(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性試料中の分析物を表す電流を検出するためのセンサーシステムの信号読取回路に装着するための使い捨て電極ストリップであって、
ａ）前記読取回路に取り外し可能に装着するように構成された実質的に平坦な表面をもつ細長形支持体と、
ｂ）前記表面に沿って延びており、前記読取回路に接続するための導電性エレメントを含む第１の導体と、
前記第１の導体と接触するように前記表面に配置されており、ニコチンアミド補因子依存性酵素と、ニコチンアミド補因子と、下記２式：
【化１】
0004373604.tif 000011
（式中、Ｘ及びＹは独立して酸素、硫黄、ＣＲ３Ｒ４、ＮＲ３もしくＮＲ３Ｒ４＋又は官能基ＣＺ１Ｚ２であり、Ｚ１及びＺ２は電子求引基であり、Ｒ１及びＲ２は独立して置換又は非置換ヘテロ芳香族基であり、Ｒ３及びＲ４は独立して水素原子、ヒドロキシル基又は置換もしくは非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アルコキシルもしくはアリールオキシ基である）の一方をもつメディエーター化合物を含み、測定中にメディエーターの酸化と還元を同時に生じる動的モードで測定した場合に約１〜８ｍＭの前記分析物の濃度に対して単調応答を与えるように充填剤成分と結合剤成分を配合した作用電極と、
ｃ）前記表面に沿って延びており、前記読取回路に接続するための導電性エレメントを含む第２の導体と、
ｄ）前記第２の導体と接触している参照／対電極を含み、
ｅ）前記表面に沿って延びており、前記読取回路に接続するための導電性エレメントを含む第３の導体と、前記第３の導体と接触している充填指示電極とを更に含み、
ｆ）前記導体が相互に電気的に接触しないように間隔をあけて配置されており、前記水性試料を前記ストリップに加えたときに相互に電気的に接触しないように構成されており、
ｇ）前記作用電極と前記参照／対電極が前記水性試料の小滴により同時に覆われて前記電極間に導電路を提供するように構成されている前記電極ストリップ。
【請求項２】
メディエーター化合物が１，１０−フェナントロリンキノンである請求項１に記載の電極ストリップ。
【請求項３】
ニコチンアミド補因子依存性酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである請求項２に記載の電極ストリップ。
【請求項４】
ニコチンアミド補因子依存性酵素が３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼである請求項２に記載の電極ストリップ。
【請求項５】
ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酵素による酸化を受ける分析物の水性試料中濃度の測定方法であって、
ａ）分析物をＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下にＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酵素で酸化する段階であって、前記ＮＡＤ（Ｐ）＋は電極ストリップの作用電極に存在し、前記電極ストリップは充填指示電極を更に含み、分析物とＮＡＤ（Ｐ）＋との反応により生成されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、下記２式：
【化２】
0004373604.tif 000012
（式中、Ｘ及びＹは独立して酸素、硫黄、ＣＲ３Ｒ４、ＮＲ３もしくＮＲ３Ｒ４＋又は官能基ＣＺ１Ｚ２であり、Ｚ１及びＺ２は電子求引基であり、Ｒ１及びＲ２は独立して置換又は非置換ヘテロ芳香族基であり、Ｒ３及びＲ４は独立して水素原子、ヒドロキシル基又は置換もしくは非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アルコキシルもしくはアリールオキシ基である）の一方をもつメディエーター化合物で酸化する段階と、
ｂ）作用電極に電位を加え、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化により還元されたメディエーター化合物を再酸化し、発生する電流を観察する段階を含み、
メディエーター化合物の一部がＮＡＤ（Ｐ）Ｈとの反応により還元され、メディエーター化合物の一部が測定期間中の前記電極への電子の移動により酸化され、前記測定期間にわたるメディエーター化合物の酸化速度、従って観察される発生電流が試料中の分析物の濃度に単調に関連付けられる前記方法。
【請求項６】
ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酵素、ＮＡＤ（Ｐ）＋及びメディエーター化合物を結合剤及び充填剤と共に前記電極の表面に付着した請求項５に記載の方法。
【請求項７】
測定期間中に観察される電流が試料中の分析物の濃度に直線的に関連付けられる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
メディエーター化合物が１，１０−フェナントロリンキノンである請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酵素が３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼである請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
印加電位が参照電極に対して２００ｍＶ以下である請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は電流滴定バイオセンサー用電極の一般分野に関する。より詳細には、本発明はこれらの電極で使用する補因子をリサイクルするためにメディエーターとして使用する化合物の分野に関する。
【０００２】
ＮＡＤ及びＮＡＤＰ依存性酵素はグルコース、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、乳酸、エタノール及びコレステロール等の臨床的に有用な物質を基質とすることが多く、非常に有用である。これらの基質及び他の分析物を検出するための電流滴定電極は、この種の酵素を添加し、還元された補因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの媒介酸化により電極との電気的連通を設定することにより設計することができる。
【０００３】
ＮＡＤ及びＮＡＤＰ依存性酵素は一般に細胞内オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．ｘ．ｘ．ｘ）である。オキシドレダクターゼは更にそれらが作用する基質の供与基の種類により分類される。例えば、ある基質内でＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼはＥＣ１．ｘ．ｘとして分類され、基質のアルデヒド又はケト基に作用するオキシドレダクターゼはＥＣ１．２．ｘ．ｘとして分類される。ＥＣ１．ｘ．ｘ酵素の基質には重要な分析物が含まれる（例えばグルコース、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、乳酸、エタノール及びコレステロール）。
【０００４】
オキシドレダクターゼの分類は酵素が使用する受容体の種類によっても分類される。本発明に関連する酵素はＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を受容体とし、ＥＣ１．ｘ．１．ｘとして分類される。これらの酵素は一般にその活性部位の内側にスルフヒドリル基をもつため、ヨード酢酸等のチオール反応性試薬により不可逆的に阻害され得る。不可逆的阻害剤は多くの場合には酵素活性に必須の特定アミノ酸残基（例えばシステイン即ちＣｙｓ）との共有結合の形成により安定な化合物を形成する。例えば、グリセルアルデヒド−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．９）はＣｙｓ１４９でヨード酢酸により化学量論的にアルキル化され、触媒活性を失う。更に、酵素グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤＨ）及び乳酸デヒドロゲナーゼはチオール試薬により不可逆的に阻害されることが知られている。従って、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼを含む安定なバイオセンサーを開発しようとする際には、チオールに対して反応性の化合物は酵素阻害剤として作用し得るので避けなければならない。
【０００５】
発明の要約
本発明は細胞内デヒドロゲナーゼ酵素の活性部位でチオール基と不可逆的に結合しないＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋メディエーター化合物の発見に基づく。このようなメディエーター化合物は通常モードの酵素阻害を生じない。従って、メディエーターはＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性酵素から作製した電流滴定電極における電気応答の安定性と信頼性を増すことができる。
【０００６】
１態様では、本発明は電流滴定バイオセンサー用試験エレメントに関する。エレメントは試薬を分配した電極を含む。試薬はニコチンアミド補因子依存性酵素と、ニコチンアミド補因子と、式：
【０００７】
【化３】
0004373604.tif 000002
（式中、Ｘ及びＹは独立して酸素、硫黄、ＣＲ３Ｒ４、ＮＲ３又はＮＲ３Ｒ４＋であり、Ｒ１及びＲ２は独立して置換又は非置換芳香族又はヘテロ芳香族基であり、Ｒ３及びＲ４は独立して水素原子、ヒドロキシル基又は置換もしくは非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アルコキシルもしくはアリールオキシ基である）の一方をもつメディエーター化合物又はその金属錯体もしくはキレートを含む。場合により、Ｘ又はＹは官能基ＣＺ１Ｚ２でもよく、Ｚ１及びＺ２は電子求引基である。
【０００８】
特に指定しない限り、全アルキル基は直鎖でも分枝鎖でもよく、炭素原子数１２個まで、好ましくは６個まで、特に４個までとすることができる。好適アルキル基はメチル、エチル、プロピル及びブチルメである。アルキル部分が別の基の部分（例えばアルコキシル基のアルキル部分）を形成する場合には、炭素原子数６個まで、特に４個までが好ましい。好適アルキル部分はメチル及びエチルである。
【０００９】
芳香族又はアリール基は任意芳香族炭化水素基とすることができ、炭素原子数６〜２４、好ましくは６〜１８、より好ましくは６〜１６、特に６〜１４とすることができる。好適アリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル及びピリル基が挙げられ、特にフェニル又はナフチル、特にフェニル基である。アリール部分が別の基の部分（例えばアリールオキシル基のアリール部分）を形成する場合には、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル又はピリル、特にフェニル又はナフチル、特にフェニル部分が好ましい。
【００１０】
ヘテロ芳香族又はヘテロアリール基は少なくとも１個のヘテロ原子を含む任意芳香族単環又は多環系とすることができる。好ましくは、ヘテロアリール基は酸素、硫黄及び窒素原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む５〜１８員、特に５〜１４員、特に５〜１０員芳香族環系である。５及び６員ヘテロアリール基、特に６員基が特に好ましい。少なくとも１個の窒素原子を含むヘテロアリール基が特に好ましい。好適ヘテロアリール基としては、ピリジル、ピリリウム、チオピリリウム、ピロリル、フリル、チエニル、インドリニル、イソインドリニル、インドリジニル、イミダゾリル、ピリドニル、ピロニル、ピリミジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ピリダジニル、ベンゾフラニル、ベンゾキサゾリル及びアクリジニル基が挙げられる。
【００１１】
上記置換基の任意のものが置換基をもつ場合には、存在し得る置換基は電気化学反応に使用する化合物の開発及び／又はそれらの構造／活性、溶解度、安定性、媒介能、公称電位（Ｅ０）又は他の性質を変える前記化合物の修飾に一般に使用されているものの任意の１種以上とすることができる。このような置換基の具体例としては例えばハロゲン原子、オキソ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、シクロアルキル、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ホルミル、アルコキシカルボニル、カルボキシル、アルカノイル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、カルバモイル、アルキルアミド、アリール又はアリールオキシ基が挙げられる。上記置換基の任意のものがアルキル置換基を表すか又は含む場合には、直鎖でも分枝鎖でもよく、炭素原子数１２個まで、好ましくは６個まで、特に４個までとすることができる。シクロアルキル基は炭素原子数３〜８、好ましくは３〜６とすることができる。アリール基又は部分は炭素原子数６〜１０とすることができ、フェニル基が特に好ましい。ハロゲン原子はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子とすることができ、従って、ハロ部分を含む任意基（例えばハロアルキル基）はこれらのハロゲン原子の任意の１個以上を含むことができる。
【００１２】
電子求引基は安定なメチレン基ＣＺ１Ｚ２を形成する任意基とすることができる。このような電子求引基はハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ホルミル、アルカノイル、カルボキシル及びスルホン酸基を含むことができる。
【００１３】
好ましくは、ＸとＹは同時に酸素原子である。
【００１４】
更にＲ１及びＲ２は独立してフェニル、ナフチル、ピリジル及びピロリル基から選択することが好ましく、ピリジル基が特に好ましい。「ピリジル基」なる用語はそのＮ酸化物とピリジニウム及びＮ置換ピリジニウム基も含む。
【００１５】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２は置換されていないか又は１個以上、好ましくは１もしくは２個のアルキル基、特にメチル基でのみ置換されている。Ｒ１及びＲ２は置換されていないことが特に好ましい。
【００１６】
Ｒ３及びＲ４が存在する場合には、水素原子とアルキル基から独立して選択することが好ましい。
【００１７】
金属錯体及びキレートとしては、遷移金属、特に第１、第２及び第３系列遷移元素（例えばルテニウム、クロム、コバルト、鉄、ニッケル及びレニウム）との錯体及びキレートが挙げられ、ルテニウムが特に好ましい。４−ビニル−４’−メチル−２，２’−ビピリジル（ｖ−ｂｐｙ）及びビピリジル（ｂｐｙ）基等の他の基も錯金属イオンの部分としてこのような錯体及びキレートに含むことができる。一般に、このような錯体及びキレートはＲ１及びＲ２のヘテロ原子が金属イオン又は金属イオン錯体と配位する結果として形成される。
【００１８】
試薬は１個以上のインク層として電極に付着することができる。試薬は作用電極に単層でスクリーン印刷することができる。
【００１９】
エレメントは１対の縦方向の実質的に平行な導電性トラックをもつ細長形電気絶縁キャリヤーと、１対の電極を含む電流滴定乾式ストリップセンサーとすることができる。電極は各々トラックの１本ずつに電気接続することができる。電極の一方を参照／対電極とし、他方を作用電極とすることができる。エレメントはダミー電極も含むことができる。更に、エレメントは電極に導入する前に試料を濾過するように配置された膜を含むことができる。
【００２０】
センサーは更に電気絶縁キャリヤー材料（例えばポリ塩化ビニル等の合成ポリマーや、合成ポリマーのブレンド）の支持ストリップを含むことができる。
【００２１】
メディエーター化合物はキノンとすることができる。利用可能なキノンの例としては、１，１０−フェナントロリンキノン、１，７−フェナントロリンキノン及び４，７−フェナントロリンキノンが挙げられる。
【００２２】
別の態様では、本発明は読取装置をもつ電流滴定センサー用電極ストリップに関する。ストリップは取り外し可能に読取装置に装着するように構成された支持体と、支持体に沿って延びており、読取装置に接続するための導電性エレメントを含む第１の導体と、第１の導体に接触しており、試料混合物と接触するように配置された作用電極と、支持体に沿って延びており、読取装置に接続するための導電性エレメントを含む第２の導体と、第２の導体と接触しており、試料と第２の導体を接触させるように配置された参照／対電極を含む。ストリップの作用電極は式：
【００２３】
【化３】
0004373604.tif 000003
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ２は上記と同義である）の一方をもつメディエーター化合物を含む。
【００２４】
本発明の更に別の態様は電極とニコチンアミド補因子の間の電子移動を媒介する方法に関する。本方法はニコチンアミド補因子依存性酵素の存在下にメディエーター化合物を使用する段階を含み、メディエーター化合物はチオール基と不可逆的に結合することができないキノイド化合物である。メディエーター化合物は例えば隣接する芳香族環に反応性不飽和結合をもつことができる。利用可能なメディエーター化合物としては、式：
【００２５】
【化４】
0004373604.tif 000004
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ２は上記と同義である）をもつものが挙げられる。例えば、メディエーター化合物は１，１０−フェナントロリンキノン、１，７−フェナントロリンキノン又は４，７−フェナントロリンキノンとすることができる。
【００２６】
更に別の態様では、本発明は印刷インクに関する。インクはニコチンアミド補因子依存性酵素と、ニコチンアミド補因子と、式：
【００２７】
【化５】
0004373604.tif 000005
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ２は上記と同義である）の一方をもつメディエーター化合物を含む。
【００２８】
例えば、メディエーター化合物は１，１０−フェナントロリンキノン、１，７−フェナントロリンキノン又は４，７−フェナントロリンキノンとすることができる。酵素は例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ又は３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとすることができる。
【００２９】
特に指定しない限り、本発明で使用する全科学技術用語は本発明の属する技術の当業者に一般に理解されていると同一の意味をもつ。本発明の実施又は試験には本明細書に記載すると同様又は等価の方法及び材料を使用してもよいが、好ましい方法と材料は下記の通りである。本明細書に引用する全刊行物、特許出願、特許、技術便覧及び他の文献はその開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とする。記載が矛盾する場合には、定義を含めた本明細書の記載を優先する。更に、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定的ではない。
【００３０】
新規メディエーターの利点の１つは酵素中の活性部位チオール基に対して非反応性である点である。このため、バイオセンサー電極の安定性と貯蔵寿命は予測できない程度まで改善される。また、この安定性の結果として、酵素とメディエーターを印刷インク又は滴定溶液に配合することができ、バイオセンサーの作製が容易になる。酵素の不可逆的阻害剤ではないメディエーターを使用する結果、バイオセンサー製造中に酵素活性の相当比率が維持される。ＮＡＤ及びＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼ酵素は一般に高価で不安定であるため、その安定性の改善は極めて望ましい。
【００３１】
本明細書に開示する化合物は広範なＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性酵素と結合した補因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのメディエーターとして使用でき、免疫化学法における抗原又は抗体のラベルとしても使用でき、更には電気化学及び生物電気化学分野の他の用途でも使用できるという利点がある。メディエーターはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとの反応後の再酸化に低い酸化電位しか必要としない。これは、外来電気活性種（例えばアスコルビン酸、尿酸）からの干渉電位が特に高い全血を試験する場合に特に有利である。低電位は試料中の電気活性種を除去するためにダミー電極を使用する必要がなくなるので有利である。また、メディエーターの天然酸化形態は還元メディエーターに付随するようなバックグラウンド電流を減らすことができる。
【００３２】
本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から理解されよう。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨメディエーターとして使用するために、チオールと不可逆的に結合できないように選択された類の化合物を開示する。これらのメディエーターはその構造、電子及び立体特徴によりチオールと殆ど反応することができない。これらのメディエーターはＮＡＤ及びＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼの活性部位スルフヒドリル基と実質的に不可逆的に結合できないため、酵素の不活化とそれに伴うバイオセンサー安定性の低下が避けられる。
【００３４】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨメディエーターは、ＥＰ１２５８６７−Ａに記載されているもののように、センサーに存在するＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性酵素の基質を分析物とする電流滴定酵素センサーの製造で使用することができる。従って、試料、特に水性試料中の分析物の存在をアッセイするのに使用する電流滴定酵素センサーを製造することができる。例えば、試料は生物体液（例えば全血、血漿又は血清）等の複雑な生物学的試料とすることができ、分析物は天然代謝物（例えばグルコース、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、エタノール、乳酸又はコレステロール）又は導入物質（例えば薬物）とすることができる。
【００３５】
本発明は更に、本明細書に開示するＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨメディエーターを含み、特に電流滴定酵素センサーの製造に有用なインクを提供する。
【００３６】
本発明は更に、酸化又は分解により対応する活性メディエーターに現場で変換することができる上記メディエーターの任意前駆物質、付加物又は還元（ロイコ）形態も包含する。このような前駆物質又は付加物としては、ヘミアセタール、ヘミチオアセタール、環状アセタール、金属ｏ−キノン錯体、プロトン化形態、アセトン付加物等が挙げられる。
【００３７】
新規メディエーターと併用可能な酵素の非限定的な例を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0004373604.tif 000006
【００３９】
本発明のメディエーターを使用する電流滴定酵素センサーは一般に試験エレメント、例えば使い捨てストリップを使用する。使い捨て試験エレメントは、例えば酵素等の試薬、ニコチンアミド補因子（即ちＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋）、分析物の濃度を表す電流を発生するための本発明のメディエーターを含む作用電極と、参照／対電極を備えることができる。試薬は試験エレメントで作用電極に結合した１層以上のインク層に添加することができる。従って、センサー電極は例えば印刷、吹付又は他の適当な付着技術により形成した電極域を含むことができる。
【００４０】
図１及び２について説明すると、一般にＰＶＣ、ポリカーボネート、ポリエステル又はポリマー混合物（例えばポリカーボネートとポリエステルの混合物であるＶａｌｏｘ）から作製した電極支持体１に３本の導電性カーボンインクの印刷トラック２，３及び４を支持する。印刷トラックは作用電極インク１６を付着する作用電極５と、参照／対電極６と、充填指示電極７と、接点８，９及び１０の位置を規定する。
【００４１】
（トラック１２の幅広露出域１４が参照電極６に重なるように）導電性トラックの細長部分に夫々銀／塩化銀粒子トラック１１，１２及び１３を積層し、更に参照／対電極１４と作用電極５と充填指示電極７と接点域８，９及び１０の位置のみが露出するように疎水性電気絶縁材料層１５を積層する。この疎水性絶縁材料は短絡を防止する役割をもつ。この絶縁材料は疎水性であるため、露出した電極に試料を閉じ込めることができる。利用可能な絶縁材料の１例はＳｅｒｉｃｏｌ  Ｌｔｄ．（Ｂｒｏａｄｓｔａｉｒｓ，Ｋｅｎｔ，英国）から市販されているＳｅｒｉｃａｒｄである。場合により、第１のメッシュ層１７と、第２の絶縁層１８と、第２のメッシュ層１９と、第３の絶縁層２０と、テープ２１を疎水性絶縁材料に積層してもよい。
【００４２】
各インク混合物は例えば第２のトラックに接続した参照電極１４のごく近傍でキャリヤー上の導電性トラックに付着することができる。こうして、有効電極域５を覆う少量の血液又は他の液体試料と作用することが可能なセンサーを作製することができる。混合物は必須ではないが、スクリーン印刷によりキャリヤーに付着すると好ましい。
【００４３】
一般に、ＮＡＤ（Ｐ）依存性デヒドロゲナーゼは式：
ＲＨ２＋ＮＡＤ（Ｐ）＋  →  Ｒ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋
（式中、ＲＨ２は基質（分析物）であり、Ｒは生成物である）に従って反応を触媒する。順反応過程では、ＮＡＤ（Ｐ）＋（即ちＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋）はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元される。適当な電流滴定バイオセンサーはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再酸化してＮＡＤ（Ｐ）＋を再生する電気化学メディエーターを提供する。電極で再酸化が生じ、基質の濃度を表す電流を発生する。
【００４４】
１態様では、乾式センサーが提供される。センサーは１対の縦方向の実質的に平行な導電性トラックを支持する細長形電気絶縁キャリヤーを含み、各トラックは読取装置に電気接続するための手段と電極を同一端に備えており、電極の一方は参照／対電極であり、他方は作用電極であり、試薬を含む。センサーは導電性トラック上でその末端間に２個の電極をもつ合成ポリマー（例えばＰＶＣ、ポリカーボネート、ポリエステル又はＶａｌｏｘ等のポリマー混合物）等の電気絶縁キャリヤー材料の支持ストリップとして構成することができる。例えば、電極は図２に示すように、キャリヤーストリップ上に並置した２個の矩形領域の形態をとることができる（即ち電極１４及び１６）。このような領域は分析物を試験するために試料（例えば全血）１滴で覆うようにターゲット域として設計することができる。所望により、液体試料と最適に接触するターゲット域を提供するように非矩形域（例えば菱形、半円形、円形又は三角形域）を使用してもよい。
【００４５】
キャリヤーは少なくとも２個の電極、即ち参照／対電極と作用電極を含む。ダミー電極等の他の電極も加えてもよい。これらの他の電極は作用電極の活性成分の１種以上を含まない以外は作用電極と同様の組成（即ち該当試薬）にすることができる。例えばダミー電極を使用すると、作用電極を流れる電荷からダミー電極を流れる電荷を差し引くと、着目反応による電荷が得られるので、より確実な結果が得られる。
【００４６】
濾過機能を実施するためにターゲット又はその上に膜を設けてもよい。例えば、膜は試料が試験ストリップに侵入する前に試料から血球を濾過することができる。利用可能な市販膜の例としては、Ｈｅｍａｓｅｐ  Ｖ、Ｃｙｔｏｓｅｐ及びＨｅｍａｄｙｎｅ（Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ，Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ１１０５０）が挙げられる。あるいは、濾過又は細胞分離膜を現場成形してもよい。これは、疎水性ポリマー（例えば酢酸セルロース、ポリビニルブチラール及びポリスチレン）及び／又は親水性ポリマー（例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及び酢酸ポリビニル）を成形することにより実施できる。
【００４７】
別の態様では、設計するシステムの信号読取回路に装着するための使い捨て電極ストリップが提供される。ストリップは液体混合物中の分析物を表す電流を検出することができる。ストリップは図２に示すように、読取回路に取り外し可能に装着するように構成された細長形支持体と、支持体に沿って延びており、読取回路に接続するための導電性エレメントを含む第１の導体と、第１の導体に接触するようにストリップに形成され、混合物と接触するように配置された作用電極と、支持体に沿って延びており、読取回路に接続するための導電性エレメントを含む第２の導体と、第２の導電性エレメントに接触しており、混合物と第２の導体を接触させるように配置された参照／対電極を含む。
【００４８】
作用電極は支持体に形成された印刷層を含むことができ、印刷層自体は酵素の基質の反応を触媒することが可能なＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼ酵素を含むことができる。この層は更に、対応するニコチンアミド補因子と、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにより酵素触媒反応と第１の導体の間で電子を移動して酵素と分析物の活性を表す電流を発生することが可能な本発明のメディエーターを含むことができる。
【００４９】
第１の導電性エレメントと作用電極は第２の導電性エレメントと参照／対電極から間隔をあけて配置することができ、電極は１滴の血液又は他の試料で完全に覆うに十分小さい総有効面積となるような寸法と配置にすることができ、一般に反応ゾーンは５ｍｍ２であるが、２５ｍｍ２程度でもよい。試料は酵素の活性を電流滴定検出するために作用電極及び参照／対電極を通って電気回路を設定する。
【００５０】
本発明の好適態様において、作用電極は酵素、ニコチンアミド補因子及びメディエーターだけでなく、測定中にメディエーターの酸化と還元の両方が生じる動的モードで測定した場合に感知される分析物の着目濃度に対して作用電極が単調増加応答を与えるように充填剤及び結合剤成分も含む配合物を使用することにより作製される。この目的は試料を加えたときに作用電極の表面に安定した反応層を提供することである。この結果、試料に溶けにくいメディエーターを使用することができる。メディエーターは酵素、補因子及び分析物との反応により還元されるにつれて電極表面のごく近傍に保持されるので、沈殿に有意損失なしに容易に再酸化することができる。実際にバルク試料からこの反応層への分析物流を測定するので、この反応薄層の維持により小さい総試料容量で全体分析反応を生じることも可能になる。
【００５１】
この反応層は少なくとも再現性動的測定を実施する時間にわたって安定に維持される必要がある。このような測定に一般的な時間は約５〜６０秒間であるが、より長時間にわたって安定であることが好ましい。一般に、着目使い捨て電極ストリップは大量生産されるので、大量製造法における固有ばらつきを考慮するために必要な性質に関して安全性限界をもつことが望ましい。
【００５２】
反応層の安定性は充填剤と結合剤を適正に組み合わせることにより改善することができる。層は所与分析物で着目濃度範囲にわたって動的測定でほぼ直線的な再現性応答を与えるために十分安定していることが好ましい。例えば、ケトン体（ヒドロキシ酪酸として測定）では約１〜８ｍＭであり、グルコースでは約２〜４０ｍＭである。
【００５３】
動的測定は酸化状態と還元状態の間のメディエーターのサイクリングを含む。このサイクリング速度は試験中に観察される電流に反映され、試料中の分析物の濃度に依存する。分析物の濃度が大きいほど、多量の酵素補因子が酵素の分析物酸化過程で還元される。メディエーターは補因子を再酸化すると還元され、その後、電極表面で再酸化される。しかし、溶解度が非常に低いため、還元された補因子との反応に直接利用できるのは少量のメディエーターに限られる。従って、還元された補因子と反応して電極で再酸化されるメディエーターはその後、別の還元補因子と反応し、動的測定の過程を通してこれが繰り返される。従って、還元補因子の濃度が大きいほど（試料中の分析物の濃度が大きいほど）、メディエーターのサイクリング駆動力は大きく、従ってサイクリング速度も高くなる。
【００５４】
場合により、補因子も動的測定中に酸化状態と還元状態のサイクリングに関与することがある。これは、反応層に存在する全分析物を変換するために十分な量の補因子が最初に存在しているか否かに依存する。最初に補因子が十分に存在していない場合には、酸化された補因子が再生されるにつれて再び還元されることにより反応層に残っている分析物の酸化を助長する。
【００５５】
他方、所与濃度の分析物が再現性である結果、特定電極ストリップ設計に動的試験で同一信号が生成され、信号が着目濃度範囲にわたって分析物の濃度と共に単調、好ましくは直線的に増加する（還元するならば信号が分析物濃度の真の関数である）ことも重要である。この結果、電極ストリップの製造業者は標準試験条件下で所与のストリップから得られる任意の所与信号が特定分析物濃度のみに相関するように所与ロットの電極ストリップに普遍的な校正を設定することができる。従って、着目濃度範囲内で分析物濃度以外に実質的に信号に影響する制御不能な変数が存在しないことが重要である。
【００５６】
信号は試験の開始後の指定時刻に観察される電流でもよいし、試験の開始後の指定時刻を含む所定時間にわたって積分される電流（主にこのような所定期間にわたって移動される電荷）でもよい。試験は作用電極と参照／対電極を試料で覆った後、その間に電位を加えることにより実施される。こうして流れる電流を所定期間にわたって観察する。電位は試料が電極を覆うとすぐに加えてもよいし、試料による電極の良好な湿潤を確保するために一般に約３秒間の短い遅延後に加えてもよい。電流又は電流積分を信号として測定するまでの指定時刻は、観察される電流に影響する主要変数を分析物濃度とするために十分長くすべきである。
【００５７】
参照／対電極は従来の銀／塩化銀電極でもよいし、作用電極と同一構造でもよい。１態様では、結合剤と充填剤を含む水性ビヒクルに酵素、補因子及びメディエーターを加えた適当な配合物を２本の個々の導電性トラックの両方に被覆してコーティングを形成してもよい。コーティングが非導電性の場合、例えば充填剤が非導体である場合には、慣用コーティングで両者電極を覆ってもよい。電位を加えると、電極の一方は他方の作用電極で遊離する電子を吸収することにより参照／対電極として機能する。参照／対電極のメディエーターは単にその電極における電子流との相互作用の結果として還元される。
【００５８】
結合剤成分と充填剤成分を作用電極に配合することにより、所望の挙動を生じる反応層が得られる。その目的は、試料を酵素、補因子及びメディエーターと相互作用させるだけでなく、これらの化学的に活性な成分を電極の表面のすぐ近傍に止めることである。結合剤成分は水性媒体の粘度を容易に増加し、膜又は層の形成を助長する材料を含むことが望ましい。このような材料の典型例はグアーガム、アルギン酸塩、イナゴマメガム、カラギーナン及びキサンタン等の多糖類である。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロール、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース及びポリ（ビニルオキサゾリジノン）等の膜形成剤として一般に知られている材料も有用である。充填剤成分は測定に関与する酸化還元反応に対して化学的に不活性であり且つ水性媒体に不溶性の粒状材料が望ましい。導電性でも非導電性でもよい。典型的な材料としては、一般にグラファイト形態のカーボン、二酸化チタン、シリカ及びアルミナが挙げられる。
【００５９】
作用電極は酵素、補因子、メディエーター、結合剤成分及び充填剤成分を水性ビヒクルに配合し、導電性トラックをもつ細長形電気絶縁キャリヤーに付着することにより簡便に作製することができる。配合物はスクリーン印刷等の印刷や他の適当な技術により付着することができる。配合物は更に処理中に酵素を保護する緩衝液、酵素を変性から保護するタンパク質安定剤及び脱泡剤等の他の成分を加えてもよい。これらの付加成分は反応層の性質に作用するものでもよい。
【００６０】
作用電極は一般に約２〜５０μｍ、好ましくは約１０〜２５μｍの乾燥厚さをもつ。実際の乾燥厚さは作用電極を構成する成分を付着するために使用する付着技術にある程度まで依存する。例えば、スクリーン印刷では約１０〜２５μｍの厚さが一般的である。
【００６１】
しかし、反応層の厚さは作用電極の乾燥厚さだけでなく、作用電極に及ぼす試料の作用にも依存する。水性試料の場合には、作用電極成分の組成がこの層の水分吸収度に影響する。
【００６２】
充填剤は一般に水性ビヒクルの約２０〜３０重量％を構成する。他の成分の量は一般に水性ビヒクルの約１重量％未満であり、所望の最終性質を達成するように実験により調節する。例えば、緩衝液とタンパク質安定剤の量は所望度の残留酵素活性を達成するように調節する。この点では、同一最終レベルの酵素活性を達成するように酵素と安定剤の使用量を増減することができる。結合剤と脱泡剤の量は付着法に適した粘度を与えるように調節すべきであり、スクリーン印刷には高粘度が適しており、グラビア印刷には低粘度が適している。
【００６３】
利用可能な水性インク配合物は表２に従って調製することができ、残余の脱泡剤、緩衝液、酵素活性増進剤及び水を加えてインク配合物１ｇとする。
【００６４】
【表２】
0004373604.tif 000007
【００６５】
反応層の安定性は種々の時間遅延でサイクリックボルタンメトリーを使用して容易に評価することができる。作用電極配合物は比較的高濃度の分析物を含む試料に配合物を暴露し、最大値まで定常的に増加する電位を加えた後に非印加電位まで定常的に低下する電位を加えることにより評価される。こうして生じる電流はピーク値まで増加した後、電圧掃引が続くにつれて低下する。このようなサイクリックボルタンメトリー評価は作用電極を試料に暴露してから種々の遅延期間後に実施される。遅延時間の増加に伴うピーク電流の変化は反応層の安定性の尺度である。反応層の安定姓が高いほど、ピーク電流の低下は小さくなる。
【００６６】
本発明の教示に従って作製した作用電極の安定性をＧｅｎｇら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，Ｎｏ．１２（１９９６）の１２６７〜１２７５頁の教示に従って作製した「作用電極」の安定性と比較するために評価を実施した。本発明の作用電極は上記に教示したように充填剤（超微粉カーボン）、結合剤、タンパク質安定剤及び脱泡剤約２５％を加え、Ｇｅｎｇの作用電極はＧｅｎｇの論文の１２６７頁に記載されているように高分子量ポリ（エチレンオキシド）を加えて作製した。各場合とも、作用電極を２０ｍＭグルコース水溶液に３秒間〜６０秒間暴露した後に銀／塩化銀参照電極に対して４００ｍＶまで５０ｍＶ／秒の走査速度で電位を加えた。本発明による配合物は安定的反応層を形成し、６０秒後のピーク電流が３秒後に観察されたピーク電流の６０％であるが、Ｇｅｎｇの論文による配合物は不安定な反応層を形成し、６０秒間暴露後にピーク電流を観察できない。
【００６７】
これは、電極が溶解して試薬がバルク溶液に損失するためであると思われる。各ボルタモグラムを以下に示す。
【００６８】
【表３】
0004373604.tif 000008
【００６９】
本発明の試験ストリップは本明細書に開示する化合物（例えば１，１０−ＰＱ）から選択されるメディエーターを使用してＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼ酵素の基質である分析物を検出することができる。
【００７０】
本発明の試験ストリップは電子装置及び計器システムで使用することを目的とする。これらのストリップは（例えば電極に特定電位を維持することにより）電気化学反応の進行を制御し、反応を監視し、結果を計算及び表示する。この種の試験ストリップと併用する計器システムに望ましい特徴は、試料液による反応ゾーンの湿潤を検出して、適時に測定を開始し、使用者の過誤により生じる誤差の可能性を低下できることである。この目的は、ストリップを計器に挿入するとすぐに試験ストリップの電極に電位を加えることにより達成することができ、この電位は測定開始前に湿潤を完了できるようにすぐに除去することができる。
【００７１】
計器は更に種々の分析物を測定するための試験ストリップを自動的に認識するための手段を備えることができる。これは、例えば１個以上の回路ループを試験ストリップに印刷すると達成することができ、各ループは米国特許第５，１２６，０３４号、第４欄、３〜１７行に記載されているようにストリップの型に特徴的な抵抗を提供することができる。別の代替例として、試験ストリップの近端にノッチ又は他の形状を切り込み、計器のスイッチ又は光学検出器により各ノッチの有無を検出してもよい。他のストリップ型認識技術としては、ストリップの色を変え、色範囲を識別することが可能な光検出器を計器に備えたり、バーコード、磁気ストリップ又は他のマーキングをストリップに備え、計器に適当な読取装置を備えてもよい。
【００７２】
大量生産用試験ストリップの１例では、ストリップ電極は参照／対電極と作用電極を含む２電極構造をもつ。キャリヤーはポリ（塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリエステル、紙、板紙、セラミック、セラミック被覆金属、これらの材料のブレンド（例えばポリカーボネートとポリエステルのブレンド）、又は別の絶縁物質等の電気絶縁表面をもつ任意材料から作製することができる。
【００７３】
スクリーン印刷等の付着法により導電性インクをキャリヤーに付着する。この層は計器を試験ストリップとインタフェースさせる接触域を形成し、接点とストリップ上の活性化学の間に電気回路を提供する。インクは例えば風乾有機カーボン混合物とすることができる。あるいは、水性カーボンインクや、銀、金、白金及びパラジウム等の金属インクでもよい。インクを乾燥又は硬化させる他の方法としては、赤外線、紫外線及び高周波照射が挙げられる。
【００７４】
銀／塩化銀混合物を含む有機溶剤系インクを使用して参照／対電極を形成する層を印刷する。代替参照対としては、Ａｇ／ＡｇＢｒ、Ａｇ／ＡｇＩ及びＡｇ／Ａｇ２Ｏが挙げられる。印刷はカーボン印刷の中央トラックを部分的に覆い、反応ゾーンまで延びる。各トラックの総電気抵抗を低下させるようにこの印刷の各部分が反応ゾーンの外側の他のカーボントラックの部分を覆うように延びているならば有用である。
【００７５】
場合により、印刷カーボン及び銀／塩化銀層の大部分を覆うように誘電インク層を印刷してもよい。この場合には、図１及び２に示すように電気接触域と反応ゾーンの下の感知域との２領域を被覆せずにおく。この印刷は反応ゾーンの領域を規定し、露出したトラックを短絡から保護するように機能する。
【００７６】
作用電極については、本発明の酵素、補因子及びメディエーターを付着するように、反応ゾーン内の導電性トラックの１本の上の規定領域内に１種以上のインクを厳密な厚さに付着する。これはスクリーン印刷により実施すると簡便である。このインクの他の付着方法としては、インクジェット印刷、滴定、グラビア印刷、フレキソ印刷及び凸版印刷が挙げられる。場合により、第２の部分活性インクを第２の導電性トラックに付着し、ダミー電極を形成してもよい。
【００７７】
インク配合物には場合により多糖滴定類を加えてもよい。利用可能な多糖類としては、グアーガム、アルギン酸塩、イナゴマメガム、カラギーナン及びキサンタンが挙げられる。インクは更に膜形成剤を加えてもよく、利用可能な膜形成ポリマーとしてはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロール、酢酸セルロース、ＣＭＣ及びポリ（ビニルオキサゾリジノン）が挙げられる。インク充填剤としては二酸化チタン、シリカ、アルミナ又はカーボンが挙げられる。
【００７８】
以下、実施例により本発明を非限定的に説明する。
【００７９】
実施例１
メディエーター：
メルドラブルー（ＭＢ）（化合物３）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．からヘミＺｎＣｌ２塩として入手した。２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）（化合物６）とＴｒｉｓ緩衝液はＳｉｇｍａから購入した。リン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）溶液（ダルベッコ組成）はＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｃｉｄａｌｓ，Ｌｔｄ．から市販されているタブレットから調製した。
【００８０】
シュードモナス種からのＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤＨ；ＥＣ１．１．１．３０）はＴｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。ｐ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＤ，Ｌ−３−ヒドロキシ酪酸はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製品とした。
【００８１】
１，１０−フェナントリリンキノン（１，１０−ＰＱ）（化合物７）はＧｉｌｌａｒｄら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａ，１４４７−１４５１，１９７０）の方法に従って調製した。１，７−フェナントロリンキノン（１，７−ＰＱ）（化合物８）はＥｃｋｅｒｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２５５３−２５３６，１９８２）により記載されている方法を使用して合成した、２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンキノン（２，９−Ｍｅ２−１，１０−ＰＱ）（化合物１０）はＭｕｌｌｉｎｓら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，７５−８１，１９９６）により開示されているようにネオクプロインの硝酸化の副生物として合成した。メト硫酸１−メトキシフェナジン（１−ＭｅＯ−ＰＭＳ）（化合物５）はＳｕｒｒｅｙ（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．３，Ｅ．Ｃ．Ｈｏｒｎｉｎｇ編，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７５３−７５６）により記載されている方法を応用した１−メトキシフェナジンのメチル化により調製した。１−メトキシフェナジンはＹｏｓｈｉｏｋａ（Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，７３：２３−２５，１９５３）により報告されているように変形Ｗｏｈｌ−Ａｕｅ反応により合成した。４−メチル−１，２−ベンゾキノン（４−Ｍｅ−ＢＱ）（化合物４）はＣａｒｌｓｏｎら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：４７９−４８５，１９８５）による一般手順に従って４−メチルカテコールをｏ−クロラニルで酸化することにより調製した。１，１０−ＰＱ錯体［Ｒｕ（ｂｐｙ）２（１，１０−ＰＱ）］（ＰＦ６）２（化合物１２）はＧｏｓｓら（Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４：４２６３−４２６７，１９８５）により報告されているように［Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２］（Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から入手した。
【００８２】
トリフルオロメタンスルホン酸１−Ｍｅ−１，１０−フェナントロリニウムキノン（１−Ｍｅ−１，１０−ＰＱ＋）（化合物１１）の調製：
トリフルオロメタンスルホン酸メチル（Ａｌｄｒｉｃｈ）（１．０ｍｌ）を窒素下に１，１０−ＰＱ（０．５０ｇ，２．３８ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（２５ｍｌ）溶液に加えた。すぐに沈殿が生じ、得られた混合物を２４時間撹拌した。濾過後に塩化メチレンで洗浄すると、１−Ｍｅ−１，１０−ＰＱ＋（０．６５ｇ，７３％）が黄色い微粉末として得られた。
【００８３】
乾式ストリップにおけるＮＡＤＨメディエーターとしてのメルドラブルーと１，１０−ＰＱの評価：
３．５ｍｇ／ｇインクの濃度で１，１０−ＰＱとＭＢを含有する有機カーボンインクからこれらのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含むスクリーン印刷電極を作製した。固体メディエーターを市販導電性カーボンインク（Ｇｗｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に混合した。
【００８４】
１，１０−ＰＱを含む電極を印刷Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋４００ｍＶの平衡電位でＰＢＳ中ＮＡＤＨ水溶液（０〜１６．７ｍＭ）で試験した用量応答曲線を図３に示す。０．５８μＡ  ｍＭ−１ＮＡＤＨの傾きが記録された。ＭＢを含む電極を印刷Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋１００ｍＶの平衡電位でＮＡＤＨ水溶液（０〜１２．４ｍＭ）で試験した用量応答曲線を図４に示す。傾きは８．４８μＡ  ｍＭ−１ＮＡＤＨに増加した。
【００８５】
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼのメディエーター阻害の評価
Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．２）中に５０Ｕ／ｍｌ  ＨＢＤＨと、ＭＢ（３）、４−Ｍｅ−ＢＱ（４）、１−ＭｅＯ−ＰＭＳ（５）、ＤＣＩＰ（６）、１，１０−ＰＱ（７）、１，７−ＰＱ（８）、２，９−Ｍｅ２−１，１０−ＰＱ（１０）、１−Ｍｅ−１，１０−ＰＱ＋（１１）及び［Ｒｕ（ｂｐｙ）２（１，１０−ＰＱ）］（ＰＦ６）２（１２）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈメディエーター１，２９又は２．５８ｍｇを各々含む１８種の溶液（各２．５ｍｌ）を調製した。酵素を含み且つメディエーターを含まない対照溶液も調製した。溶液を０．５時間３７．５℃でインキュベートした後、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸キットを使用して３４０ｎｍでＮＡＤＨを（３回ずつ）アッセイした。添加したメディエーターが対照に比較してアッセイ速度を妨害する程度に基づき、ＮＡＤＨの酸化剤としてのメディエーターの効果を定量的に測定した。
【００８６】
次にマイクロ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でポリスルホン膜（公称分子量カットオフ：３０，０００）で濾過することにより酵素をメディエーター溶液から再単離した。フィルターに残っている酵素をＴｒｉｓ緩衝液（０．２ｍｌ）に溶かし、得られた溶液をＳｉｇｍａキットで（３回ずつ）アッセイした。濾過前後のアッセイの結果を比較することにより、共有的及び／又は不可逆的に結合したメディエーターが酵素活性に及ぼす効果を測定することができた。
【００８７】
濾過前後の各溶液の２種のアッセイの結果を表３にまとめる。
【００８８】
【表４】
0004373604.tif 000009
【００８９】
これらの結果によるとフェナントロリンキノンメディエーターはメルドラブルーと１−ＭｅＯ−ＰＭＳに比較して効率の低いＮＡＤＨメディエーターであった（即ち「濾過前」のアッセイ速度は低い程度までしか抑制されなかった）が、１，１０−ＰＱ、１，７−ＰＱ、１−Ｍｅ−１，１０−ＰＱ又は［Ｒｕ（ｂｐｙ）２（１，１０−ＰＱ）］（ＰＦ６）２を含む溶液では「濾過後」に元の酵素活性の９０％以上が復元された。ＭＢ、１−ＭｅＯ−ＰＭＳ、ＤＣＩＰ又は４−Ｍｅ−ＢＱではそうではなかった。実際に、キノンメディエーター４−Ｍｅ−ＢＱは最も強力な阻害剤であり、「濾過後」に元の活性の４％しか維持されないことが判明した。従って、後者４種のメディエーターはＨＢＤＨを部分的に不活化するが、新規に記載するメディエーターは酵素活性に殆ど又は全く影響がないという利点があった。
【００９０】
各メディエーターの残留酵素活性百分率を図５に棒グラフで示すように、本発明のメディエーター（黒の棒で示す）はＨＢＤＨの強力な阻害剤ではない。他方、図５にグレーの棒で示すように、ＭＢ、４−Ｍｅ−ＢＱ、１−ＭｅＯ−ＰＭＳ及びＤＣＩＰはいずれもＨＢＤＨを不可逆的に阻害し、４３〜９６％の活性低下を伴った。
【００９１】
実施例２
ＨＢＤＨを含む乾式ストリップにおけるメルドラブルーと１，１０−ＰＱの評価
夫々２．４又は４．３ｍｇ／ｇインクの１，１０−ＰＱ又はＭＢと、酵素ＨＢＤＨ（１２０単位／ｇインク）及びＮＡＤ＋（１１０ｍｇ／ｇインク）を含む水性カーボンインクからスクリーン印刷電極を作製した。インクに多糖結合剤も加えた。
【００９２】
１，１０−ＰＱを含む電極の用量応答曲線を図６に示す。印刷Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋４００ｍＶの平衡電位でＰＢＳ中Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸水溶液（０〜２５ｍＭ）で４、１４及び２６週間保存（３０℃、乾燥）後に試験した。全３種の用量応答は非直線的であり、２４ｍＭ  Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸で８．５μＡの電流が記録された。こうして、乾式電極の応答は少なくとも２６週間安定していることが判明した。
【００９３】
ＭＢを含む電極の用量応答曲線を図７に示す。印刷Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋１００ｍＶの平衡電位でＰＢＳ中Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸水溶液（０〜２８ｍＭ）で２及び１４週間保存（３０℃、乾燥）後に電極を試験した。用量応答曲線は図４と同様であった。これらの電極では、２週間保存後に２４ｍＭ  Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸で８．６μＡの電流が記録された。これは、１，１０−ＰＱを含む乾式ストリップから得られる応答にほぼ等しい。
【００９４】
この結果、ＭＢ等の化合物はＨＢＤＨを阻害するという事実により１，１０−ＰＱに比較してＮＡＤＨを非常に効率的に媒介できることが判明した。更に、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に対する電極応答の安定性はＭＢによるＨＢＤＨの不活化により低下する。図７はこれらの電極の応答が１４週間保存後に約７％の許容不能な限界まで低下したことを示している。
【００９５】
要約すると、本発明のメディエーターを含むバイオセンサー電極は少なくとも２６週間保存後に安定した応答を示した。他方、不可逆的酵素阻害剤であるＭＢ等の慣用メディエーターを含む電極は僅か１４週間保存後に応答の低下を示した。
【００９６】
実施例３
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む乾式ストリップにおける１，１０−ＰＱの評価
夫々２．４又は４．３ｍｇ／ｇインクの１，１０−ＰＱ又はＭＢと、酵素グルコースデヒドロゲナーゼ（１２０単位／ｇインク）及びＮＡＤ＋（１１０ｍｇ／ｇインク）を含む水性カーボンインクからスクリーン印刷電極を作製した。インクに多糖結合剤も加えた。
【００９７】
電極の校正用量応答曲線を図８に示す。３．３〜２６ｍＭの生理的該当濃度のグルコースを含む全血で電極を試験した。印刷Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋５０ｍＶの平衡電位を維持した。電極はグルコース濃度範囲にわたって直線応答を生じた。従って、本発明のメディエーターは特に低い印加電位で運転する臨床的に有用なグルコースセンサーを作製するために使用できることが判明した。
【００９８】
実施例４
銀／塩化銀参照／対電極と表２の配合物をスクリーン印刷することにより作製した作用電極を備える図１及び２に示す構造を使用して電極ストリップを作製した。一方の場合には充填剤として２５重量％の超微細カーボンを加え、他方の場合には充填剤として２５重量％のチタニアを加えた。いずれの場合も酵素はグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、補因子はＮＡＤ、メディエーターは１，１０−ＰＱ、結合剤はグアーガム、タンパク質安定剤はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、緩衝液はＴｒｉｓ（．３２５重量％）とした。
【００９９】
参照／対電極と作用電極をグルコース水溶液に浸しながら両電極間に２００ｍＶ電位を加えることにより、これらの電極ストリップを評価した。電位を加えてから１５〜２０秒後に観察された電流を積分し、試験溶液のグルコース濃度に対してプロットした。カーボンを充填した配合物は２．６マイクロクーロン／ｍＭグルコースの傾きと−１マイクロクーロンのＸ軸インターセプトを与え、チタニアを充填した配合物は１．５マイクロクーロン／ｍＭグルコースの傾きと０．６マイクロクーロンのＸ軸インターセプトを与えた。プロットは以下の通りであった。
【０１００】
【表５】
0004373604.tif 000010
【０１０１】
他の態様
以上、好ましい態様について本発明を説明したが、上記説明は発明の例示を目的とし、その範囲を制限するものではないと理解すべきである。他の側面、利点及び変形も発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の１態様による電極ストリップの分解図である。
【図２】  組立後の電極ストリップを示す。
【図３】  １，１０−フェナントロリンキノンを含む印刷電極のＮＡＤＨ濃度（ｍＭ）に対する電流（μＡ）のグラフプロットである。
【図４】  メルドラブルーを含む印刷電極のＮＡＤＨ濃度（ｍＭ）に対する電流（μＡ）のグラフプロットである。
【図５】  種々のメディエーターと共にＨＢＤＨをインキュベーション後の残留酵素活性（即ち初期活性に対する百分率）を示す棒グラフである。
【図６】  ４、１４及び２６週間後に試験した１，１０−フェナントロリンキノン、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋を含む印刷電極のＤ−３−ヒドロキシ酪酸濃度（ｍＭ）に対する電流（μＡ）のグラフプロットである。
【図７】  夫々２及び４週間後に試験したメルドラブルー、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋を含む印刷電極のＤ−３−ヒドロキシ酪酸濃度（ｍＭ）に対する電流（μＡ）のグラフプロットである。
【図８】  １，１０−フェナントロリンキノン、グルコースデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋を含む印刷電極の全血中グルコースに対する校正応答のグラフプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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