(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単核球細胞と、感作性物質を含有すると予想される被験試料とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたCD86分子を検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
【請求項２】
ヒト単核球細胞と、感作性物質と、被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたCD86分子を検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ヒト単核球細胞がTHP-1細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト単核球細胞がU-937DE-4細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、感作性物質のインビトロ評価方法、及び感作性物質を活性化又は抑制する物質の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体においてレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、そして該実験動物の皮膚などに生ずる反応を視察する方法が行われている。しかしながら、この方法は動物の愛護等の見地から見直しがせまられている。
【０００３】
外来物質によりアレルギー反応が惹起される最初の段階では、感作性物質が抗原提示細胞を刺激し、活性化して、該細胞表面に、プロセシングされた抗原を担持したＭＨＣクラスII蛋白質や、ＣＤ８６分子が発現される。このような抗原提示細胞としては樹状細胞やヒト単核球細胞株が知られている。しかしながら、樹状細胞の性質には個人差があり、また再現性に問題があり、一定の特性を有する樹状細胞を安定的に入手することが困難である。また樹状細胞はその調製に困難さが伴う。
【０００４】
他方、ヒト単核球細胞株は細胞の取り扱いは比較的容易であるが、株化した培養細胞が、正常細胞と同様に感作性物質により感作されて分化し、感作物質の性質を反映して抗原提示を行うか否か明らかでない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、取扱いが容易であり、安定して入手可能な培養細胞を用いて、感作物質をインビトロで評価することができる方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、種々検討した結果、ヒト単核球細胞に感作性物質を作用させた場合、該細胞の表面に、感作性物質の量や特性を反映してＣＤ８６分子が発現されることを見出し、本発明を完成した。
従って本発明は、ヒト単核球細胞と、感作性物質を含有すると予想される被験試料とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６物質を検出することを特徴とする、感作性物質のインビトロ評価方法、又はスクリーニング方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、ヒト単核球細胞と、感作物質と、被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子を検出することを特徴とする。該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法、又はスクリーニング方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において用いるヒト単核球細胞としては、感作性物質の特性を反映してその表面にＣＤ８６物質を発現するものであれば特に限定されないが、具体例としてＴＨＰ−１細胞及びＵ−９３７ＤＥ−４細胞が挙げられる。これらの細胞は樹立された培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的には、ＴＨＰ−１細胞及びＵ−９３７ＤＥ−４細胞は、公的な細胞バンク又は民間企業より入手することができる。
【０００９】
本発明のヒト単核球細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を使用することができるが、例えば具体例としてＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清を添加することが必要である。
【００１０】
感作性物質の評価又はスクリーニングにおいては、培養地中の上記ヒト単核球細胞に被験物質を加え、例えばＣＯ2 インキュベーター中で、約３７℃にて２４〜４８時間培養（インキュベーション）を行う。ヒト単核球細胞の初期濃度は１×１０5 〜５×１０5 細胞／mlが好ましい。この場合、好ましくは、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い、対照とする。また、活性化物質を阻害又は活性化する物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中のヒト単核球細胞に、既知の感作性物質と被験物質とを加えて、上記の条件で培養（インキュベーション）を行う。この場合も、好ましくは、被験物質を加えないで上記と同様の培養を行ない、対照とする。
【００１１】
培養（インキュベーション）が終了した後、培養したヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子を検出又は測定する。ＣＤ８６の検出又は測定方法は特に限定されないが、抗−ヒトＣＤ８６抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗−ヒトＣＤ８６抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、ＣＤ８６を表面に発現している細胞を免疫原として用いて常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる。
【００１２】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．ＴＨＰ−１細胞の使用
ＴＨＰ−１細胞（大日本製薬株式会社より購入）をＲＰＭＩ１６４０（含１０％ＦＢＳ）培地を用いて５×１０5 細胞/ml に調製し、２４穴プレートに１ml／wellずつ播種した。被験物質は精製水あるいはＤＭＳＯを用いて１ mmol/ｌの溶液を調製し、それをＰＢＳを用いて適当な濃度に希釈した。精製水に溶解した被験物質溶液は０．４５μｍのフィルタを用いて除菌した。
【００１３】
溶媒が細胞の状態に影響を与えないように、精製水を用いて溶解した溶液は最終的に１％、ＤＭＳＯを用いて溶解した溶液は最終的に０．３％になるよう細胞培養液に添加した。処理した細胞はＣＯ2 インキュベーター中で２４時間培養した。培養後の細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体を用いて氷水中で４５分間染色した。染色した細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、１％ＦＢＳと０．０２％アザイドを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞１×１０5cellsの蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールと比較した。生細胞の検出はＰＩ染色により行った。
結果を図１に示す。
【００１４】
実施例２．Ｕ−９３７ＤＥ−４の使用
実施例１と同様の方法を反復した。但し、ヒト単核球細胞として、Ｕ−９３７ＤＥ−４（理化学研究所  細胞開発銀行）を用いた。結果を図２に示す。
実施例３．本発明の方法と従来技術の方法との比較
幾つかの被験物質について、実施例１に記載した本発明の方法（ＴＨＰ−１／ＣＤ８６法）の結果と、従来技術のＭＡＸ法及びＬＬＮＡ法の結果とを比較した。
【００１５】
（１）本発明の方法−実施例１の方法と同じ。
（２）ＭＡＸ法
モルモットの肩甲骨上を剪毛し、被験物質をアジュバントであるＦＣＡとともに皮内投与する。投与後７日目に皮内投与した部位に、１０％ＳＬＳ含有ワセリン軟こうを塗布し２４時間後に除去する。その後、その部位に被験物質を貼付し、４８時間後に除去する。被験物質の皮内投与３週間後に、剪毛した左腹側部に被験物質を貼付する。閉塞開始後約２４，４８および７２時間後に皮膚反応を観察する。
【００１６】
（３）ＬＬＮＡ法
マウスの耳介に被験物質を塗布（３日連続、あるいは３日連続後、塗布開始後６日目に再塗布）し、終了後翌日に耳介リンパ節細胞を調製し、５×１０6 細胞/ml にし、ＣＯ2 インキュベーター中で２４，４８、あるいは７２時間培養する。
【００１７】
リンパ節細胞の採取時にリンパ節重量を測定する。また、リンパ節細胞中のＣＤ４陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。培養したリンパ節細胞浮遊液よりＲＮＡを抽出し、そこからｃＤＮＡを作成する。それより、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い、ＩＬ−２あるいはＩＬ−４のｍＲＮＡの発現を定量する。
以上より得られるリンパ節重量、ＣＤ４陽性細胞の割合、ＩＬ−２あるいはＩＬ−４の発現量より、被験物質の感作性を判断する。
被験物質及びそのための溶剤は下記表１に示す通りであり、表１に示す結果が得られた。
【表１】
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上記の結果、本発明の方法は、実験動物を用いる従来技術の方法とほぼ一致する結果が得られることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＴＨＰ−１細胞でのＣＤ８６の発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図２】図２はＵ−９３７ＤＥ−４細胞でのＣＤ８６の発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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