(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境中のエストロゲンの高感度分析方法であって、試料中のエストロゲンを下記式(Ｉ)または式(II)により表されるラベル剤と反応させて、前記エストロゲンのフェノール性水酸基と該ラベル剤のクロロスルホニル基との反応によりエストロゲンの標識化を行い、該標識されたエストロゲンをクロマトグラフにより分離し、該分離されたエストロゲンにＥｕイオンを反応させてＥｕイオン錯体を形成し、該Ｅｕイオン錯体の濃度を時間分解蛍光検出法により分析することを特徴とする前記高感度分析方法。
【化１】
0004134304.tif 000011
0004134304.tif 000012
【請求項２】
前記エストロゲンがエストリオール、エストラジオールまたはエストロンから選択される請求項１に記載の高感度分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラベル剤およびそれを用いた高感度分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分を高感度に分析するために、通常の蛍光性化合物でラベルし、その蛍光測定により分析することが知られている。しかし、かかる通常の蛍光性化合物はバックグラウンド蛍光が大きく、環境中のエストロゲン等の微量成分を高感度に測定するにはさらにバックグラウンド蛍光を除き十分な検出限界を確保する必要がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なＥｕ（３＋）イオンと蛍光性の錯体を形成するラベル剤と、該ラベル剤を用いた高感度分析方法を提供する。特に環境中のエストロゲンを高感度で分析する方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は従来の蛍光性化合物の有する問題点を解決すべく鋭意研究した結果、新規な構造を有するラベル剤を見出した。このラベル剤は分析目的物に共有結合して安定に標識することが可能であり、通常のカラムクロマトグラフにより分離精製することができる。さらに、分離された標識された目的物はＥｕイオンと反応して安定な蛍光性錯体を形成し、得られる錯体の時間分解蛍光測定により、低バックグラウンドの十分な検出限界を有する高感度分析が可能とする。
【０００５】
すなわち、本発明にかかる新規なラベル剤は、環境中のエストロゲン等と反応して共有結合を形成する官能基を有する。さらに、Ｅｕイオンと安定な蛍光性錯体を形成するためのフッ素置換アルキル基とビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子構造を有するものである。
【０００６】
より詳しくは、本発明にかかる新規なラベル剤は、式（Ｉ）により表される構造を有する。
【化４】
0004134304.tif 000002
【０００７】
また、本発明は、上で説明した本発明にかかるラベル剤を用いた目的物の高感度分析方法を提供するものである。すなわち、目的物をラベル剤反応させて標識し、標識された前記目的物をクロマトグラフにより分離し、前記分離された目的物にＥｕイオンを反応させてＥｕイオン錯体を形成し、前記Ｅｕイオン錯体の濃度を時間分解蛍光検出法により分析することを特徴とする前記目的物の高感度分析方法を提供するものである。
【０００８】
さらに、本発明は、前記ラベル剤が、特に式（Ｉ）または式（II）により表されるラベル剤であることを特徴とする高感度分析方法をも提供するものである。
【化５】
0004134304.tif 000003
【化６】
0004134304.tif 000004
【０００９】
さらに、本発明は、前記Ｅｕイオン錯体を、Ｅｕ（３＋）塩とトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドとから形成することを特徴とする高感度分析方法をも提供するものである。
また、本発明は、特に前記目的物が、環境中のエストロゲンであることを特徴とする高感度分析方法をも提供するものである。
以下、本発明を実施の形態に即して詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
ラベル剤
本発明にかかるラベル剤は、分析目的物に共有結合して安定に標識することを可能とし、通常のカラムクロマトグラフによる良好な分離を可能とする機能と、分離された標識された目的物はＥｕイオンと反応して安定な蛍光性錯体を形成し、得られる錯体の時間分解蛍光測定により、低バックグラウンドの十分な検出限界を有する高感度分析が可能とする。
【００１１】
すなわち、本発明にかかる新規なラベル剤は、標識される目的物（例えば環境中のエストロゲン等）と反応して共有結合を形成する官能基を有する。かかる官能基としては、目的物が有する置換基により種々選択することが可能である。エストロゲンのような水酸基を有する目的物の場合、ＳＯ2Ｃｌ基のような基が特に好ましい。以下説明する本発明のラベル剤が芳香環を有するものであるからかかるＳＯ2Ｃｌ基の導入はＨＳＯ3Ｃｌと反応させることにより容易である。
【００１２】
さらに、本発明においては、Ｅｕイオンと安定な錯体を形成し、かつその錯体が十分な蛍光強度および寿命を有するものとするために、フッ素置換アルキル基（ＣnＦ2n+1、ｎは２〜５の整数）とビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子構造を有するものが好ましい。より詳しくは、本発明にかかる新規なラベル剤は、式（Ｉ）または（II）により表される構造を有する。式（II）で示す構造は、式（Ｉ）で示すＥｕイオンへのβ−ジケトン配位子を１分子中に２個有する構造である。
【化７】
0004134304.tif 000005
【化８】
0004134304.tif 000006
【００１３】
式（Ｉ）に示す構造のラベル剤は、他の配位子、例えばトリフェニルホスフィンオキシドとともにＥｕイオンと式（III）に示すような蛍光性錯体を形成する（ｎが２の場合を示した）。一方、式（II）で示すラベル剤はその分子中で」Ｅｕイオンと錯体を形成する（図示せず）。
【００１４】
【化９】
0004134304.tif 000007
【００１５】
高感度分析方法
本発明にかかる高感度分析方法は、上で説明した本発明にかかるラベル剤を用いることを特徴とするものである。また、目的物に該ラベル剤を反応させて標識し、カラムクロマトグラフで分離精製した後、分離した標識目的物にＥｕイオンを反応させて蛍光性錯体とし、得られる錯体の蛍光強度を時間分解蛍光測定で分析することを特徴とする。Ｅｕイオン錯体の時間分解蛍光測定の測定データを、あらかじめ標準物を用いて作成した検量線を利用することにより、各目的物の濃度を分析することが可能となる。
【００１６】
具体的には、本発明を用いる目的物の高感度分析方法は、（１）目的物を前記ラベル剤と反応させて標識するステップと、（２）該標識された前記目的物をクロマトグラフにより分離するステップと、（３）前記分離された目的物にＥｕイオンを（または他の配位子とともに）反応させてＥｕイオン錯体を形成するステップと、（４）前記Ｅｕイオン錯体の濃度を時間分解蛍光検出法により測定して目的物の濃度を分析するステップからなる。また、ステップ（４）では、標準目的物を用いた検量線をあらかじめ作成するステップをも含む。特に、式（Ｉ）のラベル剤を用いる場合、前記他の配位子としてトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドを用いることが好ましい。
【００１７】
かかる分析方法を用いる目的物としては、特に制限はないが、本発明は、環境中のエストロゲン（またはその混合物）の各成分を高感度に分析可能とする。
また、ラベル剤との反応は温和な条件で攪拌するのみで十分安定な標識が可能である。必要ならば適当な時間加温して反応を促進完了させることが好ましい。
【００１８】
標識された目的物を分離精製する手段についても特に制限はないが、通常公知のクロマトグラフであって、迅速にかつ再現性よく高い分離性能を得る条件を選択することは当業者にとって容易である。具体的には実施例で使用したような逆相型の充填剤カラムを用いた高速液体クロマトグラフの使用が好ましい。目的物の性質や他の成分の種類や量により条件を適宜選択することも容易である。
【００１９】
分離した標識された目的物は単離することなく、クロマトグラフから出てきた溶液にポストカラム条件でＥｕイオンを含む溶液と混合して反応させて安定な蛍光性錯体を含む溶液とすることが可能である。
【００２０】
蛍光性錯体を含む溶液の吸収測定、蛍光測定、時間分解蛍光測定の方法または装置については特に制限されず、公知の装置がそのまま、または必要な改変を行って使用することができる。励起光波長、検出波長、ゲート時間等の設定については当業者が容易に最適化することができる。
【００２１】
目的物の濃度を測定するためには、濃度既知の標準物を用いて、同様の方法でラベル剤と反応させ、またＥｕイオンと蛍光性錯体を調整することにより容易に検量線を作成することができる。標準物の濃度を変えて測定することにより検出限界値を求めることも容易である。
以下、本発明を、実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
【００２２】
【実施例】
実施例１
4,4′−bis(1″,1″,1″,2″,2″,3″,3″−heptafluoro-4″,6″−hexanedione−6″−yl)−chlorosulfo-o-terphenyl（以下BHHCTとする）の合成：
J．Yuan，K．Matsumoto，H．Kimura，Anal．Chem.，70，596（1998）に従って合成した。
元素分析：
計算値C30H17F14O7ClS（BHHCT(H2O)とした）：C 43.78; H 2.08、実測値：C 43.96; H 2.10.
1H NMR (270 MHz, acetone-d6 r.t.) δ 8.34, 8.33, 8.31, 8.30(1H)，8.24，8.23(1H)，8.16，8.13(4H)，8.00，7.98(1H)，7.57, 7.56, 7.54, 7.53(4H)，7.02(2H).
【００２３】
実施例２
5−(4″−chlorosulfo−1′,1″−diphenyl−4′−yl)−1,1,1,2,2−pentafluoro−3,5−pentanedione（以下CDPPとする）の合成（図１）：
(１)  5−(1′,1″−diphenyl−4′−yl)−1,1,1,2,2−pentafluoro−3,5−pentanedione（DPP）の合成：
無水ジエチルエーテル７０ml、ナトリウムメトキシド(3.0ｇ, 55mmol)、およびペンタフルオロプロピオン酸エチル(東京化成、3.80ｇ、20mmol) に4′−フェニルアセトフェノン(Merck、3.881ｇ, 20mmol) を加え２４時間攪拌した。減圧濃縮によりジエチルエーテルを除去した後、１５％硫酸水溶液を１００ml加えて中和し、沈殿をろ過、純水で洗浄した。１００mlのエタノールから再結晶を１回行い、得られた固体を４８時間真空乾燥してＤＰＰを得た（収量 2.88ｇ、収率 42.4％）。
元素分析：
計算値C17H11F5O2 : C, 59.65;  H, 3.24、実測値:  C, 60.82; H, 3.29.
1H NMR (270 MHz, acetone-d6 r.t.) δ 8.27 (m, 2H, Ha) ; 7.92  (m, 2H, Hb) ; 7.79 (m, 2H, Hc) ; 7.56-7.44 (m, 3H, Hd  and He) ; 7.07 (s, 1H, Hα).
(２)  5-(4″−chlorosulfo−1′,1″−diphenyl−4′−yl)−1,1,1,2,2−pentafluoro−3,5−pentanedione（CDPP）の合成：
クロロ硫酸12.5ｇにＤＰＰ２.５０ｇ（7.30mmol）を加え常温にて７時間攪拌した後、攪拌下の２００ml Ｈ2Ｏ（氷浴中）に反応溶液を滴下した。生成する沈殿を遠心分離し、冷水で洗浄した。吸引ろ過後、得られた固体を４８時間真空乾燥してＣＤＰＰを得た（収量 2.46ｇ、収率 73.2％）。
元素分析：
計算値C17H11F5O4.5SCl (CDPP・0.5 H2Oとした): C, 45.40; H, 2.46、実測値: C, 45.33;  H, 2.01.
1H NMR ( 270 MHz, acetone-d6 r.t.) δ 8.35 (m, 2H, Ha) ; 8.28 (m, 2H, Hb) ; 8.20 (m, 2H, Hc) ; 8.06 (m, 2H, Hd) ; 7.12 (s, 1H, Hα).
【００２４】
実施例３  エストロゲンの標識化反応
用いたＢＨＨＣＴ、ＣＤＰＰおよび３種類のエストロゲンであるエストリオール（Ｅ３）、エストラジオール（Ｅ２）、エストロン（Ｅ１）の構造を図２に示した。
（１）測定対象物質
エストロゲンのフェノール性水酸基とＢＨＨＣＴもしくはＣＤＰＰ中のクロロスルホニル基との反応でエストロゲンの標識化を行なった（図３）。
（２）エストロゲン標準溶液の調製
estriol (和光純薬、2.8mg, 10μmol)、estradiol (和光純薬、2.8mg, 10μmol)、estrone (ナカライテスク、2.7mg, 10μmol)、CDPP (45.0mg, 100μmol) をジメチルアセトアミド（DMA）４００μlに溶解し、トリエチルアミン１００μl を加え、室温で２時間攪拌した後、アセトニトリルで１０mlに定容した。ＢＨＨＣＴ（80.0mg, 100μmol）についても同様の操作を行い標識化した。
【００２５】
実施例４  エストロゲンの分離分析
ＨＰＬＣ条件：
移動相溶液としてトリフルオロ酢酸（関東化学）、アセトニトリル（関東化学，HPLC用）を、ポストカラム溶液として酢酸ユウロピウム(III)四水和物（和光純薬），トリ−n−オクチルホスフィンオキシド（MERCK）、ポリエチレングリコール モノ−４−オクチルフェニルエーテル（Triton-X-100, 東京化成）を用いた。
0004134304.tif 000008
試料は上記（２）で調整した標準溶液をアセトニトリルにて希釈して用いた。
図４に実験で用いたポストカラム法による分離システムの概略を示した。
【００２６】
実施例５
（１）蛍光スペクトルおよび蛍光寿命の測定
１μM（CDPP）、５μM（Eu3+）、１０μM（TOPO）、０.１％ Triton-X-100を含む２０％アセトニトリルTris-HCl緩衝溶液（pH＝8.0）の蛍光スペクトルをF-4500 (HITACHI)、蛍光寿命をLS 50B（PERKIN ELMER）にて測定した。BHHCTについても同様の操作を行った（図５）。
ＣＤＰＰ標識蛍光性錯体のλex.max は３４５nmと６１３nmであり、蛍光寿命は６６４μsであった。また、ＢＨＨＣＴ標識蛍光性錯体のλex.max は３４２nmと６１３nmであり、蛍光寿命は７２２μsであった。
（２）吸収スペクトルおよび吸光度の測定
１５μM（CDPP）、および１６μM（BHHCT）のアセトニトリル溶液の吸収スペクトルをV-570（JASCO）にて測定した。
ＣＤＰＰ標識蛍光性錯体のλmax は３４３nm（ε350 ：22000）、ＢＨＨＣＴ標識蛍光性錯体のλex.max  は３４０nm（ε350 ：34000）であった。
ＣＤＰＰおよびＢＨＨＣＴで標識したエストロゲンは、エストリオール、エストラジオール、エストロンの順に検出された。また、得られたＣＤＰＰならびにＢＨＨＣＴで標識したエストロゲンの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）は表１、２に示した。
【００２７】
【表１】
0004134304.tif 000009
【００２８】
【表２】
0004134304.tif 000010
【００２９】
５pmolから５００pmolにおけるＵＶ、ＴＲＦＤの検量線をそれぞれ図６〜９に示した。ＣＤＰＰで標識したエストロゲンとＢＨＨＣＴで標識したエストロゲンのＴＲＦＤによるクロマトグラムを図１０、１１に示す。
各種エストロゲンを個別に標識して得られたクロマトグラムについて、ＵＶおよびＴＲＦＤの測定結果を図１２〜１９に示した。
【００３０】
この結果から、ＣＤＰＰで標識したエストロゲンも、ＢＨＨＣＴで標識したエストロゲンよりもＴＲＦＤでの検出限界は良好であり、また検量線の傾きも十分大きい（特にCDPPが大きい）ため、エストロゲンはＣＤＰＰを用いるとより高感度に測定できる。
ＣＤＰＰとＢＨＨＣＴの蛍光スペクトルを比較するとＢＨＨＣＴのほうが蛍光強度は強い。しかしＨＰＬＣへ応用すると、ＢＨＨＣＴで標識したエストロゲンの保持時間はＣＤＰＰで標識したエストロゲンの２倍であるためピークは広がった。ＢＨＨＣＴで標識したエストロゲンの保持時間を短くするために、移動相中に含まれるアセトニトリルの割合や流速を増やすとＴＲＦＤでの蛍光強度は小さくなった。ＣＤＰＰについても同様のことが言え、ＴＲＦＤでの蛍光強度はＨＰＬＣシステムにおける水とアセトニトリルの割合に大きく依存していた。
【００３１】
本発明により、ＨＰＬＣにおける分離能からはＣＤＰＰのほうがＢＨＨＣＴよりもより最適であるとされたが、ユウロピウムとＣＤＰＰの錯形成反応時間や温度などについてさらに最適化することによりより高感度な検出が行えるシステムへ改良することは当業者にとって容易である。従って、本発明にかかる方法を用いることで、河川水などの環境中に含まれるエストロゲンの定量が行える。
【００３２】
【発明の効果】
本発明にかかる新規なラベル剤は共有結合を形成する官能基を有することから、環境中のエストロゲン等の目的物を容易に標識することができる。また、フッ素置換アルキル基とビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子構造を有することから、Ｅｕイオンと安定な長寿命の蛍光性錯体を形成することができる。従って、新規なラベル剤により標識された目的物を、カラムクロマトグラフで分離精製し、その後にＥｕイオンで蛍光性錯体を形成させ、得られた蛍光錯体の時間分解蛍光測定を行うことにより、目的物を低バックグラウンドで高感度に分析することができる。特に前記目的物が、環境中のエストロゲンである場合、これらの微量成分を十分高感度（十分な検出限界）で分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるＣＤＰＰの合成経路を示す図である。
【図２】本発明にかかるＣＤＰＰ、ＢＨＨＣＴおよびエストロゲンの構造を示す図である。
【図３】本発明にかかるＣＤＰＰにより目的物を標識する反応を示す図である。
【図４】本発明にかかる高感度分析方法の一態様を示す図である。
【図５】ＣＤＰＰおよびＢＨＨＣＴの蛍光スペクトルを示す図である。
【図６】ＣＤＰＰエストロゲンの検量線（ＵＶ）を示す図である。
【図７】ＣＤＰＰエストロゲンの検量線（ＴＲＦＤ）を示す図である。
【図８】ＢＨＨＣＴエストロゲンの検量線（ＵＶ）を示す図である。
【図９】ＢＨＨＣＴエストロゲンの検量線（ＴＲＦＤ）を示す図である。
【図１０】ＣＤＰＰエストロゲンのクロマトグラム（ＴＲＦＤ）を示す図である。
【図１１】ＢＨＨＣＴエストロゲンのクロマトグラム（ＴＲＦＤ）を示す図である。
【図１２】ＣＤＰＰのクロマトグラム（ＵＶ）を示す図である。
【図１３】ＣＤＰＰ−ｅｓｔｒｉｏｌのクロマトグラム（ＵＶ）を示す図である。
【図１４】ＣＤＰＰ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌのクロマトグラム（ＵＶ）を示す図である。
【図１５】ＣＤＰＰ−ｅｓｔｒｏｎｅのクロマトグラム（ＵＶ）を示す図である。
【図１６】ＣＤＰＰのクロマトグラム（ＴＲＤＦ）を示す図である。
【図１７】ＣＤＰＰ−ｅｓｔｒｉｏｌのクロマトグラム（ＴＲＤＦ）を示す図である。
【図１８】ＣＤＰＰ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌのクロマトグラム（ＴＲＤＦ）を示す図である。
【図１９】ＣＤＰＰ−ｅｓｔｒｏｎｅのクロマトグラム（ＴＲＤＦ）を示す図である。
【図１】
0004134304.tif 000013
【図２】
0004134304.tif 000014
【図３】
0004134304.tif 000015
【図４】
0004134304.tif 000016
【図５】
0004134304.tif 000017
【図６】
0004134304.tif 000018
【図７】
0004134304.tif 000019
【図８】
0004134304.tif 000020
【図９】
0004134304.tif 000021
【図１０】
0004134304.tif 000022
【図１１】
0004134304.tif 000023
【図１２】
0004134304.tif 000024
【図１３】
0004134304.tif 000025
【図１４】
0004134304.tif 000026
【図１５】
0004134304.tif 000027
【図１６】
0004134304.tif 000028
【図１７】
0004134304.tif 000029
【図１８】
0004134304.tif 000030
【図１９】
0004134304.tif 000031