(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）外膜調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、
ｂ）そのゲルから１９または２１ｋＤのバンドを切り出す工程を含む製造方法により入手可能な、１９／２１ｋＤの分子量を有するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜タンパク質であって、配列番号５に記載のＮ末端アミノ酸配列、配列番号６に記載の内部アミノ酸配列、および配列番号７に記載の内部アミノ酸配列を含む前記タンパク質。
【請求項２】
試験サンプル中のローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の検出のための方法であって、請求項１に記載のタンパク質を使用することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸配列、これらの配列を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子および生組換え運搬体、そのような核酸配列、ＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子および生組換え運搬体を含む宿主細胞、これらのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染に対するワクチン、その製造方法、ならびにローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の検出のための診断手段に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ブタ増殖性腸疾患（ＰＰＥまたはＰＥ）は、世界中の現代の養豚業における重要な疾患となっている。該疾患は、成長中の家畜群の１５％〜５０％を冒し、確認された問題家畜群における個々の動物の３０％までを冒す。現在、余分な飼料および施設時間経費における年間経済的損失は、罹患ブタ１匹当たり５〜１０米ドルであると見積もられている。ＰＰＥは、多種多様な臨床的徴候（死亡、衰弱および貧血動物、漿液性、濃い又は真っ赤な下痢、機能低下、食欲低下および運動に対する抵抗、成長遅延ならびにＦＣＲの増加）の慢性および急性状態の一群である。しかし、２つの一貫した特徴がある。第１に、剖検時に認められるにすぎない病理学的変化として、小腸および結腸粘膜の肥厚がある。第２に、罹患腸の小腸上皮細胞内の細胞質内小湾曲細菌の存在が挙げられる。現在、これらの細菌がＰＰＥの病原体であると確認されており、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）と称されている。
【０００３】
何年にもわたり、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）は実質的に全ての動物［サル、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ、ならびにダチョウおよびエモー（ｅｍｏｅ）などの多様な他の動物を含む］を冒すことが判明している。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）は、真核生物の小腸上皮細胞内でのみ増殖するグラム陰性有鞭毛細菌であり、無細胞培養は記載されていない。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）は、該細胞内で維持され増殖するためには、分裂するクリプト細胞に侵入しなければならない。該細菌は細胞膜に結合し、侵入小胞を介して小腸上皮細胞に素早く侵入する。ついでこれは急速（３時間以内）に分解し、該細菌は該細胞質内で自由に繁殖し増殖する。該細菌が感染細胞の成熟を妨げ、分裂を継続し、形成不全クリプト細胞を形成するメカニズムは依然として不明である。
【０００４】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の感染、該疾患の治療および予防に関する現在の知見は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を無細胞培地内で培養できないことにより妨げられている。ラット小腸上皮細胞内でローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を共培養することに成功したという報告があるが、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対するワクチンが必要とされていることが明らかであるにもかかわらず、これはそのようなワクチンの開発につながっていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）が、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する防御免疫を単独で又は一緒になって誘導しうる３つの新規外膜タンパク質（ＯＭＰ）を産生することが、本発明において見出された。
【０００６】
それらの３つの新規外膜タンパク質を、１９／２１ｋＤ、３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質とする。該１９／２１ｋＤタンパク質は１９ｋＤ形および２１ｋＤ形の２つの異なる形態で見出され、一方のタンパク質は他方のタンパク質の修飾体であり、両者は同一のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
該３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質のアミノ酸配列は、配列識別番号配列番号２および４で示される。これらの２つのタンパク質をコードする遺伝子の配列を決定し、それらの核酸配列を配列識別番号配列番号１および３に示す。該１９／２１ｋＤタンパク質は、それぞれ７、１２および１２アミノ酸の３つの内部アミノ酸配列により特徴づけられる。これらのアミノ酸配列を配列番号５、６および７に示す。
【０００８】
多数の異なる核酸配列が１つの同一タンパク質をコードしうることが、当技術分野においてよく知られている。この現象は、一般には、アミノ酸をコードする各トリプレットの２番目および特に３番目の塩基における、ゆらぎとして知られている。この現象は、同一タンパク質を尚もコードする２つの核酸配列に関する約３０％の非相同性を引き起こす。したがって、約７０％の配列相同性を有する２つの核酸配列は尚も１つの同一タンパク質をコードしうる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
したがって、１つの実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸配列およびそのタンパク質の免疫原性断片をコードするその核酸配列の一部であって、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも７０％の相同性レベルを有する核酸配列またはその一部に関する。
【００１０】
好ましくは、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸配列または該核酸配列の一部は、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する。より一層好ましいのは、９８％または更には１００％の相同性レベルである。
【００１１】
また、この実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸配列およびそのタンパク質の免疫原性断片をコードするその核酸配列の一部であって、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも７０％の相同性レベルを有する核酸配列またはその一部に関する。
【００１２】
好ましくは、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸配列または該核酸配列の一部は、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する。より一層好ましいのは、９８％または更には１００％の相同性レベルである。
【００１３】
ヌクレオチド相同性のレベルは、コンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を用いて、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．において見出されるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することにより測定することができる。このプログラムに関する参考文献としては、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１７４：２４７−２５０（１９９９）が挙げられる。用いるパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである：マッチに関するリウォード（ｒｅｗａｒｄ）：＋１、ミスマッチに関するペナルティー：−２、オープン・ギャップ：５、伸長ギャップ：２、ギャップｘ ドロップオフ（ｄｒｏｐｏｆｆ）：５０。
【００１４】
また、本発明のこの実施形態の１つの形態は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む新規ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質またはそのポリペプチドの免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。
【００１５】
その実施形態の好ましい形態においては、その核酸配列は、配列番号１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、９８％または更には１００％の相同性を有する。
【００１６】
また、本発明のこの実施形態の１つの形態は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する新規ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質または該ポリペプチドの免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。
【００１７】
その実施形態の好ましい形態においては、その核酸配列は、配列番号３に記載の核酸配列に対して少なくとも９０、より好ましくは９５％、９８％または更には１００％の相同性を有する。
【００１８】
本発明は、新規ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質をコードする核酸配列を開示するものであるため、これらのタンパク質を十分な量で得ることが今や初めて可能となった。これは、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させるための発現系を用いて行うことができる。したがって、より好ましい実施形態において、本発明は、本発明の核酸配列を含むＤＮＡ断片に関する。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、本発明の核酸配列がクローニングされるプラスミドでありうる。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、後記のとおり、プライマーとして使用してＤＮＡ量を増加させるのに有用である。
【００１９】
該核酸配列の発現のための必須要件は、該核酸配列に機能的に連結した適当なプロモーターであり、この場合、該核酸配列は該プロモーターの制御下にある。プロモーターの選択は、タンパク質発現のための宿主細胞として使用する細胞内で遺伝子転写を指令しうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモーターに及ぶことが、当業者に明らかである。
【００２０】
したがって、この実施形態の更に好ましい形態は、機能的に連結したプロモーターの制御下に配置された本発明のＤＮＡ断片または核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば、標準的な分子生物学的技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）により得ることができる。機能的に連結したプロモーターは、連結している核酸配列の転写を制御しうるプロモーターである。そのようなプロモーターは、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）プロモーター、例えば、該１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤ遺伝子のインビボ発現に関与するプロモーターでありうる。ただし、そのプロモーターは、発現に使用する細胞内で機能的でなければならない。それはまた、異種プロモーターでありうる。該宿主細胞が細菌である場合、使用しうる有用な発現制御配列には、Ｔｒｐプロモーターおよびオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーターおよびオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．およびＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージラムダプロモーターおよびオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーターおよびオペレーター、選択された宿主細胞に適合した終結配列および他の発現増強配列および発現制御配列が含まれる。該宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御配列には、例えば、α−交配因子が含まれる。昆虫細胞の場合、バキュロウイルスのポリヘドロンまたはｐ１０プロモーターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。該宿主細胞が哺乳類由来の場合、例示的な有用な発現制御配列には、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）またはメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２，１９８２）または熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）が含まれる。
【００２１】
細菌、酵母、真菌、昆虫および哺乳類細胞発現系は、非常に頻繁に使用されている系である。そのような系は当技術分野においてよく知られており、一般には、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡから商業的に入手可能である。これらの発現系の他には、寄生体に基づく発現系が非常に魅力的な発現系である。そのような系は、例えば、公開番号２  ７１４  ０７４を有するフランス国特許出願および米国ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ  ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．およびＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）に記載されている。
【００２２】
本発明のこの実施形態の更に一層好ましい形態は、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生組換え運搬体（Ｌｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｒｒｉｅｒ）（ＬＲＣ）に関する。そのような運搬体は、例えば、細菌またはウイルスである。これらのＬＲＣは、追加的な遺伝情報（この場合には、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列）がクローニングされている微生物またはウイルスである。そのようなＬＲＣに感染した動物は、該運搬体の免疫原に対してだけではなく、該遺伝暗号（例えば、１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤ遺伝子）が該ＬＲＣ内に追加的にクローニングされたタンパク質の免疫原性部分に対しても免疫原性応答を引き起こす。細菌ＬＲＣの一例として、当技術分野で公知の弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が好ましく使用されうる。生組換え運搬寄生体は、とりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２：１１２１−１１３０（１９９８））に記載されている。また、ＬＲＣウイルスは、標的細胞内に該核酸配列を輸送する手段として使用することができる。生組換え運搬ウイルスはベクターウイルスとも称される。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスとしては、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２）、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）およびレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄら；Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．およびＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ−１９８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９（１９８９））が挙げられる。
【００２３】
該宿主動物において本発明の挿入核酸配列の発現を誘導しうる選択された細菌、寄生虫またはウイルスのゲノム内に組換え核酸配列を導入するためには、当技術分野でよく知られているインビボ相同組換えの技術を用いることができる。
【００２４】
最後に、本発明のこの実施形態のもう１つの形態は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むＤＮＡ断片またはそのような核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子（該核酸配列は、機能的に連結したプロモーターの制御下にある）を含む宿主細胞に関する。この形態はまた、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を含有する生組換え運搬体を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌に基づくプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）または細菌発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ）またはバクテリオファージと組合された、細菌由来の細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種でありうる。該宿主細胞はまた、酵母特異的ベクター分子と組合された真核生物由来の細胞（例えば、酵母細胞）、またはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組合された高等真核細胞、例えば昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））、例えばＴｉ−プラスミドに基づくベクターまたは植物ウイルスベクターと組合された植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら；Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））、同様に適当なベクターまたは組換えウイルスと組合された哺乳類細胞、例えばＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはクランデルネコ（Ｃｒａｎｄｅｌｌ  Ｆｅｌｉｎｅ）腎細胞でありうる。
【００２５】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明の新規タンパク質、すなわち、該１９／２１ｋＤタンパク質、該３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質、ならびにそれらの免疫原性断片に関する。
【００２６】
免疫原性断片の概念は後記で定義する。
【００２７】
この実施形態の１つの形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質、および該タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００２８】
好ましい形態においては、該実施形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性の配列相同性を有するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質、およびそのようなタンパク質の免疫原性断片に関する。より一層好ましいのは、９８％または更には１００％の相同性レベルである。
【００２９】
この実施形態のもう１つの形態は、とりわけ、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質、および該タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３０】
好ましい形態は、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性の配列相同性を有するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質、およびそのようなタンパク質の免疫原性断片に関する。より一層好ましいのは、９８％または更には１００％の相同性レベルである。
【００３１】
この実施形態の更にもう１つの形態は、
ａ）外膜調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、
ｂ）そのゲルから１９または２１ｋＤのバンドを切り出す工程を含む製造方法により入手可能な、１９／２１ｋＤの分子量を有するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜タンパク質、およびそのタンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３２】
実施例１において、これらの工程の実施方法の一例を詳しく説明する。まず、感染ブタ回腸からローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を単離する工程、ついで、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜タンパク質調製物を得るための方法を説明する。最後に、「外膜タンパク質の配列決定」の項で、１９または２１ｋＤのバンドを該ゲルから単離するための方法を説明する。
【００３３】
好ましい形態においては、このローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片は、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同な内部アミノ酸配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同な内部アミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同な内部アミノ酸配列を有する。
【００３４】
より好ましい形態においては、このローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片は、配列番号５、６または７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性の配列相同性を有する。より一層好ましいのは、９８％または更には１００％の相同性レベルである。
【００３５】
タンパク質相同性のレベルは、コンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を用いて、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．において見出されるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することにより測定することができる。このプログラムに関する参考文献としては、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）が挙げられる。用いるマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６２」。用いるパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである：オープン・ギャップ：１１、伸長ギャップ：１、ギャップｘ ドロップオフ（ｄｒｏｐｏｆｆ）：５０。
【００３６】
本発明に含まれる特定のタンパク質の場合、個々のローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）株間で自然変異が存在しうると理解されるであろう。これらの変異は、全体の配列中のアミノ酸の相違により又は該配列中の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により示されうる。生物学的および免疫学的活性を実質的に改変しないアミノ酸の置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら，“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７９）に記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化中に頻繁に生じた置換としては、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、ＩＩｅ／Ｖａｌが挙げられる（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照されたい）。他のアミノ酸の置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／ＩＩｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、タンパク質を迅速かつ高感度に比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）相同タンパク質間の機能的類似性を測定するための方法を開発した。本発明の代表的な実施形態のそのようなアミノ酸置換ならびに欠失および／または挿入を有する変異は、生じるタンパク質がそれらの免疫反応性を保有している限り、本発明の範囲内に含まれる。これは、種々の野外分離体から単離された場合の本発明のローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質が、同じ免疫学的特性を有する同じタンパク質を表す一方で約７０％の相同性レベルを有しうる理由を説明するものである。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染に対して又は少なくとも該感染の臨床的徴候に対して免疫応答を誘導しうるタンパク質を尚も与える、本発明の或るタンパク質のアミノ酸配列内の変異は、「該免疫原性に実質的に影響を及ぼさない」とみなされる。
【００３７】
しかし、タンパク質を、例えばワクチン接種の目的に又は抗体を産生させるために使用する場合には、必ずしも該全タンパク質を使用する必要はない。また、単独で又は担体（例えばＫＬＨ）と共役してそのタンパク質に対する免疫応答を誘導しうる、そのタンパク質の断片（いわゆる免疫原性断片）を使用することが可能である。「免疫原性断片」は、宿主において免疫応答を誘導する能力を尚も保有する（すなわち、Ｂ−またはＴ−細胞エピトープを含む）、完全長タンパク質の断片であると理解される。現在、種々の技術を利用して、抗原断片（決定基）をコードするＤＮＡ断片を容易に同定することが可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ８６／０６４８７、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））により記載されている方法（いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法）は、エピトープ（免疫学的に重要な該タンパク質の領域）検出のための、実施容易で、迅速で十分に確立された方法である。該方法は、世界中で用いられており、それ自体が当業者によく知られている。この（実験的）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適している。また、いずれかのタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられると、現在公知のエピトープに対するそれらの配列上および／または構造上の一致に基づいて、免疫学的に重要なエピトープとして特定のポリペプチド断片を示すことが、コンピューターアルゴリズムにより可能である。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））による親水性の基準とＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：４５−１４８（１９８７）および米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造的観点との組合せに基づく。同様に、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性の基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）および米国特許出願ＮＴＩＳ  ０７／００５，８８５）の助けによりコンピューターにより、該配列からＴ細胞エピトープを予想することが可能である。概要は、一般的原理に関してはＳｈａｎ  Ｌｕ，Ｔｉｂｔｅｃｈ  ９：２３８−２４２（１９９１）に、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）に、概説としてはＬｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：３−７（１９９２）に、ＨＩＶエピトープに関してはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：２４１２−２４１８（１９９１）に記載されている。
【００３８】
したがって、本発明のもう１つの実施形態の１つの形態は、前記のとおりの本発明の１以上のタンパク質またはその免疫原性断片と医薬上許容される担体とを含む、ブタに対してローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を防御しうるワクチンに関する。
【００３９】
本発明の更にもう１つの実施形態は、ワクチンとして使用するための本発明のタンパク質に関する。
【００４０】
更にもう１つの実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染に対するワクチンの製造のための、本発明のタンパク質の使用に関する。
【００４１】
本発明のワクチンの製造方法の１つは、感染腸壁から採取した粘膜擦り取りにより得た細菌から本発明のタンパク質または免疫原性断片を生化学的に精製することによるものである。しかし、これは、非常に時間のかかるワクチン製造方法である。
【００４２】
したがって、本発明のタンパク質または免疫原性断片をコードする遺伝子の発現産物をワクチン中で使用することが、はるかに簡便である。該３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、本発明で示されている。該１９／２１ｋＤタンパク質をコードする遺伝子は、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）に記載の混合プローブハイブリダイゼーションを用いて、容易に位置決定し単離することができる。配列番号５、６および７に示すアミノ酸配列は、以下の配列を有する混合プローブの基礎を形成する。
【００４３】
【表１】
0004237960.tif 000002
【００４４】
これらの配列を使用して、該１９／２１ｋＤタンパク質をコードする遺伝子を位置決定し、該３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質をコードする遺伝子を単離したのと同様にして該遺伝子を単離することができる。
【００４５】
これらの遺伝子の発現産物に基づくそのようなワクチンは、本発明の１以上のタンパク質または本発明のその免疫原性断片を後記の医薬上許容される担体と混合することにより容易に製造することができる。
【００４６】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片を発現しうる前記の生組換え運搬体を含みうる。胃上皮に感染する例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）運搬体またはウイルス運搬体に基づくそのようなワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の自然感染態様により近いという、サブユニットワクチンより優れた利点を有する。さらに、それらの自己増殖は１つの利点である。なぜなら、免疫化のために、少量の該組換え運搬体だけしか必要でないからである。
【００４７】
前記のワクチンはすべて、能動ワクチン接種に資する。すなわち、本発明の１以上のタンパク質またはその免疫原性断片により、該宿主の免疫系が、これらのタンパク質に対する抗体を産生するように誘導されるのである。あるいは、そのような抗体を、例えばウサギにおいて産生させたり、あるいは後記の抗体産生細胞系から得ることができる。ついでそのような抗体を宿主動物に投与することができる。このワクチン接種方法、すなわち、受動ワクチン接種は、動物が既に感染しており自然免疫応答を誘導する時間が無い場合に選択されるワクチン接種である。それは、免疫低下性動物にワクチン接種するのにも好ましい方法である。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する投与抗体は、これらの場合、該細菌に直接結合しうる。これは、それがローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の増殖を直ちに減弱または停止するという利点を有する。したがって、本発明のこの実施形態の１つの形態は、本発明の３つのローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質のいずれかに対する抗体を含むワクチンに関する。
【００４８】
ワクチンはまた、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を含む前記の宿主細胞に基づきうる。
【００４９】
もう１つの効率的なワクチン接種方法は、関連抗原をコードするＤＮＡでの直接ワクチン接種である。タンパク質をコードするＤＮＡでの直接ワクチン接種は、多数の異なるタンパク質に関して成功している（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３）に概説されているとおりである）。このワクチン接種方法は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染に対するブタのワクチン接種に非常に有効である。したがって、本発明のこの実施形態の更に他の形態は、本発明のタンパク質または本発明の免疫原性断片をコードする核酸配列を含むワクチン、およびそのような核酸配列を含むＤＮＡ断片を含むワクチンに関する。この実施形態の更に他の形態は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。ＤＮＡワクチンは、例えば無針注射器を使用する皮内投与により容易に投与することができる。この投与方法は、ワクチン接種される動物の細胞内に直接的に該ＤＮＡを運搬する。１〜１００μｇのマイクログラム範囲のＤＮＡ量が非常に良好な結果を与える。
【００５０】
もう１つの実施形態においては、本発明のワクチンは更に、他のブタ病原生物およびウイルスに由来する１以上の抗原、またはそのような抗原をコードする遺伝情報を含む。そのような生物およびウイルスは、好ましくは、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）よりなる群から選ばれる。
【００５１】
本発明の全てのワクチンは医薬上許容される担体を含む。医薬上許容される担体は、例えば無菌水または無菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態においては、該担体は、例えばバッファーでありうる。
【００５２】
ワクチンの製造方法は、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片と医薬上許容される担体とを混合することを含む。
【００５３】
また、本発明のワクチンは、好ましい態様においては、アジュバントを含有しうる。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質を含む。多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの具体例としては、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（登録商標）、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、およびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモ重合体）またはＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅが挙げられる。該ワクチンはまた、いわゆる「ビヒクル」を含みうる。ビヒクルは、該ポリペプチドがそれに共有結合することなく付着している化合物である。しばしば使用されるビヒクル化合物としては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、シリカ、カオリンおよびベントナイトが挙げられる。該抗原を部分的に包埋するそのようなビヒクルの特別な形態は、いわゆるＩＳＣＯＭ（ＥＰ  １０９，９４２、ＥＰ  １８０，５６４、ＥＰ  ２４２，３８０）である。また、該ワクチンは、１以上の適当な界面活性化合物または乳化剤、例えばＳｐａｎまたはＴｗｅｅｎを含みうる。
【００５４】
しばしば、例えば分解し易いポリペプチドの分解を防ぎ、該ワクチンの貯蔵寿命を増加させ、あるいは凍結乾燥効率を改善させるために、該ワクチンを安定化剤と混合する。有用な安定化剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。また、該ワクチンを、生理的に許容される希釈剤に懸濁させることができる。言うまでもなく、アジュバント化、ビヒクル化合物または希釈剤の添加、ポリペプチドの乳化または安定化のための他の方法も、本発明に含まれる。
【００５５】
本発明のワクチンは、１〜１００マイクログラムの量で非常に適切に投与されうるが、原則として、より少ない用量が用いられうる。１００マイクログラムを超える用量は、免疫学的には非常に適しているが、商業的理由からはそれほど魅力的なものではない。
【００５６】
生弱毒化組換え運搬体（例えば、前記のＬＲＣ−ウイルスおよび細菌）に基づくワクチンは、該感染中にそれ自体で増殖するため、それよりはるかに低い用量で投与されうる。したがって、非常に適切な量は、細菌およびウイルスに関してそれぞれ１０３および１０９  ＣＦＵ／ＰＦＵの間の範囲となろう。
【００５７】
多数の投与方法を適用することができる。例えば、該ワクチンの筋肉内投与による全身投与が、適当な投与方法である。この経路に従う場合には、全身投与のための当技術分野で公知の標準的な方法が良く適している。経口投与も、有効な投与方法である。なぜなら、該感染は消化管感染だからである。好ましい経口投与方法は、非常に酸性な胃環境中でのみ分解する当技術分野で公知で頻繁に使用されるカプセル内に該ワクチンをパッケージングすることである。また、胃のｐＨを一時的に増加させるために、該ワクチンを、当技術分野で公知の化合物と混合することが可能であろう。
【００５８】
例えば該ワクチンの筋肉内投与による全身投与も適している。この経路に従う場合には、全身投与のための当技術分野で公知の標準的な方法が良く適している。
【００５９】
疾患に対する防御の観点からは、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染の迅速かつ正確な診断が重要である。したがって、本発明のもう１つの目的は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染の検出に適した診断手段を提供することである。
【００６０】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の検出のための診断試験は、例えば、被検動物から単離した細菌ＤＮＡと、該１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤ遺伝子のコード配列に基づく特異的プローブまたはＰＣＲプライマーとの反応に基づく。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ＤＮＡが該動物において存在する場合には、これは、例えば、特異的ＰＣＲプライマーに特異的に結合し、ついでＰＣＲ反応で増幅される。ついで該ＰＣＲ反応産物は、ＤＮＡゲル電気泳動において容易に検出されうる。該ＤＮＡは、被検動物の消化管から採取したスワブ中に存在する微生物から最も容易に単離されうる。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ＤＮＡによる選択的ＰＣＲ反応用のプライマーの長さを決定するための方法は、標準的なＰＣＲテキストに記載されている。少なくとも１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプライマーが頻繁に使用されるが、１５、より好ましくは１８ヌクレオチドを超えるプライマーが、ある程度はより選択的である。特に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有するプライマーが非常に一般的に適用されうる。ＰＣＲ技術は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５（１９９５）に詳細に記載されている。したがって、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸、または少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８、より一層好ましくは２０、２２、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド（その順序で好ましくなる）の長さを有するそれらの核酸の一部であって、配列番号１または３に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する該核酸配列またはそれらの一部も、本発明の一部である。そのような核酸配列をＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用して、それらがコードするＤＮＡの量を増加させることができる。これは、例えば前記の組織におけるローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の検出のための診断手段として使用する特異的ヌクレオチド配列の迅速な増幅を可能にする。
【００６１】
ＤＮＡに基づくもう１つの試験は、スワブから得た細菌物質の増殖、およびそれに続く古典的ＤＮＡ精製、およびそれに続く、放射能標識または色標識された１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質特異的ＤＮＡ断片での古典的ハイブリダイゼーションに基づくものである。ＰＣＲ反応およびハイブリダイゼーション反応は共に、当技術分野でよく知られており、とりわけ、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。
【００６２】
したがって、本発明の１つの実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ＤＮＡの検出のための診断試験に関する。そのような試験は、本発明の核酸配列またはその断片（該１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質をコードするＤＮＡに特異的なもの）を含む。そのＤＮＡに特異的な断片は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ＤＮＡに対する相同性がより高いため、他の細菌のＤＮＡよりローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ＤＮＡに対して、比較しうる条件下、より良好に結合する断片（例えば、前記のとおりの少なくとも１２ヌクレオチドのプライマー）であると理解される。
【００６３】
血清中のローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗体の検出のための診断試験は、例えば、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその抗原断片がＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁にコートされた単純な標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ試験でありうる。そのような抗体の検出方法は、例えば、１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその抗原断片を被検哺乳動物からの血清と共にインキュベートし、ついで例えば、関連哺乳動物抗体に対する標識抗体と共にインキュベートするものである。ついで色反応が、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の存在または不存在を示しうる。診断試験系のもう１つの例は、例えば、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその抗原断片を含むウエスタンブロットを被検哺乳動物の血清と共にインキュベートし、ついで該ブロットを分析するものである。
【００６４】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の検出のための診断試験に関する。そのような試験は、本発明のタンパク質またはその断片を含む。
【００６５】
また、本発明は、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質またはその抗原断片と共に血清をインキュベートすることを含む、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の血清中での検出方法に関する。
【００６６】
また、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原の特異的１９／２１ｋＤ、３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質の抗原物質の検出に基づく従ってローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染の検出に適した診断試験は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ試験でありうる。そのような試験の一例においては、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁を、該１９／２１ｋＤ、３７ｋＤまたは５０ｋＤタンパク質に対する抗体でコートする。被検物質と共にインキュベートした後、標識された抗ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗体を該ウェルに加える。ついで色反応が、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）由来の抗原物質の存在を示す。したがって、本発明の更にもう１つの実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の抗原物質の検出のための診断試験に関する。そのような試験は、本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体を含む。
【００６７】
前記で特徴づけられたとおりに表される本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断片は、ポリクローナル、単一特異性またはモノクローナルでありうる抗体（またはその誘導体）の製造に使用することができる。ポリクローナル抗体が望ましい場合には、ポリクローナル血清を製造し加工するための技術が当技術分野で公知である（例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｔｅｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）。本発明のポリペプチド（またはその変異体または断片）対して反応性であるモノクローナル抗体は、同様に当技術分野で公知の技術により近交系マウスを免疫することにより製造することができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）。
【００６８】
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明の１９／２１ｋＤ、３７ｋＤもしくは５０ｋＤタンパク質またはその抗原性断片に対する抗体と共に血清、体液の組織をインキュベートすることを含む、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）からの抗原物質の検出方法に関する。
【００６９】
最後に、本発明の１つの実施形態は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）タンパク質をコードする核酸、または少なくとも２０、好ましくは２５、３０、３５または４０ヌクレオチド（その順序で好ましくなる）の長さを有するそれらの核酸の一部であって、配列番号１または３に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する該核酸配列またはそれらの一部に関する。そのような核酸配列をＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用して、それらがコードするＤＮＡの量を増加させることができる。これは、例えば前記の組織におけるローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の検出のための診断手段として使用する特異的ヌクレオチド配列の迅速な増幅を可能にする。
【００７０】
【実施例】
実施例１：
感染ブタ回腸からのローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の分離
組織病理学的に及び抗酸Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色により確認されたローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染回腸を、ＰＥで死亡したブタから集め、−８０℃で保存した。融解後、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細菌を、該感染腸壁から採取した粘膜擦り取り物から分離した。Ｌａｗｓｏｎら（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：３０３−３２３（１９８５））に記載のとおりに、細胞内細菌を遊離させるために、該回腸擦り取り物をオムニミキサーを用いてＰＢＳ中で繰返しホモジナイズした。細胞残渣を除去するための低速遠心分離の後で得られた上清を５．０、３．０、１．２および０．８μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。ついで該濾液を８０００ｇで３０分間遠心分離して、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細菌の小さなペレットを得た。これらの細菌を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いて更に精製した。精製された細菌の種類をＰＣＲにより評価し（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２６１１−２６１５（１９９３））、一方、存在しうる混入細菌または腸残渣を示すために、分離された細菌の純度（＞９５％）を位相差顕微鏡検査により評価した。
【００７１】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜タンパク質調製物
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）からの外膜タンパク質（ＯＭＰ）を、Ｂａｒｅｎｋａｍｐら，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１４８：１１２７（１９８３）に記載されているのと実質的に同じ方法で精製した。簡単に説明すると、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配精製細菌を超音波により破壊した。膜断片を分画遠心により集め、Ｓａｒｋｏｓｙｌおよび不溶性Ｓａｒｋｏｓｙｌ  ＯＭＰを超遠心分離によりペレット化した。該ペレットを５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再溶解した。該ＯＭＰを４〜１２％  ＢＩＳ／ＴＲＩＳ  ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ）上で、該製造業者の説明に従い分離した（図１；パネルＡ）。比較のために、該隣接レーンに、全ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細胞タンパク質をローディングした。該タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０を使用して染色した。該外膜調製物においては、全細胞調製物と比較した場合の、５０、３７および１９／２１ｋＤａにおけるタンパク質バンドの明らかに認められる増強を観察することができた。このことは、これらのタンパク質がＯＭＰであることを示している。
【００７２】
精製された外膜タンパク質および全細胞に対して産生させた及び実験的攻撃後に産生させた抗血清
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の全細胞および精製ＯＭＰに対する抗血清をウサギにおいて産生させた。ｎ−ＧＮＥ（水：油＝４５：５５）中の全細胞（Ｒ２９１）またはＯＭＰ（Ｒ２７９）の調製物を、ウサギに筋肉内注射した。免疫前に耳静脈から血液サンプルを集めた。また、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配精製細菌で実験的に経口攻撃しローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染に典型的な臨床的徴候および死後病変を現したブタ（ＢＩＧ３０４Ｔ４）から、血清を得た。
【００７３】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜タンパク質の抗原の特徴づけ
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ＯＭＰの抗原性を調べるために、該ＯＭＰ調製物を４〜１２％  ＢＩＳ／ＴＲＩＳＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＯＶＥＸ）上にローディングした。分離後、該タンパク質を、基本的にはＴｏｗｂｉｎら（Ｎａｔｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６：４３５０−４３５４（１９７９））に従い、０．０２５ＭＴＲＩＳ／０．１９２Ｍ  グリシン／２０％  メタノール中のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロッティングした。膜を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有する０．０４Ｍ  ＰＢＳ中の１％脱脂粉乳でブロッキングし、ついでウサギＲ２７９抗血清（図１；パネルＢ）およびウサギＲ２９１抗血清（図１；パネルＣ）と共に１時間インキュベートし、ついでＰＢＳＴで２回洗浄した。ウサギ血清を、１％  脱脂乳／ＰＢＳＴ中、５００の希釈度で使用した。１：２０００希釈したＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを適用して、該ウサギ抗体を検出した。血清活性産物を、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、該製造業者のプロトコールに従い検出した。両方の抗血清（Ｒ２７９およびＲ２９１）は、前記のタンパク質を認識した。主として、全細胞タンパク質をＯＭＰ調製物と比較して、５０および３７ｋＤａのシグナルが再び増加し、このことはこれらの２つのタンパク質がＯＭＰであることを示している。
【００７４】
外膜タンパク質の配列決定
配列決定のために、ＢｉｏＲａｄＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩ系を該マニュアルに従い使用して、該ＯＭＰ懸濁液を分取１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。４つのタンパク質バンド（１９／２１、３７および５０ｋＤ）を該ゲルから切り出し、４℃でＥｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に輸送した。該全タンパク質のトリプシン消化後に得られた単離されたペプチドの及びＮ末端のタンパク質配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １２０Ａ  ＰＴＨ  Ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ上での自動エドマン分解により決定した。得られたタンパク質配列（表１）を、該コード遺伝子の増幅用のＰＣＲプライマーの作製に使用した。該タンパク質配列から、該１９ｋＤおよび２１ｋＤタンパク質は、基本的には、同一タンパク質に相当すると結論づけた。サイズの相違は、おそらく、翻訳後修飾によるものであろう。
【００７５】
外膜タンパク質遺伝子の増幅
ＯＭＰ遺伝子を増幅するために、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ  １００を該製造業者による記載のとおりに使用して、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ゲノムＤＮＡをＰｅｒｃｏｌｌ勾配精製細菌から単離した。得られたタンパク質配列に基づく縮重プライマーを使用して、このＤＮＡをＰＣＲにおいて使用した。プライマー９１１（ｇｇＩ  ｇｔＩ  ｔｇｇ  ｇａＹ  ｔｔＹ  ａａ）および９１２（ｔｃｃ  ｃａＩ  ｇｃＲｔａＲ  ｔｃＹ  ｔｔ）を使用して、５０ｋＤタンパク質をコードするＤＮＡを増幅した。プライマー９９０（ｔｃＲ  ａａＩ  ｇｃＲ  ａａＲ  ｔｔＩａｃＩ  ｃｃ）および１０２１（ｇｃＩ  ｇａＲ  ｇｔＩ  ａｃＩ  ｇｃＩ  ａｇ）を使用し、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２と共にＥＸＰＡＮＤ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、３７ｋＤタンパク質をコードするＤＮＡを増幅した。ついで該ＰＣＲ混合物からの１μｌを取り、同じプライマーを使用するネスティドＰＣＲにおいて使用した。これは、該５０ｋＤおよび３７ｋＤタンパク質に関してそれぞれ１２６０ｂｐおよび６５６ｂｐのバンドを与えた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切断し、ＱＩＡＧＥＮスピンプレップキットを使用して精製し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔ  ＩＩ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。該クローニング混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ  １０Ｆ内に形質転換した。Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用するコロニーＰＣＲにより、推定形質転換体をインサートに関してスクリーニングした。インサートを有するプラスミドを含有する推定クローンから、ＱＩＡＧＥＮミニプレップキットを使用してプラスミドＤＮＡを単離した。ついで、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用し、ＰＲＩＳＭ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコールに従い使用して、インサートを配列決定した。第１ＰＣＲにおいてプライマー９２３（ｔａｔ  ａｇｃ  ｔｇｔ  ｔｇａ  ｔｇｇ  ｔｇｃ  ｔｔ）を使用しネスティドＰＣＲにおいて９３６（ｇｇｔ  ｇａｔ  ａａｔ  ａｔｇ  ｃｔｔｔａｃ  ｔ）およびポリ−Ｇプライマー（ａｔａ  ｔｇｇ  ｇｇｇ  ｇｇｇ  ｇｇｇ  ｇｇｇ  ｇ）を使用するｃ−テーリングＰＣＲを用いて、該５０ｋＤコード領域のＣ末端部分を増幅した。これは、前記のとおりにクローニングされ配列決定された８４０ｂｐのバンドを与えた。
【００７６】
ｐＥＴ２４ａにおける５０ｋＤタンパク質コード化ＤＮＡのクローニング
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、該５０ｋＤタンパク質の成熟部分をコードするＤＮＡを、プライマー９６７（ｇｇａ  ａｔｔ  ｃｃａ  ｔａｔ  ｇｔａ  ｔｔｇ  ａｔｔ  ｔｔａ  ａｇｇ  ｃａａ  ａ）および９６８（ｃｇｃ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｇｃｇ  ａｔｃ  ｃｔｔ  ｇａｔ  ａａｔ  ｔｃａ  ａｇｇ）ならびにＥＸＰＡＮＤ系を使用して増幅した。該ＰＣＲ産物を該ゲルから単離し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に連結してプラスミドｐＰ５−ａを得た。理論的には、ｐＰ５−ａに媒介される５０ｋＤタンパク質の発現の誘導は、細胞質に局在する５０ｋＤのタンパク質を与えるはずである。なぜなら、クローニングされたＰ５のタンパク質配列分析は、いずれの種類の分泌シグナルの同定にもつながらなかったからである。ＯＭＰは、発現後にその天然局在部位である外膜に移行した場合にのみ、適切に折りたたんで抗原的に活性となることが、十分に確認されている。該外膜への該５０ｋＤタンパク質の移行を可能にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐｈｏＥシグナル配列が該成熟５０ｋＤタンパク質の前に融合されるようにプライマー９７２（ｇｇａ  ａｔｔ  ｃｃａ  ｔａｔ  ｇａａ  ａａｔｇａａ  ａａａ  ｇａｇ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｇｇｃ）および９６９（ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｇａａ  ｔｔｇ  ａｔａ  ｃｔｔ  ｃａｔ  ａｔｔ  ｔａａ）を使用する重複伸長ＰＣＲを適用した。該構築物をｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔ  ＩＩ内にクローニングした。正しいクローンを配列決定により同定した後、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用して、該インサートをｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔ  ＩＩプラスミドから切り出した。ついで該ＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＥＴ２４ａ内に連結して、プラスミドｐＰ５−ｆを得た。そのクローニングが該５０ｋＤタンパク質のＣ末端部分に６×Ｈｉｓタグの付加をもたらすように、プライマー９６９を設計した。
【００７７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）における該５０ｋＤタンパク質の過剰発現
プラスミドｐＰ５−ａおよびｐＰ５−ｆをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換した。得られた株ＢＬ２１−Ｐ５−ａおよびＢＬ２１−Ｐ５−ｆを、ｏ／ｎ培養後、３７℃でロータリーシェーカー（１８０ｒｐｍ）に付した（新鮮な５ｍｌのＬＢ中で希釈した）。３時間の培養後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを５０μＭ  イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、培養を３時間継続した。細胞を遠心分離により集め、サンプルを適当な対照と共に、２つの４〜１２％  ＢＩＳ／ＴＲＩＳ  ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ）上に該製造業者の記載に従いローディングした。該第１ゲルをクーマシーブリリアントブルー２５０Ｒで染色した（図２；パネルＡ）。該第２ゲルをウエスタンブロット法に使用した。該ブロットをブタ血清（ＢＩＧ３０４Ｔ４；図２；パネルＢ）でプローブした。誘導後、株ＢＬ２１−Ｐ５−ａ（レーン２）およびＢＬ２１−Ｐ５−ｆ（レーン３）においては、該陰性対照（レーン５）において欠けている余分のタンパク質バンドが出現した。株ＢＬ２１−Ｐ５−ｆにおいて産生されたタンパク質は、天然５０ｋＤタンパク質（レーン４）と比較して若干高い分子量で移動したが、これは、おそらく、Ｃ末端Ｈｉｓタグによるものであろう。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
【配列表】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）全細胞およびローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびイムノブロット（ウサギ抗血清でプローブされたもの）。レーン１，予め染色された精度マーカー（ＢｉｏＲａｄ）；２，ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）全細胞抽出物；３，ローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜調製物。パネル；Ａ：クーマシーブリリアントブルーでのタンパク質の可視化；Ｂ：精製された外膜タンパク質（Ｒ２７９）に対して産生させた血清でプローブしたブロット；Ｃ，全細胞（Ｒ２９１）に対して産生させた血清でプローブしたブロット。該１９／２１ｋＤ、３７ｋＤおよび５０ｋＤタンパク質は、それぞれＰ１／Ｐ２、Ｐ４およびＰ５で示されている。
【図２】該５０ｋＤタンパク質の過剰発現。本文中に記載されている種々のｐＥＴ２４ａ由来構築物を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）内で、該タンパク質を過剰発現させた。全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーブリリアントブルー（パネルＡ）で染色するか、またはＩｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜上にブロットし実験的感染ブタから得た抗血清でプローブした（パネルＢ）。レーン１：４５ｋＤａの予め染色された精度マーカー（ＢｉｏＲａｄ）バンド；レーン２：ＢＬ２１−Ｐ５−ａ；レーン３：ＢＬ２１−Ｐ５−ｆ；レーン４：精製されたローソニア・イントラセルラリス（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）外膜タンパク質（５０ｋＤタンパク質だけが認められる）。レーン５：未誘導のＢＬ２１−Ｐ５−ａ。
【図１】
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【図２】
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