(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記要素：
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１２１〜２７１５の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド１２１〜１０８６の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド２１４〜１０８６の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号：９のヌクレオチド９３〜２６９３の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｅ）配列番号：９のヌクレオチド９３〜１０５２の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｆ）配列番号：９のヌクレオチド１７４〜１０５２の塩基配列を含むＤＮＡ；および
（ｇ）緊縮条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の塩基配列の相補鎖にハイブリダイゼーションすることができるＤＮＡであって、ＩＬ−１７受容体をコードするＤＮＡ；
から成る群から選択される単離ＤＮＡ。
【請求項２】
下記要素：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸１〜８６５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸１〜３２２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸３２〜３２２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号：１０のアミノ酸１〜８６７のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号：１０のアミノ酸１〜３２０のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号：１０のアミノ酸２８〜３２０のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつＩＬ−１７受容体をコードするＤＮＡ；
から成る群から選択される単離ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
可溶性ＩＬ−１７Ｒを発現する、請求項３記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項３または４記載の発現ベクターによって形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６】
原核生物又は真核生物の細胞である、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
真核生物の宿主細胞が、哺乳動物の細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
哺乳動物の宿主細胞が、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞である、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
発現を促進する条件下で、請求項５ないし８記載の宿主細胞を培養し、ＩＬ−１７Ｒまたは可溶性ＩＬ−１７Ｒを回収することを含む、ＩＬ−１７Ｒタンパク質または可溶性ＩＬ−１７Ｒタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
下記要素：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸１〜８６５のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸１〜３２２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸３２〜３２２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号：１０のアミノ酸１〜８６７のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号：１０のアミノ酸１〜３２０のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号：１０のアミノ酸２８〜３２０のアミノ酸配列を含むタンパク質；および
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつＩＬ−１７受容体であるタンパク質；
から成る群から選択される単離されたタンパク質。
【請求項１１】
下記要素：
（ａ）配列番号：１０のアミノ酸２８〜３２０のアミノ酸配列を含むタンパク質；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつＩＬ−１７受容体であるタンパク質；
から成る群から選択される単離されたタンパク質。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
移植レシピエントにおける移植された器官又は移植された組織の拒絶反応を抑制するための、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
移植レシピエントにおける移植された器官又は移植された組織の拒絶反応を抑制するための医薬組成物であって、請求項３または４記載の発現ベクターを含む、前記医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１０または１１記載のタンパク質と免疫反応性である抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は一般にサイトカイン受容体の分野に関し、さらに詳しくは、免疫調節活性を有するサイトカイン受容体タンパク質に関する。
発明の背景
サイトカインは免疫又は炎症性反応の種々な状況を調節するホルモン様分子である。サイトカインは細胞上に存在する受容体と特異的に結合し、細胞へのシグナルを変換することによって、それらの効果を発揮する。Ｒｏｕｖｉｅｒ等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４４５；１９９３）は、かれらがＣＴＬＡ−８と名付けた新規なｃＤＮＡを報告している。推定（putative）ＣＴＬＡ−８は、ＨＶＳ１３と呼ばれるＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＳＶ）中に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の予測アミノ酸配列に対して５７％相同性である（Ｎｉｃｈｏｌａｓ等，Ｖｉｒｏｌ．１７９：１８９，１９９０；Ａｌｂｒｅｃｈｔ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５０４７；１９９２）。しかし、ＣＴＬＡ−８又はＨＶＳ１３のいずれにしろ、機能は知られておらず、ＣＴＬＡ−８又はＨＶＳ１３の受容体も結合タンパク質も知られていない。したがって、本発明の前には、当該技術分野において、ＣＴＬＡ−８及びＨＶＳ１３の機能を知り、これらのタンパク質の機能にある役割を果たす受容体分子又は結合タンパク質を同定する必要性があった。
発明の概要
本発明はＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）と、ＩＬ−１７のウイルス相同体であるＨＶＳ１３とに結合する新規な受容体を同定し；新規な受容体をコードするＤＮＡと新規な受容体タンパク質とを提供する。受容体はＩ型膜貫通タンパク質であり；マウス受容体は８６４アミノ酸残基を有し、ヒト受容体は８６６アミノ酸残基を有する。この受容体の可溶性形を製造して、治療セッティングにおける免疫応答を調節するために用いることができる；したがって、この新規な受容体の可溶性形を含む薬剤組成物をも提供する。この新規な受容体を含む、欠失形及び融合タンパク質、並びにこれらの相同体をも開示する。免疫応答を調節する方法及び移植された器官又は組織の拒絶を抑制する方法をも提供する。本発明のこれらの態様及び他の態様は本発明の以下の詳細な説明を参照するならば明らかになると思われる。
発明の詳細な説明
可溶性ＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）と、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＳＶ１３）中に存在するＯＲＦとを、免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質として発現させ、ＩＬ−１７受容体の発現に関して細胞をスクリーニングするために用いた。Ｔ細胞胸腺腫ＥＬ４細胞はＨＶＳ１３／Ｆｃ並びにマウスＣＴＬＡ８（ＩＬ−１７）／Ｆｃ融合タンパク質と結合することが判明した。ＥＬ４細胞からのｃＤＮＡライブラリーを製造し、受容体の発現に関してスクリーニングした。この受容体は８６４アミノ酸残基を有するＩ型膜貫通タンパク質であり、これはＩＬ−１７Ｒ（ＣＴＬＡ−８Ｒ）と名付ける。ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃタンパク質、シグナルペプチドとＩＬ−１７Ｒの細胞外領域とを含有する可溶性ＩＬ−１７Ｒ、並びに可溶性ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｒａｇ（登録商標）構築体を包含する、種々な形のＩＬ−１７Ｒを製造した。ヒトＩＬ−１７Ｒを種間（cross-species）ハイブリダイゼーションによってヒト末梢血リンパ球ライブラリーから単離した、これはネズミＩＬ−１７Ｒへの類似性を有する。オリゴヌクレオチドプローブとプライマーをも開示する。
ＩＬ−１７、ＨＶＳ１３及び相同タンパク質
ＣＴＬＡ−８は活性化Ｔ細胞ハイブリドーマクローンから単離したｃＤＮＡを意味する（Ｒｏｕｖｉｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４４５；１９９３）。ノーザンブロット分析は、ＣＴＬＡ−８転写が非常に組織特異性であることを実証した。ＣＴＬＡ−８遺伝子は、マウスにおける染色体部位１ａと、ヒトにおける２ｑ３１とに位置することが判明した。ＣＴＬＡ−８遺伝子によってコードされるタンパク質はＲｏｕｖｉｅｒ等によって同定されなかったが、ＣＴＬＡ−８の予測アミノ酸配列はＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  Ｓａｉｍｉｒｉ，ＨＳＶ１３中に存在するＯＲＦの予測アミノ酸配列に５７％相同性であることが判明している。ＣＴＬＡ−８タンパク質は本明細書ではインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）と呼ばれる。
ＨＶＳゲノムの完全なヌクレオチド配列は報告されている（Ａｌｂｒｅｃｈｔ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５０４７；１９９２）。ＨＶＳオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の１種、ＨＶＳ１３に関する付加的研究がＮｉｃｈｏｌａｓ等，Ｖｉｒｏｌ．１７９：１８９；１９９０に述べられている。ＨＶＳ１３はＨＶＳのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｇフラグメント中に存在する後期遺伝子である。ＨＶＳ１３に由来するペプチドに対して産生された抗血清は後期タンパク質と反応すると考えられる（Ｎｉｃｈｏｌａｓ等，上記文献）。
１９９５年３月２３日に出願されたＵＳＳＮ０８／４６２，３５３、ＵＳＳＮ０８／４１０，５３６の一部継続出願（ＣＩＰ）に述べられているように、全長ネズミＣＴＬＡ−８タンパク質とＣＴＬＡ−８／Ｆｃ融合タンパク質とが発現され、試験され、Ｔ細胞の増殖の同時刺激物質（costimulus）として作用することが発見されている。ヒトＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）は、ヒトＴ細胞ライブラリーを縮重（degenerate）ＰＣＲから誘導されたＤＮＡフラグメントを用いてプローブ探査することによって同定された；ＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）の相同体は他の種にも存在すると期待される。全長ＨＶＳ１３タンパク質並びにＨＶＳ１３／Ｆｃ融合タンパク質も発現され、ＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）タンパク質と同様な方法で作用することが発見された。さらに、ヘルペスウイルスの他の種も、ＨＶＳ１３によってコードされるタンパク質に相同なタンパク質をコードする可能性がある。
タンパク質と類似体
本発明は、免疫調節活性を有する単離ＩＬ−１７Ｒとその相同体を提供する。このようなタンパク質は汚染性内在性物質（endogenous material）を実質的に含まず、そして所望により、関連する天然パターンの（native pattern）・グリコシル化を伴わなくても良い。本発明の範囲内のＩＬ−１７Ｒの誘導体は、生物学的活性を保有する一次タンパク質の種々な構造形をも包含する。例えば、イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基の存在のために、ＩＬ−１７Ｒタンパク質は酸性塩又は塩基性塩の形状であるか、又は中性形状であることもできる。個々のアミノ酸残基が酸化又は還元によって修飾されることもできる。
一次アミノ酸構造は例えばグリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基等のような他の化学的部分によって共有若しくは集合性（aggregative）結合体を形成することによって、又はアミノ酸配列突然変異体を形成することによって修飾することができる。特定の官能基をアミノ酸側鎖に又はＮ−若しくはＣ−末端に結合させることによって共有結合誘導体を調製することができる。
ＩＬ−１７Ｒの可溶性形も本発明の範囲内に含まれる。ネズミＩＬ−１７Ｒのヌクレオチドと予測アミノ酸配列を配列番号：１と２に示す。コンピューター分析は、このタンパク質がアミノ酸３１と３２との間に切断部位を含むＮ−末端シグナルペプチドを有することを示した。当業者は、実際の切断部位がコンピューター分析によって予測される部位とは異なるかもしれないことを理解するであろう。したがって、切断されたペプチドのＮ−末端アミノ酸は予測切断部位のいずれかの側の約５アミノ酸の範囲内であると予想される。シグナルペプチドの後に、２９１アミノ酸細胞外領域、２１アミノ酸膜貫通領域及び５２１アミノ酸細胞質テール（tail）が続く。可溶性ＩＬ−１７Ｒはシグナルペプチドと細胞外領域（配列番号：１の残基１〜３２２）又はそのフラグメントを含む。或いは、配列番号：１の残基１〜３１を異なるシグナルペプチドで置換することもできる。
ヒトＩＬ−１７Ｒのヌクレオチドと予測アミノ酸配列を配列番号：９と１０に示す。これはネズミＩＬ−１７Ｒと多くの特徴を共有する。コンピューター分析は、このタンパク質がアミノ酸２７と２８の間に切断部位を含むＮ−末端シグナルペプチドを有することを示した。当業者は、実際の切断部位がコンピューター分析によって予測される部位とは異なるかもしれないことを理解するであろう。したがって、切断されたペプチドのＮ−末端アミノ酸は予測切断部位のいずれかの側の約５アミノ酸の範囲内であると予想される。シグナルペプチドの後に、２９３アミノ酸細胞外領域、２１アミノ酸膜貫通領域及び５２５アミノ酸細胞質テールが続く。可溶性ＩＬ−１７Ｒはシグナルペプチドと細胞外領域（配列番号：１の残基１〜３２０）又はそのフラグメントを含む。或いは、ネイティブシグナルペプチドを異なるシグナルペプチドで置換することができる。
本発明の範囲内のＩＬ−１７Ｒタンパク質とその相同体との他の誘導体は、例えばＮ−末端又はＣ−末端融合としての組換え体培養中の合成によるような、タンパク質又はそのフラグメントの、他のタンパク質又はポリペプチドとの共有又は集合性結合体を包含する。例えば結合体化ペプチドは、タンパク質の合成部位から細胞膜又は壁の内部又は外部のその機能部位へのタンパク質転移を翻訳と同時又は翻訳後に導く、タンパク質のＮ−末端領域のシグナル（又はリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母α−因子リーダー）であることができる。
タンパク質融合はＩＬ−１７Ｒタンパク質と相同体（例えば、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）の精製又は同定を容易にするために加えられるペプチドを含むことができる。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は例えばＨｏｐｐ等のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）によって述べられているような同定ペプチドに結合することもできる。高度に抗原性のペプチドは特異的なモノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを与え、発現された組換えタンパク質の迅速で、容易な精製を可能にする。Ｈｏｐｐ等の配列もウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に切断され、精製タンパク質からのこのペプチドの除去を可能にする。このようなペプチドによってキャップされる（capped）融合タンパク質もＥ．ｃｏｌｉにおける細胞内分解に耐性でありうる。
融合タンパク質は免疫グロブリンＦｃ領域に結合したＩＬ−１７Ｒのアミノ酸配列をさらに含む。典型的なＦｃ領域は、配列番号：４に示されるヌクレオチドとアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１である。Ｆｃ領域のフラグメントもＵＳＳＮ０８／１４５，８３０（１９９３年１０月２９日出願）に述べられているようなＦｃムテイン（mutein）と同様に、用いられることができる。用いられるＦｃ領域の割合に依存して、鎖間（interchain）ジスルフィド結合の形成を介してダイマーとして発現されることができる。融合タンパク質が抗体のＨ鎖とＬ鎖の両方によって形成される場合には、４個ほどのＩＬ−１７Ｒ領域を有するタンパク質オリゴマーを形成することが可能である。
他の実施態様では、ＩＬ−１７Ｒとその相同体はオリゴマー形成ジッパードメインをさらに含む。ジッパードメインはＵＳＳＮ０８／１０７，３５３（１９９３年８月１３日出願）に述べられており、これの関連開示は本明細書に援用される。ロイシンジッパードメインの例は、酵母転写因子ＧＣＮ４とラット肝臓に見い出される熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１６８１，１９８９）、ヘテロダイマーを選択的に形成する核形質転換タンパク質、ｆｏｓとｊｕｎ（Ｏ’Ｓｈｅａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５；６４６，１９８９；ＴｕｒｎｅｒとＴｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３；１６８９，１９８９）、及びネズミ癌原遺伝子、ｃ−ｍｙｃの遺伝子産物（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１７５９，１９８８）に見い出されるものである。パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス及び多くのレトロウイルスを包含する、数種類の異なるフソゲニック（fusogenic）タンパク質もロイシンジッパードメインを有する（ＢｕｃｋｌａｎｄとＷｉｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５４７，１９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：３９４，１９９１；ＤｅｌｗａｒｔとＭｏｓｉａｌｏｓ，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，６：７０３，１９９０）。
ＩＬ−１７Ｒの誘導体も免疫原、インビトロ分析の試薬として、又はアフィニティ精製方法の結合剤として用いることができる。このような誘導体は、システイン残基及びリシン残基において、例えばＭ−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステル及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような架橋剤によって得ることができる。本発明のタンパク質は例えばシアノーゲンブロミド活性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化又はトシル活性化アガロース構造のような種々な不溶性基質に反応性側鎖基（side group）を介して共有結合することができる、又はポリオレフィン表面（グルタルアルデヒド架橋を有する又は有さない）に吸着させることによって結合することができる。基質にひと度結合したならば、これらのタンパク質を、ＩＬ−１７Ｒに対して又はＩＬ−１７Ｒに類似する他のタンパク質に対して産生させた抗体、並びにＩＬ−１７Ｒ若しくはその相同タンパク質と結合する他のタンパク質に選択的に結合させるために用いることができる（分析又は精製のために）。
本発明はまた、関連する天然パターンのグリコシル化を有する又は有さないＩＬ−１７Ｒをも包含する。酵母又は哺乳動物の発現系、例えばＣＯＳ−７細胞に発現されたタンパク質は、ネイティブ分子に比べて、発現系に依存して分子量及びグリコシル化パターンにおいて類似するか又はやや異なる可能性がある。例えばＥ．ｃｏｌｉのような細菌における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現は、非グリコシル化分子を生じる。不活性化Ｎ−グリコシル化部位を有するＩＬ−１７Ｒタンパク質又はその相同体の機能的突然変異類似体は、オリゴヌクレオチド合成と連結反応（ligation）によって又は部位特異的な突然変異誘発法によって製造されることができる。これらの類似タンパク質は、酵母発現系を用いて良好な収率で相同な還元炭水化物形として製造されることができる。真核タンパク質におけるＮ−グリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ1−Ｚ（Ａ1はＰｒｏ以外の任意のタンパク質であり、ＺはＳｅｒ又はＴｈｒである）を特徴とする。この配列において、アスパラギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を与える。このような部位はＡｓｎ若しくは残基Ｚの代わりに他のアミノ酸を用いることによって、Ａｓｎ若しくはＺを欠失させることによって、又はＡ1とＺとの間に非−Ｚアミノ酸を挿入する若しくはＡｓｎとＡ1との間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入することによって除去されることができる。
ＩＬ−１７Ｒタンパク質誘導体はネイティブＩＬ−１７Ｒ又はそのサブユニットの突然変異によって得ることもできる。本明細書に記載されるＩＬ−１７Ｒ突然変異タンパク質は、ＩＬ−１７Ｒに相同であるが、１個又は複数個の欠失、挿入又は置換のためにネイティブＩＬ−１７Ｒとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＩＬ−１７ＲペプチドをコードするＤＮＡ中で生じた任意の突然変異の効果は、Ｔ若しくはＢ細胞のＩＬ−１７Ｒ若しくはその相同タンパク質による共刺激（costimulation）を阻害する又はＩＬ−１７Ｒと特異的に結合するタンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−８ｃＤＮＡ又はＨＶＳ１３ＯＲＦによってコードされる、抗体又はタンパク質）と結合する、突然変異ＩＬ−１７Ｒペプチドの能力を分析することによって容易に判定することができる。さらに、ＩＬ−１７Ｒ類似体、ムテイン又は誘導体の活性は、本明細書に述べる任意の分析方法によって測定することができる。同様な突然変異をＩＬ−１７Ｒの相同体中で生じさせて、同様な方法で試験することができる。
本発明のタンパク質の生物学的等価な類似体は、例えば、残基若しくは配列の種々な置換をおこなうことによって、又は生物学的活性に必要とされない、末端若しくは内部の残基若しくは配列を削除することによって構成することができる。例えば、システイン残基を欠失させるか又は他のアミノ酸と置換して、再生時の不適切な（incorrect）分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。突然変異誘発の他のアプローチは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を強化するための隣接二塩基性アミノ酸の修飾を含む。
一般に、置換は保存的におこなうべきである；即ち、最も好ましい代替え（substitute）アミノ酸は本発明のタンパク質がネイティブｍＩＬ−１７Ｒ又はｈＩＬ−１７Ｒと実質的に同等に、それらのリガンドと結合する能力に影響を及ぼさないようなアミノ酸である。保存的置換の例は、結合領域（単数又は複数）の外側でのアミノ酸の置換、ＩＬ−１７Ｒとその相同体との二次及び／又は三次構造を変化させないアミノ酸の置換を包含する。他の例は例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａのような、１つの脂肪族残基と他の脂肪族残基との相互の置換、又は例えばＬｙｓとＡｒｇとの置換；ＧｌｕとＡｓｐとの置換；若しくはＧｌｎとＡｓｎとの置換のような、１つの極性残基と他の極性残基との置換を包含する。他のこのような保存的置換、例えば同様な疎水性特徴を有する全領域の置換が周知である。
同様に、欠失又は挿入戦略を適用する場合には、欠失又は挿入の生物学的活性に対する潜在的な効果を考慮するべきである。本発明のタンパク質のサブユニットは末端又は内部の残基又は配列を欠失させることによって構成することができる。ＩＬ−１７と結合する、ＩＬ−１７Ｒのフラグメントは容易に製造する（例えば、制限酵素を用いて、ＤＮＡの一部を欠失させることによって）ことができ、それらがＩＬ−１７Ｒと結合する能力に関して試験することができる。産生しうる突然変異の種類に関するこの他のガイダンスは、ＩＬ−１７Ｒの配列を、同様な配列を有するタンパク質と比較することによって並び本発明のタンパク質の構造分析をおこなうことによって与えられる。
類似体ＩＬ−１７Ｒ（ＣＴＬＡ−８Ｒ）を発現させるために構成したヌクレオチド配列の突然変異は、もちろん、コーディング配列のリーディングフレーム相を維持しなければならず、ハイブリダイズして、例えばループ又はヘヤーピンのような、受容体ｍＲＮＡの翻訳に不利に影響する二次ｍＲＮＡ構造をもたらす相補的領域を形成しないことが好ましい。突然変異部位を予め決定することができるが、突然変異自体の性質を予め決定する必要はない。例えば、特定部位における突然変異体の最適の特徴を選択するために、ターゲットコドンにおいてランダムな突然変異誘発をおこなって、発現された突然変異ウイルスタンパク質を所望の活性に関してスクリーニングすることができる。
ＩＬ−１７Ｒ又はその相同体をコードするヌクレオチド配列における突然変異の全てが最終生成物に発現されるとはかぎらない、例えば、主として転写ｍＲＮＡにおける二次構造ループを避けるために（本明細書に援用されるＥＰＡ７５，４４４Ａを参照のこと）又は選択された宿主によってより容易に翻訳されるコドン、例えばＥ．ｃｏｌｉ発現のためのＥ．ｃｏｌｉ選択コドン（preference codon）を提供するために、ヌクレオチド置換をおこなって、発現を強化することができる。
ネイティブ配列のフラグメントへの連結反応を可能にする制限部位によって近接される突然変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異を特定の座（loci）に導入することができる。連結反応後に、得られた再構成配列は所望のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有する類似体をコードする。
或いは、オリゴヌクレオチド−誘導（oligonucleotide-directed）部位−特異的突然変異誘発方法を用いて、必要な置換、欠失又は挿入によって変化した特定のコドンを有する変化した遺伝子を形成することができる。上記変化を生じる典型的な方法はＷａｌｄｅｒ等（Ｇｅｎｅ，４２：１３３；１９８６）；Ｂａｕｅｒ等（Ｇｅｎｅ，３７：７３；１９８５）；Ｃｒａｉｋ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２〜１９）；Ｓｍｉｔｈ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）に開示されており、米国特許第４，５１８，５８４号と第４，７３７，４６２号とは適当な方法を開示しており、本明細書に援用される。
コード縮退（code degeneracy）のために、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にはかなりの変化が存在しうる。他の実施態様は、中程度の緊縮条件（５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡの予洗浄溶液（prewashing solution）（ｐＨ８．０）、５０℃、５ＸＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件）下で、ＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる配列と、ＩＬ−１７Ｒをコードする配列に縮退する他の配列とを包含する。好ましい実施態様では、ＩＬ−１７Ｒ類似体はアミノ酸配列において、配列番号：１又は配列番号：９に示すように、ＩＬ−１７Ｒタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同じである。同様に、ＩＬ−１７Ｒ相同体の類似体はアミノ酸配列において、ネイティブ相同タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同じである。最も好ましい実施態様では、ＩＬ−１７Ｒ又はその相同体の類似体は本発明のタンパク質のネイティブ形にアミノ酸配列において少なくとも約８０％同じである。
同一性％はコンピュータープログラム、例えばＤｅｖｅｒｅｕｘ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって述べられ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用いて算出することができる。ＩＬ−１７Ｒタンパク質に由来するフラグメントに関しては、そのフラグメント中に存在するＩＬ−１７Ｒタンパク質の割合に基づいて同一性が算出される。同様な方法を用いて、ＩＬ−１７Ｒの相同体を分析することができる。
ＣＴＬＡ−８と結合するＩＬ−１７Ｒの能力は、ＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）誘導Ｔ細胞増殖を阻害する類似体の能力を試験することによって評価することができる。或いは、ＣＴＬＡ−８又はＨＳＶ１３（又は、ネイティブＩＬ−１７Ｒと結合する、これらの相同体）を用いる、例えばエンザイム・イムノアッセイ又はドットブロットのような、適切な分析を用いて、ＩＬ−１７Ｒ類似体がＣＴＬＡ−８と結合する能力を評価することができる。このような方法は当該技術分野において周知である。
本明細書に述べるＩＬ−１７Ｒタンパク質と類似体は、薬剤組成物の製造を含めて、多くの用途を有する。本発明のタンパク質は、例えば患者供試体中のＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ｒを検出するために用いられるキットの製造に有用である。このようなキットは、ＩＬ−１７とＩＬ−１７Ｒとの相互作用のアンタゴニスト又は模倣体（mimetic）（例えば、この相互作用をそれぞれ阻害又は模倣するペプチド又は小分子）をスクリーニングする場合に必要であるような、この相互作用の検出にも有用である。このようなキットには（非限定的に）ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、固相結合分析（例えば、バイオセンサーを用いる分析）、迅速フォーマット（rapid Format）分析及びバイオアッセイ（bioassay）を包含する、多様な分析フォーマットが有用である。
ＩＬ−１７Ｒの組換え受容体の発現
本発明のタンパク質は好ましくは、ＩＬ−１７Ｒタンパク質又はその相同体をコードするＤＮＡ配列を組換え発現ベクター中に挿入して、発現を促進する条件下で組換え微生物発現系においてこのＤＮＡ配列を発現させることによる組換えＤＮＡ方法によって製造される。本発明によって提供されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列をｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーとから、又は一連のオリゴヌクレオチドからアッセンブリーして、組換え発現ベクター中に挿入され、組換え転写単位において発現されることができる合成遺伝子を形成することができる。
組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来する適当な転写又は翻訳調節要素に機能可能なように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合した、ＩＬ−１７Ｒ、その相同体又は生物学的に等価な類似体をコードする合成若しくはｃＤＮＡ由来ＤＮＡを包含する。このような調節要素は転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、以下で詳述するような、転写及び翻訳の終点を制御する配列を包含する。通常は複製起点によって与えられる、宿主における複製能力と、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子とを付加的に組み入れることができる。
ＤＮＡ領域は機能的に相互に関係するときに、機能可能なように結合する。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係する先駆体として発現される場合には、そのポリペプチドのＤＮＡに機能可能なように結合する；プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合には、コーディング配列に機能可能なように結合する；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように配置される場合には、コーディング配列に機能可能なように結合する。一般に、機能可能なように結合とは隣接（contiguous）を意味し、分泌リーダーの場合には、隣接とリーディングフレーム内であることを意味する。微生物において発現される予定であるＩＬ−１７Ｒ又は相同体をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を早期に終了させる可能性があるイントロンを含まないことが好ましい。
細菌用途のために有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素（genetic element）を含む商業的に入手可能なプラスミドに由来する、選択可能なマーカーと細菌複製起点とを含むことができる。このような商業的ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）とｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２“バックボーン”区分は適当なプロモーター及び発現されるべき構造配列と結合される。Ｅ．ｃｏｌｉはｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミド）の誘導体を用いて、典型的に形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒ等，Ｇｅｎｅ  ２：９５，１９７７）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有するので、形質転換された細胞を同定する簡単な手段を提供する。
組換え微生物発現ベクターに一般に用いられるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８；及びＧｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４，１９７９）と、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；及びＥＰＡ  ３６，７６６）と、ｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第４１２頁、１９８２）とを包含する。特に有用な細菌発現系はファージλＰLプロモーターとｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサーとを用いる。λＰLプロモーターの誘導体を組み込むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）中に存在するプラスミドｐＨＵＢ２と、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）中に存在するプラスミドｐＰＬｃ２８とを包含する。
酵母ベクター中の適当なプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホソホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ等、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８及びＨｏｌｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒドー３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ、のプロモーターを包含する。酵母発現に用いる適当なベクター及びプロモーターは、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、ＥＰＡ７３，６５７にさらに述べられる。
好ましい酵母ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉの選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製起点）と、グルコースー抑制ＡＤＨ２プロモーター及びα−因子分泌リーダーを包含する酵母ＤＮＡ配列とを用いてアッセンブリーすることができる。ＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）及びＢｅｉｅｒ等（Ｎａｔｕｒｅ３００：７２４，１９８２）によって述べられている。異種タンパク質の分泌を導く酵母α−因子リーダーは、プロモーターと発現される構造遺伝子との間に挿入することができる。例えば、Ｋｕｒｊａｎ等、Ｃｅｌｌ３０：９３３、１９８２；及びＢｉｔｔｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５３３０，１９８４参照。リーダー配列は、３’末端の近くに１つ以上の有効な制限部位を含むように修飾して、外来遺伝子へのリーダー配列の融合を促進することができる。
脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクターの転写及び翻訳制御配列は、ウイルスソースによって与えられうる。例えば、一般に用いられるプロモーター及びエンハンサーは、Ｐｏｌｙｏｍａ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起源、早期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝要素を与えるために用いられるうる。早期及び後期プロモーターの両方は、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので特に有用である（Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３，１９７８）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位から、ウイルス複製起点に位置するＢｇｌＩ部位の方向へ伸長する約２５０ｂｐ配列が含有される限り、より小さい又はより大きいＳＶ４０フラグメントも用いることができる。さらに、制御配列が選択される宿主細胞と適合する限り、ウイルスゲノムプロモーター、制御及び／又はシグナル配列を用いることができる。典型的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によって開示されるように構成されることができる。
Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞の哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定な高レベル発現のための有用な系は、実質的に、Ｃｏｓｍａｎ等（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によって述べられるように構成することができる。ＩＬ−１７Ｒ  ＤＮＡの発現のための好ましい真核ベクターは、ｐＤＣ４０６（ＭｃＭａｈａｎ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１）と呼ばれ、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）に由来する調節配列を包含する。他の好ましいベクターは、ｐＤＣ４０６から誘導される、ｐＤＣ４０９及びｐＤＣ４１０を包含する。ｐＤＣ４１０は、ＥＢＶ複製起点をＳＶ４０大きいＴ抗原をコードする配列で置換することによって、ｐＤＣ４０６から誘導された。ｐＤＣ４０９は、多重クローニング部位の外部のＢｇｌＩＩ制限部位が欠失しており、多重クローニング部位内のＢｇｌＩＩ部位を固有なものにする点で、ｐＤＣ４０６と異なる。
ＥＢＶ複製起点を含有する、例えばｐＤＣ４０６及びｐＤＣ４０９のような発現ベクターのエピソーム複製を可能にする有用な細胞ラインは、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）である。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞ラインは、ＣＶ−１細胞ラインを、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードする遺伝子でトランスフェクトすることによって誘導され、ヒトＣＭＶ即時−早期（immediate-early）エンハンサー／プロモーターから誘導されるＥＢＮＡ−１を構造的に発現する。
宿主細胞
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ方法を用いて構成された発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、本発明のタンパク質をコードする配列を含有する細胞である。形質転換された宿主細胞は、所望のタンパク質（ＩＬ−１７Ｒ又はその相同体）を発現するが、本発明のＤＮＡをクローニング又は増幅する目的のために形質転換された宿主細胞は、このタンパク質を発現する必要がない。発現されたタンパク質は、好ましくは選択されたＤＮＡに応じて培養上清へ分泌されるが、細胞膜に沈積してもよい。
ウイルスタンパク質の発現のための適当な宿主細胞は、適当なプロモーターの制御下で、原核生物、酵母又は高等真核細胞を包含する。原核生物は、グラム陰性、グラム陽性微生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．を包含する。高等真核細胞は、下記にような哺乳動物起源の確立された細胞ラインを包含する。細胞を含まない翻訳系は、本明細書に開示されたＤＮＡ構築体から誘導されたＲＮＡを用いてウイルスタンパク質を製造するためにも用いることができる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主によって用いるための適当なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌ等（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）によって述べられており、この関連記載が本明細書に援用される。
原核生物発現宿主は、広範なタンパク分解及びジスルフィド処理を必要としないＩＬ−１７Ｒ又は相同体の発現に用いることができる。原核生物発現ベクターは、一般的に、１つ以上の表現型選択可能なマーカー、例えば、抗生物質耐性を与える又は自主栄養条件を与えるタンパク質をコードする遺伝子並びに宿主内の増幅を確実にするために宿主によって認識される複製起点を含む。形質転換のための適当な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ並びに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々な種を包含するが、他のものも選択可能なものとして用いることができる。
組換えＩＬ−１７Ｒは、酵母宿主、好ましくは、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなＳａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ種から発現することができる。他の属の酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓもまた用いることができる。酵母ベクターは、一般に、２μ酵母プラスミド又は自己複製配列（ＡＲＳ）からの複製起点、プロモーター、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化及び転写終結のための配列並びに選択遺伝子を含有する。好ましくは、酵母ベクターは複製起点と、酵母とＥ．ｃｏｌｉの両方の形質転換を可能にする選択可能なマーカー（例えばＥ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子と、トリプトファン中で成長する能力を有さない酵母の突然変異株の選択マーカーを与えるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｒｐｌ遺伝子を包含する）と、下流の構造配列の転写を誘導する、高度に発現される酵母遺伝子から誘導されるプロモーターとを包含する。酵母宿主細胞ゲノムのｔｒｐ１障害の存在が、次にトリプトファン不存在下の成長による形質転換を検出するための効果的な環境を与える。
０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カサミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地においてＴｒｐ＋形質転換体を選択するための適当な酵母形質転換プロトコールは、当業者に公知である；典型的な方法は、Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９，１９７８によって述べられる。ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主株は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルによって補充された、１％酵母エキス、２％ペプトン及び１％グルコースからなる富化培地において発現のために成長させることができる。ＡＤＨ２プロモーターのデプレッションは、グルコース培地の消耗時に生じる。粗酵母上清は、濾過によって回収し、さらに精製するまで４℃において保持した。
種々な哺乳動物又は昆虫の細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることができる。昆虫細胞において異種タンパク質を産生させるためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）によって考察されている。適当な哺乳動物の宿主細胞ラインの例は、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）によって述べられている、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７ラインと、例えばＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４７８）、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞ラインを包含する、適当なベクターを発現することができる他の細胞ラインとを含む。哺乳動物発現ベクターは例えば複製起点、発現されるべき遺伝子に結合した適当なプロモーター及びエンハンサー、他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位のような、５’若しくは３’非転写配列、並びに転写終結配列のような非転写要素を含むことができる。
ＩＬ−１７受容体の精製
精製されたＩＬ−１７Ｒ、相同体又は類似体は、適当な宿主／ベクター系を培養して、本発明のＤＮＡの組換え翻訳生成物を発現させ、次に培養培地又は細胞抽出物から精製することによって製造される。例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌する系からの上清を例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットのような、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルターを用いて、最初に濃縮することができる。
濃縮工程後に、濃縮物を適当な精製マトリックスに供給することができる。例えば、適当なアフィニティマトリックスは、適当な支持体サポートに結合した、カウンター構造タンパク質又はレシチン又は抗体分子を含むことができる。或いは、例えばペンダント  ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質（substrate）のような、陰イオン交換樹脂を用いることができる。マトリックスは、タンパク質精製に一般的に用いられる、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又は他の種類であることができる。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン交換体は、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む種々な不溶性マトリックスを包含する。スルホプロピル基が好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーも本発明のタンパク質を精製する手段を提供する。
アフィニティクロマトグラフィーはＩＬ−１７Ｒとその相同体との特に好ましい精製方法である。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質として発現されたＩＬ−１７Ｒは、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができる。さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含むＩＬ−１７Ｒタンパク質をオリゴマー化ジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製することができる。ＩＬ−１７Ｒタンパク質に対するモノクローナル抗体も、当該技術分野に周知である方法を用いることによって、アフィニティクロマトグラフィー精製に有用でありうる。リガンド（即ち、ＩＬ−１７又はＨＶＳ１３）も、ＩＬ−１７Ｒのアフィニティ精製用のアフィニティマトリックスの製造に用いることができる。
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質（例えば、ペンダント  メチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる、１回以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を利用して、ＩＬ−１７Ｒ組成物をさらに精製することができる。上記精製工程の一部又は全てを、種々な組合せで用いても、同種組換えタンパク質を得ることができる。
細菌培養で生成された組換えタンパク質は通常、細胞ペレットからの初期抽出と、その後の１種以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離される。最後に、最終精製工程のために高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。組換えウイルスタンパク質の発現に用いられる微生物細胞を、凍結−解凍サイクリング、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を包含する、慣用的な方法によって破壊することができる。
分泌タンパク質として本発明のタンパク質を発現する酵母の発酵は、精製を非常に簡単にする。大規模発酵から生じる分泌組換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌ等（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）によって開示された方法と同様な方法によって精製することができる。この参考文献は分取ＨＰＬＣカラム上で組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを精製するための２回連続ＨＰＬＣ工程を述べている。
組換え体培養で合成されたタンパク質は、培養物から本発明のタンパク質を回収するために採られた精製工程に依存する量と性質のタンパク質を包含する、細胞成分の存在を特徴とする。これらの成分は通常は、酵母、原核生物又は非ヒト高等真核生物起源であり、好ましくは、約１重量％未満のオーダーの無毒な汚染物量で存在する。さらに、組換え体細胞培養は、通常はタンパク質に付随して、起源の種（species of origin）中に本質的に見い出される他のタンパク質を含まない、本発明のタンパク質の製造を可能にする。
ＩＬ−１７Ｒ組成物の投与
本発明は有効量のタンパク質と適当な希釈剤及びキャリヤーとを含む治療組成物の使用方法と、免疫反応の調節する方法とを提供する。可溶性サイトカイン受容体若しくはサイトカイン又は他の免疫調節分子と組み合わせたＩＬ−１７Ｒ又は相同体の使用もまた考えられる。さらに、可溶性ＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡもまた有用である；移植される組織又は器官は、当業者に公知の方法によってＤＮＡでトランスフェクトされることができる。従って、組織又は器官は、可溶性ＩＬ−１７Ｒを発現し，これは移植片の局在領域において作用して、移植片の拒絶を抑制する。移植片の部位へのこのようなＤＮＡを投与することを含む同様な方法は、移植片拒絶の軽減に効果を示す。
治療的用途のために、精製したタンパク質を患者、好ましくはヒトに、適応症に適当な方法での治療のために投与する。したがって、例えば、免疫機能を調製するために投与されるＩＬ−１７Ｒタンパク質組成物は、ボラス注入、連続注入、インプラントからの持続放出又は他の適当な方法で投与することができる。典型的には、治療剤は、生理的に受容されるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤と共に、精製ＩＬ−１７Ｒを含む組成物として投与される。このようなキャリヤーは、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無毒である。
通常は、こうようなタンパク質組成物の製造は、本発明のタンパク質を、緩衝液、例えばアスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース又はデキストリンを包含）、例えばＥＤＴＡのようなキレート化剤、グルタチオン及び他の安定剤並びに賦形剤と組み合わせることを含む。中性緩衝化生理的食塩水又は同種血清アルブミンは、典型的な適当な希釈剤である。好ましくは、生成物を、希釈剤として適当な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を用いた凍結乾燥物（lyophilizate）として製剤化する。適当な用量は、トライアルで決定することができる。投与量と投与頻度とは、例えば、治療すべき適応症の性質と重症度、所望の反応、患者の条件等のようなファクターに当然依存する。
ＩＬ−１７（ＣＴＬＡ−８）の受容体は、Ｔ細胞の増殖の抑制又はＴ細胞活性化の抑制のために投与することができる。したがって、可溶性ＩＬ−１７Ｒは、器官又は移植片拒絶、自己免疫疾患、アレルギー又は喘息の予防と治療に有用であると考えられる。本発明の受容体タンパク質は、活性化Ｔ細胞が関与する炎症性疾患の予防又は治療に有用である。同様に、ＨＶＳ１３とその相同体はＢ細胞増殖及び免疫グロブリン分泌を刺激する。；したがって、ＨＶＳ１３又はＣＴＬＡ−８に結合する受容体は、インビボにおいてＢ細胞増殖又は免疫グロブリン分泌を抑制するために有用である。ＣＴＬＡ−８受容体は、ＩＬ−１７Ｒを発現する細胞へのＨＶＳ１３又はＣＴＬＡ−８の結合を抑制するためにも有用である。
下記実施例は説明のために提供するものであり、限定のためではない。当業者は、実施態様で具体化される本発明の変更態様が本明細書に引用される種々な参考文献（これらの開示は本明細書に援用される）の教示を考慮するならばなされうることを理解するであろう。
実施例１
この実施例は、ＨＶＳ１３／ｍＣＴＬＡ−８の受容体（又はカウンター構造（counterstructure））を発現する細胞の同定に関する。ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（配列番号：４）とそれに続くＨＶＳ１３のアミノ酸１９〜１５１（配列番号：８）とからなるキメラタンパク質（ＨＶＳ１３  ＩＩ型Ｆｃ）を製造した。ｍＣＴＬＡ８（配列番号：６）のアミノ酸２２〜１５０をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合することによって、ネズミＣＴＬＡ８／Ｆｃ（ｍＣＴＬＡ８／Ｆｃ）を構成した。対照Ｆｃタンパク質は同様な方法によって構成した。ＨＶＳ１３／ＦｃとｍＣＴＬＡ−８タンパク質を発現し、フローサイトメトリーによる細胞ソースの同定に用いた。
細胞（１ｘ１０6）を、２％標準ヤギ血清と２％標準ウサギ血清とを含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳと０．１％ＮａＮ３）中で氷上で３０分間プレインキュベートして、非特異的結合をブロックした。１００μｌのＨＶＳ  １３／Ｆｃ、ｍＣＴＬＡ８／Ｆｃ又は対照／Ｆｃタンパク質を５μｇ／ｍｌで加え、氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をビオチン標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）で染色し、次に１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中のＰＥ−共役（conjugated）ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  ＆  Ｃｏ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で染色した。次に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。各サンプルに関して、最少５，０００細胞を分析した。１ダースより多い細胞ラインをスクリーニングし、ＨＶＳ１３／ＦｃとｍＣＴＬＡ８／Ｆｃとの両方の融合タンパク質がネズミ胸腺腫細胞ラインＥＬ４に特異的に結合することがわかった。これらの細胞は、対照／Ｆｃ融合タンパク質に結合しなかった。
実施例２
この実施例は、ＩＬ−１７Ｒをコードする遺伝子のクローニングを記述する。ＨＶＳ１３カウンター構造に関するソースの同定後、ＥＬ４哺乳類発現ライブラリーをスライド結合オートラジオグラフィー方法（Ｇｅａｒｉｎｇ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３６６７，１９８９）によってスクリーニングした。ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中に、３７℃において１０％ＣＯ２を含有する高い湿度の雰囲気下で維持し、週に２回継代培養した。フィブロネクチン処理チャンバースライド（Ｌａｂｔｅｋ）上の準集密的ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞単層を、クロロキン仲介ＤＥＡＥ−デキストラン方法によって、ネズミＥＬ４ｃＤＮＡライブラリーのプールされた形質変換体（２，０００形質変換体／プール）から誘導されたプラスミドＤＮＡによってトランスフェクトした。
ネズミＥＬ４ｃＤＮＡプールによってトランスフェクトされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞を、［125Ｉ］標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ結合及びスライドオートラジオグラフィーを用いたトランスフェクションの２日後に、ＨＶＳ１３／Ｆｃ結合に関して分析した。トランスフェクトした細胞単層を結合培地（１％ウシ血清アルブミンと５０ｍｇ／ｍｌ脱脂乾燥ミルクとを含有するＲＰＭＩ１６４０）で洗浄し、次に１μｇ／ｍｌのＨＶＳ１３／Ｆｃを加えて室温において１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、125Ｉー標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を加えてインキュベートした。細胞を結合培地で２回、ＰＢＳで３回洗浄して、２．５％グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳ中に３０分間固定し、ＰＢＳでさらに２回洗浄して、風乾した。次に、チャンバースライドをＫｏｄａｋ  ＧＴＮＢ−２写真乳液中に浸漬し、現像前に４℃において３日間露光した。
各約２，０００ｃＤＮＡの４０プールをＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞へトランスフェクトした。２プールのｃＤＮＡはＨＶＳ１３／Ｆｃタンパク質への結合を生じることがわかった。これらのプールは、１００ｃＤＮＡのプールへ分解して、次に個々のクローンへ分解した。２つの単一のｃＤＮＡクローンを単離した。これらのクローンをＣＶ１／ＥＢＮＡへトランスフェクトして、これらによってコードしたタンパク質がＨＶＳ１３／ＦｃとｍＣＴＬＡ８／Ｆｃの両方への結合を生じるかどうかを判定した。ＨＶＳ／ＦｃとｍＣＴＬＡ８／Ｆｃの両方は、クローン化したｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞に結合するが、エンプティベクターでトランスフェクトされた細胞には結合しなかった。対照／Ｆｃは、それらのいずれにも結合しなかった。
これらのクローンの配列決定により、これらが同じｍＲＮＡから誘導された３．２ｋｂ及び１．７ｋｂインサートを含有することがわかった。３．２ｋｂクローンは、５’非コーディング配列における１２０ｂｐと３’非コーディング配列における５７３ｂｐとによって囲まれた２５９５ｂｐのオープンリーディングフレームを含有した。３位置におけるプリン残基（グアニン）、良好な翻訳開始部位の最も重要なインジケーター（Ｋｏｚａｋ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：５１３４，１９８９）によって先行された予測イニシエーターメチオニンの上流にイン−フレーム（in-frame）停止コドンは存在しなかった。これはまた＋４位置にグアニンを有し、このことがこれを翻訳開始に最適にする。オープンリーディングフレームは、８６４アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質をコードすることが予測される。ヌクレオチド及び予測アミノ酸配列が配列番号：１及び２に示される。
コンピューター分析は、タンパク質がアミノ酸３１と３２との間の切断部位を含むＮ−末端シグナルペプチドを有することを示した。シグナルペプチドの後には、２９１アミノ酸細胞外領域、２１アミノ酸膜貫通領域及び５２１アミノ酸細胞質テールが続く。タンパク質の細胞外領域には、８つの可能なＮ−結合グリコシル化部位が存在する。このタンパク質の予測分子量は９７．８キロダルトンであり、算出される等電点は４．８５である。ヌクレオチドとアミノ酸配列の両方の、ＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬデータベースとの比較は、既知ヌクレオチドとタンパク質配列との有意な相同を見い出さなかった。
ＩＬ−１７ＲｍＲＮＡの細胞及び組織分布を知るために、種々なネズミ細胞ライン又は組織から誘導されたｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを、ＩＬ−１７ＲｃＤＮＡをプローブとして用いてノーザンブロット分析によって試験した。種々な組織からのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ（２μｇ／レーン）を含有するフィルターをはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。種々な細胞又は細胞ラインからのポリアデニル化ＲＮＡを単離し、１％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分画し（２μｇ／レーン）、Ｈｙｂｏｎｄナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロットした。フィルターをＩＬ−１７ＲｃＤＮＡのコーディング領域に対応するアンチセンスＲＮＡリボプローブ（riboprobe）によってプローブ探査した。ハイブリダイゼーションを６３℃においておこない、その後、６８℃の０．２％ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回洗浄した。ブロットを−７０℃において８〜４８時間暴露した。
全ての組織において、ＩＬ−１７Ｒプローブは約３．７ｋｂのｍＲＮＡの単一種にハイブリダイズした。試験した組織の中で、脾臓と腎臓において強いハイブリダイジングシグナル（hybridizing signal）が観察された。肺と肝臓では中程度のシグナルが観察され、脳、心臓、骨格筋及び精巣ではさらに弱いシグナルが観察された。下記の細胞と細胞ラインでは、同様なサイズのｍＲＮＡが検出された：胎児肝臓上皮細胞（Ｄ１１）、線維芽細胞（３Ｔ３）、ラット腸上皮細胞（１ＣＥ６）、脾臓Ｂ細胞、筋肉細胞（ＢＢ４）、マスト細胞（Ｈ７）、トリプルネガティブ胸腺細胞（ＴＮ）、前Ｂ細胞（７０Ｚ／３）、Ｔ細胞ハイブリドーマ（ＥＬ４）；並びにＴ細胞クローン７Ｃ２とＤ１０。試験した全ての細胞ラインはＩＬ−１７ＲｍＲＮＡを発現することが判明し、このことはＩＬ−１７Ｒメッセージの遍在する発現を示唆した。
実施例３
この実施例は、ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｌａｇと呼ばれる可溶性ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｌａｇ（登録商標）タンパク質を発現する構築体の構成を説明する。ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｌａｇ（登録商標）はリーダー配列と、アミノ酸１〜アミノ酸３２２のＩＬ−１７Ｒ領域（配列番号：１）と、Ｆｌａｇ（登録商標）と呼ばれるオクタペプチド（配列番号：３）とを含有する。この構築体は、本質的に他の可溶性構築体に関して述べたように、配列番号：１のアミノ酸１〜３２２をコードするＤＮＡフラグメント（実施例４に述べるように製造）を、適当なリーダー配列を含有する適当な発現ベクターに連結することによって製造される。得られたＤＮＡ構築体を例えばサル腎臓細胞ラインＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）のような適当な細胞ラインにトランスフェクトする。ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｌａｇ（登録商標）をＦｌａｇ（登録商標）抗体アフィニティカラムを用いて精製して、本明細書に述べる任意の方法を用いて、生物学的活性に関して分析することができる。
実施例４
この実施例は、ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するＩＬ−１７ＲＤＮＡ構築体の構成を説明する。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＩＬ−１７Ｒの可溶性形を哺乳動物発現ベクターｐＤＣ４０９中に次の方法で構成した：ＩＬ−１７Ｒのセンス配列とアンチセンス配列とを含有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。センスプライマーはｃＤＮＡの５’末端にＳａｌ  Ｉ部位を含有し、アンチセンスプライマーはＢｇｌ  ＩＩ部位を含有し、トランスメンブラン領域の直前で切頭されたＩＬ−１７Ｒと停止コドンとを含有した。ＩＬ−１７Ｒ  ｃＤＮＡから９８０ｂｐＤＮＡフラグメントを増幅した。このＰＣＲ生成物をＳａｌ  ＩとＢｇｌ  ＩＩとによって切断して、Ｂｇｌ  ＩＩとＮｏｔ  Ｉとによって切断されたヒトＩｇＧ１領域を有するフラグメントを用いる、Ｓａｌ  ＩとＮｏｔ  Ｉとによって予め切断されたプラスミド（ｐＤＣ４０９；ＵＳＳＮ０８／２３５，３９７参照）中への三方向連結（three way ligation）に用いた。コードされたインサート（insert）はＩＬ−１７Ｒの残基１〜３２２のアミノ酸配列（配列番号：１）をコードするヌクレオチドを含有した。この配列は全領域の配列決定によって確認された。
ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃ発現プラスミドをＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし、上清を１週間回収した。ＣＴＬＡ−８／Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）上で以下に述べるように精製した。タンパク質濃度はヒトＩｇＧ１の不変ドメインに特異的な酵素結合イムノアドソルベント分析（enzyme-linked immunoadsorbent assay）によって、及びＢＣＡ分析（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって測定し、純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とその後のゲルの銀染色とによって測定した。
実施例５
この実施例はＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質の精製を説明する。ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡ又はプロテインＧクロマトグラフィーを用いて慣用的方法によって精製する。ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を含有する約１リットルの培養上清を、哺乳動物細胞上清を濾過し（例えば、０．４５ｍフィルターにおいて）、濾液をプロテインＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に４℃において１．５ｃｍｘ１２．０ｃｍカラムに対して８０ｍｌ／時の流速度で供給することによって精製する。このカラムをＰＢＳ中０．５Ｍ  ＮａＣｌによって、洗浄緩衝液中に遊離タンパク質が検出されなくなるまで、洗浄する。最後に、カラムをＰＢＳによって洗浄する。結合した融合タンパク質を２５ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ２．８）によってカラムから溶離させ、５００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ９．１）によってｐＨ７にする。
Ｆｌａｇ（登録商標）を含むＩＬ−１７Ｒ融合タンパク質も、Ｆｌａｇ（登録商標）と結合する抗体を用いて、実質的にＨｏｐｐ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）に述べられているように、検出及び／又は精製することができる。例えば本明細書の実施例に述べられるように、ＣＴＬＡ−８の共刺激効果を数値化する任意の生物学的分析法におけるＣＴＬＡ−８活性の阻害によって、生物学的活性を測定する。
実施例６
この実施例はＩＬ−１７Ｒに対するモノクローナル抗体の製造を説明する。例えば精製組換え体ＩＬ−１７Ｒ又は、高レベルのＩＬ−１７Ｒを発現するトランスフェクトされた細胞の調製物（preparation）を利用して、例えば米国特許第４，４１１，９９３号に開示されているような慣用的方法によって、ＩＬ−１７Ｒに対するモノクローナル抗体を得る。このような抗体はＩＬ−１７Ｒの診断分析若しくは研究分析の要素として、ＣＴＬＡ−８へのＩＬ−１７Ｒ結合の阻害又はＩＬ−１７Ｒのアフィニティ精製に有用であると考えられる。
齧歯類を免疫感作するために、ＩＬ−１７Ｒイムノーゲンをアジュバント（例えば、完全若しくは不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント、明礬、又は他のアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ））中で乳化して、例えばＢＡＬＢ／ｃマウス若しくはＬｅｗｉｓラットのような、特定の齧歯類に１０〜１００μｇの範囲内の量で注射する。１０日間〜３週間後に、免疫感作された動物を追加のイムノーゲンによって追加免疫し（boosted）、その後、毎週、隔週又は３週間毎の免疫感作スケジュールで定期的に追加免疫する。ドット−ブロット分析（抗体サンドイッチ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント分析）、免疫沈降法、又はＦＡＣＳ分析を含む他の分析によって試験するために、眼窩後（retro-orbital）採血又は尾−先端切除によって定期的に血清サンプルを採取する。適当な抗体力価の検出後に、陽性（positive）動物に生理的食塩水中の抗原を静脈内注射する。３〜４日間後に、動物を殺し、脾臓細胞を回収し、ネズミミエローマ細胞ライン（例えば、ＮＳ１又は好ましくはＡｇ８．６５３［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０］）に融合させる。この操作によって得られたハイブリドーマ細胞ラインを非融合細胞、ミエローマ−ミエローマハイブリッド、及び脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリッドの増殖を抑制するために選択的媒質（例えば、ハイポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する媒質、又はＨＡＴ）中で、多重マイクロタイタープレートに培養する。
このようにして得られたハイブリドーマクローンはＩＬ−１７Ｒとの反応性に関してＥＬＩＳＡによって、例えばＥｎｇｖａｌｌ等，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１（１９７１）によって及び米国特許第４，７０３，００４号に開示された方法の適用によってスクリーニングすることができる。好ましいスクリーニング方法は、Ｂｅｃｋｍａｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２（１９９０）によって述べられている抗体捕捉方法である。次に、陽性クローンを同系の齧歯類の腹腔に注入して、高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗−ＩＬ−１７Ｒモノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせる。得られるモノクローナル抗体は硫酸アンモニウム沈降法とその後のゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。或いは、プロテインＡ又はプロテインＧへの抗体の結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーも、ＩＬ−１７Ｒタンパク質への結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーと同様に使用可能である。
実施例７
この実施例は、マイトジェンに対するＴ細胞の増殖反応を阻害するＩＬ−１７Ｒの能力を説明する。リンパ系器官を無菌状態で回収し、細胞懸濁液を形成した。脾臓とリンパ節のＴ細胞を懸濁液から単離した。得られた脾臓Ｔ細胞調製物の純度はルーチンに＞９５％ＣＤ３+及び＜１％ｓＩｇＭ+であった。精製ネズミ脾臓Ｔ細胞（２ｘ１０5／孔）を１％ＰＨＡ又は１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡのいずれかによって培養し、可溶性ＩＬ−１７Ｒの濃度を滴定した（titered into the assay）。１μＣｉ［3Ｈ］チミジンを添加して、３日間後に増殖を測定した。１０μｇ／ｍｌのＩＬ−１７Ｒ・Ｆｃの存在下若しくは不存在下、又は対照Ｆｃタンパク質の存在下で１μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａと共に２４時間培養したネズミＴ細胞に関して、サイトカイン（インターロイキン−２）の分泌を測定した。ＩＬ−２産生をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を産生ＩＬ−２量（ｎｇ／ｍｌ）として表現した。
可溶性ＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃは精製ネズミ脾臓Ｔ細胞のマイトジェン誘導増殖を用量依存的に有意に抑制したが、対照ＦｃはネズミＴ細胞増殖に影響を及ぼさなかった。マイトジェン誘導増殖の完全な抑制は１０μｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−１７Ｒ・Ｆｃ濃度において観察された。培養中のＩＬ−１７Ｒ・Ｆｃの存在下又は不存在下でＣｏｎ  Ａによって活性化された脾臓Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の分析は、Ｔ細胞培養物へのＩＬ−１７Ｒ・Ｆｃの添加がＩＬ−２産生を、培地のみ又は培地プラス対照Ｆｃタンパク質を含有する培養物中に観察されるＩＬ−２産生に比べて、８〜９分の１に低いレベルまで抑制したことを示した。同様な結果が、精製ヒトＴ細胞を用いた場合にも観察された。
実施例８
この実施例は、種間（cross species）ハイブリダイゼーションによるヒトＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡの単離を示す。ヒト末梢血リンパ球ライブラリーを調製し、実質的にＵＳＳＮ０８／２４９，１８９に述べられているように、中程度に高い緊縮条件下でネズミＩＬ−１７Ｒ  ＤＮＡを用いてスクリーニングした。長さの異なる数種類のクローンが得られた。配列決定データは、ヒトＩＬ−１７ＲがネズミＩＬ−１７Ｒと、ヌクレオチドレベルにおいて、約７６％同じであることを実証した。ヒトＩＬ−１７Ｒのヌクレオチドと予測アミノ酸配列は配列番号：１０と１１に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０中のヒトＩＬ−１７Ｒ受容体をコードするＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＧＥＭＢＬ）（ｐＧＥＭＢＬ−ｈｕＩＬ−１７Ｒと呼ばれる）は、ブタペスト条約の条件下で１９９５年６月５日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２−１７７６，ＵＳＡ）に寄託され、寄託番号６９８３４を割り当てられた。
ヒトＩＬ−１７ＲはネズミＩＬ−１７Ｒと多くの特徴を共有した。コンピューター分析は、このタンパク質が、アミノ酸２７と２８との間に切断部位を有するＮ−末端シグナルペプチドを有することを実証した。このシグナルペプチドの後に、２９３アミノ酸細胞外領域、２１アミノ酸膜貫通領域及び５２５アミノ酸細胞質テールが続く。可溶性ＩＬ−１７Ｒはシグナルペプチドと細胞外領域（配列番号：１の残基１〜３２０）又はそのフラグメントを含む。或いは、異なるシグナルペプチドがネイティブシグナルペプチドに置換することができる。Ｉ型Ｆｃ融合タンパク質（免疫グロブリン分子のＦｃ領域をコードするＤＮＡがＩＬ−１７Ｒの膜貫通領域をコードするＤＮＡの直前で及びこれの代わりに、ＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡに融合する）を、実質的に実施例４に述べるように調製した。可溶性ｈＩＬ−１７Ｒタンパク質は実質的に実施例３に述べるように、又はＩＬ−１７Ｒ若しくはそのフラグメントの細胞外領域を調製し、発現する任意の他の方法によって調製した。
実施例９
この実施例は、ネズミＩＬ−１７Ｒ遺伝子の位置付け（localization）と充分なマッピングとを示す。ゲノム全体にわたる９００遺伝標識形質（genetic marker）にわたって特徴付けられた種間交雑からのＤＮＡサンプルのパネルを分析した。遺伝標識形質は、各マウスの常染色体及びＸ染色体（Ｃｈｒ）上の５０〜８０センチモルガン（centi-Morgan）のこのマップ範囲に包含された（ＳａｕｎｄｅｒｓとＳｅｌｄｉｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：５２４，１９９０；Ｗａｔｓｏｎ等，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２：１５８，１９９２）。
最初に、両親のマウスからのＤＮＡ［Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ−ｇｌｄと、（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ−ｇｌｄｘＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１］を種々な制限エンドヌクレアーゼによって消化させ、ＩＬ−１７Ｒ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて、制限フラグメント長さ変異体（ＲＦＬＶｓ）を評価し、ハプロタイプ分析を可能にした。情報を与える（informative）Ｂｇｌ１  ＲＦＬＶが検出された：（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ−ｇｌｄ，１０．０ｋｂ；Ｍｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ，７．８ｋｂと２．２ｋｂ）。各戻し交雑マウスでは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ−ｇｌｄ親バンド又は３バンドの全て（両方のＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓバンドと、半分の強度のＣ３Ｈ／ＨＥＪ−ｇｌｄバンド）が観察され、このことは単一遺伝子座が検出されたことを示す。
ＩＬ−１７Ｒ  ＲＦＬＶのハプロタイプ分布の比較は、この遺伝子がマウスＣｈｒ６上のＲａｆ１遺伝子座によって試験された１１４減数分裂イベントの中の１１１にコセグレゲートする（cosegregated）ことを実証した。最良の遺伝子オーダー（gene order）（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２：３４９，１９８５）±標準偏差（Ｇｒｅｅｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ｅ．Ｇｒｅｅｎ編集；Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７７〜１１３頁，１９８１）は、（動原体）Ｒａｆ１−２．６ｃＭ±１．５ｃＭ−ＩＬ−１７Ｒ−２．５ｃＭ±１．５ｃＭ−Ｃｄ４であった。
実施例１０
この実施例は、可溶性ＩＬ−１７Ｒがインビボにおける器官移植片の拒絶を抑制することを実証する。新生児Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウス（生後２４時間未満）からの心臓を、実質的に米国特許第５，４９２，８８８号（１９９６年２月２０日発行）に述べられているように、成体ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）レシピエントの耳介（ear pinnae）に移植した（Ｔｒａｇｅｒ等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４７：５８７，１９８９とＶａｎ  Ｂｕｒｅｎ等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１５：２９６７，１９８３とによって述べられるように改良された、Ｆｕｌｍｅｒ等，Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１１３：２７３，１９６３の方法を用いて）。麻酔されたレシピエントの耳−心臓移植片を移植後５又は６日目に開始して、軟反射光による解剖顕微鏡下で検査することによって判定されるように、移植片を摶動活性に関して目視検査することによって、移植された心臓の生残を評価した。移植片拒絶時間は、収縮活性が停止した移植後の日として定義された。
１セットの実験では、新生児心臓を取り出し、滅菌したＰＢＳによってすすぎ洗いして過剰な血液を除去し、用意した耳介に挿入した。レシピエントマウスには、可溶性ネズミＩＬ−１７Ｒ／Ｆｃ（２００μｌ中に１００μｇ；本明細書の実施例４参照）又は対照としてのラットＩｇＧを移植後０〜３日目まで腹腔内投与した。第２セットの実験では、レシピエントマウスに、ＩＬ−１７Ｒ又はＩｇＧを０、１及び２日目に注入した；量と投与ルートは以前に実施した通りであった（ass done previously）。これらの実験の結果は表１に示す。
0004373495.tif 000002
表１は、ラットＩｇＧで処理された個々の対照マウスでは心臓同種移植片が約１３日間生残したことを示す。同種移植片レシピエントに可溶性ＩＬ−１７Ｒを４日間まで毎日投与した場合には、移植片生残は対照マウスにおける同じ移植片の生残時間よりも約７日間長い２０日間のメジアン生残時間で延長した。アルギネートビーズ中に可溶性ＩＬ−１７Ｒを封入することによってＩＬ−１７Ｒの持続放出が得られた場合には、１００μｇの可溶性ＩＬ−１７Ｒの単回投与が溶液中の可溶性ＩＬ−１７Ｒによって以前に観察されたと殆ど同じように移植片生残を延長したことが観察された。これらの結果は、可溶性ＩＬ−１７Ｒが移植された組織の拒絶を抑制することを実証する。
実施例１１
この実施例は、可溶性ＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡがインビボにおける器官移植片の拒絶抑制に有用であることを実証する。新生児Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウスからの心臓を、上記実施例１０に述べたように、成体ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）レシピエントの耳介に移植した、但し、この場合には、ＩＬ−１７Ｒ／ＦｃをコードするＤＮＡ（ｐＤＣ４０９−ＩＬ−１７Ｒ；実施例４）又は対照ＤＮＡ（エンプティｐＤＣ４０９）のいずれかを約１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する１５μｌのＰＢＳを心臓の心室に注入した。３０ゲージ針を用い、心臓に対する外傷を最少にするように注意した。次に、トランスフェクトされた心臓をＢＡＬＢ／ｃレシピエントに移植し、移植片生残を既述したように判定した。結果は表２に示す。
0004373495.tif 000003
表２は、エンプティベクターでトランスフェクトされた個々の対照マウスでは心臓同種移植片が約１５日間生残したことを示す。移植される心臓を可溶性ＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡでトランスフェクトする場合には、移植片生残は延長された。この群における５匹のマウスの中の３匹に関しては、移植片は平均して、対照マウスにおける同じ移植片の生残時間よりも９日間長い、約２４日間生残した。他の２匹のマウスに移植された移植片は、移植後６０日間を越えてまだ摶動し（即ち、拒絶されていず）、レシピエントによって明らかに受容されていた。これらの結果は、移植されるべき組織を可溶性ＩＬ−１７ＲをコードするＤＮＡによってトランスフェクトすると、レシピエントによるこのような組織の拒絶が軽減されることを実証する。
配列表
（２）配列番号：１
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：３２８８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：マウス
（Ｂ）クローン：ＨＶＳ１３  受容体
（ix）特徴：
（Ａ）ＮＡＭＡ／ＫＥＹ：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１２１．．２７１５
（xi）配列：配列番号１：
0004373495.tif 000004
0004373495.tif 000005
0004373495.tif 000006
0004373495.tif 000007
0004373495.tif 000008
（２）配列番号：２
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：８６５アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：
0004373495.tif 000009
0004373495.tif 000010
0004373495.tif 000011
0004373495.tif 000012
（２）配列番号：３
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：無関係
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：ＦＬＡＧ（登録商標）  ペプチド
（xi）配列：配列番号３：
0004373495.tif 000013
（２）配列番号：４
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：２１３アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：無関係
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：ＩｇＧ１  Ｆｃ
（xi）配列：配列番号４：
0004373495.tif 000014
（２）配列番号：５
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：無関係
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：ポリリンカー
（xi）配列：配列番号５：
0004373495.tif 000015
（２）配列番号：６
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：４９８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：マウス  ＣＴＬＡ−８
（Ｂ）クローン：
（ix）特徴：
（Ａ）ＮＡＭＡ／ＫＥＹ：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１４．．４９０
（ix）特徴：
（Ａ）ＮＡＭＡ／ＫＥＹ：シグナルペプチド
（Ｂ）存在位置：１４．．８８
（ix）特徴：
（Ａ）ＮＡＭＡ／ＫＥＹ：成熟ペプチド
（Ｂ）存在位置：８９．．４８７
（xi）配列：配列番号６：
0004373495.tif 000016
（２）配列番号：７
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：１５９アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号７：
0004373495.tif 000017
（２）配列番号：８
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：１５１アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：無関係
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  Ｓａｉｍｉｒｉ
（Ｂ）クローン：ＯＲＦ１３
（xi）配列：配列番号８：
0004373495.tif 000018
（２）配列番号：９
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：３２２３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（Ｂ）クローン：ＩＬ−１７Ｒ
（ix）特徴：
（Ａ）ＮＡＭＡ／ＫＥＹ：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：９３．．２６９３
（xi）配列：配列番号９：
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0004373495.tif 000020
0004373495.tif 000021
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（２）配列番号：１０
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：８６７アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１０：
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