＥＰ−１００８４としてそれぞれ寄託されている。
上述の形質転換体を用いて製造することにより、天然由来のアンチトロンビンＩＩＩと同等の生物活性を有するアンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することができる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないとは、後述に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。
アンチトロンビンＩＩＩの生物活性としては、ヘパリンに対する結合活性、抗血液凝固活性などがあげられる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物のヘパリンに対する結合活性、抗血液凝固活性は、公知の抗トロンビン活性測定法やヘパリンコファクター活性測定法などのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験あるいは汎発性血管内血液凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）モデル動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験などを用いて測定することができる（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌｕｍｅ ２０ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｋｕｏ Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｄ．，Ｈｉｒｏｋａｗａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，１９９２；医学のあゆみ，１２０，１１４７，１９８２；薬理と治療１７，５８４３，１９８９；臨床と研究６２，３５７３，１９８５；臨床と研究６２，３６８８，１９８５；応用薬理３０，５８９，１９８５）。
以下、本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法を具体的に説明する。
１．アンチトロンビンＩＩＩ組成物を生産するために用いる宿主細胞の作製
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を生産するために用いる宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
アンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素（以下、「フコース修飾に関連する諸酵素」と表記する）の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（以下、「ＧＭＤ」と表記する）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（以下、「Ｆｘ」と表記する）などがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド法（以下、「ＲＤＯ法」と表記する）、ＲＮＡインターフェアレンス法（以下、「ＲＮＡｉ法」と表記する）、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するための宿主細胞の作製
アンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
フコース修飾に関連する諸酵素をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、フコース修飾に関連する諸酵素をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製のために用いる宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
フコース修飾に関連する諸酵素の活性が欠失した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などを用いて、フコース修飾に関連する諸酵素の活性を測定する方法があげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
フコース修飾に関連する諸酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法でフコース修飾に関連する諸酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、フコース修飾に関連する諸酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などの市販のキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
次に、調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製），λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＹ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＹ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＮＭ５２２「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーは、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製して以下の解析に用いてもよい。
フコース修飾に関連する諸酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５'末端および３'末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、フコース修飾に関連する諸酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がフコース修飾に関連する諸酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いて、フコース修飾に関連する諸酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、フコース修飾に関連する諸酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて増幅することにより、フコース修飾に関連する諸酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
取得したフコース修飾に関連する諸酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する諸酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号７または９に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１１または１２に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、フコース修飾に関連する諸酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ ＷａｌｋｅｒTMＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、フコース修飾に関連する諸酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
取得したフコース修飾に関連する諸酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定したゲノムＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する諸酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、フコース修飾に関連する諸酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１５、１６、１７および１８に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１９に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、フコース修飾に関連する諸酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、アンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機により調製することができる。具体的には、フコース修飾に関連する諸酵素をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成して調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３'−Ｐ５'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２'−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２'−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（ｂ）相同組換え法によるアンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞の作製
アンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、フコース修飾に関連する諸酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、染色体上の標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号１５、１６、１７および１８に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号１９に記載の塩基配列があげられる。
染色体上の標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
（ｃ）ＲＤＯ方法によるアンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
フコース修飾に関連する諸酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを上記１の（１）の（ａ）に記載の方法を用い、調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、フコース修飾に関連する諸酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちフコース修飾に関連する諸酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物作製のための宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法などがあげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにサブクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、導入したフコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述１の（５）に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述４または後述５に記載の産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｄ）ＲＮＡｉ法によるアンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の上記１の（１）の（ａ）に記載の方法を用い、ｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの配列に基づき、フコース修飾に関連する諸酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したｃＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入したフコース修飾に関連する諸酵素の活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載されたｃＤＮＡの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、フコース修飾に関連する諸酵素の塩基配列に基づいて設計したｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
ｓｉＲＮＡ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ｓｉＲＮＡ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，７０（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、フコース修飾に関連する諸酵素の活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子に突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダ厶に挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のトレオニン、１３５番目のグルタミン酸、１５７番目のチロシン、１６１番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２，２０００）。すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のＧＭＤのドミナントネガティブ体の作製の結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ（配列番号８）では、１５５番目のトレオニン、１５７番目のグルタミン酸、１７９番目のチロシン、１８３番目のリシンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
フコース修飾に関連する諸酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（３）酵素に突然変異を導入する手法
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子に突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素に突然変異を導入する方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法をあげることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体をあげることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項の１の（５）に記載の方法があげられる。
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明のアントトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
（５）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等をあげることができる。
具体的には、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養容器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、本発明のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
２．本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法
アンチトロンビンＩＩＩ組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
アンチトロンビンＩＩＩ分子の全長ｃＤＮＡを調製し、該アンチトロンビンＩＩＩ分子をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、アンチトロンビンＩＩＩ分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
アンチトロンビンＩＩＩ分子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、すなわちフコース修飾に関連する諸酵素の活性が欠失した細胞を選択するか、または前述１に示された種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とするアンチトロンビンＩＩＩ分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、前記１．の（１）の（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とするアンチトロンビンＩＩＩ分子に特異的なプローブやプライマー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｈｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）の遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅ ＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ボリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオ厶ギ、ヒメツリガネゴケ、ウキクサ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加されたアンチトロンビンＩＩＩ分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にアンチトロンビンＩＩＩ分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ'ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、アンチトロンビンＩＩＩ分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を生成蓄積させ、該培養物よりアンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することができる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるアンチトロンビンＩＩＩ分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、アンチトロンビンＩＩＩ分子をコードするＤＮＡ、およびアンチトロンビンＩＩＩ分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後にアンチトロンビンＩＩＩ分子を発現させることにより、目的とするアンチトロンビンＩＩＩ分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてアンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することにより、該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することができる。
動物個体を用いてアンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とするアンチトロンビンＩＩＩ組成物を生産させる方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、アンチトロンビンＩＩＩ分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりアンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いてアンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造する方法としては、例えばアンチトロンビンＩＩＩ分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を生産する方法があげられる。
アンチトロンビンＩＩＩ分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたアンチトロンビンＩＩＩ組成物は、例えばアンチトロンビンＩＩＩ組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、アンチトロンビンＩＩＩ組成物の精製標品を得ることができる。具体的には、１９７４年にＭｉｌｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎらによって開発された固定化ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いた方法をあげることができる（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５，４３９，１９７４；続生化学実験講座８，血液下巻（日本生化学会編）ｐｐ．５６９−５７４．，東京化学同人，１９８５）。
また、アンチトロンビンＩＩＩ組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてアンチトロンビンＩＩＩ組成物の不溶体を回収する。回収したアンチトロンビンＩＩＩ組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該アンチトロンビンＩＩＩ組成物の精製標品を得ることができる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該アンチトロンビンＩＩＩ組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物の精製標品を得ることができる。
すでに宿主細胞がアンチトロンビンＩＩＩ分子を発現する能力を有する場合には、上記１に記載した方法を用いてアンチトロンビンＩＩＩ分子を発現する能力を有する細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とするアンチトロンビンＩＩＩ組成物を精製することにより、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を製造することができる。
３．アンチトロンビンＩＩＩ組成物の活性評価
精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物の抗血液凝固活性は、既に公知の抗トロンビン活性測定法やヘパリンコファクター活性測定法などのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験あるいは汎発性血管内血液凝固症（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；以下、「ＤＩＣ」と表記する）病態モデル動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験などを用いて測定することができる（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌｕｍｅ ２０ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｋｕｏ Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｄ．，Ｈｉｒｏｋａｗａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，１９９２；医学のあゆみ，１２０，１１４７，１９８２；薬理と治療１７，５８４３，１９８９；臨床と研究６２，３５７３，１９８５；臨床と研究６２，３６８８，１９８５；応用薬理３０，５８９，１９８５）。以下に、その具体的な例を示す。
（１）抗トロンビン活性測定法
精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物及び脱繊維素血漿などの被検物質を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．２％ヒト血清アルブミンを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．３を知いて段階希釈する。
希釈検体１００μＬに、７．５単位／ｍＬのトロンビン液５００μＬを加えて３７℃で１０分間反応させた後、ベリクロームアンチトロンビンＩＩＩ（ベーリングベルゲ社製）に添付されているトロンビン特異的発色性基質（ＨＤ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を希釈液にて０．２５Ｍとした基質液２ｍＬを加えてさらに３７℃で５分間反応させる。その後、５０％酢酸０．５ｍＬを加えて反応を停止させる。
反応液中の吸光度を４０５ｎｍで測定し、被検物質であるアンチトロンビンＩＩＩを加えていない対照反応溶液の吸光度から各希釈段階の被検物質を加えた反応溶液の吸光度を差し引いた値を得る。この値を不活性化トロンビン量として縦軸に、被検物質の希釈率を横軸にして片対数グラフにプロットする。プロットした測定値より不活性化トロンビン量と被検物質の希釈率の関係を直線近似し、精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物と脱繊維素血漿の測定の結果求められた近似式を比較することで、精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物の脱繊維素血漿に対する倍率を求めることができ、その力価を決定することができる。
（２）ヘパリンコファクター活性測定法
精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物及び脱繊維素血漿などの被検物質を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．２％ヒト血清アルブミンを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．３を用いて段階希釈する。
希釈検体５０μＬに、２．５単位／ｍＬヘパリンを含む０．３単位のトロンビン液１．０ｍＬを加えて３７℃で５分間反応させる。次に、２．０ｍＭに調製した上記３の（１）に記載の基質液を１００μＬ加え３７℃で２分間反応させる。その後、５０％酢酸０．５ｍＬを加えて反応を停止させる。
反応終了後、反応液中の吸光度を４０５ｎｍで測定し、上記３の（１）に記載した方法と同様の方法により、精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物の脱繊維素血漿に対する力価を決定することができる。
（３）ＤＩＣ病態モデル動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験
精製したアンチトロンビンＩＩＩ組成物のｉｎ ｖｉｖｏでの抗血液凝固活性は、ウサギを用いた急性ＤＩＣ病態モデル（臨床と研究６２，３５７３，１９８５）、ラットを用いた急性ＤＩＣ病態モデル（臨床と研究６２，３６８８，１９８５）、妊娠ウサギを用いた急性ＤＩＣ病態モデル（応用薬理３０，５８９，１９８５）などを用いて調べることができる。
また、アンチトロンビンＩＩＩ組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種モデルを用いて評価することもできる。
４．アンチトロンビンＩＩＩ組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させたアンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖構造は、通常の糖タンパク質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、アンチトロンビンＩＩＩ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
アンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
アンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、アンチトロンビンＩＩＩ組成物をヒドラジン分解して、アンチトロンビンＩＩＩ分子から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、「ＰＡ」と略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｅｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
５．アンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
アンチトロンビンＩＩＩ組成物は、糖鎖構造が異なったアンチトロンビンＩＩＩ分子から構成されている。本発明の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ組成物は、結合している全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖の割合が０％であり、高い抗血液凝固活性を示す特徴を有している。このようなアンチトロンビンＩＩＩ組成物は、上記４．に記載のアンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いたアンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を構成するアンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物を反応させる。次に、標識したレクチンとアンチトロンビンＩＩＩ分子の複合体の量を測定する。
アンチトロンビンＩＩＩ分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ Ｂａｌｋ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ Ｈｙｂｒｉｄ Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）をあげることができる。
６．アンチトロンビンＩＩＩ組成物の利用
本発明で得られたアンチトロンビンＩＩＩ組成物は、天然由来のアンチトロンビンＩＩＩ同等の高いヘパリン結合活性を有するため、血液凝固を伴う疾患の予防及び治療において有用である。
血液凝固を伴う疾患では、血液凝固が生じる部位、例えば血管内皮組織に血小板が粘着凝集し血栓が形成されることが知られている。血栓は外傷、動脈硬化、血管炎など様々な原因で生じるが、この血栓が剥離して血流により移動し、他の血管を詰まらせた場合に塞栓を起こす。動脈が血栓や塞栓で閉塞されると、閉塞部位から下流の灌流領域は虚血状態となる。このような血栓が原因で発症する各種病態は血栓症と呼ばれている。したがって、本発明のアンチトロンビンＩＩＩ組成物は血栓症の予防及び治療においても有用である。
血栓症としては、脳梗塞（脳血管障害）、心筋梗塞、四肢動脈血栓塞栓、深部静脈血栓症（血栓性静脈炎）、ＤＩＣ、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症、妊娠中毒症などがあげられる。
脳梗塞（脳血管障害）は、頭蓋内外の主幹脳動脈に形成された粥状（アテローム）硬化性病変によって引き起こされる血管の閉塞を伴う疾患である。脳血管が血栓によって急激に閉塞するため、片麻痺などの運動障害、半身の知覚障害、視野障害、失語、構音障害などの神経症状が比較的急速に出現する。脳梗塞の種類には、主幹脳動脈から分枝した細動脈の閉塞によって生じる比較的小さな脳動脈の血栓症であるラクナ脳梗塞や、心筋梗塞、僧帽弁狭窄などの心臓弁膜症、心房細動などの心疾患が原因となって心臓内で形成された血栓が遊離し、これが脳血管を閉塞するために起る心原性脳梗塞などがある。
心筋梗塞は、冠動脈の閉塞により灌流領域の心筋に血流障害が起きて、心筋細胞が壊死したものである。胸痛あるいは胸部圧迫痛などの狭心症状が発症以前からある患者もいるが、前兆症状なしで突然発症することが多い。
四肢動脈血栓塞栓には、下肢の動脈硬化症による閉塞病変である閉塞性動脈硬化症（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ：ＡＳＯ）や、四肢の動静脈に血栓性閉塞をきたす血管炎を伴う病因不明の閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ：ＴＡＯ・バージャー（ビュルガー）病）などがある。
深部静脈血栓症（血栓性静脈炎）は、手術、長期臥床、感染、妊娠、外傷等による血流うっ滞や静脈損傷等で発症する血栓症である。左下肢に発症し易く、主症状は腫脹であるが、皮膚紅潮、静脈怒脹、疼痛等の症状もでる。長時間の航空機旅行でも起り易く、この場合は、特に、エコノミークラス症候群と呼ばれている。
ＤＩＣは、急性白血病、ガン、感染症、産科的疾患、劇症肝炎、大動脈瘤、心臓瘤、巨大血管腫、糖尿病性昏睡、血管内溶血、手術、外傷、火傷、整形手術等を基礎疾患として、生体内で血液凝固系が過度に活性化されて細小血管内に広範に微小血栓形成が起り、虚血性臓器障害が起きた結果生じる疾患である。病態は基礎疾患で大きく異なり、基礎疾患の治療と共に抗凝固療法を行なう必要がある。
アンチトロンビンＩＩＩ欠損症は、アンチトロンビンＩＩＩの量的な低下あるいは質的な異常を伴う疾患である。アンチトロンビンＩＩＩの量的な低下あるいは質的な異常は、活性化血液凝固第ＩＸ、Ｘ因子及びトロンビンなどに対する阻害低下をきたし血栓症の発生の一因となる。アンチトロンビンＩＩＩ欠損症は、１９６５年に血栓症を多発するノルウェーの家系において先天的遺伝性疾患として見出された。多発性あるいは再発性の血栓症を有する患者の数％にアンチトロンビンＩＩＩ欠損症が見いだされる。アンチトロンビンＩＩＩ欠損症の患者では、年齢とともに発症頻度は増加し、妊娠、感染、外科手術、外傷、経口避妊薬の内服などが契機として発症することが多い。血栓は下肢深部静脈で生じることが多く、肺塞栓症、腸間膜静脈、脳動静脈などの部位での発症も観察される。
妊娠中毒症は、高血圧、蛋白尿、浮腫を主徴とする妊娠中に起こる疾患である。分娩後も同様の症状が認められる疾患を妊娠中毒後遺症といい、広義に妊娠中毒症に含まれる。妊娠中毒症の成因には凝固線溶系の異常が関与している。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物は、血栓の形成を予防する目的で疾患発症以前の患者に投与することもできる。そのような患者の具体的な例としては、ＰＴＣＡ後血管再狭窄、不安定狭心症、末梢動脈閉塞症、一過性脳虚血性発作、急性心筋梗塞、非Ｑ波心筋梗塞、ＤＩＣ、ヘパリン性血小板減少症による血栓合併症、急性肺血栓塞栓症、深部静脈血栓症、症候性肺動脈塞栓症、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症などの疾患を発症する危険性が考えられる患者などがあげられる。
アンチトロンビンＩＩＩ組成物を含有する医薬は、予防薬あるいは治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、アンチトロンビンＩＩＩ製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、アンチトロンビンＩＩＩ組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤はアンチトロンビンＩＩＩ組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつアンチトロンビンＩＩＩ組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。アンチトロンビンＩＩＩ組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、アンチトロンビンＩＩＩ組成物の抗血液凝固効果を検討する方法は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）実験としては、抗トロンビン活性測定法、ヘパリンコファクター活性測定法等があげられ、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験としては、ウサギ等の実験動物を用いたＤＩＣ病態モデル実験等があげられる。
抗トロンビン活性測定法、ヘパリンコファクター活性測定法、ＤＩＣ病態モデル実験は、文献［Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌｕｍｅ ２０ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｋｕｏ Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｄ．，Ｈｉｒｏｋａｗａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，１９９２；医学のあゆみ，１２０，１１４７，１９８２；薬理と治療１７，５８４３，１９８９；臨床と研究６２，３５７３，１９８５；臨床と研究６２，３６８８，１９８５；応用薬理３０，５８９，１９８５］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により、本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒトアンチトロンビンＩＩＩの構造を模式的に示した図である。
第２図は、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩに付加されているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を模式的に示した図である。
第３図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築を示した図である。
第４図は、プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩの構築を示した図である。
第５図は、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩの構築を示した図である。
第６図は、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑの構築を示した図である。
第７図は、アンチトロンビンＩＩＩのヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出パターンを示した図である。
第８図は、アンチトロンビンＩＩＩのヘパリンコファクター活性を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１ ゲノム上に存在する全てのα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子を破壊したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、「ＦＵＴ８」とも称す）両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を以下の手順で造成した。
１．チャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築
ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の１項に記載の方法により構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８ＰｕｒｏおよびプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）を用いて、以下の様にしてプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを構築した。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇを１６単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．６ＫｂのＡｓｃＩ断片を回収した。
次に、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ １．０μｇを１６単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間反応させた。消化反応後、大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、添付の説明書に従い、ＤＮＡ末端を脱リン酸化させた。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を用いて、ＤＮＡ断片を回収した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１．６Ｋｂ）０．１μｇとプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１０．１Ｋｂ）０．１μｇをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）存在下で連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）をコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），６９，２１１０（１９７２）］により形質転換した。各形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０とＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第３図に示したプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを得た。該プラスミドはＣＨＯ細胞のＦＵＴ８遺伝子ノックアウト細胞を作製するためのターゲティングベクターとして用いた。
２．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子の１コピーを破壊したＣＨＯ細胞の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５，１９８６］に対し、実施例１の１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを以下の様にして導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ２８０μｇを４００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間反応させて線状化した後、線状化した４μｇのｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを１．６×１０6個のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ2インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）［透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地］１０ｍＬに培地交換した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、Ｇ４１８耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（１）で取得したＧ４１８耐性クローンに対し、ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断を以下の様にして行った。
９６穴プレートに得たＧ４１８耐性クローンに対しトリプシン処理を行った後、２倍量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］を各ウェルに添加し、懸濁した。各ウェル中の細胞懸濁液の半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
レプリカプレート上のネオマイシン耐性クローンは、６００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含むＩＭＤＭ−ｄＦＢｓ（１０）を用いて１週間培養した後、細胞を回収し、回収した細胞から公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ］３０μＬに一晩溶解した。
ゲノムＰＣＲに用いるプライマーは以下のように設計した。まず、ＷＯ０３／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域（配列番号１３）のうち、ターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号２０または配列番号２１）およびベクター内配列に結合するプライマー（配列番号２２または配列番号２３）を調製した。それらを用いて、以下のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。即ち、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μＬ含む２５μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマーは配列番号２０または配列番号２１、リバースプライマーは配列番号２２または配列番号２３）］を調製し、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとした条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＣＨＯ細胞ゲノム領域とターゲティングベクター相同領域との境界部を含む約１．７Ｋｂの特異的増幅が認められるものを陽性クローンと判定した。
（３）ゲノ厶サザンブロットによる相同組換えの診断
本項（２）で陽性が確認されたクローンに対し、ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を以下の様にして行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（２）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で１０分間静置後、陽性クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢｓ（１０）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノ厶ＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ］１５０μＬに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＥＤＴＡ］２０μＬに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域（配列番号１３）のうち、ターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号２４および配列番号２５）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により構築したプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２ ４．０ｎｇを含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号２４および配列番号２５）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μＬに対し、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ'ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、32Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および本項（２）で取得した陽性クローンである５０−１０−１０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片のみが検出された。一方、陽性クローン５０−１０−１０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片に加え、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０．０Ｋｂの断片が検出された。両断片の量比は１：１であったことから、５０−１０−１０４株は、ＦＵＴ８対立遺伝子のうち１コピーが破壊されたヘミノックアウトクローンであることが確認された。
３．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
（１）ターグティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ導入株の取得
実施例１の２項（２）で得たＦＵＴ８ヘミノックアウトクローンのもう一方のＦＵＴ８対立遺伝子を破壊するために、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の１項に記載の方法により構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを以下の様にして導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ ４４０μｇを８００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間反応させて直線状化した後、４μｇを１．６×１０6細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ2インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに培地交換した。
この培地交換作業を７日毎に繰り返しながら５％ＣＯ2１５日間の培養を行い、ピューロマイシン耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（１）で得た薬剤耐性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
ピューロマイシン耐性クローンが出現した１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍＬを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ各クローンを播種し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１））を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）１５０μＬに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により構築したプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２ ４．０ｎｇを含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号２６および配列番号２７）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μＬに対し、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ'ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、32Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
５０−１０−１０４株から本項（１）に記載の方法により取得したピューロマイシン耐性クローンの１つであるＷＫ７０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した。ＷＫ７０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片が消失し、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０．０Ｋｂの断片のみが検出された。この結果からＷＫ７０４株は、ＦＵＴ８両対立遺伝子が破壊されたクローンであることが確認された。
４．ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトした細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
実施例１の３項で作製したＦＵＴ８ダブルノックアウトクローンに対し、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を以下の様にして導入した。
プラスミドｐＢＳ１８５ ４μｇを１．６×１０6細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍希釈した。該希釈液を接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で１０日間の培養を行い、コロニーを形成させた。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
実施例１の３項で作製したＦＵＴ８ダブルノックアウトクローンに対して遺伝子導入を行なうことにより取得したコロニーより、任意のクローンを以下の手順で採取した。まず、１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍＬを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートを作製する一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
次にレプリカプレートを、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬ、ピューロマイシンを１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて７日間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれた両対立遺伝子上の薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、Ｇ４１８およびピューロマイシン存在下で死滅する。本ネガティブ選択法により陽性クローンを選択した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で見出された陽性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ ＣＯ2、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）１５０μＬに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを２０単位の制限酵素ＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により構築したプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２ ４．０ｎｇを含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号２６および配列番号２７）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μＬに対し、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ'ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、32Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
前述の制限酵素ＮｈｅＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約８．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。また、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。さらに、相同組換えが起こった対立遺伝子からネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）またはピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去された場合には、同処理により約８．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。
親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、本実施例の２項に記載の５０−１０−１０４株、本実施例の３項に記載のＷＫ７０４株、およびＷＫ７０４株から本項（２）に記載の方法により取得した薬剤感受性クローンの１つである４−５−Ｃ３株のゲノムＤＮＡを、本法により解析した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子に由来する約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。また、５０−１０−１０４株やＷＫ７０４株では、相同組換えが起こった対立遺伝子に由来する約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が認められた。一方、４−５−Ｃ３株では、相同組換えが起こった対立遺伝子からさらにネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）およびピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去されて生じる約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。この結果から４−５−Ｃ３株は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより薬剤耐性遺伝子が除去されたことが確認された。
薬剤耐性遺伝子の除去されたＦＵＴ８遺伝子タブルノックアウトクローン（以下、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞と表記する）は、４−５−Ｃ３株以外にも複数株取得された。
実施例２．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞による遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの発現
遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを発現するＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞株を以下に示す方法で作製した。
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ヒトアンチトロンビンＩＩＩの遺伝子配列（ＵｎｉＧｅｎｅ：Ｈｓ．７５５９９）より２種類のプライマー（配列番号２８および配列番号２９）を作製し、以下のＰＣＲを行った。即ち、ヒト肝由来ｃＤＮＡ（インビトロジェン社製）をテンプレートとして含む２０μＬの反応液、すなわちＰｙｒｏｂｅｓｔ登録商標 ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ登録商標 ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号２８および配列番号２９）を含む反応液を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７４℃で２分間、からなる反応を１サイクルとした３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１４００ｂｐのヒトアンチトロンビンＩＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片が特異的に増幅されたことを確認した。
２．プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩの作製
前項１で作製したＰＣＲ産物に対してフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した精製ＤＮＡ断片を１７μＬの滅菌水に溶解した。該液に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）と１０単位のＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）、２μＬの１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）を加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間の消化反応を行った。次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）３μｇを１７．５μＬの滅菌水に溶解した。該液に１０単位のＥｃｏＲＩ、２μＬの１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを１７．５μＬの滅菌水に溶解した。さらに該液に１０単位のＢａｍＨＩと２μＬの１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。上記で得られたヒトアンチトロンビンＩＩＩ遺伝子を含むＰＣＲ産物断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１．４Ｋｂ、３．０ＫｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、精製ＰＣＲ産物断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）２０ｎｇと精製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）断片８０ｎｇをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）存在下で連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。各形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した。この結果、ヒトアンチトロンビンＩＩＩの翻訳領域全長の遺伝子配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩを得た（第４図）。
３．プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩの作製
前項２で作製したｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ３μｇを１７μｌの滅菌水に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）、１０単位のＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）、２μＬの１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。
次に、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）３μｇを１７．５μＬの滅菌水に溶解した。該液に１０単位のＥｃｏＲＩと２μＬの１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを１７．５μＬの滅菌水に溶解した。さらに該液に１０単位のＢａｍＨＩと２μＬの１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。上記で得られたｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）およびｐＫＡＮＴＥＸ９３断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１．４Ｋｂｐ、９．０ＫｂｐのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、精製ｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）５０ｎｇと精製ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）断片３０ｎｇをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）存在下で連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。各形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０とＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した。この結果、ヒトアンチトロンビンＩＩＩの翻訳領域全長の遺伝子配列を含む動物細胞発現用プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩを得た（第５図）。
４．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株へのヒトアンチトロンビンＩＩＩ発現プラスミドの安定的導入
実施例１にて作製したＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株に、前項で作製したプラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩを安定的に導入し形質転換株を作製した。プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩの遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ １００μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）６０μＬと１２０単位の制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含む６００μＬの反応液を調製し、３７℃で５時間消化反応を行うことにより線状化した。反応後、該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。次に、実施例１で取得したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞クローンのうち１株を、Ｋ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2）に懸濁して８×１０7細胞／ｍＬの液を調製した。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×ｌ０6個）と上記の線状化プラスミド９μｇを混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、エレクトロポレーション装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。同様にしてキュベット４本分に対し遺伝子導入を行ったのち、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１２０ｍＬに懸濁し、接着細胞培養用の９６ウェルプレート（グライナー社製）１２枚へ１００μＬ／ウェルで播種した。培養はＣＯ2インキュベーター（ＴＡＢＡＩ社製）にて、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。
５．５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株の取得
前項で得たｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩを安定的に導入した細胞を６日間培養した後、培養上清を除去し、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５０ｎＭ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）（シグマ社製）を添加したＩＭＤＭ培地を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら９日間の培養を行った。次いで、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび２００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を同様に３〜４日毎に繰り返しながら１８日間培養し、最終的に形成されたコロニーを２４ウェルプレート（シグマ社製）に植え替えた。さらに、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を３〜４日毎に繰り返し、適宜拡大しながら１９日間培養を行い、５００ｎＭ ＭＴＸに耐性の形質転換株を取得した。
６．アンチトロンビンＩＩＩ高生産株の選別
前項で取得した複数の５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株より、各１．５×１０6細胞を５ｍＬの１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地に懸濁し、組織培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ2、グライナー社製）へ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれるヒトアンチトロンビンＩＩＩ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定した。方法はキットに添付のマニュアルに従い、標準品には市販のヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩ（シグマ社製）を用いた。複数の５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株のうち、Ｍｓ７０５ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ２７株の培養上清中に３０４μｇ／ｍＬの濃度でヒトアンチトロンビンＩＩＩが発現していることを確認した。Ｍｓ７０５ ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ２７株は平成１５年９月９日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２として寄託されている。
実施例３．ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞による遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの発現
１．ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株へのヒトアンチトロンビンＩＩＩ発現プラスミドの導入
まず、実施例２第３項で作製したプラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ １００μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）６０μＬと１２０単位の制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含む６００μＬの反応液を調製し、３７℃で５時間消化反応を行うことにより線状化した。反応後、該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。
次に、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８．ｌｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2）に懸濁して８×１０7細胞／ｍＬとした。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０6個）と上記の線状化プラスミド９μｇを混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をジーン・パルサー・キュベット（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ；電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、エレクトロポレーション装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。エレクトロポレーションの方法は、文献［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に従った。遺伝子導入を行ったのち、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍＬジェンタマイシン（ナカライテスク社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬに懸濁し、接着細胞培養９６ウェルプレート（グライナー社製）３枚へ１００μＬ／ウェルで播種した。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。
２．ＭＴＸ耐性株の取得
前項で得たｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ導入細胞を６日間培養した後、培養上清を除去し、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび５０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）（シグマ社製）を添加したＩＭＤＭ培地を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら９日間の培養を行った。次いで、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび２００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を同様に３〜４日毎に繰り返しながら１８日間培養し、最終的に形成されたコロニーを２４ウェルプレート（グライナー社製）に植え替えた。さらに、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を３〜４日毎に繰り返し、適宜拡大しながら１９日間培養を行い、５００ｎＭ ＭＴＸに耐性の形質転換株を取得した。
３．アンチトロンビンＩＩＩ高生産株の選別
前項で取得した複数の５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株より、各１．０×ｌ０6細胞を５ｍＬの１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地に懸濁し、組織培養用フラスコヘ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれる遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定し、その結果から高生産株の選別を行なった。方法はＥＬＩＳＡキットに添付のマニュアルに従い、標準品にはヒト血漿由来製剤であるノイアート（三菱ウェルファーマ社製）を用いた。培養上清中に遺伝子組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩの蓄積が認められた一株の形質転換株を、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４と名付けた。
実施例４．遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの精製と糖鎖構造の解析
１．無血清培地への馴化
実施例２と３で作製された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ発現ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞株と、遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を以下の方法で無血清培地へ馴化した。各細胞株を４ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清培地と称す）１５ｍｌに５×１０5細胞／ｍｌで懸濁して１２５ｍｌ三角フラスコ（コーニング社製）へ播種し、回分培養を行なった。培養は、３５℃、回転速度は９０〜１００ｒｐｍで行い、継代の際には培養容器容積の４倍量以上の５％ＣＯ2を含有する空気を培地上面に通気し、三角フラスコ中の空気を置換した。３日後に培地交換を行い、６日目に５×１０5細胞／ｍｌで継代を行なった。以降、３〜４日毎に継代を二週間繰り返し、無血清培地に馴化させた。この培養により、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞株に由来し、無血清培地中での増殖能力を有する形質転換株ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株と、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株に由来し、無血清培地中での増殖能力を有する形質転換株ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＤＧ４４が得られた。得られた株を３．０×１０5細胞／ｍＬの濃度で１５ｍＬの無血清培地に懸濁し、１２５ｍＬフラスコヘ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれる遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定したところ、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株の培養上清中に１８μｇ／ｍＬ、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＤＧ４４株の培養上清中には２８μｇ／ｍＬと、両方の形質転換株で、ほぼ同等の濃度で遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩが発現していることを確認した。なお、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株はｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５の株名で、平成１６年８月１０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−１００８８として寄託されている。
２．遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ含有培養上清の取得
前項で得られた２種の無血清馴化細胞株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株およびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＤＧ４４株をそれぞれ３×１０5細胞／ｍｌで無血清培地４５０ｍｌへ懸濁して２Ｌローラーボトル（ベクトンディッキンソン社製）に播種し、培養容器容積の４倍量以上の５％ＣＯ2を含有する空気を培地上面に通気し、三角フラスコ中の空気を置換した。培養は３５℃、回転速度は５〜１０ｒｐｍで行い、培養５日目にアミノ酸などの消費された栄養素を補う目的で、フィード培地を３７．５ｍｌおよび５０％グルコース溶液を１．８ｍｌ添加した。フィード培地は、アミノ酸（Ｌ−アラニン０．２２ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．７４ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．２２ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２６ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．８０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．６６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン７．３ｇ／Ｌ、グリシン０．２６ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．３７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．９２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．９２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．２９ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２６ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．５８ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．３７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８４ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１４ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．９２ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．８３ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０００１ｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０３５ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０３５ｇ／Ｌ、葉酸０．０３５ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０６３ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０３５ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０３５ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００３５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０３５ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０００１ｇ／Ｌ）、リコンビナントヒトインスリン０．３１ｇ／Ｌ（ＪＲＨ社製）、エタノールアミン０．０２５ｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）、２−メルカプトエタノール０．００９８ｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）、大豆加水分解物ＨＹ−ＳＯＹ８ｇ／Ｌ（クウェストインターナショナル社製）、亜セレン酸ナトリウム１６．８μｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）、コレステロール脂質濃縮溶液２ｍＬ／Ｌ（２５０×水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジアミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩０．０５ｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）からなる培地である。フィード以降は培養終了まで毎日通気し、空気置換を行なった。生存率は、８０％以上を維持させながら、９〜１０日間の培養を行なった。培養終了後、培養上清中の遺伝子組換えヒトアンチトロンビン量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定した。その結果、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株およびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＤＧ４４株のそれぞれの培養上清には、６８μｇ／ｍｌおよび８７μｇ／ｍｌの濃度で遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩが含まれていることが確認された。以下、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＭＳ７０５株が産生した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩをＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ ＡＦＤＧ４４株が産生し��遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩをＡＴＩＩＩ ＤＧ４４とそれぞれ略記する。
３．遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの精製
前項で得られた遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを含む培養上清より、文献［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２２，５２５，１９９３］に記載の方法に従って遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを以下のようにして、精製した。前項で得られた遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを含む培養上清のうち、遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ約２５０ｍｇ相当の培養上清を５０ｍＭ トリス、１４ｍＭクエン酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）からなる緩衝液で平衡化したヘパリンカラム（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、２５０ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス社製）に通塔した。続いて、平衡化緩衝液１０ＣＶでヘパリンカラムを洗浄後、３Ｍ ＮａＣｌ濃度までの直線状勾配溶出法（１２ＣＶ）を用いて、遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを溶出させた。装置はＨｉｌｏａｄクロマトシステ厶（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、流速は２１ｍｌ／分とし、遺伝子組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ溶出画分は５ｍｌ毎に分画した。各画分のヒトアンチトロンビンＩＩＩ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定したところ、第７図で示すように、溶出パターンには大きく分けて３種のピークが認められたが、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５とＡＴＩＩＩ ＤＧ４４との溶出パターンは異なるパターンを示した。以下、早く溶出したピーク画分から、ピーク▲１▼画分、ピーク▲２▼画分、ピーク▲３▼画分と称す。アンチトロンビンＩＩＩをヘパリンアフィニティーで精製を行なった際に、複数のピークが認められることは、以下の文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１７５８８（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８６，７９３（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２１１５３（１９８９）］などで報告されている。また、同様にノイアートの溶出パターンを検討したところ、ピーク▲２▼画分に限局して溶出が認められた。主要ピークであるＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲２▼画分、▲３▼画分、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲１▼画分、▲２▼画分に相当する各ピーク画分は、ペリコンＸＬ（ミリポア社製）とＢｉｏｍａｘ１０（ミリポア社製）を用い、ダイアフィルトレーション法により５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に脱塩した。脱塩した各ピーク画分を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（アマシャム社製、４８０ｍｌ）に通塔し、吸着させた。続いて、１２ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１．０Ｍ ＮａＣｌ濃度までの直線状勾配溶出法（８．６ＣＶ）を用い、流速４０ｍｌ／ｍｉｎで遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを溶出させた。溶出パターンは、吸光度（Ａ２８０ｎｍ）で測定した。次に、遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを含む溶出画分を合わせ、ペリコンＸＬ（ミリポア社製）とＢｉｏｍａｘ１０（ミリポア社製）を用いてダイアフィルトレーション法により緩衝液をＰＢＳに置換し、評価用サンプルを調製した。評価用サンプルの吸光度（Ａ２８０ｎｍ）を測定し、Ａ２８０ｎｍ １．０＝０．６４ｍｇ／ｍｌとして蛋白質濃度を算出した。ま��、ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いた定量も行い、吸光度法とＥＬＩＳＡ法で濃度が等しいことを確認した。また、パジェルＳＰＧ５２０Ｌ（アトー社製）を用いて還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。電気泳動にはそれぞれ２−メルカプトエタノールで還元した２μｇの遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを用い、染色はＣＢＢ染色で行なった。その結果、全ての評価用サンプルで、分子量約６０ｋＤのＡＴＩＩＩバンド以外のバンドは確認されなかった。
４．遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの中性糖・アミノ糖組成分析
実施例４第３項で得られた評価用サンプルについて、中性糖・アミノ糖組成分析を行なった。各々の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの評価用サンプルを４．０ｍｏｌ／ｌトリフルオロ酢酸存在下で１００℃、２時間加水分解し、蛋白質から中性糖・アミノ糖を遊離させた。遊離した糖は、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗｅｉｔｚｈａｎｄｌｅｒ等の文献［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４１，１２８−１３４（１９９６）］、およびＤＩＯＮＥＸ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ ９２（Ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｇａｒｓ ｉｎ Ｍｏｌａｓｓｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｗｉｔｈ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）に記載の方法を参考にして、ＤＸ−５００糖分析装置（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて分析した。ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩの糖鎖構造は、フコースを含まない複合二本鎖型糖鎖であることが知られている［Ａｒｃｈ．ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０３，４５８（１９８０）］（第２図）。中性糖・アミノ糖組成分析結果の解析では、Ｎ−アセチルグルコサミンの組成比を４として、各単糖成分（フコース、ガラクトース、マンノース）の組成比を算出した。解析の結果、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４の糖鎖成分にはフコースが検出されたのに対して、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５の糖鎖成分におけるフコース含量は、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩであるノイアートと同様に、検出限界以下であった。また、各単糖成分の組成比より、全てのサンプルの主要な糖鎖構造は、ハイマンノース型やハイブリッド型ではなく、複合二本鎖型糖鎖であることが示唆された。
５．ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー分析
実施例４第３項で得られた評価用サンプルのα型とβ型の組成比を、Ｇｏｒａｎ ＫａｒｌｓｓｏｎおよびＳｔｅｆａｎ Ｗｉｎｇｅの方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２８，１９６−２０１（２００３）］を参考にして、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで分析した。その結果、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲２▼画分、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲１▼画分では、ヒト血漿由来のノイアートと同様に、主としてα型が含まれていた。また、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲３▼画分では、主としてβ体が含まれていた。また、ＡＴＩＩＩＤＧ４４ピーク▲２▼画分にはα型とβ型が、ほぼ同じ割合で含まれていた。以上、中性糖・アミノ糖分析とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー分析の結果を第１表にまとめた。
【表１】
0004263191.tif 000003
ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４は糖鎖にフコースを有しており、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩとは糖鎖構造が異なっていた。一方、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲２▼画分とＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲３▼画分の糖鎖構造は、それぞれヒト血漿由来のα型、β型アンチトロンビンＩＩＩに近似した糖鎖構造であることが明らかになった。また、ＡＴＩＩＩＭＳ７０５は、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩにおいて文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１７５８８（１９９３）］で報告されているように、ヘパリンアフィニティーを利用した精製方法でα型とβ型とを分離することができた。しかしながら、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲２▼画分は同様の精製をおこなっても分離できなかった。以上のことから、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５は、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩと同等の性質を有することが明らかとなった。
実施例５．精製した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの生物活性の比較
１．ヘパリン解離定数の測定
ヘパリン解離定数は、アンチトロンビンＩＩＩとヘパリンとの結合により、アンチトロンビンＩＩＩ分子の立体構造が変化するため、アンチトロンビンＩＩＩ蛋白質を構成するトリプトファン残基の蛍光強度が変化することを利用して測定することができる。アンチトロンビンＩＩＩ濃度とトロンビン濃度の間には以下の関係式１）が成り立つ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２２，５２５，１９９３）。
【数１】
式１）
0004263191.tif 000004
実施例４第３項で得られたヘパリンアフィニティーで分画したアンチトロンビンＩＩＩの各評価用サンプルのヘパリン解離定数を、以下の方法で測定した。まず、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、０．１％ ＰＥＧ６０００からなる緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。本緩衝液はサンプルの希釈に用いた。５０ｎＭアンチトロンビンＩＩＩに対して、ヘパリン（シグマ社製）を０〜２０当量加え、各溶液の蛍光強度を励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３４０ｎｍで測定した。解離定数は式１）を用いて解析ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ４（グラフパッド社製）で解析した。実施例４第３項で得られた評価用サンプルのヘパリン解離定数（Ｋｄ値、単位ｎＭ）を測定した結果を第２表に示した。ＡＴＩＩＩのヘパリンに対する結合力は、Ｋｄ値が小さいほど強い。従って、最も結合力の強いのはＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲３▼画分、次にＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５ピーク▲２▼画分およびＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲２▼画分、結合力が最も弱かったのはＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲１▼画分であった。
【表２】
0004263191.tif 000005
２．ヘパリンコファクター活性の測定
アンチトロンビンＩＩＩのトロンビン阻害速度は、ヘパリン存在下で著しく上昇することが知られている。また、トロンビンとアンチトロンビンＩＩＩの結合反応はモル比一対一で起こり、反応後は互いに活性を失うため、ヘパリン存在下では、アンチトロンビンの抗トロンビン反応は、きわめて短時間で終了してしまう。ヘパリンコファクター活性は、抗トロンビン反応終了時の残存トロンビン活性で表されるので、換言すれば、ヘパリンコファクター活性は、抗トロンビン反応終了時の活性体アンチトロンビンＩＩＩ量を測定していることになる［続 医薬品の開発，２０，１８５，１９９２］。
ヘパリンコファクター活性の測定のため、まず、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２％アルブミンからなる緩衝液（ｐＨ８．３）を調製した。本緩衝液はサンプルの希釈、酵素液の調製に用いた。アンチトロンビンＩＩＩ溶液に対して２．５単位／ｍｌのトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と０．６単位／ｍｌのヘパリン（シグマ社製）からなる酵素液１．０ｍｌ、を加え、３７℃で５分間反応させた。さらに、トロンビンの特異的基質である２．０ｍＭのＳ−２２３８（第一化学薬品社製）を１００μＬ加え、２分間発色させた後、５０％酢酸で反応を停止させた。残存トロンビン活性は、反応液中のＳ−２２３８が分解されて生じたｐ−ニトロアニリンの吸光度（Ａ４０５ｎｍ）より求めた。なお、アンチトロンビンＩＩＩは０．１５〜４μｇ／ｍＬの範囲となるように希釈し、測定に用いた。検量線の作製には、標準品としてノイアートを用い、単位体積（液量）あたりの活性（単位／ｍｌ）でヘパリンコファクター活性を算出した。実施例４第３項で得られた評価用サンプルのヘパリンコファクター活性を測定し、得られた活性値を単位質量あたりの活性（単位／ｇ）で表した結果を第８図に示した。ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５のピーク▲２▼画分、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５のピーク▲３▼画分はヒト血漿由来のノイアート（三菱ウェルファーマ社製）と同等の活性を有していたが、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲１▼画分とＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲２▼画分はノイアートよりも低値を示した。
３．ヘパリン非存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数の測定
トロンビン阻害二次速度定数の測定方法は、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２４４６０，２００２）に準じて行った。
トロンビン量に対して過剰量のアンチトロンビンＩＩＩが存在する条件下では、ヘパリン非存在下におけるＡＴＩＩＩのトロンビン阻害反応は偽一次反応に近似して考えることができるため、以下の式２）が成り立つ。
式２） １ｎ［Ｔ］ｔ＝−ｋｏｂｓ＊ｔ＋１ｎ［Ｔ］0
［Ｔ］ｔ： ｔ時間後のトロンビン濃度
［Ｔ］0： トロンビンの初濃度
ｋｏｂｓ： 偽一次速度定数
ｔ ： 時間
式３） ｋｏｂｓ＝ｋ［ＡＴ］
ｋ ： 二次速度定数
［ＡＴ］： アンチトロンビンＩＩＩ濃度
そこで、まずトロンビン阻害二次速度定数を測定するために、まず、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、０．１％ ＰＥＧ８０００からなる緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。本緩衝液はサンプルの希釈、酵素液の調製に用いた。１００ｎＭアンチトロンビンＩＩＩと１０ｎＭトロンビンからなる酵素液を調製し、２５℃で１〜４０分間反応させた。各時間ごとに、トロンビンの特異的基質である０．１５ｍＭのＳ−２２３８（第一化学薬品社製）を１００μＬ加え、約２分間の吸光度（Ａ４０５ｎｍ）を測定した。各時間における吸光度変化から残存トロンビン濃度を求め、上記２）式を用いて、偽一次速度定数を求めた。さらに、上記３）式を用いてヘパリン非存在下でのトロンビン阻害二次速度定数（単位／Ｍ／秒）を算出した。実施例４第３項で得られた評価用サンプルの二次速度定数を第３表に示した。Ｓ．Ｄ．は標準偏差を示す。ヘパリン非存在下でのトロンビン阻害二次速度定数は、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲１▼画分がわずかに低い値を示したが、他の全ての評価用サンプルでは、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩノイアートと同等の活性を示すことが示された。
【表３】
0004263191.tif 000006
４．ヘパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数の測定
実施例４第３項で得られた評価用サンプルのヘパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数を、文献［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８６，７９３，１９９２］に準じて、以下の方法で測定した。まず、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、０．１％ ＰＥＧ８０００からなる緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。本緩衝液はサンプルの希釈、酵素液の調製に用いた。１００ｎＭアンチトロンビンＩＩＩに対して０．５〜１ｎＭのトロンビンと５〜２５ｐＭヘパリン（シグマ社製）からなる酵素液を加え、２５℃で１〜３０分間反応させた後、トロンビンの特異的基質である０．１５ｍＭのＳ−２２３８（第一化学薬品社製）を１００μＬ加え、約２分間の吸光度（Ａ４０５ｎｍ）を測定した。各時間における吸光度変化から残存トロンビン濃度を求め、上記式２）を用いて、偽一次速度定数を求めた。さらに、下式４）を用いてヘパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数を算出した。
【数２】
式４）
0004263191.tif 000007
実施例４第３項で得られた各評価用サンプルのヘパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数（単位／Ｍ／秒）を測定した結果を第４表に示した。数値の表記は、たとえば２．５Ｅ＋０７は、２．５×１０7を示す。またＳ．Ｄ．は標準偏差を示す。二次速度定数は、ＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５のピーク▲２▼画分とＡＴＩＩＩ ＭＳ７０５のピーク▲３▼画分は、ノイアートと同等の活性を示したが、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲１▼画分で著しく低い値を示し、ＡＴＩＩＩ ＤＧ４４ピーク▲２▼画分もわずかに低い値を示した。この結果より、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を用いて生産された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩには、ヘパリン存在下での抗トロンビン活性が低い画分が含まれることが明らかになった。一方、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞株を用いて生産した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩには、主にヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩと同等の活性を示す画分が得られることが明らかになった。
【表４】
0004263191.tif 000008
実施例４および５での解析の結果、糖鎖構造および生物活性において、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞で生産された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩは、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株で生産された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに比較して、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩと同等の性質を有する蛋白質であることが示された。この結果より、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞で生産された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩは、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩの代替物質として適当であることが示された。
実施例６ ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞によるアミノ酸改変した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの発現
成熟型ヒトアンチトロンビンＩＩＩのＮ末端から１３５番目に位置するアスパラギン残基をグルタミン残基にアミノ酸置換した変異型ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（以下ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑと称す）を発現するＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞を、以下に示す方法で作製した。なお、ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ組成物は、Ｎ結合型糖鎖の付加部位が３ヵ所となるため、発現された遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ全てβ型となる。
１．プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑの作製
まず、アンチトロンビンＩＩＩ遺伝子配列（ＵｎｉＧｅｎｅ：Ｈｓ．７５５９９、配列番号１）に対して、Ｎ末端から１６７番目のアスパラギン残基をグルタミン残基へ置換する２種類の部位突然変異導入用オリゴＤＮＡプライマーを作製した（配列番号３０および配列番号３１）。実施例２第２項で作製したｐＢＳ−ＡＴＩＩＩを鋳型として、上記のプライマーおよびＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ登録商標 Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、アンチトロンビンＩＩＩｃＤＮＡ配列に、部位特異的変異を導入した。方法はキットに添付のマニュアルに従った。得られた形質転換株よりＱＩＡｐｒｅｐ登録商標 Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＤＮＡシーケンサＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した。その結果、変異型アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ）の翻訳領域全長のｃＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを得た（第６図）。
２．発現ベクターｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑの作製
前項で作製したｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ ３μｇを１７μｌの滅菌水に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）、１０単位のＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）、２μＬの１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。次に、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３（特許ＷＯ９７／１０３５４に記載）３μｇを１７．５μｌの滅菌水に溶解した。該液に１０単位のＥｃｏＲＩと２μＬの１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを１７．５μｌの滅菌水に溶解した。さらに該液に１０単位のＢａｍＨＩと２μｌの１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。上記で得られたｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）およびｐＫＡＮＴＥＸ９３断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１．４Ｋｂｐ、９．０ＫｂｐのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、精製ｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）５０ｎｇ、精製ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）断片３０ｎｇ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を含む反応液２０μｌを調製し、１６℃で１６時間の連結反応を行なった。得られたプラスミドＤＮＡを用い、ヒートショック法により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株よりＱＩＡｐｒｅｐ登録商標 Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、動物細胞用変異型ＡＴアンチトロンビンＩＩＩ発現プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを得た（第６図）。
３．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞へのＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ発現プラスミドの導入
実施例１にて作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞に、実施例６第２項で作製したプラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを安定的に導入した。遺伝子導入法はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを３０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μｌと１００単位の制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含む２００μｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間の消化反応を行うことによりプラスミドを線状化した。反応後、該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。次に、実施例１で取得したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4、４．０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2）に懸濁して８×１０7細胞／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０6個）と上記の線状化プラスミド９μｇを混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、エレクトロポレーション装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行ったのち、細胞懸濁液を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍｌジェンタマイシン（ナカライテスク社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬに懸濁し、接着細胞培養９６ウェルプレート（グライナー社製）３枚へ１００μｌ／ウェルで播種した。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。
４．ＭＴＸ耐性株の取得
前項で得たｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ導入細胞を６日間培養した後、培養上清を除去し、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５０ｎＭ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）（シグマ社製）を添加したＩＭＤＭ培地を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら９日間の培養を行った。次いで、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび２００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を同様に３〜４日毎に繰り返しながら１８日間培養し、最終的に形成されたコロニーを２４ウェルプレート（グライナー社製）に植え替えた。さらに、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を３〜４日毎に繰り返し、適宜拡大しながら１９日間培養を行い、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株を取得した。
５．ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ高生産株の選別
前項で取得した複数の５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株より、各１．０×１０6細胞を５ｍＬの１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地に懸濁し、組織培養用フラスコ（グライナー社製）へ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれるＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定し、高生産株を選別した。方法はＥＬＩＳＡキットに添付のマニュアルに従い、標準品にはノイアート（三菱ウェルファーマ社製）を用いた。
６．無血清培地への馴化
前項で作製したＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ発現ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞株を、実施例４第１項と同様の方法で、無血清培地へ馴化した。実施例４第１項に記載した無血清培地１５ｍｌに、細胞を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁して１２５ｍｌ三角フラスコ（コーニング社製）へ播種し、回分培養を行なった。培養は、３５℃、回転速度は９０〜１００ｒｐｍで行い、継代の際には培養器容積の４倍量以上の５％ＣＯ2を含有する空気を培地上面に通気し、三角フラスコ中の空気を置換した。３日後に培地交換を行い、６日目に播種密度５×１０5細胞／ｍｌで継代を行なった。以降、３〜４日毎に継代を二週間繰り返し、細胞を無血清培地に馴化させた。この培養により無血清培地中で増殖し、且つ凝集を起こさない細胞株ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ ＡＦＭＳ７０５を得た。得られた株を３．０×１０5細胞／ｍＬの濃度で１５ｍＬの無血清培地に懸濁し、１２５ｍＬフラスコヘ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれる遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定したところ、培養上清中に６μｇ／ｍＬの濃度で発現していることを確認した。なお、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５ＱＡＦＭＳ７０５株はｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ ＡＦＭＳ７０５の株名で、平成１６年８月１０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ− １００８９として寄託されている。
以下、実施例４に記載した方法で、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない複合型糖鎖を有する変異型の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを取得し、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の本数が３本であることを確認した。さらに、実施例５に記載した方法で該アンチトロンビンＩＩＩの生物活性を測定した結果、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で発現させた変異型の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに比較してヘパリン解離定数が有意に小さく、ヘパリンコファクター活性およびトロンビン阻害二次速度定数が有意に高いことが確認された。
実施例７ ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子が発現していない細胞株の取得
１．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株の取得
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０））を、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］にて接着培養用フラスコ７５ｃｍ2（グライナー社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。５ｍＬのダルベッコＰＢＳ（以下、ＰＢＳと表記する）（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、ＰＢＳで希釈した０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）を１．５ｍＬ添加して３７℃にて５分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心分離操作により回収し、１×１０5細胞／ｍＬの密度になるようにＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地を添加して懸濁後、未添加又は０．１μｇ／ｍＬのアルキル化剤であるＭＮＮＧ（シグマ社製）を添加した。ＣＯ2インキュベーター（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地に懸濁後、接着培養用９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に１０００細胞／ウェルの密度で播種した。各ウェルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍＬのレンズマメレクチン（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ2インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株として取得した。
２．取得したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株のＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼｍＲＮＡの定量
前項で取得した各レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株における、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素であるＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて以下の様に解析した。
（１）レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株からのＲＮＡ調製と一本鎖ｃＤＮＡの調製
親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および本実施例の１項で取得した各レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株それぞれ１×１０7細胞より、ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってＲＮＡを調製した。続いて、ＳＵＰＥＲ ＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）を用い、添付の使用説明書に従って各ＲＮＡ５μｇより２０μＬの反応液中にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたβ−アクチン遺伝子の発現量解析
本項の（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡの品質を確かめる目的で、β−アクチンｃＤＮＡがＰＣＲ法によって増幅されるかを、以下の様に検討した。
本項の（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μＬを鋳型として含む２０μＬの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ'ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３２と３３の合成オリゴＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１４サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μＬをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約８００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。その結果、調製したいずれの細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡを用いても、同程度のβ−アクチンの発現を検出することができた。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現量解析
次に、本項（１）で取得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株のＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現量解析を行った。ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、配列番号３８で示されるＣＨＯ細胞由来のＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼのｃＤＮＡ配列より、配列番号３４で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡプライマーと、配列番号３５で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡプライマーを作製した。続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μＬを鋳型として含む２０μＬの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５単位のＥｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３４と３５の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μＬをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約４３０ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。その結果、取得したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株の中に、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現が観察されない細胞株が存在することを確認した。このＧＤＰ−マンノ−ス４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現が観察されない株をＣＨＯ ＳＭ株と名付けた。なお、取得したＣＨＯ ＳＭ株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、ＣＨＯ ＳＭ株は、ＬＣＡが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位とフコースの１位がα結合で付加された糖鎖構造を認識する他のレクチンに対しても耐性を示した。具体的には、終濃度１ｍｇ／ｍＬのエンドウマメレクチン（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＰＳＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地、あるいは終濃度１ｍｇ／ｍＬのヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ；以下、ＡＡＬと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地でも耐性を有していた。
３．ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子が発現していない細胞株のゲノム解析
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および前項で取得したＣＨＯ ＳＭ株をＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地を用いて接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）でコンフルエントに到達する直前まで培養した後、文献［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に記載の方法従ってゲノムＤＮＡを調製し、取得したゲノムＤＮＡをＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ］３００μｌに一晩溶解させた。上記で調製したゲノ厶ＤＮＡ １２μｇを、３種の異なる制限酵素、ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）、ＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）でそれぞれ消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ］２０μｌに溶解し、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、文献［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に記載の方法に従い、ナイロン膜ヘゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対して８０℃で２時間の熱処理を行った。次に、ナイロンメンブレンに転写されたゲノムＤＮＡの品質を確認する目的で、細胞株を問わずゲノム中に均等に存在すると考えられるα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。ＦＵＴ８遺伝子を検出するためのプローブは以下のように調製した。まず、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１１に記載のマウスＦＵＴ８ ｃＤＮＡを含むプラスミドｍｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１ １０μｇを５０μＬのＭ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）に溶解し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で一晩消化した後、反応液をＨ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）に置換し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）でさらに一晩消化反応を行った。反応終了後、該反応液を２％アガロース電気泳動に供し、ＦＵＴ８遺伝子エクソン２を含む１５６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片２５ｎｇに対し、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて放射標識した。次に、ハイブリダイゼーションを以下のように行った。まず、上記ナイロン膜をローラーボトルヘ封入し、ハイブリダイゼーション液［４×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｌｄｔ'ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に32Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルヘ投入し、６５℃で一晩加温した。ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルム−８０℃で二晩暴露し現像した。現像後、ナイロン膜をストリッピング液［１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ］中で煮沸することにより、プローブを剥離させ、再度異なるプローブでのハイブリダイゼーションに供することとした。上記の方法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４株およびＣＨＯ ＳＭ株いずれのゲノ厶ＤＮＡにおいても、ＦＵＴ８遺伝子エクソン２に特異的な断片が検出された。以上の結果よりナイロン膜上に転写されたＣＨＯ ＳＭ株およびＣＨＯ／ＤＧ４４株由来のゲノムＤＮＡは等しい品質を有していることが示された。
一方、ＧＭＤ遺伝子エクソン５に特異的なプローブを以下のように調製した。まず、公知であるヒトＧＭＤゲノムＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ アクセッション番号ＮＴ＿０３４８８０）を基に、エクソン５に特異的に結合するオリゴＤＮＡプライマー（配列番号３６および配列番号３７）を設計した。該領域は配列番号３９に記載のヒトＧＭＤ ｃＤＮＡ配列の塩基番号３４６から塩基番号５３８に相当する。次に、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１５に記載のプラスミドｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを１０ｎｇ含む１００μＬの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、２．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号３６および配列番号３７）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分間、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとした３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を２％アガロース電気泳動に供し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片２５ｎｇに対し、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ， ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて放射標識した。該プローブを上記で示したナイロン膜に対してハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のゲノムＤＮＡではＧＭＤ遺伝子エクソン５の特異的断片が見出されたのに対し、ＣＨＯ ＳＭ株由来のゲノムＤＮＡにおいてはＧＭＤ遺伝子エクソン５の特異的断片が全く検出されなかった。以上の結果からＣＨＯ ＳＭ株はＧＭＤをコードするゲノム領域のうち、少なくともエクソン５を含む領域を欠損したＧＭＤノックアウト細胞であることが示された。
実施例８ ＣＨＯ ＳＭ株による遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの発現
１．ＣＨＯ ＳＭ株へのＡＴＩＩＩ発現プラスミドの導入
実施例７で作製されたＣＨＯ ＳＭ株に、実施例２第３項で作製したプラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩを安定的に導入した。これらの遺伝子導入は公知のエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ３０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μＬと１００単位の制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含む２００μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行うことにより線状化した。反応後、該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。次に、実施例７で取得したＣＨＯ ＳＭ株をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2）に懸濁して８×１０7細胞／ｍＬとした。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０6個）と上記の線状化プラスミド９μｇを混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、エレクトロポレーション装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行ったのち、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍＬジェンタマイシン（ナカライテスク社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬに懸濁し、接着細胞培養９６ウェルプレート（グライナー社製）３枚へ１００μＬ／ウェルで播種した。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。
２．ＭＴＸ耐性株の取得
前項で得たｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ導入細胞を６日間培養した後、培養上清を除去し、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび５０ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）を添加したＩＭＤＭ培地を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら９日間の培養を行った。次いで、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび２００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を同様に３〜４日毎に繰り返しながら１８日間培養し、最終的に形成されたコロニーを２４ウェルプレート（グライナー社製）に植え替えた。さらに、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を３〜４日毎に繰り返し、適宜拡大しながら１９日間培養を行い、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株を取得した。
３．アンチトロンビンＩＩＩ高生産株の選別
前項で取得した複数の５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株より、各１．０×１０6細胞を５ｍＬの１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地に懸濁し、Ｔ２５フラスコヘ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれるＡＴＩＩＩ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定した。その結果、培養上清中に５１３ｎｇ／ｍＬの濃度で遺伝子組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩが発現していることを確認し、この形質転換株をｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ１ ＧＭＤＫＯ株と名付けた。
以下、実施例４に記載した方法で、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを取得した。さらに、実施例５に記載した方法により該アンチトロンビンＩＩＩの生物活性を測定し、ＧＭＤノックアウト細胞で発現させた遺伝子組換えアンチトロンビンは、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で発現させた遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに比較してヘパリン解離定数が有意に小さく、ヘパリンコファクター活性とトロンビン阻害二次速度定数が有意に高いことを確認した。
実施例９ ＣＨＯ ＳＭ株によるアミノ酸改変した遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの発現
１．ＣＨＯ ＳＭ株へのＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ発現プラスミドの導入
実施例７で作製したＣＨＯ ＳＭ株に、実施例６第２項で作製したプラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを導入した。これらの遺伝子導入は公知のエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ ３０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μｌと１００単位の制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含む２００μｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行うことにより線状化した。反応後、該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。次に、実施例７で取得したＣＨＯ ＳＭ株をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／１ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4、４．０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2）に懸濁して８×１０7細胞／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×ｌ０6個）と上記の線状化プラスミド９μｇを混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、エレクトロポレーション装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行ったのち、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬに懸濁し、接着細胞培養９６ウェルプレート（グライナー社製）３枚へ１００μｌ／ウェルで播種した。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。
２．ＭＴＸ耐性株の取得
前項で得たｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ導入細胞を６日間培養した後、培養上清を除去し、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５０ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）を添加したＩＭＤＭ培地を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら９日間の培養を行った。次いで、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび２００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を同様に３〜４日毎に繰り返しながら１８日間培養し、最終的に形成されたコロニーを２４ウェルプレート（グライナー社製）に植え替えた。さらに、１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を３〜４日毎に繰り返し、適宜拡大しながら１９日間培養を行い、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株を取得した。
３．ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ高生産株の選別
前項で取得した複数の５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株より、各１．０×１０6細胞を５ｍＬの１０％透析ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地に懸濁し、Ｔ２５フラスコヘ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれるＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ量をＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定し、高生産株を樹立した。方法は添付マニュアルに従い、標準品にはノイアート（三菱ウェルファーマ社製）を用いた。その結果、得られたアンチトロンビンＩＩＩ発現株の培養上清中に４５．４ｎｇ／ｍＬの濃度でアンチトロンビンＩＩＩが発現していることを確認し、この形質転換株をｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ６ ＧＭＤＫＯ株を名付けた。
以下、実施例４に記載した方法で、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する変異型の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを取得し、Ｎ結合型糖鎖の本数が３本であることを確認した。さらに、実施例５に記載した方法で該アンチトロンビンＩＩＩの生物活性を測定し、ＧＭＤＫＯ細胞で発現させた変異型の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩは、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で発現させた変異型の遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩに比較してヘパリン解離定数が有意に小さく、ヘパリンコファクター活性とトロンビン阻害二次速度定数が有意に高いことを確認した。
実施例１０．酵母による遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩの発現
酵母には多くの種類が知られているが、組換え蛋白質を発現させる宿主としてしばしば用いられる代表的な酵母として、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属とサッカロマイセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が挙げられる。通常、これらの酵母が発現する組換え蛋白質に付加されるＮ−結合型糖鎖の主要な構造は、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側の分岐部分に９個から数十個のマンノース残基と、数個から十数個のマンノース６−リン酸残基を有する、ハイマンノース型糖鎖であることが知られている（Ｙｅａｓｔ １９，１１９１（２００２））。また、このような構造を有するハイマンノース型糖鎖は、しばしばハイパーマンノース型糖鎖とも呼ばれる。
以下に記載する実施例ではまず、主に付加されるＮ−結合型糖鎖の構造として、ハイマンノース型糖鎖と複合型糖鎖の中間の構造である、ハイブリッド型糖鎖が主に付加されたアンチトロンビンＩＩＩを発現するピキア酵母株とサッカロマイセス酵母株の作製方法について記載する。
１．ゲノム上に存在するＰＮＯ１酵素遺伝子を破壊したピキア酵母株の作製
ピキア酵母株、たとえばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５株（インビトロジェン社製）などのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法に、よって、ピキア酵母のＰＮＯ１（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ １）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＢ０９９５１４）の翻訳領域全長の配列を増幅させる。増幅させた約３２００塩基長のＰＮＯ１遺伝子配列は、その５'末端側半分の配列を、酵母由来のｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５'−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＵＲＡ３）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ３２１０９８）に置換した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰ０ベクター（インビトロジェン社製）などのベクターに挿入することにより、ＰＮＯ１遺伝子破壊用のプラスミドを作製する。次に、このプラスミド１００μｇを制限酵素で線状化した後、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）記載のエレクトロポレーション法によって、たとえばＧＴＳ１１５株などのピキア酵母に安定的に遺伝子導入を行う。次に、遺伝子導入した酵母を、ウラシルを欠損させたＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）を用いて室温にて培養し、増殖してきた各コロニーからゲノムＤＮＡを抽出する。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、酵母ＰＮＯ１遺伝子座の配列を増幅させることにより、相同組換えによってＰＮＯ１遺伝子座が破壊された酵母クローンを選択する。上記の方法により、ピキア酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に９個から数十個のマンノース残基が結合した構造を有したハイマンノース型糖鎖に改変することができる。
２．ゲノム上に存在するα−１，６−マンノース転移酵素遺伝子を破壊したピキア酵母株の作製
ピキア酵母株、たとえばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ−３３株（インビトロジェン社製）などのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によって、ピキア酵母のα−１，６−マンノース転移酵素（ＯＣＨ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ５４００６３）を増幅させる。増幅させた約２８００塩基長のＯＣＨ１遺伝子配列は、その５'末端側半分の配列を、酵母由来のｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５'−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＵＲＡ３）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ３２１０９８）に置換した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰ０ベクター（インビトロジェン社製）などのベクターに挿入することにより、ＯＣＨ１遺伝子破壊用ベクターが作製される。次に、このベクター１００μｇを制限酵素Ｓｆｉ Ｉ（ニューイングランドバイオラブズ社製）で線状化した後、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）記載のエレクトロポレーション法によって、ピキア酵母株、例えば前項に記載したＰＮＯ１遺伝子破壊株や、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＪＣ３０８株などに対し、安定的な遺伝子導入を行う。次に、遺伝子導入した酵母を、ウラシルを欠損させたＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）を用いて室温にて培養し、増殖してきた各コロニーからゲノムＤＮＡを抽出する。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、酵母ＯＣＨ１遺伝子座の配列を増幅させることにより、相同組換えによってＯＣＨ１遺伝子座が破壊された酵母クローン株を選択する。上記の方法により、ピキア酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に８個のマンノース残基が結合した構造を有したＭａｎ８型ハイマンノース型糖鎖に改変することができる。
３．組換えキメラ型α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を導入したピキア酵母株の作製
線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアグン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次にこのＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを調製する。次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、線虫α−１，２−マンノシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＮＭ＿０７３５９４）の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のαマンノシダーゼ（ＭＮＳ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｍ６３５９８）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターｐＰＩＣＺ（インビトロジェン社製）などのベクターに挿入し、酵母の小胞体内にα−１，２−マンノシダーゼを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載したＰＮＯ１遺伝子とＯＣＨ１遺伝子の両方の遺伝子を相同組換えで破壊したピキア酵母株に対し、エレクトロポレーション法により安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、ウラシルを欠損しゼオシン（インビトロジェン社製）を含有するＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーから全ＲＮＡを抽出する。次に、この全ＲＮＡから調製したｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、組換えキメラ型α−１，２−マンノシダーゼの発現が認められた酵母クローン株を選択する。上記の方法により、ピキア酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に５個のマンノース残基が結合した構造を有したＭａｎ５型ハイマンノース型糖鎖に改変できる。
４．組換えＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター遺伝子を導入したピキア酵母株の作製
酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次にこのＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを調製する。次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、酵母ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターの翻訳領域全長をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ１０６０８０）を特異的に増幅させる。次に、増幅させた約３７００塩基長のｃＤＮＡを、酵母用の発現ベクターｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン社製）などのベクターのアルコールオキシゲナーゼプロモーター配列の下流に位置する制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ切断部位とＮｏｔＩ切断部位の間に挿入し、酵母のゴルジ体内にＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を導入したピキア酵母株に対し、エレクトロポレーション法により安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、薬剤Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含有するＹＰＤ培地で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーから全ＲＮＡを抽出する。次に、この全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、組換えＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターの発現が認められた酵母クローン株を選択する。
５．組換えキメラ型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ遺伝子を導入したピキア酵母株の作製
ヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｍ５５６２１）の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のマンノース転移酵素（ＭＮＮ９）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７５２）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）などのベクターのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター配列の下流に位置する制限酵素Ｋｐｎ Ｉ切断部位とＸｂａ Ｉ切断部位の間に挿入し、酵母のゴルジ体内にＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター遺伝子を導入したピキア酵母株に対し、発現ベクターｐＡＵＲ１２３に添付のマニュアルに掲載された酢酸リチウム法により導入する。遺伝子導入後の酵母は、薬剤オーロブラシジンＡ（タカラバイオ社製）を含有するＹＰＤ培地で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーから全ＲＮＡを抽出する。次に、この全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、組換えＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉの発現が認められた酵母クローン株を選択する。上記の方法により、ピキア酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に５個のマンノース残基が結合したＭａｎ５型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側に、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が１個付加された構造を有する、ハイブリッド型糖鎖に改変することができる。
以上、Ｎ−結合型糖鎖として、ハイマンノース型糖鎖と複合型糖鎖の中間の構造である、ハイブリッド型糖鎖を主要に発現するピキア酵母株の作製方法について記載した。上述のピキア酵母以外に、組換え蛋白質を発現させる宿主としてしばしば用いられる酵母として、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が挙げられる。以下、Ｎ−結合型糖鎖としてハイブリッド型糖鎖を主要に発現するサッカロマイセス酵母株の作製方法について述べる。
６．ゲノム上に存在するα−１，６−マンノース転杉酵素遺伝子とα−１，３−マンノース転移酵素遺伝子を破壊したサッカロマイセス酵母株の作製
Ｎａｋａｙａｍａらの方法（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １１， ２５１１（１９９２））に従い、相同組換えによってＯＣＨ１遺伝子座が破壊された酵母クローンを選択する。得られたＯＣＨ１遺伝子が破壊されたサッカロマイセス酵母株は、Ｓｈｅｒｍａｎらの方法（メソッズ・イン・エンザイモロジー１９４，２１（１９９１））に従い、半数体細胞を誘導した後、α−１，３−マンノース転移酵素（ＭＮＮ１）遺伝子が破壊された変異酵母株ＬＢ１−１０Ｂ（カリフォルニア大学Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）の半数体細胞と混合し、窒素欠乏条件で培養することにより、二倍体の接合子を形成させる。次に、得られた接合子を、ウラシルとロイシンを欠損させたＹＰＤ培地で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーからゲノムＤＮＡを抽出する。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、酵母ＯＣＨ１遺伝子座の配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ５４００６３）と、ＭＮＮ１遺伝子座の配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ５４００６３Ｌ２３７５３）をそれぞれ増幅させることにより、ＯＣＨ１遺伝子座とＭＮＮ１遺伝子座の両方が破壊された酵母クローン株を選択する。上記の方法により、サッカロマイセス酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に８個のマンノース残基が結合した構造を有する、Ｍａｎ８型ハイマンノース型糖鎖に改変できる。
７．組換えキメラ型α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を導入したサッカロマイセス酵母株の作製
カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次にこのＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを調製する。次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、カビα−１，２−マンノシダーゼの翻訳領域全長をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｄ４９８２７）を特異的に増幅させる。増幅させた約１５００塩基長のｃＤＮＡは、その翻訳終止コドンを削除した３'末端側に、酵母の小胞体局在シグナルペプチド（エンボジャーナル７，９１３（１９８８））、すなわちヒスチジン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシンをコードするｃＤＮＡ配列と翻訳終止コドンを連結した後に、酵母用の発現ベクターｐＰＩＣＺ（インビトロジェン社製）などのベクターに挿入し、酵母の小胞体内にα−１，２−マンノシダーゼを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、α−１，６−マンノース転移酵素遺伝子とα−１，３−マンノース転移酵素遺伝子を破壊したサッカロマイセス酵母株に対し、エレクトロポレーション法により安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、ウラシルを欠損しゼオシン（インビトロジェン社製）を含有するＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーから全ＲＮＡを抽出する。次に、この全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、組換えキメラ型α−１，２−マンノシダーゼの発現が認められた酵母クローン株を選択する。上記の方法により、サッカロマイセス酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に５個のマンノース残基が結合した構造を有する、Ｍａｎ５型ハイマンノース型糖鎖に改変することができる。
８．組換えＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター遺伝子を導入したサッカロマイセス酵母株の作製
酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次にこのＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを調製する。次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、酵母ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターの翻訳領域全長をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＦ１０６０８０）を特異的に増幅させる。次に、増幅させた約３７００塩基長のｃＤＮＡを、酵母用の発現ベクターｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン社製）などのベクターのアルコールオキシゲナーゼプロモーター配列の下流に位置する制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ切断部位とＮｏｔ Ｉ切断部位の間に挿入し、酵母のゴルジ体内にＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を導入したサッカロマイセス酵母株に対し、エレクトロポレーション法により安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、薬剤Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含有するＹＰＤ培地で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーから全ＲＮＡを抽出する。次に、この全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、組換えＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターの発現が認められた酵母クローン株を選択する。
９．組換えキメラ型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ遺伝子を導入したサッカロマイセス酵母株の作製
ヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｍ５５６２１）の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のマンノース転移酵素（ＭＮＮ９）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７５２）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）などのベクターのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター配列の下流に位置する制限酵素Ｋｐｎ Ｉ切断部位とＸｂａ Ｉ切断部位の間に挿入し、酵母のゴルジ体内にＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター遺伝子を導入したサッカロマイセス酵母株に対し、発現ベクターｐＡＵＲ１２３に添付のマニュアルに掲載された酢酸リチウム法により導入する。遺伝子導入後の酵母は、薬剤オーロブラシジンＡ（タカラバイオ社製）を含有するＹＰＤ培地で室温にて培養し、増殖してきた各コロニーから全ＲＮＡを抽出する。次に、この全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、組換えＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉの発現が認められた酵母クローン株を選択する。上記の方法により、サッカロマイセス酵母が発現する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に５個のマンノース残基が結合した構造を有するＭａｎ５型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側に、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が１個付加された、ハイブリッド型糖鎖に改変できる。
以上の通り、Ｎ−結合型糖鎖としてＭａｎ５型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側にＮ−アセチルグルコサミン残基が１個付加された、ハイブリッド型糖鎖を主要に発現するピキア酵母株、あるいはサッカロマイセス酵母株の作製方法について述べた。次に、これらの酵母株を宿主として用い、Ｎ−結合型糖鎖としてハイブリッド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩの調製方法について述べる。
１０．組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ発現ベクターの作製
Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６，６００（１９９２））に従い、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、増幅用酵素としてＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲ反応により、成熟型ヒトアンチトロンビンＩＩＩの全長をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。次に、得られたｃＤＮＡを、酵母用の発現ベクターｐＰＩＣ６α（インビトロジェン社製）などのベクターのアルコールオキシゲナーゼプロモーター配列の下流に位置する制限酵素ＣｌａＩ切断部位とＸｂａＩ切断部位の間に挿入し、成熟型ヒトアンチトロンビンＩＩＩを分泌発現させるベクターｐＰＩＣ６α／ｈＡＴＩＩＩを作製する。
１１．組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩ遺伝子を導入した酵母株の作製
上述の成熟型ヒトアンチトロンビンＩＩＩを分泌発現させるベクターｐＰＩＣ６α／ｈＡＴＩＩＩ １００μｇを、制限酵素ＳａｌＩ（ニューイングランドバイオラブズ社製）でＨＩＳ４遺伝子内を切断し、フェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿によって、線状化ベクターを調製する。次にＭｏｃｈｉｚｕｋｉらの方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３，５５（２００１））に従い、この線状化したアンチトロンビンＩＩＩ発現ベクターを、上述の本実施例第５項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖として主にハイブリッド型糖鎖を発現するピキア酵母株、もしくは本実施例第９項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖として主にハイブリッド型糖鎖を発現するサッカロマイセス酵母株に対し、酢酸リチウム法により導入する。遺伝子導入後の酵母は、薬剤ブラストシジン（インビトロジェン社製）を含有するＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）で室温にて培養し、ブラストシジン耐性コロニーを取得する。次に、ブラストシジン耐性コロニーを液体ＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）に移植し、３０℃にて２４時間以上の回分培養を行う。培養後に得られる培養上清は、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩ医薬品ノイアート（三菱ウェルファーマ社製）などを標準品とし、ヒトアンチトロンビンＩＩＩエライザキット（アフィニティーバイオロジカルズ社製）を用いて分析する。この分析により、培養上清中に含まれる組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを検出し、その濃度を測定することが可能である。この酵母培養上清中に分泌された、Ｎ−結合型糖鎖とトてフコースを含まないハイブリッド型糖鎖を有する遺伝子遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩは、実施例４に記載した方法で、精製が可能である。また、精製されたアンチトロンビンＩＩＩ蛋白質は、上記実施例４に記載した方法で、糖鎖構造の解析が可能である。
以上の通り、Ｎ−結合型糖鎖として、Ｍａｎ５型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側にＮ−アセチルグルコサミン残基が１個付加されたハイブリッド型糖鎖を主要に発現するピキア酵母株、あるいは同様に改変されたサッカロマイセス酵母株を宿主として用い、Ｎ−結合型糖鎖としてフコースを含まないハイブリッド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを調製できることを述べた。次に、このＮ−結合型糖鎖としてハイブリッド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株を用いて、Ｎ−結合型糖鎖としてフコースを含まない複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株を作製する方法について以下に記載する。
１２．組換えキメラ型αマンノシダーゼＩＩ遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、たとえば肝臓由来のｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、αマンノシダーゼＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｕ３１５２０）の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のマンノース転移酵素（ＭＮＮ９）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７５２）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴルジ体内にαマンノシダーゼＩＩを発現させるベクターを作製する。次にこのべクターを、本実施例第１１項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖としてハイブリッド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株に対し、安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、ＲＴ−ＰＣＲによって、キメラ型αマンノシダーゼＩＩの発現を確認する。
１３．組換えキメラ型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、たとえば肝臓由来のｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｕ１５１２８）の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のマンノース転移酵素（ＭＮＮ９）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７５２）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴルジ体内にＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖としてハイブリッド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株にキメラ型αマンノシダーゼＩＩを安定的に導入した酵母株に対し、安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、ＲＴ−ＰＣＲによって、キメラ型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩの発現を確認する。上記の方法により、キメラ型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩが安定的に組み込まれた酵母株が発現する遺伝子遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩが有する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、その非還元末端側に３個のマンノース残基が二分岐する構造で結合し、二つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基が１個ずつ付加された、フコースを含まない複合二本鎖型糖鎖に改変できる。
１４．組換えＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、たとえば肝臓由来のｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＢ０４２４２５）の翻訳領域全長をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴルジ体内にＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株に対し、安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの発現を確認する。
１５．組換えキメラ型β１，４ガラクトース転移酵素遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、たとえば肝臓由来のｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、β１，４ガラクトース転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｍ２２９２１）の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のマンノース転移酵素（ＭＮＮ９）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７５２）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴルジ体内にβ１，４ガラクトース転移酵素を発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、上述の前項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株にキメラ型β１，４ガラクトース転移酵素を安定的に導入した酵母株に対し、安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、ＲＴ−ＰＣＲによって、キメラ型β１，４ガラクトース転移酵素の発現を確認する。以上の方法により、キメラ型β１，４ガラクトース転移酵素が安定的に組み込まれた酵母株が発現する遺伝子遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩが有する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、その非還元末端側に３個のマンノース残基が二分岐する構造で結合し、二つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基とガラクトース残基が１個ずつ付加された、未熟な複合二本鎖型糖鎖に改変することができる。
１６．組換えＣＭＰ−シアル酸トランスポーター遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、たとえば肝臓由来のｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｄ８７９６９）の翻訳領域全長をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴルジ体内にＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、上述の前項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株に対し、安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの発現を確認する。
１７．組換えキメラ型シアル酸転移酵素遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、たとえば肝臓由来のｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、特異的プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行うことにより、α２，３シアル酸転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７６８）、もしくは、α２，６シアル酸転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｘ６２８２２）、の活性ドメインをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅させる。増幅させたｃＤＮＡは、その５'末端側に、酵母のマンノース転移酵素（ＭＮＮ９）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｌ２３７５２）のリーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴルジ体内にシアル酸転移酵素を発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、Ｎ−結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株にキメラ型シアル酸転移酵素を安定的に導入した酵母株に対し、安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、ＲＴ−ＰＣＲによって、キメラ型シアル酸転移酵素の発現を確認する。上記の方法により、キメラ型シアル酸転移酵素が安定的に組み込まれた酵母株が発現する遺伝子遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩが有する主要なＮ−結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に２残基のＮ−アセチルグルコサミンを有し、その非還元末端側に３個のマンノース残基が二分岐する構造で結合し、二つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基とシアル酸が１個ずつ付加された、成熟した複合二本鎖型糖鎖に改変することが可能である。
１８．酵母を用いた遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ蛋白質の調製。
前項で作製した、還元末端側にフコース残基を持たず非還元末端側にシアル酸が付加された複合二本鎖型糖鎖を主に有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株は、液体ＹＰＤ培地（インビトロジェン社製）に播種し、３０℃にて２４時間以上の回分培養を行うことにより、培養上清中に遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを分泌させることが可能である。培養後に得られる培養上清は、ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩノイアート（三菱ウェルファーマ社製）などを標準品とし、ヒトアンチトロンビンＩＩＩエライザキット（アフィニティーバイオロジカルズ社製）を用いて分析する。この分析により、培養上清中に含まれる組換えヒトアンチトロンビンＩＩＩを検出し、その濃度を測定することが可能である。また、この酵母培養上清中に分泌された、Ｎ−結合型糖鎖としてフコースを含まない複合二本鎖型糖鎖を有する遺伝子遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩは、実施例４に記載した方法で、精製が可能である。また、精製されたアンチトロンビンＩＩＩ蛋白質は、実施例４に記載した方法で、糖鎖構造の解析が可能である。
以上の通り、Ｎ−グリコシド結合糖鎖としてフコースを含まない複合型糖鎖を主要に有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを発現する酵母株を作製し、その酵母の培養によって、Ｎ−グリコシド結合糖鎖としてフコースを含まない複合型糖鎖を主要に有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩを調製可能であることを示した。なお、本実施例において酵母で発現させた該アンチトロンビンＩＩＩは、ＦＵＴ８ダブルノックアウト細胞で発現させたアンチトロンビンＩＩＩや、ヒト血漿由来のアンチトロンビンＩＩＩと比較して、同等の生物活性を有する蛋白質である。
【産業上の利用可能性】
本発明により、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法が提供される。
【配列表フリ−テキスト】
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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