(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロジェニックな末梢血リンパ球由来の活性化ＣＤ４陽性細胞を製剤中の総細胞に対して９０％以上含有する感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物。
【請求項２】
アロジェニックな末梢血リンパ球が、臓器提供者もしくは骨髄提供者由来の末梢血リンパ球である請求項１に記載の感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物。
【請求項３】
活性化が、固相化抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２によって活性化される請求項１または２に記載の感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物。
【請求項４】
予防用および治療用の医薬組成物が、グレード２をこえる重篤なＧＶＨＤを引き起こさない製剤である請求項１〜３の何れか１に記載の感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物。
【請求項５】
インターロイキン２、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ４抗体固相化担体を構成成分とする請求項１〜３のいずれか１に記載の感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物の調製用キット。
【請求項６】
アロジェニックな末梢血由来リンパ球より抗ＣＤ８抗体固相化担体によりＣＤ８陽性細胞を除去する工程と、該工程によりＣＤ８陽性細胞を除去して調整したＣＤ４陽性細胞を固相化抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む増殖活性剤の存在下に増殖させる工程とからなる、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を製剤中の総細胞数に対して９０％以上含有する感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物の製造方法。
【請求項７】
アロジェニックな末梢血由来リンパ球より抗ＣＤ８抗体固相化担体によりＣＤ８陽性細胞を除去する工程と、抗ＣＤ４抗体固相化担体によりＣＤ４陽性細胞を分離する工程と、該工程により分離調整したＣＤ４陽性細胞を抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む増殖活性剤の存在下に増殖させる工程とからなる、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を製剤中の総細胞数に対して９０％以上含有する感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物の製造方法。
【請求項８】
アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞が、移植臓器又は骨髄提供者由来の活性化ＣＤ４陽性細胞である請求項６又は請求項７に記載のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を製剤中の総細胞数に対して９０％以上含有する感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
予防用および治療用の医薬組成物が、グレード２をこえる重篤なＧＶＨＤを引き起こさない製剤である請求項６〜８の何れか１に記載の感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、他人に由来する（以下、アロジェニックと略す）活性化ＣＤ（Cluster of Differentiation）４陽性細胞を製剤中の総細胞数に対して９０％以上含有する医薬組成物およびその調製方法に関する。本発明のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を製剤中の総細胞数に対して９０％以上含有する医薬組成物は、腫瘍再発の予防・治療、各種感染症の予防・治療、自己免疫疾患の予防・治療等に使用することができる。特に、腫瘍の再発予防あるいは免疫が低下した患者のウイルス感染症の予防・治療、呑食症等の自己免疫疾患の予防・治療に本発明の医薬組成物を使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
生体防御に関係する免疫系を担う主要なものの一つとしてリンパ球がある。特に、Ｔリンパ球は、細胞性免疫を担う重要な細胞の一つである。本リンパ球は、モノクローナル抗体の反応性により分類されている。例えば、抗ＣＤ３抗体との反応性を有するＴリンパ球は、ＣＤ３陽性細胞と分類される。発現される抗原とその機能の関係に関する多くの研究が行われている。Ｔリンパ球は、ＣＤ３抗原を発現するだけでなく、同時に種々の抗原を発現している。ＣＤ４抗原を発現するリンパ球（以下、ＣＤ４陽性細胞と略す）は、ＣＤ８抗原を発現するリンパ球（以下、ＣＤ８陽性細胞と略す）を活性化する役目を担うと考えられている。ＣＤ８陽性細胞は、強い細胞傷害性活性を有している。しかしながら、Ｔリンパ球の機能は多岐に及んでおり、発現している表面抗原のみで全ての機能を分類するのは一般的に困難であると考えられている。例えば、ＣＤ４陽性細胞が細胞傷害活性を有することも報告されている（Konomi Y,Sekine T,Takayama T,Fujii M,Tanaka T.Cytotoxic activity of CD4+ T cells against autologous tumor cells.Jpn. J. Cancer. Res.,Vol.86,p.854-60,(1995)）。
【０００３】
関根は、リンパ球を固相化抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖できること及び、本増殖させた自己由来リンパ球は、抗腫瘍効果を有することを報告している（特開平３−８００７６号公報）。これ以外にも抗ＣＤ３抗体あるいはインターロイキン２により末梢血等に由来するリンパ球を増殖させられること、及び本自己由来リンパ球が抗腫瘍活性を有することが数多く報告されている。
【０００４】
伊藤らは、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖させた自己由来リンパ球が先天性免疫不全患者のウイルス感染症に有効であることを報告している  （伊藤仁也、関根暉彬；医学のあゆみ、181巻、6号、426-427頁(1997年)）。
【０００５】
骨髄移植は、患者とドナーの白血球血液型（以下、ＨＬＡと略す）が一致した場合行われているが、本ＨＬＡには数多くの種類が存在し、患者とドナーでのＨＬＡが完全に一致する場合は、極めてまれである。そのため、ＨＬＡの主要なものが一致していれば、骨髄移植が行われている。しかしながら、ＨＬＡが完全に一致しないため、骨髄移植にともなって移植片対宿主病（Graft vs. Host Diseases；以下、ＧＶＨＤと略す）が引き起こされる場合がある。本疾患は重篤な症状を示すことから、本疾患の治療目的で免疫抑制剤が使用される。免疫抑制剤を投与された患者はＧＶＨＤから回復できるものの、免疫抑制状態となりサイトメガロウイルスやエプスタイン・バー・ウイルス感染症を発症し、多くの場合、死に至る。
【０００６】
Elizabethらは、このような免疫抑制状態で起こるウイルス感染症を予防・治療するために、骨髄の供与者のリンパ球からサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８陽性細胞を誘導し、骨髄移植患者のサイトメガロウイルス感染症を治療できることを報告している（Elizabeth a.Walter,M.D. et al., N .Engl. J .of Med
.,Vol.333,p.1038-1044,(1995)）。
【０００７】
臨床において、アロジェニックなリンパ球をフェレーシスなどにより調製し、白血病などの治療を目的として本リンパ球の患者への投与が行われている。本療法は、Donor Leukocyte Transfusion（以下、ＤＬＴと略す）と呼ばれる。ＤＬＴは、治療効果が高いものの急性のＧＶＨＤが５０％から８０％の患者に認められ、致死的なＧＶＨＤも２０％前後に認められる。（Kolb,H.J.et al.,Blood.,Vol.86,p.2041-2050,(1995)、Slavin,S.et al.,Exp.Hematol.,Vol.23,p.1553-1562,(1995)）また、フェレーシスには数時間もの時間がかかり、ドナーの負担が非常に大きい。
【０００８】
Giraltらは、ＣＤ８陽性細胞を除去した白血球を用いたＤＬＴを報告している（Giralt,S.et al.,Blood.,Vol.86,p.4337-4343,(1995)）。Ritzらは、フェレーシスにより調製したＣＤ４陽性細胞を使用したＤＬＴを報告している（Claret EJ.et al ,J.Clin.invest,Vol.100,No.4,p.588-866,(1997)）。いずれの場合もＧＶＨＤを起こさずにＧＶＬ（Graft versus leukemia：軽度のＧＶＨ反応が患者にとって有利に働く反応）効果が誘導されたことを報告しているが、そのＧＶＬ効果は弱い。
【０００９】
抗原特異的なアロジェニックなリンパ球では、ＧＶＨＤを引き起こすことなく目的とするウイルス感染症に有効であるが、その有効スペクトルは、目的とするウイルスのみに限定されてしまう。そのため、複数の種類のウイルス感染には、抗原特異的な複数のリンパ球を誘導する必要がある。特に、予期しないウイルス等の病原体を原因とする感染症が発生した場合、その病原体に特異的なリンパ球の誘導には、時間的がかかるため抗原特異的なアロジェニックなリンパ球は治療用に使用できない。
さらに、原因菌が同定できないような感染症では、抗原特異的なリンパ球を誘導することは困難である。そのため、有効スペクトルが広い、あるいは、有効スペクトルの限定されないものが求められている。
【００１０】
また、ＤＬＴのようなアロジェニックのリンパ球投与は、高い効果（例えば、抗腫瘍効果）が期待できるが、同時に重篤なＧＶＨＤを高頻度で引き起こす。また、ＣＤ８陽性細胞を除去したり、ただ単にＣＤ４陽性細胞を選別した細胞を使用したＤＬＴでは、ＧＶＨＤは生じないものの、その効果は非常に低いものである。さらに、ＤＬＴでは、ドナーからフェレーシスにより白血球を採取するため、ドナーの肉体的な負担が大きく、フェレーシスを行うために特別の施設を必要とする。特に、ドナーが乳幼児の場合には、大量の白血球を採取することが困難である。そのため、広い適応範囲と高い有効性を有し、同時にＧＶＨＤを引き起こさず、ドナーの負担が少なく、特別の設備を必要としない予防治療用製剤の開発が求められている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１〜４に記載の発明は、重篤なＧＶＨＤを引き起こさず、腫瘍の再発及びウイルス感染症治療、自己免疫疾患に高い治療効果を有し、治療の適応範囲が広い又は特定の治療に特に有効な医薬組成物を提供するものである。請求項５に記載の発明は、重篤なＧＶＨＤを引き起こさず、腫瘍の再発及びウイルス感染症治療、自己免疫疾患に高い治療効果を有し、治療の適応範囲が広い又は特定の治療に特に有効な予防用剤および治療用リンパ球医薬組成物をより簡易に効率良く調製できる調製用キットを提供するものである。請求項６〜９に記載の発明は、治療の広い適応範囲と高い治療の有効性を有するとともに、重篤なＧＶＨＤを引き起こさず、腫瘍の再発及びウイルス感染症、自己免疫疾患に対する予防用剤および治療用製剤を効率良く調製できる製造方法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ドナーの少量の末梢血よりリンパ球細胞を分離し、これを試験管内で増殖させ、この中からアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分として含む製剤を調製あるいは、ＣＤ４陽性細胞を末梢血より分離後、これを試験管内で増殖させることによりアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分として含む製剤を調製し、本製剤が、強い抗腫瘍効果、感染症治療効果、自己免疫疾患治療効果を有し腫瘍の再発及びウイルス感染症治療、自己免疫疾患治療に有効であり、同時に、実際的に問題となるような重篤なＧＶＨＤを引き起こさないことを明らかとし、本発明を完成するに至った。
【００１３】
（１）本発明は、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤に関する。
（２）本発明は、予防用および治療用製剤が腫瘍再発の予防用および治療用製剤である上記（１）記載の製剤に関する。
（３）本発明は、予防用および治療用製剤が感染症の予防用および治療用製剤である上記（１）記載の製剤に関する。
（４）本発明は、感染症がウイルス感染症である上記（３）記載の製剤に関する。
（５）本発明は、予防用および治療用製剤が自己免疫疾患の予防用および治療用製剤である上記（１）記載の製剤に関する。
【００１４】
（６）本発明は、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞が、移植臓器又は骨髄提供者由来の活性化ＣＤ４陽性細胞である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製剤に関する。
（７）本発明は、活性化ＣＤ４陽性細胞を製剤中の総細胞数に対して９０％以上含有する上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤に関する。
（８）本発明は、ＣＤ８陽性細胞の混入率が製剤中の総細胞数に対して１０％以下である上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤に関する。
【００１５】
（９）本発明は、抗ＣＤ４抗体固相化担体を構成成分とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の製剤の調製用キットに関する。
（１０）本発明は、インターロイキン２を構成成分とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の製剤の調製用キットに関する。
（１１）本発明は、抗ＣＤ３抗体を構成成分とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の製剤の調製用キットに関する。
【００１６】
（１２）本発明は、アロジェニックな末梢血から抗ＣＤ４抗体によりＣＤ４陽性細胞を分離することにより調製したＣＤ４陽性細胞、あるいは、アロジェニックな末梢血から抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８陽性細胞を除去することにより調製したＣＤ４陽性細胞を増殖活性化剤の存在下に増殖活性化させることを特徴とするアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤の製造方法に関する。
（１３）本発明は、アロジェニックなリンパ球細胞を増殖活性化剤の存在下に増殖させた後、抗ＣＤ４抗体により活性化ＣＤ４陽性細胞を分離すること、又は、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８陽性細胞を除去することを特徴とするアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤の製造方法に関する。
【００１７】
（１４）本発明は、増殖活性化剤が、インターロイキン２である上記（１２）又は（１３）に記載のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤の製造方法に関する。
（１５）本発明は、増殖活性化剤が、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２である上記（１２）又は（１３）に記載のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤の製造方法に関する。
（１６）本発明は、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞が、移植臓器又は骨髄提供者由来の活性化ＣＤ４陽性細胞である上記（１２）〜（１５）のいずれかに記載のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤の製造方法に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞とは、他人に由来し、増殖活性化剤により活性化された増殖活性を有するＣＤ４陽性細胞をいう。増殖活性化剤としては、抗ＣＤ３抗体及び／又はインターロイキン２等が挙げられる。
アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞は、他人に由来すれば良いが、ＧＶＨＤの危険性が少なく腫瘍の再発及びウイルス感染症、自己免疫疾患に対する予防および治療の観点から、臓器又は骨髄移植等を受けた患者の場合は、移植臓器又は骨髄等の提供者由来の活性化ＣＤ４陽性細胞であることが好ましい。
【００１９】
本発明において、活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分として含む製剤は、ＣＤ８陽性細胞等によるＧＶＨＤの危険性をなくす観点から、総細胞数に対して活性化ＣＤ４陽性細胞を９０％以上含有することが好ましく、活性化ＣＤ４陽性細胞が９５％以上含まれることがより好ましい。活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分として含む製剤は、活性化ＣＤ４陽性細胞の割合だけでなく、ＣＤ８陽性細胞の混入の割合が低いものほど好ましい。ＣＤ８陽性細胞の混入率が、総細胞数に対して、１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、１％以下であることがさらに好ましい。
【００２０】
本発明でいう製剤とは、アロジェニックな活性化ＣＤ４細胞を主成分として含んでいればどのような形態でも良い。
例えば、適当な溶液にアロジェニックな活性化ＣＤ４細胞を懸濁させた形態のものが使用できる。形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、特に、ヒト血清アルブミンが、０．０１〜５％となるように添加した輸液用生理食塩液等にアロジェニックな活性化ＣＤ４細胞を懸濁した注射剤又は点滴剤がより好ましいが、これら形態の製剤に限定されるものではない。
本発明に使用できるアロジェニックな活性化ＣＤ４細胞あるいはそれを含む製剤を冷凍保存し、必要に応じて各種疾患の予防あるいは治療に使用することができる。
【００２１】
投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、５０〜５００mlとするのが好ましく、この液量に前記の量の細胞が含まれるようにするのが好ましい。投与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は少なくとも１回以上である。
ＣＤ４陽性細胞を主成分とする製剤の投与量は、患者の状態や治療対象等により、適宜選択できるが、通常、体重１Kgあたり１×１０2個から１×１０9個である。製剤の効力の観点から、より好ましくは、１×１０4個から１×１０8個であり、さらに好ましくは、１×１０5個から１×１０8個である。
【００２２】
本発明の製剤に含まれるアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞は、種々の遺伝子を導入したり、本来持っているような遺伝子を欠落あるいは変異させたものであってもよい。
また、本発明の製剤は、ヒト免疫不全ウイルス感染に必要なコファクターを欠如した活性化ＣＤ４陽性細胞使用により、ヒト免疫不全ウイルスの予防あるいは治療、さらには、ヒト免疫不全ウイルスにより引き起こされる免疫不全状態での各種感染症の予防あるいは治療に使用できる。
本発明の製剤は、ＨＬＡが一致している場合だけでなく、ＨＬＡの一致していない患者にも使用できる。
【００２３】
本発明の製剤の適用対象としては、骨髄移植等の移植患者、感染症を伴う患者、癌患者、免疫不全症患者、自己免疫性疾患、アレルギー患者等が挙げられる。
感染症としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、クラミジア感染症、マイコプラズマ感染症等が挙げられる。ウイルス感染症としては、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス感染症が挙げられるが本ウイルス感染症のみに限定されるものでなく、各種ウイルス感染症、例えばヘルペスシンプレックスウイルス、バリセロゾスターウイルス等のヘルペス属ウイルスあるいは、ヒト白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の各種レトロウイルスによる感染症の予防及び治療用に使用できる。細菌感染症としては、緑膿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌等を原因とするものに使用することができるが、人に病原性を示す細菌による感染症であればいずれの感染症に対しても使用できる。特に原因となる病原体が未知の場合や同定が困難な病原体による感染症あるいはそれに付随するような疾患の治療や予防に本発明は使用できる。
【００２４】
癌患者としては、白血病等が挙げられるが、これに限定されるものではなく、各種固形腫瘍に対しての治療に使用できる。本発明の製剤は、腫瘍の再発を予防するだけでなく、腫瘍の治療用にも使用できる。
免疫不全症としては、先天性の免疫不全症と後天的な免疫不全症等が挙げられる。先天性の免疫不全症としては、重症複合免疫不全症、Wiscott Aldrich症候群、アデノシン・デアミネース欠損症、プリンヌクレオチド・ホスホリラーゼ欠損症等が挙げられるが、前記免疫不全症のみに限定されるものでない。後天的な免疫不全症としては、抗がん剤、免疫抑制剤、ステロイド剤等の使用による続発性免疫不全や、ヒト免疫不全ウイルスの感染によるエイズ等が挙げられるが、前記免疫不全症のみに限定されるものでない。本発明の製剤は、免疫能が低下した患者だけでなく、特定のウイルス等に対しての免疫能が欠如あるいは低下した患者に対しても予防的あるいは治療的に使用することができる。
【００２５】
自己免疫性疾患としては、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シューグレン症候群、重症筋無力症、悪性貧血、橋本病等が挙げられるが、前記自己免疫性疾患のみに限定されるものでない。
アレルギー性疾患としては、気管支喘息、スギ花粉症、じんま疹等が挙げられるが、前記アレルギー性疾患のみに限定されるものでない。本発明の製剤は、各種アレルギーの治療あるいは症状の軽減を目的として使用することができる。
【００２６】
以下、本発明のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分とする予防用および治療用製剤の製造方法について説明する。
本発明のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞は、ドナーの少量の末梢血よりリンパ球細胞を分離し、これを試験管内で増殖させ、この中からアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分として含む製剤を調製するか、または、ドナーの少量の末梢血よりリンパ球細胞を分離し、ＣＤ４陽性細胞を分離後、これを試験管内で増殖させることによりアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞を主成分として含む製剤を調製し製造する。
【００２７】
ドナーからのアロジェニックな末梢血の採取は、採血やフェレーシス等どのような方法によっても行うことができるが、簡便性やドナーの肉体的負担を考えた場合、末梢血から調製することが好ましい。
採血方法としては、静脈からの採血が好ましく、血液の凝固が起こらないように、採血した血液にヘパリンやクエン酸を加えることができる。一回に採血する量としては、０．０１mlから１００ml程度であり、特に、その量に限定されない。しかしながら、ドナーの負担、採血の手間、リンパ球細胞の分離操作を考えた場合、５mlから５０ml程度が好ましく、１０mlから２０mlの採血量がより好ましい。
【００２８】
上記採取した血液からリンパ球細胞の分離は、ショ糖や市販のリンパ球分離剤等を用いる不連続密度勾配遠心法などの周知のリンパ球細胞の分離法によって操作し取得できる。
本発明におけるリンパ球細胞又はＣＤ４陽性細胞の増殖は、周知のリンパ球細胞の培養法によって実施できる。その培養法は、特に、限定されるものではないが、例えば、特開平３−８００７６号公報に記載のように実施できる。
増殖の効率の観点から、増殖活性化剤として、インターロイキン２の存在下に培養することにより行うことが好ましく、インターロイキン２及び抗ＣＤ３抗体の存在下に培養することがより好ましい。例えば、インターロイキン２を含む培養用培地液にリンパ球細胞を浮遊させ、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器に入れ培養を開始することができる。さらに、必要により各種マイトージェンを使用してＣＤ４陽性細胞の増殖・活性化を行うこともできる。
【００２９】
抗ＣＤ３抗体としては、リンパ球細胞の増殖・活性化を促進できる抗体であれば、特に、限定されるものではない。リンパ球細胞の刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を用いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、コスト等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）が使用できる。
抗ＣＤ３抗体は、リンパ球細胞の増殖の効率、操作の容易性の観点から、固相化して用いることが好ましい。抗体を固相化する器具としては、ガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質の培養容器が挙げられる。入手が容易であることから、市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養フラスコ等を使用することもでき、その大きさは適宜選択できる。
【００３０】
固相化は、前記抗ＣＤ３抗体の希釈液を固相化する器具に添加し、例えば、４〜３７℃で２〜２４時間、静置することによって行うことができる。この抗ＣＤ３抗体の固相化には、抗ＣＤ３抗体を滅菌したダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に１〜３０μg/mlの濃度に希釈して用いることが好ましい。
固相化後、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができる。使用時に、液を除去して、必要あれば、常温のダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄できる。
【００３１】
また、本発明では培養用培地液中にインターロイキン２を用いることが、増殖の効率の観点から好ましい。インターロイキン２は、培養用培地液１〜２０００U/mlの濃度となるように用いるのが好ましい。インターロイキン２は、市販されているものを用いることができる。インターロイキン２は、水、生理食塩液、ダルベッコりん酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養用培地液等に溶解して使用することができる。一度溶解したものは、活性の低下を防ぐため、冷蔵保存することが好ましい。
【００３２】
培養用培地液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が好ましいものとして挙げられ、ＲＰＭＩ−１６４０が特に好ましいものとして挙げられる。培養用培地は、正常ヒト血清を添加したものが増殖効果に優れ好ましい。これらの培地は市販品を用いることができる。
培養は、一般的な細胞培養の方法に従うことができる。例えば、ＣＯ2インキュベータ内で行うことができる。ＣＯ2濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく 、温度は、３０〜４０℃、特に３７℃が好ましい。
【００３３】
この培養は、日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体の刺激情報が細胞に伝達されることが前提となるため、２〜２０日行うことが好ましく、３〜７日行うことが好ましい。この培養の期間内には、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜添加するのが好ましい。この培養では、通常、培養開始１〜２日目には目立った細胞の増殖はないが、３日目頃から細胞増殖が観察され、順調に増殖し出すと培養液がオレンジ色から黄色に変化するようになる。培養液の添加量は、添加前の培養中の液の液量に対して０．１〜５倍程度が好ましい。その添加割合は、培養液の劣化及びインターロイキン２活性の低下を防ぐために、１〜７日に１回行うことが好ましい。
【００３４】
抗ＣＤ３抗体存在下の培養後、さらに抗ＣＤ３抗体の刺激無しに培養を継続することもできる。すなわち、抗ＣＤ３抗体を固相化していない器具、例えば培養用フラスコ、ローラーボトル、培養用ガスパーミアブルバッグ等で投与まで培養を継続する事ができる。これら条件でのリンパ球細胞の培養は、抗ＣＤ３抗体の刺激がないこと以外は、存在下の培養の条件と同じであることが好ましく、ヒト血清の濃度、無血清培地を適時使用することが、作業性、コスト性、安全性等においてより好ましい。
【００３５】
本発明の製剤として使用するためには、主成分としてＣＤ４陽性細胞を分離し、ＧＶＨＤを引き起こすであろうと予想されるＣＤ８陽性細胞やＣＤ５６陽性細胞等を除去し高い純度とすることが必要である。
本発明のＣＤ４陽性細胞の分離は、増殖・活性化する前であっても、増殖・活性化後のいずれの場合でも実施できる。
ＣＤ４陽性細胞の分離方法は、ＣＤ４陽性細胞自体を積極的に分離する方法であっても、ＣＤ８陽性細胞やＣＤ５６陽性細胞を除去するいずれの方法でも実施することができる。あるいは、これらの方法を適宜組み合わせてＣＤ４陽性細胞の分離を行うこともできる。
【００３６】
ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞の分離には、ＣＤ４陽性細胞を分離する方法であれば限定されないが、例えば、磁気ビーズ表面に、抗ＣＤ４抗体あるいは抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体を固定化（結合）したものを使用することができる。
例えば、ＣＤ４陽性細胞自体を積極的に分離する場合、磁気ビーズ表面に、抗ＣＤ４抗体を固定化（結合）したもので実施できる。磁気ビーズは、磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１１１１６）等の市販品を用いることもできる。
【００３７】
ＣＤ４陽性細胞の分離操作法は、周知の一般的な分離方法に従うことができる。分離効率等の観点から、使用する磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体の磁気ビーズ数は分離するＣＤ４陽性細胞数に対して、好ましくは、０．１〜１００倍、より好ましくは、０．１〜１０倍、さらに好ましくは、０．５〜５倍である。分離するＣＤ４陽性細胞と磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体との反応温度は、反応の効率や細胞に与える傷害の観点から、好ましくは、４〜４０℃の範囲で行うことも好ましい。反応容量は、分離操作、無菌操作の観点から、好ましくは、０．５〜１０００ml、より好ましくは０．５〜１００ml、さらに好ましくは、１〜１０mlの範囲である。なお、ＣＤ４陽性細胞を分離する際に使用する分離用磁石は、制限されないが、例えば、マグネットＭＰＣ−１（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１２００１）等の市販品を用いることもできる。培養は磁石板上で培養することが好ましい。
【００３８】
一方、ＣＤ８陽性細胞やＣＤ５６陽性細胞を除去することができる分離方法としては、磁気ビーズ表面に、抗ＣＤ８抗体を固定化（結合）したもの、抗ＣＤ５６抗体を固定化（結合）したもので実施できる。
使用する磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体又は磁気ビーズ標識抗ＣＤ５６抗体の磁気ビーズ数は、分離効率等の観点から、分離するＣＤ８又はＣＤ５６陽性細胞数に対して、好ましくは、１〜１０００倍、より好ましくは１〜２００倍、より好ましくは、１〜５０倍である。
分離するＣＤ８陽性細胞又はＣＤ５６陽性細胞と磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体又は磁気ビーズ標識抗ＣＤ５６抗体との反応温度は、反応の効率や細胞に与える傷害の観点から、好ましくは、４〜４０℃である。
反応容量は、分離操作、無菌操作の観点から、好ましくは、０．５〜１０００ml、より好ましくは０．５〜１００ml、さらに好ましくは、０．５〜１００ml、特に１〜１０mlが好ましい。また、ＣＤ４陽性細胞を分離する際と同様に使用する分離用磁石は、制限されないが、例えば、マグネットＭＰＣ−１（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１２００１）等の市販品を用いることもできる。
【００３９】
なお、ＣＤ４陽性細胞の純度を上げる観点から、上記の方法を適宜組み合わせてＣＤ４陽性細胞の分離を行うことが好ましい。例えば、最初にＣＤ８及びＣＤ５６陽性細胞を除去し、更に、ＣＤ４陽性細胞を積極的に分離することがより好ましい。
上記以外にも、上記抗体を使用したパニング法、ロゼット法、カラム法等によりＣＤ４陽性細胞の分離をすることができる。ＣＤ４陽性細胞を分離する方法であれば方法に限定されず、どのような方法でも使用できる。
【００４０】
本発明のアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞は、前記のように、抗ＣＤ４抗体固相化担体、抗ＣＤ８抗体固相化担体、抗ＣＤ５６抗体固相化担体、インターロイキン２、抗ＣＤ３抗体を適宜組み合わせて調製できる。
本発明において、構成成分を単独の試薬として、あるいは、少なくとも２個以上の構成成分を複数の試薬として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製を行うことができる。
例えば、抗ＣＤ４抗体固相化担体、抗ＣＤ８抗体固相化担体、抗ＣＤ５６抗体、インターロイキン２、抗ＣＤ３抗体を構成成分として、これら構成成分からなる単独の試薬として、あるいは、これら構成成分からなる単独の試薬を少なくとも２個以上の複数の試薬として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製を行うことができる。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
（実施例１）
１．骨髄提供者（以下、ドナーと略す）からの採血
白血病患者にＨＬＡの一致した骨髄移植を実施後、３５日後よりIII度の重症ＧＶＨＤが認められたことより、ｍＰＳＬｐｕｌｓｅ療法として、ｍ−ＰＳＬ  （ソルメドロール社製）２０mg/kg ２days、１０mg/kg ２days、５mg/kg ２days、７日目より免疫抑制剤（CyclosporinA（サンディミュン社製）を３mg/kg投与し、軽快したが移植後免疫不全状態となった。７５日目にはサイトメガロウイルスによる間質性肺炎、腸炎、Virus asociated hemophagocytic syndrome（以下 、ＶＨＡＳと略す）を発症し、１１２日目には水痘による肺炎、ＶＨＡＳを発症した。またサイトメガロウイルスのウイルス血症を繰り返し、１３５日目には再び肺炎とＶＡＨＳを発症した。このため移植後免疫不全とサイトメガロウイルス感染症の治療に対してアロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞療法を行うことを決定し、骨髄移植と同一ドナーより、静脈から末梢血３０mlをヘパリン加採血した。
【００４２】
２．末梢血単核球の分離
クリーンベンチ（昭和科学株式会社製：Ｓ−１１００）内で無菌的に（以下、無菌的に、と略す）、採血した注射筒の注射針を、接合部近くを触らないようにはずし１９Ｇ×１１／２”注射針（発売元：株式会社ニプロ）につけ替えた。
５０ml遠沈管（岩城硝子株式会社製：２３４１−０５０）２本に、洗浄用培地（ＲＰＭＩ１６４０＋６）（株式会社日研生物医学研究所製：ＧＭ１１０６（５００ml））を１５mlずつ注ぎ込み、その遠沈管に、採血した血液全てを２本等量になるようにゆっくりと注いだ。
遠沈管の蓋を完全に閉めた後、２〜３回転倒混和した。１０mlピペット（輸入発売元：コーニングコースタージャパン：４１０５）でリンホセパールＩ（株式会社免疫生物研究所製：２３０１０（１００ml））を１５ml遠沈管（岩城硝子株式会社製：２３２７−０１５）６本に３mlづつ入れ、次に、培地で希釈した血液１０mlをそれぞれの遠沈管に、液面を乱さないようにゆっくり重層した。
回転数１，８００rpm、遠心分離温度２０℃、ブレーキをＯＦＦの状態で１５分間遠心した（遠心機は株式会社コクサン製（Ｈ−７００Ｒ）を使用）。
【００４３】
遠心後、無菌的に、遠沈管のリンパ球層の約１cm上までリンパ球細胞を吸い取らないように吸引機でゆっくり吸い取った。５mlピペットマンで血餅の層を吸い取らないようにリンパ球細胞の層をとり、あらかじめ、洗浄用培地（ＲＰＭＩ１６４０＋６）を２５ml入れておいた５０ml遠沈管に回収した。遠沈管の蓋を閉め２〜３回転倒混和した後、回転数１，８００rpm、遠心分離温度２０℃の状態で１０分間遠心した。
遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスにかけて、良くほぐした。洗浄用培地を５０ml入れ良く転倒混和した後、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ４、ＣＤ８含有率測定用に１．５mlマイクロチューブ（輸入発売元：アシスト株式会社；７２．６９０）２本に５００μｌずつサンプリングした。
【００４４】
３．チュルク液による細胞数の測定
上記２．において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。その結果、総細胞数は８．５×１０7個だった。
【００４５】
４．ＣＤ４陽性細胞の解析
上記２．において調製した２本の細胞懸濁液を６，０００rpm、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた（遠心機は株式会社佐久間製作所製：Ｍ−１５０を使用した）。
上清をきれいに吸い取った後、ダルベッコりん酸緩衝液（発売元：株式会社ニプロ：１０００ml、以下ＰＢＳ（−）と略す）８μｌとＣＤ４／ＣＤ８抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４００３９）８μｌをそれぞれのチューブに入れ良く攪拌した後、４℃で３０分間反応させた。
反応後、シース液（コールター株式会社製：アイソトンII）８００μｌをそれぞれのチューブにいれボルテックスで攪拌した後、６，０００rpm、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。上清をきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２０５２）に入れた。
ＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を使用した。ＦＡＣＳの測定はマニュアルに従って行った。
その結果、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率はいずれも２８％あった。
総細胞数とＦＡＣＳ解析でのＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率からＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞はいずれも２．４×１０7個あった。
【００４６】
５．ＯＫＴ３固相化フラスコ（中）及び（大）の調製
ＰＢＳ（−）で５μg/mlに調製しておいたＯＫＴ３（輸入発売元：ヤンセン協和株式会社、製造元：オーソファーマスーティカル：ＯＫＴ３注）溶液を、培養用フラスコ（中）（住友ベークライト株式会社製：ＭＳ−２１２５Ｒ）に５ml、培養用フラスコ（大）（住友ベークライト株式会社製：ＭＳ−２０８０Ｒ）に１０ml入れ、底面に溶液を均一に浸した。使用直前までコールドルームで保存した。
【００４７】
６．磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４陽性細胞の調製と培養
上記２．において調製した細胞懸濁液５０ml中２０ml（総細胞数３．４×１０7個、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞数がそれぞれ９．５×１０6個）を５０mlチューブに移し、回転数１，０００rpm、遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。
遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスをかけて、良くほぐした。
ＣＤ８陽性細胞数の４倍量のビーズ数を含む磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１１１０８）３００μｌを１５mlチューブ  （輸入発売元：アシスト株式会社：No.６２．５５３．００２Ｓ）にいれ、マグネットＭＰＣ−１（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１２００１）に装着し、１分間反応させた。ビーズを吸わないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
チューブにＰＢＳ（−）溶液を１ml入れ良く攪拌した後、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
もう一度、ＰＢＳ（−）溶液を１ml入れ良く攪拌した後、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
【００４８】
遠心して回収した細胞懸濁液に、反応用培地（洗浄用培地４５mlとヒト血清５mlを混合して作製）５mlを入れ、軽く懸濁した後、磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体の入っているチューブに、細胞を移し、マイルドミキサー（タイテック株式会社製：ＰＲ−１２）で軽く振とうしながら３０分間コールドルームで反応させた。反応後、チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。ビーズを吸いとらないように溶液をとり、新しい１５mlチューブに移した。再度、マグネットに装着し、１分間反応後、ビーズをとらないように溶液をとり、新しいチューブに回収し、回転数１，０００rpm、遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスをかけて、良くほぐした。
【００４９】
培養用培地２０ml（培地（ＲＰＭＩ１６４０＋７）（株式会社免疫生物研究所製）４４ml、３５，０００U/ml  ＩＬ−２（シータス社製）１ml、ヒト血清５mlを混合し培養用培地とした。以下、培養用培地と略す）を回収したＣＤ４陽性細胞に加え軽く懸濁した。
上記５．と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（中）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。ＰＢＳ（−）１０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。
再度、クリーンベンチ内でＰＢＳ（−）１０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後蓋を開け、液を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
そのフラスコに細胞懸濁液を移し、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞含有率測定用に１０００μｌ（１．５ｍｌチューブ２本に５００μｌずつとる）サンプリングし、３７℃  ＣＯ2インキュベーター（三洋電機株式会社製：ステリカルトインキュベータＭＩＰ−３０３３、湿度９５％）で培養を開始した（培養０日目）。上記４．と同様にしてＣＤ４陽性細胞の解析を行った。
その結果、ＣＤ４陽性細胞は４６％、ＣＤ８陽性細胞は５％あった。
【００５０】
７．トリパンブルー溶液による細胞数の測定
上記６．において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液１０μｌを２０μｌのトリパンブルー溶液（輸入販売元：シグマアルドリッチジャパン株式会社：Ｔ−８１５４）と混合し、血球計算版（エルマー社製９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。
その結果、総細胞数は２．６×１０7個だった。
【００５１】
８．ＣＤ４陽性細胞の拡大培養
上記６．において培養していた細胞液に、培養３日目、４日目に培養用培地を２５mlずつ加えた。
培養５日目に培養量をさらに拡大するためＯＫＴ３固相化フラスコを大きいサイズにした。すなわち、上記５．と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。
再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
そのフラスコに今まで培養していたフラスコを軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、細胞懸濁液を移した。
さらに新しい培養用培地５０mlを今まで培養していたフラスコに入れ、残った細胞を懸濁し、新しいフラスコに移した。新しいフラスコを３７℃  ＣＯ2インキュベーターに入れ、培養を継続した。
【００５２】
９．ＣＤ４陽性細胞の凍結保存
上記８．において培養していた細胞液に、  培養６日目に一度、細胞の一部を凍結保存した。保存方法は、最初、フラスコを軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、フラスコ内の培養液５００μｌを取り出し、トリプトソイ（ＴＳＡ）寒天培地（株式会社免疫生物研究所製：Ｐ９４５０１）にまき、３７℃  ＣＯ2インキュベーター（東京理化器械株式会社製：ＳＬＩ−４５０）内に入れ無菌試験をした。
フラスコ内の培養液１０μｌを取り出し、上記３．と同様に細胞数を数えた。
【００５３】
次に５０mlチューブ２本に、培養していた細胞を４０mlづつ移し、１，０００rpm、２０℃で５分間遠心した。上清を捨て細胞沈さをボルテックスにかけた後 、細胞懸濁液と細胞保存液（ヒト血清５ml、ジメチルスルホキシド（ナカライテスク株式会社製、以下、ＤＭＳＯと略す）５mlと培地（ＲＰＭＩ１６４０＋７）４０mlを混合し作製した。）をそれぞれ５分間氷中で冷やした後、４．５mlの細胞保存液で細胞懸濁液を１本にまとめ軽くピペッティングし、細胞を均一にした後、細胞保存用チューブ（輸入発売元：コーニングコースタージャパン：４３０２８９（２．０ml））３本に等量づつ入れた。
さらにチューブをバイセル（日本フリーザー社製）に入れ、−８０℃で数日保存し、その後、液体窒素タンク（Minnesota Valley Engineering社製：ＸＣ４７／１１）中で保存した。
培養時の細胞濃度は１．９×１０6個/ml、保存細胞数はチューブ１本あたり５．１×１０7個だった。
【００５４】
１０．保存ＣＤ４陽性細胞の取出しと復活化
上記９．において凍結保存しておいたＣＤ４陽性細胞を１本取り出し、３７℃のヒートブロック（タイテック株式会社製：ＴＡＬ−１Ｇ）で４分間温めた。
無菌的に、１５ml遠沈管に洗浄用培地（ＲＰＭＩ１６４０＋６）を１０ml注ぎ込み、そこにトランスファーピペット（輸入発売元：株式会社アシスト：８６．１１７２．００１）で保存リンパ球細胞を培地に入れ懸濁した。
１，０００rpm、２０℃、５分間遠心後、上清を捨て軽くタッピングしたあと 、培養用培地５０mlに懸濁し、クローニングプレート（グライナー社製：７０４１６０）に細胞懸濁液を移した。
細胞を顕微鏡で観察後、培養用３７℃  ＣＯ2インキュベーターに入れ培養を再び開始した（培養０日目）。
培養２日目に細胞がプレートいっぱいに増殖していることを顕微鏡で確認後、クローニングプレートの細胞をフラスコ（２２５cm2）（２２５cm2CELL CULTURE FLASK 輸入発売元：コーニングコースタージャパン：３０００）に移した。さらに新しい培養用培地５０mlをクローニングプレートに入れ、共洗いした後、フラスコに移し、培養用３７℃  ＣＯ2インキュベータに入れ培養を続けた。
【００５５】
培養４日目、上記５．と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液をデカントで捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
そのフラスコに今まで培養していたフラスコを軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、細胞懸濁液を移した。さらに新しい培養用培地１５０mlを今まで培養していたフラスコに入れ、残った細胞を懸濁し、新しいフラスコに移した。
新しいフラスコを３７℃  ＣＯ2インキュベーターに入れ、培養を継続した。
【００５６】
１１．培養用バッグによるＣＤ４陽性細胞の培養
上記１０．において培養していたフラスコを、培養６日目、軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、フラスコ内の培養液１mlを取り出し、サブローデキストロース（クロラムフェニコール添加）寒天培地（株式会社免疫生物研究所製：Ｐ９３１０１）と羊血液寒天培地（株式会社免疫生物研究所製：Ｐ９６２０１）に等量づつまき、３７℃  インキュベーター内に入れ無菌試験をした。
【００５７】
フラスコ内の培養液１０μｌを取り出し、上記７．と同様にして細胞数を数えた。バッグ培養用調製済みＡＩＭ−Ｖ培地（輸入総発売元：ライフテックオリエンタル株式会社：０８７−０１１２ＢＫ（１０リットル）にＩＬ−２、ヒト血清およびオキザロ酢酸を終濃度がそれぞれ２００U/ml、１％および１ｍＭとなるように加えた）と、ＣＰ−２（ＬＬ−７．１）培地（株式会社免疫生物研究所製：ＣＰ３２０４（１リットル））が等量入った７５０ml培地入りカルチャーバッグＡ−１０００（発売元：株式会社ニプロ：細胞培養用バッグ）を３７℃に温めた。
そのバッグと５０mlシリンジ（発売元：株式会社ニプロ：０８−９１２−０１）を無菌的に接続し、シリンジからフラスコの培養液をすべて注ぎ込んだ。
鉗子でチューブをはさみ、チューブの先を２ヵ所チューブシーラー（ＳＥＢＲＡ社製）でシールし、バッグを培養用３７℃  ＣＯ2インキュベーター（株式会社ヒラサワ製：ＣＰＤ−３００Ａ）に入れ培養を継続した。
【００５８】
１２．ＣＤ４細胞の無菌試験及びエンドトキシンアッセイ
上記１１．において培養していたバッグを、培養７日目（投与前日）に培養バッグのサンプリングポートから２４Ｇ×１”注射針（発売元：株式会社ニプロ）をつけた１mlシリンジ（発売元：株式会社ニプロ：０８−０１０−４）で培養液を約１ml無菌的にサンプリングした。
最初のその液は捨て、同じシリンジでもう一度約１mlサンプリングし、羊血液寒天培地に約２００μｌまき、残りを乾熱滅菌スピッツ管（生化学工業株式会社製：８００８００）に入れた。サンプリングの終わったバッグのサンプリングポートをアルコール綿をはさんだ鉗子でよく拭き蓋をした後、培養用３７℃  ＣＯ2インキュベーターに入れ培養を続けた。
寒天プレートは、３７℃  インキュベーターに入れ無菌試験し、乾熱滅菌スピッツ管は１，５００rpm、２０℃で５分間遠心した。
【００５９】
調製済み主剤溶液（エンドトキシン用キット（トキシカラーシステムＬＳ−２００セット生化学工業株式会社製：０１０１３５）およびエンドトキシン用キット（トキシカラーシステムＥＴ−１セット  生化学工業株式会社製：０１００３５）を使用）を乾熱滅菌試験管（生化学工業株式会社製：８００８０１）３本に乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペット（生化学工業株式会社製：８００８０６）を使って１００μｌづつ入れた。
ブランク用試験管に注射用蒸留水（発売元：大塚製薬株式会社）を１００μｌ、陽性コントロール用試験管にスタンダード液を１００μｌ、乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って入れた。
検体用試験管に注射用蒸留水を８０μｌ、遠心の済んだ培養上清を２０μｌ、乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って入れた。３本の試験管を３７℃ウオーターバス（株式会社井内盛栄堂製：ＲＡＣＯＭ−ＡＣＥ  ＨＴ−８０）で３０分間反応させた。
【００６０】
３０分後、それぞれの試験管に４００μｌづつ０．８Ｍ酢酸溶液（和光純薬工業株式会社製：特級）を入れ、試験管をボルテックスで攪拌後、９６ウエルプレート（住友ベークライト社製：ＭＳ−８０９６Ｆ）に４００μｌづつ反応溶液を移し、吸光度４０５nm（リファレンス６３０nm）の値をプレートリーダー（東洋測器社製：  ＥＴＹ−９６）で測定した。検体の吸光度の値を５倍した値が陽性コントロールの値を超えていないことを確認した。
【００６１】
１３．回収前の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析
ＣＤ４陽性細胞を回収する前に、バッグ培養した培養液の一部をサンプリングし、上記７．と同様にして細胞数を、上記４．と同様にしてＣＤ８陽性細胞含有率を測定した。
その結果、総細胞数３．０×１０9個、ＣＤ８陽性細胞が６％含まれていた。
総細胞数とＦＡＣＳ解析ＣＤ８陽性細胞の占める比率からＣＤ８細胞は１．８×１０8個あった。そこで、細胞を回収投与する前に、磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体でＣＤ８陽性細胞をさらに取り除くことにした。
【００６２】
１４．磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４陽性細胞の調製および回収
バッグ培養した培養液を無菌的に２５０ml遠沈管（輸入発売元：コーニングコースタージャパン：２５３５０−２５０）２本に入れ、１，５００rpm、２０℃で８分間遠心した。
遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐし、残りの培養液を遠沈管に入れ再び、１，５００rpm、２０℃で８分間遠心した。
遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐし、細胞洗浄液（生理食塩水入りバッグ（発売元：大塚製薬株式会社：１０−１７−Ｓ（１０００ml））に１９Ｇ注射針と５mlシリンジ（テルモ社株式会社製：ＳＳ−０５Ｓ）を用いて２０％ヒト血清アルブミン溶液（日本製薬株式会社製（２０ml））４．５mlを入れよく混ぜ、これを細胞洗浄液とした。以下、細胞洗浄液と略す。）をそれぞれの遠沈管に２５０mlづつ入れ１，８００rpm、２０℃で８分間遠心した。
遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。細胞洗浄液を５０mlづつ遠沈管に入れ、５０mlチューブ２本にそれぞれの細胞懸濁液を移した。１，８００rpm、２０℃で８分間遠心した。遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。
細胞洗浄液を１０mlづつ５０mlチューブに入れた。
【００６３】
ＣＤ８陽性細胞数の４倍量の数を含む磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体５mlを１５mlチューブ２本に等量づついれ、マグネットＭＰＣ−１に装着し、１分間反応させた。
ビーズを吸わないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。チューブにＰＢＳ（−）溶液を１ml入れ良く攪拌した後、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
もう一度、ＰＢＳ（−）溶液を１ml入れ良く攪拌した後、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
【００６４】
その２本のチューブに前述の調製しておいた細胞懸濁液を１０mlづつ入れ、軽く懸濁した後、マイルドミキサーで軽く振とうしながら３０分間コールドルームで反応させた。
反応後、チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。ビーズを吸いとらないように溶液をとり、新しい１５mlチューブに移した。
再度、マグネットに装着し、１分間反応後、ビーズをとらないように溶液をとり、新しいチューブに回収し、回転数１，０００rpm、遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。
【００６５】
遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスにかけて、良くほぐした。
細胞懸濁液をファイナル液（２５０ml遠心管に生理食塩液２００mlと、２０％ヒト血清アルブミン溶液１０mlを入れリンパ球細胞投与用液、ファイナル液とした。以下、ファイナル液と略す。）に十分懸濁した後１００マイクロのメッシュ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２３５０）に通した後、細胞懸濁液の液量を測定した。
また、細胞数とＣＤ４含有率を測定するため、細胞懸濁液をサンプリングした。
５０mlシリンジを分離バッグＴ−０３０（３００mlテルモ株式会社製  ：ＢＢ−Ｔ０３０ＣＪ）と接続し、細胞懸濁液をシリンジから分離バッグに注ぎ込んだ。注ぎ終わったら内筒でシリンジに残った液を押し出し、最後に鉗子でチューブをはさんだ。チューブをチューブシーラーでシールしシリンジをはさみで切り離した。
測定の結果、液量は２００ml、総細胞数は８．０×１０8個だった。
【００６６】
１５．回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析
上記４．と同様にして、回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析を行った。その結果、ＣＤ４陽性細胞は９９％であり、ＣＤ８陽性細胞は１％であった。
【００６７】
１６．ＣＤ４陽性細胞の患者への投与
上記１４．で、調製したＣＤ４陽性細胞は、患者体重あたり３×１０7個/kgで患者静脈より１時間かけて投与した。
【００６８】
（実施例２）
１．保存ＣＤ４陽性細胞の取出しと復活化
前記、実施例１の９．において凍結保存しておいたＣＤ４陽性細胞を１本取り出し、前記、実施例１の１０．と同様にして保存ＣＤ４陽性細胞の取出しと復活化を行った。
【００６９】
２．磁気ビーズ標識ＣＤ抗８抗体及び磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体によるＣＤ４陽性細胞の調製と培養
上記１．において培養した細胞を培養３日目に、より純度の高いＣＤ４陽性細胞を分け取るため、培養細胞に最初、磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体を反応させ、ネガティブフラクションを回収し、次にそのフラクションと磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体を反応させ、ポジティブフラクションを回収し培養した。
すなわち、培養した培養液の一部をサンプリングし、前記、実施例１の３．と同様にして細胞数を、前記、実施例１の４．と同様にしてＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞含有率を測定した。
その結果、細胞濃度は７．８×１０5個/ml、ＣＤ８陽性細胞が５．２％、ＣＤ４陽性細胞が８６％含まれていた。
そこで２５mlの培養液つまり２×１０7個の細胞を前記、実施例１の６．と同様にして磁気ビーズ数とＣＤ８陽性細胞数の比率が１：１になるように１５μｌの磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体を使用し、反応用培地を１mlにしてＣＤ４陽性細胞の調製をした。
【００７０】
次に、ＣＤ４陽性細胞数と等量のビーズ数を含む磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１１１１６）１２１μｌを新しい１５mlチューブ（輸入発売元：アシスト株式会社：No.６２．５５３．００２Ｓ）にいれ、マグネットＭＰＣ−１（輸入販売元：ベリタス株式会社：ＤＢ１２００１）に装着し、１分間反応させた。ビーズを吸わないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
チューブにＰＢＳ（−）溶液を１ml入れ良く攪拌した後、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。もう一度、ＰＢＳ（−）溶液を１ml入れ良く攪拌した後、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。
【００７１】
磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体を使用し、ＣＤ４陽性細胞の調製をした細胞懸濁液を磁気ビーズ標識抗ＣＤ４抗体の入っているチューブに移し、マイルドミキサー（タイテック株式会社製：ＰＲ−１２）で軽く振とうしながら３０分間コールドルームで反応させた。反応後、チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。
ビーズを吸いとらないように溶液をとった。チューブをマグネットからはずし、新しい反応用培地５mlをチューブにいれ軽く攪拌した後、再度、マグネットに装着した。１分間反応後、ビーズをとらないように溶液をとった。チューブをマグネットからはずし、培養用培地１０mlを回収したＣＤ４陽性細胞に加え軽く懸濁した。
【００７２】
前記、実施例１の５．と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（中）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。ＰＢＳ（−）１０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。再度、クリーンベンチ内でＰＢＳ（−）１０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後蓋を開け、液を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
そのフラスコに細胞懸濁液を移し、３７℃  ＣＯ2インキュベーター（三洋電機株式会社製：ステリカルトインキュベータＭＩＰ−３０３３、湿度９５％）で培養を継続した（培養３日目）。
【００７３】
培養５日目、前記、実施例１の５．と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。
再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
培養していたフラスコを軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、細胞懸濁液を１５mlチューブに移した。チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。
ビーズを吸いとらないように細胞懸濁液を新しい１５mlチューブに回収した。
再度、チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。ビーズを吸いとらないように細胞懸濁液を用意したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）に移した。
さらに新しい培養用培地４０mlを新しいフラスコに移し、３７℃  ＣＯ2インキュベーターに入れ、培養を継続した。
培養６日目、９日目に培養用培地をそれぞれ５０ml、１５０mlずつ加えた。
培養９日目に培養液をＯＫＴ３固相化フラスコからフラスコ（２２５cm2）（２２５cm2 CELL CULTURE FLASK 輸入発売元：コーニングコースタージャパン：３０００）に移した。
【００７４】
３．ＣＤ４陽性細胞の無菌試験及びエンドトキシンアッセイ
上記２．において培養していたフラスコを、培養１０日目（投与前日）に前記、実施例１の１２．と同様にしてＣＤ４陽性細胞の無菌試験及びエンドトキシンアッセイを行ない、菌等の汚染のないことを確認した。
【００７５】
４．回収前の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析
ＣＤ４陽性細胞を回収する前に、前記、実施例１の１３．と同様にして、回収前の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析を行った。
その結果、ＣＤ４陽性細胞は９９．７５％であり、ＣＤ８陽性細胞は０．２５％だった。
【００７６】
５．ＣＤ４陽性細胞の回収
上記２．においてフラスコ培養した培養液５０mlを無菌的に５０ml遠沈管に入れ、１，５００rpm、２０℃で８分間遠心した。遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐし、細胞洗浄液を遠沈管に５０ml入れ１，８００rpm、２０℃で８分間遠心した。遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。
細胞洗浄液を５０mlづつ遠沈管に入れ、５０mlチューブ２本にそれぞれの細胞懸濁液を移した。１，８００rpm、２０℃で８分間遠心した。遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。細胞洗浄液を１０mlづつ５０mlチューブに入れた。
【００７７】
遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスにかけて、良くほぐした。細胞懸濁液をファイナル液（２５０ml遠心管に生理食塩液２００mlと、２０％ヒト血清アルブミン溶液１０mlを入れリンパ球細胞投与用液、ファイナル液とした。）に十分懸濁した後１００マイクロのメッシュ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２３５０）に通した後、細胞懸濁液の液量を測定した。また、細胞数とＣＤ４含有率を測定するため、細胞懸濁液をサンプリングした。
５０mlシリンジを分離バッグＴ−０３０（テルモ株式会社製：ＢＢ−Ｔ０３０ＣＪ（３００ml））と接続し、細胞懸濁液をシリンジから分離バッグに注ぎ込んだ。注ぎ終わったら内筒でシリンジに残った液を押し出し、最後に鉗子でチューブをはさんだ。チューブをチューブシーラーでシールしシリンジをはさみで切り離した。測定の結果、液量は２００ml、総細胞数は８．０×１０7個だった。
【００７８】
６．回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析
前記、実施例１の１３．と同様にして、回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析を行った。
その結果、ＣＤ４陽性細胞は９９．７５％であり、ＣＤ８陽性細胞は０．２５％であった。
【００７９】
７．ＣＤ４陽性細胞の患者への投与
上記５．で調製したＣＤ４陽性細胞は、患者体重あたり１．０×１０6個/kgで患者静脈より３０分かけて投与した。
【００８０】
（実施例３）
１．ＰＨＡおよびＣｏｎ−Ａによるリンパ球幼若化反応の測定
ＰＨＡおよびＣｏｎ−Ａによるリンパ球球幼若化反応の検査は、株式会社エスアールエルに依頼した。その結果、前記、実施例１の２．のＣＤ４陽性細胞投与前の患者の末梢血リンパ球幼若化反応は、１９０９８cpmであったが、ＣＤ４陽性細胞投与後（３週間後）のリンパ球幼若化反応は、３８２０４cpmであった。このことより、ＣＤ４陽性細胞投与により患者の免疫能が上昇することが明らかとなった。
【００８１】
２．ＣＤ４陽性細胞数の測定
末梢血中のＣＤ４陽性細胞の測定は以下のように行った。
全血１００μｌを５mlのチューブに入れ、ＣＤ４／ＣＤ８抗体（コールター社製：Ｔ４ＲＤ１／Ｔ８−ＦＩＴＣ  ６６０３８０２）を１０μｌ入れ、よく攪拌した後４℃、３０分間反応させた。
反応後、Ｍｕｌｔｉ−Ｑ  Ｐｒｅｐ（コールター社製）で溶血、固定し、その後ＰＢＳ（輸入総発売元：ライフテックオリエンタル株式会社）を加え６，０００rpm、５分間遠心し、細胞を洗浄した後シース液を８００μｌ加え、ピペティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブ（輸入発売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２０５２）に入れた。ＦＡＣＳはコールターＸＬを使用した。
前記、実施例１の２．記載のＣＤ４陽性細胞投与前の末梢血中のＣＤ４陽性細胞数は、２０個／μｌであったが、ＣＤ４陽性細胞投与後（２週間後）のＣＤ４陽性細胞数は１１０個／μｌであった。
このことより、ＣＤ４陽性細胞投与により患者の免疫能が上昇することが明らかとなった。
【００８２】
３．サイトメガロウイルスの検出
末梢血中のサイトメガロウイルスの検出は、ＰＣＲによる検出を株式会社エスアールエルに依頼した。
ＣＤ４陽性細胞投与前においてはサイトメガロウイルスが検出されたのに対して、ＣＤ４陽性細胞投与２週間後においては、サイトメガロウイルスは、検出されなかった。
このことよりＣＤ４陽性細胞は、免疫抑制下の生体において抗ウイルス活性を有することが明らかとなった。
【００８３】
４．副作用および投与後臨床所見
ＣＤ４陽性細胞投与による急性の副作用は認めなかった。
ＣＤ４陽性細胞の投与から４週間後に発疹が認められた。
皮疹は紅斑となり全身の５０％以上に認められたが消化管ＧＶＨＤおよび肝ＧＶＨＤは生じず、グレード２に属する非常に軽度なものであった。
骨髄移植後重症なＧＶＨＤをおこしたにもかかわらず、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性細胞の投与により実質的に問題となるようなＧＶＨＤは、引き起こされなかったことが確認できた。
また投与後２週目に行った骨髄穿刺検査にて白血病の再発および髄液検査にて中枢神経再発が確認されたが、抗癌剤の投与なしで５週目には寛解した。
さらに、２ヶ月後においても白血病の再発が認められておらず、アロジェニックな活性化ＣＤ４陽性リンパ球細胞は、抗腫瘍活性も有することが明らかとなった。
さらに、Hemophagocytic syndromeが消失したことから、自己免疫疾患に対して有効であることも明らかとなった。
【００８４】
【発明の効果】
請求項１〜４に記載の予防用剤および治療用リンパ球医薬組成物は、重篤なＧＶＨＤを引き起こさず、高い治療効果を有し、治療の適応範囲が広い又は特定の治療に特に有効である。請求項５に記載の調製用キットは、重篤なＧＶＨＤを引き起こさず、高い治療効果を有し、治療の適応範囲が広い又は特定の治療に特に有効な予防用剤および治療用リンパ球医薬組成物をより簡易に効率良く調製できる。請求項６〜９に記載の予防用剤および治療用医薬組成物の製造方法は、治療の広い適応範囲と高い治療の有効性を有するとともに、重篤なＧＶＨＤを引き起こさない予防用剤および治療用医薬組成物を効率良く製造できる。