(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性材料で構成されかつその外面にペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼまたはその変異体を有するセンサー電極、対極、そのセンサー電極を予め定められた電位に維持する手段、および前記センサー電極と対極の間を流れる電流を観察する手段を備えてなるセンサー。
【請求項２】
ペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼまたはその変異体が透過可能な膜で囲まれている請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
センサー電極が一連の微小電極からなる請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
導電性材料で構成されかつその外面にペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼまたはその変異体を有するセンサー電極、および対極を、流体試料と接触させ、そのセンサー電極を予め定められた電位に維持して、試料中の芳香族化合物の酵素によって触媒される酸化反応に関連する、センサー電極と対極の間を流れる電流を観察することを含んでなる流体試料中の芳香族化合物の検定方法。
【請求項５】
芳香族化合物がハロゲン化芳香族化合物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ハロゲン化有機化合物がペンタクロロフェノールである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼまたはその変異体が透過可能な膜で囲まれている請求項４〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
流体試料が水または有機溶媒の試料である請求項４〜７のいずれか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序説
ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）などのポリハロゲン化フェノール類は環境汚染物質の主要部分を占めている。これらの化合物は、木材の防腐剤、殺真菌剤、殺虫剤及び殺菌剤として広く使用されている。ＰＣＰは殺生物剤であり、主として木材防腐のために使用されている。ＰＣＰは環境の至るところに存在し、米国環境保護庁はより重大な汚染物質とみなしている。土壌汚染の限度に関するオランダの提案値は約５ｍｇ／ｋｇ乾燥重量である。ＰＣＰ（または、さらに言えばあらゆる人造化学物質）による環境汚染を管理するには、監視を行って必要な場合、リミジエーション(remediation)を行わなわねばならない。したがって、ＰＣＰなどのより重大な汚染物質に対する、使用法が簡単でリアルタイムのセンサーが強く要望されている。このようなセンサーを開発することが本願の主題である。
【０００２】
背景
モノオキシゲナーゼ酵素であるペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼ（ＰＣＰＨ）は、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属の細菌の種（ＡＴＣＣ  ３９７２３）のペンタクロロフェノール分解経路の第一酸化ステップに関与している。ＰＣＰＨは、ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）が酸化して２，３，５，６−テトラクロロ−ｐ−ヒドロキノン（ＴｅＣＨ）に添加する反応を触媒し、その反応は２当量のＮＡＤＰＨと１分子の二酸素を必要とする（反応式１）。この６５ｋＤａのフラビン酵素をコードする遺伝子はクローン化され、配列が決定されており、その酵素はイー・コリ(E.coil)内でオーバーエクスプレスされている(over-express)。
【０００３】
ＰＣＰＨの基質の範囲は研究されている。この酵素は、フェノール基およびフェノールのオルト位置の置換基に対しても絶対要求性(absolute requirement)を有していることが見出された。したがって、ベンゼンやハロベンゼン類は基質ではなく、ＰＣＰＨは３，５−ジクロロフェノールを攻撃しないが、２，３−ジクロロフェノールは貧基質(poor substrate)である。
【０００４】
【化１】
0004263356.tif 000002
反応式１：ペンタクロロフェノールのＰＣＰＨによる酸化反応
【０００５】
発明
本発明は、ＰＣＰを、触媒反応に必要な電子の通常の供給源である電極置換ＮＡＤＰＨ(electrode replacing NADPH)によって、酵素で酸化することができるという発見に基づいている。
【０００６】
本発明は、一つの側面で、下記のセンサーを提供するものである。すなわち、導電性材料からなりかつその外面にペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼまたはその変異体を有するセンサー電極および対極、前記センサー電極を予め定められた電位に維持する手段、ならびに前記センサー電極と対極の間を流れる電流を観察する手段を備えてなるセンサーを提供する。
【０００７】
本発明は、他の側面で下記の方法を提供するものである。すなわち、流体試料中のペンタクロロフェノールなどの芳香族化合物の検定方法であって；導電性材料からなりかつその外面にペンタクロロフェノールヒドロキシラーゼまたはその変異体を有するセンサー電極および対極を、流体試料と接触させ、前記センサー電極を予め定められた電位に維持し、次いで、試料中のペンタクロロフェノール（または他のハロゲン化もしくは非ハロゲン化芳香族化合物）の酵素によって触媒される酸化反応に関連する、センサー電極と対極との間を流れる電流を観察することを含んでなる方法が提供される。
【０００８】
以下の実験の部分で使用される酵素はＰＣＰＨ自体である。さきに述べたように、ＰＣＰＨは、芳香族のヒドロキシル基に対し、またそのヒドロキシル基に対しオルト位置にあるハロゲンなどの置換基に対しても絶対的要求性を有している。ＰＣＰＨ酵素は、例えば、部位特異的突然変異誘発法によって改質して変異酵素を提供することができる。このような変異酵素は、変化して、例えば基質特異性が広がったかまたは触媒効率が改善されたと考えられる。特に、ハロゲン化芳香族化合物を酸化してハロゲン化フェノールにすることができる変異酵素を使用することが考えられる。また野生型ＰＣＰＨをもう一つの変異酵素とともに使用することも考えられる。
【０００９】
上記作用電極の導電性材料は金でもよくまたは好ましくは炭素である。後者の炭素は、その表面に酵素を固定化できるように、通常、部分的に酸化されている。補助電極すなわち対極は、通常、銀電極であり、準参照電極(quasi-reference electrode）として作動するように塩化物イオンを含有する溶液で前処理される。
【００１０】
本発明のセンサーまたは作用電極は一連の微小電極で構成されている。微小電極は、充電キャパシタンスが非常に小さく、半径方向拡散反応動態(radial diffusion kinetics)を示し、応答時間が短く、そして簡単にかつ容易に解釈される電流−電圧挙動を有している。その上、二つの電極すなわち作用電極と対極電極しか必要でない。個々の微小電極からの電流の大きさは小さいが、このことは、何百、何千もの一連の微小電極を使用すれば、ＳＮ比が改善されて相殺することができる。適切な配列では、各微小電極は、直径が好ましくは０．１〜１．０μｍの範囲内にあり、かつその隣りの微小電極から、好ましくは１〜１００μｍの距離の間隔をおいて位置している。
【００１１】
酵素は、単に、電極を酵素溶液に浸漬し次いで揮発性液体を蒸発させることによって、電極の表面に塗布することができる。あるいは、酵素は、例えば、電極表面をカルボジイミド物質ＤＤＣ［１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート］で誘導体化することによって、電極表面に固定化してもよい。あるいは、酵素は、電極表面上のゼラチンなどの親水性重合体の自立性層に固定化してもよい。電極表面上の酵素の量は、ＰＣＰなどの被検体の接触酸化反応がもたらす電流の大きさを決定する要因の一つである。電極に塗布される酵素の量は、流体試料中の被検体の予想濃度と関連させて調節することができる。
【００１２】
下記の実験の部分では、はだかで端縁が平坦な黒鉛（ＥＰＧ）電極を使用した。しかし、はだかの電極表面を酵素からさえぎるが酵素と相互に作用する適正な官能基を付与して、直接行われる電気化学反応を観察できるようにする物質で、電極を前処理することができる。このような表面の改質によって、電極の酵素吸収量が低下し、かつ得られる電気化学的応答の質と安定性が改善されると期待される。このことに関連して有用であると期待される表面改質剤の例は、ポリ−Ｌ−リシンである。
【００１３】
電極の表面上の酵素は、保護膜で囲まれていることが好ましい。この膜は透析膜でもよい。あるいは、この膜は、例えば、コートされた電極を親水性重合体の溶液中に浸漬することによって形成されるような酢酸セルロースなどの親水性重合体の層でもよい。前記保護膜の機能は、試験される流体試料の不溶性成分（水に対する溶解度が低いＰＣＰを含む）によって酵素の反応性部位が遮断されるのを防ぐ機能である。試料が有機溶媒に溶解したＰＣＰに接触すると、保護膜は、多量の有機溶媒が、センサー電極の表面上の酵素と接触し変性させるのを防ぐが、溶解したＰＣＰを通過させることができる。
【００１４】
媒体（メディエーター）を必要とせずに酵素によって触媒される基質の酸化反応を直接検出できることが本発明の利点である。
【００１５】
本発明のセンサーは、センサー電極に加えて、対極、センサー電極を予め定められた電位に保持する手段およびセンサー電極と対極の間を流れる電流を観察する手段を備えている。これらの追加の部品は、バイオセンサーに日常的に使用される種類のものである。以下の試験研究では、センサー電極は電位を−４００ｍＶに維持したが、この値は−８００〜＋５０ｍＶの範囲内で変えることができる。上記センサーの全体の構造、大きさおよび形態は従来のものでもよい。
【００１６】
分析される流体試料は、酵素の基質、一般にＰＣＰが十分に溶解可能な水性もしくは非水性で極性もしくは非極性の有機溶媒でもよい。土壌のような粒状物質のＰＣＰ汚染を測定する場合は、流体抽出物を作る必要がある。水のＰＣＰ汚染を測定する場合は、以下の実験の部分に記載されているように、試料は濃縮する必要があるであろう。本願に記載されている方法は、原則として、１ｎＭ〜１Ｍ、好ましくは１〜１００μＭの範囲内の濃度のＰＣＰを検出するのに適している。
【００１７】
実験
組み換えＰＣＰＨの発現と精製
ＰＣＰＨをコードする遺伝子を増幅した。すなわち、公表されているヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、フラボバクテリウム属細菌の種（ＡＴＣＣ  ５３８７４）の培養物から単離した全細胞ＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。そのプライマーは、クローン化のための適当な制限部位をいくつもの発現ベクターに組み込むように設計した。これら発現ベクターのうちの一つはｔａｃプロモーターを利用し、ＰＣＰＨ遺伝子を含有する組み換えベクターは、ＰＣＰＨ酵素を、イー・コリ(E. coli)菌株のＤＨ５α内で高レベルで発現する。その組み換えタンパク質を、二つのアニオン交換クロマトグラフィーのステップによって単離し、均質になるまで精製した。精製されたタンパク質は、文献に報告されているのと同一の分光学的特性とＰＣＰの酸化活性を有していた。
【００１８】
直接電気化学反応の研究
フラビン含有タンパク質と酵素の電気化学反応に関する最も以前の刊行物は、フラビンタンパク質またはフラビン酵素の間接的な媒介される電気化学反応に集中していた。グルコースオキシダーゼ、フマル酸リダクターゼおよびキサンチンオキシダーゼなどのフラビン酵素類の直接電気化学反応を記載した報告はごく少数しかないが、これらの場合、遊離フラビンの電気化学反応が妨害しているのかどうかを識別することが困難であった。
【００１９】
ＰＣＰＨの直接電気化学反応を、二窒素の雰囲気（Ｏ２＜４ｐｐｍ）下のグローブボックス内で、直流サイクリックボルタンメトリーを利用して試験した。はだかの端縁平坦黒鉛（ＥＰＧ）電極上のＰＣＰＨのサイクリックボルタンモグラム（ＣＶ）は、アノードとカソードのピーク電位の平均値として利用されるレドックス電位がＳＣＥに対して−５１２ｍＶである一対のレドックス波を示した。カソードのピーク電流は、２ｍＶｓ−１〜２００ｍＶｓ−１の走査速度の平方根に比例したが、これは拡散を制御されたプロセスを示す。ピークからピークまでのセパレーション(peak-to-peak separation)は約３０ｍＶであり走査速度とともに増大し、二つの準可逆電子電子伝達(quasi-reversible two-electron electron transfer)と一致していた。基質を添加しても、電気化学応答に影響はなかった。
【００２０】
フラビンタンパク質が、補酵素のＦＡＤを容易に失うことは周知のことである。したがって、予備実験を行ったところ、ＰＣＰＨからの電気化学応答が、実際に、完全な酵素の活性部位内の補酵素ＦＡＤによるものであり、実験中に酵素から解離した遊離のＦＡＤによるものではないことを示した。
【００２１】
電気化学的に駆動されるＰＣＰの酸化反応
ＰＣＰの酸化反応を電気化学的に駆動できるかどうかを評価するため、ＰＣＰＨの−８００ｍＶにおける直接電気化学反応を、ＰＣＰ基質の存在下、好気性環境内で行った。３０分後、新しい対のレドックス波が６０ｍＶで観察されたが、これは、基準試料のＣＶと比較すると、生成物ＴｅＣＨのレドックス電位と一致している。溶液の有機抽出物をガスクロマトグラフィーによって分析した結果も、ＰＣＰの酸化反応の生成物であるＴｅＣＨが存在していることを示した。さらに、同じ条件下の遊離ＦＡＤによって、電気化学的にもまたはガスクロマトグラフィーによっても生成物が全く検出されなかった。このことは、ＰＣＰの酸化反応が、触媒作用に必要な電子の通常の供給源である電極置換性ＮＡＤＰＨ(electrode replacing NADPH)とともに、酵素によって行われたことを示している。
【００２２】
ＰＣＰ濃度依存性接触電流：バイオセンサーの開発
電流滴定バイオセンサーを開発するため、ＰＣＰＨによって電気化学的に駆動されるＰＣＰの酸化反応から生じる接触電流のＰＣＰ濃度依存性を試験した。その接触電流を、ＰＣＰと酵素の各種濃度および各種の電極製品について測定した。
【００２３】
ＰＣＰＨ酵素は、ＥＰＧ電極上で一滴の酵素緩衝溶液を自然蒸発させることによって固定化した。そのコートされた電極を、標準の実験室用ポリエチレンフィルムまたはＯ−リングで防護された透析膜（分子量カットオフ３５００）で包んだ。このように、上記の膜によって防護された固定化酵素を有する電極を、ＰＣＰを９９．７％エタノールに溶解して得た溶液中に浸漬した。接触電流の濃度依存性は、特定の限界内で直線的になった。例えば、電極表面から蒸発した前記溶液のＰＣＰＨ濃度が８７μＭの場合、直線的範囲は約８μＭまで延びた（図１）。酵素濃度が一層高い１９６μＭの場合、直線的範囲は約２５μＭまで延びた（図２）。各酵素濃度に対する接触電流の絶対値は電極製品によって変化したが、電流／ＰＣＰ濃度のプロットの勾配は、実験誤差の範囲内で同一であった。
【００２４】
基質範囲の試験
環境由来の試料は、ＰＣＰＨの基質であるためＰＣＰのバイオセンシング(biosensing)を妨害することがある多くの他の化合物を含有している。したがって、ＰＣＰＨ酵素の基質範囲を研究した。可能性がある基質として試験した化合物は、トルエン、ビフェニル、フェニルシクロヘキサン、１−フェニルシクロヘキセン、ジフェニルメタン、ビベンジルおよびモデルの長連鎖アルカンとして含めたヘキサデカンであった。ガスクロマトグラフィーで確認したところ、これらの化合物はビベンジルを除いて、ＰＣＰＨによって酸化されなかった。ビベンジルの場合、少量の生成物がガスクロマトグラフィーで検出されたが、この生成物は化学的に特性を決定できなかった。
【００２５】
ＰＣＰに対するバイオセンシングのプロトコル
本願に記載した研究に基づいて、ＰＣＰのバイオセンシングの下記のプロトコルを提案できる。
【００２６】
土壌の試料
汚染の可能性がある土壌の試料２０ｇを、アセトン２０ｍｌとともに音波処理して有機物を抽出する。得られた混合物を、次に遠心分離するかまたは単に濾過して、粒状物を除く。現地試験の結果によっては、この遠心分離／濾過のステップは全く必要でないことがある。前記膜で保護されたＰＣＰＨベースのＰＣＰセンサーを、前記アセトン溶液に浸漬して、ＰＣＰの濃度を直接、測定することができる。土壌の汚染レベルが１ｋｇ乾燥重量当たり５ｍｇＰＣＰで、これをすべて２０ｍｌの溶媒中に抽出すると、アセトン中のＰＣＰの最終濃度約１９μＭに相当し、これは好都合なことに、本発明のＰＣＰバイオセンサーの検出限界内にある。この数値は一指針に過ぎない。というのは、抽出は１００％有効ではないし、かつ回収される溶媒の容積は正確に２０ｍｌではないからである。
【００２７】
水の試料
水中ＰＣＰ濃度の合法的な限界は＜１０μｇｌ−１のようである。この算出を行うには、目標濃度は５μｇｌ−１と考えられる。この濃度（約１９ｎＭ）は、この実験で使用されるＰＣＰバイオセンサーで直接測定するには低すぎるが、一連の微小電極を使用するなどの改善を行えば、測定可能な濃度範囲を拡大することが期待される。したがって、提案されたプロトコルは、例えばBond-Elutカラム(Varian)によって、汚染の可能性がある特定容積の水からＰＣＰを抽出し、次に、そのＰＣＰを、小容積のアセトンまたはクロロホルムなどの有機溶媒で、前記カラムから溶出させることを要求している。前記溶出に有機溶媒１ｍｌを使用すると仮定すると、その場合、ＰＣＰのバイオセンサーは４μＭの濃度を容易に検出できるので、濃度ファクター(concentration factor)は４μＭ／１９ｎＭすなわち２１０である。すなわち、２００ｍｌの水試料を、Bond-Elutカラムによって抽出して、そのカラムを１ｍｌの有機溶媒で溶出すれば、目標の合法的限界は容易に検出される。例えば１ｌのようなより多量の容積が溶出された場合は、同じ試料に対して、異なる電極で測定を繰り返すことができる。
【００２８】
バイオリミジエーションの用途に関するＰＣＰＨの工学
Orserと協同研究者たちはＰＣＰＨがフェノールの官能性に対する絶対要求性を有していることを示した。したがって、ＰＣＰＨによって、ペンタクロロフェノールは酸化されるが、ペンタクロロベンゼンは酸化されない。この官能基特異性は、恐らく、フェノール基と酵素の活性部位側鎖との間の特異的な相互作用によって起こるのであろう。最も可能性が高い相互作用は水素結合の作用である。例えば、ＰＣＰＨ活性部位内の一つ以上のアスパルテートおよび／またはグルタメートの側鎖がフェノールと水素結合を形成し、このようなイオン化した側鎖が存在していると、ペンタクロロベンゼンのような疎水性化合物の結合が強く嫌われる。
【００２９】
本発明の発明者らは、ＰＣＰＨが結晶化することができる条件を発見し、回折特性が高い結晶を製造することが進行中である。本発明の発明者らは、ＰＣＰＨの結晶構造を、ＰＣＰが結合しているか結合していないかにかかわらず決定し、フェノール誘導体に対する特異性に関与する側鎖を固定するつもりである。次にこれらの側鎖は、部位特異的突然誘発によって疎水性の側鎖に変えられるであろう。そうすると、これらの変異体は、疎水性のポリハロゲン化芳香族化合物に結合し、それら化合物を酸化してフェノール誘導体にするであろう。例えば、それら変異体は、ペンタ−およびヘキサ−クロロベンゼンを酸化してＰＣＰにするであろう。この方法が成功すれば、野生型ＰＣＰＨが結合しないペンタクロロベンゼンなどのポリ塩化芳香族化合物に対するバイオセンサーが開発される刺激的な見込みが開かれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  電極に使用したＰＣＰＨ溶液の濃度が８７μＭの場合の、ＰＣＰ濃度と接触電流の関係を示すグラフである。
【図２】  電極に使用したＰＣＰＨ溶液の濃度が１９６μＭの場合の、ＰＣＰ濃度と接触電流の関係を示すグラフである。
【図１】
0004263356.tif 000003
【図２】
0004263356.tif 000004