(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシン、フェニルアラニンのアナログ、及びジヒドロキシナフトエン酸のアナログに対する耐性を有し、且つ、ビタミンＫ２を高濃度に生産するバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌ＯＵＶ２３４８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６５９）。
【請求項２】
請求項１に記載のビタミンＫ２高生産性納豆菌を使用すること、を特徴とするビタミンＫ２高含有納豆の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のビタミンＫ２高生産性納豆菌を用いて製造されたビタミンＫ２高含有納豆。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌の育種及びその利用に係り、更に詳細には、本発明は、ビタミンＫ（vitamin Ｋ）、特にビタミンＫ２の生産性を向上させた変異納豆菌の育種、その変異納豆菌、それを使用したビタミンＫ２を多く含む納豆の製造方法及びその変異納豆菌を用いて製造されたビタミンＫ２をより高濃度に含有した納豆に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然物中から単離されたビタミンＫとしては、主に植物体が生合成するビタミンＫ１（フィロキノンphylloquinone）と、主として微生物が生合成するビタミンＫ２（メナキノンmenaquinone）などがある。さらにビタミンＫ２としては、メナキノン（ＭＫ）のキノン骨格に結合するポリプレノイド側鎖の長さによってＭＫ−１〜ＭＫ−１４までの１４種類が知られており、微生物の種類によって主に生産されるメナキノンの種類が異なっている（Microbiol. Rev., Vol.45, p.316-354, 1981）。また、ビタミンＫ３すなわちメナジオン（menadione）（２−メチル−１，４−ナフトキノン）はビタミンＫ１及びビタミンＫ２生合成の中間物質であって、かつ化学合成もされており、さらにビタミンＫ３のハイドロキノン型であるビタミンＫ４も化学合成されている。
【０００３】
ビタミンＫはもともと血液凝固因子の１つとして発見され、その血液凝固作用に対する１日当たりの必要量は約１μｇ／体重ｋｇとされている。この程度の必要量であれば、腸内細菌によってビタミンＫが生産されるので、食品などで特別に供給しなくても充分である。従って通常は血液凝固作用に関するビタミンＫ欠乏病はほとんど観察されておらず、抗生物質の多量投与後や生後７〜１０日の新生児のように腸内細菌の数が少ない時に発生することがある程度である。
【０００４】
しかし、最近そのビタミンＫに骨強化作用があることが解明されてきている。例えばビタミンＫ２の一種であるＭＫ−４について骨粗しょう症治療薬としての臨床試験が行われ、成人１日当たり１５〜４５ｍｇの投与で骨粗しょう症改善効果が認められている。また、骨粗しょう症で見られる大腿骨頚部の骨折患者の血清中のＭＫ−７やＭＫ−８の濃度は、骨折していない患者に比べて、有意に低い値を示す事などから、日常からビタミンＫを摂取して血液中のビタミンＫ濃度を高濃度に維持することが、骨粗しょう症の予防すなわち骨強化につながるものと考えられている。
【０００５】
なお、ＭＫ−４の骨強化作用は、全てのビタミンＫに共通する基本骨格部分がオステオカルシンを活性化することによる骨合成の促進効果と、ＭＫ−４の側鎖部分であるゲラニルゲラニオール部分の作用による骨吸収（骨の分解）の抑制効果の両方の効果によるものであることが解明されつつある。
【０００６】
そしてビタミンＫの骨強化作用の発現には、従来から言われている血液凝固作用の場合よりも多量のビタミンＫが必要であり、腸内細菌等による生産量だけでは不足すると推定されることから、食品などによる供給が必要になるものと考えられている。
【０００７】
ビタミンＫを含有する食品としては、ビタミンＫ１を含有する緑黄色野菜類や海藻類、ビタミンＫ２を含有する納豆などが知られており、これらの食品を摂取することでビタミンＫを補給することができる。
【０００８】
なかでも納豆はビタミンＫ２を最も多く含有しており、例えば第４訂食品成分表によれば納豆中のビタミンＫ２は納豆１００ｇ当たり８６４μｇの濃度であるとされている。また、疫学的な研究からは、納豆の消費量が多いと大腿骨頚部の骨折頻度は少ないとの関係が見出されており、さらに納豆中の主要なビタミンＫ２であるＭＫ−７がＭＫ−４と同程度の能力でカルシウムを骨芽細胞へ沈着させることができるという報告もあって、骨強化作用を期待する際のビタミンＫの供給源として納豆は優良な食品であると考えられている。
【０００９】
しかし、骨強化作用を期待するためには、納豆の現状のビタミンＫ２含有量のままでは不足していると考えられることから、さらに高濃度にビタミンＫ２を含有する納豆を開発することが求められているが、納豆中のビタミンＫ２含有量を高めようとする工夫は非常に少なく、天然物から抽出したビタミンＫ２を亜鉛とともに納豆などの食品に添加する方法（特開平１０−３６２５６）や発酵方法を改良して納豆菌による生産量を増加させる方法（特開平８−９９１６）が知られている程度であった。
【００１０】
前記のビタミンＫ２を添加する方法については、天然物からのビタミンＫ２の抽出作業が煩雑であり、費用もかかる上に、納豆に食品添加物を添加すること自体が品質上好ましいことではなく、従って納豆製造工程の工夫などにより自然な形でビタミンの含有量を高めることが求められている。
【００１１】
その点で、発酵方法を改良する特開平８−９９１６号明細書に開示の方法はより優れた方法であると考えられるが、この方法は、一般に納豆は高圧釜で蒸煮した大豆に対して納豆菌胞子を植菌し、高湿度下で温度を３７〜４５℃に制御して１５〜１８時間程度発酵させる工程を経て製造されるのに対して、比較的高温（４２〜５０℃）で長時間（２４〜４８時間）発酵させることによってビタミンＫ２の含有量を通常の納豆の約７倍程度まで高める方法である。
【００１２】
この方法によってビタミンＫの含有量が高くなるとすれば、一応ビタミンＫ高含有納豆としては目的が果たされていることになる。しかし、この方法は比較的高温で長時間発酵させることが特徴であり、このような発酵を行うといわゆる過発酵の状態となってしまい、出来上がった納豆の香りが悪化し、豆色も黒くなるし、いわゆるシャリが発生するなど、納豆そのものの品質がかなり劣化してしまうため、おいしく食べて健康を維持するという食品に本来期待されるべき姿からは、逸脱してしまうなどの充足できない点があった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、納豆の品質は通常のものと変わりなく風味豊かで、かつ骨強化作用があると期待できるビタミンＫ２をより高濃度で含有する納豆を提供することを目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、納豆の発酵条件などを変化させる従来の方法ではなく、納豆菌自体の生産能力を高めてやる方が、発酵条件や発酵設備などを大きく変える必要がなくて、品質は通常のものと変わりなく風味豊かで、かつビタミンＫ２を高濃度で含有する納豆を効率よく製造することができると考えて本発明を進めた。
【００１５】
納豆菌は、枯草菌バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また、生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バチルス・ナットウ（Bacillus natto）として分類されたり、枯草菌の変種としてBacillus subtilis var. nattoあるいはBacillus subtilis(natto）などと枯草菌と区別して分類している文献もある。納豆菌としては、Bacillus natto IFO3009、Bacillus subtilis IFO3335、同IFO3336、同IFO3936、同IFO13169などがあり、また市販の納豆種菌である高橋菌(Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製造所）など各種の納豆菌がある。
【００１６】
この納豆菌のビタミンＫ２生合成経路は完全に解明されておらず、かつビタミンＫ２生産能力を向上させる試みも全く行われていないのが現状であった。
一方、納豆菌以外の微生物でのビタミンＫ２の生産については、生産性の高い微生物を自然界から選抜した結果として、フラボバクテリウム（Flavobacterium）を取得した例（J. Ferment. Technol., Vol.62, p.321-327, 1984）、及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、クルトバクテリウム（Curtobacterium）、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）などの細菌を取得した例（特開昭６１−１７３７９２）などがある。
【００１７】
しかし、これらの微生物により生産されるビタミンＫ２はＭＫ−４、ＭＫ−５やＭＫ−６であって納豆菌が生産するＭＫ−７とは異なっていることや、かつ納豆菌ではビタミンＫ２生合成経路が不明であることなどから、前記の各種の方法が納豆菌のビタミンＫ２の生産能向上に有効かどうかは全く不明であった。
【００１８】
そこで本発明者らは、変異剤処理して得た変異納豆菌をｐ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン含有培地で培養し得られた耐性株についてその性質を検討したところ、全く予期せざることに、該耐性株はビタミンＫ２の生産性が向上しているという新知見を得、更に、上記アミノ酸アナログのみでなく上記ｍ−フルオロ体その他のチロシン、フェニルアラニンのアナログ耐性株は、いずれも上記した特性を有することも見出した。
【００１９】
すなわち本発明者らは、選択培地としてチロシン、フェニルアラニンのアナログ含有培地を使用するビタミンＫ２高生産性納豆菌の育種に成功しただけでなく、本育種方法は納豆菌のみでなく他のバチルス属細菌にも適用可能である点にも着目し、本発明を完成させるに至った。そしてチロシン、フェニルアラニンのアナログに対する耐性を有する変異納豆菌はビタミンＫ２のうちのＭＫ−７を多く含む品質良好な納豆を発酵生産することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち本発明は、チロシン、フェニルアラニンのアナログを含有する選択培地を用いて、ビタミンＫ２生産性が向上した納豆菌その他のバチルス属細菌を育種、分離する方法に係り、更に具体的態様は次のとおりである。
【００２１】
本発明は、本質的には、チロシン、フェニルアラニンのアナログに対する耐性を有し、且つ、ビタミンＫ２を高濃度に生産するバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌に関し、更には、ｐ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、β−２−フェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、フェニルアラニンヒドロキサム酸、から選ばれる少なくともひとつのアナログ耐性を有し、且つ、ビタミンＫ２を高濃度に生産するバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌に関するものである。
また、本発明は、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌を、突然変異処理または自然変異処理によってビタミンＫ２生産性を向上させた後、チロシン、フェニルアラニンのアナログを含有する選択培地を用いて分離したビタミンＫ２を高濃度に生産する納豆菌に関するものである。
そして、本発明は、ビタミンＫ２を高濃度に生産する納豆菌を使用することを特徴とする納豆の製造方法に関する。
さらに、本発明は、ビタミンＫ２を高濃度に生産する納豆菌を用いて製造されたビタミンＫ２高含有納豆に関する。
また、ビタミンＫ２を高生産し且つ優良な納豆を製造できる納豆菌は、従来未知の新規微生物であって、本発明は、上記選択方法のみに限定されることなく、他の方法で分離された該納豆菌をすべて包含するものである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明において、変異納豆菌を得るための変異方法としてはいかなる変異方法を用いてもよい。納豆菌は特別に人工的な変異処理を施さなくてもある程度の確率で自然に変異を起こすので、このような自然変異によって目的のビタミンＫ２の生産性が向上した変異納豆菌を取得することが可能である。また、人工的な手段による突然変異を起こさせて取得する方法もある。突然変異には物理的方法と化学的方法が用いられる。突然変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、例えばエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）やＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる方法などがあり、これらの方法を単独または組み合わせて適宜実施することができる。
【００２３】
本発明では、変異納豆菌の選抜培地に特色を有するものである。即ち、選択培地にフェニルアラニン、チロシンのアナログを添加することが望ましい。これらのアナログとしては多くのものが知られており、任意のものが使用できるが、特にβ−２−フェニルアラニン、フェニルアラニンヒドロキサム酸などを用いるのが望ましい。また、ｐ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン等も使用可能である。更に望ましくは、これら芳香族アミノ酸のアナログを２以上添加した選択培地を用いて、フェニルアラニンのアナログ及びチロシンのアナログに対する同時耐性株を取得することが良く、これにより効率良くビタミンＫ２を高生産する納豆菌を得ることができる。
フェニルアラニンやチロシンのアナログの添加は、変異処理をする納豆菌の耐性度を勘案して実施する必要があるが、０．３〜５０、好ましくは０．５〜１０、更に好ましくは数μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加しておくとよい。
【００２４】
変異処理される元の納豆菌としては、基本的に優れた納豆生産能を有している必要があるが、その他の性質として栄養源要求性や薬剤抵抗性などを有していても構わない。具体的には、通常的に納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、新たに自然界から分離取得された優れた納豆菌、市販の納豆から分離した納豆菌、及びさらに改良を重ねた納豆菌などを用いることができ、市販納豆から分離されたＯ−２株や、市販の種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）、宮城野菌（宮城野納豆製造所）などが適宜使用できる。
【００２５】
これらの各種納豆菌から適宜選択した納豆菌を変異処理した後、フェニルアラニンのアナログ及びチロシンのアナログを両方含む固体培地に塗抹して、３７℃で２日間程度培養し、そこで生じたコロニーを単コロニー分離した後、納豆を製造した際にビタミンＫ２を多く含有し、かつ風味豊かで物性的にも優れた品質の納豆を生産する納豆菌を取得することによって目的の変異納豆菌が取得できる。
【００２６】
このようにして開発されたビタミンＫ２高生産性の変異納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。このようにして、従来納豆と品質的に差異はなく風味豊かで、かつビタミンＫ２を高濃度で含有する納豆が生産可能となる。
【００２７】
以下に本発明の実施例について述べる。
【００２８】
【実施例１】
納豆菌の培養には、表１及び表２に記載のNutrient Broth及び改変Spizizen培地を用い、常法に従って実施した。
【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
市販納豆から分離した納豆菌Ｏ−２株を常法により紫外線照射（生存率１〜１０％）で変異処理し、ジヒドロキシナフトエン酸のアナログである１−ハイドロキシ−２−ナフトエン酸を含有（５０ｍｇ／ｌ）する選択培地で選択し、さらに紫外線照射（生存率１〜１０％）と選択培地（８０ｍｇ／ｌ）での選択を繰り返した後に得たＯＵＶ２３−ＨＮＡ９００４株を上記Nutrient Brothに白金耳で植菌し、一晩３７℃で振とう培養した後、遠心分離して滅菌生理食塩水で洗浄した。
【００３２】
この約１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度の洗浄菌体に、１００ｍｇ／ｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、２０分間振とうして、変異処理を行った。この時の生存率は１０％前後であった。
【００３３】
変異処理した菌体を上記Nutrient Brothで培養して形質を発現させ、その後に滅菌生理食塩水で洗浄し、さらに改変Spizizen培地に３ｍｇ／ｌとなるようにｐ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−フルオロ−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、β−２−チエニルアラニンを添加した固体培地に塗沫した。
【００３４】
３７℃で２〜３日間培養した後、得られたコロニーを、固体Nutrient Brothで単コロニー分離し、さらに上記のチロシン、フェニルアラニンのアナログを添加した改変固体Spizizen培地にてアナログ耐性を再確認した。このようにして得られたアナログ耐性株の中からＯＵＶ２３４８１株を得た。この菌株は、ＦＥＲＭＢＰ−６６５９として、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３５】
この変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株の胞子液と親株であるＯＵＶ２３−ＨＮＡ９００４株の胞子液及び市販納豆菌胞子液を用いて、常法通り納豆を作製した。すなわち、浸漬した大豆を水切りし、１．８ｋｇｆ／ｃｍ２で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄いフィルムで表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で発酵を行った。発酵終了後、熟成させ、その後に納豆中のビタミンＫ２の含量を評価した。
表３には、ビタミンＫ２の含量とチロシン、フェニルアラニンのアナログへの耐性を示す。
【００３６】
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【００３７】
変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株は、親株であるＯＵＶ２３−ＨＮＡ９００４株や市販納豆菌に比較して、チロシン、フェニルアラニンのアナログに対する耐性を獲得しており、それと同時にビタミンＫ２生産性が約１．７倍に向上しているのが確認された。
【００３８】
【実施例２】
常法に従い、１２０ｋｇの浸漬大豆を１．８ｋｇｆ／ｃｍ２で２２分間加圧釜で蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株の胞子を植菌し、以下常法に従って５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄いフィルムで表面を覆い、蓋をした後連続式発酵装置へ入れ、室温４０〜４４℃で高湿度下で発酵を行った。発酵終了後、熟成されて得られた納豆のビタミンＫ２を分析し、さらに２つの市販納豆製品と比較して、官能的な評価を行った。その結果を表４及び図１に示す。
なお、官能評価は納豆を常用するパネル８０名にて５段階評価法にて行い、その平均値を示した。
５点を良い、４点をやや良い、３点をどちらでもない、２点をやや悪い、１点を悪いと評価した。それぞれの評価項目を下表に示す。
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株で製造した納豆は、市販の納豆と比べてもほとんど遜色のない品質であり、かつビタミンＫ２含量が向上した納豆であることが確認された。
【００４２】
【実施例３】
市販納豆菌胞子液とビタミンＫ２高生産性の変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株の胞子液を用い、市販納豆菌胞子液を用いた場合は、特開平８−９９１６号公報に開示の方法に準じ、室温４２℃と一定にして発酵時間を１８時間（条件１）、２４時間（条件２）、４８時間（条件３）と変化させた以外は実施例１に記載の方法と同様にして、また変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株の胞子液を用いた場合は、室温４０〜４５℃、高湿度下で発酵時間を１８時間とする実施例１と同様の方法で、バッチ式納豆発酵室で納豆製造を行った。
【００４３】
すなわち、４℃で一晩浸漬した大豆を１．８ｋｇｆ／ｃｍ２で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄いフィルムで表面を覆い、蓋をした後にバッチ式納豆発酵室で１８〜４８時間発酵を行った。発酵終了後、熟成して得られた納豆のビタミンＫ２を分析を行い、さらに官能的な評価を行った結果を表５に示す。
【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
長時間発酵させることによって、確かに納豆中のビタミンＫ２含量は増加することが確認されたが、発酵時間を２４時間、４８時間と長くすることによって、アンモニア濃度が増加するとともに、アンモニア臭の強い納豆となり、またシャリが発生して食感が低下するとともに、豆色が黒くなって菌膜も溶解して外観が悪くなるなど品質は劣化することが確認された。
これに対して、変異納豆菌ＯＵＶ２３４８１株で発酵したものは、１８時間と通常の発酵時間であっても、市販納豆菌で長時間の発酵を行ったものと同程度の高濃度のビタミンＫ２を含有しており、かつ品質的にも通常の納豆とほぼ同等の品質であることが確認された。すなわち、ビタミンＫ２を高濃度で含有する高品質の納豆を通常の納豆と同程度の発酵時間で効率良く製造できることが確認された。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、通常の品質とほとんで変わりなく風味豊かで、かつ骨強化作用があると期待できるビタミンＫ２をより高濃度で含有する納豆を提供することができる。また、納豆菌その他バチルス属菌において、ビタミンＫ２高生産株をきわめて効率よく育種、分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビタミンＫ２高含有納豆と市販納豆の品質評価を示す。
【図１】
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