(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然発生ＭＣＰ−２のアミノ酸末端１−５に相当するＮＨ2-末端アミノ酸を欠き、Ｃ−Ｃケモカインアンタゴニスト活性を有する、アミノ末端切除型ＭＣＰ−２（単球走化性タンパク質−２）。
【請求項２】
配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を持つ、請求項１記載のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２。
【請求項３】
請求項１または２記載の、グリコシル化型のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２をコードするＤＮＡ配列及び遺伝子コードの縮重により同じアミノ末端切除型ＭＣＰ−２をコードするが異なる核酸配列の全てを含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項６記載の細胞を適当な培養基内で培養することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の任意のタンパク質を調製するための組換え方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、天然発生ＭＣＰ−２のアミノ酸残基１、１−２、１−３、１−４または１−５に相当するＮＨ2-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト活性を有するアミノ末端切除型ＭＣＰ−２、ならびにそれらをコードするｃＤＮＡ配列、ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする疾病の治療および／または診断でのそれらの使用、およびそれらを含む医薬組成物、に関する。
発明の背景
ケモカインは、白血球走化性および活性化の性質と共に、小さい前炎症性サイトカインファミリーを構成する。第一のシステインの位置によって、サイトカインファミリーは、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｘ3 −Ｃケモカインに分けることができる（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ．ら、１９９４；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ．ら、１９９７およびＴａｕｂＤ．ら、１９９６）。
【０００２】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）の様な数多くのＣ−Ｘ−Ｃケモカインは、好中球に対して走化性であるが、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）(monocyte chemotactic protein-3)の様なＣ−Ｃケモカインは、単球、リンパ球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞および樹状突起細胞を含む、様々な白血球に活性である。
【０００３】
ケモカインのＮＨ2-末端ドメインはレセプター結合に含まれ、ＮＨ2-末端のプロセシングは、ケモカインを活性化できる場合もあるが、ケモカインを完全に不活性化する場合もある。
【０００４】
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン血小板塩基性タンパク質は、２４のＮＨ2-末端残基の除去後のみ、好中球走化性ペプチド（ＮＡＰ−２）(neutrophil chemotactic peptide)になる（Ｗａｌｚ  Ａ．ら、１９８９およびＶａｎ  Ｄａｍｍｅ  Ｊ．ら、１９９０）。
【０００５】
ＩＬ−８からの８残基までのＮＨ2-末端の欠損は、結果として、走化性活性を強化するが、すべての好中球走化性Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインの最初のＣｙｓの前に位置するＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇモチーフのさらなる切断は、完全な不活性化の原因となる。（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ．ら、１９９１）。
【０００６】
別のＣ−Ｘ−Ｃケモカイン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）(Granulocyte chemotactic protein-2) の同様のＮＨ2-末端のタンパク質分解（最大で８アミノ酸）は、好中球走化性活性に影響を与えなかった（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ら、１９９３ａ）。
【０００７】
８−９のＮＨ2-アミノ酸を欠く合成Ｃ−Ｃケモカイン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳは、単球に不活性であるが、レセプターアンタゴニストとしては有用である（Ｇｏｎｇ  Ｊ．ら、１９９５およびＧｏｎｇ  Ｊ．ら、１９９５）。
【０００８】
ＲＡＮＴＥＳに一つのメチオニンの延長すると、分子は完全に不活性化されるが、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳは、標準のＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストとして働く。（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ａ．Ｅ．ら、１９９６）。
【０００９】
ヒトＭＣＰ−２(Monocyte Chemoattractant Protein（単球化学誘引タンパク質）-2)のクローンは、刺激：休息−末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）(peripheral blood lymphocytes)（最初はＨＣ１４と呼ばれた、Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．ら、１９８９）から誘導されたｃＤＮＡプローブでの差異ライブラリースクリーニングによって単離された。ｃＤＮＡ−誘導タンパク質は、精製された天然のそれと同一であったが、Ｇｌｎ４６がＬｙｓ４６で置換された推定アレレ変異体もまた、単離された（Ｖａｎ  Ｃｏｉｌｌｉｅら、１９９７）。
【００１０】
また、ＭＣＰ−２は、固相化学法によっても合成されている（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ら、１９９５）。
発明の説明
本発明の主な目的は、天然発生ＭＣＰ−２のアミノ酸残基１、１−２、１−３、１−４または１−５に相当するＮＨ2-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト活性を有する、アミノ末端切除型ＭＣＰ−２である。
【００１１】
より特別には、本発明の一つの目的は、図１および配列番号３または配列番号４に示す、１−５のＮＨ2-末端のアミノ酸を欠くＭＣＰ−２である、ＭＣＰ−２（６−７６）である。
【００１２】
そのような本発明のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２は、グリコシル化型であることも、または非グリコシル化型であることもできる。
【００１３】
用語「ケモカインアンタゴニスト」は、「成熟型の全長の天然発生ケモカインに対してアンタゴニストとして作用する」ことを意味する。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、本発明のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であって、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む前記ＤＮＡ配列である。
【００１５】
「実質的に同一のヌクレオチド配列」とは、遺伝子コードの縮重により、与えられたアミノ酸配列をコードするその他のすべての核酸配列を含む。
【００１６】
また、本発明は、上記のＤＮＡｓを含む発現ベクター、そのようなベクターでトランスフォームされた宿主細胞、および、上記の形質転換細胞の適当な培養基内での培養を通して本発明のそのようなアミノ末端切除型ＭＣＰ−２を調製する方法、を含む。
【００１７】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適当なプラスミド内に挿入し連結することができる。できあがったならば、発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入し、次にベクター（類）を発現させ、所望のタンパク質を得ることができる。
【００１８】
本明細書中に取り上げた本発明の任意の組換えタンパク質の発現は、適当な発現ベクターを用いて、真核生物細胞（例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞）または原核生物細胞内で達成することができる。この技術分野で既知の任意の方法を用いることができる。
【００１９】
例えば、任意の上記の方法によって得られたタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、この技術分野で周知の技術によって、適当に構築された発現ベクター内に挿入する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。二本鎖ｃＤＮＡを、ホモポリマーテイリングによって、または合成ＤＮＡリンカーまたはブラントエンド連結反応技術を含む制限連結法によって、プラスミドベクターに連結し：ＤＮＡリガーゼを用いて、ＤＮＡ分子を連結し、非所望の結合をアルカリホスファターゼ処理により除去する。
【００２０】
所望のタンパク質を発現する能力を持たせるために、発現ベクターは、遺伝子の発現およびタンパク質の生成を許すような方法で所望のタンパク質をコードするＤＮＡと連結した翻訳および翻訳調節情報を含む特異的ヌクレオチド配列も含まねばならない。最初に、遺伝子が転写されるためには、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されうるプロモーターが先行しなければならず、それにポリメラーゼが結合し、それによって転写プロセスが開始される。用いられるそのようなプロモーターは様々であり、異なる効率（強いプロモーターおよび弱いプロモーター）で働く。
【００２１】
真核生物宿主では、宿主の姿に依存して、異なる転写および翻訳調節配列を用いることができる。それらは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サルウイルスまたはその類似ウイルス等のような、ウイルス源より誘導することができ、その中の調節シグナルは、高レベルで発現する特定の遺伝子と関連している。例として、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等があげられる。抑制および活性化を可能にする、転写開始調節シグナルを選択することができ、そうすることによって遺伝子の発現を調節することができる。
【００２２】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を、機能し得るように連結された転写および翻訳調節シグナルを持ち、宿主細胞に所望の遺伝子配列を組み込む能力を持つ、ベクター内に挿入する。
【００２３】
導入されたＤＮＡによって安定にトランスフォームされた細胞を、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。また、マーカーは、独立栄養宿主への光栄養性、生命破壊耐性、例えば抗生物質あるいは銅のような重金属、またはその類似物を提供することができる。選択可能マーカー遺伝子を、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結させるか、または同時トランスフェクションにより同一細胞内に導入することができる。さらなるエレメントもまた、本発明のタンパク質の最適な合成に必要とされるであろう。
【００２４】
特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択に重要な因子には：ベクターを含むレシピエント細胞を、ベクターを含まないそのようなレシピエント細胞から識別し選択できる平易さ；特異的宿主に望ましいベクターのコピー数；および、異なる種の宿主細胞間をベクターがシャトルできることが望ましいか否か：が含まれる。
【００２５】
ひとたび、構築物（類）を含むベクター（類）またはＤＮＡ配列が発現用に調製されると、ＤＮＡ構築物（類）を、任意の様々な適当な方法：トランスフォーメーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接ミクロインジェクション等；によって、適当な宿主細胞内に導入することができる。
【００２６】
宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかであろう。正確な折り畳み又は正しい位置でのグリコシル化を含む翻訳後修飾をタンパク質分子に提供するためには、真核生物宿主、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞が好ましい。酵母細胞もまた、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を遂行することができる。酵母内での所望のタンパク質の生成に利用することのできる、強力なプロモーター配列および高いコピー数のプラスミドを利用する、数多くの組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子生成物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する。
【００２７】
ベクター（類）導入後、宿主細胞を選択培地内で増殖させ、ベクター含有細胞の増殖について選択する。クローン化された遺伝子配列（類）の発現は、結果として、所望のタンパク質を生成する。
【００２８】
本発明のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２は、本技術分野で周知の任意のその他の方法によって、特に、自動固相ペプチドシンセサイザー、次にクロマトグラフ精製を用いる、良く確立された化学合成方法によって調製することができる。
【００２９】
本発明のケモカインは、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、または、異なるアミノ酸上に適当な側鎖保護基を持つ或いは持たない、任意のその他の類似の化学合成法によっても、合成することができる。適当な側鎖保護基を持つまたは持たないアミノ酸を、例えばＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロミウム  ヘキサフルオロホスフェート／１−ヒドロキシベンゾチアゾール）−で、前活性化し、成長するペプチド鎖に結合する。次の残基を加える前に、保護基（例えばＦｍｏｃ）をα−アミノ基から除去する。合成後、すべての保護基を除去し、完全な全長ペプチドを精製し、本発明の相当するケモカインに化学的または酵素的に折り畳まれる（その中にはシステイン間のジスルフィド架橋の形成が含まれる）。
【００３０】
天然、合成または組換えのタンパク質の精製は、この目的で既知の任意の一つの方法、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、またはその類似法（例えばＰｒｏｏｓｔ  Ｐ．ら、１９９６を参照のこと）を含む任意の慣用的方法、によって遂行される。本発明のタンパク質を精製するため優先的に用いることのできるさらなる精製方法は、標的タンパク質と結合する、および生成されてカラム内に含まれるゲルマトリックス上に固定化される、モノクローナル抗体またはヘパリンアフィニティーを用いるアフィニティークロマトグラフィーである。タンパク質を含む不純な調製物をカラムに通す。タンパク質は、ヘパリンによって、または特異的抗体によって、カラムに結合されるが、不純物は通過するであろう。洗浄後、ｐＨまたはイオン強度を変化させることにより、タンパク質をゲルから溶出する。
【００３１】
本発明のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２は、ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする、疾病の治療および／または診断に有用である。そのような疾病の例として、炎症性疾患、脈管形成−および造血−関連疾患、腫瘍、ＨＩＶを含む感染症、自己免疫病、アテローム性動脈硬化症、肺動脈疾患、および皮膚障害、
；が含まれる。
【００３２】
従って、さらなる態様では、本発明は、上記疾病を治療するための薬剤製造への本発明のタンパク質の使用を提供する。
【００３３】
好ましくは、薬剤は、本発明のタンパク質を、医薬として許容しうる一つ以上のキャリヤーおよび／または賦形剤と共に含む、医薬組成物の形で存在する。そのような医薬組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様は、そのような疾病を発病する危険性を持つ患者またはそのような病理を既に示している患者に、薬理学的に活性な量の本発明のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２を投与することを含む、上記の疾病の治療方法である。
【００３５】
本発明は、以下の実施例によって説明されることになるが、如何なる場合も本発明を制限するものとして解釈すべきではない。実施例は以下に示す図に言及することになる。
実施例
実施例１：アミノ末端切除型ＭＣＰ−２
材料および方法
ケモカインおよびイムノアッセイ
以前に報告されている方法（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ら、１９９５）に従って、ＭＣＰ−２を合成し精製した。
【００３６】
特異的抗−ヒトＭＣＰ−２  Ａｂをマウスから得、製造者らによって提供された条件を用いて、合成ＭＣＰ−２を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で、アフィニティー精製した。
【００３７】
ＥＬＩＳＡプレートをアフィニティー精製した抗ヒトＭＣＰ−２でコートし、ビオチニル化抗ＭＣＰ−２を捕獲用Ａｂとして用いた。ペルオキシダーゼ標識化ストレプタビジンおよびＴＭＢで検出した。ＭＣＰ−２  ＥＬＩＳＡの検出限界は、約０．１ｎｇ／ｍｌであった。
ＭＣＰ−２の生成および精製
単球走化性タンパク質を、Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ  ａｎｄ  Ｌｅｕｖｅｎから得られた１３２の血液寄贈品から、末梢血液単核細胞誘導順化培地から、精製した（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ら、１９９６）。
【００３８】
赤血球および顆粒球を、ヒドロキシエチルスターチ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  ＡＧ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）沈降、およびメトリゾエートナトリウム溶液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ；Ｎｙｅｇａａｒｄ，Ｏｓｌｏ  Ｎｏｒｗａｙ）の勾配遠心分離により、除去した。
【００３９】
単核細胞（６０ｘ１０9 細胞）を１０μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａおよび２μｇ／ｍｌのＬＰＳと共にインキュベートをインキュベートした（５ｘ１０6 細胞／ｍｌ）。４８から１２０時間後、順化培地を集め、精製するまで−２０゜Ｃに保った。
【００４０】
天然ＭＣＰ−２を前記の４段階の精製方法で精製した（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ら、１９９６）。
【００４１】
簡単に言えば、順化培地をコントロールドポアグラス(controlled pore glass)またはケイ酸で濃縮し、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティクロマトグラフィーによって部分精製した。
【００４２】
ＭＣＰ−２免疫反応性を含むフラクションをさらにＭｏｎｏ  Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製し、ｐＨ４．０のＮａＣｌ勾配で溶出した。
【００４３】
天然ＭＣＰ−２を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したＣ−８  Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００カラム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ  ＣＴ）のＲＰ−ＨＰＬＣを通して、均一になるまで精製した。タンパク質をアセトニトリル勾配で溶出した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アミノ酸配列分析およびマススペクトロメトリーによる、ＭＣＰ型の生化学的性質決定
カラムフラクションの純度を、還元条件下、トリス／トリシンゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した（Ｐｒｏｏｓｔ  Ｐ．ら、１９９６）。タンパク質を銀染色し、以下の比較分子（Ｍｒ）マーカー：ＯＶＡ（Ｍｒ４５，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（Ｍｒ３１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（Ｍｒ２１，５００）、β−ラクトブロブリン（Ｍｒ１８，４００）、リソザイム（Ｍｒ１４，４００）およびアプロチニン（Ｍｒ６，５００）：を用いた。
【００４４】
精製ケモカインのＮＨ2-末端配列は、連結塩基としてＮ−メチルピペリジンを用いて、パルス液体４７７Ａ／１２０Ａタンパク質シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でエドマン分解して、決定された。ブロックされたタンパク質を、７５％ギ酸で５０時間、ＡｓｐとＰｒｏの間で切断した。ギ酸消化物は、さらに精製することなく配列決定した。
【００４５】
ＭＣＰ−２のＭｒを、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化／飛行時間型マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）(matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight-mass spectrometry)（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｔｏｆ  Ｓｐｅｃ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）によって決定した。α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸およびシトクロムＣを、それぞれマトリックスおよび内部標準として用いた。
走化性活性の検出
５μｍポアサイズのポリビニルピロリドン処理ポリカルボネート膜を用いたＢｏｙｄｅｎミクロチャンバー内で、新たに精製した単球（２ｘ１０6 細胞／ｍｌ）または単球ＴＨＰ−１細胞（０．５ｘ１０6 細胞／ｍｌ；継代培養後２日）へのその走化性能力について、ＭＣＰ−２を試験した。
【００４６】
１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を追加したＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で、サンプルおよび細胞を希釈した。３７゜Ｃで２時間インキュベーションした後、細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色溶液（Ｈａｒｌｅｃｏ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で固定染色し、膜を通して移動した細胞を、１０倍の油浸場内、５００倍拡大の顕微鏡で計数した。
【００４７】
サンプルの走化性指数（ＣＩ）(chemotactic index) （それぞれのチャンバーで３通り）は、［サンプルに移動する細胞数］／［対照培地に移動する細胞数］として計算された（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  Ｊ．ら、１９９２）。
【００４８】
脱感作実験では、細胞を生物学的に不活性なケモカイン変異体と共に３７゜Ｃで１０分間インキュベートし、その後、Ｂｏｙｄｅｎミクロチャンバーの上方の穴に細胞を加えた。参考値としてサンプルに対するＨＢＳＳ処理細胞からのＣＩを用いて、ＣＩの％阻害を計算した。
細胞内Ｃａ2+濃度の検出
細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ2+］i ）を、前記の方法に従って、測定した（Ｗｕｙｔｓ  Ａ．ら、１９９７）。精製された単球またはＴＨＰ−１細胞（１０7 細胞／ｍｌ）を、経口指示薬ｆｕｒａ−２（ｆｕｒａ−２／ＡＭ  ２．５μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を含むイーグルの最少必須培地（ＥＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）＋０．５％  ＦＣＳ内でインキュベートした。
【００４９】
３７゜Ｃで３０分後、細胞を２度洗浄し、１ｍＭ  Ｃａ2+および０．１％  ＦＣＳ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨでｐＨ７．４に緩衝化）を含むＨＢＳＳ中に１０6 細胞／ｍｌになるように再縣濁した。細胞を３７゜Ｃで１０分間平衡化した後、ｆｕｒａ−２蛍光をＬＳ５０Ｂ発光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
【００５０】
３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起時に、蛍光を５１０ｎｍで検出した。［Ｃａ2+］i を、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ方程式から計算した（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、１９８５）。Ｒmax を測定するため、細胞５０μＭジギトニンで溶解した。次に、２０ｍＭ  ＴｒｉｓでｐＨを８．５に調整し、溶解細胞に１０ｍＭ  ＥＧＴＡを加えることによって、Ｒmin を得た。用いられたＫd は２２４ｎＭであった。
【００５１】
脱感作実験では、最初に、単球またはＴＨＰ−１細胞を異なる濃度のバッファー、ケモカインまたはケモカインアンタゴニストで刺激した。第二の刺激として、バッファーで前刺激した後、［Ｃａ2+］i の有意の増加を誘導する濃度で、ＭＣＰ−２を用いた。第二の刺激を、第一の刺激付加２分後に適用した。第二の刺激に応答する［Ｃａ2+］i 増加阻害率（％）は、ケモカインまたはケモカインアンタゴニストでの前刺激後のシグナルをバッファー付加後のシグナルと比較して、計算した。
結果
翻訳後修飾型ＭＣＰ−２の単離
特異的感受性ＥＬＩＳＡを用いて、マイトジェンおよびエンドトキシンで刺激された末梢血液単球細胞によって生成された異なる型のＭＣＰ−２を追跡した。
【００５２】
順化培地を、コントロールドポアグラスへの吸着およびヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを含む標準単離法（Ｐｒｏｏｓｔ  Ｐ．ら、１９９６）に従って、精製した。
【００５３】
次に、ＦＰＬＣモノＳカチオン交換クロマトグラフィーによる精製を行い、次いで、Ｃ−８  ＲＰ  ＨＰＬＣのさらなる精製段階を適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、およびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって、分子質量を測定した。
【００５４】
異なる型のＭＣＰ−２を単離した；標準としての７．５ｋＤａ  ＭＣＰ−２（１−７６）に加えて、５残基を欠くＮＨ2-末端切除型７ｋＤａ型のＭＣＰ−２［ＭＣＰ−２（６−７６）］をＲＰ−ＨＰＬＣにより均一になるまで精製し、アミノ酸配列分析によって同定した（図２）。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＳ−ＭＳ（表Ｉ）では、完全なＭＣＰ−２（理論的にはＭｒ８８９３Ｄａ）の分子質量が８８８１Ｄａと得られたが、これに対して、ＭＣＰ−２（６−７６）の分子質量は８３６５Ｄａと測定され、５つのＮＨ2-末端アミノ酸の欠損が確認された（理論的にはＭｒ８３８４Ｄａ）。ＴＨＰ−１走化性アッセイでのこれらの天然ＭＣＰ−２の機能的比較から、完全なＭＣＰ−２は５ｍｇ／ｍｌでも未だ活性であるが、切除型ＭＣＰ−２（６−７６）は、０．６−６０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で試験した場合も、走化性活性は欠けた状態のままであることが示された（図３）。また、完全な天然ＭＣＰ−２を、合成ＭＣＰ−２（１−７６）および２つの残基を欠くＣＯＯＨ−末端切除型合成形［ＭＣＰ−２（１−７４）］（Ｐｒｏｏｓｔ  Ｐ．ら、１９９５）とも、機能性について比較した。
【００５５】
これらの型の最小有効走化性濃度は、５ｎｇ／ｍｌであることが分かった（図３）。走化性アッセイでは、天然の完全なＭＣＰ−１とＭＣＰ−２の比活性は比較できる（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  Ｊ．ら、１９９２）が、ＭＣＰ−２のカルシウム移動能力については、未だ検討事項のままである。
【００５６】
しかしながら、Ｃａ2+−移動実験では、天然または合成のＭＣＰ−２（１−７６）の両方の最小有効投与量は、天然の完全なＭＣＰ−１（１−７６）のそれ（図４）と比較して１０倍高いが、これに対してＭＣＰ−２（６−７６）は不活性のままである。
【００５７】
それにもかかわらず、完全なＭＣＰ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）は、ＭＣＰ−２（１５ｎｇ／ｍｌ）およびＭＣＰ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）を脱感作する能力を持ち、それぞれ走化性の５２％および４５％を阻害した。
【００５８】
Ｃａ2+アッセイでのＭＣＰ−２のこの低い比活性のため、ＭＣＰ−２（６−７６）による走化性の脱感作を、Ｂｏｙｄｅｎミクロチャンバーで行った。完全なＭＣＰ−２は、単球走化性アッセイで活性なＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３と交互脱感作すると報告されている（Ｓｏｚｚａｎｉ  Ｓ．ら、１９９４）ので、我々は、天然の不活性ＭＣＰ−２（６−７６）が、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳについて脱感作できるか否かについて、研究した（表II）。１００ｎｇ／ｍｌの不活性ＭＣＰ−２（６−７６）を含むＴＨＰ−１細胞のプレインキュベーションは、１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１（６３％）、５ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−２（７５％）、３０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−３（６２％）および１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＴＥＳ（７５％）で誘導された走化性を有意に阻害することができた。その上、それぞれのＭＣＰｓより３倍低い濃度での走化性は、１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−２（７−７６）によって完全に（９１−１００％）阻害された。さらに、１０ｎｇ／ｍｌ程の低さの濃度でも、未だ、ＭＣＰ−２（６−７６）は、ＭＣＰ−１（３ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ−２（１．５ｎｇ／ｍｌ）またはＭＣＰ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡＮＴＥＳ（３０ｎｇ／ｍｌ）によって誘導された走化性活性を有意に阻害することができる。まとめると、ＭＣＰ−２（６−７６）は、天然でも生成され、化学誘引物質として不活性であり、様々なＣ−Ｃケモカインをアンタゴナイズし、その効果はＭＣＰ−３に対して最も顕著であった。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
【表２】
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【００６１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＭＣＰ−２およびその既知の変異体のアミノ酸配列を示している。シグナル配列をイタリック体で、Ｃ−末端を太字で示している。矢印は、本発明のアミノ末端切除型ＭＣＰ−２（６−７６）の最初のアミノ酸を示している。下線は、ＭＣＰ−２変異体で異なるアミノ酸である。
【図２】  アミノ末端切除型ＭＣＰ−２（６−７６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
第１列：天然ＭＣＰ−２（１−７６、１００ｎｇ／列）；
第２列：天然ＭＣＰ−２（１−７６、３０ｎｇ／列）；
第３列：天然ＭＣＰ−２（６−７６、３０ｎｇ／列）；および、
第４列：合成ＭＣＰ−２（１−７６、６０ｎｇ／列）。
ゲルは還元条件下で泳動し、タンパク質を銀染色した。
【図３】  修飾型ＭＣＰ−２の走化性能力を比較している。完全な天然（ｎａｔ）および合成（ｓｙｎ）のＭＣＰ−２、ＮＨ2-末端切除型天然ＭＣＰ−２（６−７６）およびＣＯＯＨ−末端切除型合成ＭＣＰ−２（１−７４）を、ＴＨＰ−１細胞上の走化性活性について試験した。結果は、４回以上の独立実験からの平均ＣＩ±ＳＥＭで表す。
【図４】  天然ＭＣＰ−２はＭＣＰ−１より弱いアゴニストであり、単球内のカルシウムを可動する。完全なＭＣＰ−２（１５、５０および１５０ｎｇ／ｍｌ）は、投与量に依存してＴＨＰ−１細胞内の［Ｃａ2+］i を増加する。二回の実験からの一回の典型的な実験結果を示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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