(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を、 ２０℃以上の温度に保った後、得られるヌクレオシドの懸濁液を冷却下、リン酸化反応に付すことを特徴とする５’−ヌクレオチドの製造法。
【請求項２】
ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を ３０℃〜 ８０℃に保つ請求項１記載の５’−ヌクレオチドの製造法。
【請求項３】
ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を ２０℃以上の温度に １０分〜 １２０分保つ請求項１記載の５’−ヌクレオチドの製造法。
【請求項４】
リン酸化反応を −３０℃〜 １０℃の温度で行う請求項１記載の５’−ヌクレオチドの製造法。
【請求項５】
有機溶媒がリン酸トリ低級（Ｃ1-6）アルキルエステル類である請求項１記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項６】
リン酸トリ低級（Ｃ1-6）アルキルエステル類がリン酸トリエチルである請求項５記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項７】
リン酸化反応がオキシハロゲン化リンを用いて行われる請求項１記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項８】
オキシハロゲン化リンがオキシ塩化リンである請求項７記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項９】
オキシハロゲン化リンをヌクレオシドに対して １〜 ５倍モル量用いる請求項７記載の５’−ヌクレオチドの製造法。
【請求項１０】
ヌクレオシドがイノシンである請求項１記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項１１】
ヌクレオシドがグアノシンである請求項１記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項１２】
ヌクレオシドがイノシンおよびグアノシンの混晶である請求項１記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【請求項１３】
ヌクレオシドがシチジンである請求項１記載の５′−ヌクレオチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヌクレオシドのリン酸化改良方法に関する。さらに詳しくはヌクレオシドを有機溶媒中加温処理を行なうことによりその結晶形状を変化させた後、水酸基を無保護の状態でリン酸化する方法に関する。
本発明方法は、調味料や医薬品として有用な５′−ヌクレオチドもしくは５′−ヌクレオチド混合物、特にイノシン酸，グアニル酸およびシチジル酸等の単品もしくは混合物の工業的かつ経済的な製造法として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヌクレオシドを化学的にリン酸化する方法としては、例えば次のような方法が知られている。
１）ヌクレオシドをリン酸トリアルキルエステル中オキシ塩化リンと反応させる方法（特公昭４２−１１０７１）
２）グアノシンとイノシンとの混晶を用いる方法（特開昭５９−１６７５９９）
３）イノシンとグアノシンの混合リン酸化方法（特開平２−１１５１９５）
４）リン酸化に際してメタル化剤を用いる方法（特開昭５９−８０６９４）
５）リン酸化に際してアルミニウム化剤を用いる方法（特開昭５９−１６３３９７）
本発明の課題に関係するヌクレオシドの化学的リン酸化反応についての知見は以下の通りである。
ヌクレオシドをリン酸トリエチル下でオキシ塩化リンを添加してリン酸化反応を行なう場合、例えば、ヌクレオシドがイノシン・グアノシンの混晶の場合、イノシン・グアノシンのリン酸化反応速度が同一でないため、特にイノシンに比べてグアノシンのリン酸化反応速度は約１／３であるために、５′−モノヌクレオチド混合物を得るにあたり、ジホスフェート類やヒポキサンチン，グアニン等の副生物が生じる。
この副生物の生成を抑制する方法として上記２）に見られる様にグアノシンとイノシンとの混晶を用いてリン酸化反応を行なう方法が知られている。
また、３）に見られる様にイノシンもしくはグアノシンのアルカリ金属塩のリン酸化反応において後者のリン酸化反応を先行して行なった後、前者を加えて、逐次的にリン酸化反応を行なう等の方法が知られている。
さらに、上記４），５）に見られる様にメタル化剤もしくはアルミニウム化剤を用いてヌクレオシドの水酸基を活性化した後、リン酸化する方法が知られている。
しかし、ヌクレオシドのリン酸化過程において、ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を、約２０℃以上の温度に保ち、得られるヌクレオシドの懸濁液をリン酸化反応に付す方法についての記載はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ヌクレオシドからヌクレオチドを製造する方法、例えばイノシン及びグアノシンを任意の比率で含有する混合物、またはイノシン及びグアノシンの混晶の化学的リン酸化反応によるヌクレオチド製造法は、工業的製法として収率や副生物の生成、操作方法などの点でまだ十分満足できるものではない。したがって高純度，高収率で副生物が少なくしかも反応時間を短縮化できる５′−ヌクレオチドの製造法の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはイノシンとグアノシンの混合物の化学的リン酸化に際し、これらヌクレオシド結晶を有機溶媒（例えば、リン酸トリエチル，リン酸トリメチルなど）下において、スラリー化した後、加温処理を施し、ヌクレオシド結晶形態を変化させ、もしくは同結晶の表面積を増大させることにより、リン酸化反応速度が高められ、未反応物が著しく減少することを見出した。これらの知見に基き、さらに検討を重ねた結果、発明者らは従来にない高純度かつ高収率で５′−ヌクレオチドの混合物を得る製造法を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を、 ２０℃以上の温度に保った後、得られるヌクレオシドの懸濁液を冷却下、リン酸化反応に付すことを特徴とする５’−ヌクレオチドの製造法、
（２）ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を ３０℃〜 ８０℃に保つ第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（３）ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を ２０℃以上の温度に １０分〜 １２０分保つ第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（４）リン酸化反応を −３０℃〜 １０℃の温度で行う第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（５）有機溶媒がリン酸トリ低級（Ｃ１−６）アルキルエステル類である第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（６）リン酸トリ低級（Ｃ１−６）アルキルエステル類がリン酸トリエチルである第５項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（７）リン酸化反応がオキシハロゲン化リンを用いて行われる第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（８）オキシハロゲン化リンがオキシ塩化リンである第７項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（９）オキシハロゲン化リンをヌクレオシドに対して １〜 ５倍モル量用いる第７項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（１０）ヌクレオシドがイノシンである第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（１１）ヌクレオシドがグアノシンである第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、
（１２）ヌクレオシドがイノシンおよびグアノシンの混晶である第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法、および
（１３）ヌクレオシドがシチジンである第１項記載の５’−ヌクレオチドの製造法に関する。
【０００６】
本発明において、ヌクレオシドは、糖とプリン塩基またはピリミジン塩基がグルコシド結合をしているものを意味し、具体的にはリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドが用いられる。リボヌクレオシドとしては、例えばイノシン，グアノシン，シチジン，アデノシン，ウリジンなど、デオキシリボヌクレオシドとしては、例えばデオキシイノシン，デオキシグアノシン，デオキシシチジン，デオキシウリジンなどが用いられる。好ましくはリボヌクレオシドが用いられる。特に好ましくはイノシンまたはグアノシンが用いられる。
本発明においては、原料ヌクレオシドとして上記ヌクレオシドを単独もしくは混合物の形で用いることができる。また、ヌクレオシドは塩として用いてもよい。このような塩としては、例えば無機塩基（例えば、ナトリウム，カリウム等のアルカリ金属、カルシウム，マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニアなど）もしくは有機塩基（例えば、トリメチルアミン，トリエチルアミン等のトリアルキルアミン，ピリジンなど）との塩、または無機酸（例えば、塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸など）もしくは有機酸（例えば、酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸など）との塩が挙げられる。
【０００７】
本発明における原料ヌクレオシドとしては、特にイノシンおよびグアノシンの混晶を用いることが好ましい。該混晶は、自体公知の方法で得られたものを用いることができる。例えば、イノシンおよびグアノシンを含む水溶液より通常溶質を析出させる手段によって晶出させて得た混晶が用いられる（特公昭４７−３８１９９参照）。この場合、晶出の方法としては、例えば冷却、濃縮、種晶の添加、ヌクレオシドを溶解しない親水性溶媒（例えばアセトン）の添加、ｐＨ調整（ヌクレオシドの溶解度が大きいｐＨ３以下の酸性域、あるいはｐＨ９以上のアルカリ性域からｐＨ３〜９の範囲に調整する）など、およびこれらの組合せの方法を適宜採用できる。このような方法でヌクレオシドを含む溶液よりヌクレオシドとの混晶を析出させた後、吸引または加圧濾過、遠心分離、遠心沈降等の通常用いられる方法で該混晶を分離し、例えば減圧下に加熱乾燥する等により水などの溶媒を除去し、次いでリン酸化反応に供するのが望ましい。
【０００８】
本発明において有機溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさないものであればいずれでも用いられる。該有機溶媒としては、好ましくは極性溶媒、例えばリン酸トリメチル，リン酸トリエチル等のリン酸トリ低級（Ｃ1-6）アルキルエステル 類、リン酸トリメトキシエチルエステル，リン酸トリエトキシエチルエステル等のリン酸トリ低級（Ｃ1-6）アルコキシ低級（Ｃ1-6）アルキルエステル類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ジメチルホルムアミド，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類などが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独でもしくは２種以上を混合して用いることができる。これらの有機溶媒のうちリン酸トリ低級（Ｃ1-6）アルキルエステル類を用いることが好ましい。特に好ましい例と しては、リン酸トリエチル，リン酸トリメチルなどが挙げられる。
有機溶媒の使用量は、その種類により異なるが、通常ヌクレオシド重量に対して約５〜約２０倍量の範囲で適宜選択され、好ましくは約８〜約１７倍量程度である。
【０００９】
本発明において、リン酸化反応は次のように行われる。まず、ヌクレオシドまたはその塩を有機溶媒に懸濁し、得られる懸濁液を約２０℃以上の温度に保つ。この際、温度としては約２０〜約１００℃が好ましく、さらに好ましくは約３０〜約８０℃、特に好ましくは約４０〜約６０℃である。また、懸濁液を約２０℃以上の温度に保つ時間は前記した温度，原料ヌクレオシドの量等により異なるが、好ましくは約１０〜約１２０分、さらに好ましくは約１０〜約６０分、特に好ましくは約１０〜約２０分である。
一般的に、リン酸化反応はヌクレオシドの溶解に続いて液液反応するので、反応に使用するヌクレオシド結晶の粒度，粒形により反応速度が異なる。通常はヌクレオシド結晶が微粒である程その表面積が大きいため、反応速度を見掛上、速くすることができる。ヌクレオシド結晶の粒子径は、好ましくは約１〜約１０００μｍ，さらに好ましくは約２０〜約５００μｍである。
【００１０】
しかし本発明においては、ヌクレオシドの有機溶媒懸濁液を、約２０℃以上の温度に保つ場合、ヌクレオシド結晶はいずれの粒度，粒形のものも用いることができる。加温処理によりヌクレオシド結晶は見掛上、結晶転移に似た現象によりアモルファス状の結晶に変化するため、ヌクレオシド結晶表面積が増大し、結果としてリン酸化剤との反応速度が大きくなる。
続いて、得られるヌクレオシドの懸濁液をリン酸化反応に付す。リン酸化反応は、リン酸化剤を用いて行われる。この際、反応温度としては約−３０℃〜約１０℃が好ましく、特に好ましくは約０℃〜約１０℃である。
本発明で用いられるリン酸化剤は、通常リン酸化反応に用いられるリン酸化剤、好ましくはオキシ塩化リン、オキシ臭化リン等のオキシハロゲン化リンである。
【００１１】
リン酸化反応に際し、オキシハロゲン化リンをそのまま反応に供するよりも、一旦、部分水和物としてから用いる方が、通常５′−モノヌクレオチド生成への選択性が高く、２′または３′−モノホスフェート，ジホスフェート類の副生量が少なくなるので好ましい。
オキシハロゲン化リンの水和物を得る方法は、オキシハロゲン化リンを上記反応溶媒に加えて溶解してから、これに少量の水またはメタノール，エタノール，三級ブタノール等のアルコール類を加えて反応させればよい。
オキシハロゲン化リンの使用量は通常、ヌクレオシドに対して約１〜約５倍モル量、好ましくは約１．５〜約４倍モル量である。その使用量が少な過ぎるとヌクレオシドが未反応のまま残り、また、過度の使用量ではジホスフェート類の副生が増えると同時に目的とする５′−モノヌクレオチドの収率が下がるので好ましくない。通常、前記の使用範囲から、リン酸化剤あるいは溶媒の種類等を考慮し適宜に選択される。
反応時間は溶媒の種類、促進剤（例、ごく微量の水酸化ナトリウム等）添加の有無等によって異なるが、一般に約３０分〜約１０時間である。当反応法においては、従来のリン酸化法に比べ反応は短時間で終了する。
このようにして得られた反応生成物を常法により冷水（例、約１０℃以下，好ましくは約５℃以下）と混合することによって、未反応のリン酸化剤および生成したヌクレオシドホスホハロゲネートを加水分解し、５′−ヌクレオチドを含む溶液（加水分解液）を得る。
【００１２】
このようにして得られる５′−ヌクレオチドを精製する方法としては、自体公知の方法、例えば、
１）加水分解液のｐＨを水酸化ナトリウムで約１．５に調整した後、活性炭で処理する方法、
２）反応溶媒を他の有機溶媒を用いて抽出分離した後、水酸化ナトリウムなどのアルカリで中和してから、吸着樹脂処理あるいは晶析により精製する方法、
３）反応溶媒を他の有機溶媒を用いて抽出分離した後、活性炭で処理する方法、などが挙げられる。次いで、これらの精製方法のいずれかを経た後、常法によりヌクレオシド−５′−リン酸二ナトリウムの混晶として取得することができる。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例，比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例中、ＩＭＰＮa2とはイノシン−５′−モノリン酸二ナトリウムを、ＧＭＰＮa2とはグアノシン−５′−モノリン酸二ナトリウムを、ＩＲとはイノシンを、ＧＲとはグアノシンを、ＴＥＰとはリン酸トリエチルを、ＨＬＣとは高速液体クロマトグラフィーを意味する。
実施例１  イノシン・グアノシン混晶のリン酸化反応
イノシンとグアノシンの混晶粉末（イノシン，グアノシンが各々８５．３ｇ，１０３．６ｇ）を、室温（約１８℃）でリン酸トリエチル２１０６．２ｇに懸濁させ、約５℃に冷却した後、オキシ塩化リン２９４．３ｇと水１１．３ｇを添加して３．５時間反応させた。
一方、同様にしてイノシンとグアノシンの混晶粉末（イノシン，グアノシンが各々８５．３ｇ，１０３．６ｇ）を、室温（約１８℃）でリン酸トリエチル２１０６ｇに懸濁させ、加熱して５０℃とし１５分撹拌した後、約５℃に冷却下オキシ塩化リン２９４．３ｇと水１１．３ｇを添加して３．５時間反応させた。
続いて、各々の反応液を３２１１ｇの水（約５℃）に加えて加水分解した。この加水分解液をＨＬＣを用いて分析した結果を〔表１〕に示した。
ＨＬＣによる定量分析の際の条件は以下の通りである。この条件は以下実施例中においても同様である。
【００１４】
0004156678.tif 000002
【表１】
0004156678.tif 000003
【００１５】
実施例２  イノシンまたはグアノシンの結晶単独のリン酸化反応
イノシン，グアノシンの結晶粉末を各々８５．３ｇ，１０３．６ｇを用いて、実施例１と同様に、室温（約１８℃）でリン酸トリエチルに懸濁させた後、加温処理の有無で両者の反応液をＨＬＣを用いて分析した結果を〔表２〕に示した。
【表２】
0004156678.tif 000004
【００１６】
実施例３  ＴＥＰ下の加温条件（加温温度）の比較
イノシンとグアノシンの混晶粉末（イノシン，グアノシンが各々８５．３ｇ，１０３．６ｇ）を、室温（約１８℃）でリン酸トリエチル２１０６.２ｇに懸濁させ、加温処理を２５℃，５０℃，１００℃下で各々１５分行ない、約５℃に冷却した後、オキシ塩化リン２９４.３ｇと水１１.３ｇを添加して３.５時間反応させた。
続いて、各々の反応液を３２１１ｇの水（約５℃）に加えて加水分解した。この加水分解液をＨＬＣを用いて分析した結果を〔表３〕に示した。
【表３】
0004156678.tif 000005
【００１７】
実施例４  ＴＥＰ下の加温条件（加温時間）の比較
実施例３と全く同様にして、リン酸トリエチル下での加熱温度を５０℃として、その処理時間を１５分，３０分，６０分と変化させた場合の反応液のＨＬＣ分析結果を〔表４〕に示した。
【表４】
0004156678.tif 000006
【００１８】
実施例５  オキシ塩化リンの添加量の比較
イノシンとグアノシンの混晶粉末（イノシン，グアノシンが各々８５．３ｇ，１０３．６ｇ）を、室温（約１８℃）でリン酸トリエチル２１０６．２ｇに懸濁させ、加熱して５０℃とし１５分撹拌した後、約０℃に冷却し、ヌクレオシドに対してオキシ塩化リン１.４，１.６，１.８，２.０，２.７５倍モル量と水をそれぞれ５.４，７.２，７.２，９，１１.３ｇ添加して３．５時間反応させた。
続いて、各々の反応液を３２１１ｇの水（約５℃）に加えて加水分解した。この加水分解液をＨＬＣを用いて分析した結果を〔表５〕に示した。
【表５】
0004156678.tif 000007
【００１９】
実施例６  リン酸化反応条件の比較
イノシンとグアノシンの混晶粉末（イノシン，グアノシンが各々８５．３ｇ，１０３．６ｇ）を、室温（約１８℃）でリン酸トリエチル２１０６．２ｇに懸濁させ、加熱して５０℃とし１５分撹拌した後、約−５℃，０℃，５℃に冷却し、ヌクレオシドに対してオキシ塩化リン１．８倍モル量と水７．２ｇを添加して３．５時間反応させた。
続いて、各々の反応液を３２１１ｇの水（約５℃）に加えて加水分解した。この加水分解液をＨＬＣを用いて分析した結果を〔表６〕に示した。
【表６】
0004156678.tif 000008
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヌクレオシドより５′−ヌクレオチドを高純度，高収率で得ることができるとともに、ヌクレオシドリン酸化反応時間が短縮化され、ヌクレオチド精製工程の不純物除去操作がきわめて容易である。また、リン酸化剤であるオキシハロゲン化リンの量も常量より少なくてよい。