(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７位のアミノ酸残基がバリンに置換され、１９５位のアミノ酸残基がシステインに置換されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であって、３位置換チロシンの取込能を有するチロシルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７位のアミノ酸残基がバリンに置換され、１９５位のアミノ酸残基がアスパラギンに置換されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であって、３位置換チロシンの取込能を有するチロシルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７位のアミノ酸残基がアラニンに置換され、１９５位のアミノ酸残基がシステインに置換されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であって、３位置換チロシンの取込能を有するチロシルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７位のアミノ酸残基がバリンに置換され、１９５位のアミノ酸残基がアラニンに置換されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であって、３位置換チロシンの取込能を有するチロシルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項５】
３位置換チロシンが３−ハロゲン置換チロシンである、請求項１〜４の何れかに記載のチロシルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項６】
ハロゲンがヨウ素である、請求項５に記載のチロシルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、タンパク質生産系により３位置換チロシンを含有する蛋白質を製造する方法。
【請求項８】
タンパク質生産系が細胞内のタンパク質翻訳系である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質生産系が無細胞翻訳系である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子により形質転換された細胞。
【請求項１１】
細胞が原核細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
細胞が真核細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、チロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を改変して、元の天然のチロシンよりも非天然型の３位置換チロシンをより効率良く取り込むことができるアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素、好ましくはアミノ酸が２個以上改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体に関するものである。本発明のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素は、元の天然のチロシンよりも非天然型の３位置換チロシン、例えば３−ヨードチロシンをより効率良く取り込むことができ、野生型チロシルｔＲＮＡ合成酵素の基質であるチロシンより強く利用することができるので、これを用いて非天然のアミノ酸を選択的に、かつ位置選択的に含有する蛋白質（アロタンパク質）を高効率で製造することができる。
背景技術
タンパク質のある残基のアミノ酸を、通常蛋白質合成に関わる２０種類以外のアミノ酸（以下非天然型アミノ酸と呼ぶ）に置換した変異型タンパク質が作製されている。このような、非天然型アミノ酸を取り込んだタンパク質は、アロタンパク質（ａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ぶことが提唱されている（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ  ８５（１９８８）ｐｐ６２３７−４１）。特定の残基を、非天然アミノ酸にも置換できることは、２０種類の天然アミノ酸相互の間で置換した場合と比べて、よりきめ細やかで、系統的な改変が可能になる。また、特徴的な蛍光特性を持つアミノ酸、光によって構造を制御できるアミノ酸、光クロスリンカーとして利用できる反応基を備えたアミノ酸などをタンパク質に導入することも行われている。
アロタンパク質を生産するためには、いくつかの手法がある。コイデ（Ｋｏｉｄｅ）らは、培地に加えた非天然アミノ酸を、大腸菌に取り込ませ、特定の一種類の天然アミノ酸の代わりにその非天然アミノ酸を使用して、大腸菌にアロタンパク質を生産させた。しかしながらこの手法では、通常のアミノ酸と、非天然型アミノ酸を、合わせて２０種類しか用いることができない（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ  ８５（１９８８）ｐｐ６２３７−４１）。
別の方法では、事前に別の系でアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、無細胞翻訳系に投入することで、アロタンパク質が生産されている（Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２４４（１９８９）ｐｐ１８２−８）。この方法の難点としては、大量にアミノアシルｔＲＮＡを調製する必要がある点が挙げられる。
非天然アミノ酸を含む２１種類のアミノ酸を含んだタンパク質をさらに大量に調製するためには、非天然型アミノ酸を結合するｔＲＮＡが、翻訳反応を行う系の中で専用のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によってアミノアシル化される人工遺伝暗号系を構築することが必要である。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素はアミノ酸とｔＲＮＡとを特異的に結合させる酵素であり、生物種毎に、一部の例外を除き天然に存在する２０種類のアミノ酸それぞれに対応して２０種類存在する。細胞内にはこの様なａａＲＳがアミノ酸ごとに基本的に一種類存在することで、遺伝暗号に割り当てられるアミノ酸の種類が決まっている。例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）のひとつであるチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）は、チロシンｔＲＮＡを他のアミノ酸のｔＲＮＡから識別してこれにチロシンにしか結合させず、他のアミノ酸とは結合させない。
ところで、ワング（Ｗａｎｇ）らは，Ｏ−メチルチロシンを特異的にアミノアシル化するように改変したメタノコッカスジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｉｉ）由来のＴｙｒＲＳ変異体と、同生物由来のチロシンｔＲＮＡを改変したアンバーサプレッサーｔＲＮＡを大腸菌の中で発現させた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２９２（２００１），ｐｐ４９８−５００）。このメタノコッカスジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｉｉ）のＴｙｒＲＳ、チロシンｔＲＮＡはそれぞれ大腸菌のｔＲＮＡ、ａａＲＳと反応しない。このため、この研究で、Ｏ−メチルチロシンがアンバーコドンに特異的に導入されることが報告されている。
このような人工遺伝暗号系の構築のためには、ホストのａａＲＳと反応しないａａＲＳ・ｔＲＮＡの組を見出だすことと、非天然型アミノ酸と特異的に反応するａａＲＳ変異体の開発を行うことが重要である。非天然型アミノ酸と特異的に反応するａａＲＳは、現在までに前述のＯ−メチルチロシンに特異的なＴｙｒＲＳ改変体しか知られていない。
３位置換チロシンアナログには、細胞間情報伝達にかかわるＤＯＰＡや、タンパクの部位特異的ラベルの標的部位となりうる３−ヨードチロシンなどがあり、これらは生理活性を発揮する非天然型アミノ酸として知られている。したがって、３位置換チロシンアナログに特異的なＴｙｒＲＳを得ることが求められている。このような３位に置換体を持つチロシンアナログを、チロシンよりも効率よく取り込むＴｙｒＲＳ変異体は今のところ知られていない。３位に置換基を持つチロシンアナログを野生型ＴｙｒＲＳよりも効率よく取り込むＴｙｒＲＳ変異体は学会で報告されているが、この変異体はチロシンとチロシンアナログを同程度の効率で取り込んでしまうので、タンパク質の特定の位置に非天然型アミノ酸のみを挿入することには不適当である。
発明の開示
本発明は、非天然型アミノ酸、より詳細にはチロシンのフェニル基の３位に置換基を有する３位置換チロシンを優先的に取り込むことができる新規なチロシルｔＲＮＡ合成酵素を提供する。さらに詳細には非天然型アミノ酸が３−ヨードチロシンなどのチロシンの３−ハロチロシンである新規なチロシルｔＲＮＡ合成酵素を提供する。
また、本発明は、非天然型の３位置換チロシンを優先的に取り込むことができる新規なチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、タンパク質生産系により非天然型アミノ酸を含有する蛋白質（アロタンパク質（ａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ））を製造する新規な方法を提供する。
さらに、本発明は、非天然型の３位置換チロシンをより優先的に効率良く取り込むことができるチロシルｔＲＮＡ合成酵素をデザインするための方法、及びこのような方法でデザインされたチロシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞の提供とその細胞内での非天然アミノ酸を含むタンパク質の生産、また、デザインされたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を添加された無細胞翻訳系における、非天然アミノ酸を含むタンパク質の生産手段を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、チロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を改変して、元の天然のチロシンよりも非天然の３位置換チロシンをより効率良く取り込むことことができるアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素に関する。より詳細には、チロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列をその立体構造に基づいて標的チロシンを認識すると推定される位置のアミノ酸の２箇所以上を他のアミノ酸に改変して非天然型アミノ酸であるチロシンの３位置換体アミノ酸を効率よく、かつ選択的に取り込むことができるチロシルｔＲＮＡ合成酵素に関する。
また、本発明は、チロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を改変することにより、元の天然のチロシンよりも非天然の３位置換チロシンをより効率良く取り込むことことができるアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素を製造する際に、チロシルｔＲＮＡ合成酵素がチロシン又はチロシンのＡＭＰ複合体と結合する位置のアミノ酸を３−Ｄ構造に基づいて決定し、当該アミノ酸を他のアミノ酸に改変、好ましくは２個以上のアミノ酸を他のアミノ酸に改変することを特徴とするチロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を改変する方法に関する。
さらに、本発明は、本発明のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、非天然のアミノ酸を含有する蛋白質を製造する方法に関する。より詳細には、アミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、非天然型アミノ酸であるチロシンの３位置換チロシンを含有してなる蛋白質を製造する方法に関する。
また、本発明は、本発明のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子により形質転換された細胞と、そのような細胞内における非天然アミノ酸を含むタンパク質の生産、また、デザインされたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を添加された無細胞翻訳系における、非天然アミノ酸を含むタンパク質の生産手段に関する。
本発明者らは、アロタンパク質を効率よく、選択的に、かつ大量に製造できる方法について検討してきており、そのために非天然型アミノ酸を優先的に効率よく取り込むことができるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の開発を行ってきた。チロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の１種であり、本発明者らはチロシンの３位置換体がそれ自体で種々の生理活性を有することからチロシンアナログを認識するチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）に着目した。また、大腸菌由来のＴｙｒＲＳは真核生物のチロシンｔＲＮＡと、大腸菌由来のチロシンｔＲＮＡは真核生物のＴｙｒＲＳとそれぞれ反応しないことが知られているので、３位置換チロシンアナログに特異的なＴｙｒＲＳはタンパク質に部位特異的に非天然アミノ酸を取り込むための人工遺伝暗号系の構築の材料として有望でもある。
したがって、以下ではアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の具体的な例としてチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）を挙げて説明する。
本発明者らは、３位置換チロシンアナログに特異的なＴｙｒＲＳを得るために、酵素の基質結合部位のアミノ酸を改良することを検討した。大腸菌由来のＴｙｒＲＳのアミノ酸配列は既に知られており、これを配列表の配列番号１に示すと共に、以下にアミノ酸の１文字表記を用いてそのアミノ酸配列を示す。
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本発明者らは、この中のどのアミノ酸を改変すべきかに付いて検討し、他のアミノ酸を導入する位置を次のようにして決定した。中等度高熱菌のＴｙｒＲＳとチロシル−ＡＭＰの複合体の３−Ｄ構造については、既に報告されており（Ｂｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．，ｖｏｌ  ２０８（１９８８）ｐｐ８３−）、この３−Ｄ構造に基づいて３位置換チロシンアナログを組み込むべき位置を推定した。これは中等度高熱菌におけるＴｙｒＲＳとチロシル−ＡＭＰの複合体との関係であるが、本発明者らはＴｙｒＲＳの生物種間の保存性が高いことから、他の生物由来のＴｙｒＲＳについても同様に考えることができると推測した。
この３−Ｄ構造モデルに基づいて、本発明者らは、大腸菌のＴｙｒＲＳを、３位置換チロシンアナログを組み込むために変異を導入すべき位置として３７位および１９５位のアミノ酸を見出した。野生型のＴｙｒＲＳにおける３７位のアミノ酸はチロシン（Ｙ）であり、１９５位のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）である。前記したアミノ酸配列に下線を引いている箇所である。
まず、大腸菌ＴｙｒＳ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、次のプライマー（１）、（２）を用いたＰＣＲによって増幅した断片を、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、ｐＥＴ２６ｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込むことで、ＴｙｒＲＳの発現ベクターｐＥＴ−ＹＲＳを作成した。
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次に、３７位及び／又は１９５位のアミノ酸を部位特異的に改変する方法を説明する。
まず、３７位又は１９５位の１カ所のみのアミノ酸の置換体を作成した。３７位および１９５位それぞれの１個のアミノ酸の置換体をコードするＤＮＡ配列を作成するために使用したプライマー（３）から（８）を次に示す。
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Ｍは、Ｃ又はＡを示し、Ｎは、Ａ又はＣ又はＧ又はＴを示す。
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次に、３７位及び１９５位の両方のアミノ酸が改変された二アミノ酸置換体を作成した。
前記の工程で作成した３７位および１９５位それぞれの一アミノ酸置換体をコードするプラスミドから、プライマーを用いたオーバーラップ・エクステンション法で二アミノ酸置換体をコードするＤＮＡ配列を作成し、ｐＥＴ−ＹＲＳのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入した。オーバーラップ・エクステンション法は，プライマー（１）と（１０）の組、プライマー（９）と（１１）の組をそれぞれ用いて増幅した２つの断片を精製し、これらとプライマー（１）と（９）を用いたＰＣＲで増幅することによって行った。
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このようにして得られたアミノ酸の改変体とその記号を次の表１に示す。
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前記した工程で得られた完全な変異ＤＮＡフラグメントの各々を、プラスミドｐＥＴＹＲＳ内のテンプレートフラグメントのもとの位置に挿入した。野生型及び変異型ｔｙｒＳ遺伝子を含むプラスミドで、ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１６６，５５７−５８０）に準じた形質転換法により、各々大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）に形質転換した。各々のプラスミドを有する形質転換体を単離し培養することにより、野生型及び変異型ＴｙｒＲＳを発現させた。野生型及び変異型ＴｙｒＲＳタンパク質を大腸菌粗抽出物から精製した。
得られた改変体について基質特異性のアッセイを行った。アッセイは、以下の３種のアッセイ方法を用いた。
第１の方法は、アミノアシル化反応の反応産物の１つであるピロリン酸をピロフォスファダーゼで分解して生産される無機リン酸を定量するロイド（Ｌｌｏｙｄ）らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ２３（１９９５）ｐｐ２８８６−２８９２）を簡略化し、無機リンをＢｉｏｍｏｌ  ｇｒｅｅｎ（フナコシ）を使用して検出することで、アミノアシル化反応の測定を行った。結果を表２及び表３に示す。
第２の方法は、ロイド（Ｌｌｏｙｄ）らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ２３（１９９５）ｐｐ２８８６−２８９２）をそのまま行ったものである。結果を表４に示す。
第３の方法は、ｔＲＮＡ全長に対するチロシンまたは３−ヨードチロシンに対するアミノアシル化活性を、ウオルフソン（Ｗｏｌｆｓｏｎ）ら（Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ，４（１９９８），１０１９−１０２３）に記載される酸性ポリアクリルアミド電気泳動と同様の方法によりアッセイした。結果を図面に代わる写真として第１図に示す。
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表中のマークは、＊＊＊＞＊＊＞＊＞−の順に活性が高いことを示す。
それぞれ、５０ｎＭ、５００ｎＭ、５μＭの酵素濃度で４分間３７℃の反応で、アミノアシル化反応がマイクロプレートリーダーにより検出できたことを示す。アミノ酸濃度は、チロシン２００μＭ、３−ヨードチロシン１ｍＭであった。
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表中のマークは、＊＊＊＞＊＊＞＊＞−の順に活性が高いことを示す。
それぞれ、４分間３７℃のアミノアシル化反応によって、酵素濃度２５ｎＭで強く、２５０ｎＭで強く、２５０ｎＭで弱く、反応が検出できたことを示す。アミノ酸濃度は、チロシン２００μＭ、３−ヨードチロシン１ｍＭであった。
表２は、野生型、８個の１個のアミノ酸を変異させた酵素のアミノアシル化活性を、表３は野生型、３７Ｖ及び１６個の二重変異酵素のアミノアシル化活性を列記する。Ｔｙｒ３７及びＧｌｎ１９５の他のアミノ酸への置換により得られた酵素変異体に関して、３位置換チロシンアナログ（この実験では３−ヨードチロシン）に対するアミノアシル化活性を実質的に増加させた。一方、相対的に、これらのタンパク質の、チロシンについての特異的アミノアシル化活性は、減少する。それゆえ、これらの酵素変異体の相対的チロシンアナログ／チロシン比は野生型酵素のそれより高くなってくるものが出現した。
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表４は，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ２３（１９９５）ｐｐ２８８６−２８９２に記されているＬｌｏｙｄらの方法で行った二重変異酵素のアミノアシル化活性を列記したものである。４つの二重変異酵素はＴｙｒ３７及びＧｌｎ１９５の両方の変異の利点を組み合わせる。例えば、ＶＣの相対的チロシンアナログ／チロシン比は１０を超え、その特異的アミノアシル化活性は、Ｇｌｎ１９５に更なる変異の導入のため、単一変異酵素３７Ｖより高い。ＶＮ、ＶＳ、及びＡＣは、相対チロシンアナログ／チロシン比及び特異的アミノアシル化活性においてＶＣより劣るが、一アミノ酸置換体よりも高い相対チロシンアナログ／チロシン比及び特異的アミノアシル化活性を有するものであった。
また、表４に示す結果から、位置３７及び１９５における変異を組み合わせることは、その酵素の基質特異性を劇的に変化させ、３位置換チロシンアナログについてのアミノアシル化活性を増加させることができると結論づけることができた。酵素変異体の中で、ＶＣ、ＶＮ、及びＡＣが最も注目すべき特性及び適用可能性を有することもわかる。
第１図は、二重変異酵素のアミノアシル化活性を示す図面に代わる写真である。最もチロシンアナログ／チロシン比が高いＶＣについて、実際にｔＲＮＡとの結合を調べることができる酸性ＰＡＧＥによってアッセイを行った。その結果、ＶＣは，チロシンアナログに対する特異性が高いことが判った。
得られたＶＣと、大腸菌チロシンｔＲＮＡ由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡを用いて、コムギ胚芽の無細胞タンパク合成系のバッチ法による反応によって、ヨードチロシンを含有するタンパク質を作成することを試みた。目的タンパク質としては、そのＣ末に、スペーサー配列を介してＨｉｓタグを付加した短鎖型ｃ−Ｈ−Ｒａｓ（Ｍｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ  ２４７（１９９０）ｐｐ９３９−４５）を用いた。このタンパク質の３２番目のコドンをアンバーコドンに置換したコンストラクションから作成したｍＲＮＡを鋳型とした翻訳では、全長のタンパク質の生産は、ＴｙｒＲＳ、サプレッサーｔＲＮＡの両方が存在することに依存した（第２図）。このことより、用いたサプレッサーｔＲＮＡが、コムギ胚芽内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってほとんどアミノアシル化されないことがわかる。アンバーサプレッションによる合成量は、アンバーコドンが無いコントロールの３−４割であった。タンパク質の合成量を増やすために、サプレッションによる反応を、透析法を用いて３日間行った。この場合の生産量は１ｍｌの反応内液当たりに換算して０．１ｍｇ以上であり、タンパク質を用いた様々な実験を行うにに十分な量のタンパク質を合成できることがわかった。
実際にペプチド鎖のアンバーコドンに対応する位置にヨードチロシンが挿入されていることを質量分析によって調べた。Ｒａｓタンパクをニッケルビーズを用いて精製した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた産物を染色して得られたＲａｓの泳動度に対応するバンドを切り出してペプチダーゼ処理した断片を、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）によって分析した。レポータータンパクとして用いたＲａｓタンパク質の３２番目のコドンはチロシンに対応するコドンであるが、このコドンをアンバーコドンに改変したｍＲＮＡと，手を加えないｍＲＮＡからのそれぞれについて、反応溶液内にヨードチロシン、ＶＣ変異体、サプレッサーｔＲＮＡを全て翻訳系に添加した翻訳反応を行った。翻訳産物を消化したフラグメントのうち、Ｎ末から３２番目のアミノ酸を含むフラグメント（Ｓｅｒ１７−Ｌｙｓ４２、Ｋ３フラグメントと称す）に着目して解析を行った。その結果、アンバーサプレッションによって生じたＫ３フラグメントには、１残基のチロシンがヨードチロシンが置換された質量に対応するものが大部分で、一部のみがヨードチロシンを含まない質量を持っていた。また、アンバーコドンに対応する部位に他のアミノ酸が誤って挿入されたＫ３フラグメントは検出されなかった。アンバーコドンに挿入されたヨードチロシンとチロシンの割合をクロマトグラムの吸光度から検討した結果、アンバーサプレッションによって、Ｋ３フラグメントの９５％以上がヨードチロシンを含む一方、アンバーコドンに対応してチロシンが挿入された割合は５％以下であることがわかった。一方、通常のチロシンコドンにヨードチロシンが混入しないことを、アンバーコドンを含まないｍＲＮＡからの翻訳産物の解析では、チロシンの代わりにヨードチロシンを含んだ場合に対応する質量を持つフラグメントが検出されないことにより確認した。
本発明の方法をＲａｓタンパク質を例にして説明したが、本発明の方法はＲａｓタンパク質に限定されるものではなく、他のタンパク質についても同様に適用することができることは明らかである。
以上のように、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の具体例として大腸菌のＴｙｒＲＳを挙げて説明してきた。大腸菌の野生型ＴｙｒＲＳにおいては、３７位置のチロシン及び１９５位置のグルタミンを他のアミノ酸残基で変換することにより、非天然型アミノ酸である３位置換チロシン／チロシンの相対比が高いチロシル化活性を有する種々の酵素変異体を見出すことができることを具体例で示してきた。また、このような酵素変異体を得たことで、３位置換チロシンアナログを部位特異的に組み込んだタンパク質の生産に適用することが可能となった。
さらに、ここで使用した大腸菌野生型ＴｙｒＲＳの３７位置および１９５位置のアミノ酸残基の生物種間保存性は極めて高いことから、他の生物種のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の改変に本発明の方法を広く適用することができることは明らかである。
ここで利用した翻訳系は小麦胚芽無細胞翻訳系であるが、同様に他の真核生物由来の無細胞翻訳系や、真核細胞内においても、本発明で作成したＶＣ変異体を用いることで非天然アミノ酸を部位特異的に導入することができることは明らかである。また、この酵素を利用することで、原核生物の翻訳系内で、全てのチロシン残基を非天然アミノ酸に置換したタンパク質を作成することが出来る。このようなタンパク質の作成は、他の原核生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を本発明と同様に改変することでも可能になる。一方、本発明と同様に真核生物または古細菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を改変することで、原核生物の翻訳系の中で非天然アミノ酸を部位特異的に含んだタンパク質を作成することが可能になる。
本発明は、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の酵素−基質特異性を変えた酵素変異体を提供することを目的としたものである。より詳細には、本発明は、効率よく、選択的に、かつ非天然型アミノ酸を含有するアロタンパク質を大量に製造することができるチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を、チロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を改変することにより調製することを特徴とするものである。
本発明のチロシルｔＲＮＡ合成酵素は、非天然型アミノ酸として各種の生理活性を有することが知られている３−ヨードチロシンなどの３−ハロチロシン、３−ヒドロキシチロシンなどの３位置換チロシンを選択的に優先して効率良く取り込むことができることを特徴とするものである。また、本発明のチロシルｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌などの細菌類、酵母、動物、植物などのいずれの生物由来のものであってもよいが、前記で説明してきたように、３−Ｄ構造が既知の酵素と保存性が高いものが汎用性があることから好ましい。また、特定の生物に特異的なチロシルｔＲＮＡ合成酵素であっても、この変異体が他の生物において害をなさないのであれば、その生物において新たなアミノ酸のチロシルｔＲＮＡ合成酵素として作用することから好ましい変異体として使用することができる。
本発明のチロシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列の改変する位置を決める方法としては、チロシルｔＲＮＡ合成酵素と当該酵素が結合するアミノ酸又はアミノ酸のＡＭＰ複合体（アミノアシル化されたＡＭＰ及びアミノアシル化されたＡＭＰ類縁体など）の３−Ｄ構造に基づいて改変すべきアミノ酸の位置を決定するのが好ましいが、これに限定されるものではなく、前記で例示したチロシルｔＲＮＡ合成酵素の場合が３７位や１９５位であったことに基づいて、他のクラスＩアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素のロスマンフォールドドメイン又はクラスＩＩアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の逆平行βシートドメイン内の対応する部位に改変すべきアミノ酸の位置を決定することができる。
本発明は、このような改変すべき位置として２箇所以上のアミノ酸を選定することが好ましく、このことにより非天然型アミノ酸に対する選択性を飛躍的に向上させることが可能になった。
３−Ｄ構造に基づいて改変すべきアミノ酸の位置を決定する場合には、まず目的のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の立体構造を解析し、この立体構造において目的のアミノ酸のＡＭＰ複合体が結合する位置を解析することにより改変すべきアミノ酸の位置を決定することができる。
また、前記の例では大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いてきたために、改変位置として３７位及び１９５位を挙げてきたが、これは大腸菌の場合であって、他の生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いる場合には、立体構造において大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位及び１９５位に相当する位置のアミノ酸が改変されるべき位置となる。本発明における「立体的に相当する位置」というのは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の立体構造においてアミノ酸又はアミノ酸のＡＭＰ複合体（アミノアシル化されたＡＭＰ及びアミノアシル化されたＡＭＰ類縁体など）を認識する位置に対応しているアミノ酸の位置をさしている。
チロシルｔＲＮＡ合成酵素に新たに導入するアミノ酸としては、アミノ酸の親水性や水素結合についての距離などを考慮して、例えば、その位置にアミノ酸のＡＭＰ複合体との結合を形成させないようにする場合には、疎水性のアミノ酸に改変したり、グルタミンをアスパラギンにするなどして距離を調整することができる。
本発明の前記した例では、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位のチロシンをバリン、ロイシン、イソロイシン、又はアラニンで改変し、また１９５位のグルタミンをアラニン、システイン、セリン、又はアスパラギンで改変したが、これに限定されるものではない。
本発明の特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸で改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の製造方法としては、公知の遺伝子操作技術により行うのが好ましい。例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡを増幅させて、増幅させたＤＮＡ断片を結合させて全長のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体をコードするＤＮＡを得て、これを大腸菌などの宿主細胞を用いて発現させることにより簡便に製造することができる。この方法において使用するプライマーとしては２０〜７０塩基、好ましくは２０〜５０塩基程度である。このプライマーは改変前の元の塩基配列とは１〜３塩基がミスマッチとなるので、比較的長いもの、例えば２０塩基以上のものを使用するのが好ましい。
また、本発明の特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸で改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の製造方法としては、前記した方法に限定されるものではなく、公知のポイントミューテーション技術や、制限酵素により改変断片を導入する方法など、各種の遺伝子操作技術を使用することができる。
本発明は、前記したチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体をコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞を提供する。このような細胞としては、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
また、細胞内で発現した本発明のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を、その細胞内でそのまま蛋白質合成に使用する場合には、その目的に応じた細胞を用いることができる。
形質転換する方法としては、公知の方法を採用することができる。
本発明は、前記してきた本発明のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を用いて、３位置換チロシンの非天然型のアミノ酸を含有する蛋白質を製造する方法を提供する。前記したように、本発明の変異体は、１０倍以上の選択性で非天然のアミノ酸を特異的に結合するものであるから、この変異体又はこの変異体をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることにより、天然のアミノ酸に代えて目的の非天然のアミノ酸が導入された蛋白質を製造することができる。
また、本発明のアミノ酸配列が改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体は細胞内における使用のみならず、インビトロ（セルフリー系）における使用も包含している。
したがって、本発明は、アロタンパク質を効率よく、選択的に、特に位置選択的に、かつ大量に製造する方法を提供するものである。
実施例
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１  （ＴｙｒＲＳ遺伝子の発現ベクターの調製）
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０からチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）遺伝子をクローン化した。次に、ＴｙｒＲＳ遺伝子を大腸菌のベクターであるｐＥＴ２６ｂに挿入してプラスミドｐＥＴＹＲＳを作製した。
大腸菌ＴｙｒＲＳ遺伝子を含むこのプラスミドを鋳型とし、次の塩基配列を有するプライマー（１）、（２）、
プライマー（１）
0004263598.tif 000011
プライマー（２）
0004263598.tif 000012
を用いたＰＣＲにより増幅した断片を、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、ベクターｐＥＴ２６ｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込むことで、ＴｙｒＲＳの発現ベクターｐＥＴ−ＹＲＳを作成した。
実施例２  （変異を導入する位置の決定）
ＴｙｒＲＳの生物種間の保存性が高いので、既に報告されている中等度高熱菌のＴｙｒＲＳとチロシル−ＡＭＰの複合体の３−Ｄ構造を用いて（Ｂｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｖｏｌ  ２０８（１９８８）ｐｐ８３−）、３位置換チロシンアナログを組み込むために変異を導入すべき３７位および１９５位を見出した。
実施例３  （部位特異的変異の導入）
改変するアミノ酸置換を含むオリゴヌクレオチドを各々プライマー（変異導入プライマー）（３）〜（８）として常法により合成した。
（ａ）１個のアミノ酸が置換された一アミノ酸置換体の作成
３７位又は１９５位のそれぞれのアミノ酸の１個が置換された一アミノ酸置換体をコードするＤＮＡ配列を、次に示すプライマー（３）から（８）を用いて作成した。プライマー（３）及び（４）は、３７位の改変のためのものである。また、プライマー（５）から（８）は１９５位の改変のためのものである。
プライマー（３）：
0004263598.tif 000013
プライマー（４）：
0004263598.tif 000014
Ｍは、Ｃ又はＡを示し、Ｎは、Ａ又はＣ又はＧ又はＴを示す。
プライマー（５）：
0004263598.tif 000015
プライマー（６）：
0004263598.tif 000016
プライマー（７）：
0004263598.tif 000017
プライマー（８）：
0004263598.tif 000018
（ｂ）２個のアミノ酸が置換された二アミノ酸置換体の作成
３７位および１９５位それぞれの一アミノ酸置換体をコードするプラスミドから、プライマーを用いたオーバーラップ・エクステンション法で二アミノ酸置換体をコードするＤＮＡ配列を作成し、ｐＥＴ−ＹＲＳのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入した。オーバーラップ・エクステンション法は，プライマー（１）と（１０）の組、プライマー（９）と（１１）の組をそれぞれ用いて増幅した２つの断片を精製し、これらとプライマー（１）と（９）を用いたＰＣＲで増幅することによって行った。
プライマー（１）：
0004263598.tif 000019
プライマー（１０）：
0004263598.tif 000020
プライマー（９）：
0004263598.tif 000021
プライマー（１１）：
0004263598.tif 000022
実施例４  （野生型及び変異型ＴｙｒＲＳの発現）
前記した過程から得られた完全な変異ＤＮＡフラグメントの各々を、プラスミドｐＥＴＹＲＳ内のテンプレートフラグメントのもとの位置に挿入した。野生型及び変異型ＴｙｒＲＳ遺伝子を含むプラスミドを、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ）の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１６６，５５７−５８０）に準じて形質転換により、各々大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。
各々のプラスミドを有する形質転換体を単離し、次に１６時間、３７℃でＬＢ培地中で培養した。野生型及び変異型ＴｙｒＲＳタンパク質を、以下に記すように大腸菌粗抽出物から精製した。全ての作業は４℃で行った。
１０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）２（ｐＨ  ７．９）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭメルカプトエタノール）で平衡化したＮｉ−アガロースカラム（０．５ｍＬ）に適用した。４０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで洗った後、２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。その活性画分をプールし、緩衝液Ｂ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）に対して透析し、次に終濃度５０％になるようにグリセロールを加えて−２０℃で保存した。
上述の過程で、アラニン、バリン、イソロイシン、及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｙｒ３７位の置換により、並びにセリン、システイン、アスパラギン、アラニンからなる群から選択されるアミノ酸によるＧｌｎ１９５位の置換により生産された酵素変異体を得た。
これらは、各々、以後、３７Ａ、３７Ｖ、３７Ｉ、３７Ｌ、１９５Ｓ、１９５Ｃ、１９５Ｎ、１９５Ａと呼ぶ。更に、Ｔｙｒ３７及びＧｌｎ１９５の両方の置換により生産された二重変異酵素を得た。これらは、以後、各々ＡＳ、ＶＳ、ＩＳ、ＬＳ、ＡＣ、ＶＣ、ＩＣ、ＬＣ、ＡＮ、ＶＮ、ＩＮ、ＬＮ、ＡＡ、ＶＡ、ＩＡ、ＬＡと呼ぶ。これらを表にして表１に示す。
遺伝子操作のために用いた全ての酵素は宝酒造、東洋紡、またはニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＭＡ，ＵＳＡ））から購入した。遺伝子操作のための条件は、その酵素の供給元の助言に従った。
実施例５  （基質特異性アッセイ）
これらの酵素変異体の基質特異性を評価するために、以下の３種のアッセイ方法を用いた。
アミノアシル化反応の反応産物の１つであるピロリン酸をピロフォスファダーゼで分解して生産される無機リン酸を定量する事で、アミノアシル化反応を測定することがロイド（Ｌｌｏｙｄ）らによってに記載されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ２３（１９９５）ｐｐ２８８６−２８９２）。本発明の一つ目の方法では、この方法を簡略化し、無機リンをバイオモルグリーン（Ｂｉｏ  ｍｏｌ  ｇｒｅｅｎ（フナコシ））を使用して検出することで、アミノアシル化反応の測定を行った。測定のために、得られた各々の酵素を、３７℃で１時間、０．０５ｍｌの緩衝液Ｂ、１ｍＭ  ＡＴＰ（生化学工業）３０μＭ粗精製チロシルｔＲＮＡ、１００μＭチロシンまたは０．５ｍＭ３−ヨードチロシンと共に保温した。その反応を停止させるために、０．１ｍｌのバイオモルグリーンを加えた。その上清の吸光度を６３０ｎｍにおいて測定した。結果を表２及び表３に示す。
表２は、野生型、８個の一アミノ酸変異酵素のアミノアシル化活性を記号で示したものであり、表３は野生型、３７Ｖ及び１６個の二重変異酵素のアミノアシル化活性を同じく記号で示したものである。各表共に＊＊＊＞＊＊＞＊＞−の順に活性が高いことを示す。
Ｔｙｒ３７及びＧｌｎ１９５の他のアミノ酸への置換により得られた酵素変異体に関して、３位置換チロシンアナログに対するアミノアシル化活性を実質的に増加させた。一方、相対的に、これらのタンパク質の、チロシンについての特異的アミノアシル化活性は、減少する。それゆえ、これらの酵素変異体の相対的チロシンアナログ／チロシン比は野生型酵素のそれより高い。
２つ目の方法では、ロイド（Ｌｌｏｙｄ）ら方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ２３（１９９５）ｐｐ２８８６−２８９２）によりアッセイした。得られた各々の酵素を３７℃で６分間、０．４ｍｌの緩衝液Ｂ、１ｍＭ  ＡＴＰ（生化学工業）１００μＭ粗精製チロシルｔＲＮＡ、２００μＭチロシンまたは３−ヨードチロシンと共にインキュベーションした。アミノアシル化活性の単位を分当りに放出されたリン酸の濃度として表した。結果を表４に示す。
表４は、二重変異酵素のアミノアシル化活性を示したものである。４つの二重変異酵素はＴｙｒ３７及びＧｌｎ１９５の両方の変異の利点を組み合わせる。例えば、ＶＣの相対的チロシンアナログ／チロシン比は１０を超え、その特異的アミノアシル化活性は、Ｇｌｎ１９５に更なる変異の導入のため、単一変異酵素３７Ｖより高い。ＶＮ、ＶＳ、及びＡＣは、相対チロシンアナログ／チロシン比及び特異的アミノアシル化活性においてＶＣより劣るが、一アミノ酸置換体よりも高い相対チロシンアナログ／チロシン比及び特異的アミノアシル化活性を有する。
表４に示す結果から、位置３７及び１９５における変異を組み合わせることはその酵素の基質特異性を劇的に変化させ、３位置換チロシンアナログについてのアミノアシル化活性を増加させることができると結論づけることができる。酵素変異体の中で、ＶＣ、ＶＮ、及びＡＣが最も注目すべき特性及び適用可能性を有する。
３つ目の方法では、ｔＲＮＡ全長に対するチロシンまたは３−ヨードチロシンに対するアミノアシル化活性を、ウオルフソン（Ｗｏｌｆｓｏｎ）らの方法（Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ，４（１９９８），１０１９−１０２３）による酸性ポリアクリルアミド電気泳動と同様の方法によりアッセイした。チロシンまたはヨードチロシンは２００μＭ、それぞれの酵素は５０ｎＭで３７℃で３分間、保温したのち、電気泳動を行った。二重変異酵素のアミノアシル化活性の結果を、第１図に図面に代わる写真で示す。第１図の左側の３個は野生型であり、真ん中の３個は３７位をバリンに改変した酵素（３７Ｖ）であり、右側の３個は３７位をバリンに１９５位をシステインに改変した酵素（ＶＣ）である。それぞれの３個は左からアミノ酸を添加しない場合（ｗ／ｏ  ａａ）、３−ヨードチロシン（２００μＭ）を添加した場合（Ｉ−Ｔｙｒ）、チロシン（２００μＭ）を添加した場合（Ｔｙｒ）を示す。
その結果、ＶＣは，チロシンアナログに対する特異性が高いことが判った。
実施例６  （非天然アミノ酸を部位特異的に挿入されたタンパク質の生産）
得られた二重変異体ＶＣと、大腸菌チロシンｔＲＮＡ由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡを用いて、コムギ胚芽の無細胞タンパク合成系のバッチ法による反応によって、ヨードチロシンを含有するタンパク質を作成した。
コムギ胚芽系の無細胞タンパク合成は、プロテイオス無細胞系蛋白質合成キット（ＰＲＯＴＥＩＯＳ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ））を用いて行った。目的タンパク質としては、そのＣ末に、スペーサー配列を介してＨｉｓタグを付加した短鎖型ｃ−Ｈ−Ｒａｓ（Ｍｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２４７（１９９０）ｐｐ９３９−９４５）である。タンパク質の発現に用いるプラスミドは、キットに添付されたプラスミドｐＥＵ３−ＮＩＩのＳｐｅＩ−ＳａｌＩ部位に、短鎖型ｃ−Ｈ−ＲａｓのＣ末にスロンビン認識配列とＨｉｓタグを付加した配列に対応する遺伝子を挿入することで作成した。その結果として予想される翻訳産物のアミノ酸配列をアミノ酸の１文字標記で示すと次のとおりである。
0004263598.tif 000023
0004263598.tif 000024
翻訳反応は、キットの条件に、さらにヨードチロシンを終濃度で０．６ｍＭ加えることで行った。産物は、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて電気泳動した。このゲルに対し、イメージアナライザーＦＬＡ−２０００（ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＦＬＡ−２０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を用いて、ＲＩのカウント、またはシプロ−タンジェリン蛋白質ゲル染色（Ｃｙｐｒｏ−ｔａｎｇｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ））を用いて染色されたタンパク質のバンドを定量した。
このタンパク質の３２番目のコドンをアンバーコドンに置換したコンストラクションから作成したｍＲＮＡを鋳型とした翻訳では、全長のタンパク質の生産は、ＴｙｒＲＳ、サプレッサーｔＲＮＡの両方が存在することに依存した（第２図）。このことより、用いたサプレッサーｔＲＮＡが、コムギ胚芽内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってほとんどアミノアシル化されないことがわかる。アンバーサプレッションによる合成量は、アンバーコドンが無いコントロールの３〜４割であった。タンパク質の合成量を増やすために、サプレッションによる反応を、透析法を用いて３日間行った。この場合の生産量は１ｍｌの反応内液当たりに換算して０．１ｍｇ以上であり、タンパク質を用いた様々な実験を行うにに十分な量のタンパク質を合成できることがわかった。
実施例７  （無細胞タンパク合成の産物の質量分析）
実際にペプチド鎖のアンバーコドンに対応する位置にヨードチロシンが挿入されていることを質量分析によって調べた。ＬＣ−ＭＳ解析のために、合成されたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ磁気アガロースビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。精製物をＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲル（ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ）を用いた電気泳動によってさらに精製し、目的産物に対応する２１ｋＤａのバンドをゲルから切り出した。０．１μｇのアクロモバクタープロテアーゼＩ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ（Ｌｙｓ−Ｃ））を用いた消化を、ゲル片中で０．１％ＳＤＳを含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）中で、３７℃で１２時間行った。消化されて生じたペプチドは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（１ｘ１０ｍｍ；Ｔｏｓｏｈ，Ｔｏｋｙｏ）とＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｃ１８（１ｘ５０ｍｍ；Ｋａｎｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ）を連結したモデル１１００液体クロマトグラフィー（ｍｏｄｅｌ  １１００  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ））を用いて、３０分かけた２−６０％溶媒Ｂ（ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ）の直線勾配によって分離した。検出は、ジヨードアレイ検出器（ｄｉｏｄｅ−ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で行った。溶媒Ａ（ｓｏｌｖｅｎｔｓ  Ａ）及び溶媒Ｂ（ｓｏｌｖｅｎｔｓ  Ｂ）は、それぞれ０．０９％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液と、０．０７５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルであった。溶出物は、ＥＳＩプローブ（ＥＳＩ  ｐｒｏｂｅ）を用いたフィニガンＬＣＱイオントラップ質量分析機（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）によって解析した。タンデムＭＳシークエンシングは、Ｒａｓの３２番目のアミノ酸を含むＬｙｓ−Ｃフラグメントの［Ｍ＋２Ｈ］２＋に対応するフラグメントに対して行った。
翻訳産物を消化したフラグメントのうち、Ｎ末から３２番目のアミノ酸を含むフラグメント（Ｓｅｒ１７−Ｌｙｓ４２、Ｋ３フラグメントと称す）に着目して解析を行った。その結果、アンバーサプレッションによって生じたＫ３フラグメントには、１残基のチロシンがヨードチロシンに置換された質量に対応するものが大部分で、一部のみがヨードチロシンを含まない質量を持っていた。また、アンバーコドンに対応する部位に他のアミノ酸が誤って挿入されたＫ３フラグメントは検出されなかった。アンバーコドンに対応して挿入されたヨードチロシンとチロシンの割合をクロマトグラムの吸光度から検討した結果、アンバーサプレッションによって、Ｋ３フラグメントの９５％以上がヨードチロシンを含む一方、アンバーコドンに対応してチロシンが挿入された割合は５％以下であることがわかった。一方、通常のチロシンコドンによってはヨードチロシンが混入しないことを、アンバーコドンを含まないｍＲＮＡからの翻訳産物の解析では、チロシンの代わりにヨードチロシンを含んだ場合に対応する質量を持つフラグメントが検出されないことにより確認した（第３図）。
さらにＫ３−３２１Ｙフラグメントのタンデムマス解析により、このフラグメントの部分配列であるＰｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−（ヨード−Ｔｙｒ）−Ａｓｐを確認した。
産業上の利用可能性
本発明は、新規なチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体、及びその新規な改変方法を提供するものである。本発明の改変方法によれば、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の選択性や基質特異性の改変を、簡便な方法で、効率よく行うことができる。
本発明のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を使用することにより、ペプチドあるいはタンパク質の調製の場におけるアミノアシル化反応を利用して、天然アミノ酸に加えて非天然アミノ酸である３位置換チロシンを部位特異的に挿入することが可能となる。
また、本発明のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を用いて、効率的で、選択的で、かつ大量生産に適したアロタンパク質の製造が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を、酸性ポリアクリルアミド電気泳動と同じ方法によりアッセイしたアミノアシル化活性の結果を示す図面に代わる写真である。
第２図は、小麦胚芽無細胞翻訳系におけるアンバーサプレッションを示す。１４Ｃ−ロイシンでラベルされた翻訳産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。アンバーバーサプレッションは、ＴｙｒＲＳ−ＶＣ変異体、サプレッサーｔＲＮＡの両者がともに存在するときにのみ観察された。ａｍｂは、３２番目のコドンをアンバーコドンに置換したｍＲＮＡであり、ｓｕｐ  ｔＲＮＡは大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒ由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。
第３図は、小麦胚芽無細胞翻訳系の、系内にヨードチロシン、ヨードチロシンに特異的なＴｙｒＲＳ−ＶＣ変異体、サプレッサーｔＲＮＡを含んだ場合の翻訳産物のＬＣ−ＭＳ解析の液体クロマトグラフィーのチャートを示す。
Ｋ３とＫ９はそれぞれ、Ｒａｓタンパク質のリジルエンドペプチターゼ消化フラグメントである、Ｓｅｒ１７−Ｌｙｓ４２のフラグメントと、Ｔｈｒ１４８−Ｌｙｓ１６７のフラグメントであることが、質量分析によりわかった。チャート上段および下段はそれぞれ、アンバーコドンを含まないｍＲＮＡ、３２番目のコドンがアンバーコドンであるｍＲＮＡそれぞれの翻訳産物の解析を示す。Ｋ３フラグメントのチロシン１残基がヨードチロシンに置換した質量に対応する質量を持つフラグメント（Ｋ３−ＩＹ３２）がアンバーサプレッションの産物の解析（下段）に見い出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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