(57)【要約】本発明は、バイオマーカー特異的両親媒性ナノ粒子に関し、より詳細には、特定細胞の細胞膜に特異的に発現した蛋白質分解酵素を選択的に認識した後、結合して、効率的に細胞内流入及び選択的分解が行われることによって、診断または治療型薬物または遺伝子伝達体として使用できる両親媒性ナノ粒子を提供する。本発明の両親媒性ナノ粒子は、疾患の診断または治療に使用できる。【選択図】図１
2017512763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ａ）と、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチド及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ｂ）とを含む両親媒性ナノ粒子。
【請求項２】
親水性高分子は、ポリアルキレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、デキストラン、ポリセリン、ポリスレオニン、ポリチロシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸よりなる群から選択された１つ以上である、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項３】
親水性高分子は、メトキシアミノポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項４】
疎水性高分子は、下記化学式１で表示されるホモポリアミノ酸である、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子：
［化学式１］
（ｐｏｌｙ−Ｍ）ｎ
ここで、Ｍは、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グリシンまたはメチオニンであり、ｎは、１０〜１００を示す。
【請求項５】
蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドは、配列番号１〜１３に記載されたアミノ酸配列のうちいずれか１つで表示される、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項６】
両親媒性ナノ粒子は、直径が平均粒径５０〜２００ｎｍである、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項７】
両親媒性ナノ粒子は、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）またはミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）形態である、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項８】
両親媒性ナノ粒子は、蛍光物質をさらに含む、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項９】
両親媒性ナノ粒子は、薬剤学的活性成分をさらに含む、請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子。
【請求項１０】
親水性高分子及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ａ）と蛋白質分解酵素によって分解されるペプチド及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ｂ）を反応させる段階を含む請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
両親媒性ナノ粒子は、下記式１によって計算された質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が２５〜４０の親水性高分子またはペプチドを含んで合成されたポリマーソームである、請求項１０に記載の両親媒性ナノ粒子の製造方法：
［式１］
質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝親水性高分子またはペプチドの分子量／（親水性高分子またはペプチドの分子量＋疎水性高分子の分子量）
【請求項１２】
両親媒性ナノ粒子は、下記式１によって計算された質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が４０超過且つ７０以下の親水性高分子またはペプチドを含んで合成されたミセル構造である、請求項１０に記載の両親媒性ナノ粒子の製造方法：
［式１］
質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝親水性高分子またはペプチドの分子量／（親水性高分子またはペプチドの分子量＋疎水性高分子の分子量）
【請求項１３】
請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子を含む蛋白質分解酵素の活性または定量分析用組成物。
【請求項１４】
蛋白質分解酵素は、基質金属蛋白分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰ）、トロンビン、ＸＩＩＩａ因子（ｆａｃｔｏｒ  Ｘｉｉｉａ）、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性剤（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｕＰＡ）、フィジアン（Ｆｉｊｉａｎ）、カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ）、ＨＩＶプロテアーゼ、ＤＰＰ−ＩＶ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）またはプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）のうちいずれか１つである、請求項１３に記載の蛋白質分解酵素の活性または定量分析用組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子と、
薬剤学的に許容可能な担体とを含む標的指向型造影剤組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子と、
薬剤学的に許容可能な担体とを含む同時診断または治療用造影剤組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の両親媒性ナノ粒子と、
映像読み取りのための診断プローブとを含む多重診断プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーに特異的な標的指向能を有するポリアミノ酸基盤ナノプラットフォームとしての両親媒性ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、標的指向型ナノ伝達システムを構成するためには、両親媒性高分子合成を用いた薬物若しくは遺伝子を担持する薬物または遺伝子ナノ伝達体形成過程、形成されたナノ伝達体と標的指向分子結合の安定性を増強させることができるスペーサー結合過程、そして、高分子ナノ伝達体とスペーサーの結合後に標的指向分子結合過程を経る（図１参照）。
【０００３】
しかしながら、この技術は、工程が複雑であり、生産コストが高い短所がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記従来技術の短所を解消するためになされたものであって、単一工程を通じてスペーサー構成なしにバイオマーカーに対して特異的な標的指向能を有するポリアミノ酸基盤ナノプラットフォームとしての両親媒性ナノ粒子を提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、前記両親媒性ナノ粒子の薬剤学的用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、親水性及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ａ）と、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチド及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ｂ）とを含む両親媒性ナノ粒子を提供する。
【０００７】
また、本発明は、親水性高分子及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ａ）と蛋白質分解酵素によって分解されるペプチド及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ｂ）を反応させる段階を含む本発明の両親媒性ナノ粒子の製造方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、本発明の両親媒性ナノ粒子を含む蛋白質分解酵素の活性または定量分析用組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、本発明の両親媒性ナノ粒子と、薬剤学的に許容可能な担体とを含む標的指向型造影剤組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、本発明の両親媒性ナノ粒子と、薬剤学的に許容可能な担体とを含む同時診断または治療用造影剤組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、本発明の両親媒性ナノ粒子と、映像読み取りのための診断プローブとを含む多重診断プローブを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、バイオマーカーに対して特異的な標的指向能を有するポリアミノ酸基盤の両親媒性ナノ粒子で特定の細胞膜に特異的に発現した蛋白質分解酵素を選択的に認識した後、結合して、効率的に細胞内への流入及び選択的分解が行われることによって、診断若しくは治療型薬物または遺伝子伝達体として使用できる。
【００１３】
また、本発明の両親媒性ナノ粒子は、バイオマーカーに特異的なペプチドが結合されていて、選択的診断または治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、従来、癌診断または治療のための従来技術のナノ伝達体と本発明の両親媒性ナノ粒子の作動メカニズムを示すものである。
【図２】図２は、本発明の両親媒性ナノ粒子を製造するための両親媒性ブロック共重合体（上段）と、前記両親媒性ナノ粒子の腫瘍微細環境での細胞内への流入及び選択的分解（下段）を示すものである。
【図３】図３は、両親媒性ブロック共重合体の合成に使用されるｍＰＥＧ−ＯＨをｍＰＥＧ−ＮＨ２に変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）する過程（ｍＰＥＧ−ＯＨ→ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌ→ｍＰＥＧ−Ｎ３→ｍＰＥＧ−ＮＨ２）のＦＴ−ＩＲ確認結果を示すものである。ここで、図面内の４種のグラフにおいて、最上の矢印が示すグラフは、ｍＰＥＧ、その下の矢印が示すグラフは、ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌ、その次の矢印が示すグラフは、ｍＰＥＧ−Ｎ３、最下のグラフは、ｍＰＥＧ−ＮＨ２のＦＴ−ＩＲ結果である。２８５０ｃｍ−１でのピークは、ｍＰＥＧのＣＨ３を示し（左側図面の矢印表示）、５６０ｃｍ−１でのピークは、ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌのＳ−Ｏを示し（中間図面の矢印表示）、２１０３ｃｍ−１でのピークは、ｍＰＥＧ−Ｎ３のＮ３を示す（右側図面の矢印表示）。
【図４】図４は、両親媒性ブロック共重合体の合成に使用されるｍＰＥＧ−ＯＨをｍＰＥＧ−ＮＨ２に変形する過程（ｍＰＥＧ−ＯＨ→ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌ→ｍＰＥＧ−Ｎ３→ｍＰＥＧ−ＮＨ２）のＮＭＲ確認結果を示すものである。ここで、図面内の４種のグラフにおいて、最上のグラフは、ｍＰＥＧ、その下の矢印が示すグラフは、ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌ、すぐ下のグラフは、ｍＰＥＧ−Ｎ３、最下の矢印が示すグラフは、ｍＰＥＧ−ＮＨ２の１Ｈ  ＮＭＲ結果である。７．７９及び７．４９ｐｐｍでのピークは、ＴｓＣｌの２Ｈを示し（中間図面の矢印表示）、２．９０ｐｐｍでのピークは、ｍＰＥＧ−ＮＨ２のＣＨ２−ＮＨ２を示す（右側図面の矢印表示）。
【図５】図５は、両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕのＦＴ−ＩＲ確認結果を示すものである。ここで、図面内の６種のグラフにおいて、最上のグラフは、ｍＰＥＧ、その下のグラフ４種は、いずれも、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ、最下のグラフは、ＤＬ−ロイシンのＦＴ−ＩＲ結果である。１６６０ｃｍ−１でのピークは、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕのアミドＩ結合を示す（右側図面の矢印表示）。
【図６】図６は、両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕのＮＭＲ確認結果を示すものである。ここで、図面内の６種のグラフにおいて、最上のグラフは、ｍＰＥＧ、その下のグラフ４種は、いずれも、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ、最下のグラフは、ＤＬ−ロイシンの１Ｈ  ＮＭＲ結果である。０．９ｐｐｍでのピークは、ポリロイシンのメチルプロトンを示す（右側図面の矢印表示）。
【図７ａ】図７は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕのＮＭＲ確認結果を示すものである。ここで、ａ）は、ＭＴ１−ＭＭＰの化学式を示す。
【図７ｂ】図７は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕのＮＭＲ確認結果を示すものである。ここで、ｂ）の左側上段グラフで７．５５ｐｐｍでのピーク（矢印）は、ＭＴ１−ＭＭＰの２ＣＨ２を示し、ｂ）の右側下段グラフの０．８７ｐｐｍでのピーク（矢印）は、ポリロイシンの２ＣＨ３を示す。
【図８ａ】図８は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕとその合成に使用されるＬｅｕ−ＮＣＡ、ポリロイシン、ＭＴ１−ＭＭＰのＮＭＲ特性を確認した結果である。ここで、ａ）は、ＭＴ１−ＭＭＰの化学式を示す。
【図８ｂ】図８は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕとその合成に使用されるＬｅｕ−ＮＣＡ、ポリロイシン、ＭＴ１−ＭＭＰのＮＭＲ特性を確認した結果である。ここで、ｂ）の図面内の５種のグラフにおいて、最上のグラフは、ｍＰＥＧ、その下のグラフは、Ｌｅｕ−ＮＣＡ、その次のグラフは、ポリロイシン、その次のグラフは、ＭＴ１−ｂ−ｐＬｅｕ、最下のグラフは、ＭＴ１−ＭＭＰのＮＭＲ結果を示す。７．５５ｐｐｍでのピーク（矢印）は、ＭＴ１−ＭＭＰの２ＣＨ２を示し、４．３ｐｐｍでのピーク（矢印）は、ポリロイシンの２ＣＨ３を示し、１．７７ｐｐｍでのピークは、ＤＬ−ロイシンのＣＨを示す（矢印）。
【図９ａ】図９は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕの合成に使用されたＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕのＦｍｏｃが脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）過程を通じて除去されたことを確認したＮＭＲ結果を示すものである。ここで、ａ）は、ＭＴ１−ＭＭＰの化学式を示す。
【図９ｂ】図９は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕの合成に使用されたＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕのＦｍｏｃが脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）過程を通じて除去されたことを確認したＮＭＲ結果を示すものである。ここで、ｂ）の２種のグラフで、上段のグラフは、ＭＴ１−ｂ−ｐＬｅｕ、下段のグラフは、ＭＴ１−ｂ−ｐＬｅｕ（Ｄｅｐ．）のＮＭＲ結果を示す。
【図１０】図１０は、ｍＰＥＧ比率による両親媒性ブロック共重合体ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたポリマーソームのＴＥＭイメージを示したものである（スケールバー＝１００ｎｍ）。
【図１１】図１１は、親水性染料であるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎと疎水性染料であるＮｉｌｅ  Ｒｅｄを担持したｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたミセルまたはポリマーソームのＣＬＳＭ（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージを示したものであって（スケールバー＝５μｍ）、ａ）は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄを担持したミセル、ｂ）は、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを担持したミセル、ｃ）は、ＦＩＴＣ−ＤｅｘｔｒａｎとＮｉｌｅ  Ｒｅｄを担持したポリマーソームである。
【図１２】図１２は、ＭＴ１−ＭＭＰが多く発現しているＨＴ−１０８０細胞株を通じて両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたミセルとｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕだけで形成されたミセルの細胞内への流入程度を確認した結果である。
【図１３】図１３は、ＭＴ１−ＭＭＰが多く発現しているＨＴ−１０８０（ＭＴ１−ＭＭＰ＋＋、過発現）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＴ１−ＭＭＰ＋、若干発現）及びＭＣＦ−７（ＭＴ１−ＭＭＰ−、ほとんど発現無し）細胞株を通じて両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたポリマーソームの細胞内への流入程度を確認した結果である。
【図１４】図１４は、ＭＴ１−ＭＭＰ発現率を調節したＨＴ−１０８０細胞株にカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）が担持されたｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたペプチ−ポリマーソームを細胞流入した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
本発明は、親水性及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ａ）と、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチド及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ｂ）とを含む両親媒性ナノ粒子に関する。
【００１６】
また、本発明は、親水性高分子及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ａ）と、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチド及び疎水性高分子含有ブロック共重合体（Ｂ）を反応させる段階を含む前記両親媒性ナノ粒子の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の両親媒性ナノ粒子は、疎水性及び親水性分子の均衡を通じて自己組立体（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）または自己凝集体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成し、バイオマーカーに特異的なペプチド、すなわち、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドが結合されていて、特定細胞の細胞膜に特異的に発現した蛋白質分解酵素を選択的に認識した後、結合して、細胞内に流入し、蛋白質分解酵素によって選択的に分解され、担持物質、例えば、診断試薬、薬物または遺伝子等を細胞内に伝達することによって、診断若しくは治療型薬物または遺伝子伝達体として使用できることを特徴とする。
【００１８】
図１は、従来の癌診断または治療のための従来技術のナノ伝達体と本発明のナノ伝達体の作動メカニズムを示したものであって、図２は、本発明の両親媒性ナノ粒子を製造するための両親媒性ブロック共重合体（上段）と前記両親媒性ナノ粒子（ペプチ−ポリマーソーム）の腫瘍微細環境での細胞内への流入及び選択的分解（下段）を示したものであって、前記ペプチ−ポリマーソームは、癌細胞膜に特異的に発現したバイオマーカーであるＭＴ１−ＭＭＰを選択的に認識後、結合して、効率的に細胞内への流入及び選択的分解が行われるナノ伝達体である。
【００１９】
本明細書で使用される「ペプチ−ポリマーソーム」は、バイオマーカーに特異的なペプチドがブロック共重合体内に結合し、ポリマーソームを形成しつつ、特定の細胞または組織に発現するバイオマーカーに対して選択的に標的指向能を有するポリマーソームを指称する。特に、本発明の両親媒性ナノ粒子がポリマーソーム構造を形成するとき、これをペプチ−ポリマーソームと言う。
【００２０】
また、用語「ペプチ−ミセル」を本発明の両親媒性ナノ粒子がミセル構造を形成するときに使用する。
【００２１】
本発明の両親媒性ナノ粒子は、ブロック共重合体内に蛋白質分解酵素によって特異的に分解されるペプチドを含んでいて、スペーサー構成なしに蛋白質分解酵素に対して標的指向能を有することを特徴とする。したがって、単一工程を通じて生産コストを低減できる長所がある。また、癌、骨関節炎、リュウマチ関節炎、痴ほうまたは粥状動脈硬化症等と関連して病変部位細胞の細胞膜に特異的に発現する蛋白質分解酵素に対して標的指向能を有するので、これら疾患の診断または治療に有用に使用できる。
【００２２】
前記ブロック共重合体（Ａ）は、親水性高分子と疎水性高分子の化学的結合を通じて製造された両親媒性ブロック共重合体であることができる。
【００２３】
前記親水性高分子は、ポリアルキレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、デキストラン、ポリセリン、ポリスレオニン、ポリチロシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸等を単独または２種以上使用できる。好ましくは、分子量が１０００〜５０００のポリアルキレングリコールまたはその誘導体等を使用できる。より好ましくは、分子量が１０００〜５０００のメトキシアミノポリエチレングリコールを使用できる。
【００２４】
前記親水性高分子は、疎水性高分子との結合のために公知の技術を利用して適切に変形され得る。一具現例によれば、ｍＰＥＧ−ＯＨ→ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌ→ｍＰＥＧ−Ｎ３→ｍＰＥＧ−ＮＨ２の変形過程を経てｍＰＥＧ−ＮＨ２の形態で使用できる。
【００２５】
前記親水性ナノ粒子は、本発明の両親媒性ナノ粒子がポリマーソームを形成するために、下記式１によって計算された質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が２５〜４０であることができる：
【００２６】
［式１］
質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝親水性高分子またはペプチドの分子量／（親水性高分子またはペプチドの分子量＋疎水性高分子の分子量）
【００２７】
前記親水性ナノ粒子は、本発明の両親媒性ナノ粒子がミセルを形成するために、前記式１によって計算された質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が４０超過且つ７０以下であることができる。
【００２８】
前記疎水性高分子は、下記化学式１で表示されるホモポリアミノ酸であることができる：
［化学式１］
（ｐｏｌｙ−Ｍ）ｎ
【００２９】
ここで、Ｍは、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グリシンまたはメチオニンであり、ｎは、１０〜１００を示す。
【００３０】
本発明の一具現例によれば、前記変形された親水性高分子と疎水性ポリロイシンのペプチド結合を通じて両親媒性ブロック共重合体（Ａ）であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐｏｌｙｌｅｕｃｉｎｅ（ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ）を合成できる。
【００３１】
また、前記ブロック共重合体（Ｂ）は、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドと疎水性高分子のペプチド結合を通じて両親媒性ブロック共重合体に合成され得る。
【００３２】
疎水性高分子は、前述したホモポリアミノ酸を使用できる。
【００３３】
前記蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドは、ＭＭＰ−２／９、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１３、ＭＴ１−ＭＭＰ（メンブレインタイプ１基質金属蛋白分解酵素、ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ  １  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等を含む基質金属蛋白分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰ）、トロンビン、ＸＩＩＩａ因子（ｆａｃｔｏｒ  Ｘｉｉｉａ）、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性剤（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｕＰＡ）、フィジアン（Ｆｉｊｉａｎ）、カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ）、ＨＩＶプロテアーゼ、ＤＰＰ−ＩＶ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）またはプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）等によって特異的に分解されるものであることができる。具体的に、配列番号１〜１３に記載されたアミノ酸配列のうちいずれか１つで表示され得る。より具体的に、メンブレインタイプ１基質金属蛋白分解酵素（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ  １  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）によって特異的に分解される配列番号１に記載されたアミノ酸配列で表示され得る。
【００３４】
前記蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドの標的蛋白質分解酵素関連疾患は、下記表１に示された通りである。
【００３５】
【表１】
2017512763.tif 000003
【００３６】
前記蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドは、適切に合成され得、このような合成は、当業者に公知である多様なペプチド合成方法、例えば、固相合成法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によるエフモック法（Ｆｍｏｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を利用できる。
【００３７】
本発明の一具現例によれば、疎水性高分子であるポリロイシンとＦｍｏｃ−ＭＴ１−ＭＭＰ−ＮＨ２を反応させた後、Ｆｍｏｃの除去のための脱保護反応を経て両親媒性ブロック共重合体（Ｂ）であるＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕを合成できる。
【００３８】
前記ペプチドは、本発明の両親媒性ナノ粒子がポリマーソームを形成するために、前記式１によって計算された質量分率が２５〜４０であることができる。また、前記ペプチドは、本発明の両親媒性ナノ粒子がミセルを形成するために、前記式１によって計算された質量分率が４０超過且つ７０以下であることができる。
【００３９】
前記両親媒性ナノ粒子は、両親媒性ブロック共重合体（Ａ）と両親媒性ブロック共重合体（Ｂ）を適切な重量比率、例えば、（Ａ）：（Ｂ）は、１０：９０〜５０：５０で混合し、溶媒に分散または溶解させて製造することができる。例えば、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を水溶液に分散させた後、超音波を加える方法、有機溶媒に分散または溶解させた後、過量の水で有機溶媒を抽出または蒸発させる方法、有機溶媒に分散または溶解させた後、過量の水で透析する方法、有機溶媒に分散または溶解させた後、均質器または高圧乳化器を利用して強く溶媒を蒸発させる方法、または薄膜水和法（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）等を使用して製造できる。
【００４０】
前記有機溶媒は、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン、メチレンクロライド、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトンまたはこれらの混合物を使用できるが、これに特に制限されるものではない。
【００４１】
本発明の一具現例によれば、薄膜水和を通じて製造できる。すなわち、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を一定の比率で有機溶媒に溶かした後、回転真空減圧濃縮器（Ｒｏｔａｒｙ  ｖａｃｕｕｍｅ  ｖａｐｏｒａｔｏｒ）を通じて有機溶媒を蒸発させ、形成された薄膜を一定時間水和させた後、撹拌して、形成できる。
【００４２】
前記過程を経て製造された両親媒性ナノ粒子は、平均粒径２００ｎｍ以下であることができる。好ましくは、５０〜２００ｎｍであることができる。
【００４３】
本発明の両親媒性ナノ粒子は、ブロック共重合体の両親媒性特性を通じて疎水性コアと親水性シェルを有する球形粒子形態のミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）構造であるか、内部が空洞の親水性コアを疎水性シェルと親水性シェルが二重で取り囲んでいるポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）構造であることができる。
【００４４】
このような構造形態は、親水性高分子（及びペプチド）の質量分率を制御して製造できる。例えば、親水性高分子（及びペプチド）の質量分率が２５〜４０である場合、ポリマーソームが形成され、４０超過且つ７０以下である場合、ミセルが製造され得る。
【００４５】
ミセル構造は、内部が空洞の疎水性コア内に疎水性染料を担持でき、ポリマーソーム構造は、内部が空洞の親水性コア内に親水性染料を、疎水性シェルに疎水性染料を同時に担持でき、本発明の両親媒性ナノ粒子は、親水性及び／または疎水性薬物を担持できる薬物伝達体として使用する長所を有することが分かる。
【００４６】
したがって、本発明の両親媒性ナノ粒子は、診断のための蛍光物質をさらに含むことができる。
【００４７】
前記蛍光物質は、親水性領域または疎水性領域に物理化学的に封入または結合されていてもよい。
【００４８】
前記蛍光物質は、可視光線領域または近赤外線の蛍光を発光する蛍光体であることができ、一例として、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）、テトラメチルロダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、アロピコシアニン（ａｌｌｏｐｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ）またはその他の蛍光を発生させる蛍光物質が使用され得る。また、量子収得量（ｑｕａｎｔａｕｍ  ｙｉｅｌｄ）が高い蛍光物質を使用できる。また、親水性または疎水性染料であることができる。
【００４９】
また、本発明の両親媒性ナノ粒子は、疾患治療のための薬剤学的活性成分をさらに含むことができる。
【００５０】
前記薬剤学的活性成分は、親水性領域または疎水性領域に物理化学的に封入または結合されていてもよい。
【００５１】
前記薬剤学的活性成分は、特に制限されないが、抗癌剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性剤、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射性同位元素で標識された成分、心血管系薬物、胃腸管系薬物、または神経系薬物等を単独または２種以上使用できる。
【００５２】
本発明は、また、本発明の両親媒性ナノ粒子を含む蛋白質分解酵素の活性または定量分析用組成物に関する。
【００５３】
本発明の両親媒性ナノ粒子は、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドを容易に変更及び制御でき、所望する特定の蛋白質分解酵素及び所望する波長帯を容易に制御できるので、多様な蛋白質分解酵素に対して設計でき、前述した種類の蛋白質分解酵素の活性または定量分析が可能である。
【００５４】
本発明は、また、本発明の両親媒性ナノ粒子と薬剤学的に許容可能な担体とを含む標的指向型造影剤組成物に関する。
【００５５】
本発明の両親媒性ナノ粒子は、特定の蛋白質分解酵素に特異的に分解されるペプチドが結合されていて、前記蛋白質分解酵素が存在する細胞や組織で標的指向が可能なので、磁気共鳴及び光学映像装置等を通じて標的部位のイメージングが可能な造影剤として使用できる。
【００５６】
前記薬剤学的に許容可能な担体は、医薬分野で通常使用される担体及びビヒクルを含み、具体的に、イオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンスルフェート、リン酸水素ニナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、コロイド性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂等を含むが、これに制限されない。
【００５７】
また、本発明の標的指向型造影剤組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁液剤、または保存剤等をさらに含むことができる。
【００５８】
一様態として、本発明による標的指向型造影剤組成物は、非経口投与のための水溶性溶液で製造でき、好ましくは、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝された塩水のような緩衝溶液を使用できる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、ソジウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加できる。
【００５９】
本発明の標的指向型造影剤組成物の他の好ましい様態は、滅菌注射用水性または油性懸濁液の滅菌注射用製剤の形態であることができる。このような懸濁液は、適合な分散剤または湿潤剤（例えばツイン８０）及び懸濁化剤を使用して本分野で公知の技術によって剤形化できる。
【００６０】
また、前記滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば１、３−ブタンジオール中の溶液）であることができる。使用され得るビヒクル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、通常、滅菌された非揮発性オイルが溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含んで刺激性が少ない非揮発性オイルは、いずれでも使用できる。
【００６１】
本発明の標的指向型造影剤組成物は、診断対象から分離した組織または細胞に投与し、両親媒性ナノ粒子が発散する信号を感知し、映像を収得するのに利用され得る。
【００６２】
前記両親媒性ナノ粒子によって発散される信号を感知するためには、磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）と光学イメージングの利用が好ましい。
【００６３】
磁気共鳴映像装置は、強力な磁場の中に生体を入れ、特定周波数の電波を照射して、生体組織にある水素等の原子核にエネルギーを吸収させて、エネルギーが高い状態にした後、前記電波を中断し、前記水素等の原子核エネルギーを放出させ、このエネルギーを信号に変換してコンピュータで処理して映像化する装置である。磁気または電波は、骨に妨害を受けないため、堅い骨の周囲または脳や骨髄の腫瘍に対して縦断、横断、任意の角度で鮮明な立体的な断層像を得ることができる。特に、前記磁気共鳴映像装置は、Ｔ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像装置であることが好ましい。
【００６４】
本発明は、また、本発明の両親媒性ナノ粒子と薬剤学的に許容可能な担体とを含む同時診断または治療用造影剤組成物に関する。
【００６５】
本発明の両親媒性ナノ粒子は、薬剤学的活性成分と蛍光物質の物理化学的な封入または結合を通じて疾患と関連した蛋白質分解酵素が発現する細胞または組織において蛍光を示すことができ、磁気共鳴及び光学映像装置等を通じて生体分子の分離、診断または治療等のナノプローブ及び薬物または遺伝子伝達体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）等に利用できる。
【００６６】
前記両親媒性ナノ粒子を利用した生体診断の１つの代表的な例として、分子磁気共鳴映像診断または磁気緩和センサー（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｏｒ）が挙げられる。両親媒性ナノ粒子は、そのサイズが大きくなるにつれて、さらに大きいＴ２造影効果を示し、このような性質を利用すれば、生体分子を検出するセンサーとして使用され得る。すなわち、特定の生体分子が両親媒性ナノ粒子の絡みを誘導すれば、これによって、Ｔ２磁気共鳴映像効果が増大する。このような差異を利用して生体分子を検出する。
【００６７】
また、本発明の両親媒性ナノ粒子は、腫瘍と関連した多様な疾病、例えば扁平上皮細胞癌、子宮癌、子宮頸癌、前立腺癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳腫瘍、乳房癌、肝癌、皮膚癌、食道癌、睾丸癌、腎臓癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、胆管癌、胆嚢癌を診断及び／または治療するのに利用され得る。また、リュウマチ関節炎、骨関節炎のような炎症性疾患や、痴ほう、脳卒中等を含む難治性疾患での蛋白質分解酵素を映像化する方法に利用され得る。
【００６８】
本発明は、また、本発明の両親媒性ナノ粒子と映像読み取りのための診断プローブとを含む多重診断プローブに関する。
【００６９】
前記診断プローブは、Ｔ１磁気共鳴映像診断プローブ、光学診断プローブ、ＣＴ診断プローブ、または放射性同位元素等を使用できる。
【００７０】
前記多重診断プローブは、例えば、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドにＴ１磁気共鳴映像診断プローブを結合させれば、Ｔ２磁気共鳴映像及びＴ１磁気共鳴映像診断を同時に進行でき、光学診断プローブを結合させれば、磁気共鳴映像と光学イメージングを同時に行うことができ、ＣＴ診断プローブを結合させれば、磁気共鳴映像とＣＴ診断を同時に行うことができる。また、放射性同位元素と結合させれば、磁気共鳴映像とＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ診断を同時に行うことができる。
【００７１】
前記Ｔ１磁気共鳴映像診断プローブとしては、Ｇｄ化合物、またはＭｎ化合物等を含み、光学診断プローブとしては、有機蛍光染料（ｄｙｅ）、量子ドット、または染料標識（ｄｙｅ  ｌａｂｅｌｌｅｄ）無機支持体（例えば、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３）を含み、ＣＴ診断プローブとしては、Ｉ（ヨード）化合物、または金ナノ粒子を含み、放射性同位元素としては、Ｉｎ、Ｔｃ、またはＦ等を含む。
【００７２】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
＜実施例１＞両親媒性ナノ粒子の製造
（親水性高分子と疎水性高分子のブロック共重合体の製造）
親水性高分子として分子量２０００を有するメトキシアミノポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、０．２ｍｍｏｌ）と疎水性高分子としてポリロイシン（Ｐｏｌｙｌｅｕｃｉｎｅ）を使用してなるブロック共重合体を合成した。ポリロイシンを合成するために、ロイシン−Ｎ−カルボン酸無水物（Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｎ−Ｃａｒｂｏｘｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ、Ｌｅｕ−ＮＣＡ、６．３ｍｍｏｌ）を、トリホスゲン（ｔｒｉｐｈｏｓｇｅｎｅ、１１．４３ｍｍｏｌ）を使用したＦｕｃｈｓ−Ｆａｒｔｈｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄによって行った。Ｌｅｕ−ＮＣＡを製造するために、ＤＬ−ｌｅｕｃｉｎｅを４０℃、窒素下でＴＨＦに溶かした後、トリホスゲンを入れた。３時間後、ｎ−ヘキサンに沈殿させて得たＬｅｕ−ＮＣＡは、ＴＨＦ／ｎ−ヘキサンから再結晶した。ロイシン−Ｎ−カルボン酸無水物を製造した後、ｍＰＥＧ−ＮＨ２のＤＭＦ溶液にＬｅｕ−ＮＣＡを添加し、３５℃で窒素の下で２４時間反応を維持し、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐｏｌｙｌｅｕｃｉｎｅ（ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ）を合成した。合成されたブロック共重合体は、ジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）に沈殿を通じて分離した。
【００７４】
（ペプチド−疎水性高分子の両親媒性ブロック共重合体の製造）
バイオマーカーに特異的なペプチドとして選定した、蛋白質分解酵素によって分解されるペプチドであるＭＴ１−ＭＭＰ−ＮＨ２（配列番号１、図２参照）のＤＭＦ溶液にＬｅｕ−ＮＣＡ（Ｚ−Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ、１５．２ｍｍｏｌ）を添加し、３５℃で窒素の下で２４時間反応を維持し、ペプチド−ｂ−ｐｏｌｙｌｅｕｃｉｎｅ（ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕ）を合成した。合成されたブロック共重合体は、ジエチルエーテルに沈殿を通じて分離した。合成されたＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕのＺグループを除去するために、脱保護反応（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を行った。このために、合成されたブロック共重合体にトリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＦＡ）とＨＢｒを添加した。かくして得られた生成物を２４時間透析して分離した後、凍結乾燥した。
【００７５】
（製造された合成物のペプチ−ポリマーソームの形成）
前記で製造された両親媒性ブロック共重合体は、薄膜水和（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を通じてペプチ−ポリマーソームを形成した。まず、合成された両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕとＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕを５０：５０比率で有機溶媒に溶かした後、薄い両親媒性ブロック共重合体フィルムを製造するために、回転真空減圧濃縮器（Ｒｏｔａｒｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を通じて有機溶媒を蒸発させた。形成された薄膜を６時間水和させた後、６時間撹拌した。形成されたペプチ−ミセル及びペプチ−ポリマーソームは、図１０と図１１においてＴＥＭとＣＬＳＭを通じて確認し、４℃で保管した。
【００７６】
図３及び図４と表２は、両親媒性ブロック共重合体の合成に使用されるｍＰＥＧ−ＯＨをｍＰＥＧ−ＮＨ２に変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）する過程（ｍＰＥＧ−ＯＨ→ｍＰＥＧ−ＴｓＣｌ→ｍＰＥＧ−Ｎ３→ｍＰＥＧ−ＮＨ２）のＦＴ−ＩＲとＮＭＲ確認結果を示すものである。
【００７７】
図３のＦＴ−ＩＲを通じて２８５０ｃｍ−１でｍＰＥＧのＣＨ３、５６０ｃｍ−１でｍＰＥＧ−ＴｓＣｌのＳ−Ｏ、そして２１０３ｃｍ−１でｍＰＥＧ−Ｎ３のＮ３を確認することによって変形が行われたことを確認した。
【００７８】
また、図４の１Ｈ−ＮＭＲを通じて７．７９と７．４９ｐｐｍでｍＰＥＧ−ＴｓＣｌの２Ｈ、２．９０ｐｐｍでｍＰＥＧ−ＮＨ２のＣＨ２を確認することによって変形が行われたことを確認した。
【００７９】
変形されたｍＰＥＧ−ＮＨ２の特性は、表２に示された結果値である。
【００８０】
【表２】
2017512763.tif 000004
【００８１】
図５及び図６は、両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕのＦＴ−ＩＲとＮＭＲ確認結果を示したものであり、図５のＦＴ−ＩＲを通じて１６６０と１７５４ｃｍ−１でｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕのアミド１結合とアミド２結合が確認され、合成が行われたことが分かった。また、図６のＮＭＲを通じて０．９ｐｐｍでｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕのＣＨ３が確認され、合成が行われたことが分かり、表２で整理された分子量を確認できた。
【００８２】
図７〜図９は、両親媒性ブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕの合成を確認した結果を示す図であって、図７のＮＭＲを通じて７．５５と０．８７ｐｐｍでＭＴ１−ＭＭＰの２ＣＨ２と２ＣＨ３を確認した。図８は、ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕとその合成に使用されるＬｅｕ−ＮＣＡ、ポリロイシン、ＭＴ１−ＭＭＰのＮＭＲ特性を確認した結果であり、図９は、ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕのＦｍｏｃが脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）過程を通じて除去されたことを、７−９ｐｐｍのピークが消えることによって確認した結果である。
【００８３】
表３、図１０及び図１１は、両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕが親水性高分子及び疎水性高分子であるポリアミノ酸の比率によって粒子形態が変わることを示す結果であり、親水性高分子（ｍＰＥＧ）の質量分率を０．３３、０．３９、０．５４及び０．６４にして合成し、表３は、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕとＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕの両親媒性ナノ粒子のサイズを整理したものである。この際、両親媒性のブロック共重合体ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで親水性ペプチドの質量分率もやはり０．３４、０．３９、０．５５及び０．６５にして合成し、質量分率は、下記式１によって計算した：
【００８４】
［式１］
質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝親水性高分子またはペプチドの分子量／（親水性高分子またはペプチドの分子量＋疎水性高分子の分子量）
【００８５】
図１０を見れば、各比率による粒子形態をＴＥＭイメージを通じて確認した結果、０．６４と０．５４ではミセル、０．４０ではポリマーソームが形成されることが分かった。また、図１１でも、親水性染料であるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎと疎水性染料であるＮｉｌｅ  Ｒｅｄを担持し、粒子形態が０．６４と０．５４では、ミセルが形成され、０．４０では、ポリマーソームが形成されることを確認した。
【００８６】
図１２は、ＭＴ１−ＭＭＰが多く発現しているＨＴ−１０８０細胞株を通じて両親媒性ブロック共重合体であるＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕとｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕよりなるペプチ−ミセルとｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕよりなるミセルの細胞内への流入程度を確認した結果であって、ｍＰＥＧとＭＴ１−ＭＭＰの質量分率をそれぞれ０．３３と０．３４にして合成したペプチ−ミセルを使用した。青色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で細胞を染色した結果を示し、赤色は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄが担持されたペプチ−ミセルを示す。
【００８７】
ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕとｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕよりなるペプチ−ミセルが培養時間１時間及び２時間で細胞内への流入が良好に行われることが分かった。
【００８８】
図１３は、ＨＴ−１０８０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７細胞株で両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたポリマーソームの細胞内への流入程度を確認した結果であって、ｍＰＥＧとＭＴ１−ＭＭＰの質量分率をそれぞれ０．４０と０．３９にして合成したペプチ−ポリマーソームを使用した。青色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、緑色は、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎで細胞を染色した結果を、赤色は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄが担持されたペプチ−ポリマーソームを示す。図１３で、ＨＴ１０８０（ＭＴ１−ＭＭＰ＋＋）：ＭＴ１−ＭＭＰ過発現（基準１００％）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＴ１−ＭＭＰ＋）：ＭＴ１−ＭＭＰ若干発現（１９％）、ＭＣＦ−７（ＭＴ１−ＭＭＰ−）：ＭＴ１−ＭＭＰほとんど発現のない細胞株（０．１％）を意味する。ＭＴ１−ＭＭＰ発現は、ＨＴ１０８０細胞株を基準１００にしてｑＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した。
【００８９】
ＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕとｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕよりなるペプチ−ポリマーソームは、効果的に細胞内に流入した。
【００９０】
また、ＭＴ１−ＭＭＰ  ｓｉＲＮＡを利用して形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）してＭＴ１−ＭＭＰ発現率を調節したＨＴ−１０８０細胞株にカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）が担持されたｍＰＥＧ−ｂ−ｐＬｅｕ及びＭＴ１−ＭＭＰ−ｂ−ｐＬｅｕで形成されたペプチ−ポリマーソームを細胞内に流入させた結果、ＭＴ１−ＭＭＰ発現率が高いほど、ペプチ−ポリマーソームの細胞内への流入が増加することが蛍光強度の差異により分かった（図１４）。
【００９１】
【表３】
2017512763.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、疾病の診断または治療分野で使用できる。
【図１】
2017512763.tif 000006
【図２】
2017512763.tif 000007
【図３】
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【図４】
2017512763.tif 000009
【図５】
2017512763.tif 000010
【図６】
2017512763.tif 000011
【図７ａ】
2017512763.tif 000012
【図７ｂ】
2017512763.tif 000013
【図８ａ】
2017512763.tif 000014
【図８ｂ】
2017512763.tif 000015
【図９ａ】
2017512763.tif 000016
【図９ｂ】
2017512763.tif 000017
【図１０】
2017512763.tif 000018
【図１１】
2017512763.tif 000019
【図１２】
2017512763.tif 000020
【図１３】
2017512763.tif 000021
【図１４】
2017512763.tif 000022
【配列表】
2017512763000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月6日(2016.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーに特異的な標的指向能を有するポリアミノ酸基盤ナノプラットフォームとして両親媒性ナノ粒子に関する。
本発明は、次の大韓民国の国家研究開発事業の支援を受けている：
1.
[課題固有番号]ＮＲＦ−２０１５Ｍ３Ａ９Ｄ７０２９８７８
[部署名]未来創造科学部
[研究管理専門機関]韓国研究財団
[研究事業名]バイオ・医療技術開発事業
[研究課題名]統合型誘電体(integromics)地図基盤の標的指向型ナノ伝達体を利用したダークマター治療技術開発
[寄与率]５０％
[主管機関]延世大学校医療院産学協力団
[研究期間]２０１５年６月１日〜２０２０年５月３１日（６０ヶ月）−総研究期間
2. 
[課題固有番号]２０１５−２２−００５７
[部署名](学）延世大学校
[研究管理専門機関]（学）延世大学校
[研究事業名]延世未来先導研究事業
[研究課除名]疾病の診断及び治療のための高感度無標識細胞模倣型バイオハイブリッド技術開発
[寄与率]２５％
[主管機関]（学）延世大学校
[研究期間]２０１５年９月１日〜２０１６年８月３１日
3.
[課題固有番号]２０１５−１１−１２２３
[部署名]未来創造科学部
[研究管理専門機関]韓国研究財団
[研究事業名]グローバルフロンティア事業
[研究課除名]３Ｄ有機・無機ハイブリッド素材基盤のナノ構造体開発
[寄与率]２５％
[主管機関]延世大学校産学協力団
[研究期間]２０１４年１月１日〜２０２２年８月３１日−総研究期間
【国際調査報告】
2017512763.tif 000023
2017512763.tif 000024
2017512763.tif 000025
2017512763.tif 000026