【手続補正書】
【提出日】平成20年4月22日(2008.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
資化可能な炭素源から光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス・ラエボラクティカス（Bacillus laevolacticus）を３３℃以上４５℃以下で嫌気培養し、この培養物からＤ−乳酸を単離精製することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
二酸化炭素、窒素、アンモニアおよびアルゴンから選ばれる少なくとも１種類を通気しながら嫌気培養することを特徴とする、請求項1に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項３】
水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムおよびアンモニアから選ばれる少なくとも１種類でpH4.5〜7.0に維持しながら培養することを特徴とする、請求項1または2に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項４】
酵母エキス濃度0.1%以上0.5%未満の培地で培養することを特徴とする、請求項1から３のいずれか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法による高純度Ｄ−乳酸の安価な製造方法に関する。より詳しくは、資化可能な炭素源から光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス・ラエボラクティカス（Bacillus laevolacticus）を用いてＤ−乳酸を製造するにあたり、培養液を水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムあるいはアンモニアでpH4.5〜7.0に維持し、二酸化炭素、窒素、アンモニアあるいはアルゴンを通気しながら嫌気的条件下で行う。発酵温度を33℃以上45℃以下で行うことにより乳酸生産速度を増加させなおかつ収率を向上させ、培地中の酵母エキス濃度を0.1%以上0.5%未満の低濃度で培養することで、Ｄ−乳酸のコストを下げなおかつ化学純度を上げることにより乳酸精製を容易にする。高収率、高光学純度、高化学純度でＤ−乳酸を安価に製造する方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、従来技術の問題点を解決すべく、バシラス・ラエボラクティカス（Bacillus laevolacticus）を用いてD-乳酸をより安価に製造する方法を提供することにある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、資化可能な炭素源から光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス・ラエボラクティカス（Bacillus laevolacticus）を３３℃以上４５℃以下で嫌気培養し、この培養物からＤ−乳酸を単離精製することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明において用いることのできる微生物としては、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス・ラエボラクティカスが使用できる。好ましくは、バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492、ATCC 23493、ATCC 23494、ATCC 23495、ATCC 23496、ATCC 223549、IAM 12326、IAM 12327、IAM 12328、IAM 12329、IAM 12330、IAM 12331、IAM 12379、DSM 2315、DSM6477、DSM 6510、DSM 6511、DSM 6763、DSM 6764、DSM 6771などが挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス・ラエボラクティカスは、培地中の成分の９０％以上が資化可能な炭素源であり、なおかつ乳酸が含まれていない培養液で、バシラス・ラエボラクティカスの適温で、嫌気的条件下で、炭酸カルシウムにより中和しながら培養し、資化可能な炭素源が完全に消費された後の培養液中に生産された乳酸の光学純度が９０％以上であればよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
例えば、Ｄ−乳酸を製造したときに以下のような方法で、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス・ラエボラクティカスであるか判断できる。滅菌したグルコース100g/l、酵母エキス5g/l、硫酸マグネシウム0.2g/l、硫酸第二鉄0.01g/l、硫酸マンガン0.01g/l、塩化ナトリウム0.01g/l、炭酸カルシウム60g/lの培養液にバシラス属に属する微生物を接種し、37℃で、静置培養を行う。経時的に培養液中のグルコース濃度を測定し、グルコースが完全に消費された後の培養液中に生産された乳酸の光学純度を測定する。Ｄ−乳酸の光学純度が９０％以上であれば、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有する微生物であると判断することができる。またここで資化可能な炭素源とは、例えばグルコース、フラクトース、ガラクトース、アラビノース、セルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、マンニトール、ソルビトール、シュークロース、イヌリン、マルトース、マンノース、ラフィノース、トレハロース、スターチ等の糖類、あるいは澱粉加水分解物、糖蜜が挙げられる。さらに好ましくは、グルコース、マンノース、フラクトース、スクロース、トレハロース、イヌリン、スターチが挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
バシラス・ラエボラクティカスはまず通常の回分発酵法における操作と同様の操作で前培養を行い種菌を調整する。つまりは表−１に示した滅菌したＧＹＰ培地などで培養し、Ｄ−乳酸生産菌の生育が十分に達したら順次培養液量を増加させＤ−乳酸発酵培地の種菌を調整する。この場合、培養液量の増加は10倍から1000倍程度で増加させればよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
最終的な発酵培地での培養は好気的条件下で行うこともできるが、嫌気的条件下で行うことが好ましい。バシラス・ラエボラクティカスは好気性または通性好気性の微生物であり、通常、通気等を行うことにより好気的条件下で培養する。この様な好気的条件下では、グルコース等の糖はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝される。そのため好気的条件下では、収率が著しく低下する。本発明ではバシラス・ラエボラクティカスを嫌気的条件下で培養することにより、ピルビン酸からＤ−乳酸を、より高収率で得ることができる。嫌気的条件下で培養を行うためには、静置して行うこともできるが、不活性ガスを通気しながら行うことが好ましい。不活性ガスとしては、二酸化炭素、窒素、アンモニア、アルゴン等を用いればよく、通気量、通気手段はＤ−乳酸生産性を考え適宜決めればよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
Ｄ−乳酸発酵培地の組成は、バシラス・ラエボラクティカスに適した培地を用いればよいが、基本的にはグルコース、フラクトース、ガラクトース、アラビノース、セルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、マンニトール、ソルビトール、シュークロース、イヌリン、マルトース、マンノース、ラフィノース、トレハロース、スターチ等の糖類、あるいは澱粉加水分解物、糖蜜のようにこれらの糖類を含有するもののうち一種類及び二種類以上に対し、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸第一カルシウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、塩化ナトリウム等の無機塩類を必要に応じて加え、増殖促進成分として酵母エキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉の成分を添加するのが好ましい。乳酸生産菌は一般に多くの栄養要求性を示すために、これら増殖促進成分の添加が好ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
しかしながら、バシラス・ラエボラクティカスでは酵母エキスが０．１％以上０．５％未満の濃度でもＤ−乳酸生産性に影響を及ぼさず、より安価にＤ−乳酸を製造することができる。酵母エキスの濃度はさらに好ましくは0.2%以上0.4%以下である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
発酵液のpHは乳酸の生産に伴い徐々に低下する。バシラス・ラエボラクティカスは酸感受性を有するため、中和剤でpHを4.5以上7.0以下に保つのが好ましい。さらに好ましくはpHを5.5以上6.8以下に保つのが好ましい。ｐＨをこの範囲に保つには、中和剤を使用するのが好ましく、中和剤とてしては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムあるいはアンモニアを用いればよい。さらに好ましくはアンモニアが挙げられる。水溶性、粉末、ガスいかなる種類のものでもよく操作性を考え適宜決めればよい。