(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）５日〜６０日間で、海水で維持され、該海水の塩分をゆるやかにまたは段階を追って減少させるとともに、ＮａＣｌ食餌の供給に海水魚であるフラウンダーを供する工程；
ｂ）少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの、発現をモジュレートするか、もしくは維持する、および／またはその感受性を改変するのに十分な量で、淡水に添加する工程；
ｃ）工程ａ）を経たフラウンダーを、工程ｂ）により改変された淡水に移す工程；ならびに
ｄ）魚が摂取するための飼料を、
５ｍＭのカルシウムイオン及び８ｍＭのマグネシウムイオンを添加した淡水で１．２重量％のＮａＣｌを含む餌を与える条件に基づいて、
工程ｂ）により改変された淡水に添加する工程
を含む、
淡水において海水魚を成長させる方法。
（ただし、前記飼料は、海水魚の血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む。）
【請求項２】
ＰＶＣＲモジュレーターが、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、Ｉ型カルシミメティック、ＩＩ型カルシミメティック、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカイン、およびマクロファージ走化性ペプチド−１からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）により改変された淡水のｐＨが７．０より大きい請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2000年10月12日に出願された出願第09/687,373号の一部継続出願である。上記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
海水魚の成長は、一般的に、海岸領域(costal region) または海水タンクに限られたものである。しかしながら、多くの淡水帯水層が、例えば中西部にいる海水魚の飼育のための潜在的な環境として存在する。これまで、淡水中で海水魚を成長させる試みは、成功していない。
【０００３】
淡水中で海水魚を成長させることは、非海岸領域で海水魚を飼育する機会を提供するであろう。淡水中で海水魚を成長させる能力は、これらの領域に新鮮な魚および経済的な成長を提供しうる。
【０００４】
したがって、海水魚を淡水に適合することが可能であるかどうかを決定し、もし可能であるなら、海水魚を淡水に適合することを可能にする生物学的メカニズムを理解する必要性が存在する。特に、淡水において海水魚を成長させる必要性が存在する。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、多価カチオン感受性レセプター(PVCR)と呼ばれるレセプターの発現を増大または維持することによる、淡水において海水魚を成長させる方法に関する。海水魚を少なくとも１つのPVCRのモジュレーターに供することにより、PVCRの発現および／または感受性がモジュレートもしくは維持される。海水魚は、モジュレーターが淡水環境に、および任意に飼料に添加される場合、モジュレーターに供される。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、５日〜６０日間で、海水で維持され、該海水の塩分におけるゆるやかなまたは段階を追って減少させるとともに、ＮａＣｌ食餌の供給に海水魚であるフラウンダーを供する工程、
少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの、発現をモジュレートするか、もしくは維持する、および／またはその感受性を改変するのに十分な量で、淡水に添加する工程、前記工程を経たフラウンダーを、前記工程により改変された淡水に移す工程；
ならびに魚が摂取するための飼料を、５ｍＭのカルシウムイオン及び８ｍＭのマグネシウムイオンを有する淡水で１．２重量％のＮａＣｌを含む餌を与える条件に基づいて、工程ｂ）により改変された淡水に添加する工程を含む、淡水において海水魚を成長させる方法に関する。ただし、前記飼料は、海水魚の血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む。
本発明に有用なＰＶＣＲモジュレーターとしては、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、Ｉ型カルシミメティック（Ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃ）、ＩＩ型カルシミメティック、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカイン、およびマクロファージ走化性ペプチド−１が挙げられる。本発明の方法に適切な飼料は、少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含み、任意にＰＶＣＲモジュレーターを含みうる。
【０００７】
本発明はまた、５日〜６０日間で、海水で維持された、海水魚であるフラウンダーを、該海水の塩分におけるゆるやかなまたは段階を追った減少させるとともに、ＮａＣｌ食餌の供給に該フラウンダーを供する工程、少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの、発現をモジュレートするか、もしくは維持する、および／またはその感受性を改変するのに十分な量で、淡水に添加する工程、前記工程を経たフラウンダーを、前記工程により改変された淡水に移す工程、少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程を含む、淡水に海水魚を移す方法を包含する。ＰＶＣＲモジュレーターは、ＰＶＣＲアゴニスト、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオンまたはアミノ酸でありうる。
【０００９】
本発明はまた、約0.3mM〜約10.0mMのカルシウムおよび約0.5mM 〜10.0mMのマグネシウムを有する淡水において海水魚を成長させる方法に関する。本方法は、海水魚の血清において該PVCRモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するために十分な量のNaClを含む飼料を淡水に添加する工程を含み、ここで少なくとも１つのPVCRのモジュレートされるまたは維持される発現は１つ以上の組織においてモジュレートまたは維持される。
【００１１】
淡水のｐＨは、７．０より大きいであろう。
【００１４】
驚くべきことに、PVCRのモジュレートされるか、もしくは維持される発現および／またはPVCRの感受性の改変により、これらの海水魚が淡水中で生存し、かつ成長することが可能になることが発見された。本発明の発見まで、水産養殖業では、魚をストレス、死および／または疾患に供すること無しには、海水魚を淡水に移すことは不可能であった。この慣例とは異なって、本発明の工程の実施は、PVCRの発現をモジュレートするか、もしくは維持し、および／またはPVCRの感受性を改変し、海水魚を、ストレス、死および／または疾患が最小でまたはそれら無しで淡水に移すのを可能にし、かつ予期しないことに、魚は成長する。実際、淡水で成長する海水魚は、より高い脂肪含量、および穏やかな、「魚くささ」が少ない味を有する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、淡水において海水魚を成長させるまたは飼育する方法に関する。本方法は、多価カチオン感受性レセプター(PVCR)（例えば、少なくとも１つのPVCR）の発現をモジュレートするか、もしくは維持するおよび／またはその感受性を改変することを含む。本発明は、淡水に適合する魚の能力に影響を与えるPVCRの発現をモジュレートするか、または維持することに関する。
【００１６】
特に、本発明の方法は、少なくとも１つのPVCRモジュレーターを淡水に添加する工程、および魚による消費のために特別に作製されたか、または改変された飼料を淡水に添加する工程を含む。飼料は、血清におけるPVCRモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するのに十分な量の塩化ナトリウム(NaCl)（例えば、約1重量％〜約10重量％、または約10,000mg/kg 〜約100,000mg/kg）を含む。飼料におけるNaClのこの量は、海水魚がより多くの淡水を飲むことを引き起こすか、または誘導する。淡水はPVCRモジュレーターを含み、魚はその増大された量を摂取するので、PVCRモジュレーターの血清レベルは魚において有意に増大し、増大したもしくは維持されたPVCR発現および／または改変されたPVCR感受性を引き起こす。「有意な」増大は、対照または参照と比較したPVCRまたはRVCRモジュレーターのレベルまたは量における測定可能な増大のことを言うために本明細書で使用される。PVCRまたはPVCRモジュレーターにおける有意な増大を測定するか、または検出する方法は、本明細書に開示され、当業者に公知である。
【００１７】
本発明の方法は、海水魚を淡水に適合させることに関する。海水魚は、海水で生活する、少なくともその成体の一生のほとんどを海水中で生活する魚である。海水魚としては、例えば、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウインターフラウンダー、およびサマーフラウンダーが挙げられる。海水魚は、PVCRモジュレーターを有する淡水に順応される。
【００１８】
用語「海水魚」は、当業者により理解される。用語「淡水」は、例えば、小川、河川、池、公共の吸水設備に由来する水、または例えば、以下のイオン組成：約2mM 未満のマグネシウム、カルシウムおよびNaClを有する他の非海水供給源に由来する水を意味する。「改変された淡水」、「PVCRの添加により改変された淡水」および「PVCRモジュレーター環境」という熟語は、本明細書で記載される場合、少なくとも１つのPVCRモジュレーターが添加されている淡水のことを言う。
【００１９】
PVCRモジュレーターは、少なくとも１つのPVCRの発現をモジュレートするか、もしくは維持するか、またはその感度を改変するのに十分な量で、淡水に添加される。PVCRは、いくつかの型の海水魚の種々の組織から、分子生物学的技術を用いて単離されている。例えば、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウインターフラウンダーおよびサマーフラウンダーを含む様々な種の海水魚由来の組織試料から、核酸が単離された。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いて増幅された。実施例４に記載するように、増幅DNA を精製し、ベクターにサブクローン化し、その配列を決定した。
【００２０】
PVCRは、海水魚の種々の組織（例えば、鰓、皮、腸、腎臓、膀胱、脳または筋肉）に位置し、例えば、周囲の水中、それらの血清中または腎臓、膀胱または腸などの体内部の細管の管腔内容物中の種々のイオン（例えば、二価カチオン）を含むPVCRモジュレーターにおける改変を感じとる。PVCRモジュレーターを感じとる能力は、PVCRの発現におけるモジュレーションまたは維持を生じ、それにより魚を淡水により良好に順応することを可能にする。PVCRのモジュレートされたまたは維持された発現は、例えば、１つ以上の組織において生じうる。本明細書で使用される場合、PVCRの「感受性」は、PVCRモジュレーターの濃度における変化に応答したPVCR発現の改変のことを言う。PVCR発現は、標準法による試料におけるPVCRポリペプチドまたは核酸分子を測定するか、または検出することにより、評価されうる。
【００２１】
「PVCRモジュレーター」は、PVCRの発現をモジュレートする、またはPVCRの感受性もしくは応答性をモジュレートする、または１つ以上の組織においてすでに増大したPVCRの発現レベルを維持する化合物を意味すると、本明細書で規定される。かかる化合物としては、PVCRアゴニスト（例えば、無機ポリカチオン、有機ポリカチオンおよびアミノ酸）、II型カルシミメティックス(calcimimetics)、および間接的にPVCR発現を改変する化合物（例えば、約3,000 〜10,000国際単位／kg飼料の濃度の1,25ジヒドロキシビタミンD ）、インターロイキンβなどのサイトカイン、ならびにマクロファージ走化性ペプチド-1(MCP-1))が挙げられるが、これらに限定されない。PVCRの発現および／または感受性をモジュレートするII型カルシミメティックスの例としては、例えば、NPSPharmaceutical Inc.,のNPS-R-467 およびNPS-R-568 (Salt Lake, Utah, Patent Nos.5,962,314 ；5,763,569 ；5,858,684 ；5,981,599 ；6,001,884)であり、それは約0.1 μM 〜約100 μM の濃度の飼料または水で投与されうる。Nemeth,E.F.ら、PNAS 95:4040-4045(1998) を参照。
【００２２】
無機ポリカチオンの例は、約0.3〜約10.0mMの濃度のカルシウムおよび約0.5 〜約10.0mMの濃度のマグネシウムが挙げられる二価カチオン；および限定されないが、約1 〜約500 μM の濃度のガドリニウム(Gd3+)が挙げられる三価カチオンである。
【００２３】
有機ポリカチオンとしては、限定されないが、約1 〜約8gm/kg飼料の濃度のネオマイシンまたはゲンタマイシンなどのアミノグリコシド、ならびにポリアミンを含む有機ポリカチオン（例えば、約10μM〜10mM飼料の濃度のポリアルギニン、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、スペルミン、カダベリン、プトリシン(putricine) 、ポリ  アルギニン／ヒスチジンのコポリマー、ポリ  リジン／アルギニンのコポリマー）が挙げられる。Brown,E.M.ら、Endocrinology128: 3047-3054(1991); Quinn,S.J.ら、Am. J. Physiol. 273: C1315-1323(1997) を参照。
【００２４】
さらに、PVCRアゴニストとしては、約1〜約10gm/kg 飼料の濃度のL-トリプトファン、L-チロシン、L-フェニルアラニン、L-アラニン、L-セリン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-ロイシン、L-イソロイシンおよびL-シスチンなどのアミノ酸が挙げられる。Conigrave,A.D. ら、PNAS 97: 4814-4819(2000)を参照。モル濃度は、淡水中のPVCRモジュレーターの遊離またはイオン化した濃度のことを言い、結合したPVCRモジュレーター（例えば、ガラス、タンパク質、またはプラスチック表面を含む陰性帯電した粒子に結合したPVCRモジュレーター）の量を含まない。これらのモジュレーターの任意の組合せが、その組合せが少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持する限り、水または飼料に（本明細書に記載のNaClに加えて）添加されうる。
【００２５】
PVCRモジュレーターは、多数の方法で魚に投与されうる。本発明は、PVCRの発現をモジュレートするか、もしくは維持するおよび／またはその感受性を改変するのに十分な、任意の方法でのPVCRの投与を包含する。１つの態様において、PVCRモジュレーターは、本明細書に記載のように単純に淡水に添加される。水に添加されるPVCRモジュレーターは、魚の皮および鰓でのPVCRの発現を増大するか、もしくは維持するか、もしくは減少するおよび／またはその感度を改変し、特に魚が約1％〜約10％NaCl（例えば、約 1〜約10gm/100gm飼料の濃度）を有する飼料を与えられる場合に魚により摂取されうる。飼料へのNaClの添加に加えて、PVCRモジュレーターがまた飼料に添加されうる。飼料に添加されるPVCRモジュレーターの量および型もまた、本明細書に記載される。他の態様は、モジュレーター、例えば有機ポリカチオン中に魚を「浸す」ことにより、魚をPVCRモジュレーターに供することを含む。有機ポリカチオンは、PVCRの発現を増大するか、または維持するのに十分な量でポリカチオンが魚の皮膚および鰓に付着するのを可能にする方法で、処方されうる。
【００２６】
本発明はまた、魚の淡水環境中および血清中に存在するPVCRモジュレーターの量を評価することを包含する。PVCRモジュレーターは、当該分野で公知の方法を用いて評価または測定される。評価後、PVCRモジュレーターが水に添加され、少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量までの濃度がもたらされるか、あるいは規定された範囲内のPVCRモジュレーターの濃度がもたらされるのに十分な量までの濃度がもたらされる。例えば、わずか0.2mMのカルシウムを有すると評価される帯水層は、約0.3mM 〜約10.0mMまでの濃度をもたらすために、さらなるカルシウムを必要とする。
【００２７】
好ましい態様において、本発明は、淡水に２つのPVCRアゴニストの組合せを添加することにより実施される。特に、それぞれ約0.3mM 〜約10.0mMのカルシウム濃度および約0.5mM〜約10.0mMのマグネシウム濃度をもたらすために、カルシウムおよびマグネシウムが淡水に添加される。水へのカルシウムおよびマグネシウムの添加に加えて、イオン濃度のこれらの範囲は、魚に対して淡海水（例えば、希釈した海水）環境を提供することにより達成されうる。
【００２８】
カルシウムおよびマグネシウムは、種々の供給源由来であり得、水に添加された場合、カルシウムおよび／またはマグネシウムレベルは、PVCRの発現をモジュレートするか、もしくは維持する、および／または規定された範囲内である。カルシウムおよびマグネシウムの供給源は、種々の化合物の混合物であり得、またはそれぞれが実質的に均一または純粋な化合物に由来しうる。カルシウムの供給源としては、例えば、Ca(CO3)2、CaCl2およびCaSO4 が挙げられ、マグネシウムの供給源としては、例えば、MgCl2 、MgSO4、MgBr2 、およびMgCO3 が挙げられる。
【００２９】
１つの態様において、本発明は、NaCl食餌と同時に、少なくとも１つのPVCRモジュレーターを有する淡水への曝露を断続する（例えば、中断する）こと、ならびに継続する（例えば、中断しない）こと含む。PVCR発現および／または改変した感受性がモジュレートまたは維持されたままである限り、PVCRへの断続曝露が生じうる。少なくとも１つのPVCRモジュレーターを有する淡水中における連続した維持または淡水への曝露が、実施例２に示される。
【００３０】
海水魚は海水から移される。用語「海水」は、海に由来する水、または海に由来する水の化学組成および無機物組成に似せて処方されている水である。調製された海水の主な元素組成は、好ましくは天然の海水の主な元素組成の実質的に範囲内にある（例えば、以下のイオン組成を有する：30mMより多いマグネシウム、約6mM より多いカルシウム、および約300mM より多いNaCl）。人工海水を調製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第5,351,651号明細書に記載されている。
【００３１】
１つの態様において、海水魚は、淡水に移す前の一定期間、塩分におけるゆるやかなまたは段階を追った減少と同時のNaCl食餌の供給に魚を供することによる本発明の方法により処置される。塩分は、水中のイオン濃度（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびナトリウム）のことを言う。魚は、減少する塩分環境中に少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性をモジュレートするか、または維持するのに十分な期間維持される。淡水に移す前に減少した塩分に魚を維持する時間の長さに影響を与えうる因子としては、限定されないが、魚の大きさ、もしあれば淡水へのPVCRモジュレーターの添加前のPVCR発現または感受性のレベル、PVCRモジュレーターおよびイオンを排出する魚の能力、ならびに魚の表面と容量との比が挙げられる。それゆえ、魚が維持される時間の長さは約5日〜約60日、好ましくは約10日〜約25日の範囲でありうる。
【００３２】
海水のイオン濃度は、約10％〜約90％、好ましくは約25％〜約50％減少される。減少した塩分と塩分への種々の長さの曝露との組合せが、本発明により包含される。例えば、実施例２に記載されるように、魚は、淡水に移す前に50％海水（海水の50％の塩分）に10日間順応され、次いで25％海水（海水の25％の塩分）に15日間適合された。本明細書で使用される「順応」は、改変した水環境への成功した移行のことを言う。海水と比較して減少した塩分を有する水中での維持の後、次いで本明細書に記載のPVCRモジュレーターを有する淡水に海水魚を置く。魚は、PVCRの発現および／または感受性がモジュレートされるか、もしくは維持される限り、無期限にPVCRモジュレーターの添加により改変された淡水中に残り、成長しうる（例えば、改変された淡水中で維持され、NaCl食餌を与えられる）。
【００３３】
本発明は、さらに淡水に飼料を添加することを含む。魚に与えられる飼料の頻度および量は、当該分野に教示されている。一般的に、魚は 1日に 1〜3 回、総計約0.25〜0.5 ％体重／日の飼料を与えられる。飼料は、海水魚の血清におけるPVCRモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するのに寄与するのに十分なNaClを有する。特に、飼料中の十分な量のNaClの存在は、海水魚に周囲環境由来のより多くの水を飲ませる。NaClはPVCR感受性を減少するが、少なくとも１つのPVCRモジュレーターを有する淡水の摂取は、PVCRモジュレーターの血清レベルにおける全般的な増大を生じる。PVCRモジュレーターの血清レベルにおける増大は、PVCRの発現におけるモジュレーションを生じる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、海水魚を淡水に移すための環境を提供するための、少なくとも１つのPVCRモジュレーターを含有する水性混合物に関する。「水性混合物」は、本発明の方法による淡水への海水魚の首尾よい移行のための適切な環境を提供する組成物を意味すると本明細書において規定される。水性混合物は、本発明の方法における即座の使用のために使用前に混合されうる。代替的には、水性混合物は、水での再構築を必要としうる。水性混合物は、再構築された時に、約0.3〜10mMのCa2+および約0.5 〜10mMのMg2+を含有する溶液を与える。水性混合物は、約1gm/kg〜約10gm/kgの量のアミノ酸を任意に含みうる。
【００３５】
本発明はまた、水性食料組成物に関する。「水性食料組成物」は、本明細書に記載される場合、魚飼料のことを言う。本発明における使用に適切な水性食料組成物または飼料は、約 1重量％〜10重量％のNaCl、または約10,000mg NaCl ／kgの飼料〜約100,000mg NaCl／kgの飼料（例えば、12,000mg/kg）を含む。飼料は、本明細書において「NaCl食餌」と呼ばれる。NaClは、PVCR発現をモジュレートまたは維持する、PVCR感受性を改変するおよび／または魚がより多く飲むことを誘導する所望の効果を与えるために、他のナトリウム塩と組み合わされうる。よって、本明細書で使用される場合、用語NaClは、実質的に純粋な化合物、ナトリウムの他の供給源とNaClとの混合物またはナトリウムの他の供給源を含む。飼料はさらにPVCRモジュレーター、特にアミノ酸などのPVCRアゴニストを含みうる。１つの態様において、飼料は、約1重量％〜10重量％のNaClおよび約 1〜約10gm/kg の量のトリプトファンなどのアミノ酸を有する。この態様は、本明細書において「APS プロセスII」と呼ばれ、実施例２でさらに規定される。
【００３６】
飼料は、適当な濃度のNaClが存在する限り、多数の方法で作製されうる。飼料は、例えば、飼料を再処方することにより、または飼料がNaClを有する溶液を吸収することを可能にし、および任意にPVCRモジュレーターを添加することにより、作製されうる。さらに、トップドレシング(topdressing)が嗜好性のために添加されうる。実施例３は、飼料を作製するための１つの方法を詳細に記載する。魚飼料を調製する代替的な方法は、当業者に公知である。
【００３７】
本発明の別の態様は、約0.3〜約10.0mMのカルシウムおよび約 0.5mM〜約10.0mMのマグネシウムを有する淡水環境に魚が維持される場合、 1重量％〜10重量％のNaClを有する飼料を海水魚に与えることを含む。本発明のこの態様が行われる場合、海水魚の血清中のカルシウム、マグネシウムおよび／またはナトリウムのレベルは、淡水魚において見られるPVCR発現および／または感受性と比較して、増大される。
【００３８】
別の態様において、海水と比較して減少した塩分を有する水中にあるか、またはPVCRモジュレーターを有する淡水中にある魚はまた、光周期に曝露される。光周期は、魚を光（例えば、日光、白熱光、または蛍光）に曝露することを言う。好ましくは、光周期は、実質的に連続であるか、または成長を増大するのに十分な長さを生じる。光周期は、24時間の間隔内で少なくとも約12時間で、または約14、16、18、20、22、もしくは好ましくは約24時間などのより長い期間で生じうる。
【００３９】
本発明の方法は、海水魚におけるPVCRの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持し、それは低減された浸透性ストレスおよび低減された死亡率を生じる。本発明の方法により淡水中で養殖された海水魚は、飼料を摂取し、成長を示す。対照的に、本発明の方法により淡水中で養殖されていない海水魚は、浸透性ストレス、低減されたもしくは全くない食料摂取、および結果として起こる死を経験する。浸透性ストレスは、周囲環境と魚の体区画との間の浸透圧における差異から生じる。これは、魚のホメオスタシス平衡を乱し、減少した成長、再現される衰え、および疾患に対する低減された耐性を生じる。本発明の工程を受けた魚は、有意な量の浸透性ストレスを経験しない。結果として、魚は成長しうる。驚くべきことに、本明細書に記載され、例示されるように、本発明により適合される海水魚は、海水に維持した海水魚とほとんど同様に成長する（例えば、海水に37日間維持した魚の60％の増大した成長と比較して、本発明に37日間供した魚における53％の増大した成長）。さらに、本発明の方法により淡水中で養殖した海水魚は、淡水に直接移され、かつ本発明の工程に供されていない海水魚の生存率によりも有意に高い生存率（例えば、約60〜約100％）を示す。図15および16を参照。
【００４０】
本発明の方法はまた、淡水に移される海水魚中の疾患の発病率を減少する。本発明の方法で処理した魚は、淡水への移行に対してより少ないストレスを経験するので、その免疫機能はより強く、寄生虫性、ウイルス性、細菌性および真菌性疾患を受けにくい。したがって、本発明の方法により養殖される海水魚は、より健康である。
【００４１】
PVCRの方法評価
本発明は、魚が、海水から淡水への移送の準備ができているかどうかを決定するためのPVCRのレベルを検出するための方法を含む。PVCRレベルを測定する方法は、いくつかの適切なアッセイを含む。適切なアッセイは、免疫学的方法、例えば、FACS解析、放射免疫アッセイ、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および化学発光アッセイを含む。現在公知であるか、または将来開発される任意の方法が、PVCR発現を測定するために使用されうる。
【００４２】
PVCRまたはその一部と反応する抗体が使用されうる。好ましい態様では、抗体は、PVCRまたはその一部と特異的に結合する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、用語、抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、およびその機能的断片を含むことを意図する。用語、ポリクローナルおよびモノクローナルは、抗体調製の均一性の程度をいい、特定の作製方法に限定されることを意図するわけではない。
【００４３】
いくつかの好ましい態様では、免疫学的技術は、抗-PVCR抗体（すなわち、１つまたはそれより多くの抗体）によりPVCRレベルを検出する。用語「抗-PVCR」抗体は、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体ならびにその混合物を含む。
【００４４】
抗-PVCR抗体は、単離されたPVCRおよび／または組換えPVCRあるいはその一部のような適切な免疫原に対して惹起されうる（合成ペプチドのような合成分子を含む）。ある態様では、抗体は、単離されたPVCRおよび／または組換えPVCRあるいはその一部（例えば、ペプチド）に対して惹起されるか、または組換えPVCRを発現する宿主細胞に対して惹起される。また、トランスフェクト細胞のような組換えPVCRを発現する細胞は、免疫原として、またはレセプターに結合する抗体についてのスクリーニングにおいて使用されうる。
【００４５】
任意の適切な技術が、免疫抗原を調製し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製しうる。技術は、種々のこれらの方法を含む（例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495-497 (1975)およびEur.J.Immunol. 6: 511-519(1976); Milsteinら、Nature, 266: 550-552 (1977); Koprowskiら、米国特許第4,172,124号;Harlow, E.およびD.Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring HarborLaboratory: Cold Spring Harbor, NY); Currnet Protocols In Molecular Biology,Vol. 2 ('94年、夏Supplement 27), Ausubel, F.M.ら、編、(John Wiley & Sons: NewYork, NY), Chapter 11, (1991)）。一般に、適切な不死細胞またはSP2/0のようなミエローマ細胞株を用いる融合抗体産生細胞は、ハイブリドーマを産生しうる。例えば、目的の抗原で免疫した動物は、抗体産生細胞、好ましくは、脾臓またはリンパ節由来の細胞を提供する。選択的な培養条件は、抗体産生ハイブリドーマ細胞を単離し、一方、限界希釈技術は、それらを産生する。研究者は、所望の特異性を有する抗体産生細胞を選択するためのELISAのような適切なアッセイを使用することができる。
【００４６】
他の適切な方法は、必要な特異性を有する抗体を産生するか、または単離しうる。他の方法の例は、ライブラリーから組換え抗体を選択すること、またはマウスのような動物の免疫を当てにすることを含む。
【００４７】
この方法によれば、アッセイは、生物学的サンプル中のPVCRのレベルを決定しうる。PVCRの量を決定することにおいて、アッセイは、試験対象のサンプルとPVCRに対して特異性を有する抗体とを、抗体とPVCRとの間の複合体の形成に適切な条件下で組み合わせること、および複合体の形成を検出または測定すること（直接的または間接的に）を含む。サンプルは、直接的または間接的に得られ得、特定のサンプルおよび選択されたアッセイ形式に適切な方法により調製されうる。
【００４８】
特に、組織サンプル、例えば、鰓組織サンプルは、それらがMS-222で麻酔された後に魚から調製されうる。組織サンプルは、魚の重量オスモル濃度に対応する適切なリンガー液中の２％パラホルムアルデヒドでの浸漬により固定化され、リンガーで洗浄され、次いで液体窒素で冷却したメチルブタンを用いて包埋化合物、例えば、O.C.T.TM（Miles,Inc., Elkahart, Indiana, USA）中で凍結される。クリオスタットで８〜10μ組織切片にカットした後に、個々の切片を種々の染色プロトコルに供する。例えば、切片を、１）ヤギ血清または同じ種類の魚から得られる血清でブロックし、２）ウサギ抗CaRまたは抗PVCR抗血清とともにインキュベートし、および３）ペルオキシダーゼ結合親和性精製ヤギ抗ウサギ抗血清で洗浄し、これとともにインキュベートする。結合したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清の位置は、次いで、バラ色（rose-colored）アミノエチルカルバゾール反応産物の発色により可視化される。個々の切片は、標準的な光学顕微鏡技術によりマウントされ、観察され、撮影される。魚PVCRタンパク質を検出するために使用される１つの抗CaR抗血清は、RaKCaRタンパク質（Riccardiら、P.N.A.S.92: 131-135 (1995); アクセッション番号NP058692）の細胞外ドメインに位置するアミノ酸番号214〜236に対応する23マーペプチドを用いてウサギにおいて惹起される。23マーペプチドの配列は、ADDDYGRPGIEKFREEAEERDIC（配列番号：24）である。配列DDYGRPGIEKFREEAEERDICI（配列番号：25）またはARSRNSADGRSGDDLPC（配列番号：26）を有する小ペプチドはまた、PVCRに対する抗体を含む抗血清を作製するために使用されうる。かかる抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたはキメラでありうる。
【００４９】
放射性標識、蛍光標識または化学発光標識等の適切な標識は、直接検出されうる。それらはまた、酵素標識等の標識およびビオチンのような他の抗原性または特異的結合パートナーを用いて間接的に検出されうる。かかる標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン等の蛍光標識、ルシフェラーゼ等の化学発光標識、32P、125I、131I等の放射性同位体標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識、およびアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ビオチン、アビジン、スピン標識等が挙げられる。複合体中の抗体の検出はまた、次いで検出される（例えば、標識により）二次抗体を用いて免疫学的に行われうる。従来の方法または他の適切な方法は、抗体を直接的にまたは間接的に標識しうる。
【００５０】
本方法を行うことにおいて、PVCRのレベルは、対照とは異なる。対照と比べたPVCR発現の種々のレベルまたは存在は、統計学的に有意な量の魚が試験された魚または魚の集団が、淡水に移動する用意ができていることを示す。対照は、存在する場合、本発明の工程に供されていない、例えば、PVCRモジュレーターを有する淡水に供されていない、および／またはNaCl食餌を与えられていない魚に由来するPVCRのレベルをいう。
【００５１】
PVCRはまた、組織サンプルに由来するmRNAのノザンブロット解析によりアッセイされうる。種々のサメ組織に由来するノザンブロット解析は、鰓組織において最も高い程度のPVCR発現があり、続いて、腎臓および直腸腺であることを示した。約７kb、4.2kbおよび2.6kbの少なくとも３つの別個のmRNA種が存在するようである。例えば、PVCRはまた、ハイブリダイゼーションによりアッセイされ、例えば、本明細書中に提供されるPVCR配列（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21または23）の１つ、その相補物または配列の１つに由来するオリゴヌクレオチドを魚に由来する組織サンプルから精製されたmRNAにハイブリダイズさせることにより、PVCRがアッセイされうる。かかるハイブリダイゼーション配列は、ハイブリダイゼーション産物の検出が可能であるように、付着された検出可能標識、例えば、放射性、蛍光等を有しうる。ハイブリダイゼーション法は、周知であり、かかる方法は、Jacobsらによる米国特許第5,837,490号に提供されており、その全教示が参考として全体として本明細書中に援用される。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、好ましくは、これらのパラメータに従うべきである：（ａ）もし存在する場合、多義性塩基（「Ｎ」）が最も少ない配列の領域に設計されるべきである、ならびに（ｂ）約80℃のTm（ＡまたはＴ各々について２℃、およびＧまたはＣ各々について４℃を仮定する）を有するように設計されるべきである。
【００５２】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件は、第２の核酸配列への第１の核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする温度および緩衝液組成の条件をいい、ここで、条件は、互いにハイブリダイズする配列間の同一性の程度を決定する。それゆえ、「高ストリンジェンシー条件」は、互いに非常に類似した核酸配列だけがハイブリダイズする条件である。配列は、それらが、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、互いにあまり似ていないこともありうる。２つの配列が低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするには、より低い類似性が必要とされる。ハイブリダイゼーションが生じないストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルにハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列が、それに最も類似する配列にハイブリダイズする条件が決定されうる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度、温度、およびホルムアミド等の不安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、それらの塩基組成、２つの配列間のミスマッチ塩基対のパーセント、および他の非同一配列内の配列のサブセット（例えば、小ストレッチのリピート）の出現の頻度等の因子をも含む。洗浄は、互いにハイブリダイズする配列間の最小のレベルの類似性を決定するように条件が設定される工程である。一般に、相同性ハイブリダイゼーションのみが生じる最も低い温度から、２つの配列間の１％のミスマッチは、任意の選択されたSSC濃度について融点（Tm）において１℃の減少を生じる。一般に、SSCの濃度の倍加は、約17℃のTmの増大を生じる。これらのガイドラインを用いて、洗浄温度は、求められるミスマッチのレベルに応じて、経験的に決定されうる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.ら、編、John Wiley & Sons, Inc.,1995, 補遺を含む）、ページ2.10.1〜2.10.16および6.3.1〜6.3.6に説明される。
【００５３】
高ストリンジェンシー条件は、（１）65℃で、1x SSC（10x SSC=3M NaCl、0.3M Na3-クエン酸・2H2O(88g/リットル)、1M HClでpHを7.0に）、1％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1〜２mg/ml 変性仔ウシ胸腺DNA、（２）42℃で、1xSSC、50％ホルムアミド、1％ SDS、0.1〜２mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（３）65℃で、1％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、1mM Na2・EDTA、0.5MNaHPO4（pH 7.2）（1M NaHPO4=１リットル当たり134g Na2HPO4・7H2O、4ml85％ H3PO4）、7％ SDS、0.1〜２mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（４）42℃で、50％ホルムアミド、5xSSC、0.02M Tris-HCl（pH7.6）、1xデンハルト溶液（100x =10g Ficoll 400、10g ポリビニルピロリドン、10gウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で500mlに）、10％硫酸デキストラン、1％SDS、0.1〜２mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（５）65℃で、5x SSC、5xデンハルト溶液、1% SDS、100μg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、または（６）42℃で、5xSSC、5xデンハルト溶液、50％ホルムアミド、1％ SDS、100μg/ml変性仔ウシ胸腺DNAのいずれかでのハイブリダイゼーションを使用することができ、（１）65℃で、0.3〜0.1xSSC、0.1％ SDS、または（２）65℃で、1mM Na2EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、1％SDSのいずれかの高ストリンジェンシー洗浄をともなう。上記条件は、50塩基対またはそれより長いDNA-DNAハイブリッドに使用されることが意図される。ハイブリッドが18塩基対長未満であると考えられる場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたTm、ここでTm（℃）＝（2xAおよびT塩基の数）＋（4xGおよびC塩基の数）よりも５〜10℃低いべきである。約18〜約49塩基対長であると考えられるハイブリッドについては、Tm（℃）＝（81.5℃＋16.6(log10M)+0.41（%G+C）-0.61(%ホルムアミド)-500/L）、ここで「Ｍ」は、一価カチオン（例えば、Na+）のモル濃度であり、「Ｌ」は、ハイブリッドの塩基対長である。
【００５４】
中程度のストリンジェンシー条件は、（１）65℃で、4x SSC、（10x SSC=3M NaCl, 0.3M Na3-クエン酸・2H2O(88g/リットル)、1M HClでpH7.0に）、1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1〜２mg/mlの変性仔ウシ胸腺DNA、（２）42℃で、4xSSC、50％ホルムアミド、1％SDS、0.1〜２mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（３）65℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、1mMNa2・EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）（1M NaHPO4＝１リットル当たり134gNa2HPO4・7H2O、4ml 85％H3PO4）、7％SDS、0.1〜2mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（４）42℃で、50％ホルムアミド、5xSSC、0.02M Tris-HCl（pH7.6）、1xデンハルト溶液（100x＝10gFicoll 400, 10gポリビニルピロリドン、10gウシ血清アルブミン（画分V）、水で500mlに）、10％硫酸デキストラン、１％SDS、0.1〜2mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（５）65℃で、5xSSC、5xデンハルト溶液、１％SDS、100μg/ml変性仔ウシ胸腺DNAまたは（６）42℃で、5xSSC、5xデンハルト溶液、50％ホルムアミド、１％SDS、100μg/ml変性仔ウシ胸腺DNAのいずれかでのハイブリダイゼーションを用いることができ、65℃で、1xSSC、0.1％SDSの中程度のストリンジェンシーの洗浄をともなう。上記条件は、50塩基対またはそれより長いDNA-DNAハイブリッドについて使用されることが意図される。ハイブリッドが18塩基対長よりも短いと考えられる場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたTmよりも５〜10℃低いべきであり、ここで、Tm（℃）＝（2xAおよびT塩基の数）＋（4xＧおよびＣ塩基の数）。ハイブリッドが約18〜約49塩基対長であると考えられる場合、Tm（℃）＝（81.5℃＋16.6（log10M）＋0.41（％G＋C）−0.61（％ホルムアミド）−500/L）、ここで「Ｍ」は、一価カチオン（例えば、Na+）のモル濃度、および「L」はハイブリッドの長さ（塩基対）である。
【００５５】
低ストリンジェンシー条件は、（１）50℃で、4xSSC、（10xSSC＝3M NaCl、0.3M Na3-クエン酸・2H2O（88g/リットル）、1MHClでpH7.0に）、1%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1〜2mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（２）40℃で、6xSSC、50％ホルムアミド、1％SDS、0.1〜2mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（３）50℃で、1％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、1mMNa2・EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）（1M NaHPO4＝１リットル当たり、134gNa2HPO4・7H2O、4ml 85％ H3PO4）、7％SDS、0.1〜2mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（４）40℃で、50％ホルムアミド、5xSSC、0.02MTris-HCl（pH 7.6）、1xデンハルト溶液（100x＝10g Ficoll 400、10g ポリビニルピロリドン、10gウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で500mlに）、10％硫酸デキストラン、1％SDS、0.1〜2mg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、（５）50℃で、5xSSC、5xデンハルト溶液、1％SDS、100μg/ml変性仔ウシ胸腺DNA、または（６）40℃で、5xSSC、5xデンハルト溶液、50％ホルムアミド、1％SDS、100μg/ml変性仔ウシ胸腺DNAのいずれかでのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、50℃での2xSSC、0.1％ SDSまたは（２）0.5％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、1mMNa2EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、5％SDSのいずれかの低ストリンジェンシー洗浄をともなう。上記条件は、50塩基対以上のDNA-DNAハイブリッドについて使用されることが意図される。ハイブリッドが18塩基対長よりも短いと考えられる場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたTmよりも５〜10℃低いべきであり、ここで、Tm（℃）＝（2xAおよびT塩基の数）＋（4xＧおよびＣ塩基の数）。ハイブリッドが約18〜約49塩基対長であると考えられる場合、Tm（℃）＝（81.5℃＋16.6（log10M）＋0.41（％G＋C）−0.61（％ホルムアミド）−500/L）、ここで「Ｍ」は、一価カチオン（例えば、Na+）のモル濃度、および「L」はハイブリッドの長さ（塩基対）である。
【００５６】
従って、本発明は、PVCRタンパク質もしくはその一部に特異的な抗体、またはPVCRの核酸にハイブリダイズしうる核酸配列のいずれかを有する、PVCRの検出またはPVCRの定量のためのキットを含む。
【００５７】
PVCRの発現または感受性における変更は、適切なトランスジーンの導入により達成されうる。適切なトランスジーンは、PVCR遺伝子自身、またはPVCR遺伝子発現に直接的もしくは間接的に影響する変更遺伝子のいずれかを含む。魚卵母細胞、胚および成体におけるトランスジーンの首尾よい導入、選択および発現のための方法は、Chen,TTら、Transgenic Fish, Trends in Biotechnology 8:209-215（1990）に記載されている。
【００５８】
本発明は、以下の実施例によりさらにおよびより詳細に説明されるが、決して限定されることを意図しない。
【００５９】
実施例
実施例１．多価カチオン感受性レセプター（PVCR）は魚の塩分センサーとして働く。
多価カチオン感受性レセプター（PVCR）は、魚の塩分センサーとして働く。これらのレセプターは、浸透圧調整を担うことが知られている魚の身体（例えば、鰓、腸、腎臓）の種々の細胞の頂端膜に局在している。ツノザメ由来の全長カチオンレセプター（CaR）は、ヒトＨＥＫ細胞において発現された。このレセプターは、HEK細胞を覆う細胞外液体中のNaCl、Ca2+およびMg2+のイオン組成の変化に応答することが知られていた。イオン濃度は、淡水から海水への移行を含む範囲を包囲するように応答した。PVCRmRNAの発現はまた、淡水から海水へのそれらの移行の後に魚において調節され、PVCRアゴニストによって調節される。
【００６０】
縮重プライマーを用いた核酸増幅を用いることにより、PVCRの部分的ゲノムクローンがまた、タラ（図1A〜B）、ハドック（図2A〜B）、ヘイク（図3A〜B）、オヒョウ（図4A〜B）、サバ（図5A〜B）、ポラック（図6A〜B）、ハタ（図7A〜B）、メカジキ（図8A〜B）、マグロ（図9A〜B）、ウィンターフラウンダー（図10A〜10C）およびサマーフラウンダー（図11）を含む他の種類の魚から単離されている。ウィンターフラウンダーを除くこれらのクローンを単離するために使用される縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-TGTCKT GGA CGG AGC CCT TYG GRA TCG C-3'（配列番号：27）および5'-GGC KGG RAT GAA RGA KAT CCARAC RAT GAA G-3'（配列番号：28）であり、ここでKはTまたはGであり、YはCまたはTであり、RはAまたはGである。縮重オリゴは、標準的な方法（Preston,G.M., 1993, "Polymerase chain reaction with degenerate oligonucleotideprimers to clone gene family members," : Methods in Mol.Biol., vol.58, 編A.Harwood, Humana Press, pp. 303-312）により得られた。これらの種に由来する核酸を、増幅し、アガロースゲル電気泳動により精製し、適切なプラスミドベクター（NovagenのpT7BlueまたはPromegaのpGEM-T）に連結し、適切な細菌宿主株（NovagenのNovaBlue Competent CellsまたはPromegaのJM109コンピテント細胞）に形質転換する。プラスミドおよび挿入物を、宿主細胞から精製し、配列決定した。図13A〜Cは、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロおよびウィンターフラウンダーに由来するPVCRに関する推定されるアミノ酸配列およびアラインメントを示す。
【００６１】
ウィンターフラウンダーλZAP cDNAライブラリーを、Sinerら、Am.J.Physiol. 270:C372-C281, 1996に記載され、公開されるようにウィンターフラウンダー膀胱組織から単離されたポリA+RNAから合成されたcDNAとともに標準的な市販の試薬を用いて生産した。ウィンターフラウンダー膀胱cDNAライブラリーを、プレーティングし、得られたファージプラークを中程度のストリンジェンシー条件（0.5xSSC、0.1％SDS、50℃）下で32P標識サメ腎臓カルシウムレセプターcDNAプローブを用いてスクリーニングした。個々の陽性プラークをオートラジオグラフィーにより同定し、単離し、ファージミド感染を用いてレスキューし、KSBluescriptベクターにcDNAを移した。ウィンターフラウンダーPVCRクローンのヌクレオチド（nt）配列、図10A、（配列番号：19）を、ダイデオキシチェーンターミネーション技術を用いてヌクレオチド配列決定を行う商業的に利用可能な自動化配列決定サービスを用いて得た。推定アミノ酸配列（配列番号：20）を図10Bおよび10Cに示す。ウィンターフラウンダーPVCRヌクレオチド配列を、GENBANKおよびSWISSPIRを含む商業的に利用可能なヌクレオチドおよびタンパク質データベースサービスを用いて他の水性動物PVCRと比較した。
【００６２】
実施例２：本発明の方法を用いる淡水中の海水魚の成長
方法：
以下の実施例は、終始APSProcess IおよびAPS Process IIに言及する。APSは、「AquaBio Products Sciences登録商標, L.L.C.」を意味する。APSProcess Iはまた、本明細書中では「SUPERMOLT TM I Process」または「Process I」とも呼ばれる。「APSProcess I」魚またはサケは、APS Process Iの工程を受けた魚またはサケをいう。APS Process Iサケはまた、「SUPERSMOLT TMI」または「Process I」サケとも呼ばれる。同様に、APS Process IIはまた、本明細書中では「SUPERSMOLT TMII Process」または「Pcocess II」とも呼ばれる。「APS Process II」魚またはサケは、APS Process IIの工程を受けた魚またはサケをいう。APSProcess IIサケはまた、「SUPERSMOLT TM II」または「Process II」サケとも呼ばれる。
【００６３】
APS Process I：海水魚を、0.3〜10.0mMカルシウムおよび0.5〜10.0mMマグネシウムイオンを含む淡水に供するか、またはそこに維持する。この水は、淡水への炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムならびに塩化マグネシウムの添加により調製する。魚に、１〜７％（重量／重量）NaClを含有する固形飼料を与える。飼料に関するさらなる詳細については実施例３を参照のこと。魚を、水混合物のこのレジメ（regimen）に供するか、またはそこに維持し、標準的な孵化場ケア技術を用いて、合計30〜45日間摂食させる。水温は10〜16℃間で変化する。魚を、APSProcess Iの間、定常明期に供する。蛍光を明期に使用する。
【００６４】
APS Process II：海水魚を、0.3〜10.0mMカルシウムおよび0.5〜10.0mMマグネシウムイオンを含む淡水に供するか、そこに維持する。この水は、淡水への炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムならびに塩化マグネシウムの添加により調製する。魚に、１〜７％（重量／重量）NaClおよび飼料の1kg当たり2mgまたは4gmのL-トリプトファンを含有する固形飼料を与える。飼料に関するさらなる詳細については実施例３を参照のこと。魚を、水混合物のこのレジメに供するか、またはそこに維持し、標準的な孵化場ケア技術を用いて、合計30〜45日間摂食させる。水温度は10〜16℃間で変化した。魚を、APSProcess IIの間、定常明期に供する。蛍光灯を明期に使用する。
【００６５】
養殖場（Great Bay AquaFarms Portsmouth, NH）で育てられた動物の単一の均一ストックに全て由来する種々の重量のサマーフラウンダーを、APSラボラトリー内の人工海水（CrystralSea）に輸送し、配置した。これらを、２つの群（ｎ＝13）に分け、一方を合計81日間海水（海水対照）に維持し、標準的なフラウンダー食餌（CoreyFeeds, New Brunswick, Canada）を与えた。他方（淡水）を、５mM Ca2+、８mM Mg2+濃度の水ならびに70％標準フラウンダー飼料（CoreyFeeds, New Brunswick, Canada）および30％基底ヤリイカの1.2％NaCl補充食餌からなるAPS Process I条件に30日以上順応させた。次いで、これらのフラウンダーを、合計51日間APSProcess I条件に維持し、それらの成長を、対応する対のサマーフラウンダーの海水における維持により示される成長と比較した。
【００６６】
フラウンダーを、以下の30日スケジュールによりAPS Process Iに順応させた：
１．海水における５日間の維持
２．50％に水の塩分を減らした海水に10日間
３．25％に水の塩分を減らした海水に15日間
４．APS Process I水に魚を入れる（淡水中に５mM Ca2+、８mM Mg2+濃度、pH7.6〜8.0）
【００６７】
魚を、有色エラストマータグを用いて個々に標識し、それらの体重の変化を、51日の実験間隔の間、特定の時間点で測定した。
【００６８】
飼料変換率（feed conversion ratio）またはFCRを、魚の群に与えた食料の量を魚の群により得られる体重により割ることにより得る。魚による体重成長への食料の転換が効率的であるほど、FCRが小さくなる（小量の食料／魚の大きな体重増加）。非常に少ないFCR数（１未満）は、魚類の養殖の目標である、体重成長への食料の高度に効率的な転換をもたらす。対照的に、大きなFCRは、体重成長への食餌の非効率的な転換を意味し、一般に所望されない。大きいまたは乏しいFCRは、飼料のコストのため、および所定の重量に魚が成長するのにより多い食餌を使用することが必要であるため好ましくない。本発明の方法に供された魚のFCR値は、一般に、ほとんどの産業公開値よりも小さく、ある場合には（例えば、魚に乾燥飼料を与える場合）、より望ましい。なぜなら、本発明は、食料を食べても成長しないので全体のFCRを増大させる傾向にある浸透圧的に損傷した魚の存在を排除するからである。本発明の方法は、より低いFCRを生じ、ほとんどの魚の最適な摂食および成長を可能にする。本発明に供される魚のFCRは、魚の大多数の成長および食餌を維持するのに、または好ましくは魚の大多数の成長および飼料消費を増大させるのに十分である。魚が本発明に供される場合、それらはFCRの範囲を示し、例えば、約0.7〜約7.0の間の値を含む。特に、飼料消費または飼料取り込みが改善される。なぜなら、魚が、嗅覚層板または嗅球の細胞においてPVCRとともに食料の「匂いを嗅ぐ」か、またはそれを「感じる」からと考えられる。
【００６９】
魚の特異的成長率（SGR）を、所定の時間点の終わりに魚の重量を、魚の開始重量で割ることにより決定した。
【００７０】
飼料変換率（FCR）または特異的成長率（SGR）および成長因子（GF3）を得るための全ての計算を、標準的な一般に認められている式（Willoughby,S.Manual of Salmonid Farming Blackwell Scientific, Oxford UK 1999）を用いて行った。
【００７１】
結果および考察：
海水魚、サマーフラウンダーを、海水における匹敵する対照サマーフラウンダーによって示されるのと類似した成長速度で長期間（51日間）APS Process I条件下に順応させ、成長させうる。
【００７２】
表ＩおよびIIは、海水（海水対照）またはAPS Process I淡水条件下のいずれかに維持したサマーフラウンダーの同一群から得られたデータを示す。水質および温度（16.3℃対17.9℃平均）は比較可能であった。フラウンダーは、有意な死亡率を伴うこともなくAPSProcess I条件に首尾良く順応し、それらの全体の外観は海水に維持した匹敵する対照と有意には異ならなかった。
【００７３】
【表１】
0004230766.tif 000002
【００７４】
【表２】
0004230766.tif 000003
【００７５】
51日試験間隔の間の魚の全体の死亡率は、APS Process I条件下（5/13または38.5％）で維持したフラウンダーと比較して海水（2/13または15.4％）でより低かった。APSProcess I条件下で維持した全てのフラウンダーで増加した平均重量（27.2gm）は、海水対照群の全体の重量増加（38.4gm）と比べて少なかった。有意な重量増加を、APSProcess I魚の20日間後および海水で維持したフラウンダーの37日間後の両方の群で観察した。従って、APS Process Iで生存しているフラウンダー間の平均特異的成長率（SGR）（１日当たり0.53％体重）は、海水で維持したそれ（１日当たり0.6％体重）と匹敵した。
【００７６】
対照的に、100％の海水魚（タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウィンターフラウンダーおよびサマーフラウンダー）は、淡水に移した72時間内に死亡する。
【００７７】
APS Process I対海水において維持されたフラウンダー間の食料変換率（FCR）の比較は、APS Process I条件下で維持されたフラウンダーが、それらの匹敵する海水対照（1.99）と比較して、有意により大きなFCR（3.96）を示したことを示す。
【００７８】
図1A〜Bは、APS Process Iまたは海水条件下で維持された標識したフラウンダーの個々の重量増加成績を示す。いくつかのフラウンダー（例えば、番号９および番号11）がAPSProcess I条件下で安定した有意な成長を示し、一方で他のものが乏しい体重増加（例えば、番号10）またはさらに体重の減少（例えば、番号１）を示したように、個々の成長率に広範な変化が存在することに注目すべきである。類似した成績特徴が、海水におけるフラウンダーについて観察されたが、個々の成績における変化は、APSProcess Iで維持されたフラウンダーと比較してあまり明白ではなかった。
【００７９】
まとめると、これらのデータは、サマーフラウンダーがAPS Process Iを用いる淡水条件下で長期間（51日間）首尾良く維持されうることを示す。通常の条件下では、サマーフラウンダーの成長および生存は、約25％海水に通常制限され、そこでフラウンダーは、さらに塩分が減ると死ぬ。これらのデータは、海環境それ自身から離れた淡水環境におけるサマーフラウンダーの培養の基礎を形成し、ここで、フラウンダー切り身の値段は、海水対照と比べて乏しい成績（死亡率の増大ならびに乏しいFCRおよび体重増加）を埋め合わせる以上に優れている。
【００８０】
APS Process IIを用いて海水魚を淡水に移すことは、APS Process Iで見られるよりもさらに優れた成長率を提供することが予想される。APSProcess IIを受けたサケおよびマスは、関連する出願、全て2000年10月12日に出願された特許出願第09/687,372; 09/687,476;09/687,477号、全てタイトルは「Methods for Raising Pre-Adult Anadromous Fish」および特許出願第09/687,373号、タイトル「GrowingMarine Fish in Fresh Water」に説明されているように、成長率において有意な増大を示した。
【００８１】
実施例３：飼料
２つの一般的な方法を用いて、APS Process IおよびIIの一部として魚により消費される飼料を調製した。これらの２つのプロセスは、飼料の再処方または飼料による吸収のための濃縮溶液の添加、続いて嗜好のためにトップドレッシングすることを含む。この開示は、これらの２つの方法の各々を用いて飼料を調製するための方法論を記載する。
【００８２】
方法：
飼料製造
飼料を再処方するために、成分は以下の通りである：基礎飼料を、以下の成分および手順を用いて作製した：３０％ヤリイカ（ブレンダー中で液体化）、７０％  Ｃｏｒｅｙ Ａｑｕａｆｅｅｄｓフラウンダー食餌（ブレンダー中で粉体化）。成分を半湿性「練り粉（ｄｏｕｇｈ）」ボールにブレンドする。ＮａＣｌまたはＰＶＣＲ活性化合物を含む他の成分を、実験的パラメータに従って目方で基礎飼料にブレンドした。
【００８３】
Moore Clark標準淡水サケ食餌（サイズ1.2、1.5、2.0、2.5、および3.5mm）もまた使用されうる。トップドレッシングを、トップドレッシングが基礎食餌の重量の４％から構成されるようにペレットに適用した。トップドレッシングは、50％のオキアミ加水分解物（SpecialtyMarine Products Ltd.）および50％ニシン魚油から構成される。トップドレッシングを、嗜好のために添加し、添加成分を封着した。
【００８４】
他の成分は、本明細書中に記載されるように、目方で基礎食餌に添加されるNaCl、MgCl2、CaCl2またはL-トリプトファンを含みうる。
【００８５】
７％（重量／重量）NaClを含む飼料の調製：
APS Process Iのために：固体NaClまたはMoore Clark標準淡水サケ食餌重量の７％の重量の比で分配したNaClを、NaClの重量の約３〜４倍の容積の水道水に添加した。混合物を、マグネティックスターラーバーの使用により混合しながら60〜70℃に加熱し、塩を溶解した。次いで、NaCl溶液を、携帯型スプレーに注ぎ、1.5立方メートルの動力化セメントミキサーの内側を回転させながらMooreClark標準淡水サケ食餌に適用した。NaClリッチ溶液の吸収後、湿ったMoore Clark標準淡水サケ食餌を、ウィンドウスクリーニングに薄く広げ、ファンおよび1500ワットヒーターを備えた封入ラックシステムに配置し、乾燥プロセスを促進した。約６時間の乾燥の後、乾燥NaClリッチペレットをセメントミキサーに戻し、トップドレッシングを適用する。飼料を使用するまで室温で保存する。
【００８６】
APS Process IIのための７％（重量／重量）NaCl＋PVCRアゴニスト（トリプトファン）を含む飼料の調製：MooreClark標準淡水サケ食餌重量の７％の重量比で分配した固体の塩化ナトリウムまたはNaClを、NaClの重量の約３〜４倍の容積の水道水に添加した。混合物を、マグネティックスターラーバーの使用により混合しながら60〜70℃に加熱し、塩を溶解させた。USPGrade L-Tryptophanを、製剤必要に応じてMoore Clark標準淡水サケ食餌の１kg当たり２ｇまたは４ｇのいずれかで前記水に添加した。トリプトファンが溶解し、溶液のpHが約4.0になるまで、希塩酸を、混合しながら前記水に添加した。次いで、NaCl＋トリプトファン溶液を携帯噴霧器に注ぎ、次いで、セメントミキサーの内側を回転させながらMooreClark標準淡水サケ食餌に適用した。NaCl＋トリプトファン溶液の吸収後、湿ったMoore Clark標準淡水サケ食餌を、次いでウィンドウスクリーニングに薄く広げ、ファンおよび1500ワットヒーターを備えた封入ラックシステムに配置し、乾燥プロセスを促進した。約６時間の乾燥の後、乾燥NaCl／トリプトファン-リッチペレットを次いでセメントミキサーに戻し、トップドレッシングを適用する。飼料を使用するまで室温で保存する。
【００８７】
実施例４：いくつかの種の海水魚のDNAからPCRにより増幅された多価カチオンレセプタータンパク質の部分的ゲノムクローンのDNAおよび推定タンパク質配列。
これらのデータは、13種類の海水魚において単離された部分的PVCRゲノム配列を提供する。これらの各々のヌクレオチド配列は、ユニークであり、従って、各々の種に由来する全長cDNAを単離するためのユニークプローブとして使用されうる。さらに、これらのヌクレオチド配列は、これらの魚の種々の組織におけるPVCR発現の検出のための特異的アッセイキットの基礎を形成しうる。例えば、前記キットは、任意に、インサイチュハイブリダイゼーションに適切な標識ハイブリダイゼーションプローブを含みうる。
【００８８】
PVCRは、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウィンターフラウンダーおよびサマーフラウンダーを含むいくつかの種において単離された。SKCaRのヌクレオチド配列をともなう哺乳動物CaRの配列（図14Aおよび14B）を、標準的な方法（GMpreston, 「Polymerase chain reaction with degenerate oligonucleotide primers toclone gene family members」 Methods in Mol. Biol. Vol. 58, A.Harwood編集、HumanaPress, 303-312頁、1993）を用いて多価カチオンレセプタータンパク質の細胞外および膜貫通ドメインの高度に保存された領域に対する変性オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用した。これらのプライマーを用いて、重要な商業的産物を示す種々の魚種のcDNAまたはゲノムDNAを標準的なPCR法を用いて増幅する。次いで、増幅バンドを、アガロースゲル電気泳動により精製し、細菌株に形質転換される適切なプラスミドベクターに連結する。液体培地における成長の後、ベクターおよび挿入物を、標準的な技術を用いて精製し、制限酵素解析により解析し、適切に配列決定した。この方法を用いて、ヌクレオチド配列を増幅した。
【００８９】
この配列データを作成するために、DNAを、標準的な公開された技術を用いて示された種の各々の組織サンプルから単離した。次いで、２つの縮重PCRプライマー（DSK-F3(5'-TGT CKT GGA CGG AGC CCT TYG GRA TCG C-3'; 配列番号：29)およびDSK-R4; (5'-GGC KGGRAT GAA RGA KAT CCA RAC RAT GAA G-3'配列番号：30）を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法論を用いてDNAを増幅した。次いで、増幅DNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、標準的な方法を用いて、プラスミドベクターにサブクローニングし、増幅し、精製し、配列決定した。
【００９０】
図12A〜Cは、12種の海水魚に関する593ヌクレオチドの整列したゲノムDNA配列を示し、各々は、PVCRタンパク質の同一領域をコードする。各々の特定の種に由来する各々のヌクレオチド配列がユニークであることに留意されたい。しかし、これらの遺伝子のDNA配列における変化は、593ヌクレオチドの各々の配列内の共通の特異的ヌクレオチドでしばしば生じる。
【００９１】
図13A〜Cは、図12A〜Dに示されるゲノムヌクレオチド配列に由来する整列した対応する予測タンパク質配列を示す。PVCRのこの部分のアミノ酸配列における２、３の変化が、図12A〜Dに示されるヌクレオチド配列における変化の結果として生じることに留意されたい。これらの変化（例えば、AlaからVal；ArgからLys; およびCysからTyr）の全ては、ペプチド配列の相対的サイズ、電荷および疎水性の内のいくつかの組み合わせを保存するアミノ酸の「保存的」置換として知られている。
【００９２】
引用した参考文献、特許、および特許出願の全ては、その全体が参考として本明細書中に援用される。また、2001年10月11日出願のタイトル「Methods for Growing and Imprinting Fish UsingOdorant」、特許出願番号がまだ割り当てられていない（代理人管理番号2213.2004-001）；2001年10月11日出願のタイトル「Methodsfor Raising Pre-adult Anadromous Fish」、特許出願番号がまだ割り当てられていない（代理人管理番号2213.1004-001）；2001年10月11日出願のタイトル「PolyvalentCation-sensing Receptor Proteins in Aquatic Species」、国際出願番号がまだ割り当てられていない（代理人管理番号2213.1006-003）も伴う。さらに、2000年10月12日出願のタイトル「Methodsfor Raising Marine Fish」の特許出願第09/687,477号；2000年10月12日出願のタイトル「Methods forRaising Marine Fish」の特許出願第09/687,476号；2000年10月12日出願のタイトル「Methods for RaisingMarine Fish」の特許出願第09/687,373号；2000年10月12日出願のタイトル「Polyvalent Cation-SensingReceptor Proteins in Aquatic Species」の仮特許出願第60/240,392号；2000年10月12日出願のタイトル「PolyvalentCation-Sensing Receptor Proteins in Aquatic Species」の仮特許出願第60/240,003号の全ても、その全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、1998年９月28日出願の出願番号第09/162,021号、1997年３月27日出願の国際PCT出願第PCT/US97/05031号、および1996年３月27日出願の出願番号第08/622,738号、全てタイトルは「Polycation-SensingReceptor in Aquatic Species and Methods of Use Thereof」も全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００９３】
本発明をその好ましい態様に関して詳細に示し、記載してきたが、当業者は、種々の変更が、付随の特許請求の範囲により包囲される本発明の範囲から逸脱することなく行われうることを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1Aおよび1Bは、タラのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図２】  図2Aおよび2Bは、ハドックのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。
【図３】  図3Aおよび3Bは、ヘイクのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。
【図４】  図4A〜B は、オヒョウのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：７）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。
【図５】  図5A〜B は、サバのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：10）を示す図である。
【図６】  図6A〜B は、ポラックのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：11）およびアミノ酸配列（配列番号：12）を示す図である。
【図７】  図7A〜B は、ハタのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：13）およびアミノ酸配列（配列番号：14）を示す図である。
【図８】  図8A〜B は、メカジキののPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：15）およびアミノ酸配列（配列番号：16）を示す図である。
【図９】  図9A〜B は、マグロのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：17）およびアミノ酸配列（配列番号：18）を示す図である。
【図１０】  図10A 〜C は、ウインターフラウンダーのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：19）およびアミノ酸配列（配列番号：20）を示す図である。
【図１１】  図11は、サマーフラウンダーのPVCRの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：21）およびアミノ酸配列（配列番号：22）を示す図である。
【図１２】  図12A 〜D は、タラ（配列番号：１）、ハドック（配列番号：３）、ヘイク（配列番号：５）、オヒョウ（配列番号：７）、サバ（配列番号：９）、ポラック（配列番号：11）、ハタ（配列番号：13）、メカジキ（配列番号：15）、マグロ（配列番号：17）、ウインターフラウンダー（配列番号：19）に関する核酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１３】  図13A 〜C は、タラ（配列番号：２）、ハドック（配列番号：４）、ヘイク（配列番号：６）、オヒョウ（配列番号：８）、サバ（配列番号：10）、ポラック（配列番号：12）、ハタ（配列番号：14）、メカジキ（配列番号：16）、マグロ（配列番号：18）、ウインターフラウンダー（配列番号：20）に関するアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１４】  図14A 〜B は、SKCaRの核酸配列（配列番号：23）を示す図である。
【図１５】  図15は、APS プロセスIを受け、かつ総51日間淡水において成長させた淡水におけるサマーフラウンダーの成長を示すグラフ表示である。フラウンダーの体特徴付けの試料を、(1) 淡水中への配置前；(2)淡水中への配置後20日；(3) 淡水中への配置後30日；ならびに(4) 淡水中への配置後51日に得た。 APSプロセスI は、実施例２に規定される。
【図１６】  図16は、総51日間海水におけるサマーフラウンダーの成長を示すグラフ表示である。フラウンダーの体特徴付けの試料を、(1)海水中への配置前；(2) 海水中への配置後20日；(3) 海水中への配置後30日；ならびに(4) 海水中への配置後51日に得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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