(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体流の通路を規定し毛細流を支持するクロマトグラフィー担体と、
前記クロマトグラフィー担体に流体流接触させる血液サンプルの添加部位と、
前記添加部位から離間しており捕獲物質が非拡散的に結合している前記クロマトグラフィー担体上の検出部位と、
前記添加部位の下流の場所に拡散的に結合された標識物質と、
前記血液サンプルから血漿または血清を分離すべく前記検出部位の上流に拡散的に結合されたポリカチオンと、
ポリカチオンを中和すべく前記結合ポリカチオンの下流で前記検出部位の上流に拡散的に結合されたポリアニオンと、
から成る血液サンプル中の分析物の存在を検出するためのクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項２】
前記デバイスがイムノアッセイデバイスであることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項３】
前記ポリカチオンが前記血液サンプルの添加部位に結合されていることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項４】
前記ポリカチオンが、ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ（リシン、アラニン）３：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、アラニン）２：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、アラニン）１：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、トリプトファン）１：４臭化水素酸塩及びポリ（ジアリルジメチルアンモニウム塩化物）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項５】
前記ポリカチオンがポリ（ジアリルジメチルアンモニウム塩化物）であることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項６】
前記ポリアニオンが、硫酸デキストラン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホン酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（メチルメタクリル酸）、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸及びカルボキシメチルセルロースから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項７】
前記ポリアニオンが硫酸デキストランであることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項８】
前記ポリアニオンが前記標識物質と同じ場所でクロマトグラフィー担体に拡散的に結合されていることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項９】
前記標識物質がセレン標識物質であることを特徴とする請求項１に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
【請求項１０】
流体流の通路を規定し毛細流を支持するクロマトグラフィー担体を準備し、この通路に沿って、（ａ）前記クロマトグラフィー担体に流体流接触させる前記血液サンプルの添加部位と、（ｂ）前記添加部位から離間しており捕獲物質が非拡散的に結合している前記クロマトグラフィー担体上の検出部位と、（ｃ）前記添加部位の下流に配置された標識物質と、（ｄ）前記血液サンプルから血漿または血清を分離すべく前記検出部位の上流に拡散的に結合されたポリカチオンと、（ｅ）ポリカチオンを中和すべく前記結合ポリカチオンの下流で前記検出部位の上流の場所に拡散的に結合されたポリアニオンとを配備する段階と、
前記添加部位を前記血液サンプルに接触させる段階と、
前記血液サンプル中の分析物の存在を検出する段階と、
から成る血液サンプル中の分析物の存在を検出する方法。
【請求項１１】
前記標識物質がセレン標識物質であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリアニオンが、前記標識物質と同じ場所でクロマトグラフィー担体に拡散的に結合されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリカチオンが、ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ（リシン、アラニン）３：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、アラニン）３：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、アラニン）２：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、アラニン）１：１臭化水素酸塩、ポリ（リシン、トリプトファン）１：４臭化水素酸塩及びポリ（ジアリルジメチルアンモニウム塩化物）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリアニオンが、硫酸デキストラン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホン酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（メチルメタクリル酸）、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸及びカルボキシメチルセルロースから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、全血サンプル中の分析物を検出するためのクロマトグラフィーアッセイデバイス及び方法、より特定的には、赤血球を凝集させる赤血球分離剤と赤血球分離剤がアッセイ系に与え得るいかなるマイナス効果も中和する中和剤とを使用するデバイス及び方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
現代の臨床診断法では血液サンプルの検査が慣例になっている。しかしながら赤血球は多くの診断的定量を妨害するという不都合を生じる。赤血球は分析物のアッセイ中に特異的結合対を成す成分間の結合を阻害するであろう。また、赤血球は酵素活性を有しており、この活性は使用アッセイ次第では発生したシグナルを妨害するであろう。更に、クロマトグラフィーアッセイデバイス、特にクロマトグラフィーイムノアッセイデバイスを使用する高速試験フォーマットにおいて、赤血球は、デバイス上で反応を生じさせるために必要な流体流を阻害するであろう。これらの理由及びその他の理由から、多くのアッセイ方法には血漿または血清が使用されており、最初に全血サンプルから血漿または血清を分離する必要がある。
【０００３】
全血サンプル中の赤血球を血漿から分離するための多くの公知技術が存在する。遠心分離は全血から血漿（血餅形成前）及び血清（血餅形成後）を分離する当業界で公知の方法である。この手順では、赤血球を試験管の底に沈降させ、デカンテーションまたは別の方法で血清を分離する。しかしながら遠心分離による全血の層分離には多くの欠点がある。遠心分離は一般に大量の血液サンプルの採取を要する。更に、処理に時間が掛かる。また、開業医には維持し難い大型実験装置が必要である。最後に、血液処理工程が増えるので、血液に含まれている病原体の被害を蒙る機会が増える。
【０００４】
遠心分離の必要性を軽減または解消するために、血液の液体部分から赤血球を分離する勾配膜または捕獲膜を使用するアッセイデバイスが開発された。固定化した抗赤血球抗体も使用された。
【０００５】
赤血球を血漿または血清から分離する別の公知の方法としては、（１）全血サンプルに赤血球結合剤を混合し、凝固した赤血球を除去するために特異的結合対の少なくとも一方の成分を結合させた吸水性固体エレメントで混合物を濾過する方法；（２）任意に凝固剤を組込んだガラスマイクロファイバーフィルターで全血を濾過する方法；（３）多糖材料の遮断層または排除層を使用して赤血球の通過を防止し、乾燥試験ストリップ上のシグナルの検出または可視化の妨害を防止する方法；及び、（４）赤血球を結合させるが血漿を結合させないポリカチオン性表面をもつ支持体を使用する方法、がある。
【０００６】
赤血球を血漿から分離するこれらの技術の多くはコスト高で且つ複雑であり、結局は赤血球の分離が不完全であったり、溶血が生じたりする。溶血は非特異的結合または高いバックグラウンドをもたらし、アッセイ感度を低下させる。何故なら、遊離ヘモグロビンは検出ゾーンを淡紅色から暗褐色の間に着色させ、その結果として、検出ゾーンにヘモグロビンの色が存在するので発生した可視化学シグナルが全体的または部分的に隠蔽されるからである。更に、ポリカチオンのような分離剤をアッセイ系に使用すると、赤血球以外の別の試薬または結合成分の凝集がしばしば生じて系が妨害され易い。
【０００７】
従って、アッセイ系に不利な影響を与えることなく血液サンプル中の分析物を検出するデバイス及び方法が要望されている。このようなデバイス及び方法は、小さいサンプルも含めて種々のサイズの血液サンプルに適していなければならない。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、毛細流を支持し得る流体流の通路を規定しているクロマトグラフィー担体と、クロマトグラフィー担体に流体流接触させる血液サンプルの添加部位と、添加部位から離間したクロマトグラフィー担体上の検出部位と、添加部位の下流の場所に拡散的に結合された標識物質と、血液サンプルから血漿または血清を分離すべく検出部位の上流に拡散的に結合された赤血球分離剤と、分離剤と結合すべく結合分離剤の下流で検出部位の上流に拡散的に結合され分離剤の正電荷を中和し得る中和剤と、から成るクロマトグラフィーデバイスに関する。好ましくは、赤血球分離剤は、血清または血漿がクロマトグラフィー担体の下流に移動する前に赤血球が血清または血漿から分離されるように添加部位に配置される。
【０００９】
本発明はまた、サンプル、好ましくは血液サンプル中の分析物の存在を検出する方法に関する。方法は、毛細流を支持し得る流体流の通路を規定しているクロマトグラフィー担体を準備し、この通路に沿って、（ａ）クロマトグラフィー担体に流体流接触させる血液サンプルの添加部位と、（ｂ）添加部位から離間したクロマトグラフィー担体上の検出部位と、（ｃ）添加部位の下流の場所に拡散的に結合された標識物質と、（ｄ）血液サンプルから血漿または血清を分離すべく検出部位の上流に拡散的に結合された赤血球分離剤と、（ｅ）分離剤に結合すべく結合分離剤の下流で検出部位の上流に拡散的に結合され分離剤の正電荷を中和し得る中和剤とを配備する段階と、赤血球分離剤が血液サンプルから血清または血漿を分離し且つサンプルが流路に沿って流動するときに中和剤が分離剤の正電荷を中和するように添加部位を血液サンプルに接触させる段階と、血液サンプル中の分析物の存在を検出する段階とから成る。
【００１０】
（詳細な説明）
本発明は、全血サンプル中の赤血球が、赤血球の非存在下ならばアッセイ系によって容易に行われる筈の血液サンプル中の分析物の存在または量の測定を妨害するという観察に基づく。例えばイムノアッセイにおいて、添加部位に接触した全血サンプルは毛細管作用によってストリップの下流に移動することが難しいが、この原因は妨害的または障害的な赤血球の存在にある。本発明はアッセイ系の感度を損なうことなくこの問題を解決し得る。
【００１１】
以下の定義は本発明の実施態様の理解に役立つであろう。
【００１２】
“分析物”または“対象分析物”なる用語は、少なくとも１つのエピトープまたは結合部位を有している検出または測定すべき化合物または組成物を意味する。分析物は、天然産生の分析物特異的結合成分が存在しているかまたは該分析物に対する分析物特異的結合成分を合成し得る任意の物質を意味する。分析物の非限定例としては、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与される薬物及び違法に投与される薬物の双方を含む）、上記物質のいずれかの代謝産物または上記物質のいずれかに対する抗体がある。“分析物”なる用語はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、高分子及びその組合せを包含する。
【００１３】
“クロマトグラフィー担体”は、多孔性、吸収性、吸水性、等張性または毛管性の任意の適当な材料を意味する。これはデバイスの検出部位を含み、分析物または被験サンプルは毛細管作用すなわち灯心作用によってクロマトグラフィー担体中を搬送される。クロマトグラフィー担体は単一材料から製造されてもよく、または、多数の層が互いに流体流接触しこれによって被験サンプルが材料間を通過できるならば２種以上の材料から製造されてもよい（例えば異なるゾーン、部分、層、領域または部位を異なる材料から製造し得る）ことは当業者に容易に理解されよう。流体流接触によってサンプルの少なくとも幾つかの成分即ち分析物が多孔性材料のゾーン間を流動でき、好ましくは異なるゾーン間の接触界面に沿って均一に流動できる。天然材料、合成材料または合成的に改質した天然材料をクロマトグラフィー担体として使用できる。その非限定例としては、紙（繊維性）または紙などのセルロース材料の膜（微孔性）；セルロース並びに酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセルロース誘導体；ファイバーガラス；天然布（例えば木綿）及び合成布（例えばナイロン）；多孔質ゲルなどがある。
【００１４】
“標識”は、可視手段または計器手段によって検出可能なシグナルを発生し得る任意の物質を意味する。本発明で好適に使用される種々のラベルは、化学的または物理的手段によってシグナルを発生するラベルである。これらの例としては、酵素及び基質、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、有色のまたは着色可能な有機ポリマーラテックス粒子、リポソームまたはその他の直接観察できる物質を含有する小胞がある。本発明では放射性標識、コロイド状金属粒子またはコロイド状非金属粒子が好ましく使用される。好ましい標識はコロイド状の金及びラテックス粒子である。
【００１５】
“標識物質”または“コンジュゲート”は、特異的結合成分に結合した検出可能ラベルを含む物質を意味する。結合は共有結合でも非共有結合でもよく、核酸ハイブリダイゼーションでもよい。標識は、被験サンプル中の分析物の量に直接または間接に関係する検出可能シグナルを標識物質に発生させる。標識物質の特異的結合成分は分析物に直接または間接に結合するように選択される。
【００１６】
「特異的結合成分」は特異的結合対の各成分、即ち一方の分子が化学的または物理的手段を介して第二の分子に特異的に結合するような異なる２つの分子を意味する。特異的結合成分が免疫反応体であるとき、この成分は例えば、抗体、抗原、ハプテンまたはその複合体でよく、抗体が使用されるとき、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、組換えタンパク質または抗体、キメラ抗体、その（１つまたは複数の）混合物または（１つまたは複数の）フラグメント並びに抗体と別の特異的結合成分との混合物でよい。特異的結合成分の特定例としては、ビオチンとアビジン、抗体と対応抗原（双方がアッセイサンプルに関係を有していない）、一本鎖核酸とその相補鎖、などがある。
【００１７】
「捕獲物質」は、クロマトグラフィー担体の一部分の内部または上部に結合して１つまたは複数の「捕捉部位」を形成し、分析物、標識試薬及び／または対照試薬をクロマトグラフィー担体に固定させる１つまたは複数の特異的結合成分を意味する。本発明では結合方法は厳密に限定されない。捕獲物質は分析物及び／または標識物質を未結合アッセイ試薬及び被験サンプル中の残余成分から実質的に分離することによって検出可能シグナルの観察を容易にする。捕獲物質はアッセイの開始前またはアッセイの進行中に任意の適当な結合方法によってクロマトグラフィー担体に固定される。更に、捕獲物質はクロマトグラフィー担体の上部または内部の単一の検出部位に配備されてもよくまたは複数の部位に配備されてもよい。捕獲物質はまた、種々の検出フォーマットまたは測定フォーマットを生じる多様な配置で配備され得る。例えば、捕獲物質を文字、数字、アイコンまたは記号またはその任意の組合せとして配置し得る。
【００１８】
特に、本発明は、サンプル、好ましくは血液サンプル中の分析物の存在を検出するためのクロマトグラフィーアッセイデバイスを提供する。デバイスは好ましくは、毛細流を支持し得る流体流通路を規定しているクロマトグラフィー担体と血液サンプルの添加部位と血液サンプル中の分析物の存在または量を検出すべく添加部位から離間した検出部位とを有するクロマトグラフィーストリップの形態である。好ましくはデバイスが更に、クロマトグラフィー担体に拡散的に結合された標識物質（即ちコンジュゲート）を含む。好ましい実施態様では、標識物質は分析物に結合する物質または検出部位への結合に関して分析物と競合する物質であろう。デバイスは好ましくはクロマトグラフィー担体に結合した２つの追加物質、即ち、（１）検出部位の上流（以後の記載では、毛細管作用によって生じたサンプルの移動方向を「下流」と呼び、反対方向を「上流」と呼ぶ）で血液サンプルから血漿または血清を分離し得る赤血球分離剤と、（２）赤血球分離剤の下流及び検出部位の上流でクロマトグラフィー系に対する赤血球分離剤の作用特に副作用を中和する中和剤とを含む。
【００１９】
本発明の文脈で所与の試薬に使用した「拡散的に結合された」という表現は、標識物質、特異的結合成分、赤血球分離剤または中和剤を非限定例とする本発明に使用される任意の試薬に関する定義であり、（１種類または複数の）試薬が結合され、結合された（１種類または複数の）試薬が流路に沿って流動可能な状態であることを表す。
【００２０】
任意のアッセイ系を本発明の目的に使用し得る。イムノアッセイ系が好ましい。その非限定例は、水平流系、垂直流系、浸漬系及びディップスティックである。公知のアッセイ系を以下に概略的に記載する。
【００２１】
一般に、クロマトグラフィーストリップにおいては、少なくとも１つのサンプル添加部位と検出部位とがクロマトグラフィー担体上に配置されている。対象分析物を含む疑いのあるサンプル溶液、この場合には好ましくは血液サンプル、即ち分析液は、サンプル添加部位に添加されると毛細管作用によってクロマトグラフィー担体中を移動し、予めクロマトグラフィー担体上に配置された標識手段に含まれている標識物質またはコンジュゲートは、（免疫反応のような）結合反応によって検出されたサンプル溶液中の被検定物質の存在または量に正比例または反比例して検出部位に蓄積する。その結果、サンプル溶液中の被検定物質の存在または量が、蓄積した標識物質またはコンジュゲートの存在または量の測定によって判明する。多様な種類のクロマトグラフィーストリップが公知である。後述するものを含むこれらの公知のクロマトグラフィーストリップはいずれも本発明で使用できる。本文中で使用された「クロマトグラフィーアッセイデバイス」という用語は、アッセイで使用でき且つ保存及び運搬できるように作製されたクロマトグラフィーストリップを意味する。
【００２２】
クロマトグラフィーストリップの典型例を以下に記載する。サンプル添加部位は、標識物質が存在する場所と同じ場所に配置されてもよいが、好ましくは標識物質の上流の場所に配置される。被検定分析物を含む疑いのあるサンプル溶液をサンプル添加部位に接触させると、サンプル溶液が毛細管作用によって分析物と共にクロマトグラフィー担体中を下流方向に移動する。典型的には分析物は、検出部位に固定された捕獲物質に特異的に結合する化合物であるか、または、検出部位の捕獲物質に特異的に結合するコンジュゲートに特異的に結合する化合物である。例えば、捕獲物質が抗原であるかまたはコンジュゲートが抗原を含有しているときは分析物は抗体であり、捕獲物質が抗体であるかまたはコンジュゲートが抗体を含有しているときは分析物は抗原である。別の例として、分析物は、相補的なコンジュゲート及び捕獲物質に結合する核酸でもよい。
【００２３】
サンプル添加部位が標識物質に対して上流の場所に配置されるとき、標識物質はサンプル添加部位に隣接して配置されてもよく、または、サンプル添加部位から不連続の場所に配置されてもよい。
【００２４】
標識物質の添加は種々の手段によって行うことができ、例えばサンプル溶液添加後にクロマトグラフィーストリップ検出部位の外側のある場所に標識物質を添加してもよい。
【００２５】
標識物質がサンプル溶液の毛細管作用によって移動するように配置されているるので、サンプル溶液をサンプル添加手段に添加したときに標識物質は下流方向に移動する。
【００２６】
検出部位は一般に標識物質から下流の場所に標識物質からある程度の間隔で配置されている。検出部位では、分析物もしくはコンジュゲートだけに特異的に結合するかまたは被験物質の各々及び標識物質に特異的に結合する捕獲物質がクロマトグラフィー担体に固定されている。その結果として、１つの実施態様では、サンプル溶液の毛細管作用によって移動した分析物（ときには標識物質に結合している）が捕獲物質に結合するか、または、分析物がコンジュゲートに結合し、該コンジュゲートが捕獲物質に結合する。標識物質はこのように結合した被検定物質に結合し、これによって検出手段内で分析物の存在または量に応じた標識物質が蓄積する。あるいは、毛細管作用によって移動した標識物質と分析物とが競合的に捕獲物質に結合するか、または、コンジュゲートに結合し、該コンジュゲートが捕獲物質に結合する。その結果として、被検定物質の量に反比例する標識物質が蓄積する。
【００２７】
ある種の標識物質は捕獲物質（または以後に捕獲物質に結合するコンジュゲート）と分析物との双方に結合するが、結合が同時に生じないという場合がある。この場合には、最初に分析物が標識物質に結合し、被検定物質に結合しなかった残りの標識物質が捕獲物質に結合する。その結果、検出手段に蓄積した標識物質を測定することによって分析物の存在または量を分析できる。
【００２８】
必要な場合には、種々の物質を検出部位の上流に配置する。例えば、コンジュゲートを移動可能な状態で検出部位の上流に配置し得る。
【００２９】
幾つかの場合には、１つまたは複数の追加の検出部位を第一検出部位の下流に配置し得る。また、サンプル溶液が完全に排出されるように検出部位の下流でクロマトグラフィー担体を更に延長してもよく、または、サンプル溶液吸収材料を担体に配備してもよい。
【００３０】
上記のごとく、サンプル溶液中の対象分析物の存在または量は、検出部位に蓄積する標識物質の存在または量を測定することによって判明する。１つの例では、測定が目視によって行われる。
【００３１】
本発明は、血清及び血漿などの任意の血液サンプルに使用できるが、好ましくは、赤血球を含有する血液サンプル、即ち全血に使用される。
【００３２】
アッセイを望ましい感度で行う必要があるときは、血液サンプル中の対象分析物の検定を開始する前に赤血球を除去するのが好ましい。このためには、本発明に従って赤血球分離剤をクロマトグラフィー担体に結合させる。好ましくは、赤血球分離剤をクロマトグラフィー担体に拡散的に結合させる。赤血球分離剤は、任意の場所でクロマトグラフィー担体に結合され、赤血球を血漿または血清から分離すべく機能し得る。好ましくは、赤血球分離剤を検出部位の上流でクロマトグラフィー担体に拡散的に結合させる。最も好ましくは、赤血球分離剤をサンプル添加部位で拡散的に結合させる。この場所が好ましい理由は、赤血球がクロマトグラフィー担体に添加されたときに赤血球分離剤が直ちに赤血球を凝集させるので、毛細管作用による血清または血漿の担体に沿った流動に対する妨害はたとえあったとしても極めて少ないからである。
【００３３】
本発明の赤血球分離剤は赤血球を凝集させ得る任意の物質でよい。好ましい物質は、ポリカチオンのような正電荷をもつ物質である。ポリカチオンの例は、ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩；ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）塩化物（Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）２８０、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）５５０）；ポリ−Ｌ−アルギニン臭化水素酸塩；ポリ−Ｌ−ヒスチジン；ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（４−ビニルピリジン）塩酸塩；ポリ（４−ビニルピリジン）架橋メチルクロリド第四塩；ポリ（４−ビニルピリジン−コ−スチレン）；ポリ（４−ビニルピリジニウムポリ（フッ化水素））；ポリ（４−ビニルピリジニウム−ｐ−トルエンスルホン酸塩）；ポリ（４−ビニルピリジニウム−三臭化物）；ポリ（４−ビニルピロリドン−コ−２−ジメチルアミノエチルメタクリル酸塩）；ポリビニルピロリドン，架橋；ポリビニルピロリドン，ポリ（メラミン−コ−ホルムアルデヒド）；部分メチル化；ヘキサジメトリン臭化物；ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）１：４臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ，Ａｌａ）３：１臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ，Ａｌａ）２：１臭化水素酸塩；ポリ−Ｌ−リシンスクシニル化；ポリ（Ｌｙｓ，Ａｌａ）１：１臭化水素酸塩；及びポリ（Ｌｙｓ，Ｔｒｐ）１：４臭化水素酸塩である。最も好ましいポリカチオンはポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）塩化物（Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００）である。
【００３４】
本発明の赤血球分離剤は、赤血球をサンプルの残余部分から分離すべく機能する適当な任意の量で使用され得る。好ましくは、赤血球分離剤は約０．０４％−約１．３％（重量／容量）、より好ましくは約０．１３％−約０．３３％（重量／容量）、最も好ましくは約０．２０％−約０．３３％（重量／容量）の濃度で存在し得る。
【００３５】
赤血球分離剤の正電荷はストリップ上に存在する負電荷をもついかなる物質をも凝集させる傾向を有している。例えばクロマトグラフィー担体に結合された標識物質またはコンジュゲートも赤血球分離剤によって凝集するので、分析物がコンジュゲートに結合することが妨害されたり、競合アッセイ中に標識物質と対象分析物とが検出部位の捕獲物質またはコンジュゲートに結合することが妨害されたりする。結局、イムノアッセイ系の感度及び正確度が損なわれる。
【００３６】
従って、血球分離剤が正電荷をもつ物質であるときは、本発明の中和剤を使用するのが好ましい。中和剤は赤血球分離剤の正電荷を中和でき、これによって赤血球分離剤によって生じるアッセイ系の妨害を解消するかまたは少なくとも著しく軽減する。好ましくは、中和剤をクロマトグラフィー担体に拡散的に結合させる。中和剤は、中和剤が赤血球分離剤を中和すべく機能するクロマトグラフィー担体上の任意の場所に拡散的に結合され得るが、好ましくは赤血球分離剤の下流で検出部位の上流に配置され、より好ましくは拡散的に結合された標識物質と同じクロマトグラフィー上の場所に配置される。
【００３７】
中和剤は、赤血球分離剤の正電荷を中和し得る任意のポリアニオンでよい。好ましいポリアニオンとしては、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸Ｎａ塩）、ポリ（メチルメタクリル酸）、ポリ（（Ｎａ−４−スチレンスルホン酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸及びカルボキシメチルセルロースがあり、硫酸デキストランが最も好ましい。
【００３８】
中和剤は赤血球分離剤の正電荷を中和すべく機能する任意の量で存在し得る。一般に、中和剤の濃度は赤血球分離剤の使用濃度に依存する。中和剤は約０．３３％−約２０％（重量／容量）、より好ましくは約０．３４％−約１０％（重量／容量）、最も好ましくは０．３４％−１０％（重量／容量）の濃度で存在するのが好ましい。
【００３９】
図１は本発明のイムノクロマトグラフィーアッセイデバイスの実施態様を示す。デバイス１０は、クロマトグラフィー担体２０を含む。クロマトグラフィー担体２０の上に血液サンプル添加部位３０が配置されている。この好ましい実施態様では赤血球分離剤即ちＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）１００が添加部位３０に配置されている。添加部位３０に隣接してコンジュゲート即ちセレン標識結合物質と中和剤即ち硫酸デキストランとを含むコンジュゲートパッド４０が配置されている。更に下流に検出部位５０が存在し、検出部位５０は、アッセイ処理が終了したことをコントロールバー６０で示し、被検定物質が存在することをテストバー７０で示す。
【００４０】
本発明の別の実施態様では、好ましくはサンプルを添加部位に接触させた後でバッファを添加部位に接触させてもよい。バッファは、クロマトグラフィー担体上の流路に沿って流体が適正な流速を維持する助けとなる。バッファは、流体の流路に沿って毛細管作用で流動し得る任意の物質でよい。バッファの非限定例は、リン酸塩バッファ、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス−ＨＣｌバッファ、炭酸塩バッファ、クエン酸塩バッファ、ＨＥＰＥＳ（２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）バッファ、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）バッファ、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファなどである。濃度及びｐＨは所望のアッセイデバイスで使用し得る任意の濃度及びｐＨでよいが、好ましくは、モル濃度が約１０ｍＭ−約１００ｍＭの範囲、ｐＨが約５−９、より好ましくは約６−８の範囲である。最も好ましくは、５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４を使用する。
【００４１】
本発明に使用される流体容量はデバイスのサイズに依存する。流体がデバイス内部を検出部位まで流れるような十分な量の流体を使用するのが望ましい。好ましくは、流体容量は約２５μｌ−約１００μｌの範囲、より好ましくは約４０μｌ−約６０μｌの範囲である。これに応じて、必要であれば約１０μｌ−約４０μｌ、より好ましくは約２０μｌ−約３０μｌの容量範囲のバッファを添加するとよい。
【００４２】
本発明はまた、血液サンプル中の分析物の存在を検出する方法を目的とする。好ましくは、方法が本発明のクロマトグラフィーイムノアッセイデバイスを使用する。より詳細には方法は、（１）毛細流を支持し得る流体流の通路を規定しているクロマトグラフィー担体を準備し、この通路に沿って、クロマトグラフィー担体に流体接触させる血液サンプルの添加部位と、添加部位から離間したクロマトグラフィー担体上の検出部位と、検出部位に結合すべく分析物に結合するかまたは分析物と競合する拡散的に標識された物質（またコンジュゲート）と、血液サンプルから血漿または血清を分離すべく検出部位の上流に拡散的に結合された赤血球分離剤と、クロマトグラフィー担体に結合されたコンジュゲートとを配備する段階と；（２）赤血球分離剤が血液サンプルの血清または血漿から赤血球を分離し中和剤が分離剤の正電荷を中和するように添加部位を血液サンプルに接触させる段階と；（３）血液サンプル中の分析物の存在を検出する段階とから成る。
【００４３】
好ましくは、血球分離剤が正電荷をもつ物質であり、流体流の通路が拡散的に結合された中和剤を含む。中和剤は好ましくは赤血球分離剤と結合できる物質であり、赤血球分離剤の下流で検出部位の上流に配置され、分離剤の正電荷を中和する。
【００４４】
従って、図１の好ましい実施態様では、血液サンプルが添加部位３０に添加され、赤血球分離剤は赤血球を凝集させることによって赤血球を分離し血漿または血清を毛細管作用によってクロマトグラフィー担体２０に沿って下流に移動させる。コンジュゲートパッド４０の中和剤はデバイス１０上の赤血球分離剤及びコンジュゲートの作用を中和し、分析物はコンジュゲートパッド４０に存在するコンジュゲートに結合する。コンジュゲートに結合した分析物は引き続き下流に移動して検出部位５０に到達する。対象分析物が存在するときはテストバー７０が出現する。試験が適正に行われたことを示すために、対象分析物の有無に関わりなくコントロールバー６０が出現する。
【００４５】
本発明は好ましくは、デバイスの周囲に非反応性カバーまたは閉鎖容器を含む。好ましくは、カバーは捕獲部位との接触及び捕獲部位の汚染を防止するために少なくともクロマトグラフィー担体を包囲する。また、カバーはある程度の量のサンプルを容易に受容及び／または含有するように添加部位の近傍に隆起領域を含み得る。更に、カバーは文字、数字、アイコンまたは記号またはその任意の組合せの形態の１つまたは複数の切抜き領域を含み得る。この実施態様では、ストリップが完全に閉鎖されたときに１つまたは複数の切抜き領域が（１つまたは複数の）特定の検出部位を形成するように設計されている。ストリップの十分な部分が包装され、添加されたサンプルがストリップの一部分を先ず通過しなければ検出部位に接触できないのが好ましい。
【００４６】
本発明のデバイス及び方法は、対象分析物が血液サンプルに含まれている任意のアッセイ系で使用され得る。好ましい系の非限定例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗体（ＨＢｃＡｂ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、膵臓癌マーカー（ＣＡ１９−９）、梅毒、結核、マラリア、リーシュマニア及びデング熱である。
【００４７】
以下の実施例は本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されると考えてはならない。
【００４８】
実施例
実施例１
ポリカチオンによる赤血球凝集とＳｅ−コンジュゲート凝集との比較
本発明の目的には、全血中の赤血球（ｒｂｃ）は凝集するがセレンコンジュゲートは凝集しないのが望ましい。種々のポリカチオンを試験し、どのポリカチオンが赤血球を十分に凝集させセレンコンジュゲートをできるだけ凝集させないかについて判定した。
【００４９】
ＨＩＶ−１組換えタンパク質のセレンコンジュゲートを以下の手順で調製した。先ず、３２ｍＭの酸化セレンを９１ｍＭのＬ−アスコルビン酸と共に水溶液中で４２℃で７２時間反応させることによってセレンコロイドを調製した。このセレンコロイドを５５０ｎｍの波長の光学密度３０まで希釈し、次いで３０ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４中の４０μｇ／ｍｌの組換えＨＩＶ−１エンベロープタンパク質と共に室温で２０分間反応させた。このセレンコロイド標識ＨＩＶ−１タンパク質コンジュゲートを次に、０．１％のカゼイン含有の１０ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４で５５０ｎｍの波長の光学密度３０まで希釈し、室温で２０分間インキュベートした。次いでコンジュゲート溶液を１９７０×ｇで４℃で２０分間遠心し、上清を取出して、ペレットを廃棄した。次に２％カゼイン含有の３０ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４を上清の１／１０量に均等な量で上清に添加した。最後にこのコンジュゲート溶液を、１％カゼイン、２％ショ糖及び２％乳糖を含有する５０ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４に５５０ｎｍの波長の光学密度１０まで希釈した。
【００５０】
以下のポリカチオンの０．２５％（重量／容量）水溶液を調製した：ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩，分子量（ｍｗ）３７０００；ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩，ｍｗ１２１００、４２４００及び９２０００；ポリ−Ｌ−ヒスチジン，ｍｗ１８４００；ヘキサジメトリン臭化物、ポリ（リシン、アラニン）３：１臭化水素酸塩，ｍｗ３５０００；ポリ（リシン、アラニン）２：１臭化水素酸塩，ｍｗ４９３００；ポリ（リシン、アラニン）１：１臭化水素酸塩，ｍｗ４１６００；ポリ（リシン、トリプトファン）１：４臭化水素酸塩，ｍｗ３８０００（上記のポリカチオンはいずれもＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した）；ポリ（ジアリルジメチルアンモニウム塩化物），ｍｗ１０5−１０6（Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００、Ｃａｌｇｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）。
【００５１】
全血中の赤血球またはセレンコンジュゲートを凝集させるこれらのポリカチオンの能力を、種々のポリカチオンの０．２５％溶液３５０μｌを等量の全血またはセレンコンジュゲートに添加することによって別々の反応で観察した。溶液を混合し室温で１０分間静置し、凝集を目視で判定した。結果を表１にまとめる。１個のプラス（＋）は低度の凝集、２＋は中程度の凝集、３＋及び４＋は高度の凝集を表す。
【００５２】
【表１】
0004270751.tif 000002
【００５３】
赤血球を凝集させるが（２＋以上）セレンコンジュゲートをできるだけ凝集させない（２＋以下）ポリカチオンを選択するのが好ましい。双方が２＋を示すポリカチオンはこの基準を満たす。ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ及びＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００を以後の処理に選択した。Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００は最も費用効果的である。
【００５４】
実施例２
ポリアニオン中和によるコンジュゲート凝集の防止
Ａ．硫酸デキストランを使用するコンジュゲートの流動及び凝集の防止
ポリカチオン系の赤血球凝集試薬としてポリ−Ｌ−リシンを使用し、ポリアニオンとして種々の濃度の硫酸デキストランを試験し、ポリカチオンの正電荷が硫酸デキストランによって中和され、ポリカチオンによるセレンコンジュゲートの凝集が防止されるか否かを観察した。ポリカチオンが赤血球を既に凝集させた後、ポリカチオンとセレンコンジュゲートとの相互作用が生じる前に硫酸デキストランを添加した。以下の実験で、セレンコンジュゲートの凝集及びその後のイムノクロマトグラフィーストリップに沿った流動能力に対するポリカチオン及び硫酸デキストランの効果を判定した。
【００５５】
サンプルパッドと中和パッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、４ｍｍ幅、２０ｍｍ長さのガラス繊維フィルター（Ｌｙｐｏｒｅ  ９５２４、Ｌｙｄａｌｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）を、０．３３％のポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩，ｍｗ３７０００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の水溶液に浸漬させ、次いで真空下に乾燥することによって作製した。
【００５６】
種々の濃度の硫酸デキストランを含有する中和パッドは、木材パルプとポリエステルとから成る４ｍｍ幅、１３ｍｍ長さのフィルター（Ｓｏｎｔａｒａ  ８８０１、Ｄｕ  ｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）を、０％、１．１％、３．３％または１０％の硫酸デキストラン，ｍｗ５０００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する水溶液に浸漬することによって作製した。浸漬後、パッドを真空下で乾燥した。
【００５７】
コンジュゲートパッドは、４ｍｍ幅、４．３ｍｍ長さのガラス繊維フィルター（Ｌｙｐｏｒｅ  ９５２４、Ｌｙｄａｌｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）を、実施例１の手順で調製し希釈したセレンコロイド標識ＨＩＶ−１組換えタンパク質コンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下で乾燥した。
【００５８】
検出ストリップは、４ｍｍ幅、４０ｍｍ長さのニトロセルロース膜フィルター（カタログ＃９６４３Ｇ１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から作製した。１％ショ糖を含有する１００ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４中の５ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＩＶ−１エンベロープ抗原を、膜の末端から約１ｃｍ内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネート（コード＃７７３３、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，ＰＡ）で裏打ちした。これを十分に乾燥して抗原をニトロセルロースに固定させた。
【００５９】
長手方向の一端から他端まで各セクションを１ｍｍずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用した４ｍｍ幅のイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端に２０ｍｍ長さのサンプルパッド、次に１３ｍｍ長さの中和パッド、次いで４．３ｍｍ長さのコンジュゲートパッド、最後に４０ｍｍ長さの検出パッドを配置した。作製したストリップを次に、検出ストリップの上端からストリップの下端の１０ｍｍ内側の場所までポリエステルラミネート（コード＃８６４８、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，ＰＡ）で被覆し、サンプルパッドの約１０ｍｍを露出状態で残した。次に、それぞれ０％、１．１％、３．３％または１０％の硫酸デキストランを含む中和パッドをもつイムノクロマトグラフィーストリップのそれぞれに対して、そのサンプルパッドに８０μｌの血漿を添加した。赤色セレンコンジュゲートの凝集及びストリップに沿ったコンジュゲートの流動能力を目視によって観察した。
【００６０】
以下の表２に示す結果は、ポリカチオン溶液の電荷を中和する硫酸デキストランの非存在下ではセレンコンジュゲートが凝集しストリップに沿って流動できなかったことを示す。コンジュゲートの凝集と流動との間には反比例の関係が存在した。３．３％以上の硫酸デキストラン濃度はコンジュゲートの凝集を阻止しコンジュゲートをストリップに沿って流動させ得る十分な濃度であった。
【００６１】
【表２】
0004270751.tif 000003
【００６２】
Ｂ．硫酸デキストランの存在下の赤血球凝集
赤血球凝集に対する硫酸デキストランの影響を検討するために、１０％硫酸デキストランを含む４．３ｍｍ長さ、４ｍｍ幅の中和パッドを作製し、全血サンプルを使用して上記実験を繰り返した。この中和パッドを組み込んで上記のようなイムノクロマトグラフィーストリップを作製し、８０μｌの全血をサンプルパッドに添加した。１５分後、赤血球凝集の結果を目視によって観察し、ストリップに沿った血漿の流動能力を測定した。赤血球は凝集してサンプルパッドに保持されストリップに沿って流動しなかったが、血漿はストリップに沿って１５分間で３３ｍｍ流動した。これは、サンプルパッド中のポリカチオンが全血サンプル中の赤血球を凝集させる能力を維持していたこと、及び、中和パッド中に存在するポリアニオン即ち硫酸デキストランがこの赤血球凝集を妨害しなかったことを示す。
【００６３】
Ｃ．ポリアニオンによるコンジュゲート凝集の防止
別のポリアニオンを実施例２．Ａ．の手順で試験してセレンコンジュゲート凝集を防止する能力を判定した。１５．５ｍｍ長さ、４ｍｍ幅のサンプルパッドを０．２６％Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００を含有する水溶液に浸漬させ、次いで５５℃で乾燥した。中和パッドは使用せず、１％カゼインと２％ショ糖と２％乳糖と共にポリアニオンを含有する１０ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４でセレンコンジュゲートを希釈した。ポリアニオンとしては０％、１．１％または３．３％の硫酸デキストラン，ｍｗ５０００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または０％、０．５％、１％または２％の以下のポリアニオンのいずれかを用いた（すべてＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手）：ポリ（アクリル酸），ｍｗ５０００；ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホン酸塩），ｍｗ７０，０００；ポリ（ビニルスルホン酸，ナトリウム塩）；ポリ（メチルメタクリル酸），ｍｗ９５００；ポリ（アクリル酸，ナトリウム塩），ｍｗ２１０００。コンジュゲートパッドを種々のセレンコンジュゲート溶液に浸漬させ、真空下に乾燥した。検出ストリップを実施例２．Ａ．に記載の手順で作製し、イムノクロマトグラフィーストリップを作製した。次に、種々のポリアニオンを含有するコンジュゲートパッドを含む各イムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに５０μｌの血漿を添加した。赤色セレンコンジュゲートの凝集を目視によって観察した。表３は、試験した種々の濃度のポリアニオンで観察されたコンジュゲートの相対凝集量を示す。
【００６４】
【表３】
0004270751.tif 000004
【００６５】
上記のように、（全血を検査するときに赤血球を凝集させるために必要な）サンプルパッド中のポリカチオンの正電荷を中和するためのポリアニオンが存在しないとき、セレンコンジュゲートが凝集した。コンジュゲーションパッドに使用されたすべてのポリアニオンが試験濃度の少なくとも１つでコンジュゲート凝集を防止した。この実験はまた、ポリアニオンを必ずしも独立のパッドに添加しなくても、コンジュゲーションパッドにセレンコンジュゲートと共存させればよいことを示した。
【００６６】
実施例３
ＨＩＶ−１抗体アッセイにおいて硫酸デキストランを中和パッド中で使用したときとコンジュゲーションパッド中で使用したときの比較
４ｍｍ幅、４．３ｍｍ長さのガラス繊維フィルター（Ｌｙｐｏｒｅ  ９５２４、Ｌｙｄａｌｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）を中和パッドとして組み込んでまたは組み込まずに実施例２．Ａ．に記載の手順でイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。中和パッドを使用するときは、中和パッドを３．３％の硫酸デキストランを含有する水溶液に浸漬し次いで真空下に乾燥した。中和パッドを使用しないストリップにおいては、１％カゼインと２％ショ糖と２％乳糖と３．３％硫酸デキストランとを含有する１０ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ７．４でセレンコンジュゲートを希釈し、コンジュゲートパッドをこの溶液に浸漬し次いで真空下に乾燥した。サンプルパッドとしては、０．２％のＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００の水溶液に浸漬した以外は実施例２．Ａ．と同じパッドを使用した。
【００６７】
ＨＩＶ−１抗体を含有するヒト血清をヘマトクリット値５０％（血漿容量に基づく）のＨＩＶ陰性ヒト全血またはＨＩＶ陰性ヒト血漿で１：２０４８に希釈した。同じく全血または血漿を希釈剤として更に３つの１：２系列希釈液を調製した。８０μｌの陰性全血またはＨＩＶ−１陽性全血希釈系列から得られたサンプルを、独立の中和パッドに硫酸デキストランを含むかまたはコンジュゲートパッド上のセレンコンジュゲート溶液中に硫酸デキストランを含むイムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに加えた。８０μｌの陰性血漿またはＨＩＶ−１陽性血漿希釈系列から得られたサンプルの試験には、コンジュゲートパッド上に硫酸デキストランを含むイムノクロマトグラフィーストリップだけを使用した。サンプル添加の１５分後に結果を読取った（表４）。陽性結果は、赤色セレンＨＩＶ−１抗原コンジュゲート−ＨＩＶ−１抗体複合体がストリップの線状領域のＨＩＶ−１抗原に結合し検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。
【００６８】
【表４】
0004270751.tif 000005
【００６９】
表４の結果は、赤血球を凝集させてサンプルをストリップに沿って流動させ得るポリカチオンＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００と、ポリカチオンによるセレンコンジュゲートの凝集を防止してコンジュゲートを陽性サンプルに結合させ複合体を形成させてストリップに沿って検出領域まで流動させ得る中和剤としてポリアニオン硫酸デキストランとを使用したイムノクロマトグラフィーストリップアッセイによれば全血からＨＩＶ−１抗体を検出できることを示す。ポリアニオンは、独立の中和パッドとして使用されたときにもコンジュゲートパッド上にセレンコンジュゲートと共存したときにも有効であることが判明した。このアッセイでは、ポリアニオン（硫酸デキストラン）をコンジュゲートパッド中に使用したときのＨＩＶ−１抗体の検出感度が独立の中和パッドを使用したときの２倍に向上していた。
【００７０】
更に、表４の結果は、サンプルを流動させるために赤血球を凝集させる必要があった全血中でもサンプルの流動を阻止する赤血球が存在しない血漿中でもＨＩＶ−１抗体の検出感度が等しいことを示し、これは、ポリカチオンが全血中の赤血球を効果的に凝集させることを示す。この結果はまた、ポリアニオンは独立の中和パッドに存在するかコンジュゲートパッドに存在するかに関わりなく、全血中の赤血球を効果的に凝集させるポリカチオンの能力を妨害しないことを示す。
【００７１】
実施例４
ＨＢｓＡｇアッセイにおけるＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）及び種々のポリアニオンの使用
全血サンプル中の肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出するためのイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッド中の赤血球を凝集させるポリカチオンとしてＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００を使用し、コンジュゲートパッド中の種々のポリアニオンをポリカチオン中和試薬として使用し、セレンコンジュゲートの凝集を阻止するその能力を評価した。
【００７２】
サンプルパッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、４ｍｍ幅、１５．５ｍｍ長さのガラス繊維フィルターを０．２６％のＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００の水溶液に浸漬させ、５５℃で乾燥することによって作製した。
【００７３】
セレンコンジュゲートは実施例１と同じセレンコロイドと１２μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇに対するマウスのモノクローナル抗体（抗ＨＢｓ）とを用いて調製した。このセレンコロイド標識抗ＨＢｓコンジュゲートを次に、５５０ｎｍの波長の光学密度が２．６になるまで以下のポリアニオンの１つを含むトリスバッファで希釈した：０．５％のポリ（アクリル酸），ｍｗ２０００（ＰＡＡ−２０００）；０．５％のポリ（アクリル酸），ｍｗ２４０，０００（ＰＡＡ−２４０，０００）；０．５％の硫酸デキストラン，ｍｗ５０００；０．８％のポリ−Ｌ−アスパラギン酸，ｍｗ３６，３００；０．５％のカルボキシメチルセルロース，ｍｗ９０，０００（ＣＭＣ）。硫酸デキストランとポリ−Ｌ−アスパラギン酸とはＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手し、その他のポリアニオンはＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手した。
【００７４】
コンジュゲートパッドは、４ｍｍ幅、４．３ｍｍ長さのガラス繊維フィルターを、上記ポリアニオンの１つを用いて調製し希釈したセレンコロイド標識抗ＨＢｓコンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下に乾燥した。
【００７５】
検出ストリップは、４ｍｍ幅、４０ｍｍ長さのニトロセルロース膜フィルターから作製した。マウスモノクローナル抗ＨＢｓを３ｍｇ／ｍｌの濃度で使用して実施例２に記載の手順で調製し、膜の末端から約１ｃｍ内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネートで裏打ちした。これを十分に乾燥して抗体をニトロセルロースに固定させた。
【００７６】
長手方向の一端から他端まで１ｍｍずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用したイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端にサンプルパッド、次にコンジュゲートパッド、最後に検出ストリップを配置した。作製したストリップを次に、サンプルパッドの約１０ｍｍを露出状態に残してポリエステルラミネートで被覆した。
【００７７】
組換えＨＢｓＡｇをヘマトクリット値５０％のＨＢｓＡｇ陰性ヒト全血に１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度まで添加した。更に３つの１：２系列希釈物を全血を用いて調製した。５０μｌの陰性全血またはＨＢｓＡｇ陽性全血希釈系列から得られたサンプルを、コンジュゲートパッドに種々のポリアニオンを含むイムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに加えた。サンプル添加の１５分後に結果を読取った（表５）。陽性結果は、赤色セレン抗ＨＢｓコンジュゲート−ＨＢｓＡｇ複合体がストリップの線状領域の抗ＨＢｓに結合し検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は、検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。検出ストリップの入口部の赤色セレンコンジュゲートの凝集を目視によって観察した。
【００７８】
【表５】
0004270751.tif 000006
【００７９】
どのポリアニオンの場合にもＨＢｓＡｇの検出が可能であったが、コンジュゲート凝集を阻止したポリアニオン、ＰＡＡ−２０００、硫酸デキストラン及びポリ−Ｌ−アスパラギン酸は、全血サンプル中のＨＢｓＡｇの検出感度を２−４倍も向上させた。
【００８０】
ＨＢｓＡｇ全血サンプル添加の１分後に２５μｌの５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４を添加する以外は上記と同じ実験を、ＰＡＡ−２０００をポリアニオンとして含有しトリスバッファで希釈したセレンコロイド標識コンジュゲートを使用して繰り返した。サンプル添加後にバッファを添加しこの手順を使用して得られた結果はこの段階を使用しない結果に等しかった。従ってこれらのアッセイは、サンプル添加後のバッファの添加または不添加に拘わらず使用し得る。
【００８１】
実施例５
結核アッセイにおけるＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）及び硫酸デキストランの使用
全血サンプル中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する抗体（抗Ｍｔｂ）を検出するためのイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッド中の赤血球を凝集させるポリカチオンとしてＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００を使用し、コンジュゲートパッド中の種々の濃度のポリアニオン硫酸デキストランをポリカチオン中和試薬として使用し、セレンコンジュゲートの凝集を防止するその能力を評価した。
【００８２】
サンプルパッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、４ｍｍ幅、１５．５ｍｍ長さのガラス繊維フィルターを０．２６％のＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００の水溶液に浸漬させ、次いで真空下に乾燥することによって作製した。
【００８３】
セレンコンジュゲートは、実施例１と同じセレンコロイドと３．５μｇ／ｍｌの大腸菌の組換えＭｔｂ抗原とを用いて調製した。このセレンコロイド標識Ｍｔｂコンジュゲートを次に、５５０ｎｍの波長の光学密度が２．５になるまで０％、０．３４％、１．１％または３．３％の硫酸デキストランを含むトリスバッファで希釈した。
【００８４】
コンジュゲートパッドは、４ｍｍ幅、４．３ｍｍ長さのガラス繊維フィルターを、上記硫酸デキストラン濃度の１つを用いて調製し希釈したセレンコロイド標識Ｍｔｂコンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下に乾燥した。
【００８５】
検出ストリップは、４ｍｍ幅、４０ｍｍ長さのニトロセルロース膜フィルターから作製した。実施例２と同様に調製した０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えＭｔｂ抗原を、膜の末端から約１ｃｍ内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネートで裏打ちした。これを十分に乾燥させて抗原をニトロセルロースに固定した。
【００８６】
長手方向の一端から他端まで１ｍｍずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用したイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端にサンプルパッド、次にコンジュゲートパッド、最後に検出ストリップを配置した。作製したストリップを次に、サンプルパッドの約１０ｍｍを露出状態に残してポリエステルラミネートで被覆した。
【００８７】
抗Ｍｔｂ陽性血清をヘマトクリット値５０％の陰性ヒト全血で１：１００に希釈した。更に２つの１：２系列希釈物を全血を用いて調製した。５０μｌの陰性全血または抗Ｍｔｂ陽性全血希釈系列から得られたサンプルを、種々の濃度の硫酸デキストランを含有するコンジュゲートパッドを含むイムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに加えた。サンプル添加の１５分後に結果を読取った（表６）。陽性結果は、赤色セレンＭｔｂコンジュゲート−抗Ｍｔｂ複合体がストリップの線状領域のＭｔｂに結合し、検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は、検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。検出ストリップの入口部の赤色セレンコンジュゲートの凝集を目視によって観察した。
【００８８】
【表６】
0004270751.tif 000007
【００８９】
表６のデータは、コンジュゲートの凝集を防止するポリアニオン、この場合には硫酸デキストランが存在しない場合にはアッセイが成功しないことを示す。コンジュゲート凝集とアッセイ感度との間には反比例の関係が存在する。硫酸デキストラン濃度が３．３％のとき、コンジュゲート凝集は完全に防止され、アッセイは最も高い抗Ｍｔｂ検出感度を示す。
【００９０】
実施例６
Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）及び硫酸デキストランを使用する梅毒アッセイ
全血サンプルまたは血漿サンプル中の梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）に対する抗体（抗ＴＰ）を検出するためのイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。全血中と血漿中との検出感度を比較することによって、アッセイを妨害し検出感度を低下させないようにポリカチオンが全血中の赤血球を効果的に凝集させたか否かを判定した。サンプルパッド中の赤血球を凝集させるポリカチオンとしてＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００を使用し、セレンコンジュゲートの凝集を防止するポリカチオン中和試薬としてコンジュゲートパッド中のポリアニオン硫酸デキストランを使用した。
【００９１】
サンプルパッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、４ｍｍ幅、１５．５ｍｍ長さのガラス繊維フィルターを０．２％のＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００の水溶液に浸漬させ、５５℃で乾燥することによって作製した。
【００９２】
セレンコンジュゲートは、実施例１と同じセレンコロイドと７．５μｇ／ｍｌの梅毒トレポネーマ溶菌液（ＴＰ）とを用いて調製した。このセレンコロイド標識ＴＰコンジュゲートを次に、５５０ｎｍの波長の光学密度が２．８になるまで３．３％の硫酸デキストランを含むトリスバッファで希釈した。
【００９３】
コンジュゲートパッドは、４ｍｍ幅、４．３ｍｍ長さのガラス繊維フィルターを、上記のように調製したセレンコロイド標識ＴＰコンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下に乾燥した。
【００９４】
検出ストリップは、４ｍｍ幅、４０ｍｍ長さのニトロセルロース膜フィルターから作製した。４４μｇ／ｍｌの濃度の梅毒トレポネーマ溶菌液を実施例２に記載の手順で調製し、膜の末端から約１ｃｍ内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネートで裏打ちした。これを十分に乾燥してＴＰ溶菌液をニトロセルロースに固定させた。
【００９５】
長手方向の一端から他端まで１ｍｍずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用したイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端にサンプルパッド、次にコンジュゲートパッド、最後に検出ストリップを配置した。作製したストリップを次に、サンプルパッドの約１０ｍｍを露出状態に残してポリエステルラミネートで被覆した。
【００９６】
抗ＴＰ陽性血清をヘマトクリット値５０％の陰性ヒト全血または陰性ヒト血漿に１：１０．８に希釈した。全血または血漿を希釈剤として更に４つの１：２系列希釈物を調製した。６０μｌの陰性全血もしくは血漿または抗ＴＰ陽性の全血または血漿希釈系列から得られたサンプルを、イムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに添加した。サンプル添加の１５分後に結果を読取った（表７）。陽性結果は、赤色セレンＴＰコンジュゲート−抗ＴＰ複合体がストリップの線状領域のＴＰ溶菌液に結合し、検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は、検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。
【００９７】
表７は、全血及び血漿の双方で抗ＴＰの検出感度が同じであり、これは、ポリカチオンＭｅｒｑｕａｔ（登録商標）−１００が全血中の赤血球を効果的に凝集させたことを示す。
【００９８】
【表７】
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【００９９】
本文中に引用したすべての刊行物、特許及び特許出願は参照によって本発明に含まれる。これは、個々の文献の各々について個別的及び特定的にその記載内容全体が参照によって本発明に含まれると定義することに等しい。
【０１００】
本発明を好ましい実施態様に基づいて詳細に説明したが、好ましい実施態様の変形が可能であることは当業者に明らかであろう。本文中に詳細に記載した態様以外の態様で本発明を実施することが可能である。従って、本発明は明細書及び特許請求の範囲に提示した本発明の要旨及び範囲に包含されるすべての変更を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は本発明のクロマトグラフィーアッセイデバイスの好ましい実施態様を示す。
【符号の説明】
１０  デバイス
２０  クロマトグラフィー担体
３０  添加部位
４０  コンジュゲートパッド
５０  検出部位
６０  コントロールバー
７０  テストバー
【図１】
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