(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項２】
下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項３】
下記の何れかの塩基配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【請求項４】
ガ類に由来する遺伝子である、請求項２又は３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項２から４の何れかに記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項６】
請求項２から４の何れかに記載の遺伝子又は請求項５に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１に記載の脂肪族アシル還元酵素を採取することを含む、請求項１に記載の脂肪族アシル還元酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の脂肪族アシル還元酵素を脂肪酸由来の脂肪族アシルCoAに作用させることによりアシル還元反応を行うことを含む、脂肪族アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪族アシル還元酵素、それをコードする遺伝子、及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、ガ類などから取得することができるフェロモン腺特異的脂肪族アシル還元酵素、それをコードする遺伝子、及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多種のガは、その種固有のフェロモンの混合物を有する。フェロモン混合物は、交配活動におけるコミュニケーション媒体としての役割を果たし、フェロモン混合物の構造的／組成的変化は種特異性の一因となる(非特許文献１)。雌のガにより産生される性フェロモンの主要な一群は、アルデヒド、アルコール、または酢酸エステルなどの酸素含有官能基を有するC10〜C18不飽和非環式脂肪族化合物である。これらのフェロモン成分は、フェロモン腺で、アセチル-CoAから、脂肪酸合成、炭素鎖短縮および不飽和化（またはその逆）、並びにカルボニル炭素の還元的修飾を経てデノボ(de novo)合成される(非特許文献２及び３)。これらのフェロモン成分の生合成は通常、食道下神経節に由来するフェロモン生合成活性化神経ペプチド(PBAN)と呼ばれる特定の３３個のアミノ酸からなるペプチドホルモンにより誘起される（非特許文献４）。PBANは、ガの種によって、脂肪酸生合成経路における脂肪族アシル還元の一または複数の反応を調節することが示されている(非特許文献５及び６)。
【０００３】
この種の性フェロモンの生合成において、酸素含有官能基の生成に必要な鍵酵素は脂肪族アシル還元酵素である。脂肪族アシル還元酵素は脂肪族アシルフェロモン前駆体を対応するアルコールに変換する。ガの種によって、これらのアルコールはアセチルCoA：脂肪族アルコールトランスフェラーゼによりアセチル化されるか、またはアルコールオキシダーゼにより対応するアルデヒドへと酸化される場合が多い(非特許文献３)。鱗翅目の性フェロモンの多様な種特異的成分を生成する際に重要な役割を果たすにも関わらず、関与する脂肪族アシル還元酵素はこの大きな分類学上の群から未だ同定・特性決定されていない。
【０００４】
カイコガ(Bombyx mori)において、8番目と9番目の腹節の間に位置するフェロモン腺は、羽化の日から明期の間に性フェロモンであるボンビコール(bombykol)、すなわち(E,Z)-10,12-ヘキサデカジエン-1-オールの産生を始める(非特許文献７及び８)。ボンビコールは、アセチルCoAからパルミチン酸(16: Acyl)を経由してde novo合成され、このパルミチン酸は△11-不飽和化、△10,12-不飽和化および脂肪族アシル基の還元により段階的にボンビコールに変換される(非特許文献２及び９)。ボンビコール産生はPBANの制御下にあり、PBANはフェロモン腺に直接作用し、脂肪族アシル基の還元の段階を調節する(非特許文献１０)。PBAN制御下の鍵酵素の一つは脂肪族アシル還元酵素である(非特許文献１１)。
【０００５】
本発明者らは先に、パルミトイル-CoAを基質として用いて、Bombyx moriフェロモン腺のホモジネート中に脂肪族アシル還元酵素活性を検出した(非特許文献１１)。さらなる生化学的研究により、この酵素が還元剤としてNADHではなくNADPHを必要とすること、そしてその活性が3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素の特異的阻害剤であるコンパクチン(compactin)により阻害されることが明らかになった(非特許文献１１)。
【０００６】
【非特許文献１】
Tamaki, Y. (1985) Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry, and Pharmacology, eds. Kerkut, G. A. & Gilbert, L. I. (Pergamon, New York), 9: pp. 145-191.
【非特許文献２】
Bjostad, L. B., Wolf, W. A. & Roelofs, W. L. (1987) Pheromone Biochemistry, eds. Prestwich, G. D. & Blomquist, G. J. (Academic, Orlando), pp.77-120.
【非特許文献３】
Tillman, J. A., Seybold, S. J., Jurenka, R. A. & Blomquist, G. J. (1999) Insect Biochem. Molec. Biol. 29, 481-514.
【非特許文献４】
Raina, A.K. (1993) Annu. Rev. Entomol. 38, 329-349.
【非特許文献５】
Matsumoto, S. (1997) Recent Res. Devel. in Agricultural Biological & Chem. 1, 33-49.
【非特許文献６】
Rafaeli, A. (2002) Int. Rev. Cytol. 213, 49-91.
【非特許文献７】
Ando, T., Hase, R., Funayoshi, A., Arima, R., & Uchiyama, M. (1988) Agric. Biol. Chem. 52, 141-147.
【非特許文献８】
Fonagy, A., Yokoyama, N., & Matsumoto S. (2001) Arthropod Structure and Development 30, 113-123.
【非特許文献９】
Ando, T., Hase, R., Arima, R., & Uchiyama, M. (1988) Agric. Biol. Chem. 52, 473-478.
【非特許文献１０】
Ozawa, R., Ando, T., Nagasawa, H., Kataoka, H., & Suzuki, A. (1993) Biosci. Biotechnol Biochem 57, 2144-2147.
【非特許文献１１】
Ozawa, R., & Matsumoto, S. (1996) Insect Biochem. Molec. Biol. 26, 259-265.
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホホバ(Simmondisia chinensis)において同定された脂肪族アシル還元酵素と相同的なタンパク質をコードするBombyx moriフェロモン腺由来のcDNAを単離し、フェロモン腺におけるその酵素に対応するmRNAの特異的発現を確認し、さらに酵母(Saccharomyces cerevisiae)における機能的発現により脂肪族アシル還元酵素活性を確認することを解決すべき課題とした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、カイコガ(Bombyx mori)から新規な脂肪族アシル還元酵素（即ち、Bombyx moriフェロモン腺脂肪族アシル還元酵素(Bombyx mori pgFAR)）をコードするＤＮＡを単離することに成功した。さらに本発明者らは、クローニングされた遺伝子が、Bombyx moriのフェロモン前駆体脂肪酸を優先的に最終アルコール産物であるボンビコールに変換するフェロモン腺特異的長鎖脂肪族アシル還元酵素をコードしていることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１０】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１１】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかの塩基配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【００１２】
好ましくは、本発明の遺伝子は、ガ類に由来する遺伝子である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の遺伝子又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の形質転換体を培養し、培養物から脂肪族アシル還元酵素を採取することを含む、本発明の脂肪族アシル還元酵素の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の脂肪族アシル還元酵素を脂肪酸由来の脂肪族アシルCoAに作用させることによりアシル還元反応を行うことを含む、脂肪族アルコールの製造方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の遺伝子
本発明者らは、カイコガ(Bombyx mori)より脂肪族アシル還元酵素遺伝子の単離を試み、5'RACE法により、候補遺伝子（Bombyx mori pgFAR）を取得した。取得した遺伝子のアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。
【００１５】
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１６】
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【００１７】
本発明において、「脂肪族アシル還元酵素」とは、脂肪族脂肪酸に由来する脂肪族アシルCoAを還元して対応する脂肪族アルコールを生成する能力を有する酵素である。また、「脂肪族アシル還元酵素活性」とは、上記のような脂肪族アシルCoAを還元して対応する脂肪族アルコールを生成する反応を触媒することができる酵素活性を意味する。
【００１８】
本発明の遺伝子及びその相同遺伝子は、例えば、ガ類などの昆虫、具体的には、カイコガ(Bombyx mori)、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、タバコガ類（Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Heliothis virescens）、タバコスズメガ（Manduca sexta）などから単離できる。
【００１９】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２０】
本明細書で言う「配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、６０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００２１】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２２】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１及び２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてガ類などの昆虫（例えば、カイコガ(Bombyx mori)など）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した昆虫由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２６】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２７】
また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００２８】
例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
（２）本発明の脂肪族アシル還元酵素
本発明の脂肪族アシル還元酵素は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００３０】
本発明の脂肪族アシル還元酵素は、基質である脂肪族アシルCoAに作用するとこれを還元して対応する脂肪族アルコールを生成することができる。上記方法による脂肪族アルコールの製造方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
本発明の脂肪族アシル還元酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記（１）に記載した当該脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の脂肪族アシル還元酵素を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
【００３２】
（３）本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００３４】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３５】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００３６】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００３７】
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換え酵素タンパク質の製造
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００３８】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３９】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４０】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４２】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４３】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の酵素タンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の酵素タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４４】
（５）本発明の脂肪族アシル還元酵素の利用
本発明の脂肪族アシル還元酵素を脂肪酸由来の脂肪族アシルCoAに作用させることによりアシル還元反応を行うことによって脂肪族アルコールを製造することができる。ここで用いる脂肪酸としては、炭素数１４〜１８の直鎖飽和あるいは不飽和脂肪酸を言う。具体的には、１０，１２−ヘキサデカジエン酸、１１−ヘキサデセン酸、９−ヘキサデセン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸（ステアリン酸）などが挙げられる。
【００４５】
本発明の脂肪族アシル還元酵素を利用して脂肪族アシル還元酵素反応を行うことにより、例えば、性状の異なる多様なワックスを製造することが可能になる。このようなワックスは、潤滑剤、食品、化粧品などの分野で産業上広く使用することができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
【実施例】
実施例１：Bombyx mori脂肪族アシル還元酵素cDNAクローンの単離
（方法）
Bombyx mori(Shuko×Ryuhaku)の卵は、片倉工業（日本、松本市）から購入した。既報の通り(Fonagy, A., Matsumoto, S., Uchiumi, K., Orikasa, C. & Mitsui, T. (1992) J. Pesticide Sci. 17, 47-54)、幼虫は人工餌で育てた。羽化の直後に切除したBombyx moriフェロモン腺由来の全RNAを用いてcDNAの第一鎖を合成した。PCRは、タマナヤガ(Agrotis ipsilon)（受託番号AJ009675）由来のHMG-CoAレダクターゼに基づいたセンスオリゴヌクレオチドプライマー(5'-GTCTCGAAAGGAGCCGAAAAC-3')（配列番号３）およびオリゴ-dTプライマーを用い、ExTaqポリメラーゼ（タカラ）を使用して実施した。温度サイクル条件は、95℃で30秒、30℃で30秒および72℃で1分を6サイクル、続いて、95℃で30秒、50℃で30秒および72℃で1分を25サイクル、そして最後に72℃で10分とした。PCR産物を1％アガロースゲル上で分離した後、1〜2kbに相当するDNAをゲルから回収し、再び同条件を用いて増幅した。次いでPCR産物を、pGET-T easy system(Promega)を用いてクローニングし、得られたクローンを配列決定した。
【００４７】
上記の配列解析により、ホホバ脂肪族アシル還元酵素(JJFAR)( Metz, J, G., Pollard, M. R., Anderson, L., Hayes, T. R., & Lassner, M. W. (2000) Plant Physiol. 122, 635-644)と相同なタンパク質をコードする1299bpのクローンの存在が示された。クローンの5'末端を得るために、Marathon cDNA増幅キット(Clontech)を用い、遺伝子特異的プライマー(5'-TCCACGAACCCTCGCACTGGCTC-3')（配列番号４）およびキットに添付のアンカープライマーを使用して製造業者の指示に従って5'RACEを行った。Micro-FastTrack(Invitrogen)を用いてメッセンジャーRNAをフェロモン腺より単離した。5'RACEに用いたタッチダウンPCRの条件は、94℃で3分間、次いで94℃で5秒間および50℃で3分間を31サイクルとした。この遺伝子の全長cDNAを、Bombyx mori近交系p50(Yoshiga, T., Okano, K., Mita, K., Shimada, T., Matsumoto, S. (2000) Gene 246, 339-345)から調製したフェロモン腺cDNAライブラリーから単離した。Li-Cor DNAシークエンサー（モデル4000）およびBase ImagIRソフトウェアを用いてDNA配列決定を行った。
【００４８】
上記の結果、取得した遺伝子のORF（塩基配列を配列番号２に記載する）が、予想分子量52,322Daである配列番号１に記載の460個のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしていることが示された（図１）。他の還元酵素と同様に、推定されるアミノ酸配列は、23〜33残基にわたる保存されたNAD(P)H-結合モチーフ[I,V,F]-X-[I,L,V]-T-G-X-T-G-F-L-[G,A]を含んでいた(Aarts, M. G., Hodge, R., Kalantidis, K., Florack, D., Wilson, Z. A., Mulligan, B. J., Stiekema, W. J., Scott, R., & Pereira, A. (1997) Plant J. 12, 615-623)。このタンパク質をBombyx moriフェロモン腺脂肪族アシル還元酵素(Bombyx mori pgFAR)と命名した。推定されるアミノ酸配列について、BLAST検索プログラムを用いて公用データバンクで検索した結果、JJFAR(GenBank登録番号AF149917)と全長にわたって26％の同一性を示し、有意ではあるが高くない相同性を示した（図２）。Bombyx mori pgFARの配列はまた、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来の雄性不稔2(MS2)タンパク質（約23％の同一性）、および多様な生物由来、例えばシビレエイ(Torpedo marmorata)、線虫(Caenorhabditis elegans)およびキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(genBank登録番号AJ272073、AF098505およびAL009193)などに由来する機能が未知である他のMS2様タンパク質とも有意な相同性を示した。
【００４９】
実施例２：ノーザンブロット解析
ノーザンブロットは既報の通り実施した(Matsumoto, S., Yoshiga, T., Yokoyama, N., Iwanaga, M., Koshiba, S., Kigawa, T., Hirota, H., Yokoyama, S., Okano, K., Mita, K., Shimada, T., & Tatsuki, S. (2001) Insect Biochem. Molec. Biol., 31, 603-609)。簡単に説明すると、Bombyx moriの種々の組織から調製した変性全RNA（各10μg）を、6.6Mホルムアルデヒド／1X MOPSバッファー中1.2％ゲル上で分離し、キャピラリーブロットによりナイロン膜(Hybond N, Amersham)に転写した。1299bpのクローンを、Ready-To-Go DNA標識ビーズ(Pharmacia)を用いて［α-32P］dCTPにより標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。
【００５０】
Bombyx mori pgFARのノーザンブロット解析の結果、フェロモン腺内で2 kbの転写産物の特異的発現が示されたが、試験した他の組織、例えば頭全体、脂肪体、マルピーギ管、飛翔筋、卵巣および精巣などでは検出可能なシグナルは観察されなかった（図３Ａ)。フェロモン腺において、転写産物の量は羽化の1日前に有意に上昇したが、発現量は羽化の後やや減少するようであった（図３Ｂ）。
【００５１】
実施例３：プラスミドの構築および酵母の形質転換
ガラクトース誘導性プロモーターGAL1の後に本発明の460アミノ酸のORFを含むpESC-LEU-FARと命名したプラスミドを、シャトルベクターpESC-LEUTM(Stratagene)を用いて作成した。pESC-LEU-FARの構築のために、次の2つのプライマーを設計した。5'-AAAGGATCCAAGATGTCACACAATGG-3'（配列番号５）（BamHIサイトを含む）および5'-AATGTCGACTATAATTTATTTTTGAACAG-3'（配列番号６）（SalIサイトを含む）。KOD-Plus-(東洋紡、日本)を用いてPCRを行った。PCRの条件は、94℃で15秒、50℃で30秒および68℃で90秒の20サイクルとした。PCRに用いたcDNAの第一鎖は、p50系フェロモン腺全RNAより調製した。PCR産物をBamHIおよびSalI（タカラ、日本）で二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてアガロースゲルから精製した。精製したDNAを、BamHIおよびSalIで予め消化した線状のpESC-LEUTMベクターに連結し、次いで配列を決定した。次に、pESC-LEU-FARおよびpESC-LEUの両プラスミドを用い、pESC酵母エピトープ標識ベクター(Stratagene)についての製造業者の指示に従い、酢酸リチウムによりS. cerevisiae株YPH499（登録商標）(Stratagene)を形質転換した。個々のコロニーを10mLのL-ロイシン不含SDドロップアウト培地（アミノ酸を含まない0.67％酵母窒素塩基、2％グルコース、0.13％アミノ酸ドロップアウト粉末）に接種した。30℃で一晩インキュベートした後、酵母培養物を100mLのL-ロイシン不含SDドロップアウト培地中に1：20に希釈し、OD600が1.0になるまで30℃で増殖させた。
【００５２】
実施例４：S. cerevisiaeにおけるBombyx mori pgFARの機能的発現
（方法）
遠心分離後の細胞ペレットを、100mLの作成直後のL-ロイシン不含SGドロップアウト培地（アミノ酸を含まない0.67％酵母窒素塩基、2％ガラクトース、0.13％アミノ酸ドロップアウト粉末）に懸濁し、30℃で22時間インキュベートした。脂肪族アシル還元酵素活性を調べるために、培地の一部を作成直後のL-ロイシン不含SGドロップアウト培地中で5倍に希釈して2mlとし、0.5mMの種々の脂肪酸および0.2％タージトール(NP-40型、Sigma Aldrich)の存在下、30℃で20時間インキュベートした。インキュベーション後、培地の一部1mLを、SPD1010 Speedvac（登録商標）システム(ThermoSavant)を用いて乾燥させ、1mLのn-ヘキサンにより抽出した。ヘキサン抽出物を30μLに濃縮し、各サンプルの1μLについてGC/MSを行った。電子衝撃GC/MSは、HP-5キャピラリーカラム（内径0.25mm×30m、Agilent、Germany）を備えたJEOLオートマスサンマススペクトロメーターを用いて行った。カラム温度プログラムは、40℃で2分間、10℃／分で140℃まで、最後は4℃／分で220℃までとした。イオン化電圧は70eVとし、イオン源の温度は230℃とした。不飽和生成物の二重結合の位置は、モノエン酸についてはジメチルジスルフィド(DMDS)アダクト(Buser, H. R., Arn, H., Guerin, P., & Rauscher, S. (1983) Ann. Chem. 55, 818-822)、および共役ジエン酸については4-メチル-1,2,4-トリアゾリン-3,5-ジオン(MTAD)アダクトのMS解析により確認した(Young, D. C., Vouros, P., and Holick, M. F. J. (1990) Chromatography 522, 295-302；及びMcElfresh, J. S., & Millar, J. G. (1999) J. Chem. Ecol. 25, 687-709)。
【００５３】
基質として用いた遊離脂肪酸は、ミリスチン酸(14: Acid)（和光、日本）、ペンタデカン酸(15: Acid)(ナカライ、日本)、D3標識したパルミチン酸（ヘキサデカン-16,16,16,-d3酸、D3-16: Acid）(Isotec)、ヘプタデカン酸(17: Acid)(Sigma)、ステアリン酸(18: Acid)（関東化学、日本）、ノナデカン酸(19: Acid)(Aldrich)、エイコサン酸(20: Acid)(Aldrich)、(E)-9-パルミトレイン酸(E9-16:1 Acid)（フナコシ、日本）、および(Z)-9-パルミトレイン酸(Z9-16:1 Acid)（フナコシ、日本）である。(E)-11-パルミトレイン酸(E11-16:1 Acid)および(Z)-11-パルミトレイン酸(Z11-16:1 Acid)は、その対応するアルデヒドから調製したが、これらのアルデヒドは、n-ペンチルトリフェニルホスホニウムブロミドおよび11-（テトラヒドロ-2-ピラニルオキシ）-ウンデカナールとのWittig反応を利用して合成した。保護基を除去し、硝酸銀シリカゲルカラムで(E)-異性体と(Z)-異性体とを分離した後、クロロクロム酸ピリジニウムおよびJones試薬を用いて両方の異性体を酸化し、対応する各遊離脂肪酸とした（Bowers, A., Halsall, T. G., Jones, E. R. H., & Lemin A. J. (1953) J. Chem. Soc., 1953, 2548-2560）。(E,Z)-10,12-ヘキサデカジエン酸(E,Z10,12-16:2 Acid)を既知のアルデヒドである(E)-12-(tert-ブチルジメチルシリル）オキシ-2-ドデセン-1-アール(Uenishi, J. Kawahama, R., Izaki, Y., & Yonemitsu, O. (2000) Tetrahedron, 56, 3493-3500)から次のように合成した。アルデヒドを、n-ブタニルトリフェニル-ホスホニウムブロミドおよびナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドから調製したWittig試薬(Bestmann, H. J., Su・, J. & Vostrowsky, O. (1981) Liebigs Ann. Chem., 1981, 2117-2138)と反応させた。続いて脱保護により、6％の対応する12E-異性体および約3％の対応する(10Z,12Z)-異性体（1H-NMR解析）を含むボンビコール(E,Z10,12-16:2 OH)を得て、これをJones酸化させ(Bowers, A., Halsall, T. G., Jones, E. R. H., & Lemin A. J. (1953) J. Chem. Soc., 1953, 2548-2560)、1H-NMR解析において＞88％の幾何学的純度をもつE,Z10,12-16:2 Acidを得た。E,Z-異性体をODSカラム上でHPLCにより均一になるまで精製した。少量のE,E-異性体も別途精製し、E,Z-異性体とE,E-異性体の1：1混合物を得た。
【００５４】
（結果）
Bombyx mori pgFARの還元酵素活性および基質特異性を調べるために、本発明の460アミノ酸のORFを含むプラスミドpESC-LEU-FARを構築し、S. cerevisiae株YPH499において誘導性GAL1プロモーターの制御下でBombyx mori pgFARタンパク質を発現させた。ガラクトースにより誘導して30℃で22時間インキュベートした後、pESC-LEU-FARで形質転換した酵母細胞がヘキサデカノール(16:OH)を産生するのに対し、空のベクターpESC-LEUで形質転換した細胞はヘキサデカノール(16:OH)を産生しないことを確認した（図４Ａおよび４Ｂ）。D3標識したパルミチン酸を含む培地でインキュベートしても、取り込みおよび対応するアルコールD3-ヘキサデカノール(D3-16：OH)への還元が確認されたため（図４Ｃ）、様々な脂肪酸をインキュベーション培地に添加することにより、発現したBombyx mori pgFARの基質特異性をさらに調べた（図５から７）。これらの実験では、添加した脂肪酸から誘導される脂肪アルコールの産生を内在性の16：OHと比較することによって基質特異性を評価した。この内在性の16：OHは、図４Ａおよび４Ｂに示す通り、導入されたBombyx mori pgFARの作用により内因性基質から産生されたものである。飽和長鎖脂肪酸を用いた一連の実験において（図４Ｃおよび５）、15: Acidは対応するアルコール(15:OH)に優先的に還元された。17: Acidおよび18: Acidの対応するアルコールである17：OHおよび18：OHへの還元が起こったが、この還元は15: Acidまたは16: Acidの還元ほどは効率的ではなかった。さらに、14: Acidから対応するアルコールへの還元はわずかに検出できたが（図５Ａ)、19: Acidおよび20: Acidは還元されなかった。これらの結果から、Bombyx mori pgFARが実際に、異なる基質特異性で長鎖脂肪族アシル還元酵素活性を示すことが示された。
【００５５】
Bombyx moriにおいては、性フェロモンであるボンビコールは、Z11-16：1 Acylを経由して生合成され、さらに脱飽和されてE,Z10,12-16:2: Acylとなり、最後に還元されてボンビコール(E,Z10,12-16:2:OH)となる(Ando, T., Hase, R., Arima, R., & Uchiyama, M. (1988) Agric. Biol. Chem. 52, 473-478)。そこで、さらに不飽和C16脂肪酸を用いて基質特異性を調べた。試験したモノ不飽和C16脂肪酸の中で、Z11-16：1 AcidおよびE11-16：1 Acidの両方が、対応するアルコールへと還元された（図６Ａおよび６Ｂ)。対照的に、Z9-16：1 AcidまたはE9-16：1 Acidのいずれかを基質として利用した場合は、対応するアルコールへの還元が減少することが確認された（図６Ｃおよび６Ｄ)。ジ不飽和脂肪酸であるE,Z10,12-16:2 Acid（すなわちボンビコール前駆体脂肪酸）の実験により、この基質が優先的に還元されて、最終アルコール産物であるボンビコールに変換されることが示された（図７Ａ)。E,Z10,12-16:2 AcidおよびE,E10,12-16:2 Acidの1：1混合物をインキュベーション培地に添加すると、E,Z10,12-16:2 Acidが選択的に還元され、ボンビコールが主な産物であった（図７Ｂ)。同様に、E,Z10,12-16:1 AcidおよびZ11-16:1 Acidの1：1混合物をインキュベーション培地に添加すると、E,Z10,12-16:2 Acidが選択的に還元され、ボンビコールに変換された（図７Ｃ)。これらの結果は、Bombyx mori pgFARがボンビコール前駆体脂肪酸に対して強い基質選択性を有していることを示す。これらの発現解析を通して、検出可能な量の中間体アルデヒドは存在しなかった。また、雄のBombyx moriの典型的な交配行動が、Bombyx mori pgFARを発現する酵母細胞により引き起こされた（図８）。
【００５６】
（実施例１〜４の考察）
長鎖の第一アルコールは、遊離アルコールとして存在する場合と、より一般的には様々な生物におけるロウの場合のように結合状態で存在する場合の両方がある(Kunst, L., & Samuels, A. L. (2003) Progress in Lipid Research 42, 51-80)。これらのアルコールは、特に動物神経系組織に豊富なエーテル脂質の前駆体として機能することもできる。昆虫において、長鎖脂肪アルコールは、ロウとして表皮の外面を保護するために広く用いられているが(Blomquist, G. J., & Dillwith, J. W. (1985) Com Insect Physiol Pharmacol , eds. Kerkut, G.A. & Gilbert, L.I. 13, pp117-154)、多くのガの種においては種特異的フェロモン成分の前駆体としても重要な役割を果たしている(Tillman, J. A., Seybold, S. J., Jurenka, R. A. & Blomquist, G. J. (1999) Insect Biochem. Molec. Biol. 29, 481-514)。
【００５７】
脂肪族アルコール合成の生化学は、長鎖脂肪アルコールが対応する脂肪族アシルCoAの還元を通じて主に生合成されることを示している。アルデヒドを生成する脂肪族アシル還元酵素(FAR)と異なり、アルコールを生成するFARは通常不可欠の膜タンパク質であり、脂肪族アシルCoAの四電子還元を触媒し、中間体アルデヒドを放出せずに遊離の第一アルコールを生じる(Metz, J, G., Pollard, M. R., Anderson, L., Hayes, T. R., & Lassner, M. W. (2000) Plant Physiol. 122, 635-644；及びBurdett, K., Larkins, L. K., Das, A. K., & Hajra, A. K. (1991) J. Biol. Chem. 266, 12201-12206)。ガにおけるの性フェロモン産生の基礎となる分子機構を理解することを目的として、本発明者らは以前にBombyx moriフェロモン腺のホモジネート中に長鎖FAR活性を検出した。また、パルミトイル-CoAを基質として用い、中間体アルデヒドを放出することなく、対応するヘキサデカノールへの還元も確認されている(Ozawa, R., & Matsumoto, S. (1996) Insect Biochem. Molec. Biol. 26, 259-265)。さらにまた、CHAPを界面活性剤として用いることにより、この酵素をフェロモン腺のミクロソーム分画から可溶化できることも確認されている(Fonagy, A., Yokoyama, N., Ozawa, R., Okano, K., Tatsuki, S., Maeda, S. & Matsumoto, S. (1999) Comp. Biochem. Physiol. B. 124, 51-60)。これらの知見は、Bombyx moriの性フェロモンの産生に関与するFARが、アルコールを生成するものであることを示唆している。これまでに文献発表されたアルコール生成FAR遺伝子はJJFARのものだけであり、これは種子のロウ脂肪酸を対応する脂肪アルコールへと変換する(Metz, J, G., Pollard, M. R., Anderson, L., Hayes, T. R., & Lassner, M. W. (2000) Plant Physiol. 122, 635-644)。
【００５８】
本発明においては、pgFAR cDNAの一部を増幅するために、A. ipsilon HMG-CoAレダクターゼの配列から設計したセンスオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴ-dTを選択した。以前の研究では、HMG-CoAレダクターゼの特異的阻害剤であるコンパクチンが、インビトロアッセイにおいてフェロモン腺FAR活性を阻害することを示していた(Ozawa, R., & Matsumoto, S. (1996) Insect Biochem. Molec. Biol. 26, 259-265)。この知見からフェロモン腺FARが他のHMG-CoAレダクターゼとの配列相同性を示すことが予測された。本発明では、HMG-CoAレダクターゼ相同体のcDNAを取得することはできなかったが、意外なことにもJJFARと相同的なタンパク質をコードするクローンを単離することができた。このクローンによりコードされるタンパク質（Bombyx mori pgFARと命名）は全長にわたりJJFARと26％の同一性を有しており、多くの他のレダクターゼタンパク質と同様に、N末端領域に、一個のコンセンサスNAD(P)H結合モチーフを含んでいた（図１および図２）。Bombyx mori pgFARのノーザンブロット解析の結果、その発現は特にフェロモン腺において羽化の少し前に開始することが判明し（図３）、Bombyx mori pgFARがおそらくこの種のフェロモン生合成経路に関与していることが示唆された。さらに、S. cerevisiaeにおける機能的発現実験の結果、Bombyx mori pgFARがアルコールを生成する長鎖FARであり、異なる基質特異性を示すことが確認された（図４から図７）。炭素鎖長14〜20で分析された飽和長鎖脂肪酸中、15: Acidおよび16: Acidが優先的にそれらに対応するアルコールに還元されることが判明した。さらに、不飽和C16脂肪酸を用いた基質特異性の解明により、Bombyx mori pgFARは二重結合の位置および異性体の性質を厳密に認識しており、ボンビコール前駆体E,Z10,12-16:2 Acidに対して強い選択性を示すことを確認した（図６および図７）。最後に、Bombyx mori pgFARを発現する酵母細胞は、Bombyx moriの雄に典型的な交配行動を引き起こした（図８）。これらの知見を総合することにより、Bombyx mori pgFARが、ボンビコールの生合成の脂肪族アシル還元反応に関与するフェロモン腺特異的酵素であり、脂肪酸を最終的アルコール産物であるボンビコールに優先的に還元することを示している。
【００５９】
Bombyx moriの雌は、PBANのホルモンシグナルに反応して、羽化したのちに性フェロモンボンビコールの産生を始めるため(Fonagy, A., Yokoyama, N., & Matsumoto S. (2001) Arthropod Structure and Development 30, 113-123；及びArima, R., Takahara, K., Kadoshima, T., Numazaki, F., Ando, T., Uchiyama, M., Nagasawa, H., Kitamura, A., & Suzuki, A. (1991) Appl.. Ent. Zool. 26, 137-147)、フェロモン産生細胞は羽化迄にフェロモン産生の準備がととのっていなければならず、多数の油滴状顆粒が羽化の1日前に細胞質に急速に蓄積される(Fonagy, A., Yokoyama, N., & Matsumoto S. (2001) Arthropod Structure and Development 30, 113-123；及びFonagy, A., Yokoyama, N., Okano, K., Tatsuki, S., Maeda, S., & Matsumoto, S. (2000) J. Insect Physiol 46, 735-744)。油滴状顆粒の機能は、ボンビコール前駆体脂肪酸をトリアシルグリセロール(TG)の形態で貯蔵することである(Matsumoto S., Fonagy A., Yamamoto M., Wang F., Yokoyama N., Esumi Y., & Suzuki Y. (2002) Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1447-1455)。羽化に伴って、TGのリポリシスが起こり、その結果ボンビコール前駆体脂肪酸が遊離し、さらに脂肪族アシルCoA中間体を経由して還元されてボンビコールとなる(Matsumoto, S., Ozawa, R., Uchiumi, K., & Kurihara, M. (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 369-373)。この経路において、PBANはTGリポリシスおよび脂肪族アシル還元の反応を促進する(Ozawa, R., Ando, T., Nagasawa, H., Kataoka, H., & Suzuki, A. (1993) Biosci. Biotechnol Biochem 57, 2144-2147；及びMatsumoto S., Fonagy A., Yamamoto M., Wang F., Yokoyama N., Esumi Y., & Suzuki Y. (2002) Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1447-1455)。この後者の工程において、pgFARはPBAN制御下の鍵酵素である(Ozawa, R., & Matsumoto, S. (1996) Insect Biochem. Molec. Biol. 26, 259-265)。PBANがBombyx mori pgFARに作用する正確な制御機構はまだ解明されていないが、このペプチドが翻訳レベルまたは翻訳後レベルでこの酵素活性を調節していることは明らかである。なぜなら、Bombyx mori pgFARの発現上昇は、蛹の時期、すなわち、PBANの放出前に起こるからである（図３Ｂ）。アシルCoAデサチュラーゼ相同体並びに2つのアシルCoA結合タンパク質であるpgACBPおよびmgACBPをコードするフェロモン腺特異的遺伝子の発現上昇が、羽化の1日前に起こることは既報の通りである(Yoshiga, T., Okano, K., Mita, K., Shimada, T., Matsumoto, S. (2000) Gene 246, 339-345；及びMatsumoto, S., Yoshiga, T., Yokoyama, N., Iwanaga, M., Koshiba, S., Kigawa, T., Hirota, H., Yokoyama, S., Okano, K., Mita, K., Shimada, T., & Tatsuki, S. (2001) Insect Biochem. Molec. Biol., 31, 603-609)。同様に、Bombyx mori pgFARの発現上昇も羽化の直前に起こるため、フェロモン産生に必要な分子基盤が、調和のとれた機構によりBombyx moriのフェロモン腺で形づくられてきたものと考えられる。
【００６０】
フェロモン前駆体脂肪酸を対応するアルコールへと還元することは、ガの種に関わらず、酸素を含有する性フェロモン成分の生合成における共通の段階である(Tillman, J. A., Seybold, S. J., Jurenka, R. A. & Blomquist, G. J. (1999) Insect Biochem. Molec. Biol. 29, 481-514)。予測とは反対に、本発明では、Bombyx mori pgFARがボンビコール前駆体脂肪酸に対して強い基質特異性を示すことが判明した（図７）。この知見は、異なった種のガに由来する長鎖pgFARが、様々な基質特異性をもつpgFARファミリーを構成することを示唆する。多くのガは、種固有のフェロモン混合物を有し、複数のフェロモン成分の正確な割合は種特異性を規定している(Jurenka, R. A., & Roeolfs, W. L. (1993) Insect Lipids: Cehmistry, Biochemistry, and Biology, eds. Stanley-Samuelson, D. W., & Nelson, D. R., University of Nebraska Press, Lincoln, Nebraska. pp. 353-388)。従って、個々のpgFARの基質特異性が個々のガの種のフェロモン混合物中の成分の正確な割合を規定している可能性を示唆する。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により新規な脂肪族アシル還元酵素遺伝子が提供される。本発明の脂肪族アシル還元酵素を利用して脂肪族アシル還元酵素反応を行うことにより、例えば、性状の異なる多様なワックスを製造することが可能になる。このようなワックスは、潤滑剤、食品、化粧品などの分野で産業上広く使用することができる。
【００６２】
【配列表】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Bombyx mori pgFARのcDNAおよび推定アミノ酸配列である。5'RACEに用いたプライマー配列に対応する領域に下線を引いた。一回目のPCRで得られたC末端部分を枠で囲んで示す。NAD(P)H結合モチーフは二重の下線で示す。
【図２】図２は、Bombyx mori pgFARとその関連タンパク質との複数アライメントである。コンセンサス残基には黒く影を付けてある。NAD(P)H結合モチーフを枠で囲んで示す。BmpgFARはBombyx mori pgFAR、JJFARはホホバFAR（GenBank登録番号AF149917）、AtMS2はArabidopsis thaliana MS2タンパク質（GenBank登録番号X73652）である。
【図３】図３は、Bombyx mori pgFARのノーザンブロット解析の結果を示す。
（A)成体組織における発現。レーン1は頭部、2は脂肪体、3はマルピーギ管、4は飛翔筋、5は卵巣、6は精巣、7はフェロモン腺である。各組織は、新たに羽化した雌のガから切除した（0日）。精巣は、新たに羽化した雄のガから切除した。
（B)フェロモン腺における発現。羽化の前後で雌から切除したフェロモン腺を全RNA抽出に用いた。0日は羽化の日に対応する。
【図４】図４は、TICおよび質量クロマトグラムを用いた酵母細胞抽出物における脂肪アルコールのGC/MS解析である。
（A)pESC-LEU-FARにより形質転換した酵母細胞。
（B)pESC-LEUにより形質転換した対照酵母細胞。
（C)pESC-LEU-FARにより形質転換し、D3標識したパルミチン酸と共にインキュベートした酵母細胞。
凍結乾燥した酵母細胞からn-ヘキサンにより脂肪族アルコールを抽出した。
m/z 227およびm/z 224のフラグメントイオンは、D3標識したヘキサデカノール(D3-16：OH)およびヘキサデカノール(16:OH)の[M-18]+にそれぞれ対応する。
【図５】図５は、TICおよび質量クロマトグラムを用いた酵母細胞抽出物における脂肪アルコールのGC/MS解析である。pESC-LEU-FARにより形質転換した酵母細胞を0.5mMの飽和C14〜C18脂肪酸の存在下でインキュベートした。
（A)14: Acid。m/z 196は14:OHの[M-18]+に対応する。
（B)15: Acid。m/z 210は15:OHの[M-18]+に対応する。
（C)17: Acid。m/z 238は17:OHの[M-18]+に対応する。
（D)18: Acid。m/z 252は18:OHの[M-18]+に対応する。
【図６】図６は、TICおよび質量クロマトグラムを用いた酵母細胞抽出物における脂肪アルコールのGC/MS解析である。pESC-LEU-FARにより形質転換した酵母細胞を0.5mMのモノ-エンC16脂肪酸の存在下でインキュベートした。
（A)Z11-16:1 Acid
（B)E11-16:1 Acid
（C)Z9-16:1 Acid
（D)E9-16:1 Acid
m/z 222は16:1 OHの[M-18]+に対応する。
【図７】図７は、E,Z10,12-16:2 Acidのボンビコールへの変換である。pESC-LEU-FARにより形質転換した酵母細胞をC16脂肪酸の存在下でインキュベートした。
（A) 0.5mM E,Z10,12-16:2 Acid
（B) 0.25 mM E,Z10,12-16:2 AcidとE,E10,12-16:2 Acidとの1：1混合物
（C) 0.5 mM E,Z10,12-16:1 AcidとZ11-16:1 Acidとの1：1混合物。
【図８】図８は、Bombyx mori pgFARを発現する酵母細胞によって引き起こされる雄のBombyx moriの交尾行動である。酵母細胞を、0.5 mM E,Z10,12-16:2 Acidの存在下でインキュベートした。
（A)形質転換した酵母細胞を含むバイアルの揮発性内容物に露出する前
（B〜E)キャップ除去後の最初の3分間における雄のガの一連の行動
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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