(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸を生産する能力を有する微生物、プロピオニバクテリウム属に属する細菌およびコリネバクテリウム属に属する細菌を、糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中で培養し、培養物中にプロピオン酸、およびγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生成させることを特徴とする、該培養物からなる糠漬け風味液の製造方法。
【請求項２】
乳酸を生産する能力を有する微生物、プロピオニバクテリウム属に属する細菌およびコリネバクテリウム属に属する細菌の３群より選ばれる任意の２群に各々属する２種の微生物を、同一の糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中で培養し、残る１群に属する微生物を別の糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中に培養する、または各々の群に属する３種の微生物を別々に糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中で培養することにより得られる培養物を混合することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
乳酸を生産する能力を有する微生物の培養およびプロピオニバクテリウム属に属する細菌の培養を嫌気条件下で、コリネバクテリウム属に属する細菌の培養を好気条件下で行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物の培養が、乳酸を生産する能力を有する微生物の培養物にコリネバクテリウム属に属する細菌を培養し、その培養物にプロピオニバクテリウム属に属する細菌を培養することによって行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
微生物の培養が、乳酸を生産する能力を有する微生物の培養物にプロピオニバクテリウム属に属する細菌を培養し、別に乳酸を生産する能力を有する微生物の培養物にコリネバクテリウム属に属する細菌を培養することによって行なわれ、両培養物が混合される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
コリネバクテリウム属に属する１種類の細菌を好気的条件下および嫌気的条件下で各々培養する、あるいはコリネバクテリウム属に属する２種類の異なる細菌の一方を好気的条件下で、他方を嫌気的条件下で培養することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
コリネバクテリウム属に属する細菌が、コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２９）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
乳酸を生産する能力を有する微生物が、ラクトバチラス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
糠処理物が糠を加水分解酵素で処理したものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
コリネバクテリウム属に属し、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセラクトンおよびγ−デカラクトンから選ばれる１種以上のγ−ラクトンを生産する能力を有する微生物をオレイン酸、リノール酸およびリシノール酸から選ばれる１種以上の脂肪酸を含有する培地に培養し、該培養物中に、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセラクトンおよびγ−デカラクトンから選ばれる１種以上のラクトンを生成させ、生成したラクトンを回収することを特徴とする、ラクトンの製造方法。
【請求項１１】
微生物がコリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２９）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２９）。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、糠漬けの風味液、清澄な糠漬け風味液、それら風味液の製造法、それら風味液の必須成分であるラクトン類の製造法、およびラクトンの製造に有用なコリネバクテリウム属に属する新規な細菌等に関する。
背景技術
多くの家庭で糠漬けが作られているが、風味豊かな糠漬けを得るには、少なくとも数ヶ月以上に渡って、野菜等の食品を毎日漬込み、撹拌を行い熟成した糠床を作らなければならないため、糠床の維持管理には多大な労力を要する。
糠床を用いずに糠漬け風味を有する食品を得るためには、糠漬け風味を有する漬け液に野菜等の食品をつけ込む方法が考えられており、熟成した糠床の、香気成分、呈味成分に関する研究がなされている［日本農芸化学会誌，５７，１１１３（１９８３）］。しかしながら、好ましい糠漬け風味液に必要な風味物質は特定されておらず、さらにその化合物を高濃度に含有する糠漬け風味液の工業的な製造法は未だに確立されていない。
糠床の香気成分として、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセラクトン、γ−デカラクトン等のγ−ラクトン類が重要と考えられる。これらγ−ラクトン類の前駆体の製造に関して、乳酸菌［ガストロエンテロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ），６２，４３０（１９７２）］、コリネバクテリウム属に属する細菌［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），４５，２０２５（１９８１）］、シュードモナス属に属する細菌［アチーブス・オブ・バイオケミストリィー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ），９９，２４９（１９６２）］等がγ−ドデカラクトン前駆体（１０ヒドロキシオクタデカン酸）を生成することが知られている。
また、リシノール酸を含有するひまし油の品質向上のため、サッカロマイセス属等に属する酵母を用いてリシノール酸をγ−デカラクトンに変換する方法（特開昭６０―６６９９１号公報、特開昭６０―１００５０８号公報）、スポロボロマイセス・オーダラス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｏｄｅｒｕｓ）、フザリュウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）などを単独で用いたγ−ラクトンの発酵生産が知られている。
糠漬け風味液が清澄な液体であることにより、商品としてイメージが向上し、得られた漬物から糠等の懸濁物を取り除く必要がなくなる等の理由により、糠漬け風味液は清澄な液体であることが商品価値の面から好ましい。
このような清澄な糠漬け風味液の製造方法としては、例えば、糠の分散液を発酵させ、その後フィルタープレス、回転濾過機、遠心分離機などにより固液分離し、その分離液を糠漬け風味液とする方法が知られている。しかし、これらの方法によると清澄な糠漬け風味液は得られるが、γ−ラクトン類などの脂溶性香気成分は残さとともに除去されてしまう。このため、好ましい糠漬け風味液を得ることはできない。
また、糠の分散液の発酵液をエタノール水溶液で抽出し、該抽出液を前記分離液に混合し糠漬け風味液を取得した時には、エタノール水溶液で抽出された脂肪酸が析出し、懸濁してしまうため、清澄な糠漬け風味液は得られない。
乳酸菌、酵母およびシュードモナス属に属する細菌などのグラム陰性菌を用いた糠漬けの素の発酵法による製造方法（特公昭５７―５６８５２号公報）、糠漬けの香気成分を水蒸気蒸留法で補集した後に、該捕集成分を再添加する糠漬けの素の製造方法（特公昭５８―５０６９７号公報）等が報告されているが、いずれも清澄な糠漬け風味液を製造する方法ではない。
発明の開示
本格的な糠漬けが得られる糠漬け風味液、清澄な糠漬け風味液およびこれら糠漬け風味液の製造法の確立が求められている。
本発明者は糠漬け特有の熟成香を簡単に付与できる糠漬け風味液を工業的に製造する方法について検討した。特に、糠漬け風味液に必要な風味物質について検討した結果、プロピオン酸とγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンが糠漬け風味として重要な役割をはたすことを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成するに至った。
本発明は以下（１）〜（３０）に関する。
なお、以下、乳酸を生産する能力を有する微生物を乳酸生産菌、プロピオン酸を生産する能力を有する微生物をプロピオン酸生産菌、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生産する能力を有する微生物をγ−ＤＤラクトン生産菌と略す。
（１）  乳酸生産菌、プロピオン酸生産菌およびγ−ＤＤラクトン生産菌を、糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中で培養し、培養物中にプロピオン酸、およびγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生成させることを特徴とする、該培養物からなる糠漬け風味液の製造方法。
（２）  乳酸生産菌、プロピオン酸生産菌および、γ−ＤＤラクトン生産菌の３群より選ばれる任意の２群に各々属する２種の微生物を、同一の糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中で培養し、残る１群に属する微生物を別の糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中に培養する、または各々の群に属する３種の微生物を別々に糠の分散液もしくは糠処理物の分散液中で培養することにより得られる培養物を混合することを特徴とする、上記（１）の方法。
（３）  乳酸生産菌の培養およびプロピオン酸生産菌の培養を嫌気条件下で、γ−ＤＤラクトン生産菌の培養を好気条件下で行うことを特徴とする、上記（１）の方法。
（４）  微生物の培養が、乳酸生産菌の培養物にγ−ＤＤラクトン生産菌を培養し、その培養物にプロピオン酸生産菌を培養することによって行なわれる、上記（１）の方法。
（５）  微生物の培養が、乳酸生産菌の培養物にプロピオン酸生産菌を培養し、別に乳酸生産菌の培養物にγ−ＤＤラクトン生産菌を培養することによって行なわれ、両培養物が混合される、上記（１）の方法。
（６）  １種類のγ−ＤＤラクトン生産菌を好気的条件下および嫌気的条件下で各々培養する、あるいは異なる２種類のγ−ＤＤラクトン生産菌の一方を好気的条件下で、他方の株を嫌気的条件下で培養することを特徴とする、上記（１）の方法。
（７）  γ−ＤＤラクトン生産菌が酵母である、上記（１）〜（６）のいずれか１項の方法。
（８）  酵母が、サッカロマイセス属、クリベロマイセス属またはザイゴサッカロマイセス属に属する酵母である、上記（７）の方法。
（９）  γ−ＤＤラクトン生産菌が、コリネバクテリウム属に属する細菌である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）  コリネバクテリウム属に属する細菌が、コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２９）である、上記（９）の方法。
（１１）  乳酸生産菌が、ラクトバチラス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌である、上記（１）〜（５）のいずれか１項の方法。
（１２）  プロピオン酸生産菌が、プロピオニバクテリウム属に属する細菌である、上記（１）〜（５）のいずれか１項の方法。
（１３）  糠処理物が糠を加水分解酵素で処理したものである、上記（１）の方法。
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項の方法により得られる、糠漬け風味液。
（１５）  糠漬け風味液が、糠漬け風味成分として、５００ｐｐｍ以上のプロピオン酸と１００ｐｐｍ以上のγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有する糠漬け風味液である、上記（１４）の糠漬け風味液。
（１６）  糠漬け風味成分として、５００ｐｐｍ以上のプロピオン酸と１００ｐｐｍ以上のγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有する、糠漬け風味液。
（１７）  糠漬け風味成分として、５０〜３０００ｐｐｍのプロピオン酸と１０〜３００ｐｐｍのγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有する、糠漬け風味漬液。
（１８）  コリネバクテリウム属に属し、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセラクトンおよびγ−デカラクトンから選ばれる１種以上のγ−ラクトンを生産する能力を有する微生物をオレイン酸、リノール酸およびリシノール酸から選ばれる１種以上の脂肪酸を含有する培地に培養し、該培養物中に、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセラクトンおよびγ−デカラクトンから選ばれる１種以上のラクトンを生成させ、生成したラクトンを回収することを特徴とする、ラクトンの製造方法。
（１９）  微生物がコリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２９）である、上記（１８）の方法。
（２０）  コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２９）。
（２１）  ａ）上記（１４）〜（１６）いずれか１項の糠漬け風味液を固液分離して得られる分離溶液、または
ｂ）糠の分散液もしくは糠処理物の分散液に、乳酸生産菌およびプロピオン酸生産菌を培養して得られる培養物を固液分離して得られる分離液と、
ｃ）糠の分散液もしくは糠処理物の分散液に、乳酸生産菌およびプロピオン酸生産菌を培養して得られる培養物を固液分離して得られる残さを酸性エタノール水溶液を用いて抽出することによって得られる抽出液、または
ｄ）γ−ＤＤラクトン生産菌を培養して得られる培養物を固液分離して得られる残さを酸性エタノール水溶液を用いて抽出することによって得られる抽出液とを混合することにより得られる、清澄な糠漬け風味液。
（２２）  糠漬け風味成分として、５００ｐｐｍ以上のプロピオン酸と２０ｐｐｍ以上のγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有し、かつ水で１０倍に希釈したときの６６０ｎｍでの濁度が０．４以下である、清澄な糠漬け風味液。
（２３）  糠漬け風味成分として  ５０〜２０００ｐｐｍのプロピオン酸と１〜１５０ｐｐｍのγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有し、かつ６６０ｎｍでの濁度が０．４以下である、清澄な糠漬け風味漬液。
（２４）  ラクトンを生産する能力を有する微生物の培養物から固液分離により得られる残さを回収し、酸性エタノール水溶液を用いて該残さよりラクトンを抽出することを特徴とする、ラクトン含有液の製造方法。
ここで、ラクトンとはγ−ラクトンあるいはδ−ラクトン等全てのラクトンを意味する。
（２５）  酸性エタノール水溶液のｐＨが１．０〜６．５である、上記（２１）または（２４）の方法。
（２６）  酸性エタノール水溶液が、エタノールを１０容量％以上含有する水溶液である、上記（２１）、（２４）または（２５）の方法。
（２７）  上記（１４）〜（１７）、（２１）〜（２３）のいずれかの糠漬け風味液または糠漬け風味漬液に食品を漬けることを特徴とする、漬物の製造方法。
（２８）  上記（２７）の方法により得られる漬物。
（２９）  コリネバクテリウム属に属する細菌を含有してなる糠床用種菌。
（３０）  糠床に上記（２９）の糠床用種菌を添加することを特徴とするγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを含有する、糠床の製造方法。
以下に本発明について詳細に説明する。
乳酸生産菌、プロピオン酸生産菌およびγ−ＤＤラクトン生産菌を糠の分散液もしくは糠処理物の分散液に培養することを特徴とするプロピオン酸とγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有する新規な糠漬け風味液の製造方法、得られた培養物からなる新規な糠漬け風味液、新規なγ−ＤＤラクトン生産菌、コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＮＫ−１）株について説明する。
乳酸生産菌としては、乳酸を生産する能力を有し、食品に利用可能な微生物であればいずれでもよく、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の細菌が用いられる。特に、ラクトバチラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、エンテロコッカス・フェイカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）およびビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）に属する細菌が用いられ、ラクトバチラス・プランタラムおよびエンテロコッカス・フェイカリスに属する細菌が特に好ましい。
プロピオン酸生産菌としては、プロピオン酸を生産する能力を有し、食品に利用可能な微生物であればいずれも用いられるが、チーズ製造等に用いられるプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌、例えばプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）およびプロピオニバクテリウム・ソエニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）に属する細菌が好適に用いられる。
γ−ＤＤラクトン生産菌としては、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生成する能力を有し、かつ食品に利用可能な微生物であればいずれも用いられるが、例えば酵母およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が好適に用いられる。
γ−ＤＤラクトン生産酵母としては、例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびザイゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母があげられ、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、サッカロマイセス・イグジガス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マキシアンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ザイゴサッカロマイセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）およびザイゴサッカロマイセス・フロレンチナス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）に属する酵母が好適に用いられる。
コリネバクテリウム属に属する細菌としては、例えばコリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＮＫ−１）株が好適に用いられる。
コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＮＫ−１）株は、糠床から分離されたものであり、本菌株の菌学的性質およびび同定の根拠について以下に示す。
（Ａ）形態的性質
１）細胞の形                  ；短桿状
大きさ                    ；１．０〜１．２ｘ０．８〜１．０μｍ
２）細胞の多形性の有無        ；無
３）運動性の有無              ；無
４）胞子の有無                ；無
（Ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
１）肉汁寒天平板培養（１〜２日間培養）
ａ）生育の様相              ；良好
ｂ）色                      ；クリーム
ｃ）光沢                    ；有
ｄ）拡散性色素              ；無
２）肉汁液体培養（１〜２日間培養）
ａ）表面生育                ；無
ｂ）濁度                    ；有
３）肉汁ゼラチン穿刺培養
ａ）生育の状態              ；良好
ｂ）ゼラチンの液化          ；有
４）リトマスーミルク反応
ａ）反応                    ；アルカリ
ｂ）凝固                    ；無
ｃ）液化                    ；無
（Ｃ）生理学的性質
１）グラム染色性              ；陽性
２）硝酸塩の還元              ；肉汁培地で陽性、コハク酸培地で陰性
３）脱窒反応                  ；陰性
４）ＭＲテスト                ；陰性
５）ＶＰテスト                ；陰性
６）インドールの生成          ；陰性
７）硫化水素の生成            ；陽性
８）デンプンの加水分解        ；陰性
９）クエン酸の利用            ；コーザー培地で陽性
１０）無機窒素源の利用
ａ）硝酸塩                  ；陽性
ｂ）アンモニウム塩          ；陽性
１１）色素の生成                ；無
１２）ウレアーゼ                ；陽性
１３）オキシダーゼ              ；陰性
１４）カタラーゼ                ；陽性
１５）生育の範囲
ａ）育成ｐＨ範囲            ；ｐＨ５〜ｐＨ１１
（最適生育ｐＨ６付近）
ｂ）生育温度範囲            ；１１℃〜４５℃
（最適生育温度；２９℃付近）
１６）酸素に対する態度          ；好気性
１７）Ｏ−Ｆテスト              ；酸化的
１８）酸の生成  （好気的条件）
静置培養では非生育であったため、振とう培養の結果を示す。
＋は生成することを、−は生成しないことを、それぞれ示す。
ａ）Ｌ−アラビノース        ；−
ｂ）Ｄ−キシロース          ；−
ｃ）Ｄ−グルコース          ；＋
ｄ）Ｄ−マンノース          ；−
ｅ）Ｄ−フラクトース        ；＋
ｆ）Ｄ−ガラクトース        ；−
ｇ）マルトース              ；−
ｈ）シュークロース          ；−
ｉ）ラクトース              ；−
ｊ）トレハロース            ；−
ｋ）Ｄ−ソルビトール        ；−
ｌ）Ｄ−マンニトール        ；−
ｍ）イノシトール            ；−
ｎ）グリセリン              ；−
ｏ）デンプン                ；−
（Ｄ）化学分類的性質
１）ＤＮＡの塩基組成（Ｇ＋Ｃｍｏｌ％）  ；６９．３
２）菌体脂質：主要キノン                ；ＭＫ−９（Ｈ２）
主要脂肪酸                ；Ｃ１６：０
ミコール酸                ；Ｃｏｒｙｎｅ型
３）細胞壁ペプチドグリカン
ジアミノ酸組成              ；ｍｅｓｏ−Ａ２ｐｍ
（Ｅ）その他の性質
１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。
以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ．２（１９８６）の記載と照合した結果、本菌株は、コリネバクテリウム属関連細菌と推定した。さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を解読し、コリネバクテリウム属とその関連属の塩基配列を対照にして近隣結合法により分子系統解析した結果、本菌株はコリネバクテリウム属に分類された。
以上の結果より、本菌株がコリネバクテリウム属に属する細菌であると同定し、コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１と命名した。
本菌株は、平成１０年４月２３日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２９として寄託されている。
本発明の糠漬け風味液の製造法において、乳酸生産菌、プロピオン酸生産菌およびγ−ＤＤラクトン生産菌の培養は糠の分散液もしくは糠処理物の分散液にこれらの微生物を一緒に培地に植菌してもよく、また乳酸生産菌の培養後にプロピオン酸生産菌またはγ−ＤＤラクトン生産菌を培養し、その培養後に残りの菌を培養してもよい。
また、３種の微生物を、各々別々にもしくは任意の１種の微生物と他の２種の微生物とに分けて糠の分散液もしくは糠処理物の分散液に培養し、培養後に得られた培養物を混合してもよい。
さらに生産物が同一である、異なる２種もしくはそれ以上の微生物を使用してもよく、その培養順序、微生物の組み合わせ、培養等も任意に定めることができる。
γ−ＤＤラクトン生産菌を好気的条件下に培養するとγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンが生産されるが、嫌気的条件下に培養するとγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンの生産は減少するが、培養物に良好な風味が付与される。従って、γ−ＤＤラクトン生産菌を好気的条件と嫌気的条件の両方で培養し、得られた培養物を混合することによってより好ましい風味が培養物に付与される。
本発明において用いられる培地としては、糠もしくは糠処理物を水に糠含量１〜７０重量％の濃度に分散させたものが用いられる。
糠としては、生糠のみならず所望により焙煎、蒸煮などの処理をしたものを用いることができる。
糠処理物としては、例えば、糠の成分を種々の酵素で分解した処理物があげられ、該酵素としては例えば、リパーゼ等の脂質分解酵素、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等の蛋白質分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ等の澱粉分解酵素などの加水分解酵素があげられる。
酵素処理は糠の分散液に酵素を加え３０〜６０℃で１〜２０時間反応させることによって行われる。
また、前記培養あるいは糠の酵素処理において、必要に応じて、野菜、水産物、あるいはそれらのエキス、酵母エキス、蛋白質加水分解物、澱粉加水分解物、グルコース等を添加してもよい。
プロピオン酸生産菌はプロピオン酸の生産に乳酸を必要とするので、該生産菌が乳酸を十分量生産できないときには、培地中に乳酸を存在させなければならない。乳酸を十分生産しないプロピオン酸生産菌において、プロピオン酸生産菌を乳酸生産菌の培養液に培養する場合または乳酸生産菌とプロピオン酸生産菌を同時に培養する場合は乳酸を培地に添加しなくてもよいが、培地中に乳酸が存在あるいは生成しない場合は乳酸を培地に添加しなければならない。
γ−ＤＤラクトン生産菌が酵母である場合、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンの前駆体が必要なので、培地に１０ヒドロキシオクタデカン酸、１０ヒドロキシオクタデセン酸のγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンの前駆体を添加する必要がある。γ−ＤＤラクトン生産菌を乳酸生産菌の培養液に培養する場合または乳酸生産菌とγ−ＤＤラクトン生産菌を同時に培養する場合は、乳酸生産菌によって培地中のオレイン酸、リノール酸からγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンの前駆体が生成されるので、該前駆体を培地に添加する必要はない。
また、γ−ＤＤラクトン生産菌がコリネバクテリウム属細菌である場合は、培地にオレイン酸、リノール酸を加える必要があるが、糠にはこれらの脂肪酸が含まれているので、改めて添加しなくてもよい。該菌を糠の分散液もしくは糠処理物に培養することによって培養物中にγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生成、蓄積させることができる。
３種の微生物の培養は通常１０〜３７℃で行われ、１〜２０日間で完了し、培養物中にプロピオン酸とγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを生成、蓄積させることができる。
乳酸生産菌およびプロピオン酸生産菌の培養は、好ましくは静置培養など、嫌気的条件下で行われる。酵母およびコリネバクテリウ属に属する細菌の培養は、好ましくは振盪培養、深部通気撹拌培養など、好気的条件下で行われる。
培養によって得られる培養物は、それ自体糠漬け風味液として用いられるが、特に糠漬け風味成分として、５００ｐｐｍ以上、好ましくは１０００ｐｐｍ以上のプロピオン酸と、１００ｐｐｍ以上、好ましくは２５０ｐｐｍ以上のγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンとを含有するものが、糠漬けの風味の点で好ましい。また、この糠漬け風味液には、０．１〜１０．０重量％の乳酸および３．０〜２０．０重量％の食塩を含有するものが、糠漬けの風味の点でさらに好ましい。このうち、食塩については、上記濃度で含有することが糠漬け風味液の保存の点でも好ましい。
糠漬け風味液はそのまま糠漬け風味漬液として用いてもよいが、プロピオン酸が５０〜３０００ｐｐｍ、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンが１０〜３００ｐｐｍとなるように水等で希釈し、必要に応じて乳酸、食塩、グルタミン酸ナトリウム等を添加、調製したものを糠漬け風味漬液として用いてもよい。
次に、本発明の清澄な糠漬け風味液について説明する。
本発明の清澄な糠漬け風味液は、下記分離液と下記抽出液とを混合することにより得られる。
分離液としては、前記糠漬け風味液を固液分離して得られる分離溶液、糠の分散液もしくは糠処理物の分散液に乳酸生産菌およびプロピオン酸生産菌を培養して得られる培養物を固液分離して得られる分離溶液等があげられる。
抽出液としては、前記糠漬け風味液を固液分離して得られる残さを酸性エタノール水溶液を用いて抽出することによって得られる抽出液、後述のγ−ＤＤラクトン生産菌を培地に培養して得られる培養物を固液分離して得られる残さを酸性エタノール水溶液を用いて抽出することによって得られる抽出液等があげられる。
糠漬け風味液あるいは培養物を固液分離することによって分離溶液と残さが得られる。固液分離は、通常用いられる方法であればいかなる方法を用いてもよく、例えばフィルタープレス、回転濾過機、遠心分離機、ダイナミックフィルターなどを用いることによって行われる。残さからのγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンの抽出は酸性のエタノール水溶液を用いて繰り返し行われ、該残さよりγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを選択的に抽出することができる。
酸性エタノール水溶液としては、ｐＨ１．０〜６．５、好ましくはｐＨ２．０〜６．０のエタノール１０容量％以上、好ましくは３０容量％以上のエタノール水溶液が用いられる。ｐＨの調整は通常乳酸または塩酸あるいは乳酸生産菌の培養物を用いて行われる。エタノール水溶液を酸性にすることにより培養物中の脂肪酸などの脂質の抽出量を低減することができる。該脂質抽出量の低減化により、清澄な糠漬け風味液を製造する際の懸濁化の原因が激減され、良好な糠漬け風味液を製造することができる。
該清澄な糠付け風味液を製造する際のγ−ＤＤラクトン生産菌の培養法について説明する。
γ−ＤＤラクトン生産菌としては、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生成する能力を有する微生物であればよく、前記糠漬け風味液を製造するために用いられるγ−ＤＤラクトン生産菌がいずれも用いられる。
培地としては、糠の分散液もしくは糠処理物に限らずオレイン酸およびリノール酸を含有し、かつラクトン生産菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有する培地であれば、天然培地、合成培地のいずれの培地を用いてもよい。
γ−ＤＤラクトン生産菌が酵母である場合、γ−ドデカラクトンの前駆体および／またはγ−ドデセラクトンの前駆体が必要なので、培地に該前駆体、例えば１０ヒドロキシオクタデカン酸、１０ヒドロキシオクタデセン酸等を添加する必要がある。
γ−ＤＤラクトン生産菌を乳酸生産菌の培養液に培養する場合または乳酸生産菌とγ−ＤＤラクトン生産菌を同時に培養する場合は、乳酸生産菌によって培地中のオレイン酸、リノール酸からγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンの前駆体が生成されるので、該前駆体を培地に添加する必要はない。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
上記培地に脂肪酸の供給源として、例えば米糠またはその加水分解酵素処理物、あるいは動物脂肪、植物脂肪、乳脂肪などのリノール酸、オレイン酸を含有する食品の油脂加水分解物、さらにはそれら油脂分解物に対して０．１〜１．０の重量比率で乳蛋白質、植物蛋白質などの食品蛋白質を添加した油脂分解物の混合物等が好適に用いられる。
培養は、通常、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下、ｐＨ３〜９、１５〜４０℃で２〜７日間行われる。
上記方法で得られる清澄な糠漬け風味液は、糠漬け風味成分として５００ｐｐｍ以上、好ましくは１０００ｐｐｍ以上のプロピオン酸と、２０ｐｐｍ以上、好ましくは４０ｐｐｍ以上のγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを含有し、かつ水で１０倍に希釈したときに６６０ｎｍでの濁度が０．４以下、好ましくは０．２以下を示すものが好ましい。
該清澄な糠漬け風味液はそのまま清澄な糠漬け風味漬液として用いてもよいが、プロピオン酸が５０〜２０００ｐｐｍ、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンが１〜１５０ｐｐｍとなるように、必要に応じて水等で希釈し、必要に応じて乳酸、食塩、グルタミン酸ナトリウム等を添加、調製したものを清澄な糠漬け風味漬け液として用いてもよい。
糠漬け風味液または糠漬け風味漬液には、清澄であってもなくても、必要に応じてグルタミン酸ナトリウムなどの調味料、澱粉加水分解物、グルコース、スクロース等の糖類、蛋白質加水分解物、酵母エキス、野菜エキス、水産物エキス、また乳酸、酢酸、コハク酸などの有機酸等、さらに唐辛子、さんしょ、ゆずなどの香辛料等を添加することが可能である。
清澄であってもなくても、糠漬け風味漬液に野菜、魚介類、肉類等の食品を浸漬させる、該漬液を食品にふりかける等を行うことにより、本格的な糠漬け風味を有する漬物が得られる。
次に、コリネバクテリウム属に属する細菌を用いるγ−ドデカラクトン、γ−ドデセラクトンおよびγ−デカラクトン（以上を総称してγ−ラクトン類という）から選ばれる１種以上のγ−ラクトンの新規な製造方法について説明する。
本発明に用いられるコリネバクテリウム属に属する細菌としては、オレイン酸からγ−ドデカラクトン、リノール酸からγ−ドデセラクトンまたはリシノール酸からγ−デカラクトンを生成する能力を有するものであればいずれでも用いられ、例えば前述のコリネバクテリウムエスピーＮＫ−１株をあげることができる。
用いられる培地、培養方法については、培地にリシノール酸を添加することが必要である他は、前述のγ−ＤＤラクトン生産菌の培養に用いられる培地、培養方法が適用できる。
培養によって得られる培養物からのγ−ラクトン類の回収は、例えばカラムクロマトグラフィ等によって行われる。
次に、ラクトン生産菌を培養して得られる発酵液からの、ラクトンの抽出方法について説明する。
ラクトン生産菌としては、γ─ラクトン類、δ─ラクトン類の少なくとも一種を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物も用いられ、前述の糠漬け風味液の製造に用いられるγ−ＤＤラクトン生産菌も包含される。微生物の培養物からの抽出法としては、前述の清澄な糠漬け風味液の製造において用いた抽出法と同様の方法が適用できる。
即ち、培養物を固液分離することによって残さを取得する。固液分離は、前述の手段のいずれも適用できる。残さからの酸性のエタノール水溶液を用いた抽出操作を繰り返し行うことにより、該残さよりラクトンを選択的に抽出することができる。
酸性エタノール水溶液としては、ｐＨ１．０〜６．５、好ましくはｐＨ２．０〜６．０のエタノール１０容量％以上、好ましくは３０容量％以上のエタノール水溶液が用いられる。ｐＨの調整は通常乳酸または塩酸を用いて行われる。エタノール水溶液を酸性にすることにより培養物中の脂肪酸などの脂質の抽出量を低減することができる。
次に、本発明の糠床添加用種菌について説明する。
本発明の糠床添加用種菌は、コリネバクテリウム属に属し、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生産する能力を有する細菌を含有することを特徴とするものである。
糠床には、乳酸菌が通常存在し、また、糠床にプロピオン細菌が存在しなくてもプロピン酸が蓄積することが知られている。したがって、本発明の糠床添加用種菌には、少なくともγ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを生産するコリネバクテリウム属に属する細菌を含有していればよいが、必要に応じて乳酸生産菌またはプロピオン酸生産菌を含有させてもよい。
コリネバクテリウム属に属する細菌、乳酸菌およびプロピオン酸菌は、先に述べた本発明の糠漬け風味液の製造方法に例示されている細菌と同じものが用いられる。
このような糠床添加用種菌を添加する糠床としては、生糠や、生糠に焙煎、蒸煮した糠を加えたもの等に、必要に応じて野菜、水産物、あるいはそのエキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物を添加したもの等があげられる。
上記糠床添加用種菌を糠床に添加し、発酵させることにより、糠床中にプロピオン酸、γ−ドデカラクトンおよび／またはγ−ドデセラクトンを含有させることができ、糠漬け特有の良好な風味を有する糠漬けが得られる糠床を調製することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、実施例において特に記載がない限り％は重量％を示す。
実施例１
米糠（田島屋製）を１０％になるように水に混合した分散液（１０％米糠分散液という）を８５℃に加熱した後、５０℃に冷却し、食品加工用のプロテアーゼ（ノボ社製）、ペプチダーゼ（ノボ社製）、アミラーゼ（ナガセ生化学社製）、グルコアミラーゼ（ナガセ生化学社製）およびリパーゼ（天野製薬社製）を対米糠０．１％添加して、５０℃で３時間反応させた。反応終了後、反応混合物を１２０℃で１５分間の加熱殺菌した後、乳酸菌としてラクトバチラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ）を植菌し、２５℃で２日間静置培養した。その後、γ−ＤＤラクトン生産酵母としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を植菌し、２５℃で４日間通気撹拌培養した。培養終了後、該培養物に発酵乳酸（９０％乳酸；武蔵野商事製）を該培養物の２％添加し、プロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）を植菌して、２５℃で７日間静置培養した。
培養終了後、該培養物を９５℃で３０昼間加熱殺菌した。得られた培養物のプロピオン酸含量、γ−ドデカラクトンおよびγ−ドデセラクトンの各々の含量を測定した。なお、プロピオン酸はキャピラリー電気泳動法（ＨＰ３ＤＣＥヒューレット・パッカード社製）で定量し、γ−ドデカラクトンおよびγ−ドデセラクトンは培養物よりシクロヘキサノールを内部標準としてペンタン・エーテル混合液（１：１）で抽出した後、ガスクロマトグラフィー法で分離し、マススペクトル検出器（ＱＰ５０００島津社製）で定量した。その結果、培養物はプロピオン酸を１．１％、γ−ドデカラクトンを０．１１％、γ−ドデセラクトンを０．０７％、それぞれ含有し、熟成した糠漬け香を有していた。
また、得られた培養物即ち糠漬け風味液を水で１０倍希釈し、さらに０．５％乳酸、２．５％食塩、０．６２％グルタミン酸ナトリウムとなるように調製した漬液（本発明品）に、６％食塩水で５℃で１日間下漬けしたキュウリを漬けた。また、市販の糠漬け風味液（市販品１）を添付書に記載の用法に従って希釈して調製したのち、上記と同様な方法によりキュウリを漬けた。キュウリを５℃で２日間漬けた後、漬液を除き、スライスして「熟成香」、「糠漬け香」、「糠漬けとしての好ましさ」について、パネラー１２人で７点評点法で評価した。
結果を第１表に示す。
0004334144.tif 000002
第１表に示されるとおり、「熟成香」「糠漬け香」「糠漬けとしての好ましさ」のいずれの項目においても、本発明品では市販品１よりも優れた結果が得られた。
実施例２
１０％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸菌としてエンテロコッカス・フェイカリスを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。培養終了後、培養物を等分割して、一方には、γ−ＤＤラクトン生産酵母としてザイゴサッカロマイセス・バイリーを植菌し、５日間通気撹拌培養した。もう一方には、プロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒを植菌し、５日間静置培養した。培養終了後、両培養物を９５℃で３０分間加熱殺菌し、食塩を５％添加した。両培養物を混合して得られた混合物は、熟成した糠漬け香を有しており、プロピオン酸を１．２％、γ−ドデカラクトンを０．０８％、γ−ドデセラクトンを０．０９％、それぞれ含有していた。
また、実施例１に記載の方法に従い、該混合物の１０倍希釈水溶液（本発明品）および市販の糠漬け風味液（市販品１）にキュウリを漬け、同様の項目についてパネラー１２人で７点評点法で評価した。
結果を第２表に示す。
0004334144.tif 000003
第２表に示されるとおり、「熟成香」「糠漬け香」「糠漬けとしての好ましさ」のいずれの項目においても、本発明品では市販品１よりも優れた結果が得られた。
実施例３
１０％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。さらに、プロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒを植菌して、２５℃で７日間静置培養した。また、別途１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌後に、γ―ＤＤラクトン生産菌コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１株を植菌し、５日間通気撹拌した。培養終了後、両培養物を混合して得られた混合物は、熟成した糠漬け香を有しており、プロピオン酸を０．７％、γ−ドデカラクトンを０．０８％、γ−ドデセラクトンを０．０６％、それぞれ含有していた。
また、実施例１に記載の方法に従い、該混合物の１０倍希釈水溶液（本発明品）および市販の糠漬け風味液（市販品１）にキュウリを漬け、同様の項目についてパネラー１２人で７点評点法で評価した。
結果を第３表に示す。
0004334144.tif 000004
第３表に示されるとおり、「熟成香」「糠漬け香」「糠漬けとしての好ましさ」のいずれの項目においても、本発明品では市販品１よりも優れた結果が得られた。
実施例４
１０％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。
１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。さらにプロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒを植菌して、２５℃で７日間静置培養した。
１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。さらにγ―ＤＤラクトン生産菌としてサッカロマイセス・セルビシエを植菌して、２５℃で４日間静置培養した。
１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、γ―ＤＤラクトン生産菌としてコリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１株を植菌し、５日間通気撹拌培養した。
培養終了後９５℃に加熱殺菌した４種の培養物を等量混合して得られた混合物は、熟成した糠漬け香を有しており、プロピオン酸を０．２５％、γ−ドデカラクトンを０．０４％、γ−ドデセラクトンを０．０３％、それぞれ含有していた。
また、実施例１に記載の方法に従い、該混合物の１０倍希釈液（本発明品）および市販の糠漬け風味液（市販品１）にキュウリを漬け、同様の項目についてパネラー１２人で７点評点法で評価した。
結果を第４表に示す。
0004334144.tif 000005
第４表に示されるとおり、「熟成香」「糠漬け香」「糠漬けとしての好ましさ」のいずれの項目においても、本発明品では市販品１よりも優れた結果が得られた。
実施例５
１０％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。
１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。さらにプロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒを植菌して、２５℃で７日間静置培養した。
１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてエンテロコッカス・フェイカリスを植菌し、２５℃で２日間の静置培養した。さらにザイゴサッカロマイセス・バイリーを植菌し、２５℃で４日間静置培養した。
１０％米糠分散液を、実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてエンテロコッカス・フェイカリスを植菌し、２５℃で２日間の静置培養した。さらにγ―ＤＤラクトン生産菌としてザイゴサッカロマイセス・バイリーを植菌し、５日間通気撹拌培養した。
培養終了後９５℃に加熱殺菌した４種の培養物を等量混合して得られた混合物は、熟成した糠漬け香を有しており、プロピオン酸を０．２０％、γ−ドデカラクトンを０．０３％、γ−ドデセラクトンを０．０２％、それぞれ含有していた。
また、実施例１に記載の方法に従い、該混合物の１０倍希釈液（本発明品）および市販の糠漬け風味液（市販品１）にキュウリを漬け、同様の項目についてパネラー１２人で７点評点法で評価した。
結果を第５表に示す。
0004334144.tif 000006
第５表に示されるとおり、「熟成香」「糠漬け香」「糠漬けとしての好ましさ」のいずれの項目においても、本発明品では市販品よりも優れた結果が得られた。
実施例６
１０％米糠分散液に１％ひまし油を添加し実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１株を植菌し、４日間通気撹拌した。
その結果、γ−ドデカラクトンを６９２ｐｐｍ、γ―ドデセラクトンを２４３ｐｐｍ、γ−デカラクトンを５７２ｐｐｍ、それぞれ含有する培養物が得られた。
実施例７
コーン油を４％含む培地（０．１％酵母エキス、０．５％ペプトン、２％脱脂粉乳）にコーン油に対して１％量のリパーゼを添加し、３７℃で１０時間反応してコーン油加水分解物を取得した。コーン油加水分解物を加熱殺菌後に、コリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１株を植菌し、５日間通気撹拌した。
その結果、γ−ドデカラクトンを１８５０ｐｐｍ、γ―ドデセラクトンを５５８ｐｐｍ、それぞれ含有する培養物が得られた。
実施例８
米糠５０％、水４７％、食塩３％の配合比で混合した糠床５ｋｇを撹拌した後、キュウリ５本を糠床に漬込み、翌日取り出す捨て漬けを毎日行い、１５℃で３週間発酵させた。この発酵糠床を２分割し、一方の糠床にコリネバクテリウム・エスピーＮＫ−１株の培養菌体を０．１％接種し、さらに両方の糠床を撹拌した後、キュウリ５本を糠床に漬込み、翌日取り出す捨て漬けを毎日行い、１５℃で２週間発酵させた。その結果、菌を接種した糠床にはγ−ドデカラクトンとγ−ドデセラクトンが合計値として３２ｐｐｍ検出され、風味良好な糠床となった。一方、菌を接種しなかった他方の糠床からは、γ−ドデカラクトンおよびγ−ドデセラクトンは検出されなかった。
実施例９
米糠５０％、水４７％、食塩３％の配合比で混合した糠床２ｋｇを撹拌した後、キュウリ５本を糠床に漬込み、翌日取り出す捨て漬けを毎日行い、１５℃で３週間発酵させた。得られた発酵糠床に対して実施例３で得られた混合液、すなわち糠漬け風味液を１０％量添加して混合した後、キュウリ５本を漬込んだ。得られたキュウリは、良好な糠漬け風味を有していた。
実施例１０
１０％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で２日間静置培養した。その後、γ―ＤＤラクトン生産酵母としてサッカロマイセス・セレビシエを植菌し、２５℃で４日間通気撹拌培養した。
別途に２％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、発酵乳酸を２％添加して加熱殺菌後に、プロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒを植菌して、２５℃で６日間静置培養した。
培養終了後、両培養物を混合して得られた混合物（本発明品１）は、熟成した糠漬け香を有しており、プロピオン酸を３６１１ｐｐｍ、γ−ドデカラクトンを１５４ｐｐｍ、γ−ドデセラクトンを３５８ｐｐｍ、それぞれ含有していた。
該混合物３０Ｌをフィルタープレスパイロット機（藪田機械製）で濾過してプロピオン酸を含有する濾液を得た。残さにエタノール濃度５９％（ｖ／ｖ）、ｐＨ４．７の水溶液１０Ｌを循環させて抽出し、先の濾液と混合した。混合液の、６６０ｎｍの濁度は０．０２１であり、プロピオン酸を２５４４ｐｐｍ、γ−ドデカラクトンを２５．２ｐｐｍ、γ−ドデセラクトンを６０．１ｐｐｍ、それぞれ含有する清澄な糠漬風味液の濃縮品（本発明品２）を得た。
本発明品１、本発明品２および市販の糠漬け風味液（市販品１、２および３）について、その濁度と糠漬け風味に関与する成分の含量を測定した。なお、濁度は各製品を水で１０倍に希釈したときの６６０ｎｍの濁度で、風味成分は希釈前の原液中に含まれる濃度として、それぞれ表す。
結果を第６表に示す。
0004334144.tif 000007
また、本発明品１および本発明品２ならびに市販品１、２および３をそれぞれ用いて製造したキュウリの漬物を官能評価した。各製品をそれぞれ１０倍希釈し、さらに乳酸０．５％、２．５％食塩、０．６２％グルタミン酸ナトリウムとなるように濃度を調整して得られた漬液に、６％食塩水で５℃一日下漬けしたキュウリを漬けた。５℃で２日間漬けた後、漬け液を除き、カットしたキュウリをパネル１１名で「熟成香」「糠漬け香」「糠漬けとしての好ましさ」について７点評点法で評価した。
結果を第７表に示す。
0004334144.tif 000008
第７表に示される通り、「熟成香」、「糠漬け香」、「糠漬けとしての好ましさ」のいずれの項目においても、本発明品では市販品より優れた結果が得られた。
実施例１１
実施例１０で得られた本発明品２から実施例１０と同様な方法により調製した漬液に、カットしたキュウリを５℃で３０分間漬込んだ。その結果、糠漬け風味のある浅漬けが得られた。またカットキュウリに直接ふりかけても、糠漬け風味を有するキュウリが得られた。
実施例１２
１０％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、加熱殺菌した後に、乳酸生産菌としてラクトバチラス・プランタラムを植菌し、２５℃で３日間静置培養した。その後、γ―ＤＤラクトン生産酵母としてサッカロマイセス・セレビシエを植菌し、２５℃で４日間通気撹拌培養を行ない、γ−ドデカラクトンとγ−ドデセラクトンを合計で２８７２ｐｐｍ含有する培養物を得た。また、３％米糠分散液を実施例１と同様の方法で酵素処理し、発酵乳酸を３％添加して加熱殺菌後に、プロピオン酸生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンリッヒを植菌して、２５℃で７日間静置培養を行い、２．５１％のプロピオン酸を含有する培養物を得た。得られた両培養物を混合し、さらに０．５％乳酸、２．５％食塩、０．６２％グルタミン酸ナトリウムを添加し、プロピオン酸、およびγ−ドデカラクトンとγ−ドデセラクトンの合計の濃度が表８の各濃度になるように調製した。該混合物のｐＨを４．５に調整したものを漬け液として、該漬け液に、６％食塩水中５℃で１日間下漬けしたキュウリを漬けた。５℃で２日間漬けた後、漬け液を除き、スライスしたキュウリを「糠漬け香」および「糠漬けとしての好ましさ」につき、パネル９名４段階評価を行った。
なお、「糠漬け香」は、−は弱い、＋はやや強い、＋＋は強い、＋＋＋はとても強い、「糠漬けとしての好ましさ」は、−はあまり好ましくない、＋はやや好ましい、＋＋は好ましい、＋＋＋はとても好ましい、の４段階でそれぞれ評価した。
各パネルの評価結果の平均を第８表に示す。
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実施例１３
実施例１２と同様の方法により調製したプロピオン酸生産菌の培養物３０Ｌを、フィルタープレスパイロット機（藪田機械製）で濾過して、プロピオン酸を含有する濾液を得た。
一方、実施例１２と同様の方法により調製したγ―ＤＤラクトン生産酵母の培養物３０Ｌを、フィルタープレスパイロット機（藪田機械製）で濾過した後、濾過残さにエタノール濃度５９％（ｖ／ｖ）、ｐＨ４．７の水溶液１０Ｌを循環させて抽出し、１１５１ｐｐｍのラクトン溶液を得た。このラクトン溶液を先の濾液に混合し、０．５％乳酸、２．５％食塩、０．６２％グルタミン酸ナトリウムを添加し、プロピオン酸、およびγ−ドデカラクトンとγ−ドデセラクトンの合計の濃度が表９の各濃度になるように調製した。該混合液のｐＨを４．５に調整したものを漬け液として、該漬け液に、６％食塩水中５℃で１日間下漬けしたキュウリを漬けた。５℃で２日間漬けた後、漬け液を除き、スライスしたキュウリを「糠漬け香」および「糠漬けとしての好ましさ」につき、実施例１２と同様な評価方法により、パネル１４名で４段階評価を行った。
各パネルの評価結果の平均を第９表に示す。
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実施例１４
糠漬け香成分としてγ−ドデカラクトンおよびγ−ドデセラクトンを合計で１５４０ｐｐｍ含有する培養物を圧搾濾過後、残さの半量を、０〜５０容量％のエタノール水溶液で抽出したところ、１０容量％以上のエタノール濃度でγ−ドデカラクトンおよびγ−ドデセラクトンが回収され、３０容量％以上のエタノール濃度の水溶液による抽出で回収率が顕著に向上した（第１図参照）。
また、残さの半量を用いて、エタノール濃度３５％において、残さからの脂肪酸の抽出を、エタノール水溶液のｐＨを変化させて測定した。その結果、ｐＨ６．５以下では脂肪酸の抽出を抑えることができた（第２図参照）。
該抽出液と濾過によって得られた濾液とを混合して清澄な糠漬け風味液を調製し、これを水で１０倍に希釈して濁度を測定した。その結果、エタノール水溶液が酸性のとき、特にｐＨが６．５以下のとき、糠漬け風味液の濁度は低く、かつ良好な風味を有する、清澄な糠漬け風味液が調製できることが示された（第３図参照）。
産業上の利用可能性
本発明により、新規な糠漬け風味液、新規な清澄な糠漬け風味液、該風味液に食品を漬けることにより得られる漬け物、該風味液の必須成分であるラクトン類、および該ラクトン類を含有する糠床等を製造することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、抽出液エタノール濃度と抽出されたγ−ラクトンの濃度を示すグラフである。
第２図は、抽出液ｐＨと抽出されたγ−ラクトンおよびオレイン酸の濃度を示すグラフである。
第３図は、抽出液ｐＨと糠漬け製品の濁度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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