(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｂｉｏＢ遺伝子産物及びｎｉｆＵ遺伝子産物、又は、ｂｉｏＢ遺伝子産物、ｎｉｆＵ遺伝子産物及びｎｉｆＳ遺伝子産物、を含有する酵素反応混合物と、デスチオビオチンとを接触させ、得られたビオチンを反応混合物から単離することを特徴とする、デスチオビオチンからのビオチンの製造方法。
【請求項２】
ｂｉｏＢ遺伝子産物及びｎｉｆＵ遺伝子産物をコードするＤＮＡ、又はｂｉｏＢ遺伝子産物、ｎｉｆＵ遺伝子産物及びｎｉｆＳ遺伝子産物をコードするＤＮＡ、により形質転換され、該ＤＮＡを単一のプラスミドまたはお互いに独立した複数のプラスミド上で発現する微生物を水性栄養培地中でデスチオビオチンの存在下で培養し、得られたビオチンを培養液から単離することを特徴とする、デスチオビオチンからのビオチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はデスチオビオチンからビオチンを生産する発酵方法に関するものである。
【０００２】
ビオチンは動物、植物および微生物の栄養源として必須ビタミンの一つであり医薬品または食品添加物として非常に重要である。
【０００３】
【従来の技術】
ビオチンの発酵生産に関する数多くの研究がある。エシェリヒア(Escherichia) 株は上記の方法のために使用可能であることが知られている（例えば、特開昭61-149091 、WO87／01391 および特開昭62-155081 参照）。上記の菌株に加えてバチルス(Bacillus)株（特開平3-180174）、セラチア(Serratia)株（特開平2-27980 ）、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)株（特開平3-240489）が知られている。しかし、これらの方法は栄養源からビオチンへの炭素回収の低効率およびいくつかの場合、直接前駆体であるデスチオビオチンの蓄積のために工業利用には未だに適切ではない。したがって、デスチオビオチンからビオチンへの変換効率の改善が望まれる。エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)の休止菌体系を用いたデスチオビオチンからビオチンへの変換反応〔Antimicrob. Agents Chemother., 21, 5 (1982) 〕およびエシェリヒア・コリの無細胞抽出液を用いた変換反応〔J. Biol. Chem., 270, 19158 (1995); Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 1780 (1992); Eur. J. Biochem., 224, 173, (1994); Arch. Biochem. Biophys., 326, 48 (1996) 〕が知られている。これらの公知の事実にもとづいて、ビオチンシンターゼ（biotin synthase)とともにフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ferredoxin-NADP reductase)およびフラボドキシン（flavodoxin）の様なタンパク質因子がデスチオビオチンからビオチンへの変換反応に関与していることが解明されている。しかしながら、これらの条件下では限られた有効性のみがデスチオビオチンからビオチンへの変換反応に認められたにすぎない。他の未知タンパク質がさらに効率良くデスチオビオチンをビオチンへ変換する反応に関与していることが容易に推測された。
【０００４】
さらに、フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼおよびフラボドキシンの生理的電子伝達系を利用する代わりに、人工的電子供与体として光還元されたデアザフラビンとバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus) の精製されたビオチンシンターゼを用いた変換反応が最近報告されている〔Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, 1231 (1995)〕。しかし、報告されている反応効率はビオチンの工業生産に利用し得るほど十分に高いものではない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はデスチオビオチンからより効率良くビオチンを生産する方法を見出すことであり、この目的のためにさまざまなタンパク質因子を評価した。  その結果、ニトロゲナーゼ(nitrogenase) の金属クラスター核形成のために必要な鉄および硫黄の供給に関与することが示唆されている〔J. Bacteriol., 175, 6737 (1993) 〕ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子産物（以後、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳと略す）がデスチオビオチンからのより多いビオチンの生産にきわめて有効であることが見出された。本発明は上記の発見に基づいている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明はｂｉｏＢ遺伝子（ビオチンシンターゼをコードする）産物（以後、ＢＩＯＢと略す）とさらにｎｉｆＵ遺伝子産物、ｎｉｆＳ遺伝子産物およびそれらの組合せからなる群から選択される追加の遺伝子産物とを含有する酵素反応混合物とデスチオビオチンを接触させ、得られたビオチンを反応混合物から単離することを特徴とする、デスチオビオチンからのビオチンの製造方法を提供するものであり、かかる製造方法において、ＢＩＯＢがエシェリヒア・コリのものであり、なおかつＮＩＦＵおよび／またはＮＩＦＳがクレビシエラ・ニューモニエ（K1ebsie11a pneumoniae）のものであり、もしくは前に記載の製造方法において、該酵素反応液がＳ−アデノシルメチオニン、Ｌ−システインおよび、例えば、ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼおよびフラボドキシンからなる電子供与系またはデアザリボフラビンまたはその機能的同等物からなる電子供与体を含むものである。
【０００７】
また、本発明の更なる目的は反応をpH６．０〜８．５、好ましくはpH７．０〜８．０および２０〜４５℃の温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲で行うことからなる上記の製造方法を提供することにある。
【０００８】
さらに本発明は、ｂｉｏＢ遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列とｎｉｆＵ遺伝子産物、ｎｉｆＳ遺伝子産物およびｎｉｆＵ遺伝子産物とｎｉｆＳ遺伝子産物の組合せをコードする配列からなる群から選択される追加のＤＮＡ配列とにより形質転換され、該ＤＮＡ配列を単一のプラスミドまたはお互いに独立した複数のプラスミド上で発現する微生物を水性栄養培地中でデスチオビオチンの存在下で培養し、生産されたビオチンを培養培地から単離することを特徴とする、デスチオビオチンからのビオチンの製造方法を提供することにある。特に、このような方法においてここで言う微生物とはエシェリヒア属から選択された微生物であり、またここで言う培養は1〜５日間、好ましくは１〜３日間、ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８、１０〜４５℃温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲で行われる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明中で用いられる酵素変換反応系はＢＩＯＢとＮＩＦＵおよび／またはＮＩＦＳのタンパク質因子を含む。上記の反応のためのＢＩＯＢとしては、ＢＩＯＢを含む無細胞抽出液、または通常の酵素精製法により部分精製または完全精製されたＢＩＯＢを用いることができる。ビオチン・シンターゼ(biotin synthase) 活性を有していれば、如何なるＢＩＯＢをこの反応に用いても良いが、好ましくはエシェリヒア・コリＢＩＯＢが良い。所望により、以下の方法により大量の精製ＢＩＯＢを得ることができる。まず、ｂｉｏＢ遺伝子のコード領域の完全長をカバーする適当な大きさのＤＮＡ断片を持つエシェリヒア・コリの遺伝子ライブラリーを構築する。エシェリヒア・コリのｂｉｏＢ遺伝子は１．３kbのＮｃｏＩ−ＨａｅIII 断片中に位置していることが知られている〔J. Biol. Chem., 263, 19577 (1988) 〕ので、これらの２つの制限酵素を都合良く使用することができる。この目的のためには、市販されているさまざまなベクタープラスミドを使用することができる。Pharmacia Biotech Co. から入手できるベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ａは当該分野で一般的に使用される誘導型発現プラスミドの一つである。次に、遺伝子ライブラリーの組換えプラスミドＤＮＡの混合物をエシェリヒア・コリの株から抽出し、エシェリヒア・コリのｂｉｏＢ欠損変異株の形質転換に使用する。この目的のためには、エシェリヒア・コリＲ８７５〔bioB17; J. Bacteriol., 112, 830 (1972)〕が適している。目的のｂｉｏＢ遺伝子の発現によりビオチン非要求性を示すようになったクローンを選択する。選ばれたクローンはｂｉｏＢ遺伝子を有しており、さらにその遺伝子を発現する。この性質を示す如何なる組換えプラスミドもＢＩＯＢを得るために使用できる。ｐＴｒｃＥＢ１と命名された組換えプラスミドは目的のプラスミドの一つである。大量のＢＩＯＢを得るために、常法に従いｐＴｒｃＥＢ１により形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社）を栄養培地中で培養し発現を誘導する。生産されたＢＩＯＢは一般的なクロマトグラフィー技術により単離することができる。あるいは、エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子発現プラスミドは特開昭61-149091 または特開平7-236493に記載されている既知の方法に従い構築することもできる。
【００１０】
前記反応に使用されるＮＩＦＵとＮＩＦＳとしては、ＮＩＦＵとＮＩＦＳを含有する無細胞抽出液、または通常の酵素精製法により部分精製されたＮＩＦＵとＮＩＦＳを用いることができる。デスチオビオチンからビオチンへの変換反応に効果を示すものならば、如何なるＮＩＦＵとＮＩＦＳをこの反応に用いても良い。しかしながら、好ましくはクレビシエラ・ニューモニエのＮＩＦＵとＮＩＦＳが良い。クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を持つよく研究されている菌株である。クレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子は以下の方法により得られる。まず、クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１の遺伝子ライブラリーはＢａｍＨＩのような制限酵素により切断されたＤＮＡ断片を使用して構築する。目的のｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子はクレビシエラ・ニューモニエ染色体ＤＮＡ中の２．５kbのＢａｍＨＩ断片に含まれることが知られているので〔J. Bacteriol., 169, 4024 (1987) 〕、２．３〜２．６kbの長さのＤＮＡ断片を回収し、適当な微生物中で複製できるベクタープラスミドに連結する。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株式会社）とエシェリヒア・コリＪＭ１０９は遺伝子ライブラリーを構築するためのベクタープラスミドと宿主微生物の適した組み合わせの一つである。報告されているｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子のＤＮＡ配列をもとに合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションのような常法に従って目的のクローンを選択することができる。次に、ｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を有するＤＮＡ断片を他の発現ベクタープラスミドにサブクローニングする。ｐＴｒｃ９９Ａのような誘導型発現ベクターはｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現するためには好ましい。エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現するのに適したクローンの一つである。なお、European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge, GB) などの配列データバンクから得ることができる公表されているｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、およびｎｉｆＳ遺伝子の配列をもとに、当該分野で公知の方法（EP747 483 などを参照）に従ってこれらの遺伝子ＤＮＡを合成することも可能である。如何なるＢＩＯＢ、ＮＩＦＵまたはＮＩＦＳをコードするＤＮＡ配列でも、公表されているＤＮＡ配列にもとづいて、周知のＰＣＲ技術により任意の微生物から単離することが可能である。そのような微生物はIndustrial Property 〔(1991) 1, 29-40 〕に記載されている菌株保存機関、例えばThe American Type Culture Collection (ATCC) などから入手することができる。
【００１１】
本発明において使用される微生物の培養は既知の方法によって行うことができる。同化できる炭素源、消化できる窒素源、無機塩そして微生物の生育に必要な栄養素を含有する水性培地を水性栄養培地として使用することができる。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、ラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、デキストリンまたはグリセリンなどを使用することができる。窒素源としては、例えばペプトン、脱脂大豆粕、コーンスティープリカー、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素またはこれらの混合物を使用することができる。さらに無機塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルト、鉄などの硫酸塩、塩酸塩またはリン酸塩などを使用することができる。また必要なら、通常の栄養素もしくは動物オイル、野菜オイル、もしくは鉱物オイルなどの消泡剤を水性栄養培地に添加することもできる。得られた微生物が抗生物質耐性マーカーを有している場合、該当する抗生物質を培地に添加することもできる。目的の遺伝子の発現がイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導される場合、この化合物が培地中に存在することも可能である。培地のpHは５〜９が適当であるが、好ましくは６〜８が良い。培養温度は１０〜４５℃が適当であるが、好ましくは２５〜４０℃が良い。培養時間は通常１〜５日間であるが、１〜３日間が好ましい。
【００１２】
培養により得られた菌体からの無細胞抽出液の調製には超音波処理、ガラスビーズ存在下での破砕またはフレンチプレスによるものなどの常法が利用できる。細胞破砕後、得られた溶液は細胞残骸の分離のため遠心操作され、その上清は無細胞抽出液として使用できる。
【００１３】
酵素反応系は反応成分として上記のように調製された無細胞抽出液中に含まれるＢＩＯＢとＮＩＦＵおよび／もしくはＮＩＦＳか部分精製された同反応成分を含有する。上記のタンパク質に加えて、本反応の基質としてデスチオビオチンが添加される。デスチオビオチンの添加量は使用される酵素反応系に応じて変更できる。Ｄ−型もしくはＤ−型とＬ−型の混合物であるデスチオビオチンが基質として使用できる。Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｌ−システインおよびデアザリボフラビンまたはその機能的同等物のような電子供与体の添加は本反応を促進する。本反応のためのデアザリボフラビンまたはその機能的同等物のような電子供与系（特に人工的電子供与体として）の代わりに、ＮＡＤＰＨとともにフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼとフラボドキシンを生理的電子供与系として使用することができる。これらの添加成分の至適濃度は使用される酵素反応系に応じて変更できる。しかし一般に、５０μM 〜２mM  Ｓ−アデノシルメチオニン、１０μM 〜２mM  Ｌ−システインおよび１０〜１，０００μM デアザリボフラビンが推奨される。
【００１４】
反応進行のため、ビオチン生成に悪影響をおよぼさない緩衝液が利用できる。Tris−ＨＣｌ緩衝液が好ましく使用できる。酵素反応はpH領域６．０〜８．５、さらに好ましくはpH領域７．０〜８．０で行うのが適切である。反応温度は２０〜４５℃間、さらに好ましくは２５〜４０℃間が適切である。反応促進にデアザリボフラビンを使用する場合は、反応混合物から約１０cmの距離をおいた蛍光灯からの照射を利用した光還元により反応が開始される。反応時間は３０分から３時間程度である。酵素が活性を有している限り、より長い反応時間も有効である。
【００１５】
前記の酵素反応系の他に、ｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を直接利用することも可能である。例えば、ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子をすでに記載したように調製し、単一もしくは独立した複数のプラスミドに組込み、エシェリヒア・コリのような宿主微生物に通常の形質転換法により導入する。そして、培養系もしくは休止菌体系によりデスチオビオチンからビオチンを生産することも可能である。また所望により、この微生物の無細胞抽出液を用いた酵素反応系も利用することができる。ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子を同時に高発現するように改良されている如何なるエシェリヒア・コリも利用することが可能である。これらの菌株中では、特にエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）が好ましい。
【００１６】
前記の条件でデスチオビオチンから生産されたビオチンは容易に回収することができる。この目的のためには、ビオチンの種々の性質に適応した、ある生産物を溶液から抽出する一般的な方法を使用することができる。したがって、例えば、固形物を溶液から除去した後、濾液中のビオチンを活性炭吸着させ、溶出させ、さらにイオン交換樹脂で精製すれば良い。別の方法としては、濾液を直接イオン交換樹脂に供し、溶出後、目的の生産物をアルコールと水の混合物から再結晶させても良い。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１８】
実施例１：エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子のクローニングおよび発現
（１）染色体ＤＮＡの調製
エシェリヒア・コリＨＢ１０１〔J. Mol. Biol., 41, 459 (1969);宝酒造株式会社〕をＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％；pH７．５）１００ml中で３７℃、１０時間培養を行い、菌体を遠心分離で集めた。菌体からフェノール法(Experiments with gene fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1984, pp. 137-139; Sambrook et al. 1989 "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press) により染色体ＤＮＡを抽出精製し、０．７mgの染色体ＤＮＡを得た。
【００１９】
（２）遺伝子ライブラリーの調製
図１に示す方法に従い、（１）で得られた染色体ＤＮＡ３μg をＮｃｏＩとＨａｅIII を用いて完全に切断し、アガロースゲル電気泳動により１．２〜１．５kbのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＳｍａＩで切断したベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ａ(Pharmacia Biotech Co., Pharmacia, Uppsala, Sweden) とDNA ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いて使用説明書に従い連結させた。次いで、連鎖反応後のＤＮＡを常法(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982, pp. 252-253)に従いエシェリヒア・コリＪＭ１０９〔Gene, 33, 103 (1985)〕に導入し、ＬＢ寒天培地上で１００μg/mlのアンピシリン耐性を示す形質転換株を選んだ。その結果、強力なトリプトファン／ラクトースハイブリッドプロモーター（ｔｒｃプロモーター）〔Gene, 69, 301-315 (1988)〕の下流に染色体ＤＮＡ断片が挿入された、３，０００種類のクローンを遺伝子ライブラリーとして得た。
【００２０】
遺伝子ライブラリーを有するアンピシリン耐性形質転換株を１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地５０mlで３７℃、１６時間培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体から、アルカリ変性法(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982, pp.90-91) によりプラスミドＤＮＡプールを抽出した。
【００２１】
（３）エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子を有する組換えプラスミドの選択
（２）で得られたプラスミドＤＮＡプールを常法に従いエシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子欠損変異株Ｒ８７５〔J. Bacteriol., 112, 830-839 (1972)〕に導入した。エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子を有するクローンを得るために、アンピシリン耐性かつビオチン非要求性を示す形質転換株を１００μg/mlアンピシリン、０．０７５U/mlアビジンおよび０．１mMイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以後、ＩＰＴＧと略す）を含むＬＢ寒天培地上で選択した。
【００２２】
得られた形質転換株の一つを１００μg/mlアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、菌体から組換えプラスミドを抽出し、単離したプラスミドを制限酵素を用いて分析した。この組換えプラスミドはｂｉｏＢ遺伝子を含む１．３kbのＮｃｏＩ−ＨａｅIII 断片を有しており、ｐＴｒｃＥＢ１（図２参照）と命名した。また、このｐＴｒｃＥＢ１を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）とした。
【００２３】
（４）エシェリヒア・コリ中でのｂｉｏＢ遺伝子の発現
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）を１００μg/アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、一晩前培養し、この前培養液０．１mlを試験管中の同じ培地５mlへ移した。３７℃、３時間培養後、ｔｒｃプロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを２mMになるように添加し、４時間培養を続けた。菌体を回収し、生理食塩水で洗浄した後、菌体を超音波処理により破砕した。ｂｉｏＢ遺伝子の発現の確認を行うために、全細胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Nature, 227, 680-685 (1970) 〕に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＢＩＯＢは全細胞タンパク質の約２％まで高生産されていた。
【００２４】
実施例２：ＢＩＯＢの単離
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）を１００μg/mlのアンピシリンを含む２L テリフィック・ブロース（ＴＢ; ２４g/L 酵母エキス／ディフコ社製、１２g/L トリィプトン／ディフコ社製、４g/L グリセリン、２．３１g/L リン酸一カリウム、１２．５４g/L リン酸二カリウム）で好気的に３７℃、３時間培養した。ＢＩＯＢタンパク質の発現は１mMのＩＰＴＧ添加後さらに３時間培養することにより誘導させた。細胞は８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣｌと１mM  ＥＤＴＡを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH８．１（以後、ＴＢと略す）で洗菌後、１mM  ＥＤＴＡを含まない同バッファーで再度洗菌し、−８０℃で使用まで凍結保存した。以下のカラム操作は特に記述のない場合は室温下で実施し、他の操作は４〜１０℃で実施した。ＢＩＯＢはカラム・クロマトグラフィーでの赤色バンドと一致するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量３７kDa のタンパク質バンドとして追跡した。細胞は５mM  ２−メルカプトエタノール（以後、２−ＭＥと略す）を含む６０mlのＴＢを用いて融解後、０．２５mMフェニルメチルスルホニルフルオロリド、１０μg/mlデオキシリボヌクレアーゼＩおよび１０μg/mlリボヌクレアーゼＡ存在下でフレンチプレスによって破砕し、細胞残骸は１５，０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。溶液は５mM  ２−ＭＥを含むＴＢで２００mlにした後、同容量（２００ml）の２０％硫安 (w/v)を含むＴＢを添加した。１mM  ＥＤＴＡ添加後、溶液中のタンパク質は２mM  ２−ＭＥと１０％硫安を含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyopearl 650M （４．４×１０cm; 東ソー株式会社）に吸着させ、同平衡化バッファーで洗浄後、１０％硫安を含まない同平衡化バッファーで溶出させた。溶出画分は４倍容の２mM  ２−ＭＥを含むＴＢで希釈し、２mM  ２−ＭＥを含むＴＢで平衡化したQ-Sepharose （４．４×１０cm; Pharmacia Biotech Co.)に吸着させた。同平衡化バッファーで洗浄後、溶出は１，２００mlの０〜０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。ＮａＣｌ濃度０．３M 付近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、１０％硫安(w/v) 添加後、２mM  ２−ＭＥと１０％硫安(w/v) を含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyopearl 650S （２．２×５cm; 東ソー株式会社製）に吸着させた。同平衡化バッファーで洗浄後、溶出は２５０mlの１０〜０％硫安（w/v)の直線濃度勾配により実施した。硫安濃度６％付近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、Centriprep-30 (Amicon, Inc.)により約３mlに濃縮後、２mM  ２−ＭＥと０．２５M ＮａＣｌを含むＴＢで平衡化したHiPrep Sephacryl S200HR 26/60 (Pharmacia Biotech Co.）を通過させた。赤色をともなうＢＩＯＢピークを回収し、同容量の２mM  ２−ＭＥを含むＴＢで希釈した後、同希釈バッファーで平衡化したRESOURCE Q６ml（Pharmacia Biotech Co. ）に吸着させた。洗浄後、溶出は１２０mlの０〜０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。赤色をともなうＢＩＯＢピークを回収した。貯蔵前に、ＢＩＯＢは１mMジチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）を含む５０mM Tris −ＨＣｌ／pH８．１バッファーで約１mg/ml タンパク質終濃度に希釈後、１００μM ＦｅＣｌ3 、５０μM Ｎａ2 Ｓと室温下２時間嫌気的にインキュベートさせた。余剰のイオンとＤＴＴは０．２mM  ＤＴＴを含む０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５バッファーで平衡化したSephadex G-25 (M, 1.5 x 18 cm, Pharmacia Biotech Co.）を通過させることにより除去した。ＢＩＯＢタンパク質は２０〜３０mg/ml タンパク質終濃度まで濃縮した後、−８０℃に貯蔵した。上記の方法で調製されたＢＩＯＢタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量約３７kDa を示す単一バンドとして８０％以上と推定された（図３参照）。上記の方法で調製されたＢＩＯＢタンパク質は典型的な鉄／イオウタンパク質の吸収スペクトルパターンを示した（図４参照）。
【００２５】
実施例３：クレビシエラｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子のクローニングおよび発現
（１）染色体ＤＮＡの調製
クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１〔Nature, 237, 102 (1972) 〕をＬＢ培地５０mlで３７℃、１０時間培養した。菌体を遠心分離により回収し、染色体ＤＮＡをフェノール法により抽出した。
【００２６】
（２）遺伝子ライブラリーの調製
図５に示した方法に従い、クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子のクローニングを行った。染色体ＤＮＡ（２μg)をＢａｍＨＩにより完全に切断し、アガロースゲル電気泳動により２．３〜２．６kbのＤＮＡ断片を得た。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株式会社）をＢａｍＨＩで完全に切断した後、自己連結を避けるためにアルカリホスファターゼによる処理を行った。得られた染色体ＤＮＡ断片をDNA ligation Kit（宝酒造株式会社）を使用して上記処理を行ったｐＵＣ１９に連結し、連鎖反応後のＤＮＡを常法に従いエシェリヒア・コリＪＭ１０９に導入した。ＬＢ寒天培地上で１００μg/mlアンピシリン耐性形質転換株を選択し、染色体ＤＮＡ断片を持つ２，０００種類のクローンを遺伝子ライブラリーとして得た。
【００２７】
（３）クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンの選択
クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンの選択はManiatisら(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982, pp. 326-328)によって記載されたプロトコルに従って、コロニーハイブリダイゼーションにより行った。
【００２８】
寒天培地上で生育したコロニーをナイロン膜（Hybond-N, Amersham Co.) に移し、アルカリにより溶菌させた後、変性したＤＮＡを膜上に固定した。ハイブリダイゼーションはDIG DNA Labeling and Detection system (Boehringer Mannheim Co., Mannheim, Germany)を使用し、使用説明書に従って行った。ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子の一部の配列を有する２本のオリゴヌクレオチドを合成した。この配列を以下に示す：
ｎｉｆＵプローブ  ５′AGAGGAGCACGACGAGGGCAAGCTGATCTGCAAAT
ｎｉｆＳプローブ  ５′CGTTGGTCAGCGTGATGTGGGCGAATAACGAAACC
２本のオリゴヌクレオチドの３′末端をDIG Oligonucleotide 3'-End Labeling Kit (Boehringer Mannheim Co.) により標識し、２本の標識オリゴヌクレオチドの混合物をハイブリダイゼーション用プローブとして使用した。プローブがハイブリダイズしたクローンはDIG Luminescent Detection Kit (Boehringer Mannheim Co.) により検出した。その結果、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンとして２６個の候補が得られた。
【００２９】
４個の候補クローンを選び、候補クローンを持つ形質転換株を１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養した。菌体からアルカリ変性法により組換えプラスミドを抽出し、制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＶｓｐＩ、ＳｃａＩ）による解析を行った。次いで、ALFred DNA sequencer (Pharmacia Biotech Co.)を使用して挿入ＤＮＡ断片の両末端から３００〜４００塩基の配列を決定した。決定された塩基配列はBeynonにより報告されているクレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵ、Ｓクラスターの塩基配列〔J. Bacteriol., 169, 4024-4029 (1987)〕と同じ配列であった。この結果は、得られたクローンがクレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵ、Ｓクラスターを有していることを示していた。ｎｉｆＵ、Ｓクラスターがベクター中のラクトース（ｌａｃ）プロモーターと同方向に挿入された組換えプラスミドをｐＫＮｎｉｆ０１と命名した。また、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターがｌａｃプロモーターと逆方向に挿入された組換えプラスミドをｐＫＮｎｉｆ０２と命名した（図５参照）。
【００３０】
（４）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３の構築（図６参照）
ベクタープラスミドpBluescriptII-SK+ （東洋紡株式会社）をＨｉｎｃIIとＢａｍＨＩで完全に切断した。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０２をＶｓｐＩで完全に切断し、末端をDNA Blunting Kit（宝酒造株式会社）により平滑化した後、ＢａｍＨＩで完全切断した。ｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbの断片をアガロースゲル電気泳動により得た。２．４kbの断片を切断処理を行ったpBluescriptII-SK+ にDNA ligation Kitを使用して挿入し、組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３を得た。
【００３１】
（５）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０４の構築（図７参照）
ベクタープラスミドｐＴｒｃ９９ＡをＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断した。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断し、アガロースゲル電気泳動によりｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した．２．４kbの断片を切断処理をしたｐＴｒｃ９９ＡとDNA ligation Kitを使用して連結させた。その結果、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターがｔｒｃプロモーターの下流に挿入された組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０４を得た。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０４を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）と命名した。
【００３２】
（６）クレビシエラｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子の発現
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）を１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で３０℃、一晩前培養した。０．１mlの前培養液を５mlの同じ培地入りの試験管に移した。３０℃、３時間培養後、ｔｒｃプロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるように添加し、３時間培養を続けた。菌体を集め、生理食塩水で洗浄後、超音波処理により菌体を破砕した。ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子の発現の確認を行うために、全細胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Nature, 227, 680-685 (1970) 〕に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＮＩＦＵ、ＮＩＦＳは細胞中で高生産されていた。
【００３３】
実施例４：ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳ含有／非含有のエシェリヒア・コリ無細胞抽出液の調製
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）を１００μg/mlのアンピシリンを含むテリフィック・ブロース（実施例２参照）で好気的に３０℃、３時間培養した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳの発現は１mM  ＩＰＴＧ添加後さらに３時間培養することで誘導させた。細胞は８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣｌと１mM  ＥＤＴＡを含むＴＢで洗菌後、１mM  ＥＤＴＡを含まない同バッファーで２度洗菌し、−８０℃で使用まで凍結保存した。
【００３４】
それぞれの株の無細胞抽出液は以下のように調製した。細胞は解凍し、湿式細胞重量に対して約２倍容の、０．２mM  ２−ＭＥを含む０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５で懸濁した。懸濁液中の細胞は脱気、アルゴン置換させた後にアルゴン封入した密閉チューブ中でソニケーター（Bioruptor,コスモバイオ社製）により破砕した。不溶性物質は１００，０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。得られた上清を無細胞抽出液として使用した。この無細胞抽出液の総タンパク質濃度は６％トリクロロ酢酸によるタンパク質沈殿、アセトンによるタンパク質洗浄後、ＢＣＡタンパク質アッセイシステム（PIERCE, Rockford, IL 61105, USA)により定量した。上記の方法によりタンパク質濃度約３０mg/ml の無細胞抽出液が得られた。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳを発現するエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の無細胞抽出液はｐＴｒｃ９９Ａを持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９と同タンパク質濃度下で比較して著しい赤色を示した。無細胞抽出液はアルゴン封入状態で−８０℃で保存した。
【００３５】
実施例５：In vitro酵素反応（ＤＡＦシステム）
酵素反応混合液は全容量５０μl 中に１００μM デスチオビオチン、１，０００μM Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、２００μM Ｌ−システイン、５０μM デアザリボフラビン（ＤＡＦ）、０．６mg/ml （１６μM)ＢＩＯＢタンパク質、２０mgタンパク質／mlのエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）からの無細胞抽出液の混合物および０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５を含む。３００μl ガラススピッツ管内の酵素反応混合液は暗所下、弱い吸引とアルゴン加圧により嫌気状態とした。反応は３０℃で２０W の蛍光灯から１０cm距離の光照射により開始させた。反応８０分後、反応は９５℃加熱により停止させ、生成したビオチンはラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いた微生物定量法で定量した。エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）からの２種類の無細胞抽出液は反応混合液中に一定のタンパク質濃度２０mg/ml で、さまざまな比率で混合させた。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳを発現しているエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の無細胞抽出液の比率が上昇するのに対応して、顕著なビオチン生産の増加が認められた。エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の無細胞抽出液の含有率が６４％の場合、対照より約１．８倍高いビオチン生産が認められた（表１）。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
実施例６：ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子を同時発現するエシェリヒア・コリの構築
（１）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５の構築（図８参照）
ベクタープラスミドｐＭＷ２１８（株式会社ニッポンジーン）をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断した。ｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を実施例３で構築した組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３から単離し、切断したｐＭＷ２１８とDNA ligation Kitを使用して連結させた。その結果、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターがｌａｃプロモーターの下流に挿入された組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５が得られた。
【００３８】
ベクタープラスミドｐＭＷ２１８と組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）に常法に従い導入し、１００μg//ml のアンピシリンと１０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で形質転換株を選択した。組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１とベクタープラスミドｐＭＷ２１８を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１およびｐＭＷ２１８) と命名した。また、組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１とｐＫＮｎｉｆ０５を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５）と命名した。
【００３９】
（２）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０６の構築（図９参照）
組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１をＢａｍＨＩで完全に切断した後、自己連結を避けるためにアルカリホスファターゼによる処理を行った。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０２をＶｓｐＩで完全切断した。切断後のｐＫＮｎｉｆ０２の末端をDNA Blunting Kitを使用して平滑化し、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造株式会社）をDNA ligation Kitを使用して連結させた。ＢａｍＨＩで完全に切断した後、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＢａｍＨＩ断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。２．４kbの断片を上記処理を行ったｐＴｒｃＥＢ１にDNA ligation Kitを使用して挿入した。その結果、ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子がｔｒｃプロモーターの下流に挿入された組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０６が得られた。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０６を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）と命名した。
【００４０】
（３）ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子のエシェリヒア・コリ中での同時発現
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）を１００μg/mlのアンピシリンと１０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地および１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中でそれぞれ３０℃、一晩前培養した。０．１mlの前培養液を５mlの同じ培地入りの試験管に移した。３０℃、３時間培養後、発現を誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるように添加し、３時間培養を続けた。菌体を集め、生理食塩水で洗浄後、超音波処理により菌体を破砕した。ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子の発現の確認を行うために、全細胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Nature, 227, 680-685 (1970) 〕に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＢＩＯＢ、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質は細胞中でともに高生産されていた。
【００４１】
実施例７：発酵によるビオチンの生産
（１）エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）によるビオチンの生産エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＭＷ２１８) とエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５) を１００μg/mlのアンピシリン、１０μg/mlのカナマイシンおよび２００μg/mlのデスチオビオチンを含む５０mlのＰＣ培地（グリセリン２％、プロテアーゼペプトン５％、カザミノ酸２％、Ｋ2 ＨＰＯ4 １％、ＫＣｌ  ０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０５％、ＭｎＳＯ4 ４−６Ｈ2 Ｏ  ０．００１％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００１％；pH７．０）に植菌し３０℃で３時間振とう培養を行った。そして、ｔｒｃプロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるように添加し、３０℃で２７時間振とう培養を行った。また、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１) およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）は１００μg/mlのアンピシリンと２００μg/mlのデスチオビオチンを含む５０mlのＰＣ培地に植菌し、上記と同様に培養を行った。
【００４２】
培養終了後、１．５mlの培養液を遠心分離して菌体を除き、培養上清を回収した。培養上清中のビオチン生産量はラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）による微生物定量法により測定した。それぞれ４株のビオチン生産量の平均を表２に示す。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
実施例８：ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳの単離
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）を１００μg/mlのアンピシリンを含む１L テリフィック・ブロースで好気的に２６℃、３時間培養した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳの発現は１mM  ＩＰＴＧ添加後さらに３時間培養することにより誘導させた。細胞（５．４ｇ湿式重量）は８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣｌと１mM  ＥＤＴＡを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで洗菌後、１mM  ＥＤＴＡを含まない同バッファーで２度洗菌し、−８０℃で使用まで凍結保存した。
【００４５】
以下のカラム操作は特に記述のない場合は室温下で嫌気的に実施し、他の操作は４〜１０℃で嫌気的に実施した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質バンドとして追跡した。細胞を５mMジチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）を含む４０mlの２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４によって融解後、０．５mMフェニルメチルスルホニルフルオロリド、１０μg/mlデオキシリボヌクレアーゼＩ、１０μg/mlリボヌクレアーゼＡおよび５mMピリドキサルリン酸存在下フレンチプレスによって破砕した。細胞残骸は７，７００×ｇ、３０分の遠心分離で除去し、不溶性画分は４８，０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。溶液は同バッファーで５０mlにした後、硫酸ストレプトマイシンを１％(w/v) 終濃度で添加した。不溶物を４８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で除去した後、上清に固形硫安を30% 飽和濃度に添加した。室温下、１０分間の緩やかな撹拌後、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質を含む沈殿を４８，０００×ｇ、１０分の遠心分離により得た。沈殿を５mM  ＤＴＴを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで再溶解後、４８，０００×ｇ、３０分の遠心分離で得られる上清を５mM  ＤＴＴを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで平衡化したRESOURCE Q（6 ml, Pharmacia Biotech Co.)に吸着させた。同バッファーで洗浄後、溶出を１５０mlの０〜０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により行った。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質はＮａＣｌ濃度０．３M 付近の２０mlの画分に共溶出され、ＰＭ−３０膜（Amicon, Inc.）により３．５mlに濃縮した。濃縮されたタンパク質溶液は５mM  ＤＴＴと０．２５M ＮａＣｌを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーを用いてHiPrep Sephacryl S200HR 26/60 (Pharmacia Biotech Co.）を通過させた。すべてのＮＩＦＳタンパク質はＮＩＦＵタンパク質との複合体として、またＮＩＦＵタンパク質の一部は単量体として回収された。ＮＩＦＵ／Ｓ複合体は分子量約１４０kDa の位置に溶出され、ＮＩＦＵ単量体は分子量約３５kDa の位置に溶出された。１８mlのＮＩＦＵ／Ｓ複合体を含む画分および２４mlのＮＩＦＵ単量体を含む画分をそれぞれCentriPlus-30 (Amicon, Inc.)により３mlに濃縮した後、−８０℃で保存した。
【００４６】
実施例９：精製ＮＩＦＵ/S複合体およびＮＩＦＵ単量体のビオチン生成に対する影響
無細胞抽出液を含まない酵素反応混合液は、全容量５０μl 中に１００μM デスチオビオチン、１，０００μM ＳＡＭ、２００μM Ｌ−システイン、５０μM デアザリボフラビン、０．６mg/ml （１６μM)ＢＩＯＢタンパク質、１０mM  ＤＴＴおよび０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５を含んでいた。３００μl ガラススピッツ管内の酵素反応混合液は暗所下弱い吸引とアルゴン加圧により嫌気状態とした。反応は３０℃で２０W 蛍光灯から１０cm距離の光照射により開始させた。反応８０分後、反応は９５℃加熱により停止させ、生成したビオチンはラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いた微生物定量法で定量した。
【００４７】
精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体および精製ＮＩＦＵ単量体添加の酵素反応混合液に対する影響を検討した。１３μM 精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体添加または３０μM 精製ＮＩＦＵ単量体添加は約４倍高いビオチン生産を示した。１３μM 精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体および３０μM 精製ＮＩＦＵ単量体添加は約９倍高いビオチン生産を示した（表３参照）。
【００４８】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子のクローニング手順を示す。
【図２】組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１の構造を示す略図である。
【図３】精製されたエシェリヒア・コリＢＩＯＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】精製されたエシェリヒア・コリＢＩＯＢの吸収スペクトルを示す図である。
【図５】クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵおよびｎｉｆＳクラスターのクローニング工程および組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０２の構造を示す略図である。
【図６】クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵおよびｎｉｆＳクラスターを有する組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３の構築工程を示す略図である。
【図７】ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子発現プラスミドｐＫＮｎｉｆ０４の構築工程を示す略図である。
【図８】ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子発現プラスミドｐＫＮｎｉｆ０５の構築工程を示す略図である。
【図９】ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子発現プラスミドｐＫＮｎｉｆ０６の構築工程を示す略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004084440.tif 000009
【図６】
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【図７】
0004084440.tif 000011
【図８】
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【図９】
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