(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を増幅する方法であって、以下の工程：
（ａ）２種のプライマーセットと標的サンプルとを混合して、プライマー−標的サンプル混合物を生成する工程、ここで、前記プライマーセットはそれぞれ少なくとも１種のプライマーを含み、かつ前記標的サンプルは標的配列を含み、および
該プライマー−標的サンプル混合物を、該プライマー−標的サンプル混合物における該プライマーと該標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程であって、
ここで、 前記２種のプライマーセットは標的配列の向かい合う鎖にハイブリダイズし、および、
該標的配列が複数のリンカーと連結されたＤＮＡであり、
各リンカーがプライマー相補的部分を含み、
各プライマーが相補的部分を含み、
各プライマーの相補的部分が１以上の前記複数のリンカーの相補的部分に相補的である、工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと該プライマー−標的サンプル混合物とを混合して、ポリメラーゼ−標的サンプル混合物を生成する工程、および該ポリメラーゼ−標的サンプル混合物をインキュベートして、そして該標的配列が複製される工程であって、ここで、 該標的配列の複製が複製された鎖を生じ、そして複製の間に、該複製された鎖の少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって該標的配列から置換される、工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記２種のプライマーセットが、右のプライマーセットおよび左のプライマーセットとからなり、ここで、前記リンカーが第一の鎖と第二の鎖からなる二本鎖であり、前記右のプライマーセットのプライマーの相補的部分がすべて、前記リンカーの第一の鎖と相補的であり、そして前記左のプライマーセットのプライマーの相補的部分がすべて、前記リンカーの第二の鎖と相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記右のプライマーセットが単一プライマーからなり、そして前記左のプライマーセットが単一プライマーからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記連結されたＤＮＡが、複数のＤＮＡフラグメントを一緒に連結することによって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡフラグメントがｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡが細胞から単離されたｍＲＮＡの混合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、さらに（ｂ）前記ポリメラーゼ−標的サンプル混合物を、鎖置換に適した条件下でインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項８】
前記複製を促進する条件が実質的に等温である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複製を促進する条件がサーマルサイクリング工程を包含しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）がサーマルサイクリング工程を包含しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
開示される発明は、一般に核酸の増幅の分野にある。
【０００２】
指数関数的な増幅のための多くの方法が開発されている。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼでの増幅（ＢｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒおよびＭｕｓｈａｈｗａｒ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３５：１１７−１２６  （１９９１）；  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ９：１９９−２０２  （１９９３））が含まれる。
【０００３】
現在のＰＣＲ増幅方法は、目的の核酸配列に隣接する領域にハイブリダイズし、その結果そのプライマーで開始されるＤＮＡ複製が目的の核酸配列を複製するような２つのプライマーの使用を含む。変性工程を使用してテンプレート鎖から複製された鎖を分離することによって、同じプライマーを用いた別の回の複製は、目的の核酸配列の幾何級数的な増幅をもたらし得る。ＰＣＲ増幅は、増幅反応が連続的に進行し得ず、そして一連の反応条件において核酸サンプルを多重サイクルに供することによって実施されねばならないという欠点を有する。
【０００４】
ゲノム全体（ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ）ＰＣＲと称されるＰＣＲ増幅の改変は、同じＰＣＲ反応においてある生物のゲノム全体を増幅するランダムまたは部分的にランダムなプライマーの使用を包含する。この技術は、プライマー対が中程度の間隔でゲノムＤＮＡの全体にわたってハイブリダイズするような、ランダムまたは部分的にランダムな配列の充分数のプライマーを有することに依存する。次いで、そのプライマーで開始した複製は、別のプライマーがハイブリダイズし得る複製鎖重複部位を生じ得る。このゲノムサンプルを多重重複サイクルに供することによって、そのゲノム配列が増幅される。ゲノム全体ＰＣＲは、ＰＣＲの他の形態と同じ欠点を有する。
【０００５】
増幅が関連する別の分野は、ＲＮＡ発現プロフィール作成（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）である。ここで、目的は、生物学的サンプルにおける多くの異なる分子種の相対濃度を決定することである。目的のＲＮＡのいくつかは、比較的低濃度で存在し、そして分析前にそれらを増幅することが所望される。ポリメラーゼ連鎖反応を使用してそれらを増幅することは不可能である。なぜなら、このｍＲＮＡ混合物は、代表的に、５，０００〜２０，０００の異なる分子種からなる複合物であるからである。ポリメラーゼ連鎖反応は、異なる分子種が異なる速度で増幅し、ｍＲＮＡの相対濃度を歪めるという欠点を有する。
【０００６】
サンプルにおいてすべてのＲＮＡの中程度の増幅を同時に可能にするいくつかの手順が記載されている。例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６７５−１６８０（１９９６）において、二本鎖ｃＤＮＡが強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが各ｃＤＮＡの末端に取り込まれるような様式において合成された。次いで、このプロモーター配列を使用してｃＤＮＡを転写し、各ｃＤＮＡ分子について約１００〜１５０ＲＮＡコピーが生成した。この弱い増幅系は、少なくとも１００，０００細胞を含む生物学的サンプルのＲＮＡプロフィール作成を可能にした。しかし、非常に少数の細胞を含むサンプルのプロフィール分析を可能にするより強力な増幅方法についての必要性が存在する。
【０００７】
多重プライマーを用い、そして鎖置換を含む核酸の増幅は、欧州特許出願０  ４６６  ５２０  Ａ１、およびＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／２５１８０、およびＷＯ９５／０３４３０に記載されている。
【０００８】
従って、あまり複雑でなく、より信頼性が高く、そしてより短い時間でより多くの増幅がもたらされる増幅方法に対する必要性が存在する。
【０００９】
従って、開示される本発明の目的は、連続的等温反応において標的核酸配列を増幅する方法を提供することである。
【００１０】
開示される本発明の別の目的は、連続的等温反応においてゲノム全体または他の高度に複雑な核酸サンプルを増幅する方法を提供することである。
【００１１】
開示される本発明の別の目的は、標的核酸配列を増幅する方法を提供することであり、ここで多重コピーの標的核酸配列が単回増幅サイクルにおいて生じる。
【００１２】
開示される本発明の別の目的は、連続的等温反応において連結されたＤＮＡを増幅する方法を提供することである。
【００１３】
開示される本発明の別の目的は、連続的等温反応において標的核酸配列を増幅するためのキットを提供することである。
【００１４】
開示される本発明の別の目的は、連続的等温反応においてゲノム全体または他の高度に複雑な核酸サンプルを増幅するためのキットを提供することである。
【００１５】
（発明の要旨）
目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法が開示される。この方法は、多重プライマーによる核酸配列の鎖置換増幅に基づく。多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）と称される、この方法の１つの好ましい形態において、２セットのプライマー、右のセットおよび左のセットが使用される。右のセットのプライマーにおけるプライマーは各々が標的ヌクレオチド配列の一つの側に隣接するヌクレオチド配列に相補的な部分を有し、そして左のセットのプライマーにおけるプライマーは各々がその標的ヌクレオチド配列の他方の側に隣接するヌクレオチド配列に相補的な部分を有する。右のセットにおけるプライマーは、その標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の一つの側に相補的であり、そして左のセットにおけるプライマーは反対の鎖に相補的である。両方のセットにおけるプライマーの５’末端は、そのプライマーが核酸分子における隣接配列にハイブリダイズする場合、目的の核酸配列から遠位にある。好ましくは、各セットの各メンバーは、その標的ヌクレオチド配列に隣接する別個でかつ重複していないヌクレオチド配列に対して相補的な部分を有する。各プライマーにて開始する複製およびその標的核酸配列にわたって継続することによって増幅が進行する。この方法の主要な特徴は、複製の間の介在プライマーの置換である。一旦右のセットのプライマーから伸長する核酸鎖が、左のセットのプライマーがハイブリダイズする核酸分子の領域に達し、そして逆もそうなると、別の回のプライミングおよび複製が起こる。これは、その標的核酸配列のネスティドセットの複数コピーが短時間の期間で合成されることを可能にする。右のセットおよび左のセットにおける充分な数のプライマーを用いることによって、数回のみの複製が、目的の核酸配列の数十万ものコピーを産生するために必要とされる。この開示された方法は、ポリメラーゼ連鎖反応に対して利点を有する。なぜなら、それは、等温条件下で実施され得るからである。サーマルサイクルは必要とされない。なぜなら、伸長鎖（または、適合可能な鎖置換タンパク質）の頭部でのポリメラーゼがそれの先の鎖を置換し、それによってハイブリダイゼーションが利用可能になるからである。多重鎖置換増幅の他の利点は、非常に長い核酸セグメント（５０キロ塩基の程度で）を増幅する能力、およびより短いセグメント（１０キロ塩基以下）を迅速に増幅する能力を包含する。多重鎖置換増幅において、意図されない部位での単一のプライミング事象は、これらの部位での人為的増幅をもたらさない（なぜなら、意図された部位での増幅が意図されない部位での単一の鎖複製を迅速に凌駕するからである。）。
【００１６】
ゲノム全体鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）と称する、この方法の別の好ましい形態において、プライマーのランダムなセットを使用して、ゲノム核酸のサンプル（または高度に複雑な核酸の別のサンプル）をランダムにプライミングする。ランダムまたは部分的にランダムな配列の充分に大きなセットのプライマーを選択することによって、そのセットにおけるプライマーは、そのサンプルにおける核酸にわたって分布する核酸配列に対して、総合的に、そしてランダムに相補的となる。各プライマーにて高度に処理能力のあるポリメラーゼ開始を伴う複製および自然に終結するまで継続することによって増幅が進行する。この方法の主要な特徴は、ポリメラーゼによる複製の間の介在プライマーの置換である。この方法で、ゲノム全体の多重重複コピーが短時間で合成され得る。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応よりも利点を有する。なぜなら、これは、等温条件下で行われ得るからである。ゲノム全体鎖置換増幅の他の利点は、ゲノム全体ＰＣＲより高レベルの（５倍まで高い）増幅を含み、増幅はＰＣＲよりもあまり配列依存的ではなく、そしてＰＣＲに伴って生じ得るような再アニール人為産物も遺伝子シャフリング人為産物も存在しない（なぜなら、変性および再アニールのサイクルが存在しないからである）。
【００１７】
連結ＤＮＡの多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ−ＣＤ）と称する、この方法の別の好ましい形態において、ＤＮＡのフラグメントが、好ましくはリンカーとまず一緒に連結される。次いで、連結されたＤＮＡは、適切なプライマーを用いる鎖置換合成によって増幅される。ランダムなセットのプライマーを使用して、ゲノム全体増幅と類似した様式においてＤＮＡコンカテマーの合成をランダムにプライミングし得る。ゲノム全体増幅におけるように、ランダムまたは部分的にランダムな配列の充分大きなセットのプライマーを選択することによって、そのセットにおけるプライマーは、連結ＤＮＡにわたって分布する核酸配列に対して総合的にかつランダムに相補的となる。リンカーを使用してＤＮＡフラグメントを連結する場合、リンカー配列に対して相補的なプライマーを使用して、そのコンカテマーを増幅し得る。そのリンカーから、連結されたＤＮＡの一区画を通じて、次のリンカーへと合成が進行し、そしてそれを超えて継続する。リンカー領域が複製されるにつれて、ＤＮＡ合成のための新しいプライミング部位が作製される。このようにして、連結ＤＮＡサンプル全体の多重重複コピーが短時間に合成され得る。
【００１８】
増幅後、増幅された配列は、任意の目的、例えば、ＰＣＲ増幅配列について公知でありかつ確立されている用途のためのものであり得る。例えば、増幅された配列は、蛍光標識の検出、酵素連結検出系、抗体媒介標識検出、および放射標識の検出のような核酸についての従来の検出系のいずれかを用いて検出され得る。開示される方法の主要な特徴は、増幅がサイクルではなく連続的等温複製において生じることである。これによって、増幅があまり複雑でなく、そして出力においてはるかにより一貫することとなる。鎖置換によって、単回連続的等温反応において、核酸配列またはサンプルの多重コピーの迅速な生成が可能になる。次いで、開示された本発明を用いて生成されたＤＮＡは、任意の目的または他の任意の所望の方法において使用され得る。例えば、ＰＣＲを使用して、ゲノム全体鎖置換方法によって予め増幅した任意の特定のＤＮＡ配列をさらに増幅し得る。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
開示される方法は、標的核酸配列およびゲノム全体または他の高度に複雑な核酸サンプルの増幅を可能にする特定の材料および手順を使用する。
【００２０】
（Ｉ．材料）
（Ａ．標的配列）
標的配列（これは、増幅の目的物である）は、任意の核酸であり得る。標的配列は、複数の核酸分子、例えばゲノム全体増幅の場合、核酸分子における複数の部位、または核酸分子の単一の領域を含み得る。多重鎖置換増幅について、一般に、標的配列は、核酸分子または核酸サンプル中の単一の領域である。ゲノム全体増幅について、標的配列は、ゲノム全体または核酸サンプルである。標的配列は、目的の任意の核酸サンプルであり得る。多くのこのような核酸サンプルの供給源、同定、および調製は公知である。増幅または検出方法における使用について公知または同定されている核酸サンプルが、本明細書中に記載される方法のために使用されることが好ましい。核酸サンプルは、単一細胞由来の核酸サンプルであり得る。多重鎖置換増幅について、好ましい標的配列は、例えば長さまたは組成に起因して、ＰＣＲを使用する増幅が困難である配列である。ゲノム全体増幅について、好ましい標的配列は、単一細胞由来の核酸サンプルである。連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅について、標的は、連結されたＤＮＡである。開示される方法における使用のための標的配列は、好ましくは、複雑であり、そして非反復性である（リンカー連結されたＤＮＡにおけるリンカー、およびゲノムＤＮＡにおける反復性ＤＮＡの切片を除く）核酸分子またはサンプルの部分である。
【００２１】
多重鎖置換増幅のための標的配列：核酸サンプル中の複数の部位は、同じＭＳＤＡ反応において同時に増幅され得るが、簡便にするために、以下の議論では、増幅されるべき目的の単一の核酸配列の特徴に言及する。この配列は、以下で標的配列という。ＭＳＤＡのための標的配列は、２つの型の標的領域（増幅標的およびハイブリダイゼーション標的）を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション標的は、プライマーセット中のプライマーに相補的な標的配列中の配列を含む。増幅標的は、増幅されるべき標的配列の部分である。この目的のために、増幅標的は、好ましくはハイブリダイゼーション標的の下流、またはそれに隣接する。標的配列を選択するための特定の配列または構造上の要件は存在しない。標的配列内のハイブリダイゼーション標的および増幅標的は、プライマーセット中のプライマーに対する標的配列の関係によって規定される。プライマーは、選択される標的配列にマッチするように設計される。図１の上方のパネルは、プライマーセット中のプライマーが、どのように標的配列中の領域を規定し得るかの例を示す。プライマーがハイブリダイズする部位中およびその部位の周辺の配列が増幅されるので、増幅されるべき配列とそのプライマーのハイブリダイゼーションの部位とは離れていることが好ましいが、そのことは要求されない。この例を、図３に示す。
【００２２】
リンカー連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅において、リンカーによって結合されるＤＮＡフラグメントが増幅標的であり、そしてリンカーがハイブリダイゼーション標的である。ハイブリダイゼーション標的（すなわち、リンカー）は、増幅のために使用されるプライマーに相補的である配列を含む。増幅のために好ましい形態の連結されたＤＮＡは、連結されたｃＤＮＡである。
【００２３】
（Ｂ．プライマー）
開示される増幅方法における使用のためのプライマーは、標的配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、プライマーの相補的部分という。プライマーの相補的部分は、プライマーと標的配列との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。一般に、これは、１０〜３５ヌクレオチド長であるが、好ましくは１６〜２４ヌクレオチド長である。ゲノム全体増幅には、プライマーは１２〜６０ヌクレオチド長であることが好ましい。
【００２４】
プライマーはまた、プライマーの５’末端に、標的配列に相補的ではないさらなる配列を含むことが好ましい。この配列を、プライマーの非相補的部分という。プライマーの非相補的部分は、存在する場合、ＤＮＡ複製間に安定な置換を促進するように作用する。プライマーの非相補的部分はまた、ＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーターのような機能的配列を含み得る。プライマーの非相補的部分は、任意の長さであり得るが、一般に１〜１００ヌクレオチド長であり、そして好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。ランダムまたは部分的にランダムなプライマーがゲノム全体増幅について使用される場合、非相補的部分の使用は、好ましくない。
【００２５】
多重鎖置換増幅のためのプライマー：多重鎖置換増幅の場合において、各プライマーの相補的部分は、標的配列におけるハイブリダイゼーション標的に相補的であるように設計される。プライマーセットにおいて、各プライマーの相補的部分が、標的配列の異なる部分に相補的であることが好ましい。このセット中のプライマーが、標的配列中の隣接する部位に相補的であることがより好ましい。標的配列中のこのような隣接する部位がまた、標的配列中の増幅標的に隣接することもまた好ましい。
【００２６】
標的配列にハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが互いに分離されることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも５塩基離れていることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも１０塩基離れていることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも２０塩基離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも３０塩基離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも４０塩基離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも５０塩基離れていることがなおさらに好ましい。
【００２７】
ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、約５００塩基以下で離れていることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、約４００塩基以下で離れていることがより好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、約３００塩基以下で離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、約２００塩基以下で離れていることがなおさらに好ましい。上記の分離の好ましい上限および下限の組み合わせが、特に意図され、すべての中間の範囲を含む。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーは、互いに、同じ塩基数離れている必要はない。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーは、互いに、ほぼ同じ塩基数離れていることが好ましい。
【００２８】
プライマー間の至適な分離距離は、すべてのＤＮＡポリメラーゼについて同じではない。なぜなら、このパラメーターは、正味の重合速度に依存するからである。進行性ＤＮＡポリメラーゼは、１秒あたり５〜３００ヌクレオチドの範囲に及び得る特徴的な重合速度を有し、そしてアクセサリーｓｓＤＮＡ結合タンパク質およびヘリカーゼの存在または非存在によって影響され得る。非進行性ポリメラーゼの場合において、正味の重合速度は、酵素の濃度に依存する。なぜなら、より高い濃度では、より多くの再開始事象が存在し、そして正味の重合速度が増大されるからである。進行性ポリメラーゼの例は、φ２９ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、１秒あたり５０ヌクレオチドで進行する。非進行性ポリメラーゼの例は、Ｖｅｎｔエキソ（−）ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、低い濃度で１秒あたり４ヌクレオチド、またはより高い濃度で１秒あたり１６ヌクレオチドの有効な重合速度を与える。
【００２９】
ＭＳＤＡ反応における至適な収量を得るために、プライマー間隔は、好ましくは使用されるポリメラーゼに合わせて調整される。迅速な重合速度を有するポリメラーゼを使用する場合には、長いプライマー間隔が好ましい。より遅い重合速度を有するポリメラーゼを使用する場合には、より短いプライマー間隔が好ましい。以下のアッセイは、任意のポリメラーゼでの至適な間隔を決定するために使用され得る。このアッセイは、プライマーセットを用い、各プライマーは、５つの左側プライマーおよび５つの右側プライマーから作製される。プライマーセットは、異なるプライマー間隔を有するプライマーの異なるセットの各々と、同じ標的配列に隣接してハイブリダイズするように設計される。間隔は、プライマーセット間で、２５ヌクレオチド〜４００ヌクレオチドの範囲内の２５ヌクレオチドの増加量で組織的に変化される（各セット内のプライマーの間隔は同じである）。一連の反応が行われ、ここで同じ標的配列は、プライマーの異なるセットを使用して増幅される。ＤＮＡの最も高い実験収量を生じる間隔は、特定のＤＮＡポリメラーゼ、または使用されるＤＮＡポリメラーゼおよびアクセサリータンパク質の組み合わせについての至適なプライマー間隔である。
【００３０】
プライマーがハイブリダイズする標的配列中の部位で開始されるＤＮＡ複製は、隣接する部位にハイブリダイズされるプライマーから複製される鎖まで伸長し、そしてそれを置換する。隣接する鎖の置換は、隣接する鎖を、別のプライマーに対するハイブリダイゼーション、および引き続いての別の回の複製の開始について利用可能にする。プライマーがハイブリダイズする標的配列の領域をを、標的配列のハイブリダイゼーション標的という。図１の上方のパネルは、標的配列、および標的配列の増幅標的に対するプライマーセットの好ましい関係のうちの１つを示す。
【００３１】
プライマーセットは、任意の所望の数の、異なるヌクレオチド配列のプライマーを含み得る。ＭＳＤＡについて、プライマーセットが、複数のプライマーを含むことが好ましい。プライマーセットが３以上のプライマーを含むことがより好ましい。プライマーセットが、４以上、５以上、６以上、または７以上のプライマーを含むことがなおさらに好ましい。一般により多くのプライマーが使用されるほど、得られる増幅のレベルはより高い。プライマーセットが有し得るプライマー数に対する必須の上限は存在しない。しかし、所定の標的配列について、プライマーセット中のプライマー数は、一般に、標的配列において利用可能なハイブリダイゼーション部位の数に限定される。例えば、標的配列が１０，０００ヌクレオチドのＤＮＡ分子であり、そして２０ヌクレオチドのプライマーが使用される場合、標的配列中に５００の非重複２０ヌクレオチド部位が存在する。重複部位が所望されるか、または受容可能である場合には、これよりもより多いプライマーでさえ、使用され得る。プライマーセットが約３００以上のプライマーを含むことが好ましい。プライマーセットが約２００以上のプライマーを含むことが好ましい。プライマーセットが約１００以上のプライマーを含むことがなおより好ましい。プライマーセットが約５０以上のプライマーを含むことがより好ましい。プライマーセットが７〜約５０のプライマーを含むことが最も好ましい。上記のプライマーセットにおけるプライマーの数についての好ましい上限および下限の任意の組み合わせが特に意図され、すべての中間の範囲を含む。
【００３２】
ＭＳＤＡにおける使用のための好ましい形態のプライマーセットは、右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットというプライマーの２つのセットを含む。右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットは、標的配列の反対側の鎖に相補的であるように設計される。右側のプライマーセットの相補的な部分が、右側のハイブリダイゼーション標的に各々相補的であること、および各々が、右側のハイブリダイゼーション標的の異なる部分に相補的であることが好ましい。左側のプライマーセットの相補的な部分が各々左側のハイブリダイゼーション標的に相補的であること、および各々が左側のハイブリダイゼーション標的の異なる部分に相補的であることが好ましい。右側のハイブリダイゼーション標的および左側のハイブリダイゼーション標的は、標的配列中の増幅標的の反対の末端に隣接する。これらの関係の好ましい形態を、図１の上方のパネルに示す。右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットの各々が、プライマーセットについて上記の好ましい数のプライマーを含むことは好ましい。特に、右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、プライマーセットについて複数のプライマーを含むことは好ましい。右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、３以上のプライマーを含むことはより好ましい。右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、４以上、５以上、６以上、または７以上のプライマーを含むことはなおより好ましい。右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、プライマーセットについて約２００以下のプライマーを含むことは好ましい。右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、プライマーセットについて約１００以下のプライマーを含むことはより好ましい。右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットの各々が、プライマーセットについて７〜約１００のプライマーを含むことが最も好ましい。上記のプライマーセットにおけるプライマーの数についての好ましい上限および下限の任意の組み合わせが特に意図され、すべての中間の範囲が含まれる。所定の標的配列について、右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットが同じプライマー数を含むこともまた好ましい。所定の標的配列について、右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットが、類似の長さおよび／またはハイブリダイゼーション特徴のプライマーから構成されることもまた好ましい。
【００３３】
ゲノム全体鎖置換増幅のためのプライマー：ゲノム全体鎖置換増幅の場合において、ランダムまたは部分的にランダムなヌクレオチド配列を有するプライマーセットが使用されることが好ましい。顕著に複雑な核酸サンプル（これは、ＷＧＳＤＡについての好ましい標的配列である）において、サンプル中に存在する特定の核酸配列は公知である必要はなく、そしてプライマーは、任意の特定の配列に相補的であるように設計される必要はない。むしろ、核酸サンプルの複雑性は、ランダムまたは部分的にランダムな配列の種々のプライマーに相補的であサンプル中の、大多数の異なるハイブリダイゼーション標的配列を生じる。ＷＧＳＤＡにおける使用のためのプライマーの相補的部分は、十分にランダム化され得るか、ランダム化されている部分のみを有し得るか、または他の様式で選択的にランダム化され得る。
【００３４】
プライマーの相補的部分におけるランダムな塩基位置の数は、好ましくは、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の２０％〜１００％である。より好ましくは、ランダムな塩基位置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の３０％〜１００％である。最も好ましくは、ランダムな塩基位置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の５０％〜１００％である。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーセットは、各位置の任意のヌクレオチドの添加がランダム化されるのを可能にすることによって、標準的な技術を使用して合成され得る。プライマーセットは、類似の長さおよび／またはハイブリダイゼーション特徴のプライマーから構成されることもまた好ましい。
【００３５】
連結されたＤＮＡでの多重鎖置換増幅のためのプライマー：連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅について、ランダムまたは部分的にランダムなヌクレオチド配列を有するプライマーセットが使用され得る。顕著に複雑な核酸サンプル（例えば、多くの配列の混合物から連結されたＤＮＡ）において、サンプル中に存在する特定の核酸配列は公知である必要はなく、そしてプライマーは、任意の特定の配列に相補的であるように設計される必要はない。むしろ、核酸サンプルの複雑性は、ランダムまたは部分的にランダムな配列の種々のプライマーに相補的であるサンプル中の、大多数の異なるハイブリダイゼーション標的配列を生じる。ＭＳＤＡ−ＣＤにおける使用のためのプライマーの相補的部分は、十分にランダム化され得るか、ランダム化されている部分のみを有し得るか、または他の様式で選択的にランダム化され得る。
【００３６】
プライマーの相補的部分におけるランダムな塩基位置の数は、好ましくは、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の２０％〜１００％である。より好ましくは、ランダムな塩基位置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の３０％〜１００％である。最も好ましくは、ランダムな塩基位置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の５０％〜１００％である。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーセットは、ランダム化される各位置での任意のヌクレオチドの付加を可能にすることによって、標準的な技術を使用して合成され得る。プライマーセットは、類似の長さおよび／またはハイブリダイゼーション特徴のプライマーから構成されることもまた好ましい。
【００３７】
ＤＮＡがリンカーと連結されている場合、リンカー中の配列の相補的なプライマーを使用して増幅が行われ得る。これは、ＭＳＤＡ−ＣＤの好ましい形態である。各プライマーの相補的部分がリンカー中の配列に相補的であるように設計されることが好ましい。リンカー連結されたＤＮＡとの使用のためのプライマーは、リンカー配列の両方の鎖に相補的なプライマーを含むことが好ましい。これを図４に示す。プライマーが互いに相補的ではないこともまた好ましい。このことは、プライマーが互いにハイブリダイズするのを防ぐ。ＤＮＡを連結するために使用されるリンカーが十分に長い場合、リンカー配列の異なる部分に相補的なプライマーセットが使用され得る。これは、ＭＳＤＡにおける状況に等価であり、そしてプライマーセットは、ＭＳＤＡプライマーセットについて議論されるのと同じ様式で設計および使用され得る。ランダムなプライマーは、リンカーがＤＮＡを連結するために使用されていても、使用されていなくても、連結されたＤＮＡを増幅するために使用され得る。
【００３８】
ＭＳＤＡ、ＷＧＳＤＡ、およびＭＳＤＡ−ＣＤにおける使用のための標的配列が、配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子でないか、またはその部分ではないことが好ましい。標的配列が、単一配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子ではないか、またはその部分ではないことがより好ましい。循環複製（ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を回転させることによって合成された単一の配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子でないか、またはその部分ではないことが最も好ましい。循環複製を回転させることによって作製されるそのような縦列反復ＤＮＡの例は、ＷＯ  ９７／１９１９３において記載される縦列配列ＤＮＡである。同一またはほぼ同一のＤＮＡフラグメントから連結されるＤＮＡは、循環複製を回転させることによって作製されず、そのため循環複製を回転させることによって合成された単一の配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子ではない。従って、標的配列は、単一の配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子ではないが、いくつかのそのような標的配列（例えば、同一またはほぼ同一のＤＮＡフラグメントから連結されるＤＮＡ）は、循環複製を回転させることによって合成された単一の配列の複数の縦列反復（例えば、ＷＯ９７／１９１９３において記載される縦列配列ＤＮＡ）から構成される核酸分子よりも好ましい。開示される方法についての標的配列がＷＯ  ９７／１９１９３において記載される方法によって生成されないことが好ましい。
【００３９】
検出タグ：プライマーの非相補的部分は、増幅された配列をさらに操作または分析するために使用されるべき配列を含み得る。そのような配列の例は検出タグであり、検出タグは、プライマーの非相補的部分中に存在する特定のヌクレオチド配列である。検出タグは、検出プローブに相補的な配列を有する。検出タグは、それらのコグネイト検出プローブを使用して検出され得る。検出タグは、増幅された鎖の末端に取り込まれるようになる。結果物は、検出プローブの相補的な部分に相補的である検出タグ配列を有する増幅されたＤＮＡである。存在する場合、プライマー上に、１、２、３、または３より多くの検出タグが存在し得る。プライマーが１、２、３、または４の検出タグを有することが好ましい。最も好ましくは、プライマーは１つの検出タグを有する。一般に、プライマーは１０以下の検出タグを有することが好ましい。プライマーのサイズを除いて、プライマー上に存在し得る検出タグの数に対する必須の限定は存在しない。複数の検出タグが存在する場合、それらは同じ配列を有し得、またはそれらは異なる配列を有し得、各異なる配列は、異なる検出プローブに相補的である。プライマーが検出タグを含み、これらが単一の検出プローブに対してすべて相補的であるように同じ配列を有することが好ましい。いくつかの複数の検出方法について、プライマーが６までの検出タグを含むこと、および検出タグ部分が、検出タグ部分の各々が異なる検出プローブに相補的であるように異なる配列を有することが好ましい。類似の効果は、各々が単一の異なる検出タグを有するプライマーセットを使用することによって達成され得る。検出タグは、それぞれ、検出タグと検出プローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチド長が好ましく、検出タグ部分が１５〜２０ヌクレオチド長であることが最も好ましい。
【００４０】
アドレスタグ（Ａｄｄｒｅｓｓ  Ｔａｇ）：プライマーの非相補的部分中に含まれ得る配列の別の例は、アドレスタグである。アドレスタグは、アドレスプローブに相補的な配列を有する。アドレスタグは、増幅される鎖の末端に取り込まれるようになる。結果物は、アドレスプローブの相補的な部分に相補的であるアドレスタグ配列を有する増幅されたＤＮＡである。存在する場合、プライマー上に、１、または１より多くのアドレスタグが存在し得る。プライマーが１または２のアドレスタグを有することが好ましい。最も好ましくは、プライマーは１つのアドレスタグを有する。一般に、プライマーは１０以下のアドレスタグを有することが好ましい。プライマーのサイズを除いて、プライマー上に存在し得るアドレスタグの数に対する必須の限定は存在しない。複数のアドレスタグが存在する場合、それらは同じ配列を有し得、またはそれらは異なる配列を有し得、各異なる配列は、異なるアドレスプローブに相補的である。プライマーがアドレスタグを含み、これらが単一のアドレスプローブに対してすべて相補的であるように同じ配列を有することが好ましい。アドレスタグ部分は、それぞれ、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチド長が好ましく、アドレスタグ部分が１５〜２０ヌクレオチド長であることが最も好ましい。
【００４１】
（Ｃ．リンカー）
連結されたＤＮＡについて本明細書中で使用される場合、リンカーは、小さな二本鎖ＤＮＡ分子である。ＭＳＤＡ−ＣＤについて、リンカーは２つの主な目的を果たす：ＤＮＡフラグメントの連結を促進すること、および増幅を促進すること。第１の目的のために、リンカーは、一般に、連結されるべきＤＮＡフラグメントの末端と適合性である末端を有するように設計される。例えば、ＤＮＡフラグメントが平滑末端を有する（または、末端が平滑にされる）場合、平滑末端化リンカーが使用される。１つ以上のヌクレオチドで末端をつながれたＤＮＡフラグメントについて、リンカーは、相補的テイルを有するべきである。そのようなテイル化（ｔａｉｌｉｎｇ）の例は、ｃＤＮＡの３’末端への単一のアデノシン残基の付加である。増幅を促進するために、リンカーは、ＭＳＤＡ−ＣＤにおいて使用されるべきプライマーに相補的な１つ以上の配列を有するべきである。そのような配列を、リンカーのプライマー相補的部分という。リンカーのプライマー相補的部分は、プライマーの相補的部分に相補的である。プライマー相補的部分は、それが意図されたプライマーの部分に相補的である限り、任意の配列を有し得る。リンカーの反対の鎖上にプライマー相補的部分が存在する場合、それらは重複するべきではない。プライマーはまた、１つ以上の制限酵素切断部位を有し得る。そのような制限部位は、増幅されたＤＮＡがフラグメント、および好ましくは連結された元々のＤＮＡフラグメントを示すフラグメントに切断されることを可能にする。この目的のために、まれな制限部位（例えば、８塩基の認識部位）が使用されることが好ましい。この型のリンカーの構造の例を以下に示す：
【００４２】
【化１】
0004264919.tif 000002
リンカーはまた、１つ以上のプロモーター配列を含み得る。そのようなプロモーター配列は、増幅されたＤＮＡが、ＭＳＤＡ−ＣＤの後の転写によってさらに増幅されるのを可能にする。２つのプロモーターがリンカーに組み込まれる場合、それらは、好ましくはリンカーの異なる鎖上に位置される。両方の３’末端に単一の突出するチミジン残基、および両方の５’末端にリン酸基を有するリンカーの例を以下に示す（Ｐはリン酸を示す）：
【００４３】
【化２】
0004264919.tif 000003
プロモーターおよびプライマー配列は、任意の順で配置され得るが、上に示される配置が好ましい。任意の数のプライマーおよびプロモーターが使用され得る。しかし、連結されるべきＤＮＡがｃＤＮＡである場合、プロモーターは、ｃＤＮＡ合成のために使用されるプライマーの部分としてｃＤＮＡに組み込まれることが好ましい（Ｌｏｃｋｈａｒｔら）。
【００４４】
（Ｄ．検出標識）
開示した方法を用いて増幅された核酸の検出および定量を補助するために、検出標識は、増幅された核酸に直接取り込まれ得るか、または検出分子に結合し得る。本明細書で使用する場合、検出標識は、増幅された核酸と直接的または間接的に会合し得、そして測定可能で検出可能なシグナルを、直接的または間接的のいずれかで生じる任意の分子である。核酸に取り込まれる、または核酸プローブに結合するための多くのこのような標識は、当業者に公知である。開示した方法における使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【００４５】
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含む。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。好ましい蛍光標識は、ＦＩＴＣおよびシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７である。これらの蛍光体の吸収極大および発光極大は、それぞれ：ＦＩＴＣ（４９０  ｎｍ；５２０  ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４  ｎｍ；５６８  ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１  ｎｍ；５８８  ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２  ｎｍ；６７２  ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２  ｎｍ；７０３  ｎｍ）、およびＣｙ７（７５５  ｎｍ；７７８  ｎｍ）であり、従って、それらの同時検出を可能にする。蛍光標識は、種々の市販の供給源（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  Ｏｈｉｏを含む）から入手可能である。
【００４６】
標識されたヌクレオチドは、検出標識の好ましい形態である。なぜなら、それらは合成中に増幅産物に直接取り込まれ得るからである。増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡに取り込まれ得る検出標識の例は、ＢｒｄＵｒｄ（ＨｏｙおよびＳｃｈｉｍｋｅ，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、ＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））、およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニン（Ｋｅｒｋｈｏｆ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０５：３５９−３６４（１９９２））のような適切なハプテンで改変されたヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログを含む。適切な蛍光で標識されたヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ、およびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２：３２２６−３２３２（１９９４）である。ＤＮＡの好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）であり、そしてＲＮＡの好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに結合し得る。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチンで標識したプローブまたはジゴキシゲニンで標識したプローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として入手可能である。
【００４７】
増幅された核酸に取り込まれる検出標識（例えば、ビオチン）は、続いて、当該分野で周知の鋭敏な方法を用いて検出され得る。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）（これは、ビオチンに結合し、続いて適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセエタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3.7］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光によって次に検出される）を用いて検出され得る。
【００４８】
増幅されたＲＮＡの検出における使用のために好ましい検出標識は、アクリジニウム−エステル標識したＤＮＡプローブ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ，  Ｉｎｃ．，  Ａｒｎｏｌｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５８８−１５９４（１９８９）に記載される）である。アクリジニウム−エステル標識した検出プローブは、洗浄を伴わないで、増幅されたＲＮＡの検出を可能にする。なぜなら、ハイブリダイズしていないプローブはアルカリで破壊され得るからである（Ａｒｎｏｌｄら、（１９８９））。
【００４９】
これらの検出標識の２つ以上を組み合わせた分子はまた、検出標識と考えられる。任意の公知の検出標識は、開示されたプローブ、タグ、および方法とともに使用され得、開示された方法を用いて増幅された核酸を標識および検出する。検出標識によって生じるシグナルを検出および測定するための方法はまた、当業者に公知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーションカウンティングまたは直接的可視化によって検出され得る；蛍光分子は、蛍光分光光度計で検出され得る；燐光分子は、分光光度計によって検出され得るかまたはカメラで直接可視化され得る；酵素は、酵素によって触媒される反応の産物の検出または可視化によって検出され得る；抗体は、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出され得る。本明細書中で用いられる場合、検出分子は、増幅された核酸と相互作用し、そして一つ以上の検出標識が結合された分子である。
【００５０】
（Ｅ．検出プローブ）
検出プローブは、増幅した核酸上の検出タグに相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的な部分は、検出プローブと検出タグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチドの長さが好ましく、１６〜２０ヌクレオチド長の検出プローブの相補的な部分が最も好ましい。検出プローブは、上記の任意の検出ラベルを含み得る。好ましい標識は、ビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは、分子ビーコンである。分子ビーコンは、検出プローブがハイブリダイズされた場合にのみ蛍光部分が蛍光を発する蛍光部分で標識された検出プローブである（ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：３０３−３０９（１９９５））。このようなプローブの使用は、標識検出の前にハイブリダイズしていないプローブを除去する必要性を排除する。なぜなら、ハイブリダイズしていない検出プローブは、シグナルを生成しないからである。これは、複合アッセイに特に有用である。
【００５１】
（Ｆ．アドレスプローブ）
アドレスプローブは、プライマー上のアドレスタグに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的な部分は、アドレスプローブとアドレスタグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチドの長さが好ましく、１２〜１８ヌクレオチド長のアドレスプローブの相補的な部分が最も好ましい。アドレスプローブは、単一の相補的な部分または複数の相補的な部分を含み得る。好ましくは、アドレスプローブは、直接的にまたはスペーサー分子を介してのいずれかで、固体の支持体に結合される。アドレスプローブと固体の支持体とのこのような組み合わせは、固体の検出器の好ましい形態である。
【００５２】
（Ｇ．  オリゴヌクレオチド合成）
プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、および任意の他のオリゴヌクレオチドが、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドを生成または合成する方法は、当該分野において周知である。そのような方法は、標準的な酵素消化後のヌクレオチドフラグメント単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）第５、６章）を参照のこと）から、純粋な合成法、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｎｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成機、またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を用いるシアノエチルホスホロアミダイト法による合成法まで範囲であり得る。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成法はまた、Ｉｋｕｔａら，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法）およびＮａｒａｎｇら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル法）に記載される。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５：３−７（１９９４）に記載される方法のような、公知の方法を使用して作製され得る。
【００５３】
本明細書中に記載される多くのオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸の特定の部分に相補的であるように設計され、その結果、安定なハイブリッドがそれらの間に形成され得る。これらのハイブリッドの安定性は、ＬｅｓｎｉｃｋおよびＦｒｅｉｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１０８０７−１０８１５（１９９５）、ＭｃＧｒａｗら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６７４−６７８（１９９０）、およびＲｙｃｈｌｉｋら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：６４０９−６４１２（１９９０）に記載される方法のような、公知の方法を用いて計算され得る。
【００５４】
（Ｈ．  固体検出器）
固体検出器は、それらにアドレスプローブまたは検出分子を結合した固体基材または支持体である。固体検出器の好ましい形態は、アレイ検出器である。アレイ検出器は、そこに複数の異なるアドレスプローブまたは検出分子がアレイ、格子、または他の組織的な様式で結合した固体検出器である。
【００５５】
固体検出器における使用のための固体基材は、そこにオリゴヌクレオチドを結合し得る任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリフマル酸プロピル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基材は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、不織布、成形された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有し得る。固体基材のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュである。マイクロタイターディッシュの最も好ましい形態は、標準９６ウェルタイプである。
【００５６】
固体基材上で固定されたアドレスプローブは、固体検出器上の開示した増幅方法の産物の捕捉を可能にする。そのような捕捉は、続く検出工程を妨げ得る反応成分を洗い去る、好都合な手段を提供する。異なるアドレスプローブを固体検出器の異なる領域に付着させることにより、異なる増幅産物が、固体検出器上の異なる位置、従って診断的な位置で捕捉され得る。例えば、マイクロタイタープレート複合アッセイにおいて、９６までの異なる増幅核酸（各々が異なるプライマーのセットを介して増幅された異なる標的配列を表す）に特異的なアドレスプローブは、各々が異なるウェル中で、マイクロタイタープレート上に固定され得る。捕捉および検出は、増幅核酸に対応する標的配列がサンプル中に存在した、増幅核酸に対応するウェルの中でのみ起こる。
【００５７】
固体基材へのオリゴヌクレオチドの固定のための方法は、良く確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された結合法を用いて基材に結合され得る。例えば、適切な付着法は、Ｐｅａｓｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）、およびＫｈｒａｐｋｏら，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）により記載される。カゼイン被覆スライド上の３’アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３（１９９５）により記載される。固体基材にオリゴヌクレオチドを付着させる好ましい方法は、Ｇｕｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５４５６−５４６５（１９９４）により記載される。
【００５８】
（Ｉ．固体サンプル）
固体サンプルは、そこに標的配列が結合または接着している、固体基材または支持体である。標的配列は、好ましくは、標的サンプルまたはアッセイサンプル中に送達される。固体サンプルの好ましい形態は、アレイサンプルである。アレイサンプルは、そこに複数の異なる標的サンプルをアレイ、格子、または他の組織的な様式で結合または接着している、固体サンプルである。
【００５９】
固体サンプルにおける使用のための固体基材は、そこに標的配列を結合または接着し得る、任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリフマル酸プロピル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基材は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、スライド、繊維、織物繊維、成形された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有し得る。固体基材のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュおよびガラススライドである。マイクロタイターディッシュの最も好ましい形態は、標準９６ウェルタイプである。
【００６０】
固体基材上で固定された標的配列は、固体基材上に局在される標的特異的増幅核酸の形成を可能にする。そのような局在化は、続く検出工程を妨げ得る反応成分を洗い去る好都合な手段を提供し、そして複数の異なるサンプルを同時にアッセイする好都合な方法を提供する。増幅した核酸は、異なるサンプルが接着する各部位に独立して形成され得る。固体サンプルを形成するための標的配列または他のオリゴヌクレオチド分子の固定のために、上記の方法が使用され得る。
【００６１】
固体基材の好ましい形態は、そこに２５６までの別々の標的サンプルが小さな点のアレイとして接着しているガラススライドである。各点は、好ましくは直径０．１〜２．５ｍｍであり、最も好ましくは直径およそ２．５ｍｍである。そのような微少アレイは、例えば、Ｓｃｈｅｎａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８７−４７０（１９９５）により記載される方法を使用して製造され得る。簡潔には、微少アレイは、プリントチップを備えたアレイマシンによって、ポリ−Ｌ−リジン被覆顕微鏡スライド（Ｓｉｇｍａ）上に製造され得る。チップは、例えば、９６−ウェルのマイクロタイタープレートからの１μｌのＤＮＡサンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ）で充填され、そして所望の間隔で複数のスライド上に１スライドあたり約０．００５μｌで配置される。次いで、プリントされたスライドは、湿潤チャンバー内で２時間再水和され、１００℃で１分間急速乾燥（ｓｎａｐ−ｄｒｙ）され、０．１％ＳＤＳ中ですすがれ、そして５０％  １−メチル−２−ピロリジノンおよび５０％ホウ酸から成る緩衝液中に調製された０．０５％無水コハク酸で処理され得る。次いでスライド上のＤＮＡは、例えば、使用の直前に９０℃で２分間、蒸留水中で変性され得る。微少アレイ固体サンプルは、例えば、コンピュータ制御ＸＹステージおよび顕微鏡対物レンズを有するレーザー蛍光スキャナによって、スキャンされ得る。混合ガス、多線レーザーは、複数の蛍光物質の連続的な励起を可能にする。
【００６２】
（Ｊ．ＤＮＡポリメラーゼ）
多重置換増幅において有用なＤＮＡポリメラーゼは、単独でまたは適合する鎖置換因子と組み合せて、複製中に遭遇したハイブリダイズ鎖を置換し得るにちがいない。このようなポリメラーゼを、本明細書中で鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと呼ぶ。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことが好ましい。鎖置換は、標的配列の複数コピーの合成を生じるために必要である。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、存在すれば、合成鎖の破壊をもたらし得る。開示された方法における使用のためのＤＮＡポリメラーゼは、高度に進行性であることもまた好ましい。開示された方法における使用のためのＤＮＡポリメラーゼの適合性は、鎖置換複製を行うその能力を評価することにより容易に決定され得る。好ましい鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＢｓｔラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ（エキソ（−）Ｂｓｔ；Ａｌｉｏｔｔａら，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１２：１８５−１９５（１９９６））およびエキソ（−）Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｎｎ，Ｃｌｉｍｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１６０４−１６０８（１９９６））である。他の有用なポリメラーゼには、バクテリオファージφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｌａｎｃｏらの、米国特許第５，１９８，５４３号および同第５，００１，０５０号）、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ  ８４：  ２４７  （１９８９））、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ８２８７  （１９８７））、エキソ（−）ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：  １９６５−１９７５  （１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４５：  ６２３−６２７  （１９７４））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｇｅｎｅ  ９７：  １３−１９  （１９９１））、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（ＺｈｕおよびＩｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．  １２１９：  ２６７−２７６  （１９９４））、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＫａｂｏｏｒｄおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ，  Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．  ５：  １４９−１５７  （１９９５））が挙げられる。エキソ（−）Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼが最も好ましい。
【００６３】
鎖置換は、鎖置換因子（例えば、ヘリカーゼ）の使用により促進され得る。鎖置換因子の存在下で鎖置換複製を行い得る任意のＤＮＡポリメラーゼは、たとえこのＤＮＡポリメラーゼが、このような因子の非存在下で鎖置換複製を行わないとしても、開示される方法における使用のために適切であると考えられる。鎖置換複製において有用な鎖置換因子として、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１２）：  ７６４８−７６５３  （１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（２）：  １１５８−１１６４  （１９９４））、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ＢｏｅｈｍｅｒおよびＬｅｈｍａｎ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（２）：  ７１１−７１５  （１９９３）；ＳｋａｌｉｔｅｒおよびＬｅｈｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１（２２）：  １０６６５−１０６６９  （１９９４））、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；  ＲｉｇｌｅｒおよびＲｏｍａｎｏ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７０：  ８９１０−８９１９  （１９９５））；Ｔ４ファージ遺伝子３２タンパク質（Ｖｉｌｌｅｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｇｉｅｄｒｏｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４３９５−１４４０４（１９９６））およびウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：  １３６２９−１３６３５  （１９９２））が挙げられる。
【００６４】
鎖置換複製を行うポリメラーゼの能力は、実施例１および２に記載されるアッセイのような、鎖置換複製アッセイにおいてポリメラーゼを使用することにより決定され得る。この実施例のアッセイは適切に改変され得る。例えば、ヘリカーゼはＳＳＢの代わりに使用され得る。このようなアッセイは、使用される酵素について最適な活性に適した温度で行われるべきである。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼについては３２℃、エキソ（−）Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼについては４６℃〜６４℃、または高度好熱性生物由来の酵素については約６０℃〜７０℃である。６０℃〜７０℃のアッセイについてのプライマー長を、ランダムプライマーについては２０塩基まで、または特定のプライマーについては２２塩基まで増加し得る。ポリメラーゼを選択する別の有用なアッセイは、Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３）に記載されるプライマーブロックアッセイである。このアッセイは、伸長するプライマーの上流にハイブリダイズしその進行をブロックするオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下におけるＭ１３  ｓｓＤＮＡ鋳型を使用するプライマー伸長アッセイからなる。このアッセイにおいてこのブロッキングプラーマーを置換し得る酵素は、この公開した方法について有用である。
【００６５】
上述の物質は、この開示した方法を行うのに有用なキットとして任意の適切な組み合せによりともにパッケージされ得る。
【００６６】
（ＩＩ．方法）
この開示した方法は、複数プライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。本方法を使用し、１つ以上の特異的な配列（多重鎖置換増幅）、高度に複雑なゲノム全体または他のＤＮＡ（ゲノム全体鎖置換増幅）、あるいは連結したＤＮＡ（連結したＤＮＡの多重鎖置換増幅）を増幅し得る。一般的にこの開示した方法は、プライマーの標的核酸配列とのハイブリダイゼーション、およびこのハイブリダイゼーションプライマーによりプライミングされる標的配列の複製を含み、その結果、標的配列の複製は、この標的配列と相補的な複製した鎖を生じる。複製の間、成長している複製した鎖は、鎖置換複製を介して、他の複製した鎖を、この標的配列（または別の置換した鎖）から置換する。複製した鎖のこのような置換の例を、図中に説明する。本明細書中に使用される複製した鎖は、標的配列または別の複製した鎖にハイブリダイズしたプライマーの伸長から生じる核酸鎖である。鎖置換複製は、複製した鎖の成長末端が、この鋳型鎖（または別の複製鎖）由来の別の鎖に遭遇し、置換するＤＮＡ複製を言う。他の複製鎖による複製鎖の置換は、標的配列の複数コピーが、単一の等温反応中に作製されるようにするこの開示した方法の特徴である。
【００６７】
（Ａ．多重鎖置換増幅）
多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）と呼ばれる本方法の１つの好ましい形態において、２セットのプライマー、右セットおよび左セットが使用される。右セットプライマーにおけるプライマーは各々、標的ヌクレオチド配列の片側に隣接するヌクレオチド配列に相補的な部分を有し、ならびに左セットのプライマー中のプライマーの各々はこの標的ヌクレオチド配列の別側に隣接するヌクレオチドに相補的な部分を有する。右セットのプライマーはこの標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子１つの鎖に相補的であり、左セットのプライマーはこの反対側の鎖に相補的である。両セットのプライマーの５’末端は、このプライマーがこの核酸分子中の隣接する配列にハイブリダイズする場合、目的の核酸配列に遠位である。好ましくは、各セットの各メンバーは、この標的ヌクレオチド配列に隣接する別々のおよび非重複のヌクレオチド配列に相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始した複製により進行し、そしてこの標的核酸配列を介して継続する。本方法の重要な特徴は、複製中の在介プライマーの置換である。一旦、右セットのプライマーから伸長した核酸鎖が、この左セットのプライマーがハイブリダイズする核酸分子の領域に到達する場合、およびその逆の場合、そして逆に、別の回のプライミングおよび複製が起こる。これは、この標的核酸配列の入れ子のセットの複数コピーが短期間に合成されるようにする。
【００６８】
多重鎖置換増幅は、以下により行われ得る：（ａ）プライマーのセットを標的サンプルと混合し、プライマー標的サンプル混合物を産生し、そしてこのプライマー標的サンプル混合物を、このプライマー標的サンプル混合物中のプライマーおよび標的配列間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをこのプライマー標的サンプル混合物と混合し、ポリメラーゼ標的サンプル混合物を産生し、この標的配列の複製を促進する条件下で、このポリメラーゼ標的サンプル混合物をインキュベートする工程。鎖置換複製は好ましくは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼまたは適合鎖置換因子と組み合せたＤＮＡポリメラーゼを使用することにより達成される。ＭＳＤＡの好ましい例を、図１で説明する。ＭＳＤＡの別の例を、図３で説明する。
【００６９】
右および左セットにおける充分な数のプライマーを使用することにより、２、３回の複製のみが数十万コピーの目的の核酸配列を産生するために必要である。例えば、２６プライマーの右および左プライマーセットを各々使用して、２００，０００コピーの５０００ヌクレオチド増幅標的が１０分間（４回のプライミングおよび複製を表す）に生成され得ることが推定され得る。２６プライマーの右および左プライマーセットを各々使用して、２００，０００コピーの４７，０００ヌクレオチド増幅標的が６０分間（再度４回のプライミングおよび複製を表す）に生成され得ることもまた推定され得る。これらの計算は、１秒あたり５０ヌクレオチドのポリメラーゼ伸長速度に基づく。反応は継続され、かつ等温（サイクルは要求されない）であることが重視される。
【００７０】
この開示した方法は、ポリメラーゼ連鎖反応に対して利点を有する。なぜなら等温条件下で実施されるからである。温度サイクルは必要ではない、なぜなら伸長している鎖の頭部でこのポリメラーゼ（または適合鎖置換因子）が、その前方の鎖を置換し、これによりこの鎖のハイブリダイゼーションに利用可能にする。多重鎖置換増幅の別の利点は、非常に長い核酸セグメント（５０キロベースのオーダーで）を増幅する能力、およびより短いセグメント（１０キロベース以下）の迅速な増幅を含む。長い核酸セグメントは、この開示した方法で増幅され得る。なぜなら連続的な合成を妨げ得るか、または複製した鎖の再ハイブリダイゼーションに起因するアーチファクトの形成を可能にするサイクルがないからである。多重鎖置換増幅において、意図しない部位での単一のプライミング事象は、これらの部位でのアーチファクトの増幅を導かない（なぜなら意図した部位での増幅は、意図しない部位での一本鎖複製を迅速に追い越すからである）。
【００７１】
（Ｂ．ゲノム全体鎖置換増幅）
ゲノム全体鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）と呼ばれる本方法の別の好ましい形態において、ランダムなまたは部分的にランダムなセットのプライマーが使用され、ゲノム核酸のサンプル（または高度に複雑な核酸の別のサンプル）にランダムにプライムする。ランダムまたはほとんどランダムな配列の十分に大きなセットのプライマーを選択することにより、このセットのプライマーは、集合的に、ランダムに、試料中の核酸中に分布する核酸配列に相補的となる。増幅は、各プライマーで開始した前進的なポリメラーゼを用いた複製により進行し、そして自然に終結するまで継続する。この方法の重要な特徴は、ポリメラーゼによる置換中の介在プライマーの置換である。この方法において、ゲノム全体の複数の重複するコピーは、短期間で合成され得る。ゲノムサンプル上のＷＧＳＤＡにおいて、インキュベーションの１８０分後、各プライマーは平均で５５，０００塩基まで伸長されていることが推定され得る。十分に高い濃度のプライマーを使用することにより、複製した鎖上のさらなるプライミング事象はさらなる回数のコピーをもたらす。１８０分後、４００コピーのゲノム全体が生成されることが推定され得る。
【００７２】
ゲノム全体鎖置換増幅は以下により行われ得る：（ａ）ゲノムサンプル（または高度に複雑な他の核酸サンプル）を用いてランダムまたは部分的にランダムなプライマーのセットを混合して、プライマー標的サンプル混合物を生成し、そしてこのプライマー標的サンプル混合物中のプライマーおよびゲノムＤＮＡ間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でこのプライマー標的サンプル混合物をインキュベートする工程、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼとこのプライマー標的サンプル混合物とを混合し、ポリメラーゼ標的サンプル混合物を産生し、そしてゲノムＤＮＡ複製を促進する条件下でこのポリメラーゼ標的サンプル混合物をインキュベートする工程。鎖置換複製は好ましくは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼまたは適合鎖置換因子と組み合せたＤＮＡポリメラーゼを使用することにより達成される。ＷＧＳＤＡは図２で説明する。
【００７３】
本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応に対する利点を有する。なぜなら等温条件下で行われ得るからである。ゲノム全体鎖置換増幅の他の利点には、ゲノム全体ＰＣＲよりも高レベルの増幅（５倍高いレベルまで）が挙げられ、増幅はＰＣＲよりも配列依存性ではなく、かつＰＣＲを用いて生じ得るような再アニールアーチファクトまたは遺伝子シャッフリングアーチファクトはない（なぜなら変性または再アニールのサイクルがないからである）。
【００７４】
増幅後、増幅された配列は、ＰＣＲ増幅配列について公知および確立された使用のような任意の目的であり得る。例えば、増幅配列は、蛍光標識の検出、酵素連結検出系、抗体媒介標識検出，および放射活性標識の検出のような核酸に対する従来の検出系のいずれをも用いて検出され得る。開示された方法の鍵となる特徴は、増幅がサイクルでは起こらず、連続的な等温複製で起こることである。これは、増幅を、より簡単し、そして出力においてより大きな一致をもたらす。鎖置換は、単一の連続等温反応で、核酸配列または試料の複数コピーの迅速生成を可能にする。
【００７５】
ＷＧＳＤＡについて用いられるプライマーのセットは、プライマーが核酸試料内で所望の間隔でハイブリダイズすることを可能にする濃度で用いられることが好ましい。例えば、プライマーのセットを、それらが、平均して４０００〜８０００塩基ごとにハイブリダイズすることを可能にする濃度で用いることにより、これらの部位で開始したＤＮＡ複製が伸び、そして隣接部位から複製される鎖を置換する。プライマーは、規則的な間隔で標的配列にハイブリダイズすることは予期されないことに注意すべきである。むしろ、平均の間隔は、プライマー濃度の一般的機能である。
【００７６】
多重鎖置換増幅におけるように、隣接鎖の置換は、それを、別のプライマーへのハイブリダイゼーション、および引き続く別のラウンドの複製の開始に利用可能にする。プライマーセット中のプライマーが標的配列にハイブリダイズする間隔は、増幅のレベルを決定する。例えば、平均間隔が短い場合、隣接鎖は迅速および頻繁に置換される。平均間隔が長い場合、隣接鎖は、長い行程の複製後のみに置換される。
【００７７】
開示された方法では、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマー伸長、および所望される限り進行する前進的な鎖置換重合反応における鎖置換を触媒し、６０，０００ヌクレオチドまで、またはそれより大きい分子を生成する。好適な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、大フラグメントＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｏ（−）Ｂｓｔ）、ｅｘｏ（−）Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージφ２９のＤＮＡポリメラーゼおよびＳｅｑｕｅｎａｓｅである。鎖置換複製の間に、反応中に生成されるＤＮＡを標識するために、放射活性、またはブロモデオキシウリジン三リン酸のような改変ヌクレオチドをさらに含み得る。あるいは、ビオチン化ヌクレオチドのような（Ｌａｎｇｅｒら（１９８１））、結合成分を提供する適切な前駆体を含み得る。
【００７８】
ＰＣＲを用いるゲノム増幅、および増幅ＤＮＡの使用は、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５４８７−５８５１（１９９２）、Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−７２５（１９９２）、Ｃｈｅｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７６−１４６７９（１９９６）、およびＫｕｋａｓｊａａｒｖｉら、Ｇｅｎｅｓ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  １８：９４−１０１（１９９７）に記載されている。これらの刊行物に記載された増幅ＤＮＡの使用はまた、一般に、本明細書で開示された方法を用いて増幅されたＤＮＡに適用可能である。ＰＣＲを基礎にしたゲノム全体増幅とは異なり、ゲノム全体鎖置換増幅は、ハプロ型分析に適切である。なぜなら、ＷＧＳＤＡは、ＰＣＲを基礎にしたゲノム全体増幅より長いフラグメントを生じるからである。ＰＣＲを基礎にしたゲノム全体増幅はまた、ハプロ型分析により適切ではない。なぜなら、ＰＣＲにおける各サイクルが、同一フラグメント中に一緒に置かれる、（ゲノム中の）遠い配列の会合を生じるプライミング事象に機会を引き起こすからである。
【００７９】
（Ｃ．連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅）
連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ−ＣＤ）として言及される方法の別の好適な形態では、連結されたＤＮＡが増幅される。連結されたＤＮＡの好適な形態は、連結されたｃＤＮＡである。連結されたＤＮＡは、ＷＧＳＤＡにおけるように、ランダムまたは部分的にランダムなセットのプライマーを用いてか、または連結されたＤＮＡ中の特異的ハイブリダイゼーション標的に相補的な特異的プライマーを用いて増幅され得る。ＭＳＤＡ−ＣＤは、複合体混合物または比較的短い核酸試料（すなわち、ほぼ１００〜６，０００ヌクレオチドの範囲にあるフラグメント）の増幅に好適である。メッセンジャーＲＮＡは、このような複合体混合物の最も重要な例である。ＭＳＤＡ−ＣＤは、細胞中のすべてのｃＤＮＡを増幅する手段を提供し、これは等価な様式である。連結されたｃＤＮＡは、５，０００倍まで増幅され得るので、ＭＳＤＡ−ＣＤは、ほんの２〜３の細胞に基づくＲＮＡプロファイル分析を可能にする。ＭＳＤＡ−ＣＤを実施するために、ＤＮＡは、まず第一に連結工程に供しなければならない。（ｍＲＮＡのような）ＲＮＡ試料が増幅される場合、ＲＮＡは、最初に、標準的な方法を用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換される。このｃＤＮＡ、または増幅されるべき他のＤＮＡフラグメントの任意のセットは、次いで、好ましくはリンカーを取り込んでＤＮＡ連結物に変換される。
【００８０】
ＤＮＡフラグメントは、標準的な条件を用いる連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）により連結（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ）され得る。ＤＮＡを連結（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ）する場合、ＤＮＡフラグメントの末端の状態（平滑、スタッガーまたはラガッド）が考慮されるべきである。例えば、制限酵素もを用いた消化により産生されるようなスタッガー末端は、オーバーハング配列が適合する場合、連結化を媒介するために用いられ得る。ラガッドまたはスタッガー末端をもつＤＮＡは、連結の前に平滑末端にされ得る。これら操作のすべては、周知でありかつ一般の使用である。リンカーが用いられる場合、リンカーは、（平滑末端リンカーを用いて）平滑末端ＤＮＡ、または適合するオーバーハング末端を有するＤＮＡ（この場合リンカーはアダプターの形態であり得る）のいずれかに連結され得る。
【００８１】
以下は、ＭＳＤＡ−ＣＤをどのように用いてｍＲＮＡ配列を増幅し得るかの例を示す。第一に、ｃＤＮＡは、目的のｍＲＮＡから作成される。この例では、ｃＤＮＡは、それがリン酸化５’末端を含むような方法で作成される。次いで、ｃＤＮＡを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて両方の３’末端に１つのアデノシン残基をテールとして付ける（例えば、Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：１００４−１０１０（１９９６）により、そしてＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．のカタログにおいて記載されるように）。次いで、このＡテールｃＤＮＡは、標準的な連結緩衝液（例えば、ＨｏｌｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１１５６（１９９１）、およびＰｒｏｍｅｇａカタログ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、１９９７）２０６頁中のｐＧＥＭ−Ｔベクターの使用のための指示書を参照のこと）中、ＡＴＰおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、Ｔテールリンカーと混合され、そして反応物を、一晩１６#Ｃでインキュベートし、長い連結されたＤＮＡ分子を生成する。この連結された分子は、交互する順序にある、構造−リンカー−ＤＮＡ−リンカー−ＤＮＡ−リンカー−ＤＮＡ−の、タンデムに連結されたｃＤＮＡおよびリンカーからなる。このＡテールおよびＴテール法は、リンカーおよびＤＮＡフラグメントの、タンデムな、連結された（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を得るための多くの可能な方法の１つの例に過ぎない。リンカーなしにＤＮＡフラグメントを連結し、構造−ＤＮＡ−ＤＮＡ−ＤＮＡ−ＤＮＡ−の連結された分子を得ることもまた可能である。リンカーを備えた連結されたＤＮＡフラグメントを、本明細書では、リンカー−連結されたＤＮＡまたはリンカー−ＤＮＡ連結物と呼ぶ。リンカーなしの連結されたＤＮＡフラグメントを、本明細書では、非リンカー−連結されたＤＮＡまたは非リンカー−ＤＮＡ連結物と呼ぶ。用語連結されたＤＮＡおよびＤＮＡ連結物は、リンカー−連結されたＤＮＡおよび非リンカー−連結されたＤＮＡの両方をいう。リンカー−ＤＮＡ連結物の増幅は、非リンカー−ＤＮＡ連結物の増幅より特異的かつ効率的である。なぜなら、特異的プライマーをリンカー配列に指向させ得るからである。従って、このリンカー−ＤＮＡ連結法は、ＭＳＤＡ−ＣＤを実施する好適な形態である。
【００８２】
連結された産物は可能な限り長いことが好ましい。これは、任意の期間内にＭＳＤＡ−ＣＤを用いて得られ得るＤＮＡ増幅の程度は、連結されたＤＮＡの長さにより影響されるからである。連結されたＤＮＡが長い程、そしてそれがより多くのリンカーを含む程、増幅プロセスはより効率的である。一般に、連結は、高濃度でフラグメントを連結することが好まれる。
【００８３】
リンカー−連結されたＤＮＡに対して実施されるＭＳＤＡ−ＣＤの例を図４に示す。リンカーの異なる鎖上の異なる配列上でプライムする、２つの異なるリンカー特異的プライマーを用いた。この２つのプライマーは、互いに相補的であるべきではない。図４の一番上は、取り込まれたリンカーを有する二本鎖ＤＮＡ連結物である。ＤＮＡを変性してそれを一本鎖にし、そして２つのリンカー特異的プイラマーを利用して、複数鎖置換により増幅する。ＭＳＤＡ−ＣＤは、ＤＮＡ試料を５，０００倍増幅すると推定され得る。ｍＲＮＡプロファイリング（Ｌｏｃｋｈａｒｔら）の場合には、転写増幅と組み合わせて用い、検出の限界を改善し得、わずか２０細胞を含む試料中のプロファイリング分析を可能する。
【００８４】
リンカー−連結されたＤＮＡを用いる場合には、連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅は、（ａ）プライマーを連結されたＤＮＡ試料と混合し、プライマー−標的試料混合物を生成すること、そしてこのプライマー−標的試料混合物を、このプライマー−標的試料混合物中で上記プライマーと上記連結されたＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートすること、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを、上記プライマー−標的試料混合物と混合し、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生成すること、およびこのポリメラーゼ−標的試料混合物を、連結されたＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートすることによって実施され得る。好ましくは、鎖置換複製は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、または適合する鎖置換因子と組み合わせたＤＮＡポリメラーゼを用いることにより達成される。
【００８５】
増幅の後、増幅された配列は、ＰＣＲ増幅配列について公知および確立された使用のような任意の目的であり得る。例えば、増幅配列は、蛍光標識の検出、酵素連結検出系、抗体媒介標識検出，および放射活性標識の検出のような核酸に対する従来の検出系のいずれをも用いて検出され得る。開示された方法の鍵となる特徴は、増幅がサイクルでは起こらず、連続的な等温複製で起こることである。これは、増幅を、より簡単し、そして出力においてより大きな一致をもたらす。鎖置換は、単一の連続等温反応で、核酸配列または試料の複数コピーの迅速生成を可能にする。リンカーまたはプライマーがプロモーター配列を含む、連結されたＤＮＡに対して実施された、ＭＳＤＡ−ＣＤによって増幅されたＤＮＡ中の配列は、プロモーターを用いる転写増幅によりさらに増幅され得る。
【００８６】
連結のために用いられたリンカーが制限酵素部位を含む場合、この増幅ＤＮＡは、制限酵素消化によりフラグメント化され得る。増幅ＤＮＡの切断は、さらなるプロセッシングおよび増幅ＤＮＡの分析を可能または簡略化し得る。用いられる部位がまれであるような場合（例えば、８塩基認識部位）、得られるフラグメントは、連結された当初のＤＮＡフラグメントを示す。
【００８７】
ランダムまたは部分的にランダムなセットのプライマーが用いられる場合、それは連結されたＤＮＡをランダムにプライムする。ランダムまたは大部分がランダムな配列のプライマーの十分に大きなセットを選択することにより、セット中のプライマーは、連結されたＤＮＡ中に分布される核酸配列に対して、集合的、およびランダム、相補的である。増幅は、各プライマーで開始された前進的ポリメラーゼを用いた複製により進行し、そして自然に停止するまで継続する。この方法の鍵となる特徴は、ポリメラーゼによる複製の間に介在するプライマーの置換である。このようにして、全連結されたＤＮＡ試料の複数の重複するコピーが短時間に合成され得る。
【００８８】
ランダムまたは部分的にランダムなプライマーを用いる場合、連結されたＤＮＡの多重鎖置換増幅は、（ａ）ランダムまたは部分的にランダムなプライマーのセットを連結されたＤＮＡ試料と混合し、プライマー−標的試料混合物を生成すること、そしてこのプライマー−標的試料混合物を、このプライマー−標的試料混合物中で上記プライマーと上記連結されたＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートすること、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを、上記プライマー−標的試料混合物と混合し、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生成すること、およびこのポリメラーゼ−標的試料混合物を、連結されたＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートすることによって実施され得る。ランダムまたは部分的にランダムなプライマーを用いるＭＳＤＡ−ＣＤはＷＧＳＤＡと類似であり、そしてほぼ図２に示されるように進行する。
【００８９】
ＭＳＤＡ−ＣＤに用いられるランダムまたは部分的にランダムなプライマーのセットは、プライマーを核酸試料内で所望の間隔でハイブリダイズすることを可能にする濃度で用いられることが好ましい。例えば、プライマーのセットを、それらが、平均して４０００〜８０００塩基ごとにハイブリダイズすることを可能にする濃度で用いることにより、これらの部位で開始したＤＮＡ複製が伸び、そして隣接部位から複製される鎖を置換する。プライマーは、規則的な間隔で標的配列にハイブリダイズすることは予期されないことに注意すべきである。むしろ、平均の間隔は、プライマー濃度の一般的機能である。
【００９０】
多重鎖置換増幅におけるように、隣接鎖の置換は、それを、別のプライマーへのハイブリダイゼーション、および引き続く別のラウンドの複製の開始に利用可能にする。プライマーセット中のプライマーが標的配列にハイブリダイズする間隔は、増幅のレベルを決定する。例えば、平均間隔が短い場合、隣接鎖は迅速および頻繁に置換される。平均間隔が長い場合、隣接鎖は、長い行程の複製後のみ置換される。
【００９１】
（Ｄ．改変およびさらなる操作）
１．増幅産物の検出。
【００９２】
増幅産物は、例えば、以下に記載のように、１次標識化または２次標識化により直接的に検出され得る。
【００９３】
（ａ）１次標識
１次標識は、鎖置換複製の間に、標識部分（例えば、蛍光ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジン）を取り込むことからなる。例えば、１００ヌクレオチドごとに４アナログの頻度で、シアニン色素ＵＴＰアナログ（Ｙｕら、（１９９４））を取り込み得る。インサイチュで増幅された核酸を検出するための好ましい方法は、ＢｒｄＵｒｄをともなう増幅の間にＤＮＡを標識し、続いて取り込まれたＢＵＤＲにビオチン化抗ＢＵＤＲ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を結合させ、続いてビオチン部分にストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を結合させ、最終的に、フルオレセイン-トリアミド（ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｅｐｔ．）による蛍光を発光させることである。
【００９４】
（ｂ）検出プローブでの２次標識
２次標識は、適切な分子プローブ（検出プローブと呼ばれる）を用いて増幅ＤＮＡまたはＲＮＡを検出することからなる。例えば、プライマーは、その非相補的部分に、公知の任意の配列（検出タグと呼ばれる）を含むように設計され得る。２次ハイブリダイゼーション工程は、これらの検出タグに検出プローブを結合させるために使用され得る。検出プローブは、例えば、酵素、蛍光部分、または放射性同位元素を用いて、上記のように標識され得る。プライマーあたり３つの検出タグ、および各検出プローブあたり４つの蛍光部分を用いることにより、複製鎖ごとに合計１２の蛍光シグナルを入手し得る。
【００９５】
（ｃ）複合化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）およびハイブリダイゼーションアレイ検出
増幅核酸の検出は、異なるプライマー（各セットは、異なる標的配列を増幅するために設計されている）のセットを用いることにより複合化され得る。それらの標的を見出し得るプライマーのみが、増幅産物を生じる。所定の増幅核酸を、半導体検出器中の固定位置に捕獲するために２つの代替法がある。１つは、プライマーの非相補的部分に、各独特のセットのプライマーについて独特のアドレスタグ配列を含めることである。次いで、所定のセットのプライマーを使用して増幅された核酸は、特異的なアドレスタグ配列に対応する配列を含む。第２番目のそして好適な代替法は、標的配列中に存在する配列をアドレスタグとして用いることである。
（ｄ）酵素連結検出
標識ヌクレオチドの取り込みによって標識された増幅核酸は、確立した酵素連結検出システムで検出され得る。例えば、ビオチン−１６−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の取り込みによって標識された増幅核酸は、以下のように検出され得る。核酸を、増幅核酸中に存在する標的配列(または、その相補物）に相補的な相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（アドレスプローブ)とのハイブリダイゼーションによって、固体ガラス表面上に固定する。ハイブリダイゼーション後、ガラススライドを洗浄し、そしてアルカリフォスファターゼ-ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と接触させる。この酵素−ストレプトアビジンコンジュゲートは、増幅核酸上のビオチン部分へ結合する。過剰な酵素コンジュゲートを取り除くためスライドを再び洗浄し、そして化学蛍光基質ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を添加し、そしてカバーガラススリップで覆う。次いで、スライドをＢｉｏｒａｄ  Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒで画像化し得る。
【００９６】
２．直鎖置換増幅
標的配列の直線状増幅を生じる多重鎖置換増幅の改変形態が実施され得る。この改変方法は、直鎖置換増幅（ＬＳＤＡ）と呼ばれ、そしてすべてのプライマーが標的配列の同じ鎖に相補的であるプライマーセットを用いることにより達成される。ＬＳＤＡでは、ＭＳＤＡにおけるように、プライマーのセットが標的配列にハイブリダイズし、そして鎖置換増幅が起こる。しかし、標的配列の１つの鎖のみが増幅される。ＬＳＤＡは、新たなセットのプライマーを標的配列にハイブリダイズさせるために、複製の各ラウンドの間に熱サイクリングを必要とする。このような熱サイクリングは、ＰＣＲで用いられるそれと同様である。しかし、直線状、または単一プライマーＰＣＲとは異なり、ＬＳＤＡにおける複製の各ラウンドは、標的配列の複数コピーを生じる。用いた各プライマーに対して１コピーが作成される。従って、ＬＳＤＡで２０のプライマーが用いられる場合、２０コピーの標的配列が、複製の各サイクルで作成される。
【００９７】
ＭＳＤＡおよびＷＧＳＤＡを用いて増幅されたＤＮＡは、転写によってさらに増幅され得る。この目的のために、プロモーター配列を、鎖置換増幅に用いたプライマーの非相補的部分中、またはＭＳＤＡ−ＣＤについてＤＮＡを連結するために用いるリンカー配列に含め得る。
【００９８】
（実施例）
（実施例１：λＤＮＡの多重鎖置換増幅）
この実施例は、合計１４のプライマー（右プライマーセットおよび左プライマーセットの各々が７）を用いる多重置換増幅を例示する。各セット中のプライマーは、増幅されるべき領域のそれぞれの側にある対向する鎖にハイブリダイズするように設計されている。
【００９９】
１．最初の工程は、ニックを閉じるための連結であり、長鎖がコピーのために利用可能であることを保証する。合計１０μｇのバクテリオファージλＤＮＡを、１００μｌのＴ４リガーゼ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．２０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＡＴＰ）中に溶解した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを最終濃度８単位／μｌに添加し、そしてＤＮＡ中の任意のニックを閉鎖するために、この材料を、１．５時間３７#Ｃでインキュベートし、それを完全に二本鎖にした。次いで、このＤＮＡ溶液を、蒸留水で５倍に希釈し、２０ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡ濃度とした。
【０１００】
２．連結したλＤＮＡの１．５μｌのアリコート（３０ｎｇのＤＮＡを含む）を、１８．２μｌの蒸留水、および適切な複数プライマー混合物（標準的なホスホルアミダイト化学により作成されたプライマー）と混合した。本実施例で用いたプライマーを以下に示す。命名は、左プライマーに対して「ＰＬ」そして右プライマーに対して「ＰＲ」である。７つの左プライマーおよび７つの右プライマーを用いた。７プライマーの各セットについて、配列は、互いの間が３００〜４００ヌクレオチドの間隔を置いている。プライマーにより標的されるλＤＮＡは、マップ位置３９５００〜２２０００により境界を画される領域内に位置し、そして合計約１７５００塩基を含む。この領域は、２３２２ｂｐおよび９４１６ｂｐのλＨｉｎｄＩＩフラグメントを包含する。
【０１０１】
左プライマー（５’〜３’）
１    ＧＴＴＧＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣ    ＰＬ７（配列番号１）
２    ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＴＴＣ    ＰＬ６（配列番号２）
３    ＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣ    ＰＬ５（配列番号３）
４    ＡＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＡＧＣ    ＰＬ４（配列番号４）
５    ＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＡ    ＰＬ３（配列番号５）
６    ＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＣＴＧＴ    ＰＬ２（配列番号６）
７    ＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＡＡＴＣ    ＰＬ１（配列番号７）
右プライマー（５’〜３’）
１ｒ  ＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＡＡＣＣＣＡＣ    ＰＲ１（配列番号８）
２ｒ  ＡＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＣ    ＰＲ２（配列番号９）
３ｒ  ＡＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＴＴＧＴＴＣＣＡ    ＰＲ３（配列番号１０）
４ｒ  ＴＧＴＴＡＡＧＣＡＡＣＧＣＡＣＴＣＴＣ    ＰＲ４（配列番号１１）
５ｒ  ＡＧＴＣＴＧＧＣＧＴＡＡＣＣＡＴＣＡＴ    ＰＲ５（配列番号１２）
６ｒ  ＡＡＴＡＧＴＧＴＣＴＴＴＴＧＴＧＴＣＣ    ＰＲ６（配列番号１３）
７ｒ  ＧＣＴＴＧＴＴＡＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣ    ＰＲ７（配列番号１４）
プライマーを、次の工程（工程３、以下）で各プライマーの最終濃度が約１マイクロモル濃度であるように添加した。λＤＮＡおよびプライマー混合物を、ラムダＤＮＡを変性するために９５#Ｃで２．５分間加熱し、そしてチューブを直ちに氷中に置いた。
【０１０２】
３．多重鎖置換増幅反応を、０#Ｃで、３０μｌの容量に、工程２のチューブに以下の試薬を添加することによりセットアップし、以下に示す最終濃度を与えた：
（ａ）３μｌの１０×反応緩衝液、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、および４００μＭ  ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの最終濃度を生じるように設計されている。いくつかのＭＳＤＡ反応は、１％〜７％の範囲にある異なる濃度のＤＭＳＯでより良好に進み得る。
【０１０３】
（ｂ）１．４μＭの最終濃度までのＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）。
【０１０４】
（ｃ）０．４７５単位／μｌ（約４００ｎＭ）の濃度までのＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１０５】
４．反応物を３７#Ｃで４５分間インキュベートした。ＤＮＡは約４５倍増幅された。
【０１０６】
所望であれば、増幅ＤＮＡは、残存する一本鎖材料の大部分を再生させるために、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中、５５#Ｃで２〜２４時間の任意の時間インキュベートされ得る。増幅収率は、増幅されるべきＤＮＡ領域の各側上により多くのプライマーを用いることにより増大され得る。このために適切な数のプライマーは、所望のＤＮＡドメインの各側上に１０〜３０プライマーの範囲であり得る。各側上に２４を超えるプライマー数は、非特異的増幅の頻度を増大し得る。
【０１０７】
（実施例２：ヒトＤＮＡのゲノム全体増幅）
この実施例は、ランダムプライマーを用いるヒトゲノムの増幅のために実施されるようなゲノム全体増幅についてである。
【０１０８】
１．ＤＮＡを、末梢血リンパ球から、標準的なプロテイナーゼＫ消化、次いでフェノール／クロロホルムを用いる抽出を用いて抽出した。このＤＮＡは、Ｐｉｃｏ−Ｇｒｅｅｎ色素法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ；Ｋｉｔ  Ｐ−７５８９）を用いて定量し、次いでこの材料を、ＴＥ−０．２緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に希釈し、１ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡ濃度を得た。
【０１０９】
２．４μｌ（４ｎｇ）のヒトＤＮＡおよび２０μｌのＴＥ−０．２緩衝液を、５００μｌの微小遠心分離チューブ中で混合し、そして９７#Ｃで５分間変性した。次いでチューブを直ちに氷中に置いた。
【０１１０】
３．増幅反応を、氷浴中で、３０μｌの容量に、工程２のチューブに以下の試薬を添加することによりセットアップし、以下に示す最終濃度を与えた：
（ａ）３μｌの１０×反応緩衝液、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％ｖ／ｖＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、および４００μＭ  ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの最終濃度を生じるように設計されている。
【０１１１】
（ｂ）４．０μＭの最終濃度までの長さ２０塩基のランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー。
【０１１２】
（ｃ）３０ｎｇ／μｌの最終濃度まで添加された、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質。
【０１１３】
（ｄ）０．３５単位／μｌの最終濃度で最後に添加される、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大フラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。
【０１１４】
４．反応を４８#Ｃで４時間インキュベートし、そしてＥＤＴＡ（最終濃度４ｍＭ）の添加により停止した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）の一例の図である。上部に示すのは、目的の核酸を含む二本鎖核酸分子である（斜線領域）。右のセットのプライマーおよび左のセットのプライマーがこの核酸分子にハイブリダイズする。中部に示すのは、各プライマーから伸長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。各伸長鎖の末端におけるポリメラーゼは、その先のプライマーの伸長鎖を置換する。下部に示すのは、さらに伸長された、複製される核酸の多重鎖である。新たに複製された鎖におけるそれらの相補的な部位にハイブリダイズする次のセットのプライマーもまた示される。新たに複製された鎖によって、続きの鎖のポリメラーゼ伸長による置換を介してプライマーへのハイブリダイゼーションについて利用可能になる。
【図２】  図２は、ゲノム全体鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）の一例の図である。上部には、ゲノムＤＮＡの図的表現がある。ランダムまたは部分的にランダムなプライマーのセットからのプライマーがその核酸分子に対してハイブリダイズする（プライマー長は、測定されることを意図しない）。単純さのために、ゲノムＤＮＡの１分子の一部のみを示す。中部に示すのは、各プライマーから伸長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。各伸長鎖の末端でのポリメラーゼが、それが遭遇する任意のプライマーの伸長鎖を置換する。ランダムまたは部分的にランダムなプライマーのセットからのさらなるプライマーもまた示し、これは、新たに複製された鎖における相補的部位にハイブリダイズする。新たに複製された鎖は、次の鎖を伸長するポリメラーゼによる置換を通してプライマーへのハイブリダイゼーションについて利用可能にされる。下部に示すのは、さらに伸長した、複製された核酸の多重鎖である。単純さのために、もとの合成鎖のうち４つのみ（上側の標的配列鎖上の２つおよび下側の標的配列鎖上の２つ）を、下部パネルに示す。
【図３】  図３は、多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）の一例の図である。上部に示すのは、目的の核酸を含む二本鎖核酸分子である（斜線領域）。右のセットのプライマー（上部パネル中の上側鎖）および左のセットのプライマー（上部パネル中の下側の鎖）がこの核酸分子にハイブリダイズする。中部に示すのは、各プライマーから伸長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。新たに複製された鎖のそれらの相補部位に対してハイブリダイズするプライマーの次のセットもまた示される。この新たに複製された鎖は、次の鎖を伸長するポリメラーゼによる置換を通してそのプライマーへのハイブリダイゼーションについて利用可能にされる。各伸長鎖の末端におけるポリメラーゼは、その先のプライマーの伸長鎖を置換する。下部に示すのは、さらに伸長した、複製された核酸の多重鎖である。単純さのために、もとの合成鎖のうち４つのみ（上側の標的配列鎖上の２つおよび下側の標的配列鎖上の２つ）を、下部パネルに示す。
【図４】  図４は、連結ＤＮＡの多重鎖置換増幅（ＭＳＤＡ−ＣＤ）の一例の図である。上部には、リンカーと連結したＤＮＡの図的表現がある。中部には、リンカー配列と相補的なプライマーが、連結ＤＮＡの変性鎖にハイブリダイズされる（リンカーおよびプライマーの長さは測定されることを意図しない）。単純さのために、連結ＤＮＡの１分子の一部のみを示す。下部に示すのは、各プライマーから伸長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。各伸長鎖の末端のポリメラーゼは、それが遭遇する任意のプライマーの伸長鎖を置換する。新たに複製された鎖上の複製されたリンカー配列における相補部位に対してハイブリダイズするさらなるプライマーもまた示される。新たに複製された鎖は、次の鎖を伸長するポリメラーゼによる置換を通じてそのプライマーとのハイブリダイゼーションについて利用可能にされる。
【配列表】
0004264919.tif 000004
0004264919.tif 000005
0004264919.tif 000006
0004264919.tif 000007
【図１】
0004264919.tif 000008
【図２】
0004264919.tif 000009
【図３】
0004264919.tif 000010
【図４】
0004264919.tif 000011