(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地に検体を添加し、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達したことを、酸素透過膜のない酸素電極（３ａ）を用いて検出し、溶存酸素濃度が所定濃度に達するまでの所要時間を計測し、計測された所要時間および液体培地の種類に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出することを特徴とする細菌数測定方法。
【請求項２】
液体培地と検体とを収容する収容部（２）と、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達したことを検出するための、酸素透過膜のない酸素電極（３ａ）と、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達するまでの所要時間を計測する時間計測手段（３ｂ）（３ｃ）と、計測された所要時間に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出する細菌数算出手段（３ｅ）とを含むことを特徴とする細菌数測定装置。
【請求項３】
液体培地に検体を添加し、検体に含まれる溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になったことを、酸素透過膜のない酸素電極（３ａ）を用いて検出し、溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になるまでの所要時間を計測し、計測された所要時間および液体培地の種類に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出することを特徴とする細菌数測定方法。
【請求項４】
液体培地と検体とを収容する収容部（２）と、検体に含まれる溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になったことを検出するための、酸素透過膜のない酸素電極（３ａ）と、検体に含まれる溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になるまでの所要時間を計測する時間計測手段（３ｂ）（３ｃ）と、計測された所要時間に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出する細菌数算出手段（３ｅ）とを含むことを特徴とする細菌数測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は細菌数測定方法およびその装置に関し、さらに詳細にいえば、液体培地に検体を添加し、検体に含まれる細菌の代謝活動によって消費／生産される物質によって検体に含まれる細菌数を測定する方法およびその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、食品の衛生管理などを達成するために、食品などの検体に含まれる細菌の数を測定することが要求されている。そして、この要求を満足するために、（１）検体を段階的に希釈してそれぞれを寒天培地に一定量塗布し、２４時間程度培養し、発生したコロニーの数を計数することにより、検体に含まれる細菌数を算出する方法、（２）検体に直接培地を接触させて２４時間程度培養し、発生したコロニーの数を計数することにより、検体に含まれる細菌数を算出する方法、（３）液体培地中に発色剤を入れておき、細菌の酵素による発色を見て細菌数を算出する方法、（４）検体中の細菌数濃度を濃くする操作を行った後、細菌の呼吸活性を測定し、細菌数を求める方法（特開昭５６−１４０８９８号公報参照）、（５）検体を容器内に密閉し、酸素電極を用いて溶存酸素の減少量を測定することにより、検体中の細菌数を測定する方法（特開昭６３−１５１５０号公報参照）、（６）ホタルの発光原理であるルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用してＡＴＰを特異的に測定するＡＴＰ−バイオルミネッセンス法（ＡＴＰ法）
が提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記（１）の方法を採用した場合には、希釈系列を作製しなければならないので作業が煩雑になり、しかも、かなり長時間の培養を行わなければならないので、全体としての所要時間が著しく長くなってしまう。
【０００４】
前記（２）の方法を採用した場合には、希釈系列を作製することに伴う不都合の発生を防止することができるが、かなり長時間の培養を行わなければならないので、全体としての所要時間が著しく長くなってしまう。
【０００５】
前記（３）の方法を採用した場合にも、十分な発色を見るためにはかなり長時間がかかるので、全体としての所要時間が著しく長くなってしまう。
【０００６】
前記（４）の方法を採用した場合には、細菌数濃度を濃くする操作を行わなければならないので作業が煩雑になり、しかも、この操作を行うためにかなり長時間が必要であるから、全体としての所要時間が著しく長くなってしまう。
【０００７】
前記（５）の方法を採用した場合には、溶存酸素の減少量を測定するのであるから、減少量を測定するための測定期間により測定結果が大きく影響を受け、測定結果が大きくばらついてしまう。
【０００８】
前記（６）の方法を採用した場合には、まな板などの細菌数の測定には特には不都合が発生しないのであるが、食品中の細菌数の測定を行う場合には、細菌中のみならず、食品中にもＡＴＰが含まれているのであるから、到底細菌数を正確に測定することができない。
【０００９】
【発明の目的】
この発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、培養などの特別な前処理を行うことなく、少ない細菌数であっても短時間で細菌数を正確に測定することができる細菌数測定方法およびその装置を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１の細菌数測定方法は、液体培地に検体を添加し、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達したことを、酸素透過膜のない酸素電極を用いて検出し、溶存酸素濃度が所定濃度に達するまでの所要時間を計測し、計測された所要時間および液体培地の種類に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出する方法である。
【００１５】
請求項２の細菌数測定装置は、液体培地と検体とを収容する収容部と、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達したことを検出するための、酸素透過膜のない酸素電極と、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達するまでの所要時間を計測する時間計測手段と、計測された所要時間に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出する細菌数算出手段とを含むものである。
請求項３の細菌数測定方法は、液体培地に検体を添加し、検体に含まれる溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になったことを、酸素透過膜のない酸素電極を用いて検出し、溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になるまでの所要時間を計測し、計測された所要時間および液体培地の種類に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出する方法である。
請求項４の細菌数測定装置は、液体培地と検体とを収容する収容部と、検体に含まれる溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になったことを検出するための、酸素透過膜のない酸素電極と、検体に含まれる溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になるまでの所要時間を計測する時間計測手段と、計測された所要時間に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出する細菌数算出手段とを含むものである。
【００２０】
【作用】
請求項１または請求項３の細菌数測定方法であれば、液体培地に検体を添加し、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達したこと、または溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になったことを、酸素透過膜のない酸素電極を用いて検出し、溶存酸素濃度が所定濃度に達するまで、または溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になるまでの所要時間を計測し、計測された所要時間および液体培地の種類に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出するのであるから、培養などの前処理を行うことなく、しかも特別な試薬の添加などを行うことなく、短時間で生菌数の測定を行うことができ、しかも、正確な生菌数を得ることができ、さらに、単なる比較処理などを行うだけでよいから、処理を簡単化できる。
【００２５】
請求項２または請求項４の細菌数測定装置であれば、液体培地と検体とを収容部に収容し、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達したこと、または溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になったことを、酸素透過膜のない酸素電極により検出し、検体に含まれる溶存酸素濃度が所定濃度に達するまで、または溶存酸素濃度の変化率の絶対値が所定値以上になるまでの所要時間を時間計測手段により計測し、細菌数算出手段によって、計測された所要時間に基づいて検体中に含まれる細菌数を算出することができる。
【００２６】
したがって、培養などの前処理を行うことなく、しかも特別な試薬の添加などを行うことなく、短時間で生菌数の測定を行うことができ、しかも、正確な生菌数を得ることができ、さらに、単なる比較処理などを行うだけでよいから、処理を簡単化できる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して、この発明の細菌数測定方法およびその装置の実施の態様を詳細に説明する。
【００３４】
図１はこの発明の細菌数測定装置の一実施態様を概略的に示す斜視図である。
【００３５】
この細菌数測定装置は、測定装置本体１と、測定セル２とを有している。
【００３６】
前記測定セル２は、開閉可能な蓋２ａを有するとともに、液体培地および被検食品など（例えば、ミキサーなどですりつぶした状態の被検食品など）が収容されるセル本体２ｂと、セル本体２ｂの内部に設けた酸素電極（図示せず）と、セル本体２ｂの下部外面に導出された電極端子２ｃとを有している。この酸素電極は、例えば、セル本体２ｂの内面に設けた基板（セル本体２ｂと兼用されていてもよい）の表面に、作用極、参照極、対向極を設けるとともに、各極と対応する電極端子２ｃとを接続する引き出し配線を設けてなる。そして、各極および引き出し配線は、測定対象溶液と直接反応しない材質、例えば銀を用いて、スクリーン印刷などを行って形成されることにより、酸素透過膜の省略を可能としているとともに、各極の一部および引き出し配線のほぼ全範囲を覆うレジスト層を形成している。
【００３７】
前記測定装置本体１は、測定セル２を装着可能な少なくとも１つの凹所１ａを有しているとともに、各凹所１ａに対応させて測定結果表示部１ｂを有している。そして、測定セル２からの出力信号を入力として所定の処理（例えば、溶存酸素濃度が所定濃度に低下するまでの所要時間を計測する処理、およびこの所要時間から細菌数を算出する処理、または、溶存酸素濃度の変化率が所定値以上になるまでの所要時間を計測する処理、およびこの所要時間から細菌数を算出する処理）を行い、測定結果を得て測定結果表示部１ｂに供給する信号処理部（図示せず）を有している。
【００３８】
図２はこの発明の細菌数測定装置の一実施態様の電気的構成を示すブロック図である。
【００３９】
この細菌数測定装置は、液体培地中の溶存酸素濃度を検出する酸素電極３ａと、酸素電極３ａからの出力信号の供給が開始されたことに応答して所要時間の計時を開始するとともに、後述する検出部３ｃからの検出信号に応答して計時動作を停止する計時部３ｂと、酸素電極３ａからの出力信号が所定の閾値に達したこと（溶存酸素濃度が所定の濃度に低下したこと）を検出する検出部３ｃと、所要時間と細菌数との関係を示す検量線を保持する検量線保持部３ｄと、検出部３ｃからの検出信号に応答して、計時部３ｂにより計時された所要時間と検量線保持部３ｄに保持されている検量線とから細菌数を得て出力し、測定結果表示部１ｂに供給する細菌数出力部３ｅとを有している。ただし、検量線保持部３ｄとして培地の種類に対応する検量線を保持するものを採用し、図示しない培地指定部により指定された培地に対応する検量線を選択して、所要時間と選択された検量線とから細菌数を得て出力するものを採用してもよい。
【００４０】
図３および図４はこの発明の細菌数測定方法の一実施態様を説明するフローチャートである。ただし、図３は検量線を作成するための処理を説明するフローチャート、図４は作成された検量線を用いて細菌数の測定を行う処理を説明するフローチャートである。
【００４１】
先ず、図３のフローチャートを説明する。
【００４２】
ステップＳＰ１において、液体培地（例えば、ＭＨ−ｂ）の秤量・加熱溶解を行い、ステップＳＰ２において、液体培地の滅菌を行い、ステップＳＰ３において、各液体培地を所定量（例えば、セル本体２ｂの容積が２ｃｍ3である場合に、１９５０μｌ）だけセル本体２ｂに収容する。
【００４３】
また、ステップＳＰ４において、大腸菌を培地（例えば、ＭＨ−ｂ）に懸濁させて、Ｏ．Ｄ．（光の透過度）にて１０8ＣＦＵ（コロニーフォーミングユニット）／ｍｌに調製し、ステップＳＰ５において、滅菌蒸留水で希釈して１０7、１０6、１０5、１０4ＣＦＵ／ｍｌなどの菌液を作製し、ステップＳＰ６において、各菌液を５０μｌづつセル本体２ｂ内の液体培地に接種する。
【００４４】
なお、ステップＳＰ１からステップＳＰ３の処理とステップＳＰ４からステップＳＰ６の処理は互いに並列に行われる。
【００４５】
その後、ステップＳＰ７において、測定セル２を測定装置本体１の凹所１ａに装着して溶存酸素濃度の測定および経過時間の計測を開始し、ステップＳＰ８において、測定セル２の内部温度を所定温度（例えば、３５℃）に保持して溶存酸素濃度の測定および経過時間の計測を継続し、ステップＳＰ９において、溶存酸素濃度が所定濃度以下になるまで待ち、ステップＳＰ１０において、溶存酸素濃度が所定濃度以下になるまでの所要時間を計測し、ステップＳＰ１１において、各菌液ごとの所要時間から、所要時間と細菌数との関係を示す検量線を作成し、そのまま一連の処理を終了する。
【００４６】
さらに説明する。
【００４７】
何れの細菌濃度（細菌数）の菌液を採用した場合であっても、当初の溶存酸素濃度は互いに等しい。しかし、細菌数が１０6、１０5、１０4、１０3ＣＦＵ／ｍｌの菌液を液体培地に添加して、時間の経過に伴う溶存酸素濃度の変化を観測すれば、図５に示すように、溶存酸素濃度がほぼ０になるまでの所要時間が互いに異なることになることが分かる。具体的には、細菌数が１０6ＣＦＵ／ｍｌの場合における所要時間が約４時間であり、細菌数が１０3ＣＦＵ／ｍｌの場合における所要時間が約１０時間である。そして、酸素消費時間−細菌数（対数で表した細菌数）で検量線を表すと、図６に示すと、ほぼ直線的な関係があることが分かる。
【００４８】
ただし、溶存酸素濃度がほぼ０になるまでの所要時間に代えて、溶存酸素濃度が０よりも大きい所定濃度に達するまでの所要時間を採用することも可能である。
【００４９】
次いで、図４のフローチャートを説明する。
【００５０】
ステップＳＰ１において、検体１０ｇと液体培地１０ｇとを準備し、ステップＳＰ２において、ホモジナイザーなどを用いて検体と液体培地とを粉砕・混合し、所定時間（例えば、５分間）そのままの状態を保持し、ステップＳＰ３において、混合液を所定量（例えば、２ｍｌ）だけ測定セル２に分注し、ステップＳＰ４において、測定セル２を測定装置本体１の凹所１ａに装着して溶存酸素濃度の測定および経過時間の計測を開始し、ステップＳＰ５において、測定セル２の内部温度を所定温度（例えば、３５℃）に保持して溶存酸素濃度の測定および経過時間の計測を継続し、ステップＳＰ６において、溶存酸素濃度が所定濃度以下になるまで待ち、ステップＳＰ７において、溶存酸素濃度が所定濃度以下になるまでの所要時間を計測し、ステップＳＰ８において、計測された所要時間と検量線とから検体中の細菌数を算出し、そのまま一連の処理を終了する。
【００５１】
この測定方法を採用すれば、例えば、食品中の細菌数を１０7〜１０2ＣＦＵ／ｍｌの範囲で測定することが可能である。ここで、１０7ＣＦＵ／ｍｌは可食限界の細菌数であり、１０5ＣＦＵ／ｍｌは食中毒を考慮した細菌数であり、１０2ＣＦＵ／ｍｌは伝染病を考慮した細菌数である。そして、可食限界に関しては、汚染指標としての一般細菌数、耐熱性菌、大腸菌群、大腸菌、腸球菌が対象とされるのに対し、食中毒、伝染病に関しては、病原微生物としてのサルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、セレウス菌、ウエルシュ菌、カンピロバクター、エルシニア、病原大腸菌、ＮＡＧビブリオ、豚丹毒菌、経口伝染病菌、真菌、ボツリヌス菌が対象とされる。また、培地を選択することにより細菌の選択性を持たせることができるので、菌数の測定が要求される細菌のみを対象とする測定を達成することができる。
【００５２】
図３、図４のフローチャートにおいては、細菌として大腸菌を採用し、培地としてＭＨ−ｂを採用しているが、他の細菌を採用するとともに、他の液体培地を採用することが可能である。例えば、食肉製品、冷凍食品などに含まれるＥ．ｃｏｌｉ．の数を測定する場合には液体培地としてＥＭＢ培地を採用し、ミネラルウォーター類に含まれる腸球菌の数を測定する場合には液体培地としてブドウ糖寒天培地、ブドウ糖ブイヨンを採用し、ミネラルウォーター類に含まれる緑腸菌の数を測定する場合には液体培地としてセトリマイド寒天培地を採用する。その他、食品の種類によっては、標準寒天培地、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地、チオグリコール酸塩培地などが採用可能である。
【００５３】
次いで、大腸菌の菌数の測定の具体例を説明する。
【００５４】
先ず、寒天培地にて１夜培養した大腸菌を、ＭＨ−ｂに懸濁し、Ｏ．Ｄ．［６６０ｎｍ］にて０．１に合わせ、１０8ＣＦＵ／ｍｌの菌液を作製する。そして、滅菌蒸留水で希釈し、２×１０7、２×１０6、２×１０5、２×１０4、２×１０3ＣＦＵ／ｍｌの菌液を作製する。また、ペプトン［２０．０ｇ／ｌ］、乳糖［５．０ｇ／ｌ］、ＮａＣｌ［５．０ｇ／ｌ］、ラウリル硫酸ナトリウム［０．１ｇ／ｌ］、Ｋ2ＨＰＯ4［１．５ｇ／ｌ］、ＫＨ2ＰＯ4［１．５ｇ／ｌ］、ＭＵＧ［０．１ｇ／ｌ］の組成を有するペプトン硫酸ＭＵＧブイヨン培地１９５０ｍｌに対して各菌液を５０ｍｌ分注し、大腸菌濃度を１０7、１０6、１０5、１０4、１０3、０ＣＦＵ／ｍｌに設定し、時間の経過に伴って変化する酸素電極からの出力信号を測定したところ、図７に示す測定結果が得られた。なお、図７中において、１０7、１０6、１０5、１０4、１０3、０ＣＦＵ／ｍｌをそれぞれ１ｅ７、１ｅ６、１ｅ５、１ｅ４、１ｅ３、Ｃで示し、１回目の測定結果を▲１▼で、２回目の測定結果を▲２▼で示している。
【００５５】
これらの測定結果から分かるように、大腸菌の濃度が高いほど酸素電極からの出力信号が０になるまでの所要時間が短く、大腸菌の濃度が低いほど酸素電極からの出力信号が０になるまでの所要時間が長い。
【００５６】
また、肉エキス［３．０ｇ／ｌ］、ペプトン［１０．０ｇ／ｌ］、乳糖［５．０ｇ／ｌ］、ＢＴＢ［０．０２４ｇ／ｌ］の組成を有する乳糖ブイヨン培地（ＬＣ）、牛胆汁末［２０．０ｇ／ｌ］、乳糖［１０．０ｇ／ｌ］、ペプトン［１０．０ｇ／ｌ］、ブリリアントグリーン［０．０１３３ｇ／ｌ］の組成を有するＢＧＬＢ培地、ペプトン［２０．０ｇ／ｌ］、乳糖［５．０ｇ／ｌ］、胆汁酸塩［１．５ｇ／ｌ］、Ｋ2ＨＰＯ4［４．０ｇ／ｌ］、ＫＨ2ＰＯ4［１．５ｇ／ｌ］の組成を有するＥＣ培地を用いて同様な測定を行った。
【００５７】
そして、それぞれの測定結果を用いて、酸素電極出力が０になるまでの所要時間と菌数との関係（検量線）を求めたところ、図８に示す関係が得られた。ただし、これらの検量線の傾きの違いは初期菌濃度のばらつきが原因と思われる。
【００５８】
この関係から分かるように、培地の種類によって酸素電極出力が０になるまでの所要時間と菌数との関係が異なるので、所要時間のみならず、培地の種類をも考慮することにより、細菌数の測定精度を一層高めることができる。
【００５９】
図２から図４の実施態様においては、食品中の細菌数を溶存酸素濃度が所定濃度に減少するまでの所要時間に基づいて測定する場合について説明しているが、図２の計時部３ｂに代えて、溶存酸素濃度の変化率が所定値以上になるまでの所要時間を計測するものを採用し、図３のフローチャートのステップＳＰ９の処理、図４のフローチャートのステップＳＰ６の処理に代えて、溶存酸素濃度の変化率が所定値以上になったか否かを判定する処理を採用することが可能である。
【００６０】
そして、この場合には、溶存酸素濃度の変化率が所定値以上になるまでの所要時間に基づいて、上記実施態様と同様に食品中の細菌数を高精度に測定することができる。
【００６１】
なお、以上においては、食品中の細菌数を、溶存酸素濃度が所定濃度に減少するまでの所要時間、または溶存酸素濃度の変化率が所定値以上になるまでの所要時間に基づいて測定する場合について説明したが、細菌の代謝活動によって消費／生産する物質として、酸、糖類を採用することが可能である。そして、前者の場合には、ｐＨ計を採用し、後者の場合には、発光色素が付加された糖類を採用するとともに、分光光度計を採用して発光の測定を行えばよい。もちろん、食品以外の対象物に含まれる細菌数の測定に適用することもできる。
【００６２】
【発明の効果】
請求項１または請求項３の発明は、培養などの前処理を行うことなく、しかも特別な試薬の添加などを行うことなく、短時間で生菌数の測定を行うことができ、しかも、正確な生菌数を得ることができ、さらに、単なる比較処理などを行うだけでよいから、処理を簡単化できるという特有の効果を奏する。
【００６７】
請求項２または請求項４の発明は、培養などの前処理を行うことなく、しかも特別な試薬の添加などを行うことなく、短時間で生菌数の測定を行うことができ、しかも、正確な生菌数を得ることができ、さらに、単なる比較処理などを行うだけでよいから、処理を簡単化できるという特有の効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の細菌数測定装置の一実施態様を概略的に示す斜視図である。
【図２】この発明の細菌数測定装置の一実施態様の電気的構成を示すブロック図である。
【図３】検量線を作成するための処理を説明するフローチャートである。
【図４】作成された検量線を用いて細菌数の測定を行う処理を説明するフローチャートである。
【図５】細菌数が１０6、１０5、１０4、１０3ＣＦＵ／ｍｌの菌液を液体培地に添加して、時間の経過に伴う溶存酸素濃度の変化を観測した結果を示す図である。
【図６】酸素消費時間−細菌数（対数で表した細菌数）で表した検量線を示す図である。
【図７】ペプトン硫酸ＭＵＧブイヨン培地１９５０ｍｌに対して各菌液を５０ｍｌ分注し、大腸菌濃度を１０7、１０6、１０5、１０4、１０3、０ＣＦＵ／ｍｌに設定し、時間の経過に伴って変化する酸素電極からの出力信号を測定した結果を示す図である。
【図８】乳糖ブイヨン培地（ＬＣ）、ＢＧＬＢ培地、ＥＣ培地、ペプトン硫酸ＭＵＧブイヨン培地を用いた場合の検量線を示す図である。
【符号の説明】
２  測定セル    ３ａ  酸素電極
３ｂ  計時部    ３ｃ  検出部
３ｅ  細菌数出力部
【図１】
0004375836.tif 000002
【図２】
0004375836.tif 000003
【図３】
0004375836.tif 000004
【図４】
0004375836.tif 000005
【図５】
0004375836.tif 000006
【図６】
0004375836.tif 000007
【図７】
0004375836.tif 000008
【図８】
0004375836.tif 000009