(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片、配列表配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片、または配列表配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片をそれぞれ結合してなる一本鎖Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖと称することもある）遺伝子。
【請求項２】
当該ＶＨ鎖及び当該ＶＬ鎖が、それぞれ、ヒト血液凝固第VIII因子（以下、ＦVIIIと称することもある）の凝固活性を阻害する活性（インヒビター活性）を有し、ＦVIII−フォンビルブランド因子（以下、ｖＷＦと称することもある）複合体を認識せず、ｖＷＦに結合していないＦVIIIのみを認識するヒト抗ＦVIII抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖である、請求項１に記載のｓｃＦｖ遺伝子。
【請求項３】
配列表配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片、配列表配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片、または配列表配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子と結合してなるヒト抗ＦVIII抗体をコードする遺伝子断片。
【請求項４】
当該ＶＨ鎖及び当該ＶＬ鎖が、それぞれ、ヒト血液凝固第VIII因子の凝固活性を阻害する活性（インヒビター活性）を有し、ＦVIII−フォンビルブランド因子複合体を認識せず、ｖＷＦに結合していないＦVIIIのみを認識するヒト抗ＦVIII抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖である、請求項３に記載の遺伝子断片。
【請求項５】
配列表配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片、配列表配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片、または配列表配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び配列表配列番号１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ１ドメイン遺伝子またはＣＨ１ドメイン遺伝子とヒンジ領域遺伝子、及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子 と結合してなるヒト型抗ＦVIII抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項６】
当該ＶＨ鎖及び当該ＶＬ鎖が、それぞれ、ヒト血液凝固第VIII因子の凝固活性を阻害する活性（インヒビター活性）を有し、ＦVIII−フォンビルブランド因子複合体を認識せず、ｖＷＦに結合していないＦVIIIのみを認識するヒト抗ＦVIII抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖である、請求項５に記載の遺伝子断片。
【請求項７】
当該抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、またはＦ(ａｂ')2から選ばれる請求項５または６に記載の遺伝子断片。
【請求項８】
請求項１または２に記載の一本鎖Ｆｖ遺伝子を、ヒト抗体ＣＨ１ドメイン遺伝子、ヒンジ領域遺伝子とＣＨ２ドメイン遺伝子とＣＨ３ドメイン遺伝子、またはヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子 と結合してなるヒト型抗ＦVIII抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の遺伝子断片を発現ベクターに組込み、遺伝子組換え法により発現されるヒト抗ＦVIII抗体またはヒト型抗ＦVIII抗体フラグメント。
【請求項１０】
請求項９に記載のヒト抗ＦVIII抗体またはヒト型ＦVIII抗体フラグメントを用いた活性化ＦVIII診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（以下、ＦＶＩＩＩと称することもある）に結合し、特異的にその血液凝固活性を阻害するヒト型抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体及び抗体フラグメントの提供に関する。
背景技術
血友病Ａは、ＦＶＩＩＩの異常または欠失により血液の凝固作用が弱まった結果、内蔵や関節等に出血を起こす遺伝性疾患である。血友病Ａの患者の治療にはＦＶＩＩＩの補充療法が行われるが、補充療法を受けた患者のうちのおよそ１０％（８〜１５％）ぐらいにＦＶＩＩＩに対する抗体の出現が観察される。この抗体は抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体と呼ばれ、凝固因子補充療法を無効にし、血友病患者の止血管理を著しく困難にする。
これらの抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の性状と産生機構を明らかにすることは、インヒビター抗体産生抑制、制御を可能にすると考えられる。これまで抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体が出現した血友病患者の血清より精製した抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体（ポリクローナル抗体）やマウス抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体（マウスモノクローナル抗体）を用いた研究により、多くの知見が得られているが、患者由来の抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体のクローニングはこれまで殆ど報告されていない。
一方、疫学的な調査から、血友病患者は心筋梗塞などの動脈硬化症の発症率が低い（特に致死的な心筋梗塞発症率が有意に低い）こと（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍｏｔｏｌ．１９９０，７５，５２５−５３０、Ｌａｎｃｅｔ  １９９５，３４５（８９４３）１５２−１５５）、血漿中のＦＶＩＩＩの増加が動脈梗塞症や動脈硬化のリスクファクターとなる（Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９７，３４，１７１−１８７、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９７，８４，３５９−３６２）ことが明らかにされており、抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体等を用いて低凝固状態の保持ができれば動脈梗塞症や動脈硬化の予防及び治療に寄与する事が期待される。特に、フォンビルブランド因子（以下、ｖＷＦと称することもある）と解離した活性化ＦＶＩＩＩを特異的に認識できる抗ＦＶＩＩＩ抗体は、通常血中にｖＷＦと結合した状態で存在するＦＶＩＩＩと複合体を形成しないため血中クリアランスが長く、１回の投与で長期間低凝固状態を維持でき、かつ出血傾向や他の副作用の少ない優れた抗血栓治療薬として使用することができる。
既に我々を含め多数の施設でマウスモノクローナル抗体の作製が試みられ、多くのＦＶＩＩＩに対するモノクローナル抗体が生み出されている。それらの内のいくつかはＦＶＩＩＩの活性を阻害し、抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体として振る舞うことが確認されている。これらのマウスモノクローナル抗体を用いてＦＶＩＩＩの活性阻害領域の解析等多くの成果が得られてきた。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
しかし、完全ヒト型の抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の作製は、多数の施設で、抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体保有患者のリンパ球を用いてハイブリドーマ法（ヒトマウス、ヒトヒトハイブリドーマ法）やＥＢトランスフォーム法を用いて１０年以上に渡り検討が行われてきたが困難を究めてきた。
１９９８年になって、Ｍａｒｃ  Ｇ．Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ等がＥＢトランスフォーム法を用いて初めてその確立を報告した（Ｂｌｏｏｄ，９２（２），１９９８，４９６−５０６）。彼らが確立したＢＯ２Ｃ１１抗体はＦＶＩＩＩとｖＷＦやリン脂質との結合を阻害し、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインを認識すると考えられ、その抗体はＤＰ５フラグメント由来のＶＨとＶκ３由来のＶＬであった。彼らはまた同様の方法でＣ１ドメインに対する抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体産生クローンの確立にも成功し、その抗体がＤＰ６４とＶκ３由来であることを報告した（Ｂｌｏｏｄ，９５，２０００，１５６−１６３）。ハイブリドーマ法（ヒトマウス、ヒトヒトハイブリドーマ法）やＥＢトランスフォーム法でこの様なヒト由来抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体産生クローンを確立しているのは現在、Ｍａｒｃ  Ｇ．Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ等のグループのみである。
一方、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓ等が報告したファージ抗体法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２，５８１−５９７，１９９１）は、従来のハイブリドーマ法やＥＢトランスフォーム法に比べ、患者のリンパ球由来の抗体レパトアを短期間にしかも多くのクローンをスクリーニングできる利点を有している。近年になってこのファージ抗体法によるインヒビター抗体単離のアプローチも試みられてきた。１９９５年６月の国際血栓止血学会（イスラエル）（１９９５，ＩＳＴＨ）においてＷ．Ｈ．Ｏｕｅｈａｎｄらは、健常人由来ヒト型ファージ抗体ライブラリー及び合成ヒト型ファージ抗体ライブラリーからヒト型抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をクローニングしたことを、また、１９９７年６月の国際血栓止血学会においてＪ．Ｄａｖｉｓらは、ＶＨのみ血友病患者由来で、ＶＬは健常人由来であるヒト型ファージ抗体ライブラリーからヒト型抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をクローニングしたことを報告している。しかし、これらは合成や半合成でヒト型ファージ抗体ライブラリーを構築しており、ＶＨ、ＶＬとも完全に血友病患者由来ではない。更に、これらの報告で得られたクローンはＥＬＩＳＡによりＦＶＩＩＩへの結合性は有しているが、ＦＶＩＩＩの凝固活性を阻害することは確認されていない。更に２０００年には、Ｅ．Ｎ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ等が、ＶＬ鎖が正常人由来、ＶＨ鎖がインヒビター保有患者由来のファージ抗体ライブラリーを構築し、４種のＦＶＩＩＩ反応性のクローンを分離し、２種がＦＶＩＩＩのＣ２ドメインを、２種がＡ２ドメインと反応性を有することを報告している（ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｒｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ＶＨ１  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ（Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：５５８−５６３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｖ  ｇｅｎｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｉｄｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａ２  ｄｏｍａｉｎ（Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：５４０−５４５））。
Ｃ２ドメインは、ｖＷＦとの結合やリン脂質との結合に関与し、患者血中の多くの抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の主要な認識領域であることが報告されている（Ｈｅａｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．等、Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３  ｃｏｎｔａｉｎ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２，３７０１−３７０９）。
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ等の研究では、Ｃ２ドメインに対する抗体フラグメントが得られているが、その抗体フラグメントはＦＶＩＩＩの阻害活性を有さなかった。従って、ファージ抗体法を用いて、インヒビター活性を有するヒト型抗ＦＶＩＩＩ抗体の分離にはいまだ成功例がなく、充分な知見が得られていない状況である。
（その解決方法）
従来、ファージ抗体法を用いてインヒビター活性を有するヒト型抗ＦＶＩＩＩ抗体の分離ができなかったのは、抗体フラグメントのＶＬ鎖を患者由来のものを用いていないことや、スクリーニング方法に課題があるためと推定された。
発明者等はこれらの問題を鋭意研究、解決の結果、ＦＶＩＩＩに対して明らかな特異性と阻害活性を有する新規な抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体を患者リンパ球よりファージ抗体法を用いて分離することに成功し、その特異的な抗体ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を明らかにした。
発明を実施するための最良の形態
ヒト抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の可変（Ｖ）領域に関する情報を得るために、まず本発明者らは、抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体を有する血友病Ａ患者の末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて、免疫グロブリン重鎖、軽鎖ｃＤＮＡを増幅、更に両者を１ｉｎｋｅｒ  ＤＮＡで結合し、患者リンパ球由来のＶＨ鎖とＶＬ鎖のランダムな組み合わせによる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ＤＮＡを作製した。
このｓｃＦｖ  ＤＮＡをｐｈａｇｅｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、１０７クローンからなる血友病Ａ患者由来のｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製した。このライブラリーを、抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体を介して固相に固定化されたＦＶＩＩＩと反応させて、ＦＶＩＩＩと結合可能な抗ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖディスプレイファージクローンをスクリーニングした。
当該抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体は、定法により作製されるもので、マウスモノクローナル抗体が使用される。また、当該抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体は、このましくはＦＶＩＩＩのＡ２領域もしくは活性化ＦＶＩＩＩのＬ鎖の立体構造依存性エピトープを認識する抗体であることが好ましい。このような抗体を使用することにより、ＦＶＩＩＩを立体構造に大きな変化を与えることなく固相化担体上に保持することが可能となる。従って、このスクリーニング系では各々の抗ＦＶＩＩＩマウスモノクローナル抗体が認識するエピトープ以外を認識する抗ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖを呈示したファージクローンが得られることになる。
また、当該モノクローナル抗体をビオチンで標識し、更に固相としてアビジン固定化磁性粒子を使用することにより、ヒトＦＶＩＩＩと結合可能な抗ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖディスプレイファージクローンを容易に回収することができる。
ビオチン化した抗ＦＶＩＩＩマウスモノクローナル抗体を用いることにより、精製したＦＶＩＩＩを必要とせず、また微量のＦＶＩＩＩでスクリーニングを行うことが可能となる。
スクリーニングの結果、７種類の抗ＦＶＩＩＩ結合能を有するｓｃＦｖクローンが分離され、その内、３種がＦＶＩＩＩ凝固活性を阻害した。得られた３種のクローンのＶＨ遺伝子はいずれもＶＨ１ファミリーのＤＰ−５（１−２４）由来、ＶＬ遺伝子はＶκ１ファミリーのＤＰＫ９（０１２／０２）由来であった。他の４種のクローンのＶＨはＶＨ１ファミリーのＤＰ−８８或いは４Ｍ２８由来、ＶＬはＤＰＫ２２、Ｖｇ、ＤＰＫ９、ＩＧＬＶ６Ｓ１由来であり、阻害活性を有するクローンと異なっていた。ＦＶＩＩＩ凝固活性を有するクローンのＶＨはＭａｒｃ  Ｇ．Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ等と同様のＤＰ−５セグメント由来であったが、ＶＨのＣＤＲ３の配列は大きく異なっていた。また、これらのクローンのＶＬ鎖のＣＤＲ３配列内のセリンもしくはスレオニンのグルタミンへの変異で、これらのクローンのＦＶＩＩＩ結合活性が殆ど消失することことから、これらのクローンのＦＶＩＩＩへの結合にはＶＬ鎖のＣＤＲ３が重要な役割を果たしていることを明らかにした。
得られた３種のクローン（ＹＫ３．３．３８、ＹＫ３．３．４０、ＹＫ３．３．５０）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の塩基配列並びにアミノ酸配列を配列表に示した。ＹＫ３．３．３８のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を配列番号１〜２及び配列番号３〜４に、ＹＫ３．３．４０のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を配列番号５〜６及び配列番号７〜８に、ＹＫ３．３．５０のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を配列番号９〜１０及び配列番号１１〜１２にそれぞれ示した。
更に、当該配列中、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ１からＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１３から１８に示した。なお、ＣＤＲ１、２、３の定義はＫａｂａｔの分類による（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ（１９８７））。
［ＶＨ鎖］
0004205576.tif 000002
［ＶＬ鎖］
0004205576.tif 000003
上述した配列番号１〜２及び３〜４、５〜６及び７〜８、９〜１０及び１１〜１２に記載の塩基配列及びアミノ酸配列は、ヒトＦＶＩＩＩの凝固活性に対して阻害活性を有するヒト抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体のＶ領域の重鎖（ＶＨ鎖）及び軽鎖（ＶＬ鎖）に相当するものである。
本発明で開示されるＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いてｓｃＦｖの形で得られた物であるが、原則としてその適用はｓｃＦｖに限定されることはなく、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常部と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常部の一部と組み合わせたＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、更に、ｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンの定常部と結合させた一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）などの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。
また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も同様である。
また、本発明により得られる抗体フラグメントの性状解析の結果、その認識するＦＶＩＩＩのエピトープはＦＶＩＩＩをＳＤＳ処理することによって消失した。更に、これらの抗体フラグメントが結合したＦＶＩＩＩはリン脂質やｖＷＦと結合できなかった。従って、これらの抗体フラグメントは血中に流れているｖＷＦと結合したＦＶＩＩＩには結合せず、ｖＷＦから解離して活性化型となったＦＶＩＩＩとのみ結合する特性を有している。
これらの抗体フラグメントは、患者プラズマ由来のインヒビター抗体と競合する。従って、これらの抗体フラグメントは患者のインヒビター抗体と同一エピトープ、Ｃ２ドメインの構造依存的なエピトープを認識し、同一の性状を有すると推定される。
更にこれらの抗体フラグメントのＦＶＩＩＩ阻害活性は、６７００〜２９１００ベセスダユニット／ｍｇと非常に強力であった。
（従来技術より有効な効果）
以上より、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子は、ＦＶＩＩＩの凝固活性を強力に阻害することができ、血栓症の予防及び治療のための薬剤として使用することができる。特に本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子はＦＶＩＩＩ−ｖＷＦ複合体を認識せず、フォンビルブラント因子に結合していない活性化したＦＶＩＩＩのみを認識することができるので、通常血中に存在するＦＶＩＩＩ−ｖＷＦ複合体に反応することなく、活性化したＦＶＩＩＩとのみ反応することが可能になる。
このことは血中半減期が非常に長く、出血傾向という副作用を起こしにくい他の抗血栓剤にない優れた効果が期待できる上、ＡＰＴＴ測定などにより効果をモニターできる優れた新規抗血栓剤となることを示している。
また、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子はその特性から、別のエピトープ（抗原決定基）を認識する抗ＦＶＩＩＩ抗体を組み合わせて血中のｖＷＦと解離した活性型ＦＶＩＩＩのレベルを測定する免疫学的測定法を提供する事が可能である。
また、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子を免疫学的に不活性な吸着物質からなる免疫吸着物質と吸着させた複合体は多くの応用が可能になる。
まず第一にはヒト血漿または血清中に存在する微量のＦＶＩＩＩをイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。更に、遺伝子組換え法により形質転換された培養細胞から産生される培養上清中のＦＶＩＩＩの精製に用いることが可能である。
第二に、ヒト血漿または血清中またはヒト免疫グロブリン画分あるいは製剤中からヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィにより、本抗体の可変領域に対する抗イディオタイプ抗体を精製することが可能になる。このことは、本抗体と同様の性状のインヒビター抗体を有する患者の治療に新たな選択肢を提供するものである。
即ち、ＦＶＩＩＩ製剤投与前或いは同時にこれらの抗イディオタイプ抗体を患者に連続的に投与すること或いは抗イディオタイプ抗体を用いた免疫吸着法によりインヒビター抗体を除去することにより、抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の活性を抑制することが可能になる。現在インヒビター保有患者の治療、特に重篤な出血もしくは手術時などには血中に存在するインヒビターを中和し、更に止血レベルに達するために大量のＦＶＩＩＩ製剤の投与が行われている。この治療ではインヒビター抗体の上昇を招き、止血効果の低下が起きたり、出血傾向を起こしたりする場合が知られている。抗イディオタイプ抗体では、ヒト型抗体であるため抗原性は低く、また特異的であるため副作用の危険性は少ない。
また、インヒビター抗体除去に用いられているプロテインＡ固定化カラムに変わり、このような抗イディオタイプ抗体固定化カラムを用いれば特異的なインヒビター抗体の除去が可能になる。
また、更に本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子の可変部位のペプチド、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチドあるいはそのペプチドで修飾した高分子キャリアーを用いてインヒビター抗体の抗イディオタイプ抗体産生を誘導する新たな免疫寛容療法薬を提供する。既に、インヒビター保有患者に対するＦＶＩＩＩ製剤を用いた免疫寛容療法の試みが行われている。これは非出血時にＦＶＩＩＩ製剤を繰り返し定期投与して、そのインヒビター力価を低下もしくは消失させる方法である。しかし、この方法は１００〜２００単位／ｋｇのＦＶＩＩＩ製剤を１日２回連日投与したり、２５単位／ｋｇを隔日長期間にわたって投与するため、極めて高価であると共に、出血傾向の増大やアナフィラキシー等の危険性があり、また比較的低いインヒビター保有患者しか対象にできないなど課題が多い。
また、特許公報第２８３８１６６号では、ＦＶＩＩＩ抗原成分と主に患者の血漿中から得られたＦＶＩＩＩ阻害剤成分からなる免疫複合体を用いた阻害剤産生の抑制のための医薬組成物及び方法を開示している。しかし、使用する抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体は基本的に患者等のヒト血漿成分から調製したものであり、その成分の調製に多大な労力を必要とすると共に、品質の均一性を保つことが困難である。また、インヒビターを保有する患者の血漿中には免疫複合体が多数存在する症例が報告されているため、腎臓への複合体の沈着増強と副作用を考慮しなければならない。
これに対し、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子の可変部位のペプチド特に相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチドあるいはそのペプチドで修飾した高分子キャリアーを用いてインヒビター抗体の抗イディオタイプ抗体産生を誘導する場合は、通常のワクチン接種に準じた取り組みが可能と考えられる。
本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子と同様の特異性、反応性を有するインヒビター保有患者の場合には同様のイディオタイプを持つと考えられる。
また、発明者等は、開示した抗体可変領域の中でも、特にＨ鎖のＣＤＲ３領域とＬ鎖のＣＤＲ３の領域がインヒビター抗体とＦＶＩＩＩの結合の安定化に重要であることを見いだしている。従って、これらのＣＤＲペプチドを患者に免疫して、抗イディオタイプ抗体産生を誘導できれば、血中のインヒビター抗体の働きを抑制することが可能になると考えられる。また、この方法は、インヒビター抗体の特に相補性決定領域に対する抗イディオタイプ抗体産生を誘導しようするものであるが、生成した抗イディオタイプ抗体によりインヒビター抗体産生Ｂ細胞に対してアポトーシスを誘導する可能性も示唆されており、極めて特異的かつ、出血傾向の増大等のリスクを伴わない安全な治療法を提供することが可能になる。
以上のように本発明のヒト型モノクローナル抗体は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を中和でき、血栓症の予防及び治療のための薬剤として使用することができる。特に本発明のヒト型モノクローナル抗体は血液凝固第ＶＩＩＩ因子−フォンビルブランド因子複合体を認識せず、フォンビルブラント因子に結合していない血液凝固第ＶＩＩＩ因子のみを認識する。従って、血中半減期が非常に長く、出血を起こしにくい優れた効果が期待できる上、ＡＰＴＴ測定などにより効果をモニターできる優れた新規抗血栓剤となる。
また、本抗体を用いて血中の活性化した第ＶＩＩＩ因子の診断も可能になる。
更に、本発明のヒト型モノクローナル抗体を用いることにより抗原エピトープとなるペプチドの単離と血漿中の抗イデオタイプ抗体の単離が可能となる。得られるペプチドと抗イデオタイプ抗体は、中和もしくは免疫寛容の機構により、インヒビター抗体を生じた血友病患者の治療に有効であることが期待される。
また、更に本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子の可変部位のペプチド、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチドあるいはそのペプチドで修飾した高分子キャリアーを用いてインヒビター抗体の抗イディオタイプ抗体産生を誘導する新たな免疫寛容療法薬を提供する。
以下、実施例にそって本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：血友病患者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）により報告されている方法を参考に調製した。
抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体保有患者末梢血２８ｍｌよりＦｉｃｏｌｌにてリンパ球を分離し、ＰＢＳで充分に洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で処理して、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを３つに分割し、ヒトＩｇＧ、κ鎖、λ鎖の定常領域に特異的なｐプライマーを使用し、ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏ  ｔｅｃ）にて、それぞれのｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートにして、Ｍａｒｋｓらが報告したのと同様にＶＨとＪＨ及びＶκとＪκ、ＶλとＪλの組合せで各ジーンファミリーに特異的なプライマーを用いて、それぞれの抗体Ｖ領域遺伝子をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて増幅した。
更に、ＶＨとＶκ、及びＶＨとＶλをリンカーＤＮＡを用いて、アッセンブリーＰＣＲ法により結合させ、一本鎖ｓｃＦｖ  ＤＮＡを作製した。ｓｃＦｖ  ＤＮＡは更にＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位を付加し、アガロースゲルで電気泳動後、精製した。精製したｓｃＦｖ  ＤＮＡは制限酵素ＳｆｉＩ（Ｔａｋａｒａ）とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で消化後、ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを結合させたｐＣＡＮＴＡＢ５ＥはＶＨ−Ｖκ、ＶＨ−Ｖλ毎にエレクトロポレイションにより大腸菌ＴＧ１に導入した。形質転換したＴＧ１の数から、ＶＨ−Ｖκ、ＶＨ−Ｖλはそれぞれ１．０３×１０７、４．８５×１０６クローンの多様性を有すると評価された。この形質転換したＴＧ１から、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてファージ抗体を発現し、患者由来ｓｃＦｖ呈示ファージライブラリーを調製した。
《実施例２：スクリーニング》
スクリーニング用バッファー（４％スキムミルク，０．５％ウシ血清アルブミン，５０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ）に溶かした１０単位／ｍＬ血液凝固第ＶＩＩＩ因子（クロスエイトＭ）を５００μＬとスクリーニング用バッファーに溶かした０．５μｇ／ｍＬビオチン化抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体ＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−１８２（マウス、第ＶＩＩＩ因子軽鎖認識）またはＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−２８２（マウス、ＦＶＩＩＩ重鎖Ａ２ドメイン認識）を５００μＬとをプラスチック試験管（ＦＡＬＣＯＮ２０５８）に取り混合し、室温で３０分反応させた。これに患者由来ヒト型抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を１ｍＬ加え、室温で１時間反応させたのち、更に４℃で一晩反応させた。
２％スキムミルク−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで処理したアビジン結合磁性粒子（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ）１００μＬを上記のビオチン化抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体：ＦＶＩＩＩ混液１ｍＬに加え、１５分間穏やかに転倒混和した。マグネチックラックを用いて、磁性粒子を集め、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで８回洗浄し、更にトリス緩衝液で２回洗浄を行った。洗浄後の磁性粒子に、１ｍＬのグリシン緩衝液を加え懸濁し、室温で１０分放置し、一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは５００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えて、ｐＨを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１の培養液５ｍＬを加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪してＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ、５分で遠心して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレートに播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Ｃｏａｓｔｏｒ）を使って懸濁、回収した。このＴＧ１  ５００μＬを、５０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。血友病患者由来ファージライブラリーＶＨ−Ｖκ、ＶＨ−Ｖλ、それぞれに対してスクリーニングを計３回行った。３回目のスクリーニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認及びＦＶＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。
《実施例３：ｓｃＦｖの発現と回収》
可溶性ｓｃＦｖを大腸菌ＨＢ２１５１を用いて発現させ、大腸菌ペリプラズム画分より回収、粗精製した。更に精製が必要な場合はＲＰＡＳ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、アフィニティ精製を行った。
精製したｓｃＦｖ蛋白の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、ｓｃＦｖ蛋白のＣ末端のＥ−Ｔａｇエピトープを標的にしたウェスタンブロッティングにより確認した。ｓｃＦｖ蛋白精製品の蛋白濃度の決定には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。
《実施例４：スクリーニングＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡ》
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。
ＦＶＩＩＩ軽鎖認識のＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−１８２とＦＶＩＩＩ重鎖Ａ２ドメイン認識のＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−２８２の抗原決定基の異なる２種類の抗ＦＶＩＩＩマウスモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。５μｇ／ｍＬ抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−１８２、またはＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−２８２を１００μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｕｎｃ））に入れ、プレートシーラー（三光純薬）でシールし、室温または４℃で一晩放置、抗体を固定化した。ＴＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ，ＴＢＳを３００μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートに入れ、室温で１時間静置し、ブロッキングを行った。１０単位／ｍＬの血液凝固第ＶＩＩＩ因子液（クロスエイトＭ１０００（日本赤十字社））を１００μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートに入れ、プレートシーラーでシールし、３７℃で２時間静置した。ＦＶＩＩＩ液を捨て、ＥＬＩＳＡプレート洗浄液で５回洗った後、ｓｃＦｖもしくはｓｃＦｖ呈示ファージを含む試料液を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、室温で一晩反応させた。試料液を捨て、洗浄液で５回洗った後、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識２次抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃で１時間反応させた。反応液を捨て、ＥＬＩＳＡプレート洗浄液で５回洗った後、発色基質液（ＴＭＢＺ−過酸化水素）を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で５〜１０分発色させた。１規定硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れて発色反応を停止させた後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅマルチプレートオートリーダーＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸで４５０ｎｍの吸光度を測定した。評価した９９クローン全てが、ＦＶＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＦＶＩＩＩ特異的であることが確認された。
《実施例５：クローンの配列分析》
単離したコロニーのｓｃＦｖ遺伝子前後領域をＰＣＲで増幅し、得られたＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩやＫｐｎＩなどの３〜５種類の制限酵素で分解し、アガロース電気泳動のバンドパターンから、コロニーを分類した。その結果、完全なｓｃＦｖ遺伝子を保持した１３クローンが同定された。これらのクローンのＶＨ及びＶＬのＤＮＡ塩基配列をＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。
《実施例６：単離したヒト型抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子一本鎖抗体の評価》
精製ｓｃＦｖを用いて、ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡと抗凝固活性試験を行った結果、７種類が、ＦＶＩＩＩに特異に結合することが確認できた。そのうちの３種類に、ＦＶＩＩＩの凝固活性を阻害することが見いだされた。この３種のクローンＹＫ３．３．３８、ＹＫ３．３．４０、ＹＫ３．３．５０について、詳細な検討を行った。
抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−１８２、またはＦＶＩＩＩ：Ｃ１４−２８２固定化プレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｕｎｃ））に０．００１〜１０単位／ｍＬに調製したＦＶＩＩＩ液（クロスエイトＭ１０００（日本赤十字社））を１００μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートに入れ、プレートシーラーでシールし、３７℃で２時間静置した。ＦＶＩＩＩ液を吸引除去して洗浄液で５回洗浄後、ｓｃＦｖ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で一晩反応させた。試料液を吸引除去して洗浄液で５回洗浄後、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識抗Ｅｔａｇ抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃で１時間反応させた。試料液を吸引除去して洗浄液で５回洗浄後、発色基質液（ＴＭＢＺ−過酸化水素）を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で１０分発色させた。１規定硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れて発色反応を停止させた後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  マルチプレートオートリーダーＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＹＫ３．３．３８  ｓｃＦｖを用いた場合の結果を図１に示す。ＦＶＩＩＩを０．０１単位／ｍｌ以上の高感度で検出、測定できることが示された。ＦＶＩＩＩの血中濃度は、出血傾向が強い状況下でも０．０１単位／ｍｌ以上と報告されていることから、この測定系は血中の活性化ＦＶＩＩＩのモニタリングに充分な感度を有していた。
《実施例７：抗凝固活性試験》
単離したヒト型抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子一本鎖抗体の評価は、テストチームＦＶＩＩＩキット（第一化学薬品）とＦＶＩＩＩ欠乏血漿（ＤＡＤＥ）を用いた部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定によって行った。
テストチームＦＶＩＩＩキットの反応は添付の説明書の操作法Ａエンドポイント法のとおりであるが、９６ウェルマイクロプレートで測定できるようにスケールを１／４に縮小した。
部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定には、Ｆｉｂｒｉｎｔｉｍｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ）を用い、以下の文献の方法に従った：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．ＮＣＣＬＳ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｈ２１−Ａ２．Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，ＰＡ．１９９１．；Ｓｉｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｓ．；Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｎｇｅｒ，１９８３：１３０−１３３。
抗原抗体反応は、抗体試料希釈液と１単位／ｍｌ  ＦＶＩＩＩ液（クロスエイトＭ）とを等量混合し、３７℃で２時間以上反応させた。その後、テストチームＦＶＩＩＩキットまたは部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定を行った。
テストチームＦＶＩＩＩキットによる測定成績を図２に示す。いずれのクローンも１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度でＦＶＩＩＩ活性を強力に阻害することが示された。これは部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）でも同様の結果であった。
《実施例８：フォンビルブランド因子存在下における影響の検討》
上記実施例の抗原抗体反応において、ほとんどｖＷＦを含まないＦＶＩＩＩ（クロスエイトＭ、日本赤十字製）とマルチマーのｖＷＦを含む精製ＦＶＩＩＩ（コンファクトＦ、財団法人  化学及血清療法研究所製）の両者を用いてｖＷＦの存在の影響について比較検討した。部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定によるＹＫ３．３．３８を用いた場合の成績を図３に示す。比較に市販のインヒビター患者血漿（ＧｅｄｒｇｅＫｉｎｇＭｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．ｌｏｔ．ＧＫ１８３３−９２９Ｊ２）を用いた。
これらの検討により、本発明の抗ＦＶＩＩＩ抗体クローンＹＫ３．３．３８、ＹＫ３．３．４０、ＹＫ３．３．５０は、ｖＷＦに結合したＦＶＩＩＩを不活化せず、単独で存在するＦＶＩＩＩを不活化することが明らかになった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、抗ヒトＦＶＩＩＩ  Ａ２マウスモノクローナル抗体を固定化したＥＬＩＳＡプレートと得られたｓｃＦｖクローンを組み合わせたＥＬＩＳＡによるヒトＦＶＩＩＩの測定例を示す。
図２は、３種の抗ヒトＦＶＩＩＩ精製ｓｃＦｖを用いたテストチームＦＶＩＩＩの測定例を示す。
図３は、ヒトＦＶＩＩＩにｖＷＦを含まないＦＶＩＩＩとマルチマーのｖＷＦを含む精製ＦＶＩＩＩ製剤を用いた場合の部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定による精製ｓｃＦｖを用いた場合のＦＶＩＩＩ残存活性の評価結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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