(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インシュリンを合成および／または排出するために細胞を刺激するために有効量のヒドロキシプロピル−メチルセルロースを含む、膵臓β−細胞を培養するための細胞培地。
【請求項２】
インシュリンを生成および／または排出するために膵臓β−細胞を刺激するための装置であって、水性培地中のヒドロキシプロピル−メチルセルロースの溶液を保持した容器を含む上記の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、膵臓細胞を刺激してインシュリンを生成および／または排出するための方法に関し、該刺激は培養、運搬、貯蔵、分離、移植等に関連して与えられる。本願で考えられる膵臓細胞は、成熟インシュリン生成性βー細胞およびそれらの前駆体、胎児βー細胞が含まれる。
本発明はまた、成人および／または胎児の細胞、特に幹細胞、線維芽細胞、神経細胞および上皮細胞のような、現存する媒体では培養が難しいまたは不可能と思われていた種類の細胞のインービトロ培養法に関する。
本発明はまた、成人および／または胎児の細胞をインービトロ培養法、ペプチドをバクテリア、特にＥ．ｃｏｌｉ、中で発現する方法、傷の治癒法、皮膚の処理法（トリートメント）、および組織および器官移植体の保存および／または運搬および／または貯蔵法に関する。
更に本発明は、上記方法を実施するための手段および該手段の使用法に関する。
従来の技術
インシュリン生成性膵臓細胞の移植は、膵臓がこの極めて重要なホルモンを生成しないか或いは不充分な量でしか生成しない糖尿病患者への、現在使用されている終生のインシュリン投与に代わる魅力的な代替法である。現在、膵臓移植は、膵臓の器官全体またはその大部分の移植を意味する。膵臓小島のみ、即ちβー細胞を含む細胞集落、は初期の実験状態にあると思われる。膵臓小島のみの移植は膵臓全体の移植よりもより魅力的であろう。何故なら、ヒト由来のかかる器官の入手は限られているからである。臨床的研究用の生育可能な豚または人間の小島の製造は知られており（Ｇｒａｙ  Ｄ  Ｗ  Ｒ外、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（糖尿病）１９８４年、３３：１０５５；Ｒｉｃｏｒｄｉ  Ｃ外、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９０年、３７：１３７７）、かかる移植は励ましとなる結果を与えた（例えば、Ｓｃｈａｒｐ  Ｄ  Ｗ外、Ｄｉａｂｅｔｅｓ１９９０年、３９：５１５）。しかしながら、残る問題は、充分な量のこれらの細胞調製物をいかに供給するか、そして実質的量のインシュリンを排出させるために、それらをいかに刺激するかということである。いろいろな理由から、胎児膵臓組織を使用することが提案された（概説用に、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ａ  およびＳａｎｄｌｅｒ  Ｓ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６（１９９２年）２０−３８参照；この概説の参照は、ここで引用された研究論文の参照を包含する）。
胎児の膵臓組織の移植の成功には、体外移植組織を移植前にある期間培地内に保持することが必要である。該組織を生育可能な状態に保持するのに加えて、βー細胞の成長および分化のために、それを刺激してインシュリンの排出を促進することが望ましい。
胎児組織粒子（ＩＣＣ、βー細胞を含む膵臓小島細胞群落の小島様移植体）の製造に当業界で知られた方法は、胎児膵臓組織をコラゲナーゼを用いて分解することを含む（ＡｎｄｅｒｓｓｏｎおよびＳａｎｄｌｅｒ、ｏｐ．ｃｉｔ．参照）。いろいろな理由から、比較的低度に分化された組織をそれらの製造に使用するが、インシュリン用に免疫化学的に染色した細胞を僅かに含む調製物が得ら、従ってインシュリンー生成性と確認される。他方、ＩＣＣは適当な培養条件で後に分化されるに充分な潜在性がある。かかる分化は、ヒト成長ホルモン、プロラクチン、およびニコチンアミドのようなポリ（ＡＤＰ−リボース）シンテターゼの阻害剤によって刺激されると思われる。更に、インシュリン自体の排出を刺激することができる。本来、Ｄ−グルコースは主要な刺激剤であるが、インービトロでのＤ−グルコースに対する細胞反応は、低分化膵臓組織を用いた場合に特に、低いか又はゼロである。しかしながら、他の薬剤、例えばテオフィリンのようなホスホージエステラーゼの阻害剤、は高グルコースレベルでインシュリンの排出を刺激する。
発明の目的
従って、本発明の目的は、インシュリンを生成および／又は排出するために、胎児または成熟した膵臓組織から単離したインシュリンー生成性βー細胞を刺激する方法を提供することであり、“インシュリンー生成性”細胞の定義は、刺激および／または分化によるインシュリン生成に適する細胞を含み、かかる細胞を生育可能な状態に維持し、かかる細胞を培養し、そしてかかる細胞を貯蔵および運搬することである。本発明の別の目的は、該方法を実施するための手段を提供することである。本発明の他の目的は、刺激され、生育可能な状態に維持され、運搬または貯蔵されたかかる細胞の使用である。本発明の更に別の目的は、細胞の刺激、運搬、貯蔵または培養に関連して使用される装置である。
本発明の更に別の目的は、下記の発明の概要、好ましい態様の記述、および添付の請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の概要
本発明によって、インシュリン生成性細胞、特にインシュリン生成性細胞の水性懸濁液、を水溶性セルロース誘導体と、刺激または貯蔵中、刺激調製物の運搬または培養中に、接触させることを特徴とする上記の種類の方法を提供することである。かかる刺激調製物には移植用の調製物が含まれる。好ましいセルロース誘導体は、アルキル化、ヒドロキシーアルキル化、およびアルキル化／ヒドロキシアルキル化セルロースである。かかるセルロース誘導体の例はヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルーメチルセルロース、ヒドロキシエチルーエチルセルロース、ヒドロキシプロピルーメチルセルロースである。最も好ましいのはヒドロキシプロピルーメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。本発明によるセルロース誘導体の（本当のまたはコロイド状の）水溶液は粘性であることが知られている。本願で使用するセルロース誘導体の用語は、セルロース鎖を重量平均分子量が２，０００以下のフラグメントに実質的に分解して得られたセルロースの誘導体を含まない。本願で使用するセルロース誘導体の用語は、セルロースヒドロキシ基中の水素をアルキル基、好ましくは炭素原子数１−５のアルキル基、で置換して得られたセルロースの薬学的に許容される誘導体を含む。
非セルロース系炭水化物ポリマー、例えばアルギン酸塩または寒天（ＥＰ−Ａ  ３６３  １２５）またはヒアルウロン酸は、かなりの粘性の水溶液を与えるが、本発明による実質的なβー細胞刺激作用を発揮しない。
本発明によるセルロース誘導体の水溶液は、塩の形体の栄養物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ホルモン等のような他の薬剤を含むことができる。いろいろな種類の細胞培地は、適当量の本発明によるセルロース誘導体を有することができ、これにより本発明によるβー細胞刺激水溶液が得られる。
本発明によって、上記セルロース誘導体を含むβー細胞刺激水溶液の使用が開示される。これらの使用は、膵臓細胞の培養、運搬、移植、および貯蔵から選ぶのが好ましい。
本発明によって、上記方法を実施するための装置も提供され、該装置は、本発明によるセルロース誘導体の水溶液を含むβー細胞用の容器を含む。
本発明の第２の側面によると、成人および／または胎児細胞、特に現存する媒体中では培養が難しいまたは不可能と思われる細胞、例えば幹細胞、神経細胞、線維芽細胞および上皮細胞、のインービトロ培養法が開示され、該方法は培養状態に保持された上記細胞を水溶性のセルロース誘導体と接触させることを含む。好ましいセルロース誘導体は、アルキル化、ヒドロキシーアルキル化、およびアルキル化／ヒドロキシーアルキル化セルロースである。かかるセルロース誘導体の例は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルーメチルセルロース、ヒドロキシエチルーエチルセルロース、ヒドロキシプロピルーメチルセルロースである。最も好ましいのはヒドロキシプロピルーメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。
本発明の第３の側面によると、ペプチドをバクテリア、特にＥ．ｃｏｌｉ、中で発現する方法が開示され、該方法は、該バクテリアを水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。好ましいセルロース誘導体およびその例は前のパラグラフで記載した。
本発明の第４の側面によると、傷の治癒法が開示され、該方法は傷を水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。好ましいセルロース誘導体およびその例は前のパラグラフで記載した。
本発明の第５の側面によると、皮膚の無傷の保全と再生を目的とした皮膚の処置法が開示され、該方法は皮膚を水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。好ましいセルロース誘導体およびその例は前のパラグラフで記載した。
本発明の第６の側面によると、プラスミドをバクテリア、特にＥ．ｃｏｌｉ、中で発現する方法が開示され、該方法は、該バクテリアを培養状態に保持している時に水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。
本発明の第７の側面によると、組織および器官移植体の保存および／又は運搬および／又は貯蔵方法が開示され、該方法は、該移植体を保存および／又は運搬および／又は貯蔵に有効量の水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。
本発明の第８の側面によると、喉頭、気管、気管支および肺の上皮の治癒を含む呼吸器官上皮の治癒を促進する方法が開示され、該方法は、治療上有効量の水溶性セルロース誘導体を、例えば噴霧器により与えられるその水溶液の微滴の形体で、投与することを含む。
本発明の第９の側面によると、培養状態に保持されている真核細胞をインービトロで刺激する方法が開示され、該方法は代謝生成物の細胞成熟又は排出を促進することを含み、該方法は該細胞を細胞成熟量又は細胞促進量の水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。
本発明の第１０の側面によると、培養状態に保持されている真核細胞をインービトロで培養する方法が開示され、該方法は該細胞を水溶性セルロース誘導体と接触させることを含む。
上記の方法を実施するための本発明による手段は、水溶性セルロース誘導体を含む。好ましいセルロース誘導体は、アルキル化、ヒドロキシーアルキル化、およびアルキル化／ヒドロキシーアルキル化セルロースである。かかるセルロース誘導体の例は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルーメチルセルロース、ヒドロキシエチルーエチルセルロース、ヒドロキシプロピルーメチルセルロースである。最も好ましいのはヒドロキシプロピルーメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。
本発明の水溶性セルロース誘導体の有益な効果に関する仮説に拘束されないが、移植用の生きている細胞、細胞塊、組織および器官に対する効果は、セルロース誘導体の水溶液が、公知の培地が与える環境よりもより自然でより組織化された環境を与えることによると考えられる。
本発明のさらなる利点および好ましい特徴は、請求の範囲および下記の発明の好ましい態様の記述に開示されるが、非限定的な該態様は例示のためにすぎない。
発明の好ましい態様
上記の好ましい態様に関係する図面は、グラフの形体の多くの図面を含む：
図１は、胎児豚ＩＣＣのグルコースー刺激インシュリン放出のグラフであり、
図２は、胎児豚ＩＣＣのプロインシュリンの刺激および全タンパク質生合成のグラフであり、
図３は、胎児豚ＩＣＣのグルコース酸化速度であり、
図４は、胎児豚ＩＣＣのインシュリンー陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞の数であり、そして
図５は、糖尿病を誘発した裸（ｎａｋｅｄ）のマウスへのＩＣＣの移植のグラフである。
例１
ＤＮＡおよび豚の小島様の細胞群落のインシュリン含量に対するＨＰＭＣの効果
胎児の豚の膵臓外植体を、培地ＲＰＭＩ１６４０中で、表１の第１および第２欄に指示したようにヒト血清およびＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を添加して、５日間培養した。
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例２
豚の小島様の細胞群落（ＩＣＣ）の小島（プロ）インシュリン（ＰＩ）生合成速度および全タンパク質（ＴＯＴ）生合成速度に対するＨＰＭＣの効果
ＩＣＣを表１に記載したように培養した。次にそれらをＫＲＢＨ＋２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中で、１６．７ｍＭのグルコースおよび５０μＣｉ／ｍｌのＬ−［４．５ー3Ｈ］ロイシンの存在下で２時間培養した。その後、ＩＣＣを均質化しそして（プロ）インシュリン生合成速度を免疫吸収法により測定した；全タンパク質生合成速度をＴＣＡ−沈殿の後に測定した。値は、６−７回の実験についての平均＋ＳＥＭである。
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例３
胎児豚膵臓の小島状細胞群落（ＩＣＣ）のグルコース刺激インシュリン放出
膵臓外植体を、培地ＲＰＭＩ１６４０中で、１０％ヒト血清（ＨＳ）のみ、又は９％ＨＳ＋１％Ｘ、又は５％ＨＳ＋５％Ｘ、又は１％ＨＳ＋９％Ｘを添加して、５日間培養した。引き続きＩＣＣを取り出し、そして１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび１．７ｍＭのグルコース（黒い棒）又は１６．７ｍＭのグルコース（平行斜線の棒）を含むクレブスーリンゲル重炭酸塩バッファ中で３７℃（Ｏ2：ＣＯ2；９５：５）で１時間培養した。培地に放出されたインシュリンを放射−免疫検定法により測定した。結果を図１に示す。値は、８回の実験についての平均＋ＳＥＭである。
例４
胎児豚膵臓の小島状細胞群落（ＩＣＣ）のテオフィリンー刺激インシュリン放出
ＩＣＣを例１に記載したように培養し、引き続きＩＣＣを取り出し、そして１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび１．６７ｍＭのグルコース＋５ｍＭのテオフィリンを含むクレブスーリンゲル重炭酸塩バッファ中で３７℃（Ｏ2：ＣＯ2；９５：５）で１時間培養した。結果を図２に示す。値は、８回の実験についての平均＋ＳＥＭである。
例５
胎児豚膵臓の小島状細胞群落（ＩＣＣ）のグルコース酸化速度
ＩＣＣを図１に記載したように培養した。該小島を、１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）および１．７ｍＭ（黒い棒）又は１６．７ｍＭのグルコースを含むクレブスーリンゲル重炭酸塩バッファ中、Ｄ−［Ｕ−14Ｃ］グルコースの存在下で、３７℃（Ｏ2：ＣＯ2；９５：５）で１時間培養した。結果を図３示す。値は、３回の実験についての平均＋ＳＥＭである。
例６
胎児豚の膵臓の小島状細胞群落（ＩＣＣ）のインシュリンー陽性細胞
ＩＣＣを例１に記載したように培養した。５日目にＩＣＣを取り出し、洗い、９％のホルマリン中に固定し、パラフィン中に埋め、６μｍの片を切断した。該片を、モルモット抗−ウシインシュリン抗体を用いて、インシュリンについて免疫細胞化学的に染色した。結果を図４示す。値は、４回の実験についての平均＋ＳＥＭである。
例７
糖尿病を誘発した裸（ｎａｋｅｄ）のマウスへの移植
裸（ｎａｋｅｄ）のマウスに、アロキサン（ａｌｌｏｘａｎ）を注入することにより糖尿病を誘発すると（Ｄｕｎｎ，Ｊ  Ｓ，ＭｃＬｅｔｃｈｉｅ，Ｌａｎｃｅｔ  ２（１９４３年）３８４；Ｂｏｑｕｉｓｔ  Ｌ，Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，Ｓｅｃｔ．Ａ，８８（１９８０年）２０１）、２−３日で血糖値＞２５ｍｍで示される低血糖症となった。約１週間後にこの種類の他のマウスからの無傷のＩＣＣを、この低血糖症の麻酔した動物に移植した。腹部壁を切開しそして左腎臓を移動した。腎臓の薄いカートリッジカプセルに小さい穴を開け、ＩＣＣを含むピペットを注意深くカプセルの下に挿入した。ＩＣＣをカプセル内に沈着させ、ピペットを取り出しそして腹部壁および皮膚を縫合した。
第１回の一連の実験で、６００ＩＣＣに相当する２×３μｌのＩＣＣの標準的用量を注入した。３種のＩＣＣを比較した：
（１）対照体、即ち培地：ＲＰＭＩ１６４０＋１０ｍＭのニコチンアミド＋１０％のヒト血清（ＨＳ）の中で培養したＩＣＣ小島；
（２）培地：ＲＰＭＩ１６４０＋１０ｍＭのニコチンアミド＋１０％のヒト血清（ＨＳ）＋食塩水中の１．５％ＨＰＭＣの中で培養したＩＣＣ小島；
（３）培地：ＲＰＭＩ１６４０＋１０ｍＭのニコチンアミド＋１０％のヒト血清（ＨＳ）＋食塩水中の１．５％ＨＰＭＣ９％＋１ｍＭの２−デオキシグルコース（ＤＧ）の中で培養したＩＣＣ小島。添加の理由は、ＤＧがこれらの培養中に線維芽細胞の成長を低減させそしてＩＣＣの取り入れを容易にすることを見いだすことであった。これと対照的に、ＤＧは別の実験で示されたように、グルコースで刺激されたインシュリンの放出を生じることに関して、胎児豚ＩＣＣの分化に影響を及ぼさない。
実験（１）−（３）の結果を図５に示す。四角括弧内の数は動物の数を示す。動物は時間０に移植された。血糖を７日目に測定し、その後１週間の間隔で測定した。矢印は腎切除術を示す、即ち、ＩＣＣ移植体を有する腎臓を取り出し、その１週間後に血糖を測定した。腎切除後に血糖は、グループ（２）および（３）の動物ではグループ（１）の動物よりも急速に減少し、糖尿病における移植体の治療効果を示す。取り出した移植体の組織学的検査は、十分完全なβー細胞を含めてそれらが構造的に無傷であることを示した。
第２回の一連の実験で、ＩＣＣの量を１×３μｌのＩＣＣに減少させた（図６）。その他と全てのパラメータは上記の第１回の一連の実験のように設定した。結果は第１回の実験と本質的に同じであった。対照体（１）は糖尿病が７週間で治癒しなかった（血糖値１０μＭは治癒閾値と考えられる）。一方グループ（２）および（３）の動物は正常血糖になった。ＤＧの使用は血糖値の低下に明らかに有益な効果をもつらしい。
第３回の一連の実験で、ＩＣＣの用量を３×３μｌに増大し、グループ（１）−（３）に加えて、追加の動物グループ（４）を加え、そこでＨＰＭＣ溶液は食塩水の代わりに中性リン酸塩バッファの溶液とした。グループ（２）−（４）に行った処理は血糖値を下げるのに有効であった（図７）。しかしこの一連の実験はグループ（４）の一匹の動物の死によって乱された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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