(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0004369052.tif 000013
［式中、Ｒ１は、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、（イソ）キノリニル、テトラヒドロ（イソ）キノリニル、３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリニル、クロマニル、またはショウノウ基であり、これらの基は、任意に（１−８Ｃ）アルキルまたは（１−８Ｃ）アルコキシから選択される１つ以上の置換基で置換されていても良く；
Ｒ２及びＲ３は、独立にＨまたは（１−８Ｃ）アルキルであり；
Ｒ４は、（１−８Ｃ）アルキルまたは（３−８Ｃ）シクロアルキルであるか；
或いはＲ３とＲ４が、それらが結合される窒素原子と一緒になって、任意に別のヘテロ原子を含有する非芳香族の（４−８）員環を表し、その環は、任意に（１−８Ｃ）アルキルまたはＳＯ２−（１−８Ｃ）アルキルで置換されていても良く；
Ｚは、式（ＩＩ）：
【化２】
0004369052.tif 000014
｛式中、Ｒ５は、独立にＯＳＯ３−または（１−８Ｃ）アルコキシである｝を有する負電荷の五糖残基であり、その電荷は、正電荷の対イオンで補償される；
Ｑは、式（ＩＩＩ）：
−［（ＣＨ２）２Ｏ］ｍ−［（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ３−Ｃ（Ｏ）］ｐ−Ｗ−（ＣＨ２）ｓ−
（ＩＩＩ）
｛式中：Ｗは、
−［１，４−フェニレン−ＮＲ３−Ｃ（Ｏ）］ｑ−（ＣＨ２）ｒ−Ｓ−、または
−（ＣＨ２）ｔ−Ｓ−（ＣＨ２）ｕ−［Ｏ（ＣＨ２）２］ｖ−Ｏ−（ＣＨ２）ｗ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３−であり｝；
およびＲ３は独立に、Ｈまたは（１−８Ｃ）アルキルであり；
ｍ＝１〜１２；ｎ＝１〜８；ｐ＝０〜４；ｑ＝０または１；ｒ＝１〜８；ｓ＝１〜８；ｔ＝１〜８；ｕ＝１〜８；ｖ＝１〜１２；ｗ＝１〜８であって；それらの原子の合計数は１０〜７０個であり；および、−［（ＣＨ２）２Ｏ］ｍ−部分は、それでＱがＺに付着される末端基である｝を有するスペーサーである］の化合物；
あるいは薬剤学的に許容可能なその塩、またはその誘導体［該誘導体中、アミジノ部分のアミノ基は、ヒドロキシ基または（１−６Ｃ）アルコキシカルボニル基で保護されている］。
【請求項２】
該Ｚが、それ自体ＡＴ−ＩＩＩ介在性の抗第Ｘａ因子活性を有するオリゴ糖から誘導されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該Ｒ１がフェニル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル、またはナフチルであり；Ｒ２がＨであり；およびＮＲ３Ｒ４がピペリジニル基を表すことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
該Ｑが：
−［（ＣＨ２）２Ｏ］５−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−；
−［（ＣＨ２）２Ｏ］５−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−（ＣＨ２）２−［Ｏ（ＣＨ２）２］３−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）４−；および
−［（ＣＨ２）２Ｏ］３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−１，４−フェニレン−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物と薬剤学的に適当な補助剤からなる薬剤組成物。
【請求項６】
治療に用いるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
血栓症または他のトロンビン関連疾患を治療もしくは予防するための薬剤を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な抗血栓症物質、それらの調製法、活性成分としてそれらの化合物を含有する薬剤組成物、並びに、薬剤の製造における該化合物の使用に関するものである。
【０００２】
セリンプロテアーゼは、血液凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす酵素である。このグループのプロテアーゼのメンバーは、例えば、トロンビン、トリプシン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、及びプロテインＣである。
【０００３】
トロンビンは、凝血カスケードにおける最終のセリンプロテアーゼ系酵素である。トロンビンの最も重要な機能は、フィブリノーゲンを開裂してフィブリンモノマーを発生させることであり、これらのフィブリンモノマーが架橋されて不溶性ゲルを形成する。更に、トロンビンは、凝血カスケードの早い段階で第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子を活性化することにより、トロンビン自体の生成を調節する。また、トロンビンは細胞レベルでの重要な作用も有しており、そこでは、トロンビンが特異的な受容体に作用し、血小板凝集や、内皮細胞の活性化、及び線維芽細胞増殖を引き起こす。従って、トロンビンは、止血及び血栓形成を調節する上で中心的な役割を担っている。トロンビンの阻害薬は広範囲にわたる治療上の用途を持っていると考えられるため、この分野における広範な研究が為されている。
【０００４】
別の重要なセリンプロテアーゼである第Ｘａ因子は、プロトロンビンからトロンビンへの転化を触媒する。
【０００５】
セリンプロテアーゼの合成阻害薬、より特定的にはトロンビンの合成阻害薬の開発では、ベンズアミジン部分が重要な構造の一つである。それは、それの天然基質である側鎖がプロトン化された塩基性アミノ酸、Ａｒｇ及びＬｙｓをまねたものである。この部分を伴う化合物が広範且つ再三再四研究されている。このタイプのトロンビン阻害薬の非常に有力な代表物は、アミノ酸誘導体、Ｎα−（２−ナフチルスルホニル）−グリシル−４−アミジノフェニルアラニン−ピペリジド（ＮＡＰＡＰ）（Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ，Ｊ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２９、６３５−６４２、１９８３年）である。しかし、ＮＡＰＡＰのプロフィールは、治療用途としては魅力的でない：例えば、この化合物はトロンビン特異性が低く、溶解性にも乏しい。その後、ＥＰ第０，２３６，１６３号に開示されているＮ−アルキル置換誘導体や、ＥＰ第０，５５８，９６１号、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，第１３回（６０ＬＸＡＷ）；９４；ｐｐ．６４３−５（Ｓｔｕｂｅｒ，Ｗ．ら、Ｐｅｐｔ．：Ｃｈｅｍ．，Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．（ＰＣＲＭＥＹ、１０２２０１７８）；９４；Ｖｏｌ．２１号；ｐｐ．７１２−１２（Ｗａｌｔｅｒ，Ｅ．ら）、及びＥＰ第０，５１３，５４３号に記載されているグリコペプチド誘導体等のＮＡＰＡＰの誘導体が調製された。しかし、これらの誘導体化は、ＮＡＰＡＰに比べるとその薬理学的プロフィールに改善をもたらしたかもしれないが、そのようなＮＡＰＡＰ誘導化合物はすべて、まだ直接的なトロンビン阻害薬としてしか活性でなく、それらは、血漿中での半減期が制限されており、クリアランスが速い（従って、それらの抗トロンビン活性は短時間しか発揮されない）。
【０００６】
今や、式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
0004369052.tif 000002
［式中、Ｒ１は、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、（イソ）キノリニル、テトラヒドロ（イソ）キノリニル、３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリニル、クロマニル、またはショウノウ基であり、これらの基は、任意に（１−８Ｃ）アルキルまたは（１−８Ｃ）アルコキシから選択される１つもしくはそれ以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈまたは（１−８Ｃ）アルキルであり；
Ｒ４は、（１−８Ｃ）アルキルまたは（３−８Ｃ）シクロアルキルであるか；
あるいはＲ３とＲ４が、それらが結合される窒素原子と一緒になって、任意に別のヘテロ原子を含有する非芳香族の（４−８）員環を表し、その環は、任意に（１−８Ｃ）アルキルまたはＳＯ２−（１−８Ｃ）アルキルで置換されていてよく；
Ｑは、１０個から７０個の原子からなる鎖長を有するスペーサーであり；そしてＺは、２個から６個の単糖単位からなる負電荷のオリゴ糖残基であり、その電荷は、正電荷の対イオンで補償される］の化合物；
あるいは薬剤学的に許容可能なそれらの塩、またはそれらのプロドラッグが、有力で非常に多能性の高い抗血栓症物質であることが見出された。本発明の化合物は抗トロンビン活性を有しているが、それらが、非介在性の直接的な抗トロンビン（第ＩＩａ因子）活性と、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）介在性の抗−Ｘａ活性の両方を備えた調整可能な混合されたプロフィールを持つように、それらの化合物の構造を選択的に修飾してもよい。従って、本発明の化合物は二重阻害物質である。また、本発明の化合物は血漿中の半減期が長く、その結果として、それらの化合物は、ＮＡＰＡＰや以上で報告されたその誘導体よりも長時間持続性の抗トロンビン活性を持っている。更に、本発明の化合物は、血小板因子４（ＰＦ４）の中和作用を免れることができる。毒性が低いことも本発明の化合物の一つの利点である。
【０００８】
別のタイプの二重阻害物質がＥＰ第０，６４９，８５４号に開示されている。本発明の化合物とは反対に、その特許公報で開示されている複合糖化合物は、ＡＴ−ＩＩＩ介在性の抗−Ｘａ活性に加えて、「間接的」な、ＡＴ−ＩＩＩ介在性の抗トロンビン活性を発揮する。
【０００９】
本発明の化合物は、トロンビン介在性の疾患やトロンビンに関係する疾患を治療及び予防するのに有用である。これは、凝血カスケードが活性化される数多くの血栓性状態及び前血栓性状態を含み、それらは、これらに限定するものではないが、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症、血栓性静脈炎、血栓症または塞栓症に由来する動脈閉塞症、血管形成術または血栓溶解術の術中あるいは術後における動脈再閉塞症、動脈損傷または侵襲的な心臓病学的処置後の再狭窄症、術後性の静脈血栓症または塞栓症、急性または慢性のアテローム性動脈硬化症、卒中、心筋梗塞、癌及び転移、並びに神経変性疾患を含む。また、本発明の化合物は、例えば透析や手術で必要になる体外血液循環における抗凝血剤としても使用することができる。更に、本発明の化合物は、インビトロでの抗凝血剤としても使用することができる。
【００１０】
本発明の化合物の混合されたプロフィールは、オリゴ糖残基Ｚの性状及びスペーサーＱの長さを変えることにより調整することができ、それにより、一連のプロフィールを得ることができる。
【００１１】
２個から６個の糖単位からなる負電荷のあらゆるオリゴ糖残基を本発明の化合物で使用することができる。本発明の適当な化合物は、Ｚが硫酸化またはリン酸化されたオリゴ糖残基を表す化合物である。好適には、そのオリゴ糖残基Ｚは、ＥＰ第０，４５４，２２０号及びＥＰ第０，５２９，７１５号に開示されている糖等の、それ自体がＡＴ−ＩＩＩ介在性の抗−Ｘａ活性を有するオリゴ糖から誘導される。特に好適なオリゴ糖残基は五糖残基である。最も好適には、Ｚは、次の式（ＩＩ）：
【００１２】
【化４】
0004369052.tif 000003
［式中、Ｒ５は、独立に、ＯＳＯ３−または（１−８Ｃ）アルコキシである］を有している。
【００１３】
本発明の更に好適な化合物は、式中のＲ１がフェニル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル、またはナフチルを表す式（Ｉ）の化合物である。好適な化合物では、ＮＲ３Ｒ４がピペリジニル基を表す。好適には、Ｒ２はＨである。
【００１４】
スペーサーの化学構造は、本発明の化合物の抗血栓作用にとって二次的であるか、あるいは重要でないが、スペーサーは完全に剛性でなくてよい。可撓性が非常に高いスペーサーの方が他のものよりも適している。
【００１５】
更に、合成上の理由から、ある種のスペーサーの方が他のものよりも適当である。容易に使用することができる適当なスペーサーは、例えば、次の式（ＩＩＩ）：
−［（ＣＨ２）２Ｏ］ｍ−［（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ３−Ｃ（Ｏ）］ｐ−Ｗ−（ＣＨ２）ｓ−（ＩＩＩ）
［式中：
Ｗは、−［１，４−フェニレン−ＮＲ３−Ｃ（Ｏ）］ｑ−（ＣＨ２）ｒ−Ｓ−または
−（ＣＨ２）ｔ−Ｓ−（ＣＨ２）ｕ−［Ｏ（ＣＨ２）２］ｖ−Ｏ−（ＣＨ２）ｗ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３−であり；
そして、Ｒ３は、独立に、Ｈまたは（１−８Ｃ）アルキルであって；
ｍ＝１−１２；ｎ＝１−８；ｐ＝０−４；ｑ＝０または１；ｒ＝１−８；ｓ＝１−８；ｔ＝１−８；ｕ＝１−８；ｖ＝１−１２；ｗ＝１−８であって；それらの原子の合計数は１０−７０個であり；そして、−［（ＣＨ２）２Ｏ］ｍ−部分は、それでＱがＺに付着される末端基である］を有している。
【００１６】
好適なスペーサーは次のもの：
−［（ＣＨ２）２Ｏ］５−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−；
−［（ＣＨ２）２Ｏ］５−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−（ＣＨ２）２−［Ｏ（ＣＨ２）２］３−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）４−；及び
−［（ＣＨ２）２Ｏ］３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−１，４−フェニレン−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−；
である。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物の説明では以下の定義が用いられる。（１−８Ｃ）アルキルという用語は、１−８個の炭素原子を有する分枝または非分枝のアルキル基を意味しており、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、及びオクチルである。メチル及びエチルが好適なアルキル基である。
【００１８】
（１−８Ｃ）アルコキシという用語は、１−８個の炭素原子を有するアルコキシ基を意味しており、そのアルキル部分は前に定義された通りの意味を有している。メトキシが好適なアルコキシ基である。
【００１９】
（３−８Ｃ）シクロアルキルという用語は、３−８個の炭素原子を有するシクロアルキル基を意味しており、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロへプチル、またはシクロオクチルである。シクロペンチル及びシクロヘキシルが好適なシクロアルキル基である。
【００２０】
スペーサーの長さは、Ｚとその分子のペプチド部分との間の最も短い鎖に沿って数えたスペーサーの原子数であり、スペーサーに結合されているオリゴ糖Ｚの酸素原子は計数されていない。
【００２１】
「プロドラッグ」という用語は、アミジノ部分のアミノ基が例えばヒドロキシ基または（１−６Ｃ）アルコキシカルボニル基で保護された、本発明の化合物を意味している。
【００２２】
本発明の化合物は、当分野で一般的に知られた方法を用いてシステインまたはリジンでグリシン位置においてＮＡＰＡＰ（またはＮＡＰＡＰ類似体）を誘導体化し、続いてその化合物を（ａ）オリゴ糖−スペーサー残基にカップリングするか、あるいは（ｂ）スペーサーにカップリングした後、チオール基で誘導体化し、その後、オリゴ糖残基にカップリングすることにより調製される。このために、例えば文献において既知（例えば、これらのソースに限定するものではないが、ＥＰ第０，４５４，２２０号及びＥＰ第０，５２９，７１５号から既知）のオリゴ糖や、製品として入手可能なオリゴ糖等のあらゆる適当なオリゴ糖を使用することができる。それらのオリゴ糖を、例えばＢｕｉｊｓｍａｎ，Ｒ．らが開示した方法（抄録誌、第９回欧州炭水化物シンポジウムユトレヒト大会（１９９７年）、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ａ１５０）により、適当な時機にリン酸化してもよい。オリゴ糖へのスペーサーのカップリングは、例えば、ＥＰ第０，６４９，８５４号に記載されている方法を用いることにより実施することができる。
【００２３】
本発明の化合物を調製するための上述の方法における一つの処理ステップであるペプチドのカップリングは、アジ化物法、混合無水物法、活性化エステル法、好適にはカルボジイミド法、特にはＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような触媒性化合物及びラセミ化抑制化合物の付加を伴うカルボジイミド法による方法等の、ペプチドフラグメントをカップリング−または縮合−するための当分野で既知の方法により実施することができる。この件に関する一つの概説が、Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編集の「ペプチド、分析、合成、生物学」第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年）に与えられている。
【００２４】
本化合物中に存在するアミン官能基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、またはフタロイル（Ｐｈｔｈ）基のようなα−アミノ基を保護するためにペプチド化学で通常使用される基を意味するＮ−保護基で合成処理中に保護されてもよい。保護基の除去は、それらの保護基の性状に応じて異なる方法で行うことができる。通常、脱保護は、酸性条件下において、スカベンジャーの存在の下に行われる。アミノ保護基及びそれらの除去方法に関する一つの概説が上記の「ペプチド、分析、合成、生物学」第３巻に与えられている。
【００２５】
遊離塩基の形態で生じ得る本発明の化合物は、反応混合物から薬剤学的に許容可能な塩の形態で単離することができる。また、薬剤学的に許容可能な塩は、式（Ｉ）の遊離塩基を、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸等の有機酸または無機酸で処理することによっても得ることができる。
【００２６】
本発明の化合物はキラル炭素原子を有しており、従って、純粋な鏡像異性体として、または鏡像異性体の混合物として、もしくはジアステレオマーを含有する混合物として得ることができる。純粋な鏡像異性体を得る方法は、例えば塩が光学的に活性な酸とラセミ混合物から得られる塩の結晶化やキラルカラムを用いるクロマトグラフィー等、当分野で周知である。ジアステレオマーに対しては、順相または逆相カラムを用いることができる。
【００２７】
本発明の化合物は経腸的に、もしくは非経口的に投与することができる。これらの化合物並びにその組成物の正確な適用量及び治療方式は、勿論、その薬剤が投与される個々の患者のニーズ、病状または必要度、及び診療医の判断に依存するであろう。一般的に、非経口的な投与は、吸収への依存度がもっと高い他の投与方法よりも用量が少なくてすむ。しかし、ヒトに対する一日量は、好適には０．００１−１００ｍｇ／体重（ｋｇ）であり、より好適には０．０１−１０ｍｇ／体重（ｋｇ）である。
【００２８】
本発明の化合物を伴って製造される薬剤は、急性抗凝血療法における佐剤として使用してもよい。そのようなケースでは、その薬剤は、そのような病状を治療するのに有用な他の化合物と共に投与される。
【００２９】
例えば標準的な参考文献であるＧｅｎｎａｒｏらの「レミントン薬科学」（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年、特に第８部：「薬剤の調製とそれらの製造」を参照）に記載されているもの等の薬剤学的に適当な助剤と混合して用いる場合には、それらの化合物は、丸剤、錠剤等の固形の投与単位に圧縮してもよいし、あるいは、処理してカプセル剤や座剤の形態にしてもよい。また、例えば、注射剤として使用するため、あるいは、鼻腔用スプレー剤等のスプレー剤として使用するため、薬剤学的に適当な液体により、それらの化合物を溶液、懸濁液、または乳濁液の形態で適用することもできる。
【００３０】
例えば錠剤等の投与単位を作る場合には、賦形剤、着色剤、高分子結合剤等の通常の添加剤の使用が考えられる。一般的には、活性な化合物の機能を妨害しないものであれば、あらゆる薬剤学的に許容可能な添加剤を使用することができる。それらの化合物と共に投与することができる適当な担体は、適当な量で使用されるラクトース、デンプン、セルロース誘導体等、あるいはそれらの混合物を含む。
【００３１】
次に、以下の実施例により、本発明を更に例証する。
【００３２】
実施例
実施例で使用される略号：
ＤＭＡＰ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
Ａｃ＝アセチル
ＭＭＴｒ＝モノメトキシトリチル
Ｂｎ＝ベンジル
ＤＣＨＡ＝ジシクロヘキシルアンモニウム
ＥＤＣｌ＝塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤｉＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
Ｐｙｒ＝ピリジニル
ＴＥＧ＝テトラエチレングリコール
ＨＥＧ＝ヘキサエチレングリコール
ＡＰＡ＝アミジノフェニルアラニン
Ｃｙｓ＝システイン
化合物の番号は式記載用紙に載っている化合物を指している。
【００３３】
４−Ｏ−（４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α／β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミダート（４）
ピリジン（１００ｍＬ）中におけるマルトトリオース（１）（２．０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に無水酢酸（６．２ｍＬ、６５ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＡＰ（０．７９ｇ、６．５ｍｍｏｌ）を加えた。５時間後、その反応混合液を炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｍ、２５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（２００ｍＬ）で３回抽出した。それらを合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。その生成物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、１／１から０／１まで、ｖ／ｖ）で精製することにより、白色の泡として「２」を得た（収率９１％、３．５ｇ）。「２」（３．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３４ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）中における０．１Ｍ酢酸ヒドラジン溶液で１時間処理することにより、アノマー脱アセチル化を果たした。真空下で濃縮した後、その反応混合液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム（１Ｍ、３×２５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥（硫酸マグネシウム）させ、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、３／２から１／０まで、ｖ／ｖ）で精製することにより、「３」を得た（収率９２％、２．７ｇ）。化合物「３」（２．７ｇ、３．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）中に溶解し、トリクロロアセトニトリル（１．７ｍＬ）を触媒量の炭酸セシウム（０．２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）と共に加えた。１時間後、その反応混合液を濾過し、得られた濾液を減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル／ＴＥＡ、５０／４９／１から０／９９／１まで、ｖ／ｖ／ｖ）でその粗生成物「４」を精製することにより、白色の泡として純粋な「４」を得た（１．９ｇ、７１％）。
【００３４】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−アミノヘキサエチレングリコール４−Ｏ−（４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（６）
ジクロロメタン（１．５ｍＬ）中におけるドナー「４」（０．６９ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）とアクセプター「５」（０．３１ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の溶液を、活性化された分子ふるい４Å（２５０ｍｇ）の存在下においてアルゴンを流しながら１時間攪拌した。その溶液を−２０℃に冷却し、その反応混合液に、ジクロロメタン（０．６ｍＬ）中におけるトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１５μＬ）の溶液を滴下しながら加えた。１０分後、ＴＬＣ分析（ジクロロメタン中における５％のメタノール）はある生成物の存在を示した。その反応混合液に固体の炭酸水素ナトリウム（０．３ｇ）を加え、１０分間攪拌した後、濾過した。その濾液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、続いて、炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｍ、２×２５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥（硫酸マグネシウム）させ、真空下で濃縮した。その残分をシリカゲル（酢酸エチル中における０−４％のメタノール）を用いたクロマトグラフィーにかけることにより、純粋な「６」を得た（０．５７ｇ、収率５６％）。
【００３５】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−アミノヘキサエチレングリコール４−Ｏ−（４−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（７）
化合物「６」（０．５７ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を、メタノール（１５ｍＬ）中におけるカリウムｔｅｒｔ−酪酸エステル（４３ｍｇ、Ａｃ１ｍｍｏｌ当たり１０ｍｇ）の溶液で処理した。１時間後、ＴＬＣ分析（酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水、５／７／４／１．６、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）は、「６」が「７」に完全に転化されたことを示した。その反応をＤｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ４−Ｈ＋樹脂で中和した。その樹脂を濾過して取り除き、得られた濾液を減圧下で濃縮することにより、「７」が得られ（０．３７ｇ、収率９５％）、その化合物をそれ以上精製することなく使用した。
【００３６】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−アミノヘキサエチレングリコール４−Ｏ−（４−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル−２，３，４，６−テトラキス−（ジベンジルホスファート））−α−Ｄ−グルコピラノシル−２，３，６−トリス（ジベンジルホスファート））−β−Ｄ−グルコピラノシド２，３，６−トリス（ジベンジルホスファート）（９）
アセトニトリル／ジオキサン（２／１、ｖ／ｖ、２ｍＬ）中における「７」（８６ｍｇ、９５μｍｏｌ）と「８」（４５０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の混合物に、アセトニトリル（１ｍＬ）中における１Ｈ−テトラゾール（５４ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。２０℃で１時間攪拌した後、その反応混合液を氷浴で冷却し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（０．７５ｍＬ）を加えた。４５分間攪拌し続けた後のＴＬＣ分析は、ある主要な生成物の存在を示した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００／０から９５／５まで、ジクロロメタン／メタノール、ｖ／ｖ）で精製することにより、純粋な「９」を得た（３１１ｍｇ、収率９２％）。
【００３７】
１−アミノヘキサエチレングリコール４−Ｏ−（４−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル２，３，４，６−テトラキスホスファート）−α−Ｄ−グルコピラノシル２，３，６−トリホスファート）−β−Ｄ−グルコピラノシド２，３，６−トリホスファート（１０）
化合物「９」（３１１ｍｇ、８７μｍｏｌ）を、数滴の酢酸を含有するｔｅｒｔ−ブタノール／水（６／１、ｖ／ｖ、２０ｍＬ）に溶解した。その溶液を、１０％Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）の存在下において、水素を連続的に流しながら攪拌した。３時間後、濾過してそのＰｄ／Ｃ触媒を取り除き、得られた濾液を真空下で濃縮した。次いで、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ４−Ｎａ＋でイオン交換することにより「１０」を得た（１７９ｍｇ、収率９８％）。
【００３８】
Ｎ−２−ナフタレンスルホニル−Ｓ−４−モノメトキシトリチル−（Ｌ）−システイン（１２）
製品として入手可能なＳ−４−モノメトキシトリチル−（Ｌ）−システイン（１１）（０．３４ｇ、１ｍｍｏｌ）と、ジオキサン（５ｍＬ）、及び１０％炭酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）の攪拌混合液に２−ナフタレンスルホニルクロリド（０．２５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。１時間攪拌した後、５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）を加えることによりその反応混合液を酸性化し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。それらを合わせた有機層を乾燥（硫酸マグネシウム）させ、減圧下で濃縮した。その粗生成物を、シリカゲル（メタノール／ジクロロメタン／トリエチルアミン、０／９９／１から４／９５／１まで、ｖ／ｖ／ｖ）を用いてクロマトグラフィーにかけることにより「１２」を得た（収率７６％、０．４４ｇ）。
【００３９】
Ｎ−２−ナフタレンスルホニル−Ｓ−２−ピリジンスルフェニル−（Ｌ）−システイン（１４）
化合物「１２」（０．４４ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸とトリイソプロピルシランのジクロロメタン溶液（１／１／１８、ｖ／ｖ／ｖ）を加えた。２０分間攪拌した後、その混合液を水に注ぎ、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出した。それらを合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。その粗混合物中における痕跡量のトリフルオロ酢酸をトルエンで共蒸発させることにより取り除いた。結果として得られた遊離チオール「１３」をイソプロパノール（２．５ｍＬ）中に再溶解し、イソプロパノール／２Ｎ酢酸水溶液（１／１、ｖ／ｖ、２０ｍＬ）中におけるＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌＴＭ（１．７ｇ、７．６ｍｍｏｌ）の溶液に滴下させながら加えた。１時間後、ＴＬＣ分析はその反応が完了していることを示し、その混合液を減圧下で濃縮した。得られた残分中の痕跡量の酢酸をトルエンで共蒸発させることにより取り除いた。その粗生成物をアセトン（１０ｍＬ）中に溶解し、この溶液にジシクロヘキシルアミン（０．３ｍＬ）を加え、その後、化合物「１４」を、それのＤＣＨＡ塩としてその反応混合液から沈殿させた。その沈殿物を単離し、酢酸エチル（５０ｍＬ）中に溶解した後、５％クエン酸水溶液（２×３０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を乾燥（硫酸マグネシウム）させ、減圧下で濃縮することにより、純粋な「１４」を得た（収率５５％、０．２５ｇ）。
【００４０】
Ｎ（Ｎ（Ｎα−２−ナフタレンスルホニル−Ｓ−２−ピリジンスルフェニル−（Ｌ）−システイニル）−（Ｄ，Ｌ）−４−アミジノフェニルアラニル）ピペリジン（１６）
ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中におけるＮ−（（Ｄ，Ｌ）−４−アミジノフェニルアラニル）ピペリジンジヒドロクロリド（１５）（０．１３ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）とシステイン誘導体「１４」（０．１６ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＯＢｔ（５８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣｌ（８２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、及びＮ−エチルモルホリン（１１０μＬ、０．７８ｍｍｏｌ）を加えた。１６時間攪拌した後、その混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、水（２×１０ｍＬ）で洗った。その有機層を乾燥（硫酸マグネシウム）させ、真空下で濃縮した。その残分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（初めに、ジクロロメタン中における１０％−２０％のメタノールで不純物を取り除き、その後、酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水（１６／７／１．６／４、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で生成物を溶出する）で精製し、続いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（溶離液：メタノール／ジクロロメタン、４／１、ｖ／ｖ）を用いてゲル濾過することにより、均質な「１６」を得た（７０％、０．１９ｇ）。
【００４１】
マルトトリオース−デカホスファート「１８」とペプチド「１６」との縮合結合
０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（１．０ｍＬ、ｐＨ７．５）中におけるマルトトリオース−デカホスファート「１８」（２１ｍｇ、９．８μｍｏｌ）の溶液に、メタノール（１ｍＬ）中におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−２−ブロモアセテートの溶液を加えた。２時間攪拌した後、その反応混合液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムに通し、水中における１０％アセトニトリルで溶出した。それらの適切なフラクションをプールし、低温（２５℃）で減圧下において濃縮することにより、化合物「１９」を得た。ＮＡＰＡＰ類似体「１６」（１０ｍｇ、１５μｍｏｌ）を、ヘリウムに通し且つ音波処理することにより脱ガスされたメタノール（１ｍＬ）と０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（０．７５ｍＬ、ｐＨ７．０）の混合液に溶解した。この溶液にトリブチルホスフィン（４．１μＬ、１６μｍｏｌ）を加え、その反応混合液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。１時間後、ＨＰＬＣ分析（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＰＲ１８−カラム）は、２−ピリジンスルフェニル基が完全に開裂していることを示し、その反応混合液に、ジメチルホルムアミド（０．２５ｍＬ）と０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（０．５０ｍＬ、ｐＨ７．０）中における化合物「１９」の溶液を加えた。その混合液を３時間攪拌した後、その粗混合液をゲル濾過（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＨＷ−４０、溶離液：０．１５ＭのＴＥＡＢ）により精製した。それらの適切なフラクションの濃縮と、それに続く、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ−Ｎａ＋イオン交換により、凍結乾燥後、均質な共役体「Ｉ」を得た（１０．１ｍｇ、収率４７％）。それらの２つのジアステレオ異性体を半−分取ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＲＰ−１８カラム、勾配：０．０５ＭのＴＥＡＡ水溶液中における１７．５％−２２．５％のＣＨ３ＣＮ）で分離することにより、ジアステレオ異性体「Ｉ−ａ」（保持時間：２８．６分）とジアステレオ異性体「Ｉ−ｂ」（保持時間：３３．０分）を得た。それらの２つの異性体をゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＤＮＡ−グレード  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）により脱塩し、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ−Ｎａ＋イオン交換樹脂を用いてＮａ＋−型に変換した。
【００４２】
ジアステレオ異性体「Ｉ−ａ」：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：マルトトリオース：（還元末端）４．６５（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１）、３．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、４．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、３．７６（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）；５．５０（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１’）、４．１８（ｍ、１Ｈ、Ｈ２’）、４．１０（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；（非還元末端）５．７１（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１”）、４．０９（ｍ、１Ｈ、Ｈ２”）、４．４５（ｍ、１Ｈ、Ｈ３”）、４．１５（ｍ、１Ｈ、Ｈ４”）；３．９５−３．８４（Ｈ５、マルトトリオース）；スペーサー：３．６５−３．５１（ｍ、２２Ｈ、ＯＣＨ２  ＨＥＧ）、３．３５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、３．１５（ｓ、２Ｈ、ＳＣＨ２（Ｏ））；ペプチド：８．３１（ｓ、１Ｈ，Ｈａｒｏｍ  ＮＡＳ）、８．０６−７．６７（ｍ、６Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＮＡＳ）、７．７０、７．１７（２×ｄ、４Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＡＰＡ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．２８（ｍ、１Ｈ、αＣＨ  ＡＰＡ）、３．９１（ｍ、１Ｈ、αＣＨ  Ｃｙｓ）、３．３０−３．０４（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２Ｎ  ピペリジン）、２．８２−２．６２（ｍ、３Ｈ、βＣＨ２  Ｃｙｓ、βＣＨ  ＡＰＡ）、２．５７（ｍ、１Ｈ、βＣＨ’  ＡＰＡ）、１．４５−１．２５（ｍ、６Ｈ、ＣＨ２  ピペリジン）；
ＥＳ−ＭＳ：［Ｍ−３Ｈ］３−７２４．１、［Ｍ−２Ｈ］２−１０８６．７。
【００４３】
ジアステレオ異性体「Ｉ−ｂ」：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：マルトトリオース：（還元末端）３．８０（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、４．３２（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、３．８９（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）；５．４９（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１’）、４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｈ２’）、４．１１（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；（非還元末端）５．７０（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１”）、４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｈ２”）、４．５２（ｍ、１Ｈ、Ｈ３”）、４．２４（ｍ、１Ｈ、Ｈ４”）；３．９１−３．８４（Ｈ５、マルトトリオース）；スペーサー：３．６３−３．５２（ｍ、２２Ｈ、ＯＣＨ２  ＨＥＧ）、３．３５（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、３．１７（ＡＢ、２Ｈ、ＳＣＨ２（Ｏ））；ペプチド：８．３５（ｓ、１Ｈ，Ｈａｒｏｍ  ＮＡＳ）、８．０７−７．６５（ｍ、６Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＮＡＳ）、７．７７、７．２２（２×ｄ、４Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＡＰＡ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．６２（ｔ、１Ｈ、αＣＨ  ＡＰＡ、ＪαＣＨ、βＣＨ＝７．３Ｈｚ）、４．０５（ｍ、１Ｈ、αＣＨ  Ｃｙｓ）、３．０５−３．００（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２Ｎ  ピペリジン）、２．８５−２．６７（ｍ、４Ｈ、βＣＨ２  Ｃｙｓ、βＣＨ２  ＡＰＡ）、１．８８−１．２４（ｍ、６Ｈ、ＣＨ２  ピペリジン）；
ＥＳ−ＭＳ：［Ｍ−３Ｈ］３−７２４．０、［Ｍ−２Ｈ］２−１０８６．２。
【００４４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−１４−Ｓ−２−ピリジンスルフェニル−１４−メルカプト−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノアート（２２）
スペーサー「２０」（０．７５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）（Ｐ．Ｗｅｓｔｅｒｄｕｉｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９６年、３５、３、ｐ３３１−３３３）とＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌＴＭ（２．６ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、ｎ−ブチルアミン（４ｍＬ）で処理した。２時間攪拌した後、その反応混合液を真空下で濃縮し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）に再溶解した後、５％クエン酸水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸／ジクロロメタン、０／１／９９から６／１／９３まで、ｖ／ｖ／ｖ）にかけることにより、純粋な「２１」を得た（０．８０ｇ、収率８８％）。化合物「２１」（０．８０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）とＥＤＣｌ（０．４５ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、その反応混合液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、氷水（２０ｍＬ）で３回洗った後、乾燥（硫酸マグネシウム）させ、濃縮することにより「２２」（０．９８ｍｇ、収率９８％）を得、この化合物をそれ以上精製することなく使用した。
【００４５】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎα−ベンゼンスルホニル−（Ｌ）−リジン（２４）
開始材料として「２３」とベンゼンスルホニルクロリドを用いて、「１２」に対して説明したのと同様に調製した（０．８６ｇ、収率７５％）。
【００４６】
Ｎε−（１４−Ｓ−２−ピリジンスルフェニル−１４−メルカプト−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノイル）−Ｎα−ベンゼンスルホニル−（Ｌ）−リジン（２６）
化合物「２４」（０．８６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、酢酸エチル中における３Ｎ塩化水素で処理した。１５分後、その反応混合液を真空下で濃縮した。その残分中に存在する痕跡量の酸を、トルエンで共蒸発させることにより取り除いた。その粗生成物「２５」をジオキサン／水混合液（４／１、ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）中に溶解し、この溶液に、化合物「２２」（０．９８ｇ、２．１ｍｍｏｌ）とＤｉＰＥＡ（１．１ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、その反応混合液をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を乾燥（硫酸マグネシウム）させ、真空下で濃縮した。その残油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−１０％のメタノール／酢酸エチル）で精製することにより、均質な「２６」を得た（０．９５ｇ、収率６７％）。
【００４７】
Ｎ（Ｎ（Ｎε−（１４−Ｓ−２−ピリンスルフェニル−１４−メルカプト−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノイル）−Ｎα−ベンゼンスルホニル−（Ｌ）−リジニル−（Ｄ，Ｌ）−４−アミジノフェニルアラニル）ピペリジン（２７）
開始材料として「２６」と「１５」を用いて、「１６」に対して説明したのと同様に調製した（８７ｍｇ、収率７０％）。
【００４８】
マルトトリオース−デカホスファート「１８」とペプチド「２７」との縮合結合（ＩＩ）
開始材料として「１８」と「２７」を用いて、「Ｉ」に対して説明したのと同様に調製した。粗生成物「ＩＩ」の精製は、半−分取ＨＰＬＣ（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＲＰ−１８カラム）により果たした。続いて、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＤＮＡ−グレード  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）により脱塩し、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ４−Ｎａ＋イオン交換樹脂を用いてＮａ＋−型に変換した後、凍結乾燥することにより、白色の綿毛状の固体として純粋な「ＩＩ」を得た（８．５ｍｇ、「１８」からの収率２３％）。
【００４９】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：マルトトリオース：（還元末端）４．６７（ｍ、１Ｈ、Ｈ１）、４．０７（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、４．４０（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、４．０６（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）；５．４９（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１’）、４．２４（ｍ、１Ｈ、Ｈ２’）、４．６６（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）、４．１０（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；（非還元末端）５．７３（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１”）、４．１７（ｍ、１Ｈ、Ｈ２”）、４．３８（ｍ、１Ｈ、Ｈ３”）、４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｈ４”）；３．９５−３．８２（Ｈ５、マルトトリオース）；スペーサー：４．０３、４．０２（２×ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ））、３．７３−３．５９（ｍ、３６Ｈ、ＯＣＨ２  ＴＥＧ、ＨＥＧ）、３．３８（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、３．２７、３．２６（２×ｓ、２Ｈ、ＳＣＨ２（Ｏ））、２．７５（２×ｔ、２Ｈ、ＣＨ２Ｓ）；ペプチド：７．８１−７．５２（ｍ、５Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＢＳ）、７．７９、７．７６、７．４２、７．４１（４×ｄ、４Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＡＰＡ）、４．８７、４．６６（２×ｔ、１Ｈ、αＣＨ  ＡＰＡ、ＪαＣＨ、βＣＨ＝７．４Ｈｚ）、４．０７（ｍ、１Ｈ、αＣＨ  Ｌｙｓ）、３．３７−３．７３（ｍ、８Ｈ、εＣＨ２  Ｌｙｓ、βＣＨ２  ＡＰＡ、ＣＨ２Ｎ  ピペリジン）、１．９６−１．４６（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２  ピペリジン、β／γ、δＣＨ２  Ｌｙｓ）；
ＥＳ−ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋８０１．２、［Ｍ＋２Ｈ］２＋１２００．８。
【００５０】
部分的に保護された五糖「３０」
既知の五糖「２９」（５３ｍｇ、４９μｍｏｌ）（Ｒ．Ｃ．Ｂｕｉｊｓｍａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、１９９６年、２、１２、ｐ１５７２−１５７７）をジメチルホルムアミド（０．２５ｍＬ）と水（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド（１８ｍｇ、７２μｍｏｌ）とＮ−エチルモルホリン（１８．６ｍＬ）で処理した。１５分間攪拌した後、ＴＬＣ分析（酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水、５／７／１．６／４、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）は反応が完了していることを示し、その反応混合液をＲＰ−１８カラムに直接適用して、水／メタノール（９０／１０から６０／４０まで）で溶出した。それらの適切なフラクションをプールし、少量になるまで濃縮した後、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ４−Ｈ＋イオン交換カラムに通し、水で溶出した。その溶出液を真空下で濃縮することにより、純粋な「３０」を得た（５４ｍｇ、収率９１％）。
【００５１】
硫酸化された五糖「３２」
化合物「３０」（５４ｍｇ、４５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン三酸化硫黄複合体（０．５１ｇ、各ヒドロキシル基に対して５当量）を加え、その混合物を、５５℃で１６時間、窒素雰囲気下において攪拌した。続いて、その混合液を０℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた（トリエチルアミン三酸化硫黄複合体の各式に対して５当量）。その混合液を１時間攪拌し、少量になるまで濃縮した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムに通し、水中における１０％アセトニトリルで溶出した。それらの適切なフラクションをプールし、少量になるまで濃縮した後、それをＤｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ４（Ｎａ＋型）のカラムに通し、水で溶出した。その溶出液を濃縮し、０．２Ｎの塩化水素（１ｍＬ）に再溶解した後、４℃で１６時間放置した。その反応混合液を０．１Ｎの水酸化ナトリウムで中和した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムで脱塩し、水中における１０％アセトニトリルで溶出することにより、均質な「３１」を得た。化合物「３１」を、数滴の酢酸を含有するｔｅｒｔ−ブタノール／水（６／１、ｖ／ｖ、２０ｍＬ）に溶解した。その溶液を、１０％Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）の存在下において、水素を連続的に流しながら攪拌した。３時間後、Ｐｄ／Ｃ触媒を濾過により取り除き、その濾液を真空下で濃縮することにより、純粋な「３２」を得た（６０ｍｇ、収率６０％）。
【００５２】
五糖「３２」とペプチド「１６」の縮合結合
五糖「３２」（１５ｍｇ、６．５μｍｏｌ）を０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（２ｍＬ、ｐＨ７．５）中に溶解し、この溶液にｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢＴＭ（１６ｍｇ、３３μｍｏｌ）を加えた。暗所における３時間の攪拌後、ＨＰＬＣ分析（ｍｏｎｏＱ陰イオン交換）は反応が完了していることを示し、その粗生成物「３４」をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ３０カラム（水中における１０％のアセトニトリル）で精製した。それらの適切なフラクションをプールし、低温（２５℃）で真空下において濃縮した。使用前にヘリウムに通し且つ音波処理することにより脱ガスされたメタノール（１ｍＬ）と０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（０．７５ｍＬ、ｐＨ７．０）の混合液中におけるＮＡＰＡＰ類似体「１６」（９ｍｇ、１４μｍｏｌ）の溶液に、トリブチルホスフィン（３．９μＬ、１５μｍｏｌ）を加えた。アルゴン雰囲気下における１時間の攪拌後、ＨＰＬＣ分析（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＲＰ−１８カラム）は、２−ピリジンスルフェニル基が完全に開裂されていることを示した。ジメチルホルムアミド（０．２５ｍＬ）と０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（０．５０ｍＬ、ｐＨ７．０）中における誘導体化された五糖「３４」の溶液を加え、その混合液を３時間攪拌した。その粗生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムに通し、水中における１０％アセトニトリルで溶出した。それらの適切なフラクションをプールし、少量になるまで濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０カラムで脱塩し、水中における１０％メタノールで溶出した。その溶出液を濃縮し、凍結乾燥することにより、白色の固体として共役体「ＩＩＩ」を得た（９ｍｇ、収率５２％）。
【００５３】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ  ３．６０、３．５３、３．４３（３×ｓ、９Ｈ、ＣＨ３ＯＥ、Ｇ、Ｈ）；環Ｄ：５．５３（ｍ、１Ｈ、Ｈ１）、４．１５（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、４．５８（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、３．５６（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）、３．９２（ｍ、１Ｈ、Ｈ５）、４．２６、４．１３（２×ｍ、２Ｈ、Ｈ６、Ｈ６’）；環Ｅ：４．７０（ｄ、１Ｈ、Ｈ１、Ｊ１、２＝８．１Ｈｚ）、４．２１（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、３．６２（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、３．９２（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）、３．７４（ｍ、１Ｈ、Ｈ５）；環Ｆ：５．３９（ｄ、１Ｈ、Ｈ１、Ｊ１、２＝３．８Ｈｚ）、４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、４．５６（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、３．８３（ｔ、１Ｈ、Ｈ４、Ｊ３、４＝Ｊ４、５＝９．８Ｈｚ）、４．１２（ｍ、１Ｈ、Ｈ５）；環Ｇ：５．１５（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ１）、４．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、３．７６（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、４．２１（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）、４．８０（ｍ、１Ｈ、Ｈ５）；環Ｈ：５．１０（ｄ、１Ｈ、Ｈ１、Ｊ１、２＝３．６Ｈｚ）、４．３１（ｍ、１Ｈ、Ｈ２）、４．５４（ｍ、１Ｈ、Ｈ３）、４．２１（ｍ、１Ｈ、Ｈ４）；スペーサー：７．５１、７．５３、７．１３、７．１２（４×ｄ、４Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＳＩＡＢ）、３．７３（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、３．６６（ｍ、１２Ｈ、ＯＣＨ２  ＴＥＧ）、３．３１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）；ペプチド：８．２７、８．２２（２×ｓ、１Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＮＡＳ）、７．９８−７．６０（ｍ、６Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＮＡＳ）、７．７１、７．６４、７．４６、７．４４（４×ｄ、４Ｈ、Ｈａｒｏｍ  ＡＰＡ）、４．６０、４．４５（２×ｔ、１Ｈ、αＣＨ  ＡＰＡ、ＪαＣＨ、βＣＨ＝６．６Ｈｚ）、４．００、３．９７（２×ｍ、１Ｈ、αＣＨ  Ｃｙｓ）、３．１０−２．８５（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２Ｎ  ピペリジン）、２．８２−２．７０（ｍ、３Ｈ、βＣＨ２  Ｃｙｓ、βＣＨ  ＡＰＡ）、２．６１（ｍ、１Ｈ、βＣＨ’  ＡＰＡ）、１．５５−１．１５（ｍ、６Ｈ、ＣＨ２  ピペリジン）；
ＥＳ−ＭＳ：［Ｍ−Ｈ］−２６８０．６。
【００５４】
同様な方法を用いて、以下の化合物が調製される：
【００５５】
【化５】
0004369052.tif 000004
【００５６】
【化６】
0004369052.tif 000005
【００５７】
本発明の化合物の生物学的な活性度を以下の試験法により決定した。
【００５８】
Ｉ．抗トロンビンアッセイ
トロンビン（第ＩＩａ因子）は、凝血カスケードにおける一つの因子である。
トロンビンによりもたらされる色原体基質ｓ−２２３８の加水分解速度を吸光分光分析法で測定することにより、本発明の化合物の抗トロンビン活性を評価した。緩衝液系における抗トロンビン活性に対してこのアッセイを用い、試験化合物のＩＣ５０値を評価した。
【００５９】
試験媒質：トロメタミン−ＮａＣｌ−ポリエチレングリコール６０００（ＴＮＰ）緩衝液
参照化合物：Ｉ２５８１（Ｋａｂｉ）
賦形剤：ＴＮＰ緩衝液。
【００６０】
ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、アセトニトリル、またはｔｅｒｔ−ブチルアルコールで可溶化を補助することができ、これらの物質は、最終反応混合液中における濃度が２．５％になるまで有害な影響を及ぼすことがない。
【００６１】
試験技法    試薬＊
１．トロメタミン−ＮａＣｌ（ＴＮ）緩衝液
緩衝液の組成：
トロメタミン（Ｔｒｉｓ）：６．０５７ｇ（５０ｍｍｏｌ）
ＮａＣｌ：５．８４４ｇ（１００ｍｍｏｌ）
水（水を加えて１ｌにする）
ＨＣｌ（１０ｍｍｏｌ・ｌ−１）を用いて、溶液のｐＨを３７℃で７．４に調整する。
【００６２】
２．ＴＮＰ緩衝液
ポリエチレングリコール６０００をＴＮ緩衝液に溶解して３ｇ・ｌ−１の濃度にする。
【００６３】
３．Ｓ−２２３８溶液
一瓶のＳ−２２３８（２５ｍｇ；Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を２０ｍｌのＴＮ緩衝液に溶解して１．２５ｍｇ・ｍｌ−１（２ｍｍｏｌ・ｌ−１）の濃度にする。
【００６４】
４．トロンビン溶液
ヒトトロンビン（１６０００ｎＫａｔ／バイアル；Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｂｌｏｅｄｔｒａｎｓｆｕｓｉｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をＴＮＰ緩衝液に溶解して８３５ｎＫａｔ・ｍｌ−１の原液を得る。使用する直前にこの溶液をＴＮＰ緩衝液で希釈し、３．３４ｎＫａｔ・ｍｌ−１の濃度にする。
【００６５】
＊・使用するすべての成分が分析グレードのものである。
【００６６】
・水溶液の調製には、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ品質）を使用する。
【００６７】
試験化合物溶液及び参照化合物溶液の調製
試験化合物及び参照化合物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して１０−２ｍｏｌ・ｌ−１の原液を得る。各原液を賦形剤で段階希釈して１０−３、１０−４、及び１０−５ｍｏｌ・ｌ−１の濃度にする。原液を含めたこれらの希釈液をアッセイに使用する（反応混合液中における最終濃度：それぞれ、３・１０−３；１０−３；３・１０−４；１０−４；３・１０−５；１０−５；３・１０−６及び１０−６ｍｏｌ・ｌ−１）。
【００６８】
試験手順
室温で、０．０７５ｍｌ及び０．０２５ｍｌの試験化合物溶液または参照化合物溶液、あるいは賦形剤をマイクロタイタープレートのウェルに交互にピペッティングし、これらの溶液を、それぞれ、０．１１５ｍｌ及び０．０１６５ｍｌのＴＮＰ緩衝液で希釈する。Ｓ−２２３８溶液の０．０３０ｍｌアリコートを各ウェルに加え、そのプレートを予熱し、インキュベーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）内で振盪しながら３７℃で１０分間、前温置する。前温置後、各ウェルに０．０３０ｍｌのトロンビン溶液を加えてＳ−２２３８の加水分解を開始させる。そのプレートを３７℃で（３０秒間振盪しながら）温置する。反応速度マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｗｉｎｒｅａｄｅｒ  ｐｌｕｓ、Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、温置の１分後から開始し、４０５ｎｍにおける各サンプルの吸光度を２分毎に９０分間測定する。
【００６９】
すべてのデータを、ＬＯＴＵＳ−ＭＥＡＳＵＲＥを用いてＩＢＭパーソナルコンピュータに収集する。各化合物の（反応混合液中におけるｍｏｌ・ｌ−１単位で表した）濃度での吸光度、及びブランクでの吸光度を、分単位の反応時間に対してプロットする。
【００７０】
応答の評価：各最終濃度に対して、アッセイプロットから最大級光度を算出した。Ｈａｆｎｅｒら（Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１９７７年；２７（ＩＩ）：１８７１−３）によるロジット変換分析法を用いて、ＩＣ５０値（ブランクの最大吸光度の５０％阻害をもたらす、μｍｏｌ・ｌ−１単位で表した最終濃度）を算出した。
【００７１】
【表１】
0004369052.tif 000006
【００７２】
ＩＩ．抗第Ｘａ因子アッセイ
活性第Ｘ因子（第Ｘａ因子）は、凝血カスケードにおける一つの因子である。第Ｘａ因子によりもたらされる色原体基質ｓ−２２２２の加水分解速度を吸光分光分析法で測定することにより、本発明の化合物の抗第Ｘａ因子活性を評価した。緩衝液系における抗第Ｘａ因子活性に対してこのアッセイを用い、試験化合物のＩＣ５０値を評価した。
【００７３】
一般的に、本試験で用いた手順及び試験条件は、上述の抗トロンビンアッセイの場合と同様であった。相異点を以下に示す。
【００７４】
参照化合物：ベンズアミジン
賦形剤：ＴＮＰ緩衝液。
【００７５】
ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、アセトニトリル、またはｔｅｒｔ−ブチルアルコールで可溶化を補助することができ、これらの物質は、最終反応混合液中における濃度が１％（ＤＭＳＯの場合）及び２．５％（その他の溶媒の場合）になるまで有害な影響を及ぼすことがない。
【００７６】
試験技法    試薬＊
３．Ｓ−２２２２溶液
一瓶のＳ−２２２２（１５ｍｇ；Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を１０ｍｌの水に溶解して１．５ｍｇ・ｍｌ−１（２ｍｍｏｌ・ｌ−１）の濃度にする。
【００７７】
４．第Ｘａ因子溶液
ウシ第Ｘａ因子ヒト（７１ｎＫａｔ／バイアル；Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を１０ｍｌのＴＮＰ緩衝液に溶解し、次いで、３０ｍｌのＴＮＰ緩衝液で更に希釈することにより、１．７７ｎＫａｔ・ｍｌ−１の濃度にする。希釈液は、その都度新たに調製しなければならない。
【００７８】
試験手順
このアッセイでは、（抗トロンビンアッセイにおける）Ｓ−２２３８溶液の代わりに、上述のＳ−２２２２溶液を各ウェルに加える。
【００７９】
【表２】
0004369052.tif 000007
【００８０】
【化７】
0004369052.tif 000008
【００８１】
【化８】
0004369052.tif 000009
【００８２】
【化９】
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【００８３】
【化１０】
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【００８４】
【化１１】
0004369052.tif 000012