(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカーＤ１９S６３とＤ１９S９５との間のヒト染色体１９ｑ由来の分離されたポリヌクレオチドにおいて、
イ．配列番号：１のヌクレオチド２２２４と配列番号：１のヌクレオチド２２５８の間のポリヌクレオチドにおける３塩基ユニットＣＴＧの５０回を超える繰返しを含むＤＮＡの塩基配列、
ロ．前記イの相補配列、
または、
ハ．前記の各ＤＮＡの塩基配列のいずれかから転写されるＲＮＡ配列もしくは前記の各ＤＮＡ配列のいずれかに対応するＲＮＡの塩基配列、
を含む分離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：１のヌクレオチド２２２４と配列番号：１のヌクレオチド２２５８の間の３塩基ユニットＣＴＧの５回以上の繰返しを含む配列番号：１のフラグメントまたは当該フラグメントの相補配列を含むプローブであり、かつ、検出可能な標識を結合させた、ＤＭ罹患の分析のための核酸ハイブリッド形成プローブ。
【請求項３】
ＤＭに伴う特性について個体のＤＮＡを試験する方法であって、
当該方法は、個体から採取された、マーカーＤ１９S６３とＤ１９S９５との間のヒト染色体１９ｑからの、配列番号：１のヌクレオチド２２２４と配列番号：１のヌクレオチド２２５８との間に対応するヌクレオチドにおける３塩基ユニットＣＴＧの多数回の繰返しを含む配列を含有する、遺伝子ＤＮＡの試料と、または、個体からの当該ＤＮＡから転写され、または、当該ＤＮＡに対応する、ＲＮＡと、請求項２に記載の１つ以上のハイブリッド形成プローブとをハイブリダイズさせ、染色体１９ｑ由来のＤＮＡ中の３塩基配列ＣＴＧ若しくはその相補配列についての繰返し領域の長さ若しくは繰返しの回数を測定し、また、当該ＤＮＡから転写された、または当該ＤＮＡに対応するＲＮＡ中の等価の３塩基ユニットの繰返しの回数を測定する方法において、
ここで、当該繰返しの回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセスを含む、方法。方法。
【請求項４】
当該試料を、１つ以上の当該プローブとハイブリダイズする前に、最初に制限酵素にさらすことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
当該制限酵素をＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩから選択することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号：１のヌクレオチド２２２４と配列番号：１のヌクレオチド２２５８の間の塩基配列ＣＴＧの多数回の繰返しを含む領域に密接して隣接する第一および第二のオリゴヌクレオチドを含み、当該第一および第二のオリゴヌクレオチドがそれぞれ配列番号：１の１６〜３２塩基の塩基配列を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項７】
配列番号：１のヌクレオチド２２２４と配列番号：１のヌクレオチド２２５８の間の塩基配列ＣＴＧの多数回の繰返しを含む領域に隣接する第一および第二のオリゴヌクレオチドを含むプライマーであって、当該第一および第二のオリゴヌクレオチドがそれぞれ配列番号：１の１６〜３２塩基の塩基配列を含み、各プライマーが配列番号：１のヌクレオチド２２２４および配列番号：１のヌクレオチド２２５８から５〜７５塩基離れていることを特徴とするプライマー。
【請求項８】
塩基配列ＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＣ、または、ＧＡＡＣＧＧＧＧＣＴＣＧＡＡＧＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣ、またはそれらの相補配列を有するプライマー。
【請求項９】
個体から採取されるＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料と、１つ以上の核酸プローブとをハイブリタイズすることを含むＤＭリスクの判定のための試験方法に使用するキットであって、当該キットは、請求項２に記載の核酸プローブを含み、選択的にＰＣＲプライマーを含み、当該ＤＭリスク判定のための試験方法が、ヒト染色体１９ｑの由来のＤＮＡ中の３塩基配列ＣＴＧまたはその相補配列、又は上記のＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡまたは当該ＤＮＡに対応するＲＮＡの中の等価の３塩基ユニットの、繰り返し数を、検知し、モニターし又は判定し、あるいは、当該繰返しを含む領域の長さを検知し、モニターし又は判定して、繰返し回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセスを含むことを特徴とするＤＭリスクの判定のための試験方法に使用するキット。
【請求項１０】
個体から採取されるＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料と、１つ以上の核酸プローブとをハイブリダイズすることを含むＤＭリスクの判定のための試験方法に使用するキットであって、当該キットは、請求項２に記載の核酸プローブおよび請求項６に記載のＰＣＲプライマーを含み、当該ＤＭリスクの判定のための試験方法が、ヒト染色体１９ｑ由来のＤＮＡ中の３塩基配列ＣＴＧのまたはその相補配列のまたは上記のＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡまたは当該ＤＮＡに対応するＲＮＡの中の等価の３塩基ユニットの、繰返し数を直接に、または間接に検知し、モニターし又は判定し、あるいは、当該繰返しを含む領域の長さを検知し、モニターし又は判定して、繰返し回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセスを含むことを特徴とするＤＭリスクの判定のための試験方法に使用するキット。
【請求項１１】
ＤＭに伴う特性について個体のＤＮＡを試験する方法であって、
該方法が、配列番号：１のヌクレオチド２２２４と配列番号：１のヌクレオチド２２５８の間の塩基配列ＣＴＧの多数回の繰返しを含む、マーカーＤ１９Ｓ６３とマーカーＤ１９Ｓ９５の間のヒト染色体１９ｑ由来のＤＮＡ中の３塩基配列ＣＴＧの繰り返しまたはその相補配列を含む、個体のＤＮＡの領域を核酸増幅方法で増幅するプロセスと、染色体１９ｑ由来のＤＮＡにおける３塩基配列ＣＴＧまたはその相補配列の多数回の繰返し、あるいは、当該ＤＮＡから転写されたＲＮＡまたは当該ＤＮＡに対応するＲＮＡ中の等価の３塩基ユニットの多数回の繰返し回数を測定するプロセスと、を含み、
ここで、当該繰返し回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセスを含む、ＤＭに伴う特性について個体のＤＮＡを試験する方法。
【請求項１２】
ヒトの間で長さの異なるＣＴＧの繰返しの領域の長さを、ヒト由来のＤＮＡ試料において、測定することにより、ＤＭに伴う特性について個人のＤＮＡを試験する方法であって、当該領域は配列番号：１のヌクレオチド２２２４に後続し、配列番号：１のヌクレオチド２２５８に先行する領域であって、ヒト染色体１９ｑに位置し；
イ．前記試料を制限酵素にさらし、それによって消化された試料を生産するプロセス、
ロ．請求項２に記載のプローブに、消化された試料をハイブリダイズするプロセス、
ハ．上記イのプロセスを経て消化され上記ロのプロセスを経てハイブリダイズされた試料とその試料の大きさを特定するプロセスであって、これによってＤＮＡ試料内のＣＴＧの繰返し領域の長さを測定し、そのＣＴＧの繰返し回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセス、
を含む、ＤＭに伴う特性について個体のＤＮＡを試験する方法。
【請求項１３】
ヒト由来のＤＮＡ試料のＣＴＧの繰返し領域の長さを測定することによって、ＤＭに伴う特性についてヒトのＤＮＡを試験する方法であって、当該領域は配列番号：１のヌクレオチド２２２４に後続し、配列番号：１のヌクレオチド２２５８に先行する領域であって、ヒト染色体１９ｑに位置し、
イ．各オリゴヌクレオチドがＣＴＧの繰返し領域に密接して隣接するＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドによって、ＣＴＧの繰返しを増幅するプロセス、
ロ．増幅されたＤＮＡの長さを測定するプロセスであって、これによって、当該ＤＮＡ試料における当該繰返し領域の長さを測定し、そのＣＴＧの繰返し回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセス、
を含む、ＤＭに伴う特性についてヒトのＤＮＡを試験する方法。
【請求項１４】
ヒトの間で長さの異なるＣＴＧの繰返し領域の長さを測定することによって、ＤＭに伴う特性についてヒトのＤＮＡを試験する方法であって、当該領域は配列番号：１のヌクレオチド２２２４に後続し、配列番号：１のヌクレオチド２２５８に先行する領域であって、ヒトＤＮＡの試料内のヒト染色体１９ｑに位置し、
ヒト由来のＤＮＡの試料においてＣＴＧの繰返し領域を含む分離されたＤＮＡ分子の塩基配列を測定するプロセスを含み、
ＣＴＧの繰返し回数が５０回を超えるか否かを判定するプロセスを含む、ＤＭに伴う特性についてヒトのＤＮＡを試験する方法。
【請求項１５】
配列番号：２からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、筋ジストロフィーの中でも、最も一般的に成人に見られる形態である。筋緊張性ジストロフィーは、八千人に一人の割合で発症すると考えられ、世界の母集団の大半で認められる遺伝性神経筋疾患である。（Harper PS, ”Myotonic Dystrophy”；2nd Edn., Saunders, 1989）発症や疾患重篤度は、一種の白内障が晩年に生じるだけの極軽度の罹患成人から、母体から遺伝子欠陥を継承した罹患乳児に認められ生命に危険がある新生児形態まで様々である。症状のタイプも非常に様々であり、筋肉、脳、心臓、内分泌器官などのさまざまな組織が関係し得る。一般的、ＤＭは、筋緊張、進行性筋衰弱によって特徴づけられる。これまで、ＤＭは処置不可能であり、その生化学的原理は知られていない。
ＤＭの原因となる遺伝子は、家系研究によって染色体１９の長いアームの小さい領域にマッピングされている。（Harley HG et al, American Journal of Human Genetics 49, pp68-75（1991））。その後の研究では、この遺伝子は標識Ｄ１９Ｓ６３とＤ１９Ｓ９５の間にあることがわかった。発明者らは、ＤＭ患者のＤＮＡ中の疾患を起こす原因である正確な部位を同定するＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）を単離した。このＤＮＡの塩基配列はヒトの脳内で発現する遺伝子を表現するＤＮＡフラグメントを収集したものの中から得た。このＤＮＡ内の塩基配列は、長さが２７００個以上の塩基から成り、ユニークなものである。その生化学的機能については、今後の研究課題である。このＤＮＡの塩基配列は、その長さ方向に、３塩基ユニット（CTG）の繰返しの列が含まれている。このトリプレットが繰り返される回数は、個体間に差がある。正常な非罹患者では、その回数は５回から約４０回である。ＤＭ患者の場合、５０回と少なくとも２０００回との間である。一般に、回数が増加すれば、疾患も重篤である。発明者らは、繰返しの回数が４０個と５０個の間の個体を認めたたことがないため、人は、繰返し回数が５０個未満の非罹患者と繰返し回数が５０個以上の罹患者との、異なる二グループに分類されることが示唆される。３塩基の配列の繰返し回数は、ＤＭ患者と正常な個体とでは、根本的に遺伝的差異があるように思われる。通常、ＤＮＡの塩基配列が本質的に変化せずに親から子に渡されるのが遺伝的継承の場合であるが、ＤＭ家系におけるこの特定の配列に関してはあてはまらない。多くの場合、繰返し回数は、罹患した親から罹患した子に伝播する際に増加する。この増加は、ＤＭ家系の世代継承の際の症状の重篤度の増加や発症の低年齢化に相関する。これらの所見は、１００組のＤＭ家系と２００の対照試料を含んで発明者らが実験室で行った広範囲にわたる試験に基づくものである。
発明の大要
ある態様では、本発明は、ヌクレオチドの塩基配列において、
３塩基ユニットＣＴＧまたはその相補配列の可変回の繰返し回数がＤＭに罹患した個体では約５０を超えるヒト染色体１９ｑ由来のＤＮＡの塩基配列；
前記可変回の繰返しを含む領域に渡って前記第１の配列に標準条件でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列；
前記各ＤＮＡの塩基配列のいずれかから転写されるＲＮＡの塩基配列もしくは前記各ＤＮＡの塩基配列のいずれかに一致するＲＮＡの塩基配列；または、
前記各塩基配列の１つを有するフラグメント
を含むことを特徴とする塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
上記ヌクレオチドの塩基配列は、配列番号：１で実質的に提供されるものであるのが好ましい。
さらに別の態様では、本発明は、試料ヌクレオチドの塩基配列内の前記３塩基ユニットの繰返し回数を測定するのに有用であり、前記試料のヌクレオチド配列または、その相補配列、あるいはこれらのいずれかのフラグメントにハイブリダイズすることができるヌクレオチドの塩基配列を含み、且つ、検出可能な標識を結合して有することを特徴とする、核酸ハイブリッド形成プローブを提供する。
もっと別の態様では、本発明は、染色体１９ｑから得られるＤＮＡ内の塩基配列ＣＴＧまたはその相補配列の繰返し回数、または上記のＤＮＡの塩基配列から転写されるか上記のＤＮＡの塩基配列に対応するＲＮＡ内の等価の３塩基ユニットの繰返し回数を、直接もしくは間接に観察し、モニタリングしまたは測定するステップか、あるいは、前記繰返しを含む領域の長さを観察し、モニタリングし、または測定するステップを、含むことを特徴とするＤＭリスク診断用検査方法を提供する。
上記のＤＭリスク診断用検査方法は、個体から得られるゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの試料を上述で定義した１つ以上のハイブリッド形成用プローブとハイブリダイズするステップを含むことが好ましく、当該試料は初期に制限酵素に暴露し、その後、前記プローブ１つ以上とハイブリッド形成することが好ましい。
適切な制限酵素はＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩである。しかし、他の多くの酵素でも、適切なプローブを有していれば、ＤＭ患者と非罹患成人とでは長さが異なるフラグメントに用いることができる。
本発明のこの様態の重要な特徴は、繰返し回数または繰返し領域長から個体のＤＭの発症度を予測することができるということにある。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など、少なくとも上述のヌクレオチド塩基配列の可変回繰返し領域を増幅するための核酸増幅方法に使用するプライマーにも及んでいる。前記プライマーは、例えば、各々が前記繰返し領域からおよそ５塩基から７５塩基分離れて前記繰返し領域に燐接する第１および第２のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。前記第１および第２のオリゴヌクレオチドは、各々が８から３２の塩基から成る配列を含み、ある一つの態様では、図１のプライマー参照１０１および１０２（配列番号：２）と実質的に同じものまたはその補体が好ましい。
別の態様では、本発明は、個体から得られるゲノムのＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料と１つ以上の核酸プローブとをハイブリダイズするステップを含み、上記のＤＭ診断用検査方法を実行用のハイブリッド形成プローブおよび１つ以上の他の構成要素を含み、上記のプローブが上述で定義されるプローブであり、そして任意にＰＣＲプライマーを含むことを特徴とするＤＭリスク診断用検査方法実行用キットを提供する。
本文に開示される技術は、臨床試験だけでは診断用検査をすることができない場合でも、非罹患の正常なヒトとＤＭ遺伝子のキャリアとを区別することができる。これは、サザンブロット法またはノーザンブロット法およびハイブリッド形成、および／または、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むＤＮＡ分析またはＲＮＡ分析の標準的な方法によって行うことができる。遺伝子キャリアには子孫が重篤に罹患し得るリスクが常に存在するので、ＤＮＡ試験またはＲＮＡ試験によるキャリア検出がＤＭ家系から要望されている。ＤＭのリスク負っている妊婦がすでに進行している場合、その家族から絨毛膜絨毛採取または羊水穿刺およびＤＮＡ分析によって胎児の出生前診断用検査を要求されることが度々あり、その結果堕胎したりそのまま出産したりする決定が成されることがある。
現在、ＤＮＡ診断用検査では、ＤＭ遺伝子の一部ではないＤＮＡの塩基配列を間接的に使用しているが、これは技術的に不十分なことが度々あり、当人よりも他の家族構成員の協力を必要としている。さらに、症候の発症度はわからず、疾患遺伝子の存否がわかるだけである。本文記載の技術は、このような限界を克服し、当事者から得たＤＮＡまたはＲＮＡの試料に疾患遺伝子が存在するかを診断用検査できるようにし、家族すべてを分析する必要を省くものである。これによって、処置速度が速まり（妊娠中は十分考慮しなくてはならない）、誤診のリスクを相当減少される。さらに、本発明に係る技術によって、ヒトの発症度および妊娠のリスクなどを予測することができることは重要である。ＤＭは状態が非常に変化するので、ささいなことで成人が致死性先天性疾患ではないかと訴えた時点から、家族およびそのカウンセラーにとって体調がいかに重篤な状況にあるかを知ることが重要であり、その結果、通知選択を行うことができる。
以上、本発明について述べてきたが、本発明は上述または以下の説明に述べた特徴を組み合わせた発明にも及ぶ。
本発明はさまざまな方法で行うことができるが、次に本発明の例について図面を用いて開示する。
図面の説明
図１は、ＤＭ患者の内部で膨脹しつつある１０ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの制限地図である。
図２（ａ）および（ｂ）は、固体数に対するフラグメント長の変化を示すオートラジオグラフであり、
図２（ｃ）は、図２（ｂ）の固体に対する系統樹である。
実験の詳細
ＤＮＡの単離
ヒト染色体１９の一連のフラグメントを、ＤＭ遺伝子が含まれていることが知られる領域から単離した。
ＤＭ遺伝子は、１９ｑの２００キロベース（ｋｂ）区間にマッピングされ、現在では１９ｑ１３．３にあると考えられている。放射還元ハイブリッド２Ｆ５の構成は、λファージ内のこの領域全体を容易にクローニングすることができる最も隣接したマーカーを有する２メガベースのヒト染色体１９を含んでいる。放射還元ハイブリッドおよびパルスフィールドゲル電気泳動を行ってさらにクローンを局在化させた。クローンλＭ９Ｃは種間保守が強いことがわかり、サブクローン（ｐＢＢＯ．７）はＲＦＬＰをＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩで同定した。
放射還元ハイブリッド２Ｆ５のライブラリー由来の一連のファージクローンを用いて、ＤＭで不均衡な結合位置であるＤ１９Ｓ６３とＤ１９Ｓ９５の区間を繋いだ。この区間を集中的にスクリーニングした結果、サブクローンｐＢＢＯ．７を含むλＭ１０Ｍ、λＭ８ＬおよびλＳＭ２と呼ばれるクローンであることを確認するに至った。これらのクローンは、ＤＭ患者ではサイズが大きくなっている１０ｋｂの長さのＥｃｏＲＩフラグメントにかかる。クローンλＭ１０Ｍは、そのようなクローンの一つであり、以下のように、ＤＭ患者と正常な個体とを区別する能力があることがわかった。すなちわ、クローンλＭ１０Ｍから得たＤＮＡのフラグメントを放射能特性により標識し、「ＤＮＡプローブ」を作成した。ＤＭ患者および正常な個体から得た一連のＤＮＡ試料は、ＥｃｏＲＩと呼ばれる細菌酵素を用いて特異的な小フラグメントに消化分解された。これらの小フラグメントをその長さに応じて寒天ゲル中での電気泳動によって分離し、ナイロン膜に付着させた（サザンブロット法）。次に、λＭ１０Ｍから得られた上記の放射活性プローブを上記のナイロン膜と共にインキュベートした。これによって、ヒトＤＮＡの各試料に対応する塩基配列を見付けることができる（ＤＮＡハイブリッド形成）。ナイロン膜上のこれらのフラグメントの位置は、Ｘ線フィルムに露光して視覚化することができる（オートラジオグラフィー）。この実験から、Ｍ１０Ｍに対応するフラグメントは、量を変更しても、正常な個体から得られたＤＮＡ内よりもＤＭ患者のＤＮＡ内のほうがいつも大きい、ことがわかった。より多数のサンプルについて追跡確認したところ、λＭ１０Ｍは筋緊張性ジストロフィーの原因であるＤＮＡの塩基配列のコピーを含むことが明らかになった。
元のλＭ１０Ｍのクローンは、完全なヒト染色体ＤＮＡ由来のものであった。このＤＮＡのごく一部のみが「発現」された、すなわち、タンパク質を生成することによって遺伝子として機能した、ので、Ｍ１０Ｍをプローブとして用いて第２次クローン化塩基配列を得た。この第２次クローンは、ヒトの脳で発現される遺伝子の大半を代表するｃＤＮＡのコレクションから採取されたものである。この第２次クローンは、Ｃ２８と呼ばれ、ヒトＤＮＡ中の２７２６個の塩基を含んでいる。その全体のＤＮＡの塩基配列は決定され、（配列番号：１）に示されている。ＤＭ患者の内部で膨脹しつつある３塩基繰返しの位置は、ＤＭ罹患の多くの組織の中で発現されるｍＲＮＡのポリ（Ａ）トラックから約５００ｂｐの位置にあることが示されている。内部に繰返しが存在するＲＮＡは、プロテインキナーゼ遺伝子系のメンバーに対して強力なアミノ酸相同性を有するポリペプチドをコード化する。
ＤＭ突然変異に関するヒトＤＮＡ試料の分析
２つの異なるが相補的な方法で、ＤＭ突然変異体の存在と膨脹した配列のサイズを測定した。これらの方法は、ヒトの血液、含嗽剤または絨毛膜絨毛生検から得られるＤＮＡ試料で実行することができる。上記の方法はいずれも、標準的な分子遺伝学的実験室方法に基づいている（Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T.“Molecular cloning - a laboratory manual”.Cold Spring Harbor Press, 1989）。
最初の方法は、サザンブロット法とハイブリッド形成に基づいており、寸法範囲の上端に向かう膨脹した塩基配列を検出するのに最も効果的である。試験すべき人から得た５〜１０μｇのＤＮＡ試料を、正常な対照のものと並行して、３７℃で２〜４時間、制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩを用いてインキュベートして消化分解させる。次に、試料を１６−１８時間、０．８％寒天ゲル内にて４５ボルトで電気泳動によって分離し、ＤＮＡを一夜かかって毛細管作用でナイロン膜に移した（サザンブロット法）。ナイロン膜を寒天ゲルから取り出し、乾燥させ、ＤＮＡを紫外線照射で固定した。Ｃ２８塩基配列（配列番号：１）の一部分から成るプローブは、放射活性トレーサーをＤＮＡの塩基配列の中に組込むことによって作製される。次に、これをナイロン膜と共に水性緩衝液内で６５℃で一夜インキュベートして、このプローブをナイロン膜上でＤＮＡ試料とハイブリダイズさせる。余分な未結合プローブを、稀薄食塩水を用いて、６５℃で洗浄し、ナイロン膜を暗室、−７０℃で１〜４日間、Ｘ線フィルムに照射する。照射フィルムを現像し、元のナイロン膜と並べると、さまざまな試料と３塩基繰返し配列を含むフラグメント寸法を識別することができる。
第２の方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づき、正常なものよりもわずかに大きいＤＭ突然変異の検出には最良の方法である。「プライマー」と呼ばれ、Ｃ２８（配列番号：１）由来であり、３塩基繰返しの部位に近接する小さくてユニークなＤＮＡの塩基配列を１組使用する。試験すべき個体から得た小さな試料（０．１−０．５μｇ）のＤＮＡを、正常な対照と並行して、２０ｐモルの各プライマー、１ユニットの細菌酵素（Ｔａｑポリマー）、ＤＮＡ合成用の単位塩基および緩衝塩と共に、２０μｌ容積の中に混合させる。次に、混合液をサイクリック３段階のインキュベーションのプロトコールに掛ける。最初の段階では、混合液を９０秒間で９４℃まで加熱し、ＤＮＡ試料の２本鎖を分離する。第２の段階は、６２℃で６０秒間であり、プライマーを試料ＤＮＡ上の相補的部位に結合させることができる。第３の段階の期間は、７２℃で２分間である。Ｔａｑポリメラーゼ酵素は、プライマーを基にして、試料の各鎖上で新たな相補的ＤＮＡ鎖を合成する。自動プログラム可能な冷却加熱装置を使用し、３段階通して３０回行う。各サイクル毎に、分子数が２倍になるので、最終結果は２つのプライマーによって区切られた区間の塩基配列を特異的に増幅することになる。発明者らの方法では、３塩基繰返し領域がＤＭ患者の内部では膨脹していることがわかる。ＰＣＲ反応の生成物は寒天ゲル電気泳動（３％寒天ゲル、８０ボルトを２時間）によって分離され、蛍光染料を用いたＤＮＡ染色によって視覚化される。増幅されたフラグメントの大きさは、既知の標準方法と比較して評価され、同様の電気泳動ゲルに分離される。
上述の方法を変更することができることは理解できよう。例えば、配列番号：１はｃＤＮＡ（ＲＮＡ由来）配列であり、ゲノムＤＮＡ中には、これと一緒に混合した隣接・干渉塩基配列がある。ゲノムＤＮＡ中のＣＴＧ繰返し領域に隣接する適切なＰＣＲプライマーは上述のプライマーと異なったものを使用してもよい。
例
サザンブロット法を用いて、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化分解し、ｐＢＢＯ．７すなわちλＭ９Ｃのシングルコピーのサブクローンで精査する。
結  果
図２から、すべての個体は一定〜１５ｋｂバンド（Ｃ）を有していることは明らかである。正常な個体は、１０ｋｂおよび９ｋｂの両バンドに対してホモ接合かヘテロ接合である（対立遺伝子１および２）。罹患個体は、これらの２つのバンドの１つの他に、１０ｋｂより大きい第２のバンドを有する。図２（ａ）および（ｂ）では、これを▲で示した。図２（ａ）では、個体に関係なくレーン２、４および８は正常である。レーン１，５及び７は罹患した個体とは関係なく、レーン３、６および９は、個体１と２、４と５および７と８のそれぞれの罹患した子孫である。レーン１は検出できる寸法変化が最小のものであり、レーン６は最大のものである。２つの異なるバンドが、オートラジオグラフに見られる。レーン５および７は、複数の個体に見られたバンドの墨点である。
図２（ｂ）では、個体４は、後期発現と分類され、正常の１０ｋｂバンドよりもごく僅か大きい新規のフラグメントを有する。罹患した２人の子孫は、成人になってからの発現（個体１は極微小だけ増加したフラグメント）と、成人初期の発現（患者の父親よりも〜１ｋｂ大きい新規のフラグメントを有する個体７）として分類される。罹患した孫（個体３および８）は、いずれも初期の発症として分類され、それぞれの両親と祖父母よりも遥かに大きなフラグメントを有することが分かる。個体８は、発症が最も若く、最も重篤に罹患し、この家族の中で最も大きなフラグメントを有する。
図１に示す制限マップは、罹患していない個体から得られる重複したゲノムファージクローンから誘導されたものである。ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＨｉｎｃＩＩ（Ｃ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）およびＳａｃＩ（Ｓ）に対する制限部位を示す。上記のサブクローン化した１．４ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント（ｐＭ１０Ｍ−６）を、膨脹領域に隣接するＰｓｔＩ部位およびＨｉｎｃＩＩ部位で拡張して示す。ＰＣＲプライマー９６、９８、１００、１０１、１０２および１０３の位置と、プライマー１０１と１０２の間の配列を示す。
塩基配列表
（１）一般情報
(i)  出願人
（Ａ）名称：ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＷＡＬＥＳ  ＣＯＬＬＥＧＥ  ＯＦ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ
（Ｂ）ストリート名：ＴＨＥ  ＨＥＡＴＨ
（Ｃ）都市名：ＣＡＲＤＩＦＦ
（Ｄ）州名：ＷＡＬＥＳ
（Ｅ）国名：Ｕ．Ｋ．
（Ｆ）郵便番号：ＣＦ４  ４ＸＮ
（Ｇ）電話番号：０２２２−７４７７４７
（Ｈ）ファクシミリ番号：０２２２−７４２９１４
(ii)  発明の名称：筋緊張性ジストロフィー診断用ＤＮＡ配列、材料および方法
(iii)配列数：２
(iv)  コンピュータ読解形式
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC-DOS／MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：Patent In Release #1.0，Version #1.25
（ＥＰＯ）
(V)  本発明のデータ
出願番号：ＷＯ  ＰＣＴ／ＧＢ／９３＊＊＊＊＊＊＊＊
(vi)先行出願データ
（Ａ）出願番号：ＧＢ  ９２０２４８５．０
（Ｂ）出願日：０６−ＦＥＢ−１９９
（２）配列番号：１に関する情報
(i)  配列特性
（Ａ）配列の長さ：２７２６塩基対
（Ｂ）配列型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
(ii)  配列の種類：ｃＤＮＡ
(iv)  配列の特徴：
（Ａ）特性を表す記号：ｒｅｐｅａｔ  ｒｅｇｉｏｎ
（Ｂ）存在位置：２２２５．．．２２５７
(iv)  配列の特徴：
（Ａ）特性を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄ
（Ｂ）存在位置：２１９０．．．２２１８
(iv)  配列の特徴：
（Ａ）特性を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄ
（Ｂ）存在位置：２３０８．．．２３３４
（ＸＩ）配列：配列番号：１
0004205158.tif 000002
0004205158.tif 000003
：（２）配列番号：２に関する情報
(i)  配列特性
（Ａ）配列の長さ：  １４５塩基対
（Ｂ）配列型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
(ii)  配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)  配列の特徴：
（Ａ）特性を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄ
（Ｂ）存在位置：１．．．２８
(iv)  配列の特徴：
（Ａ）特性を表す記号：ｒｅｐｅａｔ  ｒｅｇｉｏｎ
（Ｂ）存在位置：３６．．．６８
(iv)  配列の特徴：
（Ａ）特性を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄ
（Ｂ）存在位置：（相補配列）１１９．．．１４５
（ＸＩ）配列：配列番号：２
0004205158.tif 000004
【図１】
0004205158.tif 000005
【図２】
0004205158.tif 000006