(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列３、配列４及び配列５から成るグループから選択された肝炎ＧＢウイルスＣ（ＨＧＢＶ−Ｃ）５′ＮＴＲに特異的なプローブ。
【請求項２】
配列１と配列２とから成るプライマー対を含むＨＧＢＶ−Ｃの標的ヌクレオチドを増幅するための組成物。
【請求項３】
試験サンプル中のＨＧＢＶ−Ｃ標的ヌクレオチドの存在を検出するアッセイであって、
ａ．標的ＨＧＢＶ−Ｃヌクレオチド配列を含む疑いのある試験サンプルを、配列１と配列２との対であるＨＧＢＶ−Ｃプライマー対と接触させて反応混合物を形成する段階と、
ｂ．前記反応混合物を、配列３、配列４及び配列５から成るグループから選択された少なくとも１つのＨＧＢＶ−Ｃプローブと接触させる段階と、
ｃ．試験サンプル中のＨＧＢＶ−Ｃ標的ヌクレオチドの存在を検出する段階とから成るアッセイ。
【請求項４】
前記ＨＧＢＶ−Ｃプローブを検出可能なシグナル発生化合物に結合させることを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記シグナル発生化合物が、化学発光化合物、フルオレセイン及び酵素から成るグループから選択されることを特徴とする請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ＨＧＢＶ−Ｃプローブがハプテンに結合されていることを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ハプテンが、アダマンタン、カルバゾール、フルオレセイン及びビオチンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
試験サンプル中の標的ＨＧＢＶ−Ｃヌクレオチドを検出するための検査キットであって、
ａ．配列１と配列２との対であるＨＧＢＶ−Ｃ標的ヌクレオチドに特異的なプライマー対を収容した容器と、
ｂ．配列３、配列４及び配列５から成るグループから選択された少なくとも１つのＨＧＢＶ−Ｃ特異的プローブを収容した容器とを含む検査キット。
【請求項９】
前記ＨＧＢＶ−Ｃプローブが検出可能なシグナル発生化合物に結合されていることを特徴とする請求項８に記載の検査キット。
【請求項１０】
前記シグナル発生化合物が、化学発光化合物、フルオレセイン及び酵素から成るグループから選択されることを特徴とする請求項８に記載の検査キット。
【請求項１１】
前記ＨＧＢＶ−Ｃプローブがハプテンに結合されていることを特徴とする請求項８に記載の検査キット。
【請求項１２】
前記ハプテンが、アダマンタン、カルバゾール、フルオレセイン及びビオチンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、一般的にはＨＧＢＶに関し、より特定的には肝炎ＧＢウイルスの検出に有用な核酸プローブ及びプライマーに関する。
複数系統の疫学的及び実験的な研究からは、静脈内薬物使用者の急性ＮＡＮＢＨの発作が多様であること、輸血によってＮＡＮＢＨに罹患した患者の潜伏期間が一様でないこと、交差抗原刺激したチンパンジー実験の結果では感染したチンパンジーの肝臓病理が超構成的であること、及び、原因因子であると推定される物質が異なるクロロホルム耐性を示すこと、などが証明され、これらの証拠は、非経口的に伝播する非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の原因因子が２つ以上存在することを示唆している。Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８５：４３９−４６２（１９８３）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８５：７４３−７６８（１９８３）；Ｆ．Ｂ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４２：４００−４０７（１９８０）；Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｆ．Ｃｈｉｓａｒｉ，ｅｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍａｓｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６８−２８０（１９８４）；及び、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４８：２５４−２６５（１９８３）。
現在では、ドナーサンプル中の肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）抗体を検出することによって、供血系のＮＡＮＢＨ感染血液の７０〜８０％が除去されている。即ち、ＮＡＮＢ肝炎因子を原因とする肝炎の伝播をＨＣＶの検出によって完全に防止することはできない。Ｈ．Ａｌｔｅｒら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１４９４−１５００（１９８９）。最近の論文はまた、輸血後肝炎（ＰＴＨ）及びＰＴＨに無関係な集団感染性の急性及び／または慢性の肝炎の原因となる付加的な肝炎因子の存在に着目している。例えば、１９８８年から１９９０年にわたってフランスで行った予測的臨床調査でモニターした１８１人の患者から、合計１８人のＰＴＨ患者が発見された。これらの１８人の患者のうちの１３人は、抗ＨＣＶ抗体、肝炎Ｂ型ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）及びＨＣＶの核酸試験で陰性を示した。著者らは、非Ａ非Ｂ非ＣのＰＴＨの原因因子が存在する可能性が極めて大きいのではないかと推測した。Ｖ．Ｔｈｉｅｒｓら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １８：３４−３９（１９９３）。また、１９８５年から１９８８年にわたってドイツで行った別の調査でも、モニターした１４７６人の患者のうち、ＰＴＨが報告された２２人の患者はＨＢＶまたはＨＣＶの感染に関係がなかった。Ｔ．Ｐｅｔｅｒｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３９：１３９−１４５（１９９３）。
最近になって、肝炎であると臨床診断された患者から新しいファミリーのフラヴィウイルスの検出が報告された。この新しいファミリーのウイルスは、このウイルスに感染した最初の患者の頭文字に因んで“ＧＢ”ウイルスと命名されている。これらのウイルスは、Ｊ．Ｎ．Ｓｉｍｏｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３４０１−３４０５（１９９５）；及びＪ．Ｎ．Ｓｉｍｏｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １（６）：５６４−５６９（１９９５）に報告されている。これらのウイルスの臨床的及び疫学的な有意性を判断するための研究は現在進行中である。
プライマー及び検出プローブとしてＤＮＡオリゴマーを使用するＤＮＡハイブリダイゼーションアッセィの使用によって、試験サンプル中のＨＧＢＶをより高度に検出できる。試験サンプル中に存在するＤＮＡ標的核酸の量は微量であるかもしれないので、通常は標的ＤＮＡを増幅し、次いで検出する。試験サンプル中に存在し得る標的核酸配列の増幅及び検出方法は当業界で公知である。このような方法としては、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−３２０３０８に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−４３９１８２及び参照によって本発明に含まれるものとする米国特許第５，４２７，９３０号に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）、国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ９３／２０２２７に記載のマルチプレックスＬＣＲ、などがある。これらの方法は、医学診断分野及び遺伝学、分子生物学、生化学の分野で汎用されている方法である。
ＨＧＢＶに由来のＤＮＡオリゴマープローブ、並びに、これらのプローブを利用した診断方法及び検査キットを提供することは有益であろう。このようなプローブは医学の分野で急性及び／または慢性のウイルス肝炎をより正確に診断する能力を著しく向上させ、提供された血液及び臓器中の非Ａ非Ｂ非Ｃ肝炎を検出することによってより安全な血液及び臓器の提供を可能にするであろう。
発明の概要
本発明は、新規な肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）のＤＮＡオリゴマーから成るプライマー及びプローブを提供する。ＤＮＡプライマー及びプローブは、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６、配列７、配列８、配列９、配列１０、配列１１、配列１２、配列１３、配列１４及び配列１５として同定されている。また、配列１６、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０、配列２１、配列２２、配列２３、配列２４、配列２５、配列２６、配列２７、配列２８、配列２９、配列３０及び配列３１も提供される。配列１、２、３、４、５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６及び２７はＧＢＶの５′非翻訳領域（ＮＴＲ）に特異的である。配列６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２８、２９、３０及び３１はＨＧＢＶのＮＳ３領域に特異的である。ＨＧＢＶの５′ＮＴＲ領域に特異的なＨＧＢＶプライマーは配列１と配列２、配列１と配列１６、配列１８と配列１９、及び、配列２１と配列２２である。ＨＧＢＶのＮＳ３領域に特異的なＨＧＢＶプライマーは配列６と配列７及び配列３０と配列３１である。
本発明はまた、試験サンプル中のＨＧＢＶの存在を検出するためのアッセイを提供する。このアッセイは、（ａ）標的ＨＧＢＶ  ＤＮＡ配列を含む疑いのある試験サンプルを、配列１と配列２との対、配列６と配列７との対、配列１と配列１６との対、配列１８と配列１９との対、配列２１と配列２２との対、及び、配列３０と配列３１との対から成るグルーブから選択された一対のＨＧＢＶプライマーと、配列３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２３、２８及び２９から成るグループから選択された少なくとも１つのＨＧＢＶプローブから成るＨＧＢＶ特異的検出プローブとに接触させる段階と、（ｂ）試験サンプル中の標的ＤＮＡの存在を検出する段階とを含む。ＨＧＢＶプローブをシグナル発生化合物またはハプテンに結合させてもよい。このシグナル発生化合物は、化学発光化合物、フルオレセイン化合物及び酵素から成るグループから選択される。ハプテンは、アダマンタン、カルバゾール、フルオレセイン及びビオチンから成るグループから選択される。反応を固相で行ってもよい。プローブ及びプライマーの各々をアダマンタンとカルバゾールのような異なるハプテンに結合させてもよく、この結合を、５′端、３′端、５′端と３′端との双方で生じさせてもよく、または、５′端または３′端自体またはその近傍に２つ以上のハプテンを結合させてもよい。更に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって反応を増幅させてもよい。
更に、試験サンプル中の標的ＨＧＢＶ  ＤＮＡを検出するための検査キットが提供される。このキットは、（ａ）配列１と配列２との対、配列６と配列７との対、配列１と配列１６との対、配列１８と配列１９との対、配列２１と配列２２との対、及び、配列３０と配列３１との対から成るグループから選択された一対のＨＧＢＶプライマーを収容した容器と、（ｂ）配列３、配列４、配列５、配列８、配列９、配列１０、配列１１、配列１２、配列１３、配列１４、配列１５、配列１７、配列２０、配列２３、配列２８及び配列２９から成るグループから選択されたＨＧＢＶ特異的な検出プローブを収容した容器と、から成る。ＨＧＢＶプローブをハプテンまたは検出可能なシグナル発生化合物に結合させてもよい。このシグナル発生化合物は、化学発光化合物、フルオレセイン化合物及び酵素から成るグループから選択される。ハプテンは、アダマンタン、カルバゾール、フルオレセイン及びビオチンから成るグループから選択される。反応を固相で行ってもよい。反応をＰＣＲのような増幅プロセスによって増幅してもよい。プローブ及びプライマーの各々をアダマンタンとカルバゾールとのような異なるハプテンに結合させてもよく、この結合を５′端、３′端または５′端と３′端との双方で生じさせてもよく、あるいは、５′端または３′端自体またはその近傍に２つ以上のハプテンを結合させてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の好ましいアッセイ方法の諸段階を示す概略図である。
図２は、反応複合体の概略図である。
発明の詳細な説明
本発明は、ＤＮＡオリゴマープローブ、これらのプローブを使用してＨＧＢＶ標的ヌクレオチド配列の存在を判定する方法、及び、これらのプローブを含む検査キットを提供する。
ＨＧＢＶに由来の核酸配列の部分は、試験サンプル中のＨＧＢＶの存在を判定するため、及び、天然に産生する変種を単離するためのプローブとして有用である。また、これらの配列から、（１つまたは複数の）ＨＧＢＶゲノム内部にコードされたＨＧＢＶ抗原のポリペプチド配列を入手することが可能になり、診断試験の標準もしくは試薬として及び／またはワクチンの成分として有用なポリペプチドを産生し得る。これらの核酸配列に由来のプローブまたはＰＣＲプライマーを使用することによってＨＧＢＶゲノムの他の部分の単離及び配列決定もできるようになり、その結果として、追加のＨＧＢＶのプローブ及びポリペプチドを樹立でき、これらの追加のプローブ及びポリペプチドもまたＨＧＢＶの診断及び／または治療において予防薬及び治療薬として有用であろう。これらの核酸プローブは、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６、配列７、配列８、配列９、配列１０、配列１１、配列１２、配列１３、配列１４、配列１５、配列１６、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０、配列２１、配列２２、配列２３、配列２４、配列２５、配列２６、配列２７、配列２８、配列２９、配列３０及び配列３１として同定されている。
本発明は、ＨＧＢＶ由来のポリヌクレオチドの存在及び／または量を検出するために使用できる試薬を含む検査キットを提供する。アッセイに使用されるこれらの試薬は、バイアルまたはビンのような１つ以上の容器を備え、各容器がアッセイに使用される核酸プローブまたは核酸プローブのカクテルのような個別の試薬を収容している検査キットの形態で提供される。このような検査キットは、バッファ、対照、などのような通常の知識をもつ当業者に周知の他の成分も含み得る。
本文中で使用された“肝炎ＧＢウイルス”または“ＨＧＢＶ”なる用語は、ヒトのような哺乳動物の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ肝炎または場合によっては他の疾病の原因となるウイルス種、弱毒株、または、これらのウイルスに由来の欠陥干渉性粒子を総合的に意味する。この用語は、汚染食品、飲料水、などによって伝播された急性ウイルス肝炎、対人接触（性的伝播、呼吸器及び非経口経路も含む）または静脈内薬物使用によって伝播されたＨＧＢＶによる肝炎も含む。本文中に記載の方法は、ＨＧＢＶに罹患した患者を同定し得る。個々のＨＧＢＶ単離物を夫々、“ＨＧＢＶ−Ａ”、“ＨＧＢＶ−Ｂ”及び“ＨＧＢＶ−Ｃ”として特定する。本文中に記載されたように、ＨＧＢＶゲノムはＲＮＡから成る。ＨＧＢＶのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を分析すると、このグループのウイルスがフラヴィウイルス科のゲノム編成と同様のゲノム編成を有することが判明する。ゲノム編成の類似性だけを根拠とするのではないが主としてゲノム編成の類似性に基づいて、ウイルス分類学の国際委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎ  ｔｈｅ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）は、この科を３つの属、即ちフラヴィウイルス、ペスティウイルス及び肝炎Ｃグループから構成するように勧告した。アミノ酸レベルにおける類似性の研究は、肝炎ＧＢウイルスのサブクローンが肝炎Ｃウイルスに対して低度ではあるがある程度の配列類似性を有することを証明した。現在では、ＨＧＢＶ−ＣがＨＣＶの遺伝子型でないことが証明されている。例えば、参照によってその記載内容が本発明に含まれると前述した１９９５年４月６日出願の米国特許出願第０８／４１７，６２９号を参照するとよい。
本文中で“類似性”及び／または“同一性”なる用語は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の近縁度を記述するために使用されている。アミノ酸配列の“類似性”及び／または“同一性”を判断する技術は当業界で公知であり、例えば、アミノ酸配列を直接決定し本発明で提供された配列に比較する方法、及び、（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）推定ＨＧＢＶのゲノム材料のヌクレオチド配列を決定し、その内部にコードされたアミノ酸配列を決定し、対応する領域を比較する方法がある。一般に、“同一性”なる用語は、各ゲノムの適当な場所におけるＨＧＢＶのヌクレオチド配列と（１つまたは複数の）別の株のヌクレオチド配列との正確なマッチアップ（ｍａｔｃｈ−ｕｐ）またはＨＧＢＶのアミノ酸配列と（１つまたは複数の）別の株のアミノ酸配列との正確なマッチアップを意味する。また、一般に“類似性”なる用語は、アミノ酸が等しいかまたはアミノ酸が電荷もしくは疎水性などにおいて同様の化学的及び／または物理的特性を有している適当な場所におけるＨＧＢＶのアミノ酸配列と（１つまたは複数の）別の株のアミノ酸配列との正確なマッチアップを意味する。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，５３７１１から入手可能）として入手できるプログラム，例えば、ＧＡＰプログラムは、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド配列間の同一性及び類似性の双方を計算し得る。２つの配列間の同一性及び類似性を計算する別のプログラムは当業界で公知である。
更に、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃの株を同定するために以下のパラメーターを単独でまたは組合わせて使用し得る。種々のＨＧＢＶ株は遺伝的に、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上近縁であると考えられているので、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃとこれらの肝炎ＧＢウイルスの１つの株との間のゲノムの全ヌクレオチド配列の同一性は約４５％以上であろうと予測される。
また、種々のＨＧＢＶ株は遺伝的に、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上近縁であると考えられているので、アミノ酸レベルにおけるＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｂとの間のゲノムの全配列の同一性は約３５％以上であろうと予測される。更に、少なくとも約１３個のヌクレオチドから成る対応する隣接配列が存在し、これは２つ以上の隣接配列の組合せから成ってもよい。また、種々のＨＧＢＶ株は遺伝的に、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上近縁であると考えられているので、アミノ酸レベルにおけるＨＧＢＶ−ＢとＨＧＢＶ−Ｂの１つの株との間のゲノムの全配列同一性は約３５％以上であろうと予測される。更に、少なくとも約１３個のヌクレオチドから成る対応する隣接配列が存在し、これは２つ以上の隣接配列の組合せから成ってもよい。また、ＨＧＢＶ株は遺伝的に、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上近縁であると考えられているので、アミノ酸レベルにおけるＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ｃの１つの株との間のゲノムの全配列同一性は約３５％以上であろうと予測される。更に、少なくとも約１３個のヌクレオチドから成る対応する隣接配列が存在し、これは２つ以上の隣接配列の組合せから成ってもよい。
例えばＨＧＢＶ  ｃＤＮＡまたはＨＧＢＶゲノムのような指定配列“に由来の”ポリヌクレオチドなる表現は、指定ヌクレオチド配列の１つの領域に対応するポリヌクレオチド、即ち該領域に類似であるかまたは相補的であるほぼ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、いっそう好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドから成るポリヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが由来した領域の配列は、ＨＧＢＶゲノムに固有の配列に類似であるかまたは相補的である。配列がＨＧＢＶゲノムに固有の配列に相補的であるか類似であるかは、当業者に公知の技術によって判断できる。指定配列の固有性を判断する方法として、例えばデータバンクにおける配列比較を使用し得る。配列が由来した領域の非限定例としては、特異的エピトープをコードする領域、並びに非翻訳及び／または非転写領域がある。
由来したポリヌクレオチドは必ずしも物理的にＨＧＢＶのヌクレオチド配列に由来しなくてもよく、ポリヌクレオチドが由来した（１つまたは複数の）領域中の塩基配列によって提供された情報に基づいた化学合成、複製、逆転写または転写などを非限定例とする任意の方法で作製されてもよい。更に、指定配列の領域に対応する領域の組合せを所望の用途に整合するように公知の方法で修飾してもよい。
“ポリヌクレオチド”、“オリゴマー”及び“オリゴヌクレオチド”なる用語は本文中で互換的に使用されている。
本文中で使用された“ポリヌクレオチド”なる用語は、任意の長さの重合形態のヌクレオチド、例えばリポヌクレオチドまたはデオキシリポヌクレオチドを意味する。この用語は、分子の主要構造だけに関して使用されている。従って、この用語は、二重鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びに二重鎖及び一本鎖ＲＮＡを包含する。この用語はまた、メチル化及び／またはキャップ化による修飾を包含し、また、非修飾形態のポリヌクレオチドを包含する。
“ｃＤＮＡに対応する配列を含むＨＧＢＶ”なる用語は、ＨＧＢＶが指定ＤＮＡ中の配列に類似のまたは相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。ｃＤＮＡに対する類似性または相補性の程度は約５０％以上、好ましくは少なくとも約７０％、いっそう好ましくは少なくとも約９０％であろう。対応する配列は、少なくとも約７０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８０ヌクレオチド、いっそう好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチドの長さであろう。ＨＧＢＶとｃＤＮＡとの対応は当業界で公知の方法で判断でき、例えば、配列決定した材料と記述されたｃＤＮＡとを直接比較する方法、または、一本鎖ヌクレアーゼによってハイブリダイゼーション及び消化し次いで消化フラグメントをサイズ決定する方法がある。
“精製したウイルスポリヌクレオチド”なる用語は、ウイルスポリヌクレオチドに天然に結合しているポリペプチドが本質的に除去されたＨＧＢＶゲノムまたはそのフラグメントを意味する。即ち、このようなポリペプチドの約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上が除去されたＨＧＢＶゲノムまたはそのフラグメントを意味する。ウイルスポリヌクレオチドの精製方法は当業界で公知であり、例えば、カオトロピック剤で粒子を破壊し、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーによって（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドとポリペプチドとを分離し、密度に従って沈降させる。従って、“精製したウイルスポリペプチド”なる用語は、ウイルスポリペプチドに天然に結合している細胞性成分が本質的に除去されたＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。即ち、このような細胞性成分の約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上が除去されたＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。精製方法は当業者に公知である。
本文中で使用された“ポリペプチド”なる用語は、アミノ酸の分子鎖を意味しており、生成物の特定の長さを意味しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に包含される。しかしながらこの用語は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、などのようなボリペプチドの発現後の修飾を意味するものではない。
“読取り枠”または“ＯＲＦ”なる用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の１つの領域を意味する。この領域はコーディング配列の一部分を表してもよくまたはコーディング配列全部を表してもよい。
“コーディング配列”は、適当な調節配列のコントロール下に配置されるとｍＲＮＡに転写されるか及び／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５′−末端の翻訳開始コドンと３′−末端の翻訳終止コドンとによって決定される。コーディング配列の非限定例は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換えポリヌクレオチド配列である。
“と免疫学的に同一視できる”なる用語は、通常はＨＧＢＶタンパク質から成る（１つまたは複数の）指定ポリペプチド中に存在する固有の（１つまたは複数の）エピトープ及び（１つまたは複数の）ポリペプチドが存在することを意味する。免疫学的同一性は抗体結合及び／または結合における競合によって決定され得る。これらの技術は当業者に公知であり、本文中にも記載されている。エピトープの固有性は、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のような公知のデータバンクでコンピュータ検索し、他の既知のタンパク質とのアミノ酸比較を行うことによって決定できる。
本文中で使用された“エピトープ”なる用語は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、３つのアミノ酸をエピトープに固有の空間的コンホメーションで含み得ると考えられる。一般にはエピトープは少なくとも５つのこのようなアミノ酸から構成され、より普通にはエピトープは少なくとも８〜１０個のアミノ酸から構成される。空間的コンホメーションの検査方法は当業界で公知であり、例えば、ｘ線結晶学及び二次元核磁気共鳴がある。
本文中で使用された“個体”なる用語は、脊椎動物、特に哺乳動物種の構成員を意味しており、その非限定例は、家畜、狩猟動物、霊長類及びヒトである。より特定的にはこの用語はキヌザル（ｔａｍａｒｉｎ）及びヒトを意味する。
本文中で使用された“プラス鎖”（または“＋”）なる用語は、ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を意味する。“マイナス鎖”（または“−”）なる用語は、“プラス”鎖の配列に相補的な配列を含む核酸を意味する。
ウイルスの“正の鎖をもつゲノム”は、ゲノムが、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであるかに関わりなく、一本鎖であり（１つまたは複数の）ウイルスポリペプチドをコードしていることを意味する。
“試験サンプル”なる用語は、分析物（例えば、問題の抗体または問題の抗原）のソースとなる個体の体内の成分を意味する。これらの成分は当業界で公知である。これらの試験サンプルは、本文中に記載した本発明の方法によって試験できる生物サンプルを包含し、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、呼吸管、腸管及び尿生殖管の種々の外分泌液、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などのようなヒト及び動物の体液、細胞培養上清のような生物流体、固定組織標本、固定細胞標本、を包含する。
“アウトライン精製されたＨＧＢＶ”は、通常はウイルスに結合している細胞性成分、及び、感染組織中に存在し得る他の種類のウイルスから単離されたＨＧＢＶの調製物を意味する。ウイルスを単離する技術は当業者に公知であり、例えば、遠心分離及びアフィニティクロマトグラフィーがある。
“ＰＮＡ”は、標的の存在を決定するために本文中に記載されたアッセイのような手順で使用され得る“ペプチド核酸”を意味する。ＰＮＡは、ＲＮＡ標的またはＤＮＡを指向し得る中性電荷部分を含む。例えば本発明のＤＮＡプローブの代わりにアッセイで使用されるＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブを用いたときには得られない利点を与える。これらの利点としては、製作適性、大規模標識、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する不感受性、ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する方法に存在する酵素分解に対する抵抗性、がある。これらのＰＮＡを、フルオレセイン、放射性核種、化学発光化合物、などのようなシグナル発生化合物で標識し得る。従って、ＰＮＡ、または、モルホリノ化合物のような他の核酸類似体をアッセイ方法でＤＮＡまたはＲＮＡの代わりに使用できる。本文中ではＤＮＡプローブを使用するアッセイを記載しているが、必要に応じてアッセイ試薬を適宜に変更しＰＮＡまたはモルホリノ化合物をＲＮＡまたはＤＮＡに代替して使用できることは当業者に理解されよう。
“固相”（“固体支持体”）は当業者に公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、微粒子例えばラテックス粒子、ヒツジ（または他の動物の）赤血球、硬膜細胞、などを包含する。“固相”は決定された要因ではなく、当業者が選択できる要因である。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性のビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンのチップ、ヒツジ（または他の動物の）赤血球及び硬膜細胞はすべて好適例である。固相にプローブを固定化する適当な方法としては、イオン性、疎水性、共有結合性の相互作用、などがある。本文中で使用された“固相”なる用語は、不溶性である任意の材料、または、その後の反応によって不溶性にできる任意の材料を意味する。固相は、捕獲試薬を吸引し固定化する固有の能力に基づいて選択され得る。あるいは、捕獲試薬を吸引し固定化する能力を有する付加的レセプターを固相に保持させてもよい。付加的レセプターは、捕獲試薬自体に対して反対符号の電荷を有する荷電物質でもよく、または、捕獲試薬に結合した荷電物質でもよい。更に別の変形では、固相に固定化（付着）され特異的結合反応を介して捕獲試薬を固定化する能力を有している任意の特異的成分がレセプター分子として使用されてもよい。レセプター分子はアッセイの実施前またはアッセイの実施中に捕獲試薬を固相材料に間接結合させ得る。従って、固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性の金属、試験管のガラスまたはシリコンの表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適当な動物の）赤血球、硬膜細胞、並びに、通常の知識をもつ当業者に公知の他の形態のいずれでもよい。
また、検出抗体によってアクセスされ得る十分な多孔性と抗原に結合し得る適当な表面親和性とをもつ任意の適当な多孔質材料から構成された固相も本発明の範囲内に包含される。一般には微孔質構造が好ましいが、水和状態でゲル構造をもつ材料も同様に使用できる。このような有用な固体支持体の非限定例としては、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋されたグアーガム、セルロースエステル、特に硝酸及びカルボン酸とのエステル、混合セルロースエステル及びセルロースエーテルのような天然の高分子糖質及び合成的に修飾、架橋または置換されたそれらの誘導体；天然の窒素含有ポリマー；ビニルポリマーのような適当な多孔質構造に調製され得る合成ポリマー；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩などのアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩のような多孔質無機材料；粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラスのようなアルミニウムまたはケイ素の酸化物または水和物（これらの材料は上記ポリマー材料と共にフィルターとして使用されてもよい）；既存の天然ポリマーに対する合成ポリマーの重合を開始させることによって得られたグラフトコポリマーのような上記材料の混合物またはコポリマー、がある。これらのすべての材料は、フィルム、シートまたはプレートのような適当な形態で使用されてもよく、または、紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは布のような適当な不活性担体に塗布、接着または積層されてもよい。
ニトロセルロースの多孔質構造は、多様な試薬に対して優れた吸収性及び吸着性を有している。ナイロンもまた同様の特性を有しており、同様に好適である。上述したこのような多孔質固体支持体は厚み約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形態であるのが好ましい。孔径の値は広い範囲内で選択できるが、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に好ましくは約０．１５〜１５ミクロンである。このような支持体の表面は、抗原または抗体を支持体に共有結合させる化学処理によって活性化されてもよい。しかしながら通常は、十分には理解されていない疎水性の力による多孔質材料への吸着によって抗原または抗体の不可逆的結合が得られる。適当な固体支持体は米国特許出願第２２７，２７２号にも記載されている。
“指示試薬”は、ＨＧＢＶに対する特異的結合成分に結合（付着）させた外的手段によって検出され得る測定可能シグナルを発生することができ且つこのようなシグナルを発生する“シグナル発生化合物”（“ラベル”とも呼ばれる）から成る。本文中で使用された“特異的結合成分”なる用語は、特異的結合対を構成する１つの成分を意味する。即ち、異なる２つの分子について、一方の分子が化学的または物理的手段を介して第二の分子に特異的に結合することを意味する。指示試薬は、ＨＧＢＶに対する特異的結合対の抗体成分を構成しているが、指示試薬が更に、ハプテン−抗ハプテン系のような任意の特異的結合対の一方の成分、例えば、ビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、糖質またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたはレセプター分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害物質または酵素、などであってもよい。更に、特異的結合対は、例えば分析物−類似体のような初期特異的結合成分の類似体から成る成分を含んでもよい。免疫反応性特異的結合成分は、抗体またはそのフラグメント、抗原またはそのフラグメント、または、抗体／抗原複合体でもよく、このような複合体は、サンドイッチアッセイでＨＧＢＶに結合し得、競合アッセイで捕獲試薬に結合し得、間接アッセイで補助的特異的結合成分に結合し得る組換えＤＮＡ分子によって形成される複合体を包含する。
本発明で考察される種々の“シグナル発生化合物”（ラベル）は、色原体、酵素のような触媒、フルオレセイン及びローダミンのような発光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールのような化学発光化合物、放射性元素及び直接可視ラベルを包含する。酵素の例は、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、などである。特定ラベルの選択が決定されているのではなく、ラベルが、単独でまたは１つもしくは複数の追加の物質と共にシグナルを発生できればよい。
“検出ラベル”なる用語は、検出が可能であるような特性または特性値を有する分子または部分を意味する。検出ラベルは、例えば、放射性同位体、フルオロホア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、ケミルミノホア（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、酵素、コロイド状粒子、蛍光性微粒子、などによって直接的に検出できるラベルでもよい。または、ラベルは、例えば特異的結合成分によって間接的に検出できるラベルでもよい。直接ラベルが、例えば、基質、トリガ用試薬、光、などのようなラベルを検出し得る追加成分を要する場合もあることは理解されよう。間接ラベルを検出に使用する場合、典型的には間接ラベルをコンジュゲートと組合わせて使用する。“コンジュゲート”は典型的には、直接検出可能なラベルに付着または結合させておく特異的結合成分である。固相試薬の合成と同様に、コンジュゲート合成のための結合化学は当業界で公知であり、例えば、特異的結合成分の特異的結合特性またはラベルの検出可能な特性を破壊しない任意の化学的手段及び／または物理的手段を包含する。
本文中で使用された“ハプテン”なる用語は、抗体に結合する能力を有しているがキャリアタンパク質に結合しないときは抗体形成を誘導できない部分的抗原または非タンパク質結合成分を意味する。ハプテンの実例は、ビオチン、アビジン、アダマンタン、フルオレセイン及びカルバゾールである。
本文中で使用された“分析物”なる用語は、試験サンプル中に存在する筈の検出されるべき物質を意味する。分析物は、対応する特異的結合成分（例えば抗体）が天然に存在しているかまたは対応する特異的結合部位が作製され得る任意の物質である。従って、分析物は、アッセイ中に１つまたは複数の特異的結合成分に結合し得る物質である。“分析物”はまた、標的核酸配列、ハプテン、抗体及びその組合せのような任意の抗原性物質を包含する。分析物は、特異的結合対の一方の成分であるから、ビタミンＢ１２を定量するために特異的結合対の一方の成分として使用される固有タンパク質因子、葉酸を定量するために使用される葉酸塩結合タンパク質、または糖質を定量するために特異的結合対の一方の成分として使用されるレクチンのような天然に産生する特異的結合パートナー（対）を介して検出され得る。分析物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的、などを包含し得る。
欧州特許公開０３２６１００に対応する審査中の米国特許出願第１５０，２７８号及び米国特許出願第３７５，０２９号（欧州特許公開第０４０６４７３号に対応）に記載されているように、固定化可能な反応複合体を負荷電ポリマーによって固定化するイオン捕獲手順を利用する実施態様は、高速溶液相免疫化学反応を実施するために本発明で使用し得る。固定化可能な免疫複合体を、負荷電ポリアニオン／免疫複合体と予め処理した正荷電多孔質マトリックスとの間のイオン性相互作用によって反応混合物の残りから分離し、欧州特許公開第０，２７３，１１５号に対応する米国特許出願第９２１，９７９号に記載されているような化学発光シグナル測定に記載された系を含む前述の種々のシグナル発生系を用いて検出する。
本発明方法はまた、微粒子（磁性または非磁性）から成る固相を用いる全自動または半自動システムを含む微粒子技術を利用するシステムに応用し得る。このようなシステムは、欧州特許出願第０，４２５，６３３号及び第０，４２４，６３４号にそれぞれ対応する審査中の米国特許出願４２５，６５１及び４２５，６４３に記載されたシステムを包含する。
分析物検出用の走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の使用も適当である。走査型プローブ顕微鏡、特に原子力顕微鏡では、捕獲相を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用して、固相の表面に存在する筈の抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル型顕微鏡を使用すると、多くのイムノアッセイシステムで抗原／抗体複合体を検出するために通常は使用しなければならないラベルの必要性が除去される。このようなシステムは、審査中の米国特許出願第６６２，１４７号に記載されている。
本発明によれば、ＨＧＢＶグルーブのウイルスは全部のＨＧＢＶウイルスに共通の合成型、組換え型または天然型プローブ（“万能”プローブと呼ばれる）の使用によってアッセイで検出可能であると考えられている。また、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃまたは更に別のＨＧＢＶウイルスの種々のエピトープを同定する種々の合成型、組換え型または天然型プローブを任意のアッセイフォーマットで使用できることも本発明の範囲に包含される。後者の場合、これらを１つの固相に塗布してもよく、または個別の各プローブを微粒子のような個別の固相に塗布し、次いで組合せてプローブの混合物を形成し、後でアッセイに使用してもよい。このようなアッセイフォーマットの変形は通常の知識をもつ当業者に周知であり、これに関しては後述する。
本発明の試薬及び方法は、キヌザルまたはヒトのようなＨＧＢＶ感染個体の血漿、血清または肝臓ホモジェネート中に存在する親密に近縁のヌクレオチド配列のファミリーを準備することによって可能になる。このヌクレオチド配列のファミリーはヒトまたはキヌザル起原ではない。その理由としては、このファミリーが非感染個体から得られたヒトのゲノムＤＮＡにもキヌザルのゲノムＤＮＡにも感染しないこと、この配列ファミリーのヌクレオチドはＨＧＢＶ感染個体の肝臓（または肝臓ホモジェネート）、血漿または血清中にだけ存在すること、また、配列がＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）中に存在しないことが挙げられる。更に、配列ファミリーは、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ及びＨＥＶのゲノムの内部に含まれている配列に核酸レベルで有意な同一性は示さず、翻訳産物として有意でないと考えられる低レベルの同一性を示す。ＨＧＢＶに感染したヒトの感染性血清、血漿または肝臓ホモジェネートはこれらのポリヌクレオチド配列を含むが、非感染のヒトの血清、血漿または肝臓ホモジェネートはこれらの配列を含まない。これらのポリヌクレオチド配列のいくつかによって感染させた肝臓のノーザンブロット分析は、これらの配列がウイルスゲノムと同様のサイズをもつ大きいＲＮＡ転写物に由来することを証明する。ＨＧＢＶに感染したヒトの血清、血漿または肝臓ホモジェネートは、このポリヌクレオチドに結合する抗体を含むが、非感染のヒトの血清、血漿または肝臓ホモジェネートは、このポリペプチドに対する抗体を含まない。これらの抗体は、急性の非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎感染後の個体で誘発されている。これらの判断基準によれば、配列はウイルス配列であり、ウイルスは、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎を発症させるかまたはこれらの肝炎に関連すると考えられる。
このファミリーの核酸配列が入手できれば、ＨＧＢＶ感染を原因とする非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎の診断に有用であり且つ血液ドナー、提供血液、血液製品及び感染個体のスクリーニングにも有用であるＤＮＡプローブ及びポリペプチドを構築できる。例えば、配列から、約８〜１０ヌクレオチドまたはもっと大きいヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーを合成することが可能であり、このようなオリゴマーは、例えばウイルス保有の疑いのある被験者の血清中のウイルスゲノムの存在を検出するため、または、提供血液をウイルスの存在に基づいてスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用である。核酸配列のファミリーはまた、ＨＧＢＶ感染中に増加する抗体の存在に対する診断試薬として有用なＨＧＢＶ特異的ポリペプチドの設計及び作製を可能にする。核酸配列に由来の精製ポリペプチドに対する抗体はまた、感染個体及び血液中のウイルス抗原を検出するために使用され得る。また、ＨＧＢＶ感染個体の発病防止及び／または治療のために有用なＨＧＢＶに対するワクチン用及び抗体産生用に使用できるポリペプチドの設計及び作製もこれらの核酸配列によって可能になる。
単離されたＨＧＢＶ核酸配列の確定された部分を基底として使用し、切り出しまたは合成によって約８ヌクレオチドまたはそれ以上のオリゴマーを作製できる。このオリゴマーはＨＧＢＶゲノムとハイブリダイズし、（１つまたは複数の）ウイルス因子の同定、更にウイルスゲノムのキャラクタリゼーション、並びに、罹病個体の（１つまたは複数の）ウイルスの検出に有用である。ＨＧＢＶポリヌクレオチドの天然型または組立型のプローブは、ハイブリダイゼーションによってユニークなウイルス配列を検出できる長さである。６〜８ヌクレオチドが処理可能な長さであろうが、１０〜１２ヌクレオチドの配列が好ましく、約２０ヌクレオチドの配列が最も好ましい。これらの配列は、異質性のない領域に由来するのが好ましい。これらのプローブは全自動オリゴヌクレオチド合成方法のような常用の標準方法を用いて調製できる。ＨＧＢＶゲノムのいずれかの固有部分への相補性があれば十分であろう。完全な相補性はフラグメントの長さが増せば必要ないかもしれないが、プローブとして使用するためには完全な相補性が望ましい。
診断試薬として使用するときは、血液または血清のような分析すべきサンプルに含まれている核酸を抽出するように処理し得る。サンプルから得られた核酸をゲル電気泳動または他のサイズ分離技術で処理してもよく、あるいは、核酸サンプルをサイズ分離しないでドットブロットしてもよい。次にプローブを標識する。好適なラベル及びラベルをプローブに付着させる方法は当業界で公知であり、その非限定例は、ニックトランスレーションまたはキナーゼ化によって取込まれた放射性ラベル、ビオチン、蛍光性及び化学発光性プローブである。これらのラベルの多数の実例が本文中に開示されている。サンプルから抽出した核酸を次に、適当な緊縮性（stringency）のハイブリダイゼーション条件下で標識プローブによって処理する。
プローブはＨＧＢＶゲノムに対して完全に相補性にすることができる。従って、疑陽性を防止するために通常は高緊縮性条件が望ましい。しかしながら、高緊縮性条件が使用できるのはプローブが異質性のないＨＧＢＶゲノムの領域に相補的な場合だけである。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、温度、イオン強度、処理時間の長さ、ホルムアミドの濃度、などの洗浄手順中の多数の要因によって決定される。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）参照。ハイブリダイゼーションは複数の異なる技術によって実施し得る。増幅は、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−ベータレプリカーゼ、ＮＡＳＢＡ、などによって実施し得る。
ＨＧＢＶゲノム配列は感染個体の血清中に比較的低いレベル、例えば約１０２〜１０３配列／ｍｌの濃度で存在すると予測される。このレベルは、ハイブリダイゼーションアッセイでＬＣＲまたはＰＣＲのような増幅技術を使用することが必要となろう。このような技術は当業界で公知である。例えば、“Ｂｉｏ−ｂｒｉｄｇｅ”システムは、核酸プローブに修飾３′−ポリ−ｄＴ−テールを付加するためにターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用する（Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）。ポリｄＴ−テールを付けたプローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせ、次いでビオチン修飾したポリ−Ａにハイブリダイズさせる。また、欧州特許１２４２２１にもＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記載されており、このアッセイでは、分析物を、酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＤＮＡプローブにアニーリングし、得られたテール付き二重鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。欧州特許２０４５１０は、分析物ＤＮＡを、ポリ−ｄＴ−テールのようなテールを有するプローブと、ポリ−Ａ配列のようなプローブのテールにハイブリダイズする配列を有し複数の標識鎖に結合し得る増幅鎖に接触させるＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを記載している。この技術では、まず標的ＨＧＢＶ配列を血清中で約１０6配列／ｍｌまで増幅させてもよい。この増幅はＳａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３（１９８６）によって記載された方法で行うとよい。次に、（１つまたは複数の）増幅配列を当業界で公知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出し得る。プローブはプローブ核酸配列を含む診断キットにパッケージでき、この配列は標識されていてもよい。あるいは、プローブを標識せず、標識用成分をキットに含ませてもよい。キットはまた、適宜パッケージされた他の試薬、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要なまたは望ましい材料例えば標準、及び、アッセイを実施するための説明書、を含み得る。
本発明で使用できる他の公知の増幅方法の非限定例としては、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０）に教示され、Ｎａｔｕｒｅ：３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１−９２（１９９１）で論議されている所謂“ＮＡＳＢＡ”または“３ＳＲ”技術、及び、Ｑ−ベータリプリカーゼがある。
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（“ＦＩＳＨ”）も本文に記載の試薬を用いて実施できる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、遺伝情報の特定断片の存在及び個々の細胞内部のその特定位置を証明するために核酸ハイブリダイゼーションプロセスによって形態的に完全な組織、細胞または染色体を採取する。この技術では、細胞の均質化及び標的配列の抽出が不要なので、細胞集団中の配列の正確な位置及び分布を提供する。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、配列を含む細胞中に集中した問題の配列を同定し得る。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはまた、問題の配列を含む不均一な細胞集団中で細胞の型及び画分を同定できる。ＤＮＡとＲＮＡとを同じアッセイ試薬で検出できる。増幅を要せずに標的を検出するためにＰＮＡまたはモルホリノ化合物をＦＩＳＨ法に使用できる。増強シグナルが望まれる場合、シグナルを増強し、その結果として方法の感度を増強するために、多数のフルオロホアを使用できる。多数のオリゴヌクレオチドを用いる１段階方法または慣用の多段階方法のような種々のＦＩＳＨ方法が知られている。この種の方法をフローサイトメトリー及びイメージ解析のような種々の手段によって全自動化することも本発明の範囲に包含される。
本文中に記載されたアッセイは、ＨＧＢＶ核酸配列を含有する任意のクローンに由来するか、これらのクローン中のＨＧＢＶ核酸配列に由来するか、または、これらのクローン中の核酸配列の起原となったＨＧＢＶゲノムに由来する１つのウイルス抗原を使用し得る。あるいは、イムノアッセイは、これらのソースに由来のウイルス抗原の組合せを使用してもよい。イムノアッセイではまた、例えば、同じウイルス抗原に対するモノクローナル抗体または異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得る。アッセイの非限定例としては、競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチ型アッセイに基づくアッセイがある。アッセイは固相を使用してもよく、または、免疫沈降によって行ってもよく、もしくは、固相を用いない他の任意の方法によって行ってもよい。シグナル発生化合物としてラベルを用いるアッセイの実例及びこれらのラベルは本文中に記載されている。また、審査中の米国特許出願第６０８，８４９号、第０７０，６４７号、第４１８，９８１号及び第６８７，７８５号に記載されているようなビオチンとアビジン、酵素ラベルまたはビオチン−抗ビオチン系を用いてシグナルを増幅してもよい。
ＨＧＢＶ核酸配列は、ＨＧＢＶゲノムの配列に関してより多くの情報を得るため、及び、ＨＧＢＶ因子を同定し単離するために使用されてもよい。このような情報は、ＨＧＢＶゲノムの種類、ウイルス粒子の構造、ＨＧＢＶを構成する抗原の種類、などのＨＧＢＶのキャラクタリゼーションに役立つと考えられる。この情報からは更に、追加のポリヌクレオチドプローブ、ＨＧＢＶゲノムに由来のポリペプチド及びＨＧＢＶエピトープに対する抗体などが導かれ、これらはＨＧＢＶを原因とする非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎の診断及び／または治療に有用であろう。
合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ，ＤＮＡ３：４０１（１９８４）に記載されているような全自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて作製できる。所望の場合、標準反応条件を使用し、32Ｐ−ＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって、合成鎖を32Ｐで標識してもよい。ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離されるＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ配列は、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）によって記載されたような部位特異的突然変異誘発を含む公知の方法によって修飾されてもよい。簡単に説明すると、修飾すべきＤＮＡをファージに一本鎖配列としてパッケージし、修飾すべきＤＮＡの部分に相補的でそれ自体の配列中に所望の修飾を有している合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＤＮＡポリメラーゼによって二重鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複製を含む形質転換細菌の培養物を寒天中で平板培養してプラークを得る。理論的には、新しいプラークの５０％が、突然変異配列を有するファージを含み、残りの５０％が初期配列を含む。プラークのレプリケートを、正しい鎖とのハイブリダイゼーションに好適で被修飾配列とのハイブリダイゼーションに不適な温度及び条件で、標識した合成プローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションによって同定された配列を回収しクローニングする。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、核酸またはその混合物に含まれている所望の任意の核酸配列（標的）を増幅するための技術である。ＰＣＲでは、標的核酸の相補性鎖の外側末端でハイブリダイズを生じさせるために一対のプライマーを過剰量で使用する。
標的核酸を鋳型として用いポリメラーゼによって各プライマーを延長する。延長産物は初期標的鎖から解離後に標的配列自体になる。次に新しいプライマーがポリメラーゼによってハイブリダイズし、延長され、このサイクルが繰返されて標的配列分子の数が幾何数列的に増加する。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号に開示されている。
ＬＣＲは標的増幅の代替メカニズムである。ＬＣＲでは、２つのセンス（第一と第二）プローブと２つのアンチセンス（第三と第四）プローブとを標的に対して過剰量で使用する。第一プローブは標的鎖の第一セグメントにハイブリダイズし、第二プローブは標的鎖の第二セグメントにハイブリダイズする。第一及び第二のセグメントは、一次プローブが融合産物として結合できるように位置決めされている。更に、第三（二次）プローブは、第一プローブの一部分にハイブリダイズでき、第四（二次）プローブは同様の結合可能な状態で第二プローブの一部分にハイブリダイズできる。標的が最初から二重鎖であるならば、二次プローブも最初に標的相補鎖にハイブリダイズするであろう。センスプローブとアンチセンスプローブとの融合鎖は、いったん標的鎖から分離されると、相補的な二次融合産物を形成するために結合できる第三及び第四のプローブとハイブリダイズするであろう。融合産物は標的またはその相補鎖に機能的に等価である。ハイブリダイゼーションと結合とのサイクルを繰返すことによって、標的配列の増幅が達成される。この技術は、参照によって本発明に含まれるものとする欧州特許出願３２０，３０８に記載されている。ＬＣＲ技術の他の特徴に関しては、参照によって本発明に含まれるものとする欧州特許出願４３９，１８２に開示されている。
１つの実施態様においては本発明は一般的に、標的ＨＧＢＶヌクレオチド配列を含む疑いのある試験サンプルを、一対の増幅プライマーから成る増幅試薬と、アンプリコン配列の内部領域にハイブリダイズできる検出プローブとに接触させる段階を含む。本発明で提供される方法で使用されるプローブ及びプライマーは、捕獲ラベル及び検出ラベルで標識されており、この場合、プローブは一方のタイプのラベルで標識され、プライマーは他方のタイプのラベルで標識されている。更に、プライマーとプローブとは、プローブ配列がプライマー配列よりも低い溶融温度を有するように選択されている。増幅試薬と検出試薬と試験サンプルとを増幅条件下に置き、これによって、標的配列の非存在下で、標的配列のコピー（アンプリコン）を産生させる。正常な場合には、標的配列とその相補鎖とを増幅するようなプライマーが提供されるのでアンプリコンは二重鎖である。次に、二重鎖アンプリコンを熱変性して一本鎖のアンプリコン成分を生じさせる。一本鎖アンプリコン成分が形成されると、混合物を冷却して、プローブと一本鎖アンプリコン成分との間の複合体を形成させる。
意外にも、一本鎖アンプリコン配列とプローブ配列とを冷却したときに、プローブ配列は一本鎖アンプリコン成分に優先的に結合した。従って、プライマーによって産生されるアンプリコンは、プローブよりも高い溶融温度を有しているに違いない。従って、混合物を冷却したときに、二重鎖アンプリコンの再形成が予測された。しかしながら前述したように、このような事態は生じない。プローブは一本鎖アンプリコン成分に優先的に結合することが判明した。更に、このプローブ／一本鎖アンプリコン結合の優先性は、プライマー配列をプローブよりも過剰量で添加したときにも存在する。
プローブ／一本鎖アンプリコン成分のハイブリッドが形成された後、このハイブリッドを検出する。プライマー及びプローブに存在する検出ラベル及び捕獲ラベルを用いてハイブリッドを検出するためには、標準不均一アッセイフォーマットが好適である。ハイブリッドは、捕獲ラベルによって固相試薬に結合でき、検出ラベルによって検出できる。検出ラベルが直接検出可能なラベルである場合、固相上のハイブリッドの存在は、必要に応じてラベルに検出可能なシグナルを発生させ、このシグナルを検出することによって検出される。ラベルが直接検出可能でない間接ラベルである場合、捕獲されたハイブリッドを、通常は直接検出可能なラベルに付着させた結合成分から成るコンジュゲートに接触させ得る。コンジュゲートは複合体に結合し、複合体上のコンジュゲートの存在が直接検出可能なラベルによって検出され得る。従って、固相試薬上のハイブリッドの存在を判定できる。ハイブリダイズしなかったアンプリコンまたはプローブと未結合のコンジュゲートとを洗浄によって除去するために、洗浄段階を使用し得ることは当業者に理解されよう。
試験サンプルは典型的には、標的配列を含有する疑いのある何らかのサンプルである。試験サンプルは、個体から標本を採取し、標的核酸を遊離させるために標本に含まれている任意の細胞を必要に応じて破壊するというような当業界で公知の方法を用いて調製できる。標的配列は一本鎖として記載されているが、これは、標的配列が実際には二重鎖であるが増幅プライマー配列とのハイブリダイゼーションに先立ってその相補鎖から分離されたような場合も包含することをここでは意図している。好ましい方法でＰＣＲを使用する場合、通常は標的配列の末端が既知である。好ましい方法でＬＣＲまたはその変法を使用する場合、通常は全標的配列が既知である。典型的には標的配列が例えばＲＮＡまたはＤＮＡのような核酸配列である。
本発明で提供される方法は、反応混合物を熱サイクル処理する公知の増幅反応を、特にＰＣＲ及びＧＬＣＲで使用できる。増幅反応は典型的には、標的核酸配列のコピーを反復的に作製するためのプライマーを使用する。通常はこの標的配列はより大きい核酸配列の小領域である。プライマー自体は標的配列の領域に相補的な核酸配列である。これらのプライマーは増幅条件下で標的配列の相補的領域にハイブリダイズまたは結合する。標的配列のコピーは典型的には、ハイブリダイズしたプライマーにヌクレオチドを付加するため及び／または隣合うプローブ対を結合させるためにポリメラーゼ活性またはリガーゼ活性をもつ酵素を個別にまたは組合せて使用するプライマー延長及び／または結合の方法によって作製される。モノマーまたはプレフォームされたオリゴマーとしてプライマーまたはプローブに付加されるヌクレオチドも標的配列に相補的である。プライマーまたはプローブが十分に延長及び／または結合された後、例えば、核酸の相補鎖を解離させる温度である“溶融温度”まで反応混合物を加熱することによって標的配列から分離する。このようにして標的配列に相補的な配列が形成される。
次に、任意の二重鎖配列を分離し、プライマーまたはプローブを夫々の標的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーまたはプローブを延長及び／または結合させ、再分離することによって、標的配列の数を更に増幅するための新しい増幅サイクルを惹起し得る。増幅サイクルによって作製された相補鎖は、プライマー延長用または標的配列の数を更に増幅するための２つのプローブのギャップ充填用の鋳型として役立つ。典型的には、反応混合物を２０〜１００回のサイクルで処理し、より典型的には反応混合物を２５〜５０回のサイクルで処理する。サイクル回数は常法によって決定できる。このようにして、標的配列及びその相補的配列の多数コピーが作製される。即ち、プライマーは、増幅条件下に存在するときに標的配列の増幅を開始させる。
ＰＣＲでは一般に、標的鎖の一部分及びその相補鎖に相補的な２つのプライマーを使用する。ＬＣＲでは一般に、標的配列に相補的な２つのプローブと標的相補鎖に同様に相補的な２つのプローブとから成る４つのプローブを使用する。前述のプライマーセット及び酵素に加えて、核酸増幅反応混合物は更に、公知の他の試薬を含み得る。これらの試薬の非限定例としては、マンガン、マグネシウム、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のような酵素補因子；並びに、例えばデオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸のようなデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）がある。
増幅プライマーは標的配列の増幅を開始させるが、検出（またはハイブリダイゼーション）プローブは増幅に関与しない。検出プローブは通常は核酸配列または非荷電核酸類似体であり、その例は国際特許出願９２／２０７０２に開示されたペプチド核酸；米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号及び第５，１４２，０４７号に記載されたモルホリノ類似体、などである。プローブが担持するラベルの種類次第で、プローブは、増幅反応で作製されたアンプリコンの捕獲または検出に使用される。プローブは標的配列の増幅に関与せず、従って、プローブに追加のｄＮＴＰを付加できないように“延長不可能”になっていなければならない。類似体は通常は単独では延長不可能であり、核酸プローブは、ヒドロキシル基が延長に参加できないようにプローブの３′端を修飾することによって延長不可能にされ得る。例えば、プローブの３′端を捕獲ラベルまたは検出ラベルによって官能化し、これによってヒドロキシル基を消費するかまたは他の方法でブロックする。あるいは、３′ヒドロキシル基の単なる開裂、置換または修飾を行ってもよい。１９９３年４月１９日出願の米国特許出願第０７／０４９，０６１号はプローブを延長不可能にするために使用できる修飾を記載している。
従って、プライマー対プローブの比は重要でない。即ち、プローブまたはプライマーを一方の濃度が他方の濃度よりも高くなるような過剰量で反応混合物に添加してもよい。あるいは、プライマーとプローブとを等しい濃度で使用してもよい。しかしながら好ましくは、プライマーをプローブよりも過剰量で反応混合物に添加する。即ち、プライマー対プローブの比は、例えば５：１〜２０：１が好ましい。
プライマー及びプローブの長さは一定でなくてもよいが、プローブ配列は、プライマー配列よりも低い溶融温度を有するように選択される。従って、プライマー配列は一般的にプローブ配列よりも長い。プライマー配列は、典型的には２０〜５０ヌクレオチドの範囲の長さ、より典型的には２０〜３０ヌクレオチドの範囲の長さである。典型的なプローブは１０〜２５ヌクレオチドの範囲の長さである。
プライマー及びプローブの種々の合成方法が当業界で公知である。同様に、プライマーまたはプローブにラベルを付着させる方法も当業界で公知である。例えば、慣用のヌクレオチドホスホラミジット化学とＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．，（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手し得る器具とを用いて所望の核酸プライマーまたはプローブを合成することは常法となっている。本発明のプライマーまたはプローブのようなオリゴヌクレオチドを標識するための多くの方法が文献に記載されている。Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の双方は、プローブ標識方法を発表し、商品化した。例えば、３′−アミン−ＯＮ  ＣＰＧ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて第一級アミンを３′オリゴ末端に付着させ得る。同様に、Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて第一級アミンを５′オリゴ末端に付着させ得る。慣用の活性化及び結合化学を用いてアミンを種々のハプテンに反応させ得る。更に、各々が参照によって本発明に含まれるものとする１９９０年１２月１１日出願の米国特許出願第６２５，５６６号及び１９９０年１２月２０日出願の米国特許出願第６３０，９０８号の各々は、それぞれ５′末端及び３′末端でプローブを標識する方法を教示している。１９９２年６月２５日公開のＷＯ９２／１０５０５及び１９９２年７月９日公開のＷＯ９２／１１３８８は、それぞれ５′末端及び３′末端でプローブを標識する方法を教示している。オリゴヌクレオチドの公知の標識方法の１つによれば、ラベル−ホスホラミジット試薬を調製し、これを使用してオリゴヌクレオチドの合成中にラベルをオリゴヌクレオチドに付加する。例えば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）；またはＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、公開された米国特許出願０７／２４６，６８８（ＮＴＩＳ  ＯＲＤＥＲ  Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６，６８８）（１９８９）参照。好ましくは、プローブを３′端及び５′端で標識する。
捕獲ラベルはプライマーまたはプローブによって担持されており、固相試薬の特異的結合成分との結合対を形成する特異的結合成分となり得る。勿論、プライマーまたはプローブ自体が捕獲ラベルとして機能し得ることは理解されよう。例えば、固相試薬の結合成分が核酸配列である場合、結合成分がプライマーまたはプローブの相補的部分に結合し、これによってプライマーまたはプローブが固相に固定化されるように結合成分を選択するとよい。プローブ自体が結合成分として役立つ場合には、プローブが一本鎖アンプリコン成分に相補的でない配列即ち“テール”を含むことは当業者に理解されよう。プライマー自体が捕獲ラベルとして役立つ場合には、プライマー配列に完全には相補的でないプローブが選択されているので、プライマーの少なくとも一部分が固相上の核酸と自由にハイブリダイズできるであろう。
一般に、プローブ／一本鎖アンプリコン成分複合体は、不均一イムノアッセイを実施するために常用の技術を用いて検出できる。この実施態様において検出は、市販のＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）装置（Ａｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＩ）によって使用されるプロトコルに従って行うのが好ましい。
図１（ａ）−図１（ｆ）は、本発明のアッセイフォーマットの概略図である。図１（ａ）に示すように、標的配列１０とプライマー２０から成る増幅試薬と検出プローブ３０とを含む試験サンプルを容器４０に添加して反応混合物を形成する。試薬の添加後、反応混合物を増幅条件下に維持して、図１（ｂ）に示すように標的鎖６０のコピーを生じさせる。図１（ｂ）の混合物を次に加熱し、二重鎖アンプリコンを熱解離して図１（ｃ）に示すように一本鎖アンプリコン成分７０とする。次に図１（ｃ）の混合物を冷却し、プローブ８０を一本鎖アンプリコン成分７０に結合させて、図１（ｄ）に示すプローブ／一本鎖アンプリコン成分複合体を形成する。図１（ｅ）は複合体の検出方法を示す。図１（ｅ）に示すように、複合体を固相試薬９０に固定化し、コンジュゲート１００を複合体に固定化する。固相試薬上の複合体の存在は試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出できる。図２は、反応複合体の概略図を示す。大きい白丸が固相を表し、Ｙ Ｙが両端にハプテン（Ｙ）の付いたプローブ配列を表し、ａｎｔｉ−Ｙが抗ハプテンＹ抗体を表し、Ｘが異なるハプテンを表し、ａｎｔｉ−ＸがハプテンＸに対する抗体を表し、（＊）が検出可能なシグナル発生化合物を表す。プローブ及びプライマーの各々が、アダマンタン及びカルバゾールのような異なるハプテンに付着できること、付着が５′端、３′端または５′端と３′端との双方で生じ得ること、あるいは、５′端または３′端自体またはその近傍に２つ以上のハプテンが付着できることが理解されよう。以下の実施例中で、配列１、２、６、７、１６、１８、１９、２１、２２、２５、２６及び２７は、特に注釈がない限り各５′端の１位に付着したアダマンタンを有しており、配列３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０及び３１は、特に注釈がない限り各３′端の最終ヌクレオチド位置に付着したカルバゾールを有しており、配列１７、２０、２３、２４、２８及び２９の各々は、特に注釈がない限り５′端の１位に付着したアダマンタンと３′端の最終ヌクレオチド位置に付着したカルバゾールとを有している。
本文中に開示したプライマー及びプローブは、試験サンプルを一対のプライマーと接触させ、増幅を惹起し、ハイブリダイゼーションプローブを添加し、検出を実行する典型的なＰＣＲアッセイに有用である。
本発明を実施例に基づいて以下に説明する。これらの実施例は非限定的な代表例であり、本発明の要旨及び範囲はこれらの実施例に限定されない。
実施例
実施例１：ＨＧＢＶ  ＮＴＲプライマーセットによる増幅
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲによって上記標的配列を検出するために標的特異的プライマー検出プローブを設計した。これらのプライマーは配列１及び配列２であった。
Ａ．ＮＴＲプライマーセット：ＮＴＲプライマーセット（配列１と配列２）を用いて標的配列を増幅し、標準シアノエチルホスホラミジット結合化学を用いて５′端をアダマンタンでハプテン化した。
次に、表１に示す種々のハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅産物を検出した。ヒト胎盤性ＤＮＡ（ｈｐＤＮＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて特異性を評価した。ＮＴＲ配列を含むプラスミドＤＮＡを用いて反応性を評価した。
0004237823.tif 000002
0004237823.tif 000003
Ｂ．プラスミドの記述
１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３と５００ｍＭのＫＣｌとから成る１０×ＰＣＲバッファ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、以下に記載の手順で反応１〜１２（表１）のＰＣＲ延長を実施した。ＭｇＣｌ2の最終濃度は２ｍＭであり、ヌクレオチドの最終濃度は＠２００μＭであった。表１の反応条件を表２に示す。
0004237823.tif 000004
増幅後に反応生成物をＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）で検出した。これらの実験で得られたデータを表３に示す。表３のデータはＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅及び検出を証明した。
0004237823.tif 000005
実施例２：ＮＳ３プライマーセットによる増幅
Ａ．ＮＳ３プライマーセット：ＮＳ３プライマーセット（ＮＳ３  Ｓ１とＮＳ３  Ａ１、夫々配列７と配列６）を用いて標的配列を増幅し、実施例１に記載の手順で５′端をアダマンタンでハプテン化した。表３に示す種々のハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅産物を検出し、標準シアノエチル結合化学を用いて３′端をカルバゾールでハプテン化した。ヒト胎盤性ＤＮＡ（ｈｐＤＮＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて非特異的増幅／ハイブリダイゼーションを評価した。ＮＳ３配列を含むプラスミドＤＮＡを用いて反応性を評価した。
0004237823.tif 000006
0004237823.tif 000007
Ｂ．ＮＳ３プラスミドの記述
２５０ｍＭのビシン、５７５ｍＭの酢酸カリウム、４０％（ｗ／ｖ）のグリセロール，ｐＨ８．２及び２．５ｍＭの最終濃度のＭｎ（ＯＡｃ）２から成る５×ＥＺバッファ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を用いてＰＣＲ延長を実施した。ヌクレオチドは濃度２００μＭであった。表６の反応条件を以下の表５に示す。
ＮＳ３プラスミド（クローンｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１）は、ブダペスト条約の約定に基づいて１９９４年１１月８日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｃｅｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に寄託され、寄託の年月日から３０年間、寄託の最終申請日から５年間、または米国特許の実効期間、のうちの最長期間にわたって維持される。これらの寄託物及び本文に記載の他の寄託材料は単なる便宜的な例示であり、本文に提供された教示を考慮して本発明の実施するために必ずしもこれらを必要とするものではない。ｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．６９７１１で受託された。全ての寄託材料中のＨＧＢＶ  ｃＤＮＡ配列は参照によって本発明に含まれるものとする。
0004237823.tif 000008
増幅後に反応生成物をＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システムでハイブリダイズさせ検出した。これらのデータを表６に示す。表４のデータはＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅及び検出を証明した。
0004237823.tif 000009
実施例３：ＧＢ血清サンプルＰＣＲ／ＬＣｘ（登録商標）パラメーター
“ＩＶＤＵ３００”はＧＢ因子を含むことが判っているサンプルである。これを以下の手順で試験した。陰性対照は正常血清であった。
Ａ．ＨＧＢＶ  ５′ＮＴＲ検出
プライマー（配列１と２）及び検出プローブ（配列３と４）を用い、実施例１と同様の手順で標的配列（表７）をＰＣＲ増幅した。この試験では、プライマーを０．２５ｍＭ（３．０×１０13分子）の濃度及び検出プローブを０．０１ｍＭ（１．２×１０12分子）の濃度で使用した。更に、０．０２５単位／ｍｌ（合計５単位）のｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼと合計２０ｎｇのｒＲＮＡとを存在させた。
逆転写酵素反応を６０℃で３０分間実施した。生成物を以下のサイクリング条件下でＰＣＲ増幅した。９４℃で１分／５５℃で１分／７２０Ｃで１分を４０サイクル。次に、オリゴマーハイブリダイゼーション段階を９５℃で５分、１５℃で浸漬まで行った。
増幅後、反応生成物をＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）で検出した。これらの実験で得られたデータを表７に示す。表７のデータは、ＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅及び検出を証明した。
0004237823.tif 000010
Ｂ．ＨＧＢＶ  ＮＳ３検出
プライマー（配列６と７）及び検出プローブ（配列１４と１５）を用い、実施例２と同様の手順でＲＮＡサンプル（表８）の反応性をＰＣＲ増幅した。この試験では、プライマーを０．２５ｍＭ（３．０×１０13分子）の濃度及び検出プローブを０．０１ｍＭ（１．２×１０12分子）の濃度で使用した。更に、０．０２５単位／ｍｌ（合計５単位）のｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼとアッセイ対照として合計５００ｎｇのｒＲＮＡとを存在させた。
逆転写酵素反応を６４℃で１０分／６２℃で１０分／６０℃で１０分／５８℃で１０分／５６℃で１０分／５４℃で１０分／５２℃で１０分／５０℃で１０分間実施した。生成物を以下のサイクリング条件下でＰＣＲ増幅した。９４℃で１分／５５℃で１．５分を４０サイクル。次に、オリゴマーハイブリダイゼーション段階を９５℃で５分、１５℃で浸漬まで行った。増幅後、反応生成物をＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）で検出した。これらの実験で得られたデータを表８に示す。表８のデータは、ＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅及び検出を証明した。
0004237823.tif 000011
実施例４：ＨＧＢＶ  ＮＴＲプライマーセットによる増幅
上記標的配列をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲによって検出するために標的特異的プライマー検出プローブを設計した。使用されたこれらのプライマーは配列１及び配列１６であった。
Ａ．ＮＴＲプライマーセット
ＮＴＲプライマーセット（配列１と配列１６）を用いて標的配列を増幅し、標準シアノエチルホスホラミジット結合化学を用いてそれらの５′端をアダマンタンでハプテン化した。
次に、プローブ３ＦＳ３（配列１７）を用いてＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システムで増幅産物を検出した。標準シアノエチル結合化学を用いてプローブの３′端をカルバゾールでハプテン化しておいた。結果を表９に示す。
0004237823.tif 000012
Ｂ．その他の試験
付加的なＮＴＲプライマーセットを用いて標的配列を増幅し、標準シアノエチルホスホラミジット結合化学を用いてそれらの５′端をアダマンタンでハプテン化した。次に、表１０に示す種々のプローブを用い、Ａｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システムで増幅産物を検出した。標準シアノエチル結合化学を用いてプローブの３′端をカルバゾールでハプテン化しておいた。
0004237823.tif 000013
実施例５：同じプローブを用いたプライマーの種々の組合せの性能試験
プライマーの種々の組合せの感受性及び特異性を評価するために、種々のプライマーの組合せを同じプローブを用いて実施例３に記載の手順で試験した。試験した種々の組合せを以下の表１１に示し、組合せを符号“Ａ”、“Ｂ”、“Ｃ”及び“Ｄ”で表す。符号“Ａ”、“Ｂ”、“Ｃ”及び“Ｄ”で表すこれらの組合せの結果を以下の表１２に示す。プローブが配列３の場合、５′の１位及び３′端の１５位の双方にカルバゾールを付着させておいたことを理解されたい。
0004237823.tif 000014
0004237823.tif 000015
実施例６：プライマー及びプローブの組合せに依存する感受性及び特異性
プライマーの種々の組合せの感受性及び特異性を評価するために、種々のプライマーの組合せを同じプローブを用いて実施例６に記載の手順で試験した。試験した種々の組合せを以下の表１３に示し、組合せを符号“Ａ”、“Ｂ”、“Ｃ”、“Ｄ”及び“Ｅ”で表す。符号“Ａ”、“Ｂ”、“Ｃ”、“Ｄ”及び“Ｅ”で表すこれらの組合せの結果を以下の表１４に示す。
0004237823.tif 000016
0004237823.tif 000017
実施例６：ＧＢＶ−ＣＮＳ３を検出するための非産生性プライマーの使用
プライマー対とプローブとの性能を測定するために、プローブとして配列２８及び配列２９を用い実施例３の手順に従ってプライマー対（配列１８と配列１９）を試験した。サイクリング条件は、９４℃で１分／５５℃で２０分／９４℃で１分／５１℃で１分３０秒を４０サイクル、９７℃で５分、１５℃で２分から浸漬までであった。ＰＣＲのサイクリング条件はタッチダウンＰＣＲよりも高速で単純であった。Ｋ．Ｈ．Ｒｏｕｘ，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：８１２−８１４（１９９４）。反応の結果を以下の表１５に示す。
0004237823.tif 000018
上記から明らかなように、本明細書に記載した本発明のプローブは個体のＨＧＢＶを検出するために有用である。本発明の他の用途及び変形は本明細書の開示から当業者に明らかであろう。従って、本発明が請求の範囲のみによって限定されることが理解されよう。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000019
配列番号：２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000020
配列番号：３
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000021
配列番号：４
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000022
配列番号：５
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000023
配列番号：６
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000024
配列番号：７
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000025
配列番号：８
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000026
配列番号：９
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000027
配列番号：１０
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000028
配列番号：１１
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000029
配列番号：１２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000030
配列番号：１３
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000031
配列番号：１４
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000032
配列番号：１５
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000033
配列番号：１６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000034
配列番号：１７
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000035
配列番号：１８
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000036
配列番号：１９
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000037
配列番号：２０
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000038
配列番号：２１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000039
配列番号：２２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000040
配列番号：２３
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000041
配列番号：２４
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000042
配列番号：２５
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000043
配列番号：２６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000044
配列番号：２７
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000045
配列番号：２８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000046
配列番号：２９
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000047
配列番号：３０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000048
配列番号：３１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0004237823.tif 000049
【図１ａ】
0004237823.tif 000050
【図１ｂ】
0004237823.tif 000051
【図１ｃ】
0004237823.tif 000052
【図１ｄ】
0004237823.tif 000053
【図１ｅ】
0004237823.tif 000054
【図２】
0004237823.tif 000055