(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
を有するポリアミンアナログまたは誘導体であって、
ここで、Ｒ１は、以下の式
【化３０】
0004044728.tif 000024
を有し、ここで
ｒおよびｓは、独立して変化し、そして０〜６であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｎ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２、ＣＮ、（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＦ２）ｎＣＦ３、またはＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３であり、ここで、ｎ＝０〜１０であり；そして
Ｑは、ＣＯＮＨ、ＳＯ２ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＮＨＣＳＮＨ、ＮＨＳＯ２、ＳＯ２、ＯまたはＳであり；
Ｒ２は、以下の式を有し、
ＮＨＣＨ（Ｚ１）（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＣＨ２）ｑＣＨ（Ｚ１）ＮＨＲ３
ここで、
（ａ）ｎ、ｐおよびｑは、独立して変化し、そして１〜１２であり；
（ｂ）Ｒ３はＨ；Ｃ１−１０アルキル；Ｃ２−１０アルケニル；Ｃ２−１０アルキニル；脂環式；アリール；アリール置換アルキル、アルケニルもしくはアルキニル；アルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換アリール；グアニジノもしくはヘテロ環であり；そして
（ｃ）Ｚ１はＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３もしくはシクロプロピルである；そして
ＸはＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＳ、またはＳＯ２である。
【請求項２】
以下からなる群から選択される、ポリアミンアナログまたは誘導体：
【化３１】
0004044728.tif 000025
【化３２】
0004044728.tif 000026
【請求項３】
請求項２に記載のポリアミンアナログまたは誘導体であって、ここで該ポリアミンアナログは、以下からなる群から選択される：
【化３３】
0004044728.tif 000027
【請求項４】
ポリアミン輸送の阻害のための薬学的組成物であって、ここで、請求項１〜３のいずれかに記載のポリアミンアナログまたは誘導体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
【請求項５】
ポリアミン輸送の阻害のための薬学的組成物であって、以下の組合せを含む、組成物：
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載のポリアミンアナログまたは誘導体；
（ｂ）ポリアミン合成のインヒビター；および
（ｃ）薬学的に受容可能な賦形剤。
【請求項６】
請求項５に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記ポリアミン合成のインヒビターがジフルオロメチルオルニチンである。
【請求項７】
請求項４または５に記載の薬学的組成物であって、さらに、前記ポリアミンアナログまたは誘導体と組み合わせて、所望されない細胞増殖に関するか、および／またはポリアミン輸送の阻害により処置可能である疾患または状態を処置するために有用であることが公知の１つまたはそれ以上のさらなる薬剤を含む、組成物。
【請求項８】
被験体における疾患または状態を処置するための、請求項４〜７のいずれかに記載の薬学的組成物であって、該疾患または状態が、所望されない細胞増殖に関するか、および／またはポリアミン輸送の阻害により処置可能である、薬学的組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の薬学的組成物であって、ここで前記所望されない細胞増殖が、免疫系の細胞、血管ネオンチマ（ｎｅｏｎｔｉｍａ）の細胞、腫瘍細胞の増殖または所望されない血管形成に関連する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
治療剤および診断剤としての新規ポリアミンアナログ
（発明の背景）
（発明の分野）
化学および生化学の分野における本発明は、薬理学的および農業的用途を有する新規ポリアミン輸送（ＰＡＴ）インヒビター化合物の合成および使用、ならびに生化学的アッセイのための、または分泌されたポリアミン結合標的の精製のためのプローブとしての使用に関する。薬剤として、これらの化合物は、望ましくない細胞増殖の障害、原発性ガン（ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｃａｎｃｅｒ）を処置するために、単独または他のポリアミン合成インヒビターのような他の薬剤と組み合わせて使用される。いくつかのこれらの化合物を使用するアッセイは、ポリアミンの取り込みまたは輸送（ＰＡＴ）をモニターするために有用であり、そしてポリアミンまたは種々の分子上における他の基本的なリガンドへの結合部位の分析を可能にする。本発明はまた、新規ポリアミン組み合わせライブラリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｙ）の合成および使用に関する。これらのライブラリーは、ＰＡＴを阻害する成分および／または細胞性ポリアミントランスポーター（ＰＡＴｒ）に結合する成分を見出すために使用される。これらのライブラリーまたはこのライブラリーの使用を介して見出された化合物の種々のメンバーは、薬剤、農薬およびプローブとしての有用性を有する。本発明はまた、膜ならびに可溶性タンパク質のポリアミン結合部位を含む重要な（ｋｅｙ）エレメントを同定する。
【０００１】
（背景分野の説明）
ポリアミンは、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび脂質の活性を調整することによって細胞のための「緩衝」システムを提供する遍在性分子である。ポリアミンはアポトーシスにおいて直接的な役割を果たし得る。哺乳動物および他の生物は、能動的ポリアミン取り込みおよびそれらのポリアミン合成能力を相補する再利用システムを有する。ポリアミンはこのような広範な分子および細胞性活性を調整するので、本明細書中に開示されるポリアミンアナログは、種々の疾患性状態、特にガンを標的化するための新規のアプローチを提供し、そしてまた、細胞性活性をモニターするための独特な道具を提供する。
【０００２】
（ポリアミンおよびガン）
抗がん剤としてのポリアミンの可能性は長く認識されてきた。ポリアミンは、ＤＮＡに特異的に結合することにより、真核生物および原核生物のクロマチン構造に影響を与え（Ｂａｌａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １００：１２９−１４０，１９９１）、その結果、ＤＮＡ上の結合部位が飽和した場合に凝集が生じる。ポリアミンおよびヒストンのアセチル化は、そのＤＮＡへの親和性を低下させ、そして順に、ヌクレオソームの構造および機能の変化を生じさせ、その結果、コア粒子の末端でのＤＮＡのゆるみによるＤＮＡ複製および転写の調節を生じる。ポリアミンは、ＤＮＡ複製のために絶対に必須であるので、これらはガンの処置において目的のものである。特定の関心は、細胞内ポリアミンレベルの低下による細胞増殖の阻止に、焦点が当てられてきた。本明細書中に記載されるポリアミンアナログは、多数の異なるレベルで作用することによりガンおよび他の増殖性疾患の予防および処置に有用である。本発明は、ＰＡＴの阻害に注目する。他の標的としては、スペルミン／スペルミジンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）、ハイプシン修飾、および細胞サイクルを阻害するかまたはアポトーシスを誘導する他のタンパク質の誘導が挙げられる。
【０００３】
（ポリアミントランスポーター（ＰＡＴｒ））
迅速に増殖する、形質転換したガン細胞によるポリアミンについての増加した要求は、増加した合成速度によって部分的にのみ満たされる。この増加したポリアミンに対する必要性を開発するために、合成インヒビターが検索されている。さらに、ポリアミン濃度を低下させることによって、細胞死または増殖阻害を導くクロマチン構造の異常が生じ得る（Ｑｕｅｍｅｎｅｒ，Ｖ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：４４３−４４８，１９９４；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：５８１−５８６，１９９３）。ポリアミン合成インヒビターを用いて臨床現場において観察された初期の期待はずれな結果は、特異的な能動輸送システムによるポリアミンの輸送での代償的な増加から生じることがだんだん明らかとなった（Ｓｅｉｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２１１−２１８，１９９０；Ｓｅｉｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８：８４３−８６１，１９９６）。オルニチンデカルボキシラーゼの自殺基質インヒビターであるα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）またはＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼのインヒビターであるメチルグリオキサルビス（グアニルヒドラゾン）（ＭＧＢＧ）を用いての細胞培養で見出された見込みのある結果は、ヒト臨床試験へは移行しなかった（Ｓｃｈｅｃｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ；ＭｃＣａｎｎ，Ｐ．Ｐ．ら編；１９８７，３４５−３６４頁）。ポリアミンプールへの炭素移行のためのわずか２つの手段は合成または輸送であるので、これらの経路の両方の同時阻害が有望な抗ガン処置アプローチであると本発明によりみなされる。
【０００４】
この化学療法アプローチの有効性を確認する研究は、ＰＡＴを欠損する移植マウスＬ１２１０白血病細胞を使用した。野生型Ｌ１２１０ガン細胞（インタクトなＰＡＴを有する）を移植されたマウスは、ＤＦＭＯで処置した場合でさえ、１２日後に死亡した。対照的に、ＰＡＴ欠損Ｌ１２１０細胞を移植したＤＦＭＯマウスは６０日より長く生存した（Ａｓｋ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．６６：２９−３４，１９９２）。また、これらの著者らは、野生型Ｌ１２１０細胞を保有するマウスの、（１）ＤＦＭＯ（２）低ポリアミン食餌および（３）抗生物質（これは腸管内菌叢によるポリアミン産生を減少する）の組み合わせを用いての処置が、ＤＦＭＯ単独で処置したものと比較して延長した生存を生じることを示した。
【０００５】
ガン細胞への増加したＰＡＴは、細胞殺傷を促進する。Ｊ．Ｌ．Ｈｏｌｌｅｙら（Ｃａｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４１９０−４１９５，１９９２）は、クロラムブシル単独と比較して、クロラムブシル−スペルミジン結合体の細胞傷害性の２２５倍までの増加を示した。一連のニトロイミダゾール−ポリアミン結合体もまた、有効であった（Ｈｏｌｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：７６３−７６９，１９９２）。他は、マラリアの多剤耐性株に感染したマウスが、クロロキノリン−プトレシン結合体での処置により治療されたことを示した（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３５０６−１３５１１，１９９７）。それゆえ、この細胞傷害性化合物の有効性はポリアミンとの結合により増強され得る。これらの効果は、これらの化合物をガン細胞へ送達するためのＰＡＴシステムの開発に起因されてきた。それゆえ、本発明は、ポリアミンと細胞へのそれらの送達のための公知の薬剤との多数の異なる結合体の、迅速および効率的な試験に部分的に関する。さらに、以下に記載するように、本発明は公知の薬剤の細胞傷害性特性をポリアミンの促進された輸送とを組み合わせる。これは、本明細書中に記載されるＰＡＴｒの周辺の、本発明の発見に依存する。ＰＡＴｒ基質の構造活性相関（ＳＡＲ）のデータベースを利用することにより、本発明は新規化学物質実体または新規ポリアミン結合体の輸送能力を推定し得る。
【０００６】
（ポリアミン輸送（ＰＡＴ）アッセイ）
ＰＡＴを測定するためのハイスループットアッセイは公知ではない。放射化学アッセイは、輸送の生化学的分析について使用され、そして酵母および種々の哺乳動物細胞におけるＰＡＴの研究に使用されている（Ｋａｋｉｎｕｍａ、Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１６：９８５−９９２，１９９５；Ｓｅｉｌｅｒ  Ｎ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８：８４３−８６１、１９９６）。例えば、Ｈｕｂｅｒ、Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：９３４−９４３，１９９５を参照のこと。
【０００７】
放射測定アッセイは、放射標識ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミジンまたはスペルミン）を使用するが、シグナルの低さに起因して、多数の接着性または非接着性細胞が必要とされる。スペルミンでは、細胞およびプラスチックへのその非接着性吸収に起因してさらなる注意が必要である。細胞を試験化合物および放射標識ポリアミンと混合してこのアッセイを開始する。この細胞を、細胞型に依存して、１〜６０分間インキュベートする。このアッセイを、その培地の除去およびそのプレートを４℃に冷却することによって終結させる。次いで、この細胞をコールドの培地で３回洗浄し、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムに溶解し、次いで溶液中の放射能をシンチレーション計測によって測定する。このアッセイは、ハイスループット手順に規模拡大することは、放射能からのシグナルが低いこと、および放射能を伴う手順に固有の取り扱い要件に起因して困難である。
【０００８】
（ポリアミンおよびアナログに対するコンビナトリアルアプローチ）
コンビナトリアル化学は、分子探索の迅速に変動しつつある分野であり、まだその萌芽期にある。概説については、Ｌａｍ．Ｋ．Ｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２：１４５−１６７、１９９７；Ｓａｌｅｍｍｅ、Ｆ．Ｒ．ら；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３１９−３２４、１９９７；Ｇｏｒｄｏｎ、Ｅ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１、１９９４；Ｇａｌｌｏｐ、Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１、１９９４を参照のこと。製薬産業は今や、１「フラスコ」中での数百〜数千もの化合物の組合せ合成、次いで試験およびそれらの結果の解析をするという、もともとのアプローチが多くの落とし穴を伴う冗漫な手順であることを認識している。薬化学のより伝統的なアプローチ、すなわち、１つの化合物を一度に合成および試験することによって、標的に関する構造活性相関（ＳＡＲ）についてより信頼性がありかつ情報に富む結果が得られる。従って、コンビナトリアル化学における流行は、別個の容器において各化合物を有する、１度に多重の化合物を合成することに向けられている。従って、多くの者が、この１化合物／１ウェル並行合成アプローチを分子探索に適応してきた。多くのリード化合物がこの方法で生成されたが、コンビナトリアル化学は、必要な薬物様特徴を有する分子を必ずしも導くとは限らない。
【０００９】
コンビナトリアル化学は、分子探索の迅速に変動しつつある分野であり、まだその萌芽期にある。概説については、Ｌａｍ．Ｋ．Ｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２：１４５−１６７、１９９７；Ｓａｌｅｍｍｅ、Ｆ．Ｒ．ら；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３１９−３２４、１９９７；Ｇｏｒｄｏｎ、Ｅ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１、１９９４；Ｇａｌｌｏｐ、Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１、１９９４を参照のこと。製薬産業は今や、１「フラスコ」中での数百〜数千もの化合物の組合せ合成、次いで試験およびそれらの結果の解析をするという、もともとのアプローチが多くの落とし穴を伴う冗漫な手順であることを認識している。薬化学のより伝統的なアプローチ、すなわち、１つの化合物を一度に合成および試験することによって、標的に関する構造活性相関（ＳＡＲ）についてより信頼性がありかつ情報に富む結果が得られる。従って、コンビナトリアル化学における流行は、別個の容器において各化合物を有する、１度に多重の化合物を合成することに向けられている。従って、多くの者が、この１化合物／１ウェル並行合成アプローチを分子探索に適応してきた。多くのリード化合物がこの方法で生成されたが、コンビナトリアル化学は、必要な薬物様特徴を有する分子を必ずしも導くとは限らない。
【００１０】
ポリアミンアナログは、合成が困難なことで悪名高い。その最終生成物のポリカチオン性の性質に起因して、伝統的なクロマトグラフィー技術（例えば、シリカゲルクロマトグラフィー）は、使用され得ない。中間物は、この化合物の精製および有機溶媒での抽出を可能にする親油性保護基を必要とする。Ｂｅｒｇｅｒｏｎは、これらの問題のいくつかを、メシチル型アミノ保護基の使用を通じて解決した（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：１４７５−１４９４、１９９７）。これらは、取り扱いの問題を解決しただけでなく（これにより、シリカゲルでの精製および有機溶媒による抽出が可能になった）、このポリアミンの骨格の延長の合成処理もまた与えた。ＮａＨでの処理後、アミドナトリウムアニオンを生成し、これをアルキルハライドでアルキル化して、骨格を延長し得る。
【００１１】
このアプローチは、合成の可能性をいくらか拡大するが、なお著しく限定されている。メシチル基の使用は、ＨＢｒ／ＨＯＡｃのような過激な試薬を除去のために使用することを必要とし、それにより、得られたポリアミンの酸安定性のものの置換基が限定される。適切なアルキルハライドの利用可能性もまた、このアミノ出発材料とともに、制限されている。従って、このアプローチは、より単純なアナログ生成に対する有意義な進出を行ったが，構造多様性についてのその可能性において非常に限定されている。他の合成アプローチは、類似の限定に受ける（Ｍｏｙａ，Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ；Ｃａｒｔｅｒ、Ｃ．編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ、１９９７；１６７−１８４頁）。固相ポリアミンアナログ合成の初期のいくつかの報告（Ｂｙｋ、Ｇ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．３８：３２１９−３２２２、１９９７；Ｆｕｒｋａ、Ａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７：４８７、１９９１）は、共有結合リンカー残基および構造成分の充分な多様性の欠如を含む重大な限定を有する。これらの欠陥は、本発明により効率的に取り組まれる。
【００１２】
（スペルミン／スペルミジンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）の誘発）
ポリアミンの細胞レベルは、厳密に調節されており、その結果、濃度においてほんの小さな枠の多様性しか許容されない。この調節は、ポリアミン合成、取り込みおよび代謝の制御によって媒介される。異常に高濃度のポリアミンは、アポトーシスに関連する酵素ＳＳＡＴを誘発する（Ｐａｒｃｈｍｅｎｔ、Ｒ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６６８０−６６８６、１９８９）。ポリアミンアナログは、細胞型特異的な方法で（おそらく、この細胞におけるポリアミンアナログの蓄積およびこのアナログがポリアミン感受性レセプターまたはＳＳＡＴ転写のポリアミン感受性リプレッサーまたはアクチベーターへの結合に起因して）この酵素の誘発によってアポトーシスを誘発する（Ｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１１５５７−１１５６２、１９９７；Ａｌｂａｎｅｓｅ、Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９１：１３１−１３７、１９９３）。このＳＳＡＴ触媒反応の生成物であるアセチル化ポリアミンは、酵素ポリアミンオキシダーゼについての基質であり、この酵素は、アポトーシス応答により近い原因を担うと考えられるＨ2Ｏ2の化学量論的放出を生じる。
【００１３】
（ヒプシン（ｈｙｐｕｓｉｎｅ））
タンパク質ｅＩＦ−５Ａは、タンパク質合成において役割を果たすようであるが、その正確な機能は、解明されないまま残っている（Ｈａｎａｕｓｋｅ−Ａｂｅｌｍ、Ｈ．Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６６：９２−９８、１９９５）。ｅＩＦ−５Ａは、通常ではないアミノ酸ヒプシンによって修飾されている点で独特である。ヒプシンは、デオキシヒプシルシンターゼ（スペルミンを基質として用いる）およびデオキシヒプシルヒドロキシラーゼの連続的作用によって翻訳後に生じる。ｅＩＦ−５Ａのこの修飾の阻害は、細胞周期のＧ１期後期における増殖の停止と同時に生じる。この修飾は、すべてはないにせよほとんど真核生物において生じる。本発明者らは、デオキシヒプシルシンターゼのインヒビターが所望されない細胞増殖（例えば、ガン）に関連する疾患を、細胞周期をブロックすることによって処置するに有用であることを見い出した。
【００１４】
（血管新生の阻害）
ポリアミン合成の阻害は、固体腫瘍の脈管化を減少する。ＤＦＭＯでの１ヶ月の処置は、子宮頸上皮内新生物を有するヒトにおいて新生物血管数の５０％の減少をもたらした（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＡＡＣＲ  ３９：Ａｂ．６００、１９９８）。ＤＦＭＯは、インビボで、腫瘍細胞によって誘発される血管新生を阻害する（Ｊａｓｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．７９：３９−４３、１９９４）。ポリアミンアナログの１種であるスクアレンもまた、ウサギ角膜アッセイにおいて血管新生を阻害する。
【００１５】
（細胞増殖をブロックするか、またはアポトーシスを誘発する他の機構）
輸送、ＳＳＡＴおよびデオキシヒプシンシンターゼは、ガンおよび他の増殖疾患についての治療を開発するための標的である。ガンと関連する、可能なポリアミン関連標的は、まだ消費されていない。ＣＨＥＮＳｐｍは、アポトーシスを誘発するが上記の機構をいずれによっても機能しないポリアミンアナログである（Ｈａ，Ｈ．Ｃ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５５７−１１５６２（１９９７））。ＣＨＥＮＳｐｍは、ＳＳＡＴを誘発しないが、スペルミジンおよびスペルミンレベルを減少し、そして毒性濃度未満でＧ2細胞周期の停止をもたらす。このことは、通常ではない作用様式を示唆する。ポリアミンは、チューブリンに結合し、そしてその管束化を促進することが公知であるが、これは、ポリアミンがアポトーシスを誘発し得るかまたは細胞増殖を阻害し得る機能の可能性のいくつかのうちのほんの一つに過ぎない。例えば、いくつかの微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）もまた、ポリアミンを結合する。
【００１６】
（ポリアミンアナログによるガン関連分子のモニタリング）
いくつかのポリアミン結合抗ガン標的が、種々のポリアミンアナログを用いてモニターされ得る。スペルミン／スペルミジンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）酵素反応の生成物であるアセチル化ポリアミンは、酵素ポリアミンオキシダーゼについての基質である。アセチル化ポリアミンの酸化は、アポトーシス応答の原因を担うと考えられるＨ2Ｏ2の化学量論的放出を生じる。この誘発は、細胞型特異的であり、そしてこの細胞におけるポリアミンアナログの蓄積およびＳＳＡＴの転写のポリアミン感受性リプレッサ−またはアクチベーターへのその可能な結合に起因していると考えられる。このリプレッサ−はまだ同定されていないが、その検出についてのプローブ／アッセイは、より良い薬物の合成を可能にする。
【００１７】
（膜結合型タンパク質）
いくつかの細胞レセプターは、レセプター結合活性に影響するポリアミン結合部位を有する。高血圧、骨粗鬆症、アルツハイマー病および虚血はすべて、カルシウムレセプター、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプター、グルタミン酸レセプター、Ｃａ2+チャネルおよびいくつかの内向き整流Ｋ+チャネルのようなポリアミン結合レセプターを介して標的化され得る（Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｈ５８７−Ｈ５９２、１９９４）。
【００１８】
（他の疾患におけるポリアミン）
（血管形成後傷害）
ＰＡＴインヒビターが細胞増殖の阻害に寄与し得るので、本発明者らは、このインヒビターを血管形成後傷害の処置において有用であるとして再検討した。内皮細胞の露出および血管壁傷害は、新生内膜過形成および管腔狭窄を導く。例えば、平滑筋細胞増殖の阻害は、新生内膜形成を阻害し得る。本発明に従って、傷害後の細胞増殖のこの開始は、ＰＡＴインヒビターを用いて（好ましくはポリアミンシンターゼインヒビターとの組合せで）の処置に受容可能である（Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．Ｍ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：３６１１−３６１９、１９９７：Ｎａｋａｏｋａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８２４−２８３２、１９９７；Ｍａｉｌｌａｒｄ，Ｌ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５３６−５４６，１９９７）。
【００１９】
（高血圧）
Ｃａ2+チャネルは、ポリアミンについて高親和性の結合部位を有し、これは、ポリアミンのレベルによって調節される。ポリアミンは、βアドレナリン作用媒介性のＣａ2+レベルの変化および収縮性を調節する（Ｖｅｎｔｕｒａ、Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｈ５８７−Ｈ５９２、１９９４）。Ｃａ2+チャネルおよび結合は、Ｖｅｎｔｕｒａ、前出において、ＮＭＤＡレセプターおよびＫ+内向き整流チャネルについて記載されるように測定され得る。従って、適切なポリアミンまたはアナログを利用して、現在使用されているチャネルブロッカーに代えてＣａ2+を調節し得る。
【００２０】
（骨粗鬆症）
骨および組織（例えば、神経）カルシウムレベルは、副甲状腺および腎臓に存在する、外在Ｃａ2+感覚性レセプター（ＣａＲ）によって調節される。ＣａＲは、特殊なポリアミン結合部位を有する。このレセプターの調節は、骨粗鬆症の処置に対する約束されたアプローチであると考えられる。
【００２１】
（アルツハイマー病）
ＣａＲは、脳において、副甲状腺における役割とは異なる役割を果たす。この疾患における凝集したβアミロイドタンパク質は、ＣａＲを刺激し得、その結果そのダウンレギュレーションを導き得る。ポリアミンも同様に、ＣａＲに結合し得、そしてβアミロイドによって刺激されるＣａＲダウンレギュレーションを阻害する。従って、ポリアミンまたはポリアミンアナログは、保護分子として作用し得る。
【００２２】
（免疫抑制）
低用量のメトトレキサートは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）についての一般的な処置である。その効力についての理由は公知ではないが、それは、リンパ系細胞の増殖の阻害ではないと考えられている。Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）代謝がその免疫抑制活性において直接の役割を果たすことが提唱されている。
【００２３】
免疫応答に対するＡｄｏＭｅｔ代謝の直接の効果は公知ではないが、ポリアミンについての役割が示唆されている（Ｆｕｒｕｍｉｔｓｕ、Ｙ．ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２０：１６６１−１６６５、１９９３；Ｎｅｓｈｅｒ、Ｇ．ら、Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍａｔ．３３：９５４−９５７、１９９０）。サイトカインは、ＲＡの病因において直接の役割を果たすと考えられており、そしてＩＬ−２は、患者の滑液（これは、ポリアミンのインヒビターによって反転された状態）において少ない（Ｆｌｅｓｈｅｒ、Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１３５６−１３６２，１９８７）。ポリアミンシンターゼインヒビターＤＦＭＯは、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（これは、全身性エリテマトーデスのモデルである）の寿命を延長する。
【００２４】
ポリアミンレベルは、ＲＡ患者の尿、滑液、滑膜組織、および末梢血単核球において上昇している。これらの細胞をメトトレキサートの存在下で培養すると、ＩｇＭ−リウマチ様因子の生成が阻害された。スペルミジンは、この効果を反転した。このことで、本発明者らは、ポリアミン合成インヒビターと、ＰＡＴインヒビターとの組合せが自己免疫疾患を処置し得るに有用であることを指摘する。他のポリアミンアナログであるスペルグアリン（ｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）およびデオキシスペルグアリンは、免疫抑制性であり、そして多発性硬化症の処置に利点があり得る（Ｂｅｒｇｅｒｏｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：１７００、１９８７；Ｄｒｕｇ  Ｆｕｔ．１６：１１６５，１９９１）。
【００２５】
（精神障害）
本発明者らがＰＡＴを高親和性で阻害することを見出した多数の化合物は、本明細書に開示されるように、いくつかの公知の抗精神病薬または抗鬱薬と構造的に類似する。
【００２６】
（核酸に対する安定な結合のためのＤＮＡ／ＲＮＡポリアミンハイブリッド）  天然に存在するポリアミン（スペルミンおよびスペルミジン）におけるアンモニウムポリカチオン間の間隔は、３〜４炭素である。これはまさに、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリアニオン性ホスフェート骨格に対する最適な結合のための空間的間隔である。この相互作用は、クロマチンタンパク質との相互作用とともに、遺伝子転写および発現を調節することが示唆されてきた。近年、このようなイオン性相互作用が、結合したポリカチオン性３’、−５’ポリグアニジンリンカーと、ヌクレオシドの塩基部分とを組み合わせて二重らせんまたは三重らせん形成を増強させることによって研究されている。ホスホジエステル骨格単位を、カチオン性グアニジン単位で置換したオリゴマーポリアデノシルＲＮＡアナログは不活性であった。なぜなら、三本鎖形成が減少したからである（Ｄｅｍｐｃｙ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：４３２６−４３３０、１９９６；Ｇｏｏｄｎｏｗ、Ｊｒ．Ｒ．Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：３１９５−３１９８および３１９９−３２０２、１９９７）。これらの核酸アナログは、ワトソンクリック塩基対合に一致する二重らせんのように融解した。
【００２７】
これに関して、本発明は、ポリアミン鎖へ複合構造的置換基を組み込んで、ＤＮＡまたはＲＮＡの、複製、転写または翻訳を阻害するについての標的化を最適化する、組成物および方法を提供する。
【００２８】
（標的としての他のポリアミン結合レセプター）
薬理学的に特に興味深いのは、ポリアミンが種々のレセプターまたはチャネル機能を調節する方法である。特に、ポリアミンは、ＲＮＡ編集部位においてグリシン残基を含有する基質から構築されるＣａ2+透過性グルタミン酸レセプターを調節する。Ｋ+内向き整流チャネルの内向き整流は、細胞質Ｍｇ2+を用いて外向き流をブロックすること（または、内因性チャネル開口）によって誘発される。この開口は、主として，細胞質ポリアミンによるブロックに起因する（Ｓｈｙｎｇ−Ｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１２０１４−１２０１９、１９９６）。本発明に従って、ポリアミンアナログは、虚血、発作、および心臓血管疾患において重要であるグルタミン酸レセプターを調節するに有用である。ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストは、鎮痙薬として作用し、その結果、ＮＭＤＡレセプターに活性な因子は、さらに有用な標的である。
【００２９】
（ポリアミン調節の抗感染性効果）
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｓｍａ  ｃｒｕｚｉのような寄生生物は、それらの成長に必要なポリアミンを、それら自体が合成するのではなく、それらの宿主から得ていると考えられる。ＤＦＭＯ（ＯＤＣインヒビターの一つ）は、プトレシン（これは、スペルミジンおよびスペルミン合成の前駆体である）の利用能を減少させる。ＤＦＭＯは、マウスのＴ．ｂｒｕｃｅｉ感染を治癒させ、そしてＴ．ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅによって生じるヒトのアフリカ睡眠病に対して活性である。ＤＦＭＯはまた、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎においておよびコクシジウム原生動物寄生生物であるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍによる感染において臨床的有用性を有する。研究室において、ＤＦＭＯは、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ、およびＥｉｍｅｒｉａに対して作用する（Ｍａｒｔｏｎ，Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３５：５５−９１、１９９５）。ポリアミンはまた、ＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ生物の増殖に必須である（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｓ．、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．９４〜１２１頁、１９８８）。従って、本発明の化合物および方法は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｓｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ、Ｅｉｍｅｒｉａ、ＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａによって生じる疾患を処置するために使用され得る。
【００３０】
（植物病原体）
ポリアミンのレベルを低下することで、広範な真核生物（例えば、Ｕｒｅｍｙｃｅｓ  ｐｈａｓｅｏｌｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ、Ｏ．Ｕｎｉｇｏｌｉｏｌａｔｅ品種（マメサビ病（ｂｅａｎ  ｒｕｓｔ）））から植物を保護し得る。ＤＦＭＯは、以下の植物において有効な抗真菌剤である：Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ萎凋病真菌からのトマト植物；黒さび病（ｓｔｅｍ  ｒｕｓｔ）真菌およびうどんこ病真菌からのコムギ；うどんこ病真菌からのマメ科植物；うどんこ病からのリンゴＭａｃｉｎｔｏｓｈ種の葉；葉さび病真菌からのオーグルオーツムギ（Ｏｇｌｅ  ｏａｔ）；ならびにトウモロコシさび病真菌からのトウモロコシ（米国特許第４，８１８，７７０号）。ポリアミンレベルをＰＡＴ阻害によって低下させる、またはポリアミンを利用するかもしくはポリアミンによって影響を受ける系に対して他の作用を有する本発明の組成物は、広範な真菌から植物を保護するに有用であり得る。
【００３１】
（種々の標的）
ポリアミンは、放射線傷害からＤＮＡを保護し得る（Ｎｅｗｔｏｎ、Ｇ．Ｌ．ら、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１４５：７７６−７８０、１９９６）。従って、ポリアミンレベルを上昇させるか、または内因性ポリアミンについてより有効に代替する薬剤は、放射線治療に対する有用な付加物であり得る。ポリアミンは、哺乳動物の繁殖を制御する（米国特許第４，３０９，４４２号）および胚成長を維持する（米国特許第４，３０９，４４２号）に重要な役割を果たし得る。ポリアミンに起因する他の作用は、抗下痢、抗蠕動、胃腸管の抗痙攣性、抗ウイルス性、抗レトロウイルス性、抗乾癬性、および殺虫性の作用を含み得る（米国特許第５，６５６，６７１号）。
【００３２】
本発明はまた：（ａ）特異的な金属結合を必要とする毒性または放射性の金属の廃棄物の除去（これは、インビボまたは環境的な使用のためにポリアミンを設計させ得る。）；（ｂ）Ｘ線、コンピュータ補助断層撮影法または磁気共鳴技術のような医療用造影システムにおける造影増強；（ｃ）非対称性の有機合成または解像において必要である酵素様触媒；（ｄ）生体異物無毒化；ならびに（ｅ）ヌクレオシダーゼ活性。
【００３３】
（組合せ治療）
特定の薬剤は、培養中の腫瘍細胞の増殖を、細胞傷害性薬剤と相加的な様式で阻害する。薬剤８−クロロ−ｃＡＭＰ（８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ）（Ｔｏｒｔｏｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５１０７−５１１１，１９９７）は、ＰＬＡ−１を選択的にダウンレギュレートするｃＡＭＰアナログである、ＰＬＡ−１は、細胞増殖および新生物形成に直接関与し、そして特定のオンコジーンおよび増殖因子の細胞分裂効果を媒介するシグナル伝達タンパク質である。ヒトＧＥＯ結腸ガン異種移植片を有するヌードマウスにおいて、８−Ｃｌ−ｃＡＭＰは、腫瘍血管新生およびＥＧＦファミリーの増殖因子の分泌を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害するのに、抗ＥＧＦレセプター抗体と相乗作用した。８−Ｃｌ−ｃＡＭＰは、本発明のポリアミンアナログとは異なる機構によって作用する。
【００３４】
本発明のＰＡＴインヒビターは、単独、８−Ｃｌ−ｃＡＭＰとの組合せ、あるいはＯＤＣインヒビターとおよび／またはＳＡＭ脱炭酸インヒビター（８−Ｃｌ−ｃＡＭＰのありまたはなしで）との組合せで使用され得る。ポリアミン調節がクロマチン構造に影響を与えるので、他の薬剤（トポイソメラーゼインヒビター、ＤＮＡアルキル化剤およびＤＮＡインターカレート剤（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、クロロゾトシンなど）を含む）も、本発明のＰＡＴインヒビターとの組合せで使用され得る。
【００３５】
上記の文献の引用は、上記のものいずれも、適切な先行技術であることを承認するものではないことが意図される。これらの文献の日付または内容に関する表示に関するすべての言及は、本出願人に利用可能な情報に基づいており、そしてこれらの文書の日付または内容の正確さに関して承認することを何ら構成しない。
【００３６】
（発明の要旨）
本発明は、一連のポリアミンアナログもしくは誘導体、およびその薬剤としての、農業用としての、もしくは環境的に有用な薬剤としての使用に関する。本発明は、膜（および可溶性タンパク質）特にＰＡＴｒへの結合（およびポリアミン結合）の鍵（ｋｅｙ）であるこれらの化合物内の部位および構造を規定する。
【００３７】
本発明の組成物には、１つ以上の部位で置換されたポリアミン誘導体が挙げられる。二置換型ポリアミンは、好ましくは、２ヵ所の末端窒素で置換されるが、あるいは、またはさらに、内部の窒素および／または内部の炭素原子で置換され得る。
【００３８】
好ましい実施態様は抗ガン化学療法剤として薬学的有用性を有する非常に特異的なＰＡＴインヒビターである。このような活性を有する好ましい化合物には、Ｎ1−ダンシルスペルミン（モノダンシルスペルミンすなわちＭＤＳとも称される（１））、Ｎ1−ダンシルスペルミジン（モノダンシルスペルミジンすなわちＭＤＳｄとも称される）、Ｎ1−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル（ｃａｐｒｏｙｌ）］スペルミン（ＤＡＣＳとも称される（４））、Ｎ1−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル］スペルミジン（ＤＡＣＳｄ）、Ｎ1−［（Ｎ6−５−（４−クロロベンズアミドメチル）−チオフェン−２−スルホニル）−６−アミノカプロイル］スペルミン（５）またはＮ1−［（Ｎ6−（２−ジベンゾフランスルホニル）−６−アミノカプロイル］スペルミン（６）が挙げられる。後者２つの化合物は、アリール基とポリアミンの間のＣ６カプロイルスペーサーを欠いている対応する化合物と比較して、驚くほど高い結合および阻害活性を有する。この理由のために、ＤＡＣＳ（４）およびＤＡＣＳｄ、ならびに化合物５および６は、薬学的組成物として好ましい。代わりのスペーサー（またはリンカーもしくはカプラー（ｃｏｕｐｌｅｒ））および他のアリールまたはヘテロ環式「ヘッド」基（これらの全ては本明細書中に開示される）の使用は、さらになお強力なＰＡＴインヒビターを得ることが期待される。
【００３９】
好ましい置換基は、結合親和性を増加させるか、あるいは化合物のポリアミン結合分子（例えば、ＰＡＴｒ）、酵素またはＤＮＡへの結合の不可逆性を増強する構造である。このようなさらなる置換基には、アジリジン基および種々の他の脂肪族、芳香族、混合脂肪族−芳香族、または複素環式多重環構造が挙げられる。ＰＡＴｒまたは別のポリアミン結合分子に不可逆的に結合する（アジリジンのような）反応性部分もまた、本発明の範囲内にある。求核剤と反応して共有結合を形成する反応基の例には、クロロ−、ブロモ−およびヨードアセトアミド、フッ化スルフォニル、エステル、ナイトロジェンマスタードなどが挙げられる。このような反応性部分は診断的または研究的状況では親和性標識のために使用され、そしてＰＡＴまたはポリアミン合成を阻害する薬剤の内の部位で薬理学的活性を促進する。この反応基はアジドまたはベンゾフェノン基のような反応性光親和性基であり得る。光親和性標識のための化学薬品は当該分野において周知である（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ，Ｓ．Ａ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５１：１２４７９−１２５２０，１９９５）。ガンの処置のための光反応性化合物もまた、当該分野において公知である。
【００４０】
具体的には、分子のポリアミン結合部位に結合するかまたはポリアミン輸送を阻害するポリアミンアナログまたは誘導体である組成物であり、この組成物は、以下の式を有し、
Ｒ1−Ｘ−Ｒ2
ここで、
Ｒ1はＨであるか、あるいは、直鎖もしくは分枝Ｃ1-10脂肪族、脂環式、単環もしくは多環式芳香族、単環もしくは多環式アリール置換脂肪族、脂肪族置換単環もしくは多環式芳香族、単環もしくは多環式ヘテロ環、単環もしくは多環式ヘテロ環置換脂肪族、および脂肪族置換芳香族からなる群から選択されるヘッド基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）であり；
Ｒ2はポリアミンであり；そして
Ｘは、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＳ、またはＳＯ2である。
【００４１】
上記の組成物の別の実施態様において、Ｒ2は、以下の式を有し、
ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ（ＣＨ2）pＮＨ（ＣＨ2）qＮＨＲ3
ここで、
（ａ）ｎ、ｐおよびｑは、独立して変化し、そしてｎ＝ｐ＝ｑ＝１〜１２であり；
（ｂ）Ｒ3はＨ；Ｃ1-10アルキル；Ｃ1-10アルケニル；Ｃ1-10アルキニル；脂環式；アリール；アリール置換アルキル、アルケニルもしくはアルキニル；アルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換アリール；ガウアニジノ（ｇａｕａｎｉｄｉｎｏ）；ヘテロ環；ヘテロ環置換アルキル、アルケニルもしくはアルキニル；およびアルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換へテロ環である。
【００４２】
上記の組成物はさらに、ＸとＲ2との間に、リンカーＬおよびさらなる基ｙを含み得る。その結果、当該組成物は以下の式を有し、
Ｒ1−Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ｒ2
ここで、
Ｌは、Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10アルケニル、Ｃ1-10アルキニル、脂環式またはヘテロ環式であり；
Ｘは、ＣＯ、ＳＯ2、ＮＨＣＯまたはＮＨＣＳであり；そして
Ｙは、ＣＯＮＨ、ＳＯ2ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＮＨＣＳＮＨ、ＮＨＳＯ2、ＳＯ2、Ｏ、またはＳである。
【００４３】
上記の組成物において、Ｒ1は、以下の式を有し得る：
【００４４】
【化７】
0004044728.tif 000002
【００４５】
ここで、
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｎ（（ＣＨ）nＣＨ3）2、ＣＮ、（ＣＨ）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｓ（ＣＨ2）nＣＨ3、ＮＣＯ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＦ2）nＣＦ3、またはＣＯ−Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3であり、ここで、ｎ＝０〜１０である；
あるいは、Ｒ1は、以下の式を有する：
【００４６】
【化８】
0004044728.tif 000003
【００４７】
ここで
Ｒ4およびＲ5は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｎ（（ＣＨ）nＣＨ3）2、ＣＮ、（ＣＨ）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｓ（ＣＨ2）nＣＨ3、ＮＣＯ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＦ2）nＣＦ3、またはＣＯ−Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3であり、ここで、ｎ＝０〜１０である；
別の実施態様において、Ｒ1は、以下の式を有する：
【００４８】
【化９】
0004044728.tif 000004
【００４９】
ここで
ｒおよびｓは、独立して変化し、そしてｒ＝ｓ＝０〜６であり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｎ（（ＣＨ）nＣＨ3）2、ＣＮ、（ＣＨ）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｓ（ＣＨ2）nＣＨ3、ＮＣＯ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＦ2）nＣＦ3、またはＣＯ−Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3であり、ここで、ｎ＝０〜１０である；そして
Ｑは、ＣＯＮＨ、ＳＯ2ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＮＨＣＳＮＨ、ＮＨＳＯ2、ＳＯ2、ＯまたはＳである。
【００５０】
さらに、Ｒ1は、以下の式を有し得る：
【００５１】
【化１０】
0004044728.tif 000005
【００５２】
ここで、
ｒおよびｓは、独立して変化し、そしてｒ＝ｓ＝０〜６であり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｎ（（ＣＨ）nＣＨ3）2、ＣＮ、（ＣＨ）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｓ（ＣＨ2）nＣＨ3、ＮＣＯ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＦ2）nＣＦ3、またはＣＯ−Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3であり、ここで、ｎ＝０〜１０である；そして
Ｑは、ＣＯＮＨ、ＳＯ2ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＮＨＣＳＮＨ、ＮＨＳＯ2、ＳＯ2、ＯまたはＳである。
【００５３】
上記の組成物において、Ｒ1は、以下からなる群から選択され得る：ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、ピレン、ジベンゾフラン、アクリジン、２，１，３−ベンゾチオジアゾール、キノリン、イソキノリン、ベンゾフラン、インドール、カルバゾール、フルオレン、１，３−ベンゾジアジン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、アダマンタン、カンファー、ピピリジン（ｐｉｐｉｒｉｄｉｎｅ）、アルキルピペラジン、モルホリン、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、チオフェン、フラン、ピロール、アルキル−１，２−ジアゾール、アルキルイミダゾール、アルキル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール、アルキル−１Ｈ１，２，３，４−テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、１，３，４−チアジアゾール、ピリジニル、ピリミジン、１，２−ジアジン、１，４−ジアジンおよび１，３，５−トリアジン、４−ジメチルアミノアゾベンゼン、３−フェニル−５−メチルイソオキサゾール、３−（２−クロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール、２−（４−クロロフェニル）−６−メチル−７−クロロキノリン、６−クロロイミダゾ［２，１−β］チアゾール、α−メチルケイ皮酸、および２−［１，２−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾジオキセピニル］チアゾール。
【００５４】
Ｒ1はまた、Ｄ−もしくはＬ−アミノ酸であり得る。
【００５５】
Ｒ1が以下の群から選択される式を有する上記の組成物もまた、提供される。
【００５６】
【化１１】
0004044728.tif 000006
【００５７】
ここで、
Ｒ12およびＲ13は、独立して、以下である：Ｈ、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、ピレン、ジベンゾフラン、アクリジン、２，１，３−ベンゾチオジアゾール、キノリン、イソキノリン、ベンゾフラン、インドール、カルバゾール、フルオレン、１，３−ベンゾジアジン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、アダマンタン、カンファー、ピピリジン、アルキルピペラジン、モルホリン、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、チオフェン、フラン、ピロール、アルキル−１，２−ジアゾール、アルキルイミダゾール、アルキル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール、アルキル−１Ｈ１，２，３，４−テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、１，３，４−チアジアゾール、ピリジニル、ピリミジン、１，２−ジアジン、１，４−ジアジンおよび１，３，５−トリアジン、４−ジメチルアミノアゾベンゼン、３−フェニル−５−メチルイソオキサゾール、３−（２−クロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール、２−（４−クロロフェニル）−６−メチル−７−クロロキノリン、６−クロロイミダゾ［２，１−β］チアゾール、α−メチルケイ皮酸、あるいは２−［１，２−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾジオキセピニル］チアゾール；
そしてさらに、
ここで、式（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）において、Ｒ12、Ｒ13またはその両方の環は、必要に応じて、以下の１つ以上で置換される：ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｎ（（ＣＨ）nＣＨ3）2、ＣＮ、（ＣＨ）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3、Ｓ（ＣＨ2）nＣＨ3、ＮＣＯ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＦ2）nＣＦ3、またはＣＯ−Ｏ（ＣＨ）nＣＨ3であり、ここで、ｎ＝０〜１０であり；
Ｒ14およびＲ15、ならびに、式（Ｃ）において、Ｒ13は、独立して、（ＣＨ2）n、（ＣＨ2）nＣＨ＝ＣＨ、（ＣＨ2）n（ＣＨ＝ＣＨ）mＣＯ、または（ＣＨ2）nＣＯであり、ここでｎ＝０〜５であり、そしてｍ＝１〜３であり；
Ｙ1およびＺ1は、独立して、ＣＯＮＨ、ＳＯ2ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＮＨＣＳＮＨ、ＮＨＳＯ2・ＮＨＳＯ2、ＳＯ2−ＮＨＳＯ2、ＳＯ2、Ｏ、ＳまたはＣＯＯであるか
あるいは、
Ｒ1が式（Ａ）または（Ｂ）のものである場合、Ｙ1は、Ｒ12のＣもしくはＮ原子とＲ13のＣもしくはＮ原子との間の結合を表し、かつＺ1が、Ｒ13のＣもしくはＮ原子とＲ14のＣもしくはＮ原子との間の結合を表す；あるいは
Ｒ1が式（Ｃ）のものである場合、Ｙ1は、Ｃと、Ｒ13のＣもしくはＮ原子との間の結合を表し、かつＺ1が、Ｃと、Ｒ14のＣもしくはＮ原子との間の結合を表す；あるいは
Ｒ1が式（Ｄ）のものである場合、Ｙ1は、Ｒ12のＣもしくはＮ原子とＲ14のＣもしくはＮ原子との間の結合を表し、かつＺ1が、Ｒ13のＣもしくはＮ原子とＲ15のＣもしくはＮ原子との間の結合を表す。
【００５８】
上記の組成物において、Ｒ2は、好ましくは、以下の式を有し、
ＮＨＣＨ（Ｚ1）（ＣＨ2）nＮＨ（ＣＨ2）pＮＨ（ＣＨ2）qＣＨ（Ｚ1）ＮＨＲ3
ここで、
（ａ）ｎ、ｐおよびｑは、独立して変化し、そしてｎ＝ｐ＝ｑ＝１〜１２であり；
（ｂ）Ｒ3はＨ；Ｃ1-10アルキル；Ｃ1-10アルケニル；Ｃ1-10アルキニル；脂環式；アリール；アリール置換アルキル、アルケニルもしくはアルキニル；アルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換アリール；ガウアニジノ（ｇａｕａｎｉｄｉｎｏ）もしくはヘテロ環であり；そして
（ｃ）Ｚ1はＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3もしくはシクロプロピルである。
【００５９】
別の実施態様において、Ｒ2は以下の式を有する：
【００６０】
【化１２】
0004044728.tif 000007
【００６１】
ここで
Ｘ＝１〜４であり；ｙ＝１〜３であり、
Ｒ10およびＲ11は、独立して、Ｈ、（ＣＨ2）nＮＨＲ12もしくは（ＣＨ2）kＮＨ（ＣＨ2）lＮＨＲ12であり、ここで、ｎ＝ｋ＝ｌ＝１〜１０であり、そしてＲ12は、ＨまたはＣ（Ｎ＝Ｈ）ＮＨ2である。
【００６２】
上記の組成物において、Ｒ2は、好ましくは、以下からなる群から選択される：Ｎ1−アセチルスペルミン、Ｎ1−アセチルスペルミジン、Ｎ8−アセチルスペルミジン、Ｎ1−グアニジノスペルミン、カダベリン、アミノプロピルカダベリン、ホモスペルミジン、カルジンホルスペルミジン（ｃａｌｄｉｎｅ（ｈｏｒｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ））、７−ヒドロキシスペルミジン、サーミン（ノルスペルミン）（ｔｈｅｒｍｉｎｅ（ｎｏｒｓｐｅｒｍｉｎｅ））、サーモスペルミン（ｔｈｅｒｍｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、カナバルミン（ｃａｎａｖａｌｍｉｎｅ）、アミノプロピルホモスペルミジン、Ｎ、Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）カダベリン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ4−アミノプロピルノルスペルミジン、Ｎ4−アミノプロピルスペルミジン、カルドペンタミン（ｃａｌｄｏｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、ホモカルドペンタミン、Ｎ4−ビス（アミノプロピル）ノルスペルミジン、サーモペンタミン（ｔｈｅｒｍｏｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、Ｎ4−ビス（アミノプロピル）スペルミジン、カルドヘキサミン（ｃａｌｄｏｈｅｘａｍｉｎｅ）、ホモサーモヘキサミン、ホモカルドヘキサミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）エチレンジアミン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ピペラジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−ピペラジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、トリス（３−アミノプロピル）アミン、およびトリス（アミノエチル）アミン。
【００６３】
好ましい組成物は本明細書中で、３、４、５、６、１３、１４、２９、４０、４３、４４、４５、５７、５８、５６、６６、６７、７２、７６、８４、８８、８９、９５および９６と記載された化合物からなる群から選択されるポリアミンアナログであり、最も好ましくは、化合物４、５、６、４３、６５、６６、８４、８９、９５または９６である。
【００６４】
Ｒ1またはＲ3は、１つまたは１つより多数の部位で、標的分子（例えば、タンパク質または核酸、好ましくは細胞性レセプターまたは他の細胞表面分子）上で求核部位と共有結合を形成し得る反応性部分に結合され得る。このような組成物は、診断用および治療用使用の両方において有利である基本的に不可逆な結合を可能にする。
【００６５】
本発明はまた、ポリアミン輸送の阻害が所望される疾患および状態を処置するために有用な薬学的組成物に関し、これは上に記載される組成物および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。この薬学的組成物はさらにポリアミン合成のインヒビター（好ましくはＤＦＭＯ）を含み得る。他の組みあわせには、上記の薬学的組成物および前記疾患または状態を処置するために有用であることが公知の１つまたはそれ以上のさらなる薬剤が挙げられる。
【００６６】
本発明はまた、所望されない細胞増殖に関するおよび／またはポリアミン輸送の阻害により処置可能である被験体における疾患および状態を処置するための方法を提供し、これは上記被検体に上に記載される薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する。この所望されない細胞増殖は免疫系の細胞、血管ネオンチマ（ｎｅｏｎｔｉｍａ）の細胞、腫瘍細胞の増殖または所望されない血管形成に関連し得る。上に記載される処置されるべき好ましい疾患には、ガンまたは血管形成後傷害が挙げられる。
【００６７】
本発明は、細胞へのポリアミン取り込みまたは特異的なリガンドへのポリアミン結合の改善されたアッセイに有用な一連のポリアミンアナログに関する。本発明は、ＰＡＴｒ（ＰＡＴｒ）のような膜タンパク質および可溶性タンパク質へのポリアミン結合に重要（ｋｅｙ）であるエレメントを同定し、そしてこれはこの技術を介してモニターされ得る。
【００６８】
二置換型ポリアミン（好ましくは、一方の末端で反応基を有する）はまた、アッセイまたは生化学的プローブとして使用され得る。
【００６９】
好ましいアッセイ方法は、検出可能な標識（「レポーター」）（好ましく発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、最も好ましくはダンシル基、または種々の手段（ＥＬＩＳＡによるものを含む）を介して検出され得る別の置換基）として働く部分を有する一置換型ポリアミンプローブを使用する。好ましいアッセイ方法は、固体支持体に固定化されたポリアミンまたはアナログを使用する。
【００７０】
ポリアミンコア上に存在し得るさらなる置換基（レポーター基を有するかまたは有さない）は、結合親和性を増加させるか、あるいは化合物のポリアミン結合分子（例えば、ＰＡＴｒ）、酵素またはＤＮＡへの結合の不可逆性を増強する構造物である。このようなさらなる置換基には、アジリジン基および種々の他の脂肪族、芳香族または複素環式多重環構造が挙げられる。ＰＡＴｒまたは別のポリアミン結合分子に不可逆的に結合し得る（アジリジンのような）反応性部分もまた、意図される。求核剤と反応して共有結合を形成する基の例には、クロロ−、ブロモ−およびヨードアセトアミド、フッ化スルフォニル、エステル、ナイトロジェンマスタードなどが挙げられる。このような反応性部分は、診断的または研究的状況では親和性標識のために使用され、そしてＰＡＴまたはポリアミン合成を阻害する薬剤の一部として薬理学的活性を促進する。この反応基はアジドまたはベンゾフェノン基のような反応性光親和性基であり得る。光親和性標識における化学薬品は周知である（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ，Ｓ．Ａ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５１：１２４７９−１２５２０，１９９５）。さらに、ガンの処置のための光反応性化合物もまた、当該分野において公知である。
【００７１】
本発明は高処理能力スクリーニングアッセイを包含し、これはＰＡＴのインヒビター、好ましくは競合的インヒビターとしての活性をスクリーニングされる多数の可能性のある標的化合物の処理を可能にする。この方法は、自動装置（ｒｏｂｏｔｉｃ）サンプルおよび当該分野において公知のプレート取り扱いシステムを用いての使用のための９６ウエルマイクロプレート形式に適合されている。この輸送を検出するための手段は、使用される検出可能な標識の機能である。蛍光および化学ルミネセンスは選り抜きの方法である。本発明はまた、ポリアミン結合部位への独特の薬物団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を包含し、これらはポリアミン結合標的を単離するために、またはその結合によって選択された標的の高次構造状態をアッセイするために使用され得る。
【００７２】
シグナルの増幅を可能にする酵素的アッセイもまた、提供される。ここでビオチンまたはいくつかの他の「レポーター」は「検出可能な標識」としてポリアミンへと結合され、そして酵素へと結合されたストレプトアビジンの結合、続いての色素産生性基質からの酵素発色産物の生成を可能にすることにより検出される。抗体によって認識されるビオチンおよび「ハプテン」基の両方がポリアミンへと結合されている組成物もまた、包含される。別の組成物において、このハプテンは直接的に酵素へと結合される。この化合物はハプテンに特異的な抗体によって捕獲され得、そして上記のストレプトアビジン−酵素複合体とビオチン相互作用をすることによって検出され得る。あるいは、ストレプトアビジンは捕獲のために使用され得、そして抗体は検出のために使用され得る。いずれの場合においても、シグナル増幅は感度の顕著な増加を可能にする。
【００７３】
詳細には、この診断またはアッセイ組成物は、ポリアミン輸送またはポリアミン結合のアッセイに使用されるために設定され、そして上に記載されるようなポリアミンアナログを包含し、これは検出可能に標識されそして／または検出され得る少なくとも１つのレポーター基を含む。好ましくは、このアナログはリンカー基（Ｌ）をレポーター基と上記ポリアミンとの間に含む。
【００７４】
上に示されるように、好ましいレポーター基は発蛍光団、発色団または発光団であり、最も好ましくはダンシルまたはビオチニルであり；このポリアミンは好ましくはスペルミン、スペルミジンまたはプトレシンである。この有用性に対して最も好ましいものは、モノダンシルスペルミンまたはＤＡＣＳである。
【００７５】
診断用組成物はまた、シグナルとしてまたはいくつかのレポーター基の１つとして、抗体によって認識されるハプテンを含む。
【００７６】
上記の診断用組成物は、酵素に結合したポリアミンアナログを有し得る。
【００７７】
好ましい実施態様において、ポリアミンアナログは固体支持体に固定化される。
【００７８】
ポリアミン輸送を検出するための本明細書中に提供されるアッセイ方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）細胞を上記の組成物とインキュベーションする工程；および（ｂ）この細胞におけるレポーター基の存在を検出する工程。未知の化合物を、そのポリアミン結合部位へのその結合について、またはポリアミントランスポーターを介しての細胞への進入について同定するためのスクリーニングアッセイに適用される場合、このアッセイは以下の工程を包含する：（ａ）ポリアミン結合部位を有する分子もしくは細胞またはポリアミントランスポーターを有する細胞を、（ｉ）請求項２６〜３３のいずれかに記載されるポリアミンアナログと、（ｉｉ）上記の未知の化合物を伴ってかまたは伴わずに、インキュベーションする工程；（ｂ）上記細胞もしくは分子へと結合されたまたは上記細胞へとインターナライズされた上記レポーターの量を測定する工程；ならびに（ｃ）上記未知の化合物の存在下で結合されたまたはインターナライズされたレポーターの量を、上記未知の化合物の非存在下での結合されたまたはインターナライズされたレポーターの量と比較する工程を包含し、ここで検出された上記レポーターの量における減少が上記未知の化合物の結合または輸送の尺度である。
【００７９】
本発明の方法には、ポリアミンライブラリーの高処理能力固相合成が挙げられる。このライブラリーは、固相支持体、分子を支持体へ付着させる切断可能なリンカー、一連の保護されたアルデヒド、結合されてそして続いて還元性アミド生成を介してアミンへと還元され得るアミノ酸などであるエキステンダーの付加物、ならびに種々のターミネーター分子の特徴を含む。この組み合わせは、本明細書中に記載される、多くの標的およびアッセイのために使用され得る非常に広範な新規アナログの合成を可能にする。
【００８０】
（好ましい実施態様の説明）
本発明者らは、治療的用途の新規化合物を設計し、そして効率的なハイスループットアッセイにおけるＰＡＴおよびポリアミン結合を測定するためのプローブのような化合物を使用した試験を発明した。この新規な方法を使用して、それらを、競合的および非競合的の両方で取り込みを阻害するＰＡＴｒについてスクリーニングし、これに対して高親和性を有する化合物を発見した。このような化合物は、多数の疾患（特に癌）における薬物として有用である。これらはまた、例えばポリアミン合成インヒビター（例えばＤＦＭＯ（これは、オルニチンデカルボキシラーゼを阻害する））と、または他の薬剤との新規な薬物組合せの一成分として使用され得る。本発明の化合物はまた、他の疾患または状態（ここで、ポリアミンは、上記のような役割をしている）に有用であり、農学的用途および環境的用途を有する。
【００８１】
本発明者らは、種々の化学基が、ポリアミンと結合されて、ＰＡＴインヒビターとして、またはＰＡＴアッセイにおけるプローブとして、および薬物スクリーニングについて、ポリアミンに有利な特性を与え得ることを見出した。これらの化学的修飾は、その効果的結合を破壊せず、実際、ＰＡＴｒについての誘導体化されたポリアミンの親和性を増強する。それ故、これらの化合物は、ポリアミン取り込みのインヒビターの発見に有用である。
【００８２】
（定義）
本明細書中で用いられる、用語「ポリアミン」は、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン、ならびにより長い直鎖ポリアミン、分枝ポリアミンなど（これらは、２個と約１０個の間の窒素を有し得る）を意味することが意図される。また、ポリアミンの誘導体またはアナログ（Ｃ原子または末端もしくは内部Ｎ原子に結合した任意の多数の官能基を有する基本的ポリアミン鎖を含む）も、この定義に包含される。ポリアミン誘導体は、そのポリアミン核と誘導体化する官能基との間に、末端リンカーまたはスペーサー基を含み得る。
【００８３】
「ヘッド基」は、上記ポリアミンに直接結合されるか、またはこのポリアミンに結合されたリンカーに結合されるかのいずれかの部分として定義される。芳香族または複素環式基が好ましいが、脂肪族基またはアロアルキル（ａｒｏａｌｋｙｌ）基は包含される。従って、ヘッド基は、蛍光部分（これはまた、「レポーター」として働く）であり得る。
【００８４】
「インヒビター」部分または基は、ポリアミンを誘導体化する化学基であり、これは、（１）この誘導体を天然ポリアミンよりも、高い親和性を有するＰＡＴｒに結合させる、および／または（２）他の手段により、ポリアミン（または本発明のプローブ）の細胞への取り込みまた細胞より小さいＰＡＴｒ調製をブロックする。本発明者らは、本明細書中で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞および他の細胞においてＰＡＴを効率的に阻害する化合物を開示する。多数の異なるタイプのこのようなインヒビターが合成された；様々なその合成スキームを、本明細書中で開示する。
【００８５】
「レポーター部分」は、プローブの部分を形成する化学的部分であり、これは、そのプローブに検出可能性（直接または例えば酵素的増強を介してのいずれか）を与え、従って、このプローブが結合するＰＡＴｒの活性の決定を可能にする。レポーターは、それ自身が検出可能なシグナルを発するか、または検出可能なレポーター特異的パートナーに対するその親和性によって検出可能なシグナルを発するか、あるいはこのレポーターに結合するかそうでなければこのレポーターと反応することによって検出可能となるかのいずれかの理由で、検出可能である。好ましい実施態様においては、このポリアミンアナログは、固体支持体に固定化され、この固体支持体は、複合混合物からの、このアナログおよび任意の相互作用／結合分子の取り出しを可能とする。
【００８６】
（構造活性相関（ＳＡＲ）の概観）
ＰＡＴインヒビターは、トランスポーターであるスペルミジンの天然基質の修飾によって開発した。本発明者らは、３−アミドプロピル基の、スペルミジンのジアミノブチル部分への導入が、図１に示されるような有意により良好な輸送インヒビターを生成したことを発見した。最適なアミドまたはスルホンアミド置換基は、中程度のサイズの芳香族基であることが見出され、これは、輸送インヒビターおよび輸送アッセイレポーター分子の両方として、Ｎ1−ダンシルスペルミン（ＭＤＳ）の発明を導いた。ＭＤＳは、スペルミジンおよびＮ1−アセチルスペルミンと比較して、細胞に対する増加した結合親和力を有する。細胞増殖およびＰＡＴの顕著に向上した阻害は、ＭＤＳの芳香族「ヘッド」基とポリアミン核との間での６−炭素原子リンカーの導入により得られた。この新たな分子であるＮ1−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル］スペルミン（すなわちＤＡＣＳ）４は、公知の最も強力なＰＡＴインヒビターの１つである。生物学的系との相互作用において、ＤＡＣＳは、上記した多くの所望の特性を示す。本発明者らは、ＤＡＣＳおよび他の関連したアナログを、広範に研究した。
【００８７】
リード化合物としてのＤＡＣＳ４のＳＡＲを、図２（特に、化合物７３〜９８）に示すように広範に調査した。上で議論したように、変化は、ＤＡＣＳのいくつかの領域のそれぞれでおこり、トランスポーター結合に対する効果を測定した。芳香族「ヘッド」基を変えることの影響を、遠位アミノ末端で、異なる芳香族および非芳香族Ｎ−スルホンアミドを用いて、多数の異なる誘導体化４−ニトロフェニルエステルを合成することによって調査した。別の「ヘッドなし」アナログのシリーズを合成して、疎水性芳香族基の重要性を調査した。要約すると、本発明者らは、ＰＡＴを効果的に阻害する多数の化合物を設計し、合成した。本明細書で記載されるように、様々な置換基を有する、全ての一置換、二置換、および多置換ポリアミドは、薬物としての使用が意図される。
【００８８】
Ａ．（Ｎ1−置換ポリアミンアナログ）
１シリーズのインヒビターを、ポリアミンとスルホニルクロリド、アシル、イソシアネート、イソチオシアネート、アルキルクロリド、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキシエステルとの直接反応により、図３および実施例Ｉ〜ＩＶに記載されるように、生成した。異なるヘッド基、結合およびポリアミンを組み合わせた。この図の多くは、この分子のポリアミン核の非限定的例としてのスペルミンを示す。
【００８９】
このポリアミン核は、上で定義されるように変化され得る。Ｎ1−（１−ピレニルスルホニル）スペルミン１５の、スペルミンおよび１−ピレンスルホニルクロリドからの合成（図５）は、実施例ＩＩにおいて詳細に記載される。
【００９０】
Ｎ1−（（１−カルボニル）−４−（１−ピレニル）ブタン）スペルミン７の、スペルミンおよびピレン酪酸からの合成（図６）は、インサイチュでカルボン酸の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成するための、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（すなわちＥＤＡＣ）の使用を示す。この一工程方法は、ポリアミンのアミドアナログを生成する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。Ｎ−（１−アントラセニル）−Ｎ’−（Ｎ1−スペルミジル）ウレア９の、１−アミノアントラセンおよびスペルミンからの合成（図４）は、実施例ＩＶにより詳細に記載される。これは、中間体としての活性化ウレタンによる尿素の合成を示す。尿素誘導体はまた、置換イソシアネートを使用して合成され得る。例えば、１−アミノアントラセンは、まず、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートで活性化されてウレタンを形成し、これがスペルミンと反応されて置換尿素９を生じる。Ｎ−（Ｎ１−スペルミジル）−２−（ナフチル）アセトアミド１０３、Ｎ−（Ｎ1−スペルミジル）−２−（ナフトキシ）アセトアミド１０４およびＯ−（フルオレニルメチル）−Ｎ−（Ｎ１−スペルミジル）ウレタン１０５の合成は、それぞれ、実施例Ｖ〜ＶＩＩに記載される。
【００９１】
このグループの最も良好なＰＡＴインヒビターは、ポリアミン核としてスペルミンを有し、ピレニル（図５；実施例ＩＩ（１５）を参照のこと）、５−（４−クロロベンズアミドメチル）チオフェニル（１３）またはダンシル（３）（図７；実施例Ｉ）のようなヘッド基を含む。これらの３つの化合物は、ＰＡＴｒを阻害し、それぞれ、９１、５８および８０ｎＭのＫiを有する。ヘッド基はまた、化合物１４により示されるアミド結合を介してスペルミンに結合され得、これにより、３７ｎＭのＫiが得られる。このタイプのインヒビターは、典型的には、およそ１００ｎＭのＫi値を有し、ＭＤＡ増殖アッセイにおけるＲ値は＞１である。しかし、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−アミノプロピル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、トリス（３−アミノプロピル）アミンまたはトリス（２−アミノエチル）アミンでスペルミンを置換した場合、ポリアミン輸送アッセイにおけるＫi値は、２００ｎＭを超えた。このようなより阻害性でない化合物は、図２（これは化合物３〜９８を列挙する）から省略する。これらのタイプの化合物の合成は、図４〜７（実施例Ｉ〜ＩＶ）に例示した。
【００９２】
実施例は、この合成方法に関するキーポイントを例示する。実施例Ｉでは、ＣＨ2Ｃｌ2溶媒中のポリアミンを、酸クロライドのＣＨ2Ｃｌ2溶液に滴下して処理した。これにより、非置換、一置換および二置換ポリアミン誘導体の統計的混合物を得た。このことは、本明細書中で記載される方法による精製が純粋な一置換および二置換誘導体を生じたので有利である。次いで、各アナログを、生物学的アッセイ（ＰＡＴ阻害および細胞増殖阻害）において試験した。一保護ポリアミン中間体を使用して個々の一置換誘導体を生成することは、時折有利であった。このアナログの大規模（＞５ｇ）生成は、副生成物の除去を非常に容易にしたので、この様式で達成された。
【００９３】
好ましい一保護ポリアミン中間体は、Ｂｌａｇｂｒｏｕｇｈら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３５：２０５７−２０６０，１９９４）に従って、テトラヒドロフラン中で、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートを使用して、生成されるＮ1−ｔＢｏｃ誘導体であった。一保護されたスペルミンを使用して、ナフチル−２，６−ビス（Ｎ，Ｎ’−スペルミジルスルホンアミド）を、実施例ＶＩＩＩに記載されるように合成した。
【００９４】
（Ｂ．リード化合物の発見）
このアミド、スルホアミドまたは尿素置換基に関する構造的調査に続いて、ポリアミン核とヘッド基との間に、６炭素直鎖脂肪族リンカーを導入することは、ＰＡＴｒに対する結合の１０倍の増加を生じると決定した（図１を参照のこと）。この化合物（ＤＡＣＳ４）がその生物学的標的に対して高親和性であると仮定して、さらなる修飾に対するリード化合物としてこれを選択した。ＤＡＣＳ４の合成についての２つの方法を示す。第１の方法は、２つの市販の出発物質で、少量のＤＡＣＳ４を合成するために適切であるものを使用する。スペルミンおよび６−（（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル）アミノ）ヘキサン酸スクシンイミジルエステルからのＤＡＣＳ４の合成は、図８に示される。（化合物４、９９、１０６を示し）、そして実施例ＩＸにより詳細に記載される。第２の多工程方法（図９；化合物４、９９、１０７〜１１０を示す）は、この修飾アナログを生成するための、構造的にフレキシブルな合成手順を使用する。第２の方法（実施例Ｘ〜ＸＩＩＩ）におけるＤＡＣＳ４の多工程生成は、本明細書中で記載される多くのリンカーアナログの合成に使用される手順を示す。この方法は、一部は、Ｒ．Ｇｏｏｄｎｏｗら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４６：３２６７，１９９０）に基づく。Ｎ−ｔＢｏｃブロック化アミノ酸のｐ−ニトロフェニルエステルは、ＥｔＯＡｃ中でＤＣＣを使用して合成され、次いで、トリフルオロ酢酸／ＣＨ2Ｃｌ2法により脱ブロックされる。次いで、このｐ−ニトロフェニルアルキルアミノエステルは、アシルクロリド、スルホニルクロリド、または等価体を用いて誘導体化されて、ヘッド基が生成される。このＮ−置換アミノ酸ｐ−ニトロフェニルエステルは、過剰のポリアミンとメタノール中で容易に反応して、所望の生成物を生じる。この所望の一置換生成物を、過剰のポリアミンおよび少量の二置換副生成物から、低圧Ｃ１８逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）およびＣＨ3ＯＨ／０．５Ｎ  ＨＣｌ溶出により、精製する。あるいは、この生成物は、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）７０のような弱いカチオン交換剤で、ＮＨ4ＯＨグラジエントを用いて、分離され得る。さらに詳細な説明は、実施例Ｘ〜ＸＩＩＩに提供される。図８および９に示される２つの方法は、この研究にわたって使用した２つの精製法（実施例ＩＸ、ＸＩＩＩ）を比較する。
【００９５】
第２の手順を使用して、異なる「ヘッド」基が、ｐ−ニトロフェニル活性化エステル（異なる「ヘッド」基は以下に概説した）に、容易に結合され得る。この活性エステルの精製に続いて、それは、様々なポリアミン誘導体に容易に結合され得る。この方法はまた、リンカーの選択に多大な柔軟性を与える。酸およびアミノの両方の官能基を有する任意の化合物が、この分子に組み込まれ得る。実施例ＩＸ〜ＸＩＩＩを参照のこと。
【００９６】
（ＤＡＣＳの構造修飾）
（ポリアミン核）
１．（一般的構造問題）
以下の構造は、この化合物のポリアミン核になされ得る一般的修飾を示す。
【００９７】
【化１３】
0004044728.tif 000008
【００９８】
ここで、ｘ、ｙおよびｚは、独立して変化し、０〜１２であり得、そしてＲ1、Ｒ2およびＲ3は、Ｈ、アルキル、またはアリール基であり得る。立体異性体は、分離され得る。
【００９９】
目的の標的（例えばタンパク質）に対する結合選択性を現実化する有利な一般的アプローチは、結合分子の立体配置的または立体化学的に定義されたアナログを合成することである。分子が採用し得る可能な回転異性体または立体配置の数を顕著に減少させることによって、所望の部位への増加した結合が得られ得る。この分子はもはや全ての「立体配置的スペース」を探し出さなければならないことはないので、その標的との相互作用のそのエネルギーは数倍増加する。
【０１００】
他の人は、立体配置的に制限されたアナログを合成することによって、ポリアミンアナログに関する選択的問題を解決する試行をしている。Ｇａｎｅｍは、スペルミンのブチル部分を、２−ブテンおよび２−ブチンジアミノ誘導体で置換した（Ｇａｎｅｍ，Ｂ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５２，５０４４−５０４６）。Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６２，５１６９−５１７３は、立体化学的に定義され立体配置的に制限されたピロリジン環を、このスペルミン骨格に組み込んだ（図１０；１１５、ｘ＝１）。Ｂｒａｎｄ，Ｇ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，８６０９−８６１２は、スペルミジンおよびスペルミンのシクロポリアミンアナログを合成した。例えば、図１０（１１３、ｘ＝３、４および５）を参照のこと。本発明者らは、この研究を、図１０に示されるその他のアナログを生成することによって拡大した。これらのアナログは、様々な公知の方法を使用することによって合成される。このアナログ（ここでｘ＝１）は、スペルミンまたはＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンと、ホルムアルデヒドとの反応によって、Ｇａｎｅｍ，Ｂ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９８２，１５，２９０に記載されるように、生成される。その一級アミンは、アナログ１１１および１１３については、Ｎ−ｔＢｏｃ誘導体として保護される。次いで、酸脱保護は、所望の生成物を与える。誘導体１１２（ここでｘ＝１）はまた、Ｇａｎｅｍのように合成された。
【０１０１】
アナログ１１１および１１３（図１０）（ここでｘ＝２〜４）は、還元的アルキル化により生成された。Ｎ1，Ｎ14−ビス（ｔＢｏｃ）スペルミンを、ジアルデヒドであるＯＨＣ（ＣＨ2）x-2ＣＨＯおよびＮａＢＨ4と、ＥｔＯＨ中で反応させた。化合物１１２および１１４を、同様の手順により、適切なＮ1，Ｎ4−二保護スペルミン誘導体で、生成した。
【０１０２】
立体化学的に定義された内部環式構造（図１０、１１５）は、図４に示されるアルコール１３０から生成された中間体アルデヒドを使用して、合成される。この保護されたアルコール１３０は、Ｓｗｅｒｎ条件を使用して、アルデヒドに酸化され得る。ホルミルメチレントリフェニルホスホランを用いたＷｉｔｔｉｇ反応によるアルデヒド伸長、続いて、還元（過剰に還元されたアルコールは、ピリジニウムクロロクロメートを使用して、アルデヒドに再酸化され得る）および還元的アミノ化／環化により、アナログ（ここでｘ＝２）を生成する手順は完了した。３−ブロモプロピルトリフェニルホスホニウムブロミドを用いたＷｉｔｔｉｇ反応、脱保護および分子内アルキル化環化により、アナログ（ここでｘ＝３）が生成され得る。いずれの立体異性体も、Ｌ−またはＤ−オルニチンで開始することによって、生成され得る。グアニジウム基を含有するポリアミンは、Ｉｗａｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．２３  １４４３−１４４５，１９９３に従って、合成される。
【０１０３】
２．（天然ポリアミン）
天然ポリアミン（プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンを含む）は、それらを種々の「ヘッド」および「リンカー」基に結合させることによって、本発明の組成物に組み込まれる。同様に用いられ得る他の天然ポリアミンには、以下のものが挙げられる：Ｎ1−アセチルスペルミン、Ｎ1−アセチルスペルミジン、Ｎ8−アセチルスペルミジン、Ｎ1−グアニジノスペルミン、カダベリン、アミノプロピルカダベリン、ホモスペルミジン、カルジン（ｃａｌｄｉｎｅ）（ノルスペルミジン）、７−ヒドロキシスペルミジン、テルミン（ｔｈｅｒｍｉｎｅ）（ノルスペルミン）、テルモスペルミン（ｔｈｅｒｍｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、カナバルミン、アミノプロピルホモスペルミジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）カダベリン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ4−アミノプロピルノルスペルミジン、Ｎ4−アミノプロピルスペルミジン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、Ｎ4−ビス（アミノプロピル）ノルスペルミジン、テルモペンタミン、Ｎ4−ビス（アミノプロピル）スペルミジン、カルドヘキサミン、ホモテルモヘキサミン、およびホモカルドヘキサミン。
【０１０４】
３．Ｎ1−アルキル化ポリアミン
一置換されたポリアミンのインビボにおける代謝的安定性は、酵素的分解に抵抗するために、これらの化合物を修飾することによって、増大される。例えば、アルキル基を有する末端一級アミン基の置換は、酸化代謝を防ぐことによって、これを達成する。本発明はまた、アルキル化した第二アミン基を有する化合物を含む。アミド窒素のＮ−アルキル化は、タンパク質分解性の分解を遅くする。
【０１０５】
上記の変化は、多数の合成経路によって達成され得る。炭素原子αの第二窒素への置換および窒素のアシル化はまた、ポリアミン酸化酵素による分解を遅くし得る。このような化学的修飾は、これらの化合物の潜在的な薬理学的副作用を最小化し得る。
【０１０６】
誘導体化されたＰＡＴ輸送インヒビターの潜在的な代謝分解を減少するために、末端の遊離一級アミノ基が、図１１（化合物２、４７、７７、１１６−１１７）に例示されるように、Ｎ−アシル化（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：３４６４−３４７、１９９４）によってブロックされ得る。Ｎ1−アセチルスペルミン２の水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）還元は、所望されるＮ1−エチルスペルミン１１６を生成する。メタノール中におけるアミノ酸のＮ1−エチルスペルミン１１６またはＮ1−アセチルスペルミン２とＮ置換ｐ−ニトロフェニルエステルとの反応は、一級Ｎ1におけるエチルまたはアセチル基で修飾された所望の化合物を与える。
【０１０７】
あるいは、メチル基はスペルミンの末端アミノ基（１２１）へα導入され得る（Ｌａｋａｎｅｎ、Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：７２４−７３４、１９９２）。１，１２−ジメチルスペルミンアナログ１２１は、正常な代謝分解に対して非常に抵抗性があった。図１２（化合物６６、１８、１２１）に示されるように、この化合物は、容易にリンカーおよびヘッドグループにカップリングされる。Ｇａｎｅｍ，Ｂ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８６、５１、４８５６−４８６１は、ビスα−ｇｅｍ−ジメチルポリアミンアナログを合成した。本発明者らは、これらの２つの報告を拡張し、そして以下に記載した経路によってビス−シクロプロピルアミンアナログを合成した。図１３を参照のこと。Ｃｈａｐｌｉｎｓｋｉ，Ｖ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９６、３５、４１３−４１４またはＬｅｅ，Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７、６２、１５８４−１５８５に従った、過ベンジル化されたジアミドとＥｔＭｇＢｒおよびＴｉ（ＯＰｒ）4との反応は、完全に保護されたスペルミンのビス−シクロプロピルアミノアナログを生成した。触媒的水素化は、完全に脱保護されたポリアミンを得る。他に内部的に、シクロプロピル置換ポリアミンアナログは、図１３に示される方法と類似の方法で生成され得る。生成された他のアナログは、図１３の底に示される。これらのシクロプロピルポリアミンアナログは、細胞酵素によって活性化され、アルキル化剤となる。
【０１０８】
アセチル（４７）、Ｎ−エチル（３５）およびα−ジメチル（６６）置換による４のポリアミンアナログが合成され、それぞれ、２１００、４１、１８ｎＭのＫi（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ＰＡＴｒの場合）を有することが示されている。
【０１０９】
検出可能な程度にラベル化したポリアミン誘導体は、開始物質として放射標識された14Ｃ−スペルミンまたは他の放射標識されたポリアミンを使用して合成され得る。
【０１１０】
４．内部置換したポリアミンアナログ
内部炭素においてアルキル化された種々のポリアミンアナログがまた、合成され得る。５−カルボキシスペルミン、テトラｔＢｏｃ−５−カルボキシスペルミンおよびその酸塩化物が、Ｈｕｂｅｒ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７５５６−２７５６３、１９９４に従って合成される。次いで、得られる酸塩化物は、種々の求核性試剤と反応され、後にｔＢｏｃ基を除去され得、カルボキシ置換ポリアミンアナログが生成する。次いで、これらのアナログは、リンカーおよび／またはヘッドグループを寄与する試剤にカップリングされ得る。あるいは、カルボキシ中間体は、多数のアナログを合成するために使用される中間体に還元され得る。このようなアナログは、本発明において、図１４（化合物１３０−１３４）に示されるように、アルキル化剤（例えば、内部アジリジンスペルミン誘導体）、またはポリアミンの生合成、利用および分解（例えば、スペルミンシンターゼ、デオキシヒプシンシンターゼ、ポリアミンオキシダーゼ）に含まれる酵素の酵素活性化不可逆インヒビターとして興味がある。置換された炭素原子上で作用する任意の酵素は、酵素の活性部位残基をアルキル化し得る高度に反応活性中間体を発生する。
【０１１１】
５．市販のポリアミンアナログ
多くのポリアミン誘導体は、市販され、そしてこれらは本発明のポリアミンアナログを生成するためにさらに容易に誘導体化され得る。
【０１１２】
ヘッドグループ
１．一般的説明
以下に示される鉛化合物の一般的構築は、ヘッドグループ、リンカーとポリアミンとの間の接続を示し：
【０１１３】
【化１４】
0004044728.tif 000009
【０１１４】
ここで、カップリング剤1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＳ（＝Ｏ）2、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−または−ＮＨ−；およびカップリング剤2は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−または−ＮＨ−である。
【０１１５】
多数のカップリング化学物質は、「ヘッド」グループとリンカー部位を組み合わせるために使用され得る。数種類の「ヘッド」グループは、これらのヘッドグループ上に置換し得る追加の基であるとして以下に開示される。
【０１１６】
ポリアミンとリンカーとの間のカップリングは、リンカーの説明の前に以下に記載される。以下は、ヘッドグループの定義である。
【０１１７】
好ましいヘッドグループの構造的多様性は、非常に大きく、そしてアミンに共有結合され得るほとんどの有機基は、潜在的候補である。以下の表は、意図されるヘッドグループに関する手引きを提供するが、決して制限されることは意図されない。これらのヘッドグループの環式構造における一および多置換もまた、意図される。
【０１１８】
ヘッドグループ置換の一覧表
ハロゲン
メチル
エチル
プロピル
イソプロピル
ブチル
イソブチル
ｔｅｒｔ−ブチル
ペンチル
２−ペンチル
３−ペンチル
ネオペンチル
シクロペンチル
シクロプロピル
シクロブチル
シクロヘキシル
シクロへプチル
シクロオクチル
シクロノニル
シクロデシル
ヘキシル
２−ヘキシル
３−ヘキシル
アリル
ビニル
アセチレン
プロパルジル
ホモプロパルジリル
ヒドロキシル
メトキシル
エトキシル
プロポキシル
チオ
メチルチオ
エチルチオ
プロピルチオ
ブチルチオ
イソプロピルチオ
ニトロ
アミノ
アセトアミド
ホルムアミド
カルボキシリック
メチルエステル
エチルエステル
プロピルエステル
イソプロピルエステル
シアノ
イソシアネート
トリフルオロメチル
トリクロロメチル
トリブロモメチル
アジド
アセトキシ
カルボキサミド
Ｎ−メチルカルボキサミド
Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド
Ｎ−エチルカルボキサミド
Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド
２．芳香族基
芳香族基として、フェニルナフチル、１−、２−、または３−ビフェニル、インデニル、アセナフチレニル、アントラセニル、フェナントレニル、フェナレニル、トリフェニレニルピレニル、ジフェニルメチレニルなどが挙げられる。
【０１１９】
３．複素環式基
複素環式基として、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ビフェニル、フラニル、ピロリル、１，２−ジアゾリル、イミダゾリル、１Ｈ，１，２，３−トリアゾリル、１Ｈ−１，２，３，４−テトラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、１，２−ジアジニル、１，４−ジアジニル、１，３，５−トリジニル、ジベンゾフラニル、アクリジニル、２，１，３−ベンゾチアジアゾール、イソキノリニル、キニリル、ベンズフラニル、イソベンゾフラニル、１，３−ベンゾジアジニル、フェナジニル、フェノキサジニル、フェノチアジニル、ピラン、クロメニル、キサンテニル、インドリジニル、イソインドリル、インドリル、プリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリシニル（ｐｔｅｒｉｃｉｎｙｌ）、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、イソチアゾリル、フラザニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、およびビオチニルが挙げられる。
【０１２０】
４．脂肪族基
このクラスは、リンカーに結合した直鎖、分枝および環式炭化水素を含む。この基として、Ｃ2-10アルカン；１個〜３個の不飽和を含むＣ3-10アルケン；１個〜３個の不飽和を含むＣ3-10アルキレン；分枝のＣ3-10アルカン、アルケンおよびアルキン；Ｃ3-8シクロアルキル、アダマンチル、カンホリル、コレステロールなどを含む多環式脂肪族炭化水素およびステロイド様環式系が挙げられる。
【０１２１】
５．種々の−
ａ．ＤＮＡインターカレーター：
ポリアミンへのインターカレーターのカップリングは、核酸標的において非常に高い親和力を有する試剤を得る。この使用に受け入れられるインターカレート化剤の例は、アクリジン、９−アミノアクリジン、プロフラビン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、エリピチシン、ＢＤ−４０、アムサクリン、アコダゾール、２−フェニルキノリンカルボキサミド、クリスナトール、ニトラクリン、ピラゾロアクリジン、ミトノアフィド、アメタントロン、オキサントラゾール、ビサントレン、エチノマイシンである。ＤＮＡインターカレート化剤の論評については、Ｂａｇｕｌｅｙ，Ｂ．Ｃ．、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１、６、１−３５を参照のこと。
【０１２２】
ｂ．生化学的結合
薬物選択性は、ターゲッティング特異細胞あるいは細胞上における酵素／レセプターによって達成される。以下の生化学物は、選択的薬剤：ステロイド、プロスタグランジン、リン脂質；酵素補助因子（例えば、ＮＡＤＨ、ＡｃｅｔｙｌＣｏＡ、ＡｄｏＭｅｔ、フラビン、トリプトファントリプトフィルキノン（ＴＴＱ）などのような分子を含むヌクレオチドを含む）を生成するためのポリアミンへのカップリングのための候補である。
【０１２３】
追加の一連のヘッドグループは、種々の大きさのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＯ−メチル化ＰＥＧ（ＭｅＯＰＥＧと略される）ポリマーに結合したポリアミンを含む。
【０１２４】
６．複数の環式ヘッドグループ
ヘッドグループは、単純なアルキル置換から多環式および多−単−環式置換まで変化し得る。幾つかの構造的変化は、概略的に図１５に表される。
【０１２５】
スペーサーＸ、ＹおよびＺ（例えば、図１５、化合物１３５−１３９）は、複数の環式ヘッドグループにおける異なる環式構造に結合する結合または直鎖基として定義される。幾つかの場合において、このスペーサーは、直接のＣ−ＣまたはＣ−Ｎ結合として機能する。当該分野で公知の従来のスペーサーは、本明細書中で記載されるリンカーと同様である。公知の化学物質が、スペーサー（例えば、アミド、スルホンアミド、エーテル、チオエーテル、エステル、−Ｃ−Ｃ−および−Ｃ−Ｎ−および−Ｎ−Ｎ結合の形成）を用いて、ヘッドグループにおける環式構造の共有結合のために使用される。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、多環式ヘッドグループに置換される場合、代表的には脂環式、芳香族、または複素環式環である。これらの環式構造はまた個々に、置換され得る。上記の幾つかの多環式ヘッドグループの種類は、商業供給源から利用可能であり、そして例が図１６の構造１４０〜１４７の構造として示される。あるいは、これらまたは同様の化合物が容易に合成される。
【０１２６】
（リンカー基）
１．（一般的説明）
化合物のリンカー部分は、一方の端部にアミノ基、および、他方の端部に酸基を有する一般構造によって表され得る。リンカーの１つの基は、尿素結合を介してポリアミンに、および、アミド、尿素、またはスルホンアミド結合を介してヘッド基に結合されたジアミノ基を含む。ヘッド基はまた、エーテル、チオエーテル、およびＣ−Ｃ結合等の、他の結合を介して結合され得る。上で（「ヘッド基、１．一般的説明と示したセクションにおいて）示した模式的構造は、ヘッド基をポリアミンに結合し、そして、所望の長さ、ならびに、立体特性、配置特性、および疎水性特性の組み合わせを所有するリンカー部分の官能基を示す。また、可能な、カプリング方法の組み合わせを示す。各カプリング方法は、他の位置において、図３の３つの方法のいずれかと組み合わされて使用され、その結果、所望の特性の幅広いアレイを生じ得る。
【０１２７】
リンカー基は、下で説明する変形例の数が反映された特性の範囲を有し得る。リンカー構造の変化は、疎水性、親水性、ヘッドとポリアミン部分との間の距離、ヘッドおよびポリアミン部分の立体配置、配置特性、溶解性、ならびに電気的特性等の、ポリアミンアナログ全体の特性に影響を及ぼす。
【０１２８】
２．（脂肪族直鎖リンカー）
１シリーズのリンカーが、ヘッド基とポリアミンとの間の異なる距離の影響をテストするために合成されていた。このシリーズは、化合物１４８として下に示す、さまざまな炭素鎖長を有する直鎖脂肪族リンカーによって最も簡単に表される。
【０１２９】
【化１５】
0004044728.tif 000010
【０１３０】
本発明者らは、リンカー長が、ＰＡＴ阻害活性および細胞成長阻害活性に著しい影響を及ぼすのを発見した。低いＫiは、芳香族ヘッド基の存在下で、Ｃ6リンカーに最適である。しかし、ヘッド基が存在しない場合には、増殖阻害活性または輸送阻害活性の差は、著しくはなかった。したがって、「ヘッドなし」化合物は、約２５ｎＭのオーダーのＫiを有するが、それらの能力の点から、最も実際に輸送されそうな、より減衰された阻害効果細胞増殖（乳癌細胞株）を有する。前立腺癌細胞株は、図１８および実施例ＸＩに示す、これらの「ヘッドなし」インヒビターによって、より強力に阻害される。Ｃ３−ヘッドなし化合物は、細胞増殖に著しい影響を及ぼした。
【０１３１】
さまざまなポリアミンおよびヘッド基で始まるこのシリーズの化合物への合成経路は、図９に示し、かつ、実施例ＩＸ〜ＸＩＩＩにより詳細に説明するＤＡＣＳ４合成スキームによって表される。アミノ基は、Ｎ−ｔＢｏｃ基によって保護され、そして次に、カルボン酸がｐ−ニトロフェニルエステルを形成することにより活性化される。Ｎ−ｔＢｏｃ基の酸脱保護の後、アミノ基は、所望のヘッド基の、酸またはスルホンアミドクロリドと反応させられ得る。精製の後、メタノール中での選んだポリアミンとの直接反応により、所望の生成物が得られる。これは、（１）２：９のＭｅＯＨ／０．５Ｎ  ＨＣｌを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、または（２）０〜２Ｎ  ＮＨ4ＯＨの直線勾配を用いた、ＢｉｏＲｅｘ７０樹脂（ＮＨ4形態）での、陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかによって、精製され得る。
【０１３２】
３．（不飽和直鎖脂肪族リンカー）
さまざまな程度の不飽和（アルケンおよびアルキン）が、アルケン誘導体の幾何異性体と共に、下（１４９および１５０）に示すリンカー部分に導入され得る。これらの変形例は、最終生成物への立体配置制限の導入を可能にする。
【０１３３】
【化１６】
0004044728.tif 000011
【０１３４】
ここで、ｎ＝０〜７、ｍ＝１〜４である。
【０１３５】
４．（炭素置換および環状脂肪族リンカー）
分岐鎖、環状飽和脂肪族リンカー基は、立体配置制限を所望のポリアミンアナログに課す。下の化合物１５１および１５２は、このクラスの構造を示す。
【０１３６】
【化１７】
0004044728.tif 000012
【０１３７】
ここで、ｎ＝１〜１０であり、ＲおよびＲ’は独立して変動し、かつ、ＨまたはＣＨ3（ＣＨ2）mであり得、ｍ＝１〜１０である。
【０１３８】
５．（キラル炭素置換アミノ酸リンカー）
多数ある市販のキラルアミノ酸のうちのいずれかを用いることにより、大きな構造の多様性が、ポリアミンアナログに素早く組み込まれ得る。いくつかのＮ−ｔＢｏｃ保護アミノ酸およびいくつかのＮ−ｔＢｏｃ保護アミノ酸ｐ−ニトロフェニルエステルを含む、図９に示す合成スキームにおいて使用されるキラルアミノ酸中間体の多くもまた、市販されている。図１９（１５３）は、この方法によって生成されたさまざまな誘導体を示す。
【０１３９】
当該分野で公知の、さらなる１０００個のαアミノ酸アナログが、ポリアミン付加体を形成するために使用され得る。これらは、図８および図９で説明する合成手順を介して本発明へと非常に簡単に組み込まれる。いくつかのカギとなる例として、ｔ−ブチルグリシン、オルニチン、α−アミノイソ酪酸、２−アミノ酪酸、α−アミノスベリン酸、４−クロロフェニルアラニン、シトルリン、β−シクロヘキシルアラニン、３，４−デヒドロプロリン、３，５−ジヨードチロシン、ホモシトルリン、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、β−ヒドロキシバリン、４−ニトロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、ピログルタミン、β−（２−チエニル）アラニン等がある。いくつかの重要なβ−アミノ酸は、上で説明した化学を介して、本発明に容易に組み込まれる。カギとなる例は、β−アラニン等である。
【０１４０】
天然Ｌ−アミノ酸（Ｌ＝Ｓ）またはＤ−アミノ酸（Ｄ＝Ｒ）の、両方の立体異性体が、本発明において用いられ得る。各異性体は個々に使用され得るので、アナログの構造的多様性は著しく向上する。
【０１４１】
６．（「ヘッドなし」リンカー）
所望の生物学的特性は、常にヘッド基の存在に依存するわけではない。よって、ヘッド基のない、ポリアミンおよびリンカーを含む、いわゆる「ヘッドなし」誘導体の大きなシリーズが合成かつテストされた。これらの誘導体は、Ｎ−ｔＢｏｃアミノ酸の活性エステル（ｐ−ニトロフェニルまたはＮ−ヒドロキシルスクシンイミド）を目的のポリアミンと反応させることにより生成される。得られたＮ−ｔＢｏｃ保護誘導体は、次に、０〜２Ｎ  ＮＨ4ＯＨの直線勾配を用いた、ＢｉｏＲｅｘ７０樹脂（ＮＨ4形態）での、陽イオン交換クロマトグラフィーによって、精製される。次に、ｔＢｏｃ基は、酸処理によって、切断され得る。ｔＢｏｃおよび酸脱保護誘導体の両方が、生物活性についてテストされ得る。上で説明したアミノ酸の完全なシリーズは、他の誘導体と共に合成された。Ｎ1−［６−アミノカプロイルスペルミン］の合成についてのより詳細な説明は、実施例ＸＩＶに示す。
【０１４２】
（反応性、不可逆ポリアミン輸送インヒビター）
Ａ．（アルキル化剤）
１．（アジリジン）
発蛍光団および他の巨大な末端基で置換されたポリアミンは、ＰＡＴｒに結合された高い結合活性の固有的特性を有することがわかった。このことは、診断または調査ツールとしての有用性に加えて、ＰＡＴを阻害するのに望ましい、疾患または健康状態を処理するための治療剤として有用であることを示唆している。ＤＮＡ等の他のポリアミン標的についての、それらの固有の親和性は、それらの治療的有用性の範囲をさらにいっそう拡大する。
【０１４３】
好適な実施態様において、ポリアミンの核は、アジリジニル基と置換される。図２０に示す実施態様は、第２の置換基（ダンシルまたは他の巨大な基等の発蛍光団）を有する。アジリジニル置換ポリアミンは、標的結合複合体（受容体、輸送体、酵素、および核酸）内の求核基と反応する。さらに、それらは、他の反応性部分をポリアミンに結合するために利用され得る。これらの一置換または二置換ポリアミンアナログは、それらアナログの（ａ）ＰＡＴｒ、（ｂ）ポリアミン合成、および（ｃ）核酸を基質として用いる反応の阻害のために、薬物として有用である。
【０１４４】
ある実施態様において、アジリジンとは異なる反応基が、既にヘッド基およびリンカーで置換されたポリアミンに導入される。この反応基は、標識されたポリアミンを、ＰＡＴｒ等のポリアミン結合標的分子上の適切な求核部位に共有結合することを可能にする。このタイプの化合物は、受容体、酵素、または核酸を共有的に標識するのに使用される。したがって、修飾ポリアミンは、診断アッセイにおいて有用な親和性ラベルとして、かつ、ポリアミン結合標的を単離するためのツールとして機能する。繰り返して言うが、薬物として使用されるこのような化合物は、ＰＡＴまたはＤＮＡ−ポリアミン相互作用をブロックすることにより改善される疾患または健康状態を処置する。それらの結合の相対的不可逆性の利点によって、このような化合物は、当該分野で公知の化合物と比べて、より低い投薬量で、または、より少ない頻度で使用され得る。
【０１４５】
二置換ポリアミンは、ポリアミン上の適切なアミン保護基を用いることによって合成される。スペルミンの段階的な官能化のための試薬は公知である（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，  Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５３：  ３１０８−３１１１（１９８８）およびＢｙｋ，  Ｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３８：  ３２１９−３２２２（１９９７））。Ｂｅｒｇｅｒｏｎら（前出）は、４つの独立したアミン保護基（ベンジル、ｔ−ブトキシカルボニル、トリフルオロアセチル、および２，２，２−トリクロロ−ｔ−ブトキシカルボニル）の使用を記載している。各保護基の選択的除去を可能にする条件も記載されている。これらの反応条件は、スペルミンの各窒素の、独立した選択的誘導体化を可能にする。したがって、本発明は、単官能型スペルミンの、４つの窒素のうちのいずれか１つの上にあるリンカー／ヘッド基での誘導体化、および、１を超える数の官能化窒素でのポリアミンアナログの合成を含む。
【０１４６】
スペルミンにアジリジン基を導入する方法（Ｌｉら、Ｌ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ３９：３３９−３４１（１９９６））および、スペルミジンの誘導体にアジリジン基を導入する方法（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ３４：  ３８０（１９９３））が利用可能である。Ｎ1−（アジリジニル）−Ｎ12−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル］スペルミンについての合成スキームを、図２０（１５４〜１５７）に示す。
【０１４７】
図２０がスペルミン誘導体の合成を示すのに対して、いずれか他のポリアミン誘導体が、適切に保護されたポリアミン前駆体、リンカー／ヘッド基部分への結合、および３−アジリジンプロパナールでの還元的アミノ化を用いて生成され得る。次に、保護基の除去により、所望の、反応性ポリアミン誘導体が得られる。このアプローチのさらなる例（このアプローチが可能にする化学的フレキシブルさを示す）を、図２１（１５８〜１６０）に示す。
【０１４８】
３．（他の反応基）
アジリジン基の代わりに加えられ得、かつ、求核性試薬（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）と反応して共有結合を形成する他の有用な部分は、クロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、スルホニルフルオリド、エステル、ナイトロジェンマスタード等を含む。
【０１４９】
化学反応性の２−ハロアセトアミド基は、適切な２−ハロ酢酸ハライドとの反応により、いずれかのポリアミンアナログへと容易に導入され得る。他の化学反応基について、以下に説明する。
【０１５０】
Ｂ．（光化学的活性化試薬）
生物学的活性分子上での光化学的活性化官能基の使用は周知である（Ｆｌｅｍｉｎｇ，  Ｓ．Ａ．のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５１：１２４７９−１２５２０，  １９９５）。ポリアミン領域において、Ｆｅｌｓｃｈｏｗらはアジド安息香酸部分をスペルミンに結合し、そして、得られた付加体の、細胞表面タンパク質との相互作用を調べた（Ｆｅｌｓｃｈｏｗ，  ＤＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２８，  ８８９−８９５，  １９９７；Ｆｅｌｓｃｈｏｗ，  ＤＭら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２８７０５−２８７１１，  １９９５）。それらの光プローブは、ＰＡＴｒについて、スペルミジンに対して見かけ上１μＭのＫiを有していたので、記載された光標識の施されたタンパク質は、ポリアミン結合タンパク質の混合物であった。本発明の、最も強力なＰＡＴインヒビターの１つであるＤＡＣＳは、１０ｎＭ未満のＫiを有する。これは、Ｆｅｌｓｃｈｏｗらによって報告された化合物の１００倍の高さの親和性を示す。したがって、この分子に光活性化可能基を導入することにより、ＰＡＴｒタンパク質の単離が確実に行われる。
【０１５１】
１．（アジド）
ダンシルクロリドにおけるアジドによるジメチルアミノ基の置換は、光化学性反応型化学基を生成する。１−アジド−５−ナフタレンスルホニルクロリドの調製が記載されており（Ｍｕｒａｍｏｔｏ，  Ｋ．、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８４，  ４８（１１），  ２６９５−２６９９）、また、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）から市販されている。ＤＡＣＳについての、この化合物の合成スキームへの導入は簡単であり、ダンシルクロリドの置換を要求するだけである。
【０１５２】
このアジド誘導体は、ＰＡＴｒタンパク質の単離および特性付けを可能にし、かつまた、不可逆性の光活性化可能薬物分子としての使用を見出す。
【０１５３】
２．（ジアジリジン）
ヘッド基上でのジアジリジン基の置換は、上で述べたのと同じ目的の多くを達成する。
【０１５４】
３．（ジアゾ基）
光活性化可能ヘッド基を有するポリアミンアナログは、ｐ−ニトロフェニル３−ジアゾピルベート、つまり、光活性化可能３−ジアゾピルベート基を脂肪族アミンに導入するための試薬、を用いて生成される。この試薬も、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．から入手可能である。この試薬を遊離アミノ、ｐ−ニトロフェニル活性型リンカー前駆体と反応させ、リンカー／ヘッド基中間体を精製し、そして、これをポリアミンと反応させることにより、所望の誘導体が生成される。
【０１５５】
ＰＡＴおよび他のポリアミン結合タンパク質のためのレポーター分子（プローブ）
種々の部位がポリアミンに結合され得、ＰＡＴアッセイにおけるプローブとしてのおよび薬物スクリーニングのための有効性を有するＰＡＴの新規インヒビターを生成する。このような化学修飾は、効果的な結合を破壊せず、そして実際にＰＡＴｒのための誘導体化されたポリアミンの親和力を向上する。このような化合物は、従って、ポリアミンの取り込みの測定、より重要なことに、この取り込みの治療学的に有用なインヒビターを発見するための高スループットスクリーニングアッセイにおいて有用である。
【０１５６】
好ましい実施態様において、ポリアミンアナログは、そのアナログおよび複雑な混合物からのアナログおよび任意のインターカレート／結合分子の除去を可能にする固体支持体に固定化される。
【０１５７】
多数のポリアミン結合タンパク質は、治療学的発明のための標的であるため、ポリアミンの結合または取り込みのための改良されたアッセイが好ましい。ポリアミン構造の小さな変化は、活性において劇的な効果を有し得る。レポーター分子は、ＰＡＴｒへのそれらの結合活性を維持する間、容易に検出可能であるポリアミンアナログである。ＰＡＴｒへの最適な結合において、レポーターは、十分に特異的であるため、他のポリアミン結合分子の結合は、アッセイにおいて妨害されない。Ｎ1置換ポリアミンは、ＰＡＴｒおよび数個の他のポリアミン結合タンパク質（例えば、外部センシングＣａ+2レセプターおよびＮＭＤＡレセプター）のための競合的インヒビターである。高親和性の現在のプローブを用いて輸送体（またはメンブレンレセプターに結合する任意の他のポリアミン）へ結合する分子の当該分野において、報告はない。本発明者らは、それ故に、合理的な範囲の検出性を維持し、そしてスペルミンを用いて競合的に結合する適切なレポーター結合性ポリアミンを生成することに焦点を合わせた。図１は、種々のＮ1連結ポリアミンアナログのための合成スキームを例示する。
【０１５８】
レポーターヘッドグループ
ヘッド／レポーターグループの構造的多様性は、非常に大きく、そしてアミンに共有結合し得るほとんどの有機基を含む。しかし、以下に記載された基は、本発明のヘッドグループの幾つかの例であり、そして限定されないことが意図される。
【０１５９】
Ａ．蛍光／化学発光ヘッドグループ
ダンシル蛍光基は、大多数の発蛍光団（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、６編、分子プローブ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、１９９６に開示される）によって置換され得る。大多数のダンシルポリアミン様分子は公知であり、そして、市販され、ジダンシルカダベリン、モノダンシルカダベリン、ジダンシルプロレシン、ＭＤＳおよびトリダンシルスペミジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を含む。モノダンシルプトレシン（Ｒａｉｎｅ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．８２：２４１、１９８４）およびモノダンシルカダベリン（Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｊ．Ｌ．Ｇ．ら，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｕｅｄｉｃａ８：４９７−５０４、１９７１）の合成が記載されている。
【０１６０】
一般に、蛍光試剤がスペルミンのようなポリアミンのアミノ官能基と容易に反応するためのその能力に基づいて選択される。このような蛍光プローブの例は、可視スペクトルにかかるＢｏｄｉｐｙTM（４，４−ジフロロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアズ−ｓ−インダセン）発蛍光団を含む（米国特許第４，７７４，３３９号；同第５，１８７，２８８号；同第５，２４８，７８２号；同第５，２７４，１１３号；同第５，４３３，８９６号；同第５，４５１，６６３号）。この群の好ましい要素は、４，４−ジフルオロ−５，７ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸である。本発明に従う誘導体化するポリアミンのための好ましい発蛍光団は、紫外光によって励起されるものである。適切な蛍光物質として、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅTM、クマリン誘導体、ナフタレン（本明細書中に例示されるようなそのダンシルクロリドは要素である）、ピレンおよびピリジルオキサゾール誘導体、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄTM、ＢｏｄｉｐｙTM、エリトロシン、エオシン、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン、アントラセン、アクリジン、蛍光フィコビリンタンパク質およびそれらの複合体ならびに蛍光標識されたミクロビーズが挙げられる。特定の蛍光体（例えば、フィコビリタンパク質および蛍光標識されたミクロビーズ）は、細胞が幾つかのＰＡＴｒ部位を有する蛍光シグナルの増幅を可能にする。
【０１６１】
蛍光色素、蛍光誘導体および蛍光色素様分子（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎTMおよびその誘導体、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎTMおよびＲｈｏｄｏｌ  ＧｒｅｅｎTM）は、イソシアネート、スクシンイミジルエステルまたはジクロロトリアジニル活性基を使用してアミン基とカップリングされる。長波長ローダミンは、基本的に窒素における置換によりＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ  誘導体であり、公知の最も光安定な蛍光ラベル化試剤である。これらのスペクトルは、ｐＨ４〜１０の変化によって影響され、多くの生物学的適用のための蛍光色素において重要な利点である。この基として、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミンおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ誘導体が挙げられる。
【０１６２】
なお別の手段において、アミノ基またはポリアミン中の基は、蛍光生成物（例えば、フルオレサミン、ジアルデヒド（例えば、ｏ−フタルジアルデヒド、ナフタレン−２，３−ジカルボキシレートおよびアントラセン−２，３−ジカルボキシレート））を得る試薬と反応される。７−ニトロベン−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）誘導体、塩化物およびフッ化物の両方は、蛍光生成物を得るためにアミンを修飾するために有用である。
【０１６３】
当業者は、公知の蛍光試薬がアミン以外の基を修飾することを認識する。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．、前出；２章（ここで、チオールの修飾が４７−６２頁に記載される）を参照のこと。アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸およびアミドの修飾は、Ｈａｕｇｌａｎｄ、前出（６３−８１頁）に記載されている。従って、ＰＡＴｒのための蛍光基質は、これらの他の反応性基を使用して、設計され、合成され得る。最も好ましいレポーター部位は、発蛍光団、自発的にリン光を発するもの、または特定の波長の光を用いた照射に応答して蛍光発光するもののいずれかである。
【０１６４】
化学発光レポーターはまた、受容可能である。特に有用な化学発光ラベル化化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０１６５】
（Ｂ．放射性ヘッド基）
検出のためのプローブを使用するために、種々の放射性基がプローブの位置測定のために付加され得る。放射性基は、任意の種々の塩化スルフォニル、ハロゲン化アシルまたは他の活性化基もしくは非活性化基であり得、これはポリアミンアナログ中へと取り込まれ得る種々の放射性元素を含む。ポリアミン自体は検出の助けとなり得る放射性元素を含み得る。
【０１６６】
放射性レポーター部分は、放射された放射線の測定により検出される。適切な放射性レポーター部分の例には、γ放射体（例えば、125Ｉ、123Ｉおよび99mＴｃ）で標識されたものが挙げられる。いくつかのα放射体およびβ放射体が検出のために十分であり得る。
【０１６７】
（Ｃ．固定化ヘッド基）
市販されている種々の抗体の多大な供給およびアビジン−ビオチンのような種々の結合システムを用いて、種々の固定化可能なヘッド基のポリアミンアナログへの配置を可能にする。これには、特異的抗体（例えば、抗ダンシル、抗フルオレセイン、抗ＢＯＤＩＰＹ、抗Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、抗Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅおよび抗ＤＮＰ）が市販されている低分子が挙げられる。タンパク質またはペプチドもまた、利用可能な抗体を用いての検出のためのポリアミンへと誘導体化され得る。
【０１６８】
（Ｄ．固体支持体）
この酵素学的アッセイの種々の実施態様において、この固定化は捕獲タンパク質（例えば、ストレプトアビジンまたは抗体）に結合し得る任意の「固体支持体」へのものであり得る。周知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、デキストラン、ナイロン、天然または改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が挙げられる。このキャリアの性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるかまたは不溶性であるかのいずれかである。この支持体物質は、固定化分子がそのリガンドへと結合し得る限り、任意の構造立体配置を有し得る。それゆえ、この支持体立体配置は、球状（ビーズ中の場合）または円柱状（試験チューブまたはマイクロウエルの内部表面、ロッドの外部表面またはチップの場合）であり得る。あるいは、この表面は平面状（例えば、シート、試験小片、マイクロウエルの底など）であり得る。磁化可能基（例えば、ガドリニウム錯体）または電気不伝導性（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｏｐａｑｕｅ）基もまた、特定の実施態様に有用である。当業者には結合抗体または抗原のための多数の他の適切なキャリアが公知であり、あるいは慣用的な実験の使用によりこのようなことを確認し得る。
【０１６９】
（ポリアミン輸送のアッセイ）
ＰＡＴインヒビターを同定するためのＰＡＴアッセイの好ましい実施態様は、蛍光ポリアミン様プローブを用いる高処理能力アッセイである。ＰＡＴｒを介しての細胞膜を通過するプローブの輸送は、候補輸送インヒビターの存在下で試験される。この工程および引き続いての全ての工程は、好ましくは増加した効率のために自動装置システムによって行われる。
【０１７０】
細胞は、接着および１５〜９６時間内の中期対数増殖期について適切な密度で９６ウエル滅菌マイクロプレートにプレーティングされる（「試験プレート」）。開始速度の測定のために、プレプレート（９６ウエルプレート形式）が、例えば、可能性のある阻害性化合物（例えば、ＰａｎＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡにより調製されるもの）の組み合わせライブラリーを使用して調製される。また、ポリアミン組み合わせライブラリーの説明は以下を参照のこと。
【０１７１】
各ウエル中に１ｎｍｏｌの試験インヒビターに加えて、１μｍｏｌのアミノグアニジンおよび１〜１００ｎｍｏｌの蛍光ポリアミンプローブが添加される。最終容量は約２５μｌ〜約２００μｌであり得る。アミノグアニジンは培養培地におけるポリアミン化合物の酸化的分解を阻害するために含まれる。
【０１７２】
このアッセイは、指定時刻の様式（ｔｉｍｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）でプレプレートの内容物を試験プレートへと移すことにより開始される。この細胞は試験インヒビターおよび蛍光ポリアミンプローブと共に１〜６０分間、インキュベートされる。このインキュベーションは培地を取り除き、そしてウエルを３回氷冷培地（この培地は１ｍＭアミノグアニジンおよび１μＭスペルミジンを含む）で洗浄することにより終結される。次いで、この細胞は界面活性剤（例えば、１００μｌの０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて溶解され、そして蛍光プレート読み取りシステム（好ましくは、上部読み取り蛍光分析計（ｔｏｐ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ））へと移される。
【０１７３】
ウエルは、この試験インヒビターが、ネガティブ（インヒビターの存在しない）コントロールの５０％未満への蛍光の低下を生じさせた場合にはポジティブとしてスコアされる。次いで、ポジティブをスコアするインヒビター化合物は、蛍光プローブおよびこの試験インヒビターの両方の濃度を変化しつつ上記のアッセイを反復することによって、その結合定数を決定するために試験される。標準反応速度分析が実施されて阻害の型（例えば、競合的対非競合的）およびその有効性を定量する。
【０１７４】
従来的な放射測定アッセイ（以下に記載される）を使用して、本発明は、細胞株においてＰＡＴを阻害する能力について、１週間当たり約２０個の化合物をスクリーニングし得た。本明細書中に開示される高処理能力蛍光アッセイを用いて、１週間当たり２５０個以上の化合物をスクリーニングし得る。放射測定アッセイは同一の化合物の同定を導き得るが、タイムスケールはより長くあり得る。
【０１７５】
記載されるように、好ましい検出方法は本発明の修飾ポリアミンプローブの蛍光に基づく。しかし、多数の他の有用な検出方法が存在し、これには化学発光、色素生成性ならびに従来的な放射測定が挙げられる。化学発光検出のために、化学発光性基が蛍光性基の代わりに置換される。例えば、蛍光フルオレサミン付加物はビス−トリクロロフェニルオキサレートを有する化学発光生成物へと転換され得る（Ｗａｌｔｅｒｓ，ＤＬら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．８：２０７−２１１，１９９４）。さらに別の実施態様において、色素生成性検出は高い吸光係数を有する発色団と共に使用される。
【０１７６】
高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）は迅速な薬剤探索プロセスの必須な部分となった。ＨＴＳアッセイを使用して、多数の化合物が、存在するライブラリーまたは例えば本明細書中に記載されるコンビナトリアルアプローチにより合成されたライブラリー由来の候補化合物を使用してアッセイされ得る。現在、製薬業界において１０００〜１００，０００で番号付けられた化合物が、９６または３８４ウエルのいずれかを用いるマイクロタイタ−プレート形式および自動装置デバイス（これは試薬を移し、洗浄し、振盪し、次いで活性シグナルを測定し、このシグナルは直接的にコンピューター互換性形態へと読みこまれる）を使用して、慣用的にスクリーニングされている。迅速な薬剤開発を助ける自動装置デバイスおよび最適化プログラムは、当該分野において周知である。ＨＴＳの３つの必要条件は、スピード、正確さおよび経済性である。
【０１７７】
（Ａ．放射測定アッセイ）
従来的な放射活性アッセイにおいては、この細胞は、無血清培地中で［５，８−14Ｃ］スペルミンを伴う増殖条件下で種々の間隔の間、インキュベートされる。細胞は、標準組織培養培地中で２４ウエルプレートに既知の密度で配置され、そして接着させられ、そして１５〜９６時間の間、増殖させられる。このアッセイにおいては低シグナルの放射活性のために、９６または３８６ウエルマイクロプレートはこのアッセイにおいては使用され得ず、このことは処理能力についての主な妨げ（ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ）を引き起こす。細胞数が決定され、そしてこのプレートは３７℃で温度を制御されたシステムに配置される。アミノグアニジンが培地に１ｍＭの最終濃度になるように添加される。試験されるべきインヒビターおよび放射リガンド（好ましくは3Ｈ−スペルミジン、14Ｃ−スペルミジンまたは14Ｃ−スペルミン）は別々のプレート中で調製される。このアッセイはインヒビターと放射リガンドとを混合することにより開始される。細胞は、細胞の型に依存して約１〜６０分の間隔の間、インキュベートされる。このアッセイは培地を取り除き、そしてプレートを４℃へと冷却することによって終結される。次いで、細胞は冷培地を用いて３回洗浄され、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中に溶解され、そして溶液中の放射活性はシンチレーションカウントすることにより決定される。
【０１７８】
（Ｂ．ＰＡＴアッセイを用いる使用のためのポリアミンアナログの開発）
上に記載されるように、レポーター部分はポリアミンの末端アミンまたは内部の部位へと結合され得る。最も好ましいのは、いずれかの窒素に結合された単置換蛍光性基である。ポリアミンの異なる炭素上での蛍光性基の置換は、Ｎ−（４−ダンシルアミノブチル）スペルミン−５−カルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）により例示される。ポリアミンアナログ１個当たりのレポーター基（例えば、発蛍光団）の数は、変化し得る。ＰＡＴｒとの競合的相互作用を可能にする蛍光の最大数が好ましい。モノダンシルスペルミン（ＭＤＳ）の場合、発蛍光団の最適な数は１個である。レポーター部分がダンシルである場合、このアッセイの感度は、蛍光測定（製造者の指示に従う）の間の抗ダンシル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）の使用により改善され得る。
【０１７９】
ＰＡＴアッセイのための好ましいポリアミンプローブは、以下の特性を有する：これらはＰＡＴｒに結合し、天然の基質と競合し（図２７および２８）、そしてこのような結合の後に細胞の中へとインターナライズされる（実施例ＸＸＶ）。好ましいプローブには、ポリアミンコアへとへと結合された発蛍光団、発色団または発光（例えば、化学発光または生物発光（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５：５１２，１９７９））が挙げられる。
【０１８０】
アッセイで利用されたプローブの量またはプローブの細胞内局在は、プローブがＰＡＴｒへと結合する機会を得て、そして取り込まれた後に、レポーター部分によって放射されるシグナルを測定および／または位置を突き止めることにより決定される。このプローブは、具体的には結合リガンドであり得るか、または１組の近位相互作用対の１つであり得る。
【０１８１】
（Ｃ．酵素ポリアミン輸送スクリーニングアッセイ）
（１．酵素増強ＥＬＩＳＡ）
感受性のスクリーニングアッセイへの別の好ましいアプローチには、このポリアミンプローブ上の検出可能な標識により放射されたシグナルの酵素増幅を使用する。より特異的な試料は、補因子標識プローブであり、これはこの標識がこの補因子であるところの酵素およびこの酵素の基質を添加することにより検出され得る。このような酵素は好ましくは、基質に作用し、色のような測定可能な物理的性質を有する生成物を生成する酵素である。このような酵素の例は以下に挙げられる。
【０１８２】
（２．増強した検出についてのポリアミンの固定化）
酵素的に増強したアッセイの好ましい実施例は、このビオチン／ストレプトアビジン系を利用することにより実施され得る（図３１を参照のこと）。スペルミンのようなビオチン標識したポリアミンが、例えば図２９および３０に示されるように調製される。このＰＡＴアッセイは、この適切に溶解した細胞中のプローブが以下に記載される形式の１つを使用して検出されることを除いて、上述のとおりに実施される。例えば、細胞にビオチン標識したポリアミン（例えばＮ1−ビオチン標識スペルミン）を輸送させた後、この細胞は溶解され、この溶解物はプラスに帯電したポリアミンを保持するマイナスに電化したミクロプレート膜を通して濾過した。洗浄、およびアルブミンのようなタンパク質を有する反応を起こしていない部位の適切なブロッキング後、この膜をストレプトアビジン−酵素結合体とインキュベートし、洗浄した。この膜はこの酵素の色素生産性の基質で処置され、そしてこの色シグナルが分光計で読まれた後、設定された時間の間インキュベートされた。比色の、蛍光の、および化学発光の基質はこの手順に適合している。
【０１８３】
別の実施態様において、この溶解物はグルタルアルデヒドを使用してポリリジン処理したプレートと反応させ、このポリアミン類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）をこのプレートに架橋する。次にこのＳｃｈｉｆｆ塩基は還元され、ＤＡＣＳのような固定化リガンドまたは類似体を生成する。次にこのリガンドはこの適切なレポーター系を介して検出される。ＤＡＣＳの場合において、このレポーターは、ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）検出系に結合した抗−ウサギＩｇＧに結合した抗−ダンシルＩｇＧ抗体により検出される（図３２；実施例ＸＸＶＩ）。別の実施態様において、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＳまたはＣｉｂａｃｒｏｍ  Ｂｌｕｅを使用して、この溶解物から得られた画分が使用される。
【０１８４】
この手順の利点は、（１）ビオチン化したスペルミンのこの膜への固定化は、洗浄を介して妨害化合物を除去させること、および（２）酵素−または抗体−結合レポーター系を介する増幅は、単一標識基質と比較した感受性を増加する。この増加した感受性には、アッセイあたり少数の細胞しか必要でない。このマイクロタイタ−プレート形式（ｆｏｒｍａｔ）は迅速なＨＴＳを可能にする。
【０１８５】
この酵素的に増強したアッセイのさらなる実施態様は、このレポーター部分、例えばハプテン２，４−ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）、２，４，６−トリニトロフェニル（ＴＮＰ）、または好ましくはダンシルに対する抗体の使用である。代わりにこのポリアミンは、異なるハプテン基（ビオチン以外）と結合し得る。ダンシルで誘導体化したビオチン標識スペルミンの場合、この細胞および細胞溶解中に輸送後、これらの分子はストレプトアビジンコートしたミクロプレートウェルに固定化され、洗浄される。ダンシルに特異的な抗体は、固定化された任意のダンシル基に結合させられる。次にこの固定化抗体は酵素と結合した２次抗体（この抗−ダンシル抗体に特異的な抗−免疫グロブリン）と反応させられる。この２次抗体がこの免疫化複合体と結合させられた後、この酵素の色素生産性基質が、設定された間隔で添加される。この酵素生成シグナル（呈色反応）の評価は、このＰＡＴｒに結合したポリアミン量の測定である。
【０１８６】
前の酵素アッセイは、原則として周知の酵素免疫アッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に類似している。例えば、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１；Ｖａｎ  Ｒｅｇｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．Ｈ．Ｖ．（編）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，第一巻（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２、２０９〜２５９頁）を参照のこと。Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５０：７７−９０，１９９２；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８０）。ストレプトアビジンまたは抗体と結合し得る酵素には、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレア−ゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼがあるが、これらに限定されない。
【０１８７】
（増強した検出についての第２のヘッド基の固定化）
別の実施態様において、このビオチン−スペルミン−ハプテン（好ましくはダンシル）分子は固定化抗−ダンシル抗体を使用して捕獲される。この場合において、２つのレセプター分子は図３１のとおりこのポリアミン類似体に結合されるにちがいない。１つのレポーターは例えば、過剰なプローブを洗い流すことを可能にするビーズ（または他の固体支持体）を含有する抗体への固定化に使用される。この他のレポーターは感受性の検出に使用される。酵素と結合したストレプトアビジンまたは酵素結合した抗ストレプトアビジンに続くストレプトアビジンは、シグナル増幅／検出に好ましい。
【０１８８】
ビオチンとこのポリアミン間のリンカーは重要である。このポリアミン−ビオチンがこの固体支持体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１９９３）に固定化された後、ストレプトアビジンでの結合を最大化するように設計すべきである。多くの異なるリンカー分子は、一般的に市販されているが、このポリアミンとビオチン、例えばビオサイチンとの間で誘導され得る。種々の長さの多くの異なるリンカーは、当該分野において公知である。これと同一の考慮は、リガンド／ビオチン以外の標識について重要である。
【０１８９】
（ポリアミンプローブを使用する他の薬理学的標的のアッセイ）
本発明はまた、取りこみ後のポリアミンの組織学的なまたは細胞化学的な局在化に使用され得る。本明細書中に記載されるポリアミン類似体はこの細胞内に局在化される。従って、この型のプローブは細胞または組織の細胞学的解析に使用され得、異常に高いまたは低いレベルのポリアミンを有する細胞または細胞内の部位を同定する。Ｎ1−ダンシルスペルミンはこの核小体およびこの核膜に特異的に局在化することが示される（実施例ＸＸＶＩ）。この核の構造は、進行している癌の病期分類についての公知の指標である。本蛍光プローブは、蛍光顕微鏡の使用を伴う伝統的な細胞学的な解析中に援用され得、現在の診断技術の正確さを増強する。
【０１９０】
このＰＡＴ活性アッセイに加えて、このレポータープローブはポリアミンの公知のポリアミン標的および結合部位との結合を定量化するために使用され得る。これらの部位には、このＮＭＤＡレセプター、Ｋ+内向き整流チャネル（ＩＲＫ）、タンパク質キナーゼＣＫ２、およびホスホリパーゼＣδ１がある。ポリアミンはまた特にＲＮＡおよびＤＮＡと結合し、ポリアミン相互作用はハイプシン（ｈｙｐｕｓｉｎｅ）合成における役割を演じる。本明細書中に記載のとおり、改変したポリアミン類似体を発生することは容易であるため、特異的な類似体は各ポリアミン結合標的について発生する。
【０１９１】
（ポリアミンと結合する可溶性タンパク質）
多くのタンパク質はポリアミンに結合する。このようなタンパク質のアッセイは、本発明の範囲に含まれ、結合した蛍光ポリアミンを使用する競合アッセイにより、薬物候補を同定し得る。さらに密接にまたは不可逆的に結合するポリアミン類似体は任意のポリアミン結合タンパク質または目的の他のポリアミン結合標的を抽出および単離するために使用され得る。基質またはポリアミンが結合するとき、幾つかのタンパク質は立体配位的な変化を起こす。本スクリーニングアッセイが適用されると、後者が特定の立体配位部位にある場合、このプローブはタンパク質に結合するか結合しないかのいずれかである。１つの実施例は、タンパク質キナーゼＡ２，バインディンポリアミンについて、この酵素の基質結合部位を改変する立体配位的な変化を起こすアイソザイムである。αサブユニットのみから成るメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ２）のアイソザイムは、αおよびβサブユニットを有するアイソザイムよりも、ポリアミン阻害についてずっと感受性である。
【０１９２】
（ポリアミン輸送の試験インヒビター）
上述の種々の合成経路により生成される化合物のスクリーニングを介して、幾つかの化合物はポリアミン輸送を効果的に阻害することが見い出された。ＤＡＣＳ４はＫｉ１０ｎＭを有する化合物のようなものである。ＰＡＴインヒビターのようにその有効性を増強するために、ＤＡＣＳは、ポリメラーゼまたはＯＤＣインヒビター、ＤＦＭＯの存在下で、細胞増殖（図２２〜２４；実施例ＸＩＸ）のインヒビターとして試験された。Ｒ値はＤＦＭＯの存在下でのＩＣ５０を超える、ＤＦＭＯの存在下でのＩＣ５０の比率として計算された（実施例ＸＸ）。動力学的な測定および生物学的な解析を共に使用して、本発明者らはＰＡＴの阻害と増殖との間で高い相関を観察した。図２（実施例ＸＸ）におけるこの３つの化合物６、４および５は、以下に要約するようにＫｉ値（それぞれ５、１０、および１０μＭ）およびＲ値（それぞれ２２０、４００、および２１０）の最良の組み合せを有する：
インヒビター  Ｋｉ（μＭ）    Ｒ
６            ５          ２２０
４          １０          ４００
５          １０          ２１０
ポリアミンに関しない幾つかの他の化合物は、非競合的機構によりＰＡＴを阻害することが示された。これらの化合物（図２５）には幾つかの抗−精神病薬（塩化トリフルオペラジンおよび塩化クロルプロマジン（ｔｈｏｒａｚｉｎｅ））を含む。化合物１６１および１６２はＰＡＴ阻害活性（実施例ＸＸＩＩを参照のこと）を有した。化合物１６３は、以前にＰＡＴインヒビターであることが示されたが、また抗精神病薬でもある。
【０１９３】
実施例ＸＸＩは、ＤＡＣＳ（図２６）によるスペルミジン／スペルミン  アセチルトランスフェラーゼ酵素活性の阻害を記載する。これに基づき、これらの化合物の幾つかは、内部移行した場合、２重の目的を果たし得る。
【０１９４】
種々の「ヘッドなし」ポリアミン類似体の効果はまた、評価され、実施例ＸＸＩＩＩに記載される。
【０１９５】
（薬学的組成物および治療用組成物）
薬学的組成物における使用のために好ましい化合物には、上記のモノ置換およびジ置換ポリアミン化合物の全てが含まれ、最も好ましくは、ＤＡＣＳ（４）ならびに化合物５、１７１、および６であり、おもにそれらの化合物の薬学的に受容可能な塩の形態においてである。塩基性基を含有する本発明の化合物の薬学的に受容可能な酸付加塩は、適切な場合、塩基性アミンの存在下で、当該分野で公知の方法によって、強い、または中程度に強い、非毒性の有機酸または無機酸とともに形成される。本発明に含まれる酸付加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および硝酸塩である。
【０１９６】
上記のように、本発明の化合物は、ＰＡＴまたはポリアミン合成を阻害する能力、多数の疾患または状態のいずれ（最も顕著にはガン）の処置においても活用される特性を有する。本発明の組成物は、それ自体で活性であり得るか、またはインビボで活性な形態に変換される「プロドラッグ」として作用し得る。
【０１９７】
本発明の化合物、およびその薬学的に受容可能な塩は、都合のよい投薬形態（例えば、カプセル、含浸したオブラート剤、錠剤、または注射可能な調製物）に組み込まれ得る。固体または液体の薬学的に受容可能なキャリアが利用され得る。
【０１９８】
好ましくは、本発明の化合物は、全身的に、例えば、注射によって投与される。使用される場合、注射は、公知の任意の経路によってであり得、好ましくは、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、または腹腔内であり得る。注射剤は、溶液または懸濁液として、注射前に流体中に液体または懸濁液とされるのに適した固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかの従来の形態で調製され得る。
【０１９９】
固体キャリアには、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、石膏、スクロース、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が含まれる。液体キャリアには、糖蜜、ピーナッツ油、オリーブ油、生理食塩水、水、デキストロース、グリセロールなどが含まれる。同様に、キャリアまたは希釈剤は、任意の徐放材料、例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンを、単独で、またはワックスとともに含み得る。液体キャリアが使用される場合、その調製物は、糖蜜、エリキシル、エマルジョン、軟ゼラチンカプセル、アンプルのような滅菌注射可能流体（例えば、溶液）、または水性もしくは非水性の流体懸濁液の形態においてであり得る。このような薬学的に受容可能な組成物の要約は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  （Ｇｅｎｎａｒｏ  第１８版、１９９０）に見出され得る。
【０２００】
薬学的調製物は、錠剤形態のために必要であれば、混合、顆粒化、および圧縮のような工程、あるいは経口または非経口（局所、経皮、膣内、鼻内、気管支内、頭蓋内、眼内、耳内、および直腸内投与を含む）投与のための所望の製品を得るために適切であれば、成分の混合、充填、および溶解のような工程を包含する製薬化学の従来技術に従って作製される。薬学的組成物はまた、少量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤化剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）を含有し得る。
【０２０１】
投与の好ましい経路は全身であるが、その薬学的組成物は、局所的もしくは経皮的に（例えば、軟膏、クリーム、もしくはゲルとして）；経口的に；直腸に（例えば、坐剤として）；非経口的に（注射もしくは連続的注入により）；膣内に；鼻内に；気管支内に；頭蓋内に；耳内に；または眼内に投与され得る。
【０２０２】
局所的適用のために、その化合物は、局所的に適用されるビヒクル（例えば、膏薬（ｓａｌｖｅ）または軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｎｔ））中に組み込まれ得る。活性成分のためのキャリアは、噴霧可能であるか、または噴霧可能でない形態のいずれかであり得る。噴霧可能でない形態は、局所適用にとって常在性のキャリアを含み、そして好ましくは水の動的粘度よりも大きい動的粘度を有する半固体か、または固体形態であり得る。適切な処方物には、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、糊膏、膏薬などが含まれるが、これらに限定されない。所望の場合、これらは、滅菌されるかまたは補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液、もしくは浸透圧に影響を与える塩など）と混合され得る。噴霧可能でない局所用処方物のための好ましいビヒクルには、軟膏基剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００））；従来のクリーム（例えば、ＨＥＢクリーム）；ゲル；ならびにワセリンなどが含まれる。
【０２０３】
局所適用のために同様に適切なものは、噴霧可能なエアロゾル調製物であり、ここで、ペプチド（好ましくは、固体または液体の不活性なキャリア物質との組み合わせで）が、スクイーズボトル中にパッケージングされるか、または加圧された揮発性の通常は気体の噴霧剤と混合されてパッケージングされる。そのエアロゾル調製物は、溶媒、緩衝液、界面活性剤、芳香剤、および／または抗酸化剤を、本発明の化合物に加えて含有し得る。
【０２０４】
好ましい局所適用のために（特にヒトのために）、その化合物の有効量を、患部領域（例えば、皮膚表面、粘膜、目など）に投与することが好ましい。この量は、一般に、処置される領域、症状の重篤度、および利用される局所用ビヒクルの性質に依存して、適用ごとに約０．００１ｍｇから約１ｇの範囲である。
【０２０５】
本発明の組成物は、疾患または状態を処置するために使用される１つ以上のさらなる化合物と組み合わせて与えられる。ガンを処置するために、ポリアミン誘導体が、例えば、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンブラスチン）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；葉酸塩インヒビター（例えば、メトトレキサート、プリトレキシム（ｐｒｉｔｒｅｘｉｍ）、またはトリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ））；抗代謝剤（例えば、５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシド）；インターカレート抗生物質（例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン）；酵素または酵素インヒビター（例えば、アスパラギナーゼ）；トポイソメラーゼインヒビター（例えば、エトポシド）；あるいは生物学的応答修飾剤（例えば、インターフェロン）のような抗ガン剤と組み合わせて与えられる。実際に、任意の公知のガン治療剤を、本明細書中に開示される置換ポリアミンと組み合わせて含む薬学的組成物は、本発明の範囲内にある。最も好ましくは、本発明の化合物は、ポリアミン合成インヒビター（例えば、ＤＦＭＯ）と組み合わせて投与される。
【０２０６】
本発明の薬学的組成物はまた、例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、および抗球虫剤を含む抗感染剤のような１つ以上の他の医薬品を含み得る。
【０２０７】
本発明の化合物の代表的な単回用量は、約１ｎｇ／ｋｇ体重と約１０ｇ／ｋｇ体重との間である。その用量は、好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と約１ｇ／ｋｇ体重との間であり、そして最も好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間である。局所投与のために、その化合物の約０．０１〜２０％、好ましくは、１〜５％濃度の範囲の用量が示唆される。約１〜５００ｍｇの範囲の１日の総投薬量が、経口投与のために好ましい。しかし、前述の範囲は、示唆的である。なぜなら、個々の処置レジメンに関する可変量の数が大きく、そしてこれらの推奨される値からかなりの離れた値が予想されるからである。
【０２０８】
疾患または状態の処置のための化合物の有効量または有効用量は、特定の疾患または状態のために認証されたインビトロ系またはインビボ動物モデルを使用して決定され得る。ガンの場合、多くの当該分野で認証されたモデルが公知であり、そして広範な種類のヒトのガンを代表する。その化合物は、多数のヒトまたは非ヒト動物起源のガン細胞株の任意のものを用いる標準的なアッセイを使用して、培養中でのガン細胞増殖の阻害について試験され得る。これらのアプローチの多く（動物モデルを含む）は、Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．ら、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （第３版）」、Ｃａｎｃ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，  Ｐａｒｔ  ３，３：１−１１２に詳細に記載され、これはその全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２０９】
平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）ライブラリ合成
ポリアミドおよびアナログへの組合せ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）アプローチ
組合せ化学（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、急速に変化しつつある、分子調査の分野であるが、依然として、その幼児期にある。概説について、Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５〜１６７、１９９７；Ｓａｌｅｍｍｎｅ、Ｆ.Ｒ.ら；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３１９〜３２４、１９９７；Ｇｏｒｄｏｎ、Ｅ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ．３７：１３８５〜１４０１、１９９４；Ｇａｌｌｏｐ、Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１、１９９４）を参照。製薬産業は、数百から数千の化合物を一つの「フラスコ」で組合せた合成に続いて結果をテストおよび逆重畳する最初のアプローチが、多くの落とし穴を伴う退屈なプロセスであることを現在悟りつつある。さらに従前的な医化学のアプローチ、すなわち、１度に１つの化合物の合成およびテストは、標的の周囲のＳＡＲについて、より信頼性がありかつ情報が多い結果をもたらす。組合せ化学におけるトレンドは、従って、複数の化合物を一度に、それぞれ別の容器中で合成することに向かっている。従って、多くは、この１化合物／１-ウェル平行合成アプローチを応用している。多くの先導的（ｌｅａｄ）化合物がこの方法で生成されるが、この化学は、必らずしも必要な薬物様性能を有する分子に導かない。
【０２１０】
先導的最適化のさらなる工程の後の薬物様性能（分子量、親水性／疎水性、輸送、代謝および安定性）の取り込みは、薬物開発コストを低減する。従って、所望の性能が最初のライブラリに取り込まれる新規な化学を追求することが好ましい。先導的同定と、新薬物候補の生産との間の工程の数を減少させることにより、コストが顕著に低減され得る。
【０２１１】
ポリアミンおよびスルホニルクロライドのアレイで出発する平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）合成を用いて、置換ポリアミンのライブラリが合成され得る。２つの異なるアミンおよび３つの異なる酸クロライドから出発する６の置換ポリアミンの平行合成が、実施例ＸＶに詳細に説明される。
【０２１２】
適切な、利用可能な装置を用いて、２４個ほどの多くの化合物が、同時に一つの設備上で合成され得る。市販の設備は、高いスループットの平行合成を支持する。１度に９６個の化合物を合成するためのマイクロタイタープレートフォーマットが現在日常的であり、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ  ＰＴＹ  ＬＴＤ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）により開発された９６マルチピン技術が、代表例である。このフォーマットは、異なる長さの炭素リンカーを有するポリアミンアナログを合成するのに特に有用である。異なるポリアミンおよびスルホニルクロライドを用いる合成される組合せライブラリーは、実施例ＸＶＩに説明される。
【０２１３】
同様に、実施例ＸＶＩＩに説明されるように、市販されている酸クロライドが、異なるポリアミンを用いる平行組合せ合成に使用され、モノ置換ポリアミンアミドのライブラリーが得られる。適切な（市販の）アミンのｐ−ニトロフェニルクロロホルメートでの活性化により、平行して、置換ウレアが合成される。次いで、生成物は、市販のアミンと反応させられて、所望の置換ウレアを、実施例ＸＶＩＩＩに説明されるように、得る。数千の置換カルボン酸、スルホン酸、スルホニルクロライド、酸クロライド、およびアミンが、様々な市販のアミンへの（直接またはリンカーを介しての）カップリングのために市販されている。従来の方法は、市販されていない誘導体について私用され得る。これらのライブラリーを包含する化合物は、高いスループットのスクリーニングアッセイにおいて、異なる疾患の状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてその強度について評価される。
【０２１４】
本明細書中で説明される化学は、「１化合物／１ウェルアプローチ」を用いて、組合せ合成に容易に応用される。実施例ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩは、これがどのようにされたかを例示する。このアプローチにより、多くの新規アナログが、短時間に作製され、その結果、所望の薬物用性能が、迅速に創り出される。
【０２１５】
本発明者らは、治療用途のための、そして様々なアッセイのためのプローブとしての新規化合物を合成する方法を設計した。このような化合物は、多くの疾患において、特にガンに対する薬物として有用である。これらはまた、例えば、ＤＦＭＯ（これは、オルニチンデカルボキシラーゼ、ＯＤＣを阻害する）などのポリアミン合成インヒビターまたは他の薬剤との組合せ薬物治療の成分として有用であり、そのことにより、新規な組合せ化学療法レジメンを提供する。本発明の化合物はまた、ポリアミンが上記の役割を果たす他の疾患または状態を処置するのに有用である。
【０２１６】
（ポリアミンアナログの組合せ合成）
本発明は、ＰＡＴ阻害に関する薬物標的および他の関連する薬理学的および産業的標的に関するＳＡＲを研究するのに利用可能な化学のレパートリーを延長する。汎用的で効率的なＮａＢＨ3ＣＮ還元アミノ化試薬と可溶性（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ）または不溶性ポリマー支持体とを組み合わせることによって、強力な組合せ方法論が提供される。さらに重要な技術的イノベーションは、リンカーから残存するさらなる残留物の問題なく所望のポリアミンを塩として提供するＢｏｃ様リンカーの使用を含む。
【０２１７】
ポリアミン鎖の延長の方向は、過アルキル化が起こらないことを確実にすると同時に高い収率を確実にする。過アルキル化は、ジ−アルキル副生物（ＭｅＯ−ＰＥＧＯ−リンカー−ＮＨ2プラスＲ−ＮＨ2の代わりにＭｅＯ−ＰＥＧＯ−リンカー−ＣＨＯプラス過剰のＲ−ＮＨ2）もたらす。
【０２１８】
関連する化学の特にマイルドな性質が与えられると、多くの、重要かつ新規な構造的特徴（例えば、炭素鎖上のキラルな置換基（アミノ酸誘導シントンを用いる）、ヘテロ環置換基、炭水化物、ヌクレオシド、コンホーメーション制限、および最終的には、公知の薬物を含む）が、得られるポリアミン生成物中に容易に取り込まれ得る。
【０２１９】
（合成方法）
本合成方法は、図３３に示される合成サイクル中のこの新規な技術の３つの主要なコンポーネントを合わせる。これは、（１）成長鎖を固着するための可溶性ポリマーの使用、（２）延長剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）および（３）鎖延長をブロックするターミネーターを含む。
【０２２０】
第１に、図３４に示されるように、活性化ｔｅｒｔ−アルコキシカルボニルＭｅＯ−ＰＥＧポリマーが合成される。第２に、このポリマーが、遊離のアミノ保護アルデヒド延長シントンと反応する。図３５は、市販のアミノアルコールまたはキラルなアミノ酸前駆体プールのいずれかからのこれらの延長剤の生成を示す。第３に、合成サイクルに続いて、ＮａＢＨ3ＣＮでの還元アミノ化反応を用いて最初に骨格を延長し、その後、アルデヒドによるさらなる還元アミノ化工程により、上記の第２級アミン生成を停止させる（図３６）。最終工程は、キャッピングおよびポリマー支持体からの酸切断であり、所望のポリアミンアナログを酸塩として提供する（図３７）。
【０２２１】
１．活性化ポリマー
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（カタログ、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．、２３０７  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｒｏａｄ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ  ３５８０１）のポリマー支持体としての選択は、本発明の技術イノベーションのキーの１つである。この材料は、以下の独特な性能を有する：（ａ）ほとんどの一般的に使用される有機溶媒中への溶解性（表１を参照；Ｂａｙｅｒ、Ｅ．ら、Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．、Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ、１３ｔｈ、１２９、１９７５）および（ｂ）ジエチルエーテルの添加による沈殿可能性。これらの特性は、固相の問題の多くを克服する。例えば、反応パートナー間の完全な接触が、固相バリアーなしで、反応速度および収率を非常に増大させることが周知である（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｐ．；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９：１１０６５〜１１１３３、１９９３）。以下の表１に見られるように、反応の完了後、溶解性ポリマー生成物は、ジエチルエーテル中に単に注ぐことにより、反応媒体から沈降し得る。さらに、他の支持体またはチップが置換され得る。
【０２２２】
0004044728.tif 000013
ろ過の後、ポリマーは、無水エタノール中での再結晶により、過剰な試薬および副生物からさらに精製され得る。これらの独特な特性は、他のタイプのライブラリについて、他人により開発された。Ｊａｎｄａらは、この樹脂を使用して、ペンタペプチドおよびアリールスルホンアミドライブラリを製造した（Ｈａｎ、Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：６４１９〜６４２３、１９９５；Ｊａｎｄａ、Ｋ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２３４〜２４７、１９９６）。Ｋｒｅｐｉｎｓｋｙおよび共同研究者らは、同じ選択的溶解性ポリマー支持体を使用して、構造的に複雑なオリゴサッカライドを生産した（Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｓ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：２１１６〜２１１７、１９９５；Ｋｒｅｐｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｊ．、ＵＳ、５，６１６〜６９８、１９９７）。これらの報告は、複雑かつ長い合成手順におけるこの支持体の実現可能性を明らかに示す。
【０２２３】
Ｈｏｄｇｅｓは、新規な手順を報告した。それによれば、ｔｅｒｔ−アルコキシカルボニル官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）により、アミンは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのポリスチレン樹脂に結合され得る（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ、Ａ．Ｓ．ら；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：３１５３〜３１５７、１９９７）。このＢｏｃ様リンカーは、最終工程における酸処理によるリンカー部分の樹脂からの完全な除去を可能にするという明確な利点を有する。従って、本発明におけるこの方法の応用は、最終的なポリアミン生成物を、リンカー残存物のない酸塩として提供する。
【０２２４】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨでのこのリンカー方法論の導入を図３４に示す。ＴＨＦ中での、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（１ａ）のリチウムもしくはナトリウム塩の形成、続いての、２−メチル−４−ハロ（もしくはトシル）−１−ブテンでのアルキル化により、ポリマーの所望のアルケンエーテル（２ａ）が得られる。例えば、参照（Ｄｏｕｇｌａｓら、前出；およびＵＳ５，２５２，７１４）。Ｈｇ（ＯＡｃ）2でのオキシ水銀化、続いての還元性脱金属により、所望の第３級アルコール（３）が得られる（Ｂｒｏｗｎ、Ｈ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：１８４４〜１８５０、１９７０）。次いで、Ｈｏｄｇｅｓ（前出）の「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」方法が使用され、第１のアミンサブユニットとの反応に対してこの樹脂を活性化する。Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールおよび４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンとの反応により、中間体（ｔｅｒｔ−アルコキシカルボニル）イミダゾールが得られ、これはメチルトリフルオロメタンスルホネート（ＭｅＯＴｆ）でのメチル化により活性化される。過剰のＭｅＯＴｆは、Ｅｔ3Ｎ（これは、これ自身では、活性化イミダゾリド４ａと反応しない）での処理により除去される。
【０２２５】
２．伸長剤ユニット
この技術における大きな融通性は、伸長剤合成のための開始物質の選択において成り立つ。図３５に示されるように、キラルアミノ酸貯蔵所からの選択によって、遊離アミノ／保護されたアルデヒドは、幾つかの容易な工程において、高収率および高純度で生成された。非保護アミノ酸５ａは、ＮａＢＨ4およびＩ2を用いた処理によってアミノアルコールに直接に還元され得る（Ｂｈａｓｋａｒｋａｎｔｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：５９６４−５９６５、１９９１）。にもかかわらず、アミノ酸の保護は、最初のカルボキシレート還元工程の場合に、特により複雑なアミノ酸を用いる場合に必要とされ得る。トリフルオロアセチル基（Ｓ−エチルトリフルオロチオアセテートを使用して）を用いたより求核性のあるアミノ官能基の選択的な保護は、所望の保護アミノアルコール６ａを得る（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｅ．、Ｃａｌｖｉｎ、Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７７：１７７７９−２７８３、１９９５）。それを導入し、そしてそれを穏やかな塩基で切断する容易さのために、この保護基が主に選択される。ＤＭＳＯ中で、ジシクロカルボジイミドおよびジシクロ酢酸を使用するＰｆｉｔｚｎｅｒ／Ｍｏｆｆａｒｔ酸化、次いで、１，３−ジフェニルイミダゾリジンのようなインサイチュアルデヒド保護は、結晶性の完全に保護された中間体７を得る（Ｐｆｉｔｚｎｅｒ，Ｋ．Ｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７：５６６１、Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ、Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３９、２９０、１９７４）。
【０２２６】
このアルデヒド保護基の使用は、一度に数個の問題、例えば、しばしば問題となる遊離アルデヒドの精製を克服する。多くのこれらの１，３−ジフェニルイミダゾリジン７化合物は、非常に結晶性が良く、そして、精製が容易である（Ｗａｎｚｌｉｃｋ、Ｈ．Ｗ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．８６：１４６３、１９５３）。水酸化アンモニウム水溶液を用いた単純な加水分解は、遊離アミン／保護アルデヒド伸長剤ユニット８を生成する。
【０２２７】
市販されるアミノアルコール６ａは、図３５の連続工程で使用される。このアミノ保護、アルコール酸化、アルデヒド保護およびアミド加水分解工程は、３，４および５−炭素鎖アミノアルコール６ａを用いて成功する。これらのシントン８ａは、天然に存在するプトレシン、スペルミジンおよびスペルミンを模倣するポリアミン骨格の保護を可能にする。
【０２２８】
３．合成サイクル
活性化されたポリマー４ａ（図３４）と伸長剤ユニット８ａ（図３５）の両方を手にして、カップリング方法が試験される準備をし、使用した。第一の伸長剤ユニット８ａは、活性化ポリマーと反応され、カルバメート９ａ（図３６）を介してリンクされる保護アルデヒドを得る（図３６）。９ａの末端アルデヒドから１，３−ジフェニルイミダゾリドン基の選択的脱保護は、カップリング反応のための必要とされる開始基質を生成する。この加水分解は、酢酸のような弱酸を使用して、困難性を引き起こさない。というのも、Ｂｏｃ様リンカー部位がＣＨ2ＣＨ2中の１０％ＴＦＡのようなより激しい酸条件下で切断されることが期待されるためである（イソプロピリデンケタール（Ｂｏｃ基よりも高い酸感受性基）の存在下でＤｏｗｅｘ５０カチオン交換樹脂（Ｈ+型）を用いて５’−アルデヒド性アデノシンの１，３−ジフェニルイミダゾリジンを切断した。
【０２２９】
収率を最適化するために、非環式アセタール、環式アセタールまたは酸安定ジチオアセタールを含む他のアルデヒド保護基が、スキーム中に組み込まれ得る。このポリマーアルデヒド１０ａは、次いで、ＴＨＦまたはメタノールのような適切な溶媒中で、Ｂｏｒｃｈ還元性アミノ化下にて、過剰の次の遊離アミン／保護アルデヒドサブユニット８ａ（図３５）と反応された（Ｂｏｒｃｈ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：２８９７−２９０４、１９７１）。固体基板上での還元性アミノ化反応は周知である（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１１６２−１１６６、１９８７；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：４７−５０、１９９５；Ｄａｖｒａｊ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６１、：９３６８−９３７３、１９９６）。
【０２３０】
初期のイミン形成は、微量のＡｃＯＨで触媒され、次いで、ＮａＢＨ3ＣＮの添加によって、メチレン第二アミン生成物１１ａを得る（図３６）。１１ａにおける第二アミノ基は、初期イミン形成において使用される過剰のアミンとさらに反応され得ない。過剰の遊離アミノ伸長剤ユニット８ａを使用することによって、完全な反応が保証される。完全な反応は、任意の多段階固相合成法において重要である。というのも、低い反応収率は、潜在的に、全て所望されない種の複雑な生成混合物を与え得る。
【０２３１】
過剰のアミノ伸長剤を有するこの合成法において、カップリングを達成することによって、９８％以上の収率が達成される。
【０２３２】
過剰のアミンは、アルデヒド成分に基づく所望の第二アミンの収率を増大させる。異なるアミノ／アルデヒド反応パートナーが異なる速度で反応することが期待される。しかし、過剰のアミンを添加することによって、そして、長時間反応を進行させることによって、完全な反応が、全ての場合で期待される。
【０２３３】
得られた、１１ａの遊離の第２級アミノ官能基の上で、第２の還元アミノ化反応が、ここで、行われ得る。広範な取り合わせの市販のアルデヒドが、この反応に適切であり、これは、得られるポリアミン骨格を、興味深くそして新規な方法で、「着飾らせ（ｄｒｅｓｓ）」得る。
【０２３４】
大きなシリーズの単純な直鎖もしくは分枝鎖アルキルアルデヒドが利用可能である。これらの改変されたポリアミンは、より大きい親油性を有する。そのため、生物学的膜および血液脳関門を架橋するそれらの能力を増大させる。多数の不飽和アルケンアルデヒドのいずれもがまた使用され得る。特に興味深い例は、アクロレインである。これは、保護基として機能し得、そのことにより、得られるアリルアミンのＲｈ（Ｐｈ3Ｐ）3Ｃｌ触媒での脱保護により第２級アミンに戻すことを可能にする（Ｌａｇｕｚｚａ、Ｂ．Ｃ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．２２：１４８３〜１４８６、１９８１）。この第２級アミン生成のための別の方法は、ｔＢｏｃ基の使用であり、これは、最終反応において、リンカーと共に切り離される。
【０２３５】
広範な種類の芳香族アルデヒドがまた使用可能である。一連の置換ベンズアルデヒド誘導体ならびに様々なヘテロ環式芳香族アルデヒドのいずれもが使用され得る。
【０２３６】
この可能性はまた、炭水化物および炭水化物ホスフェートを用いることによる、さらに水溶性の誘導体に延長され得る。カップリング化学反応の汎用性およびマイルドな性質により、非常に複雑な分子（例えば、ヌクレオシドアルデヒド）もまた使用され得、これらの新規なアナログを修飾し得る。周知の高度に強力な、ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーのポリホスフェート骨格へのポリアミンの結合は、特異的な、強固に結合したポリカチオン性ＤＮＡ「３重らせん」アナログについての可能性を創造する（Ｄｅｍｐｃｙ、Ｒ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、９３：４３２６〜４３３０、１９９６；Ｇｏｏｄｎｏｗ、Ｊｒ．Ｒ．Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：３１９５〜３１９８、および３１９９〜３２０２、１９９７）。このようなシリーズは、ポリアミン標的を取り囲む分子空間の分析を可能にする（以下に説明する）。多大な合成のフレキシビリティーにより、ポリアミン骨格（延長ユニットの選択により得られる）においてのみならず、得られる骨格に着飾らせるために利用可能なターミネーターの範囲においても、ポリアミンアナログの周囲の大きい分子多様性を創造することが可能である。
【０２３７】
完全に末端化されそして「修飾された」ポリアミンを手にすることにより、最終的なキャッピングおよびポリマー支持体からの切断が行われる（図３７）。最終的なキャッピングの化学反応はまた非常に多様である。１，３−ジフェニルイミダゾリジン１２ａ（図３６）のマイルドな脱保護により、１０ａを生成し（図３６および３７）、そして還元性アミノ化条件下でのアンモニアとの反応により、切断されたポリアミンアナログ１５ａは、第１級アミノ官能基を両端に有する。第２級アミノ官能基を１端に有する構造を作製するためには、遊離末端アルデヒドと第１級アミンとの反応が行われる。第２級アミンとの反応により、第３級アミンが末端位置において得られる。２官能性末端、第３級アミンを得るための別の方法は、第１級アミンとの反応、および続いてのアルデヒド性ターミネーターと上記のように反応させられることによる。
【０２３８】
最終的に、ポリアミンのいずれかの末端の選択的修飾は、末端をキャッピングし、ポリマー性支持体から切断し、そしてアルデヒドと反応させることにより達成される。これは、還元性アミノ化条件下でのすべてのアミノ官能基においてさらなる反応から選択的に保護されるポリアミンをもたらすので、このアプローチの合成の多様性は、実質的に無限である。
【０２３９】
４．分析および精製手順
上記の反応のそれぞれのタイプを追求するために、いくつかの強力な分析技術が使用され得る。合成の間中、任意の中間体が1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲ技術により分析され得る（Ｈａｎら、前出；Ｊａｎｄａら、前出；Ｄｏｕｇｌｓら、前出；Ｋｒｅｐｉｎｓｋｙら、前出）。ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ樹脂の官能基化の程度は、フェニルイソシアネートとの反応および得られる未反応ポリマー性ヒドロキシル基上に形成されるカルバメート基のＵＶ分析により分析され得る。（未反応ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨの分析（Ｍ．Ｗ．＝５０００ダルトン）の分析は、１７，５００Ｍ-1ｃｍ-1のε236値を与える）。遊離のアルデヒド基が、２，４−ジニトロフェノルヒドラジンとの反応およびその後のＵＶ定量により定量される。遊離アミノ基は、ニンヒドリンとの反応およびその後のＵＶ分析により定量される（Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：５９５、１９７９）。赤外スペクトルは、官能基同定に使用される。ポリマーからの切断後の最終製品の重量とともに、これらの技術からの情報を用いて、個々の分析方法の間の関係が作製される。最終的な、切断された製品は、標準的な技術により完全に分析される。例えば、1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲ、ＵＶ分析（適用可能な場合）、ＩＲスペクトル、融点、ＨＰＬＣおよびＴＬＣ遅延時間および元素分析。これらの技術が、生物学的テストの前のさらなる精製を認める場合、クロマトグラフィー技術（例えば、カチオン交換または逆相クロマトグラフィー）がその目的に有効に用いられる（Ｓｉｅｇｅｌ、Ｍ．Ｇ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：３５５７〜３３６０、１９９７）。このアプローチにより合成される化合物の例を図３５に示す。
【０２４０】
（固相合成）
液相合成についての上記で説明されるアプローチはまた、固相支持体としてポリスチレン樹脂、チップベースシステム（ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、マルチピンシステム（ｍｕｌｔｉ−ｐｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ）およびヒドロキシル基を有するマイクロウェルを用いて行われ得る。ヒドロキシルリンカーを有する多くの固相支持体は、例えば、Ｗａｎｇ樹脂（Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｗ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９５：１１２８−１３３３、１９７３）を利用し得る。多くのリンカーは記載されてきており、主要な努力は、切断後の化合物の選択を生じるリンカーを排除する「リンカーなし」樹脂を設計する方法にある。
【０２４１】
液体ベースのアプローチと対照的に、固相アプローチの反応条件は、最適な収量を与え、そして副反応または不完全な反応を最小にするために計画される。従って、過剰の試薬を使用し、そして洗浄除去する；望ましくない試薬はまた、補足剤樹脂で除去される（Ｂｏｏｔｈ  Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：４８８２、１９９７）。触媒樹脂を使用して、反応を速くする。
【０２４２】
交互結合基（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を有する固体支持体の例は、ポリアミンアナログを合成するために図３９に示され、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−メトキシメチルポリスチレン１６ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を例示する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．、３５：９３３３、１９９４）。ブロック化アミノアルデヒドを有する１２の反応は、１７ａを生じ、これはＨｇＣｌ2／ＨｇＯで脱ブロック化され、アルデヒド１８ａになる。ＮａＢＨ3ＣＮの存在下でのブロック化アミノアルデヒドを有するアルデヒド１８ａの反応は、第２アミンを含む延長した鎖を有する１９ａを生じ、これはターミネーターアルデヒドでブロックされて１９ａを生じる。化合物１９ａは樹脂から脱ブロックされそして切断されて生成物を生じ得るかまたは次のサイクルで反応し得るかのどちらかである。ヒドロキシテールを含む所望の生成物は、９５％ＴＦＡ／５％Ｈ2Ｏでの処理によって樹脂から解放される。
【０２４３】
マルチピン法は、寸法安定ポリプロピレン／ポリエチレンピンのモジュラー８×１２マトリクスを基礎として、これにグラフトポリマーを共有結合させる。合成をグラフトポリマー上で行い、これは適用に合うように変化され得る。異なるリンカー基を含むマルチピンシステムの例（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、図４０に示す。Ｒｉｎｋアミドリンカーを、ピンＰに結合した構造２３ａとして示す（Ｒｉｎｋ  Ｈ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．、２８：１７８７−１７９０、１９８７）。このリンカーは、使用する前にＦｍｏｃ保護基の除去を必要とする。所望の生成物は、次いで、それを遊離アミノ基から構築することによって合成される。合成の完了後、生成物を５％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2を用いて切断し得、第１アミドを得る。この基は、弱酸および塩基に対して安定である。構造２３ａおよび２５ａを有するピンを、カルボン酸を結合するために使用する。２３ａの安定性は良好であり、そして強塩基に対してのみ不安定であり、そして９５％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏで切断される。対照的に２５ａは強塩基に対して安定であり、そして９５％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏで切断される（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４４：１５８−１６５、１９９４）。構造２４ａは酸を結合するために使用され、これはＮａＯＨまたはＮＨ2Ｒのいずれかで切断され得、アミンを得る。このピンの型は、ＨＦ、ＴＦＡおよび弱塩基の存在下で使用され得る。構造２７ａは、２５ａと同様に実行されるが、より弱い酸に対してより安定であり、そして一般に不安定である（Ｂｒａｙ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：２１９７−２２０３、１９９４）。構造２６ａはカルボン酸を結合するために使用され、切断されて次いでＮａＯＨまたはＮＨ2Ｒを含むＣＨ2Ｎ2でアルキル化され（アミドを得るために）、そしてアルキル化の前に強酸または強塩基に安定化される。これは、当業者に明らかであり、これらの固体支持体は、上記のアプローチに包含される。さらに、当該分野における他の固体支持体は、公知の化学反応と組み合わせられて、使用される特定の切断可能リンカーによって決まる異なる官能基を含むポリアミンアナログを生成し得る。
【０２４４】
ここで一般に本発明の説明してきたが、同様のことが例示の様式で提供される以下の実施例を参照することによって容易に理解され、そして指定する場合を除いて、本発明を限定する意図はない。
【０２４５】
（実施例Ｉ）
Ｎ1−ダンシルスペルミン３の合成
Ｎ1−ダンシルスペルミンの合成は、図７に示される。４℃に冷却した３０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の０．８１ｇ（４ｍｍｏｌｅ）のスペルミンおよび０．１ｇ（ｍｍｏｌｅ）のトリエチルアミンに、９０分かけて２０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した０．２７ｇ（１ｍｍｏｌｅ）のダンシルクロリドを滴下した。温度を周囲温度まで上昇させ、１６時間撹拌し、トリエチレンアミン塩酸塩を除去するために濾過した。沈殿物を２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、そして合わせたＣＨ2Ｃｌ2抽出物をＷｈａｔｍａｎ  ｎｏ  １  濾紙で濾過し、エバポレートして乾燥し、０．４５ｇを得た。イソプロパノール：ピリジン：酢酸：水（４：１：１：２）中のシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーは、０．２％ニンヒドリン／エタノールをスプレーした場合、出発スペルミンを示さず、そして主要な２つのスポットを示した。この物質を８ｍｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）に溶解し、そして０．５ｍｌ／分の流速で５００ｍｌにわたって、１．０Ｍ酢酸アンモニウムと１．２５Ｍ塩酸間のｐＨ勾配を用いるＢｉｏｒａｄ７０弱陽イオン交換体（１．５×４８ｃｍ）上でクロマトグラフし、８ｍｌの画分を収集した。単一スポットを有する画分を収集し、ｐＨ１０．５に調節し、そして２×２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。このＣＨ2Ｃｌ2画分をＷｈａｔｍａｎ濾紙で濾過し、エバポレートして乾燥した。固体生成物を、塩酸で酸性化したエタノールに溶解し、そしてエタノールから再結晶して０．１４ｇのＮ1−ダンシルスペルミンを得た（また、限定された（ｔｅｒｍｅｄ）モノダンシルスペルミンまたは「ＭＤＳ」）。ＮＭＲスペクトルはこの構造を確認した。この生成物は、再結晶により精製され、イオン交換クロマトグラフィーを全くしなかった。
【０２４６】
（実施例ＩＩ）
Ｎ1−（１−ピレニルスルホニル）ダンシルスペルミン１５の合成
Ｎ1−（１−ピレニルスルホニル）ダンシルスペルミンの合成を図５に示す。４℃まで冷却した２５ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の０．５６ｇ（２．８ｍｍｏｌｅ）のスペルミンおよび０．０６９ｇ（０．６９ｍｍｏｌｅ）のトリエチルアミンに、３０分かけて２０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した０．２０ｇ（０．６９ｍｍｏｌｅ）のダンシルクロリド１−ピレンスルホニルクロリドを滴下した。温度を周囲温度まで上昇させ、１６時間撹拌し、トリエチルアミン塩酸塩を除去するために濾過した。
【０２４７】
沈殿物を２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、そして合わせたＣＨ2Ｃｌ2抽出物を、エバポレートして乾燥し、そして酢酸エチルに溶解し、これを２５ｍｌ、５％のＮａ2ＣＯ3で２回および２５ｍｌの水で１回抽出した。この酢酸エチルをＷｈａｔｔｍａｎ  ｎｏ  １  濾紙で濾過し、エバポレートして乾燥し、０．２６ｇを得た。
【０２４８】
イソプロパノール：ピリジン：酢酸：水（４：１：１：２）中のシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーは、０．２％ニンヒドリン／エタノールをスプレーした場合、出発スペルミンを示さず、そして主要な２つのスポットを示した。
【０２４９】
この物質を８ｍｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、そして０．５ｍｌ／分の流速で５００ｍｌにわたって、１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）と１．２５Ｍ塩酸／メタノール（１：１）間のｐＨ勾配を用いるＢｉｏｒｅｄ７０弱陽イオン交換体（１．５×４８ｃｍ）上でクロマトグラフし、８ｍｌの画分を収集した。単一スポットを有する画分を収集し、ｐＨ１０．５に調節し、そして２×２５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル画分をＷｈａｔｍａｎ濾紙で濾過し、エバポレートして乾燥した。固体生成物を、塩酸で酸性化したエタノールに溶解し、そしてエタノールから再結晶して０．１０ｇのＮ1−（１−ピレニルスルホニル）スペルミン・３ＨＣｌを得た。ＴＬＣは単一成分を示し、そしてＮＭＲスペクトルはこの構造を確認した。
【０２５０】
（実施例ＩＩＩ）
Ｎ1−（（１−カルボニル）−４−（１−ピレニル）ブタン）スペルミン３７の合成
Ｎ1−（（１−カルボニル）−４−（１−ピレニル）ブタン）スペルミンの合成は、図６に示される。加熱しながらＣＨＣｌ3に溶解した０．２９ｇ（１ｍｍｏｌｅ）の１−ピレン酪酸に、０．１９ｇ（１ｍｍｏｌｅ）のＥＤＣ、０．１２ｇ（１ｍｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロキシスクシンアミドを添加し、そして室温で３０分間撹拌し、その時点でこの溶液を２０ｍｌのＣＨＣｌ3に溶解した０．８２ｇ（４ｍｍｏｌｅ）のスペルミンに滴下した。この反応をさらに４時間進行させ、この時点で等量の酢酸エチルで希釈した。この溶液を２５ｍｌの５％Ｎａ2ＣＯ3で抽出し、そして２５ｍｌの水で１回抽出した。この有機溶液をＷｈａｔｔｍａｎ  ｎｏ  １  濾紙で濾過し、そしてエバポレートして乾燥し、０．２５ｇ得た。
【０２５１】
イソプロパノール：ピリジン：酢酸：水（４：１：１：２）中のシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーは、０．２％ニンヒドリン／エタノールをスプレーした場合、出発スペルミンを示さず、そして主要な２つのスポットを示した。
【０２５２】
この物質を８ｍｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、そして０．５ｍｌ／分の流速で５００ｍｌにわたって、１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）と１．２５Ｍ塩酸／メタノール（１：１）間のｐＨ勾配を用いるＢｉｏｒａｄ７０弱陽イオン交換体（１．５×４８ｃｍ）上でクロマトグラフし、８ｍｌの画分を収集した。単一スポットを有する画分を収集し、ｐＨ１０．５に調節し、そして２×２５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル画分をＷｈａｔｍａｎ濾紙で濾過し、エバポレートして乾燥した。固体生成物を、塩酸で酸性化したエタノールに溶解し、そしてエタノールから再結晶して０．１３ｇのＮ1−（（１−カルボニル）−４−（１−ピレニル）ブタン）スペルミンを得た。ＴＬＣは単一成分を示し、そしてＮＭＲスペクトルはこの構造を確認した。
【０２５３】
（実施例ＩＶ）
Ｎ−（１−アントラセニル）−Ｎ’−（Ｎ１−スペルミジル）尿素（９）
Ｎ−（１−アントラセニル）−Ｎ’−（Ｎ１−スペルミジル）尿素の合成は、図４に示される。１００ｍｌのベンゼン中の１ｇの１−アミノアントラセン（５．２ｍｍｏｌｅ）および１．０４ｇのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５．２ｍｍｏｌｅ）を、ｐＨ紙で測定した場合ＨＣｌガスが出なくなるまで（３時間）、空気冷却器を使用して還流した。所望の生成物であるＮ−（１−アントラセニル）−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）尿素（１．６ｇ；収率８６％）を冷却した反応物から濾過し、そしてベンゼンで洗浄した。この生成物を、さらに精製しないで使用した。
【０２５４】
３０ｍｌのジクロロメタン中の０．５ｇ（２．５ｍｍｏｌｅ）のスペルミンに、２０ｍｌのジクロロメタン中の０．１８ｇ（０．５ｍｍｏｌｅ）のウレタンを滴下した。この反応を１６時間進行させ、この時点で２×５０ｍｌの５％Ｎａ2ＣＯ3溶液で抽出し、続いて１×５０ｍｌの水で抽出した。この濾過溶液を高真空でエバポレートして乾燥させた。この残渣をＭｅＯＨに溶解し、そして４当量の６Ｎ塩酸溶液で酸性化した。この溶液をエバポレートして乾燥し、次いでＥｔＯＨ／ＭｅＯＨから再結晶して、シリカゲルＴＬＣ（イソプロパノール：ピリジン：酢酸：水（４：１：１：２））で主要な１つのスポットを示す化合物を２７．５ｍｇ得た。
【０２５５】
（実施例Ｖ）
Ｎ−（Ｎ1−スペルミジル）−２−（ナフチル）アセトアミド（１０３）の合成  実施例ＩＸ？？？に記載されるような合成スキームを、出発化合物が１−ナフチル無水酢酸（Ｎ６−（ダンシル）−６−アミノカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代わりに）の違いで実行した。これは、以下に示すような生成物Ｎ−（Ｎ1−スペルミジル）−２−（ナフチル）アセトアミド
【０２５６】
【化１８】
0004044728.tif 000014
【０２５７】
を生成する。公知の化学反応を使用して鎖長を所望されるように増加し得る。好ましい長さは、ｎ＝１〜１０である。
【０２５８】
（実施例ＶＩ）
Ｎ−（Ｎ1−スペルミジル）−２−（ナフトキシ）アセトアミド（１０４）の合成
同様の合成を出発物質（２−ナフトキシ）−酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して実行し、その結果、生成物は以下に示すようなＮ−（Ｎ1−スペルミジル）−２−（ナフチトキシ）アセトアミド
【０２５９】
【化１９】
0004044728.tif 000015
【０２６０】
である。公知の化学反応を使用して鎖長を所望されるように増加し得る。好ましい長さは、ｎ＝１〜１０である。
【０２６１】
（実施例ＶＩＩ）
Ｏ−（フルオレニルメチル）−Ｎ−（Ｎ１−スペルミジル）ウレタンの合成
実施例ＩＩに記載されるような合成スキームを、出発化合物９、１−ピレニルスルホニルクロリドの代わりにフルオレニルメチルクロロホルメートを使用して、以下のように行う。
【０２６２】
【化２０】
0004044728.tif 000016
【０２６３】
（実施例ＶＩＩＩ）
二置換官能基化化合物は、当該分野で周知である（例えば、スルホニルクロリド、ベンゾイルクロリド、シアネート、チオシアネートなど）。２，６−ナフタレンジスルホニルクロリドとスペルミンとの反応は、以下に示される。
【０２６４】
【化２１】
0004044728.tif 000017
【０２６５】
（実施例ＩＸ）
方法１によるＮ1−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル］スペルミン（ＤＡＣＳ４）
方法１によるＤＡＣＳの合成は、図８に示される。この反応物と生成物は、以下に示される。氷浴で冷却された２０ｍｌのジクロロメタン中の０．５５ｇのスペルミン（２．７ｍｍｏｌｅ）に、１０ｍｌのジクロロメタンに溶解した０．１２５ｇのＮ６−（ダンシル）−６−アミノカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．２７ｍｍｏｌｅ）を３０分かけて滴下した。反応系を周囲温度で１６時間撹拌し、その時点で濾過して沈殿物を除去した。濾液を３０ｍｌのＣＨＣｌ3で希釈し、そいて２×５０ｍｌの５％Ｎａ2ＣＯ3溶液、続いて１×５０ｍｌの水で抽出した。有機相を濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣（０．２０ｇ）を７ｍｌのメタノールに溶解し、そして５当量の６Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。溶媒をエバポレートし、そして固体をエタノール／メタノールから再結晶して０．０７３ｇ（収率３９％）の所望の生成物を得た。イソプロパノール：ピリジン：酢酸：水（４：１：１：２）でのシリカゲルＴＬＣは単一の蛍光スポットを示し、これはまた、ニンヒドリン陽性スポットを与えた。名目上の質量分析、イオン対逆相クロマトグラフィーおよびＮＭＲは化合物の同定および純度を確認した。
【０２６６】
（実施例Ｘ）
４−ニトロフェニル６−（Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキソネート１０８
この化合物（ＤＡＣＳの中間体として示される）を図９に示す。乾燥した丸底フラスコに、１１．５５ｇ（５０ｍｍｏｌｅ）の６−（Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキサン酸１（ＮｏｖｏＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能）、１２．４ｇ（６０ｍｍｏｌｅ）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｓｙｃｌｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）および８．３５ｇ（６０ｍｍｏｌｅ）の４−ニトロフェノールを添加した。これらの固体に、１５０ｍｌの乾燥ＥｔＯＡｃをアルゴン下で室温で添加し、オフホワイトの不均一の懸濁物を生成した。３時間室温でこの固体ＤＣＵをＣｅｌｉｔｅのパッドで濾過した後、このパッドを３×５０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。合わせた濾液をエバポレートして２７ｇの黄色固体を得た。これは、２００ｍＬの無水ＥｔＯＨから結晶化して、第１収集物として１３．５４ｇ（７７％）の白色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨＣｌ3）Ｒｆ０．７。ＮＭＲはこの化合物の同定を確認した。
【０２６７】
（実施例ＸＩ）
４−ニトロフェニル６−アミノヘキソネートトリフルオロ酢酸塩１０９
この化合物（ＤＡＣＳの中間体として示される）は、図９に示される。３０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の５．０ｇ（１４．２ｍｍｏｌｅ）の１０８の溶液に、１５ｍＬのトリフルオロ酢酸を室温で添加した。多くの気泡が透明な反応溶液中に形成された。１時間後、この溶液を減圧下で除去し、透明なオイルを得た。このオイルをジエチルエーテルで摩擦し、白色蝋様の固体を形成し、これを高真空下で乾燥した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3中の１０％ＭｅＯＨＲｆ０．０５）は次の工程に十分な純度である生成物を示した。収量５．２５ｇ白色固体（１００％）。
【０２６８】
（実施例ＸＩＩ）
４−ニトロフェニル６−（Ｎ−（ダンシル）アミノ）ヘキソネート１１０
この化合物（ＤＡＣＳの中間体として示される）は、図９に示される。５０ｍＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の４．２ｇ（１１．５ｍｍｏｌｅ）の懸濁液に、３．７１ｇ（１３．８ｍｍｏｌｅ）の固体のダンシルクロリドを添加し、続いてアルゴン下室温でシリンジで４．８ｍＬ（３４．５ｍｍｏｌｅ）の乾燥Ｅｔ３Ｎを滴下した。得られた黄色溶液を室温で１８時間撹拌し、その時点で溶媒をエバポレートして、緑色油状固体を得た。この物質を２５０ｍｌのＣＨＣｌ3に溶解し、そして１００ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ2Ｏ次いでブラインで洗浄した。有機層を乾燥し、そしてエバポレートして、５．８５ｇの緑色油状固体を得た。これを１００ｍＬの無水ＥｔＯＨから結晶化し、２．１３６ｇ（３８％）の黄色古来を第１収集物から得た。母液を第２収集物のために結晶化し得るか、またはＣＨＣｌ3次いでさらに純粋な生成物のためにＣＨＣｌ3中の１０％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲルでカラムクロマトグラフィーによって生成し得る。Ｍ．ｐ．８４〜８６℃。ＮＭＲはこの化合物の同定を確認した。
【０２６９】
（実施例ＸＩＩＩ）
方法２によるＮ1−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル］スペルミン（ＤＡＣＳ４）
この合成方法は図９に示される。２ｍＬのＭｅＯＨ中の７２．８ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌｅ）のスペルミンの透明な溶液に、２．０ｍＬの０．１５Ｍ  ＭｅＯＨ溶液（０．３０ｍｍｏｌｅ）の１１０を室温で滴下した。１滴を添加した後、非常に明るい黄色がになった。この黄色溶液を１５分間撹拌し、その時点で溶媒をエバポレートし、２２０ｍｇの黄色油状固体を得た。この粗生成物を１．０ｍＬの０．５Ｍ  ＨＣｌに溶解し、そして２０／８０ＭｅＯＨ：０．５Ｍ  ＨＣｌでＣ−１８ＲＰシリカゲル（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ＃７０２５−０１）の１×３６ｃｍカラムを適用した。同じ溶媒での溶出は、白色固体として７９ｍｇ（３８％）の純粋な塩酸塩を与えた。４／１／１／２のイソプロパノール：酢酸：ピリジン：Ｈ2Ｏを用いるＴＬＣは、ＤＡＣＳについて０．７０、ジアシル副生成物について０．９０およびスペルミンについて０．１８のＲｆを与える。ＮＭＲはｋの化合物の同定を確認した。
【０２７０】
（実施例ＸＩＶ）
Ｎ1−［６−アミノカプロイルスペルミン］１７１
この反応スキームは以下に詳細に記載されるように行う。
【０２７１】
【化２２】
0004044728.tif 000018
【０２７２】
５．０ｍＬのＭｅＯＨ中のｐ１２５ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌｅ）のスペルミンの透明な溶液に、５．０ｍＬのＭｅＯＨ中の１８１ｍｇ（０．５２ｍｍｏｌｅ）の３の懸濁液を添加した。得られた明るい黄色溶液を室温で１５分間撹拌し、この時点で溶媒をエバポレートした。得られた黄色固体を１０ｍＬのＨ2Ｏに溶解し、そしてＢｉｏＲｅｘ７０（ＮＨ4+型）樹脂の１×３０ｃｍカラムに適用した。溶出を０〜１Ｎ  ＮＨ4ＯＨの直線勾配で行った。生成物を含む画分をエバポレートし、１８１ｍｇのＮ−ｔ−Ｂｏｃ中間体を得、これは４−ニトロフェノールを混入した。この物質を３．０ｍＬのＨ2Ｏに溶解し、そして３．０ｍＬの６Ｎ  ＨＣｌを室温で添加した。２時間後、室温でこの透明な溶液を３×５ｍＬのＣＨＣｌ3で、１×ＥｔＯＡｃで、次いで１×ＣＨＣｌ3で再び抽出した。次いで、この水層をエバポレートし、２２０ｍｇ（９２％）の白色固体を得た。ＮＭＲはこの化合物の同定を確認した。
【０２７３】
（実施例ＸＶ）
平行組み合わせライブラリ合成（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）
平行合成に関する一般的な反応を以下の反応に示す。
【０２７４】
【化２３】
0004044728.tif 000019
【０２７５】
３つの１０ｍｌ反応バイアル（Ｒｅａｃｔ−Ｖｉａｌ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の各々に、０．７４ｍｍｏｌｅのスペルミンおよび０．１５ｍｍｏｌｅのトリエチルアミンを入れた。同様に３つのさらなる反応バイアルに、０．７４ｍｍｏｌｅのスペルミンおよび０．１５ｍｍｏｌｅのトリエチルアミンを入れた。同様に３つのさらなる反応バイアルにも、０．７４ｍｍｏｌｅのプトレシンおよび０．１５ｍｍｏｌｅのトリエチルアミンを入れた。これらのフラスコの各々に、２．５ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2を添加し、そしてフラスコを隔壁で閉鎖し、そしてＲｅａｃｔ−ｂｌｏｃｋ（商標）アルミニウムブロック中で４５分間−２０℃に冷却し、この時点で加熱のスイッチを切った状態でＲｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ（商標）Ｈｅａｔｉｎｇ／Ｓｔｉｒｒｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅを配置した。２．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の３種の酸クロリド（１−ナフチルスルホニルクロリド、２−ナフチルスルホニルクロリドおよび１０−カンファースルホニルクロリド）を、スペルミンおよびプトレシンの各々に対する隔壁を通して２．５ｍｌシリンジ（Ａｌｌ−ＰＰ／ＰＥ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を介して１５分間かけて滴下した。各バイアルはまた、プランジャの外に無水ＣａＣｌ２で満たした２．５ｍｌシリンジからなる排出管を含む。この反応を周囲温度で１６時間進行させ、この時点で２×２．５ｍｌの５％炭酸ナトリウム溶液、続いて２×２．５ｍｌの水で抽出した。有機溶媒に２．５ｍｌのメタノールおよび５当量の６Ｎ  ＨＣｌ溶液を添加した。ｋの溶媒をアルゴンでエバポレートし、そして高真空で乾燥した。イソプロパノール：酢酸：ピリジン：水（４：１：１：２）でのシリカゲルＴＬＣは、ＵＶ／蛍光またはエタノール中０．２％ニンヒドリン染色のいずれも主要な１つの成分を示した。純度を、８０％より大きいように確立した。この構造、収率およびポリアミン輸送体の阻害を以下の表１に示す。
【０２７６】
（実施例ＸＶＩ）
平行ライブラリ合成（ａ）
Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ（商標）Ｈｅａｔｉｎｇ／Ｓｔｉｒｒｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅのトリプルモジュールを使用して、２４個の１０ｍｌバイアルを同じ時間で使用し、それによって化合物の実質的な数を増加し、平行して合成し得る。さらに１個以上のこれらのモジュールを同時に使用した。以下に列挙した市販のアミンおよび上記のように合成されたアミンを用い、このアプローチを使用して、化合物のライブラリを市販のスルホニルクロリド（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．から、少数を指定する）を用いて実施例Ｉに記載される様式で合成する。
【０２７７】
（ポリアミンの一覧）
【０２７８】
【化２４】
0004044728.tif 000020
【０２７９】
（表１）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における構造、収率およびポリアミン輸送体の阻害
【０２８０】
【化２５】
0004044728.tif 000021
【０２８１】
（実施例ＸＶＩＩ）
（並行（ｐａｒａｌｌｅｌ）ライブラリー合成（ｂ））
実施例Ｉにおけるように、スルホニルクロリドの代わりにカルボン酸ハライド（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｈａｌｉｄｅ）を有するライブラリーを、以下に示すように合成する。有用なカルボン酸ハライドは、様々な供給元から市販されている。
【０２８２】
【化２６】
0004044728.tif 000022
【０２８３】
（実施例ＸＶＩＩＩ）
（Ｎ’−「ヘッド基」−Ｎ’’−（Ｎ１−スペルミジル）ウレアのライブラリーの合成）
実施例ＩＶに示されるタイプの合成は、出発ウレタンを、異なる芳香族アミンを前駆体として使用して、まず並行して合成することを違いとして、行う。
【０２８４】
（実施例ＸＩＸ）
（ポリアミンアナログによる細胞増殖およびその阻害）
本発明者らは、ＯＤＣインヒビターと相乗作用の輸送インヒビターのスクリーニングにおける使用に対する増殖アッセイを開発した。エストロゲン非感受性ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を、このスクリーニングにおいて最初の細胞株とする。この細胞株（多くの乳癌が有する）は、高率のポリアミン輸送を有する（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９１）  １１：１８０７−１８１４）。ポリアミン輸送阻害についてのスクリーニングを最適化するために、１．０μＭスペルミジンを、ＯＤＣインヒビターの効果を逆にするために、培地に添加した。このアッセイはまた、７日間にわたって行われた。なぜならば、これは、ＯＤＣインヒビターの機構により細胞増殖において最も良いダイナミックレンジを可能にするからである。細胞は、細胞内レベルのポリアミンが、増殖阻害性レベルまで減少し始める前に、数回の分裂を必要とする。従って、増殖は、その３〜４日目まで、有意には止まらない。
【０２８５】
ポリアミン輸送インヒビターについてのスクリーニングに使用した場合、この増殖アッセイ単独では、ポリアミン取り込みの減少を立証しない。従って、この増殖アッセイおよび速度論輸送アッセイを、輸送阻害を確証するために使用した。
【０２８６】
Ａ．（ＤＡＣはポリアミン輸送を阻害し、ＯＤＣインヒビターと相乗的に働く）
数千の化合物のスクリーニングは、本発明者らおよびその共同研究者らが、スペルミジン取り込み（Ｋi  ８ｎＭ）、プトレシン取り込み（Ｋi  ５．４ｎＭ）を阻害し、ＯＤＣインヒビターと組み合わせた増殖について０．６μＭのＩＣ50を有する輸送インヒビターを同定することを可能にした（図２２）。この化合物の１００を超えるアナログが合成され、ＳＡＲデータは、ポリアミン取り込みを阻害するのに必要なこの構造的特徴について集めされている。さらなる化合物は、ＤＡＣＳよりさらに強い効力をもって発見されたが、下記したほど徹底的には研究されなかった。上記のアッセイ条件下（１．０μＭの補充ポリアミンとともに）で、ＯＤＣ阻害単独による増殖減少は無い。さらに、ＤＡＣＳは、非常に高濃度（３００μＭ）に達するまで、単独では増殖阻害性ではない。ＤＡＣＳは、以前は無効なＯＤＣインヒビターを、ポリアミン存在下で、増殖インヒビターとして非常に有効にする。
【０２８７】
ポリアミン存在下でのＤＡＣＳおよびＯＤＣインヒビターの組合せによる増殖阻害（図２３）は、有意な細胞外ポリアミンの非存在下でのＯＤＣインヒビターの効果を模倣する。増殖阻害は、２日目に現れ始め、細胞増殖は３日目までに６９％減少した。増殖は、実際、ＤＡＣＳと組み合わせたＯＤＣインヒビターを用いてプラトーに達したが、ＤＡＣの非存在下で継続した。この効果は、この細胞株において細胞増殖抑制性であると思われるが、長期の場合は、細胞傷害性であるかもしれない。
【０２８８】
Ｂ．（天然ポリアミンの存在下で、ＤＡＣＳは効果的である）
細胞外のスペルミジン、スペルミンおよびプトレシンは、その細胞内への取り込みを増加することによって、ＯＤＣインヒビターの効果を逆にし得る。ポリアミンの主要な排出形態（Ｎ1−アセチルスペルミンおよびＮ1−アセチルスペルミジン）はまた、ＯＤＣインヒビターの効果を逆にし得る。ＤＡＣＳは、天然のポリアミン、プトレシン、スペルミジン、Ｎ1−アセチルスペルミンおよびＮ1−アセチルスペルミジンが、その細胞をＯＤＣ阻害から救うことを阻止する。これは、いくつかの理由にとって重要である。文献における報告は、１つより多いトランスポーターが存在することを示唆している。これが真実である場合、ＤＡＣＳは、低濃度で、全てのポリアミンの取り込みをブロックするのに効果的である。
【０２８９】
Ｃ．（ＤＡＣＳはいくつかのタイプの癌に効果的である）
ＤＡＣＳを、ＯＤＣインヒビターと組み合わせて、いくつかのヒト癌細胞株に対して、インビトロで試験した。これらには、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、グリア芽細胞腫、前立腺、および結腸の細胞株が挙げられる。ＤＡＣＳは、これら全ての腫瘍細胞株に対して、インビトロで効果的である。図２４は、ＤＡＣＳの、ＰＣ−３前立腺癌細胞に対する効果を示す。
【０２９０】
（実施例ＸＸ）
（輸送および増殖アッセイにおけるポリアミンアナログのスクリーニング）
多数の潜在的なＰＡＴ輸送インヒビターの、ＰＡＴおよびＭＤＡ細胞増殖に対する効果を、図２（３〜９８）に要約する。この比ＲはＯＤＣインヒビターと組み合わせたポリアミンアナログについてのＩＣ50に対する、ポリアミン単独についてのＩＣ50である。このＲの値は、ポリアミンアナログとＯＤＣインヒビターとの間の「相乗作用」の相対レベルを示す。この増殖アッセイ条件下では、ＯＤＣインヒビター単独では阻害を示さない。
【０２９１】
（実施例ＸＸＩ）
（輸送インヒビターはポリアミンを利用する酵素を阻害する）
本発明の組成物（ＰＡＴインヒビターと命名する）がＰＡ系に対する他の活性を有するか否かを決定するために研究を行った。具体的には、ＤＡＣＳの、ＰＡ再利用に関与する酵素を阻害する能力を評価した。使用した方法は、Ｃａｓｅｒｏ，Ｒ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ２７０：６１５−６２０（１９９０；本明細書中でその全体を参考として援用する）に記載されるものであった。このアッセイは、アセチルスペルミジンを形成するための、14Ｃ−標識アセチルＣｏＡのスペルミジンへの取り込みを測定する。様々な濃度のＤＡＣＳを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）、１ｍＭスペルミジンおよび１ｍＭ14Ｃ−アセチルＣｏＡを含有する反応混合物に添加した。この生成物を、ホスホセルロース濾紙に結合することによって単離し、反応の程度をシンチレーションカウントによって決定する。
【０２９２】
図２６に示されるように、ＤＡＣＳは、スペルミジン／スペルミンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）を、用量関連様式で阻害した。
【０２９３】
実施例ＸＸＩＩ
三環式および他の複素環式化合物は、ポリアミン輸送の阻害が可能である。
【０２９４】
実施例ＸＸに記載のポリアミン輸送アッセイを使用して、いくつかの複素環式化合物を、輸送のインヒビターとしてのそれらの活性について試験した。その三環式抗鬱薬および抗精神病薬に非常に類似したいくつかの化合物が、ポリアミン輸送を阻害するという予期しない発見がなされた。図２５に示される化合物のうち、化合物１６１、１６２および１６５は、４１ｎＭ（Ａ１７２細胞に対して）および５００ｎＭ（ＭＤＡ細胞に対して）のＫｉで、ＰＡＴの非競合インヒビターとして作用した。
【０２９５】
これらの化合物は、図２５の化合物１６３〜１６４に類似しており、これは抗精神病薬および抗鬱薬として知られている。これらに見られることは、このタイプの上記化合物は、ポリアミン摂取を変調することを示している。
【０２９６】
実施例ＸＸＩＩＩ
ポリアミン類似体による成長阻害でのリンカー長または「ヘッド無し」状態の効果
化合物を、１μＭのスペルミジンおよび、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する２３０μＭのＯＤＣインヒビターまたはＰＣ３細胞に対する１ｍＭのＯＤＣインヒビターの存在下での細胞成長を阻害する能力について試験した。実施例ＸＩＸに記載のように、細胞をプレートし、薬物を添加した。２または３鎖長の炭素を有する「ヘッド無し」リンカーは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌には無効であったが、図１９および２０に示したように、ＰＣ３前立腺癌細胞での成長を示した。
【０２９７】
実施例ＸＸＩＶ
ＰＡＴアッセイにおける蛍光プローブとしてのＭＤＳの評価
この実験の目的は、上記ＭＤＳが、輸送アッセイ中で3Ｈ−スペルミジンと競合することを示すことであった。
【０２９８】
上記のように、一般的な放射測定ＰＡＴアッセイおよびＡ１７２細胞を使用して、ＭＤＳが輸送アッセイ中で、3Ｈ−スペルミジンを競合的に置換することが分かった（図２７および図２８）。
【０２９９】
実施例ＸＸＶ
モノダンシルスペルミン摂取の蛍光顕微鏡分析
細胞を滅菌したチャンバーの中のスライドにプレートし、１５〜４８時間増殖し、スライドへの細胞の接着を確実にした。培地を除去し、そして３７℃で１０分間インキュベーションした１μＭのＭＤＳを含む新鮮な培地と置換した。次いで、この培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。５０μｌの容積中のグリセロール（５０％ｖ／ｖ）をチャンバーに添加し、スライドを除去し、そしてカバーガラスで覆った。
【０３００】
３４０ｎｍで励起し、５３０ｎｍで発光するフィルターのセットを具備した蛍光顕微鏡を使用して、スライドを通常の光および蛍光下で観察した。ダンシル化スペルミンの摂取を微視的に観察し、写真に記録した。
【０３０１】
ここには顕微鏡写真は含まれていないが、ＭＤＳと共にインキュベートした培養した細胞は、微視的に可視化された蛍光によって示されたように、ラベルした材料を摂取した。核小体（これは、プローブが結合可能な多量のＲＮＡを含む）は、特に強い染色を示した。予期したように、このプローブは、膜構造の裏層に見られた。
【０３０２】
実施例ＸＸＶＩ
Ｎ1−ダンシルスペルミンの酵素的検出
ポリリシンプレートを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５（１０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＮａＮ3を含有）中の２００μｌのポリリシン（５μｇ／ｍｌ）を添加することによって調製した。このプレートを３７℃で２０分間インキュベートし、同時にそのウェルを２００μｌの水で３回洗浄した。次いで、そのプレートを２５℃で１時間、５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）中の２．５％グルタルアルデヒド１μｌで処理し、同時にそのウェルを５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）２００μｌで２回、そして水で１回洗浄した。種々の濃度のＮ1−ダンシルスペルミンまたはＤＡＣＳのいずれかを、０．１ｐｍｏｌｅ／ウェルと１０ｐｍｏｌｅ／ウェルの間の範囲のウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。次いで、このウェルをＰＢＳ中の０．３％ＮＨ4ＯＨ２００μｌで処理し、室温で１時間インキュベートし、同時に２００μｌのＰＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で２回洗浄した。次いで、そのウェルを１０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＮａＢＨ4２００μｌで処理し、同時にそれらを２００μｌのＰＢＳＴで２回洗浄した。次いで、そのウェルを１時間２００μｌの１％ＢＳＡでブロックし、同時にそれらをＰＢＳＴで１回洗浄した。ダンシル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１／２００の希釈で１００μｌＰＢＳＴ中の各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートし、同時にＰＢＳＴで４回洗浄した。ここで、各ウェルに対して、１／５０００に希釈した１００μｌの抗ＨＲＰ抗体を添加し、４℃で２時間インキュベートし、同時に各ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。酵素活性を、１００μｌのＮＢＴまたはＯＰＤ（０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍｌあたり５ｍｇのＯＰＤ）のいづれかで、かつ室温で１０分間のインキュベーションを用いて決定した。色をプレートリーダーの６３０ｎｍで測定した。
【０３０３】
この測定は、ＰＡＴアッセイの代替の実施態様であり、これは信号を増幅し、検出限界を低くする間接的検出を使用している。この方法によって、極めて低濃度のプローブの検出が可能になる。図３２に示した結果は、ＤＡＣＳのレベルが０．１ｐｍｏｌｅが検出できるくらいに低いことを示した。
【０３０４】
実施例ＸＸＶＩＩ
ポリアミン類似体の改変
アルデヒド性ヌクレオシドターミネーターを有する伸長ポリアミン類似体を「改変」することによって、連続特異的ハイブリッドオリゴマーを生成することが可能になる。各アミノ基は、個々にそして特異的に、図３８に示したように、４個のリボヌクレオシド（または２’−デオキシリボヌクレオシド）のうちの任意のもので「改変」される。
【０３０５】
この技術は、３重らせん形成アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２６７〜２８２（１９９７））の問題を、細胞へのポリアミンの輸送能力をヌクレオチド連続特異性の構造的特徴と合わせることで解決するためのアプローチを提供する。この輸送は、生体利用度の制限を克服するが、さらにそのようなオリゴマーの生体安定性を増大する。
【０３０６】
（実施例ＸＸＶＩＩＩ）
図３６および３７に概説したアプローチに従って、ブロック化３−アミノプロパナール２７ａ、ベンズアルデヒド２８ａを第１のターミネーターとして用いて、ブロック化メチオニナール２９ａを延長剤として用いて、そして、アセトンを最終のターミネーターとして用いて、化合物３１ａ（図３９）を合成した、
（実施例ＸＸＩＸ）
適切なブロック化アミノアルデヒド、アルデヒドまたはケトンを用いて、化合物のライブラリーを合成する。一般構造を以下に示す。
【０３０７】
【化２７】
0004044728.tif 000023
【０３０８】
アルデヒドおよびアミノアルデヒドの場合、Ｒ1およびＲ3は両方とも水素である。ケトンおよびアミノケトンの場合、Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈまたは−（ＣＨ2）nＣＨ3であり、ここでｎ＝０〜６である。ケト官能基（ｋｔｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）はまた、環構造の一部であり得る。Ｒ2およびＲ4は、脂肪族、脂環族、芳香族およびヘテロ環である。アルデヒド、ケトン、アミノ−アルデヒドまたはアミノ−ケトン官能基を含み得る化合物の例は、以下である：ジベンゾフラン、アクリジン、２，１，３−ベンゾチオジアゾール、キノリン、イソキノリン、ベンゾフラン、インドール、カルバゾール、フルオレン、１，３−ベンゾジアジン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、アダマンタン、カンファー、ピペリジン、アルキルピペラジン、モルホリン、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、チオフェン、フラン、ピロール、アルキル−１，２−ジアゾール、アルキルイミダゾール、アルキル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール、アルキル−１Ｈ１，２，３，４−テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、１，３，４−チアジアゾール、ピリジニル、ピリミジン、１，２−ジアジン、１，４−ジアジンおよび１，３，５−トリアジン、４−ジメチルアミノアゾベンゼン、２−［１，２−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾジオキセピニル］チアゾール、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、ピレン、２〜１０個の炭素を含むアルカン、１〜３個の不飽和および３〜１０個の炭素を含むアルケン、１〜３個の不飽和および３〜１０個の炭素を含むアルキン、分枝アルカン、アルケン、アルキン（３〜１０個の炭素を含む）。上記の官能基を１つもしくはそれ以上を含む多くのアルデヒド、ケトン、アミノアルデヒドおよびアミノケトンは、市販されている。複数のアミノアルコール、アミノアルデヒドの前駆体を、以下の表２に示す。
【０３０９】
（表２）
アミノアルコール延長剤
アリノール（ａｌｉｎｏｌ）
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール
Ｌ−メチオニノール
Ｄ−グルコサミン
Ｒ，Ｓ−２−アミノ−１−ブタノール
４−アミノブタノール
３−アミノ−１−プロパノール
トランス−２−アミノシ（ａｍｉｎｏｃｙ）シクロヘキサノール
５−アミノペンタノール
（Ｓ）−（＋）−２−アミノ−３−シクロヘキシル−１−プロパノール
Ｒ，Ｓ−２−アミノ−２−フェニルエタノール
ＤＬ−２−アミノ−１−ヘキサノール
６−アミノ−１−ヘキサノール
１−（１Ｓ，２Ｓ）（＋）２−アミノ−３-メトキシ−１−フェニル−１−プロパノール
２−アミノ−３−メチル−１−ペンタノール
２−アミノ−４−メチル−１−ペンタノール
２−（２−アミノ−４−ニトロアニリノ）エタノール
Ｄ，Ｌ−２−アミノ−１−ペンタノール
２−アミノフェネチルアルコール
２−アミノ−１−フェネチルエタノール
２−アミノ−３−メチル−１−ペンタノール
（Ｒ）−（＋）−２−アミノ−３−フェニル−１−プロパノール
（Ｓ）−（−）−２−アミノ−３−フェニル−１−プロパノール
２−（−３アミノフェニルスルホニル）エタノール
Ｄ，Ｌ−１−アミノ−２−プロパノール
Ｄ，Ｌ−２−アミノ−１−プロパノール
３−アミノ−１−プロパノール
Ｄ−ガラクトサミン
Ｄ−マンノサミン。
【０３１０】
（実施例ＸＸＸ）
市販の供給源から、もしくは当該分野で公知の合成経路から選択される、適切にブロックされたアミノアルデヒド、アルデヒドまたはケトンを用いて、化合物のライブラリーを合成する。アミノアルデヒドは、様々な方法で、様々な出発物質（例えば、Ｌ−およびＤ−アミノ酸、アミノアルコール、またはＮＯ2もしくは−ＣＮ基で置換されたアルコールもしくはカルボン酸）から合成される。アミノアルデヒドは、適切にブロック化されたアミノアルコールから、公知の手順で合成される（Ｌａｒａｃｋ、Ｒ．、Ｉｎ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ。、ＮＹ、１９８９、６０４〜６１６頁）。アミノアルデヒドは、適切にブロックされたアミノカルボン酸またはブロックされたアミノニトリルから直接合成される（前述、６１６〜６１７頁）。
【０３１１】
本発明を充分に説明したので、本発明の精神および範囲から離れることなく、かつ、過度の実験を要することなく、広範囲の、均等なパラメーター、濃度、および条件において同じことが行われ得ることが当業者に理解されるであろう。
【０３１２】
本発明を、その具体的な実施態様に関して説明したが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、以下において、添付された請求の範囲の中で、本発明が関する分野の公知のまたは従来の実施におけるような、そして本明細書中で上述された本質的な特徴に応用され得るような、一般的な本発明の原理に従いかつ本明細書の開示からのそのような脱離を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または応用をカバーすることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、スペルミジン、ＭＤＳおよびＤＡＣＳの間の構造および活性の相関（ＳＡＲ）を示す。Ｋi値は、ＰＡＴ阻害アッセイで得られる阻害定数である。
【図２Ａ】図２（図２Ａ〜２Ｊ）は、多数の化学構造式３〜９８（細胞の増殖に対するその効果について試験した）の表の提示である。Ｒ（増殖阻害活性の指標）は、試験化合物の存在下における細胞増殖の、試験化合物およびＤＦＭＯの存在下における増殖に対する比である。Ｋi（阻害定数）は、細胞培養における化合物のＰＡＴ阻害を反映する。これらの生物学的効果は、ＳＡＲ分析の基礎を提供する。
【図２Ｂ】  図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】  図２Ｂの続きである。
【図２Ｄ】  図２Ｃの続きである。
【図２Ｅ】  図２Ｄの続きである。
【図２Ｆ】  図２Ｅの続きである。
【図２Ｇ】  図２Ｆの続きである。
【図２Ｈ】  図２Ｇの続きである。
【図２Ｉ】  図２Ｈの続きである。
【図２Ｊ】  図２Ｉの続きである。
【図３】  図３は、Ｎ1−置換ポリアミンアナログ９９〜１０２への合成経路を示す。
【図４】  図４は、Ｎ−（１−アントラセニル）−Ｎ’−（Ｎ1−スペルミジル）ウレア９の合成のスキームである。
【図５】  図５は、Ｎ1−（１−ピレニルスルホニル）スペルミン１５の合成のスキームである。
【図６】  図６は、Ｎ1−（（１−カルボニル）−４−（１−ピレニル）ブタン）スペルミン７の合成のスキームである。
【図７】  図７は、Ｎ1−ダンシル−スペルミン３（ＭＤＳ）の合成のスキームである。
【図８】  図８および９は、それぞれ、ＤＡＣＳ合成についての異なるスキームを示す。
【図９】  図８および９は、それぞれ、ＤＡＣＳ合成についての異なるスキームを示す。
【図１０】  図１０は、立体配置的に制限されたポリアミンアナログの４つのクラス（１１１〜１１４）、および底部において、立体化学的に定義された内部環状ポリアミンアナログ（１１６）を示す。
【図１１】  図１１は、合成スキームであり、ここで、遊離の一級アミノ基は、Ｎ−アシル化（４４）およびＮ−アルキル化（７７）によりブロックされ、それによって、その誘導体化ＰＡＴインヒビターの潜在的代謝性分解を減少させる。
【図１２】  図１２は、ビスα−ｇｅｍ−ジメチルポリアミンアナログ１２１についての合成スキームである。
【図１３】  図１３は、シクロプロピル基を含む内部で置換されたポリアミンアナログ（１２２〜１２６）についての合成スキームである。
【図１４】  図１４は、Ｃ−Ｃ分枝を含む内部で置換されたポリアミンアナログ（１２７〜１３４）についての合成スキームである。
【図１５】  図１５は、多環ヘッド基（１３５〜１３９）とともに使用するためのスペーサーまたはリンカーの例を示す。
【図１６】  図１６は、多環ヘッド基を含む一連の化合物（１４０〜１４７）を示す。
【図１７】  図１７は、ＤＦＭＯありおよびなしでの、ＭＤＡ乳癌細胞の増殖に対するＤＡＣＳの効果を示すグラフである。
【図１８】  図１８は、ＤＦＭＯありおよびなしでの、ＰＣ−３前立腺癌細胞の増殖に対するヘッドなしポリアミンアナログの効果を示すグラフである。
【図１９】  図１９は、キラル炭素置換アミノ酸リンカー基を列挙している。
【図２０】  図２０は、Ｎ1−（アジリジニル）−Ｎ12−［（Ｎ6−ダンシル）−６−アミノカプロイル］スペルミン１５７の合成のスキームである。
【図２１】  図２１は、二置換アジリジニルポリアミンアナログ１６０の合成のスキームである。
【図２２】  図２２は、ポリアミン合成インヒビターＤＦＭＯの存在下（黒四角）または非存在下（◆）における、ＤＡＣＳによる、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖の阻害を示すグラフである。ＰＡＴおよび腫瘍細胞増殖に対する多数のポリアミンアナログの効果については、図２Ａ〜２Ｊもまた参照のこと。細胞を、１ｍＭ  ＤＦＭＯありおよびなしで、変化させた濃度のＤＡＣＳの存在下で、プレートした。細胞数（コントロールの％として表される）を、上記のように６日間後に決定した。
【図２３】  図２３は、１μＭスペルミジンの存在下での細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図２４】  図２４は、ＤＡＣＳおよびＤＦＭＯの組合せによる、ＰＣ−３前立腺癌細胞の増殖の阻害を示すグラフである。条件および詳細については、図２２の説明を参照のこと。
【図２５】  図２５は、一群の化学構造（１６１〜１６５）（３つの公知の向精神化合物であるトリフルオペラジン（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ）１６３、トラジン（ｔｈｏｒａｚｉｎｅ）およびイミプラミン１６５を含む）を示す。化合物１６１、１６２および１６５は、ポリアミン輸送を阻害した。
【図２６】  図２６は、ＤＡＣＳによる、スペルミジン／スペルミンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）酵素活性の阻害を示すグラフである。
【図２７】  図２７は、Ｎ1−モノダンシルスペルミン（ＭＤＳ）の取り込み速度論と、放射標識化スペルミジンの取り込みとの比較を示すグラフである。ＭＤＳ濃度は以下のとおりであった：◆０黒三角１μＭ  黒四角０．３μＭ  ×３μＭ。
【図２８】  図２８は、Ａ１７２グリア芽腫細胞における、蛍光による、ＤＦＭＯ非存在下でのＭＤＳの検出を示すグラフである。
【図２９】  図２９および３０は、ビオチン修飾ポリアミンである、Ｎ1−［（Ｎ6−（ビオチニル）−６−アミノカプロイル）］スペルミンおよびＮ1−（ビオチニル）スペルミンの合成を記載する。
【図３０】  図２９および３０は、ビオチン修飾ポリアミンである、Ｎ1−［（Ｎ6−（ビオチニル）−６−アミノカプロイル）］スペルミンおよびＮ1−（ビオチニル）スペルミンの合成を記載する。
【図３１】  図３１は、「固定化ハンドル」および「レポーターハンドル」の組合せを作製するためにポリアミンの修飾が可能な部位を示す略図である。
【図３２】  図３２は、酵素的検出システムを使用した、Ｎ１−ダンシルスペルミンおよびＤＡＣＳの検出を示すグラフである。
【図３３】  図３３は、ポリアミン誘導体を生成するための合成サイクルにおける、本発明の組成物の３つの主要な要素を集める一般スキームである。
【図３４】  図３４は、遊離のアミノ／保護化アルデヒドエキステンダーシントンと反応される、活性化ｔｅｒｔ−アルコキシカルボニルＭｅＯ−ＰＥＧポリマーの合成を概説する。
【図３５】  図３５は、市販のアミノアルコール類またはキラルアミノ酸前駆体プールのいずれかからの、これらのエキステンダーの生成を示す。
【図３６】  図３６は、この合成サイクルにおける次の工程を示す：ＮａＢＨ3ＣＮを用いた還元的アミノ化を使用して、最初に、その骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を広げ、続いて、生成された二級アミンを終結させるためにアルデヒドを用いてさらなる還元的アミノ化工程を行う。
【図３７】  図３７は、最終工程を示し、この工程は、最終キャッピングおよび所望のアナログのトリフルオロ酢酸塩としての重合支持体からの生成物の酸媒介切断を包含する。
【図３８】  図３８は、アルデヒドのヌクレオチドターミネーターを用いて伸長されるようなポリアミンアナログの「修飾」を示す。各アミノ基は、任意のその４つのリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドを用いて、個々にそして特異的に修飾（ｄｒｅｓｓ）され得る。
【図３９】  図３９は、ポリアミンライブラリーの固相合成に使用される代替連結基を有する固体支持体の例を示す。３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−メトキシメチルポリスチレンが示される。
【図４０】  図４０は、グラフトポリマーが共有結合される次元的に安定なポリプロピレン／ポリエチレンピンの多ピン法において使用される様々なリンカーを示す。このＲｉｎｋアミドリンカーは、上記ピンに結合した構造２３ａとして示される。
【図４１】  図４１は、固相支持体を使用して合成される化合物を示し、そしてその合成アプローチは、図４および５ついて記載される。化合物３１ａは、第１のエキステンダーとしてブロック化３−アミノプロパナール２７ａ、第１のターミネーターとしてベンズアルデヒド２８ａ、第２のエキステンダーとしてブロック化メチオニナール２９ａ、および最終ターミネーターとしてアセトンを使用して合成される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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