(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
【請求項２】
下記（ａ）から（ｄ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
【請求項６】
下記式(I)
【化１】
0004270918.tif 000036
（式中、Ｒは水素原子、アルキル基またはアリール基を示す）で表される化合物、下記式(II)
【化２】
0004270918.tif 000037
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物、及び、下記式（III）
【化３】
0004270918.tif 000038
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物からなる群より選ばれるカルボニル基含有化合物に、請求項４または５に記載の形質転換体、該形質転換体培養物、該形質転換体処理物からなる群より選ばれるいずれかを作用させてカルボニル基含有化合物を不斉還元させることを特徴とする下記式(IV)
【化４】
0004270918.tif 000039
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物の製造方法。
【請求項７】
式（II）及び式（III）で表される化合物が、それぞれ下記式（II'）
【化５】
0004270918.tif 000040
（式中、Ｒは前記と同義である）及び下記式（III'）
【化６】
0004270918.tif 000041
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される光学活性体であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体培養物または該形質転換体処理物を用いた光学活性アルコール類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−ヘプト−６−エン酸エステル類を化学的に製造する方法としては、例えば、特許文献１に以下に示す製造ルートが知られている。
【０００３】
【化７】
0004270918.tif 000002
【０００４】
また、特許文献２には、光学活性なシッフ塩基を用いて製造する方法も報告されている。
またさらに、特許文献３には、（Ｒ）−３−tert-ブチルジメチルシリルオキシ−６−ジメトキシホスフィニル−５−オキソヘキサン酸メチルエステルを用いて極低温にて製造する方法も報告されている。
一方、より安価にまた副生産物の少ない方法として、微生物の菌体及び／または該菌体処理物を用いて、カルボニル基を有する化合物から立体選択的に還元し、光学活性なアルコール体を生成する方法を上記化合物の製造に応用する方法が考えられるが、カルボニル基の側鎖にキノリン骨格を有する化合物を用いる方法として、非特許文献１には、以下に示す反応をミクロバクテリウム  キャンポクエマドエンシス（Microbacterium campoquemadoensis）MB5614株を用いて行えることが記載されている。
【０００５】
【化８】
0004270918.tif 000003
【０００６】
また、非特許文献２には、以下に示す反応をパン酵母を用いて行えることが記載されている。
【０００７】
【化９】
0004270918.tif 000004
【０００８】
しかしながら、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エステル類のように、カルボニル基のα位にオレフィンが存在する上に、カルボニル基が連続して存在する化合物については、微生物を用いて立体選択的に還元できるという例は知られていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
Appl microbiol Biotechnol(1998)49:ｐ.709-717
【非特許文献２】
Bioorg Med Chem Lett, vol8, p1403-(1998)
【特許文献１】
特開平１−２７９８６６号公報
【特許文献２】
特開平８−９２２１７号公報
【特許文献３】
特開平８−１２７５８５号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類を工業的に安価に製造できる新規な製造方法を開発することが望まれていた。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類の製造方法について鋭意検討した結果、原料となるカルボニル基含有化合物の還元反応を触媒する新規酵素を単離し、組換え菌を用いて発現させた該酵素を、原料となるカルボニル基含有化合物に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物を得ることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）  下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。；
（２）  下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。；
（３）  （２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。；
（４）  （３）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。；
（５）  （２）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。；
（６）（４）または（５）に記載の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物からなる群より選ばれるいずれかを用いてカルボニル基含有化合物を不斉還元することを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。；
及び
（７）カルボニル基含有化合物が、下記式（II’）
【００１３】
【化１０】
0004270918.tif 000005
【００１４】
（式中、Ｒは水素原子、アルキル基またはアリール基を示す）及び下記式（III’）
【００１５】
【化１１】
0004270918.tif 000006
【００１６】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される光学活性体であることを特徴とする（６）に記載の製造方法に存する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又はそのホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するものである。
本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類とする活性をいう。このような活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系において、酵素として、目的のポリペプチド、形質転換体細胞、形質転換体細胞培養物または形質転換体細胞処理物を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列が明らかになったので、後述するように本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、オガタエア属酵母の培養物より精製することも出来る。
【００１９】
オガタエア属酵母としては、例えば、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）が特に本発明のカルボニル還元酵素の産生能に優れ、この酵母は、例えばＩＦＯ
１４７３株として財団法人発酵研究所より入手する事が出来る。
微生物の培養物からの本発明のポリペプチドの取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物をＹＭ培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することが出来る。例えば、ＤＥＡＥセファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、オクチルセファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、Ｑ−セファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、スーパーデックス２００を用いたゲル濾過等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００２０】
このように精製されたオガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）に由来する本発明のポリペプチドは、典型的には以下の性状を備えたものである。
（１）至適ｐＨ
５．０〜６．０
（２）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略）による分子量測定で約２７，０００Ｄａである。
さらにこの酵素は以下の性状で特徴付ける事が出来る。
（３）安定ｐＨ範囲
ｐＨ５．５〜６．５  の範囲で比較的安定である
（４）作用適温の範囲
至適温度は６０〜７０℃である。
（５）温度安定性
４０℃まで比較的安定である。
（６）阻害
本酵素は水銀（Ｉ）イオン、鉛（ＩＩ）イオンにより阻害を受ける。
上記の方法で単離された本発明のポリペプチドは、単なるカルボニル基含有化合物だけでなく、ジカルボニル化合物も不斉還元する能力を有する優れた酵素である。
【００２１】
本発明のポリペプチドのホモログとは、カルボニル還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ酸配列を有するものである。ここで複数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００２２】
ちなみに上記ポリペプチドのホモロジー検索は、例えば、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象に、FASTA programやBLAST  programなどを用いて行うことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のprobable short chain dehydrogenase（T41540）の３７．４%であった。
【００２３】
また、本発明のＤＮＡは、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、具体的には配列番号２に記載の塩基配列を含むものが挙げられる。
【００２４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、本発明のポリペプチドを上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断後、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決める。
【００２５】
決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid  Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
【００２６】
なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされるゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになったため、配列番号２に基づく化学合成等によって得ることもできる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡホモログとは、カルボニル還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡホモログとしては、具体的には配列番号２に記載の塩基配列がコードするポリペプチドにおいて、カルボニル還元酵素活性を害さない範囲内において、配列番号２に記載の塩基配列に１から複数個の塩基が欠失、付加または置換された塩基配列を含むものが挙げられる。ここで複数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２７】
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄＥｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００２８】
また、本発明のＤＮＡのホモログは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から調整したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００２９】
各ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（ 以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３０】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３１】
上記のようにして単離された、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。発現ベクターとしては、本発明のＤＮＡを発現可能なベクターであれば特に限定されず、形質転換する宿主微生物の種類などに応じて適宜選択可能である。あるいは、形質転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３２】
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させることができる。
【００３３】
このとき、本発明のＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流にそれぞれ組み込むことができる。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、などに詳細に記述されている。
【００３４】
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３５】
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌；
ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌；
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母；
ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００３６】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属であり、特に好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属である。
形質転換体の作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring  Harbor Laboratories)。
【００３７】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ pＬ、pＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００３８】
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240(Gene, 26, 273-82(1983))を挙げることができる。
【００３９】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４０】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces  cerevisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４１】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００４２】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００４３】
さらに本発明は、上記の方法などで得られる本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物を、反応基質である下記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（III）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、光学活性アルコールを製造する方法に関する。形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物はいずれかを単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
下記式(I)
【００４４】
【化１２】
0004270918.tif 000007
【００４５】
（式中、Ｒは水素原子、アルキル基またはアリール基を示す）
で表される化合物、下記式(II)
【００４６】
【化１３】
0004270918.tif 000008
【００４７】
（式中、Ｒは前記と同義である）
で表される化合物、及び、下記式（III）
【００４８】
【化１４】
0004270918.tif 000009
【００４９】
（式中、Ｒは前記と同義である）
本発明の製造方法に用いられる原料である、上記式（I）〜（III）で表される化合物において、Ｒは、水素原子、アルキル基またはアリール基を示す。
アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基等の、アルキル基またはアリール基で置換されていてもよい直鎖、分岐若しくは環状のアルキル基である。
アリール基としては、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等の、アルキル基で置換されていても良いフェニル基又はナフチル基が挙げられる。
上記Ｒとして好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくはＣ1〜Ｃ4のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。
【００５０】
本発明の製造方法において、上記式（II）および（III）で表される化合物は少なくとも下記式（II'）および下記式（III'）で表される光学活性体を含む。上記式（II）および（III）で表される化合物のうち下記式（II'）および下記式（III'）の含有量が多いことが好ましい。さらに上記式（II）および（III）で表される化合物は下記式（II'）および下記式（III'）からなることが好ましい。下記式（II'）および下記式（III'）で表される化合物においてＲは前記と同義である。
【００５１】
【化１５】
0004270918.tif 000010
【００５２】
（式中、Ｒは前記と同義である）
【００５３】
【化１６】
0004270918.tif 000011
【００５４】
（式中、Ｒは前記と同義である）
なお、本発明の製造方法により式（Ｉ）〜（III）及び（II'）〜（III'）で表される化合物から得られる産物は混合物でもよいが、少なくとも下記式（IV)を含む。下記式（IV）で表される化合物においてＲは前記と同義である。
【００５５】
【化１７】
0004270918.tif 000012
【００５６】
（式中、Ｒは前記と同義である）
式（Ｉ）〜（III）及び（II'）〜（III'）で表される化合物は、特開平１−２７９８６６号公報、特開平８−１２７５８５号公報、特開平５−１７８８４１号公報等に記載された方法と公知の方法を組み合わせることによって、任意に製造することができる。これらの化合物は１種あるいは２種以上を組み合わせて原料として使用することができる。
【００５７】
原料として、式（I）で表される化合物を用いて式（IＶ）で表される化合物を製造する場合には、その製造中間体として、式（II'）で表される化合物を経由する場合と、式（III'）で表される化合物を経由する場合がある。
ついては、式（Ｉ）で表される化合物から、あらかじめ式（II'）で表される化合物及び式（III'）で表される化合物を製造し、それを単離し、さらに式（IＶ）で表される化合物へ誘導してもよいし、式（II'）で表される化合物及び式（III'）で表される化合物を単離することなく、そのまま式（IＶ）で表される化合物を製造してもよい。
【００５８】
また、反応基質は、通常、基質濃度が０．０１〜９０ｗ／ｖ%、好ましくは０．１〜３０ｗ／ｖ%の範囲で用いられる。これらは、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００５９】
本発明の製造方法において、カルボニル基含有化合物に上記形質転換体を作用させるに当たっては、該形質転換体細胞をそのまま、該形質転換体細胞培養物、あるいは該形質転換体細胞を公知の方法によって処理して得られる該形質転換体細胞処理物、例えば、該形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該形質転換体細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを用いることができる。
【００６０】
また、本発明の製造方法においては、補酵素ＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好ましく、通常、０．００１mM〜１００mM、好ましくは０．０１〜１０mM添加する。
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ+還元能を利用する方法、２）ＮＡＤＰ+からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
【００６１】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いても良い。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素に比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
【００６２】
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなど、の添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００６３】
また、上記３）の方法においては、本発明のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
【００６４】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６５】
本発明の製造方法は、反応基質及び本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物または該形質転換体処理物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。上記水性媒体としては、リン酸ナトリウムやリン酸カリウムなどを用いた緩衝液などを用いることができ、その緩衝液に有機溶媒や、界面活性剤などの通常の酵素反応に用いられる任意成分を適宜加えたものを用いることができる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の水溶性溶媒や酢酸ブチルやヘキサン等の非水溶性有機溶媒などが挙げられ、反応基質の溶解度が高い物を好ましく使用することができる。界面活性剤としてはＴｗｅｅｎ８０やシュガーエステルなどが挙げられる。
【００６６】
本発明の方法は、通常、４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明の方法により生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
尚、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類は、目的とする３Ｒ，５Ｓ体の他に異性体として、３Ｓ，５Ｒ体、３Ｒ，５Ｒ体及び３Ｓ，５Ｓ体が存在し、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、ＤＯＬＥと略す）を例として示すと、その構造式は以下の通りである。
【００６８】
３Ｓ，５Ｒ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｓ−ＤＯＬＥはシン（Ｓｙｎ）体のＤＯＬＥであり、 ３Ｓ，５Ｓ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｒ−ＤＯＬＥはアンチ（ａｎｔｉ）体のＤＯＬＥである。
実施例中、目的生成物である３Ｒ，５Ｓ体の純度をエナンチオマー過剰率で示すことがあるが、本実施例中では、エナンチオマー過剰率を（3R,5S体 - 3S,5R体）／（3R,5S体 + 3S,5R体）（%e.e.）で示した。
【００６９】
【化１８】
0004270918.tif 000013
【００７０】
＜製造例１＞  （Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、ＤＯＸＥと略す）の合成
攪拌機、滴下ロートおよび温度計を付けた５００ｍＬの四つ口フラスコに、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、５−ＭＯＬＥと略す）５．０２ｇ（１１．２２ｍｍｏｌ）およびアセトン４２０ｍＬを加え攪拌する。調製されたＪｏｎｅｓ酸化剤（濃硫酸３ｍＬと酸化クロム３．３５ｇを混合させた後、水で２５ｍＬまで希釈することにより得られた試剤）１０．５ｍＬを０℃で２０分を要して滴下し、氷冷下で２時間攪拌を行った後、メタノール１０ｍＬをゆっくり加えて反応を停止した。次に反応混合液を減圧下、アセトンを留去させた後、酢酸エチル２５０ｍＬを加え、得られた溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍＬで２回、引き続き飽和食塩水溶液６０ｍＬで２回抽出・分液した後、酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して、標記化合物３．０３ｇ（収率：６０．６％）を得た。
【００７１】
1H-NMR(300MHz, CDCl3, δppm): 7.79-7.19(8H, m), 7.71(1H, d), 6.03(1H, d), 5.51(1H,s), 4.21(2H, q), 3.40(2H, s), 2.35-2.40(1H, m), 1.39-1.41 (2H, m), 1.28(3H, t), 1.07-1.09(2H, m).
【００７２】
＜製造例２＞  ５Ｓ-（Ｅ）−７−〔２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、５Ｓ−ＭＯＬＥと略す）の合成
減圧下加熱乾燥した後に窒素ガスを導入したシュレンク管に、（Ｓ）−２−〔Ｎ−３―メチル−５−tert-ブチルサリチデン）アミノ〕−３−メチル−１−ブタノ−ル０．８７ｇ（３．３ｍｍｏｌ）、塩化メチレン５ｍｌおよびチタンテトラエトキシド０．６３ｍｌ（６．０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１時間攪拌混合した。該シュレンク管を−５０℃に冷却後、（Ｅ）−３−〔２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）- キノリン−３−イル〕− プロプ−２−エン−１−ア−ル０．９５ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍｌに溶解して滴下し、５分間攪拌した後、更にジケテン０．５１ｇ（６ｍｍｏｌ）を添加し、−５０℃を保ちながら２２時間攪拌して反応させた。得られた反応混合液を、塩化メチレン２５ｍｌと０．２４Ｍ重曹水２５ｍｌの混合溶液中に添加し、２時間、室温で、激しく攪拌し２層溶液を得た。得られた２層溶液は分液し、水層については塩化メチレン１０ｍｌで抽出を２回行った。塩化メチレン層と塩化メチレン抽出液とを合わて塩化メチレン溶液を得た。該塩化メチレン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィ−（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）で精製して、５Ｓ-（Ｅ）−７−〔２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステル（５Ｓ−ＭＯＬＥ）０．７５ｇを得た（光学純度：７３％ｅｅ、（Ｅ）−３−[２−シクロプロピル−４−(４−フルオロフェニル)−キノリン−３−イル]−プロプ−２−エン−１−ア−ルに対する収率：５６％）。
【００７３】
＜実施例１＞  カルボニル還元酵素の単離
オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株を２０ＬのYM培地（グルコース24g、酵母エキス3g、麦芽エキス3g、ペプトン5g/L、 pH 6.0）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体のうち３００ｇを５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＤＴＴ）で澱懸し、ダイノーミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に12%w/vのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を添加し、遠心分離により上清を得た。その上清を標準緩衝液（１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ）で平衡化したＤＥＡＥセファロース６ＦＦ（２．６ｃｍｘ２８ｃｍ）に添加した。標準緩衝液でカラムを洗浄した後、さらに０．０７M塩化ナトリウムを含む標準緩衝液で洗浄後、０．０７〜０．１８M塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。溶出した画分を回収し、カルボニル還元酵素活性測定を行った。
【００７４】
カルボニル還元酵素活性測定は以下の反応液組成：酵素活性測定画分  200μL、にＮＡＤＰＨ  ８ｍＭの水酸化カリウム  ０．１ｍＭの水溶液１０μＬ、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）25μL、２０ｇ／Ｌ  ＤＯＸＥ（ＤＭＳＯ溶液）１０μＬ添加したものを30℃、一夜振とう反応させることで行った。活性検出は以下方法で行った。反応終了後の反応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。展開終了後、ＵＶランプにて生成物の確認をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：ＤＯＬＥ）はＲｆ＝０．３３である。
【００７５】
カルボニル還元酵素活性は、０．１３Ｍ塩化ナトリウム付近にピークが見られた。溶出した活性画分を回収し、硫安を終濃度０．３Ｍになるまで添加し、０．３Ｍ硫安を含む標準緩衝液（１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡化したオクチルセファロースＣＬ４Ｂ（０．８cm×２０cm）に添加し、硫安濃度を０．３〜０Ｍの勾配溶出を行った。カルボニル還元酵素活性は、０Ｍ硫安付近にピークが見られた。
【００７６】
溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により標準溶液まで脱塩、濃縮した後同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５に添加し、同緩衝液及び０．０５Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液で洗浄後、０．０５Ｍ〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。カルボニル還元酵素活性は、０．１７Ｍ  塩化ナトリウム画分に溶出したため、この画分を回収し、濃縮した。濃縮した酵素液をスーパーデックス２００  ＨＲ１０／３０を用い、０．１５M塩化ナトリウムを含む標準緩衝液でゲル濾過を行った。ゲル濾過により得られた活性画分の分子量は、約１０．７万Ｄａであった。
【００７７】
また、上記活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約２．７万Ｄａであった。
また、該酵素を種々のケトンやアルデヒドと反応させることにより、具体的には、基質100mMのイソプロパノール溶液を５μＬ、ＮＡＤＰＨ  ８ｍＭ及び水酸化カリウム  ０．１ｍＭの水溶液１０μＬを0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で総量２５０μＬの反応液としたものの中でのＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することにより、その還元活性を測定した。このときの２，２，２−トリフルオロアセトフェノンでの吸光度変化量を１００としたときの比活性を表1に示した。
【００７８】
【表１】
0004270918.tif 000014
【００７９】
該酵素の至適ｐＨは、ｐＨの異なる複数の緩衝液中で、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定することで求めた。具体的には、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液及びクエン酸緩衝液において、それぞれpHの異なるものを用意し、活性測定した。反応の至適pHは５．０〜６．５であった。
また、反応温度だけを変化させて、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定し、カルボニル還元酵素の作用至適温度を測定したところ、至適温度は６０〜７０℃であった。
【００８０】
該酵素のｐH安定性は、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液及びクエン酸緩衝液において異なるｐＨのものを複数用意し、それぞれ30℃、30分間インキュベートし、残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５〜６．５において最も安定であった。
該酵素の温度安定性は、ｐＨ７．０で２０ｍＭのリン酸緩衝液中、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び８０℃の温度でそれぞれ10分間放置した後、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定することにより調べた。それによると本発明の酵素は４０℃まで７９%以上の残存活性を示し、５０℃以上で急速に失活しはじめ、７０℃では活性が全くなくなることがわかった。
【００８１】
また、該酵素を種々の試薬中で30℃、10分間処理した後、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定したところ、該酵素は、硝酸水銀や塩化鉛のような水銀（Ｉ）イオン、鉛（ＩＩ）イオン存在下で活性が顕著に阻害された。
【００８２】
＜実施例２＞  カルボニル還元酵素の部分アミノ酸配列の解析
実施例１で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩、濃縮後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、30℃で終夜処理を行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ (アマシャム-ファルマシア製uRPC  C2/C18、 46mm × １００mm) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。分取したペプチドピーク３種をFrac20,27及び30とし、それぞれエドマン法によりアミノ酸配列の解析を行った。Frac20,27及び30のそれぞれのアミノ酸配列は配列番号３、４及び５に示した。同様にカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩後エドマン法によりＮ末端アミノ酸の解析を行い、結果を配列番号６で示した。
【００８３】
＜実施例３＞  オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株由来の本発明のＤＮＡの配列解析及び形質転換体の作製
オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株をＹＭ培地で培養し、菌体を調製した。
菌体からの総ＲＮＡの精製は、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）を用いて行った。精製したＲＮＡをもとにしてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。方法はそれぞれ添付の説明書通りに行った。
【００８４】
実施例２で得られたN末端アミノ酸配列を元にセンスデジェネレイト(degenerate)プライマー及び配列番号３、４及び５のアミノ酸配列を元にそれぞれアンチセンスのデジェネレイト(degenerate)プライマーを計４種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号７、8、９、1０に示した。N末端と3つの部分アミノ酸配列の組み合わせ（3通り）でプライマーを選び、 プライマーを各４００ｐｍｏｌ、dNTP   ０．４ｍｍｏｌ、上記で合成したオガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株のｃＤＮＡ１μL、TaKaRa  Taq用１０×緩衝液 (宝酒造社製)５μL及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ２ユニット(宝酒造社製、商品名「TaKaRa  Taq」)を含む５０μLの反応液を用い、変性（94℃、30秒) 、アニール（50℃、30秒）、伸長（72℃、1分）を30サイクル、PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research社製)を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号９のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号１０との組み合わせにおいて特異的と思われるバンドが検出できた。
【００８５】
上記で得られた３種類のＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出しGel  Extraction  kit(QIAGEN社製)にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を、pGEM-T  Vector  System(Promega社製)によりTAクローニングし、大腸菌DH5α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を１%バクトトリプトン、０．５%バクト酵母エキス及び１%塩化ナトリウムを含む培地（以下、LB培地と略す）にアンピシリン（１００μg/mL）を加え、１．５％バクトアガーでプレート化したもの上で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、ベクターの配列より合成された配列番号１１及び１２をプライマーとしてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを100μg/mLアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Mini-Prep (QIAGEN製) によりプラスミドを精製した。配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号９のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号１０のプライマーとの組み合わせから得られたプラスミドをそれぞれphir21-23、phir21-25、phir21-27とした。
【００８６】
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決定されたphir21-23、phir21-25、phir21-27の各挿入断片部分の塩基配列をそれぞれ配列番号：１３、１４、１５として示した。
上記塩基配列を元に設計したプライマーを用いて、オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株から調製された総ＲＮＡに対し、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法を行った。
【００８７】
５’ＲＡＣＥ法は、配列番号１６、１７で示される塩基配列のプライマーをGene  Specific  Primer(以下GSPと略す)1,2として用い、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、ｖｅｒ２．０(Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)にて行った後、それをテンプレートとして再度配列番号１８で示される塩基配列のプライマーをGSPとして５’ＲＡＣＥ法を行った。
３’ＲＡＣＥ法については、配列番号１９で示される塩基配列のプライマーをGSPとして用い、３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ(Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)を用いて行った。なお、各ＲＡＣＥ法はおのおの添付されている取扱説明書に基づいておこなった。
【００８８】
得られたDNA断片はpGEM-T  Vector  System(Promega社製)によりTAクローニングし、大腸菌DH5α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を１００μg/mLアンピシリンを含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、ベクターの配列より合成された配列番号１１、１２をプライマーとして用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを１００μg/mLアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Mini-Prep (QIAGEN製) によりプラスミドを精製した後に、ダイターミネーター法によりＤＮＡ塩基配列の解析を行った。
【００８９】
上記５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥで得られたphir21-25の5'上流の塩基配列及び3'下流の塩基配列と、配列番号１４に記載の塩基配列情報とを元に作成したＤＮＡ配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてORF検索を行い、本発明のＤＮＡ配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２０に示される塩基配列及びアミノ酸配列に仮決定した。
【００９０】
配列番号２０に記載のアミノ酸配列を用いてDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のprobable short chain dehydrogenase（T41540）の３７．４%であった。引き続き、上記配列番号２０に記載の配列を元に、クローニング用のプライマーとして配列番号：２１に記載の塩基配列及び配列番号：２２に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０pmol、dNTP２００nmol、オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株のcDNA 1μL 、KOD-DNApolymerase用１０×緩衝液 (東洋紡社製)５μL、KOD-DNA polymerase２．５ユニット(東洋紡社製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９6℃、３０秒)、アニール（５４℃、３０秒）、伸長（７４℃、１分）を３０サイクル、PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research社製) を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００９１】
上記で検出されたバンド部分をQIAGEN  Gel  Extraction kit（キアゲン社製）にて回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIとEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、再度、Qiagen  Gel  Extraction  kit (キアゲン社製) により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、EcoRI、及びHindIIIで消化したpKK223-3（ファルマシア社製）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
【００９２】
形質転換体をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、ベクターの配列より合成された配列番号２３で示される塩基配列のプライマー及び配列番号２４で示される塩基配列のプライマーを用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μg/mLのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Qiagen 500（キアゲン社製）を用いてプラスミドを精製し、pKK223-3OCR1とした。
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号：２で表される塩基配列からなる遺伝子の5'上流にクローニングのための６塩基が、3'下流にオガタエア・ミヌタ変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ  １４７３株由来のダブルストップコドン（TAGTAAT）とクローニングのため６塩基が付与されたＤＮＡ断片であった。
ｐＫＫ２３３−３ＯＣＲ１に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号：２５に、該ＤＮＡ断片がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示した。
【００９３】
＜実施例５＞  本発明のＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたＤＯＸＥからのＤＯＬＥの製造
実施例４で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μg/mL）、0.1mM イソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生育させ、得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌後、180μLの100mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に懸濁した後に、下記に示す方法により、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エチルエステル（ＤＯＸＥ）を基質として還元活性を確認した。
【００９４】
上記菌体懸濁物に2g/L NADP+  (オリエンタル酵母社製)10μＬ、トルエン  1μＬを添加後、5分間ボルテックスミキサーで攪拌した。50%グルコース  10μＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ溶液（天野製薬社製；２５U/mL）  10μＬ、上記基質をＤＭＳＯに20g/Lで溶解させたもの50μＬ（基質  １ｍｇ分）を添加後４０℃で20時間振とう反応させた。反応終了後の反応懸濁液にアセトニトリル１．７５ｍＬを添加して希釈後遠心し、上清上の生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：MCIGEL  CHP2MGM(三菱化学社製)
溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝800／100／100／１
流速：0.6ml/min
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：60℃
この結果、収量は３１９μｇであり、収率は３１．９%であった。
【００９５】
また、光学純度の測定は、反応終了後の反応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。
【００９６】
展開終了後、ＵＶランプにて生成物の確認をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６  、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：以下、ＤＯＬＥと略す）はＲｆ＝０．３３である。ＤＯＬＥのＴＬＣ上のスポットを掻き取りイソプロパノール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およびＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度を分析した。
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ダイセルCHIRALCEL AD
溶離液：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９００／１００／１
流速：１ml/min
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：室温
その結果、光学純度は１００%e.e.、anti体は０．６%であった。
また該遺伝子を含まないプラスミドpKK223-3を持つ大腸菌を０．１mMIPTGを添加したＬＢ培地で終夜培養した菌体を、同様に反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【００９７】
＜実施例６＞  本発明のＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた５Ｓ−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
実施例４で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μg/mL）、0.1mM イソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生育させ、得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌後、180μLの100mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に懸濁した後に、下記に示す方法により、５Ｓ−（Ｅ）−７−〔２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステル（５Ｓ−ＭＯＬＥ）を基質として還元活性を確認した。
【００９８】
上記菌体懸濁物に2g/L NADP+  (オリエンタル酵母社製)10μＬ、トルエン  1μＬを添加後、5分間ボルテックスミキサーで攪拌した。50%グルコース  10μＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ溶液（天野製薬社製；２５U/mL）  10μＬ、上記基質をＤＭＳＯに20g/Lで溶解させたもの50μＬ（基質  １ｍｇ分）を添加後４０℃で20時間振とう反応させた。反応終了後の反応懸濁液をアセトニトリルで希釈後遠心し、上清上の生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：コスモシル  ５Ｃ１８ＭＳ−ＩＩ  ４．６ｘ２５０ｍｍ(ナカライ社製)
溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝３５０／１５０／５００／１
流速：０．６ml/min
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：５０℃
この結果、収量は  807μｇであり、収率は  80.7%、ａｎｔｉ体は  15.3％であった。
【００９９】
また、光学純度の測定は、反応終了後、反応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。
展開終了後、ＵＶランプにて生成物の確認をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６  、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：以下、ＤＯＬＥと略す）はＲｆ＝０．３３である。ＤＯＬＥのＴＬＣ上のスポットを掻き取りイソプロパノール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およびＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度を分析した。
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ダイセルCHIRALCEL AD
溶離液：ヘキサン／エタノール＝９５／５
流速：１ml/min
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：５０℃
その結果、光学純度は97%e.e.、anti体は15.2%であった。
また該遺伝子を含まないプラスミドpKK223-3を持つ大腸菌を０．１mMIPTGを添加したＬＢ培地で終夜培養した菌体を、同様に反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【発明の効果】
医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【配列表】
0004270918.tif 000015
0004270918.tif 000016
0004270918.tif 000017
0004270918.tif 000018
0004270918.tif 000019
0004270918.tif 000020
0004270918.tif 000021
0004270918.tif 000022
0004270918.tif 000023
0004270918.tif 000024
0004270918.tif 000025
0004270918.tif 000026
0004270918.tif 000027
0004270918.tif 000028
0004270918.tif 000029
0004270918.tif 000030
0004270918.tif 000031
0004270918.tif 000032
0004270918.tif 000033
0004270918.tif 000034
0004270918.tif 000035