(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンとコラーゲンとの架橋複合体をポリエチレングリコールのカルボキシル末端に２個以上のスクシンイミジル基を有する多官能性架橋剤を用いて製造する方法において、
リン酸緩衝液中に１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度範囲で架橋前に細胞をあらかじめ混合しておき、ｐＨ７．０〜８．０、２５〜３７℃、濃度０．１〜０．２ＭのＮａＣｌを含んだ該リン酸緩衝液中でグリコサミノグリカンとコラーゲンとを混合し、架橋剤濃度０．３〜３ｍＭで架橋することによって、生理的条件下でポリイオンコンプレックスを形成せず、均一な混合溶液中で架橋形成を行ない、生きた状態で細胞を内包する組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−コラーゲン複合体を合成することを特徴とするグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造法。
【請求項２】
前記複合体は、含水率が９０〜９９重量％のゲルであることを特徴とする請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多官能性架橋剤によって架橋形成した軟骨などの組織再生マトリックス用材料であるグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
関節軟骨は、一度損傷を受けると非常に再生が困難な生体組織であることが知られている。老化やスポーツ傷害によって引き起こされる変形性関節症の患者は、世界全体で約１０００万人（国内で約１２０万人）と言われており、軟骨を再生させるための材料開発が強く望まれている。従来、軟骨組織の主成分であるグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸：ＨｙＡまたはコンドロイチン硫酸：ＣｈＳ）とポリカチオン（コラーゲン：Ｃｏｌ）からなる複合体の調製は、ポリイオンコンプレックスを化学架橋する方法が採られていた。
【０００３】
このような架橋生成物は、特開平８−３４７４７号公報、特開平８−５３５４８号公報、特表平８−５０２０８２公報、特開平９−２４９７５１公報、特表平１０−５０１７０６公報、特表平１１−５０９２５６公報、特表２０００−５０１９７５公報、特表２０００−５０２３８０公報などに開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の特開平９−２４９７５１公報、特開平８−３４７４７号公報、特表２０００−５０１９７５公報などに開示されている方法では、アルコール中あるいは水中で架橋反応を行うため、注入可能な架橋生体物質組成物は、細胞および組織への悪影響（細胞死）が考えられる。そのためこのような問題を回避できる架橋方法が求められている。
【０００５】
特表平１０−５０１７０６公報には、架橋形成したゲルに細胞を内包することが可能であると記載されている。しかしながら、水中では、浸透圧の違いにより細胞（膜）は破壊されてしまう。また、上述のように、コラーゲンとグリコサミノグリカンを水中で共存させることは不可能なため、細胞を入れることも不可能である。
【０００６】
また、特開平９−２４９７５１公報には、コラーゲンとグリコサミノグリカンを多官能性架橋剤で架橋可能との内容が記載されているが、コラーゲンとグリコサミノグリカンは水溶液中では、コラーゲンのプラスチャージとグリコサミノグリカンのマイナスチャージによってポリイオンコンプレックス（不均一な沈殿）を形成するので現実的には不可能である。したがって、ポリイオンコンプレックスを形成しない架橋方法が求められている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、関節軟骨の細胞外マトリックスの主成分であるポリカチオンとグリコサミノグリカンとの新規な架橋複合体の製造法を提供する。
【０００８】
すなわち、本発明は、グリコサミノグリカンとコラーゲンとの架橋複合体をポリエチレングリコールのカルボキシル末端に２個以上のスクシンイミジル基を有する多官能性架橋剤を用いて製造する方法において、リン酸緩衝液中に１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度範囲で架橋前に細胞をあらかじめ混合しておき、ｐＨ７．０〜８．０、２５〜３７℃、濃度０．１〜０．２ＭのＮａＣｌを含んだ該リン酸緩衝液中でグリコサミノグリカンとコラーゲンとを混合し、架橋剤濃度０．３〜３ｍＭで架橋することによって、生理的条件下でポリイオンコンプレックスを形成せず、均一な混合溶液中で架橋形成を行ない、生きた状態で細胞を内包する組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−コラーゲン複合体を合成することを特徴とするグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造法である。
【０００９】
また、本発明は、前記複合体は、含水率が９０〜９９重量％のゲルであることを特徴とする上記の製造法である。
【００１０】
本発明の製造法によれば、生理的条件、すなわち、ｐＨ７．０−８．０、２５〜３７℃、濃度０．１−０．２ＭのＮａＣｌの条件下のリン酸緩衝液中で合成反応を行うことができるため、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度範囲で細胞を架橋前にあらかじめ混合しておき、架橋反応を行うことが可能である。生理的ｐＨおよび塩濃度を含んだ溶液中で架橋反応することで細胞を生きた状態でゲル内に内包することが可能となる。必要に応じて生体中に含まれる他のイオン、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、カリウムイオンを添加することも可能である。細胞を混合する際のコラーゲンあるいはＧＡＧの濃度は、０．５〜５ｗｔ％が好ましい。
【００１１】
このことは、患部の形状（例えば、欠損した軟骨の形）をしたコラーゲンとグリコサミノグリカンと細胞との複合体からなる組織体（生体組織様構造を持った人工物）を作ることが可能であることを意味する。また、本発明の製造法で用いる架橋剤は、細胞毒性が低いため、得られた複合体は、注射器で生体内の骨、軟骨、髄核等に注入する細胞を生きた状態で内包する組織再生マトリックス用材料としても使用できる。
【００１２】
本発明の架橋複合体は、架橋密度の制御が容易であり、含水率：９０〜９９重量％であり、コラゲナーゼで分解し、軟骨、髄核、肝臓、血管の組織再生材料として優れた物性を有している。特に、グリコサミノグリカン／ポリカチオンが５０／５０〜１／９９重量比の時に軟骨に極めて類似した物性を示す。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の合成法で使用する架橋剤の求電子性脱離基は、例えば、スクシンイミジル基、スルホスクシンイミジル基またはそれらの誘導体である。これらの架橋剤としては、ペンタエリトリトールをベースとした４官能性架橋剤、エチレングリコールベースの２官能性架橋剤、グリセリンベースの３官能性架橋剤、ヘキサグリセリンベースの８官能性架橋剤等が挙げられる。ポリエチレングリコールの分子量は、１０００以上のものが好ましいが、特に限定されない。
【００１４】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（種類によらない）と複合するポリカチオンには、コラーゲン（数１０種類のタイプによらない）およびその誘導体、コラーゲンの変性体であるゼラチン（分子量によらない）、ポリリジン（分子量によらない）、キトサン（脱アセチル化度、分子量によらない）等アミノ基を有する高分子が含まれる。コラーゲンは、アテロ化したもの（コラーゲン末端のテロペプチド部分を除去したもの）を用いる方が望ましい。
【００１５】
以下、下記の化学式で示されるポリエチレングリコールのカルボキシル末端にスクシンイミジル基を有する４官能性架橋剤（Pentaerythritol polyethyleneglyco ether tetrasuccinimidyl glutarate ）についてさらに詳しく説明する。スクシンイミジル基は、ｐＨ７以上においてエステルの加水分解が進行するため、生理的条件下で架橋反応を行うことができる。
【００１６】
【化１】
0004230135.tif 000002
【００１７】
ポリエチレングリコールのカルボキシル末端がスクシンイミジル化されたカルボキシル基は、ｐＨ７以上の雰囲気下においてスクシンイミジル基が脱離する。スクシンイミジル基が脱離したカルボキシル基は、コラーゲンあるいはＧＡＧの水酸基あるいはアミノ基と反応し、コラーゲンおよびＧＡＧの分子間、分子内の架橋を行いゲルを形成する。
【００１８】
コラーゲンとＧＡＧを含有するゲルの合成を行う場合、コラーゲンとＧＡＧは、それぞれの水溶液を混合すると、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。均一なコラーゲン−ＧＡＧを含有するゲルを合成するには、ＰＩＣを形成しない条件下で架橋を行う必要がある。コラーゲンの良溶媒であるリン酸イオンを含む溶液でｐＨ７．４の緩衝液を調製し、グリコサミノグリカンと混合すると、この条件ではコラーゲンとグリコサミノグリカンはポリイオンコンプレックスを形成せず、均一な混合溶液が得られる。
【００１９】
図１には、上記の架橋剤でＩＩ型コラーゲンを種々のｐＨで架橋した後の膨潤度（＝（ゲル中の水の重量）／（ゲルの乾燥重量))を示す。なお、膨潤度＝含水率／（１００−含水率）で示される。架橋剤の濃度が増加すると膨潤度が小さくなっていくことから、架橋が進んでいることが分かる。しかしながら、架橋剤の添加量が３ｍＭ以上になるとコラーゲンの析出により不均一なゲルとなり好ましくない。よって、好ましい架橋剤濃度は０．３〜３ｍＭである。均一なゲルであれば膨潤度は特に限定されない。
【００２０】
ｐＨの影響は、架橋剤が低濃度（０．３ｍＭ）の際には認められるが、それ以外の条件では認められない。ゲル形成反応は、４℃では３０分程度かかるのに対し、２５℃、３７℃では、５分以内に終了する。したがって、ゲル形成反応温度は２５〜３７℃が好ましい。
【００２１】
図２は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に種々の濃度の塩を添加し、コラーゲンとヒアルロン酸（Ｃｏｌ／ＨｙＡ＝１：１）およびコラーゲンとコンドロイチン硫酸（Ｃｏｌ／ＣｈＳ＝１：１）を架橋した場合の生成物の透過率を調べた結果を示している。ｐＨ７．４の条件では、どの塩濃度でもＰＩＣ形成は認められないことが分かった。すなわち、このことは、生理的条件下で反応を進めることが可能であること、つまり、細胞を架橋前にあらかじめ混合しておき、架橋反応を行うことが可能であることを意味する。
【００２２】
なお、透過率測定は、分光光度計によって５００ｎｍの光の透過率を調べることで行った。透過率１００％ということは、光が完全に透過することで、均一で透明な液体であることを示す。０％では光が全く透過しないということで、ポリイオンコンプレックスのような沈殿が形成されていることを意味する。水中でコラーゲンとグリコサミノグリカンを混合するとポリイオンコンプレックスが形成されて透過率が０％になるが、リン酸イオンを含んだ緩衝溶液中で混合すると混合溶液の透過率がほぼ１００％であることから均一に混合していることが分かる。透過率のデータは、生理的ｐＨに加え、生理的塩濃度でも均一な混合溶液が得られることを示している。
【００２３】
コラ一ゲン単独の場合と同様に、ＧＡＧを添加した系でも０．３〜１０ｍＭの範囲でゲルが得られ（ＨｙＡは０．１〜１０ｍＭ）、添加する架橋剤の濃度の増加に伴い、膨潤度は減少する。しかしながら、コラーゲン単独の場合と同様、架橋剤の添加量が３ｍＭ以上になるとコラーゲンの析出により不均一なゲルとなり好ましくない。ゲル形成反応は、コラーゲン−ＧＡＧの場合も３７℃では５分以内で終了する。
【００２４】
【実施例】
参考例１
ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液（４℃）に塩を添加し、生理的条件下（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）とし、ＩＩ型コラーゲン＋１０ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨｙＡ）を溶解し、その後、１．０ｍＭの濃度の架橋剤を添加した。架橋剤として、ポリエチレングリコール（ユニット数ｎ＝５６）のカルボキシル末端にスクシンイミジル基を持つペンタエリトリトールベースの４官能性ポリエチレングリコールを使用した。
【００２５】
十分攪拌後、脱泡し、３７℃の温水中で１８時間かけて架橋反応を行ったところ、コラーゲンとヒアルロン酸を含有するゲルが合成された。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度（＝（ゲル中の水の重量）／（ゲルの乾燥重量))は１０８．８であった。ＰＩＣ形成は認められなかった。
【００２６】
参考例２
架橋剤の濃度を０．３ｍＭとした以外は参考例１と同様に合成を行った。参考例１と同様のゲルが得られた。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度は１７７．６であった。
【００２７】
参考例３
架橋剤の濃度を３ｍＭとした以外は参考例１と同様に合成を行った。参考例１と同様のゲルが得られた。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度は８３．８であった。
【００２８】
参考例４
ヒアルロン酸の代わりにコンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）を用い、１．０ｍＭの濃度の架橋剤を添加した以外参考例１と同様に合成を行った。参考例１と同様のゲルが得られた。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度は９５．６であった。
【００２９】
参考例５
架橋剤の濃度を０．３ｍＭとした以外は参考例４と同様に合成を行った。参考例１と同様のゲルが得られた。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度は１１０．７であった。
【００３０】
比較例１
１ｍＭの濃度の架橋剤を添加した以外は参考例４と同様に架橋反応を行った。架橋剤の濃度が低いためゲルが形成されなかった。
【００３１】
比較例２
１０ｍＭの濃度の架橋剤を添加した以外は参考例１と同様に架橋反応を行った。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度は２２．１であった。各参考例と比較して架橋剤の濃度が高いため架橋剤中のポリエチレングリコール鎖の影響でコラーゲンが析出・沈殿し、不均一なゲルになった。
【００３２】
図３に、参考例１〜５および比較例１、２により得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度を示すように、架橋剤濃度が高くなるにつれ膨潤度が小さくなることが分かる。
【００３３】
実施例１
参考例１と同様に、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液（４℃）に塩を添加し、生理的条件下とし、ＩＩ型コラーゲン＋１０ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨｙＡ）を溶解し、軟骨細胞を架橋前にあらかじめ混合して、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように調整した軟骨細胞−コラーゲン−ヒアルロン酸の混合溶液（ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）にペンタエリトリトールベースの４官能性架橋剤を入れ、３７℃で１０分間インキュベートした。その結果の写真を図４に示す。写真中の丸いものが全てゲル中に内包した軟骨細胞である。軟骨細胞は、コラーゲン−ヒアルロン酸ゲル中に均一に分散しており、軟骨細胞特有の丸い形態をしていることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ポリエチレングリコールのカルボキシル末端にスクシンイミジル基を有する四官能性架橋剤でＩＩ型コラーゲンを種々のｐＨで架橋した後の膨潤度を示すグラフである。
【図２】図２は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に種々の濃度の塩を添加した場合の透過率を示すグラフである。
【図３】図３は、参考例１〜５および比較例１、２により得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤度を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例１により得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスに内包された軟骨細胞を示す図面代用写真である。
【図１】
0004230135.tif 000003
【図２】
0004230135.tif 000004
【図３】
0004230135.tif 000005
【図４】
0004230135.tif 000006