(57)【要約】  本発明は、マイトフュージン−１（Ｍｆｎ１）ポリペプチドを提供するステップ、及びＭｆｎ１ポリペプチドと候補薬剤の結合とを検出するステップを含む、Ｍｆｎ１に結合可能な薬剤を同定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイトフュージン−１（Ｍｆｎ１）に結合可能な薬剤を同定する方法であって、Ｍｆｎ１ポリペプチドを提供するステップ、及び前記Ｍｆｎ１ポリペプチドと候補薬剤との結合を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
Ｍｆｎ１の活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、Ｍｆｎ１ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと候補薬剤とを含む調製物を提供するステップ、及び前記候補薬剤が前記Ｍｆｎ１ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの活性に影響するか否かを検出するステップを含む方法。
【請求項３】
Ｍｆｎ１の活性が、Ｍｆｎ１のＧＴＰアーゼ活性を決定することによって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記候補薬剤をＧＴＰ存在下で前記Ｍｆｎ１ポリペプチドと接触させるステップ、及びＧＤＰへのＧＴＰの加水分解を測定するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｍｆｎ１の活性を調節することが可能な薬剤であって、マイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）の活性を調節しない薬剤を同定するための方法である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｍｆｎ２の活性が、Ｍｆｎ２のＧＴＰアーゼ活性を決定することによって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｍｆｎ１の活性を減少させる薬剤を同定するための方法である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｍｆｎ１とＧＴＰとの相互作用を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
ｄ）Ｍｆｎ１ポリペプチドを提供するステップ、
ｅ）ＧＴＰ分子を提供するステップ、及び
ｆ）候補薬剤の存在下で前記Ｍｆｎ１ポリペプチドと前記ＧＴＰ分子との結合を検出するステップ
を含む方法。
【請求項９】
Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングを調節する薬剤を同定するための方法であって、Ｍｆｎ１ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させるステップ、及び前記Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングの増減をモニタリングするステップを含む方法。
【請求項１０】
Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングを減少させる薬剤を同定するための方法である、請求項９に記載の方法であって、Ｍｆｎ１ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させるステップ、及び前記Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングの減少をモニタリングするステップを含む方法。
【請求項１１】
Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングを減少させる薬剤であって、Ｍｆｎ２ポリペプチドの発現又はプロセシングを調節しない薬剤を同定するための方法である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｍｆｎ１関連疾患の症状を予防、調節、減少又は改善する薬剤を同定するための方法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
代謝疾患の症状を予防、減少又は改善する薬剤を同定するための方法である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
代謝疾患の症状を予防、調節、減少又は改善する薬剤を同定する方法であって、Ｍｆｎ１活性を調節するものとして同定された薬剤を前記代謝疾患の動物モデルに投与するステップ、及び前記動物モデルにおける前記代謝疾患の進行を観察するステップを含む方法。
【請求項１５】
前記候補薬剤が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を用いて同定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記代謝疾患が、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又は小分子である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
代謝疾患の処置又は予防における使用のための、Ｍｆｎ１の活性を調節することが可能な薬剤。
【請求項１９】
代謝疾患の処置における使用のための請求項１８に記載の薬剤であって、Ｍｆｎ１の活性を減少させることが可能な薬剤。
【請求項２０】
代謝疾患の処置における使用のための請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の薬剤であって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は小分子からなる群から選択される薬剤。
【請求項２１】
代謝疾患の処置における使用のための請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はポリペプチドをコードするベクター。
【請求項２２】
代謝疾患の処置における使用のための請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のベクター又は薬剤であって、前記代謝疾患が、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択される、ベクター又は薬剤。
【請求項２３】
代謝疾患を予防又は処置する薬剤をスクリーニングする方法における、Ｍｆｎ１ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
代謝疾患のバイオマーカーとしての、Ｍｆｎ１ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２５】
対象における代謝疾患又は該疾患の素因を診断する方法であって、対象から得られた試料におけるＭｆｎ１の発現レベルを測定することを含む方法。
【請求項２６】
前記代謝疾患が、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明はマイトフュージン−１（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１）に関する。より詳細には、本発明は、マイトフュージン−１に結合可能な、又はマイトフュージン−１の活性若しくは発現を調節することが可能な薬剤を同定する方法に関する。本発明は、これらの方法により同定される薬剤及び治療におけるこれらの薬剤の使用にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
ミトコンドリアは、体のほとんどすべての細胞に存在する細胞内小器官である。ミトコンドリアは、多くの細胞内過程、最も顕著にはエネルギー代謝において重要な役割を果たしている。ミトコンドリアの機能障害は、代謝系合併症及び心血管合併症、神経変性疾患並びに癌を含む数多くの病理に結びついている。
【０００３】
しかし、ミトコンドリアは単独のものとして分離される細胞内小器官ではない。むしろ、それらは、代謝の必要性に応じて細胞の呼吸能を適合させるために、細胞中を動き回り、融合及び分裂することができる動的な構造である。
【０００４】
ミトコンドリアの融合及び分裂には数個の遺伝子が重要である。これらの中で、マイトフュージン−１及びマイトフュージン−２（Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２）はミトコンドリア外膜の融合を担っている。いずれのタンパク質も、ミトコンドリア外膜に局在する膜貫通ＧＴＰアーゼである。Ｍｆｎ１とＭｆｎ２の主要な相違は、細胞内でミトコンドリアを相互に接着させるのみならず小胞体内腔ともつなぐことができるＭｆｎ２の能力にある（ｄｅ  Ｂｒｉｔｏ  Ｏ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｃｏｒｒａｎｏ  Ｌ．（２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：６０５−１０）。
【０００５】
Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の発現調節は、ミトコンドリア新生（例えば、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体共活性化因子α（ＰＧＣ−１α）の活性化により引き起こされるもの）を制御する支配プログラムにより通常は組織化されている（Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｆ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５：１７８３−９１）。Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の過剰発現は異常に伸長したミトコンドリアを誘発する。逆に、Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の下方制御は小さな丸形のミトコンドリア（「分裂ミトコンドリア」と呼ばれる）を生じる。
【０００６】
２型糖尿病患者で、ミトコンドリアが高度に分裂した構造を呈することが示されている（Ｂａｃｈ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１７１９０−７）。さらに、肥満状態及び２型糖尿病においてＭｆｎ２の下方制御も確認されている（Ｂａｃｈ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１７１９０−７）。糖尿病患者で一般に見られるミトコンドリアの機能障害はこのことにより説明できると示唆されている。これらの結果から、Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２いずれの下方制御も糖尿病の発症に寄与する因子になり得ると考えられた。
【０００７】
Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２欠失形質転換マウスモデルの開発が困難であったことにより、当初生体内でのＭｆｎ１及びＭｆｎ２の研究は妨げられていた。生殖細胞系列でのＭｆｎ１又はＭｆｎ２の欠失はいずれも、マウスにおいて妊娠中期の胎生致死を引き起こす（Ｃｈｅｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６０：１８９−２００）。このことを克服するために、組織特異的にＭｆｎ２を欠失することのできる条件付きノックアウトマウスモデルが作製された。続いて、関連する代謝研究を容易にするために、これらのマウスをＣ５７Ｂｌ／６Ｊの遺伝的背景に戻し交配された。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊの遺伝的背景は、高脂肪食飼育によりヒトの代謝疾患を模倣できることから、かかる研究に最も一般的に用いられる系統である。
【０００８】
肝特異的Ｍｆｎ２欠失（Ｍｆｎ２−ＬＫＯ）マウスの研究結果は先行研究と一致した。このモデルは肝臓において著しいミトコンドリア機能障害を示し、マウスは空腹時高血糖症を呈した（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：５５２３−８）。高脂肪食を与えられた場合、そのマウスはインスリン抵抗性の進展に対して極度に感受性であった。このことは、変化したミトコンドリア構造がブドウ糖の恒常性に有害である可能性を確実なものとした。
【０００９】
Ｍｆｎ１欠失マウスにおける同様の研究は同様の結果を示すであろうと広く考えられていた。
【発明の概要】
【００１０】
１つの態様では、本発明は、マイトフュージン−１（Ｍｆｎ１）ポリペプチドを提供するステップ、及びＭｆｎ１ポリペプチドと候補薬剤との結合を検出するステップを含む、Ｍｆｎ１に結合可能な薬剤を同定する方法を提供する。
【００１１】
１つの実施形態では、方法は、マイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）に比べてＭｆｎ１に優先的に結合可能な薬剤を同定するためのものである。例えば、その薬剤は、Ｍｆｎ２よりＭｆｎ１に対して高い親和性でＭｆｎ１に結合し得る。１つの実施形態では、その薬剤はＭｆｎ１には結合するが、マイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）には結合しない。
【００１２】
他の態様では、本発明は、Ｍｆｎ１の活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、Ｍｆｎ１ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと候補薬剤とを含む調製物を提供するステップ、及びかかる候補薬剤がＭｆｎ１ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの活性に影響するか否かを検出するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
１つの実施形態では、Ｍｆｎ１の活性はＭｆｎ１のＧＴＰアーゼ活性を決定することによって測定される。
【００１４】
他の実施形態では、方法は、ＧＴＰ存在下で候補薬剤をＭｆｎ１ポリペプチドと接触させるステップ、及びＧＴＰのＧＤＰへの加水分解を測定するステップを含む。
【００１５】
１つの実施形態では、方法は、マイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）に比べてＭｆｎ１の活性を優先的に調節（例えば阻害）することが可能な薬剤を同定するためのものである。他の実施形態では、方法は、Ｍｆｎ１の活性を調節することが可能な薬剤であって、マイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）の活性を調節しない薬剤を同定するための方法である。Ｍｆｎ２の活性は、Ｍｆｎ２のＧＴＰアーゼ活性を決定することによって測定され得る。例えば、その薬剤は、Ｍｆｎ１阻害においてＭｆｎ２阻害より低い５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有し得る。１つの実施形態では、その薬剤はＭｆｎ１の活性は阻害するが、マイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）の活性は阻害しない。
【００１６】
他の実施形態では、方法は、Ｍｆｎ１の活性を減少させる薬剤を同定するための方法である。Ｍｆｎ１の活性は、候補薬剤がない場合の活性に比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少し得る。
【００１７】
他の実施形態では、方法は、例えばインスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常及び糖尿病からなる群から選択される疾患などの代謝疾患を処置又は予防することが可能な薬剤を同定するためのものである。
【００１８】
他の態様では、本発明は、Ｍｆｎ１とＧＴＰとの相互作用を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
ａ）Ｍｆｎ１ポリペプチドを提供するステップ、
ｂ）ＧＴＰ分子を提供するステップ、及び
ｃ）候補薬剤の存在下でＭｆｎ１ポリペプチドとＧＴＰ分子との結合を検出するステップ
を含む方法を提供する。
【００１９】
他の態様では、本発明は、Ｍｆｎ１ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させるステップ、及びかかるＭｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングの増減をモニタリングするステップを含む、Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングを調節する薬剤を同定するための方法を提供する。
【００２０】
１つの実施形態では、方法は、Ｍｆｎ１ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させるステップ、及び前記Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングの減少をモニタリングするステップを含む、Ｍｆｎ１ポリペプチドの発現又はプロセシングを減少させる薬剤を同定するためのものである。Ｍｆｎ１の発現は、候補薬剤がない場合の発現レベルに比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少し得る。
【００２１】
１つの実施形態では、前述のいずれの方法も、疾患、例えばＭｆｎ１又はミトコンドリアの融合若しくは機能障害に関連する疾患の症状を予防、調節、減少又は改善する薬剤を同定するためのものである。方法は、代謝疾患の症状を予防、減少又は改善する薬剤を同定するためのものである場合もある。その代謝疾患は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択され得る。
【００２２】
他の態様では、本発明は、Ｍｆｎ１活性を調節するものとして同定された薬剤を前記代謝疾患のモデル動物に投与するステップ、及びかかるモデル動物における代謝疾患の進行を観察するステップを含む、代謝疾患の症状を予防、調節、減少又は改善する薬剤を同定する方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態では、候補薬剤は前述の任意の方法を用いて同定される。
【００２４】
代謝疾患は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択され得る。
【００２５】
前述の方法の薬剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又は小分子であり得る。
【００２６】
他の態様では、本発明は、Ｍｆｎ１の活性を調節すること又はＭｆｎ１の発現若しくはプロセシングを調節することが可能な、代謝疾患の処置又は予防における使用のための薬剤を提供する。
【００２７】
１つの実施形態では、代謝疾患の処置又は予防における使用のための薬剤は、Ｍｆｎ１の活性、発現又はプロセシングを減少させることが可能な薬剤である。その薬剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は小分子からなる群から選択することができる。
【００２８】
他の態様では、本発明は、本発明の前述した態様での代謝疾患の処置における使用のための、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はポリペプチドをコードするベクターを提供する。
【００２９】
本発明のベクター又は薬剤は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択される代謝疾患の処置又は予防における使用のためのものであり得る。
【００３０】
他の態様では、本発明は、代謝疾患を予防又は処置する薬剤をスクリーニングする方法における、Ｍｆｎ１ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００３１】
他の態様では、本発明は、代謝疾患のバイオマーカーとしての、Ｍｆｎ１ポリペプチド又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００３２】
他の態様では、本発明は、対象から得られた試料におけるＭｆｎ１の発現レベルを測定することを含む、対象における代謝疾患又は前記疾患の素因を診断する方法を提供する。その代謝疾患は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、空腹時血糖異常、及び糖尿病からなる群から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１。標準食のＭｆｎ１−ＬＫＯマウスでは血糖制御に影響はない。（Ａ）１８週齢の雄性対照マウス又はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスに２ｇ／ｋｇ体重で腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。（Ｂ）２０週齢の雄性対照マウス又はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスに０．３Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。すべての値は、対照マウスがｎ＝１１、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスがｎ＝９の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表示されている。
【図２】図２。Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスは高脂肪食飼育においてより良い糖耐性及びインスリン感受性を示す。（Ａ）１０週齢の対照マウス及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスを低脂肪食（ＬＦＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）で飼育した。（Ａ）体重の変化。（Ｂ）高脂肪食飼育８週後にエコーＭＲＩにより測定された身体組成。（Ｃ）高脂肪食開始後１０週で２ｇ／ｋｇ体重でマウスに腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。（Ｄ）高脂肪食開始後１２週で老齢マウスに０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。曲線上面積（ＡＯＣ）値を右図に示す。すべての値は、対照マウスがｎ＝１０、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスがｎ＝１０の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表示されている。＊は、それぞれの対照マウスに対する統計的有意差をｐ＜０．０５で示している。
【図３】図３。低血糖に対するメトホルミンの作用はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスで増強される。１２週齢の対照マウス及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスを８週間高脂肪食（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で飼育した。その後、マウスは一晩絶食させ、生理食塩水（溶媒として）又はメトホルミン（１２５ｍｇ／ｋｇ）いずれかを注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。すべての値は、各群ｎ＝１０のマウスの平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表されている。＊は、対照マウスとＭｆｎ１−ＬＫＯマウスとの間の統計的有意差をｐ＜０．０５で示している。白い四角は対照マウスの値に用いられており、黒い四角はＭｆｎ１−ＬＫＯに用いられている。
【図４】図４。野生型及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスにおけるミトコンドリア呼吸のメトホルミンによる阻害。野生型及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスから新しく抽出したミトコンドリアを呼吸測定液で均質化し、２ｍｇの組織を呼吸測定解析に用いた。リンゴ酸及びグルタミン酸の添加によってミトコンドリアにおける複合体Ｉの活性を刺激した。その後、最大の共役的呼吸を達成するためにＡＤＰを添加し、続いてメトホルミンの効果を評価した。棒グラフは、呼吸の絶対量を各遺伝子型について４つのミトコンドリア調製物の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で示している。＊は、遺伝子型間の統計的有意差をｐ＜０．０５で示している。下の表は、異なるメトホルミン用量での最大呼吸に対する残存％を表している。白い棒グラフは対照マウス、黒い棒グラフはＭｆｎ１−ＬＫＯマウスに用いられている。
【発明の詳細な説明】
【００３４】
本発明者らは、肝特異的Ｍｆｎ１欠失（Ｍｆｎ１−ＬＫＯ）マウスモデルを作製した。作製を達成するために、Ｍｆｎ１のｆｌｏｘマウス（すなわちＭｆｎ１遺伝子が２つのｌｏｘＰ部位に挟まれているマウス）を、アルブミンプロモーターによりＣｒｅリコンビナーゼの発現が制御されているマウスと交配することにより、生殖細胞系列のＭｆｎ１の欠失に関係する胎生致死を克服した。Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスは正常な外観を有し対照マウスに等しいエネルギー消費を示すが、エネルギー源としては脂肪を好むことを、本発明者は発見した。加えて、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスの肝臓は、より高い呼吸容量及びより多い呼吸複合体を示した（表２）。
【００３５】
しかし、驚くべきことに、通常の低脂肪食で飼育された場合、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスは、Ｍｆｎ２−ＬＫＯマウスで観察される空腹時高血糖症又はブドウ糖恒常性の異常を示さない（図１Ａ〜Ｂ）（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：５５２３−５５２８）。さらに驚くべきことに、本発明者らは、高脂肪食が与えられた場合、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスは、体重増加（図２Ａ）及び脂肪量（図２Ｂ）増加は対照マウスと同じであるが、耐糖性（図２Ｃ）及びインスリン感受性（図２Ｄ）がより高いままであることを発見した。この重要な打開は、Ｍｆｎ１の下方制御が糖尿病に対抗する有力な戦略を提供する可能性があることを示唆する。
【００３６】
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態が非限定的な例としてこれから記載されるであろう。
【００３７】
本発明の実施には、特段の指示がない限り、当業者にとって可能な範囲の化学、分子生物学、微生物学及び免疫学の従来技術が用いられるであろう。そのような技術は文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５年及び定期的に追補）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ  （１９９６）  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ  （１９９０）  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（ｅｄ．）  （１９８４）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；及びＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ  （１９９２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照。これらの一般的な教科書の各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
マイトフュージン：
マイトフュージン−１（Ｍｆｎ１）及びマイトフュージン−２（Ｍｆｎ２）は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｆｚｏ又は酵母Ｆｚｏ１タンパク質の哺乳動物の相同体である。哺乳動物のＭｆｎ１及びＭｆｎ２タンパク質は組織により発現レベルは異なるが、多くの組織で広く発現している。Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２はいずれもミトコンドリアの構造維持に重要である。
【００３９】
Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２は、Ｃ末端の膜結合領域によりミトコンドリア外膜に係留している。両タンパク質は細胞質側にＮ末端ＧＴＰアーゼ領域を有している。加えて、少なくともＭｆｎ１はＣ末端に７アミノ酸反復を有している。この領域は、ミトコンドリアの繋留をもたらす二量体逆平行コイルドコイル構造を形成することが示されている（Ｋｏｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：８５８−６２）。
【００４０】
Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２両タンパク質、及びそれらの機能するＧＴＰアーゼ領域はミトコンドリアの融合に必須である。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、Ｍｆｎ１はヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来である。例えば、Ｍｆｎ１は下記配列を含み得る：
ＭＡＥＰＶＳＰＬＫＨＦＶＬＡＫＫＧＩＴＡＩＦＤＱＬＬＥＦＶＴＥＧＳＨＦＶＥＡＴＹＫＮＰＥＬＤＲＩＡＴＥＤＤＬＶＥＭＱＧＹＫＤＫＬＳＩＩＧＥＶＬＳＲＲＨＭＫＶＡＦＦＧＲＴＳＳＧＫＳＳＶＩＮＡＭＬＷＤＫＶＬＰＳＧＩＧＨＩＴＮＣＦＬＳＶＥＧＴＤＧＤＫＡＹＬＭＴＥＧＳＤＥＫＫＳＶＫＴＶＮＱＬＡＨＡＬＨＭＤＫＤＬＫＡＧＣＬＶＲＶＦＷＰＫＡＫＣＡＬＬＲＤＤＬＶＬＶＤＳＰＧＴＤＶＴＴＥＬＤＳＷＩＤＫＦＣＬＤＡＤＶＦＶＬＶＡＮＳＥＳＴＬＭＮＴＥＫＨＦＦＨＫＶＮＥＷＬＳＫＰＮＩＦＩＬＮＮＲＷＤＡＳＡＳＥＰＥＹＭＥＤＶＲＲＱＨＭＥＲＣＬＨＦＬＶＥＥＬＫＶＡＮＡＬＥＡＱＮＲＩＦＦＶＳＡＫＥＶＬＳＡＲＫＱＫＡＱＧＭＰＥＳＧＶＡＬＡＥＧＦＨＡＲＬＱＥＦＱＮＦＥＱＩＦＥＥＣＩＳＱＳＡＶＫＴＫＦＥＱＨＴＩＲＡＫＱＩＬＡＴＶＫＮＩＭＤＳＶＮＬＡＡＥＤＫＲＨＹＳＶＥＥＲＥＤＱＩＤＲＬＤＦＩＲＮＱＭＮＬＬＴＬＤＶＫＫＫＩＫＥＶＴＥＥＶＡＮＫＶＳＣＡＭＴＤＥＩＣＲＬＳＶＬＶＤＥＦＣＳＥＦＨＰＮＰＤＶＬＫＩＹＫＳＥＬＮＫＨＩＥＤＧＭＧＲＮＬＡＤＲＣＴＤＥＶＮＡＬＶＬＱＴＱＱＥＩＩＥＮＬＫＰＬＬＰＡＧＩＱＤＫＬＨＴＬＩＰＣＫＫＦＤＬＳＹＮＬＮＹＨＫＬＣＳＤＦＱＥＤＩＶＦＲＦＳＬＧＷＳＳＬＶＨＲＦＬＧＰＲＮＡＱＲＶＬＬＧＬＳＥＰＩＦＱＬＰＲＳＬＡＳＴＰＴＡＰＴＴＰＡＴＰＤＮＡＳＱＥＥＬＭＩＴＬＶＴＧＬＡＳＶＴＳＲＴＳＭＧＩＩＩＶＧＧＶＩＷＫＴＩＧＷＫＬＬＳＶＳＬＴＭＹＧＡＬＹＬＹＥＲＬＳＷＴＴＨＡＫＥＲＡＦＫＱＱＦＶＮＹＡＴＥＫＬＲＭＩＶＳＳＴＳＡＮＣＳＨＱＶＫＱＱＩＡＴＴＦＡＲＬＣＱＱＶＤＩＴＱＫＱＬＥＥＥＩＡＲＬＰＫＥＩＤＱＬＥＫＩＱＮＮＳＫＬＬＲＮＫＡＶＱＬＥＮＥＬＥＮＦＴＫＱＦＬＰＳＳＮＥＥＳ
（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＫ０６８４０．１；配列番号１）
【００４２】
他の実施形態では、Ｍｆｎ１はハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来である。例えば、Ｍｆｎ１は下記配列を含み得る：
ＭＡＥＴＶＳＰＬＫＨＦＶＬＡＫＫＡＩＴＡＩＦＧＱＬＬＥＦＶＴＥＧＳＨＦＶＥＡＴＹＲＮＰＥＬＤＲＩＡＳＥＤＤＬＶＥＩＱＧＹＲＮＫＬＡＶＩＧＥＶＬＳＲＲＨＭＫＶＡＦＦＧＲＴＳＳＧＫＳＳＶＩＮＡＭＬＷＤＫＶＬＰＳＧＩＧＨＴＴＮＣＦＬＳＶＥＧＴＤＧＤＫＡＹＬＭＴＥＧＳＤＥＫＫＳＶＫＴＶＮＱＬＡＨＡＬＨＭＤＫＤＬＫＡＧＣＬＶＨＶＦＷＰＫＡＫＣＡＬＬＲＤＤＬＶＬＶＤＳＰＧＴＤＶＴＴＥＬＤＩＷＩＤＫＦＣＬＤＡＤＶＦＶＬＶＡＮＳＥＳＴＬＭＮＴＥＫＨＦＦＨＫＶＮＥＲＬＳＫＰＮＩＦＩＬＮＮＲＷＤＡＳＡＳＥＰＥＹＭＥＤＶＲＲＱＨＭＥＲＣＬＨＦＬＶＥＥＬＫＶＶＳＰＳＥＡＲＮＲＩＦＦＶＳＡＫＥＶＬＮＳＲＫＨＫＡＱＧＭＰＥＧＧＧＡＬＡＥＧＦＱＡＲＬＱＥＦＱＮＦＥＱＴＦＥＥＣＩＳＱＳＡＶＫＴＫＦＥＱＨＴＩＲＡＫＱＩＬＤＴＶＫＮＩＬＤＳＶＮＶＡＡＡＥＫＲＶＹＳＭＥＥＲＥＤＱＩＤＲＬＤＦＩＲＮＱＭＮＬＬＴＬＤＶＫＫＫＩＫＥＶＴＥＥＶＡＮＫＶＳＣＡＭＴＤＥＩＣＲＬＳＶＬＶＤＥＦＣＳＥＦＨＰＴＰＳＶＬＫＶＹＫＳＥＬＮＫＨＩＥＤＧＭＧＲＮＬＡＤＲＣＴＮＥＶＮＡＳＩＬＱＳＱＱＥＩＩＥＮＬＫＰＬＬＰＡＧＩＱＮＫＬＨＴＬＩＰＣＫＫＦＤＬＳＹＤＬＮＣＨＫＬＣＳＤＦＱＥＤＩＶＦＲＦＳＬＧＷＳＳＬＶＨＲＦＬＧＳＴＮＡＱＲＶＬＬＧＬＳＥＰＩＦＱＶＰＲＳＬＡＳＴＰＴＡＰＳＮＰＡＡＰＤＮＡＡＱＥＥＬＭＩＴＬＩＴＧＬＡＳＬＴＳＲＴＳＭＧＩＩＶＶＧＧＶＩＷＫＴＶＧＷＫＬＩＳＶＴＬＳＭＹＧＡＬＹＬＹＥＲＬＴＷＴＴＲＡＫＥＲＡＦＫＱＱＦＶＮＹＡＴＥＫＬＱＭＩＶＳＦＴＳＡＮＣＳＨＱＶＱＱＥＭＡＴＴＦＡＲＬＣＱＱＶＤＶＴＱＫＨＬＥＥＥＩＡＲＬＳＫＥＩＤＱＬＥＫＩＱＮＮＳＫＬＬＲＮＫＡＶＱＬＥＳＥＬＥＮＦＳＫＱＦＬＨＰＳＳＧＥＳ
（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＯ３４６６０．１；配列番号２）
【００４３】
好ましい実施形態では、Ｍｆｎ１は、配列番号１又は２と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の相同性を有し、ミトコンドリアの融合及び／又はミトコンドリア外膜への組み込みを促進することが可能であるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
他の実施形態では、Ｍｆｎ１は、配列番号１若しくは２のタンパク質、又は配列番号１若しくは２と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％のアミノ酸相同性を有し、ミトコンドリアの融合及び／又はミトコンドリア外膜への組み込みを促進することが可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００４５】
本発明の１つの実施形態では、Ｍｆｎ２はヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来である。例えば、Ｍｆｎ２は下記配列を含み得る：
ＭＳＬＬＦＳＲＣＮＳＩＶＴＶＫＫＮＫＲＨＭＡＥＶＮＡＳＰＬＫＨＦＶＴＡＫＫＫＩＮＧＩＦＥＱＬＧＡＹＩＱＥＳＡＴＦＬＥＤＴＹＲＮＡＥＬＤＰＶＴＴＥＥＱＶＬＤＶＫＧＹＬＳＫＶＲＧＩＳＥＶＬＡＲＲＨＭＫＶＡＦＦＧＲＴＳＮＧＫＳＴＶＩＮＡＭＬＷＤＫＶＬＰＳＧＩＧＨＴＴＮＣＦＬＲＶＥＧＴＤＧＨＥＡＦＬＬＴＥＧＳＥＥＫＲＳＡＫＴＶＮＱＬＡＨＡＬＨＱＤＫＱＬＨＡＧＳＬＶＳＶＭＷＰＮＳＫＣＰＬＬＫＤＤＬＶＬＭＤＳＰＧＩＤＶＴＴＥＬＤＳＷＩＤＫＦＣＬＤＡＤＶＦＶＬＶＡＮＳＥＳＴＬＭＱＴＥＫＨＦＦＨＫＶＳＥＲＬＳＲＰＮＩＦＩＬＮＮＲＷＤＡＳＡＳＥＰＥＹＭＥＥＶＲＲＱＨＭＥＲＣＴＳＦＬＶＤＥＬＧＶＶＤＲＳＱＡＧＤＲＩＦＦＶＳＡＫＥＶＬＮＡＲＩＱＫＡＱＧＭＰＥＧＧＧＡＬＡＥＧＦＱＶＲＭＦＥＦＱＮＦＥＲＲＦＥＥＣＩＳＱＳＡＶＫＴＫＦＥＱＨＴＶＲＡＫＱＩＡＥＡＶＲＬＩＭＤＳＬＨＭＡＡＲＥＱＱＶＹＣＥＥＭＲＥＥＲＱＤＲＬＫＦＩＤＫＱＬＥＬＬＡＱＤＹＫＬＲＩＫＱＩＴＥＥＶＥＲＱＶＳＴＡＭＡＥＥＩＲＲＬＳＶＬＶＤＤＹＱＭＤＦＨＰＳＰＶＶＬＫＶＹＫＮＥＬＨＲＨＩＥＥＧＬＧＲＮＭＳＤＲＣＳＴＡＩＴＮＳＬＱＴＭＱＱＤＭＩＤＧＬＫＰＬＬＰＶＳＶＲＳＱＩＤＭＬＶＰＲＱＣＦＳＬＮＹＤＬＮＣＤＫＬＣＡＤＦＱＥＤＩＥＦＨＦＳＬＧＷＴＭＬＶＮＲＦＬＧＰＫＮＳＲＲＡＬＭＧＹＮＤＱＶＱＲＰＩＰＬＴＰＡＮＰＳＭＰＰＬＰＱＧＳＬＴＱＥＥＦＭＶＳＭＶＴＧＬＡＳＬＴＳＲＴＳＭＧＩＬＶＶＧＧＶＶＷＫＡＶＧＷＲＬＩＡＬＳＦＧＬＹＧＬＬＹＶＹＥＲＬＴＷＴＴＫＡＫＥＲＡＦＫＲＱＦＶＥＨＡＳＥＫＬＱＬＶＩＳＹＴＧＳＮＣＳＨＱＶＱＱＥＬＳＧＴＦＡＨＬＣＱＱＶＤＶＴＲＥＮＬＥＱＥＩＡＡＭＮＫＫＩＥＶＬＤＳＬＱＳＫＡＫＬＬＲＮＫＡＧＷＬＤＳＥＬＮＭＦＴＨＱＹＬＱＰＳＲ
（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＫ１８７２８．１；配列番号３）
【００４６】
他の実施形態では、Ｍｆｎ２はハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来である。例えば、Ｍｆｎ２は下記配列を含み得る：
ＭＳＬＬＦＳＲＣＮＳＩＶＴＶＫＫＤＫＲＨＭＡＥＶＮＡＳＰＬＫＨＦＶＴＡＫＫＫＩＮＧＩＦＥＱＬＧＡＹＩＱＥＳＡＳＦＬＥＤＴＨＲＮＴＥＬＤＰＶＴＴＥＥＱＶＬＤＶＫＧＹＬＳＫＶＲＧＩＳＥＶＬＡＲＲＨＭＫＶＡＦＦＧＲＴＳＮＧＫＳＴＶＩＮＡＭＬＷＤＫＶＬＰＳＧＩＧＨＴＴＮＣＦＬＲＶＧＧＴＤＧＨＥＡＦＬＬＴＥＧＳＥＥＫＫＳＶＫＴＶＮＱＬＡＨＡＬＨＱＤＥＱＬＨＡＧＳＭＶＳＶＭＷＰＮＳＫＣＰＬＬＫＤＤＬＶＬＭＤＳＰＧＩＤＶＴＴＥＬＤＳＷＩＤＫＦＣＬＤＡＤＶＦＶＬＶＡＮＳＥＳＴＬＭＱＴＥＫＱＦＦＨＫＶＳＥＲＬＳＲＰＮＩＦＩＬＮＮＲＷＤＡＳＡＳＥＰＥＹＭＥＥＶＲＲＱＨＭＥＲＣＴＳＦＬＶＤＥＬＧＶＶＤＲＡＱＡＧＤＲＩＦＦＶＳＡＫＥＶＬＳＡＲＶＱＫＡＱＧＭＰＥＧＧＧＡＬＡＥＧＦＱＶＲＭＦＥＦＱＮＦＥＲＱＦＥＥＣＩＳＱＳＡＶＫＴＫＦＥＱＨＴＶＲＡＫＱＩＡＥＡＶＲＬＩＭＤＳＬＨＩＡＡＱＥＱＲＶＹＣＬＥＭＲＥＥＲＱＤＲＬＲＦＩＤＫＱＬＥＬＬＡＱＤＹＫＬＲＩＫＱＩＴＥＥＶＥＲＱＶＳＴＡＭＡＥＥＩＲＲＬＳＶＬＶＤＥＹＱＭＤＦＨＰＳＰＶＶＬＫＶＹＫＮＥＬＨＲＨＩＥＥＧＬＧＲＮＬＳＤＲＣＳＴＡＩＡＳＳＬＱＴＭＱＱＤＭＩＤＧＬＫＰＬＬＰＶＳＭＲＮＱＩＤＭＬＶＰＲＱＣＦＳＬＳＹＤＬＮＣＤＫＬＣＡＤＦＱＥＤＩＥＦＨＦＳＬＧＷＴＭＬＶＮＲＦＬＧＰＫＮＳＲＲＡＬＬＧＹＳＤＱＶＱＲＰＬＰＬＴＰＡＮＰＳＭＰＰＬＰＱＳＳＬＴＱＥＥＬＭＶＳＭＶＴＧＬＡＳＬＴＳＲＴＳＭＧＩＬＶＶＧＧＶＶＷＫＡＶＧＷＲＬＩＡＬＳＦＧＬＹＧＬＬＹＶＹＥＲＬＴＷＴＴＫＡＫＥＲＡＦＫＲＱＦＶＥＹＡＳＥＫＬＱＬＩＩＳＹＴＧＳＮＣＳＨＱＶＱＱＥＬＳＧＴＦＡＨＬＣＱＱＶＤＩＴＲＤＮＬＥＱＥＩＡＡＭＮＫＫＶＥＡＬＤＳＬＱＳＲＡＫＬＬＲＮＫＡＧＷＬＤＳＥＬＮＭＦＴＨＱＹＬＱＰＳＲ
（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＭ８８５７７．１；配列番号４）
【００４７】
好ましい実施形態では、Ｍｆｎ２は、配列番号３又は４と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の相同性を有し、ミトコンドリアの融合をもたらすことが可能であるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
他の実施形態では、Ｍｆｎ２は、配列番号３若しくは４のタンパク質、又は配列番号３若しくは４と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％のアミノ酸相同性を有し、ミトコンドリアの融合をもたらすことが可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００４９】
マイトフュージン結合：
本発明は、マイトフュージン、例えばＭｆｎ１又はＭｆｎ２に結合可能な薬剤を同定する方法を含む。
【００５０】
方法は、質的又は量的な結果のいずれかを提供することが可能である。本発明の方法は、Ｍｆｎ１若しくはその断片に結合可能な薬剤を同定すること及びその代わりに若しくはそれに加えてそのような結合を特性評価することのいずれのためにも用いられ得る。例えば、方法は、絶対的若しくは相対的な結合親和性、及び／又は結合のエンタルピー若しくはエントロピーを測定することを可能とし得る。結合親和性は平衡解離定数（Ｋｄ）又は結合定数（Ｋａ）によって表され得る。
【００５１】
候補薬剤は、例えばペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体又は小分子など、対象となり得るいかなる薬剤であってもよい。好ましくは、候補薬剤は潜在的な治療対象に関する化合物又は混合物である。好ましくは、候補薬剤は哺乳動物、特にヒトに対して低毒性である。いくつかの実施形態では、候補薬剤には天然化合物又は植物若しくは動物の抽出物などの化合物の混合物を含む栄養剤及び／又は食品成分を含ませることが可能である。
【００５２】
候補薬剤は、例えばコンビナトリアルケミストリーにより作成されたライブラリー又はファージディスプレイのライブラリーなど薬剤ライブラリーの部分である場合もある。１つの実施形態では、候補薬剤は植物性の生理活性分子ライブラリーの部分である。
【００５３】
候補薬剤とタンパク質の結合を同定するためのいくつかのアッセイ技術が当業者に知られている。用いられるアッセイ技術は、好ましくは、自動化及び／又は候補薬剤のハイスループットスクリーニングが容易にできるものである。アッセイは、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、レジンなどの使い捨ての固体支持体で実施され得る。
【００５４】
例えば、Ｍｆｎ１は、例えばマイクロビーズ、レジン、マイクロタイタープレート又はアレイなどの固体の支持体に固相化され得る。そして、候補薬剤は固相化されたＭｆｎ１に接触させられる。弱く又は非特異的に結合した薬剤を除去するために随意に洗浄処理を適用することができる。その後、Ｍｆｎ１に結合した薬剤を検出及び同定することができる。結合した薬剤の検出を容易にするために、候補薬剤は容易に検出可能なマーカーで標識され得る。マーカーは、例えば、放射性標識、酵素標識、抗体標識、蛍光標識、粒子（例えばラテックス又は金）標識、又は同様のものを含み得る。
【００５５】
あるいは、上述の手順は逆でもよく、候補薬剤を固相化し、Ｍｆｎ１をかかる固相化薬剤に接触させてもよい。弱く又は非特異的に結合したＭｆｎ１を除去するために随意に洗浄処理を適用することができる。その後、Ｍｆｎ１が結合した薬剤を検出及び同定することができる。結合の検出を容易にするために、Ｍｆｎ１は上述のように容易に検出可能なマーカーで標識され得る。
【００５６】
上述のアッセイに加えて、他の適切なアッセイ技術も当業者に知られている。そのような技術の例は、放射標識測定、蛍光測定、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光法、蛍光異方性測定、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）及び同様のものである。これらのアッセイは、Ｍｆｎ１に結合する薬剤を同定するために適用され得る。実際、ハイスループットスクリーニングを容易にするために、これら技術の多くについて自動化のための基盤が広く当業者に知られている。
【００５７】
１つ以上のアッセイ技術が、候補薬剤のＭｆｎ１への結合を詳細に理解するために用いられ得る。例えば、質的な結合情報を与えるアッセイを方法の第一段階として用いた後に、量的な結合データを与える異なる技術を用いたさらなるアッセイを続けることもできる。
【００５８】
Ｍｆｎ１に結合可能な薬剤を同定するための技術が上記で検討されてきたが、これらの技術は、Ｍｆｎ２に結合可能な薬剤を同定するために同じく適用可能であることが理解されるべきである。加えて、これらの技術は、Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２に結合しない薬剤の同定も可能にするであろうことが理解されるべきである。
【００５９】
上述のアッセイ技術は、競合的結合試験を実施するために改変することが可能である。これらの技術は、例えば候補薬剤の存在下でタンパク質の基質又は補因子への結合を分析するのにも同様に適している。したがって、タンパク質とその基質又は補因子との結合を調節する薬剤を選別及び同定するために上述の技術を使用することが可能となろう。例えば、これらのアッセイは、候補薬剤の存在下でのＭｆｎ１又はＭｆｎ２とＧＴＰとの結合の検出を可能とするであろう。したがって、例えばＧＴＰへの結合を減少させるなど、Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２のＧＴＰへの結合を調節する薬剤を同定することが可能となろう。
【００６０】
好ましくは、本発明の薬剤はＭｆｎ１に高親和性で結合するであろう。例えば、本発明の薬剤は、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満又は１０ｎＭ未満のＫｄでＭｆｎ１に結合するであろう。
【００６１】
本発明の薬剤は、基本的にＭｆｎ２に比べてＭｆｎ１に優先的に結合する。換言すれば、薬剤は基本的にＭｆｎ２よりＭｆｎ１に選択的であり、例えば、同一条件下でかかる薬剤はＭｆｎ２より高い親和性でＭｆｎ１に結合する。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴分析、ＥＬＩＳＡなど（例えば上述のものなど）、当業者に知られている標準的な技術を用いて測定することができ、結合定数（Ｋａ）又は解離定数（Ｋｄ）のいずれかにより定量され得る。
【００６２】
好ましい実施形態では、薬剤は少なくとも２：１の親和性比でＭｆｎ１及びＭｆｎ２に結合する（例えば、Ｋａ（Ｍｆｎ１）／Ｋａ（Ｍｆｎ２）≧２）。さらなる実施形態では、薬剤は、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１０００：１、少なくとも１０，０００：１のＭｆｎ１／Ｍｆｎ２親和性比を有し得る。例えば、薬剤は、１００μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、最も好ましくは１０ｎＭ未満のＫｄでＭｆｎ１に結合し得る。かかる薬剤は、１０ｎＭ超、好ましくは１００ｎＭ超、より好ましくは１μＭ超、最も好ましくは１００μＭ超のＫｄでＭｆｎ２に結合し得る。１つの実施形態では、薬剤はＭｆｎ２に結合しない（例えば、薬剤は、標準的なアッセイ条件下で、Ｍｆｎ２に対し無視できる程度の結合しか示さない又は結合を実質的に示さない）。
【００６３】
マイトフュージン活性：
本発明はまた、マイトフュージン、例えばＭｆｎ１又はＭｆｎ２の活性を調節することが可能な薬剤を同定するための方法を含む。Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２の活性は、例えばＭｆｎ１又はＭｆｎ２のＧＴＰアーゼの酵素活性を分析することによって、直接分析され得る。代わりに又は加えて、Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２の活性は、例えば細胞内のミトコンドリアの融合を分析することによって、間接的に分析され得る。
【００６４】
タンパク質、例えばＧＴＰアーゼなどの酵素の活性を減少させる候補薬剤の能力はＩＣ５０値により表現され得る。ＩＣ５０は、タンパク質の活性を５０％減少（例えば酵素活性の５０％の減少）させるのに必要とされる薬剤の濃度である。ＩＣ５０値の算出は当業者に知られている。好ましくは、本発明の薬剤は、Ｍｆｎ１活性（例えばＧＴＰアーゼ活性）の阻害について１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。
【００６５】
本発明の薬剤は、基本的にＭｆｎ２に比べてＭｆｎ１を優先的に阻害する。換言すれば、薬剤は基本的にＭｆｎ１を選択的に阻害し、例えば、かかる薬剤は、同一条件下でＭｆｎ２に比べてＭｆｎ１の活性阻害についてより低いＩＣ５０値を有する。好ましい実施形態では、薬剤は少なくとも２：１のＩＣ５０比でＭｆｎ２及びＭｆｎ１を阻害する（例えば、ＩＣ５０（Ｍｆｎ２）／ＩＣ５０（Ｍｆｎ１）≧２）。さらなる実施形態では、薬剤は、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１０００：１、少なくとも１０，０００：１のＭｆｎ２／Ｍｆｎ１のＩＣ５０比を有し得る。例えば、薬剤は、Ｍｆｎ１阻害について１００μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、最も好ましくは１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有し得る。薬剤は、Ｍｆｎ２阻害について１０ｎＭ超、好ましくは１００ｎＭ超、より好ましくは１μＭ超、最も好ましくは１００μＭ超のＩＣ５０を有し得る。１つの実施形態では、薬剤はＭｆｎ２活性を阻害しない（例えば、薬剤は、標準的なアッセイ条件下で、Ｍｆｎ２活性に対し無視できる程度の阻害しか示さない又は阻害を実質的に示さない）。
【００６６】
ＧＴＰアーゼアッセイ：
ＧＴＰアーゼ活性を測定するためのいくつかの技術が当業者に知られている。そのようなＧＴＰアーゼアッセイは、付随して無機リン酸の放出を生じるＧＴＰアーゼによるＧＴＰのＧＤＰへの変換を検出することに基づくものであり得る。これらの技術は、細胞から単離されたＧＴＰアーゼ、例えばＭｆｎ１又はＭｆｎ２に応用することができる。Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２は組換え技術を用いて発現させることが可能である。好ましくは、かかるＭｆｎ１又はＭｆｎ２は精製されている。Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の発現及び精製の方法は当業者に知られている。
【００６７】
１つの実施形態では、ＧＴＰアーゼ活性は、［α−３２Ｐ］標識したＧＴＰを用いてＧＴＰからＧＤＰへの変換をモニタリングすることによって決定することが可能である。簡潔には、ＧＴＰアーゼ反応における様々な時点で薄層クロマトグラフィによるＧＴＰ及びＧＤＰの分離が実施され得る。そして、それぞれの時点でのＧＴＰ及びＧＤＰの相対量がホスフォイメージャ分析により定量され得る。適切な［α−３２Ｐ］に基づくＧＴＰアーゼアッセイは、Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１７：６５３５−４６（Ｍｆｎ１に適用）及びＷａｒｎｏｃｋ  Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３１０−４に記載されている。
【００６８】
他の実施形態では、ＧＴＰアーゼ活性は、ＧＴＰ加水分解で産生される無機リン酸（Ｐｉ）の放出を検出するためのアッセイを用いて決定され得る。例えば、酵素反応の間の無機リン酸放出を検出するためのマラカイトグリーン比色アッセイが当業者に知られている。簡潔には、これらのアッセイは、マラカイトグリーン検出試薬が無機リン酸との結合により変色されるという原理に基づいている。色の変化は、各時点までに放出された無機リン酸の定量が可能である分光光度検出によって測定され得る。例えばＩｎｎｏｖａ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＧＴＰａｓｅ  ａｓｓａｙなどの、適切な市販のマラカイトアッセイが入手可能である。そのような比色アッセイはハイスループットスクリーニングに適している。
【００６９】
ミトコンドリア融合アッセイ：
ミトコンドリア融合に対する候補薬剤の効果も細胞内で直接分析することが可能である。ミトコンドリア融合を分析する方法は当業者に知られている。例えば、ミトコンドリアは、共焦点顕微鏡を用いるタイムラプス撮影により細胞内で可視化され得る。この技術は、Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２のノックアウトがミトコンドリア動態及び融合に及ぼす効果についての研究においてＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６０：１８９−２００）が記載している。
【００７０】
マイトフュージン発現：
Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２の発現を分析する方法は、本発明においてタンパク質レベルで候補薬剤の効果を選別するために用いられ得る。加えて、診断方法の部分として、対象者からの試料中のタンパク質、例えばＭｆｎ１、Ｍｆｎ２又は他のバイオマーカーの発現レベルを分析することもできる。タンパク質の発現レベルは疾患又は疾患の素因に関連し得る。
【００７１】
タンパク質の発現レベルを決定するためのいくつかの技術が当業者に知られている。これらの技術は、候補薬剤がＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２の発現レベルに及ぼす効果についての試験に適用することが可能である。用いられる技術は、好ましくは、自動化及び／又は候補薬剤のハイスループットスクリーニングが容易にできるものである。
【００７２】
例えば、選別は、リポーター部分に操作可能に連結されたＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２をコードする核酸を有する細胞を用いて実施され得る。リポーター部分は、内在性のＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２をコードする遺伝子に操作可能に連結され得る。あるいは、リポーター部分に操作可能に連結されたＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２の外来複製物が細胞に導入され得る。この実施形態では、細胞は、天然のＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２発現を欠失するように操作され得る。Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２に連結されたリポーター部分が異なっていて相互に識別可能である場合がある。適切なリポーター部分は、例えば緑色、黄色、チェリー色、シアン色又はオレンジ色の蛍光タンパク質などの蛍光標識を含む。
【００７３】
「操作可能に連結」することにより、記載された構成要素が意図された様式でそれらが機能するような関係になると理解される。
【００７４】
そのような細胞を候補薬剤と接触させて細胞内のリポーター部分の発現レベルを分析することによってＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２の発現レベルをモニタリングすることができる。蛍光リポーター部分は、例えばフローサイトメトリー、蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、及び蛍光顕微鏡観察などの、いくつかの当業者に知られている技術により分析され得る。Ｍｆｎ１又はＭｆｎ２の発現は同一細胞内で別々に又は同時に分析され得る。Ｍｆｎ１及び／又はＭｆｎ２の発現レベルは候補薬剤と接触させる前後で比較され得る。あるいは、Ｍｆｎ１及び／又はＭｆｎ２の発現レベルは、候補薬剤と接触させた細胞と対照細胞の間で比較され得る。Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の発現への効果が両方とも決定された場合、候補薬剤の効果はＭｆｎ１とＭｆｎ２の発現の比として表すこともできる。
【００７５】
例えば、Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２などのタンパク質の発現を分析するために他の方法を用いることもできる。タンパク質の発現は直接分析され得る。例えば、発現は、クマシー染色又は銀染色による可視化を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のような方法を用いて定量的に分析され得る。あるいは、発現は、タンパク質産物に結合する抗体プローブを用いるウェスタンブロット解析又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量的に分析され得る。上述のリポーター部分で標識されたＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２もこれらの方法で用いられ得る。あるいは、タンパク質の発現は、例えばそのタンパク質に対応するｍＲＮＡ、例えば細胞内で転写されるＭｆｎ１及び／又はＭｆｎ２の量を調査することによって、間接的に分析され得る。このような分析は、定量的逆転写ＰＣＲ及びノザンブロット解析などの方法を用いることにより達成することができる。
【００７６】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ：
マイトフュージン発現は、転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）を用いて調節することができる。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によりもたらされる転写後遺伝子抑制は、外来遺伝子の発現を制御するため保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルスなどの配列の無作為な挿入が、相同な１本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスのゲノムＲＮＡの配列特異的な分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられている。そのサイレンシング効果はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：４２９−３３）。ＲＮＡｉの機構は、長いｄｓＲＮＡを約２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ２重鎖にプロセシングすることを含む。これらの産物はｍＲＮＡ分解の配列特異的な介在分子であり、低分子干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞では、３０ｂｐより長いｄｓＲＮＡが、タンパク質合成の停止及び非特異的ｍＲＮＡ分解を誘導するインターフェロン応答を活性化することが明らかとなっている（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：２２７−６４）。しかし、この応答は２１ｎｔのｓｉＲＮＡ２重鎖を用いることにより回避され得（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−８８；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８）、培養哺乳動物細胞での遺伝子機能の分析を可能とする。
【００７７】
ｓｈＲＮＡは、小さな環状配列により隔てられた短い逆位反復ＲＮＡからなる。これらは細胞機構によって即座に１９〜２２ｎｔのｓｉＲＮＡにプロセシングされ、それにより標的遺伝子の発現が抑制される。
【００７８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することによって標的ｍＲＮＡの翻訳を効果的に減少させることが可能な、小さな（長さ２２〜２５ヌクレオチド）非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは生物で天然に産生される小さなＲＮＡの非常に大規模な群であり、その中の少なくともいくつかは標的遺伝子の発現を制御している。マイクロＲＮＡ集団の構成要素にはｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４がある。ｌｅｔ−７遺伝子は、線虫の成長の間、内在性タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する高度に保存された小さなＲＮＡ種をコードしている。活性のあるＲＮＡ種はまず約７０ｎｔの前駆体として転写され、転写後に約２１ｎｔの成熟型にプロセシングされる。ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４はいずれも、ダイサー酵素により成熟型にプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。
【００７９】
アンチセンスの概念は、細胞内でメッセンジャーＲＮＡに短鎖の修飾されている場合もあるＤＮＡ又はＲＮＡ分子を選択的に結合させ、コードされるタンパク質の合成を妨げるというものである。
【００８０】
標的タンパク質の発現を調節するためのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡの設計法、及び対象となる細胞へこれらの分子を送達する方法は当業者に知られている。さらに、生物中の特定の細胞型におけるタンパク質発現を例えば組織特異的プロモーターの使用を通じて特異的に調節（例えば減少）する方法も当業者に知られている。
【００８１】
代謝疾患：
本発明の薬剤は代謝疾患の処置又は予防に用いられ得る。代謝疾患は、糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能異常、又は空腹時血糖異常であり得る。好ましくは、代謝疾患は糖尿病である。糖尿病は１型又は２型糖尿病であり得、好ましくは２型糖尿病である。
【００８２】
糖尿病は、主にインスリンの合成又は利用が体内でできないことに起因する高血糖濃度により特徴づけられる代謝状態である。高血糖症は、神経障害、失明、手足の切断、腎不全、網膜症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、糖尿病由来の壊疽、心臓発作、及び脳卒中を含む、数多くの臨床的合併症を引き起こす。
【００８３】
最も一般的な糖尿病の型は、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）及び最多の型である２型糖尿病である。２型糖尿病の増加は主として肥満率の上昇による。現在、１１億人を超える人々が過体重であると推定されており、そのうちおよそ３億２０００万人は肥満である。
【００８４】
１型糖尿病は、インスリンを産生する膵臓のベータ細胞の破壊を引き起こす自己免疫疾患である。２型糖尿病は、インスリンの分泌量が不適切である（インスリン欠乏）あるいは血糖値抑制におけるインスリンの効果が弱められている（インスリン耐性又はインスリン抵抗性）状態である。
【００８５】
２型糖尿病発症についての病態生理は複雑で多因子性である。肥満、座りがちの生活習慣、及び／又は加齢は、インスリン抵抗性及び経年の血中インスリン濃度の増加を引き起こし得る。ある時点で血糖制御の喪失が現れ始め、耐糖能異常又は空腹時血糖異常を生じる。最終的に２型糖尿病になる場合がある。したがって、インスリン抵抗性、耐糖能異常、及び空腹時血糖異常は正常な糖恒常性と糖尿病の中間の代謝状態を表す。
【００８６】
代謝疾患の動物モデル：
代謝疾患、例えば、糖尿病、インスリン抵抗性、及び耐糖能異常についてのいくつかの動物モデルが当業者に知られている。上記に検討したように、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスモデルは、高脂肪食飼育によりヒトの代謝疾患を模倣可能であることから、動物に基づく研究に普通に用いられる。
【００８７】
１型糖尿病のモデルは、ベータ細胞の化学的アブレーション又は自己免疫疾患を発症するげっ歯類の育種により開発することができる。げっ歯類又は高等動物の化学的アブレーションは、例えばＳＴＺ又はアロキサンを用いて達成することが可能である。１型糖尿病の自己免疫モデルは、ＮＯＤマウス、ＢＢラット、及びＬＥＷ．１ＡＲ１／−ｉｄｄｍラットを含む。加えて、遺伝的に誘導されたインスリン依存性糖尿病を有するＡＫＩＴＡマウスが、１型糖尿病のモデルとして使用され得る。例えば、ブタ及びカニクイザルなどの高等生物のモデルは、膵切除又はベータ細胞の化学的アブレーションの後、１型糖尿病のモデルとして用いられ得る。
【００８８】
２型糖尿病のモデルは通常インスリン抵抗性のモデルでもある。例えば、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂマウス、Ｌｅｐｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒ肥満及びＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラット、ＫＫマウス、ＯＬＥＴＦラット、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｏｂｅｓｅマウス並びに同様のものなど、多くの２型糖尿病モデルは肥満である。２型糖尿病モデルは、例えばＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスなど、高脂肪食で飼育することにより作り出すことも可能である。２型糖尿病の非肥満モデルはＧｏｔｏ−Ｋａｋｉｚａｋｉラット及びｈＩＡＰＰマウスを含む。加えて、ネコ、イヌ、ブタ、及び昔のヒト以外の霊長類の２型糖尿病モデルが当業者に知られている。これらのモデル系は本発明の方法において用いられ得る。
【００８９】
当業者に知られている適切な動物モデルは、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｉｎｇ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６６：８７７−９４）が詳細に記載している。加えて、上記で検討されたＭｆｎ１−ＬＫＯ及びＭｆｎ２−ＬＫＯマウスも代謝疾患の動物モデルとして用いられ得る。
【００９０】
細胞へのポリペプチド及びポリヌクレオチドの導入：
本発明で用いる薬剤はポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明の方法又はスクリーニングアッセイの部分として細胞内へ導入することが必要な場合がある。
【００９１】
本発明でポリペプチドを使用する場合、ポリペプチドは、直接（例えばポリペプチドそのものが投与され得る）、又は対象とする細胞でポリペプチドを発現させる条件下でポリペプチドをコードする核酸配列を細胞内に導入することによって投与され得る。核酸はベクターを用いて細胞内に導入され得る。
【００９２】
ベクターは、対象とする核酸をある環境から他の環境に移動させることのできる又は異動を容易にする道具である。本発明に従って、実施例の方法により、組換え核酸技術で使用されるいくつかのベクターは、核酸断片（例えば異種ｃＤＮＡ断片などの異種ＤＮＡ断片）などの核酸配列を標的細胞内に運ぶことができる。ベクターは、細胞内で異種核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を維持する、核酸断片を含むベクターの複製を容易にする、又は核酸断片によりコードされるタンパク質の発現を容易にする、といった目的のために用いられ得る。ベクターは非ウイルス性又はウイルス性であり得る。組換え核酸技術で用いられるベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミド、染色体、人工染色体、及びウイルスが挙げられる。ベクターは例えば核酸（例えばＤＮＡ）のみである場合もある。最も単純な形では、ベクターそのものが対象の核酸である場合がある。
【００９３】
本発明で用いられるベクターは、例えばプラスミド又はウイルスベクターであり得、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び随意にプロモーターのレギュレーターを含み得る。
【００９４】
本発明で用いられるポリヌクレオチドを含むベクターは、形質転換及び形質導入などの当業者に知られている様々な技術を用いて細胞内へ導入され得る。例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスのベクターなどの組換えウイルスベクターを用いた感染、核酸の直接注入、及び遺伝子銃による形質転換など、いくつかの技術が当業者に知られている。
【００９５】
ウイルスによらない送達系としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ形質移入法が挙げられる。ここで、形質移入は、遺伝子を標的細胞へ送達するために非ウイルスベクターを用いるステップを含む。
【００９６】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの移動は、当業者に知られている、物理的又は化学的に細胞膜を透過可能にし得るいかなる方法によっても実施され得る。細胞内へポリペプチドを移動するために細胞浸透ペプチドを用いることも可能である。
【００９７】
ウイルスによらない送達系としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ形質移入の方法及びリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。典型的な形質移入方法としては、電気穿孔法、ＤＮＡ遺伝子銃、脂質を介した形質移入、凝縮させたＤＮＡを介した形質移入、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン試薬を介した形質移入、陽イオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４；５５６）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９８】
加えて、本発明は、例えばＤＮＡ修飾剤の送達など、遺伝子ターゲティングの手法を用いることが可能である。
【００９９】
ベクターは発現ベクターであり得る。本明細書で記載される発現ベクターは、転写可能な配列を有する核酸領域を含んでいる。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡをコードする配列がこの定義に含まれる。
【０１００】
好ましくは、発現ベクターは、コードする配列の宿主細胞による発現を可能とする制御配列に操作可能に連結された、本発明での使用のためのポリヌクレオチドを含む。コード配列に「操作可能」に連結された調節配列は、制御配列に適した条件下でコード配列の発現が達成されるような形で連結される。例えば制御配列により指示される転写量について転写を調節する因子への応答性をより高めるさらなる転写調節因子の付加によって、制御配列を修飾することが可能である。
【０１０１】
ポリヌクレオチド：
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは１本鎖又は２本鎖であり得る。遺伝暗号の縮重の結果、数多くの異なるポリヌクレオチドが同一のポリペプチドをコードし得ることは当業者に理解されるであろう。加えて、本発明のポリペプチドを発現するいかなる特定の宿主生物におけるコドン使用をも反映して、日常的な技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの配列に影響を与えずにヌクレオチドを置換することが、当業者に可能であることが理解されるべきである。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において実施可能な任意の方法によって修飾され得る。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドの生体内での活性又は寿命を増強するために実行することができる。
【０１０３】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換え技術、合成又は当業者により使用可能ないかなる手段によっても生産され得る。それらは標準的な技術によってクローン化され得る。
【０１０４】
長いポリヌクレオチドは、一般的に組換え手法を用いて、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて生産される。このような生産には、クローン化しようとする標的配列に隣接する１対のプライマーを作製するステップ（例えば約１５から３０ヌクレオチド）、例えば動物又はヒト細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡなどのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとプライマーを接触させるステップ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施するステップ、（例えばアガロースゲルで反応混合物を精製することによって）増幅断片を単離するステップ、及び増幅されたＤＮＡを回収するステップを含むであろう。増幅したＤＮＡを適切なベクターにクローン化できるように適切な制限酵素認識部位を含有するようにプライマーを設計することができる。
【０１０５】
タンパク質：
本明細書で用いられる「タンパク質」という用語は、個々の構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合により連結されている複数ポリペプチドの複合体に加えて、単鎖ポリペプチド分子を含む。本明細書で用いられる「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、単量体がアミノ酸であり、ペプチド結合又はジスルフィド結合を通じて連結された重合体を表す。
【０１０６】
多様体、誘導体、類似体、相同体、及び断片：
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明は多様体、誘導体、類似体、相同体、及びこれらの断片をも包含する。
【０１０７】
本発明の状況において、所与の任意の配列の多様体は、（アミノ酸又は核酸残基いずれでも）その特定の配列残基が、問題となるポリペプチド又はポリヌクレオチドが少なくとも１つの内在性機能を保持するような形で修飾されている配列である。多様体配列は、天然のタンパク質又はヌクレオチドに存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、交換、及び／又は多様化によって得ることが可能である。
【０１０８】
本明細書で用いられる「誘導体」という用語は、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して、生じるタンパク質又はポリペプチドが少なくとも１つの内在性機能を保持している、１つ（以上）のアミノ酸残基からの又はアミノ酸配列へのいかなる置換、多様化、修飾、交換、欠失、及び／又は付加をも含む。
【０１０９】
本明細書で用いられる「類似体」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して、任意の模倣体を、すなわちそれが模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１つの内在性機能を有する化学物質を含む。
【０１１０】
典型的には、アミノ酸置換は、求められる活性又は能力を修飾配列が保持する場合に限り、例えば１、２又は３〜１０又は２０の置換からなるものであり得る。アミノ酸置換は非天然に生じる類似体の使用も含み得る。
【０１１１】
本発明で用いられるタンパク質は、機能に影響しない変化をもたらし機能的に同等のタンパク質を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有することも可能である。内在性機能が保持されるならば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性といった残基の性質の類似性に基づいて意図的にアミノ酸置換を行うこともできる。例えば、負電荷を有するアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正電荷を有するアミノ酸はリシン及びアルギニンを含み、同程度の親水性を有し非荷電の極性頭基を伴うアミノ酸はアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを含む。
【０１１２】
保存的置換は例えば下記表に従ってなされ得る。２列目の同じ区画内の、好ましくは３列目の同じ行内のアミノ酸は相互に置換可能である。
【表Ｘ】
2017512068.tif 000002
【０１１３】
「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列又は野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するものを意味する。「相同性」という用語は「同一性」と等しいとすることができる。
【０１１４】
本発明の状況において、相同配列は、対象の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９７％又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むものとする。一般的に、相同体は、対象とするアミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性は類似性（すなわち同様の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）と考えることも可能であるが、本発明の状況においては配列の同一性による相同性の方を好んで表す。
【０１１５】
本発明の状況において、相同配列は、対象の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９７％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むものとする。相同性は類似性と考えることも可能であるが、本発明の状況においては配列の同一性による相同性の方を好んで表す。
【０１１６】
相同性比較は目視により、又はより普通には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことが可能である。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性又は同一性の百分率を算出することが可能である。
【０１１７】
相同性の百分率は連続した配列に対して算出され得る。すなわち、１つの配列が他の配列と並べられ、１つの配列中のアミノ酸又はヌクレオチドの各々が、他の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。通常、そのようなギャップなしアライメントは比較的短い残基数に対してのみ実施される。
【０１１８】
これは非常に簡単で一貫性のある方法だが、例えば、アミノ酸又はヌクレオチド配列内に挿入又は欠失が１つあることを除いて他は同一である一対の配列で、１点の挿入又は欠失の後に続く残基又はコドンをアライメントから外してしまう可能性があることを考慮できず、したがって全体的なアライメントを行った場合に相同率が大きく低下する可能性がある。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアに過度にペナルティーを加算することなく、挿入及び欠失の可能性を考慮に入れた最適なアライメントを提示するよう設計されている。これは、局所的な相同性が最大となるように配列アライメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１１９】
しかし、これらのより複雑な方法は、アライメントにおいて生じる各々のギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるので、その結果、同一のアミノ酸又はヌクレオチドが同数である場合は、できるだけ少ないギャップを有し、比較している２つの配列間の関連性が高いことを示す配列のアライメントが、ギャップを多く有するものより高いスコアを獲得するであろう。ギャップの存在について比較的高いコストを加え、ギャップ中の残基に続くそれぞれの残基に小さなペナルティーを負わせる「アフィンギャップコスト」が、一般的に用いられる。これは最も普通に用いられるギャップ評価系である。ギャップペナルティーを高くすると、当然のことながら有するギャップがより少ない最適化アライメントが生じるであろう。ほとんどのアライメントプログラムで、ギャップペナルティーは変更可能である。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に用いる場合は初期設定の値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列についての初期設定のギャップペナルティーはギャップ当たり−１２、各伸長当たり−４である。
【０１２０】
したがって、最大の相同性の百分率を算出するためには、まずギャップペナルティーを考慮に入れた最適なアライメントの生成が必要である。そのようなアライメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較の実施が可能な他のソフトウェアの例としては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同前−１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式を含む。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡはいずれもオフライン及びオンラインでの検索が可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同前、７−５８から７−６０ページ参照）。しかし、いくつかの用途ではＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる他のツールもタンパク質配列及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７（１）：１８７−８参照）。
【０１２１】
最終的な相同性の百分率は同一性により測定することができるが、アライメント処理そのものは、通常、全か無かの対比較に基づいてはいない。その代わり、化学的な類似性又は進化的な距離に基づくそれぞれの対比較にスコアを割り当てる、スケール変換されたスコア行列が一般に用いられる。そのような普通に用いられる行列の例はＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラム一式の標準行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に公開初期値又は提供されている場合はカスタムシンボル比較表のいずれかを用いる（より詳細には使用説明書参照）。いくつかの適用では、ＧＣＧパッケージの公開初期値、又は他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２のような標準行列を用いることが好ましい。
【０１２２】
一旦ソフトウェアが最適なアライメントを生成すれば、相同性の百分率、好ましくは配列同一性の百分率を算出することが可能である。通常、ソフトウェアはこれを配列比較の部分として行い、数値で結果を生成する。
【０１２３】
「断片」は多様体でもあり、その用語は一般に、機能的な意味で又は例えばアッセイにおいて関心対象となっているポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を表す。したがって、「断片」は、完全長のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を表す。
【０１２４】
そのような多様体は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することが可能である。挿入する場合、挿入部位の両側それぞれの天然の配列に対応する５’及び３’隣接領域と共に挿入をコードする合成ＤＮＡが作製され得る。その配列が適切な酵素で切断され切断物に合成ＤＮＡが連結され得るように、隣接領域には、天然の配列の部位に対応する便利な制限酵素切断部位を有するであろう。その後、ＤＮＡはコードされるタンパク質を作製するために本発明に従って発現される。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作する当業者に知られている数多くの標準的な技術の例示に過ぎず、他の既知技術も用いられ得る。
【０１２５】
本発明のマイトフュージン（例えばＭｆｎ１又はＭｆｎ２）のすべての多様体、断片、又は相同体は、ミトコンドリア融合をもたらすために結合する能力を保持しているであろう。
【０１２６】
コドン最適化：
本発明で用いられるポリヌクレオチドはコドンの最適化がなされ得る。コドン最適化は、以前に国際公開第１９９９／０４１３９７号及び国際公開第２００１／０７９５１８号に記載されている。異なる細胞では特定のコドンの使用に相違がある。このコドンの偏りは、細胞型における特定ｔＲＮＡの相対量の偏りに対応している。対応するｔＲＮＡの相対量に合うよう配列中のコドンを変化させることによって発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型で稀であることがわかっているコドンを意図的に選択することによって発現を減少させることが可能である。このように、転写度合いを追加的に制御可能である。哺乳動物の細胞のコドン使用頻度は他の多様な生物と同様に当業者に知られている。
【０１２７】
抗体：
本明細書で用いられる抗体は、選択された標的に結合可能であり、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）２、モノクローナル及びポリクローナル抗体、キメラ、ＣＤＲ移植、及びヒト化を含む設計された抗体、並びにファージディスプレイ又は代わりの技術を用いて生産された人工的に選択される抗体を含む、抗体全体又は抗体断片を表す。
【０１２８】
加えて、本発明では、例えば「アビボディ」、「アビマー」、「アンチカリン」、「ナノボディ」及び「ＤＡＲＰｉｎ」など古典的抗体も使用され得る。
【０１２９】
抗体の生産方法は当業者に知られている。あるいは、抗体は市販の供給源に由来するものでもよい。
【０１３０】
ポリクローナル抗体が望ましい場合は、選択された哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はウマ）が免疫され得る。免疫された動物の血清を既知の手順に従って採取し処理することができる。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する場合は、そのポリクローナル抗体は免疫親和性クロマトグラフィにより精製され得る。ポリクローナル抗血清を生産し加工する技術は当業者に知られている。
【０１３１】
本発明で用いられる抗原（例えばタンパク質）に対するモノクローナル抗体も当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論はよく知られている。不死化させた抗体産生細胞株は、細胞融合並びに腫瘍形成性のＤＮＡによるＢ細胞の直接形質転換又はエプスタイン−バールウイルスを用いた形質移入などの他の技術によっても作製することが可能である。抗原に対して生産されたモノクローナル抗体の集団は、例えばアイソタイプ及び抗原決定基の親和性など様々な特性により選別され得る。
【０１３２】
代わりの技術として、ファージが、外殻の表面上に、例えば多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するｓｃＦｖ断片を発現する、ファージディスプレイのライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。この技術は当業者に知られている。
【０１３３】
抗原に対するモノクローナル及びポリクローナルいずれの抗体も診断において特に有益であり、中和するこれらの抗体は受動免疫療法に役立つ。モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を生成するために特に用いられ得る。抗イディオタイプ抗体は、防御が望まれる感染因子である抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。
【０１３４】
抗イディオタイプ抗体を生成するための技術は当業者に知られている。この抗イディオタイプ抗体は、抗原の免疫原性領域の解明に加えて処置にも有益であり得る。
【０１３５】
処置の方法：
本明細書中の処置というすべての表現は治療的、緩和的及び予防的処置を含むと理解されるべきである。哺乳動物、特にヒトの処置が好ましい。ヒト及び獣医学的処置はいずれも本発明の範囲内である。
【０１３６】
投与：
本発明で使用される薬剤は単独で投与され得るとしても、特にヒトの治療法において、それらは一般的には医薬担体、賦形剤又は希釈剤との混合物で投与されるであろう。いくつかの実施形態では、薬剤は栄養剤、食品添加物、又は食品成分であり、したがって適切な食品組成物に処方され得る。それ故、薬剤は、例えば食品製品、飲料、ペットフード製品、補助食品、機能性食品、又は栄養製剤で投与され得る。
【０１３７】
用量：
当業者は、本発明の薬剤のうちの１つについて、過度の実験を行うことなしに、対象への投与のために適切な用量を容易に決定することが可能である。一般には、医師が個々の患者に最も適切な実際の用量を決定し、その用量は、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、齢、体重、健康状態、性別、食事、投与の方法及び時期、排泄率、併用する薬剤、特定の状態についての重症度、並びに個々に受けている治療を含む様々な要因によるであろう。もちろん、より高い又はより低い用量範囲が優れている個別の場合があり得、そのような場合は本発明の範囲内にある。
【０１３８】
診断のバイオマーカー及び方法：
試料：
診断及び予防の方法という面での「試料」は、対象に由来する試料を表すものとして本発明の範囲内にあると理解される。生体試料は、対象から直接得られるものであってもよいし、又は前記対象から得られた培養細胞に由来するものであってもよい。
【０１３９】
スクリーニングアッセイという面での「試料」は、適切な細胞、細胞集団、動物モデル又はヒトを表すものとして本発明の範囲内にあると理解される。これらの試料は必ずしも対象に由来しなくてもよい。この面での試料は細胞株由来の細胞集団であり得る。
【０１４０】
対象：
「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物のいずれをも表す。ヒト以外の動物の例は、例えば、ヒト以外の霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えばマウス、ラット又はモルモット）、ブタ及びネコといった哺乳動物などの脊椎動物を含む。好ましい実施形態において対象はヒトである。
【実施例】
【０１４１】
実施例１．  一般的方法論：
材料：
特段の記載がない場合、ＰＪ３４を含むすべての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０１４２】
動物実験：
純系Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊを背景とした雄のＭｆｎ１のｆｌｏｘマウスが、ＩＲＢ  Ｂａｒｃｅｌｏｎａ（スペイン）のＡｎｔｏｎｉｏ  Ｚｏｒｚａｎｏ教授により作成された。その後、肝特異的にＭｆｎ１遺伝子を欠失させたマウス（Ｍｆｎ１−ＬＫＯ）を育成するために、このマウスと、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素を発現するマウスを交配させた。ｆｌｏｘ動物が対照として用いられた。マウスは、水並びにげっ歯類の標準食（Ｄ１２４５０Ｊ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）又は高カロリー、高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を自由に利用できる状態で収容し、１２時間の明暗周期の下で飼育した。すべての動物実験は、現地国内及びＥＵの倫理指針に従って実施された。体重をモニタリングするために、マウスは各週同一曜日に計量し摂食量を測定した。すべての研究において、絶食（８：００開始）した場合は６時間後（１４：００）に動物を屠殺し、下記に詳述するように組織の採取及び処理を行った。経口の耐糖試験及び腹腔内インスリン耐性試験は、以前（Ｌａｇｏｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６）に記載されている通りに決定した。そして、血漿インスリンは、ヘパリン添加血漿試料中で特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を用いて決定した。ヘパリンを入れた採血管に血液試料を採取し、遠心分離後に血漿を単離した。我々は、Ｏ２消費量、ＣＯ２生成量、及び自発運動量を、文献（Ｌａｇｏｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６）に記載されている通り、開放型間接熱量測定系（Ｓａｂｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａｓ  Ｖｅｇａｓ，ＮＶ，ＵＳＡ）で２４〜４８時間にわたり測定した。エネルギー消費量は、エネルギー当量２０．１Ｊ／ｍＬ  Ｏ２を用いて算出した。呼吸商は、Ｏ２消費量に対するＣＯ２生成量の比とした。運動量測定の間、ビームラインの横断は各々１５分間についてまとめた。各１５分間のビームライン横断の合計を時間に対してプロットし、各実験集団で平均的であった個々のマウスについてＡＵＣを算出した。
【０１４３】
ｍＲＮＡ解析：
製造者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡをＤＮＡ分解酵素で処理し、２ｍｇのＲＮＡを逆転写（ＲＴ）に用いた。ｃＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎｕｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で精製した。５０倍希釈したｃＤＮＡを定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）反応に用いた（Ｌａｇｏｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応は、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びｑＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、次のプライマーで実施した：ベータ−２−マイクログロブリン（ハウスキーピング遺伝子；Ｆ：ＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧ（配列番号５）；Ｒ：ＴＡＴＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴ（配列番号６））；シクロフィリン（ハウスキーピング遺伝子：Ｆ：ＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＧ（配列番号７）；Ｒ：ＣＧＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣ（配列番号８））；Ｍｆｎ１（Ｆ：ＡＧＧＧＧＡＣＣＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＧ（配列番号９）；Ｒ：ＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧ（配列番号１０））；Ｍｆｎ２（Ｆ：ＡＣＧＴＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡ（配列番号１１）；Ｒ：ＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＴ（配列番号１２））。Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の発現評価は２つの常発現遺伝子により補正した。
【０１４４】
ミトコンドリアの単離、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット：
以前（Ｆｒｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ，２００７）に記載されている通り、ミトコンドリアの単離にはおよそ０．５ｍｇの肝臓を用いた。最終的なミトコンドリア塊は、溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ４０、５ｍＭ  ニコチンアミド、１ｍＭ  酪酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４）に再懸濁された。タンパク質濃度はＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定し、試料の希釈はタンパク質濃度が等しくなるよう調整した。タンパク質は、以前（Ｃａｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００４）に記載されている通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロース膜上に移された。
【０１４５】
ウェスタンブロット解析に用いた抗体：
Ｍｆｎ１、ポリン、及びＯＸＰＨＯＳのカクテル抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入し、ＯＰＡ−１抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）から購入した。ペルオキシダーゼ標識した２次マウス及びウサギ抗体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１４６】
ミトコンドリアの呼吸：
ミトコンドリアの機能は、以前（Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）に記載されている通り、呼吸測定器（Ｏｒｏｂｏｒｏｓ  Ｏｘｙｇｒａｐｈ−２ｋ；Ｏｒｏｂｏｒｏｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて評価された。摘出したばかりの１片の肝臓（約５０ｍｇ）を計量し、弛緩液（２．８ｍＭ  Ｃａ２Ｋ２ＥＧＴＡ、７．２ｍＭ  Ｋ２ＥＧＴＡ、５．８ｍＭ  ＡＴＰ、６．６ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  タウリン、１５ｍＭ  クレアチンリン酸ナトリウム、２０ｍＭ  イミダゾール、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール、及び５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ７．１）に入れ、解剖処理の最後に、エッペンドルフ製の電動乳棒を用いて、２００マイクロリットルの氷冷した呼吸測定液（０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、３ｍＭ  塩化マグネシウム、６０ｍＭ  ラクトビオン酸カリウム、２０ｍＭ  タウリン、１０  ｍＭ  リン酸二水素カリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１１０ｍＭ  ショ糖、及び０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．１）中でこの組織をゆっくり均質化した。その後、呼吸測定液の量は、０．１ｍｇ組織／マイクロリットルの濃度となるように調整した。そして、２ｍｇの破砕物を呼吸チャンバに加えた。すべての測定は２回反復した。基質としてリンゴ酸（終濃度２ｍＭ）、グルタミン酸（２０ｍＭ）、及びピルビン酸（１０ｍＭ）を添加することによって、呼吸鎖の複合体Ｉからの基底酸素流量（漏出）を測定した。複合体Ｉ＋ＩＩを通って収束した電子の流れについて、ＡＤＰ（５ｍＭ）とそれに続く複合体ＩＩの基質であるコハク酸（１０ｍＭ）の添加によって酸化的リン酸化を定量した。その後、プロトノフォアであるカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（０．２μＭ）を滴下し、電子伝達系を介する最大流量を達成した。最後に、ロテノン（０．１μＭ）及びアンチマイシンＡ（２．５μＭ）をそれぞれ順次添加することにより、複合体Ｉ及びＩＩＩからの電子伝達を阻害した。
【０１４７】
統計解析：
動物試験の統計解析において、すべてのデータは正規分布することが確認された。有意性の評価のために、我々は独立標本のためのスチューデントのｔ検定を実施した。統計解析ソフトウェアは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用い、すべてにおいてｐ値＜０．０５を有意とした。
【０１４８】
実施例２．  肝特異的Ｍｆｎ１欠失（Ｍｆｎ１−ＬＫＯ）は、全体的な外観、摂食量、身体活動又はエネルギー消費を変化させないが、全身の脂質酸化速度を促進する（表１）：
１６週齢のＭｆｎ１−ＬＫＯ及び対照マウスで、身体組成を分析するためにエコーＭＲＩ解析（エコー核磁気共鳴画像解析）を行い、その直後から日々の活動及び摂食量を評価するためにＣＬＡＭＳ解析を実施した。マウスは２４週齢で屠殺し、Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２の発現をＲＴ−ｑＰＣＲで分析するために肝臓から全ｍＲＮＡを抽出した。
【０１４９】
実施例３．  Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスの肝臓はより高い呼吸能を示す（表２）：
対照及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスは２４週齢で供試された。（Ａ）実施例１の記載に従って全肝臓の破砕物を呼吸測定アッセイに用いた。すべての値は、対照マウスがｎ＝１１、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスがｎ＝９の、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表示されている。
【０１５０】
実施例４．  標準食のＭｆｎ１−ＬＫＯマウスでは血糖制御に影響はない（図１）：
（Ａ）１８週齢の雄性対照又はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスに２ｇ／ｋｇ体重で腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。（Ｂ）２０週齢の雄性対照又はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスに０．３Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。すべての値は、対照マウスがｎ＝１１、Ｍｆｎ１−ＬＫＯがｎ＝９の、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表示されている。
【０１５１】
実施例５．  高脂肪食飼育において、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスはより良い耐糖性及びインスリン感受性を示す（図２）：
（Ａ）１０週齢の対照及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスを低脂肪食（ＬＦＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）で飼育した。（Ａ）体重の変化。（Ｂ）８週の高脂肪食飼育後にエコーＭＲＩにより測定された身体組成。（Ｃ）高脂肪食の開始から１０週後にマウスに２ｇ／ｋｇ体重で腹腔内注入し、記載の期間で血糖量を追跡調査した。（Ｄ）高脂肪食開始後１２週に老齢マウスは０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内注入され、記載の期間で血糖量が追跡調査された。曲線上面積（ＡＯＣ）値は右に示されている。すべての値は、対照マウスがｎ＝１０、Ｍｆｎ１−ＬＫＯがｎ＝１０の、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表示されている。＊は、それぞれの対照マウスに対する統計的有意差をｐ＜０．０５で示している。
【０１５２】
実施例６．  メトホルミンの低血糖への影響はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスで増強される：
メトホルミンは、ビグアニド類の経口抗糖尿病薬であり、特に腎機能が正常である体重過剰及び肥満の個体における２型糖尿病処置の第１選択薬である。メトホルミンは、インスリン抵抗性が重要因子となり得る疾患においても利用される。メトホルミンは、肝臓によるブドウ糖産生を抑制することによって作用する。メトホルミンは、インスリン又は他の医薬との組み合わせで処方されることもある。
【０１５３】
図３に見られるように、メトホルミンの低血糖への影響はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスで増強される。１２週齢の対照及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスは、高脂肪食（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で８週間飼育した。その後、マウスを一晩絶食させ、生理食塩水（溶媒として）又はメトホルミン（１２５ｍｇ／ｋｇ）いずれかを注入し、記載の時点で血糖量を追跡調査した。すべての値は、各群ｎ＝１０のマウスの平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表されている。＊は、対照マウスとＭｆｎ１−ＬＫＯマウスとの間の統計的有意差をｐ＜０．０５で示している。
【０１５４】
実施例７．  メトホルミン注入によりＭｆｎ１−ＬＫＯマウスにおいて促進されたＡＭＰＫ活性化：
１２週齢の対照及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスを高脂肪食（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で８週間飼育した。その後、マウスを一晩絶食させ、生理食塩水（溶媒として）又はメトホルミン（１２５ｍｇ／ｋｇ）いずれかを注入した。マウスは９０分後に屠殺し、直後に肝臓を摘出し凍結させた。タンパク質抽出物を得、ＡＭＰＫ活性化の指標であるＣＲＴＣ２、ｅＩＦ２アルファ及びＧＡＰＤＨを検査するためにウェスタンブロット解析に用いた。測定されたＡＭＰＫ活性化指標が表すように、対照マウスに比較してＭｆｎ１−ＬＫＯマウスは促進されたＡＭＰＫ活性化を示した。
【０１５５】
実施例８．  野生型及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスにおけるメトホルミンによるミトコンドリア呼吸の阻害：
ミトコンドリアの呼吸を測定する方法は上記実施例１に記載されている。野生型及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスから抽出したてのミトコンドリアを呼吸測定液に再懸濁し、１００μｇのタンパク質を呼吸測定解析に用いた。複合体Ｉの活性はリンゴ酸及びグルタミン酸の添加により刺激した。その後、最大共役呼吸を達成するためにＡＤＰを添加し、続いてメトホルミンの効果を評価した。図４の棒グラフは、呼吸の絶対量を各遺伝子型について４つのミトコンドリア調製物の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で示している。＊は、野生型及びＭｆｎ１−ＬＫＯ間の、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示している。下の表は、異なるメトホルミン用量での最大呼吸に対する残存の百分率を表している。
【０１５６】
一般に、メトホルミンの作用は複合体Ｉの阻害が主要な原因だと考えられているが、未だ十分には理解されていない（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ：Ｆｒｏｍ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｆｏｒｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｍｅｔ．２０１４．０９．０１８）。この実施例で示されたように、メトホルミン投与後、ミトコンドリア複合体Ｉの呼吸はＭｆｎ１−ＬＫＯマウスで対照マウスより強く阻害される。
【０１５７】
表１：
対照及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスの全体的な外観及びエネルギー消費のパラメータ。すべての値は、対照マウスがｎ＝１１、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスがｎ＝９の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表されている。
【表１】
2017512068.tif 000003
【０１５８】
表２：
対照及びＭｆｎ１−ＬＫＯマウスの肝臓における呼吸値（ｐｍｏｌ／（秒×ｍｇ組織））。値は、アンチマイシン−Ａ（複合体ＩＩＩ阻害剤）添加後に残った残存呼吸を引いた後の正味の呼吸速度である。すべての値は、対照マウスがｎ＝１１、Ｍｆｎ１−ＬＫＯマウスがｎ＝９の平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）で表されている。
【表２】
2017512068.tif 000004
【０１５９】
参考文献：
Ｃａｎｔｏ  Ｃ，Ｓｕａｒｅｚ  Ｅ，Ｌｉｚｃａｎｏ  ＪＭ，Ｇｒｉｎｏ  Ｅ，Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ＰＲ，Ｆｒｙｅｒ  ＬＧ，Ｃａｒｌｉｎｇ  Ｄ，Ｂｅｒｔｒａｎ  Ｊ，Ｐａｌａｃｉｎ  Ｍ，Ｚｏｒｚａｎｏ  Ａ，Ｇｕｍａ  Ａ  （２００４）  Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１２２６０−１２２６８
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Ｌａｇｏｕｇｅ  Ｍ，Ａｒｇｍａｎｎ  Ｃ，Ｇｅｒｈａｒｔ−Ｈｉｎｅｓ  Ｚ，Ｍｅｚｉａｎｅ  Ｈ，Ｌｅｒｉｎ  Ｃ，Ｄａｕｓｓｉｎ  Ｆ，Ｍｅｓｓａｄｅｑ  Ｎ，Ｍｉｌｎｅ  Ｊ，Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｐ，Ｇｅｎｙ  Ｂ，Ｌａａｋｓｏ  Ｍ，Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ  Ｐ，Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ  （２００６）  Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＳＩＲＴ１  ａｎｄ  ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ．Ｃｅｌｌ  １２７：１１０９−１１２２
Ａｎｉｌａ  Ｋ．Ｍａｄｉｒａｊｕ，Ｄｅｒｅｋ  Ｍ．Ｅｒｉｏｎ，Ｙａｓｍｅｅｎ  Ｒａｈｉｍｉ，Ｘｉａｎ−Ｍａｎ  Ｚｈａｎｇ，Ｄｅｍｅｔｒｉｏｓ  Ｔ．Ｂｒａｄｄｏｃｋ，Ｒｏｎａｌｄ  Ａ．Ａｌｂｒｉｇｈｔ，Ｂｒｅｔｔ  Ｊ．Ｐｒｉｇａｒｏ，Ｊｏｈｎ  Ｌ．Ｗｏｏｄ，Ｓａｎｊａｙ  Ｂｈａｎｏｔ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｊｕｒｃｚａｋ，Ｊｏａｏ−Ｐａｕｌｏ  Ｃａｍｐｏｒｅｚ，Ｈｕｉ−Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅ，Ｇａｒｙ  Ｗ．Ｃｌｉｎｅ，Ｖａｒｍａｎ  Ｔ．Ｓａｍｕｅｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇ．Ｋｉｂｂｅｙ  ＆  Ｇｅｒａｌｄ  Ｉ．Ｓｈｕｌｍａｎ  （２０１４）  Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ５１０：５４２−５４６（２６  Ｊｕｎｅ  ２０１４）
【０１６０】
上記明細書で言及したすべての出版物は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲及び趣旨を逸脱することのない、本発明についての記載された方法の様々な変更及び変形は、当業者にとって明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されてきたが、請求されている本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、生化学及び生物工学、又は関連分野において技術を有する者にとって明白である本発明実施のための記載形態の様々な変更は、以下の請求項の範囲内にあることが意図されている。
【図１】
2017512068.tif 000005
【図２】
2017512068.tif 000006
【図３】
2017512068.tif 000007
【図４】
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【配列表】
2017512068000001.app
【国際調査報告】
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2017512068.tif 000010
2017512068.tif 000011
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