(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、哺乳動物の多能性幹細胞を得ることを含む、哺乳動物の多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
精巣細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該精巣細胞は精原幹細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
該精原幹細胞はＧＳ細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該精巣細胞はＰ５３不全である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、請求項１に記載の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、哺乳動物の培養細胞を得る工程；
（工程２）白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地を用いて、工程１で得られた培養細胞を培養し、哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程。
【請求項７】
工程１が精巣細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、請求項１に記載の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、哺乳動物のＧＳ細胞を得る工程；
（工程２）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて、工程１で得られたＧＳ細胞を培養し、哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程。
【請求項９】
精巣細胞が出生後の哺乳動物由来である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞がＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかが陽性である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞がＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔが陽性である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
ＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかが陽性であり、Ｉｇｆ２ｒ及びＰｅｇ１０のＤＭＲのメチル化頻度がＥＳ細胞の１／２倍以下であり、且つＨ１９及びＭｅｇ３ＩＧのＤＭＲのメチル化頻度が０〜６０％である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、哺乳動物の精巣細胞に由来する多能性幹細胞。
【請求項１３】
ＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔが陽性である、請求項１２に記載の多能性幹細胞。
【請求項１４】
以下の工程を含む、非ヒト哺乳動物のキメラ胚の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて非ヒト哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）当該多能性幹細胞を非ヒト哺乳動物の宿主胚に導入し、非ヒト哺乳動物のキメラ胚を得る工程。
【請求項１５】
以下の工程を含む、キメラ哺乳動物（ヒトを除く）の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて非ヒト哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）当該多能性幹細胞を非ヒト哺乳動物の宿主胚に導入し、非ヒト哺乳動物のキメラ胚を得る工程；
（工程３）当該キメラ胚を非ヒト宿主哺乳動物の子宮又は卵管に移入し、キメラ哺乳動物（ヒトを除く）を得る工程。
【請求項１６】
以下の工程を含む、多能性幹細胞に由来する非ヒト哺乳動物の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて非ヒト哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）当該多能性幹細胞を非ヒト哺乳動物の宿主胚に導入し、非ヒト哺乳動物のキメラ胚を得る工程；
（工程３）当該キメラ胚を非ヒト宿主哺乳動物の子宮に移入し、キメラ哺乳動物（ヒトを除く）を得る工程；
（工程４）当該キメラ哺乳動物を交配し、多能性幹細胞に由来する非ヒト哺乳動物を得る工程。
【請求項１７】
以下の工程を含む、非ヒト哺乳動物の４倍体キメラ胚の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて非ヒト哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）該多能性幹細胞を非ヒト哺乳動物の４倍体胚に導入し、非ヒト哺乳動物の４倍体キメラ胚を得る工程。
【請求項１８】
以下の工程を含む、非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞に由来する非ヒト哺乳動物の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて非ヒト哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）該多能性幹細胞を非ヒト哺乳動物の４倍体胚に導入し、非ヒト哺乳動物の４倍体キメラ胚を得る工程；
（工程３）当該４倍体キメラ胚を非ヒト宿主哺乳動物の子宮又は卵管に移入し、該多能性幹細胞に由来する非ヒト哺乳動物を得る工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む、哺乳動物の機能細胞の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む培地を用いて哺乳動物由来の精巣細胞を培養し、哺乳動物の多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）該多能性幹細胞を機能細胞分化条件にて培養し、哺乳動物の機能細胞を得る工程。
【請求項２０】
該機能細胞は中胚葉系細胞である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
該中胚葉系細胞が、血球系細胞、脈管系細胞および心筋細胞からなる群から選ばれるいずれかである、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
該機能細胞は外胚葉系細胞である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２３】
該外胚葉系細胞は神経系細胞である、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
神経系細胞が、神経細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト及びアストロサイトからなる群から選ばれるいずれかである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該機能細胞は内胚葉系細胞である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２６】
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はノルトリンおよびアルテミンからなる群から選択されるいずれかのその均等物、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びに
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの少なくとも何れか一方
を含む、哺乳動物の精巣細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、精巣細胞を用いて多能性幹細胞を製造する方法、当該方法により製造された多能性幹細胞、当該多能性幹細胞に由来するキメラ胚、キメラ動物、非ヒト動物等を製造する方法、当該多能性幹細胞から中胚葉系細胞等の機能細胞を製造する方法、精巣細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物等に関する。
【背景技術】  生殖細胞（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）は子孫へ遺伝子を伝播する能力を有する点でユニークである。この細胞は生殖のための配偶子を作るために高度に特殊化されているが、多くの証拠によりこの細胞の多能性が示唆されている。例えば、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）は、生殖腺にほとんど常に発生し、多様な成熟段階の多種の細胞や組織を含む。さらに、胎仔生殖細胞は特殊な条件下で培養した時に、多能性細胞を生ずることが知られている。これらの胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）は内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）から単離した胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）に類似した分化特性を有している。これらの知見は、生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｌｉｎｅａｇｅ）細胞は多能性細胞を生み出す能力を維持していることを強く示唆するが、出生後の正常生殖腺から多能性細胞が確立できたことはない。ＥＳ細胞及びＥＧ細胞は、いずれも出生前の胚あるいは胎仔から採取されるので、ヒトへの臨床応用に際しては、倫理上の大きな問題を有しており、出生後の個体から多能性細胞を樹立する技術の開発が求められていた。
本願発明者らは、体内において子係へ遺伝情報を伝えることのできる唯一の幹細胞である、精原幹細胞のインビトロ培養方法を開発した（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３）。新生仔の精巣細胞をグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の存在下で培養すると、生殖細胞が固有の形状のコロニーを形成し、幹細胞が５ヶ月以上にわたり増殖した。不妊マウスの精細管に移植すると、培養した細胞は正常な精子及び子孫を産出し、テラトーマや体細胞への分化は認められないことから、生殖細胞系列に完全にコミットしていることが示された。これは精細管に移入するとテラトーマを生ずるＥＳ細胞とは対照的である。これらの結果に基づき、本願発明者らは、この細胞をＥＳ細胞やＥＧ細胞と識別するために、生殖系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＧＳ細胞）と名づけた。即ち、ＧＳ細胞は生殖系列細胞を拡大させる第３の方法の意義があるが、ＥＳ／ＥＧ細胞とは分化能力において明らかに異なっている。
上記事情に鑑み、本発明は、出生後の個体から多能性幹細胞を製造する新たな方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、新生マウスの精巣細胞をＧＳ細胞培養と類似の条件下で培養すると、ＧＳ細胞のコロニーに加えて、ＥＳ細胞コロニーと識別がつかない形態を呈するコロニーが出現することを確認した。これらのＥＳ様細胞はＥＳ細胞培養条件下で選択的に増殖した。当該ＥＳ様細胞はヌードマウスの皮下等に移植するとテラトーマを発生すること、インビトロで多様な機能細胞へと分化誘導されること、当該ＥＳ様細胞を胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）内にマイクロインジェクションすることにより正常な胚発生が起こり、生殖細胞も含む極めて多様な組織を形成することなどから、当該ＥＳ様細胞は、ＥＳ細胞と同様に多能性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下に関する。
（１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得ることを含む、多能性幹細胞の製造方法。
（２）培地が更に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む、上記（１）に記載の製造方法。
（３）培地が更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれかを含む、上記（１）又は（２）のいずれか１つに記載の製造方法。
（４）精巣細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の製造方法。
（５）該精巣細胞は精原幹細胞である、上記（１）に記載の製造方法。
（６）該精原幹細胞はＧＳ細胞である、上記（５）に記載の製造方法。
（７）該精巣細胞はＰ５３不全である、上記（１）に記載の製造方法。
（８）以下の工程を含む、上記（１）に記載の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、培養細胞を得る工程；
（工程２）白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地を用いて、工程１で得られた培養細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程。
（９）工程１の培地が更に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む、上記（８）に記載の製造方法。
（１０）工程１の培地が更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれかを含む、上記（８）又は（９）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１１）工程１が精巣細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、上記（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１２）以下の工程を含む、上記（１）に記載の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、ＧＳ細胞を得る工程；
（工程２）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて、工程１で得られたＧＳ細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程。
（１３）精巣細胞が哺乳動物由来である、上記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１４）哺乳動物が出生後である、上記（１３）に記載の製造方法。
（１５）多能性幹細胞がＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかが陽性である、上記（１）に記載の製造方法。
（１６）多能性幹細胞がＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔが陽性である、上記（１５）に記載の製造方法。
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか１つに記載の製造方法により製造された多能性幹細胞。
（１８）ＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかが陽性である、精巣細胞に由来する多能性幹細胞。
（１９）ＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔが陽性である、上記（１８）に記載の多能性幹細胞。
（２０）以下の工程を含む、キメラ胚の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）当該多能性幹細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る工程。
（２１）以下の工程を含む、キメラ動物（ヒトを除く）の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）当該多能性幹細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る工程；
（工程３）当該キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入し、キメラ動物（ヒトを除く）を得る工程。
（２２）以下の工程を含む、多能性幹細胞に由来する非ヒト動物の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）当該多能性幹細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る工程；
（工程３）当該キメラ胚を宿主動物の子宮に移入し、キメラ動物（ヒトを除く）を得る工程；
（工程４）当該キメラ動物を交配し、多能性幹細胞に由来する非ヒト動物を得る工程。
（２３）以下の工程を含む、４倍体キメラ胚の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）該多能性幹細胞を４倍体胚に導入し、４倍体キメラ胚を得る工程。
（２４）以下の工程を含む、多能性幹細胞に由来する非ヒト動物の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）該多能性幹細胞を４倍体胚に導入し、４倍体キメラ胚を得る工程；
（工程３）当該４倍体キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入し、多能性幹細胞に由来する非ヒト動物を得る工程。
（２５）以下の工程を含む、機能細胞の製造方法：
（工程１）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞を得る工程；
（工程２）該多能性幹細胞を機能細胞分化条件にて培養し、機能細胞を得る工程。
（２６）該機能細胞は中胚葉系細胞である、上記（２５）に記載の製造方法。
（２７）該中胚葉系細胞が、血球系細胞、脈管系細胞および心筋細胞からなる群から選ばれるいずれかである、上記（２６）に記載の製造方法。
（２８）該機能細胞は外胚葉系細胞である、上記（２５）に記載の製造方法。
（２９）該外胚葉系細胞は神経系細胞である、上記（２８）に記載の製造方法。
（３０）神経系細胞が、神経細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト及びアストロサイトからなる群から選ばれるいずれかである、上記（２９）に記載の方法。
（３１）該機能細胞は内胚葉系細胞である、上記（２５）に記載の製造方法。
（３２）グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む、精単細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物。
（３３）更に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む、上記（３２）に記載の組成物。
（３４）更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれかを含む、上記（３２）又は（３３）のいずれかに記載の組成物。
本発明の製造方法を用いれば、従来出生前の個体（受精卵、胚等）からしか得ることの出来なかったＥＳ細胞やＥＧ細胞等の多能性幹細胞を、出生後の個体から製造することが可能である。当該多能性幹細胞を用いれば、自家移植のための組織適合性を有する多様な組織を構築することが可能であり、再生医療、遺伝子治療等の医学分野において有用である。また、当該多能性幹細胞はトランスジェニック動物やノックアウト動物等の遺伝子改変動物の作成に用いることが出来るので、バイオテクノロジー分野において有用である。
【図面の簡単な説明】  図１はＧＳ細胞および、本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞のコロニーの形態を表す写真である。ａ〜ｄの各図において、右下の線はいずれも５０μｍを示す。ａは培養の初期段階においてＧＳ細胞（白矢頭）および当該多能性幹細胞（白矢印）のコロニーが混在している状態を示す写真である。ｂは培養の初期段階における当該多能性幹細胞のコロニーの形態を示す写真である。多能性幹細胞同士がより詰め込まれている（ｐａｃｋｅｄ）。ｃは完全に確立された当該多能性幹細胞のコロニーの形態を示す写真である。コロニーの形態が完全にＥＳ細胞コロニー様となっている。ｄは典型的なＧＳ細胞のコロニーの形態を示す写真である。
図２は異なる染色体数を有する分裂中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ｓｐｒｅａｄ）の分布を示す。少なくとも２０個の細胞が計測された。ＥＳ細胞（ＥＳ（１２９））、ｄｄＹマウス由来ＥＳ様細胞（ＥＳ−ｌｉｋｅ（ｄｄＹ））、ＤＢＡ／２マウス由来ＥＳ様細胞（ＥＳ−ｌｉｋｅ（ＤＢＡ））及びＤＢＡ／２マウス由来ＧＳ細胞（ＧＳ（ＤＢＡ））からの結果である。縦軸には頻度（％）を、横軸には染色体数を示す。
図３は本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞の細胞表面マーカーの発現を表すヒストグラムである。（ａ）はＳＳＥＡ−１、（ｂ）はβ１−インテグリン、（ｃ）はα６−インテグリン、（ｄ）はＥｐＣＡＭ、（ｅ）はＣＤ９、（ｆ）はフォルスマン抗原、（ｇ）はＥＥ２、（ｈ）はｃ−ｋｉｔの各発現を示す。縦軸には細胞数（個）を、横軸には各細胞表面マーカーの発現を相対的蛍光強度として示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。細胞数全体に対するゲート中の細胞の割合（％）は、それぞれ、（ａ）８５．１４％、（ｂ）９３．７２％、（ｃ）９７．９８％、（ｄ）９６．３６％、（ｅ）９９．１１％、（ｆ）２５．３８％、（ｇ）９２．２９％、（ｈ）は５７．８８％である。
図４はＧＳ細胞の細胞表面マーカーの発現を表すヒストグラムである。（ａ）はＳＳＥＡ−１、（ｂ）はβ１−インテグリン、（ｃ）はα６−インテグリン、（ｄ）はＥｐＣＡＭ、（ｅ）はＣＤ９、（ｆ）はフォルスマン抗原、（ｇ）はＥＥ２、（ｈ）はｃ−ｋｉｔの発現を示す。縦軸には細胞数（個）を、横軸には各細胞表面マーカーの発現を相対的蛍光強度として示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。細胞数全体に対するゲート中の細胞の割合（％）は、それぞれ、（ａ）０．６７％、（ｂ）８４．８３％、（ｃ）９９．７０％、（ｄ）９９．２０％、（ｅ）９９．１１％、（ｆ）１．７２％、（ｇ）９２．７８％、（ｈ）は６４．１４％である。
図５はＥＳ細胞の細胞表面マーカーの発現を表すヒストグラムである。（ａ）はＳＳＥＡ−１、（ｂ）はβ１−インテグリン、（ｃ）はα６−インテグリン、（ｄ）はＥｐＣＡＭ、（ｅ）はＣＤ９、（ｆ）はフォルスマン抗原、（ｇ）はＥＥ２、（ｈ）はｃ−ｋｉｔの発現を示す。縦軸には細胞数（個）を、横軸には各細胞表面マーカーの発現を相対的蛍光強度として示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。細胞数全体に対するゲート中の細胞の割合（％）は、それぞれ、（ａ）９６．４６％、（ｂ）９９．６９％、（ｃ）９７．２３％、（ｄ）９６．１０％、（ｅ）９９．６８％、（ｆ）７９．１１％、（ｇ）８１．７８％、（ｈ）は９３．９０％である。
図６は培養開始前における精巣細胞の細胞表面マーカーの発現を表すヒストグラムである。（ａ）はＳＳＥＡ−１、（ｂ）はフォルスマン抗原の発現を示す。縦軸には細胞数（個）を、横軸には相対的蛍光強度を示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。細胞数全体に対するゲート中の細胞の割合（％）は、それぞれ、（ａ）０．９２％、（ｂ）４３．０２％である。
図７は培養開始前における精巣細胞の各細胞表面マーカーの発現を表すヒストグラムである。縦軸には細胞数（個）を、横軸には相対的蛍光強度を示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、灰色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。細胞数全体に対する陽性細胞の割合（％）を各ヒストグラム内に示す。
図８は抗ＥＥ２抗体及び抗フォルスマン抗原抗体による新生精巣細胞の二重免疫染色の結果を示す図である。
図９はアルカリフォスファターゼ染色の結果を表す図である。（ａ）は本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞のコロニー、（ｂ）はＧＳ細胞のコロニー、（ｃ）はＥＳ細胞のコロニーをそれぞれ示す。
図１０はＲＴ−ＰＣＲの解析結果を表す図である。ＧＳ細胞（ＧＳ）及び本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞（ｍＧＳ）のＯＣＴ−４、Ｒｅｘ−１、Ｎａｎｏｇ及びＨＰＲＴの発現を示す。
図１１はＲＴ−ＰＣＲの解析結果を表す図である。ＧＳ細胞（ＧＳ）、ＥＳ様細胞（ＥＳ−ｌｉｋｅ）及びＥＳ細胞（ＥＳ）からのｃＤＮＡの３倍希釈系列が特異的プライマーにより増幅された。
図１２はＥＳ様細胞におけるインプリンティングの解析結果を表す図である。Ｈ１９、Ｍｅｇ３ＩＧ、Ｒａｓｇｒｆ１、Ｉｇｆ２ｒ及びＰｅｇ１０領域のＤＭＲメチル化を示す。ＤＮＡメチル化が亜硫酸染色体シークエンシングにより解析された。黒楕円はメチル化シトシン−グアニン部位（ＣｐＧｓ）を、白楕円は非メチル化ＣｐＧｓを示す。
図１３はＥＳ様細胞におけるインプリンティングの解析結果を表す図である。
（Ａ）Ｐ５３ノックアウトマウスからのＧＳ細胞及びＥＳ様細胞のＣＯＢＲＡを示す。ＥＳ様細胞が見出された日を０日目と示し、記載された時間にて細胞が採集された。この培養において、１２日目までにはＥＳ様細胞のみが見出された。図の下の数字はメチル化の割合（％）を示す。（Ｂ）野生型マウス（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）及びＰ５３ノックアウトマウス（Ｐ５３）からのＥＳ様細胞における、Ｏｃｔ−４遺伝子上流領域のＣＯＢＲＡを示す。図の下の数字はメチル化の割合（％）を示す。右図はＯｃｔ−４遺伝子上流領域の模式図である。白矢頭は非メチル化ＤＮＡの大きさを示す。黒矢頭はメチル化ＤＮＡの大きさを示す。各部位を切断するために用いられた酵素は括弧内に示す。Ｕ：非切断、Ｃ：切断。
図１４はＥＳ様細胞におけるインビトロ及びインビボでの分化を示す図である。（Ａ−Ｈ）ＯＰ９細胞での分化を示す図である。（Ａ）８日目における敷石状構造（血球系細胞）を示す図である。（Ｂ）共培養７日後のＣＤ４５陽性造血細胞の発生を示す図である（左）。該細胞群において、Ｇｒ１陽性顆粒球、Ｍａｃ１陽性マクロファージ又はＴｅｒ１１９陽性赤血球が観察された（右）。（Ｃ）採集された細胞のメイ−ギムザ染色を示す図である。ミエロイド前駆細胞（矢頭）と赤芽球（矢印）が観察された。（Ｄ、Ｅ）脈管細胞（血管内皮細胞等）の分化を示す図である。Ｆｌｋ−１陽性細胞は共培養４日後に選別され、ＣＤ３１陽性（Ｄ）又はＶＥカドヘリン陽性（Ｅ）脈管細胞は細胞選別の６日後に出現した。（Ｆ−Ｈ）心筋の分化を示す図である。Ｆｌｋ−１陽性細胞は選別の６日後にＭＦ２０陽性（Ｆ）又はｃＴｎ−Ｉ陽性（Ｇ）心筋に分化した。（Ｈ）ＡＮＰ陽性（青）心房筋及びＭＬＣ２ｖ陽性（茶）心室筋を示す図である。（Ｉ）培養８日後にメチルセルロース内のエンブリオボディから発生した赤血球細胞を示す図である。細胞は赤色を示す。（Ｊ−Ｍ）ゼラチン被覆プレート上での神経細胞の分化を示す図である。誘導後５日目のＴｕｊ陽性ニューロン（Ｊ）、誘導後７日目のＧＦＡＰ陽性アストロサイト（Ｋ）及びＭＢＰ陽性オリゴデンドロサイト（Ｌ）を示す。Ｔｕｊ陽性ニューロン（矢頭）の中に、ＴＨ及びＴｕｊ両陽性ドパミン作動性ニューロン（矢印）が出現した（Ｍ）。（Ｎ）皮下のテラトーマ切片を示す図である。腫瘍は多様な分化細胞型を有し、筋（ｍ）、神経（ｎ）、そして上皮（ｅ）組織を含む。（Ｏ−Ｑ）Ｐ５３ノックアウトＧＳ細胞からの精子形成を示す図である。（Ｏ）非移植（左）及び移植（右）レピシエント精巣の巨視的比較を示す図である。移植精巣はサイズの上昇を示す。（Ｐ、Ｑ）非移植（Ｐ）及び移植（Ｑ）Ｗ精巣の組織学的様相を示す図である。精子形成において正常な様相を示す（Ｑ）。染色：Ｃｙ３、赤（Ｊ−Ｍ）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、緑（Ｍ）。スケールバー＝５０μｍ（Ａ、Ｄ−Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）、２０μｍ（Ｃ、Ｌ）、２００μｍ（Ｎ、Ｐ、Ｑ）、１ｍｍ（Ｏ）。
図１５はフローサイトメトリー解析の結果を表す図である。  （ａ）はネガティブコントロール、（ｂ）はＴｅｒ１１９、（ｃ）はＣＤ４５、（ｄ）はＭａｃ１／Ｇｒ１（Ｍｉｘで染色）の解析結果を示す。  （ａ）〜（ｄ）中、上側のドットプロットにおいて、縦軸には各細胞表面マーカーの発現を、横軸にはＥＧＦＰの発現を相対的蛍光強度としてそれぞれ示す。  （ａ）〜（ｄ）中、下側の表は、各４分割ゲート（左上、右上、左下、右下）におけるプロット数（イベント）、全生存細胞数に対する割合（％ゲート）、全細胞数に対する割合（％全体）を示す。
図１６はキメラ動物の作製を示す図である。（Ａ）１２．５−ｄｐｃキメラ胚は、ＵＶ光下で蛍光発光を示す（矢印）。同腹のコントロール胚（矢頭）では、蛍光発光は観察されなかった。左図は可視光下での観察である。（Ｂ）新生キメラ動物（矢印）は、蛍光発光を示した。（Ｃ）成熟キメラ動物である。ドナー細胞由来の被毛色（黄褐色）を示す。（Ｄ−Ｉ）１２．５−ｄｐｃキメラ胚の側矢状断面を示す図である。蛍光発光は、脳（Ｄ）、腸管（Ｅ）、心臓（Ｆ）、肝臓（Ｇ）、脊髄（神経管）下部（Ｈ）及び胎盤（Ｉ）で観察された。（Ｊ）キメラマウス由来の精巣は、蛍光発光を示した。精巣細胞懸濁液中の生殖細胞の中に、ＥＧＦＰ発現が観察された（挿入図）。（Ｋ）キメラ由来の子孫を示す図である。子孫の一個体（矢印）は蛍光発光を示し、ドナー由来であることが確認された。（Ｌ）ＥＳ様細胞を４倍体胚と凝集させて作製した１０．５−ｄｐｃ胚（矢印）と卵黄嚢は、蛍光発光を示した。胎盤（矢頭）では蛍光は観察されなかった。対比染色はプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）で行った（Ｄ−Ｉ）。染色：ＥＧＦＰ、緑（Ａ、Ｂ、Ｄ−Ｌ）；ＰＩ、赤（Ｄ−Ｉ）。スケールバー＝１００μｍ（Ｄ−Ｉ）、１ｍｍ（Ｊ）。
図１７はキメラマウス新生仔のＵＶ光下での観察結果を示す。
図１８はキメラマウス胎仔の凍結切片の蛍光顕微鏡による組織学的観察結果を示す図である（脊髄（神経管）下部）。
発明の詳細な説明
本発明の多能性幹細胞の製造方法は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養し、多能性幹細胞（本明細書において、ＥＳ様細胞又は多能性生殖系列幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｍＧＳ細胞）と呼ぶ場合がある）を得ること（例えば単離、分離、選別、精製等）を含む。
多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養可能で、長期間にわたって増殖することができ、自己複製能を持ち、生体を構成する全ての細胞やその前駆細胞に分化しうる能力を有する細胞をいう。
精巣細胞とは、精巣を構成する全ての細胞を含み、例えば、精原幹細胞、精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞、精子、ライディヒ細胞、セルトリ細胞、間細胞、雄性生殖細胞、生殖細胞等が挙げられる。
精原幹細胞とは、自己再生し、精子又はその前駆細胞（例えば精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞等）へ分化し得る能力（精原幹細胞としての能力）を有する生殖系列細胞をいう。精原幹細胞としては、例えば、始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）、幹細胞である精原細胞（精原細胞のうち精原幹細胞としての能力を有する細胞）、生殖系列幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。本発明において、精原幹細胞は、好ましくは、雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）、幹細胞である精原細胞又はＧＳ細胞である。
ＧＳ細胞とは、インビトロでＧＤＮＦレセプター作動性化合物（ＧＤＮＦ又はその均等物）に依存的に増殖された精原幹細胞、例えば、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３に記載された方法により増殖された精原幹細胞をいう。
精巣細胞は、精巣より自体公知の方法で調製することができる。例えば精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、ＤＮａｓｅなどの分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる（例えば、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３等を参照）。精巣細胞は培養液等により洗浄され、本発明の多能性幹細胞の製造に供せられる。
当該精巣細胞は、本発明の多能性幹細胞の製造に供せられる前に、培養されていてもよい。培養条件は、特に限定されないが、たとえば、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３に記載されているように、上述の酵素処理で得られた精巣細胞をグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等の存在下で培養させることにより、精原幹細胞を増殖させ、ＧＳ細胞を得て、これを用いてもよい。
また、当該精巣細胞は、本発明の多能性幹細胞の製造に供せられる前に、多能性幹細胞を産生する能力の高い画分を濃縮したものであってもよい。当該画分としては、例えば、精原幹細胞、精原細胞、雄性生殖細胞、生殖細胞等があり得る。
濃縮方法としては、例えば当該画分の細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーターや、抗体磁性マイクロビーズ等を用いる方法などが挙げられる。例えば、精原幹細胞は、α６−インテグリン、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９等の細胞表面抗原を指標に濃縮することができる（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，８３４６−８３５１，２００１；Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．７０，ｐ７０−７５，２００４等を参照）。あるいはヘキスト等のｄｙｅを用いて精原幹細胞を濃縮することも可能である（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３１，４７９−４８７，２００４等を参照）。
本発明において用いられる精巣細胞は、動物由来であれば、特に限定されない。当該動物は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されず、脊椎動物、無脊椎動物のいずれであってもよいが好ましくは脊椎動物である。
脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、特に限られないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。
脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。
当該哺乳動物は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において、出生前であっても、出生後であってもよいが、好ましくは出生後である。
出生前の胎仔を用いる場合、該胎仔の発生段階は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されず、例えば雄性生殖堤（ｇｅｎｉｔａｌ  ｒｉｄｇｅ）の形成以降の発生段階が挙げられる。例えば、マウスにおいては、１２．５ｄｐｃより後、例えば１３．０ｄｐｃ以降、好ましくは１３．５ｄｐｃ以降、より好ましくは１４．５ｄｐｃ以降、更に好ましくは１６．５ｄｐｃ以降の発生段階を挙げることが出来る。
出生後の動物を用いる場合、該動物の齢は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されず、新生仔、幼仔、成体、老体のいずれであってもよいが、若齢の動物ほど精巣に含まれる幹細胞（精原幹細胞等）の頻度が高いこと等から、製造効率の観点からはより若齢の動物を用いることが好ましい。即ち、用いられる動物は、好ましくは新生仔又は幼仔、より好ましくは新生仔である。ここで成体とは性成熟に達した個体（例えばマウスでは４週以上の齢）を、幼仔とは性成熟には達していないが精子形成をしている個体（例えばマウスでは５日〜４週齢）を、新生仔とは精子形成が開始される以前の個体（例えばマウスでは０〜４日齢）をいう。
出生後の動物としてマウスを用いる場合、該マウスの齢は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、例えば０〜８週齢、好ましくは０〜３週齢、より好ましくは０〜８日齢、最も好ましくは０〜２日齢である。０日（週）齢とは、出生当日を意味する。
本発明において用いられる精巣細胞としてＰ５３不全精巣細胞を用いてもよい。本発明の製造方法においてＰ５３不全精巣細胞を用いることにより、野生型精巣細胞を用いた場合と比較して、極めて高い効率で多能性幹細胞を得ることが出来る場合がある。特に、精巣細胞として成体由来の細胞や、ＧＳ細胞を用いる場合等において、Ｐ５３不全精巣細胞の利用は有利である。
「Ｐ５３不全」とはＰ５３遺伝子が機能的に不十分である状態、即ちＰ５３遺伝子が本来有する正常な機能を十分に発揮できない状態をいい、Ｐ５３遺伝子が全く発現していない状態、またはＰ５３遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、あるいはＰ５３遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、またはＰ５３遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にＰ５３遺伝子産物の機能が低下した状態が挙げられる。
Ｐ５３不全精巣細胞としては、例えば、Ｐ５３遺伝子欠損ホモ接合体又はＰ５３遺伝子欠損ヘテロ接合体、好ましくはＰ５３遺伝子欠損ホモ接合体を挙げることが出来る。Ｐ５３不全精巣細胞は、例えば、Ｐ５３不全動物（Ｐ５３遺伝子欠損動物等）の精巣細胞を回収することにより得ることが出来る。或いはＰ５３遺伝子に対するターゲッティングベクターを精巣細胞に導入し、相同性組換えによりＰ５３遺伝子を欠損させることによっても、Ｐ５３不全精巣細胞を得ることが出来る。
また、別の実施態様では、Ｐ５３不全精巣細胞は、Ｐ５３遺伝子の発現または機能を抑制する物質（例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等）の細胞への導入により製造することが出来る。Ｐ５３の発現または機能を抑制する物質の精巣細胞への導入は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、Ｐ５３遺伝子の発現または機能を抑制する物質が核酸分子又はそれを含む発現ベクターである場合、リン酸カルシウム法、リポフェクション法／リポソーム法、エレクトロポレーション法などが用いられ得る。
本発明において、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の均等物とは、本発明の方法において用いられたときに多能性幹細胞の製造を達成し得る範囲において特に限定されないが、ノルトリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ペルセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）等のＧＤＮＦ様化合物、ＧＤＮＦレセプター（群）または補助レセプター（群）に対してグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）およびＧＤＮＦ様化合物と同様の作用を有する他の化合物（例えばＧＤＮＦレセプター（群）または補助レセプター（群）を特異的に認識する抗体、ＧＤＮＦレセプター（群）または補助レセプター（群）に対する作動性化合物等）を含む概念である。このようなレセプター（群）または補助レセプター（群）には、それぞれＲｅｔチロシンキナーゼおよびＧＤＮＦ−ファミリーレセプターα：ｓが含まれる。
ＧＤＮＦ様化合物とは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と類似の構造を有するか、あるいはそのレセプターまたは補助レセプターに対してグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のように作用する化合物、例えば本発明の方法において用いられたときに多能性幹細胞の製造を達成し得る化合物を意味する。ＧＤＮＦ様化合物としては、特に、ノルトリン、ペルセフィン、アルテミン等が挙げられる。
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）およびＧＤＮＦ様化合物は構造的に類似し、ｃＲｅｔレセプターチロシンキナーゼは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルトリン、ペルセフィンおよびアルテミンの共通するシグナル伝達レセプターとして作用する。
「グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のように作用する化合物」とは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のシグナルを伝達するレセプターまたはその補助レセプターに対し、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と同様に作用する化合物を意味する。
「ＧＤＮＦレセプター」とは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはＧＤＮＦ様化合物の結合物質、すなわち、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはＧＤＮＦ様化合物のシグナルを伝達可能な化合物を意味する。「ＧＤＮＦレセプター」としては、特に、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはＧＤＮＦ様化合物のシグナル媒介性レセプターであるｃＲｅｔレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。
「ＧＤＮＦ補助レセプター」とは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはＧＤＮＦ様化合物のシグナルを伝達しないが、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはＧＤＮＦ様化合物のシグナルを伝達するレセプターを活性化するレセプターを意味する。このような化合物は、特に、そのメンバーがＧＤＮＦファミリーレセプターα：ｓ（ＧＦＲα）と称されるレセプターである。これらはまた、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ペルセフィン、アルテミンおよびノルトリンのシグナル伝達レセプター複合体（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と関係する。該ファミリーのレセプターとしては４メンバー（ＧＦＲα１〜４）（Ｊｉｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５，９−１０（１９９６）；Ｊｉｎｇ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３３１１１−３３１１７（１９９７）；Ｔｒｅａｎ  ｏｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８２，８０−８３（１９９６）；Ｓｕｂａｎｔｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６，１２６７−１２７３（１９９７））が既知である。これらは独立してシグナルを伝達することができるが、すべてがリガンド結合およびｃＲｅｔ活性化に不可欠である。
本発明の製造方法において、培地中に含まれるグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物の濃度は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、いっそうより好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。
本発明の製造方法において用いられる培地は、更に白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含むことが好ましい。
本発明の製造方法において、白血病阻害因子（ＬＩＦ）が培地中に含まれる場合には、その濃度は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常１０〜１０６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、例えば１０〜１０５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、好ましくは１０２〜１０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、より好ましくは３×１０２〜５×１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌである。
本発明の製造方法において用いられる培地は、好ましくは更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれか、より好ましくは両方を含む。
本発明の製造方法において、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が培地中に含まれる場合には、その濃度は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、いっそうより好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜３０ｎｇ／ｍｌである。
本発明の製造方法において、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が培地中に含まれる場合には、その濃度は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、いっそうより好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。
本発明において培地に含まれうるサイトカイン（グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されない。
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）としては、例えば、ヒト及びラット（ＷＯ９３／０６１１６号パンフレット）、マウス（例えばＧｅｎｅ  ２０３，２，１４９−１５７，１９９７参照）等のグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が例示される。
白血病阻害因子（ＬＩＦ）としては、例えば、ヒト（特開平１−５０２９８５号公報）、マウス（特開平１−５０２９８５号公報）、ヒツジ（特開平４−５０２５５４号公報）、ブタ（特開平４−５０２５５４号公報）、ウシ（特開平８−１５４６８１号公報）等の白血病阻害因子（ＬＩＦ）が例示される。
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）としては、例えば、マウス（例えばＮａｔｕｒｅ，２５７，３２５−３２７，１９７５参照）、ヒト（例えばＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８，４１５，１９９１参照）等の上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が例示される。
塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）としては、例えば、ヒトｂＦＧＦ（例えばＥｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，８，９５，１９８７参照）、ウシｂＦＧＦ（例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６９６３，１９８４参照）、マウスｂＦＧＦ（例えばＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３８，４５４−４６３，１９９０参照）、ラットｂＦＧＦ（例えばＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７，２５６−２６３，１９８８参照）等が例示される。
また、当該サイトカインは、本発明の多能性幹細胞の製造方法において用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る範囲において、精製された天然、合成または組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。また、上述の各サイトカインの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。
変異タンパク質における挿入、置換又は欠失されるアミノ酸の数は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは、７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であることを意味する。相同性の割合（％）は、（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖ．５，ｐ．１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２））に記載されているとおり、配列の整列を助するために１００アミノ酸長中に４個のギャップを導入しうる場合には、比較する配列中の同一のアミノ酸残基であって整列する２種の配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の割合（％）として算出される。また、野生型のアミノ酸配列を有する上記各サイトカインに対する抗体との交差反応性に基づいて単離しうる任意のタンパク質、あるいは上記各サイトカインの野生型のアミノ酸配列をコードする遺伝子または遺伝子セグメントとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより単離される遺伝子によりコードされるタンパク質が、実質的に相同なものとして含まれる。
上記ストリンジェントな条件としては、例えばサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１」等に記載されたハイブリダイゼーション条件（例えば、約４５℃、６．０×ＳＳＣ中におけるハイブリダイゼーション等）が例示される。
多能性幹細胞等の幹細胞の培養においては、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等のサイトカインを含む培地を用いることにより、より安定した幹細胞の培養が達成できる。それゆえ、本発明の製造方法において、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等を含む培地を用いることにより、より安定して多能性幹細胞を製造することができる。
ＬＩＦは例えば多能性幹細胞の未分化状態の維持に、ＥＧＦ及びｂＦＧＦは例えば多能性幹細胞の増殖の増強に、それぞれ有用であり得る。
本発明の製造方法において用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ−１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅ  ｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５、ＲＩＴＣ８０−７、ＨＦ−Ｃ１、ＭＣＤＢ１０７、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ等が挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
当該培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、ステロイド（例えばβ−エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物（例えばＳｔｅｍＰｒｏ−Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
また、当該培地は、血清を含むことができる。血清としては、動物由来の血清であれば、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。
本発明の製造方法においては、精巣細胞をフィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞としては、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、ＥＳ細胞やＥＧ細胞等の多能性幹細胞を多能性を維持しながら培養する際に用いられる自体公知のフィーダー細胞を用いることができ、例えば、繊維芽細胞（マウス胎仔繊維芽細胞、マウス繊維芽細胞株ＳＴＯ等）が挙げられる。
フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。
本発明の製造方法における細胞培養条件は、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。
本発明の多能性幹細胞の製造方法を、更に詳細に説明すると、例えば以下の通りである。
精巣より分離された精巣細胞を、培地中に懸濁し、細胞培養用容器内に播種し、培養する（第一の培養）。
当該細胞培養用容器は、通常の細胞培養において使用されるものを用いることができるが、好ましくは、精巣細胞の容器への接着を促進させるために、ゼラチン等によってコーティングされている。以下の培養に用いられる容器も同様である。
第一の培養を継続することのみによっても、多能性幹細胞を製造することは可能であるが、好ましくは、第一の培養の開始から約６〜１８時間後（例えば一晩培養後）に、第一の培養における培養細胞、好ましくは浮遊している培養細胞（少なからず生殖細胞を含む）を、別の細胞培養用容器へ継代する（第二の培養）。継代された細胞は、培養条件によっても異なるが、継代後通常１週間以内に、細胞培養用容器の底面にコロニーを形成する。コロニー形成は顕微鏡等を用いて確認することができる。
好ましくは、第二の培養の開始から通常５〜１４日後、細胞をトリプシン処理等により分散し、培地中に再度懸濁して、更に新しい培養用プレートへ継代する（第３の培養）。同様に継代を繰り返すことで、平坦な形状の体細胞は消滅する。従って、２度目あるいは３度目の継代以降は、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することが好ましい。継代の間隔、細胞の希釈率は、培養条件によって適宜判断されるが、例えば２〜５日間隔、１〜１／４希釈（培養初期においては好ましくは１〜１／２希釈）が例示される。また、確立されたＥＳ細胞様コロニーの継代の間隔、細胞の希釈率としては、例えば２〜５日間隔、１／４〜１／１０希釈が例示される。
上記培養において、培養された細胞は培養開始後約３〜６週間までには、２種類の形態のコロニーを形成する。一方のコロニーは、細胞間架橋（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｒｉｄｇｅ）と桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）様構造により特徴付けられる形態を有しており、これはＧＳ細胞のコロニーである。他方のコロニーは、より硬く詰め込まれ（ｐａｃｋｅｄ）、ＥＳ細胞のコロニーの形態と極めて類似した形態を有しており、これは本発明に係る多能性幹細胞のコロニーである。従って、ＧＳ細胞のコロニーと、本発明にかかる多能性幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。
上述の形態を指標に、例えば、顕微鏡下で多能性幹細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップするか、限界希釈等により、多能性幹細胞を単離し得る。あるいは多能性幹細胞の細胞表面マーカー等を指標にして、セルソーター等を用いて多能性幹細胞を単離し得る。
また、一態様において、上述と同様の培養条件により、ＧＤＮＦ又はその均等物を含む培地を用いて精巣細胞を培養することによりＧＳ細胞を得て、該ＧＳ細胞を更に上述の培養条件によりＧＤＮＦ又はその均等物を含む培地を用いて引続き培養することによっても、ＧＳ細胞から多能性幹細胞が派生し、本発明の多能性幹細胞を得ることが出来る。
ＧＳ細胞のコロニーの形態は、上述の通り、本発明に係る多能性幹細胞のコロニーと、明確に視覚的に識別可能であり、顕微鏡下でＧＳ細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーション等を用いて選択的にピックアップするか、限界希釈等により、ＧＳ細胞を単離し得る。
この場合、ＧＳ細胞を獲得するための培養期間は、本発明の方法により多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、該培養期間は通常１年以内、例えば６ヶ月以内、好ましくは３ヶ月以内、より好ましくは７週間以内である。
本発明の多能性幹細胞の製造方法においては、工程全体を通して、同一組成の培地を用いてもよいが、複数の組成の培地を、経時的に使い分けて用いてもよい。このようにすることで多能性幹細胞をより選択的に増殖させ、多能性幹細胞をより効率よく製造することができる場合がある。
例えば、培養に用いる培地を、培養の途中で、精巣細胞の初期の培養に用いる培地（培地Ａとする）から、多能性幹細胞の長期培養により適した培地（培地Ｂとする）へ変換することができる。
即ち、培地Ａを用いて精巣細胞を培養し、培養細胞を得て、当該培養細胞を培地Ｂを用いて培養することで、多能性幹細胞を効率よく得ることができる。
培地Ａに含まれ得るサイトカインは、上述と同様である。
培地Ｂは上述のサイトカイン（グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））を含まなくてもよいが、好ましくは白血病抑制因子（ＬＩＦ）を上述と同様の濃度で含む。
また、培地Ａ、Ｂにそれぞれ含まれ得る血清の濃度は、上述と同様であるが、培地Ａ中に含まれ得る血清の濃度は、好ましくは０．１〜５（ｖ／ｖ）％であり、より好ましくは０．３〜３（ｖ／ｖ）％である。培地Ｂ中に含まれ得る血清の濃度は、好ましくは２〜３０（ｖ／ｖ）％であり、より好ましくは１０〜２０（ｖ／ｖ）％である。
また、培地Ａ、Ｂのそれぞれの基礎培地は、上述と同様であるが、培地Ａの基礎培地は、精原幹細胞（ＧＳ細胞等）の培養に好適に用いられる基礎培地（例えばＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ等）であり得、培地Ｂの基礎培地はＥＳ細胞の培養に好適に用いられる基礎培地（例えばＤＭＥＭ等）であり得る。
培地Ａ、Ｂが含むことができる添加物は、上述と同様である。
培地を培地Ａから培地Ｂに変換する時期は、培養条件等によって異なるため、一律に規定しがたいが、例えばマウスの場合、第一の培養の開始から１０〜１２０日後、好ましくは１４〜４０日後である。
更に、培地Ａを培地Ｂへ変換した直後の約４〜４０日間、培地Ｂにグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を上述の濃度で添加した組成の培地を用いて細胞を培養することにより、より高い効率で多能性幹細胞を製造し得る。
またこのような培地Ａ、培地Ｂを用いる精巣細胞の培養は上述と同様にフィーダー細胞の存在下で行ってもよい。
本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞は、通常２ヶ月以上、好ましくは５ヶ月以上にわたり、多能性を維持しながら増殖する。
単離された当該多能性幹細胞の維持、増殖、培養においては、好ましくは、上述の培地Ｂが用いられる。
本発明の製造方法により得られた細胞が多能性を保持しているか否かは、以下に例示する自体公知の方法により確認することができる。
例えば、フローサイトメーター等を用いて、得られた細胞の細胞表面マーカー等の発現が解析される。有用な細胞表面マーカーとしては、ＳＳＥＡ−１（ＥＳ細胞マーカー）、フォルスマン抗原（ＥＳ細胞マーカー）、β１−及びα６−インテグリン（ＥＳ及びＧＳ細胞マーカー）、ＥｐＣＡＭ（ＥＳ細胞及び精原細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ）マーカー）、ＣＤ９（ＥＳ細胞及び精原幹細胞マーカー）、ＥＥ２（精原細胞マーカー）、ｃ−ｋｉｔ（分化した精原細胞マーカー）等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、例えばマウス由来の多能性幹細胞であれば、ＳＳＥＡ−１、フォルスマン抗原、β１−及びα６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかが陽性であり、好ましくは、全てが陽性である。また、フォルスマン抗原及びｃ−ｋｉｔは好ましくは弱陽性である。ＧＳ細胞はＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原が陰性であるので、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞はＧＳ細胞から明確に識別される。
ここで細胞表面マーカーの発現が「陽性」とは、細胞表面マーカーが細胞表面上に発現しており、当該細胞表面マーカーに対する特異的抗体による特異的結合が確認できることをいう。「弱陽性」とは、他の細胞と比較して、細胞表面マーカーの発現量が相対的に弱い、細胞表面マーカーの発現量の弱い集団が相対的に多い、又は細胞表面マーカーを発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
マウス以外の動物種の多能性幹細胞においても、細胞表面マーカーの発現様式はマウスと同様である。ただし、当該動物種が生来的に保有していないマーカーがある場合は、当該マーカーは解析から除外されるなど、種差が考慮される。
また、本発明の製造方法により得られた細胞の細胞内のアルカリフォスファターゼの活性を自体公知の方法により測定することによっても、当該細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、ＥＳ細胞と同様にアルカリフォスファターゼが陽性である。一方、ＧＳ細胞はアルカリフォスファターゼが弱陽性乃至陰性であるので、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、ＧＳ細胞から明確に識別される。
あるいは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ＰＣＲ）等によって、多能性幹細胞に特異的に発現している遺伝子等の発現を解析することによっても、本発明の製造方法により得られた細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。例えばマウス由来の多能性幹細胞であれば、多能性幹細胞に特異的に発現している遺伝子としては、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＲａｓ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ５７、Ｅｓｇ−１等の未分化なＥＳ細胞を維持するのに必須の分子が例示される。本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＲａｓ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ５７及びＥｓｇ−１からなる群から選ばれる少なくともいずれかの遺伝子を発現しており、好ましくは、全ての遺伝子を発現している。ＧＳ細胞においては、これらの遺伝子の発現は本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞と比較して一般に弱く、特にＮａｎｏｇの発現がほとんど認められず、当該多能性幹細胞は、ＧＳ細胞から明確に識別される。
更に、染色体ＤＮＡ中のＤＭＲの亜硫酸染色体シークエンシング（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２９，ｐ１８０７−１８１７，２００２）やＣＯＢＲＡ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２５，ｐ２５３２−２５３４，１９９７）等により、細胞のインプリンティングパターンを解析することによっても、本発明の製造方法により得られた細胞が多能性を保持しているかを確認し、或いは他の幹細胞（ＥＳ細胞、ＧＳ細胞等）と明確に識別することが出来る。例えば本発明の方法により得られた多能性幹細胞がマウス由来であれば、母性インプリント領域であるＩｇｆ２ｒ及びＰｅｇ１０のＤＭＲはほとんどメチル化されていないが、ＥＳ細胞はよりメチル化されている（例えばメチル化頻度として２倍以上）。また、父性インプリント領域であるＨ１９及びＭｅｇ３ＩＧのＤＭＲは、ＧＳ細胞においてはほぼ完全にメチル化されているが、本発明の多能性幹細胞においてはそのメチル化は不完全である（例えばメチル化頻度として０〜６０％）。
ＧＳ細胞のＤＭＲはほぼ完全に雄性のインプリンティングパターンを有し得るので、本発明の方法を用いて精原幹細胞（ＧＳ細胞等）から多能性幹細胞を製造する際に、該インプリンティングパターンを追跡することにより、培養物中の該多能性幹細胞の割合や、製造の進行の程度を把握することが出来る。即ち、ＧＳ細胞からの多能性幹細胞の派生に伴い、父性インプリント領域（Ｈ１９、Ｍｅｇ３ＩＧ、Ｒａｓｇｆｒ１等）におけるＤＭＲのメチル化頻度は低下し得る。
また、Ｏｃｔ−４領域のＤＭＲの低メチル化状態（例えばメチル化頻度として２０％以下の状態）を確認することにより、本発明の方法により製造された多能性幹細胞が未分化状態を維持していることを確認することも出来る。
本発明の製造方法により得られた細胞を、免疫不全動物や免疫寛容を誘導した動物の皮下又は精細管内等へ注入し、テラトーマの形成の有無を解析することによっても、当該細胞の多能性を確認できる。本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞はテラトーマを形成することができ、当該テラトーマ内には３つの胚葉系に分化した多様な細胞（例えば神経、表皮、筋肉、気管支上皮、軟骨、骨、扁平上皮、神経上皮等）が確認される。一方、ＧＳ細胞は精細管内へ注入されると、精子形成コロニーを形成し、テラトーマを形成しない。従って、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞はＧＳ細胞と明確に識別される。
また、本発明の製造方法により得られた細胞を宿主胚に導入し、キメラ動物の誕生の有無を解析することによっても、当該細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞は、宿主胚に導入されると、キメラ動物の正常な発生に寄与することができる。一方、ＧＳ細胞は宿主胚に導入されても、キメラ動物の正常な発生に寄与することは出来ず、従って、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞はＧＳ細胞と明確に識別される。
また、インビトロにおいてＥＳ又はＥＧ細胞を各種の機能細胞へ分化させる自体公知の方法を適用し、本発明の製造方法により得られた細胞のインビトロにおける分化能力を解析することによっても、当該細胞の多能性を確認できる。「機能細胞」とは、ＥＳ又はＥＧ細胞から派生し得る体細胞又は生殖細胞であり、例えば、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、内胚葉系細胞等を挙げることが出来る。
例えば、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、自体公知の中胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、中胚葉系細胞へ分化する。
中胚葉系細胞としては、特に限定されないが、例えば、血球系細胞（造血系細胞を含む）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨細胞，軟骨細胞，腱細胞，脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。好ましくは、中胚葉系細胞は、血球系細胞、脈管系細胞（血管内皮細胞等）又は心筋細胞である。
上記血球系細胞としては、特に限定されないが、例えば血球細胞（例えばＣＤ４５陽性細胞など）、赤芽球系細胞（例えばＴｅｒ１１９陽性細胞など）、ミエロイド系細胞（例えば単球系細胞（例えばＭＡＣ１陽性細胞など）、好中球系細胞（例えばＧｒ１陽性細胞など））などが挙げられる。
上記心筋細胞としては、例えばＭＦ２０陽性細胞等、ｃＴｎ−Ｉ陽性細胞などが、心房筋細胞としてはＡＮＰ陽性細胞等、心室筋としてはＭＬＣ２ｖ陽性細胞等、上記脈管系細胞（血管内皮細胞等）としては、例えばＣＤ３１陽性細胞、ＶＥカドヘリン陽性細胞などが挙げられる。脈管系細胞はＤｉＩアセチル化低密度リポタンパク質の取込によっても特定され得る。
中胚葉系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を中胚葉系細胞へ分化させ得る、自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えばタイプＩＶコラーゲンコートしたプレート中における培養（例えばＢｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９３，ｐ１２５３−１２６３，１９９９等参照）、メチルセルロース培地中での培養（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ  １２５，ｐ１７４７−１７５７，１９９８）、中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞（例えばＯＰ９細胞などのストローマ細胞）との共培養（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３；Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，ｖｏｌ．２２，ｐ９７９−９８４；Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７２，７２２−７２４，１９９６；Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９３，ｐ１２５３−１２６３，１９９９；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ  １２５，ｐ１７４７−１７５７，１９９８等参照）などが挙げられる。
本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞を血球系細胞や脈管系細胞（血管内皮細胞等）へ分化させる場合には、好適には、当該多能性幹細胞を上述の中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞と共培養する（例えば「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３」、「Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，ｖｏｌ．２２，ｐ９７９−９８４」、「Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７２，７２２−７２４，１９９６」等参照）。例えばマウスの場合には、当該多能性幹細胞を上述の中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞と共培養することにより、脈管−造血前駆細胞への分化を誘導し、該細胞を例えばＰＥＣＡＭ−１陽性細胞、Ｆｌｋ−１陽性細胞として採取し、得られた細胞を更に中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞と共培養することにより、脈管細胞を得ることが出来る。或いは、該細胞はメチルセルロース培地中で培養されてもよい（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ  １２５，ｐ１７４７−１７５７，１９９８）。
また、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させる場合には、好適には、当該多能性幹細胞をＳＣＦの存在下で上述の中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞と共培養する（例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３等参照）。或いは、例えばマウスの場合には、当該多能性幹細胞を上述の中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞と共培養することにより、Ｆｌｋ−１陽性細胞を採取し、得られた細胞を更に中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞と共培養することにより、心筋細胞を得ることが出来る。
また、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、自体公知の外胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、外胚葉系細胞へ分化する。外胚葉系細胞としては、特に限定されないが、例えば、神経系細胞、表皮系細胞等が挙げられる。外胚葉系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を外胚葉系細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、下記の神経系細胞分化誘導条件等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、自体公知の神経系細胞分化条件にて培養することにより、神経系細胞へ分化する。神経系細胞としては、例えば神経細胞（例えばＭＡＰ２陽性細胞、Ｔｕｊ陽性細胞など）、ドパミン作動性ニューロン（例えばＴＨ及びＴｕｊ両陽性細胞など）、グリア細胞（例えばＭＢＰ陽性細胞など）、オリゴデンドロサイト（例えばＭＢＰ陽性細胞など）、アストロサイト（例えばＧＦＡＰ陽性細胞等）等が挙げられる。
神経系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を神経系細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、神経細胞分化誘導培地（例えばＮ２Ｂ２７培地）を用いたゼラチンコートプレート上での培養等が挙げられる（例えばＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，１８３−１８６，２００３等参照）。
また、本発明の製造方法により得られる多能性幹細胞は、自体公知の内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、内胚葉系細胞へ分化する。内胚葉系細胞としては、特に限定されないが、例えば、消化器系細胞、膵細胞、肝細胞、呼吸器系細胞、甲状腺等が挙げられる。内胚葉系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を内胚葉系細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、インスリン産生細胞への分化条件（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，１１３０７−１１３１２）等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該多能性幹細胞は凍結保存・融解後も多能性を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎仔血清アルブミンを含有するセルバンカー（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。
本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。融解の方法も特に限定されないが、例えば、３７℃の恒温槽中で、１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を用いて行うことができる。具体的には、恒温槽に凍結チューブを浮かべ、凍結させた細胞へＤＭＥＭ／ＦＣＳを滴下して融解する。細胞を遠心して洗浄した後、培地に再度懸濁する。
一度起眠した当該多能性幹細胞を、培養後、再度凍結しても、当該細胞の多能性は維持される。
本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞は、長期間にわたって、多能性を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該多能性幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された多能性幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞等の遺伝子改変多能性幹細胞を製造することができる。
本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞への遺伝子導入の方法としては、例えば、特定の遺伝子が機能的に発現できるように構築されたベクターを多能性幹細胞に導入する。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、センチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられる。
ベクターを多能性幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法が挙げられる。ウイルスをベクターに用いる場合には、上述の一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを細胞に導入してもよいし、ウイルス粒子を、細胞へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを細胞に導入することができる。
特定の外来遺伝子が導入された安定な遺伝子改変多能性幹細胞を選択するには、例えば、ベクターと同時にマーカー遺伝子を細胞へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。
特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞を得る方法としては、例えばターゲッティングベクターを用いた相同的組換え（ジーンターゲッティング法）が挙げられる。即ち、特定の遺伝子の染色体ＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすること等によって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（ターゲッティングベクター）を、相同組換え法により多能性幹細胞の染色体に導入し、得られた細胞について当該特定の遺伝子のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した特定の遺伝子のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞を選択することにより得ることができる。或いは、組織特異的または発達段階特異的な様式で特定の遺伝子を欠失させるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系等を用いてもよい（Ｍａｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１９９９−２００２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４３２３−４３３０）。
本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞は、生体を構成する全ての体細胞へ分化する能力を有しており、ＥＳ細胞やＥＧ細胞に適用される全ての試験技術、方法を当該多様性幹細胞に適用することができ、当該多能性幹細胞を用いて多様な機能細胞、組織、動物（ヒトを除く）等を製造することができる。また上述の方法で遺伝子を改変した多能性幹細胞を用いれば、遺伝子が改変された多様な機能細胞、組織、動物（ヒトを除く）等を製造することができる。
例えば、本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞を上述の中胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、上述の中胚葉系細胞を製造することができる。
また、本発明の製造方法により得られるマウスの多能性幹細胞を上述の外胚葉系細胞（例えば神経系細胞等）分化条件にて培養することにより、上述の外胚葉系細胞（例えば神経系細胞）を製造することができる。
更に、本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞を上述の内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、上述の内胚葉系細胞を製造することができる。
その他、本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞を、例えば、ＥＳ細胞を脈管細胞（血管内皮細胞等）へ分化させる方法（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２５，１７４７−１７５７，１９９８）、ＥＳ細胞を神経細胞へ分化させる方法（Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２８，３１−４０，２０００）、ＥＳ細胞を色素細胞へ分化させる方法（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２５，２９１５−２９２３，１９９８）、ＥＳ細胞をインスリン産生細胞へ分化させる方法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，１１３０７−１１３１２，２０００）、ＥＳ細胞を外胚葉系細胞へ分化させる方法（ＷＯ０１／０８８１００号パンフレット）、ＥＳ細胞の細胞塊（エンブリオイドボディ）を形成させることにより内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトを製造する方法（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，１０，３１，１９９８）等を用いて、多様な機能細胞へと分化誘導することにより、多様な機能細胞を製造することができる。或いは、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ１１４５７−１１４６２，２００３や、Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２７，ｐ１４８−１５４，２００４に記載された方法により、本発明の多能性幹細胞より精子等の生殖細胞を製造し、これを交配に用いることにより該多能性幹細胞の子孫動物を得ることも可能であり得る。
また、本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞をヌードマウス等の免疫不全動物や、免疫寛容を誘導した動物に移入することによりテラトーマを形成させ、当該テラトーマ中から多様な機能細胞を単離することもできる。
更に、本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞の遺伝子を改変し、得られた遺伝子改変多能性幹細胞に上述の方法を適用することにより、遺伝子改変機能細胞を得ることが可能である。
本発明に係る多能性幹細胞を用いた動物（ヒトを除く）の製造は、例えばキメラ胚を用いる方法等の自体公知の方法に準じて行うことができる。
例えば、まず本発明の製造方法により得られた多能性幹細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る。「宿主」の動物種は、導入される多能性幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。「胚」としては、特に限定されないが、例えば胚盤胞、８細胞期胚等が挙げられる。
「胚」はホルモン剤（例えば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させることに等より得ることができる。多能性幹細胞を宿主胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法等が知られているが、いずれの方法を用いることも可能である。
次に、当該キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入し、キメラ動物（ヒトを除く）を得る。宿主動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が移入された宿主動物は、妊娠し、キメラ動物（ヒトを除く）を出産する。
更に、当該キメラ動物（ヒトを除く）を正常動物又は当該キメラ動物同士と交配し、次世代（Ｆ１）個体の中から当該多能性幹細胞由来遺伝子を保有する個体を選択することにより、当該多能性幹細胞由来遺伝子を保有する動物（ヒトを除く）（当該多能性幹細胞に由来する動物）を得ることができる。多能性幹細胞由来遺伝子を保有する動物（ヒトを除く）の選択は、様々な形質を指標として用いることができるが、例えば体色や被毛色が指標として用いられる。また、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選択を行うこともまた可能である。
また、本発明に係る多能性幹細胞を４倍体胚に導入し、４倍体キメラ胚を得て、当該４倍体キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入することによって、該多能性幹細胞に由来する動物を直接得ることも出来る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐ８４２４−８４２８，１９９３）。４倍体胚は自体公知の方法により胚盤胞を電気融合させることにより得ることが出来るが、２細胞胚盤胞をマンニトール溶液中で電気パルスを適用することによって電気融合させてもよい。
上述の方法を用いることにより、例えば特定の外来遺伝子が導入された多能性幹細胞から、当該導入された外来遺伝子を保有する動物（トランスジェニック動物）を得ることができる。また、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞から、遺伝子欠損ヘテロ接合体動物を得ることができる。更に得られた遺伝子欠損ヘテロ接合体動物を繁殖させることで、遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。
また、本発明は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）又はその均等物を含む、精巣細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物に関する。当該組成物を含む培地を用いて、上述の方法により精巣細胞を培養することにより、精巣細胞に由来する多能性幹細胞を得ることができる。
当該組成物は、更に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含むことが出来る。
また、当該組成物は、更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれか、好ましくは全てを含むことができる。
当該組成物は、更に生理学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物、基礎培地などを含むことができる。
当該組成物は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、本発明の製造方法に用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは当該組成物は、本発明の製造方法に用いられる培地であってもよい。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】実験材料及び方法
（細胞培養）
精巣細胞は、ｄｄＹマウス、ＤＢＡ／２マウス、あるいはＤＢＡ／２バックグラウンドにかけあわせたトランスジェニックマウス系統Ｃ５７ＢＬ６／Ｔｇ１４（ａｃｔ−ＥＧＦＰ−Ｏｓｂｙ０１）（以下Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅと呼ぶことがある）（大阪大学、岡部博士より提供）の新生仔（生後０〜８日齢）から採集された。このＧｒｅｅｎ  ｍｉｃｅはＥＧＦＰ遺伝子を実質的に全ての細胞型において発現しているので、ＥＧＦＰの蛍光を指標に当該マウス由来の細胞を追跡することが可能である。
また、幾つかの試験においてはＩＣＲバックグラウンドのＰ５３欠損マウス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．８，ｐ３３１３−３３２２，１９９３）の新生仔から、精巣細胞が採集された。
精巣細胞はコラゲナーゼ（タイプＩＶ、シグマ社製）およびトリプシン（インビトロゲン社製）を用いた２段階酵素分解によって採集された。
即ち、マウスの精巣を摘出し、ＰＢＳ中で白膜を除去し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｉ型）を含むハンクス液中、３７℃にて適宜振蘯しながら１５分間インキュベートし、精細管をほぐした。ＰＢＳにより２回洗浄してはがれた間質の細胞を除去した後、１．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅを含む０．２５％トリプシン液中で３７℃にて適宜振蘯しながら１５分間インキュベートし、精細管をばらばらにした。ＰＢＳを加え、トリプシンを不活性化した後、ピペッティングを行って細胞浮遊液を得た。これを２０〜３０μｍのナイロンメッシュに通して未消化細胞塊を除去し、６００×ｇで５分間遠心して精巣細胞を回収した。
精巣細胞は、ゼラチンコートされた組織培養プレートに配分された（２×１０５細胞／３．８ｃｍ２）。精巣細胞用の培養培地は、ＳｔｅｍＰｒｏサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２５μｇ／ｍｌ  インスリン、１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、６０μＭ  プトレシン、３０ｎＭ  セレン酸ナトリウム、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０μｇ／ｍｌ  ピルビン酸、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸（シグマ社製）、５ｍｇ／ｍｌ  ウシアルブミン（ＩＣＮ  バイオメディカル社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、ＭＥＭ非必須ビタミン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０−４Ｍ  アスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、３０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌ  プロゲステロン（シグマ社製）、２０ｎｇ／ｍｌ  マウス上皮細胞成長因子（ＥＧＦ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（マウス白血病抑制因子：ＬＩＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  組換えラットＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、１（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ  バイオサイエンス社製）が添加されたＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃で維持された。
一晩のインキュベート後に、浮遊している細胞は活発なピペッティングの後に第２培養プレートへ継代された。継代された細胞は１週間以内に増殖してプレートの底に拡がり、コロニーを形成した。
細胞はトリプシン処理によって分散され、５〜１４日間隔（この間隔をＤＩＶと称することがある）で、生体外の新しい培養プレート（×１〜×１／２希釈）へ移された。コロニーは、約１０日で本来の大きさに成長し、細胞は再び継代された（×１希釈）。２度目あるいは３度目の継代から、細胞はマイトマイシンＣで不活性化されたマウス胎存繊維芽細胞（ＭＥＦ）で維持され、２〜５日毎に、培養初期は１から１／２希釈、その後１から１／４希釈の新しいＭＥＦへ継代された。更に、確立されたＥＳ細胞様コロニーは、２〜５日毎に１／４から１／１０希釈の新しいＭＥＦへ継代された。
ＥＳ細胞様コロニーの出現後、細胞は、最終濃度として１５（ｖ／ｖ）％ＦＣＳ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＥＳＧＲＯ（マウス白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、インビトロゲン社製）及び１０ｎｇ／ｍｌ  組換えラットＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地にて培養された。
その後更に細胞は最終濃度として１５（ｖ／ｖ）％ＦＣＳ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、及び１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＥＳＧＲＯ（マウス白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、インビトロゲン社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地にて維持された。
また、一部の試験においては、ＥＳ細胞様コロニーの出現後、細胞は最終濃度として１５（ｖ／ｖ）％ＦＣＳ、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、及び１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＥＳＧＲＯ（マウス白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、インビトロゲン社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地にて培養され、維持された。（当該培養条件をＥＳ細胞培養条件という場合がある。）
新生仔精巣からＥＧ細胞を誘導するために、同様の培地に２０ｎｇ／ｍｌ  ヒトｂＦＧＦ（インビトロゲン社製）を更に補充し、細胞はＳｌ４−ｍ２２０（大阪大学  仲野博士より提供）上で培養された。
成体精巣培養のために、３〜８週齢のＰ５３欠損マウスからの２×１０７個の細胞が用いられ、抗ＣＤ９抗体により精原幹細胞が（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．７０，ｐ７０−７５，２００４）に記載されたように回収され、選択された細胞がゼラチンコートプレート上に播種された（３×１０５細胞／９．５ｃｍ２）。ＧＳ細胞コロニーをマイクロマニピュレーションによりピックアップし、増殖のためにＭＥＦへ移した。
ＥＳ様細胞とＧＳ細胞とは、実体顕微鏡下でコロニーをパスツールピペット等でピックアップすることによっても分離できた。
中胚葉系列への分化のために、培養細胞はＯＰ９フィーダー層上にて培養され、細胞の分化は既述（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７２，ｐ７２２−７２４，１９９６、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ  １２５，ｐ１７４７−１７５７，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３、Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９３，ｐ１２５３−１２６３，１９９９等）の通り実施された。分化に用いられた全てのサイトカインはキリンビール株式会社より提供された。
培養細胞のインビトロにおける血球系細胞への分化誘導は、（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７２，ｐ７２２−７２４，１９９６）の記載に従って実施された。即ち、当該培養細胞をＯＰ９ストローマフィーダー上で培養することにより、血球系細胞への分化を誘導した。
また、一部の試験においては、（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ  １２５，ｐ１７４７−１７５７，１９９８）の記載に従って、培養細胞から血球系細胞への分化誘導が行われた。即ち、培養細胞をメチルセルロース培地中で培養した。
培養細胞の、インビトロにおける心筋細胞への分化誘導は、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３）の記載に従って実施された。即ち、当該培養細胞を、ＳＣＦの存在下、ＯＰ９ストローマフィーダー上で培養することにより、心筋細胞への分化を誘導した。
培養細胞の、インビトロにおける脈管細胞（血管内皮細胞等）の分化誘導は、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３）の記載に従って実施された。即ち、当該培養細胞をＯＰ９ストローマフィーダー上において培養することにより、脈管−造血前駆細胞へ分化を誘導し、５日後にＰＥＣＡＭ−１陽性細胞をソートし、ソートされた細胞をさらにＯＰ９ストローマフィーダー上で培養することにより、脈管細胞（血管内皮細胞等）への分化を誘導した。
脈管細胞はＤｉＩアセチル化低密度リポタンパク質（モレキュラープローブス社製）の取込により特定された。
培養細胞の、インビトロにおける神経細胞およびグリア細胞への分化誘導は、Ｎ２Ｂ２７培地を用い、（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐ１８３−１８６，２００３）の記載に従って実施された。即ち、当該培養細胞を、Ｎ２Ｂ２７培地中、０．１％ゼラチンコート組織培養プラスチックプレートに０．５−１．５  ｘ  １０４／ｃｍ２の密度で播種した。培地は２日ごとに新しいものと交換した。Ｎ２Ｂ２７は、改変Ｎ２（２５ｇ／ｍｌ  インシュリン、１００ｇ／ｍｌ  アポトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌ  プロゲステロン、１６ｇ／ｍｌ  プトレシン、３０ｎＭ  セレン酸ナトリウム及び５０ｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンフラクションＶ（Ｇｉｂｃｏ社製））を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ社製）とＢ２７を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（共にＧｉｂｃｏ社製）との１：１の混合液である。
また、ＥＳ細胞としては、１２９ｓｖｊマウス由来のものを用いた。
一部の試験においては、ＣＡＧプロモーターの下でＥＧＦＰ遺伝子をユビキタスに発現しているＤ３  ＥＳ細胞（大阪大学岡部博士より提供：Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐ１９３−２００，１９９１）が用いられた。ＥＳ細胞は標準的なＥＳ細胞培地で維持された。
（抗体及び染色）
本発明の製造方法で製造された細胞等の性質を確認するために、自体公知のＥＳ細胞や精子形成細胞等のマーカーの発現を調べるフローサイトメトリーが実施された。
一次抗体としては、ラット抗ＥｐＣＡＭ（Ｇ８．８）、マウス抗ＳＳＥＡ−１（ＭＣ−４８０）、マウス抗筋繊維タンパク質（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＦ２０）（発生研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）、ラット抗マウスフォルスマン（Ｆｏｒｓｓｍａｎ）抗原（Ｍ１／８７）、ラット抗ヒトα６−インテグリン（ＣＤ４９ｆ）（ＧｏＨ３）、ビオチン化ハムスター抗ラットβ１インテグリン（ＣＤ２９）（Ｈａ２／５）、ビオチン化ラット抗マウスＣＤ９（ＫＭＣ８）、ＡＰＣ結合ラット抗マウスｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）（２Ｂ８）、ラット抗マウスＣＤ３１（ＭＥＣ１３．３）、ＰＥ結合ラット抗マウスＴｅｒ１１９（Ｔｅｒ−１１９）、ビオチン化ラット抗マウスＭａｃ１（Ｍ１／７０）、ビオチン化ラット抗マウスＧｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、ラット抗マウスＶＥ−カドヘリン（１１Ｄ４．１）、ＡＰＣ結合ラット抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１）（ＢＤバイオサイエンス社製）、ラット抗ＴＤＡ抗原（ＥＥ２）（大阪大学西宗博士より提供）、ＡＰＣ結合ラット抗マウスＦｌｋ−１（Ａｖａｓ１２α１）（理研西川博士より提供）、ヤギ抗マウス心筋トロポニン−１（ｃＴｎ−１）（サンタクルスバイオテクノロジー社製）、マウス抗ヒトミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）（アレクシスバイオケミカルズ社製）、ウサギ抗マウス心房性ナトリウム利尿ペプチド（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＡＮＰ）（プロトスバイオテックコーポレーション社製）、マウス抗ヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（Ｐｍ４３）、ウサギ抗グリア繊維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＡＰ）、ウサギ抗マウスタイロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、マウス抗ヒトβ−チュブリンＩＩＩ（Ｔｕｊ）（ＳＤＬ．３Ｄ１０）（シグマ社製）、抗ＭＡＰ２ウサギポリクローナル抗体、マウス抗ミオシン重鎖モノクローナル抗体（ＭＦ２０）が用いられた。
ＡＰＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製）、ＡＰＣ結合ストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンス社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７結合ヤギ抗ラットＩｇＭ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（モレキュラープローブ社製）、Ｃｙ３結合ロバ抗マウスＩｇＧ、Ｃｙ３結合ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＡＬＰ若しくはパーオキシダーゼ結合ロバ抗マウスＩｇＧ、ＡＬＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ社製）、ＡＬＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（ベクターラボラトリーズ社製）又はＡＬＰ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（ケミコン社製）が二次抗体として用いられた。
細胞染色技術は（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，ｖｏｌ．９６，ｐ５５０４−５５０９，１９９９）の記載に従って実施された。細胞はＦＡＣＳ−Ｃｉｌｉｂｕｒシステム（ＢＤバイオサイエンス社製）で解析した。
インビトロで分化させた機能細胞の免疫細胞染色は、標凖的なプロトコールを用いて実施された。即ち細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で固定し、一次抗体で処理し、抗原の局在をＣｙ３を結合させた二次抗体を用いて可視化した。
ＡＬＰ又はＤＡＢ染色は、ＶＥＣＴＯＲアルカリフォスファターゼ基質キット又はＤＡＢ基質キット（ベクターラボラトリーズ社製）を用い、製造者のプロトコールに従って、それぞれ行われた。
アルカリフォスファターゼ染色は（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５２，８０９−８１１，１９９１；Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．４４，８３１−８３８，１９８６）の記載に従って実施された。
（移植及びレシピエントの解析）
テラトーマ形成の解析においては、約２×１０６個の培養された細胞がＫＳＮヌードマウス（日本ＳＬＣ）の皮下に注入され、移植から３週間後に解析された。形成された組織は１０％中性緩衝ホルマリンで固定され、パラフィン切片の処理がなされた。切片はヘマトキシリンおよびエオジンで染色され、顕微鏡下観察された。
精細管内への微注入のために、約３×１０５個の細胞が免疫抑制されたＷマウス（日本ＳＬＣ）レシピエントの精細管内へ輸出管を通して注入された（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６８，１６７−１７３，２００３）。
全ての動物実験のプロトコールは、京都大学の動物保護および使用制度委員会によって承認されたものである。
（キメラ形成及び顕微受精）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３．５ｄｐｃ胚盤胞の割腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌ）内に１０から１５個のＧｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ由来の培養された細胞がピエゾ駆動マイクロマニピュレーターを用いて注入された（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２１，２３９７−２４０５，１９９５）。胚盤胞は２．５ｄｐｃの偽妊娠ＩＣＲ里親マウスの卵管又は子宮に、微注入の日に戻された。約７０％の細胞が注入時に、ＥＳ細胞注入後のキメリズムの割合や生殖系列への伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）に影響を及ぼす正倍数性核型（ｅｕｐｌｏｉｄ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）を保持していた。
４倍体胚凝集キメラが、２細胞胚盤胞を３００ｍＭマンニトール溶液中で電気パルス（２５００Ｖ／ｃｍ  １０μ秒）を適用することによって電気融合させたことを除き、Ｎａｇｙらが開発した方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐ８４２４−８４２８，１９９３）を用いて作成された。
１２．５ｄｐｃの胎仔マウスを摘出し、ＵＶ光下実体顕微鏡を用いて観察した。また、当該胎仔マウスは４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラ精機）中で凍結し、凍結切片を作成した。切片は、蛍光顕微鏡（オリンパス共焦点レーザースキャニング顕微鏡）を用いてＧｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ由来のＥＧＦＰの蛍光を指標にキメリズムを解析した。対照染色としてはＰＩを用いた。
また自然分娩により出産されたキメラマウス新生仔を、ＵＶ光下実体顕微鏡を用いて観察した。
顕微受精はＢＤＦ１卵母細胞を用いて既述の通り行われた（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２１，ｐ２３９７−２４０５，１９９５）。胚は培養の翌日に移入された。
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲによるＯｃｔ−４、ＨＰＲＴ、Ｒｅｘ−１、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、Ｅｓｇ−１、Ｃｒｉｐｔｏ及びＺＦＰ５７の発現の解析は、（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９７，３９２−３９５，２００２；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１３，４７３−４８６，１９９３；Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１３，６３１−６４２，２００３；ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１００，１４９２６−１４９３１，２００３；Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２３，５４１−５４５，２００３；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１２，１９２１−１９２８，２００２；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３５，１２−３２，２００１；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２６５，４９１−５０１，２００４等）に記載の特異的プライマーを用いて実施された。Ｏｃｔ−４、ＵＴＦ１及びＨＰＲＴのＰＣＲ増幅は下記の特異的プライマーを用いて行われた。
［Ｏｃｔ−４］
５’−ＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１）
５’−ＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴ−３’（配列番号２）
［ＵＴＦ１］
５’−ＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＴ−３’（配列番号３）
５’−ＴＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＧＡＡＧＧＴＡＴ−３’（配列番号４）
［ＨＰＲＴ］
５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴ−３’（配列番号５）
５’−ＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’（配列番号６）
（インプリントされた遺伝子の解析）
インプリントされた遺伝子のＤＭＲの亜硫酸染色体シークエンシングは既述の通りに行われた（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２９，ｐ１８０７−１８１７，２００２）。亜硫酸処理された染色体ＤＮＡからの各々のＤＭＲ領域のＰＣＲ増幅は、下記の特異的プライマーを用いて行われた。
［Ｈ１９］
５’−ＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号７）
５’−ＡＡＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧ−３’（配列番号８）
［Ｍｅｇ３  ＩＧ］
５’−ＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＴＡＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号９）
５’−ＡＴＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣ−３’（配列番号１０）
［Ｒａｓｇｒｆ１］
５’−ＧＴＧＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧ−３’（配列番号１１）
５’−ＡＴＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１２）
［Ｉｇｆ２ｒ］
５’−ＴＴＡＧＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＧ−３’（配列番号１３）
５’−ＡＡＡＴＡＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１４）
［Ｐｅｇ１０］
５’−ＧＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＡＧＴＧ−３’（配列番号１５）
５’−ＴＴＡＡＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴ−３’（配列番号１６）
［Ｏｃｔ−４］
５’−ＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号１７）
５’−ＴＣＣＡＡＣＣＣＴＡＣＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１８）
ＤＮＡ配列は両方向において決定された。ＣＯＢＲＡについては、ＰＣＲ産物は起源となる未転換ＤＮＡ中のＣｐＧを含む配列を認識する制限酵素により消化された（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２５，２５３２−２５３４，１９９７）。消化されたＤＮＡバンドの強度は、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅソフトウェア（フジ写真フィルム社製）により定量された。
結果
新生仔のＤＢＡ／２マウス又はｄｄｙマウスの精巣をＧＤＮＦ，ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＬＩＦを含有する培養液中で培養した際に、コロニーの大部分は、細胞間架橋（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｒｉｄｇｅ）と桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）様構造により特徴付けられる、ＧＳ細胞の典型的な外観を有していた（図１ｄ）。しかしながら、少数（＜５％）のコロニーはＥＳ細胞への著しい類似を呈していた（図１ａ及びｂ）。これらのコロニーはより硬く詰め込まれ（ｐａｃｋｅｄ）、通常培養開始後３から６週間（約４〜７回継代）以内に出現した。
これらのＥＳ細胞様コロニーは、ＦＣＳ、２−メルカプトエタノール、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及びグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地用いて、マウス胎仔繊維芽細胞フィーダー上にて培養すると、数の増加により選択的に増殖した。２から３回の継代後、培養中のほとんどのコロニーはＥＳ細胞様コロニーとなった（図１ｃ）。これらのＥＳ細胞様コロニーはＥＳ細胞培養条件（ＦＣＳ、２−メルカプトエタノール及びマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いて、マウス胎仔繊維芽細胞フィーダー上にて培養）にて維持することが可能であった。この後、細胞をＥＳ細胞培養条件下で維持する限りは、形態は変化しなかった。反対にＧＳ細胞は、精原幹細胞の自己再生分裂のための必須の成長因子であるＧＤＮＦ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８７，ｐ１４８９−１４９３，２０００）の不在のため、該条件下では増殖することが出来なかった。
ヘキスト３３２５８を添加したキナクリン染色による染色体解析（ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ＥＳ様細胞が、分裂中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ｓｐｒｅａｄ）の７０〜８５％において正常な核型（ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）（４０、ＸＹ）を有することを示した（図２）。
当該ＥＳ様細胞は、インビトロで、３０乃至４８回の継代で５ヶ月以上、未分化状態を維持しながら増殖した。これらの結果は再現性があった。なぜなら、異なる染色本型（ｄｄＹ、ＤＢＡ／２、ＩＣＲ等）や齢（０から８日齢）のマウスを含む２１回の実験中４回において同様な細胞が獲得されたからである。
ＥＳ様細胞を形成する全頻度は約１．５×１０７個細胞中１個であった（新生仔精巣３５個に相当）。意義深いことに、少なくとも２０回の試験において、新生仔精巣細胞を直接ＥＳ細胞培養条件で培養しても、ＧＳ細胞、ＥＳ様細胞のいずれも出現しなかった。同様に、少なくとも１５回の試験において、新生仔精巣細胞を膜結合スチール因子（ｍＳＣＦ）、ＬＩＦ及びｂＦＧＦの存在（ＥＧ細胞培養条件）下で培養しても、ＧＳ細胞、ＥＳ様細胞のいずれも出現しなかった；ＧＤＮＦの添加がＧＳ細胞及びＥＳ様細胞コロニーの両方の発生に必須であった。
ＧＳ細胞がＥＳ様細胞に転換し得るか決定するために、培養開始から２ヶ月後に、マイクロマニピュレーションにより全部で１４８個のＧＳ細胞コロニーをピックアップした。ＧＳ細胞は９６穴プレートに移され、更に３ヶ月増殖された。その結果、１個のＧＳ細胞コロニーがＥＳ様細胞を産生した。該ＥＳ様細胞の多能性はヌードマウス内への皮下注入による、インビボにおけるテラトーマ形成能力により確認された。
更に、本発明者らはＰ５３ノックアウトマウス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．８，ｐ３３１３−３３２２，１９９３）を用いた。Ｐ５３ノックアウトマウスは高い頻度で精巣テラトーマを発症する（ＡＰＭＩＳ，ｖｏｌ．１１１，ｐ１８４−１９１，２００３）。本発明者らはＥＳ様細胞がテラトーマ形成細胞と密接に関与し得るとの仮説を立て、当該系統からの確立されたＧＳ細胞がより容易にＥＳ様細胞に転換するか検討した。ＧＳ細胞がＩＣＲバックグラウンドの新生Ｐ５３ノックアウトマウスから確立された。ＧＳ細胞の増殖スピード及び形態は野生型細胞のそれらと区別がつかず、ＧＳ細胞を得るためにＧＤＮＦが同様に必要であった。
培養から２ヵ月後、３０〜４０個の未分化形態のＧＳ細胞コロニーがマイクロマニピュレーションによりピックアップされ、９６穴プレートに移され、ＧＳ細胞培養液（ＧＤＮＦ、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ含有）中で培養された。意義深いことに、２つの異なる試験において、２ヶ月以内にＧＳ細胞由来培養物中にＥＳ様細胞が出現し、該コロニーは野生型細胞からのＥＳ様コロニーと形態学的に区別できなかった。
Ｐ５３ノックアウトＧＳ細胞からのＥＳ様細胞の出現頻度（２回の試験中２回）は野生型ＧＳ細胞を用いた場合と比較して極めて高かった。
Ｐ５３ノックアウトマウスを用い、本発明者らは成熟精巣からのＧＳ細胞がＥＳ様細胞を産生できるかについても試験した。精原幹細胞が抗ＣＤ９抗体を用いて３〜８週齢マウスから採集され、ＧＳ細胞培地中で培養された。ＧＳ細胞は２乃至３の試験において発生した。培養開始から４〜７日後に未分化形態のＧＳ細胞がピックアップされ、インビトロでマイトマイシンＣ不活化されたマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）上にてコロニーが増殖された。全体で、８回の試験中２回において、培養４週以内にＥＳ様細胞が出現した。
これらのＥＳ様細胞の表現型を調べるために、Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅからの培養を確立した。当該ｍｉｃｅはＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を、精原細胞を含めてユビキタスに発現しているので（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３）、ＵＶ光励起により培養細胞をフィーダー細胞から識別することができる。
上記培養細胞中のＥＧＦＰ陽性の細胞（ＥＳ様細胞）について表面抗原の発現がフローサイトメーターにより解析され、当該細胞がほぼ一つの形質学的集団を構成することが示された（図３）。図３（ａ）〜（ｈ）に示されるように、当該細胞は、ＳＳＥＡ−１（ＥＳ細胞マーカー）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ５５６５−５５６９，１９７８）、β１−及びα６−インテグリン（ＥＳ及びＧＳ細胞マーカー）（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３）、ＥｐＣＡＭ（ＥＳ細胞及び精原細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ）マーカー）（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，ｖｏｌ．１１６，ｐ３７９−３８４，１９９９）およびＣＤ９（ＥＳ細胞及び精原幹細胞（ＧＳ細胞）マーカー）（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．７０，ｐ７０−７５，２００４）が陽性であり、ＥＥ２（精原細胞マーカー）（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，ｖｏｌ．４０，ｐ２２１−２２７，１９９５）は陽性又は弱陽性、フォルスマン抗原（ＥＳ細胞マーカー）（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２９２，ｐ１５４−１５６，１９８１）及びｃ−ｋｉｔ（分化した精原細胞マーカー）（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４０，ｐ５８９４−５９００，１９９９）が弱陽性であった。
これとは対照に、ＧＳ細胞はＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原が完全に陰性であることから（図４（ａ）、（ｆ））、当該ＥＳ様細胞はＧＳ細胞とは異なる表現型を有することが示唆された。また、ＧＳ細胞はβ１−及びα６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、ＥＥ２及びｃ−ｋｉｔが陽性であった。（図４（ｂ）〜（ｅ）、（ｇ）、（ｈ））。Ｐ５３ノックアウトマウスからのＧＳ細胞は同様の発現プロファイルを示した（データ示さず）。
また、ＥＳ細胞はＳＳＥＡ−１、β１−及びα６−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ９、フォルスマン抗原及びｃ−ｋｉｔが陽性であり、ＥＥ２は弱陽性であった（図５（ａ）〜（ｈ））。
培養開始前の精巣細胞は、ＳＳＥＡ−１が陰性であり、４０％程度の集団がフォルスマン抗原陽性であった（図６（ａ）（ｂ）、図７）。培養開始前の新生精巣細胞集団においてフォルスマン抗原の幾つかの発現を見出したが、それは非生殖細胞集団による発現であって、ＥＥ２陽性細胞は見出せなかった（図８）。
当該ＥＳ様細胞は、ＥＳ細胞に特徴的であるアルカリフォスファターゼが強陽性であった（図９（ａ））。一方ＧＳ細胞はアルカリフォスファターゼが弱陽性乃至陰性であり（図９（ｂ））、当該ＥＳ様細胞はＧＳ細胞とは異なる表現型を有することが示唆された。ＥＳ細胞はアルカリフォスファターゼが陽性であった（図９（ｃ））。
次に、本発明者らは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、胚性カルシノーマ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＥＣ）又はＥＳ細部に特異的に発現している多くの分子を試験した。未分化なＥＳ細胞を維持するのに必須なＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１及びＮａｎｏｇに加え（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ｖｏｌ．１９，ｐ２７１−２７８，２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ１４９２６−１４９３１，２００３、Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１３，ｐ６３１−６４２，２００３、Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１３，ｐ６４３−６５５，２００３）、ＥＳ様細胞はＣｒｉｐｔｏ、ＥＲａｓ、ＵＴＦ１及びＺＦＰ５７をＥＳ細胞と同様のレベルで発現していた（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３５，１２−３２，２００１；Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２３，５４１−５４５，２００３；ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．１７，ｐ２０１９−２０３２，１９９８；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１２，１９２１−１９２８，２００２；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２６５，４９１−５０１，２００４）。これらの結果は、当該ＥＳ様細胞は、ＥＳ細胞と表現型が類似していることを示唆した。一方、ＧＳ細胞もこれらの分子の幾つかを発現するが、発現は一般により弱かった。重要なことに、ＧＳ細胞においてはＮａｎｏｇの発現がほとんど認められず、ＧＳ細胞はＥＳ細胞とは異なる自己再生の為のメカニズムを有し、また当該ＥＳ様細胞はＧＳ細胞とは異なる表現型を有することが示唆された（図１０、１１）。
ＥＳ様細胞のインプリンティングパターンを解析するために、３つの父性インプリント領域（Ｈ１９、Ｍｅｇ３  ＩＧ及びＲａｓｇｒｆ１領域）及び２つの母性インプリント領域（Ｉｇｆ２ｒ及びＰｅｇ１０領域）の示差的メチル化領域（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ：ＤＭＲｓ）が２つの独立した細胞について亜硫酸シークエンシングにより試験された（図１２）。父性インプリント領域は異なる程度でメチル化されていたが、母性インプリント領域はＥＳ様細胞においてはほとんどメチル化されていなかった。ＥＳ細胞におけるＤＭＲは、母性インプリント領域も含めて、一般的にＥＳ様細胞におけるものよりも、よりメチル化されており、Ｈ１９領域のＤＭＲは他の領域のＤＭＲよりも、より広範囲にわたってメチル化されていた。逆に、ＧＳ細胞は完全に雄性のインプリンティングパターン（Ｈ１９及びＭｅｇ３  ＩＧ  ＤＭＲの完全なメチル化、並びにＩｇｆ２ｒ  ＤＭＲの脱メチル化）を示した。
次に、本発明者らはＰ５３ノックアウトマウスからのＧＳ又はＥＳ様細胞のインプリント状態を試験した。ＧＳ細胞のＥＳ様細胞への転換の間の４つの異なる時点での同じ細胞集団から、染色体ＤＮＡが単離された。この試験において、ＤＭＲのインプリント状態は結合亜硫酸制限解析（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＣＯＢＲＡ）（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２５，ｐ２５３２−２５３４，１９９７）により決定された（図１３Ａ）。野生型ＧＳ細胞の解析から推測されるように、Ｐ５３ノックアウトマウスからのＧＳ細胞は雄性インプリントパターンを有していた。しかしながら、Ｈ１９、Ｍｅｇ３ＩＧ及びＲａｓｇｆｒ１領域のＤＭＲにおけるメチル化の消失、及びＩｇｆ２ｒ領域中のＤＭＲのメチル化が、ＥＳ様細胞出現後すぐに観察された。インプリントパターンの混乱はＧＳ細胞が消失した時にさえ継続し、ＥＳ様細胞の出現１８日後において、Ｐｅｇ１０領域のＤＭＲのみがそのままであった。ＥＳ細胞及びＥＳ様細胞におけるＯｃｔ−４領域のＤＭＲは全て低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）されており、これはこれらの細胞の未分化状態を確認した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７９，ｐ１７０６３−１７０６９，２００４）（図１３Ｂ）。
ＥＳ様細胞が体細胞系列へ分化することが出来るかを決定するために、本願発明者らはインビトロでＥＳ細胞の分化を誘導するためにデザインされた方法を用いた。Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ由来のＥＳ様細胞は第一にＯＰ９ストローマフィーダー層に移された。ＯＰ９ストローマフィーダー細胞は造血系細胞、血球細胞や筋細胞等の中胚葉系細胞の分化を支持できる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２６５，ｐ１０９８−１１０１，１９９４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐ４０１８−４０２３，２００３）。１０日以内に、造血系細胞、血球系細胞、脈管細胞（血管内皮細胞等）（ＣＤ３１陽性細胞）及び自発的に拍動する心筋細胞（ＭＦ２０陽性細胞）を含む多様な細胞が確認された。血球系細胞には、赤芽球（Ｔｅｒ１１９陽性細胞）、血球細胞（ＣＤ４５陽性細胞）、ミエロイド系細胞（ミエロイド前駆細胞、単球系細胞（Ｍａｃ１陽性細胞）、好中球系細胞（Ｇｒ１陽性細胞））が含まれていた（図１４Ａ−Ｈ、図１５）。
ＥＳ様細胞をメチルセルロース中で培養し、エンブリオイドボディを形成させたときにも、造血を誘導することが出来た（図１４Ｉ）。神経系列細胞の分化のために、ＥＳ様細胞をゼラチンコートディッシュ上へ移すと（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．２１，ｐ１８３−１８６，２００３）、該細胞はニューロン（ＭＡＰ２陽性細胞）又はグリア細胞（ＭＢＰ陽性細胞）を形成した（図１４Ｊ−Ｌ）。ドパミン作動性ニューロンも、低い頻度ながら見出された（図１４Ｍ）。ＥＳ細胞を用いて分化効率を比較すると、ＥＳ様細胞はＥＳ細胞よりもよりグリア細胞を産生し、ＥＳ様細胞から有意によりの多く脈管細胞（血管内皮細胞等）または心筋細胞コロニーが派生した。しかしながら、ＥＳ様細胞は、ＥＳ細胞分化のためのプロトコールを用いて期待される全ての系列を産生することが出来た（表１）。
【表１】
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表１は精巣からのＥＳ様細胞のインビトロ分化を示す。表中の値は平均値±ＳＥＭを示す。少なくとも３試験からの結果である。ＥＳ細胞は１２９マウスからの由来であり、一方、ＥＳ様細胞はＤＢＡ／２マウスからの由来である。＊：Ｆｌｋ−１陽性細胞（５    １０３）が共培養４日後にソートされ、２４穴プレート中のＯＰ９フィーダー上へ再び播かれた。†：細胞はソーティング７日後に回収され、フローサイトメトリーにより解析された。赤血球、マクロファージ及び顆粒球が、それぞれ抗Ｔｅｒ１１９、抗Ｍａｃ１及び抗Ｇｒ１抗体により確認された。‡：ソーティング８日後における、それぞれのウェル中の陽性細胞の数を示す。脈管細胞はＤｉＩ−アセチル化低比重リポタンパク質の取り込みにより決定された。心筋コロニーは、拍動しているコロニーを数えることにより確認された。§：４８穴プレート中のゼラチン上に細胞（２．５  １０４）が播かれ、１ｃｍ２あたりの陽性細胞の数が、播腫後５日（ニューロン）又は７日（アストロサイト又はオリゴデンドロサイト）に決定された。ニューロンは抗Ｔｕｊ抗体により、一方アストロサイト及びオリゴデンドロサイトは、それぞれ、抗ＧＦＡＰ抗体又は抗ＭＢＰ抗体により決定された。ドパミン作動性ニューロンが〜１０細胞／ウェル産生された。¶：ｔ−テストにより統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であることを示す。
ＥＳ様細胞は、ヌードマウス内への皮下注入により、インビボにおいてテラトーマを形成する能力について更に試験された。移植後３乃至４週間で、全てのレシピエント（８／８）において、移植された細胞は典型的なテラトーマを生じた（図１４Ｎ）。当該癌（テラトーマ）には、３つの胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒ）の派生物、例えば神経、表皮、筋肉、気管支上皮、軟骨、骨、扁平上皮細胞、神経上皮等が含まれていた。同様の結果が、３つの異なるクローンやＰ５３ノックアウトマウスからのＥＳ様細胞（８／８）を用いて得られ、ＥＳ細胞に由来するテラトーマとの有意な組織学的差異は観察されなかった。これとは対照に、ＧＳ細胞や新鮮な精巣細胞をヌードマウスの皮下へ移植しても、癌形成は認められなかった（データ示さず）。従って、当該ＥＳ様細胞は、ＥＳ細胞と類似した様式で、多様な体細胞系列へ分化する特性を有することが示された。
当該ＥＳ様細胞は精巣からの起源であるので、生殖系列細胞への分化能力は、精原細胞移植の技術により試験された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９１，ｐ１１２９８−１１３０２，１９９４；特表平７−５０１７０５号公報）。この方法は、精原幹細胞により、不妊動物の空の精細管を再コロニー化（ｒｅｃｏｌｏｎｉｚｅ）させて、成熟精子へ分化させる。当該培養細胞を免疫抑制された未成熟のＷマウス内に移植した（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６８，ｐ１６７−１７３，２００３）。このマウスは先天的に不妊であって、精細管内に内在性の分化している生殖細胞を有していない（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９１，ｐ１１２９８−１１３０２，１９９４）。移植後１ヶ月で、全てのレシピエント動物（１０／１０）は精巣内にテラトーマを発生した。精細管組織は乱れており、組織学的解析では精子形成の兆候はなかった。テラトーマ内に認められた細胞の型は、皮下注入により発生させたものと同様であり（データ示さず）、このことは精細管の微小環境は当該培養細胞の分化パターンに影響しないことを示している。これとは対照に、野生型又はＰ５３ノックアウトのＧＳ細胞が精細管内に注入されたときには、移植後２ヶ月以内に正常な精子形成が認められた（図１４Ｏ−Ｑ）。
更に当該ＥＳ様細胞のインビボにおける分化特性を調べるために、当該ＥＳ様細胞を胚盤胞内に微注入した。なぜなら、ＥＳ細胞は胚盤胞へ入り（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）、生殖系列を含む、体内の全ての細胞型に寄与するからである。５から１５個のＧｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ由来のＥＳ様細胞をＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞内に注入した。キメリズムや生殖系列伝達の割合に極めて影響を及ぼす正倍数性細胞（ｅｕｐｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ）の割合は、注入時には７０％であった（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６，ｐ３２１−３２８，１９９７）。
インビトロで２４時間培養後、当該キメラ胚は偽妊娠レシピエントマウスの子宮に戻された。レシピエント動物の幾つかはキメリズムをみるために１２．５ｄｐｃで解析され、他のレシピエントは最後まで発生させた。胎生１２．５日において胎仔は正常に発生し、２５％（３／１２）においてキメリズムが観察され、胎仔の全身においてＵＶ光下でＥＧＦＰの発現が認められた（図１６Ａ）。キメラマウス胎仔は自然分娩により出産され、新生動物では３６％（１３／３６）において胎仔と同様にキメリズムが観察された（図１６Ｂ）（図１７）。キメリズムは成熟期の被毛色によっても確認された（図１６Ｃ）。ＥＧＦＰ発現を示す６匹の死んだ胎仔を認め、幾つかの胚は部分的に又は完全に堕胎されていた。ドナー細胞の寄与のパターンは解析された両方の段階（胎仔及び新生仔）において類似していた；ＥＧＦＰ陽性ドナー細胞の寄与が中枢神経系（脳、脊髄、神経管等）、肝臓、心臓、肺、精巣、体節（ｓｏｍｉｔｅｓ）、腸管、及び卵黄嚢（ｙｏｌｋ  ｓａｃ）、胎盤の絨毛膜（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を含む他の組織において認められた（図１６Ｄ−Ｊ）（図１８）。
ドナー細胞は６週齢におけるキメラマウスの精巣内においても見出されたので、子孫を獲得するために顕微受精を行った。円形の精子が回収され、Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２（ＢＤＦ１）卵母細胞中へ微注入された。８１個の培養された胚のうち、６４個（７９％）が２細胞へ分化し、５匹の偽妊娠雌内へ移入された。１８個（２２％）の胚が着床し、レシピエントマウスからの２匹の子孫のうち１匹がドナー起源を表すＥＧＦＰ蛍光を示した（図１６Ｋ）。興味深いことに、対照ＥＳ細胞は胚への幅広い寄与を示したが、ＧＳ細胞を用いた試験においてはドナー細胞の寄与は観察されなかった（表２）。
【表２】
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表２はＥＳ様細胞の胚発生への寄与を示す。ＮＡ：不実施を示す。＊：幾つかの試験では、胎仔は１９．５ｄｐｃにて帝王切開により分娩された。†：出生後翌日において生存している仔の数を示す。
ＥＳ陽細胞の全発生能を試験するために、本発明者らは４倍体補足技術（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐ８４２４−８４２８，１９９３）を用いた。この技術は、全てドナーＥＳ細胞からなる生存動物の産生を可能にする。全部で９２個の４倍体胚が電気融合により創造され、ＥＳ様細胞と凝集され、偽妊娠ＩＣＲ雌へ移入された。レシピエント動物の幾つかは１０．５ｄｐｃにて屠殺され、１匹の正常に見える胎仔と正常な胎盤による多くの吸収が認められた。胎仔はいくつかの成長遅延を示したものの、卵黄嚢を含む全身に渡りＥＧＦＰ遺伝子を明確に発現していた（図１６Ｌ）。このことは、胎仔はドナーＥＳ様細胞に由来することを示す。
以上より、インビボにおいても本発明のＥＳ様細胞は生殖系列を含む生体のあらゆる体細胞に分化しうる能力（全能性）を有することが示された。
（考察）
上記実施例は、出生後の精巣の中に多能性の幹細胞の存在を明らかとした。「幹細胞可塑性」現象の幾つかのケースは細胞融合が原因であるが（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１６，ｐ６３９−６４８，２００４）、本発明のＥＳ様細胞は同じメカニズムによっては説明できない。なぜなら、本発明のＥＳ様細胞は皮下移植後にテラトーマを形成するからである。精巣由来のＥＳ様細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞の出生後の相対物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）でありうる。上記実施例の結果は予期できないものである。なぜなら、ＰＧＣは１３．５ｄｐｃ後に試験的テラトーマ形成又はＥＧ細胞形成に対して抵抗性になるからである（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．，ｖｏｌ．１５，ｐ６９−７４，１９８４；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２０，ｐ３１９７−３２０４，１９９４）。ＥＧ細胞は初期の生殖細胞からの多能性幹細胞の単離物の例でしかないと考えられる（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５９，ｐ５５０−５５１，１９９２；Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７０，ｐ８４１−８４７，１９９２）。ＥＧ細胞は８．５−１２．５ｄｐｃ胎仔から回収された初期の生殖細胞に由来し、ｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦの混合物を用いてインビトロで培養される。しかしながら、細胞をインビボでテラトーマ形成させた後に培養するケースを除けば、多能性細胞は同じ培養条件を用いても、新生の生殖細胞から単離することはできない（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２０，ｐ３１９７−３２０４，１９９４）。本発明のＥＳ様細胞は２つの理曲によりテラトーマ由来ではなさそうである。第一に、本発明に係るＥＳ様細胞の派生物の頻度は自然に起こるテラトーマ形成の極めて低い頻度よりも有意に高い（１２９ハイブリッドバックグラウンドの雄１１２９２匹中、１つのテラトーマ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，ｖｏｌ．２７，ｐ４４３−４５３，１９６１））。第二に、増殖因子の補充がＥＳ様細胞の確立に必須である。実際に、自然に起こったテラトカルシノーマから少数のＥＣ細胞株しか獲得されていない（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ４７５−５０８，１９８６）。従って、多能性細胞を形成する能力は生殖系列に内在し得る。上記実施例に基づき、本発明のＥＳ様細胞を、生殖系列にのみ分化できるＧＳ細胞と識別するために、多能性生殖系列幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｍＧＳ細胞）と呼ぶことを提案する。
本発明において、提案される一つの重要な問題は、ｍＧＳ細胞の起源である。一つの可能性は、ｍＧＳ細胞はＧＳ細胞から独立して出現し、胎仔期から精巣中に存在していた未分化の多能性細胞の集団を起源とすることである。ＥＧ細胞は１２．５ｄｐｃまでのＰＧＣから樹立されたが（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７０，ｐ８４１−８４７，１９９２；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２０，ｐ３１９７−３２０４，１９９４）、類似の特徴を有する細胞が新生精巣中に残存し、ＥＳ様細胞を産生したのかもしれない。実際に、野生型ｍＧＳ細胞のインプリンティング解析の結果はｍＧＳ細胞のための異なる起源を示唆する。雄性の生殖細胞においては、染色体インプリンティングは胎仔期の間に消去され、雄特異的インプリンティングが出生時あたりに前精原細胞において獲得されはじめ、出生後に完了する（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．５８，ｐ１８−２８，１９９９；Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．９，ｐ２８８５−２８９４，２０００；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，ｖｏｌ．６，ｐ７０５−７１４，１９９２）。ＧＳ細胞は典型的な雄性インプリンティングパターンを有しており、ｍＧＳ細胞のインプリンティングパターンは雄性の生殖細胞や体細胞とは明らかに異なっていた。これはｍＧＳ細胞が、インプリント消去を受けた雄性の生殖細胞を部分的に起源とし得ることを示唆する。
新生仔精巣中の雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）は異成分性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）であると報告されている；偽足性（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄ）雄性生殖細胞は精原細胞移植の後に精子形成を生ずる能力を有す一方、円形（ｒｏｕｎｄ）雄性生殖細胞は精子形成を生じず、インビトロでアポトーシスを起こす。精原幹細胞活性に関してｍＧＳ細胞はＧＳ細胞とは異なっているので、ｍＧＳ及びＧＳ細胞は異なった雄性生殖細胞の型を起源としているかもしれない。
もう一方の可能性は、ｍＧＳ細胞は精原幹細胞に由来し、多能性細胞になれる能力は生殖系列細胞（精原幹細胞等）の一般的な特徴の１つであるかもしれないということである。セルトリ細胞との相互作用は、通常は生殖細胞を精子形成に向かわせ、精巣内における多系列分化を抑制し得る。しかしながら、本発明の培養条件中で、セルトリ細胞の不在下で生殖系列細胞を継続的に刺激して増殖させたときに、生殖細胞がこの抑制から開放され、細胞のうちのいくつかが多能性細胞に転換するのかもしれない。テラトジェネシス（ｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）は環境の影響に対して感受性が強く、インビボにおいて胎仔生殖堤（ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｒｉｄｇｅ）の子宮外（ｅｃｔｏｐｉｃ）移植によりテラトーマ形成は有意に高められる（〜１０倍）（Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．，ｖｏｌ．１５，ｐ６９−７４，１９８４）。本発明の多能性幹細胞の製造方法において、培養開始後の早い時点における継代による体細胞の希釈が、ｍＧＳ細胞の樹立に有効であることから、精巣の環境は多系列分化にとって抑制的であるようである。ＰＧＣはインビトロ培養後にのみ多能性となることができ、サイトカイン補充がＥＧ細胞転換にも必要であるので（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７０，ｐ８４１−８４７，１９９２；Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５９，ｐ５５０−５５１，１９９２）、増殖刺激及び体細胞からの解放が生殖系列細胞の分化プログラムを変更したのかもしれない。
上記実施例中の証拠の多くが、精原幹細胞の多能的特性のための支持を提供している。第一に、新生精巣中にはＰＧＣ様生殖細胞は見出されず、ＥＧ細胞培養条件（ｍＳＣＦ＋ＬＩＦ＋ｂＦＧＦ）中では新生精巣からｍＧＳ細胞を誘導することは出来なかった。従って、ｍＧＳ細胞はＥＧ細胞とは異なるメカニズムを経て発生し、該結果は新生精巣中のＰＧＣ様細胞は、たとえ存在するとしても、ｍＧＳ細胞の創造の原因ではないことを示唆している。
第二に、野生型及びＰ５３ノックアウトマウス由来のＧＳ細胞コロニーをピックアップしたものからｍＧＳ細胞が出現したという結果は、ｍＧＳ細胞はＧＳ細胞から発生することを意味する。Ｐ５３遺伝子の欠失により精巣テラトーマ形成に対する感受性が１００倍も増加する（ＡＰＭＩＳ，ｖｏｌ．１１１，ｐ１８４−１９１，２００３）。それにもかかわらず、この系統からのＧＳ細胞は形質学的には野生型精原細胞と類似しており、精細管中に移入したときに正常にみえる精子形成を産生する。この意味で、Ｐ５３ノックアウトマウスからのＧＳ細胞は野生型ＧＳ細胞と区別がつかず、精原幹細胞のための規準を満たす。このモデルを用いて、ＧＳ細胞における雄性インプリントの喪失に伴い、ｍＧＳ細胞に部分的雄性インプリントが起こることを見出した。野生型ＧＳ細胞においても同様であると考えられる；部分的な雄性インプリントパターンはｍＧＳ細胞の起源を直接示すものではなく、むしろＥＳ／ＥＧ細胞において報告されているように（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２０，ｐ３１９７−３２０４，１９９４；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２５，ｐ２２７３−２２８２，１９９８；Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９３，ｐ９５−９７，２００１）インビトロにおけるエピジェネティックな不安定性を示しているのかもしれない。
これらの結果は、ＧＳ細胞が多能性である、或いは一つの遺伝子（Ｐ５３）の欠失によってより容易に多能性を獲得し得ることを強く示唆する。マウスにおけるテラトーマ形成は、もっぱら１２９／Ｓｖバックグラウンドにおいて発生し、ＰＧＣから発生すると考えられている（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．，ｖｏｌ．１５，ｐ６９−７４，１９８４）。しかしながら、上記実施例は精原幹細胞が多能性であることを強く示唆する。
興味深いことに、ｍＧＳ細胞における多能性の獲得は精原幹細胞潜在力の喪失と同時に起こる。精巣起源であるにもかかわらず、ｍＧＳ細胞は精細管中に戻して移入されたときに、テラトーマを形成することは、精細管の環境はもはや細胞が多能性となった後では生殖細胞分化（精子形成）を支持できないことを示している。これは、長期間培養後に正常な精子形成を生ずることができるＧＳ細胞とは対照的である（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，ｖｏｌ．６９，ｐ６１２−６１６，２００３）。従って、ｍＧＳ細胞はＥＳ／ＥＧ細胞と細胞機能に関してより密接に関連している。精原幹細胞潜在力の喪失の理由は不明である；しかしながら、これはｍＧＳ細胞の樹立過程の間におけるＧＤＮＦに対する反応性の喪失と関連しているかもしれないと推測される。なぜならＧＤＮＦはインビボにおいて精原幹細胞の自己更新（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ）分裂を促進するための必須因子であるからである（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７８，ｐ１４８９−１４９３，２０００）。
上記実施例において最も重要な結果の一つは、ｍＧＳ細胞の正常胚発生への寄与である。ドナー細胞マーカーが生殖系列細胞を含む生体の多様な部分に存在した。これらの結果は、ｍＧＳ細胞は癌を産生するのみならず、正常胚発生にも寄与し得ることを実証する。ｍＧＳ細胞のインプリント状態は生殖系列能力には影響を及ぼさず、キメラ動物から正常な子孫が獲得された。これは、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞の両方が、たとえ雄性インプリントパターンを伴っていても生殖系列キメラを産生するとの以前の報告と一致する（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ４７５−５０８，１９８６；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．１２０，ｐ３１９７−３２０４，１９９４；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６１，ｐ６２６−６２８，１９９４；Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．７，ｐ８８１−８８４，１９９７）。
出生後の精巣からの多能性幹細胞の派生は、医学及びバイオテクノロジーにおける重要な実用価値を有する。本発明の製造方法により製造されたｍＧＳ細胞は、他に報告された出生後動物から得られた多能性細胞とは、形態学、マーカーの発現、および分化能力の点から異なっている（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐ５０２−５０８，２００２；Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１６，ｐ６３９−６４８，２００４）。個々の細胞型の生物学を研究し、臨床応用の可能性を評価するのは重要であるが、ｍＧＳ細胞は、ＥＳ細胞から特定の系列の細胞を引き出すための技術を直接適用できる点で重要な利点を有している。ｍＧＳ細胞は出生後の動物から、動物（胎仔や胚を含む）を犠牲にすることなく獲得することができるので、ｍＧＳ細胞の派生はＥＳ細胞と比較して倫理上の問題もより少ない。更に自家移植のために、組織適合性で多能的な組織を利用できることは、ＥＳ細胞を基礎とした技術に関連した免疫学的問題を回避することもできるであろう。Ｐ５３ノックアウトマウス試験等の結果は、ｍＧＳ細胞は成熟精巣から生じ得る事を示唆する。現研究段階においては、成熟精巣からＧＳ細胞をより効率的に導くための系の開発が重要であり、例えばＲＮＡ干渉等により、ＧＳ細胞におけるＰ５３発現の抑制が、ｍＧＳ細胞の派生の頻度を増大させるのに有用かもしれない。また分化の範囲及び効率に対するインプリンティングの影響を試験することも重要であろう。
出生後の雄性生殖細胞は精子を産生するために完全にコミットしていると考えられていたが、本発明は、その多能性を証明し、またＥＳ様幹細胞を派生する源として精巣が役立つことが示唆された。ＧＳ細胞と併せて、ここに述べた新たな幹細胞株は、生殖系列の生物学の理解に重要な関わりあいがあり、バイオテクノロジーおよび医学のための比類のないツールを提供する。
【産業上の利用可能性】  本発明の製造方法を用いれば、従来受精卵や胚などからのみ得ることの出来た多能性幹細胞を、出生後の個体から製造することが可能である。当該多能性幹細胞を用いれば、自家移植のための組織適合性を有する多様な組織を構築することが可能であり、再生医療、遺伝子治療等の医学分野において有用である。また、また、当該多能性幹細胞はトランスジェニック動物やノックアウト動物等の作成に用いることが出来るので、バイオテクノロジー分野において有用である。
本出願は日本で出願された特願２００４−１０１３２０（出願日：２００４年３月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：Ｏｃｔ−４の特異的プライマー
配列番号２：Ｏｃｔ−４の特異的プライマー
配列番号３：ＵＴＦ１の特異的プライマー
配列番号４：ＵＴＦ１の特異的プライマー
配列番号５：ＨＰＲＴの特異的プライマー
配列番号６：ＨＰＲＴの特異的プライマー
配列番号７：Ｈ１９の特異的プライマー
配列番号８：Ｈ１９の特異的プライマー
配列番号９：Ｍｅｇ３  ＩＧの特異的プライマー
配列番号１０：Ｍｅｇ３  ＩＧの特異的プライマー
配列番号１１：Ｒａｓｇｒｆ１の特異的プライマー
配列番号１２：Ｒａｓｇｒｆ１の特異的プライマー
配列番号１３：Ｉｇｆ２ｒの特異的プライマー
配列番号１４：Ｉｇｆ２ｒの特異的プライマー
配列番号１５：Ｐｅｇ１０の特異的プライマー
配列番号１６：Ｐｅｇ１０の特異的プライマー
配列番号１７：Ｏｃｔ−４の特異的プライマー
配列番号１８：Ｏｃｔ−４の特異的プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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