(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Clostridium butyricum FERM P-14285。
【請求項２】
請求項１に記載されたClostridium butyricum FERM P-14285を含有する、酪酸菌含有製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する方法に使用する酪酸菌および酪酸菌含有製剤に関し、より詳細にはEHEC SU 5053（Ｏ１５７）のベロ毒素の産生を阻害する方法および病原性大腸菌を安全に殺菌する方法に使用する酪酸菌および酪酸菌含有製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、病原性大腸菌を殺菌する方法として、病原性大腸菌に感染した個体に抗生物質を投与する方法が知られていた。
【０００３】
しかし、病原性大腸菌の中には、例えば、EHEC SU 5053（Ｏ１５７）のような、細胞が死滅する際あるいは菌数が許容最高菌数に達した際に、細胞内で産生された毒素を遊離する菌がある。このような毒素のうちには、出血性の下痢だけでなく、溶血性尿毒症症候群をも引き起こし、これにより赤血球などの細胞膜が破壊され、個体が死に至る原因となり得る極めて危険な毒素がある。このような菌に感染した個体に抗生物質を投与すると、抗生物質により菌が死滅する際に毒素が遊離され、さらに個体内（特に腸管内）に蓄積されるので、このような菌に感染した個体に抗生物質を投与することは極めて危険である。また、抗生物質を投与する時点で、菌数が許容最高菌数に達している場合には、すでに毒素が遊離されているので、このような状態の菌に感染した個体に抗生物質を投与することは、さらに極めて危険である。
【０００４】
一方、ヒト腸管内常在性大腸菌を、病原性大腸菌の１種であるEHEC SU 5053（Ｏ１５７）と共に混合培養することによって、EHEC SU 5053（Ｏ１５７）の増殖が強く抑制されることが知られている（牛嶋  彊「成人と母乳栄養新生児の腸管内容物模擬培地による嫌気連続培養における腸内常在菌の腸管出血性大腸菌に対するする拮抗作用の差異」、医学と生物学 134(5):149-154 1997、牛嶋  彊「嫌気培養液中で許容最高菌数レベルに達した常在性大腸菌による腸管出血性大腸菌、その他のグラム陰性腸炎起因菌の増殖阻止」、医学と生物学 134(2):39-44 1997、牛嶋  彊「ヒト大腸内常在性大腸菌の腸管病原性大腸菌と腸管出血性大腸菌に対する強い拮抗作用」、医学と生物学 127(1):5-9 1993、および牛嶋  彊「腸炎起因性大腸菌に対するヒト大腸内常在菌の拮抗作用」、医学と生物学 126(1):9-14 1993を参考のこと）。
【０００５】
しかし、この培養液に抗生物質であるホスホマイシン（細胞壁合成インヒビター）を添加すると、EHEC SU 5053（Ｏ１５７）が死滅する際に、大量のベロ毒素が培養液中に遊離する。これで明らかなように、ヒト腸管内常在性大腸菌は、病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）が増殖している間に、病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）内で産生される毒素が培養液中に遊離することを抑制するが、ホスホマイシンを添加した場合には、病原性大腸菌内で産生される毒素が培養液中に遊離することを抑制しない。
【０００６】
従って、細胞が死滅する際に毒素を産生する菌（例えば、EHEC SU 5053（Ｏ１５７））に感染した個体において、このような菌の毒素の産生を阻害し、さらにそのような個体に安全に抗生物質を投与して、そのような菌を安全に殺菌することができる方法、ならびにその方法に用いられる薬剤が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、病原性大腸菌に汚染された領域に、この発明に係る酪酸菌を接種し、さらに特定の抗生物質を添加することにより、病原性大腸菌の毒素（特に、ベロ毒素）の産生が顕著に阻害されるという知見を得、本発明を完成した。また、ヒト腸管内常在性大腸菌（以下、本明細中において「ヒト腸管内常在性E.coli」という場合がある）を有し、そして病原性大腸菌に汚染された領域に、この発明に係る酪酸菌を接種し、さらに特定の抗生物質を添加することにより、上記と同様に病原性大腸菌の毒素の産生が顕著に阻害され、安全に病原性大腸菌を殺菌できるという知見をも得、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、病原性大腸菌に汚染された領域において、病原性大腸菌の毒素の産生を顕著に阻害する方法、およびその方法を用いて安全に病原性大腸菌を殺菌する方法に使用する酪酸菌および酪酸菌含有製剤に関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、前記病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する方法は、病原性大腸菌に汚染された領域に、この発明に係る酪酸菌および特定の抗生物質を添加する工程を包含する構成とした。
【００１０】
病原性大腸菌に汚染された領域は、Clostridium butyricum FERM P-14285が、ヒト腸管内常在性大腸菌と共存すると、病原性大腸菌の毒素を産生することを阻害することを促進するという観点から、ヒト腸管内常在性大腸菌を有していることが好ましい。また、病原性大腸菌に汚染された領域に、ヒト腸管内常在性大腸菌を添加しても良い。このようなヒト腸管内常在性大腸菌としては、例えば、E.coli ATCC 25922が挙げられる。
【００１１】
また、前記毒素を遊離する病原性大腸菌を安全に殺菌する方法は、毒素を産生する病原性大腸菌に汚染された領域であって、ヒト腸管内常在性大腸菌を有する領域に、この発明に係る酪酸菌および特定の抗生物質を添加する工程を包含する構成とした。このようなヒト腸管内常在性大腸菌については、以前に記載したのと同様である。
【００１２】
本明細書において、「毒素の産生」とは、毒素が生成されることだけでなく、生成した毒素が遊離し、そして蓄積されることをも指す。
【００１３】
本発明に係る酪酸菌とは、Clostridium butyricum FERM P-14285のことである。
【００１４】
Clostridium butyricum FERM P-14285は、1994年４月21日に日本の工業技術院生命工学工業技術研究所にClostridium butyricum NTとして寄託された酪酸菌である。
【００１５】
病原性大腸菌としては、例えば、腸管出血性大腸菌（EHEC）が挙げられる。本発明の方法は、腸管出血性大腸菌（EHEC）が産生する毒素のうち、特にEHEC SU 5053（Ｏ１５７）が産生するベロ毒素（ベロ毒素１型およびベロ毒素２型）に対して極めて有効である。
【００１６】
前記特定の特定の抗生物質とは、ホスホマイシンおよびその金属塩である。また、ホスホマイシンの金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、二ナトリウム塩およびカルシウム塩が挙げられる。
【００１７】
病原性大腸菌に汚染された領域とは、特に限定されないが、例えば、EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を含有する培養液、EHEC SU 5053（Ｏ１５７）に感染した患者の腸管内などが挙げられる。
【００１８】
一方、本発明に係る酪酸菌は、ホスホマイシンと併用することによって病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する構成とした。このような酪酸菌は、以下の発明の実施の形態で説明するように、ホスホマイシンと併用することによって、病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する。このような酪酸菌は、ヒト腸管内常在性大腸菌およびホスホマイシンと併用することによって病原性大腸菌を安全に殺菌することができる。
【００１９】
酪酸菌、ヒト腸管内常在性大腸菌、病原性大腸菌、病原性大腸菌の毒素、病原性大腸菌に汚染された領域および抗生物質については、以前に記載したのと同様である。
【００２０】
本発明に係る酪酸菌を含有する酪酸菌含有製剤の剤形は、特に限定されないが、取り扱いの面から散剤が好ましい。このような本発明に係る酪酸菌を含有する酪酸菌含有製剤も、本発明の範囲に包含される。
【００２１】
本発明に係る酪酸菌含有製剤は、ベロ毒素の産生を阻害することに悪影響を与えない限り、必要に応じて、添加剤を含有し得る。このような添加剤としては、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、溶解補助剤、崩壊延長剤、乳化剤、懸濁化剤、坐剤基剤などが挙げられる。本発明に係る酪酸菌含有製剤に用いられる賦形剤としては、例えば、乾燥バレイショデンプンが挙げられる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
前記病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する方法、前記病原性大腸菌を殺菌する方法は、腸管出血性大腸菌の１種である病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）およびヒト腸管内常在性大腸菌としてE.coli ATCC 25922を含有する培養液に、Clostridium butyricum FERM P-14285、次いで抗生物質としてホスホマイシンを添加する工程を包含する。病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）が、ベロ毒素（ベロ毒素１型およびベロ毒素２型）を産生することは周知である。
【００２３】
前記病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する方法、および病原性大腸菌を殺菌する方法は、上記の工程を包含することにより、以下の効果を有する。
【００２４】
ヒト腸管内常在性大腸菌E.coli ATCC 25922および病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を含有する培養液に、Clostridium butyricum FERM P-14285およびホスホマイシンを添加することにより、この病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）のベロ毒素の産生がこれらの相互作用により顕著に阻害され、そしてホスホマイシンにより安全に病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を殺菌することができる。
【００２５】
病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を含有する培養液が、ヒト腸管内常在性大腸菌E.coli ATCC 25922を含有する場合、EHEC SU 5053（Ｏ１５７）の増殖が阻害され、そして菌の増殖中はベロ毒素が培養液中に遊離することも抑制される。このことは、従来の技術の欄に参考として記載された４つの文献により公知である（なお、これらの文献は本明細書に参照として援用される）。しかし、ホスホマイシンなどにより病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を殺菌しようとすると、ベロ毒素が培養液中に遊離してくる。
【００２６】
しかし、前記方法によると、病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）およびヒト腸管内常在性大腸菌E.coli ATCC 25922を含有する培養液におけるベロ毒素の産生は、ヒト腸管内常在性大腸菌E.coli ATCC 25922によって阻害されるだけでなく、Clostridium butyricum FERM P-14285により、特にホスホマイシンを添加した場合にこれら３つの相互作用によってさらにより顕著に阻害される。
【００２７】
ホスホマイシンは、細胞壁合成インヒビターであるので、病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を殺菌することができる。従って、上記のような３つの相互作用によって、ベロ毒素の産生を阻害しつつ、安全に病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を殺菌することができる。
【００２８】
このようにしてベロ毒素の産生が、ヒト腸管内常在性大腸菌E.coli ATCC 25922とClostridium butyricum FERM P-14285とホスホマイシンとの相互作用により阻害されるので、これら３つの間の相互作用によって、ベロ毒素の産生もさらにより顕著に抑制され、そしてEHEC SU 5053を安全に殺菌することができる。従って、病原性大腸菌に感染した患者に、極めて安全にホスホマイシンを投与することができる。
【００２９】
なお、下痢時にはヒト腸管内常在性E.coliの菌数レベルが上昇することが知られている（例えば、下山孝ら、「腸内細菌叢とその病態像：大腸疾患を中心にして」最新医学 33(10):2047-2055 1978を参考のこと。この文献は本明細書に参照として援用される）。このため、病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）に汚染されたため、通常、下痢状態である腸管内では、ヒト腸管内常在性E.coliの菌数レベルが上昇するため、Clostridium butyricum FERM P-14285およびホスホマイシンによるベロ毒素の産生の阻害がさらにより顕著に促進される。従って、本発明に係る酪酸菌は、ホスホマイシンと併用することによって、腸管内を病原性大腸菌EHEC （Ｏ１５７）に汚染された下痢状態の個体に対して極めて効果的である。
【００３０】
従って、ベロ毒素を産生する病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）に汚染された領域に、ホスホマイシンのみを単独で添加する従来の病原性大腸菌を殺菌する方法と比較して、ヒト腸管内常在性E.coliにより、EHEC（Ｏ１５７）の増殖が防止され、そしてホスホマイシンによりEHEC（Ｏ１５７）を殺菌できるだけでなく、さらにホスホマイシンとClostridium butyricum FERM P-14285との間の相互作用、あるいはヒト腸管内常在性E.coliとホスホマイシンとClostridium butyricum FERM P-14285との間の相互作用により、EHEC（Ｏ１５７）によるベロ毒素の産生が防止される。従って、結果としてベロ毒素によって死に至り得る溶血性尿毒症症候群の発現を抑制しつつ、EHEC（Ｏ１５７）の増殖を防止し、さらにこの病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）を殺菌することができる。上記の内容は、後に記載する実施例１においてさらに詳細に説明される。
【００３１】
（別の発明の実施の形態その１）
前記病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する別の方法は、腸管出血性大腸菌の１種である病原性大腸菌EHEC SU 5053（Ｏ１５７）を含有する培養液に、Clostridium butyricum FERM P-14285、次いで抗生物質としてホスホマイシンを添加する工程を包含する。
【００３２】
病原性大腸菌の毒素の産生を阻害する上記の方法は、上記の工程を包含することにより、以下の効果を有する。
【００３３】
病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）を含有する培養液に、Clostridium butyricum FERM P-14285およびホスホマイシンを添加することにより、この病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）のベロ毒素の産生がこれらの相互作用により阻害される。上記の内容は、後に記載する実施例２においてさらに詳細に説明される。
【００３４】
（別の発明の実施の形態その２）
一方、本発明に係る酪酸菌は、Clostridium butyricumFERM P-14285である。
【００３５】
上記の酪酸菌は、病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）に感染し、さらにベロ毒素により生じる疾患を患う患者に、抗生物質としてのホスホマイシン（細胞壁合成インヒビター）と組み合わされて投与される。このように投与された酪酸菌含有製剤はホスホマイシンと組み合わされることにより、以前の記載と同様に、これらの相互作用が得られ、ベロ毒素の産生が顕著に阻害される。従って、病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）に感染した患者において、溶血性尿毒症症候群の発現を抑制しつつ、病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）の増殖を防止し、病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）を安全に殺菌することができる。このような酪酸菌は、適切な賦形剤などと組み合わされ酪酸菌含有製剤として製造販売される。このような酪酸菌含有製剤は、主として医療用医薬品として用いられる。
【００３６】
【実施例】
本発明を以下の実施例を用いてさらに詳細に説明するが、以下の実施例は例示の目的にのみ用いられ、限定の目的で用いられてはならない。
【００３７】
（培養液の組成）
本実施例で用いた培養液は、蒸留水100mlあたり以下の成分を含有する：
可溶性デンプン                ０．２ｇ
グルコース                    ０．０５ｇ
ラクトース                    ０．１ｇ
ソルボース                    ０．０５ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4               ０．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                   ０．７ｇ
Ｎa2ＨＰＯ4                   １ｇ
Ｎａ2ＣＯ3（無水）            ０．１ｇ
ＮａＣl                       ０．２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ０．０１ｇ
ＣａＣｌ2                     ０．００１ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ０．０００５ｇ
酵母エキス                    ０．０１ｇ
L-システイン塩酸塩１水和物    ０．０２ｇ
チオグリコール酸ナトリウム    ０．０２ｇ
胆汁末                        ０．００５ｇ
パルチミン酸ナトリウム        ０．００５ｇ
ステアリン酸ナトリウム        ０．００５ｇ
リノール酸ナトリウム          ０．００２ｇ
オレイン酸ナトリウム          ０．００２ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）      ０．０２５ｇ
ヘミン                        ０．００１ｇ
ビタミンＢ12                  ０．００００５ｇ
ビタミンＫ3                   ０．００００１ｇ
消泡剤（１）                  ０．０１ｇ
アミノ酸（２）                ５μmol
（１）：商品名トーレシリコン（トーレシリコン株式会社製）
（２）：アミノ酸は、タンパク質を構成する主要Ｌ−アミノ酸２０種から、システイン、シスチン、およびオキシプロリンを除いた１７種のアミノ酸が含有されている（アスパラギン、スレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、およびトリプトファン）。
【００３８】
上記の培地の組成については、牛嶋  彊「消化管、特に小腸下部、盲腸、結腸における細菌の共生と拮抗に関与する栄養または、増殖抑制物質の働きを検討するための半合成培地」、医学と生物学 106(4):199-204 1983にさらに詳細に記載されている（この文献は参照として本明細書に援用される）。
【００３９】
上記の培養液および簡易嫌気連続培養装置（牛嶋  彊「嫌気条件下の細菌の共生と拮抗を検討するための簡易連続培養装置」、医学と生物学 108(2):71-74 1984、およびUshijima, T. and Seto, A.:Selected faecal bacteria and nutrients essential for antagonism of Salmonella typhimurium in anaerobic continuous flow cultures. J. Med. Microbiol. 35:111-117 1991を参考のこと。これらの文献は参照として本明細書に援用される）を用いて以下の実験を行った。
【００４０】
（ベロ毒素検出用キット）
以下の実施例で用いたベロ毒素検出用キットは、デンカ生研株式会社製大腸菌ベロトキシン検出用キット（ＶＴＥＣ−ＲＰＬＡ「生研」）である（以下、単に「キット」という）。
【００４１】
なお、本キットは、以下のラテックス、対照ベロ毒素、および希釈液を含む：
(1)感作ラテックスＶＴ１
この感作ラテックスＶＴ１は、ベロ毒素１型の特異抗体（ウサギIgG）、および保存剤としてのアジ化ナトリウム（0.1％）を含有する。
【００４２】
(2)感作ラテックスＶＴ2
この感作ラテックスＶＴ2は、ベロ毒素２型の特異抗体（ウサギIgG）、および保存剤としてのアジ化ナトリウム（0.1％）を含有する。
【００４３】
(3)対照ラテックス
この対照ラテックスは、正常ウサギIgG、および保存剤としてのアジ化ナトリウム（0.1％）を含有する。
【００４４】
(4)対照ベロ毒素１型
この対照ベロ毒素１型は、凍結乾燥状態のベロ毒素１型、および保存剤としてのラクトースおよびウシ血清アルブミン含有する。
【００４５】
(5)対照ベロ毒素2型
この対照ベロ毒素2型は、凍結乾燥状態のベロ毒素2型、および保存剤としてのラクトースおよびウシ血清アルブミンを含有する。
【００４６】
(6)希釈液
この希釈液は、ウシ血清アルブミン（0.5％）、および保存剤としてのアジ化ナトリウム（0.1％）を含有するリン酸塩緩衝塩化ナトリウム溶液(PBS)である。
【００４７】
（E. coli ATCC 25922含有液の調製方法）
以下に記載される成分を含有する半流動保存培地（ｐＨ  約７．０）にE. coli ATCC 25922を接種した後、一晩インキュベートし、E. coli ATCC 25922含有培地を調製した。この培地を滅菌生理食塩水（約２ｍｌ）に添加し、E. coli ATCC 25922含有液を調製した。このE. coli ATCC 25922含有液の菌数を１０倍段階希釈により測定したところ、約１０8cfu/mlであった（McFarland No.3-4、少し白濁する程度）。
【００４８】
上記の半流動保存培地は、蒸留水100mlあたり以下の成分を含有する：
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）                  １ｇ
プロテオーズペプトンＮｏ．３（Ｄｉｆｃｏ）        ０．５ｇ
肉エキス（極東製薬株式会社製）                    ０．３ｇ
酵母エキス（ＢＢＬ）                              ０．２ｇ
グルコース                                        ０．３ｇ
可溶性デンプン                                    ０．１ｇ
ＮａＣｌ                                          ０．５ｇ
Ｎａ2ＣＯ3 （無水）                                ０．１ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                                         ０．４ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩１水和物                      ０．０２ｇ
チオグリコール酸ナトリウム                        ０．０２ｇ
寒天                                              ０．１５ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）                          ０．０３ｇ
ヘミン                                            ０．００１ｇ
ビタミンＫ3                                       ０．００００１ｇ
【００４９】
（EHEC SU 5053含有液の調製方法）
上記と同一の成分を含有する半流動保存培地（ｐＨ  約７．０）にEHEC SU 5053を接種した後、一晩インキュベートし、EHEC SU 5053含有培地を調製した。この培地を滅菌生理食塩水（約２ｍｌ）に添加し、EHEC SU 5053含有液を調製した。このEHEC SU 5053含有液の菌数を１０倍段階希釈により測定したところ、約１０8cfu/mlであった（McFarland No.3-4、少し白濁する程度）。
【００５０】
（Clostridium butyricum FERM P-14285含有液の調製方法）
以下に記載された成分を含有する半流動保存培地（ｐＨ  約６．８）にClostridium butyricum FERM P-14285を接種した後、一晩インキュベートし、Clostridium butyricum FERM P-14285含有培地を調製した。この培地を滅菌生理食塩水（約２ｍｌ）に添加し、Clostridium butyricum FERM P-14285含有液を調製した。このClostridium butyricum FERM P-14285の菌数を１０倍段階希釈により測定したところ、約１０8cfu/mlであった（McFarland No.3-4、少し白濁する程度）。
【００５１】
上記の半流動保存培地は、蒸留水100mlあたり以下の成分を含有する：
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）                  １ｇ
プロテオーズペプトンＮｏ．３（Ｄｉｆｃｏ）        ０．５ｇ
酵母エキス（ＢＢＬ）                              ０．０２ｇ
ラクトース                                        ０．３ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4                                       ０．５ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                                         ０．５ｇ
ＮａＣｌ                                          ０．３ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                ０．０１ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩１水和物                      ０．０２ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）                          ０．０３ｇ
寒天                                              ０．０５ｇ
【００５２】
（実施例１）
上記の約３７℃の培養液（約１３０ml）を培養瓶に入れ、次いで好気性細菌群の菌数が増加し、嫌気性細菌群の菌数が低下した下痢状態の腸管内の環境を再現するために、上記のE. coli ATCC 25922含有液、Clostridium butyricum FERM P-14285含有液およびEHEC SU 5053含有液を培養液に接種し、菌数をそれぞれ約１０6ｃｆｕ／ｍｌとした。
【００５３】
次いで、１時間ごとに、培養瓶中の培養液（約１３０ｍｌ）のうち、約５重量％（約６．５ｍｌ）を除去し、新鮮な培地を同量添加しつづけながら（以下、この操作を培地流量５％／時間という）約３７℃、約２４時間培養した。この時点で、E. coli ATCC 25922、Clostridium butyricum FERM P-14285およびEHEC SU 5053の菌数を、それぞれ以下に示す選択培地を用いて計測した。
【００５４】
この菌数の計測方法を詳しく述べると、培養液（０．１ｍｌ）を培養瓶から取り出し、滅菌生理食塩水を用いて１０倍段階希釈した。次いで、各１０倍段階希釈後の各希釈液（０．１ｍｌ、１０1〜１０10倍希釈）を各選択培地に塗布し、各選択培地を約３７℃で約４８時間培養した。各選択培地のうち、菌数を数えることのできる培地（約３０〜１００個のコロニーを生じた培地）においてコロニーの数を目視で測定したのち、培養液の各菌数を算出した。
【００５５】
E. coli ATCC 25922用の選択培地は、蒸留水100mlあたり以下の成分を含有する：
ＮａＣｌ                                          ０．５ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4                                       ０．４ｇ
Ｎａ2ＣＯ3（無水）                                ０．１ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4                                   ０．２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                ０．０１ｇ
ソルボース                                        ０．５ｇ
チオ硫酸ナトリウム（無水）                        ０．１ｇ
寒天                                              １．５ｇ
酵母エキス                                        ０．００５ｇ
デオキシコール酸ナトリウム                        ０．０２ｇ
リノール酸ナトリウム                              ０．０２ｇ
中性赤                                            ０．００２ｇ
ファンギソン（アンホテリシンＢ）（＊１）          ０．０００５ｇ
上記成分を加熱溶解後、約５５℃まで冷却し、ファンギソン（＊１）を添加し、混合して平板培地とした（ｐＨ  約７）。
【００５６】
なお、この平板培地においては、E. coli ATCC 25922を接種後、約３７℃で約４８時間インキュベートすると、E. coli ATCC 25922の大きな赤いコロニーが検出される。なお、この培地においては、EHECは小さな淡いピンク色のコロニーとして検出される。
【００５７】
Clostridium butyricum FERM P-14285用の選択培地は、蒸留水100mlあたり以下の成分を含有する：
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）                  １ｇ
プロテオーズペプトン No.3(Difro)                  ０．５ｇ
酵母エキス（ＢＢＬ）                              ０．１ｇ
ラクトース                                        ０．５ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                                         １．０ｇ
ＮａＣｌ                                          ０．５ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩１水和物                      ０．０２ｇ
酢酸ナトリウム                                    ０．５ｇ
寒天                                              １．５ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）                          ０．０３ｇ
アンフォテリシンＢ（＊１）                        ０．０００５ｇ
トリメトプリム（＊１）                            ０．００３ｇ
カナマイシン（＊１）                              ０．００５ｇ
ポリミキシンＢ（＊１）                            １０4units
ペニシリンＧ（＊１）                              １０3units
メチル赤                                          ０．００１ｇ
上記成分を加熱溶解後、約５０℃〜約５５℃まで冷却し、アンフォテリシンＢ、トリメトプリム、カナマイシン、ポリミキシンＢ、およびペニシリンＧ（＊１）を添加し、混合して平板培地とした（ｐＨ  約５．５）。
【００５８】
なお、この平板培地においては、Clostridium butyricum FERM P-14285を接種後、約３７℃で約４８時間〜約７２時間インキュベートすると、Clostridium butyricum FERM P-14285は平板培地の表面に白色コロニーとして検出される。なお、この平板培地においては、E. coliおよびEHECは増殖せず、検出されない。
【００５９】
EHEC SU 5053用の選択培地は、蒸留水100mlあたり以下の成分を含有する：
ＮａＣｌ                                          ０．５ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4                                       ０．４ｇ
Ｎａ2ＣＯ3（無水）                                ０．１ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4                                   ０．２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                ０．０１ｇ
ラフィノース                                      ０．５ｇ
チオ硫酸ナトリウム（無水）                        ０．１ｇ
寒天                                              １．５ｇ
酵母エキス                                        ０．００５ｇ
デオキシコール酸ナトリウム                        ０．０２ｇ
リノール酸ナトリウム                              ０．０２ｇ
中性赤                                            ０．００２ｇ
ファンギソン（アンホテリシンＢ）（＊１）          ０．０００５ｇ
上記成分を加熱溶解後、約５５℃まで冷却し、ファンギソン（＊１）を添加し、混合して平板培地とした（ｐＨ  約７）。
【００６０】
なお、この平板培地においては、EHEC SU 5053を接種後、約３７℃で約４８時間インキュベートすると、EHEC SU 5053の大きな赤いコロニーが検出される。なお、この培地においては、E.coliについては、小さな淡いピンク色のコロニーとして検出される。
【００６１】
なお、培地流量を約５％／時間としたのは、腸管内を再現するためである。約５％／時間は、健常な腸の状態において、摂取された食物が１日で便となって排出される流量である。なお、下痢状態の場合には、約３０％／時間〜約５０％／時間以上の流量となるが、このような速い流れでは、菌の相互作用の解析が困難となるので、培地流量を約５％／時間とし、下痢の初期状態（すなわち、軽い下痢状態）を再現した。
【００６２】
次いで、ベロ毒素検出用培養液として、上記の培養液から２mlを採取し、約５℃および約４０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離した。上清を２．５ｍｌの注射器に入れ、注射器の先端にメンブランフィルター（０．２２μｍ、Sterile Millex-GV,0.22μmfilter unit,Low protein binding sterilization,(Millipore社製)）を設け、さらにこのメンブランフィルターを注射器と挟むようにして予め滅菌した試験管を設置し、次いで注射器のピストンをおして上清の濾過および除菌を行い、ベロ毒素測定試料液（以下、単に「試料液」という場合がある）を調製した。ベロ毒素の検出を、上記のキットを用いて、ベロ毒素測定試料液が凝集するかどうかを判定することにより、ベロ毒素１型およびベロ毒素２型について行った。
【００６３】
より詳細には、キットに付属している９６ウェル（縦１２列、横８列）のマイクロプレートの縦１、２および３列目の各ウェルに、キットに付属している希釈液をそれぞれ２５μｌずつ入れ、横１列目の各ウェルにベロ毒素測定試料液を２５μｌ添加し、２倍希釈試料液を調製した。希釈液とベロ毒素測定試料液とが十分混合した後に、横１列目の各ウェルからそれぞれ２５μｌ取り出し、横２列目の各ウェルにそれぞれ入れ、４倍希釈試料液を調製した。これを横８列目まで繰り返し、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、および２５６倍の希釈試料液（各２５μｌ）をそれぞれ調製した。また、同様にして、キットに付属している対照ベロ毒素１型およびベロ毒素２型についても、上記と同様にして２倍から２５６倍の希釈試料液をそれぞれ調製した（それぞれ、縦４列目および縦５列目、各表においては「測定対照液」という）。なお、横８列目のウェルにおける２５６倍の各希釈試料液については、１２８倍の各希釈試料液（２５μｌ）と各ベロ毒素測定試料液（２５μｌ）とが十分混合した後に、ウェルから各２５μｌの２５６倍希釈液を除去した。
【００６４】
次いで、縦１列目の各ウェル（計８ウェル）にキットに付属している感作ラテックスＶＴ１を、縦２列目の各ウェル（計８ウェル）にキットに付属している感作ラテックスＶＴ２を、縦３列目の各ウェル（計８ウェル）にキットに付属している対照ラテックスを添加した。同様に、縦４列目の各ウェルおよび縦５列目の各ウェルについても、それぞれ感作ラテックスＶＴ１および感作ラテックスＶＴ２を添加した。次いで、ブレンダーでマイクロプレートを振盪させ、各ウェルの混和を充分に行った後、室温で一晩静置して判定した。縦３列目の対照ラテックスが凝集しなかったことを確認し、感作ラテックスにより凝集した場合を陽性（＋）とし、凝集しなかった場合を陰性（−）とした。ベロ毒素測定試料液が凝集してベロ毒素１型およびベロ毒素２型が陽性となる最も希釈倍数の高い希釈率を凝集陽性最高希釈倍率とし、凝集陽性を示す試料液の最高希釈倍率を、凝集価、すなわち毒素量とした。
【００６５】
培養液から上記のベロ毒素検出用培養液を採取した直後に、培養液にホスホマイシン二ナトリウム塩（Sigma Chemical Co.社（米国）製、以下、単に「ホスホマイシン」と言う）を、その濃度が約２５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間インキュベートした。この２４時間のインキュベート後（すなわち、菌の接種から４８時間後）のE. coli ATCC 25922、Clostridium butyricum FERM P-14285およびEHEC SU 5053の菌数を上記と同様の方法で測定し、そしてベロ毒素１型およびベロ毒素２型を検出した。次いで、さらに４８時間インキュベートした。この４８時間のインキュベート後（すなわち、菌の接種から９６時間後、ホスホマイシン添加後７２時間後）のE. coli ATCC 25922、Clostridium butyricum FERM P-14285およびEHEC SU 5053の菌数を上記と同様の方法で測定した。
【００６６】
なお、添加するホスホマイシン二ナトリウム塩の量を約２５０μｇ／ｍｌとした理由は、ホスホマイシンを経口投与（規定量）した場合に、糞便中にホスホマイシンが約２００μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ含有されているためである（佐藤  肇ら、小児科臨床 37(9):199-214 1984を参照のこと。この文献は、本明細書中に参考として援用される）。また、嫌気性条件下でのEHEC SU 5053に対するホスホマイシンのＭＩＣ（最小阻止濃度）は約12.5μｇ／ｍｌ、E. coli ATCC 25922に対するホスホマイシンのＭＩＣは約50μｇ／ｍｌであることが知られている。
【００６７】
本実施例１における各菌数を表１に示し、そしてベロ毒素の検出結果を表２（菌の接種から２４時間後、ホスホマイシン添加直前）、および表３（菌の接種から４８時間後、ホスホマイシン添加後２４時間後）に示す。これらの表１〜表３のまとめを図１に示す。図１の左側の縦軸は菌数を、右側の縦軸は凝集陽性最高希釈倍率を、そして横軸は培養時間を示す。
【００６８】
【表１】
0004210354.tif 000002
【００６９】
【表２】
0004210354.tif 000003
【００７０】
【表３】
0004210354.tif 000004
（実施例２）
上記の培養液（約１３０ml）に、E. coli ATCC 25922含有液を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様に培養、測定、および検出を行った。本実施例２における菌数を表４に示し、ベロ毒素の検出結果を表５（培養開始２４時間後、ホスホマイシン添加直前）、および表６（培養開始４８時間後、ホスホマイシン添加２４時間後）に示す。これらの表４〜表６のまとめを図２に示す。図２の左側の縦軸は菌数を、右側の縦軸は凝集陽性最高希釈倍率を、そして横軸は培養時間を示す。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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（比較例１）
好気性細菌群の菌数が増加し、嫌気性細菌群の菌数が低下した下痢状態の腸管内の環境を再現するために、上記の培養液（約１３０ml）に、Clostridium butyricum FERM P-14285含有液を接種せず、E. coli ATCC 25922含有液およびEHEC SU 5053含有液のみを各菌の濃度が約１０6ｃｆｕ／ｍｌとなるように接種したこと以外は、実施例１と同様に培養、測定、および検出を行った。本比較例１における各菌数を表７に示し、ベロ毒素の検出結果を表８（培養開始２４時間後、ホスホマイシン添加直前）、表９（培養開始２９時間後、ホスホマイシン添加５時間後）、表１０（培養開始４８時間後、ホスホマイシン添加２４時間後）に示す。これらの表７〜表１０のまとめを図３に示す。図３の左側の縦軸は菌数を、右側の縦軸は凝集陽性最高希釈倍率を、そして横軸は培養時間を示す。
【００７４】
【表７】
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【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【００７７】
【表１０】
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（比較例２）
上記の培養液（約１３０ml）に、Clostridium butyricum FERM P-14285を接種せず、EHEC SU 5053含有液のみを、濃度が約１０6ｃｆｕ／ｍｌとなるように接種したこと以外は、実施例１と同様に培養、測定、および検出を行った。本比較例２における菌数を表１１に示し、ベロ毒素の検出結果を表１２（培養開始２４時間後、ホスホマイシン添加直前）、および表１３（培養開始４８時間後、ホスホマイシン添加２４時間後）に示す。これらの表１１〜表１３のまとめを図４に示す。図４の左側の縦軸は菌数を、右側の縦軸は凝集陽性最高希釈倍率を、そして横軸は培養時間を示す。
【００７８】
【表１１】
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【００７９】
【表１２】
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【００８０】
【表１３】
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実施例１および比較例１から、Clostridium butyricum FERM P-14285を接種した培養液中（実施例１、表１〜表３、図１）では、接種していない培養液中（比較例１、表７〜表１０、図３）と比較して、ホスホマイシン添加後２４時間以降のベロ毒素の産生がより強く阻害されていることが理解される。また、菌接種から２４時間後と９６時間後とのEHEC SU 5053の菌数を比較すると、共にEHEC SU 5053の菌数は約１万分の１まで減少し、Clostridium butyricum FERM P-14285は、ホスホマイシンのEHEC SU 5053に対する殺菌作用にほとんど全く悪影響を与えないことも理解される。従って、本発明の方法によって、ベロ毒素の産生を阻害することができるので、病原性大腸菌EHECに汚染された領域（例えば、腸管内）において、極めて安全に病原性大腸菌EHECを殺菌することができる。
【００８１】
実施例２および比較例２から、Clostridium butyricum FERM P-14285を接種した培養液中（実施例２、表４〜表６、図２）では、接種していない培養液中（比較例２、表１１〜表１３、図４）と比較して、上記と同様に、ホスホマイシン添加後２４時間におけるベロ毒素の産生が明らかに阻害されていることが理解される。
【００８２】
また、実施例１（表１〜表３、図１）と実施例２（表４〜表６、図２）とを比較すると、ホスホマイシンの存在下でClostridium butyricum FERM P-14285だけでなく、E. coli ATCC 25922をも培養液に接種することにより、EHEC SU 5053がより強力に殺菌され、さらにベロ毒素の産生もより顕著に阻害されていることが理解される。従って、Clostridium butyricum FERM P-14285は、ホスホマイシンと併用されてベロ毒素の産生を阻害し、そしてEHEC SU 5053が殺菌されるが、さらにこれらとE. coli ATCC 25922との間の相互作用によって、ベロ毒素の産生がさらに顕著に阻害され、そしてEHEC SU 5053もさらに顕著に殺菌されることも理解される。
【００８３】
（実施例３）
本実施例では、抗生物質と併用することによって病原性大腸菌毒素阻害する酪酸菌含有製剤について説明する。
【００８４】
オートクレーブで約１２１℃約１５分間滅菌した公知の液体培地にClostridium butyricum FERM P-14285を接種し、約３７℃で約２４時間インキュベートし、培養液Ａを調製した。
【００８５】
一方、フラスコに別の公知の液体培地を加え、同様に滅菌した後、培養液Ａを添加し、次いで約３７℃で約２４時間インキュベートし、培養液Ｂを調製した。一方、公知の液体培地を添加し、滅菌した本培養タンクに、培養液Ｂを添加し、約３７℃で約２４時間インキュベートし、培養液Ｃを調製した。次いで、培養液Ｃを１２０００ｒｐｍで約２時間かけて遠心分離し沈殿物を採取した。次いで、この沈殿物およびラクトースを水道水に添加し、約１７時間かけて真空凍結乾燥し、酪酸菌原菌末を作製した。次いで、この酪酸菌原菌末と乾燥バレイショデンプンとを混合し、６０メッシュの篩いにかけ酪酸菌含有製剤を作製した。
【００８６】
上記のように作製された酪酸菌含有製剤は、Clostridium butyricum FERM P-14285を含有するため、病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）のベロ毒素に汚染された領域に、ホスホマイシンなどの抗生物質と共に添加することにより病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）のベロ毒素の産生を阻害し、安全に病原性大腸菌EHEC（Ｏ１５７）を殺菌することができる。
【００８７】
【発明の効果】
本発明により、病原性大腸菌に汚染された領域において、病原性大腸菌の毒素（特にベロ毒素）の産生を顕著に阻害する方法および病原性大腸菌を安全に殺菌する方法に使用する酪酸菌および酪酸菌含有製剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１のデータをまとめたグラフである。
【図２】図２は、実施例２のデータをまとめたグラフである。
【図３】図３は、比較例１のデータをまとめたグラフである。
【図４】図４は、比較例２のデータをまとめたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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