(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、カチオン界面活性剤を存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする生体内物質の測定方法（ただし、一般式Ｉ：
【化１】
0004263830.tif 000008
［式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ１は炭素原子１０〜１６個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し；Ｒ２は炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し；Ｒ３は、ｎ＝０の場合には、水素、炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し、ｎ＝１の場合には、炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し；Ｒ４は、ｎ＝０の場合には、水素、炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し、ｎ＝１の場合には、炭素原子１〜１０個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味するか、あるいはＲ２，Ｒ３およびＲ４はそれが結合する窒素原子とともにピリジニウム基を形成するが、この場合はｎ＝１でＲ２が炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味する場合と同様に、相当する陰イオンが存在する］で示される界面活性剤１種または２種以上を使用する、ｐＨ１〜３でのジアゾ化法による血清中の総ビリルビンの定量方法を除く）。
【請求項２】
生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、窒素原子に結合する炭素数５以上の有機基を少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩を存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする生体内物質の測定方法（ただし、一般式Ｉ：
【化２】
0004263830.tif 000009
［式中、ｎ＝１であり、Ｒ１は炭素原子１０〜１６個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し；Ｒ２は炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し；Ｒ３は炭素原子１〜４個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味し；Ｒ４は炭素原子１〜１０個を有する直鎖状または分岐状のアルキルを意味するか、あるいはＲ２，Ｒ３およびＲ４はそれが結合する窒素原子とともにピリジニウム基を形成するが、この場合は、相当する陰イオンが存在する］で示される界面活性剤１種または２種以上を使用する、ｐＨ１〜３でのジアゾ化法による血清中の総ビリルビンの定量方法を除く）。
【請求項３】
生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、セチルピリジニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化トリオクチルメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする生体内物質の測定方法。
【請求項４】
前記測定される生体内物質が、ビリルビンまたはウロビリノーゲンである請求項１〜３のいずれかに記載の生体内物質の測定方法。
【請求項５】
セチルピリジニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化トリオクチルメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分とする、インジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制する反応抑制剤。
【請求項６】
ジアゾニウム塩と請求項５に記載の反応抑制剤との組み合わせからなる生体内物質測定試薬。
【請求項７】
請求項６に記載の生体内物質測定試薬を有する生体内物質測定試験紙。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インジカンの影響を受けない生体内物質の測定方法、前記方法に好適に用いられる反応抑制剤、生体内物質測定試薬および生体内物質測定試験紙に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビン、ウロビリノーゲン等の生体内の物質を定性的にまたは定量的に測定する方法の一つとして、生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応による呈色反応を利用することが知られている。
例えば、ビリルビンは、各種肝臓疾患や各種胆道疾患により尿中濃度が増加する生体内物質であるが、この尿中ビリルビンの測定は、上記反応を利用する測定方法による場合が多く、特に、尿試験紙等の簡便な方法によく用いられる。反応を下記式（１）に示す。
【０００３】
【化１】
0004263830.tif 000002
【０００４】
この場合、全検体中１〜２％の偽陽性が出現し、それらについては、他の方法で再検して陰性であることを確認する必要があり、経済的、時間的な負担が大きかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、インジカンの干渉を受けず、至適濃度範囲が広く、インジカン濃度が高い場合にも用いることができる生体内物質の測定方法、前記方法に好適に用いられる反応抑制剤、生体内物質測定試薬および生体内物質測定試験紙を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、カチオン界面活性剤を存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする生体内物質の測定方法を提供する。
【０００７】
本発明は、生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、窒素原子に結合する炭素数５以上の有機基を少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩を存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする生体内物質の測定方法を提供する。
【０００８】
前記第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩が、セチルピリジニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化トリオクチルメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つであるのが好ましい。
【０００９】
前記生体内物質が、ビリルビンまたはウロビリノーゲンであるのが好ましい。
【００１０】
また、本発明は、カチオン界面活性剤を有効成分とする、インジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制する反応抑制剤を提供する。
【００１１】
本発明は、窒素原子に結合する炭素数５以上の有機基を少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩を有効成分とする、インジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制する反応抑制剤を提供する。
【００１２】
本発明は、セチルピリジニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化トリオクチルメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分とする、インジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制する反応抑制剤を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、ジアゾニウム塩と前記反応抑制剤との組み合わせからなる生体内物質測定試薬を提供する。
【００１４】
更に、本発明は、前記生体内物質測定試薬を有する生体内物質測定試験紙を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定方法であって、特定の反応抑制剤を存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする生体内物質の測定方法である。
測定される生体内物質は、ジアゾニウム塩とジアゾカップリング反応をするものであれば特に限定されず、例えば、ビリルビン、ウロビリノーゲンが挙げられる。生体内物質は、特に限定されないが、体液中に存在する状態で測定されるのが好ましく、尿、血液等が測定対象として挙げられる。尿、血液等の体液は、そのまま測定対象としてもよいが、固形分である血球や不純物等を除去して測定対象としてもよいし、水等で希釈して測定対象としてもよい。
このような測定対象中には、タンパク質分解産物トリプトファンの代謝産物であるインジカンが含まれる。例えば、尿中には、インジカンが正常値で２〜７．５ｍｇ／ｄｌ含まれ、異常な量のタンパク質分解が起こった場合や腸内における腐敗の程度が増大した場合（例えば、便秘、大腸炎）には２０〜２００ｍｇ／ｄｌ含まれる。従来の測定方法では、インジカンが測定対象中に存在すると、ビリルビン等の生体内物質の測定に用いられるジアゾニウム塩の呈色反応が起こり、測定結果は偽陽性を示す。
【００１６】
ジアゾニウム塩は、一般式ＡｒＮ2 Ｘ（式中、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基を表し、Ｘは、塩酸、フッ化ホウ酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸その他の酸の陰イオンを表す。）で表される化合物であれば、特に限定されず、例えば、２，６−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩、２，４−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩、２−メチル−５−ニトロベンゼンジアゾニウム塩、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸、４−メトキシベンゼンジアゾニウム塩、３，４−メチレンジオキシベンゼンジアゾニウム塩が挙げられる。
また、ジアゾニウム塩として、ジアゾニウムを２個以上有するものも用いることができる。例えば、ｐ，ｐ´−ジジアゾジフェニルエーテル四フッ化ホウ酸塩、３，３´−ジメトキシ−４，４´−ジジアゾビフェニル四フッ化ホウ酸塩が挙げられる。
本発明においては、上記生体内物質と上記ジアゾニウム塩との組み合わせは問わないが、生体内物質がビリルビンである場合には、ジアゾニウム塩としてｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸、２，４−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩を用いるのが好ましく、生体内物質がウロビリノーゲンである場合には、ジアゾニウム塩としてｐ，ｐ´−ジジアゾジフェニルエーテル四フッ化ホウ酸塩、４−メトキシベンゼンジアゾニウム塩を用いるのが好ましい。
【００１７】
本発明においては、生体内物質の測定の際のジアゾニウム塩の量が、生体内物質１ｍｏｌに対して、０．１〜１０００ｍｏｌであるのが好ましい。
【００１８】
本発明においては、ジアゾニウム塩は、水等の溶媒に溶解する等して液体として用いてもよいし、固体として用いてもよいし、液体としてから担体に含浸させて、担体に保持させた状態で用いてもよい。
【００１９】
生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応は、呈色反応である。例えば、ビリルビンとｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸との反応は、上記式（１）で表され、赤褐色を呈する。このような呈色を目視観察や、紫外可視吸収スペクトル等を用いた機器分析によって検知し、生体内物質を測定する。
【００２０】
本発明の生体内物質の測定方法は、上述した生体内物質の測定において、特定の反応抑制剤を存在させて、生体内物質と共に測定対象中に存在するインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制することを特徴とする。また、本発明は、そのような反応抑制剤を提供する。
本発明の反応抑制剤は、インジカンと反応する等によりインジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応を抑制する物質を有効成分とし、そのような有効成分としては、例えば、カチオン界面活性剤；窒素原子に結合する炭素数５以上の有機基を少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩が挙げられる。
カチオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、テトラアルキルアンモニウム型、ピリジニウム型等の第四アンモニウム型カチオン界面活性剤；アミン塩型カチオン界面活性剤が挙げられる。
また、窒素原子に結合する炭素数５以上の有機基を少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩としては、第四級アンモニウム塩および／または第四級ピリジニウム塩であって、窒素原子に結合する炭素数５以上の有機基を少なくとも１つ有するものであれば、特に限定されないが、例えば、下記式（２）〜（４）で表される化合物が挙げられる。
【００２１】
【化２】
0004263830.tif 000003
【００２２】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ5 は、炭素数５以上のアルキル基であり、好ましくは炭素数８〜１８の直鎖アルキル基である。Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、それぞれ炭素数１以上のアルキル基である。）
【００２３】
中でも、下記式（５）で表されるセチルピリジニウムクロライド（ＣＰＣ）、下記式（６）で表される塩化ベンザルコニウム（式中、Ｒ9 は、Ｃ8 Ｈ17〜Ｃ18Ｈ37を示す。）、下記式（７）で表される塩化セチルトリメチルアンモニウムおよび下記式（８）で表される塩化トリオクチルメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つであるのが好ましい。
【００２４】
【化３】
0004263830.tif 000004
【００２５】
特に、ＣＰＣ、塩化ベンザルコニウムおよび塩化セチルトリメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つであるのが好ましく、ＣＰＣおよび／または塩化ベンザルコニウムであるのがより好ましい。
【００２６】
本発明の反応抑制剤は、上記物質の１種または２種以上を有効成分とすればよく、他の成分を含んでいてもよい。また、上記物質の１種または２種以上をそのまま反応抑制剤として用いてもよい。
【００２７】
本発明において、上記物質はインジカンと反応すると考えられるため、インジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応が抑制される。従って、本発明によれば、生体内物質とジアゾニウム塩とのジアゾカップリング反応を利用する生体内物質の測定において、インジカンの干渉による偽陽性を回避することができる。
【００２８】
本発明の生体内物質の測定方法は、インジカンの濃度が高い場合であっても、その干渉を抑制することができる。
尿中のインジカン濃度は、高い場合には、１００〜２００ｍｇ／ｄｌまで達する。従来、ビリルビン測定におけるインジカン干渉の改善のためにアジ化ナトリウムを用いる方法が提案されていたが、アジ化ナトリウムは多量に用いるとビリルビンと反応してしまうため少量の使用に限られ、測定対象中のインジカンがこのように高濃度である場合には、その干渉を有効に抑制することができなかった。
これに対して、本発明の生体内物質の測定方法は、インジカンの濃度が高い場合にも、上記反応抑制剤を少量用いれば、その干渉を抑制することができる。また、上記反応抑制剤を多量に用いても、ビリルビン、ウロビリノーゲン等の生体内物質と反応することはない。従って、用いることができる量の幅が従来のアジ化ナトリウムに比べて極めて広い。
【００２９】
具体的には、生体内物質の測定の際の上記反応抑制剤中の有効成分の量が、インジカン１ｍｏｌに対して、１ｍｏｌ以上であるのが好ましい。上記範囲で、インジカンによるジアゾニウム塩の呈色反応が十分に抑制される。
【００３０】
本発明においては、ジアゾニウム塩と上記反応抑制剤とを組み合わせて、生体内物質測定試薬として用いることができる。即ち、本発明は、ジアゾニウム塩と上記反応抑制剤との組み合わせからなる生体内物質測定試薬を提供する。本発明の生体内物質測定試薬は、ジアゾニウム塩と反応抑制剤との組み合わせは特に限定されず、上述したジアゾニウム塩の１種以上と上述した反応抑制剤の１種以上とを自由に組み合わせることができる。
【００３１】
本発明の生体内物質の測定方法は、その使用の態様を特に限定されない。例えば、上記生体内物質測定試薬を担体（例えば、濾紙、ビーズ）に担持させた状態で測定してもよいし、液体である測定対象中に上記生体内物質測定試薬を含有させて測定してもよい。
本発明の生体内物質測定試薬を担体に担持させる場合は、ジアゾニウム塩と反応抑制剤を担体の同じ部分に存在させてもよいし、異なる部分に存在させてもよい。例えば、担体として紙を用いるときには、ジアゾニウム塩と反応抑制剤とを紙全体に同じような分布で存在させてもよいし、ジアゾニウム塩を内部に、反応抑制剤を表面付近にというように存在させてもよい。
また、本発明の生体内物質測定試薬を液体である測定対象中に含有させて測定する場合は、ジアゾニウム塩と反応抑制剤を同時に溶解等により含有させてもよいし、初めに反応抑制剤を測定対象中に溶解しておき、その後測定前にジアゾニウム塩を溶解して含有させてもよい。
測定対象の温度は、特に限定されないが、通常５〜４０℃で行う。
呈色反応の検出は、目視で行ってもよいし、紫外可視吸収スペクトル等を用いた機器分析を用いてもよい。
本発明の生体内物質の測定方法の中でも、測定が簡易かつ安価に行えるので、試験紙を用いる方法が好ましい。
【００３２】
本発明は、上記方法を用いるための試験紙を提供する。即ち、ジアゾニウム塩と上記生体内物質測定試薬を有する生体内物質測定試験紙を提供する。中でも、生体内物質測定試薬の反応抑制剤が、セチルピリジニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化トリオクチルメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つである生体内物質測定試験紙が好ましい。
【００３３】
本発明の生体内物質測定試験紙におけるジアゾニウム塩の含有量は、１〜５００μｇ／ｃｍ2 であるのが好ましい。
また、本発明の生体内物質測定試験紙における上記反応抑制剤の有効成分の含有量は、１０〜３０００μｇ／ｃｍ2 であるのが好ましい。
具体的には、尿中のビリルビンを測定する場合において、反応抑制剤の有効成分として、ＣＰＣを用いるときには、試験紙におけるＣＰＣの含有量は、１０〜２０００μｇ／ｃｍ2 であるのが好ましく、塩化ベンザルコニウムを用いるときには、試験紙における塩化ベンザルコニウムの含有量は、１５〜３０００μｇ／ｃｍ2 であるのが好ましい。
【００３４】
本発明の生体内物質測定試験紙の製造方法は、特に限定されないが、濾紙に上記ジアゾニウム塩と上記反応抑制剤とを含浸、塗工等により担持させる方法を用いることができる。ジアゾニウム塩と反応抑制剤とは、同時に含浸等させてもよいし、別々に含浸等させてもよい。別々に含浸等する場合には、その順序は特に限定されないが、初めにジアゾニウム塩を含浸等させ、次に反応抑制剤を含浸等させると、反応抑制剤を試験紙の表面近くに偏在させることができる。具体的には、ジアゾニウム塩の溶液と反応抑制剤の溶液とを用意しておき、初めにジアゾニウム塩の溶液に濾紙を浸せきした後、取り出し乾燥し、乾燥後の濾紙を反応抑制剤の溶液に浸せきした後、取り出し乾燥して、本発明の生体内物質測定試験紙を得ることができる。
【００３５】
本発明の生体内物質測定試験紙の用途は、特に限定されないが、尿、血液等の中の生体内物質の測定に好適に用いられる。
本発明の生体内物質測定試験紙を尿試験紙として用いる場合には、ビリルビンのみの単項目測定用としてもよいし、他の測定項目を有していてもよい。尿試験紙の形態は、特に限定されないが、樹脂、紙等で作られたスティックに、本発明の生体内物質測定試験紙を貼付したものを好適に用いることができる。この場合、尿試験紙がビリルビン以外の測定項目を有するときには、各測定項目用の試験紙も、同様にスティックに貼付することができる。
【００３６】
本発明の生体内物質測定試験紙は、インジカンの濃度が高い場合であっても、その干渉を抑制することができる。また、上記反応抑制剤の有効成分を含有させることのできる量の幅が従来のアジ化ナトリウムに比べて極めて広い。
【００３７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
１．生体内物質測定試験紙の調製
（実施例１）
メタリン酸−グリシン緩衝溶液（ｐＨ２）１００ｍｌにｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸５００ｍｇを溶解し、１液とした。一方、エタノール１００ｍｌに上記式（５）で表されるＣＰＣ２５００ｍｇを溶解し、２液とした。
次に、濾紙（３１ＥＴ、ワットマン社製）を１液に数秒間浸せきした後取り出し、６０℃で３０分間乾燥した。乾燥後の濾紙を２液に数秒間浸せきした後取り出し、４０℃で３０分間乾燥し、本発明の生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、ＣＰＣ含有量が１１５０μｇ／ｃｍ2 であった。
【００３８】
（実施例２）
２液として、エタノール１００ｍｌに上記式（６）で表される塩化ベンザルコニウム３１００ｍｇを溶解したものを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、本発明の生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、塩化ベンザルコニウム含有量が１４００μｇ／ｃｍ2 であった。
【００３９】
（実施例３）
２液として、エタノール１００ｍｌに上記式（７）で表される塩化セチルトリメチルアンモニウム２３００ｍｇを溶解したものを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、本発明の生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、塩化セチルトリメチルアンモニウム含有量が１１００μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４０】
（実施例４）
２液として、エタノール１００ｍｌに上記式（８）で表される塩化トリオクチルメチルアンモニウム３０００ｍｇを溶解したものを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、本発明の生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、塩化トリオクチルメチルアンモニウム含有量が１３００μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４１】
（実施例５）
メタリン酸−グリシン緩衝溶液（ｐＨ２）１００ｍｌにｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸５００ｍｇを溶解し、次いで上記式（５）で表されるＣＰＣ２５００ｍｇを溶解し、１液とした。
次に、濾紙（３１ＥＴ、ワットマン社製）を１液に数秒間浸せきした後取り出し、６０℃で３０分間乾燥し、本発明の生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、ＣＰＣ含有量が１５００μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４２】
（比較例１）
２液として、何も溶解していないエタノール１００ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４３】
（比較例２）
２液として、エタノール１００ｍｌに下記式（９）で表される塩化ベンジルトリメチルアンモニウム１３００ｍｇを溶解したものを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム含有量が６００μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４４】
（比較例３）
２液として、エタノール１００ｍｌに下記式（１０）で表される硝酸テトラブチルアンモニウム２２００ｍｇを溶解したものを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、硝酸テトラブチルアンモニウム含有量が１０００μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４５】
（比較例４）
２液として、エタノール１００ｍｌに下記式（１１）で表される塩化テトラメチルアンモニウム８００ｍｇを溶解したものを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、生体内物質測定試験紙を得た。
得られた試験紙は、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸含有量が２３０μｇ／ｃｍ2 、塩化テトラメチルアンモニウム含有量が３５０μｇ／ｃｍ2 であった。
【００４６】
【化４】
0004263830.tif 000005
【００４７】
２．尿中ビリルビンの測定
健康人正常尿に、１ｄｌ当たり２０、５０、１００、３００および１０００ｍｇのインジカンをそれぞれ添加した後、かくはん溶解して、尿中インジカン濃度が高い尿の検体を作成した。
次に、実施例および比較例で得られた各試験紙を５ｍｍ×５ｍｍの正方形に切り取り、両面テープで支持体に接着し、これを各検体に１〜２秒間浸せきした後取り出し、呈色の状態を目視観察した。目視観察した呈色の程度を「−」（呈色なし）、「小」、「中」、「大」に分けて評価した。
【００４８】
また、以下に示す市販のビリルビン測定試験紙についても、各検体に１〜２秒間浸せきした後取り出し、呈色の状態を目視観察し、同様に評価した。
比較例５：Ａ社製、主成分２，６−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩
比較例６：Ｂ社製、主成分２，４−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩
比較例７：Ｃ社製、主成分２，４−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩
比較例８：Ｄ社製、主成分２，４−ジクロルベンゼンジアゾニウム塩
比較例９：Ｅ社製、主成分２−メチル−５−ニトロベンゼンジアゾニウム塩
【００４９】
結果を第１表（添加インジカン量２０〜３００ｍｇ／ｄｌ）および第２表（添加インジカン量２０〜１０００ｍｇ／ｄｌ）に示す。
本発明の測定方法に用いられる本発明の生体内物質測定試験紙は、特定の反応抑制剤によりインジカンとジアゾニウム塩との反応を抑制するため、インジカンによる呈色が全くないか、呈色があっても僅かであることが分かる（実施例１〜５）。特に、ＣＰＣを用いた場合（実施例１および５）および塩化ベンザルコニウムを用いた場合（実施例２）は、添加インジカン量３００ｍｇ／ｄｌにおいても全く干渉を受けることがなく、尿中インジカン濃度が高い場合には１００〜２００ｍｇ／ｄｌに達することを考慮しても、十分なインジカン干渉抑制効果があることが分かる。
これに対し、特定の反応抑制剤以外の物質を用いた場合（比較例２〜４）には、何も用いなかった場合（比較例１）と比べて、インジカン干渉抑制効果がなかった。また、従来市販されている試験紙（比較例５〜９）は、いずれもインジカンの干渉を受け、これらの試験紙では、正確なビリルビンの測定が困難であることが分かる。
【００５０】
【表１】
0004263830.tif 000006
【００５１】
【表２】
0004263830.tif 000007
【００５２】
【発明の効果】
本発明の生体内物質の測定方法は、インジカンの干渉を受けず、至適濃度範囲が広く、インジカン濃度が高い場合にも用いることができるので、極めて有用である。
また、本発明の反応抑制剤は、本発明の生体内物質の測定方法に好適に用いられる。
また、本発明の生体内物質測定試薬は、本発明の生体内物質の測定方法に好適に用いられる。
また、本発明の生体内物質測定試験紙は、測定が簡易かつ安価に行えるので、本発明の生体内物質の測定方法に好適に用いられる。