(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応に使用される酵素であるα−アミラーゼを活性化する方法であり、α−アミラーゼを、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水に溶解して活性化することを特徴とする酵素の活性化方法。
【請求項２】
酵素反応に使用される酵素である酸性プロテアーゼを活性化する方法であり、酸性プロテアーゼを、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成酸性水に溶解して活性化することを特徴とする酵素の活性化方法。
【請求項３】
酵素反応に使用される酵素であるリパーゼを活性化する方法であり、リパーゼを、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成酸性水に溶解して活性化することを特徴とする酵素の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応に使用される酵素であるα−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼを活性化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品素材の調理、加工等、食品加工における酵素反応に関与する酵素には多くの種類があり、その主要な酵素としては、α−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼ等が知られている。α−アミラーゼは、澱粉を分解してデキストリン、異性化糖、ブドウ糖、水飴、マルトース、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、カップリングシュガー等の製造に使用され、酸性プロテアーゼは、醤油、味噌、麺つゆ、焼き肉のたれ、ドレッシング等の製造に使用され、リパーゼは、脂肪酸、石鹸、糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、香料、メントール等の製造に使用される。これらの酵素の使用に際しては、酵素反応の前段階において、酵素の活性を高めておくことが有利である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来、酵素の使用に際しては、酵素反応の前段階で、酵素を蒸留水、または反応液のｐＨに合わせた緩衝液に溶解して酵素溶液にする手段が採られている。これは、通常、酵素反応が最適な範囲のｐＨで行われるため、酵素溶液を添加した際に反応液が最適なｐＨの範囲から外れないようにするためである。換言すれば、かかる手段は、酵素の活性を予め高めるものではない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、酵素反応に使用される主要な酵素であるα−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼを酵素反応に使用する場合、酵素反応の前段階において、酵素の活性を高める方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酵素反応に使用される主要な酵素であるα−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼを酵素を活性化する方法であって、これらの酵素を、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成水に溶解して活性化するものである。
【０００６】
しかして、本発明に係る酵素の活性化方法においては、前記酵素としてα−アミラーゼを採用する場合には前記電解生成水として電解生成アルカリ性水を採用すること、前記酵素として酸性プロテアーゼを採用する場合には前記電解生成水として電解生成酸性水を採用すること、前記酵素としてリパーゼを採用する場合には前記電解生成水として電解生成酸性水を採用することを特徴とするものである。
【０００７】
【発明の作用・効果】
本発明に係る酵素の活性化方法によれば、図２、図４、図６に示すグラフを参照すれば明らかなように、酵素を水道水等通常の水（ｐＨ約７）に溶解する場合に比較して、酵素の活性が高くなっている。特に、酵素としてα−アミラーゼを採用する場合には、電解生成水として電解生成アルカリ性水を採用することにより、酵素として酸性プロテアーゼを採用する場合には、電解生成水として電解生成酸性水を採用することにより、また、酵素としてリパーゼを採用する場合には、電解生成水として電解生成酸性水を採用することにより、酵素の活性を高めることができる。
【０００８】
これらの結果は、酵素を酵素反応に使用するに際して電解生成水に溶解することにより酵素の活性化を図ることができること、個々の酵素については、電解生成水を使用する酵素に対応して適宜選択することによりその活性化を図ることを教示している。
【０００９】
電解生成水が酵素の活性を高める理由は定かではないが、非電解生成水でｐＨのみを変化させた水を溶解液として採用した比較例（図２、図４、図６に示す１点鎖線グラフ）を参照すれば、電解生成水を溶解液として採用した場合には、比較例に比して酵素の活性を一層高めている。酵素の活性が溶解液のｐＨに依存することは知られているが、電解生成水の場合には、ｐＨ以外の機能が大きく寄与していることが認められる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に係る酵素の活性化方法についての具体的例を、α−アミラーゼ（実験例１）、酸性プロテアーゼ（実験例２）、リパーゼ（実験例３）について説明する。
【００１１】
（実験例１）
α−アミラーゼとしてアミラーゼVIII−Ａ（シグマ株式会社社製：大麦麦芽起源）を採用するとともに、酵素を活性化するための供試水として下記に示す電解モデル水（電解生成水）およびｐＨモデル水を採用して、図１のフローチャートに示す方法で酵素の活性化実験を下記の条件で行った。
【００１２】
電解モデル水：蒸留水に塩化ナトリウムを溶解して１００ｍｇ／ｌの濃度の塩化ナトリウム水溶液を調製して、この水溶液を原水として有隔膜電解して得た電解生成水（ｐＨ３，ｐＨ４，ｐＨ１０，ｐＨ１１）。ｐＨモデル水：蒸留水に水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加して各種のｐＨの水溶液（ｐＨ３，ｐＨ４，ｐＨ１０，ｐＨ１１）を調製し、この水溶液に塩化ナトリウムを添加してＮａイオン濃度を電解モデル水の原水と一致させた水溶液（Ｎａイオン濃度３９．３ｍｇ／ｌ）。
【００１３】
酵素活性測定キット：アミラーゼＢ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製、発色酵素液キット、基質液キット、反応停止液キット）。活性測定：試験管に酵素溶液０．０１ｍｌと発色酵素液キット１ｍｌを入れて反応開始液としてこれを３７℃で５分間加温し、次いでこれに基質液キット１ｍｌを入れて３７℃で１０分間反応させ、最後にこれに反応停止液キット２ｍｌを入れて反応を停止する。この反応液を分光光度計で６２０ｎｍの吸光度を測定し、この吸光度に基づいて酵素量を算出する。
【００１４】
実験方法：図１のフローチャートに示す方法にて実施する。先ず、α−アミラーゼ８５ｍｇに供試水を加えて１００ｍｌの定容とした酵素溶液を調製し、この酵素溶液０．０１ｍｌ中に発色酵素液キット１ｍｌを添加して３７℃で５分間加温し、次いで基質液キット１ｍｌを添加して反応開始液として酵素反応を開始する。酵素反応においては、３７℃で１０分間正確に加温して行い、その後反応停止液キット２ｍｌを添加して反応を停止する。この反応液を分光光度計で６２０ｎｍの吸光度を測定する。
【００１５】
本実験における各供試水、酵素溶液、反応開始液の性質変化の状態を表１および表２に示すとともに、各供試水に基づく酵素の活性状態を表３および表４に示す。また、各供試水に基づくｐＨと酵素活性比との関係を図２に示す。但し、図２に示す酵素活性比は、ｐＨ７の原水における酵素活性を１とする各酵素活性の比率を意味する。但し、酵素活性の値は５回測定した場合の平均値である。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
【表２】
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【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
酵素活性については、供試水がアルカリ性域では酵素活性が上昇して、かつ酸性域では酵素活性が低下している。この傾向は電解モデル水、ｐＨモデル水ともに共通しているが、アルカリ性域での酵素活性の上昇率および酸性域では酵素活性の低下率は、ｐＨモデル水に比較して電解モデル水が大きい。特に、両モデル水がｐＨ１１である場合の酵素活性に着目すると、酵素活性は、電解モデル水においては２０％上昇しているのに対して、ｐＨモデル水においては７％であって、電解モデル水とｐＨモデル水との間では酵素に対する活性化の作用に大きな差があることが認められる。
【００２１】
以上のことから、酵素の活性化を図るには電解生成水が有効であること、酵素としてα−アミラーゼを採用する場合には、電解生成アルカリ性水が極めて有効であることが判明した。電解生成アルカリ性水のこのような効果は、ｐＨモデル水とを比較すればｐＨのみに起因するものではなく、また、表１および表２に示すｐＨおよび酸化還元電位（ＯＲＰ）の値が電解生成アルカリ性水とｐＨモデル水との間で差がないことから、ｐＨおよび酸化還元電位にのみに起因するものでないものと認められる。従って、電解生成水の酵素の活性化に及ぼす作用は、ｐＨ、酸化還元電位、および、その他の潜在する機能の総合によるものと判断される。
【００２２】
（実験例２）
酸性プロテアーゼとしてプロテアーゼXXIII（シグマ株式会社社製：Aspergillus oryuse起源）を採用するとともに、酵素を活性化するための供試水としては実験例１で使用した電解モデル水（電解生成水）およびｐＨモデル水を採用して、図３のフローチャートに示す方法で酵素の活性化実験を下記の条件で行った。
【００２３】
酸性プロテアーゼ：プロテアーゼXXIII。緩衝液：マッキルベイン緩衝液ｐＨ３（燐酸二ナトリウム、クエン酸）。カゼイン溶液：カゼイン（発色用）２ｇに１０倍に薄めた乳酸５ｍｌを加え、さらに蒸留水を加えて完全に白濁状に溶解するまで掻き混ぜる。この白濁液を一度沸騰させてから冷却し、これにｐＨ３のマッキルベイン緩衝液２０ｍｌを加え、さらに蒸留水を加えて１００ｍｌに定容。チロシン標準溶液：Ｌ−チロシン１０．０ｍｇに１Ｎ塩酸１ｍｌを加えて全容を１００ｍｌとして、これを原液（１００ｍｇ／ｌ）とする。検量線は原液を使用し、標準液として０ｍｇ／ｌ，２５ｍｇ／ｌ，７５ｍｇ／ｌ，１００ｍｇ／ｌのものを使用。
【００２４】
酵素溶液の調製：酸性プロテアーゼ２５ｍｇに供試水を加えて２５ｍｌに定容し、室温（２５℃）で５分間放置したもの。酵素活性の表示：酸性プロテアーゼの活性は、４０℃で６０分間に１μｇのチロシン相当量の呈色を示す活性を１単位（１Ｕ）とする。酵素活性（１Ｕ／ｍｌ）＝生成チロシン量×６／１（反応液量）×１／０．５（酵素液量）。
【００２５】
実験方法：図３のフローチャートに示す方法にて実施する。先ず、カゼイン溶液１．５ｍｌに緩衝液１．０ｍｌを加えて４０℃で５分間加温し、このカゼイン溶液に予め調製した酵素溶液０．５ｍｌを加えて反応開始液として酵素反応を開始する。酵素反応においては、４０℃で６０分間反応させた後、０．４Ｍトリクロール酢酸溶液（ＴＣＡ）３ｍｌを加えて反応を停止し、反応停止液中の沈殿を濾別する。得られた濾液１ｍｌを分取し、この濾液に０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌと０．４Ｎフェノール試薬１ｍｌを加えて４０℃で３０分間発色を行い、６６０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２６】
本実験における電解モデル水を使用した供試水、酵素溶液、反応開始液の性質変化の状態を表５に示すとともに、同供試水に基づく酵素の活性状態を表６に示す。また、電解モデル水およびｐＨモデル水を供試水とするｐＨと酵素活性比との関係を図４のグラフに示す。但し、図４に示す酵素活性比は、ｐＨ７の原水における酵素活性を１とする各酵素活性の比率を意味する。
【００２７】
【表５】
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【００２８】
【表６】
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【００２９】
酵素活性については、供試水が酸性域では酵素活性が上昇し、かつアルカリ性域では酵素活性が低下している。この傾向は電解モデル水、ｐＨモデル水ともに共通しているが、酸性性域での酵素活性の上昇率およびアルカリ性域では酵素活性の低下率は、ｐＨモデル水に比較して電解モデル水が大きい。電解モデル水がｐＨ３である場合には酵素活性が４２％上昇し、電解モデル水がｐＨ４である場合には酵素活性が３８％上昇していて、ｐＨモデル水に比較して酵素活性化が高い。
【００３０】
以上のことから、酵素の活性化を図るには電解生成水が有効であること、酵素として酸性プロテアーゼを採用する場合には、電解生成酸性水が極めて有効であることが判明した。電解生成酸性水のこのような効果は、ｐＨモデル水とを比較すればｐＨのみに起因するものではなく、電解生成酸性水の電解機能の総合によるものと認められる。
【００３１】
（実験例３）
リパーゼとして生化学工業株式会社製リパーゼ（Rhizopus delemar起源）を採用するとともに、酵素を活性化するための供試水としては実験例１で使用した電解モデル水（電解生成水）およびｐＨモデル水を採用して、図５のフローチャートに示す方法で酵素の活性化実験を下記の条件で行った。
【００３２】
基質：トリオレン。緩衝液：０．０５ＭでｐＨが５．６の酢酸緩衝液。賦活剤：０．１ＭＣａＣｌ2溶液。反応停止剤：エタノール。酵素溶液の調製：リパーゼ１０ｍｇに供試水を加えて１０ｍｌに定容し、室温（２５℃）で５分間放置したもの。
【００３３】
実験方法：図５のフローチャートに示す方法にて実施する。先ず、トリオレン０．４８ｍｌに酢酸緩衝液１．８ｍｌおよび賦活剤であるＣａＣｌ2溶液０．２ｍｌを加えて３０℃で１０分間加温し、これに酵素溶液０．２ｍｌを加えて反応開始液として酵素反応を開始する。酵素反応においては、３０℃で３０分間振とうしつつ反応させた後、反応液にエタノール８ｍｌを加えて反応を停止し、反応停止させた反応液を酵素活性測定に供する。
【００３４】
酵素活性測定：反応液にエタノール８ｍｌおよび蒸留水２．６８ｍｌを加えて、撹拌しつつ０．０１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ９まで滴定し、下式により酵素活性を算出する（０．０１Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌに相当するオレイン酸量を１単位（Ｕ）とする。但し、ブランクテストには、酵素溶液に代えて蒸留水を使用）。
【００３５】
リパーゼ活性（unit）＝５×（Ｔ−Ｔb）×ｎ  Ｔ：試料の水酸化ナトリウム滴下量、Ｔb：ブランクテストでの水酸化ナトリウム滴下量、ｎ：希釈率。
【００３６】
本実験における電解モデル水を使用した供試水、酵素溶液、反応開始液の性質変化の状態を表７に示すとともに、同供試水に基づく酵素の活性状態を表８に示す。また、電解モデル水およびｐＨモデル水を供試水とするｐＨと酵素活性比の関係を図６のグラフに示す。但し、図６に示す酵素活性比は、ｐＨ７の原水における酵素活性を１とする各酵素活性の比率を意味する。
【００３７】
【表７】
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【００３８】
【表８】
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【００３９】
酵素活性については、供試水が酸性域では酵素活性が上昇し、かつアルカリ性域では酵素活性が低下している。この傾向は電解モデル水、ｐＨモデル水ともに共通しているが、酸性域での酵素活性の上昇率は電解モデル水が大きく、アルカリ性域での低下率はｐＨモデル水が大きい。電解モデル水がｐＨ３である場合には酵素活性が１８％上昇し、電解モデル水がｐＨ４である場合には酵素活性が１６％上昇していて、ｐＨモデル水に比較して酵素活性化が高い。
【００４０】
以上のことから、酵素の活性化を図るには電解生成水が有効であること、酵素としてリパーゼを採用する場合には、電解生成酸性水が極めて有効であることが判明した。電解生成酸性水のこのような効果は、ｐＨモデル水とを比較すればｐＨのみに起因するものでないものではなく、電解生成酸性水の電解機能の総合によるものと認められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】α−アミラーゼの活性化実験を実施するためのフローチャートである。
【図２】α−アミラーゼの活性化実験における供試水のｐＨと酵素活性比との関係を示すグラフである。
【図３】酸性プロテアーゼの活性化実験を実施するためのフローチャートである。
【図４】酸性プロテアーゼの活性化実験における供試水のｐＨと酵素活性比との関係を示すグラフである。
【図５】リパーゼの活性化実験を実施するためのフローチャートである。
【図６】リパーゼの活性化実験における供試水のｐＨと酵素活性比との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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