(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって、かつ、骨芽細胞の分化を促進する働きを有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされる蛋白質であって、かつ、骨芽細胞の分化を促進する働きを有する蛋白質。
但し、上記におけるハイストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施するものである。
【請求項４】
ヒト由来である請求項１、２又は３記載の蛋白質。
【請求項５】
マウス由来である請求項１、２又は３記載の蛋白質。
【請求項６】
配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子又は核酸。
【請求項７】
配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子又は核酸であって、かつ、骨芽細胞の分化を促進する働きを有する遺伝子又は核酸。
但し、上記におけるハイストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施するものである。
【請求項８】
ヒト由来である請求項６又は７記載の遺伝子又は核酸。
【請求項９】
マウス由来である請求項６又は７記載の遺伝子又は核酸。
【請求項１０】
請求項６又は７記載の遺伝子又は核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである請求項１０記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の組換えベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸をプローブ又はプライマーとして用いて、請求項６又は７記載の遺伝子又は核酸を検出する方法。
但し、上記におけるハイストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施するものである。
【請求項１４】
請求項１、２又は３記載の蛋白質を認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨形成に関与する新規蛋白質およびその遺伝子に関する。より詳細には、骨芽細胞の分化を促進する働きを有する新規蛋白質およびその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
正常な骨代謝は、骨形成と骨吸収のバランスの上に成り立っている。骨形成は、主として間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞（osteoblast）が担っており、骨吸収は、造血系幹細胞から分化した破骨細胞が担っていることが知られている。
【０００３】
骨粗鬆症は、これらのバランスが骨吸収側に傾くことによって発症するとされている。骨粗鬆症には２つのタイプに分類される。１つは閉経後骨粗鬆症と呼ばれ、著しい骨量の減少が認められる。このタイプでは骨代謝が高回転型となり、骨形成と骨吸収が共に活発であるが、バランスが骨吸収側に傾くために発症する。もう一つのタイプは、老人性骨粗鬆症と呼ばれ、骨量が徐々に減少する。このタイプでは骨芽細胞の機能低下が原因とされており、これに起因してバランスが骨吸収側に傾くため発症すると考えられている。
【０００４】
これまでに知られている骨粗鬆症治療薬は、骨吸収を抑制する作用機序のものが多く、骨形成を促進するものはほとんど存在しない。骨形成を促進することにより、骨量の減少を抑制し、骨量を増加させるような骨粗鬆症のための治療薬や治療方法の開発が望まれている。また、骨形成や骨芽細胞分化のメカニズムの解明も、そのような治療薬や治療方法開発のために重要であり、強く望まれている。
【０００５】
しかし、骨形成や骨芽細胞分化に関してはいまだ不明な点も多く、例えば、骨芽細胞への分化に関与する因子として、骨形成因子（ＢＭＰ：bone morphogenetic protein）（Maitiら、Indian J. Exp. Biol.、第36巻、第274‐244頁、1998年）や転写因子Ｃｂｆａｌ（Komoriら、Cell、第89巻、第755‐764頁、1997年）など、ごく少数が知られているにすぎない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、骨形成（より詳細には骨芽細胞分化）に関与する新規蛋白質及び新規遺伝子を提供することにある。また、これらの発現を検出又は変調させる手段を提供することにある。また、上記以外の目的については以下の記載より明らかである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、骨芽細胞様細胞（マウスＭＣ３Ｔ３―Ｅ１）が、活発な骨形成能を有する骨芽細胞に分化（成熟）する際に特異的に発現する新規蛋白質及びその遺伝子を見いだした。さらに、この遺伝子を骨芽細胞様細胞中で過剰発現させることにより、活発な骨形成能を有する骨芽細胞への分化（成熟）が促進されることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択される蛋白質及びこれらをコードする遺伝子又は核酸である。
（Ａ）配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ）配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって、かつ、骨芽細胞の分化を促進する働きを有する蛋白質。
【０００９】
また、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される遺伝子又は核酸である。
（ａ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子又は核酸。
（ｂ）配列番号１〜１０のいずれかで示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子又は核酸であって、かつ、骨芽細胞の分化を促進する働きを有する遺伝子又は核酸。
【００１０】
また、これらを含有する組換えベクターならびに宿主細胞、これらの発現を検出又は変調させる方法である。
【００１１】
骨芽細胞（osteoblast）は、骨形成を担う細胞であり、成長中の骨の形成表面などに普遍的に存在する。
【００１２】
本発明の蛋白質（Osteoblast Differentiation Promoting Factor：ＯＢＤＰＦ）及び遺伝子（Osteoblast Differentiation Promoting Factor遺伝子：ＯＢＤＰＦ遺伝子）は、骨芽細胞の分化（成熟）を促進する働きを有する。すなわち、骨芽細胞中での発現によって、該細胞を未分化（未成熟）な状態（活発な骨形成能を有しない状態）から分化（成熟）した状態（活発な骨形成能を有する状態）への移行を促進する。
【００１３】
また、本発明の蛋白質及び遺伝子は、骨芽細胞が分化（成熟）する段階で特異的に発現する。すなわち、骨芽細胞が未分化（未成熟）な状態（活発な骨形成能を有しない状態）では発現が認められないかあるいは低い発現しか認められないが、骨芽細胞が分化成熟する段階（活発な骨形成能を獲得する段階）で高い発現が認められる。
【００１４】
後記配列表の配列番号１は、発明者らが単離したマウスＯＢＤＰＦ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１上段）及びその翻訳領域にコードされたＯＢＤＰＦ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１下段）を表す。
【００１５】
また、配列番号２は、ヒトＯＢＤＰＦ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２上段）及びその翻訳領域にコードされたＯＢＤＰＦ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２下段）を表す。ヒトとマウスのＯＢＤＰＦ蛋白質のアミノ酸配列（５３９アミノ酸残基）を比較すると、約８７％の相同性が認められる。
【００１６】
また、配列番号３〜１０は、マウスＯＢＤＰＦのゲノム遺伝子中のエキソン−イントロン境界領域を含む塩基配列を表す。
【００１７】
前記配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列またはアミノ酸配列について、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）およびプロテインデータベース（ＮＢＲＦおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に対してホモロジー検索を行った結果、ＥＳＴで３'末端側の一部配列が一致するもの（Genbank/EMBL 登録番号AA387395（マウスembryo由来、461bp）及び登録番号AA984854（ヒトspleen由来、375bp））が見出されたのみであった。骨形成に関連する機能を示唆する情報はなく、また全長ｃＤＮＡの配列と一致するものもなかった。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質としては、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、骨芽細胞の分化（成熟）を促進する働きが失われない程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１〜約５５個、より好ましくは１〜約３０個である。このような蛋白質は、配列番号１または２で示されたアミノ酸配列と通常、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上のアミノ酸レベルのホモロジーを有する。このような蛋白質には、自然界で発見される変異型蛋白質のほか、人為的に改変した変異蛋白質、異種生物由来の蛋白質等が含まれる。
【００１９】
本発明の遺伝子又は核酸としては、配列番号１又は２で示される塩基配列を有するＤＮＡを含むものが挙げられる。また、配列番号１又は２で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようなハイブリダイズし得るＤＮＡは、骨芽細胞の分化（成熟）を促進する働きが失われないものであればよい。このようなＤＮＡは、配列番号１又は２で示される塩基配列と、通常、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上のホモロジーを有する。このような遺伝子又は核酸としては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００２０】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェントな条件では、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。
【００２１】
本発明の遺伝子は、哺乳動物の骨芽細胞などを遺伝子源としてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
【００２２】
骨芽細胞としては、例えば前記のような哺乳動物の骨（頭頂骨など）から分離した骨芽細胞を用いることができる。また、骨芽細胞として、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（Sudo,Hら、Journal of Cell Biology、第９６巻、第１９１〜１９８頁、１９８３年；理化学研究所  ＲＣＢNo.１１２６）などの骨芽細胞様の株化細胞を用いることができる。あるいはまた、骨芽細胞に分化し得る細胞などを用いてもよく、このような細胞として、例えばヒト骨肉腫細胞（osteosarcoma）Ｓａｏｓ−２（理化学研究所  ＲＣＢNo.０４２８）などが挙げられる。
【００２３】
本発明の遺伝子は、例えば、ディファレンシャル・ディスプレイ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法等、発現量の変化する遺伝子を選択的にスクリーニングする技術と、骨芽細胞の分化モデルとを用いて単離することができる。骨芽細胞の分化モデルとしては、前記のような骨芽細胞のインビトロ培養系などを採用することができる。
【００２４】
例えば骨芽細胞様細胞（マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３―Ｅ１など）を、アスコルビン酸およびβ-グリセロールリン酸などの刺激存在下で培養することにより分化誘導し、分化成熟した骨芽細胞を得る。これらから調製したｍＲＮＡを用い、分化成熟させる前の細胞と分化成熟させた細胞との間で発現量が異なる遺伝子を、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Science、第２５７巻、第９６７〜９７１頁、１９９２年およびCancer Research、第５２巻、第６９６６〜６９６８頁、１９９２年）などにより、スクリーニングしてｃＤＮＡを取得できる。
【００２５】
得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法などを適宜組み合わせてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ｃＤＮＡを取得できる。また、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム遺伝子を単離することができる。また、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異種生物由来の相同遺伝子を単離することができる。このような哺乳動物としては、例えばイヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギおよびラットなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
【００２６】
また、本発明の遺伝子又は核酸は、本明細書中に開示された配列情報（後記配列表の配列番号１〜１０）を利用して容易に取得することもできる。例えば、開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法などを適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし取得できる。
【００２７】
ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２８】
得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物の蛋白質をコードする翻訳領域を決定でき、この蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。
【００２９】
また、ｃＤＮＡ等をプローブとし、未分化細胞と分化細胞のｍＲＮＡについて、ノーザンブロッティングを行うことにより、本発明の遺伝子が、骨芽細胞が分化（成熟）する段階で特異的に発現していることを確認することができる。
【００３０】
本発明の遺伝子及び蛋白質が、骨形成に関与すること（より詳細には骨芽細胞の分化（成熟）を促進する働きを有すること）は、例えば次のようにして確認することができる。
【００３１】
本発明の遺伝子又は蛋白質を発現させるための発現ベクターを、未分化（未成熟）の骨芽細胞に導入し過剰発現（overexpression）させる。過剰発現させた細胞を培養し、骨芽細胞の分化を示すマーカーを検出測定して、分化（成熟）の状態を調べる。過剰発現によって分化（成熟）の促進が認められれば、骨形成に関与する（骨芽細胞の分化（成熟）を促進する働きを有する）ことが確認できる。
【００３２】
活発な骨形成能を有する骨芽細胞、すなわち、分化（成熟）した骨芽細胞は、細胞内に骨基質沈着（沈着カルシウム）が認められ、石灰化する。また、細胞質中にアルカリホスファターゼ反応を示す顆粒が存在する。活発な骨形成がとまると、骨芽細胞中のこれら顆粒も消失し、アルカリホスファターゼ活性は急減することが知られている。
【００３３】
従って、分化のマーカーとしては、沈着カルシウム量やアルカリフォスファターゼ活性を好適に用いることができる。このほか、オステオカルシン活性やオステオポンチンの発現量なども分化マーカーとして用いることができる。
【００３４】
骨芽細胞としては、哺乳動物の頭頂骨などから分離した骨芽細胞、骨芽細胞様の株化細胞（マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１など）を用いることができる。このうち、とりわけ骨芽細胞様の株化細胞（マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１など）が好適に使用できる。
【００３５】
本発明の蛋白質は、通常の遺伝子組換え技術により過剰発現（overexpression）させ生産することができる。また、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白（fusion protein）の形で発現させ生産することもできる。
【００３６】
例えば、蛋白質をコードするＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。
【００３７】
発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞の発現系などが挙げられる。このうち、機能がよく保存された蛋白質を得るためには、昆虫細胞（Spodoptera frugiperda SF9、SF21等）および哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）を宿主として用いることが好ましい。
【００３８】
ベクターとしては、哺乳動物細胞系の場合、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等、昆虫細胞系の場合、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。
【００３９】
プロモーターとしては、哺乳動物細胞系の場合、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等、昆虫細胞系の場合、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。
【００４０】
蛋白質をコードするＤＮＡとしては、自然界に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（例えば、配列番号１及び２に示される塩基配列を有するもの）を用いることができるが、これに限定されない。目的とする蛋白質のアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）（Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662〜5666頁、1984年） 等によって実施できる。
【００４１】
本発明の蛋白質は、発現ベクターを導入した細胞の培養物などから、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法など）を適宜組合せることによって、分離精製できる。
【００４２】
本発明の遺伝子又は核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（オリゴヌクレオチドもしくポリヌクレオチド）は、本発明の遺伝子を検出するためのプローブとして使用できる。また、遺伝子の発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドや、リボザイム、デコイとして使用することもできる。このような核酸としては、例えば、配列番号１〜１０で示される塩基配列の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を有するヌクレオチドを用いることができる。
【００４３】
また、本発明の遺伝子の発現に対する被験物質の作用を、以下のようにして検定することができる。例えば、ゲノム遺伝子の５'上流域に存在する発現調節領域（プロモータ、エンハンサーなどを含む領域）と適当なレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等）を連結した構成を含む試験用ベクターを構築し、これを適当な細胞に導入する。この細胞を被験物質の存在下、培養し、レポータ遺伝子の発現を指標として、本発明の遺伝子の発現に対する被験物質の作用を検定する。このような検定結果をもとに、本発明の遺伝子の発現を変調（抑制又は増強）させる薬物のスクリーニング、同定、評価等を行うことができる。
【００４４】
本発明の遺伝子及び蛋白質の発現を変調（抑制又は増強）させる作用を有する薬物は、骨形成に関連する種々の疾患（骨粗鬆症、大理石病、骨軟化症など）の治療薬又は予防薬となる可能性がある。
【００４５】
本発明の蛋白質、又は、これと免疫学的同等性を有する蛋白質もしくはペプチド（蛋白質の断片または部分配列を有する合成ペプチド等）を抗原として用いて、本発明の蛋白質を認識する抗体を取得することができる。免役学的同等性を有するとは、例えば本発明の蛋白質に対する抗体と交差反応を生じるということを意味する。
【００４６】
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。また、モノクローナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を作製できる。
【００４７】
上記で得られた抗体を用いて、通常の免役化学的方法（enzyme immuno assay法など）により、本発明の蛋白質の細胞中又は組織中などにおける発現を検出することができる。あるいは、抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより本発明の蛋白質の精製を実施することができる。
【００４８】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００４９】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.F. およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００５０】
【実施例】
実施例１  マウスＯＢＤＰＦ遺伝子のｃＤＮＡの単離
１）マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の培養
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（理化学研究所  ＲＣＢNo.１１２６）を以下のように培養した。
【００５１】
すなわち、通常は、細胞（未分化細胞）を、10％ウシ胎児血清を含むα-ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて継代培養した。また、細胞を分化成熟させて石灰化させる場合は、前記培地にてコンフルエントに達するまで培養した後、培地にアスコルビン酸（0.2mM）およびβ-グリセロールリン酸（10mM）を添加して分化を誘導し、さらに１１〜１４日間培養して分化細胞を得た。
【００５２】
２）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の骨芽細胞への分化段階で発現促進される遺伝子の単離
前記１）と同様に培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の未分化細胞及び分化細胞（アスコルビン酸とβ-グリセロールリン酸を添加して１１日培養後の細胞）（各々約１０9ｃｅｌｌｓ）から、トータルＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡセパレーターキット（クローンテック社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡを用いて、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Liangら、Science、第２５７巻、第９６７〜９７１頁、１９９２年）により、以下のようにして候補クローンの選択を行った。
【００５３】
逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ついで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのプライマーとしては、ランダムプライマー（任意の配列からなる約２０マーのプライマー）を用いた。反応は、９５℃で４０秒間、３０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で４サイクル、続いて９５℃で４０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３０サイクル、および最終サイクルとして７２℃で５分間の条件で１サイクルを行った。
【００５４】
このようなＰＣＲを約３００種類のプライマーについて行い、得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。ゲル上に展開されたバンドを観察し、分化細胞由来のサンプルでは認められるが、未分化細胞由来のサンプルでは観察されないバンドを、候補クローンとして選択した。
【００５５】
候補クローンのバンドから、ｃＤＮＡ断片を溶出して回収し、同じプライマーを使用し、再度ＰＣＲを行ってＤＮＡを増幅させた後、これをベクタープラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングした。
【００５６】
３）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の未分化細胞および分化細胞における遺伝子の発現
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の未分化細胞および分化細胞における候補遺伝子の発現をノーザンブロッティングにより調べた。すなわち、未分化細胞および分化細胞由来のトータルＲＮＡを用い、前記候補クローンのｃＤＮＡ断片をプローブとしてノーザンブロッティングを行った。その結果、未分化細胞では、候補クローンに対応する遺伝子の発現が認められないが、分化細胞では発現が認められた。このように、分化細胞で特異的に発現していることが確認できたことから、候補クローンが骨形成関連遺伝子のｃＤＮＡであると考えられた。
【００５７】
４）全長ｃＤＮＡのクローニングと塩基配列決定
前記２）と同様にして得た分化細胞由来のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。前記２）で得られた候補クローンのｃＤＮＡ断片（α−32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたもの）をプローブとして、前記ｃＤＮＡライブラリーについて、高ストリンジェントな条件下でプラークハイブリダイゼーションを行った。
【００５８】
陽性クローンのうち挿入断片が長いクローンを選択し、これらクローン由来のプラスミドについて、種々の欠失プラスミドを作製し、ダイデオキシ法により挿入ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列を決定したｃＤＮＡ部分をつなぎ合わせて、マウスのＯＢＤＰＦ遺伝子の全長ｃＤＮＡを取得した。
【００５９】
ｃＤＮＡの塩基配列を解析して、オープンリーディングフレームを同定し、さらにそれにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を決定した。後記配列表の配列番号１に、全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１の上段）及びそれにコードされるＯＢＤＰＦ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１の下段）を示した。
【００６０】
アミノ酸配列から推定されるマウスＯＢＤＰＦ蛋白質の分子量は約６１Ｋｄである。また、このアミノ酸配列について、ハイドロパシーを解析した結果、ＯＢＤＰＦ蛋白質は、７個の膜貫通領域（transmembrane domain）を含む膜蛋白質様の構造を有すると予想された。また、１個のロイシンジッパーと、約８個程度のＮ−糖鎖付加（Ｎ−グリコシレーション）部位を有すると考えられた。予想される構造の模式図を図１に示した。
【００６１】
実施例２    ヒトＯＢＤＰＦ遺伝子のｃＤＮＡの単離
実施例１で得られた、マウスＯＢＤＰＦ遺伝子の全長ｃＤＮＡの翻訳領域を含む断片をα−32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）について、プラークハイブリダイゼーションを行って陽性クローンを得た。コロニーハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェントな条件下で行った。
【００６２】
得られた陽性クローンのうち、挿入断片の長いクローンを選択し、これらクローン由来のプラスミドについて、前記実施例１の４）項記載と同様にして、挿入断片ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００６３】
かくして、ヒトＯＢＤＰＦ遺伝子の全長ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡの塩基配列を解析して、オープンリーディングフレームを同定し、さらにそれにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を決定した。後記配列表の配列番号２に、全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２の上段）及びそれにコードされるＯＢＤＰＦ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２の下段）を示した。
【００６４】
アミノ酸配列から推定されるヒトＯＢＤＰＦ蛋白質の分子量は約６１Ｋｄである。また、マウスとヒトの配列を比較したところ、マウスとヒトのＯＢＤＰＦ遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列のホモロジーは、翻訳領域（約１．6ｋｂ）で約８７％であった。また、マウスとヒトのＯＢＤＰＦ蛋白質（５３９アミノ酸残基）のアミノ酸配列のホモロジーは、約８７％であった。
【００６５】
実施例３  マウスＯＢＤＰＦゲノム遺伝子の単離
実施例１で得た、マウスＯＢＤＰＦ遺伝子の全長ｃＤＮＡ断片をプローブとして、マウスＳｖＪゲノミック  ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）について、プラークハイブリダイゼーションを行い、ＯＢＤＰＦゲノム遺伝子のＤＮＡを含む陽性クローンを得た。これら陽性クローンのゲノムＤＮＡ部分をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にサブクローニングした。ついで、サザンブロッティングにより、各クローンのゲノムＤＮＡ上に存在するｃＤＮＡ領域（エキソン部分）を決定し、エキソン部分を含むクローンについて、ダイデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定した。ＯＢＤＰＦ遺伝子のゲノムＤＮＡと全長ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、エキソン−イントロンの存在域を明らかにした。
【００６６】
後記配列表の配列番号３〜１０には、マウスＯＢＤＰＦゲノム遺伝子のエキソン−イントロン境界域の塩基配列を示した。配列番号３、４、５、６、７、８、９及び１０は、各々、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５〜１０、エキソン１１、エキソン１２及びエキソン１３〜１６の塩基配列と、それらを囲むイントロンの塩基配列を示す。また、マウスＯＢＤＰＦゲノム遺伝子の制限酵素地図、及びエクソンの位置を図２に示した。
【００６７】
実施例４  骨芽細胞の分化（成熟）過程におけるＯＢＤＰＦ遺伝子の発現
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を、実施例１と同様にアスコルビン酸およびβ-グリセロールリン酸を添加した培地で培養して分化誘導し、０、４、７、１１及び１５日培養後の細胞から全ＲＮＡを調製した。実施例１の３）で得たマウスＯＢＤＰＦ遺伝子のｃＤＮＡ断片（配列番号１の６６２番目から１１１２番目の塩基に相当する断片）をプローブとし、これら全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行った。
【００６８】
その結果、図３に示した通り、ＯＢＤＰＦのｍＲＮＡは、培養０日後（コンフルエント直後）（レーン１）ではほとんど発現が認められなかったが、４及び７日後（レーン２及び３）では著しい発現増大が認められた。その後、１１及び１５日後（レーン４及び５）では、やや発現が減少したが、０日後と比べると発現レベルは高かった。このように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化（成熟）の進展に伴って発現量が変化したことから、ＯＢＤＰＦ遺伝子は骨芽細胞の分化（成熟）に関与すると考えられた。
【００６９】
実施例５  マウスの各種組織におけるＯＢＤＰＦ遺伝子の発現
マウスの種々の組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、大腿骨、頭頂骨）におけるＯＢＤＰＦ遺伝子の発現を、以下のようにノーザンブロッティングで調べた。
【００７０】
骨および頭頂骨の組織を、マウス（ＩＣＲ系雄性マウス、１２週齢）から、採取し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。その他の組織については、市販のマウスポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ＢＡＬＢ／ｃ系マウスより調製されたもの；商品名  マウスＭＴＮ  ｂｌｏｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。
【００７１】
前記の各組識由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡについて、ノーザンブロッティングを行った。プローブとしては、実施例１の３）で得たマウスＯＢＤＰＦ遺伝子ｃＤＮＡのＰｓｔＩ断片（配列番号１の第６６２〜１１１２番目の塩基配列に相当）を用いた。
【００７２】
ノーザンブロティングの結果、図４に示した通り、大腿骨、頭頂骨及び脾臓において、約２．５ｋｂ付近にバンドが検出され、発現が認められた。
【００７３】
実施例６  ＯＢＤＰＦの過剰発現による骨芽細胞の分化促進
１）ＯＢＤＰＦ発現ベクターの構築及びＯＢＤＰＦ過剰発現細胞の取得
実施例１の３）で得たマウスＯＢＤＰＦ遺伝子のｃＤＮＡ断片（配列番号１の１９７番目から１８５１番目の塩基に相当する断片、コーデイング領域をすべて含む）を末端平滑化した後、エロンゲーション１αプロモーターを含むベクタープラスミド（ｐＥＦ／ｎｅｏ）の前記プロモーター下流（ＳｐｅＩ切断部位）に順方向に連結し、ＯＢＤＰＦ発現ベクターを構築した。
【００７４】
前記で得たＯＢＤＰＦ発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで線状化した。これをマウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に、エレクトロポレーション法にて導入した後、細胞を、ネオマイシン（Ｇ４１８）を含有するα−ＭＥＭ培地で約１０日間培養して、Ｇ４１８耐性を示す細胞を１０クローン選択した。これらＧ４１８耐性細胞（すなわち発現ベクターが導入された細胞）について、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcript - polymerase chain reaction）を行ってＯＢＤＰＦのｍＲＮＡが過剰発現（overexpression）していることを確認した。
【００７５】
２）ＯＢＤＰＦ過剰発現細胞における骨芽細胞分化マーカーの解析
前記で得た１０クローンのＯＢＤＰＦ過剰発現細胞（S01, S02, S05, S06, S07, S09, S13, S15, S17,及びS18と称する）について、発現ベクター導入後０〜１４日間、アスコルビン酸及び（20mM）及びβ−グリセロールリン酸（10mM）を添加した培地中で培養して分化誘導した後、骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性および沈着カルシウム量を測定した。また、対照細胞としてはベクターのみを導入した細胞を用いた。
【００７６】
アルカリフォスファターゼ活性は、以下のようにして測定した。すなわち、細胞をＰＢＳ（phosphate buffered saline）で洗浄後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−１００を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕して酵素液を得た。ホスファターゼ活性測定用キット（Phosphatase Substrate System 、Kirkegaard & Perry Laboratories 社製）を用い、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（p-nitrophenylphosphate）を基質として活性を測定した。
【００７７】
沈着カルシウム量は、以下のようにして測定した。すなわち、細胞をＰＢＳ（phosphate buffered saline）で洗浄後、0.5N塩酸を加えて溶解した。4℃で一晩処理した後、遠心して上清を得、上清中のカルシウム量を、カルシウム含量測定用キット（カルシウムＣテストワコー、和光純薬製）を用いてオルトクレゾールフタレインコンプレキソン法（ＯＣＰＣ法）によって測定した。
【００７８】
結果を図５に示した。（Ａ）には０〜１４日培養後のアルカリフォスファターゼ活性を、また（Ｂ）には１４日培養後の沈着カルシウム量を各々示した。
【００７９】
図５に示した通り、ＯＢＤＰＦを過剰発現させた細胞では、対照細胞（ベクターのみ導入した細胞）と比較して、アルカリホスファターゼ活性及び沈着カルシウム量のいずれについても顕著な増大が認められた。このように、ＯＢＤＰＦの過剰発現により、骨芽細胞の分化マーカーの著しい増大と活発な骨形成能が認められたことから、ＯＢＤＰＦは骨芽細胞の分化成熟を促進する働きを有すると考えられた。
【００８０】
【発明の効果】
本発明の遺伝子、蛋白質、及びこれらを認識するプローブや抗体などを利用した検出方法は、骨形成や骨芽細胞分化（成熟）の機構解明に有用である。また、骨粗鬆症、大理石病、骨軟化症等の疾患の病態研究や診断、治療や予防のための医薬の開発などに有用である。
【００８１】
【配列表】
<110> Tanabe Seiyaku Co., Ltd.
<120> Bone Forming Related Gene
<130> A00-4635
<140> JP H10-318226
<141> 1998-11-10
<160> 10
<210> 1
<211> 2457
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> CDS
<222> (205)..(1824)
<400> 1
cccaccatga ctgtgctcga gccatagcgc ctctcccggc cttccaagag gacccacact           60
tcttcctgta ggtggcaaca gtgacacctg tttgaccagt gaggctgagc cagggactgc          120
aagagggagg aggcagacaa ctcggagagg agctgggagg cagagctgcg ggcttgcttg          180
ctcactgtgt aaaaggcctt aacc atg gca gat tcc ccc ggc tgc tgc tcc atc tgg     237
Met Ala Asp Ser Pro Gly Cys Cys Ser Ile Trp
1               5                  10
gcc cgc tgc ctc cac tgc ctg tac agc tgc cac tgg agg aaa tat cct            285
Ala Arg Cys Leu His Cys Leu Tyr Ser Cys His Trp Arg Lys Tyr Pro
15                  20                  25
aaa cag aag atg caa acc agc aag tgc gac tgt atc tgg ttt ggc ctg            333
Lys Gln Lys Met Gln Thr Ser Lys Cys Asp Cys Ile Trp Phe Gly Leu
30                  35                  40
ctc ttc ctc acc ttc ctc ctg tcc ctg gga tgg ctg tac atc ggg ctc            381
Leu Phe Leu Thr Phe Leu Leu Ser Leu Gly Trp Leu Tyr Ile Gly Leu
45                  50                  55
atc ctt ctc aat gat ctg cac aac ttc aat gaa ttc ctg ttc cgc cat            429
Ile Leu Leu Asn Asp Leu His Asn Phe Asn Glu Phe Leu Phe Arg His
60                   65                  70                 75
tgg gga cac tgg atg gac tgg tcc ctg ata gtc ctg ctg gtc gtc tct            477
Trp Gly His Trp Met Asp Trp Ser Leu Ile Val Leu Leu Val Val Ser
80                  85                  90
ctc ctg gtc aca tat gca tcc ttg cta ttg ctc ctg ggc ctg ctc ctg            525
Leu Leu Val Thr Tyr Ala Ser Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu
95                  100                 105
caa ctc tgt gga cag cct ctg cat ctt cac agt ctc cac aag gtg ctg            573
Gln Leu Cys Gly Gln Pro Leu His Leu His Ser Leu His Lys Val Leu
110                 115                 120
ctg ctc ctc att gta ctt cta gtg gcc gcg gga ctg gtg ggc ctg gat            621
Leu Leu Leu Ile Val Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Val Gly Leu Asp
125                 130                 135
atc caa tgg cgg cag gag tgg cat agt tta cga ctg tca ctg cag gcc            669
Ile Gln Trp Arg Gln Glu Trp His Ser Leu Arg Leu Ser Leu Gln Ala
140                 145                 150                 155
aca gcc cca ttc ctt cac att gga gca gtt gct gga atc acc ttg ttg            717
Thr Ala Pro Phe Leu His Ile Gly Ala Val Ala Gly Ile Thr Leu Leu
160                 165                 170
gcc tgg cct gtg gct gat acc ttc tac cgc atc cac cca aga ggc ccc            765
Ala Trp Pro Val Ala Asp Thr Phe Tyr Arg Ile His Pro Arg Gly Pro
175                 180                 185
aag gtt ctg cta ctg ttg cta ttt ttt gga gtc act ctg gtc atc tac            813
Lys Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Phe Gly Val Thr Leu Val Ile Tyr
190                 195                 200
ctg atg ccg ctg ctg ttc atc tct tcc ccc tgc atc atg aaa ctc aga            861
Leu Met Pro Leu Leu Phe Ile Ser Ser Pro Cys Ile Met Lys Leu Arg
205                 210                 215
gat tta ccc ccc aag cct ggg ctg gtg gga cac cga ggg gcc ccc atg            909
Asp Leu Pro Pro Lys Pro Gly Leu Val Gly His Arg Gly Ala Pro Met
220                 225                 230                 235
ctg gcc cct gag aat acc ctg atg tcc ctg agg aag aca gct gaa tgt            957
Leu Ala Pro Glu Asn Thr Leu Met Ser Leu Arg Lys Thr Ala Glu Cys
240                 245                 250
gga gcg gct gtg ttt gag aca gat gtg atg gtc agc tct gac gga gtc            1005
Gly Ala Ala Val Phe Glu Thr Asp Val Met Val Ser Ser Asp Gly Val
255                 260                 265
ccc ttt ctc atg cat gat gag cga ctg agc agg act acc aat gta gcc            1053
Pro Phe Leu Met His Asp Glu Arg Leu Ser Arg Thr Thr Asn Val Ala
270                 275                 280
tct gtg ttt cca gag cga atc tca gcc cac agc agt gac ttc tcc tgg            1101
Ser Val Phe Pro Glu Arg Ile Ser Ala His Ser Ser Asp Phe Ser Trp
285                 290                 295
gct gaa ctg cag aga ctc aat gct gga acc tgg ttc cta gag agg caa            1149
Ala Glu Leu Gln Arg Leu Asn Ala Gly Thr Trp Phe Leu Glu Arg Gln
300                 305                 310                 315
cct ttc tgg ggg gcc aaa aag ctg tca ggc tct gat cgg aag gag gct            1197
Pro Phe Trp Gly Ala Lys Lys Leu Ser Gly Ser Asp Arg Lys Glu Ala
320                 325                 330
gag aat cag acc ata cca gca tta gaa gaa cta ctg aag gaa gca gca            1245
Glu Asn Gln Thr Ile Pro Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Glu Ala Ala
335                 340                 345
gct ctc aac ctt tcc atc atg ttt gac ttg cgc cga ccc cca aga aac            1293
Ala Leu Asn Leu Ser Ile Met Phe Asp Leu Arg Arg Pro Pro Arg Asn
350                 355                 360
cac aca tac tat gat act ttt gtg aat cag aca ctg gag gct gtg ttg            1341
His Thr Tyr Tyr Asp Thr Phe Val Asn Gln Thr Leu Glu Ala Val Leu
365                 370                 375
agt gca aac gtg tcc caa gct atg gtt ctt tgg ctc cca gat gaa gac            1389
Ser Ala Asn Val Ser Gln Ala Met Val Leu Trp Leu Pro Asp Glu Asp
380                 385                 390                 395
cgt gct aac gtg cag caa cgc gcc ccc aga atg cgc cag ata tat gga            1437
Arg Ala Asn Val Gln Gln Arg Ala Pro Arg Met Arg Gln Ile Tyr Gly
400                 405                 410
cat cag gga ggc aat tgg act gag agg ccc cag ttt ctc aac ctc ccc            1485
His Gln Gly Gly Asn Trp Thr Glu Arg Pro Gln Phe Leu Asn Leu Pro
415                 420                 425
tat caa gac ctg cca gca ttg gat atc aag gcc ctg cac cag gat aat            1533
Tyr Gln Asp Leu Pro Ala Leu Asp Ile Lys Ala Leu His Gln Asp Asn
430                 435                 440
atc tca gtg aac ctg ttt gta gtg aac aag ccc tgg ctc ttc tcc ctg            1581
Ile Ser Val Asn Leu Phe Val Val Asn Lys Pro Trp Leu Phe Ser Leu
445                 450                 455
ctc tgg tgt gca ggg gtg gat tct gtc acc acc aat gcc tgc cag ctg            1629
Leu Trp Cys Ala Gly Val Asp Ser Val Thr Thr Asn Ala Cys Gln Leu
460                 465                 470                 475
ctg caa cag atg cag aac ccc ctc tgg ctt ctt ccc cct caa aaa tac            1677
Leu Gln Gln Met Gln Asn Pro Leu Trp Leu Leu Pro Pro Gln Lys Tyr
480                 485                 490
tta atg att tgg gtg atc acc gac tgt gcc tcc att ctg ctg ctt ttg            1725
Leu Met Ile Trp Val Ile Thr Asp Cys Ala Ser Ile Leu Leu Leu Leu
495                 500                 505
agt atc ttc ctc ctc cga ggg gga tgt gct aag aga aac aga aca ggc            1773
Ser Ile Phe Leu Leu Arg Gly Gly Cys Ala Lys Arg Asn Arg Thr Gly
510                 515                 520
tta gaa aca gca gtg cta ctg acc aag atc aac aat ttc gcc tct gag            1821
Leu Glu Thr Ala Val Leu Leu Thr Lys Ile Asn Asn Phe Ala Ser Glu
525                 530                 535
tga atgccgggcc caggccgcca ccagctgctg tctaaggcct gtgtgcactg                 1874
ttcaaaggga aggacaggag ctgaagtgga atgtcctaga atcaaatgtt tggaggaggg          1934
agcattgcta acagaagatt ttgaactcag agggccctct gtccagatgg tgggcatgtc          1994
tcaagctgcc atggaatttg ctgcctttgg tgtttgacat gaattagtcg gaaagacagt          2054
gactgacaag aagttactcc caaaatgaaa ttaaagcaag gaagtgagag agattgccaa          2114
gataatgcat taggcttgtg tgcacatgta cttggataga agaagcaggg tgtgtcaggg          2174
tgggatagct cagaatgatg actgaaggaa atttggccac aatggccttt ccggaagaac          2234
tcttaagatg ctgaagacag tccacactcc atgccttctc ttctcaccct cacacttcat          2294
cttcttttct gcctacaggc tgggagtgaa aaagctcatt tagcaatata atattgtgtc          2354
tatggtaggt ttttgttgtg agcaatgaat ggttcctgta tcttgcctgt taatctgtta          2414
ttcaatgaat ttttaatttg tcatttgaaa aaaaaaaaaa aaa                            2457
<210> 2
<211> 2199
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> CDS
<222> (252)..(1871)
<400> 2
gcagatttgc tctccctccc gcttcctccc tcccatcttc ccacccgggc tgtgcccagg            60
ccacagagca gctgcaggcc ttgggagagg acccacacag cctcctgtag gtggcaacag           120
tgccacctgt ttgactcata gggctgaacc gaggactgaa aaagggagga ggcagaccac           180
tcggagagga gctgggaagc agtgcagaga ggagagcgga gcggagctgc cgctgagcaa           240
aggccttcac c atg gcc gag tcc ccc ggc tgc tgc tcc gtc tgg gcc cgc tgc ctc    296
Met Ala Glu Ser Pro Gly Cys Cys Ser Val Trp Ala Arg Cys Leu
1              5                   10                  15
cac tgc ctg tat agc tgc cac tgg agg aaa tgc ccc aga gag agg atg             344
His Cys Leu Tyr Ser Cys His Trp Arg Lys Cys Pro Arg Glu Arg Met
20                   25                 30
caa acc agc aag tgc gac tgt atc tgg ttt ggc ctg ctc ttc ctc acc             392
Gln Thr Ser Lys Cys Asp Cys Ile Trp Phe Gly Leu Leu Phe Leu Thr
35                  40                  45
ttc ctc ctt tcc ctg agc tgg ctg tac atc ggg ctc gtc ctt ctc aat             440
Phe Leu Leu Ser Leu Ser Trp Leu Tyr Ile Gly Leu Val Leu Leu Asn
50                  55                 60
gac ctg cac aac ttc aat gaa ttc ctc ttc cgc cgc tgg gga cac tgg             488
Asp Leu His Asn Phe Asn Glu Phe Leu Phe Arg Arg Trp Gly His Trp
65                   70                  75
atg gac tgg tcc ctg gca ttc ctg ctg gtc atc tct cta ctg gtc aca             536
Met Asp Trp Ser Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Ser Leu Leu Val Thr
80                   85                  90                  95
tat gca tcc ttg cta ttg gtc ctg gcc ctg ctc ctg cgg ctt tgt aga             584
Tyr Ala Ser Leu Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Arg Leu Cys Arg
100                 105                 110
cag ccc ctg cat ctg cac agc ctc cac aag gtg ctg ctg ctc ctc att             632
Gln Pro Leu His Leu His Ser Leu His Lys Val Leu Leu Leu Leu Ile
115                 120                 125
atg ctg ctt gtg gcg gct ggc ctt gtg gga ctg gac atc caa tgg cag             680
Met Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Val Gly Leu Asp Ile Gln Trp Gln
130                 135                 140
cag gag tgg cat agc ttg cgt gtg tca ctg cag gcc aca gcc cca ttc             728
Gln Glu Trp His Ser Leu Arg Val Ser Leu Gln Ala Thr Ala Pro Phe
145                 150                 155
ctt cat att gga gca gcc gct gga att gcc ctc ctg gcc tgg cct gtg             776
Leu His Ile Gly Ala Ala Ala Gly Ile Ala Leu Leu Ala Trp Pro Val
160                 165                 170                 175
gct gat acc ttc tac cgt atc cac cga aga ggt ccc aag att ctg cta             824
Ala Asp Thr Phe Tyr Arg Ile His Arg Arg Gly Pro Lys Ile Leu Leu
180                 185                 190
ctg ctc cta ttt ttt gga gtt gtc ctg gtc atc tac ttg gcc ccc cta             872
Leu Leu Leu Phe Phe Gly Val Val Leu Val Ile Tyr Leu Ala Pro Leu
195                 200                 205
tgc atc tcc tca ccc tgc atc atg gaa ccc aga gac tta cca ccc aag             920
Cys Ile Ser Ser Pro Cys Ile Met Glu Pro Arg Asp Leu Pro Pro Lys
210                 215                 220
cct ggg ctg gtg gga cac cga ggg gcc ccc atg ctg gct ccc gag aac             968
Pro Gly Leu Val Gly His Arg Gly Ala Pro Met Leu Ala Pro Glu Asn
225                 230                 235
acc ctg atg tcc ttg cgg aag aca gct gaa tgc gga gct act gtg ttt            1016
Thr Leu Met Ser Leu Arg Lys Thr Ala Glu Cys Gly Ala Thr Val Phe
240                 245                 250                 255
gag act gat gtg atg gtc agc tcc gat ggg gtc ccc ttc ctc atg cat            1064
Glu Thr Asp Val Met Val Ser Ser Asp Gly Val Pro Phe Leu Met His
260                 265                 270
gat gag cac ctc agc agg acc acg aat gta gcc tct gta ttc cca accv           1112
Asp Glu His Leu Ser Arg Thr Thr Asn Val Ala Ser Val Phe Pro Thr
275                 280                 285
cga atc aca gcc cac agc agt gac ttc tcc tgg act gaa ctg aag aga            1160
Arg Ile Thr Ala His Ser Ser Asp Phe Ser Trp Thr Glu Leu Lys Arg
290                 295                 300
ctc aat gct gga tcc tgg ttc cta gag agg cga ccc ttc tgg ggg gcc            1208
Leu Asn Ala Gly Ser Trp Phe Leu Glu Arg Arg Pro Phe Trp Gly Ala
305                 310                 315
aaa ccg ctg gca ggc cct gat cag aaa gag gct gag agt cag acg gta            1256
Lys Pro Leu Ala Gly Pro Asp Gln Lys Glu Ala Glu Ser Gln Thr Val
320                 325                 330                 335
cca gca tta gaa gag cta ttg gag gaa gct gca gcc ctc aac ctt tcc            1304
Pro Ala Leu Glu Glu Leu Leu Glu Glu Ala Ala Ala Leu Asn Leu Ser
340                 345                 350
atc atg ttc gac ttg cgc cga ccc cca cag aac cac aca tac tat gac            1352
Ile Met Phe Asp Leu Arg Arg Pro Pro Gln Asn His Thr Tyr Tyr Asp
355                 360                 365
act ttt gtg atc cag aca ttg gag act gtg ctg aat gca agg gtg ccc            1400
Thr Phe Val Ile Gln Thr Leu Glu Thr Val Leu Asn Ala Arg Val Pro
370                 375                 380
caa gcc atg gtc ttt tgg cta cca gat gaa gat cgg gct aat gtc caa            1448
Gln Ala Met Val Phe Trp Leu Pro Asp Glu Asp Arg Ala Asn Val Gln
385                 390                 395
cga cgg gca cct gga atg cgc cag ata tat gga cgt cag gga ggc aac            1496
Arg Arg Ala Pro Gly Met Arg Gln Ile Tyr Gly Arg Gln Gly Gly Asn
400                 405                 410                 415
aga acg gag agg ccc cag ttt ctt aac ctc ccc tat caa gat ctg cca            1544
Arg Thr Glu Arg Pro Gln Phe Leu Asn Leu Pro Tyr Gln Asp Leu Pro
420                 425                 430
cta ttg gat atc aag gca ttg cat aag gat aat gtc tcg gtg aac cta            1592
Leu Leu Asp Ile Lys Ala Leu His Lys Asp Asn Val Ser Val Asn Leu
435                 440                 445
ttt gta gtg aac aag ccc tgg ctc ttc tct ctg ctt tgg tgt gca ggg            1640
Phe Val Val Asn Lys Pro Trp Leu Phe Ser Leu Leu Trp Cys Ala Gly
450                 455                 460
gtg gat tcg gtc acc acc aac gac tgc cag ctg ctg cag cag atg cgt            1688
Val Asp Ser Val Thr Thr Asn Asp Cys Gln Leu Leu Gln Gln Met Arg
465                 470                 475
tac cct atc tgg ctt att acc cct caa acc tac cta atc ata tgg gtc            1736
Tyr Pro Ile Trp Leu Ile Thr Pro Gln Thr Tyr Leu Ile Ile Trp Val
480                 485                 490                 495
att acc aat tgt gtt tcc acc atg ctg ctt ttg tgg acc ttc ctc ctc            1784
Ile Thr Asn Cys Val Ser Thr Met Leu Leu Leu Trp Thr Phe Leu Leu
500                 505                 510
caa agg aga ttt gtt aag aag aga ggg aaa act ggc tta gaa aca gca            1832
Gln Arg Arg Phe Val Lys Lys Arg Gly Lys Thr Gly Leu Glu Thr Ala
515                 520                 525
gtg ctg ctg aca agg atc aac aat ttc atg atg gag tga atgccctgcc             1881
Val Leu Leu Thr Arg Ile Asn Asn Phe Met Met Glu
530                 535
ctgcttcccc acccaagcca gtctacattg cccaaacagc aagggttgga gagtggctta          1941
agtggaatgc ttcaggggtg gtgggttgca agtgggggga gctttgccaa caggaggttt          2001
tgaaccatga gggccctctg cccaggtgat gggcattccc taagctgcta tggaatctgc          2061
tccctttggg gttttgacct gagatgtttg ggaagagagt gagtaatgag aagtttctcc          2121
tcaaatgaaa ctagaacaga ggaagtaaaa gggagattgc tcggaaaaaa aaaaaaaaaa          2181
aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                                        2199
<210> 3
<211> 2529
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 2314..2508
<223> exon 1
<400> 3
tgatgcccac ttctggctta caggcatata tgtagttaga acactgtata catatgtctt            60
agtcagggtt tctattcctg cacaaacatc atgaccaaga agcaagttgg ggcagaaagg           120
gtttattcgg cctatacttc catactgcag ttcatcacca aggaagtcag gactggaact           180
caagcaggtc aggaagcagg agctgatgca gaggccatgg agggatgtta cttactggct           240
tgcttcccct ggcttgccca gcctgctcag ttatagaacc aagactacca gcccagagat           300
ggtcccaccc acaaggggtc tttccccctt aatcactaat tgagaaagtg ccttacagat           360
ggatctcatg gaggcatttt ctcaactgaa gctcctttct ctgtgataac tccagctgtg           420
tcaagttgac acaaaactag ccagtacaac atagtaaaca aatcttttta aaaaaatgtt           480
caaggtcctt agcctgtact ttgcatataa gaaaatcaag tgtctgcttt accatacaat           540
agcaaatact tgagagatgg agttgtctgg agaatgtgtt taatttagct catggtgttg           600
gaggccctgg gccatgctta gaaacccata ttagttcatg acagaagtac gatggagcag           660
gatggaagaa aatagtggaa ggatctgggt cccatcacca gccttcgaga gcatactctc           720
cagtatacaa aagacagaca ctccacgaga acctacctcg ctataaagtt tcccccaacc           780
tcccaaattg taccacaggc cagggaacaa gctgtgaaca cacaagccct tggggaacat           840
taaatatcta acagagatag taccgtggta caaagaggtg gttatataga gttacaatgt           900
cagtgaatat tagagctggg aacagaagcc agttacattt accatatagt tctttctagt           960
gccctgcaat cctactaatg cttttccgtt tacagaacaa aactactgcc cccttgcttt          1020
ctcccttaaa aaggaagtgg gggtgggggg ggacaaggat tattccttac cttatgccag          1080
atttcttgtc tccagttaga agccagaagg ggggccagcc atgcagtacc tcatacaggc          1140
tatatttgaa accttttggg agttttcaag ccttgaggct catccatgca tatcgaatgc          1200
tgtccccacc ccaccacccc ctaaaaggct ctcaaaccat ccccacgtac aagaaaacaa          1260
gactctagaa tccaccacaa cccaagcaaa ggaaattgaa aaacaacctg ccaagaatga          1320
ctcccagtgg aggactaggt gacccgctgg ccctccctgg cttcctgcca gcaagcagcc          1380
ttgcttctct ttgcatttta attctgagag agttagagaa tctctgtcat tgccaaatag          1440
agcctctgga tacaatggga aagctgagag ggagggaacc agctcctggc agaagagagc          1500
cagtctccct cactggataa aattgagtgt gtggaggggg aggggaagcc agcttatctg          1560
taaggagtca tcctttccca ccctccatag tgctcacaca cagaccccaa gtcacttcat          1620
cagccccaat ccaagagctg tccatcaaca cagcgcccat gcaatcctgt actttttata          1680
ctaagctgac cacagcttgc atggccacct gcttcttttg tacatgttca tcttccaaaa          1740
gcctggtacc ctaatacact atacactcct gaagccattc agtgcttgat aaacaagaca          1800
gtgagcctga tatcctgaat gagcacctga tgggtggtgc ggtgagggct attgaataca          1860
tccacaggga ctcctggtcc agaaatgggg catctactgc ctagagttca taaagtcact          1920
tcaatagcat cactacgatg gaattgcaga agtataaata gcccaagagg aaagggaagc          1980
taatgattgg aagttgtact cctaggaagc ttgaggttag acttccttat ccactcaaga          2040
gtttctaggg gactggcagg gccccttctc ctcgctgcca agttgcaaaa ttgtgtggtc          2100
acctccccca gcttccctcc ctcctatgcc ctcagtcctg gcctcctaga gccaggacaa          2160
agccctcagg cagtgactgg gaggggaaca ggaggaggga cagagggatg gggaaggctg          2220
cacaaaggaa ttcctcacac caagccccct gactgccagc tccagagagt aaagaagccg          2280
acctcctctc cagctagctc actcgctcat cttcccacca tgactgtgct cgagccatag          2340
cgcctctccc ggccttccaa gaggacccac acttcttcct gtaggtggca acagtgacac          2400
ctgtttgacc agtgaggctg agccagggac tgcaagaggg aggaggcaga caactcggag          2460
aggagctggg aggcagagct gcgggcttgc ttgctcactg tgtaaaaggt gtgagggctc          2520
gggaaagct                                                                  2529
<210> 4
<211> 158
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 21..134
<223> exon 2
<400> 4
caaatgtcct tttcccccag gccttaacc atg gca gat tcc ccc ggc tgc tgc tcc atc      59
Met Ala Asp Ser Pro Gly Cys Cys Ser Ile
1               5                  10
tgg gcc cgc tgc ctc cac tgc ctg tac agc tgc cac tgg agg aaa tat             107
Trp Ala Arg Cys Leu His Cys Leu Tyr Ser Cys His Trp Arg Lys Tyr
15                   20                 25
cct aaa cag aag atg caa acc agc aag gtggagaaag gatggggggg tgac              158
Pro Lys Gln Lys Met Gln Thr Ser Lys
30                  35
<210> 5
<211> 159
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 32..136
<223> exon 3
<400> 5
agctgagagc ttctctcctg ctcctttgca g tgc gac tgt atc tgg ttt ggc ctg ctc       58
Cys Asp Cys Ile Trp Phe Gly Leu Leu
1               5
ttc ctc acc ttc ctc ctg tcc ctg gga tgg ctg tac atc ggg ctc atc             106
Phe Leu Thr Phe Leu Leu Ser Leu Gly Trp Leu Tyr Ile Gly Leu Ile
10                  15                  20                   25
ctt ctc aat gat ctg cac aac ttc aat ga gtgtgtcatg taccacctcc ttcc           159
Leu Leu Asn Asp Leu His Asn Phe Asn Glu
30                  35
<210> 6
<211> 155
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 26..119
<223> exon 4
<400> 6
aacatcttcc tttaccctcc tacag a ttc ctg ttc cgc cat tgg gga cac tgg atg gac    59
Phe Leu Phe Arg His Trp Gly His Trp Met Asp
1               5                   10
tgg tcc ctg ata gtc ctg ctg gtc gtc tct ctc ctg gtc aca tat gca             107
Trp Ser Leu Ile Val Leu Leu Val Val Ser Leu Leu Val Thr Tyr Ala
15                  20                  25
tcc ttg cta ttg gttggtccag ggacatccgg cctaactccc acataa                     155
Ser Leu Leu Leu
30
<210> 7
<211> 1552
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 26..85
<223> exon 5
<220>
<221> exon
<222> 328..426
<223> exon 6
<220>
<221> exon
<222> 600..693
<223> exon 7
<220>
<221> exon
<222> 853..1001
<223> exon 8
<220>
<221> exon
<222> 1124..1206
<223> exon 9
<220>
<221> exon
<222> 1318..1468
<223> exon 10
<400> 7
aagtgcccct tctgtctgtt cccag ctc ctg ggc ctg ctc ctg caa ctc tgt gga cag      58
Leu Leu Gly Leu Leu Leu Gln Leu Cys Gly Gln
1               5                   10
cct ctg cat ctt cac agt ctc cac aag gtacagtgaa ttggcagtga tgaggagagg        115
Pro Leu His Leu His Ser Leu His Lys
15                   20
ggatgctggg tccagcaccc tgatggtcat ttgcttttct atccctgggg tcaagatcag           175
gacctgaaat ccagtacatg tttattgagt gaaagcatag tacatgcgtt caggaagggg           235
aagaatcctg tgtccacaga atgaagaggt agccccagtc accatgagcc taggctaaca           295
aggaaggccc attcattcgt ccctggcccc ag gtg ctg ctg ctc ctc att gta ctt cta     354
Val Leu Leu Leu Leu Ile Val Leu Leu
25
gtg gcc gcg gga ctg gtg ggc ctg gat atc caa tgg cgg cag gag tgg             402
Val Ala Ala Gly Leu Val Gly Leu Asp Ile Gln Trp Arg Gln Glu Trp
30                  35                  40                  45
cat agt tta cga ctg tca ctg cag gtgagtagct gacctccact atctatgtgg            456
His Ser Leu Arg Leu Ser Leu Gln
50
gagccttggc ccatgcctat tctggaacat gacattgcct cctggtccta tgagactgca           516
gatctctctg gactgcagag aagggggagg cacaacacag aacaatagga agaagagcct           576
tcctcaccag ctcttttcca cag gcc aca gcc cca ttc ctt cac att gga gca gtt gct   635
Ala Thr Ala Pro Phe Leu His Ile Gly Ala Val Ala
55                  60                  65
gga atc acc ttg ttg gcc tgg cct gtg gct gat acc ttc tac cgc atc             683
Gly Ile Thr Leu Leu Ala Trp Pro Val Ala Asp Thr Phe Tyr Arg Ile
70                  75                  80
cac cca aga g   gtgccaacat cagcccacat tcactctcac tggacaccag tgtctctgcc      743
His Pro Arg Gly
85
acccacccca ccccaccccc agtttcctgt acctgagctc tgccctctgc ccgtagagct           803
ccaccttacc tgttgccttt cccctaagct tgtcctccac tttctacag gc ccc aag            860
Pro Lys
gtt ctg cta ctg ttg cta ttt ttt gga gtc act ctg gtc atc tac ctg             908
Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Phe Gly Val Thr Leu Val Ile Tyr Leu
90                   95                 100
atg ccg ctg ctg ttc atc tct tcc ccc tgc atc atg aaa ctc aga gat             956
Met Pro Leu Leu Phe Ile Ser Ser Pro Cys Ile Met Lys Leu Arg Asp
105                 110                 115
tta ccc ccc aag cct ggg ctg gtg gga cac cga ggg gcc ccc atg gtaagtggtg     1011
Leu Pro Pro Lys Pro Gly Leu Val Gly His Arg Gly Ala Pro Met
120                 125                 130
ggcagaaatc tagacaagtg aaaatgaatt tgctcctcta ggcttcagga tcaggtctga          1071
ggttcccagc cccgcccttc cctgctacct tctcaccacc tccctttcac ag ctg gcc          1129
Leu Ala
135
cct gag aat acc ctg atg tcc ctg agg aag aca gct gaa tgt gga gcg            1177
Pro Glu Asn Thr Leu Met Ser Leu Arg Lys Thr Ala Glu Cys Gly Ala
140                 145                 150
gct gtg ttt gag aca gat gtg atg gtc ag gtgatggagg gtgggaccta gggggttggt    1236
Ala Val Phe Glu Thr Asp Val Met Val Ser
155                 160
gggctggggg acacagtggg gggactcggg aaaagatgtc agctccagag ctttgtcccc          1296
tgacacttct tgtgcccaca g c tct gac gga gtc ccc ttt ctc atg cat gat gag cga  1354
Ser Asp Gly Val Pro Phe Leu Met His Asp Glu Arg
165                 170
ctg agc agg act acc aat gta gcc tct gtg ttt cca gag cga atc tca            1402
Leu Ser Arg Thr Thr Asn Val Ala Ser Val Phe Pro Glu Arg Ile Ser
175                 180                 185                 190
gcc cac agc agt gac ttc tcc tgg gct gaa ctg cag aga ctc aat gct            1450
Ala His Ser Ser Asp Phe Ser Trp Ala Glu Leu Gln Arg Leu Asn Ala
195                 200                 205
gga acc tgg ttc cta gag gtgaggacgc cagccaagat gaggccacta cctccttgac        1508
Gly Thr Trp Phe Leu Glu
210
actcagggca gagtccattt cagcagtatg cactcgctgc accc                           1552
<210> 8
<211> 358
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 116..337
<223> exon 11
<400> 8
ctgcagagca aattccaggc cagacaggac tgtagaaaac aaacaaacag atggcaagga            60
ttgggagaaa accttgaggc ctcttgtgat gttgaaataa tttcctctct tatag agg            118
Arg
1
caa cct ttc tgg ggg gcc aaa aag ctg tca ggc tct gat cgg aag gag             166
Gln Pro Phe Trp Gly Ala Lys Lys Leu Ser Gly Ser Asp Arg Lys Glu
5                  10                  15
gct gag aat cag acc ata cca gca tta gaa gaa cta ctg aag gaa gca             214
Ala Glu Asn Gln Thr Ile Pro Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Glu Ala
20                 25                   30
gca gct ctc aac ctt tcc atc atg ttt gac ttg cgc cga ccc cca aga             262
Ala Ala Leu Asn Leu Ser Ile Met Phe Asp Leu Arg Arg Pro Pro Arg
35                  40                   45
aac cac aca tac tat gat act ttt gtg aat cag aca ctg gag gct gtg             310
Asn His Thr Tyr Tyr Asp Thr Phe Val Asn Gln Thr Leu Glu Ala Val
50                  55                   60                  65
ttg agt gca aac gtg tcc caa gct atg gtgatgtatc caggctccta a                 358
Leu Ser Ala Asn Val Ser Gln Ala Met
70
<210> 9
<211> 234
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 33..181
<223> exon 12
<400> 9
attaaatttt gttcattgcc cctgaaccac ag gtt ctt tgg ctc cca gat gaa gac cgt      59
Val Leu Trp Leu Pro Asp Glu Asp Arg
1               5
gct aac gtg cag caa cgc gcc ccc aga atg cgc cag ata tat gga cat             107
Ala Asn Val Gln Gln Arg Ala Pro Arg Met Arg Gln Ile Tyr Gly His
10                  15                  20                   25
cag gga ggc aat tgg act gag agg ccc cag ttt ctc aac ctc ccc tat             155
Gln Gly Gly Asn Trp Thr Glu Arg Pro Gln Phe Leu Asn Leu Pro Tyr
30                  35                  40
caa gac ctg cca gca ttg gat atc aa gtgagtgtca aggaaaggaa taaaaggacc         211
Gln Asp Leu Pro Ala Leu Asp Ile Lys
45                   50
ccccaaggtt gactgtcaga aaa                                                   234
<210> 10
<211> 1582
<212> DNA
<213> mouse
<220>
<221> exon
<222> 62..209
<223> exon 13
<220>
<221> exon
<222> 348..430
<223> exon 14
<220>
<221> exon
<222> 714..739
<223> exon 15
<220>
<221> exon
<222> 827..1496
<223> exon 16
<400> 10
gagtctcaga cgtgagctgg gcaaattctg tatgttcctc catttccccc cacttccaca            60
g g gcc ctg cac cag gat aat atc tca gtg aac ctg ttt gta gtg aac             107
Ala Leu His Gln Asp Asn Ile Ser Val Asn Leu Phe Val Val Asn
1               5                  10                  15
aag ccc tgg ctc ttc tcc ctg ctc tgg tgt gca ggg gtg gat tct gtc             155
Lys Pro Trp Leu Phe Ser Leu Leu Trp Cys Ala Gly Val Asp Ser Val
20                   25                 30
acc acc aat gcc tgc cag ctg ctg caa cag atg cag aac ccc ctc tgg             203
Thr Thr Asn Ala Cys Gln Leu Leu Gln Gln Met Gln Asn Pro Leu Trp
35                  40                  45
ctt ctt gtaaggactc tagaactgtc cctgcccctc atgtccaatc tcttatttcc              259
Leu Leu
tcttaaacct gtacccctcc atatttattt accccatatg ctactcttgg gagttctggc           319
cactgaaggg acttttccat ttccatag ccc cct caa aaa tac tta atg att              371
Pro Pro Gln Lys Tyr Leu Met Ile
50                  55
tgg gtg atc acc gac tgt gcc tcc att ctg ctg ctt ttg agt atc ttc             419
Trp Val Ile Thr Asp Cys Ala Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Phe
60                  65                 70
ctc ctc cga gg gtgagtgctt ttgccttggt ctcctgggca ctttcccggg                  470
Leu Leu Arg Gly
75
ccccaagtaa aaaaggttga gtctgactgg agtgcactgc ccgggattaa gattttgtca           530
ttgcaaattt cgagttttcc ttatctctat aaaatgtctt gaccctggcg aaagcagttt           590
tggggaaccc tgggttggag agtcttgtaa caagttggtg gaacttgcaa cagaaaaaaa           650
gaaagtctca atctctctct ctctctttct ctctctctct ttctctcccc cccccctctc           710
tag g gga tgt gct aag aga aac aga aca g gtaagaatgc ccttgccctt cctttcttat    769
Gly Cys Ala Lys Arg Asn Arg Thr Gly
80                  85
tttctcctca tttcccctgg cttcactccc tgtatgaccc gtctcttact tctctag gc           828
tta gaa aca gca gtg cta ctg acc aag atc aac aat ttc gcc tct gag             876
Leu Glu Thr Ala Val Leu Leu Thr Lys Ile Asn Asn Phe Ala Ser Glu
90                  95                  100
tga atgccgggcc caggccgcca ccagctgctg tctaaggcct gtgtgcactg                  929
ttcaaaggga aggacaggag ctgaagtgga atgtcctaga atcaaatgtt tggaggaggg           989
agcattgcta acagaagatt ttgaactcag agggccctct gtccagatgg tgggcatgtc          1049
tcaagctgcc atggaatttg ctgcctttgg tgtttgacat gaattagtcg gaaagacagt          1109
gactgacaag aagttactcc caaaatgaaa ttaaagcaag gaagtgagag agattgccaa          1169
gataatgcat taggcttgtg tgcacatgta cttggataga agaagcaggg tgtgtcaggg          1229
tgggatagct cagaatgatg actgaaggaa atttggccac aatggccttt ccggaagaac          1289
tcttaagatg ctgaagacag tccacactcc atgccttctc ttctcaccct cacacttcat          1349
cttcttttct gcctacaggc tgggagtgaa aaagctcatt tagcaatata atattgtgtc          1409
tatggtaggt ttttgttgtg agcaatgaat ggttcctgta tcttgcctgt taatctgtta          1469
ttcaatgaat ttttaatttg tcatttggtc acagtctaat catttctgtg ccggagttgg          1529
aagaatgctt tttccatctg gaactggatg taaaatgaca ttgagaggtc atc                 1582
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＯＢＤＰＦ蛋白質の膜蛋白質としての構造を示した予想模式図。
【図２】  マウスＯＢＤＰＦゲノム遺伝子の制限酵素地図、及びエクソンの位置を示した図。
【図３】  分化促進したマウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（アスコルビン酸とβ-グリセロールリン酸を添加、０、４、７、１１、１５日培養後）におけるＯＢＤＰＦ遺伝子の発現（ノーザンブロッティングの結果）を示した図。
【図４】  マウスの各組織におけるＯＢＤＰＦ遺伝子の発現（ノーザンブロティングの結果）を示した図。
【図５】  ＯＢＤＰＦを過剰発現させたマウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における骨芽細胞分化マーカーの解析結果（（Ａ）０〜１４日培養後のアルカリフォスファターゼ活性、（Ｂ）１４日培養後の沈着カルシウム量）を示した図。
【図１】
0004218091.tif 000002
【図２】
0004218091.tif 000003
【図３】
0004218091.tif 000004
【図４】
0004218091.tif 000005
【図５】
0004218091.tif 000006