(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）菌株のビール混濁性を判定する方法であって、DNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）特異的プライマーを用いて、前記被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の該B遺伝子領域の一部を増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、得られた制限酵素切断パターンに基づき、該菌株のビール混濁性の判定を行うことを特徴とし、前記DNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）特異的プライマーが、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドとのセットである、方法。
【請求項２】
制限酵素がHin1Ｉ、ApaLＩ、およびHaeＩＩＩの組み合わせである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
制限酵素切断パターンが４つに分類される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンが、ラクトバチルス・ブレビス標準株VTT-E64029の属する分類に当てはまるとき、該被検ラクトバチルス・ブレビス菌株をビール混濁性株であると判定する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予めビール混濁性株を少なくとも１つ含むラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを取得し、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンと比較して、ビール混濁性の判定を行う請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記取得されたラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを分類し、ビール混濁性株が属する分類を特定するステップをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンが前記特定された分類に当てはまるとき、該被検ラクトバチルス・ブレビス菌株をビール混濁性株であると判定する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列表の配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載の核酸配列からなる群より選択される核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドとのセットからなるDNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）増幅用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体であるラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）菌株のビール混濁性を判定する方法に関する。さらに詳しくは、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）の一部をＰＣＲによって増幅し、その増幅断片の制限酵素切断パターンを指標として、前記被検ラクトバチルス・ブレビス菌株のビール混濁性を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビール製造工程中に、ある種の乳酸菌が混入すると、混濁や酸敗などを起こし製造されたビールの品質を損なう危険性が知られている。特に、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）が代表的なビール混濁性菌である。しかしながら、これらの種に属する全ての株が、ビールに混濁を引き起こす性質（以下、「ビール混濁性」という）を有している訳ではない。そこで、被検菌がラクトバチルラス・ブレビス種であるか否かを判定するだけでなく、該被検菌株がビール混濁性を有する株であるか否かについても識別し、菌株に応じた対策を立案、実施する必要がある。その一つの方法として、抗血清を用いたビール混濁性を有するラクトバチルス・ブレビスの検出法が提案されている（特開平１０−１０４２３８号公報）。しかし、この方法では、増殖した培地成分の影響によって、ラクトバチルス・ブレビスの表面抗原の発現に影響が出ることが考えられ、誤判定を起こす可能性が生じるという問題があった。また、ホップやホップのイソα酸に対する耐性を調べて、乳酸菌等のビール混濁性を判定する方法（特開平９−２６０号公報、Fernandez,J.L.et al．；Letters in Applied Microbiol., 1992, 14:13-16）も提案されているが、この方法では試験条件が判定結果に影響する可能性がある他、被検菌のビール中での増殖性を正確に判定することが困難であった。さらに、ラクトバチルス・ブレビスのD-乳酸脱水素酵素のポリアクリルアミド電気泳動での移動度から、該微生物が混濁性を有するグループか否かを判定する方法（特開平９−９００８９４号公報）も提案されているが、判定までに時間がかかるという問題があった。また、遺伝子レベルでの各種菌株の同定・検出に用いられている16S rRNAでは、ラクトバチルス・ブレビス種間の正確な菌の分子系統学的な解析が不可能であった。すなわち、ビール混濁性を有する菌株とビール混濁性を有さない菌株との識別は、ここでも困難であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の問題点に鑑み、従来技術の手法とは別の観点から、最も、ビール製造において脅威となるラクトバチルス・ブレビス種について、ビール中で増殖可能な株か否かを判定する方法の開発が望まれている。したがって、本発明の目的は前記の課題を解決し、ラクトバチルス・ブレビスと同定された被検菌株について、ビール中で増殖する能力があるか、つまりそのビール混濁性の有無について、迅速かつ正確に判定する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく検討を重ね、その過程でDNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）遺伝子（以下、gyrB遺伝子ともいう）に着目した。さらに、生理学、生化学および遺伝子的な手法からラクトバチルス・ブレビスと同定された菌株のgyrB遺伝子の一部をＰＣＲ手法により増幅すると、その増幅断片の制限酵素切断パターンが大きく４つのグループに分類することができ、しかもビール混濁性を有する株がその内の1つのグループに集中することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、被検ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）株のビール混濁性を判定する方法であって、DNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）特異的プライマーを用いて、前記被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の該B遺伝子領域の一部を増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、得られた制限酵素切断パターンに基づき、ビール混濁性の判定を行うことを特徴とする前記方法を提供する。
【０００６】
上記方法において、好ましくはDNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）特異的プライマーが、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドとのセットである。
【０００７】
また、上記方法において、好ましくは制限酵素がHin1Ｉ、ApaLＩ、およびHaeＩＩＩの組み合わせである。この場合、制限酵素切断パターンが４つに分類される。
【０００８】
前記方法において、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンが、ラクトバチルス・ブレビス標準株VTT-E64029の属する分類に当てはまるとき、該被検ラクトバチルス・ブレビス株をビール混濁性株であると判定する。
【０００９】
また、本発明は、上記方法において、予めビール混濁性株を少なくとも１つ含むラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを取得し、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンと比較して、ビール混濁性の判定を行うことを特徴とする。
【００１０】
前記方法において、好ましくは、取得されたラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを分類し、ビール混濁性株が属する分類を特定するステップをさらに含む。この場合、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンが前記特定された分類に当てはまるとき、該被検ラクトバチルス・ブレビス菌株をビール混濁性株であると判定する。
【００１１】
さらに、本発明は配列表の配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載の核酸配列からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、由来する各ラクトバチルス・ブレビス株に特徴的な核酸配列、つまり配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に記載の核酸配列によって特徴付けられる。
【００１２】
加えて、本発明は、上記いずれかの方法に使用できる、DNAジャイレースサブユニットB遺伝子（gyrB）増幅用プライマーセットを提供し、それは配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドとのセットからなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書で使用する、「ビール混濁性」とはビール中で被検ラクトバチルス・ブレビス菌株が増殖可能であり、増殖によりその菌株がビールの混濁を引き起こす性質をいう。
【００１４】
本発明は、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株のビール混濁性を判定するために、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによる遺伝子増幅法と、増幅断片を制限酵素により切断後、アクリルアミドゲル電気泳動によるパターン解析を行うことを基礎としている。
【００１５】
前述のように、ラクトバチルス・ブレビスと同定された菌株の全てがビール中で増殖するのではなく、一部の菌株のみがビール中で増殖することが可能である。このような有害菌株を判定、すなわち、被検菌株が有害菌株であるか否かを判定するのに、本発明はその菌株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子領域の約540bpの核酸配列を利用するものである。
【００１６】
ジャイレース(gyrase)は、細菌性のDNAトポイソメラーゼの一種であり、ＤＮＡの高次構造の修復等に関与しているとされている。DNAジャイレースは、２つのタンパク質からなり、そのタンパク質Ａは、分子量100kDaで、タンパク質Ｂは、分子量90kDa若しくは70kDaである。近年、このタンパク質Ｂをコードする遺伝子gyrBが各種細菌の分類に非常に有効であるとの報告がなされてきた(例えば、Watanabe, K., et al, Appl. Environ. Microbiol. 61, 1104-1109(1995)を参照)。
【００１７】
本発明に従えば、gyrB特異的プライマーを用いて、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株のgyrB遺伝子領域の一部を増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、得られた制限酵素切断パターンに基づき、ビール混濁性の判定を行うことができる。ここで、ビール混濁性の判定は、予めビール混濁性株を少なくとも１つ含むラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを取得し、被検菌ラクトバチルス・ブレビスの制限酵素切断パターンと比較することによって行う。好ましい実施の形態では、まず前記取得されたラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを分類し、ビール混濁性株が属する分類を特定する。さらに、被検ラクトバチルス・ブレビス菌株の制限酵素切断パターンが特定された分類に当てはまるかどうかを確認し、当てはまるとき、該被検ラクトバチルス・ブレビス菌株をビール混濁性株であると判定する。
【００１８】
gyrB特異的プライマーは、被検菌gyrB遺伝子内の標的核酸配列に特異的にアニールするプライマーであるが、そのプライマーセットの内、一方は非特異的にアニールするものであってもよい。ラクトバチルス・ブレビス菌に対しては、好ましくは、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドとのセットからなるプライマーセットを特異的プライマーとして使用する。
【００１９】
このようなプライマーでgyrB遺伝子領域の一部をＰＣＲ増幅するが、そのＰＣＲ条件等は、標準的なものと実質的に異ならない。増幅後、得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、例えば、アガロース電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、ＤＮＡの検出を行う。このようにして得られた制限酵素切断パターン（ＤＮＡの電気泳動パターン）を菌株間で比較する。
【００２０】
好ましい実施の形態では、予めビール混濁性株を少なくとも１つ含むラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンを取得する。具体的には、下記の標準株を使用して、前記プライマーセットでＰＣＲ増幅、制限酵素切断、およびアガロース電気泳動と一連の操作を行う。また、好ましくは制限酵素として、Hin1Ｉ、ApaLＩ、およびHaeＩＩＩの組み合わせを使用するが、この特定の酵素の組み合わせには限定されない。ラクトバチルス・ブレビス標準株群の制限酵素切断パターンがその中に含まれるビール混濁性株の判別・特定を可能にする組み合わせならば、おおよそ任意の組み合わせが可能であろう。得られた制限酵素切断パターンは、大きく４つのグループに分類することができ、ビール混濁性を有する株がその内の１つのグループに集中することが見出された。ここで使用した、標準株の代表例、制限酵素、およびグループ分類を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
上記の代表株は、いずれも菌株保存機関から容易に入手可能であり、それらの入手先は、菌株番号に示されている。
【００２３】
次いで、各グループの菌株について、イソα酸に対する耐性およびビール中での増殖能力を調べたところ、グループＩＩbに属するもののみに、ビール混濁性を認めた。従って、上記の制限酵素の組み合わせを使用すると、被検菌の制限酵素切断パターンがこの特定された分類（すなわち、グループＩＩb）に当てはまるかどうかを確認し、当てはまるとき、該被検菌をビール混濁性株であると判定することができる。
【００２４】
ビール工場等現場で、ビール混濁性を有するラクトバチルス・ブレビス菌株を検出・同定するには、対象となる製品ビールをメンブレンフィルターでろ過して、フィルター上に存在する菌類を乳酸菌選択増殖培地（例えば、ｍ−ＮＢＢ培地）で培養した後、集菌して本発明の判定方法に供する。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）  供試菌のgyrB遺伝子の増幅
プライマーセット［GYPF（配列番号１）、GYPR（配列番号２）］は、gyrB遺伝子の一部約540bp［Staphylococcus aureus ATCC12600のgyrB遺伝子（GenBank登録No.D10489）の346番目の核酸から907番目の核酸に相当する］を増幅する。このプライマーセットによるラクトバチルス・ブレビスのgyrB遺伝子の増幅、およびその他の各種乳酸菌、さらに乳酸菌以外の供試菌のgyrB遺伝子の増幅について検討した。
【００２７】
（ゲノムＤＮＡ調製）
MRS寒天培地（Difco社）に供試菌を植菌し、30℃、嫌気ボックス（タバイエスペック社、N2：CO2：H2＝90：5：5）中で、2〜5日間培養を行った菌を試験に供した。ＤＮＡ抽出液PrepMan(商標)Ultra（アプライド・バイオシステム社）を用いて菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２８】
（ＰＣＲ増幅）
ＰＣＲアッセイはGeneAmp(商標)PCR System 9700（アプライド・バイオシステム社）を用いて行った。反応液TaKaRa Ex Taq(商標)（寶酒造社）に上記ＤＮＡ溶液、およびプライマーセットを加え、ＰＣＲ反応を行った。この液はゲノムＤＮＡ100ng以上を含み、ＤＮＡ変性は95℃、30秒、アニーリングは55℃、30秒、ＤＮＡ伸長反応は72℃、45秒で35サイクル繰り返した。
【００２９】
（ＰＣＲ産物の検出）
ＰＣＲ増幅に続いて、ＰＣＲ産物の検出はゲル電気泳動によって行った。ＰＣＲサンプル５μｌをポリアクリルアミドゲルに供した。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で10分間染色後、紫外線照射して観察し、確認した。ＰＣＲアッセイで試験した菌株とそれらの増幅結果を表２に示す。
【００３０】
（ＰＣＲ産物の核酸配列）
増幅したgyrB遺伝子の核酸配列の決定は、増幅断片の５’、３’部分をGYPFとGYPRを用いて、ABI PRISM(商標)dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction KitとジェネティックアナライザABI PRISM(商標)310（アプライド・バイオシステム社）で行った。
【００３１】
表２に示すように、GYPFとGYPRとのプライマーセットを用いたＰＣＲ法による約540bpの増幅断片は、ラクトバチルス・ブレビスの全ての株に確認できた。しかし、ラクトバチルス・ブレビス以外の幾種かの乳酸菌にも、約540bpの増幅断片が観察された。
【００３２】
さらに、ラクトバチルス・ブレビスJCM1061株、VTT-E-64028株、SBC8026株およびJCM1170株の540bp断片の核酸配列を決定し、５’側から452bpの核酸配列を比較したところ、菌株間で数核酸〜数十核酸が異なっていることが判明した。それぞれの核酸配列を配列表の配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に示す。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
（実施例２）  供試菌株のグループ分け
ラクトバチルス・ブレビス種の４菌株の核酸配列に相違がみられたことより、それぞれを識別できる制限酵素サイトを検索し、制限酵素Hin1Ｉ、ApaLＩ、HaeＩＩＩを選び出した。
【００３５】
（約540bp増幅断片の制限酵素による切断）
実施例１で示したＰＣＲ増幅条件で、各種菌株の約540bp断片を増幅した。この断片を含む反応液8.5μｌに、10倍濃度の緩衝液１μｌおよび酵素液0.5μｌを加え、37℃、4時間〜１晩の間、反応を行った。Hin1ＩおよびHaeＩＩＩには緩衝液M、ApaLＩには緩衝液Lを使用した（寶酒造社）。反応終了後、反応液５μｌをポリアクリルアミドゲルに供し、ＤＮＡのバンドはエチジウムブロマイド溶液で10分間染色後、紫外線照射して観察した。各制限酵素で切断したパターンを図１に示す。図１および表１に従い、菌株の制限酵素切断パターンをグループ分けすると表３のようになる。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
JCM1559株を除く、１５株のラクトバチルス・ブレビス菌はグループＩ、ＩＩa、ＩＩb、ＩＩＩの何れかのグループに分類された。また、ラクトバチルス・ブレビス以外の菌株で、約540bpの断片が増幅された株については、増幅断片がHin1ＩおよびApaLＩで切断されないか、されても切断長がラクトバチルス・ブレビスのものと明らかに異なっていたため、上記Ｉ〜ＩＩＩの何れのグループにも属さないことが確認された。
【００３８】
（実施例３）  ビール混濁性株の識別
（イソα酸に対する耐性試験）
ラクトバチルス・ブレビス種に属する計１６株について、イソα酸に対する耐性試験を以下の手順で行った。
【００３９】
MRS液体培地（Difco社）で培養した培養液を滅菌生理食塩水にて、濁度OD660が約0.1になるように調製した。この菌液0.1mlを、試験管に分注した、40ppmのイソα酸（Versuchsstation Schweiz Breuereien社）を含むMRS液体培地（ｐH5.2）10mlに添加し、嫌気ボックス中、30℃、3〜10日間培養を行い、その間に増殖が目視で確認されたものを、イソα酸耐性を有する株と判定した。この耐性試験結果を各菌株について表４に示す。
【００４０】
（ビール混濁試験）
ラクトバチルス・ブレビス種に属する前記と同一の計１６株について、ビール混濁試験を以下の手順で行った。
【００４１】
MRS液体培地（Difco社）で培養した培養液を滅菌生理食塩水にて、濁度OD660が約0.1になるように調製した。この菌液0.1mlを、試験管に分注した市販のビール10mlに添加し、嫌気ボックス中、30℃、1〜4週間培養を行い、その間にビールの混濁等を目視で確認した。培養期間中に、ビールの混濁が確認されたものを、ビール混濁性を有する株と判定した。このビール混濁試験結果を各菌株について表４に示す。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
表４の結果から明らかなように、ビール混濁試験において、ビール混濁性を有する株と判定された株はすべてグループＩＩbに属している。なお、グループＩＩbに属するVTT-E-64029株は、ビール混濁試験において非混濁性株と判定された。しかし、本菌株は、乳酸菌のビール混濁性を判定する指標の1つとして考えられているイソα酸に耐性を示すことから、混濁性を示す生理状態に変化する可能性があると考えられる。したがって、グループＩＩbに属する菌株は、ビール混濁を起こす能力を有する可能性が非常に高い株である、と考えるのが妥当である。このように、実施例２において得られた制限酵素切断パターンに基づく分類とビール混濁性判定試験として認められているビール混濁試験やイソα酸耐性試験の結果に基づく分類が良好な一致を示すことから、本発明の判定方法は後者に劣らない信頼性のあるビール混濁性判定方法となる。しかも、本発明の判定方法は、菌株のＤＮＡさえ得られれば、約4〜10時間程度で完了し、数日以上の培養試験を必要とする従来技術の判定方法に比較して、判定時間の大幅な短縮をもたらす。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によれば、ラクトバチルス・ブレビス種と同定された菌株がビール中で増殖する能力（ビール混濁性）を有するか否かの判定を、従来技術の方法（例えば、ビール混濁試験やイソα酸耐性試験）よりも迅速、かつ正確に行うことができる。したがって、本発明の判定方法をビール工場における工程管理の指標として導入することにより、ビール製造工程における微生物管理に寄与することができる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２において得られた、各菌株からの約540bp増幅断片の制限酵素切断パターンを示す電気泳動模式図である。
【図１】
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