(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス、若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の複数の作業からなる一連の処理を、生体高分子等の目的物質に対して、その作業目的に適合した複数種類の磁性体粒子を順次結合および解離させることによって行うとともに、
前記処理は、その作業の内容、順序に応じて、ピペット手段の吸引、吐出、その回数の指示、必要な試料や必要な各種類の前記磁性体粒子を含有する容器の位置の指定、および磁場を及ぼすか否かの指示を予めプログラム化して、信号により少なくとも分注機、および磁石に指示を与えることで行われ、
前記結合および解離した磁性体粒子は、ピペット手段の内部に外側面から磁場を及ぼすことによってピペット手段の内部に吸着させられ、または磁場を解除して磁性体粒子を液中に懸濁させられることを特徴とする複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項２】
前記処理は、分注機のピペットノズル先端部に着脱自在に装着されたピペットチップで行うことを特徴とする請求項１に記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項３】
前記ピペットチップは、試料の吸引若しくは吐出と磁石の接離制御により生体高分子、微生物或は特定の物質が結合した磁性体粒子について、捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の各作業工程間の移送を行うことを特徴とする請求項２に記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項４】
前記生体高分子、微生物若しくは物質を、前記分注機の前記ピペットノズル先端部に着脱自在に装着された前記ピペットチップを利用して磁性体粒子に結合させて、細胞の捕獲、細胞核溶解若しくは蛋白質溶解等の精製処理を行なうことで、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを抽出し、次に、プローブ、ビオチン若しくはストレプトアビジンがコーティングされた他の磁性体粒子が特定の塩基配列断片を単離させることを特徴とする請求項２に記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項５】
前記複数の磁性体粒子を利用した前記各作業は、免疫反応又は相補的ＤＮＡ等の特異的親和性物質を介して行うことを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項６】
前記複数の磁性体粒子を利用した前記生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出若しくは単離作業工程の間に、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等の増幅工程を組み入れたことを特徴とする請求項４に記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項７】
前記複数の磁性体粒子を利用した前記生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出若しくは単離作業工程の後に、単離された特定の塩基配列断片等の生体高分子、微生物若しくは物質を化学発光や蛍光若しくは酵素呈色にて、その特定の塩基配列断片等の有無、生体高分子、微生物若しくは物質を免疫反応等を介して測定することを特徴とする請求項４乃至請求項６のいずれかに記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項８】
前記生体高分子、微生物若しくは物質を、前記分注機のピペットノズル先端部に着脱自在に装着された前記ピペットチップを利用して磁性体粒子に結合させて、細胞の捕獲、細胞核溶解、蛋白質溶解若しくは免疫反応等の精製処理を行なうことで、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等を抽出し、次に、必要に応じて抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等については増幅させた後、該ピペットチップを利用して抗体、プローブ、ビオチン若しくはストレプトアビジンがコーティングされた他の磁性体粒子で特定のＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等を単離させ、次に、この単離されたＤＮＡ，ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等を、化学発光、蛍光若しくは酵素呈色にて、その特定の塩基配列断片等の有無や量等を測定することを特徴とする請求項４乃至請求項７のいずれかに記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項９】
ピペット手段の吸引、吐出、その回数の指示、必要な試料や必要な各種類の前記磁性体粒子を含有する容器の位置の指定、および磁場を及ぼすか否かの指示を予めプログラム化して、少なくとも分注機、および磁石に指示を与えることにより、試料中に第１磁性体粒子をピペット手段により混合又は攪拌させることによって試料中の目的物質を第１磁性体粒子に結合させて捕獲する工程と、目的物質が捕獲された第１磁性体粒子をピペット手段によって分離し、その残液を除去する工程と、磁性体粒子から前記目的物質を解離するための解離用液と前記第１磁性体粒子を混合又は攪拌することによって目的物質を第１磁性体粒子から解離させる工程と、該第１磁性体粒子を除去する工程と、ピペット手段による混合又は攪拌によって該目的物質を第２磁性体粒子に結合させて捕獲する工程と、該第２磁性体粒子をピペット手段によって分離する工程とを少なくとも含むとともに、
前記ピペット手段による分離は、前記目的物質を結合した磁性体粒子が、ピペット手段の内部に外側面から磁場を及ぼすことによって、ピペット手段の内面に吸着させることによって行うことを特徴とする複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項１０】
前記目的物質は塩基配列断片を含むＤＮＡ等であり、前記第１磁性体粒子は表面が多孔性であり、前記解離用液は純水であり、前記第２磁性体粒子は、プローブ、ビオチン又はストレプトアビジン等がコーティング又は結合されたものであり、前記第１磁性体粒子から解離されたＤＮＡ等は、ピペットチップを用いて必要に応じてプライマーと混合させ、プライマーと反応したＤＮＡ等はＰＣＲに入れてＤＮＡ等を増幅した後、該ＤＮＡ等をビオチン化させ、ビオチン化した特定のＤＮＡ等を第２磁性体粒子に捕獲させて分離し、分離後に化学発光、蛍光等の反応物質を結合させて測定する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【請求項１１】
前記試料が血清等の体液成分であり、目的物質は抗原又は抗体であり、前記第１磁性体粒子又は第２磁性体粒子には、前記目的物質と直接に又は他の１又は２以上の中間物質を介して間接に特異的に反応する物質がコーティング又は結合されていることを特徴とする請求項９記載の複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス、細菌若しくは細胞等の生体高分子、微生物若しくは物質（以下、「ＤＮＡ等」という。）の処理作業に必要な細胞の捕獲、細胞核の溶解、蛋白質の溶解、ＤＮＡ等の抽出、ＤＮＡ等の単離およびＤＮＡ等の標識、測定又は回収等の作業を、自動的に行なうことを可能とする複数種類の磁性体粒子を用いる生体高分子、微生物又は物質の処理方法に関する。
技術の背景
近年、ＤＮＡ等の研究は、工学分野や医学分野、農学分野、理学分野、薬学分野等、あらゆる分野で行なわれており、その目的は、ゲノムシーケンシング、臨床診断、農植物品種改良、食品菌検査、創薬システム等、様々である。
このように非常に適用分野が広く、また、その応用が期待されるＤＮＡ等の解析は、従来、遠心分離法、高速液体クロマト法、ゲル電気泳動法、ディスポカラム法、透析法、ガラスパウダー法、磁性体微粒子洗浄ノズル法若しくは免疫血清反応等、多種の方法で行なわれている。
しかしながら、上記遠心分離法の場合には、容器の自動装填および取り出しの自動化が非常に難しく、また、遠心後、上清・沈澱の分画を機械的に行なうことが非常に難しく、汎用性に乏しい、という問題を有していた。
また、高速液体クロマト法の場合、分離カラムが基本的に消耗部品となるので、該カラムへの試料のインジェクションや分離時間管理が機械化できず、また、同じカラム内を通過するので、コンタミネーションを完全に防止することができない、という問題を有していた。
さらに、ゲル電気泳動法の場合、ゲルの調整を機械化することができず、ＤＮＡの分離は基本手法として一般的ではあるが、その分離断片を取り出すのは用手法により行なわざるを得ない、という問題を有していた。
一方、ディスポカラム法は、特定のＤＮＡ断片を取り出すためキット化される一つの手法であるが、コストが非常に高く、また、使用範囲も狭い。しかも、分注・カラム通過液をコントロールしにくく、機械化には解決すべき問題が多々ある、という問題を有していた。
また、透析法は、透析に時間がかかり、また、少量対応がしにくいので、あまり用いられてはいない。
ガラスパウダー法は、二酸化珪素の物質を利用したＤＮＡの優れた抽出法で、工程は簡便になるが、フィルターか遠心分離によりパウダーを分離するため、全自動化しにくい、という問題を有していた。
さらに、磁性体微粒子洗浄ノズル法は、磁性体によりシリンダーと吸引・吐出制御で自動化できるが、ノズルの洗浄方式では基本的にコンタミネーションを解決することができない、という問題を有していた。
また、免疫血清反応には、通常液相法と固相法とが用いられるが、液相法においては、前記遠心分離法と同様の問題点があり、また、固相法においても、遠心分離法と同様の問題点や固相担体から解離するための多種類フィルタが必要であり全自動しにくく多種類の固相担体を用いる方法が困難で非特異結合を回避する適当な手段がなく、高感度・特異的分析に限界があるという問題を有していた。
この発明は、かかる現状に鑑み創案されたものであって、その目的とするところは、第１に、少なくとも２種類以上の磁性体粒子を組み合わせるだけで、細胞の捕獲、細胞核の溶解、蛋白質の溶解、ＤＮＡ等の抽出、ＤＮＡ等の単離およびＤＮＡ等の標識・測定等の一連の作業を自動的に、かつ、一貫して達成することができるＤＮＡ等の処理方法を提供することを目的とする。第２には、この第１の原理と本出願人が先に提案した「分注機を利用した磁性体の脱着制御方法およびこの方法によって処理される各種装置」（特願平７−３９４２５号）の原理とを組み合わせることで、さらに効率的なＤＮＡ等の全自動解析を達成することができ、しかも、完全なクロスコンタミネーションの防止を保障することができる理想的なＤＮＡ等の処理方法を提供することを目的とするものである。第３には、２種類以上の磁性体粒子を制御することで、濃縮、攪拌、遠心分離、透析等の処理をも含め一貫して行うことできるので、装置規模を縮小化しコストを削減することができるＤＮＡ等の処理方法を提供することを目的とするものである。第４には、複数種類の磁性体粒子を使い分けて、各作業工程で最適な磁性体粒子を選択することによって、多くの作業工程からなる種々の処理を、効率良く、信頼性良く、且つ、確実に、迅速に実行できるとともに、多様性及び汎用性が高い。
発明の開示
上記目的を達成するため、第一の発明に係る複数種類の磁性体粒子を用いるＤＮＡ等の処理方法にあっては、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス、若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の作業からなる処理を、その作業目的に適合した複数種類の磁性体粒子を利用して自動的に行なうものである。
ここで、「処理」とは、捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の作業を含む。「生体高分子」は、生体内で合成される高分子物質であって、タンパク質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡ等）、多糖等を含む。タンパク質には免疫物質も含む。「微生物」には、ウィルス、プラスミド、細菌、細胞等を含む。「物質」には、生体高分子以外の分子生物学的物質を含む有機又は無機の化学物質を含む。「複数種類」には、例えば、磁性体粒子の大きさ、形状、素材、物性、多孔性の有無等の表面の性質、若しくは付着・結合物質又はコーティング物質の相違による種類がある。
「作業目的に適合した複数種類の磁性体粒子を利用して行う」やりかたとしては、作業対象物質を直接又は他の物質を介して間接に磁性体粒子に結合させ、磁性体粒子に磁場を及ぼすことによって磁性体粒子を、例えばピペット手段によって分離して、残液を除去したり、又は磁性体粒子自体を除去したり、磁場を解除することによって該磁性体粒子を液中に懸濁させて目的物質を捕獲したり、目的物質をすること又はこれらの組み合わせや繰り返しによって行われる。したがって、作業の内容によっては、先行する作業で用いた磁性体粒子の除去を条件に同一の新たな磁性体粒子を用いても良い。
複数種類の磁性体粒子を用いることによって、各作業で最適な磁性体粒子を選ぶことができるので各作業の効率や信頼性を高めるとともに、一連の作業からなる複雑な処理を自動的に一貫して、迅速に行うことができ、且つ、先行する作業で残存する不要な物質を、洗浄等によらずに除去することができるので、高精度で信頼性のある処理を行うことができる。
前記磁性体粒子に磁場を及ぼすには、例えば、磁性体粒子にピペット手段の先端部と貯溜部とを結ぶ液通路内に液の吸引又は吐出によって磁性体粒子を懸濁させた液を通過させる際に液通路の外側面から行う。これによって、液から磁性体粒子を効率良く分離して、濃縮、捕獲、抽出、回収、単離等を行うことができる。
「自動的」とは、作業の内容、順序に応じて、例えば、ピペット手段の吸引、吐出、その回数の指示、必要な試料や必要な各種類の磁性体粒子を含有する容器の位置の指定、使用済みの磁性体粒子の廃棄、容器の移送、磁場を及ぼすのか及ぼさないかの指示、インキュベーションの時間等を予めプログラム化し、信号により分注機や容器移送機、磁石等に指示を与えることにより行う。
第二の発明は、第一の発明において、前記細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の作業からなる処理は、分注機のピペットノズル先端部に着脱自在に装着されたピペットチップで行なうものである。
これによって、ピペットチップの洗浄を行わなくても、クロスコンタミネーションなしで、効率よく迅速に処理を行うことができる。
第三の発明は、第二の発明において、前記ピペットチップは、試料の吸引若しくは吐出と磁石の接離制御により生体高分子、微生物或は特定の物質が結合した磁性体粒子を捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の各作業工程間の移送を行うものである。
「結合」には、例えば、磁性体粒子自体への付着、磁性体粒子にコーティングされた所定物質への吸着、接着、又は反応物質による反応等によって磁性体粒子に結び付ける場合を含む。
第四の発明は、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質を、分注機のピペットノズル先端部に着脱自在に装着されたピペットチップを利用して磁性体粒子に結合させて、細胞の捕獲、細胞核溶解若しくは蛋白質溶解等の精製処理を行なうことで、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを抽出し、次に、プローブ或はビオチン若しくはストレプトアビジンがコーティングされた他の磁性体粒子が特定の塩基配列断片を単離させるものである。ここで、遺伝子の本体とされる核酸が糖とリン酸からなる鎖状化合物の糖に、窒素を含んだ複素環式化合物がグリコシド結合した構造をとっているが、この複素環式化合物であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、アグニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）を「塩基」としている。
第五の発明は、第一の発明乃至第四の発明のいずれかにおいて、前記複数の磁性体粒子を利用した細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出、回収、単離、増幅、標識、分析又は測定等の各作業工程には、免疫反応又は相補的ＤＮＡ等の特異的親和性物質を介して行うものである。
第六の発明は、第四の発明において、前記複数の磁性体粒子を利用した細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出若しくは単離作業工程の間に、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等の増幅工程を組み入れたものである。
ここで、「ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等」には、これらを形成する塩基配列断片をも含む。
第七の発明は、第四の発明乃至第六の発明のいずれかにおいて、前記複数の磁性体粒子を利用した細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の捕獲、抽出若しくは単離作業工程の後に、単離された特定の塩基配列断片等の生体高分子、微生物若しくは物質を化学発光や蛍光若しくは酵素呈色にて、その特定の塩基配列断片等の有無、生体高分子、微生物若しくは物質を免疫反応等を介して測定するものである。
第八の発明は、第四の発明乃至第六の発明のいずれかにおいて、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質を、分注機のピペットノズル先端部に着脱自在に装着されたピペットチップを利用して磁性体粒子に結合させて、細胞の捕獲、細胞核溶解、蛋白質溶解若しくは免疫反応等の精製処理を行なうことで、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等を抽出し、次に、必要に応じ抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡについては増幅させた後、ピペットチップを利用して抗体、プローブ、ビオチン若しくはストレプトアビジンがコーティングされた他の磁性体粒子で特定のＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等を単離させ、次に、この単離された特定のＤＮＡ，ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ等を、化学発光、蛍光若しくは酵素呈色にて、その特定の塩基配列断片等の有無や量を測定するものである。
第九の発明は、試料中に第１磁性体粒子をピペット手段により混合又は攪拌させることによって試料中の目的物質を第１磁性体粒子に結合させて捕獲する工程と、目的物質が捕獲された第１磁性体粒子をピペット手段によって分離し、その残液を除去する工程と、磁性体粒子から前記目的物質を解離するための解離用液と前記第１磁性体粒子を混合又は攪拌することによって目的物質を第１磁性体粒子から解離させる工程と、該第１磁性体粒子を除去する工程と、ピペット手段による混合又は攪拌によって該目的物質を第２磁性体粒子に結合させて捕獲する工程と、目的物質が捕獲された第２磁性体粒子をピペット手段により分離する工程とを少なくとも含むものである。
ここで、「目的物質」には、生体高分子、微生物若しくは物質を含む。
本発明に記載された工程以外の工程の挿入を排除するものではなく、例えば、目的物質の加工や標識化する工程が、目的物質の解離前又は解離後に付け加えられても良い。したがって、目的物質は、工程の進展とともに変化しうる。
「ピペット手段による分離」は、例えばピペット手段が吸引又は吐出する際に、ピペット手段の内部に磁場を及ぼすことによって、ピペット手段の内部に磁性体粒子を吸着させることによって行う。
本発明では、複数種類の磁性体粒子を取り替えつつ用いることによって、先行する工程で使用された種々の不要の物質を除去しつつ次の工程に進むことができる。したがって、同一の磁性体粒子を使い続ける場合に、該磁性体粒子に蓄積されて残存する不要物質が次の工程で行われる反応や測定に悪影響を与える事態を防止し、高感度で高精度又は信頼性のある処理を行うことができる。
本発明では、２種類の磁性体粒子を用いる場合を説明したが、当該場合に限られることなく、２種類の磁性体粒子を用いた処理を繰り返すことによってさらに第３、第４…の磁性体粒子を用いることができる。
第十の発明は、第九の発明において前記目的物質は塩基配列断片を含むＤＮＡ等であり、前記第１磁性体粒子は表面が多孔性であり、前記解離用液は純水であり、前記第２磁性体粒子は、プローブ、ビオチン又はストレプトアビジン等がコーティング又は結合されたものであり、前記第１磁性体粒子から解離されたＤＮＡ等は、ピペットチップを用いて必要に応じてプライマーと混合させ、プライマーと反応したＤＮＡ等はＰＣＲに入れてＤＮＡ等を増幅した後、該ＤＮＡ等をビオチン化させ、ビオチン化した特定のＤＮＡ等を第２磁性体粒子に捕獲させて分離し、分離後に化学発光、蛍光等の反応物質を結合させて測定する工程を含むものである。
第十一の発明は、第九の発明において、前記試料が血清等の体液成分であり、目的物質は抗原又は抗体であり、前記第１磁性体粒子又は第２磁性体粒子には、前記目的物質と直接に又は他の１又は２以上の中間物質を介して間接に特異的に反応する物質がコーティング又は結合されているものである。
以上のように構成された各発明によって、少なくとも２種類の磁性体粒子を組み合わせるだけで、細胞の捕獲、細胞核の溶解、蛋白質の溶解、ＤＮＡ等の抽出、ＤＮＡ等の単離およびＤＮＡ等の標識若しくは測定等の一連の作業を自動的に、かつ、一貫して達成することができる。
また、各発明にあっては、上記２種類以上の磁性体粒子を用いる第１の原理と本出願人が先に提案した分注機を利用した磁性体の脱着制御の原理とを組み合わせることで、さらに効率的なＤＮＡ等の全自動解析を達成することができ、しかも、完全なコンタミネーションの防止を達成することができる。
さらに、各発明にあっては、２種類以上の磁性体粒子を制御することで、濃縮、攪拌、遠心分離、透析等の処理をも含め一貫して行うことができるので、機構・制御が非常に容易であるため装置規模を縮小化しコストを大幅に低減することができる。
またさらに、各発明にあっては、複数種類の磁性体粒子を使い分けて、各作業工程で最適な磁性体粒子を選択することによって、多くの作業工程からなる種々の処理を、効率良く、信頼性良く、且つ確実に、迅速に実行できるとともに、多様性及び汎用性が高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の実施の位置形態例に係るＤＮＡ等の抽出・解析装置の概略的な構成を示すブロック図である。
図２は、同装置の作動ステップを順に示す作業フロー説明図である。
本発明を実施する最良の形態
以下、この発明の第一の実施の形態例を、添付図面に基づき詳細に説明する。
図１は、２種類の磁性体微粒子を利用し、これら磁性体微粒子を本出願人が先に提案した原理と組み合わせてＤＮＡ解析装置を構成した場合を例示しており、図２は、このＤＮＡ解析装置による作業工程が概略的に示されている。勿論、この発明は、目的物質として、上記ＤＮＡだけではなく、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、ウィルス若しくは細菌等の生体高分子、微生物若しくは物質の抽出若しくは解析等の処理にも適用することができる。
この形態例に係るＤＮＡ解析装置は、ＸＹＺ移動機構で昇降自在、かつ、水平移動自在なピペットノズルの先端部に着脱自在に装着されるピペットチップ２が、図２に示すように、サンプリング、試薬分注、第１磁性体微粒子注入、ＤＮＡ吸着、純水吸引、ＤＮＡ捕獲、プライマー注入の作業を行なうように駆動制御され、このプライマーが注入された容器は、この後、ＰＣＲ３で多段階加熱処理されてＤＮＡの増殖が行なわれ、このＤＮＡ増殖作業が終了した後、上記ピペットチップ２は、上記容器内に第２磁性体微粒子を注入し、次に、アルカリ処理液の注入、ＤＮＡ洗浄液の吸引、吐出、化学発光、蛍光或は酵素呈色反応が行なわれるように駆動制御されている。
第１磁性体微粒子は、球形が均一、かつ、０．３〜５ミクロン以下と微小である。また、該磁性体粒子はその表面が多孔質であったり、シリカゲルが混合された物質が多く使用されていて、表面への付着等により効率よくＤＮＡ等を結合して回収できるものである。
第２磁性体微粒子は、定量、測定反応を司るもので、特定の塩基配列断片を捕獲する目的でプローブ、或は、磁性体微粒子の表面とＤＮＡ等との間でビオチン（Biotin）とストレプトアビジン（Streptavidin）との親和性の高い反応を利用するため、上記ビオチンまたはストレプトアビジンを磁性体微粒子にコーティングするとともに、ストレプトアビジン又はビオチン化されたＤＮＡ等が用いられる。
ＰＣＲ３は、ＤＮＡの増殖を行なう公知の手法、装置であって、例えば、サンプルを９６℃まで加熱した後、これを４０℃まで冷却し、この後、再び９６℃まで加熱し、４０℃まで冷却する、という工程を複数回繰り返すように構成されている。
化学発光、蛍光或は酵素呈色等を利用して目的塩基配列断片の試料中の存在或は量を確認する測定装置は、例えば、ＰＭＴや分光光度計等の公知の微光量光学測定装置が用いられる。
次に、以上のように構成されてなるＤＮＡ解析装置によってＤＮＡの解析を行なう工程を、図２に基づき説明する。
先ず、ホモジナイズされたサンプルに必要試薬（ＳＤＳやプロテアーゼ）を分注して蛋白等を溶解させる（ステップａ）。
この後、この蛋白等が溶解したサンプル試料に上記第１磁性体微粒子を注入して、該第１磁性体微粒子にサンプル試料中のＤＮＡ等を物理吸着等により結合させ捕獲する（ステップｂ）。
次に、所定のインキュベーションを経た後、上記容器中の試料を吸引して、該ピペットチップ２の外部に接離自在に配設された磁石Ｍがピペットチップ２の外周面に密着し、ＤＮＡ等が捕獲された第１磁性体微粒子をピペットチップの内面に吸着させる（ステップｃ）。
次に、解離液として純水を吸引して第１磁性体微粒子に捕獲されたＤＮＡ等と第１磁性体微粒子とを解離させる（ステップｄ）。このとき、上記磁石Ｍは、ピペットチップ２から離れた位置、即ち、吸引された試料に磁力の影響が及ばない位置まで離れるように駆動制御される。
この後、上記磁石Ｍを再びピペットチップ２の外周面に密着させて、第１磁性体微粒子のみをピペットチップ２の内面に吸着させた状態でＤＮＡ等と純水を分離させ、ＤＮＡ等のみを取り出し回収する（ステップｅ）。この後、上記第１磁性体微粒子は廃棄される。
次に、上記ピペットチップ２は、分離されたＤＮＡ等をプライマーと混合させる（ステップｆ）。
この後、上記プライマーと反応したＤＮＡ等は、上記ＰＣＲ３に入れられて所定の温度加熱（９６℃）と冷却（４０℃）が繰り返されてＤＮＡの増殖が行なわれる（ステップｇ）。
次に、上記ピペットチップ２は、ＰＣＲ３で増幅されたＤＮＡ試料を、例えばビオチン化によって標識をつけ、ビオチンと特異的に親和性の良いストレプトアビジンがコーティングされた前記第２磁性体微粒子を注入する（ステップｈ）。
この後、上記ピペットチップ２は、このＤＮＡ試料中にアルカリ処理液を分注し（ステップｉ）、次に、このアルカリ処理されたＤＮＡ試料を吸引し、上記磁石Ｍによって該第２磁性体微粒子をピペットチップ２の内面に吸着させた後、洗浄水の吸引・吐出して第２磁性体微粒子を洗浄し、特定の塩基配列断片を単離する（ステップｊ）。
次に、この単離した塩基配列断片に、化学発光、蛍光或は酵素呈色反応物質をＤＮＡ等、或は、ＤＮＡと結合した粒子と結合させ（ステップｋ）、ＰＭＴや分光光度計等の公知の微光量光学測定装置で目的の塩基配列断片の有無を測定し、或は、その量を測定する（ステップｌ）。
以上説明したように、本実施の形態例では、第１磁性体微粒子として多孔質のものを用いることにより純水によって容易に解離させやすいものを選び、第２磁性体微粒子としては強固に結合して目的物質を効率的に捕獲するものを選んでいる。したがって、第１磁性体微粒子を効率良く解離して目的物質を回収して測定を効率良く行うことができる。また、第１磁性体微粒子を廃棄して第２磁性体微粒子に置き換えることによって、第１磁性体微粒子に付着して残存する異物を排除することができるので信頼性のある測定を行うことができる。
次に、本発明を免疫血清反応に適用した第二の実施の形態例について説明する。
第一の実施の形態例において、ＤＮＡの代わりに抗原、第１磁性体微粒子について第一抗体結合磁性体微粒子を用い、プライマーやＰＣＲを用いずに第二抗体を用い、標識化のために第三抗体を用い、純水による解離の代わりに他の解離剤を用いるとともに、前記標識化した第三抗体と特異的に反応する物質を結合又はコーティングした第２磁性体微粒子を用いることによって免疫血清反応を実現することができる。
本実施の形態例を血清中ＣＥＡ（ガン胎児性）抗原検出に適用した場合について説明する。
第１の工程で、第一反応用マイクロプレートの各プレートホールに、予め、第１磁性体微粒子として抗ＤＮＰマウス抗体結合磁性体微粒子（第一抗体）と、該抗ＤＮＰマウス抗体と特異的に反応するＤＮＰを有するＤＮＰ及びビオチン化抗ＣＥＡマウス抗体（第二抗体）、発光基質と反応して発光するＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）標識抗ＣＥＡマウス抗体（第三抗体）、解離剤としてＤＮＰ−リジン、及び第２磁性体微粒子としてストレプトアビジン結合磁性体微粒子を各試薬チップで各プレートホールに分注しておく。尚、抗原抗体反応によって結合する場合の解離剤としては、該抗原又は抗体と同種の抗原又は抗体を含む物質を用いることができる。
第２の工程で、反応用チップで血清サンプルを吸引して反応用容器に入れ、第１磁性体微粒子である前記抗ＤＮＰマウス抗体結合磁性体微粒子、及び第二抗体であるＤＮＡ及びビオチン化抗ＣＥＡマウス抗体とをピペットチップで前記反応用容器に分注して混合攪拌した後インキュベーションを行う。すると、血清中に含有する目的物質である前記ＣＥＡ抗原は、直接第１磁性体微粒子とは結合しないが、ＤＮＰ及びビオチン化抗ＣＥＡマウス抗体と特異的に反応して結びつくとともに、該ＤＮＰ及びビオチン化抗ＣＥＡマウス抗体が前記第１磁性体微粒子の抗ＤＮＰマウス抗体と特異的に反応して結びつく。したがって、目的物質である前記ＣＥＡ抗原は、第二抗体を介して第一抗体がコーティングされている第１磁性体微粒子と結合し捕獲される。
第３の工程で、インキュベーションの後、ピペットチップの側面に磁石を接近させること等によって、内部に磁場を及ぼすことによって前記ＣＥＡ抗原を捕獲した第１磁性体微粒子をピペットチップの内面に吸着すること等により分離して残液を除去した後、分離した該第１磁性体微粒子をＡＬＰ標識抗ＣＥＡマウス抗体と混合攪拌した後インキュベーションを行う。これによって、該ＡＬＰ標識抗ＣＥＡマウス抗体は、前記第１磁性体微粒子に捕獲された目的物質たるＣＥＡ抗原と特異的に反応して結合する。
第４の工程で、インキュベーションの後、該ＣＥＡ抗原及び該ＡＬＰ標識抗ＣＥＡマウス抗体を捕獲した第１磁性体微粒子をピペットチップの内部に磁場を及ぼすことによって内面に吸着させることによって分離し、その残液を除去した後、解離剤であるＤＮＰ−リジンの溶液を吸引して該第１磁性体微粒子から捕獲したＣＥＡ抗原、ＡＬＰ標識抗ＣＥＡマウス抗体、並びに、ＤＮＰ及びビオチン化抗ＣＥＡマウス抗体の組合体を解離した後、第１磁性体微粒子を分離して除去した後、残液にピペットチップを用いて前記第２磁性体微粒子であるストレプトアビジン結合磁性体微粒子を注入し混合攪拌する。すると、前記組合体のうちビオチン化抗ＣＥＡマウス抗体と第２磁性体微粒子にコーティングされたストレプトアビジンとが特異的に反応し該組合体は第２磁性体微粒子に捕獲される。
第５の工程で、インキュベーションの後、該組合体を捕獲した第２磁性体微粒子を前記ピペットチップに磁場を及ぼすことによって分離し、残液を除去した後、発光基質ＡＭＰＰＤを添加することによって前記組合体を形成するＡＬＰ標識抗ＣＥＡマウス抗体に作用して発光させ、発光量を測定することによって、ＣＥＡ抗原を解析することができる。
以上示したように、本実施の形態例によると、複数種類（ここでは２種類）の異なる磁性体微粒子を順次交換して用いることによって、各作業で最適な磁性体微粒子を選択して各作業の効率を高めるとともに、作業への悪影響を排除することができる。例えば、上記例では、第１磁性体微粒子にコーティングされた物質は解離剤で容易に捕獲物質を解離することができるものであり、第２磁性体微粒子は、強固な結合によって捕獲物質を保持し、測定を効率良く行うことができる。また、第１磁性体微粒子のコーティング物質が測定等の後の作業に与える影響を排除している。また、本実施の形態例によれば、先行する作業工程で使用された種々の不要な物質の残存を、容易、且つ、十分に除去することができる。これによって、高感度で信頼性良い後の測定等の作業工程を保証することができる。
尚、第一の実施の形態例では、ビオチン化させたＤＮＡに対してストレプトアビジンがコーティングされた第２磁性体微粒子に捕獲させたものであるが、本発明は当該場合に限られるものではなく、例えば、プローブを用いたハイブリダイゼション法によってＤＮＡの分析測定等の処理を行うことができる。さらには、前記磁性体微粒子にオリゴｄＴをコーティングさせ、抽出したＲＮＡを溶解した液に、該磁性体微粒子を混合することによってｍＲＮＡを捕獲し、捕獲したｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成するようにしても良い。さらに、ビオチン化したｍＲＮＡにｃＤＮＡをハイブリダイズさせた液に、ストレプトアビジンをコーティングした磁性体微粒子を分注させて、ビオチン化したｍＲＮＡを該磁性体微粒子に結合させる。その後、磁石を接近させることによってハイブリダイズしたｃＤＮＡを該磁性体微粒子に捕獲させて回収させるようにしても良い。
上記形態例では、この２種類の磁性体微粒子を用いてＤＮＡ等の解析を行なう場合を例にとり説明したが、本発明にあってはこれに限定されるものではなく、３種類以上の磁性体微粒子を用いて上記解析作業を行なうように構成することもできることは勿論である。例えば、第一の実施の形態例で、細胞を抽出する際にも、生体組織から切り出した組織小切片をホモジナイズさせた後、細胞を抽出する際にも、他の磁性体微粒子にリガンド又は受容体をコーティング等することによって該磁性体微粒子を用いて細胞の抽出を行うことができる。以上の例は主として生体高分子についての処理に適用したが、本発明はこれらの物質に適用する場合に限られることなく、例えば、有機又は無機を含む化学物質の処理に適用できることは言うまでもない。
【図１】
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【図２】
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