(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の存在または量を測定するための乾燥した物品であって、
該物品は、
ブルーの正染性状態におけるトルイジンブルーＯを安定化するのに十分な寸法の加水分解されていないＤＮＡ、トルイジンブルーＯ、およびトルイジンブルーＯに関して異染性を引起こすバインダーを含み、
少なくとも２つの表面を更に有し、
該物品は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置される物品であり、
該物品は、
加水分解されていないＤＮＡ、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを包含する、物品中に含有させるために選択される成分を適量含有する溶液を調製し、
該溶液を固体支持体上に塗布し、そして
塗布膜を乾燥させて塗布液を固形化する
ことによって調製される、乾燥した物品。
【請求項２】
エンテロトキシン産生性ブドウ球菌の含有が疑われる検体を培養する工程であって、但しこの検体は、ブドウ球菌を培養するために選択される栄養培地を含んでいる、工程；
非耐熱性ヌクレアーゼ活性を不活化するために検体を加熱処理する工程；
乾燥した物品を検体に接触させる工程であって、ここで、前記物品は加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを含み、少なくとも２つの表面をさらに含み、そして前記検体に対して配置するのに適合し、ならびにここで、前記検体はブドウ球菌を増殖するために選択される栄養培地を含み、そして非耐熱性ヌクレアーゼ活性を不活化するために加熱処理されている、工程；および
該物品における青色から赤色またはピンク色への色の変化の有無を検出することによって、該検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の有無を確認する工程であって、ここで検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の数を計数する工程；
を包含し、
該物品は、
ブルーの正染性状態におけるトルイジンブルーＯを安定化するのに十分な寸法の加水分解されていないＤＮＡ、トルイジンブルーＯ、およびトルイジンブルーＯに関して異染性を引起こすバインダーを含み、
少なくとも２つの表面を更に有し、
該物品は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置される物品であり、
該物品は、
加水分解されていないＤＮＡ、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを包含する、物品中に含有させるために選択される成分を適量含有する溶液を調製し、
該溶液を固体支持体上に塗布し、そして
塗布膜を乾燥させて塗布液を固形化する
ことによって調製される、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の数を測定する方法。
【請求項３】
前記定量が前記物品における色の変化を伴う前記検体中のコロニーの数を計数する工程、および該数と検体中の潜在的エンテロトキシン産生性ブドウ球菌の量とを相関させる工程を含む、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、検体における耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌（Staphylococcus aureusを含む）の検出、および加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを含有するそのような検出のための物品に関する。
発明の背景
潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検出は食品加工の重要な局面であり、加工中および加工後の混入を示唆するためのスクリーニング手段として使用され得る。潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌に対する食物検体の評価は、食物中の可能な病原体種の存在を直接示唆するのに役立つことができる。公知のエンテロトキシン産生種であるStaphylococcus aureus（S.aureus）の検出は、食品加工において特に重要である。Staphylococcusのエンテロトキシンを潜在的に産生し得る他の種も知られており、これらの種による混入について検体を試験することは重要であり得る。さらに、病原性ブドウ球菌感染症を示唆する患者検体を試験することも臨床的環境において重要である。
S.aureusを検出するための現在の方法は、検体の分画部分におけるS.aureusの推定される存在を測定するためのBaird-Parker卵黄−亜テルル酸塩−ピルビン酸塩寒天培地（BPAと省略される）を使用する。本方法では、BPAプレートは48時間のインキュベーション後の「代表的な」コロニーの存在について試験される。次いでコロニーの検体を24時間までのさらなるインキュベーションのための脳−心臓輸液に移す。ブロス培養物をさらなる６時間のインキュベーションのためにウサギ血漿と混合する。次いで、培養物−血漿混合物を血漿の凝集（すなわち、凝塊）の存在について評価する。凝塊を生じる培養物を「コアグラーゼ陽性」とする。コアグラーゼ陽性の結果に従ってBPAから陽性が推定されれば、検体においてS.aureusの存在が確認されたとみなす。
S.aureusの存在に関連するコアグラーゼ活性の使用はまた、エンテロトキシン産生を含む病原性の可能性と相関すると考えられている。しかし、コアグラーゼ試験は本質的に面倒で時間がかかるため、大量の検体を日常的に試験するには実用的ではない。
現在、S.aureusの存在については食品加工および臨床的環境の両方において確認される。例えば、臨床的環境では、検体は「CNS」（コアグラーゼ陰性staph.）または「CPS」（コアグラーゼ陽性staph.）として報告される。
コアグラーゼ試験に対する２つの代替的方法は、S.aureusのコアグラーゼ反応に対する良好な統計的関係：ヒアルロニダーゼおよび耐熱性ヌクレアーゼ（TNase）を示している。しかし、ヒアルロニダーゼ系は複雑で費用が高い。TNase活性のための試験も、Lachicaら、Applied microbiology 21（4）、585〜87頁（1971）が異染性染料のトルイジンブルーＯ（加水分解されたおよび加水分解されていないDNAの存在下における示差染色によってTnaseを検出するための染料）の使用について記載するまでは面倒であった。
TNaseの検出方法については記載されており、（１）TBO/DNA寒天を充填したペトリ皿においてウェルを形成し、煮沸した培養物をウェル内においてTNaseの存在を決定すること、（２）顕微鏡用スライド（または等価物）の表面上に成型されたTBO/DNA寒天培地内にウェルを形成し、（１）の手順に従うこと、（３）発達したBPAを60℃で少なくとも２時間プレインキュベートした後、Baird-Parker寒天（または等価物）に溶融したTBO/DNA寒天を重層することを含む方法において使用される。（１）、（２）、および（３）は、TNaseについて陽性であるコロニーまたは懸濁物から２〜４時間内に読み取り可能な結果を生じる。これらの方法を用いて、様々な研究者がTNase試験とS.aureusに対するコアグラーゼ試験との100％までの相関を明らかにしている。
TNase活性は、潜在的にエンテロトキシンを産生し得る他のStaphylococcus種においても検出されており、それは、コアグラーゼ陰性のもの（例えば、Staphylococcus hyicus）も含む。従って、TNaseはコアグラーゼ試験よりも良好なエンテロトキシン原性の指示物であると思われる。すなわち、エンテロトキシンを産生する微生物の大部分はTNase陽性であるが、エンテロトキシンを産生する微生物のすべてが必ずしもコアグラーゼ陽性であるわけではない。
TNase試験の現在の方法は信頼することができるが、結果を得るためにはウェルを形成させるかまたは溶融寒天を調製する必要があることから、多数の検体を試験またはスクリーニングする際のそれらの有用性はかなり制限される。これらの方法は時間がかかり、多数の検体を試験する場合には非効率的な技術である。従って、食品加工または臨床アプリケーションにおいて、多数の検体のための効率的かつ信頼できる試験またはスクリーニングを可能にする、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌のためのTNase試験を開発することが所望される。
発明の概要
１つの局面において、本発明の特徴は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の存在を検出または確認するための物品にある。物品は、加水分解されてないヌクレオチド、トルイジンブルーOおよびバインダーを含有する。物品は、少なくとも２つの面を有し、S.aureusなどのエンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置するのに適合する。
好ましい実施態様において、バインダーはグアガム（guar gum）である。物品は、さらに、コントラスト増強剤としてλ−カラゲナン（carrageenan）を含み得る。物品は、任意の厚さまたは形状であり得る。例えば、物品は、ディスク状の形状であり得、そのようなものとして、プレートまたはウェル内、あるいはPetrifilmTMなどの薄フィルム培養プレートシステム上に配置するのに適合し得る。好ましくは、物品は、約0.12〜0.25mmの厚さを有する。
物品は、好ましくは、物品の１つの面に接する、ポリエステルフィルムなどの固体支持体を含有する。物品は、さらに、保護材を含み得る。保護材は、物品の暴露面に接し得る。物品が、一方の面に接する固体支持体を含む場合、保護材は対向面に接し得る。
本発明の物品は、物品中の加水分解されていないヌクレオチドの耐熱性ヌクレアーゼ（TNase）介在性の加水分解が、特定のpHで生じるように選択された試薬を含有し得る。好ましくは、物品は、ヌクレオチドの加水分解が約9.0のpHで生じるように選択された試薬を含有する。あるいは、物品は、好ましくは、ヌクレオチドの加水分解が約7.3のpHで生じるように試薬を含有し得る。
もう１つの局面において、本発明は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の検出方法を特徴とする。方法は、（１）耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための上記の物品を、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の含有が疑われる検体に貼付する工程、および（２）検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の有無を確認する工程を含む。該有無は、物品における青色から赤色またはピンク色への色の変化の有無を検出することにより確認される。
好ましい実施態様において、検体は食物検体である。他の好ましい実施態様において、検体は、患者由来の検体である。
試験検体が貼付される培養培地は、例えば、Baird-Parker Agarなどの寒天を基材とする培地、あるいはより好ましくは、ブドウ球菌を増殖させるために適合した薄フィルム培養プレート装置であり得る。
培養培地で試験検体を培養する工程は、好ましくは、検体を約37℃で約18〜48時間インキュベートする工程を含む。検体の加熱工程は、好ましくは、検体を少なくとも約60℃で、少なくとも約30分間インキュベートする工程を含む。
方法は、さらに、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の数を定量する工程を含み得る。定量は、物品における色の変化を伴うコロニーの数を計数する工程、および潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検体中の量とコロニー数とを相関させる工程を含み得る。
もう１つの面において、本発明は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の検出キットを特徴とする。キットは、検体由来の微生物を増殖させるための試薬および栄養分、ならびに検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品を含有する。
好ましい実施態様において、微生物を増殖させるための試薬および栄養分は、ブドウ球菌を増殖させるために適合された薄フィルム培養プレート装置を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の物品の１つの実施態様を示す装置の断面図である。
図２は、本発明の物品の１つの実施態様を示す装置の部分分解斜視図である。
図3a〜図3cは、薄フィルム培養プレート装置を伴う本発明の物品の１つの実施態様での使用を表す。
発明の詳細な説明
本発明は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品を提供する。本発明の物品は、非常に多数の検体の迅速、効率的かつ高感度のTNase分析を可能にし、従って、S.aureusを含む、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検出のために現在使用されている扱い難く時間のかかるTNase法よりも明白な利点を提供する。物品はまた、コアグラーゼ試験以上の利点を提供する；TNase試験は、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検出における感度がさらに高い。なぜなら、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌のすべてが必ずしもコアグラーゼ陽性ではないが、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の大部分はTNase陽性であるからである。本発明の物品は、S.aureusの存在に関する食品検体の分析で特に有用である。
本発明の物品は、（１）検体中に耐熱性ヌクレアーゼ（TNase）が存在すれば、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌が検体中に存在することを示し、そして（２）異染性染料のトルイジンブルーOが、酸性多糖およびDNAの存在下でTNase活性を検出するために使用され得るという指針を利用する。
トルイジンブルーOは異染性染料である。異染性とは、いくつかの物質との複合体が形成されることによって、本来の染料の吸収スペクトルと異なる吸収スペクトルが生じるために、染料が正しく染まらない特性のことである。トルイジンブルーOの正しいまたは正染的な染色は、青色である。しかし、異染的な染色によって、ピンク色〜赤色またはスミレ色が生じる。トルイジンブルーOは、DNAとの複合体が形成される場合には青色に染まるが、アガロース、λ−カラゲナンまたはヘパリンなどの酸性多糖との複合体が形成されると、異染性が生じ、染料は、赤みを帯びたピンク色〜赤みを帯びたスミレ色に染まる。
トルイジンブルーOは、酸性多糖よりもDNAに対して大きな親和性を有し、DNAは、トルイジンブルーOを青色の正染状態で安定化する。しかし、DNAse産生生物が存在する場合、DNAは加水分解され、酸性多糖から保護されないトルイジンブルーOが遊離し、染料は、赤みを帯びたピンク色〜赤みを帯びた紫色の異染性形態に変化する。青色から赤みを帯びたピンク色または赤みを帯びた紫色への色の変化は、DNAse（例えば、耐熱性ヌクレアーゼ）産生微生物の肯定的な同定である。
従って、本発明は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品を提供する。物品は、加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーOおよびバインダーを含有する。物品は、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体（通常は、培養された検体）に対して配置するのに適合する。
物品は、液体または溶融状態とは対照的に、試験時の使用のために安定な条件で保存され得る程度に比較的乾燥した状態である。そのようなものとして、物品は、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置するのに適合する。従って、使用において、本発明の物品は、その都度調製される寒天でのウェル形成を必要とする現在利用可能な方法、または溶融寒天の使用と比較して非常に有利である。
検体中の加水分解されていないヌクレオチドは、典型的には、DNAの形態である。DNAは容易に購入することができる（例えば、Difco Laboratories、Detroit、MIから入手可能なサケ精子DNA）が、トルイジンブルーOで青色に染色される（すなわち、トルイジンブルーOを青色の正染状態で安定化させる）ように十分な大きさの任意のヌクレオチドであり得る。従って、本明細書中で使用される用語「加水分解されていないヌクレオチド」は、そのような核酸をいう。トルイジンブルーOは、市販されている（Sigma Chemical Company、St.Louis、MO）。
物品におけるバインダーは、トルイジンブルーOに関して異染性を生じさせ、そして物品の他の成分と溶液中で混合され、次いで物質上に被覆され、乾燥させて物品を形成し得る任意のバインダーであり得る。酸性多糖は、トルイジンブルーOに関して異染性を生じさせることが知られており、好ましいバインダーである。物品での使用に適する多くのバインダーが存在する。適切なバインダーの非限定的な例として、アガロース、グアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガムおよび他の天然ガムが挙げられる。好ましいバインダーは、グアガムである。
物品はまた、好ましくは、（TNase活性のための）塩化カルシウム、（適切なイオン強度を提供するための）塩化ナトリウム、またはTris塩酸塩／Tris塩基などの（TNase反応が生じるpHを制御するための）緩衝液系などの他の構成要素を含み得る。
本発明の物品は、様々なpHの溶液から調製され得る。そのようなものとして、物品は、TNase介在性のヌクレオチドの加水分解が、選択されたpHで生じるような試薬を含有する。例えば、下記の実施例１に示すように、本発明の好ましい実施態様による物品は、pH7.3の溶液から作製され得る。あるいは、下記の実施例２に示すように、本発明のもう１つの好ましい実施態様による物品は、pH9.0の溶液から作製され得る。
TNase活性の最適pHは、8.5〜9.0である。検体中のTNaseと物品中の加水分解されていないヌクレオチドとの間のTNase反応がこの最適範囲のpHで生じるように物品が調製される場合、物品における色の変化は、容易に検出することができる。
TNase反応がTNase活性の最適pH範囲外（例えば、それより低いpH）で生じるように物品が調製される場合、コントラスト増強剤を物品中に含めることは好都合であり得る。例えば、λ−カラゲナンは、異染性シフト、従って核酸の存在／非存在下でのトルイジンブルーO／DNAにより認められるコントラストを増強することが知られている。米国特許第4,241,181号を参照のこと。その開示内容は、コントラスト増強剤としてのλ−カラゲナンの使用を記載することによって、参考として本明細書中に援用される。従って、物品中にコントラスト増強剤が含まれることは、TNase反応が耐熱性ヌクレアーゼ活性の最適pH範囲外で生じる系では好都合である。
本発明による物品を調製するための例示的な条件を、以下の実施例で例示する。
一般に、物品の調製は、物品に含まれるために選択される適量の成分（加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーOおよびバインダーを含む）を含有する溶液を調製する工程、溶液を冷却する工程、次いで溶液を固体支持体に被覆する工程を含む。次いで、被覆フィルムを乾燥し、被覆した溶液を固化させる。１つの好ましい非限定的な実施態様を例示するために、3.6g/Lのサケ精子DNA、0.32g/LのトルイジンブルーO、および１％（w/v）のグアガムを含有する溶液を、0.18mmのポリエステルフィルムの固体支持体に被覆し、次いで200°Fで２〜10分間乾燥する。得られる乾燥被覆物は、任意の所望の厚さであり得るが、好ましくは、約0.12〜0.25mmの厚さを有する。成分およびその量は、特定の適用に所望されるものに依存して、物品が不撓性であるかまたは可撓性であるように選択され得る。
図１は、好ましい実施態様における物品を示す。物品２、固体支持体３および保護材４を含む複合体１の断面を示す。物品２は、上記のように、バインダー、加水分解されていないヌクレオチドおよびトルイジンブルーOを含有する。図１に示すように、物品２は、面５および面６の２面を有する。固体支持体３は第１の面５に接し、保護材４は第２の面６に接する。
固体支持体３は、ポリエステルフィルムなどのポリマーフィルムであり得る。固体支持体３は、乾燥後に成型される物品を提供するための鋳型から誘導され得る。あるいは、固体支持体３は、被覆および乾燥の後、所望の大きさまたは形状の物品に切断または、打抜きが可能なシート材から誘導され得る。固体支持体３に使用される材料は、物品／固体支持体複合体に任意の程度の不撓性または可撓性を与えるために選択され得る。さらに、物品および／または物品／固体支持体複合体は、特定の適用に所望されるものに依存して任意の形状または厚さで調製され得る。
固体支持体は、好ましくは、使用中の物品において生じる色の変化が視認できるように透明であるか、または少なくとも光透過性である。固体支持体はまた、物品を安定化し、損傷から保護する。
固体支持体は、物品から剥離可能であるように選択することができ、固体支持体を伴わない試験において物品が自由に使用される。例えば、固体支持体としてポリエステルフィルムを使用する場合、使用している間に物品が水和すると、固体支持体を物品から剥離させることができる。
本発明の物品は、さらに、保護材を含み得る。図１に、保護材４を断面で示す。保護材は、物品の暴露面に隣接して配置してもよい。例えば、固体支持体が物品の１つの面に隣接する場合、保護材は、対向面に隣接し得る。保護材は、貯蔵および輸送するときに物品を保護するポリマーフィルムまたは格子であり得、乾燥後には吸湿性である物品を互いに隔てるための物品間のスペーサーとして機能し、安定な貯蔵およびより長い貯蔵期間を可能にし得ることが好ましい。図１に、保護材４を、格子として断面で示す。
保護材は、使用前に物品の面から剥離可能または除去可能であるように選択される。保護材としての使用に適切な材料は、当該分野で公知である。
上記のように、物品は、任意の所望の厚さ、形状または不撓性であり得、存在すれば、固体支持体は、任意の所望の厚さであり、任意の所望の程度の不撓性または可撓性が与えられるように選択され得る。
図２を参照すると、本発明の物品２を含有する複合体１について、部分分解透視図で示されている。図２に示す物品は、一般に、円板様の形状であるが、物品は、特定のアプリケーションのために所望される任意の形状であってもよい。図２に示す複合体１は、物品２、固体支持体３、および分解図において、格子として示される保護材４を含有する。物品２は、面５および面６の２面を有する。分解図において格子状として示される保護材４が取り除かれ、検体に対して配置するのに物品の面６が出現する。
本発明の物品は、Staphylococcus aureusなどのエンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置するのに適合する。そのようなものとして、物品は、検体への押し付けまたは貼付が可能である。物品は、（液体または溶融形態とは対照的に）比較的乾燥した形態であり、検体への容易な貼付または設置を可能にする。検体への貼付の際、物品は水和する。
検体は、典型的には、培養された熱処理検体であり、例えば、薄層培養プレート装置（例えば、3M、St.Paul、MNより入手可能なPetrifilmTM）またはBaird-Parker培地などの寒天ゲルを基材とする培養系で培養された検体である。耐熱性ヌクレアーゼ酵素は、培養されたエンテロトキシン産生ブドウ球菌のコロニーから遠くに拡散しないため、試験しようとする検体は、推定されるエンテロトキシン産生ブドウ球菌のコロニーの近くに本発明の物品を配置することを可能にする形式で調製され得るべきである。耐熱性ヌクレアーゼの拡散には限界があるため、薄フィルム培養プレート形式が特に好ましい。なぜなら、そのような装置における培養培地の薄層は、好都合なことに、推定されるエンテロトキシン産生ブドウ球菌のコロニーを含有する培養された検体の非常に近くに物品を配置することを可能にする。
使用において、物品は、物品が検体と接触するように、検体に貼付されるかまたは置かれる。例えば、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体を、Baird-Parker寒天などの寒天培地で、プレートまたはウェルで増殖させ、熱処理（例えば、60℃で30分間）して非耐熱性のヌクレアーゼ活性を不活性化させた場合、物品を寒天にかぶせ、それにより検体と接触させて配置することができる。TNaseが存在する（エンテロトキシン産生ブドウ球菌の存在と相関する）場合、加水分解された核酸の存在下でのトルイジンブルーOの特徴的な赤色またはピンク色の染色が、適切な条件下で約１〜４時間以内に生じる。その特徴的な染色パターンは、通常、赤色またはピンク色の「輪」が、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われるコロニーを取り囲む形態である。
薄フィルム培養プレート形式において、試験検体、例えば、Stomacherなどの装置で希釈および処理された食品検体は、例えば、ゲル化剤および微生物を増殖させるための栄養分を含有するフィルムに貼付される。栄養分は、ブドウ球菌を増殖させるために選択され得る。試験検体はまた、患者由来の培養された検体、例えば、血清、皮膚または他の供給源などであり、ここで、患者検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するために物品が使用される。
次いで、検体は、典型的には、カバーフィルムで覆われ、検体中の微生物を検出可能なレベルまで増加させることが可能な温度および時間でインキュベートされる。微生物が検体中に存在すれば、インキュベーション中に微生物のコロニーが現れる。インキュベーションおよび非耐熱性ヌクレアーゼの活性を不活性化するための熱処理の後に、本発明の物品を検体に接触させて置いてもよい。
米国特許第4,565,783号および同第5,232,838号（これらの開示は、参考として援用される）は、本発明の物品との使用に適する薄フィルム培養プレート装置を詳しく記載する。
図3a〜図3cは、薄フィルム培養プレート装置を伴う本発明の物品の使用を示す。図3aは、本発明の物品との使用に適する薄フィルム培養プレート装置10の例を示す。この装置は、乾燥した培養培地12が付着しているボトムフィルム11を含有する。培養培地は、例えば、ブドウ球菌を増殖させるために適合された培地であって、乾燥させたブロスまたは粉末化した栄養分としてフィルムに被覆された培地を含有し得る。（ボトムフィルム11から剥離して示される）カバーフィルム13は、貯蔵およびインキュベーションの間、培養培地12を覆う。カバーフィルム13は、好ましくは、培養培地12と接触する面14に被覆されたゲル化剤を含有する。試験検体を培養培地12に貼付するとき、カバーフィルム13は、検体および培養培地13とともにゲル化剤と接触させるためにボトムフィルム11にかぶせられる。次いで、装置をインキュベートして、検体中に存在する微生物を増加させ、ゲル化した培養培地にコロニーを形成させる。インキュベーション後、次いで、培養検体は、好ましくは、非耐熱性ヌクレアーゼの活性を不活性化させるのに十分な温度に加熱される。次いで、カバーフィルム13は、ボトムフィルム11から剥離し得る。その結果、本実施態様では、コロニーを含有するゲル化した培養培地がカバーフィルムの面14に付着する。
図3bは、インキュベーション後に剥離された薄フィルム培養プレート装置10を示す。コロニー21を含有するゲル化した培養培地20が、カバーフィルム13に付着される。図3bには、本発明の物品２および支持層３を含有し、耐熱性ヌクレアーゼの検出において使用される複合体１も示されている。示された複合体１は円板形であるが、使用状況に適切な任意の形状であり得る。使用において、物品２を含有する複合体１は、カバーフィルム13をボトムフィルム11に貼付するとき、物品２の暴露面６が、ゲル化した培養培地20およびコロニー21と接触するように装置に置かれる。例えば、図3bに示す実施態様において、複合体１は、ゲル化した熱処理培養培地に対して物品２の暴露面６を上向きにして、ボトムフィルム11に単純に置かれる。次いで、カバーフィルム13は、複合体１がカバーフィルム13とボトムフィルム11との間に配置されるように、物品２を覆ってボトムフィルム11に貼付される。次いで、装置をインキュベートし、耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の有無を確認するために色の変化を見る。
図3cは、本発明による物品２を用いたインキュベーション後の薄フィルム培養プレート装置10を示す。透明または少なくとも光透過性のカバーフィルム13を通して視認できるハッチングで示した領域22は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の存在を認める色の変化を表す。
本発明の物品は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌について行われる定性的および定量的試験で使用され得る。定性的試験において、青色から赤色またはピンク色への色の変化を見えるようにすることによって、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の存在が認められる。定量的な試験において、物品を使用することによって、TNase陽性（潜在的にエンテロトキシンを産生し得る）ブドウ球菌のコロニー数の計数、および標準的な計数技術を使用してそのような微生物の定量が可能となる。
従って、本発明はまた、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検出方法を提供する。方法は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品を、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に貼付する工程、および検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の有無を確認する工程を含む。
物品を検体に貼付する工程に先立って、検体は、典型的には、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる試験検体を培養培地に最初に貼付し、培養培地中の試験検体をインキュベートし、非耐熱性ヌクレアーゼの活性を不活性化させるのに十分な温度および時間で検体を加熱することによって行われる試験のために調製される。試験検体のインキュベーションは、典型的には、30〜37℃で約18〜48時間行われる。検体を加熱して行われる非耐熱性ヌクレアーゼの活性の不活性化は、少なくとも約60℃で約30分間行われる。
本発明の方法において物品を貼付する検体は、Baird-Parker寒天培養物などの寒天を基材とする培養物、または本明細書中に記載の薄フィルム培養プレート装置であり得る。方法は、さらに、検体中のエンテロトキシン産生または潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌を定量する工程を含み得る。定量化工程は、物品での色の変化を伴うコロニー数を計数する工程、および当該分野で公知の技術を使用して、その数と検体中のエンテロトキシン産生ブドウ球菌の量とを相関させる工程を含み得る。
本発明は、さらに、耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検出キットを提供する。キットは、微生物を増殖させるための広範囲な形式のいずれか、例えば、寒天および薄フィルム培養プレートなどに適合し得る。本発明のキットは、微生物を増殖させるための試薬および栄養分を、好ましくは薄フィルム培養プレート装置の形態で含み、さらに、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための本発明による物品を含む。
実施例Ｉ
pH7.3物品の調製
以下の成分を、Staphylococcus aureusを検出するための物品の調整に使用した：
0004347415.tif 000002
培地（pH7.3と呼ぶ）を以下のように調製した：すべての試薬（TBOおよびグアガムを除く）を、１リットルの脱イオン水中でともに混合した。懸濁物を一定の撹拌で混合し、沸騰するまで加熱した。TBOを混合物に添加し、撹拌を維持しながら熱を除去した。次いで、懸濁物をエアミキサー（激しいボルテックス）で混合し、グアガムを添加して均質になるまで混合した。懸濁物を40℃で一晩冷却し、次いでナイフコーターで0.18mmポリエステルフィルム上に被覆した。0.12〜0.25mmのナイフ間隙を評価した（0.05〜0.10ｇの被覆重量／24平方インチ）。フィルムを２〜10分間、200°Fで加熱乾燥した。
実施例II
pH9.0物品の調製
以下の成分からもう１つの培地を作製した：
0004347415.tif 000003
本培地（pH９と呼ぶ）は、pH7.3培地と同一に調製し、同様に被覆した。被覆重量は両培地とも同じであった。被覆したフィルムは、評価のために２インチ平方に切断した。
実施例III
TBO/DNA寒天の調製
これらの培地を、以下のように作製したTBO/DNA寒天と比較した：
0004347415.tif 000004
培地（TBO/DNA寒天と呼ぶ）を以下のように調製した：すべての試薬（TBOを除く）を、１リットルの脱イオン水中でともに混合した。懸濁物を一定の撹拌で混合し、沸騰するまで加熱した。TBOを混合物に添加し、撹拌を維持しながら熱を除去した。混合物をオートクレイブ（250°F／15気圧／15分）した。培地を46℃まで下げ、次いで15×100mmペトリ皿に小分けした（12〜15ミリリットル／プレート）。固化後、プレートを倒置し、室温で一晩インキュベートした。次いでプレートを使用するまで４℃で保持した。
実施例IV
Staphylococcus aureusの検出
以下のブドウ球菌単離物の一晩（37℃）のトリプチカーゼソイブロス（DiMed、St.Paul、MN）培養物を調製した：
American Type Collection#；凝集結果
0004347415.tif 000005
培養物をBufferfieldのリン酸緩衝液で希釈して、約50cfu/mmとした。それぞれの希釈培養物の１ミリリットル検体を３つの同一な3MTM PetrifilmTMAerobic Countプレート上にプレート化し、37℃で18〜24時間インキュベートした。フィルムを60℃で１時間プレインキュベートした。２つのプレートを別に設定し、pH９およびpH7.3確認ディスクを評価した。
付着したゲルを伴うフィルムを他方のフィルムから分離するように、寒天評価のためのPetrifilmTMプレートを分離した。これらのフィルム（ゲルを伴う）を寒天プレートの表面上に重層し、次いで評価のために37℃でインキュベートした。
PetrifilmTMプレートフィルムを分離し、次いでディスクをゲルに接触するように配置することによって確認ディスクを評価した。次いで、PetrifilmTMプレートフィルムを再密封し、次いで寒天プレートしてこれらを37℃でインキュベートした。結果は以下の通りである：
0004347415.tif 000006
0004347415.tif 000007
プレートを30分毎に読み取った。すべてのコロニーは、37℃のインキュベーションの90分以内に陽性となった。ディスクの結果（pH９またはpH7.3）間または寒天プレートの結果間に差異は認められなかった。
実施例Ｖ
Baird Parker寒天でのStaphylococcus aureusの検出
本実施例において、一晩ブロス培養物をBufferfieldのリン酸緩衝液で希釈して、約500cfu/ミリリットルとした。希釈培養物の0.1ミリリットルをBaird-Parker寒天（DiMed）上にプレート化し、次いで37℃で48時間インキュベートした。48時間後、プレートを60℃で２時間インキュベートした。TBO/DNA寒天を上記に概説したように調製した。但し、46℃まで下げ12〜15ミリリットルを敷き詰めたBPAプレートに小分けした。被覆した側が寒天に接触するように、pH9.0およびpH7.3ディスクを寒天プレートの表面に置いた。次いで、プレートを37℃でインキュベートし、次いで30分毎に読み取ったところ、以下の結果を得た：
0004347415.tif 000008
プレート上のすべてのコロニーは、37℃のインキュベーションの2時間以内に陽性となった。ディスクおよびTBO/DNA寒天間に差異は認められなかった。
実施例VI
PetrifilmTM形式を使用したStaphylococcus aureusの検出
pH7.3確認ディスクを、以下の増殖培地を用いるPetrifilmTM形式における確認として評価した：
0004347415.tif 000009
培地（PSAと呼ぶ）を以下のように調製した：すべての試薬を、１リットルの脱イオン水中でともに混合した。懸濁物をエアミキサー（激しいボルテックス）により一定の撹拌で混合し、80℃に加熱した。懸濁物を4℃で一晩冷却し、次いでナイフコーターで0.18mmポリエステルフィルム上に被覆した。約31mmのナイフ間隙を評価した（0.22〜0.25ｇの被覆重量／24平方インチ）。フィルムを２〜10分間、200°Fで加熱乾燥した。
アクリル酸を基材とする接着剤を用いて、0.05cmポリスチレンフォームをPSA被覆したフィルム上に積層した。それぞれのポリスチレンプレートのほぼ中央から直径５cmの円を取りだし、ウェルに提供した。フォームの頂部（全表面を覆っている）にプリプロピレンフィルム（0.1mm）の１片を（ヒンジテープの１片によって）付着させた。このフィルムの片側を、0.15g/Lの塩化トリフェニルテトラゾリウムを含有するアクリル酸接着剤で被覆した。この接着剤上に、約0.4ｇ／24平方インチでグアガムを粉末被覆した。
以下のブドウ球菌単離物の一晩（37℃）のトリプチカーゼソイブロス（DiMed、St.Paul、MN）培養物を調製した：
American Type Collection#；凝集結果
0004347415.tif 000010
培養物をBufferfieldのリン酸緩衝液で希釈して、約50cfu/mmとした。それぞれの希釈培養物の１ミリリットル検体を２つのPSAプレート上にプレート化し、37℃で18〜24時間インキュベートした。次いで、フィルムを60℃で１時間プレインキュベートした。２つのプレートを別に設定し、pH7.3被覆溶液（ディスク）およびTBO/DNA寒天を評価した。
付着したゲルを伴うフィルムを他方のフィルムから分離するように、寒天評価のためのPetrifilmTMプレートを分離した。これらのフィルム（ゲルを伴う）を寒天プレートの表面上に重層し、次いで評価のために37℃でインキュベートした。
Petrifilmプレートフィルムを分離し、次いでディスク（被覆側）をゲルに接触するように配置することによってpH7.3確認ディスクを評価した。次いで、PetrifilmTMプレートフィルムを再密封し、次いで寒天プレートしてこれらを37℃でインキュベートした。結果は以下の通りである：
0004347415.tif 000011
プレートを30分毎に読み取った。すべてのコロニーは、37℃のインキュベーションの90分以内に陽性となった。ディスクの結果（pH7.3）間または寒天プレートの結果間に差異は認められなかった。
他の実施例は、本発明の請求の範囲内にある。
【図１】
0004347415.tif 000012
【図２】
0004347415.tif 000013
【図３Ａ】
0004347415.tif 000014
【図３Ｂ】
0004347415.tif 000015
【図３Ｃ】
0004347415.tif 000016