(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコ細胞質多角体病ウイルスの外殻構成タンパク質の一つであるＶＰ３のＣ末端に目的タンパク質を融合した融合タンパク質をコードする遺伝子と、カイコ細胞質多角体病ウイルスの外殻構成タンパク質であるポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子とを昆虫細胞中で共発現させて該細胞内において産生された、目的タンパク質をポリヘドリンタンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体。
【請求項２】
ポリヘドリンタンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしている請求項１のタンパク質複合体。
【請求項３】
粒子状で産生される請求項１または２のタンパク質複合体。
【請求項４】
ポリヘドリンタンパク質が結晶化する際に、目的タンパク質を結晶状体で取り込んで産生されたものである請求項１、２または３のタンパク質複合体。
【請求項５】
目的タンパク質が、酵素、抗原、タンパク質に他のタンパク質などの生体関連化学物質を結合させたもの、光化学特性を有するタンパク質、および電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質よりなる群より選ばれる請求項１ないし４のいずれかのタンパク質複合体。
【請求項６】
カイコ細胞質多角体病ウイルスの外殻構成タンパク質の一つであるＶＰ３のＣ末端に目的タンパク質を融合した融合タンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターをカイコ細胞質多角体病ウイルスの外殻タンパク質であるポリヘドリンタンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターとともに昆虫細胞に感染させたのち、この細胞を培養して、その中で目的とするタンパク質をポリヘドリンタンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させるタンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
目的とするタンパク質が、酵素、抗原、光化学特性を有するタンパク質、および電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質よりなる群より選ばれる請求項６のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
請求項６または７の方法によりタンパク質複合体を作製し、それを回収することにより、純度の高い目的とするタンパク質試料を回収するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、昆虫細胞、植物細胞などの細胞を使った外殻タンパク質で包み込まれた各種タンパク質、例えば酵素タンパク質、ケイ光タンパク質、免疫抗体タンパク質などを純粋な状態、好ましくは結晶で得るための技術に関するものである。
背景技術
タンパク質をタンパク質で包み込むという方法は、溶解したタンパク質溶液にて結晶状のタンパク質の表面に塗布するなどの方法が考えられるが、実際上は、結晶状のタンパク質を溶解せずに、タンパク質溶液を塗布しコーティングするという作製方法はきわめて難しい。また、酵素などの有用タンパク質を保護する目的にては、タンパク質でコーティングする例はほとんどない。
タンパク質を保護する方法としては、多糖類高分子やポリエチレングリコールなどの高分子をタンパク質に共有結合させるなどの処理による方法がとられている。タンパク質の官能基であるアミノ基やカルボニル基などに温和な反応条件にて結合させる方法であるが、結合部位などを制御することはできず、結合部位はタンパク質により異なる。ゆえに、この保護法は、すべてのタンパク質に対しても適用できる技術ではない。
タンパク質の保存を目的としては、低温度で保存する方法がとられたり、多糖類高分子やポリエチレングリコールなどのタンパク質構造を安定化させる機能があると期待される物質などを添加、混合したりする方法であるが、いづれも、外的な環境変化、特に、水が周辺に出現した場合には、あるいは、湿度が上昇、あるいは、結露した場合には、添加した物質ともに保護するべきタンパク質が溶解され、安定性を失うことになる。また、微生物などの生物により分解捕食を受けるなどにより機能を失う。
一部の酵素や抗体タンパク質分子のような高分子性のタンパク質はその一部がタンパク質分解酵素の働きによって分解を受けるとその機能を完全に消失する。また、このような高分子性のタンパク質はその高次構造を保持する働きが弱いため、冷凍保存などによってもその機能を速やかに消失してしまう。
一方、目的とするタンパク質の保護の安定性を調べるには、そのタンパク質を取り出してその目的タンパク質の個々の機能を調べる必要がある。
一方、タンパク質の結晶を得る方法としては、高濃度のタンパク質溶液に、適当な金属塩などを添加するなどの結晶化条件を探索して小型の結晶を得る方法が一般的であるが、この結晶化には法則性がなく、結晶化の対象とするタンパク質種類ごとに膨大な条件を検討する必要がある。
発明の開示
酵素などの有用なタンパク質を実用に供する場合に、タンパク質の性能維持が重大な問題であった。すなわち、タンパク質は、室温で保存あるは、放置することにより、その機能である触媒活性を失うことが一般的であり、ゆえに、機能を維持したままの保存には、冷蔵庫などの低温での放置あるいは保管が必要であった。その性能維持のための技術は、このタンパク質の保存性の付与、安定性の向上の課題を解決できる手法であり、室内での温度条件にて、今までのタンパク質保存方法と比べて、優れて安定に機能を維持できることが、課題である。
本発明は、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせた性能維持効果をもたらした酵素などの有用な目的タンパク質を提供することを目的とする。
また、酵素などの有用タンパク質を水溶液中に存在させて、その機能を長期間維持させることが課題である。そのための技術として、有用タンパク質に保護タンパク質をコーティングする技術が必要である。コーティングする技術は、有用タンパク質への外界からの影響、すなわち、水分によるタンパク質の溶解や、微生物などによる分解作用・捕食などの有用タンパク質の機能を喪失させられる状況を回避できる。
本発明は、保護タンパク質をコーティングした酵素などの有用な目的タンパク質を提供することを目的とする。
また、タンパク質は、機能を有した生体高分子であるが、さまざまな発色団、光吸収分子を内包しており、その光学的特性や、電子特性などが期待されるところであるが、そのような用途に適用する場合において、アモルファス状態である乾燥標品の状態ではなく、結晶状態のタンパク質が必要と考えられ、そのような結晶状態のタンパク質を造りだすことが課題である。そのための技術として、まず、その結晶状態のタンパク質を供する技術が必要である。一般に、タンパク質の結晶は、極めて、作製が困難であり、結晶状態のタンパク質を容易に作製すること、および、均質な結晶を作製することが、該技術の解決しようとする課題である。
そこで、本発明は、酵素などの有用な目的タンパク質を結晶状態で調製すること、より詳細には細胞内で結晶化して産生するタンパク質を、目的タンパク質をコーティングするための保護タンパク質とすることで、酵素などの有用な目的タンパク質を結晶状態で調製することを目的とする。
また、本発明は、遺伝子組み換え技術を利用して、酵素などの有用な目的タンパク質を結晶状態で簡単に調製する方法を提供することを目的とする。
細胞内で結晶化して産生するタンパク質を利用する技術は、タンパク質のまったく新規な素材開発について、用途を開くためのきわめて有効な技術である。
細胞質多角体病ウイルスは感染の後期に、その感染細胞においてた角体タンパク質からなる多角体を形成し、その中に多数のウイルス粒子を包埋する。この多角体の中にウイルス粒子が特異的に入る理由は、同ウイルス粒子の外殻タンパク質と多角体タンパク質との間での特異的な関係によるものであることがわかっている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，９８８−９９５（２００１））。
本発明は、この多角体の中に高分子性の目的タンパク質を包埋させ、またその包埋効率を高めることを目的とする。そこで、細胞質多角体病ウイルスの外殻タンパク質をコードする遺伝子を短くすることにより、多角体の中に包埋させることができるタンパク質のサイズ（分子量）を大きくし、さらに効率良く多角体の中にこの目的とするタンパク質を包埋させる。
また、多角体の中に目的タンパク質を包埋させることによって、どれくらい長期間その目的タンパク質の機能を保持できるのかを調べるには、目的タンパク質を多角体から取り出して調べる必要があった。本発明は、多角体の中に目的タンパク質を包埋させる際に、これと同時に緑色蛍光タンパク質などの蛍光や発光機能を有するタンパク質を包埋させることにより、常時目的タンパク質の機能が検査できるようにすることを目的とする。
本発明は、細胞内において産生された、より具体的には粒子状で産生された、目的タンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を要旨としている。
外殻タンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしており、その場合、本発明は、細胞内において産生された、より具体的には粒子状で産生された、目的タンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造の、外殻タンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体である。
外殻タンパク質が結晶化する際に、目的タンパク質を結晶状体で取り込んで産生されたものであり、その場合、本発明は、細胞内において、外殻タンパク質が結晶化する際に、目的タンパク質を結晶状体で取り込んで産生された、より具体的には粒子状で産生された、目的タンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体、好ましくは外殻タンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体である。
外殻タンパク質が、多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質であり、その場合、本発明は、細胞内において産生された、好ましくは多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質が結晶化する際に、目的タンパク質を結晶状体で取り込んで産生された、より具体的には粒子状で産生された、目的タンパク質を該多角体タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体、好ましくは該多角体タンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体である。
細胞が昆虫細胞または植物細胞であり、その場合、本発明は、昆虫細胞内または植物細胞内において産生された、好ましくは多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質が結晶化する際に、目的タンパク質を結晶状体で取り込んで産生された、より具体的には粒子状で産生された、目的タンパク質を該多角体タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体、好ましくは該多角体タンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体である。
目的タンパク質が、酵素、抗原、タンパク質に他のタンパク質などの生体関連化学物質を結合させたもの、光化学特性を有するタンパク質、および電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質よりなる群より選ばれており、その場合、本発明は、細胞内（昆虫細胞内または植物細胞内）において産生された、好ましくは多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質が結晶化する際に、酵素、抗原、タンパク質に他のタンパク質などの生体関連化学物質を結合させたもの、光化学特性を有するタンパク質、および電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質よりなる群より選ばれる目的タンパク質を結晶状体で取り込んで産生された、より具体的には粒子状で産生された、目的タンパク質を該多角体タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体、好ましくは該多角体タンパク質が、目的タンパク質に対して、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体である。
また、本発明は、細胞内において、目的とするタンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させるタンパク質複合体の製造方法を要旨としている。
細胞が昆虫細胞または植物細胞であり、その場合、本発明は、昆虫細胞または植物細胞内において、目的とするタンパク質を外殼タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させるタンパク質複合体の製造方法である。
目的とするタンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターを外殻タンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターとともに細胞に感染させたのち、この細胞を培養して、その中で目的とするタンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させており、その場合、本発明は、昆虫細胞または植物細胞内において、目的とするタンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターを外殻タンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターとともに細胞に感染させたのち、この細胞を培養して、その中で、目的とするタンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させるタンパク質複合体の製造方法である。
目的とするタンパク質が、酵素、抗原、光化学特性を有するタンパク質、および電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質よりなる群より選ばれており、その場合、本発明は、昆虫細胞または植物細胞内において、酵素、抗原、光化学特性を有するタンパク質、および電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質よりなる群より選ばれる目的とするタンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させる、より具体的には目的とするタンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターを外殻タンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターとともに細胞に感染させたのち、この細胞を培養して、その中で、目的とするタンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体を産生させるタンパク質複合体の製造方法である。
また、本発明は、上記のいずれかの方法によりタンパク質複合体を作製し、それをを回収することにより、純度の高い目的とするタンパク質試料を回収するタンパク質の製造方法を要旨としている。
発明を実施するための最良の形態
＜目的とするタンパク質＞
外殻タンパク質で包み込まれる目的とするタンパク質（目的タンパク質）は、いわゆる機能性タンパク質であり、好ましくは結晶状態で存在する。
目的とするタンパク質は、酵素・抗原・蛍光発光、高屈折率、光電変換等の光化学特性を有する光化学特性を有する機能性タンパク質・電子伝達反応、酸化還元反応等の電子授受反応の特性を有する機能性タンパク質が例示される。より具体的には、紫外線を照射するとケイ光を発するケイ光タンパク質、生体触媒作用を示す酸素タンパク質、免疫抗体タンパク質、インターフェロン、インターロイキンなどの生理活性タンパク質が例示される。
＜外殻タンパク質＞
外殻タンパク質は、より具体的にはウィルスによってコードされた外殻タンパク質であり、このウィルスがコードする外殻タンパク質は、昆虫の多角体病ウィルスによってコードされた多角体タンパク質である。例えば、昆虫の細胞質多角体病ウィルスコート外殻タンパク質として、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＢｍＣＰＶ）の外殻タンパク質（細胞質多角体タンパク質）が例示される。
細胞質多角体病ウイルスはレオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）のサイボウイルス属（Ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ）に分類される。このウイルスは昆虫の中腸皮膜組織の円筒細胞に感染し、感染した細胞の細胞質に多角体と呼ばれる大きなタンパク質の結晶を産生するという特徴を持っている。この多角体には多数のウイルス粒子が包埋されている。また、多角体はウイルスがコードする多角体タンパク質がウイルスの感染後期に発現され、結晶化したものである。
多角体の機能の一つに、ウイルス病の水平感染において外界からウイルス自身の感染力を保護することが挙げられる。すなわち、多角体は非イオン性やイオン性の界面活性剤、酸性や中性のｐＨの溶液にも全く溶解しない。また、紫外線照射を受けても、包埋されたウイルスには影響が及ぼされない。さらに、細菌による腐敗によっても多角体は溶解しないため、その中のウイルスは保護される。
もう一つの機能として、ウイルスを目的の場所（ウイルスが感染し、増殖できる細胞）まで確実に運ぶということである。すなわち、昆虫に摂食された多角体は強アルカリ性の消化液により溶解し、ウイルス粒子が放出され感染が生じる。
カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＢｍＣＰＶ）のウイルスゲノムは１０本に分節された二本鎖ＲＮＡである（セグメント１から１０でそれぞれＳ１からＳ１０と表記する）。多角体を構成するタンパク質である多角体タンパク質（ポリヘドリン、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）はそのうちの最も小さいＳ１０にコードされており、分子量は３０ｋＤａである。ＢｍＣＰＶのウイルス粒子はＶＰ１（１５１ｋＤａ），ＶＰ２（１４２ｋＤａ），ＶＰ３（１３０ｋＤａ），ＶＰ４（６７ｋＤａ），ＶＰ５（３３ｋＤａ）の５種類のタンパク質から構成されている。１２５Ｉを用いたＢｍＣＰＶの標識実験から、とＶＰ１とＶＰ３がウイルスの外層を構成しているタンパク質であることがわかっている（Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０，１０５３−１０７０）。ウサギの網状赤血球を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ実験が行われ、このウイルスの外層を構成するタンパク質であるＶＰ１とＶＰ３はそれぞれＳ１とＳ４にコードされているものと推定された（ＭｃＣｒａｅ  ａｎｄ  Ｍｅｒｔｅｎｓ（１９８３）ｉｎ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，３５−４１）。
このＢｍＣＰＶの外層を構成するタンパク質の一つであるＶＰ３をコードしているＳ４の解析によって、Ｓ４の全長３，２５９塩基で、１４番目から１６番目までの開始コドン（ＡＴＧ）と３，１８５番目から３，１８７番目までの終了コドン（ＴＡＡ）を持つ一つの大きなｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）持つことがわかった。このＯＲＦは１，０５７個のアミノ酸から構成されており、ＶＰ３の分子量は約１３０ｋＤａであると推定される。
細胞質多角体タンパク質分子を組み込んだウイルスベクター及び機能性タンパク質分子を組み込んだウイルスベクターの調製方法を、細胞質多角体病ウイルスとして、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を用いた場合について説明する。
多角体タンパク質分子を組み込んだウイルスベクターの調製は、例えばオートグラファ・キャリホルニカ・核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）由来のバキュロウイルスベクターに、公知方法［「ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）」，第７４巻，第９９〜１０２ページ参照］を用いて、ポリヘドリン遺伝子を組み込むことによって行われる。
他方、機能性タンパク質分子を組み込んだウイルスベクターの調製は、例えば先ずカイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）の外層構成タンパク質の一つであるＶＰ３のＣ末端に機能性タンパク質を連結した融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作製し、次いで前記のオートグラファ・キャリホルニカ・核多角体病ウイルス由来のバキュロウイルスベクターに導入することによって行われる。
次に、このように調製した２種のウイルスベクターを昆虫の組織細胞に感染させるには、この２種のウイルスベクターを液体状で同時に昆虫細胞に接種し、室温で０．５〜３時間放置して、ウイルスを細胞に十分に吸着させたのち、ウイルス液を除去し、仔ウシ胎児血清を含む培養液を加え、２０〜３０℃の温度で２〜１０日間培養する。
次いで、この培養液から感染細胞を分離し、冷却下に摩砕し、摩砕液からろ過又は遠心分離により多角体を含む固形分を回収すれば、所望のタンパク質複合結晶体が得られる。
このようにして得られるタンパク質複合結晶体は、必要に応じ、さらに密度勾配法による分画、緩衝液による洗浄などを行って精製することができる。
このようにして、細胞質多角体タンパク質結晶に対し、質量比１／１０〜１／１０００の範囲で機能性タンパク質微結晶を含むタンパク質複合結晶体が得られる。
この場合、機能性タンパク質のＮ末端又はＣ末端に細胞質多角体病ウイルスの外層を構成するタンパク質であるＶＰ３のアミノ酸配列を導入し、この融合タンパク質をバキュロウイルスベクターで発現させるが、この際、細胞質多角体病ウイルスの多角体を発現するウイルスとともに、昆虫細胞に感染させることにより、多角体中に融合タンパク質が包理される。このために、バキュロウイルスベクターで発現させた外来タンパク質、すなわち機能性タンパク質が、細胞質多角体病ウイルスの構成タンパク質のＮ末端又はＣ末端に挿入されるように、細胞質多角体病ウイルスの構成タンパク質をコードするｃＤＮＡと外来タンパク質遺伝子とを結合させる必要がある。この際、構成タンパク質と外来タンパク質遺伝子のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームがインフレームになるようにすることが重要であり、このようにして細胞質多角体病ウイルスの構成タンパク質と外来タンパク質を１つの融合タンパク質として発現させる組み換えバキュロウイルスが形成される。
＜目的タンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ構造のタンパク質複合体＞
目的タンパク質が外殻タンパク質（細胞質多角体タンパク質結晶）の中に分散状態で含まれるタンパク質複合結晶体でる。細胞内において、外殻タンパク質が結晶化する際に、目的タンパク質を取り込んで、好ましくは結晶状態で取り込んで、粒子状で産生されたものである。第１図は、本発明のタンパク質複合結晶体の一例の顕微鏡拡大写真であり、これから明らかなように、機能性タンパク質微結晶は、細胞質多角体タンパク質結晶中に分散した状態で含まれている。
＜タンパク質複合体を産生するための細胞＞
タンパク質複合体を産生するために用いる細胞は、ウイルスに感染できる細胞であれば特に制限されるものではない。細胞は昆虫でも昆虫細胞よく、植物体でも植物細胞でもよい。
＜昆虫において産生されたタンパク質複合結晶体＞
タンパク質複合結晶体は、例えば多角体タンパク質分子を組み込んだウイルスベクターと、機能性タンパク質分子を組み込んだウイルスベクターを別々に調製し、次いでこの２種のウイルスベクターを昆虫の組織細胞に同時に感染させ、この２種のウイルスに感染した昆虫細胞中で多角体を生成させたのち、この多角体を結晶として取り出すことによって製造することができる。このように、細胞質多角体病ウイルスと機能性タンパク質をコードしたウイルスとを同時に感染させることにより、一挙に機能性タンパク質微結晶を内部に分散含有する多角体タンパク質結晶が得られる。
上記の２種のウイルスベクターを感染させるために用いる昆虫は、ウイルスに感染できる細胞であれば特に制限されるものではないが、一般に、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に属するもの、特にシヤクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、ヤママユガ（Ｓａｌｕｒｎｉｉｄａｅ）、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｅｔｕｉｄａｅ）に属するものが用いられる。入手が容易で取り扱いやすい点で、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｌ）、ムガサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ  Ｈｅｌｆｅｒ）、ネキリムシ（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ  ｓｐ．）、アワヨトウ（Ｌｅｕｃａｎｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ  Ｈｏｗｏｒｔｈ）などが通常用いられている。
このＶＰ３をコードしているＳ４の１３５８番目と２７１１番目に存在する制限酵素サイトＸｂａＩ間を欠落させたＶＰ３／ＧＦＰのキメラ遺伝子（ＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰ）を作製した。次に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）由来のバキュロウイルスベクターに導入し、このＶＰ３（ＸｂａＩ）とＧＦＰの融合タンパク質を昆虫細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（Ｓｆ２１）で発現させた。その際、ＢｍＣＰＶの立方体の多角体を形成するために、ポリヘドリン遺伝子を組み込んだ組み換えＡｃＮＰＶ（ＡｃＣＰ−Ｈ）（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９９−１０２）も同時にＳｆ２１細胞に接種した。２つのウイルスに感染したＳｆ２１細胞から多角体を精製し、この融合タンパク質が多角体の中に包埋されアルカリ条件下において多角体が溶解するのと同時に放出されるかどうかを緑色蛍光を用いて調べた。その結果、ＶＰ３（ＸｂａＩ）とＧＦＰから成る融合タンパク質はＶＰ３とＧＦＰから成る融合タンパク質の発現の場合と同様に、多角体の溶解に伴って放出されたことから、この融合タンパク質は多角体の中に特異的に取り込まれていることがわかった。これにより、多角体と呼ばれる粒子内に目的とするタンパク質（目的タンパク質）を取り込ませる方法、および、目的タンパク質をポリヘドリンと呼ばれるタンパク質で包み込んだ粒子を作製する方法においてＶＰ３を短くすることが可能であることを示した。
＜各種機能性タンパク質結晶を純粋な状態で製造すること＞
タンパク質複合結晶体中の細胞質多角体タンパク質結晶がアルカリ性溶液に溶解するが、その内部に包理されていた機能性タンパク質微結晶は、アルカリに対して安定である。したがってこのタンパク質複合結晶体を利用すれば、各種機能性タンパク質結晶を純粋な状態で製造することができる。
本発明は、機能性タンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターを細胞質多角体病ウイルスの細胞質多角体タンパク質ＤＮＡを組み込んだウイルスベクターとともに昆虫細胞に感染させたのち、この昆虫細胞を培養して、その中で機能性タンパク質結晶を包理した細胞質多角体タンパク質結晶からなるタンパク質複合結晶体を生成させ、次いでこのタンパク複合結晶体をアルカリ性水溶液中に溶出させたのち、この溶出液から機能性タンパク質結晶を分離回収することを特徴とする純粋な機能性タンパク質結晶の製造方法を提供するものである。
具体的には、機能性タンパク質を含む多角体をアルカリ、例えば水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８．０以上、好ましくは８．５〜１１．０に調整するとタンパク質結晶体は溶解するが、これを再び中性に戻すと、細胞質多角体タンパク質のみが沈澱してくるので、これを細胞残さとともに、遠心分離又はろ過により除くと機能性タンパク質のみを含む溶液が得られる。
この際の緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液など通常の遺伝子操作に慣用されている緩衝液を用いることができる。処理速度としては、室温すなわち５〜３０℃の範囲の温度が用いられるが、所望ならば機能性タンパク質がそこなわれない範囲で加温することもできるし、また所望ならば溶解を促進するために、緩やかにかきまぜたり、振りまぜることもできる。
次に、このようにして得た機能性タンパク質のみを含有する緩衝液を濃縮、凍結乾燥、分画塩析など溶液中からタンパク質結晶を回収する際に慣用されている方法を施すことにより、上記の溶液から純粋の状態で機能性タンパク質結晶を回収することができる。
次に、本発明を、植物において産生されたタンパク質複合結晶体を例に説明する。
本発明の植物において産生されたタンパク質複合結晶体は、外殻タンパク質結晶と目的とするタンパク質微結晶との２種の結晶から構成され、目的とするタンパク質微結晶は、外殻タンパク質結晶中に分散した状態で含まれている。
カイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）の外層タンパク質の一つであるＶＰ３のアミノ酸配列のデータベースを用いた解析から、このタンパク質は同じレオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類されているオリザウイルス属（Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ）やフィジウイルス属（Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ）に分類されている植物レオウイルスのウイルスキャプシッドタンパク質との間で高い相同性が見られた〔Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，９８８−９９５〕。このことより、ＢｍＣＰＶのウイルスキャプシッドタンパク質やポリヘドリンを植物で発現させた場合、昆虫細胞と同じ様な機能を持つタンパク質にプロセッシングされるものと期待された。
＜ＶＰ３／ＧＦＰ多角体の植物での発現＞
そこで、このＶＰ３のＣ末端に、機能性タンパク質として緑色タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）を連結し、ＶＰ３とＧＦＰから成る融合タンパク質（ＶＰ３／ＧＦＰ）をコードするキメラ遺伝子を作製した。ＶＰ３／ＧＦＰ−キメラ遺伝子を含むプラスミドｐＡｃ  ＶＰ３／ＧＦＰと植物発現ベクターであるＴｉプラスミドｐＩＧ１２１を用いて３段階の過程で、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの下流にＶＰ３／ＧＦＰキメラ遺伝子をもつＴｉプラスミドベクターｐＩＧ  １２１−ＶＰ３／ＧＦＰを構築した。一方、ポリヘドリン遺伝子をｐＢＳ（ＫＳ）−ＨからＫｐｎ  Ｉ−Ｓａｃ  Ｉ断片として切り出し、これをｐＩＧ  １２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に挿入したベクターｐＩＧ  １２１−Ｈを構築した。アグロバクテリウム法によりｐＩＧ  １２１−Ｈを導入して発現を確認した植物（ジャガイモおよびベラドンナ）に、ｐＩＧ  １２１−ＶＰ３／ＧＦＰを導入することによって、両遺伝子をもつ形質転換植物を得た。ポリヘドリンおよびＧＦＰタンパク質が生成されていることをウエスタンブロッティング法で確認すると共に、顕微鏡観察によって多角体が構築されていることを確認した（第２図）。さらに顕微鏡下でこの植物組織をアルカリ処理したところ、極めて短時間で多角体は溶解することが経時的に観察され、アルカリ条件で溶解するという多角体の特徴を確認することができた（第３図）。なおこの際、多角体の中から放出されたＶＰ３／ＧＦＰキメラタンパク質に基づく緑色蛍光も観察されたが、植物自身の自家蛍光の妨害があるため、カイコ細胞のように明確なものではなかった。これにより、ポリヘドリン遺伝子およびＶＰ３／ＧＦＰのキメラ遺伝子発現系を含んでいるトランスジェニック植物において、多角体と呼ばれる粒子内に目的とするタンパク質（目的タンパク質）を取り込ませる方法、および、目的タンパク質をポリヘドリンと呼ばれるタンパク質で包み込んだ粒子を作製する方法が開発されたことを示した。
＜組み換え多角体の応用した相互作用するタンパク質の検出と単離＞
細胞の機能と秩序は種々の高分子物質の相互作用（タンパク質とタンパク質、ＤＮＡとタンパク質）に基づいて成り立っている。相互作用するこれらの物質を検出する方法としてこれまでにファーウエスタンブロット法やｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ法が開発されている。これらの方法では、相互作用する分子を抗体との反応やレポーター遺伝子の活性により間接的に検出するので、特に相互作用するタンパク質を細胞内にある自然な状態で、一段階で検出・単離することが困難であるのが一般的である。組み換え多角体を利用する本方法は、このような制約を解決しようとするものである。
相互作用する一組のタンパク質ＡとＢを考える。タンパク質Ａの遺伝子を用いて組み換え多角体を作り、分離する。合成されたタンパク質Ａの一部は、多角体表面に結合した状態にある。Ａと相互作用するタンパク質Ｂを含む細胞抽出液に、この多角体を混合して適当な時間反応させた後、遠心分離によって多角体を分離すると、Ｂは多角体表面のＡに結合した状態で、混在する多数のタンパク質から一段階で単離できる。この方法では電気泳動、膜へのブロッティング等の操作を必要としないので、Ｂを細胞から抽出された自然な状態で検出・単離することが可能となる。
またＡが遺伝子発現に関わるタンパク質であれば、ＢをゲノムＤＮＡ断片とすることによって、ＤＮＡとタンパク質の相互作用を検出するサウスウェスタン法の改良型として利用することも可能である。
植物において、上記の方法により目的タンパク質を包み込んだ粒子を作製し、その粒子を回収することにより、純度の高い目的タンパク質試料を回収する。
不安定な機能性タンパク質結晶を安定なタンパク質結晶中に閉じ込めて安定化する方法について、昆虫の中腸皮膜組織の円筒細胞に感染し、感染した細胞の細胞質に多角体と呼ばれる大きなタンパク質の結晶を産生する細胞質多角体病ウイルスを利用することにより、上記の多角体病ウイルスタンパク質結晶中に種々機能性タンパク質結晶を分散状態で閉じ込めたタンパク質複合結晶体を形成しうる。
細胞質多角体病ウイルス由来の多角体（細胞質多角体）に特定のタンパク質を取り込ませることにより、このタンパク質に他のタンパク質などの生体関連化学物質を結合させることができ、細胞質多角体に生体関連化学物質が結合した状態で回収しうる。
ある特定のタンパク質のみを回収する方法としては、そのタンパク質に対する特異抗体をあらかじめ作製し、タンパク質と抗体との間に生じる抗原抗体反応を用いて、沈澱産物などとして回収する方法が用いられている。しかし、この方法では、分離をすることを目的とするタンパク質は高純度に精製され、さらにそれに対して抗体を作製しなければならない。これに対して、細胞質多角体の中にある特定のタンパク質を取り込ませ、これを細胞抽出液などの未精製のサンプル中に加えると、細胞質多角体の表面に分布しているタンパク質と未精製のサンプル中に存在する生体関連化学物質が結合する。細胞質多角体は遠心操作などにより容易に集めることができるため、細胞質多角体に結合した状態で、結合した生体関連化学物質を回収することができる。さらに、多角体に特定のタンパク質を取り込ませる場合、そのタンパク質をコードする遺伝子があれば細胞質多角体の中に取り込ませることができる。このため、ゲノム解析によって得られた未知の遺伝子によってコードされたタンパク質の機能を解析することが可能となる。
Ｘ線解析に必須であるタンパク質の結晶を得るための結晶を得るために、細胞質多角体にタンパク質を結晶状態で取り込ませる。これをＸ線解析し、さらに他の物質を含まない空の状態の細胞質多角体をＸ線解析し、得られた２つの結果を比較することにより、細胞質多角体に取り込まれたタンパク質のＸ線解析を行うことができる。
細胞質多角体にタンパク質を結晶状態で取り込ませ、得られた細胞質多角体を核として、タンパク質の結晶を作製しうる。
タンパク質の立体構造を解析する手段として、Ｘ線解析による手法が用いられる。これにはタンパク質の結晶が必要となる。しかし、タンパク質の結晶を得るにはタンパク質を高純度に精製し、タンパク質それぞれの性質に適した結晶条件を探し、結晶を得ることが必要である。通常この操作には約半年の期間あるいはそれ以上の時間を要する。また、タンパク質によっては結晶を得ることができないことも多い。しかし、細胞質多角体のタンパク質を結晶状態で取り込ませることができるため、細胞質多角体にタンパク質を取り込ませた状態で直接Ｘ線解析する、もしくはそれを核として結晶を成長させる。後者の場合、通常、タンパク質の結晶を作製するためには結晶の核があれば、容易に結晶を得ることができるため、この細胞質多角体は結晶を作製するための重要な手法となる。
細胞質多角体にタンパク質を取り込ませる際、そのタンパク質に緑色蛍光タンパク質などを融合タンパク質として組込むことによって、発光などにより、そのタンパク質が取り込まれている状態を容易に識別できる。
細胞質多角体に目的とするタンパク質が取り込まれているかどうかを判定するには、多角体を回収し、アルカリ溶液（ｐＨ１１）中でこの多角体を溶解させ、その中に取り込まれているタンパク質を取り出す。しかし、緑色蛍光タンパク質などの発光するタンパク質とともに細胞質多角体に入れることによって、細胞質多角体の発光の有無により、目的とするタンパク質の取込みが確認できる。
酵素などの有用なタンパク質を実用に供する場合に、タンパク質の性能維持が重大な問題であった。すなわち、タンパク質は、室温で保存あるは、放置することにより、その機能である触媒活性を失うことが一般的であり、ゆえに、機能を維持したままの保存には、冷蔵庫などの低温での放置あるいは保管が必要であった。その性能維持のための技術は、このタンパク質の保存性の付与、安定性の向上の課題を解決できる手法であり、室内での温度条件にて、今までのタンパク質保存方法と比べて、優れて安定に機能を維持できることが、課題である。
本発明は、安定性向上または保護または保存性向上または、それら効果のいづれかの組み合わせた性能維持効果をもたらした酵素などの有用な目的タンパク質を提供することができる。
また、酵素などの有用タンパク質を水溶液中に存在させて、その機能を長期間維持させることが課題である。そのための技術として、有用タンパク質に保護タンパク質をコーティングする技術が必要である。コーティングする技術は、有用タンパク質への外界からの影響、すなわち、水分によるタンパク質の溶解や、微生物などによる分解作用・捕食などの有用タンパク質の機能を喪失させられる状況を回避できる。
本発明は、保護タンパク質をコーティングした酵素などの有用な目的タンパク質を提供することができる。
また、タンパク質は、機能を有した生体高分子であるが、さまざまな発色団、光吸収分子を内包しており、その光学的特性や、電子特性などが期待されるところであるが、そのような用途に適用する場合において、アモルファス状態である乾燥標品の状態ではなく、結晶状態のタンパク質が必要と考えられ、そのような結晶状態のタンパク質を造りだすことが課題である。そのための技術として、まず、その結晶状態のタンパク質を供する技術が必要である。一般に、タンパク質の結晶は、極めて、作製が困難であり、結晶状態のタンパク質を容易に作製すること、および、均質な結晶を作製することが、該技術の解決するとする課題である。
そこで、本発明は、酵素などの有用な目的タンパク質を結晶状態で調製すること、より詳細には細胞内で結晶化して産生するするタンパク質を、目的タンパク質をコーティングするための保護タンパク質とすることで、酵素などの有用な目的タンパク質を結晶状態で調製することができる。
また、本発明は、遺伝子組み換え技術を利用して、酵素などの有用な目的タンパク質を結晶状態で簡単に調製する方法を提供することができる。
細胞内で結晶化して産生するするタンパク質を利用する技術は、タンパク質のまったく新規な素材開発について、用途を開くためのきわめて有効な技術である。しかしながら、これまでのように昆虫ウイルス遺伝子発現ベクターであるバキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞で多角体の作製やその中に目的タンパク質を取り込ませる場合、多角体の中にバキュロウイルスが混入する危険性がある。一方、多角体を昆虫細胞から精製する場合においてもその試料中に同様にバキュロウイルスが混入する危険性がある。目的タンパク質を取り込ませた多角体を大量に必要とする場合、昆虫細胞を何らかの方法で大量増殖させ、これに組み換えバキュロウイルスベクターを感染させる必要があり、莫大なコストが必要となる。
しかし、植物において多角体を作らせることも可能であることから、これに目的タンパク質を取り込ませることにより、上記のようなウイルス混入の危険性およびコストの問題点を解決できる。
本発明における細胞質多角体病ウィルス等のウィルスの外殻タンパク質（多角体タンパク質）とは、細胞内で結晶化することにより、多角体と呼ばれる粒子を形成する。この結晶化の際、この粒子に包み込まれる目的タンパク質も同様に結晶状体で取り込まれる。このため、目的タンパク質の結晶を得るために不可欠である結晶化のための核として、この粒子内に取り込まれた目的タンパク質を利用できる。
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
《ウイルスと細胞》
カイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）のＨ株は細胞質に立方体の多角体を形成する株である。また、このＨ株の多角体タンパク質のみを発現するように構築されたリコンビナントウイルスＡｃＣＰ−Ｈを使用した。昆虫培養細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（Ｓｆ２１）を１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）培地で継代したものを使用した。
（１）ｃＤＮＡの合成
ＢｍＣＰＶから２本鎖を抽出し、低融点アガロースゲル（［エフ・エム・シー（ＦＭＣ）社製，商品名「ＧＴＧ」］を用いて、４番目のセグメント（以下Ｓ４という）を分離した。次に公知方法［「ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」，第１８１巻，第７４９〜７５５ページ（１９９１年）］を用いて、Ｓ４の両末端配列に基づき（＋）鎖側として、配列表配列番号３（左端から第５〜１２番目はＮｏｔＩサイト）、（−）鎖側として配列表配列番号４（左端から第５〜１０番目はＢａｍＨＩサイト）の２種類のプライマーを合成した。次いで、これらのプライマーを用い、タイムサーバー（Ｔｉｍｅｓｅｖｅｒ）ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により、Ｓ４のｃＤＮＡを行ったのち、イーエックス・タック（Ｅｘ  Ｔａｑ）ポリメラーゼ（タカラ社製）を用いてＰＣＲ増幅した。このようにして増幅したＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩサイトを選択的に切断する制限酵素（以下ＮｏｔＩ制限酵素という）及びＢａｍＨＩサイトを選択的に切断する制限酵素（以下ＢａｍＨＩ制限酵素という）で消化した。
（２）リコンビナントバキュロウイルスの構築（Ｉ）
Ｓ４のｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化した断片をバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製）のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込み、リコンビナントトランスファーベクターｐＡｃＶＰ３を構築した。さらに、このｐＡｃＶＰ３をＳ４の塩基配列２９６４番目から２９９９番目に存在する部位ＢｇｌＩＩとＳａｌＩを選択的に切断する制限酵素（以下制限酵素ＢｇｌＩＩ及び制限酵素ＳａｌＩという）で消化し、緑色ケイ光タンパク質（以下ＧＦＰという）との融合タンパク質を発現するベクターｐＥＧＦＰＮ２（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩサイトに組み込んだ。
次いで、このベクターを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、バキュロウイルストランスファーベクター（ｐＶＬ１３９２）のＮｏｔＩサイトに組み込み、リコンビナントトランスファーベクター（ｐＡｃＶＰ３／ＧＦＰ）を構築した。また、ｐＥＧＦＰＮ２を制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＮｏｔＩで消化し、バキュロウイルストランスファーベクター（ｐＶＬ１３９３）２（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに組み込み、ＧＦＰのみを発現させるリコンビナントトランスファーベクター（ｐＡｃＧＦＰ）を構築した。構築したこれら３種類のリコンビナントトランスファーベクターをそれぞれ５μｇを０．５μｇの線状のバキュロゴールド・バキュロビールス（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製）とともにリポフェクチン法により昆虫培養細胞Ｓｆ２１にトランスフェクションを行った。その後プラーク純化を行い、それぞれのリコンビナントウイルスＡｃＶＰ３、ＡｃＶＰ３／ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰを調製した。
（３）リコンビナントバキュロウイルスの構築（ＩＩ）
Ｓ４のｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化した断片をバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込み、リコンビナントトランスファーベクターｐＡｃＶＰ３を構築した。次に、制限酵素ＸｂａＩ（Ｓ４の塩基配列１，３５８番目から１，３６３番目と２，７１１番目から２，７１６番目に存在する）で消化し、セルフライゲーションによりリコンビナントトランスファーベクターｐＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）を構築した。さらに、このｐＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩ（Ｓ４の塩基配列２，９６４番目から２，９９９番目に存在する）で消化し、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）との融合タンパク質を発現するベクターｐＥＧＦＰＮ２（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩサイトに組み込んだ。その後、ＮｏｔＩで消化し、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩサイトに組み込み、リコンビナントトランスファーベクターｐＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰを構築した。構築したリコンビナントトランスファーベクター５μｇを０．５μｇの線状のＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）と同時にリポフェクチン法により昆虫培養細胞Ｓｆ２１にトランスフェクションを行った。その後プラーク純化を行い、リコンビナントウイルスＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰを作製した。
《Ｓｆ２１細胞におけるリコンビナントタンパク質の発現》
リコンビナントウイルスは２０ｐ．ｆ．ｕ．／ｃｅｌｌでＳｆ２１細胞（ｌｘ１０６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍシャーレ）に感染させた。また、ＡｃＶＰ３／ＧＦＰとＡｃＣＰ−ＨもしくはＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ／ＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈのように２種類のウイルスを同時に感染させるダブル感染はそれぞれ１０ｐ．ｆ．ｕ．／ｃｅｌｌで行った。ウイルスを１時間室温で細胞に吸着させた後、ウイルス液を除去し、２ｍｌの１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００を加え２７℃で４日間インキュベートした。感染細胞はウェスタンブロッティングやＧＦＰの蛍光測定に用いた。
《多角体の精製》
ＢｍＣＰＶ  Ｈ株由来の立方体の多角体を形成する組み換えバキュロウイルスＡｃＣＰ−Ｈ（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９９−１０２）とＡｃＶＰ３／ＧＦＰもしくはＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰをＳｆ２１細胞（ｌｘ１０８個）に感染させ、４日目の感染細胞から立方体の多角体を回収した、ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で洗った後、氷中でホモジナイザーを用いて磨砕した。磨砕液は１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄後、遠心により多角体を回収した。さらに１．５Ｍ−２．２Ｍの蔗糖を用いた密度勾配法で５０，０００Ｘｇで４５分間遠心し、多角体の分画を抽出した。抽出したサンプルはＰＢＳで洗浄した後、１５，０００Ｘｇで１０分間遠心して精製した多角体を回収した。
《ＧＦＰとＶＰ３の融合タンパク質の発現》
ＡｃＶＰ３／ＧＦＰとＡｃＣＰ−ＨおよびＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈにダブル感染した細胞から多角体を精製し、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に懸濁することで多角体を溶解することなくＧＦＰを失活させたあと、ｐＨを上げていくことにより、多角体から溶出してくる緑色蛍光を測定した。その結果、ｐＨ１０．０以下では緑色蛍光に変化は見られなかったが、ｐＨ１０．０を越えると多角体が溶解し緑色蛍光が確認された（第４図）。以上のことからＶＰ３とＧＦＰの融合タンパク質は多角の中に包埋されており、多角体の溶解に伴って溶出したと考えられた。また、ＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈにダブル感染した細胞から精製した多角体の場合も、同様に酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に懸濁することで多角体を溶解することなくＧＦＰは失活し、その後ｐＨを上げていくことにより、多角体から溶出してくる緑色蛍光を測定した。その結果、ｐＨ１０．０以下では緑色蛍光に変化は見られなかったが、ｐＨ１０．０を越えると、多角体が溶解することにより、緑色蛍光が再び確認された（第４図）。
すなわち、ＢｍＣＰＶの多角体タンパク質とＶＰ３は特異的な相互作用により認識しあい、その結果このＶＰ３とＧＦＰの融合タンパク質（本発明における目的タンパク質の実施例の一つ）が多角体と呼ばれる粒子内に包み込まれ、さらには、ＶＰ３の後半の２分の一以上を欠落させても（ＶＰ３（ＸｂａＩ）、ＶＰ３（ＸｂａＩ）／ＧＦＰは効率良く多角体の中に包埋されたことを示している。
参考例１
前記（１）で合成したｃＤＮＡを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ［ストラータジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製］にクローニングして得た５クローンについて、それぞれのデレーション変異株を、デレーション・キット・フォア・キロ−シークエンス（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ，タカラ社製）を用いて形成させた。
次いで、ピーイー・アプライド・バイオシステムズ社（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓ）製のアブピリズム・ターミネーター・サイクル・シークエンシングキット（ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）及び３７３Ａオートメイテッド・シークエンサー（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用い、塩基配列の解析を行った。その結果、ＢｍＣＰＶのＳ４は、配列表配列番号１に示すように全長３，２５９塩基であり、１４番目から１６番目までの開始コドン（ＡＴＧ）と３，１８５番目から３，１８７番目までの終了コドン（ＴＡＡ）を持つ１つの大きなｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）が存在することが分った。このＯＲＦは１，０５７個のアミノ酸から構成されており（配列番号２）、その分子量は約１３０ｋＤａであると予測された。ウェスタンブロッティングを行ったところ、精製したビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）のＶＰ３にも約１３０ｋＤａのところにバンドが確認された。また、非感染細胞、ＡｃＮＰＶ感染細胞、ＡｃＶＰ３感染細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、分子量が約１３０ｋＤａのところに新たなバンドが確認され、ウェスタンブロッティングを行っても抗体が反応したことから、ＶＰ３はＳ４にコードされていることが確認できた。
参考例２
ＧＦＰはｐＨ５からｐＨ１２で安定しており、また、多角体はｐＨ１０．０を越えると溶解してしまうことが知られている。そこで、ＶＰ３が多角体に埋包されているかどうかを調べるために、ＧＦＰを用いて多角体の溶解前と後のケイ光測定を行った。多角体を精製したあと、１ｍｌの蒸留水、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ１１．０）でそれぞれ懸濁した。さらに酢酸緩衝液の懸濁液には５ｍｏｌ／ｍ３ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを徐々に上げていき、ｐＨが、６．０、１０．０、１２．５のところで３０℃で３０分インキュベートしたのち、ケイ光度計（日立製作所製，製品記号Ｆ−２０００）を用いてＧＦＰのケイ光度を４７５ｎｍで励起し、５１０ｎｍで測定した。この結果をグラフとして第４図に示す。
さらに、ＡｃＶＰ３／ＧＦＰ単独とＡｃＶＰ３／ＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈのダブル感染を３５ｍｍシャーレで行い、感染４日目にＧＦＰの発光をオリンパス製ホトマイクロスコープで確認した。
参考例３
ＡｃＶＰ３／ＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈのダブル感染した細胞を顕微鏡で観察したところ、ＢｍＣＰＶの多角体の縁に沿って強く緑色ケイ光が確認された。しかし、ＡｃＶＰ３／ＧＦＰのみに感染した細胞では細胞質全体で緑色ケイ光が観察された。したがって、ＢｍＣＰＶの多角体をＶＰ３では何らかの相互作用が存在することが推測できたが、ＶＰ３がＢｍＣＰＶの多角体の中に埋包されているかどうかはまだ確認できていない。
そこで、ＡｃＶＰ３／ＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈのダブル感染した細胞から多角体を精製し、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に懸濁することで多角体を溶解することなくＧＦＰを失活させたあと、ｐＨを上げていくことにより、多角体から溶出してくる緑色ケイ光を測定した。その結果、ｐＨ１０．０以下では緑色ケイ光に変化は見られなかったが、ｐＨ１０．０を越えると、多角体が溶解してしまい、緑色ケイ光も確認された。一方、ＡｃＧＦＰとＡｃＣＰ−Ｈをダブル感染させ、同様に測定したが、全く緑色ケイ光を検出できなかった。以上のことからＶＰ３とＧＦＰの融合タンパク質は多角体の中に埋包されており、多角体の溶解に伴って溶出したと考えられる。すなわち、ＢｍＣＰＶの多角体タンパク質とＶＰ３は特異的な相互作用により認識しあい、その結果このＶＰ３とＧＦＰの融合タンパク質が多角体と呼ばれる粒子内に包み込まれたことを示している。
ウイルスと細胞
カイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）のＨ株は細胞質に立方体の多角体を形成する株である。また、このＨ株の多角体タンパク質のみを発現するように構築されたリコンビナントウイルスＡｃＣＰ−Ｈを使用した。昆虫培養細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（Ｓｆ２１）を１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）培地で継代したものを使用した。
ｃＤＮＡの合成
ＢｍＣＰＶから二本鎖ＲＮＡを抽出し、４番目のセグメント（Ｓ４）が低融点アガロースゲル（ＦＭＣ）によって分離された。ｃＤＮＡを合成するためにＫｕｃｈｉｎｏらが報告しているＳ４の両末端配列〔Ｋｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８１，７４９−７５５〕を基に（＋）鎖側として５’ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧ  ３’（下線部はＮｏｔＩサイト）、（−）鎖側として５’ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＡＣＧＴＴＴＣＣ３’（下線部はＢａｍＨＩサイト）の２種類プライマーの合成を行った。Ｓ４のｃＤＮＡの合成はこれらのプライマーを用いて、Ｔｉｍｅｓｅｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）によって行った。合成したｃＤＮＡはＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲで増幅した。増幅したＰＣＲ産物は制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化した。この断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＫ＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んだあと、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９；ＴＯＹＯＢＯ）を用いて形質転換し、５クローンを塩基配列の解析に用いた。
塩基配列の解析
Ｓ４の全長を持つ５クローンからそれぞれのｄｅｌｅｔｉｏｎ変異株をＤｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて作製したものを塩基配列の解析に用いた。塩基配列の解析はＡＢＩＰＲＩＳＭ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の３７３Ａ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで行った。
実験例２
植物による多角体形成の確認
ポリヘドリン遺伝子の発現により、植物細胞内で多角体が形成されることを実証するためにプラスミドベクターｐＩＧ１２１のＧＵＳ遺伝子とポリヘドリン遺伝子とを交換し、ｐＩＧ１２１−ＣＰを作製した（第５図）。まず、ｐＩＧ１２１を制限酵素ＳａｌＩで消化し、ＧＵＳ遺伝子を除去し、そこにＢｍＣＰＶのポリヘドリン遺伝子を挿入した。このプラスミドが、２種の抗生物質耐性遺伝子（カナマイシンおよびハイグロマイシン）をもつことを利用して、形質転換細胞の選抜、ｍＲＮＡ、ポリヘドリン発現、多角体形成の有無を確認できる。しかし、次の通り、ポリヘドリン遺伝子を組み込んだ形質転換植物細胞にさらに、ＶＰ３／ＧＦＰのキメラ遺伝子を挿入する必要があり、この場合のスクリーニングを容易にするために、制限酵素ＳｐｈＩでカナマイシン耐性遺伝子の大部分を除去したプラスミドｐＩＧ１２１−ＣＰ（Ｋｍ−）を作製し、これを用いた。この場合、形質転換植物はハイグロマイシン耐性、カナマイシン感受性となる。得られた形質転換植物では、昆虫細胞でバキュロウイルスベクターを用いた場合と同じような、立方体の多角体の形成が認められた。
植物によるＶＰ３−ＧＦＰの発現
ＶＰ３−ＧＦＰのキメラ遺伝子を同様にｐＩＧ１２１のＧＵＳ遺伝子と交換することによって、ｐＩＧ１２１−ＶＰ３／ＧＦＰを作製した（第６図）。ｐＩＧ１２１を制限酵素ＳａｌＩで消化し、ＧＵＳ遺伝子を除去し、そこにＶＰ３−ＧＦＰのキメラ遺伝子を挿入した。このプラスミドが、２種の抗生物質耐性遺伝子（カナマイシンおよびハイグロマイシン）をもつことを利用して、形質転換細胞の選抜、ｍＲＮＡ、キメラタンパク質  の発現、ＧＦＰの緑色蛍光発光能の有無を確認できる。得られた形質転換植物細胞に長波長の紫外線を照射すると、緑色蛍光の発光が認められた。
ポリヘドリン遺伝子およびＶＰ３／ＧＦＰキメラ遺伝子の両方の発現
まず、プラスミドｐＩＧ１２１−ＣＰ（Ｋｍ−）を用いてポリヘドリン遺伝子を組み込んだ形質転換植物細胞に、さらにｐＩＧ１２１−ＶＰ３／ＧＦＰを導入した。この結果、ポリヘドリン遺伝子のみの形質転換植物では、ハイグロマイシン耐性となるが、カナマイシンに対しては感受性となる。しかし、次にｐＩＧ１２１−ＶＰ３／ＧＦＰを導入することによりこの形質転換植物はハイグロマイシンに対しても耐性となる。このような２段階のスクリーニングによって、最終的にポリヘドリン遺伝子とＶＰ３／ＧＦＰキメラ遺伝子の両方の遺伝子を持つ形質転換植物細胞を得た。
形質転換に用いた宿主植物
今回、無菌状態で培養しているジャガイモ（ナス科）を用いたが、特にこの植物に限定されるものではない。これは、上記のベクターはアグロバクテリウム用のものであり、プロモーターにはＣａＭＶ３５Ｓが使われている。遺伝子を導入できる宿主としては、ナス科などの双子葉植物が一般的であるが、単子葉植物でも可能である。
実験例３
多角体の精製
ポリヘドリン遺伝子とＶＰ３／ＧＦＰキメラ遺伝子の両方の遺伝子を持つ形質転換植物細胞を磨砕し多角体を細胞から遊離させた。この磨砕液は１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄後、遠心により多角体を回収した。さらに１．５Ｍ−２．２Ｍの蔗糖を用いた密度勾配法で５０，０００Ｘｇで４５分間遠心し、多角体の分画を抽出した。抽出したサンプルはＰＢＳで洗浄した後、１５，０００Ｘｇで１０分間遠心して精製した多角体を回収した。
ＶＰ３／ＧＦＰの蛍光測定方法
ＧＦＰはｐＨ５からｐＨ１２で安定しており、また、多角体はｐＨ１０．０を越えると溶解してしまうことが知られている。そこで、ＶＰ３が多角体に包埋されているかどうかを調べるために、ＧＦＰを用いて多角体の溶解前と後の蛍光を測定を行った。多角体を精製したあと、１ｍｌの蒸留水、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ１１．０）でそれぞれ懸濁した。さらに酢酸緩衝液の懸濁液には５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを徐々に上げていき、ｐＨが、６．０、１０．０、１２．５のところで３０℃で３０分インキュベートした後、Ｆ−２０００  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いてＧＦＰの蛍光光度を４７５ｎｍで励起し、５１０ｎｍで測定した。また、Ｌｏｗｒｙ法を用いてタンパク質量を測定し、タンパク質１ｍｇあたりの蛍光度を換算した。
ＶＰ３／ＧＦＰの蛍光測定結果
ポリヘドリン遺伝子およびＶＰ３／ＧＦＰからなるキメラ遺伝子を導入した形質転換植物細胞から多角体の形成が確認された。これは、当初のＢｍＣＰＶが他の植物ウイルスと相同性を示した結果から類推されたように、植物細胞においてもポリヘドリンは昆虫細胞と同様に発現され、多角体としての構造物を作ることが確認された。次に、植物組織から多角体を精製し、得られた精製多角体を水に懸濁したところ、緑色蛍光が観察された（第７図）。これによって、植物細胞においてＶＰ３／ＧＦＰが昆虫細胞と同様に発現され、機能性タンパク質としてその性質を発揮することができることを示している。またこれは同時に多角体の表面にＶＰ３／ＧＦＰが一部露出していることを示している。
さらに、精製した多角体を一度、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に懸濁することで多角体表面に露出しているＶＰ３／ＧＦＰの緑色蛍光を発する能力を失わせた後、徐々にｐＨを上げていくことにより、多角体から溶出してくる緑色蛍光を測定した。その結果、ｐＨ１０．０以下では緑色蛍光に変化は見られなかったが、ｐＨ１０．０を越えると、多角体が溶解し、強い緑色蛍光が観察された（第７図）。以上のことからＶＰ３とＧＦＰの融合タンパク質は多角体の中に包埋されており、多角体の溶解に伴って溶出したと考えられた。すなわち、植物細胞内においてもＢｍＣＰＶの多角体タンパク質とＶＰ３は特異的な相互作用により認識しあい、その結果このＶＰ３とＧＦＰの融合タンパク質（本発明における目的タンパク質の実施例の一つ）が多角体と呼ばれる粒子内に包み込まれたことを示している。
産業上の利用可能性
本発明によると、不安定な各種機能性タンパク質を微結晶として、安定な細胞質多角体タンパク質結晶中に埋包したタンパク質複合結晶体が提供される。したがって、極めて不安定な酵素タンパク質の長期保存や、機能性タンパク質が保有する機能の発現を時期特異的に調節することが可能となる。さらに、粒子内に取り込まれた機能性タンパク質はこの粒子が結晶構造をとることから、タンパク質の高次構造解析に必要なタンパク質の結晶化の際に不可欠である核として用いることが可能となる。また、結晶化されたタンパク質は、その物性を生かしての電子材料や光学材料などのディバイス材料としての利用が期待できる。
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、植物において目的とするタンパク質（目的タンパク質）を外殻タンパク質で包み込む方法、および、植物において目的タンパク質を外殻タンパク質で包み込んだ粒子を作製する方法が提供される。この発明により、目的タンパク質を取り込ませた大量の粒子を生産でき、この粒子の中にはウイルスは一切存在しない。この粒子に取り込ませることにより、極めて不安定な酵素タンパク質の長期保存や、機能性タンパク質が保有する機能の発現を時期特異的に調節することが可能となる。さらに、粒子内に取り込まれた目的とするタンパク質（目的タンパク質）はこの粒子が結晶構造をとることから、タンパク質の高次構造解析に必要なタンパク質の結晶化に寄与できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のタンパク質複合結晶体の一例の顕微鏡拡大写真である。第２図は、植物細胞で形成された多角体の顕微鏡拡大写真である。第３図は、アルカリ条件での多角体の溶解を説明する顕微鏡拡大写真である。第４図は、参考例２のタンパク質複合結晶体のｐＨによるケイ光度の変化を示すグラフである。第５図は、ポリヘドリンを発現させるためのベクターｐＩＧ１２１−ＣＰ（Ｋｍ−）である。第６図は、ＶＰ３とＧＦＰのキメラタンパク質を発現させるためのベクターｐＩＧ１２１−ＶＰ３／ＧＦＰである。第７図は、植物で作った多角体に含まれるＶＰ３／ＧＦＰキメラタンパク質の測定である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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