(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に示すアミノ酸配列を含んでなる、精製組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする、単離された核酸であって、図１に示すヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項４】
プラスミドｐＭＲ１０を含んでなる、請求項３記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターで形質転換させた組換え宿主細胞。
【請求項６】
Ｅ．  ｃｏｌｉである、請求項５記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
ｃＩ+及びｃＩ８５７対立遺伝子をもつＥ．  ｃｏｌｉである、請求項６記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
ＤＨＩλ+［ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、λ+］及びＭ５２４８［λ（ｂｉｏ２７５、ｃＩ８５７、ｃＩＩＩ＋、Ｎ＋、λ（Ｈ１））］よりなる群から選択される、請求項６記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
少なくとも１つの連鎖停止剤及び１つ以上のヌクレオチドトリホスフェートの存在下、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼで配列決定すべきＤＮＡ鋳型から連鎖停止フラグメントを作り出して、該フラグメントの大きさから該ＤＮＡの配列を決定するという段階を含んでなる、ＤＮＡの配列決定方法。
【請求項１０】
請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼを含んでなる、ＤＮＡ配列決定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連技術についての説明
本出願は、１９９８年６月１７日に提出された米国仮出願番号第６０／０８９,５５６号（この米国仮出願に開示されている内容は全て、本明細書の一部を構成する。）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本開示は、改良された強固性(robustness)および有効性を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【０００３】
背景
ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応(「ＰＣＲ」)による核酸増幅、自己持続性配列複製(「３ＳＲ」)、および高温ＤＮＡ配列決定といったような、多くの組換えＤＮＡ技術において有用な酵素である。熱安定性ポリメラーゼが特に有用である。熱は、ポリメラーゼ活性を消失させないので、変性段階が終わる毎にさらなるポリメラーゼを加える必要はない。
【０００４】
しかしながら、多くの熱安定性ポリメラーゼは、産生される生成物の量を制限し得る、または生成物の標準的な指数関数的蓄積におけるプラトー現象の原因となり得る、５'→３'エキソヌクレアーゼまたは構造依存性一本鎖エンドヌクレアーゼ(「ＳＤＳＳＥ」)活性を示すことが見出されている。そのような５'→３'ヌクレアーゼ活性は、特に、Ｇ＋Ｃに富む標的に対して、１０kb以上の長いＰＣＲ産物を有効に作り出す能力の減損の原因となり得る。ＤＮＡ配列決定の適用およびサイクル配列決定の適用において、５'→３'ヌクレアーゼ活性の存在は、所望のバンド強度の減少および／または擬似もしくは背景バンドの発生の原因となり得る。
【０００５】
さらに、現在利用できる酵素の多くは、一般に、高い塩の環境、条件に対して感受性がある。現在利用できる酵素は、まずまずのプロセシング能力を有し(より分配的であり−よりしばしば低下し−より詳細に説明する)、dＩＴＰを加えて、コンプレッション現象の問題に取り組む−通常、酵素活性を消滅させる。
【０００６】
従って、高い塩の条件に対して耐性の増大を有する、改良されたＤＮＡポリメラーゼ、dＩＴＰの有効利用、高い産生力、およびＧＣに富む鋳型に対する改良された性能に対する要請が存在し続けている。
【０００７】
発明の要約
本発明の開示は、図１に示すアミノ酸配列を含んでなる、精製された組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、さらにはまた、少なくとも約８０％の活性を５０mＭ以上の塩濃度で示す、精製された組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを教示する。本発明の開示はさらに、少なくとも約７０％の活性を２５mＭ以上の塩濃度で示す、精製された組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および結合事象(binding event)あたり約３０ヌクレオチドの連続移動性(processivity)を有する、精製された組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを教示する。
【０００８】
本発明の開示はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする、単離された核酸であって、図１に示すヌクレオチド配列からなる核酸、さらにはまた、その核酸を含んでなる組換えＤＮＡベクター、およびそのベクターで形質転換させた組換え宿主細胞をも教示する。
【０００９】
本発明の開示はまた、少なくとも１つの連鎖停止剤および１つ以上のヌクレオチドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼで配列決定すべきＤＮＡ鋳型から連鎖停止フラグメントを作り出して、該フラグメントの大きさから該ＤＮＡの配列を決定するという段階を含んでなる、ＤＮＡを配列決定する方法をも教示する。本発明の開示はまた、ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる、ＤＮＡを配列決定するためのキットをも教示する。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、ＦＹ７ポリメラーゼに関するアミノ酸配列(およびそれをコードするＤＮＡ配列)を示す。
【００１１】
図２は、ＡＢＩの３７７型 自動蛍光ＤＮＡ配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Ｍn条件で調製したＦＹ７ポリメラーゼを使用して配列決定された、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【００１２】
図３は、ＡＢＩの３７７型 自動蛍光ＤＮＡ配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Ｍg条件で調製したＦＹ７ポリメラーゼを使用して配列決定された、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【００１３】
図４は、様々なＫＣl濃度の下、Ｔhermo Ｓequenase(商標)酵素 ＤＮＡポリメラーゼ 対 ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの最大ポリメラーゼ活性％を示す。
【００１４】
図５は、Ｔhermo Ｓequenase(商標)酵素 ＤＮＡポリメラーゼ 対 ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼを使用しての放射能標識化ＤＮＡ配列決定反応における、ＤＮＡ配列決定能力に対する高い塩濃度の効果を示す。
【００１５】
図６−１０は、Ｔhermo Ｓequenaseの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。２５mＭ程度の低い濃度では、データの特質は、読取り長さが少なくとも６００塩基から約４５０塩基まで減少するという点で影響を受ける。５０mＭの塩では、その読取り長さはさらに約３５０塩基まで、７５mＭでは約２５０塩基まで減少して、１００mＭでは、その読取り長さは無視できる。
【００１６】
図１１−１５は、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。少なくとも７５mＭのＫＣlには、性能に対して有害な効果はなく、１００mＭのＫＣlでは、データの特質において僅かな減少しかない。
【００１７】
図１６は、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼに関して測定した連続移動性と比較する、Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼ、ＡmpliＴaq ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼに関して測定した連続移動性を示す。
【００１８】
図１７は、dＧＴＰ(グアノシントリホスフェート)アナログであるdＩＴＰ(イノシントリホスフェート)を７２℃で取り込む放射能標識化配列決定反応において、ＦＹ７ ポリメラーゼ 対 Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合に得られる、改良された読取り長さを示す。
【００１９】
図１８−２２は、蛍光標識化ターミネーターＤＮＡ配列決定反応において、Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【００２０】
図２３−２７は、蛍光標識化ターミネーターＤＮＡ配列決定反応において、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【００２１】
発明の詳細な説明
ＤＮＡ配列決定のための改良されたポリメラーゼを得る目的で、完全な長さのＴhermus thermophilusおよびＴhermus aquaticus ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素において見出されるエキソヌクレアーゼ活性を減少させることにより、一連のポリメラーゼ変異体を構築した。６つの保存されたモチーフ(ＧutmanおよびＭinton（１９９３）Ｎucleic Ａcids Ｒesearch ２１，４４０６−４４０７)をpol Ｉ型ポリメラーゼのアミノ末端ドメインにおいて同定することができ、これには、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が存することが示されている。さらに、これらの保存された領域における６つのカルボキシレート残基は、Ｔhermus aquaticus ＤＮＡ pol Ｉのエキソヌクレアーゼドメインの活性部位に位置すべき結晶構造で示されている(Ｋimら，（１９９５）Ｎature ３７６，６１２−６１６)。次の通り、ＴthおよびＴaqポリメラーゼにおける６つの保存されたモチーフのうちの３つでのカルボキシレートおよび他の残基に対する部位特異的変異誘発により、点変異を起こした：
Ｔaq Ｄ１８Ａ、Ｔaq Ｔ１４０Ｖ、Ｔaq Ｄ１４２Ｎ／Ｄ１４４Ｎ。これらは全て、エキソヌクレアーゼドメインの外側に変異Ｆ６６７Ｙを有する。
Ｔth Ｄ１８Ａ、Ｔth Ｔ１４１Ｖ、Ｔth Ｄ１４３Ｎ／Ｄ１４５Ｎ。これらは全て、エキソヌクレアーゼドメインの外側に変異Ｆ６６９Ｙを有する。
【００２２】
エキソヌクレアーゼ活性、連続移動性、鎖置換、塩耐性、熱安定性、および配列決定の特質に関して、全てのポリメラーゼを評価した。１つのＦＹ７ポリメラーゼ、Ｔth Ｄ１８Ａ、Ｆ６６９Ｙを以下でさらに詳細に記載する。
【００２３】
実施例
方法
インビトロでの変異誘発
ＰＣＲを使用して、アスパラギン酸をクローン化された完全な長さのＦ６６９Ｙ Ｔth(プラスミド pＭＲ１０)のコドン１８(Ｄ１８Ａ)でアラニンアミノ酸変化へと導入した。変異原性プライマー１(ＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣ)は、コドン１８およびＢstＢＩ制限部位が含まれるpＭＲ１０のヌクレオチド１９−６０とつながる。オリゴヌクレオチドプライマー２(ＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣ)は、pＭＲ１０のＥcoＲＩ部位とつながる。pＭＲ１０を鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ産物をＢstＢＩおよびＥcoＲＩで消化させ、pＭＲ１０の２つのフラグメント：５０００bpのＫpnＩ／ＢstＢＩおよび２０５７bpのＥcoＲＩ／ＫpnＩに結合させて、プラスミドpＭＲ１２を作成した。Ｅ. coli株の細胞 ＤＨ１λ+を一次形質転換に使用して、株 Ｍ５２４８(λ cI８５７)をタンパク質発現に使用したが、cI+およびcI８５７対立遺伝子をもつＥ. coli株の比較可能な対はいずれも利用することができた。あるいはまた、rec+ cI+株をいずれもナリジキシン酸のような化学薬剤により導入して、ポリメラーゼを産生することができた。
【００２４】
ポリメラーゼの精製
プラスミドpＭＲ１２を含むＭ５２４８を、１００mg／ml アンピシリンを含む、１リットルのＬＢ培地(１％ トリプトン、０.５％ 酵母エキス、１％ ＮaＣl)、好ましくは２Ｘ ＬＢ培地にて３０℃で培養した。ＯＤ600が１.０に達したら、その培養物を４２℃で１.５時間保持(induce)した。次いで、その培養物を２０℃未満まで冷却して、細胞をＳorvall ＲＣ−３Ｂ遠心機における５０００rpmにて４℃での１５〜３０分間の遠心分離により収集した。収集した細胞を−８０℃で保存した。
【００２５】
細胞ペレットを予め温めておいた溶解緩衝液(５０mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ ８.０、１０mＭ ＭgＣl2、１６mＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、１mＭ ＥＤＴＡ、０.１％、好ましくは０.２％ Ｔween ２０、０.１％、好ましくは０.２％ ＮＰ４０)２５mlに再縣濁させた。好ましくは、その溶解緩衝液は３００mＭ ＮaＣlを含む。再縣濁させた細胞を７５−８５℃で１０−２０分間インキュベートし、１分間音波処理して、遠心分離により澄ませた。澄ませたライゼートを、１００mＭ、好ましくは３００mＭ ＮaＣlを含む緩衝液Ａ(５０mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ ８.０、１mＭ ＥＤＴＡ、０.１％ Ｔween ２０、０.１％ ＮＰ４０)にて平衡化したジエチルアミノエチルセルロース(Ｗhatman ＤＥ ５２)の３００mlのカラムを通過させた。画分をポリメラーゼ活性に関してアッセイし、ピークのポリメラーゼ活性を実証する画分をプールし、緩衝液Ａで５０mＭ ＮaＣlまで希釈して、緩衝液Ａ中の５０mＭ ＮaＣlで平衡化したヘパリンセファロースカラム(２０ml)へと充填した。ポリメラーゼを緩衝液Ａ中の５０mＭから７００mＭまでのＮaＣlの直線的な塩のグラジエントでカラムから溶出した。画分をポリメラーゼ活性に関してアッセイし、ピークの活性を実証する画分をプールして、最終緩衝液(２０mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ ８.５、５０％(ｖ／ｖ) グリセロール、０.１mＭ ＥＤＴＡ、０.５％ Ｔween ２０、０.５％ ＮＰ４０、１mＭ ＤＴＴ、１００mＭ ＫＣl)に対して透析した。精製されたタンパク質をＦＹ７と名付ける。アミノ酸配列(およびそれをコードするＤＮＡ配列)を図１に示す。
【００２６】
細菌株
Ｅ. coli株：ＤＨＩλ+[gyrＡ９６、recＡ１、relＡ１、endＡ１、thi-１、hsdＲ１７、supＥ４４、λ+]；Ｍ５２４８[λ(bio２７５、cI８５７、cIII＋、Ｎ＋、λ(Ｈ１))]。
【００２７】
ＰＣＲ
Ｅ. coli ＤＨＩλ+由来のプラスミドＤＮＡ(pＭＲ１０)をＳＤＳアルカリ溶解法(Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，１９８９)により調製した。反応条件は次の通りであった：反応物１００μlあたり、１０mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ ８.３、５０mＭ ＫＣl、１.５mＭ ＭgＣl2、０.００１％ ゼラチン、１uＭ 各々のプライマー、２.５Ｕ Ｔaqポリメラーゼ。サイクリング条件は、９４℃で２分間、次いで、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間、続いて、７２℃で７分間を３５サイクルであった。
【００２８】
実施例１：Ｍn条件での酵素の調製
次の「プレミックス(pre-mix)」プロトコルにおいて、試薬は全て、２つの溶液；試薬混合物Ａおよび試薬混合物Ｂに含まれる。
【００２９】
試薬混合物Ａ
次の試薬を組合わせて、試薬混合物Ａ １０mlを製造した：
２.５ml １Ｍ ＨＥＰＰＳ Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ'−(３−プロパンスルホン酸)、pＨ ８.０；
５００μl １Ｍ 酒石酸、pＨ ８.０；
５０,０００単位 ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼ；
１単位 Ｔhermoplasma acidophilum 無機ピロホスファターゼ；
１００μl １００mＭ dＡＴＰ；
１００μl １００mＭ dＴＴＰ；
１００μl １００mＭ dＣＴＰ；
５００μl １００mＭ dＩＴＰ；
９.３７５μl １００μＭ Ｃ−７−プロパルギルアミノ−４−ローダミン−６−Ｇ−ddＡＴＰ；
９０μl １００μＭ Ｃ−５−プロパルギルアミノ−４−ローダミン−Ｘ−ddＣＴＰ；
６.７５μl １００μＭ Ｃ−７−プロパルギルアミノ−４−ローダミン−１１０−ddＧＴＰ；
１６５μl １００μＭ Ｃ−５−プロパルギルアミノ−４−テトラメチルローダミン−ddＵＴＰ；
１０μl ５０mＭ ＥＤＴＡ；
１ml グリセロール；
体積を脱イオンＨ2Ｏで１０,０００μlとした。
【００３０】
試薬混合物Ｂ
次の試薬を組合わせて、試薬混合物Ａ １０mlを製造した：
１０μl １Ｍ ＭＥＳ ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸、pＨ ６.０；
２００μl １Ｍ ＭgＣl2；
７５μl １Ｍ ＭnＳＯ4；
体積を脱イオンＨ2Ｏで１０,０００μlとした。
【００３１】
実施例２：実施例１から得られた調製物の使用
試薬混合物Ａ ２μl、試薬混合物Ｂ ２μl、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡ ２００ng、プライマー(Ｍ１３−４０ 前方 ５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ)５pmole、および全体積を２０μlとする脱イオン水を一緒に混合して、熱サイクラーに(９５℃で３０秒間、６０℃で１分間)２５サイクルかけた。サイクリング後、１.５Ｍ 酢酸ナトリウム、２５０mＭ ＥＤＴＡを含む溶液４μlを加えた。その溶液を混合して、エタノール４体積(１００μl)を加えた。氷上での１５−２０分間のインキュベーション、続いて、遠心分離により、ＤＮＡを沈殿させた。上清を除去して、ペレットを７０％ エタノールで洗浄し、乾燥させて、充填色素を含むホルムアミド４μlに再縣濁させた。次いで、再縣濁させたＤＮＡを自動蛍光ＤＮＡ配列決定装置(ＡＢＩの３７７型装置)で操作した。その機械からのＤＮＡ配列のプリントアウトを図２として示す。
【００３２】
実施例３：Ｍg条件での酵素の調製
次の「プレミックス」プロトコルにおいて、試薬は全て、１つの溶液に含まれる。
【００３３】
配列決定プレミックス
次の試薬を組合わせて、配列決定プレミックス８００μlを製造した：
２００μl ５００mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ ９.５、２０mＭ ＭgＣl2；
１００μl ４０単位／μl ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼ、０.０００８単位／μl Ｔhermoplasma acidophilum 無機ピロホスファターゼ；
１００μl １０mＭ dＩＴＰ、２mＭ dＡＴＰ、２mＭ dＴＴＰ、２mＭ dＣＴＰ；
１００μl ０.１２５μＭ Ｃ−７−プロパルギルアミノ−４−ローダミン−６−Ｇ−ddＡＴＰ；
１００μl １.２μＭ Ｃ−５−プロパルギルアミノ−４−ローダミン−Ｘ−ddＣＴＰ；
１００μl ０.０９μＭ Ｃ−７−プロパルギルアミノ−４−ローダミン−１１０−ddＧＴＰ；
１００μl ２.２μＭ Ｃ−５−プロパルギルアミノ−４−テトラメチルローダミン−ddＵＴＰ。
【００３４】
実施例４：実施例３から得られた調製物の使用
配列決定プレミックス４μl、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡ ２００ng、プライマー(Ｍ１３−４０ 前方 ５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ)５pmole、および全体積を２０μlとする脱イオン水を一緒に混合して、熱サイクラーに(９５℃で３０秒間、６０℃で２分間)２５サイクルかけた。サイクリング後、７.５Ｍ 酢酸アンモニウム７μlを加えた。その溶液を混合して、エタノール４体積(１００μl)を加えた。氷上での１５−２０分間のインキュベーション、続いて、遠心分離により、ＤＮＡを沈殿させた。上清を除去して、ペレットを７０％ エタノールで洗浄し、乾燥させて、充填色素を含むホルムアミド４μlに再縣濁させた。次いで、再縣濁させたＤＮＡを自動蛍光ＤＮＡ配列決定装置(ＡＢＩの３７７型装置)で操作した。その機械からのＤＮＡ配列のプリントアウトを図３として示す。
【００３５】
実施例５：Ｔhermo Ｓequenase(商標)酵素およびＦＹ７酵素に関するポリメラーゼ活性 対 塩濃度(ＫＣl)
様々なＫＣl濃度の下、最大ポリメラーゼ活性％をＴhermo Ｓequenase(商標)酵素 ＤＮＡポリメラーゼおよびＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼに関して測定した。その結果を図４に示す。そのデータは、反応混合物において、ＦＹ７がＴhermo Ｓequenase(商標)よりずっと高い塩の最適条件、さらにはまた、塩に対して広範囲の耐性を有することを示す。５０％の活性を与える塩濃度は、Ｔhermo Ｓequenaseに関するよりＦＹ７に関するほうが５倍高い。
【００３６】
放射能標識化ＤＮＡ配列決定反応におけるＤＮＡ配列決定能力に対する高い塩濃度の効果もまた試験した。その結果を図５に示す。５０mＭ以上のＫＣl濃度では、Ｔhermo Ｓequenase(商標) ポリメラーゼ性能は、使用可能なデータを得ることができないレベルまで低下する。しかしながら、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼは、１００mＭのＫＣl濃度でも極めて良好な配列決定データを与えることができる。
【００３７】
実施例６：蛍光配列決定の塩耐性
これらの実験は、蛍光標識化ターミネーターＤＮＡ配列決定反応において、先に実証したＤＮＡ配列決定能力に対する高い塩濃度でのポリメラーゼ活性の効果を試験した。その結果を図６−１５に示す。
【００３８】
図６−１０は、Ｔhermo Ｓequenaseの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。２５mＭ程度の低い濃度では、データの特質は、読取り長さが少なくとも６００塩基から約４５０塩基まで減少するという点で影響を受ける。５０mＭの塩では、その読取り長さはさらに約３５０塩基まで、７５mＭでは約２５０塩基まで減少して、１００mＭでは、その読取り長さは無視できる。
【００３９】
図１１−１５は、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。少なくとも７５mＭのＫＣlには、性能に対して有害な効果はなく、１００mＭのＫＣlでは、データの特質において僅かな減少しかない。
【００４０】
幾つかのタイプのＤＮＡ調製物には、塩が混入し得る(これは、ＤＮＡ配列決定データの特質に対して有害である)ことが認められるので、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの使用は、より広範囲の鋳型条件に対して、より強固な配列決定反応を可能とする。
【００４１】
実施例７：ポリメラーゼの連続移動性
連続移動性(ＤＮＡポリメラーゼの結合事象あたりに取り込まれるヌクレオチドの数)を様々なＤＮＡ配列決定ポリメラーゼに関して測定した。その結果を図１６に示す。Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼは、結合事象あたり４ヌクレオチドまでの連続移動性しか有していない。ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼは、結合事象あたり３０ヌクレオチドまでで、Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼより７倍大きい、そしてＡmpliＴaq ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼより２倍まで大きい連続移動性を有する。
【００４２】
実施例８：７２℃でdＩＴＰでのポリメラーゼ伸長
そのシリーズは、dＧＴＰ(グアノシントリホスフェート)アナログであるdＩＴＰ(イノシントリホスフェート)を７２℃で取り込む放射能標識化配列決定反応において、ＦＹ７ ポリメラーゼ 対 Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合に得られる、改良された読取り長さを試験した。その結果を図１７に示す。ＦＹ７は、標準的な33Ｐ[α−dＡＴＰ]配列決定条件下、Ｔhermo Ｓequenaseより５０−１００多いヌクレオチドを取り込むことができる。
【００４３】
実施例９：読取り長さに対する伸長段階時間の効果
これらの実験シリーズは、蛍光標識化ターミネーターＤＮＡ配列決定反応において、Ｔhermo ＳequenaseおよびＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの読取り長さおよびデータの特質の増大する伸長段階時間の効果を試験した。その結果を図１８−２７に示す。
【００４４】
図１８−２２は、Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。このデータは、少なくとも６００塩基の良質な読取りが達成されるために、最低２分の伸長段階がＴhermo Ｓequenaseにより必要とされることを示す。シグナル強度は、通例、４分の伸長(この酵素および方法を利用する市販の製品において指定される時間)で最大まで増大する。
【００４５】
図２３−２７は、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。このデータは、少なくとも６００塩基の良質な読取りが達成されるために、最低３０秒の伸長段階がＦＹ７により必要とされることを示す。シグナル強度は、約１分の伸長時間でプラトーに達する。ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼは、４分の１〜２分の１の伸長反応時間でＴhermo Ｓequenaseと同等の特質のデータをもたらすことができる。
【００４６】
先の実施例は、本発明の様々な態様を詳細に記載するが、多くの変更が当業者に明らかである。従って、先の実施例は、説明を目的とするものであって、付記する特許請求の範囲を制限するために何ら使用すべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＦＹ７ポリメラーゼに関するアミノ酸配列(およびそれをコードするＤＮＡ配列)を示す。
【図２】  図２は、ＡＢＩの３７７型 自動蛍光ＤＮＡ配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Ｍn条件で調製したＦＹ７ポリメラーゼを使用して配列決定された、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図３】  図３は、ＡＢＩの３７７型 自動蛍光ＤＮＡ配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Ｍg条件で調製したＦＹ７ポリメラーゼを使用して配列決定された、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図４】  図４は、様々なＫＣl濃度の下、Ｔhermo Ｓequenase(商標)酵素 ＤＮＡポリメラーゼ 対 ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの最大ポリメラーゼ活性％を示す。
【図５】  図５は、Ｔhermo Ｓequenase(商標)酵素 ＤＮＡポリメラーゼ 対 ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼを使用しての放射能標識化ＤＮＡ配列決定反応における、ＤＮＡ配列決定能力に対する高い塩濃度の効果を示す。
【図６−１０】  図６−１０は、Ｔhermo Ｓequenaseの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。２５mＭ程度の低い濃度では、データの特質は、読取り長さが少なくとも６００塩基から約４５０塩基まで減少するという点で影響を受ける。５０mＭの塩では、その読取り長さはさらに約３５０塩基まで、７５mＭでは約２５０塩基まで減少して、１００mＭでは、その読取り長さは無視できる。
【図１１−１５】  図１１−１５は、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。少なくとも７５mＭのＫＣlには、性能に対して有害な効果はなく、１００mＭのＫＣlでは、データの特質において僅かな減少しかない。
【図１６】  図１６は、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼに関して測定した連続移動性(processivity)と比較する、Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼ、ＡmpliＴaq ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼに関して測定した連続移動性を示す。
【図１７】  図１７は、dＧＴＰ(グアノシントリホスフェート)アナログであるdＩＴＰ(イノシントリホスフェート)を７２℃で取り込む放射能標識化配列決定反応において、ＦＹ７ ポリメラーゼ 対 Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合に得られる、改良された読取り長さを示す。
【図１８−２２】  図１８−２２は、蛍光標識化ターミネーターＤＮＡ配列決定反応において、Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【図２３−２７】  図２３−２７は、蛍光標識化ターミネーターＤＮＡ配列決定反応において、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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