(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面上に載置し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２】
複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面上に載置し、基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理した単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによる反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項３】
複数のプローブ核酸を二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面上に固定し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてセンサ面上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによる反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項４】
複数のプローブ核酸を二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面上に固定し、基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理した単鎖状のターゲット核酸を試料としてセンサ面上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによる反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項５】
酵素が酸化還元酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
複合体に基質を加える際、補酵素、補欠分子または金属イオンなどのコファクターも加えるようにした請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸（ＮＡ）を検出する従来の手法として螢光法がある。この螢光法は、スライドガラスの表面に数百〜数万種類のプローブ核酸（固相プローブ）を固定して設け、このプローブ核酸に螢光物質で標識処理したターゲット核酸（液相プローブ）を試料として供給して、相補的な核酸どうしをハイブリダイズ（対合）させ、ハイブリダイズしなかったターゲット核酸を流し去り、プローブ核酸とターゲット核酸とがハイブリダイズして生成された複合体の螢光を、螢光レーザ顕微鏡やＣＣＤカメラからなる光学系およびこれに接続されたコンピュータなどを備えた装置を用いて検出して、その場所を特定するというものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記螢光法においては、発生する螢光の強度が微弱であり、その光を検出することが困難であるため、螢光レーザ顕微鏡として大がかりかつ高価なものを用いる必要があるとともに、検出信号の飽和によって定量性が低下するといった問題がある。
【０００４】
この発明は、上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を高感度かつ迅速にしかも安価な構成によって測定することができる核酸の検出方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、この発明の核酸の検出方法は、複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面上に載置し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしている（請求項１）。
【０００６】
上記核酸の検出方法においては、複数のプローブ核酸を樹脂製メンブレン上における位置とセンサ面における載置位置とを対応させておく。そして、センサ面上において酵素、好ましくは酸化還元酵素と基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを、二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面によって検出するようにしているので、どの位置のプローブ核酸においてｐＨが変化したかを把握することができ、これにより、ターゲット核酸を検出することができる。
【０００７】
したがって、従来の螢光法のように高価かつ大がかりな光学系を用いる必要がなく、安価かつ簡単な構成で核酸を検出することができる。そして、加える基質の量を適宜加減することにより、水素イオンの増加または減少量を調整することができ、高感度検出が可能になる。
【０００８】
また、上記核酸の検出方法においては、プローブ核酸をナイロンなどの樹脂製メンブレン上に固定し、これにターゲット核酸を加えるようにしているので、樹脂製メンブレンを取り替えるだけで、二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面については再利用が可能である。したがって、ランニングコストが安くなる。
【０００９】
さらに、上記核酸の検出方法においては、水素イオンを二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面によって検出するようにしており、その経時変化を把握することができる。
【００１０】
なお、前記プローブ核酸とターゲット核酸の組み合わせとしては、
プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡ
プローブＲＮＡとターゲットＲＮＡ
プローブＤＮＡとターゲットＲＮＡ
プローブＲＮＡとターゲットＤＮＡ
がある。
【００１１】
そして、上記核酸の検出方法において、請求項２に記載してあるように、単鎖状のターゲット核酸を酵素、好ましくは酸化還元酵素によって予め標識処理しておいてもよい。
【００１２】
また、上記核酸の検出方法において、請求項３または４に記載してあるように、センサ面上にプローブ核酸を直に固定し、このプローブ核酸にターゲット核酸を試料として加えるようにしてもよい。
【００１３】
さらに、上記核酸の検出方法において、請求項６に記載してあるように、複合体に基質を加える際、補酵素、補欠分子または金属イオンなどのコファクターも加えるようにしてもよい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。図１および図２は、この発明の第１の実施の形態を示す。まず、図１は、この発明の核酸の検出方法を実施するための装置の一例を示すもので、この図において、１は二次元ｐＨ分布測定装置、２はこの装置の上部に形成される平面視矩形状のセンサ面で、例えば２ｃｍ×２ｃｍ程度の大きさを有し、複数のｐＨセンサ素子２ａよりなり、ｐＨの二次元分布を検出できるように構成されている。この二次元ｐＨ分布測定装置としては、例えば特開平１０−３３２４２３号公報に示すように、特に、図６に示すようなＣＣＤを用いたｐＨの二次元分布を測定する二次元ｐＨ分布測定装置（化学ＣＣＤ装置）がある。この化学ＣＣＤ装置は、水素イオン濃度（ｐＨ）に対応して深さを変化するように構成されたポテンシャル井戸をセンサ素子として複数個二次元的に配置し、これらのポテンシャル井戸に電荷を注入して、ｐＨの大きさをこのポテンシャル井戸の大きさに応じた電荷に変換するように構成したものである。
【００１５】
そして、図１において、３は化学ＣＣＤ装置１からの出力信号を処理し、画像出力することができるコンピュータなどの画像出力装置で、センサ面２におけるｐＨ分布を二次元的に表示するカラーディスプレイ４を備えている。
【００１６】
次に、上記化学ＣＣＤ装置１を用いた核酸の検出方法の一例を、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの組み合わせを例に挙げて、図２をも参照しながら説明する。なお、図１の矢印Ｘは、処理プロセスの進行方向を示している。
【００１７】
まず、プローブＤＮＡ（固相プローブ）５とするＤＮＡをＰＣＲ増幅して採取する（図２中の符号Ａ参照）。
【００１８】
前記増幅された複数の互いに異なるプローブＤＮＡ５を、マイクロアレイヤー（スポッター）を用いてナイロンメンブレン６上にプロットし、ＵＶクロスリンカーで固定する（図２中の符号Ｂ参照）。ここで用いるナイロンメンブレン６は、例えば厚み数十〜数百μｍで、センサ面２とほぼ同じ大きさである。そして、複数のプローブＤＮＡ５を固定したナイロンメンブレン６を化学ＣＣＤ装置１のセンサ面２上に載置する（図２中の符号Ｄ参照）。この場合、ナイロンメンブレン６上に設けられた複数のプローブＤＮＡ５の載置位置は、画像出力装置３のメモリ内にデータとして記憶しておく。なお、４ａは、センサ面２を構成する複数のセンサ素子に対応する位置を示しており、この各位置に対応するようにプローブＤＮＡ５が位置している。
【００１９】
一方、ターゲットＤＮＡ（液相プローブ）８は、二重らせん構造のＤＮＡ７を熱またはアルカリ処理して単鎖状とするか、あるいは、直接単鎖状のＤＮＡを化学合成して作成する。その前後のいずれかにおいて標識処理を行う。具体的には、二重らせん構造のＤＮＡ７にポリメラーゼ反応を利用してビオチンなどのリンク剤９が結合したヌクレオチドを取り込ませて標識処理した後、熱またはアルカリで処理して単鎖状のターゲットＤＮＡ８とする。あるいは、単鎖状のＤＮＡを化学合成する際に末端をビオチンまたはジゴキシゲニンなどのリンク剤９によって標識処理しターゲットＤＮＡ８とする。あるいは、二重らせん構造のＤＮＡ７を熱またはアルカリで処理して単鎖状のターゲットＤＮＡ８とし、各ターゲットＤＮＡ８の末端をビオチンまたはジゴキシゲニンなどのリンク剤９によって標識処理し（図２中の符号Ｃ参照）、これを試料とする。
【００２０】
前記標識処理したターゲットＤＮＡ８を試料としてナイロンメンブレン６上に供給して、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとをハイブリダイゼーション操作を行う（図２中の符号Ｄ参照）。このとき、いくつかのターゲットＤＮＡ８は、プローブＤＮＡ５とハイブリダイズし、複合体１０を形成する。そして、洗浄液によってナイロンメンブレン６上を洗浄し、プローブＤＮＡ５と複合体１０を形成しなかったターゲットＤＮＡ８’を除去する（図２中の符号Ｄ参照）。
【００２１】
次いで、ビオチン化酵素（好ましくはビオチン化ベルオキシダーゼ）あるいはアビジン、ビオチン化酵素（好ましくはビオチン化ベルオキシダーゼ）を用いたＡＢＣ法により、あるいは、酵素標識抗ジゴキシゲニン抗体（好ましくは抗ジゴキシゲニン−ポリペルオキシダーゼ抗体）を用いた方法により、前記プローブＤＮＡ５とターゲットＤＮＡ８との複合体１０を、例えばペルオキシダーゼやグルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素１１で標識処理する（図２中の符号Ｅ参照）。なお、符号１１’は余剰の酸化還元酵素である。
【００２２】
そして、前記酸化還元酵素１１によって標識処理した複合体１０に、例えば過酸化水素とフェノール誘導体あるいはグルコースなどの基質１２を加え、酸化還元酵素と基質（必要によっては補酵素や金属イオンなどのコファクター）とによって酸化還元反応を起こさせる（図２中の符号Ｆ参照）。そして、この酸化還元反応によってＨ+ イオン１３が生じ、このＨ+ イオン１３は、センサ面２によって検出される。化学ＣＣＤ装置１では、センサ面２における各センサ素子におけるｐＨに関連した信号が１次データとして画像出力装置３に送られ、これを二次元情報に変換することにより、ディスプレイ４上において，ｐＨが変化した場所の色が変化してカラー表示され、コンピュータ処理により、ターゲットＤＮＡ８の塩基配列などが判断できる。また、複合体１０となったＤＮＡの位置を目視によっても確認することができ、試料中に含まれるターゲットＤＮＡ８を確認することができる。なお、図２において、４ａはｐＨが変化した部分を示し、また、１２’は余剰の基質を示している。
【００２３】
上述のように、この発明の核酸の検出方法においては、従来の螢光法のように高価かつ大がかりな光学系を用いる必要がなく、安価かつ簡単な構成で核酸を検出することができる。そして、加える基質の量を適宜加減することにより、Ｈ+ イオン１３の発生量を調整することができ、高感度検出が可能になる。
【００２４】
また、上記核酸の検出方法においては、プローブＤＮＡ５をナイロンメンブレン６上に固定し、これにターゲットＤＮＡ８を加えるようにしているので、ナイロンメンブレン６を取り替えるだけで、センサ面２、すなわち、化学ＣＣＤ装置１については再利用が可能である。したがって、ランニングコストが安くなる。
【００２５】
さらに、上記核酸の検出方法においては、ｐＨ変化を化学ＣＣＤ装置１のセンサ面２によって検出するようにしており、その経時変化を把握することができる。
【００２６】
図３は、この発明の第２の実施の形態を示し、この実施の形態においては、プローブＤＮＡ５を化学ＣＣＤ装置１のセンサ面２上に直接固定している。この第２の実施の形態におけるプローブＤＮＡ５の採取方法や固定方法やその後の処理は、第１の実施の形態における方法および処理と同様であるので、その詳細な説明を省略する。なお、図中の６ｂはセンサ面２を構成する複数のセンサ素子に対応する固定位置を示している。
【００２７】
上述の第１および第２の実施の形態においては、複合体１０を酸化還元酵素１１によって標識処理していたが、これに代えて、図４に示す実施の形態のように、ターゲットＤＮＡ８を酸化還元酵素１１によって標識処理してもよい。
【００２８】
上述の実施の形態は、いずれもＤＮＡについての検出方法であったが、この発明の核酸の検出方法は、ＲＮＡについても同様に適用することができ、この場合、ＲＮＡを逆転写反応を行ってターゲットＤＮＡやプローブＤＮＡを形成すればよく、後の操作は、上記各実施の形態と同様である。また、ＲＮＡをプローブＲＮＡとしてナイロンメンブレン６上あるいはセンサ面２上に固定することもできる。
【００２９】
上記実施の形態においては、ｐＨの変化を化学ＣＣＤ装置１によって検出するようにしていたが、この発明はこれに限られるものではなく、種々の二次元ｐＨ分布測定装置を用いることができる。例えば、特開平８−２１３５８０号公報や特開平８−３２０３０５号公報などに記載されている二次元ｐＨ分布測定装置や、特公平５−３３４４５号公報に記載されているＣＭＯＳ型センサ、あるいは、プローブＤＮＡ５の数が少ない場合には、実開平４−２４０６１号公報に記載されているＩＳＦＥＴアレイを用いることができる。さらに、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ６１（１９９９）１５４−１６２に記載されているように、複数のセンサ電極を設け、各電極に電圧を加えてピロール付加したプローブＤＮＡを、各電極に固定するようにしてもよい。この場合、電極の横にｐＨセンサを設ける必要がある。
【００３０】
また、基質１２と酸化還元反応を起こす酸化還元酵素１１として、グルコースディヒドロゲナーゼなどの脱水素酵素を用いてもよく、さらに、複合体１０に基質１２を加える際、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨなどの補酵素も加えるようにしてもよい。
【００３１】
さらに、ナイロンメンブレン６に代えて、ニトロセルロースのような他の樹脂製メンブレンを用いるようにしてもよい。
【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明の核酸の検出方法によれば、ＤＮＡなどの核酸を高感度かつ迅速にしかも安価な構成によって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この発明の核酸の検出方法を実施する装置の全体構成を概略的に示す図である。
【図２】  前記核酸の検出方法における操作手順の一例を説明するための図である。
【図３】  この発明の他の実施の形態を示す図である。
【図４】  この発明の核酸の検出方法における操作手順の他の例を説明するための図である。
【符号の説明】
１…二次元ｐＨ分布測定装置、２…センサ面、５…プローブ核酸、６…樹脂製メンブレン、８…ターゲット核酸、１０…複合体、１１…酵素、１２…基質、１３…水素イオン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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