(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび巨核球における発現に特異的なプロモーターをコードするＤＮＡからなる血液凝固因子の組織特異的発現のためのＤＮＡ構築体。
【請求項２】
プロモーターとしてヒト血小板糖タンパク質IIｂ（ＧＰIIｂ）プロモーターをコードするＤＮＡが挿入された請求項１記載のＤＮＡ構築体。
【請求項３】
血液凝固因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは血液凝固第IX因子をコードするｃＤＮＡである請求項１または２に記載のＤＮＡ構築体。
【請求項４】
ヒト第IX因子遺伝子の最初の部分切断イントロン（イントロン１）が第IX因子ｃＤＮＡにさらに挿入されている請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築体。
【請求項５】
血液凝固第IX因子は、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築体によってトランスフェクトされた巨核球系培養細胞内で発現される血液凝固第IX因子の製造方法。
【請求項６】
血液凝固第IX因子の産生はインデューサーによって刺激される請求項５記載の方法。
【請求項７】
血液凝固第IX因子の産生はホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）によって刺激される請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明の主題は血液凝固因子の組織特異的な発現のためのＤＮＡ構築体である。
【０００２】
【背景技術】
血液凝固第IX因子（ＦIX）は肝細胞によって産生され、血液循環中に分泌されるビタミンＫ依存性糖タンパク質であることは知られている（Kurachiら, 1995; Salierら, 1990）。ＦIX遺伝子はＸ染色体上に存在し、８個のエキソンおよび７個のイントロンを含有する（Camerinoら, 1984; Boydら, 1984; Yoshitakeら, 1985）。第IX因子の不存在または欠乏は、血友病Ｂと呼ばれる重篤な出血性障害を生じる（Robertsら, 1993）。
【０００３】
血友病Ｂは単一の既知遺伝子の変化により生じる。したがって、それは遺伝子療法の標的の可能性が早くから提案されていた。標的として選択される細胞は、遺伝子導入のために容易に利用できるものでなければならず、有意なレベルで第IX因子を発現できる必要がある。これらの標的細胞中で、ＦIX分子は活性な凝固因子になるように修飾される必要がある（γ−カルボキシル化およびプロペプチドの切断）。数種の標的細胞の可能性が、たとえば肝細胞（Nakaiら, 1998）、角化細胞（Whiteら, 1998）、筋細胞（Baruら, 1995; Wangら, 1997）または骨髄ストローマ細胞（Cheringtonら, 1998）で試験された。インビトロにおいてはヒトＦIX ｃＤＮＡを有するレトロウイルスベクターでトランスフェクトされたヒト骨髄性白血病細胞系（ＨＬ60）が生物学的に活性なＦIXを産生できることが示された（Haoら, 1995）。本発明は造血細胞、とくに血小板における血液凝固因子の発現を意図するものである。
【０００４】
造血細胞としては、主として赤血球表現型を発現する（Martinら, 1982）が、一部血小板膜糖タンパク質様の巨核球マーカーも発現する（Tabilioら, 1984）ヒト赤白血病細胞系ＨＥＬがすでに使用されている。ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）による誘導後ＨＥＬ細胞系は、巨核球タンパク質様糖タンパク質IIｂ／IIIａ複合体、血小板因子４またはフォンビルブラント因子の発現量の増大を示す（Long & 共同研究者, 1990）。ＰＭＡの作用はプロテインキナーゼＣの活性化に仲介される（Nishizukaら, 1984; Hongら, 1996）。
【０００５】
ヒト血小板糖タンパク質IIｂ（ＧＰIIｂ）は、フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびフォンビルブラント因子の特異的受容体として機能するIIｂ−IIIａ複合体としても知られている血小板インテグリンIIｂβ３のαサブユニットである（Haas & Plow, 1994）。ＧＰIIｂ ｃＤＮＡは最初、ＨＥＬ細胞およびヒト巨核球からのｍＲＮＡライブラリーより単離された（Uzanら, 1988; Frachetら，1990）。ヒトＧＰIIｂ遺伝子は Prandiniら（1988）によって同定された。
【０００６】
ＧＰIIｂプロモーターの組織特異性はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を用いて評価された。ＧＰIIｂプロモーターの制御下においては、ＣＡＴの発現は造血細胞系ＨＥＬにおいてのみ検出された（Uzanら, 1991）。
【０００７】
血友病Ｂを遺伝子療法によって処置するためには、第IX因子の組織特異的発現を有することが必要である。本発明は、このような造血細胞における血液凝固因子の発現の問題に解決を提供する。
【０００８】
今般、ＤＮＡ構築体は、それが血液凝固因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび造血細胞における発現に特異的なプロモーターをコードするＤＮＡからなる場合は、血液凝固因子の組織特異的発現に適当であることが見出された。上述の問題に対する解決は、プロモーターとしてヒト血小板糖タンパク質IIｂ（ＧＰIIｂ）コードするＤＮＡを用いるＤＮＡ構築体によって証明されたのである。
【０００９】
【発明の開示】
上記ＤＮＡ構築体の開発は次のように実施された。
Ａ．キメラ分子の構築
１．ＦIX ｃＤＮＡの発生
野生型ＦIX遺伝子は、アミノ酸−46、−41および−39に密集するインフレームな３つのＡＴＧコドンを含有する。ＦIXの産生の改良を試みるために、様々なＡＴＧ部位をもつ５つのＦIX ｃＤＮＡ発現ベクターをＣＭＶプロモーターによる指揮下に作成した。ＨepＧ２細胞系において以前に発現増大活性を有することが示された部分切断ＦIXイントロン１（Kurachiら, 1995）をクローン化し、ＦIX ｃＤＮＡ中に導入した。このプロジェクトの初期の頃には、ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ）およびＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）構築体で安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞が培養上清における最良のＦIX産生を招来した。−41ＡＴＧしかもたないこれらの２つの構築体ＦIX（−41Ｓ）およびＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）ｃＤＮＡは、したがって、造血細胞系のトランスフェクションに使用された最初のＦIX構築体であった。ＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡの修飾された５′末端（配列番号１）は
【化１】
0004373578.tif 000002
である。
【００１０】
しかしながら、ＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡで得られた結果はすべてＦIX（ＷＴ）およびＦIX（ＷＴ.Ｉ１）ｃＤＮＡによってさらに確認された。ＦIX ＷＴ ｃＤＮＡの５′末端（配列番号２）は
【化２】
0004373578.tif 000003
である。
【００１１】
２．ＧＰIIｂプロモーターベクターの発生
系統特異的プロモーターＧＰIIｂは造血細胞中でＦIX導入遺伝子を発現させるために選択された。−643／＋33ＧＰIIｂプロモーターおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子をもつｐＢＬＣＡＴ−ＧＰIIｂベクターが G. Uzan から得られた。
【００１２】
ＦIXの発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen, the Netherlands）を用いるためには（これはさらに制限酵素部位とネオマイシン抵抗性遺伝子を有し、したがって、次の試験にさらに便利であると思われる）、内因性ＣＭＶプロモーターをＧＰIIｂプロモーターにより置換した。このプロモーターはｐＢＬＣＡＴ−ＧＢIIｂベクターからＨind III−ＢamＨＩ消化ののちに選択された。この生成物は、プロモーターの特異性に重要なドメイン（Uzanら, 1991 および 1995）からなるＧＰIIｂプロモーターの−597／＋33フラグメント（配列番号３）を包含する。それは同じ酵素で開裂されたＣＭＶ−欠失ｐｃＤＮＡ３に導入された。得られた構築体がいわゆるｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂであった（配列番号４および図１）。すべてのＦIX ｃＤＮＡは、ＢamＨＩ−ＸhoＩ消化を用いてｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂプラスミドにサブクローニングされた。
【００１３】
３．β−ガラクトシダーゼベクターの発生
ＨＥＬ細胞系における部分切断（−597／＋33）ＧＰIIｂプロモーターの活性を試験するために、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を選択した。β−Galの遺伝子発現がＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー（図２）によって指揮されているｐＵＴ535ベクター（Cayla, Toulouse, France）を選んだ。ＣＭＶ配列を部分切断ＧＰIIｂプロモーターにより交換するために、ＧＰIIｂプロモーターをＨind III−ＢamＨＩで消化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してブラント末端を得て、ついでＢstＥII−ＮcoＩ開裂したクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理ｐＵＴ535に導入した。ＧＰIIｂ−β−GalベクターはｐＵＴ535−ＧＰIIｂと命名した（図２）。陰性対照プラスミド（ｐＵＴ535−δＣＭＶ）はＢstＥ II−ＮcoＩ消化によってＣＭＶ配列を欠失させたｐＵＴ535であった。
【００１４】
Ｂ．造血細胞におけるＧＰIIｂプロモーターの組織特異性
ｐＵＴ535、ｐＵＴ535δＣＭＶおよびｐＵＴ535−ＧＰIIｂ構築体は２つの異なる細胞系：ＨＥＬおよびＨeＬa細胞で試験した。ＨＥＬ細胞系（ヒト赤白血病細胞）は、巨核球プロモーター発現の試験に用いられたクラシカルな細胞系である。ＨeＬa細胞（ヒト子宮頚部上皮癌）はそれらのクラシカルな陰性対照カウンターパートである。
【００１５】
材料および方法：
ＨＥＬ細胞は５％ＣＯ2を含有するＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地中に維持した。β−Galベクター（２μg ＤＮＡ）は、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６（Boehringer Mannheim）を用いてＨＥＬ細胞（１×１０6）にトランスフェクトした。一夜インキュベートしたのち、細胞を収穫し、１０mlのＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ（Boehringer Mannheim）中に置いた。２つのアッセイの１つでは、ＰＭＡ（Sigma）を培地に加えた（最終濃度：１nM）。ＨeＬa細胞は５％ＣＯ2を含有するＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に維持した。５×１０6個の細胞を含む９０mmのペトリ皿をトランスフェクションの前日に調製した。細胞を２０μgのＤＮＡおよび２０μｌのリポフェクチン（登録商標）試薬（Gibco）で５時間処理した。このインキュベーション時間後に、細胞をＰＭＡ １nMを含むかまたは含まないＤＭＥＭ−１％ＢＳＡで洗浄し、その中に置いた。細胞を４０時間後に収穫し、溶解緩衝液とインキュベートし、溶解物を最終タンパク質濃度１.５mg／mlに希釈した。化学ルミネッセントβ−Galレポーター遺伝子アッセイキット（Boehringer Mannheim）を製造業者によって記載されたように使用してβ−ガラクトシダーゼを定量した。
【００１６】
結果：
ＨeＬa細胞では、β−Galレポーター遺伝子は、細胞がＣＭＶプロモーターを含むベクターでトランスフェクトされた場合にのみ、ＰＭＡの誘導なしでまたは誘導により発現された。ＧＰIIｂプロモーターによって指揮された構築体では、β−Galの発現は見出せなかった（図３、パネルＡ）。
【００１７】
ＨＥＬ細胞では（図３、パネルＢ）ＣＭＶが最高のβ−Gal産生を与えた（以下の表１）。しかしながら、ＧＰIIｂプロモーターは有意な量のβ−Galの産生を導き、ＰＭＡ処置後に産生は増大した。ＨＥＬ細胞中ｐＵｔ535で得られたβ−Gal量を１００％とすると部分切断ＧＰIIｂプロモーターによるβ−Gal量はＰＭＡ処理しない細胞中では１３％であった。比較により、Uzanら（1991）は、ＧＰIIｂプロモーターによるＣＡＴ活性は同じ細胞系においてＲＳＶプロモーターの制御下に得られたＣＡＴ活性の１５％に相当することを見出している。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
結論として、ＨeＬa細胞ではβ−Gal発現は検出されなかったから、造血細胞系では−597／＋33ＧＰIIｂプロモーターがレポーター遺伝子の組織特異的発現を誘発した。ＨＥＬ細胞のこれらの一過性のトランスフェクションにおいては、この造血細胞特異的プロモーターで得られるβ−Gal産生はＣＭＶプロモーターで測定された結果と比較して低かった。しかしながら、インビトロで得られた結果はUzanら（1991）により公開された結果に類似している。
【００２０】
Ｃ．ＨＥＬ細胞におけるＦIXの一過性発現
造血細胞におけるＦIX産生の可能性を試験するため、ＨＥＬ細胞を、それぞれＣＭＶ−ＦIXおよびＧＰIIｂ−ＦIXと呼ばれるＣＭＶまたはＧＰIIｂプロモーターのいずれかを有するＦIXベクターで一過性にトランスフェクトした。試験は最初にＦIX（−41Ｓ）構築体で行い、この結果をＦIX ＷＴ構築体で確認した。
【００２１】
１．材料および方法
７.５×１０6ＨＥＬ細胞を２０μｌのSuperfect Transfection 試薬（Qiagen）を使用して２０μgのＤＮＡでトランスフェクトした。６時間後に細胞を収穫し、ＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ±ＰＭＡ １nM中に置き、最終濃度を２.５×１０6細胞／mlとした。９６時間後に上清を集め、細胞を計数した。
【００２２】
ＦIX ＷＴ構築体については、ｐｃＤＮＡ３−ＦIX ＷＴおよびｐｃＤＮＡ３  ＷＴ.Ｉ１を６μgのFugeneおよび２μgのＤＮＡを用いてＨＥＬ細胞（１×１０6細胞）にトランスフェクトした。一夜インキュベートしたのち細胞を収穫し、ＣＭＶ−ＦIXトランスフェクションについては５mlのＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ／ＰＭＡ １nM中に、ＧＰIIｂ−ＦIXトランスフェクションについては２.５mlの誘導培地中に置いた。トランスフェクション４日後に上清を回収し、細胞を数えた。
【００２３】
２．ＦIX（−41Ｓ）構築体での結果
細胞をＰＭＡなしでインキュベートした場合は、ＣＭＶ−ＦIX構築体で得られたＦIXの産生はきわめて低く、ＥＬＩＳＡ（Asserachrom ＦIX, Stago, Asnieres, France）によって正確に検出することはできなかった。図４に示した結果は、１nM ＰＭＡとインキュベートしたのちに得られた。ＣＭＶプロモーターの制御下にはＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞によるＦIXの分泌は低く（４０８.６６pg／ml）有意ではなかった。最良の産生はＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でトランスフェクトされた細胞により得られた。平均産生量はＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡによる場合より２倍高く、ＦIX（−41Ｓ）ｃＤＮＡで得られた結果と有意に（ｐ＜０.０５）異なっていた。細胞数を調整した場合にも類似の結果が得られた。実際、ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）によってトランスフェクトされたＨＥＬは、４.５±２.５ng／１×１０6細胞を産生し、この結果はＦIX（−41Ｓ）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞で得られた結果と有意に相異した（１.５±０.９ng／１×１０6細胞；ｐ＜０.０１）。
【００２４】
ＧＰIIｂ−ＦIX構築体についても類似の実験を行った。この場合は（トランスフェクション後、２.５×１０6細胞／ml）、ＦIXの産生は弱すぎて、上清に検出できなかった。３０kdカットオフのMicrosep（登録商標）マイクロコンセントレーター（Pall Gelman Sciences）を使用してタンパク質を濃縮した。ＰＭＡ−刺激ＨＥＬ細胞によって得られた濃縮ＧＰIIｂ-ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）上清中ではＦIXタンパク質はわずかに検出可能であった。この結果はβ−Galレポ−ター遺伝子で得られた結果と一致し（表１）、ＣＭＶプロモーターに比べてＧＰIIｂの能力は低いことが確認された。
【００２５】
３．ＦIX ＷＴ構築体による結果
図５はＦIX ＷＴによって得られたＦIXの産生を示す。これらの結果は以下を確認するものである。
- ＨＥＬ細胞は一過性トランスフェクション後にＦIXを産生できる。
- 最良の産生レベルはＦIX ＷＴ.Ｉ１構築体で得られ、相当するＦIX ＷＴの結果とは有意差があった。
- ＨＥＬ細胞において一過性トランスフェクション後、ＧＰIIｂプロモーターはＦIXの産生についてＣＭＶプロモーターより有効性が劣った。ＧＰIIｂ−ＦIXＷＴ.Ｉ１−トランスフェクトＨＥＬ細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下に同じｃＤＮＡで得られたＦIX産生の約３０％を産生した（２５７.７１±８５.３８pg／１×１０6細胞 vs ８８１.２８±２８８.３２pg／１×１０6細胞）。
【００２６】
Ｄ．安定にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞中におけるＦIXの発現
上述のように、一過性発現システムで低いＦIXの産生が得られた。したがって、安定にＦIXを発現する細胞を発生させた。
【００２７】
１．材料および方法
細胞：ＨＥＬ細胞（１×１０6細胞）を、FUGENE（登録商標）６トランスフェクションシステム（Boehringer，Mannheim）を用いて５時間、ＰvuＩ線状化プラスミド２μgによりトランスフェクトした。インキュベーション後細胞を収穫し、０.６mg／mlのＧ418を補充した新鮮な培地中に置いた。
【００２８】
ＦIXの産生を比較するため、Ｇ418−抵抗性細胞をビタミンＫ １ng／ml±ＰＭＡ １nM（２.５×１０5細胞／ml）を補充したＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ中に置いた。１、２、３または４日間インキュベートしたのち、細胞を計数し、上清を凍結した。ＦIXの濃度はＦIX ＥＬＩＳＡキット（Asserachrom ＦIX, Stago, Asnieres, France）を用いて測定した。
【００２９】
イムノブロッティング分析：上清（１ml）を、平衡緩衝液（Hepes １０mM，ＫＣｌ １００mM，ＭｇＣｌ2 ２mM，Triton×100 ０.１％）中に４倍希釈した。Centeon（登録商標、USA）によって恵与されたDEAE A50 Sephadexに結合した抗−ヒト第IX因子抗体５０μｌを上清溶液に加え、４℃で１時間インキュベートした。ＤＥＡＥをついで遠心分離（２５００rpmで２分）により集め、平衡緩衝液で３回洗浄した。第IX因子はLaemmli緩衝液（Laemmli, 1970）で溶出した。第IX因子を含有するサンプルをSDS-PAGE／１０％ポリアクリルアミドゲル上電気泳動に付し、Hybond（登録商標）C Pure膜（Amersham）上にセミドライブロットした。ブロットを、ＴＢＳ（０.１５Ｍ ＮａＣｌ，１０mM Tris-ＨＣｌ，pH７.５）−Tween（０.１％）によって室温で１時間ブロックし、ついでポリクローナルウサギ抗−ヒトＦIX抗体（Dako，登録商標）の１：３,０００希釈液とインキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ついでペルオキシダーゼ標識抗−ウサギ抗体（Biorad）の１：１０,０００希釈液と３０分間インキュベートした。３回洗浄後、化学ルミネッセントシグナルを、ＥＣＬシステム（Amersham，登録商標）を用いオートラジオグラフィーによって検出した。
【００３０】
プロコアギュラント活性：第IX因子活性を一段階凝血アッセイによって測定した。対照血漿５０μｌを、イミダゾール緩衝液（Diagnostica Stago, Asnieres, France）に希釈した（１／１０）。希釈した上清５０μｌを５０μｌの第IX因子欠乏血漿（Immuno Illkirch, France）および５０μｌのSilimat（登録商標）セファリン（Bio-merieux；登録商標、Marcy l'Etoile, France）に加えた。４分間３７℃でインキュベートしたのち、５０μｌの５０mM ＣａＣｌ2緩衝液を加えて凝血を開始させた。凝血時間をSTA Compact（登録商標）コアギュロメーター（Diagnostica Stago（登録商標）, Asnieres, France）で測定し、第IX因子活性をｌｏｇ−ｌｏｇ標準曲線から測定した。
【００３１】
第XIａ因子によるＦIXの活性化：ＦIXを免疫沈降させ、インビトロにおいて第XIａ因子（Enzyme Research Lab., Swansea, UK）により、酵素／基質比１／４０でさらに活性化させた。活性化緩衝液の組成は、Tris-ＨＣｌ ５０mM、ＮａＣｌ １５０mM、ＣａＣｌ2 ５mM、ポリエチレングリコール０.０１％、pH７.５であった。反応混合物を１時間３０分間３７℃でインキュベートし、反応したサンプルをついでLaemmli緩衝液に希釈した。
【００３２】
ノーザンブロット分析：７×１０6の安定にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞からRneasy Miniキット（Qiagen, Courtaboeuf, France）を使用して総ＲＮＡを調製した。リン酸緩衝液（１０mM ＮａＨ2ＰＯ4、１０mM Ｎａ2ＰＯ4、pH７）中１.２％アガロースゲル上電気泳動に付したのち、ｍＲＮＡをナイロン膜（Hybond N, Amersham, Les Ulis, France）上にトランスファーした。完全長のヒト第IX因子またはラットＧＡＰＤＨからなるＲＮＡプローブを発生させ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼキット（Boehringer Mannheim, Meylan, France）でインビトロトランスクリプションシステムを用いて、ジゴキシゲニン−ＵＴＰを含有するＮＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションしたのち、Boehringer Mannheim（Meylan,France）からのＤＩＧルミネッセント検出キットを用い、化学ルミネッセンスによりシグナルを検出した。
【００３３】
２．ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞の１日ＦIX産生
2.1．ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）トランスフェクトＨＥＬ細胞
ｐｃＤＮＡ３−トランスフェクトＨＥＬ細胞の上清中にＦIXは検出されなかった（図６）。４日後、ＣＭＶ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でトランスフェクトされた細胞の条件培地中に１１.６５ng／mlのＦIXが検出された。ＰＭＡ誘導後、ＦIXの産生（２５９.８７ng／ml）はＰＭＡなしで得られた産生より２３倍高く、一過性トランスフェクションで得られた結果よりも２５０倍高かった。
【００３４】
2.2．ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）トランスフェクトＨＥＬ細胞
ＨＥＬ細胞をｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂベクターでトランスフェクトした場合には、条件培地中に、ＦIXは検出されなかった。ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）でＨＥＬ細胞をトランスフェクトした場合、ＦIXはインキュベーションの４日間に規則的に増加した（図７）。培養４日後、ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）のプールは、上清中に３５.０±７.８ng／mlのＦIXを産生した。ＰＭＡ誘導後には、ＦIXの産生は１６５.０±３２.５２ng／mlに達した。
【００３５】
2.3．プロコアギュラント活性
ＦIXのプロコアギュラント活性はＨＥＬ細胞からの上清中のＦIX抗原と正相関した（図８）。ＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞（培養培地：ＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ）により産生されるＦIXの比活性は０.３４±０.０７mU／ngであった。
【００３６】
2.4．ＦIX免疫沈降
トランスフェクトされたＨＥＬ細胞の上清を免疫沈降させ、ウエスタンブロットにより分泌タンパク質の分子量を確証した。精製組換え第IX因子（Mononine，登録商標）を対照として使用した。ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ発現細胞の上清には、ＦIXは検出されなかった。ＰＭＡで誘導したかまたは誘導しないＧＰIIｂ−ＦIX（−41Ｓ.Ｉ１）ＨＥＬ細胞の上清には、分子量約６０kDaの１つの特異的なバンドが検出された。このタンパク質は免疫精製したＦIX（Mononine，登録商標）と同じレベルで移動した
【００３７】
３．ＦIX（ＷＴ）およびＦIX（ＷＴ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞の１日ＦIX産生
3.1．安定なトランスフェクション後におけるＣＭＶおよびＧＰIIｂプロモーターの有効性の比較
ＨＥＬ細胞を、ｐｃＤＮＡ３.１およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂを陰性対照として用い以下の構築体：ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）、ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）および相当するＣＭＶ構築体［ＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ）およびＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）］により安定にトランスフェクトした。図９はＣＭＶ−ＦIXおよびＧＰIIｂ−ＦIXＨＥＬ細胞で得られた結果を示す。期待されたように２つの陰性対照（ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ）では、ＦIXは上清に検出されなかった。ＦIX（ＷＴ）の発現がＧＰIIｂプロモーターによって指揮されたときは、ＣＭＶ−ＦIXに比べ有意に高いＦIXの産生が上清に測定された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）発現ＨＥＬ細胞は、同じ条件（±ＰＭＡ）でＣＭＶ−ＦIX（ＷＴ）によってトランスフェクトされたＨＥＬ細胞よりも約５〜１０倍高いＦIX量を産生した。
【００３８】
3.2．イントロン１はＦIXの産生を増大させる
本発明者らは、ＧＰIIｂプロモーターによって指揮されたＦIX（ＷＴ.Ｉ１）がＨＥＬ細胞においてＦIXの産生を増大させる能力について試験した。上清における第IX因子の濃度の評価により最高の産生はＦIX（ＷＴ.Ｉ１）構築体で得られることが証明された。実際、培養４日後、ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞は、ＧＰIIｂ−ＦIX発現ＨＥＬ細胞よりも約３０倍高いＦIX量を分泌した（図１０）。細胞をＰＭＡで刺激した場合には、ＧＰIIｂＦIX.Ｉ１でトランスフェクトされた細胞もまた、ＧＰIIｂ−ＦIX−発現細胞と比較して高いＦIXＣ量（×１２）を産生した（日４の値：３９８.０４±９４.２３ng／ml vs ３２.１２±１４.８５ng／mlのＦIX）。
【００３９】
3.3．ＨＥＬ細胞の上清に産生された組換えＦIXの性質
ＨＥＬ細胞の上清におけるＦIXタンパク質の性質をさらに明らかにするため、ＦIXを免疫沈降させ、サンプルを電気泳動に付し、ブロットした。ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ発現ＨＥＬ細胞においては二次抗体単独で単一の非特異的バンドが検出された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）およびＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞では、約６０kDaに特異的なバンドが検出された。この分子量は以前に検出されたＦIX（−41ＳＩ１）、対照およびｐｃＤＮＡ３−ＣＭＶ／ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）発現ＨepＧ２細胞によって産生されるＦIXに類似した。イムノブロット分析におけるバンドの強度の差は図１０に示した抗原量と正相関した。
【００４０】
3.4．ＦIXプロコアギュラント活性およびＦXIａによるＦIX活性化
ＦIXは、完全な活性のためには適切にプロセッシングされる必要のあることは以前に示されている。第IX因子のコアギュラント活性を、ＰＭＡ−刺激ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）でトランスフェクトされたＨＥＬ細胞の上清において測定した（図１１）。ＦIXのプロコアギュラント活性は抗原濃度に正相関し、分子の正しいプロセッシングを指示した。上清の平均ＦIX比活性は１６０±６９Ｕ／mgであった。凝血カスケードの間に、ＦIXはＦXIａによって活性化される必要がある。ＦXIａとのインキュベーション後におけるＦIXの切断、すなわちＨＥＬ細胞から免疫沈降させたＦIXの活性化は重鎖（２９kDa）および軽鎖（１９kDa）に相当する２つのバンドの出現を生じた。活性化率およびＨＥＬ上清からのタンパク質プロファイルはMononineで得られた結果と類似した。
【００４１】
3.5．ノーザンブロット分析
本発明者らは、ＨＥＬ細胞で産生されるＦIXタンパク質の量がＦIX ｃＤＮＡ中のＦIXイントロン１の存在に密接に関連することを示した。本発明者らはＨＥＬ細胞の異なるトランスフェクションからのＦIX ｍＲＮＡを分析した。ｍＲＮＡはＰＭＡによって誘導するかまたはしないでｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂでトランスフェクトしたＨＥＬ細胞中のＦIX ｍＲＮＡプローブとはハイブリダイズしなかった。ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）構築体でトランスフェクトされた細胞では、１.４kbｍＲＮＡの正しいサイズを示す１個の特異的なバンドが検出された。ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ＨＥＬ細胞では、ＦIX ｍＲＮＡはＰＭＡ誘導後にのみ検出可能であった。これらのｍＲＮＡはＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）ＨＥＬ細胞中に検出されるものと同じサイズを有する。異なる溶解物中のｍＲＮＡの量は上清中に検出される抗原の量に正相関し、したがって、非刺激ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ＨＥＬ細胞で検出されないことが説明される。しかしながら、大量の総ｍＲＮＡを用いた場合は、期待されたｍＲＮＡがこれらの細胞中に検出されることが確認された。
【００４２】
3.1Ｅ．結論
上述の結果は造血細胞系ＨＥＬが完全に活性なＦIXを産生し分泌することを示している。一過性のトランスフェクション後、最高の産生はＣＭＶ−ＦIX ＨＥＬ細胞に比べてＣＭＶ−ＦIX.Ｉ１ ＨＥＬ細胞で得られ、この造血細胞系中のＦIXイントロン１の発現増加活性が証明された。ＧＰIIｂプロモーターを使用すると、ＦIX産生は組織特異的であった。安定なトランスフェクションは、ＧＰIIｂプロモーターがＨＥＬ細胞においてＦIX転写の誘導に効果的であり、ＦIXイントロン１は重要な発現増加活性を有することを証明した。分泌されるＦIXタンパク質は約６０kDaの分子量を有し、Mononine（登録商標）に含有されるＦIXに類似し、したがって正常な突然変異プロセスを受けるものと思われる。最後に一段階凝血アッセイを用いたＦIXコアギュラント活性はＦIX抗原に相当した。ＦXIａ活性化後のタンパク質プロファイルはMononineで得られたプロファイルに類似し、組換え分子が完全に活性であることを指示している。ＨＥＬ細胞で得られたこれらの結果は、ＦIXタンパク質がＣＤ３４＋造血幹細胞によって産生され得るという仮説を支持するものである。
【００４３】
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【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐｃＤＮＡ３ベクター中へのＧＰIIｂプロモーターのクローニングを示す。
【図２】β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子ベクターとして、ｐＵＴ535−δＣＭＶベクターよりｐＵＴ535−ＧＰIIｂベクターの構築を示す。
【図３】ＨeＬa細胞中（パネルＡ）およびＨＥＬ細胞中（パネルＢ）中、ＧＰIIｂにより指揮されるβ−Gal一過性発現を示す。
【図４】ＨＥＬ細胞中、ＣＭＶプロモーターの制御下における一過性ＦIXの産生を示す（ｐｃＤＮＡを統計処理の対照として使用）。
【図５】ＰＭＡ １nMによる誘導後、ＨＥＬ細胞中ＣＭＶまたはＧＰIIｂプロモーターの制御下における一過性ＦIX ＷＴの産生を示す（ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂをそれぞれ統計処理の対照として使用）。
【図６】安定にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞中ＣＭＶプロモーターを用いた場合の１日ＦIX産生を示す。
【図７】安定にトランスフェクトされたＨＥＬ細胞中、ＰＭＡ誘導によりまたはよらないＧＰIIｂプロモーター下におけるＦIXの産生を示す（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ構築体を統計処理の対照として使用）。
【図８】ＨＥＬ細胞上清中のＦIXのプロコアギュラント活性（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ構築体を統計処理の対照として使用）。
【図９Ａ】ＨＥＬ細胞中におけるＦIX（ＷＴ）構築体の安定な発現を示す（パネルＡ：ＰＭＡなしで培養、ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂを統計処理の対照として使用）。
【図９Ｂ】ＨＥＬ細胞中におけるＦIX（ＷＴ）構築体の安定な発現を示す（パネルＢ：ＰＭＡ １nMと培養、ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３−ＧＰＩＩｂを統計処理の対照として使用）。
【図１０】ＨＥＬ細胞中（ＰＭＡなしで培養）におけるＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ）ならびにＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）構築体の安定な発現を示す（ｐｃＤＮＡ３−ＧＰIIｂ／ＦIX（ＷＴ）を統計処理の対照として使用）。
【図１１】ＰＭＡ刺激ＧＰIIｂ−ＦIX（ＷＴ.Ｉ１）発現ＨＥＬ細胞からのＦIXプロコアギュラント活性を示す（値は個々の３回の実験の平均を表す）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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