(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＦＮ−γによりＵ−９３７細胞中でその産生量が未処理のＵ−９３７細胞と比較して１００倍超亢進される９７〜１０４アミノ酸の大きさを有する免疫調節タンパク質であって、白血球の表面に結合し、そして
ａ）成熟タンパク質について配列番号：２に示されるＤＮＡ配列によりもしくは配列番号：１に示されるゲノム配列によりコードされ、又は
ｂ）配列番号：１もしくは２に示されるＤＮＡ配列、又は配列番号：１のｂｐ４８〜１６２、ｂｐ５４４〜６５２、ｂｐ１０４４〜１１６２、ｂｐ１４７５〜１５６７、ｂｐ１７７５〜１７９７又はｂｐ２３２５〜２７０９に位置するＤＮＡ配列のフラグメントとストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされることを特徴とする免疫調節タンパク質。
【請求項２】
ＩＦＮ−γによりＵ−９３７細胞中でその産生量が未処理のＵ−９３７細胞と比較して１００倍超亢進される９７〜１０４アミノ酸の大きさを有し、白血球の表面に結合する免疫調節タンパク質の原核生物又は真核生物宿主細胞中での発現を確保するのに用いるための核酸分子であって、該核酸分子の配列が、
ａ）配列番号：１に示されるＤＮＡ配列又はその相補的ＤＮＡ配列、
ｂ）ａ）からの配列の１つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列、及び
ｃ）ｂ）に言及される配列の１つとストリンジェント条件下でハイブリダイズするであろう核酸配列、
を含む群から選択され、
その免疫調節タンパク質の読み枠が配列番号：１の位置１１４４のＡＴＧ開始部位により規定され、ここで前記ＡＴＧの後のタンパク質コード化領域中の読み枠のシフトがないことを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸を検出するための方法であって、検査されるべきサンプルを、
ａ）配列番号：１もしくは２に示される配列又はそれらの相補配列を有するＤＮＡ、
ｂ）ａ）からの配列の１つと、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含む群から選択される核酸プローブと共にインキュベートし、
前記核酸プローブを前記サンプルの核酸とインキュベートし、そして前記サンプルの核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイゼーションを、必要に応じて更なる結合パートナーにより、検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、白血球特異的及び免疫調節タンパク質（LST-1）に、そして組換え技術により生産される対応するタンパク質、並びにLST-1活性を有するタンパク質をコードする核酸、使用の方法及び生産の方法に関する。
サイトカインは、組織の細胞構成物間又は異なる組織間のオートクライン、パラクリン又は内分泌シグナルの交換を媒介する50kD未満の分子量を有するタンパク質である。これまでに同定されたサイトカインには、成長因子、インターロイキン及びインターフェロンがあり、体の多くの系：造血系、免疫系、神経系、骨格系、結合組織、及びおそらくほとんどの他の組織並びに体の器官の細胞に作用する（参照文献については、Thompson ed．（1991），The Cytokine Handbook，London，Academic Press及びA.Miyajimaら、Annual Reviews Immunol．10（1992）295〜331を参照のこと）。サイトカインの例は、EGF，NGF，PDGF，FGF，IL-1〜IL-7，GM-CSF，G-CSF，MCSF，IFN，TNF-α，TGF-α及び-βである。
100を超えるサイトカインがこれまでに同定されているが、潜在的な健康管理の進展に重要であり得る更なる新しいサイトカインについての必要性がある。
発明の概要
従って、本発明の目的は、新しい生物特性を示す新しいサイトカインを提供することである。
本発明の更なる目的は、その結合タンパク質がよりすぐに利用できるであろうために、新しいタンパク質を発現することができる組換えDNA分子を用いて新しいタンパク質を提供することである。本発明のこれら及び他の目的は、配列番号：３のアミノ酸配列と少くとも85％の相同性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群から選択される本発明による精製されたタンパク質であって、該タンパク質に特異的な抗体又はその白血球上の細胞表面レセプターに結合することができるタンパク質を提供することにより達成された。
特定の実施形態の記載
本発明は、LST-1活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を用いて生産された組換えタンパク質を含む特に新しい治療用組成物を含む。組換えタンパク質の生産のために用いることができるLST-1 cDNAは、最初にU-937細胞（DSM ACC5）から最初に単離され、これらの細胞からmRNAのIFN-γ RT-PCRクローニングで刺激され、636bpの長さを有するpLST-1と呼ばれるcDNAクローンを生ずる。LST-1 cDNAの分析は、LST-1が６のエキソンからなることを示す。これらのエキソンは、エキソン１Ａ（bp48〜162），１Ｂ（bp544〜652），２（bp1044〜1162），３（bp1475〜1567），４（bp1775〜1797）及び５（bp2325〜2709）と呼ばれる。エキソン５において、位置2345の後に内部５′ドナースプライス部位がある。他のスプライシングにより、LST-1タンパク質の２つの異性体が形成され得、従ってそれらは104又は97アミノ酸のいずれかの長さを有する（配列番号：３及び４）。ヒトpLST-1 cDNAクローンは、停止コドンをコードする延長した５′領域を含む。
本発明は、その産生量が100倍超、好ましくは1000倍超、IFN-γによりU-937細胞内で刺激され、白血球の表面に結合する新しいサイトカイン様タンパク質（以下、LST-1タンパク質、又はLST-1で示す）であって、
ａ）その成熟タンパク質について配列番号：２に示されるDNA配列により又は配列番号：１に示されるゲノム配列によりコードされ、
ｂ）ストリンジェント条件下で配列番号：１もしくは２に示されるDNA配列又はその成熟タンパク質をコードするDNA領域内のDNA配列のフラグメントとハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、
ｃ）遺伝コードの縮退がない場合にａ）又はｂ）に規定される配列とハイブリダイズし、アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするであろうDNA配列によりコードされ、
ｄ）そして前記タンパク質の読み枠は、後の配列番号：１の位置1144におけるATG開始部位により規定され、ここで前記ATG後のタンパク質コード化領域における読み枠のシフトはない。
サイトカイン様タンパク質に基づく。
そのタンパク質は、そのDNA配列により（好ましくは配列番号：１から縮退したcDNA配列により）そしてそれから得られたアミノ酸配列により規定され得る。LST-1タンパク質は、個体間で異なる天然の対立遺伝子変異がおこり得る。このようなアミノ酸の変異は、通常、アミノ酸置換である。しかしながら、それらは、全配列へのアミノ酸の欠失、挿入又は付加でもあり得る。範囲及び型の両方の点でそれが発現される細胞及び細胞型に依存する本発明によるLST-1タンパク質は、配列番号：３によるLST-1タンパク質からグリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよいが、配列番号：４が好ましい。
LST-1 mRNAは、Ｔ細胞、マクロファージ、U-937並びに低レベルで、そのタンパク質が免疫調節活性を示すこれらの組織中に存在するリンパ球及びマクロファージのためであり得るヒト扁桃、肺及び肝臓において構成的に発現される。U-937細胞中でIFN-γによって、転写は強く増強される。Jurkat T細胞系（ATCC TIB 152）のTPA（12−ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート）での刺激に基づいて、LST-1 mRNAの短い誘導が観察された。mRNAの増加は、４時間後に始まり、刺激から８時間後にピークに達し、そして刺激後24時間後に更に減少する。
“免疫調節活性”とは、そのタンパク質が直接的又は間接的にマクロファージとのＴ細胞の協同を調節することを意味する。
白血球の表面への結合は、好ましくは試験管内で評価される。このような方法は当該技術で周知である。
“ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”という用語は、２つの核酸フラグメントが、Sambrookら（“Expression of cloned genes in E．coli”，Molecular Cloning：A laboratory manual（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA，9.47〜9.62及び11.45〜11.61）に記載される標準ハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができることを意味する。
更に詳しくは、本明細書に用いられるストリンジェント条件は、１mol／ｌ NaCl、１％SDS及び10％デキストランスルフェート中でのハイブリダイゼーションという。この後、２×SSCでの５分の室温でのフィルターの２回の洗浄、及び30分の１回の最後の洗浄が行われる。この最後の洗浄は0.5×SSC、0.1％SDSであり得、より好ましくは0.2×SSC、0.1％SDSであり得、最も好ましくは0.1×SSC、0.1％SDSであり得、その最後の洗浄は65℃で行われ得る。当業者は、他の条件が同程度のストリンジェンシーを許容し、“ストリンジェンシー条件下”という表現に含まれ、そして本明細書に含まれることを認めるであろう。
LST-1は、グリコシル化又は非グリコシル化形態で活性であるタンパク質である。非グリコシル化形態は、原核細胞における組換え技術によって形成され得る。
“LST-1活性を有するタンパク質”とは、少量のアミノ酸変異を有するが、実質的に同じLST1活性を有するタンパク質を意味する。実質的にそれは、その活性が同じ生物特性のものであり、好ましくはアミノ酸配列中に少くとも85％の相同性を有することを意味する。より好ましくは、そのアミノ酸配列は少くとも90％同一である。LST-1は、LST-1に対するモノクローナル抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによりU-937細胞から精製することができる。他の周知のタンパク質精製技術、例えば免疫沈降、ゲルろ過、イオン対象、クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動、選択的沈降、及び電気泳動等を用いることも好ましい。精製手順の間に単離された画分は、LST-1特異的抗体を用いることにより、LST-1活性の存在について分析することができる。
本発明によるタンパク質は、組換え手段によっても作ることができる。原核生物内での組換えにより作られる場合、非グリコシル化LST-1タンパク質が得られる。本発明によって供される核酸配列によって、いずれかの要求される細胞（例えばヒト細胞以外の他の哺乳動物の細胞）のゲノム中のLST-1遺伝子又はその変異体について調査すること、これらを同定すること及びLST-1タンパク質をコードする所定の遺伝子を単離することが可能である。このような方法及び適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、例えば、Sambrook，J.ら（“Expression of cloned genes in E．coli”in Molecular Cloning：A laboratory manual（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA）及びB.D.Hames，S.G.Higgins（Nucleic acid hybridisation-a practical approach（1985）IRL Press，Oxford，England）に記載される。この場合、これらの出版物に記載される標準プロトコルが、通常、実験に用いられる。
組換えDNA技術の使用は、多数のLST-1タンパク質誘導体の生産を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、欠失又は付加のような個々の又はいくつかのアミノ酸において修飾され得る。その誘導体は、例えば部位特異的変異誘発によって行われ得る。このような変異は当業者によって容易に行うことができる（J.Sambrook，B.D.Hames，前掲）。LST-1タンパク質の特徴的な特性（上述の細胞系の阻害）が保護されることを更に確実にしなければならない。それゆえ本発明は、更に、外来DNAの原核又は真核生物の発現の産物であるLST-1タンパク質に関する。
本発明は、LST-1タンパク質の原核又は真核宿主細胞における発現を確保するのに用いるための核酸分子であって、
ａ）配列番号：１及び２に示されるDNA配列又は３の相補配列、
ｂ）ａ）からの配列の１つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）遺伝コードの縮退がない場合、ａ）又はｂ）に示される配列の１つとハイブリダイズするであろう核酸配列、
ｄ）並びに前記タンパク質の読み枠が後の配列番号：１の位置1144におけるATG開始により規定され、ここで前記ATG後のタンパク質コード化領域のシフトがないもの
を含む群から選択される核酸分子に関する。
このようなLST-1タンパク質をコードする核酸により、本発明によるタンパク質は、再現可能に大量に得ることができる。原核又は真核生物、例えば原核宿主細胞又は真核宿主細胞内での発現のために、当業者に周知である方法に従って、核酸は適切な発現ベクター内に一体化される。このような発現ベクターは、好ましくは、調節可能／誘導可能プロモーターを含む。次にこれらの組換えベクターは、適切な宿主細胞、例えば原核宿主細胞として大腸菌、又は真核宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、奇形癌
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昆虫細胞、CHO又はCOS細胞内に発現のために導入され、そして形質転換又は形質導入された宿主細胞は、異種遺伝子の発現を許容する条件下で培養される。そのタンパク質の単離は、宿主細胞から又は宿主細胞の培養上清から周知の方法に従って行うことができる。このような方法は、例えばAusubel I.，Frederick M.（Current Protocols in Mol．Biol.(1992)，John Wiley and Sons，New York）により記載される。またそのタンパク質の試験管内再活性化も必要とされ得る。
更に、本発明は、ゲルクロマトグラフィー分離及び画分の精製により、U-937細胞系の培養上清の単離によってLST-1タンパク質を得るための方法に関する。
LST-1タンパク質を組換え産生する形質転換又は形質導入された宿主細胞の検出並びにそのタンパク質の精製は、好ましくは、このタンパク質に結合する抗体によって行われる。このような抗体は、抗原又は免疫原として本発明によるタンパク質を用いることによって、周知の方法によって簡単に得ることができる。
それゆえ本発明は、更に、このタンパク質に結合する抗体の生産のための本発明によるLST-1活性を有するタンパク質の使用に関する。
抗LST-1抗体は、好ましくはアジュバントを併う、精製されたLST-1又はLST-1のポリペプチド誘導体での適切な脊椎動物の免疫化によって形成される。上述の技術は文献において公知であり、例えばHarlow及びLane eds.（Antibody：A laboratory manual(1988)，Cold Spring Harbor Laboratories Press）により記載される。
このため、この目的のために通常用いられる動物、例えば特にヒツジ、ウサギ又はマウスは、本発明によるタンパク質で免疫化され、次にその免疫化された動物から、周知の方法に従って抗血清が単離されるか、又はその免疫化された動物の脾臓細胞が、
0004347412.tif 000003
及びMilsteinの方法（Nature 256（1975）495〜497）に従って、不朽化細胞、例えばミエローマ細胞と融合される。これらのLST-1タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する細胞は、この方法において得られ、そしてクローン化されたハイブリドーマ細胞から選択される。この方法において得られたモノクローナル又はポリクローナル抗体は、黒色腫阻害タンパク質の免疫吸収精製のための支持材料、例えばセルロースに結合し得る。更に、この種の抗体は、サンプル、例えば切断組織又は体液中のLST-1タンパク質の検出のために用いることができる。
それゆえ本発明は、更に、LST-1タンパク質で動物を免疫化し、そしてその免疫化された動物の血清又は脾臓細胞から抗体を単離することにより得られうるLST-1タンパク質に対する抗体に関する。
更に、LST-1タンパク質が免疫調節活性を有することが判明している。
本発明は、更に、腫瘍治療に又は免疫調節剤として用いることができる治療剤を生産するための本発明によるタンパク質の使用に関する。
本発明によるタンパク質は、前記の治療の適用のための医薬製剤において、必要に応じて通常用いられる補助剤、充填剤及び／又は添加物と一緒に処理される。
それゆえ本発明は、更に、本発明によるLST-1タンパク質を、必要に応じて通常用いられる補助剤、充填剤及び／又は添加物と一緒に含む治療組成物に関する。
本発明は更に、遺伝子療法及び特に遺伝子療法のための薬剤の生産のための、LST-1遺伝子の配列、好ましくはLST-1活性を有するタンパク質をコードする核酸分子、又は５′未翻訳領域からのポリペプチドを活性化する核酸分子の使用に関する。
体細胞の遺伝子療法は、例えばレトロウイルスベクター、他のウイルスベクターを用いることにより、又は非ウイルス遺伝子転移（T.Friedmann，Science 244（1985）1275；Morgan 1993，RAC DATA MANAGEMENT REPORT，June 1993）により行うことができる。
遺伝子療法に適したベクターシステムは、レトロウイルス（Mulligan，R.C.（1991）in Nobel Symposium 8：Ethiology of human disease at the DNA level（Lindsten，J．and Pattersun Editors）143-189，Raven Press）、アデノ関連ウイルス（McLughlin，J.Virol．62(1988)，1963）、ワクシニアウイルス（Mossら.，Ann.Rev.Immunol．5（1987）305）、ウシパピロマウイルス(Rasmussenら.，Methods Enzymol．139（1987）642)又はエプスタインバールウイルス（Margolskeeら.，Mol.Cell.Biol．8（1988）2937）もしくは単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルスの群からのウイルスである。
周知の非ウイルスデリバリーシステムもある。このため、通常、“ヌード”核酸、好ましくはDNAが用いられ、又は補助剤、例えば転移試薬（リポソーム、デンドロマー、ポリリシン−トランスフェリン−コンジュゲート(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 84（1987）7413）と一緒に、核酸が用いられる。
遺伝子療法の他の好ましい方法は、相同的組換えに基づく。これにおいて、LST-1タンパク質をコードするいずれかの遺伝子が１又は複数のコピーにおいて体細胞のゲノム内に挿入され得、及び／又はその細胞中に外来的に存在するLST-1遺伝子は調節され、好ましくは活性化され得る。
相同的組換えの方法は、例えばKucherlapati，（Proc．in Nucl.Acids Res．and Mol.Biol．36（1989）301）；Thomasら.，（Cell 44（1986）419-428）；Thomas及びCapecchi（Cell 51（1987）503-512）；Doetschmanら.，（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85（1988）8583-8587）並びにDoetschmanら.，（Nature 330（1987）576-578）に記載される。これらの方法において、ゲノム内の特定部位において一体化されるべきDNAの部分（LST-1の遺伝子フラグメント）は標的DNAに結合される。標的DNAは、ゲノムDNAの（好ましくはLST-1遺伝子内又はその近くの）領域に相補的（相同）であるDNAである。一本鎖DNAの２つの相同な部分（例えば標的DNA及びゲノムDNA）が互いに近くにある時、それらはハイブリダイズして二本鎖ヘリックスを形成するであろう。次にLST-1遺伝子フラグメント及び標的DNAは、組換えによりゲノム内に一体化され得る。この相同的組換えは、試験管内及び生体内（被検体内）の両方で行うことができる。
好ましくは、LST-1活性を有するタンパク質をコードするDNA，LST-1発現を阻害するフラグメント（ノック・アウト配列）又は細胞のゲノムの一体化の後、LST-1活性を有するタンパク質のこの細胞内での発現を活性化することができるフラグメントが用いられる。このようなフラグメントは、例えば、対応するLST-1領域に対して異種であるか又はLST-1遺伝子に一体化した後、実際に発現していない（silent）又は少ししか発現していないLST-1遺伝子を転写的及び／又は翻訳的に活性化するプロモーター及び／又はエンハンサーであり得る。
これにより、このDNAにより、１又は複数のLST-1遺伝子が標的細胞内に新しく導入され、又は哺乳動物細胞のゲノム中の本質的に転写的に発現しない遺伝子が、その哺乳動物細胞が内因性LST-1タンパク質を産生することができるようにされるように活性化される。このため、DNA構成物は相同的組換えによりゲノム内に挿入されるここでそのDNA構成物は、次のもの：それに作用的に連結されるならこの遺伝子の発現を刺激することができるDNA調節因子；及びその領域がこのゲノム内又はその近位にあるこのゲノム内の領域に相同である１又は複数のDNA標的セグメントを含む。この構成物は、その調節セグメントがLST-1活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に作用的に結合するように哺乳動物細胞のゲノム内に挿入される。好ましくは、その構成物は、特にLST-1活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が細胞内に挿入される場合に増幅性配列を更に含む。
LST-1遺伝子の標的細胞への導入のため、その構成物は、調節因子、１もしくは複数のLST-1遺伝子及び１もしくは複数の標的セグメントを含む。その標的セグメントは、それらがゲノムの適切な領域とハイブリダイズすることにより、相同的組換えの後、その挿入されたLST-1遺伝子が発現されるように選択される。
相同的組換えが始められ得る多数の過程が知られている。好ましくは、相同的組換えは、DNA複製又は細胞の有糸分裂の間におこる。この種のDNAは、腫瘍の治療のための剤の生産のため又はホスト生物中の同種又は異種LST-1の産生のために用いることができる。
LST-1タンパク質をコードする核酸を検出するのに用いることができる本発明により供されるLST-1タンパク質の核酸配列に基づくテストを供することができる。このようなテストは、例えば、細胞又は細胞ライゼート中で、及び核酸診断により行うことができる。この場合、検査されるべきサンプルは、LST-1タンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズするであろうプローブと接触させられる。プローブとサンプルからの核酸との間のハイブリダイゼーションは、発現されたLST-1タンパク質の存在を示す。このような方法は当業者に周知であり、例えば、WO 89／06698，EP-A 0 200 362，USP 2915082，EP-A 0 063 879，EP-A 0 173 251，EP-A 0 128 018に記載される。本発明の好ましい実施形態において、LST-1タンパク質をコードするサンプルの核酸は、テストする前に、例えば公知のPCR技術によって増幅される。誘導された（標識された）核酸プローブは、通常、核酸診断の分野に用いられる。このプローブは、サンプルからの担体に結合した変性されたDNA又はRNAに接触させられ、この過程において、温度、イオン強度、pH値及び他の緩衝条件が、核酸サンプルの長さ及びそれより生ずる予想されるハイブリッドの融点により、その標識されたDNA又はRNAが相同なDNA又はRNAと結合することができる（ハイブリダイゼーション、Sowthern，E.M.，J.Mol.Biol．98(1975)，503-517；Wahl，G.M．et al．Proc.Natl.Acad.Sci USA 76（1979），3683〜3687）ように選択される。適切な担体は、ニトロセルロースに基づく膜もしくは担体材料
0004347412.tif 000004
粉体形態の補強もしくは結合ニトロセルロース又は種々の官能基（例えばニトロ基）で誘導されたナイロン膜
0004347412.tif 000005
である。
次に、ハイブリダイズしたDNA又はRNAは、不特異的な結合を防ぐために洗浄及び飽和を通した後、抗体又は抗体フラグメントと共に担体をインキュベートすることによって検出される。抗体又は抗体フラグメントは誘導化の間に核酸プローブ内に組み込まれた物質に対してのものである。その抗体は次に標識される。しかし、直接、標的されたDNAを用いることも可能である。抗体とのインキュベーションの後、特異的に結合した抗体コンジュゲートを検出するだけのために、再び洗浄される。次にその決定は、公知の方法に従って抗体又は抗体フラグメントの標識によって行われる。
LST-1発現の検出は、例えば次のように行うことができる。
−固定化された組織スミア及び単離された分裂中期染色体を用いての固定化された全細胞とのイン・シトウハイブリダイゼーション、
−コロニーハイブリダイゼーション（細胞）及びプラークハイブリダイゼーション（ファージ及びウイルス）、
−ノーザン・ハイブリダイゼーション（RNA検出）、
−血清分析（例えばスロット−ブロット分析による血清中の細胞の細胞型分析）、
−増幅後（例えばPCR技術）。
それゆえ本発明は、LST-1タンパク質をコードする核酸を検出するための方法であって、検査されるべきサンプルを、
ａ）配列番号：１及び２に示されるDNA配列又はこれらに対する相補配列、及び
ｂ）ａ）からの配列の１つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸
からなる群から選択される核酸プローブとインキュベートし、該核酸プローブを、前記サンプルからの核酸とインキュベートし、そして、前記サンプル中の核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを、必要に応じて更なる結合パートナーによって検出することを特徴とする方法を含む。
これにより、LST-1は、腫瘍診断（転移、進行）における価値ある予後マーカーであり、細胞増殖、特にＴ細胞白血病細胞のための活性マーカーである。
ヒト組織球リンパ腫細胞系U-937は、寄託番号DSMACC5で許容され、1990年４月３日から、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124，Braunschweigの公共コレクションに含まれており、自由にアクセスできる。
LST-1遺伝子を含むプラスミドpLST-1は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124，Braunschweigに1995年５月24日にBoehringer Manuheim GmbHにより寄託され、番号DSM10011が割り当てられている。
本発明は、以下の実施例と組み合わせて配列表によりより詳細に詳説される。
配列番号：１は、LST-1ゲノム領域のヌクレオチド配列を示す。多形PvuII制限部位は位置2841である。TATAボックス、IFN-γ−活性化部位（FcγR1）、及びインターフェロン刺激性遺伝子因子−２応答性因子（ISGF-2）は、各々位置279，1509、及び1814で開始する。そのDNA配列はGenBankデータバンクに寄託されている（受託番号：U00921）。
配列番号：２は、LST-1のタンパク質及びcDNAを示す。
配列番号：３は、LST-1タンパク質配列（104アミノ酸）を示す。
配列番号：４は、LST-1タンパク質配列（異性体97アミノ酸）を示す。
省略：BAT，HLA-B−関連転写物；MHC、主要組織適合性遺伝子複合体；LST-1、白血球特異的転写物−１；pLst1、LST-1 cDNAクローン；MER、中位反復頻度繰返し（medium reiteration frequency repeat）；TNF-α、腫瘍壊死因子−α；TNFA，TNF-αをコードする遺伝子；TNFB、腫瘍壊死因子−βをコードする遺伝子；リンホトキシン−βをコードする遺伝子。
実施例１
LST-1ゲノム領域の単離
ヒトＢ細胞系CAHを、ホモ接合の個々のタイプのHLA-A3，-Bu47，-Cu６、及び-DR７から確立した。上述のように、ベクターpTCF中のコスミドライブラリーcahを形成するためにゲノムDNAを用いた（E.H.Weissら、Immunobiology 170（1985）367〜380）。TNFAプローブへのハイブリダイゼーションによって、いくつかのコスミドを単離した。LTB遺伝子の上流の領域を含むコスミドcah5から得られたサブクローンを、cah5のHindIIIエンドヌクレアーゼ制限によって得た。その消化物の再連結は、18kb長の端が切りとられたクローン（cah5dH3）を生じた。各々Pst6，Pst4、及びPst11，Pst400及びPst700として示される1.5kb，0.8kb，3.1kb，0.4kb及び0.7kbの５つの隣接するPstＩフラグメントを単離してベクターpUC19内にサブクローンした。
実施例２
ヌクレオチド配列の測定
サブクローンPst4，Pst6、及びPst11並びに各々400及び700bpの２つの更なる５′ PstＩフラグメント（Pst400及びPst700）を、Sequenase 2.0（USB，Braunschweig，Germany）又はＴ７ポリメラーゼ（Pharmacia，Freiburg，Germany）を用いてジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーション法で両方向について配列決定した。これらのフラグメントのゲノム組成を、オリゴヌクレオチドを用いる、PstＩ制限部位を横切るcah5dH3の直接的配列決定により決定した。これは、その順番を確認し、制限フラグメントPst6，Pst4，Pst11，Pst400及びPst700間にいずれかの小さなフラグメントが位置する可能性を排除した。
実施例３
細胞培養及び刺激実験
非接着性ヒトJurkat T細胞、ヒト組織球細胞系U-937、及びヒト単球細胞系Mono Mac6を、RPMI1640培地中で増殖させた。接着性A431及びHeLa上皮癌細胞系を、Pulbecco’s modified Eagle’s培地（DMEM）中で増殖させた。両培地のために、10％心臓不活性化胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％  Ｌ−グルタミン（全てGibco-BRC，Berlin，Germanyから購入）を、補足物として用いた。全ての細胞を増湿雰囲気中で５％CO2下で37℃で培養した。Jurkat細胞の刺激を、50ng／ml  12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート（TPA）（Sigma，Deisenhoten，Germany）及び５μｇ／mlフィトヘマグルチニン（PHA）（Sigma）で行った。ヒト単球細胞系Mono Mac6を４時間、（サルモネラミネソタ（Salmonellaminnesota）；Sigmaから調製された）１mg／mlリポポリサッカリドで刺激した。組織球細胞系U-937を、48時間、200Ｕ／mlインターフェロン−γで刺激した。
実施例４
LST-1 cDNAのクローニング、キャラクタリゼーション及び発現
RNAの逆転写、そして後のインターフェロン−γで刺激したU-937細胞から単離されたmRNAのポリメラーゼ鎖反応（RT-PCR）により、636bp長のpLst1で示されるcDNAクローンを生じた。これは、約200bpのポリ（Ａ）尾部の予想される長さのため、約800bp長のノーザンブロットにより検出されたmRNAのサイズとよく一致する。pLst1のcDNA配列は、異なるヒト細胞系からクローンされたゲノム配列のコード化領域と同一であった。配列分析は、ヒトLST-1とマウスB144転写物との間に十分に保存された３つの領域を表し、そしてヒト遺伝子のエキソン2.4に割り当てることができた。
TNF領域中の他の遺伝子のように、LST-1は、６つのエキソン（１Ａ，１Ｂ，２，３，４，５）及び５つのイントロンからなる。その転写方向はTNFA及びTNFBと同じであるが、近隣のLTB遺伝子と反対である。この結果は、J.M.Wroblewskiら（Immunogenetics 32（1990）200〜204）により公開されるH-2Db領域の構成において標識されたマウスB144の方向と一致しない。ヒトpLst1 cDNAクローンは、全ての３つの読み枠内に停止コドンをコードする延長された５′領域を含み、それゆえ全長であると考えることができる。LST-1 cDNAは、潜在的にトランスメンブランタンパク質をコードする。
LST-1 cDNAは、適切なベクター（例えばpBR322）を用いて、原核生物、好ましくは大腸菌中で発現することができる。そのタンパク質は、分泌後又は細胞質に蓄積した封入体からナチュレーション後のいずれかで単離することができる。
実施例５
LST-1の発現
LST-1 mRNAは、Ｔ細胞、マクロファージ、U-937並びに低レベルで、これらの組織中に存在するリンパ球及びマクロファージのためであり得るヒト扁桃、肺及び肝臓において構成的に発現される。Hela及びA431細胞のような上皮細胞系においてLST-1転写物は検出されなかった（データは示さない）。この発現パターンは、我々に、対応する遺伝子白血球特異的転写物−１（LST-1）と命名された。転写レベルは、インターフェロン−γでの刺激によりU-937細胞において強く増強され得るが、マクロファージ細胞系Mono Mac6中のリポポリサッカリドによっては増強されない、TPA（12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート）でのJurkat T細胞系の刺激は、構成的レベルを超えるLST-1 mRNAの一時的な発現を誘導した。誘導の後、mRNA発現レベルは刺激後４時間に上昇し、８時間にピークにより、そして24時間に下降した。
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Wroblewski，J.M.，ら.，Immunogenetics 32（1990）200-204
配  列  表
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：5581塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA（ゲノム）
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0004347412.tif 000008
0004347412.tif 000009
0004347412.tif 000010
0004347412.tif 000011
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：312塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0004347412.tif 000012
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：104アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0004347412.tif 000013
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：97アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0004347412.tif 000014