(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体であって、
３２個のアミノ酸からなる細胞質ドメイン、２９個のアミノ酸からなる膜通過ドメイン及び９５７個のアミノ酸からなる成熟タンパク質からなる天然のヒトαv鎖のＣ末端から５２個までから６１個までのいずれかのアミノ酸までが欠失してなるＣ末端欠失のαv鎖と、
４１個のアミノ酸からなる細胞質ドメイン、２９個のアミノ酸からなる膜通過ドメイン及び６９２個のアミノ酸からなる成熟タンパク質からなる天然のヒトβ3鎖のＣ末端から６１個までから７０個までのいずれかのアミノ酸までが欠失してなるＣ末端欠失のβ3鎖と、
からなる
ことを特徴とする可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体。
【請求項２】
前記Ｃ末端欠失αv鎖および前記Ｃ末端欠失β3鎖のＮ末端側にそれぞれシグナルを更に有する請求項１に記載の可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体。
【請求項３】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＡにより測定した場合に、Ｃ末端欠失のαv鎖の分子量が１２０ｋＤａ（±１２ｋＤａ）であり、Ｃ末端欠失のβ3鎖の分子量が約８０ｋＤａ（±８ｋＤａ）である請求項２に記載の可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体。
【請求項４】
リガンド結合活性が損なわれていない、高純度に精製された可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体を高収率で調製する方法であって、
（ｉ）３２個のアミノ酸からなる細胞質ドメイン、２９個のアミノ酸からなる膜通過ドメイン及び９５７個のアミノ酸からなる成熟タンパク質からなる天然のヒトαv鎖のＣ末端から５２個までから６１個までのいずれかのアミノ酸までが欠失してなるＣ末端欠失のαv鎖をコードする第１のＤＮＡと、４１個のアミノ酸からなる細胞質ドメイン、２９個のアミノ酸からなる膜通過ドメイン及び６９２個のアミノ酸からなる成熟タンパク質からなる天然のヒトβ3鎖のＣ末端から６１個までから７０個までのいずれかのアミノ酸までが欠失してなるＣ末端欠失のβ3鎖をコードする第２のＤＮＡを、バキュロウイルス発現系のバキュロウイルス転送用ベクターに組み込んで、サブクローニングを行う工程と、
（ｉｉ）前記第１及び／または第２のＤＮＡを含むベクターを、前記発現系のバキュロウイルスのゲノムＤＮＡに移入させる工程と、
（ｉｉｉ）前記完全な組換えバキュロウイルスで昆虫細胞を感染させる工程と、
（ｉｖ）前記感染昆虫細胞を培地で培養して、ヘテロ二量体のＣ末端欠失型αvβ3付着受容体を該培地中に発現させる工程と、
（ｖ）発現したＣ末端欠失型αvβ3付着受容体を、ヒトαvβ3付着受容体またはその個別の構成鎖に特異的に結合する抗体を使った抗体アフィニティクロマトグラフィにより培地から精製する工程と、
を有することを特徴とする可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体の調製方法。
【請求項５】
前記第１、第２のｃＤＮＡを同じバキュロウイルスベクターに組み込んでサブクローニングする請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
バキュロウイルス発現系がＢａｃＰＡＫシステムである請求項４または５に記載の調製方法。
【請求項７】
感染用の昆虫細胞が、ハイ  ファイヴ（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ）（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）細胞である請求項４〜６のいずれかに記載の調製方法。
【請求項８】
抗体アフィニティクロマトグラフィに使用される特異的抗体が、登録番号が２７２−１７Ｅ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２１６０）であるハイブリドーマ細胞株で産生されたｍＡｂ  １７Ｅ６である請求項４〜７のいずれかに記載の調製方法。
【請求項９】
Ｃ末端欠失型αv鎖をコードする第１のｃＤＮＡが、オリゴヌクレチドである、５’−ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ−３’（配列番号：１）と、５’−ＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ−３’（配列番号：２）をプライマーとして使用したＰＣＲにより作成され、
Ｃ末端欠失型β3鎖をコードする第２のｃＤＮＡが、オリゴヌクレチドである、５’−ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ−３’（配列番号：３）と、５’−ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＴＡ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ−３’（配列番号：４）をプライマーとして使用してＰＣＲにより作成された
ものである請求項４〜８のいずれかに記載の調製方法。
【請求項１０】
αvβ3付着受容体を阻害する治療薬の発見のための、請求項１〜３のいずれかに記載の可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体の使用法。
【請求項１１】
治療薬化合物がＲＧＤペプチドまたは非ペプチド性の類似物質である請求項１０に記載の使用法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体及び該可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体を阻害する可能性のある治療用化合物を使用して、治療用化合物の天然のαvβ3付着受容体を阻害する能力のある治療用化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
治療用化合物としてのＲＧＤペプチドまたは非ペプチド性類似体を、検出標識により検出が可能なように修飾し、固定化された精製可溶性組換えＣ末端欠失αvβ3付着受容体と反応させ、さらに、該受容体に結合したリガンドの量が測定される請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンド結合活性が損なわれていない、新規の精製組換えαvβ3付着受容体（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびバキュロウイルス−昆虫細胞発現系を使用した組換え技術により可溶性の非膜結合型付着受容体を、優れた収率で生産することのできる方法に関する。このように作製された可溶性受容体は、天然のαvβ3付着受容体を阻害することができる新しい治療薬のスクリーニングにも容易に適用できるものである。さらに、本発明は宿主細胞の表面膜に結合している受容体を界面活性剤を使用して溶解させることにより、完全鎖長の組換えαvβ3付着受容体を優れた収量で生産できる方法に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）は、付着受容体のスーパファミリーであり、これは、細胞外に固体状の環境を有する細胞の、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への付着、及び他の細胞への付着の両方を制御しているものである。付着あるいは癒着は、細胞にとって基本的に重要なものであり、固定と移動のためのきっかけを、あるいは成長と分化のためのシグナルを与えるものである。インテグリンは、細胞付着、血餅形成のための移動、炎症、胚形成、癌の増殖と転移のような多くの正常または病理的事象に直接に関与しており、根本的な治療手段におけるターゲットとなるものである。
【０００３】
インテグリンは、非共有結合のα及びβサブユニットから成り、必須のヘテロ二量体膜通過タンパク質である。インテグリンは、β１、β２、β３、αv鎖の４つの、部分的に重複したインテグリン・サブファミリーに分類され、ある特定の細胞は各サブファミリーとは別の種類のインテグリンを発現する。最近の１０年間において、研究者から、インテグリンは細胞付着に関与している主要の受容体であり、治療手段における好適なターゲットとしてなり得ることが示されてきた。インテグリンに関する報告としては、例えばE.Ruoulahti(J.Clin. Invest. 1991, 87)やR.O.Hynes(Cell, 1992, 69)がある。
【０００４】
αv系列のインテグリンは主要なサブファミリーであると見られているもので、従来から指摘されてきた機能と最近に見いだされた新しい機能を有する。例えば、メラノーマ細胞株では、腫瘍発生と転移とに関連したαv系インテグリンの発現の増加(Felding-Habermann et al. 1992,J.Clin. Invest. 89, 2018, Marshall et al. 1991, Int. J. Cancer49, 924)によって、癌細胞の転移過程にαv系のインテグリンが関与していることが示唆された。癌細胞の付着、拡大、特に、最も典型的な上皮悪性腫瘍である結腸直腸癌についてインテグリンの関与が議論されている。
【０００５】
αv系インテグリンは、ＲＧＤ（ＮＨ2-アルギニンーグリシンーアスパラギン酸−ＣＯＯＨ）トリペプチド配列を有するリガンドを結合部位として特異的に認識するとされている。αv系受容体インテグリンであるαvβ1、αvβ3、αvβ5はビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）の相当部位を特異的に認識し、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6はフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の相当部位を認識し、αvβ3はフォンビルブラント因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ）、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）及びオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）の相当部位を認識する(Busk et al. 1992, J.Biol. Chem. 267, 5790; Smith and Cheresh 1990, J. Biol. Chem. 265, 2168)。これらの抗インテグリン抗体、例えばαvβ3インテグリンに対する抗体をブロックする機能については知られている（Cheresh and Spiro 1987, J. Biol. Chem. 262, 17703; Chuntharapai et al. 1993, Exp. Cell Res. 205, 345; EP95119233)。
【０００６】
種々のペプチドおよび抗体によるリガンドとインテグリンとの間の相互作用の阻害という点に基づいて、癌の増殖・転移、ウイルス感染、骨粗しょう症、血管形成などの多様なプロセスの中での、ビトロネクチン受容体としてのαvβ3インテグリンの重要な役割が注目されるに至っている(Felding-Habermann and Cheresh 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 864; Brooks et al, 1994, Cell 79, 1157; Brooks et al. 1994, Science 264, 569)。αvβ3インテグリンの治療手段における強力なターゲットとしての浮上は、精製αvβ3を必要とするプロセスであるαvβ3アンタゴニストの検索をリードすることとなった。多くの必須の膜タンパク質に共通するように、インテグリンも非イオン性界面活性剤の存在下のみにおいて活性のある可溶性分子として得られるものであり、そのため、薬剤のスクリーニングのためのαvβ3のヒト胎盤からの精製は、厄介で、コストがかかり、健康に対する考えられ得るリスクを有するものとなっている(Mitjans et al.1995, J. Cell Sci. 108,2825)。組換え型のインテグリンについては、すでにＣＨＯ細胞(O'Toole et al., 1990, Cell Regul. 1, 883)や胎児腎臓２９３細胞(King et al., 1990, J. Bone Mine Res. 9, 381)のような真核生物系での発現が行われているが、ＤＮＡ組換え技術によって生化学的に満足できる量の生産は未だなされていない。末端欠失型の可溶性αvβ3インテグリンの生物学的活性に関する報告はないし、組換え技術による完全鎖長を有するαvβ3受容体の生化学的に重要な量での生産も行われていない。
【０００７】
従って、比較的容易で安全な方法により、精製されており、かつ生化学的に使える量での生産が可能な可溶性組換えαvβ3受容体が提供されることが望まれている。更に、そのようなプロセスは、完全鎖長のαvβ3受容体の生産にも有益であり得る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を使用した、生物学的に十分な機能を有する可溶性αvβ3の最初の高レベル発現及び精製について記載するものである。哺乳動物細胞におけるのと同様に処理された組換えタンパク質（付着受容体）の高収量を達成するために、バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子が強力なウイルスプロモータとして使用され、αvβ3タンパク質の過剰発現が達成された。この可溶性タンパク分子は、天然の胎盤におけるもの及び完全長の組換え受容体におけるリガンドとの結合活性及び特異性を維持しており、そして、界面活性剤を用いずに精製することができるために、結合性の人工物の混入の可能性を除去でき、構造解析における高度な解析結果とスクリーニングにおける高生産性に適した分子を製造することができる。
【０００９】
本発明の目的は、リガンド結合活性が損なわれていない、本質的に精製された可溶性のαvβ3付着受容体を提供することにある。ヒト由来の対応する受容体は本発明における好適な態様の一つである。
【００１０】
本発明の受容体は、αv鎖とβ3鎖を有し、それぞれの鎖のＣ末端において、膜通過ドメインを含む部分、または該膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）を含む部分と細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃｄｏｍａｉｎ）の全てを含む部分の分だけ鎖長が短くなっている構造を採り得る。成熟したヒトのαv及びβ3タンパク質鎖におけるアミノ酸配列およびＤＮＡ配列については、膜通過ドメインおよび細胞質ドメインのものとともにすでに知られている。
【００１１】
本発明において特に好ましい対象は、対応する成熟タンパク質鎖におけるＮ末端から数えて、約９５７個のアミノ酸を有する末端欠失型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ：基準となるものの末端部分を削除して短縮化したもの）αv鎖と、約６９２個の末端欠失型のβ3鎖を有する可溶性ヒト組換え受容体を利用できるようにすることである。この好ましい形の可溶性受容体では、成熟タンパク質鎖における実質的に全ての膜通過ドメインとともに細胞質ドメインの全てが除去されている。しかしながら、以下に示すとおり、膜通過ドメインの部分を含む可溶性受容体も本発明に含まれる。また、本発明は、ヒトαvβ3付着受容体に限定されない。本発明における方法によれば、ヒト由来でないαvβ3受容体を問題なく生産することもできる。更に、ヒトのものに相当する受容体を、以下に示す本発明の方法によって生産することができる。
【００１２】
本発明にかかる方法によってリガンド結合活性が損なわれていない、高純度に精製された可溶性組換えヒトαvβ3付着受容体を収率よく生産することができ、この方法は、
（ｉ）Ｃ末端から数えて少なくとも５２個のアミノ酸を含む部分の分だけ鎖長が短くなった前記受容体のαv鎖をコードする第一のｃＤＮＡと、Ｃ末端から数えて少なくとも６１個のアミノ酸からなる部分の分だけ鎖長が短くなった前記受容体のβ3鎖をコードする第二のｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系のバキュロウイルス転送ベクターに組み込んでサブクローニングを行い、
（ｉｉ）上記の第一及び／または第二ＤＮＡを含むベクターを、前記発現系のバキュロウイルスのゲノムＤＮＡに移入させて組換えバキュロウイルスを形成し、
（ｉｉｉ）該組換えバキュロウイルスの完全な状態を昆虫細胞に感染させ、
（ｉｖ）感染した昆虫細胞を培養基で培養して、末端欠失型のヘテロ二量体αvβ3受容体を該培養基中に発現させ、
（ｖ）前記発現した受容体を、ヒトαvβ3受容体またはその個々の成分鎖に特異的に結合する抗体を使用した抗体アフィニティクロマトグラフィにより、培地から分離し、精製することを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の態様として、完全鎖長の組換えαvβ3受容体、特に、ヒト由来のものの生産のための類似の方法が開示されている。この方法は以下の工程によって特徴付けられる。
【００１４】
（ｉ）前記受容体の完全なαv鎖をコードする第一のｃＤＮＡと、前記受容体の完全なβ3鎖をコードする第二のｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系のバキュロウイルスベクターに組み込み、サブクローニングをする。
【００１５】
（ｉｉ）上記第１及び／または第２のＤＮＡを含むベクターを、前記バキュロウイルス発現系のバキュロウイルスのゲノムＤＮＡに移入させ、組換えバキュロウイルスを得る。
【００１６】
（ｉｉｉ）前記の完成された組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させる。
【００１７】
（ｉｖ）感染した昆虫細胞を培養基で培養し、発現した細胞膜結合型の受容体を界面活性剤で溶解させる。
【００１８】
（V）上記で溶解した受容体をヒトαvβ3受容体またはその成分鎖に特異的である抗体を使用した抗体アフィニティクロマトグラフィにより細胞を除いた培地から精製する。
【００１９】
本発明のαvβ3受容体は、天然の受容体を阻害することのできる治療用化合物を発見するために有用である。従って、本発明は、このような薬剤化合物の発見のためにこの可溶性受容体を適用する方法をも含む。前述したように、本発明にかかる受容体を利用して開発が期待できる薬剤化合物としては、１個以上のＲＧＤユニットを含む全ての、線状または環状ペプチドまたはαvβ3付着受容体に対してＲＧＤペプチドと同様な生物学的活性を示す非ペプチド類似体がある（下記参照）。
【００２０】
本発明には、先に記載した、更に以下に記載するαvβ3受容体を使用した、治療用化合物、特にαvβ3受容体を阻害できるＲＧＤペプチドまたはその非ペプチド類似体の天然のαvβ3受容体を阻害できる能力に基づいたスクリーニングの方法も含まれる。
【００２１】
本発明においては、以下の略語が用いられている。
【００２２】
αvβ3    インテグリン
１７Ｅ６    ｍＡｂ（モノクローナル抗体）
ＡＰ３      ｍＡｂ
ＬＭ６０９  ｍＡｂ
Ｐ４Ｃ１９  ｍＡｂ
Ｐ１Ｆ６    ｍＡｂ
αv（ＦＬ）  完全鎖長のαv鎖
αv（ＳＬ）  短鎖（末端欠失型αv鎖）のαv
β3（ＦＬ）  完全鎖長のβ3鎖
β3（ＳＬ）  短鎖（末端欠失型β3鎖）のβ3
ＢａｃＰＡＫ  バキュロウイルス発現系
ＳＦ９（Ｓｆ９）、ハイ・ファイヴ（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ）  昆虫細胞
Ｍ．Ｏ．Ｉ．  感染多重度
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる微生物、細胞株、プラスミド、ファージミド、プロモータ、耐性マーカ、複製オリジン、その他のベクターフラグメントは、市販されているか、一般的に入手可能なものである。上記のうちで市場から直接入手できないものについても定法による調製可能であるか、または別の一般的に入手可能な材料で代用可能である。本発明では、わずかに改変または変更させた配列を有するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、あるいは化学的方法や物理的方法により意図的または無作為に得られた変異体や変種も用いられる。一般的にここに記載された特性及び機能を示すこれらの全ての変異体や変種が含まれる。
【００２４】
本発明による技術と方法に関しての本質的な内容がこの明細書に詳しく説明されている。詳しく説明されてないその他の技術は、当業者には知られている標準の方法であるか、参考文献に詳しく説明されているか、原特許申請書、標準文献 (Sambrook et al., 1989: 「分子クローニング, 実験マニュアル」, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbar Laboratory Press; Harlow and Lane 1988:「抗体ー実験マニュアル」, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press) に記載されている。
【００２５】
インテグリンαvとインテグリンβ3のｃＤＮＡについても知られており[Fitzgerald et al., 1987, J. Biol. chem. 262, 3936(β3); Suzuki et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 14080 (αv)]、入手も可能で、例えば、ヌクレオチド合成器により作製することもできる。
【００２６】
本発明による成熟完全鎖長のヒトαvタンパク質鎖は、１０１８個のアミノ酸を有するが、そのうち膜通過ドメインには約２９個のアミノ酸が、細胞質ドメインには約３２個のアミノ酸がある。従って、細胞質ドメイン及び膜通過ドメインを含む領域は合計約６１個のアミノ酸から構成される。この領域は、この鎖のＣ末端に位置する。従って、本発明において好ましい末端欠失型αv鎖は、およそ９５７個のアミノ酸から構成される。
【００２７】
本発明による成熟完全鎖長のヒトβ3タンパク質鎖は、７６２個のアミノ酸を有するが、そのうち膜通過ドメインには、αv鎖の場合と同様に、約２９個のアミノ酸があり、細胞質ドメインには約４１個のアミノ酸がある。従って、細胞質ドメイン及び膜通過ドメインの領域は合計約７０個のアミノ酸で構成されている。これら膜通過ドメイン及び細胞質ドメインの領域はＣ末端側に位置している。従って、本発明において好ましい末端欠失型β3鎖は、およそ６９２個のアミノ酸から構成される。
【００２８】
本発明においては、受容体鎖の全鎖長から細胞質ドメインと膜通過ドメインの全てが除かれていることが好ましい。しかし、細胞質ドメイン全部と膜通過ドメインのアミノ酸鎖の１部分だけを取り除いたものでもかまわない。αv鎖またはβ3鎖が末端欠失型は、膜通過ドメイン由来の、１〜１０個のアミノ酸、特に、１〜５個のアミノ酸が付いていることが好ましい。この末端欠失型αvβ3受容体はその後の状況においてグリコシル化される。グリコシル化の程度は、その由来（起源）と使用した宿主により違ってくる。
【００２９】
本発明で使用したバキュロウイルス発現系は、よく知られたもので一般に入手可能である。好ましいバキュロウイルス発現系としては、クロンテックラボラトリ社（Clontech Laboraratories, Inc.；ケンブリッジバイオサイエンス、ＵＫから入手可能）のＢａｃＰＡＫ（商品名）であるが、その他のものでも使用可能である。
【００３０】
本発明によれば、昆虫細胞を組換えバキュロウイルスＤＮＡで感染させる。原理的にはすべての昆虫細胞システムを使えるが、ウイルスシステムに対する高感染性と、良好かつ安定した発現を保証するものが好ましい。昆虫細胞としては、市販されているＳＦ９細胞、特に、ハイ・ファイヴ（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ）細胞が好ましい。本発明によれば、サブクローニングの段階ではＳＦ９細胞を使用し、最終の発現段階ではＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を使用することが好ましい（実施例参照）。
【００３１】
ＳＦ９細胞（例えば、Invitrogen Corporationから販売されている）は昆虫細胞用の品質を有する１０％胎児ウシ血清(FBS, Life Technologies, Inc.)を追加したＴＣ１００内で保存し、Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞(例えば、Invitrogen Corporation から販売されているＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）は１６．５ｍＭのＬ−グルタミン(Life Technologies, Inc.)、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）で補足したエクスプレスファイブ培地(Express Five medium、Life Technologies, Inc.)内で保存する。
【００３２】
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を使用して、ヒト組換えαvβ3受容体の生産を下記の要領で実施した。バキュロウイルス発現システムは、Kidd and Emery(1993, Appl. Biochem. Biotechonol. 42, 137; O'Reilly et al.,1992:「バキュロウイルス発現ベクター実験マニュアル」、Oxford University Press, Inc. New York)の提案した方法と同様に使用した。
【００３３】
ＰＣＲにより、膜通過ドメイン及び細胞外部分との境界（図１）をコードしている部位で末端を切り取ったαvとβ3鎖ｃＤＮＡを作製した。末端欠失型のαv鎖とβ3鎖［αv（ＳＬ）とβ3（ＳＬ）］ｃＤＮＡおよび完全鎖長のαv鎖とβ3鎖［αv（ＦＬ）β3（ＦＬ）］ｃＤＮＡを、バキュロウイルス転送ベクターｐＢａｃＰＡＫ９にサブクローニングした。本発明では、各受容体鎖のｃＤＮＡを、安定性に関する問題を避けるために、別々のベクターにそれぞれクローニングすることもできる。しかし、各鎖の等モル状態を維持するために単一のベクターを使用することが好ましい。実験では、驚いたことに、両方の受容体鎖のＤＮＡ配列を持つベクターが大きいものであったにもかかわらず安定であった。
【００３４】
削除される末端領域がそれぞれ、９８７個のαv鎖アミノ酸［９５７個の成熟タンパク質＋３０個のシグナルペプチド］及び７１８個のβ3鎖アミノ酸［６９２個の成熟タンパク質＋２６個のシグナルペプチド］をコードする完全な膜通過ドメインと細胞質ドメインを含む場合には、この末端欠失型αvとβ3鎖のｃＤＮＡには通常シグナル配列が含まれる。完全長の、または末端欠失型のαvもしくはβ3鎖を発現させるための組換えバキュロウイルスは、線状化にしたバキュロスウイルスＢａｃＰＡＫ６をゲノムＤＮＡに同時移入により形成し、その後、ＳＦ９細胞またはＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞中でのプラーク精製及び増幅によって濃度を高めた(O'Reilly et al., 1992: 「バキュロウイルス発現ベクター：実験マニュアル」, Oxford University, Inc. New York）。移入したプラスミドが正確に移入されているかどうかを、組換えウイルスゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロット手順により確認した。
【００３５】
完全鎖長のαv鎖を発現するＳＦ９細胞とＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を代謝標識して検出した結果から、約１１０ｋＤａと１５０ｋＤａの２通りの組換えタンパク質が存在することが判明した（図２Ａ、３列目）。同様に、完全鎖長のβ3鎖を発現するＳＦ９細胞を代謝標識して検出した結果でも、約９０ｋＤａと１２５ｋＤａの２本のバンドが見られた（図２Ａ、４列目）。疑似感染させた場合（１列）と、組換えＤＮＡが組み込まれていないウイルスで感染をさせた場合（列２）との比較から、ウイルスのライフサイクルの非常に遅い段階における宿主細胞ゲノムの抑制度が示された。個々の完全鎖長か、または、末端欠失型のαvもしくはβ3をそれぞれ発現する細胞をツニカマイシンで処理すると（図２Ｂ、１、３、５、７列）、移動速度の遅いバンドの発生が阻害されており、これは、１５０／１１０ｋＤａバンド（図２Ｂ、２、４列）と１２５／９０ｋＤａバンド（図２Ｂ、６、８列）の部位が、組換えタンパク質のグルコシル化された部分とグリコシル化されない部位とにそれぞれ対応していることを示している。この結果は、Ｎ−グリコシル化のような翻訳後修飾がなされるバキュロウイルス系における組換えタンパク質の割合が、ウイルスのライフサイクルの遅い段階では減少するという２、３の報告(Jarvis and Finn 1995, Virology 212, 500)を確認するものである。αvタンパク質とβ3タンパク質がグリコシル化されている場合とグリコシル化されていない場合でのサイズにおける比較的大きな差異は、タンパク質がかなりの量でグリコシル化され、しかも、αvタンパク質の場合には１３のＮーグルコシル化部位があること、β3タンパク質には１０のＮーグルコシル化部位があることに関係がある。
【００３６】
インテグリンは細胞外マトリックスと細胞骨格との間の構造付着機能により細胞形態を決定し、調節する(Schwartz et al., 1995, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 549; Montgomery et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8856)。バキュロウイルス感染の後期の段階では、ＳＦ９細胞／Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞細胞は、αvまたはβ3のいずれかだけを発現する組換えバキュロウイルスを感染させた時も、組換え体を含まないウイルスを感染させた時と同じように、細胞形態は通常円形になりその結合も緩やかである（図３Ａ）。しかし、αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）、または、αv（ＳＬ）＋β3（ＦＬ）を共発現するウイルスを感染した昆虫細胞では、その細胞同士が強固に結合され、さらに大きく広がった細胞形態が見られる（図３Ｂ及び図３Ｃ）。αv（ＦＬ）＋β3（ＳＬ）、または、αv（ＳＬ）＋β3（ＳＬ）を発現するウイルスを同時感染させた細胞では、その形態には変化は見られない。これらの結果は、α鎖の細胞質ドメインが、β鎖の細胞質ドメインの細胞骨格への親和性に対しての負の調節に関与しているという説(Filardo and Cheresh 1994, J. Biol. Chem. 269, 4641;Akiyama et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 15961; LaFlamme et al.,1994, J. Cell Biol. 126, 1287)を裏付けるものである。αvβ3受容体は、ペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有する多数のリガンドと結合する。このことに対応して、ビトロネクチンをコートしたプレート上でのαv及びβ3ウイルス感染ＳＦ９細胞の細胞形態の変化は、ＲＧＤペプチドを作用させる試験において阻害された。（表１）。
【００３７】
【表１】
0004349662.tif 000002
アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸、またはグリシンの代わりにβ−アラニンで置換した対照ペプチド、すなわちｃｙｃ（ＲＧＥｆＶ）およびｃｙｃ（ＲβＡＤｆＶ）を使用した場合にも細胞形態に影響はなかった。
【００３８】
ＳＦ９細胞よりもバキュロウイルスの発現分泌タンパク質を多く産生すると言われている(Davis et al., 1993, In Vitro Cell Dev. Bio. Anim. 29A, 388)Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞に、完全鎖長のαvとβ3、末端欠失型のαvとβ3の両方を発現する組換えバキュロウイルスを種々に組み合わせたものを感染させた。細胞抽出物または細胞で調節した培地を用いたｍＡｂ  ＬＭ６０９とαvβ3との複合体の免疫沈降実験（図４）の結果から、組換えαvβ3ヘテロ二量体が、そのαv鎖とβ3鎖の一つまたは両方が完全鎖長を有する時には細胞表面に存在することが分かっている（図４、１〜３列）。さらに重要なことは、末端欠失型のαvと末端欠失型のβ3の同時発現の場合には、可溶性のヘテロ二量体が分泌されることである（図４、９列）。無血清環境で可溶性のαvβ3の産生によって、その後の後続する処理が大きく簡便化され、抗αvβ3化合物を探索するための大規模なスクリーニング手順の構築にある程度の柔軟性を導入できることが示された。
【００３９】
本発明にかかる、新規な末端欠失型のαvβ3受容体およびその完全鎖長の変異体は、組換え技術による発現工程の後、抗体アフィニティクロマトグラフィーで精製される。本発明で使用した発現系は、上記の受容体の高産生に極めて効果的なものであり、異タンパク質の産生が少なく、単一の精製手順で、通常十分に高度に精製された製品を得ることができる。抗体アフィニティクロマトグラフィーはよく知られた技術である。ここでは、ある抗原エピトープに対して特異性を有する抗体が、適当に活性化された支持体マトリックス、例えば、修飾されたアガロースやセファロースに酵素的にあるいは化学的に結合している。本発明によれば、使用される好適な抗体はαvβ3受容体、または単一のαv鎖またはβ3鎖に対して高い特異性を有していることが必要である。アフィニティクロマトグラフィーに使える抗体は沢山知られており、それらのいくつかは誰にでも利用できるパブリックドメインの抗体であるのでその入手に問題はない。ＡＰ３（抗−β3）、ＬＭ６０９（抗−αvβ3）、Ｐ４Ｃ１０（抗−β1）、Ｐ１Ｆ６（抗−αvβ5）、１７Ｅ６（抗−αv）については詳細な特性解析がなされている(Mitjans et al., 1995, J.Cell Sci. 108, 2825)。モノクローナル抗体である１７Ｅ６は、２７２−１７Ｅ６と呼ばれるハイブリドーマ細胞から産生される抗体のことである。このハイブリドーマ細胞は、ドイツ・微生物寄託機関(Braunschweig, FRG)（寄託番号ＤＭＳ・ＡＣＣ２１６０）に寄託された。このモノクローナル抗体１７Ｅ６は、ヨーロッパ特許出願（０７１９８５９）での特許の対象でもある。抗−β3抗体ＡＰ３は、寄託機関ＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号：ＨＢ−２４２）。抗体１７Ｅ６と抗体ＡＰ３は、容易に入手できるので、特に本発明では適している。ＬＭ６０９(Cheresh and Spiro 1987, J. Biol. Chem. 262, 17703)は、α鎖とβ鎖の両方に対しての抗体として作用するので特に興味があるものである。
【００４０】
上記の抗体を支持体に担持させた後、感染後溶菌させた昆虫細胞の清浄な無細胞培地（本発明にかかる末端欠失型、または、溶解された完全鎖長の組換え受容体を含む）を、上記の支持体の入ったカラムに入れ、数回このカラム内を循環させて、発現した受容体を固定抗体に結合させる。その後、精製したαvβ3受容体をイオン性緩衝液でカラムから洗い出して、そのままリガンド結合やその他の実験にすぐに使用できる。
【００４１】
ヒトのビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲンは、ヒト血漿から精製できる(Yatohgo et al., 1988, Cell Struct, Funct. 13, 281; Ruoslahti et al., 1982, Methods Enzymol 82, Pt A, 803; Ruoslahti 1988, Ann. Rev. Biochem. 57, 375; Kazal et al., 1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989)。組換えヒトαvβ3の精製及び特性の解析は、詳細には下記の方法で行うことができる。１７Ｅ６、ＡＰ３またはＬＭ６０９抗体を使用したアフィニティ・クロマトグラフィーを実施する。ヒト胎盤由来のαvβ3を、例えば、スミス＆チェレッシュ(Smith and Cheresh)(1988, J.Biol. Chem. 263, 18726)の方法を採用して抗体アフィニティ・クロマトグラフィーで精製する。
【００４２】
完全鎖長の組換えαvβ3は、αv（ＦＬ）とβ3（ＦＬ）を同時に感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞昆虫細胞の抽出物を非イオン系界面活性剤に溶解させることにより精製できる。可溶性の末端欠失型のαvβ3は、αv（ＳＬ）とβ3（ＳＬ）を同時に感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞からは、界面活性剤を使用せずに精製できる。ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）においては、同じ抗体（ＬＭ６０９、１７Ｅ６、ＡＰ３）によって、末端欠失型の可溶性の組換えαvβ3と、完全鎖長の可溶性組換えαvβ3の両方が認識され、ＥＬＩＳＡによるタイター値で判定した場合に、溶解された胎盤由来のαvβ3と同程度の親和性を示すことが判明した。しかし、抗−β1（Ｐ４Ｃ１０）抗体または抗−αvβ5特異（Ｐ１Ｆ６）抗体は、どちらも認識せず、これは、エピトープの保存と、αvβ3に他のインテグリンが低濃度で混入していることを示す（図５）。
【００４３】
精製した胎盤由来αvβ3は、非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）を行うと、解離をして、１６０ｋＤａのα鎖と９５ｋＤａのβ鎖の２本のバンドが現れる（図６、２列目）。精製した完全鎖長の組換えαvβ3では、約１４０ｋＤａのαv鎖と、９０ｋＤａのβ3鎖に解離したバンドが現れる（図６、３列目）。組換えαvβ3が低分子量となるのには、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞により発現された組換えタンパク質の不完全なグリコシル化または変性したゴリコシル化が原因している可能性がある。精製した可溶性の組換えαvβ3では、約１２０ｋＤａの末端欠失型αv鎖と、８０ｋＤａの末端欠失型β3鎖への解離を示すバンドが現れる。この分子量の低下は、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞において発現した組換えタンパク質の不完全な、あるいは通常と異るグルコシル化のためであると考えられる。精製された組換えαvβ3は、約１２０ｋＤａの末端欠失型のαv鎖と、約８０ｋＤａの末端欠失型のβ3鎖に分離する。
【００４４】
αv鎖は、通常、翻訳後開裂が起こり、密度の重鎖と軽鎖に分かれてからこれらの間にジスルフィド架橋結合が起こる（図１）(Hynes 1992, Cell 69, 11)。それ故、還元条件下では、胎盤由来のαvβ3のうちのα鎖は、さらに解離して１４０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖となり（図６、６列目）、β鎖は１１０ｋＤａに相当する位置まで移動する。α鎖の軽鎖の中には膜通過を遮断する部位があり、完全鎖長のα鎖も、末端欠失型の組換えα鎖も、還元条件下では、１４０ｋＤａの位置までの移動を起すはずであった。しかし、完全鎖長αv鎖と、可溶性αv鎖では、還元条件下でも非還元条件下でも同じ分子量を示し（７、８列目）、これは、αv鎖には翻訳後に部分的な開裂しか起こらなかったことを示している。７、８列目の約１２０ｋＤａでの弱いバンドは重αv鎖であると考えられる。胎盤由来のαvβ3と組換えαvβ3との間での相違は、バキュロウイルス感染の非常に遅い時期における不完全なタンパク質分解プロセスに原因がある(O'Reilly et al., 1992, 「バキュロウイルス発現ベクター：実験マニュアル」, Oxford University Press. Inc. New York)。表２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果である。
【００４５】
【表２】
0004349662.tif 000003
本発明の方法によれば、短鎖の組換えαvβ3受容体と完全鎖長の組換えαvβ3受容体の両方が作製可能である。本発明により作製された受容体が、なかでも末端欠失型が、例えばヒト胎盤から分離して比較例として用いた天然の受容体のリガンド結合特異性を有することを示すために、結合特異性分析を行った。この分析のために、αvβ3受容体の拮抗阻害剤として知られるリガンドを使用した。前述したように、ＲＧＤアミノ酸配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン）を含む線状化ペプチドまたは環状ペプチドが優れた拮抗阻害剤である。この目的のための適当なペプチドとしては、例えば、次のものがある。ＧＲＧＤＳＰＫ、エチスタチン(Echistatin)、環状−ＲＧＤｆＶ、環状−ＲＧＤｆＮＭｅＶ、環状−ＲβＡＤｆＶ、ＫＴＡＤＣ（Ｔｒｔ）ＰＲＮＰＨＫＧＰＡＴ、ＧＲＧＥＳＰＫ、環状−ＫＧＤｆＶ、環状−ＲＧＥｆＶ。これらの他に、ＲＧＤペプチドと類似した作用をし、αvβ3受容体との結合能のある非ペプチド系化合物も使用できる。このようなＲＧＤペプチド及び非ペプチド類似体はすでによく知られた物質であり（ヨーロッパ特許出願番号９６１１３９７２，ヨーロッパ特許公開０５７８０８３，０６３２０５３，０４７８３６３，０７１０６５７，０７４１１３３、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２１８１）、公知の標準的な方法で合成することも可能である。これらのリガンドを、従来技術で知られている方法により、標識分子または原子で修飾して使用する。ビオチン化リガンドを使用することが好ましい。
【００４６】
末端欠失型の組換えαvβ3受容体あるいはその完全鎖長誘導体を、例えば、マイクロタイタープレート上に吸着させて固定化し、上記の標識リガンドを反応させる。本発明によるαvβ3受容体は上記のリガンドと強く結合するが、非ＲＧＤペプチドとは結合せず、ヒト胎盤由来の生体αvβ3受容体と極めて類似した性質を示す。このことは、本発明にかかる方法により入手できる受容体が、特異的なリガンド結合能という点で、本来の機能を有していることを示している。
【００４７】
詳細には、末端欠失型の組換えαvβ3受容体の生物活性の測定は下記の方法で実施され得る。
【００４８】
組換えαvβ3受容体と胎盤由来のαvβ3受容体の両方について、末端欠失型のものと完全鎖長のものを固定化して、それらに対するビオチン化リガンドの結合能を測定する。αvβ3受容体に結合することが知られている３種類の、ＲＧＤ配列を有するリガンド（ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン）を使用した。これらのリガンドは、その濃度に応じて、完全鎖長の受容体と可溶性受容体のそれぞれの調製物と結合し、結合における重複した濃度依存性と飽和濃度は胎盤由来のαvβ3受容体の場合と同様である（図７）。組換えαvβ3受容体との特異的相互反応の試験にビトロネクチンを使用する。ビオチン化したビトロネクチンと上記のペプチドまたは非ペプチド類似体の濃度を増加させながら固定化受容体に同時にインキュベートして反応させた。上記で述べたペプチド化合物は、ビトロネクチンが胎盤由来のαvβ3受容体、完全鎖長のαvβ3受容体および可溶性組換えαvβ3受容体のいずれにも結合することを阻害し（図８、９）、β−アラニン−グリシンの対照ペプチドの約４〜５倍の阻害効果を示す。各受容体の環状−ＲＧＤｆＶに対するＩＣ50は、ナノモル（１−５ｎＭ）範囲の低い濃度であった。ここで使用した同じ方法を使えば、すでに知られているαvβ3受容体に特異的なリガンドから、αvβ3受容体阻害剤になりうる可能性のある物質を薬剤化合物をとしてスクリーニングすることが可能となる。
【００４９】
本発明は、バキュロウイルス昆虫細胞発現系が、培地中あるいは細胞表面上に分泌される可溶性の受容体としての完全な機能性を有するヒト組換えαvβ3インテグリンを多量に発現させるために使用できることを示している。αvβ3に対する特異的複合抗体（ＬＭ６０９、１７Ｅ６、ＡＰ３）での沈降及び精製によって示されるように、この受容体の二重（ＳＬ）末端欠失型が複合体の形で分泌される。最適の条件下であれば、１リットルの培養基（上清）当たり１〜１０ｍｇ、好ましくは２〜５ｍｇの収量（可溶性であるとともに完全鎖長の受容体）を得ることができる。可溶性αvβ3の生化学的に有用な量での定常的な生産ができることで、αvβ3を使用した薬剤化合物のスクリーニングにおける高生産性及びこの重要な受容体の構造解析ができるようになる。なお、胎盤組織から分離される天然の受容体の収量は組織１ｋｇ当たり約１〜２ｍｇである。
【００５０】
本発明における方法で得られた組換え完全長の、及び末端欠失型のαvβ3タンパク質のそれぞれの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡによる検定において、９５〜９９％、好ましくは９７〜９９％である。可溶性の組換え受容体では、完全鎖長の組換え受容体に較べて阻害剤に対する感度が約４分の１である。末端欠失型の可溶性受容体のもうひとつの長所は、界面活性剤を使用せずに精製できることである。通常必要とされる非イオン系界面活性剤は極めて高価である（例えば、オクチル−β−Ｄグリコーピラノシド１０ｇで５００ドル）。胎盤組織から３〜４ｍｇの受容体を溶解させるのに必要な界面活性剤は約２５ｇである。
【００５１】
一方が完全鎖長で他方が末端欠失型のα鎖とβ鎖［αv（ＦＬ）×β3（ＳＬ）またはαv（ＳＬ）×β3（ＦＬ）］を有する組換えウイルスを共感染させた細胞は、ヘテロ二量体の受容体を細胞表面に発現する。しかし、α鎖とβ鎖が両方とも完全長であるか、あるいは、β鎖が完全長でα鎖が末端欠失型を含む細胞では、それがビトロネクチンに結合する時に形状変化が起こる。この付着と拡張という細胞形態の変化がαvβ3の特異的性質を示すことは、ＲＧＤ配列を含むペプチドの添加がリガンドと天然受容体との相互作用を特異的にブロックする一方で、ＲＧＥ配列またはＲＡＤ配列を含むペプチドの両方はこれらの相互作用をブッロクしない点によって示される。完全鎖長のα鎖と末端欠失型のβ鎖を有する細胞では拡張は見られない。
【００５２】
ＥＬＩＳＡの検定結果によれば、β3に特異的な抗体ＡＰ３(Newman et al., 1985, Blood 65, 227)と、αvに特異的である抗体１７Ｅ６(Mitjans et al., 1995, J. Cell Science. 108, 2825)と、複合体に特異的である抗体ＬＭ６０９(Cheresh and Spiro 1987, J. Biol. Chem. 262, 1770323)は、完全鎖長の受容体と末端欠失型の受容体の両方を特異的に認識する。このことは、組換えインテグリンが胎盤由来のαvβ3と同じエピトープをもっていることを示している。
【００５３】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果において、αv−鎖およびβ3−鎖に典型的なバンドが現れている。完全鎖長の組換えα鎖の分子量は胎盤由来の完全鎖長のα鎖に較べて小さい（１６０ｋＤａに対して約１４０ｋＤａ）が、これは、昆虫細胞におけるグリコシル化の度合いの減少か、またはグルコシル化の内容の違いが起こっているためと考えられる。
【００５４】
完全鎖長及び可溶性の組換えαvβ3受容体は共に、リガンドであるビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチンに特異的に結合し、ビトロネクチンの結合は、ＲＧＤを有するペプチドにより特異的に阻害され、その場合の濃度依存性は胎盤由来の受容体と同じである。
【００５５】
このように、完全鎖長、および、末端欠失型のヒトαvβ3受容体に対するリガンドの結合特異性や胎盤由来のものと同定度の飽和濃度が判明したことにより、労力を使わずに、ヒトの胎盤を使用することによるリスクもなしに、バキュロウイルス昆虫細胞発現系を使用して機能的な組換えαvβ3受容体を大規模生産することが可能となる。さらに、本発明で使用したバキュロウイルス発現系を使用すれば、修飾受容体やキメラ受容体も発現させることも可能で、これらは、リガンドの結合とそれに続くシグナル伝達機構の分子レベルでの研究に有用なものとなる。
【００５６】
【実施例】
実施例１：組換え転送ベクターの構築
αvｐｃＤＮＡ-１Ｎｅｏ（Felding-Habermann 1992, J. Clin. Invest., 89, 2018）から、αvｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片として切り出し、転送プラスミドｐＢａｃＰＡＫ８(Clontech社)に組み込んでクローニングを行った。ここで作製された組換え体をαv（ＦＬ）（ｐＢａｃ８）と名づけた。β3ｐｃＤＮＡ−１Ｎｅｏからインテグリンβ3ｃＤＮＡをＸｂａＩ断片として切り出し、転送プラスミドｐＢａｃＰＡＫ９(Clontech社)に組み込んでクローニングした。膜貫通部分を欠失した末端欠失型のαvｃＤＮＡとβ3ｃＤＮＡをＰｆｕ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ(Stratragene社)を使用したポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により構築した。
【００５７】
成熟αv（シグナル配列を含む）の１〜９８７番のアミノ酸をコードしている末端欠失型αvｃＤＮＡを下記に示すオリゴヌクレチド・プライマーを用いて作製した。
【００５８】
５’−ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ−３’（前進プライマ、配列番号：１）と、
５’−ＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ［ＡＣＴ］  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡＴＧＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ−３’［逆方向プライマ（配列番号：２）であり、９８７番のアミノ酸をコードする配列に続いて翻訳終始コドン（ＡＣＴ）を含み、この後にＸｂａＩ制限酵素切断部位（下線部）がある。］。
【００５９】
ＰＣＲ生成物を制限酵素Ｓａ１ＩとＸｂａＩで消化して、その断片をＳａ１Ｉ／ＸｂａＩで切断されたαvｐｃＤＮＡ−１Ｎｅｏに組み込みクローニングした。末端欠失型のαvｃＤＮＡをｐＢａｃＰＡＣ９のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断部位に組み込んでサブクローニングをして、産生したクローンをαv（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）と名づけた。成熟β3（シグナル配列を含む）の１〜７１８番のアミノ酸をコードしている末端欠失型β3ｃＤＮＡを下記に示すオリゴヌクレチド・プライマーを用いて作製した。
【００６０】
５’−ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ［ＡＴＧ］  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ−３’［前進プライマー（配列番号：３）であり、翻訳開始コドン（ＡＧＴ）とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（下線部）を含む］と、
５’−ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ［ＣＴＡ］  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ−３’［逆方向プライマ（配列番号：４）であり、７１８番のアミノ酸をコードする配列に続いて翻訳終始コドン（ＣＴＡ）を含み、この後にＸｂａＩ制限酵素切断部位（下線部）がある。］。
【００６１】
ＰＣＲ生成物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断して、その断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切断されたｐＳＫ＋(Stratagene社)に組み込んでクローニングをした。産生したクローン[（β3（ＳＬ）（ｐＳＫ＋）]をＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ベーリンガーマンハイム社）で補充して末端平滑化を行った。平滑末端を有する線状化プラスミドをＸｂａＩで消化して、その断片をｐＢａｃＰＡＫ９のＳｍａＩ／ＸｂａＩ切断部位に組み込んでサブクローニングをした。産生したクローンをβ3（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）と名づけた。αv（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）とβ3（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）の両方のＰＣＲ増幅部位のＤＮＡ塩基配列を確認して、その構築物のすべてについて、正確なサイズのタンパク質が発現されているかについて、ＴＮＴ−結合網状赤血球溶解液システム（Coupled Reticulocyte Lysate System；Promega社）を使用して、バクテリオファージＴ７プロモータでのin vitro転写と翻訳により試験した。
実施例２：組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルスゲノムＤＮＡであるＢａｃＰＡＫ６(Clontech)を高タイターのストックから入手して(Page and Murphy 1990: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, New Jersey, USA)、制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ(Kitts and Possee 1993, Biotechniques 14, 810)で線状化した。完全鎖長及び末端欠失型のαvとβ3インテグリンを発現する組換えバキュロウイルスクローンを、クローンテック社(Clontech)のＢａｃＰＡＫ製品プロトコールに従って作製した。負の対照として使用するために、ｐＢａｃＰＡＫ９を転送プラスミドとして使用して、組換えＤＮＡを含まないクローンを調製した。
【００６２】
正確に組換えられたウイルスクローンが産生されていることをＰＣＲで増幅させて確認し、そのウイルスをＳＦ９細胞に感染させた(O'Reilly at al., 1992, バキュロウイルス発現ベクター；実験マニュアル, Oxford University Press Inc, New York)。
実施例３：ＳＦ９細胞に発現されたタンパク質の代謝パルス標識。
【００６３】
文献記載の方法で、ＳＦ９細胞の代謝パルス標識検出を実施した(Summer and Smith 1987:「バキュロウイルスと昆虫細胞の取扱いマニュアル」、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin B-1555)。指定に応じて、代謝パルス標識を行う前と行っている間の１６時間にわたって、濃度１０μｇ／ｍｌのツニカマイシン（シグマ）を反応させた。細胞は１００μｌの緩衝液[1% Nonidet(商標) P-40, 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.4 mM Pefabloc(商標)(Boehringer Mannheim社), 10μg/ml Leupeptin及びE64(sigma), 10 mM Tris/HCl; pH7.4; Nonidet P-40は界面活性剤であり、Pefabloc(商標)は、プロテアーゼ阻害剤である）] 中で溶菌させた。菌溶解液をエッペンドルフマイクロヒュージにより１４００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、還元条件下で、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動で分離した。その後、固定化させ、乾燥してオートラジオグラフィを実施した (Sambrook et al., 1989:「分子クローニング：実験マニュアル」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
実施例４：昆虫細胞でのタンパク質の発現
組換えタンパク質が、Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞により、単分子層または懸濁液の状態で発現された。αvを発現する組換えバキュロウイルスと、β3を発現する組換えバキュロウイルスの両方を、培地を最小の量にして、静かに撹拌しながら同時感染させた。この時の、それぞれの感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）は５〜２０（１個の細胞に対して５〜２０のウイルスＤＮＡを感染させる）であった。２時間後に、細胞だけを新鮮なＥｘｐｒｅｓｓ・Ｆｉｖｅ培地に移して２７℃で、４８〜６４時間インキュベートした。膜に結合している組換えインテグリンを分離するために、遠心分離（１０００×ｇ，１０分）を行い、細胞を収集し細胞ペレットとして使用した。可溶性組換えインテグリンを分離するために、細胞を除去した上清を使用した。
実施例５：免疫沈降法
Ａｆｆｉｇｅｌ（商標）ビーズ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）(Mitjans et al., 1995, J. Cell Sci.108, 2825)に結合したαvβ3複合体の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体ＬＭ６０９を使用して、表面ビオチン化細胞の抽出液と細胞で調整した培地（cell conditioned medium）での免疫沈降検出法を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとHybond-PVDF膜(Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350)上でのウエスタンブロット法を実施した後、メーカよりの指示書に従ってＥＣＬウエスタンブロット検出試薬(Amersham社)を用いた強化化学ルミネセンス法を行ってビトチン化タンパク質の検出を行った。
実施例６：細胞の形態変化の検討
ＳＦ９細胞（１×１０6菌／ウエル）を６枚のウエル・プレート上にそのままか、あるいは、精製ヒト血漿ビトロネクチン（ＰＢＳ中濃度５μｇ／ｍｌ；２時間）をコーティングしたプレート上に固定し、非特異的部位をブロックした（ＰＢＳ中濃度３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を使用）。その後、種々の組み合わせでウイルスを感染させた。感染をさせた後４８時間、細胞形態に変化がないか観察した。指定に応じて、培地に１０μＭ環状ペプチドをαvインテグリン−リガンド相互作用  [環状（ＲＧＤｆＶ）、環状（ＲβＡＤｆＶ）または環状（ＲＧＥｆＶ）（ここで小文字はＤ−アミノ酸）]の競争的阻害剤として添加した。
実施例７：組換えインテグリンの精製
完全鎖長のαvβ3を発現するＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を収集して、ＰＢＳで洗浄して、氷冷した細胞溶解用緩衝液（１００ｍＭ  ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、１ｍＭＣａＣｌ2、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商標）、ｐＨ７．４、ＰＢＳ中）を用いて、４℃で１時間溶解させた。この細胞溶解液を遠心分離（１０、０００×ｇ、４５分、４℃）して、その上澄みを、細胞溶解用緩衝液で事前平衡化させてある、１７Ｅ６抗体使用のアフィニティクロマトグラフィ・カラムの中を４℃で１昼夜再循環させた。洗浄後（ベッド容量２０ｍｌ、２×１０ｃｍカラム、５０ｍＭ  ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４、ＰＢＳ溶液）、結合タンパク質を溶出させ（５０ｍＭ  ＯＧ、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ３．１）、その溶出液を２８０ｎｍでモニターをして、分画を直ちに中和した（１：５０容量３Ｍ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８）。ピーク分画をプールして透析（１０ｍＭ  ＯＧ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４、ＰＢＳ溶液）して濃縮し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。その一部（タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌ）を−８０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質分析法（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＢＳＡ標準液に対するタンパク質濃度を測定した。感染したＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞の培養上清（無細胞培地）を、１７Ｅ６抗体使用のアフィニティクロマトグラフィ・カラムの中を再循環させることにより、可溶性末端欠失型組換えαvβ3の精製を行った。洗浄、溶出、測定については、緩衝液に界面活性剤を含まない点を除いて、完全鎖長のαvβ3で説明した通りである。精製受容体のＥＬＩＳＡ検出には、ヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ接合体（ＢＩＯ−ＲＡＤ）と３， ３’，５，５’−テトラメチルベンジジン−ジヒドロクロリド（シグマ）を基質として使用した。
実施例８：
可溶性で膜貫通部分を完全長で有するαvβ3受容体の精製は、ＬＭ６０９抗体使用のアフィニティクロマトグラフィ・カラムを使用して行われた。
実施例９：抗体アフィニティクロマトグラフィ・カラムの作製
支持マトリックス（Ａｆｆｉｇｅｌ（商標）、ＢＩＯＲＡＤ）を５００ｍｌ冷却ＰＢＳにて洗浄した。精製抗体を、循環回転状態で、支持マトリックス（５ｍｇ／ｍｌゲル）と一緒に約１２時間インキュベートした。上澄みを取り除いて、その後、マトリックス上で引き続き活性を示しているものを０．１Ｍエタノールアミンで遮断した。支持マトリックスを０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で交互に洗浄してから直接使用した。
実施例１０：インテグリンリガンド結合、競争的アッセイ；リガンドと抗体のビオチン化
タンパク質のＰＢＳ溶液を５倍濃縮の結合用緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3）で１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。 作製したばかりのＮ−ハイドロキシスクシンイミドビオチン（シグマ）[1 mg/ml DMSO溶液]を、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液に添加して、２０℃で２時間インキュベートした。透析（ＰＢＳ、０．０２５％ＮａＮ3）後、タンパク質濃度を測定した。ビオチン化したタンパク質を４℃で保存した。
【００６４】
リガンド結合分析：インテグリンをコーティング緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０μＭ  ＭｎＣｌ2、２０ｍＭトリス／ＨＣＬ；ｐＨ７．４）で、濃度が１μｇ／ｍｌになるように希釈して、その１００μｌを９６ウエルマイクロタイタープレートに１昼夜４℃で吸着させた。プレートを一度に結合緩衝液（コート用緩衝液に０．１％(w/v)ＢＳＡを含む）で洗浄して、ブロッキング用緩衝液（３％(w/v)ＢＳＡを含むコート用緩衝液）で３７℃で２時間ブロックした。結合用緩衝液で洗浄した後、連続的に希釈ビオチン化リガンドを添加した。これを、インキュベート（３時間、３７℃）をした後、結合していないリガンドを結合緩衝液で洗い流し、結合したビオチンを抗ビオチン−アルカリフォスファターゼ接合抗体とインキュベートしてこれを検出して、さらに、ｐ−ニトロフェニル  リン酸（ＢＩＯ−ＲＡＤ）基質を使用して結合抗体を定量した。
実施例１１：インテグリンリガンド結合、競争的アッセイ
競争的アッセイ：インテグリンを前述の方法で固定化した。連続的に希釈した環状ペプチドをビオチン化ビトロネクチン（１μｇ／ｍｌ）と並行して添加した。３７℃で３時間インキュベートした後、上記と同じように、結合リガンドを検出した。３重アッセイを数回繰り返した。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】二量体のαvβ3受容体を図式化したものであり、末端欠失のためのαv鎖の切断部位とβ3鎖の切断部位が示されている。αv鎖は、通常、翻訳後開裂が起こり、重鎖（αvｈｃ）と軽鎖（αvｌｃ）に分かれ、その後、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）架橋により結合される。ＥＣ：細胞外、ＰＭ：細胞膜、ＩＣ：細胞内、ＩＡＣ：インテグリンと結合している細胞質骨格、Ｌｉｇ：リガンド。
【図２】（Ａ）疑似感染させたＳＦ９細胞（１列目）と組換え体を含まないウイルスを感染させたＳＦ９細胞（２列目）、αv（ＦＬ）を含むウイルスを感染させたＳｆ９細胞（３列目）またはβ3（ＦＬ）を含むウイルスを感染させたＳＦ９細胞（４列）を、35Ｓ標識アミノ酸を使用して２時間の代謝標識を行い、感染後４０時間で結果を見たものである。細胞抽出物は、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。右側に標準標識タンパク質の分子量をｋＤＡとして表示している。（Ｂ）αv（ＦＬ）（１、２列目）、αv（ＳＬ）（３、４列目）、β3（ＦＬ）（５、６列目）、β3（ＳＬ）（７、８列目）を感染させたＳＦ９細胞を、１０μＭツニカマイシンのＤＭＳＯ溶液で処理するか（１、３、５、７列）、あるいは、ＤＭＳＯだけで処理した場合（２、４、６、８列）の結果を示している。感染細胞を上記と同じように代謝パルス標識した。標準標識タンパク質を右に示している。
【図３】同時感染をさせた後の細胞形態の変化を示したものである。組換えタンパク質を含まないウイルス（Ａ）、αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）を含むウイルス（Ｂ）、αv（ＳＬ）＋β3（ＳＬ）を含むウイルス（Ｃ）をそれぞれ感染させたＳＦ９を感染後４８時間目に位相差顕微鏡で見たものである。
【図４】細胞表面と可溶性αvβ3との免疫沈降法分析の結果である。αv(ＦＬ)＋β3(ＦＬ)を含むウイルス（１、６列）、αv(ＦＬ)＋β3(ＳＬ)を含むウイルス（２、７列）、αv(ＳＬ)＋β3(ＦＬ)を含むウイルス（３、８列）、αv(ＳＬ)＋β3(ＳＬ)を含むウイルス（４、９列）または組換えタンパク質を含まないウイルス（５、１０列）を同時感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞から調製した細胞抽出物（１〜５列）と細胞で調整した培地（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）（６〜１０列）を使用した。αvβ3複合体をモノクローナル抗体ＬＭ６０９を使用して免疫沈降させ、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＰＶＤＦ膜に移し、ストレプトアジビン−ＨＲＰ接合体で標識検出した結果である。
【図５】精製受容体の分析結果である。各種のモノクローナル抗体を使用して、精製完全鎖長の、および末端欠失型のαvβ3のエピトープと純度が分析された。受容体濃度を増加させながら固定化させて、抗体ＬＭ６０９（抗−αvβ3抗体）、１７Ｅ６（抗−αv抗体）、ＡＰ３（抗−β3抗体）、Ｐ４Ｃ１０（抗−β1抗体）、Ｐ１Ｆ６（抗−αvβ5抗体）を反応させて分析した。縦軸は、４５０ｎｍでの吸光度。横軸：コートされた受容体濃度（μｇ／ｍｌ）。（○）胎盤由来αvβ3、（■）αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）、（◆）αv（ＳＬ）＋β3（ＳＬ）。
【図６】精製受容体の分析を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製受容体の分析である。１、５列：ＨＭＷ、２、６列：胎盤由来αvβ3、３、７列：αv(ＦＬ)×β3(ＦＬ)、４、８列：αv(ＳＬ)×β3(ＳＬ)。１、３、５、７列：非還元条件下。２、４、６、８：還元条件下。
【図７】精製組換えαvβ3の活性試験結果である。固定化受容体へのリガンド結合を示す。ビオチン化ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチンを固定化した受容体に結合させた。結合したリガンドを抗−ビオチン抗体で検出した。縦軸：吸光度（４０５ｎｍ）で示したリガンド結合。横軸：ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチンの濃度（μｇ／ｍｌ）。（○）胎盤由来αvβ3、（■）αv(ＦＬ)＋β3(ＦＬ)、（◆）αvΔ(ＳＬ)＋β3Δ(ＳＬ)。
【図８】異なる受容体とビトロネクチンの結合に対するＲＧＤペプチドの作用を示すものである。図に示した数種のペプチドの濃度を上げながら、ビオチン化ビトロネクチンをインキュベートした。縦軸：ビトロネクチンの結合率（％）、横軸：ペプチド濃度。（●）胎盤由来αvβ3、（■）末端欠失型組換えαvβ3（第１調製）、（▲）末端欠失型組換えαvβ3（第２調製）。
【図９】異なる受容体とビトロネクチンの結合に対するＲＧＤペプチドの作用を示すものである。図に示した数種のペプチドの濃度を上げながら、ビオチン化ビトロネクチンをインキュベートした。縦軸：ビトロネクチンの結合率（％）、横軸：ペプチド濃度。（●）胎盤由来αvβ3、（■）末端欠失型組換えαvβ3（第１調製）、（▲）末端欠失型組換えαvβ3（第２調製）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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