(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリンツメタル狭心症治療薬のスクリーニングのための，内向き整流カリウムチャネルKir6.1遺伝子の欠損に関してホモ接合体であるマウスの使用。
【請求項２】
該マウスが，（ａ）生後６週までにおける半数を超える突然死，（ｂ）不整脈，及び（ｃ）心電図における自発性のＳＴセグメント上昇のうちの少なくとも何れかを呈することを特徴とするものである，請求項１の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトにおけるプリンツメタル（Prinzmetal）狭心症のモデル動物である内向き整流カリウム（Ｋ+）チャネルKir6.1欠損マウスに関する。
【発明の属する技術分野】
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
内向き整流カリウムチャネル（Kir）は、生理学的に重要な多くの役割を演じている（１）。配列の類似性に基づいて、Kirファミリーは現在７つのサブファミリー、すなわちKir1.x〜Kir7.xに分類されている（１〜３、２７）。Kir6.1及びKir6.2を含むKir6.xサブファミリーのメンバーは、Kirファミリーの他のメンバーと異なり、それら自身のみでは機能するＫ+チャネルを細胞膜表面に形成できず、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の治療に広く用いられているスルフォニルウレア化合物の受容体である制御SURサブユニット（４〜６）を必要とするという点で独特である。スルホニルウレア受容体には、２種の異なった遺伝子に基づく２つのアイソフォームSUR1、SUR2（７）がある。加えて、SUR2には、SUR2A（７）及びSUR2B（８）を主とする数種のスプライス・バリアント（splicing variants）がある。Kir6.2サブユニットとSUR1、SUR2A、SUR2Bその他のSUR2バリアント・サブユニットとの共発現は、異種発現系において、明確な対ヌクレオチド及び対薬物感受性を伴ったＫATPチャネル電流を生み出す（４〜６）。Kir6.2サブユニット及びSUR1サブユニットは、膵β細胞（９）及び腹側正中視床下部（ventromedial hypothalamus: VMH）のグルコース応答性ニューロン（GRNs）において、ＫATPチャネルを構成している（１０）。Kir6.2サブユニット及びSUR2Aサブユニットは、心筋細胞において、及び、おそらく骨格筋細胞においても（７）、ＫATPチャネルを構成している。Kir6.2サブユニット及びSUR2Bサブユニットは、血管以外の平滑筋においてＫATPチャネルを構成している（８）。Kir6.2ノックアウトマウスの研究が、Kir6.2を含むＫATPチャネルの多くの生理学的役割を明らかにしてきた。例えば、膵β細胞におけるKir6.2／SUR1チャネルが、それぞれ、グルコース誘発性の及びスルホニルウレア誘発性のインスリン分泌の双方において極めて重要であり（１１）、一方、VMHにおいては、Kir6.2／SUR1チャネルは、低血糖に際した自律神経性ニューロンによるグルカゴン分泌に関与している（１０）。SUR1ノックアウトマウスの研究はまた、インスリン分泌におけるKir6.2／SUR1チャネルの重要性を確認している（１２）。Kir6.2／SUR2Aチャネルは、Ｋ+チャネルオープナー（KCOs）により誘発される心臓の興奮性と収縮性の抑制を仲介するとともに（１３）、虚血プレコンディショニング（ischemic preconditioning）に部分的に貢献している（１４）。加えて、SUR2ノックアウトマウスの研究のいて、骨格筋におけるKir6.2を含んだＫATPチャネルが、グルコース取り込みに関与していることが示されている（１５）。復元した系において、Kir6.1サブユニット及びSUR1（１６，１７）、SUR2A（１８）、又はSUR2B（１９〜２１）サブユニットは、種々の電気生理学的及び薬理学的特性を持ったＫ+チャネル電流を生ずることが示されているが、自然状態で組織に存するKir6.1サブユニットと各SURサブユニットの実際の組み合わせ及びそれらの生理学的役割は、確認されていない。
【０００３】
Kir6.1（アミノ酸配列を配列番号１に示す。）はそのアイソフォームであるKir6.2と63.7％のアミノ酸同一性を有している。加えて、一般に内向き整流Ｋ+チャネルはイオン透過性領域（H5）においてGly-Tyr-Glyを有しているのに対して、Kir6.1とKir6.2は両方ともGly-Phe-Glyモチーフを同領域に有している（６）。このように、Kir6.1とKir6.2とは、構造的に非常によく似ている。Kir6.2を含んだＫ+チャネルの電気生理学的及び薬理学的性質は、復元した系（７〜９）や自然状態での細胞（１０、１１、１３）においてよく特徴づけがなされているが、Kir6.1を含んだＫ+チャネルのそれらは、十分には理解されていない。HEK293細胞におけるKir6.1とSUR1の共発現は、トルブタミド感受性Ｋ+チャネル電流を誘発し（１６）、他方、COS7細胞におけるKir6.1とSUR2Aの共発現は、非常に高濃度のUDPに対して応答性の電流を生ずるが（１８）、しかしそれらの生理学的意義は知られていない。Kir6.1とSUR2B（HEK293T細胞におけるSUR2Aのスプライス・バリアント）の共発現は、Ｋ+電流を生み出し、それはATPに対しては感受性がなく、UDP等のようなヌクレオシド二リン酸によって活性化され、そしてスルホニルウレアであるグリベンクラミド（１９）によって阻害される。これらの性質は、自然状態での血管平滑筋のＫNDPチャネルにの性質と類似している（２８）。血管平滑筋におけるＫNDPチャネルは、ＫATPチャネル遮断薬であるグリベンクラミドにより閉じられることから（２９）、当初、平滑筋ＫATPチャネルと呼ばれていたが、ATPに対して感受性がないことから（２８）、現在はＫNDPチャネルと呼ばれるようになっている。クロマカリム（cromakalim）やピナシジルなどのような血管拡張効果を有するK+チャネルオープナーが、KNDPチャネルを開くことから、このチャネルは、血管平滑筋の拡張応答に関与していると考えられている。しかしながら、Kir6.1が自然状態で血管平滑筋のKNDPチャネルの構成要素であるか否かは、判っていない。
【０００４】
一方、安静時の狭心発作に可逆性の一過性ＳＴ上昇を伴うヒトの狭心症の一型として、プリンツメタル狭心症（異型狭心症とも呼ばれる）が知られている。プリンツメタル狭心症の発作は安静時、特に夜間から早朝にかけての睡眠中に出現する。心電図上、発作時に、典型的な狭心症では通常低下するはずの誘導で、ＳＴ部分の上昇が見られるという特徴を示すと共に、心室性期外収縮、房室ブロック、心室細動等の不整脈がしばしば出現する。太い冠状動脈の攣縮による冠血流量の急激な減少が、この発作を引き起こすと考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Kir6.1を含むＫ+チャネルの生理学的役割を明らかにするための手段として、且つ、Kir6.1の機能不全に関連付けられる疾患、特にプリンツメタル狭心症の治療薬の探索のための手段として有用なモデル動物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、遺伝子ターゲッティングの手法により、Kir6.1遺伝子を破壊し、該破壊に関してホモ接合体であるマウス（Kir6.1-/-マウス）を作成した。更に、Kir6.1遺伝子産物を全く発現しない該マウスを用いて、Kir6.1を含んだチャネルが、血管の緊張の制御に極めて重要であること、及びマウスにおけるその遺伝子の破壊が、ヒトにおけるプリンツメタル狭心症（異型狭心症）様の、自発性の心虚血によって引き起こされる不整脈（房室ブロック）に関連付けられる突然死を、高い比率で起こすことを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、内向き整流カリウムチャネルKir6.1遺伝子の欠損に関してホモ接合体であるマウス（Kir6.1-/-マウス）を提供する。該ホモ接合体マウスは、プリンツメタル狭心症の発症メカニズム解明及びその治療薬のスクリーニングのために使用することができる。
【０００８】
更に本発明は、内向き整流カリウムチャネルKir6.1遺伝子の欠損に関してヘテロ接合体であるマウス（Kir6.1+/-マウス）をも提供する。該へテロ接合体マウスは、互い同士の交配と、生まれた仔マウスの選別とによる、上記ホモ接合体マウスの再生産ための手段としての親マウスとして使用することができる。
【０００９】
更に本発明は、該ホモ接合体マウス及びヘテロ接合体マウスの心臓その他の臓器、及び、組織、特に心筋組織及び大動脈平滑筋組織その他の血管組織、並びに、心臓、及び血管平滑筋細胞その他の細胞をも提供する。これらの組織、臓器及び細胞は、プリンツメタル狭心症に対する、及びKir6.1の異常が関連する他の疾患に対する、治療薬のスクリーニングのために使用することができる。
【００１０】
後述のように、Ｋ+チャネルオープナー（channel opener）であるピナシジルは、Kir6.1-/-マウスの血管平滑筋細胞においてＫ+電流を誘発せず、またKir6.1-/-マウスは、ピナシジルに対する血管拡張応答も欠いていた。血管収縮薬であるメチルエルゴメトリンの投与は、Kir6.1-/-マウスにおいて、ＳＴ上昇およびこれに続く心臓死を誘発したが、野生型マウス（Kir6.1+/+）ではこれは見られなかった。このことは、ヒトにおける冠動脈の収縮性亢進によって特徴付けられるプリンツメタル狭心症に類似の表現型を、Kir6.1-/-マウスがとっていることを示している。すなわち、これらの結果は、Kir6.1を含んだK+チャネルが、血管の、特に冠動脈の緊張の制御に極めて重要であること、及び、その破壊がプリンツメタル狭心症の発症に関与していることを示している。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定されることは意図しない。
【実施例】
〔Kir6.1-/-マウスの作成〕
＜Kir6.1-/-マウスの遺伝子ターゲティング＞
本発明らは、チャネルのポア形成領域を含んだKir6.1遺伝子のイントロン２及びエキソン３の一部を置換（図１）することによって、Kir6.l欠損マウスを作り出した。すなわち、129Svマウスゲノムライブラリー（λDASHファージライブラリー中）をマウスKir6.1 のコード領域の全長ｃＤＮＡ（配列番号２）（ヌクレオチド１〜1275）を用いてスクリーニングした。12個の陽性クローンを単離し、制限酵素マップを作成した。得られた制限酵素マップをもとに、ターゲティングベクターを、マウスKir6.1遺伝子のエキソン３より約1.2ｋｂ上流にあるイントロン２内のXbal部位から、エキソン３内にあるMroI部位までの断片をネオマイシン耐性遺伝子カセットで置き換える形で作成した。５’側アームとして3.8ｋｂ、３’側アームとして7.0ｋｂのゲノム断片を用いた。負の選択のため、チミジンキナーゼカセットをターゲティングベクターの３’末端に付加した。ターゲティングベクターを、ＥＳ細胞株（Ｒ１）にエレクトロポレーションで導入し、トランスフェクション後８日目に130の生存クレーンを採取した。相同組換えクローンは、サザンブロットで同定した。プローブとしてターゲティングベクターの５’側アームよりも上流の2.4ｋｂのゲノム断片（SphI〜XhoI断片）を用い、ゲノムＤＮＡはSphIで消化した。14個のＥＳ細胞クローンにおいて相同組換えが起きているのが判明した。これらのクローンを用いて、細胞集合によりキメラマウスを作り出し、４個の独立のマウス株を確立した。Kir6.1遺伝子が破壊されていることは、ゲノムサザンブロット及びノーザンブロットにより確認した。これらのマウスをC57BL6マウスと戻し交配した。
【００１２】
ヘテロ接合体（Kir6.1+/-）のマウスを交配することによって、ホモ接合体（Kir6.1-/-）のノックアウトマウスを作成した。相同組換えは、マウスの尾から単離したゲノムDNAのサザンブロットによって、下記のようにして確認した（図２）。更に、Kir6.1 mRNAの発現欠如も確認し、そしてKATPチャネルの種々のサブユニット（Kir6.2、SUR1及びSUR2）のmRNA発現レベルの変化の有無を、ノーザンブロットにより下記のようにして調べた（図３）。Kir6.2、SUR1及びSUR2のmRNA発現は、Kir6.1+/+（野生型）及びKir6.1-/-のマウスで同様であった。このことは、それらの制御はKir6.1からは独立していること、及びKir6.2その他のサブユニットが、転写レベルでKir6.1の欠損を補填することができないことを示している。
【００１３】
＜サザンブロット及びノーザンブロット解析の方法＞
標準的方法により、マウスの尾及び各種組織から、ゲノムＤＮＡ（サザンブロット用）及び総ＲＮＡ（ノーザンブロット用）を調製した。ＤＮＡ（10μｇ）又はＲＮＡ（20μｇ）を１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に移し取った。高ストリンジェント条件で、32Ｐ標識プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。サザンブロットに用いたプローブは、図１に示したKir6.1のゲノムＤＮＡ断片（SphI部位からBamHI部位まで）（配列番号３）であった。ノーザンブロットに用いたプローブは、それぞれ次の通りであった。
（１）マウスKir6.1のｃＤＮＡ断片〔GenBank Accession No. D88159のヌクレオチド配列（配列番号４）（５’側非翻訳領域のヌクレオチド1〜203及び３’側非翻訳領域のヌクレオチド1479〜1712を含む）のヌクレオチド１〜1330に対応する断片〕
（２）マウスKir6.2のｃＤＮＡ断片〔GenBank Accession No NM_010602のヌクレオチド配列（配列番号５）のヌクレオチド＋134〜＋1064に対応する断片〕
（３）ヒトＳＵＲ１のｃＤＮＡ断片〔GenBank Accession No AF087138のヌクレオチド配列（配列番号６）のヌクレオチド185〜1250に対応する断片〕
（４）ラットＳＵＲ２のｃＤＮＡ断片〔ラットＳＵＲ２Ａ、GenBank Accession No NM_013040のヌクレオチド配列（配列番号７）のヌクレオチド39〜1118に対応する断片〕
【００１４】
〔Kir6.1-/-マウスの飼育・観察〕
136匹の仔マウスの分析により、Kir6.1-/-マウスの数は、メンデルの遺伝法則から期待されるところに比して僅かに（約５％）低いに過ぎないことが判明した。しかしながらKir6.1-/-マウスは、成熟前の死亡を起こしやすく、大半は生後５週と６週の間に死亡する（図４）。これらの動物は、正常な挙動と活動性レベルの観察されたときから24時間以内に死亡、いわゆる突然死をしているのが発見された。
【００１５】
〔薬物〕
以下の実験において、次の薬物を使用した：ピナシジル（SIGMA）、グリベンクラミド（SIGMA CHEMICAL）。ピナシジルは、0.1Ｎ塩酸含有生理食塩水に溶解させた。グリベンクラミドは、ＤＭＳＯに溶解させた（試験中の溶媒の最終濃度は0.1未満）。
【００１６】
〔統計解析〕
実験における全てのデータは平均±ＳＥで表した。データの統計解析は、野生型とKir6.1-/-マウスについての分散分析（ANOVA）を用いて行い、ｐ＜0.05を有意とみなした。
【００１７】
〔心電図によるマウス心臓の電気生理学的検討〕
Kir6.1-/-マウスの突然死に心臓の電気生理学的機能不全が寄与しているのか否かを判定するため、野生型（Kir6.1+/+）マウス及びKir6.1-/-マウスの心電図を、埋め込み型ラジオテレメトリーを用いてモニターした（図５〜８）。
無拘束状態における覚醒マウスの心電図の記録は、通常の端子II位置に設置した皮下端子を用い、埋め込み式高周波発信機（TA10ETA-F20）（DATA SCIENCES, St. Paul, MN）によって行なった。麻酔マウス及び単離心臓（ランゲンドルフ（Langendorff）灌流心臓）の心電図は、身体表面（端子II）又は心外膜に端子を設置して記録した。
モニター期間の大半において、Kir6.1-/-マウス（ｎ＝４）の心拍数（ＨＲ、ｂｐｍ）及びQRS時間（ｍｓ）及びPR間隔（ｍｓ）は、野生型マウス（ｎ＝４）と同様であった（図５）。しかしながら、Kir6.1-/-マウスは全て（４／４）、数秒から殆ど１分にわたって持続する、自発性のSTセグメント上昇を示した（図６）。ST上昇開始から数秒ないし２、３分の潜伏時間の後、全例において様々な程度の房室（AV）ブロックが現れた（図６〜８）。Kir6.1-/-マウスのすべて（４／４）において、１回目、２回目及び３回目の房室ブロックが認められたが、Kir6.1+/+マウスにおいては、ST-Tの変化や房室ブロックの兆候はなかった（０／４）。Kir6.1-/-マウスの４匹中２匹は、記録期間中に死亡し、持続的な３回目の房室ブロックをもたらす自発性のST上昇を示し、そのとき、心拍停止に至るまでＲ−Ｒ間隔が徐々に延長した。従って、Kir6.1-/-マウスの死亡原因は、心筋虚血に関連付けられると思われる。
【００１８】
〔心筋細胞の電気生理学的検討〕
Kir6.1は、心臓（２４）に最も豊富に発現され、心筋細胞に存在する（２５）。そこで、Kir6.1+/+マウス及びKir6.1-/-マウスから単離した心室心筋細胞の電気生理学的性質を比較した。擬似定常状態の膜電流は、ランプ（ramp）パルスプロトコールを用いて記録した。
すなわち、個々の心室細胞を酵素により単離し、細胞全体の膜電流をパッチクランプ法（１３）により記録した。ピペット溶液は、20ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのホスホクレアチン二カリウム、110ｍＭのアスパラギン酸一カリウム、１ｍＭのＡＴＰ二カリウム、10ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＣａ8.0、ｐＨ７．４）よりなるものとした。用いた外液は、143ｍＭのＮａＣｌ、5.4ｍＭのＫＣｌ、1.8ｍＭのＣａＣｌ2、0.5ｍＭのＭｇＣｌ2、0.33ｍＭのＮａＨＰＯ4、5.5ｍＭのグルコース、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ7.4）を含有するＨＥＰＥＳ−タイロード液とした。心臓の細胞における電圧及び電流クランプ実験は、36.0℃にて行った。
結果：
Kir6.1+/+マウス（３匹からの６細胞）及びKir6.1-/-マウス（３匹からの５細胞）の何れの心室細胞も、逆転電位がカリウム平衡電位に近かった（図９）。両細胞において、Ｋ+チャネルオープナーであるピナシジル（pinacidil）は、濃度依存性の外向き電流増大を示し、それは１μＭのグリベンクラミドによって遮断された。このことは、ＡＴＰ感受性Ｋ+電流（ＩK,ATP）であることを示している。対照条件においても、また１、10、100μＭのピナシジル又は100μＭピナシジル＋１μＭグリベンクラミド添加後においても、０ｍＶにおいて、Kir6.1+/+マウス及びKir6.1-/-マウスの間で、外向き電流の密度に有意差はなかった。Kir6.1+/+及びKir6.1-/-心室細胞の間で、ベースライン活動電位パラメータに有意差はなかった。ピナシジルは、Kir6.1+/+心室細胞（４匹からの14細胞）及びKir6.1-/-心室細胞（４匹からの９細胞）の双方において、活動電位持続時間を（APD）を短縮した（図１０）。Kir6.1+/+細胞及びKir6.1-/-細胞の90％再分極レベルでのAPD（APD90）は、100μＭのピナシジルにより、31.6±2.3ｍｓから18.3±2.2ｍｓへと、及び31.1±4.2ｍｓから18.3±3.9ｍｓへと、それぞれ有意に短縮され、これらは、１μMのグリベンクラミド添加後、対照のレベルへと復帰した。
【００１９】
〔大動脈血圧の測定〕
Ｋ+チャネルオープナーは、血管のＫATPチャネルを開くことによって血管平滑筋を弛緩させることで、動脈血圧を低下させることが知られている。そこで本発明らは、Ｋ+チャネルオープナーであるピナシジルに対する、Kir6.1+/+マウス及びKir6.1-/-マウスの血管拡張応答を、インビボ（in vivo）で先ず検討した。
鈴木等（１２）の方法と同様にして、血液動力学的測定を行なった。0.3ｍｇ／ｋｇのピナシジルの静注後の平均動脈圧（MAP）の変動を、縦座標に記した。各点は、両群について各６匹の動物の平均±ＳＥを示す。
結果：
マウスの心拍数（HR）及び平均動脈圧（MAP）を含む基底血液動力学値は、ウレタン麻酔下のKir6.1+/+マウス及びKir6.1-/-マウスにおいて、同様であった［それぞれ、HRは、Kir6.1+/+マウスで602±28拍／分、Kir6.1-/-マウスで659±17拍／分、MAPはKir6.1+/+マウスで65±9ｍｍＨｇ、Kir6.1-/-マウスで67±7ｍｍＨｇ］。ピナシジルの静注（0.3ｍｇ／ｋｇ）は、MAPを、Kir6.1+/+マウスでは５分以内に約30ｍｍＨｇ低下させたが、Kir6.1-/-マウスでは低下させなかった（図１１）。
【００２０】
〔単離大動脈における大動脈収縮の測定〕
Kir6.1+/+マウス及びKir6.1-/-マウスから単離した胸大動脈リングの張力の変化を測定することにより、Ｋ+チャネルオープナーに対する胸大動脈の血管拡張応答をインビトロで更に検討した（図１２）。
鈴木等（１３）の方法と同様にして、単離した胸大動脈の力学的機能の研究を行なった。すなわち、内皮を除いた胸大動脈を摘出し、リング状に切断した（各リングの長さ：４ｍｍ）。等尺性張力の記録のために、リングを恒温の器官浴に取り付けた。９５％Ｏ2、５％ＣＯ2を通じたクレブス・ヘンゼライト溶液で浴を灌流した。0.1μＭノルエピネフリンで大動脈リングを予備収縮させ、ピナシジルを累積的な仕方で添加した。
結果：
Kir6.1+/+マウス（４匹からの５サンプル）においては、ピナシジルは、濃度依存的な血管拡張効果を示した（図１２、上側のパネル）。これに対し、Kir6.1-/-マウスから単離したリング（４匹からの５サンプル）に対しては、ピナシジルは、KATPチャネル仲介性の血管拡張効果を全く誘発しなかった（図１２、下側のパネル）。
【００２１】
〔大動脈平滑筋細胞の電気生理学的検討〕
Kir6.1-/-マウスが、Ｋ+チャネルオープナーに対する大動脈の血管拡張応答をインビボとインビトロの双方で欠いていたことから、グリベンクラミド感受性のＫNDPチャネル電流（１９）がKir6.1+/+マウスの大動脈平滑筋に検出されるか否かを調べた。個々の胸大動脈平滑筋細胞を酵素により単離し、心筋細胞について行なったのと同様にして電気生理学的検討を加えた。
平滑筋細胞実験に用いた細胞外の高Ｋ+溶液、及びピペット溶液の組成は、それぞれ次の通りであった。細胞外高Ｋ+液：2.9ｍＭのＮａＣｌ、140ｍＭのＫＣｌ、2.2ｍＭのＣａＣｌ2、1.2ｍＭのＭｇＣｌ2、14ｍＭのグルコース、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ7.4）。ピペット液：140ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＡＴＰ二カリウム、10ｍＭのＥＧＴＡ、及び10ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ溶液（ｐＨ7.2）。膜電流は室温で測定した。
高K+（140ｍＭ）溶液中の−40ｍＶに保持された大動脈平滑筋細胞における全細胞膜電流に対する10ｍＭピナシジルの効果を検討した。
結果：
ピナシジルは、Kir6.1+/+平滑筋細胞において、グリベンクラミドによって遮断される内向きＫ+電流を有意に誘発したが、Kir6.1-/-細胞においては認め得るほどのいかなるＫ+電流も惹起することはできなかった（Kir6.1+/+で9.53±2.32 pA/pF、Kir6.1-/-で0.13±0.07 pA/pF、P<0.05）（図１４）。このことは、Kir6.1-/-マウス大動脈から単離した血管平滑筋において、ＫNDPチャネル電流が欠如していることを明白に示している。
【００２２】
〔インビボ及びインビトロでのメチルエルゴメトリンによる冠動脈攣縮の誘発〕  Kir6.1-/-マウスの突然死と血管緊張の制御不全との関連を探るため、セロトニン受容体を刺激し且つ血管平滑筋の血管収縮を直接に惹起する麦角アルカロイドであるメチルエルゴメトリン（２６）を用いて、血管攣縮の誘発を試みた。興味深いことに、麻酔下のKir6.1-/-マウスにおいて、エルゴメトリン誘導体であるメチルエルゴメトリンの静注（20ｍｇ）は、心電図において即座にＳＴセグメントの上昇（８匹のうち４匹）（図１６）及び抑制（８匹のうち１匹）を誘発し、前者は、Kir6.1-/-マウスにおいて埋め込み式ラジオテレメトリーにより得られた上昇（図６）に類似していた。メチルエルゴメトリンは、心電図における変化と同時に心臓死を誘発したが（Kir6.1-/-マウス８匹のうち５匹）、７匹のKir6.1+/+マウスにおいては、該薬物注射後の心電図の有意な変化や死亡は見られなかった。メチルエルゴメトリンの投与はまた、Kir6.1-/-マウスのランゲンドルフ（Langendorff）灌流した心臓を用いたインビトロでの心電図における類似の変化をも惹起し、Kir6.1-/-マウスの単離心臓において、メチルエルゴメトリン（20ｍｇ）はＳＴセグメント上昇を誘発した（４例中４例）が、Kir6.1+/+マウスにおいては誘発しなかった（５例中０例）（図１６、１７）。
【００２３】
〔考察〕
上述のように、Kir6.1-/-マウスは、非常に高率で、自発性ST上昇とそれに続く一連の房室ブロックとに関連付けられる突然心臓死（SCD）を起こした。突然心臓死（SCD）は、成人及び幼児における、予期せぬ急死の主要原因と考えられている（３０）。SCDの大半は、冠動脈のアテローム硬化症、心筋疾患、及び炎症性心疾患等のような基礎心疾患を有する患者において起こるが、不整脈又は心筋虚血によって起こる急性心停止による予想外のSCDが見られることもある。イオンチャネル〔Ｋ+（KVLQT1、HERG、KCNE1、又はMiRP1）、Ｎａ+又はＣａ2+チャネルサブユニット〕（３１）、ギャップジャンクションタンパク質（コネクシン40：connexin40）（３２）及び心特異的な転写因子（Nkx2.5及びHF-1b）（３３）の破壊による遺伝的異常は、ヒト及びマウスの致死的不整脈により引き起こされるＳＣＤに関与していることが示されている。これらのうち、Ｋ+、Ｎａ+又はＣａ2+チャネルにおける異常は、心筋細胞の脱分極と再分極とに影響し、ヒト及びマウスに、長ＱＴ症候群（long-QT syndrome）を引き起こす。長ＱＴ症候群のマウスモデル（３４〜３６）から単離された心筋細胞においては、異常なイオン電流が細胞膜に検出された。しかしながら、Kir6.1-/-マウスにおいては、Kir6.1が心臓において最も豊富に発現されているという事実にもかかわらず（２３）、心筋細胞の細胞膜において電気生理学的異常は見出されなかった。加えて、Kir6.1-/-マウスの心筋細胞に正常なＫATPチャネルが存在することを見出した。従って、心筋細胞の細胞膜におけるＫATPチャネルの構成要素は、Kir6.1でなくKir6.2である。Kir6.1-/-マウスの心筋細胞の電気生理学的性質に異常がないことは、Kir6.1-/-マウスにおいて見られる房室ブロックの病態生理学は、Ｋ+、Ｎａ+又はＣａ2+チャネルの機能不全によって起こる長QT症候群とは異なっていることを示している。代わりに、房室ブロックは、心筋虚血によって引き起こされる自発性ST上昇に起因する。Kir6.1-/-マウスの心筋細胞の正常な電気生理学的性質とは対照的に、大動脈平滑筋のＫNDPチャネルが、Kir6.1-/-マウスにおいて欠損していることをが見出された。本発明らは、血管平滑筋におけるKNDPチャネルが、Kir6.2ノックアウトマウスにおいて正常であることを既に報告している（１３）。今回の知見は、Kir6.1が、血管平滑筋の細胞膜のＫNDPチャネルの構成要素であることを示している。インビボ（血圧低下）及びインビトロ（大動脈リングの弛緩）の双方における、ピナシジルに対するKir6.1-/-マウスの血管拡張応答の欠如は、Kir6.1を含んだＫNDPチャネルが、血管緊張の制御において極めて重要な役割を演じていることを示唆している。
【００２４】
Kir6.1-/-マウスにおける最も著しい知見は、致死的な房室ブロックをもたらす自発性冠動脈攣縮であり、これは、ヒトのプリンツメタル狭心症（異型狭心症）に似た表現型である。プリンツメタル狭心症は、プリンツメタル等によって1959年に報告された不安定狭心症の特異な一形態であり、殆ど専ら休息時にのみ発症し、そして発作の間の心電図におけるＳＴセグメントの上昇と関連付けられている（２２）。プリンツメタル狭心症の病態生理学は、心外膜冠動脈の収縮性亢進（アテローム硬化症変性を伴う場合も伴わない場合もある）であると考えられている（２３、３７）。プリンツメタル狭心症の殆どの症例では、発作は自然に解消するが、冠動脈の血管攣縮が長引いた場合、心筋梗塞、重篤な房室ブロック、生命に関わる心室頻拍症、又は突然死をもたらすことがある（３８）。プリンツメタル狭心症の診断は、発作の際の心電図上におけるＳＴセグメントの上昇の検出により、又は麦角アルカロイド又はアセチルコリンを用いて冠動脈攣縮を誘発させることによって（２３）、行なわれる。Kir6.1-/-マウスの突然死が、自発的ＳＴ上昇（房室ブロック）に関連付けられ、且つ、麦角アルカロイドであるメチルエルゴメトリンがインビボ及びインビトロの双方でKir6.1-/-マウスにおけるＳＴセグメントの変化（上昇又は抑制）を誘発することから、Kir6.1-/-マウスは、プリンツメタル狭心症の動物モデルとなる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のKir6.1-/-マウスは、冠動脈攣縮の発症を解明するための、並びにプリンツメタル狭心症等の冠血管疾患のための新しい薬物の探索のための手段を提供する。
【００２６】
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【００２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Kir6.1配座、ターゲティングベクター、及び得られた部位特異的に破壊された配座のマップ。白、斜線、黒、及び灰色の四角は、それぞれ、非翻訳エキソン、タンパク質をコードするエクソン、ネオマイシン耐性遺伝子、及びチミジンキナーゼ遺伝子を示す。「Ｂ」は、BamHI部位を示す。
【図２】  野生型（Kir6.1+/+）、ヘテロ接合（Kir6.1+/-）及びホモ接合（Kir6.1-/-）突然変異体からの、BamHI消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。図１に示したプローブを使用。
【図３】  Kir6.1+/+マウス及びKir6.1-/-マウスからのＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図４】  Kir6.1+/+マウス（太線、ｎ＝36）、Kir6.1+/-マウス（破線、ｎ＝67）及びKir6.1-/-マウス（細線、ｎ＝27）の、生後生存率（％）。
【図５】  Kir6.1+/+マウス（上側）及びKir6.1-/-マウス（下側）の正常時心電図。
【図６】  Kir6.1-/-マウスの心電図に記録された自発性ＳＴ上昇。
【図７】  Kir6.1-/-マウスの１回目（上側）、２回目（中央）、及び３回目（下側）の房室ブロック並びに、各々に先立つＳＴ上昇（左）。「Ｐ」は、Ｐ波を示す。
【図８】  心電図モニタリング中に死亡した２匹のKir6.1-/-マウスの１匹における顕著な徐脈の代表的心電図
【図９】  全細胞膜電流に対するピナシジル及びグリベンクラミドの効果を示す、Kir6.1+/+マウス（上側）及びKir6.1-/-マウス（下側）の全細胞膜電流の記録例。PIN＝ピナシジル、GLB＝グリベンクラミド
【図１０】  Kir6.1+/+マウス（左側）及びKir6.1-/-マウス（右側）の活動電位に対するピナシジル及びグリベンクラミドの効果の測定結果。
【図１１】  麻酔マウスにおける平均動脈圧（MAP）に対するピナシジルの効果を示すグラフ。圧変化は、基底値との差として表示。
【図１２】  Kir6.1+/+マウス（上側）及びKir6.1-/-マウス（下側）からの大動脈リングの拡張に対するピナシジル（PIN）及びグリベンクラミド（GLB）の効果。NE＝ノルエピネフリン。数字0.3、１、３及び10は、用いたピナシジルの濃度（μＭ）。
【図１３】  Kir6.1+/+マウス（○）及びKir6.1-/-マウス（●）の大動脈リングにおける用量（ピナシジル）−応答（拡張）関係を示すグラフ。
【図１４】  Kir6.1+/+マウス（上側）及びKir6.1-/-マウス（下側）の大動脈平滑筋における、ピナシジル誘発、グリベンクラミド感受性電流の記録。
【図１５】  10μＭピナシジル添加後のグリベンクラミド感受性電流密度を示すグラフ。
【図１６】  Kir6.1-/-マウスのインビボでのメチルエルゴメトリン静注の前後の心電図。
【図１７】  Kir6.1-/-マウスのインビトロでのメチルエルゴメトリン添加の前後の心電図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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