(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスベクターであって、該アデノウイルスベクターは、初期アデノウイルス遺伝子の発現を制御するＥ２Ｆ転写調節配列および該アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域における変異を含むアデノウイルスベクターであって、該変異は、該Ｅ１ａ領域によってコードされるタンパク質へのＲＢ結合を消失させるものである、アデノウイルスベクター。
【請求項２】
前記転写調節配列がＥ２Ｆプロモーターを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記Ｅ２Ｆ転写調節配列が内因性アデノウイルスＥ１ａプロモーターの代わりに使用されている、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記Ｅ２Ｆ転写調節配列が内因性アデノウイルスＥ４プロモーターの代わりに使用されている、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、Ｓｐ１、ＡＴＦ、ＮＦ１およびＮＦＩＩＩ／Ｏｃｔ−１を含むウイルス複製を実質上促進するヌクレオチド調節部位をさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターであって、該アデノウイルスベクターは、アデノウイルス初期遺伝子の発現を制御するウイルス転写調節部位および該アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域における変異を含み、ここで該部位は、Ｅ２Ｆ転写調節配列の挿入によって不活性化され、その結果、Ｅ２Ｆ転写調節配列が該アデノウイルス遺伝子の発現を制御する、アデノウイルスベクターであって、該変異は、該Ｅ１ａ領域によってコードされるタンパク質へのＲＢ結合を消失させるものである、アデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記転写調節配列がＥ２Ｆプロモーターを含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記不活性化される転写調節部位が内因性アデノウイルスＥ１ａプロモーターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記不活性化される転写調節部位が内因性アデノウイルスＥ４プロモーターである、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記不活性化される転写調節部位が内因性アデノウイルスＥ１ａおよびＥ４プロモーターの両者を含んでいる、請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】
Ｅ２Ｆ応答性である前記転写調節配列がヒトＥ２Ｆ−１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む、正常細胞の存在下で癌細胞を殺滅するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アデノウイルスベクター、および係るベクターを製造し使用するための方法に関するものである。より詳細には、本発明は、実質的な腫瘍細胞特異的腫瘍崩壊活性を付与する、E1Aおよび／またはE4領域のプロモーターに突然変異および置換を含む、改良されたアデノウイルスベクターに関するものである。
【０００２】
背景
今世紀初期からウイルスが癌の治療に使用されてきた。このアプローチは二つの部分から成っていた。まず、新生物細胞中で選択的に複製してこれを殺滅し、一方正常細胞は容赦する腫瘍崩壊性ウイルスを単離または作製することである。研究者等は当初、野生型ウイルスを使用したが、このアプローチは、限定された成功ではあったものの幾らかの成功を収めた。正常組織に対する損傷を全くまたは殆ど伴わずに腫瘍崩壊および腫瘍成長の減速が起こったものの、疾病の経過には有意な変化が無かった。Smith et al., Cancer 9:1211-1218(1956)、Cassel,W.A. et al.、Cancer 18:863-868(1965)、Webb,H.E. et al.、Lancet 1:1206-1209(1966)を参照されたい。さらに、Kenney,SおよびPagano,J. J.Natl.Cancer Inst.、86巻no.16、p.1185(1994)をも参照されたい。
【０００３】
より最近になって、有効性が限られた野生型ウイルスの使用に伴う疾病の再発のため、研究者等は、高用量で導入してよく、新生物細胞においては複製コンピテントであるが正常細胞ではそうでない、組換えウイルスの使用に頼った。このようなウイルスはそれ自身で有効な腫瘍崩壊性物質であり、さらには、該ウイルスの抗新生物活性を増強する導入遺伝子を持ち且つそれを発現するよう作り替えることができる。このクラスのウイルスの一つの例は、ウイルスゲノムのE1B領域における突然変異体であるアデノウイルスである。米国特許5677178、およびBischoff,J.R.、D.H.Kim、A.Williams、C.Heise、S.Horn、M.Muna、L.Ng、J.A.Nye、A.Sampson-Johannes、A.Fattaey、およびF.McCormick、1996、Science、274:373-6を参照されたい。
【０００４】
導入遺伝子を発現する非複製ウイルスである、研究者の用いた第二のアプローチから、癌治療のための導入遺伝子を持つまたは持たない複製コンピテントウイルスの使用を区別することが重要である。ここでは、ウイルスは、新生物細胞の直接または間接的な殺滅を司る導入遺伝子を単に運搬する媒体として使用されているにすぎない。このアプローチは、癌治療のためにウイルスを使用する主たるアプローチであったし、またそうであり続ける。しかしながらこれは限られた成功を収めたに過ぎず、複製するウイルスよりは有効性が低いように思われる。にも拘わらず、外来遺伝子が、E1領域(McGrory、Virology 163:614-17(1988)を参照されたい)、E3領域(Hanke、Virology 177:437-44(1990)およびBett,J、Virol. 67:5911-21(1993)を参照されたい)またはE1除去ベクターのE3領域中に挿入されてきた。
【０００５】
上記のように、高用量ウイルス療法の使用の結果引き起こされる正常組織の損傷を回避するためには、腫瘍細胞では当該ウイルスの複製を促進し、よって腫瘍崩壊活性を促進するが、正常細胞に対しては本質的に無害とさせるような突然変異を、当該ウイルスが有することが好ましい。このアプローチは、正常細胞の増殖を制御する細胞増殖調節機構の多くは、新生物細胞中では不活性化されまたは失われること、そしてこの同じ増殖制御機構が、ウイルス複製を促進するウイルスによって不活性化される、という知見を利用している。したがって、特定の正常細胞増殖制御機構を不活性化するウイルス遺伝子の除去または不活性化は、そのウイルスが正常細胞中で複製することを妨げることになるが、このようなウイルスは、特定の増殖制御機構を欠く新生物細胞中で複製し、それを殺滅するであろう。
【０００６】
例えば、分裂中の正常細胞は、増殖調節機構、網膜芽細胞腫腫瘍サプレッサーを一時的に欠失しており、これは或る種の新生物細胞には欠けており、無制限の増殖に結びついている。網膜芽細胞腫腫瘍サプレッサー遺伝子(RB)の遺伝子機能の欠失は、様々なタイプの腫瘍の病因に関連している。pRBまたはp105と呼ばれる105キロダルトンのポリペプチドである、この腫瘍サプレッサー遺伝子の産物は、細胞サイクル調節蛋白である。このpRBポリペプチドは、細胞サイクルのG1期に細胞を停止させることにより、細胞増殖を阻害する。pRB蛋白は、アデノウイルスE1a、SV40ラージT Ag、および乳頭腫ウイルスE7を包含する幾つかのDNAウイルス腫瘍蛋白の主たる標的である。これらのウイルス蛋白はpRBに結合してこれを不活性化し、また、pRBを不活性化する機能はウイルス複製の促進において重要である。pRB蛋白は、アデノウイルスE2遺伝子および幾つかの細胞遺伝子の発現に関係するE2F転写因子と相互作用し、この転写因子の活性を阻害する(Bagchi et al.(1991) Cell 65:1063；Bandara et al.(1991) Nature 351:494；Chellappan et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 89:4549。
【０００７】
アデノウイルス腫瘍蛋白E1aはpRB/E2F複合体を破壊し、E2Fの活性化を導く。しかしながら、E2Fを複合体形成させる充分な機能的pRBを欠失する分裂中の新生物または正常細胞は、転写の上で活性なE2Fを所有するための、E1aのような機能的腫瘍蛋白の存在を必要としない。それ故、RBを複合体形成させる能力を欠くが他の本質的な複製機能を実質的に保持している、複製不全アデノウイルス種は、RB機能に欠陥のある細胞(例えば、正常な分裂中の細胞、または実質上除去されたRBアレレについて同型接合または異型接合である細胞、本質上非機能的であるRB蛋白突然変異体をコードしているRBアレレを含む細胞、RB蛋白の機能の欠失を導く突然変異を含む細胞)において複製表現型を示すが、複製しない非新生物細胞においては実質上複製表現型を示さないと考えられる。このような複製不全アデノウイルス種をE1a-RB(-)複製不全アデノウイルスと称する。
【０００８】
いずれもRB機能を欠失する、新生物細胞と分裂中の正常細胞との部分集団、および、本質的に正常なRB機能を発現する非分裂非新生物細胞の部分集団を含む、細胞集団(例えば混合細胞培養または人間の癌患者)は、感染条件(即ち、その細胞集団のアデノウイルス感染にとって好適な条件、典型的には生理的条件)の下でE1a-RB(-)複製不全アデノウイルスの感染用量を含む組成物と接触させることができる。これによりその細胞集団がE1a-RB(-)複製不全アデノウイルスに感染する結果となる。この感染は、RB機能を欠く新生物および分裂正常細胞(RB-細胞)の部分集団を含む細胞のかなりの部分で複製表現型の選択的発現を供するが、本質的に正常なRB機能を有する非分裂新生物細胞の部分集団では複製表現型の実質的発現を供しない。感染したRB(-)細胞(新生物または分裂正常細胞)における複製表現型の発現は、例えば細胞変成効果(CPE)、細胞溶解、アポトーシス等によるその細胞の死を引き起こし、その結果、その細胞集団からのこうしたRB(-)細胞の選択的除去を導く。米国特許5801029および5972706を参照されたい。
【０００９】
典型的には、RB(-)新生物細胞の選択的殺滅にとって好適なE1a-RB(-)複製不全アデノウイルス組み立て物は、E1aポリペプチドがRB蛋白に有効に結合する能力を不活性化する突然変異(例えば、欠失、置換、フレームシフト)を含む。このような不活性化突然変異は典型的には、p105 RB蛋白とp107蛋白の結合に関わるE1aCR1ドメイン(Ad5のアミノ酸30-85；ヌクレオチド位置697-790)および／またはCR2ドメイン(Ad5のアミノ酸120-139；ヌクレオチド位置920-967)で起こる。好ましくはCR3ドメイン(アミノ酸150-186にわたる)は存続し、末端切除p289Rポリペプチドとして発現され、アデノウイルス初期遺伝子のトランス活性化において機能的である。図1は、E1a-289Rポリペプチドのドメイン構造を模式的に描いている。
【００１０】
アデノウイルスのE1a領域での変化に加えて、転写の上で活性なE2Fの制御下に、重要な複製機能を有するウイルスを組み立てることにより、ウイルスの、RB機能を欠く新生物細胞の特異的殺滅を増強することが望ましい。アデノウイルス複製サイクルは二つの相を持っている。初期相の間には、4つの転写ユニットE1、E2、E3およびE4が発現され、ウイルスDNA合成開始後に起こる後期相では、主に主要後期プロモーター(MLP)から後期転写物が発現される。後期メッセージはこのウイルスの構造蛋白の大半をコードしている。E1、E2およびE4の遺伝子産物は、転写活性化、細胞の形質転換、ウイルスDNA複製およびその他のウイルス機能を担っており、ウイルス増殖に必要である。Halbert,D.N. et al.、1985 J.Virol. 56:250-7を参照されたい。
【００１１】
もし、ウイルス複製に関与するアデノウイルスの領域をE2F応答性転写ユニットを介するE2Fの制御下に置くことができるなら、これは、RB機能を欠く新生物細胞を選択的に殺し正常細胞は殺さない、増強されたアデノウイルスを提供することになる。
【００１２】
背景説明のため、E4領域を包含するウイルス複製に関わる領域およびE2F応答性プロモーターに変化を有するアデノウイルスベクターに関して、以下の参考文献を示す。
【００１３】
WO98/091563(発明者Branton et al.)は、細胞死の誘発にアデノウイルスE4蛋白を使用するための方法および組成物を記載している。
【００１４】
Gao G-P. et al.は、肝臓に向けた遺伝子療法のための、E1およびE4除去を有するアデノウイルスベクターの使用を記載している。J.Virology、1996年12月、8934-8943頁。
【００１５】
WO98/46779は、修飾されたE4領域を含む導入遺伝子を発現でき、E4またはf3を保持している或る種のアデノウイルスベクターを記載している。
【００１６】
Yeh,P. et al.は、アデノウイルスE1およびE4領域の有効な二重トランス相補性を可能にする、293細胞の最小E4機能的ユニットの発現を記載している。Yeh,P. et al. J.Virology、1996年1月、559-565頁を参照されたい。
【００１７】
米国特許第5885833号は、アクティベーター配列、プロモーターモジュール、および構造遺伝子を含む核酸組み立て物を記載している。このプロモーターモジュールは、CHR領域と、E2Fファミリーの蛋白に結合する核酸配列とを含んでいる。
【００１８】
Wang,Q et al.(Gene Ther. 2:775-83(1995))は、E1および／またはE4領域を欠く組換えアデノウイルスベクターの増殖のための293パッケージングセルラインを記載している。親の293細胞中のE1A遺伝子産物のトランス活性化効果、および、E4遺伝子の過剰発現を回避するため、E4プロモーターを、細胞誘導可能ホルモン遺伝子プロモーターであるマウスアルファインヒビンプロモーターに置換した。KrougliakおよびGrahamは、アデノウイルスタイプ5のE1、E4およびpIX遺伝子を発現し、よってこれらの領域の各々を欠失するアデノウイルス突然変異体の複製を補完できるセルラインの開発を記載している。Krougliak,V.およびGraham,F.、Human Gene Therapy 6巻p.1575-1586、1995を参照されたい。Fang,B. et al.(J.Virol. 71:4798-803(1997))は、E4プロモーターを、GAL4/VP16トランスアクティベーターを安定に発現する293細胞中でのアデノウイルスベクターのパッケージングを促進する、合成GALA/VP16プロモーターに置換した、弱毒化した、複製非コンピテントなアデノウイルスベクターを記載している。このウイルスは、E1領域を除去することによって複製非コンピテントとされた。
【００１９】
米国特許第5670488号は、1またはそれ以上のE4オープンリーディングフレームが除去され、ウイルスのインビトロ複製を進めるに充分なE4配列を保持し、そして発現調節配列に機能的に結合しアデノウイルスゲノム中に挿入された目的DNA配列を有する、アデノウイルスベクターを記載している。
【００２０】
米国特許第5882877号は、アデノウイルスゲノムのE1、E2、E3およびE4領域ならびに後期遺伝子が除去され、さらに発現調節配列に機能的に結合した目的核酸配列を含むアデノウイルスベクターを記載している。
【００２１】
WO98/13508は、目的とする導入遺伝子に機能的に結合したE2F応答性プロモーターを使用する、選択的標的化悪性細胞を記載している。
【００２２】
Neuman,E. et al.は、E2F-1遺伝子の転写は、そのプロモーター内のE2F DNA結合部位により細胞サイクル依存性とされることを示している。Mol Cell Biol. 15:4660(1995)を参照されたい。Neuman,E. et al. はさらに、ヒトE2F1遺伝子の構造と部分的ゲノム配列を示している。Gene 173:163-9(1996)を参照されたい。
【００２３】
Parr,M.J. et al.は、インビボでの腫瘍選択性導入遺伝子の発現が、E2F応答性アデノウイルスベクターによって仲介されることを示している。Nat.Med. 3:1145-9(1996)を参照されたい。Adams,P.D.およびW.G.Kaelin,Jrは、E2Fによる転写制御を示している。Semin Cancer Biol. 6:99-108(1995)を参照されたい。
【００２４】
Hallenbeck,P. et al.は、組織特異的複製のためのベクターを記載している。このようなベクターの一つはアデノウイルスであって、これは標的組織中で選択的に複製されて、該ベクター自身に由来する、または該遺伝子から発現される異種遺伝子産物に由来する、治療上の利益を提供すると述べられている。前者の例では、組織特異的転写調節配列が、該ベクターの複製に必須の遺伝子のコード化領域に機能的に結合している。E1a、E1B、E2およびE4を包含する幾つかのコード化領域が記載されている。WO96/17053およびWO96/17053を参照されたい。
【００２５】
Henderson et al.は米国特許第5698443号で、前立腺細胞特異的応答要素の転写調節の下での、E1A、E1BまたはE4遺伝子のうち少なくとも一つを有するアデノウイルスベクターを示している。
【００２６】
癌を治療するためのその他の手段をウイルスが提供することは明らかである。したがって、新生物細胞中で選択的に複製し且つこれを殺滅するウイルスは、癌との戦いにおいて医師の兵器庫にある貴重な武器となるであろう。
【００２７】
発明の要約
本明細書に記載の発明は、組換えアデノウイルスベクター、ならびに、それ、好ましくは、非新生物細胞を全くまたは殆ど殺すことなく新生物細胞を実質的且つ選択的に殺し、前初期遺伝子の発現を制御する少なくとも1個、好ましくは2個のアデノウイルスプロモーター領域が、或る転写ヌクレオチド調節開始部位は除去またはその他の方法で不活性化され、一方、必要な、またはウイルス複製を実質上促進する部位は保持され、そして、係るヌクレオチド調節開始部位を除去して腫瘍細胞特異的転写ユニットに、そして除去されたウイルス遺伝子が所望により異種遺伝子に置換されるような変化を施した、複製コンピテントなアデノウイルスベクターを組み立てるための方法を提供するものである。
【００２８】
本発明はさらに、アデノウイルスプロモーター領域が好ましくはE1aおよび／またはE4である、上記の組換えウイルスベクターおよび方法を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、或るE1aおよびE4プロモーター転写ヌクレオチド開始部位が除去されまたはその他の方法で不活性化され、腫瘍細胞特異的転写ユニットに置換されている、非新生物細胞を殆どまたは全く殺さずに新生物細胞を実質的且つ選択的に殺す、アデノウイルスベクターを提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、E4プロモーター転写ヌクレオチド開始部位のうち少なくとも幾つかが除去されまたはその他の方法で不活性化され、一方、Sp1、ATF、NF1およびNFIII/Oct-1結合部位のうち幾つかを包含するウイルス複製を促進する部位は保持され、そしてE4プロモーターヌクレオチド開始部位が腫瘍細胞特異的転写ユニットで置換されている、非新生物細胞を殆どまたは全く殺さずに新生物細胞を実質的且つ選択的に殺す、アデノウイルスベクターを提供する。
【００３１】
本発明の目的は、E1aおよび／またはE4プロモーター転写ヌクレオチド開始部位が除去され、腫瘍細胞特異的転写ユニットで置換されている、上記のアデノウイルスベクター［ここで、このようなアデノウイルスベクターは、E1aポリペプチドがRB蛋白に有効に結合する能力を不活性化する突然変異(例えば、欠失、置換、フレームシフト)をさらに示す］を説明することである。
【００３２】
本発明のさらなる特徴は、上に述べたE1aおよび／またはE4プロモーターヌクレオチド開始配列を、pRb/p107、E2F-1／-2／-3、G1サイクリン／cdk複合体を包含するpRbシグナル伝達経路に応答する腫瘍細胞特異的転写ユニットで置換することで構成され、好ましくは該プロモーターはE2F応答性である。
【００３３】
本発明はさらに、疾病、好ましくは、新生物疾患を包含する過剰増殖性細胞増殖に起因する疾病を、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを使用して予防または治療するための方法を提供する。
【００３４】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の、特許および特許出願を包含する全ての刊行物は、その各々の刊行物が引用によりその全内容を本明細書の一部とする旨具体的且つ個別的に指示されているかのように、同程度まで、引用により本明細書の一部とする。
【００３５】
さらに、本発明に係るアデノウイルスベクターの腫瘍崩壊活性は、E2F応答性プロモーターの調節下にウイルス遺伝子を発現させるpRb経路中の分子を含む作用機構に帰せられているが、本発明はこの機構により限定されると解してはならない事に留意すべきである。むしろ本発明に係るアデノウイルスベクターの腫瘍崩壊活性は、pRb経路を経て腫瘍崩壊性を発揮すると考えられる、ただしそうでないかも知れない、構造因子の機能であるという事が理解できるであろう。したがって、本発明に係るアデノウイルスベクターは、E1aまたはE4遺伝子のいずれかを発現させる少なくとも1個のE2F応答性プロモーターを持つことにより、腫瘍対正常細胞殺滅の選択制を誘導する。好ましいアデノウイルスベクターは、下記のように、2個のE2F応答性プロモーターを有し、その一方はE1aプロモーターに、他方はE4プロモーターに代わるものである。
【００３６】
定義
別途定義の無い限り、本明細書で使用する技術的および科学的用語は全て、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意義と同じ意義を有する。全体として、本明細書で使用する命名法および下記の実験室的方法は当分野で周知であり、一般的に使用されているものである。
【００３７】
組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換(例えば、電気穿孔、リポフェクション)には標準技術を使用する。一般に酵素反応および精製工程は製造者の明細に従って実施する。この技術および方法は一般的に、当分野における常法および、本明細書全編を通じて提供される種々の一般的参考文献に従って実施する(一般に、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、N.Y.)。本明細書で使用する命名法および下に記載する分析化学、有機合成化学、および薬品調合の実験室的方法は周知であり、当分野で一般に使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調合およびデリバリー、ならびに患者の治療については標準技術を使用する。
【００３８】
当業者は、本発明に係るE1Aおよび／またはE4シャトルベクターを製造するための本発明に係るアデノウイルスの遺伝学的製造を容易にする刊行物を理解できるであろう。そういったものには、Hitt,M. et al. Construction and propagation of human adenovirus vectors（Cell Biology: a Laboratory Handbook; J.Celis(編)、Academic Press、N.Y.(1996)；Graham,F.L.およびPrevec,L. Adenovirus based expression vectors and recombinant vaccines（Vaccines: New Approaches to Immunological Problems、R.W.Ellis(編) Butterworth. Pp.363-390）；ならびにGraham,F.L.およびPrevec,L. Manipulation of adenovirus vectors（Methods in Molecular Biology、7巻: Gene Transfer and Expression Techniques E.J.MurrayおよびJ.M.Walker(編) Humana Press Inc.、クリフトン、N.J. pp109-128, 1991）が包含される。これらの論文に記載の材料および方法は下記で使用でき、または使用した。
【００３９】
本発明の、選択された具体的態様を示す式において、アミノおよびカルボキシ末端基(しばしば具体的に示されていないが)は、別途記載の無い限り、生理的pH値においてそれらが呈する型であると理解される。本明細書に記載のアミノ酸残基は好ましくは「Ｌ」異性体型である。20の慣用的アミノ酸の立体異性体(例えばD-アミノ酸)、非天然アミノ酸、例えばa.a-分布アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および、その他の非慣用的アミノ酸もまた、そのポリペプチドにより所望の機能的性質が達成される限り、本発明に係るポリペプチドのための好適な構成成分となり得る。示されるペプチドに関して、各々コードされた残基は、適当ならば、標準ポリペプチド命名法と一致した慣用的アミノ酸の慣用名に対応する三文字表示で示す(J.Biol.Chem.、243:3552-59(1969)に記載され、37 CFR §1.822(b)(2)に採用されている)。
【００４０】
本開示全般に使用する以下の用語は、別途指摘の無い限り以下の意義を有すると理解する：
【００４１】
「アデノウイルス転写ヌクレオチド調節部位」配列に対して適用する「不活性化」という語は、当該配列の全部または一部の除去を包含する突然変異により、係る配列を非機能的とすること、または、アデノウイルス転写ヌクレオチド配列中に他の配列を挿入し、それによりこれを非機能的とすることを意味する。
【００４２】
本明細書中言及する「アデノウイルス」という語は、ヒトから単離される47以上のアデノウイルスサブタイプ、ならびに他の哺乳動物および鳥類由来の同数のサブタイプを指す。Strauss、”Adenovirus infections in humans” (The Adenoviruses、Ginsberg編、Plenum Press、ニューヨーク、N.Y.、pp451-596(1984))を参照されたい。この用語は好ましくは二つのヒト血清型Ad2およびAd5に適用される。
【００４３】
本明細書中言及する「ポリヌクレオチド」という語は、少なくとも10塩基の長さを持つ高分子型のヌクレオチドを意味し、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型である。この用語は一本鎖および二本鎖型のDNAを包含する。
【００４４】
本明細書中言及する「オリゴヌクレオチド」という語は、天然に存在するおよび天然に存在しないオリゴヌクレオチド鎖により連結した、天然に存在する、および修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは200塩基またはそれ以下の長さを有するポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは10ないし60塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブのためには一本鎖であるが、例えば遺伝子突然変異体の組み立てで使用するためには、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってよい。本発明に係るオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００４５】
本明細書中使用する「標識」または「標識された」という語は、例えば放射標識したアミノ酸の取り込みによる、または標識されたアビジンにより検出可能なビオチニル部分をポリペプチドに結合させることによる、検出可能なマーカーの取り込みを指す(例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジン、または光学的方法もしくは比色法により検出できる酵素活性)。ポリペプチドおよび糖蛋白を標識する様々な方法が当分野で周知であり、且つ使用することができる。
【００４６】
本発明に係るアデノウイルスの殺滅の選択性に適用する「腫瘍細胞特異的」という句は、E2F応答性プロモーターに機能的に結合したウイルス遺伝子の発現により殺滅される腫瘍細胞を意味する。E2Fが正常細胞、とりわけ分裂中の正常細胞により発現されることを考慮すると、本発明に係るアデノウイルスは、腫瘍細胞より程度は小さいが、分裂中の正常細胞をも殺滅すると予想される。
【００４７】
本明細書で言及される「配列相同性」という語は、二つの核酸配列間の塩基一致の比率、または二つのアミノ酸配列間のアミノ酸一致の比率を言い表している。配列相同性をパーセンテージ、例えば50%で表現する時、このパーセンテージは、他の何らかの配列と比較した、その長さの配列の一致の比率を指す。一致を最大とするため、(二つの配列のいずれかに)間隙を入れることができる。15塩基またはそれ以下の長さの間隙を通常使用し、6塩基またはそれ以下が好ましく、2塩基またはそれ以下がより好ましい。
【００４８】
本明細書中使用する「に対応する」という語は、ポリペプチド配列が対照ポリペプチド配列の全体または一部に対し相同である(即ち、厳密に進化論的な関連がある訳ではなく、同一である)こと、またはポリペプチド配列が対照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。これに対して、本明細書中使用する「に対し相補的である」という語は、その相補的配列が対照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対し相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列「TATAC」は対照配列「TATAC」と相当し、対照配列「GTATA」に対し相補的である。
【００４９】
以下の用語を使用して2またはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を描写する：「対照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列一致」、「配列一致のパーセンテージ」、および「実質的一致」。「対照配列」とは、配列比較の基礎として使用する規定された配列である。対照配列は、例えば完全長cDNAのセグメントとしての、より長い配列のサブセットであってよく、または、配列表に掲げる遺伝子配列は完全なcDNAまたは遺伝子配列を含んでいてよい。一般に、対照配列は少なくとも20ヌクレオチド長、しばしば少なくとも25ヌクレオチド長、そしてしばしば往々にして少なくとも50ヌクレオチド長である。二つのポリペプチドは、各々(1)この二つのポリペプチド間で類似の配列(即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含むことができ、そして(2)この二つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含むことができるため、二つ(またはそれ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性を持つ部分的領域を比較同定するための「比較ウィンドウ」上でこの二つのポリヌクレオチド配列を比較することによって実施する。本明細書中で使用できる「比較ウィンドウ」とは、少なくとも20の連続するヌクレオチド位置を持つ概念的セグメントを指す［ここで、ポリヌクレオチド配列は少なくとも20の連続ヌクレオチドを持つ対照配列と比較でき、そして比較ウィンドウ内のこの部分のポリヌクレオチド配列は、この二つの配列の最適な並置のために、対照配列(これは付加または除去を含まない)に比して20パーセントまたはそれ以下の付加または除去(即ち間隙)を含むことができる］。比較ウィンドウを並置するための最適な配列並置は、SmithおよびWaterman(1981) Adv.Appl.Math. 2:482の部分的相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443の相同性並置アルゴリズム、PearsonおよびLipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 85:2444の類似性方法の探索、これらのアルゴリズムのコンピューターを利用した実行(GAP.BESTFIT.FASTA.およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI)、または視察によって遂行でき、様々な方法により作成される最良の並置(即ち、比較ウィンドウ上で最も高いパーセンテージの相同性を産む)を選択する。「配列一致」という語は、二つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウ上で同一(即ち、ヌクレオチド-ヌクレオチドベースで)であることを意味する。「配列一致のパーセンテージ」という語は、二つの最適並置した配列を比較ウィンドウ上で比較し、両方の配列で同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、UまたはI)が存在する位置の数を決定して合致した位置の数を求め、合致位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数(即ちウィンドウサイズ)で除し、結果に100を掛けて配列一致のパーセンテージを求めることによって算出する。本明細書中使用する「実質的な一致」という語はポリヌクレオチド配列の性質を指し、ここでこのポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウィンドウ、しばしば少なくとも25-50ヌクレオチドのウィンドウ上で対照配列と比較した時に、少なくとも85パーセントの配列一致、好ましくは少なくとも90ないし95パーセントの配列一致、より普通には少なくとも99パーセントの配列一致を有する配列を含み、また、配列一致のパーセンテージは、比較ウィンドウ上で対照配列の計20パーセントまたはそれ以下の除去または付加を含み得るポリヌクレオチド配列に対して対照配列を比較することによって算出する。対照配列は、より長い配列のサブセットであってよい。
【００５０】
本発明の好ましい態様はヒトE2F-1プロモーターの組み込みであるが、「実質的に一致」しているプロモーターはE2F応答性プロモーターの定義内に入ることが意図されている。
【００５１】
本明細書中使用する「実質的に純粋」とは、目的の種が、存在している優勢な種(即ち、モルベースで、それが組成物中の他のいかなる個別的種よりも多量にある)であり、そして好ましくは実質的に精製された画分が、目的の種が、存在している全ての高分子種の少なくとも50パーセント(モルベースで)を構成する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物はその組成物中に存在する全高分子種の約80パーセント以上、より好ましくは約85%、90%、95%そして99%を構成する。最も好ましくは、目的とする種は、本質的に均質(常套的検出法では当該組成物中に混入種を検出できない)となるまで精製する［ここでこの組成物は、本質的に単一の高分子種から成る］。
【００５２】
本明細書中使用する「ポリペプチドフラグメント」または「ペプチドフラグメント」という語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端除去を有するポリペプチドであって、残りのアミノ酸配列が、例えば完全長cDNA配列から予想される天然に存在する配列中の対応位置と一致している、ポリペプチドを指す。フラグメントは典型的には8-10アミノ酸長、好ましくは少なくとも10-20アミノ酸長、さらに好ましくは20-70アミノ酸長である。
【００５３】
「pRB経路」または「pRbシグナル伝達経路」という句は、少なくとも部分的に、pRb/p107、E2F-1/-2/-3、およびG1サイクリン/cdk複合体を包含するpRb活性に影響を及ぼす分子を意味する。現在未知の分子もまたこの定義に含まれることが理解できるであろう。これらの分子は、E2F応答性プロモーターを介する転写レベルで、少なくとも部分的にこれらの生物学的効果を仲介する。
【００５４】
本明細書中のその他の化学用語は、McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.編、1985)  McGraw-Hill、サンフランシスコ(引用により本明細書の一部とする)に例示の当分野における常套的用法に従って使用する。
【００５５】
遺伝子工学によりクローニングされた遺伝子からの蛋白の製造はよく知られている。例えば、Bell et al.の米国特許第4761371号、6欄、3行ないし9欄65行を参照されたい。したがって以下の考察はこの分野の全体像を意図するものであり、当該技術の全状態を反映させようとするものではない。
【００５６】
蛋白をコードしているDNAを、本内容に鑑み、化学合成により、適当な細胞またはセルライン培養由来のmRNAの逆転写物をスクリーニングすることにより、適当な細胞のゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはこれらの方法の組み合わせにより、下に説明するように本発明に係るE1Aおよび／またはE4アデノウイルス組み立て物中に挿入できる。例えば、本発明の一つの態様は、プロドラッグ活性酵素をコードしている遺伝子の発現であって、ここで係る遺伝子は、それらの複製能力に影響を及ぼさない本発明に係るアデノウイルスの領域中に組み込まれる。既知の遺伝子配列情報から作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、mRNAまたはゲノムDNAのスクリーニングが実施できる。プローブは検出可能な基で標識できる。
【００５７】
別法として、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の使用により遺伝子配列を回収できる。Mullis et al.の米国特許第4683195号およびMullisの4683202号を参照されたい。
【００５８】
ベクターは複製可能なDNA組み立て物であり、所望の蛋白をコードしているDNAの増幅、および／または蛋白をコードしているDNAの発現に使用する。発現ベクターは、目的蛋白をコードしているDNA配列が、適当な宿主中でその蛋白を発現させることのできる適当な調節配列と機能的に結合している、複製可能なDNA組み立て物である。係る調節配列の必要性は、選択された宿主および選ばれた形質転換法に応じて変わり得る。一般に、調節配列は、転写プロモーター、転写を制御するための所望によるオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、および、転写と翻訳の終止を制御する配列を包含する。増幅ベクターは発現調節ドメインを必要としない。通常、複製起点により付与される宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子がありさえすればよい。
【００５９】
DNA領域は、それらが互いに機能的に関連している時、機能的に結合している。例えば、プロモーターは、それが配列の転写を制御しているならば、コード化配列と機能的に結合しており；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置していれば、コード化配列と機能的に結合している。一般に、機能的に結合している、とは、連続していることを意味し、そしてリーダー配列の場合は、連続し且つリーディングフレーム内にあることを意味する。内因性アデノウイルスE1aおよび／またはE4領域プロモーター転写ヌクレオチド調節開始部位が除去されている例における、本発明に係る好ましい態様のプロモーターは、腫瘍細胞特異的プロモーターによる置換であって、蛋白pRb/p107、E2F-1/-2/-3、G1サイクリン/cdk複合体を包含するpRbシグナル伝達経路の分子に対して直接的または間接的に応答性であるプロモーターであり、好ましくはこのプロモーターはE2F応答性であり、より好ましくはこのプロモーターはヒトE2F-1である。
【００６０】
pRbシグナル伝達経路中の分子に対し応答性、とは、E2F応答性プロモーターの調節下でウイルス遺伝子の発現により引き起こされる腫瘍細胞の殺滅を意味する。
【００６１】
本発明での使用に好適な宿主細胞は、原核生物、酵母細胞、または高等真核生物細胞を包含する。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えばEscherichia coli(E.coli)またはBacilliを包含する。高等真核生物細胞は、下記のような哺乳動物起源の確立されたセルラインを包含する。宿主細胞の例は、DH5a、E.coli W3110(ATCC27325)、E.coli B、E.coli X1776(ATCC31537)およびE.coli294(ATCC31446)である。
【００６２】
多細胞生物から誘導される細胞の培養は、組換え蛋白合成のための望ましい宿主である。原則として、脊椎動物由来であれ無脊椎動物由来であれ、いかなる高等真核生物細胞培養も利用可能である。しかしながら哺乳動物細胞が好ましい。細胞培養中でのこのような細胞の増殖は日常的手法となっている。Tissue Culture、Academic Press、KruseおよびPaterson編(1973)を参照されたい。有用な宿主セルラインの例はVEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)セルライン、およびFL5.12、WI138、BHK、COS-7、CVおよびMDCKセルラインである。このような細胞のための発現ベクターは、通常(必要ならば)、複製起点、発現されるべき遺伝子の上流に位置するプロモーター、およびリボソーム結合部位、RNAスプライス部位(イントロンを含むゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニル化部位、ならびに転写終止配列を含む。
【００６３】
本明細書中使用する「複製不全ウイルス」という語は、細胞増殖を専ら阻害し、細胞溶解を惹起し、または、ウイルス複製表現型の発現を支持し、そして細胞増殖の阻害、細胞溶解の惹起、アポトーシスの誘発、または非複製非形質転換細胞における複製表現型の発現が実質上できない、予め決定されている細胞集団(例えば、pRbシグナル伝達経路中の分子に応答性の腫瘍細胞)においてアポトーシスを誘発(集合的には殺滅と考えられる)する、ウイルスを指す。
【００６４】
「RB機能」という語は、RB遺伝子によりコードされている本質上正常なレベル(即ち、同じ組織学的タイプの非新生物細胞に比して)のポリペプチドを有するという性質を指し、ここでRBポリペプチドは、野生型アデノウイルス2または5のE1a蛋白に結合できる。例えば、RBの不活性(即ち突然変異体)型の産生により、またはpRBポリペプチドの発現の実質的な低下または全喪失により、またはpRbレベルに影響を及ぼすpRb経路中の分子の1またはそれ以上における変化により、RB機能は失われ得る。これとは別に、「RB機能」とは、発現の時期と、E2F応答性pRb経路感受性プロモーターの調節下にある蛋白の発現量の点で正常な、遺伝子の転写活性を指す。
【００６５】
RB機能は、野生型RB蛋白をコードしているRBアレレを含む新生物細胞には実質上存在しない。例えば、RBもしくはpRB経路の分子の異常な非細胞プロセシングもしくは局在を招く突然変異といったようなRB遺伝子座の外での遺伝子変化は、RB機能の喪失を招き得る。
【００６６】
「複製表現型」という語は、複製不全アデノウイルスのようなウイルスに感染した細胞の、以下に述べる表現型に関する性質のうちの1またはそれ以上を指す：(1)後期遺伝子産物、例えばカプシド蛋白(例えば、アデノウイルスペントン塩基ポリペプチド)またはウイルス後期遺伝子プロモーターから開始するRNA転写物の実質的な発現、(2)ウイルスゲノムの複製または複製中間体の形成、(3)ウイルスカプシドまたはパッケージングされたビリオン粒子の統合、(4)感染した細胞における細胞変成効果(CPE)の出現、(5)ウイルス溶解サイクルの完成、および(6)機能的腫瘍蛋白をコードしている野生型複製コンピテントDNAウイルスに感染した非新生物細胞のRB機能の排除に典型的に付随する、その他の表現型の変化。複製表現型は、列挙した表現型についての性質の少なくとも一つ、好ましくは表現型についての性質のうち1以上を含む。
【００６７】
本明細書中使用する「抗新生物複製不全ウイルス」という語は、細胞の溶解によるものであろうとアポトーシスによるものであろうと、同じ組織学的細胞型を有する感染した非複製非新生物細胞に比して、感染した新生物細胞を選択的に殺滅することにより、人間において新生物の成長または進行を阻害する機能的性質を有する組換えウイルスを指す。
【００６８】
本明細書中使用する「新生物細胞」および「新生物」とは、相対的に自律的な増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の著明な喪失を特徴とする異常増殖表現型を示す細胞を指す。新生物細胞は、活発に複製できる、または一時的な非複製静止状態(G1またはG0)にある細胞を含み、同様に、新生物細胞は、よく分化した表現型、あまり分化していない表現型を持つ細胞、または両方の型の細胞の混合物を含み得る。したがって、与えられた時点において必ずしも全ての新生物細胞が複製中の細胞である訳ではない。新生物細胞として定義された組は、良性新生物中の細胞と悪性(または明白な)新生物中の細胞とで構成される。率直に言って新生物細胞はしばしば腫瘍細胞または癌細胞と称され、典型的には、内胚葉または外胚葉の組織学的起源の細胞から起始するならば癌腫と呼ばれ、中胚葉に由来する細胞型から起始するならば肉腫と呼ばれる。
【００６９】
本明細書中使用する「生理的条件」とは、無傷の哺乳動物細胞における、または生存哺乳動物の組織空間もしくは臓器における条件と実質上類似のイオン強度、pH、および温度を有する水性環境を指す。典型的には、生理的条件は、約150mM NaCl(または所望によりKCl)、pH6.5-8.1、およびおよそ20-45℃の温度を有する水溶液を含む。一般に、生理的条件は、生体高分子の分子間結合にとって好適な結合条件である。例えば、150mM NaCl、pH7.4、37℃の生理的条件が一般に適当である。
【００７０】
発明の態様
アデノウイルスのE1aおよびE4領域はヒト細胞の有効且つ生産的な感染にとって必須である。E1a遺伝子は生産的感染において転写される最初のウイルス遺伝子であり、その転写は他のいかなるウイルス遺伝子産物の作用にも依存していない。しかしながら、残りの初期ウイルス遺伝子の転写はE1a遺伝子発現を必要とする。E1aプロモーターは、E1a遺伝子の発現の調節に加えて、ウイルスゲノムのパッケージングのためのシグナルおよびウイルスDNA複製の開始に要する部位を統合する。Schmid,S.I.およびHearing,P.、Current Topics in Microbiology and Immunology、199巻67-80頁(1995)を参照されたい。
【００７１】
E1aアデノウイルスベクターに適用される本発明は、CAATボックス、TATAボックスおよび転写開始のための開始部位を含む基本アデノウイルスE1aプロモーターを、腫瘍特異性を表し、そして好ましくはE2F応答性であり、そしてより好ましくはヒトE2F-1プロモーターである、基本プロモーターに置換することを含んでいる。したがって、このウイルスは、E2F応答性プロモーターからの転写を活性化する分子を欠く、またはそのような分子が機能していない細胞では抑制される。正常な非分裂または静止細胞はこのクラスに包含されるが、それは、転写因子E2FがpRbまたは網膜芽細胞腫蛋白に結合しており、よってE2F応答性プロモーターに結合してこれを活性化するためのE2Fの利用ができないためである。対照的に、遊離E2Fを含む細胞はE2Fに基づく転写を支持するに相違ない。このような細胞の一例は、生産的ウイルス感染を起こすことのできる、pRb機能を欠く新生物細胞である。
【００７２】
E1aプロモーター中に存在するエンハンサー配列、パッケージングシグナル、およびDNA複製開始部位の保持は、pRb機能を欠く新生物細胞においてアデノウイルス感染が野生型のレベルにまで進行することを確実とする。本質において、修飾されたE1aプロモーターは、実質的な腫瘍特異的殺滅を引き起こす腫瘍特異的転写活性化を付与し、それでいて正常細胞には安全性の向上を提供する。
【００７３】
内因性E1aプロモーターをE2F応答性プロモーターに置換することによるE1aアデノウイルスベクターの製造において、アデノウイルス5ゲノムのヌクレオチド375の上流の要素は無傷に保持される。ヌクレオチドの番号付けは、Schmid,S.I.およびHearing.P. Current Topics in Microbiology and Immunology、199巻67-80頁(1995)に記載の通りである。これは、ウイルスゲノムのパッケージングのために同定された7個のA反復モチーフの全てを含んでいる(上記SchmidおよびHearingの図2を参照されたい)。ヌクレオチド375からヌクレオチド536までの配列はBsaAIないしBsrBI制限開始部位により除去され、一方E1A蛋白のための翻訳開始コドンの上流の23塩基対は依然として存続している。E2F応答性プロモーター、好ましくはヒトE2F-1を、既知の材料と方法を用いて、除去された内因性E1aプロモーター配列に代わって置換する。E2F-1プロモーターは実施例1に記載のように単離できる。
【００７４】
E4領域はアデノウイルス感染の後期に起こる多くの事象に関わっており、有効なウイルスDNA複製、後期mRNA蓄積と蛋白合成、スプライシング、ならびに宿主細胞蛋白合成の遮断に必要とされている。殆どのE4転写ユニットが欠損しているアデノウイルスは複製が極めて不完全であり、一般に、高力価を達成するためにはE4補充セルラインで増殖させねばならない。E4プロモーターはウイルスゲノムの右端付近に位置しており、複数のオープンリーディングフレーム(ORF)の転写を司っている。最大の転写活性の仲介に必須の幾つかの調節因子が、このプロモーターの特徴である。これらの配列に加えて、E4プロモーター領域はウイルスDNAの複製に必要な調節配列を含んでいる。E4プロモーターの描写およびこれら調節配列の位置を図2および3に示す。
【００７５】
本発明の別の態様は、E4基本プロモーターが、腫瘍特異性を示すことが立証されているプロモーター、好ましくはE2F応答性プロモーター、より好ましくはヒトE2F-1プロモーターに置換されたアデノウイルスベクターの作製である。E4発現の促進のためにE2F応答性プロモーターが好ましい理由は、E1aプロモーターをE2F応答性プロモーターに置換したE1aアデノウイルスベクターの上記文脈で考察した理由と同じである。pRbの腫瘍抑制機能は、E2F-1プロモーターのようなE2F応答性プロモーターを抑制する能力と相関している(Adams,P.D.およびW.G.Kaelin,Jr. 1995、Cancer Biol. 6:99-108；Sellers,W.R.およびW.G.Kaelin 1996、published erratum appears in Biochim Biophys Acta 1996 Dec 9;1288(3):E-1、Biochim Biophys Acta. 1288:M1-5、Sellers,W.R.、J.W.RodgersおよびW.G.Kaelin,Jr. 1995、Proc Natl Acad Sci USA 92:11544-8)。ヒトE2F-1プロモーターは広範に特性決定されており、pRb/p107、E2F-1／-2／-3、およびG1サイクリン／cdk複合体を包含するpRbシグナル伝達経路、ならびにE1Aに対して応答性であることが示されている(Johnson,D.G.、K.OhtaniおよびJ.R.Nevins 1994、Genes Dev. 8:1514-25；Neuman,E.、E.K.Flemington、W.R.SellersおよびW.G.Kaelin,Jr 1995、Mol Cell Biol. 15:4660；Neuman,E.、W.R.Sellers、J.A.McNeil、J.B.LawrenceおよびW.G.Kaelin,Jr. 1996 Gene 173:163-9)。この調節の全てではないにせよ殆どは、E2F-1プロモーター内部にある複数のE2F部位の存在に帰せられている。よって、この(これらの)修飾を持つウイルスは、無傷の(野生型)pRb経路を有する正常細胞では弱毒化され、pRbの抑制機能が不完全な細胞では正常な感染／複製プロフィールを示すと予想できる。この突然変異体ウイルスの正常な感染／複製プロフィールを維持するため、本発明者等は、E4プロモーターの遠位末端の逆方向末端反復配列(ITR)を保持した。何故ならこれは、ウイルスDNAの複製に必要な調節要素の全てを含んでいるためである(Hatfield,L.およびP.Hearing 1993、J.Virol. 67:3931-9；Rawlins,D.R.、P.J.Rosenfeld、R.J.Wides、M.D.ChallbergおよびT.J.Kelly,Jr. 1984、Cell 37:309-19；Rosenfeld,P.J.、E.A.O’Neill、R.J.WidesおよびT.J.Kelly 1987、Mol Cell Biol、7:875-86；Wides,R.J.、M.D.Challberg、D.R.RawlinsおよびT.J.Kelly 1987、Mol Cell Biol. 7:864-74)。これは、このウイルスに感染したpRb経路不全腫瘍細胞で野生型レベルのウイルスを獲得することを容易にするものである。
【００７６】
本発明に係るE4領域を含むアデノウイルス組み立て物において、E4プロモーターは好ましくはウイルスゲノムの右端付近に位置し、複数のオープンリーディングフレーム(ORF)の転写を司る(Freyer,G.A.、Y.KatohおよびR.J.Roberts 1984、Nucleic Acids Res. 12:3503-19；Tigges,M.A.およびH.J.Raskas 1984、Splice junctions in adenovirus 2 early region 4 mRNAs: multiple splice sites produce 18 to 24 RNAs. J Virol. 50:106-17；Virtanen,A.、P.Gilardi、A.Naslund、J.M.LeMoullec、U.PetterssonおよびM.Perricaudet 1984、J Virol. 51:822-31)。転写活性を仲介する幾つかの調節要素がこのプロモーター内で特性決定されている(Berk,A.J. 1986、Annu Rev Genet. 20:45-79；Gilardi,P.およびM.Perricaudet. 1986、Nucleic Acids Res. 14:9035-49；Gilardi,P.およびM.Perricaudet 1984、Nucleic Acids Res. 12:7877-88；Hanaka,S.、T.Nishigaki、P.A.SharpおよびH.Handa 1987、Mol Cell Biol. 7:2578-87；Jones,C.およびK.A.Lee、1991、Mol Cell Biol. 11:4297-305；Lee,K.A.およびM.R.Green 1987、Embo J. 6:1345-53)。これらの配列に加えて、E4プロモーター領域はウイルスDNA複製に関与する要素を含んでいる(Hatfield,L.およびP.Hearing 1993、J.Virol. 67:3931-9；Rawlins,D.R.、P.J.Rosenfeld、R.J.Wides、M.D.ChallbergおよびT.J.Kelly,Jr. 1984、Cell 37-309-19；Rosenfeld,P.J.、E.A.O’Neill、R.J.WidesおよびT.J.Kelly 1987 Mol Cell Biol. 7:875-86；Wides,R.J.、M.D.Challberg、D.R.RawlinsおよびT.J.Kelly 1987 Mol Cell Biol. 7:864-74)。E4プロモーターの描写およびこれら調節配列の位置は図1および2に示す。Jones,C.およびK.A.Lee、Mol Cell Biol. 11:4297-305(1991)をも参照されたい。これらの考察を考慮して、二つの新規な制限エンドヌクレアーゼ部位：ヌクレオチド35576にあるXhoI部位およびヌクレオチド35815にあるSpeI部位を作り出すことにより、E4プロモーターシャトルを設計した(図3を参照されたい)。XhoIおよびSpeIの両者による消化は35581から35817までのヌクレオチドを取り除く。これにより、E4転写に最大の影響を及ぼすことが示されている配列の全てを含む、E4転写開始部位に対する塩基-208ないし+29が、効果的に排除される。特にこれは、プロモーター活性化に最も顕著な効果を有すると証明されているE4F結合部位の二つの逆方向反復配列を包含している。しかしながら、ウイルスDNA複製にとって必須である、3個のSpI結合部位の全て、5個のATF結合部位のうち2個、ならびにNF1およびNFIII/Oct-1結合部位の両者は保持される。また、取り除かれるE4プロモーター要素の多くは、類似の機能を保持し(例えば、転写開始部位およびTATAボックス)、それでいてE2F応答性プロモーター部位を介した腫瘍細胞特異性を付与する部位に置き換えることができる。
【００７７】
好ましいE2F応答性プロモーターはヒトE2F-1プロモーターである。pRb経路への応答を仲介するE2F-1プロモーター中の重要調節要素は、インビトロおよびインビボの両方でマッピングされている(Johnson,D.G.、K.OhtaniおよびJ.R.Nevins 1994、Genes Dev. 8:1514-25；Neuman,E.、E.K.Flemington、W.R.SellersおよびW.G.Kaelin,Jr. 1995、Mol Cell Biol. 15:4660；Parr,M.J.、Y.Manome、T.Tanaka、P.Wen、D.W.Kufe、W.G.Kaelin,JrおよびH.A.Fine、1997、Nat Med. 3:1145-9)。したがって、本発明者等はSpeIおよびXhoI部位をその中に組み込んだプライマーを用いるPCRによって、転写開始部位に対して塩基対-218から+51までのヒトE2F-1プロモーターフラグメントを単離した。これによりE4プロモーターシャトル内部に存在する同じ部位が作り出され、E4プロモーターをE2F-1プロモーターに直接置換することができる。このベクターの組み立ての詳細を実施例でさらに説明する。
【００７８】
本発明の一つの態様は、内因性ヌクレオチド転写調節配列［ここでこの配列は好ましくはE1aおよび／またはE4プロモーター配列である］を、pRb/p107、E2F-1/-2/-3といったようなE2F転写因子、およびG1サイクリン/cdk複合体を包含するpRbシグナル伝達経路中の要素(即ち分子)への応答であるヌクレオチド転写調節配列に、迅速且つ容易に置換できる、E1aおよび／またはE4シャトルベクターを記載することである。上記のE1aまたはE4アデノウイルスベクターは、無傷、即ち野生型のpRb経路を含む正常細胞では弱毒化され、それでいてpRbの抑制機能を包含するRb経路が不完全な細胞では正常な感染プロフィールを示すと予想できる。E2F-1プロモーターに自己調節E2F部位が存在するため、内因性E1aおよび／またはE4配列の代わりに導入されたpRbシグナル伝達経路の要素に応答するヌクレオチド転写調節配列を有する任意のE1AまたはE4アデノウイルスベクターは、好ましくはE1A-CR2(保存領域2)ドメイン内に第二の突然変異を有するであろう。これは、pRbにより仲介されるE2F要素の抑制を破壊するE1Aの能力を最小化することにとって望ましい。
【００７９】
上に述べたように、アデノウイルス腫瘍蛋白E1aは、pRB/E2F複合体を破壊し、E2Fの放出、よってその活性化を引き起こす。好ましいE1aおよび／またはE4アデノウイルスシャトルベクター組み立て物は、pRbに結合しE2Fにとって代わるE1aの領域における突然変異体である組み立て物である。したがって、本発明のE1aおよび／またはE4シャトルベクターを作製するための、本発明に係る方法および組成物における使用にとって好適なE1a-RB複製不全アデノウイルス組み立て物は、以下の例：(1)有効なRB結合に必要なCR1およびCR2ドメインを欠き(アミノ酸2ないし150；ヌクレオチド560-1009の除去)、CR3ドメインを実質上保持しているE1a蛋白をコードしている、アデノウイルス血清型5 NT dl 1010（Whyte et al.(1989) Cell 56:67）、および(2)野生型アデノウイルスの全E1a領域をコードしているヌクレオチド448-1349の領域を欠く除去されたウイルスゲノムを含む、アデノウイルス血清型5 dl 312(Jones NおよびShenk T(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 76:3665)を包含するが、これらに限定される訳ではない。Ad5 NT dl 1010は好ましいE1a-RB複製不全アデノウイルスであり、Dr.E.Harlow、マサチューセッツ総合病院、ボストン、MAから入手できる。
【００８０】
RBに結合する能力を欠くさらなるE1a突然変異体(E1a(-))は、E1aポリペプチドをコードしているE1a遺伝子領域、典型的にはCR1および／またはCR2ドメインに突然変異を作製し、この突然変異体E1aポリペプチドを発現させ、突然変異体E1aポリペプチドを、水性結合条件下にp105またはRBの結合フラグメントに接触させ、そして、本発明での使用に好適なE1a(-)突然変異体候補物質として、RBに特異的に結合しない突然変異体E1aポリペプチドを同定することにより、当業者によって作製できる。これに代わる検定は、突然変異体E1aポリペプチドを、水性結合条件下で300kD蛋白および／またはp107蛋白もしくはその結合フラグメントと接触させ、そして、300kDおよび／またはp107ポリペプチドと特異的に結合しない突然変異体E1aポリペプチドを、E1aおよび／またはE4シャトルベクターの産生における本発明での使用にとって好適なE1a(-)突然変異体候補物質として同定することを包含する。これに代わる結合検定は、E1a(-)突然変異体蛋白が転写因子E2Fと複合体を形成する能力がないこと(またはE1a蛋白の不在)を決定すること、および／または生理的条件下でRB:E2F複合体からRB蛋白を解離させる能力を欠くことを決定することを包含する(Chellappan et al.(1991)に引用された仕事)。
【００８１】
別法として、E1a機能を欠く突然変異体を決定するための機能的検定、例えば、E1a依存性転写調節配列に連結した種々のリポーターポリペプチドの転写の、E1aによるトランス活性化の喪失等を利用する。このような不活性化突然変異は典型的にはE1a CR1ドメイン(Ad5のアミノ酸30-85；ヌクレオチド位置697-790)および／またはCR2ドメイン(Ad5のアミノ酸120-139；ヌクレオチド位置920-967)で起こり、それらはp105 RB蛋白とp107蛋白の結合に関わっている。好ましくは、CR3ドメイン(アミノ酸150-186にかけて)は存続し、末端切除p289Rポリペプチドとして発現され、アデノウイルス初期遺伝子のトランス活性化において機能的である。
【００８２】
E2F応答性プロモーターヒトE2F-1がE1aおよび／またはE4にとって代わる好ましいプロモーターであるが、pRb経路の要素によって直接的または間接的に活性化されるいかなるE2F応答性ヌクレオチド配列をも、内因性プロモーターの代わりに適切に使用できることに留意することが重要である。
【００８３】
さらに、E1aおよび／またはE4アデノウイルスベクターの組み立ては或る種の転写ヌクレオチド開始部位の除去を含むが、このような除去されまたは保持される部位の正確な数が本発明を限定するものと解してはならない。本発明の説明において意図されることは、内因性プロモーターの代わりにE2F応答性プロモーターがE1aおよび／またはE4遺伝子を駆動するよう機能し、腫瘍細胞を殺滅するということである。このプロセスは、E2F応答性プロモーター中に存在する転写開始部位の数または型に応じて程度が変化する。
【００８４】
ここに記載の本発明はアデノウイルスおよびE2F応答性プロモーターに関して述べているが、本発明はアデノウイルスに限定されないことに留意することが重要である。事実、当業者には、アデノウイルスと類似の生活環を示す事実上全てのウイルスに適用し、その結果、E2F応答性プロモーターが組み込まれてそのようなウイルスに選択的腫瘍細胞殺滅を付与する何らかの遺伝子の発現を制御できる事が理解できるであろう。
【００８５】
発明の用途
上に述べたように、本発明のアデノウイルスは、変化したpRb経路機能を有する疾病の治療に使用できる。さらに、本発明に係るアデノウイルス療法は、常套的化学療法のような他の抗新生物プロトコル、または他のウイルスと組み合わせることができる。米国特許第5677178号を参照されたい。化学療法は、全身的、癌への直接注入、または、所望の化学療法剤を適当な徐放性材料に結合させる、もしくは腫瘍の動脈内灌流によって癌の部位に局在化させることを包含する、熟練した医師にとって周知の方法により、投与することができる。好ましい化学療法剤はシスプラチンであり、好ましい用量は、治療しようとする癌の性質、およびシスプラチンの投与時に通常考慮されるその他の因子に基づき医師が選択できる。好ましくは、シスプラチンは50-120mg/m2の用量を3-6時間かけて静脈内投与する。より好ましくは、80mg/m2の用量で4時間かけて静脈内投与する。シスプラチンと組み合わせて投与するのが好ましい第二の化学療法剤は5-フルオロウラシルである。5-フルオロウラシルの好ましい用量は1日当たり800-1200mg/m2を連続5日間である。
【００８６】
本発明のアデノウイルスを使用するアデノウイルス療法は、遺伝子療法のような他の抗新生物プロトコルと組み合わせることができる。米国特許第5648478号を参照されたい。上に述べたように、本発明での使用のためのアデノウイルス組み立て物は特異的癌細胞殺滅を表す。このような組み立て物は、適当なプロドラッグの存在下で本発明に係るE1aおよび／またはE4アデノウイルスベクターの抗新生物効果を増強する、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはその他を包含するプロドラッグアクティベーター遺伝子を有することができる。米国特許第5631236号を参照されたい。
【００８７】
また、本発明のアデノウイルス突然変異体が宿主動物におけるそれらの効果を低下させる免疫反応を導く場合は、それらの効果を最大化するために適当な免疫抑制薬と共に投与できる。これとは別に、アデノウイルスの蛋白外被を修飾して免疫原性のより低いウイルスを生成する種々の方法が存在する。アデノウイルスの外被の主たる免疫原性成分であるヘキソン蛋白を、より免疫原性が低くなるよう遺伝学的に作り換えられることを示した、PCT/US98/0503を参照されたい。これは、正常なウイルスヘキソン蛋白エピトープを、ヘキソン蛋白には通常見出されないアミノ酸の配列に置換することでキメラヘキソン蛋白を作製することによってなされる。このようなアデノウイルス組み立て物は野生型ウイルスより免疫原性が低い。
【００８８】
本発明の別の態様は、E1aおよび／またはE4シャトルベクター、好ましくは該ウイルスのE1B、E3領域中に異種遺伝子を組み込むことである。このような異種遺伝子または生物活性ペプチドをコードしているそのフラグメントの例は、免疫調節蛋白をコードしているもの、および、上記のようなプロドラッグアクティベーターを包含する(即ち、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、米国特許第5358866および5677178号)。前者の例は、インターロイキン2、米国特許第4738927または5641665号；インターロイキン7、米国特許第4965195または5328988号；およびインターロイキン12、米国特許第5457038号；腫瘍壊死因子アルファ、米国特許第4677063または5773582号；インターフェロンガンマ、米国特許第4727138または4762791号；またはGM-CSF、米国特許第5393870または5391485号を包含する。さらなる免疫調節蛋白には、MIP-3を包含するマクロファージ炎症蛋白(Well,T.N.およびPeitsch,MC、J.Leukoc. Biol vol61(5):545-50頁、1997を参照されたい)、ならびにBADおよびBAXを包含する細胞自殺またはアポトーシス誘発蛋白が包含される。Yang,E. et al. Cell、80巻、285-291頁(1995)；およびSandeep,R. et al. Cell、91巻231-241頁(1997)を参照されたい。単球走化性蛋白(MCP-3アルファ)もまた使用できる。好ましい異種遺伝子の態様は、好ましくは癌細胞に対しては毒性で正常細胞に対してはそうでない蛋白をコードしている遺伝子に融合させた、細胞膜を貫通している蛋白、例えばVP22またはTATをコードしている遺伝子から成るキメラ遺伝子である。
【００８９】
本発明のアデノウイルスE1A突然変異体組み立て物の有効性を増大させるため、特定の腫瘍細胞型に増強した向性を示すよう、それらを修飾することができる。例えば、PCT/US98/04964に示すように、アデノウイルスの外被上の蛋白を修飾して、正常細胞よりも腫瘍細胞上にあるレセプターに、より高程度に結合する化学物質、好ましくはポリペプチドを展示するようにさせることができる。米国特許第5770442号および米国特許第5712136号もまた参照されたい。このポリペプチドは抗体であってよく、好ましくは一本鎖抗体である。
【００９０】
アデノウイルス突然変異体の精製
アデノウイルスは、超遠心分離を用いる塩化セシウムバンディングを包含する幾つかの技術によって常套的に精製する。しかしながら、アデノウイルスの大規模生産には、塩化セシウム超遠心分離による容易に利用できる方法よりも高収量が得られる方法が望ましく、1またはそれ以上のクロマトグラフィー工程を含む。好ましい方法はイオン交換クロマトグラフィーを利用する。例えば、PCT/US97/21504；およびHuyghe et al.、Human Gene Therapy、6巻1403-1416(1996)を参照されたい。
【００９１】
製剤
アデノウイルス突然変異体を包含するアデノウイルスは、患者への治療的および診断的投与のために製剤化できる。治療的または予防的使用のためには、薬理学的有効用量のアデノウイルスを含有する無菌組成物を、例えば新生物状態の治療のため人間の患者または獣医学上の人間以外の患畜に投与する。一般にこの組成物は、水性懸濁液中に約103ないし1015またはそれ以上のアデノウイルス粒子を含む。このような無菌組成物にはしばしば薬学上許容し得る担体または賦形剤を使用する。様々な水溶液、例えば水、緩衝化した水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等を使用できる。これらの溶液は無菌であり、一般に所望のアデノウイルスベクター以外の粒子状物質を含まない。この組成物は、生理的条件に近づけるのに必要な薬学上許容し得る補助物質、例えばpH調節および緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有させることができる。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤を含有させることができる。
【００９２】
本発明のアデノウイルスまたはそこに含まれるDNAは、リポソームまたは免疫リポソームデリバリーによって新生物細胞に導入することもでき、このようなデリバリーは、新生物細胞集団上に存在する細胞表面の性状(例えば、免疫リポソーム中の免疫グロブリンに結合する細胞表面蛋白の存在)に基づき、選択的に新生物細胞を標的とすることができる。典型的には、ビリオンを含有する水性懸濁液をリポソームまたは免疫リポソーム中に被包する。例えば、アデノウイルスビリオンの懸濁液を常法によりミセルに被包し免疫リポソームを生成することができる(米国特許第5043164号、米国特許第4957735号、米国特許第4925661号；ConnorおよびHuang(1985) J.Cell Biol. 101:582；Lasic DD (1992) Nature 355:279；Novel Drug Delivery(Prescott LFおよびNimmo WS編;Wiley、ニューヨーク、1989)；Reddy et al.(1992) J.Immunol. 148:1585頁)。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原(例えばCALLA、CEA)に特異的に結合する抗体を含む免疫リポソームを使用してビリオンを標的とする、またはビリオンDNAの標的をこれらの細胞とすることができる。
【００９３】
本発明のアデノウイルスまたはそのカクテルを含有する組成物は新生物疾患の予防および／または治療的処置のために投与できる。治療的適用では、既に特定の新生物疾患に罹患している患者に、その病態および合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するに充分な量の組成物を投与する。これを達成するための充分な量を「治療的有効用量」または「有効用量」と定義する。この用途のための有効な量は、病態の重篤度、患者の一般状態、および投与経路に依存する。
【００９４】
予防的適用では、本発明のアデノウイルスまたはそのカクテルを含有する組成物を、現在のところ新生物疾患状態でない患者に投与して、癌の再発に対する患者の耐性を増強し、または寛解期間を延長させる。このような量を「予防的有効用量」と定義する。この用途において、正確な量はやはり患者の健康状態および免疫の全般的レベルに依存する。
【００９５】
実施例
実施例1
E2F-1E4アデノウイルスベクター組み立て物
組換えプラスミドpAd75-100(14)はPatrick Hearingから入手し、これはpBR322のEcoRIとBamHI部位の間の、75.9マップ単位(m.u.)のEcoRI部位から、100m.u.のウイルスゲノムの右端まで(BamHIリンカーは100m.u.に位置する)のAd5 d1309フラグメントを含んでいる。このEcoRIからBamHIに至るフラグメントをLitmus28(New Ingland Biolabs)に直接サブクローニングしてL28:p75-100.d1309を作製した。L28:p75-100.dl309のNotIからNdeIに至るフラグメントを、pAd5-SN由来の野生型NotIからNdeIに至るフラグメント(Ad5ヌクレオチド29,510-31,089)に置換することにより、dl309の無い野生型Ad5 E3配列(Ad5ヌクレオチド30005ないし30750)を復活させた(米国特許出願第09/347604号に記載。未発表のインハウスベクター)。このプラスミドはL28:p75-100wtと命名された。プロモーターシャトルを作製するため、突然変異誘発鋳型となる僅かに小さなベクターを作製した。pAD75-100由来のEcoRVからBamHIに至るフラグメント(Ad5ヌクレオチド33758ないし33939)をpKSII+中に直接サブクローニングすることにより、プラスミドpKSII+:p94-100を組み立てた。ヌクレオチド35,577のXhoI部位およびヌクレオチド35816のSpeI部位を、Stratagene Quickchange部位指定突然変異誘発法を用いて作製した。これらの部位の作製に使用したオリゴヌクレオチドは、XhoI（5’-GCTGGTGCCGTCTCGAGTGGTGTTTTTTTAATAGG-3’およびその相補体5’-CCTATTAAAAAAACACCACTCGAGACGGCACCAGC-3’）ならびにSpeI（5’-GGGCGGAGTAACTAGTATGTGTTGGG-3’およびその相補体5’-CCCAACACATACTAGTTACTCCGCCC-3’）であった。SpeIおよびXhoI制限部位の両者を含むこのベクターはpKSII+:E4PSVと命名された。pKSII+バックボーンにSpeIおよびXhoI部位の両方が存在するため、pKSII+:E4PSV由来のEcoRVからBamHIに至るフラグメントをPvuIIおよびBamHI部位を介してpRSET(Invitrogen)中にサブクローニングし、pRSET:E4PSVと命名した。全てのベクターおよび点突然変異をABI自動シークエンサー上で二本鎖配列分析によって確認した。
【００９６】
ヒトE2F-1プロモーターを鋳型pGL3:E2F-1(-242)およびpGL3:E2F-1△E2F(-242)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって単離した。pGL3:E2F-1(-242)は転写開始部位に対して-242位より外側に野生型ヒトE2F-1プロモーターを含む。pGL3:E2F-1△E2F(-242)は、E2F結合部位パリンドロームの両方が不活性化点突然変異を含む以外は同じ配列を含む。PCRに使用したプライマーは以下の通りである：SpeI-E2F1P(5’-GTGAGCACTAGTCGCCTGGTACCATCCGGACAAAGCC-3’)およびXhoI-E2F1P(5’-GTGAGCCTCGAGCTCGATCCCGCTCCGCCCCCGG-3’)。100ナノグラムの鋳型DNAをPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の条件下にPCR増幅した：98℃で最初の変成を5分間、その後98℃1分間の変成と68℃1分間のアニーリング／プライマー伸長を30サイクル、その後68℃5分間の最終プライマー伸長。PCR生成物はQiagen精製し、SpeIおよびXhoIで消化し、ゲル精製し、SpeIおよびXhoI消化したpRSET:E4PSVにライゲーションした。これらのプロモーターシャトルベクターをE2F1-E4PSVおよびE2F1△-E4PSVと命名したが、これらはヒトE2F1プロモーターの転写開始に対して-218から+51までの配列を有する。E2F1-E4PSVおよびE2F1△-E4PSVの両者由来のBstEIIからBamHIに至るフラグメントを、同じ酵素で消化したL28:p75-100.dl309およびL28:p75-100.wtの両者にサブクローニングすることにより、機能的ウイルスの作製に使用する最終ベクターを作製した。これらのベクターをE2F1-E4PSV.309、E2F1-E4PSV.wt、E2F1△-E4PSV.309およびE2F1△-E4PSV.wtと命名した。全てのベクターを上記のように二本鎖配列分析により確認した。
【００９７】
実施例2
E2F1-E4アデノウイルス組み立て物
10マイクログラムのE2F1-E4PSV.309をEcoRIおよびBamHIで消化し、子牛腸管フォスファターゼで処理し、ゲル精製した。1マイクログラムのEcoRI消化dl922/47 TP-DNAを、E4領域を駆動する野生型E2F-1プロモーターを含むこの精製フラグメント約5マイクログラムに、16℃で一夜ライゲーションした。ライゲーションを標準CaPO4トランスフェクション法を用いて293細胞中にトランスフェクトした。簡潔に述べると、ライゲーションしたDNAを鮭精子DNA 24マイクログラム、2.5M CalCl2 50マイクロリットルと混合し、H2Oで最終容量500マイクロリットルに調節した。この溶液を500マイクロリットルのHepes-緩衝化食塩水(pH7.05)に滴下した。25分間放置した後、沈殿を、10%牛胎児血清(FBS)を添加したDMEM中で生育させた293細胞の60mm皿2枚に滴下し、60-80%密集とした。16時間後、単層を燐酸緩衝化食塩水(カルシウムとマグネシウムを除く)で1回洗浄し、その後2%FBSを添加したDMEM中の1%Seaplaqueアガロースから成る5mlの寒天を積層した。プラークを単離するまで3-4日毎に上記寒天3-4mlを皿に積層した。
【００９８】
実施例3
E2F1-E4ウイルスの増殖および確認
一次プラークをパスツールピペットで単離し、細胞変成効果(CPE)が完了するまで、2%FBSを添加したDMEM 2ml中の293細胞を入れた6ウェル皿で増殖させた。DNA分析のため、ウイルス上清の十分の一(200ml)を取り置き、残りを低温バイアル中、-80℃で保存した。DNAは、QiagenのBlood Kitを使用しその推奨に従って単離した。この物質の十分の一を、以下のプライマーを使用して所望の突然変異の存在についてPCRによりスクリーニングした：dl922/47のため(5’-GCTAGGATCCGAAGGGATTGACTTACTCACT-3’および5’-GCTAGAATTCCTCTTCATCCTCGTCGTCACT-3’)そしてE4領域のE2F-1プロモーターのため(5’-GGTGACGTAGGTTTTAGGGC-3’および5’-GCCATAACAGTCAGCCTTACC-3’)。ClontechのAdvantage cDNA PCRキットを使用しPerkin Elmer 9600機で以下の条件を用いてPCRを実施した：98℃5分間の最初の変成、その後98℃1分間の変成および68℃3分間のアニーリング／プライマー伸長を30サイクル、その後68℃5分間の最終プライマー伸長。引き続き、陽性プラーク(PCRにより決定)を配列分析により確認した。上のPCR生成物をゲル精製し、同じプライマーで配列決定した。次いで陽性プラークを第二巡目のプラーク精製に付し、前記のように確認した。ウイルスを293細胞中で増殖させ、2回の塩化セシウム勾配超遠心分離により精製した。
【００９９】
実施例4
E2F1-E1aおよびE2F1-E1a/E2F1-E4ベクターの組み立て
ヒトE2F-1プロモーターを鋳型pGL3:E2F-1(-242)およびpGL3:E2F-1△E2F(-242)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって単離した。pGL3:E2F-1(-242)は転写開始部位に関して-242位より外側に野生型ヒトE2F1プロモーターを含む。pGL3:E2F-1△E2F(-242)は、E2F結合部位パリンドロームの両方が不活性化点突然変異を含む以外は同じ配列を含む。PCRに使用したプライマーは以下の通りである：BamHI-E2F1P(5’-GTGAGCGGATCCGCTCGATCCCGCTCCGCCCCCGG-3’)およびHindIII-E2F1P(5’-GTGAGCAAGCTTCGCCTGGTACCATCCGGACAAAGCC-3’)。100ナノグラムの鋳型DNAをPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の条件下にPCR増幅した：98℃で最初の変成を5分間、その後98℃1分間の変成と68℃1分間のアニーリング／プライマー伸長を30サイクル、その後68℃5分間の最終プライマー伸長。PCR生成物はQiaquickカラム(Qiagen)で精製し、BamHIおよびHindIIIで消化し、ゲル精製し、BamHIおよびHindIIIで部分消化したp922/47-SVにライゲーションした(下記参照)。これらのプロモーターシャトルベクターをE2F1wt-922/47.PSVおよびE2F1△-922/47.PSVと命名したが、これらはヒトE2F1プロモーターの転写開始に関して-218から+51までの配列を有する。全てのベクターをABI自動シークエンサー上で二本鎖配列分析により確認した。
【０１００】
P922/47-SVは、ヌクレオチド922ないし947のE1A-CR2除去をも含む、E1Aプロモーターシャトルベクターである。pSP64(Promega)をまずHindIIIで消化し、Klenow DNAポリメラーゼで末端切除し、次いで再ライゲーションしてpSP64 Delta H3を作製することによりプラスミドP922/47-SVを組み立てた。次にpXC1(Microbix)由来の1.737bpのEcoRIからXbaIに至るフラグメント(Ad5およびpBR322 DNAの両者を含む)を、EcoRIおよびXbaI消化したpSP64 Delta H3にライゲーションしてpSP64-RI/Xbaを作製した。次いでpSP64-RI/XbaをHindIIIおよびBamHIで消化し、Klenow DNAポリメラーゼで末端除去し、再ライゲーションしてP Delta E1 Delta +を作製した。この分子内除去は、HindIII、BamHIおよびClaI部位を効果的に取り除きつつpXC1プラスミドの9529から9875までの配列を取り除いた。次に、P Delta E1 DeltaをBsAaIで消化しHindIIIリンカー(NEB)にライゲーションすることによってAd5のヌクレオチド376に新規なHindIII部位を創り出し、P Delta E1 Delta +Hを作製した。次いでPCR突然変異誘発によって新規なBamHI部位をAd5のヌクレオチド539に創った。最初2つのPCR反応を実施した。pBR322に存在するプライマー5’EcoXC1部位および3’Bam(5’-CGCGGAATTCTTTTGGATTGAAGCCAATATG-3’)および3’Bam(5’-CAGTCCCGGTGTCGGATCCGCTCGGAGGAG-3’)と共にP Delta E1 Delta +Hを鋳型として使用し、一方、プライマーBsr-Bam(5’-CTCCTCCGAGCGGATCCGACACCGGGACTG-3’)および3’E1A.Xba(5’-GCGGGACCACCGGGTGTATCTCAGGAGGTG-3’)によるPCR反応では鋳型としてプラスミドpXC1(Microbix)を使用した。このPCR生成物をアガロースゲル上で単離し、Qiagenゲル抽出キットを用いて精製した。次にこの二つのPCR生成物を混合し、最外部のプライマー5’EcoXC1および3’E1A.Xbaを用いてPCRを反復した。得られた約1400bp PCR生成物を次いでEcoRIおよびXbaIで消化し、EcoRIおよびXbaI消化したP Delta E1 Delta +HにライゲーションしてDelta E1 Delta +H+Bを作製した。次に、P Delta E1 Delta +H+BをEcoRIおよびXbaIで消化し、この1393bpフラグメントをEcoRIおよびXbaI消化したpXC1(Microbix)にライゲーションすることによってpXC1-SVを組み立てた。最後に、PCRの鋳型としてpCIA-922/47(Peter Whiteにより提供された)を使用し以下のプライマーを用いてp922/47-SVを作製した：Bsr-Bam(5’-CTCCTCCGAGCGGATCCGACACCGGGACTG-3’)および3’E1A.Xba(5’-GCATTCTCTAGACACAGGTG-3’)。得られたPCR生成物をQiagen Qiaquickカラムで精製し、BamHIおよびXbaIで消化し、その後、BamHIおよびXbaIで消化しておいたpXC1-SVにライゲーションした。
【０１０１】
実施例5
E2F1-E1aおよびE2F1-E1a/E2F1-E4ウイルス組み立て物
それぞれ10マイクログラムのE2F1wt-922/47.PSVまたはE2F1 Delta-922/47.PSVを、10マイクログラムのpJM17(Microbix)により、標準CaPO4トランスフェクション法を用いて293細胞中に同時トランスフェクトすることにより、ONYX-150(E2F1wt-922/47)およびONYX-151(E2F1 Delta-922/47)を作製した。10マイクログラムのプラスミドE2F1-E4PSV.309(ID-086)をEcoRIおよびBamHIで消化することによりONYX-411(E2F1wt-922/47 + E2F1wt-E4)を作製した。次に、消化したDNAを子牛腸管フォスファターゼで処理し、ゲル精製した。次に、1マイクログラムのEcoRI消化ONYX-150(E2F1wt-922/47) TP-DNAを、E4領域を駆動する野生型E2F-1プロモーターを含むこの精製フラグメント5マイクログラムに、16℃で一夜ライゲーションした。DNAを2.5M CaCl2 50マイクロリットルと混合し、最終容量500マイクロリットルとすることにより、CaPO4トランスフェクションを実施した。ONYX-411の場合、トランスフェクション混合物は、ライゲーションされたDNAに加え鮭精子DNA 24マイクログラムを含有させた。この溶液を500マイクロリットルのHepes-緩衝化食塩水(pH7.05)に滴下した。25分間放置した後、沈殿を、10%牛胎児血清(FBS)を添加したDMEM中で生育させた293細胞の60mm皿2枚に滴下し、60-80%密集とした。16時間後、単層を燐酸緩衝化食塩水(カルシウムとマグネシウムを除く)で1回洗浄し、その後2%FBSを添加したDMEM中の1%Seaplaqueアガロースから成る5mlの寒天を積層した。プラークを単離するまで3-4日毎に上記寒天3-4mlを皿に積層した。
【０１０２】
実施例6
E2F1-E1aおよびE2F1-E1a/E2F1-E4ウイルスの増殖および確認
一次プラークをパスツールピペットで単離し、細胞変成効果(CPE)が完了するまで、2%FBSを添加したDMEM 2ml中の293細胞またはA549細胞を入れた6ウェル皿で増殖させた。DNA分析のため、ウイルス上清の十分の一(200マイクロリットル)を取り置き、残りを低温バイアル中、-80℃で保存した。DNAはQiagenのBlood Kitを使用しその推奨に従って単離した。この物質の十分の一を、以下のプライマー対の組を使用して所望の突然変異の存在についてPCRによりスクリーニングした。E1Aを駆動するヒトE2F1プロモーターの存在を、プライマーAd5-left(5’-GGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCC-3’)およびE1Astart.NC(5’-GGCAGATAATATGTCTCATTTTCAGTCCCGG-3’)を用いて確認した。E1A内部のヌクレオチド922から947までの除去の存在を、プライマーAf-7(5’-GCTAGGATCCGAAGGGATTGACTTACTCACT-3’)およびAf-5(5’-GCTAGAATTCCTCTTCATCCTCGTCGTCACT-3’)を用いて確認した。E4領域全体を駆動するヒトE2F1プロモーターの存在を、プライマーE4.3NCb(5’-GCCATAACAGTCAGCCTTACC-3’)およびAd5-3’end(5’-GGTGACGTAGGTTTTAGGGC-3’)を用いて確認した。E3領域(dl309)に存在する除去を、プライマーE3.C8(5’-CCTTTATCCAGTGCATTGACTGGG-3’)および3’-E3I(5’-GGAGAAAGTTTGCAGCCAGG-3’)を用いて確認した。ClontechのAdvantage cDNA PCRキットを使用しPerkin Elmer 9600機で以下の条件を用いてPCRを実施した：98℃5分間の最初の変成、その後98℃1分間の変成および68℃3分間のアニーリング／プライマー伸長を30サイクル、その後68℃5分間の最終プライマー伸長。引き続き、陽性プラーク(PCR分析により決定)を配列分析により確認した。上のPCR生成物をゲル精製し、同じプライマーで配列決定した。次いで陽性プラークを293細胞またはA549細胞で第二巡目のプラーク精製に付し、前記のように正確に確認した。ウイルスを293細胞中で増殖させ、2回の塩化セシウム勾配超遠心分離により精製した。全ての大規模ウイルス調製物を上と同じPCRおよび配列分析により確認した。さらに、全ての大規模ウイルス調製物をHindIIIまたはXhoIのいずれかによる消化で確認し、フラグメントを0.9%アガロースゲル上で単離することにより分析した。
【０１０３】
ここに本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、付記した請求項の精神または範囲を逸脱することなく本発明に数多くの変化および修飾を施し得る事が明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  E1a-289Rポリペプチドのドメイン構造を模式的に示している。
【図２】  アデノウイルスE4プロモーターを示している。
【図３】  E4プロモーターを、選択されたプロモーターに置換することを促進する、本発明のE4シャトルベクターならびに制限部位SpeIおよびXhoIの位置を図式的に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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