(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積を求め、その接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する継代培養限界判定方法であって、
予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係を求めておき、今回求めた接着面積をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。
【請求項２】
継代培養を続けるか否かを判定するにあたっては、前記接着面積が所定の閾値より小さいときに継代培養を続けると判定する
請求項１記載の継代培養限界判定方法。
【請求項３】
前記所定の閾値は、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係に基づいて決定される
請求項２記載の継代培養限界判定方法。
【請求項４】
前記接着面積を求めるにあたっては、前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を求める
請求項１〜３のいずれか記載の継代培養限界判定方法。
【請求項５】
前記接着面積を求めるにあたっては、前記培養容器の底面を撮像した画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する
請求項４記載の継代培養限界判定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の継代培養限界判定方法であって、
前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求め、前記接着面積及び前記倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の継代培養限界判定方法であって、
予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞分裂回数との相関関係を求めておき、今回求めた倍加時間をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の継代培養限界判定方法であって、
前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、前記比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。
【請求項９】
請求項８に記載の継代培養限界判定方法であって、
予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞分裂回数との相関関係を求めておき、今回求めた比増殖速度をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。
【請求項１０】
特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積を求める接着面積算出手段と、
前記接着面積算出手段によって算出された接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段と
を備え、
前記判定手段は、前記接着面積算出手段によって算出された接着面積を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する、
継代培養限界判定装置。
【請求項１１】
前記判定手段は、前記接着面積が所定の閾値より小さいときに継代培養を続けると判定する、
請求項１０記載の継代培養限界判定装置。
【請求項１２】
前記所定の閾値は、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係に基づいて決定される
請求項１１記載の継代培養限界判定装置。
【請求項１３】
前記接着面積算出手段は、
前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する
請求項１０〜１２のいずれか記載の継代培養限界判定装置。
【請求項１４】
前記培養容器の底面を撮像する撮像手段を備え、
前記接着面積算出手段は、前記撮像手段によって撮像された画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する
請求項１３に記載の継代培養限界判定装置。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の継代培養限界判定装置であって、
前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求める倍加時間算出手段を備え、
前記判定手段は、前記細胞接着面積算出手段によって算出された接着面積及び前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の継代培養限界判定装置であって、
前記判定手段は、前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞分裂回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれかに記載の継代培養限界判定装置であって、
前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求める比増殖速度算出手段を備え、
前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の継代培養限界判定装置であって、
前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞分裂回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。
【請求項１９】
コンピュータに請求項１〜９のいずれかに記載の継代培養限界判定方法を実現させるためのプログラム。
【請求項２０】
コンピュータを請求項１０〜１８のいずれかに記載の継代培養限界判定装置として機能させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、継代培養限界判定方法、その装置及びそのコンピュータプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト組織をインビトロ(in vitro)で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。特にヒト皮膚組織については、欧米において商品化レベルにまで達している。ここで、ヒト皮膚組織、例えばヒト表皮角化細胞（Keratinocyte）による培養細胞シートの製品化のフローを図１０に基づいて説明する。まず、患者の健康な部位から少量の組織片を採取し、酵素処理によって細胞分散させた後、角化細胞を分離・回収する（ステップＳ１）。次に、その角化細胞を用いて初代培養を行う（ステップＳ２）。その後、初代培養で増殖させた細胞を別の複数の培養容器に分けて接種（播種）し（ステップＳ３）、培地交換等の操作を必要に応じて行うと、細胞が増殖して培養面での細胞の占める面積が徐々に増加し、所定面積に達する（ステップＳ４）。このとき、製品として総合的に必要となる十分な面積（細胞数）が確保されたか否かをチェックし（ステップＳ５）、確保されていなければ細胞をトリプシンなどのプロテアーゼによって培養容器から剥離・回収し（ステップＳ６）、必要な面積が確保できるまで継代培養を繰返し行うことで面積を増やす。一方、必要な面積が確保されたならば組織構築のために三次元培養（重層化）を施し（ステップＳ７）、これを移植用の培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う（ステップＳ８）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、細胞は寿命を持っていて無制限に分裂できるわけではないため、必要な面積を確保する前に寿命が訪れて増殖しなくなるケースがある。このように増殖しなくなると、三次元培養に進めないこともあるため、生産効率が低下するという問題があった。このため、細胞の寿命つまり継代培養の限界を予測する方法の確立が望まれていたが、細胞の寿命は細胞を採取した部位や患者の年齢などにより変動することから、これまでそのような予測をすることは困難であった。
【０００４】
本発明は上記問題点を解決することを課題とするものであり、細胞の継代培養限界を判定できる継代培養限界判定方法を提供すること、並びにその装置及びコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発明の効果】
本発明者は、培養容器に接着した細胞の接着面積とその細胞の残り細胞分裂回数（つまりあと何回細胞分裂を行えるか）との関係を調べたところ、両者の間には細胞を採取した患者や採取部位等に依存せず細胞の培養条件に依存する相関関係があることがわかった。また、同じく細胞の倍加時間とその細胞の残りの細胞分裂回数との関係を調べたところ、両者の間にも細胞を採取した患者や採取部位等に依存せず細胞の培養条件に依存する相関関係があることがわかった。このような新たな知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明の継代培養限界判定方法は、特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積を求め、その接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定するものである。細胞の接着面積とその細胞の残りの細胞分裂回数との相関関係は培養条件に依存して決まるため、細胞の培養条件と接着面積がわかればその細胞の寿命を予測することができる。このため、細胞の接着面積は継代培養を続けるべきか否かの指標となり得、細胞の接着面積を追跡すれば継代培養限界を判定できる。これにより、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞分裂能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【０００７】
なお、三次元培養は、細胞が重層化していけばどのような操作を行ってもよい。例えば、無血清培地による培養の場合にはＣａ（カルシウム）のリッチな培地に交換することにより重層化していき、フィーダーレイヤー(Feeder Layer)培養法の場合には所定時に継代操作をせずコンフルエント状態にし、そのコンフルエント状態に至った後さらに培養を続けることで重層化していく。
【０００８】
この方法を実現するための継代培養限界判定装置の一例としては、特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積を求める接着面積算出手段と、前記接着面積算出手段によって算出された接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段とを備えたものが挙げられる。
【０００９】
ここで、「細胞」とは、まず培養容器の底面に直接接着するか又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広がっていき、その後細胞分裂する接着依存性細胞のことをいう。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性肝細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【００１０】
また、「特定の培養条件」とは、例えば、ガス雰囲気、培地、培地交換サイクル、継代タイミング（培養容器の底面がどの程度細胞に覆われたら継代を行うかのタイミング）、細胞分散剤（底面に接着している細胞を剥がすもの）などによって特定された条件をいう。
【００１１】
また、「培養容器」としては、細胞が培養できるものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。
【００１２】
本発明の継代培養限界判定方法において、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係を求めておき、今回求めた接着面積をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。こうすれば、細胞の接着面積から残り細胞分裂回数を予測することができるため、継代培養を続けるか否かを判定しやすい。具体的には、残り細胞分裂回数が所定値（例えば１回とか２回）になったときを継代培養の限界点と定めたとすると、予め残り細胞分裂回数がその所定値になるときの接着面積を閾値として求めておき、今回算出された接着面積とその閾値とを比較することにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。より具体的には、本発明の継代培養限界判定方法において、継代培養を続けるか否かを判定するにあたっては、前記接着面積が所定の閾値より小さいときに継代培養を続けると判定してもよい。
【００１３】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示した装置構成において、前記判定手段は、前記接着面積算出手段によって算出された接着面積を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００１４】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記接着面積を求めるにあたっては、前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を求めてもよい。こうすれば、細胞１個あたりの接着面積を比較的容易に求めることができる。
【００１５】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示したいずれかの装置構成において、前記接着面積算出手段は、前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する構成が挙げられる。
【００１６】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記接着面積を求めるにあたっては、前記培養容器の底面を撮像した画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出してもよい。こうすれば、培養容器の底面の撮像画像から細胞１個あたりの接着面積を容易に求めることができ、自動化にも適している。
【００１７】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示した装置構成において、前記培養容器の底面を撮像する撮像手段を備え、前記接着面積算出手段は、前記撮像手段によって撮像された画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する構成が挙げられる。
【００１８】
ここで、表面被覆率と接着細胞濃度とから細胞１個あたりの接着面積を算出する一例を示す。測定時における細胞１個当たりのみかけの接着面積（みかけの細胞接着面積）をＡｃ、培養容器底面に占める細胞の表面被覆率をＣｄ、接着細胞濃度をＸａとすると、Ａｃは下記数１式で表される。なお、本明細書では、ある特定の細胞のパラメータ値ではなく複数の細胞の平均のパラメータ値であることを表す場合には、パラメータの先頭に「みかけの」を付すものとする。
【００１９】
【数１】
Ａｃ＝Ｃｄ／Ｘａ
【００２０】
なお、Ｘａは単位面積当たりの接着細胞数を表すパラメータであるが、撮像手段によって撮像された培養容器底面の画像全体の面積をＳ、画像全体に占める接着細胞数をｎａとすると、Ｘａは下記数２式で表される。このＸａは培養容器底面の複数箇所で撮像した画像を用いて算出し、その平均値を採用することが好ましい。
【００２１】
【数２】
Ｘａ＝ｎａ／Ｓ
【００２２】
また、表面被覆率Ｃｄは、単位面積当たりの細胞接着面積の割合を表すパラメータであり、下記数３式で示されるように、撮像手段によって撮像された培養容器底面の画像において、画像全体の面積Ｓに対する個々の細胞の接着面積Ｓａの総和（ΣＳａ）が占める割合で示される。
【００２３】
【数３】
Ｃｄ＝（ΣＳａ）／Ｓ
【００２４】
例えば、紀ノ岡らの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，ｐ２３４−２３９（２０００））の画像解析手法を撮像画像に施すことにより得られる。この場合、原画像に対して背景分離処理、ルックアップテーブル変換処理、平滑化処理、二値化抽出処理、孤立点除去処理、クロージング処理、穴埋め処理、エリア抽出処理、画素数計測処理の順に画像解析を行い、画像全体の画素数（面積Ｓ）に対する細胞接着部分の画素数（接着面積の総和ΣＳａ）の割合を表面被覆率Ｃｄとして算出する。なお、原画像に対する接着部分の抽出処理としては、これらの画像処理方法に限定されず、種々の画像解析処理を行うことが可能である。このＣｄは継代タイミングの指標として用いることができ、例えばＣｄが所定値以上になった時点又は所定値を越えた時点を継代タイミングとし、培養容器から細胞を剥離して次の継代培養を行うようにしてもよい。
【００２５】
次に、細胞分裂回数を算出する一例を示す。継代回数Ｎｐにおけるみかけの細胞分裂回数をＮd,Np、初期の細胞接種濃度をＸ０とすると、Ｎd,Npは下記数４式で表される。そして、一連の継代培養（継代培養１回目から最終回まで）における累積細胞分裂回数Ｎｄは、各継代培養における総和として表される。
【００２６】
【数４】
Ｎd,Np＝ｌｏｇ2（Ｘａ／Ｘ０）
【００２７】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求め、前記接着面積及び前記倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。この継代培養限界判定方法では、特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積及びその細胞の倍加時間を求め、その接着面積及び倍加時間に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する。ここで、細胞の接着面積が継代培養を続けるべきか否かの指標となり得ることは前述したが、細胞の倍加時間とその細胞の残りの細胞分裂回数との相関関係も培養条件に依存して決まるため、細胞の培養条件と倍加時間とがわかればその細胞の寿命を予測することができる。このため、細胞の倍加時間は継代培養を続けるべきか否かの判定の指標となり得る。つまり、細胞の倍加時間を追跡すれば継代培養限界を判定できる。これにより、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞分裂能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【００２８】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示したいずれかの装置構成において、前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求める倍加時間算出手段を備え、前記判定手段は、前記細胞接着面積算出手段によって算出された接着面積及び前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００２９】
ここで、倍加時間を算出する一例を示す。みかけの倍加時間をｔｄとすると、ｔｄは下記数５式で表される。ここで、ｔは測定時、△ｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００３０】
【数５】
0004230723.tif 000002
【００３１】
本発明の継代培養限界判定方法において、特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求め、その倍加時間に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。前述の通り、細胞の倍加時間を追跡しても継代培養限界を判定できる。
【００３２】
この方法を実現する継代培養限界判定装置の一例としては、特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求める倍加時間算出手段と、前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段とを備えたものが挙げられる。
【００３３】
本発明の継代培養限界判定方法において、倍加時間を利用する場合には、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞分裂回数との相関関係を求めておき、今回求めた倍加時間をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。こうすれば、細胞の倍加時間から残り細胞分裂回数が予測できるため、継代培養を続けるか否かを判定しやすい。具体的には、残り細胞分裂回数が所定値（例えば１回とか２回）になったときを継代培養の限界点と定めたとすると、予め残り細胞分裂回数がその所定値になるときの倍加時間を閾値として求めておき、今回算出された倍加時間とその閾値とを比較することにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。
【００３４】
この方法を実現するための継代培養限界判定装置の一例としては、先ほどの継代培養限界判定装置において、細胞の倍加時間を継代培養を続けるべきか否かの判定の指標とする際、前記判定手段は、前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞分裂回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００３５】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、前記比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定してもよい。この継代培養限界判定方法では、特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、その比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する。例えば、前記比増殖速度のみに基づいて判定してもよいし、前記接着面積及び前記比増殖速度に基づいて判定してもよいし、前記倍加時間及び前記比増殖速度に基づいて判定してもよいし、前記接着面積、前記倍加時間及び前記比増殖速度に基づいて判定してもよい。ここで、細胞の接着面積や倍加時間が継代培養を続けるべきか否かの指標となり得ることは前述したが、細胞の比増殖速度とその細胞の残りの細胞分裂回数との相関関係も培養条件に依存して決まるため、細胞の培養条件と比増殖速度とがわかればその細胞の寿命を予測することができる。このため、細胞の比増殖速度は継代培養を続けるべきか否かの判定の指標となり得る。つまり、細胞の比増殖速度を追跡すれば継代培養限界を判定できる。これにより、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞分裂能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【００３６】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示したいずれかの装置構成において、前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求める比増殖速度算出手段を備え、前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００３７】
ここで、比増殖速度を算出する一例を示す。みかけの比増殖速度をμとすると、μは下記数６式で表される。ここで、ｔは測定時、△ｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００３８】
【数６】
0004230723.tif 000003
【００３９】
本発明の継代培養限界判定方法において、特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、その比増殖速度に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。前述の通り、細胞の比増殖速度を追跡しても継代培養限界を判定できる。
【００４０】
この方法を実現する継代培養限界判定装置の一例としては、特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求める比増殖速度算出手段と、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段とを備えたものが挙げられる。
【００４１】
本発明の継代培養限界判定方法において、比増殖速度を利用する場合には、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞分裂回数との相関関係を求めておき、今回求めた比増殖速度をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。こうすれば、細胞の比増殖速度から残り細胞分裂回数が予測できるため、継代培養を続けるか否かを判定しやすい。具体的には、残り細胞分裂回数が所定値（例えば１回とか２回）になったときを継代培養の限界点と定めたとすると、予め残り細胞分裂回数がその所定値になるときの比増殖速度を閾値として求めておき、今回算出された比増殖速度とその閾値とを比較することにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。
【００４２】
この方法を実現するための継代培養限界判定装置の一例としては、先ほどの継代培養限界判定装置において、細胞の比増殖速度を継代培養を続けるべきか否かの判定の指標とする際、前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞分裂回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００４３】
コンピュータを上述の継代培養限界判定装置として機能させるためのプログラムや、コンピュータに上述の継代培養限界判定方法を実現させるためのプログラムは、通常、コンピュータのＣＰＵによって読み出すことが可能なＣＤ−ＲＯＭやＨＤＤ等の記録媒体に記録され、そこからＣＰＵによって読み出されて実行される。このため、このようなプログラムは上述した継代培養限界方法の作用効果を発揮するために用いられ、有用性が高い。また、このプログラムは、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体（例えばハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤなど）に記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介して配信されてもよいし、その他どのような形で授受されてもよい。
【００４４】
なお、本実施形態では、継代培養の限界判定のための指標として細胞の接着面積による説明を行ったが、接着面積の代わりに細胞を培養容器の一面（例えば底面）に投影させたときの投影面積を利用しても、同様の効果を得ることができる。この場合、走査型共焦点レーザ顕微鏡等の焦点能力の高い撮影装置を利用しなくとも、ＣＣＤカメラ等の焦点能力の低い撮影装置を利用することができ、簡易な構成とすることができる。
【００４５】
【実施例】
［実施例１］
１．使用した角化細胞
本実施例では０才包皮由来の角化細胞、２２才乳房由来の角化細胞、７０才乳房由来の角化細胞（いずれも（株）クラボウ製）を凍結バイアルとして購入し使用した。いずれも初代培養を経た後、凍結された細胞群であった。
【００４６】
２．継代培養の手順
図１は培養操作の概略説明図である。図１に示すように、凍結バイアルを速やかに融解した後、培養容器であるポリスチレン製７５ｃｍ2Ｔ型フラスコ（ヌンク社製）に接種した。この培養操作を継代１回目（Ｎｐ＝１）と定義した。培養は無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２、（株）クラボウ製）中、３７℃、ＣＯ2５％雰囲気下で行った。培養中、培地交換は７２時間ごとに行った。そして、Ｔ型フラスコの底面を細胞が被覆する表面被覆率Ｃｄが０．８を越えた時点、つまり培養容器底面の８０％が細胞で覆われた時点で次回の継代培養に移行した。継代培養は、まず、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液を培養面１ｃｍ2あたり０．０２ｍｌとなるように滴下して３７℃にて３分間静置することで細胞群を剥離し、次に、トリプシンインヒビターによって剥離を停止させた後、細胞群を回収して１０００ｒｐｍ、８分間の遠心分離によって各酵素を除去し、続いて、新鮮な培地によって細胞を再懸濁し、生存細胞の接種濃度が１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように新しいＴ型フラスコに接種した。培養は前出の無血清培地中で３７℃、ＣＯ2５％雰囲気下で行い、培地交換は７２時間ごとに行った。そして、表面被覆率Ｃｄが０．８を越えた時点で次回の継代培養に移行した。本実施例では継代５回（Ｎｐ＝５）まで行った。
【００４７】
３．各継代培養におけるパラメータの算出
各継代培養において、Ｔ型フラスコ１個あたり底面３箇所をＣＣＤカメラによって毎日培養容器底面の画像を取り込み、撮影された画像の面積Ｓにおける接着細胞数ｎａをカウントし、下記数７式に示すように各箇所での接着細胞濃度Ｘａ’を算出し、それらの平均値をそのときの接着細胞濃度Ｘａとした。
【００４８】
【数７】
Ｘ’ａ＝ｎａ／Ｓ
Ｘａ  ＝（底面３箇所でのＸ’ａの平均値）
【００４９】
また、紀ノ岡らの論文（前出）の画像解析手法を撮影画像に施すことにより、撮影された画像（面積Ｓ）における細胞接着部分の総和面積ΣＳａを画素数に基づいて、下記数８式に示すように各箇所での細胞の表面被覆率Ｃ’ｄを算出し、それらの平均値をそのときの表面被覆率Ｃｄとした。更に、下記数９式により、みかけの細胞接着面積Ａｃを算出した。
【００５０】
【数８】
Ｃ’ｄ＝（ΣＳａ）／Ｓ
Ｃｄ  ＝（底面３箇所でのＣ’ｄの平均値）
【００５１】
【数９】
Ａｃ＝Ｃｄ／Ｘａ
【００５２】
ここで、図２は、ある継代培養での培養時間ｔに対する接着細胞濃度Ｘａの変化を表したグラフである。細胞の培養過程は、一般に細胞接着期、誘導期及び対数増殖期を含んでなり、細胞接着期は、培養容器内に接種してからその容器底面に接着するまでの期間であり、誘導期は、細胞接着期の終了後から培養容器底面に接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの期間であり、対数増殖期は、前記誘導期の終了後から培養容器の底面にほぼコンフルエントな状態（本実施例ではＣｄ＝０．８）になるまでの期間である。
【００５３】
各継代培養でのみかけの細胞分裂回数Ｎd,Npは、下記数１０式から算出した。そして、このＮd,Npを累積することにより累積細胞分裂回数Ｎｄを算出した。また、みかけの倍加時間ｔｄは下記数１１式より算出し、みかけの比増殖速度μは下記数１２式より算出した。なお、これ以降、各パラメータにつき接頭語の「みかけの」を省略して説明することもある。
【００５４】
【数１０】
Ｎd,Np＝ｌｏｇ2（Ｘａ／Ｘ０）
但し、Ｘ０＝１．０×１０4cells/cm2
Ｎｄ＝（累積細胞分裂回数）
【００５５】
【数１１】
0004230723.tif 000004
【００５６】
【数１２】
0004230723.tif 000005
【００５７】
４．倍加時間と寿命満了時について
一連の継代培養の増殖過程を示すために、０才ドナー由来の角化細胞の累積培養時間に対する、累積細胞分裂回数Ｎｄ及びみかけの倍加時間ｔｄの変化を表すグラフを図３に示す。
【００５８】
各継代培養において次の継代培養に移る直前の表面被覆率Ｃｄは、それぞれ０．８３，０．８９，０．８８，０．８１であった。図３から明らかなように、継代２回目及び３回目（Ｎｐ＝２及び３）の培養後期には、みかけの倍加時間ｔｄが急激に上昇したが、次の継代培養の初期ではこの影響を受けることなく倍加時間は低い値に戻り、細胞群の増殖は良好であった。このみかけの倍加時間ｔｄの一時的な上昇は、接触阻害（Contact Inhibition）の発現によるものと考えられる。接触阻害は、隣合う細胞同士が接触し、細胞分裂できる空間が少なくなることによって細胞増殖が抑制される現象をいう。しかし、継代４回目（Ｎｐ＝４）において、累積培養時間が４００時間を越えた頃から細胞群の分裂は継代３回目まで続いた上昇が見られなくなり、接触阻害の影響を受けているとは考えられない時期からみかけの倍加時間ｔｄが増大し続け、次の継代５回目（Ｎｐ＝５）の初期にもみかけの倍加時間ｔｄが低い値に戻ることはなかった。
【００５９】
本実施例では、角化細胞の寿命満了時は、継代１回目における平均倍加時間を基準としてその１０倍の倍加時間に達したときと定義した。具体的には、継代１回目における平均倍加時間は２０．６時間であったため、倍加時間が２０６時間に達した時を寿命満了時と定義した。そして、図３に基づいて倍加時間が２０６時間になったときの累積培養時間を求め、それに対応する累積細胞分裂回数Ｎｄを求め、それを寿命満了時の限界細胞分裂回数ＮｄＦとした。寿命満了時以降の累積細胞分裂回数ＮｄはほぼＮｄＦのままであり、更なる細胞分裂はほとんど起こっていないことがわかる。このことは、寿命満了時の定義が妥当であることを示している。
【００６０】
このように倍加時間によって寿命満了時を定義することは以下の事実によってもその妥当性が支持される。即ち、継代培養を繰り返した細胞群は、別途調べた分化度合いの指標であるインボルクリン含有量が顕著に増大したことから明らかなように成熟した細胞（分化した細胞）の割合が高くなっているが、このような細胞は分裂能力が低下していることから結果として細胞群全体の倍加時間が著しく増大することになる。逆にいえば、当初に比べて倍加時間が著しく増大したということは細胞分裂能力をほとんど持たない細胞で占められているということであり、細胞群全体としてみたときに寿命満了とみて差し支えないといえる。
【００６１】
５．残り細胞分裂回数と細胞接着面積又は倍加時間との関係
残り細胞分裂回数をＮｄＲとすると、このＮｄＲは下記数１３式のように、限界細胞分裂回数ＮｄＦから現在の累積細胞分裂回数Ｎｄを差し引いた値として表される。
【００６２】
【数１３】
ＮｄＲ＝ＮｄＦ−Ｎｄ
【００６３】
この残り細胞分裂回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化と、同じくみかけの細胞接着面積Ａｃの変化を図４に示した。図４では、０才由来、２２才由来、７０才由来の各角化細胞を用いて培養したときの結果をまとめて表記した。この図４から明らかなように、残り細胞分裂回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化及びみかけの細胞接着面積Ａｃの変化は、ドナーによらずどの角化細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することがわかった。また、残り細胞分裂回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化及びみかけの細胞接着面積Ａｃの変化は、本実施例の培養条件と異なる条件を採用した場合には異なる曲線に沿って推移したが、その培養条件を採用する限りドナーによらずどの細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することもわかった（実施例２参照）。
【００６４】
残り細胞分裂回数ＮｄＲが僅かになった細胞は、みかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃが急激に増大しているが、これは寿命満了のために細胞分裂することなくただ培養面に接着している状態の細胞が多数を占めていることによると考えられる。このように、寿命満了間近になるとみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃが急激に増大するということは、逆にいえば、みかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃが急激に増大したときには寿命満了間近になり、更なる継代培養を行うのに相応しくないといえる。
【００６５】
具体的には、残り細胞分裂回数ＮｄＲの下限回数を予め定めておき（例えば１回）、その下限回数に対応したみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃを図４から求め、そのようにして求めたみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃを予め閾値として定めておく。その後、同じ培養条件で同じ又は異なるドナー由来の角化細胞を培養したとき、時間の経過に伴ってみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃを算出し、それらを先ほどの閾値と比較し、閾値を越えた時点で残り細胞分裂回数ＮｄＲが予め定めた下限回数を下回ったと判断し、次回の継代培養処理を中止すればよい。したがって、図１０のステップＳ５において必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞分裂能力が残っている状態のうちに三次元培養工程（図１０のステップＳ７）に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。なお、上述のようにみかけの倍加時間ｔｄとみかけの細胞接着面積Ａｃの両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよいが、いずれか一方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。
【００６６】
６．残り細胞分裂回数と比増殖速度との関係
上述した５．では細胞接着面積Ａｃと倍加時間ｔｄのいずれか一方又は両方を判定指標として残り細胞分裂回数を予測し、継代培養限界の判定を行ったが、これらに代えて又は加えて、みかけの比増殖速度μを判定指標としてもよい。比増殖速度μは、下記数１４式のように、みかけの倍加時間ｔｄから求めることができるが、接着細胞濃度Ｘａの時間変化から求めることもできる。なお、Ｘａ（ｔ）は時刻ｔにおける接着細胞濃度を表し、△ｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００６７】
【数１４】
0004230723.tif 000006
【００６８】
図５に、０才、２２才、７０才ドナー由来の各角化細胞の培養時間に対する累積細胞分裂回数Ｎｄ、みかけの比増殖速度μ及びみかけの接着細胞面積Ａｃの変化を表すグラフを示した。但し、プロットした実験結果は、上述した５．の実験と同一条件下で行った別の実験の結果である。図５に示される各角化細胞の比増殖速度μの変化において、μの値が顕著に減少する直前点を臨界点（図中の矢印）として求めた。μが顕著に減少するということは、倍加時間ｔｄが著しく増大したことを示すので、細胞の増殖能が低下し、継代培養の限界が近いことを意味する。
【００６９】
表１には、各臨界点における比増殖速度μ、細胞接着面積Ａｃ、残り細胞分裂回数ＮｄＲを示した。この表１に示されるように、臨界点においては細胞株によることなく比増殖速度μ、細胞接着面積Ａｃがほぼ同じ値を示した。また、臨界点以降の残り細胞分裂回数ＮｄＲ（＝ＮｄＦ−Ｎｄ）も２〜３回であった。このため、これらの臨界点に基づいて比増殖速度μの閾値を定めておき、その後同じ培養条件で同じ又は異なるドナー由来の角化細胞を培養したとき、時間の経過に伴って比増殖速度μを算出し、それらを先ほどの閾値と比較すれば、継代培養限界（残り細胞分裂回数ＮｄＲが例えば２〜３回となる時期）を予測することができる。このように継代培養限界を予測することにより、細胞が増殖不可能になる前に三次元培養工程に移行して製品化（シート化）することが可能となる。例えば、比増殖速度μ［ｈ-1］の閾値を０．０２とすることで、継代限界となる前すなわち残り細胞分裂回数ＮｄＲが２〜３回の状態で三次元培養工程に進んで製品化することが可能となる。なお、限界細胞分裂回数ＮｄＦついては、上述した４．と同様にして求めた。
【００７０】
【表１】
0004230723.tif 000007
【００７１】
図６に、残り細胞分裂回数ＮｄＲとみかけの比増殖速度μとの関係を表すグラフを示す。比増殖速度μも倍加時間ｔｄと同様、細胞株によらず一様のフィッティングラインで示される。これは、μとｔｄが反比例の関係にあることを考慮すれば予想され得ることである。図６に示されるように、各臨界点（黒塗）を境にＮｄＲがゼロに近づくにつれて比増殖速度μが急激に減少し、再び臨界点の値よりも大きくなることはなかった。この臨界点の前後において近似直線（図中の点線）の傾きが異なるため、両直線の交点におけるμの値に基づいて閾値を設定することで、容易且つ明確に継代培養限界を判定、評価することができる。あるいは、倍加時間ｔｄの場合とは異なり、各年齢のプロットのいずれについてもプロットの存在しない領域（図６の斜線領域）が現れるため、この領域に閾値を設定することで、倍加時間ｔｄの閾値を設定する場合に比べて容易且つ明確に継代培養限界を判定、評価することができる。
【００７２】
［実施例２］
実施例１では無血清培地による培養について説明したが、本実施例では実施例１とは異なる培養法であるフィーダーレイヤー(Feeder Layer)培養法について説明する。
【００７３】
１．使用した表皮細胞
本実施例では２０才（２個体）、４７才、５５才（２個体）、６８才の患者から皮膚組織を採取し、ディスパーゼやトリプシン等のプロテアーゼにより表皮細胞(keratinocyte)として単離した。この表皮細胞を用いて細胞懸濁液を調製した。
【００７４】
２．継代培養の手順
マイトマイシンＣにより増殖能を抑制したマウス線維芽細胞をフィーダ細胞として、培養フラスコの底面に敷設した後、１．で調製した細胞懸濁液を播種した。この培養操作を継代１回目（Ｎｐ＝１）と定義した。細胞播種後、５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を培養用培地として注入し、フィーダ細胞の存在下で表皮細胞を培養した。表皮細胞のコロニー形成が確認された後、適時にトリプシンにより細胞群を剥離し、次に、トリプシンインヒビターによって剥離を停止させた後、細胞群を回収して１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって各酵素を除去した。続いて、新鮮な培地によって細胞を再懸濁し、新しい培養フラスコに播種した。
【００７５】
本実施例では、所定時間が経過しても継代操作に必要となる十分な細胞が得られなくなったとき、例えば、観察的にはコロニー（細胞集団）が十分に形成されなかったときを細胞増殖の限界とし、一つ前の継代培養を限界継代回数ＮｐＦとした。したがって、本実施例においては、各個体によって限界継代回数ＮｐＦが５〜１４と大きく異なる。
【００７６】
３．各継代培養におけるパラメータの算出
各継代培養において、みかけの細胞分裂回数Ｎd,Npを下記数１５式より、みかけの倍加時間ｔｄを下記数１６式より算出した。但し、本実施例においては、Ｘ０は播種細胞密度、Ｘａは次の継代操作時（細胞回収時）における細胞密度、Δｔは１回の継代培養に要した培養時間を示す。
【００７７】
【数１５】
Ｎd,NP＝ｌｏｇ2（Ｘａ／Ｘ０）
【００７８】
【数１６】
0004230723.tif 000008
【００７９】
４．残り細胞分裂回数と倍加時間との関係
本実施例における残り細胞分裂回数ＮｄＲと倍加時間ｔｄとの関係を図７に示す。ここでは、継代１回ごとにその継代の初期の細胞数と終期の細胞数とをカウントし、フラスコ底面の大きさで除することによりそれぞれの細胞密度Ｘ０，Ｘａを求め、それらの細胞密度に基づいて倍加時間ｔｄを求めたため、１回の継代につき１つの倍加時間ｔｄが対応することになる。したがって、各細胞において図７にプロットされた数だけ継代培養が行われたことになる。なお、残り細胞分裂回数ＮｄＲは下記数１７式で表される。累積細胞分裂回数ＮｄはＮd,Npを累積することにより算出した。
【００８０】
【数１７】
ＮｄＲ＝ＮｄＦ−Ｎｄ
【００８１】
図７では、２０才由来（２個体）、４７才、５５才（２個体）、６８才由来の各表皮細胞を用いて培養したときの結果をまとめて表記した。この図７から明らかなように、残り細胞分裂回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化は、継代回数や患者（個体差）によらず、どの表皮細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することがわかった。また、残り細胞分裂回数ＮｄＲが僅かになった細胞は、みかけの倍加時間ｔｄが急激に増加することがわかった。即ち、みかけの倍加時間ｔｄの急激な増大は寿命満了が間近であることを示しており、更なる継代培養を行うのに相応しくないといえる。
【００８２】
具体的には、残り細胞分裂回数ＮｄＲの下限回数を予め定めておき（例えば２〜３回）、その下限回数に対応したみかけの倍加時間ｔｄを図７から求め、そのようにして求めたみかけの倍加時間ｔｄを予め閾値として定めておく。一方、新たに培養を開始し、時間の経過に伴ってみかけの倍加時間ｔｄを算出し、それらを先ほどの閾値と比較し、閾値を超えた時点で残り細胞分裂回数ＮｄＲが予め定めた下限回数を下回ったと判断し、次回の継代培養処理を中止すればよい。
【００８３】
このように、培養条件を変えたフィーダーレイヤー培養法によっても、個体間の差は見られず、倍加時間ｔｄと残り細胞分裂回数ＮｄＲとの関係は一様なフィッティングラインで示された。したがって、本発明は培養条件が異なる種々の培養方法に広く応用できる。また、同一培養条件においては、細胞の個体特性によることなく閾値を設定することができるので、容易に細胞分裂限界又は継代限界を判定することができ、そのような限界に至る前に三次元培養工程に移して製品化（シート化、重層化）することができる。なお、本実施例においては、倍加時間ｔｄを用いて継代培養限界の判定を行ったが、実施例１の６．で述べたように比増殖速度μを用いて判定してもよい。
【００８４】
［実施例３］
以上の知見に基づいて製作される継代培養限界判定装置１０は、図８に示すように、培養中のＴ型フラスコ底面を撮影する撮像手段としてのＣＣＤカメラ１１と、各種指令やデータを入力する入力装置としてのキーボード１２と、各種情報を出力する出力装置としてのディスプレイ１３と、各種演算を実行する処理装置としてのコンピュータ１４とを備えて構成されている。
【００８５】
コンピュータ１４は、オペレータによって継代培養判定処理の開始が入力されたあと、予め定められた測定タイミングになるごとに内部メモリから継代培養判定処理のプログラムを読み出し、これを実行する。図９は継代培養判定処理のフローチャートである。まず、ＣＣＤカメラ１１は継代培養中のＴ型フラスコ底面を撮影してその画像をコンピュータ１４へ送信するが、そのＣＣＤカメラ１１から送信されてきた画像を読み込み（ステップＳ１００）、その画像に基づいて接着細胞濃度Ｘａ及び表面被覆率Ｃｄを前出の数７式及び数８式に基づいて算出する（ステップＳ１１０）。接着細胞濃度Ｘａを算出する際には細胞数が必要になるが、この細胞数はコールタカウンタなどの自動測定器から読み込む構成としてもよいし、オペレータが別途測定した値をキーボード等から入力する構成としてもよい。続いて、表面被覆率Ｃｄと接着細胞濃度Ｘａから前出の数９式に基づいてみかけの細胞接着面積Ａｃを算出し（ステップＳ１２０）、今回のみかけの細胞接着面積Ａｃと細胞接着面積閾値とを比較し（ステップＳ１３０）、前者が後者以下ならば残り細胞分裂回数は十分であり増殖能力があるとみなしてディスプレイ１３に継代培養の継続を許容する旨の表示を出力し（ステップＳ１４０）、このプログラムを終了する。一方、ステップＳ１３０で前者が後者を上回ったならば残り細胞分裂回数は僅かであり増殖能力が低いとみなしてディスプレイ１３に次回の継代培養処理の中止を促す表示を出力し（ステップＳ１５０）、このプログラムを終了する。
【００８６】
この継代培養限界判定装置１０によれば、継代培養を継続すべきか否かの判断を的確に行うことができるため、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞分裂能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【００８７】
この継代培養限界判定装置１０はみかけの細胞接着面積Ａｃに基づいて継代培養を続けるべきか否かを判定したが、これとは別に、みかけの倍加時間ｔｄを算出し、これとみかけの倍加時間閾値とを比較し、前者が後者以下ならば増殖能力があるとみなして継代培養の継続を許容する旨をディスプレイ１３に表示し、前者が後者を上回ったならば増殖能力が低いとみなして次回の継代培養処理を中止する旨をディスプレイ１３に表示してもよい。あるいは、みかけの比増殖速度μを算出し、これとみかけの比増殖速度閾値とを比較し、前者が後者以下ならば増殖能力があるとみなして継代培養の継続を許容する旨をディスプレイ１３に表示し、前者が後者を上回ったならば増殖能力が低いとみなして次回の継代培養処理を中止する旨をディスプレイ１３に表示してもよい。また、みかけの細胞接着面積Ａｃ、みかけの倍加時間ｔｄ、みかけの比増殖速度μの一つが閾値を上回ったときに増殖能力が低いとみなしてもよいし、いずれか二つが閾値を上回ったときに増殖能力が低いとみなしてもよいし、三つとも閾値を上回ったときに増殖能力が低いとみなしてもよい。
【００８８】
なお、上述した継代培養限界判定装置１０では、コンピュータ１４が本発明の接着面積算出手段及び判定手段に相当し、ＣＣＤカメラ１１が撮像手段に相当するが、コンピュータ１４がみかけの倍加時間ｔｄを求める場合にはは倍加時間算出手段にも相当し、コンピュータ１４がみかけの比増殖速度μを求める場合には比増殖速度算出手段にも相当する。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養操作の概略説明図である。
【図２】ある継代培養での培養時間ｔに対する接着細胞濃度Ｘａ（ｔ）の変化を表したグラフである。
【図３】０才ドナー由来の角化細胞の累積培養時間に対する、累積細胞分裂回数Ｎｄ及びみかけの倍加時間ｔｄの変化を表すグラフである。
【図４】残り細胞分裂回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃの変化を表すグラフである。
【図５】各角化細胞の培養時間に対する累積細胞分裂回数Ｎｄ、みかけの比増殖速度μ及びみかけの接着細胞面積Ａｃの変化を表すグラフである。
【図６】残り細胞分裂回数ＮｄＲとみかけの比増殖速度μとの関係を表すグラフである。
【図７】残り細胞分裂回数ＮｄＲと倍加時間ｔｄとの関係を表すグラフである。
【図８】継代培養限界判定装置の概略構成図である。
【図９】継代培養限界判定処理のフローチャートである。
【図１０】ヒト皮膚組織の製品化のフローである。
【符号の説明】
１０・・・継代培養限界判定装置、１１・・・ＣＣＤカメラ、１２・・・キーボード、１３・・・ディスプレイ、１４・・・コンピュータ、Ａｃ・・・みかけの細胞接着面積、Ｃｄ・・・表面被覆率、Ｎｄ・・・累積細胞分裂回数、ＮｄＦ・・・限界細胞分裂回数、ＮｄＲ・・・残り細胞分裂回数、Ｎｐ・・・継代回数、ｔｄ・・・倍加時間、Ｘａ・・・接着細胞濃度、ｎａ・・・接着細胞数、Ｓ・・・画像全体の面積、Ｓａ・・・細胞面積。
【図１】
0004230723.tif 000009
【図２】
0004230723.tif 000010
【図３】
0004230723.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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