(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再狭窄の治療又は予防のための有効量の薬剤及び/又は治療薬および有効量のホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（以下、ＰＩＰ２と略記する）とを含む再狭窄の治療又は予防のための薬剤組成物であって、ＰＩＰ２は該薬剤及び/又は治療薬と混合され、かつ、疾患部位又は異常部位にて、下記の結合部分群の少なくとも１つと結合する結合剤として機能することを特徴とするもの：
（ａ）ＲＳＨＫＴＲＳＨＨ
｛アミノ酸の一文字コード｝あるいは
0004210330.tif 000021
｛アミノ酸の三文字コード｝あるいは
CGC−TCG−CAC−AAG−ACC−AGG−TCG−CAC−CACでコード化されるもの、
（ｂ）ＲＰＨＦＨＫＲ
｛アミノ酸の一文字コード｝あるいは
0004210330.tif 000022
｛アミノ酸の三文字コード｝あるいは
CGG−CCC−CAC−TTC−CAC−AAG−CGGでコード化されるもの。
【請求項２】
有効量のホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（以下、ＰＩＰ２と略記する）を含む再狭窄の治療又は予防のための薬剤組成物であって、ＰＩＰ２は疾患部位又は異常部位にて、下記の結合部分群の少なくとも１つと結合する結合剤として機能することを特徴とするもの：
（ａ）ＲＳＨＫＴＲＳＨＨ
｛アミノ酸の一文字コード｝あるいは
0004210330.tif 000023
｛アミノ酸の三文字コード｝あるいは
CGC−TCG−CAC−AAG−ACC−AGG−TCG−CAC−CACでコード化されるもの、
（ｂ）ＲＰＨＦＨＫＲ
｛アミノ酸の一文字コード｝あるいは
0004210330.tif 000024
｛アミノ酸の三文字コード｝あるいは
CGG−CCC−CAC−TTC−CAC−AAG−CGGでコード化されるもの。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、レセプターが介在する治療によって治療可能な疾患や異常を治療するために好適な新規な結合剤、および治療が必要な哺乳動物の各部位のレセプターに結合するように該結合剤を使用する方法に関する。本発明は、例えば、ヒト悪性腫瘍の治療に使用できる。
発明の背景
Ｈｙａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを譲受人とする米国特許出願第０７／６７５，９０８号明細書および同様にＨｙａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを譲受人とするＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９０／００３０６、公開番号第ＷＯ９１／０４０５８号公報（これから米国特許出願第０７／６７５、９０８が国内段階として出願されている）には、少なくとも約１０ｍｇのヒアルロン酸（ＨＡ）を投与して、人体の治療が必要な部位に有効量の薬剤及び／又は治療薬を運び、瘢痕組織を始めとする治療が必要な部位の組織を全ての膜を介して治療すべき細胞の送り込むようにする使用法が開示されている。
上記ＰＣＴ出願明細書の第２５頁第１７行には、薬剤及び／又は治療剤と少なくとも約２００ｍｇのヒアルロン酸（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）を併用した場合の効果について記載がある。即ち、薬剤及び／又は治療剤投与時の副作用（胃腸障害、神経異常、抑欝などが通常認められる副作用である）が、例えば、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症剤）等を単独投与した場合、通常許容されている適正投与量以上で投与されたときでも抑制できることが記載されている。同様にＨｙａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを譲受人とする米国特許出願第０８／４８６，３２８号明細書、同第０８／５２０，５９１号明細書、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ９５／００４７７号明細書には、ヒアルロン酸類の使用によって、ヒアルロン酸に対して高い親和性を示す細胞表面レセプターを発現する組織および細胞の細胞活性の調節について開示している。これら細胞表面レセプターは、ヒアルロナンを結合する付着分子ＩＣＡＭ−１、付着分子ＣＤ４４及び付着分子ＨＡＲＬＥＣ［ヒアルロン酸（ヒアルロナン−Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）レセプター肝臓内皮細胞）、および調節分子ＲＨＡＭＭ（ＨＡ介在運動性を対象とするレセプター−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＨＡ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を有する。ＨＡＲＬＥＣは肝臓内皮細胞に発現し、（その細胞表面に産生し、かつ付着する）。有効量のある形のヒアルロン酸を投与して、細胞表面レセプターに結合した場合、人体内において、ヒアルロン酸に対して高い親和性を示す細胞表面レセプターを発現する組織及び／又は細胞（例えば、付着細胞または調節細胞）の細胞活性を調節することができる。
薬剤及び／又は治療剤を輸送するためにヒアルロン酸を使用できる理由の一つは、その細胞表面レセプターに対する選択的結合である。
人体は、少なくとも１０28の異なるアミノ酸の組合せを有する。例えば、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｏ’Ｎｅｉｌ、Ｋａｒｙｎ  Ｔ．、ｅｔ  ａｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４５、（１９９４）、３７０−３８６を参照。ある種のヒアルロン酸、例えばヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）を誘因体として人体に送り込むと、全体で少なくとも１０28の組み合せからわずか２つのアミノ酸の組み合せがＨＡに結合する。この２つの組み合せはＨＡに対する特異性が高い。
１．最初の組み合せのアミノ酸配列は次の通りである。
0004210330.tif 000002
下線部はＨＡ結合タンパク質（Ｒｈａｍｍ、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４４、ＨＡＲＬＥＣなど）の基本的アミノ酸モチーフである。下線部は結合部分である。
２．アミノ酸結合部分の第２系列は第２アミノ酸配列に存在する。即ち、
0004210330.tif 000003
このアミノ酸の結合部分は小さく、結合対象部分は細胞核である。この小さな結合部分は、細胞核に転座するただ一つのＨＡレセプターであるＨＡ結合タンパク質Ｒｈａｍｍにも結合する。
各アルファベットは以下の表に示す異なるアミノ酸を表す。
0004210330.tif 000004
上記モチーフがＨＡ結合部分になることを示す証拠は、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．１３、Ｎｏ．２（１９９４）、ｐｐ．２８６−２９６に発表された論文“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｈｕａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＲＨＡＭＭ、ＣＤ４４  ａｎｄ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ”にある。この論文（写しを添付してある）の内容は、本明細書で従来例として使用する。
本発明者は、試験を通じて、別な分子、即ちＰＩＰ−２（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェートであり、このうちのホスホイノシトール−４，５−ビスホスフェートが活性部分である）がこれら同じ部分に特異的に結合することを見いだした。ＰＩＰ２の構造式は次の通りである。
0004210330.tif 000005
上記式のうちの下記の部分が活性部分である。
0004210330.tif 000006
よく知られているように、ＲｈａｍｍはＨＡに結合する。本発明者は、試験によって、ＲｈａｍｍはＰＩＰ２にも結合することを見いだした。ＰＩＰ２を過剰に使用した場合、ＨＡを置換する。Ｒｈａｍｍは、腫瘍形成、再狭窄や他の修復例に対して“ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ”になる点で、きわめて重要なレセプターである。ＨＡは、（Ｒｈａｍｍを始めとする）表面細胞レセプターに選択的に結合する能力があるため、薬剤を疾患部位や異常部位に輸送するために使用するのにすぐれたものである。このように、ＰＩＰ２はＨＡを単独で使用して、あるいは薬剤及び／又は治療剤と併用して、治療してきた同じ異常や疾患を治療するために使用できる。ＰＩＰ２は小さな分子であるため、ＰＩＰ２、あるいはＰＩＰ２、ＨＡに似た化合物、即ちＨＡやＰＩＰ２の類似体、同族体、誘導体、錯体なども有効にかつより簡単に使用できるはずである。これら化合物は、新規な、合成または精製天然化合物である。なお、天然に産生するものは、未精製状態である。
即ち、本発明の目的は新規な結合剤を提供することである。
本発明の別な目的は、治療を必要とする、例えば、悪性腫瘍や再狭窄の治療を必要とする哺乳類の体内部位にあるレセプターと結合するレセプター介在治療によって治療可能な疾患や異常を治療するために上記の新規結合剤を使用する治療方法を提供することである。
当業者ならば、以下の発明の要約および実施例の詳細な説明から、本発明の上記以外の目的を理解できるはずである。
発明の要約
本発明は、第１に、（ヒアルロナン、薬学上許容できるヒアルロナンの塩または他の形のヒアルロン酸類以外の）、有効量の結合剤と併用して、有効量の薬剤及び／又は治療剤を投与するレセプター介在治療によって治療可能な、あるいは予防可能な疾患及び／又は異常を治療及び／又は予防する新規な方法を提供するものである。この結合剤は、薬剤及び／又は治療剤と混合して投与する。疾患部位または異常部位に到達すると、以下の結合部分からなる群から選択される少なくとも一つの部分で上記部位に結合する。
（ａ）ＲＳＨＫＴＲＳＨＨ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000007
｛アミノ酸の三文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000008
｛別コード｝
（ｂ）ＲＰＨＦＨＫＲ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000009
｛アミノ酸の三文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000010
｛別コード｝
このような結合剤の一つは、ＰＩＰ２の活性部分、ホスホイノシトール−４，５−ビスホスフェートである。新規な結合剤は、ヒアルロナンも結合する上記部分に結合するため、本発明は、ヒアルロナンが有効な、任意のレセプター介在治療にも適用可能である。このように、本発明はヒアルロナンの使用方法と同様にして、再狭窄の予防や他の治療にも使用できる。即ち、本発明は以下の公開、未公開公報に記載されている治療や予防治療に使用できる。まず、１９９５年１２月１日にカナダ特許庁に出願され、“所定投与量の薬剤および治療剤の標的”を発明の名称とするカナダ特許出願第２，１６４，２６０号明細書、および１９９６年３月２９日に出願され、“所定投与量の薬剤、治療剤およびその他のグリコサミノグリカン類（ＧＡＧＳ）の標的”を発明の名称とするカナダ特許出願第２，１７３，０３７号明細書を挙げる。さらに、以下のものがある。
0004210330.tif 000011
いずれも従来例として本明細書で使用するものである。なお、各明細書記載の各形態のヒアルロナンを例えば本明細書に開示する他の結合剤で置換することができ、同様に使用することができる。
いくつかの用途を説明するために、一例として、ＰＣＴ／ＣＡ９０／００３０６（国際公開第ＷＯ９１／０４０５８）から次の記載を引用する。
（ｉ）第１７頁第３行〜第１８頁第１６行に次の記載がある。
本出願人は、疾患や異常を治療するために、症例に応じて、治療上有効な非毒性量の薬剤及び／又は治療剤を使用した、あるいは配合した併合製剤および製剤組成が疾患や異常を治療するために、治療すべき個々の細胞に細胞膜を介して治療されるべき部位において、（瘢痕組織を含む）組織への製剤の浸透を促進するのに十分な量のヒアルロン酸及び／又はその塩（例えば、ナトリウム塩）及び／又はヒアルロン酸の同族体、類似体、誘導体、錯体、エステル、フラグメント及び／又はサブユニットとともに投与するか、これらに担持した形で哺乳類に投与できることを見いだした。詳しくは、これら併合製剤または製剤組成は、必要に応じて、治療上有効な非毒性量の疾患や異常を治療する薬剤及び／又は治療剤、例えば遊離ラジカルスカベンジャー（例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ））、（単核細胞症治療用の）ビタミンＣ、抗癌剤、化学療法剤、避妊クリームＤｅｌｆｅｎTMに存在するノノキシノール−９［ノニルフェノキシポリエトキシエタノール］などのノニオン系表面活性剤、アニオン系表面活性剤（例えば、塩化セチルピリジニウム）やカチオン系表面活性剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）などの抗ウィルス剤、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、例えば、インドメタシン、ナプロキセンおよび（ＴｏｒａｄｏｌTMの商標で市販されている）ケトラックのトロメタミン塩およびステロイド系抗炎症剤、抗真菌剤、解毒剤（例えば、直腸浣腸剤）、鎮痛剤、気管支拡張剤、抗菌剤、抗生物質、血管虚血治療剤（例えば、糖尿病治療剤、バージャー病治療剤）、抗体単クローン剤、育毛を対象とする局所投与用ミノキシジル、利尿剤（例えば、ＬａｓｉｘTMの商標で市販されている（フロセミド））、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）、リンホカイン（例えば、インターロイキン−２などやα−ａｎｄ−β−インターフェロンなど）を利用したり、配合するものである。このような併合製剤や製剤組成物を罹患している患者に投与した場合、疾患や異常に予期しない程の改善がみられる。
これら製剤組成物はさまざまな方法で投与できる。即ち、静脈投与、動脈投与、腹腔投与、胸膜腔投与、経皮投与、皮膚への（局所）投与、直腸投与、経口投与、（例えば、腫瘍、膿瘍などの患部への）直接注射投与、患者の皮膚へ貼った絆創膏への投与などの投与方法が利用できる。ヒアルロン酸及びその塩、および製剤は別々に投与することも可能であるが、疾患や異常を治療するためには、好ましくは同一部位（ある部位では静脈投与、そして他の部位ではピギーバック方式投与）に、十分な量で、しかも連続的か断続的（好ましくは共存的に、より好ましくは同時に）に投与するのがよい。
（ｉｉ）第２５頁、第１８行から第２６行、第１４行には次の記載がある。
このように、また発明の別な態様によれば、（ｎ−メチルグルカミンに溶解した）インドメタシンなどのＮＳＡＩＤや他のＮＳＡＩＤを２００ｍｇ以上のヒアルロン酸とともに、体重１ｋｇにつき１〜２ｍｇの量でＮＳＡＩＤ（例えば、インドメタシンとＮＭＧ）を投与すると、（必要に応じて）大量にインドメタシンを投与した場合でも、胃腸障害、神経異常や抑欝などの重大な毒性副作用が生じない。ヒアルロン酸量をこれより抑えると、通常の副作用が再発する恐れがある。さらに、認められた反応は、ＮＳＡＩＤ（例えば、ＩｎｄｏｃｉｄTM）をヒアルロン酸と併用した場合によりすぐれたものになり、全身の静脈により投与しても、併用が病変組織を“標的”にすることを明らかに示している。このように、腫瘍性の病気に罹患した患者に、他の薬剤（例えば、アスコルビン酸［ビタミンＣ］、フロレチンや抗癌剤など）に加えて、５０〜２００ｍｇのＮＳＡＩＤ−ヒアルロン酸（ヒアルロン酸ナトリウム）（例えば、インドメタシンおよびヒアルロン酸）を投与すると、疼痛がただちに劇的に消える。この後少しの時間がたつと、腫瘍部が消散、再吸収され、肺機能や肝機能に、これら臓器に腫瘍が残存していても、改善が認められることになる。このように、ヒアルロン酸（その塩など）とともに投与されたＮＳＡＩＤ（またはステロイド系抗炎症剤）によって活性が増大したマクロファージの作用によって死滅した腫瘍、腫瘍遺残や腫瘍毒素が体外に排出されることになる。即ち、本出願人は、ＮＳＡＩＤをヒアルロン酸（ヒアルロン酸ナトリウム）と併用すると、マクロファージ機能を阻害するプロスタグランジンシンセターゼの酵素作用による産生を阻止することによって、マクロファージを脱阻害するとみている。このように、ヒアルロン酸（塩などの形で）はＮＳＡＩＤの活性を強化するだけでなく、プロスタグランジン合成抑制剤の使用に伴う副作用や毒性を低減するものである。
化学療法剤として使用するのに好適な薬剤を例示すれば、ノバントロン（ミトキサントロン）、メソトレキサート、５−ＦＵ（５−フルオウラシル）、カルボプラチン、経口投与用メチルＣＣＮＵ、およびミトマイシンＣがある。
（ｉｉｉ）第２６頁、第３２行〜第３７には次の記載がある。
ヒアルロン酸およびその塩は異なる投与量、即ち体重７０ｋｇに対して１０〜１，０００ｍｇの投与量で使用でき、最適投与量は体重７０ｋｇに対して５０〜３５０ｍｇである。毒性がないため、ヒアルロン酸を過剰量（例えば、体重７０ｋｇに対して３，０００ｍｇ）で使用しても、副作用は認められない。
（ｉｖ）第２９頁、第２７行から第３３頁、第３１行には次の記載がある。
本発明に使用するのに好適なある一つの形のヒアルロン酸及び／又はその塩（例えば、ナトリウム塩）、およびヒアルロン酸の同族体、類似体、誘導体、錯体、エステル、フラグメント及びサブユニット、好ましくはヒアルロン酸およびその塩は、Ｓｔｅｒｉｖｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ製のフラクションである。このようなフラクションの一つは、ヒアルロン酸ナトリウム２０ｍｇ／ｍｌの１５ｍｌバイアル（３００ｍｇ／バイアル−Ｌｏｔ２Ｆ３）である。ヒアルロン酸ナトリウムフラクションは２％溶液で、平均分子量は約２２５，０００である。フラクションはまた水ｑ．ｓ．を含み、これは、注射組成物とするには、Ｕ．Ｓ．Ｐ．に従って三回蒸留し、殺菌する。ヒアルロン酸及び／又はその塩のバイアルは、バイアルの内容物と反応しないブチルストッパーで密封したタイプ１ホウケイ酸ガラスバイアルに担持してもよい。
ヒアルロン酸及び／又はその塩（例えば、ナトリウム塩）、およびヒアルロン酸の同族体、類似体、誘導体、錯体、エステル、フラグメント及びサブユニット、好ましくはヒアルロン酸およびその塩のフラクションは、下記の特性をもつヒアルロン酸及び／又はその塩からなるものである。
以下に示す特性のうち少なくとも一つの特性を示す、天然源から得られたヒアルロン酸の実質的にピロゲンを含まない、精製フラクション。
ｉ）１５０，０００〜２２５，０００の分子量、
ｉｉ）硫酸化ムコ多糖類が全重量基準で約１．２５％未満、
ｉｉｉ）タンパク質が全重量基準で約０．６％未満、
ｉｖ）鉄分が全重量基準で約１５０ｐｐｍ未満、
ｖ）鉛分が全重量基準で約１５ｐｐｍ未満、
ｖｉ）グルコサミンが０．００２５％未満、
ｖｉｉ）グルクロン酸が０．０２５％未満、
ｖｉｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンが０．０２５％未満、
ｉｘ）アミノ酸が０．００２５％未満、
ｘ）２５７ｎｍにおけるＵＶ消衰係数が約０．２７５未満、
ｘｉ）２８０ｎｍにおけるＵＶ消衰係数が約０．２５未満、および
ｘｉｉ）７．３〜７．９の範囲にあるｐＨ。
好ましくは、ヒアルロン酸を水と混合する。また、ヒアルロン酸フラクションの平均分子量が１５０，０００〜２２５，０００の範囲にあるのが好ましい。より好ましくは、ヒアルロン酸のフラクションが下記に示す特性のうち少なくとも一つの特性を有する。
ｉ）硫酸化ムコ多糖類が全重量基準で約１％未満、
ｉｉ）タンパク質が全重量基準で約０．４％未満、
ｉｉｉ）鉄分が全重量基準で約１００ｐｐｍ未満、
ｉｖ）鉛分が全重量基準で約１０ｐｐｍ未満、
ｖ）グルコサミンが０．００１６６％未満、
ｖｉ）グルクロン酸が０．０１６６％未満、
ｖｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンが０．０１６６％未満、
ｖｉｉｉ）アミノ酸が０．００１６６％未満、
ｘ）２５７ｎｍにおけるＵＶ消衰係数が約０．２３未満、
ｘｉ）２８０ｎｍにおけるＵＶ消衰係数が約０．１９未満、および
ｘｉｉ）７．５〜７．７の範囲にあるｐＨ。
他の形のヒアルロン酸及び／又はその塩、およびヒアルロン酸の同族体、類似体、誘導体、錯体、エステル、フラグメントおよびサブユニットについては、他の製造メーカー、例えば既に言及した先行文献に記載されている各メーカーから入手可能である。さらに、本発明では、以下の具体的特性をもつ、ＬｉｆｅＣｏｒｅTM  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ．製のヒアルロン酸ナトリウムを使用するのが有利である。
特性 特性値など
外観                      白色ないしクリーム色の粒子
臭気                      知覚できるほどの臭気はない
平均粘度                  <750,000ダルトン
分子量
UV/Vis走査、190〜820nm    基準走査対応
OD、260nm                 <0.250D単位
ヒアルロニダーゼ感受性    陽性反応
IR走査                    基準走査対応
pH、10mg/g溶液            6.2〜7.8
水                        最大８％
タンパク質                <0.3mcg/mgNa
Ｈｙ
アセテート                <10.0mcg/mgNaHy
重金属、最大ppm
As  Cd  Cr  Co   Cu   Fe   Pb   Hg   Ni
2.0 5.0 5.0 10.0 10.0 25.0 10.O 10.0 5.0
微生物による生物学的負荷    認められず
内毒素                      <0.07EU/mgNaHy
生物学的安全性試験          ウサギによる眼球毒性試験をパス
以下の各文献には、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸源、およびヒアルロン酸の製造方法および回収方法が記載されている。
米国特許第４，１４１，９７３号には、以下の特性を示す（ナトリウム塩を含む）ヒアルロン酸フラクションが記載されている。
（ａ）平均分子量が約７５０，０００以上、好ましくは約１，２００，０００以上である。即ち、限界粘度数が約１，４００ｃｍ3／ｇ以上、好ましくは２，０００ｃｍ3／ｇ以上である。
（ｂ）タンパク質含量が０．５重量％未満である。
（ｃ）ヒアルロン酸ナトリウム１％溶液の紫外線吸光度が波長２５７ｎｍで３．０未満、好ましくは波長２８０ｎｍで２．０未満である。
（ｄ）ヒアルロン酸ナトリウムの１％生理学的緩衝液の動粘度が約１，０００ｃＳ以上、好ましくは約１０，０００ｃＳ以上である。
（ｅ）２２０ｎｍで測定した場合、ヒアルロン酸ナトリウムの０．１〜０．２％生理学的緩衝液のモル旋光度が−１１×１０3ｄｅｇｒｅｅ−ｃｍ2／モル（二糖類）未満である。
（ｆ）生理学的緩衝液に溶解したヒアルロン酸ナトリウムの１％溶液１ｍｌを硝子液に注入して、存在する硝子液のほぼ半分を置き換えた場合、ヨザル眼球の硝子液および前房の有意味な細胞浸潤が生じない、房水フレアがない、硝子液に濁りやフレアがない、角膜、水晶体、虹彩、網膜および絨毛膜に対して病理学的変化がない。このＨＵＡが
（ｇ）無菌で、ピロゲンを含まず、そして
（ｈ）非抗原性である。
カナダ特許第１，２０５，０３１号（従来例として米国特許第４，１４１，９７３号に言及）には、平均分子量が５０，０００〜１００，０００、２５０，０００〜３５０，０００および５００，０００〜７３０，０００のヒアルロン酸ナトリウム、およびその製造方法が記載されている。
高分子量ヒアルロン酸（またはその塩か他の形のヒアルロン酸）を使用する場合、筋肉内凝固を起こさずに投与を可能にするために、希釈する必要がある。
（ｖｉ）第３３頁、第３７行から第３５頁、第３０行には次の記載がある。
このように、本出願人がヒアルロン酸（およびヒアルロン酸ナトリウム及び／又は他の形のヒアルロン酸）を薬剤及び／又は治療剤と併用して、異常や疾患を治療した場合に、全く予期しない結果が得られた。
具体例
１．適用例
癌、マクロファージの活性増大
薬品および薬剤
遊離ラジカルスカベンジャー、スーパーオキシドジムスターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、抗癌剤、ＮＳＡＩＤ、化学療法剤、解毒剤（例えば、コレスチラミン）
１Ａ．適用例
脳外傷患者（ＤＭＳＯ）における脳腫ちょうの抑制
薬品および薬剤
ジメチルスルホキシド
２．適用例
育毛、局所投与による増毛
薬品および薬剤
ミノキシジル−併用
３．適用例
ヘルペス、粘膜潰瘍、帯状泡疹
薬品および薬剤
ノニオン系表面活性剤（ノノキシノール−９など）、アニオン系表面性剤（塩化セチルピリジニウムなど）、カチオン系表面活性剤（塩化ベンザルコニウムなど）
４．適用例
腎不全、心不全、高血圧、浮腫
薬品および薬剤
利尿剤−フロセミド
５．適用例
感染症、アクネ、単核細胞症
薬品および薬剤
抗生物質、抗菌剤、殺菌剤、ｅｔｃ．アスコルビン酸、ヒアルロン酸
６．適用例
移植
薬品および薬剤
シクロスポリン
７．適用例
炎症、腫瘍破壊物の除去
薬品および薬剤
非ステロイド系抗炎症剤、ＮＳＡＩＤ（毒素、遺残など）、ジクロフェナク
適用例
副作用の抑制
薬品および薬剤
インドメタシン、ピロキシカム
適用例
（背中の痛みなどの）疼痛除去
薬品および薬剤
イブプロフェン、ケトロラックのトロメタミン塩、ナプロキセン
８．適用例
解毒
薬品および薬剤
浣腸剤、解毒剤、腹膜透析
９．適用例
気管支拡張
薬品および薬剤
ベクロメタゾンジプロピオネートなどの気管支拡張剤、クロモグリク酸ナトリウム（ただし、適用例は気管支拡張剤としてだけではない。）
１０．適用例
血管虚血
薬品および薬剤
トレンタールなどの適当な薬剤と併用して、糖尿病、バージャー病などにおける四肢の治療に使用
１１．適用例
ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）
薬品および薬剤
ＤＭＳＯ、ビタミンＣ、（インドメタシン、ナプロキセン、ケトラックトロメサタンなどの）ＮＳＡＩＤ、インターフェロン、ＶｉｂｒａｍｙｃｉｎTM、（ドキシサイクロン）、テトラサイクリン
１２．適用例
糖尿病
薬品および薬剤
インシュリン
１３．適用例
閉経後
薬品および薬剤
エストロゲン代替物
１４．適用例
局所予防
薬品および薬剤
代謝拮抗剤（インフェクション−スルホンアミドなど）
１５．適用例
腫ちょうの抑制
薬品および薬剤
ＤＭＳＯ
１６．適用例
高血圧、心臓
薬品および薬剤
カルシウムチャネルブロッカー（インサフィシャンシーニフェジピンなど）、β−ブロッカー（アテノール、プロパノールなど）
１７．適用例
プロスタグランジン合成抑制
薬品および薬剤
アセチルサリチル酸
１８．適用例
（移植を目的として）組織を灌流する灌流液による組織酸素供給の強化
薬品および薬剤
灌流剤
即ち、本発明は、別な態様によれば、レセプター介在治療によって治療することができ、かつ（ヒアルロナン以外の形の）結合剤を有効な量で投与することからなる疾患や異常を治療する方法であって、上記結合剤が、
（ａ）ＲＳＨＫＴＲＳＨＨ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000012
｛アミノ酸の三文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000013
｛別コード｝
（ｂ）ＲＰＨＦＨＫＲ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000014
｛アミノ酸の三文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000015
｛別コード｝
から選択される少なくとも一つの結合部分で疾患部位または異常部位に結合することによって、上記レセプターの機能を抑制する疾患または異常の治療方法を提供するものである。
この態様によれば、例えば、再狭窄を予防するために、この結合剤を有効な量で投与すると、狭窄部位に平滑筋細胞が移動したり、白血球細胞（マクロファージ）が侵潤することがなくなる。
治療上有効な量と考えられる結合剤の量は、体重１ｋｇにつき結合剤（例えば、ＰＩＰ２）約０．１〜約１．５ｍｇである。好ましくは、治療を受ける患者の体重１ｋｇにつき結合剤（例えば、ＰＩＰ２）を約０．２〜１ｍｇを投与できる。この量を上記範囲外にしても有効であるが、好ましくは、細胞や人体のいずれに対しても毒性を示さない量で結合剤を投与する必要がある。にもかかわらず、使用する量では結合剤が毒性がないと考えられる場合でも、患者個々にとって有効な量で結合剤を投与した場合に細胞が死ぬことがある。投与は必要な期間続ける。
上記のＰＩＰ２は、本発明の目的を満足するもので、投与する場合には、体重１ｋｇにつき約０．１〜約１．５ｍｇ、特に０．２〜１ｍｇの適正量で使用する。ＰＩＰ２の薬効（例えば、治療効果）を増強するために、例えば、グルクロン酸や他の適当な非毒性・親水性剤にＰＩＰ２を結合するなどして、変性すると、ＰＩＰ２の脂肪可溶性を低く抑えることができる。反応生成物は、ＰＩＰ２と親水性剤とから調製することができる。
また、ＰＩＰ２結合分子はそれ自体が変性して、ホスフェートをサルフェート、カーボネート、ナイトレート、サルファイト、ナイトライトなどの他の部位によって置換することができる。
また、目的のレセプターへの結合を達成するために、イノシトール環全体を必要とするものではない。つまり、ヒドロキシルラジカルが結合する４つの炭素原子からなる、椅子形構造部分のみが上記結合に必要と考えられる。換言すれば、下記の式で表される椅子形構造を構成するこれら４つの炭素原子を含む別な分子が好適である。即ち、次の構造式の化合物が好適である。
0004210330.tif 000016
ただし、Ｒ1とＲ2は、分子の残りの部分とともに、（ＰＩＰ２と同様に）閉環を形成するか、あるいは結合することなく、閉環分子を形成するブリッジを形成し、そしてＲ1とＲ2はそれぞれ低級アルキルか他の適当な置換基である。
さらに、体内に自然に存在するＨＡに結合して、ＨＡがレセプターを刺激することを阻止する結合剤として、下記の右旋形結合部分（アミノ酸配列）
（ａ）ＲＳＨＫＴＲＳＨＨ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000017
｛アミノ酸の三文字コード｝
（ｂ）ＲＰＨＦＨＫＲ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000018
｛アミノ酸の三文字コード｝
を使用することができる。これらの作用機序は、上記の右旋形が分割できないことによる。このように、右旋形アミノ酸配列は、大きな結合部分および小さな結合部分両者の結合モチーフに結合するために使用できる。
上記の、
（ａ）ＲＳＨＫＴＲＳＨＨ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000019
｛アミノ酸の三文字コード｝
（ｂ）ＲＰＨＦＨＫＲ
｛アミノ酸の一文字コード｝、あるいは
0004210330.tif 000020
｛アミノ酸の三文字コード｝
それぞれに対するアンチセンスペプチド、および上記で説明した右旋形アンチセンスペプチドもまた好適である。これれらは、当業者ならば簡単かつ容易に同定できるはずである。また、これらは公知方法によって調製でき、これについても、当業者ならば理解できるはずである。従って、ＰＩＰ２模擬体や（ヒアルロナンの形を取らない）他のヒアルロナン模擬体も好適である。アンチセンスペプチドは次の通りである。
（ａ）については、アンチセンスペプチドはＡＳＶＦＷＳＳＶＶ（別コードで示せば、GCG-AGC-GTG-TTC-TGG-TCC-AGC-GTG-GTG）であり、
（ｂ）については、アンチセンスペプチドはＡＧＶＫＶＦＡ（別コードで示せば、GCC-GGG-GTG-AAG-GTG-TTC-GCC）である。
アンチセンスペプチドは、当業者者にとっては公知な方法によって製造でき、簡単に同定できる。以下の文献が参考になる。
（ｉ）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４５、ｐ．３７０、および
（ｉｉ）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ”、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１１７、１９９２、ｐ．１３４３。
これらアンチセンスペプチドの使用量は前記と同じで、体重１ｋｇにつき約０．１〜約１．５ｍｇである。この量を上記範囲外にしても有効であるが、上記と同様に好ましくは、細胞や人体のいずれに対しても毒性を示さない量でアンチセンスペプチドを投与する必要がある。にもかかわらず、使用する量ではアンチセンスペプチドが毒性がないと考えられる場合でも、患者個々にとって有効な量で投与した場合に細胞が死ぬことがある。投与は必要な期間続ける。
【図面の簡単な説明】
図１
（１）ビオチニル化ヒアルロナン単独、（２）ＰＩＰ２を５ｕｇ／ｍｌ、（３）ＰＩＰ２を５０ｕｇ／ｍｌ、（４）ＰＩＰ２を２５０ｕｇ／ｍｌ、および（５）未標識ヒアルロナンを１００ｕｇ／ｍｌ存在させた状態で、ビオチニル化ヒアルロナンプローブにアミノ酸配列ＲＳＨＫＴＲＳＨＨを含むファージを結合した。これら結果から、ＰＩＰ２により、上記配列へのヒアルロナンの結合が有効に抑制できることがわかる。また、未標識ヒアルロナンのこの配列に対するビオチニル化ヒアルロナンに拮抗する能力により、ヒアルロナンとこの配列との間の相互作用の特異性が確認できる。
図２
ＰＩＰ２の、ＲＨＡＭＭへのヒアルロナンの結合を抑制する能力。（ａ）ビオチニル化ヒアルロナンはＲＨＡＭＭに結合する（この細部および対照については、Ｙａｎｇ等の論文“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｏｎｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ”、（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．１３、Ｎｏ．２、ｐｐ．２８６−２９６、１９９４を参照。この文献の内容は従来例として本開示に記載してある）。（ｂ）２５０ｕｇ／ｍｌのＰＩＰ２は、本質的に、ヒアルロナンからＲＨＡＭＭに結合する能力を奪うものである。図１に示した配列ＲＳＨＫＴＲＳＨＨは基本アミノ酸（７つの介在アミノ酸）基本アミノ酸のヒアルロナン結合モチーフ（細部については、上記のＹａｎｇ等の論文を参照）を有し、これがＰＩＰ２に結合するため、ＰＩＰ２が、ヒアルロナンがＲＨＡＭＭにおいて結合する同じモチーフに結合する。
図３
トランスブロット評価における3Ｈ−ＰＩＰ２のＲＨＡＭＭへの結合。3Ｈ−ＰＩＰ２はＲＨＡＭＭに結合し、これは未標識ＰＩＰ２に拮抗する。
図４
細胞質および細胞核に局在化したＲｈａｍｍ。
図５
細胞核、そして程度は小さいが細胞質に存在するＦＩＴＣ−ＨＡ。
実施例の詳細な説明
手順
図１
ストレプタビジン被覆ビーズで捕捉したビオチニル化ヒアルロナンに暴露することによって配列ＲＳＨＫＴＲＳＨＨを有するバクテリオファージを単離した。次に、これらバクテリオファージを５〜２５０ｕｇのＰＩＰ２の存在下でビオチニル化ヒアルロナンに、あるいは１００ｕｇの未標識外因性ヒアルロナンに暴露した。これらの異なる条件下においてビオチニル化ヒアルロナンプローブで捕捉したバクテリオファージを寒天プレートに面線接種し、３７℃で４８時間培養した。培養プレートを次に写真撮影した。
図２
Ｙａｎｇ，Ｂ．、Ｙａｎｇ．Ｂ．Ｌ．、Ｓａｖａｎｉ，Ｒ．Ｃ．およびＴｕｒｌｅｙ，Ｅ．Ａ．がＴｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ１３、２８６−２９６（１９９４）に詳しく記述しているように、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌に形質変換したＲＨＡＭＭｖ２ｃＤＮＡを使用して、ＲＨＡＭＭ変異体２を合成した。ＲＨＡＭＭタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上記文献を参照）中で電気泳動させ、酢酸ニトロセルロースにトランスブロットした。次に、ビオチニル化ヒアルロナンを膜培養し、結合したビオチニル化ヒアルロナンを上記文献記載の化学発光によって検出した。同じではあるが別なブロットにおいて、ビオチニル化ヒアルロナンをＰＩＰ２（２５０ｕｇ／ｍｌ）と混合し、混合物を次にＲＨＡＭＭを有する膜で培養した。上記と同様にして、結合ビオチニル化ヒアルロナンを化学発光により検出した。
図３
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、かつ上記のようにしてニトロセルロース膜にトランスブロットしたＲＨＡＭＭで、トリチウム標識化ＰＩＰ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ、５０ｕＣｌ／１０ｍｌ）を培養した。放射線標識化ＰＩＰ２をＲＨＡＭＭで１時間培養し、洗浄し、ＫＯＤＡＫの放射能写真フィルムに一月露光した。Ｂｉｏｒａｄデンシトメーターを使用して、フィルム走査した。ブロットを洗剤で洗浄し、多クローン抗ＲＨＡＭＭ抗体を使用して、ＲＨＡＭＭについて再プローブして、放射線標識化バンドがＲＨＡＭＭタンパク質に一致するかどうかをチェックした。
ＰＩＰ２疑似体投与量の決定
ヒアルロナンに拮抗する投与量範囲は５−２５０ｕｇ／１０ｍｌ。ラットの血液容量は約１５ｍｌで、ラットの平均体重は２５０ｇである。
従って、ラットに対するＰＩＰ２の使用量は体重基準で２５〜３７５ｕｇ／２５０ｇまたは１００〜１，５００ｕｇ／ｋｇまたは０．１〜１．５ｍｇ／ｋｇである。
当業者にとっては公知な方法で、有効量の変更アデノウイルス組み込み遺伝子治療剤（例えば、ＧＭＣＳＦ−髄コロニー刺激因子における成長の頭文字）を投与を目的として調製する。この変更アデノウイルスは、投与されると、免疫システムを腫瘍に引き付ける作用をもつ。本発明では、従来より知られている方法で投与するのではなく、本発明のアンチセンスペプチドでアデノウイルス組み込み遺伝子治療剤を変更して、表面に変更“ウイルスコート”したものを患者に投与する。なお、当業者ならば、公知方法によってこれを簡単に実施できるはずである。
乳癌、膵臓癌、結腸癌では、ＨＡ（ヒアルロナン）レセプターが増大する。換言すれば、過度に表現される。転移の場合、ＲＨＡＭＭ表現（ＨＡレセプター表現）が大きく表れる。即ち、上記のようにアンチセンスペプチド（結合部分の鏡像）をオーバーコートとして組み込んで（そして特に上記のアンチセンスペプチド（ｂ）を組み込んで）変更したアデノウイルスを投与すると、癌性腫瘍のＲＨＡＭＭに結合し、アデノウイルスが正確に細胞核に到達する。このため、腫瘍の核がアデノウイルスによって変更され（遺伝子が設計通りに有効に複製される）、腫瘍が免疫システムによって破壊されることになる。これは、ＲＨＡＭＭを表現する細胞では、ヒアルロナンが細胞に到達し、ＲＨＡＭＭに結合し、約１５分後、ヒアルロナンが細胞核に浸透することによる。アンチセンスペプチド、例えばアンチセンスペプチドは、従って、細胞に正確に浸透し、細胞核に浸透する。この作用機序を図４および図５に示す。特に、図５では、ＦＩＴＣ−ＨＡ（ヒアルロナン）が細胞核および細胞質に存在している。同じことは、上記のアンチセンスペプチドについてもいえる。この点については、“Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｕｓ”、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．５６３−５６４（Ｂ．Ａｌｖｅｒｔｚ、Ｄ．Ｂｒａｇ、Ｊ．Ｌｅｗｉｓ、Ｍ．Ｒａｆｆ、Ｋ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ．Ｏ．Ｗａｔｏｓｎ）が参考になる。
発明の範囲から逸脱せずに、上記実施例では多くの変更が可能である。従って、ここで開示したものはすべて発明を説明するためのもので、発明を制限するものではない。
【図１】
0004210330.tif 000025
【図２（ａ）】
0004210330.tif 000026
【図２（ｂ）】
0004210330.tif 000027
【図３】
0004210330.tif 000028
【図４】
0004210330.tif 000029
【図５】
0004210330.tif 000030