(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）  第一の免疫化を以下の工程：
同一の遺伝子型の動物の胎生期の胚から、組織の細胞懸濁物サンプルを得る工程；
組織の細胞懸濁物サンプルを、同一の遺伝子型の動物に対して免疫化する工程；
免疫化した動物から、血液または脾臓細胞を得る工程；そして
血液または脾臓細胞から、リンパ球懸濁物を分離する工程；
により行い；
（2）  第二の免疫化を以下の工程：
上記により得たリンパ球懸濁物を、同系の無傷動物に対して免疫化する工程；
免疫化工程を複数回繰り返す工程；
免疫化した動物から、抗血清を得る工程；
抗血清に対して、同一の動物の無傷器官の細胞を添加する工程；
細胞と抗血清の混合物の沈殿相から液体相をデカントすることにより、上清を得る工程；
上清を濾過して、特異的抗血清を調製する工程；
により行う；
二段階免疫化法により、普遍的な腫瘍性抗原に対する特異的抗血清を製造する方法。
【請求項２】
濾過工程を、多孔性フィルターを介して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程：
特異的抗血清を、被検体の組織、血液またはその他の生理学的液体に対して添加する工程；
特異的抗血清を使用した被検サンプルについての免疫蛍光法、血液試験またはまたはその他の免疫検出についての周知の方法の指標と、同一の遺伝子型の非免疫化動物の対照血清を使用した対照指標と、比較する工程；そして
被検サンプルの結果が、対照サンプルの結果と異なる場合に、被検サンプルが悪性腫瘍を含有すると決定する工程；
により行う、請求項1に記載の二段階免疫化法により得られる普遍的な腫瘍性抗原に対する特異的抗血清を使用して、悪性腫瘍を検出する方法。
【請求項４】
比較工程を、以下の工程：
被検サンプルからの血液試験の結果と対照サンプルからの血液試験の結果を、以下の式：
【化１】
0004322424.tif 000006
式中、“α”は診断相関係数を示し、
“A”は、普遍的な腫瘍性抗原に対する特異的抗血清を被検体の血液に添加することにより得られる、試験的な試験における血液試験の指標を示し、
“B1”および“B2”は、同一の遺伝子型の非免疫化動物の血清を、被検体の血液に対して添加することにより生成される、対照試験における血液試験の指標を示し、
“X”は、解析における血液試験の指標の最大値を示す（すなわち、試験においてはAおよび
【化２】
0004322424.tif 000007
の大きい方の指標である）
に当てはめる工程；そして
診断係数“α”が≧1.5である場合に、被検サンプルが悪性腫瘍を含有すると決定する工程；
により行う、請求項3に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、医薬、特に腫瘍学、その領域の分野および悪性腫瘍を診断する分野に関する。
【０００２】
発明の背景
腫瘍学における免疫診断のの簡単な概観は、以下のように示される。
悪性細胞がその固有の抗原を有することは、1949年にL.A. Zilberにより最初に言及され、1957年にT. PranおよびG. Mainにより証明された。
【０００３】
Abilevによれば、4群の抗原が存在する。
1）ウィルス性腫瘍性抗原。それらは、この型のいずれかのウィルス腫瘍についても同一である。
2）発ガン性腫瘍性抗原。それらは、患者だけでなく、腫瘍についても同一である。
3）移植型の異性体抗原、または腫瘍特異的移植抗原。それらは、個々の腫瘍型において異なり、化学物質により誘導される。そしてそれらは同一のウィルスにより引き起こされる異なる腫瘍中において同一である。
4）胎児性抗原。
【０００４】
発癌プロセスの間、細胞は脱分化しており、その結果それらは胎児性構造を獲得する。それらの内部では、生物の胎児期発生に対して特異的である、胎児性抗原であることが見出されている。これらの抗原は、腫瘍に対して生物を免疫化することができる。より研究が進んでいる抗原は、以下のもの：α-フェトプロテインおよび癌胎児性抗原（CEA）である。前者は、肝臓の癌腫に見出されており、後者は小腸、胃、食道、そして膵臓の腺癌に見出されている。
【０００５】
神経芽細胞腫、リンパ肉腫、脳腫瘍を有する小児は、α2-フェトプロテインを有する。胃の癌腫を有する者は、胎児性硫酸糖タンパク質を有する。上述した抗原は、細胞膜の内側または血液循環中に局在する。
【０００６】
いわゆる異種特異的抗原（heterospecific antigens）と呼ばれる抗原の特異的な群が存在している。それらは、生物に対して異種として分類することができず、一方、腫瘍のそばではそれらはその他の通常組織中に存在する。異種特異的抗原の中には、腎臓中そして肝臓腫瘍、すなわちヘパトーマ中に標準的に存在する、腎臓抗原がある。
【０００７】
腎臓の腺癌は、肺および肝臓の抗原を含有する。
悪性腫瘍の免疫学的診断は、被検体血液中の指標である上述した抗原、それらに対する抗体の指標に基づいて、および腫瘍性抗原リンパ球に対して感作されたことを示すことに基づいている。
【０００８】
リンパ肉腫、神経芽細胞腫を診断する方法は、α-フェトプロテインを示すことに基づいている（CEAに対する抗体を示すことについては、特許RU, 2077725, G. 01 N 33/53中の方法を参照）。
【０００９】
異種抗原を示すことについては、特許RU N 2063768, 1991, A 61K 39/00、特許RU N 2025734, MPK G 01 N 33/53、著者の発明者証USSR N 170922、著者の発明者証N 1589215を参照。
【００１０】
著者の発明者証N 1805392（G 01 N 33/53）においては、リンパ球抗原（Hlab 35）により癌を診断する方法を記載する。
事実、既存の診断レベルの試験には、普遍的なものは何もない。血中の抗体を示すことはあまり信頼性のある試験ではなく、ヒト血液には非常に幅広い抗腫瘍抗体および組織抗体のスペクトルが存在する。特異的普遍的な腫瘍性抗原を示すための既存の方法はない。
【００１１】
この分野においては、悪性細胞の増殖を阻害する感作されたリンパ球が展望において示される。それにも関わらず、それらは、“それら固有の”腫瘍型に対してのみ活性である。
【００１２】
このように、腫瘍免疫学的診断について使用された方法は、腫瘍の第一義的診断の要求をあらゆる点で満たしておらず、それらは悪性新生物および高リスクな群をスクリーニングする際には、全く満足のいかないものである。したがって、それらは、悪性腫瘍の治癒を免疫モニタリングする際にのみある程度使用することができる。
【００１３】
既存の方法の失敗は、悪性腫瘍性抗原に対して使用された抗血清が、その固有の特徴を満足していないという事実により、説明することができる。
発明の開示
本発明の目的は、腫瘍および器官型とは独立した普遍的な腫瘍性抗原に対する抗血清を作成することである。
【００１４】
特異的抗血清を作成するための請求項に記載した方法および当該抗血清を使用して診断する方法の原型は、特許RU N2063768, 1991, IPC, A 61 K 39/00に記載されている。この方法は、腫瘍組織を死者から採取し、それを凍結し、細胞懸濁物を得て、細胞を分散・デカントさせ、抗原を上澄み液から抽出し、抽出液で動物を免疫化し、免疫化した動物から血液を採取し、その動物から生成物を得て、被検体血液との反応物中に特異的抗血清を満たし、そしてその結果腫瘍を診断することが含まれる。
【００１５】
請求項に記載された方法では、周知の方法とは異なり、悪性腫瘍中で機能するT細胞性受容体のイディオタイプに対する抗血清を得ることができる。すなわち、抗イディオタイプ抗胎児血清を得ることができる。それにより、その起源および部位とは独立して腫瘍のすべての型を診断することができる。
【００１６】
特異的抗血清を作成する方法を達成するため、2段階免疫を行うことが必要である。これは、同一の遺伝子型の動物から胎児期の胚を採取し、それを分散させ、細胞懸濁物を得ることを含む。その後、同一の遺伝子系統の動物を、細胞懸濁物を用いて免疫化する。免疫化した後、動物から脾臓細胞を採取し、1.065〜1.079の密度勾配で細胞懸濁物からリンパ球を分離ことが必要である。上述したリンパ球を使用すると、純系無傷動物の複数回免疫化を達成し、そしてその後標準的な方法を用いてそれら動物から抗血清を得ることが必要である。この抗血清は濾過しなければならない（フィルターのおよその孔直径は20 mcmである）。
【００１７】
得られた抗血清は、異なるヒトおよび異なる器官から採取した異なる型の腫瘍とともに沈殿反応に供する。
得られた抗血清に基づいて、悪性腫瘍を診断するための方法を考案することを可能とする。
【００１８】
腫瘍を診断するための周知の同様な方法は、十分に感度が高いわけではない。それらの中でもより効率的なものであっても、40〜60％を超えるレベルの感度を有しているものはない。周知の腫瘍学的免疫診断試験のこのような低いレベルから説明できることは、前記反応において使用された腫瘍マーカーが、現実にそれらの固有の特性を満足していないということである。それらは、個別の生物または標準的な器官システムに特徴的な、器官特異的または腫瘍胎児性抗原である。以下の事柄が導き出される；腫瘍形成メカニズムの特性のみの期待される普遍的免疫学的説明は、非腫瘍性状態（炎症、膠原病）の個々の特徴により置換される。
【００１９】
器官特異的抗原は、腫瘍性細胞形質転換については、結合しないことが周知である。それから、悪性腫瘍を診断することにより、偽陽性の結果の割合が高くなる。
【００２０】
腫瘍マーカーを示すための提示された方法は、腫瘍増殖の普遍的な高度に特異的な抗原性マーカーを開示し、腫瘍発生の全期間にわたって保持される点で、周知の方法と大きく異なる。
【００２１】
本方法は、悪性腫瘍の組織学的に異なる細胞中において、見かけ上胚特異的な抗原を認識する、腫瘍発生機能において安定なものが存在することを確立した著者の理論的および実験的仕事の結果に基づくものである。前記機構は、腫瘍形成（不死化および進行）現象に基づいていることが証明されている。
【００２２】
腫瘍を診断する方法を実行するため、提示された方法を使用して特異的抗血清を得て、被検体組織または生理学的体液との免疫学的反応物中に普遍的な腫瘍性抗原に対する抗血清を満たすことが必要である。その後、腫瘍を免疫蛍光法によりまたは血液試験により診断する。免疫蛍光反応物または被検体の血液試験中の腫瘍組織を組織として使用することができる。
【００２３】
腫瘍診断は、試験的な試験および対照試験との反応の結果の間に、統計学的に信頼性のある相違があることにより証明される。
血液試験を得ることにより、試験的試験と対象試験とのあいだの相違を計算するための以下の式：
【００２４】
【化３】
0004322424.tif 000002
【００２５】
ここで、αは診断相関数であり、腫瘍が存在する場合にはαは1.5以上となり、
Aは、試験的な試験における血液試験の指標であり（腫瘍性抗原に対する抗血清をクエン酸を付加した被検体血液に添加する）、
B1およびB2は、対照試験における血液試験の指標であり（抗血清を得るために使用された同一の動物の血清をクエン酸を付加した被検体血液に添加する）、
Xは、試験における血液試験の指標の最大値であり、AまたはB1とB2との平均値、すなわち
【００２６】
【化４】
0004322424.tif 000003
【００２７】
である、
を使用するべきである。
本発明の成績の態様
悪性腫瘍を診断するための方法を達成する実施例である。
【００２８】
胎生期において、体重300〜500 gのWister系統のラットから胚を採取する。胚の組織は、以下の相関関係、すなわち組織の体積：培地199が1：5で、培地199中で分散する。得られた懸濁物は、無傷のWister系統ラットを免疫化するのに1週間使用する。
【００２９】
1.5箇月の期間の後、脾臓細胞を動物から採取し、分散し、そしてフィコ-ベログラフィン（phycoverografin）の勾配1.065〜1.079で、リンパ球を得る。
前記リンパ球から、懸濁液を得て、培地199との相関係数を1：1とし、それを毎週別の無傷ラットに与える。5回の免疫化の後、ラットを屠殺し、それらから血液を採取し、“薄めて”、それから抗血清を得て、濾過する。上述した抗血清を用いて、以下に述べる群の患者から血液試験を行った。血液試験を行うために、内部直径約0.8 mmを有する標準的毛細管を用いる。解析中に採取された800 mclの新鮮全静脈血を、採取した瞬間の後20秒間以内に、200 mclの5％クエン酸ナトリウム緩衝溶液に添加する。血液と保存剤を混合するため、解析は60分以内に行うべきである。解析は、溶血または凝固した場合においては行うべきではない。前記血液はそれぞれ70 mclの3つに分配し、各部分は3つの別個の試験管中に保存すべきである。部分のうちの1つに、20 mclの試験的な（抗体を伴う）血清を添加すべきであり、その他2つには、20 mclの対照の（抗体を含まない）血清を添加すべきである。血清は、保存剤を伴う血液中に直接的に、壁を伝わらせることなく満たすべきである。毛細管は、同一のサイズのものであるべきである。混合物を混合し、レベルマークが5/0となるまで毛細管中に満たす。このように、これらを60分間保持する。60分後に、指標（index）を読みとり、そして上述した数式にしたがって計算する。
【００３０】
Wister系統ラットを用いて前記の方法により採取した抗血清を、特定の患者について疾患を診断するために使用した。
患者K、1942 y.o.の血液試験においては、d-s：直腸癌であり、得られた結果は以下の通り：
A=25、B1=28、B2=28
である。
【００３１】
数式にしたがって、相関係数αを計算した：
【００３２】
【化５】
0004322424.tif 000004
【００３３】
1.7＞1.5であり、これは悪性腫瘍の診断を証明した。
心耳の小葉に繊維腫を有する患者の血液試験においては、結果は以下の通り：
A=10、B1=12、B2=12
である。
【００３４】
数式にしたがって、相関係数αを計算した：
【００３５】
【化６】
0004322424.tif 000005
【００３６】
α＜1.5であり、これは良性腫瘍の診断を証明した。
以下は、悪性腫瘍を有する患者の群を調査した結果である。
コメド乳癌−125患者
感度−83.2％
肺癌−247患者
感度−98.1％
胃ガン−156患者
感度−85.2％
結腸癌−23患者
感度−82.5％
直腸癌−27患者
感度−92.5％
悪性甲状腺腫−58患者
感度−79.5％
腎臓癌−38患者
感度−78.6％
子宮体癌−412患者
感度−75.0％
子宮頚癌−41患者
感度−81.8％。
【００３７】
対照群
ほぼ健常−400患者
感度−5.1％
乳房病嚢胞性−繊維性−221患者
感度−8.3％
胃炎−120患者
感度−6.2％
胃潰瘍−62患者
感度−8.3％
膠原病−40患者
感度−6.5％
肺炎−40患者
感度−7.2％
（急性および慢性）
前立腺炎−18患者
感度−2.1％
慢性大腸炎−115患者
感度−4.2％。
【００３８】
産業上の利用可能性
結論：提示した方法は、92.4％以上の感度を有し、非常に効率的な診断試験である。
【００３９】
本出願において、普遍的な腫瘍性抗原に対する特異的な抗血清は、診断装置の主要な構成要素であり、ロシアおよび外国においてTurtestRの商標名で販売されている。