(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトT細胞白血病ウイルス1感染細胞株FPM1-V1AXが成体ヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuに移植された動物であって、細胞株FPM1-V1AXが、ヒトT細胞白血病ウイルス1感染細胞株FPM1をヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuの体内で増殖させて樹立した細胞株であり、細胞株FPM1は、ヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuと同系の免疫正常ラットF344/N Jcl-rnu/+のT細胞にヒトT細胞白血病ウイルス1を感染させて樹立した細胞株であり、移植した細胞株FPM1-V1AXから腫瘍が成長し、この腫瘍が、細胞株FPM1-V1AXによって免疫されたラットF344/N Jcl-rnu/+のT細胞移植によって縮小することを特徴とするヒト成人T細胞白血病モデル動物。
【請求項２】
免疫正常ラットF344/N Jcl-rnu/+のT細胞にヒトT細胞白血病ウイルス1を感染させて樹立された、新生仔ヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuの体内では増殖するが、成体ヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuの体内では増殖しないヒトT細胞白血病ウイルス1感染細胞株FPM1を新生仔ヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuの体内で増殖させて樹立した細胞株であって、成体ヌードラットF344/N Jcl-rnu/rnuの体内で腫瘍に成長することを特徴とするヒトT細胞白血病ウイルス1感染細胞株FPM1-V1AX。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、成人Ｔ細胞白血病モデル動物に関するものである。さらに詳しくは、この出願は、長期間に渡ってヒトＴ細胞白血病ウイルス１感染細胞を増殖させ、腫瘍の発生過程だけでなく、成人Ｔ細胞白血病の発症メカニズム並びにそれに対する感染者の応答機構等を詳細に分析することのできる成人Ｔ細胞白血病モデル動物に関するものである。
背景技術
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＴＬ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１（ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ−１：ＨＴＬＶ−１）の感染によって引き起こされるＴ細胞の腫瘍である。
ＨＴＬＶ−１の感染から腫瘍化、病態発症に至る機構は不明な点が多く、例えば、種々の病態群においてウイルスの塩基配列を比較しても、個々の病態を特徴付けるような配列の特殊性は見出されていない。このため、ＡＴＬにおける様々な病態の１次的決定因子は、感染者側（ホスト）の要因によるものであることが想定されている。
また、ＡＴＬにおける病態は、急性的なものから慢性的なものまで、あるいは経過が緩慢なものから劇症型のものまで様々であることから、ＡＴＬの発症には幾つかの段階が存在することが示唆されている。そして、ＨＴＬＶ−１感染におけるこのような多段階的な発症過程は、自然発生的な突然変異の影響ばがりでなく、ウイルス感染細胞の増殖能とホストの免疫反応との相互作用によっても影響を受けているものと考えられている。
以上のとおり、ＨＴＬＶ−１の感染によるＡＴＬ発症には、ホストの要因が深く関与していることから、ＡＴＬ発症機構を解明し、さらにはその有効な予防・診断並びに治療手段を開発するためには、適切な動物モデルが不可欠である。
なお、培養細胞を用いたＨＴＬＶ−１感染細胞株は、サル、ネコ、ラットおよびウサギのリンパ球で樹立されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３８：８６７−８７５，１９８６；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３４：５１３−５１７，１９８４；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．，７６：８６−９４，１９８５）。また、ＨＴＬＶ−１は、ウサギ、サルおよびラットに感染することも知られそいる（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．，７６：８６−９４，１９８５；Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６９：３３６−３３９，１９９３；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０：４０３−４０７，１９８７，Ｊ．Ｖｉｌｏｌ．，６６：６６８６−６６９４，１９９２）。そして、これらの感受性動物を用いて幾つかの動物モデルが作成され、ＨＴＬＶ−１が関与する疾患について研究が行われている。例えば、ＷＫＡ系ラットを用いた疾患モデル動物は、ＨＡＭ／ＴＳＰ様疾患の病理メカニズムの分析によく用いられている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：９８１−９８９，１９９２；Ｊ．Ｖｉｌｏｌ．，６８：７２２１−７２２６、１９９４）。
一方、ＡＴＬ動物モデルとしては、ウサギやラットを用いた系がわずかに知られているが、その適用範囲は限られている。例えば、ウサギＡＴＬモデルは成体動物においてＡＴＬ様疾患を再現性よく発症するが（Ｌａｂ，Ｉｎｖｅｓｔ．，７４：６９６−７１０，１９９６）、この動物モデルでは免疫学的な研究はほとんど行われていない。その主たる理由は、ウサギの近交系を得ることが困難なためである。また、ラットのＡＴＬ発症モデルの場合には、新生仔においてのみＡＴＬ様疾患が観察され、発病期間も極めて短期間であるため、腫瘍学的および免疫学的研究を同時に行うことが困難である。また、このラットモデルでは、ＡＴＬにおける病態の多様性に対応することも不可能である（Ｊ．Ｖｉｌｏｌ．，６６：６６８６−６６９４，１９９２）。
このように、ＡＴＬ発症機構を解明し、さらにはその有効な予防・診断並びに治療手段を開発するためには動物モデルの存在が不可欠であるが、従来の動物モデルはその適用範囲が様々に制限されるという点において満足のいくものではなかった。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、成体動物においてＡＴＬ様疾患を再現性よく長期間に渡って発症させることができ、しかも腫瘍学的、免疫学的な分析を可能とする新しいＡＴＬモデル動物を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決する発明として、ＨＴＬＶ−１感染細胞株を移植されたＴ細胞機能欠損動物であることを特徴とするＡＴＬモデル動物を提供する。このモデル動物においては、ＨＴＬＶ−１感染細胞株が、Ｔ細胞機能欠損動物と同系の免疫正常動物のＴ細胞由来であることを好ましい態様としている。また、Ｔ細胞機能欠損動物がヌードラットであることを別の好ましい態様としている。
この出願はまた、免疫正常ラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／＋のＴ細胞にＨＴＬＶ−１を感染させて樹立したＴ細胞株ＦＰＭ１と、この細胞株ＦＰＭ１をヌードラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕの体内で増殖させて樹立したＴ細胞株ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸをも提供する。
発明を実施するための最良の形態
この発明のＡＴＬモデル動物は、ＨＴＬＶ−１感染細胞株をＴ細胞機能欠損動物に移植することによって作成した動物個体である。
Ｔ細胞機能欠損動物は、近交系が確立しているラット、マウス等を対象とすることができる。これらのＴ細胞機能欠損動物は、既存のヌードラットやヌードマウス等を用いることができる。またＴ細胞機能に関係する特定遺伝子をノックアウトするなどして人為的に作成した動物であってもよい。このような人為的に作成したＴ細胞機能欠損動物の場合には、その野生型を免疫正常動物として用いることができる。
ＨＴＬＶ−１感染細胞株は、既に樹立されている既存の細胞株を用いることもでき、または公知の方法に従い、動物細胞にＨＴＬＶ−１を感染させることによって新たに樹立することもできる。動物細胞へのＨＴＬＶ−１の感染は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合には、動物の胸腺細胞と、ＨＴＬＶ−１感染動物細胞とを共培養する。
この発明のＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株ＦＰＭ１は、免疫正常ラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／＋のＴ細胞にヒトＴ細胞白血病ウイルス１を感染させることによって樹立した新たなＨＴＬＶ−１感染細胞株である。
また、このようにして取得したＨＴＬＶ−１感染細胞株を以下と同様の方法によりＴ細胞機能欠損動物に移植し、動物の体内で増殖／継代させてもよい。この発明のＴ細胞株ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸは、前記Ｔ細胞株ＦＰＭ１をヌードラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕの体内で増殖させて樹立した新たなＨＴＬＶ−１感染細胞株である。
次いで、これらのＨＴＬＶ−１感染細胞株を、Ｔ細胞機能欠損動物の皮下、腹腔内または静脈内に移植する。細胞株を移植するＴ細胞機能欠損動物は、新生仔（例えば生後２４時間以内）であっても成体であってもよい。移植する細胞数は動物の種や体重等に応じて１０４〜１０８個程度とすることができる。
このようにしてＨＴＬＶ−１感染細胞株を移植された動物は長期間に渡ってＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株を増殖させ、ＨＴＬＶ−１産物を産生するため、腫瘍の発生過程だけでなく、ＡＴＬの発症メカニズム並びにそれに対するホストの免疫応答機構等を詳細に分析することが可能である。
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１：ＨＴＬＶ−１感染細胞株の移植
既存の各種ＨＴＬＶ−１感染細胞株（２×１０６個）を新生仔ラット（生後２４時間以内）の皮下または腹腔内に移植した。また、同じく各細胞株（１×１０７個）を４週齢のラットの皮下、腹腔または静脈内に移植した。
ＨＴＬＶ−１感染細胞株細胞株は、ＷＫＡ系ラット由来のリンパ細胞株ＴＡＲＳ−１およびＴＡＲＴ−１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：９８１−９８９，１９９２）、Ｆ３４４系ラット由来のリンパ細胞株Ｆ３４４−Ｓ１（Ｊ．Ｅｘｐ．，Ｍｅｄ．，１５９：１１０５−１１１６，１９８４）、ＷＫＡラット由来のＨＴＬＶ−１感染細胞株Ｗ７ＴＭ−１（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４２０２−４２１１，１９９０）、並びにＨＴＬＶ−１感染ヒト細胞株ＭＴ−２（Ｎａｔｕｒｅ，２９４：７７０−７７１，１９８１）を使用した。
ラットは、メスのヌードラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ（ｎｕ／ｎｕ）と、その同系ラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／＋（ｎｕ／＋）（いずれもＣｌｅａ  Ｊａｐａｎ社より購入）、メスのＦ３４４／Ｓｌｃ（Ｆ３４４）ラットおよびＷＫＡ／ＫｍＳｌｃ（ＷＫＡ）ラット（いずれもＳＬＣ  Ｊａｐａｎ社より購入）を用いた。
以上のとおりに作成した細胞株移植動物について、以下を試験した。
方法：
（１）皮下移植した細胞株の測定
移植後、１週間に１度、皮下腫瘍の表面最長長さ（ａ，ｍｍ）および幅（ｂ，ｍｍ）を測定し、腫瘍の大きさ（Ｖ）を以下の式（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４４：２０４−２１０，１９９７）によって算出した。
Ｖ＝ａ×ｂ２×１／２
（２）細胞株移植動物の組織学的試験
移植から１０週間後、動物の各臓器を取り出し、顕微鏡観察した。また、各臓器をホルマリン固定後にパラフィン包埋し、その薄片をヘマトキシリン−エオシン染色して顕微鏡観察した。また、凍結切片は、抗ラットＩＬ−２レセプターα鎖モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ラットＣＤ４ｍＡｂ、または抗ＨＴＬＶ−１ＴａｘｍＡｂと、Ｌｔ−４（Ｊａｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８１：２２５−２３１、１９９０）を１次抗体として免疫組織学的に染色した。
（３）ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出
移植動物の各組織からゲノムＤＮＡを単離し、文献記載の方法（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７２：７２８９−７２９３，１９９８）に従い、ＨＴＬＶ−１プロウイルスのｐｘ領域をＰＣＲ増幅した。また、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの３’末端側鎖の配列を特定するため、文献記載の方法（Ｂｌｏｏｄ，８４：３０８０−３０８５，１９９４）に従って、逆転写ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物は市販のシークエンサーにより配列を決定した。
結果：
（１）ＨＴＬＶ−１感染細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖
表１は、各ＨＴＬＶ−１感染細胞株と、それらを移植したラット、移植経路および各臓器の顕微鏡観察結果である。
この表１に示したとおり、細胞株Ｆ３４４−Ｓ１およびＴＡＲＳ−１は、移入経路に関わりなく、ヌードラット（ｎｕ／ｎｕ）において全身性に増殖した。第１図は、これら細胞株Ｆ３４４−Ｓ１（■）およびＴＡＲＳ−１（●）の皮下増殖の過程を示したグラフである。
また、Ｆ３４４−Ｓ１を移植した５匹のうち、１匹は移植後３週間で死亡し、他の４匹は著しく衰弱したため、移植後３、４、７および８週間で安楽死させた。これらのラットのうち、１匹は歩行障害（ｄｙｓｂａｓｉａ）を発症しており、他は重度の黄疸を呈した。一方、細胞株ＴＡＲＳ−１を移植したラットは１０週間後まで生存した。
検死の結果、Ｔ細胞機能に欠損のあるヌードラットで移植細胞は最も増殖していた。しかしながら、免疫正常ラットでは細胞株Ｆ３４４−Ｓ１およびＴＡＲＳ−１は増殖しなかった。また、表１にも示したとおり、ＴＡＲＴ−１、Ｗ７ＴＭ−１およびＭＴ−２はヌードラットでも免疫正常動物でも増殖しなかった。
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（２）成体ヌードラットにおける腫瘍転移
Ｆ３４４−Ｓ１細胞株を皮下移植したラットを検死した結果、肺、肝臓、脾臓、脊髄、卵巣およびリンパ節に腫瘍結節が観察された。組織学的検査の結果、肺、リンパ節および皮下層において腫瘍細胞の大きな浸潤が認められた。一方、ＴＡＲＳ−１を移植したラットは、１匹が肺への転移を示した他は、腫瘍の転移は観察されなかった。
（３）ＨＴＬＶ−１プロウイルスの組織分布
表２は、細胞株Ｆ３４４−Ｓ１およびＴＡＲＳ−１を移植したヌードラットにおけるプロウイルスの組織分布をＰＣＲ法により調べた結果である。この表２から明らかなように、Ｆ３４４−Ｓ１を移植した全てのラットでは、検査したほとんど全ての組織でＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡが検出された。また、ＴＡＲＳ−１を移植したラットでは、全てのラットではないが、検査したほとんどの組織にプロウイルスＤＮＡが検出された。このことから、前記（２）の結果において転移が顕在化していない組織でもＨＴＬＶ−１が分布していることが確認された。
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実施例２：ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株ＦＰＭ１の樹立とラットへの移植
ラットＦ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／＋（ｎｕ／＋）の脾臓細胞と、ＨＴＬＶ−１感染ヒト細胞株ＭＴ−２とをＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン含有；培養開始時にはインターロイキン−２［１０Ｕ／ｍｌ］を添加）で共培養し、ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株ＦＰＭ１を樹立した。この細胞株ＦＰＭ１は、ヒトＡＴＬ患者の細胞と同様に、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ２５、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩを発現する。
樹立したＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株ＦＰＭ１はＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％ＦＣＳおよび抗生物質含有）で培養した。
次いで、細胞株ＦＰＭ１（１×１０７個）を４週齢ラットの皮下に移植した。また、細胞株ＦＰＭ１（２×１０６個）を新生仔ラット（生後２４時間以内）の皮下に移植した。
ＦＰＭ１を皮下移植した４週齢のヌードラットでは、移植後最初の２週間は皮下腫瘤の成長が観察されたが、これは徐々に縮小し、最終的には消滅した。また、はっきりした転移も観察されなかった。しかしながら、各組織のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲの結果、表２に示したとおり、多くの組織でＨＴＬＶ−１  プロウイルスＤＮＡが検出されたことから、細胞株ＦＰＭ１は、転移は顕在化していなくとも、様々な組織に移行していることが確認された。
一方、ＦＰＭ１を移植した新生仔ヌードラットは２週間に渡って腫瘍を増大させた。以降は、衰弱が激しくなったため安楽死させた。免疫組織学的検査の結果、浸潤腫瘍細胞はラットＩＬ−２受容体を顕著に発現していることが確認された。また、これらの腫瘍細胞は、ラットＣＤ４およびＨＴＬＶ−１  ｔａｘも僅かにポジティブであった。なお、ＦＰＭ１を移植した免疫正常ラットの新生仔では腫瘍細胞は全く観察されなかった。
実施例３：ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸの樹立とラットへの移植
実施例２において新生仔ヌードラットにおいて増殖したＦＰＭ１細胞を単離し、細胞株ＦＰＭ１−Ｎ２を樹立し、次いでこの細胞株を新生仔ヌードラット（ｎｕ／ｎｕ）とその同系の免疫正常ラット（ｎｕ／＋）の皮下に移植した。移植細胞株は免疫正常ラット（５匹）では増殖しなかったが、ヌードラット４匹では移植細胞は皮下で増殖した。このうち３匹は移植後２週間で死亡し、残りの１匹は安楽死させた。検死の結果、肥大リンパ節が観察され、これを単離し、培養して細胞株ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを樹立した。以上の結果は表３に示したとおりである。
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次いで、この細胞株ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを成体ヌードラット３匹の皮下に移植し、３匹のラットとも腫瘍を成長させることを確認した。１匹は移植後２週間で死亡し、２匹は３週間後に安楽死させた。検死の結果、３匹とも肝臓への腫瘍転移とリンパ節の腫大が観察された。また、１匹のラットでは、腎臓と脾臓への転移も観察された。
さらに、実施例２で樹立したＦＰＭ１細胞株で免疫した免疫正常ラット（４週齢）のＴ細胞を成体ヌードラットの腹腔内に投与するとともに、ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを皮下に移植した。結果は第２図に示したとおりである。ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸのみを移植した動物（■）、およびナイーブＴ細胞とＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを移植した動物（○）では皮下腫瘍は移植後２週間後まで成長を続けたが、免疫Ｔ細胞とＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを移植した動物（●）では移植後１週間で腫瘍は縮小した。そして、これらの腫瘍縮小動物では腫瘍の転移は観察されなかった。一方、コントロール動物では肺および肝臓への移転が観察された。
これらの結果から、Ｔ細胞免疫系が腫瘍の増殖阻害に深く関与していることが確認された。
実施例４：ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ遺伝子によるＴ細胞免疫誘導
ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ発現プラスミドおよびコントロールプラスミドを、Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎを用いて免疫正常ヘテロラットに１週間に１回、連続２週間投与し、最終投与の１週間後に脾臓よりＴ細胞を分離した。このＴ細胞をＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸで１週間刺激した後、ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸまたはＦＰＭ−ＳＶに対するに対する細胞障害活性を測定した。
結果は第３図に示したとおりであり、ｔａｘ発現プラスミド投与ラット由来のＴ細胞のみが、ＨＴＬＶ−１感染細胞に特異的な細胞障害活性を示した。
実施例５：ｔａｘ免疫Ｔ細胞のＡＴＬモデル動物に対する効果
実施例４で作製したｔａｘ発現プラスミド投与ラット由来のＴ細胞およびコントロールプラスミド投与ラット由来のＴ細胞をそれぞれ移植したヌードラットと、Ｔ細胞を移植していないヌードラットに、ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸ細胞を皮下接種し、その増殖を評価するために皮下の腫瘤のサイズを計測した。
結果は第４図に示したとおりであり、ｔａｘ発現プラスミド投与ラット由来のＴ細胞が、ＨＴＬＶ−１感染細胞の生体内での増殖を強く抑制することが確認された。
産業上の利用可能性
この発明によって、長期間に渡ってＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株を増殖させるＡＴＬモデル動物が提供される。このモデル動物は、腫瘍の発生過程だけでなく、ＡＴＬの発症メカニズム並びにそれに対するホストの免疫応答機構等を詳細に分析することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
第１図は、細胞株Ｆ３４４−Ｓ１（■）およびＴＡＲＳ−１（●）の皮下増殖の過程を示したグラフである。
第２図は、ＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸのみを移植した動物（■）、ナイーブＴ細胞とＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを移植した動物（○）、および免疫Ｔ細胞とＦＰＭ１−Ｖ１ＡＸを移植した動物（●）における腫瘍成長過程を示したグラフである。
第３図は、ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ遺伝子を用いて免疫誘導した免疫正常ラットＴ細胞のＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞に対する特異的細胞障害活性を示したグラフである。
第４図は、ＡＴＬモデル動物の腫瘤発達に対するｔａｘ免疫Ｔ細胞の効果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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