(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５未満のアミノ酸からなる単離ペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
0004210735.tif 000007
からなる群より選ばれるアミノ酸配列
を含み、ＣＴＬ応答を誘導することができる
ことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列：ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ（配列番号６）からなるペプチドである、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列：ＬＴＦＧＷＣＦＫＬ（配列番号８）からなるペプチドである、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列：ＲＩＬＱＱＬＬＦＩ（配列番号１８）からなるペプチドである、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
前記単離ペプチドが別のペプチドに連結している、請求項１〜４のいずれかに記載の単離ペプチド。
【請求項６】
前記単離ペプチドが第２分子に連結している、請求項１〜４のいずれかに記載の単離ペプチド。
【請求項７】
前記第２分子が、脂質、ヘルパーＴ細胞エピトープ、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ又は担体分子である、請求項６に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
ＨＬＡ  Ａ２．１分子を発現している抗原提示細胞と複合体を形成している請求項１〜７のいずれかに記載の単離ペプチドを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項９】
ＨＬＶ由来ＣＴＬエピトープが相互に結合してなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、
１以上のエピトープが以下のアミノ酸配列：
0004210735.tif 000008
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ応答を誘導することができる
ことを特徴とする、単離核酸。
【請求項１０】
前記エピトープの１つが、アミノ酸配列：ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ（配列番号６）からなるエピトープである、請求項９に記載の単離核酸。
【請求項１１】
前記エピトープの１つが、アミノ酸配列：ＬＴＦＧＷＣＦＫＬ（配列番号８）からなるエピトープである、請求項９に記載の単離核酸。
【請求項１２】
前記エピトープの１つが、アミノ酸配列：ＲＩＬＱＱＬＬＦＩ（配列番号１８）からなるエピトープである、請求項９に記載の単離核酸。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列：ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ（配列番号６）、ＬＴＦＧＷＣＦＫＬ（配列番号８）、ＲＩＬＱＱＬＬＦＩ（配列番号１８）及びＫＬＶＧＫＬＮＷＡ（配列番号１９）からなるエピトープを含んでいる、請求項９に記載の単離核酸。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項１５】
免疫原性ペプチド組成物を使用する方法であって、
１５未満のアミノ酸からなる単離ペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
0004210735.tif 000009
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ応答を誘導することができるペプチドを提供する工程；
該免疫原性ペプチドとＨＬＡ  Ａ２．１分子との複合体を形成する工程、
ＨＬＡ  Ａ２．１−制限ＣＴＬと、該ペプチドとＨＬＡ  Ａ２．１分子との複合体とをインビトロで接触させて、ＣＴＬ応答を誘導する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、アミノ酸配列：ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ（配列番号６）からなるペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列：ＬＴＦＧＷＣＦＫＬ（配列番号８）からなるペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、アミノ酸配列：ＲＩＬＱＱＬＬＦＩ（配列番号１８）からなるペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＬＡ  Ａ２．１分子が細胞上に発現している、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、米国特許出願第６０／０１３，９８０号の一部係属出願であり、この出願は、米国特許出願第０８／５８９，１０８号、米国特許出願第０８／４５４，０３３号及び米国特許出願第０８／３４９，１７７号に関連し、この米国特許出願第０８／３４９，１７７号は米国特許出願第０８／１５９，１８４号の一部係属出願であり、この米国特許出願第０８／１５９，１８４号は米国特許出願第０８／０７３，２０５号の一部係属出願であり、この米国特許出願第０８／０７３，２０５号は米国特許出願０８／０２７，１４６号の一部係属出願である。更に、本出願は、米国特許出願第０８／２０５，７１３号にも関連する。これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
発明の背景
本発明は、多数の病的状態、例えばウイルス性疾患及びガン等を予防、治療又は診断するための組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、選択された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、免疫応答を誘導することができる新規ペプチドを提供する。
ＭＨＣ分子は、クラスＩ又はクラスII分子に分類される。クラスII  ＭＨＣ分子は、免疫応答の開始及び維持に関連する細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージなどにおいて主に発現する。クラスII  ＭＨＣ分子はヘルパーＴリンパ球により認識され、ヘルパーＴリンパ球の増殖及び提示された特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほとんど全ての有核細胞中で発現し、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識され、該抗原を有する細胞は破壊される。ＣＴＬは、腫瘍拒絶及びウイルス感染との闘いにおいて特に重要である。
ＣＴＬは、完全な外来抗原そのものよりも、ＭＨＣクラスＩ分子に結合したペプチド断片形態の抗原を認識する。抗原は、普通は細胞により内生的に合成されなければならず、タンパク質抗原の一部は、細胞質中で小さいペプチド断片に分解される。これらの小さいペプチドのあるものは、プレ−ゴルジコンパートメント（pre-Golgi compartment）に転位し、クラスＩの重鎖と相互作用し、適切な折り畳み及びサブユニットβ２ミクログロブリンとの結合を促進する。次いでペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、発現及び特異的ＣＴＬによる可能性のある認識のために細胞表面に移動（route）する。
ヒトＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の研究により、ペプチドが結合する溝は、クラスＩの重鎖のα１及びα２ドメインの折りたたみにより生成することが示された（Bjorkman et al.,Nature 329:506（1987））。しかしながら、これらの研究において、溝に結合するペプチドの正体は決定されなかった。
Buusら（Science 242:1065（1988））は、ＭＨＣからの結合ペプチドの酸溶出方法をはじめて開示した。続いてRammenseeら（Falk et al.,Nature 351:290（1991））は、クラスＩ分子に結合した天然に処理されたペプチドを特徴づけするアプローチを開発した。他の研究者は、質量分析法によりＢ型クラスＩ分子（Jardetzky et al.,Nature 353:326（1991））及びＡ２．１型クラスＩ分子（Hunt et al.,Science 225:1261（1992））から溶出したペプチドの慣習的自動化配列決定により、種々のＨＰＬＣ画分中のより豊富なペプチドの直接のアミノ酸配列決定を行うことに成功した。ＭＨＣクラスＩにおける天然に処理されたペプチドの特徴付けのレビューは、Rotzschke及びFalkにより示されている（Rotzschke and Falk,Immunol.Today 12:447（1991））。
Setteら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3296（1989））は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的モチーフはＭＨＣ結合能力の予想に使用することができることを示した。Schaefferら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4649（1989））は、ＭＨＣ結合は免疫原性に関連していることを示した。数名の研究者（De Bruijn et al.,Eur.J.Immunol.,21:2963-2970（1991）;Pamer et al.,991 Nature 353:852-955（1991））は、クラスＩ結合モチーフを、動物モデルにおける可能性のある免疫原性ペプチドの同定へ適用することができるという予備的な証拠を示した。与えられたクラスＩアイソタイプの多数のヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは未だ報告されていない。これらの異なる対立遺伝子の組み合わせた頻度が、ヒトの非近交系群（human outbred population）の大部分、おそらくは過半数をカバーするのに十分に高いことが望ましい。
当該技術分野における発展にもかかわらず、先行技術は、この研究結果に基づく、有用なヒトペプチドを基本とするワクチン又は治療薬を未だ提供していない。
発明の概要
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを提供する。適切なＭＨＣ対立遺伝子産物に結合する免疫原性ペプチドは、好ましくはその長さが９〜１０残基であり、特定の位置、例えば２番目及び９番目の部位に保存された残基を含む。更にペプチドは、本明細書で定義される負の（negative）結合残基を、長さが９アミノ酸のペプチドの場合、その他の部位、例えば１、３、６及び／又は７番目の部位に、長さが１０アミノ酸のペプチドの場合、その他の部位、例えば１、３、４、５、７、８及び／又は９番目の部位には含まない。本発明は、ＨＬＡ  Ａ２．１に効率的に結合するペプチドの選択を可能にするモチーフ内の位置を定義する。
多数の免疫原性標的タンパク質上のエピトープを、本発明のペプチドを使用して同定することができる。本発明のペプチドは、病原体（例えば、ウイルス病原体、真菌病原体、細菌病原体、原生動物病原体など）、又はガン関連抗原に由来する抗原性タンパク質の配列に基づいて製造することができる。適切な抗原の例には、前立腺ガン特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア又は表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン・バーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）及びパピローマウイルス抗原が含まれる。したがって、ペプチド又はこれをコードする核酸は、インビボ及びエキソビボにおける治療及び診断への適用のための医薬組成物に有用である。
定義
「ペプチド」という用語は、本明細書においては、「オリゴペプチド」と互換的に用いられ、通常は隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合により、互いに結合した残基、通常はＬ−アミノ酸の連続物を意味する。本発明のオリゴペプチドはその長さが約１５残基未満であり、通常は約８〜１１残基好ましくは９又は１０残基からなる。
「免疫原性ペプチド」は、ＭＨＣ分子に結合し、ＣＴＬ応答を誘導するような対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し、該免疫原性ペプチドが由来する抗原に対しての細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。
免疫原性ペプチドは、本発明のアルゴリズムを使用することにより都合よく同定される。アルゴリズムは、免疫原性ペプチドの選択を可能にするスコア（score）を作成する数学的手順である。通常は、結合閾値（binding threshold）についてのアルゴリズムのスコアを使用することにより、特定の親和性での結合の高い可能性を有し、それゆえ次には免疫原性になるペプチドの選択が可能になる。アルゴリズムは、ペプチドの特定の部位における特定のアミノ酸のＭＨＣ結合への影響又はモチーフ含有ペプチドにおける特定の置換の結合への影響に基づく。
個別のペプチドのエピトープのＭＨＣクラスＩ分子に対する結合親和性と、免疫原性との間の関係が、２つの異なる実験的アプローチにおいて解析されている（Sette,et al.,J.Immunol.,153:5586-5592（1994））。第一のアプローチにおいては、１０，０００倍の範囲のＭＨＣ結合親和性を有する、可能性のあるエピトープの免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ*０２０１トランスジェニックマウスにおいて解析した。第二のアプローチにおいては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に由来する約１００の異なる可能性のあるエピトープ（全てＡ*０２０１結合モチーフを有する）の抗原性を、急性肝炎患者のＰＢＬを使用して評価した。両ケースともに、約５００ｎＭ（好ましくは５００ｎＭ以下）の結合閾値が、ペプチドのエピトープのＣＴＬ応答を誘発する能力を決定していることを見出した。これらのデータは、天然に処理されたペプチド又は既述のＴ細胞エピトープのいずれかについてのクラスＩ結合親和性測定と十分に関連している。これらのデータは、Ｔ細胞応答の形成における決定基選択の重要な役割を示している。
「保存された残基」とは、ペプチドの特定の部位において不規則分布により予想される頻度よりも有意に高い頻度で存在するアミノ酸のことである。通常、保存された残基とは、免疫原性ペプチドにおいてＭＨＣ構造との接触点を提供している残基である。定義された長さのペプチド内の１〜３、好ましくは２つの保存された残基が、免疫原性ペプチドに対するモチーフを定義している。通常、これらの残基は、ペプチド結合溝、溝の特異的ポケットに埋められた側鎖と密接に接触している。通常、免疫原性ペプチドは３つまでの保存された領域、より通常には２つの保存された領域を含んでいるだろう。
本明細書で使用するとき、「負の結合残基」とは、特定の部位（９残基の場合、１、３及び／又は７番目の部位）に存在する場合に、非結合性又は低結合性であり、免疫原性にならない、すなわちＣＴＬ応答を誘導しないペプチドを生じさせる残基のことである。
「モチーフ」という用語は、定義された長さ、通常は約８〜約１１アミノ酸のペプチドにおける残基のパターンであって、特定のＭＨＣ対立遺伝子産物により認識されるものを意味する。通常ペプチドモチーフは、ヒトＭＨＣ対立遺伝子の各々で異なり、高度に保存された領域及び負の残基のパターンにおいて異なる。
対立遺伝子産物に対する結合モチーフは、正確性（precision）の増加する程度を用いて定義することができる。ある場合においては、保存された残基の全てが、ペプチド内の正しい位置に存在し、１、３及び／又は７番目の部位には負の残基が存在しない。
「単離された」又は「生物学的に純粋な」という句は、天然状態において見出されたときに通常伴っている成分が実質的又は本質的に存在していない物質のことを意味する。したがって、本発明のペプチドは、自然環境で関係している物質、例えば抗原提示細胞上のＭＨＣ  Ｉ分子を含んでいない。たとえタンパク質を均一又は有力なバンド（dominant band）に単離した場合であっても、天然タンパク質の５〜１０％の範囲で、所望のタンパク質と同時精製された微量混入物が存在する。本発明の単離されたペプチドは、そのような同時精製された内因性のタンパク質を含まない。
「残基」という用語は、アミド結合又は擬似アミド結合によりオリゴヌクレオチドに組み込まれた、アミノ酸又は擬似アミノ酸を意味する。
好ましい態様の説明
本発明は、ヒト  クラスＩ  ＭＨＣ（ＨＬＡと呼ばれる場合もある）の対立遺伝子サブタイプに対する対立遺伝子特異的ペプチドモチーフ、特にＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子により認識されるペプチドモチーフの決定に関する。次いでこれらのモチーフを使用して、可能性のある抗原又は自己抗原標的のアミノ酸配列が既知である、あらゆる所望の抗原、特にヒトのウイルス性疾患、ガン又は自己免疫疾患と関連する抗原からＴ細胞エピトープを定義する。
多数の可能性のある標的タンパク質上のエピトープをこの方法で同定することができる。適切な抗原の例には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア及び表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン・バーウイルス抗原、メラノーマ抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原が含まれる。
本発明のペプチドを用いて病状を軽減し、発症又は再発を処置又は予防してもよい自己免疫関連疾患には、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、重症筋無力症（ＭＧ）、水疱性類天疱瘡（真皮−表皮接合部における基底膜に対する抗体）、天疱瘡（ムコ多糖タンパク質複合体又は細胞内セメント物質に対する抗体）、糸球体腎炎（糸球体基底膜に対する抗体）、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血（赤血球に対する抗体）、橋本病（甲状腺に対する抗体）、悪性貧血（内因子に対する抗体）、特発性血小板減少性紫斑病（血小板に対する抗体）、グレーブス病及びアジソン病（サイログロブリンに対する抗体）などが含まれる。
多数の疾患に関連した自己抗原が同定されている。例えば、実験的に誘導した自己免疫疾患においては、病原に関連する抗原が特徴付けされている。関節炎を患うラット及びマウスにおいては、コラーゲン誘導関節炎では天然タイプIIコラーゲンが、アジュバント関節炎ではマイコバクテリア熱ショックタンパク質が同定され、マウスにおいては、実験的アレルギー性甲状腺炎（ＥＡＴ）でサイログロブリンが同定され、実験的アレルギー性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）ではアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）が同定され、マウス及びラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ではプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が同定された。更に、ヒトにおいても標的抗原が同定され、ヒト関節リウマチではタイプIIコラーゲンが同定され、重症筋無力症ではアセチルコリン受容体が同定された。
これらの抗原由来のエピトープを含むペプチドを合成し、次いで、例えば精製したクラスＩ分子及び放射性ヨウ素化ペプチド及び／又は空の（empty）クラスＩ分子を発現している細胞を使用しての、例えば免疫蛍光染色及び流動微小蛍光測定、ペプチド依存性クラスＩアセンブリアッセイ（assembly assay）及びペプチド競合によるＣＴＬ認識阻害により、適切なＭＨＣ分子に結合する能力について試験した。更に、クラスＩ分子に結合するペプチドを、ウイルス感染した標的細胞又は腫瘍細胞と反応することができるＣＴＬ群を提供することができる、インビトロ又はインビボにおける一次ＣＴＬ応答を誘導する可能性のある治療薬としての能力だけでなく、感染又は免疫化個体に由来するＣＴＬに対する標的として役立つ能力についても評価した。
ＭＨＣクラスＩ抗原はＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子座によりコードされている。ＨＬＡ−Ａ及びＢ抗原は、ほぼ均等な密度で細胞表面上に発現するが、ＨＬＡ−Ｃの発現はきわめて低い（おそらく１０倍程低い）。各遺伝子座は多数の対立遺伝子を有する。本発明のペプチド結合モチーフは、各対立遺伝子のサブタイプに対して比較的特異的である。
ペプチドを基礎とするワクチンについて、本発明のペプチドは、好ましくはヒトにおいて広い分布を有しているＭＨＣ  Ｉ分子により認識されるモチーフを含んでいる。ＭＨＣ対立遺伝子は、異なる民族及び人種において異なる頻度で発現するので、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は標的人種に依存するだろう。表１は、異なる人種間のＨＬＡ−Ａ遺伝子座産物における種々の対立遺伝子の頻度を示している。例えば、コーカソイド人の大多数は、４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ、すなわちＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２及びＡ２４．１に結合するペプチドによりカバーすることができる。同様に、アジア人の大多数は、追加の５番目の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１１．２に結合するペプチドを含んでいる。
0004210735.tif 000002
0004210735.tif 000003
ペプチド化合物を記載するために使用した命名法は、慣習にしたがい、各アミノ酸残基のアミノ基を左側（Ｎ末端）に示し、カルボキシル基を右側（Ｃ末端）に示す。選択された本発明の特定の態様を表す式においては、詳細には示さないけれども、アミノ末端基及びカルボキシル末端基は、特別に述べないかぎり、生理的ｐＨ値のおいて想定される形態をとる。アミノ酸構造式において、通常、各残基は、標準的な３文字又は１文字名称により表される。アミノ酸残基のＬ型は、１つの大文字又は３文字記号の最初の文字における大文字により表され、Ｄ型形態を有するアミノ酸のＤ型は、１つの小文字又は３文字記号の最初の文字における小文字により表される。グリシンは不斉炭素を有さないので、単に「Gly」又はGとして記載される。
本発明のペプチドを同定するために使用する手順は、Falk et al.,Nature 351:290（1991）に開示された方法にしたがう。この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、この方法には、通常は免疫沈降又は親和性クロマトグラフィーによる、適切な細胞又は細胞系からのＭＨＣクラスＩ分子の大規模単離が含まれる。当業者に周知の、所望のＭＨＣ分子単離のためのその他の方法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除、高性能リガンドクロマトグラフィー及び前記すべての技術の組み合わせが含まれる。
典型的には、免疫沈降を使用して所望の対立遺伝子産物を単離する。使用する抗体の特異性に依存して、多数のプロトコルを使用することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ1及びＨＬＡ−Ｃ分子の親和性精製のために、対立遺伝子産物特異的ｍＡｂ試薬を使用することができる。ＨＬＡ−Ａ分子単離用の数種のｍＡｂ試薬が入手可能である。モノクローナルＢＢ７．２は、ＨＬＡ−Ａ２分子単離に適している。標準的な技術を使用して調製したこれらのｍＡｂを有する親和性カラムを、首尾よく使用して各ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精製する。
対立遺伝子特異的ｍＡｂに加えて、反応性の広い抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣｍＡｂ、例えばＷ６／３２及びＢ９．１２．１並びに抗ＨＬＡ−Ｂ、ＣｍＡｂであるＢ１．２３．２を、以下に示す実施例に記載したようにして、代替の親和性精製プロトコルに使用することができるだろう。
単離したＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドを、通常は酸処理により溶離する。標準的変性方法、例えば熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤又はこれらの組み合わせにより、ペプチドをクラスＩ分子から分離することができる。
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチド画分をＭＨＣ分子から更に分離し、次いで配列決定した。ペプチドは、当業者に周知の種々の標準的方法により分離することができ、この方法にはろ過、限外ろ過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特異的抗体を用いての沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動法などが含まれる。
単離したペプチドの配列決定は、エドマン分解などの標準的技術にしたがい行うことができる（Hunkapiller,M.W.,et al.,Methods Enzymol.91,399[1983]）。配列決定に適したその他の方法には、既報（Hunt,et al.,Science 225:1261（1992）（参照することにより本明細書に組み込まれる））にしたがう個々のペプチドの質量分析配列決定が含まれる。通常、異なるクラスＩ分子からなるバルクの不均一ペプチド（例えば、プールした（pooled）ＨＰＬＣ画分）のアミノ酸配列決定により、各クラスＩ対立遺伝子に対して特徴的な配列モチーフが明らかになる。
異なるクラスＩ対立遺伝子に特異的なモチーフの定義は、アミノ酸配列が既知の抗原性タンパク質からの可能性のあるペプチドエピトープの同定を許容する。通常、可能性のあるペプチドエピトープの同定は、最初に所望の抗原のアミノ酸配列を、モチーフの存在についてコンピューターを使用してスキャンすることにより行われる。次いでエピトープ配列を合成する。ＭＨＣクラス分子に結合する能力を種々の異なる方法で測定する。前記の関連出願に記載されているクラスＩ分子結合アッセイは１つの方法である。文献に記載されたその他の代替の方法には、抗原提示の阻害（Sette,et al.,J.Immunol.141:3893（1991））、インビトロアセンブリアッセイ（Townsend,et al.,Cell 62:285（1990））及び突然変異細胞、例えばＲＭＡ．Ｓを使用してのＦＡＣＳを基本とするアッセイ（Melief,et al.,Eur.J.Immunol.21:2963（1991））が含まれる。
次に、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイにおいて陽性であることを試験したペプチドを、インビトロにおける特異的ＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイする。例えば、ペプチドとともにインキュベートした抗原提示細胞を、応答細胞群におけるＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイすることができる。抗原提示細胞は、正常細胞、例えば末梢血単核細胞又は樹枝状細胞などであることができる（Inaba,et al.,J.Exp.Med.166:182（1987）;Boog,Eur.J.Immunol.18:219（1988））。
代わりに、内部的に処理されたペプチドを有するクラスＩ分子をロード（load）する能力を欠いており、適切なヒトクラスＩ遺伝子を形質移入した突然変異哺乳動物細胞系、例えばマウス細胞系ＲＭＡ−Ｓ（Karre,et al.,Nature,319:675（1986）;Ljunggren,et al.,Eur.J.Immunol.21:2963-2970（1991））及びヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリッド、Ｔ２（Cerundolo,et al.,Nature 345:449-452（1990））を都合よく使用し、ペプチドを添加したときの、インビトロでの一次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力について試験した。使用することができるその他の真核細胞系には、種々の昆虫細胞、例えば蚊の幼虫（ＡＴＣＣ細胞系ＣＣＬ１２５、１２６、１６６０、１５９１、６５８５、６５８６）、カイコ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８８５１）、ヨトウムシ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）、蛾（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８０）及びショウジョウバエ細胞系、例えばシュナイダー細胞系（Schneider,J.Embryol.Exp.Morphol.,27:353-365（1927））が含まれる。
末梢血リンパ球を、正常ドナー又は患者の単純静脈穿刺又は白血球除去血輸血にしたがい都合よく単離し、ＣＴＬ前駆体の応答細胞源として使用した。ある態様においては、適切な抗原提示細胞を、１０〜１００μＭのペプチドとともに、無血清培地中、適切な培養条件下で４時間インキュベートした。次いで、ペプチドをロードした抗原提示細胞を、応答細胞群とともに、インビトロで、最適化培養条件下で７〜１０日間インキュベートした。陽性のＣＴＬ活性化は、放射性標識化標的細胞、すなわち特異的ペプチドパルス化標的（specific peptide-pulsed targets）及びペプチド配列が由来する関連ウイルス又は腫瘍抗原の内生的に処理された形態を発現している標的細胞を殺すＣＴＬの存在を培養についてアッセイすることにより測定することができる。
ＣＴＬの特異性及びＭＨＣ制限を、適切又は不適切なヒトＭＨＣクラスＩを発現している異なるペプチド標的細胞を試験することにより測定した。ＭＨＣ結合アッセイにおいて陽性について試験し、特異的ＣＴＬ応答を生じたペプチドを、本明細書においては免疫原性ペプチドと呼ぶ。
免疫原性ペプチドは、合成により若しくは組換えＤＮＡ技術又は天然源、例えば全ウイルス又は腫瘍から調製することができる。好ましくはペプチドには、その他の天然の宿主細胞タンパク質及びその断片が実質的に存在しないが、ある態様においては、ペプチドを、天然の断片又は粒子に合成により結合させることができる。
ポリペプチド又はペプチドは、種々の長さを有することができ、中性（非荷電）形態又は塩形態のいずれかの形態をとることができ、例えばグリコシル化、側鎖酸化若しくはリン酸化などの修飾なし又はこれらの修飾を含むことが可能であり、本明細書に記載するようなポリペプチドの生物学的活性を破壊しない修飾条件に付することができる。
望ましくは、大きいペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持しつつ、ペプチドはできる限り小さい。可能であるならば、本発明のペプチドの長さを９又は１０アミノ酸残基に最適化し、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に結合する内生的に処理されたウイルス性ペプチド又は腫瘍細胞ペプチドと大きさにおいて同一であることが望ましい。
所望の活性を有するペプチドを、必要に応じて修飾し、ある所望の属性、例えば改善された薬理特性を与えてもよいが、所望のＭＨＣ分子に結合し、適切なＴ細胞を活性化するという未修飾ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加させるか又は少なくとも維持していなければならない。例えば、ペプチドを、種々の改変、例えば保存的又は非保存的置換に付してもよく、この場合そのような改変は、その使用において、改善されたＭＨＣ結合などの利点を提供するだろう。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／又は化学的に類似の別のアミノ酸残基で置換すること、例えば疎水性残基をべつの残基で、又は極性残基を別の残基で置換することを意味する。置換には、Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及びPhe、Tyrなどの組み合わせが含まれる。１つのアミノ酸置換の影響を、Ｄ−アミノ酸を使用して調査してもよい。そのような修飾は、例えば、Merrifield,Science 232:341-347（1986）,Barany and Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds.（N.Y.,Academic Press）,pp.1-284（1979）;and Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,（Rockford,Ill.,Pierce）,2d Ed.（1984）に記載される周知のペプチド合成手順を使用することにより行うことができるだろう。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。
ペプチドは、例えばアミノ酸の付加又は削除によるアミノ酸配列の延長又は短縮により修飾することができる。本発明のペプチド又はその類似体を、特定の残基の順番又は組成を改変することにより修飾することができるが、生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基、例えば決定的な接触部位に存在する残基又は保存された残基は、生物学的活性に悪影響を与えることなしに通常改変しないことは容易に理解されるだろう。決定的でないアミノ酸は、タンパク質内で天然に存在しているもの、例えばＬ−α−アミノ酸又はそのＤ−異性体に限定する必要はなく、Ｌ−α−アミノ酸の多数の誘導体だけではなく非天然アミノ酸、例えばβ−γ−δ−アミノ酸を含んでいてもよい。
通常は、１つのアミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して、静電電荷、疎水性などの結合に対する影響を測定する。例えば、ペプチドの長さに関する一連の正荷電アミノ酸置換（例えば、Lys若しくはArg）又は負荷電アミノ酸置換（例えばGlu）により、種々のＭＨＣ分子及びＴ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンが明らかになった。更に、小さい比較的中性の残基、例えばAla、Gly、Pro又は類似の残基を使用した複数の置換を用いてもよい。置換はホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーであってもよい。置換又は付加される残基の数及び種類は、必須の接触点間に必要な間隔及び求められる特定の機能属性（疎水性対親水性）に依存する。親ペプチドの結合親和性と比較して増加した、ＭＨＣ分子又はＴ細胞受容体に対する親和性を、前記の置換により達成してもよい。あらゆる場合において、そのような置換は、結合を破壊する静電及び電荷障害を避けるように選択されたアミノ酸残基又はその他の分子断片を使用しなければならない。
アミノ酸置換は通常１残基である。置換、削除、挿入又はこれらのあらゆる組み合わせを組み合わせて、最終のペプチドを製造してもよい。置換変異体は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されているものである。ペプチドの性質を細かく調節することが望まれる場合、置換は通常以下に示す表２にしたがい行われる。
0004210735.tif 000004
機能上の実質的な変化（例えば、ＭＨＣ分子又はＴ細胞受容体に対する親和性）は、表２に示す置換よりも保存的でない置換を選択、例えば（ａ）置換領域におけるペプチドバックボーンの構造、例えばシート構造又はらせん構造としての維持、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性の維持、又は（ｃ）側鎖のバルク（bulk）の維持に対する影響において有意に異なる残基を選択することにより行われる。ペプチドの特性において最大の変化を生じることを通常期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル基の疎水性残基、例えばロイシル基、イソロイシル基、フェニルアラニル基、バリル基又はアラニル基での置換、（ｂ）正に荷電した側鎖を有する残基、例えばリシル基、アルギニル基又はヒスチジル基の負に帯電した側鎖を有する残基、例えばグルタミル基又はアスパルチル基での置換、又は（ｃ）大きい側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンの、側鎖を有さない残基、例えばグリシンでの置換であろう。
ペプチドは、免疫原性ペプチド内に２つ以上の残基のイソステール（isostere）を含んでいてもよい。本明細書で定義するイソステールとは、第一の配列の立体構造が第二の配列に特異的な結合部位に適合しているため、第二の配列で置換することができる、２以上の残基からなる配列のことである。この用語は、特に当業者に周知のペプチドバックボーン修飾を含んでいる。そのような修飾には、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置換、延長、削除又はバックボーンの架橋が含まれる。一般的には、Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,peptides and Proteins,Vol.VII（Weinstein ed.,1983）を参照のこと。
種々の擬似アミノ酸又は非天然アミノ酸を用いてのペプチドの修飾は、インビボにおけるペプチドの安定性の増加に特に有用である。安定性は多数の方法によりアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ及び種々の生物学的媒体、例えばヒト血漿及び血清などを使用して、安定性を試験してきた。例えば、Verhoef et al.,Eur.J.Drug Metab.Pharmacokin.11:291-302（1986）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して都合よく測定した。プロトコルは通常以下に示す通りである。プールしたヒト血清（ＡＢ型、熱不活化せず）を、使用前に遠心分離により脱脂した。次いで血清をＲＰＭＩ組織培養培地を用いて２５％に希釈し、ペプチド安定性の試験に使用した。予定の時間間隔で、少量の反応溶液を採取し、６％水性トリクロル酢酸又はエタノールに添加した。濁った反応サンプルを１５分間冷却（４℃）し、遠心（spun）して沈澱した血清タンパク質をペレット化した。次いで、安定性−特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相クロマトグラフィーにより、ペプチドの存在を測定した。
本発明のペプチド又はＣＴＬ刺激活性を有するその類似体を修飾して、改善された血清中半減期以外の所望の属性を与えてもよい。例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、ヘルパーＴ細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含んでいる配列への結合により増強することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／ヘルパーＴ結合物は、スペーサー分子により連結されている。通常スペーサーは、比較的小さい中性分子、例えば生理学的条件下で実質的に荷電していないアミノ酸又は擬似アミノ酸を含んでいる。通常スペーサーは、例えばAla、Gly又は非極性アミノ酸若しくは中性の極性アミノ酸からなるその他の中性スペーサーから選ばれる。任意に存在するスペーサーは、同一の残基を含んでいることを必要とせず、それゆえヘテロ−又はホモ−オリゴマーであってもよいことは理解されるだろう。スペーサーが存在する場合、通常、スペーサーは少なくとも１又は２つの残基であり、より一般的には３〜６つの残基である。代わりに、ＣＴＬペプチドはスペーサーなしにヘルパーＴペプチドに結合してもよい。
免疫原性ペプチドは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端において、ヘルパーＴペプチドに、直接又はスペーサーを介して結合していてよい。免疫原性ペプチド又はヘルパーＴペプチドのいずれかのアミノ末端はアシル化されていてもよい。例示的なヘルパーＴペプチドには、破傷風トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリア原虫（malaria circumsporozoite）３８２〜３９８及び３７８〜３８９が含まれる。
ある態様においては、本発明の医薬組成物は、ＣＴＬを初回刺激（prime）する少なくとも１つの成分を含んでいることが望ましい。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを初回刺激することのできる薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基を、Lys残基のα及びεアミノ基に結合し、次いで例えばGly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Serなどの１つ以上の結合残基を介して、免疫原性ペプチドに結合することができる。次いで、脂質化（lipidated）ペプチドは、ミセル形態で直接注射、リポソームへ組み込み又はアジュバント、例えばフロイントアジュバント中で乳化することができる。好ましい態様においては、特に有効な免疫原は、Lysのα及びεアミノ基に結合し、次いで例えばSer-Serの連結を介して免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合しているパルミチン酸を含んでいる。
ＣＴＬ応答の脂質による初回刺激の別の例として、大腸菌リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ3ＣＳＳ）を、適切なペプチドに共有結合して、ウイルス特異的ＣＴＬの初回刺激に使用することができる。Deres et al.,Nature 342:561-564（1989）を参照のこと。本文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。例えば、本発明のペプチドをＰ3ＣＳＳに結合することができ、リポペプチドを個体に投与し、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に初回刺激する。更に、適切なエピトープを示すペプチドに結合したＰ3ＣＳＳを用いて中和抗体の誘導をも初回刺激することができるときには、２つの組成物を組み合わせて、感染に対する体液性応答及び細胞性応答の両者をより効率的に誘導することができる。
更に、追加のアミノ酸を、ペプチドの末端に追加して、別のペプチドへの結合の容易性、キャリヤー担体又は大きなペプチドへの結合、ペプチド又はオリゴペプチドの物理的又は化学的特性の修飾などを提供することができる。例えばチロシン、システイン、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸などのアミノ酸を、ペプチド又はオリゴペプチドのＣ−又はＮ−末端に導入することができる。ある場合においては、Ｃ末端における修飾がペプチドの特性を改変するかもしれない。更に、ペプチド又はオリゴヌクレオチド配列は、末端のＮＨ2アシル化、例えばアルカノイル（Ｃ1〜Ｃ20）又はチオグリコリルアセチル化、末端カルボニルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより修飾することにより、天然の配列と差別化することができる。ある場合においては、これらの修飾により、担体又はその他の分子への結合のための部位を提供してもよい。
本発明のペプチドは、多種の方法により製造することができる。その比較的小さい大きさのため、慣習的な技術にしたがい、溶液中又は個体担体上でペプチドを合成することができる。種々の自動合成機を商業的に入手し、既知のプロトコルにしたがい使用することができる。例えば、前出Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2d.ed.,Pierce Chemical Co.（1984）を参照のこと。
代わりに、組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。この技術では、興味の対象となる免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換又は形質移入し、発現に適切な条件下で培養する。これらの技術は当該技術分野において一般的に知られており、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York（1982）に記載されている。この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。したがって、本発明のペプチドの１以上を含む融合タンパク質を使用して、適切なＴ細胞エピトープを提供することができる。
本明細書で意図する長さを有するペプチドをコードする配列を、化学的技術、例えばMatteucci et al.,J.Am.Chem.Soc.103:3185（1981）のホスホトリエステル法により合成することができるとき、天然のペプチド配列をコードする塩基を適切な塩基で置換することにより、簡単に修飾することができる。次いでコード配列を適切なリンカーへ提供し、当該技術分野において商業的に入手することができる発現ベクターに結合し、ベクターを適切な宿主への形質転換に使用して、所望の融合タンパク質を生産する。多数のベクター及び適切な宿主系を入手することができる。融合タンパク質の発現については、コード配列を、操作可能に結合した開始コドン、終止コドン、プロモーター領域及びターミネーター領域並びに通常は複製系に提供し、所望の細胞宿主における発現用の発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合するプロモーター配列を、所望のコード配列を挿入するために都合のよい制限部位を含むプラスミドに提供する。得られた発現ベクターで適切な細菌宿主を形質転換する。適切なベクター及び制御配列を使用することにより、酵母又は哺乳類細胞宿主を使用してもよい。
本発明のペプチド、医薬組成物及びワクチンは、ウイルス感染及びガンを治療及び／又は予防するための、哺乳類、特にヒトへの投与に有用である。本発明の免疫原性ペプチドを使用して治療することができる疾患の例には、前立腺ガン、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、腎臓ガン、子宮ガン、リンパ腫、ＣＭＶ及びコンドリローマ・アクミナタム（condlyloma acuminatum）が含まれる。
医薬組成物については、本発明の免疫原性ペプチドを、既にガンを患っている個体又は興味の対象となるウイルスに感染した個体に投与する。感染の潜伏期又は急性期にある個体を、免疫原性ペプチドを適宜その他の治療と別々又は組み合わせて用いることにより治療することができる。治療応用においては、組成物を、ウイルス又は腫瘍抗原に対する効果的なＣＴＬ応答を誘導し、病状及び／又は合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で患者に投与する。これを達成するのに適切な量を、本明細書においては「治療学的有効投与量」と定義する。この用途に有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、治療対象疾患の段階及び重症度並びに処方する医師の判断に依存するが、（治療用投与又は予防用投与）のための初回免疫化についての通常の範囲は、７０ｋｇの患者に対してペプチド約１．０μｇ〜約５０００μｇであり、続く追加免疫では、患者の血液中の特異的ＣＴＬ活性の測定による患者の応答及び状態に依存する数週間から数ヶ月の追加投与計画にしたがいその投与量はペプチド約１．０μｇ〜約１０００μｇである。本発明のペプチド及び組成物は、重症状態、すなわち生命を危うくする状態又は生命を危うくする可能性のある状態において通常使用されることに留意すべきである。そのような場合、外来性物質の最小化及びペプチドの相対的に無毒の性質を考慮して、治療を行う医師が実質的に過剰量のペプチド組成物を投与することが可能であり、望ましいであろう。
治療用途については、ウイルス感染の最初の徴候時、検出時、腫瘍の手術的除去時又は急性感染の場合は診断直後に投与を開始すべきである。これに続いて、少なくとも徴候が実質的に軽減し、その後もその状態が続くようになるまで、追加免疫投与を行う。慢性感染においては、初回量に続く追加投与量が要求されるだろう。
本発明の組成物を用いての感染個体の治療は、急性感染した個体の感染の回復を早めるだろう。慢性感染の発生が疑われる（又は慢性感染しやすい）個体について、本発明の組成物は、急性から慢性感染への展開を予防する方法において特に有用である。例えば、感染前又は感染中に、疑わしい個体が同定された場合、本明細書に記載されるように、組成物に個体を標的とさせ、大集団への投与の必要性を最小化することができる。
ペプチド組成物を、慢性感染の治療に使用して、免疫系を刺激し、保菌者のウイルス感染細胞を除去することができる。細胞障害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な製剤中の免疫賦活ペプチドの量及び投与様式を提供することが重要である。したがって、慢性感染の治療については、７０ｋｇの患者に対して、１回の投与あたり、約１．０μｇ〜約５０００μｇ、好ましくは約５μｇ〜１０００μｇが代表的な範囲である。免疫化投与に続く追加免疫投与が、確立した間隔、例えば１〜４週間、あるいは個体を効果的に免疫化するための延長期間の間、要求されてもよい。慢性感染の場合、少なくとも臨床症状又は臨床検査が、ウイルス感染が除去又は実質的に軽減し、その後のその状態であることを示すまでは、投与を続けるべきである。
治療学的処置用の医薬組成物は、非経口、表面、経口又は局所投与を意図している。好ましくは医薬組成物は、非経口、例えば静脈内、皮下、皮内又は筋肉内に投与する。したがって、本発明は、許容しうる担体、好ましくは水性担体中に溶解又は懸濁した免疫原性ペプチド溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。例えば、水、緩衝化水、０．８％生理的食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などの種々の水性担体を使用してもよい。組成物を、慣習的な周知の滅菌技術により滅菌又は無菌的にろ過してもよい。得られた水性溶液をそのまま使用するために包装又は凍結乾燥してもよい。凍結乾燥製剤は使用前に滅菌液と組み合わせる。組成物は、生理学的状態に近づけるために要求される薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調節剤及び緩衝剤、張度調節剤（tonicity adjusting agent）、湿潤剤など、具体的には酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでいてもよい。
医薬製剤中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチド濃度は、広範囲で変化させることができ、すなわち重量基準で約０．１％未満、通常は約２％又は少なくとも約２％から２０％〜５０％又はそれ以上までであり、選択した特定の投与様式にしたがい、主に液量、粘度などにより選択されるだろう。
本発明のペプチドをリポソームを介して投与してもよい。リポソームはペプチドに特定の組織、例えばリンパ組織を標的とさせること、感染細胞に対する選択性に役立ち、ペプチド組成物の半減期を増加させる。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などが含まれる。これらの製造においては、送達するペプチドを、単独又はリンパ球間に普及している受容体に結合する分子、例えばＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体又はその他の治療用又は免疫原性組成物とともにリポソームの一部に組み込む。これにより、本発明の所望のペプチドで満たされた又は装飾されたリポソームをリンパ球部位に向けることができる。この場合リポソームは選択された治療用／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明における使用のためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、通常これには中性又は負に荷電したリン脂質及びステロール、例えばコレステロールが含まれる。脂質の選択は、例えばリポソームの大きさ、酸不安定性及び血液流中におけるリポソームの安定性への配慮により通常左右される。リポソーム製造のために種々の方法が利用可能である。例えば、Szoka et al.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467（1980）,U.S.Patent Nos.4,235,871, 4501,728, 4,837,028 and 5,019,369に記載されており、これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。
免疫細胞を標的にするために、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体又はその断片などを含むリガンドをリポソームに組み込むことができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液を、特に投与様式、送達するペプチド及び治療対象疾患の段階にしたがい変化する投与量で、非経口的、局所的、表面的に投与してもよい。
個体組成物については、慣習的な無毒性固体担体を使用することができ、これらには、例えば医薬品品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与のための、薬学的に許容しうる無毒性組成物は、通常使用されるあらゆる賦形剤、例えば前記の担体を、通常活性成分、すなわち本発明の１以上のペプチドの１０〜９５％、好ましくは２５〜７５％の濃度で組み込むことにより形成する。
エアロゾル投与について、免疫原性ペプチドは、界面活性剤及び噴霧剤とともに、微粉化して供給する。ペプチドの典型的な百分率は、重量基準で０．０１〜２０％、好ましくは１〜１０％である。界面活性剤は当然無毒性でなければならず、好ましくは噴霧剤に可溶性である。そのような薬剤の代表例は、炭素数６〜２２の脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（olesteric acid）及びオレイン酸と脂肪族多価アルコール又はその環無水物とのエステル又は部分エステルである。混合したエステル、例えば天然グリセリドと混合したエステルを使用してもよい。界面活性剤は、組成物重量の０．１〜２０％、好ましくは０．２５〜５％を構成する。組成物の均衡は、通常噴霧剤である。所望により、担体は、鼻腔内送達用にレシチンを含むこともできる。
本発明の別の態様は、活性成分として本明細書で記載した免疫原性ペプチド又はそれをコードする核酸を、免疫原性的有効量で含むワクチンに向けられる。ペプチド又は核酸を、担体に結合させて又は活性ペプチド単位のホモポリマー又はヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主に導入してもよい。そのようなポリマーは、免疫反応の増加という利点を有し、異なるペプチドを使用してポリマーを作成したときには、ウイルス又は腫瘍細胞の異なる抗原決定基と反応する抗体及び／又はＣＴＬを誘導する追加の能力という利点を有する。有用な担体は当該技術分野において周知であり、例えばサイログロブリン、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸、例えばポリ（リジン：グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎コアタンパク質、Ｂ型肝炎組換えワクチンなどが含まれる。ワクチンは、生理学的に耐えられる（許容しうる）希釈剤、例えば水、リン酸緩衝生理的食塩水又は生理的食塩水などを含むことができ、更にアジュバントを含むこともできる。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバンなどのアジュバントは、当該技術分野において周知の物質である。前記したように、本発明のペプチドをＰ3ＣＳＳなどの脂質に結合することにより、ＣＴＬ応答を初回刺激することができる。前記のペプチド組成物を注射、エアロゾル、経口、経皮又はその他の経路で用いて免疫化したとき、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な多量のＣＴＬを産生することによりワクチンに応答し、宿主はその後の感染に対して少なくとも部分的に免疫性になるか又は慢性感染の発達に対して耐性になる。
本発明のペプチドを含むワクチン組成物を、ウイルス感染又はガンが疑われる又はそれらの危険性のある患者に投与し、抗原に対する免疫応答を誘導し、患者自身の免疫応答能力を増強する。そのような量を「免疫原性的有効量」と定義する。この用途においては、正確な量は、患者の健康状態及び体重、投与様式、製剤の性質などに依存するが、通常その範囲は、７０ｋｇの患者あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇ、より一般的には７０ｋｇの患者あたり約１０μｇ〜約５００μｇである。
ある場合においては、本発明のペプチドワクチンと、興味の対象になるウイルス、特にウイルスエンベロープ抗原に反応する中和抗体を誘導するワクチンとを組み合わせることが好ましい。
治療又は免疫化目的には、本発明のペプチドを、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニア又は鶏痘により発現させることができる。このアプローチには、本発明のペプチドをコードする核酸配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使用が含まれる。急性感染若しくは慢性感染した宿主又は感染していない宿主へ導入したとき、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、これにより宿主のＣＴＬ応答を誘導する。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号明細書に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。別のベクターはＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターはStover et al.（Nature 351:456-460（1991））に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明のペプチドの治療的投与又は免疫化に有用な多種のその他のベクター、例えばサルモネラ・チフスベクターなどは、本明細書の記載より当業者に明らかであろう。
１以上の本発明のペプチドをコードする核酸を患者に投与することもできる。このアプローチについては、例えばWolff et al.,Science 247:1465-1468（1990）、米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号明細書に記載されている。
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい方法では、本発明の複数のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のために選択したＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作成するために、エピトープのアミノ酸配列を逆転写する。ヒトコドン用の表を使用して、各アミノ酸のコドン選択を導いた。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列を直接隣接させ、連続的ポリペプチド配列を作成した。発現及び／又は免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子の設計に組み込むことができる。逆転写され、かつミニ遺伝子配列に含まれるアミノ酸配列の例には、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列及び小胞体保存シグナルが含まれる。更に、合成（例えばポリアラニン）又はＣＴＬエピトープに隣接する天然フランキング配列を含むことにより、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示を改善させてもよい。
ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることにより、ミニ遺伝子配列をＤＮＡに転換する。重複オリゴヌクレオチド（長さ３０〜１００塩基）を、周知の技術を使用して適切な条件下で合成し、リン酸化し、精製し、アニールした。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドの末端を結合する。次いでＣＴＬエピトープポリペプチドをコードする合成ミニ遺伝子を、所望の発現ベクターにクローニングする。
当業者に周知の標準的な制御配列をベクターに含ませ、標的細胞における発現を確保する。数種のベクター要素、すなわちミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター、効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル、大腸菌の複製起点及び大腸菌の選択マーカー（例えば、アンピシリン又はカナマイシン耐性）が要求される。この目的に対して、多数のプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。その他の適切なプロモーター配列については、米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号明細書を参照のこと。
ミニ遺伝子の発現及び免疫原性を最適化するために、追加のベクター修飾が要求されてもよい。ある場合においては、効率的な遺伝子発現のために、イントロンが要求され、１以上の合成又は天然イントロンを、ミニ遺伝子の転写領域に組み込むことができる。ミニ遺伝子発現を増加させるために、ｍＲＮＡ安定化配列の包含も考慮することができる。最近、免疫賦活配列（ＩＳＳ又はＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性の役割を果たすことが提唱された。免疫原性を増強させることが見出されるならば、これらの配列をベクター中の配列をコードするミニ遺伝子の外側に含ませることができる。
ある態様においては、ミニ遺伝子にコードされたエピトープ及び免疫原性を増強又は低下させるために含ませる第二のタンパク質の生成を許容する二頭発現ベクターを使用することができる。同時発現する場合、免疫応答を有利に増強させることができるタンパク質又はポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）又は同時刺激分子が含まれる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを、細胞内標的シグナルに結合し、ＣＴＬエピトープとは別々に発現させることができる。これにより、ＨＴＬエピトープをＣＴＬエピトープとは異なる細胞コンパートメント（cell compartment）に向けることが可能になるだろう。所望により、ＭＨＣクラスII経路へのＨＴＬエピトープのより効率的なエントリーを促進し、ＣＴＬ誘導を改善させることができる。ＣＴＬ誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答の特異的減少は、特定の疾患においては有利であるだろう。
発現ベクターを選択したら、ミニ遺伝子をプロモーター下流のポリリンカー領域にクローニングする。このプラスミドで適切な大腸菌株を形質転換し、標準的な技術を用いてＤＮＡを調製する。ミニ遺伝子の配向及びＤＮＡ配列並びにベクターに含まれるその他の要素を、制限マッピング（restriction mapping）及びＤＮＡ配列解析を使用して確認した。正しいプラスミドを有する細菌細胞を、マスターセルバンク（master cell bank）及びワーキングセルバンク（working cell bank）として保存することができる。
プラスミドＤＮＡの治療量は、大腸菌の発酵、続く精製により生成する。ワーキングセル由来のアリコートを使用して、発酵培地（例えばテリフィックブロス（Terrific Broth））に接種し、周知の技術にしたがい振盪フラスコ又はバイオリアクター中で飽和になるまで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、キアゲン（Quiagen）により供給される固相アニオン交換樹脂などの標準的生態分離技術を使用して精製することができる。必要ならば、ゲル電気泳動又はその他の方法を使用してスーパーコイルＤＮＡを開環及び直鎖形態から単離することができる。
種々の製剤を使用しての注射用の精製プラスミドＤＮＡを製造することができる。これらのなかのもっとも単純なものは、滅菌リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。「裸のＤＮＡ」として知られるこのアプローチは、現在、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与に使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫療法的効果を最大にするためには、精製プラスミドＤＮＡを製剤化する代替の方法が望ましいだろう。種々の方法が文献に記載されているが、新技術が利用可能であろう。カチオン性脂質を製剤中で使用することができる（Debs and Zhu（1993）WO93/246640;Mannino and Gould-Fogerite（1988）Bio Techniques 6（7）:682-691;Rose U.S.Pat No.5,279,833;Brigham（1991）WO91/06309;and Felgner et al.（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7414を参照のこと）。更に、糖脂質、融合リポソーム（fusogenic liposome）、ペプチド及び保護性、相互作用的、非縮合的集合物（ＰＩＮＣ）と呼ばれる化合物を、精製プラスミドＤＮＡに合成（complex）し、安定性、筋肉内分散性または特異的器官又は細胞型への輸送に影響を与えることもできる。
例えば、米国特許第５，２０４，２５３号明細書に記載されたようにして、バリスティック送達（ballistic delivery）を使用して核酸を投与することもできる。ＤＮＡのみを含む粒子を投与することもできる。代わりに、ＤＮＡを、金などの粒子に付着させることもできる。
標的細胞の感作を、ミニ遺伝子にコードされたＣＴＬエピトープの発現及びＭＨＣクラスＩ提示の機能的アッセイとして使用することができる。プラスミドＤＮＡを、標準的ＣＴＬクロム放出アッセイの標的として適切な哺乳類細胞系に導入する。使用するトランスフェクション方法は、最終の製剤に依存するだろう。「裸の」ＤＮＡについてはエレクトロポレーションを使用することができるが、カチオン性脂質では直接のインビトロトランスフェクションが可能である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いての感染細胞の濃縮に使用することが可能である。次いで細胞をクロム−５１を用いて標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ系に対する標的細胞として使用する。５１Ｃｒ放出により検出された細胞溶解は、ミニ遺伝子にコードされたＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示の生成を示している。
インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能的試験についての第二のアプローチである。適切なヒトＭＨＣ分子を発現しているトランスジェニックマウスをＤＮＡ産物で免疫化する。投与量及び投与経路は製剤に依存する（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質合成ＤＮＡについてはＩＰ）。免疫化２１日後、脾細胞を収穫し、試験する各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激した。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）を、標準的な技術を使用して、ペプチドをロードしたクロム−５１標識化標的細胞の細胞溶解についてアッセイした。ミニ遺伝子にコードされるエピトープペプチドのＭＨＣによるロードにより感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ誘導に対するＤＮＡワクチンの機能を示している。
更に、抗原性ペプチドを使用して、エキソビボでＣＴＬを誘導してもよい。得られたＣＴＬを使用して、従来型の治療に応答しない文はペプチドワクチンアプローチに応答しない患者の慢性感染（ウイルス性又は細菌性）又は腫瘍を治療することができる。特定の病原体（病原菌又は腫瘍抗原）に対するエキソビボでのＣＴＬ応答を、患者のＣＴＬ前駆体細胞（ＣＴＬｐ）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）源及び適切な免疫原性ペプチドとを組織培養中でインキュベートすることにより誘導する。ＣＴＬｐが活性化され、十分に成長し、エフェクターＣＴＬへ発達するのに適切なインキュベーション時間（通常は１〜４週間）後、細胞を患者に戻す。そこでは、特異的標的細胞（感染細胞又は腫瘍細胞）が破壊されるだろう。
本発明のペプチドは診断薬としての使用が見出されるだろう。例えば、本発明のペプチドを使用して、ペプチド又は関連ペプチドを用いる治療方法に対する特定の個体の感受性を測定してもよい。したがって、現在の治療プロトコルの修飾又は病気に罹った個体の予後の測定において有用であろう。更に、ペプチドを使用して、個体に慢性感染の発生の実質的な危険性があるか否かを予測してもよい。
以下に示す実施例は説明目的で提供するものであり、限定を目的として提供するものではない。
実施例１
クラスＩ抗原の単離を、前記の関連出願の記載のようにして行った。天然に処理されたペプチドを、前記のようにして単離し、配列決定した。対立遺伝子特異的モチーフ及びアルゴリズムを決定し、定量的結合アッセイを行った。
前記で同定したＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子に対するモチーフを用いて、種々の抗原性タンパク質に由来するアミノ酸配列を、これらのモチーフの存在について分析した。表３はこれらの調査結果の結果を示している。結合親和性は、関連出願に記載されたアッセイにおける標準ペプチドと比較しての結合の百分率として表現した。
前記の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明のその他の変形は、当業者に容易に理解され、これらは請求の範囲に含まれる。本明細書において引用したすべての刊行物、特許及び特許出願は参照することにより本発明に組み込まれる。
0004210735.tif 000005
0004210735.tif 000006