(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血漿もしくは寒冷沈降による血漿の上澄液から出発する、治療用の免疫グロブリンＧ濃厚液の製造方法であって、いかなるエタノール沈殿法をも含まず、そして、それが、免疫グロブリン類が、常に液相にｐＨ５．５〜７．８において残留する一連のクロマトグラフィー段階およびウイルス不活化段階を含んでなり、その方法全体が、連続的に：
ａ−ヒト血漿または寒冷沈殿による血漿の上澄液を用意する段階、
ｂ−脱塩段階、
ｃ−陰イオン交換ゲルによるクロマトグラフィー段階、
ｄ−ウイルス不活化処理段階、および
ｅ−陽イオン交換ゲルによるクロマトグラフィー段階、
を含んでなる方法。
【請求項２】
出発材料が、寒冷沈降による血漿の上澄液であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
寒冷沈降による血漿の上澄液が、陰荷電のセルロースおよびパーライト、および少量の陽荷電樹脂から作られた０．５〜０．２μの多孔性をもつ一連のフィルターのカートリッジでの濾過による予備精製段階にかけられることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
陰イオン交換ゲルおよびヘパリン−セファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）から選ばれるゲルへのある種の血漿タンパク質の吸着による、１回または数回の予備精製段階を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
段階ｂが、ｐＨ７．８の０．０２２Ｍトリス−塩酸（TRIS−ＨＣｌ）バッファーで平衡化された架橋デキストラン型ゲルにおいて遂行され、そして血漿タンパク質を含む画分が回収されて、段階ｃにかけられることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
段階ｃが、ｐＨ７．８の０．０２５Ｍトリス−塩酸バッファーで平衡化された、ＤＥＡＥ基のグラフトした架橋アクリルアミド型ゲルにおいて遂行され、そしてその濾液が回収されて、段階ｄにかけられることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
段階ｄが、溶媒・界面活性剤処理によって、２５℃で少なくとも６時間遂行されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
段階ｅが、ｐＨ５．５の０．０２４Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化された、カルボキシメチル基のグラフトした架橋アクリルアミド型ゲルにおいて遂行され、そしてそのゲルに吸着された免疫グロブリンが、バッファーのイオン強度を０．１５〜０．１９ＭのＮａＣｌに高めることによって溶出されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
段階ｅから溶出された免疫グロブリンが、サッカロース１１０ｇ／ｌにより補足され、次いで、凍結乾燥されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、治療用に適切な免疫グロブリンＧ濃厚液および該濃厚液の製造方法に関する。
数種の多価免疫グロブリン調製物が、しばしば使用されてきた。一般に、それらは、選ばれた領域の全体集団に正常に存在する、全ての抗体の存在が保証される提供者２０００〜５０００人の保存血清から調製される。
それらの免疫グロブリン調製物は、多少とも改変された慣用的なＣｏｈｎ法に従い、エタノール沈殿によって製造される。この方法は、ある種のタンパク質の変性と免疫グロブリン凝集体の形成を引き起こすエタノール処理に因る大きな欠点をもっている。これらの凝集体は、補体系の活性化とアナフィラキシー反応に因る治療上不利な反応を誘導する。したがって、これらの調製物は、静脈注射には不適切であり、注射できる量と、それ故その効率とが制限される筋肉内注射に対してのみ用いることができる。
既に、数種の処理が、この問題を解決するために行われている：免疫グロブリンのペプシンまたはプラスミン切断、β−プロピオラクトン、または還元剤とアルキル化剤による処理、ｐＨ４における処理、凝集体沈殿を起こすためのＰＥＧによる処理。
好ましくは、本発明者は、これらの酵素的もしくは化学的処理を避け、そしてエタノール沈殿段階を用いなかった。したがって、本発明者は、一連のクロマトグラフィー分離を含み、いかなる沈殿段階をも含まない方法を確立した。
免疫グロブリン濃厚液は、既に、Friesenら（Friesen - Joint IABS/CSL Sym. on Standarization in Blood Fractionation - Australia 1986 - Develop. biol. Standard. 67, 1987, 3-13；immunoglobulins - Pub. Central Lab. Netherland Red Cross 1988 - Ed. Krynen, Strenger, Van Aken）によって、１または２回のイオンクロマトグラフィー段階：
−  ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼による１回のクロマトグラフィーは、高度免疫血清からの特異的γ−グロブリンの製造に適する；
−  ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ▲Ｒ▼と、それに続くＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼クロマトグラフィーは、比較的大量の処理を可能にし、多価免疫グロブリン類の調整には好適であるが、それは、工業的規模での有利さは見いだされない；の段階を用いて調製された。
免疫グロブリン精製は、それらの生物活性が、それらの構造的完全さに結び付いているが、該活性を、酵素活性による場合のように、容易には測定できないので、前記の問題に加えて特別な問題を伴う。例えば、特定の特異抗体については、同一のＥＬＩＳＡ抗体価を示す種々の濃厚液が、それらの調製法にしたがって、さまざまな程度のウイルス感染力の中和能を示す。
したがって、本発明者は、工業規模（例えば、血清の５０００リットルバッチ以上の）において遂行でき、そしてさらに、治療価値をもつ他のタンパク質の回収にも適合する、免疫グロブリン精製のための非変性の方法を開発することを試みた。
本発明による免疫グロブリン濃厚液の製造方法は、いかなるエタノール沈殿段階をも含まず、免疫グロブリン類が、常に液相にｐＨ５．５〜７．８において残留する一連のクロマトグラフィー段階を含む。また、本方法は、例えば、溶媒・界面活性剤処理のようなウイルス不活化処理を含む。
本発明による方法は、全血漿または好ましくは、寒冷沈降による血漿の上澄液（cryosupernatant）について適切である。
それは、多価免疫グロブリン調製物のための多量の保存血漿、ならびに特異的免疫グロブリン調製物のための少量の高度免疫血漿に対して使用できる。
好ましくは、血漿もしくは血漿画分の出発材料は、特許請求の方法を実施する前に、予備精製段階にかけられる。この予備精製は、陰荷電のセルロースおよびパーライトおよび少量の陽荷電樹脂から作られた０．５〜０．２μの多孔性をもつ一連のカートリッジ（ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ▲Ｒ▼フィルター、Cuno-USA）での濾過によって遂行される。これらのフィルターは、それらの陰荷電により、第ＩＸ因子を吸着して除去するが、予備精製段階を行わない場合には、それは、免疫グロブリン類と一緒に精製されて、場合により、最終産物による不利な反応と低圧現象を引き起こすであろう。
本方法は、ある種の血漿タンパク質を除去することができ、それによって、特に大容量の必要なその後のクロマトグラフィーカラムのサイズを縮小することができる、１回または数回の予備精製を含んでもよい。
タンパク質画分は、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子およびタンパク質Ｃを吸着して、除去するＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼のような陰イオン交換ゲルの存在で、バッチ法で予備精製される。その後、それは、アルブミンおよびα−抗トリプシンを吸着して、除去するＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ▲Ｒ▼のような陰イオン交換ゲルのカラム上に注入される。後者のタンパク質は、周知の方法に従って、本特許請求の方法の副産物として、非常に高収量で脱着され、濃縮できる。
前記カラムから流出するタンパク質画分は、抗トロンビンＩＩＩを除去するために、次のクロマトグラフィー段階の前に、任意に、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ▲Ｒ▼カラムでのクロマトグラフィー段階にかけることもできる。
本発明による方法は、０．０２２Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８で平衡化されたＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼Ｇ２５のような架橋デキストラン型ゲルのカラム上へ、任意の予備精製段階の濾液を注入し、血漿タンパク質含有画分を収得することによる、限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーのいずれかによって脱塩する段階を含む。
次に、該タンパク質性画分は、好ましくはＤＥＡＥ−グラフトゲルを充填された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に注入される。非常に高い収量は、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８で平衡化されたＤＥＡＥ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ▲Ｒ▼ＰＬＵＳ  ＬＳ（SEPRACOR-IBF ref.262080）のような架橋アクリルアミド型ゲルを用いて得られる。このカラムは、免疫グロブリンＧを除く、ほとんど全ての血漿タンパク質を吸着する。免疫グロブリンＧは、濾液に流出し、５０ｇ／ｌに濃縮できる。
次に、濃厚免疫グロブリン溶液は、例えば、好ましくは０．３％ＴｎＢＰ（リン酸トリ（ｎ−ブチル））と１％ＴＷＥＥＮ▲Ｒ▼８０のような溶媒・界面活性剤の存在で、２５℃で少なくとも６時間、緩く撹拌しながらウイルス不活化処理にかけられる。
さらに、本発明による方法は、好ましくはカルボキシメチル（ＣＭ）基グラフトゲルを用いる陽イオン交換ゲルでのクロマトグラフィーを含む。非常に高い収量は、０．０２４Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．５で平衡化されたＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ▲Ｒ▼ＬＳ（SEPRACOR、ref.260280）のようなゲルを用いて得られる。
このゲルは、免疫グロブリンを吸着し、濾液中の溶媒・界面活性剤を可能にする。その免疫グロブリン類は、バッファーのイオン強度を０．１５〜０．１９ＭＮａＣｌに増加することによって、脱着され、溶出される。
サッカロース１１０ｇ／ｌが、その濃厚液に添加され、それが分配され、凍結乾燥される。
前記の方法によって得られた免疫グロブリンＧ濃厚液の分析は、それが、凝集体、免疫グロブリンＡを全く含まず、そして驚くべきことに、また、免疫グロブリンＥも全く含まないか、またはそれらが血漿レベルの１０％レベルでのみ存在して、その生産物に、さらなる治療上の優位性を与えることを示している。
したがって、本発明は、凝集した免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＥ、および免疫グロブリンＡを全く含まない新規な血漿由来の免疫グロブリンＧ濃厚液に関する。
これらの性質は、特に、それを静脈注射に適切なものにし、それ故、それは、該注射に応じて整えられる。
次の実施例は、本発明による方法の実施態様の形を提供するが、その範囲を限定するものではない。
実施例１
出発材料は、正常な集団からランダムに選ばれた健康な提供者からの保存血漿５００リットルである。
常法により血漿の寒冷沈降の後、上澄液が、回収されて、連続するクロマトグラフィー段階にかけられる。
１．Ａ−脱塩クロマトグラフィー
このクロマトグラフィーは、０．０２２Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８で平衡化されたＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼Ｇ２５の６５リットルを充填されたＧＦ  ０４−０６カラム（ＳＥＰＲＡＣＯＲ▲Ｒ▼）において、流速４５０  ｌ／ｈｒで行われる。
その濾液は、デンシトメトリーによってモニターされ、全てのタンパク質を含有する画分が収集される。
カラムは、１ＭＮａＣｌ溶液で洗浄して再生される。
１．Ｂ−イオン交換ゲルによるクロマトグラフィー
このクロマトグラフィーは、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８で平衡化されたＤＥＡＥ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ▲Ｒ▼の６５リットルを充填されたＧＦ  ０８０１５カラムにおいて、流速１５０  ｌ／ｈｒで行われる。
これらの実施条件下で、免疫グロブリンＧは、事実上、カラムに吸着しない唯一のタンパク質である。
流出濾液は、デンシトメトリーによってモニターされ、そのタンパク質画分が収集される。それは、ほとんど１００％純度の免疫グロブリンＧを含有する。
カラムに吸着されて残るアルブミンは、そのバッファー中に０．４ＭＮａＣｌを添加することによって溶出でき、さらに、常法により濃縮される。
カラムは、２ＭＮａＣｌ溶液で洗浄して再生される。
１．Ｃ−ウイルス不活化処理
前記カラムの濾液は、約５０ｇ／ｌに濃縮され、そして既知の処理、すなわち、弱い撹拌下２５℃で６時間、溶媒・界面活性剤の混合液を添加することによる処理にかけられる。その混合液は、０．３％ＴｎＢＰおよび１％ＴＷＥＥＮ８０を含有する。
１．Ｄ−陽イオン交換ゲルによるクロマトグラフィー
このクロマトグラフィーは、０．０２４Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５で平衡化されたＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ▲Ｒ▼の６５リットルを充填されたＧＦ  ０８０１５カラムにおいて、流速２０〜１００  ｌ／ｈｒで行われる。
これらの実施条件下で、免疫グロブリンは、そのゲルに吸着され、溶媒・界面活性剤混合物と起こり得る変性された混入物もしくは他の残渣が、濾液において除去される。
次いで、その免疫グロブリンは、バッファーのイオン強度を、０．１５〜０．１９Ｍ塩化ナトリウムの添加により増加することによって脱着される。
収得液は、免疫グロブリン濃度３０〜５０ｇ／ｌをもち、サッカロース１１０ｇ／ｌの添加後、それ以上の操作をせずに、分配できる。
カラムは、１ＭＮａＣｌ溶液で洗浄して再生される。
実施例２
実施例１の方法において、付加される前以ての予備精製段階が、最初のクロマトグラフィー前に含まれる。
冷却上澄液は、主として陰荷電をもつ０．５〜０．２μの多孔性をもつフィルターの一連の３種のカートリッジ（米国特許第4,783,262号および同4,859,340号に記載され、「ＣＵＮＯフィルター」として知られているＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ▲Ｒ▼フィルター−Ｃｕｎｏ−工程濾過製品−Commercial Intertech Corp. USAの子会社）での濾過にかけられる。該フィルターは、精製セルロース、パーライトおよび少量の陽荷電樹脂から作られる。その他の市販のフィルターシステムも、また使用できるであろう。
フィルターは、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡ二ナトリウムを含むｐＨ５．５〜６．５、好ましくは６のクエン酸／リン酸バッファーを用いて洗浄される。
この濾過段階は、第ＸＩ因子を吸着して、除去できる。
実施例３
実施例１もしくは実施例２の方法において、付加される予備的吸着段階は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼Ｇ２５における最初の脱塩クロマトグラフィー前に含まれる。この予備的吸着は、血漿１リットル当たりＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ▲Ｒ▼１．５ｇの存在で、２〜５時間バッチ法で実施される。それは、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子およびタンパク質Ｃを吸着して、除去させる。免疫グロブリン類は、上澄液に存在する。
さらに、この上澄液は、ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ▲Ｒ▼ＣＬ６ＢＦＦ（Pharmacia-Sweden）でのカラムクロマトグラフィーによる付加的な予備精製にかけられる。その血漿画分は、透析され。０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムにより伝導度１．６ｍＳに、そしてｐＨ７．６に調整される。そのカラムは、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．６を用いて平衡化される。
免疫グロブリン類は、濾液中に流出する。
この方法は、２つの優位性を提供する：
−  それは，予備精製された免疫グロブリン類を流出させて、次の段階に対して比較的小さいカラムの使用を可能にする；
−  それは、アルブミンおよびα−抗トリプシンを吸着保持し、その結果、免疫グロブリン類が、既知の方法により、非常に高収量で回収し、精製できる。
予備精製された免疫グロブリンＧを含む濾液は、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ▲Ｒ▼での付加的なカラムクロマトグラフィーにかけることもできる。そのカラムは、０．０２Ｍリン酸塩−０．１５４Ｍ塩化ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８を用いて平衡化される。
このクロマトグラフィーは、免疫グロブリン類が、濾液中に流出する間、抗トロンビンＩＩＩを吸着させて、結果的に除去できる。
実施例４
サイトメガロウイルスのようなモデルとして選ばれたウイルスについて、抗体価およびウイルス感染力の中和能が、慣用的エタノール分画に続くｐＨ４でのペプシン処理により調製された免疫グロブリンと、本発明の方法により調製された免疫グロブリンとの間で比較された。
0004218980.tif 000002
結果は、等量の抗体（ＥＬＩＳＡによって測定された）に関して、それらの生物活性（中和能）により評価された品質は、クロマトグラフィー法によって製造された抗体の方が有意に良好であることを、明らかに示している。
実施例５
ＩｇＥの量が、出発材料の血漿、常法により調製された（実施例４記載のように）ＩｇＧ濃厚液、および本発明のクロマトグラフィー法により調製されたＩｇＧ濃厚液において測定された。
次表は、ＩｇＥが、材料として使用された血漿中よりも、常法の調製物においてより多く存在するのに対して、クロマトグラフィー法においては、残留するＩｇＥは、ほとんど発見されないことを示している。
0004218980.tif 000003