(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）１５〜２５℃で液状を示す油相２０〜９０重量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、Ｅ）アミノ酸またはその塩０．０１〜１０重量％および分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコール０．０１〜１０重量％、およびＤ）生物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜７５重量％を含有する油中水型オイルアジュバントワクチン。
【請求項２】
Ａ）１５〜２５℃で液状を示す油相３０〜９０重量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、Ｅ）アミノ酸またはその塩０．０１〜１０重量％および分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコール０．０１〜１０重量％、およびＤ）生物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜６５重量％を含有する油中水型オイルアジュバント相と、Ｆ）非イオン系界面活性剤を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤０．２〜２０重量％を含有する外水相からなる水中油中水型オイルアジュバントワクチン。
【請求項３】
Ａ）１５〜２５℃で液状を示す油相が脂肪酸エステルである請求項１または２に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項４】
Ａ）常温で液状を示す油相が脂肪酸エステルとスクアレンとの混合物である請求項１または２に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項５】
Ａ）１５〜２５℃で液状を示す油相が、シス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸とアルコールとのエステル化物である請求項１または２に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項６】
Ｂ成分の非イオン系界面活性剤を構成する脂肪酸が、シス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸である請求項１または２に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項７】
Ｆ）の外水相が、非イオン系界面活性剤を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤とグリセロリン脂質との混合物０．２〜２０重量％を含有する外水相である請求項２に記載の水中油中水型オイルアジュバントワクチン。
【請求項８】
Ａ）１５〜２５℃で液状を呈する油相に、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物と、Ｂ成分の非イオン系界面活性剤とＥ）アミノ酸またはその塩および分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコールを含有する水溶液とを、Ｂ成分の非イオン系界面活性剤：Ｅ成分の水溶液が重量比で１：１から１：２０となるように混合、攪拌したものとを加えたのち、Ｄ）生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加えて乳化させることを特徴とする請求項１に記載の油中水型オイルアジュバントワクチンの調製方法。
【請求項９】
Ａ）１５〜２５℃で液状を呈する油相に、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物と、Ｂ成分の非イオン系界面活性剤とＥ）アミノ酸またはその塩および分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコールを含有する水溶液とを、Ｂ成分の非イオン系界面活性剤：Ｅ成分の水溶液が重量比で１：１から１：２０となるように混合、攪拌したものとを加えたのち、Ｄ）生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加えて調製した油中水型オイルアジュバントワクチンを、さらにＦ）非イオン系界面活性剤を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤０．２〜２０重量％を含有する水相中に添加し、乳化することを特徴とする請求項２に記載の水中油中水型オイルアジュバントワクチンの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オイルアジュバントワクチンおよびその調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オイルアジュバントワクチンは、古くから効率よく免疫を強化するワクチンとしてよく知られている。とくに、不活化した抗原を用いる場合には、非常に有効な免疫増強効果を発揮することから、実験室レベルでは依然として古典的なオイルアジュバントワクチンであるFreundのアジュバントが利用されている。しかし、Freundのアジュバントに代表される鉱物油を主成分とするオイルアジュバントは、確かに高い免疫増強効果が認められる反面、接種反応も著しく、接種部位周辺に無菌化膿巣や肉芽腫の形成を引き起こし、外面的には浮腫、腫脹、硬結、壊死が観察されることや残留性が懸念されることなどから、ワクチンへの応用が大きく阻まれてきた。家畜における局所反応の残留は、その肉を消費に適さないものにすることから、可能な限り軽減することが望まれる。それゆえ鉱物油を主成分とするオイルアジュバントを用いたワクチンは、接種部位などで制限を受ける場合がある。
【０００３】
ワクチンの有効性と持続性を高いレベルで保持させることは、疾病の予防というワクチン本来の目的を果たす上で不可欠な要素であるが、その対象が生体であることを考慮すると、有効性や持続性だけでなく、ワクチン自体の安全性がきわめて重要となってくる。
【０００４】
そこで、これらの問題を解決することを目的として、これまで多くの検討が行われてきている。たとえば、特公平６−８１７３１号公報には、界面活性剤として無水マンニトール・オレイン酸エステルを、油分として流動パラフィンを用いた油中水滴型の油性アジュバントが示されている。ＷＯ９１／００１０７号（特表平４−５０６５２１号）公報には、油分として植物油などの代謝可能な油と鉱物油などの代謝不可能な油を混合して用いた低粘度の油中水型の油性アジュバントが示されている。また、特開平６−１７２２１６号公報には、油分に植物油を、界面活性剤としてソルビタン脂肪酸エステルとポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステルを用いたオイルアジュバントワクチンが示されており、特公平６−３９３８６号公報には、生免疫原材料と、鉱物油を使用した水中油型乳剤とを混合したアジュバント生ワクチンが示されている。
【０００５】
しかるに、上記の方法によるオイルアジュバントワクチンはいずれも、注射局所反応や生体内残留性などの面に加え、ワクチンとしての製剤安定性の面でも満足できるものではなかった。
ワクチンは、接種対象があくまでも生体であることから、有効でかつ可能な限り安全なものが求められるのは当然のことであるが、医薬品であることを考慮すると、できる限り安定なものが求められる。
【０００６】
しかし、オイルアジュバントワクチンの場合は、エマルションのタイプや使用する油分および界面活性剤の種類等によって、免疫増強作用だけでなく、製剤としての安定性に大きな差が生じることが知られており、とくに不活化ワクチンの場合、十分な感染防御力を長期間、しかも再現性よく発現させるワクチンを調製することが困難であった。
また、従来の油中水型オイルアジュバントワクチンの短所である注射局所反応や生体内残留性を改善させることを目的として、水中油中水型のオイルアジュバントワクチンなどが提案されているが、従来の手段では、製剤としての長期安定性の面で多くの問題が残されており、実用化させることが困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来、局所反応や残留性、製剤安定性のために利用が制限されていたオイルアジュバントワクチンに関し、それらの問題点を解決するものであり、その目的とするところは、免疫刺激物質を処方中に使用しなくても、高い抗体産生力を長期間維持することができ、生体に安全で、かつ製剤安定性にすぐれたオイルアジュバントワクチンを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、鋭意検討した結果、常温で液状を示す油分と、親油性である特定の非イオン系界面活性剤とヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物との混合物である乳化剤と、生物学的に許容される有効量の抗原成分を含有する水相とで構成される油中水型オイルアジュバントワクチン、およびこの油中水型エマルション（上記油中水型オイルアジュバント）で構成される相と、特定の乳化剤を含む外水相からなる水中油中水型オイルアジュバントワクチンが、生体に接種した際の局所安全性にすぐれ、すぐれた抗体産生力を長期間発揮するものであることを見出すと共に、この油中水型オイルアジュバントワクチンを調製する際、まず常温で液状を示す油分に、親油性である特定の非イオン系界面活性剤と、ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物と、さらに親油性である特定の非イオン系界面活性剤とアミノ酸またはその塩および特定の糖または糖アルコールを含有する水溶液との混合物を加えたのち、抗原を含有する水相を加えて乳化する方法をとることにより、非常に低粘度な領域においても高い安定性を示し、かつ抗体産生力およびその維持能にすぐれた油中水型オイルアジュバントワクチンを調製できること、また、この方法に従い油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した後、さらにこれを特定の乳化剤を含む水相に添加し、乳化することにより、安全性並びに安定性に優れ、かつ従来の同タイプのものに比べすぐれた抗体産生力を長期間発揮する水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の第一は、Ａ）常温で液状を示す油相２０〜９０重量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を示す非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、およびＤ）生物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜７５重量％を含有するオイルアジュバントワクチンに関するものである。
【００１０】
また本発明の第二は、Ａ）常温で液状を示す油相３０〜９０重量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、40℃で液状を示す非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、およびＤ）生物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜６５重量％を含有する油中水型オイルアジュバント相、およびＦ）非イオン系界面活性剤を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤０．２〜２０重量％を含有する外水相からなる水中油中水型オイルアジュバントワクチンに関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のオイルアジュバントワクチンを構成するＡ成分は、常温で液状を示す油分である。この明細書において「常温」とは、１５〜２５℃の範囲内の温度を意味する。
常温で液状を呈する油分としては、従来より一般的に食品や医薬品、化粧品などに用いられているエステル系油性基剤、あるいは非エステル系油性基剤のうち、常温で液状を示すものから種々選択、使用することができる。常温で液状を示す非エステル系油性基剤としては、軽質流動パラフィンやスクアレン、スクアラン、ポリブテンなどが挙げられる。また、常温で液状を示すエステル系油性基剤としては、カプリル酸やカプリン酸などの中鎖の飽和脂肪酸や、オレイン酸やリノール酸などの長鎖の不飽和脂肪酸とアルコールから誘導される種々のエステル系誘導体の他、天然由来の脂肪酸エステルであるピーナツ油、オリーブ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ホホバ油などの液状の植物油、あるいは動物由来の液状油であるオレンジラフィー油などが挙げられ、これらのうちから、目的に応じて１種、あるいは、２種以上の混合物として用いればよい。その中でも、オレイン酸のエステル系誘導体や植物油といった油は、酸化安定性が比較的高いことに加え、生体に対する親和性が高く、局所刺激性や残留性を低減できるという長所を有しているため、油分としては、これらの代謝性油のみから、１種、あるいは、２種以上の混合物を選択、使用する方が好ましい。とくに好ましくは、シス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸と、たとえば、グリセロール、ジグリセロール、プロピレングリコール、エチルアルコール、デシルアルコール、あるいはシス−Δ９−オクタデセノールを８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪族アルコールを９０重量％以上含有するオレイルアルコールなどとのエステル化物からなるエステル系油性基剤を用いるのがよい。また、本発明においては、上記のエステル系油性基剤とスクアレンとを混合して用いることもできる。
【００１２】
本発明において、オイルアジュバントワクチンを構成する乳化剤の一つであるＢ成分は、３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を示す親油性の非イオン系界面活性剤である。上記の部分エステルは、多価アルコールの種類によって異なるが、たとえば、水酸基が３個のグリセロールの場合、主にモノエステルとジエステルと少量のトリエステルとの混合物であり、水酸基が４個のジグリセロールやソルビタンの場合、モノエステル、ジエステルと少量のトリエステルおよびテトラエステルとの混合物である。これら部分エステルまたはそれらの混合物のうち、４０℃で液状を示し、かつ親油性であるものが選択、使用される。
【００１３】
部分エステルを構成する３個以上の水酸基を有する多価アルコールとしては、たとえば、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール、ヘキサグリセロール、オクタグリセロール、デカグリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ソルビタンなどが挙げられる。
部分エステルを構成する脂肪酸としては、たとえば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸など、上記の多価アルコールとの部分エステルが４０℃で液状を呈するものである限り、公知の種々の脂肪酸を使用することができる。これらの脂肪酸の中でも、とくにシス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸が好ましい。
【００１４】
Ｂ成分の部分エステルとして、とく特に好適なものは、上記のシス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸から誘導される、グリセロールモノオレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンジオレート、ジグリセロールモノオレート、ジグリセロールジオレートなどである。これらの部分エステルは、アシル基として高純度に精製されたオレイン酸が導入されているため、乳化剤としての酸化安定性にすぐれ、また界面活性剤分子間の配向性が高まる結果、乳化安定性などの機能性にすぐれるといった特徴があり、現在、一般に市販されているオレイン酸誘導体と比べて、最終的に調製されるオイルアジュバントワクチンの安定性が改善されるとともに、生体に接種した際の安全性が大きく向上するという効果を有している。
【００１５】
本発明のオイルアジュバントワクチンを構成するＣ成分であるヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物において、ヒドロキシ脂肪酸のトリグリセライドとしては、ヒマシ油や硬化ヒマシ油などがある。この場合、エチレンオキサイドの平均付加モル数が２０モル未満では、低粘度な領域で安定なエマルションを形成させることができず、結果として、良好なオイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。また、エチレンオキサイドの平均付加モル数が６０を越えると、エマルションが転相しやすくなり、やはり、最終的に良好なオイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。このトリグリセライドのエチレンオキサイド付加物の使用量は、全処方中（油中水型オイルアジュバントワクチンの全体量中）、０．５〜１０重量％程度とするのがよい。０．５重量％未満では、ワクチンの乳化安定性が低下する恐れがある。また、１０重量％を越えると、エマルションが転相しやすくなり、やはりワクチンの安定性が低下する恐れがある。
【００１６】
本発明で用いるＥ成分は、アミノ酸またはその塩と、分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコールである。本発明においては、オイルアジュバントワクチン中にアミノ酸またはその塩と分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコールを含有させることにより、ワクチンの乳化安定性をさらに高めることができる。アミノ酸またはその塩としては、食品や日本薬局方医薬品あるいは日本薬局方外医薬品として一般的に用いられているものの中から選択使用できる。アミノ酸には、グリシン、アラニン、アルギニン塩酸塩、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、ハイドロキシプロリン、セリン、スレオニン、パリン、フェニルアラニンなどがあり、これらの中でも中性のアミノ酸が好ましい。また、アミノ酸の塩には、ナトリウム塩やカリウム塩などの１価の金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩などの２価の金属塩がある。これらのアミノ酸またはその塩のうち、とくにアスパラギン酸ナトリウム１水和物、アスパラギン酸カリウム２水和物、グルタミン酸ナトリウム１水和物、グルタミン酸カリウム１水和物などが好ましく用いられる。これらのアミノ酸は、通常Ｌ−体であるが、その異性体であるＤ−体、またそれらの混合物であるＤＬ−体であっても同様に使用できる。
【００１７】
また、上記の非還元性の糖または糖アルコールとしては、食品や日本薬局方医薬品あるいは日本薬局方外医薬品として一般的に用いられているものの中から選択使用でき、とくにトレハロース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトールなとが好ましく用いられる。
本発明で用いられるアミノ酸またはその塩および分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アルコールの使用量は、それぞれ全処方中（オイルアジュバントワクチンの全体量中）、０．０１〜１０重量％とするのがよい。
オイルアジュバントワクチンにおいて、Ａ成分の油分およびＤ成分の抗原を含有する水相の比率は、アジュバントの用途目的あるいは選択する抗原種に応じて、適宜選択される。とくに、本発明の油中水型オイルアジュバントワクチンは、特定の油分と特定の乳化剤が組み合わされていることにより、高い安定性が維持されるので、これに応じて油分および抗原を含有する水相の比率も広い範囲で選択することができる。一般的には、油分：水相が重量比で９０：５から２０：７５、好ましくは、８０：１５から３０：６５となるようにするのがよい。
【００１８】
また、このアジュバントの調製に際し、前記Ｂ成分の非イオン系界面活性剤とＣ成分のヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との添加量は、両者を合わせて、全処方中、０．５〜３０重量％、好ましくは３〜２０重量％の割合とするのが望ましい。０．５重量％未満では安定な乳化系を得ることができず、３０重量％を越えると、注射局所での反応性が高まり、本発明の目的とする安全性の高いオイルアジュバントワクチンが得られなくなる。
【００１９】
本発明のオイルアジュバントワクチンの第一は、上記の油分、乳化剤および抗原を含有する水相により構成される油中水型オイルアジュバントワクチンであり、このオイルアジュバントワクチンは、たとえばつぎのような方法で調製することができる。まず、Ａ成分の油分に、Ｂ成分の４０℃で液状を呈する非イオン系界面活性剤と、Ｃ成分のヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物とを加えて撹拌混合し、しかるのちにＤ成分の生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加えて撹拌混合して乳化させるというものであり、この方法により、良好な乳化状態を有する油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができる。
【００２０】
本発明ではその際、Ａ成分の常温で液状を呈する油分に、Ｂ成分の３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで４０℃で液状を示す親油性の非イオン系界面活性剤と、Ｃ成分のヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物と、さらにＢ成分の非イオン系界面活性剤とＥ成分の水溶液とを前者：後者が重量比で１：１から１：２０となるように混合し、これを強固なゲル状の組成物となるまで攪拌したものを加えて、混合、分散させ、しかるのちにＤ成分の生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加えて攪拌混合して乳化させることにより、安全性が損なわれることなく、低粘度であって、しかも低温保存下においても非常に高い安定性を有する油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができる。その際、上記のＢ成分の３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで４０℃で液状を示す親油性の非イオン系界面活性剤とＥ成分の水溶液からなる強固なゲル状の組成物を調製する時に、攪拌機によって高温になる場合には、常温以下に保つために冷却しながら攪拌を行うようにすればよい。
【００２１】
なお、Ｂ成分とＥ成分の水溶液との混合比率は、Ｅ成分の水溶液中のアミノ酸またはその塩および非還元性の糖または糖アルコールの種類とその濃度に応じて、適宜最適な比率が選ばれる。たとえば、Ｅ成分の水溶液がＬ−グルタミン酸ナトリウム１水和物５重量％およびラクチトール５重量％の水溶液の場合、Ｂ成分：Ｅ成分の水溶液の重量比が１：２〜１：１０の範囲となるようにするのがよい。また、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物３０重量％およびラクチトール２０重量％の水溶液の場合、Ｂ成分：Ｅ成分の水溶液の重量比が１：２〜１：１５の範囲となるようにするのがよい。その際、Ｅ成分の水溶液中の濃度は、使用するアミノ酸またはその塩および非還元性の糖または糖アルコールの溶解度の範囲内において、できるだけ高い方が望ましい。
【００２２】
本発明におけるオイルアジュバントワクチンの第二は、前記の油中水型のオイルアジュバントからなる内相と、非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体のＨＬＢ（親水親油バランス）が１０以上である乳化剤を含有する外水相とで構成される水中油中水型オイルアジュバントワクチンである。
なお、この明細書において「ＨＬＢ」（親水親油バランス）は、W.C.Griffin によって提唱された式（W.C.Griffin, J. Soc. Cosmetic Chemists, 1, 311(1949)参照）に従って求めている。
【００２３】
本発明の水中油中水型オイルアジュバントワクチンを構成する外水相に用いられる、全体のＨＬＢが１０以上の乳化剤は、全体のＨＬＢが１０以上であれば、単品、もしくは二種以上の混合物から選択使用することができる。単品でＨＬＢ１０以上の非イオン系界面活性剤としては、一般に医薬品用途などで用いられているものの中から選択すればよく、たとえば、ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物、ポリオキシエチレンアルキル（アルケニル）エーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどから、ＨＬＢが１０以上となるものを選択して使用すればよい。
【００２４】
このうち、ＨＬＢが１０以上であるヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物としては、上記のオイルアジュバントワクチンを構成するものと同様のもの、つまり、ヒマシ油や硬化ヒマシ油などからなるヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物の中から、エチレンオキサイドの平均付加モル数が２０以上のもの、好ましくは２０〜６０モル付加物を用いることができる。この場合、エチレンオキサイドの平均付加モル数が２０未満では、内相となる油中水型オイルアジュバントを外水相中に安定に分散させることができず、結果として、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。また、エチレンオキサイドの平均付加モル数が６０を越えると、内相の油中水型オイルアジュバントワクチンが転相しやすくなり、やはり、最終的に良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。
【００２５】
また、ＨＬＢが１０以上のソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物としては、脂肪酸部分が不飽和であるソルビタンオレイン酸エステルの他、ソルビタンラウリン酸エステルやソルビタンカプリル酸エステルなどの飽和脂肪酸からなるソルビタンエステルのエチレンオキサイド付加物の中から、エチレンオキサイドの平均付加モル数が１０以上のものが挙げられる。その中でも、とくにシス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸からなるソルビタンオレイン酸エステルのエチレンオキサイド付加物であるポリオキシエチレンソルビタンオレートのエチレンオキサイドの平均付加モル数が１０〜４０であるものを用いるのが好ましい。この場合、エチレンオキサイドの平均付加モル数が１０未満では、内相となる油中水型オイルアジュバントを外水相中に安定に分散させることができず、結果として、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。また、エチレンオキサイドの平均付加モル数が４０を越えると、内相の油中水型オイルアジュバントが転相しやすくなり、やはり、最終的に良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。
【００２６】
ポリオキシエチレンアルキル（アルケニル）エーテルとしては、たとえば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテルなどの高級飽和アルコールのエチレンオキサイド付加物やポリオキシエチレンオレイルエーテルなどの高級不飽和アルコールのエチレンオキサイド付加物など、一般的に知られているアルキル（アルケニル）エーテル系界面活性剤が挙げられ、その中でも、上記のアルキル（アルケニル）基の炭素数が１２〜１８であり、エチレンオキサイドの平均付加モル数が１０以上のもの、好ましくは１０〜４０のものを用いるのがよい。その中でも、とくにシス−Δ９−オクタデセノールを８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪族アルコールを９０重量％以上含有するオレイルアルコールのエチレンオキサイド１０〜４０モル付加物であるポリオキシエチレンオレイルエーテルを用いるのが好ましい。この場合、アルキル（アルケニル）基の炭素数が１２未満では、内相の油中水型オイルアジュバントが転相しやすくなり、結果として、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなり、炭素数が１８を越えると、内相となる油中水型オイルアジュバントを外水相中に安定に分散させることができず、やはり、最終的に良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。さらに、エチレンオキサイドの平均付加モル数が１０未満では、内相となる油中水型オイルアジュバントワクチンを外水相中に安定に分散させることができず、結果として、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。また、エチレンオキサイドの平均付加モル数が４０を越えると、内相の油中水型オイルアジュバントワクチンが転相しやすくなり、やはり、最終的に良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる。
【００２７】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールとしては、一般的に医薬品や化粧品に用いられているものの中から、ＨＬＢが１０以上であるものを選択して使用することができる。その中でもエチレンオキサイドのモル数（平均重合度）が５０〜２００、プロピレンオキサイドのモル数（平均重合度）が５〜８０であり、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドのモル数（平均重合度）の比が２：１以上であるものを用いるのが好ましい。この場合、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドのモル数（平均重合度）の比が２：１より低くなると、内相となる油中水型オイルアジュバントを外水相中に安定に分散させることができず、結果として、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができなくなる恐れがある。
【００２８】
本発明の水中油中水型オイルアジュバントワクチンを構成する外水相に用いる乳化剤は、上記のような単独でＨＬＢ１０以上を示すものの他、上記のように、一種以上の高ＨＬＢの非イオン系界面活性剤と一種以上の低ＨＬＢの非イオン系界面活性剤を混合して、全体のＨＬＢを１０以上に調整したものでもよい。その際に用いる低ＨＬＢの非イオン系界面活性剤としては、たとえば、ソルビタンモノオレート、ソルビタンセスキオレート、グリセロールモノオレートなど、一般に医薬品等に広く用いられるものの中から選択使用することができる。高ＨＬＢの非イオン系界面活性剤と低ＨＬＢの非イオン系界面活性剤を混合して用いる例としては、例えば、ＨＬＢ１５．０のポリオキシエチレンソルビタンモノオレートと、ＨＬＢ３．７のソルビタンセスキオレートの場合であれば、それぞれを重量比２：１で混合することにより、全体のＨＬＢが約１１．２である乳化剤を得ることができる。
【００２９】
本発明においては、外水相を構成する乳化剤として、上記のような全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤と、グリセロリン脂質とを混合して使用することにより、目的とする水中油中水型オイルアジュバントワクチンの安定性をさらに高めることができる。
【００３０】
上記の全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤と混合して用いるグリセロリン脂質としては、大豆由来のリン脂質（大豆レシチン、大豆水添レシチンなど）や卵黄由来のリン脂質（卵黄リン脂質、卵黄水添リン脂質など）など、天然由来のものの他、高度に精製された種々の高純度リン脂質（ホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンなど）やリゾリン脂質などの中から種々選択して使用することができ、これらは単独で使用しても、２種以上を選択混合して使用してもよい。
【００３１】
上記のＨＬＢ１０以上の非イオン系界面活性剤とグリセロリン脂質を混合して用いる際、それらの混合比は、非イオン系界面活性剤：グリセロリン脂質が重量比で２０：１〜１：２となるようにすればよい。
【００３２】
なお、本発明の水中油中水型オイルアジュバントワクチンを構成する外水相に用いる乳化剤の使用量は、外水相中０．２〜２０重量％、とくに好ましくは０．５〜１０重量％とするのがよい。この場合、０．２重量％未満では良好な水中油中水型を維持することができず、また、２０重量％を越えると、オイルアジュバントワクチンの粘度が高まり接種に適さなくなると共に、生体に接種した際の安全性が低下する場合がある。
また、本発明の水中油中水型オイルアジュバントワクチンにおいて、内相を構成する油中水型オイルアジュバント相と外水相の混合比は、目的に応じて、油中水型オイルアジュバント相：外水相が重量比で２：１から１：１０になるようにすればよい。
【００３３】
このようにして調製される水中油中水型オイルアジュバントワクチンは、あらかじめ抗原を含有する水相を用いて、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した後、これを内相として、特定の乳化剤を含む水相に加えて乳化するという二段階乳化法により、内水相中に抗原を効率よく内包することができる。
本発明の水中油中水型オイルアジュバントワクチンは、例えば、以下の方法により調製することができる。その方法は、あらかじめ抗原を含有した油中水型のオイルアジュバントワクチンを本発明にしたがって調製した後、これをさらに非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤、あるいは非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤と、グリセロリン脂質とを含有した水相に添加し、再乳化するというものである。本発明においては、この二段階乳化法をとることにより、水中油中水型としての安定性にすぐれ、かつ安全性の高い水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製することができる。
【００３４】
本発明ではその際、まず、常温で液状を呈する油分に、Ｂ成分の３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで４０℃で液状を示す親油性の非イオン系界面活性剤と、Ｃ成分のヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物と、Ｂ成分の非イオン系界面活性剤とＥ成分の水溶液とを前者：後者が重量比で１：１から１：２０となるように混合し、これを強固なゲル状の組成物となるまで攪拌したものを加えて、混合、分散させ、しかるのちにＤ成分の生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加えて攪拌混合して乳化させて、高い安定性を示す油中水型のオイルアジュバントワクチンを調製した後、これをさらにＦ成分の非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤、あるいは非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤と、グリセロリン脂質とを含有した水相に添加し、再乳化するという方法をとることにより、安全性が損なわれることなく、かつさらに高い安定性を有する水中油中水型のオイルアジュバントワクチンを調製することができる。
本発明の油中水型オイルアジュバントワクチンの水相、水中油中水型オイルアジュバントワクチンの内水相、または水中油中水型オイルアジュバントワクチンの外水相に用いる水分は、リン酸緩衝水溶液や生理食塩水、あるいはリン酸緩衝生理食塩水など、ワクチン一般に用いられるものから選択、使用することができる。
【００３５】
なお、本発明において、水中油中水型オイルアジュバントワクチンは、その調製条件などによって、抗原が内相である油中水型エマルション中の内水相のみに内包される場合と、その一部が外水相に漏出して、内水相と外水相の両水相に存在する場合があるが、いずれの場合にも、本発明に係るオイルアジュバントワクチンの効果が損なわれるものではない。
【００３６】
本発明において、オイルアジュバントワクチンを構成する油相、内水相、および水中油中水型オイルアジュバントワクチンを構成する外水相等には、それぞれ医薬品として当然のことながら、緩衝化剤や安定化剤、浸透圧調整成分など、アジュバント活性には直接関与しない種々の成分を含有させることができる。
また、本発明におけるオイルアジュバントワクチンの調製に際しては、ホモミキサーやホモジナイザー、ＣＬＥＡＲＭＩＸ（エム・テクニック（株）製）などの一般的な乳化装置の他、多孔質膜を利用した膜乳化装置など、一般的に乳化が可能な手段であればどのような装置でも使用することができる。
【００３７】
本発明のオイルアジュバントワクチンを構成する水相に含有させる抗原としては、一般的に用いられている不活化菌体や不活化ウイルス粒子の他、サブユニットワクチンで用いられる、アタッチメントプロテインやエンベロープ抗原といった病原体の感染防御因子など、数多くの種類や形態が挙げられるが、本発明に記載のオイルアジュバントワクチンは、特定の油分と特定の乳化剤の組み合わせにより、非常に安定な乳化状態が得られるため、抗原の形態や大きさにかかわらず、生物学的に許容される有効量であれば目的とするものを広く選択することができる。
さらに、本発明のオイルアジュバントワクチンにおいては、エマルション内に抗生物質などのような抗原以外の薬効成分を配合することも当然可能である。
【００３８】
以上のように、本発明のオイルアジュバントワクチンは、配合する成分を種々選択することにより、さまざまなタイプの生体に投与可能な医薬用組成物を形成することができる。たとえば、動物用ワクチンの場合であれば、一般的に広く用いられている皮下注射や筋肉内注射の他に、経口投与や直腸投与、鼻腔内投与などによる免疫賦活が考えられるが、その投与経路については目的に応じて種々選択すればよい。
【００３９】
このように、本発明により調製されるオイルアジュバントワクチンは、非常に安定でかつ良好なエマルションを形成するために、ワクチンとしての安定性にすぐれるとともに、安全性も高いといった特徴を有しており、さまざまな生物に対して、有効性と安全性の両面にすぐれた、有用なワクチンとして使用することができる。
【００４０】
次に、本発明を、実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。「部」は他に明記しない限り「重量部」である。
【実施例】
［オイルアジュバントワクチンの調製］
以下の各実施例で使用したオイルアジュバントワクチンは、いずれも、次に示す方法で調製した。なお、処方中に記載された成分は、いずれも、加熱滅菌か、濾過滅菌のうち、各々に適した方法により、滅菌処理済みのものを使用した。また、撹拌、乳化などの各操作は、すべてクリーンベンチ内で、無菌環境下にて行った。
【００４１】
《実施例１：ワクチンａ》
Ａ成分として、エチルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＥＯ−９０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９９２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］１．６部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．４部とを加えて十分に撹拌した後、これに抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）６部を撹拌しながら徐々に加え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用いて、８，０００回転で１０分間撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンａを調製した。
【００４２】
《実施例２：ワクチンｂ》
Ａ成分として、精製ヒマワリ油６部と、スクアレン６部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１．６部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．４部を加えて十分に撹拌した後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様の方法により撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンｂを調製した。
【００４３】
《実施例３：ワクチンｃ》
Ａ成分として、オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１２部を用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］０．８部と、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９０１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］０．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．５部を加えて十分に撹拌した後、これに撹拌しながら、抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下実施例１と同様に撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンｃを調製した。
【００４４】
《実施例４：ワクチンＸ１》
まずＢ成分として、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９０１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］５部を用い、またＥ成分として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物３部およびマンニトール１部を精製水６部に溶解させた水溶液を用い、このＢ成分とＥ成分の水溶液を、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用いて、１０，０００回転／分で１０分間攪拌混合してゲル状物質を得た。
次にＡ成分の油として、オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部を用い、スクアレン６部とを用い、これらの油分に、Ｂ成分としてソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１．６部と、Ｃ成分として５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均付加モル数４０〕０．４部を加えて十分に攪拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、攪拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相８部を徐々に加え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用いて、８，０００回転／分で１０分攪拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンＸ１を調製した。
【００４５】
《実施例５：ワクチンＸ２》
まずＢ成分として、ジグリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＰＧＯ−９０２１Ｌ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部を用い、またＥ成分として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物４部およびラクチトール１部を精製水７部に溶解させた水溶液を用い、このＢ成分およびＥ成分の水溶液を、実施例４と同様に攪拌混合して、ゲル状物質を得た。
次に油分として、精製ヒマワリ油６部と、エチルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＥＯ−９０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部とを用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均付加モル数４０〕０．４部を加えて十分に攪拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、攪拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相８部を徐々に加え、以下実施例４と同様に攪拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンＸ２を調製した。
【００４６】
《実施例６：ワクチンＸ３》
まずＢ成分として、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９９１Ｐ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］４部と、グリセロールジオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９０２Ｐ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］４部を、またＥ成分として、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム１水和物４部およびトレハロース１部を精製水11部に溶解させた水溶液を用い、このＢ成分およびＥ成分を、実施例４と同様に攪拌混合して、ゲル状物質を得た。
次に油分として、デシルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＤＯ−９９」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］８部と、スクアレン４部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９９２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］０．８部と、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ９９１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］１．２部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均付加モル数４０〕０．４部を加えて十分に攪拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、攪拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相１０部を徐々に加え、以下実施例４と同様に攪拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンＸ３を調製した。
【００４７】
《実施例７：ワクチンｄ》
Ａ成分として、エチルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＥＯ−９９」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％〕１．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．３部とを加えて十分に撹拌した後、これに抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を撹拌しながら徐々に加え、以下、実施例１と同様に撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール［エチレンオキサイド平均重合度１６０、プロピレンオキサイド平均重合度３０、ＨＬＢ＝１６．０］０．４部をリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌しながら、上記の油中水型オイルアジュバント１０部を徐々に加え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用いて、８，０００回転で５分間撹拌混合して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンｄを調製した。
【００４８】
《実施例８：ワクチンｅ》
Ａ成分として、精製ホホバ油６部と、スクアレン６部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．４部を加えて十分に撹拌した後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様の方法により撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＴ−２２１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０、ＨＬＢ＝１５．８］０．２部をリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌しながら、上記の油中水型オイルアジュバント１０部を徐々に加え、以下実施例７と同様に撹拌混合して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンｅを調製した。
【００４９】
《実施例９：ワクチンｆ》
Ａ成分として、オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部と、グリセロールトリオレート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９９３」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％〕６部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］０．９部と、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９９１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］０．８部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．３部を加えて十分に撹拌した後、これに撹拌しながら、抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様に撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数６０、ＨＬＢ＝１４．８］０．１４部と、大豆水添レシチン［日本油脂（株）製、コートソームＮＣ−２１］０．０６部とをリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌しながら、上記の油中水型オイルアジュバント１０部を徐々に加え、以下、実施例７と同様に撹拌混合して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンｆを調製した。
【００５０】
《実施例１０：ワクチンＸ４》
まずＢ成分として、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９０１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］５部を、またＥ成分として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物３部およびマンニトール１部を精製水６部に溶解させた水溶液を用い、このＢ成分およびＥ成分を、実施例４と同様に攪拌混合して、ゲル状物質を得た。
次に油分として、エチルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＥＯ−９０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．３部とを加えて十分に撹拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、これに抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相８部を攪拌しながら徐々に加え、以下、実施例４と同様に攪拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール［エチレンオキサイド平均重合度１６０、プロピレンオキサイド平均重合度３０、ＨＬＢ１６．０］０．４部をリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを攪拌しながら、前記の油中水型オイルアジュバントワクチン１０部を徐々に加え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用いて、８，０００回転／分で５分間攪拌混合して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンＸ４を調製した。
【００５１】
《実施例１１：ワクチンＸ５》
まずＢ成分として、ソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部を、またＥ成分として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物４部およびラクチトール１部を精製水７部に溶解させた水溶液を用い、このＢ成分およびＥ成分を、実施例４と同様に攪拌混合して、ゲル状物質を得た。
次に油分として、精製ヒマワリ油１０部と、スクアラン２部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．３部を加えて十分に撹拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、これを攪拌しながら抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相８部を攪拌しながら徐々に加え、以下、実施例４と同様の方法により攪拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製、「ノニオン  ＯＴ−２２１」、シス−９−オクタデセン酸含量５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０、ＨＬＢ１５．８］０．１４部と、大豆水添レシチン［日本油脂（株）製、コートソームＮＣ−２１］０．０６部とをリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを攪拌しながら、上記の油中水型オイルアジュバントワクチン１０部を徐々に加え、以下実施例７と同様に攪拌混合して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンＸ５を調製した。
【００５２】
《比較例１：ワクチンｇ》
油分として、軽質流動パラフィン［エッソ（株）製「クリストール５２」］６部を用い、これにソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ノニオンＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：８３重量％］０．８部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製「ノニオンＯＴ−２２１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０］０．２部とを加えて十分に撹拌しながら、抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）３部を徐々に加え、以下、実施例１と同様に撹拌混合して、比較オイルアジュバントワクチンｇ（油中水型）を調製した。
【００５３】
《比較例２：ワクチンｈ》
Ａ成分として、オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部と、スクアラン６部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製、「ノニオン  ＯＴ−２２１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０］０．４部を加えて十分に撹拌した後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様の方法により撹拌混合して、比較オイルアジュバントワクチンｈ（油中水型）を調製した。
【００５４】
《比較例３：ワクチンｉ》
Ａ成分として、オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部と、スクアラン６部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＴ−２２１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０］０．４部を加えて十分に撹拌した後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様の方法により撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数６０、ＨＬＢ１４．８］０．１４部と、大豆水添レシチン［日本油脂（株）製、コートソームＮＣ−２１］０．０６部とをリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌しながら、上記の油中水型オイルアジュバントワクチン１０部を徐々に加え、以下、実施例７と同様に撹拌混合して、比較オイルアジュバントワクチンｉ（水中油中水型）を調製した。
【００５５】
《比較例４：ワクチンＹ１》
ソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量９４重量％］５部と、ラクチトール４部を精製水６部に溶解させた水溶液とを、実施例４と同様に撹拌溶解して、ゲル状物質を得た。
次に油分として、グリセロールトリオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＧＯ−９０３」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ  ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート〔日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＴ−２２１」、シス−９−オクタデセン酸含量５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０〕0.５部とを加えて十分に撹拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、撹拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相６部を徐々に加え、以下実施例４と同様に撹拌混合して、比較オイルアジュバントワクチンＹ１（油中水型）を調製した。
【００５６】
《比較例５：ワクチンＹ２》
油分として、軽質流動パラフィン［エッソ（株）製「クリストール５２」］６部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製「ノニオンＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］0.８部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製「ノニオン  ＯＴ−２２１」、シス−９−オクタデセン酸含量５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モル数２０］0.２部とを加えて十分に撹拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相３部を徐々に加え、以下実施例１と同様に撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数６０、ＨＬＢ１4.８］0.２部をリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌しながら、前記の油中水型オイルアジュバントワクチン１０部を徐々に加え、以下実施例１０と同様に撹拌混合して、比較オイルアジュバントワクチンＹ２（水中油中水型）を調製した。
【００５７】
［免疫試験］
次に実際に種々の抗原を含有するオイルアジュバントワクチンについて、免疫試験を行った。各試験例中で用いているワクチンの記号は、そのワクチンが、前記実施例および比較例の各々の記号に対応した処方に基づいて調製されたものであることを示している。
【００５８】
《試験例１：豚アクチノバシラス感染症（App)不活化ワクチン》
Actinobacillus pleuropneumoniae NG-22 株（血清型２型）を液体培地に接種し、37℃で通気撹拌培養した菌液をホルマリンで不活化し、遠心分離により集菌・洗浄したものを抗原とした。この抗原をリン酸緩衝生理食塩水を用いて、不活化前生菌数が１０10個／ドーズとなるよう調製したものを水相として用いた。
免疫群は４週齢ＳＰＦ(Specific Pathogen Free)ブタ各５頭に１頭当たりワクチンａ、ｃ、Ｘ２の１ml、ワクチンｄ、ｆ、Ｘ４の２mlを４週間間隔で２回筋肉内に注射した。比較免疫群は４週齢ＳＰＦブタ各５頭に１頭当たりワクチンｇ、ｈの１ml、ワクチンｉ、Ｙ２の２mlを４週間間隔で２回筋肉内に注射した。また、５頭の非免疫同居対照群をおいた。各回注射後２週間について注射局所を含む臨床症状の観察、および試験期間中経時的に血清を採取し、その血清について補体結合反応（ＣＦ）抗体価を測定し、推移を観察した。初回注射後１６週に注射局所の剖検を行い、結節の大きさ・分布により病変スコア（無；０〜重；３）をつけ、各群５頭の平均を求めた。
【００５９】
安全性の結果については、表１に示した。免疫群に発熱、臨床症状の異常はみられなかった。比較免疫群では、初回及び追加免疫直後に一過性の体温の上昇および元気の消失が認められた。初回免疫後１６週の剖検において、免疫群では病変はとくに認められなかったが、比較免疫群では注射物によると思われる結節が認められた。
【００６０】
【表１】
0004104186.tif 000002
【００６１】
有効性の結果については、表２−１および表２−２に示した。免疫群のなかでワクチンａ、ｃおよびＸ２注射群は注射後４週よりＣＦ抗体価が上昇し、注射後８週においては１２８〜２５６倍の良好な抗体応答を認め、対照となる比較免疫群のワクチンｇ注射群とほぼ同等、またワクチンｈ注射群より明らかに高い抗体応答を示した。本発明の水中油中水型エマルションタイプのオイルアジュバントワクチンであるワクチンｄ，ｆおよびＸ４は、良好かつ安定な乳化状態を実現し、先述の油中水型エマルションタイプのオイルアジュバントワクチンとほぼ同等の良好な抗体応答を示した。対照となる比較免疫群のワクチンｉおよびＹ２は調製したワクチンの乳化状態が極めて不安定であり、その注射群はワクチンｄ、ｆと比較して明らかに低い抗体応答を示した。
以上の成績は、本発明のオイルアジュバントワクチンが代謝性油のみで構成されている場合でも、非代謝性の鉱物油系ワクチンとほぼ同等の免疫賦活効果を示すとともに、局所反応性においては、鉱物油系アジュバントワクチンと比較して優れていることを証明するものである。
また、本発明の方法により調製されたオイルアジュバントワクチンが、代謝性油のみで構成されている場合においても、高い安定性を有すると共に、非代謝性の鉱物油のみによる従来のオイルアジュバントワクチンとほぼ同等の免疫効果を長期間にわたって示すこと、および局所反応性においては、鉱物油のみによる従来のワクチンと比較して優れていることを証明するものである。
【００６２】
【表２】
0004104186.tif 000003
【００６３】
【表３】
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【００６４】
《試験例２：日本脳炎不活化ワクチン》
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）中山株をマウスの脳内に接種して培養し、ウイルスの最も増殖した時期に脳を採取した。採取した脳から脳乳剤を作製し、その乳剤を遠心し、上清をホルマリンで不活化したものを抗原として用いた。なお、ホルマリンを添加したリン酸緩衝生理食塩水を用いて、不活化前ウイルス量が１０6.0 ＬＤ50／ドーズとなるよう調整したものを水相として用いた。免疫群は１０週齢ＳＰＦブタ各５頭に１頭当たりワクチンｂの１ml、ワクチンｅの２mlを筋肉内に注射した。比較免疫群は１０週齢ＳＰＦブタ５頭に１頭当たりワクチンｇの１mlを筋肉内に注射した。また、５頭の非免疫同居対照群をおいた。注射後２週間について注射局所を含む臨床症状の観察、および試験期間中経時的に血清を採取し、その血清について赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を測定し推移を観察した。注射後１６週に注射局所の剖検を行い、結節の大きさ・分布により病変スコア（無；０〜重；３）をつけ、各群５頭の平均を求めた。
【００６５】
安全性の結果については、表３に示した通りである。免疫群、比較免疫群ともに発熱、臨床症状の異常はみられなかった。しかし、注射後１６週の剖検では、免疫群では病変は認められなかったが、比較免疫群では注射物によると思われる結節が認められた。
【００６６】
【表４】
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【００６７】
有効性については、表４に示したように、免疫群であるワクチンｂ注射群は注射後４週にはＨＩ抗体価の上昇が認められ、注射後８週においては８０〜１６０倍の良好な抗体応答を示し、対照となる比較免疫群のワクチンｇ注射群と同等の抗体応答が認められた。本発明の水中油中水型エマルションタイプのオイルアジュバントワクチンであるワクチンｅは、良好かつ安定な乳化状態を実現し、１回の注射によりＨＩ抗体価の上昇を認め、先述の油中水型エマルションタイプのオイルアジュバントワクチンと同等の良好な抗体応答を示した。
【００６８】
【表５】
0004104186.tif 000006
【００６９】
以上の成績は、本発明のオイルアジュバントワクチンが、抗原にＪＥＶを用いた場合においても非代謝性油と同等の免疫効果を示すとともに、局所反応性においては優れていることを証明するものである。
【００７０】
《試験例３：鶏ニューカッスル病（ＮＤ）不活化ワクチン》
ニューカッスル病ウイルス石井株を１０日齢発育鶏卵の尿膜腔内に１０5.0EID50/egg接種し、３７℃で４日間培養後、感染尿膜腔液を採取した。これをホルマリン水溶液を用いて不活化したものを抗原として用いた。なお、ホルマリンを添加したリン酸緩衝生理食塩水を用い、不活化前ウイルス含有量として１０8.5EID50／ドーズとなるように調整したものを水相として用いた。
まず、免疫群として、ＳＰＦ鶏群由来５週齢鶏各１０羽に１羽当たりワクチンａ、ｂの0.5 ml、ワクチンｄ、ｅの１mlを筋肉内に注射し、さらに、各２０羽に１羽当たりワクチンＸ１、Ｘ２の0.5 ml、ワクチンＸ５の1.5 mlを筋肉内に注射した。比較免疫群としては、ＳＰＦ鶏群由来５週齢鶏各１０羽に１羽当たりワクチンｇの0.5 ml、ワクチンｉの１mlを筋肉内に注射し、さらに、各２０羽に１羽当りワクチンＹ２の0.5 mlを筋肉内に注射した。また、それぞれに対して１０羽および２０羽の非免疫同居対照群をおいた。
ワクチンａ、ｂ、ｄ、ｅについては、注射後１０週間注射局所を含む臨床症状を観察すると共に、経時的に血清を採取し、その血清について赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を測定し推移を観察した。注射後１０週目に各群５羽について注射局所の剖検を行い、残留物の程度・分布により病変スコア（無；０〜重；３）をつけ、各群の平均を求めた。他の５羽についてはＮＤウイルス佐藤株の１０4 鶏致死量／羽を筋肉内に注射し攻撃を行い、攻撃後２週間臨床症状を観察すると同時に、攻撃時及び攻撃後２週間目に採血し、得られた血清についてＨＩ抗体価を測定し、感染の有無を判定した。
【００７１】
また、ワクチンＸ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｙ２については、注射後２０週間注射局所を含む臨床症状を観察すると共に、経時的に血清を採取し、その血清について赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を測定し推移を観察した。注射後１０週目に各群１０羽について注射局所の剖検を行い、残留物の程度・分布により病変スコア（無；０〜重；３）をつけ、各群の平均を求めた。さらに１０羽については注射後２０週目にＮＤウイルス佐藤株の１０4 鶏致死量／羽を筋肉内に注射し攻撃を行い、攻撃後２週間臨床症状を観察すると同時に、攻撃時及び攻撃後２週間目に採血し、得られた血清についてＨＩ抗体価を測定し感染の有無を判定した。
【００７２】
安全性の結果については、表５−１および表５−２に示した通りである。比較免疫群であるワクチンｇ、ｉ、Ｙ２注射群では、注射直後に一過性の跛行を認めた。それに対し、免疫群では全てのワクチン注射群において、試験期間中異常を認めなかった。注射後１０週における剖検では、免疫群ではワクチンｂ注射群の５羽中２羽、またワクチンＸ２注射群の１０羽中６羽に少量の油状物が認められたが、他の注射群では病変を認めなかった。比較免疫群ではワクチンｇ、ｉ、Ｙ２ともに中度から重度のワクチン残留物が認められた。
【００７３】
【表６】
0004104186.tif 000007
【００７４】
【表７】
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【００７５】
有効性についての成績は、表６−１および表６−２にまとめた通りである。油中水型オイルアジュバントワクチンである免疫群のワクチンａ、ｂ、Ｘ１、Ｘ２と比較免疫群のワクチンｇの成績を比較するとき、両者間に差はみられず同等と考えられた。水中油中水型オイルアジュバントワクチンである免疫群のワクチンｄ、ｅ、Ｘ５と比較免疫群のワクチンｉ、Ｙ２の成績を比較するとき、後者のＨＩ抗体価が明らかに低い値を示した。
以上の成績は、本発明のオイルアジュバントワクチンが、代謝性油のみで構成されている場合においても、非代謝性の鉱物油とほぼ同等の免疫効果を示すとともに、局所反応性においては、鉱物油系オイルアジュバントワクチンの場合よりはるかに優れていることを証明するものである。
また、本発明の方法により調製されたオイルアジュバントワクチンが、高い安定性を有し、非代謝性の鉱物油のみによる従来のオイルアジュバントワクチンとほぼ同等の免疫効果を示すとともに、局所反応性においては、鉱物油のみによる従来のオイルアジュバントワクチンと比較して優れていること、また、本発明により調製された水中油中水型アジュバントワクチンについても、同様に高い安定性を有し、長期にわたり良好な有効性を発揮しながら、局所安定性の面では優れていることを証明するものである。
【００７６】
【表８】
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【００７７】
【表９】
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【００７８】
《試験例４：牛流行熱不活化ワクチン》
牛流行熱（ＢＥＦ）ウイルスＹＨＬ株を、単層細胞層を形成させたＨｍＬｕ−１細胞にＭＯＩ(Multiplicity of Injection) 0.01になるように接種し、３７℃で６０分間吸着させた後、３４℃で３日間培養した上清をホルマリン水溶液を用いて不活化したものを抗原として用いた。なお、ホルマリンを添加したリン酸緩衝生理食塩水を用い、不活化前ウイルス含有量として１０6.0TCID50 ／ドーズとなるように調整したものを水相として用いた。
免疫群は体重約１５０ｋｇのウシ各２頭に、１頭当たりワクチンａ、Ｘ１、Ｘ３の１ml、ワクチンｄの３mlを筋肉内に注射した。比較免疫群は体重約１５０ｋｇのウシ各２頭に、１頭当たりワクチンｇ、Ｙ１の１mlを筋肉内に注射した。また、２頭の非免疫同居対照群をおいた。注射後２週間注射局所を含む臨床症状の観察、および体温測定を行った。また、注射後経時的に血清を採取し、得られた血清について中和抗体価を測定した。注射後２０週には注射局所の剖検を実施した。
【００７９】
安全性の結果は、表７にまとめた通りである。免疫群、比較免疫群ともに臨床症状、体温に異常は認められなかったが、注射局所の剖検においては、比較免疫群は免疫群に比べてワクチンの残留が重度であった。
【００８０】
【表１０】
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【００８１】
また、有効性の結果については、表８−１および表８−２にまとめた通りである。免疫群は注射後４週より抗体の上昇を認め、比較免疫群と同様の抗体価の推移を示し、さらに免疫群Ｘ１およびＸ３は、比較免疫群のワクチンＹ１を上回る抗体価の推移を示し、その傾向は注射後２０週まで維持されていた。
【００８２】
【表１１】
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【００８３】
【表１２】
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【００８４】
以上の成績は、本発明のオイルアジュバントワクチンが、代謝性油のみで構成されている場合においても、非代謝性の鉱物油とほぼ同等の免疫効果を示すとともに、局所反応性においては、鉱物油系アジュバントワクチンよりはるかに優れていることを証明するものである。
また、本発明の方法により調製されたオイルアジュバントワクチンが、高い安定性を有し、かつ長期にわたる免疫効果を示すとともに、局所反応性の面でも優れていることを示すものである。
【００８５】
〔安定性〕
次に、前述の実施例４〜６、７〜１１および比較例４〜５で調製した各オイルアジュバントワクチンについて、その調製後、速やかに下記の要領にて、安定性の評価を行った。これらの結果は、後記の表９に示される通りであった。
【００８６】
《試験例５：油中水型オイルアジュバントワクチン》
油中水型オイルアジュバントワクチン５mlを、１５mlのふた付きのポリプロピレン製スピッツ管（滅菌済）に入れ、各温度での安定性の評価を行った。調製１日後、３ケ月後、１２ケ月後に肉眼判定の後、位相差顕微鏡（１０００倍）を用いて、各サンプルについてそれぞれ５視野ずつの観察を行い、その結果を以下の基準で評価した。
◎：相の分離がほとんど見られず、かつ乳化状態と粒子径にほとんど変化がないもの
○：油相がわずかに分離しているか、油中水型の状態に変化は認められないが、粒子径に若干の変化が認められるもの
△：水相の分離が認められるか、あるいは、油中水型を保持しているが、粒子の合一が明らかに認められるもの
×：油相、水相共に分離が認められるか、あるいは、エマルション粒子が大きな液滴となり、良好な油中水型が認められないもの
××：内相の抗原がほとんど保持されておらず、明らかに相分離が認められるもの
【００８７】
《試験例６：水中油中水型オイルアジュバントワクチン》
水中油中水型オイルアジュバントワクチン１０mlを、２０mlのふた付きのガラス製スクリュー管（滅菌済）に入れ、各温度での安定性の評価を行った。調製１日後、３ケ月後、１２ケ月後に肉眼判定の後、位相差顕微鏡（１０００倍）を用いて、各サンプルについてそれぞれ５視野ずつの観察を行い、以下の基準で評価した。
◎：乳化状態と粒子径にほとんど変化が認められないもの
○：水中油中水型の状態には変化が認められないが、粒子径に若干の変化が認められるもの
△：水中油中水型を保持しているが、粒子の合一が明らかに認められるもの
×：エマルション粒子が大きな液滴となり、良好な水中油中水型が一切認められないもの
××：水中油中水型がほとんど保持されておらず、明らかに相分離が認められるもの
【００８８】
【表１３】
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【００８９】
前述の表１〜表８および表９の結果から明らかなように、本発明により、安全性および抗体産生能ともにすぐれたオイルアジュバントワクチンが得られること、また油分に、ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物と、本発明のＢ成分とＥ成分の水溶液からなるゲル状物質を加えて混合したのち、生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加えて乳化させる方法により、低粘度であって、かつ長期安定性および抗体産生持続能ともにすぐれたオイルアジュバントワクチンを調製できること、そしてこの方法により調製した油中水型オイルアジュバントワクチンをさらに本発明の乳化剤を含有した水相に添加し、再乳化させる方法により、安全性および抗体産生能ともにすぐれた水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製できることがわかる。
【発明の効果】
本発明により、植物由来のレクチンのような免疫刺激物質を処方中に全く使用しなくても、高い抗体産生力を長期間発揮すると共に、医薬品としての製剤安定性や局所反応性にすぐれた、有用なオイルアジュバントワクチンを調製することができる。