(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡ
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５およびドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡを含むベクター
【請求項２】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞にストレスを与え、細胞死を誘導する工程、
（ｄ）細胞死が誘導された細胞数を測定する工程、
を含み、上記細胞死が誘導された細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
【請求項３】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）移動した細胞数を測定する工程、
を含み、上記移動した細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
【請求項４】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程、
を含み、上記ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
【請求項５】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
【請求項６】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験試料の存在下で、ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとを接触させる工程、
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとの結合を検出する工程、
を含み、上記結合が、被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
【請求項７】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２〜６のいずれかに記載の評価方法により、複数の被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料を選択する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）請求項２〜６のいずれかに記載の評価方法により、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料を選択する工程
【請求項９】
請求項７または８に記載の工程に、さらに細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、AMPK関連リン酸化酵素5の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞ホメオスタシスは、細胞増殖と細胞死と細胞生存との間の絶妙のバランスを示し、従って、腫瘍形成は、細胞ホメオスタシスのバランス崩壊の所産であると考えられる（Wyllie et al., Int. Rev. Cytol. 1980, 68, 251-306）。腫瘍の細胞増殖及び細胞生存はいずれも、基本的には、血中から供給される栄養、特にグルコースと、酸素とによって維持されており、従って、アンバランスな栄養供給及び無秩序な腫瘍細胞増殖により、腫瘍組織の中心では壊死性の細胞死が誘発される（Dang and Semenza., Trends Biochem. Sci. 1999,24, 68-71；Helmlinger et al., Nat. Med. 1997, 3, 177-182；Southerland, Science  1988, 240, 178-184）。最近、本発明者らは、ヒト肝癌細胞系及びヒト正常繊維芽細胞系を含む大部分の細胞系が、グルコース飢餓条件下で細胞死を起こすことを証明した（Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207；Esumi et al., J. Biol. Chem., in press；Kato et al., Oncogene in press）。興味深いことに、膵臓癌細胞系PANC-1のようないくつかの腫瘍細胞が、臨床的血管造影における低血管（hypovascular）所見と一致して、グルコース飢餓に対する高い抵抗性を示すことが証明され（Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207）、そしてその抵抗性はAMPK活性に依存していることが見出された（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press）。さらに、抵抗性は低酸素条件によっても開始し、それもAMPK活性に依存している（Esumi et al., J. Biol. Chem., in press）。
【０００３】
AMPKは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼファミリーに属するSNF-1（sucrose-non-fermenting protein kinase）のヒトホモログであり、代謝ストレス、低酸素、熱ショック、及び虚血の下にある細胞において活性化されることが、よく証明されている（Carlson, Curr. Opin. Microbiol. 1999, 2, 202-207；Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855）。SNF-1/AMPKファミリーは、哺乳動物を含むいくつかの種において高度に保存されており（Becker et al., Eur. J. Biochem. 1996, 235, 736-743；Gardner et al., Genomics  2000, 63, 46-59；Heyer et al., Mol. Reprod. Dev. 1997, 47, 148-156；Inglis et al., Mamm. Genome 1993, 4, 401-403；Ruiz et al., Mech. Devel. 1994, 48, 153-164；Wang et al., FEBS Lett. 1999, 453, 135-139）、AMPKのαサブユニットが触媒サブユニットであることが既知である（Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855）。現在までに、4種のタンパク質、AMPK-α1及びα2（Aguan et al., Gene  1994, 149, 345-350；Carling et al., Eur. J. Biochem. 1989, 186, 129-136；Davies et al., Eur. J. Biochem. 1989, 186, 123-128；Stapleton et al., J. Biol. Chem. 1996, 611-614）、MELK（マウスタンパク質／Heyer et al., Mol. Reprod. Dev. 1997, 47, 148-156）、及びSNARK（ラットタンパク質／Lefebvre et al., . Biochem. J. 2001, 355, 297-305）がAMPKファミリーの触媒サブユニットとして同定されている。AMPK活性化はThr172のリン酸化により開始することが報告されているが（Hawley et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 27879-27887）、いかにしてリン酸化が開始するかは、未だ不明である。
【０００４】
癌抑制遺伝子ATMは、神経学的変性及び癌素因を伴うヒト遺伝性疾患、ataxia teleangiectasia（毛細血管拡張性運動失調）の研究中に単離された（Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2, 215-217；Lavin and Shiloh, Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 177-202；Savitsly et al., Science  1995, 268, 1749-1753）。ATMは、ホスファチジルイノシトールキナーゼファミリーに属し、DNA二本鎖切断に対する細胞応答中に、そのSer15及びSer20におけるリン酸化を介して癌抑制遺伝子p53を活性化するという特徴を有する（Banin et al., Science  1998, 281, 1674-1677；Canman et al., Science  1998；Sheih et al., Cell 1997, 91, 325-334）。いくつかの研究が、DNA損傷による細胞応答にATM/p53経路が密接に関与していることを報告しているが、ATM/p53経路の制御の分子的メカニズムは解明されていない。例えばATM活性化は、遺伝学的損傷及び非遺伝学的損傷の両方による細胞応答に関与しているが、いかなる因子がATMリン酸化を刺激するのかは不明である。
【０００５】
細胞生存も、腫瘍細胞維持に不可欠の系の一つもあり、セリン／トレオニンプロテインキナーゼAktが、細胞生存因子として同定されている（Datta et al., Genes Dev. 1999, 13, 2905-2927）。細胞生存シグナル伝達において、PI-3Kにより活性化が開始するAktは、Bad（Datta et al., Cell 1997, 91, 231-241；Peso et al., Science  1997, 278, 687-689）、カスパーゼ9（Cardone et al., Science  1998, 282, 1318-1321）、Forkhead（Brunet et al., Cell 1999, 96, 857-868）、及びMdm2（Mayo and Donner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98, 11598-11603）をリン酸化することが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、AMPKファミリーに属するタンパク質およびその機能を同定し、該タンパク質の利用方法を提供することにある。より詳細には、AMPK関連リン酸化酵素5の用途を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、推定分子量74kDaの661アミノ酸をコードする新規なヒトAMPKファミリーのメンバーを同定し、それをARK5（AMPK-Related Kinase 5：AMPK関連リン酸化酵素5）と名付けた。ARK5は、595〜600aaに推定Aktリン酸化モチーフを有し、Ser600が活性型Aktによりリン酸化され、それにより共通のAMPK 基質であるSAMS-ペプチドに対するキナーゼ活性が活性化されることが見出された。さらに、Akt1により活性化されたARK5が、ATMをリン酸化することも判明した。また、栄養飢餓中、ARK5は、Akt依存に細胞の生存を支持することが判明した。一方、ヒト膵臓癌細胞系PANC-1と比較して、PANC-1に対しARK5が安定的にトランスフェクトされたPANC-1細胞系（P/ARK細胞系）は、インビトロ転移活性の2倍超の増加を示した。また、該インビトロ転移活性は、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ／Akt経路に依存していることが見出された。P/ARK細胞系においては、有意に高い栄養飢餓に対する抵抗性、並びに活性型のMMP-2及びMMP-9の培地中への分泌の増加が観察されたが、PANC-1細胞系においては観察されなかった。さらに、P/ARK細胞系は、MT1-MMPの発現を示し、それにより、浸潤におけるMMPの重要な役割が示された。ヌードマウスにおいて、P/ARK細胞系は、移植から12週間後に腫瘍増殖の10倍超の増加を示し、移植された腫瘍巣内の壊死区域が、P/ARK細胞系においては親PANC-1細胞と比較して有意に減少していた。さらに、P/ARK細胞系を移植されたヌードマウスには、筋肉浸潤及び腸管膜転移が顕著に観察された。
【０００８】
以上の結果から、ARK5は、栄養飢餓などの細胞死を導くストレスから細胞を保護する薬剤として利用できることが判明した。また、ARK5阻害剤は、腫瘍などの疾患の治療や予防に使用できることが判明した。さらに、ARK5を指標とすることで、腫瘍などの疾患の検査が可能になることが判明した。
【０００９】
即ち、本発明は、ARK5の用途に関し、以下の〔１〕〜〔１９〕を提供するものである。
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡ
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５およびドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡを含むベクター
〔２〕  ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現を抑制するためのヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または、それらを含むベクターを有効成分として含有する、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを治療または予防するための薬剤。
〔３〕  ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞。
〔４〕  被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔３〕に記載の細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞にストレスを与え、細胞死を誘導する工程、
（ｄ）細胞死が誘導された細胞数を測定する工程、
を含み、上記細胞死が誘導された細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定され、減少する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
〔５〕  被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔３〕に記載の細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）移動した細胞数を測定する工程、
を含み、上記移動した細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔６〕  被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程、
を含み、上記ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔７〕  被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔８〕  被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験試料の存在下で、ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとを接触させる工程、
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとの結合を検出する工程、
を含み、上記結合が、被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、抑制される場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔９〕  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制する試料のスクリーニング方法。
（ａ）〔４〕〜〔８〕のいずれかに記載の評価方法により、複数の被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を選択する工程
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）〔４〕〜〔８〕のいずれかに記載の評価方法により、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を選択する工程
〔１１〕  〔９〕または〔１０〕に記載の工程に、さらに細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
〔１２〕  ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査方法。
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を対照と比較する工程
〔１４〕  ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５、または、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査方法。
〔１５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１４〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を対照と比較する工程
〔１６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１４〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からRNA試料を調製する工程
（ｂ）該RNA試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするRNAの量を測定する工程
（ｃ）測定されたRNAの量を対照と比較する工程
〔１７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１４〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からcDNA試料を調製する工程
（ｂ）該cDNA試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするcDNAの量を測定する工程
（ｃ）測定されたcDNAの量を対照と比較する工程
〔１８〕  ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査薬。
〔１９〕  ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に結合する抗体を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、AMP活性化タンパク質リン酸化酵素（AMPK）ファミリーに属するAMPK関連リン酸化酵素5（ARK5）を単離し、該ARK5の機能を同定した。本発明は、この知見に基づくものである。
【００１１】
本発明は、ARK5をコードするDNA、ARK5およびドミナントアクティブ型のAktをコードするDNA、または、それらDNAを含むベクターを有効成分として含有する、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤を提供する。
【００１２】
上記ストレスとしては、好ましくは、細胞死を誘導するストレスである。このような細胞死を誘導するストレスとしては、特に制限はなく、低酸素ストレス、低栄養ストレス、代謝ストレス、熱ストレス、または、虚血ストレスなどが例示できる。
【００１３】
本発明の細胞にストレス耐性を賦与する薬剤が適用可能な疾患としては、例えば低酸素ストレス、低栄養ストレス、代謝ストレス、熱ストレス、または、虚血ストレスなどが関与している疾患が挙げられる。より具体的には、心筋梗塞、脳血栓等による虚血性脳疾患などが例示できるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の細胞にストレス耐性を賦与する薬剤は、移植用臓器の庇護剤としても使用しうる。
【００１４】
本発明における細胞にストレス耐性を賦与する薬剤に含有されるARK5が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられる。
【００１５】
ヒトARK5のcDNAの塩基配列および該cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例を、それぞれ、配列番号：１および配列番号：２に示す。
【００１６】
本発明におけるARK5をコードするDNAには、ARK5（例えば配列番号：２）と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAも含まれる。このようなDNAとしては、例えば、ARK5の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするDNAが挙げられる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるDNAが、ARK5（例えば配列番号：２）と同等の生物学的機能や生化学的機能（活性）を有するタンパク質をコードするDNAであることを意味する。例えば、ARK5（例えば配列番号：２）と同等なストレス耐性能やリン酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAは、本発明のARK5をコードするDNAに含まれる。
【００１７】
対象となるDNAがARK5（例えば配列番号：２）と同等なストレス耐性能を有するか否かは、例えば、該DNAが導入された細胞のグルコース飢餓への耐性度を評価することで判定することができる。また、対象となるDNAがARK5（例えば配列番号：２）と同等なリン酸化活性を有するか否かは、例えば、該DNAからコードされるタンパク質によるATMに対するリン酸化活性、または、SAMSペプチドに対するリン酸化活性を評価することで判定することができる。
【００１８】
あるDNAからコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ARK5（例えば配列番号：２）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製することができる。
【００１９】
また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ARK5（例えば配列番号：２）のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAもまた本発明のARK5をコードするDNAに含まれる。
【００２０】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２１】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
【００２２】
ARK5のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のペプチドやポリペプチドとが融合したものである。
【００２３】
また、あるDNAからコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、ARK5をコードするDNA配列（例えば配列番号：１）もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いDNAを単離することは、周知の技術である。
【００２４】
また、本発明におけるARK5コードするDNAには、ARK5をコードするDNA（例えば配列番号：１）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ARK5と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAも含まれる。
【００２５】
ARK5と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、5×SSC 、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２６】
また、ARK5をコードするDNAの配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用して、ARK5と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離することも可能である。
【００２７】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるDNAがコードする、ARK5と機能的に同等なタンパク質は、通常、ARK5とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のARK5をコードするDNAには、ARK5（例えば配列番号：２）と機能的に同等であり、かつ該タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。
【００２８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２９】
また、本発明におけるAktとは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼAktを意味する。AktのcDNAの塩基配列および該cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例を、それぞれ、配列番号：３および配列番号：４に示す。
【００３０】
本発明において、ドミナントアクティブ型のAktは、例えば、文献（Cross, D.A. et al., Nature  378: 785-789 (1995); Kohn, A.D.et al., J. Biol. Chem.271: 31372-31378 (1996)）等に記載の方法に従って作製できる。ドミナントアクティブ型のAktのcDNAの塩基配列および該cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例を、それぞれ、配列番号：５および配列番号：６に示す。
【００３１】
本発明において、ARK5またはドミナントアクティブ型のAktをコードするDNAを、生体内で該DNAの発現を保証するベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入することができる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdexlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo)などが挙げられるが、これらに制限されない。ARK5またはドミナントアクティブ型のAktをコードするDNAをベクターへ挿入する操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning, 5.61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。本発明においては、上記の方法により、細胞にストレス耐性を賦与するための遺伝子治療を行うことが可能である。
【００３２】
また、本発明は、ARK5の発現を抑制するためのヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または、それらを含むベクターを有効成分として含有する、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasia（毛細血管拡張性運動失調）を治療または予防するための薬剤を提供する。ここで、腫瘍としては、好ましくは転移性腫瘍が挙げられるが、これに限定されるものではない。腫瘍が転移性腫瘍の場合、上記薬剤は、該転移性腫瘍の浸潤または転移を抑制するために使用される。
【００３３】
本発明において、ARK5の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ARK5をコードするDNA配列（例えば配列番号：１）中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはARK5のDNA配列中の連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例を、配列番号：７に示すが、これに限定されるものではない。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はmRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、DNAまたはmRNAとオリゴヌクレオチドとがDNA配列に特異的にハイブリダイズできる限り、1 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【００３７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ARK5の産生細胞に作用して、該ARK5をコードするDNA又はmRNAに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、mRNAの分解を促進したりして、ARK5の発現を抑制することにより、結果的にARK5の作用を抑制する効果を有する。
【００３８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
【００３９】
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００４０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００４１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調製し、好ましい量を用いることができる。
【００４２】
本発明は、ARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する。このような細胞としては、実施例に記載のH/ARK5（ARK5をコードするDNA が導入されたHepG2細胞）やP/ARK5（ARK5をコードするDNA が導入されたPANC-1細胞）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明におけるARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞は、被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法、および、該評価方法を利用したスクリーニング方法に使用することができる有用な細胞である。
【００４３】
本発明におけるARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞は、ARK5をコードするDNAを細胞に導入することで作製することができる。また、内因性のARK5をコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することで作製することも可能である。細胞や該細胞に導入されるARK5が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
【００４４】
ARK5をコードするDNAを細胞に導入する場合、ARK5をコードするDNAは、発現ベクターに組み込むことが好ましい。例えば、HepG2細胞、PANC-1細胞、PC-10細胞、A549細胞、ASPC-1細胞、HLF細胞、HF細胞、CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13、pSV2neo、pcDNA I、pCD8などが挙げられる。
【００４５】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００４６】
本発明は、被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法を提供する。
【００４７】
本発明の評価方法の一つの態様としては、まず、ARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する。次いで、該細胞に被験試料を接触させる。本発明における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００４８】
本発明において、細胞と被験試料との接触は、例えば、細胞の培養液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、ARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞へ導入することも可能である。
【００４９】
本発明の評価方法の一つの態様では、次いで、該細胞にストレスを与え、細胞死を誘導する。このような細胞死を誘導するストレスとしては、特に制限はなく、低酸素ストレス、低栄養ストレス、代謝ストレス、熱ストレス、または、虚血ストレスなどが例示できる。
【００５０】
本発明の評価方法の一つの態様では、次いで、細胞死が誘導された細胞数を測定する。本発明において、細胞死が誘導された細胞数を測定する方法としては、当業者に周知の方法を使用することが可能である。例えば、実施例に記載のHoechst 33342/PI染色などで評価することが可能であるが、この方法に限定されるものではない。
【００５１】
本発明の評価方法の一つの態様では、上記細胞死が誘導された細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定され、減少する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される。
【００５２】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、ARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する。次いで、該細胞に被験試料を接触させる。次いで、移動した細胞数を測定する。本発明において、移動した細胞数は、当業者に周知の方法で測定することが可能である。例えば、Matrigel-Coated Invation Chamber（Becton-Dickinson Company,Franklin Lakes,NJ）において、マトリゲル層を通り下方のチャンバーの底へ移動する細胞数を、位相差顕微鏡を用いて計測することが可能であるが、この方法に制限されるものではない。
【００５３】
本発明の評価方法の別の態様では、上記移動した細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
【００５４】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、ARK5に被験試料を接触させる。用いられるARK5の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【００５５】
また、本発明の評価方法に用いられるARK5が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。ARK5が発現している細胞としては、内在性のARK5を発現している細胞、または外来性のARK5を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のARK5を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、上記外来性のARK5を発現している細胞は、例えば、ARK5をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のARK5を有する細胞は、例えば、ARK5をコードするDNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のARK5が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【００５６】
また、ARK5が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ARK5をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【００５７】
また、本発明において「接触」は、ARK5の状態に応じて行う。例えば、ARK5が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、ARK5が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをARK5が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた2ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００５８】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、ARK5の活性または活性型ARK5の量を測定する。ARK5の活性およびその測定方法は、既述している。
【００５９】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、上記ARK5の活性または活性型ARK5の量が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
【００６０】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、ARK5遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
【００６１】
本発明において、「機能的に結合した」とは、ARK5遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ARK5遺伝子のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ARK5遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００６２】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ARK5をコードするDNAもまた含まれる。
【００６３】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【００６４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００６５】
また、ARK5遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【００６６】
また、該遺伝子からコードされるARK5を含む画分を定法に従って回収し、該ARK5の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ARK5に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ARK5の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【００６７】
本発明の評価方法の別の態様では、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
【００６８】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、被験試料の存在下で、ARK5とAktとを接触させる。用いられるARK5とAktは、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。Aktの精製は、当業者に周知の方法で行うことができる。
【００６９】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、ARK5とAktとの結合を検出する。例えば、被検試料の存在下で、ARK5とAktとを発現する細胞を培養し、細胞を回収後、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の結合を評価することができる。また、例えば被検試料の存在下で、ARK5とAktとを試験管内でインキュベートし、一方のタンパク質に対する抗体、またはこれらのタンパク質に融合させたタグに対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体または該タンパク質に付加したタグに対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の結合を評価することができる。また、一方のタンパク質を支持体に結合させておき、他方のタンパク質を結合させ、そこに被検試料を適用する。結合していたタンパク質が解離するか否かを検出することにより被検試料の効果を評価することもできる。
【００７０】
本発明の評価方法の別の態様では、上記結合が、被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、抑制される場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
【００７１】
さらに、本発明は、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制する試料を効率的にスクリーニングする方法を提供する。本発明の細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制する試料のスクリーニング方法の一つの態様においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価し、複数の被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を選択する。
【００７２】
上記スクリーニング方法の他の態様においては、まず、ARK5に複数の被験試料を接触させる。次いで、ARK5と被験試料との結合を検出する。次いで、ARK5と結合する被験試料を選択する。
【００７３】
ARK5を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ARK5をコードするDNAを、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13、pSV2neo、pcDNA I、pCD8などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【００７４】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法 (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987))、リン酸カルシウム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、DEAEデキストラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985))、リポフェクチン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993))等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【００７５】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をARK5のN末またはC末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてARK5を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりARK5の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（His-tag）、インフルエンザ凝集素 HA、ヒトc-myc、FLAG、Vesicular stomatitis ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7 gene10 タンパク質（T7-tag）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSV-tag）、E-tag（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ARK5に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。
【００７６】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はARK5、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ARK5に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ARK5に対する抗体は、例えば、ARK5をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したARK5の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【００７７】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスIgG 抗体であれば、Protein A SepharoseやProtein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、ARK5を、例えば、GSTなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン-Sepharose 4Bなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ARK5の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【００７８】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Harlow,E. and Lane, D.: Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988) ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【００７９】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはSDS-PAGEが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはARK5に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である35S-メチオニンや35S-システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接SDS-ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
【００８０】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた2-ハイブリッドシステムを用いて行う方法が挙げられる。
【００８１】
2-ハイブリッドシステムにおいては、ARK5またはその部分ペプチドをSRF DNA結合領域またはGAL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ARK5と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、VP16またはGAL4転写活性化領域と融合する形で発現するようなcDNAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来cDNAを単離する（酵母細胞内でARK5と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したcDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、該cDNAがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりARK5に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
【００８２】
2-ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、HIS3遺伝子の他、Ade2遺伝子、LacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、PAI-1（Plasminogen activator inhibitor type1）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。2ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
【００８３】
ARK5と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ARK5をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにARK5と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、ARK5に結合したポリペプチドを調製することができる。
【００８４】
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴDNAを合成し、該DNAをプローブとしてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするDNAを得ることができる。
【００８５】
また、ポリペプチドに限らず、ARK5に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したARK5に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ARK5に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13、Hogan JC Jr.,Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-9）が当業者に公知である。
【００８６】
本発明において、結合した試料を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ARK5と被験試料との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばBIAcore、Pharmacia製）。したがって、BIAcore等のバイオセンサーを用いることによりARK5と被験試料との結合を評価することが可能である。また、結合した試料を検出又は測定する手段としては、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法においては、上記方法により得られたARK5と結合する被験試料について、本発明の評価方法により、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する。次いで、ARK5と結合する被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を選択する。
【００８８】
さらに、本発明においては、医薬組成物の製造方法を提供する。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００８９】
また、本発明は、ARK5の活性もしくは活性型ARK5の量、または、ARK5もしくは該ARK5をコードするDNAの発現量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査方法を提供する。このような検査方法によって、腫瘍の悪性度（例えば転移能など）の判定、抗腫瘍剤による化学療法や放射線治療に対しての腫瘍耐性能の判定、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの確定診断が可能になるものと考えられる。
【００９０】
以下に本発明の検査方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定されるものではない。なお、本発明の検査において、対照とは、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの非罹患者を意味する。
【００９１】
本発明のARK5の活性または活性型ARK5の量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、まず、被検者からタンパク質試料を調製する。本発明において、被検者からのタンパク質試料は、例えば、被検者の腫瘍、筋肉、神経などの病変部と、リンパ球、白血球などの血球成分などを含む試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。
【００９２】
本発明の方法においては、次いで、該タンパク質試料に含まれるARK5の活性または活性型ARK5の量を測定する。次いで、測定されたARK5の活性または活性型ARK5の量を対照と比較する。
【００９３】
また、本発明のARK5または該ARK5をコードするDNAの発現量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、まず被検者からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれるARK5の量を測定する。次いで、測定されたARK5の量を対照と比較する。
【００９４】
このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法(米国特許第4,376,110号)、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法(Wideら、Kirkham及びHunter編集、「ラジオイムノアッセイ法（Radioimmunoassay）」、E. and S. Livingstone、エジンバラ、(1970))、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.5（2002）、蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.8（2002））、2次元電気泳動法、SDSポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、上記検査方法は、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者からRNA試料を調製する。次いで、該RNA試料に含まれるARK5をコードするRNAの量を測定する。次いで、測定されたRNAの量を対照と比較する。その他の態様としては、まず、被検者からcDNA試料を調製する。次いで、該cDNA試料に含まれるARK5をコードするcDNAの量を測定する。次いで、測定されたcDNAの量を対照と比較する。被検者からのRNA試料やcDNA試料は、例えば、被検者の被検者の腫瘍、筋肉、神経などの病変部と、リンパ球、白血球などの血球成分などを含む試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。
【００９６】
このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。
【００９７】
本発明はまた、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査方法に使用される検査薬を提供する。このような検査薬としては、ARK5をコードするDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬、または、ARK5に結合する抗体を含む検査薬が挙げられる。ここで、該抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えば本実施例において記載されている抗SNARK抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。
【００９８】
また、上記オリゴヌクレオチドは、ARK5をコードするDNA（たとえば配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするものである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ARK5をコードするDNAに対し、完全に相補的である必要はない。
【００９９】
上記オリゴヌクレオチドを含む検査薬としては、上記本発明の検査方法に使用しうるプローブ（該プローブが固定された基板の形態であってもよい）やプライマーが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１００】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ARK5をコードするDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【０１０３】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【０１０４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）FLAF-TAG ARK5の調製
FLAGタグを有するARK5は、LA PCR（Takara Biomedicals,Kyoto,Japan）；上流プライマー：5'-AAGCTTATGGATTATAAAGATGATGATGATAAAGAAGGGGCCGCCGCGCCTGTGGCGGGG-3'（配列番号：８）；下流プライマー：5'-TCTAGACTAGTTGAGCTTGCTGCAGATCTCCAG-3'（配列番号：９）を用いて、かずさDNA研究所より提供された全長KIAA0537がライゲートしたpBluescript II SK+ベクターより調製した。PCR産物をサブクローニングのためpT7-Blue Tベクターへとライゲートさせ、次いでHindIII及びXbaIにより消化された挿入cDNAをpcDNA3.1(+)発現ベクターへと再ライゲートさせた。アンチセンスベクターの調製のため、pcDNA3.1(-)発現ベクターへも挿入cDNAをライゲートさせた。
【０１０５】
（２）細胞系及びトランスフェクション
ヒト肝癌細胞系HepG2は、10％ウシ胎児血清（FCS：Sigma Chemical Co.,Ltd.,MO）が補足されたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において維持した。トランスフェクションのため、細胞を2.5×105／ウェルで6穴プレートに播き、次いである程度修飾されたTransFast Transfection Reagent（5μg DNA／ウェル：Promega Corporation,WI）を使用してトランスフェクションを実施した。48時間後、ヒトARK5発現クローンの調製のため、G418選択を1mg/mlで実施した。
【０１０６】
（３）抗体及び組換えタンパク質
FLAGに対するモノクローナル抗体、抗FLAG結合アガロース、組換え活性型Akt1、並びにドミナントネガティブ及びドミナントアクティブAkt1発現ベクターは、Upstate Biotechnology（NY）より購入した。
【０１０７】
（４）細胞死誘導アッセイ
細胞死誘導は、以前に記載されたようなHoechst 33342/PI染色法（Hasegawa et al., Cancer Res. 1996, 56, 1713-1718；Shimizu et al., Oncogene 1996, 12, 2045-2050）により評価した。Hoechst 33342及びPIは、Molecular Probesより購入した。処理後、細胞を収集し、Hoechst 33342及びPIで染色し、次いで蛍光顕微鏡により観察した。PIで染色された核を保持する細胞の、全細胞（約1000個）に対する比により、細胞誘導比を示した。
【０１０８】
（５）Akt1インビトロリン酸化アッセイ
FLAGタグを有するタンパク質を、抗FLAG結合アガロースにより細胞溶解物から単離し、25ｍＭトリス（pH7.5）、2ｍＭ DTT、10ｍＭ MgCl2を含有するキナーゼ緩衝液に懸濁させた。続いて、100μM [γ-32P]ATP（20μCi）及び組換え活性型Akt1を、組換えタンパク質を含有するキナーゼ緩衝液に添加し、30℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、アガロースを0.1％ NP-40を含有するPBSで6回洗浄し、PBSに再懸濁させ、放射性同位体活性をシンチレーション計数器（Beckman Coulter,Inc.,CA）で測定した。さらに、測定された試料を、オートラジオグラフィーのため7.5％ SDS-PAGE上で分離した。
【０１０９】
（６）細胞系及び細胞培養
ヒト膵臓癌細胞系PANC-1に対しARK5が安定的にトランスフェクトされたPANC-1細胞系（P/ARK）を、10％ウシ胎児血清（FCS：Sigma Chemical Co.,Ltd.,St.Louis,MO）が補足されたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において維持した。
【０１１０】
（７）インビトロ腫瘍転移アッセイ
インビトロ腫瘍転移アッセイは、Matrigel-Coated Invation Chamber（Becton-Dickinson Company,Franklin Lakes,NJ）を用いて実施した。細胞（5×104個／チャンバー）を培養培地を含む各チャンバーに播き、次いで内側チャンバー及び外側チャンバーの培地を6週間後に交換した。48時間後、浸潤した細胞を、位相差顕微鏡下で計数した。
【０１１１】
（８）MMP発現に関するウェスタンブロッティング分析
PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系を2.5×105個／ウェルで6穴培養プレート上に播いた。24時間後、培地を無血清DMEMに交換し、無血清培養を48時間実施した。培養後、培地を収集し、centriprep（Millipore Corporation,Bedford,MA）により濃縮し、細胞をPBS-1% NP-40により溶解させた。SDS-PAGEにより分離した濃縮培地及び細胞抽出物を、半乾燥ブロッティングシステムによりニトロセルロース膜へと転写した。膜を、室温で1時間、5％(w/v)スキムミルク（Becton-Dickinson Co.）を含有するPBSでブロッキングし、PBSと0.05％Tween20との混合物（Sigma,Tween-PBS）で洗浄し、次いでMMP-2、MMP-9、又はMT1- MMPに対する抗体（Fuji Chemical Co.,Ltd.,Toyama,Japan）のPBS希釈物と共に室温で一夜インキュベートした。Tween-PBSで洗浄した後、膜を、2000倍希釈のHRP結合抗マウスIgG抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,CA）と共にインキュベートした。膜をTween-PBSで洗浄し、次いでECLシステム（Amersham Pharmacia Biotech K.K.,UK）により可視化した。
【０１１２】
（９）インビボ腫瘍形成性アッセイ
PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系の腫瘍形成性は、5×106個の細胞を、6週齢雄BALB/c nu/nuマウスの背部へ皮下移植することにより調査した。12週間にわたり、各腫瘍の長さ（L）及び幅（W）の直径を測定し、腫瘍容積を次式により計算した。腫瘍容積＝(L/2)×(W/2)2×π×(4/3)。移植後12週間後に、マウスを屠殺し、組織をホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋し、8μmの連続切片を調製した。切片を、Delafieldのヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【０１１３】
[実施例１]  ARK5の同定
本発明者らは、ヒト精巣一本鎖DNAから、AMPKファミリー遺伝子SNARKをコードするヒトcDNAを単離し、このタンパク質に対するポリクローナル抗体を調製した。その抗体を使用して、いくつかのヒト細胞系、肺癌PC-10及びA549、膵臓癌PANC-1及びASPC-1、肝癌HepG2及びHLE、並びに繊維芽細胞HFにおけるSNARKの内因性の発現を調査した。図１に示されるように、イムノブロッティングにより、試験された細胞系のうちのいくつかにおいて、74kDaの未知の交差反応性タンパク質の発現が明らかとなった（強：PC-10、PANC-1、ASPC-1、及びHLE；弱：A549及びHF；無：HepG2）。
【０１１４】
本発明者らは、ヒトSNARKアミノ酸配列、又は抗ヒトSNARK抗体を調製するために使用したペプチド配列、及びNational Cancer Institute（米国）のヒトタンパク質データベースを使用したBLAST検索分析により、この74kDaの未知のタンパク質を同定することを試み、KIAA0537 cDNAクローン（Nagase et al. DNA Res 1998, 28, 31-39）によりコードされる推定タンパク質を見出した。図２に示されるように、SNARK及びKIAA0537タンパク質の推定触媒ドメインは、84％の類似性を示し、抗ヒトSNARK抗体の調製に使用したペプチド配列も、KIAA0537タンパク質との高い類似性を示した。
【０１１５】
このKIAA0537 cDNAクローンがSNARK抗体により検出された未知の74kDaタンパク質をコードしているか否かを調査するため、本発明者らは、FLAGタグを有するKIAA0537 cDNAを調製した。そのcDNAをHepG2において発現させると、抗FLAGモノクローナル抗体及び抗SNARKポリクローナル抗体を使用したイムノブロッティングが、共通の74kDaのバンドを与え、そのことにより、KIAA0537 cDNAが、前述の未知の74kDaタンパク質をコードしていることが示唆された（図３Ａ）。
【０１１６】
4種の因子、AMPK-α1、AMPK-α2、MELK、及びSNARKがAMPKファミリーの触媒サブユニットとして同定されているため（図３Ｂ）、本発明者らは、KIAA0537をARK5（AMPK-Related Kinase 5：AMPK関連リン酸化酵素5）と名付けた。ARK5アミノ酸配列（配列番号：２）の相同性検索分析により、ARK5がヒトSNARKと55.0％の全体相同性を有することが明らかとなった（図３Ｂ）。ARK5は、AMPK-α1、AMPK-α2、MELKとも、それぞれ47％、45.8％、42.4％の相同性を示した（図３Ｂ）。これらのデータは、ARK5がAMPにより活性化されるセリン／トレオニンプロテインキナーゼであることを強く示唆している。
【０１１７】
74kDa のバンドに関する抗SNARKとの交差反応を示さないHepG2細胞に、ARK5発現ベクターをトランスフェクト（H/ARK）することにより、直接、この可能性を検討した（図１及び図４Ａ）。図４Ａに示されるように、H/ARKは、抗SNARK抗血清を使用したウェスタンブロット上に74kDaの明瞭なバンドを示した。これは、免疫沈降法によりさらに確認された。まず、親HepG2細胞系及びH/ARK系からの細胞抽出物を、抗FLAG抗体で免疫沈降させ、上清及び免疫沈降物の両方を抗SNARK抗血清を使用したウェスタンブロット分析にかけた。H/ARK細胞由来の免疫沈降物のみが、強い反応性を与えた（図４Ａ）。基質としてGST-SAMSペプチドを使用したインビトロのキナーゼ活性は、トランスフェクション後、明らかな増加を示した。その活性は、200μM AMP（図４Ｂ）の存在下でさらに刺激され、従って、ARK5がヒトAMPKファミリーの新規メンバーであることが強く示された。
【０１１８】
[実施例２]  ARK5はグルコース飢餓に対する抵抗性を媒介する
本発明者らは、栄養飢餓に対する抵抗性が腫瘍悪性度の決定因子の一つであること（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press；Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207；Esumi et al., J. Biol. Chem., in press）、グルコース飢餓に対する抵抗性がAMPKの活性化（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press）又は低酸素条件（Esumi et al., J. Biol. Chem., in press）により誘導されうることを提唱した。これに関して、グルコース飢餓に対する抵抗性のメカニズムにおけるARK5の関与を調査した。ヒト肝癌細胞系HepG2に定常状態酸素圧（21%O2）下でグルコース飢餓を施した場合、24時間の処理中、細胞の90％超が壊死性の細胞死を起こしたが、同様の処理中に細胞死を示したH/ARK細胞は40％のみであった（図５Ａ）。1％酸素圧において細胞にグルコース飢餓を施した場合、HepG2の90％超が生存したが、ARK5に対するアンチセンスRNA発現ベクターをHepG2細胞にトランスフェクトした場合には約50％の細胞が死滅した（図５Ｂ）。これらの結果は、ARK5が、グルコース飢餓に対する抵抗性に関与していることを明白に示している。
【０１１９】
[実施例３]  ARK5はAktによるSer600のリン酸化により活性化される
GST-SAMSリン酸化として測定される全AMPK活性は、HepG2においては、1hrのグルコース飢餓中わずかに増加したが、H/ARK細胞においては、同様の1hrのグルコース飢餓中、劇的に増加した（図６Ａ）。ARK5発現ベクターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターにより駆動されるため、ARK5のmRNAレベルは、1hrのグルコース飢餓中、変化せず、ARK5タンパク質も変化を示さなかった（図６Ａ）。
【０１２０】
本発明者らは、HepG2細胞において、もう一つのプロテインキナーゼAktが栄養飢餓の直後に活性化されることを以前に見出した（Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207）。図６Ｂより明らかなように、Aktは、迅速にリン酸化された（図６Ｂ）。従って、本発明者らは、AktとARK5との間に、ARK5の活性化をもたらす何らかの相互作用が存在するか否かを決定した。
【０１２１】
ARK5のアミノ酸配列分析より、図７に示されるように、完全に保存された推定Aktリン酸化部位がC末端部分に存在することが明らかとなった。これらの観察は、ARK5がAktによるSer600のリン酸化により活性化されることを示唆している。この可能性をインビトロで直接検討した。SerをAlaに置換することにより、ARK5のSer600点突然変異を構築し、FLAGタグを有する発現ベクターを構築した（ARK5/SA）。野生型及びARK5/SAの両方をHepG2細胞へとトランスフェクトし、FLAGタグを有するARK5及びARK5/SAを、抗FLAG抗体結合アガロースによる免疫沈降により精製した。GST-SAMSリン酸化活性及びARK5リン酸化の両方を、PDK1により活性化されたAkt1の存在下又は非存在下でのインビトロでのインキュベーションの後、調査した。図８の結果は、ARK5のみがAktにより活性化され、同時にリン酸化されることを明白に示した。
【０１２２】
AktによるARK5の活性化をさらに調査するため、インビボでのこれらの成分の生理学的相互作用を調査した。ARK5及びリン酸化Aktの細胞内局在の免疫蛍光実験により、これらの2個の成分が主に細胞質に局在していることが明らかとなった（図９Ａ）。Aktは、HepG2細胞において、グルコース飢餓又はインスリン処理のいずれかにより活性化される。これらの条件下で、ARK5及びAktの共免疫沈降を調査した。その結果、ARK5及びAktは相互に会合しているが、グルコース飢餓又はインスリン処理のいずれかによるAkt活性化の直後に解離することが明白に示された（図９Ｂ）。これらの結果より、ARK5は細胞質においてAktと会合しているが、Aktが何らかの刺激により活性化されると、ARK5がSer600においてリン酸化され、酵素的活性化及びAktからの解離がもたらされることが示された。
【０１２３】
前述のように、HepG2細胞におけるARK5の過剰発現は、グルコース飢餓に対する抵抗性をもたらす。ARK5の酵素的活性化がグルコース飢餓に対する抵抗性にとって実際に必要であるか否かを決定するため、グルコース飢餓中のHepG2生存に対する、ARK5変異体、並びにドミナントアクティブ型及びドミナントネガティブ型のAktのトランスフェクション、そしてAkt活性化の化学的阻害剤の効果を、調査した。図１０Ａに示されるように、24時間のグルコース飢餓中、HepG2細胞の90％超が壊死性細胞死を起こした。野生型ARK5をトランスフェクトすることにより壊死性細胞死は約40％にまで抑制されたが、ARK5/SA又はAktリン酸化部位を含むC末端領域の66アミノ酸を欠くARK5のトランスフェクションによっては抑制されなかった。ドミナントアクティブAktをHepG2細胞へとトランスフェクトした場合にも、細胞死誘導が有意に抑制されたが、ドミナントネガティブAktでは抑制されなかった。ARK5とドミナントアクティブAktとの組み合わせ発現は、さらに約20％にまで細胞死を抑制したが、ドミナントネガティブAkt及び／又はARK5変異体は、抑制することができなかった（図１０Ａ）。これらの結果は、活性型Aktにより活性化されるARK5が、HepG2細胞におけるグルコース飢餓に対する抵抗性にとって不可欠であることを明白に示している。
【０１２４】
これらの観察は、H/ARK細胞を使用することによりさらに確認された（図１０Ｂ）。ドミナントアクティブAktをH/ARK細胞へと導入した場合、細胞死は顕著に抑制された。しかしながら、ドミナントネガティブAktを使用した場合には、より大きく細胞死の誘導が起こった（図１０Ｂ）。PI-3Kの阻害剤、LY294002を含めた場合、Aktの活性化は明白に阻害され、同時に細胞死が増加した。これらの結果は、一過性トランスフェクションの結果と一致している。さらに、グルコース飢餓によるAkt活性化は、LY294002に対する感受性を有することが既知である（Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207）。
【０１２５】
[実施例４]  ATMはARK5標的候補である
本発明者らは、HepG2細胞系において、グルコース飢餓中のp53リン酸化により、細胞周期の進行が、G1期で遅れること、及びATM遺伝子産物がこの過程に関与していることを見出した（Kusakai et al.,発表予定）。細胞生存及び細胞周期進行が、グルコース飢餓中、AMPKにより調節されることが見出されたため（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press；Imamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 2001, 287, 562-567）、本発明者らは、ATMがAMPKの標的であると推測した。図１１Ａに示されるように、アミノ酸配列分析により、ATMが、Akt（2部位：RXRXXS/T（配列番号：１０）；Mayo and Donner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98, 11598-11603）及びAMPK（23部位：XM/I/L/F/VXXXXS/TXXXL/M/I/F/V（配列番号：１１）；Hardie and Carling, Eur. J. Biochem. 1997, 246, 259-273）のためのいくつかの推定リン酸化部位を含有することが明らかとなった。
【０１２６】
Hisタグを有するATM（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 8021-8026）が安定的に発現されているPANC-1細胞（P/ATM）を使用して、32Pインビボ標識実験を実施した。通常の培地中で培養されたP/ATM細胞において、His-ATMへの32P取り込みが検出され、P/ATM細胞にグルコース飢餓を施すと、ATMリン酸化の増加が検出された（図１１Ｂ）。興味深いことに、ARK5に対するアンチセンスRNA発現ベクターの一過性発現によりATMリン酸化は完全に抑制され、ARK5を一過性発現する細胞においてはATMのリン酸化の増加が検出された（図１１Ｂ）。このことは、ARK5が、グルコース飢餓中ATMをリン酸化することを示唆している。この可能性をさらに確認するため、インビトロリン酸化を調査した。図１１Ｃに示されるように、ARK5、又はPDK1により活性化されたAkt1は、単独では、ATMをリン酸化しなかったが、ARK5及び活性型Akt1の両方の存在下ではATMリン酸化が検出され（図１１Ｃ）、従って、ARK5がATMをリン酸化することが直接示された。
【０１２７】
セリン／トレオニンプロテインキナーゼAMPKは、酵母SNF-1の哺乳動物ホモログであり（Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855；Mitchelhill et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 2361-2364；Woods et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 19509-19515）、酵素活性化は、代謝ストレス、低酸素、熱ショック、及び虚血の下にある細胞においてAMP：ATP比の上昇により誘発される（Carlson, Curr. Opin. Microbiol. 1999, 2, 202-207；Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855）。最近、本発明者らは、AMPK活性化が、栄養飢餓中の細胞死に対する腫瘍の抵抗性に関与していることを証明した（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press）。従って、AMPKは、腫瘍細胞生存因子である可能性がある。最近、新規AMPKファミリー遺伝子SNARKがラットcDNAライブラリーより同定され（Lefebvre et al., Biochem. J. 2001, 355, 297-305）、本発明者らは、そのヒトホモログを同定した（Suzuki et al., in press）。
【０１２８】
SNARKに関する研究中、いくつかの組織に由来する腫瘍細胞系において未知の免疫交差反応性の74kDaタンパク質が観察され、本発明者らは、それがARK5であることを見出した。AMPKのα1及びα2サブユニット、並びにSNARKを含む他のAMPKファミリーのメンバーと同様に、ARK5は、SAMSペプチドに対するリン酸化活性を示した。さらに、ARK5のリン酸化活性は、AMPの存在下で促進され、従って、本発明者らは、ARK5がAMPKファミリーの新規メンバーであることを提唱する。AMPKファミリーの中で、ARK5はSNARKに対して最も高い類似性を示し、ARK5の推定触媒ドメインは、SNARKのそれと84％の類似性を示した。
【０１２９】
酸素及び栄養、特にグルコースの供給は、腫瘍細胞の増殖及び生存にとって不可欠であり、これらの成分の欠乏は、腫瘍細胞の重大な損傷を引き起こす（Dang and Semenza, Trends Biochem. Sci. 1999, 24, 68-71；Helmlinger et al., Nat. Med. 1997, 3, 177-182；Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207；Southerland, Science 1988, 240, 178-184）。栄養飢餓は、腫瘍細胞の過剰増殖により引き起こされた供給−需要バランスの崩壊により、いくつかの腫瘍領域において病態生理学的に引き起こされ、そのような領域内の細胞は壊死性の細胞死を起こす（Dang and Semenza, Trends Biochem. Sci. 1999, 24, 68-71；Helmlinger et al., Nat. Med. 1997, 3, 177-182；Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207；Southerland, Science 1988, 240, 178-184）。従って、血液供給の増加、即ち腫瘍血管形成は、腫瘍の進展にとっての中枢であると考えられており、実際、腫瘍悪性度は、多くの場合に腫瘍血管形成と高度に相関していることが見出されている（Forkman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98, 398-400；Folkman, Adv. Cancer Res. 1974, 19, 331-358）。しかしながら、本発明者らは、最近、栄養飢餓に対する抵抗性が様々な癌細胞系の間で大きく異なっており、臨床的に低血管（hypovascular）であることが既知の膵臓癌には、強い抵抗性が観察されることを見出した（Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207）。これらの観察から、本発明者らは、栄養飢餓に対する抵抗性が、腫瘍進展のためのもう一つの決定因子であるという仮説を立てた。Akt及びAMPKが、抵抗性メカニズムに関与していることが見出された（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press；Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207；Kato et al., Oncogene in press）。さらに、元来はグルコース飢餓に対する感受性が極めて高い正常ヒト繊維芽細胞及びヒト肝癌細胞系HepG2において、低酸素により、グルコース飢餓に対する抵抗性が誘導されうる。Akt及びAMPKは、低酸素により誘導される抵抗性に密接に関与していると考えられる（Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press；Esumi et al., J. Biol. Chem., in press）。
【０１３０】
これらの所見を考え合わせ、本発明者らは、Aktシグナル伝達経路とAMPKシグナル伝達経路、特にARK5との間に関連が存在すると推測した。いくつかの種において観察されるAktリン酸化モチーフのコンセンサス配列は、RXRXXS/T（配列番号：５）（Mayo and Donner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98, 11598-11603）であることが確立されている。興味深いことに、ARK5は、595〜600アミノ酸にそのコンセンサス配列を含有しており、Aktにより直接活性化されることが本実施例におけるインビトロリン酸化により証明された。この観察は、ARK5がAktの新規標的であることを強く示している。本実施例において、ドミナントアクティブAkt1も、細胞をグルコース飢餓から救済したが、ARK5発現はHepG2細胞においてイムノブロッティングレベルでは検出されなかった。ARK5に対するアンチセンスRNA発現ベクターは、グルコース飢餓中の細胞死をわずかに促進した。HepG2細胞においてはARK5が低レベルに発現しているのかもしれず、この量のARK5がドミナントアクティブAkt1に応答したのかもしれない。この概念と一致して、細胞生存活性は、ARK5により促進され、ARK5変異体は、ドミナントアクティブAkt1により誘導される細胞生存を取り消した。ARK5は、HepG2においてAktの下流の腫瘍細胞生存因子として作用する。以前の研究において、本発明者らは、AMPK-α1及びα2サブユニットに対するアンチセンスRNA発現ベクターが、HepG2細胞における低酸素により誘導されるグルコース飢餓に対する抵抗性（Esumi et al., J. Biol. Chem., in press）及びPANC-1細胞における構成性の抵抗性（Kato et al., Oncogene in press）を抑制することを見出した。ARK5と、AMPK-α1及びα2とが相互作用するか否かは現在のところ明らかでないが、ARK5がAMPK-キナーゼとして機能する可能性はある。これらの結果に基づき、本発明者らは、ARK5が、Aktの新規基質であること、Aktにより活性化されたARK5が栄養飢餓に対する腫瘍の抵抗性と密接に関与していることを提唱する。
【０１３１】
最近、本発明者らは、AMPKファミリーが、p53蓄積を介した細胞周期停止に関与していることを証明した（Imamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 2001, 287, 562-567）。本実施例において、本発明者らは、AktがARK5の上流エフェクターであることを証明し、従って、グルコース飢餓中のARK5の標的因子を同定することを試みた。ヒト遺伝性疾患であるataxia teleangiectasiaは、神経学的変性及び癌素因により特徴付けられるが、ATMはこの症候群において欠損している遺伝子である（Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2, 215-217；Lavin and Shiloh, Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 177-202；Savitsly et al., Science  1995, 268, 1749-1753）。ATMは、ホスファチジルイノシトールキナーゼファミリーのメンバーであり（Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2, 215-217；Lavin and Shiloh, Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 177-202；Savitsly et al., Science  1995, 268, 1749-1753）、放射線曝露に応答して、p53リン酸化を介してG1/Sチェックポイントを活性化する（Banin et al., Science  1998, 281, 1674-1677；Canman et al., Science  1998）。DNA損傷に応答して、活性化されたATMは、p53をSer15においては直接的に、Ser20においてはChk2により間接的にリン酸化し、細胞周期停止又は細胞死を引き起こす（Banin et al., Science  1998, 281, 1674-1677；Canman et al., Science  1998；Sheih et al., Cell 1997, 91, 325-334）。DNA損傷のセンサーとしての機能に加え、ATMは酸化ストレスのセンサーでもあることが示唆されている（Rotman and Shiloh, Cancer Surv. 1997, 29, 285-304；Pearce and Humphrey, Trends Cell Biol. 2001, 11, 426-433）。A-T細胞及びAtm遺伝子破壊マウスにおける増加した酸化ストレスの証拠がこれを支持している（Barlow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 9915-9919；Gatei et al., Oncogene. 2001, 20, 289-294）。ARK5がグルコース飢餓に応答してインビトロ及びインビボでATMをリン酸化するという本発明者らの観察は、グルコース欠乏中の細胞生存の維持におけるATM/p53経路の関与（Kusakai et al., in press）と共に、細胞内シグナル伝達におけるATMのより全般的な役割をさらに支持する。アミノ酸配列分析より、ATMが、AMPK（23部位）及びAkt(2部位)によるリン酸化のためのコンセンサス配列を含有していることが明らかとなった。Akt1により活性化されたARK5は、ATMをリン酸化したが、活性型Akt1は単独ではリン酸化しなかった。それは、おそらく、コンフォメーションの拘束又はATMと複合体を形成する他のタンパク質の存在のためであろう。非損傷シグナル伝達におけるATMの役割のその他の証拠は、インスリンにより活性化されたATMキナーゼが、タンパク質合成の制御因子4E-BPI（PHAS-1）をリン酸化することを示したYang and Kastan,2001により提供されている。本明細書に記載された結果は、その報告と適合しており、本発明者らは、インスリン処理がAktを活性化し、次にAktがARK5を活性化し、それにより、ATMの活性化がもたらされうることを証明した。ATMがグルコース飢餓条件におけるARK5の下流エフェクターであることも、本発明者らは示した。この経路によるATMの活性化は、提唱されているインスリン処理後スキームに付加的な経路を追加するであろう（Yang and Kastan, Nat Cell Biol. 2001, 2, 893-898；Lavin, Nat Cell Biol. 2000, 2, 215-217）。
【０１３２】
本実施例において、本発明者らは、ヒトAMPKファミリーの新規メンバーとしてARK5を同定した。ARK5活性化は、Aktにより制御され、活性化されたARK5は、次に、グルコース飢餓中、ATMをリン酸化した。リン酸化されたATMは、p53のリン酸化及び蓄積を介して細胞周期のG1期における停止を誘導するため（Banin et al., Science  1998, 281, 1674-1677；Canman et al., Science  1998；Sheih et al., Cell 1997, 91, 325-334）、本所見は、AMPKファミリーがグルコース飢餓中のp53蓄積に関与しているという本発明者らの以前の概念と一致している（Imamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 2001, 287, 562-567）。Akt活性化はインスリン又はインスリン様増殖因子（IGF）に対する感受性を有する細胞において証明されており、インスリン及びIGFは細胞増殖に不可欠である（Lawlor and Alessi, J. Cell Sci. 2001, 114, 2903-2910）。興味深いことに、ヒト膵臓癌細胞系は、ARK5の発現を示すが、ヒト正常膵臓細胞は示さない（かずさDNA研究所ホームページ上のKIAA0537の公式データ）。従って、この矛盾は、ARK5細胞の分布によると考えられる。本実施例の結果に基づき、本発明者らは、ARK5が腫瘍悪性度と関連した栄養飢餓に対する腫瘍の抵抗性において重大な役割を果たしていることを提唱する。従って、ARK5は癌治療のための新規の標的になりうる。
【０１３３】
[実施例５]  ARK5はインビトロで腫瘍転移を誘導した
腫瘍転移においては、腫瘍移動活性が必須要件の一つであり、最近、腫瘍移動がAkt活性化の結果として引き起こされることが報告されたが（Kim D et al., FASEB J 2001, 15, 1953-1962;Higuchi M et al., Cur Biol 2001, 11, 1958-1962）、Aktが腫瘍移動を誘導する分子メカニズムは未だ不明である。ARK5は栄養飢餓中のAktの基質であるため、本発明者らは、ARK5が腫瘍移動を誘導するか否かを調査した。
【０１３４】
PANC-1細胞系をマトリゲルコーティングを施された浸潤チャンバーに播くと、48時間で約150個の細胞が、マトリゲル層を通り下方チャンバーの底へと転移した（図１２Ａ）。しかしながら、転移した細胞の大部分がチャンバーの底に付着することができず、図１２Ｂに示されるように重度の損傷を示した。対照的に、P/ARK細胞系は400個超が転移を示し、大部分がチャンバーの底に付着し生存可能であった（図１２Ａ及びＢ）。従って、ARK5が腫瘍細胞の移動を刺激し、転移細胞の生存を支持することが示された。しかしながら、P/ARK細胞系において検出された腫瘍細胞転移は、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ／Akt経路の強力かつ特異的な阻害剤LY294002（Vlahos CJ et al., J Biol Chem 1994, 269, 5241-5248.）の添加により、完全に抑制された。これらの所見は、ARK5がAktの刺激の下で腫瘍転移を誘導することを強く示唆している。
【０１３５】
[実施例６]  ARK5により誘導されたマトリックスメタロプロテイナーゼ産生
マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は、細胞−細胞マトリックス及び基底膜マトリックスの分解による腫瘍転移に密接に関与しているため（Liotta et al., Nature 1980, 284, 67-68）、本発明者らは、2つの細胞系のMMP産生を比較した。RT-PCR分析により、P/ARK細胞系においては、MMP-2（ゼラチナーゼA）及びMMP-9（ゼラチナーゼB）のmRNAレベルが顕著に増加しているが、MMP-3（ストロメライシン-1）（データは示していない）は増加していないことが明らかとなり、ウェスタンブロッティング分析によってもこれらの酵素の明白な増加が示された（図１３）。これは、これらの酵素の不活型について特に当てはまり、従って、ARK5がMMPの分泌及び活性化に密接に関与していることが示された。膜結合型マトリックスメタロプロテイナーゼとして同定されたMT1-MMPは、膜固定ドメインのタンパク質分解によるMMP-2及びMMP-9の活性化に関与している（Okada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 2730-2734;Koshikawa et al., J. Cell Biol. 2000, 148, 615-624）。MT1-MMP発現はPANC-1細胞系においてはほぼ検出不可能であったが、P/ARKにおいては劇的に増加していた（図１３）。従って、ARK5がMT1-MMP産生を介してMMP-2及びMMP-9の分泌及び活性化を誘導することが示唆された。さらに、これらのMMP産生は、P/ARK細胞をマトリゲル上で培養した場合、より強くなった（図１３）。
【０１３６】
[実施例７]   ARK5による腫瘍形成増加及び壊死抑制
インビトロ実験より、ARK5が腫瘍形成、浸潤、及び転移を刺激しうることが強く示唆された。そこで、PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系をヌードマウスに移植した。図１４に示されるように、移植から12週間後、P/ARK細胞系は、PANC-1細胞系と比較して10倍の腫瘍容積の増加を示した（表１）。
【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
移植から12週間後、PANC-1により形成された腫瘍巣の全てが、中心の壊死を示した（図１５Ａ）。対照的に、P/ARK細胞系は、小型腫瘍巣（1/5）及び大型腫瘍巣（4/5）という2つの型の腫瘍巣を形成した。小型P/ARK腫瘍巣においては、壊死領域は観察されず、中心領域の腫瘍細胞は生存していた（図１５Ａ）。興味深いことに、大型P/ARK腫瘍巣は、断片的（piece meal-like）壊死を示したが、大規模な中心壊死は示さなかった（図１５Ｂ）。これらの所見より、P/ARKにより形成された腫瘍巣が壊死誘導に対して抵抗性を有することが推測された。一方、ARK5はグルコース飢餓により引き起こされる細胞死に対する抵抗性を示す所見が得られている。従って、本実施例における所見は、上記所見とよく一致している。そこで、本発明者らは、PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系により形成された腫瘍巣内の壊死領域を測定した。図１５Ｃに示されるように、P/ARK腫瘍は、わずか約20％の壊死領域を含有していたが、PANC-1の腫瘍では約60％の領域が壊死を示した。腫瘍壊死は、酸素・栄養供給とエネルギー需要とのバランス、及び内因的な飢餓に対する腫瘍の抵抗性により決定される。血液供給は、腫瘍微小血管密度により仮定された。これらの結果は、ARK5を高レベルに発現している細胞が、腫瘍巣内の壊死に対する高い抵抗性を保持していることを強く示唆している。
【０１３９】
[実施例８]  ARK5により誘導された筋肉浸潤及び腸管膜転移
ARK5のインビボ効果をさらに解明するため、病理学的観察を実施した。図１６Ａ及び表２に示されるように、P/ARK由来の腫瘍巣（3/5）は筋肉層への浸潤を示したが、PANC-1由来の腫瘍巣（0/5）は示さなかった。PANC-1細胞系（1/5）及びP/ARK細胞系（1/5）の両方が、肝臓転移を示した（表２）。
【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
しかしながら、興味深いことに、P/ARK細胞系（1/5）を移植されたヌードマウスにおいては、転移が観察された。図１６Ｂに示されるように、転移巣が腸管膜に観察され、腫瘍細胞が筋肉層及び腸管上皮層へと浸潤していた。
【０１４２】
本実施例において、ARK5は、インビトロ実験において腫瘍細胞転移を刺激した。P/ARK細胞系は、PANC-1細胞と比べて2倍の転移活性の増加を示し、そして活性はAktに依存していた。さらに、ARK5は、腫瘍転移の中心的因子であるMMP-2及びMMP-9の活性化も示した。最近、MMP-2及びMMP-9を分泌する因子（活性化因子）が同定され、MT1-MMP（membrane type-1 matrix metalloproteinase／参照（Okada et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1995, 92, 2730-2734））と名付けられた。そして、本発明者らの結果は、ARK5がMT1-MMPの発現を新たに誘導することを証明した。これらの結果に基づき、本発明者らは、インビトロで観察された腫瘍細胞転移が以下のようにして起こったと提唱する。ARK5がAkt活性化の刺激によりMT1-MMP発現を誘導する。新たに誘導されたMT1-MMPが、続いて、MMP-2及びMMP-9の膜結合ドメインをタンパク質分解し、それらを培地中へ分泌する。放出されたMMP-2及びMMP-9がマトリゲルを溶解させ、P/ARK細胞が孔を通って下方チャンバーの底へと転移する。
【０１４３】
ARK5により誘導された腫瘍の進展及び転移は、インビボでも証明された。PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系をヌードマウスに移植すると、P/ARK細胞系が移植されたマウスにおいては、腫瘍容積の10倍超の増加が観察された。さらに、P/ARK細胞系により形成された腫瘍巣においては、進行中の壊死性細胞死が有意に抑制されていた。腫瘍巣内の細胞の生存及び増殖は、栄養及び酸素により維持されており、従って、腫瘍巣の中心の細胞は、グルコース及び酸素の不足により、壊死性細胞死を起こす（Dang et al., Trends Biochem. Sci. 1999, 24, 68-71;Southerland, Science 1988, 240, 178-184;Helmlinger et al., Nat. Med. 1997, 3, 177-182）。ARK5は、インビトロで、栄養飢餓により誘導される細胞死に対する抵抗性を示した。従って、ここでのインビボ所見は、インビトロ観察と相関している。
【０１４４】
さらに、本実施例において、P/ARK細胞系により形成された腫瘍巣においては、独特の壊死パターンが観察された。一般的には、大部分の腫瘍巣が、中心壊死パターンを示し、本実施例においてPANC-1細胞系により形成された腫瘍巣も、その一般的なパターンを示した。しかしながら、興味深いことに、P/ARK由来腫瘍巣内の壊死領域は、いくつかの部分に分離されており、それは、「島」ではなく「群島」のようであった。本実施例において、本発明者らは、それを「虫食い状壊死（piece-meal like necrosis）」として評価した。各断片的壊死領域は、PANC-1細胞系により形成された腫瘍巣内の壊死領域よりも有意に小さく、領域を全て合わせたとしても、有意に小さかった。従って、本発明者らは、この独特の壊死パターンも、ARK5により誘導された抵抗性によるものと推測する。
【０１４５】
本実施例においては、ARK5による腫瘍転移が、インビトロ及びインビボの両方で証明された。腫瘍巣の中心領域に存在する大部分の細胞は、腫瘍過剰増殖の結果としての栄養飢餓により壊死を起こしている。しかしながら、膵臓癌細胞のようないくつかの腫瘍細胞は、栄養飢餓に対する高い抵抗性を示し、その抵抗性はAkt及びAMPKの活性による。本発明者らは、腫瘍転移は、不都合な微小環境から、より好都合な環境への腫瘍細胞の逃避行為であると推測している。その推測に基づき、本発明者らは、Akt及びAMPKファミリーの両方による膵臓癌転移を以下のように仮定した。腫瘍過剰増殖の結果として、中心領域の腫瘍細胞が栄養減少による細胞ストレスを受ける。この栄養飢餓がまずAkt活性化を引き起こし、活性化されたAktが続いてARK5をリン酸化する。活性型Aktの刺激により、活性化されたARK5が、MT1-MMP発現を誘導し、誘導されたMT1-MMPが、MMP-2及びMMP-9を活性化する。このようにして、ARK5を高レベルに発現している腫瘍細胞は、MMP-2及びMMP-9を使用して、他の組織へと転移する。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明によって、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤、および、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ataxia teleangiectasiaを治療または予防するための薬剤の提供が可能になった。さらに、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ataxia teleangiectasiaの検査方法および該検査方法に使用可能な検査薬の提供が可能になった。
【０１４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  未知タンパク質の抗SNARK抗体との交差反応を示す写真である。いくつかの細胞系（肺：肺癌PC-10及びA549、膵臓：膵臓癌PANC-1及びASPC-1；肝臓：肝癌HepG2及びHLE；並びに繊維芽細胞：HF）からの細胞抽出物を、ヒトSNARKに対するポリクローナル抗体によりイムノブロットした。アステリスクは、未知の74kDaのタンパク質の位置を示す。
【図２】  KIAA0537（上）及びヒトSNARK（下）の推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号：２および１２に記載）を示す図である。ボックスA：推定触媒ドメインの領域を、ボックスBはヒトSNARKに対するポリクローナル抗体の調製に使用したアミノ酸配列を示している。
【図３】  新規AMPK関連プロテインキナーゼを示す写真および図である。
（Ａ）  FLAG- KIAA0537の発現ベクターでトランスフェクトされた（+）又はトランスフェクトされていない（-）HepG2細胞からの細胞抽出物を、抗FLAGモノクローナル抗体又は抗SNARKポリクローナル抗体によりイムノブロットした。
（Ｂ）  AMPKファミリーに属する分子の進化系統樹及び概略モデルを示している。
【図４】  ARK5のSAMSペプチドリン酸化活性を示す写真および図である。
（Ａ）  ヒトSNARKに対するポリクローナル抗体によるイムノブロッティング分析を、HepG2細胞又はH/ARK細胞に由来する細胞抽出物又は抗FLAGモノクローナル抗体による免疫沈降物に対して実施した。
（Ｂ）  200μM AMPの存在下（+）又は非存在下（-）において、細胞抽出物（HepG2及びH/ARK）又は組換えFLAG-ARK5（rARK5）によるSAMSリン酸化を測定した。酵素活性は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。アステリスクは、統計学的有意性p<0.01（t検定）を示す。
【図５】  グルコース飢餓に対する抵抗性におけるARK5の関与を示す図である。
（Ａ）  グルコースを含む（+）又は含まない（-）培地を24時間施したHepG2細胞又はH/ARK細胞において、Hoechst33342/PI染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。アステリスクは、統計学的有意性p<0.01（t検定）を示す。
（Ｂ）  ARK5に対するアンチセンスRNA発現ベクターでトランスフェクトされた（黒）又はトランスフェクトされていない（白）HepG2細胞に、正常酸素（21％）又は低酸素（1％）の酸素圧下で、24時間、グルコースを含む（+）又は含まない（-）培地を施した。インキュベーション後、Hoechst33342/PI染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。アステリスクは、統計学的有意性p<0.01（t検定）を示す。
【図６】  AktによるARK5の活性化を示す図および写真である。
（Ａ）  グルコースを含む（+）又は含まない（-）培地中で1時間培養されたHepG2細胞又はH/ARK細胞に由来する細胞抽出物のSAMSリン酸化活性を測定した。酵素活性は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している（上グラフ）。酵素活性の測定に使用された細胞抽出物におけるARK5発現も、調査した（下パネル）。
（Ｂ）  示された時間、グルコース飢餓を施されたHepG2細胞又はH/ARK細胞に由来する細胞抽出物を、Ser473においてリン酸化されたAkt又は全Aktに対するポリクローナル抗体によりイムノブロットした。
【図７】  ARK5及び他の既知のAkt基質の推定Aktリン酸化部位のアミノ酸配列の比較を示す図である。ARK5タンパク質の概略モデル中の影付きのボックス及び黒塗りボックスは、それぞれ、推定触媒ドメイン領域及びAktリン酸化モチーフ領域である。図中のアミノ酸配列は、配列番号：１３〜２０に記載している。
【図８】  ARK5のAktリン酸化部位の突然変異分析を示す図である。ARK5及びARK5/SAを、インビトロで活性型Akt1の存在下（+）又は非存在下（-）でインキュベートした。インキュベーション後、シンチレーション計数により、ARK5（上）又はSAMS（下）のリン酸化を測定した。32P取り込みは、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。アステリスクは、統計学的有意性p<0.01（t検定）を示す。
【図９】  AktとARK5との相互作用を示す写真である。
（Ａ）  H/ARK細胞を、グルコースを含む（G+）又は含まない（G-）培地中で1時間培養し、次いで抗FLAGモノクローナル抗体（ARK）、又はSer473においてリン酸化されたAktに対するポリクローナル抗体（pAkt）による免疫蛍光実験を実施した。
（Ｂ）  H/ARK細胞に、0〜60分間、グルコース飢餓又はインスリン刺激を施し、全細胞抽出物又はFLAG又はAktに対する抗体による免疫沈降物を、全Akt、リン酸化されたAkt、又はFLAGに対する抗体によりブロットした。
【図１０】  （Ａ）  ARK5、ドミナントアクティブAkt、ドミナントネガティブAkt、ARK5欠失変異体、及び／又はARK-SA変異体で一過性トランスフェクトされた、又はトランスフェクトされていないHepG2細胞に、グルコース飢餓を24時間施したことを示す図である。インキュベーション後、Hoechst33342/PI染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。
（Ｂ）  ドミナントアクティブAkt又はドミナントネガティブAktで一過性トランスフェクトされた、又はされていないH/ARK細胞に、LY294002（20μM）の存在下又は非存在下で、24時間グルコース飢餓を施したことを示す図である。インキュベーション後、Hoechst33342/PI染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。
【図１１】  ARK5によるATMのリン酸化を示す図および写真である。
（Ａ）  各コンセンサス配列がボックス内に示されている。AMPK（上）又はAkt（下）によるリン酸化部位の概略モデルが、ATM配列上に矢印により示されている。各コンセンサス配列が、それぞれボックス内に示されている。
（Ｂ）  5μM CdCl2の添加により16時間ATM発現が誘導されたP/ATM細胞（Zhang et al.,1997）に、ARK5又はARK5/ASを24時間トランスフェクトした、又はトランスフェクトしなかった。トランスフェクション後、32Pのインビボ標識を実施し、細胞をグルコースを含む又は含まない培地中で1時間インキュベートした。His-ATMへの32P取り込みを、Ni-アガロース収集により検出し、5％SDS-PAGEにより可視化した。
（Ｃ）  PDK1により活性化されたAkt1（2μg）の存在下又は非存在下で、His-ATM（2μg）をARK5と反応させた、又は反応させなかった。His-ATMへの32P取り込みを、Ni-アガロース収集により検出し、5％SDS-PAGEにより可視化した。
【図１２】  マトリゲルコーティングが施された浸潤チャンバーを使用したインビトロ腫瘍転移アッセイを示す図および写真である。
（Ａ）  PANC-1細胞系（ARK5-）及びP/ARK細胞系（ARK5+）を上方チャンバーに播き、20μM LY294002の存在下（+）又は非存在下（-）で48時間インキュベートした。インキュベーション後、下方チャンバーの底へと転移した細胞を計数した。転移細胞の数は、3回の実験の平均として示されており、バーはSE値を表している。
（Ｂ）  PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系を浸潤チャンバーで48時間培養し、次いで、48時間後、下方チャンバーの底へと転移した細胞を位相差顕微鏡で観察した。
【図１３】  MMPの分泌及び発現を示す写真である。PANC-1細胞系（ARK5-）及びP/ARK細胞系（ARK5+）を、マトリゲルコーティングが施された（+）又は施されていない（-）6穴プレートにおいて、無血清培地で48時間培養した。培養後、MMP-2及びMMP-9の分泌の検出のため培養培地を濃縮し、MT1-MMP発現の調査のため細胞抽出物を収集した。
【図１４】  ヌードマウスにおけるPANC-1細胞系及びP/ARK細胞系の腫瘍形成性を示す図である。PANC-1細胞系（白）及びP/ARK細胞系（黒）をヌードマウス（各5匹）へと移植し、腫瘍容積を12週間にわたり測定した。腫瘍容積は、5個のデータの平均として示されており、バーはSE値を表している。
【図１５】  ヌードマウスにおいてPANC-1細胞系及びP/ARK細胞系により形成された腫瘍の組織学的観察を示す写真および図である。移植から12週間後、PANC-1細胞系及びP/ARK細胞系により形成された小型（Ａ）及び大型（Ｂ）腫瘍巣を抽出し、HE染色した。壊死領域は「N」として示されている。さらに、各腫瘍巣の中心領域が、それぞれ300倍に拡大されている。
（Ｃ)  各腫瘍巣内の壊死領域を測定し、壊死領域の比率を5個のデータの平均として示した。バーはSE値を表している。
【図１６】  筋肉浸潤（Ａ）及び腸管膜転移（Ｂ）を示す写真である。M：筋肉；T：腫瘍；ML：筋肉層；Int.：腸管。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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