【手続補正書】
【提出日】平成20年10月3日(2008.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮角化細胞を、カルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養して得られる表皮角化細胞層膜。
【請求項２】
前記支持体が、０．１〜１２μｍの微細孔を有するポリエチレンテレフタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトラフルオロエチレン製から選択される隔膜であることを特徴とする、請求項１に記載の表皮角化細胞層膜。
【請求項３】
前記表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の表皮角化細胞層膜。
【請求項４】
請求項１〜３何れか１項に記載の表皮角化細胞層膜で隔された二室のチャンバーの一室に、被験物質で処理後或いは被験物質の添加と同時に、標識物質を充填し、被験物質の非存在下及び存在下における標識物質の他室への移動の程度を計測し、計測された移動の程度が、被験物質の存在下に比して、被験物質の非存在下の方が著しかった場合に、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用が著しいと判別することを特徴とする、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用の鑑別法。
【請求項５】
請求項４における標識物質がイオン性の物質であり、その移動の程度が電気抵抗値の変化として鑑別されることを特徴とする、請求項４に記載のバリア機能向上作用の鑑別法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用の鑑別法において、前記移動の程度が、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下の方が、非存在下の１０％以上の移動の抑制が観測された場合に、被験物質は皮膚バリア層透過抑制作用を有する物質であると判別することを特徴とする、皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、新規な表皮角化細胞層膜、及びそれを利用した皮膚バリア層における透過抑制作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、タイトジャンクションの発現する表皮角化細胞層膜を構築する技術を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、表皮角化細胞を、カルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養することにより、この様な表皮角化細胞層膜が得られることを見いだし、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）表皮角化細胞を、カルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養して得られる表皮角化細胞層膜。
（２）前記支持体が、０．１〜１２μｍの微細孔を有するポリエチレンテレフタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトラフルオリエチレン製から選択される隔膜であることを特徴とする、（１）に記載の表皮角化細胞層膜。
（３）前記表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の表皮角化細胞層膜。
（４）（１）〜（３）何れか１項に記載の表皮角化細胞層膜で隔された二室のチャンバーの一室に、被験物質で処理後或いは被験物質の添加と同時に標識物質を充填し、被験物質の非存在下及び存在下における標識物質の他室への移動の程度を計測し、計測された移動の程度が、被験物質の存在下に比して、被験物質の非存在下の方が著しかった場合に、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用が著しいと判別することを特徴とする、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用の鑑別法。
（５）（４）における標識物質がイオン性の物質であり、その移動の程度が電気抵抗値の変化として鑑別されることを特徴とする、（４）に記載のバリア機能向上作用の鑑別法。（６）（４）又は（５）に記載の皮膚バリア層のバリア機能向上作用の鑑別法において、前記移動の程度が、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下の方が、非存在下の１０％以上の移動の抑制が観測された場合に、被験物質は皮膚バリア層透過抑制作用を有する物質であると判別することを特徴とする、皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の表皮角化細胞層膜は、表皮角化細胞を、カルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養して得られることを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
かかる表皮角化細胞を培養すべきカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液培地としては、表皮角化細胞培養用の市販の培地を用いることができ、例えば、０．１５ｍＭのＣａを含有する液体培地である、「Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２」（倉敷紡績株式会社製）が好適に例示できる。かかる培地を用いて、支持体の存在下表皮角化細胞を２×１０6cell／ｍｌ播種し、３５〜４０℃で５０％二酸化炭素気流下で４８〜９６時間培養することにより、支持体にコンフルエントな状態で細胞層が形成される。ここで、コンフルエントな状態としては、支持体の表面全体に少なくとも一層の細胞が存在し、部分的には、多くとも３層程度の積層でとどまっている状態を意味する。又、前記支持体としては、この様な細胞層膜の構築に使用される支持体であれば特段の限定はなく、０．１〜１２μｍの微細孔が存在する膜が好ましく例示できる。この様な細胞層膜構築のための支持体は既に市販されているものが存し、かかる市販品を購入して使用することができる。例えば、コーニング社やミリポア社より、ポリエチレンテレフタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトタフルオロエチレン製の膜が市販されているので、これらを購入して使用することができ、好ましい。これらの中では、コーニング社製「トランスウェル」（０．４μｍポアを有するポリエチレンテレフタレート膜）が好ましく例示できる。又、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地としては、前記「Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２」に適宜塩化カルシウムなどのカルシウム塩を添加して調整し、用いることができる。かかる液体培地中で前記支持体上にコンフルエントとなって構築された表皮角化細胞層膜を３５〜４０℃で５０％二酸化炭素気流下で４８〜９６時間培養することにより、タイトジャンクション構造を有する細胞膜とすることができる。これに被験物質を加えて更に同条件で２４〜９６時間培養し、加えないで培養を続けたものとの膜の透過性の差を見ることにより、被験物質の表皮角化細胞層膜への影響を知ることができる。透過性の差は以下の鑑別法で述べるように鑑別できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用の鑑別法は、前記本発明の表皮角化細胞層膜を隔膜とした二室のチャンバーの一方に、被験物質を充填し前もって細胞層膜を被験物質で処理した後、或いは、被験物質と標識物質を同時に培地などのベヒクルとともに充填し、標識物質の他室への移動がどの程度被験物質の存在下阻害されるかを指標に鑑別される。ここで、標識物質としては、その移動が明確に検知できるものであればその種類を問わず、電位差、電導度、電気抵抗の変化などでその移動が把握できるイオン性物質、吸光度や蛍光強度でその移動が把握できる蛍光標識物質や色剤などが例示できる。
特に好ましいものとしてはイオン性物質が例示できる。かかるイオン性物質は培地に含有されているものでも良く、この場合は被験物質と標識物質の同時投与となり、かかるイオン性物質の移動の程度は細胞層の電気抵抗値を測定することにより鑑別できる。蛍光標識物質としては、蛍光標識デキストリンなどが例示でき、添加後更にインキュベーションをして蛍光強度の変化を見ることが好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
かかる鑑別において、標識物質の移動が、被験物質の存在下での表皮角化細胞層膜形成
で阻害された場合、表皮角化細胞層膜の構築が緻密にされていると判断され、これによってin vivo  の皮膚に適用した場合には、角層の物質透過の阻害性が向上し、以て、皮膚バリア機能が向上されると判定される。従ってこの様な被験物質は、皮膚に塗布すれば角層バリア機能を向上させる素材であると判別される。この有効性は、前記標識物質の移動の抑制において、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下の方が、非存在下の１０％以上の移動の抑制が観測された場合に有効と判別される。又、その抑制の程度が著しいほど、角層バリア機能の向上作用は著しいと判別される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
培養表皮角化細胞層におけるタイトジャンクションの検出（蛍光抗体染色法）
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。
コンフルエントになったことを確認し、そのまま０．１５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地で９６時間培養を続けたものと、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養したものに関して、タイトジャンクション構成タンパクの１つであるオクルーディンの抗体染色を実施した。すなわち、この培養ヒト表皮角化細胞を１％ホルマリン水溶液にて固定し、ブロッキング操作の後、抗オクルーディンン一次抗体（ウサギ製：ＺＹＭＥＤ社製）とＦＩＴＣ標識二次抗体（ロバ製：ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）処理による蛍光抗体染色を行った。結果を図１（高カルシウム条件）、図２（低カルシウム条件）に示す。図１、図２の結果より、培養途中でコンフルエントに達した後に、高カルシウム条件で培養することにより、図１に示すように、タイトジャンクション構成タンパク質の１つであるオクルーディンが細胞膜周辺に強く発現していることが判った（矢印）。一方、低カルシウム条件でそのまま培養を続けたものでは、この様なオクルーディンの強い発現と膜への局在は観察されず（図２）、本発明のスクリーニング方法で用いた条件において、タイトジャンクションが強く形成されていることが示唆された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
電流の抵抗値によるイオン性物質の透過抑制作用の測定
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。
コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ
２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、実施例２の製造例１のオウレン抽出エキス或いは実施例２の製造例２のトウヒ抽出エキスを１０-5ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換して、培養を継続し、１日後、２日後、３日後にＴＥＲを測定した。抽出エキスの添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値に対する、一定時間後のＴＥＲ値の割合（％）で示した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
蛍光物質の透過性抑制による皮膚バリア機能の測定
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。
コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、実施例２の製造例１のオウレン抽出エキスを無添加、１０―５ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換して、培養を継続した、１日後に上層、下層の培地をＰＢＳに交換し、ＰＢＳにて計３回洗浄し、上層に１ｍｇ／ｍｌ−ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ  ＰＢＳ溶液０．５ｍｌ、下層にＰＢＳを０．５ｍｌに置換して、２４時間後の下層の蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。図５の結果より、エキス無添加のコントロールに比べて、オウレン抽出エキスを添加して培養した系において、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの透過性が低下し、培養表皮角化細胞層のバリア機能が向上していることが判り、オウレン抽出エキスは皮膚バリア機能を向上させる作用を有していた。