(57)【要約】  ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーの合成方法、ならびに該ＤＭポリマーを含んでなる組成物およびその使用を開示する。該方法は、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）などの反応物質を酸化条件下高濃度塩水溶液と接触させることを含んでなる。得られたＤＭポリマーは不溶性粒子または基材面上のコーティングとして形成し得る。該ＤＭポリマーの例示的使用としては、汚染溶液から重金属イオンを除去すること、またはゲンタマイシンなどのカチオン性薬物の捕捉および送達が挙げられる。
2017512893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーの合成方法であって、
次式：
【化１】
2017512893.tif 000015
［式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ１〜３アルキル、第一級アミン、第二級アミン、ハロゲン化物、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒド、カルボン酸エステルまたはカルボキサミドからなる群から独立して選択され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、第一級または第二級アミンであり、ｘは０〜３の範囲であり、ｙは０〜３の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上であり、Ｒ２はカルボン酸である。］
を有する反応物質を酸化条件下で高濃度塩水溶液と接触させることを含み、それにより、前記ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーが形成される、前記方法。
【請求項２】
ｘおよびｙが各々１であり、Ｒ２が−ＣＯＯＨであり、Ｒ５が−ＮＨ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応物質が、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩水溶液中の塩濃度が１００ｍＭより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記塩水溶液中の塩濃度が２００ｍＭより高い、請求項４に記載の方法
【請求項６】
前記塩水溶液中の塩濃度が５００ｍＭより高い、請求項５に記載の方法
【請求項７】
前記塩水溶液中の前記塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記塩水溶液がアルカリ性溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記反応物質および前記高濃度塩水溶液を面と接触させる工程を含んでなり、それにより、ＤＭコーティングが前記面上に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コーティングが自然に前記面上に形成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＭコーティングが１０ｎｍ厚より厚い、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記面が負荷電基材を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記形成されたＤＭポリマーが不溶性粒子の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法の実施により形成されたＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマー。
【請求項１５】
前記ＤＭポリマーがカルボン酸残基を含んでなる、請求項１４に記載のＤＭポリマー。
【請求項１６】
前記ＤＭポリマーが基材面上のコーティングの形態である、請求項１４に記載のＤＭポリマー。
【請求項１７】
前記コーティングが１０ｎｍ厚より厚い、請求項１６に記載のＤＭポリマー。
【請求項１８】
前記基材面がバイオメディカル機器の面である、請求項１６に記載のコーティング。
【請求項１９】
前記ポリマー上で捕捉された重金属イオンまたはカチオン性薬物をさらに含んでなる、請求項１４に記載のＤＭポリマー。
【請求項２０】
前記カチオン性薬物がカチオン性アミノグリコシドである、請求項１９に記載のＤＭポリマー。
【請求項２１】
前記ＤＭポリマーが不溶性粒子の形態である、請求項１４に記載のＤＭポリマー。
【請求項２２】
流体中の金属イオン数の減少方法であって、
請求項１４に記載のＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを、１つ以上の金属イオンを含んでなる流体と接触させ、
それにより、前記ＤＭポリマーが前記金属イオンのうちの少なくとも１つと結合し、それにより、前記流体中の金属イオン数を減少させる工程
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の金属イオンが、Ｐｂ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋またはＨｇ２＋からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
カチオン性薬物の送達方法であって、
請求項１４に記載のＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを、１つ以上のカチオン性薬物と接触させ、それにより、前記カチオン性薬物が前記ＤＭポリマーと可逆的に結合する工程；および
前記ＤＭポリマーから前記カチオン性薬物を放出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記カチオン性薬物がカチオン性アミノグリコシドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノグリコシドが、ゲンタマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、アルベカシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシン、およびストレプトマイシンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを合成するためのキットであって、
ａ）次式：
【化２】
2017512893.tif 000016
［式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ１〜３アルキル、第一級アミン、第二級アミン、ハロゲン化物、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒド、カルボン酸エステルまたはカルボキサミドからなる群から独立して選択され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、第一級または第二級アミンであり、ｘは０〜３の範囲であり、ｙは０〜３の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上であり、Ｒ２はカルボン酸であり、
ｘは０〜１０の範囲であり、ｙは０〜１０の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上である。］
を有する反応物質、
ｂ）金属塩、および
ｃ）使用説明書
を備える前記キット。
【請求項２８】
前記金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
アルカリ性緩衝液をさらに備える、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＤＭポリマーでコーティングされる基材面をさらに備える、請求項２７に記載のキット。
【請求項３１】
前記基材面がバイオメディカル機器の面である、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／９６９，９２０号（その全文は、全ての目的のために、本文書中で参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）の優先権を主張する
【０００２】
連邦支援研究開発に関する報告
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により承認された助成金Ｒ３７ＤＥ０１４１９３を受けて、政府支援により行われた。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は概してポリマー粒子およびコーティングに関する。より詳細には、本発明は表面コーティングまたは不溶性粒子として高イオン強度の溶液中で自然に形成するＤＯＰＡ−メラニンポリマーに関する。
【背景技術】
【０００４】
メラニンは自然に広く存在し、色素沈着、光防護、抗酸化剤、金属結合及び他の生物特性を呈する。メラニンの重要なサブクラスはユーメラニンであり、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）酸化、分子内環化、オリゴマー化、および凝集が関与する経路によりチロシンから形成して不溶性および不均一性固体を生じる。ユーメラニンに関する研究は生物機能に関連して構造特性関連性を理解することへの関心によりある程度動機づけられているだけでなく、関心の高いメラニン薄膜の光学的、電気的特性および技術応用への関心の高まりによるところである。
【０００５】
合成および天然メラニンは多くの溶媒に不溶であり、この特性は薄膜などの有用な形態への加工処理の挑戦を表す。これまで、溶液流延法、（エレクトロ）スプレー法、スピンコーティング法、電気化学析出、およびパルスレーザー蒸着により、基材上にメラニン様薄膜の成膜を行ってきた。概して、有機溶媒またはＮａＯＨもしくはアンモニア水溶液中にメラニンを溶解する必要に加えて、大部分の報告された方法は、見通しがある、高性能な機器を要する、複雑で多段階のプロトコールを使用する、あるいは実施した基材でのみ実行可能であるかのいずれかである。これらの制約のせいで、メラニン薄膜の成膜に対する簡便で汎用な方法の必要性がいまだ高い。重要性の高いインフラの必要性を避け、様々な基材の組成、形状および構造に適応できるメラニン薄膜の形成方法は、バイオインスパイアード材料のこの関心の高い分野の実践的応用の開発を加速するだろう。
【０００６】
ドーパミンなどのＤＯＰＡリッチなイガイ接着タンパク質のカテコラミン擬態の水溶液中に基材を浸漬塗布するメラニン様コーティングで表面を修飾する簡便で汎用な方法は、米国特許公開第２００８／０１４９５６６号（全目的のため本文書の参照により組み入れられるものとする）に開示されている。ドーパミンはマイルドな塩基性で通気した水溶液中で自然に自己酸化して、事実上いかなる基材上にも粘着性ポリドーパミン（ＰＤＡ）膜を形成する。ＰＤＡは、そのユーメラニンとの化学的類似性からドーパミンメラニンとも呼ばれ、生体分子の固定化、表面エネルギー修飾、バイオミネラリゼーションおよびバイオセンシングなどの多くの応用をもたらすさらなる修飾のためのプライマーとして作用できる。対象の分子は一段階反応でドーパミンと同時に混合成膜して、所望の特性を有する面を作製できる。
【０００７】
ドーパミンのいくつかの誘導体および他のカテコラミン類は多種多様な基材上に同様に重合する。例えば、ノルエピネフリンはドーパミンでは見られないヒドロキシル基の存在によって加わったε−カプロラクトンの開環重合開始能力で粘着膜中に重合することが分かった。ユーメラニン様薄膜の技術的応用をさらに加速するはずであるので、ＰＤＡと同様に様々な基材上にＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）膜を自然重合することは興味深いであろう。ＰＤＡと比較して、ＤＭ膜は様々な応用に利用できるより高濃度の遊離カルボン酸を示すと期待されるだろう。
【０００８】
しかしながら、水または低イオン強度緩衝液中におけるＤＯＰＡのアルカリ性自己酸化の経過報告は、可溶または溶液安定超分子ナノ会合であるメラニン様生成物という結果であった。当業者はＰＤＡ膜の自然形成のため開発した標準条件（緩衝通気Ｈ２Ｏ、ｐＨ８〜９）を用いたＤＯＰＡからの粘着膜形成が困難であることを経験してきた。in-situ 成長したＤＭ膜は、典型的にはドーパミンを用いてずっと厚い膜を得る条件下、１０ｎｍ以下の厚さを達成することのみ分かっている。このように、ＰＤＡと比較して、ＤＭ膜はＤＯＰＡの自然自己酸化により基材上に成長することは相当により困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当技術分野において様々な応用のためＤＭ膜および粒子の製造方法の改良の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書では、高イオン強度において容易な方法でＤＭ膜のin-situ 自然自己酸化成膜を開示する。厚い粘着性ＤＭ膜は金属酸化物、貴金属およびポリマーを含む広範囲な基材上に形成した。ＤＭ膜は多くの所望のＰＤＡ膜特性を有するが、例えば、高親水性ならびに静電結合能力およびカチオン放出能力などのいくつかの利点を有する。後者の特性はＤＭ膜からカチオン性アミノグリコシドの担持および放出により抗菌性コーティングを製造するために利用された。
【００１１】
高イオン強度アルカリ緩衝液を、表面基材を必要としないでＤＯＰＡを自己酸化するために使用して、その結果、５，６−ジヒドロキシインドールカルボン酸（ＤＨＩＣ）含有物を含む不溶性粒子のＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）を形成できることを、本明細書でさらに開示する。このような粒子は塩タイプおよび溶液中に含有される濃度に関連して結合の程度を有する金属イオンに対する高結合能を有する。このように、得られたＤＭ粒子を、とりわけ、重金属治療のために使用できる。
【００１２】
したがって、第一の態様において、本発明は、ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーの合成方法を包含する。該方法は、酸化条件下、次式：
【化１】
2017512893.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ１〜３アルキル、第一級アミン、第二級アミン、ハロゲン化物、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒド、カルボン酸エステルまたはカルボキサミドからなる群から独立して選択され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、第一級または第二級アミンであり、Ｘは０〜３の範囲であり、ｙは０〜３の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上であり；Ｒ２はカルボン酸である。］
を有する反応物質を高濃度塩水溶液と接触させる工程を含む。該方法を実施した結果、ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーが形成される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ｘおよびｙは１であり、Ｒ２は−ＣＯＯＨであり、Ｒ５は−ＮＨ２である。いくつかのそのような実施形態において、該反応物質は、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）である。いくつかの実施形態において、該塩水溶液濃度は１００ｍＭより高い。場合に応じて、塩濃度は２００ｍＭより高くてもよく、５００ｍＭより高くてもよい。
【００１４】
いくつかの非限定的で例示的実施形態において、使用される塩はナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、またはカルシウム塩である。いくつかの実施形態において、該塩水溶液はアルカリ性溶液である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、該方法は、反応物質および高濃度塩水溶液を面と接触させる工程をさらに含む。この工程を実施した結果、ＤＭコーティング膜が該表面上に形成される。
【００１６】
いくつかのそのような実施形態において、ＤＭコーティング膜は自然に該表面に形成される。他のそのような実施形態において、ＤＭコーティング膜は１０ｎｍ厚より厚い。さらに他のそのような実施形態において、該面は負に荷電した基材を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、形成されたＤＭポリマーは不溶性粒子の形態である。
【００１８】
第二態様において、本発明は、上記方法の実施により形成されたＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを包含する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＤＭポリマーはカルボン酸残基を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＤＭポリマーは基材面上のコーティングの形態である。いくつかのそのような実施形態において、該コーティングは１０ｎｍ厚より厚い。いくつかのそのような実施形態において、該基材面はバイオメディカル機器の面である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＤＭポリマーは該ポリマー上に捕捉された重金属イオンまたはカチオン性薬物をさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、該カチオン性薬物はカチオン性アミノグリコシドである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＤＭポリマーは、不溶性粒子の形態である。
【００２３】
第三の態様において、本発明は、流体中の金属イオン数の減少方法を包含する。該方法は、上記ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを、１つ以上の金属イオンを含んでなる流体と接触させる工程を含む。結果として、ＤＭポリマーは少なくとも１つの金属イオンと結合し、それにより、流体中の金属イオン数を減少させる。いくつかの実施形態において、該１つ以上の金属イオンはＰｂ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋またはＨｇ２＋であってよい。
【００２４】
第四の態様において、本発明は、カチオン性薬物の送達方法を包含する。該方法は、（ａ）上記ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを、１つ以上のカチオン性薬物と接触させ、それにより、カチオン性薬物がＤＭポリマーと可逆的に結合する工程、および（ｂ）ＤＭポリマーからカチオン性薬物を放出する工程を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、該カチオン性薬物はカチオン性アミノグリコシドである。使用され得る例示的なアミノグリコシドとしては、ゲンタマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、アルベカシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシン、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
第五の態様において、本発明はＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーの合成キットを包含する。かかるキットは、ａ）次式：
【化２】
2017512893.tif 000004
［式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ１〜３アルキル、第一級アミン、第二級アミン、ハロゲン化物、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒド、カルボン酸エステルまたはカルボキサミドからなる群から独立して選択され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、第一級または第二級アミンであり、ｘは０〜３の範囲であり、ｙは０〜３の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上であり、Ｒ２はカルボン酸であり、ｘは０〜１０の範囲であり、ｙは０〜１０の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上である。］
を有する反応物質、
ｂ）金属塩、およびｃ）使用説明書を備える。
【００２７】
いくつかの実施形態において、該金属塩はナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、またはカルシウム塩である。いくつかの実施形態において、該キットはアルカリ性緩衝液をさらに備える。
【００２８】
いくつかの実施形態において、該キットはＤＭポリマーで塗布される基材面をさらに備える。いくつかのそのような実施形態において、該基材面はメディカル機器の面である。
【００２９】
本明細書および請求の範囲の中で、「含む（including）」および「含んでなる（comprising）」という語はオープンエンドな語であり、「含むが限定しない」という意味であると解釈するべきである。これらの語は、「から本質的になる」および「からなる」というより制限的用語を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】高イオン強度におけるアルカリ性ＤＯＰＡ溶液中の簡便な浸漬コーティングによるコンフォーマルＤＯＰＡ−メラニン膜形成を示す模式図である。
【図２】ｐＨ８．５におけるＤＭ膜形成。（Ａ）１６時間後のＤＭ膜厚に対するＮａＣｌ濃度の影響。（Ｂ）時間の関数としてのＤＭ膜（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の成長。ドーパミン酸化の反応スキームＩ（Ａ）およびＩＩ（Ｂ）。
【図３】０または２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭビシンｐＨ８．５中の５ｍＭドーパミンから１６時間後の形成されたＰＤＡ厚。
【図４】５ｍＭドーパミン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭビシン、ｐＨ８．５からのＰＤＡ膜成長の時間依存性。
【図５】ＤＭで０〜３回コーティングされたＰＣ基材の写真。各コーティングサイクルは５ｍＭドーパミン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭビシン、ｐＨ８．５から２０時間であった。コーティング厚を示す。
【図６】ＤＭコーティング（１５８ｎｍ厚、両サイド）されたＰＣ基材の広帯域吸収スペクトル。
【図７】ＤＭにあるが、ＰＤＡにないＣＯＯ−（１６００ｃｍ−１のＣ−Ｏの非対称伸縮）およびＣＯＯＨ（１７００〜１７３０ｃｍ−１のＣ＝Ｏの伸縮）の存在を示す、Ａｕ上に成膜されたＰＤＡ膜およびＤＭ膜のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトル。
【図８】ＤＭ膜の表面形態および濡れ性。（Ａ）１６時間後に形成されたＴｉＯ２上の２３ｎｍ厚ＤＭのＳＥＭ画像。（Ｂ）様々な基材上に１６時間後に形成されたＤＭおよびＰＤＡの前進水接触角。＊は１０°より小さい角度を示す。（Ｃ）それぞれ、純粋なままのＰＣ、ＰＤＡでコーティングされたＰＣ、およびＤＭでコーティングされたＰＣ上の前進水滴の画像。
【図９】様々な可能性のある結合および酸化状態を有するＤＨＩＣＡおよびＤＨＩサブユニットの混合物からなる最終生成物を用いたメラニン形成の現在の理解に基づくＤＭ膜形成の提案されている経路。
【図１０】ＤＭ膜からのカチオン性抗菌化合物の結合および放出。（Ａ）Ｈ２ＯまたはＧＭ溶液への暴露１６時間後のＤＭまたはＰＤＡの厚さ変化パーセント。（Ｂ）４時間にわたるＰＣ／ＤＭ／ＧＭからのＧＭ放出。（Ｃ）ＤＭ膜厚の関数として、ＰＣ／ＤＭ／ＧＭからの４時間ＧＭ放出。（Ｄ）ＤＭ／ＧＭ（下）またはＰＤＡ／ＧＭ（上）でコーティングされたＰＣの１８時間インキュベート後の黄色ブドウ球菌（S. aureus）の阻害ゾーン。（Ｅ）ＰＤＡおよびＤＭでコーティングされたＰＣへの４時間暴露後の浮遊黄色ブドウ球菌の生存率を示す死アッセイ。
【図１１】ＥＬＩＳＡにより測定した、Ｈ２Ｏ、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ含有ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ）、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２含有ＨＥＰＥＳ（０．８１４ｍＭ）、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２含有ＨＥＰＥＳ（１．８ｍＭ）、およびＤＭＥＭ（１５５ｍＭ  Ｎａ＋、０．８１４ｍＭ  Ｍｇ２＋、１．８ｍＭ  Ｃａ２＋）中のＤＭ／ＧＭコーティングからのゲンタマイシンの放出。（＊および＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示す。）
【図１２】ＰＤＡはＤＨＩサブユニットのみを含有するが、ＤＭはＤＨＩＣＡおよびＤＨＩの両方を含有することを示すＤＭおよびＰＤＡ形成の比較。
【図１３】２５０ｍＭ  ＮａＣｌのＤＭ粒子形成及び上記を示す、１６時間後の様々なＮａＣｌ濃度を含有する１０ｍＭビシンｐＨ８．５緩衝液中の５ｍＭ  ＤＯＰＡの光学顕微鏡写真。
【図１４】５００ｍＭ  ＮａＣｌビシン緩衝液を用いて形成されたＰＤＡ（上段）およびＤＭ（下段）のＳＥＭ。
【図１５】アルカリ性過酸化物分解アッセイ後のメラニン試料の２６９ｎｍにおいて検出したＨＰＬＣ分析。示された標準品は、７．９分で溶離するＰＤＣＡを１μｇ／ｍＬおよび１０．２分で溶離するＰＴＣＡを１μｇ／ｍＬ含有していた。各試料のＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比をそのスペクトルの下に示す。
【図１６】ＤＭ形成に対する塩の種類および濃度の影響。（Ａ）ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比および（Ｂ）ｐＨ４．８において１ｍＭ溶液から結合するＰｂ（ＩＩ）。
【図１７】１ｍＭの（Ａ）Ｃｕ、（Ｂ）Ｐｂ、（Ｃ）Ｃｄおよび（Ｄ）Ｈｇに対するＡＣ、ＰＤＡ、ＤＭ（Ｎａ）、ＤＭ（Ｍｇ）、ＳＭおよびＣＭの結合能。
【図１８】ｐＨ４．８におけるＰｂ（ＩＩ）結合等温線。
【図１９】１ｍＭ溶液からのＰｂ（ＩＩ）結合に対する接触時間の影響。
【図２０】水から有害金属を除去するために固体支持体として充分に機能するＤＭの不溶性形態を探求して、様々な濃度のＮａＣｌを含有するｐＨ８．５緩衝液中、１６時間、ＤＯＰＡを自己酸化させた。超えると沈殿物が光学顕微鏡により観察されるＮａＣｌが２５０ｍＭになるまで塩濃度を増加するにつれ、懸濁液は色が濃くなった。
【図２１】走査電子顕微鏡により、ＰＤＡおよびＤＭ粒子は様々なサイズであり、より小さなサブミクロン粒子の凝集物であることが明らかになった。
【図２２Ａ】ＰＤＡの正確な化学構造は、これから完全に解明されなければならないが、主にＤＨＩを含み［３５］、一方、ＤＯＰＡから形成された合成メラニンはＤＨＩおよびＤＨＩＣＡサブユニットの両方を含むことが分かっている。本発明者らは、ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比および結果的にＰｂ結合に対する一価（ＮａＣｌ、ＫＣｌ）および二価塩（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２）の種々の濃度の影響をさらに探求した。１２５、２５０、５００および１０００ｍＭの各塩の存在下ＤＭを形成して、ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比に対する影響を決定した。各塩について、塩濃度が増加するにつれてＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比が増加する明らかな傾向（ｐ＜０．０１）を見出した。
【図２２Ｂ】ＭｇＣｌ２を用いて形成されたＤＭは最もＰｂ（ＩＩ）と結合し、次いで、ＣａＣｌ２であることを本発明者らは見出したことをここで明らかにする。ＮａＣｌおよびＫＣｌを用いて形成されたＤＭはほとんどＰｂ（ＩＩ）と結合しなかった。各種の塩について、結合したＰｂ（ＩＩ）量も、ＤＭ形成中使用された塩濃度がより高いほど増加した。この傾向はＤＭのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比と相関があり（Ｍｇ＞Ｃａ＞Ｎａ≒Ｋ）、塩の種類およびその濃度の両方は、形成中のそのＤＨＩＣＡ含有量の増加によりＤＭのＰｂ（ＩＩ）結合量を間接的に促進できることを示唆している。
【図２３】ＰＤＡは、１８．２ｍｇ／ｇであると分かっているＡＣの約５倍多い８９．２ｍｇ／ｇの最大Ｐｂ（ＩＩ）結合能を有することが分かった。全てのＤＨＩＣＡ含有メラニンは、ＰＤＡ＜ＳＭ＜ＤＭ（Ｎａ）＜ＣＭ＜ＤＭ（Ｍｇ）の順で、ＰＤＡより著しく高い最大Ｐｂ（ＩＩ）結合能を有していた。
【図２４】本発明者らは、ＤＭ（Ｍｇ）、ＤＭ（Ｎａ）およびＣＭは、試験した最初の時点内でその最大吸着を達成する（１５分）ことを見出し、これは本発明者らの最初の時点であった。ＳＭおよびＰＤＡについて、約６０分まで結合は増加した。ＤＭ粒子によるＰｂ（ＩＩ）の速い結合により、ＤＭ粒子はインライン水浄化用吸着剤として好適となる。
【図２５Ａ】Ｃｕ（ＩＩ）結合能は、ＡＣ＜ＰＤＡ＜ＳＭ＜ＤＭ（Ｎａ）＜ＣＭ＜ＤＭ（Ｍｇ）の順であった。
【図２５Ｂ】Ｐｂ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）の定性的に類似の結合傾向のために、先ずＰｂ（ＩＩ）がメラニンのカテコールと同様に結合して、それから、より高濃度でカルボキシルと結合すると推測している。
【図２５Ｃ】Ｃｄ（ＩＩ）について、ＰＤＡの９．６倍〜１３．２倍多く結合したＤＨＩＣＡ−ＤＭ（Ｎａ）、ＤＭ（Ｍｇ）およびＣＭ中にリッチなメラニンを見出した。
【図２６】アルカリ性過酸化物分解アッセイ後のメラニン試料を２６９ｎｍにおいて検出したＨＰＬＣ分析。それぞれ、７．７分および９．８分で溶離したＰＤＣＡおよびＰＴＣＡ（ここで１μｇ／ｍＬで示す）の標準溶液。
【図２７】スキーム１
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．概論
本発明は面上に成膜した膜またはコーティングの形態または不溶性粒子の形態のＤＯＰＡ−メラニンポリマーを自然に形成する新規な方法を提供する。本発明の界面化学および合成化学はバイオメディカル機器、薬物送達担体および再生医療骨格の表面改質、バイオセンサー、生物付着耐性、工業用および消費者用塗料、半導体、金属除去、表面触媒ならびに次世代電子ディスプレイを含む重要な分野で有用になるだろう。本発明の特定の非限定的実施形態を以下により詳細に説明する。
【００３２】
ＩＩ．自然自己酸化のための反応物質
本明細書で開示される自然自己酸化プロセスで使用される反応物質は、高イオン強度、好ましくはアルカリ性の溶液中の酸化条件下で反応して、ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）ポリマーを形成する。該反応物質は次式を有する：
【化３】
2017512893.tif 000005
［式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ１〜３アルキル、第一級アミン、第二級アミン、ハロゲン化物、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒド、カルボン酸エステルまたはカルボキサミドからなる群から独立して選択され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、第一級または第二級アミンであり、ｘは０〜３の範囲であり、ｙは０〜３の範囲であり、但し、ｘまたはｙは１以上であり、Ｒ２はカルボン酸である。］
【００３３】
ＤＯＰＡ
１つのそのような実施形態において、該反応物質は、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）またはその塩である：
【化４】
2017512893.tif 000006
【００３４】
ＩＩＩ．自然自己酸化のための高イオン強度溶液
本発明で使用される高イオン強度塩溶液は充填剤、色素、湿潤剤、粘度調整剤、安定化剤、抗酸化剤または架橋剤などの添加剤も含有できる。該反応物質を必要に応じて架橋できる。必要に応じて、塩溶液は微粒子充填剤、表面活性剤、ＵＶ吸収剤、光開始剤、着色剤および指示薬などの様々なアジュバントを含有できる。
【００３５】
「高イオン強度」は、使用される塩濃度が１００ｍＭ以上であり、２００ｍＭ以上であることを意味するものとし、他の実施形態では、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、または５００ｍＭ以上の塩濃度を有する溶液を使用する。使用できる塩濃度範囲としては、１００〜５０００ｍＭ、１００〜４０００ｍＭ、１００〜３０００ｍＭ、１００〜２０００ｍＭ、１００〜１０００ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１５０〜５０００ｍＭ、１５０〜４０００ｍＭ、１５０〜３０００ｍＭ、１５０〜２０００ｍＭ、１５０〜１０００ｍＭ、１５０〜５００ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３００ｍＭ、２００〜５０００ｍＭ、２００〜４０００ｍＭ、２００〜３０００ｍＭ、２００〜２０００ｍＭ、２００〜１０００ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、および２００〜３００ｍＭが挙げられる。
【００３６】
「アルカリ性」は、溶液のｐＨ値が７．１〜１２の範囲であり、好ましいｐＨは７．５〜１０の範囲であり、さらに好ましいｐＨは７．５〜８．５の範囲であると意味するものとする。アルカリ性溶液は基材面上に反応物質の重合を引き起こす。
【００３７】
「溶液」は、少なくとも１つの溶質が水を含むが、水および、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびヘキサンなどの有機溶媒の混和溶液も含む溶媒中に溶解していることを意味するものとする。好ましくは、溶液を使用前少なくとも短期間貯蔵してもよいが、該溶液を使用直前に作製する。
【００３８】
「酸化条件下」は、酸素またはトリエチルアミンなどの有機塩基を溶解した水溶液および非水溶液のアルカリｐＨを意味するものとする。代替の実施形態では、過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、tert-ブチルヒドロペルオキシド、有機過酸化物類、ベンゾキノン類、ナフトキノン類、アントラキノン類を含むキノン類、ニトロアリール化合物、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ３＋およびＭｎ３＋を含む金属酸化剤、フェノール類、インドール類、アミノベンゼン類などの酸化剤を含んでなる溶液を使用して反応物質の酸化により重合を開始できる。
【００３９】
１つの実施形態において、基材は反応物質溶液中に浸漬またはディップ（dip）する。以下の実施例は好ましい接触方法を例証する。しかしながら、これに限定されないが、スワブ塗布（swabbing）、ディップ塗布、スピン塗布、ダイ塗布、インクジェット塗布、スプレー式、スクリーン印刷（例えば、ロータリースクリーン印刷）、グラビア印刷、写真平版印刷およびフレキソ印刷、マイクロコンタクトプリンティング、ナノリソグラフィーを含む様々な技術を使用して基材面を反応物質溶液と接触できる。
【００４０】
接触の際、ＤＭ膜は基材面上に形成する。好ましい実施形態において、該ＤＭ膜は基材面上の平滑で連続的ポリマーコーティングを含んでなり、該ポリマーコーティングは実質的に一定の厚さを有する。一般的な指針として、ポリマーコーティングは１０ｎｍより厚い厚さで基材面上に存在する。いくつかの実施形態において、該厚さは約１１〜１０００ｎｍの範囲、好ましくは約１１〜１００ｎｍの範囲である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、合成は自然発生的である。「自然（発生的）」は、反応が熱力学的に好ましく、したがって、作用または力を連続的にインプットすることなく進むことを意味するものとする。当業者が認識しているように、非自然反応の非限定的例は外部から印加された電流を要する電気分解である。
【００４２】
ＩＶ．基材
いくつかの実施形態において、該方法は、基材の少なくとも部分を上記反応物質と接触させることを含んでなる。
【００４３】
「基材」はいかなる無機または有機基材も意味するものとする。例えば、該基材は、粘着性ポリマーを受容するために面を提供する有機固体、無機固体、または有機および無機固体の組合せであり得る。適切な有機または無機基材は、繊維状、フィラメント状、メッシュ状、多孔質または溶媒膨潤質（例えば、ハイドロゲルまたは有機ゲル）の物であってもよい。好ましくは、該基材を選択する際に、基材および反応物質間に充分な程度の接着力があるように配慮する。
【００４４】
適切な無機基材としては、水晶、ガラス、シリカおよび他の酸化物またはアルミナ、インジウムスズ酸化物、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ３）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ３）、ガリウムヒ素（ＧａＡｓ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ランガサイト（ＬＧＳ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、シリコン（Ｓｉ）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、およびチタン酸ジルコン酸鉛（「ＰＺＴ」）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化ニオブ（Ｎｂ２Ｏ５）；ならびにアルミニウム、銅、金、銀および鋼などの金属または合金などの無機基材が挙げられるが、これに限定されない。他の適切な無機基材としては、雲母、ダイヤモンドおよびニッケルチタン（ＮｉＴｉ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００４５】
適切な有機基材としては、ポリエステル類（例えば、ポリエチレンテレフタレートまたはポリエチレンナフタレート）、ポリアクリレート類（例えば、ポリメチルメタクリレートまたは「ＰＭＭＡ」）、ポリ酢酸ビニル（「ＰＶＡＣ」）、ポリビニルブチラール（「ＰＶＢ」）ポリ酢酸エチル（「ＰＥＡ」）、ポリ（ジフェノキシホスファゼン）（「ＰＤＰＰ」）、ポリカーボネート（「ＰＣ」）、ポリプロピレン（「ＰＰ」）、高密度ポリエチレン（「ＨＤＰＥ」）、低密度ポリエチレン（「ＬＤＰＥ」）、ポリスルホン（「ＰＳ」）、ポリエーテルスルホン（「ＰＥＳ」）、ポリウレタン（「ＰＵＲ」）、ポリアミド（「ＰＡ」）、ポリ（ジメチルシロキサン）（「ＰＤＭＳ」）、ポリ塩化ビニル（「ＰＶＣ」）、ポリフッ化ビニリデン（「ＰＶｄＦ」）、ポリスチレン（「ＰＳｙ」）およびポリエチレンスルフィドを含む熱可塑性樹脂；およびセルロース誘導体、ポリイミド、ポリイミドベンゾオキサゾールおよびポリベンゾオキサゾールなどの熱硬化性樹脂が挙げられるが、これに限定されない。他の適切な有機基材としては、グラファイト、カーボンナノチューブ、フラーレン、グラフェン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、および乳酸グリコール酸共重合体およびテフロン（登録商標）が挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
未処理基材
本発明の方法をいずれかの条件で、基材上で使用できる。例えば、塗料、油、グリース、保護剤などの既存コーティングを有する基材を、さらに前処理も洗浄もしないで使用できる。
【００４７】
前処理された基材
別の実施形態では、基材を代わりにまたは追加で前処理して膜形成を促進できる。好ましい前処理としては、電子およびイオンビーム照射、適切な反応性または非反応性雰囲気の存在下放電（例えば、プラズマ、グロー放電、コロナ放電、誘電体バリア放電または大気圧放電）；化学的前処理（例えば、低固形分溶液の ポリ二塩化ビニリデンまたはポリエステルおよびアジリジン架橋剤の溶剤型混合物を用いて）；火炎前処理；オゾン前処理ありまたはなしの紫外線前処理が挙げられるが、これに限定されず；ポリマー基材を使用する場合、該基材中に機能性ポリマーを含浸させる。代替の実施形態では、本発明は人工的または自然にダメージした／変化した基材上のコーティングを促進する方法を提供する。
【００４８】
Ｖ．使用
反応物質で処理した基材の現在の応用は多く、抗生物付着および抗酸化面への応用；カテーテル、ステント、人工骨、歯および透析管用医療機器；バイオＭＥＭＳ、およびセンサー用半導体；ならびにセンサー、診断、および細胞イメージング用金属ナノ粒子および量子ドットが挙げられるが、これに限定されない。
【００４９】
抗菌面および抗生物付着面
この実施形態において、ＤＭポリマーで塗布された基材面は抗菌特性を示し得る、またはそのような特性を有する結合抗菌剤を含み得る。非限定的例について以下の実施例１参照。
【００５０】
反応物質で処理した基材を使用して、医療および歯科用機器およびインプラント、船体、人工または天然組成物の海洋および陸上構造物、水処理施設、食品加工面、ならびに建築および住宅資材用途の生物付着耐性基材を提供できる。
【００５１】
「生物付着（biofouling）」は、巨大分子、細胞、タンパク質、微生物、藻類および他の生物ならびに固体−液体または固体−空気界面におけるそれらの副産物の非特異的吸着を意味するものとし、しばしば、例えば、医療機器およびセンサーの性能、安全性、および寿命に悪影響を及ぼす結果となる。「耐性」は、生物付着に関連する、巨大分子、微生物、タンパク質、微生物、藻類および他の生物ならびに固体−液体または固体−空気界面におけるそれらの副産物の非特異的吸着を防止するために修飾された基材を意味するものとする。現在、ポリエチレングリコール（ＰＥＧまたはＰＥＧ化）の表面固定化は生体適合性（non-fouling）表面の製法に最もポピュラーなアプローチであったが、面に関係なく、ＰＥＧ分子の固着はいまだ主要なチャレンジのままである。
【００５２】
酸化防止
この実施形態において、ＤＭポリマーは抗酸化特性を示し得る、または酸化から面下部を保護し得る。
【００５３】
薬物送達
ＤＭポリマーは特定にカチオン性薬物と可逆的に結合し得る。したがって、薬物送達に使用できる。非限定的例について以下の実施例１参照。
【００５４】
無電解金属化
この実施形態では、好ましくは、上記高イオン強度溶液中で、反応物質で面を処理し、次いで、処理した面を金属溶液に暴露して粘着性金属膜を形成する。
【００５５】
求核性付加
この実施形態では、好ましくは、上記高イオン強度溶液中で反応物質と基材を接触させて、次いで、反応物質で処理した基材を求核剤に暴露する。「求核剤」は、電子密度の低い化学種、求核剤の核電荷に引き寄せられる傾向を有する電子密度の高い化学種を意味するものとする。重要な求核剤としては、第一級および第二級アミン類、チオール類、アジド類、ニトリル類、アルデヒド類、イミダゾール類、アジド類、ポリヘキサメチレンジチオカルボネート、水素、ヒドロキシル類、カルボン酸類、アルデヒド類、カルボン酸エステル類またはカルボキサミド類、その他が挙げられる。
【００５６】
【表１】
2017512893.tif 000007
【００５７】
適切な求核剤は、タンパク質または核酸などのより複雑な分子の部分を含んでなり得る。
【００５８】
ポリマーグラフト
この実施形態では、好ましくは、上記高イオン強度溶液中で反応物質と基材を接触させて、次いで、反応物質で処理した基材を、上記求核剤を含むいずれかの合成ポリマーを含むポリマーに暴露する。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の場合、ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２、メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＨ、ＳＨ−ＰＥＧ−ＳＨ、分岐ＰＥＧ−ＮＨ２、および分岐ＰＥＧ−ＳＨはＳＭＡ処理面と反応するポリマー構造である。ポリマーグラフトの代替形態も考えられ、フリーラジカルグラフト重合、原子移動ラジカル重合、プラズマ重合／蒸着、プラズマ処理および表面照射、ならびにカチオン性およびアニオン性モノマーまたはオリゴマー付加が挙げられる。
【００５９】
金属捕捉
この実施形態では、流体中の金属イオン量を本方法により製造した反応物質処理基材または不溶性ＤＭ粒子と結合することにより減少できる。「減少する」は、好ましくは、最大汚染物質濃度（ＭＣＬ）より低く、または他の全金属用に確立されたベンチマークまで溶液中の金属イオン量のいずれもの減少を意味するものとする。該方法により製造されたＤＭポリマーは、基材上の膜の不溶性粒子の形態であるかにかかわらず、金属イオンを含有する溶液中に存在し、それにより、表面改質された基材は溶液中の金属イオン量を減少させる。該方法をフロースルー式でもバッチ式でも実施できる。非限定的例について以下の実施例２および３参照。
【００６０】
ＶＩ．キット
本発明の代替の実施形態では、ＤＭポリマーを自然に合成するキットを提供する。１つの実施形態において、該キットは、高イオン強度溶液を作製するための塩、上記反応物質、希釈剤、および場合に応じて、修飾される基材または緩衝液および使用説明書を含んでなる。
【００６１】
「使用説明書」は、出版物、記録、略図、または本明細書に記載の目的の１つのため本発明の有用性を伝えるために使用する他の表現手段を意味するものとする。該キットの教材を、例えば、本発明を含む容器に添付でき、または本発明を含む容器と一緒に輸送できる。あるいは、教材を容器と別々に輸送または教材およびＳＭＡ溶液および基材をレシピエントにより協同的に使用できる本発明を含むインターネットウェブサイト上の電子的に利用できる形態で提供できる。
【実施例】
【００６２】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例において、本発明の様々な新規で有用な実施形態を説明する。実施例は特定のコーティング、ＤＯＰＡで製造した膜および粒子ならびにその使用方法を参照するが、本発明は該実施例で示された実施形態に限定されるものではない。
【００６３】
実施例１：抗菌化合物を担持および放出するためのＤＯＰＡ−メラニンコーティングの高イオン強度形成
コンフォーマル（conformal）ＤＯＰＡ−メラニン膜を、高イオン強度のアルカリ性ＤＯＰＡ溶液中でのシンプルディップコーティングにより、様々な基材上に形成した（図１）。ポリドーパミンと比較して、ＤＯＰＡ−メラニンコーティングは高親水性の利点を有するとともに、カチオンを結合および放出する能力も有する。ＤＯＰＡ−メラニンをコーティングしたポリカーボネートを使用して、黄色ブドウ球菌を阻害および殺傷する抗菌面を形成することにより、本発明者らは後者を示す。
【００６４】
メラニンは自然に広く存在し、染色、光防護、抗酸化剤、金属結合および他の生物特性を提供する［１］。メラニンの重要なサブクラスはユーメラニンであり、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）酸化、分子内環化、オリゴマー化、ならびに凝集して不溶性および不均一性固体を伴う経路によりチロシンから形成する［２，３］。ユーメラニンに関する研究は、生体機能に関連した構造的特性の関係性への関心からある程度動機付けられている［４］が、メラニン薄膜の興味深い光学的電気特性および技術的応用への関心の高まりのためでもある［５〜７］。
【００６５】
合成および天然メラニンは多くの溶媒に不溶であり、この特性は薄膜などの有用な形態への加工処理の挑戦を表す。過去に、基材上にメラニン様薄膜の成膜を、溶液キャスト法［８，９］、（電子）スプレー法［１０，１１］、スピンコーティング法［１２〜１４］、電気化学析出［７，９，１５］およびパルスレーザー蒸着［１６］により実施されてきた。概して、有機溶媒またはＮａＯＨもしくはアンモニア水溶液中へのメラニンの溶解が必要であることに加えて、ほとんどの報告された方法は、見通しがある、高性能な機器を要する、複雑で多段階のプロトコールを使用する、あるいは実施した基材でのみ実行可能であるかのいずれかである。これらの制約のせいで、メラニン薄膜の成膜に対する簡便で汎用な方法の必要性が未だ高い。重要性の高いインフラの必要性を避け、様々な基材の組成、形状および構造に適応できるメラニン薄膜の形成方法は、バイオインスパイアード材料のこの関心の高い分野の実践的応用の開発を加速するだろう。
【００６６】
メラニン様コーティングで面を修飾する簡便で汎用な方法が最近報告され、ＤＯＰＡリッチなイガイ接着タンパク質のカテコラミン擬態の水溶液中に基材をディップ塗布する［１７，１８］。この分野の文献を占めるプロトタイプカテコールアミンは、弱塩基性で通気した水溶液中で自己酸化して実質的にいかなる基材上にも粘着性ポリドーパミン（ＰＤＡ）膜を形成するドーパミンである［１７］。そのユーメラニンとの化学的類似性のためにドーパミンメラニンとも呼ばれるＰＤＡは、生体分子固定、表面エネルギー修飾、生体内鉱質形成、バイオセンシングなどの多数の応用をもたらすさらなる修飾のためのプライマーとして作用できる［１９，２０］。対象の分子も一段階反応でドーパミンと同時に共成膜して所望の特性を有する面を作製できる［２１］。
【００６７】
ドーパミンのいくつかの誘導体および他のカテコラミン類は広範な基材上に同様に重合する。例えば、ノルエピネフリンはドーパミンでは見られないヒドロキシル基の存在によって加わったε−カプロラクトンの開環重合開始能力で粘着膜中に重合することが分かった［２２］。カテコールおよびアミンの官能性を両方有する他の分子は、ＤＮＡ固定化［２３］および抗生物付着ブラシの表面重合［２４］を可能とするため、様々な面をコーティングするために使用されてきた。
【００６８】
ユーメラニン様薄膜の技術的応用をさらに加速するはずであるので、ＰＤＡと同様に様々な基材上にＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）膜を自然重合することは興味深いであろう。ＰＤＡと比較して、ＤＭ膜は様々な応用に利用できるより高濃度の遊離カルボン酸を示すと期待されるだろう。しかしながら、水中または低イオン強度緩衝液中のＤＯＰＡのアルカリ性自己酸化の経過報告は溶解性［２５〜２７］または溶液安定性超分子［２８］であるメラニン様生成物をもたらす結果であった。この挙動と一致して、本発明者らは、他の者と同様に、特に、ＴｉＯ２およびＳｉＯ２［２９］などの負荷電基材上の自然ＰＤＡ膜形成（緩衝通気Ｈ２Ｏ、ｐＨ８〜９）のために開発された標準条件を用いて、ＤＯＰＡから粘着膜を形成する困難を経験した。
【００６９】
Ｇｒｅｃｏらは、システイニルＤＯＰＡ−メラニン（ＣＤＭ）の存在下、ＤＯＰＡの自己酸化によるコアシェルメラニン粒子の自然形成について報告した［３０］。ＣＤＭ粒子は、ＤＯＰＡ酸化およびＤＭシェルのエピタキシャル析出に重要な役割を果たすことが明らかとなり、したがって、該方法が他の基材上にＤＭ薄膜形成をする一般的アプローチを提供できるかどうかは不確かである。少数の報告は、ポリマー膜上のＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）薄膜コーティングのin-situ 形成が、濡れ性を改良［３１，３２］し、分子の共有結合型固定のためのプライマーとして作用する［３３〜３５］ことを示したが、しかしながら、in-situ 成長したＤＭ膜はドーパミンを使用してずっと厚い膜を通常得る条件下で、１０ｎｍ以下の厚さにしかならないことが分かった。したがって、ＰＤＡと比較して、該文献は、ＤＭ膜がＤＯＰＡの自然自己酸化により基材上で成長するのはかなりより難しいことを示している。
【００７０】
この実施例において、本発明者らは、高イオン強度において容易にＤＭ膜の自然発生的in-situ自己酸化成膜が進行することを予想外に見出したことを報告する。厚い粘着性ＤＭ膜は金属酸化物、貴金属およびポリマーを含む広範囲な基材上に形成した。ＤＭ膜は多くの所望のＰＤＡ膜特性を有するが、例えば、高親水性ならびに静電結合能力およびカチオン放出能力などのいくつかの利点を有する。後者の特性はＤＭ膜からカチオン性アミノグリコシドの担持および放出により抗菌性コーティングを製造するために利用された。
【００７１】
ＤＭ膜形成のイオン強度依存性を、貴金属（Ａｕ）、酸化物（ＴｉＯ２）、およびポリマー（ポリカーボネート、ＰＣ）の代表的例を０〜１ＭのＮａＣｌ濃度のビシン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）中のＤＯＰＡ（５ｍＭ）の水溶液に暴露して、分光エリプソメトリーを用いて１６時間後に形成されたＤＭ膜の厚さを測定することにより明らかにした（図２Ａ）。ＰＣおよびＴｉＯ２基材上で、ＤＭ膜をＮａＣｌ非存在下検出しなかったが、２５０ｍＭ以上のＮａＣｌ濃度において、それぞれ、８０ｎｍおよび４０ｎｍで横ばいになり、イオン強度の増加と共に厚さが増加した。この挙動は、その厚さがＮａＣｌ濃度に依存しないことが分かっているＰＤＡコーティングと全く対照的であった（図３）。２０ｎｍ薄膜がＮａＣｌなしで形成し、２５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて１４０ｎｍに上昇後、ＮａＣｌ濃度のさらなる上昇と共に約８０ｎｍまで減少するＡｕ上のＤＭ形成は異常であった。この異常な挙動の原因はこの時点で分かっていないが、再現性良く観察され、この現象は、負電荷のＤＭ膜によりＡｕ基材の静電的誘導に関連し得ると本発明者らは仮定している。にもかかわらず、ＮａＣｌの５００ｍＭ以上において、Ａｕ上のＤＭ厚はＰＣ（約８０ｎｍ）上のものと同様であった。
【００７２】
これらの予備結果に基づいて、緩衝液Ａ（１０ｍＭビシン、ｐＨ８．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）をＤＭ形成用に最適な緩衝液として選択し、動力学的試験で使用して５ｍＭのＤＯＰＡに暴露された基材上のＤＭ膜の成長を観察した。膜成長は、８〜２４時間、最速に起こる膜厚成長と共にＳ字形状を示した（図２Ｂ）。３６時間以上のＴｉＯ２上のＤＭ成長は、Ｈ２Ｏで洗浄した場合、たぶん、ＤＭおよび負電荷のＴｉＯ２面間の静電反発力のせいで、断片的に離層している（１５０ｍＭのＮａＣｌで線上した場合、同じ膜は離層しなかった）が、ＤＭコーティングは試験した全基材に対してコンフォーマルであり粘着性があった。対照的に、緩衝液Ａ中で形成されたＰＤＡはＳ字形状の成長曲線を示さなかった（図４）。ＰＤＡ同様、ＤＭ膜は、ユーメラニンと類似の広帯域の吸収（図６）のせいで、成膜時間および厚さに依存して、色の濃いコーティングとして見られる（図５）［３６］。
【００７３】
減衰全反射モードのフーリエ変換赤外分光法（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）を使用して、Ａｕ上に成膜したＤＭ膜およびＰＤＡ膜間の官能基の違いを比較した。ＤＭおよびＰＤＡの主要な違いは、それぞれ、ＣＯＯ−（非対称伸縮）およびＣＯＯＨ（伸縮）に対応する１６００ｃｍ−１のピークの存在および１７００〜１７３０ｃｍ−１のショルダーであった（図７）［３７］。これらのデータは、カルボン酸基がＤＭ内に存在し、プロトン化およびカルボン酸イオンの両方の形態で存在することを示唆している。
【００７４】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を使用して、１６時間後に形成されたＤＭコーティングの特性をさらに決定した。元の状態の基材と比較して、ＤＭ修飾基材はＮ含有率の増加を示し、０．１１、ＤＯＰＡの理論的Ｎ／Ｃ比と同様なＮ／Ｃ比に達した（表２）。Ｏ／Ｃ比はＤＯＰＡの理論的Ｏ／Ｃ比０．４４同等か小さいことが分かった。重要なことに、ＡｕおよびＴｉなどの基材特異的シグナルを消失あるいは劇的に減少し、典型的ＸＰＳ分析深さ（約１０ｎｍ）より厚い外膜ＤＭ膜の形成を示唆した。本発明者らは、ＦＴＩＲデータにより示唆されたＮａカルボン酸塩の存在のせいである様に、全てのＤＭ膜内のＮａ約３％の存在にも注目した。
【００７５】
【表２】
2017512893.tif 000008
【００７６】
ＤＭコーティングしたＴｉＯ２の走査電子顕微鏡は、ＤＭ膜が下層の基材を覆い隠しており、粗面または多孔性面を有することを明らかにした（図８Ａ）。全ての３つのＤＭ修飾基材はほとんど完全に濡れ性を有し（＜１０°）、これは高密度のイオン化されたカルボン酸基の存在に起因すると考えている。対照的に、ＰＤＡ修飾基材の前進接触角は約３５°であり（図８Ｂ〜Ｃ）、文献と一致する［１７］。
【００７７】
ＰＤＡ同様に、金属配位、水素結合およびπスタッキングなどの多種多様な相互作用に関与する能力があるので、ＤＭ膜が種々の型の基材と接着する能力は、カテコール官能基の存在と関係していると思われる［３８］。ＰＤＡの構造はいくつかの最近の報告の主題であった［３９〜４１］。１つの仮説は、ＰＤＡが、ユーメラニンと関連する構造を有し、サブユニットとして５，６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）および５，６−ジヒドロキシインドールカルボン酸（ＤＨＩＣＡ）からなると通常考えられている［３６］。Ｖｅｃｃｈｉａらの最近の研究は、先ず、ドーパミンが高ｐＨでそのキノンに酸化して、それから、多段階経路を経て反応して、非環化ドーパミンのサブユニット、ドーパミンから環化したＤＨＩ、およびピロールカルボン酸部分を含有する複合生成物をもたらすことを示唆している［４０］。
【００７８】
ＤＯＰＡは天然ユーメラニンの前駆体であるので、ＤＭの形成（図９）は、ドーパキノンへの酵素介在ＤＯＰＡ酸化、シクロドーパへの環化、ドーパクロムへの転換、ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）によるＤＨＩＣＡおよびＤＨＩへの転位を含むより密接な擬態生物メラニン形成が起こり、それから、ユーメラニンへの酸化重合が起こると予想される［４２］。ＤＣＴの非存在下、大部分のドーパクロムは脱カルボン酸が起こり、ＤＨＩＣＡの代わりにＤＨＩを形成する［４３］。対照的に、本発明者らのＦＴＩＲおよびＸＰＳデータは、カルボン酸の重要な存在は高塩緩衝液中で形成されたＤＭ膜内に貯蔵されることを示唆している。高イオン強度におけるＤＯＰＡおよびその誘導体の脱プロトン化したカルボン酸イオンの電荷スクリーニングは凝集および表面結合の増加をもたらす。ＤＭ膜の正確な組成、非環化ＤＯＰＡサブユニットの存在、サブユニット間の結合、およびそれらの酸化状態はいまだ未知のままであり、さらに調査する必要があるだろう。
【００７９】
ＰＤＡと比較してＤＭのカルボン酸残基による得られる官能性利点を例証するため、ＤＭ膜をカチオン性アミノグリコシドゲンタマイシン（ＧＭ）の結合および放出について探求した。ＧＭはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）を含む微生物の広範スペクトルに対して効果的であり［４４］、高い罹患率および死亡率をもたらす院内感染の最大の原因の１つである［４５］。基材をＤＭまたはＰＤＡでコーティングし、それから、Ｈ２ＯまたはＧＭ溶液（Ｈ２Ｏ中５ｍｇ／ｍＬ）に１６時間浸漬した。厚さ測定により、全基材上のＤＭ膜およびＰＤＡ膜の両方がＨ２Ｏ中約１〜５％厚さが減少することを明らかになり、緩く結合したＤＭおよびＰＤＡの消失のせいであり得ると推測している（図１０Ａ）。ＧＭ溶液中、ＰＤＡ膜は同様な量（１〜３％）厚さが減少し、一方、全３つの基材上のＤＭ膜は約１０〜１５％膨張した。ＸＰＳにより、ＤＭコーティングされた基材へのＧＭの添加はＮ／Ｃ比の増加およびＯ／Ｃ比の減少をもたらすことが明らかになり、このことは、ＤＭ膜中にＧＭを取り込むことと一致している（表１）。加えて、Ｎａシグナルの実質的消失は、ＤＭ膜中のカルボン酸イオンと初期に会合するＮａ＋イオンのカチオン置換によりＧＭが取り込まれたことを示唆している。これらの結果は、ＧＭがＤＭに取り込まれたがＰＤＡ中には有意に取り込まれていないことを示唆している。
【００８０】
コーティングしたＰＣ基材（ＰＣ／ＤＭ／ＧＭ）をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に浸漬し、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてＧＭの放出を測定することにより、ＤＭからのＧＭの放出を調査した。図１０Ｂに示すように、５６ｎｍ厚のＤＭ膜は、４時間にわたって、ＧＭ  ０．９５μｇ／ｃｍ２を放出した。ＤＭ膜から担持および放出されたＧＭ総量を、ＤＭ厚さを変えることにより容易に調節できるはずであり（図１０Ｃ）、より厚いＰＤＡ膜を形成するために前に示した方法、工程間の洗浄および乾燥を含めてコーティングに要する時間または複数回のコーティングサイクルにより該ＤＭ厚さを順に制御した［４６］。放出培地中の無機塩の組成は、ＧＭ放出に影響することが分かり（図１１）、ＤＭＥＭ中に見られるＮａ＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋がＧＭ放出に役割を果たしていることを示唆していた。
【００８１】
Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒディスク拡散アッセイを実施してＧＭ添加ＤＭ膜が黄色ブドウ球菌の成長を阻害する能力を評価した。コーティングおよび未コーティングＰＣ基材を、黄色ブドウ球菌を植菌した寒天プレート上に置いて、１８時間インキュベートした。図１０Ｄに示すように、ＤＭ／ＧＭのインキュベーションは１６．７ｍｍの阻止帯をもたらし、ＧＭがコーティングから放出されて基材から離れた微生物の成長を阻害することを示した。対照的に、そのままのＰＣ、ＧＭで処理したＰＣ（ＰＣ／ＧＭ）、ＰＤＡ、ＰＤＡ／ＧＭ、およびＤＭはいずれの阻止帯も示さなかった（表３）。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
ＧＭ添加ＤＭが静菌性だけでなく殺菌性でもあったことを示すため、プランクトン様の黄色ブドウ球菌を４時間基材と一緒にインキュベートして、次いで、生き残った微生物を計数する死アッセイを実施した。ＧＭ添加ＤＭに暴露した微生物はかなり殺菌を示したが、全ての他のコーティングはそのままのＰＣと統計的に同様な生存率であった（図１０Ｅ）。一緒に、これらの実験は、ＤＭ膜のみが黄色ブドウ球菌を阻害および殺菌するのに充分なＧＭを添加および放出することが可能であることを示しており、ＤＭのカルボン酸基の存在に相関すると思われるＰＤＡに勝るＤＭの有意な利点を例証した。
【００８４】
結論として、本発明者らは、弱アルカリの水性条件下、ＤＯＰＡを厚い粘着性ＤＭ膜に重合するための高イオン強度を活用する容易な基材汎用性表面改質技術を開発した。浸漬コーティングによるＤＭ膜の自然成膜は以前に使用されてきたＤＭコーティング方法と比較して顕著に簡便であり、ＤＭ膜を支持することができる基材の範囲および構成を拡張できる。より広範に研究されてきたＰＤＡ膜と比較して、ＤＭ膜は改良された濡れ性を示し、カチオン性ゲスト分子を添加できる。ＤＭ膜からＧＭを担持および放出して黄色ブドウ球菌を殺すことを示すことにより、これを例示したが、多種多様な他のカチオン性アミノグリコシドで作用すると予見されるだろう。ＤＭ膜の形成の容易さおよび可逆的カチオン結合特性は、面の微生物コロニー化を防止するためにカテコールアミンコーティングの新規な応用をもたらす可能性がある。
【００８５】
実験
ＤＯＰＡおよびドーパミン重合：Ｌ−ＤＯＰＡ（１０ｍＭ）を先ずＨ２Ｏに溶解し、それから、２Ｘ緩衝液（１０ｍＭビシン、ｐＨ８．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて同体積中に混合した。ドーパミンＨＣｌ（５ｍＭ）を緩衝液Ａに直接溶解した。２４ウェルプレート中に基材を入れて、所望の時間、ＤＯＰＡまたはドーパミン溶液中に浸漬した後、Ｈ２Ｏで徹底的に洗浄してＮ２でブロー乾燥した。ＰＣ試料を、表を下にして表面張力により浮かせた。
【００８６】
ＧＭ担持および放出：ＰＤＡまたはＤＭでコーティングした基材を５ｍｇ／ｍＬのＧＭのＨ２Ｏ溶液に一夜（１６時間）暴露した後、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎ２でブロー乾燥した。１ｍｌのＤＭＥＭを含む２４ウェルプレート中にＧＭ担持基材を入れた。放出溶液中のＧＭ濃度をＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、テキサス州）を用いて測定した。
【００８７】
特性決定：４００〜１０００ｎｍの波長を用いた複数の入射角においてＥＳＭ−３００分光エリプソメーター（Ｊ．Ａ．Ｗｏｏｌｌａｍ、ネブラスカ州リンカーン）を用いて全膜の厚さを測定した。ＰＤＡおよびＤＭ層を、初期固定計数（Ａｎ＝１．４５、Ｂｎ＝０．０１）を用いてＣａｕｃｈｙモデルの屈折率および厚さにフィットした。日立ＳＵ８０３０を用いて１０ｋＶで、５ｎｍ  Ｏｓコーティングした試料をＳＥＭ観察した。
【００８８】
微生物阻害および死アッセイ：ＰＣ基材をＤＭ（約９０ｎｍ）またはＰＤＡ（約８０ｎｍ）で２０時間２回コーティングし、それから、上記の様にＧＭを添加した。黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）をトリプシンダイズ液体培地（３０ｇ／Ｌ）中一夜展開し、生理食塩水洗浄液と一緒に５分間４０００ｒｃｆで２回遠心分離した。Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒアッセイのため、微生物を１５０ｍＭ生理食塩水中の１０８ＣＦＵ／ｍＬに再懸濁し、その１００μＬを４ｍｍ厚カチオン調整ミューラー・ヒントン（ＣＡＭＨ）寒天上に広げた。インキュベーション（１８時間、３５℃）のため、試験試料（１２ｍｍ径円形ＰＣ）を寒天上に置いた後、阻止帯を測定した。ＧＭディスク（１０μｇ  ＧＭ、６ｍｍ径、ＢＤ、ＮＪ）をポジティブコントロール用に使用した。死アッセイのため、１０％仔ウシ血清（ＡＴＣＣ）を含有するＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中の１０７ＣＦＵ／ｍＬで、微生物を再懸濁し、その１００μＬを２４ウェルプレート中の各基材に暴露した。ポジティブコントロールは、５０μｇ／ｍＬのＧＭを含む同じ微生物溶液であった。４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、ウェルプレートを２分間、超音波処理して、いかなる接着した微生物を放出し、該微生物溶液を連続的に希釈し、ＣＡＭＨ寒天上に置いた。２４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、計数を行った。
【００８９】
別段の断りがない限り、全試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＨ２Ｏを精製した（≧１８ＭΩ）。熱蒸着（Ｌｅｓｋｅｒ  Ｎａｎｏ−３８）によりＡｕ、または電子ビーム蒸着（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ａｕｔｏ５００）によるＴｉＯ２で、Ｓｉウエハーをコーティングした。ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ社（イリノイ州エルムハースト）からＰＣ（Ｍａｋｒｏｌｏｎ  ＧＰ）基材を購入した。全基材を１ｘ１ｃｍに切断して、次いで、５％Ｃｏｎｔｒａｄ−７０、Ｈ２ＯおよびＩＰＡ中１０分間の超音波処理により洗浄した。
【００９０】
Ｃ（１ｓ）ピーク（２８４．６ｅＶ）を用いて補正したスペクトルを用いてＥＳＣＡＬａｂ２５０Ｘｉ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でＸＰＳを行った。ＺｎＳｅ  ＡＴＲ結晶を装備したＴｈｅｒｍｏ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｎｅｘｕｓ８７０を用いて、ＡＴＲ−ＦＴＩＲデータを収集した。ノースウェスタン大学のＮｕａｎｃｅ  Ｋｅｃｋ−ＩＩ施設において、ＸＰＳおよびＡＴＲ−ＦＴＩＲ分析を行った。
【００９１】
実施例２：有害重金属除去用ＤＨＩＣＡリッチＤＯＰＡ−メラニン粒子の高イオン強度形成
この実施例では、高イオン強度緩衝液を用いて不溶性ＤＭ粒子の形成を調査し、それらを重金属結合に適用して、ＡＣ、ＰＤＡ粒子およびメラニンの他の形態とのその結合能力を比較する。重合溶液に使用する塩の種類および濃度が重金属と結合するＤＭの能力と相関するＤＭのＤＨＩサブユニットに対するＤＨＩＣＡの比に対する有意な効果を有することを示す。
【００９２】
開発途上国および先進国両方の飲料水の重金属汚染は主要な関心事である。特に、鉛汚染は子供および生まれる前の胎児に対するその有毒作用のせいで深刻な問題である。ユーメラニン、広範に分布する生物色素は重金属イオンとのその高結合親和性で有名である。しかしながら、合成ユーメラニンは、１つには溶解性があることが原因で、重金属イオン用薬剤として利用されてこなかった。この実施例では、高イオン強度アルカリ性緩衝液がＤＯＰＡを自己酸化するために使用でき、その結果、高ＤＨＩＣＡ含有率を有するＤＯＰＡ−メラニンの不溶性粒子が形成することを示す。次いで、本発明者らは、メラニンのＤＨＩＣＡ含有率がＰｂ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）およびＨｇ（ＩＩ）の結合能と相関があることを示す。特に、ＭｇＣｌ２アルカリ性緩衝液を用いて形成されたＤＯＰＡ−メラニンは、天然セピアメラニンより指定の重金属イオンに対する高結合能を有することが分かった。これらの発見は、高イオン強度で形成された合成ＤＯＰＡ−メラニンが重金属改善のための使用に優れた物質であり得ることを示す。
【００９３】
世界中の何百万人の人々は、それが基本的人権であるにもかかわらず、飲料水を浄化する手段を有しない（１）。規制が不充分な発展途上国では、鉛、カドミウムおよび水銀などの重金属を含有する産業廃棄物が水道を汚染し続けている（２）。先進国でさえ、鉛製パイプ管の使用を継続し、時々、水道水中の危険な鉛レベルの原因となり得る（３）。血中の低レベルの鉛でさえ、子供の知的発達に有害作用を有し（４）、長期暴露は筋振戦および筋力低下、高血圧、神経行動障害、および腎疾患などの様々な健康問題に関連する（５、６）。最近のワシントンＤ．Ｃ．の水道水中の鉛汚染は、現地子供の血中危険な鉛レベルの結果であった（７）が、胎児死亡の増加とも関連していた（８）。
【００９４】
メラニンは、動物および植物内に広範に分布する色の濃い色素であり、光防護、抗酸化、および金属結合などの多種多様な機能を果たす（９）。メラニンの主要な分類はユーメラニン、フェオメラニン、およびニューロメラニンである。ユーメラニンは５，６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）サブユニットおよび５，６−ジヒドロキシインドールカルボン酸（ＤＨＩＣＡ）サブユニットからなる黒色または褐色ポリマーであり、ヒトの皮膚、髪および眼内に見られる主要な色素である。生物メラニン形成では、チロシンがチロシナーゼによりドーパキノンに酸化されて、次いで、ドーパクロムに環化および転換され、これは、ＤＨＩに自然に脱カルボン酸化するか、あるいはドーパクロムトートメラーゼによりＤＨＩＣＡに酵素的に転位する。それからＤＨＩおよびＤＨＩＣＡは、さらに酸化重合および凝集が起こり、ユーメラニンを形成する（１０）。フェオメラニン、赤い髪にその色を与える黄色または赤色色素は、ベンゾチアジンサブユニットおよびベンゾチアゾールサブユニットからなる。フェオメラニン形成はドーパキノンの後、ユーメラニン形成から分岐して、システインとの反応を含み、フェオメラニンのサブユニットを形成するさらなる反応を起こすシステイニルドーパを形成する（１０）。ニューロメラニンは黒質内で見られ、酵素活性の代わりに自己酸化によりドーパミンから形成するユーメラニンと異なり、それ故、ＤＨＩＣＡサブユニットの代わりに大部分はＤＨＩを含有するだろう（１１）。
【００９５】
メラニン類は、いくつかの金属用キレート剤ＥＤＴＡより高くさえある高親和性を有する重金属イオンとのその結合能で有名である（１２〜１４）。特に、ニューロメラニンは、重金属のキレートにより神経保護の役割を果たすと仮定されてきた（１５、１６）。事実、ニューロメラニン欠乏はパーキンソン病と関連していた（１１）。アルカリ性ｐＨにおけるドーパミンの自己酸化により形成されたドーパミンメラニンはニューロメラニンの合成モデルとして使用されてきた（１７、１８）。本発明者らは、ドーパミンメラニンが、ドーパミンのアルカリ性水溶液中に単純にディップ塗布により実質的にいずれもの基材上にコンフォーマルコーティングとしても形成することを最近見出した（１９）。このコーティングはポリドーパミン（ＰＤＡ）として広く知られるようになり、多種多様な分野の無数の応用に有用であることが示されてきた（１９）。ＰＤＡの１つの応用は重金属改善である。ＰＤＡコーティングしたガラスビーズは、重金属除去のための工業的標準である活性炭（ＡＣ）の数倍の能力で重金属と結合することが分かった（２０）。ＰＤＡ粒子およびＰＤＡ官能化グラフェンハイドロゲルも、同じ目的のため使用されてきた（２１、２２）。
【００９６】
ＰＤＡはドーパミンから形成されるので、主にＤＨＩを含み、出発分子がＤＯＰＡである場合にのみ形成できるＤＨＩＣＡを欠く（２３）。ＰＤＡは、ＤＨＩサブユニットのカテコールおよびアミンにより重金属と結合すると考えられている（２０）。対照的に、ＤＯＰＡから形成された合成メラニンはＤＨＩサブユニットおよびＤＨＩＣＡサブユニットの両方を含む（図１２）。ＤＨＩＣＡはＤＨＩと比較して付加的カルボン酸を含むので、合成ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭポリマー）は増強した能力および親和性で重金属と結合すると期待するだろう。しかしながら、重金属改善にＤＭの使用についてほとんど報告がなく、これは、アルカリ性緩衝液中のＤＯＰＡの自己酸化により形成されたＤＭはｐＨ３以上で可溶なままである事実に起因すると考えている（１７、２４）。比較として、同じ緩衝液中で形成されたＰＤＡは容易に沈殿し、それ故、重金属結合後物理的分離しやすい（１７）。加えて、ＤＭは、特に金属酸化物の様な負電荷基材上に、ＰＤＡの様なコーティングを形成しない（２５）。本発明者らは、これは、重合および／または凝集を限定する形成中のＤＨＩＣＡのカルボキシルの負電荷の反撥に起因すると仮定したが、高イオン強度の使用により、静電結合によるカチオン性薬物を結合および放出もできる様々な基材上でのＤＭ膜形成を可能とするように電荷を選別できる（上記実施例１参照）。
【００９７】
材料
Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ（バージニア州クリスチャンズバーグ）からＰｂ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）およびＨｇ（ＩＩ）の１０，０００ｐｐｍ溶液を購入した。Ｌ−ＤＯＰＡ、ドーパミンＨＣｌ、および使用される全ての他の化学品をＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００９８】
メラニン類の合成
ＤＯＰＡまたはドーパミン（１０ｍＭ）を緩衝液（２０ｍＭビシン、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に溶解した。通気するため振盪しながら開放びん中、室温で一夜（２０時間）、溶液を反応させた。それから、５分間４５００ｒｃｆで溶液を遠心分離し、上澄みをデカントして、Ｈ２Ｏ中にペレットを再懸濁した。上澄みが透明になるまで、この洗浄工程を約１０分繰り返した。それから、Ｈ２Ｏ  ５ｍＬ中にペレットを再懸濁し、液体窒素で凍結し、３日間凍結乾燥し、１日間大気水分と平衡にした。塩の添加後、８．５に調節したｐＨで、１２５〜１０００ｍＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、あるいはＣａＣｌ２を含有するビシン緩衝液中でＤＭも形成した。
【００９９】
アルカリ性過酸化物分解アッセイ
メラニンを、少し変更を加えて確立したプロトコール（２６）を用いて分解した。簡単に言えば、メラニン０．１ｍｇをＨ２Ｏ  １００μＬに懸濁し、１ＭのＫ２ＣＯ２  ３７５μＬおよび３０％Ｈ２Ｏ２  ２５μＬを混合して、室温で２０時間振盪した。その後、残ったＨ２Ｏ２を１０％Ｎａ２ＳＯ３  ５０μＬの添加により分解し、混合物を６Ｍ  ＨＣｌ  １４０μＬで酸性にした。試料８０μＬを流速０．７ｍＬ／分、５０℃でＣ１８カラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣ分析し、２６９ｎｍにおける吸収をモニターして定量化のため使用した。様々な濃度のＰＴＣＡおよびＰＤＣＡ溶液を補正用に使用した。
【０１００】
金属イオン結合
全金属イオン溶液を１０，０００ｐｐｍ原液からその所望の濃度まで調製し、Ｐｂ、ＣｕおよびＣｄについてはｐＨを４．８に、ＨｇについてはｐＨを３．６に調節した。各試料５ｍｇを、１５ｍＬ金属フリー遠心分離チューブ中で金属イオン溶液１０ｍＬと混合した。室温においてロッカー上で３時間の平衡の後、チューブを５分間４５００ｒｃｆで遠心分離した。それから、上澄みを、０．２２μｍフィルターを通過させて、その金属濃度が既知の希釈において誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて分析した。それから、メラニンと結合した金属を上澄みの金属濃度の減少から推量した。
【０１０１】
走査電子顕微鏡
ＰＤＡおよびＤＭ粒子をＨ２Ｏ中に懸濁し、１ｘ１ｃｍシリコンウエハー上に滴下して、乾燥させた。それから、試料を５ｎｍオスミウムでコーティングして、日立ＳＵ８０３０走査電子顕微鏡を用いて、１０ｋＶで画像を得た。
【０１０２】
ＰＤＡおよびＤＭ合成
ｐＨ８．５ビシン緩衝液（２０ｍＭ）中にドーパミン（１０ｍＭ）を溶解して２０時間撹拌することにより、ＰＤＡ粒子を合成した。形成されたＰＤＡ粒子を遠心分離で容易に集め、Ｈ２Ｏ洗浄液に安定であった。対照的に、ＤＯＰＡから同じ緩衝液中でＤＭ粒子の合成を試みる場合、形成されたＤＭは可溶性のままであり、遠心分離できなかった。Ｃｈｉｏらは、この観察について以前に記載していたが、形成後のＤＭを沈殿させるために、ｐＨを３未満に低下（カルボキシルをプロトン化するため）または塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの塩の使用が必要であることに注目した（２４）。しかしながら、本発明者らは、形成後に酸性化または塩を用いて沈殿させたＤＭは、純粋Ｈ２Ｏに懸濁した場合溶解するＤＭ粒子を得ることを見出した。
【０１０３】
形成後のＤＭを沈殿させるためのみに塩を使用する代わりに、ＤＭ形成中の緩衝液中に塩を存在させる影響を調査した。様々な濃度のＮａＣｌで、一夜（２０時間）ｐＨ８．５緩衝液中、ＤＯＰＡを自己酸化させて、溶液を、光学顕微鏡を用いて観察した。図１３に示すように、溶液は次第に色が濃くなったが、１２５ｍＭまでのＮａＣｌを含有する緩衝液中で粒子の形成は見られなかった。２５０ｍＭのＮａＣｌに始まり、微粒子が見られ、５００ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌで、大きな粒子が沈殿した。５００〜１０００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で形成されたＤＭを遠心分離により集めることができ、酸性化する必要なく、純粋Ｈ２Ｏで洗浄した。このことは、ＤＭ形成中に塩を存在させることがその重合または凝集を増加させ、おそらく、ＤＨＩＣＡの静電反撥力の低下により、大きな粒子をもたらしたことを示唆している。
【０１０４】
走査電子顕微鏡は、ＰＤＡ粒子が約５μｍ径であり、約５００ｎｍ径の微粒子から融合したと思われることを明らかにした。ＤＭ粒子はずっとより大きく、直径で４０μｍと測定され、その表面上にサブミクロンの形態も含まれていた（図１４）。
【０１０５】
ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比
本発明者らは、Ｎａ＋カチオンが、形成中のＤＨＩＣＡの負電荷カルボキシルをシールドし、静電反発力を低下させて、それ故、重合を増加させることで、ＤＨＩＣＡの取込みの増加に伴い大きなＤＭ粒子をもたらすと仮定した。これを調査するため、アルカリ性過酸化物分解アッセイを用いて、ＰＤＡおよびＤＭを、それぞれ、ＤＨＩＣＡおよびＤＨＩの分解した生成物であるＰＴＣＡおよびＰＤＣＡに分解した。それから、図１５に示すように、これらの生成物をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて定量化し、ＤＨＩＣＡ／ＤＨＩの比を示すことができるＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を得た（２７）。比較のため、ＰＤＡ、およびメラニンの２種類の市販の形態であるチロシンの過酸化物酸化により合成される合成メラニン（ＳＭ）、およびイカ（Sepia officinalis）から単離されたコウイカメラニン（ＣＭ）に対してもアッセイを実施した。
【０１０６】
ＰＤＡのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比は最低０．４２６±０．０２であり、これは、ＤＨＩＣＡがＰＤＡ中で形成しない場合に期待される。しかしながら、ＰＤＡからまだ測定可能なレベルのＰＴＣＡがあるが、これは、２つの位置によりその隣と共役したＤＨＩサブユニットに起因すると思われた（２３）。対照的に、５００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて合成したＤＭは、ＰＤＡより有意に高い１．９６±０．１９のＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を有した。この結果、ＰＤＡと対照的に、ＤＭがＦＴＩＲにより測定したようにカルボン酸を含んでいることを本発明者らが見出したことと一致する（実施例１参照）。ＤＭのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比も、０．５３３±０．０１のＳＭより有意に高く、このことは、ＮａＣｌアルカリ性緩衝液を用いたメラニン形成方法が、市販ＳＭの形成に使用されている方法であるチロシンの過酸化物酸化と比較してより高いＤＨＩＣＡ含有率をもたらすことを示している。ＣＭが２３．３±０．９のずっとより高い比を有することも本発明者らのアッセイは示したが、これは文献で見られる値と一致する（２８）。このことは、酵素なしで形成された合成メラニンがドーパクロムの自然脱カルボン酸のせいで約１０％のＤＨＩＣＡしか含有しないが、ドーパクロムをＤＨＩＣＡに転位するドーパクロムトートメラーゼの酵素作用によって、天然メラニンが約５０％のＤＨＩＣＡを含有することは公知なので驚くべきことではなかった（２９）。
【０１０７】
メラニンのＤＨＩＣＡ含有率増加
本発明者らが合成するメラニンのＤＨＩＣＡ含有率を増加させるために、ＤＭ形成中、ｐＨ８．５緩衝液中の様々な濃度の種々の一価および二価塩の使用、例えば、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａの塩化物について探求した。各塩のため、１２５、２５０、５００および１０００ｍＭを使用してＤＭを形成し、ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比に対する種類および濃度の両方の影響について測定した。本発明者らは、少なくとも５００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌが酸性化なしで不溶性ＤＭを形成するために必要であるが、同じことをするのに必要なＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２は１２５ｍＭのみであることを観察した。図１６Ａに示すように、アルカリ性過酸化物分解アッセイを用いて、より高濃度の塩が緩衝液中に存在する場合、形成されたＤＭのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比の増加傾向を見出した。結果として、二価塩の使用は、一価塩を使用する場合より有意に高いＤＭのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を得た。このことは、ＤＭ形成中の緩衝液中のイオン強度が、形成されたＤＭのＤＨＩＣＡ／ＤＨＩ比に影響を与える重要な役割を果たすことを示唆している。Ｋに対するＮａおよびＣａに対するＭｇを比較する場合、より小さいイオン半径を有する金属の使用は、結果として、より高いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を得た。これは、電荷遮蔽のより強い効果を有するより高い電荷密度を有する金属イオンに起因し得る。本発明者らの合成メラニンの中で達成した最も高いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比は、２３．３のＣＭの比にほとんど匹敵する２０．３である１０００ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて形成されたＤＭであった。
【０１０８】
それから、本発明者らは、鉛結合アッセイで４種の異なる塩を用いて形成されたＤＭを使用して、形成されたＤＭの鉛結合能に対する該塩の効果を測定した。該アッセイでは、試料をＰｂ（ＩＩ）溶液１ｍＭと３時間混合し、遠心分離して、Ｐｂ濃度の変化についてＩＣＰ−ＭＳを用いて上澄みを分析した。図１６Ｂに示すように、ＤＭのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比と同じ順（Ｍｇ＞Ｃａ＞Ｎａ≒Ｋ）に従ったＤＭと結合したＰｂ量を見出し、ＤＨＩＣＡの増加は金属結合の増加をもたらすことを示した。
【０１０９】
重金属結合
本発明者らは、本明細書で、それぞれ、ＤＭ（Ｎａ）およびＤＭ（Ｍｇ）と呼ぶ、５００ｍＭ  ＮａＣｌあるいは５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭビシンｐＨ８．５緩衝液中で形成されたＤＭを用いて、金属結合試験を継続した。両方のＤＭを、鉛、銅、カドミウムおよび水銀に対する結合能について活性炭（ＡＣ）、ＰＤＡ、ＳＭおよびＣＭと比較した。
【０１１０】
図１７Ａに示すように、Ｃｕ（ＩＩ）結合能は、ＤＭ（Ｍｇ）＞ＣＭ＞ＤＭ（Ｎａ）＞ＳＭ＞ＰＤＡの順であった。この順番は、低いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を有するが、ＣＭより高いＣｕ（ＩＩ）結合能を有するＤＭ（Ｍｇ）を除いて、そのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比の順番と対応していた。最良の性能を発揮する物質は、１２４．３ｍｇ／ｇの結合能を達成し、９５．６％の利用可能なＣｕ（ＩＩ）と結合するＤＭ（Ｍｇ）であった。ＣＭは、９９．５ｍｇ／ｇの結合能と同等であり、７６．５％の利用可能なＣｕ（ＩＩ）と結合しており、僅差で２番目となった。Ｈｏｎｇらによる研究により、新鮮なセピアメラニンは、本発明者ら自身のものに近い７０ｍｇ／ｇまでのＣｕ（ＩＩ）と結合することが見出された（３０）。同じ研究で、メラニン中のＣｕ（ＩＩ）結合部位はカルボキシルの代わりにカテコール基であることが示唆された。しかしながら、ＦｒｏｎｃｉｓｚとＳａｒｎａは、より早期に、電子常磁性共鳴分光法を使用して、ｐＨが６未満の場合、Ｃｕ（ＩＩ）がカルボキシル上でメラニンと結合することを示唆した（３１、３２）。ＨｏｎｇとＳｉｍｏｎは、後に、ＣＵ（ＩＩ）は先ずカテコール部位と結合して、それから、より高濃度のＣＵ（ＩＩ）においてカルボキシルで結合すると結論した（３３）。本発明者らの結果は、より高含有率のＤＨＩＣＡを有するメラニンはＣｕ（ＩＩ）との結合を増加したことを示しており、カルボキシル基がｐＨ４．８においてＣｕ（ＩＩ）結合に関与することを支持している。
【０１１１】
Ｐｂ（ＩＩ）結合については、ＰＤＡは、ＡＣの約７倍のＰｂ（ＩＩ）と結合し、前の試験と一致していた（図１７Ｂ）（２０）。ＤＨＩＣＡ含有メラニンは全て、ＤＭ（Ｍｇ）＞ＣＭ＞ＤＭ（Ｎａ）＞ＳＭの順で、ＰＤＡより有意に高いＰｂ（ＩＩ）結合能を有した。Ｃｕ（ＩＩ）結合の類似の定性的傾向のために、Ｐｂ（ＩＩ）が先ずカテコールと同様に結合して、それから、より高濃度でカルボキシルと結合すると推測している。ＤＭ（Ｍｇ）は、４１２．４ｍｇ／ｇの結合能と同等であり、全利用可能なＰｂ（ＩＩ）の９９％以上を除去したことは注目すべきである。
【０１１２】
ＤＭ（Ｍｇ）が、より低いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を有するにもかかわらずＣＭより多い金属イオンと結合できるという本発明者らの結果で今までに観察した傾向の原因は、因子の組合せにあり得る。第一に、使用したＣＭは金属イオンと有意に結合しない約５〜７％のマトリックスタンパク質からなるメラニン顆粒である（１３）。第二の可能性ある因子は、ＤＭ（Ｍｇ）中の残基の未酸化ＤＯＰＡが溶液の金属イオンを減少していることであり得る。
【０１１３】
Ｃｄ（ＩＩ）結合については、ＤＨＩＣＡ含有メラニンは、ＰＤＡと比較して、少なくとも８倍の結合能を有した（図１７Ｃ）。この大きな差は、カテコールよりＤＨＩＣＡのカルボキシル上に多く結合するＣｄ（ＩＩ）に起因し得る。Ｃｈｅｎらの研究により、イカメラニンとのＣｄ（ＩＩ）の結合はＰｂ（ＩＩ）との比較よりもっとマクロソルト（macrosalts）との競合により減少することを見出され、カルボキシルへの静電引力がＣｄ（ＩＩ）結合に対してより優占することを支持した（１４）。
【０１１４】
Ｈｇ（ＩＩ）結合については、ＤＭ（Ｍｇ）およびＣＭは、全利用可能なＨｇ（ＩＩ）の約９９％を除去し、同様に良好に性能を発揮した（図１７Ｄ）。ＰＤＡおよびＳＭは、それぞれ、利用可能なＨｇ（ＩＩ）の８０％および８８％を除去した。ＰＤＡおよびＤＨＩＣＡ含有メラニンのＨｇ（ＩＩ）結合能間の対比は前の３つの金属イオンの場合よりずっと小さかった。しかしながら、ＤＭ（Ｎａ）、ＤＭ（Ｍｇ）およびＣＭはさらに、ＡＣと比較して、ほとんど７倍のＨｇ（ＩＩ）を除去した。このことは、カテコール結合部位がカルボキシルよりずっと多くＨｇ（ＩＩ）の良好なキレート剤であることを示唆している。
【０１１５】
Ｐｂ（ＩＩ）結合親和性および接触時間効果
本発明者らは、等温線を決定するために０．２ｍＭ〜２ｍＭの範囲の様々な開始濃度における本発明の試料とＰｂ（ＩＩ）との結合についてさらに調査した（図１８）。メラニンと金属イオンとの結合は、１つタイプの結合部位より多くの部位において起こり、表面吸着現象ではないことが分かっており、それ故、ラングミュア吸着式の仮定に合わないことに注目している。しかしながら、現在の文献はメラニンと金属イオンとの凝集結合親和性および能力を表すためにラングミュア吸着モデルを使用してきた（３４、３５）が、このように、本発明者らは、比較する目的で同じことを行った。表４に示すように、本発明の試料の結合親和性および最大能力の両方は、同じ順、ＤＭ（Ｍｇ）＞ＣＭ＞ＤＭ（Ｎａ）＞ＳＭ＞ＰＤＡ＞ＡＣに従った。ＤＭ（Ｍｇ）の最大Ｐｂ（ＩＩ）結合能は、４０５ｍＭ−１の結合親和性を有し、４２０．７ｍｇ／ｇである。比較として、ＡＣは、１９．２ｍｇ／ｇの結合能および３．５ｍＭ−１の結合親和性を有することが分かった。
【０１１６】
【表４】
2017512893.tif 000010
【０１１７】
Ｄｅｍｉｒｂａｓらにより、市販スルホン酸イオン交換樹脂は、８４ｍｇ／ｇのＰｂ（ＩＩ）結合能および１２．３ｍＭ−１の結合親和性を有することが見出された（３６）。Ｓｏｎｏらは、ＤＯＰＡのチロシナーゼ酸化によりＰＶＤＦ上にコーティングした合成ユーメラニンが９２ｍｇ／ｇのＰｂ（ＩＩ）結合能および１７．４ｍＭ−１の結合親和性を有すると決定した（３４）。本発明者らは、差が１つには異なる方法に起因し得ると認識しているが、本発明のＤＭ粒子のずっとより高い結合能および親和性は、高イオン強度緩衝液中の形成が原因によるその高いＤＨＩＣＡ含有率に起因し得る。
【０１１８】
Ｐｂ（ＩＩ）結合の接触時間の依存性を、異なる時間において、メラニンと混合した１ｍＭのＰｂ（ＩＩ）のサンプリングにより決定した。図１９に示すように、ＤＭ（Ｍｇ）、ＤＭ（Ｎａ）およびＣＭは、１０分以内にその最大吸着に達することを見出し、これは、最初の時点であった。ＳＭでは、結合は約２４０分まで増加したが、ＰＤＡは６０分においてその結合ピークに達した。ＤＭ粒子によるＰｂ（ＩＩ）の速い結合により、ＤＭ粒子はインライン浄水用物質として好適となる。
【０１１９】
表面積
ＡＣの重金属の吸着能力は、その高表面積による。表５に示すように、本発明の試料の表面積を決定するために、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）表面分析を使用した。ＡＣは、７９２．２ｍ２／ｇの表面積を有すると分かった。比較として、本発明者らの試験の全メラニンは、８ｍ２／ｇ未満の表面積を有すると分かったが、多孔性でないと考えることができる。ＤＭ（Ｎａ）およびＤＭ（Ｍｇ）の両方は、他のメラニンより著しく低い表面積を有し、これは、その大きな粒子径による可能性がある。ＢＥＴ表面積分析およびバレット・ジョイナー・ハレンダ（ＢＪＨ）細孔容積分析を用いて、ＬｉｕとＳｉｍｏｎも、セピアメラニンが非多孔性物質であると決定し（３７）、このことは、本発明者らが見出したことと一致する。ＤＭおよびＣＭの高結合能を考慮して、金属結合は、メラニン粒子の表面だけでなく、金属イオンの内部拡散により物質内至る所で起こると思われる。Ｌｉｕらも、セピアメラニン中のイオン拡散チャネルの存在を仮定した（１３）。
【０１２０】
【表５】
2017512893.tif 000011
【０１２１】
収率
１ｇのスケールでＰＤＡおよびＤＭ形成の収率を、１日間大気水分との平衡後（平衡収率）、３日間の凍結乾燥後（乾燥収率）算出した。予想含水率と共に結果を表６に示す。
【０１２２】
【表６】
2017512893.tif 000012
【０１２３】
結論
結論として、本発明者らは、高イオン強度においてアルカリ性緩衝液を用いて、高ＤＨＩＣＡ含有率を有するＤＭ粒子を合成した。ＤＨＩＣＡ含有率の増加と共に、メラニンは、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、およびＨｇ（ＩＩ）などの重金属に対してより高い結合能を有することを示した。ＤＭ粒子は、Ｐｂ（ＩＩ）に対する高結合親和性および速い結合を有すると分かった。まとめると、この試験は、高ＤＨＩＣＡ合成メラニンは、有毒重金属の除去の用途に有望であり得ることを示している。天然ユーメラニンに近いＤＨＩＣＡ／ＤＨＩ比でメラニンを自己酸化するための高イオン強度緩衝液の使用も、ユーメラニンの合成モデルを使用している研究者にとって関心深いものであり得る。
【０１２４】
実施例３．重金属捕捉のためのＤＨＩＣＡリッチＤＯＰＡ−メラニンの簡易合成
この実施例では、高イオン強度緩衝液を用いて不溶性ＤＭ粒子の形成を調査し、それらを重金属捕捉に適用して、ＡＣ、ＰＤＡ粒子およびメラニンの他の形態とのその捕捉能力を比較する。重合溶液に使用する塩の種類および濃度が重金属と結合するＤＭの能力と同様に相関するＤＭのＤＨＩサブユニットに対するＤＨＩＣＡの比に対する有意な効果を有することを示す。
【０１２５】
水から高濃度の重金属を除去する通常の方法としては、化学沈殿、膜濾過、イオン交換樹脂、酸化還元および溶媒抽出が挙げられる［９］。しかしながら、これらの方法は、しばしば、厳しい規制上の要件未満の重金属濃度に低減するのに不充分である［１０］。微量の重金属イオンの除去のため、活性炭、キトサン、ゼオライトおよび粘土などの吸着系技術は広く探求されてきた［１１］。残念ながら、これらの吸着剤の多くは、重金属イオンに対して比較的低結合能および弱結合親和性に悩まされる［１２］。現存の吸着剤の化学修飾により能力および親和性の両方を増強する試みがいくつか進展してきたが［１２〜１５］、代替の吸着剤の開発が望まれている。
【０１２６】
ＰＤＡの正確な化学構造は、これから完全に解明されなければならないが、主にＤＨＩを含み［３５］、一方、ＤＯＰＡから形成された合成メラニンはＤＨＩおよびＤＨＩＣＡサブユニットの両方を含むことが分かっている（図２７）。ＤＨＩＣＡは第二の金属結合部位として作用できるカルボン酸を含むので、合成ＤＯＰＡ−メラニン（ＤＭ）は、ＰＤＡと比較して、能力および親和性が増強して重金属と結合すると期待するだろう。しかしながら、合成ＤＭは、天然ユーメラニンで見られる５０％と比較して、約１０％のみのＤＨＩＣＡを含有することが分かった［３６］。今までに、重金属改善での合成ＤＭの使用はほとんど報告されていないが、本発明者らは、これは、一つには、アルカリ性緩衝液中でのＤＯＰＡの自己酸化により形成されたＤＭが約ｐＨ３以上で可溶性のままであるという事実によるものであると考えている［２４、３７］。
【０１２７】
比較として、同じ緩衝液中で形成されたＰＤＡは容易に沈殿し、それ故、重金属結合後に物理的に分離し易い［２４］。加えて、ＤＭの自己酸化は、特に、金属酸化物の様な負電荷基材上において、ＰＤＡの様に容易にコーティングを形成しない［３８］。これは、形成、限定的重合および／または凝集中のＤＨＩＣＡのカルボキシルの負電荷の反発力によると仮定して、本発明者らは、最近、高イオン強度緩衝液の使用により、様々な基材上でＤＭ膜を形成でき、静電結合によりカチオン性薬物の結合および放出可能となることを示した［３９］。
【０１２８】
材料および方法
Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ（バージニア州クリスチャンズバーグ）からＰｂ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）およびＨｇ（ＩＩ）の１０，０００ｐｐｍ標準溶液を購入した。ドーパミンＨＣｌ、ｌ−ＤＯＰＡ、コウイカメラニン（ＣＭ、カタログ番号Ｍ２６４９）、合成メラニン（ＳＭ、カタログ番号Ｍ８６３１）、および使用した全ての他の化学品をＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。全てのＨ２Ｏを、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｃｏｒｐ．（アイオワ州ダビューク）のＮＡＮＯｐｕｒｅ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、抵抗率≧１８．２ＭΩ−ｃｍまで精製した。ＰＤＣＡおよびＰＴＣＡは、Ｋａｚｕｍａｓａ  Ｗａｋａｍａｔｓｕ博士から快く提供してもらった。
【０１２９】
メラニン類の合成
ＰＤＡを、室温で２０時間、ロッカー上に置いた開放びん内のビシン緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）中でのドーパミンＨＣｌ（１０ｍＭ）の自己酸化により形成した。それから、５分間４５００ｒｃｆで溶液を遠心分離し、上澄みをデカントして、Ｈ２Ｏ中にペレットを再懸濁した。上澄みが透明になるまで、この洗浄工程を１０分繰り返した。それから、ペレットを５ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁し、凍結乾燥して、使用前デシケーター内に貯蔵した。ｌ−ＤＯＰＡ（１０ｍＭ）を、０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２あるいはＣａＣｌ２のいずれかを含有するビシン緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）中に溶解したこと以外、同様な方法でＤＭを合成した。ＤＭの洗浄および単離を上記のように行った。
【０１３０】
アルカリ性過酸化物分解アッセイ
天然および合成メラニンのＤＨＩおよびＤＨＩＣＡ含有率を、少しの変更を加えて、確率したプロトコール［４０］を用いて確認した。簡単に言えば、メラニン０．１ｍｇをＨ２Ｏ  １００μＬ中に懸濁し、１ＭのＫ２ＣＯ２の３７５μＬおよび３０％Ｈ２Ｏ２の２５μＬと混合して、室温で２０時間振盪した。次いで、残ったＨ２Ｏ２を、１０％Ｎａ２ＳＯ３を５０μＬ加えて分解し、混合物を６ＭのＨＣｌの１４０μＬで酸性化した。この混合物８０μＬを、流速０．７ｍＬ／分で５０℃に保持した移動相０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．１）／メタノール、９８：２（ｖ／ｖ）を用いて、Ｃ１８カラムを使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、２６９ｎｍにおける吸収をモニターした。定量化のため、様々な濃度のＰＤＣＡおよびＰＴＣＡ標準溶液の試料から、標準曲線を決定し、本発明者らの条件下、それぞれ、７．７分および９．８分に溶離することが分かった（図２６）。
【０１３１】
金属イオン結合
全ての金属結合実験を、バッチ法を用いて行った。金属イオン溶液を、Ｈ２Ｏで、２ｍＭ（Ｐｂ、ＣｕおよびＣｄ）または４ｍＭ（Ｈｇ）まで、１０，０００ｐｐｍの原液を希釈して調製した。ＮＨ４ＯＨおよびＨＮＯ３を用いて、ｐＨを４．８（Ｐｂ、ＣｕおよびＣｄ）または３．６（Ｈｇ）に調節した。典型的な実験では、メラニン固体５ｍｇを、１５ｍＬ金属フリー遠心分離チューブ内の金属イオン溶液１０ｍＬと混合した。室温においてロッカー上で４時間の撹拌後、チューブを５分間１５，０００ｒｃｆで遠心分離した。それから、上澄みを単離し、金属含有率１０〜１００ｐｐｂの範囲内まで希釈し、次いで、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて分析した。結合した金属量を、次式を用いて、上澄みの金属イオン濃度の減少から推測した：
【０１３２】
【数１】
2017512893.tif 000013
【０１３３】
式中、ｑｅは吸着剤グラム当たりに結合した金属の質量であり、Ｃ０およびＣｅは溶液中の金属イオンに結合した初期および最終濃度であり、Ｖは体積、Ｗは吸着剤の質量である。
【０１３４】
走査電子顕微鏡
ＰＤＡおよびＤＭ粒子をＨ２Ｏに懸濁し、１ｘ１ｃｍシリコンウエハー上にピペットで滴下して乾燥させた。それから、試料を５ｎｍオスミウムでコーティングして、日立ＳＵ８０３０走査電子顕微鏡を用いて、１０ｋＶで画像を得た。
【０１３５】
光学顕微鏡
ＤＭ粒子を、様々な濃度のＮａＣｌを含有するｐＨ８．５ビシン緩衝液中の５ｍＭ  ＤＯＰＡから、上記の様に形成した。１６時間の形成後、各溶液１ｍＬをポリスチレン２４ウェルプレート中にピペットで滴下して、明視野光学顕微鏡を用いて画像を得た。
【０１３６】
ＰＤＡおよびＤＭ合成
ビシン緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）中のドーパミン溶液は、ＰＤＡが形成され沈殿し始めるにつれて、数時間にわたって色が濃くなった。１６時間後、ＰＤＡ粒子を、４５００ｒｃｆで遠心分離により容易に集めて、Ｈ２Ｏ中、耐溶解性があった。対照的に、この手法を用いてｌ−ＤＯＰＡから合成したＤＭは可溶なままであり、遠心分離により単離できなかった。Ｃｈｉｏらは、前に同様な観察を行ったが、ＤＭの合成および単離はｐＨ＜３に酸性化するか、あるいは塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの塩の添加を必要とすることを記述した［３７］。しかしながら、本発明者らの試みでは、この手法を用いて形成し単離したＤＭは、純粋なＨ２Ｏ中に懸濁した場合、再溶解した。
【０１３７】
水から有害金属を除去するために固体支持体として充分に機能するＤＭの不溶性形態を探求して、様々な濃度のＮａＣｌを含有するｐＨ８．５緩衝液中、１６時間、ＤＯＰＡを自己酸化させた。ＮａＣｌが２５０ｍＭ（この濃度を超えると沈殿物が光学顕微鏡により観察された）になるまで塩濃度を増加するにつれ、懸濁液は色が濃くなった（図２０）。５００〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌで形成されたＤＭ固体を、４５００ｒｃｆで遠心分離により単離でき、酸性化なしで、純粋Ｈ２Ｏで洗浄したが、高濃度のＮａＣｌの存在下自己酸化により形成されたＤＭは低塩濃度で形成されたものと物理化学的に異なっていたことを示唆している。本発明者らは、Ｎａ＋カチオンが、形成中のＤＨＩＣＡの負電荷カルボキシルをシールドし、静電反発力を低下させて、それ故、重合を増加させることで、大きなＤＭ粒子をもたらすと仮定した。他の塩の限定された調査は、不溶性ＤＭも、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１２５ｍＭ）またはＣａＣｌ２（１２５ｍＭ）を含有する緩衝液中で形成できることを示唆した。走査電子顕微鏡により、ＰＤＡおよびＤＭ粒子は様々なサイズであり、より小さなサブミクロン粒子の凝集物であることが明らかになった（図２１）。
【０１３８】
ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比に対するＤＭ合成条件の影響
メラニン固体のＤＨＩおよびＤＨＩＣＡ含有率を決定するため、メラニンのＤＨＩＣＡサブユニットおよびＤＨＩサブユニットが、それぞれ、ピロール−２，３，５−トリカルボン酸（ＰＴＣＡ）およびピロール−２，３−ジカルボン酸（ＰＤＣＡ）に分解する、アルカリ性過酸化物アッセイを行った。したがって、ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比をＤＨＩＣＡ／ＤＨＩ比の代理と見なされる［４１］。比較のため、本発明者らは、ＰＤＡ、チロシンの過酸化物酸化により合成される合成メラニン（ＳＭ）、およびイカ（Sepia officinalis）から単離されるコウイカメラニン（ＣＭ）に対してもアッセイを行った。アッセイは、ＳＭおよびＣＭが、０．６３±０．１および２６．４±１．３のＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を有し（表７）、文献と一致する［４２］ことを示した。天然メラニンのずっと高いＤＨＩＣＡ含有率は、ドーパクロムをＤＨＩＣＡに転位するドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）の酵素作用に起因するが、酵素なしで形成された合成メラニンはドーパクロムの自然脱カルボン酸が原因で低いＤＨＩＣＡ含有率である［３６］。
【０１３９】
【表７】
2017512893.tif 000014
【０１４０】
ＰＤＡのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比は、０．４８±０．０３と最も低かったが、これは、ドーパミン前駆体がカルボン酸を含まないので予想されることである。それにもかかわらず、低いが測定可能なレベルのＰＴＣＡをＰＤＡ中に検出されたが、これは、２位を経て共役しているＤＨＩサブユニットに起因すると思われた［３５］。興味深いことに、５００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中のＤＭの合成の簡単な修飾は、ＰＤＡおよびＳＭより有意に高い（ｐ＜０．００１）、１．８０±０．０２までＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を増加させた。この結果は、高イオン強度で形成されたＤＭコーティングがＦＴＩＲにより確認されたようにカルボン酸を含んでいたという本発明者らの前の発見と一致するものである［３９］。ＤＭの高ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比は、アルカリ性緩衝生理食塩水中のＤＭ自己酸化方法が、結果として、市販ＳＭを形成するために使用されているチロシンの過酸化物酸化と比較して、より高いＤＨＩＣＡ含有率を得ることを示している。
【０１４１】
ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比および結果的にＰｂ結合に対する一価（ＮａＣｌ、ＫＣｌ）および二価塩（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２）の種々の濃度の影響をさらに探求した。１２５、２５０、５００および１０００ｍＭの各塩の存在下ＤＭを形成して、ＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比に対する影響を決定した。各塩について、本発明者らは、塩濃度が増加するにつれてＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比が増加する明らかな傾向（ｐ＜０．０１）を見出した（図２２Ａ）。ＮａＣｌおよびＫＣｌのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比は、１．６〜２．１の値で、同様であった。二価塩の使用は、結果として、ＤＭ形成中の一価塩より有意に高いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を得た。二価カチオンにより得られた高イオン強度はさておき、この結果は、アルカリ土類金属カチオンとの錯体形成中のカテコールの付加的脱プロトン化から得られたカテコレート酸化の増加とも関連している可能性がある［４３］。最も高いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比は、天然ＣＭ（２６．４）にほとんど匹敵する、１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を使用して形成されたＤＭの２０．３であった。これらのデータは、ＤＭ形成中に緩衝液中で使用された塩の濃度および電荷の両方が、ＤＨＩＣＡ／ＤＨＩ含有率に対して強い影響を及ぼすことを示している。
【０１４２】
Ｐｂ（ＩＩ）結合
その金属結合特性に対するＤＭ合成中の塩の効果を決定するため、メラニン粉体を１ｍＭ  Ｐｂ（ＩＩ）溶液と３時間混合し、遠心分離し、上澄みをＩＣＰ−ＭＳを用いて、残ったＰｂ（ＩＩ）濃度について分析した。図２２Ｂに示すように、ＭｇＣｌ２を用いて形成されたＤＭが最もＰｂ（ＩＩ）と結合し、次いで、ＣａＣｌ２であることを見出した。ＮａＣｌおよびＫＣｌを用いて形成されたＤＭはほとんどＰｂ（ＩＩ）と結合しなかった。各種の塩について、結合したＰｂ（ＩＩ）量も、ＤＭ形成中使用された塩濃度がより高いほど増加した。この傾向はＤＭのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比と相関があり（Ｍｇ＞Ｃａ＞Ｎａ≒Ｋ）、塩の種類およびその濃度の両方は、形成中のそのＤＨＩＣＡ含有量の増加によりＤＭのＰｂ（ＩＩ）結合量を間接的に促進できることを示唆している。
【０１４３】
その後、本発明者らは、５００ｍＭ  ＮａＣｌまたは５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２（以後、それぞれ、ＤＭ（Ｎａ）およびＤＭ（Ｍｇ）と呼ぶ）、活性炭（ＡＣ）、ＰＤＡ、ＳＭ、およびＣＭのいずれかの存在下で形成されたＤＭのＰｂ（ＩＩ）結合特性を比較した。０．２ｍＭ〜２ｍＭ  Ｐｂ（ＩＩ）中、４時間、固体をインキュベートし、未結合のＰｂ（ＩＩ）をＩＣＰ−ＭＳにより測定した。メラニンと金属イオンとの結合は、１つより多いタイプの結合部位で起こり得ると認識しているが、ラングミュア吸着式を使用してデータをフィットした。それにもかかわらず、現在の文献はメラニンと金属イオンとの凝集結合能および親和性を表すためにラングミュア吸着モデルを使用してきた［４４、４５］が、このように、本発明者らは、比較する目的で同じことを行った。
【０１４４】
表７および図２３に示すように、ＰＤＡは、１８．２ｍｇ／ｇであると分かっているＡＣの約５倍多い８９．２ｍｇ／ｇの最大Ｐｂ（ＩＩ）結合能を有することが分かった。全てのＤＨＩＣＡ含有メラニンは、ＰＤＡ＜ＳＭ＜ＤＭ（Ｎａ）＜ＣＭ＜ＤＭ（Ｍｇ）の順で、ＰＤＡより著しく高い最大Ｐｂ（ＩＩ）結合能を有していた。図２２に見られる傾向と同様に、メラニンのＰｂ（ＩＩ）結合能の順番は、ＣＭより低いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を有するにもかかわらずより高い能力を有するＤＭ（Ｍｇ）以外、そのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比と同じ順番に従っていた。著しいことに、ＤＭ（Ｍｇ）は、４９４．１ｍｇ／ｇの最大のＰｂ（ＩＩ）能力および１７０．５ｍＭ−１の結合親和性を有していた。この結合能は多くの他の分類の吸着剤（ゼオライト、粘土、およびキトサン）ならびにさらにＤｅｍｉｒｂａｓらが測定して８４ｍｇ／ｇのＰｂ（ＩＩ）結合能および１２．３ｍＭ−１の結合親和性を有する市販のスルホン酸イオン交換樹脂［４６］より高い［１１］。
【０１４５】
最近の研究では、Ｓｏｎｏらは、ＤＯＰＡのチロシナーゼ酸化によりＰＶＤＦ上にコーティングした合成ユーメラニンが、９２ｍｇ／ｇの最大Ｐｂ（ＩＩ）結合能および１７．４ｍＭ−１の結合親和性を有すると決定した［４４］。本発明のＤＭ粒子のより高い結合能および親和性は、本発明者らは２つの試験間の方法論的な差があると戒めるが、高イオン強度緩衝液中の合成から得られたそのより高いＤＨＩＣＡ含有率に起因し得る。
【０１４６】
Ｐｂ（ＩＩ）結合の接触時間の依存性を、８時間にわたってメラニン粉体と一緒に２ｍＭ  Ｐｂ（ＩＩ）をインキュベートすることにより決定した。図２４に示すように、本発明者らは、ＤＭ（Ｍｇ）、ＤＭ（Ｎａ）およびＣＭは、試験した最初の時点以内でその最大吸着を達成し（１５分）、これは最初の時点であった。ＳＭおよびＰＤＡについて、約６０分まで結合は増加した。ＤＭ粒子によるＰｂ（ＩＩ）の速い結合により、ＤＭ粒子はインライン水浄化用吸着剤として好適となる。
【０１４７】
他の重金属に対する結合能
同様な方法論を用いて、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）およびＨｇ（ＩＩ）結合能を、ＡＣおよび様々なメラニンについて測定した。図２５Ａに示すように、Ｃｕ（ＩＩ）結合能は、ＡＣ＜ＰＤＡ＜ＳＭ＜ＤＭ（Ｎａ）＜ＣＭ＜ＤＭ（Ｍｇ）の順であった。この順番は、Ｐｂ（ＩＩ）結合と同様であり、そのより低いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比にもかかわらず、１４８．４ｍｇ／ｇのより高いＣｕ（ＩＩ）結合能を有するＤＭ（Ｍｇ）以外、そのそれぞれのＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比の順番と一致した。本発明者らは、ＣＭが１１７．２ｍｇ／ｇのＣｕ（ＩＩ）と結合することを見出した。比較として、Ｈｏｎｇらは、新鮮なセピアメラニンが７０ｍｇ／ｇまでのＣｕ（ＩＩ）と結合することを見出した。この差は、Ｈｏｎｇらは、金属イオン濃度測定前に０．１ｍＭ  ＨＣｌでＣｕ（ＩＩ）飽和ＣＭ顆粒を洗浄したことに起因し得るが、これは結合したＣｕ（ＩＩ）を部分的に脱着させた可能性がある［４７］。
【０１４８】
同じ研究で、メラニンのＣｕ（ＩＩ）結合部位はカルボキシルの代わりにカテコール基であることを示唆した。しかしながら、ＦｒｏｎｃｉｓｚとＳａｒｎａは早期に電子常磁体共鳴分光法を使用して、ｐＨが６未満の場合にＣｕ（ＩＩ）はカルボキシル上でメラニンと結合することを示唆した［４８、４９］。ＨｏｎｇとＳｉｍｏｎは、後に、Ｃｕ（ＩＩ）は先ずカテコール部位と結合し、それから、より高いＣｕ（ＩＩ）濃度においてカルボキシルと結合すると結論した［５０］。Ｐｂ（ＩＩ）（図２５Ｂ）およびＣｕ（ＩＩ）の定性的に類似の結合傾向のために、先ずＰｂ（ＩＩ）がメラニンのカテコールと同様に結合して、それから、より高濃度でカルボキシルと結合すると推測している。
【０１４９】
Ｃｄ（ＩＩ）について、本発明者らは、ＰＤＡの９．６倍〜１３．２倍多く結合したＤＨＩＣＡ−ＤＭ（Ｎａ）、ＤＭ（Ｍｇ）およびＣＭ中にリッチなメラニンを見出した（図２５Ｃ）。この対比は、Ｐｂ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）の場合よりずっと大きく、それぞれ、４．３倍〜６．２倍および６．２倍〜８．８倍であった。このことは、Ｃｄ（ＩＩ）が、カテコールの代わりにＤＨＩＣＡのカルボキシル上で支配的に結合することを示唆し得る。Ｃｈｅｎらの研究により、イカメラニンとのＣｕ（ＩＩ）の結合はＰｂ（ＩＩ）との比較するときよりもっと塩との競合により減少することを見出され、カルボキシルへの静電引力がＣｄ（ＩＩ）結合に対してより優占するという考えを支持した。
【０１５０】
Ｈｇ（ＩＩ）では、ＤＭ（Ｎａ）、ＤＭ（Ｍｇ）およびＣＭは、驚くべきことに１１２８〜１２４４ｍｇ／ｇのＨｇ（ＩＩ）と結合した（図２５Ｄ）。６２２ｍｇ／ｇのＨｇ（ＩＩ）と結合するＰＤＡと比較して、ＤＨＩＣＡリッチメラニンは２倍多く結合した。ニューロメラニンがＨｇ（ＩＩ）イオンに対して高親和性を有することは公知であったことを考えると、このことは驚くべきことでないのかもしれない［２２］。メラニンのＨｇ（ＩＩ）結合のため、カテコール結合部位は、少なくともカルボキシル部位と同様に重要である可能性がある。加えて、ＨＧ（ＩＩ）は、カテコールとの酸化還元反応によりＨｇ（０）に還元され得る。
【０１５１】
全４種の重金属イオンについて、本発明者らは、より低いＰＴＣＡ／ＰＤＣＡ比を有するにもかかわらず、ＤＭ（Ｍｇ）がＣＭより多く結合することを観察した。このことは、複数の因子の組合せに起因し得る。第一に、使用したＣＭは金属イオンと有意な結合を示すと期待されない、約５〜７％のマトリックスタンパク質からなるメラニン顆粒である［５１］。第二の因子は、ＣＭが既に、海水で見られ、見かけの結合能を低下させる少量の内在性金属イオンを含有していたことであり得る［２０］。
【０１５２】
表面積
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）表面分析を使用して本発明の吸着剤の表面積を決定した（表７）。ＡＣは７９２．２ｍ２／ｇの表面積を有すると分かったが、本発明者らの試験の全てのメラニンは、８ｍ２／ｇ未満の表面積を有すると分かり、本質的に多孔性でないと考えることができる。ＤＭ（Ｎａ）およびＤＭ（Ｍｇ）の両方は、他のメラニンより著しく小さい表面積を有し、これは、高イオン強度においてその形成に関連し得る。ＢＥＴ表面積分析およびバレット・ジョイナー・ハレンダ（ＢＪＨ）細孔容積分析を用いて、ＬｉｕとＳｉｍｏｎも、ＣＭが非多孔性物質［５２］であると決定し、このことは、本発明者らが見出したことと一致する。ＡＣの重金属の吸着能力は、その高表面積による。しかしながら、ＤＭおよびＣＭの高結合能その上小さい表面積を考慮して、金属結合は、メラニン粒子の表面だけでなく、金属イオンの内部拡散により物質内至る所で起こると思われる。この仮説は、Ｆｅ（ＩＩＩ）に対するその高結合能に基づくセピアメラニンのイオン拡散チャネルの存在を示唆したＬｉｕらによっても支持される［２０］。
【０１５３】
結論として、本発明者らは、高イオン強度においてアルカリ性緩衝液中の自己酸化により不溶性ＤＭ粒子を合成した。二価塩および高塩濃度の使用により、ＤＭ中のより高いＤＨＩＣＡ含有率を得た。特に、ＭｇＣｌ２緩衝液中で形成されたＤＭは最も高いＤＨＩＣＡ含有率を有し、天然メラニンとほとんど匹敵する。ＤＭ中のＤＨＩＣＡ含有率の増加はＰｂ（ＩＩ）の結合の増加と相関があった。Ｐｂ（ＩＩ）のラングミュア最大結合能および結合親和性をＡＣ、ＰＤＡ、ＳＭ、ＤＭ（Ｎａ）、ＤＭ（Ｍｇ）およびＣＭにわたって比較したが、ＤＭ（Ｍｇ）は最も高い能力および親和性の両方を有することが分かった。Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）およびＨｇ（ＩＩ）の結合能も決定したが、同様に、ＤＭ（Ｍｇ）は、ＡＣ、ＰＤＡ、ＳＭ、ＤＭ（Ｎａ）およびＣＭより有意に高い結合能を有することが分かった。まとめると、この試験は、ＤＨＩＣＡリッチ合成メラニンは高イオン強度において容易に合成され、水溶液から重金属隔離するための優れた吸着剤の役割をすることを示している。高イオン強度において形成された合成ＤＭは、そのＤＨＩＣＡ含有率が天然ユーメラニンを密接に模倣するので、ユーメラニンの合成モデルとして研究者にとって興味深いものである可能性もある。
【０１５４】
上記説明、添付図およびそれらの説明は本発明を例証するためであり、本発明を限定するものでないことを留意すべきである。本発明の多くのテーマおよび変化形は本開示に照らせば当技術分野の当業者にとって示唆されるだろう。このようなテーマおよび変化形は全て本発明の予見の範囲内である。例えば、本発明は上記概説した様々な例示的実施形態に関連して記載されているが、様々な代替、修飾、変化形、改良、および／または実質的均等物は、既知であるか、まれであるか、現在予見されないかにかかわらず、少なくとも通常の技能を有する当業者にとって明白になり得る。本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更を成し得る。従って、本発明は、これらの例示的実施形態の全ての既知または後に開発される代替、修飾、変化形、改良、および／または実質的均等物を包含するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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