(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性ニューロパシー、老人痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積状態、非動脈性視神経ニューロパシー、ビタミン欠乏症、椎骨間板ヘルニア、クロイツヘルト−ヤコブ病、手根トンネル症候群、末梢性ニューロパシーであって、尿毒症、多尿、低血糖に伴う末梢性ニューロパシー、シェーグレン−ラルソン症候群、急性知覚ニューロパシー、慢性運動失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性赤血球増多症、ＩｇＡ及びＩｇＧ高グロブリン血症、様々な薬剤及びトキシンの合併症、シャルコー−マリー−ツース病、毛細血管拡張性運動失調、フリートライヒ運動失調、アミロイド多発性神経障害、副腎脊髄神経傷害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリー病、リポ蛋白血症、てんかん、貧血、不安、疼痛過敏、精神病、けいれん、眼内圧の異常な上昇、酸化的ストレス、及びオピエート耐性及び依存から選ばれるグルタメートの毒性により生じるかまたはそれにより増悪する疾患により生じる神経損傷に引続く二次的神経変性を低下させるための、Ｃｏｐ１を含む医薬組成物。
【請求項２】
グルタメートの毒性から中枢神経系細胞を保護するための、Ｃｏｐ１によって活性化されたＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項３】
糖尿病性ニューロパシー、老人痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積状態、非動脈性視神経ニューロパシー、ビタミン欠乏症、椎骨間板ヘルニア、クロイツヘルト−ヤコブ病、手根トンネル症候群、末梢性ニューロパシーであって、尿毒症、多尿、低血糖に伴う末梢性ニューロパシー、シェーグレン−ラルソン症候群、急性知覚ニューロパシー、慢性運動失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性赤血球増多症、ＩｇＡ及びＩｇＧ高グロブリン血症、様々な薬剤及びトキシンの合併症、シャルコー−マリー−ツース病、毛細血管拡張性運動失調、フリートライヒ運動失調、アミロイド多発性神経障害、副腎脊髄神経傷害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリー病、リポ蛋白血症、てんかん、貧血、不安、疼痛過敏、精神病、けいれん、眼内圧の異常な上昇、酸化的ストレス、及びオピエート耐性及び依存から選ばれるグルタメートの毒性により生じるかまたはそれにより増悪する疾患により生じる神経損傷に引続く二次的神経変性を低下させるための、Ｃｏｐ１によって活性化されたＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項４】
活性化Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞である、請求項２又は３の医薬組成物。
【請求項５】
活性化Ｔ細胞は、血縁のドナー、又はＨＬＡ−適合した若しくは部分的に適合したドナー、セミ同種異系、若しくは完全同種異系のドナーからの同種異系Ｔ細胞である、請求項２又は３の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は、2000年1月20日出願の米国特許出願09/467,793, 2000年6月7日出願の米国特許出願60/209,799及び2000年7月20日出願の米国特許出願09/620,216からの優先権の利益を亮受する。出願09/467,793, 60/209,799 及び09/620,216それぞれの内容は引用により本明細書に導入される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、中枢神経系（NS）の傷害若しくは疾患による作用を緩和するために、神経の再生促進又は神経細胞の変性を防止若しくは阻害する組成物及び方法に関する。とくに本発明は、ヒト対象の中枢神経系又は末梢神経系内神経における再生の促進、又は神経の傷害若しくは疾患によって生じる神経細胞の変性の防止若しくは阻害のための、コポリマー1（Cop-1）又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド、及び／又はCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドで活性化されたT細胞からなる組成物に関する。本発明の組成物は、単独で又は任意に所望の組み合わせで投与することができる。
【０００３】
（発明の背景）
神経系は中枢神経系及び末梢神経系を包含する。中枢神経系（CNS）は脳及び脊髄からなり、末梢神経系（PNS）は他の神経エレメントのすべて、すなわち脳及び脊髄外の神経及び神経節から構成される。
【０００４】
神経系に対する傷害は、外傷性損傷たとえば穿通性外傷若しくは鈍的傷害、又はそれらに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、糖尿病性ニューロパシー、老人痴呆及び虚血を包含する療気若しくは障害によって起こる。
【０００５】
中枢神経系の完全性は、その妥協が免疫系により解消される複雑な「両為工作（balancing act）」によって維持されている。大部分の組織においては、免疫系が保護、修復及び治癒において本質的な役割を演じている。中枢神経系においては、その独特な免疫の特典により免疫学的反応は比較的限定されている（Streilein, 1993, 1995）。証拠の増加している主要部分によると、哺乳動物の中枢神経系が損傷を受けたのちには機能的な回復を達成できないのは、傷害された組織と免疫系の間の有効でない対話を反映することを指示している。たとえば、中枢神経系と血液運搬マクロファージの間のコミュニケーションは切断された軸索の再成長能に影響し、活性化マクロファージの移植は中枢神経系の再成長を促進することができる（Lazarov Spieglerら, 1996；Rapalinoら, 1998）。
【０００６】
活性化されたT細胞は、それらの抗原特異性には無関係に、中枢神経系実質に入るが、中枢神経系の抗原と反応できるT細胞のみがそこに維持されるように思われる（Hickeyら, 1991；Werkele, 1993；Kramerら, 1995）。中枢神経系白質の抗原、たとえばミエリン塩基性タンパク質（MBP）と反応できるT細胞は、それらを未被験のレシピエントラットに接種して数日以内に麻痺性疾患の、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を誘導することができる（Ben-Nun, 1981a）。抗-MBP T細胞はまた、ヒト疾患、多発性硬化症に関与し得る（Ota, Kら, 1990；Martin, 1997）。しかしながら、それらの病原性の可能性にもかかわらず抗-MBP T細胞のクローンは健康な対象の免疫系にも存在する（Burns, 1983；Pette, M. ら, 1990；Martinら, 1990；Schluesenerら, 1985）。通常、無傷の中枢神経系を巡回する活性化T細胞は一過性に中枢神経系白質の損傷の部位に蓄積する（Hirschbergら, 1998）。
【０００７】
中枢神経系の傷害の悲劇的な結果は、一次的な損害が、しばしば、明らかに傷害されていないか、又は些細な損傷しかない隣接神経細胞の二次的な損傷と、一次的な傷害により徐々に複合することである（Fadenら, 1992； Faden, 1993； McIntosh, 1993）。一次的損傷は、細胞外イオン濃度の変化、遊離ラジカル量の増加、神経伝達物質の放出、成長因子の枯渇、及び局所的炎症を起こす。これらの変化は、最初は一次的障害を免れた隣接神経細胞の破壊現象のカスケードを誘発する（Lynchら, 1994；Bazenら, 1995；Wuら, 1994）。この二次的損傷は電圧依存性又はアゴニスト開口チャンネル、イオン漏出、カルシウム依存性酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ及びヌクレアーゼの活性化、ミトコンドリア機能不全及びエネルギーの枯渇により仲介され、神経細胞死を最高潮にする（Yoshinaら, 1991；Hovdaら, 1991；Zivinら, 1991；Yolesら, 1992）。一次傷害により直接生じた喪失を超える広範囲の神経細胞の喪失は「二次的変性」と呼ばれている。
【０００８】
一次的リスク因子が除去又は緩和された場合でも、疾患の自己増殖を生じる最も一般的なメディエーターの一つは、二重の活性すなわち必須の神経伝達物質として機能して正常な中枢神経系（CNS）における重要な役割を演じるが、その生理学的レベルが過剰になった場合には毒性を発揮する興奮性アミノ酸である、グルタミン酸がある。グルタミン酸の増加は多くのCNS障害で報告されている。興奮性毒性化合物としてのその役割において、グルタミン酸は、急性及び慢性の変性障害（緑内障における視神経の変性を含む）の最も一般的な毒性のメディエーターである（Pittら, 2000及びSchoeppら, 1996）。内因性グルタミン酸はてんかん重積状態、脳虚血又は外傷性脳傷害後急性に起こる脳傷害に寄与する。また慢性的な神経細胞変性たとえば萎縮性側索硬化症及びハンチントン舞踏病のような傷害にも寄与する。
【０００９】
集中的な研究が、局所的に作用する薬物、たとえばNMDA-受容体アンタゴニストの使用によるグルタミン酸の細胞毒性作用を緩和するために試みられてきた（Brauner-Osborneら, 2000）。しかしながら、この種の慣用の治療は毒性作用の中和には不満足であることが多く、生理学的な機能に干渉するように思われる。ヒトにおいては、このような化合物は、治療薬としては不適当とする向精神的及び他の副作用を有する。それらはまた、グルタミン酸の至る所に存在するCNS神経伝達物質としての必須の生理学的機能と干渉する欠点がある。グルタミン酸の活性は正常な生理学的機能に必須であるが、急性の傷害後又は慢性のCNS障害においては潜在的に破壊的であるので、グルタミン酸活性の有害な作用を中和する試みでは、生体の他の部位におけるその必須の活性を消失させることなく中和されなければならない。
【００１０】
中枢神経系傷害の他の悲劇的な結果は哺乳動物の中枢神経系における神経細胞は傷害後、自発的な再生を受けないことである。したがって、中枢神経系の傷害は運動及び感覚機能の永久的な損傷を生じることになる。
【００１１】
脊髄損傷は最初、その損傷の重症度とは無関係に、脊髄ショックとして知られている完全な機能麻痺を生じる。損傷後数日で始まり、3ないし4週で終わる自発的な脊髄ショックからの回復が観察される場合がある。傷害がもっと軽い場合には、機能的な結果はより良好である。回復の程度は傷害を受けなかった組織マイナス二次的変性による喪失の量の関数である。傷害からの回復は、二次的変性を低下させる神経保護的処置によって改善される。たとえば、グルタミン酸の作用の緩和は、多くの場合、神経保護薬物開発の標的である。この目的で開発された薬物中にはとくに、N-メチル-D-アスパルテート（NMDA）-受容体又はα-アミノ-3-ヒドロキシ- 5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸（AMPA）-受容体アンタゴニストがある。これらの薬物は、CNS活性に重要なNMDA及びAMPA受容体の機能に干渉するので、必然的に重篤な副作用を有する。最も集中的に研究されているNMDA-受容体アンタゴニストの一つはMK801であり、これは効果的な神経保護作用を提供するが、重篤な副作用を伴っている。脳虚血及び外傷性脳傷害の動物モデルでは、NMDA及びAMPA受容体アンタゴニストは急性の脳傷害に対して保護作用を示し、行動欠損を遅延させる。このような化合物はヒトでも試験されているが、治療効果はまだ確立されていない。グルタミン酸作動性伝達に作用する薬物に反応し得る他の臨床状態にはてんかん、貧血、不安、痛覚過敏及び精神病が包含される（Meldrum, 2000）。
【００１２】
本発明者らの実験室では最近、患者の神経系（NS）の抗原を認識する活性化T細胞が、神経の再生を促進するか又は神経保護作用を付与することを発見した。PCT公開WO99/60021を参照されたい。この内容の全体は引用により本明細書に導入される。さらに特定すれば、MBPに反応性のT細胞は部分的に挫滅された視神経（Moalemら, 1999）、及び脊髄損傷（Haubenら, 2000）のラットモデルにおいて神経保護作用を示した。最近まで免疫系は免疫細胞が神経系の修復に参加することを排除すると考えられてきた。NS-特異的活性化T細胞が、神経再生の促進又はCNS若しくはPNSの傷害若しくは疾患により生じた損傷に続く神経系組織の二次的変性からの保護に使用できることの発見は全く驚くべきことであった。
【００１３】
上記WO 99/60021に記載されたNS-特異的な活性化T細胞は、患者のNSの抗原に特異性を有する活性化T細胞である。T細胞に対する特異性を付与するために用いられる抗原は、患者の自己NS-抗原、それに由来するペプチド、又は活性化T細胞が患者のNSにおける抗原を認識する限り他の個体若しくは他の種のNS-抗原でも、若しくはそれに由来するペプチドであってもよい。
【００１４】
上記NS-特異的な活性化T細胞は神経再生の促進又は疾患の作用の防止若しくは阻害に使用される。処置される疾患が自己免疫疾患であり、自己免疫抗原がNS抗原である場合、神経細胞傷害又はこのような疾患によって生じた変性の処置に使用されるT細胞は、その疾患に関与するのと同じ自己免疫抗原に対して活性化されない。
【００１５】
上に引用したPCT公開WO99/60021には、NS-特異的に活性化されたT細胞をNS-特異的抗原又はそれから誘導されたペプチドと任意に組み合わせて投与することを含む傷害又は疾患の効果を緩和するための療法が開示されている。上記WO 99/60021に定義されたNS-特異的抗原とは、活性化後、患者のNS中の傷害又は疾患の部位にT細胞が蓄積されるように、T細胞を特異的に活性化する抗原を指す。さらに、NS-特異的抗原又はそれから誘導されるペプチドの経口投与は、傷害後直ちに、臨界的T細胞応答を構築するために能動免疫処置と組み合わせることができる。
【００１６】
この以前の発明において、インビトロ若しくはインビボでT細胞の活性化又は患者の免疫処置に使用されるNS-特異的な抗原は、NS組織、好ましくはCNS傷害又は疾患の部位における組織から得られた抗原とすることができる。天然の又は合成のNS-特異的抗原又はエピトープは、MBP, MOG, PLP, MAG, S-100, β-アミロイド、Thy-1, P0, P2及び神経伝達物質受容体を含むことが開示されている。WO 99/60021に開示されたこのような有用なNS-特異的な抗原の例示的な例には、ヒトMBP, ヒトプロテオリピドタンパク質（PLP）、及びヒトオリゴデンドロサイト糖タンパク質がある。また、T細胞を活性化するが自己免疫疾患は誘導しない、NS-特異的、自己抗原、又はNS-特異的抗原の誘導体から誘導されたペプチド、たとえばミエリン塩基性タンパク質（MBP）のアミノ酸51〜70を含むペプチド、が開示されている。
【００１７】
このようなNS-特異的T細胞の作用機構はまだ発見されていないが、外因性の投与されたT細胞のCNS傷害部位における大量の蓄積は、傷害部位におけるT細胞の存在が神経保護における顕著な役割を果たすことを示唆している。しかしながら、蓄積は必要条件ではあるものの、非自己抗原オボアルブミンに特異的なT細胞もその部位に蓄積するが神経保護作用はない（Hirschbergら, 1998）ように、この目的には十分ではないように思われる。
【００１８】
L-Ala, L-Glu, L-Lys及びL-Tyr残基、モル比約6部のAla対、2部のGlu対、4.5部のLys対、1部のTyrから構成され、分子量15,000〜25,000を有する高分子量合成、塩基性ランダムコポリマーは実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、感受性動物に誘導できる多発性硬化症（MS）に類似の疾患の処置又は防止のための薬剤として米国特許3,849,550に最初に記載された。平均分子量23,000のこのコポリマーのバッチがコポリマー1又はCop-1と命名され、数種の動物種でEAEをきわめて効果的に保護又は抑制することが示された（Teitelbaumら, 1971, 1974a, 1974b）。
【００１９】
その後、Cop-1はMSの悪化-軽減型を有する患者における再発数を有意に低下させることが見出された（Bornsteinら, 1990；Selaら, 1990；Johnsonら, 1994）。L-Glu, L-Ala, L-Tyr及びL-Lysを平均分子分画0.141, 0.427, 0.095及び0.338で含有する合成ポリペプチドの酢酸塩型コポリマー1は、多発性硬化症の治療用医薬であるCOPAXONE（商標）の活性成分である。
【００２０】
したがって、MSの処置におけるコポリマー1の効果は、多発性硬化症患者におけるミエリン抗原に対する自己免疫T細胞の反応性の抑制又は脱活性化の達成にあることが明らかである。この目的には、コポリマー1をアジュバントなしで毎日皮下注射して投与する。
【００２１】
Cop-1は本来、MBPを模倣し、EAEを誘導するために設計されたが、脳炎誘発性はなく、MBP（Teitelbaumら, 1971）、PLP（Teitelbaumら, 1996）又はMOG（Ben-Nunら, 1996）によって誘発されるEAEを抑制さえすることが見出された。Cop-1がEAEの発症を防止し、多発性硬化症（MS）を緩和する正確な機構はまだ明らかではない。しかしながら、このコポリマーのある種の重要な免疫学的性質を現れた。研究により、Cop-1のT細胞（Webbら, 1973）及び抗体（Teitelbaum, 1988）レベル両者におけるMBPとの部分交叉反応性が明らかにされている。Cop-1はMBP免疫支配的なエピトープに関するT細胞抗原受容体のアンタゴニストとして働くことができる（Aharoni, 1998）。それはまた、様々のMHCクラスII分子に結合し、それらが特異的抗原-認識性を有するT細胞へ結合することを妨げることができる（Fridkis-Hareliら, 1999a）。齧歯類においては、Cop-1はおそらく脳炎誘発性T細胞のバイスタンダー（bystander）サプレッサーとして働く（Aharoni, 1998）調節細胞を誘導する。このようなT細胞の養子移入は、MBP（Aharoniら, 1993）、PLP（Aharoni, 1998）又は全脊髄ホモジネート（Aharoniら, 1997）によって誘導されるEAEの発症を防止することが見出された。
【００２２】
さらに、Cop-1及び関連コポリマーならびにコラーゲンII（CII）ペプチドとリウマチ性関節炎（RA）-関連HLA-DR分子の競合的相互作用及びCII-特異的T細胞応答の阻害の両方について直接的な証拠が報告されており、これらの化合物がリウマチ性関節炎に対して有効である可能性が示唆されている（Fridkis-Hareli, 1998、1999b）。
【００２３】
「経口耐性」を得るための自己抗原の経口投与が様々な自己免疫疾患の処置のために開示されている。たとえば、EP 359 783には多発性硬化症の処置のためのMBPの経口投与が開示されている。PCT国際公開WO91/12816, WO91/08760及びWO 92/ 06704はすべて、様々な自己抗原による経口耐性法を使用する他の自己免疫疾患の処置を開示している。ミエリン抗原に対する自己免疫T細胞応答の抑制を達成するためのコポリマー1の摂取又は吸入による多発性硬化症の処置がPCT国際公開WO98/30227に開示されている。
【００２４】
コポリマー1に関連する化合物もまた研究され、コポリマー1に類似の性質を有することが見出されている。たとえば、精製されたクラスII MHC分子に結合するコポリマー1中に見出される4つのアミノ酸の3つからなるコポリマーがある（Fridkis-Hareliら, 1999a, WO 005250）。さらに、多発性硬化症及びリウマチ性関節炎関連HLA-DR分子に対するコポリマー1の結合モチーフが最近、明らかにされている（Fridkis-Hareliら, 1999b）。これらの結合モチーフから固定した配列のポリペプチドが容易に提案され、HLA-DR分子のペプチド結合溝への結合が試験できる。このようなペプチドにはCop-1自身と類似の方法での作用が期待される。このような合成ペプチドの例はWO 005249に開示されている。
【００２５】
本明細書のこの項又は他の部分におけるいかなる文献の引用又は同定は、このような文献が本発明における先行技術として利用できることの許可として解釈されるべきものではない。
【００２６】
（発明の概要）
本発明は、神経系（NS）の傷害又は疾患の効果を緩和及び処置するために、神経再生を促進又は神経細胞変性を防止又は阻害する方法及び組成物に向けられている。本発明はその一部を、Cop-1に対して活性化されたT細胞が神経の再生を促進し、又は神経の保護を付与するという、出願人の予期しなかった発見に基づくものである。さらにそれはその一部を、Cop-1に対して活性化されたT細胞がグルタメートの毒性から神経細胞を保護するという本発明者らの予期しなかった発見に基づいている。本明細書で使用される「神経保護」の語は、NSにおける傷害又は疾患の変性作用の防止又は阻害を意味し、一次的リスク因子が除去又は減弱されたときでさえ持続する二次的な神経変性作用からの保護も包含する。これには、白質及び灰質両者の保護が包含される。最近まで免疫系は神経系の修復への参加から免疫細胞を除外していると考えられていた。全く驚くべきことに、Cop-1活性化T細胞が神経の再生の促進又はCNS若しくはPNSの傷害若しくは疾患により生じる損傷に続く二次的変性からの神経系組織の保護に使用できることが発見されたのである。
【００２７】
本明細書で用いられる「活性化されたT細胞」の語は、（i）Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドに暴露することによって活性化されたT細胞、及び（ii）このような活性化されたT細胞の子孫を包含する。
【００２８】
一実施態様においては、本発明は治療有効量のCop-1-特異的活性化T細胞を含む医薬組成物、及びCNS又はPNSにおいて神経の再生を促進又は神経細胞変性を防止若しくは阻害するために、このような組成物をNSの傷害又は疾患の作用を緩和するのに有効な量で用いる方法を提供する。本明細書で用いられる「Cop-1-特異的活性化T細胞」の語は、Cop-1若しくはCop-1-関連ペプチド又はポリペプチドに対する特異性を有する活性化T細胞を意味する。
【００２９】
Cop-1-特異的活性化T細胞は、神経の再生を促進するため、又は一次的NS傷害若しくは疾患に続く二次的な変性作用、又は多発性硬化症を除いて以下のセクション（3）に記載するような疾患若しくは状態によって生じる神経変性過程の作用を防止若しくは阻害するために使用される。非限定的な例には緑内障、卒中、虚血、銃撃、及び危険なスポーツにより生じる脳障害が包含される。Cop-1-特異的活性化T細胞は、ミエリン（白質）に関連する一次的及び二次的リスク因子に対する神経保護を提供するのみでなく、発見されたグルタミン酸毒性に対する保護作用からみて、神経細胞本体自身（灰質）に関連する一次的及び二次的リスク因子に対しても神経保護作用を提供する。したがって、Cop-1-特異的活性化T細胞は本発明の目的に有用であることが期待され、既知の免疫療法技術によっては示唆されなかったものである。
【００３０】
さらに、Cop-1はグルタミン酸毒性から保護するので、その活性は単にミエリンとの交叉反応性を介するものではない。それは、たとえば調節細胞又は調節物質の創製による調節活性を有するはずである。この調節活性から考えて、Cop-1ワクチン及びCop-1-特異的活性化T細胞にはまた、酸化的ストレス及び神経細胞に対する障害の他の原因によって生じる損傷から白質及び灰質を保護することも期待される。さらに、この調節活性から、本発明は先行技術に示唆されたような多発性硬化症からの神経細胞の保護のみならず、多発性硬化症以外の自己免疫疾患からの神経細胞の保護においても使用することができる。
【００３１】
本発明はまた、治療的有効量のCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドを含む医薬組成物、及び神経再生を促進するため、あるいはCNS若しくはPNSにおける神経細胞の変性を防止又は阻害するためにこのような組成物を使用する方法を提供する。この場合の量は、インビボ又はインビトロにおいてT細胞を活性化するのに有効な量であり、活性化されたT細胞はNSの障害若しくは疾患の作用を阻害又は緩和する。
【００３２】
本発明の実施に際しては、Cop-1-特異的活性化T細胞の投与を含む傷害又は疾患の作用を緩和又は処置するための治療はCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドと任意に組み合わせて行うことができる。
【００３３】
さらに、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド抗原の経口投与はアジュバント中で投与されたCop-1とのプライミング後の神経保護に有効である。すなわち経口的に投与されたCop-1は、このようなCop-1を好ましくはアジュバント中で一次的に活性化したのち、T細胞の活性を増大させ、傷害直後に重要なT細胞応答を構築するために使用することができる。
【００３４】
他の実施態様においては、後日必要に応じて個体の神経保護処置のためにCop-1感作T細胞を保存するために、細胞バンクを確立することができる。この場合、自己由来のT細胞は個体から得られる。別法として同種異系又はセミ同種異系のT細胞は、最も一般的なMHC-クラスII型それぞれのT細胞のバンクが存在するように保存され得る。もし個体が、傷害について処置されるなら、好ましくは自己の保存T細胞が使用されるが、もし自己T細胞が利用できないときは、患者と同じMHC II型分子を共有する細胞を使用すべきであり、これらはその個体内で動作可能であることが期待される。細胞はCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドに暴露したのちの活性化状態で保存されるのが好ましい。しかしながら細胞は静止状態で保存し、使用のためにそれらを解凍して調製してから、活性化することもできる。バンクの細胞系は凍結保存することが好ましい。細胞系は本技術分野で既知の任意の方法により調製される。細胞を解凍したならば、非生存細胞を除去するため、注射前に培養するのが好ましい。この培養の間に、Cop-1抗原又はペプチドを最初の活性化に使用したように活性化又は再活性化することができる。別法として、活性化はマイトジェンたとえばフィトヘマグルチニン（PHA）又はコンカナバリンAの存在下に（前者が好ましい）培養することにより達成することができる。これは細胞をさらに高い活性化状態に置くことになる。細胞を培養するために要する数日は、本発明による処置が傷害後1週又はそれ以上までの任意の時間に開始され、それでなお有効であることから、患者に有害であることはない。別法として、時間が重要な場合には、保存細胞を解凍後直ちに投与することもできる。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明の詳細な説明は単に説明の容易さから、以下のサブセクション：（1）Cop-1特異的な活性化されたT細胞；（2）Cop-1及びCop-1-関連ペプチド及びポリペプチド；（3）治療的使用；（4）製剤及び投与；（5）Tリンパ球の自己細胞バンクの確立；（6）例；及び（7）結果の考察に分割する。
【００３６】
（1）Cop-1特異的活性化T細胞
Cop-1特異的活性化T細胞（ATC）は、セクション（2）に定義するようにCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドの存在下に活性化されたT細胞である。このようなATCは、NSの変性を生じるCNS又はPNSの傷害又は疾患の作用を処置すなわち緩和又は阻害するために、あるいはNSとくにCNSにおける再生の促進に使用することができる。さらに、急性であれ慢性であれ、すべての神経細胞変性疾患においてグルタメートはメディエーターであることから、このようなATCは、グルタメートの毒性からのCNS細胞の保護又はグルタメートの毒性によって発症又は悪化した疾患又は状態たとえば異常な眼内圧の処置に使用することができる。
【００３７】
Cop-1特異的活性化T細胞は、好ましくは自己細胞であり、最も好ましくはCD4及び／又はCD8表現型であるが、また関連ドナー、たとえば兄弟姉妹、両親、子供又はHLAがマッチした、部分的にマッチした、セミ同種異系の若しくは完全に同種異系のドナーからの細胞であってもよい。
【００３８】
対象から単離された自己T細胞の使用に加えて、本発明はまた神経保護のために、セミ同種異系T細胞の使用を包含する。これらのT細胞は短期又は長期系として調製され、中枢神経系に対する傷害に冒され、T細胞による神経保護を必要とする対象にその直後、又は1〜3日間培養したのちに投与するため慣用の凍結保存法によって保存される。
【００３９】
セミ同種異系T細胞の使用は、APCが、MHC分子、クラスI又はクラスIIであって、それに対し特異的な応答性T細胞集団が限定されているものを、そのT細胞により認識される抗原エピトープとともに発現することを条件として、T細胞が異種抗原提示細胞（APC）により提示される特異的な抗原エピトープを認識できるという事実に基づく。したがって、対象のMHC分子、好ましくはHLA-DR若しくはHLA-DQ又は他のHLA分子の少なくとも一つの対立遺伝子産物を認識し、Cop-1エピトープに特異的であるT細胞のセミ同種異系集団は、対象のNS傷害領域中のCop-1と交叉反応する抗原を認識し、必要とされる神経保護作用を生じる。接着分子、白血球遊走分子、及びT細胞の傷害領域への移動、そこでの、蓄積及び活性化を受けるのに必要な補助分子には多型は全くないか、又はほとんどない。したがって、セミ同種異系のT細胞は神経保護を必要とするCNS部位に移動し、蓄積し、活性化されて所望の作用を産生することができる。
【００４０】
セミ同種異系のT細胞は対象の免疫系によって拒絶されるが、その拒絶の発生までには約2週間を要することが知られている。したがって、セミ同種異系のT細胞は、神経保護作用を発揮するのに必要な機会の2週間のウインドウを有することになる。2週後、セミ同種異系T細胞は対象の生体から拒絶されるが、その拒絶は、対象から異種T細胞を除去し、活性化されたT細胞による望ましくない結果を防止するので有利である。このようにセミ同種異系T細胞は重要な安全因子を提供し、好ましい実施態様である。
【００４１】
比較的少数のHLAクラスII分子が集団中の大部分の個体によって共有されていることが知られている。たとえば、ユダヤ人の集団では約50％がHLA-DR5遺伝子を発現する。すなわち、HLA-DR5に限定されるCop-1エピトープに反応性の特異的T細胞のバンクはその集団の50％に有用な筈である。全集団は、数種の他の一般的なHLA分子、たとえばDR1, DR4, DR2等に制限された少数の追加のT細胞系により本質的にカバーされる。すなわち、均一なT細胞系の機能的なバンクを、与えられた集団内のほとんどすべての個体に直ちに使用するために調製及び保存することができる。このようなT細胞のバンクは、処置機会の開かれたウインドウの間に神経保護を必要とする対象から十分な数の特異的T細胞を得ることのいかなる技術的な問題をも克服するものである。セミ同種異系T細胞はそれらの神経保護の役割を遂行したのちには安全に拒絶される。本発明のこの態様は矛盾なく、本明細書に記載のような自己T細胞の使用に追加される。
【００４２】
Cop-1-特異的な活性化T細胞は、弱毒化Cop-1-特異的活性化T細胞も使用できるが、非弱毒化のものが好ましい。T細胞は本技術分野において周知の方法、たとえばそれらに限定されるものではないが、γ-照射たとえば1.5〜10.0 Rad（Ben-Nunら, 1981b；Ben-Nunら, 1982）及び／又は、たとえば米国特許4,996,194（Cohenら）に記載された加圧処理を用いて弱毒化することができる。好ましい実施態様においては、Cop-1-特異的な活性化T細胞は以下に記載のようにして単離することができる。T細胞は本技術分野で既知の方法（Morら, 1995）によって単離精製することができる。例示的な例についてはセクション（6）例1を参照されたい。
【００４３】
Cop-1を認識する対象の循環T細胞は既知の操作を用いて単離、増殖することができる。Cop-1-特異的な活性化T細胞を得るには、T細胞を単離し、Cop-1-特異的ATCをついで既知の操作（Burnsら, 1983；Petteら, 1990；Martinら, 1990；Schluesenerら, 1985；Suruhan-Dires Keneliら, 1993；これらは引用により本明細書に導入される）によって増殖させる。
【００４４】
T細胞のエキソビボ活性化の間に、T細胞は少なくとも1種の増殖促進因子が添加された媒質中でそれらを培養することによって活性化することができる。この目的に適当な増殖促進因子は、これらに限定されるものではないが、サイトカインたとえば腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン2（IL-2）及びインターロイキン4（IL-4）がある。
【００４５】
一実施態様においては、活性化T細胞は内因的にNSにおける傷害又は疾患の作用を緩和する物質を産生する。
【００４６】
他の実施態様においては、活性化T細胞はたとえば、それらに限定されるものではないが、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）、神経栄養因子（NGF）、神経栄養因子-3（NT-3）、神経栄養因子4/5（NT-4/5）、脳由来神経栄養因子（BDNF）；インターフェロン-γ（INF- γ）及びインターロイキン-6（IL-6）を包含する他の細胞を刺激する物質を内因的に産生する。この場合、他の細胞は直接又は間接に傷害又は疾患の作用を緩和する。
【００４７】
インビトロでのそれらの増殖後、T細胞は哺乳動物対象に投与される。好ましい実施態様においては、T細胞はヒト対象に投与される。T細胞の増殖はCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドを使用して実施するのが好ましい。
【００４８】
Cop-1-活性化T細胞は直ちに使用することもできるし、又は以下に記載するようにたとえば凍結保存法により後の使用のために保存することもできる。Cop-1-特異的な活性化T細胞はまた、以前に凍結保存して置いたT細胞を用いて得ることができる。すなわち細胞を解凍したのち、T細胞をCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドと、最良には末梢血リンパ球（PBL）とともにインキュベートしてCop-1-特異的ATCの調製物を得る。
【００４９】
本技術分野の熟練者には明らかなように、T細胞は培養前又は培養後にたとえば凍結保存法によって保存することができる。
【００５０】
使用できる凍結保存剤には、それらに限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド（DMSO；Levelockら, 1959；Ashwood-Smith, 1961）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Rinfret, 1960）、ポリエチレングリコール（Sloviterら, 1962）、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、i-エリトリトール、D-リビトール、D-マンニトール（Roweら, 1962）、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース、塩化コリン（Roweら, 1962）、アミノ酸（Phan The Tranら, 1960a）、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート（Lovelock, 1954）、無機塩（Phan The Tranら, 1960b；Phan The Tranら）、ならびにヒドロキシエチルデンプンやヒト血清アルブミンと混合したDMSO（Zaroullaら, 1980）を使用することができる。
【００５１】
制御された冷却速度が重要である。凍結冷却剤（Rapatzら, 1968）及び細胞型が異なると至適冷却速度も変動する。たとえば細胞の生存及びそれらの移植能に対する冷却速度の影響についてはRoweら（1962b）；Rowe（1966）；Lewisら（1967）及びMazur（1970）参照。水が氷へと変わる融合相の熱は最小限であるべきである。冷却操作は、たとえばプログラム可能な凍結デバイス又はメタノール浴操作を用いて実施することができる。
【００５２】
プログラム可能な凍結装置では、至適冷却速度を決定することが可能であり、標準的で再現可能な冷却が容易になる。プログラム可能な、制御された速度でのフリーザーたとえばCryomed又はPlanarは凍結計画を所望の冷却速度曲線に合わせることを可能にする。
【００５３】
完全に凍結された後、直ちに細胞は長期の凍結保存容器に移される。一実施態様においては、サンプルを機械フリーザー中で、たとえば温度を約−80℃又は約−20℃に維持するフリーザー中で凍結保存することができる。好ましい実施態様においては、サンプルは液体窒素（−196℃）又はその蒸気中で凍結保存し得る。このような保存によれば、超低真空で内部が超断熱された大きいThermos型容器に類似の高度に効率のよい液体窒素冷凍庫の利用が可能になり、熱の漏出及び窒素のロスは最低限に抑えられる。
【００５４】
取扱い、凍結保存及びT細胞の長期保存に対する考慮及び操作については以下の文献に見出すことができる：Gorin (1986) 及びInternational Atomic Energy Agency（1969）。これらは引用により本明細書に導入される。
【００５５】
生存細胞の凍結保存に関する他の方法又はそれらの変法としては、たとえば冷却金属鏡技術が利用可能であり、推奨される。Liveseyら（1987）；Linnerら（1986）；米国特許4,199,022（Senkenら）；米国特許3,753,357（Schwartz）；及び米国特許4,559,298（Fahy）参照。
【００５６】
凍結された細胞は好ましくは急速に（たとえば、37〜47℃に維持した水浴中で）で解凍し、解凍したならば直ちに冷却する。解凍時に細胞の凝集を防止するため細胞を処理することが望ましい。凝集の防止には、様々な方法を使用することができる。それらに限定されるものではないが、凍結の前若しくは後にDNアーゼ（Spitzerら, 1980）、低分子量デキストラン及びシトレート、シトレート、ヒドロキシエチルデンプン（Stiffら, 1983）、又は酸性シトレートデキストロース（Zaroulisら, 1980）等の添加が包含される。
【００５７】
凍結剤がヒトに対して有毒である場合には、解凍されたT細胞を治療的に使用する前に除去する必要がある。凍結剤を除去する方法の一つには、無毒な濃度までの希釈がある。
【００５８】
凍結されたT細胞が解凍され、回収されたならば、非凍結T細胞に関して記載したように神経細胞の再生の促進に使用される。解凍されたならばT細胞は、それらが凍結前に活性化されていた場合、直ちに使用される。しかしながら、解凍した細胞は患者に注射する前に、非生存細胞を除去するために培養することが好ましい。さらに、凍結細胞が静止T細胞である場合には約1〜3日の期間にわたるこの培養過程で、細胞が活性化されるように、また凍結前にそれらが活性化されていた場合にはさらに高度な活性化を達成するために、適当な活性化剤を添加することができる。通常、投与前にこのような培養工程を行う時間があるので、T細胞は傷害後1週、多分さらにもっとのちに投与することができ、それらは神経再生及び神経保護作用を維持することができる。
【００５９】
（2）Cop-1ならびにCop-1-関連ペプチド及びポリペプチド
Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド抗原又はその誘導体を含有する医薬組成物は、NSの変性を生じる傷害若しくは疾患の作用の防止若しくは阻害のため、NSとくにCNSにおける神経の再生を促進するため、CNS細胞をグルタメートの毒性から保護するため、又はグルタメートの毒性がその原因若しくはその悪化の原因となる傷害若しくは疾患の処置のために使用することができる。さらにCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド抗原又はその誘導体は、T細胞のインビボ又はインビトロ活性化に使用することができる。一実施態様においては、神経再生の促進又はCNS若しくはPNSの傷害若しくは疾患の作用を防止若しくは阻害するための方法であって、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド抗原又はその誘導体を哺乳動物に投与することを含み、該Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド抗原又はその誘導体はインビボでT細胞を活性化して、CNS又はPNSの傷害又は疾患部位に蓄積されるT細胞集団を産生させる。他の実施態様においては、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド抗原又はその誘導体は、CNSをグルタメートの毒性から保護する方法又はグルタメートの毒性がその原因若しくは増悪の原因になった傷害若しくは疾患の処置方法において投与される。
【００６０】
本発明に使用される組成物は、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドとすることができる。本発明のこの目的では、「Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチド」にはミエリン塩基性タンパク質（MBP）と機能的に交叉反応し、抗原の提示に際しMHCクラスII上でMBPと競合できる任意のペプチド又はポリペプチド（ランダムコポリマーが包含される）が包含されるよう意図されている。
【００６１】
組成物は、陽性の電荷を有するアミノ酸、たとえばリジン及びアルギニン、の適当量を、陰性の電荷を有するアミノ酸、たとえばグルタミン酸又はアスパラギン酸、（より少量が好ましい）、任意に充填剤としての役を果たす電気的に中性のアミノ酸、たとえばアラニン又はグリシン、及び任意に、このコポリマーに免疫学的性質を付与するのに適合するアミノ酸、たとえばチロシン又はトリプトファンのような芳香族アミノ酸を組み合わせて含むランダムコポリマーとすることができる。このような組成物は、WO 005250に開示された組成物のいずれもが包含される。この内容は全体を引用により本明細書に導入する。
【００６２】
さらに特定すれば、本発明に使用することができる組成物は、
a）リジン及びアルギニン；
b）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
c）アラニン及びグリシン；及び
d）チロシン及びトリプトファン
の群の少なくとも3つのそれぞれから選択される1個のアミノ酸を含むランダムコポリマーからなる群から選択される少なくとも一種のコポリマーを含む。
【００６３】
本発明に使用されるコポリマーは、L- 若しくはD-アミノ酸又はそれらの混合物から構成される。本技術分野の熟練者には周知のように、L-アミノ酸は大部分の天然タンパク質中に存在する。しかしながら、D-アミノ酸は市販品を入手することが可能であり、本発明のターポリマー及び他のコポリマーを作成するために用いられるアミノ酸の一部又はすべてを置換することができる。本発明はD-及びL-アミノ酸の両者を含有するコポリマー、ならびに主としてL-又はD-アミノ酸のいずれかからなるコポリマーを意図するものである。
【００６４】
本発明の一実施態様においては、コポリマーは4つの異なるアミノ酸を含有し、それぞれ群（a）〜（d）の異なる1つからのものである。この実施態様における好ましいコポリマーはアラニン、グルタミン酸、リジン及びチロシンの組み合わせを含み、全体の正味電荷は陽性で、分子量は約2,000〜約40,000ダルトン、好ましくは約2,000〜約13,000ダルトンである。最も好ましい例は平均分子量約4,700〜約13,000ダルトンのコポリマー1（Cop-1）である。コポリマー1の好ましい分子量範囲及び好ましい製造方法は米国特許5,800,808に記載されている。その内容は全体が引用により本明細書に導入される。これは例示のために示したのみであり、組成物は上述の一般的基準に合致する限り、構成成分に関して及び構成成分の相対的な比率に関しての両者で変動することは自明である。すなわち、コポリマーは、長さが約15〜約100, 好ましくは約40〜約80個のアミノ酸のポリペプチドとすることができる。
【００６５】
他の実施態様においては、コポリマーはそれぞれ群（a）〜（d）のうちの3つの群の異なる1つからの異なる3つのアミノ酸を含有する。これらのコポリマーは、本明細書においてはターポリマーと呼ぶ。
【００６６】
一実施態様においては、本発明に使用されるターポリマーはチロシン、アラニン及びリジンを含有し、本明細書中、以下YAKと呼ぶ。これらターポリマーのアミノ酸の平均モル分画は変動させることができる。たとえば、チロシンは約0.005〜約0.250のモル分画で存在することができ；アラニンは約0.3〜約0.6のモル分画で存在することができ；リジンは約0.1〜約0.5のモル分画で存在することができる。平均分子量は約2,000〜約40,000ダルトン、好ましくは約3,000〜約35,000ダルトンである。さらに好ましい実施態様では、平均分子量は約5,000〜約25,000ダルトンである。リジンはアルギニンで、アラニンはグリシンで、及び／又はチロシンはトリプトファンで置換することが可能である。
【００６７】
他の実施態様においては、本発明に使用されるターポリマーはチロシン、グルタミン酸及びリジンを含有し、本明細書中、以下YEKと呼ぶ。これらターポリマーのアミノ酸の平均モル分画は変動させることができる。たとえば、グルタミン酸は約0.005〜約0.3000のモル分画で存在させることができ、チロシンは約0.005〜約0.250のモル分画で存在させることができ；リジンは約0.3〜約0.7のモル分画で存在させることができる。平均分子量は2,000〜約40,000ダルトン、好ましくは約3,000〜約35,000ダルトンである。さらに好ましい実施態様においては、平均分子量は約5,000〜約25,000ダルトンである。グルタミン酸はアスパラギン酸で、リジンはアルギニンで、及び／又はチロシンはトリプトファンで置換することが可能である。
【００６８】
他の実施態様においては、本発明に使用されるターポリマーは、リジン、グルタミン酸及びアラニンを含有し、本明細書中、以下KEAと呼ぶ。これらポリペプチドのアミノ酸の平均モル分画は変動させることができる。たとえば、グルタミン酸は約0.005〜約0.300のモル分画で存在させることができ；アラニンは約0.005〜約0.600のモル分画で存在させることができ；リジンは約0.2〜約0.7のモル分画で存在させることができる。平均分子量は2,000〜40,000ダルトン、好ましくは約3,000〜35,000ダルトンである。さらに好ましい実施態様においては、平均分子量は約5,000〜約25,000ダルトンである。グルタミン酸はアスパラギン酸で、アラニンはグリシンで及び／又はリジンはアルギニンに置換することが可能である。
【００６９】
他の実施態様においては、本発明に使用されるターポリマーは、チロシン、グルタミン酸及びアラニンを含有し、本明細書中以下YEAと呼ぶ。これらのポリペプチドにおけるアミノ酸の平均モル分画は変動させることができる。たとえば、チロシンは約0.005〜約0.250のモル分画で存在させることができ；グルタミン酸は約0.005〜約0.300のモル分画で存在させることができ；アラニンは約0.005〜約0.800のモル分画で存在させることができる。平均分子量は2,000〜約40,000ダルトン、好ましくは約3,000〜約35,000ダルトンである。さらに好ましい実施態様においては、平均分子量は約5,000〜約25,000ダルトンである。チロシンはトリプトファンで、グルタミン酸はアスパラギン酸で、及び／又はアラニンはグリシンで置換することが可能である
【００７０】
さらに好ましい実施態様においては、ターポリマーのアミノ酸モル分画はコポリマー1に関して好ましいものとほぼ等しい。コポリマー1におけるアミノ酸のモル分画は、グルタミン酸約0.14, アラニン約0.43, チロシン約0.10及びリジン約0.34である。コポリマー1の最も好ましい平均分子量は約5,000〜約9,000ダルトンである。本明細書に開示された有用性のためのコポリマー1の活性は以下の1又は2以上の置換、すなわちグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、アラニンのグリシンへの置換、リジンのアルギニンへの置換、及びチロシンのトリプトファンへの置換が行われても維持されることが期待される。
【００７１】
グルタミン酸、アラニン及びチロシンのさらに好ましいターポリマー若しくはYEAのモノマーのモル比は約0.21：約0.65：約0.14である。
【００７２】
さらに好ましいグルタミン酸、アラニン及びリジンのターポリマー若しくはKEAのモノマーのモル比は約0.15：約0.48：約0.36である。
【００７３】
さらに好ましいグルタミン酸、チロシン及びリジンのターポリマー若しくはYEKのモノマーのモル比は約0.26：約0.16：約0.58である。
【００７４】
さらに好ましいチロシン、アラニン及びリジンのターポリマー若しくはYAKのモノマーのモル比は約0.10：約0.54：約0.35である。
【００７５】
ターポリマーは、本技術分野の熟練者に利用できる任意の操作によって調製することができる。たとえば、ターポリマーは、溶液中所望のアミノ酸モル比を用いて、又は固相合成操作により、縮合条件下に調製することができる。縮合条件には、適当な温度、pH, 及び1つのアミノ酸のカルボキシル基を他のアミノ酸のアミノ基と縮合させてペプチド結合を形成させる溶媒条件が包含される。縮合剤たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドはペプチド結合の形成を促進するために使用することができる。官能基、たとえば側鎖残基及び一部のアミノ又はカルボキシル基、を望ましくない副反応に対して保護するためには、遮断基を使用することができる。
【００７６】
たとえば、チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-ε-トリフルオロアセチルリジンのN-カルボキシ無水物を、無水ジオキサン中イニシエーターとしてジエチルアミンの存在下、常温において重合させる方法は米国特許3,849,650に開示されている。グルタミン酸のγ-カルボキシル基は氷酢酸中、臭化水素によって脱遮断することができる。トリフルオロアセチル基は、リジンから1モルのピペリジンにより除去される。本技術分野の熟練者であれば、この方法は所望のアミノ酸、すなわちコポリマー1中4つのアミノ酸の3つを含有するペプチド及びポリペプチドを、グルタミン酸、アラニン、チロシン又はリジンのいずれか1種に関する反応を選択的に排除することにより、製造できるように調整することが可能であることは容易に理解されよう。本願の目的において「常温」及び「室温」の語は、約20〜約26℃の範囲の温度を意味する。
【００７７】
ターポリマーの分子量はポリペプチドの合成時に又はターポリマーが製造されたのちに調整することができる。ポリペプチドの合成時に分子量を調整するためには、合成条件又はアミノ酸の量を、ポリペプチドが所望の長さにほぼ到達した場合に合成が停止するように調整する。合成後、所望の分子量を有するポリペプチドは、利用可能ないかなるサイズ選択操作によっても、たとえば分子量サイジングカラム又はゲル上でのポリペプチドのクロマトグラフィー、及び所望の分子量範囲の収集によって得ることができる。本発明のポリペプチドをまた、たとえば酸又は酵素による加水分解により、部分的に加水分解して、高分子量種を除去し、ついで酸又は酵素を除くことにより精製することもできる。
【００７８】
一実施態様においては、所望の分子量を有するターポリマーは保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させて所望の分子量プロフィルを有するトリフルオロアセチル-ポリペプチドを形成させることを包含する方法によって調製できる。この反応は1又は2以上の試験反応によって予め定められた時間の間、及び温度で実施される。試験反応の間、時間及び温度を変動させ、試験ポリペプチドの与えられたバッチにおける分子量範囲が決定される。ポリペプチドのバッチで至適な分子量範囲を提供する試験条件をバッチに使用する。すなわち、所望の分子量プロフィルを有するトリフルオロアセチル-ポリペプチドが、保護されたポリペプチドを試験反応で予め決定された時間の間及び温度において臭化水素酸と反応させることを包含する方法により製造することができる。所望の分子量プロフィルを有するトリフルオロアセチル-ポリペプチドをついで、水性ピペリジン溶液で処理して、所望の分子量を有する低毒性ポリペプチドを形成させる。
【００７９】
好ましい実施態様においては、与えられたバッチからの保護されたポリペプチドの試験サンプルを臭化水素酸と約10〜50時間約20〜28℃の温度で反応させる。そのバッチについての最善の条件を、数回の試験反応の試行によって決定する。たとえば、一実施態様においては、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と約17時間、約26℃の温度で反応させる。
【００８０】
Cop-1のMS-関連HLA-DR分子への結合モチーフは既知（Fridkis-Hareliら,
1999b）であるから、固定された配列のポリペプチドは容易に調製され、Fridkis- Hareliら（1999b）の文献に記載されたように、HLA-DR分子のペプチドの結合溝への結合について試験することができる。このようなペプチドの例はWO 005249に開示されたペプチドであり、その全内容は引用により本明細書に導入される。上記出願にとくに開示された32個のペプチドを以下の表1に掲げる。このようなペプチド及び他の類似のペプチドはCop-1と同様の活性を有することが期待される。しかしながら、これは本発明に従って、それらのT細胞を活性化する能力を試験することによって容易に決定することができる。このすべては過度の実験を行わないで実施できる。このようなペプチド及び他の類似のペプチドは、Cop-1-関連ペプチド又はポリペプチドの定義内であるとみなされ、それらの使用は本発明の部分であると考えられる。
表1
配列番号                ペプチド配列
1                  AAAYAAAAAAKAAAA
2                  AEKYAAAAAAKAAAA
3                  AKEYAAAAAAKAAAA
4                  AKKYAAAAAAKAAAA
5                  AEAYAAAAAAKAAAA
6                  KEAYAAAAAAKAAAA
7                  AEEYAAAAAAKAAAA
8                  AAEYAAAAAAKAAAA
9                  EKAYAAAAAAKAAAA
10                  AAKYEAAAAAKAAAA
11                  AAKYAEAAAAKAAAA
12                  EAAYAAAAAAKAAAA
13                  EKKYAAAAAAKAAAA
14                  EAKYAAAAAAKAAAA
15                  AEKYAAAAAAAAAAA
16                  AKEYAAAAAAAAAAA
17                  AKKYEAAAAAAAAAA
18                  AKKYAEAAAAAAAAA
19                  AEAYKAAAAAAAAAA
20                  KEAYAAAAAAAAAAA
21                  AEEYKAAAAAAAAAA
22                  AAEYKAAAAAAAAAA
23                  EKAYAAAAAAAAAAA
24                  AAKYEAAAAAAAAAA
25                  AAKYAEAAAAAAAAA
26                  EKKYAAAAAAAAAAA
27                  EAKYAAAAAAAAAAA
28                  AEYAKAAAAAAAAAA
29                  AEKAYAAAAAAAAAA
30                  EKYAAAAAAAAAAAA
31                  AYKAEAAAAAAAAAA
32                  AKYAEAAAAAAAAAA
【００８１】
本発明に使用される好ましいコポリマーは、本明細書においてはCop-1とも呼ぶコポリマー1である。コポリマー1は数カ国でCOPAXONE（商標）、Glatiramer acetateの商品名で多発性硬化症（MS）の処置に承認されている。COPAXONE（商標）はTeva Pharmaceutical Ltd, Petah Tikva, Israelの商標である。数回の臨床試験によって、コポリマー1は高々注射部位に軽度の反応を生じるわずかな副作用反応のみで良好に寛容されることが証明されている（Johnsonら, 1995）。
【００８２】
（3）治療的使用
セクション（1）〜（2）に記載の組成物は神経再生の促進、又は一次的NS傷害、たとえば閉鎖された頭部傷害及び鈍的外傷、たとえば危険なスポーツへの参加によって生じる外傷、穿通性外傷、たとえば銃撃による外傷、出血性卒中、虚血性卒中、緑内障、脳虚血、又は腫瘍切除のような手術によって生じた傷害に続く二次的な変性の防止若しくは阻害に使用できる。さらにこのような組成物は変性過程たとえば灰質若しくは白質のいずれか（又は両者）に、様々な疾患又は障害、たとえばそれらに限定されるものではないが、糖尿病性ニューロパシー、老人痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、てんかん重積状態、非動脈性視神経ニューロパシー、椎骨間板ヘルニア、ビタミン欠乏、プリオン病たとえばクロイツヘルト−ヤコブ病、手根トンネル症候群、様々な疾患たとえばそれらに限定されるものではないが、尿毒症、多尿、低血糖を含む上記様々な疾患に伴う末梢性ニューロパシー、シェーグレン−ラルソン症候群、急性知覚ニューロパシー、慢性運動失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性赤血球増多症、IgA及びIgG高グロブリン血症、様々な薬剤（たとえばメトロニダゾル）及びトキシン（たとえば、アルコール又は有機リン酸塩）の合併症、シャルコー−マリー−ツース病、毛細血管拡張性運動失調、フリートライヒ運動失調、アミロイド多発性神経障害、副腎脊髄神経傷害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリー病、リポ蛋白血症等を包含する様々な疾患又は障害の結果として生じる変性を起こす疾患の作用を緩和するために使用することができる。本発明のグルタメート保護の局面に関する所見に照らすと、本発明により処置できる他の臨床状態には、てんかん、貧血、不安、疼痛過敏、精神病、けいれん、眼内圧の異常な上昇、酸化的ストレス、及びオピエート耐性及び依存が包含される。さらに、本発明のグルタメート保護の局面、すなわちグルタメートの毒性により生じるか又は増悪する傷害又は疾患の処置には、術後処置、たとえばCNSからの腫瘍の除去及びCNSに対する他の形態の手術が包含される。
【００８３】
Cop-1免疫処置が驚くべきことにグルタメートの毒性に対する保護に有用であることが見出されたという事実を顧みれば、本発明によるCop-1処置又はCop-1-関連T細胞処置は、上掲の状態の処置において、ミエリンが冒された後期のみならず、グルタメートのレベルを毒性レベルまで上昇させる因子によって神経細胞が攻撃される初期にも有効であることが期待される。したがって、本発明は、いかなる徴候、すなわちたとえば虚血性卒中、アルツハイマー病等の初期段階を含む、グルタメートレベルの上昇により生じるか又は増悪する慢性又は急性の神経変性に有用である。
【００８４】
さらに、このグルタメート毒性の保護は、Cop-1の役割がミエリンとの交叉反応に限定されるものではないことを確立する。それはまた、調節性細胞又は調節性物質を創製することによる調節活性を持つにちがいない。この調節活性から考えて、Cop-1ワクチン及びCop-1特異的活性化T細胞は、酸化的ストレス及び神経細胞に対する他の障害の原因によって起こる障害から白質及び灰質を保護することも期待される。この調節活性により本発明はさらに、先行技術によって示唆されている多発性硬化症のみならず、多発性硬化症以外の自己免疫疾患からも神経細胞を保護するために使用することができる。
【００８５】
好ましい実施態様においては、活性化T細胞又は本発明のCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドを含む免疫組成物は、神経再生の促進、又は二次的な神経変性の防止若しくは阻害が示される疾患又は障害（ただし多発性硬化症及び新生物を除く）の処置に使用される。好ましい実施態様においては、本発明の組成物はヒト対象に投与される。
【００８６】
以上開示されたように、Cop-1は多発性硬化症患者においてミエリン抗原に対する自己免疫T細胞の抑制又は脱活性化を達成する薬物として使用されてきた。その目的では、Cop-1はアジュバントなしで毎日皮下注射によって投与されている。先行技術ではまた、Cop-1の多発性硬化症患者に対する経口経路による投与は、ミエリン抗原に対する自己免疫T細胞応答の抑制の誘導も目的とすることが開示されている。多発性硬化症の処置の先行技術でのこれらのCop-1の使用は本発明の主題である神経保護のためのCop-1の使用とは基本的に異なっていることに注意されたい。第一に本発明者らの実験室から出願されたWO99/60021に示すように、神経保護はミエリン抗原に特異的に向けられた自己免疫T細胞の活性化によって仲介される。したがって、T細胞の自己免疫性を抑制するために設計された薬物、Cop-1が特異的な抗-ミエリンT細胞自己免疫性の活性化を必要とする作用を有することは驚くべきことである。第二に、本発明による神経保護のためのCop-1の使用は抗-Cop １T細胞の投与に基づくものであるが、それはCop-1が多発性硬化症の処置のために使用される方法ではない。第三に、好ましい実施態様においては、本発明は多発性硬化症の処置又は他の治療目的で以前には使用されたことがないタイプのCop-1製剤である、アジュバントたとえば不完全フロイトアジュバント又は完全フロイトアジュバント中でのCop-1の使用を意図するものである。本発明においては神経保護のためにCop-1の経口投与が意図されるが、これは常にCop-1を、好ましくはアジュバント中で一次的に活性化したのちに行われる。すなわち、経口的なCop-1は、Cop-1で一次的に活性化したのちにT細胞の活性を増強するために使用することができる。
【００８７】
したがって、組成物及びその作用様式ならびに神経保護は実用的にも概念的にも新規である。ミエリン抗原に対するT細胞の反応性を抑制又は脱活性化するためのCop-1の使用に通暁している本技術分野の通常の熟練者にも、ミエリン抗原に特異的に向けられたT細胞を活性化するために特異的に設計された方法で、神経保護におけるそれらの有益な作用（自己免疫疾患によって生じる変性過程を緩和することを含む）のためにCop-1を使用することは自明ではなかった。
【００８８】
Cop-1-活性化T細胞はまた、免疫治療方法を使用しないで、新生物により引き起こされる変性過程を緩和するためにも使用できる。Cop-1で活性化されたT細胞は神経変性部位に蓄積し、この変性の阻害が促進される。
【００８９】
（4）製剤及び投与
本発明に使用するための医薬組成物は、1又は2種以上の生理学的に許容される担体又は賦形剤を用いて慣用方法で製剤化される。担体（単数又は複数）は組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。
【００９０】
以下の担体、投与様式、剤形等の例示は、そのなかから本発明での使用のために選択される担体、投与様式、剤形等の既知の可能性として掲げられるものである。しかしながら、本技術分野の通常の熟練者には理解されるように、与えられた製剤及び選択された投与様式により所望の結果が達成されることを決定するために、それはまず試験されなければならない。したがって、たとえば有効成分がCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドである場合、その特定の製剤及び投与様式は、その有効成分がインビボにおいてワクチンとして、T細胞がそれに対して活性化するように、働くことを可能にするものでなければならない。もしそのような免疫応答が得られない場合には、その特定の製剤及び投与様式は本発明において使用すべきではない。
【００９１】
同様に、有効成分が活性化T細胞である場合には特定の製剤及び投与様式は、活性化されたT細胞が本発明により、CNSにおける傷害部位に集まれるように活性な状態で血流中に到達できることを確実にするため、試験しなければならない。
【００９２】
「担体」の語は、治療薬がそれらとともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを意味する。医薬組成物における担体は、結合剤たとえば微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドン又はポビドン）、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトース又はラクトースモノキドレート（monochydrate）；崩壊剤たとえばアルギン酸、トーモロコシデンプン等；滑沢剤又は界面活性剤たとえばステアリン酸マグネシウム、又はラウリル硫酸ナトリウム；グライダント（glidant）たとえばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤たとえばスクロース又はサッカリン；及び／又は賦香剤たとえばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジフレーバーを含んでもよい。
【００９３】
投与方法には、それらに限定されるものではないが、非経口投与たとえば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（たとえば、経口、鼻内、バッカル、膣内、直腸内、眼内）、胸膜内、局所的及び皮内経路が包含される。投与は全身的又は局所的とすることができる。
【００９４】
経口投与のためには、医薬組成物は液体剤形たとえば溶液、シロップ若しくは懸濁液等の液体型でもよく、又は使用前に水若しくは他の適当なビヒクルで再構築する医薬製品として提供され得る。このような液体製剤は慣用方法により、医薬的に許容される添加物たとえば懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水添食用油）；乳化剤（たとえば、レシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえば、アーモンド油、油状エステル又は分溜植物油）；ならびに防腐剤（たとえば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピルエステル又はソルビン酸）と共に調製される。医薬組成物は慣用方法により医薬的に許容される賦形剤たとえば結合剤（たとえば、予めゼラチン化したトーモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば、ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（たとえば、馬鈴薯デンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製される錠剤又はカプセルの形態とすることもできる。錠剤は本技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。
【００９５】
経口投与用の製剤は活性化合物の制御された放出を与えるように適当に製剤化することができる。
【００９６】
バッカル投与のためには、組成物は慣用方法で製剤化した錠剤又はロゼンジの形態とすることができる。
【００９７】
組成物は注射たとえばボーラス注射又は連続的な輸液による非経口投与用に製剤化することもできる。注射用の製剤は単位投与量剤形として、添加した防腐剤とともにたとえばアンプル又は多重容器中に提供することができる。組成物は油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液又は乳化液のような形態とすることができ、処方剤、たとえば懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤を含有し得る。別法として活性成分は適当なビヒクルたとえば滅菌された、パイロジェンを含まない水で使用前に構築するための粉末剤形としてもよい。
【００９８】
組成物はまた、たとえば慣用の坐剤基剤たとえばカカオ脂又は他のグリセライドを含有する坐剤又は停留浣腸剤のような直腸用組成物とすることもできる。
【００９９】
吸入による投与のためには、本発明による使用のための組成物は、適当な噴射剤たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当な気体を用いて加圧パック又はネブライザーから提供されるエアロゾルスプレーの形態で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、測定された量を送達するバルブを提供することによって決定することができる。吸入器又は注入器に使用するためのたとえばゼラチン等のカプセル及びカートリッジには、化合物ならびに適当な粉末基剤たとえばラクトース及びデンプンの粉末混合物を含有させ製剤される。
【０１００】
好ましい実施態様においては、Cop-1-活性化T細胞、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドを含む組成物は、ヒトに静脈内投与するのに適した医薬組成物として定常的操作によって製剤化される。通常、静脈内に投与される組成物は、滅菌した等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤たとえばリグノカインを含有していてもよい。一般的に、成分は別個に又は互いに混合して供給される。組成物が注入によって投与される場合、それは滅菌した医薬用の水又は食塩水を含有する輸液ボトルに配剤される。組成物が注射によって投与される場合は、滅菌した注射用の水又は食塩水のアンプルが、成分を投与前に混合できるように提供される。
【０１０１】
Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドを含む医薬組成物は免疫処置のための通常の方法で任意にアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントの非限定的な例にはミョウバン及び不完全なフロイトのアジュバントが包含される。投与されるペプチド若しくはポリペプチドの免疫原性を改善する他の様式には、アルブミン又は他の担体との凝集物又は複合体の形態での投与が包含される。これらのすべては、ワクチンの技術分野における通常の熟練者には周知である。代謝可能な脂質乳化液、たとえばIntralipid又はLipofundinをWO97/02016に開示された様式でのCop-1治療のためのビヒクルとして使用することもできる。この全内容は引用により本明細書に導入される。これらの物質は、TH1のTH2サイトカインへのシフトを起こすことが知られているが、TH2サイトカインが動作可能ではないと考える理由はなく、本発明の目的には多分、好ましくさえあると思われる。
【０１０２】
Cop-1が経口的に導入される場合、それは他の食品形態と混合して、固体、半固体、懸濁液又は乳化液の形態で消費され、またそれは医薬的に許容される担体たとえば水、懸濁剤、乳化剤、フレーバー増強剤等と混合してもよい。一実施態様においては、経口組成物は腸溶性コーティングを施してもよい。腸溶性コーティングの使用は本技術分野において周知である。たとえば、Lehman（1971）にはEudragit S及びEudragit Lのような腸溶性コーティングが教示されている。The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Ed.にもEudragit S及びEudragit Lの適用が教示されている。本発明に使用できるEudragitの1種にはL30D55がある。
【０１０３】
Cop-1は上述のある種の形態で吸入又は点鼻液により経鼻的に投与することもできる。さらに経口的な吸入はCop-1を気管及び気管支通路の粘膜層に送達させるために使用される。
【０１０４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分1又は2以上を充填した1又は2以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。
【０１０５】
好ましい実施態様においては、本発明の医薬組成物は哺乳動物好ましくはヒトに傷害後又はNSにおける変性病変の検出後直ちに投与される。本発明の治療方法は、Cop-1-活性化T細胞、又はCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドの投与、又はそれらの任意の組み合わせの投与を包含し得る。組み合わせ治療を用いる場合は、Cop-1はCop-1-活性化T細胞投与の前に、それと同時に、又はその投与後に投与される。
【０１０６】
一実施態様においては、本発明の組成物は以下の1又は2以上と組み合わせて投与される：（a）単核食細胞、好ましくは、それらの神経細胞再生促進能を増強するために刺激された培養単球（PCT国際公開WO97/09985に記載されたようなもの、その全体は引用により本明細書に導入される）；（b）神経栄養因子たとえば酸性線維芽細胞増殖因子；及び（c）抗炎症治療物質（すなわち、抗炎症ステロイド、たとえばデキサメサゾン若しくはメチルプレドニソロン、又は非ステロイド性抗炎症ペプチドたとえばThr-Lys-Pro (TKP)）。
【０１０７】
他の実施態様においては、PCT国際公開WO97/09985及び1988年3月11日出願の米国特許出願一連番号09/041,280による単核食細胞が、CNS内の傷害又は損傷部位に、Cop-1-活性化T細胞、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドの非経口投与と同時に、その前に又はその後に注射される。
【０１０８】
他の実施態様においては、Cop-1-活性化T細胞、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドの投与は単回用量として又は反復して、好ましくは2週間隔で、以後さらに長い間隔を置いて1ヶ月に1回、3ヶ月に1回、6ヶ月毎に1回など投与される。処置の経過は数月、数年、又は処置される状態及び疾患によって時には個体の一生涯通じて、続けられる。CNS傷害の場合、処置は数日から数月また数年毎の範囲で、状態が安定化して、二次的変性の発症のリスクがなくなるか又は限られたリスクしかなくなるまで継続される。慢性ヒト疾患又はパーキンソン病の場合には、本発明による処置は一生行われる。
【０１０９】
本技術分野の熟練者には明らかなように、治療効果は時には処置される状態又は疾患、個体の年齢及び健康状態、個体の他の物理的パラメーター（たとえば、性別、体重等）、ならびに様々な他の因子たとえば個体が他の薬剤を服用しているか等に依存する。
【０１１０】
本発明のCop-1-活性化T細胞を含む治療組成物の至適用量は、処置される部位におけるNSの傷害又は疾患に冒されている神経線維の数に比例する。好ましい実施態様においては、用量範囲は約105の神経線維を冒す損傷（例えば、ラットの視神経の完全な切断）の処置には、約5×106〜107であり、106〜107神経線維を冒す損傷（例えばヒト視神経の完全な切断）の処置には約107〜約108の用量範囲が使用される。本技術分野の熟練者には明らかなように、T細胞の用量は処置される損傷又は傷害部位において、冒されていると考えられる神経線維の数に比例して増減させることができる。
【０１１１】
（5）Tリンパ球の自己細胞バンクの確立
神経傷害後の二次的な障害を最小限にするため、患者は、Cop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドに感作させた自己又は同種異系Tリンパ球を投与して処置することができる。機会のウインドウがまだ正確に定義されていないので、成功の機会を最大限にするため、一次的な傷害後できるだけ早く、好ましくは約1週以内に、投与されるべきである。
【０１１２】
活性化のために必要な時間と処置に要する時間の間のギャップを埋めるために、NS傷害の場合の二次的変性に対する神経保護治療に備えて将来使用するように調製された自己Tリンパ球の個人的保管によってバンクを確立できる。Tリンパ球を血液から単離し、ついでCop-1又はCop-1-関連ペプチド若しくはポリペプチドに感作する。細胞をついで凍結し、患者の名前、確認番号及び血液型を付して必要なときまで細胞バンク中に適当に保存する。
【０１１３】
さらに、CNSの自己幹細胞は、NSの外傷性障害、たとえば虚血又は機械的傷害ならびに処置される神経変性状態たとえばアルツハイマー病又はパーキンソン病が生じた場合に個々の患者による使用の可能性のために処理され、保存できる。別法として、セミ同種異系又は同種異系T細胞を、T細胞のソースと1個のMHC II型分子を共有する任意の個人による使用のために、バンクに凍結保存することができる。
【０１１４】
以下の実施例は、本発明のある種の特徴を例示するものであるが、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【０１１５】
（6）例
例1及び例2についての材料及び方法
動物：近交系雌成熟Lewisラット（8〜12週齢）はAnimal Breeding Center of The Weizman Institute of Sciencesから供給された。ラットは明度及び温度が調節された部屋で飼育し、各実験毎に年齢を一致させた。動物はIACUC（International Animal Care and Use Committee）の規制に従って処理した。
【０１１６】
抗原：モルモットの脊髄からのミエリン塩基性タンパク質（MBP）及びオボアルブミン（OVA）はSigma（St. Louis, MO）から購入した。本例に使用されたCop-1はTeva Pharmaceuticals（イスラエル）のCOPAXONE（商標）製品であり、この製品の市販品を購入した。
【０１１７】
抗体：マウスモノクローナル抗ラットT細胞受容体（TCR）は、Boris Reizis博士より恵与された。Cy-3接合ヤギ抗マウスIgG（ラット、ヒト、ウシ、及びウマ血清タンパク質に対し最小の交叉反応）はJackson ImmunoResearch（West Grove, PA）から購入した。
【０１１８】
T細胞系：T細胞系は、上記抗原で免疫処置したLewisラットから得られた排出（draining）リンパ節から発生させた（Ben-Nunら, 1981a）。抗原をリン酸塩緩衝食塩水（PBS）に溶解し（1 mg/mL）、Mycobacterium tuberculosis（Difco Laboratories） 4 mg/mLを補充した等容量の不完全フロイトアジュバント（IFA）（Difco Laboratories、デトロイト、MI）と共に乳化した。10日後、抗原をラットの後肢足パッド（肉趾）に0.1 mL エマルションとして注射し、ラットを屠殺し、それらの排出リンパ節を外科的に摘出し、分離させた。細胞を洗浄し、L-グルタミン（2 mM）、2-メルカプトエタノール（5×10-5 M）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）、ペニシリン（100 IU/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）、非必須アミノ酸（1 mL/100 mL）及び自己血清1％（容量/容量）を補充したダルベッコの改良イーグル媒質（DMEM）を含有する刺激媒質中抗原（10μg/ mL）で活性化した。37℃、98％相対湿度、10％CO2で72時間インキュベートしたのち、細胞を10％ウシ胎児血清（FCS）（容量/容量）、及びコンカナバリンA（ConA）刺激脾臓細胞（Gillisら, 1978）の上清から誘導された10％T細胞増殖因子を加えた、上記と同濃度のDMEM, L-グルタミン酸、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び抗生物質からなる増殖媒質に移した。細胞を増殖媒質中で4〜10日間増殖させたのちに、それらの抗原（10μg/mL）を刺激媒質中、照射（2000 rad）胸腺細胞（107細胞/mL）の存在下に再刺激した。T細胞系は刺激及び増殖を繰り返して増殖させた（Ben-Nunら, 1982）。
【０１１９】
視神経の挫滅傷害：視神経を以前に記載されたように（Duvdevaniら, 1990）挫滅傷害に付した。略述すれば、ラットにRompun（キシラジン, 10mg/kg；Vitamed, イスラエル）及びVetalar（ケタミン, 50 mg/kg；Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA）を腹腔内（i.p.）注射して深く麻酔した。両眼手術顕微鏡を用いて、右眼に側方眼角切開術を行い、結膜を側方に角膜まで切開した。レトラクタ球筋の分離後、視神経をブラント切開によって眼窩内に露出させた。目盛り付きの交叉作動鉗子を用いて視神経を眼から1〜2 mmの挫滅傷害に付した。短期間（2週間）の試験には、この期間が二次的変性及び処置に対するその応答を証明するために至適である（Yoles, 1998）ことから、軽度及び重度の挫滅傷害を与えた。傷害を与えなかった反対側の神経は干渉しないで放置した。
【０１２０】
網膜神経節細胞の逆行性標識による二次的変性の測定：視神経軸索及びそれらが付着した網膜神経節細胞（RGC）の二次的変性を、蛍光親油性染料、ヨウ化4-(4-(ジデシルアミノ)スチリル)-N-メチルピリジニウム  イオジド（4-Di-10-Asp）（Molecular Probes Europe BV, オランダ）を挫滅傷害から2週後に傷害部位の遠位に傷害後適用して測定した。無傷の軸索のみが染料をそれらの細胞本体へと運搬できるので、2週後における傷害部位の遠位への染料の適用は一次的障害及び二次的変性の両者を生存できた軸索のみが計数されることを保証する。このアプローチは、その線維が形態学的に無傷である神経細胞のみが、傷害部位の遠位に適用された染料を取り込み、それをそれらの細胞体に輸送できるので、依然として機能的に無傷な神経細胞と、その軸索は傷害されているが細胞体はなお生存している神経細胞とを分別することができる。この方法を用いると、標識されたRGCの数は依然として機能している神経細胞数を反映し、信頼できる。標識及び測定は次のように実施した。すなわち、右の視神経を再び、この場合も網膜への血液の供給を損なうことなく露出した。完全な軸索切断術を傷害部位の遠位境界から1〜2 mmに実施し、4-Di-10-Aspの固体結晶（直径0.2〜0.4 mm）を新たに生成した軸索切断部位に沈着させた。染料適用から5日後にラットを屠殺した。網膜を眼から摘出し、4％パラホルムアルデヒド溶液中、平坦化して全体のスライド上標本として調製し、標識されたRGCを蛍光顕微鏡で検査した。
【０１２１】
酵素免疫測定法によるアッセイ：抗-MBP T細胞を増殖媒質中で1週間増殖させ、ついでPBSで洗浄し刺激媒質中に再懸濁した。T細胞（0.5×106細胞/mL）を照射胸腺細胞（107細胞/mL）の存在下、ConA（1.25μg/mL）又はMBP抗原（10μg/mL）、又はCop-1抗原（60μg/mL）、又はOVA抗原（10μg/mL）、又は抗原なしで刺激媒質中、37℃、98％相対湿度、10％CO2においてインキュベートした。さらに、照射胸腺細胞（107細胞/mL）を刺激媒質中、単独でインキュベートした。48時間後、細胞を遠心分離に付し、それらの上清を集めてサンプリングした。サンプル中のニューロトロフィン（NT）-3、神経栄養因子（NGF）及びNT-4/5の濃度を、サンドイッチ酵素免疫測定法（ELISA）キット（Promega, Madison, WI）を用いて測定し、NT標準と比較した（ELISAリーダーを用いて450 nmにおける吸収を測定）。脳由来神経栄養因子（BDNF）のサンプル中濃度は感受性サンドイッチELISAで測定した。略述すれば、96-ウエル平底プレートを0.025 M NaHCO3及び0.025 M Na2CO3（pH 8.2）中トリ抗-ヒトBDNF抗体（Promega, Madison, WI）でコーティングした。組換えヒトBDNF（標準として使用；Research Diagnostics, Flanders, NJ）を、PBS（pH 8.2）中3％ウシ血清アルブミン（BSA）, 0.05％ポリオキシエチレン-ソルビタンモノラウレート（Tween-20）及び1％FCSを含有するブロック溶液に連続希釈して用いた。結合したBDNFはプレートをブロック溶液中、マウス抗-ヒトBDNF抗体（Research Diagnostics）とついでペルオキシダーゼ接合ヤギ抗-マウスIgG（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）とインキュベートして検出した。プレートは3, 3’, 5, 5’-テトラメチルベンチジン液体基質システム（Sigma, St. Louis, MO）を用いて展開した。反応は1 M H3PO4を添加して停止させ、光学密度を450 nmで測定した。各実験の結果は、刺激媒質中でインキュベートした照射胸腺細胞のバックグランドレベルを差し引いたのち、サンプル1 mLあたりの分泌NT量として計算した。
【０１２２】
免疫組織化学：神経の縦方向の凍結切片（厚さ10μm）をゼラチンでコーティングしたガラススライド上に取り、蛍光染色用に調製するまで凍結した。切片をエタノール中室温で10分間固定し、二重蒸留水で2回洗浄し、0.05％のTween-20含有PBS中で3分間インキュベートした。切片をついで室温において1時間3％FCS及び2％BSA含有PBS中に希釈した、TCRに対するマウス抗-ラットモノクローナル抗体（Hunig, 1989）とインキュベートした。切片をついで、0.05％Tween-20を含むPBSで3回洗浄し、Cy-3接合ヤギ抗-マウスIgG（ラット、ヒト、ウシ、及びウマ血清タンパク質に対する最小の交叉反応；Jackson Immuno Research, West Grove, PA）と室温において1時間インキュベートした。切片をTween-20含有PBSで洗浄し、1,4-ジアゾビシクロ（2, 2, 2）オクタン含有グリセロールで処理し、蛍光のクエンチングを阻害した。切片はZeiss Universal蛍光顕微鏡で観察した。
【０１２３】
例1：抗-Cop-1 T細胞による神経保護
Cop-1に対して反応性のT細胞の養子免疫移入は傷害された視神経に対して神経保護作用を有する
本発明者らの実験室での以前の研究において、急性CNS外傷後のラットで、CNS自己抗原たとえばMBPに特異的な脳炎誘発性T細胞の受動移入により傷害の広がりが防止され、したがって、二次的な変性が休止されることを示した（WO99/ 60021参照）。この場合、Cop-1に反応性のT細胞の神経保護作用が証明され、そのT細胞はBMP反応性T細胞とは異なり脳炎誘発性ではないことが証明された。軽度（図1A）又は重度（図1B）の視神経傷害後直ちに、ラットにIFA中PBS又はIFA中Cop-1-特異的T細胞を注射した。二次的変性の評価には傷害2週後に神経トレーサー染料、4-Di-10-Aspを傷害部位に対して遠位の視神経に適用した。5日後、ラットを屠殺し、網膜を摘出して平坦に標本（スライド標本）化した。4つの視野からの標識された（生存）RGCは各網膜の視神経円板からほぼ等距離に位置し、蛍光顕微鏡下に計数した。結果は図1A及び図1Bに示す。Cop-1-反応性T細胞の神経保護作用はPBSの場合に比較して、軽度の挫滅傷害（P<0.005, Studentのt-検定）及び重度の挫滅傷害（P<0.05, Studentのt-検定）の両者で有意であった。結果は3回の実験をまとめたものである。各群は6〜10匹のラットを包含した。
【０１２４】
Cop-1-反応性T細胞は傷害及び非傷害神経細胞組織の両者に蓄積する
本発明者らの実験室は以前に、挫滅傷害ラット中への抗-MBP T細胞の受動移入に続いて、傷害部位に注射されたT細胞の大量の蓄積を生じることを示している。本研究におけるCop-1-反応性T細胞の受動移入はまた、PBS-処置傷害ラットにおける内因性抗-MBP T細胞の蓄積に比較して、傷害部位における注射されたT細胞の有意な蓄積を生じた。Cop-1-処置ラットにおけるT細胞の蓄積は、注射7日後に最大となった。これらの所見は様々な特異性のT細胞系を注射された場合のそれ以前の結果と一致した。その研究では、傷害された神経における損傷部位でのT細胞の蓄積は、CNS自己抗原に特異的なT細胞のみの蓄積が認められる非傷害神経とは異なり、非選択的であった。したがって、傷害された神経におけるCop-1に対するT細胞の蓄積は、常駐するCNSタンパク質との交叉認識、及びそれゆえ活性についての徴候を提供するものではない。しかしながら、Cop-1に対するT細胞はMBPに対するT細胞と同様、OVAに対するT細胞とは異なり非傷害神経に蓄積したのである（結果は示していない）。Cop-1に反応性のT細胞の蓄積はMBPに特異的なT細胞の場合より少ないが、これらの所見はさらに、インビボにおけるCop-1とMBPの間の交叉反応性に関する考えを支持するものである。
【０１２５】
MBP及びCop-1に特異的な注射T細胞系のサイトカイン及びニューロトロフィンのプロフィル
非刺激T細胞からの上清、又は刺激媒質中48時間ConAマイトジェン又はMBP抗原又はCop-1抗原で刺激したT細胞からの上清をサンドイッチELISAに付した。これらの細胞によって分泌される生成物を含む培養媒質を集め、それらのサイトカイン含量をELISAによって定量した。結果は表2に示す。活性化T細胞は非刺激T細胞よりもはるかに大量のサイトカインを分泌した。MBP-刺激T細胞はTh1-特異的サイトカインINFを優先的に発現したのに対して、Cop-1-刺激T細胞はTh2-特異的サイトカインIL-10を優先的に発現した。最大量の分泌サイトカインはConAで刺激されたT細胞の上清中に検出された（表2）。
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【０１２６】
ニューロトロフィンの発現、及びそれらの特異的抗原により活性化されたT細胞による分泌の上方調整は、最近、本発明者らの実験室で証明された。T細胞仲介神経保護の基底にある機構への洞察を得るための試みにおいて、本研究におけるT細胞の上清をELISAに付して、神経保護を担うT細胞のニューロトロフィン（NT）プロフィルを決定した。Cop-1-刺激T細胞はNGF及びNT-4/5の両者を分泌したが、抗-MBP T細胞によって分泌される量よりも少なかった。抗-MBP T細胞による産生に比較して、Cop-1-刺激T細胞によるNT-3の産生は有意ではなかったが、BDNFの産生は多かった（図2A）。すなわち、Cop-1-刺激T細胞は、調べたすべての神経栄養因子を、著しいBDNFの例外を除いて少量しか産生しない（図2A）。別個に刺激したT細胞によって分泌されるNT-3及びBDNFの量の4つの独立した測定では類似の結果が得られた。それぞれの場合、Cop-1-刺激T細胞細胞は抗-MBP T細胞の場合よりも約2.5倍多くのBDNFを産生し、NT-3の量では10％のみ産生した（図2B）。
【０１２７】
例2：Cop-1によるワクチン化
Cop-1によるワクチン化は二次的変性から視神経線維を保護する
本例は、2日後に与えたブースターを用いたINF中Cop-1によるワクチン化が臨界的な時間ウインドウ内に、神経保護のために十分強力な免疫応答を生じることを示す意図である。麻酔したラットを視神経の軽度な挫滅傷害に付し、直ちにIFA中Cop-1によりワクチン化し、2日後にブースター投与を行った。2週後、RGCを逆行的に標識し、5日後にラットを屠殺し、網膜を摘出した。IFA中Cop-1でワクチン化したラットは、IFA中PBSを注射した対照ラットに比較して有意な神経保護の証拠を示した（図3）。
【０１２８】
例3：グルタメート毒性からの保護
実験1：Cop-1でのワクチン化はグルタメート毒性から視神経線維を保護する
傷害された神経のCop-1での免疫処置によって得られる有望な神経保護により、保護が外傷によって生じた神経傷害に限定されるものか、又は、グルタメート誘発毒性により生じる、不良環境条件からの、より一般的な保護であるかを明らかにすることは重要である。したがって、以下の実験を行った。
【０１２９】
免疫処置：C57B1/6J OLAマウス（8〜10週齢）に、それぞれ、5 mg/mLの
Mycobacteria H37 RA（Difco）を含有する等容量の完全フロイトアジュバント（CFA）と共に乳化した計75μg のCop-1を注射した。第二群のマウスにはCFAとのリン酸緩衝食塩溶液（PBS）の乳化液を注射した。グルタメートを網膜内に導入する10日前に、計0.1 mL容量の乳化液を腹腔内注射した。
【０１３０】
グルタメート毒性：免疫10日後にマウスを麻酔し、200 nmoleのグルタメートを含有する食塩水1μLを右眼のガラス体中に注射した。左眼には注射をせず、対照として用いた。
【０１３１】
網膜神経節細胞の標識：RGCの生存を評価する3日（72時間）前にそれぞれのマウスを麻酔し、定位固定デバイス上に置いた。頭蓋を露出し、乾燥して清潔に保持した。ブレグマを確認して目印を付した。注射が指定された点は脳表面から2 mmの深さ、前後軸索中ブレグマの後方2.92 mm, 及び中線の側方0.5 mmであった。右及び左半球における指定された座標上の頭皮にウインドウを穿孔した。ニューロトレーサー染料, FluoroGold（食塩水中4％溶液；Fluorochrome, Dever, CO）をついで、ハミルトンシリンジを用いて適用した（1μL, 速度0.5μL/分）。
【０１３２】
RGCの生存の評価：グルタメートの投与7日後に眼を摘出し、網膜を剥がし、4％パラホルムアルデヒド溶液中、全体を平坦に標本（スライド上標本）化した。視神経円板から約1 mmに位置する同一のサイズ（0.078 mm2）の6〜8の視野からの標識された細胞を蛍光顕微鏡下により計数し平均した。結果は図4に示す。グルタメートの毒性は対照において、Cop-1によって免疫処置したマウスより約4倍高かった。
【０１３３】
実験2：グルタメートの毒性及び高眼圧に対する神経細胞の保護のためのワクチン化
本研究においては、軸索傷害後に有効な神経保護を提供する、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MMOG）から誘導されるペプチド又はMBPによる能動又は受動免疫処置（Moalemら, 1999a；Moalemら, 1999b；及びFisherら, 2000）がグルタメートによって引き起こされた毒性から神経細胞を保護しないことを示す。しかしながら、グルタメートの毒性からの保護はCop-1によるワクチン化で達成された。Cop-1による免疫処置が、圧力は高いままで免疫処置によっては影響されない条件下で、緑内障のラットモデルにおける高眼圧によって誘導される網膜神経節細胞死からの高度に効果的な保護を提供することがさらに示された。
【０１３４】
材料及び方法
動物：すべての動物はInstitutional Animal Care and Use Committeeによって作成された規制に従って処理した。8〜13週齢のC57EL/6J及びBalb/c株のマウスならびに8〜12週齢の近交系成熟LewisラットはAnimal Breeding Center of The Weizman Institute of Sciencesから供給され、明度及び温度が調節された部屋で飼育した。ラットはそれぞれの実験ごとに年齢及びサイズを一致させた。実験に使用する前に、動物はケタミン80 mg/kg及びキシラジン16 mg/kgの腹腔内投与によって麻酔した。
【０１３５】
抗原： Cop-1はTeva Pharmaceuticals（Petah Tikva, イスラエル）から購入した。ミエリンオリゴデンドドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド（pMOG）1-22（GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL）（配列番号：33）は、M, Fridkin博士の実験室（Department of Chemistry of the Weizman Institute of Science）により自動多重ペプチドシンセサイザー（AMS422, Abimed, Langenfeld, ドイツ）を用いFmoc法で合成された。モルモットの脊髄からのMBPはSigma（イスラエル）から購入した。
【０１３６】
免疫処置：マウス又はラットを、0.5又は5 mg/mLのMycobacterium tuberculosisを含有する完全フロイトアジュバント（CFA）の等容量で乳化した、それぞれ75μg若しくは100μgのCop-1、又は300μgのpMOGで免疫処置した。エマルション（総容量0.15 mL）を側腹部の1部位に皮下注射した。1週後、pMOGで免疫処置したマウスに同一の免疫処置を他の側腹部にブースターとして与えた。対象マウスにはCFA（Difco, Detroit, Michigan, USA）中リン酸塩緩衝食塩水（PBS）を注射した。
【０１３７】
視神経の挫滅傷害：マウス及びラットを麻酔し、眼球から1〜2 mmの視神経の眼窩内部分において重度の挫滅傷害に付した。両眼手術顕微鏡を用いて結膜を切開し、視神経を露出させた。目盛り付きの交叉作動鉗子を用い、血液の供給に干渉しないように特に注意を払って、神経を2秒間（マウス）又は30秒間（ラット）挫滅させた。
【０１３８】
グルタメート及びNMDAの注射：麻酔したマウス又はラットの右眼を、27-ゲージの針により強膜の上部で穿孔し、30-ゲージの針を付した10-μLのハミルトンシリンジをガラス体に届くまで挿入した。マウスには、食塩水に溶解した総容量1μL（200 nmole）のL-グルタメート又は1μLのN-メチル-D-アスパルテート（NMDA; 75 nmole；RBI, Boston, MA）を注射した。ラットには2μL（375 nmole）のL-グルタメートを注射した。
【０１３９】
マウスへの定位染料の傷害前適用：頭蓋を露出させ、15％過酸化水素を用いて乾燥し、清潔に保持した。ブレグマを確認して目印を付した。各半球の頂部隆起上に穿孔した（中線の後方0.292 mm, 側方0.05 mm）。定位置測定デバイス及びハミルトンインジェクターを用いて、マウスに, FluoroGold（食塩水中5％溶液；Fluorochrome, Dever, CO； 1μL）を各半球の頂部における1点に、脳の骨質表面からの深さ0.16 mm又は0.175 mmに注射した（マウスの株による）。注射完了後、創傷を縫合した。染料の逆行性の取り込みは生存細胞のマーカーを提供する。
【０１４０】
マウスにおける網膜神経節細胞の生存の評価：マウスに致死用量のペントバルビトン（170 mg/kg）を投与した。眼を摘出し、網膜を剥がし、パラホルムアルデヒド（PBS中4％）中、全体を平坦に標本（スライド上標本）化した。同一のサイズ（0.7 mm2）の4〜6の選択された視野からの標識された細胞を計数した。選択された視野は視神経円板からほぼ等距離（約3 mm）に位置し、視神経円板からの距離の関数としてのRGC密度変動を克服した。視野は蛍光顕微鏡（800倍）下に、マウスが受けた処置は知らない観察者により盲検法で計数させた。各網膜における視野あたりの平均RGC数を計算した。
【０１４１】
ラットにおける網膜神経節生存細胞の評価：ラットにおけるRGCの生存を、傷害後に、蛍光親油性染料、ヨウ化4-(4-(ジデアシルアミノ)スチリル)-N-メチルピリジニウム  イオジド（4-Di-10-Asp）（Molecular Probes Europe BV, オランダ）を視神経ヘッドから遠位に適用して測定した。標識及び測定は次のように実施した。すなわち、視神経を網膜への血液の供給を阻害することなく露出した。視神経のヘッドから1〜2 mmで軸索の完全な切除を行い、4-Di-10-Aspの固体結晶（直径0.2〜0.4 mm）を生成した軸索切断部位に沈着させた。染料の適用5日後にラットを屠殺した。網膜を眼から摘出し、4％パラホルムアルデヒド溶液中に平坦化したスライド上標本として調製し、標識されたRGCを蛍光顕微鏡で検査した。IOP実験動物では、神経節細胞はデキストランテトラメチルローダミン（DTMR）（Molecular Probes, OR）の逆行性輸送によって標識された。3000 MW DTMRの結晶を眼球から約2〜3 mmの視神経の切断末端に適用した。24時間後に、網膜全体をスライド上標本化し、各四半分中2つの8領域における標識神経節細胞を、400×拡大において（視神経円板の縁から0.66〜1.103 mm）計数した。
【０１４２】
マウスCop-1-T-細胞系の発生：マウスT-細胞系はCop-1抗原で免疫処置したC57BL/6Jマウスから得られた排出リンパ節細胞から発生させた。抗原をPBS（1 mg/mL）に溶解し、5 mg/mLのMycobacterium tuberculosis（Difco）を補充した等容量のCFAと共に乳化した。後肢肉趾に免疫処置した10日後、マウスを屠殺し、それらの排出リンパ節を外科的に摘出し、分離させた。細胞を洗浄し、L-グルタミン（2 mM）、2-メルカプトエタノール（5×10-5 M）、ペニシリン（100 unit/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）及び自己血清0.5％（容量/容量）を補充したRPMIを含有する刺激媒質中抗原（10μg/ mL）で活性化した。37℃、98％相対湿度、10％CO2で72時間インキュベートしたのち、細胞を、5％ウシ胎児血清（容量/容量）、及びコンカナバリンA-刺激脾臓細胞の上清から誘導された10％T細胞増殖因子を加えた、上記と同濃度の非必須アミノ酸（1 mL/100 mL）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）、L-グルタミン、β-メルカプトエタノール、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したRPMIからなる増殖媒質に移した。細胞を増殖媒質中で10〜14日間増殖させたのちに、それらの抗原（10μg/mL）を刺激媒質中、照射（2500 rad）胸腺細胞（107細胞/mL）の存在下に再刺激した。T細胞系は刺激及び増殖を繰り返して増殖させた。基本的に、この細胞系は以前に記載された細胞系（Aharoniら, 1997）と類似の表現型を有する。
【０１４３】
ラットCop-1-T-細胞系の発生：T細胞系は上記抗原で免疫処置したLewisラットから得られた排出リンパ節細胞から発生させた。抗原をリン酸-緩衝食塩溶液（PBS）（1 mg/mL）に溶解し、4 mg/mLのMycobacterium tuberculosis（Difco）を補充した等容量の不完全フロイトアジュバント（IFA）（Difco Laboratories, デトロイト、MI）と共に乳化した。ラット後肢肉趾に抗原を0.1 mLの乳化液として注射した10日後、ラットを屠殺し、それらの排出リンパ節を外科的に摘出し、分離させた。細胞を洗浄し、L-グルタミン（2 mM）、2-メルカプトエタノール（5×10-5 M）、ペニシリン（100 IU/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）、非必須アミノ酸（1 mL/100 mL）及び自己血清1％（容量/容量）を補充したダルベッコ改良イーグル媒質（DMEM）含有刺激媒質中抗原（10μg/ mL）で活性化した。37℃, 98％相対湿度、10％CO2で72時間インキュベートしたのち、細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）（容量/容量）、及びコンカナバリンA (Con A)-刺激脾臓細胞の上清から誘導されたT細胞増殖因子10％を加えた、上記と同濃度のDMEM, L-グルタミン、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び抗生物質からなる増殖媒質に移した。細胞を増殖媒質中で4〜10日間増殖させたのちに、それらの抗原（10μg/mL）で、刺激媒質中、照射（2000 rad）胸腺細胞（107細胞/mL）の存在下に再刺激した。T細胞系は刺激及び増殖を繰り返して増殖させた。
【０１４４】
組織学的分析：グルタメート又は食塩水の注射7日後に、マウスに致死用量（170 mg/kg）のペントバルビトンを注射して屠殺し、眼を摘出し、ホルムアルデヒド（PBS中4％）中、4℃で48時間固定した。切片（厚さ10μm）をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシン（H & E）で染色した。
【０１４５】
ラットにおける高眼圧の発生／ラットにおける眼内圧の上昇：雄性Lewisラットをケタミン（15 mg/kg）、アセプロマジン（1.5 mg/kg）及びキシラジン（0.3 mg/kg）の混合物で麻酔した。眼内圧（IOP）の上昇は四肢及び強膜静脈のレーザー光凝固により達成された。ラットは、1週間隔でブルー−グリーンアルゴンレーザー（1 watt, 0.2秒間、2回の処置で50μmの計130〜150スポットを送達；Coherent, Palo Alto, CA）の2回のレーザー処置を受けた。ラットに獣医用トランキライザーであるアセプロマジン3.0 mg/kgを筋肉内注射し、結膜を麻酔するために0.5％プロパラカインを眼に局所的に適用したのち、TONO-PEN（Mentor, Norwell, MA）を用いて、IOPを1週に1回測定した。
【０１４６】
結果
ミエリン関連抗原はグルタメート毒性に対して保護をしない：本発明者らの実験室では以前にミエリン関連抗原による受動及び能動免疫処置がマウス及びラットにおける視神経挫滅傷害（例1及び2；Moalemら, 1999, 及びFisherら, 2000）、成熟ラットにおける脊髄挫傷に伴う外傷後変性を減弱させ得る（Haubenら, 2000a 及びHaubenら, 2000b）ことを証明した。このように免疫学的な神経保護が非機械的傷害後にも同様に表れるか否かを調べるために、ミエリン関連抗原による能動免疫又はこれらの抗原と反応性のT細胞受動移入が、グルタメートのガラス体注射によって誘発される毒性に対して神経保護を提供するかどうかを最初に調べた。ラット及びマウスの視神経を挫滅傷害に付した。本発明者らの実験室からの免疫学的神経保護について確立されたプロトコールを用いて、MOG-由来ペプチドによる能動免疫処置（Fisherら, 2000）をマウスに、及びラットにおける抗-MBP T細胞の受動移入（Moalemら, 1999）を実施した。グルタメートによる傷害は、マウス及びラットの両者で1週後に、測定可能なRGCの死を招くことが以前に（Yolesら, 2000）示されている濃度でグルタメートをガラス体内に注射することによって与えた。
【０１４７】
マウスはグルタメート（200 nmole）のガラス体内注射の前にpMOGで免疫した。グルタメートの注射1週後、RGC生存率を評価したときには、pMOGによる免疫処置の有益な効果の証拠は検出できなかった（図5A）。同様にグルタメート注射をラットにおける抗-MBP T細胞の受動移入によって直ちに追跡した場合にも、検出可能な有益な効果は検出できなかった（図5B）。すなわち、視神経の挫滅後マウスにおいて神経保護応答の誘導が最近示されたpMOG（1〜22）によるワクチン接種（Fisherら, 2000）にもかかわらず、本研究においてpMOG-ワクチン化マウスをグルタメート障害に付したのちにはこのような神経保護は認められなかった。
【０１４８】
これらの所見から本発明者らは2つの可能性を考えるに至った。すなわち、グルタメート毒性後のRGCの喪失は免疫保護に反応するものではなく、グルタメート誘発RGC死には免疫系は関与しないか、又はミエリン関連抗原たとえばpMOG及びMBPはグルタメート毒性に対する保護のための正しい抗原ではないのいずれかである。本発明者らの実験室からの最近の結果（Kipnisら, 2000）は、グルタメートによって生じる細胞死の率は、正常な動物におけるよりも成熟T細胞を欠くラット又はマウスで高いことを示し、CNS傷害に対する有益な生理学的応答にはT細胞が関与することが強く示唆されている。したがって、この内因性グルタメートによって誘発されるT細胞応答を増強することは傷害を受けた網膜に対して有益な作用を有するように思われる。
【０１４９】
Cop-1免疫処置はグルタメート毒性に対して保護作用を有する：グルタメート誘導毒性に対して有益な免疫応答を誘発する可能性がある生理学的抗原の探索がまだこの段階では主要な目的であったことから、本発明者らは、グルタメートに対する免疫応答の外因性免疫系処理の目的に使用できる可能性がある抗原の発見に興味をもった。最初に、グルタメート注射がRGCをリンパ球に接近可能にするか否かを調べた。多数のリンパ球がグルタメートを注射した眼に、グルタメート注射後24時間以内に侵入することが見出され（図6A及び6B）、これは免疫処理はグルタメートへの局所的暴露後、RGCの生存に影響することを示唆した。これらの2つの観察を考え合わせて本発明者らは、グルタメートの毒性はT細胞仲介保護作用を活性化すると確信し、この有益な免疫応答を増強する方法の探索へと進むことになった。適当な抗原の探索では、多発性硬化症患者の薬物として用いられるオリゴペプチドであり、最近成熟ラットの視神経挫滅傷害モデルにおいて神経保護を増強することが示された（Kipnisら, 2000a）合成ポリマー、コポリマー1（Cop-1）が適当な候補物質として考慮された。
【０１５０】
最初に、Cop-1による免疫処置がラットのみでなくマウスにおける視神経挫滅傷害後、RGCの生存に有益な作用を有するか否かを調べた。この研究には、Balb/cマウスを使用した。ラットにおいて視神経の挫滅傷害後に有益であることが見出されたプロトコールを用いたCop-1での免疫処置はマウスにおける視神経の挫滅傷害後にも有益であった（図7）。
【０１５１】
次に、同じプロトコールがグルタメート誘発毒性に対する神経保護を導くことができるか否かを検討した。この研究では、グルタメート傷害後の網膜神経節の細胞喪失がBalb/cの場合よりも高い（Kipnisら, 2000b）C57b1/6マウスを使用した。グルタメートのガラス体内注射の10日前に、C57b1/6マウスを、5 mg/mLの細菌を含有するアジュバント中に乳化したCop-1で免疫処置した。この株は本発明者らの実験室での最近の発見、すなわちこれらのマウスにおけるグルタメートの注射によって誘導されるRGCの喪失は、神経細胞喪失と自己免疫疾患に対する抵抗性の間の遺伝子連関によりBalb/cマウスにおけるよりもこれらのマウスで大きいとの発見に鑑みて選択された（Kipnisら, 2000b）。Cop-1による免疫処置はグルタメートの毒性の有意な低下を生じた（図8A）。このモデルにおけるCop-1による免疫処置のための治療的ウインドウを確立することを試みて、2種の異なる濃度での細菌（0.5又は5 mg/mL）を含有するアジュバント中に乳化させたCop-1を用いた実験を反復し、マウスをグルタメート傷害に関して異なる時間に免疫処置した。グルタメートの注射の日に免疫処置したマウスではなお、相当するアジュバント中に乳化したPBSを注射したマウスに認められるよりも有意に高いRGCの生存率を示した（図8B及び8C）。いずれのアジュバントも有意な効果を生じた。免疫処置とグルタメート傷害の間の時間とともにCop-1の保護効果は低下し、Cop-1による免疫処置がグルタミン酸の注射後直ちに又は24時間後行われた場合、RGCの平均生存率はPBS注射網膜におけるよりも有意に高く、Cop-1がグルタミン酸注射の48時間後に与えられた場合は有意ではなかった（図8D）。興味あることにCop-1による免疫処置は、最近本発明者らにより、典型的なアポトーシス細胞死とは異なる特徴を有するRGC死をこのインビボモデルで生じるNMDAにより起こる毒性からマウスを保護しなかった（図9）。
【０１５２】
Cop-1に対して反応性のT細胞の養子移入はグルタミン酸の毒性に対して保護作用を有する：観察されたCop-1による免疫処置が、グルタメート毒性に対するT細胞仲介神経保護を招くかどうかを決定するために、5×106 Cop-1-反応性T細胞（250μL, 腹腔内）を、グルタメート（200 nmole）の注射後直ちにマウスに受動移入した。1週後、PBSを腹腔内に注射された対照マウス（1238±2, n=3）に比べてCop-1-反応性T細胞を注射されたマウス（1978±86, n=6）では有意に多いRGCが生存した（図10）。
【０１５３】
Cop-1免疫処置はラットにおける高眼圧により誘発される死から網膜神経節細胞を保護する：Lewisラットに1週間の間隔で2回のレーザー処置を行い、IOPを上昇させた。ついで3週間にわたる指示された時点における測定では、レーザー処置の2週後にIOPは30±0.4 mmHg（平均±SEM）にまで上昇し、それ以後ほぼそのレベルに維持された（図11B）。これらのラットにおける網膜神経節細胞の生存率は、初めのレーザー処置から3週後に測定され、レーザー処置されていない対照ラットより有意に低かった（19.9％±0.51％、平均±SEMで低い）（図11B）。網膜神経節細胞の生存に対するCop-1免疫処置の効果を調べるため、ラットを最初のレーザー処置の日にCFA中に乳化したCop-1で免疫処置した。対照ラットには同じアジュバント中PBSを注射した。3週後、網膜神経節細胞を逆行的に標識し、24時間後に網膜を切開し、全体をスライド上標本化し、標識された網膜神経節細胞を計数した。Cop-1で免疫処置されたラットにおける生存網膜神経節細胞数はPBS/CFA注射対照の場合より有意に高く（図11C）、両群ラットのIOPは、注射されなかったレーザー処置ラット群と同程度の高さに維持された（図11A）。類似の、しかしわずかに小さい効果が、それらのIOPが既に高い時点でCop-1によって免疫処置されたラットにおいて認められた（図11D）。
【０１５４】
（7）結果の考察
工業界において最も一般的ではあるが破壊的外傷性傷害の一つである脊髄障害にはまだその治癒は見出されていない。CNS神経細胞は末梢性神経系の神経細胞とは異なり、傷害後には限られた再生能力しか示さないことは40年以上前から知られている。この20年間に再生を促進する試みは、部分的な回復を招来するアプローチを獲得するに至っている。この数年間に、ヒト脊髄に受けた大部分の外傷性傷害は部分的であるが、それにもかかわらず、得られた機能的喪失は最初の傷害の重症度によって説明できるよりはるかに悪いことが明らかにされている。すなわち、二次的変性の自己増殖過程が決定的であるように思われる。
【０１５５】
最近、傷害誘発性の二次的変性を停止させることにかなりの研究努力が払われている。現在までの試みはすべて、薬理学に基づくものであり、脊髄卒中からの回復にある程度の改善をもたらしている。これに対して本研究は自己維持の天然の機構と考えられる機序を増強する細胞療法を記載するものであり、単回の処置で長期に続く回復を招くものである。この回復の程度は薬理学的方法を使用して報告された回復を凌駕するように思われる。
【０１５６】
大部分の組織では、傷害により誘発された損傷は組織を保護し、そのホメオスターシスを維持する細胞性免疫応答を誘導する。この応答はマクロファージ及び免疫系の本質的な武器を有する他の細胞に帰せられるものである。養子免疫を担うリンパ球が組織の維持に参画すると考えられたことはこれまでなかった。旧来の教示によれば、養子免疫は外来性の危険に向けられるものである。しかしながら、本研究は、養子T細胞免疫応答が異種病原は存在しないときでも保護的に働けることを示している。組織維持の場合には、T細胞の特異性は組織自己抗原に向けられている。
【０１５７】
上述の例の結果は、挫滅CNS神経ならびにグルタメート毒性に暴露された視神経におけるCop-1に反応性のT細胞の神経保護作用を証明している。部分視神経挫滅のラットモデルにおいて、CNS傷害の日に、Cop-1-反応性T細胞の養子投与又はCop-1によるワクチン化は神経線維の二次的変性に著しい保護作用を示した。ワクチン化が視神経の外傷性傷害後における損傷の拡大を防止できる可能性のある方法として示されたのはこれが始めてである。
【０１５８】
ラット視神経の挫滅傷害後におけるCop-1-反応性T細胞の注射は二次的変性の破壊的な作用に対して有意な保護を生じた。T細胞は期待されたように傷害部位に蓄積したが、それらは傷害されていない神経にも蓄積した。傷害されていないCNSにおけるT細胞の蓄積は提示された抗原によりT細胞受容体が認識される場合にのみ可能である。活性化されたT細胞は、それらの特異性とは無関係に血液脳関門（BBB）を通過可能であるが、CNS抗原に反応性がある細胞のみが傷害されていない神経に蓄積することができる（Hickey, 1991）。したがって、この発見は、Cop-1-反応性T細胞とCNSのミエリン成分間のインビボ交叉認識を初めて証明するものである。傷害部位におけるこの認識が多分、T細胞活性化のトリガーとして働き、活性化T細胞による多分、適当な神経栄養因子又はまだ発見されていない因子の分泌を介してT細胞の保護表現型に向けたスイッチングを招く。本研究はそれらの特異的抗原によって活性化されたCop-1-反応性T細胞が、神経細胞の生存に主要な役割を果たす（Yanら, 1992；Sendtnerら, 1992）有意な量のBDNFを分泌することを証明するものである。
【０１５９】
Cop-1は本来、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）の活性を模倣し、齧歯類に炎症性脱髄疾患EAEを誘発するために設計されたものである。しかしながら、それは非髄縁誘発性であり、MBP（Teitelbaumら, 1971）、プロテオリピドタンパク質（PLP）（Teitelbaumら, 1996）又はMOG（Ben-Nunら, 1996）によって誘導されるEAEを抑制さえすることが見出された。Cop-1は齧歯類におけるEAEの発症を防止し、ヒトにおける多発性硬化症を緩和させる。研究では、Cop-1に対する抗体とMBP又はこれらの抗原に向けられたT細胞の間に部分的な交叉反応性が証明されている（Webbら, 1973及びTeitelbaumら, 1988）。Cop-1は、免疫支配的（immunodominant）MBPエピトープに対するT細胞抗原受容体のアンタゴニストとして働き得る（Aharoniら, 1998）。それはまた、様々な主要組織適合複合体（HMC）クラスII分子に結合し、それらが特異的抗原認識性を有するT細胞に結合するのを防止する（Fridkis-Hareliら, 1998）。齧歯類においては、Cop-1は髄炎誘発性T細胞を抑制する調節細胞の発現を誘導する。齧歯類におけるこのようなT細胞の養子移入はMBP（Aharoniら, 1993）,  PLP（Teitelbaumら, 1996）又は全脊髄ホモジネート（Aharoniら, 1997）によって誘発されるEAEの発症を防止することが見出された。
【０１６０】
すなわち、Cop-1による免疫処置は、MBP及び他のミエリン関連タンパク質による免疫処置と異なりEAEを誘発せず、アジュバントの不存在下にCop-1によって誘導されたT細胞は調節性を有する。傷害後直ちに、IFA中Cop-1により免疫し、2日後にブースター投与を行うと強力な神経保護作用を示した。このような免疫処置は約1週以内にその細胞性応答のピークに達するものと思われるが、その時点の前にもCNS中には少なくともある程度の神経保護活性を発揮するのに十分に多いT細胞数が明らかに存在すると考えるのは合理的である。MBPによる免疫処置後、EAEの症状は10日後に現れ、これはその時点までに免疫応答は傷害部位に髄炎誘発性T細胞を蓄積させ、それらの損傷を与え、EAE症状を発症させるのに十分強力であることを指示している。本研究は、IFA中Cop-1による免疫処置から2日後のブースター投与により、視神経における免疫応答は二次的変性を防止するのに十分であることを示唆している。この応答がT細胞の受動移入後に得られる応答に比較して若干遅れる可能性があるがそれでも、それは一次的な損傷を免れた神経線維の保護に必要な時間ウインドウ内に達成された。ラットの視神経での以前の研究では、二次的変性により生じる神経細胞の喪失は軽度の挫滅傷害後1週で約25％、傷害後2週で55％であることが示されている（Yoles, 1998）。すなわち、応答が要求される強度に達するまでに1週を要したとしても、この時点でもなお保護を必要とする神経線維が存在する。活性化Cop-1-反応性T細胞の養子免疫移入後及びCop-1による能動免疫処置後に得られた結果を比較すると、二次的変性からの保護の程度は両者でほぼ同じであったように、最大の効果を発揮するまでに要する時間に関しては、2つの処置の間に有意差はないことが示唆される。Cop-1はこの場合、その既知の作用とは反対の作用を発揮していることが強調されるべきである。Cop-1はT細胞の自己免疫性を抑制するように設計された物質であることが知られているのに対し、ここではそれは特異的な抗-ミエリンT細胞自己免疫性の活性化を要求する作用を有する。
【０１６１】
結論として、以前の研究ではラットCNSにおける軸索の傷害は、ミエリンタンパク質に向けられた自己免疫T細胞応答を覚醒させるが、二次的変性から神経線維を保護するには弱すぎることを示している。この免疫応答は自己免疫疾患を伴う危険がなく増強できることは、本研究により、CNSによって交叉認識されるが髄炎誘発性ではないポリマーを使用することによって達成された。傷害時の受動移送又は免疫処置のいずれかによって得られる、ポリマーに対するT細胞免疫応答は外傷後の維持に有効な手段を提供する。T細胞仲介神経保護はこの場合、神経細胞が変性を受けやすく、神経保護に従いやすいCNS神経における慢性及び急性傷害の両者に適用可能であることが証明された。それはまた、グルタメート毒性により引き起こされる一次的及び二次的変性の保護にも適用できる。Cop-1による受動的及び能動的免疫処置によって達成されるT細胞依存性の免疫学的神経保護もまた、慢性的に高いIOPを示すマウス及びラットモデルにおいて、グルタメート誘発毒性の有効な治療法であるという結果に示されている。
【０１６２】
Cop-1による受動及び能動免疫処置の両者がグルタメート毒性からの有効な神経保護を提供することを示す例3における研究の結果として、グルタメートに伴う神経細胞毒を低下させる方法としてワクチンを開発することができる。これらの観察は多くの興味ある意味を有する。すなわち、（i）自己免疫疾患、多発性硬化症の患者における免疫抑制剤として用いられるCop-1はグルタメート誘発神経毒に対するワクチンとして有効である。（ii）局所的なストレスシグナルによるCNS神経細胞の喪失は全身的な免疫操作から恩恵を受けることができる。（iii）同じ神経細胞、この場合RCGは、応答の抗原特異性が変わるものの、傷害の性質及び部位には無関係に全身的免疫応答によって恩恵を受けることができる。（iv）Cop-1の有益な活性は、傷害（機械的又は生化学的）のタイプに明らかに依存しないが、その傷害が活性化する死の機構に決定的に依存するように思われる。例3では、誘導された免疫活性は、細胞を、グルタメートによって引き起こされる死に対しては保護を示したが、NMDAによって引き起こされる死に対しては保護しなかった。（v）Cop-1は免疫原として働き、ミエリンタンパク質の交叉認識を必ずしも要求しない機構によって神経保護作用を誘発し得る。
【０１６３】
二次的変性に対する免疫学的な神経保護と自己免疫疾患の免疫学的治療との間には重要な差があることは強調されなければならない。前者は有益なT細胞の能動的な関与を要求するが、後者は髄炎誘発性T細胞の免疫修飾又はそれらの抑制のいずれかから利益を享受する。免疫原として働くCop-1は、神経細胞傷害からの神経保護及び自己免疫疾患の治療の両目的で働く。多分、それはこれを、一方では、神経保護に必要な有益な自己免疫T細胞応答を提供し（Moalemら, 1999a；Moalemら, 1999b；Kipnisら, 2000a；Moalemら, 2000c；Schwartzら, 1999）、他方では自己免疫疾患の回避のために要求される免疫修飾を提供する（Neuhausら, 2000）。
【０１６４】
MBPに反応性のT細胞は、本発明者らの実験室において、部分的に挫滅された視神経（Moalemら, 1999及びSchwartzら, 1999）及び脊髄の挫傷性損傷ラットモデルで神経保護作用を示した。本発明者らの実験室における以前の所見では、Cop-1-反応性T細胞とCNSミエリン成分間のインビボ交叉認識が証明された（Kipnisら, 2000a）。本発明者らは、T細胞の再活性化の誘発より、したがってT細胞の保護的表現型へのスイッチを生じるこのような認識を、軸索傷害後におけるT細胞の神経保護の基底にある機構の可能性を表すものであると提案する。Cop-1-反応性T細胞（例1及び2; Kipnisら）が、BMP-反応性T細胞（Moalemら, 2000）と同様に、それらの特異的抗原によって活性化された場合に、神経細胞の生存に主要な役割を果たすニューロトロフィン（Sendtnerら, 1992及びYanら, 1992）、脳由来神経栄養因子の有意な量を分泌することが、本発明者らによってさらに示されたのである。例1において、本発明者らの実験室では、抗-Cop-1 T細胞が暴露されたミエリンエピトープと交叉反応できる、白質に対する物理的外傷後のCop-1に対するT細胞免疫を調べた。ミエリン抗原が関与するとは考えられない条件下に直接神経細胞体を冒すグルタメート毒性に対して、Cop-1による免疫処置が活性であるという例3における本所見は、抗-Cop-1-反応性T細胞がそれらの異質性により、網膜に関連する抗原を含む様々な抗原に応答することを示唆している。Cop-1-反応性T細胞は直接グルタメート自体と相互作用することができる。このような相互作用は、Cop-1-反応性T細胞、又は内因性T細胞を保護的表現型に変換させることができる。
【０１６５】
Cop-1-反応性T細胞がガラス体内に注射されたグルタメート又は網膜内のマイクログリア活性化細胞と相互作用する可能性は、グルタメートの注射後24時間にガラス体内で観察される多数の侵入リンパ球によって支持される。Cop- 1を注射されたマウスでは侵入リンパ球にはある程度、Cop-1に特異的なリンパ球が包含されるように思われる。この観察は、Cop-1-反応性T細胞の受動移入がCop-1による能動免疫処置の場合と類似の効果を有するとの所見とともに、ワクチン化の効果は実際、体液性免疫又はCop-1自身よりも、むしろT細胞によって仲介されることを示唆している。グルタメートは一次的傷害からある時間を置いて現れる二次的変性のメディエーターである（Yolesら, 1998）ことから、直接的なグルタメート毒性の場合の24時間の処置ウインドウは、CNS外傷の場合、Cop-1処置の、ウインドウははるかに幅広いことを意味するものと思われる。Cop-1は毒性傷害がNMDAによって誘発された場合には保護作用を示さなかったことには興味をもって注目すべきである。これはNMDAが、アポトーシスの明瞭な徴候及びNMDA受容体アンタゴニストを用いる以外の治療の明らかな機会もなく、ほとんど直接的に死のシグナルを課することを示す本発明者の実験室からの研究と一致する。したがって、Cop-1による免疫処置がNMDA誘発毒性に対して無効であることは驚くべきことではない。抑制剤としてではなく、むしろ神経保護物質としてのCop-1の活性がその投与経路に依存するか否かを確立する問題がまだ残されている。また、CNS抗原に特異的なT細胞又はCop-1のような交叉反応性抗原に特異的なT細胞の局所的な蓄積がCNSの傷害後にどのようにして神経保護を仲介するかの決定も残されている。
【０１６６】
例3における研究で証明されたT細胞により仲介される神経保護は、神経細胞が変性を受けやすく神経保護に従いやすいCNS神経（Schwartzら, 2000a；Schwartzら, 2000b；Dobelら, 1999；Grunblattら, 2000）における慢性及び急性傷害の両者に適用可能であると考えられることが証明された。慢性的状態、緑内障はIOPに関連し、失明を招く原因であることが多い。しかしながら、この疾患はIOPが正常範囲内に留まっていても進行を続けることは共通して経験されることであり、機械的な圧迫のみが多分、視神経傷害の単独の理由ではなく、したがって、処置は、IOPの低下に加えて神経保護療法が包含されなければならない（総説に関しては、Osborneら, 1999；Schwartzら, 2000c；Weinrebら, 1999参照）。最近の研究では、たとえばグルタメートアンタゴニスト（Chaudharyら, 1998）又は一酸化窒素シンターゼ阻害剤（Neufeldら, 1999）を用いる処置が、IOPの上昇したラットモデルにおける網膜神経節細胞死を緩和することを示している。しかしながら、これらの薬剤による生理学的応答との干渉が、病原部位においては多分有益と考えられるが、正常な組織には望ましくない副作用を招いて有害である可能性があるという危険がある。したがって、臨床的観点からより好ましいアプローチは組織自身の防御機構を利用し増強することである。
【０１６７】
圧力が高いままでさえも達成される神経保護の本所見は、臨床的な観点からは大きな利点である可能性が大きい。これは、圧力を正常まで低下させても緑内障の患者には必ずしも安全ではなく、彼らに残された神経細胞は正常な細胞よりも脆弱である（Agis, 2000）。しかも、このような患者で安全とみなされる圧力まで、すなわち12 mmHgまでIOPを低下させることは実行不能と思われる。
【０１６８】
以上、本発明を十分に説明してきたが、本技術分野の熟練者には自明であるように、同じことが広範囲の均等なパラメーター、濃度及び条件内で、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、また煩雑な実験を要しないで実施できると理解されるべきである。
【０１６９】
本発明をその特定の実施態様に関して説明してきたがそれはさらに修飾できるものであることを理解すべきである。本出願は、一般的に本発明の原理に従うすべての変化、用途又は適用をカバーし、本発明が関する既知の慣用の実務のような、また上述の必須の特徴に適用されるような、また添付のクレームに従うような本開示からの逸脱を包含することを意図するものである。
【０１７０】
雑誌の論説若しくは抄録、公開された又は相当する米国特許若しくは外国特許出願、発行された米国特許若しくは外国特許、又はその他の参考文献を含む本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用文献中に提示されたすべてのデータ、表、図面及び明細書を含めてその全体が引用により本明細書に導入される。さらに、本明細書に引用された参考文献中に引用された参考文献の全内容も引用により、その全体が本明細書に導入される。
【０１７１】
既知の方法工程に関して、慣用の方法工程、既知の方法又は慣用方法は、本発明の態様、説明又は実施態様が関連技術中に開示、教示又は示唆されていることを何ら承認するものではない。
【０１７２】
特異的な実施態様の以上の記述は本発明の一般的な性質を完全に明らかにしているので、本技術分野の熟練者の知識（本明細書に引用した参考文献の内容も含めて）を適用することにより他者は、煩雑な実験を行わないで、また本発明の一般概念から逸脱することなく、このような特異的実施態様を容易に修飾及び／又は様々な応用への適合が可能である。したがってこのような適合及び修飾は本明細書に提示した教示及び指針に基づいて、開示された実施態様の意味及び均等の範囲内に包含される意図である。本明細書中のことばづかい及び用語は説明の目的であって限定を意図するものではないことを理解すべきであり、本明細書のことばづかい及び用語は、本技術分野における通常の技術者の知識と組み合わせ、本明細書に提示した教示及び指針に従って当業者により解釈されるべきである。
【０１７３】
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【０１７４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  視神経の軽度（図1A）又は重度（図1B）の傷害後直ちに不完全フロイトアジュバント（IFA）中PBS（図中にPBSと表示）又はIFA中Cop-1-特異的T細胞（Tcop1と表示）を注射したラットから摘出した網膜における標識された（生存）RGC／mm2の数を示すグラフである。
【図２】  図2A及び2Bは、分泌された神経栄養因子のELISAを表すグラフである。ラット抗-MBP（図2Aにおける白いバー）又は抗-Cop-1（図2Aにおける黒いバー）T細胞は刺激媒質中それらの特異的抗原とともに48時間培養した。T細胞の上清を集め、サンドイッチELISAに付した。グラフは各サンプル中に分泌されたNT3, BDNF, NGF及びNT-4/5の濃度を示す。抗-Cop-1T細胞によって分泌されたBDNF又はNT-3の量に対する抗-MBP T細胞によって分泌された量の比を図2Bに示す。ニューロトロフィン（NT）についての5回の独立した実験における平均の比±SDを示す。
【図３】  Cop-1による免疫処置がいかに二次的変性から視神経線維を保護するかを示すグラフである。軽度の視神経傷害の直後に、IFA中PBS又はIFA中Cop-1によってラットの皮下に免疫処置を行った。二次的変性の評価のため、挫滅傷害後2週目に傷害部位の遠位における視神経にニューロトレーサー染料4-Di-10-Aspを適用した。5日後にラットを屠殺し、それらの網膜を摘出して平坦にスライド上標本化した。各網膜の視神経円板からほぼ等距離に存在する4つの視野からの標識（生存）RGCを蛍光顕微鏡下に計数した。PBS注射の場合と比較して、Cop-1による免疫処置の神経保護作用は有意であった（P<0.05, Studentのt-検定）。結果は2回の実験をまとめたものである。各群は8〜10匹のラットを包含した。
【図４】  Cop-1による免疫処置がいかにグルタメートの毒性から視神経線維を保護するかを示すグラフである。マウスを完全フロイトアジュバント（CFA）中に乳化したCop-1によって免疫処置し、対照マウスにはCFA単独を注射した。ついで、各マウスの一方の眼には食塩水単独を注射し、他方の眼には200 nmoleのグルタメートを含有する食塩水を注射した。グルタメートの投与後7日目に、網膜を摘出して平坦にスライド上標本化した。標識（生存）網膜神経節細胞（RGC）を計数した。バーは、食塩水又はグルタメート含有食塩水のいずれかを投与されたCFA-処置マウス及び食塩水又はCop-1を含む食塩水のいずれかを投与されたCFA-Cop-1-処置マウスの対照に対する％として、残ったRGCを示す。
【図５】  図5A及び5Bは、pMOGによる免疫処置（図5A）又は抗-MBP T細胞の受動移入（図5B）が、グルタメート毒性からマウスRGCを保護しないことを示している。図5Aにおいては、C57BL/6JマウスをL-グルタメート（200 nmole）の静脈内注射によってグルタメートの毒性に直接暴露する14日前にpMOGで免疫処置した。4日後、RGCをFluoroGoldで逆行的に標識し、さらに3日後に網膜の摘出及び計数を行った（例3、実験2の材料と方法の項参照）。RGCの生存は平均±SEM／mm2 として表す。グルタメート注射後のRGCの生存には、CFA中pMOGで処置した群（n=8）とCFA中PBSで処置した対照群（n= 7）との間に有意差は認められなかった。図5Bでは、グルタメートをLewisラットに静脈内投与した。4日後、RGCに4-Di-10-Aspを適用して標識し、5日後に網膜の摘出及び計数を行った。T細胞処置群における網膜細胞の生存率は対照群におけるそれと有意差は示さなかった [1 mm2あたりのRGC数、平均±SEM  (各群n=6)]。
【図６】  図6A及びBは、グルタメートのガラス体内への注射後における白血球の浸潤を示している。グルタメートはC57Bl/6マウスのガラス体内に注射した。24時間後、眼を摘出し、組織学的に処置した。グルタメート注射（図6A）及び対照マウス（図6B）の両者のH & E染色網膜切片（10μmの厚さ）を示す。バー=200μm。
【図７】  視神経の傷害後における網膜神経節細胞の生存率を示すグラフである。近交系成熟Balb/cのRGCをFluoroGoldで逆行的に標識し（例3、実験2の材料と方法の項参照）、10日後、CFA中に乳化した50μg のCop-1で免疫処置した。対照のマウスにはCFA中PBSを注射した（各群n= 8〜12）。RGCの標識後3日目にマウスを視神経の眼窩内部分の重篤な挫滅傷害に付した。傷害の2週後に網膜を摘出し、それらの標識RGCを計数した（例3、実験2の材料と方法の項参照）。非免疫処置対照に比較して、CFA中Cop-1で免疫処置したマウスにおいて生存率は有意に高かった（P<0.001, Studentのt検定）。
【図８】  図8A〜Dは、Cop-1での能動免疫処置によるグルタメート毒性からの神経保護を示す。図8Aにおいては、グルタメートの注射10日前に、マウスをCFA中Cop-1の皮下注射により免疫処置する（5 mg/mL, 細菌）か、CFA中PBSを注射した。一つの実験の結果を示す（各群n=5）。1 mm2あたりの生存RGC数（平均±SEM）はCFA中PBSを注射したマウス又はグルタメートのみを投与されたマウスよりCop-1で免疫処置したマウスにおいて有意に高かった（P<0.02, 両側t-検定）。CFA中PBSの注射ではRGCの数に何らの影響も検出されなかった。実験は3回反復したが、同じ結果が得られた。Cop-1処置群で計13匹の動物及びPBS処置群で計15匹の動物が試験された。図8Bでは、グルタメートのガラス体内注射直後に、マウスをCFA中乳化Cop-1で免疫処置した（5 mg/mL, 細菌）。1 mm2あたりの生存RGC数（平均±SEM）を1週後に測定した。一つの実験における結果を示す。Cop-1による免疫処置の効果は有意であった（P<0.05, 両側t-検定；Cop-1群でn=12, 対照群でn=8）。この実験は、Cop-1免疫処置群で11匹のマウス及びCFA中PBS注射群で8匹のマウス（5 mg/mL, 細菌）を用いて反復した。図8Cにおいては、グルタメート傷害及び直ちに0.5 mg/mLの細菌含有アジュバント中Cop-1による免疫処置後のRGCの生存。1 mm2あたりの生存RGC数は、グルタメート注射マウス（n=5）よりもCop-1免疫処置マウスで有意に高かった（P<0.04, 両側t-検定）。図8Dでは、グルタメート傷害前、直後、又は48時間後に行われた免疫処置後のRGCの生存を示す。バーは、反復した実験から収集した各処置で試験されたすべてのマウスについて得られたプールした結果を示す。免疫処置をグルタメート傷害の48時間後に実施した場合は、何ら作用は見られなかった。
【図９】  Cop-1の免疫処置はNMDA毒性からマウスを保護できなかったことを示している。NMDA（75 nmole）の注射10日前に、マウス（n=5〜7）をCFA中Cop-1又はCFA中PBSの皮下注射によって免疫した。RGCの標識及び蛍光顕微鏡下での生存RGCの計数は図5Aについて記載した通りとした。正常な眼における生存率の百分率として表したCop-1免疫処置マウスにおけるRGCの生存率はPBS注射マウスの場合と類似し（ｐ=0.55, Studentのt検定）、神経保護作用は得られないことを示している。
【図１０】  Cop-1-反応性T細胞がグルタメート毒性からRGCを保護することを示す。グルタメート（200 nmole）の注射後直ちに、マウスにCop-1-反応性T細胞又はPBSを注射した。染料の適用、RGCの調製及び計数、ならびにRGCの生存率の計算は図5Bについて記載した通りに行った。PBSを注射した対照マウスの網膜におけるよりもCop-1-反応性T細胞を注射したマウスの網膜で有意に高い標識RGCが観察された（ｐ<0.0007, Studentのt検定）。
【図１１】  図11A〜Dは、慢性的に増大したIOP及びCop-1免疫処置の、Lewisラットにおける網膜神経節細胞の生存率に対する影響を示す。図11Aでは、上強膜の及び四肢の静脈の閉塞を生じるレーザー焼灼はIOPの上昇についで網膜神経節細胞の死を招来する。レーザー照射3週後の平均IOPは、静脈の閉塞を生じたラットにおいて30.4±0.42 mmHg（平均±SEM, n=5）であり、ナイーブなラットでは15.8±0.2 mmHg（n=7）であった。図11Bには静脈の閉塞3週後に、ナイーブなラットよりもレーザー処置ラットにおいて、19.9±0.51％（平均±SEM）少ない、網膜神経節細胞の数が計数された。図11Cには静脈の閉塞後直ぐのCop-1による免疫処置が網膜神経節細胞の喪失を低下させることを示している。レーザー照射直後、ラットをCFA中Cop-1（200μg）で免疫処置するか（n=15）、又はCFA中PBSを注射した（n=13）。3週後に網膜を摘出し、全体をスライド上標本化して、ローダミンデキストランアミンで予め標識された網膜神経節細胞数を計数した。バーは、ラットの各群における網膜神経節細胞の喪失をナイーブなラットにおける網膜神経節細胞数の百分率として計算して示す（平均±SEM）。2つの群における網膜神経節細胞数の差は有意であった（P<0.0001, 両側t-検定）。図11Dでは、網膜神経節の喪失に対するCop-1による遅延免疫処置の効果を、静脈閉塞10日後にラットを免疫処置することによって調べた。バーは、Cop-1（n=5）又はPBS（n=4）で処置された群における網膜神経節細胞の喪失をナイーブな動物における網膜神経節細胞数の百分率として計算して示す（平均±SEM）。Cop-1による遅延免疫処置後に神経保護作用に向かう傾向が観察され、その差は片側t-検定でのみ有意であった（p=0.04）。
【配列表】
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0004328090.tif 000007
0004328090.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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