(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞尿試料からの核酸を精製、安定化及び／又は単離する場合に、核酸含有試料に、夾雑物の結合のための吸着マトリックスとしてセルロース、馬鈴薯澱粉および／または馬鈴薯粉を添加することを特徴とする、糞尿試料からの核酸を精製、安定化又は／及び単離する方法。
【請求項２】
吸着マトリックスとして、セルロース及び馬鈴薯粉からの混合物を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離に引き続き核酸の酵素的操作をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸塩基特異的増幅）又は３ＳＲ（自己支持配列複製）により行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
糞便試料からの核酸を分析、検出又は単離するための請求項１から３のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項５】
（ａ）核酸含有試料の収容のために好適な緩衝液
及び
（ｂ）糞尿試料からの夾雑物を結合するためのセルロース、馬鈴薯澱粉および／または馬鈴薯粉を主体とする不溶性吸着マトリックス
を包含している、糞尿試料からの核酸を精製及び安定化するための試薬キット。
【請求項６】
核酸を更に精製するための薬剤、無機又は／及び有機の担体及び場合によっては溶液、補助物質又は／及び付属品を包含する、請求項５に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、夾雑物、例えば核酸を害し酵素反応を抑制する物質を除去することにより、生物学的物質からの核酸を安定化、精製又は／及び単離する方法に関する。この方法は、殊に糞便試料中の核酸を分析、検出又は単離するために好適である。更に、本発明の方法の実施のために好適である試薬キットを開示する。
種々の研究分野からの多くの例は、貯蔵の間に核酸を害し、例えば増幅による核酸の酵素的操作を阻止する物質で不純化されている生物学的物質からの核酸の分析の重要性を記載している。従って、生物学的物質中に含有されている核酸の他の分析のための使用性にとって、これらの物質が非常に低い濃度でのみ存在しているか又は全く試料から除去されることが重要である。
糞尿試料からの核酸の分析は特に重要性を有する。医療用の主用途は、消化管の腫瘍の初期診断時のパラメータとして役立つことのできる糞便からの核酸ＤＮＡの腫瘍特異的変化の検出である。同様に、核酸に基づく試験法により糞便試料からの細菌及びウイルス性の感染病原体の検出の重要性が増大している。
糞便からの核酸を単離する１つの方法は、ＷＯ９３／２０２３５に開示されている。しかしながら、この方法は、核酸の低い収率のみを示している。更に、ＤＮＡ−障害性又は／及びＰＣＲ−抑制性の物質は分離されない。従って、単離されたＤＮＡは、長時間貯蔵することができず、このＤＮＡの特異的な分析すべき遺伝子部分の増殖のための増幅は、再現可能な結果を生じない。この公知方法の特に重大な１つの欠点は、ＰＣＲ−増幅時に、更なる分析に必要である単一の配列を有する完全なＤＮＡ−フラグメントを生じないことである。これを得るためには、増幅された遺伝子部分の経費のかかるクローニングが必要である。この技術水準の方法のもう一つの欠点は、著しく健康を害する溶剤フェノール及びクロロホルムを使用しなければならないことである。
従って、本発明の根底にある課題の一つは、生物学的物質中の核酸の分解を安定化させ、核酸の酵素的操作を阻止する物質を分離することのできる方法を提供することであった。殊に、糞尿試料からの核酸の確実な単離を可能とする方法が提供されるべきである。
この課題は、生物学的物質からの核酸を精製、安定化又は／及び単離するための法により解決され、この方法は、生物学的物質からの核酸含有試料に、夾雑物の結合のための吸着マトリックス（Adsorptionsmatrix）を添加し、引き続き、この核酸から場合により結合した夾雑物を分離除去することを特徴とする。核酸含有試料と吸着マトリックスとの接触は、直接又は液体中への試料を入れた後に行うことができる。
本発明の方法により、生物学的物質から単離された核酸、殊にＤＮＡの使用性を明らかに改善することができる。さらに、吸着マトリックスの添加により、核酸を害する物質も酵素的操作を阻止する物質も充分に分離除去される。従って、本発明の方法により安定化された核酸は、長時間にわたり貯蔵することができる。更に、吸着マトリックスの添加により処理された核酸の例えばＰＣＲによる増幅時に再現可能な結果が得られる。この再現性は、核酸分析の際の結果の証言能力にとって重要である。本発明の方法により精製された核酸の高い品質は、例えば、これは、直接配列決定又はヘテロ二重分析により試験することができることで明らかである。クローニングは不必要である。更に、本発明の方法では、健康を害する溶剤を使用する必要がない。
本発明の方法で使用される吸着マトリックスは、それが核酸を害する又は／及び酵素反応の実施を阻止する又は／及び酵素反応を抑制する夾雑物、例えばヘモグロビンの分解生成物、例えばビリルビン及びその分解生成物又は／及び胆汁酸又はその塩又はその分解生成物及び他の植物又は動物起源の分解生成物に結合することができるような特性を有する。不溶性の吸着マトリックスの場合には、試料からの容易な分離が可能であるので、これを使用するのが有利である。
炭水化物又は／及びポリペプチドを主体とする吸着マトリックスを用いて良好な結果が得られる。炭水化物をベースとする吸着マトリックス、例えば多糖類を含有する吸着マトリックスが有利である。特に、α−又は／及びβ−グリコシド結合した炭水化物、例えば澱粉、セルロース、グリコーゲン又は／及び他の生物源又は非生物源の炭水化物及びその誘導体又はそれらの混合物を含有する吸着マトリックスを使用するのが有利である。
穀紛、即ち主としてセルロース、澱粉、脂質及び塩又はそれからの成分の混合物の使用が最も有利である。例えば、穀物、トウモロコシ、豆類、大豆及び馬鈴薯又はこれらからの成分又は混合物からの穀粉が好適であると立証された。当業者にとって、当然、前記の種類の穀紛と並んで、他の種類の穀粉又は数種の穀粉又はそれらからの成分の混合物も使用できる。馬鈴薯紛又はこれからの成分の使用が最も有利である。同様に精製炭水化物、例えばセルロース及び穀粉、例えば馬鈴薯紛からの混合物も有利である。
更に、穀粉、殊に前記の種類の穀粉１種以上からの可溶性成分の組成の炭水化物を主体とする吸着マトリックスの使用が有利である。
この吸着マトリックスを生物学的試料に添加する量は、主として試料の特性、即ち夾雑物の量に依存する。吸着マトリックスを核酸含有試料に対して０．０５：１〜１００：１の重量割合で使用する際に、良好な結果が得られた。特にこの吸着マトリックスを０．１：１〜１０：１の量で添加するのが有利である。
本発明の方法により安定化されるべき核酸含有試料は、核酸を分解する又は酵素的反応を抑制する夾雑物を含有する生物学的物質に由来する。特に核酸含有試料は糞尿に由来する。しかしながら、これは、例えば他の起源、例えば全ての種類の組織、骨髄、ヒト及び動物の体液、例えば血液、血清、血漿、尿、精液、脳髄液、喀痰及び塗沫標本、植物、植物部分及び植物エキス、植物汁、菌類、微生物、例えば細菌、化石化又はミイラ化された試料、土壌試料、沈殿汚泥、廃水及び食料品に由来しうる。夾雑物としては、例えばヘモグロビンの分解生成物、例えばビリルビン及びその分解生成物又は／及び胆汁酸又はその塩又はその分解生成物又は他の種類の夾雑物も含有しうる。
この方法の良好な取扱いのために、生物学的物質からの試料を吸着マトリックスに添加する前に、緩衝液中に入れることが好適であると立証された。試料を吸着マトリックスと一緒に恒温保持することは、室温で行うことができる。この恒温保持時間は、広い範囲で変動することができる。この恒温保持の後に吸着マトリックスを例えば遠心により試料から分離することができる。例えば液体試料の場合には、試料に直接、吸着マトリックスを添加することもできる。更に、試料を吸着マトリックス上に遠心により、真空設定により又は／及び重力を用いて導くことができ、この際、吸着マトリックスはカラム中に充填されて存在するのが有利である。
この吸着マトリックスでの処理は、試料中に含有している核酸の充分な安定化上昇をもたらし、引き続く核酸の単離の際に良好な再現性をもたらす。このことは、殊に、この単離に核酸の酵素的操作、例えば増幅又は／及び制限切断を引き続き行う場合に当てはまる。特に、増幅を、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸塩基特異的増幅）又は３ＳＲ（自己支持配列複製；Self Sustained Sequence Replication）により実施するのが有利である。
本発明の特に有利な１態様は、糞便試料からの核酸、殊にＤＮＡの分析、検出又は単離である。本発明の方法により、糞尿試料から、突然変異、殊に腫瘍特異性ＤＮＡ−突然変異の検出に使用することのできる、きれいで増幅可能な核酸が得られる。
本発明の方法は、夾雑物及び多量の細菌性核酸の存在下における核状の真核性核酸の特異的検出を可能とするので、腫瘍診断のために極めて重要である。
本発明の方法の使用下での糞便−ＤＮＡの分析により、消化管の腫瘍、殊に膵臓−又は腸腫瘍を早期にかつ正確に診断することができる。この診断は、例えば腫瘍特異性のＤＮＡ−突然変異への癌遺伝子又は／及び腫瘍抑制遺伝子の検査により行う。消化管の腫瘍の細胞は、連続的に糞便中に剥離出現するので、本発明の方法により糞便中の腫瘍特異性ＤＮＡ−突然変異の検出が可能になる。さらに、本発明の方法は、腫瘍の除去に関連して現れる治療のモニター及び腫瘍予防検診の規則的かつ確実な実施を可能とする。
結腸腫瘍に関する技術水準から公知の非侵襲性の特有の慣用の試験、糞便中の潜血に関する試験とは反対に、本発明の方法では、誤−陽性の結果はないか又は非常に希である。更に、既に腺腫期、即ち腫瘍進行の非常な早期に突然変異する遺伝子中の突然変異の検出は、糞便−血液試験として明らかに早期のかつ特異的診断を可能とする。この突然変異分析の好適な対象としては、殊に腫瘍抑制遺伝子ＡＰＣ（アデノマトーゼ  ポリポシス  コリ；Adenomatoese Polyposis Coli）（Fearon und Vogelstein（1990）、Cell 61,759-761）及びｒａｓ−癌遺伝子を使用することができる。糞便試料からのＤＮＡ中のこれら双方の遺伝子の突然変異分析により、殊に腸腫瘍、例えば大腸腫瘍及び膵臓腫瘍を検出することができる。このＡＰＣ−遺伝子及びｒａｓ−遺伝子と並んで、勿論、他の腫瘍関連遺伝子も癌診断のために、分析対象として使用することができる。
腫瘍関連遺伝子を別として、このゲノムの翻訳されなかった反復部分も、癌診断時の分析対象として使用することができる。これらのいわゆるマイクロサテライト部分を増幅させ、ゲル電気泳動により得られるバンド標本を健康な体物質からのＤＮＡのバンド標本と比較する。バンド標本の差異は、腫瘍の存在の立証を示すことができる。
本発明の方法の使用のもう一つの例は、法廷分析における糞尿又は体物質から精製された核酸の検査による個人の正確な同定である。このために、このゲノムの反復性多形の部分を増幅させ、この増幅生成物をゲル電気泳動により分離させる。得られたバンド標本を他の疑わしい又は近縁の人のＤＮＡの標本と比較することにより、当該個人を同定することができる。
糞尿試料からのＤＮＡの本発明による単離のためのもう一つの重要な用途は、動物生物学的な集団遺伝学的、評価遺伝学的及び植物学的研究及び動物及び植物の調査である。従来は、このような調査は、屡々、動物種の希少性及び当該動物が特定の場所で出現する低い確立により失敗している。おおよその居留場所が知られている場合には、残存糞尿の本発明の方法による分析は、動物の血族関係の度合い、残された移動経路又はその動物の食習慣に関する重要な立証を提供ことができる。同様に、糞尿核酸の分析から、例えば微生物又はウイルス性の核酸の検出により、例えば細菌性又はウイルス性の感染に関する重要な診断学的情報を引き出すことができる。
本発明のもう一つの目的は、生物学的物質からの核酸の安定化及び精製のための試薬キットであり、これは、
（ａ）核酸含有試料を収容するために好適である緩衝液及び
（ｂ）生物学的物質からの夾雑物の結合のための吸着マトリックス
を包含する。
この吸着マトリックスは、分包された形で、例えば遠心分離可能なミニカラムのようなカラム中に充填されて存在していてよい。
この試薬キットは、付加的に核酸の精製のための薬剤（これは、例えば無機又は／及び有機の担体及び場合によっては溶液、助剤又は／及び付属品を包含する）を含有するのが有利である。担体の無機成分は、例えば多孔性又は非多孔性の金属酸化物又は金属混合酸化物、例えば酸化アルミニウム、二酸化チタン又は二酸化ジルコニウム、シリカゲル、ガラス、例えば変性又は非変性ガラス粒子又はガラス紛、石英、ゼオライト又は前記の物質の１種以上の混合物を主体とする物質であってよい。他方、この担体は、例えば場合によって官能基で変性されたラテックス粒子、合成ポリマー、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、フッ化ポリビニリデン、殊に超高分子量のポリエチレン又はＨＤ−ポリエチレン又は前記物質１種以上の混合物から選択される有機成分を含有していてもよい。
担体は、例えば平均粒径０．１μｍ〜１０００μｍを有する粒子の形で存在しうる。多孔性担体を使用する場合には、２μｍ〜１０００μｍの平均孔径が有利である。この担体は、場合によっては、例えばガラス、石英又はセラミック製の粒子、フィルター層、膜、例えばその中にシリカゲルが配置されている膜、無機担体、例えば石英又はガラスウール製の繊維又は織物の弛るいバラ体の形で、及び合成ポリマーからのラテックス又はフリット物質の形で存在することができる。
更に、この試薬キットは、なお適当な溶液、例えば洗浄溶液又は試料の収容のための緩衝液を含有していてもよい。核酸含有試料の収容のために好適である緩衝液は、例えばトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．５〜９．５、ＥＤＴＡ及び場合によりＮａＣｌを主剤とする緩衝液系である。殊に糞便試料を収容するための特に好適な緩衝液は、トリス−ＨＣｌｐＨ９  ５００ミリモル、ＥＤＴＡ  ５０ミリモル及びＮａＣｌ  １０ミリモルを含有する。
更に、本発明による試薬キットは、補助物質、例えば酵素及び他の核酸の処理のための薬剤、例えば少なくとも１種の増幅プライマー及び核酸の増幅のために好適である酵素、例えば核酸ポリメラーゼ又は／及び少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを含有していてもよい。
核酸の増幅のためのプライマーは、分析すべき遺伝子、即ち例えば癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子又は／及びマイクロサテライト部分に由来するのが有利である。核酸の増幅のために好適である酵素及び制限エンドヌクレアーゼは公知であり、市場で入手できる。
更に、本発明を次の実施例につき詳述する。
例１
糞便試料からのＤＮＡの分析
次の吸着マトリックスを試験した：不動態化された仔牛血清−アルブミン（ＲＳＡ）、セルロース及び馬鈴薯澱粉（全て  Sigma,Muenchen,DEから）及び馬鈴薯粉（Honig,Postbus  45,1540  AA  Koog a/d Zaan,NL）、ここで、これは、実質的にセルロース、澱粉、脂質及び塩からの不溶性混合物である。
人の糞便試料を集め、凍結乾燥させ、−８０℃で貯蔵した。糞便２００ｍｇを糞便溶解緩衝液（ＳＬＰ：トリス−ＨＣｌ  ｐＨ９．０  ５００ミリモル、ＥＤＴＡ５０ミリモル、ＮａＣｌ  １０ミリモル）６００μｌ中でホモゲナイズさせた。このホモジェネートのそれぞれの１／４に、ＳＬＰ２００μｌをそれぞれ吸着マトリックス１００ｍｇと一緒に加えた。この混合物を激しく混合し、細菌及び他の夾雑物の沈殿のために、５００×ｇ又は１３０００×ｇでそれぞれ５分間、２回遠心にかけた。澄明な上澄みを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でのプロテイナーゼＫでの処理の後に、ＤＮＡを、血液及び組織からのＤＮＡ−精製のために好適であるＤＮＡ−スピンカラム（Qiagen,Hilden,DE）の使用下に精製した。カラム処理及び洗浄工程を、製造者が指定しているように実施した。
次いで、ＤＮＡを、スピンカラムから１５０μｌの蒸留水の最終量中で溶離させ、使用までに−２０℃で保存した。染色体ＤＮＡの収率を２６０ｎｍでの吸収の測定により測定した。
全ての調製物は、１５〜２０μｇの比較可能な総−ＤＮＡ−量を示した。分析用アガロースゲルでは、吸着マトリックス用いる場合と用いない場合の調製物からのゲノム性ＤＮＡの間の相違が認められなかった。吸着マトリックスの添加により、抽出された染色体ＤＮＡの収率の増加も確認されなかった。
単離された核酸の安定性の試験のために、１週間保存の後のＤＮＡを試験した。結果を第１表に示す。最も安定なＤＮＡ−試料は、吸着マトリックスとしての馬鈴薯粉の使用の後に得られた。
ＰＣＲによる増幅のために、精製染色体ＤＮＡ  ３μｌを、トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３  １０ミリモル、ＫＣｌ  ５０ミリモル、ＭｇＣｌ２  １．５ミリモル、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ３０マイクロモル、各プライマー４００ナノモル、ＲＳＡ１００μｇ／ｍｌ及びＴａｑ−ポリメラーゼ（AGS,Heidelberg,DE）０．７５単位を含有する５０μｌの総量中で用いた。
感度改善のために、Nested-ＰＣＲ−法（Jackson et al.,（1991）,McPherson,N.J.Quirke,P. Taylor,G.R.（Hrsg.）,PCR-A Practical Approach,Oxford University Press）を、ビオチン−標識されたNested-プライマーの使用下に実施した。吸着マトリックスの不存在下に精製されたＤＮＡ−試料のＰＣＲは、完全にブロックされていた。吸着マトリックスとしてのＲＳＡ、セルロース又は馬鈴薯澱粉の添加により、部分的に再現可能なＰＣＲ−結果を得ることができた（第１表）。
１０の全ての分析された試料中の再現可能なＰＣＲ−結果は、吸着マトリックスとしての馬鈴薯粉の使用の際に得られた。ＰＣＲ−フラグメントは、ヘテロ二重分析時の使用のためにも直接配列決定のためにも好適であった。このために、１本鎖ＤＮＡの調製を、製造者の指示に従い、ストレプトアビジン−結合マグネットビーズ（Dynal,Hamburg,DE）の使用下に行った。
0004264133.tif 000002
例２
糞便試料の精製
次の緩衝液を使用した：
緩衝液ＳＬＰ：（例１参照）
緩衝液Ａ：グアニジニウム／ＨＣｌ  ５．６モル；Ｔｗｅｅｎ  ２０  ２０％
緩衝液Ｂ：トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５  １０ミリモル；ＮａＣｌ  １００ミリモル；エタノール７０％
緩衝液Ｃ：トリス／ＨＣｌ  ｐＨ９．０  １０ミリモル；ＥＤＴＡ  ０．５ミリモル
凍結乾燥された１糞便試料から３ｇを秤取し、緩衝液ＳＬＰ  ２ｍｌと充分な渦動により混合した。引き続き、カラムに馬鈴薯粉とセルロースとの１：１混合物（ｗ／ｗ）を充填し、１５０ｍｌの遠心分離管中に装入した。緩衝液中に入れられた試料をこのカラム中に移し、５００ｕｐｍで５分間の遠心分離により夾雑物から澄明にした。
この澄明化された試料１．２ｍｌに、プロテイナーゼＫ−株溶液（１．７８５ｍｇ／ｍｌ）０．１２５ｍｌ及び緩衝液Ａ  １．２ｍｌを加えた。この試料を渦動により１分間混合し、引き続き７０℃で１０分間恒温保持した。無水アルコール１．３ｍｌの添加及び充分な混合の後に、この溶液をＱｉａ−ＡＭＰ−ミデイカラム（Qiagen）中に移し、核酸を遠心によりシリカマトリックス上に結合させた。
結合された核酸を  緩衝液Ｂ  ２．５ｍｌで２回洗浄することにより精製し、緩衝液Ｃ  ０．５ｍｌでＱｉａ−ＡＭＰ−ミデイカラムから溶離させ、更なる使用まで−２０℃で貯蔵した。
貯蔵された試料で例１と同様に実施したＰＣＲで、再現可能な結果を得ることができた。