(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラムノース、フェノールレッド、酵素発色基質、亜テルル酸塩およびセフィキシムを含有する培地であって、酵素発色基質がＸ−Ｇｌｃおよび／またはＸ−Ｇａｌであることを特徴とする大腸菌Ｏ２６分離用培地。
【請求項２】
さらに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする請求項１に記載の大腸菌Ｏ２６分離用培地。
【請求項３】
培地 １，０００ｍＬあたり、ペプトン５−１５ｇ、酵母エキス２−５ｇ、塩化ナトリウム０．１−１０ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．０５−０．５ｇ、Ｘ−Ｇｌｃ０．０５−０．５ｇおよび／またはＸ−Ｇａｌ０．０５−０．５ｇ、ラムノース１−２０ｇ、亜テルル酸カリウム１−５ｍｇ、セフィキシム０．００５−０．１ｍｇ、フェノールレッド０．０１−０．１ｇ、寒天１０−２０ｇを含有する大腸菌Ｏ２６分離用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は食中毒菌である腸管出血性大腸菌血清型Ｏ２６（大腸菌Ｏ２６）の分離用培地に関するものである。
【０００２】
なお、本発明では次の略語を使用することがある。また、−Ｇｌｃで表される酵素発色基質は、グルクロン酸体および適当な塩を含むものとする。
【略語表】
Ｘ−Ｇｌｃ：5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucopyranoside
Ｘ−Ｇａｌ：5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranoside
Ｂｌｕｏ−Ｇｌｃ：5-Bromo-3-Indolyl-β-D-Glucopyranoside
Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ：5-Bromo-3-Indolyl-β-D-Galactopyranoside
ＭＵ−Ｇｌｃ：4-Methyl-Umbelliferyl-β-D-Glucopyranoside
ＭＵ−Ｇａｌ：4-Methyl-Umbelliferyl-β-D-Galactopyranoside
ＯＮＰ−Ｇｌｃ：o-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranoside
ＯＮＰ−Ｇａｌ：o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside
Ｍａｇｅｎｔａ−Ｇｌｃ：5-Bromo-6-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucopyranoside
Ｍａｇｅｎｔａ−Ｇａｌ：5-Bromo-6-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranoside
Ｓａｌｍｏｎ−Ｇｌｃ：6-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucopyranoside
Ｓａｌｍｏｎ−Ｇａｌ：6-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranoside
【０００３】
【従来の技術】
大腸菌Ｏ２６は腸内細菌科に属し、グラム陰性、通性嫌気性の無芽胞桿菌であり、菌体表面にある抗原構造によって通常の大腸菌と区別される。大腸菌Ｏ２６による食中毒は、本菌に汚染された食肉、牛乳、卵及びこれらの加工食品を摂取し、腸管内で増殖することによって起こる感染型食中毒で、大腸菌Ｏ２６食中毒は増加の傾向にあるとされている。
【０００４】
大腸菌Ｏ２６の検出は一般的には以下のように行われている。まず、検体をマッコンキー寒天培地（ＭＡＣ）、デソキシコーレイト寒天培地（ＤＥＳＯ）などの腸内細菌選択培地に塗抹する。３７℃、１８−２４時間培養し、平板培地上の集落を観察する。さらに平板培地上の大腸菌と思われる集落を釣菌し、大腸菌同定キットや生化学性状検査鑑別培地に接種し、３７℃、１８−２４時間培養し同定する。大腸菌と同定されたのち、これらの集落や増菌された菌を用いて、抗血清による免疫学的試験により血清型Ｏ２６であることを確認する。菌数の少ない場合は、分離培養の前にｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥＣ（ｍＥＣ）培地やＥＣ培地による増菌培養を行う場合がある。
【０００５】
このように従来の大腸菌Ｏ２６検出法は熟練された技術と３〜５日間の長時間が必要であるという問題があった。また、前述した各種の選択分離培地は大腸菌のみの選択分離を目的としたものではなく、そのほとんどの培地では多くの腸内細菌が発育する。
それ故、このような選択分離培地から大腸菌を疑う菌株を鑑別するには熟練と経験が必要であり、大腸菌と確認された後さらに血清型を特定する必要がある。通常検査される材料中には食中毒の原因となる大腸菌Ｏ２６と同時に通常の大腸菌が混在している場合が多く、そのため多くの集落を釣菌して確認する必要があり、原因菌の特定は困難を極めている。従って、大腸菌Ｏ２６のみを鑑別できる選択分離培地での所見で大腸菌Ｏ２６の有無が判断できれば、汚染された食材や食品を早期に排除でき、また食中毒患者の早期診断が可能になる。大腸菌Ｏ２６を短時間で検出し、汚染された食品や加工原料を排除することは、食品会社や一般消費者にとって重要な問題であり、また食中毒患者の糞便等の検体より、原因菌を迅速に発見することは、患者の早期治療の一助となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、食品をはじめとする種々の検体中の大腸菌Ｏ２６を、特殊な熟練や技術を必要とせず、短時間にかつ容易にまた正確に検出できる特定の培地組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
従来、細菌の識別にその菌が保有する酵素を利用する方法が知られている。それはその酵素により分解され、色素を発生する酵素発色基質を用いる方法である。
例えば、１９７５年、１９７６年に発表された文献[1][2]には、細菌由来の酵素により分解されて黄色の色素であるオルトニトロフェノールを発生するＯＮＰ−ＧａｌやＯＮＰ−Ｇｌｃ、蛍光性色素であるメチルウンベリフェロンを発生するＭＵ−ＧａｌやＭＵ−Ｇｌｃを酵素発色基質として添加した酵素発色基質培地の記載があり、大腸菌等の微生物の識別に用いられている。
また、米国特許３８７０６０１号、特開昭６４−２５９６号、特開平４−５１９００号等にはＭａｇｅｎｔａ−Ｇａｌ、Ｘ−Ｇｌｃ、Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ、Ｘ−Ｇａｌ等の酵素発色基質を添加した腸内細菌識別用培地が記載されている。
しかしながら、酵素発色基質を大腸菌Ｏ２６の分離用・鑑別用に用いた培地の例は未だ報告されていない。
[1] J. Clin. Pathol. (1975), 28(8), 686-7
[2] ACTA PATHOL. MICROBIOL. SCAND. SECTION B, (1976 Oct) 84B (5) 245-51.
【０００８】
かかる実状において本発明者は、大腸菌Ｏ２６は他の大腸菌と同様にグルコシダーゼおよびガラクトシダーゼを保有するが、大腸菌Ｏ２６は他の大腸菌とは異なりラムノース分解能を有さないことに注目し、この性質とｐＨ指示薬および酵素発色基質とを組み合わせることにより、鋭意努力の結果、本発明を完成した。つまり、大腸菌Ｏ２６では、培地中のラムノースが分解されないため、ｐＨ指示薬は中性色を示し、また、保有している酵素により、酵素発色基質は分解され発色するが、見かけ上の色はｐＨ指示薬の中性色と基質の発色との相加された発色となる。
通常の大腸菌では、培地中のラムノースが分解され酸を生成するため、ｐＨ指示薬は酸性色を示し、保有している酵素により、酵素発色基質は分解され発色するが、見かけ上の色はｐＨ指示薬の酸性色と基質の発色との相加された発色となる。
この２者の相加された発色の違いにより本発明では大腸菌Ｏ２６を分離鑑別する。
本発明に用いる基礎培地としては糖分解能によって腸内細菌を鑑別するＳＳ寒天培地、マッコンキー寒天培地、ＤＨＬ寒天培地、デソキシコーレート寒天培地等が使用可能である。
【０００９】
（１)本発明はラムノース、ｐＨ指示薬、および酵素発色基質を含有する大腸菌Ｏ２６分離用培地である。
（２)ｐＨ指示薬としては中性色と酸性色が異なる指示薬が本発明に使用可能であり、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモフェノールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッドよりなる群から選ばれるｐＨ指示薬が本発明には適している。
（３)その中でもｐＨ指示薬としてはフェノールレッドが最適である。
（４)酵素発色基質はグルコピラノシド誘導体またはガラクトピラノシド誘導体より選ばれ、グルコピラノシド誘導体はグルクロニダーゼにより分解され、ガラクトピラノシド誘導体はガラクトシダーゼにより分解され、発色が起こる。なお、本発明では発蛍光性の基質、例えばＭＵ−Ｇａｌ、ＭＵ−Ｇｌｃも酵素発色基質として取り扱う。
（５)また酵素発色基質としてインドリル誘導体も本発明には有用である。インドリル誘導体は酵素により分解され酸化され、対応するインドリル色素、例えばＸ−Ｇａｌ・Ｘ−Ｇｌｃであれば、青色のブロモクロロインジゴを発生する。
（６）酵素発色基質はＸ−Ｇｌｃ、Ｘ−Ｇａｌ、Ｂｌｕｏ−Ｇｌｃ、Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ、ＭＵ−Ｇｌｃ、ＭＵ−Ｇａｌ、ＯＮＰ−Ｇｌｃ、ＯＮＰ−Ｇａｌ、Ｓａｌｍｏｎ−Ｇｌｃ、Ｓａｌｍｏｎ−Ｇａｌよりなる群より選ばれ、１種でも複数でも構わない。
（７)さらに本発明の培地に炭素数が１０〜３０のアニオン性界面活性剤を１種または２種以上を添加すると本発明の選択性が増す。
（８)アニオン性界面活性剤としては胆汁酸塩類およびアルキル硫酸塩類より選ばれ、より具体的には胆汁末、コール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等が本発明には好ましい。
（９)さらに選択剤として亜テルル酸塩を添加すると本発明の選択性が増す。
（１０)さらに選択剤としてセフィキシムを添加すると本発明の選択性が増す。
（１１)より具体的には本発明は、培地 １，０００ｍＬあたり、ペプトン５−１５ｇ、酵母エキス２−５ｇ、塩化ナトリウム０．１−１０ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．０５−０．５ｇ、Ｘ−Ｇｌｃ０．０５−０．５ｇおよび／またはＸ−Ｇａｌ０．０５−０．５ｇ、ラムノース１−２０ｇ、亜テルル酸カリウム１−５ｍｇ、セフィキシム０．００５−０．１ｍｇ、フェノールレッド０．０１−０．１ｇ、寒天１０−２０ｇを含有する大腸菌Ｏ２６分離用培地である。
Ｘ−Ｇｌｃ／Ｘ−Ｇａｌは単独で使用しても良いし、両方を使用しても良い。
【００１０】
【作用】
本発明の培地の作用を上記（１１）記載の培地組成に従って説明する。
本発明は大腸菌Ｏ２６の有するラムノース非分解能、ガラクトピラノシド分解能およびグルコピラノシド分解能を利用し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを用いることで暗緑色から暗紫色の集落の有無により大腸菌Ｏ２６を鑑別すること原理としている。
【００１１】
血清型Ｏ２６以外の大腸菌の多くは培地に添加したラムノースを分解して酸を産生する。通常使用される培地のｐＨは中性（７）付近であり、ｐＨ指示薬として添加したフェノールレッドにより培地色は朱〜赤色を呈している。ラムノースを分解する大腸菌は培地中のラムノースを分解し、培地のｐＨを低下させるため、それらの菌の集落及び集落周辺部は黄色に変色する。
しかし、大腸菌Ｏ２６のようなラムノース非分解菌は酸を産生しないため培地ｐＨの低下はなく、むしろ菌の発育による培地中のペプトンの分解物によりｐＨが上昇することから、集落はより赤色が強くなり、集落周囲の培地色も赤色にとどまる。
添加するラムノース量は培地１Ｌあたり１〜２０ｇが適当であり、フェノールレッド量は０．０１〜０．１ｇが適当である。
【００１２】
一般に血清型Ｏ２６を含む大腸菌は、ガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼを保有し、酵素発色基質を分解し、色素を発生させる。本発明に用いるＸ−Ｇｌｃは、血清型Ｏ２６を含む大腸菌により特異的に分解され、青色を呈する。同様にＸ−Ｇａｌも血清型Ｏ２６を含む大腸菌群の菌により特異的に分解され青色を呈する。この場合、上述のように大腸菌Ｏ２６はラムノースを分解しないため集落と集落周囲の培地色は赤色になり、この色の上にＸ−ＧａｌあるいはＸ−Ｇｌｃの分解による青色が重なり、集落色は暗緑色から暗紫色を呈する。一方、大腸菌Ｏ２６以外のラムノース分解性大腸菌の集落及び集落の周囲の色は黄色になり、この黄色にＸ−ＧａｌあるいはＸ−Ｇｌｃの分解による青色が重なり淡緑色から緑色の集落を呈する。また、大腸菌以外のＸ−ＧａｌあるいはＸ−Ｇｌｃを分解できない菌はその菌のラムノース分解能の有無により、黄色あるいは赤色の集落になり、大腸菌Ｏ２６と容易に鑑別ができる。つまり、本発明の培地上では、大腸菌Ｏ２６、その他の大腸菌、ラムノース分解菌、ラムノース非分解菌でそれぞれのコロニーの発色が異なるので、各菌の分離鑑別が容易である。Ｘ−Ｇａｌ、Ｘ−Ｇｌｃは単独でも併用しても良い。添加するＸ−Ｇａｌ、Ｘ−Ｇｌｃの量は培地１Ｌあたり０．０５〜０．５ｇが適当である。
【００１３】
本発明では培地中にアニオン性界面活性剤を添加することにより、バチラス等のグラム陽性菌の発育を抑制している。本培地に有用なアニオン性界面活性剤としては、デスオキシコール酸等の胆汁酸塩類、及びラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩が挙げられる。
【００１４】
本培地では選択剤亜テルル酸カリウムの添加で、血清型Ｏ２６以外の大腸菌の発育を抑制している。なお、本培地に添加する亜テルル酸カリウム量は培地１Ｌあたり１〜５ｍｇが適当である。
【００１５】
本培地では選択剤セフィキシムの添加で、腸内細菌であるプロテウス属菌の発育を抑制している。なお、本培地に添加するセフィキシム量は培地１Ｌあたり０．００５〜０．１ｍｇが適当である。これ以下ではプロテウス属菌の発育を抑えられず、またこれ以上では大腸菌Ｏ２６も抑制される。
【００１６】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００１７】
実施例１  本培地および従来培地の作成
以下に示す組成の本発明の培地（本培地）、デソキシコーレイト寒天培地（ＤＥＳＯ）、ラムノース加マッコンキー寒天培地（Ｒ−ＭＡＣ）を作成した。各組成に精製水を加え全量を１０００ｍＬとした。加熱溶解後、約５０℃に冷却しシャーレに２０ｍＬずつ分注し、平板を作成した。
【００１８】
【組成１】
本培地の組成 (培地 １，０００ｍＬあたり)
───────────────────
ペプトン                       １２ｇ
酵母エキス                       ３ｇ
塩化ナトリウム                   ５ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム       ０．１ｇ
Ｘ−Ｇａｌ                   ０．１ｇ
Ｘ−Ｇｌｃ                   ０．１ｇ
ラムノース                     １０ｇ
亜テルル酸カリウム           ２．５ｍｇ
セフィキシム               ０．０１ｍｇ
フェノールレッド           ０．０５ｇ
寒天                           １５ｇ
───────────────────
ｐＨ７．２±０．２
【００１９】
【組成２】
ＤＥＳＯ培地組成 (培地 １，０００ｍＬあたり)
───────────────────
ペプトン                       １０ｇ
乳糖                           １０ｇ
デスオキシコール酸ナトリウム     １ｇ
塩化ナトリウム                   ５ｇ
リン酸二カリウム                 ２ｇ
クエン酸塩鉄アンモニウム         ２ｇ
中性紅                   ０．０３３ｇ
寒天                           １５ｇ
───────────────────
ｐＨ７．２±０．２
【００２０】
【組成３】
Ｒ−ＭＡＣ培地組成 (培地 １，０００ｍＬあたり)
───────────────────
ペプトン                       ２０ｇ
ラムノース                     １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ．２             １．５ｇ
塩化ナトリウム                   ５ｇ
中性紅                     ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット   ０．００１ｇ
寒天                           １５ｇ
───────────────────
ｐＨ７．０±０．２
【００２１】
実施例２  本培地および従来培地による大腸菌Ｏ２６の分離
（１）試験菌
社内保存の血清型Ｏ２６の大腸菌９菌株、その他の血清型の大腸菌５菌株および大腸菌以外の腸内細菌８菌種１０株を用いた。使用した菌種名と各培地での集落の発色は「表１」に記載した。
（２）接種及び判定
ハートインフュジョンブイヨンで１夜培養した試験菌を実施例１で作成した各培地に１白金耳量塗抹し、３７℃で１６時間培養後、出現した集落を観察した。結果を表１に示した。
【００２２】
（３）結果
【表１】
0004334067.tif 000002
0004334067.tif 000003
【００２３】
表１より、試験した大腸菌Ｏ２６はすべて本培地上で暗紫色の集落を形成し、Ｏ２６以外の血清型の大腸菌および大腸菌以外の腸内細菌とはそれぞれ発色が異なり、鑑別がついた。
デソキシコーレイト寒天培地（ＤＥＳＯ）では、乳糖非分解性のセラチア、プロテウス以外の菌は全て赤色集落を形成し、大腸菌Ｏ２６の鑑別はできなかった。
ラムノース分解能を利用したラムノース加マッコンキー寒天培地（Ｒ−ＭＡＣ）では、大腸菌Ｏ２６とその他の大腸菌の鑑別はできたが、大腸菌以外の腸内細菌のうちラムノース非分解菌（Serratia marcescens、Proteus mirabilis、P.vulgaris）は透明の集落を形成し、大腸菌Ｏ２６との鑑別はできなかった。
【００２４】
実施例３  食材からの大腸菌Ｏ２６の検出
大腸菌Ｏ２６の汚染を想定した牛挽肉４検体を使用した。牛挽肉２５ｇをｍＥＣブロス２２５ｍＬと混和し、３５℃１８時間前培養し、その培養液を本培地、デソキシコーレイト寒天培地、およびラムノース加マッコンキー寒天培地に１白金耳量塗抹し、３７℃で１６時間培養後、出現した集落を観察し、各培地で大腸菌Ｏ２６と思われる集落を釣菌した。具体的には本培地では暗紫色の集落を、デソキシコーレイト寒天培地では乳糖分解菌を大腸菌として釣菌した。ラムノース加マッコンキー培地ではラムノース非分解菌として透明の集落を釣菌した。
各培地から釣菌した１〜１０個の集落をそのまま用いて、生化学性状検査および抗血清検査を行い、大腸菌Ｏ２６の同定を行った。
判定は釣菌した集落のほとんどが大腸菌Ｏ２６であった場合をＡ、大腸菌Ｏ２６として同定するのにいくつかの集落の試験が必要で、釣菌した集落のうち一部が大腸菌Ｏ２６と確認されるように検出が困難であった場合をＢ、大腸菌Ｏ２６を検出できなかった場合をＣとして判定を行った。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0004334067.tif 000004
【００２６】
得られた集落を生化学性状検査および大腸菌Ｏ２６抗血清で確認したところ、本培地で大腸菌Ｏ２６と思われた集落から釣菌した菌株はすべて大腸菌Ｏ２６であった。
ラムノース加マッコンキー寒天培地（Ｒ−ＭＡＣ）でもすべての検体から本菌を検出することができたが、そのうち３検体は判定Ｂを示し、釣菌した菌の大部分が大腸菌Ｏ２６以外の菌であった。
デソキシコーレイト寒天培地（ＤＥＳＯ）では１検体のみから大腸菌Ｏ２６を検出でき（判定Ｂ）、この場合も釣菌した菌の大部分が大腸菌Ｏ２６以外の菌であった。デソキシコーレイト培地上で大腸菌Ｏ２６を疑って釣菌したにもかかわらず大腸菌Ｏ２６ではなかった菌（判定Ｃ）は、その後の確認試験の結果より、他の血清型の大腸菌であった。
従って、本発明の培地の使用により、１回の選択分離培養で食材由来の大腸菌Ｏ２６が検出可能となった。
【００２７】
【発明の効果】
従来の大腸菌Ｏ２６の検出は熟練された技術と３〜５日間の長時間が必要であった。これは大腸菌Ｏ２６用の選択分離培地はなく、一般の腸内細菌あるいは大腸菌の検出を目的とした培地を使わざるを得なく、このような培地では大腸菌Ｏ２６のみではなく、Ｏ２６以外の大腸菌を含む多くの腸内細菌が発育するためであった。そのため従来の選択分離培養では、疑わしい集落を出来るだけ多く釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清試験により大腸菌Ｏ２６のスクリーニングあるいは同定を行い、大腸菌Ｏ２６を疑う集落を鑑別するには多くの経験と熟練が必要であった。
しかし、本培地を用いることでそうした経験などを必要とせず非常に高い確率で大腸菌Ｏ２６の検出が可能になり、また、大腸菌Ｏ２６以外の菌の試験に要していた試薬類、操作の手間と時間も削減できる。
【００２８】
さらに本培地では一回の選択分離培養により、暗緑色から暗紫色集落の有無で大腸菌Ｏ２６の存在が簡単に判断できるので、汚染された食材や食品を早期に排除でき、また品質管理期間の短縮により賞味期間も延長可能で食品流通の経済性に大きく貢献できる。
また、糞便検査や嘔吐物の検査に用いれば、大腸菌Ｏ２６による食中毒患者の早期診断が可能になることから、早期に有効な治療の一助ともなる。