(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される化合物（IX）またはその塩である精製マクロライド化合物。
0004373496.tif 000028
ここで、
R1は、O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり、RはH、アシル、アルキル、またはフェニル基であり、
R2は、アルキル、H、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+であり、XはH、Na、K、アミン、またはその他の１価陽イオン分子であり、
Rはアシル、アルキル、またはフェニル基であり、
R’は、アルキルまたはフェニル基である。
【請求項２】
化合物が、下記式で表されるラソノライドBである、請求項１記載のマクロライド化合物。
0004373496.tif 000029
【請求項３】
組成物が、適当な薬学的担体およびマクロライド化合物またはその塩を含み、該マクロライド化合物が下記式で表される化合物（IX）である、癌細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
0004373496.tif 000030
ここで、
R1は、O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり、RはH、アシル、アルキル、またはフェニル基であり、
R2は、アルキル、H、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+であり、XはH、Na、K、アミン、またはその他の１価陽イオン分子であり、
Rはアシル、アルキル、またはフェニル基であり、
R’は、アルキルまたはフェニル基である。
【請求項４】
マクロライド化合物が、下記式で表されるラソノライドBである、請求項３記載の薬学的組成物。
0004373496.tif 000031
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本明細書は1994年２月18日に提出された同時係属中の出願番号第08/198,747号の一部継続出願である。
発明の背景
腫瘍学および化学療法を含む抗腫瘍手段には、かなりの研究および資源が費やされてきた。腫瘍増殖の阻害、緩和、または調節の手助けとなる特定の方法および化学的組成物が開発されているとはいえ、新規な方法および抗腫瘍化学的組成物が必要とされている。いくつかの天然物および有機体は、非常に多様な有用な生物活性を有する化学分子の供給源となり得ることがわかっている。海洋生物は多様な生物活性を有する化合物を発見するための供給源であった。そのような発明のために発行された米国特許のいくつかは以下の通りである：抗ウイルス活性を有し、ホヤから単離されたジデムニン（didemnins）に関する米国特許第4,548,814号；海綿テイカキシネラ・モルチェラ（Teichaxinella Morchella）およびチロカウリス・ワルペルシ（Ptilocaulis walpersi）から単離され、抗腫瘍特性を有する化合物について開示している米国特許第4,729,996号；海綿ヨツウデデスマカイメン種（Theonella sp.）から単離され、抗ウイルス、抗腫瘍、および抗真菌特性を有する化合物について開示している米国特許第4,808,590号；ならびに、カリブ海海綿アゲラス・コニフェリン（Agelas coniferin）から単離され、抗ウイルスおよび抗菌特性を有する化合物について開示していする米国特許第4,737,510号。明らかに海綿は、生物学的化合物の供給源であることが証明されており、シャウアー（Sheuer, P.J.）編「天然海産物、化学的および生物学的特性（Marine Natural Products, Chemical and Biological Perspectives）」、Academic Press, New York、1978〜1983、I〜V巻；フォークナー（Faulkner, D.J.）（1984）天然物報告書1:551〜598；天然物報告書（1986）3:1〜33；天然物報告書（1987）4:539〜576；J.Am.Chem.Soc.（1985）107:4796〜4798）を含む、海綿由来の有機化合物を開示する多くの出版物が発行されている。
本発明は、出発材料として海綿を用い、これまで当技術分野において記述されていないクラスの生物学的に活性な化合物、および抗腫瘍剤として有用なそれらの化合物を含む新規の薬学的組成物を当技術分野に提供する。本発明のもう一つの利点およびさらなる出願範囲は、本明細書に記載の詳細な説明から明らかになると思われる；しかし、そのような説明から本発明の意図および範囲内で様々な変更および修正が明らかとなるため、本発明の好ましい態様を示す詳細な説明は、例示のためにのみ提示されることを理解すべきである。
発明の簡単な概要
本発明は、マクロライド系新規化合物、およびこれらの化合物の使用法に関する。本マクロライド、化合物（I）〜（IX）の構造を下に示す。
0004373496.tif 000002
ここで、R1およびR3は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R2は、Xが、H、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rが、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’が、アルキルもしくはフェニル基である、
アルキル、H、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+。
0004373496.tif 000003
ここで、R1は、
Xが、H、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rが、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’が、H、アルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OR、CHO、COOR’、またはCOO-X+である。
0004373496.tif 000004
ここで、
R1は、Xが、H、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rが、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’が、H、アルキルもしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；R2は、H、アルキル、CH2OR、CHO、COOR’、またはCOO-X+である。
0004373496.tif 000005
ここで、
Rは、Xが、H、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
R’が、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R”が、H、アルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OR’、CHO、COOR”、COO-X+である。
0004373496.tif 000006
ここで、
R1は、Xが、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rが、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、Rが、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R3は、Xが、H、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rが、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’が、H、アルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OR、CHO、COOR’、またはCOO-X+である。
0004373496.tif 000007
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアルキルもしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、Rが、H、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R3は、Xが、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rが、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+である。
0004373496.tif 000008
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアルキルもしくはフェニル基である、H、R、またはXであり；
R2は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOHもしくはORであり；
R3は、XがNa、K、もしくはアミンであり
Rがアシル、アルキルもしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+である。
0004373496.tif 000009
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアルキルもしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、HおよびOHまたはORであり；
R3は、XがNa、K、もしくはアミンであり
Rがアシル、アルキルもしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+である。
0004373496.tif 000010
ここで、
R1は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびOR；
R2は、XがH、Na、K、アミンもしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアシル、アルキルもしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
アルキル、H、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’、またはCOO-X+である。
マクロライド系化合物は生物学的活性を有し、細胞増殖の調節に有効となり得る。本明細書に特に例示するのは、フォルセピア（Forcepia）海綿から単離したラソノライド化合物である。化合物（I）および（IX）のそれぞれ特異的誘導体であるラソノライドAおよびラソノライドBは、腫瘍細胞の増殖を阻害することがわかっている。したがって、これらの化合物およびその誘導体ならびに類似体は、動物およびヒトにおける癌の治療に有用である。
本発明の化合物はまた、癌および正常細胞を含む、細胞における細胞骨格の変化の様々な面を決定する生化学的プローブとして用いることが可能であり、したがって植物、動物、およびヒトの特定疾患の研究における重要なツールとしても有用となりうる。
【図面の簡単な説明】
図１はラソノライドAの調製のための概略を示す。
発明の詳細な開示
本発明は、海綿から単離できる新規の化学的化合物に関する。これらの化合物の類似体および誘導体についても記述しており、請求の範囲内に含まれる。これらの化合物は抗腫瘍活性を有することが示されている。このように、本発明は、化合物自身ならびにこれらの化合物を含有する薬学的組成物に関する。新規組成物を投与することによって、癌細胞（例えば腫瘍細胞）の宿主となる動物を治療する方法についても開示しており、請求の範囲内に含まれる。海綿からの新規化合物の単離方法についても記述する。これらの化合物の類似体および誘導体は既知の方法によって作製することができる。親化合物は下記のように海綿から単離することができる。
天然のマクロライド産物であるラソノライドAおよびラソノライドBの単離は、溶媒分配法の後にクロマトグラフィーを用いて行った。これらの単離方法は、本明細書中で下記に詳細に記述する。新規化合物の最終精製は、当業者によって容易に理解されるように、結晶化または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかを用いて達成される。
本発明の単離マクロライドは、下に示す構造を有する化合物を含む。例えば、化合物（I）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000011
ここで、
R1は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R2は、XがH、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
アルキル、H、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（I）は、本発明の好ましい化合物である、ラソノライドA、およびその誘導体、類似体、異性体、およびその塩の一つを具体的に示している。天然のラソノライドA化合物を得るための一つの単離スキームを図１に示す。ラソノライドAの構造は、主に1Hおよび13C NMRデータに基づいて決定した。ラソノライドAは、R1がOHでありR2がCH2OHである化合物（I）の特異的誘導体である。ラソノライドAの構造は以下の化学式によって示される：
0004373496.tif 000012
本発明のその他の化合物は化合物（II）〜（IX）によって具体的に示される。特に、化合物（II）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000013
ここで、
R1は、XがH、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がH、アルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OR、CHO、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（II）の構造に従う好ましい化合物は、R1がCH2OHである。
化合物（III）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000014
ここで、
R1は、XがH、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がH、アルキルもしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、もしくはHおよびORであり；R2は、H、アルキル、CH2OR、CHO、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（III）の構造に従う好ましい化合物は、R1がHおよびOHでありR2がCH2OHである。
化合物（IV）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000015
ここで、
Rは、XがH、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
R’がH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R”がH、アルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OR’、CHO、COOH、COOR”またはCOO-X+である。
化合物（IV）の構造に従う好ましい化合物は、RがCH2OHである。
化合物（V）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000016
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R3は、XがH、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がH、アルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OR、CHO、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（VI）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000017
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアルキル、もしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R3は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（VII）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000018
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアルキルもしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOHもしくはORであり；
R3は、XがNa、K、もしくはアミンであり
Rがアシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（VIII）は以下の構造を有する：
0004373496.tif 000019
ここで、
R1は、XがNa、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアルキルもしくはフェニル基である、
H、R、またはXであり；
R2は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、HもしくはORであり；
R3は、XがNa、K、もしくはアミンであり
Rがアシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
H、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’またはCOO-X+である。
本発明のもう一つの好ましいマクロライドは化合物（IX）であり、以下の構造を有する：
0004373496.tif 000020
ここで、
R1は、RがH、アシル、アルキル、もしくはフェニル基である、
O、またはHおよびOH、またはHおよびORであり；
R2は、XがH、Na、K、アミン、もしくはその他の１価陽イオン分子であり
Rがアシル、アルキル、もしくはフェニル基であり
R’がアルキルもしくはフェニル基である、
アルキル、H、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR’またはCOO-X+である。
化合物（IX）の好ましい態様は、以下の構造によって示される、R1がHおよびOHでありR2がCH2OHであるラソノライドBである：
0004373496.tif 000021
ラソノライドAおよびラソノライドBの全ての態様および誘導体は、当業者に周知の標準的な反応および方法を用いて調製することができる。例えば、Rをアセチル基（Ac）に置換することによって調製されるラソノライドAまたはラソノライドBの誘導体は、標準的なアセチル化反応によって得ることができる。特異的反応はより詳細に下記に記述する。実施例６−化合物の類似体および変種参照。
開示されている化合物は、天然資源からこれまで単離されていない。本化合物はフォルセピア属（Forcepia）の海綿から単離することができる。フォルセピアの他に、他の海綿も本化合物（I）〜（IX）源として用いることができる。これらのその他の海綿には、アカルヌス（Acarnus）、リソデンドリクス（Lissodendoryx）、ヘミテダニア（Hemitedania）、テダニア（Tedania）等が含まれる。その誘導体を含む本発明の化合物は抗腫瘍活性を有する。このように、それらは癌を含む多くの疾患の治療に用いることができる。さらに、本化合物は生化学的プローブ、すなわち、植物、動物、およびヒトの細胞の細胞骨格構造の研究における有用なツールとして用いることができる。
以下は、本発明の実施にとって最良の形態を含む方法を図示する実施例である。これらの実施例は制限的なものとして解釈すべきではない。特に明記しない限り、百分率は全て重量で、および溶媒混合物の比率は全て容積である。
実施例１−海綿の同定および存在位置
研究対象となる海綿のフォルセピア種（コボネカイメン（Poecilosclerida）目、ネンエキカイメン（Myxillidae）科）は、英国バージニア諸島（緯度18 29.13°N、経度64 37.65°N）のグアナ島北東部のグランドグート（Grand Ghut）北海岸の海面から深度63フィートで採集することができる。採集部位の地形は、平坦な岩と砂である。海綿の色は赤〜オレンジ色で、形は球状である。このフォルセピア種はトリラビス？（?trilabis）種と同定した。バン・ソースト（Van Soest, R.W.M.）（1984）「キュラソー島とその他のカリブ海地域の海綿、第III部。コボネカイメン目（Marine sponges from Curacao and other Caribbean localities, Part III. Poecilosclerida）」Stud.Fauna Curacao Caribb.Isl.66（199）:1〜167参照。
目的のフォルセピア種はまた、サニベル島（北緯15.72’〜15.81’、西経83°41.99’〜83°41.02’）の約84海里西のフロリダ大陸棚南西部の深度225〜230フィートで採集することもできる。この位置の地形は、平坦でわずかに傾斜している。
海綿は以下のよう分類された：
門              海綿動物門
綱              普通海綿綱
目              コボネカイメン目
科              ネンエキカイメン科
属              フォルセピア（Forcepia）属
種              トリラビス？（?trilabis）種
海綿は、ハーバーブランチオーシャングラフィックインスティテュート貯蔵ライブラリ（Harbor Branh Oceanographic Institute storage library）において試料番号17-VIII-92-2-026に分類される。
実施例２−ラソノライドAおよびラソノライドBの単離
A．ラソノライドAの初回単離。被験化合物であるラソノライドAを得るため、被験化合物の原料海綿であるフォルセピア・トリラビス？（Forcepia ?trilabis）をブレンダーですりつぶし、エタノール200mlで３回抽出した。抽出時間はそれぞれ、約８、15、および８時間であった。すりつぶした海綿からエタノール抽出物をデカントし、自然濾過し、真空下で濃縮することにより、粗エタノール抽出物が得られた。この抽出物を次に、等量の水と酢酸エチルに溶媒分配した。酢酸エチル抽出液を真空下で濃縮し、ヘプタンと10％含水メタノールでさらに溶媒分配した。水性画分に十分量の水を加えて、総含水量を40％にした。40％含水メタノール画分を次に塩化メチレンで分配した。次に塩化メチレン抽出物を真空下で濃縮し、溶媒勾配１：１メタノール／水、80：20メタノール／水、および100％メタノールを用いて、逆相ODSゲルを充填した真空フラッシュカラム（VFC）を通過させてさらに精製した。80：20メタノール／水から得られた画分を次に、順相シリカゲルセミプレップカラムおよび溶出溶媒として70：30酢酸エチル／ヘプタンを用いたHPLCによってさらに精製した。これにより、純粋なラソノライドAが得られた。単離手順を図式で示したものを図１に示す。被験化合物の類似体および誘導体は、実質的に同様の抽出および精製技法を用いて得られた。
生物活性化合物であるラソノライドAは、有機体に存在する主要な細胞傷害性化合物であり、海綿の湿重量に対して約0.05％の収量で純粋な形で単離することができる。大容量単離は、水抽出物（メタノール抽出物を水／酢酸エチルで分配後に得ることができる）のRP-18真空液体クロマトグラフィーに続き、調製したカラム上でRP-18 HPLCを行うことによって、達成される。この方法で必要な材料は全て当業者には容易に入手可能である。
B．ラソノライドAのその後の単離およびラソノライドBの単離。化合物ラソノライドAをより多く単離するため、試料源である海綿17-VII-92-2-26 100gを、ブレンダーでエタノールを用いてすりつぶした。溶液を約２時間攪拌した。エタノールをデカントし、真空下で濃縮した。エタノール溶液は暗オレンジ色であった。
すりつぶした海綿をエタノールでさらに３回以上抽出した（約200ml、1.5時間）。
エタノール抽出物を全て合わせてこれを真空下で濃縮することにより、粗抽出物約390gが得られ、これを試料I.D.PAH V-4-1とした。
粗抽出物PAH V-4-1を酢酸エチルと水で溶媒分配した（水約150mlおよび酢酸エチル約150mlを３回）。エタノール抽出液を合わせて真空下で濃縮すると、抽出物約0.90gが得られ、これを試料I.D.番号PAH-V-5-1とした。
水性画分を次にブタノール（約150mlを３回）で抽出した。ブタノール分配液を合わせてこれを真空下で濃縮することにより、抽出物約0.53gが得られ、これを試料I.D.番号PAH-V-5-2とした。次に水を凍結乾燥によって除去し、抽出物約3.25gが得られた（試料I.D.番号PAH V-5-3）。
PAH-V-5-1画分を、10％含水メタノール（約100ml）およびヘプタン（約75mlを３回）でさらに溶媒分配した。ヘプタン抽出液を合わせて、ヘプタン画分は271.0mgであった（試料I.D番号PAH-V-6-1）。含水メタノール抽出液に十分量の水を加えて総含水量が40％の含水メタノールとした。40％含水メタノールを塩化メチレン（約75mlを３回）で分配した。塩化メチレン抽出から試料I.D.番号PAH-V-6-2 93.0mgが得られた。
40％メタノール画分を真空下で濃縮した。40％含水メタノール分配の質量：試料I.D.番号PAH-V-6-3 0.5358g。1H NMR分画によって、PAH-V-6-2はラソノライドA様化合物を含有した。
PAH-V-6-2画分をさらに精製するため、これを真空フラッシュカラムODSショートカラム（大きさ約４cm×5.2cm）（バイダック（Vydac）蛋白ペプチドC18充填材料）を通過させた。ごく少量のメタノールに試料を溶解して加え、以下の溶媒系で溶出した：
0004373496.tif 000022
1H  NMRによって、PAH V-7-3がラソノライドAを含有していることは明白であった。
さらに精製するために、70％酢酸エチルおよび30％ヘプタンを用いてPAH V-7-3をセミプレップシリカゲルHPLCカラムに注入した。
0004373496.tif 000023
1H  NMRおよび13C NMRによって、PAH V-8-4がラソノライドAであることは明白であった。1H NMRおよび13C NMR分析では、PAH V-8-6画分がラソノライドAと類似の成分で構成されるが、一部異なっていた。この違いは分子の側鎖にあると考えた。様々なNMRスペクトル（HMBC、TOCSY、13C、および1H）を注意深く分析することにより、試料I.D.番号PAH V-8-6中の単離化合物の構造は、ラソノライドBとして示されるものであると決定した。
実施例３−化合物の特徴付け
ラソノライドAの特徴はNMRスペクトル分析によって決定した。これらのデータの結果を下記の表３に示す。
0004373496.tif 000024
0004373496.tif 000025
実施例４−抗腫瘍活性
ラソノライドAを、P388マウス白血病細胞およびA549ヒト肺癌細胞に対する毒性について調べ、蛋白キナーゼC（PKC）の活性化およびEL-4細胞接着に関連するシグナル伝達経路を乱すことができるか否かを調べた。
A．細胞株の維持。P388マウス白血病細胞は、メリーランド州ベセスダの米国国立癌研究所（National Cancer Institute）のJ.メイヨ（Mayo）博士から得た。A549細胞およびEL-4-IL-2細胞（TIB）は、メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から得た。P388細胞は、10％ウマ血清を加えたロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート培地1640（Roswell Park Memorial Institute medium 1640:RPMI-1640）で維持し、プラスチック組織培養フラスコで培養して、５％CO2含有湿潤空気を含むインキュベーター内で37℃で維持した。A549細胞は、10％ウシ胎児血清を加えたこと以外は、RPMI-1640培地で同様に維持した。P388およびA549細胞の抗生物質非含有保存培養液を、２〜５日間隔で新鮮な増殖培地で105個/mlに希釈して培養した。EL-4細胞は、10％v/v熱不活化仔ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、６μg/ml L-グルタミン、および５×10-3M2-メルカプトエタノール（TCM）（グランドアイランドバイオロジカルズカンパニー（Grand Island Biologicals Co.,）、グランドアイランド、ニューヨーク州）を加えたことを除いて、同様に維持した。
細胞は３〜４日毎に継代した。生存率はトリパンブルー排除によって決定し、常に80％以上であった。接着アッセイでは、凍結保存培養から15代以内の細胞を使用した。ホルボル-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）、および4α-ホルボル-12-ミリステート-13-アセテート（4α-PMA）は、LCサービスコーポレーション（LC Services Corporation:ウォバーン、マサチューセッツ州）から得た。PMAおよび4α-PMAの保存溶液はDMSOで調製し、使用するまで-70℃で保存した。
B．方法。P388に対する抗増殖活性を評価するため、薬物非含有培地、または粗抽出物の最終希釈１：500またはその中間希釈を含む培地、ならびに10.0、1.0、0.10、および0.010μg/mlの純粋化合物を含む培地中で、細胞数１×105個/mlの培養液200μl（96ウェル組織培養プレート、ヌンク、デンマーク）を用意した。希釈に用いた溶媒は全てエタノールで、これは全てのプレートから真空下で除去した。48時間の暴露後、下記のように臭化3-［4,5-ジメチルチアゾール-2-イル］-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）を用いてP388細胞を計数した。
ラソノライドAまたはその類似体のA549細胞に対する抗増殖作用を評価するため、化合物暴露の24時間前に、最終濃度1.5×105個/ml培地となるようマイクロタイタープレートのウェル中に単層培養として細胞を用意した。各培養ウェルから培地100μlを除去し、薬物非含有培地または粗抽出物の最終希釈１：500またはその中間希釈を含む培地、ならびに10.0、1.0、0.10、および0.010μg/mlの純粋化合物を含む培地100μlを加えた。プレートを37℃で72時間インキュベートし、細胞を下記のようにMTTによって計数した。
ラソノライドAまたはその類似体の細胞増殖に及ぼす効果を定量するため、５mg MTTを含む暖かい増殖培地75μlを各ウェルに加えた。培養物をインキュベーターに戻してそのまま90分放置した。還元型フォルマザンの形成を分光光度的に定量するため、プレートを遠心して（900g、５分）、培養液を吸引除去し、酸性化イソプロパノール（濃縮HCl/Lイソプロパノール２ml）200μlを各ウェルに加えた。得られた溶液の吸光度をプレート・リーダー（MR700マイクロプレートリーダー、ダイナテック・ラボラトリーズ（Dynatech Laboratories）、チャンティリー、バージニア州）にて570nmで測定した。試験ウェルの吸光度を薬物非含有ウェルの吸光度で除して、無処置培養の吸光度の50％を示す化合物濃度（IC50）を、ロジット変換データの直線回帰によって決定した。本試験における細胞数の観察範囲では、P388およびA549細胞数とフォルマザン生成との間に比例関係を認めた。
EL-4細胞に及ぼす被験化合物の効果を評価するため、EL-4細胞（2.5×105個/ウェル）を、96ウェル平底マイクロタイター試験プレートで、PMA（最終濃度16nM）の存在下（プレート#1）または非存在下（プレート#2）で、海綿代謝物を１濃度につき３ウェルずつ加えて37℃で培養した。試験化合物は、エタノールの最終濃度が1.25％を超えないように、TCMで希釈した。対照は、細胞のみをインキュベートしたもの（陰性対照）およびPMAと共にインキュベートした細胞（陽性対照）で構成された。EL-4-IL-2細胞およびPMAの非存在下で化合物の同一希釈からなる別の対照プレート（プレート#3）を細胞傷害性プレートとし、下記のように接着用に処理せず、EL-4-ILー2細胞に対する化合物の細胞毒性作用の可能性をモニターするために用いた。インキュベーション時間は37℃で１時間であった。インキュベーション時間の後、プレート#1および#2を以下のように処理した；プレートをトレー上で軽くたたいて各ウェルの内容物を除去し、液の残ったウェルの水分を排水してタオルに吸い取らせるために、プレートをペーパータオル上に逆さまにした。各ウェルにTCM 100μl容量を室温で加えて、プレートを設定５で４分間回転するプラットフォームシェーカー（ミニ・オービタルシェーカー（Mini-Orbital Shaker）、ベルコバイオテクノロジー（BELLCO Biotechnology）、バインランド、ニュージャージー州）上に載せた。次にプレートを180°回転させて、さらに４分間振とうさせた。プレートを下ろして、内容物を記述のように再度除去して吸い取らせ、各ウェルにTCMを加え、プレートを回転シェーカー上に置いた。さらに２回の洗浄サイクルを行うため、この段階を繰り返した。
ウェル内容物の除去後、TCM 200μl容量およびMTT溶液（２mg/mlTCM溶液）75μlを全てのプレートの各ウェルに加えた。プレートを37℃でさらに４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレート#1および#2を軽くたたいてプレートの内容液を再度流しに除去し、プレートをペーパータオルに吸い取らせた。プレート#3は遠心して同様に吸い取らせた。次に得られたフォルマザン結晶を溶解するために、イソプロパノール200μl容量を全てのプレートの各ウェルに加えた。プレートリーダー（マイクロプレートオートリーダー、モデルEL-311、バイオテック・インストルメンツ，インク（BIO-TECH Instruments, Inc.）、ウィノスキー、バーモント州）を用いてプレートを570nmで吸光度測定した。各３個づつのウェルの吸光度を平均し、標準誤差を求めた。各試験ウェルの平均吸光度と標準誤差をプロットして結果をグラフに表した。結果を以下のように解釈した：
PKC（接着誘発物質）のアゴニスト。接着細胞によって代謝されたMTTの吸光度が、細胞のみをインキュベートした場合（陰性対照）より大きいことから示されるように、化合物はPMAの非存在下（プレート#2）でEL-4-IL-2細胞の接着を誘発した。
PKC（接着誘発物質）のアンタゴニスト。MTTの吸収がなかったことから示されるように、化合物はPMAの非存在下（プレート#2）でEL-4-IL-2細胞の接着を誘発しなかった。MTTの吸収がなかったことから示されるように、化合物はPMAの存在下（プレート#1）でEL-4-IL-2細胞の接着を阻害する。プレート#3で測定すると、化合物は細胞障害物質ではない。
C．結果。
（ｉ）ラソノライドA。ラソノライドAに関するA549、P388、およびEL-4接着アッセイの結果を表４に示す。精製ラソノライドA（バイアル、#10319）は、マウス白血病細胞に対して強い阻害特性を有し、IC50値は0.01μg/ml未満であることが判明した。ラソノライドAはまた、培養ヒト肺癌細胞（A549）に対してもIC50が0.04μg/mlであることがわかった。EL-4接着アッセイを用いても、ラソノライドAの阻害は強かった。精製化合物はEL-4接着ではIC50値が0.019であることが示された。化合物ラソノライドAまたはこれに由来する組成物は、ヒトまたは動物の腫瘍の阻害に用いることができる。
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（ii）ラソノライドB。ラソノライドBを含む順相HPLC抽出物（試料I.D.番号PAH V-8-6、バイアル番号11176）についても、A549、P388、およびEL-4接着アッセイにおける活性の有無を調べた。ラソノライドBアッセイの結果を下記の表５に示す。
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実施例６−化合物の類似体および変種
新規化合物であるラソノライドAの修飾は、当業者によって容易に行うことができる。
本出願で用いられているように、「類似体」「変種」および「誘導体」という語は、実質的にもう一つの化合物と同じであるが、例えば、さらにアミノ酸または側基を加えることによって修飾されていてもよい化合物を指す。本出願で用いられているように、「類似体」「変種」および「誘導体」という語は、別の化合物と実質的に同じであるが、その化合物の特定の位置の原子または分子置換を有する化合物を指してもよい。
記述の通り、化合物の好ましい態様はラソノライドAであり、これはR1がOHおよびR2がCH2OHである上記の構造を含む。しかし、この好ましい態様の類似体または誘導体は、周知の標準反応を用いて容易に調製することができる。これらの標準反応は、メチル化、アセチル化、および酸性化を含むが、これらに限定しない。本明細書に特に例示された誘導体および類似体は、以下のように調製することができる：
１．メチル化。ラソノライドAは標準的なメチル化法を用いてメチル化することができる。例えば、メチル化試薬であるジメチル硫酸は、メタノール中でラソノライドAと反応して、R1がCH3である上記構造を生じる。
２．アセチル化。標準的なアセチル化反応を用いて、アセチル基をラソノライドAに加えることができる。アセチル化は、分子上に遊離のヒドロキシル基が存在する位置に起こり得る。例えば、ラソノライドAのアセチル化は、過剰量の無水酢酸およびピリジン（１：２）によって行うことができ、R1およびR2がCH2COO-である化合物（I）として上記構造を生じる。この構造はさらに、上述の標準的なメチル化法を用いてメチル化することができ、R1およびR2がCH2COOCH3である上記構造を生じる。
本発明は、特に例示した化合物およびその他の組成物について示される特定の構造を含む。本発明はさらに、構造の類似体、変種、および誘導体と共に誘導体の類似体および変種を含む。これらの類似体、変種、および誘導体は、類似体、変種、または誘導体が最初に例示した化合物と実質的に同じ関連生物活性を保持する限り、本発明の中に含まれる。例えば、原子または分子置換を行うことは当業者の技術範囲内である。これらの置換が関連する生物または化学活性を実質的に変化させない程度であれば、得られた化合物は本発明の範囲内に入る。「関連する生物または化学活性」という語は、化合物の特定の適用に関する関係活性を指す。例えば、ラソノライドAでは１つ以上の使用が本明細書で論じられている。これらの使用は、細胞骨格構造試験における生化学的プローブとしての適用を含む。ラソノライドAをこれらの方法で用いられる場合には、「類似体」は、生化学プローブとして用いることができる化合物の能力を実質的に変化させることなく、ラソノライドAが修飾された（例えば、分子置換によって）化合物を指す。分子置換は本発明の主題の範囲内にあるタイプの修飾の唯一の例である。
実施例７−処方および投与
本発明の化合物は、様々な非治療および治療目的にとって有用である。本発明の化合物が、生化学プローブとして、および腫瘍増殖の調節に有効であることは、試験から明らかである。新規化合物およびそれらを含む組成物の治療応用は、当業者に現在または将来的に知られる適当な治療の方法および技術によって達成されると予期することができる。さらに、本発明の化合物はその他の有用な化合物および組成物の調製の出発材料または中間体として用いられる。
上記適応における宿主に対する投与は、感染の種類、宿主関与のタイプ、年齢、体重、健康状態、もしあれば併用治療の種類、治療回数、および治療比に依存すると考えられる。
本発明の化合物は、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って処方することができる。処方化は、当業者に周知の、容易に入手できる多くの情報源に詳細に記述されている。例えば、マーチン（E.W.Martin）による「レミントンの製薬科学（Remington’s Pharmacuetical Sciences）」に、本発明に関連して用いることができる処方が記述されている。一般に、本発明の組成物は、生物活性化合物の有効量を、組成物の有効な投与を容易にするために適した担体と組み合わせるように処方される。
本明細書に記載の実施例および態様は、例示の目的のために限られ、その実施例および態様から、その様々な修飾または変更が当業者に示唆され、本明細書および添付の請求の範囲の意図する範囲内に含まれることを理解すべきである。
【図１】
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