(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0004225694.tif 000013
（式中、Ｒは直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ４アルキル；Ｒ１は水素、直鎖若しくは分岐のＣ１〜Ｃ３アルキル、直鎖若しくは分岐のＣ１〜Ｃ３アルコキシ、アリール、又はハロゲンを示す）
で表される化合物の製造方法であって、有機溶媒中で酵素を触媒とし、式
【化２】
0004225694.tif 000014
（式中、ｎは２〜４の整数；Ｒ２は水素又は直鎖若しくは分岐のＣ１〜Ｃ４アルキル；Ｒ３は直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ４アルキル；或いは、Ｒ２及びＲ３は窒素原子と共に５員環〜７員環の飽和環を形成する）で表わされるアミノアルコールを用いて、式Ｉのトランス鏡像異性体の混合物をエステル交換に付すことによって、式
【化３】
0004225694.tif 000015
（式中、Ｒ及びＲ１は前記と同義である）で表わされるトランス３−フェニルグリシド酸エステルを酵素的速度論的に分割して、それぞれ式ＩＩＩ及びＩＶ：
【化４】
0004225694.tif 000016
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｎは前記と同義である）で表わされる、逆の絶対配置を有する、エステル交換しないトランスエステル及びエステル交換したトランスエステルとの混合物を得、次いで上記式ＩＩＩ及びＩＶで表わされるエステルの混合物を分離することを含み、
前記酵素が、任意に担持された、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼ、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来リパーゼ、ブタ膵臓リパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来リパーゼ、コムギ胚芽由来リパーゼ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来リパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来リパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ由来リパーゼ、Ｐｅｎｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ由来リパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ由来リパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来リパーゼ、Ｐｅｎｎｉｃｉｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ由来リパーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来リパーゼ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ由来リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｅａ由来リパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来リパーゼ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来リパーゼから選ばれるリパーゼである、方法。
【請求項２】
Ｒがメチルである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式ＩＩのアミノアルコールが、３−ジメチルアミノ−１−プロパノ−ル、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−メチルアミノエタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン、及び１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジンから選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記式（ＩＩ）のアミノアルコールが２−ジメチルアミノエタノールである請求項３の方法。
【請求項５】
アミノアルコール（ＩＩ）とトランス−３−フェニルグリシド酸エステル（Ｉ）とのモル比が２０：１〜０．４：１の間にある請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アミノアルコール（ＩＩ）とトランス−３−フェニルグリシド酸エステル（Ｉ）とのモル比が２：１である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、担持されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記反応終了後に前記酵素を回収することと、それを任意に後続サイクルで再使用することとを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒が、芳香族溶媒、炭化水素、エーテル、ケトン、アルコール、非プロトン性双極性溶媒、塩素化溶媒、及びこれらの混合物から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒が、ベンゼン、クロロベンゼン、キシレン、トルエン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−へプタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルエチルケトン、アセトン、ｔｅｒ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、アセトニトリル、塩化メチレン、及びこれらの混合物から選ばれる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応溶媒がトルエンである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エステル交換反応によって放出されるアルコールＲＯＨが分子ふるいにより除去される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エステル交換反応によって放出されるアルコールＲＯＨが、適切な共溶媒の存在下、共沸蒸留によって除去される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記エステル交換したエステルＩＶおよびエステル交換しなかったエステルＩＩＩが、酸水溶液抽出によって分離される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルを製造する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、３−フェニルグリシド酸エステル類を分割する方法に関し、より詳細には、アミノアルコール類とのエステル交換による３−フェニルグリシド酸エステル類の酵素的（酵素による）速度論的（又は動的）分割方法に関する。
【０００１】
【従来の技術】
３−フェニルグリシド酸のエステルは公知の化合物で、多くの文献に記載されており、合成中間体として広く用いられている。
例えば、適切に分割されたトランス−３−フェニルグリシド酸のエステルは、通常、公知の天然の抗癌剤であるパクリタキセル［メルクインデックス，第ＸＩＩ版，ｎ．７１１７，１２００頁］の側鎖である（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンの調製に使用される。
【０００２】
上記以外の重要な用途として、３−フェニルグリシド酸エステル、特に（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルは、薬品名ジルチアゼム［メルクインデックス，第ＸＩＩ版，ｎ．３２４７，５４１頁］として公知のカルシウム遮断活性を呈する薬剤、即ち（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−３−アセトキシ−５−（２−ジメチルアミノエチル）−２，３−ジヒドロ−２−（４−メトキシフェニル）−１，５−ベンゾチアゼピン−４（５Ｈ）−オン、の合成に用いられる。
【０００３】
ジルチアゼムは、幾つかの文献に記載の方法、例えば、英国特許第１２３６４６７号及び２１６７０６３号、或いは欧州特許第１２７８８２号及び１５８３４０号（いずれも田辺製薬株式会社名義）に請求されている方法に従って、３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸のエステルを出発物質として調製することができる。
【０００４】
ジルチアゼムを調製するためには、各種合成中間体のうちの一つについて光学分割を行うことが必要である。当然のことではあるが、プロセスの初期段階で分割を行う方が、分割を施される製品の経済的価値が低く、従って排除される異性体に係る損失がさほど大きくないため、経済的に好都合である。
【０００５】
従って、３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルの純粋な鏡像異性体を得ることができれば、当該化合物が合成における最初の光学活性な反応中間体となるため、有利である。
【０００６】
文献に報告されている３−フェニルグリシド酸エステルの製造方法の多くはラセミ混合物を生成する。生成し得る２対の鏡像異性体対のうち１対を主に得ることは可能である。例えば、４−メトキシベンズアルデヒドとクロロ酢酸メチルとのダルツェン縮合（Ｄａｒｚｅｎｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９８６），５１，２７５９］の場合、合成経路を適切に選択し、実験条件を最適化することによって、トランスラセミ体（２Ｒ*，３Ｓ*）が得られる。
【０００７】
トランス鏡像異性体の１対を排除するにしても、所望の鏡像異性体を単離することが結局は必要となり、分割技術が必要となる。特に、ジルチアゼム合成に用いる３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルの場合は、２Ｒ，３Ｓの絶対配置が所望され、又、パクリタキセルの側鎖の製造［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９３），５８，１２８７］に用いる３−フェニルグリシド酸エステルの場合は、合成経路により、２Ｒ，３Ｓ又は２Ｓ，３Ｒ鏡像異性体が所望される。
【０００８】
より慣用的な分割方法、即ち、純粋な鏡像異性体である分割試薬とラセミ混合物とを相互作用させることによってジアステレオマー混合物に転化し、次いで、例えばクロマトグラフィー精製又は分別晶出等の古くから用いられている方法によってこの混合物を分離する方法があるが、この方法とは別の、速度論的分割技術は実に好ましい方法である。
【０００９】
このような分割技術は、上述の方法とは異なり、光学活性な試薬又は非キラル試薬（但しキラル触媒の存在下）に対するそれぞれの鏡像異性体の反応速度の違いに基づくものである。
【００１０】
特に重要なキラル触媒群は酵素類から構成されるが、分割試薬としての酵素の利用が認識され、発展したのはつい最近のことである［Ａ．Ｚａｋｓら，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，（１９９７），２，５１３］。
カルボン酸類及び関連エステル類を分割する多くの酵素的方法が文献に記載されている。例えば、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．（１９８５）２４，６１７及び（１９８９），２８，６９５に発表されたレビューを参照されたい。
【００１１】
当該分野における、リパーゼやプロテアーゼ等の加水分解酵素を非水性媒質中で使用し、エステル交換反応によってエステルを速度論的分割に付す方法［Ａ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９９０），２３，１１４］は、例えば以下の経路に従うが、これらは特に興味深い方法である。
【００１２】
【化５】
0004225694.tif 000002
【００１３】
最良の条件下において、２種の鏡像異性体のうち１種だけを選択的にエステル交換し、エステル交換した鏡像異性体と他の鏡像異性体とを分別し、次いで、ラセミ混合物をほぼ定量的収率で分割することが可能である。
上述の方法では、２種類のエステルを分離する操作、例えばクロマトグラフィー、選択的結晶化、蒸留、又は塩化を効率的に行うために、出発化合物に比べて化学的／物理的特性が全く異なるエステルを新たに形成させることが必要である。従って、アルコールＲbＯＨの選択は重要である。
【００１４】
酵素的エステル交換技術を用いてフェニルグリシド酸エステルラセミ体を分割する幾つかの方法が文献に報告されている。
第１の例として、英国特許出願第２２４６３５１号（本出願人による）に、酵素的エステル交換による３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルラセミ体の分割が記載されている。
【００１５】
パクリタキセルの側鎖合成に、Ｄａ−Ｍｉｎｇ  Ｇｏｕらが同様の手法を用いている［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９３），５８，１２８７］。著者らは、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来のリパーゼを触媒とし、イソブチルアルコールを用いたエステル交換反応によるトランスメチル３−フェニルグリシド酸エステルの分割を記載している。
【００１６】
単一種の鏡像異性体の最終的な単離に採用される方法は、クロマトグラフィー又は分留、即ち、研究室規模で一般に用いられ、工業レベルでは容易に適用しにくい方法である。
【００１７】
エステラーゼを触媒とし、アルコールとしてＣ2〜Ｃ10アルカノールを用いたエステル交換反応によってフェニルグリシド酸エステルを速度論的に分割する同様の方法が、タナベによるＪＰ０６／０７８７９０に報告されている。例え所望の生成物、即ち上述のジルチアゼムの前駆体である（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルが高い光学純度で得られたとしても、この方法は、単離にクロマトグラフィー技術を利用しているため、工業レベルに適用するのは容易ではない。
【００１８】
一方、欧州特許出願第４９８７０６号［シンセラボ（Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）］に記載されている別の手法として、単一種の鏡像異性体の単離における上述の難点を克服する別の経路が提案されている。その手法は、エステル交換によって単一種の鏡像異性体を立体選択的に不溶化することに基づいており、４−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの存在下に、トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルのラセミ体を酵素的エステル交換反応に付すことによって、（２Ｓ，３Ｒ）鏡像異性体の不溶なカルボキシエステルが形成される。ろ過およびろ液の蒸発によって所望の（２Ｒ，３Ｓ）鏡像異性体を回収する。
【００１９】
しかしながら、工業的観点から好ましい高濃度条件下で処理すると、酵素の存在に加えて、トルエン相外に不溶な（２Ｓ，３Ｒ）カルボキシエステルおよびヒドロキシ酪酸ナトリウムが存在するため、トルエン反応混合物はとりわけ濃厚になる。これらの固体が酵素表面に析出するために酵素活性が低下することは不可避であり、回収も困難になる。
【００２０】
懸濁液のろ過特性を向上するためには寧ろ希釈条件下で処理することが必要である。例えば、上述の特許の実施例１には３％ｗ／ｖ溶液の使用が記載されているが、プロセスの生産性は低下する。上述の理由から、シンセラボの請求する方法は工業的には適用し難い。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らの知る限りでは、工業分野に容易に適用することができ、且つ所望の鏡像異性体を単離する操作が極めて簡単である、アミノアルコールとのエステル交換による３−フェニルグリシド酸エステルの酵素による速度論的分割方法はどの文献にも記載されていない。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、とりわけ工業的適用に適切な３−フェニルグリシド酸エステルの鏡像異性体（エナンチオマー）混合物の酵素的速度論的分割方法を見出した。当該方法は、エステルの鏡像異性体混合物を、非水性条件下でアミノアルコールを用いてエステル交換に付し、次いで、酸性媒質を用いた抽出によって、エステル交換しなかったエステルからエステル交換したエステルを分離するものである。
【００２３】
よって本発明に係る方法は、
【００２４】
【化６】
0004225694.tif 000003
【００２５】
（式中、Ｒは直鎖又は分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル；Ｒ1は水素、直鎖若しくは分岐のＣ1〜Ｃ3アルキル、直鎖若しくは分岐のＣ1〜Ｃ3アルコキシ、アリール、又はハロゲン）を製造する方法であって、有機溶媒中で酵素を触媒とし、式
【００２６】
【化７】
0004225694.tif 000004
【００２７】
（式中、ｎは２〜４の整数；Ｒ2は水素又は直鎖若しくは分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル；Ｒ3は直鎖又は分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル；或いは、Ｒ2及びＲ3は窒素原子と共に５員環〜７員環の飽和環を形成する）で表わされるアミノアルコールを用いて、式Ｉのトランス鏡像異性体の混合物をエステル交換に付すことによって、式
【００２８】
【化８】
0004225694.tif 000005
【００２９】
で表わされるトランス３−フェニルグリシド酸エステルを酵素的速度論的に分割して、それぞれ式ＩＩＩ及びＩＶ：
【００３０】
【化９】
0004225694.tif 000006
【００３１】
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びｎは前記と同義である）で表わされる、逆の絶対配置を有する、エステル交換しなかったトランスエステルとエステル交換したトランスエステルとの混合物を得、次いで、上記式ＩＩＩ及びＩＶのエステルの混合物を分離することを含む方法である。
【００３２】
本発明に係る方法は容易に実施され、面倒な精製操作を伴わず、無毒な市販の試薬を用いて、式Ｉのエステルのラセミ体から単一種の鏡像異性体を高収率且つ高い鏡像異性体過剰率で得ることができる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明に係る反応であるエステル交換反応は、適切な酵素の存在下、非水性媒質中で、式Ｉのトランスエステルラセミ体と式ＩＩのアミノアルコールとを反応させることによって実施される。
式Ｉのトランスエステルラセミ体は公知の化合物であって、例えば任意的に置換されたベンズアルデヒド及び対応する２−ハロアセテートを出発物質として、先に引用したダルツェン縮合［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９８６），５１，２７５９］によって容易に調製することができる。
【００３４】
本発明に係る分割プロセスに使用可能な式Ｉのエステルとして、例えば、メチル、エチル及びプロピルエステルが挙げられる。
メチルエステルが特に好ましい。
【００３５】
本発明に係る方法によれば、エステル交換反応は式ＩＩのアミノアルコールの存在下で進行する。
【００３６】
本発明に係る方法に利用できる式ＩＩのアミノアルコールとして、例えば、３−ジメチルアミノ−１−プロパノ−ル、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−メチルアミノエタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン、及び１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジンが挙げられる。
【００３７】
２−ジメチルアミノエタノールは、入手が容易で、毒性が極めて低く、室温で液体であり、且つ安定な化合物であることから、特に好ましい。
本発明に係る酵素的分割方法によれば、式ＩＩのアミノアルコールは、式Ｉのエステルを基準として、２０：１〜０．４：１のモル比で用いられる。
好ましくは、上記モル比は１０：１〜１：１であり、より好ましくは、２：１である。
【００３８】
上記目的に各種酵素を使用することができる。
特に、動物、微生物又は植物由来のリパーゼを用いることができる。リパーゼとして、例えば、任意的に担持された、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼ、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来リパーゼ、ブタ膵臓リパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来リパーゼ、コムギ胚芽由来リパーゼ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来リパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来リパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ由来リパーゼ、Ｐｅｎｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ由来リパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ由来リパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来リパーゼ、Ｐｅｎｎｉｃｉｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ由来リパーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来リパーゼ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ由来リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｅａ由来リパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来リパーゼ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来リパーゼが挙げられる。
【００３９】
特に好ましくは、商品名Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）である、担持されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼ、セライトに担持されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｅａ由来リパーゼＰＳ（Ａｍａｎｏ）、ＩＩ型ブタ膵臓リパーゼ（Ｓｉｇｍａ）、及びＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来リパーゼＣＥ５（Ａｍａｎｏ）である。
商品名Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）である担持されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼは、その高いエナンチオ選択性、安定性、及び入手しやすさから、更に好ましい。
【００４０】
本発明に係る方法に用いる酵素は、反応終了時に回収し、活性を損なうことなく繰り返し使用することが可能である。
本発明に係る酵素的エステル交換反応は、非水性媒質中で行われる。
【００４１】
反応溶媒として用いることができる有機溶媒として、例えば、ベンゼン、クロロベンゼン、キシレン、トルエン等の芳香族溶媒；ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−へプタン等の炭化水素；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル；メチルエチルケトン、アセトン等のケトン；ｔｅｒ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール等のアルコール；アセトニトリル等の非プロトン性双極性溶媒；又は塩化メチレン等の塩素化溶媒；又はこれらの混合物が挙げられる。
実際の使用上の理由から、トルエンを用いることが好ましい。
【００４２】
本発明に係るエステル交換反応は可逆反応となり得るが、特に、脱離するアルコールＲＯＨの求核性が強い場合にその傾向が強い。
反応の平衡を所望の方向に移行させるために各種手段を講じることができる。例えば、α位若しくはβ位に電子吸引基を有する求核性の低いアルコール又はビニル型のアルコールからのＲ残基を有する式Ｉのエステルを用いることができる。それによって、非反応性カルボニル種を得るか或いはＲがアシル残基である式Ｉの無水物を得る。
【００４３】
従って、Ｒが、例えば、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２−クロロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、シアノメチル、２−ニトロプロピル、ビニル、及びイソプロペニル残基、又は、ホルミル、アセチル、又はプロピオニル等のアシル残基で表わされるエステルも本発明の範囲に包含される。
【００４４】
一方、別の手法として、式ＩＩのアミノアルコールの濃度を増加する手法や、エステル交換反応中に放出されるアルコールＲＯＨを除去する手法がある。アルコールＲＯＨを除去できる方法は幾つかあり、例えば、不活性材料への吸収、又は減圧蒸留があり、好ましくは共沸蒸留が用いられる。
特に好ましくは、アルコールＲＯＨは共沸蒸留によって除去される。
【００４５】
アルコール吸収に使用できる不活性材料として、例えば分子ふるいが挙げられる。メタノールの場合、好ましくは５Å分子ふるい（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｔｙｐｅ  ５Å，１／８”ロッド，Ｆｌｕｋａ）である。
【００４６】
共沸蒸留によるアルコールＲＯＨの除去は、除去すべきアルコールの種類に応じて選ばれた第２溶媒を、適切な量で反応媒質中に添加することによって実施することができる。この第２溶媒は、アルコールＲＯＨと共に、任意に反応溶媒とアミノアルコールと共に、アルコールＲＯＨそのものよりも沸点の低い共沸系を生成する。従って、減圧下で穏やかに加熱することによって共沸物を除去し、更に、任意に蒸発したアミノアルコールを回復することによって、極端な実験条件、即ち、基質の化学的安定性及び酵素の高いエナンチオ（鏡像異性体）選択性の維持と両立しない条件を用いずに、反応の平衡を好ましい状態にシフトさせることができる。
例えばアルコールＲＯＨがメタノールである場合、共沸物の形成に用いる第２溶媒はメチルシクロヘキサンであってもよい。
【００４７】
本発明に係る方法の重要なパラメータは反応温度である。反応温度は速度だけでなく酵素系のエナンチオ選択性にも影響する。
一般に、基質の溶解性が最も高く、任意の共沸系が留去され、且つ理想的な酵素活性が得られる温度で実施される。
例えば、使用可能な温度は、大気圧下又は減圧下において５〜５０℃の範囲とすることができる。好ましくは１０〜３０℃の間で実施し、更に好ましくは室温で実施する。
【００４８】
本発明に係る方法によれば、反応生成物の単離操作は特に簡単で、容易に実施することができる。
一般に、単離操作は、担持された酵素及び任意の分子ふるいをろ過により除去し、ろ液を抽出することによって実施される。この抽出は、まず、水溶性の式ＩＩのアミノアルコールの過剰分を除去するべく水を用いて実施し、次いで、酸性の水相を用いて実施する。エステル交換した式ＩＶの生成物は酸性の水相中に、エステル交換しなかった式ＩＩＩの生成物は有機相中に存在するであろう。
酸洗浄は、有機又は無機酸、例えば酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、又はスルホン酸の水溶液を用いて行う。上記酸の濃度と添加条件は、アミン基を塩化させるために十分なｐＨの媒質を確実に得るものであると共に、所望の鏡像異性体の化学的安定性と両立するものである。
【００４９】
式ＩＩＩ及び式ＩＶのエステルの混合物をそれぞれ有機相中と酸性の水相中とに分離した後は、簡単な蒸発操作を行って式ＩＩＩの生成物を有機相から回収することができる。
【００５０】
得られた粗生成物は、更なる処理や精製を施すことなく、例えば上述の文献に記載された合成方法に従って、ジルチアゼムの製造に直接用いることができるような光学純度を有する。
一方、単離された未精製エステルの鏡像体過剰率を更に向上するべく、ホモキラル化合物の結晶で適切な飽和溶液を核に用いて引続き結晶化させることが可能である。
【００５１】
本発明に係る分割方法は、２種類の鏡像異性体が酵素触媒条件下で異なる反応速度を呈することに基づいている。選択的にエステル交換反応する鏡像異性体は、使用する酵素の種類によって異なる場合がある。
例えば、担持されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標））の存在下で３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルのトランスラセミ混合物を出発物質に用いた場合、鏡像異性体（２Ｓ，３Ｒ）が選択的にエステル交換され、一方、ジルチアゼム合成中間体として有用な対掌体（２Ｒ，３Ｓ）は変化しない。この場合は、有用な鏡像異性体は有機相の蒸発によって回収される。
【００５２】
本発明方法の好ましい実施態様においては、室温下、共沸物を形成するように選択された共溶媒の存在下、適切な有機溶媒中の、式Ｉのトランスエステルラセミ体の溶液に、リパーゼ及び式ＩＩのアミノアルコールを添加する。共沸蒸留条件下で懸濁液を攪拌しながら、エステル交換の完了までに要する時間、溶媒、共溶媒及びアミノアルコールを適切に回復し、次いでろ過する。回収した酵素は有機溶媒で洗浄し、後の反応で再使用する。ろ液は、式ＩＶのアミノエステルが完全に除去されるまで、まず水洗し次いで酸性溶液で洗浄し、蒸発乾固して、式ＩＩＩのホモキラルエステルの粗生成物を得る。式ＩＩＩのホモキラルエステルの粗生成物は、任意的に、式ＩＩＩのエステルの光学的に純粋なサンプル等を核に用いて結晶化させてもよいが、そのままの状態で用いてもよい。
【００５３】
本発明に係る方法は容易に実現可能で、式Ｉのホモキラルなグリシド酸エステルを高収率且つ高い鏡像異性体過剰率で得ることができる。
出発物質である式Ｉのエステルは、ダルツェン反応によって、ほぼ完全なトランス鏡像異性体混合物として容易に調製することができる。これにより、更なる精製操作を施さずに、反応粗生成物を次の酵素的分割に直接付すことができる。
【００５４】
穏やかな反応条件を用いる当該プロセスは、特に温度を制御し、非水性溶媒を使用した場合は、非常に不安定な基質である３−フェニルグリシド酸のエステルにとって特に適切なものとなる。本発明方法の実験条件は、所望の鏡像異性体のエポキシド環の加水分解開裂反応が最小限に抑えられるという効果を奏し、当該鏡像異性体の回収率が向上する。
【００５５】
更に、フェニルグリシド酸エステルの有機相への溶解性が非常に高く、反応中に固体が形成しないため、高濃度な有機溶液中で本発明方法を実施することが可能となり、従って、先に引用した欧州特許出願第４９８７０６号（シンセラボ）に記載の方法に比べて生産性が向上し、本発明方法が工業的応用に特に適切なものとなる。
【００５６】
本発明方法の他の有利な点は、非常に安定な酵素を用いることである。この酵素は取り扱いが容易で、反応終了後に簡単なろ過によって回収することができ、しかも高い酵素活性を維持することから、生産サイクルに繰り返し使用することができる。
最後に、本発明方法の重要な利点は、所望の鏡像異性体の最終単離操作が極めて簡単なことである。当該鏡像異性体の最終分離において、エステル交換プロセス中に得られた塩基性の官能基が利用されるが、このことによって所望のエステルが実際に定量的に回収される。クロマトグラフィーや蒸留等の他の方法に比べ、操作が極めて容易で、状況に応じた使い方ができ、低コストであるため、実使用上非常に有利であるという効果が得られる。
更に、ｐＨの制御下に分離プロセスを行うことは、対象となる３−フェニルグリシド酸エステル等の、酸に対する感応性が高く不安定な基質には非常に適している。
【００５７】
穏やかな反応条件下で、特に非水性溶媒を用い、操作が容易で反応終了後に回収可能な安定性の極めて高い酵素を利用し、２−ジメチルアミノエタノール等の簡単なアミノアルコールを用い、単一種の鏡像異性体の最終単離操作が極めて簡単で、生産性が高く、ホモキラルな３−フェニルグリシド酸エステルが高収率且つ高い鏡像異性体過剰率で得られることから、本発明方法が特に工業的応用に適切なものとなると結論づけられる。
【００５８】
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
実施例１
異なる酵素を用いた、２−ジメチルアミノエタノールを用いた酵素的エステル交換によるトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
異なるリパーゼ、特に、名称Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）である担持されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼ（４５０Ｕ／乾燥生成物１００ｍｇ：Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、セライトに担持されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｅａ由来ＰＳリパーゼ（３７５Ｕ／乾燥生成物５０ｍｇ：Ａｍａｎｏ）、ＩＩ型ブタ膵臓由来リパーゼ（１３３０Ｕ／乾燥生成物１００ｍｇ：Ｓｉｇｍａ）及びＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来ＣＥ５リパーゼ（５５０Ｕ／乾燥品１００ｍｇ：Ａｍａｎｏ）を用いて、２−ジメチルアミノエタノールを用いたトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体のエステル交換試験を数回実施した。
酵素のエナンチオ選択性Ｅを、以下のＳｉｈの式［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８２），１０４，７２９４参照］に従って計算した。
Ｅ＝ｌｎ［（１−ｃ）（１−ｅｅs）］／ｌｎ［（１−ｃ）（１＋ｅｅs）］
（式中、ｃは反応率、ｅｅsは残留基質の鏡像異性体過剰率を表わす）
トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体（２１ｍｇ；０．１ｍｍｏｌ）をｔｅｒ−ブチルメチルエーテル（０．８ｍｌ）に溶解し、この溶液に、２−ジメチルアミノエタノール（０．２ｍｌ；２ｍｍｏｌ）と市販の酵素試料（１０／５０／１００ｍｇ）とを加えることにより反応を行った。得られた懸濁液を攪拌しながら、表に記載した時間室温下に放置した。
この反応による反応率ｃおよび鏡像異性体過剰率ｅｅsは、以下（表１）に示す分析条件下でＨＰＬＣ分析により評価した。
【００６０】
【表１】
0004225694.tif 000007
【００６１】
分析用試料は、反応物の一部を採取し、それをろ過し、有機溶液にペトロラタム：酢酸エチル混合物（９５：５）を加えて適切に希釈し、次いで、０．０５Ｍの酢酸／酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝５）で洗浄することにより調製した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、直接ＨＰＬＣ分析に用いた。
具体的な試験条件と得られた結果を以下の表２に示す。
【００６２】
【表２】
0004225694.tif 000008
【００６３】
上記実施例において、２Ｓ，３Ｒ鏡像異性体が選択的にエステル交換され、一方、ジルチアゼム合成に有用な鏡像異性体は変化しなかった。
上記表に記載したデータから、ここに使用した酵素が良好なエナンチオ選択特性を示すことが判る。
【００６４】
実施例２
異なる溶媒を用いた、２−ジメチルアミノエタノールを用いた酵素的エステル交換によるトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
室温下、異なる溶媒を用いて実施例１と同様の操作を行い、Ｎｏｖｏｚｉｍ４３５（登録商標）の存在下に２−ジメチルアミノエタノールを用いてトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体のエステル交換試験を数回実施した。出発物質を以下に示す。
トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体（２１ｍｇ；０．１ｍｍｏｌ）
２−ジメチルアミノエタノール（０．２ｍｌ；２ｍｍｏｌ）
溶媒（０．８ｍｌ）
Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）（１０ｍｇ）
実施例１に記載した手順に従って実施したＨＰＬＣ分析に基づくｃとｅｅs
の計算値を以下の表に列挙する。
【００６５】
【表３】
0004225694.tif 000009
【００６６】
上記Ｅ値から、異なる溶媒を使用しても酵素作用は実質的に変化しないことが判る。
【００６７】
実施例３
異なるアミノアルコールを用いた、酵素的エステル交換によるトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
室温下、トルエン中で異なるアミノアルコールとＮｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）とを用いて実施例１と同様の操作を行い、トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体のエステル交換試験を数回実施した。出発物質を以下に示す。
トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体（Ｍｅ−ＰＧＡ）
アミノアルコール
トルエン
Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）
分子ふるい５Å
実施例１に記載した手順に従って実施したＨＰＬＣ分析に基づくｃとｅｅsの計算値を以下の表４に列挙する。
【００６８】
【表４】
0004225694.tif 000010
【００６９】
対象とする酵素的エステル交換プロセスにアミノアルコールを用いることによって、実質的に同等の反応率と鏡像異性体過剰率が得られる。
【００７０】
実施例４
異なる温度による、２−ジメチルアミノエタノールを用いたトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
系の温度を変化させ、実施例１と同様の操作を行って、エステル交換試験を数回実施した。
得られた結果と、それに対応する実験条件を以下の表５に示す。
【００７１】
【表５】
0004225694.tif 000011
【００７２】
上記実験データから、酵素による製造法のエナンチオ選択性は、温度を変化させても維持されることは明らかである。
【００７３】
実施例５
分子ふるいの存在下における、トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体（１０ｇ）をトルエン（３４ｇ）に溶解した。この溶液に、Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）（１ｇ）、粉砕した分子ふるい５Å（１５ｇ）及び２−ジメチルアミノエタノール（８．７ｇ）を順に加えた。
懸濁液を室温で３〜４時間攪拌した後、減圧下でろ過した。トルエン（２０ｇ）を用いて酵素と分子ふるいを洗浄し、トルエン相を回収した。
トルエン相全体（５４．９ｇ）には、トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステル（４．７２ｇ；ｃ＝５２．８％）が含まれていた。
このトルエン溶液に、０℃に冷却した水（１００ｇ）を加え、３０分間攪拌した。相分離の後、０℃に冷却した水（８０ｇ）を有機相に加え、攪拌しながら、８５％リン酸溶液（１．４ｇ）をｐＨ６．８になるまでゆっくりと加え、水（２０ｇ）を加えた。
この溶液を１時間攪拌しながら、予め調製したリン酸溶液を加え、ｐＨを６．８に維持した。
相分離の後、トルエン相に、０℃に冷却した水（８０ｇ）とリン酸溶液とをｐＨ６．８になるまで加えた。この溶液を３時間攪拌しながら、ｐＨが６．８に維持されるように酸性溶液（２０ｇ）を加えた。相分離の後、水相をトルエンで抽出した。
回収したトルエン相はトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステル（４．５６ｇ）を含み、その２Ｒ，３Ｓ：２Ｓ，３Ｒ鏡像異性体比は９０：１０（２Ｒ，３Ｓ鏡像異性体収率＝８２％）であった。
トルエン溶液を減圧下で蒸発させ、粗生成物４．７ｇを回収した。
この生成物にトルエン（５ｇ）を加え、５０℃まで加温して完全に溶解させた後、（２Ｒ、３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルの結晶を数粒加えることにより結晶化を開始した。
この混合物を２時間かけて０℃に冷却し、同温度で１時間保持した。析出物をろ過し、予め０℃に冷却したトルエン（１．７ｇ）で洗浄し、６０℃の減圧オーブンで４時間乾燥した。２Ｒ，３Ｓ：２Ｓ，３Ｒ鏡像異性体比が９９：１である生成物３．１ｇを得た（２Ｒ，３Ｓ鏡像異性体の結晶収率＝７５％）。
【００７４】
実施例６
共沸蒸留条件下における、２−ジメチルアミノエタノールを用いたトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体（１２ｇ）をトルエン（５８ｍｌ）に溶解した。この溶液に、Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）（１ｇ）、２−ジメチルアミノエタノール（１２ｍｌ）、及びメチルシクロヘキサン（１０ｍｌ）を順に加えた。
この懸濁液を４時間攪拌し、減圧蒸留（Ｐ＝３０ｍｍＨｇ、Ｔ＝２５℃）によって共沸混合物を除去し、蒸発した溶媒と２−ジメチルアミノエタノールを、遂次的追加（トルエン６ｍｌ、メチルシクロヘキサン２４ｍｌ、２−ジメチルアミノエタノール１２ｍｌ）により、もとの状態に戻した。
実施例５に記載した方法と同様の方法で所望の生成物を単離し、同等の収率と鏡像異性体過剰率で２Ｒ，３Ｓ鏡像異性体を得た。
【００７５】
実施例７
Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５(R)を再使用した、２−ジメチルアミノエタノールを用いたトランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体の分割
数回の反応にわたり酵素を再使用した場合における酵素の安定性を評価する目的で、実施例６に記載した方法と同様の方法でエステル交換試験を数回実施した。反応が終了する毎に酵素をろ過により回収し、トルエンで洗浄し、室温の空気中で乾燥し、後の反応で再使用した。
出発物質と条件を以下に示す。
【００７６】
トランス３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸メチルエステルラセミ体（Ｍ
ｅ−ＰＧＡ）                                      １２ｇ（１５％ｗ／ｖ）
２−ジメチルアミノエタノール（ＤＭＡＥ）          １２ｍｌ
トルエン                                          ５８ｍｌ
メチルシクロヘキサン                              １０ｍｌ
Ｎｏｖｏｚｉｍ  ４３５（登録商標）                  １ｇ
温度                                              ２５℃
圧力                                              ３０ｍｍＨｇ
他の実験変数と得られた結果を以下の表６に示す。
【００７７】
【表６】
0004225694.tif 000012
【００７８】
変換率と鏡像異性体の過剰量が定常値を示すことから、再使用酵素系は安定性が高いという特徴を有し、従って、同等の効率を維持しながら後続のサイクルに再使用することができる、と結論づけられる。