(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料の光学的変化を、時間の経過とともに検出することにより血液凝固時間を測定する血液凝固検査方法において、測定開始から凝固反応終了までの間に少なくとも１つのチェックポイントまたはチェック領域を設け、そのチェックポイントまたはチェック領域における反応状態を監視することによって初期反応異常を検出し、チェックポイントまたはチェック領域における反応状態の監視は、所定の項目と所定の閾値とを比較することによって行われ、該項目は、以下の項目のうち少なくとも１つであることを特徴とする血液凝固反応解析方法。
（１）第1の光量から第2の光量まで変化するために必要な第1の時間
（２）所定期間の光学的変化量
（３）第３の光量から第４の光量まで変化するために必要な第2の時間と、第５の光量から第６の光量まで変化するために必要な第３の時間との比
（４）第7の光量まで到達するために必要な第4の時間
【請求項２】
血液凝固時間の測定がAPTTの測定である請求項１記載の血液凝固反応解析方法。
【請求項３】
初期反応異常を検出するとエラーフラグを表示する請求項１または２に記載の血液凝固反応解析方法。
【請求項４】
凝固反応に基づいて血液凝固時間を算出し、
初期反応異常を検出すると、血液凝固時間とともにエラーフラグを表示する請求項３記載の血液凝固反応解析方法。
0004334171.tif 000002
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固時間測定において、反応初期の異常を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液凝固の検出方法としては、血液が凝固するに従って液体の粘性が高くなるのを調べる方法（粘張度検出法）と、血液が凝固するに従って白く濁るのを検出する方法（濁度検出法）、およびこれら二つを混合した方法とに大別される。粘張度検出法は、検体となる血漿に棒状あるいは球状の磁性物を投入し、凝固検出用試薬を混合したとき、凝固によってこれらの磁性物の動きが鈍くなるのを検出する方法である。しかし、この粘張度検出法は血液凝固の最終産物であるフィブリン塊の形成状態（すなわち、フィブリン量が多少あるいは凝固状態の硬軟）によって測定結果が大きく左右されると言う特性を持ち、ある一定値以上の粘張度がなければ正確に検出できないと言う欠点がある。また、磁性物の動きを観察する測定原理であるために、磁性物の強弱に影響されると言う欠点もある。濁度検出法は、検体血漿と凝固試薬とを混合することによってのみ凝固測定を行なう方法であり、磁性物の投入は必要としない。検出する方法としては透過光検出方式、または散乱光検出方式がある。これらの検出方式ではフィブリノーゲン量が少ない場合でも透過光量の変化、あるいは散乱光量の変化として捉えることができるので、粘張度検出法にみられるような欠点はない。
【０００３】
凝固点解析方法には、（１）パーセント検出法、（２）微分法、（３）二重微分法、（４）変曲点法、（５）ゆらぎ検出法などがある。中でもパーセント検出法においては、単位時間あたりの光学的変化量が最も大きく、フィブリンモノマーの重合反応速度の高い50%部位を検出点に取ることによって低フィブリノーゲン検体や乳び、溶血検体のような検体であっても、より正確な凝固測定が可能である。
【０００４】
図１は、散乱光検出方式で得られる信号強度の変化を説明するための図である。血漿が凝固していく過程を光学式検出装置（散乱光検出方式）で調べた時の結果を示す。図中のＡ点は血漿と凝固試薬が混合された時点であり、その後、多段におよぶ凝固反応が進行し、安定的フィブリンの形成により散乱光の変化となって現れる（図中Ｂ点）。安定的フィブリンの形成が進行すると散乱光の変化は増加するが、ほとんどのフィブリノーゲンが消費され、散乱光量の変化はなくなり、反応は終息する（Ｃ点）。凝固時間は、たとえばＢ点の散乱光量（未凝固レベル）を０％としＣ点の散乱光量を１００％とする時の５０％点である時間（Ｔ点）で表すことができる。ΔＨは凝固反応開始時と終了時との散乱光量の変化分である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
通常、血液凝固反応による試料の光学的変化は、例えば、時間を横軸に、散乱光変化を縦軸にとると図1に示すような凝固反応曲線になる。これはフィブリン形成による試料の濁り度合を捉えているものであるが、フィブリン形成に至るまでには以下のような複雑な過程を有する。血液凝固の機構は通常二つの経路から起こるとされる。すなわち、一つの経路は、外因系凝固と言われる経路であり、表皮細胞等から放出される組織トロンボプラスチンを出発点として凝固第VII因子が活性化され、この活性化された凝固第VII因子により凝固第X因子が活性化され、その後、凝固第V因子、第II因子の活性化が起こり、最終的にはフィブリノーゲンがフィブリンに転化することにより凝固が起こる経路である。一般的に、この経路の凝固反応の強弱（即ち正常か異常かという判定）はプロトロンビン時間（ＰＴ）と言われる方法によって測定される。もう一つは、内因系凝固と言われる経路であり、接触等により、凝固第XII因子に活性化が起こり、第XI因子を活性化させる。引き続いて活性化第XI因子は第IX因子を活性化させ、さらに活性化第IX因子はカルシウムイオン・第VIII因子の共同作用のもとに第X因子を活性化させる。その後、第V因子、II因子の活性化が起こり、最終的にはフィブリノーゲンがフィブリンに転化することにより凝固がおこる経路である。一般的に、この経路の凝固反応の強弱（即ち正常か異常かという判定）は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、あるいは部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）と言われる方法によって測定される。また、凝固反応の最終段階においてはフィブリノーゲンがフィブリンに転化する反応が必要であり、これにより凝固が完成する。
【０００６】
上記のように血液凝固は多段階にわたる反応であるため、その反応経路に異常があるときには不安定な挙動を示すことがある。例えば、反応の途中で一時的に反応が停止（光学的変化がなくなる）したかのような状態になったり、血漿に試薬を添加した直後から徐々に光学的変化を示し、必ずしも図１のような反応曲線にならない場合がある。一例として、ヘパリン投与患者で高フィブリノーゲン検体について光学的変化量に基づいて凝固時間を測定した場合、APTTが極端に短縮傾向を示すことがある。このような検体では、外因系の亢進状態に起因する凝固反応による２段反応を示すと考えられ(図２)、反応初期から時間とともに試料の光学的変化量が徐々に増大した後（１段目）、本来の凝固反応による光学的変化量が増大する(２段目)ものと考えられる。通常とは異なる挙動を示した結果、誤った凝固時間を算出したと考えられる。
【０００７】
したがって、本発明は、上記のような反応初期の異常を的確に捉えられるような血液凝固反応解析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の血液凝固反応解析方法は、血液試料の光学的変化を、時間の経過とともに検出することにより血液凝固時間を測定する血液凝固検査方法において、測定開始から凝固反応終了までの間に少なくとも１つのチェックポイントまたはチェック領域を設け、そのチェックポイントまたはチェック領域における反応状態を監視することによって初期反応異常を検出することを特徴とする。
【０００９】
反応状態の監視とは、例えば、以下の項目を挙げることができる。
（１）フィブリン形成時における反応速度の異常の有無（SLOW REACTION CHECK）
（２）初期反応の有無(START ANGLE CHECK)
（３）凝固反応曲線のドリフトの有無(DRIFT CHECK)
（４）あらかじめ設定された光学的変化量に到達するまでにかかる時間の異常の有無(EARLY% CHECK)
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えば図３に示したような構成を有する血液凝固測定装置を用いて実施できる。
なお、本発明における血液試料とは、ヒトを含む哺乳動物の血液から分離した血漿又は希釈された血漿である。血液試料を収容する透光性容器は、光学的検知に係る部分が透明になっていればよいが、これには、例えば直径１０〜２０ｍｍ、高さ５０〜１００ｍｍのガラス又は樹脂製の試験管を使用することができる。
【００１１】
また、血液試料に添加する凝固用試薬は、その測定項目によって異なり、例えば、ＰＴ（プロトロンビン時間）測定用やＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）測定用、Ｆｂｇ（フィブリノーゲン量）測定用の試薬をそれぞれ用いることができる。
【００１２】
収容された血液試料に光を照射する光源には、例えばＬＥＤを、血液試料から得られる光学的情報として散乱光を受光する受光器には、フォトダイオードやフォトトランジスタをそれぞれ用いることができる。なお、光学的情報としては、散乱光の他に透過光が挙げられる。また、散乱光量の時間的変化における飽和を測定して凝固時間を算出する計測部には、ＣＰＵ，ＲＯＭ，ＲＡＭからなるマイクロコンピュータを用いることができる。なお、本発明において飽和とは、散乱光量の時間的変化が、一時的にあるいは永続的になくなったことをいう。
測定結果を表示するための表示部としては、CRTや液晶を用いることができる。また印字用紙に測定結果を印字するようにしてもよい。
【００１３】
検出部は、散乱光量の値を所定時間毎に順次取り込んで格納するものであってもよい。判定部は、凝固反応開始を検知した後に、最新の飽和値と最新の取込み値との差を算出し、その差が第１所定値より小さいとき散乱光量は増加しない（飽和）と判定するものであってもよい。判定部は、最新の取込み値と最小取込み値との差の、最新の飽和値と最小取込み値との差に対する比を算出し、その比が第２所定値より小さいとき散乱光量は増加しない（飽和）と判定するものであってもよい。また、判定部は、最新の飽和値と最新の取込み値との差を算出すると共に、最新の取込み値と最小取込み値との差の、最新の飽和値と最小取込み値との差に対する比を算出し、その差が第１所定値より小さく、かつ、その比が第２所定値より小さいとき散乱光量は増加しないと判定するものであってもよい。散乱光量の飽和が検出された時に、さらに散乱光量が増加しないかを所定時間監視し、再び増加するときには、次の散乱光量の飽和を検出するという動作をくり返し、最終的な飽和値を測定するようにすることによって、反応が途中で一時的に停止したかのような挙動を示す場合であっても、より正確な凝固時間を決定することができる。さらに判定部は、最終的な飽和値を決定した後、凝固反応の時間的変化を解析し、所定の条件を満たした場合に初期反応異常と判定する。
【００１４】
次に、試薬添加直後（反応開始直後）より徐々に光学的変化を示す場合の判定部における初期反応異常の判定方法について説明する。
(1)フィブリン形成時における反応速度の異常の有無
通常、血漿に試薬が添加されて反応が進んでフィブリンが形成されかける時点までは光学的変化量はごく小さいが、フィブリン形成が進むとともに短時間のうちに急激な光学的変化を起こす。したがって、フィブリン形成による光学的変化の起こり初めから凝固終了レベルの間に特定の変化量の位置にチェックポイントを設け、そこでの反応速度を調べれば、異常をチェックすることが可能になる。反応速度は、チェックポイントにおける単位時間当たりの光学的変化量を算出することにより得てもよいし、あるいは、チェックポイントを中心として一定範囲を設定し、その範囲内の光学的変化を起こすのに要する時間を求めてもよい。反応速度に閾値を設け（閾値は例えば実験的あるいは経験的に設定することができる）、閾値に満たない場合は「反応速度異常」と判定する。異常と判定した場合は、エラーフラグ（例えば「＊」等の記号や「Ｅ」等の文字）を設定し、表示部に表示してもよい。以下についても同様である。
【００１５】
(2)初期反応の有無
また、通常反応初期（例えばAPTTでは20秒くらい）には光学的変化量はほとんどないので、反応初期の間で特定の２つの時間をチェックポイントとして設定し、その間の光学的変化量を求めることによって、初期反応の有無を判断することができる。上記と同様に閾値をあらかじめ設定しておき、閾値を超えた場合は、「初期反応あり」と判定する。さらに、未凝固レベルから凝固終了点までの光学的変化量にも閾値を設けておき、閾値に満たない場合は測定エラーで結果を報告しないようにし、閾値以上の場合は、エラーフラグを表示して測定エラーであることを示した上で結果を報告するようにしてもよい。
【００１６】
(3)反応曲線のドリフトの有無
通常、反応初期には光学的変化の速度は遅く、フィブリン形成時には光学的変化の速度は速くなり、反応初期とフィブリン形成時とで反応速度の差は顕著である。一方、光学的変化が徐々に起こる検体では、通常検体ほど反応速度に差は出ない。したがって、反応初期とフィブリン形成時とで反応速度を比較することによって光学的変化量が徐々に増大しているかどうか（ドリフトの有無）をチェックすることが可能になる。具体的には、反応初期の特定の光学的変化量の位置とフィブリン形成時の特定の光学的変化量の位置にそれぞれチェックポイントを設け、各々のポイントにおける反応速度を求め、さらに比（反応初期における反応速度／フィブリン形成時における反応速度）を算出し、あらかじめ設定しておいた閾値と比較することによって算出された比が閾値に満たない場合には「ドリフトあり」と判定する。なお、反応速度の求め方は前述と同様である。
【００１７】
(4)あらかじめ設定された光学的変化量に到達するまでの時間のチェック
さらに、通常検体では、フィブリン形成による光学的変化を起こすまでには比較的時間がかかる。一方、光学的変化を徐々に起こす検体では、光学的変化が血漿に試薬を添加した直後あるいは比較的早い時間で起こる。したがって、特定の光学的変化量の位置をチェックポイントとして設定し、そこに到達するまでの時間を求め、あらかじめ設定しておいた閾値と比較することによって異常を検知することが可能になる。
【００１８】
上記(1)〜(4)のチェックは、一つだけでなく複数を組み合わせればより感度よく初期反応異常を検出することができる。また、本発明の方法は、特にAPTT測定において有用である。
【００１９】
【実施例】
図３は実施例の構成を示す構成説明図である。図３において、透明な試験管１には、測定される血漿が予め収容され、試薬供給器２からピペット3を介して試薬（例えば、PT試薬）が試験管１へ供給されると、LED4からの光が試験管１に照射される。試験管１の内部で散乱した散乱光はフォトダイオード５に受光され、散乱光量が検出される。
【００２０】
計測部6は、散乱光量の飽和を検出する検出部6aと、散乱光量が増加するか否かを判定する判定部6bと、散乱光量の飽和を検出した時にその後の所定時間内に散乱光量がさらに増加するか否かを判定し増加するときには次の飽和を検出するという処理がくり返し行なわれるように検出部6aと判定部6bとを制御する制御部6cと、散乱光量の飽和が最終的に検出されたとき、その飽和値に基づいて凝固時間を算出する算出部6dを備え、フォトダイオード5の出力信号を処理して、処理結果をCRT7に表示するようになっている。なお計測部6は、CPU，ROM，RAMからなるマイクロコンピュータから構成されている。
【００２１】
このような構成における動作を図4に示すフローチャートを用いてさらに詳述する。まず、ステップS1において初期設定が行われ、次に計測部6からの指令により、試薬供給器2から試薬が供給されると、同時にLED4が点灯され、フォトダイオード5から現在の散乱光量D(i）が取り込まれ測定が開始される（ステップS2,S3）。散乱光量の取込みは例えば0.1秒毎に行なわれる。
【００２２】
次に、測定開始から予め設定された最大測定時間Tm(例えば600秒）がこの時点で経過していなければ(ステップS4）、今まで取り込んだ値の内の最小値Dminと、現在値D(i)と差が演算され、その差が初期設定した値dより大きいと、取り込み値に変化があった、つまり凝固反応が始まったものと判断される（ステップS5）、そして、現在値D(i)が取り込まれる度に、現在よりｋ回前の取り込み値D(i−k）との差が演算され（但し、k=1,2,3,.....63とする）、その差が所定値eより小さくなると（ステップS6）、その時のD(i）が暫定的な飽和値Delと見なされる（ステップＳ７）。
【００２３】
その後、現在値D(i）が取り込まれる毎に、D(i)とDelと差、および(D(i)-Dmin)の(Del−Dmin)に対する比が演算され、差が所定値fより小さく、かつ、比が1.2より小さい場合には、現在値D(i)は変化しない（飽和）と見なされる（ステップS8）。
【００２４】
そして、変化しない状態が所定時間Ts（例えば100秒）経過すると（ステップS9）、飽和値Delが最終的な飽和値Denと決定される（ステップＳ10）。
【００２５】
図5は、上記の経過を示すグラフである。図5に示すようにDenを100％、Ｄminを0％として、散乱光量が50％に達する時間t1が凝固時間として算出され、図5のグラフとt1の値がCRT7に表示される。
【００２６】
次に、ステップS8においてD(i）が変化したときにはdが(d+Del)に再設定され、ルーチンはステップS3へ戻る。そして、ステップS3〜S8がくり返され、D(i）が時間Tsだけ経過しても変化しない（飽和）と見なされたときには（ステップS9）、飽和値Delが最終的飽和値Denと決定される（ステップS10）。なお、ステップS4において、測定開始後の時間がTmを超えた場合には、測定は打切られ、「測定不能」がCRT7に表示される。
【００２７】
また、最終的飽和値Denが決定されると、次に判定部において初期反応異常のチェック(ステップS11)が以下のようにして行われ、異常がなければ凝固時間が算出され、異常と判定されればエラーフラグが設定されCRT7に表示される。
【００２８】
図６〜図９及び図10〜図13のフローチャートを用いて、APTT測定において、試薬添加直後（反応開始直後）から光学的変化を起こす異常検体の検出方法について説明する。なお、説明を簡単にするために、未凝固レベルから凝固終了点までの光学的変化量（散乱光変化量）ΔH（＝Den−Dmin）が同一の正常検体と異常検体を例示する。
【００２９】
（１）フィブリン形成時における反応速度の異常の有無(SLOW REACTION CHECK)
図６において、まず、あらかじめチェックポイントHTを設定しておく。HTは任意に決めることができるが、全散乱光変化量の50%地点が正常検体と異常検体の反応速度の差が出やすく好ましい。次に、HTを中心としてhの幅のウインドウを設定しておく。hの値は任意に設定することができる。例えば、HTが50%、hが4%の場合、46%〜54%の範囲の散乱光量変化に要する時間dT＝T54%−T46%（T54%：54%まで変化するのに要する時間、T46%：46%まで変化するのに要する時間）を求める。
【００３０】
正常検体がウインドウ内の散乱光量変化に要する時間dtnに比較して、異常検体ではウインドウ内の散乱光量変化に要する時間dtaは長くなる。したがって、あらかじめ閾値dTmax（dTmaxは実験的あるいは経験的に決めることができる）を設定しておけば、dT＞dTmaxを満たした場合に異常として判定する。異常と判定した場合は、エラーフラグを設定して表示することができる。異常検出のためのフローチャートを図10に示す。
【００３１】
（２）初期反応の有無(START ANGLE CHECK)
図7において、反応初期の時間帯（APTTでは約20秒）で第1時間ポイントt1、第2時間ポイントt2をあらかじめ設定し、t1とt2の間をチェック領域とする。その領域内で散乱光量変化の最大値(Hmax)のポイント(tmax, Hmax)と散乱光量変化の最小値(Hmin)のポイント(tmin, Hmin)を探す。なお、複数の最高値のポイントがあった場合、最大時間のポイントを (tmax, Hmax) とする。また、複数の最低値のポイントがあった場合には、最小時間のポイントを(tmin, Hmin)とすることができる。図７の例では、tmin＝t1、tmax＝t2となり、各ポイントにおける散乱光変化量がそれぞれ、Hmin、Hmaxとなる。
【００３２】
次に、チェック領域内の散乱光変化量dH＝Hmax  Hminを算出する。正常検体の散乱光変化量dHnに対して、異常検体の散乱光変化量dHaは大きくなる。したがって、閾値dHLimitを設定し、dH≧dHLimitを満たす場合は、異常と判定してエラーフラグを設定して表示部に表示する。
【００３３】
また、反応開始から凝固終了点までの散乱光変化量ΔHに閾値ΔHLimitを設定し、dH≧dHLimitかつtmax＞tmin かつΔH≦ΔHLimitの場合、初期反応が見られた上にフィブリン形成による十分な光学的変化量がなかったとして測定エラーとしてエラーフラグを設定し、表示部に表示する。dH≧dHLimitかつtmax ＞ tmin かつΔH＞ΔHLimitの場合、初期反応が見られるが十分な光学的変化量があったと判断し、エラーフラグを設定して測定エラーであることを表示した上で凝固時間を算出し、結果を表示する。dH＜dHLimitの場合、初期反応がなかったと判定し、凝固時間を算出して結果を表示する。異常検出のためのフローチャートを図11に示す。
【００３４】
（３）反応曲線のドリフトの有無(DRIFT CHECK)
図8において、まず、第1チェックポイントH1を反応初期の散乱光量の位置に、また第2チェックポイントH2をフィブリン形成時の散乱光量の位置にあらかじめ設定する。H1およびH2は任意に決めることができる。次に、それぞれのチェックポイントを中心としてhの幅のウインドウを設定しておく。hの値は任意に設定することができる。例えば、H1＝10%、H2＝50%、hが4%の場合、6〜14%及び46%〜54%の範囲のウインドウを設定する。次にそれぞれのウインドウ内の散乱光量変化に要する時間dT1＝T14%−T6%（T14%：14%まで変化するのに要する時間、T6%：6%まで変化するのに要する時間）及びdT2＝T54%−T46%（T54%：54%まで変化するのに要する時間、T46%：46%まで変化するのに要する時間）を求める。さらに、二つのチェックポイントでの反応速度の比R=dT1/dT2を算出する。正常検体のRn＝dTn1/dTn2（Rn；正常検体における反応速度の比、dTn1；第1チェックポイント内の散乱光量変化に要する時間、dTn2；第2チェックポイント内の散乱光量変化に要する時間）に比べて、異常検体のRa=dTa1/dTa2（Ra；正常検体における反応速度の比、dTa1；第1チェックポイント内の散乱光量変化に要する時間、dTa2；第2チェックポイント内の散乱光量変化に要する時間）は小さくなる。したがって、閾値RLimitを設定しておき、R＜RLimitを満たす場合は、ドリフトあり（反応曲線が平坦でなく徐々に上昇している状態である）と判定し、エラーフラグを設定し、表示部に表示する。異常検出のためのフローチャートを図12に示す。
【００３５】
（４）あらかじめ設定された光学的変化量に到達するまでの時間(EARLY% CHECK)
図9において、特定の散乱光量のチェックポイントHsをあらかじめ設定しておく。本チェック項目は、散乱光量が変化し始める時間が早すぎないかどうかを監視するものであり、Hsは散乱光量が変化し始めの位置に設定することが好ましい。次に散乱光量がHsまで変化するのに要する時間tsを求める。正常検体のtns（tns；正常検体において散乱光量がHsまで変化するのに要する時間）に比べて異常検体のtas（tas；正常検体において散乱光量がHsまで変化するのに要する時間）は短くなる。したがって、閾値tLimitをあらかじめ設定しておき、ts＜tLimitを満足する場合は、変化し始める時間が早すぎる、と判定し、エラーフラグを設定し表示部に表示する。異常検出のためのフローチャートを図13に示す。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、凝固反応の初期反応異常を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】凝固反応による散乱光変化を示した図である。
【図２】初期反応異常を示す検体の散乱光変化を示した図である。
【図３】血液凝固測定装置の構成を示した図である。
【図４】血液凝固測定装置で凝固時間の算出を示したフローチャートである。
【図５】実施例における散乱光量の時間的変化を示す図である。
【図６】フィブリン形成時における反応速度異常の検出のための説明図である。
【図７】初期反応の有無の検出のための説明図である。
【図８】反応曲線のドリフトの有無の検出のための説明図である。
【図９】あらかじめ設定された光学的変化量に到達するまでの時間の異常の検出のための説明図である。
【図１０】フィブリン形成時における反応速度異常の検出を示したフローチャートである。
【図１１】初期反応異常の有無の検出を示したフローチャートである。
【図１２】反応曲線のドリフトの有無の検出を示したフローチャートである。
【図１３】あらかじめ設定された光学的変化量に到達するまでの時間の異常の検出を示したフローチャートである。
【符号の説明】
１  試験管
２  試薬供給部
３  ピペット
４  LED
５  フォトダイオード
６  計測部
７  CRT
【図１】
0004334171.tif 000003
【図２】
0004334171.tif 000004
【図３】
0004334171.tif 000005
【図４】
0004334171.tif 000006
【図５】
0004334171.tif 000007
【図６】
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【図７】
0004334171.tif 000009
【図８】
0004334171.tif 000010
【図９】
0004334171.tif 000011
【図１０】
0004334171.tif 000012
【図１１】
0004334171.tif 000013
【図１２】
0004334171.tif 000014
【図１３】
0004334171.tif 000015