(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の組換え蛋白質を細胞内において生産するための方法であって、細胞を提供する工程であり、前記細胞がECACC受託番号96022940として寄託されたPER.C6細胞で表され、前記細胞が、そのゲノム中にアデノウイルスのE1A及びE1Bをコードする配列を備え、そのゲノム中にアデノウイルス構造蛋白質をコードする配列を含まず、及びヒト胚網膜芽細胞腫から得られている工程、前記細胞に組換え蛋白質をコードする遺伝子が与えられる工程、前記細胞を適切な培地中で培養する工程及び前記細胞及び/又は前記培地から組換え蛋白質を収集する工程を備え、ここで、前記組換え蛋白質が前記細胞のゲノム中に組み込まれた核酸によってコードされた蛋白質である、方法。
【請求項２】
細胞が更に、そのゲノム中にアデノウイルスのE2Aをコードする配列を備える、請求項1記載の方法。
【請求項３】
培養の間に前記細胞が懸濁液中にある、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
適切な培地が動物又はヒト由来の血清を含まない培地である、請求項1-3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
組換え蛋白質がヒト蛋白質である、請求項1-4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
組換え蛋白質が免疫グロブリンの少なくとも1種の可変領域を含む、請求項1-5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
組換え蛋白質が免疫グロブリンである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
組換え蛋白質がモノクローナル抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
組換え蛋白質がエリスロポエチン、又はその機能性誘導体、相同物、又は断片である、請求項1-5のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え蛋白質がアデノウイルス蛋白質以外のウイルス蛋白質である、請求項1-4のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス蛋白質が、インフルエンザウイルスノイラミダーゼ及び/又はヘマグルチニン;エンテロウイルス蛋白質;ヘルペスウイルス蛋白質;オルソミクソウイルス蛋白質;レトロウイルス、パルボウイルス又はポパボウイルスの蛋白質;ロタウイルス又はコロナウイルスの蛋白質;トガウイルス蛋白質、風疹ウイルス蛋白質又はイースタン、ウエスタン、又はベネズエリアンのウマ脳脊髄炎ウイルス蛋白質;A型肝炎ウイルス蛋白質、又はB型肝炎ウイルス蛋白質のような肝炎を引き起こすウイルスの蛋白質;ブタコレラウイルス蛋白質のようなペスチウイルス蛋白質、又は狂犬病ウイルス蛋白質のようなラブドウイルス蛋白質からなる群より選ばれる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
組換え蛋白質が、CMVプロモーターの制御下にある核酸によってコードされた蛋白質である、請求項1-11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
細胞が更に、アルファ2,3-シアリルトランスフェラーゼ、アルファ2,6-シアリルトランスフェラーゼ又はベータ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組み込まれたcDNAを備える、請求項1-12のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、組み換え蛋白質の生産の分野に、より特異的には蛋白質の生産のためのヒト細胞の使用に関する。本発明は更に、モノクローナル抗体生産の生産の分野に、そしてより特異的にはモノクローナル抗体の生産のためのヒト細胞の使用に関する。本発明は更にウイルス蛋白質の生産の分野に関する。本発明は、ウイルス病原体に対する脊椎動物、特に哺乳動物及びヒトの防御の助けとなるワクチンの生産に特に有用である。
【０００２】
〔従来の技術〕
組み換え蛋白質の生産のための方法及び組成物がここに開示されている。本発明は、グリコシル化及び適切な折り畳み（folding ）の様な翻訳後修飾又は翻訳近辺修飾（peri-translational modifications）を必要とする蛋白質の生産に特に有用である。異種細胞におけるヒト組み換え蛋白質の発現については、よく記録されている。組み換え蛋白質のための多くの生産システムが利用可能となっており、細菌、酵母、真菌から昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞の範囲までおよんでいる。
【０００３】
しかしながら、これらの発展に関わらず、いくつかの生産システムはまだ最適ではなく、又は特異的なクラスの蛋白質の生産にのみ適している。例えば、グリコシル化、γ−カルボキシレーション、又はγ−ヒドロキシレーションの様な翻訳後又は翻訳近辺修飾（peri-translational modifications）を必要とする蛋白質は、原核細胞の生産システムにおいては生産されない。原核細胞の発現システムにおける他の良く知られた問題は、生産されるべき産物の折り畳み（folding ）が不正確であることが多いということであり、多くの場合に不溶性の封入体ができるという結果となる。真核細胞のシステムは特に真核生物由来の蛋白質の生産を改善するものであるが、利用可能な生産システムにはまだ多くの障害がある。例えば酵母株における高マンノシレーションは、酵母が糖蛋白質を適切に発現させるシステムに影響する。その様にして調製された治療用の蛋白質を患者に投与したとき、高マンノシレーションはしばしば免疫反応さえ引き起こす。更に、酵母の分泌シグナルは哺乳動物の分泌シグナルと異なっており、そのためにヒトポリペプチドを含む哺乳動物蛋白質を細胞外へ輸送する際により問題があり、それは今度は連続的な生産及び／又は単離の問題が生じるという結果となる。
【０００４】
哺乳動物細胞は広範囲の翻訳後修飾を行う能力を有しているために、その様な蛋白質の生産の目的に広く使用されている。哺乳動物細胞における組み換え蛋白質の発現は過去の年月の間に劇的に発展し、多くの場合には日常的な技術となった。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO ）は、生物薬剤的な蛋白質及び診断目的の蛋白質の生成のための、日常的でかつ便利な生産システムとなった。以下の多くの特性のためにCHO は宿主細胞として適している。CHO 細胞における達成することができる生産レベルは非常に高く、その細胞系統は感染性又はウイルス様の微粒子が存在しない安全な生産システムを提供する。CHO 細胞の元々の細胞系統の履歴はあいまいであるが、その特性は広く解析されている。CHO 細胞はバイオリアクターの中で、血清を含まない培養培地を用いて、高密度になるまで生育させることが可能である。CHO のdhfr変異体（DG-44 クローン、Urlaub et al,1983 ）が開発されて、外来のdhfr遺伝子を導入することにより容易な選抜システムが、そしてその後に良く制御されたdhfr遺伝子の増幅とメトトレキセートを用いたトランスジーンが得られた。しかしながら、少なくとも二つ（異なった）のサブユニットを含む糖蛋白質又は蛋白質は引き続き問題を引き起こした。
【０００５】
グリコシル化した蛋白質の生物的な活性は、オリゴサッカライド構成成分の厳密な性質によって大きく影響されることがある。グリコシル化の型は、その糖蛋白質の免疫原性、標的性、薬物動力学にも大きな影響を有することがある。近年、グリコシル化を決定する細胞因子について大きな進展があり、多くのグリコシルトランスフェラーゼ酵素がクローニングされた。これはグリコシル化機構の代謝工学を目的とした研究を結果的にもたらした（Fussenegger et al.,1999; Lee et al.,1989; Vonach et al.,1998; Jenkins et al.,1998; Zhang et al.,1998; Muchmore et al.,1989）。その様な戦略の例を以下に記載する。CHO 細胞は機能を有したα-2,6シアリル−トランスフェラーゼ酵素を欠損しており、α-2,3結合を介してガラクトースにシアリル酸を排他的に付加するという結果となる。α-2,6結合を欠いていると、血流からの蛋白質の排出が促進されることがあると知られている。
【０００６】
この問題に対処するために、適切なグリコシルトランスフェラーゼでトランスフェクションすることにより、CHO 細胞はヒトグリカンのプロファイルと似る様に設計されている。CHO 細胞はルイスオリゴサッカライドを生産することもまたできない。CHO 細胞系統は、ヒトN-アセチル-D- グルコサミニルトランスフェラーゼとα-1,3- フコシルトランスフェラーゼIII を発現するように開発された。それに対して、CHO 細胞を含むゲッシ動物細胞は、CMP-N-アセチルノイラミン酸ヒドロラーゼを生産することが知られており、それはCMP-N-アセチルノイラミン酸をグリコシル化する、ヒトには存在しない酵素である（Jenkins et al,1996）。この型のグリコシル化を行う蛋白質は、注射した際には強い免疫反応を引き起こすことがあることがある（Kawashima et al,1993）。そのヒドロラーゼ酵素をコードするゲッシ類の遺伝子が最近同定されたことにより、この活性をを欠損していてこのゲッシ類型の修飾を行わないCHO 細胞の開発は最も促進されそうである。
【０００７】
〔発明が解決しようとする課題〕
そこで本分野は、ヒトのグリコシルトランスフェラーゼ酵素を発現させることにより、哺乳動物宿主細胞をグリコシル化する潜在力を改変することが可能であることを教えるものである。いまのところ、組み換え蛋白質上のCHO 由来のグリカン構造は、天然のヒト対応物（counterpart ）上に存在しているそれらを模倣しているかもしれないが、それらはなお同一とはほど遠いことが見出されている。他の潜在的な問題は、全てのグリコシル化酵素の全てがクローン化されて代謝工学のために利用できる訳ではない、ということである。天然のヒト対応物（counterpart ）とは異なっている蛋白質を治療上投与することは、患者の免疫システムを活性化して、治療の効果に影響するかもしれない望ましくない反応を引き起こす結果となるかもしれない。非ヒト細胞を用いることの他の問題は、翻訳の途中又は後に起こる蛋白質の折り畳み（folding ）が正しく起こらないことから引き起こされるかもしれず、それは他の利用可能なチャペロン蛋白質が存在していることに依っているかもしれない。異常な折り畳み（folding ）が起こって、その蛋白質の生物学的活性の低下又は欠如へとつながる可能性がある。更に、モノクローナル抗体の様な、異なったサブユニットから構成させる蛋白質を共同して形成する別個のポリペプチドを、正しい相対的な量において同時に発現させることは、非常に重要である。ヒト蛋白質のための全ての必要な設備を提供し、発現させて正確にプロセスさせることを、ヒト細胞はより良く行うことができるであろう。
【０００８】
そこで、ヒト組み換え蛋白質を生産するための方法を有することは明らかに望ましく、それはグリコシル化の様な翻訳後修飾及び翻訳近辺修飾（peri-translational modifications）などのヒト型プロセシングと一致するプロセシングを与えるヒト細胞を含み、大規模な生産にもまた適している。
【０００９】
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明は少なくとも一つの蛋白質性の物質を細胞内において生産するための方法を提供するものであり、本方法は少なくとも一つのアデノウイルスのE1蛋白質又は機能を有するその相同物、断片及び／又は誘導体をコードする配列をそのゲノム中に有する真核細胞を提供する過程を含み、その細胞はそのゲノム又はゲノム中に結合させた配列からアデノウイルス構造蛋白質をコードすることはなく、前記方法は前記細胞に組み換えた蛋白質性物質をコードする遺伝子を与える過程、前記細胞を適切な培地中で培養する過程及び前記細胞及び／又は前記培地から少なくとも一つの蛋白質性物質を回収する過程を含む。蛋白質性物質とは、ペプチド結合によって連結された少なくとも二つのアミノ酸よりなる物質である。その物質は前記アミノ酸部分に物理的に連結された一つ又はそれ以上の他の分子を更に含んでも含まなくともよい。その様な他の分子の非限定的な例には、炭水化物及び／又は脂質分子を含む。
【００１０】
アデノウイルス構造遺伝子蛋白質をコードする核酸は、多くの理由により存在してはならない。理由の一つは、生産された蛋白質を調製している間にアデノウイルス構造蛋白質が存在すると、その様にして生産された蛋白質の多くの適用において非常に望ましくないということである。その様な構造蛋白質を生産物から除去することは、調製中においてそれの発生を防ぐことによって最も良く達成することができる。好ましくは、前記真核細胞は哺乳動物細胞である。好ましい態様において、その細胞から回収された蛋白質性の物質及びその細胞自身は同じ種に由来する。例えば、その蛋白質をヒトに投与することを意図するならば、細胞と前記の細胞から回収された蛋白質性物質の両者は、ヒト由来であることが好ましい。ヒト細胞の利点の一つは、商業的に最も魅力的である蛋白質の大部分はヒト蛋白質であるということである。前記細胞から回収された蛋白質性の物質は、前記細胞から生産された任意の蛋白質性の物質であることが可能である。一つの態様において、前記少なくとも一つの回収された蛋白質性物質の、少なくとも一つが前記遺伝子によりコードされている。他の態様において、遺伝子が前記細胞に与えられて、一つ又はそれ以上の内在的に存在している遺伝子の細胞内での発現を促進及び／又は誘導する。例えば、細胞内で蛋白質性の物質の発現を促進させることができる蛋白質をコードしている遺伝子を前記細胞に与えることによる。
【００１１】
「遺伝子を与える」とは、興味の対照である核酸を発現可能な型（format）において含む核酸を意味し、例えば発現カセットがある。興味の対照である核酸は、天然のプロモーター又はその誘導体又は全く異種のプロモーターから発現することができる。興味の対照である核酸は、イントロンを含むことも含まないこともある。同様に、それはcDNA又はcDNA様の核酸であることもある。興味の対照である核酸は蛋白質をコードすることもある。代わりに、興味の対照である核酸は、アンチセンスRNA をコードすることもある。
【００１２】
本発明は更に、少なくとも一つのヒト組み換え蛋白質を細胞内において生産するための方法を提供するものであり、その方法は少なくとも一つのアデノウイルスのE1蛋白質又は機能を有するその誘導体、相同物、又は断片をコードする配列をそのゲノム中に有するヒト細胞を与え、当該細胞はアデノウイルス構造蛋白質を生産せずに前記ヒト組み換え蛋白質をコードする遺伝子を有している過程、前記細胞を適切な培地中で培養する過程、及び前記細胞及び／又は前記培地から少なくとも一つのヒト組み換え蛋白質を回収する過程を含む。本発明まで、何らかの再現性があってスケールアップが可能な方法において、ヒト組み換え蛋白質を生産するのに適していることが見出されているヒト細胞は、あったとしてもほんの少しであった。我々は少なくとも不死化するアデノウイルスE1蛋白質をそのゲノムに含む細胞は、外来性の成長因子に比較的に依存せずに生育することができることを見出した（それらはE1が存在することにより不死化している）。
【００１３】
更に、これらの細胞はかなりの量の組み換え蛋白質を生産することが可能であり、また作られた組み換え蛋白質を正確にプロセシングすることが可能であった。もちろんこれらの細胞は非ヒト蛋白質を生産することもまた可能である。かなりの量の組み換え蛋白質を生産するために使用されてきたヒト細胞系統は、多くの場合癌細胞系統（形質転換した）である。組み換え蛋白質の生産のために使用されてきた多くのヒト細胞が癌由来であることは、これらの特定の細胞系統と働くことに余分の危険を加え、またどの蛋白質又は他の調製物においても、形質転換活性又は癌原性材料を除くために、非常に厳しい単離操作を行うという結果をなる。本発明においては、そのために本発明の方法を採用することが好ましく、そこで前記細胞は初代細胞に由来する。永久に生育することを可能をするために、初代細胞は何らかの性質において不死化される必要があり、それは本発明においてはアデノウイルスE1の導入によって達成される。本分野において、形質転換と不死化の間に何の境界があるかは明らかではない。ここでその差は、不死化した細胞は永久に生育することを表すがその表現型はまだ存在しており、そして形質転換した細胞もまた永久に生育することができるが通常表現型の劇的な変化も示す、ということにより表させることになっている。
【００１４】
細胞培養を通じて組み換え蛋白質を大規模（継続的に）に生産するために、細胞を固定する必要がなく生育させることが可能とすることが、本分野において好ましい。本発明の細胞はその能力を有している。固定に依存した生育能は、細胞がE2A 又はその機能を有する誘導体又は相同物又は断片ををコードする配列をそのゲノム中に含むことにより改善され、そこで前記E2A をコードする配列は好ましくはts125 の様な温度感受性変異体E2A をコードする。望みの組み換え蛋白質を単離することが容易である、清浄で安全な生産システムを有するために、本発明の方法を有することは好ましく、そこで前記ヒト細胞は他のアデノウイルス配列を含まない。本発明の方法及び使用のために最も好ましい細胞は、ERACC 寄託番号96022940として寄託されたPER.C6又はその誘導体（derivative）である。PER.C6は、例えば形質転換し、アデノウイルスに由来するE1領域によってやはり不死化しているヒト293 細胞と比較して操作性が良い。PER.C6細胞は特性解析されており、非常に広範囲に文章化されており、一方PER.C6細胞はスケールアップの過程、懸濁液における生育及び成長因子に依存しないことなどのふるまいが非常によい。特に、PER.C6が懸濁液中で高い再現性においてもたらされるという事実は、大規模生産のために非常に適したものとするものである。更に、PER.C6細胞系統はバイオリアクターでの生育により特徴ずけられるものであり、バイオリアクター中でそれは非常に高密度に生育する。
【００１５】
本発明による細胞、特にPER.C6は更に利点を有しており、それは動物又はヒト由来の血清あるいは動物又はヒト由来の血清成分の非存在下で培養できる、ということである。そこで、単離は容易となり、一方培養中に付加されたヒト又は動物蛋白質が存在しないために安全性は促進され、更にそのシステムの信頼性は非常に高い（合成培地は再現性では最高である）。更に、アデノウイルスのEarly Region 1A （E1A ）が存在することにより、この特異的な領域を欠いている（ヒト）細胞系統と比較して異なったレベルの利点が加わる。転写活性化因子としてのE1A は、サイトメガロウイルスのイメディエートアーリー遺伝子（Immediate Early gene）のエンハンサー／プロモーター由来の転写を促進することが知られている（Olive et al,1990; Gorman et al,1989 ）。生産するべき組み換え蛋白質がCMV エンハンサー／プロモーターの制御下にあるとき、発現レベルは前記細胞において増加し、E1A を欠損している細胞では増加しなかった。
【００１６】
そこで、本発明は真核細胞において組み換えた蛋白質性の物質の生産を促進するための方法を提供するものであり、本方法は前記真核細胞に前記蛋白質性物質の少なくとも一部分をコードする核酸を与え、そこで前記コード配列はCMV プロモーター、E1A プロモーター、又はそれらのうちいずれかの機能を有する相同物、誘導体及び／又は断片の制御下となる過程、及び前記細胞にEIA 活性又はEIA 様活性を更に与える過程を含む。CMV プロモーターと同様に、E1A プロモーターの活性もまた、一つ又はそれ以上のE1A 産物を発現している細胞においては、その様な産物を発現していない細胞と比較してより高い。E1A 発現の促進は、いくつかの他のプロモーターで特徴的であることが実際に知られている。本発明において、その様なプロモーターはE1A プロモーターの機能を有する相同物であると見做される。E1A の効果は、転写活性化因子であるE1A プロモーター又はその相同物の魅力を通じて、及び／又はそのプロモーターに転写抑制因子が付着することを除去／回避することを介して仲介される。プロモーターへの活性化因子及び抑制因子の結合は、配列に依存した形で起こる。E1A プロモーターの機能を有する誘導体及び／又は断片又はその相同物は、そのために、少なくとも一つのE1A 蛋白質によって制御された活性化因子及び／又は抑制因子の核酸結合配列を少なくとも含む。
【００１７】
本発明の細胞の他の利点は、アデノウイルスE1B 遺伝子を有して構成的に発現する、ということである。アデノウイルスE1B は、プログラムされた細胞死又はアポトーシスの良く知られた阻害剤である。この阻害は、55K のE1B 産物を介して、それの転写因子p53 への結合及び引き続いた阻害のいずれかによって起こる（New and Berk, 1992）。E1B 領域の他の産物である19K E1B は、結合することにより、そしてそれによって細胞死の蛋白質であってp53 の支配下にあるBax とBak を阻害することにより、アポトーシスを抑制することが可能である（White et al,1992; Debbas and White,1993; Han et al,1996; Farrow et al.1995）。これらの特徴は、組み換え蛋白質の発現にとって非常に有用となりうるものであり、過剰発現した時には、p53 に依存した経路を通じてアポトーシスの誘導に関与している可能性がある。
【００１８】
本発明は更に、ヒト組み換え蛋白質の生産のためのヒト細胞の使用を提供するものであり、前記細胞は少なくともアデノウイルスの不死化E1蛋白質又は機能を有するその誘導体、相同物又は断片をコードする配列をそのゲノム中に有し、その細胞はアデノウイルス構造蛋白質を生産しない細胞である。本発明の他の態様において、その様な使用において前記ヒト細胞は初代細胞に由来し、好ましくは前記ヒト細胞はPER.C6細胞又はその誘導体である。本発明は更に本発明による使用を提供するものであり、その様な使用において前記細胞はE2A 又は機能を有するその誘導体、相同物又は断片をコードする配列をそのゲノム中に有し、好ましくは前記E2A は温度感受性である。
【００１９】
本発明は本発明による方法によって、又は本発明による使用によって、得ることができるヒト組み換え蛋白質もまた提供するものであり、前記ヒト組み換え蛋白質は単離された天然の対応物蛋白質とは異なったグリコシル化パターンを有する。
【００２０】
本発明の他の態様においてヒト細胞を提供し、その細胞はアデノウイルスE1又は機能を有するその誘導体、相同物又は断片をコードする配列をそのゲノム中に有しているヒト細胞であり、その細胞はアデノウイルスの構造蛋白質を生産せずかつ組み換え蛋白質をコードする遺伝子を有し、好ましくはERACC 寄託番号96022940として寄託されたPER.C6に由来するヒト細胞である。
【００２１】
本発明のまだ他の態様においてPER.C6/E2Aの様なヒト細胞を提供するものであり、その細胞はアデノウイルスE2A 又は機能を有するその誘導体、相同物又は断片をコードする配列をそのゲノム中に有しているヒト細胞を提供し、好ましくは前記E2A は温度感受性である。
【００２２】
これらの細胞内において発現するべき蛋白質及び本発明の方法を使用することは、本技術分野の当業者に良く知られている。それらは好ましくは天然において、例えば分泌、チャペロン化した折り畳み（folding ）及び／又は輸送、他のサブユニットとの共合成、グリコシル化、リン酸化などの、何らかの種類のプロセシングを受けるヒト蛋白質である。治療目的又は診断目的の典型的な使用の例には、いくつかのサブユニットから成るモノクローナル抗体、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（tPA ）、顆粒球コロニー活性化因子（G-CSF ）及びヒトエリスロポエチン（EPO ）が含まれる。EPO は、特に生体内において、その活性と免疫原性がグリコシル化に大きく依存している典型的な産物である。これまで、比較的高レベルのEPO は、赤血球産生を促進する活性が同等であるにも関わらず、ヒト尿から精製されたEPO と比較してグリコシル化が異なっているCHO 細胞を使用することにより達成することができた。その様にEPO のグリコシル化に差があることは、しかしながら、レシピエントにおける免疫原性の問題と半減期が変化するという問題につながっている。
【００２３】
本発明は更に、この目的のための新規のヒトの不死化した細胞系統、及び生産のためにそれを使用することを開示するものである。PER.C6細胞（WO 97/00326 ）は、アデノウイルスセロタイプ５（Ad5 ）E1A とE2B をコードする配列（Ad5 核酸459-3510）を含むプラスミドを用いて、ヒトフォスフォグリセレートキナーゼ（PGK ）プロモーターの制御下において、初代ヒト胚網膜細胞をトランスフェクションすることにより産生される。
【００２４】
下記の特徴により、PER.C6は組み換え蛋白質生産の宿主として特に有用となる。１．十分に特性解析されたヒト細胞系統であること；２．GLP を遵守して開発されたこと；３．ヒト−又は動物由来の蛋白質を欠いている、規定された血清を含まない培地中で懸濁培養液として生育できること；４．ローラーボトル、振盪フラスコ、スピナーフラスコ及びバイオリアクターを用いた生育適合性があり、二倍増殖時間が約35時間であること；５．CMV エンハンサー／プロモーターの制御下において、E1A により引き起こされる遺伝子発現のアプレギュレーションが存在すること；６．組み換えトランスジーンの過剰発現により促進されるかもしれないp53-依存性アポトーシスがE1B の存在によって防止されること
【００２５】
本発明の一つの態様において、従来の哺乳動物細胞系統と比較して2 から200 倍多く蛋白質及び／又は蛋白質性物質を生産することが可能である、本発明の方法を提供するものである。好ましくは、前記従来の哺乳動物細胞系統がCHO 、COS 、Vero、HeLa、BHK 及びSp-2細胞系統から成る群より選択される。
【００２６】
本発明の一つの観点において、その蛋白質性物質又は蛋白質はモノクローナル抗体である。抗体、又はイムノグロブリン類（Igs ）は、体液性免疫反応において中心的な役割を果たす血清蛋白質であり、抗原と結合してそれらを不活性化し、又は炎症反応を引き起こして結果としてそれらを除去する。抗体は、癌関連マーカー、ウイルス被覆蛋白質及びリンパ球細胞表面糖蛋白質を含む、広範囲のリガンドと特異的に相互作用することが可能である。そこで、それらはヒトの疾患の診断及び治療のために非常に有用な物質である。組み換えたモノクローナル及び一本鎖抗体の技術は、新規の治療および診断剤の開発のための新たな観点を開いている。マウスモノクローナル抗体は、感染疾患や癌を治療するために、広範囲の臨床的な試行において治療薬として使用されてきた。ネズミモノクローナル抗体で治療された患者の最初の報告は1980年に出版された（Nadler et al.1980 ）。しかしながら、これらの物質において見られた効果は、一般的には非常に失望させるものであった（総論として、Lowder et al.1986, Mellstedt et al.1991, Baldwin and Byers 1986 を見よ）。
【００２７】
伝統的に、組み換えモノクローナル抗体（イムノグロブリン類）はB 細胞ハイブリドーマ上で生産される。その様なハイブリドーマは、最初にその特異性で選抜されたイムノグロブリン産生性B 細胞をマウスミエローマ細胞と融合することにより作製され、それによってB 細胞を不死化する。マウスB 細胞を不死化する元々の戦略は1975年に開発された（Kohler and Milstein ）。しかしながら、その様なハイブリドーマ中に生産されたイムノグロブリンは、マウス由来であるという欠点を有しており、抗体特異性に乏しく、抗体親和性が低く、重篤な宿主抗マウス抗体反応（host anti-mouse antibidy response:HAMA,Shawler et al.1985 ）を引き起こすという結果となっていた。このHAMA反応は患者の炎症、発熱そして死にさえもつながる可能性がある。マウス抗体はヒトの中で低い親和性を有しており、まだ理由は判らないが、ヒト抗体（21日、Frodin et al.1990 ）と比較してヒトの循環において非常に短い半減期（19-42 時間）を有している。
【００２８】
HAMA反応の重篤さと共に、そのことがよりヒト型であるか又は完全にヒト化したイムノグロブリンを作製するための代わりの戦略を開発することを促した（Owens and Young 1994, Sandhu 1992, Vaswani et al.1998 に総論とされている）。その様な戦略の一つは、ヒトイムノグロブリンの定常領域をネズミのその対応物（counterpart ）によって置き換えることを用いており、「キメラ」及び「ヒト化」抗体を新たに作製する結果となっている。HAMA反応は主として定常領域に依っているために、このアプローチがとられた（Oi et al,1983; Morrison et al,1984）。その様なキメラ抗体の一例が、CAMPATH-1Hである（Reichmann et al.1988）。非ホジキンB 細胞リンパ腫と難治性リウマチ様関節炎の治療に用いられたCAMPATH-1H抗体はヒト抗原CAMPATH-1 （CDw52 ）を標的としており、ヒト抗原CAMPATH-1 は全てのリンパ系細胞と単球上に存在しているが、他の型の細胞上には存在していない（Hale et al.1988, Isaacs et al.1992）。
【００２９】
他の例はヒトCD20抗原（Reff et al.1994 ）を標的としたRituxan （Rituximab ）および15C5であり、15C5は血液凝固を画像化するのに使用されているヒト断片-D二量体（Vandamme et al.1990, Bulens et al.1991）に対して作製したキメラ抗体である。しかしながら、これら新世代のキメラ抗体はまだ部分的にはネズミ型であり、たとえ完全にマウス由来の抗体に対するHAMAほどには重篤でないにせよ、ヒトにおいて免疫反応を引き起こすことが可能である。
【００３０】
他のより高度なアプローチにおいては、抗体の可変領域の中に存在しているが抗原認識のためには明らかに必須でない残基の範囲が、よりヒトに近いアミノ酸のストレッチにより置き換えられており、第二世代又は超キメラ型抗体を得る結果となる（Vaswani et al.1998）。このアプローチの良く知られた例はヘルセプチン（Herceptin ）であり、それはHER2（癌特異的抗原）を標的とした95％ヒト型の抗体であり、乳癌患者に使用されている。
【００３１】
マウス組み換え免疫グロブリンに取って替わるためのより良い方法は、ヒト免疫グロブリンの発生を生じるものであろう。重要なことには、実験的な生体物質で人を免疫することは非倫理的であるので、マウスB細胞で示されたような不死化特異的B細胞を後で選択することは不可能である(Kohler and Milstein 1975)。患者からのB細胞を腫瘍抗原に対する特異的抗体として選別したが、マウス抗体と比較すると人材からヒト免疫グロブリンを調製することは技術的により困難である(Kohler and Milstein 1975)。完全なヒト抗体を生産するための組み換え法は、ヒトの器官の可変領域を発現する抗体ライブラリーにおかれたファージを使用して可能になっている(McCafferty等、1990、Clarkson等、1991、Barbas等、1991、Garrard等、1991、Winter等、1994、Burton and Barbas、1994)。これらの可変領域を、ある抗原に対して特異的親和性について選択して、次にヒト免疫グロブリンの不変領域と結合させて、ヒト組み換え免疫グロブリンを生じる。後者の方法の一例は、腫瘍結合EpCAM分子(Huls等、1999)に対して向けられた、完全なヒトIgG1 カッパー免疫グロブリン、すなわちUBS-54に転化された単鎖Fv 抗体17-1Aである(Riethmuller等、1994)。
【００３２】
組み換え免疫グロブリンを生成する生産系は、多種多様である。臨床試験で最初に使用されたマウス免疫グロブリンは、多量にそれらの親特異的B細胞で生産され、不死化のためにマウス骨髄種細胞に融合させた。この系の欠点は、生産された免疫グロブリンは、完全にマウス起源であり、劇的な免疫反応（HAMA反応）をヒト患者において与えるということである(上述参照)。
特に、ヒトの抗体は免疫可能な親B細胞を欠き、したがって、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）又は乳児ハムスター腎臓細胞(BHK)などの他の系において生産しなければならない。腫瘍誘導ヒト又はマウス骨髄種細胞などの免疫グロブリン生産に一般に適する細胞を使用する事も可能である。
【００３３】
しかしながら、完全なネズミ免疫グロブリンを生産する本来同定され不死化したB細胞(±10μg/ml、Sandhu 1992)と比較したとき、骨髄種細胞で得られた抗体収率は、一般にかなり低い(±0.1μg/ml)。
これら及び他の短所を避けるため、異なるシステムが、より高い収率でヒト免疫グロブリンを生産するために開発されている。
【００３４】
例えば、トランスジェニックマウス株を生産することができたことが最近示され、当該株は、ヒトの対応部分で置き換えたマウスIgG遺伝子を有している(Bruggeman等、1991、Lonberg等、1994、Lonberg and Huszar、1995、Jacobovits、1995)。ヒト重鎖及び軽鎖(カッパー)免疫グロブリン（Ig）座の大きい断片を含む酵母人工染色体(YACs)を、Ig不活性マウスに導入し、遺伝子再配列、組み立て、及びレパートリーを含め、ヒトに見られるような極めて類似するヒト抗体生産を生じた(Mendez等、1997、Green等、1994)。同様に、Fishwild等は、後で従来のハイブリドーマ技術を使用してヒト免疫グロブリンを得るためにヒトIg-トランスジェニックを構築した。ハイブリドーマ細胞は、安定性、成長、及び分泌レベルを含め、野生型マウスのものと類似の性質を有するヒト免疫グロブリンを分泌した。当該トランスジェニックマウス株から生産された組み換え抗体は、非ヒトアミノ酸配列を有していない。
【００３５】
それにもかかわらず、これまで生産されたヒト免疫グロブリンは、非ヒト細胞において生産される欠点を有し、グリコシル化及び／又はサブユニットの折り畳みなどの非ヒト翻訳後修飾を生じた。全ての抗体は、それらの不変領域において保存された位置でグリコシル化され、糖の存在は、補体活性などの抗原クリアランス機能に致命的となる可能性がある。付加した糖の構造は、抗体活性にも影響を与える可能性がある。抗体グリコシル化は、生産される細胞、抗体の形成、及び細胞培養条件によって影響を受ける可能性がある。例えば、マウス細胞において生産された抗体は、ヒト細胞で生産されたタンパク質に存在しないGal α-３Gal残基を含むグリカンを有する(Borrebaeck等、1993、Borrebaeck 1999)。抗Gal α-３Gal抗体の非常に高いタイター(100μg/ml、Galili,、1993)がヒトに存在し、それらのグリカンにおけるこの残基を有する(ネズミ)タンパク質の急速なクリアランスを引き起こす。
【００３６】
効果を発揮するために患者は延長した期間非常に高い組み換え免疫グロブリンの投与量で治療を受ける必要があることはすぐに明白になった。ヒト細胞において生産されないヒト免疫グロブリンにおける翻訳後修飾は、大動脈からのこれらの抗体のクリアランス率にかなり影響すると思われる。
Gal α-３Gal残基がこの細胞株から引き出したタンパク質にグルカンが存在しないので、なぜCHO細胞上に生産された免疫グロブリンを非常に高投与量で適用する必要があるのか不明である(Rother and Squinto, 1996)。
それゆえ、Gal α-３Gal残基以外の他の翻訳後修飾がそのようなCHO細胞で生産された完全なヒト免疫グロブリンに対して、ヒトにおいて特異的な免疫反応を巻き込むようである。
【００３７】
それゆえ、この技術は、腫瘍誘導タンパク質配列なしに、ヒト抗体を生産する事が可能であることを教示するものである。しかしながら、組み換え免疫グロブリンの現在の生成は、天然のヒトの対応、例えば、グリコシル化及び折りたたみ等の翻訳後修飾といまだ異なっている。これは、患者の免疫系の活性化を生じさせるかもしれず、治療の効き目に影響を与えるかもしれない望ましくない応答の原因となるかもしれない。それゆえ、キメラ抗体の開発にもかかわらず、現在の生産系は依然として完全なヒト活性抗体を生産するための最適化を必要としている。
【００３８】
したがって、適切に振る舞い、加えて、ヒト腫瘍細胞で観察されるより速い収率で生産される完全なヒト抗体を生産するための方法を明らかに望まれる。
それゆえ、これに限定されないが、たとえばグリコシル化などの翻訳後及び翻訳前修飾のような矛盾しないヒト型タンパク質プロセッシングを生産するヒト細胞を提供する事は、当該技術における改善であろう。更なる利点は、組み換え哺乳類細胞及び組み換え哺乳類細胞由来の免疫グロブリンを大量生産で生産する方法を提供することであろう。
【００３９】
したがって、本発明は、組み換え哺乳類細胞において免疫グロブリンの少なくとも１つの可変領域を生産するための方法を提供することにあり、アデノウイルスの不死化E１タンパク質又はそのゲノムにおける機能的誘導体、相同物及び／又はその断片の少なくとも1つをコードする核酸を含み、さらに、前記免疫グロブリンをコードする第二の核酸を含み、適当な培地で前記細胞を培養し、かつ、前記細胞及び／又は培地から少なくとも１つのモノクローナル抗体を収穫する事を含む。
【００４０】
これまでに、もしあるとしても、僅かだが、再生可能で高級などのような方法においても免疫グロブリンを生産するのに適当なヒト細胞を見出した。本発明の細胞は、少なくとも不死化アデノウイルスE1タンパク質を含み、外因性の成長因子とかなり無関係に成長する能力を有する。
さらに、これらの細胞は、有意義な量で免疫グロブリンを生産する能力を有し、生成した免疫グロブリンを正確にプロセスする能力を有する。免疫グロブリン生産に使用される細胞型は、腫瘍誘導されているという事実は、それら特定の細胞株で機能することに対して余分なリスクを加え、いかなる調製においても形質転換活性又は腫瘍形成物質を避けるために、免疫グロブリンに対して非常に厳しい単離方法を生じる。
【００４１】
それゆえ、本発明による方法を使用することが好ましく、それによって、前記細胞は、初代細胞から誘導される。無制限に成長可能とするために、初代細胞を、不死化する必要があり、それは、本発明においてアデノウイルスE1タンパク質の導入によって達成した。細胞培養を通して大規模(連続)生産を達成するために、固定の必要なく、成長能力のある細胞を所有することが好ましい。本発明の細胞は、そのような能力を有する。細胞がアデノウイルスのゲノムにおいてE2A(又は機能的誘導体又は相同体又はそれらの断片)をコードするアデノウイルス誘導配列を含むとき、この固定非依存性成長能力は改善される。好ましい実施態様において、配列をコードするE2Aは、ts125などの温度耐性突然変異体E2Aをコードする。加えて、前記細胞は、(例えば、tTaをコードする)核酸を含むことができ、当該核酸は、プロモーター(例えば、Tet０プロモーター)の制御下に置かれたとき、関心のある遺伝子の規則正しい発現を可能とする。
【００４２】
核酸は、免疫グロブリンの重鎖、種々の重鎖、軽鎖、及び／又は種々の軽鎖をコードすることができる。あるいは、分離した、すなわち別個の核酸は、(上述した)最初の核酸に対する対応として、Ig(又は、機能的誘導体、相同体、及び／又はその断片)の1又はそれ以上の可変領域をコードすることができる。ここで述べた1又はそれ以上の核酸は、ScFvをコードすることができ、ヒト又はヒト化とすることもできる。本発明の核酸は、誘導可能なプロモーター(又はその機能的誘導体)の制御下に好ましく置かれる。
【００４３】
所望の免疫グロブリンを単離し易い清潔で、かつ安全な生産系を持つためには、本発明による方法を使用することが好ましく、それによって、前記ヒト細胞は、他のアデノウイルス配列を含まない。本発明の方法と使用に対して最も好ましい細胞は、ECACC no.９６０２２９４０下で寄託されたようなPER.C6又はその誘導体である。PER.C６は、例えば、アデノウイルスE1領域によって不死化した形質転換ヒト２９３細胞より、取り扱いにおいて特により安定であることが判明した。PER.C6細胞は、大規模で、懸濁液成長可能で、及び成長因子無関係の良好な方法であると証明されて、広範に特徴つけられ、提供されている。
【００４４】
さらに、PER.C６は、比較的再生産可能な方法において、懸濁液へ組み込むことができ、とりわけ、大規模生産に対して適切にさせる。この点に関して、PER.C６細胞株は、バイオリアクター成長に特徴づけられ、そこでは、非常に高い濃度へ成長することができる。
【００４５】
本発明の細胞、特に、PER.C6は、動物若しくはヒト誘導血清、又は動物若しくはヒト誘導血清成分の不存在下で優位に培養することができる。それゆえ、モノクローナル抗体の単離は、単純化され、安全性は、培養における追加のヒト又は動物タンパク質の不存在のために高められる。さらに、ここで考えるような合成媒体を使用することは再生産性を高めるので、血清の存在しないことは、系の信頼性を高める。さらに、本発明は、免疫グロブリンの少なくとも１つの可変領域を生産するための組み換え哺乳動物細胞の使用を提供し、前記細胞は、そのゲノムにおける少なくともアデノウイルスの不死化E1タンパク質、又は機能を有する誘導体、相同物、又はその断片をコードする配列を有し、その細胞は、構造的なアデノウイルスタンパク質を生産しない。別の実施態様において、本発明は、初代細胞から誘導されるような使用を提供し、好ましくは、前記ヒト細胞はPER.C6細胞又はその誘導体である。
【００４６】
さらに、本発明は、本発明による使用を提供し、前記細胞は、さらに、そのゲノムにおいてE2A(又は機能を有する誘導体、アナログ又はその断片)をコードする配列を含み、好ましくは、前記E2Aは温度耐性である。加えて、本発明は、本発明を使用する方法を提供し、前記細胞は、さらに、前記誘導可能なプロモーターを誘導するためのトランス活性 (trans-activating) タンパク質を含む。
【００４７】
本発明は、本発明による方法、又は本発明による使用によって得ることが可能な免疫グロブリンも提供する。
別の実施態様において、本発明は、そのゲノムにおいてアデノウイルス(又は機能を有する誘導体、相同物、又はその断片)のE1をコードする配列を有するヒト細胞を提供し、その細胞は、アデノウイルス構造タンパク質を生産せず、ヒト組み換えタンパク質をコードする遺伝子を有し、ECACC no.96022940の下で寄託されたようなPER.C6から誘導されたヒト細胞が好ましい。
【００４８】
さらに、別の実施態様において、本発明は、さらにE2A(又は機能を有する誘導体、アナログ又はその断片)をコードする配列をそのゲノム中に有するヒト細胞、PER.C6／E2Aなどを提供し、好ましくは、E2Aは、温度耐性である。本発明の細胞において発現される免疫グロブリンは、当業者に既知である。組み換え免疫グロブリンの例は、限定されないが、ハーセプチン(Herceptin)、リトキサン(Rituxan(Rituximab))、UBS-54、CAMPATH-１H及び15C5を含む。
【００４９】
さらに、本発明は、本発明の不死化組み換え哺乳類動物細胞を利用して、適当な培地において同様に培養し、選別したIgの少なくとも1つの可変領域を組み換え哺乳動物細胞及び／又は培地から収穫して、組み換え哺乳類動物細胞において免疫グロブリンの少なくとも1つの可変領域を生産するための方法を提供する。免疫グロブリン、免疫グロブリンの可変領域、又はその誘導体は、哺乳動物の治療上の処置又は薬剤組成物の製造に使用することができる。
【００５０】
別の側面において、本発明は、ワクチンとして使用するアデノウイルス以外のウイルスタンパク質又はアデノウイルスタンパク質を生産するための方法を提供し、当該方法は、アデノウイルスのE1遺伝子又はその機能を有する誘導体の少なくとも１つの遺伝子産物をコードする少なくとも1つの配列を有する細胞を調製し、前記ウイルスタンパク質をコードする核酸を有する細胞を調製し、前記ウイルスタンパク質を発現可能な適当な培地において前記細胞を培養し、ウイルスタンパク質を前記培地及び／又は前記細胞から収穫することを含む。本発明までに、あるとしても僅かだが、(ヒト)細胞が、いずれの再生産可能で高度な方法及び／又は十分に高収率及び容易な精製においてワクチンとして使用する前記ウイルスタンパク質を生産するのに適することが判明した。私達は、アデノウイルスE1配列を含む細胞、好ましくは、それらのゲノムにおいて有意義な量でウイルスタンパク質を生産する能力を有する細胞を見出した。
【００５１】
本発明の好ましい細胞は、ヒト初代細胞から誘導され、細胞は、前記E1遺伝子の遺伝子生産物によって不死化されていることが好ましい。成長可能にするために、もちろん初代細胞も不死化する必要がある。そのような細胞の良い例は、ヒト胚網膜牙細胞腫から誘導したものである。
本発明による細胞においてE1遺伝子配列が細胞サイクル中に失わない事が重要である。それゆえ、E1遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物をコードする前記配列が前記(ヒト)細胞のゲノム中に存在することが好ましい。安全のために、本発明による細胞において不必要なアデノウイルス配列を避けるように注意を払うことが最も良い。それゆえ、本発明の別の実施態様は、アデノウイルス構造タンパク質を生産しない細胞を提供することである。しかしながら、大規模(連続)ウイルスタンパク質生産を細胞培養において達成するために、固定することなく成長可能な細胞を有することが好ましい。本発明の細胞は、そのような能力を有する。そこからの回収が容易で、かつ所望によりウイルスタンパク質を精製することが容易な清潔、かつ安全な生産系を得るために、前記ヒト細胞は、他のアデノウイルス配列を含まない本発明による方法を採用することは好ましい。本発明の方法及び使用に対して最も好ましい細胞は、ECACC no. 96022940下で寄託されたようなPER.C6、又はその誘導体である。
【００５２】
したがって、本発明は、本発明による細胞を使用した方法を提供し、前記細胞は、さらに、E2A、又は機能を有する誘導体、又はアナログ、その断片をコードする配列を含み、好ましくは、E2A又は機能を有する誘導体又はアナログ又はその断片をコードする前記配列が、前記ヒト細胞のゲノム中に存在する細胞であり、さらに好ましくは、配列をコードする前記E2Aは、温度耐性突然変異体E2Aをコードする細胞である。
【００５３】
さらに、上述したように、本発明は、前記(ヒト)細胞が懸濁液中で成長可能であることを特徴とする本発明による方法も提供する。
本発明は、前期ヒト細胞が血清の不存在下において培養することができる方法も提供する。本発明による細胞、特にPER.C6は、血清又は血清成分の不存在下で培養することができるという追加の利点を有する。それゆえ、単離が容易で、安全性が向上し、系の信頼性は良好である(合成した媒体は、再生産性において最も良い)。本発明のヒト細胞、特に初代細胞に基づくもの、とりわけHER細胞に基づくものは、通常の翻訳後修飾及び翻訳修飾、及び組み立ての能力がある。これは、それらがワクチン使用用ウイルスタンパク質を調製するのに非常に適することを意味する。
【００５４】
それゆえ、本発明は、前記ウイルスタンパク質が、翻訳後修飾及び／又は翻訳修飾を経たタンパク質を含み、とりわけ、前記修飾は、グリコシル化からなる事を特徴とする本発明による方法を提供する。ワクチンは、ヒトのワクチン接種に使用することができる。しかしながら、ワクチンは、動物においても効果を有する。この実施態様において、ワクチンは、細胞がワクチンのウイルスタンパク質が引き出された種と同じ種から引き出されることを特徴とする本発明によって生産されることが好ましい。ウイルスタンパク質は、全ウイルスタンパク質又は機能を有するその誘導体とすることができる。ウイルスタンパク質の機能を有する同等物は、ウイルスタンパク質の少なくとも免疫原部分である。いかなる信頼性ある方法で生産するのにもやっかいなウイルスワクチンの良い例は、インフルエンザワクチンである。本発明は、前記ウイルスタンパク質がインフルエンザウイルスノイラミニターゼ及び／又はヘマグルチニンの少なくとも1つを含むことを特徴とする本発明による方法を提供する。本発明による方法において生産することができる他のウイルスタンパク質は、エンテロウイルス、例えば、ライノウイルス、アフターウイルス、ポリオウイルス等、ヘルペスウイルス、例えば、ヘルペスシンプレックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ウシヘルペスウイルス等、オルソミクソウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、例えば、ニューキャッスル病ウイルス等、レスピレートリーシンシチオウイルス(respiratory synciio virus)、おたふくかぜウイルス、又は麻疹ウイルス等、レトロウイルス、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ロータウイルス、又はコロナウイルス、たとえば、伝染性の胃腸炎ウイルス又はフラビウイルス、たとえば、ダニ媒介の脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスなど、トガウイルス、たとえば、風疹ウイルス、イースタン、ウエスタン又はベネズエリアン(venezuelean)ウマ脳脊髄炎ウイルス、肺炎を引き起こすウイルス、たとえば、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルスなど、ぺスティウイルス、たとえば、ブタコレラウイルス、ラブドウイルス、たとえば、狂犬病ウイルスなど由来のタンパク質を含む。
【００５５】
本発明は、アデノウイルスのE1タンパク質、機能を有する誘導体、相同物、その断片をコードする配列をそのゲノム中に有するヒト細胞であって、当該細胞は、ワクチンとして使用するための少なくとも1つのウイルスタンパク質を生産するためにアデノウイルス構造タンパク質を生産しない細胞の使用も提供する。もちろんこのような使用に関して、本発明による方法に好ましい細胞もまた好ましい。本発明は、本発明による方法及び使用から生じる生産物、特に適当な賦形剤からなる薬剤組成物、いくらかの構成(サブユニット)アジュバントを取り上げるとき、とりわけそれらの使用及び／又は方法によって得られるウイルスタンパク質も提供する。
【００５６】
投与の適量及び方法は、まだ利用されていない限り、既知の登録されたワクチンを通じて通常の臨床試験を通じて選別することができる。それゆえ、本発明による方法又は使用によって得ることが可能なワクチンにおいて使用するためのウイルスタンパク質であって、いかなる非ヒト哺乳類タンパク質性物質や、ウイルスタンパク質などからなる薬剤配合物のないウイルスタンパク質も提供する。
好ましい実施態様において、本発明は、本発明による方法、又は本発明による使用によって得る事ができるインフルエンザワクチンを提供する。
別の側面において本発明は、真核細胞においてタンパク質性物質の生産を高めるための抗アポトーシス活性を有する、アデノウイルスE1Bタンパク質、機能を有する誘導体、相同物及び／又はその断片の使用を提供し、当該使用は、前記E1Bタンパク質、誘導体、相同物及び／又はその断片を有する前記真核細胞を提供することを含む。好ましい実施態様において前記使用は、本発明の細胞を含む。別の好ましい実施態様において、本発明は、本発明の方法及び／又は使用における前記使用を提供する。
【００５７】
実施例
本発明を説明するために、以下の実施例を与えるが、本発明の範囲を限定する意図ではない。ヒトエリスロポエチン(EPO)分子は、4つの糖鎖を含んでいる。３つは、アスパラギンに対するN結合を含み、１つはセリン残基も対するO結合を含む。EPOの生物学的活性におけるグリコシル化の重要性はよく提供されている(Delorme等1992、Yamaguchi等1991)。ヒトEPOをコードするｃDNAを、PER.C6細胞及びPER.C6/E２A細胞において、クローン化し発現させ、発現を示し、グリコシル化パターンを分析した。
【００５８】
実施例１：基本的発現ベクターの構築
プラスミドpcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)をNruI及びEcoRVで消化し、５‘末端でShimpアルカリホスファターゼ(SAP, GIBCO Life Tech.)で脱リン酸化し、サイトメガロウイルス(CMV)由来の直後の初期エンハンサー及びプロモーターを欠くプラスミド断片をゲルから精製した。組み換えアデノウイルスを生産するために、重複するアデノ誘導配列の次に全長CMVエンハンサー／プロモーター(−735から＋９５まで)を含むプラスミドpAdAptを、AvrIIで消化し、クレノウポリメラーゼで満たし、HpaIで消化し、CMVエンハンサー及びプロモーターを含む断片をアガロースゲルで精製した。このCMVエンハンサー及びプロモーター断片をブラント／ブラントでNruI／EcoRV断片へpcDNA3.1/hygro(-)から括った。生じたプラスミドをpcDNA2000/Hyg(-)と指定した。
【００５９】
プラスミドpcDNA2000/Hyg(-)をPmlIで消化し、ヒグロマイシン耐性マーカー遺伝子を欠く線状のプラスミドをゲルから精製し、再びくくった。生じたプラスミドをpcDNA2000と指定した。プラスミドpcDNA2000をPmlIで消化し、SAPによって両末端を脱リン酸化した。導入した非コード性の、ｃDNAの上流及び下流のPmlI部位を用いてcDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって野生型DHFR−遺伝子を得るために、野生型ヒトDHFRｃDNAを含むプラスミドpIG−GC９(Havega等、1998)を使用した。使用したPCRプライマーは、DHFR上流、すなわち、５‘-GAT  CCA  CGT  GAG  ATC  TCC  ACC  ATG  GTT  GGT  TCG  CTA  AAC  TG-3’、及び、DHFR下流、すなわち、５’−GAT  CCA  CGT  GAG  ATC  TTT  AAT  CAT  TCT  TCT  CAT  ATAC−３‘であった。PCR生成物をPmlIで消化し、pcDNA2000(PmlIで消化し、SAPで脱リン酸化した)の中につつるのに使用し、pcDNA2000/DHFRwtを得た(図1)。野生型配列及び正確に使用したクローニング部位を二本鎖シークエンシングによって確定した。さらに、ヒトDHFR遺伝子（DHFRm）の突然変異体を使用して、メトトレキセートへの10,000倍の耐性をPER.C6及びPER.C6/E2Aにおいて高い転写活性を有するゲノム領域における導入遺伝子の可能な組み込みの選別によって達成した。 この突然変異体は、PCR法によって導入された位置32(フェニルアラニンに対してセリン)及び位置159(ロイシンに対してプロリン)においてアミノ酸置換を有する。プラスミドpIG‐GC12でのPCRを、ヒトDHFRの突然変異体を得るために使用した。この突然変異体のクローニングは、野生型DHFRに匹敵する。突然変異体DHFRで得られたプラスミドをpcDNA2000/DHFRmと指定した。
pIPspAdapt ６(Galapagos)をAgeI 及び BamHI制限酵素で消化した。生じたポリリンカー断片は、以下の配列、すなわち、５‘−ACC GGT  GAA  TTC  GGC  GCG  CCG  TCG  ACG  ATA  TCG  ATC  GGA  CCG  ACG  CGT  TCG  CGA  GCG  GCC  GCA  ATT  CGC  TAG  CGT  TAA  CGG ATC  C−３’を有する。使用したAgeI及びBamHI認識部位をアンダーラインで示す。この断片は、いくつかの特有の制限酵素認識部位を含み、アガロースゲルで精製し、AgeI/BamHI消化し、アガロースゲル精製pcDNA2000／DHFRwtプラスミドにくくった。生じたベクターをpcDNA2001／DHFRwtと命名した(図2)。
pIPspsAdapt７（Galapagos）をAgeI及びBamHI制限酵素で消化し、それは、以下の配列、すなわち、５‘−ACC GGT  GAA  TTG  CGG  CCG  CTC  GCG  AAC  GCG  AAC  GCG  TCG  GTC  CGT  ATC  GAT  ATC  GAT  ATC  GTC  GAC  GGC  GCG  CCG  AAT  TCG  CTA  GCG  TTA  ACG GAT CC −３’を有する。使用したAgeI及びBamHI制限部位をアンダーラインで示す。ポリリンカー断片は、(pIPspAdapt６と異なる)いくつかの制限酵素認識部位を含んでおり、該断片は、アガロースゲルから精製し、AgeI/BamHI消化し、アガロースゲル精製したpcDNA2000／DHFRwtにくくられている。これは、pcDNA2002／DHFRwtとなる(図3)。
PcDNA2000／DHFRwtを制限酵素PvuIIで一部消化した。このプラスミドにおいて2つのPvuII部位が存在し、クローニングを、BGHポリAの下流PvuII部位ではなく、SV４０ポリAとColE1との間の部位で行なった。単一部位消化したプラスミド混合物はＳＡＰで脱リン酸化し、クレノウ酵素で平滑化し、アガロースゲルで精製した。pcDNA2001／DHFRwtをMunI及びPvuII制限酵素でで消化し、両方のブラント末端を有するためにクレノウ及び遊離ヌクレオチドで充填した。生じたCMVプロモーター−リンカーーBGHポリ(A)含有断片をゲルから単離し、ベクターから分離した。この断片を一部消化し脱リン酸化したベクターにくくり、方向と挿入部位のためにチャックされた。生じたプラスミドをpcDNAs3000／DHFRwtと命名した(図4)。
【００６０】
実施例２  EPO発現ベクターの構築
全長ヒトEPOｃDNAを、オリゴヌクレオチドプライマーEPO−START、すなわち、５‘AAA  AAG  GAT  CCG  CCA  CCA  TGG  GGG  TGC  ACG  AAT  GTC  CTG  CCT  G−３’及びEPO−STOP、すなわち、５‘AAA  AAG  GAT  CCT  CAT  CTG  TCC  CCT  GTC  CTG  CAG  GCC  TC−３’(Cambridge Bioscience Ltd)を使用して、PCRでヒト成熟肝臓ｃDNAライブラリーでクローン化した。増幅した断片をBamHIで線形にしたpUC１８内でクローン化した。配列を二本鎖シークエンシングによってチェックした。pUCにおいてEPOｃDNAを含有するこのプラスミドを、BamHIで消化し、EPO挿入物をアガロースゲルから精製した。プラスミドpcDNA2000／DHFRwt及びpcDNA2000／DHFRｍをBamHIで線形にし５‘突出でSAPによって脱リン酸化し、プラスミドをアガロースゲルから精製した。EPOcDNA断片をpcDNA2000／DHFRwt及びpcDNA2000／DHFRmのBamHI部位のなかにくくり、生じたプラスミドをpEPO2000／DHFRwt(図５)、及びpEPO2000／DHFRmと指定した。
【００６１】
プラスミドpMLPI.TK(WO 97／00326で述べた)は、PER.C6(WO 97/00326及びUS 08／892,873で述べた)等の改良パッケージング細胞株と組み合わせて使用するのに設計されたアダプタープラスミドの一例である。まず、PCR断片を、pZipΔMo＋PyF101（N）鋳型DNA(PCT／NL96／00195で述べた)から、以下のプライマー、すなわち、LTR−1(５‘−CTG  TAC  GTA  CCA  GTG  CAC  TGG  CCT  AGG  CAT  GGA  AAA  ATA  CAT  AAC  TG−３’)及びLTR−２(５‘−GCG  GAT  CCT  TCG  AAC  CAT  GGT  AAG  CTT  GGT  ACC  GCT  AGC  GTT  AAC  CGG  GCG  ACT  CAG  TCA  ATC  G−３’)を用いて生成した。その後、PCR生成物をBamHIで消化し、PvuII及びBamHIで消化したpMLP10(Levrero等、1991)の中にくくり、それによって、ベクターpLTR10を得た。このベクターは、bp１からbp454までのアデノウイルス配列ついで突然変異体ポリオマ―ウイルス(PyF101)由来のエンハンサーによって置換されたその野生型エンハンサー配列を有するMo−MuLV LTRの一部からなるプロモーターを含む。プロモーター断片をL420と指定した。次に、ネズミHSA遺伝子のコード領域を挿入した。pLTR10をBstBIで消化し、その後クレノウ処理、NcoIでの消化をした。HSA遺伝子を、以下のプライマー、すなわち、HSA１(５‘−GCG  CCA  CCA  TGG  GCA  GAG  CGA  TGG  TGG  C−３’)及び HSA１(５‘−GTT  AGA  TCT  AAG  CTT  GTC  GAC  ATC  GAT  CTA  CTA  ACA  GTA  GAG  ATG  TAG  AA−３’)を使用してPUC18−HSA(Kay等1990)でのPCR増幅によって得た。269bpPCR断片をシャトルベクターにNcoI及びBglII部位を使用してサブクローン化した。
HSA遺伝子の正確なコード配列の確定した組み込みを配列化するが、TAG終止コドンの直後に余分なTAG挿入物を有した。その後、タグ重複を含むHSA遺伝子領域のコード領域を、NcoI／SalI断片として切り取り、3.5kb NcoI／BstBIカットpLTR10のなかへクローン化して、pLTR−HSA10を得た。残存ITR、パッケージングシグナル、L420プロモーター及びHSA遺伝子を含む断片をEcoRI及びBamHIで消化した後、このプラスミドを同じ酵素で消化し、それによってプロモーター及び遺伝子配列を置き換え、新しいアダプタープラスミドpAd5／L420−HSAを生じた。
【００６２】
pAd５／L420−HSAプラスミドをAvrII及びBglIIで消化し、その後クレノウ処理し、HhaI及びAvrIIで処理しその後T4DNAポリメラーゼ処理によって得たpcDNA１／amp(Invitrogen)由来のブラント1570bp断片へくくった。このアダプタープラスミドをpAd５／ClIPと命名した。
【００６３】
残存ITRからベクター配列の除去を可能とするために、pAd５／L420−HSAをEcoRIで一部消化し、線形断片を単離した。オリゴ配列５‘TTA  AGT  CGA  C-３’をそれ自身アニールして、SalI部位及びEcoRI突出を有するリンカーを得た。リンカーを一部消化したpAd５／L420−HSAベクターにくくり、pAd５／L420−HSAにおいて残存アデノウイルスITRの23bp上流のEcoRI部位に挿入したリンカーを有するクローンを選別し、pAd5／L420−HSA salを得た。
【００６４】
残存ITRからベクター配列の除去を可能とするために、pAd５／CLIPもEcoRIで一部消化し、線形断片を単離した。EcoRIリンカー５‘TTA  AGT  CGA  C-３’を一部消化したpAd５／CLIPベクターにくくり、残存アデノウイルスITRの23bp上流のEcoRI部位に挿入したリンカーを有するクローンを選別し、pAd5／CLIP salを得た。ベクターpAd5／L420−HSAも修飾して残存ITRの上流にPacI部位を創った。これに関して、pAd5・L420−HSAをEcoRIで消化し、PacIリンカー(５‘AAT  TGT  CTT AAT TAA CCG  CTT  AA−３’)でくくった。くくった混合物をPacIで消化し、割られたリンカーを取り除くために、線形DNAをアガロースゲルから単離した後、再びくくった。これは、結果としてアダプタープラスミドpAd５／L420−HSA.pacとなった。
【００６５】
このプラスミドを、AvrII及びBglIIで消化した。このベクター断片を同じ制限酵素で消化したリンカーオリゴヌクレオチドにくくった。リンカーを、以下の配列、すなわち、PLL−１(５‘−GCC  ATC  CCT  AGG  AAG  CTT  GGT  ACC  GGT  GAA  TTC  GCT  AGC  GTT  AAC  GGA  TCC  TCT  AGA  CGA  GAT  CTG  G-3’)及びPLL−２(５‘−CCA  GAT  CTC  GTC  TAG  AGG  ATC  CGT  TAA  CGC  TAG  CGA  ATT  CAC  CGG  TAC  CAA  GCT  TCC  TAG  GGA  TGG  C-3’)のアニーリングオリゴによって作製した。このアニールしたリンカーをAvrII／BglII消化したpAd５／L420−HSA.pac断片に別々にくくり、pAdMire.pacとなった。次に、pacリンカーを含む断片の除去後、salリンカーを含むpAd５／CLIP.sal由来の0.7kbScaI／BsrGI断片を、pAdMire.pac プラスミドのScaI／BsrGI部位にクローン化した。生じたプラスミドをpAdMire.salと命名した。
【００６６】
プラスミドpAd5／L420−HSA.pacをAvrIIで消化し、５‘突出末端をクレノウ酵素を使用して充填した。HindIIIを用いた2番目の消化は、L420プロモーター配列の除去となった。ベクター断片を単離し、別々にCMVプロモーター配列を含むPCR断片にくくった。以下のプライマー、すなわち、CMVプラス（５’−GAT  CGG  TAC  CAC  TGC  AGT  GGT  CAA  TAT  TGG  CCA  TTA  GCC−３‘）及びCMVminA(５’GAT  CAA  GCT  TCC  AAT  GCA  CCG  TTC  CCG  GC−３‘)を用いてpCMVLacI(登録遺伝子(stratagene))からCMV配列の増幅後、このPCR断片を得た。３’突出末端をT４DNAポリメラーゼで処理することによって除去した後、このPCR断片をまずPstIで消化した。その後、DNAをHindIIIで消化し、AvrII／HindIII消化したpAd５／CMV−HSA.pacベクターにくくった。生じたプラスミドをpAd５／CMV−HSAS.pacと命名した。その後、このプラスミドをHindIII及びBamHIで消化し、ベクター断片を単離し、pAdMire.pacの消化後、得られたHindIII／BglIIポリリンカー配列にくくった。生じたプラスミドをpAdApt.pacと命名し、該プラスミドは、ヒトCMVプロモーター／エンハンサー(Boshart等、1985)のヌクレオチドー７３５〜＋９５を含んでいる。適切な翻訳のための完全なコザック配列(Kozak sequence)を含む全長ヒトEPO cDNA(Genbank accession No.：M11319)を、BamHI消化した後、pUC18バックボーンから除去した。cDNA挿入物をアガロースゲルから精製し、BamHIで消化したpAsApt.pacのなかへくくり、次に、SAPを用いて５‘及び３’挿入部位で脱リン酸化し、アガロースゲルから精製し、短いBamHI−BamHIリンカー配列を除去した。得られた環状プラスミドをKpnI、DdeI及びNcoI制限消化で全てが正しい大きさのバンドを与えることをチャックした。さらに、2本鎖配列によって方向と配列を確認した。正しい方向においてヒトEPO ｃDNAを有する得られたプラスミドをpAdApt.EPOと命名した(図6)。
【００６７】
実施例３  UBS−54 発現ベクターの構築
イントロン配列及び結合(ヒンジ)領域を含むヒト免疫グロブリンG1(IgG1)遺伝子の重鎖の不変領域(CH1、−２及び−３)を上流及び下流プライマーを使用してPCRによって生成した。上流プライマーの配列(CAMH-UP)は、５‘GAT  CGA TAT CGC TAG CAC  (CAA  GGG  CCC  ATC  GGT  C)−３’であり、アニーリングヌクレオチドをイタリック体(括弧でくくる)で表し、2つの一連の制限酵素認識部位(EcoRV及びNheI)をアンダーラインで示す。
【００６８】
下流プライマーの配列(CAMH−DOWN)は、５‘−GAT  CGT TTA AAC (TCA  TTT  ACC  CGG  AGA  CAG)−３’であり、アニーリングヌクレオチドをイタリック体(括弧でくくる)で表し、導入PmeI制限酵素認識部位をアンダーラインで示す。
ヒトIgG1重鎖の領域が整列された順序は、以下の通りである。すなわち、CH1−イントロン−ヒンジ−イントロン−CH2−イントロン−CH３である。PCRを、ヒトフィブリノーゲン由来のD二量体に対して向けられるヒト抗体の重鎖を含むプラスミド(pCMガンマ NEO Skappa Vガンマ Cガンマ hu)にて行なった(Vandamme等、1990)。この抗体を15C5と命名し、イントロン配列を含むヒト不変領域の導入を行ないヒト化した(Bulens等 1991)。
【００６９】
PCRは、1621ヌクレオチドの生成物を生じた。NheI及びPmeI部位を簡易なクローニングのためにpcDNA2000／Hyg(−)ポリリンカーの中に導入した。2つのアミノ酸(Ala及びSer)をコードするNheI部位は、CH1の不変領域の一部であるが、鋳型に存在するDNAにハイブリダイズしなかった(Crowe等1992)。
PCR産物をNheI及びPmeI制限酵素で消化し、アガロースゲルから精製し、NheI及びPmeI消化しアガロースゲル精製したpcDNA2000／Hygro(−)の中にくくった。これは、結果としてプラスミドpHC2000／Hyg(−)(図7)を生じ、これは、ヒト用のいずれの同定免疫グロブリン重鎖のいずれの可能な可変領域に対するイントロンを含んでおり、ヒト重鎖不変領域に結合するために使用することができる。
【００７０】
ヒト免疫グロブリン(IgG1)遺伝子の軽鎖の不変領域を、上流及び下流プライマーを使用してPCRによって生成した。すなわち、上流領域プライマー(CAML−UP)の配列は、５‘−GAT  CCG TAC G(GT  GGC  TGC  ACC  ATC  TGT  C)-3’であり、アニーリングヌクレオチドをイタリック体(括弧でくくる)で表し、導入SunI制限酵素認識部位をアンダーラインで示す。
【００７１】
下流領域プライマー(CAML−DOWN)の配列は、５‘−GAT  CGT TTA AAC (CTA  ACA  CTC  TCC  CCT  GTT  G)-3’であり、アニーリングヌクレオチドをイタリック体(括弧でくくる)で表し、導入PmeI制限酵素認識部位をアンダーラインで示す。ネズミシグナル配列及びヒトIgG１軽鎖の不変領域へ結合した15C５の軽鎖のネズミ不変領域を有するプラスミド(pCMカッパー DHFR１３ １５C５カッパー 人工)でPCRを行なった(Vandamme等、1990、Bulens等1991)。
PCRは、340ヌクレオチド生産物を生じた。SunI及びPmeI部位をクローニングのためにpcDNA2001／DHFRwt ポリリンカーのなかに導入した。SunI部位は2つのアミノ酸(Arg及びThr)をコードし、スレオニン残基は、ヒト免疫グロブリン軽鎖の不変領域の一部であり、一方、アルギニン残基は、CAMPATH−１Hの可変領域の一部である(Crowe等、1992)。これは次の３‘をプラスミド特有のSunI部位へクローニングするのを可能とした。PCR生産物をSunI及びPmeI制限酵素で消化し、アガロースゲルから精製し、BamHI、PmeI消化し、アガロースゲル精製したクレノウ酵素及び遊離ヌクレオチドで平滑化されたpcDNA2001／DHFRwtへくくった。正しい方向でくくったものは、BamHI部位を5’末端で欠き、SunI及びPmeI部位を保存した。生じたプラスミドをpLC2001／DHFRwt(図８)と命名し、当該プラスミドは、ヒトのためにいかなる同定免疫グロブリン軽鎖のいかなる可能な可変領域に対してもヒト軽鎖不変領域を結合するために使用することができる。
【００７２】
pNUT−Cガンマ(Huls等、1999)は、ヒトIgG1重鎖の不変領域、イントロン、及びヒンジ領域を含み、以下のリーダーペプチド配列、すなわち、MACPGFLWALVISTCLEFSM(配列：５‘−ATG  GCA  TGC  CCT  GGC  TTC  CTG  TGG  GCA  CTT  GTG  ATC  TCC  ACC  TGT  CTT  GAA  TTT  TCC  ATG−３’)によって先導された完全なヒト化モノクローナル抗体のガンマ鎖の最初の不変領域の上流及び可変領域を受容する。これは、長さ約2kbの挿入物を生じた。全ガンマ鎖を、上流プライマー(UBS-UP)及び下流プライマーCAMH−DOWNを用いて、PCRによって増幅した。UBS−UPの配列は、以下のようである。すなわち、５‘−GAT  CAC GCG TGC TAG (CCA  CCA  TGG)  CAT  GCC  CTG  GCT  TC−３’であり、導入したMluI及びNheI部位はアンダーラインで示し、完全なコザック(Kozak)配列をイタリック体(括弧でくくる)とした。生じたPCR生産物を、NheI及びPmeI制限酵素で消化し、アガロースゲルから精製し、やはりNheI及びPmeIで消化し、ｔSAPで脱リン酸化し、ゲルから精製したpcDNA2000／Hygro(−)プラスミドへくくった。生じたプラスミドをpUB−Heavy2000／Hyg(−)と命名した(図9)。pNUT-Cカッパーは、ヒトIgG1カッパーの軽鎖の不変領域を含み(Huls等1999)、以下のリーダーペプチド、すなわち、MACPGFLWALVISTCLEFSM(配列：５‘−ATG  GCA  TGC  CCT  GGC  TTC  CTG  TGG  GCA  CTT  GTG  ATC  TCC  ACC  TGT  CTT  GAA  TTT  TCC  ATG−３’、プラスミド上の詳細に関してUbiSysを参照。)によって先導される完全なヒト化モノクローナル抗体UBS−５４カッパー鎖の可変領域を受容した。これは、長さ約1.2kbの挿入物を生じた。全挿入物は、上流プライマーUBS−UP及び下流プライマーCAML−DOWNを使用してPCRで増幅し、これによって翻訳開始部位を修飾する。生じたPCR生産物をNheI及びPmeI制限酵素で消化し、アガロースゲルから精製し、やはりNheI及びPmeIで消化し、ｔSAPで脱りん酸化し、ゲルから精製したpcDNA2001／DHFRwtへくくり、pUBS−Light2001／DHFRwtを生じた (図10) 。可変領域とpNUT−Cガンマに存在する最初の不変領域との間に位置する余分なイントロンを除去し、かつシグナルペプチド及び可変領域をヒトIGG1重鎖領域の野生型不変領域へ結合するために、pNUT−Cガンマにおいてカルボキシル末端不変領域に存在する多量の多形性を欠くとき、PCR生産物を、以下の配列を有するプライマーUBS−UP及びプライマーUBSHV−DOWNを用いて生成する。配列は、５‘−GAT  CGC TAG (CTG  TCG  AGA  CGG  TGA  CCA  G)−３’であり、ここで、導入したNheI部位は、アンダーラインで示し、アニーリングヌクレオチドをイタリック体(括弧でくくる)とする。生じたPCR生産物を、NheI制限酵素で消化し、ゲルから精製し、NheI消化し、SAP脱リン酸化して、ゲルから精製したpHC2000／Hyg(−)プラスミドへくくった。正確な方向の挿入物とリーディングフレームを有するプラスミドをpUBS２−Heavy2000／Hyg(−)と命名した(図１１)。
【００７３】
可変領域とｐＮＵＴ−Ｃκに存在する定常領域の間に位置するエキストライントロンを除去するために、かつシグナルペプチドおよび可変領域をヒトＩｇＧ１軽鎖の野生型定常領域に結合するために、ＰＣＲ生成物をプライマＵＢＳ−ＵＰおよび以下の配列：５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＴＣ−３’（ここで、導入ＳｕｎＩ部位に下線を付し、アニーリングヌクレオチドをボールドにする。）を有するプライマＵＢＳＬＶ−ＤＯＷＮを使用して生成する。次に、得られたＰＣＲ生成物をＭｌｕＩおよびＳｕｎＩ制限酵素を使用して消化し、ゲルで精製し、ゲルで精製したＭｌｕＩおよびＳｕｎＩ消化ｐＬＣ２００１／ＤＨＦＲｗｔプラスミドに結合した。得られたプラスミドをｐＵＢＳ２−軽２００１／ＤＨＦＲｗｔと呼ぶ（図１２）。
【００７４】
ＵＢＳ−５４の全長重鎖のＰＣＲ生成物をＮｈｅＩおよびＰｍｅＩ制限酵素を使用して消化し、クレノウ酵素を使用して平滑化する。このフラグメントを、ＢｓｔＸＩ制限酵素で消化し、平滑化し、ＳＡＰにより脱リン酸化し、ゲルで精製したプラスミドｐｃＤＮＡｓ３０００／ＤＨＦＲｗｔに結合する。重鎖挿入断片を伴ったプラスミドをｐＵＢＳ−重３０００／ＤＨＦＲｗｔと呼ぶ。続いて、前記軽鎖のＰＣＲをＭｌｕＩおよびＰｍｅＩ制限酵素を使用して消化し、平滑化し、ゲルで精製し、そして、ＨｐａＩを使用して消化し、ｔＳＡＰにより脱リン酸化し、ゲルで精製したｐＵＢＳ−重３０００／ＤＨＦＲｗｔに結合する。得られたベクタをｐＵＢＳ−３０００／ＤＨＦＲｗｔを呼ぶ（図１３）。可変領域と第１定常領域の間のイントロンのない、かつ野生型のカルボキシ末端定常領域（２０３１ヌクレオチド）を有するｔＵＢＳ−５４の重鎖をエンコードする遺伝子は、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩを使用したｐＵＢＳ２−２０００／Ｈｙｇ（−）の消化およびクレノウ酵素およびＥｃｏＲＩ部位を平滑化する遊離ヌクレオチドを使用した処理の後、ゲルで精製する。次に、挿入断片を、ＢｓｔＸＩで消化し、平滑化し、ＳＡＰを使用して脱リン酸化し、ゲルで精製したｐｃＤＮＡｓ３０００／ＤＨＦＲｗｔプラスミドに結合する。得られたプラスミドをｐＵＢＳ２−重３０００／ＤＨＦＲｗｔと呼ぶ。その後、ｐＵＢＳ２−軽２００１／ＤＨＦＲｗｔをＥｃｏＲＶおよびＰｍｅＩを使用して消化し、ＵＢＳ−５４のκ鎖の可変領域に結合したシグナルペプチドを含む７５５ヌクレオチド挿入断片、およびイントロン配列のないヒトＩｇＧ１κ鎖の定常領域を、ゲルで精製し、そして、ＨｐａＩを使用して消化し、ｔＳＡＰを使用して脱リン酸化し、ゲルで精製したｐＵＢＳ２−重３０００／ＤＨＦＲｗｔに結合する。得られたプラスミドをｐＵＢＳ２−３０００／ＤＨＦＲｗｔと呼ぶ（図１４）。
【００７５】
プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）をＢｓｔＢＩ制限酵素を使用して消化し、クレノウ酵素を使用して平滑化し、次に、ＸｍａＩ酵素を使用して消化する。ネオマイシン制限遺伝子含有フラグメントをアガロースゲルで精製し、そして、ＸｍａＩおよびＰｍｌＩ制限酵素を使用して消化し、ＳＡＰを使用して脱リン酸化し、ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを除去するためにゲルで精製したｐＵＢＳ２−軽２００１／ＤＨＦＲｗｔプラスミドに結合した。得られたプラスミドをｐＵＢＳ−軽２００１／Ｎｅｏと呼んだ。このフラグメントを、ＸｍａＩ／ＰｍｌＩで消化し、ゲルで精製したｐｃＤＮＡ２００１／ＤＨＦＲｗｔプラスミドにも結合し、ｐｃＤＮＡ２００１／Ｎｅｏを得た。ＵＢＳ−５４可変領域のＰＣＲ生成物および消化し生成した定常領域ＰＣＲ生成物をＭｌｕＩ／ＰｍｅＩで消化したｐｃＤＮＡ／Ｎｅｏとのスリーポイント連結反応において使用した。得られたプラスミドをｐＵＢＳ２−軽２００１／Ｎｅｏと呼ぶ。
【００７６】
実施例４：ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ発現ベクターの構成
ケンブリッジバイオサイエンス社（英国）は、完全なコザック（Ｋｏｚａｋ）配列、続くシグナル配列および公開されたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖の可変領域（１９９２年、Ｃｒｏｗｅ氏らによる）を含む３９６ヌクレオチドフラグメントを作る。このフラグメントは、５’末端に、導入されたユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位を、３’末端に、導入されたユニークＳｕｎＩ部位を含み、適当なシャトルベクターにクローニングする。このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｕｎＩを使用して消化し、得られたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖フラグメントをゲルで精製し、そして、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｕｎＩで消化し、アガロースゲルで精製したｐＬＣ２００１／ＤＨＦＲｗｔに結合する。得られたプラスミドをｐＣＡＭＰＡＴＨ−軽２００１／ＤＨＦＲｗｔと呼ぶ。ケンブリッジバイオサイエンス社（英国）は、完全なコザック配列、続くシグナル配列およびＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖の公開された可変領域（１９９２年、Ｃｒｏｗｅ氏らによる）を含む４３８ヌクレオチドフラグメントを作り、適当なクローニングベクターにクローニングする。この生成物は５’末端にユニークＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を、かつ３’末端にユニークＮｈｅＩ制限酵素認識部位を含む。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩを使用して消化し、得られたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖フラグメントをゲルで精製し、そして精製されＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩで消化したｐＨＣ２０００／Ｈｙｇ（−）に結合した。得られたプラスミドをｐＣＡＭＰＡＴＨ−重２０００／Ｈｙｇ（−）と呼ぶ。
【００７７】
実施例５
１５Ｃ５発現ベクターの構成
イントロン配列、ヒンジ領域、１５Ｃ５κ軽鎖からシグナルペプチドにより先行された可変領域を含むヒト定常領域からなるヒトフィブリンフラグメントＤ−二量体（１９９１年Ｂｕｌｅｎｓ氏ら、および１９９０年Ｖａｎｄａｍｍｅ氏らによる）に対して指向したモノクローナル抗体１５Ｃ５のヒト化バージョンの重鎖を、下流プライマーとしてのＣＡＭＨ−ＤＯＷＮ、上流プライマーとしての１５Ｃ５−ＵＰを使用して、テンプレートとしてのプラスミド「ｐＣＭｇａｍｍａ  ＮＥＯ  Ｓｋａｐｐａ  Ｖｇａｍｍａ  Ｃｇａｍｍａ  ｈｕ」上のＰＣＲにより増幅する。１５Ｃ５−ＵＰは、以下の配列：５’−ＧＡ  ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＣＴＡ  GCC ACC ATG GＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＡＴＣ−３’を有する。ここで、導入されたＭｌｕＩおよびＮｈｅＩ制限認識部位に下線を付し、完全なコザック配列を半角で表す。適当なコザックを適切に導入するために、＋４位置（ＡＴＧ開始コドンのアデニンは＋１である。）のアデニンをグアニンで置換し、その結果、アルギニンからグリシンアミノ酸への突然変異をもたらす。プライマーの二量体化を防止するために、グアニンの＋６位置をチミンで置換し、シトシンの＋９位置をチミンで置換する。後者の突然変異は、トレオニン残渣を無傷で残す。得られたＰＣＲをＮｈｅＩおよびＰｍｅＩ制限酵素で消化し、ゲルで精製し、そして、ＰＣＲを、ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩ制限酵素で消化し、ＳＡＰで脱リン酸化し、アガロースゲルで精製したｐｃＤＮＡ２０００／Ｈｙｇｒｏ（−）に結合する。得られたプラスミドをｐ１５Ｃ５−重２０００／Ｈｙｇ（−）と呼ぶ。ヒト定常領域および２０のアミノ酸シグナルペプチドで置換された可変領域からなるヒトフィブリンフラグメントＤ−二量体（１９９１年、Ｂｕｌｅｎｓ氏ら、および１９９０年、Ｖａｎｄａｍｍｅ氏らによる）に対して指向したモノクローナル抗体１５Ｃ５のヒト化バージョンの軽鎖を、下流プライマーとしてのＣＡＭＬ−ＤＯＷＮ、上流プライマーとしての１５Ｃ５−ＵＰを使用して、テンプレートとしてのプラスミドｐＣＭκ  ｈｕ上のＰＣＲにより増幅する。得られたＰＣＲをＮｈｅＩおよびＰｍｅＩ制限酵素で消化し、ゲルで精製し、そして、ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＳＡＰで脱リン酸化し、アガロースゲルで精製したｐｃＤＮＡ２００１／ＤＨＦＲｗｔに結合する。得られたプラスミドをｐ１５Ｃ５−軽２００１／ＤＨＦＲｗｔと呼ぶ。
【００７８】
実施例６：  メトトレキセートハイグロマイシンおよびＧ４１８選択レベルの確立
ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａを異なる密度でシードした。これらの選択性研究におけるメトトレキセート（ＭＴＸ）の開始濃度は、０ｎＭと２５００ｎＭの間の範囲にある。両細胞ラインに対する致死量の濃度を定量した。６−ウェル皿においてウェル当たり１００．０００細胞の密度で細胞をシードした場合、ウェルは１０ｎＭで未だ１００％の融合性であり、２５ｎＭで９０〜１００％の融合性であった。一方、殆どの細胞は、６日から１５日の培養後、５０ｎＭおよびそれ以上の濃度で死んだ。これらの結果を表１に纏める。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、ハイグロマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子のいずれかをもたらすプラスミドによりエンコードされた組み換えモノクローナル抗体に対する重および軽量鎖を発現する発芽後成長安定コロニーを選択するために、ハイグロマイシンとＧ４１８の組み合わせに対する耐性に対して試験した。細胞を、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む正常培地で成長された場合、非トランスフェクト細胞は死に、安定なコロニーが現れた（実施例７参照）。
【００７９】
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞ＡＴＣＣ：ＣＲＬ９０９６を、それぞれの培地に異なる密度でシードする。これらの選択性研究においてメトトレキセートの開始濃度は、約０．５ｎＭから５００ｎＭの範囲である。細胞ラインに対する致死量であるこの濃度を定量し、次に、ＩｇＧ重鎖選択（ｈｙｇ）および軽鎖選択（ｄｈｆｒ）の場合、ハイグロマイシン上での成長選択直後に使用した。
【００８０】
実施例７：安定な細胞ラインを得るためのＥＰＯ発現ベクターのトランスフェクション
細胞ラインＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａの細胞を、約２００〜３００万細胞／皿にて４０組織培養皿（直径１０ｃｍ）にシードし、それぞれの条件（１０％のＣＯ２濃度および、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａに対して３９℃、ＰＥＲ．Ｃ６に対して３７℃の温度）で一夜置いた。次の日、トランスフェクションを３７℃でピポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ）を使用して全て行った。４時間後に新たな（ＤＭＥＭ）培地で置換した後、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を再び３９℃に移し、一方、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を３７℃に保持した。全て標準プロトコルに従って、２０皿の各細胞ラインを、５μｇＳｃａＩで消化したｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔを使用してトランスフェクトし、２０皿を、５μｇＳｃａＩで消化したｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｍを使用してトランスフェクトした。別の１３皿を、メトトレキセート死および約５０％のトランスフェクション効率に対する負のコントロールとして使用した。次の日、皿に、透析したＦＢＳを含む培地に溶解したＤＨＦＲｗｔに対して１００〜１０００ｎＭの、ＤＨＦＲｍに対して５０．０００〜５００．０００ｎＭの範囲の濃度でＭＴＸを添加した。細胞を４〜５週間培養した。組織培地（ＭＴＸ含有）を、毎２〜３日で新しくした。細胞を正のコントロールと負のコントロール間で比較しながら、毎日死に対してモニターした。発芽後成長コロニーを採取して、二次培養した。正のコントロールは、高可能性として、適用されたＭＴＸの高濃度の毒作用の為に、突然変異ＤＨＦＲ遺伝子を受け入れたトランスフェクタントから二次培養できなかった。野生型ＤＨＦＲ遺伝子を用いてトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞から、コロニーは２５０と５００ｎＭのＭＴＸで皿上に現れたが、細胞が１００ｎＭのＭＴＸ上で成長した場合に、最初の継代において細胞ラインが確立されただけであった。これらのコロニーは、二次培養の間生きておらず、廃棄した。
【００８１】
実施例８：トランスフェクト細胞の二次培養
各細胞ラインから、ＭＴＸ濃度のしきい値への耐性を有する約５０の選択されたコロニーをそれぞれ培地プラスＭＴＸ中で９６ウェル、２４ウェル、６ウェルのプレートおよびＴ２５フラスコにおいて続いて成長させた。細胞がＴ２５組織培養フラスコにおける成長に達した場合、各クローンの少なくとも１バイアルを冷凍し、貯蔵し、そして次に、ヒト組み換えＥＰＯ生成物に対して試験した。このため、Ｒ＆Ｄシステムからの市販のＥＬＩＳＡキットを使用した（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ，  ｃａｔ．＃  ＤＥＰＯＯ）。種々のコロニーが異なる成長特性および成長曲線を有するを思われるので、ＥＰＯ生成物に対する標準を以下のようにセットした。０日に細胞をフラスコ当たり５０から１５０万の濃度でＴ２５組織培養フラスコ中にシードした。４日に、上清を取り、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡにおいて使用した。これから、生成レベルを１日当たり１００万シード細胞当たりＥＬＩＳＡ単位としてセットした。（Ｕ／１Ｅ６／日）。多くのこれらのコロニーを表２に示す。
【００８２】
良好な製造業者のクローンの以下の選択は、高発現、培養挙動、および生存能力に基づいた。長期期間の生存能力、長期間のローラーボトルおよびバイオリアクター中での懸濁成長を調べるために、最も良好な製造業者のクローンのより多くのバイアルを冷凍し、さらなる調査Ｐ８、Ｐ９、Ｅ１７およびＥ５５の為に以下の最も良好な製造業者の各細胞ラインを選択した。ここにおいて、「Ｐ」はＰＥＲ．Ｃ６を、「Ｅ」はＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａを表す。これらのコロニーを二次培養し、２箇月の範囲でメトトレキセートの用量を増加した。濃度はしきい値濃度で開始し、約０．２ｍＭに増加する。これらの２箇月の間、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ実験を、ＥＰＯ生成の増加を検出するためにレギュラー基準について行った。最も高いメトトキセート濃度で、最も良好な安定な製造業者を選択し、最良のＣＨＯクローンからの量と比較し、細胞保存（ＲＬ）用に使用した。全ての他のクローンから、５のバイアルを冷凍する。増幅したＥＰＯ  ｃＤＮＡコピーの数をサザンブロッティングで検出した。
【００８３】
実施例９：バイオリアクターにおけるＥＰＯ製造
ＰＥＲ．Ｃ６，Ｐ９のトランスフェクトした安定な細胞ラインを製造する最良の実施ＥＰＯは、懸濁に付され、１から２リットルの発酵槽に規模を拡大した。Ｐ９を懸濁するために、付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞がフラスコから離れ、懸濁培養を形成した後、次に、ＰＥＲ．Ｃ６（ＪＲＨ）に対してＪＲＨ  ＥｘＣｅｌｌ  ５２５培地を使用して培養した。細胞を２種のＭＴＸ濃度に置いた。つまり、０ｎＭおよび１００ｎＭである。これらの濃度（ローラーボトル中）に達したＥＰＯの一般的な製造レベルは、それぞれ１日当たり１００万シード細胞当たり１５００と５７００単位であった。ＭＴＸ非存在下の低収量は組込みＤＮＡの除去により説明できるが、長期間低濃度のＭＴＸに維持される細胞は、１００ｎＭのＭＴＸの濃度に再び移された場合、前者の収量に達する可能性があるので、あたかも組込みＤＮＡの活動停止作用があるように思われる（実施例１１）。
【００８４】
懸濁Ｐ９細胞を１００ｎＭのＭＴＸで正常に成長させ、バイオリアクターの接種用に使用した。２のバイオリアクターのセットを試験した。つまり、灌流および繰り返しバッチ培養である。
【００８５】
Ａ．２リットルのバイオリアクターにおける灌流
細胞を、１ｍｌ当たり０．５×１０６細胞の濃度でシードし、細胞が１ｍｌ当たり約２．３×１０６細胞の密度に達した後３日に灌流を開始した。灌流速度は、２４時間当たり約２５０ｍｌのブリードで、２４時間当たり１容量であった。このセットでは、Ｐ９細胞は、１ｍｌ当たり約５×１０６細胞の一定の濃度を維持し、１箇月にわたりほとんど９５％の生存能力を維持した。ＥＰＯ濃度を、レギュラー基準で定量し、図１５に示した。２リットルの灌流バイオリアクターでは、Ｐ９細胞は、１ｍｌ当たり約６０００ＥＬＩＳＡ単位の製造レベルを維持できた。１日当たり１作業容量（１．５から１．６リットル）の灌流速度について、これは、２リットルのセットではＰ９細胞は、ＭＴＸの非存在下で２リットルのバイオリアクター当たり１日当たり約１×１０７単位を製造したことを意味する。
【００８６】
Ｂ．２リットルのバイオリアクターにおける繰り返しバッチ
ローラーボトルで成長したＰ９懸濁細胞を使用して、ＭＴＸの存在下で２リットルのバイオリアクターに接種し、１ｍｌ当たり約１５０万細胞の密度まで成長させ、その後、集団の３分の１を除去し（２〜３日当たり±１リットル）、残りの培養を新たな配置で希釈して、再び１ｍｌ当たり５０万細胞の密度に達した。この製造を３週間繰り返し、作業容量を１．６リットルに維持した。除去した培地のＥＰＯ濃度を定量し、図１６に示した。平均濃度は１ｍｌ当たり約３０００ＥＬＩＳＡ単位であった。２日の平均期間の後、集団を希釈した。これは、この２リットルセットではＰ９細胞は、ＭＴＸの非存在下で１日当たり約１．５×１０６単位を製造したことを意味する。
【００８７】
Ｃ．種々の溶解酸素濃度、温度、ｐＨセットの１リットルバイオリアクター中の繰り返しバッチ
新たなＰ９懸濁細胞を、ローラーボトル中１００ｎＭのＭＴＸの存在下で成長させ、ＪＲＨ  ＥｘＣｅｌｌ  ５２５  培地中１ｍｌ当たり３０万細胞の密度まで４×１リットルバイオリアクターの接種用に使用した。ＥＰＯ収量を３、５、７日後に定量した。試験された第１のセットは０．５％、１０％、１５０％であり、正のコントロールとしては５０％の溶解酸素（％ＤＯ）であった。５０％のＤＯは、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰ９細胞を正常に維持する条件である。別の実験では、Ｐ９細胞を接種し、異なる温度（３２℃、３４℃、３７℃、３９℃）でＥＰＯ製造について試験した。ここで、３７℃はＰＥＲ．Ｃ６およびＰ９に対して正常なセットである。第３の実験では、新たなＰ９細胞を接種し、種々のｐＨセット（ｐＨ６．５、ｐＨ６．８、ｐＨ７．０、ｐＨ７．３）でＥＰＯ製造について試験した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞をｐＨ７．３に正常に維持する。ＥＰＯ収量（シード後３日）の概観を図１７に示す。温度が３２℃から３９℃に上がると、明らかに、ＥＰＯ濃度は増加する。それは、３９℃（表４）で成長したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞についても言えた。また、５０％のＤＯは、ここで試験した範囲でＰ９に対して最適である。ｐＨ６．５では、このバイオリアクター中の生存可能性は７日後に８０％以下に低下するので、細胞は生き残ることができない。これらのセットで製造されたＥＰＯ試料は、グリコシル化および２Ｄ電気泳動の電荷について調べる（実施例１７も参照）。
【００８８】
実施例１０：ＤＨＦＲ遺伝子の増幅
実施例８に記載された多くの細胞ラインを増幅実験において使用し、２箇月より長い期間でＭＴＸの濃度の増加によるＤＨＦＲ遺伝子の数を増加させる可能性を定量した。この濃度は、しきい値濃度（１００ｎＭ）で開始し、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ、１２００ｎＭの中間的な段階で、１８００ｎＭまで増加させた。この間に、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ実験をレギュラー基準で行い、１日当たり１００万シード細胞当たりの単位を検出した（図１８）。最高のＭＴＸ濃度（１８００ｎＭ）で、幾つかのバイアルを冷凍した。細胞ペレットを得て、ＤＮＡを抽出し、次に、ＢｇｌＩＩで消化した。その理由はこの酵素はｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔにおける野生型ＤＨＦＲ遺伝子の周囲を切断するからである（図５）。そこで、このサイズの明確なＤＨＦＲバンドはサザンブロットにおいて内因性のＤＨＦＲから識別されるであろう。このＤＮＡを実験して、ブロットし、このブロットを放射性ＤＨＦＲプローブでハイブリッド形成し、次にバックグラウンドコントロールとしてのアデノウイルスＥ１プローブでハイブリッド形成した（図１９）。ハイブリッドバンドの強度をホスホリメジャー（phosphorimager）で測定し、バックグラウンドレベルで補正した。これらの結果を表３に示す。たとえ、この場合、組込みベクターを使用せず、内因性ＤＨＦＲのみを使用しても、明らかに、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子を増幅することができる。
【００８９】
実施例１７：安定な細胞ラインにおけるＥＰＯ発現の安定性
実施例８で述べた多くの細胞ラインを、ＭＴＸの存在下および非存在下で長期間の培養に付した。ＥＰＯ濃度を、規則的に測定し、この場合、Ｔ２５フラスコ当たり１．０から１．５×１０６細胞をシードして、４日間置き、１日当たり１００万シード細胞当たりのＥＰＯ生成レベルを計算した。結果を図２０に示す。これから、ＭＴＸの存在下で細胞を培養する場合、Ｐ６細胞のＥＰＯは比較的安定に発現すること、およびＭＴＸの非存在下でＥＰＯ生成が減少することがわかる。しかし、Ｐ９細胞を、ＭＴＸの非存在下で長期間培養した後、１００ｎＭのＭＴＸ上に再び置くと、発現したＥＰＯは、元のレベル（１日当たり１００万シード細胞当たり±３０００ＥＬＩＳＡ単位）に達し、組込みプラスミドは除外されるが、安定に組込まれて、再び元に切り換わることができることを示している。ＭＴＸの存在下でＰ８の生成レベルは数多くの継代にわたり時間と共に減少するが、一方、Ｐ９の生成は少なくとも６２の継代に対して安定であるので、細胞ラインＰ８およびＰ９には相違があるように考えられる。
【００９０】
実施例１２：プラスミドＤＮＡトランスフェクション後の付着したおよび懸濁した細胞における組換え体ＥＰＯの一時的な発現
実施例２からのｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔ  ｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｍ  およびｐＡｄＡｐｔ．ＥＰＯプラスミドを、カラム上でＥ．ｃｏｌｉから精製し、リポフェクトアミン、電気泳動、ＰＥＩ、または他の方法を使用して、トランスフェクトする。ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞をカウントして、ＤＭＥＭプラス血清またはＪＲＨ  ＥｘＣｅｌｌ  ５２５培地または懸濁中のトランスフェクション用の適当な培地にシードする。
トランスフェクションを３７℃で、使用したトランスフェクション法に応じて１６時間まで、当業者が知っている方法にしたがって行う。次に、その細胞を異なる温度に置き、培地を血清を含むあるいは含まない新たな培地に置換する。血清成分を完全に含まない培地を得る必要がある場合には、血清を含まない新たな培地を３時間後に再び除去し、血清成分を含まない培地により再度置換される。組換え体ＥＰＯ生成の定量のために、試料を異なる時点で採取する。組換え体蛋白質の収量を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム）を使用して定量する。ここで、１単位は約１０ｎｇの組換え体ＣＨＯ−生成ＥＰＯ蛋白質（１００，０００単位／ｍｇ）に等しい。これらの実験で使用した細胞は、その起源、特性、温度の為に、異なる速度で成長する。したがって、生成された組換え体ＥＰＯの量は、一般に、ＥＬＩＳＡキットで使用した抗血清は非−および高グリコシル化組換え体ＥＰＯ間を識別しないことを考慮にいれて、ＥＬＩＳＡ単位／１０６シード細胞／日において計算される。一般に、これらの計算に対する試料は、トランスフェクションの際、培地を置換した後４日で採取する。
【００９１】
リポフェクトアミンを使用して３７℃でトランスフェクトし、血清の存在下で３９℃で成長させたＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞は、典型的に、３１００単位／１０６細胞／日を生成した。血清を含まない培地の入れ換えなしで、血清成分の非存在下では、これらのリポフェクトアミン−トランスフェクト細胞は、２６００単位／１０６細胞／日を生成した。リポフェクトアミンを使用して３７℃でトランスフェクトし、次に血清の存在下で３７℃で成長させたＰＥＲ．Ｃ６細胞は、典型的に、７５０単位／１０６細胞／日を生成した。血清の非存在下では、５９０単位／１０６細胞／日である。比較のために、同じ発現プラスミドｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔおよびｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｍを適用して、中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，ＥＣＡＣＣ  ｎｒ．８５０５０３０２）を、リポフェクトアミン、ＰＥＩ、リン酸カルシウム法、および他の方法を使用して、トランスフェクトした。ＣＨＯ細胞を、リポフェクトアミンを使用してトランスフェクトし、次に血清の存在下でＨａｍｓ  Ｆ１２培地で培養した場合、１９０単位／１０６細胞／日の収量を得た。トランスフェクトをＤＭＥＭ中で行った場合はより高い収量を得ることができるけれども、血清の非存在下では、９０単位／１０６細胞／日を生成した。
【００９２】
付着したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を含む種々のプレートを３７℃でｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔを使用してトランスフェクトし、次に３２℃、３４℃、３７℃、または３９℃に置いて、組み換え体ＥＰＯ生成について温度の影響を定量した。温度依存生成レベルは、４日の試料からの計算で、２５０〜６１０単位／１０６シード細胞／日の範囲で観察された。これから、ＰＥＲ．Ｃ６とＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａにおいて観察された生成レベル間の差は、インキュベーション温度に部分的に起因することを示す（図１７参照）。ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａは、３７℃で成長が良好であるので、３７℃でさらに研究を行った。
【００９３】
付着したＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を含む種々のプレートをｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔ、ｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｍおよびｐＡｄＡｐｔ．ＥＰＯと共に、リポフェクトアミンを使用してトランスフェクトした。トランスフェクション後4時間で、ＤＭＥＭを、ＤＭＥＭプラス血清または血清を含まないＪＲＨ培地のいずれかで置き換え、ＥＰＯを数日で上清中に蓄積し、異なる培地で生成した濃度を定量した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を３７℃でインキュベートし、一方、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を３９℃に置いた。類似の発現カセットを含むので、異なるプラスミドからのデータを平均した。６日の試料から計算により以下のデータを得た。つまり、ＤＭＥＭ中で成長したＰＥＲ．Ｃ６は４００単位／１０６シード細胞／日を生成し、ＪＲＨ培地中に置いた場には、３００単位／１０６シード細胞／日を生成した。ＤＭＥＭ中で成長したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２ａは１８００単位／１０６シード細胞／日を生成し、ＪＲＨ培地中に置いた場には、１１００単位／１０６シード細胞／日を生成した。部分的には温度の違いに起因するけれども（上記参照）、ここでも、ＰＥＲ．Ｃ６とＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ間の生成レベルに明らかな相違が観察された。しかし、ＤＭＥＭ培地中の濃度対ＪＲＨ培地中の濃度間にはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａについて重大な相違がある。ただし、この効果は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞においては殆ど完全に失われている。
【００９４】
この系で得られたＥＰＯ発現データを表４に纏める。ＰＥＲ．Ｃ６およびその誘導体はＤＮＡトランスフェクション系を大規模化するのに使用できる。懸濁細胞についてのＷｕｒｍおよびＢｅｒｎａｒｄ（１９９９）のトランスフェクションは、１〜１０リットルのセットアップで行うことができる。ここで、１〜１０ｍｇ／ｌの組み換え体蛋白質の収量（０．１〜１ｐｇ／細胞／日）を、電気泳動を使用して得た。制御が良好で、特に多くの蛋白質のスクリーニングに対して収量が高く、安定なセットにおいて毒性蛋白質が生成され得ないことが、この系に対して要求される。血清の非存在下で、最良のＰＥＲ．Ｃ６細胞についてのリポフェクトアミンのトランスフェクションについて、我々は５９０単位／１０６細胞／日（１  ＥＬＩＳＡ単位が約１０ｎｇ  ＥＰＯであるとき、＋／−５．９ｐｇ／細胞／日）に達した。一方、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａは、３１ｐｇ／細胞／日（血清の存在下）であった。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａの懸濁培養用に使用した培地（ＪＲＨ  ＥｘＣｅｌｌ  ５２５）は、ＰＥＩのような成分を使用して、有効な一時的なＤＮＡトランスフェクションを支持しない。したがって、培地を調整して、組み換え体ヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡを含むｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｗｔおよびｐＥＰＯ２０００／ＤＨＦＲｍ、および他のｃＤＮＡのエンコードした組み換え体蛋白質を含むｐｃＤＮＡ２０００／ＤＨＦＲｗｔのトランスフェクション後、組み換え体ＥＰＯの生成を可能にする。
【００９５】
精製したプラスミドＤＮＡを使用して一時的なＤＮＡトランスフェクションを支持するために、調整した培地中で成長するＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａの１〜１０リットルの懸濁培養は、電気泳動または他の方法のために使用され、同じ発現プラスミドを使用してトランスフェクションを行う。数時間後、トランスフェクション培地を除去し、血清のない新たな培地で置換する。組み換え体蛋白質を数日間で上清中に蓄積可能にし、その後、その上清を収集し、全ての細胞を除去する。この上清を、組み換え体蛋白質を精製するために、下流プロセシングに使用する。
【００９６】
実施例１３：ＡｄＡｐｔ．ＥＰＯ．組み換え体アデノウイルスの生成
ｐＡｄＡｐｔ．ＥＰＯを、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．ｔｅｔＯ−Ｅ４、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．ΔＥ２Ａ、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩ−ｒＩＴＲ．ΔＥ２Ａ．ｔｅｔＯ−Ｅ４コスミドと共に、適当な細胞ライン中で、当業者が知っている方法を使用してコ−トランスフェクトした。次に、細胞を数日間、適当な温度に、完全なｃｐｅが観察されるまで置いた。その後、細胞を数回、凍結／解凍段階に付し、細胞から全てのウイルスを除き、その後、細胞屑をスピンダウンした。ＩＧＡｄ５／ＡｄＡｐｔ  ＥＰＯ．ｄＥ２Ａに対して。上清を使用して細胞を感染させ、幾つかの希釈物を使用して、プラーク精製に対してアガロースのオーバーレイを施した。多くの日が経過した後、単一のプラークが、高希釈物においてはっきり目視された。９のプラークおよび１の負のコントロール（明確なプラーク間の細胞を採取した。したがって、ウイルスを殆ど含まない）を採取し、Ａ５４９細胞上でＥＰＯ生成に対して調べた。全プラーク採取ウイルスは正であり、負のコントロールは組換え体ＥＰＯを生成しなかった。１の正の生産物を使用して、適当な細胞を感染させ、Ｔ−２５フラスコからローラーボトルセットにウイルスを広げた。ローラーボトルからの上清を使用して、ウイルスを精製し、その後、ウイルス粒子（ｖｐ）の数を定量し、当業者が知っている方法を使用して、感染単位（ＩＵ）を比較した。その後、ｖｐ／ＩＵ比を決定した。
【００９７】
実施例１４：付着よび懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞のＩＧＡｄ５／ＡｄＡｐｔＥＰＯｄＥ２Ａを用いた感染
実施例１３からの精製したウイルスを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびその誘導体における組換え体ＥＰＯの一時的な発現用に使用した。ＩＧ．Ａｄ５／ＡｄＡｐｔ．ＥＰＯ．ｄＥ２Ａウイルスを使用して、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染し、一方、ＩＧ．Ａｄ５／ＡｄＡｐｔ．ＥＰＯ．ｔｅｔＯＥおよびＩＧ．Ａｄ５／ＡｄＡｐｔ．ＥＰＯ．ｄＥ２Ａ．ｔｅｔＯＥ４ウイルスを使用して、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を感染させ、複製の可能性を低下させ、さらに、複製法に起因して組み換え体蛋白質生成の阻害を防止した。感染を付着細胞および懸濁細胞について、適当な培地中で、感染の多重度の範囲（ｍｏｉ）、つまり２０、２００、２０００、２００００ｖｐ／細胞、を使用して実施した。感染を４時間、６ウェルプレートからローラーボトルまでの種々のセットで実施し、この後、ウイルス含有上清を除去した。細胞をＰＢＳで洗浄し、あるいは直接新しい培地に取り替えた。その後、細胞に、数日間、組み換え体ＥＰＯを生産させ、その間、試料を採取し、ＥＰＯ収量を定量した。また、生きている細胞の数と死んだ細胞の数の比較した。生産されたＥＰＯの量を再びＥＬＩＳＡ単位／１Ｅ６シード細胞／日として計算した。その理由は、種々の細胞ラインは、継代数および温度や選択圧力等の環境の為に、異なる成長特性を有するからである。
【００９８】
懸濁成長ＰＥＲ．Ｃ６細胞をローラーボトル中の、２５０ｍｌのＪＲＨ  ＥｘＣｅｌｌ  ５２５培地にシードし（１００万細胞／ｍｌ）、次に、精製したＩＧ．Ａｄ５／ＡｄＡｐｔ．ＥＰＯ．ｄＥ２Ａウイルスを使用して、２００ｖｐ／細胞で感染させた。ｖｐ定量用に使用した見積もりは高かった（このバッチのｖｐ／ＩＵ比は３３０であり、これは、0．６１ＩＵ／細胞のｍｏｉを示す）。したがって、全ての細胞が感染ウイルスに影響されたのではない。日６の試料からの、このセットにおける組み換え体ＥＰＯの典型的な生成は、１９０単位／１０６シード細胞／日であり、一方、５０％の生きているおよび死んだ細胞を含む培地を新しい培地で置換するセットでは、約２４０単位／１０６シード細胞／日であった。培地の取り替えは、生きている細胞の生存能力に影響しなかったが、除去された組み換え体蛋白質は、たとえ大量でも、実験の最後に得られた量に加え得る。細胞を２０ｖｐ／細胞のｍｏｉ、約０．０６の感染単位／細胞で感染させた他は同一の実験を実施した。培地の取り替えなしで、７０ＥＬＩＳＡ単位／１０６細胞／日を得た。一方、日３で５０％の培地を取り替えた実験では、８０単位／１０６細胞／日の典型的な量を測定した。これは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染に、多くの感染単位数を使用すると、用量反応効果があることを示している。
【００９９】
更に、DMEM中で成長するPER.C6細胞を、6-ウェルプレート中に播種し、付着させるための血清と共に、2mlの DMEM中に一晩放置した。翌日、細胞を、もう一バッチのIG.Ad5/AdApt.EPO.dE2Aウイルス（vp/IU比560）により、200 vp/細胞（0.35 感染性ユニット/細胞）の感染多重度で、感染させた。4時間後、培地を含んだウイルスを取り除き、血清を含んだ新鮮な培地により置換し、そして、毎日新鮮な培地で培地の置換を行いながら、2週間以上、細胞に、組み換えEPOを生産させた。1日、4サンプルから計算した組み換えEPO生産の収率は、60ユニット/106細胞/日であった。
この系で得られた発現データを、表5にまとめた。
【０１００】
アデノウイルス(E4)の初期領域4のtTA-tetO調節性発現が、活性なE4がない場合、組替えウイルスの複製容量を減少させるという事実があるため、組み換えアデノウイルスがヒトEPOのcDNAを導入遺伝子として運び、E4遺伝子がtetオペロンの制御下にあるという設定において、PER.C6/E2Aとその親細胞ラインPER.C6の蛋白質生産の可能性のあるポテンシャルを用いて、組み換え蛋白質の生産もできる。次に、E4 mRNAが非常に低レベルで生産されることにより、細胞ラインPER.C6/E2A中には組み換え複製ウイルスが非常に低いながら検知可能なレベルとなり、また、PER.C6中では該ウイルスは検知できないレベルとなる。この方法で組み換えEPOを生産するために、2つのウイルスIG.Ad5/AdApt.EPO.tetOE4及びIG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A.tetOE4を用い、PER.C6細胞及びその誘導体を感染させる。付着懸濁細胞を、小規模設定（6-ウェルプレートとT25フラスコ）及び大規模設定（ローラーボトルと発酵槽）で、異なる感染多重度の精製アデノウイルスで感染させた。異なる時点でサンプルを採取し、EPOレベルを決定する。
【０１０１】
ウイルス性背骨中のE1及びE2Aで欠損したウイルスを、PER.C6/E2A細胞中で補足することはできるが、元のPER.C6細胞中では補足できないので、両方の細胞ラインの混合物を、IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2Aウイルスの存在下で培養する設定を用いる。ウイルスはPER.C6/E2A中で複製し、続いて感染した細胞を溶菌し、その後、PER.C6又はPER.C6/E2A細胞を感染させる。反対に、PER.C6細胞中では、ウイルス性粒子が生成されるため、ウイルスは複製せず、細胞は溶菌しないが、上澄み中に分泌される組み換えEPOを生産する。使用済み培地、死んだ細胞及び残骸を除去しながら、新鮮な培地と新鮮なPER.C6及びPER.C6/E2A細胞を一定の流れで加える、定常状態の培養/複製/EPO生産システムを開始する。これと共に、組み換えEPOを該システム系から採取し、ウイルス性粒子を除去する下流処理手順での精製に使用する。
【０１０２】
実施例15：組み換えEPOの精製及び分析
成長細胞の複数の大量のバッチをバイオリアクター中で生産し、分泌された組み換えヒトEPO蛋白質を、当業者に公知の手順に従い精製する。PER.C6及びPER.C6/E2Aの安定クローン又はトランスフェクタント由来の精製組み換えヒトEPO蛋白質を、市販のEPO及び当業者に公知の方法を用いヒト起源（尿）から精製したEPOとの比較によりグリコシル化と折りたたみ性(folding)とについてチェックする（実施例16及び17参照）。PER.C6及びPER.C6/E2A由来の精製及びグリコシル化したEPO蛋白質を、生体内実験、クリスタル(1983)が記載したようにマウスの脾臓中、及び生体外アッセイで、生物学的活性について試験した（実施例18参照）。
【０１０３】
実施例16：PER.C6のベータ−ガラクトシド  アルファ  2,6−シアリルトランスフェラーゼの活性
チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞はベータ−ガラクトシド  アルファ  2,6−シアリルトランスフェラーゼに対応する遺伝子を含まないので、該CHO細胞上で生産される内在性組み換え糖蛋白質のN-及びO-結合オリゴ糖の末端での、2,6-結合シアル酸の欠損をもたらすことが知られている。アルファ  2,3−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子はCHO細胞中に存在するので、該細胞で生産された蛋白質は、典型的には2,3結合タイプに由来する。しかしながら、ヒトの尿から精製されたEPOは、アルファ  2,3−及びアルファ  2,6-結合シアル酸の双方を含む。ヒト細胞ラインであるPER.C6細胞が、アルファ  2,3−及びアルファ  2,6-結合の双方を含む組み換えEPOを生産できるか否かを決定するため、EPO発現ベクターでトランスフェクションした後、PER.C6細胞で生産された組み換えEPOに対して、直接ノイラミニダーゼアッセイを実施した。コントロールとして、CHO細胞に由来し、アルファ  2,3タイプのシアル酸結合のみを含む、市販のEprexサンプルを使用した。使用されたノイラミニダーゼは、アルファ  2,3結合ノイラミン酸（シアル酸）をN-及びO-結合グルカンから特異的に切断するニューカッスル病ウイルス(NDV)と、全ての末端N-又はO-結合シアル酸（アルファ  2,3、アルファ  2,6及びアルファ  2,8結合）を非特異的に切断するコレラ菌(VC)とに由来した。両ノイラミニダーゼはベーリンガー(Boehringer)から入手し、製造業者によって提供されたガイドラインに従いサンプルとともに培養した。結果を図21Aに示す。レーン2及び3（NDVノイラミニダーゼで処理）では、レーン1（非処理PER.C6 EPO）に比べて僅かなシフトが観測される。このEPOサンプルをVC由来のノイラミニダーゼと共に培養すると、NDV処理したサンプルに比べて、いっそう速い泳動バンドが観測される。しかしながら、市販のEprexでは、NDV由来ノイラミニダーゼを適用した場合のみ、シフトが観測され（レーン6及び7を、レーン5の非処理サンプルと比較）、VCノイラミニダーゼを使用した場合では、シフトは観測されなかった（レーン8）。
【０１０４】
更に、アルファ  2,6結合タイプのシアル酸がCHO細胞上に確かに存在せず、PER.C6細胞の細胞表面上に存在する蛋白質中に確かに存在することを示すため、次の実験を実行した。CHO細胞を、トリプシン-EDTAを用いて固体支持体から離し、一方、PER.C6には、懸濁細胞を用いた。双方の懸濁液をMem-5% FBSで1回洗い、37℃で1時間、この培地中で培養した。PBSで洗浄した後、結合培地（トリス緩衝塩類溶液、pH 7.5、0.5%BSA、MgCl2とMnCl2とCaCl2を各1mM）中で約106細胞/mlになるように、細胞を再懸濁した。細胞を複数分取し、アルファ  2,6 Gal及びアルファ  2,3 Galタイプのシアル酸結合にそれぞれ特異的に結合する、DIGで標識したレクチン、即ちSambucus nigraアグルチニン(SAN)及びMaackia amurensisアグルチニン(MAA)と共に、室温で1時間培養した。コントロール細胞は、レクチンなしで培養した。1時間後、レクチン処理細胞及びコントロール細胞の双方をPBSで洗浄し、次に室温で1時間、FITC標識抗-DIG抗体（ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannheim)）と共に培養した。続いて、細胞をPBSで洗浄し、FACソート装置（ベクトン・ディキンソン(Becton Dickinson)）で蛍光強度を分析した。FACS分析の結果を、図21Bに示す。SNAレクチンをCHO細胞で培養した場合、非処理細胞に比べて、シフトが見られないが、一方、このレクチンをPER.C6細胞で培養した場合、非処理細胞に比べて（開視野）、明らかなシフト（暗視野）が観測される。双方の細胞ラインをMAAレクチンで培養する場合、双方の細胞ラインは、非処理細胞に比べて、明らかなシフトをもたらす。
【０１０５】
これらのEPO消化及びFACSの結果から、ハムスターのCHO細胞中に存在しない、ベータ−ガラクトシド  アルファ  2,6−シアリルトランスフェラーゼ活性が、ヒトPER.C6細胞中に存在するというのが結論である。
【０１０６】
実施例17：PER.C6生産EPO中のシアル酸含有量の測定
EPOのN-及びO-結合グルカンに存在する末端のノイラミン酸（又はシアル酸）は、蛋白質が肝臓中で酵素により血流から除かれることから保護する。更に、これらのシアル酸は負に帯電しているので、電荷又は比pIにより、異なるEPO形体を区別することができる。そのため、PER.C6及びCHO細胞で生産されたEPOを、第一の次元では電荷で蛋白質を分離し（pH範囲3-10）、第二の次元では分子量で蛋白質を更に分離する、2次元電気泳動法に用いた。続いて、蛋白質を、抗-EPO抗体によるウェスタンブロット法で、ブロットし及び検知した。
【０１０７】
クマジーブルー又は銀染色法を用いてゲルを染色し、続いてゲルから異なるスポットを取り出すことによって、分離されたEPO蛋白質を検知し、質量分析法により、蛋白質上に存在する、異なるN-又はO-結合グリコシレーション化した特定のグルカン(glycan)組成を測定することも可能である。
【０１０８】
図22Aに、P9の上澄みに由来する多数のEPOサンプルを示す。P9は、安定的に組み換えヒトEPOを発現するPER.C6細胞ラインである（実施例8参照）。これらのサンプルを、約9から14のシアル酸を有するEPO形体のみを含む、市販のEprexと比較した。そのため、Eprexは負に帯電し、ゲルのpH3側に集まるべきである。図22Bは、細胞をDMEM培地で培養する付着設定におけるP9に由来するEPOと、pEPO2000/DHFRwtベクターで一過性的にトランスフェクトしたCHO細胞に由来するEPOとの比較を示す。全ての形体がP9サンプルでは検知できるにも関わらず、明らかに、EPOの低形体はCHOサンプル中では検知できない。シアル酸含有量は、1から14まで、第一の次元で分離されたバンドを数えることで分かる。ウェスタンブロット法を、ECLを用いて実施したため、また、ブロット上でEPO分子を検知するのに用いられたのが抗体かどうかが比較的不明確であるため、更に、グリコシレーションが抗体による認識又はニトロセルロースへの移動のどちらを阻害できるのかが知られていないため、これらの混合物中に存在する各形体のパーセンテージを決定することは不可能である。しかしながら、EPO分子を含んだシアル酸の分離した形体の存否を決定することは可能である。PER.C6は、シアル酸を含む14の組み換えヒトEPOのイソフォームの全ての範囲を生産できると結論することができる。
【０１０９】
実施例18：PER.C6生産EPOの生体外機能性
組み換えEPOの生体中での機能を、血流中の半減期により決定する。EPOの除去が、シアル酸によって保護されていないグルカン中のガラクトース残基に結合する肝臓酵素により起こり、また、腎臓を通した除去によっても起こる。この腎臓による濾過は、ミスフォールドによるのか、低-又はミス-グリコシレーションによるのかは、知られていない。更に、骨髄中の標的に到達し前駆細胞上のEPO受容体に結合するEPO分子もまた、血液の循環から除去される。EPO受容体への結合及び下流への信号は、EPO分子の適切なグリコシレーション状態に、大きく左右される。シアル酸は、EPOがEPO受容体に結合するのをある程度阻止することができ、それによって、蛋白質の効果の低下をもたらす。しかしながら、シアル酸はEPOが除去されるのを防ぐため、これらの糖は、EPO受容体へのEPOの移動において蛋白質を保護するEPO機能にとって不可欠なものである。シアル酸が生体外でEPOから除去される場合、受容体へより良好な結合が起こり、より強い下流への信号をもたらす。このことは生体内と生体外で機能性が著しく異なることを意味し、生体中では低-シアル酸化(under-sialylation)が半減期の短縮の原因になる可能性があるが、生体外では、適切なEPO受容体の結合特性を、チェックすることができるにも関わらずである（タケウチら、1989）。
【０１１０】
EPOの機能性に対する生体外アッセイにおいて幾つかの記載があるが、それらのうちでは、IL3、GM-CSF及びEPO依存ヒト細胞ラインTF-1の刺激が最も普通に用いられる。この結果、1mg当りの生体外ユニット数が決定できる（キタムラら、1989；ハマーリング(Hammerling)ら、1996）。生体外アッセイにおける他のものは、EPOによって刺激され分化した骨髄細胞のアガロース層の下に赤色コロニーの形成するもの、培養されたマウス骨髄細胞（クリスタルら、1981及び1983；タケウチら、1989）、ラット骨髄細胞（ゴールドバッサー(GoldWasser)ら、1975）中のヘムへ59Feを取りこむもの、及び抗血清に対するEPOの認識を決定するラジオイムノアッセイ(RIA)がある。PER.C6/E2A細胞で生産されたEPOを用い、次のようにして、TF-1細胞を刺激した。細胞を、培養においてこれらの細胞の不明瞭な成長を刺激できるIL3又はGM-CSFが欠如した培地中に、1ウェル当り約10,000細胞の濃度で、96-ウェルプレートに播種した。続いて、培地を加え、最終的な濃度を、1ml当り0.0001、0.001、0.01、0.1、1及び10ユニットにする。正のコントロールであるEprexのユニットは分かっているが（1ml当り4000ユニット）、これらのユニットはELISAで決定し、同じ濃度に希釈した。細胞をこれらのEPOサンプルで4日間培養し、その後、MTSアッセイ(Promega)を実施し、490nmでの蛍光測定により生存能力のある細胞のチェックを行った（蛍光は、MTSがホルマザンに移行した後、検知できる）。図23は、EPO発現ベクターによりトランスフェクトし続いて37℃及び39℃で4日間培養したPER.C6/E2A細胞に由来する2つのサンプルの活性を示す。この結果は、39℃で得られたサンプルの方が37℃で得られたサンプルより活性が高いことを示唆し、このことは、シアル酸含有量がより高い温度で部分最適であることを示すと考えられる。これにより、PER.C6生産EPOは体外のアッセイにおいてTF-1細胞を刺激できることが示され、このヒト細胞ラインで生産されたEPOがEPO受容体と相互作用をし、分化を促進できることを強く示唆する。
【０１１１】
実施例19：PER.C6及びPER.C6/E2Aにおける組み換えマウス及びヒト化及びヒトモノクロナール抗体の生産
A.一過性DNAトランスフェクション
cDNAがコードするマウス、ヒト化及びヒトモノクロナール抗体(mAbs)の重鎖及び軽鎖を、2つの異なる系でクローン化する。一方の系では、重鎖及び軽鎖を一つのプラスミド（修飾されたpcDNA2000/DHFRwtプラスミド）の中に一体化し、もう一方の系では、cDNAの重鎖及び軽鎖を別々に異なるプラスミドの中にクローン化する（実施例1、3、4及び5参照）。これらのプラスミドは同一の選択マーカー（DHFRのような）を担持することができ、又は夫々それら自身の選択マーカーを担持することができる（DHFR遺伝子を含むもの及び例えば新抵抗マーカーを含むもの）。一過性の発現系では、次の選択を実施しないので、ベクターの中心にどのような選択マーカーが存在するかは重要でない。当該技術で用いられる通常のトランスフェクション法では、等量のプラスミドをトランスフェクトする。重鎖及び軽鎖の双方を一つのプラスミドに一体化する事の欠点は、両方のcDNAの発現を促進するプロモーターが相互に影響しあい、夫々の遺伝子のcDNAコピーの数が厳密に同じでも、両サブユニットの発現レベルが不均等になることである。
【０１１２】
マウス及びヒト化モノクロナール抗体の重鎖及び軽鎖のcDNAを含んだプラスミドをトランスフェクトし、数日後、正しく折りたたまれた抗体の濃度を、当業者に公知の方法を用いて決定する。温度や使用された培地等の条件を、PER.C6及びPER.C6/E2Aの双方についてチェックする。生産された組み換え抗体の機能性を、特定の抗原に対するアフィニティーを決定することにより制御した。
【０１１３】
Ｂ．一過性ウイルス感染
H鎖およびL鎖をコードするcDNAを２つの異なる系でクローンする。一方は、H鎖およびL鎖を単一のアダプタプラスミドに統合するものであり（修飾pAdApt.pac）、他方はH鎖およびL鎖cDNAを別々にクローンして２つの異なるアダプタにする（それぞれをpAdApt.pacに別々に入れる）。第１の系では、E2A欠失(dE2A)と共にE1欠失(dE1)を保有するか、またはアデノウイルスの骨格鎖中のtatOE4挿入という状態で両方の欠失を保有するウイルスを増殖する。第２の系では、H鎖およびL鎖をpAdApt.pac内で別々にクローンし、同じ骨格鎖を有するウイルスに別々に伝播する。これらのウイルスを用いて、付着および懸濁成長PER.C6およびPER.C6/E2A細胞に単一感染または重感染を行う。数日後、サンプルを採取して全長組み換え抗体濃度を測定し、その後アフィニティー調査に特定抗原を用いてこれらの抗体の機能性を測定する。
【０１１４】
Ｃ．組込みプラスミドの安定的生産および増幅
H鎖とL鎖とを一緒に保有する発現プラスミドおよびH鎖とL鎖とを別々に保有するプラスミドを用いて、付着PER.C6およびPER.C6/E2A細胞ならびにCHO-dhfr細胞にトランスフェクトする。続いて、細胞をMTXおよび／またはハイグロマイシンならびにネオマイシンに曝露し、異なるプラスミドの組込みを選択する。また、G418およびハイグロマイシンを用いた２重選択を行い、ネオマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドの組込みを選択する。全長モノクロナール抗体の発現を測定し、最も良く発現したクローンを、組込みの安定性、コピー数の検出、両方のサブユニットのレベルの測定、灌流および流加バイオリアクター等のより大きな設備におけるmAb生産に最良の細胞株を用いた後のMTX濃度上昇時の増幅能力を含む後の調査に用い、その後にaAbsの量および質の最適化を行う。
【０１１５】
実施例２０：安定な細胞株を得るためのmAb発現ベクターのトランスフェクション
PER.C6細胞を４７枚の組織培養シャーレ内のDMEM＋１０％FBSに約2.5×106細胞／シャーレで接種し、通常の培養条件下（CO2濃度１０％、３７℃）に一晩置いた。翌日、シャーレ当たり、pUBS-Heavy2000/Hyg(-)を消化し精製したMunI１μｇおよびpUBS-Light2001/Neo（図３を参照のこと）を消化し精製したScaI１μｇを用いて、通常の手順でリポフェタミンを用いて、３９枚のシャーレに３７℃で同時トランスフェクションを行った。一方、pcDNA2000/Hyg(-)を消化し精製したMunI１ｇおよびpcDNA2001/Neoを消化し精製したScaI１ｇを用いて、２枚のシャーレをコントロールとして同時トランスフェクションした。トランスフェクション効率のコントロールとして、LacZコントロールベクターを用いて４枚のシャーレにトランスフェクションを行い、２枚のシャーレにはトランスフェクションを行わず、陰性コントロールとして用いた。
【０１１６】
５時間後、DMEMで細胞を２回洗浄し、選択を行わずに新しい培養液を再供給した。翌日、異なる選択試薬を含有する新しい培養液に培養液を交換した。H鎖とL鎖との同時トランスフェクション体３３枚、空ベクターをトランスフェクションしたもの２枚および陰性コントロール（トランスフェクションしていないもの）２枚を５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンのみで培養した。H鎖とL鎖との同時トランスフェクション体２枚およびトランスフェクション効率シャーレ（LacZベクター）２枚を５００μｇ／ｍｌのG418のみで培養した。トランスフェクション効率シャーレ２枚には選択培地で処理せず、約４０％であるトランスフェクション効率に用いた。２枚を５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌのG418を組み合わせて培養し、２枚を２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンと５００μｇ／ｍｌのG418を用いて培養した。
【０１１７】
ハイグロマイシンのみと培養した場合、細胞が成長し過ぎるので、ハイグロマイシンとG418選択剤との組み合わせにより、トランスフェクションした２つのベクターのうち１種類のみを組み込んだ細胞が直ちに殺されることが明らかになった。したがって、接種７日後、同時トランスフェクション体全てを、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンと５００μｇ／ｍｌのG418との組み合わせを用いてさらに培養する。細胞の培地は、２または３日ごとに同じ濃度の選択剤を含有する培地に交換した。接種１４日後、G418濃度を２５０μｇ／ｍｌに、ハイグロマイシン濃度を５０μｇ／ｍｌに調整した。接種２２日後、選択、釣り上げおよび継代培養が可能な程度にまで多数のコロニーが成長した。約３００の個別のコロニーを選択し、１０ｃｍシャーレから釣り上げ、次いで９６ウエルおよび／または２４ウエルプレートを介し、６ウエルプレートを介してT25フラスコに成長させた。この段階で細胞を凍結し（継代培養コロニー毎に４バイアル）、かつ実施例２６で説明するELISAを用いて懸濁物内で組み換えUBS-54mAbの生産レベルを測定する。
【０１１８】
CHO-dhfr細胞を組織培養シャーレ（直径１０ｃｍ）内のハイポキサンチンおよびチミジンを含むDMEM＋１０％FBSに約１００万細胞／シャーレで接種し、通常条件下に一晩置く。翌日、pUBS-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS-Light2001/DHFRwtを用い、リポフェタミンを用いた通常の手順下で、同時トランスフェクションに用いる。数時間後に培地を新しい培地と交換し、トランスフェクションしていない細胞が増殖する可能性無しに、安定な組込みが起きる場合、異なる密度に分離して細胞が選択培地に適合できるようにする。まずコロニーをハイグロマイシン耐性で選択し、次にMTXを加えてこれらの継代培養細胞株内の２つのプラスミドの２重組み込みのために選択する。
【０１１９】
pUBS-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS-Light2001/Neoに関して説明したトランスフェクションをPER.C6およびPER.C6/E2A内でpUBS2-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS2-Light2001/Neoを用いて行い、その後のハイグロマイシンと、続いてG418との培養または選択剤の両方の組み合わせについて前記した培養の何れかを用いて選択を行う。pUBS-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS-Light2001/DHFRwtに関して説明したように、CHO-dhfrセルをpUBS2-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS2-Light2001/DHFRwtでトランスフェクトし、細胞をまずハイグロマイシンで選択し、その後MTXを選択することによりL鎖ベクターの組込みを制御するという順次方法で選択を行う。さらに、PER.C6およびPER.C6/E2AもpUBS-3000/Hyg(-)およびpUBS2-3000/Hyg(-)でのトランスフェクションに用いる。一方、CHO-dhfr細胞をpUBS-3000/DHFRwtおよびpUBS2-3000/DHFRwtでトランスフェクトし、その後、MTX濃度を上げて組込みプラスミドの選択およびさらなる増幅を行う。pcDNAs300の場合、H鎖とL鎖との両方のmRNAの数が同じとなることが予想されるが、別々のベクターの場合、イムノグロブリンの２つのサブユニット間で正確な平衡が達成されているかどうかは不明である。また、トランスフェクションをPER.C6、PER.C6/E2AおよびCHO-dhfrに対して実施例４および５において説明した発現ベクターを用いて行い、それぞれヒト化IgGl mAb CAMPATH-1Hおよびヒト化IgGl mAb 15C5を発現する安定な細胞株を得る。
【０１２０】
実施例２１：トランスフェクトした細胞の継代培養
pUBS-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS-light2001/NeoでトランスフェクトしたPER.C6セルから、ハイグロマイシンおよびG418を含有する培地で培養した約３００のコロニーを、続いて９６ウエル、２４ウエルおよび９ウエルプレートでそれぞれの培地にそれぞれの選択剤を加えて一般的に培養した。２４ウエルプレートで成長可能な細胞を、実施例２６で説明するELISAを用いてmAb生産について調査した。細胞が陽性を示した場合、各クローンから少なくとも１つのバイアルを凍結保存し、続いて細胞を試験し、かつ継代培養した。高発現、培養作用および生存性に基づいて産出の多いクローンを選択する。長期生存性の調査、組み込みプラスミドの増幅および長期間の懸濁成長を可能にするために、最も生産量の多いクローンを凍結し、各細胞株の最も生産量の多いものを更なる研究のために多数選択する。異なるプラスミドでトランスフェクトしたCHO-dhfr細胞と、H鎖およびL鎖の他の組み合わせならびに選択マーカーの他の組み合わせによりトランスフェクトしたPER.C6およびPER.C6/E2A細胞とに対して同様の実験を行う。
【０１２１】
実施例２２：バイオリアクター内でのmAbの生産
PER.C6のトランスフェクト細胞株で最もUBS-54の生産の多い細胞株を、PBS内で細胞を洗浄することにより懸濁液内に入れる。次に、最初は小培養フラスコで、続いてローラーボトルで、そして１乃至２リットルのファーメンターにスケールアップして、細胞をJRH ExCell 525培地内で培養する。長期間に渡りベクターの組込みが安定であることが証明されるまで、細胞をハイグロマイシンおよびG418選択剤内に保持する。細胞が付着相のままの場合、または細胞が懸濁の場合にこれを終了する。懸濁成長mAb生産PER.C6細胞をハイグロマイシンおよびG418で一般的に培養し、ローラーボトルからバイオリアクターへの接種に用いる。灌流バイオリアクター内および供給したバッチ設定内で細胞が成長した後に、生産したmAbの生産量、機能性および品質を検査する。
【０１２２】
Ａ．２リットルのバイオリアクター内での灌流
選択剤の入っていない懸濁培地に、約0.5×106細胞／ｍｌの濃度で細胞を接種し、細胞密度が約2〜3×106細胞／ｍｌに達した日から灌流を開始する。灌流速度は通常１体積／２４時間であり、２５０ｍｌ／２４時間のブリードを伴う。この設定で、細胞は通常約5×106細胞／ｍｌの密度で一定であり、９５％生存性は１ヶ月以上である。mAb生産レベルを定期的に測定する。
【０１２３】
Ｂ．２リットルのバイオリアクター内での流加
試運転において、ローラーボトルで成長したPER.C6懸濁細胞を生産するmAbを用いて、選択剤の入っていない２リットルのバイオリアクターに、３０万〜５０万細胞／ｍｌの密度、作業体積３００〜５００ｍｌで接種し、細胞培養株の生存性が１０％に下がるまで成長させる。接種後何日で生存細胞密度が５０万細胞／ｍｌ未満に下がるかを測定し、培養株寿命基準とする。細胞は通常２００万〜３００万細胞／ｍｌの密度まで成長した後、培地成分が律速となって生存性が低下する。さらに、培地中のグルコースおよびアミノ酸等の必須成分が細胞によってどれだけ消費されたかを測定する。その次に、どのようなアミノ酸が生産され、他のどのような生産物が培養株内に蓄積しているかを測定する。これにより、培養株寿命を増大し、よって上清中のmAb濃度を増加するために定期的に炭化される濃縮した供給サンプルが生産される。別の設定では、異なる時期に細胞に添加し、かつより長期に渡り細胞の生存性を上昇させ、ついには上清中のmAb濃度をより高くする１０倍濃縮培地サンプルを作る。
【０１２４】
実施例２３：ヒト化組み換えモノクロナール抗体の一過性発現
ベクターを含有するUBS-54  H鎖およびL鎖遺伝子の適正な組み合わせをPER.C6細胞の一過性トランスフェクション実験に用いた。ここで、どの選択マーカーがプラスミド骨格鎖に導入されたかは重要ではない。なぜなら、発現は短期間（２〜３日）しか持続しないからである。効率的なトランスフェクションのために他のカチオン性脂質化合物を用いることもできるが、通常トランスフェクション法はリポフェクタミンである。T25フラスコ設備から少なくとも１０リットルのバイオリアクターに一過性法を外挿する。約３５０万のPER.C6およびPER.C6/E2A細胞をT25フラスコの第１日に接種した。第２日にリポフェクタミンを用い細胞を最大８μｇのプラスミドDNAでトランスフェクトし、２〜４時間後に更新し、２日間放置した。次に上清を収集し、定量ELISA中でヒトIgGlイムノグロブリンに対する抗体価を測定した（CLB、実施例２６も参照のこと）。この系の全ヒト抗体のレベルは、PER.C6に関しては約４．８μｇ／１００万種細胞であり、PER.C6/E2Aに関しては１１．１μｇ／１００万種細胞である。生産された抗体のどれだけが完全な大きさであり、かつ２つのH鎖と２つのL鎖から出来ているかを測定すると同時に、H鎖および／またはL鎖の単体およびジスルフィド架橋に結合したものの発現レベルを測定するために、サブユニットを単独で認識するコントロールELISAを作る。全てがヒト（化）IgGlサブユニットを検出する、捕捉されかつ染色された異なる抗体の組み合わせを用いる。PER.C6トランスフェクタント（コントロールベクターまたはpUBS-Heavy2000/Hyg(-)およびpUBS-Light2001/DHFRwtでトランスフェクトしたもの）の上清を完全な大きさのmAb生産に関して調査した（図２４）。DTTを用いて、または用いずにサンプルを処理し、それにより完全な大きさのmAb（還元されていないもの）とH鎖およびL鎖（還元されたもの）とを識別できるようにする。予想された通り、L鎖が同時発現した場合にのみH鎖が隠され、ほとんどの抗体は完全な大きさである。
【０１２５】
実施例２４：一過性トランスフェクションのための拡大システム
PER.C6およびこれらの誘導体を用いて、DNAトランスフェクションシステムを拡大する。WurmとBernard（１９９９年）によると、１〜１０リットルの設備で懸濁細胞のトランスフェクションを実施して、エレクトロポレーションを用いて１〜１０ｍｇ／ｌ（０．１〜１ｐｇ／細胞／日）の組み換え蛋白質の生産量を達することができる。
【０１２６】
これを十分に制御し、かつ産出量のより多いシステム、特に多数の蛋白質および安定な設備では生産されない毒性蛋白質のスクリーニングに対する必要性がある。さらに、CHO等の細胞株はリポフェクタミン等の細胞死を誘発する薬剤により激しく影響されるので、この薬剤に対して耐性のある細胞が必要であると従来技術は教示している。PER.C6はトランスフェクション法の影響を非常に受けるので、PER.C6およびその誘導体はこの目的に非常に有用である。調整培地内で成長して精製プラスミドDNAを用いた一過性DNAトランスフェクションを支持するPER.C6およびPER.C6/E2Aの懸濁細胞株１〜５０リットルをエレクトロポレーションまたは他の方法に用いて、同じ発現プラスミドにトランスフェクションを行う。数時間後にトランスフェクション培地を取り除き、血清の入っていない新しい培地と交換する。数日間放置して組み換え蛋白質を上清中に蓄積させ、その後上清を収集して全ての細胞を取り出す。上清を組み換え蛋白質を精製するダウンストリームの処理に用いる。
【０１２７】
実施例２５：ウイルス感染用拡大システム
実施例３、４および５で説明した抗体のH鎖およびL鎖cDNAを、別々におよび組み合わせて組み換えアデノウイルスアダプタープラスミド内にクローンする。抗体のH鎖とL鎖の両方の発現レベルを等しくなるように組み合わせを作る。H鎖およびL鎖が別々にクローンされた場合、ウイルスは別々に生産され増殖する。ウイルス粒子の感染能力および濃度を測定し、PER.C6およびその誘導体に重感染させて上清中に組み換えmAbを生産する。アダプターベクターおよび組み換えアデノウイルスの生産ならびにmAbの生産は、組み換えEPOに関して説明した通りである（実施例１３および１４を参照のこと）。
【０１２８】
実施例２６：ヒトmAbｓの測定用ELISAの開発
Greiner microlonプレート655061番を非ヒトIgGlカッパモノクロナール抗体（Pharmingen #M032196 0.5）を用い、PBS中４μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ／ウエルでコートした。４℃で一晩、または３７℃で９０分間培養を行った。次いで、０．０５％  Tween/PBS（４００μｌ／ウエル）で３回ウエルを洗浄し、続いて５％の牛乳を０．０５％  Tween/PBSに溶解したものをウエル当たり１００μｌ用いて３７℃で３０分間ブロックし、０．０５％  Tween/PBSをウエル当たり４００μｌ用いてプレートを３回洗浄した。精製ヒトIgGl抗体（Sigma、#108H9265）を０．５％牛乳／０．０５％  Tween/PBS中で５０〜４００ｎｇ／ｍｌの範囲に希釈して、標準物質として用いた。ウエル毎に１００μｌの標準物質を３７℃で１時間培養した。次いで、０．０５％  Tween/PBSを用いて、ウエル毎に４００μｌを用いて３回プレートを洗浄した。ビオチン標識したマウスモノクロナール非ヒトIgGl抗体（Pharmingen #M045741）を２ｎｇ／ｍｌの濃度で第２抗体として用いた。ウエル毎にこの抗体を１００μｌ加え、３７℃で１時間培養し、４００μｌの０．０５％  Tween/PBSを用いてウエルを３回洗浄した。
【０１２９】
続いて、接合体、すなわち１００μｌ／ウエルの１０００倍に希釈したストレプトアビジン−HRP溶液（Pharmingen #045975）を加え、３７℃で１時間培養し、０．０５％  Tween/PBSを４００μｌ／ウエル用いて再びプレートを３回洗浄した。
【０１３０】
１錠のABTS錠（Boehringer Mannheim #600191-01）を５０ｍｌのABTSバッファ（Boehringer Mannheim #60328501）に溶解し、この溶液１００μｌを各ウエルに加え、室温または３７℃で１時間培養した。最後に、ODを４０５ｎｍで測定した。mAbをコードしたベクターでトランスフェクトした細胞の上清サンプルを一般的に溶解し、０．５％  牛乳／０．０５％  Tween/PBSで希釈した。サンプルが検量線の直線域に適合しない場合には、他の希釈液を用いた。
【０１３１】
実施例２７：組み換えサブユニットワクチンのためのヒト細胞内でのインフルエンザHA蛋白質およびNA蛋白質の生産
既知であり、かつ定期的に出現する新規なウイルス株のヘマグルチニン（HA）蛋白質およびノイラミニダーゼ（NA）蛋白質をコードした遺伝子のcDNA配列を、pcDNA2000、ｐcDNA2001、ｐcDNA2002およびｐcDNA3000ベクター内にクローニングするのに都合のよいプライマーを用いPCRにより決定および発生した。続いて、得られた発現ベクターを組み換え蛋白質の安定かつ一過性の発現のためにPER.C6およびその誘導体にトランスフェクトして、厳格かつ十分に定義された条件下でヒト細胞を用いた完全に標準化した方法で生産される組み換えHAおよびNA蛋白質の生産を招く。標準的期間、これらの組み換えHAおよびNA組み換え蛋白質を細胞に蓄積させる。ｐcDNA3000ベクターを用いた場合、両方のcDNAを同時にクローンすることが可能であり、細胞に両方の蛋白質を同時に生産させることが可能である。分離した、または組み合わせた培養株から、標準技法に従って蛋白質を生成し、当業者により最終HAおよびNA力価を測定し、蛋白質の活性を調査する。次いで、精製した組み換え蛋白質をワクチンの研究に用い、かつ最終的には大規模ワクチン目的に用いる。
【０１３２】
ブタインフルエンザウイルスA/swine/Oedenrode/7C/96（Genbank 受入番号AF092053）のHA1断片を、配列5′ ATT GGC GCG CCA CCA TGA AGA CTA TCA TTG CTT TGA GCT AC 3′を有するフォワードプライマーおよび配列5′ GAT GCT AGC TCA TCT AGT TTG TTT TTC TGG TAT ATT CCG 3′を有するリバースプライマーを用いたPCRにより得た。得られた1.0kbのPCR生成物をAscIおよびNheI制限酵素を用いて消化し、AscIおよびNheIで消化精製したpcDNA2001/DHFRwtベクターを用いて結合し、pcDNA2001/DHFRwt-swHA1を得た。また、同じウイルスのHA2断片を、HA1に関して説明したと同じフォワードプライマーおよび配列5′ GAT GCT AGC TCA GTC TTT GTA TCC TGA CTT CAG TTC AAC ACC 3′を有する別のリバースプライマーを用いたPCRにより増幅した。得られた1.6kbのHA2PCR生成物をHA1に関して説明したと同じ方法でクローンし、pcDNA2001/DHFRwt-swHA2を得た。
【０１３３】
実施例２８：翻訳後修飾酵素をコードしたcDNAの組込み
安定で、一過性にトランスフェクトおよび感染したPER.C6およびPER.C6/E2A中の組み換え蛋白質生産レベルは非常に高く、またMTX濃度の増加によりDHFR依存性増幅において高い発現レベルが通常得られるので、翻訳後修飾に関与する酵素の内在レベルの「外部滴定」が起こりえる。したがって、翻訳後修飾の異なる種類およびグルコシル化、リン酸エステル化、カルボキシル化、折りたたみおよび輸送等のプロセスに関与するヒト酵素をコードしたcDNAが、PER.C6およびPER.C6/E2Aに過剰発現し、小規模および大規模設備において過剰レベルにまで生産されるより機能的な組み換え生成物を可能にする。CHO細胞を操作し、アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼを導入してtPAおよびヒトエリスロポイエチンの発現および生理活性を高めることが可能であることが示されている（Zhangら  １９９８年、Minchら  １９９５年、Jenkinsら １９９８年）。ベータ  １，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ等の他の遺伝子も昆虫およびCHO細胞に導入して、Ｎ結合型オリゴ糖枝構造が改良され、かつ末端残基におけるシアル酸濃度が高まった（Weikertら  １９９９年；Hollisterら  １９９８年）。アルファ  ２，３−シアリルトランスフェラーゼ、アルファ  ２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびベータ  １，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードしたcDNAを組み込むことによりPER.C6細胞を修飾して、さらにこのヒト細胞株で作られた組み換え蛋白質のシアル酸濃度を増加させる。
【０１３４】
実施例２９：CHO-dhfr細胞におけるアデノウイルスＥ１Ｂの過剰発現による細胞死の阻害
組み換え外来蛋白質を過剰発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞は細胞死信号に対し非常に敏感であり、野生型またはこれらの細胞を誘導した原細胞に比べて、安定な生産細胞株の中でも一般に高い死亡率を招く。また、トランスフェクションの調査にリポフェクタミン等の薬剤を用いた場合、CHO細胞は細胞死効果により死ぬ。したがって、種々の理由による細胞死により非常に容易に細胞が死ぬという点で、CHO細胞は組み換え蛋白質生産において非常に不利である。アデノウイルスのE1B遺伝子が抗細胞死効果を有することが知られている（Whiteら  １９９２年；YewおよびBerk  １９９２年）ので、説明した抗体（実施例３、４および５を参照のこと）のH鎖とL鎖の両方を発現する安定なCHO-dhfr細胞をアデノウイルスE1B cDNAでトランスフェクトして、E1B蛋白質を安定または一過性に発現させ、最終的にこれらの細胞内での細胞死を低くし、よって組み換え蛋白質の生産速度を増加させる。一過性にトランスフェクトした細胞および安定的にトランスフェクトした細胞を野生型のCHO-dhfr細胞とをトランスフェクション法による細胞死または組み換え蛋白質を過剰発現したという事実による細胞死に関するFACS分析で比較する。
【０１３５】
実施例３０：ヒト細胞おけるアデノウイルスE1Bの過剰発現による細胞死の阻害
PER.C6細胞およびその誘導体はアデノウイルスのE1AおよびE1B遺伝子を発現する。A549等の他のヒト細胞を用いて、アデノウイルスE1Bを安定に過剰発現させて、CHO細胞に関して説明した通り（実施例２９参照のこと）アデノウイルスE1B遺伝子の存在による抗細胞死効果を測定する。ほとんどの細胞はリポフェクタミン等のトランスフェクション剤または他のカチオン性脂質に反応して大規模な細胞死を招き、最終的には、ごくわずかの細胞のみが処理を生き残るという事実により、分泌された組み換え蛋白質の濃度が低くなる。毒性蛋白質または細胞死誘導蛋白質の過剰発現に対する反応、およびリポフェクタミン等のトランスフェクション剤に対する反応に関して、安定なE1B過剰発言細胞と親細胞株とを比較する。
【０１３６】
実施例３１：機能性DHFR蛋白質欠乏PER.C6誘導細胞株の生成
PER.C6セルを用い、異なる系を用いたDHFR遺伝子をノックアウトさせ、実施例１乃至５で説明したベクターまたは他のDHFR発現ベクターをコードした外来組込みDHFR遺伝子の増幅に使用可能な細胞株を得る。PER.C6細胞を異なるクロモソームの存在に関してスクリーニングし、ヒトDHFR遺伝子を保有するクロモソームであって、転写回数の少ないものを選択する。続いて、これらの細胞をノックアウト実験に用いる。この実験において、DHFR遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し、選択マーカーで置換する。ダブルノックアウト細胞株を得るために、２つの異なる選択マーカーを用いた相同的組み換えを介するか、または例えばCHO細胞について説明された他のシステム（Urlaubら  １９８３年）により、対立遺伝子の両方を取り出す。また、他のシステムを、例えばアンチセンスRNAを用い、または遺伝子が取り除かれるか、ノックアウトされていないが、遺伝子のダウンストリーム生成物の機能性が破壊されているRNA/DNAハイブリッドを介して、DHFR蛋白質の機能性が低減されているか、または完全に取り除かれているものに適用する。
【０１３７】
実施例３２：プロテアーゼおよびノイラミニダーゼ阻害剤を用いた組み換え蛋白質の長期生産
MTX、血清およびプロテアーゼ阻害剤の存在下および非存在下における長期発現に、実施例８で説明した安定なクローンを用いる。安定または一過性細胞を何日間も放置して、組み換えヒトEPO蛋白質を蓄積させた。直線的増加の代わりに平坦な曲線が観察された。これは蓄積したEPOが経時劣化していることを示している。これは、光または温度等の外部因子による不活性プロセスであってよい。生細胞により生産されたか、または死細胞の溶解の際に放出される特定のプロテアーゼが組み換えEPO蛋白質を消化してもよい。したがって、安定生産細胞にトランスフェクションした後の培養基により高濃度のCuSO4を添加してより安定な生産曲線を検出する。細胞を数日間培養し、種々の時期にEPOの量を測定する。CuSO4は既知のプロテアーゼ活性阻害剤であり、ダウンストリームプロセッシングおよびEPO精製中に容易に取り除くことができる。DNAトランスフェクションおよびウイルス感染の一過性発現の後に、CuSO4の最適な濃度を用いて、組み換えヒトEPO蛋白質を生産する。さらに、CuSO4の最適濃度を安定クローンのEPO生産にも用いる。末端シアル酸の存在が組み換え蛋白質の長期循環半減期を確保するのに重要となるEPOの場合、高度にシアル酸を付加したEPOを生産することが必要である。ストレス要因による活性化の際に分泌されるノイラミニダーゼを生細胞が生産するので、これらのストレス要因および生産されたノラミニダーゼにより、生産されたEPOはそのシアル酸を失うであろう。シアル酸の欠損を防ぐために、ノラミニダーゼ阻害剤を培地に加えて、生産したEPOにシアル酸を長期に結合させる。
【０１３８】
実施例３３：増幅可能なグルタミン酸合成酵素系を用いたヒト細胞における組み換え蛋白質の安定な発現
PER.C6およびその誘導体を用いて、グルタミン酸合成酵素（GS）系を用いた組み換え蛋白質を安定に発現させる。まず、細胞をグルタミン酸フリーの培地内での成長能力に関して検査する。グルタミン酸フリー培地内で細胞が成長できない場合、これらの細胞は十分なGSを発現せず、最終的には細胞死を招くということを意味する。GS遺伝子を選択マーカーとして発現ベクターに組込み（DHFR遺伝子に関して説明したと同様に）、メチオニンスルホキシイミン（MSX）の濃度を上げることにより増幅させ、DHFRに関して示したようにして安定組込みベクター全体を共増幅するので、関心組み換え蛋白質の過剰発現を起こすことができる。Sandersらの報告（１９８４年）以後、GS遺伝子発現系が実現可能となり、CockettらによりDHFR選択系とGSとの比較が行われた（１９９０年）。BebbingtonらによりGSを用いた組み換えmAbｓの生産が初めて記述された（１９９２年）。
【０１３９】
GS遺伝子を実施例１で説明したベクターの構造鎖または組み換え蛋白質をコードしたcDNAにクローンし、mAbｓのH鎖およびL鎖をGS遺伝子を保有する入手可能なベクターにクローンする。続いて、これらのベクターをPER.C6にトランスフェクトし、ベクターの安定な組込みを伴って細胞が成長することのできるMSX濃度下で選択する。
【０１４０】
実施例３４：ヒト細胞における組み換えHIV gp120蛋白質の生産
適当な翻訳開始のために完全コザック配列を、および実施例１で説明した発現ベクターにクローニングするために好適な制限酵素認識配列をアップストリームプライマーに含むプライマーを用いて、ヒト免疫不全ウイルスからの高グルコシル化外膜蛋白質gp120をコードしたcDNAをPCRにより決定し、かつ得る。続いて、このPCR生成物を両方の鎖について配列決定して、PCRの誤りが導入されていないことを確認する。
【０１４１】
PER.C6、その誘導体およびCHO-dhfr細胞に発現ベクターをトランスフェクトして、安定に生産する細胞株を得る。Gp120は主としてO結合型オリゴ糖を有する高度にグルコシル化された蛋白質であるので、CHO生産gp120とPER.C6生産gp120との糖修飾の違いを2D電気泳動実験および次に質量分析実験で測定する。当業者により組み換え蛋白質を精製し、続いて機能性および他の検定に用いる。精製した蛋白質をワクチン目的に用いてHIV感染を防ぐ。
【０１４２】
（参考文献）
Baldwin RW, Byers VS (1986) Monoclonal antibodies in cancer treatment. Lancet 1,603-605.
Barbas CF, Kang AS, Lerner RA and Benkovic SJ (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proc Natl Acad Sci USA. 88,7978
Bebbington CR, Renner G, Thomson S, Abrams D, Yarranton GT (1992) High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Bio/technology 10,169-175.
Borrebaeck CAK, Malmborg A-C and Ohlin M (1993) Does endogenous glycosylation prevent the use of mouse monoclonal antibodies as cancer therapeutics? Immunology Today 14,477479.
Borrebaeck CAK (1999) Human monoclonal antibodies: The emperor's new clothes? Nature Biotech. 17,621.
Boshart W, Weber F, Jahn G, Dorsch-Hasler K, Fleckenstein B, Schaffner W (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41, 521-530.
Bruggeman M, Spicer C, Buluwela L, Rosewell I, Barton S, Surani MA, Rabbits TH (1991) Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus. Eur J Immunol. 21,1323-1326.
Bulens F., Vandamme A-M., Bernar H., Nelles L., Lijnen RH. and Collen D (1991) Construction and characterization of a functional chimeric murine-human antibody directed against human fibrin fragment-D dimer. Eur J Biochem. 195,235-242.
Burton DR and Barbas III CF (1994) Human antibodies from combinatorial libraries. Adv Immunol. 57,191-280.
Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver ME and Shephard HM (1992) Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89,4285-4289.
Clarkson T, Hoogenboom HR, Griffiths A and Winter G (1991) Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 353,624.
Cockett MI, Bebbington CR, Yarranton GT (1990) High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in chines hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification. Bio/technology 8,662-667.
Crowe JS., Hall VS., Smith-MA., Cooper HJ. and Tite JP (1992) Humanized monoclonal antibody CAMPATH-1H: myeloma cell expression of genomic constructs, nucleotide sequence of cDNA constructs and comparison of effector mechanisms of myeloma and Chinese hamster ovary cell-derived material. Clin Exp Immunol 87,105-110.
Debbas M, White E (1993) Wild-type p53 mediates apoptosis by E1A, which is inhibited by E1B. Genes Dev. 7,546-554.
Delorme E, Lorenzini T, Giffin J, Martin F, Jacobsen F, Boone T, Elliot S (1992) Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin. Biochemistry 31,9871-9876.
Farrow SN, White JH, Martinou I, Raven T, Pun KT, Grinham CJ, Martinou JC, Brown R (1995) Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E1B 19K. Nature 374,731-733.
Fishwild DM, O'Donnell SL, Bengoechea T, Hudson DV, Harding F, Bernhard SL, Jones D, Kay RM, Higgins KM, Schramm SR, Lonberg N (1996) High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nat Biotechnol. 14,845-851.
Fussenegger M, Bailey JE, Hauser H, Mueller PP (1999) Genetic optimization of recombinant glycoprotein production by mammalian cells. Trends Biotechn. 17,35-42.
Frdin JE, Lefvert AK, Mellstedt H (1990) Pharmacokinetics of the mouse monoclonal antibody 17-1A in cancer patients receiving various treatment schedules. Cancer Res. 50,48664871.
Galili U (1993) Interaction of the natural anti-Gal antibody with alpha-galactosyl epitopes: a major obstacle for xenotransplantation in humans. Immunol Today 14,480-482.
Garrard L, Yang M, O'Connell M, Kelley R and Henner DJ (1991) Fab assembly and enrichment in a monovalent phage display system. BioTechnology 9,1373.
Goldwasser E, Eliason JF, Sikkema D (1975) An assay for erythropoietin in vitro at the milliunit level. Endocrinology 97,315-23.
Green LL, Hardy MC, Maynard-Currie CE, Tsuda H, Louie DM, Mendez MJ, Abderrahim H, Noguchi M, Smith DH, Zeng Y (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet. 7,13-21.
Gorman CM, Gies D, McCray G, Huang M (1989) The human cytomegalovirus major immediate early promoter can be trans activated by adenovirus early proteins. Virology 171,377385.
Hale G, Dyer MJS, Clark MR, Phillips JM, Marcus R, Reichmann L, Winter G and Waldmann H (1988) Remission induction in non Hodgkin lymphoma with reshaped human monoclonal antibody CAMPATH-1H. Lancet 2,1394-1399.
Hammerling U, Kroon R, Wilhelmsen T, Sjdin L (1996) In vitro bioassay for human erythropoietin based on proliferative stimulation of an erythroid cell line and analysis of carbohydrate-dependent microheterogeneity. J Pharm Biomed An. 14,1455-1469.
Han J, Sabbatini P, Perez D, Rao L, Modha D, White E (1996) The E1B 19K protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes Dev. 10,461-477.
Havenga MJ, Werner AB, Valerio D, van Es HH (1998) Methotrexate selectable retroviral vectors for Gaucher disease. Gene Ther. 5,1379-1388.
Hollister JR, Shaper JH, Jarvis DJ (1998) Stable expression of mammalian betal, 4-galactosyltransferase extends the Nglycosylation pathway in insect cells. Glycobiology 8,473480.
Huls GA., Heijnen IAFM., Cuomo ME., Koningsberger JC., Wiegman L., Boel E., Van der Vuurst de Vries A-R., Loyson SAJ., Helfrich W., Van Berge Henegouwen GP., Van Meijer M., De Kruif J. and Logtenberg T (1999) A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments. Nature Biotechnol. 17,276-281.
Isaacs JD, Watts RA, Hazleman BL, Hale G, Keogan MT, Cobbold SP, Waldmann H (1992) Humanised monoclonal antibody therapy for rheumatoid arthritis. Lancet 340,748-52.
Jacobovits A (1995) Production of fully human antibodies by transgenic mice. Curr Opin Biotechnol. 6,561-566.
Jenkins N, Parekh RB, James DC (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol. 14,975-81.
Jenkins N, Buckberry L, Marc A, Monaco L (1998) Genetic engineering of alpha 2,6-sialyltransferase in recombinant CHO cells. Biochem Soc Trans. 26, S115.
Kawashima I, Ozawa H, Kotani M, Suzuki M, Kawano T, Gomibuchi M, Tai T (1993) Characterization of ganglioside expression in human melanoma cells: immunological and biochemical analysis. J Biochem (Tokyo) 114,186-193.
Kay R, Takei F, Humphries RK (1990) Expression cloning of a cDNA encoding M1/69. J Immunol. 145,1952-1959.
Kitamura T, Tange T, Terasawa T, Chiba S, Kuwaki T, Miyagawa K, Piao Y-F, Miyazono K, Urabe A, Takaku F (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol. 140,323-334. hler G and Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495.
Krystal, G, Eaves, AC, Eaves CJ (1981) A quantitative bioassay for erythropoietin, using mouse bone marrow. J Lab Clin Med. 97,144-157.
Krystal G (1983) A simple microassay for erythropoietin based on 3H-thymidine incorporation into spleen cells from phenylhydrazine treated mice. Exp Hematol. 11,649-660.
Lee EU, Roth J, Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264,13848-13855.
Levrero M, Barban V, Manteca S, Ballay A, Balsamo C, Avantaggiata ML, Natoli G, Skellekens H, Tiollais P, Perricaudet M (1991) Defective and non-defective adenovirus vectors for expression foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101,195-202.
Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368,856-859.
Lonberg N, Huszar D (1995) Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 13,65-93.
Lowder JN, Meeker TC, Levy R (1985) Monoclonal antibody therapy of lymphoid malignancy. Cancer Surv. 4,359-375.
McCafferty J, Griffiths AD, Winter G and Chiswell DJ (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348,552.
Mellstedt H, Frodin JE, Masucci G, Ragnhammar P, Fagerberg J, Hjelm AL, Shetye J, Wersall P, Osterborg A (1991) The therapeutic use of monoclonal antibodies in colorectal carcinoma. Semin Oncol. 18,462-477.
Mendez MJ, Green LL, Corvalan JR, Jia XC, Maynard-Currie CE, Yang XD, Gallo ML, Louie DM, Lee DV, Erickson KL, Luna J, Roy CM, Abderrahim H, Kirschenbaum F, Noguchi M, Smith DH, Fukushima A, Hales JF, Klapholz S, Finer MH, Davis CG, Zsebo KM, Jakobovits A (1997) Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat Genet. 15,146-156.
Minch SL, Kallio PT, Bailey JE (1995) Tissue plasminogen activator coexpressed in Chinese hamster ovary cells with alpha (2,6)-sialyltransferase contains NeuAc alpha (2,6) Gal beta (1,4) Glc-N-AcR linkages. Biotechn Prog. 11,348-351.
Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT (1984) Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci USA. 81,6851-6855.
Muchmore EA, Milewski M, Varki A, Diaz S (1989) Biosynthesis of N-glycolyneuraminic acid. The primary site of hydroxylation of N-acetylneuraminic acid is the cytosolic sugar nucleotide pool. J Biol Chem. 264,20216-20223.
Nadler L, Stashenko P, Hardy R, Kaplan W, Burton L, Kufe DW, Antman KH, Schlossman SF (1980) Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphomaassociated antigen. Cancer Res. 40, 3147-3154.
Oi VT, Morrison SL, Herzenberg LA, Berg P (1983) Immunoglobulin gene expression in transformed lymphoid cells. Proc Natl Acad Sci US A. 1983 80,825-829.
Olive DM, Al-Mulla W, Simsek M, Zarban S, al-Nakib W (1990) The human cytomegalovirus immediate early enhancer-promoter is responsive to activation by the adenovirus-5 13S E1A gene. Arch Virol. 112,67-80.
Owens RJ and Young RJ. (1994) The genetic engineering of monoclonal antibodies. J. Immunol Methods 168,149-165.
Reff ME, Carner K, Chambers KS, Chinn PC, Leonard JE, Raab R, Newman RA, Hanna N and Anderson DR (1994) Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood 83,435-445.
Reichmann L, Clark M, Waldmann H and Winter G (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nature 322,323-327.
Riethmuller G, Riethmuller G, Schneider-Gadicke E, Schlimok G, Schmiegel W,-Raab R, Hoffken K, Gruber R, Pichlmaier H, Hirche H, Pichlmayr R, et al. (1994) Randomised trial of monoclonal antibody for adj-uvant therapy of resected Dukes'C colorectal carcinoma. Lancet 343,1177-1183.
Rother RP and Squinto SP (1996) The alpha-Galactosyl epitope: A sugar coating that makes viruses and cells unpalatable. Cell 86,185-188.
Sanders PG, Wilson RH (1984) Amplification and cloning of the Chinese hamster glutamine synthetase gene. EMBO J. 3,65-71.
Sandhu JS (1992) Protein Engineering of antibodies. Critical Rev Biotechnology 12,437-462.
Shawler DL, Bartholomew RM, Smith LM and Dillman RO (1985) Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG. J Immunol. 135,1530.
Takeuchi M, Inoue N, Strickland TW, Kubota M, Wada M, Shimizu R, Hoshi S, Kozutsumi H, Takasaki S, Kobata A (1989) Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proc Natl Acad Sci USA. 86, 7819-7822.
Urlaub G, Kas E, Carothers AM, Chasin LA (1983) Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33,405-412.
Vandamme A-M., Bulens F., Bernar H., Nelles L., Lijnen RH. and Collen D (1990) Construction and characterization of a recombinant murine monoclonal antibody directed against human fibrin fragment-D dimer. Eur J Biochem. 192,767-775.
Vaswani SK and Hamilton RG (1998) Humanized antibodies as potential therapeutic drugs. Ann Allergy, Asthma and Immunol. 81,105-115.
Vonach B, Hess B, Leist C (1998) Construction of a novel CHO cell line coexpressing human glucosyltransferases and fusion PSGL-1-immunoglobulin G. In: O.-W. Merten et al (eds), New developments and new applications in animal cell technology, pp. 181-183, Kluwer Academic Publishers.
Weikert S, Papac D, Briggs J, Cowfer D, Tom S, Gawlitzek M, Lofgren J, Mehta S, Chisholm V, Modi N, Eppler S, Carroll K, Chamow S, Peers D, Berman P, Krummen L (1999) Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize sialic acid content of recombinant glycoproteins. Nature Biotechnology 17,11161121.
White E, Sabbatini P, Debbas M, Wold WS, Kusher DI, Gooding LR (1992) The 19-kilodalton adenovirus E1B transforming protein inhibits programme cell death and prevents cytolysis by tumor necrosis factor alpha. Mol Cell Biol. 12,2570-2580.
Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE and Hoogenboom HR (1994) Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. 12,433-455.
Wurm F, Bernard A (1999) Large-scale transient expression in mammalian cells for recombinant protein production. Curr Opin Biotechnol. 10,156-159.
Yamaguchi K, Akai K, Kawanishi G, Ueda M, Masuda S, Sasaki R (1991) Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties. J Biol Chem. 266,20434-20439.
Yew PR, Berk AJ (1992) Inhibition of p53 transactivation required for transformation by adenovirus early 1B protein. Nature 357,82-85.
Zhang X, Lok SH, Kom OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 27,441-452.
【０１４３】
（表：組み換えEPOの収量）
種々のメトトレキサート（MTX）濃度で培養した６および１５日後のPER.C6およびPER.C6/E2AのMTX死滅のまとめ。０日目に細胞を接種し、１日目にMTXと共に培養を開始し、６日間培養を続けた。次いで、集密度（confluency）（％）を記録し、培地をMTXを加えた新しい培地に交換し、さらに９日間培養を続け、その後集密度（％）を再度記録した（１５日目）
【表１】
0004210036.tif 000002
【０１４４】
組み換えヒトEPOを安定に発現する付着PER.C6およびPER.C6/E2A細胞株。PEPO2000/DHFRwtの安定な組込みおよび発現により細胞株を作った（図５）。100nM MTXの存在下でT25フラスコ設備ないで４日成長させた後、生産レベルを上清中で測定した。
【表２】
0004210036.tif 000003
【０１４５】
内在性および組込みDHFR DNAの増幅速度。図１９からのサザンブロットにおけるハイブリダイジング帯の強度をホスホイメージャーで測定し、背景レベルを補正して、最終的に内在性および組込みDHFR遺伝子の大まかな増幅速度を計算した。
【表３】
0004210036.tif 000004
【０１４６】
一過性DNAトランスフェクションにおけるEPO収量。種細胞百万個あたりの収量をEPO ELISAで、PER.C6、PER.C6/E2AおよびCHO細胞からの上清を測定した。実施例１２で説明した通り、これらの細胞を、ウシ胎児血清の存在下または非存在下で、種々の培養温度で、pEPO2000/DHFRwt発現ベクターでトランスフェクトした。
【表４】
0004210036.tif 000005
【０１４７】
ウイルス感染後に得られたEPO収量。種細胞百万個あたりの収量をEPO ELISAで、PER.C6細胞からの上清を測定した。実施例１４で説明した通り、これらの細胞を、組み換えIG.Ad5.AdApt.EPO.dE2Aアデノウイルスで感染させた。ウイルスの２つの異なるバッチを異なるvp/IU比（330および560）で２つの異なる設備に用いた（ローラーボトル上清培養株および６ウエル付着培養株）。
【表５】
0004210036.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】  pcDNA2000/DHFRwt
【図２】  pcDNA2001/DHFRwt
【図３】  pcDNA2002/DHFRwt
【図４】  pcDNAs3000/DHFRwt
【図５】  pEP02000/DHFRwt
【図６】  pAdApt. EPO
【図７】  pHC2000/Hyg (-)
【図８】  pLC2001/DHFRwt
【図９】  pUBS-Heavy2000/Hyg (-)
【図１０】  pUBS-Light2001/DHFRwt
【図１１】  pUBS2-Heavy2000/Hyg (-)
【図１２】  pUBS2-Light2001/DHFRwt
【図１３】  pUBS-3000/DHFRwt
【図１４】  pUBS2-3000/DHFRwt
【図１５】  ２リットルの灌流バイオリアクター中でのEPO濃度をｍｌ当たりのELISA単位で示す。
【図１６】  細胞密度を２乃至３日毎に０．５×１０６細胞／ｍｌに戻した、2リットルの反復バッチバイオリアクター中でのEPO濃度である。
【図１７】  ４×１リットル反復バッチバイオリアクターに０．３×１０６細胞／ｍｌで接種し、異なる条件に置いた３日後の、安定して生産するP9細胞からのEPO濃度。左：溶存酸素の設定を変えたもの。中央：温度を変えたもの。右：定ｐHを変えたもの。P9細胞に対する標準設定は、５０％ＤＯ、３７℃およびｐＨ７．３である。実験ごとに、各設定の４番目の棒で示した前記設定のコントロール実験を行った。
【図１８】  PER.C6誘導細胞株P8およびP9中のMTX濃度上昇時のEPO生産。ELISA単位／百万個種細胞／日で計算した。
【図１９】  MTX濃度上昇時のDHFR遺伝子の増幅。通常のPER.C6細胞（MTXの存在下では成長しない）ならびにP8およびP9細胞（100nM、800nMおよび1800nM MTXの存在下で培養）から誘導されたBgIII消化DNAのサザンブロット。まず、放射性DHFRプローブを用いてハイブリダイズし、続いてストリップし、次いで内在コントロールとして放射性アデノウイルスE1プローブと共に培養する。
【図２０Ａ】  細胞株P8の組み換えEPO発現の安定性を示す。MTXの存在下または非存在下で細胞を４ヶ月以上の期間で約６０代継代培養し、EPO生産をELISA単位／百万個種細胞／日として計算した。
【図２０Ｂ】  細胞株P9の組み換えEPO発現の安定性を示す。MTXの存在下または非存在下で細胞を４ヶ月以上の期間で約６０代継代培養し、EPO生産をELISA単位／百万個種細胞／日として計算した。
【図２１Ａ】  CHO細胞と比較したPER.C6中のベータ−ガラクトシド  アルファ２，６−シアリルトランスフェラーゼの活性を示す。EPO発現プラスミド（左）およびEprex（右）でトランスフェクトしたPER.C6の上清からのEPOのウエスタンブロットである。PER.C6-EPOを、未処理（列１）、２つの異なるバッファ中でNDV誘導ノイラミニダーゼ処理後（列２および３）およびVC誘導ノイラミニダーゼ処理後（列４）に実験した。Eprexを、未処理（列５）および同様のノイラミニダーゼ処理後（列５〜８）に実験した。
【図２１Ｂ】CHO細胞と比較したPER.C6中のベータ−ガラクトシド  アルファ２，６−シアリルトランスフェラーゼの活性を示す。細胞と共に培養した２つのDIG結合レクチンを認識する、すなわちシアル酸とガラクトースとの間のアルファ２，６結合を特異的に認識するか（Sambucus nigraアグルチニン、上図）、またはアルファ２，３シアル酸−ガラクトース結合を特異的に認識する（Maackia amurensisアグルチニン、下図）抗DIG抗体処理後（塗りつぶし部）のPER.C6（右図）およびCHO細胞（左図）のFACS分析における推移である。非レクチン処理細胞のFACS分析（無地部）と比較した。
【図２２Ａ】  種々の培養設定で生産された組み換えEPOの２Ｄ／ウエスタン分析を示す。組み換えヒトEPOを安定に発現するP9細胞をT175フラスコではDMEM中で、ローラーボトルおよびバイオリアクターではJRH Excell 525培地中で成長させ、２Ｄ電気泳動により分離し、H162および抗EPO抗血清と共にブロットして培養した。シアル酸の全領域を含有するEPO（P9上清からの）を含むサンプルを高濃度のシアル酸を含有するEPO形態のみを含む市販のEprexと比較した。
【図２２Ｂ】種々の培養設定で生産された組み換えEPOの２Ｄ／ウエスタン分析を示す。付着設定におけるDMEM培地中で成長した付着P9細胞由来のEPOを、やはりDMEM培地中で培養した一過性にトランスフェクトしたCHO細胞由来のEPOと比較した。培養中にはFBSが存在したが、EPO蓄積を開始する前に除去した。これらのサンプル（１〜１４）の推奨シアル酸濃度を２つのブロットの間に示す。
【図２３】  CHO細胞上に生産された市販のEprexと比較した、ヒトTF-1細胞を用いて３７℃で生産したPER.C6/E2A-EPOのin vitro機能性検定。
【図２４】  pUBS-Heavy2000/Hyg(-)とpUBS-Light2001/DHFRwt（列６）とを用いて、または別々にベクターを用いて（列４および５）トランスフェクトしたPER.C6細胞からの上清中の抗ヒトIgGl  H鎖抗体を用いたウエスタンブロット。陽性コントロールとして、希釈したヒト血清を乗せ（IgG、列１）、陰性コントロールとしてLacZをコードする発現ベクターをトランスフェクトし（コントロール、列３）、かつマーカー（M、大きさは図示せず）を乗せた（列２）。上図は、H鎖およびL鎖ジスルフィド架橋が完全なままであり、約220kDの全mAbが検出された、DTT処理していないトランスフェクタントからのサンプルと共に乗せたゲルからのものである。下図は、ジスルフィド架橋を取り除き、H鎖とL鎖とを完全に分離するDTT処理した同じトランスフェクタントからのサンプルを示す。ブロットをヒトIｇGl  H鎖を認識する抗体と共に培養した。L鎖を、ECL-ウエスタン手順に用いる第２の（ポリクロナール）抗体による背景認識により染色する。
【図１】
0004210036.tif 000007
【図２】
0004210036.tif 000008
【図３】
0004210036.tif 000009
【図４】
0004210036.tif 000010
【図５】
0004210036.tif 000011
【図６】
0004210036.tif 000012
【図７】
0004210036.tif 000013
【図８】
0004210036.tif 000014
【図９】
0004210036.tif 000015
【図１０】
0004210036.tif 000016
【図１１】
0004210036.tif 000017
【図１２】
0004210036.tif 000018
【図１３】
0004210036.tif 000019
【図１４】
0004210036.tif 000020
【図１５】
0004210036.tif 000021
【図１６】
0004210036.tif 000022
【図１７】
0004210036.tif 000023
【図１８】
0004210036.tif 000024
【図１９】
0004210036.tif 000025
【図２０Ａ】
0004210036.tif 000026
【図２０Ｂ】
0004210036.tif 000027
【図２１Ａ】
0004210036.tif 000028
【図２１Ｂ】
0004210036.tif 000029
【図２２Ａ】
0004210036.tif 000030
【図２２Ｂ】
0004210036.tif 000031
【図２３】
0004210036.tif 000032
【図２４】
0004210036.tif 000033