(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５型アデノウイルスベクターにおいて、ＣＡＲ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）への結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、３５型のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＲＧＤ）モチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする、変異型アデノウイルスベクター。
【請求項２】
ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異が、ファイバーノブのＦＧループ、ＡＢループ、又はＤＥループの変異である請求項１に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項３】
ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の４８９番から４９２番までのアミノ酸に相当するファイバーノブのＦＧループのアミノ酸の欠失である、請求項１に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項４】
標的とする組織や細胞に特異的な受容体を認識するターゲティングリガンドをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の変異型アデノウイルスベクターに、目的遺伝子を結合したことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
組換えアデノウイルスベクターの調製方法であって、以下の工程：
（ａ） 請求項１から４のいずれか１項に記載の変異型アデノウイルスベクターと、目的遺伝子を含むベクターをライゲートし、組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
（ｂ） 野生型ファイバーを発現する２９３細胞を作製する工程、
（ｃ） 上記（ａ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、ゲノム両端に存在する制限酵素部位で切断して線状にし、上記（ｂ）の野生型ファイバーを発現する２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させる工程、
（ｄ） 上記（ｃ）の増殖操作を複数回繰り返し、野生型ファイバーを一部に有する組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
（ｅ） 上記（ｄ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、野生型ファイバーを発現しない２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させ、変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターを回収する工程、
を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させた変異型アデノウイルスベクターに関する。かかる変異型アデノウイルスベクターは、ターゲティング能を有するアデノウイルスベクター開発の基盤ベクターとなる。
【０００２】
【従来技術】
アデノウイルスは、1953年、小児の扁桃腺やアデノイド組織培養液中から分離され、現在までにヒト、トリ、ウシ、サル、イヌ、マウスあるいはブタを宿主とする80以上の血清型の存在が明らかにされている。ヒトを宿主とするアデノウイルスについては、これまで51種類以上の血清型が発見されており、その中でも2型と5型とが遺伝子治療用ベクターとして用いられている。5型アデノウイルスはエンベロープを持たず、252個のカプソメアよりなる正20面体構造をしている。そのうち頂点にある12個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の240個はヘキソンと呼ばれる。ファイバー遺伝子はウイルス後期遺伝子のL５領域に位置し、5型ウイルスのファイバー分子は581個のアミノ酸からなり、３量体を形成している。その構造は、テイル、シャフト、ノブ部分に分けられる。
【０００３】
アデノウイルスの細胞への感染は、ウイルス表面上のファイバーノブがアデノウイルス受容体（CAR:Coxsackie-Adenovirus Receptor)に結合し（Bergelson J.M., et al., Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5, Science, 275, 1320-1323 (1997）)、その後、ペントンベースのArg-Gly-Asp （RGD）モチーフが細胞表面上のインテグリン（αvβ3、αvβ5など）に結合することによって起こる（Wickham T. J., et al., Integrins avb3 and avb5 promote adenovirus internalization but not virus attachment, Cell, 73, 309-319 (1993）)。
【０００４】
アデノウイルスベクターは多くの組織や細胞への遺伝子導入が可能であるが、細胞表面上の受容体であるCARへの結合が感染の第一ステップであるため、CARの発現がない細胞（気道上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、一部の癌細胞など）には効率良く感染できない。また、ベクターの感染域に組織特異性がなく、全身投与した場合、特定の組織や細胞に非特異的に移行することが知られている。そのため、局所における遺伝子導入を目的とし、標的組織に直接アデノウイルスベクターを投与しても、組織から漏れ出たベクターが他臓器に移行して免疫反応を助長する可能性がある。さらに、CARの発現がない、あるいは弱い組織を標的とした場合には、より高濃度のベクターを投与する必要があるため、細胞・組織障害、免疫反応という副作用をもたらすことになる。
【０００５】
従って、細胞受容体を介して感染するのでなく、標的とする細胞に特異的な個々の受容体を認識して感染できるようなアデノウイルスベクターが、これからの遺伝子治療用ベクターに求められている。そのため、ファイバーやペントンベースに変異を導入することにより、ネイティブな受容体であるCARやαvインテグリンを認識しないアデノウイルスベクターの構築が、ターゲティング能を有したアデノウイルスベクターの開発への基盤となる。本発明者らは、かかる目的のために、受容体への結合能を欠損させたアデノウイルスとして、CARと結合できないようにファイバーノブのFGループの4アミノ酸を欠失したアデノウイルスベクターや、ペントンベースのArg-Gly-Asp （RGD）モチーフを欠失させることでインテグリンと結合できなくしたアデノウイルスベクターを作製し、それらの遺伝子導入活性を培養細胞（in vitro）又はマウスへの全身投与（in vivo）で検討した（非特許文献１参照）。その結果、CARとの結合能を欠損させたアデノウイルスベクターのin vitroでの遺伝子導入活性は、野生型のファイバーを有したアデノウイルスベクターの約１％の活性しか有していなかった。また、インテグリンとの結合能を欠損させたアデノウイルスベクターのin vitroでの遺伝子導入活性は、野生型の約70〜90％の活性を保持していた。in vivoにおける検討では、野生型のファイバーを有したアデノウイルスベクターを全身投与すると肝臓への遺伝子導入活性が95％以上と高く、肝臓への非特異的な移行が起こっていると推察された。しかしながら、上記のいずれの変異ベクターを用いても、この肝臓への遺伝子導入活性は低下せず、特定の組織への非特異的な移行を十分に抑制できないことがわかった。
【０００６】
一方、5型アデノウイルスとは別にCAR以外の受容体を認識して感染するとされている35型アデノウイルスが存在するが、その受容体は現在のところ不明である。本発明者らは、5型アデノウイルスのファイバー（ノブとシャフト）を35型アデノウイルスのファイバーと置換することでより広い感染域を持つベクターを開発している（非特許文献２）。
【０００７】
【非特許文献１】
Mizuguchi H. et al., Gene Ther.,9, 769-776 (2002)；CAR- orαv integrin-binding ablated adenovirus vectors, but not fiber-modified vectors containing RGD peptide, do not change the systemic gene transfer properties in mice.
【非特許文献２】
Mizuguchi H. et al., Gene, 285, 69-77 (2002)；Adenovirus vectors containing chimeric type 5 and type 35 fiber proteins exhibit altered and expanded tropism and increase the size limit of foreign genes.
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、全身投与した場合に特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させたアデノウイルスベクターを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ファイバーへの新たな変異導入を検討したところ、5型アデノウイルスのファイバーを35型に置換したアデノウイルスをマウスへ全身投与した場合、肝臓への遺伝子導入率が1000分の１に低下するという知見を得た。そこで、本発明者らはかかる知見に着目し、５型アデノウイルスにおいてCARへの結合能欠損のためのファイバーノブの変異、インテグリンへの結合能欠損のためのペントンベースのArg-Gly-Asp （RGD）モチーフ欠失に加え、シャフト部分を35型に置換することによって特定の組織や細胞への非特異的な移行性が飛躍的に抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  ５型アデノウイルスベクターにおいて、CAR(Coxsackie-Adenovirus Receptor)への結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、５型以外のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びペントンベースのArg-Gly-Asp （RGD）モチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする、変異型アデノウイルスベクター。
(2)  ５型以外のファイバーシャフトが、35型のファイバーシャフトである、上記(1)の変異型アデノウイルスベクター。
(3)  CARへの結合能を欠損させるための変異が、ファイバーノブのFGループ、ABループ、又はDEループの変異である上記(1)の変異型アデノウイルスベクター。
(4)  CARへの結合能を欠損させるための変異が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の489番から492番までのアミノ酸に相当するファイバーノブのFGループのアミノ酸の欠失である、上記(1)の変異型アデノウイルスベクター。
(5)  標的とする組織や細胞に特異的な受容体を認識するターゲッティングリガンドをさらに含む、上記(1)から(4)のいずれかの変異型アデノウイルスベクター。
(6)   上記(1)から(5)のいずれかのアデノウイルスベクターに、目的遺伝子を結合したことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
(7)  組換えアデノウイルスベクターの調製方法であって、以下の工程：
(a)  前記(1)から(5)のいずれかの変異型アデノウイルスベクターと、目的遺伝子を含むベクターをライゲートし、組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
(b)  野生型ファイバーを発現する293細胞を作製する工程、
(c)  上記(a)で得られた組換えアデノウイルスベクターを、ゲノム両端に存在する制限酵素部位で切断して線状にし、上記(b)の野生型ファイバーを発現する293細胞にトランスフェクトし、増殖させる工程、
(d）  上記(c)の増殖操作を複数回繰り返し、野生型ファイバーを一部に有する組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
(e）  上記(d)で得られた組換えアデノウイルスベクターを、野生型ファイバーを発現しない293細胞にトランスフェクトし、増殖させ、変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターを回収する工程、
を含む上記方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、５型アデノウイルスベクターにおいて、CARへの結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、５型以外のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びArg-Gly-Asp （以下、RGDという）モチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする。５型アデノウイルスのファイバー部分のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、それをコードする塩基配列を配列番号２に示す。
【００１１】
ファイバーノブの変異は、CARへの結合能を欠損させるための変異であればいかなるものでもよいが、好ましくはFGループ、ABループ、又はDEループの変異、より好ましくはFGループの４アミノ酸（配列表の配列番号1に示す5型アデノウイルスファイバー分子のアミノ酸配列における489番から492番までのアミノ酸に相当）の欠失をいう。
【００１２】
ここで、「CARへの結合能を欠損させる」とは、実質的にその結合能を欠損させることをいい、必ずしも結合能を完全になくすという意味ではない。例えば、ファイバーノブの変異によって、ファイバーノブに変異のない野生型の5型アデノウイルスのCARに対する結合活性を２０％以下、好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下に減少させることをいう。
【００１３】
本発明においてファイバーシャフトの変異は、５型以外のファイバーシャフトに置換するものであれば特に限定はされない。そのような置換ファイバーシャフトの例としては、好ましくは35型のファイバーシャフトが挙げられるが、３型、７型、11型、12型、16型、17型、28型、40型、41型、50型、51型のファイバーシャフトであってもよい。また、ファイバーシャフトはヒト由来のほか、チンパンジー、イヌ、ヒツジ、トリ、ウシ、マウス由来であってもよい。
【００１４】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、例えば、35型に置換されたファイバーシャフト、CARへの結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、及びRGDモチーフ欠失を有するペントンベースを含むプラスミドベクターをそれぞれ構築し、後記実施例に具体的に示すように、これらを順次ライゲートすることによって調製することができる。
【００１５】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、上記の変異を少なくとも有していればよく、ウイルスゲノムは、導入する目的遺伝子の大きさによって、Ｅ１欠損、Ｅ１／Ｅ２Ａ欠損、Ｅ１／Ｅ３欠損、Ｅ１／Ｅ４欠損、Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損、Ｅ１／Ｅ２Ａ／Ｅ４欠損、ガットレス（ウイルスゲノムの複製とパッケージングに必要な領域（左端約0.4kb、右端約0.2kb）以外の全てを欠損）を有していもよい。
【００１６】
本発明の変異型アデノウイルスベクターには、標的細胞の受容体を特異的に認識するターゲティングリガンドを結合させてもよい。
ターゲティングリガンドは、アデノウイルスベクターのファイバーのHIループ又はC末端領域のいずれか又は両方に結合させることが好ましい。ターゲティングリガンドのアデノウイルスベクターへの結合は、該リガンドをコードするＤＮＡをファイバーのHIループをコードする遺伝子配列又はC末端領域をコードする遺伝子配列のいずれか又は両方に導入することによって行うことができる。
【００１７】
「ファイバーのHIループをコードする遺伝子配列」とは、配列表の配列番号１に示す5型アデノウイルスファイバー分子のアミノ酸配列の537番から549番までの領域をコードする塩基配列をいい、５型アデノウイルスにおいては、HIループをコードする遺伝子配列は、該ウイルスゲノムDNAの32647〜32685番目に相当する。
【００１８】
「ファイバーのC末端領域をコードする遺伝子配列」とは、配列表の配列番号１に示す5型アデノウイルスファイバー分子のC末端アミノ酸から数えて10個のアミノ酸をコードする塩基配列をいい、ファイバー分子の最後のアミノ酸（581番目）をコードする塩基配列は、５型アデノウイルスにおいて該ウイルスゲノムDNAの32782〜32784番目に相当する。したがって、外来ペプチドコードDNAは、アデノウイルスゲノムDNAの32754〜32785番目の間に、フレームを合わせて導入すればよい。
【００１９】
HIループをコードする遺伝子配列及び／又はC末端領域をコードする遺伝子配列に、ターゲティングリガンドをコードするDNAを導入する際には、これら遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入し、これらの制限酵素認識配列を用いて上記DNAを導入すればよい。ここで、「ユニークな制限酵素認識配列」とは、アデノウイルスゲノムDNAに本来存在しない制限酵素認識配列をいい、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、PacI、XbaI、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される配列が挙げられる。好ましい態様として、HIループ領域にCsp45I配列、Ｃ末端領域にClaI配列を挿入することが例示される。
【００２０】
ターゲティングリガンドは、標的とする組織や細胞に特異的な受容体を認識する、すなわち該受容体と結合する又は相互作用する分子であれば特に限定はされない。そのような分子としては、例えば、メラノーマのMSH（メラニン細胞刺激ホルモン）受容体と結合する分子、インテグリン受容体と結合する分子、ヘパラン硫酸含有受容体と結合する分子、ラミニン受容体と結合する分子、E-セレクチンとの親和性を有する分子、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンNG2受容体と結合する分子、staphylococcal protein A由来の免疫グロブリンA結合ドメイン（a small synthetic version of the staphylococcal protein A-derived Z domain）分子等が挙げられる。例えば、MSH（メラニン細胞刺激ホルモン）受容体と結合する分子としてSYSMEHFRWGKPV（配列番号３）を含むペプチド、インテグリン受容体と結合する分子としてRGD（Arg-Gly-Asp）を含むペプチド（代表的には、RDG-4Cペプチド（配列番号４））、ヘパラン硫酸含有受容体と結合する分子としてポリリジン（K7)（配列番号５）を含む分子、ラミニン受容体と結合する分子としてTS(GYIGSR)3SS（配列番号６）又はTSAA(SIKVAV)2（配列番号７）、E-セレクチンとの親和性を有する分子としてTRSDITWDQLWDLMKTS（配列番号８）、コンドロイチン硫酸プロテグリカンNG2レセプターと結合する分子としてTAA(Thr-Ala-Ala)含む分子又はLTLRWVGLMS（配列番号９）を含む分子、staphylococcal protein A由来の免疫グロブリンA結合ドメイン分子としてFNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD（配列番号１０）等を用いることができる。SYSMEHFRWGKPVはメラノーマ細胞に対して、RGDモチーフは頭頚部癌、内皮細胞、平滑筋細胞等に対して、７個のリジンが結合したポリリジンK7はマクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、T細胞に対してそれぞれ親和性が高いためこれらの細胞を標的とする場合にそれぞれ適している。
【００２１】
本発明のアデノウイルスベクターには、治療目的となる目的遺伝子を結合させて組換えアデノウイルスベクターを作製し、遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。
【００２２】
目的遺伝子としては、いわゆる遺伝子治療に効果が認められる、あるいは効果があるとされる遺伝子であれば何ら限定されないが、例えば、直接又は間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子遺伝子、細胞増殖抑制因子遺伝子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ(HSVtk)とガンシシクロビルの組み合わせ（HSVtk/GCV）、シトシンデアミナーゼと5-フルオロシトシンの組み合わせ（CD/5FC）、ウラシルホスホリラーゼと5-フルオロウラシルの組み合わせ(UP/5FU)などが挙げられる。このような目的遺伝子は、一般にはアデノウイルスゲノムのE1領域（342-3528)及び／又はE3領域(28133-30818)と置換され、又はこの領域に挿入される。
【００２３】
目的遺伝子のアデノウイルスベクターへの導入は、本発明者らが既に開発した簡便な１ステップのin vitroライゲーションで目的遺伝子をE1欠損領域（アデノウイルスゲノムDNAに本来存在しないI-CeuI、SwaI、PI-SceIを有する）に挿入できるプラスミドの一部（pAdHM4)を利用することが好ましい (Mizuguchi H., et al., Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998)；Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.）。
【００２４】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、パッケージング細胞である293細胞に対しても感染できないため、増殖させることができない。そこで、本発明者らは、野生型ファイバーを発現する293細胞を利用して組換えアデノウイルスベクターを回収する方法を新たに開発した。
【００２５】
本方法は、以下の工程を含むものである。
(a)  上記の変異型アデノウイルスベクターと、目的遺伝子を含むベクターをライゲートし、組換えアデノウイルスベクターを得る工程
(b)  野生型ファイバーを発現する293細胞を作製する工程
(c)  上記(a)で得られた組換えアデノウイルスベクターを、ゲノム両端に存在する制限酵素部位で切断して線状にし、上記(b)の野生型ファイバーを発現する293細胞にトランスフェクトし、増殖させる工程
(d）  上記(c)の増殖操作を複数回繰り返し、野生型ファイバーを一部に有する組換えアデノウイルスベクターを得る工程
(e）  上記(d)で得られた組換えアデノウイルスベクターを、野生型ファイバーを発現しない293細胞にトランスフェクトし、増殖させ、変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターを回収する工程
【００２６】
上記工程(b)で使用する「野生型ファイバーを発現する293細胞」とは、通常の293細胞に野生型ファイバーを発現させるように操作したものであって、後記実施例１に従って調製することができる。また、「野生型ファイバー」とは変異を施していない5型アデノウイルスのファイバーをいう。一方、最終段階の工程(e)で使用する「293細胞」（本明細書において「通常の293細胞」と記載する場合がある。）とは、ヒト胎児由来腎細胞をアデノウイルスでトランスフォームして作製された細胞株であり、E1遺伝子を含むアデノウイルスDNAの一部を持っており、アデノウイルスベクターの増殖に通常用いられるものである。
【００２７】
工程(b)で作製する野生型ファイバー発現293細胞において、染色体に組み込まれた野生型ファイバー遺伝子が、アデノウイルスベクター複製中にベクターの変異型ファイバーとの間で組換えをおこす可能性を減らすため、染色体に組み込んだ野生型ファイバー遺伝子にはアミノ酸変異を伴わない変異を少なくとも約500bpおきに挿入しておくことが好ましい。
【００２８】
上記工程（c)で増殖された組換えアデノウイルスベクターは、ファイバー部分の一部が野生型ファイバーに置換される。従って、この増殖過程で生じるウイルスは、その一部の野生型ファイバーを利用して293細胞に感染することが可能である。
上記工程（d）では、工程(c)の増殖操作を複数回、例えば３〜５回繰り返すが、回数はアデノウイルスベクターの増殖の状況により適宜調整すればよい。
【００２９】
以上のようにして増殖させたアデノウイルスベクターを、最終段階（工程（e))で増殖させるときに野生型ファイバーを発現していない通常の293細胞に感染させる。その結果、最終産物として変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターが293細胞から回収される。従って、この組換えアデノウイルスベクターは、もはや293細胞などの通常の細胞にはほとんど全く感染できない。
【００３０】
本発明の組換えアデノウイルスベクターを用いる遺伝子治療の形態としては、標的細胞を体外に取り出して遺伝子導入を行う体外法（ex vivo法）、体内に遺伝子を導入する体内法（in vivo法）があるが、いずれの治療形態にも適用される。体外法では患者由来の細胞を一旦体外で培養し、本発明の組換えアデノウイルスベクター導入処理をした後に患者に投与すればよいし、体内法では本発明の組換えアデノウイルスベクターを直接患者体内（皮膚、筋肉、肝臓、肺、血管内など）へ投与すればよい。
【００３１】
上記組換えアデノウイルスベクターの投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、特に癌治療を目的とする場合は、癌原病巣に対して又は癌種に対応した予想転移部位に対して局所注射等の局所投与を行うことが好ましい。
【００３２】
本発明の変異型アデノウイルスベクターの標的細胞への遺伝子導入効率は、上記の目的遺伝子に代えてあるいは目的遺伝子と共にリポーター遺伝子をベクターに挿入し、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定することによって評価できる。このようなリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（いわゆるGFP）をコードする遺伝子等を用いることができる。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）  トリプル変異型アデノウイルスベクターの作製
(1) アデノウイルスベクター作製のためのベクタープラスミドpAdHM54の作製
pAdHM54（変異ファイバーノブ、Ad35型シャフト、及びRGDモチーフ欠失ペントンベースを有するアデノウイルスベクター作製のためのベクタープラスミド）は以下のように作製した。
【００３４】
(1-1) Ad35型ファイバーシャフト部分含有プラスミド
まず、Ad35のファイバー周辺の遺伝子を含むプラスミドであるpF35-2.2 [Mizuguchi H., Hayakawa T., Gene, 285, 69-77 (2002)；Adenovirus vectors containing chimeric type 5 and type 35 fiber proteins exhibit altered and expanded tropism and increase the size limit of foreign genes.] をAgeI で切断し、T4DNA polymerase処理後、XbaI linkerとライゲーションした。ライゲーション産物をXbaIで切断し、セルフライゲーションしてpF35-2.3を得た。pF35-2.3のファイバーシャフトとノブの間にquickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene社) 、oligonucleotide 1(5'-a aag gat agt att aat acc tta tgg act gga-3':配列番号１１) と oligonucleotide 2(5'- tcc agt cca taa ggt att aat act atc ctt t -3':配列番号１２）を用いてAseI部位を作製し、pF35-2.3(AseI)を得た。
【００３５】
(1-2) Ad35型ファイバーシャフト及びAd5型ファイバーノブ（FGループ変異）含有プラスミド
次に、Ad35型ファイバーシャフトとAd5型ファイバーノブ（FGループの変異）を持つプラスミドpHM-S35-K5-CAR(-)を作製するために以下の▲１▼〜▲４▼のフラグメントをライゲートした。
▲１▼pF35-2.3(AseI)をAseIとAflIIで切断したフラグメント（Ad35型ファイバーシャフトを含む。）
▲２▼pAdHM42（E1/E3欠損領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを有したプラスミドであり、E1欠損領域にI-CeuI、SwaI、PI-SceI部位を有したベクタープラスミド。FGループ領域が4アミノ酸欠失しており、HIループ領域にCsp45I部位を有する。）を鋳型とし、oligonucleotide 3(5'-aat aat  act ttg tgg acc aca cca gct-3'：配列番号１３) と oligonucleotide 4(5'-ttc gaa gtt gtg tct cct gt-3'：配列番号１４)をプライマーとして用いてPCRで増幅した産物をTAクローニングにてプラスミドpGEM-T Easy（プロメガ社）に組み込んでpGEM-Teasy-knobCAR(-)-Fを作製し、これをAseIとCsp45Iで切断したフラグメント（Ad5型ファイバーノブの始めからHI ループまでを含んでおり、CARとの結合部位であるFG ループの4アミノ酸が欠失している。)
▲３▼pHM14-Eco3(Koizumi N., Mizuguchi H., Utoguchi N., Watanabe Y., Hayakawa T.; Generation of fiber-modified adenovirus vector containing heterologous peptides in both the HI loop and C terminus of the fiber knob. J. Gene Med., in press.)をCsp45IとMunIで切断したフラグメント（Ad5型ファイバーノブのHI ループ領域から後半部分を含みファイバーノブのC末端領域にClaI部位を含む。）
▲４▼pHMCMV6（Mizuguchi H., Kay MA., Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999); A simple method for constructing E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector.）をMunIとAflIIで切断したフラグメント
【００３６】
上記▲１▼〜▲４▼のフラグメントをライゲーションし、Ad35型ファイバーシャフトに続きAd5型ファイバーノブを持つプラスミドpHM-S35-K5-CAR(-)を得た。pHM-S35-K5-CAR(-)は、ファイバーノブ領域はCARとの結合能を欠損させるようにFGループの欠失を持ち、HI ループをコードする部分にCsp45I 部位、C末端にClaI 部位を持つ。
【００３７】
(1-3) Ad35型ファイバーシャフト、Ad5型ファイバーノブ（FGループ欠失）、及びAd5型ファイバーテイル含有プラスミド
上記で得られたpHM-S35-K5-CAR(-)をMunIとAflIIで切断し、pF35-2.2のMunIとAflIIで切断したものとライゲーションしてpS35-K5-2.2CAR(-)を得た。pS35-K5-2.2CAR(-)はAd5型ファイバーテイルを持ち、Ad35型ファイバーシャフトに続きAd5型ファイバーノブを持つ（ファイバーノブ領域はCARとの結合能を欠損させるようにFGループの欠失を持ち、HI ループをコードする部分にCsp45I 部位、C末端にClaI 部位を持つ）。
【００３８】
(1-4) Ad35型ファイバーシャフト、Ad5型ファイバーノブ（FGループ欠失）、Ad5型ファイバーテイル、及びRGDモチーフ欠失ペントンベース含有プラスミド
上記で得られたpS35-K5-2.2CAR(-)をSrfIとMunIで切断し、pHM14-Eco2(Koizumi N., Mizuguchi H., Utoguchi N., Watanabe Y., Hayakawa T.; Generation of fiber-modified adenovirus vector containing heterologous peptides in both the HI loop and C terminus of the fiber knob. J. Gene Med., in press.)をSrfIとMunIで切断したものとライゲーションしてpHM14-Eco2-S35を得た。pHM14-Eco2-S35はAd5型ゲノムの27332から３'末端までを含み、ファイバーシャフトの部分のみAd35型に置換されている（ファイバーノブ領域はCARとの結合能を欠損させるようにFGループの欠失を持ち、HI ループをコードする部分にCsp45I 部位、C末端にClaI 部位を持つ）。pHM14-Eco2-S35をEcoRIとClaIで切断し、pAdHM43（E1/E3欠損領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを有し、E1欠損領域にI-CeuI、SwaI、PI-SceI部位を有したベクタープラスミド。ペントンベースのRGDモチーフコード領域を欠失）をEcoRIとClaIで切断したものとライゲーションすることによってpAdHM54を作製した（図１）。pAdHM54 は以下の特徴を有する。
【００３９】
(i) E1/E3欠損領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを有している。
(ii) ペントンベースのRGDモチーフコード領域を欠失し、ファイバーノブ領域はCARとの結合能を欠損させるようにFGループの欠失を持ち、HI ループをコードする部分にCsp45I 部位、C末端にClaI 部位を持つ。
(iii)ファイバーシャフト領域は35型アデノウイルス由来である。
（iv)E1欠損領域にI-CeuI、SwaI、PI-SceI部位を持つ。
【００４０】
(2) 組換えアデノウイルスベクターの作製
(2-1) 野生型ファイバー発現293細胞の作製
ハイグロマイシン耐性遺伝子を有し、CMVプロモーターに制御された野生型ファイバー発現プラスミドpCMVmfiber-Hyg-R（野生型の5型アデノウイルスのファイバーシャフト、ノブ、テイルを発現）を、293細胞にSuperFect(キアゲン社)を用いてトランスフェクトした。野生型ファイバー遺伝子には計31塩基のナンセンス変異を少なくとも500bpおきに挿入し、アデノウイルスベクター複製中にベクターの変異ファイバーとの間で組換えを起こす可能性を減少させた。ハイグロマイシンで選択することにより、野生型ファイバー発現細胞株ファイバー−293を得た。尚、ファイバーの発現は抗-ファイバーポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにて確認した。
【００４１】
(2-2) 組換えアデノウイルスベクターの構築及び増幅
組換えアデノウイルスベクターは文献 (Mizuguchi H., et al., Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998): Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.及びMizuguchi H., et al., Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999); A simple method for constructing E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector.)に記載された手法に基づいてin vitroライゲーション反応によって構築した。
【００４２】
まず、(1)で得られたpAdHM54をI-CeuI及びPI-SceIで切断し、これをI-CeuI及びPI-SceI切断したpCMVL1 (Mizuguchi H., et al., Gene Ther., 8, 730-735 (2001); A simplified system for constructing recombinant adenoviral vectors containing heterologous peptides in the HI loop of their fiber knob.)とライゲートし、pAdHM54-L2を得た。同様に、pAdHM4(Mizuguchi H., et al., Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998); Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.)をI-CeuI及びPI-SceIで切断し、これをI-CeuI及びPI-SceI切断したpCMVL1 (Mizuguchi H., et al., 同上）とライゲートし、pAdHM4-L2を作製した。
【００４３】
pAdHM54-L2は、以下のように組換えアデノウイルスベクターとして構築した。先ず、pAdHM54-L2をPacIで消化し、（2-1)で調製したファイバー−293細胞へトランスフェクトした。トランスフェクション後、10〜14日で細胞変性効果が観測され、Ad/ΔFΔP-S35-L2が増幅していることを確認した。ウイルス懸濁液を凍結融解して回収し、10〜20倍量の細胞数のファイバー−293細胞に作用させた。2〜3日で細胞変性効果が観測された。以後上記操作を3回行い、組換えアデノウイルスベクター（Ad/ΔFΔP-S35-L2）を増幅した。最終増幅ステップは、Ad/ΔFΔP-S35-L2を通常の293細胞に作用させ、増幅した。以上の増幅工程を図１に示す。
【００４４】
一方、Ad-L2は、pAdHM4-L2をPacIで消化し、293細胞にトランスフェクトすることによりAd/ΔFΔP-S35-L2と同様に調製した。ただし、パッケージング細胞としては全行程を通常の293細胞を用いた。
図２に、変異型アデノウイルスベクター（Ad/ΔFΔP-S35-L2）及び従来型アデノウイルスベクター（Ad-L2)の構造を示す。また、Ad/ΔFΔP-S35-L2のファイバー部位のアミノ酸配列を配列番号１５に、またそれをコードする塩基配列を配列番号１６に示す。
【００４５】
得られた各組換えベクター由来のウイルスは、定法（Lieber A., et al., J. Virol. 70, 8944-8960（1996）; Recombinant adenoviruses with large deletions generated by Cre-mediated excision exhibit different biological properties compared with first-generation vectors in vitro and in vivo.）に従って精製した。その結果、Ad/ΔFΔP-S35-L2の収量は、1012ウイルス粒子（vector particle (VP)/mlの濃度で約1ml）であった。これは、従来型のアデノウイルスベクターAd-L2の場合とほぼ同等の収量であった。ウイルス粒子力価の測定は、Maizel JVJ., et al., Virology, 36, 115-125 (1968); The polypeptides of adenovirus. I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12.に記載された方法に準じて行った。
【００４６】
（実施例２） in vitro試験
SK HEP-1細胞（CAR陽性）とLN444細胞（CAR陰性）にAd-L2、Ad/ΔFΔP-L2、Ad/ΔF-S35-L2、Ad/ΔFΔP-S35-L2（下記表１参照）を3000 VP（vector particle）/cellで1.5時間作用させ、48時間培養後、ルシフェラーゼ発現量を定量した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
（Ad-L2：従来型のヒト5型アデノウイルスベクター、 Ad/ΔFΔP-L2：ファイバーノブとペントンベースに変異を挿入したアデノウイルスベクター、 Ad/ΔF-S35-L2：ファイバーノブに変異を挿入し、ファイバーシャフトを35型アデノウイルスのものに置換したアデノウイルスベクター、Ad/ΔFΔP-S35-L2：ファイバーノブとペントンベースに変異を挿入し、かつファイバーシャフトを35型アデノウイルスのものに置換したアデノウイルスベクター）
【００４９】
結果を図３に示す。データは平均値± S.D.(n=4)で表した。SK HEP-1細胞（CAR陽性）においては、トリプル変異型Ad/ΔFΔP-S35-L2を作用させた細胞は従来型Ad-L2導入細胞を作用させた細胞に比べ1％以下のルシフェラーゼ発現しか示さず、その差が顕著であった。ダブル変異型Ad/ΔFΔP-L2、Ad/ΔF-S35-L2を作用させた細胞もトリプル変異型Ad/ΔFΔP-S35-L2ほどではないが、低いルシフェラーゼ発現しか示さなかった。この傾向はLN444細胞（CAR陰性）においても認められた。
【００５０】
（実施例３） in vivo試験
C57 Bl6マウス（メス）にAd-L2、Ad/ΔFΔP-L2、Ad/ΔF-S35-L2、Ad/ΔFΔP-S35-L2を3.0×1010VP尾静脈内から投与した。48時間後、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓を回収し、ルシフェラーゼ発現量を定量した。
結果を図４(Ａ）に示す。データは各投与群につき６〜８匹から得られた結果の平均値± S.E.で表した。
従来型Ad-L2投与の場合は、肝臓をはじめ各臓器で高いルシフェラーゼ発現を示した。特に、肝臓への遺伝子導入活性は約99％を示した。一方、ダブル変異型Ad/ΔFΔP-L2, Ad/ΔF-S35-L2の肝臓におけるルシフェラーゼ発現は200倍以上減少し、他臓器においても低い活性を示した（図４（Ａ））。トリプル変異型Ad/ΔFΔP-S35-L2では、さらに各臓器での活性が低下し、肝臓においては、30000倍以上ルシフェラーゼ発現が低下した（図４（Ａ），（Ｂ））。従って、Ad/ΔFΔP-S35-L2は積極的に特定の臓器に移行する活性を有しないベクターであり、ターゲッティングアデノウイルスベクターのための基盤ベクターになりうる。
【００５１】
（実施例４）  ファイバー−293細胞で増殖させたアデノウイルスベクターの遺伝子導入試験
野生型ファイバー発現293細胞（以下、ファイバー−293細胞という）でベクターを増殖させる方法、又は実施例１の記載に従い、最終段階を除く段階はファイバー−293細胞でベクターを増殖させ、最終段階のみを通常の293細胞でベクターを増殖させる方法で回収したAd/ΔFΔP-S35-L2について、各ベクターの遺伝子導入活性をSK HEP-1細胞（CAR陽性）において検討した。各ベクターは300 VP（vector particle）/cellでSK HEP-1細胞（CAR陽性）に1.5時間作用させ、48時間培養後、ルシフェラーゼ発現量を定量した。結果を図５に示す。データは平均値± S.D.(n=4)で表した。野生型ファイバー発現293細胞で回収したAd/ΔFΔP-S35-L2は、通常の293細胞で回収したAd/ΔFΔP-S35-L2に比べ約10倍のルシフェラーゼ発現を示した。このことから、ファイバー−293細胞で回収したAd/ΔFΔP-S35-L2のファイバー部分の一部は通常のファイバーに置換され、その結果高いルシフェラーゼ発現を示したと考えられる。これに対し、ベクター増殖の最終段階を通常の293細胞で回収したAd/ΔFΔP-S35-L2では、ファイバー部分は変異ファイバーになっているため、通常の細胞への遺伝子導入能は減弱されている。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、全身投与した場合に特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させた変異型アデノウイルスベクターが提供される。かかる変異型アデノウイルスベクターは、標的となる組織や細胞に特異的な受容体を認識するようなターゲティングリガンドを結合させることによって、細胞受容体を介して感染するのでなく、標的とする細胞に特異的な個々の受容体を認識して感染できることから、ターゲティング能を有するアデノウイルスベクター開発の基盤ベクターとなる。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、pAdHM54の構造、及びベクター増幅工程を示す。
【図２】  図２は、変異型アデノウイルスベクター（Ad/ΔFΔP-S35-L2）及び従来型アデノウイルスベクター（Ad-L2)の構造を示す。
【図３】  図３は、従来型アデノウイルベクター、変異型（ダブル、トリプル）アデノウイルスベクターのin vitroにおける遺伝子導入試験の結果を示す。
【図４】  図４（Ａ）は、従来型アデノウイルベクター、変異型（ダブル、トリプル）アデノウイルスベクターのin vivoにおける遺伝子導入試験の結果を示す。図４（Ｂ）は、従来型アデノウイルベクター、変異型（トリプル）アデノウイルスベクターのin vivoによる遺伝子導入試験の結果を示す。
【図５】  野生型ファイバー発現293細胞で増殖させたアデノウイルスベクターの遺伝子導入試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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