(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直流電源と、液体試料またはゲル試料を保持する容器と、電圧を印加することにより容器内の一部に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対と、電極対への電圧の印加による試料中の粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と印加電圧の変化に伴う試料中の粒子の拡散による過渡回折格子の変化を制御する誘電泳動制御部と、過渡回折格子に向けて光を照射する光源と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器とを備え、
過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化から粒子に関する評価を行うことを特徴とする光学的測定装置。
【請求項２】
上記電源が交流電源であることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
【請求項３】
上記過渡回折格子の発生後に行う印加電圧の変化が、電圧供給の停止であることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
【請求項４】
電極対を構成するそれぞれの電極は、一定間隔を空けて並ぶ複数の電極片とこの電極片どうしを電気的に接続する接続部とからなり、
一方の電極における各電極片の片側端が、間隔を空けて他方の電極における各電極片の片側端に対向するように配置されていることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
【請求項５】
少なくとも容器の一部が光源光を透過する材料で形成されるとともに、この光源光を透過する容器部分に電極対が形成されており、過渡回折格子に向けて光源光を透過する容器部分から光源光を入射させ、光検出器は試料を透過した回折光または試料で反射した回折光を検出することを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
【請求項６】
直流電圧印加により試料中に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対を用い、電極対に電圧を印加して試料中の粒子に誘電泳動を引き起こして粒子による過渡回折格子を形成し、
続いて印加電圧を変化させて過渡回折格子を形成する試料中の粒子を拡散させ、
このときの過渡回折格子による回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うことを特徴とする光学的測定方法。
【請求項７】
過渡回折格子の形成に続く印加電圧の変化が、印加電圧の停止であることを特徴とする請求項６に記載の光学的測定方法。
【請求項８】
媒体中に移動可能に分散させた粒子群、もしくは粒子が分散してなるゲル状の試料に対し、空間周期を有する電界を印加することにより当該粒子群に空間周期的な濃度変化を持たせて疑似的な回折格子を生成させ、その状態で粒子群に対してレーザ光以外の光を照射して得られる回折光を検出し、上記電界の印加を変化させた時点からの回折光の時間変化から、粒子群の拡散係数および粒子径を算出することを特徴とするナノ粒子測定方法。
【請求項９】
上記光をレーザ光とすることを特徴とする請求項８に記載のナノ粒子測定方法。
【請求項１０】
上記擬似的な回折格子を生成させた後の電界の印加の変化を、電界の停止とすることを特徴とする請求項８に記載のナノ粒子測定方法。
【請求項１１】
被測定粒子群を媒体中に移動可能に分散させた試料、もしくは被測定粒子群が分散してなるゲル状の試料を保持する試料保持手段と、その試料保持手段内の試料に対して空間周期を有する電界を印加する電極およびその電源と、試料保持手段内の試料に光を照射するレーザ光源以外の光源と、その光が試料を透過することにより生じる回折光を検出する検出光学系と、その検出光学系の出力を取り込み、上記電界の印加により被測定粒子群に空間周期的な濃度変化を生成させた状態で電界の印加を変化させた時点からの回折光の時間的変化から被測定粒子群の拡散係数および粒子径を算出するデータ処理手段を備えていることを特徴とするナノ粒子測定装置。
【請求項１２】
上記光源がレーザ光源であることを特徴とする請求項１１に記載のナノ粒子測定装置。
【請求項１３】
上記被測定粒子群に空間周期的な濃度変化を生成させた後の電界の変化が、電界の印加停止であることを特徴とする請求項１１に記載のナノ粒子測定装置。
【請求項１４】
上記試料保持手段が試料を収容する透明なセルであり、上記電極が、当該試料セルに対して装着され、所定の間隔で互いに平行に伸びる部分を含む透明電極であることを特徴とする請求項１１に記載のナノ粒子測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中に存在する粒子（例えば淡白などの生体分子、各種の微粒子など）の拡散に関する情報を、粒子により生じる過渡回折格子による回折光を利用して計測する光学的装置および方法と、同等の原理を用いて直径が１００ｎｍ以下のいわゆるナノ粒子の粒子径を測定する方法および装置に関する。
本発明の方法、装置は、例えば創薬、バイオテクノロジー、食品などの分野での分子の調査、研究に適用することができる。また、拡散係数の計測により、粒子の粒径を計測する粒子計測分野に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
粒子の拡散を測定する手法のひとつに過渡回折格子法がある。例えば、過渡回折格子法を用いて拡散定数を計測し、拡散定数変化による蛋白質の会合検出を行うことが開示されている（特許文献１参照）。
従来の過渡回折法では、図１２に示すように、２つの同一波長のパルス励起光を、互いに交差するようにして試料に照射し、干渉縞を形成する。パルス励起光による干渉縞の明部分に存在する試料中の分子（粒子）は、局所的に光励起されるのに対し、干渉縞の暗部分に存在する試料中の分子（粒子）は、光励起されないことから、干渉縞領域では、励起分子と非励起分子とが交互に規則的に並ぶように存在し、一時的に回折格子（過渡回折格子という）が形成される。
【０００３】
この過渡回折格子が形成された領域に、別途にプローブ光を照射すると、プローブ光は過渡回折格子によって回折されることになる。そして、パルス励起光照射によって励起分子、非励起分子による過渡回折格子が形成された後、時間経過とともに励起分子、非励起分子が拡散することによって混ざり合い、過渡回折格子が崩れてくると、過渡回折格子によるプローブ光の回折光強度が減衰することになる。このときの回折光強度の減衰曲線は、試料中の分子の拡散定数（拡散係数）を現わしていることから、減衰曲線を測定することにより、試料中の分子の拡散係数を計算することができ、さらには、拡散係数から、試料中の粒子の大きさ（粒径）や形状、溶媒との相互作用に関する情報を取得することができる。【０００４】
また、粒子径が１００ｎｍ以下の粒子は、一般にナノ粒子と称され、同じ材質であっても通常のバルク物質とは異なる性質を表すことから、さまざまな分野で利用され始めている。粒子径を測定する方法としては、レーザ回折・散乱式をはじめとして種々のものが知られているが、粒子径が１００ｎｍ以下のナノ粒子については、主として動的散乱法（光子相関法）と称される測定方法に基づく方法が用いられている（例えば、米国特許第５，０９４，５３２号および日本特開２００１−１５９５９５号を参照。）。【０００５】
動的散乱法は、粒子のブラウン運動を利用したものであり、媒体中でブラウン運動をしている粒子に光ビームを照射し、粒子による散乱光の強度を所定の位置で測定して、粒子のブラウン運動に起因する散乱光強度の揺らぎ、つまり散乱光の経時的変化を捕らえ、各粒子がその粒径に応じた激しさでブラウン運動をすることを利用して被測定粒子群の粒度分布を算出する。
【特許文献１】特開２００４−８５５２８号公報
【特許文献２】米国特許第５，０９４，５３２号明細書
【特許文献３】特開２００１−１５９５９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述した従来の過渡回折格子法では、同一波長の２本の励起光を交差させて干渉縞を形成するために、光路長をほぼ揃えた２本の励起光を測定領域に導くととともに、発生した干渉縞に基づいて形成される回折格子に対し、特定の入射角を持ったプローブ光を入射させている。そのため、２本の励起光と１本のプローブ光とを、測定しようとする１点で交差させる必要があり、励起光、プローブ光の３本の光軸調整が必要になり、調整作業が困難である。【０００７】
また、蛋白質などの分子（粒子）を試料とする場合に用いる励起光には、波長が短いエキシマレーザなどの大型のレーザが必要となるため、装置が大型化してしまう。
また、蛋白質などの分子（粒子）を試料とする場合には、通常、蛋白質分子（粒子）自体のみでは、励起光によって屈折率、吸収係数、拡散係数が変化することはないので、光励起される試薬（蛍光試薬など）により試料物質をラベル化する必要がある。
しかしながら、試料に対しラベル化処理を施すことにより、測定対象の蛋白質分子（粒子）の性質、特性が変化してしまうおそれがある。
また、一般に、ラベル化処理は、不可逆反応であるため、ラベル化処理により、試料中の分子（粒子）自体が破壊されてしまい、同一試料を用いた再測定ができず、また、回収して他の目的で再利用することもできない。さらに、過渡回折格子を形成するための光励起反応についても一般には不可逆反応であり、励起光が照射され一度測定された試料からは、それ以後は、弱い信号しか発生しなくなるので、再測定することができない。【０００８】
また、蛋白質などのラベル化処理が容易な分子以外を試料とする場合では、物質によってはラベル化処理ができず、励起光による粒子の光励起自体が困難であって、上述した過渡回折格子法による測定が困難なこともある。【０００９】
そこで、本発明の第１の課題は、励起光が不要であり、また、２本の励起光、プローブ光間の光軸調整を行うことなく過渡回折格子法を用いた測定が可能な光学的測定装置を提供することを目的とする。
同時に本発明は、試料のラベル化処理を行うことなく、過渡回折格子を用いて、試料の拡散に関する特性を測定することができる光学的測定装置を提供することを目的とする。【００１０】
一方、ナノ粒子の測定に関し、粒子からの散乱光の揺らぎを測定する動的散乱法（光子相関法）においては、大きな散乱光中の小さな揺らぎを測定する必要があること、換言すれば明るい視野中での光強度の変動を計測する必要があることから、その原理上、測定感度が低いとともに、Ｓ／Ｎが悪いといった問題は避けられない。【００１１】
そこで、本発明の第２の課題は、従来の動的散乱法に比して、ナノ粒子の粒子径を、高い感度で良好なＳ／Ｎのもとに測定することのできる方法および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記した第１の課題を解決するためになされた本発明の光学的測定装置は、直流電源と、液体試料またはゲル試料を保持する容器と、電圧を印加することにより容器内の一部に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対と、電極対への電圧の印加による液体試料中の粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と電圧印加の変化に伴う液体試料中の粒子の拡散による過渡回折格子の消滅を制御する誘電泳動制御部と、過渡回折格子に向けて光を照射する光源と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器とを備え、過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化から粒子に関する評価を行うようにしている。
【００１３】
本発明の光学的測定装置によれば、電極対に対して、電源から電圧を印加することにより、容器内の一部に、電気力線密度が高い領域と電気力線密度が低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる。容器内の液体試料またはゲル試料中に含まれる粒子には、この電気力線分布によって誘電泳動作用が生じ、粒子の移動が生じる。すなわち、容器内には、電極対の配置によって規則的に並ぶ電気力線分布が発生していることから、液体試料中の粒子またゲル試料中の粒子が誘電泳動作用によって電気力線密度が高い領域に集中することによって、粒子の密な領域と疎な領域とが規則的に並ぶようになり、過渡回折格子が形成される。
この過渡回折格子に対して、光源からプローブ光を照射すれば、過渡回折格子により、特定方向に回折光が発生することになる。回折光は、誘電泳動作用によって、過渡回折格子が安定して発生しているときには強い回折光が生じている。電圧印加によって過渡回折格子が安定して発生している状態で、電圧印加を変化、例えば停止させると、電気力線が変化ないしは消滅し、誘電泳動が変化もしくは停止する。そのため、容器内の粒子には、拡散による移動が生じるようになり、過渡回折格子が崩れてぼやけるようになる。その結果、過渡回折格子によって生じる回折光の強度が、時間経過とともに減衰するようになるが、このときの減衰曲線は、拡散係数を現わしているので、回折光強度を光検出器により測定し、回折光強度の減衰曲線を得ることで、粒子の拡散係数、さらには、粒子の形状、粒子径、溶媒との相互作用の情報を得るようにする。【００１４】
また、別の観点からなされた本発明の光学的測定方法は、直流電圧印加により液体試料中に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対を用い、電極対に電圧を印加して液体試料中の粒子に誘電泳動を引き起こして粒子による過渡回折格子を形成し、続いて電圧印加を変化させて過渡回折格子を形成する液体試料中の粒子を拡散させ、このときの過渡回折格子による回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うようにする。
【００１５】
この発明の光学的測定方法によれば、電極対に電圧を印加して液体試料中の粒子に誘電泳動を引き起こし、試料液体中の粒子を電気力線密度が高い領域に集中させて、粒子による過渡回折格子を形成する。続いて、電圧印加を変化させて液体試料中の過渡回折格子を形成する粒子を拡散させ、過渡回折格子を時間経過とともに崩していく。このときの過渡回折格子の変化に伴う回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うようにする。【００１６】
また、前記した第２の課題を解決するため、本発明のナノ粒子測定方法は、媒体中に移動可能に分散させた粒子群、もしくは粒子が分散してなるゲル状の試料に対し、空間周期を有する電界を印加することにより当該粒子群に空間周期的な濃度変化を持たせて疑似的な回折格子を生成させ、その状態で粒子群に対して光を照射して得られる回折光を検出し、上記電界を変化させた時点からの回折光の時間変化から、粒子群の拡散係数および粒子径を算出することによって特徴づけられる。【００１７】
また、本発明のナノ粒子測定装置は、請求項１に係る発明方法を用いた測定装置であって、被測定粒子群を媒体中に移動可能に分散させた試料、もしくは被測定粒子群が分散してなるゲル状の試料を保持する試料保持手段と、その試料保持手段内の試料に対して空間周期を有する電界を印加する電極およびその電源と、試料保持手段内の試料に光を照射する光源と、その光が試料を透過することにより生じる回折光を検出する検出光学系と、その検出光学系の出力を取込み、上記電界の印加により被測定粒子群に空間周期的な濃度変化を生成させた状態で電界の印加を変化させた時点からの回折光の時間的変化から被測定粒子群の拡散係数および粒子径を算出するデータ処理手段を備えていることをによって特徴づけられる。【００１８】
ここで、本発明のナノ粒子測定装置においては、上記試料保持手段が試料を収容する透明なセルであり、上記電極が、当該試料セルに対して装着され、所定の間隔で互いに平行に伸びる部分を含む透明電極である構成を好適に採用することができる。【００１９】
本発明のナノ粒子測定方法および装置は、媒体中で拡散状態の粒子群に電界を印加することによって、粒子群の空間的な濃度変化による擬似的な回折格子を生成し、その回折格子による回折光を検出しつつ、電界の印加を変化させて粒子群が再び拡散状態となる間の回折光の変化から、粒子群の拡散係数と粒子径を算出することにより、課題を解決するものである。【００２０】
すなわち、媒体中に拡散している粒子群はゼータ電位を有しているため、その粒子群に対して空間周期を有する電界を印加することにより、粒子群はその電界に応じて媒体中を移動し、これによって粒子群に空間周期的な濃度変化が生じ、粒子群による回折格子が生成される。その状態で電界の印加を変化、例えば停止すると、粒子群は濃度が均一となるように再び拡散状態に戻り、回折格子は消失する。粒子が小さければ回折光ははやく消失し、粒子が大きければ回折光はゆっくりと消失する。粒子群による回折格子の生成状態からその回折格子が消失する間、粒子群に光を照射して回折光を検出すれば、回折光の消失に要する時間を知ることができ、この時間から後述する（２），（３）式を用いて粒子群の拡散係数と粒径を求めることができる。【００２１】
粒子群による疑似回折格子に光を照射することによって発生する回折光は、粒子群を透過する光に対して、光の波長、回折格子の間隔に応じた角度で進行し、かつ、動的散乱法で得られる個々の粒子による散乱光に比して強いため、測定する信号が強く、動的散乱法に比してＳ／Ｎおよび感度が大幅に改善される。【００２２】
本発明のナノ粒子測定装置においては、媒体中に被測定粒子群を移動可能に分散させた試料を保持する試料保持手段として透明なセルを用い、この試料に対して電界を印加するための電極として、透明セルに装着され、所定の間隔で互いに平行に伸びる部分を含む透明電極とし、特に、その屈折率を透明セルの構成材料の屈折率と近似させることにより、電極が回折光に及ぼす影響を少なくすることができて好適である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の光学的測定装置の実施の形態の構成を示す斜視図である。
【図２】図１の光学的測定装置の電極部分の形状を示す平面図である。
【図３】電極に交流電圧を印加したときに形成される過渡回折格子を説明する図である。
【図４】過渡回折格子を形成後に電圧を停止して粒子を拡散させたときの状態を説明する図である。
【図５】本発明の光学的測定装置による印加電圧波形（Ａ）と回折光強度（Ｂ）のタイムチャートを示す図である。
【図６】本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態の構成図であり、光学的構成を表す模式図と、電気的構成を表すブロック図と併記して示す図である。
【図７】図６における試料セル２１の構造説明図であり、（Ａ）はレーザ光の照射方向から見た模式的正面図で、（Ｂ）はそのＢ−Ｂ線で切断した模式的拡大断面図である。
【図８】本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態の作用説明図である。
【図９】本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態における透明電極３３に対する電圧のＯＮ／ＯＦＦのタイミングと、回折光強度の関係の例をグラフである。
【図１０】本発明のナノ粒子測定装置の他の実施の形態における試料セルの電極構成の例の説明図である。
【図１１】本発明のナノ粒子測定装置の更に他の実施の形態における試料セルの電極構成の例の説明図である。
【図１２】従来からの過渡回折格子法を説明する図である。
【符号の説明】
【００２４】
１１  容器
１２ａ  底板
１２ｂ  枠体
１３，１４  電極
１３ａ〜１３ｄ，１４ａ〜１４ｄ  直線状電極片
１３ｅ，１４ｅ  接続部
１５  交流電源
１６  光源
１７  レンズ光学系
１８  光検出器
１９  誘電泳動制御部
２１  試料セル
３１  透明ガラス
３３  透明電極
３３ａ  指部
２２  電極電源
２３  レーザ光源
２４  検出光学系
２４ａ  ピンホール
２４ｂ  フォトダイオード
２５  ビームストッパ
２６  装置制御およびデータ取込み・処理装置
Ｐ  粒子
Ｗ  試料
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれることはいうまでもない。【００２６】
図１は、本発明の一実施形態である光学的測定装置の構成を示す斜視図であり、図２はその電極部分の構成を示す平面図である。この光学的測定装置は、誘電泳動作用を利用しつつ光学的測定を行うものであり、粒子を含む液体試料を保持する容器１１、容器１１の底面となる底板１２ａに形成される一対の電極１３，１４と、電極１３および電極１４に交流電圧を印加する交流電源１５と、光源１６と、光源光を収束するレンズ光学系１７と、回折光を検出する光検出器１８と、交流電源１５から電極１３，１４への電圧印加を制御する誘電泳動制御部１９とからなる。【００２７】
容器１１は、底板１２ａの上に、側壁となる枠体１２ｂを貼り付けることにより形成してある。この容器１１は、ガラス等の光透過性の材料が用いられ、底板１２ａを通して、入射光が電極１３，１４の間の間隙部分に照射できるようにしてある。なお、入射光が照射される部分以外の容器部分は、光透過性材料以外のものを用いてあるいは遮光部材を設けて、不要な光の入射を遮断し、検出感度を高めるようにしてもよい。【００２８】
電極１３，１４は、マスクパターニング手法を用いて，底板１２ａ上に形成される。なお、本実施形態では、底板１２ａに電極１３，１４を形成しているが、容器１１が十分に深い場合には、底板１２ａに代えて、側壁となる枠体１２ｂに電極１３，１４を形成してもよい。
電極１３は、平行な直線状の電極片１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄが一定間隔を空けて平行に並べられるとともに、これらの直線状電極片の片側端どうしを電気的に接続する接続部１３ｅが設けられ、いわゆる櫛型電極を形成している。
電極１４についても同様であり、平行な直線状の電極片１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄが一定間隔を空けて平行に並べられるとともに、これらの直線状電極片の片側端どうしを電気的に接続する接続部１４ｅが設けられ、いわゆる櫛型電極を形成している。
そして、電極１３と電極１４とは、直線状電極片１３ａ，１４ａの片側端どうし、直線状電極片１３ｂ，１４ｂの片側端どうし、直線状電極片１３ｃ，１４ｃの片側端どうし、直線状電極片１３ｄ，１４ｄの片側端どうしが、それぞれ、間隙Ｓを空けて対向配置するようにしてある。【００２９】
電極１３，１４の寸法は、直線状電極片の電極幅ｄ１、直線状電極片間の間隔ｄ２のいずれについても、０．５μｍ〜２０μｍ程度でそれぞれ一定寸法にするのが好ましいが、一定間隔ごとに各間隙Ｓが配置され、電圧を印加したときに各間隙Ｓの部分に電気力線密度が高い領域が発生し、その隣に電気力線密度が低い領域が発生するものであれば、形状や寸法は、特に限定されない。例えば、電極幅ｄ１と電極間隔ｄ２とが異なる寸法になるようにしてもよいし、電極片の形状が直線状でなくてもよい。【００３０】
交流電源１５には、液体中の粒子に誘電泳動を引き起こすことができる電圧、周波数の交流電源が用いられる。具体的には、１〜１００Ｖ，１０ＫＨｚ〜１０ＭＨｚ程度の交流電圧が印加できる交流電源を使用する。なお、一般的には、高周波電源を用いるのが好ましい。【００３１】
プローブ光を照射するための光源１６は、測定対象となる液体試料に応じて種類を選択すればよいが、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源（波長６３３ｎｍ）や、その他のレーザ光源を用いるのが好ましい。
レンズ光学系１７は、光源光を収束し、電極１３，１４の間の間隙Ｓを含む過渡回折格子が形成される領域Ａに、光源光が照射できるように光軸が調整される。なお、光源光の入射角度が調整できるようにして、測定対象、測定目的に応じて、透過回折光、反射回折光のいずれでも、取得できるようにするのが好ましい。例えば、透過回折光による測定を行う場合は、入射角は、容器底面と液体試料との界面で全反射が生じない条件に設定される。【００３２】
光検出器１８は、透過回折光を検出する場合は、液体試料の上部側に配置する。光検出器１８には、回折角を測定するための角度調整機構が設けられており、回折光の強度とともに回折角が検出できるようにしてある。この光検出器１８には、フォトダイオードやＣＣＤが用いられる。なお、角度調整機構を設ける代わりに、複数の素子を並べたアレイセンサを用いて、回折角が計測できるようにしてもよい。【００３３】
誘電泳動制御部１９は、いわゆるＣＰＵ，ＲＯＭ，ＲＡＭなどからなるコンピュータにより構成され、予め記憶されたプログラムにより、交流電源１５から電極１３，１４に対して、過渡回折格子を形成するために必要な交流電圧を、必要な時間だけ印加し、その後、電圧印加を停止して粒子の拡散を引き起こす制御を行う。【００３４】
次に、上記装置の計測動作について説明する。予め、光源１６から領域Ａに入射光が照射できるように光学系を調整しておく。
まず、誘電泳動制御部１９の制御により、交流電源１５から電極１３、電極１４間に交流電圧Ｖ０を印加する。液体試料中に粒子（例えば蛋白質など）が存在すると、交流電圧による誘電泳動作用が働き、粒子は電気力線が集中する領域に移動する。図３は、交流電圧を印加したときの粒子の状態を説明する図である。図に示すように、電気力線が集中する間隙Ｓ部分に粒子が移動することにより、粒子が密な領域Ｂと疎な領域Ｃとが交互に並び、粒子による過渡回折格子が形成される。
このとき、領域Ａに入射した光源１６からの入射光は、過渡回折格子によって回折され、特定方向に回折光を生じる。交流電圧が継続して印加されているときは、過渡回折格子は、安定して存在しているので、過渡回折格子による強い強度の回折光が光検出器１８により検出される。これを基準値として計測しておく。【００３５】
続いて、誘電泳動制御部１９の制御により、電極１３，１４への交流電圧の印加を停止する。これにより、誘電泳動作用が停止することになり、間隙Ｓに集中していた粒子は、拡散により、しだいに広がっていく。その結果、過渡回折格子が崩れて、しだいに薄くぼやけるようになり、やがて図４に示すように、過渡回折格子が消滅する。過渡回折格子が薄くなっていく課程で、回折光の強度が弱くなるので、回折光強度の強度変化を光検出器１８で測定する。【００３６】
以上の計測動作により得られる回折光の強度変化のタイムチャートを、印加電圧の波形とともに図５に示す。誘電泳動を停止した後の減衰曲線は、拡散係数に依存するので、減衰曲線から拡散係数を求めることで、粒子の拡散に関する情報を得ることができる。【００３７】
（他の実施形態）
上記実施形態では、透過回折光を検出したが、反射回折光を検出してもよい。反射回折光を利用すれば、光吸収性のある液体試料についても、回折光の検出を容易に行うことができる。
なお、反射回折光を測定する光学的測定装置の場合は、図１に示した装置構成において、光検出器１８の位置を、底板１２ａの下部側に配置するようにする。
反射回折光測定の場合、好ましくは、光源１６から照射される入射光の入射角を、全反射が生じる条件にして、反射する回折光の光量をできるだけ増やすようにする。例えば、容器１１が、ガラス製であり、液体試料として水系試料が保持されている場合、入射角を４６度前後にするのが好ましい。【００３８】
また、上記実施形態では、電極１３，１４はそれぞれの直線状の電極片の片側端どうしが対向するようにし、電極間の間隙部分に過渡回折格子を形成するようにしたが、電極の形状パターンはこれに限られず、要するに、電圧を印加したときに、電気力線密度が高い領域と電気力線密度が低い領域とが交互に規則的に並ぶ形状であれば、誘電泳動による過渡回折格子を形成することができるので、本発明を実施することができる。【００３９】
更に、以上の実施の形態においては、粒子を分散させた液体試料を測定した例を示したが、粒子が分散しているゲル試料についても測定可能である。そして、交流電圧の印加に代えて直流電圧を印加しても上記と同様な測定が可能であり、また、過渡回折格子を形成してから電圧の印加を停止して粒子を拡散させた例を示したが、電圧の印加を停止することに代えて、印加電圧を変化させてもよく、この場合、交流電圧を用いる場合にはその周期や振幅を変化させることによって粒子を拡散させてもよい。【００４０】
次に、本発明のナノ粒子測定装置についての実施の形態を説明する。
図６は本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態の構成図であり、光学的構成を表す模式図と、電気的構成を表すブロック図とを併記して示す図である。また、図７は図６における試料セル２１の構造説明図であり、（Ａ）はレーザ光の照射方向から見た模式的正面図で、（Ｂ）はそのＢ−Ｂ線で切断した模式的拡大断面図である。【００４１】
試料セル２１は、互いに微小な隙間を開けて対向する平行な透明ガラス３１，３２をその周壁の一部として含んでおり、使用状態ではこれらの透明ガラス３１，３２が鉛直方向に沿うように配置される。各透明ガラス３１，３２には、互いに対向する位置にそれぞれ上下方向に一定の間隔Δを開けて水平に伸びる多数の指部３３ａを備えた櫛形の透明電極３３が装着されている。この透明電極３３には、電極電源２２から＋もしくは−の直流電圧が選択的に供給される。透明電極３３への電圧の供給により、試料セル２１内の試料には指部３３ａのパターンに応じた空間周期を有する電界が印加されることになる。なお、透明電極３３の材料としては、例えばＩＴＯを採用することができる。このＩＴＯは屈折率が約２．０程度であり、試料セル２１の透明ガラス３１として、屈折率２．０程度の高屈折率ガラス（例えばオハラ社製商品名ｓ−ＬＡＨ７９；屈折率２．０）を用いることにより、後述するレーザ光の照射時に透明電極３３による回折光が実質的に生じることがなく、好適である。【００４２】
試料セル２１には、その一方の透明ガラス３１側からレーザ光源２３からのレーザ光がほぼ水平に照射される。試料セル２１を挟んでレーザ光源２３の反対側には、後述するように試料セル２１を通過するレーザ光の回折光を検出するための検出光学系２４が配置されている。この検出光学系２４は、レーザ光源２３からのレーザ光の光軸Ｌに対して後述する角度θの位置に配置されており、ピンホール２４ａとフォトダイオード２４ｂによって構成されている。また、レーザ光軸Ｌ上には、試料セル２１を通過したレーザ光が検出光学系２４や外部などに漏れることを防止するためのビームストッパ２５が配置されている。【００４３】
フォトダイオード２４ｂにより検出された回折光は、装置制御およびデータ取込み・処理装置２６に取り込まれ、後述する演算によって被測定粒子群の拡散係数と粒子径の算出に供される。なお、この装置制御及びデータ取込み・処理装置２６は、以上のデータ処理のほか、装置全体の制御を行うものであって、例えばパーソナルコンピュータとその周辺機器によって構成することができる。【００４４】
次に、以上の構成からなる本発明の実施の形態による測定動作を、その原理とともに述べる。
試料セル２１内には、被測定粒子群であるナノ粒子群を水などの媒体中に分散させた状態の試料が充填される。通常、液中に分散しているナノ粒子の表面は、＋もしくは−の表面電位（ゼータ電位）を持っている。つまり帯電している。前記した透明電極３３には、粒子が持つ荷電と同じ極性の電圧が印加される。例えば粒子が＋の電荷を持っている場合には、透明電極３３には＋の電圧が印加される。ここで、粒子のゼータ電位が小さい場合には、分散剤（界面活性剤）や、媒液のＰＨを変化させるなどの方法で表面電位を調整することができる。【００４５】
図８（Ａ）に示すように、試料Ｗ中の被測定粒子Ｐが＋の電荷をもっている場合には、電極３３に＋の電位を印加する。これにより、各粒子Ｐはクーロン力により電極３３の各指部３３ａに対して反発し、図８（Ｂ）に示すように、電極３３の各指部３３ａの間に移動し（電気泳動）、多数の粒子Ｐによって指部３３ａのパターンに応じた空間周期を有する擬似的な回折格子が生成される。この状態で試料セル２１に対して照射されるレーザ光は、この多数の粒子Ｐによる回折格子により回折する。電極３３の指部３３ａ間の距離を上記のようにΔ、レーザ光の波長λ、回折角をθ、次数をｍとすると、
ｍλ＝Δ・sin θ  ・・（１）
の関係が成立する。例えばλ＝０．６３２８μｍ、指部３３ａ間の距離Δを３μｍとしたとき、１次の回折光はθ≒１２°の角度に現れる。前記した検出光学系２４はレーザ光の光軸Ｌに対してこの角度θの位置に配置されており、この回折光の強度を検出する。
【００４６】
図８（Ｂ）のように試料に対して電圧により擬似的な回折格子が生成されている状態から、透明電極３３への電圧の印加を停止して電界を消失させると、図８（Ｃ）に示すように、各粒子Ｐは再び拡散状態に戻る。粒子Ｐの拡散により擬似的な回折格子は消滅し、回折光も消失する。電界の消失時点から回折光が消失する時間は、粒子の拡散時間に依存するので、回折光の消失時間を計測することにより、以下に示すように粒子の拡散係数Ｄを算出することができる。また、この拡散係数Ｄから粒子径を算出することができる。【００４７】
図９に透明電極３３に対する電圧のＯＮ／ＯＦＦのタイミングと、回折光強度の関係の例をグラフで示す。粒子Ｐの径が大きい場合には、電界の消失時点から粒子Ｐが拡散して回折格子が消失するまでに要する時間が長く、逆に粒子Ｐの径が小さい場合にはその時間は短くなる。【００４８】
拡散による粒子Ｐの濃度変化は以下の拡散方程式で表される。【００４９】
【数１】
0004375576.tif 000002
【００５０】
ここで、ｕ（ｘ，ｔ）は粒子濃度であり、ｘは指電極３３ａの間隔ｄ方向への空間座標で、ｔは時間である。【００５１】
粒子濃度の変化に対する回折光強度の変化をあらかじめ求めておくことにより、回折光強度の経時的変化を検出することで、（２）式を用いて粒子Ｐの拡散係数Ｄを算出することができる。【００５２】
また、拡散係数Ｄと粒子径ｄの関係は、ボルツマン定数ｋと絶対温度Ｔ、および媒液の粘性率μ０を用いて、以下のＥｉｎｓｔｅｉｎ−Ｓｔｏｋｅｓの関係式で表される。【００５３】
【数２】
0004375576.tif 000003
【００５４】
装置制御及びデータ取込み・処理装置２６は、電極３３に印加する電圧をＯＮ・ＯＦＦするタイミングと、回折光強度をサンプリングするタイミングを同期させることにより、回折光の消失時間を正確に測定することができ、その測定結果を用いて（２）式を計算することによって拡散係数Ｄを求めることができ、その拡散係数Ｄを用いて（３）式を計算することによって被測定粒子Ｐの粒子径ｄを算出することができる。【００５５】
以上の実施の形態において特に注目すべき点は、拡散係数Ｄおよび粒子径ｄを求めるための信号が、従来の動的散乱法のように個々の粒子からの散乱光の揺らぎの測定信号ではなく、多数の粒子群により形成された擬似的な回折格子による回折光の測定信号である点であり、これにより、動的散乱法に比して感度並びにＳ／Ｎが大幅に向上する。【００５６】
ここで、以上の実施の形態において、試料セル２１の透明ガラス３１，３２と透明電極３３の屈折率差により回折光が発生する場合があり、この場合、その回折光強度が検出光学系２４によって検出されることになるが、この回折光は時間的に変化しないため、測定後に全体の回折光強度から変化しない回折光強度分を減じることにより、測定への影響はない。【００５７】
また、以上の実施の形態においては、試料セル２１の互いに対向する透明ガラス３１，３２に透明電極３３を対向して装着した例を示したが、図１０に示すように、互いに対向する２枚の透明ガラス３１，３２のうちの一方にのみ、先の例と同等の指部３３ａを有する透明電極を装着してもよく、この場合においても粒子Ｐは各指部３３ａに電圧を印加することによって先の例と同等の擬似的な回折格子を形成する。【００５８】
更に、本発明においては、図１１に示すように、透明ガラス３１および／または３２に、先の例と同等の指部３３ａを備えた透明電極と、これとは逆極性の電圧が印加される指部３４ａを備えた透明電極を装着し、各指部３３ａ，３４ａを交互に配置した電極構成を採用することもできる。この場合、例えば＋に帯電している粒子Ｐは−電圧が印加されている指部３４ａに沿うように移動して擬似的な回折格子を形成し、この粒子群による回折格子の間隔は、指部３３ａ，３４ａによる回折格子の間隔の２倍となり、粒子群による回折光と、電極による回折光とは互いに異なる回折角を持つため、電極による回折光の影響をより少なくし得るという利点がある。
【００５９】
また、以上の実施の形態においては、被測定粒子群を媒液中に分散させた例を示したが、媒体としては液体のほか気体としてもよく、更には、粒子の種類によっては固体中に移動可能に分散しているものもあり、この場合には固体を媒体とすることもできる。更に、粒子が分散したゲル状の試料であっても同様に測定可能である。【００６０】
更に、以上の実施の形態では粒子による回折格子に対してレーザ光を照射してその回折光を測定したが、レーザ光以外の光であってもよい。また、粒子により疑似回折格子を形成した後、電極に対する電圧の印加を停止することに代えて、印加電圧を例えば小さくして粒子を拡散させてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の光学的測定装置によれば、蛋白質などの生体分子や各種微粒子の光学的測定を、励起光を用いることなく過渡回折格子を形成することができ、プローブ光だけを測定位置に光軸調整すればよく、容易に過渡回折格子を用いた測定を行うことができる。また、本発明の光学的測定装置および方法を用いると、試料のラベル化処理を行う必要がなく、かつ、光励起することなく、過渡回折格子を用いて試料の拡散のしやすさなどの特性を測定することができることから、試料の再測定が可能であり、試料自体の再利用が可能である。
【００６２】
また、本発明の光学的測定装置において、電極対を構成するそれぞれの電極が一定間隔を空けて並ぶ複数の電極片とこの電極片どうしを電気的に接続する接続部とからなり、一方の電極における各電極片の片側端が、間隙を空けて他方の電極における各電極片の片側端に対向するように配置されるようにすれば、電気力線密度の高い領域は、各電極片の片側端どうしが対向する間隙の位置に集中し、その隣接領域に電気力線密度の低い領域が集中することにより、各電極片の片側端どうしが対向する間隙の位置に沿って、過渡回折格子が生じるので、電極対が存在しない領域（対向する電極の間の間隙部分）に過渡回折格子が発生することになり、電極対による影響を受けることなく、過渡回折格子のみによる回折光強度の変化を測定することができる。【００６３】
本発明のナノ粒子測定方法および装置では、比較的簡単な装置構成のもとにナノ粒子の測定が可能となるとともに、従来の動的散乱法に比して、検出すべき信号の強度が格段に強くなることから、Ｓ／Ｎの向上と感度の向上を達成することができる。【００６４】
また、媒体に被測定粒子群を分散させた試料を透明セルに収容し、その透明セルに装着した透明電極によって空間周期的な電界を付与す構成を採用することにより、電極が回折光に及ぼす影響を少なくすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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