(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列の１９〜２２３の配列を有し、エンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載される１〜１８のアミノ酸配列をＮ末端側に更に有してなる請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）由来である、請求項１または２に記載の酵素。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質または酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる、ＤＮＡ構成物。
【請求項５】
配列番号２に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が酵母または糸状菌である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属またはピキア（Pichia）属に属するものである、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、フザリウム（Fusarium）属またはアクレモニウム（Acremonium）属に属するものである、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、フザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）、またはアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主および/またはその培養物から請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素、タンパク質を採取する工程を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質または酵素の製造法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法で生産された、エンドグルカナーゼ酵素。
【請求項１５】
請求項１〜３及び請求項１４のいずれか一項に記載のタンパク質または酵素を含んでなる、セルラーゼ調製物。
【請求項１６】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜３および請求項１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項１７】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜３および請求項１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項１９】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２０】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜３および請求項１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２１】
セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２２】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、またはすすぎを通じて行われる、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状または安定化された液体状で含有してなる、洗剤添加物。
【請求項２４】
請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる、洗剤組成物。
【請求項２５】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行なう工程において、請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
【請求項２６】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２７】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜３および１４のいずれか一項に記載のタンパク質もしくは酵素、または請求項１５に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、エンドグルカナーゼ、エンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物、およびセルラーゼ調製物を用いるセルロース含有繊維の処理方法に関するものである。
背景技術
セルロース含有繊維に所望の特性を与えるために、セルロース含有繊維をセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触り及び外観を改善するために、あるいは着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている（ヨーロッパ特許第３０７，５６４号）。
現在、デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウオッシュ外観の付与、肌触りの改善用途には、木材不朽菌であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）やフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のセルラーゼが使用されている。これらセルラーゼは複数のセルラーゼ成分の混合物である。それらの実用化は、セルロース含有繊維に対して所望の効果を奏するには多量のセルラーゼ調製物を使用する必要から生じる困難性によって妨げられてきた。
上記のセルラーゼ調製物の短所は、多量のエンドグルカナーゼを含む調製物によって改善されつつある。例えば、エンドグルカナーゼ活性を増強したセルラーゼ調製物は、国際公開第ＷＯ８９／０９２５９号、国際公開第ＷＯ９１／１７２４３号、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号、及び国際公開第ＷＯ９４／２１８０１号で公表されている。特に、国際公開第ＷＯ９１／１７２４３号には、フミコーラ由来の精製された４３ｋＤエンドグルカナーゼ成分（ＥＧＶ）が、従来公知の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物の約１００倍ものジーンズ脱色活性を有することが開示されている。また、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号には、フミコーラ由来のエンドグルカナーゼ成分であるＮＣＥ４が、従来公知の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物の２５倍のジーンズ脱色活性、１００倍ものリヨセル毛羽除去活性を有することが開示されている。
デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウオッシュ外観の付与、肌触りの改善のために上記セルラーゼによる処理がおこなわれていたが、その場合、処理工程中で衣料にインジゴ染料の一部が再付着または逆染色、すなわち白場汚染してしまう等の問題が発生している。
汚染の度合いを低める試みには、セルラーゼ処理液中に界面活性剤等の試薬を添加し、インジゴ染料を分散させる方法がある。しかしながら、この方法は追加の化学品の経費を生じ、廃液の環境負荷を増大させるという問題がある。
したがって、デニム染めセルロース含有繊維への処理において、高活性でありながら白場汚染の度合いが低いセルラーゼが所望されていた。
発明の開示
本発明者らは、今般、糸状菌であるフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）より、セルロース繊維を崩壊する高い活性を有する新規のエンドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５及びその遺伝子を単離し、また、この酵素の分子量が約２５ｋＤａと小さく、かつ、セルロース結合部位（ＣＢＤ）が構造中に存在しないというフミコーラ由来のセルロース繊維を分解する酵素としては例がない構造を有していることを示した。
また、酵素ＮＣＥ５をフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を宿主として発現させて得た調製物を用いたデニム染めセルロース含有繊維への処理において、活性はＮＣＥ４と同等の高い活性を有する一方で、驚くべきことに白場汚染の程度がＮＣＥ４と比較して低いことを示した。
したがって、本発明は、デニム染めセルロース含有繊維への処理において、白場汚染の度合いが低いセルラーゼ及びその遺伝子の提供をその目的とする。
また、本発明は、良好な特性を有するセルラーゼ調製物の提供をその目的としている。
更に、本発明は、上記酵素を用いたセルロース含有繊維の効率的で安価な処理法の提供をその目的としている。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２０００−１５０４６３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
セルラーゼ
本発明によるエンドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５は、デニム染めセルロース含有繊維への処理において、白場汚染の程度がＮＣＥ４と比較して低いという有利な性質を有する。よって、本発明による酵素によれば、デニム染めセルロース含有繊維への処理における、界面活性剤等の化学品の添加量を低減し、その結果、コストの低減化を実用化し、環境への負荷への低減を達成しうる。
本酵素はＳ．ＴａｋａｓｈｉｍａらによるＨ．ｇｒｉｓｅａのｅｇｌ４の配列（Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．／Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６７（１９９９）８５−９７）と相同性を示す、新規なタンパク質である。本酵素は分子量が約２５ｋＤａと小さく、かつ、セルロース結合部位（ＣＢＤ）が構造中に存在しないという特徴を有する。天然においては、糸状菌フミコーラから単離され、セルロース繊維を崩壊する高い活性を有している酵素は全てセルロース結合部位（ＣＢＤ）を有していた（例えば、国際公開第ＷＯ９１／１７２４３号には、フミコーラ由来の精製された４３ｋＤエンドグルカナーゼ成分（ＥＧＶ）、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号には、フミコーラ由来のエンドグルカナーゼ成分（ＮＣＥ４））。しかしながら、天然においては、フミコーラ由来でＣＢＤが存在せずにセルロースを崩壊する高い活性を有する酵素は今までに知られていなかった。
フミコーラ由来以外の酵素で、ＣＢＤが存在しないエンドグルカナーゼとして特表平８−５０７６９５には、トリコデルマ・ロンジブラシアトゥム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｉｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）からＥＧＩＩＩが単離され、ＣＭＣａｓｅ活性（レマゾール・ブリリアント・ブルー・カルボキシメチルセルロースアッセイ）の至適ｐＨが５．５〜６．０であり、従来知られていたトリコデルマ由来のセルラーゼと比較して中性からアルカリ領域でも高い活性を有していることが開示されている。一方、本発明における酵素のＣＭＣａｓｅの至適ｐＨは５．０から９．０であり、ＥＧＩＩＩと比較して更にアルカリ領域で高い活性を有していることを示した。
本酵素は、配列番号１に記載される配列の一部または、１９〜２２３位の配列を有するタンパク質である。本発明にあって、配列番号１に記載される配列の一部とは、例えばプローブとして利用可能な程度の長さ、さらには、その一部の配列であっても依然としてセルラーゼ活性、とりわけエンドグルカナーゼ活性を維持するその部分配列を意味するものとする。
また、本発明には、上記タンパク質のＮ末端に、更に配列番号１の１〜１８位のアミノ酸配列の一部または、全部を有するタンパク質も包含される。ここで、配列番号１の１〜１８位のアミノ酸配列は、シグナルペプチドと考えられることから、その一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に本発明には、前記タンパク質の改変タンパク質が含まれる。本発明において、改変タンパク質とは、上記のタンパク質のアミノ酸配列において、１以上、好ましくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失、または置換などの改変が生じたタンパク質であって、依然としてセルラーゼ活性、とりわけエンドグルカナーゼ活性を保持するものを意味する。
本発明による酵素は、糸状菌類、具体的には、フミコーラ属（例えば、フミコーラ・インソレンス）の微生物から得ることができる。
本発明によれば、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、よって、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
本発明によるヌクレオチド配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでもよい。本発明によるヌクレオチド配列の典型的な取得方法としては、フミコーラ・インソレンスのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
本発明による、エンドグルカナーゼＮＣＥ５のアミノ酸配列をコードする、典型的配列は、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号２に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、６７０〜６７２のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、５５から５７のヌクレオチド配列は２０５残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
エンドグルカナーゼ活性
エンドグルカナーゼ活性は、一般的にカルボキシメチルセルロースを加水分解する活性である「ＣＭＣアーゼ活性」を意味する。「ＣＭＣアーゼ活性」は、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。また、被験タンパク質を加えたＣＭＣ溶液の粘度変化を指標とした方法によっても「ＣＭＣアーゼ活性」を測定することができる。
本発明では、Ｎｅｅｎａ  Ｄｉｎらの方法（Ｎｅｅｎａ  Ｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９９１）１０９６−１０９９）に従い、脱脂綿からのフィブリルの遊離を指標としてエンドグルカナーゼ活性を測定する。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中に被験タンパク質とステンレスビーズと脱脂綿を加え、洗濯堅牢度試験機（Ｌ−１２、大栄科学精器製作所社製）にて５５℃、１２０分間反応させた後、脱脂綿から遊離されるフィブリルの量を６００ｎｍの吸光度にて測定する。
発現ベクター及び形質転換された微生物
本発明においては、前記の本発明による配列番号１に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質をコードする塩基配列（以下、単に「本発明によるＤＮＡ配列」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるＤＮＡ配列の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター及びターミネーター及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡ配列によってコードされるエンドグルカナーゼ酵素を発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
本発明における宿主糸状菌は、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものであることができる。さらにそれらの好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）若しくはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられる。
微生物の寄託
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７（原寄託：ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３６、原寄託日：１９９６年７月１５日）の受託番号のもと、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。本発明によるセルラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍ（実施例４参照）で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、平成１２年４月１８日ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
プラスミドｐＥＧＤ０１を導入した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ／ｐＥＧＤ０１）はＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７３（原寄託：ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７２９、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
セルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明の別の態様によれば、上記の本発明によるエンドグルカナーゼ酵素、その改変ペプチドを含んでなるセルラーゼ調製物が提供される。本発明によるセルラーゼ調製物は、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素、その改変ペプチドに、他のセルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ及び本発明以外のエンドグルカナーゼを含めてもよく、更にセルラーゼ調製物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等とともに混合され製造されてもよい。また、本発明におけるセルラーゼ調製物はいずれか適当な形状、例えば粉末または液体状に調製することができる。
更に本発明によれば、着色セルロース含有繊維の澄明化をもたらす方法であって、エンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物で着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる方法、並びに、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす方法、すなわち、着色セルロース含有繊維にストーンウオッシュの外観を与える方法が提供される。そして、この方法は、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物により着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
本発明による上記方法は、洗濯中にセルロース含有繊維を処理することにより実施できる。しかしながら、繊維の処理は、場合によって、ソーキングまたはすすぎ中に、繊維が浸漬されているかまたは浸漬されうる水に、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物を添加することによって実施されてもよい。
更に本発明によれば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか、毛羽立ちを低減するか、肌触りが悪くなる速度を低減するか、またはごわ付きを低減する方法が提供される。この方法は、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素、またはセルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
接触温度、エンドグルカナーゼ酵素の量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的とした減量加工の場合、５０〜６０℃程度の温度で、１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼを使用することにより処理することができる。更に、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす場合、５０〜６０℃程度の温度で、２〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼを使用することにより処理することができる。
また、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するかまたは毛羽立ちを低減する場合、５０〜６０℃程度の温度で、０．０５〜１０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼ酵素を使用することにより処理することができる。
また、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物を洗剤組成物中で用いることにより、粒質土壌除去、色彩澄明化、脱毛羽立ち、脱ピリング及び手粗さ軽減に関し、それらを改善することができる。本発明が定義する洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性または双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。
更に、本発明の洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェート（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、スクロース、及びグルコースの脂肪酸エステル、並びにポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
本発明によるエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物は古紙に作用させることにより、脱インキが可能であることが見出された。これより、古紙から再生紙をつくる過程において本発明によるエンドグルカナーゼ酵素による処理で有意に改善できる。本発明に用いられる古紙は、一般に言われる古紙は全て用いることができ、例えば機械パルプ、化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の印刷古紙が含まれる。
また、本発明に言う脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品をいい、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３などのアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、それにアニオン系、ノニオン系の界面活性剤、オレイン酸等の補集材、助剤としてｐＨ安定剤、キレート剤、分散剤等が挙げられる。
また、本発明によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素による処理で有意に改善できるものと考えられる。したがって、本発明によれば、パルプのろ水性の改善方法であって、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含んでなる方法が提供される。本発明で処理できるパルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプまたは加工熱処理及び他の高収率パルプが挙げられる。
更に、本発明によるエンドグルカナーゼを動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。したがって、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含んでなる方法が提供される。
実施例
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  フミコーラ・インソレンスからの脱脂綿フィブリル遊離活性を有する成分の単離精製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）を、（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）に植菌し、３７℃で振とう培養した。７日間培養の後、得られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより菌体を除き、培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この、粗精製セルラーゼ調製液２００ｍｌを、最終濃度１Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調整した後、あらかじめ１Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させた、Ｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥカラム（ゲル体積１５０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に流速２０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、硫酸アンモニウム濃度を１．０Ｍから０Ｍに直線勾配溶出法により流速２０ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、硫酸アンモニウム濃度が０．３Ｍのときに得られた画分の一部に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。そこで、この画分２００ｍｌを分取した。これを２回実施した。
ここで、得られた活性画分４００ｍｌを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で硫酸アンモニウム１．５Ｍとなるように調整した後、あらかじめ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、硫酸アンモニウム濃度１．５Ｍ溶液で平衡化させた、Ｓｏｕｒｃｅ  ＩＳＯカラム（ゲル体積１２５ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に流速２０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍ溶液から超純水に対して、直線勾配溶出法により流速２０ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、硫酸アンモニウム濃度が１．０５Ｍのときに得られた画分の一部に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。そこで、この画分２００ｍｌを分取した。
更に、得られた活性画分２００ｍｌに対して硫酸アンモニウムを６５％飽和となるように加え、４℃で６０分間攪拌した後、１５０００ｒｐｍで遠心し、沈澱を回収した。この沈澱を２０ｍｌの蒸留水に溶解し、ウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社）を用いて、脱塩を行い、４０ｍｌの溶液を回収した。
ここで、更に、得られた活性画分のうち３０ｍｌ分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように調整した後、あらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させた、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ゲル体積１６ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に流速５ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１Ｍ  ＮａＣｌに対して、直線勾配溶出法により流速４ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、ＮａＣｌ濃度が約０．１２Ｍのときに得られた画分の一部に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。そこで、この画分１２ｍｌを分取した。
更に、得られた活性画分のうち６ｍｌ分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように調整した後、あらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させた、ＭｏｎｏＳ  ５／５ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１Ｍ  ＮａＣｌに対して、直線勾配溶出法により流速１ｍＬ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、ＮａＣｌ濃度が約０．１Ｍのときに得られた画分の一部に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。そこで、この画分１〜３ｍｌを分取した。この画分をＮＣＥ５として単離した。このＮＣＥ５はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤの単一なバンドを示した。ここまでのＮＣＥ５の精製の工程を５０回繰り返し、精製サンプルを大量に得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはテフコ社のシステムを用いて実施した。すなわち、電気泳動槽（Ｎｏ．０３−１０１）、電源（Ｍｏｄｅｌ：３５４０）、ゲル１０％（０１−０７５）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーキット（０６−０３０１）を用いた。泳動条件は、１８ｍＡ／１０分、次いで２０ｍＡ／９０分であった。泳動後のタンパク質の検出には、電気泳動用２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩ「第一」（第一化学薬品社製）を用いて銀染色を行った。マーカーとしての標準タンパク質は、バイオ・ラッド社のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量標準タンパク質・Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ（１６１−０３０４）を用いた。
脱脂綿フィブリル遊離活性はＮｅｅｎａ  Ｄｉｎらによる方法（Ｎｅｅｎａ  Ｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９９１）１０９６−１０９９）を改良した方法で行なった。すなわち、洗濯堅牢度試験機を用いて以下の条件で反応させた場合の脱脂綿から遊離される毛羽の量を６００ｎｍ吸光度にて測定した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度    ：５５℃
時間    ：１２０分
反応ｐＨ  ：ｐＨ７（５０ｍＭ燐酸緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにステンレスビーズと脱脂綿を適当量加えた。
〔実施例２〕  セルラーゼＮＣＥ５の部分アミノ酸配列
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の同定
実施例１において精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定するため、ＮＣＥ５画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（テフコ社製）を行った後、ＰＶＤＦ膜へエレクトロブロッティングし、クマジーブリリアントブルーＲ２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、脱色し、水で洗浄し、風乾した。ここから分子量２５ｋＤａのタンパク質がブロットされた部分を切り出し、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列の解析を試みたが、エドマン分解によるシグナルは得られず、Ｎ末端のアミノ酸が修飾保護されていることが判明した。そこで、０．５％ポリビニルピロリドン（分子量４０，０００、Ｓｉｇｍａ社製）／１００ｍＭ酢酸溶液に３７℃、３０分浸漬し、膜上のタンパク質未結合部分をブロックした後、Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（宝酒造株式会社製）で５０℃、５時間処理することにより修飾Ｎ末端残基を除去し、あらためてシークエンシングを行った。得られた配列は以下の通りであった。
ＮＣＥ５のＮ末端アミノ酸配列
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（２）ペプチドマッピング
実施例１において精製されたタンパク質のインターナルアミノ酸配列を決定するため、還元アルキル化した後、ペプチドマッピングを行った。
つまり、チューブにて３００μｇの精製されたタンパク質を５００μＬの還元アルキル化用緩衝液（０．５Ｍトリス、７Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ２）に溶解した後、ＤＴＴ１ｍｇを加えた。チューブ中の空気を窒素で置換し、室温で５時間保持し、タンパク質の還元を行った。還元反応の後、モノヨード酢酸２．５ｍｇを加え、遮光中、室温で３０分間、アルキル化反応を行った。反応終了後、脱塩のために蒸留水に対して透析を行い、凍結乾燥後、得られた粉末を還元アルキル化ＮＣＥ５とした。
この粉末を０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。タンパク質に対し約１／５０モル量のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、３７℃、一晩反応させた。同分解産物をＭｏｄｅｌ  １７２μプレパラティブＨＰＬＣシステム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてカラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃ１８  ２２０×２．１ｍｍ、０．１％ＴＦＡ、５％アセトニトリル〜０．０８５％ＴＦＡ、３５％アセトニトリルグラジェント）を行い、５種のペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により決定した。その結果は以下の通りであった。
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これらＮ末端アミノ酸配列及びペプチドマッピングによって得られたアミノ酸配列のうち４個のペプチドは、Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａらによるフミコーラ・グリセアのｅｇｌ４の配列（Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．／Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６７（１９９９）８５−９７）と同一であった。しかし、Ｔ−４３．０においては同一配列は認められなかった。よって相同性を示す配列はあるものの、同一ではなく、新規なタンパク質であることが示唆された。
〔実施例３〕  セルラーゼＮＣＥ５のｃＤＮＡのクローニング
（１）  ｃＤＮＡの単離とライブラリーの作成
セルラーゼ成分ＮＣＥ５遺伝子のスクリーニングには、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１からｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成しライブラリーを作製した。
▲１▼  全ＲＮＡの調製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を実施例１に記載した（Ｎ）培地で２日間培養し、菌体を遠心分離（３５００ｒｐｍ，１０分）により回収した。そのうち３ｇの菌体を滅菌水で洗浄し、液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で磨砕した。この磨砕した菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）により、添付のマニュアルに従い全ＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動法により染色像として全ＲＮＡを確認した。
▲２▼  ポリＡテイル＋ＲＮＡ（＝ｍＲＮＡ）の調製
▲１▼で調製した全ＲＮＡのうち１ｍｇから、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、添付のマニュアルに従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにアプライしｍＲＮＡを溶出単離した。更に、ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動法によりスメアーな染色像としてｍＲＮＡを確認した。
▲３▼  ｃＤＮＡの合成
▲２▼で調製したｍＲＮＡの５μｇから、Ｔｉｍｅ  Ｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、添付のマニュアルに従い、ｃＤＮＡ合成を行った。
▲４▼  ｃＤＮＡライブラリーの作製
合成した全ｃＤＮＡの平滑末端に前述のＴｉｍｅ  Ｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔに含まれているＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを、添付マニュアルに従い連結した。このＤＮＡ断片の全量を、ファージベクター、λＺＡＰＩＩクローニングキット（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩアームにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用い連結させ、エタノール沈澱後、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。このようにして得られた組換えファージベクターを、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社製）により添付のマニュアルにしたがってｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させ、ファージライブラリーとした。これを用いて目的遺伝子をクローニングした。
（２）  ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅と解析
（１）−▲３▼で作製したｃＤＮＡを鋳型にし、実施例２の部分アミノ酸配列の情報をもとにＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。
各プライマーは、Ｎ末及びペプチドＴ−４３．０の＊で示したアミノ酸配列に対応する、以下のような合成オリゴヌクレオチドを作製した。
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ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１μｇのｃＤＮＡを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）と添付の緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、及び１μＭの各プライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃１分間、（９４．０℃３０秒間、５５．０℃３０秒間、７２．０℃１分間）Ｘ２５回、７２．０℃５分間。
この反応により約５００ｂｐのＤＮＡが増幅され、これをＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｅｍｉｘ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈｅｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付のプロトコールに従いシーケンスを行った。その結果、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列には、実施例２で得られた部分アミノ酸配列を全て含んでいた。よって、以降のスクリーニングのプローブとして用いた。
（３）  セルラーゼ成分ＮＣＥ５遺伝子のクローニング
▲１▼  プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ＰＣＲ法により増幅させた５００ｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇを、あらかじめＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により、標識化した。
（１）−▲４▼で作製したファージプラークは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロントランスファーメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に写し取り、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでアルカリ処理し、メンブラン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変成後、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、風乾させＤＮＡを固定した。その後、キットのマニュアルにしたがって、ハイブリダイゼーションを行い、検出反応をし、ＦＵＪＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  Ｘ−ＲＡＹ  ＦＩＬＭ（富士写真フィルム社製）に感光させ、６個の陽性クローンを得た。
▲２▼  ファージＤＮＡの調製
陽性クローンからのＤＮＡの調製は、キットの添付マニュアルに従い、プラスミドＤＮＡとして調製した。
アンピシリンに耐性を示す大腸菌ＳＯＬＲＴＭから、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）にＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドを調製し、これをテンペレートに（２）で使用したＮ末端とＴ−４３．０のプライマーを用い、前述と同様の条件下でＰＣＲを行った。その結果、１個のプラスミドにおいて５００ｂｐの増幅産物を得られた。よって、このプラスミドに目的とするＤＮＡがクローン化されていることが予測されたので、これをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、約１ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を含んでいた。
（４）  ｃＤＮＡ塩基配列の決定
（３）の▲２▼において得られた陽性組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミドに挿入された約１ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片の塩基配列は、Ｔ３、Ｔ７シーケンス用プライマーを使用し、前述と同様の方法で決定した。結果、この塩基配列は６７２ｂｐのＯＲＦを含んでおり、その塩基配列、及びＯＲＦから推定されるアミノ酸配列はそれぞれ、配列表の配列番号２、及び配列番号１に示した。
また、この予測されるタンパク質のＮ末端から１８アミノ酸以降の配列は、実施例２の（１）において決定した２５ｋＤａのタンパク質のＮ末端配列に一致し、故に本遺伝子は２５ｋＤａのタンパク質をコードしていることが明らかとなった。
更にこのＯＲＦの１〜１８アミノ酸の配列については、本タンパク質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列であると考えられた。
〔実施例４〕  ＮＣＥ５遺伝子のフミコーラ・インソレンスでの発現
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１における発現ベクターは、国際公開第ＷＯ  ００／２４８７９号に記載の方法にしたがって得られたプラスミドｐＪＤ０１を利用し以下のように構築した。
（１）  ＮＣＥ５発現プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５の構築
▲１▼  ＮＣＥ５遺伝子への部位特異的変異導入
ＮＣＥ５遺伝子は、プラスミドｐＪＤ０１のＢａｍＨＩ部位に連結できるように、開始コドンのすぐ上流の配列と終止コドンのすぐ下流にあらかじめＢａｍＨＩを含む形でプライマーを設計し、ＰＣＲ法にて増幅した。変異導入用プライマーは以下のようにデザインした。
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ＰＣＲの反応は、実施例３で得られた陽性組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミドをテンペレートに前述と同様の条件下で行った結果、１．０％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅産物を確認したので、Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  Ｓ−４００  ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にて未反応物を除去しエタノール沈澱後、ＢａｍＨＩにて消化した。次に、全量を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、６７０ｂｐのＤＮＡ断片をＳｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて添付のマニュアルに従い回収し、そのＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、図１に示されるプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍを得た。更に、この挿入断片について前述の方法にて塩基配列を決定し、確認した。
▲２▼  プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５の作製
国際公開第第ＷＯ  ００／２４８７９号記載のプラスミドｐＪＤ０１をＢａｍＨＩにて消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、約８．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を前述のＳｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ  Ｋｉｔにて回収し、これを大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社製）を用い添付のマニュアルに従い脱リン酸化した。また、▲１▼で得られたプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍにおいても同様にＢａｍＨＩにて消化し、６７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収しそれぞれをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２にて連結し、図２に示される発現プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５を得た。
（２）  プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）培地の組成は、実施例１に記載した（Ｎ）培地にグルコース（３．０％）を加え、アビセルを除いたものである。得られた菌体を０．５Ｍシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍｌ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ、０．５Ｍシュークロース）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μｌ）を加え氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
以上の処理を加えたプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）添加ＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃、５日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
〔実施例５〕  ｐＪＮＤ−ｃ５の形質転換体の培養及び同定
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
前述のようにプラスミドｐＪＮＤ−ｃ５をフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１に導入し、ハイグロマイシン耐性を示す株を４０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養し，得られた培養上澄を１２％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（テフコ社製）電気泳動により解析したところ、１２クローンにおいてＮＣＥ５と推定される２５ｋＤａタンパク質が、特に増強されていた。
（２）組換えＮＣＥ５のＮ末端アミノ酸残基の同定
（１）で大量発現したタンパク質がＮＣＥ５遺伝子由来であることを確認するために、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。まず、培養上澄について１２％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ電気泳動にて分離し、実施例２の方法にしたがってＰＶＤＦ膜にタンパク質を電気的に写し取り、分子量２５ｋＤａのタンパク質について、修飾Ｎ末端残基を除去し、プロテインシーケンサーに供した。その結果、プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ５のＮ末端アミノ酸配列と一致した。
〔実施例６〕  フミコーラ・インソレンスで発現させたＮＣＥ５によるデニム染めセルロース含有繊維の脱色活性評価
実施例５で得られたＮＣＥ５遺伝子を発現させたフミコーラ・インソレンス培養液、ＮＣＥ４遺伝子を発現させたフミコーラ・インソレンス培養液及びフミコーラ・インソレンス培養液を用いて、糊抜きした１２オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理をした。ＮＣＥ４遺伝子を発現させたフミコーラ・インソレンス培養液は、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号の記載に従ってフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１に発現プラスミドｐＥＧＤ０１を導入することによって得られた形質転換体を、（Ｎ）培地にて３７℃で５日間振とう培養して得られたものを用いた。フミコーラ・インソレンス培養液は、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を（Ｎ）培地にて３７℃で５日間振とう培養して得られたものを用いた。
試験機械：２０ｋｇワッシャー（三洋電機株式会社製全自動洗濯機
ＳＣＷ５１０１）
温度    ：６５℃
時間    ：６０分
ｐＨ    ：６．２（６．７ｍＭリン酸緩衝液）
処理液には、セルラーゼ調製液とともにゴムボールを適当量加えた。
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製ＣＭ−５２５ｉ）を用い、Ｌａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。コントロール（未処理繊維）に対するＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき１０点のΔＬ値を測定し（ｎ＝１０）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ値＝約６となるのに必要なエンドグルカナーゼのタンパク濃度を算出した。
タンパク濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンで標準曲線を作製し定量した。
その結果は、次の第１表に記載の通りであった。
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〔実施例７〕  フミコーラ・インソレンスで発現させたＮＣＥ５によるデニム染めセルロース含有繊維の脱色時の白場汚染評価
実施例５で得られたＮＣＥ５遺伝子を発現させたフミコーラ・インソレンス培養液、ＮＣＥ４遺伝子を発現させたフミコーラ・インソレンス培養液について、種々の温度でデニム染めセルロース含有繊維の脱色を行った。添加酵素濃度は、６５℃で、ΔＬ＝約６となるのに必要な量とした。
白場汚染の評価は、デニム染めセルロース含有繊維に縫い付けた白色木綿布の試験後の白色度を分光測色計（ミノルタ社製ＣＭ−５２５ｉ）を用い、Ｌａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。Ｌ値が大きいほど白色布が白く、白場汚染の程度が低いことが示される。
その結果は、下記の第２表に示される通りであった。いずれの反応温度においても、ＮＣＥ５はＮＣＥ４と比較して、脱色の程度が大きいのに対して、白場汚染の程度は低く、ＮＣＥ５が白場汚染の程度が低いことは、この結果より明らかである。
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〔実施例８〕  洗濯堅牢度試験機によるフミコーラ・インソレンスで発現させたＮＣＥ５の再生セルロース系繊維に対する毛羽除去作用の評価
実施例５で得られたフミコーラ・インソレンスで発現させたＮＣＥ５の、再生セルロース系繊維の代表例であるリヨセルの毛羽除去活性を以下のように評価した。
あらかじめ染色されたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製）を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製１０ｃｍ×１０ｃｍ）を下記の条件でリヨセルの毛羽除去処理を行なうことにより、形成された毛羽が完全に除去されるのに要するフミコーラ・インソレンスで発現させたＮＣＥ５のタンパク濃度を算出した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度    ：５５℃
時間    ：６０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ  ：ｐＨ５（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
その結果は、６ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の添加量で毛羽が完全に除去されることが明らかとなった。
〔実施例９〕  洗剤として配合した場合のフミコーラ・インソレンスによって発現されたＮＣＥ５の綿毛羽除去作用の評価
実施例５で得られたフミコーラ・インソレンスによって発現されたＮＣＥ５の、綿の毛羽除去活性を以下のように評価した。すなわち、実施例５で調製したフミコーラ・インソレンスによって発現させたＮＣＥ５の培養上清液を用いて、界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（２ｃｍ×１５ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行なった。形成された毛羽が完全に除去されるのに要するタンパク質量を求めた。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度    ：４０℃
時間    ：１２０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ９．３（５ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液）
（ノニオン性界面活性剤）
パーソフトＮＫ−１００（日本油脂（株）社製）０．２０ｇ／Ｌ
（アニオン性界面活性剤）
ＬＡＳ（和光純薬（株）社製）０．１０ｇ／Ｌ
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
その結果は、４５ｍｇ／Ｌのタンパク濃度で毛羽が完全に除去され、着色布の澄明化が可能となった。
また、ＪＩＳ  Ｌ１０９６号にある４５°カンチレバー法に従い、綿ニットの剛軟性を測定した。その結果、酵素を添加せず処理したものは綿ニット試験片が移動した長さが１２７ｍｍであったのに対して、ＮＣＥ５を１５ｍｇ／Ｌ（タンパク濃度）添加して処理したものは綿ニット試験片が移動した長さが８１ｍｍと明らかに柔軟化していることが認められた。
〔実施例１０〕  フミコーラ・インソレンスによって発現されたＮＣＥ５の紙パルプのろ水性改善評価
乾燥重量６ｇの広葉樹由来の未漂白クラフトパルプにＮＣＥ５を発現させたフミコーラ・インソレンス培養液をタンパク質量で６０μｇ加え、２７０ｍｌの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で、５０℃、１時間反応した。１０分間煮沸して、酵素を失活させた後、ＪＩＳ  Ｐ−８１２１にしたがって、ろ水度（ＣＳＦ）を測定した。
その結果は第３表に示される通りであった。
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明のエンドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５は、洗剤組成物に使用される他、古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善、並びにセルロース含有繊維の毛羽立ちの低減、肌触りおよび外観の改善、色の澄明化、色の局所的変化、ごわつきの低減等に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍの構成を表す。
図２は、プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５の構成を表す。
【図１】
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【図２】
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