(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ２Ｂ２−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４３）およびＳ２Ｅ５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４４）よりなる群から選択されるハイブリドーマから産生され、ニューロシンおよび／または該前駆体に対して選択的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ハイブリドーマ２Ｂ２−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４３）。
【請求項３】
ハイブリドーマＳ２Ｅ５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４４）。
【請求項４】
ＩｇＧ、アルブミン、トリプシノーゲンに対し交差反応を示さない、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１または４に記載の抗体のヒトに対する抗原性を少なくしたキメラ抗体またはヒト化抗体。
【請求項６】
請求項１、４および／または５に記載の抗体を使用することを特徴とする、被検試料中に含有されるニューロシンおよび／または該前駆体の定量方法。
【請求項７】
前記定量方法をＥＬＩＳＡ系において使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１、４および／または５に記載の抗体を用いることを特徴とする、ニューロシンおよび／または該前駆体の組織内における存在を確認するための免疫組織学的検査方法。
【請求項９】
請求項１、４および／または５に記載の抗体を含有するアルツハイマー病の診断剤。
【請求項１０】
請求項１、４および／または５に記載の抗体を含有するパーキンソン病の診断剤。
【請求項１１】
アルツハイマー病の診断剤の製造における請求項１、４および／または５に記載の抗体の使用。
【請求項１２】
パーキンソン病の診断剤の製造における請求項１、４および／または５に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、特定のセリンプロテアーゼ、すなわちニューロシン（Ｎｅｕｒｏｓｉｎ）に対して選択的に結合するモノクローナル抗体とその製造法、および該モノクローナル抗体を用いる各種疾患の診断方法に関する。
背景技術
プロテアーゼは、一般に、不活性前駆体として生合成され、分子内で限定水解を受け、活性型プロテアーゼへ変換される。プロテアーゼである限りペプチド結合を加水分解する作用を有するが、種類によってその作用様式は異なる。プロテアーゼは、その触媒基の種類により、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼ等に分類される。各種のプロテアーゼは、普遍的な消化性を有するものから、様々な調節ドメインを持ち、基質特異性が厳密で、固有の蛋白質のみを特異的に加水分解するものまで、多彩な性質を有している。
セリンプロテアーゼの至適ｐＨは、中性から弱アルカリ性で、分子量は一般に３０，０００以下の場合が多い。分子量の大きい血液凝固・線溶・補体系プロテアーゼは、すべてトリプシン様セリンプロテアーゼに属しており、これらは多くの調節ドメインを持ち、生体反応において極めて重要なプロテアーゼカスケードを形成している。
セリンプロテアーゼは、その一次構造からスブチリシン族とキモトリプシン族に分けられる。スブチリシン族は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のみが産生するが、キモトリプシン族は微生物や動植物に広く分布する。触媒活性には、Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２、Ｓｅｒ−１９５（キモトリプシン番号）が関与し、一般にジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）によって不活化される。その活性発現には、Ａｓｐによって影響されたＨｉｓがＳｅｒ−１９５からプロトンを奪い、Ｓｅｒが活性化される触媒トライアートが必要である。さらに、基質と結合し、基質のカルボニル基が分極して、酸素原子がオキシアニオンとなる。トリプシンは、この部位にＡｓｎ−１８９があり、ＬｙｓやＡｒｇなどの塩基性アミノ酸の陽電荷と相互作用する。一方、キモトリプシンは、この部位がＳｅｒ−１８９であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐなどの芳香族アミノ酸やＬｅｕ、Ｍｅｔも結合する。また、エラスターゼは、キモトリプシンと同様、Ｓｅｒ−１８９であり、Ａｌａなどの非芳香族アミノ酸と相互作用する。その他のキモトリプシン族として、アクロバクタープロテアーゼ、プラスミン、メダラシン、アクロシン、Ｖ８プロテアーゼ、カテプシンＧ、キマーゼ、プロリン特異的エンドペプチダーゼ、顎下腺プロテアーゼＡ、ＸＩＩａ、ＸＩａ、血漿カリクレイン、Ｉｘａ、Ｘａ、α−トロンビン、ＶＩｌａ、プロテインＣ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、Ｃｌｒ、Ｃｌｓ、Ｃ２、Ｂ、Ｄ、Ｉ、γ−セミノプロテイン、組織カリクレイン、カブトガニ血球のＣ因子、Ｂ因子、凝固酵素等がある。
最近、セリンプロテアーゼのコンセンサス配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、多くの新規プロテアーゼのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列が決定されている。この方法により、Ｙａｍａｍｕｒａら（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３９，３８６，１９９７）、Ｇｓｃｈｗｅｎｄら（Ｇｓｃｈｗｅｎｄ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，９，２０７，１９９７）、Ｃｈｅｎら（Ｃｈｅｎ，Ｚ−Ｌ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５，５０８８，１９９５）およびその他の多数の研究者が新規セリンプロテアーゼを発見している。
特開平９−１４９７９０号の配列番号３には、新規セリンプロテアーゼとしてのニューロシンが開示されている。ニューロシンは、また、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１３５０，１１−１４，１９９７にも報告されている。既知のセリンプロテアーゼとの類似性が３０％未満であるニューロシンは、ヒト結腸癌ＣＯＬＯ  ２０１細胞の培養上清中にセリンプロテアーゼ活性を認め、全てのセリンプロテアーゼ遺伝子を単離した結果得られたものである。これによりセリンプロテアーゼ遺伝子を用いてニューロシンを大量に生産する方法及び該酵素を用いる特異的阻害物質のスクリーニング方法が提供される。また、当該スクリーニング方法は、各種疾患治療剤の探索に有用であることも示されている。
ニューロシンの機能は、現在のところ不明であるが、脳に豊富に発現しているところから、脳機能の維持に重要な役割を果たしていると予想している。また、リコンビナント蛋白を用いればさらに詳細な機能が判明する可能性がある。
特開平６−６２８５５号には、新規セリンプロテアーゼとしてのジーム（Ｚｙｍｅ）が開示されており、これはまた、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４０），２５１３５−２５１４２，１９９７にも報告されている。ジームのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、キモトリプシン様酵素の活性を有するコンセンサス配列に対してＰＣＲ増幅をすることにより、アルツハイマー病患者の脳ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、決定された。ジームをコードしているｍＲＮＡはいくつかの哺乳類で認められる。また、脳、腎臓および唾液腺に豊富に発現しているが、脳に関しては、胎児脳では発現せず、成人脳でのみ発現している。さらに、ジームは、１９ｑ１３．３染色体に遺伝子が存在し、この部位は、遅発型家族性アルツハイマー病と結合している部分であることが明らかになっている。従って、ジームは、アルツハイマー病およびダウン症候群のような神経疾患の特徴を明らかにするのに有用であると考えられている。
ＷＯ９８／１１２３８号には、新規セリンプロテアーゼとしてのプロテアーゼＭ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ）が開示されており、これはまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（５），６２４−６３６，１９９６にも報告されている。プロテアーゼＭのｃＤＮＡは、正常ヒト乳腺上皮７６Ｎ細胞系より得られ、カリクレイン、前立腺特異的抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＡ）およびトリプシンに極めて類似した配列を有している。また、プロテアーゼＭの遺伝子は、１９ｑ１３．３染色体に存在している。プロテアーゼＭは、転移性乳ガン細胞系をダウンレギュレーションするが、そのｍＲＮＡは初期乳癌細胞系、卵巣癌組織、癌細胞系で強く発現しており、初期乳腺癌および初期卵巣癌に有用なマーカーとなると考えられている。
これらニューロシン、ジームおよびプロテアーゼＭは、由来こそ異なるものの、そのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、さらにはコードしている遺伝子の染色体配座位置まで全く同じである。従って、これらセリンプロテアーゼは、同一物質の可能性が高く、以下、本明細書では、ニューロシンの名称で統一することにする。上記したように、このセリンプロテアーゼは、異なった研究グループによってほぼ同時期に発見され、その薬理活性が研究されており、今後、様々な場面でその重要性が明らかになることが期待されている。例えば１９９５年にＧａｍｅｓら（Ｇａｍｅｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，；Ｎａｔｕｒｅ，３７３，５２３，１９９５）が、また、１９９６年にＨｓｉａｏら（Ｈｓｉａｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，９９，１９９６）が、β−アミロイド前駆体タンパク質（β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、βＡＰＰ）を大量に発現させ、アミロイドβ蛋白（Ａβ）の沈着が認められるトランスジェニックマウスの作製に成功しており、上記セリンプロテアーゼのアルツハイマー病等に対する役割が今後さらに解明されることになろう。
特開平６−６２８５５号に記載されているように、ジーム（すなわち、ニューロシン）はアルツハイマー病およびダウン症候群においても重要な役割を担っている。アルツハイマー病はその病理学的所見から初老期発症のアルツハイマー病と老年期に発症するアルツハイマー型老年痴呆とに区別する必要があるとの考えもあるが、本明細書では両者をまとめてアルツハイマー病とする。
アルツハイマー病は臨床上、種々の認知機能が進行性に低下することにより特徴づけられ、その神経病理学的所見の中心は、神経細胞の変性・脱落に加えて老人斑や神経原繊維変化といった異常な構造物を認めることである（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ，；Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１６，９３，１９９６）。このうち、老人斑は正常加齢でも出現するが、アルツハイマー病脳における出現頻度は遙かに高度であり、疾患特異性の高い病理学的所見である。また、老人斑の構成成分であるＡβの蓄積がアルツハイマー病脳において最も早期の病理学的所見であること、さらにＡβの前駆体であるβＡＰＰ遺伝子に点突然変異を有する家族性アルツハイマー病が発見されていることなどから、Ａβの蓄積機構（β−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）の解明は病因論的に最も重要な課題といえる。
βＡＰＰの存在する２１番目染色体のトリソミーであるダウン症候群では、３０歳以降に全例でアルツハイマー病と同様な脳の病理所見が認められるが、Ｔｅｌｌｅｒら（Ｔｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２，９３，１９９６）は、胎児から６０歳台のダウン症候群の脳から抽出された可溶性Ａβを免疫沈降とウェスタンブロットにより定量した結果、可溶性Ａβ４２は年齢や老人斑の密度に相関して増加することを報告し、また、老人斑の存在しない若年ダウン症候群例でも可溶性Ａβ４２は認められ、対照群ではほとんど見られなかったことにより、可溶性Ａβ４２の増加はβＡＰＰの過剰生産に関与していることや、老人斑の形成に関与していることを示唆した。また、Ｔｏｋｕｄａら（Ｔｏｋｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４１，２７１，１９９７）は、血漿中のＡβ１−４０とＡβ１−４２（４３）が共に、ダウン症候群では対照群より有意な増加が認められたことを報告した。これらの事実より、ニューロシンがダウン症候群に対して何らかの作用を示している可能性も存在する。
また、ニューロシンはアルツハイマー病の近縁に位置すると考えられるボクサー脳（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）およびびまん性レビー小体病に対しても何らかの作用を有すると考えられる。
老人斑は、アルツハイマー病脳の大脳皮質を中心に出現する直径５０〜２００μｍの斑状構造物である。時間の経過した老人斑は、中心部にアミロイド核を有し、周囲には、変性した神経突起や反応性グリア細胞の集積を認める。Ａβは、βシート構造をとって重合し、アミロイド線維を形成する。細胞外で重合したこれらのアミロイドＡβが神経細胞に対して毒性を発揮すると一般に考えられている（Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，２７９，１９９０、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，３７３，１９９４）。Ａβは、分子量約４ｋＤａ、約４２個のアミノ酸からなるアミロイド核の主成分であり、老人斑以外、髄膜や皮質の小血管にも蓄積し、アミロイド性血管症を形成する。Ｋａｎｇら（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３，１９８７）は、Ｇｌｅｎｎｅｒら（Ｇｌｅｎｎｅｒ，Ｇ．Ｇ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｗ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２０，８８５，１９８４）より明らかにされたＡβのアミノ酸配列の情報をもとにクローニングを行い、Ａβはより大きな前駆体であるβＡＰＰに由来することを示した。
βＡＰＰは、膜貫通性の受容体類似の構造を持つ分子量１２〜１３万の糖蛋白であり、Ａβは、βＡＰＰの膜貫通ドメインから細胞外ドメインにかけて組み込まれている。現在６種類のβＡＰＰが同定されているが、アミロイド沈着に関与しているものとして主に脳に多く発現しているβＡＰＰ６９５（Ｋａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，４２４５，１９８５）、Ｋｕｎｉｔｚファミリーのセリンプロテアーゼインヒビターに相同性を持つ５６個のアミノ酸部位を有するβＡＰＰ７５１、さらにＭＲＣ  ＯＸ−２抗原に相同性を持つ１９個のアミノ酸部位を有するβＡＰＰ７７０等が同定されており、βＡＰＰ７５１、βＡＰＰ７７０は全身臓器で多く発現している。これらはいずれもＣ末端から９９番目にＡβ部分を有していることから、脳アミロイド形成に関係すると考えられている。
βＡＰＰの生理学的機能は不明であるが、細胞表面に発現されたβＡＰＰ、またＡβドメイン内で切断を受け細胞外に放出された可溶性βＡＰＰは、細胞外にあって細胞接着分子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ａｎｄ  Ｂｅｈｌ，Ｃ．；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，６２９，２７５，１９９３）あるいはなんらかの栄養因子（Ｓａｉｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ，５８，６１５，１９８９）として働いているとの報告がある。一方、βＡＰＰは、神経細胞においては軸索流にのって神経突起末端まで運ばれ、シナプス膜に発現し、シナプス形成あるいはその維持に重要な役割を果たしていると想像されている（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｗ，ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，５６３，１８４，１９９１）。
βＡＰＰの代謝には、大別して２系統が想定されている。すなわち、Ａβドメインの中央部で、いわゆるα−セクレターゼ（ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）により切断され、Ｎ末端産物が細胞外に放出される分泌経路と、直接あるいは一度細胞表面に発現された後、細胞内に取り込まれ、最終的にリソソーム内で分解されるエンドソーム−リソソーム経路（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）である。これらのβＡＰＰ代謝系のどの部位においてＡβが産生されるのかは未だ不明であるが、Ａβ産生部位の一つの可能性として、Ａβは、βＡＰＰが分泌小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に取り込まれた直後に切り出され、瞬時にして細胞外に放出されるものと想像される  （Ｋｏｏ，Ｅ．Ｈ．ａｎｄ  Ｓｑｕａｚｚｏ，Ｓ．Ｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７３８６，１９９４）。
Ａβの発見以来、βＡＰＰからのＡβ切り出しは病的状態においてのみ生じると考えられていたが、その後の研究でＡβは生理的にも産生され、培養上清中（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３５９，３２２，１９９２、Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，１２６，１９９２）あるいは脳脊髄液中（Ｓｈｏｊｊ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，１２６，１９９２、Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３５９，３２５，１９９２）に可溶性の状態で存在することが明らかにされた。βＡＰＰからＡβが切り出される際、ＡβのＮ末端側を切断する酵素（β−セクレターゼ）とＡβのＣ末端側を切断する酵素（γ−セクレターゼ）が必要となる（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ，７５，１０３９，１９９３）。これらＡβのセクレターゼは未だ同定されていないが、β−セクレターゼによる切断はアミノ酸配列に厳密に依存していることが最近明らかにされた（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｎ，１４，６６１，１９９５）。
現在、α−セクレターゼの候補として、システインプロテアーゼであるカテプシンＢ（Ｔａｇａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ，；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７７，３７７，１９９１）および分子量１０５〜１２０ｋＤａのメタロプロテアーゼ（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７９，１１４８，１９９１）が報告されており、γ−セクレターゼの候補としては、プロリルエンドペプチダーゼ（Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２６０，１３１，１９９０）、β−セクレターゼの候補としては、クリプシン（ｃｌｉｐｓｉｎ、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３８３６，１９９０）、インゲンシン（ｉｎｇｅｎｓｉｎ、Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７，３８８，１９８９）等が提唱されている。
この様な状況の中、βＡＰＰのＮ末端側のＭｅｔ５９６−Ａｓｐ５９７の間で切断し、Ａβを産生する新規セリンプロテアーゼとしてニューロシンが発見された。これまでに述べたように、ＡβおよびβＡＰＰならびにアルツハイマー病およびダウン症候群のさらなる詳細な研究を行うに当たり、ニューロシンの測定系は必須である。
アルツハイマー病の臨床診断は、今日、ＤＳＭ−ＩＩＩＲおよびＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡの診断基準（Ｍｃｋｈａｎｎ，Ｇ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，３４，９３９，１９９４）または、ＤＳＭ−ＩＶの診断基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌｓ  ｏｆ  ｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ  ｅｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９４）に基づいて行われているのが一般的である。しかし、これらの診断基準は、日常生活や社会生活上重大な支障を引き起こすほどの認知機能の低下を条件としているため、患者一人一人の社会生活のレベル、更に診断に当たる医師の専門性、経験にも左右され得るものであり、科学的客観性に乏しいことが指摘されている。また、アルツハイマー病の確定診断は、病理組織学的検索によりなされるわけであるが、臨床診断と剖検診断との不一致も少なからず指摘されている。
現在、アルツハイマー病の臨床診断では補助的手段として画像診断も用いられるようになり、ＰＥＴやＳＰＥＣＴにより海馬、大脳皮質の頭頂葉等の特異的な部位においてアルツハイマー病に特異的である代謝の低下、萎縮（Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｎｕｃｌ  ．Ｍｅｄ．，３５，１，１９９４）を初めとする脳機能の検査ができるようになった。ＰＥＴでは多数例での検査は困難であるが、ＳＰＥＣＴによる血流所見の多数例のデータから、アルツハイマー病の約８０％の症例で頭頂葉から側頭葉の血流の低下が見られると言う報告がある（羽生春雄  他；アルツハイマー病の画像診断、日本老年医学会雑誌、３１、６８３、１９９４）。しかしながら、頭頂葉から側頭葉にかけての血流低下によりアルツハイマー病を確定するのは極めて危険であり、残りの症例では頭頂葉ではなく前頭葉の血流低下を示すこともあるので注意が必要である。これらに対しては、ピック病、進行性失語症等の変性型大脳萎縮症および進行性核上性麻痺などの鑑別が重要であり、現在では病理診断を待つ以外にない。
また、ＭＲＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）検査では、悪性腫瘍、血管障害、代謝性変化を有する疾患などに使用される有用な所見（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，Ｐ．Ａ．；Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１７０，１，１９８９）が得られているが、アルツハイマー病を含む痴呆患者に関して有用である報告は殆どない。特に、１Ｈ−ＭＲＳにおいては、ＮＡＡ（Ｎ−アセチル−アスパルテート）ピークの減少という脳萎縮所見と重なり、特徴的な痴呆所見を検出できないのが現状である（Ｐｅｔｔｅｇｒｅｗ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４６，４１９，１９８７、Ｂａｒａｎｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｌａｎｃｅｔ，ｉ，５１７，１９８５、Ｓｍｉｔｈ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．；Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９８６；Ｖｏｌ．４．Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｃｉｎｅ，１３８６，１９８６）。
更に、ＣＴ・ＭＲＩ画像診断も用いられている。ＣＴにより、側頭葉と頭頂葉に強調される限局性萎縮と進行性の全般性萎縮、更に萎縮と平行した脳室拡大およびｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＰＶＬ）またはｌｅｕｋｏ−ａｒａｉｏｓｉｓと呼ばれる脳室周囲白質の変化が所見できる。しかし、脳の萎縮やＰＶＬ等の白質病巣はアルツハイマー型痴呆に特異的ではなく、脳萎縮は年齢と共に進行する（Ｂａｒｒｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２６，１０１１，１９７６、Ｚａｔｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；ＡＪＮＲ，３，１，１９８２）ことが報告されており、必ずしもアルツハイマー型痴呆に対して前記所見が見られるとは限らない。
ＭＲＩにおいては、特に自由な撮影面による脳の各部位の観察ができ、また、Ｘ線ＣＴでは見いだせない微小血管病変の存在等が確認でき有意義である。アルツハイマー病の脳に関しては、軸位断・矢状断ならびに冠状断で撮影すると、ＣＴでは見落とされていた所見が明らかとなる。まず、矢状断撮影により脳梁の萎縮が早期から認められることが判明し、冠状断撮影による海馬を含む側頭葉の詳細な観察が可能となり、更に、脳実質の所見はプロトン強調画像で灰白質・白質の鑑別が容易になった。しかしながら、ＭＲＩは磁場強度や装置の性能または撮影条件により得られる画質が異なるため、異なる施設間で数値的比較ができるのは萎縮性変化のみである。また、画像計測には限界も存在し、線分よりも面積、さらには体積計測がより鋭敏と考えられるが、日常的に困難である。また、血管性痴呆でも脳室拡大を認め得るし、脳底動脈領域の虚血後に海馬の萎縮を認める症例も存在する。
生物学的診断マーカーの開発は、この様な経緯の中からアルツハイマー病の臨床診断に、より正確的な客観性を与えるものとして多くの研究者から求められてきたと同時に、１）アルツハイマー病治療薬の客観的な効果判定システム、２）アルツハイマー病の診断基準を満たす以前の、あるいは発症前のアルツハイマー病の検出という将来的に重要な役割が期待されている。更に、同一の診断マーカーを用いることにより、異なる施設間の比較研究も可能となる。従って、生物学的診断マーカーの開発は多くのアルツハイマー病研究領域の中でも、最も重要な領域として認識され、将来への展望が期待されている。
現在までに行われてきた診断マーカー開発へのアプローチは、アルツハイマー病を特徴付ける病理学的変化である老人斑や神経原線維変化の構成成分からのアプローチと、それ以外の物からのアプローチに大別される。前者として脳脊髄液タウ蛋白、Ａβおよびその前駆体蛋白であるβＡＰＰ、後者として抗コリン剤による瞳孔散大試験、Ａｐｏ  Ｅおよび他のアルツハイマー病関連遺伝子があるが、良好な結果は得られていない。
本発明者らは、脳で発現が認められるニューロシンが、脳の生理を検討できる有用なサンプルである脳脊髄液中に分泌されることにより、今後、種々の脳疾患（例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群等）を特定することができ、また、脳疾患の初期においても有効に診断できる生物学的診断マーカーとなり得ると考えた。そのためにも、ニューロシンを測定する系が必須である。
ＷＯ９８／１１２３８号に記載されているように、プロテアーゼＭ（すなわち、ニューロシン）は癌細胞においても重要な役割を担っている。癌を外科的にあるいは局所的放射線照射で根絶するのが困難である理由は、癌に転移能力があるからである。固形腫瘍細胞が体内に広がるには、本来隣接していた細胞との接着をゆるめて、本来の組織から離れ、他の組織の中を通り、血管もしくはリンパ管に到達し、基底層と管の内皮層を抜けて循環系に入り、体のどこかで循環系から出て、新しい環境中で生存し、増殖しなければならない。各種癌腫での隣接する上皮細胞との接着性は、上皮の細胞間接着分子であるカドヘリンが発現されなくなると失われるが、組織の突破は細胞外マトリックスを分解する蛋白分解酵素に依存すると考えられている。
マトリックスを分解する酵素としては、主に金属プロテアーゼ（Ｒｈａ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ，；Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４３，１７５，１９９７）とセリンプロテアーゼが知られている。これらは共同でコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンのようなマトリックス蛋白を分解する。特に今まで知られているセリンプロテアーゼの中でマトリックスの分解に関与するものとして、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（Ｕ−ＰＡ）がある（Ｋｉｎｊｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９，１５，１９７９、Ｄａｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４４，１４６，１９８５、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ，８２，７２４，１９９８、Ｓｈｉｂａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２３，５５５，１９９７）。Ｕ−ＰＡは蛋白分解連鎖反応に特異的な引き金の役割を持つ。その直接の標的はプラスミノーゲンで、これは血中に豊富にあり、傷や腫瘍及び炎症部位などの組織の再構築部位に蓄積する不活性なセリンプロテアーゼの前駆体である。その他に、癌の転移・浸潤に関与しているプロテアーゼとして組織因子（Ｋｉｎｊｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９，１５，１９７９）、ライソゾーム系の加水分解酵素（Ｓｌｏａｎｅ，Ｂ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４２，９８０，１９８２）およびコラゲナーゼ（Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，；Ｃｅｌｌ，４７，４８７，１９８６）等が知られている。
現在我が国の死因の第一位を占める疾病は癌であって、年間２０万人以上が死亡している。ゆえに、癌の診断と治療もしくは予防の目印になる特異物質の研究が精力的に行われている。この特異物質を腫瘍マーカーもしくは腫瘍マーカー関連バイオマーカーと名付けている。これらは癌の治療前診断補助、発生臓器および病理組織型の推定、治療効果のモニタリング、再発の早期発見や予後の予測等に利用され、現在では腫瘍マーカーは臨床に不可欠の検査となっており、中でも肝細胞癌やヨークサック腫瘍に特異性が高いアルファ胎児蛋白（ＡＦＰ）（Ｔａｋｅｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，９，１１０，１９８８）と癌胎児性蛋白抗原（ＣＥＡ）は世界中で広く利用されている。将来、腫瘍マーカーの必要性は益々高まり、信頼性の高い癌の血清学的診断法である臓器特異的マーカー、腫瘍細胞種特異的マーカー等の開発が期待されている。
現在までにヒト前立腺上皮細胞で発現しているセリンプロテアーゼであるヒト腺性カリクレイン（ｈＫ２）は、前立腺癌のマーカーとして有用であることが報告されている。また、ｈＫ２は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の配列と７８％の相同性を有しており、ＰＳＡも前立腺癌の生化学的マーカーとして広く使用されている（Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ，Ｓ．Ｄ，ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３４，４４，１９９８、Ｐａｎｎｅｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１１，１２７３，１９９７、Ｃｈｕ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１８，１２３，１９９７、Ｈｓｉｅｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，，５７，２６５１，１９９７）。さらに、ｈＫ２は、前立腺癌のマーカーだけでなく、胃ガンのマーカーとしても有用であることが報告されている（Ｃｈｏ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ，７９，８７８，１９９７）。
その他、血清中サイトケラチン１９フラグメントを測定するシフラ（ＣＹＦＲＡ２１−１）は肺癌に有用であること（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８５，１１７８，１９９４）、ガストリン放出ペプチド前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）が肺小細胞癌に対して有用な腫瘍マーカーであること（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊａｐａｎ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８６，６９８，１９９５）が報告されている。従って、シフラとＰｒｏＧＲＰを組み合わせることにより、肺癌の早期診断上で、極めて有用な補助診断法となり得ることが期待されている。
特に卵巣癌は、早期発見し難く、進行癌で見つかることが多い疾患であること、組織型の多様性が多く、画像診断だけでは組織型の推定が困難であること、良性卵巣腫瘍が少なく、悪性との鑑別が常に必要であること等の理由により、腫瘍マーカーを使用する頻度が高い。現在、卵巣癌の腫瘍マーカーとして糖鎖関連抗原であるＣＡ１２５等が臨床応用されているが、ＣＡ１２５は加齢に伴って、また閉経後には健常人の平均値が低下することが判明している。故に、ＣＡ１２５の弱点を補強したマーカーを開発することが必要であり、かつ望まれている。また、乳癌においては、ＣＥＡ、ＴＰＡ、ＣＡ１５−３等が用いられているが、いずれも感度および特異性ともに優れた腫瘍マーカーはなく、早期診断には不十分であった。
この様な状況下において、初期乳癌および初期卵巣癌のマーカーとなり得るセリンプロテアーゼとしてのニューロシンが発見されたのである。前記したように、癌の転移・浸潤メカニズムの更なる詳細な研究を行うに当たり、当該セリンプロテアーゼ、すなわちニューロシンの測定系は必須である。更に、今後、初期卵巣癌および初期乳癌を特定することができ、また、これらを有効に診断できる生物学的診断マーカーとなり得ることも期待される。そのためにも、ニューロシンを測定する系の提供が望まれる。
また、ＷＯ９８／１１２３８号にはモノクローナル抗体の記載があるが、実際にハイブリドーマを作成し、セリンプロテアーゼに対して特異性を有するモノクローナル抗体は得られていない。そこでは、公知技術を用いて作成できると記載されているが、ハイブリドーマのスクリーニングの段階でセリンプロテアーゼに対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られるとは限らない。
発明の目的
上記の事情に鑑み、本発明者らはセリンプロテアーゼに対して特異的に結合するモノクローナル抗体の作製に着手した。
かくして、本発明の主な目的は、セリンプロテアーゼであるニューロシンを測定するために使用出来る、ニューロシンに対して特異的に結合するモノクローナル抗体を提供するにある。
本発明の他の目的および本発明の利点を、添付の図面を参照して以下に説明する。
発明の概要
本発明者らは、特異性に優れ、測定感度の良好なニューロシンの測定方法を提供すべく鋭意研究を行った結果、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ニューロシンを抗原として用いることにより、特異性に優れたモノクローナル抗体を作製し得ることを知見し、本発明を完成した。本発明は、検体中のニューロシンを測定するために使用出来る、少なくとも１種のモノクローナル抗体を提供するものである。
また、本発明は、該モノクローナル抗体を使用するアルツハイマー病診断用の医薬組成物および診断方法ならびにパーキンソン病診断用の医薬組成物および診断方法も提供するものである。
発明の詳細な説明
本発明により、ニューロシンに対するモノクローナル抗体、および、該抗体を産生するハイブリドーマ２Ｂ２−６細胞株および８２Ｅ５細胞株の２種が得られた。これらの各ハイブリドーマ細胞は、１９９８年６月１７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に対して、それぞれ受託番号ＦＥＲＭＰ−１６８４３およびＦＥＲＭＰ−１６８４４として寄託されている。これら２種のハイブリドーマ２Ｂ２−６細胞株およびＳ２Ｅ５細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、両者ともＨ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。本発明はまた、上記抗体のクラススイッチ変異体、例えば、アイソタイプＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａおよびその他の免疫グロブリンサブクラスに属する変異体等を包合し、その様な変異体は、Ｍａｒｔｉｎらの方法により作成することができる（Ｃｏｃｏ，Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１４５，１１１８，１９９１）。
ニューロシンに対するモノクローナル抗体の作製には、免疫原性抗原として使用できるニューロシンが必要である。抗原としての天然由来ニューロシンは、例えばポリクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーに付することにより、より高度に精製することが出来る。天然由来の他に、好ましくは培養細胞、例えばニューロシン産生細胞を用いてニューロシンを得ることが出来る。ニューロシン産生細胞としては、例えばヒト脳由来細胞、ヒト唾液腺由来細胞、ヒト腎由来細胞、癌細胞等が挙げられる。これらのニューロシン産生細胞は、当該分野で知られた、あるいはそれらと実質的に同様な培地や培養方法を用いて培養し、培養上清中に産生されるニューロシンを例えばイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはポリクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが出来る。
また、組換えニューロシンも用いることができる。具体的には、ニューロシンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を含む組換えベクターにより宿主細胞を形質転換した後、この形質転換宿主を培養して、ニューロシンのアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造し、該ポリペプチドを免疫原として使用するものである。ニューロシンのｃＤＮＡを含む組換えベクターは、通常の遺伝子組換え手法により、例えばプラスミドベクターに挿入することによって作製される。ベクターとしては、プラスミドやファージの他に、ワクシニアウィルス、バキュウロウィルス等のウィルスも使用出来る。
宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌等の原核生物、ならびに各種細胞、例えば動物細胞、ＣＨＯ細胞等の市販の細胞株ならびに酵母、植物細胞、昆虫細胞等の真核生物を用いることが出来る。また、原核生物に使用できるプロモーターとしては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン、ラクトースオペロン等を用いることができる。真核生物に使用できるプロモーターとしては、例えば、ウィルスプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、解糖系酵素に対するプロモーター等がある。また、マルチクローニングサイト、プロモーター、耐性遺伝子、複製開始点、ターミネーター、リポソーム結合部位等を有する市販のベクターあるいはプラスミドも使用することができる。耐性遺伝子には、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシンに対するもの等がある。この様にして調製されたニューロシンは、更に免疫原性コンジュゲートとしてもよいが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用出来る。
このように、抗原は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織、形質転換細胞等の抗原産生原料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析、セファデックス等によるゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィー法等により精製して得ることができる。
さらに、ニューロシンは、それを断片化したもの、あるいはクローニングされ、配列決定されたｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得られたポリペプチド断片であってもよく、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体蛋白質類と結合させてハプテン−蛋白質の免疫コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体をデザインすることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基等を付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにすることができる。
本発明ではニューロシンに特異的に結合する少なくとも１種のモノクローナル抗体を提供する。本発明にかかるモノクローナル抗体は、組換えニューロシンを免疫原として動物を免役した後、ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合、ハイブリドーマの選択およびモノクローン化、モノクローナル抗体の製造、必要に応じて腹水化といった工程で作製できる。細胞融合前には、まず使用されるミエローマ細胞の調製をしておく必要がある。細胞融合前に使用される腫瘍細胞株としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選択することができる。
抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビアジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカゲル等が挙げられる。免疫は、例えばＢａｌｂ／ｃマウス、ＦＩマウス等のマウスをはじめとする動物を使用することが出来る。
一方、本発明に従えば、組換えニューロシンを用いてニューロシンに対するポリクローナル抗体の製造も可能である。抗体は抗血清であってもよく、より精製されたものであってもよい。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は次のようにして行われる。免役された動物の脾臓もしくはリンパ節細胞を摘出し細胞懸濁液を得る。得られた細胞懸濁液とミエローマ細胞株をＭＥＭ、ＤＭＥＭもしくはＲＰＭＩ−１６４０培地中に置き、ポリエチレングリコールなどの細胞融合剤を添加する。必要に応じて、ジメチルスルホキシドを少量加え、細胞融合を促進させることも出来る。
この様にして得られたハイブリドーマを、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み、ＦＣＳを含有したＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等で選択する。ハイブリドーマの培養上清を、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、フローサイトメトリーなどでニューロシンあるいはその断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いてスクリーニングすることにより、分離することが出来る。
この様にしてクローン化されたハイブリドーマを培養し、モノクローナル抗体の製造に用いることができる。所望のモノクローナル抗体を、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の適当な培地中で培養し、その培養上清から得ることが出来る。大量のモノクローナル抗体を得るにはハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合、ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性のある動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいはヌードマウスなどに各ハイブリドーマを移植し、腹水中に産生きれたモノクローナル抗体を得ることが出来る。動物は、ハイブリドーマを移植する前にプリスタンなどの鉱物油を腹腔内に投与しておくことが出来る。腹水液はそのままあるいは常法により精製することが出来る。例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックス等によるゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法等により精製することが出来る。
抗体を標識化するものとして、酵素、酵素基質、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、放射性物質等を用いることが出来る。標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用することが出来る。
本発明での実施態様として、本発明の抗体を、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫沈降、イムノブロット、イムノアッセイ、例えば競合型または非競合型イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラテックス凝集法、蛋白精製、アフィニティーカラム等において使用することができる。ＥＬＩＳＡ法による場合は好ましくはサンドイッチ型アッセイがよい。なお、イムノアッセイには、免疫組織学的検討、イムノブロット、免疫沈降等の免疫反応を利用した方法全てを含有する。
本発明のモノクローナル抗体を使用することができる検体もしくは試料は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料等が使用できるが、好ましくは生体由来の試料、例えば、血液、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジネート、生検試料、細胞、組織、脳組織、脳由来細胞系、神経細胞系、神経由来細胞系、乳腺由来細胞系、乳腺組織、卵巣由来細胞系、卵巣組織、癌細胞系、癌組織等が挙げられる。
従って、本発明は、この様なハイブリドーマ細胞系、イムノアッセイおよび検査キットをも提供する。さらに、本発明はニューロシンを特異的に認識するモノクローナル抗体、この抗体を用いることを特徴とするニューロシンの検出ならびに定量のためのイムノアッセイ、およびこのイムノアッセイを実施するための検査キットを提供する。
また、本発明により得られたモノクロナール抗体は、実施例４において示すように、ＩｇＧ、アルブミン、トリプシノーゲンに対して交差反応を示さず、ニューロシンに対する特異性が高く、ニューロシンの検出ならびに定量において、非常に有用である。
さらに、実施例５において示すように、本発明のモノクローナル抗体は、ニューロシンの成熟型のみならず、プロ体にも免疫反応性を有する。
一般に、様々なプロセッシングが翻訳後のタンパク質に対しても行われ、活性型タンパク質が作られる。多くの分泌タンパクは、まず、活性型タンパク質のＮ末端に通常１５〜６０個程度のアミノ酸残基から成る分泌に関与するペプチド（分泌シグナル）を付けた不活性前駆体型（プロ体）として細胞質内のリボソーム上で合成される。このペプチド部分は細胞膜を通過する機構に関連しており、ほとんどの場合、膜を通過する際に特異的なプロテアーゼで切断・除去され、成熟型タンパク質となる。分泌シグナルは中央部に疎水性アミノ酸から成る広い疎水性領域を有し、Ｎ末端近くには塩基性アミノ酸残基を有している。また、ある種のタンパク質は不活性前駆体（プロ体）のＮ末端にさらに分泌シグナルが結合しているものも存在し、この様なタンパク質をプレプロタンパク質（プレプロ体）という。
例えば、トリプシンはアミノ酸に翻訳された直後はプレプロ体として存在し、細胞外に分泌された後はプロ体として存在し、十二指腸でエンテロペプチダーゼもしくはトリプシン自体によって限定分解されて活性型トリプシンとなる。
本明細書中で言うプロ部分とはプロ体から活性型タンパク質を削除した部分を言い、プレ部分とはプレプロ体からプロ体を削除した部分を言い、プレプロ部分とはプレプロ体から活性型タンパク質を削除した部分を言う。
ニューロシンも例外でなく、プレプロ体として翻訳され、その後プロ体となり、さらに、プロ部分が削除されて活性型ニューロシンとなるのである。
上記したように、本発明のモノクローナル抗体はニューロシンの成熟型のみならず、プロ体にも免疫反応性を有することが判明した。すなわち、脳脊髄液中に存在するニューロシンはプロ体として存在していることが判明し、本発明によって得られたモノクローナル抗体は組換え活性型ニューロシンのみならず、天然のニューロシンにも免疫反応性を有することが判明した。
本発明のモノクローナル抗体は、アルツハイマー病およびパーキンソン病の診断にも使用できる。
脳に存在するセリンプロテアーゼは発達段階、シナプス可塑性およびアルツハイマーを含む神経学的疾患に関わっているという報告がある。最近、Ｄａｖｉｅｓらは、ラット脳の海馬より組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＲＮＫ−Ｍｅｔ−１）、脳セリンプロテアーゼであるＢＳＰ１およびＢＳＰ２が高発現しているという報告をした（Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７３，２３００４−２３０１１，１９９８）。ＢＳＰ１およびＢＳＰ２はそれぞれ新規トリプシン様プロテアーゼであり、ＢＳＰ１はニューロプシンと定義された（Ｃｈｅｎ，Ｚ．−Ｌ．ｅｔ  ａｌ，；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，，１５，５０８３−５０９７，１９９５）。
最近、脳において高発現している新規トリプシン様セリンプロテアーゼがクローニングされ、ニューロシンと定義された（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３５０，１１−１４，１９９７）。ニューロシンは２４４アミノ酸から成り、セリンプロテアーゼファミリーに類似している。また、ニューロシンは、ヒトトリプシノーゲン１と２８．４％、ヒトトリプシノーゲン２と２６．３％、ヒトカリクレインと２２．９％、ヒトファクターＸと１３．８％およびヒトキモトリプシノーゲンと１２．５％のホモロジーを有しているが、トロンビン、キモトリプシンおよびプラスミンの基質を切断しない。このことから、ニューロシンは脳にてトリプシン様の役割を担っていることが考えられる。
さらに、実施例６および７に示すように、本発明のモノクローナル抗体を用いて脳組織切片を免疫染色した結果、脳に存在するあらゆる細胞の核が染色された。また、神経細胞においては神経細胞質、神経細胞核および神経突起が染色された。これに対し、アルツハイマー病患者の脳組織障害部位に存在する神経突起は殆ど染色されなかった。老人斑、細胞外神経原繊維変化領域およびレビー小体にニューロシンの存在が確認された。このことから、ニューロシンは、β−アミロイドタンパクのようなタンパクの分解に関与しているものと考えられる。
また、本発明により脳に存在する様々な細胞にニューロシンが存在することが証明された。
ニューロシンが核に特異的に存在するグリア細胞と対照的に、神経においては細胞質、核、核小体およびそれらの突起もニューロシン陽性であった。パーキンソン病脳およびアルツハイマー病脳の組織障害部位の神経細胞においては殆どニューロシンは含まれず、アルツハイマー病脳においては、ニューロシンは数個の老人斑および神経原繊維変化領域に存在している。
アミロイド前駆タンパク（ＡＰＰ）はアミノ酸の数により３つの型（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０）に分類されている。ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０はＫｕｎｉｔｚ−タイプセリンプロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）の機能を有する５６アミノ酸を含んでいる。最近、Ｍｏｉｒらは、アルツハイマー病患者の脳はＫＰＩを含むＡＰＰ種の比率が正常脳に比較して有意に高いことを報告している（Ｍｏｉｒ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２７３，５０１３−５０１９，１９９８）。彼らは弧発性アルツハイマー病において、これらのアミロイド産生物質の増加がアミロイド沈着に関与していると示唆している。
ＫＰＩドメインを含む分泌されたアイソフォームはプロテアーゼネキシン２（ＰＮ−２）と同一である。ＰＮ−２はトリプシン（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３３１，５３０−５３２，１９８８、Ｓｉｎｈａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８９８３−８９８５，１９９０）、キモトリプシン（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３３１，５３０−５３２，１９８８、Ｓｉｎｈａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８９８３−８９８５，１９９０）、ファクターＩＸａ（Ｓｃｈｍａｉｅｒ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２，２５４０−２５４３，１９９３）、Ｘａ（Ｍａｈｄｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２３４６８−２３４７４，１９９５）およびＸＩａ（Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２６５，９５９１−９５９４，１９９０）のようなセリンプロテアーゼインヒビターとして知られている。トリプシン（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２７，１４５−１５４，１９９６、Ｗｉｅｇａｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅ，１３６，１６７−１７５，１９９３）、ファクターＸａ（Ｈａｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３４３，８５−９４，１９９７）、ＸＩａ（Ｓａｐｏｒｔｉｔｏ−Ｉｒｗｉｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６２６５−２６２６９，１９９５）、その他のセリンプロテアーゼ、トロンビン（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１８５，１０００−１００４，１９９２）、および新規キモトリプシン様酵素（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２５１３５−２５１４２，１９９８）は、ＡＰＰのプロセッシングに関与している酵素であることが報告されている。さらに、トロンビン（Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１４６，１５２−１５４，１９９２）およびトリプシン（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２７，１４５−１５４，１９９６）はアルツハイマー病脳のβ−アミロイド沈着部に局在することも証明されている。
本発明者らは、ニューロシンが老人斑に局在することによりアミロイド沈着に関与する酵素であることを証明した。また、ＡＰＰは膜に結合しており、セクレターゼにより切断されることが報告されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３１１１−３１１６，１９９４、Ｖａｓｓｉｌａｃｏｐｏｕｌｏｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，，６４，２１４０−２１４６，１９９５）。ニューロシンも膜画分に存在していることにより、ＡＰＰのプロセッシングに関与しているものと考えられる。抗ニューロシン抗体により細胞外神経原繊維変化が染色されたということは、ニューロシンは神経より分泌され、このような病因学的組織構造の蛋白分解に対し何らかの役割を担っているものと考えられる。トリプシンは既に神経原繊維変化領域に存在することが報告されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２７，１４５−１５４，１９９６）。ニューロシンがレビー小体に存在しているということは、凝集構造体の蛋白分解機能を示している可能性がある。
すなわち、アルツハイマー病およびパーキンソン病には、ニューロシンが関連するものと考えられ、それゆえ、ニューロシンの検出、またはその発現量を測定することにより、これらニューロシンが関連する疾患を診断することが可能となる。
また、実施例６および７はニューロシンに対するモノクローナル抗体を用いた実験系であるが、ニューロシンのｍＲＮＡを標的とした実験系においても同様の結果が期待でき、試料検体から得られるｍＲＮＡを用いても、上記疾患の診断を行うことが可能である。
さらに本発明により得られた２種のモノクローナル抗体は、ニューロシンに対する特異性が異なるため、これらを組み合わせて用いることにより、さらに優れた特異性が得られ、上記疾患の診断を高感度で診断することが可能である。
また、本発明のモノクローナル抗体をニューロシンに関連する疾患の診断もしくは治療の目的でヒトに投与する場合、ヒトに対する抗原性を最小限にする方法を採ることもできる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体を公知の方法でキメラ抗体もしくはヒト化抗体とすることにより実施でき、本発明のモノクローナル抗体には、これらのヒトに対する抗原性を少なくした抗体も含まれる。以下に、上記抗体を作製する方法を説明する。
キメラ抗体とはマウス抗体とヒト抗体のキメラ分子をいう。ヒトに任意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能である。ゆえに、マウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒト体内に投与する治療用や画像診断用モノクローナル抗体等として利用できる。公知のキメラ抗体の関連技術として、特開平０５−３０４９８９号、特開平０４−３３０２９５号、ＷＯ９１／０６６４９号、特開昭６３−０３６７８６号、特公平０６−９８０２１号等に記載されるものがある。
しかし、最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒト化抗体が開発された。ヒト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、相補性決定領域）の遺伝子配列のみをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）し、抗体分子のＣＤＲを除いた全分子をヒト化した抗体である。本抗体はヒト・マウス・キメラ抗体より、マウスの抗体部分が少ないため、抗原性が少なく安全性が高いと言われている。我が国では現在、成人性Ｔ細胞白血病に対するヒト化抗体の臨床試験が行われている。ヒト化抗体の製造方法およびその関連技術については、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（ＷＯ９２／２２６５３号、ＷＯ９８／４５３３２号、ＷＯ９４／０４６７９号、ＷＯ９８／３７２００号、ＷＯ９４／０４６７９号）および英国Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社（ＷＯ９４／２９４５１号、ＷＯ９４／２９３５１号、ＷＯ９４／１３８０５号、ＷＯ９３／０６２３１号、ＷＯ９２／０１０５９号、ＷＯ９１／１６９２７号、ＷＯ９１／１６９２８号、ＷＯ９１／０９９６７号、ＷＯ８９／０１９７４号、ＷＯ８９／０１７８３号）等が特許出願している。
マウスモノクローナル抗体をヒトの体内に投与すると、ヒトにとっては異種タンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある。そこで、ヒトモノクローナル抗体が望ましいが、融合効率が悪くまた抗体産生が安定なハイブリドーマを得ることは難しかった。しかし、現在技術は進歩し、ヒトモノクローナル抗体を作製することが可能となっている。
ヒトモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）で形質転換する方法、さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、遺伝子工学を利用しキメラ抗体、ヒト化抗体を作製する方法などがある。キメラ抗体とは異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげて作製された抗体であり、ヒト化抗体とはマウスなどにヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造に置換した抗体をいう。ヒトモノクローナル抗体作製用の親細胞は、ヒト／マウスのヘテロミエローマであるＳＨＭ−Ｄ３３株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６８）またはＲＦ−Ｓ１株を用いるとマウスの親細胞と同等の高い融合効率が得られる。これらの親細胞を用いて得られたハイブリドーマはフィーダー細胞なしでクローニングが可能であり、ＩｇＧタイプの抗体を比較的安定にしかも大量に産生することができる。親細胞の培養には、１５％ＦＣＳを加えたＥＲＤＦ培地を用い、その他の操作はマウスの場合と同様である。また、ＩｇＧタイプのヒトモノクローナル抗体を作製するには抗原で充分に感作されたヒトリンパ球を末梢血から採取して用いるのが好ましい。充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場合にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原感作を行うこともできる。
上記に示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  抗ニューロシンモノクローナル抗体の作製
以下の手順に従って、抗ニューロシンモノクローナル抗体を作製した。
（ａ）免疫原の調製（組換えニューロシン蛋白質を発現する細胞の作製）
特開平９−１４７９０号またはＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３５０，１１，１９９７に記載されている方法に準じて、ＣＯＬＯ２０１細胞よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成し、ｐＳＰＯＲＴ／ニューロシンをクローニングした。
ｐＳＰＯＲＴ／ニューロシンよりＰＣＲによりニューロシンの成熟体の翻訳領域を得、これをｐＳｅｃＴａｇＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、発現プラスミドを作製した。まず、ニューロシンの翻訳領域の５’末端、３’末端に制限酵素Ｂａｍ  ＨＩで認識される配列を付加したプライマーを作製した。これらを配列番号１および２に示す。
配列番号１：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣ
配列番号２：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴ
これらプライマーを用いてｐＳＰＯＲＴ／ニューロシンをテンプレートにＰＣＲで増幅することでＢａｍ  ＨＩ認識配列付加ニューロシン翻訳領域を得た。このＰＣＲ産物とｐＳｅｃＴａｇＢを制限酵素Ｂａｍ  ＨＩで消化し、ライゲーションキットＶｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ社製）に形質転換した。形質転換したコロニーのうち、ニューロシン遺伝子を含むコロニーをＰＣＲで確認し、発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ／ニューロシンを得た。その遺伝子地図を図１に示す。
発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ／ニューロシンおよびＣＨＯ細胞を用いて組換えニューロシン蛋白質を作製した。直径１０ｃｍの培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）にＣＨＯ細胞を１×１０６個播種し、翌日Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ＧＴＢＣＯ社製）５ｍｌで細胞をリンスした後、新たに５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を加え、３７℃で２時間培養した。その後、ｐＳｅｃＴａｇ／ニューロシン１μｇおよびリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１０μｌの混合液を培養上清に加え、３７℃で６時間培養した。培養後１０％牛胎児血清添加α−ＭＥＭ溶液で細胞を洗い、２５ｃｍ２のＴ型フラスコで培養した。遺伝子導入後の培地にはゼオシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、薬剤選択によりプラスミドが導入された細胞のみを選択した。培地交換は１週間に２回の頻度で行い、細胞がコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシンを用いてフラスコより剥離し、継代した。
このようにしてニューロシン発現細胞を得た後、無血清培地で細胞を培養し、培養上清から組換えニューロシンを得た。その後、培養上清を１５００ｒｐｍ、１５分間遠心後、ＭＥＳ緩衝液（同人）を用いて透析し、同じ緩衝液で平衡化した２種類の陽イオン交換樹脂（Ｈｉｔｒａｐ−ＳＰおよびＭｏｎｏ−Ｓ、ファルマシア社製）に通した。次に、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）にてゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｉｌ  Ｓ−２００、ファルマシア社製）に通して精製し、抗原溶液とした。
また、例えば他の分泌シグナルを有さないベクターを用いた場合には、組換えニューロシンを得るには、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００またはＴｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳにて沈殿した細胞を破壊するか、もしくは機械的、例えばホモジナイザーまたはソニケーターを使用することができる。細胞破壊液を遠心後、可溶化画分の上澄み液を上記の方法で精製して用いることもできる。
また、特開平９−１４７９０号またはＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３５０，１１，１９９７に記載されている方法を用いて発現プラスミドｐｄＫＣＲ／Ｔｒｐ５９を作製し、これをＣＨＯ細胞に導入して形質転換させ、形質転換させたＣＨＯ細胞を上記した方法を用いて培養し、培養上清中から組換えニューロシンを精製し、これを抗原溶液として使用してもよい。
さらに、天然ニューロシンの高産生無蛋白培養細胞株ＨＰＣ−Ｙ３の培養上清（１０Ｌ）からゲル濾過カラム、イオン交換カラム、疎水クロマト、分取用アクリルアミド電気泳動等によってヒト天然ニューロシンを精製することも出来、これを免疫原として使用してもよい。
（ｂ）免疫処置
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス５匹に対し、（ａ）で調製した免疫用抗原溶液をフロイント完全アジュバント（ＤＴＦＣＯ社製）と１：１で混和してエマルジョン化したものを、ニューロシン蛋白質が約１００μｇ／匹となるよう皮下注射した。以後、ほぼ２週間毎に３回追加免疫を行い、免疫用抗原溶液をフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）と１：１で混和しエマルジョン化したものをニューロシン蛋白質が約１００μｇ／匹となるよう調製し、皮下注射した。３回目の追加免疫の３日後に尾静脈より採血し、血清中の抗体価を以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。高い抗体価を有していたマウスについて、３回目の追加免疫の２週間後に免疫用抗原溶液を生理食塩液に溶解したものをニューロシン蛋白質が約１００μｇ／匹となるよう腹腔内投与し、その３日後に免疫したマウスから脾臓細胞を調製し、以下の細胞融合に用いた。
（ｃ）ＥＬＩＳＡ法（直接固相法）
免疫用抗原と同様の方法で調製したニューロシン蛋白質の蛋白質溶液を、ＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調製し、５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに２時間吸着させた。精製水で５回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキングを行った。その後洗浄し、（ｂ）で得られた血清を血清希釈用バッファー（５％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で５０００倍に希釈し、５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。プレートを洗浄後、２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させた。ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ＳＩＧＭＡ  １０４  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｔａｂｌｅｔｓ）を基質反応液（０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．７））に２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、基質溶液を調製した。精製水で７回プレートを洗浄し、該基質溶液を５０μｌ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と３０分間反応させた後、５０μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを加え、反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（ｄ）細胞融合、ハイブリドーマの作製
上記ＥＬＩＳＡ法の結果によりニューロシン蛋白質に対する抗体価の上昇が認められたマウス３匹から最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞を調製した。細胞融合時の親株は、事前に２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含む培地で選択し、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株であることを確認したＢａｌｂ／ｃマウス由来ミエローマＳＰ２細胞株を用いた。ＳＰ２細胞２×１０７個と脾細胞１×１０８個をあわせ、ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００；Ｍｅｒｃｋ社製）を細胞融合促進剤として使用し、常法に従い細胞融合を行った。融合後の細胞は、脾細胞換算で３．０×１０８個／ｍｌになるようにエスクロン培地（三光純薬製）にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えた培地（ＨＡＴ培地）に懸濁し９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。該融合細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３〜５日毎に半量ずつ培地交換を行いながら培養した。ＨＡＴ培地で培養可能なハイブリドーマのみ選択培養した。
（ｅ）ハイブリドーマのスクリーニング
コロニー形成の確認されたウェルについて、培養上清中のニューロシン蛋白質に対する抗体の有無を確認するために、（ｃ）で示したのと同じＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを行い、ニューロシンおよびトリプシノーゲンをそれぞれ吸着させた２種類のプレートを用いて、ニューロシン蛋白質に対して強く反応するコロニーを選択し、クローニングに供した。
（ｆ）ハイブリドーマのクローニング
ニューロシン蛋白質に対して結合する抗体を産生するハイブリドーマについて限界希釈法によるクローニングを３回繰り返し行い、ニューロシン蛋白質に対して特異的に結合する抗体を産生し、且つ安定した増殖能を有するハイブリドーマ２Ｂ２−６細胞株およびＳ２Ｅ５細胞株の２種を得た。これらの各ハイブリドーマ細胞は、１９９８年６月１７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に対して、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４３およびＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４４として寄託された。
（ｇ）モノクローナル抗体のタイピング
上記で得られた２種のハイブリドーマ２Ｂ２−６細胞株およびハイブリドーマＳ２Ｅ５細胞株の培養上清０．５ｍｌを使用し、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を用いてアイソタイプを調べた。２種のハイブリドーマ２Ｂ２−６細胞株およびＳ２Ｅ５細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、両者ともＨ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。
（ｈ）モノクローナル抗体の調製と精製
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．５ｍｌ／匹のプリスタンを腹腔内投与し、その１０日後に上記ｄのクローニングで得られた２種のハイブリドーマ２Ｂ２−６細胞株およびＳ２Ｅ５細胞株をそれぞれ約１０７細胞数／０．５ｍｌ／匹で腹腔内に注入した。１０日後頃からマウスの腹部肥大を認めたため、１８Ｇの注射針を用いて腹水を採取した。採取した腹水は、１，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離し、その上清を３７℃、３０分間放置した後、４℃で一晩静置した。１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離後、得られた上清をアフィニティーカラム、セファロースプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて各モノクローナル抗体を精製した。この抗体溶液の２６０、２８０、３２０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｗｅｒｂｕｌｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ法により抗体濃度を測定した。
（ｉ）ウエスタンブロッティング
組換え体ニューロシンタンパク質の発現を以下のように確認した。
各クローニング細胞の培養上清を回収後、等量の２×ＳＤＳローディング緩衝液（第一化学社製）と混合し、沸騰浴中で５分間加熱したものをサンプル溶液とした。該サンプル溶液をＳＤＳ電気泳動装置（第一化学社製）およびトリス−グリシン緩衝液（第一化学社製）を用いて１０−２０％ポリアクリルアミドゲル（第一化学社製）で電気泳動した。一方、泳動中、ブロット用に３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔｔｍａｎ社製）を緩衝液Ａ（第一化学社製）に２枚、緩衝液Ｂ（第一化学社製）に１枚、緩衝液Ｃ（第一化学社製）に３枚浸した。また、ポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をメタノールに浸した後、精製水に浸し水になじませた。
蛋白質のＰＶＤＦ膜への転写は、電気泳動後ゲルを装置から取り出し、ブロッター（ファルマシア社製）に陽極側から緩衝液Ａに浸した２枚の濾紙、緩衝液Ｂに浸した１枚の濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲルおよび緩衝液Ｃに浸した３枚の濾紙を記載の順に置き、８ｍＶで１．５時間で行った。転写後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（雪印乳業社製）で室温で１時間振とうすることでブロッキングした。該膜を、以下の実施例２で調製したウサギ抗ニューロシンポリクローナル抗体を５％牛胎児血清添加ＰＢＳで希釈したものと４℃で一晩反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識マウスＩｇＧ抗体を加え、室温で１時間反応後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液で発色させ、培養上清中組換え体ニューロシン蛋白質の発現を確認した。
実施例２  抗ニューロシンポリクローナル抗体の作製
（ａ）免疫
遺伝子組換えで生産し精製されたニューロシン蛋白質１００μｇをフロイントの完全アジュバントと混合し、ウサギに初回免疫を行った。その後２週間間隔で同様の投与法により計４回の追加免疫を行った。
（ｂ）抗血清の精製
上記で免疫されたウサギから得られたウサギ抗血清をアフィニティーカラム、セファロースプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＩｇＧ分画に精製した。
（ｃ）ニューロシン抗原カラムの作製および抗体の精製
精製水で膨潤させた活性化済みアフィニティー担体樹脂０．３ｇ（ＦＭＰ：２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルフォナート、生化学工業社製）をカラムに充填し、精製水１０ｍｌで洗浄した。遺伝子組換えで生産し精製されたニューロシン蛋白質１０μｇをカップリングバッファー（５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムバッファーｐＨ８．５）１０ｍｌに溶解し、カップリングバッファーに溶解した抗原をカラムに充填しカラムの両端をパラフィルムでふさぎ、４℃で一晩転倒混和した。その後、カップリングバッファー５ｍｌでカラムを洗浄した。更にブロッキングバッファー２０ｍｌで洗浄し、ブロッキングバッファーを１０ｍｌ加えてカラムの両端をパラフィルムでふさぎ、室温で３時間転倒混和した。その後、カラムを精製水２０ｍｌで洗浄し、更に０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）２０ｍｌで洗浄し、再度精製水２０ｍｌで洗浄した。上記（ｂ）で精製したＩｇＧ分画をこのニューロシン抗原カラムにて常法により精製した。
実施例３  抗ニューロシン抗体を用いたＥＬＩＳＡ系の開発
（ａ）ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）
実施例１で得られたモノクローナル抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させた。精製水で５回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業社製）３００μｌでブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、遺伝子組換えで生産し精製されたニューロシン蛋白質を適当な濃度（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）にＰＢＳで希釈し、これを１００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させた。精製水で５回洗浄後、実施例２で得られたウサギ抗血清を血清希釈用バッファー（５％ＦＢＳを含むＰＢＳ）を用いて５μｇ／ｍｌに希釈し、該希釈液１００μｌずつを各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。プレートを洗浄後２０００倍アルカリフォスファターゼ標識ウサギＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ社製）を１００μｌずつ加え、室温で１時間反応させた。ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ＳＴＧＭＡ  １０４  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｔａｂｌｅｔｓ）を基質反応液（０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．７））に２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解し、基質溶液を調製した。精製水で７回プレートを洗浄し、該基質溶液を１００μｌ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と３０分間反応させた後、１００μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを加え反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（ｂ）サンドイッチ酵素免疫測定法における共存物質の影響
ヒトアルブミン、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）およびトリプシノーゲンの影響を調べた。
上記のＥＬＩＳＡ法と同様の方法で操作を行い、抗原反応時にニューロシン蛋白質（２００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌにそれぞれ、ヒトアルブミンを適当な濃度（０〜２０００μｇ／ｍｌ）、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）を適当な濃度（０〜２００００μｇ／ｍｌ）、トリプシノーゲンを適当な濃度（０〜４０μｇ／ｍｌ）等量加えて反応させた。
実施例４  患者検体の測定
（ａ）モノクローナル抗体の特異性
本発明により樹立されたモノクローナル抗体である２Ｂ２−６およびＳ２Ｅ５がニューロシンに特異的に反応しているか否かを検討するためにウェスタンブロッティングを行った。結果を図２（電気泳動図）に示す。この結果から、２Ｂ２−６およびＳ２Ｅ５は組換えニューロシンを認識することが示された。また、ニューロシンとホモロジーの高いトリプシノーゲンには結合しなかったことから、２Ｂ２−６およびＳ２Ｅ５はニューロシンに特異的であることが判明した。
また、組換えニューロシンが天然物と異なった場合を考慮して、天然源のヒト膵臓癌細胞株ＨＰＣ−Ｙ３培養上清、さらに脳脊髄液（ＣＳＦ）を同時に反応させたが、組換えニューロシンと同じ大きさにバンドが確認された。
（ｂ）検量線の作製
樹立したモノクローナル抗体によりＥＬＩＳＡが作製できるが、まずポジティブコントロールの組換えニューロシンで検量線を作製した。よい検量線であればシグモイド曲線が得られる。結果を図３に示す。同図において、横軸はニューロシンの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表し、縦軸は光学密度（４０５ｎｍ）を表す。この結果から明らかなように、ニューロシン濃度が５〜１０００ｎｇ／ｍｌでシグモイド曲線が得られ、１０〜５００ｎｇ／ｍｌで直線性が得られた。すなわち、この範囲であれば検体を定量できる。また、適量のＢＳＡ（例えば５μｇ／ｍｌ）を加えることにより、検出感度を上昇させることが出来る。
（ｃ）共存物質の影響の検討
ヒトサンプルを測定するＥＬＩＳＡでは、抗原抗体反応に影響する様々な物質が共存する。そこで、実施例３で記載した方法を用い、ＥＬＩＳＡ系を採用した本発明の検定法に及ぼす、共存物質の影響を検討した。蛋白質ではアルブミン、抗体等が問題となると考えられるので、これらを一定量のニューロシンに混合させて定量した。また、ホモロジーの高いトリプシノーゲンも混合させたが影響なかった。結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。同図において、横軸は共存物質であるＩｇＧ、アルブミンまたはトリプシノーゲンの濃度（μｇ／ｍｌ）を表し、縦軸は光学密度（４０５ｎｍ）を表す。この結果から、ＥＬＩＳＡ系を使用した本発明の検定法において、共存物質による影響を実質的に受けることなく、正確なニューロシン量を測定することが出来ることが理解される。
（ｄ）ＣＳＦ中のニューロシンの測定
実際にアルツハイマー病を含む様々な疾患を有する患者から採取したＣＳＦ（脳脊髄液）をウェスタンブロットとＥＬＩＳＡで比較検討した。ＥＬＩＳＡでは、ＣＳＦを１／１０に希釈して測定に供した。
結果を図５（電気泳動図）に示す。これから理解されるように、ウェスタンブロットとＥＬＩＳＡにおいて、同様な結果が得られる。また、患者検体中のニューロシンには、バラツキがあることが判明した。従って、ＣＳＦ中のニューロシンの量を測定することにより、各疾患との関わりを証明することが可能である。
実施例５  ＣＳＦ中のニューロシンの精製
（ａ）抗体カラムの作製
プロテインＡカラムで精製した抗体（Ｓ２Ｅ５）１０ｍｇを０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液ｐＨ８．３で透析した。透析した抗体をあらかじめ１ｍＭ塩酸で活性化したＮＨＳ活性化セファロースハイパフォーマ（ファルマシア）カラムに添加し、３時間、室温で反応させた。６倍容量の洗浄液Ａ（０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン溶液ｐＨ８．３）で洗浄し、更に６倍容量の洗浄液Ｂ（０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸溶液ＰＨ４．０）で洗浄した。再度、６倍容量の洗浄液Ａで洗浄し、洗浄液Ａを満たした状態で１時間、室温で放置した。後に、６倍容量の洗浄液Ｂで洗浄した。洗浄液ＡおよびＢによる洗浄をもう一回繰り返し、最後にＰＢＳで平衡化した。
（ｂ）ＣＳＦ中のニューロシンの精製
ＣＳＦ１０ｍｌを遠心後（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）、上清をＰＢＳで透析した。透析したＣＳＦをあらかじめＰＢＳで平衡化しておいたＳ２Ｅ５抗体カラムにかけた。溶出を５Ｍチオシアン酸ナトリウムとＰＢＳで行った。次にこの溶出分画を２０ｍＭ  ＭＥＳバッファーｐＨ６．０で透析した。透析した分画をあらかじめ２０ｍＭ  ＭＥＳバッファーｐＨ６．０で平衡化しておいた陽イオン交換カラム（ハイトラップＳｐ、ファルマシア）に添加した。０から０．２Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出を行った。なお、すべての精製工程を４℃で行った。
（ｃ）溶出分画の電気泳動法およびウェスタンブロット法
塩化ナトリウム溶出分画を実施例１で示したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色法によりゲルを染色した。また、同様に電気泳動を行い、上記に示したようにウェスタンブロット法を行い、抗体カラムに使用したＳ２Ｅ５モノクローナル抗体にて免疫染色をおこなった。その結果を図６に示す。図６に示すように、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶出付近の分画に銀染色法で分子量約３万ダルトンのマーカー付近にシングルバンドを検出した（Ａ）。さらにこの分画をＳ２Ｅ５モノクローナル抗体で免疫染色をおこなったところ、同バンドが検出された（Ｂ）。
（ｄ）精製したＣＳＦ由来ニューロシンの一次構造解析
精製したＣＳＦ由来ニューロシンのＮ末端アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシステムズ、モデル４７３Ａ）を用いて分析した。陽イオン交換カラムで精製した０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶出分画をプロソーブ（ファルマシア）を用いてＰＶＤＦ膜に濃縮吸着させた後、アミノ酸シーケンサーに供した。その結果、ニューロシンの塩基配列から推定されるアミノ酸配列のプロ体のアミノ酸配列に相当するＮ末端側アミノ酸配列が確認され、本発明のモノクローナル抗体はニューロシンのプロ体にも免疫反応性を有することが判明した（図７）。
実施例６  脳組織のウェスタンブロッティング
抗ニューロシン抗体の免疫学的特異性について、正常脳２例およびアルツハイマー病脳２例より得た脳組織を用いてイムノブロット解析を行った。頭頂葉の検体を５倍容量のバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭロイペプチン、１μＭペプスタチンおよび０．３μＭアプロチニン）にてホモジナイズし、該ホモジネートを４℃で３０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。上清を粗細胞ゾル画分として収集した。沈殿物を再度ホモジネート用バッファーに溶解し膜画分として用いた。それぞれの画分のタンパク質５０μｇを含む部分標本を還元条件下にてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５％ポリアクリルアミドゲル）の電気泳動を行い、その後２０％メタノールを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ＝８．３）を用いてニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．４）、５％スキムミルクパウダーで前処理し、４℃、１８時間、２％スキムミスク含有ＴＢＳで１／１，０００倍希釈した抗ニューロシン抗体（２Ｂ２−６）を反応させたものを用いた。膜全体を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳにて洗浄し、１％スキムミルク含有ＴＢＳＴでアルカリフォスファターゼ結合抗マウス抗体を用いて、室温下、２時間反応させた。その後、さらに膜をアルカリフォスファターゼ基質バッファー（０．３３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム（ＢＲＬ）、０．４４ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＲＬ）、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝９．５））で洗浄した。
その結果、図８に示すように、ホモジネート画分（Ｗ）および膜画分（Ｍ）は、抗ニューロシン抗体により単一バンドが確認されたが、細胞ゾル画分（Ｃ）には認められなかった。ゆえに、ニューロシンは脳組織において膜画分に存在することが証明された。
実施例７  脳組織免疫染色
（ａ）脳組織の調製
アルツハイマー病に罹患していない神経学的に正常な７名の患者、アルツハイマー病に罹患している６名の患者およびパーキンソン病に罹患している５名の患者より脳組織を得、実験に用いた。アルツハイマーの診断はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇの基準を採用した（Ｋｈａｃｈａｔｕｒｉａｎ，Ｚ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４２，１０９７−１１０５，１９８５）。また、パーキンソン病の診断はＣａｌｎｅらの基準を採用した（Ｃａｌｎｅ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３２，Ｓ１２５−１２７，１９９２）。神経学的に正常な３名の男性および４名の女性の年齢は６０〜８２歳であり、アルツハイマー病の２名の男性および４名の女性の患者の年齢は６７〜８２歳であり、またパーキンソン病の２名の男性および３名の女性の患者の年齢は７０〜７５歳であった。それぞれの脳組織は患者の死亡後２〜１２時間後に得た。
（ｂ）免疫染色
頭頂葉、海馬および中脳から組織断片を摘出し、４％パラホムアルデヒド含有リン酸緩衝液で２日間固定した。その後、実験使用時まで４℃の低温条件下、ＰＨ＝７．４の１５％シュクロースを含有した０．１Ｍリン酸緩衝液中で保存した。実験使用時に組織断片を凍結させマイクロトームを用いて２０μｍの厚さに切片を作製し、免疫組織学的手法（ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，５１６−５２６，１９８９）により染色を行った。抗ニューロシン抗体（Ｓ２Ｅ５）を１／１，０００倍希釈し、該一次抗体と組織切片とを低温下にて４８時間反応させ、その後０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した。その後、アビジン−ビオチンＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）と反応させた。さらに、ビオチン結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）で室温下、２時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、０．００１％３．３’−ジアミノベンジジン０．６％ニッケル硫酸アンモニウム、０．０５％イミダゾールおよび０．０００３％  Ｈ２Ｏ２を含有する液にてペルオキシダーゼラベルを可視化した。濃紫色に発色したのが確認されると反応を停止させた。該切片を洗浄し、ガラススライドにマウントし、アルコールにより脱水させエンテランにて保護した。
（ｃ）結果
アルツハイマー病に罹患している患者の脳組織を用いた結果を図９に、パーキンソン病に罹患している患者の脳組織を用いた結果を図１０に示す。
抗ニューロシン抗体を用いた免疫組織化学染色ではコントロールとして用いた脳において全てのニューロンの核で染色が認められた（図９）。また核小体、突起および細胞質の様なその他のニューロンの成分も染色された（図９Ａ、９Ｂ）。核の染色は研究に用いたどの脳においても同様の結果が得られた。
アルツハイマー病の患者の脳において、突起を持ったニューロンの染色は頭頂葉（図９Ｃ）そして海馬のＣＡ１領域（図９Ｆ）のようなダメージを受けた領域ではほとんど観察することができなかった。ニューロンにおける核の染色のみがこの領域で観察することができた。しかし、海馬のＣＡ４領域でニューロンのあらゆる成分がはっきりと染まっていることが観察できた（図９Ｅ）。数カ所の老人班に染色が観察され（図９Ｃ、９Ｄ）、細胞外神経原繊維変化領域もまたニューロシンに対して陽性であった（図９Ｆ）。細胞内原繊維変化領域は陰性であった。
パーキンソン病の患者の中脳組織において動眼運動核でのニューロン全てがニューロシンに対にて陽性であった（図１０Ａ）。コントロール脳では黒質においでメラニンを含んだ神経のいくつかがニューロシンに対にて陽性であった（図１０Ｂ）。パーキンソン病の脳においてニューロシンに陽性でかつメラニンを含んだニューロンはほとんど観察することができなかった（図１０Ｃ）。レビー小体はニューロシンに対にて陽性であった（図１０Ｄ）。
図９および１０に示されるように、アルツハイマー病およびパーキンソン病の患者の脳組織と、正常な患者の脳組織とで、本発明の抗ニューロシン抗体を用いた免疫染色の結果が異なることから、これらの疾患を免疫組織学的検査により診断することが可能である。
実施例８  ＥＬＴＳＡ法の改良
（ａ）改良ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）
実施例１で得られたモノクローナル抗体（Ｓ２Ｅ５）をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業社製）３００μｌでブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、再度０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。次に実施例１の遺伝子組換えで生産し精製されたニューロシン蛋白質を適当な濃度（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）に０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｂ）で希釈し、これを１００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、実施例２で得られた抗血清をＰＢＳ−Ｂを用いて５μｇ／ｍｌに希釈し、該希釈液１００μｌずつを各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔでプレートを洗浄後、ＰＢＳ−Ｂにて５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１００μｌずつ加え、室温で１時間反応させた。ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ＳＩＧＭＡ  １０４  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｃ  ｔａｂｌｅｔｓ）を基質反応液（０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．７））に２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解し、基質溶液を調製した。ＰＢＳ−Ｔで７回プレートを洗浄し、該基質溶液を１００μｌ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と２０分間反応させた後、１００μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを加え反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
改良後のＥＬＩＳＡ標準曲線を図１１に示す。図１１において、横軸はニューロシンの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表し、縦軸は光学密度（４０５ｎｍ）を表す。この結果から明らかなように、ニューロシン濃度が１〜３０ｎｇ／ｍｌで直線性が得られ、上記の改良型ＥＬＩＳＡを用いることにより、測定感度が著しく上昇した。
（ｂ）血清中ニューロシンの測定
正常人および患者（アルツハイマー病、パーキンソン病、その他様々な疾患を有する）の血清中のニューロシン量を上記の改良型ＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法では血清を１／２００に希釈して測定に供した。その結果、８０ｎｇ／ｍｌの濃度においても、当該ＥＬＩＳＡ実験系を用いることにより、血清中のニューロシン含量を高感度に測定できることが判明した。図１２に示す通り、測定した５０検体のうち４８検体には殆ど血清中にニューロシンは含まれなかったが、２検体にはニューロシン含量が高濃度に含まれていた。
（ｃ）各疾患とＣＳＦ中のニューロシン含量との相関関係
ＣＳＦ中のニューロシン含量を上記のＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、中枢神経疾患でない末梢神経疾患患者（中枢性神経疾患に対する対照群）のＣＳＦニューロシン含量は年齢と共に増加していた。また、中枢性神経疾患の痴呆のうち、変性痴呆、血管性痴呆およびアルツハイマー型痴呆の３群に分けＣＳＦ中のニューロシン含量を測定した。その結果、変性痴呆においては対照群と同じく年齢と共に増加しており、高齢者においては高濃度領域に分布していたが、血管性痴呆においてはＣＳＦニューロシン含量との相関関係は全く得られなかった。特に、アルツハイマー病に罹患している患者のＣＳＦ中ニューロシン含量は比較的低濃度領域に分布しており、この結果は組織免疫染色の結果を支持するものであった。
以上記載したごとく、本発明により、ニューロシンに対して特異性を有するモノクローナル抗体が提供される。本発明にかかる抗ニューロシン抗体を使用することにより、試料（例えばＣＳＦ）中のニューロシンを検出することが可能となった。
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、検体試料中に混入することが考えられるＩｇＧ、アルブミン、トリプシノーゲンと交差反応を示さず、感度のよいＥＬＩＳＡ系が確立することができる。
ニューロシンの量は、各種疾患と関連性を有するものであるから、本発明により新しい診断法が確立されたものと言うことが出来る。
また、本発明の抗ニューロシン抗体を用いることにより、例えば脳切片などの免疫染色を行うこともでき、免疫組織学的に各種疾患を検査することも可能である。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ／ニューロシンの遺伝子地図を示す図である。
図２は、本発明のモノクローナル抗体のウェスタンブロッティングの結果を示す比較図（電気泳動写真）である。
図３は、組換えニューロシンの検量線を示す図である。
図４は、ＥＬＩＳＡ系によるニューロシンの定量に共存物質が実質的な影響を及ぼすものではないことを示す共存物質濃度と光学密度の相関グラフを示す図である。
図５は、患者検体のウェスタンブロッティングとＥＬＩＳＡ系との相関性を示す比較図（電気泳動写真）である。
図６は、陽イオン交換カラムで分離精製したヒトＣＳＦ由来ニューロシンの電気泳動図を示す図である。
図７は、ヒトＣＳＦ由来ニューロシンのＮ末端アミノ酸配列決定の結果を示す図である。
図８は、神経学的に正常な患者から得た脳組織を用いたイムノブロット解析の結果を示す図である。レーンＷはホモジネート画分、レーンＣは細胞ゾル画分、レーンＭは膜画分を用いた結果を示す図である。
図９は、脳組織を抗ニューロシン抗体で免疫染色した結果を示す図である。ＡおよびＢは神経学的に正常な脳組織、Ｃ〜Ｆはアルツハイマー病に罹患した脳組織を用いた結果を示す。
Ａ：頭頂葉灰白質に存在し、突起を有する神経細胞も他の細胞同様に核が染色された。
Ｂ：頭頂葉白質ではグリア細胞の核が染色された。
Ｃ、Ｄ：アルツハイマー病脳の頭頂葉に存在する、突起を有する神経細胞の極少数しか染色されなかった。神経細胞の核および核小体が染色された（矢頭で示す）。老人斑も抗ニューロシン抗体により染色された（矢印で示す）。
Ｅ：海馬のＣＡ４領域に存在する、突起を有する錐体細胞がニューロシン陽性細胞であった。
Ｆ：海馬のＣＡ１領域に存在する、細胞外神経原繊維変化領域はニューロシン陽性であった。
図１０は、脳組織を抗ニューロシン抗体により免疫染色した結果を示す図である。ＡおよびＢは神経学的に正常な脳組織、ＣおよびＤはパーキンソン病に罹患した中脳組織を用いた結果を示す。
Ａ：動眼神経核に存在する多くの神経細胞はグリア細胞と同様にニューロシン陽性であった。
Ｂ：いくつかのメラニン含有細胞はニューロシン陽性であった。
Ｃ：パーキンソン病脳においては、メラニン含有細胞の数が極めて少なくなり、残っている神経細胞の少数がニューロシン陽性であった。
Ｄ：レビー小体はニューロシン陽性であった。
図１１は、改良後のＥＬＩＳＡ標準曲線を示す図である。
図１２は、改良後のＥＬＩＳＡ法により測定した血清中のニューロシン量である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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