(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃの測定方法において、免疫学的方法によって測定を実施することを特徴とする肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃの測定方法。
【請求項２】
免疫学的方法が酵素イムノアッセイである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵素イムノアッセイを適当な固相上で実施する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
酵素イムノアッセイにおいて、試料をＳＰ−Ｃに結合する一次抗体に曝し、結合した抗体の量を酵素標識を有する二次抗体を使用して測定し、その際、測定を酵素触媒による呈色反応または化学発光によって実施する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
固相がクロマトグラフィープレートであり、試料をクロマトグラフィープレート上に分離して酵素イムノアッセイを実施する、請求項３記載の方法。
【請求項６】
固相がマイクロタイタープレートであり、酵素イムノアッセイをＥＬＩＳＡ技術を使用して実施する、請求項３記載の方法。
【請求項７】
肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃに特異的な抗体。
【請求項８】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
ｒＳＰ−Ｃを抗原成分として使用し、抗体がヒトの肺界面活性剤中に存在するＳＰ−Ｃに特異的である免疫化法によって得られる抗体。
【請求項１０】
ＳＰ−Ｃ特異抗体を含む、請求項１記載の方法を実施するための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃの測定方法、ＳＰ−Ｃ特異的抗体ならびに該方法を実施するための試薬キットの供給に関する。
【０００２】
全ての脊椎動物の肺は“肺界面活性剤”と呼ばれる物質混合物を含んでいる。該混合物は界面活性特性を有し、かつ肺の肺胞の領域における表面張力を低減させる。リン脂質、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の他に、肺界面活性剤は他の必須の成分としてタンパク質を含有する。最近では、４種の異なる界面活性剤タンパク質が記載されており、これらは発見された順序に応じてＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｄと称される（Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-998）。用語ＳＰは界面活性剤タンパク質（界面活性剤関連タンパク質、ＳＰ）を意味する。
【０００３】
ＳＰ−Ｂおよび、特にＳＰ−Ｃは強度に疎水性のタンパク質である。肺界面活性剤中の疎水性タンパク質の全割合は約１％である（Curstedt, T., Joernvall, H., Robertson, B., Bergmann, T., Bergren, P.: Two Hydrophobic Low-Molecular-Mass Protein Fractions of Pulmonary Surfactant. Characterization and Biophysical Activity. Eur. J. Biochem. 1987, 168, 255-262）。
【０００４】
肺界面活性剤の試料（例えば肺洗浄から）中のこれらの疎水性タンパク質の測定（検出および、特に定量）はしばしば、全く可能であれば親水性タンパク質のために使用される技術を使用すると不十分な結果が得られる。親水性タンパク質の分離および測定のために慣用に使用される方法、例えば“ウェスタンブロッティング”またはＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）技術はある一定の条件下でのみ疎水性タンパク質に適用できる。それというのも一方では“ウェスタンブロッティング”自体は半定量的であり、かつ他方ではＥＬＩＳＡの使用は、一般に水性系に可溶性のタンパク質を使用してのみ実施できるので非常に問題があるからである。殆どの場合には、定量されるべきほんの微量の分析物が存在するに過ぎない。更に、分析されるべき試料においてＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃはしばしば、慣用の方法による定量をより困難にさえもする他の疎水性物質（例えば脂質）と会合している。ＥＬＩＳＡにおいて、試験されるべき物質を通常、混合物中に含まれる他の成分から測定前に分離しない。
【０００５】
Ｖａｎ Ｅｉｊｋとその助手（Van Eijk, M., De Haas, C.G.M. and Haagsman, H.P.: Quantitative Analysis of Pulmonary Surfactant Proteins B and C. Analytical Biochemistry 1995, 232, 231-237）は肺界面活性剤の試料中のＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｂの定量のための方法を記載している。界面活性剤タンパク質を含有する抽出物を高圧液体クロマトグラフィーによって分離し、かつＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃを２２８ｎｍの吸収によって検出および定量する（検出限界は１μｇのＳＰ−Ｂおよび４μｇのＳＰ−Ｃである）。
【０００６】
ＳＰ−Ｂに関しては、ＥＬＩＳＡ技術による定量的検出が記載されている（Kraemer, H.J., Schmidt, R., Guenther, A., Becher, G., Suzuki, Y., Seeger, W.: ELISA Technique for Quantification of Surfactant Protein B(SP-B) in Bronchoalveolar Lavage Fluid. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995, 152, 1540-1544）。ＳＰ−Ｃの測定のためのイムノアッセイは従来記載されていない。それというのも明らかにＳＰ−Ｃ特異的抗体の調製がうまくいかなかったからである（Beers. M.F., Wali, A., Eckenhoff, M.F., Feinstein, S.I., Fisher, J.H. and Fisher, A.B.: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1992, 7, 368-378）。
【０００７】
本発明の課題は、試料中の肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃの測定法を簡単な方法で、かつ高い感度で可能にする方法を提供することである。
【０００８】
意想外にもＳＰ−Ｃに特異的であり、従って免疫学的方法でＳＰ−Ｃを測定することを可能にする抗体を提供することに成功した。
【０００９】
従って、本発明は、測定を免疫学的方法で実施して試料中のＳＰ−Ｃを測定するための方法を提供する。
【００１０】
他の内容は従属請求項から理解される。
【００１１】
本発明の内容において、ＳＰ−Ｃの測定とはＳＰ−Ｃの検出および、特に定量であると解されるべきである。
【００１２】
本発明の内容において、用語“ＳＰ−Ｃ”とはＰｏｓｓｍａｙｅｒ（Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-998）によって提案された命名に類似して、ＳＰ−Ｃと称される天然の肺界面活性剤またはホニュウ類の羊水中に存在する界面活性剤タンパク質の“ファミリー”と解されるべきである。
【００１３】
更に用語“ＳＰ−Ｃ”は化学合成されたＳＰ−Ｃまたは組み換えによって製造されたＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｃの変異体、例えば１種以上のアミノ酸を欠失しているか、または他のアミノ酸によって置換されているこれらの変異体も含む。化学合成されたＳＰ−Ｃまたは組み換えによって製造したＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｃの変異体は、例えばＷＯ９１／１８０１５号、ＷＯ９１／００８７１号、ＷＯ８９／０４３２６号、ＷＯ９３／２１２２５号およびＷＯ９５／３２９９２号に記載されている。
【００１４】
有利にはＳＰ−Ｃはヒトの肺界面活性剤またはヒトの羊水中に存在する界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃを意味すると解される。
【００１５】
本発明の内容において、“免疫学的方法”は免疫化学、特に抗原−抗体反応に基づく分析方法を意味すると解される。免疫学的方法の例はイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、固相技術と組み合わせて：ＥＬＩＳＡ）あるいは免疫蛍光測定法を含む。イムノアッセイは調査されるべき試料をＳＰ−Ｃ結合抗体に曝し、かつＳＰ−Ｃに結合する抗体の量を検出および定量することによって実施する。これらのアッセイにおいて、検出および定量は直接または間接的に公知法において実施される。このように、抗原−抗体複合体の検出および定量はＳＰ−Ｃに対する抗体および／または一次抗体に対する二次抗体によって運ばれてよい適当な標識を使用することによって可能にする。前記のイムノアッセイの種類によって、標識は、例えば放射性標識、蛍光色素あるいは適当な基質を使用して検出および定量できるホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素である。
【００１６】
本発明の１つの実施態様において、免疫学的方法は適当な固相を使用して実施する。挙げられる適当な固相は、慣用にＥＬＩＳＡ技術のために使用されるポリスチレン製の慣用の市販されているマイクロタイタープレートまたはメンブレン（例えばポリビニリデンジフルオリド製、ＰＶＤＦ）を含む。意想外にも、本発明による方法においてはクロマトグラフィープレートも固相として使用するのに適当であることが判明した。クロマトグラフィープレートを使用する本発明による方法の遂行は以下にイムノ−ＴＬＣと称する。
【００１７】
本発明による方法を実施するために、試料を固相に施与する。有利には試料は適当な溶剤中のＳＰ−Ｃの溶液であり、かつ溶剤は試料を固相に施与した後に蒸発させる。調査されるべき試料の適当な溶剤中の溶液を調製するために、疎水性タンパク質を可溶化させるのに適当であると判明している有機溶剤または溶剤混合物を使用するのが有利である。挙げられる例は短鎖アルコール、特にメタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）またはｎ−プロパノールである。更にイムノ−ＴＬＣに関しては、非極性溶剤および極性溶剤が有用であると判明しており、その際、適当な非極性溶剤は、特にクロロホルム、メチレンクロリドおよびトルエンであり、適当な極性溶剤は短鎖アルコールである。クロロホルム／メタノール混合物が特に有利であると挙げられる。
【００１８】
所望であれば、少量の水および／または酸または塩基を前記の溶剤または溶剤混合物中に添加して、溶剤特性を改善してもよい。
【００１９】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料または羊水試料のＳＰ−Ｃ含有量をイムノ−ＴＬＣによって測定する場合、ＳＰ−Ｃを固相への施与の前に水相（ＢＡＬ試料、羊水）から適当な溶剤または溶剤混合物に移すのが有利である。これは便宜的に適当な有機溶剤または溶剤混合物による抽出、例えばブライ−ダイアー抽出法（Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911-917）およびその後のフォルチ洗浄（Folch washing）（J. Biol. Chem. 1957, 226, 497-509）によって実施される。
【００２０】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料または羊水試料のＳＰ−Ｃ含量をＥＬＩＳＡ技術によって測定する場合、試料を適当な水に混和性の溶剤または溶剤混合物で希釈するのが有利である。挙げられる適当な水に混和性の溶剤または溶剤混合物は、特に短鎖アルコール、例えばエタノールおよびイソプロパノール、またはそれらの混合物である。
【００２１】
更に、本発明による方法に関しては調査されるべき試料中の妨害成分を試料中のＳＰ−Ｃの免疫学的検出の前に固相上で分離または除去することが有利であると判明した。これは、調査されるべき試料中に他の成分、例えば他の界面活性剤タンパク質あるいは脂質がＳＰ−Ｃの他に存在する場合に特に有利である。
【００２２】
クロマトグラフィープレートを本発明による方法において固相として使用する場合、試料は薄層クロマトグラフィーによって分離してよい。この目的のために溶剤の施与および蒸発の後に試料の薄層クロマトグラフィーを実施する。適当なクロマトグラフィープレートはそのコーティングが有機媒体中の疎水性混合物の分離のために適当である全てのプレートである。商標名Ｄｉｏｌでメルク・ダルムシュタットによって市販されている、変性シリカ基体を有するＨＰＴＬＣプレートが本明細書においては特に適当であると判明している。疎水性タンパク質の薄層クロマトグラフィーのために適当な溶剤は有機溶剤および溶剤混合物である。非極性溶剤および極性溶剤の混合物の使用が特に有利であり、その際、適当な非極性溶剤は、特にクロロホルム、メチレンクロリドおよびトルエンであり、かつ適当な非極性溶剤は短鎖アルコール、特にメタノール、エタノールおよびイソプロパノールである。所望であれば、少量の水および／または酸または塩基を添加してもよい。少量の水およびアンモニアを添加したクロロホルムおよびメタノールの混合物が有利である。試料のプレートへの施与ならびに分離の実施は慣用の方法で、例えば市販の装置を使用して実施する。施与されるべき試料は、有利には有機溶剤中のＳＰ−Ｃの溶液である。免疫学的検出のための準備において、クロマトグラフィープレートを薄層クロマトグラフィーによる分離後に乾燥させる。
【００２３】
意想外にも、使用される固相がＥＬＩＳＡ技術において慣用に使用されるポリスチレン製マイクロタイタープレートである場合、試料中の妨害成分を試料の施与の後に１回以上の選択的な洗浄工程によって除去できることが判明した。この目的のために、調査されるべきＢＡＬ試料を有利には施与の前に水溶性有機溶剤（例えばアルコール、例えばイソプロパノール）で希釈し、かつｐＨを７未満（有利にはｐＨ３〜４）に調整する。所望であれば生物学的試料の不均質性によって引き起こされるプレート表面上へのＳＰ−Ｃの不定の吸着量を最少化できる。これは、例えば試料の施与および乾燥の後（かつ洗浄の前に）に適当な溶剤、例えばトリフルオロエタノール中に再溶解させ、引き続き乾燥させることによって実施できる。妨害成分は試料の施与および溶剤の蒸発後に適当な溶剤での洗浄によって除去できる。こうして妨害脂質を、例えばメタノールでの１回以上の洗浄によっ除去できる。
【００２４】
免疫学的検出のための準備において、所望であれば固相を適当な方法で前処理する。例えば固相上の非特異的結合部位を適当なブロッキング溶液、例えばゼラチンまたはタンパク質溶液で飽和させてもよい。引き続き固相をＳＰ−Ｃ特異的抗体の溶液と一緒にインキュベートする。該抗体が標識されていない場合、検出および定量は一次抗体を認識する標識された二次抗体を使用して実施できる。この目的のために、過剰の一次抗体を洗浄によって除去し、次いでプレートを標識された二次抗体と一緒にインキュベートする。洗浄によって過剰の抗体を除去した後に抗原−抗体複合体の検出および定量を標識によって実施する。
【００２５】
検出および定量工程のために適当であり、かつ一次抗体または二次抗体によって運ばれてよい標識は当業者に公知である。挙げられる例は、放射性標識、蛍光色素および、有利には比色検出または化学発光検出を可能にする酵素、例えばホスファターゼまたはペルオキシダーゼを含む。使用される標識によって引き続きの検出または定量を公知法で実施する。
【００２６】
本発明による方法をＥＬＩＳＡ技術を使用して実施する場合、有利には抗原−抗体複合体を、ペルオキシダーゼ−標識抗体および基質としてＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］）を使用する酵素触媒による呈色反応によって検出および定量する。しかしながら、検出に関して当業者に公知の他の発色法、化学発光法または蛍光法を使用してもよい。
【００２７】
本発明による方法をイムノ−ＴＬＣを使用して実施する場合、抗原−抗体複合体を、有利にはルミノール（Ｒ）（Luminol（Ｒ））を基質として使用する酵素触媒による化学発光反応を介して検出および定量する。しかしながら、検出に関して当業者に公知の他の発色法、化学発光法または蛍光法を使用してもよい。
【００２８】
既に記載したように、意想外にもＳＰ−Ｃ、特にヒトの肺界面活性剤または羊水中に存在するＳＰ−Ｃに特異的な抗体を提供することに成功した。従って本発明はＳＰ−Ｃ、特にヒトの肺界面活性剤または羊水中に存在するＳＰ−Ｃに特異的な抗体を提供する。更に該抗体は、有利には他の界面活性剤タンパク質、例えばＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｂといかなる交差反応性を示さないことを特徴としている。
【００２９】
有利にはＳＰ−Ｃ特異的抗体はポリクローナル抗体である。
【００３０】
ＳＰ−Ｃ特異的抗体は当業者に公知の方法（例えばAntibodies: A Laboratory Manual. Eds. E. Harlow and D. Lane. Cold Spring Harbor Laboratory 1987記載されているような）と類似に製造される。
【００３１】
ＳＰ−Ｃに対するポリクローナル抗体の製造は公知の免疫化法によって有利に実施される。本明細書においては、免疫化法における抗原として組み換えＳＰ−Ｃ（以下にｒＳＰ−Ｃとも称する）を使用し、かつ通常使用するより大量の抗原を使用し、かつ抗原投与の回数を増加させることが有利であると判明している。免疫化法において、０．５ｍｇ〜２ｍｇ（有利には１ｍｇ）のｒＳＰ−Ｃを有利には抗原投与あたりに使用し、その際、抗原投与の回数は、有利には３〜６週間（有利には４週間）の間隔をおいて、有利には５〜７回である。更にｒＳＰ−Ｃは不溶性粒子の形（凝集物または沈殿物）でか、またはキャリアー分子とカップリング（例えばタンパク質またはビーズ）させて使用することが有利であると判明している。凝集体および沈殿物は、有利には“実施例”において記載されるように慣用の方法で得ることができる。
【００３２】
挙げられる免疫化法での使用のために適当なｒＳＰ−Ｃはヒューマンアイデンティカルなジパルミトイル化された組み換えＳＰ−Ｃ（ｒｈＳＰ−Ｃ２Ｐａｍ）またはＳＰ−Ｃの組み換え変異体（modification）を含む。挙げられるＳＰ−Ｃの組み換え変異体は、例えば国際特許出願ＷＯ９５／３２９９２号に記載される３４アミノ酸を有するパルミトイル化されていないヒューマンアイデンティカルな組み換えＳＰ−Ｃ（ｒｈＳＰ−Ｃ）またはＳＰ−Ｃ変異体を含み、その際、該アミノ酸配列の位置４および５のアミノ酸はフェニルアラニンであり、かつ該アミノ酸配列の位置３２のアミノ酸はイソロイシンである（該アミノ酸配列内に規定された位置はＷＯ９５／３２９９２号に記載される式Ｉのペプチドのためのアミノ酸配列に基づく）。ｒＳＰ−Ｃ３４（ＦＦ／Ｉ）と称されるペプチドの遺伝子工学による製造は同様にＷＯ９５／３２９９２号に記載されている。
【００３３】
また従って本発明はＳＰ−Ｃ、特にヒトのＳＰ−Ｃに対するポリクローナル抗体を免疫化によって製造するための方法に関し、その際、免疫化のために使用される抗原成分は組み換えＳＰ−Ｃである。
【００３４】
例によって、ＳＰ−Ｃに特異的な抗体の製造ならびに試料中のＳＰ−Ｃの免疫学的測定を以下に記載する。
【００３５】
実施例
１．  ポリクローナル抗体の調製
１．１  ｒＳＰ−Ｃに対する抗血清の調製
イソプロパノール／水（９５：５）中に溶解させたｒＳＰ−Ｃ［ｒｈＳＰ−Ｃ２Ｐａｍ、ｒｈＳＰ−ＣまたはｒＳＰ−Ｃ３４（ＦＦ／Ｉ）］１ｍｇ（ｐＨ４）を真空濃縮器（スピードヴァク（Ｒ）（Speedvac（Ｒ））中で蒸発させ、かつ燐酸緩衝させた生理食塩水（ＰＢＳ）０．５ｍｌ中で超音波浴中で超音波（５分間）でインキュベーションすることによって再懸濁させた。該工程によって抗原として使用される凝集ｒＳＰ−Ｃが得られた。次いで該懸濁液を基本的な免疫化のためにフロイント完全アジュバント０．２ｍｌと混合し、追加抗原注射のためにフロイント不完全アジュバント０．５ｍｌと混合した。この目的のために、溶液を挿管によって連結された２つのシリンジ間で前後に５〜１０回押し動かした。次いでエマルジョン０．２ｍｌ部をウサギに皮下注射した。免疫化計画は標準的なプロトコールによって実施した：一次免疫化の後に、５回の追加抗原注射を４週間の間隔で投与した。その都度、血液試料を採取し、最後の注射の１０日後に力価の展開を観測した。力価が十分になったらすぐに、血液５０ｍｌを採取し、かつ血清を標準的方法で調製した。
【００３６】
また基本的な免疫化のためにＡＢＭ−Ｓ（アンチボディマルチプライアースペシャル）を使用でき、かつ追加抗原注射のためにＡＭＢ−Ｎ（アンチボディマルチプライアーノーマル）を使用できるか、または他の公知のアジュバントを免疫化のために使用できる。フロイントアジュバントの使用によって、一方ではＡＢＭアジュバントを使用する場合よりもかなり高い抗体価が得られ、他方ではフロイントアジュバントは動物１００％において免疫応答を誘発し、かつＡＢＭが使用される場合には、僅か約５０％の動物だけが誘発されるに過ぎない。更にｒＳＰ−Ｃを適当な担体材料、例えば活性化ＣＨセファロースにカップリングさせ、次いでアジュバント、有利にはフロイントアジュバントを使用するか、または使用しないでウサギに皮下で投与してよい。
【００３７】
全ての適当な動物種を抗体の調製のために使用できる。従ってウサギの他にニワトリを使用してもよい。
【００３８】
１．２  力価の測定
個々の血清において、力価を異なる希釈でウェスタンブロット分析を使用して標準的な方法によって測定した。ゲル電気泳動のために、シェガーおよびジャゴウ（Schaegger and Jagow(Analyt. Biochem. 1987, 166:368-379)）によるＳＤＳ／トリシン法を使用した。本明細書においては、０．１μｇの適当なｒＳＰ−Ｃを１５％濃度のポリアクリルアミドゲル中で分離し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）メンブレンにトランスファーし、１：１０００、１：５０００、１：１００００および１：２５０００、１：５００００、１：１０００００および１：２０００００の希釈で血清と一緒にインキュベートした。結合した一次抗体をペルオキシダーゼをカップリングさせた二次抗体（抗ウサギＩｇＧまたは抗ニワトリＩｇＹ）によってアマシャム（Brunswick）からのＥＣＬ（Enhanced Chemiluminescence）系を使用する化学発光を介して検出した。力価は１：１００００〜＞１：２０００００で変化した。ウエスタンブロッティングでの検出限度は＜１０〜１００ｎｇで変化した。
【００３９】
１．３  得られた抗体の特異性：他の肺界面活性剤タンパク質との相互反応
全ての抗血清／抗体をその都度抗原として使用されるｒＳＰ−Ｃと反応させた。意想外にもこれらは天然のジパルミトイル化されたＳＰ−Ｃ（ｈＳＰ−Ｃ２Ｐａｍ；ヒトまたは動物の肺洗浄から単離した）ならびにまた他の天然もしくは変異ｒＳＰ−Ｃとも相互反応した。
【００４０】
抗血清／抗体は他の肺界面活性剤タンパク質、例えばＳＰ−ＡまたはＳＰ−Ｂと反応しない。従って抗血清はＳＰ−Ｃ、特にヒトのＳＰ−ＣをＳＰ−Ｃの未知の含有量を有する溶液、例えば肺洗浄または羊水中で検出するため、または免疫組織化学および免疫細胞化学を使用して組織切片上で検出を実施するために適当である。
【００４１】
２．  イムノ−ＴＬＣ
２．１  試料調製：気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）からのＳＰ−Ｃの抽出
０．８ｍｌのＢＡＬ、２．０ｍｌのメタノールおよび１．０ｍｌのクロロホルムを遠心分離管中にピペッティングし、ヴォルテックス（Vortex）を使用して完全に混合した。もう１．０ｍｌのクロロホルムの添加によって相分離が生じた。繰り返し混合した後に、１．０ｍｌの超純水を添加し、かつ試料を再度ヴォルテックスを使用して約３０秒間混合した。試料を２４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。下相を（所望であれば２工程）エッペンドルフキャップ（Eppendorf cap）中に移し、スピードヴァクを組み合わせで使用して蒸発乾涸させた。その間に、上相を２．０ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（８６／１４／１、容量）で洗浄した。第２の下相をその都度、第１の相の同一のエッペンドルフキャップ中に移し、前記のように遠心分離し、また蒸発乾涸させた。上相を廃棄した。抽出物をクロロホルム／メタノール７０：３０（ｖ／ｖ）中に取った。
【００４２】
２．２  薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
薄層クロマトグラフィーのために、変性シリカマトリックスを有するメルクダルムシュタットによって商標名Ｄｉｏｌとして市販されているＨＰＴＬＣプレートを使用した。試料を自動的にＨＰＴＬＣプレート上にリングメートＩＶ（Lingmat IV）（Camag, Berlin）を使用して施与した。試料を施与した後に、プレートを空気乾燥させ、かつそのクロマトグラフィーをＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ混合物［ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／２５％濃度ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ＝３２．５／１５／１／２（容量）］を液相として使用して実施した。クロマトグラフィー後にプレートを乾燥させた。
【００４３】
２．３  免疫学的検出および定量
非特異的結合部位を飽和させるために、乾燥させたＨＰＴＬＣプレートを３％濃度のＰＢＳ中の魚のゼラチン（これは１５０ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）を含有する）と一緒に４時間インキュベートした。次いで該プレートを一晩インキュベートし、通常１：１００００の希釈でＳＰ−Ｃ特異的一次抗体の存在下に緩慢に振盪させた。結合していない抗体をＴＢＳ／Ｔでの繰り返しの洗浄によって４ｍＭのトリス塩酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．４）から分離した。一次抗体とのハイブリダイゼーションのために、プレートをセイヨウワサビのペルオキシダーゼ標識された二次抗体と一緒にＴＢＳ／Ｔ中１：１０００００の希釈で２時間インキュベートした。結合していない抗体を前記のようにＴＢＳ／Ｔでのプレートの繰り返しの洗浄によって分離し。免疫反応性の複合体をアマシャムブフラー（Amarsham Buchler）からのＥＣＬ検出システム（ルミノール（Ｒ）およびエンハンサーからなる）を使用して可視化した。プレートをＸ線フィルム（ハイパーフィルム アマシャム）に１〜１０分間曝した。
【００４４】
２．４  Ｘ線フィルムのビデオイメージングおよびコンピュータによる評価
免疫複合体を定量するために、Ｘ線フィルムをビデオイメージャー（サイバーテック、ベルリン、ドイツ）を使用してディジタル化した。Ｘ線フィルム上のシグナル強度をデンシトメーターソフトウェアＤｉａｎａを使用してコンピュータによって評価した（Raytest）。
【００４５】
２．５  ＳＰ−Ｃの定量
肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃを測定するために、ＢＡＬフラクションを抽出した。少量のＳＰ−Ｃを定量するために、標的タンパク質を高率の脂質から分離する必要がある。このことは薄層クロマトグラフィーによって達成される。使用されるフラクション中のＳＰ−Ｃはスタンダードを使用して定量した。
【００４６】
３．  ＥＬＩＳＡ技術
３．１．１  試料調製およびＰＢＳ緩衝液を使用するマイクロタイタープレートの被覆
ＥＬＩＳＡのために使用される担体材料はポリスチレン製の９６ウェルを有するマイクロタイタープレート（ポリソープ（Ｒ）Ｆ９６（Polysorp（Ｒ）F96）証明書付、Nunc, Wiesbaden）である。スタンダード（ヒューマンアイデンティカルｒＳＰ−Ｃ、ｃ＝３００μｇ／ｍｌ）をイソプロパノール／水（８０：２０，ｐＨ３．０）と４０ｎｇ／ウェル〜３１２．５ｐｇ／ウェル（ｖ＝１００μｌ／ウェル、ｃ＝０．４〜０．００３１２５μｇ／ｒＳＰ−Ｃのｍｌに相当する）の一連の濃度で希釈した。測定されるべき試料（気管支肺胞洗浄、ＢＡＬ）をイソプロパノール／水（８０：２０，ｐＨ３．０）で希釈した。通常、全容量１００μｌ中のＢＡＬ１０μｌまたは２０μｌをウェルにピペッティングした。各プレートは内部標準（定義されたＳＰ−Ｃ濃度を有するＢＡＬ）を有する。全ての試料およびスタンダードを一双で測定した。全ての希釈をポリプロピレン製の２ｍｌの反応容器（エッペンドルフ、ハンブルク）中で実施した。
【００４７】
試料およびスタンダードのピペッティングの後に、マイクロタイタープレートを換気された乾燥キャビネット中で３７℃で６時間乾燥するまでインキュベートした。生物学的試料の不均一性によって惹起されるプレート表面におけるＳＰ−Ｃの可変的吸着を１００μｌのトリフルオロエタノール中に再び吸収させることによって最少化させた。更なる乾燥工程（３７℃、３時間）後に、ＳＰ−Ｃに対して約５０〜１００倍過剰に存在するリン脂質を２回の連続的な洗浄工程によって選択的に除去した。第１工程においては、２００μｌのメタノールを添加し、かつプレートを室温で撹拌しながら（２０分間）インキュベートした。溶剤をデカンテーションで除去し、次いでプレートを２００μｌのメタノールでもう一度洗浄し、メタノールを直ちにデカンテーションで除去した。次いでプレートを２００μｌのＰＢＳ／０．５％のｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。
【００４８】
３．２．１  試料調製およびトリス塩酸緩衝液を使用するマイクロタイタープレートの被覆
全てのスタンダード溶液およびＳＰ−Ｃの水性試料を８０％の２−プロパノール／２０％の水（ｖ／ｖ）ｐＨ３．５と混合した。ＳＰ−Ｃスタンダード（ヒトのｒＳＰ−Ｃ、ｃ＝３００μｇ／ｍｌ）を０．４〜０．００３１２５μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。水性試料（気管支肺胞洗浄液、ＢＡＬＦ）を８０％の２−プロパノール／２０％の水（ｖ／ｖ）ｐＨ３．５と１：５（ｖ／ｖ）で混合した。全ての希釈を２０ｍｌのポリプロピレンバイアル（エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）中で実施して容器壁にＳＰ−Ｃが吸着するのを防ぎ、次いで各試料またはスタンダード１００μｌの容量をポリスチロールのマイクロタイタープレート（ポリソープ（Ｒ）Ｆ９６、保証書付、Nunc, Wiesbaden, Germany）に移した。公知のＳＰ−Ｃ含量を有するＢＡＬＦ試料を各マイクロタイタープレート上で同時に処理した。全てのスタンダードおよび試料を一双に処理した。
【００４９】
液体の除去は３７℃での一晩の蒸発によって達成した。引き続きの１００μｌ／ウェルの１，１，１−トリフルオロエタノールの添加に引き続いて、再び３７℃（３時間）での蒸発によって生物学的試料のプレートへの吸着を最適化した。リン脂質をメタノールでの２回の引き続いての洗浄工程によって選択的に除去した。この目的のために、２００μｌ／ウェルのメタノールをプレートに施与し、かつ周囲温度下に緩慢に振盪させながら２０分間インキュベートした。有機溶剤のデカンテーションの後に、該工程を更にインキュベートせずに繰り返した。デカンテーション後直ちに、ウェルを５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．６＋０．５％のｔｗｅｅｎ２０（シグマ、ディーゼンホフェン、ドイツ）で３回洗浄した。
【００５０】
３．２．１  ＰＢＳ緩衝液を使用する免疫学的検出および定量
以下のＥＬＩＳＡシステムはラインケ他（Reinke et al）によって開発された方法（Prostaglandins 1989, 37:577-586）に基づいている。過剰の結合部位をブロッキングするために、試料をＰＢＳ／１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と一緒に２時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０で３回すすいだ後に、ＳＰ−Ｃ抗血清を施与した。この目的のために、抗血清をＰＢＳ／１％のＢＳＡ中で１：２０００で希釈し、この溶液の２００μｌを各ウェルにピペッティングし、プレートを室温で１２〜１５時間インキュベートし、かつ引き続きもう一度３回洗浄した（前記参照）。２００μｌのビオチニル化した抗ウサギ抗体（ロバ、アマシャム−ブフラー、ブルンスウィック）のＰＢＳ／１％ＢＳＡ中での１：１０００希釈を次いで施与し、プレートを室温で２時間インキュベートした。過剰の抗体を除去するために、プレートを３回洗浄した。次いで試験の感度をアビジン／ビオチンペルオキシダーゼ技術（ＡＢ複合体、ダコ、ハンブルク）を使用して向上させた。この目的のために、１滴のアビジン溶液および１滴のビオチニル化したセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を５ｍｌのＰＢＳに添加し、混合物を３０分間平衡化させた。２００μｌのこのストック溶液のＰＢＳ／１％ＢＳＡ中での１：５０希釈をプレート上で２時間インキュベートし、かつ引き続きプレートをもう一度３回洗浄した（前記参照）。
【００５１】
酵素的顕色は基質、２，２′−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）［NGO, T.T.: Chromogenic substrates for enzyme imunoassau in nonisotopic immunoassay, New York: Plenum Publishing Corporation, 1988, p. 57-84]の添加によって開始する。この目的のために、２０ｍｇのＡＢＴＳおよび１０μｌの３０％のＨ２Ｏ２を３０ｍｌの基質緩衝液（６０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物、５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム一水和物ｐＨ４．２）［PETERS, H. J.; BAUMGARTEN, H.; SCHULZE, M.: Monoklonale Antikoerper-Herstellung und Charakterisierung. Berlin: Springer Verlag, 1985］中に溶解させ、かつこの溶液２００μｌをウェル中にピペッティングした。顕色後（２時間、室温または一晩４℃で）に、試料をＥＬＩＳＡ測光器（リーダー４００Ｖ．１．１（Reader 400V.1.1），ＳＬＴ、Crailsheim）中で４０５または４５０ｎｍで分光光度的に評価した。
【００５２】
３．２．２  トリス塩酸緩衝液（Tris/Cl buffer）を使用する免疫学的検出および定量
ウェルへの非特異的なタンパク質の結合を１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Paesel and Lorei, Frankfurt/Main, Germany）を含有する５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）緩衝液２００μｌでブロッキングした。周囲温度での２時間のインキュベーション後に、ウェルを５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）＋０．５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、かつ抗ＳＰ−Ｃ抗血清の５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）＋１％ＢＳＡ中の１：２０００希釈を添加した。１２〜１５時間室温でインキュベートした後に、ウェルを前記のように大規模に洗浄し、かつ２００μｌのビオチニル化した抗ウサギ抗体（アマシャム−ブフラー、ブラウンシュバイク、ドイツ；５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）＋１％ＢＳＡ中１：１０００）と一緒に２時間インキュベートした。遊離抗体の除去後に、２００μｌのアビジン−ビオチン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（ＡＢ複合体、ダコ、Glostrup, Denmark;提供者の説明書によるストック溶液、作業溶液  トリス塩酸ｐＨ７．６＋１％ＢＳＡ中１：５０）とのインキュベーションを更に２時間実施して引き続き洗浄した。酵素的色素変換は２００μｌの２，２′−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ、ベーリンガー、マンハイム、ドイツ；基質緩衝液３０ｍｌ（６０ｍＭの酢酸ナトリウム＋５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．２））＋１０μｌの３０％のＨ２Ｏ２中の２０ｍｇ）でウェルを充填することによって開始した。４℃での一晩のインキュベーション後に、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００５３】
３．３  ＳＰ−Ｃの定量
ＢＡＬ試料中のＳＰ−Ｃをコンピュータ支援の三次スプライン補間によって所有しているｒＳＰ−Ｃスタンダードを使用して検量線を作成することにより定量した。
【００５４】
商業的利用
本発明による方法は試料中のＳＰ−Ｃ含量の定量的測定を有利に可能にする。例えばヒトの肺界面活性剤または羊水中のＳＰ−Ｃ含量を測定でき、あるいは組織切片中のＳＰ−Ｃを免疫組織化学および免疫細胞化学によって検出できる。このように本発明による方法は有利には肺界面活性剤不足または肺界面活性剤の組成の変化に関連する疾患状態を診断するために使用される（Guenther et al.: Surfactant Alternations in Severe Pneumonia Acute Respiratory Distress Syndrome and Cardiogenic Lung Edema. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996, 153, 176-184; Seeger et al.: Alveolar Surfactant and Adult Respiratory Distress Syndrome. Clin. Investig. 1993, 71, 177-190; Cosmi et al.: Respiratory Distress Syndrome: Requirements of Perinatal Diagnosis, Prevention and Treatment. In Lachmann B. Ed.: Surfactant Replacement Therapy in Neonatal and Adult Respiratory Distress Syndrome, Springer Verlag 1988）。例として挙げられる疾患状態は新生児呼吸困難症候群（ＩＲＤＳ）または成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）である。
【００５５】
また本発明はヒトの肺界面活性剤または羊水中のＳＰ−Ｃ含量を免疫学的方法によって測定することを含むＩＲＤＳまたはＡＲＤＳの診断方法を提供している。
【００５６】
また本発明は本発明による方法を実施するための試薬キットに関し、その際、該試薬キットはＳＰ−Ｃ特異抗体を含む。どのように方法を実施するかに依存して、該キットは他の成分を含む。例として挙げられる他の成分は標識された二次抗体、緩衝溶液、洗浄溶液、検出工程で必要な試薬、クロマトグラフィープレートまたはマイクロタイタープレートおよび有機溶剤または溶剤混合物である。