(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＤＮＡを固相基材表面に捕捉する方法であって、
該試料をｐＨ１２以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：
固相基材表面に固定化した少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中のＤＮＡとを結合させてＤＮＡを捕捉する工程、又は
少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中のＤＮＡとを結合させた後に該ＤＮＡを固相基材表面に接触させて捕捉する工程
とを含む方法。
【請求項２】
試料中のＤＮＡを検出する方法であって、
該試料をｐＨ１２以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：
固相基材表面に固定化した少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中のＤＮＡとを結合させてＤＮＡを捕捉する工程、又は
少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中のＤＮＡとを結合させた後に該ＤＮＡを固相基材表面に接触させて捕捉する工程
とを含み、さらに該捕捉されたＤＮＡを鋳型として特定塩基配列の核酸を増幅させて検出する工程
を含む方法。
【請求項３】
少なくとも１種の２価金属イオンがマグネシウムイオンである請求項１又は２に記載の方法
【請求項４】
ｐＨ１２以上において少なくとも１種の２価金属イオンと結合しており固相基材表面に捕捉されたＤＮＡ。
【請求項５】
少なくとも下記の工程を含む請求項１に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料に少なくとも１種の２価金属化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオンとの会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程。
【請求項６】
少なくとも下記の工程を含む請求項１に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に少なくとも１種の２価金属化合物を添加し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオンとの会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程。
【請求項７】
少なくとも下記の工程を含む請求項２に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料に少なくとも１種の２価金属化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオンとの会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉されたＤＮＡを鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。
【請求項８】
少なくとも下記の工程を含む請求項２に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に少なくとも１種の２価金属化合物を添加し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオンとの会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉されたＤＮＡを鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。
【請求項９】
濾過により固相基材表面に上記の会合体を捕捉する請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固相基材がフィルターである請求項５から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固相基材が不織布からなるフィルターである請求項５から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種の２価金属がマグネシウムである請求項５から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡを含有する試料にｐＨ１２以上で溶解度が０．２ｍM以上の金属イオンを添加する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のＤＮＡを捕捉するためのキット又は試料中のＤＮＡを捕捉及び検出するためのキットであって、
該試料からＤＮＡを抽出するための試薬；
該試料をｐＨ１２以上にするための試薬；
少なくとも１種の２価金属化合物；
固相基材；及び
特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素
からなる群から選ばれる要素のうち少なくとも２つの要素を含むキット。
【請求項１５】
ｐＨ１２以上において少なくとも１種の２価金属イオンと結合することにより会合体を形成しており、かつ固相基材表面に捕捉されたＤＮＡ。
【請求項１６】
少なくとも下記の工程を含む請求項１に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程。
【請求項１７】
少なくとも下記の工程を含む請求項１に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程。
【請求項１８】
少なくとも下記の工程を含む請求項２に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉されたＤＮＡを鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。
【請求項１９】
少なくとも下記の工程を含む請求項２に記載の方法。
(a)ＤＮＡを含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中のＤＮＡと少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会合体を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉されたＤＮＡを鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。
【請求項２０】
濾過により固相基材表面に上記の会合体を捕捉する請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
固相基材がフィルターである請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
固相基材が不織布からなるフィルターである請求項１６から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１種の２価金属がマグネシウムである請求項１６から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡを含有する試料にｐＨ１２以上で溶解度が０．２ｍＭ以上の金属イオンを添加することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料中のＤＮＡを捕捉するためのキット又は試料中のＤＮＡを捕捉及び検出するためのキットであって、
該試料からＤＮＡを抽出するための試薬；
該試料をｐＨ１２以上にするための試薬；
少なくとも１種の２価金属化合物；
少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物；
固相基材；
特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素
からなる群から選ばれる要素のうち少なくとも２つの要素を含むキット。
【請求項２６】
ｐＨ１２以上において少なくとも１種の２価金属イオン及び該２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物と結合することにより会合体を形成しており、かつ固相基材表面に捕捉されたＤＮＡ。
【請求項２７】
少なくとも下記の工程を含む請求項１に記載の方法。
(a)少なくとも１種の２価金属イオンを固相基材表面に固定化する工程；
(b)ＤＮＡを含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；及び
(c)工程(a)で得られた固相基材表面に工程(b)で得られた試料を接触させて、固相基材表面にＤＮＡを捕捉する工程。
【請求項２８】
少なくとも下記の工程を含む請求項２に記載の方法。
(a)少なくとも１種の２価金属イオンを固相基材表面に固定化する工程；
(b)ＤＮＡを含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(c)工程(a)で得られた固相基材表面に工程(b)で得られた試料を接触させて、固相基材表面にＤＮＡを捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉されたＤＮＡを鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。
【請求項２９】
濾過により固相基材表面にＤＮＡを捕捉する請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
固相基材がフィルターである請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
固相基材が不織布からなるフィルターである請求項２７から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
固相基材が少なくとも１種の２価金属イオンを固定化可能な残基を有する高分子化合物を含む請求項２７から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１種の２価金属イオンを固定化可能な残基がカルボン酸基である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
固相基材が少なくとも１種の２価金属イオンを固定化可能な固相基材層を多層化した固相基材である請求項２７から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種の２価金属がマグネシウムである請求項２７から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
固相基材が少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物をコーティングした固相基材である請求項２７から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＤＮＡを含有する試料にｐＨ１２以上で溶解度が０．２ｍM以上の金属イオンを添加する工程を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
試料中のＤＮＡを捕捉するためのキット又は試料中のＤＮＡを捕捉及び検出するためのキットであって、
該試料からＤＮＡを抽出するための試薬；
該試料をｐＨ１２以上にするための試薬；
少なくとも１種の２価金属化合物；
少なくとも１種の２価金属イオンを固定化可能な固相基材；
少なくとも１種の２価金属イオンを固定化した固相基材；
特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素
からなる群から選ばれる要素のうち少なくとも２つの要素を含むキット。
【請求項３９】
ｐＨ１２以上において固相基材表面に固定化された少なくとも１種の２価金属イオンと結合することにより該固相基材表面に捕捉されたＤＮＡ。
【請求項４０】
固相基材が酵素吸着抑制剤をコーティングした固相基材である請求項２、７、８、１８、１９、又は２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
酵素吸着抑制剤が牛血清アルブミンである請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２価金属イオンを介した核酸会合体や２価金属イオン固定化基材などを用いた核酸捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を含有する試料からの核酸の調製は、バイオテクノロジーや臨床診断等の分野において重要な技術である。例えば遺伝子組み替え技術ではベクターＤＮＡやクローン化しようとするＤＮＡの両方を単離することが必要であり、遺伝病や癌遺伝子について遺伝子検査を行うには、血液中の白血球細胞等から核酸を抽出することが必要である。【０００３】
一般的に、核酸は遊離の分子としては存在せず、例えば細菌、細胞、ウィルス粒子中などに存在し、たんぱく質、脂質、及び糖からなる細胞膜や細胞壁で覆われている。また、核酸自身はヒストンタンパク質等と複合体を形成している。このような状態で存在する核酸を抽出するには、核酸を覆う細胞膜や細胞壁を破壊し、前記複合体のたんぱく質を変性又は分解して可溶化し、核酸を遊離させ、遊離した核酸を抽出する操作が必要である。【０００４】
核酸を細胞から調製する方法としては、細胞を含む試料をＳＤＳやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理して可溶化した後、フェノールで蛋白質を変性除去して核酸を精製する方法が一般的である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、９．１６−９．２３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）。しかし、この方法は手間と時間がかかることから、より簡便な方法が求められている。【０００５】
核酸を単離するためのより簡便な方法としては、例えばシリカを用いる方法がＷＯ９９／２２０２１に開示されている。この方法では、まず細胞をカオトロピック性試薬で処理して細胞を溶解し、核酸を遊離させる。次に、シリカ又はその誘導体からなる核酸結合性坦体に核酸を吸着させて、この坦体をカオトロピック性試薬や有機溶媒で遠心洗浄する。最後に、低塩のバッファーで核酸を溶出する。この方法はフェノール法に比較すると簡便であるものの、まだ多くの工程を含み、遠心操作が必要であるという欠点を有している。また、ＰＣＲなどの酵素反応を強く阻害するカオトロピック塩やエタノールを使用するので、これらの物質を完全に除く必要がある、そのため操作が煩雑になり時間がかかるなどの欠点がある。【０００６】
白血球分離フィルターのような細胞吸着性繊維集合体を用いて末梢血白血球から核酸を調製する方法が特公平８−２４５８３号公報や特開平８−２８０３８４号公報に開示されている。特公平８−２４５８３号公報に記載された方法では、まず白血球分離フィルターに血液を通して、血液中の白血球をフィルターに吸着させ、血液の他の成分と分離する。このフィルターにＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ；  １ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ｐＨ７．６）を通して洗浄し、ヘモグロビン等の蛋白質を除去する。こうして分離洗浄された白血球をフィルターごと例えば−８０℃で凍結した後、室温で放置して白血球を解凍する。それから繊維状物質にＴＥ−ｍｉｘ（ＴＥ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５）を加えて、フィルターの繊維状物質に吸着されていた白血球を繊維状物質から回収する。しかしながら、特公平８−２４５８３号公報には、回収された白血球からゲノムＤＮＡを抽出する操作を従来の技術（フェノール処理）に従って行っていることが示されている。すなわち、白血球に１０％  硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤と蛋白分解酵素（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）を加えて、６５℃で１５時間 インキュベートし、これにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅＡ）を加えて３７℃で１時間インキュベートした後、これをフェノール試薬で処理し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させて精製する方法が示されている。【０００７】
特開平８−２８０３８４号公報には、有核細胞を吸着した後、有核細胞中の核酸又は蛋白質を取り出す方法が開示されている。核酸又は蛋白質を取り出す方法としては、極細繊維集合体に細胞を結合したまま細胞溶解液を通液して溶解するか、あるいは破砕などを行う方法が示されている。この方法の利点は、吸着した細胞をそのまま破砕、溶解処理することが可能なことである。吸着した細胞を脱着することなく、吸着した細胞を破砕し、又は溶解することから、吸着した細胞を脱着する方法よりも容易に実施が可能である。しかしながら、この公報においても、細胞溶解後の核酸精製については従来の技術をそのまま用いており、新しい方法は開示されていない。すなわち、まず細胞を吸着した極細繊維集合体を精製水や界面活性剤で処理し、極細繊維集合体を通過した細胞溶解液から通常のフェノール・クロロホルム法で核酸を精製している。【０００８】
以上のように、末梢血白血球から核酸を調製する方法において白血球分離フィルターのような細胞吸着性繊維集合体を用いることは従来知られていたが、上記の方法は白血球の分離や核酸抽出のステップまでをフィルターを用いて行う方法にすぎず、その後の核酸精製工程は既存の核酸精製法を用いるものである。従って、核酸の精製工程が複雑になり時間と手間がかかるという欠点があった。【０００９】
さらに簡便な方法として、フィルターを用いて細胞から核酸を直接精製する方法がＷＯ００／２１９７３に開示されている。この方法は以下の工程を含んでいる。（１）まず、細胞を含む試料をフィルターにかけて細胞をフィルターに吸着させる。（２）次にフィルターに吸着された細胞を溶解し、（３）フィルターで濾過する。（４）フィルターに吸着された核酸を洗浄する。（５）最後に、核酸をフィルターから溶出する。吸着した核酸は４０℃から１２５℃に加温すると溶出され、溶出バッファーのｐＨは５から１１の範囲で、塩濃度は高くても低くてもよい。精製された核酸のＡ260／Ａ280は１．８であり、ＰＣＲの鋳型として使用可能である。ＷＯ００／２１９７３には、核酸を精製する目的に使用可能なフィルターの例としてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｆｉｌｔｅｒｓが挙げられており、一方、使用不可能な例としてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ  ｆｉｌｔｅｒｓが挙げられているが、該方法に適したフィルターは、精製ＤＮＡをフィルターに通しても精製ＤＮＡを捕捉しないことが必須である。また、この方法において、細胞を溶解してからフィルターにかけるとＤＮＡの収率が８０％低下してしまうので実用的ではない。さらに、この方法を用いて血液から核酸を調製する場合、実験者は白血球を溶解する前に赤血球を溶血させる必要がある。加えて、上記のように細胞をフィルターに吸着させてから精製する方法では、細胞の種類に応じてフィルターを選択しなければならないという欠点がある。【００１０】
これらの欠点を克服したさらに簡便な方法として、不織布を用いて核酸を分離、増幅、及び検出する方法がＷＯ０３／００６６５０に開示されている。この方法は、まず細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させ、次に該不織布に核酸を増幅するための溶液を加えて、該不織布に吸着された核酸を鋳型として核酸を増幅する工程を含んでいる。この方法では特別な試薬を一切用いることなく不織布に試料中の核酸を接触させるという非常に簡便な方法により、核酸を不織布上に精製することが可能である。また不織布上に精製した核酸は核酸合成反応液に接触させることにより、そのまま増幅反応が可能であり、核酸の検出が簡便である。しかしながら、この方法では比較的低濃度（１ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬ）の核酸を捕捉する場合に試料中に共存するタンパク質、例えばアルブミンやグロブリンなどの影響で捕捉率が大幅に低下する欠点がある。【００１１】
一方、核酸を単離するための方法として２価金属イオンを使用している例としては、例えばシリカを用いる方法（ＷＯ９９／２２０２１）が知られている。この方法では、まず細胞をカオトロピック性試薬で処理して細胞を溶解し、核酸を遊離させる。次に、シリカ又はその誘導体からなる核酸結合性坦体に核酸を吸着させて、この坦体をカオトロピック性試薬や有機溶媒で遠心洗浄する。最後に、低塩のバッファーで核酸を溶出する。この方法において、核酸の担体への吸着時に核酸の固定化を維持するために溶液への添加物としてマグネシウムを含む各種の塩類を用いている。【００１２】
この方法では、マグネシウムイオンを基材側に固定化して液相側の核酸を捕捉するための手段として用いているのではなく、また、マグネシウムイオンを核酸単離のための手段として主体的に用いているのではない。マグネシウム塩を用いて２本鎖核酸をタンパク質から分離する方法が特願平５−１６４８４１号公報に開示されている。この方法ではｐＫ９未満の水酸基で置換された芳香族部分を含むポリマーを基材として用い、該基材にｐＨ７〜１０で一価又は多価の陽イオンを共存させて核酸及びタンパク質を含む液相を接触させることによりタンパク質及び１本鎖核酸を基材に結合させ、液相から基材に結合しなかった２本鎖核酸を分離する。この方法は試料をｐＨ１２以上の高アルカリ条件下で変性させる工程を含んでおらず、またマグネシウムを核酸捕捉剤として積極的に基材に固定化しているわけではない。さらに、この方法はマグネシウムイオンをｐＨ１２以上の高アルカリ条件下で核酸と共存させて基材に結合させているわけではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、核酸を含む試料から従来の方法よりも簡便かつ高収率に核酸を捕捉して回収する方法を提供することにある。さらに本発明の課題は、従来の核酸増幅技術に使用可能な迅速かつ簡便な核酸調製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは鋭意検討の結果、試料に塩化マグネシウムなどのマグネシウム化合物を添加した後、水酸化ナトリウムなどの塩基を加えることによりｐＨを１４付近にまで高めると、タンパク質が共存する試料においても核酸の不織布に対する捕捉効率が劇的に回復することを見出した。さらに検討を進めた結果、驚くべきことに高アルカリ条件下において核酸は２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンの特異的作用により会合体を形成すること、及びこの会合体の形成により核酸の見かけのサイズが大きくなってフィルターへの捕捉効率が高まり、タンパク質を含む試料から高収率で核酸を捕捉することができることを見出した。
また本発明者らは核酸を含む試料に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１４付近にまで高めた試料を調製し、この試料をマグネシウムを固定化した不織布に対して通水させると、驚くべきことに、タンパク質が共存する試料において核酸の不織布に対する捕捉効率が劇的に高まることを見出した。本発明者らはさらに検討を続けた結果、高アルカリ条件下において１本鎖に変性させた核酸ではマグネシウムとの結合力が非常に高まっており、液相の核酸が容易に固相のマグネシウムに捕捉されることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成された。
すなわち、本発明により、
試料中の核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、
該試料をｐＨ１２以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：
固相基材表面に固定化した少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させて核酸を捕捉する工程、又は
少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させた後に該核酸を固相基材表面に接触させて捕捉する工程
とを含む方法、及び
試料中の核酸を検出する方法であって、
試料をｐＨ１２以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：
該試料をｐＨ１２以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：
固相基材表面に固定化した少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させて核酸を捕捉する工程、又は
少なくとも１種の２価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させた後に該核酸を固相基材表面に接触させて捕捉する工程
とを含み、さらに該捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列の核酸を増幅させて検出する工程
を含む方法が提供される。これらの方法において、少なくとも１種の２価金属イオンがマグネシウムイオンであることが好ましい。【００１５】
以下、上記の本発明を３つの形態に大別して説明する。【００１６】
第１の形態により、核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸及び２価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を含みｐＨが１２以上に調節された試料を固相基材表面に対して接触させる工程を含む方法が提供される。
この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：
(a)核酸を含有する試料に２価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に塩基を添加して試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中の核酸の会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕捉する工程
を含む方法が提供される。
また、別の典型的な方法では、少なくとも下記の工程：
(a)核酸を含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に２価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加して、試料中の核酸の会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕捉する工程
を含む。【００１７】
別の観点からは、核酸を検出する方法であって、核酸及び２価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を含みｐＨが１２以上に調節された試料を固相基材表面に対して接触させ、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列の核酸を増幅させて検出する工程を含む方法が提供される。
この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：
(a)核酸を含有する試料に２価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に塩基を添加して試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中の核酸の会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。
また、別の典型的な態様では、少なくとも
(a)核酸を含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に２価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加して、試料中の核酸の会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。【００１８】
さらに別の態様では、上記工程(d)及び(e)は、以下の工程で置き換えることができる。
(d')工程(c)で得られた固相基材表面から核酸を溶出させ、得られた溶出液に特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を加えて、該溶出液中の核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e')工程(d')で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。上記の溶出工程において、好ましくは、熱溶出、界面活性剤溶出、又はＥＤＴＡ溶出を行うことができる。
上記の各発明の好ましい態様によれば、濾過により固相基材表面に核酸の会合体を捕捉する上記の方法；及び固相基材がフィルターである上記の方法が提供される。【００１９】
第２の形態により、核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸と２価金属化合物及び２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物とを含みｐＨが１２以上に調整された試料を固相基材表面に対して接触させる工程を含む方法が提供される。
この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：
(a)核酸を含有する試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会合体を捕捉する工程
を含む。
また、別の典型的な態様では、少なくとも
(a)核酸を含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中の核酸と少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；及び
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会合体を捕捉する工程
を含む。
さらに別の態様によれば、核酸を検出する方法であって、核酸と２価金属化合物及び２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物とを含みｐＨが１２以上に調整された試料を固相基材表面に対して接触させ、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列の核酸を増幅させて検出する工程を含む方法が提供される。
この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：
(a)核酸を含有する試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；
(b)工程(a)で得られた試料のｐＨを１２以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会合体を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。
また、別の典型的な態様では、少なくとも
(a)核酸を含有する試料のｐＨを１２以上に調整する工程；
(b)工程(a)で得られた試料に少なくとも１種の２価金属化合物及び該少なくとも１種の２価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中の核酸と少なくとも１種の２価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；
(c)工程(b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会合体を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。【００２０】
第３の形態では、核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸を含有するｐＨ１２以上の試料を２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化した固相基材表面に対して接触させる工程を含む方法が提供される。
この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：
(a)固相基材表面に２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化する工程；
(b)核酸を含有する試料をｐＨ１２以上に調整する工程；及び
(c)工程(a)で得られた固相基材表面に工程(b)で得られた試料を接触させて、固相基材表面に核酸を捕捉する工程
を含む。【００２１】
別の観点からは、核酸を検出する方法であって、核酸を含有するｐＨ１２以上の試料を２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化した固相基材表面に対して接触させた後、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列の核酸を増幅させて検出する工程を含む方法が提供される。
この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：
(a)固相基材表面に２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化する工程；
(b)核酸を含有する試料をｐＨ１２以上に調整する工程；
(c)工程(a)で得られた固相基材表面に工程(b)で得られた試料を接触させて、固相基材表面に核酸を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面に対して特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。また、別の典型的な態様では、少なくとも下記の工程：
(a)固相基材表面に２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化する工程；
(b)核酸を含有する試料をｐＨ１２以上に調整する工程；
(c)工程(a)で得られた固相基材表面に工程(b)で得られた試料を接触させて、固相基材表面に核酸を捕捉する工程；
(d)工程(c)で得られた固相基材表面から核酸を溶出させ、得られた溶出液に特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を加えて、該溶出液中の核酸を鋳型として特定塩基配列を有する核酸を増幅する工程；及び
(e)工程(d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程
を含む。上記の溶出工程において、好ましくは、熱溶出、界面活性剤溶出、又はＥＤＴＡ溶出を行うことができる。【００２２】
上記の各発明の好ましい態様によれば、濾過により固相基材表面に核酸を捕捉する上記の方法；固相基材がフィルターである上記の方法；固相基材が２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化可能な残基を有する高分子を含む上記の方法；２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化可能な残基がカルボン酸基である上記の方法；及び固相基材が２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化した固相基材層を多層化した固相基材である上記の方法が提供される。【００２３】
さらに別の観点からは、本発明により、核酸の捕捉用具であって、その表面に２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンが固定化された固相基材からなる用具；及び核酸の捕捉用具であって、その表面に２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定化可能な残基を有する固相基材からなる用具が提供される。
また、核酸の検出キットであって、(a)その表面に２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンが固定化された固相基材；及び(b)特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド３燐酸、及び核酸合成酵素のうち少なくとも１つを含むキットが本発明により提供される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の方法では、核酸の捕捉、濃縮、及び分離精製に特別な装置は不要であり、簡便に核酸を捕捉し、捕捉した核酸を増幅して検出することができる。２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンにより固相基材表面に捕捉された核酸は、そのまま核酸合成反応の鋳型として用いることができ、さらに界面活性剤、熱、又はキレート剤などの作用により容易に固相基材表面から溶出させることが可能であることから、核酸を含む溶出液を得て核酸合成及び検出反応を簡便に行なうことも可能である。また、２価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを介して会合体を形成することにより固相基材表面に捕捉された核酸は、そのまま核酸合成反応の鋳型として用いることができ、さらに界面活性剤、熱、又はキレート剤などの作用により容易に固相基材表面から溶出させることが可能であることから、核酸を含む溶出液を得て核酸合成及び検出反応を簡便に行なうことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は実施例で用いた不織布を固定化したカラムの構造を示した図である。
【図２】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較結果を示した図である。縦軸は濁度０．１となるまでの経過時間を示す。
【図３】マグネシウムイオン固定化不織布での核酸捕捉効果（不織布表面の蛍光強度）を示した図である。
【図４】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較（ポリマーコート不織布へのマグネシウム吸着と多層化フィルターの効果）を示した図である。縦軸は濁度０．１となるまでの経過時間を示し、(1)ないし(5)は不織布の状態を表す。
【図５】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較（試料のアルカリ処理有無の比較）を示した図である。縦軸は濁度０．１となるまでの経過時間を示し、(1)及び(2)は不織布の状態を表す。
【図６】例５で得た不織布表面の蛍光強度を測定した結果を示した図である（生理食塩水試料）。図中の数字は蛍光強度を示し、(1)ないし(3)は不織布に吸引した試料番号を示す。
【図７】例６で得た不織布表面の蛍光強度を測定した結果を示した図である（ＮａＯＨ処理試料）。図中の数字は蛍光強度を示し、(1)ないし(4)は不織布に吸引した試料番号を示す。
【図８】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（塩化マグネシウムの添加による効果の確認）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示し、(1)ないし(3)は不織布に吸引した試料番号を示す。
【図９】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（塩化マグネシウムの添加濃度の検討）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。
【図１０】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（試料ｐＨの影響の検討）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。
【図１１】例１０におけるアルカリ条件下でのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である（マグネシウムの添加効果）。レーン１  λＤＮＡレーン２  λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡレーン３  λＤＮＡ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン４  λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン５  λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ
【図１２】例１１におけるアルカリ条件下でのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である（マグネシウムの添加濃度の影響）。５％アガロース、０．０５Ｎ  ＮａＯＨレーン１  λＤＮＡ＋０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン２  λＤＮＡ＋０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン３  λＤＮＡ＋０．３ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン４  λＤＮＡ＋０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン５  λＤＮＡ＋０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2
【図１３】例１１におけるｐＨ８条件下でのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である（マグネシウムの添加効果）。レーン１  λＤＮＡレーン２  λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡレーン３  λＤＮＡ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン４  λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2レーン５  λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ
【図１４】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（各種二価金属イオンを固定化した不織布の比較）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。
【図１５】不織布上に捕捉したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である（１％アガロース）。レーン１〜４は使用した不織布に対するマグネシウムイオン固定化の有無、及び吸引したサンプルの順に示す。レーン１  未固定化、ＢＣＧ菌ゲノム２００ｐｇ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨレーン２  未固定化、ＢＣＧ菌ゲノム２００ｐｇ＋０．３％ＨＳＡ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨレーン３  マグネシウム固定化、ＢＣＧ菌ゲノム２００ｐｇ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨレーン４  マグネシウム固定化、ＢＣＧ菌ゲノム２００ｐｇ＋０．３％ＨＳＡ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ
【図１６】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（ＥＤＴＡ及びストロンチウムの添加効果）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。(1)ないし(5)は不織布に吸引した各試料を示す。
【図１７】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（尿試料に対するマグネシウム固定化不織布の核酸捕捉効果）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。横軸は不織布に吸引した各試料を示す。図中左の青斜線のカラムは未処理の不織布、右の赤いカラムはマグネシウムを固定化した不織布を示す。
【図１８】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（核酸捕捉後の不織布に対するＢＳＡ含有洗浄液の効果）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。横軸は洗浄液に含まれるＢＳＡの濃度を示す。
【図１９】不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図である（金属イオン親和性高分子の添加効果）。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を示す。(1)ないし(4)は不織布に吸引した各試料を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明において、核酸を含有する試料としては、例えば、細胞を含む試料から細胞を破壊して調製された細胞抽出液が挙げられる。本明細書において、細胞とは真核細胞、原核細胞、又はウイルスを意味しており、特にヒト体細胞、ヒト末梢血白血球、感染症の原因となる真菌、細菌、又はウイルスを含む。試料の種類は特に限定されず、例えば、血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、又は細胞培養液など細胞を含むものであればその種類は特に限定されない。また、試料は何らかの処理をほどこした処理液であってもよい。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が挙げられる。【００２７】
細胞抽出液とは、細胞を破壊して得られる細胞の構成成分を含む混合物のことである。細胞抽出液は、一般的には、細胞を含む試料に細胞溶解液を作用させて調製することができる。細胞溶解液とは、細胞を破壊して核酸を抽出するために用いられる溶液のことであり、必要により界面活性剤や酵素などを含むが、これらをの一部又は全てを含む必要はない。酵素としては、蛋白質分解酵素、例えばＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなどを用いることができるが、細胞種によってはリゾチーム、リゾスタフィン（スタフィロコッカス属）、β１，３−グルカナーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ（真菌類）なども用いられる。ＲＮＡを除いた方が好ましい場合には、ＲＮａｓｅＡのようなＲＮＡ分解酵素を加えればよい。また、上記のような酵素を含まなくともよい。動物細胞では低張液に接触させるだけで細胞を破裂させることも可能である。また細胞抽出液は、細胞を含む試料に超音波をかけたり、ホモジナイザーで破砕するなど物理的な力を加えて作製することも可能である。【００２８】
２価金属化合物は溶液中の核酸に２価金属イオンを供給できる物質であればその種類は特に限定されるものではない。例えば２価金属塩又は２価金属高分子錯体などが適当である。２価金属塩としては、例えば、塩化物、硫酸化物、又は硝酸化物などが好ましい。２価金属としては、例えば、亜鉛、マンガン、マグネシウムなどが好ましいが、最も好ましいのはマグネシウムである。２価金属化合物はｐＨを１２以上に調整する前に細胞溶解液などの試料に加えておいてもよく、あるいは試料をｐＨ１２以上に調整した後、試料をフィルターなどの固相基材表面に接触させる前に加えてもよい。核酸の会合を促進する２価金属化合物の濃度範囲は特に限定されないが、例えば0.1ｍＭ以上が望ましい。【００２９】
本発明において試料をｐＨ１２以上に調整するための試薬は特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの強塩基が適当である。この強塩基の水溶液を適宜の量添加することにより、試料のｐＨを１２以上に調整することができる。【００３０】
核酸を含む試料を固相基材表面に接触させるための手段としては、例えば、試料溶液を固相基材表面上に流すか、あるいは試料溶液を固相基材表面に吸引もしくは加圧などにより透過させ、又は試料溶液に固相基材を浸漬するなどの手段を挙げることができる。【００３１】
固相基材の材質及び形状は特に限定されないが、例えば、多孔質のシート状基材を用いることができ、好ましくはフィルターを用いることができる。フィルターの形状及び素材は限定されないが、例えば不織布、織布、メンブレンフィルター、中空糸フィルター、焼結フィルター、ガラス繊維フィルターなどを例示できる。好ましくは不織布からなるフィルターを固相基材として用いることができる。不織布とは短繊維又はフィラメントを、機械的、熱的、化学的な手段を用いて接着又は交絡させて作るシート状又はウェブ状の構造体である（第２版  繊維便覧  繊維学会編  丸善）。不織布はさまざまな方法で生産することができるが、基本的な工程はウェブ（繊維の方向がある程度揃った繊維塊のシート状のもの）の形成工程と、ウェブの接着工程、それに仕上げ工程を含む。不織布としては天然繊維から化学繊維まで種々の繊維が用いられているが、一般的に用いられているのは綿、レーヨン、ポリエステル、ポリプロピレン、又はナイロンなどであり、その他の繊維としてアクリル、ビニロン、ガラス繊維、パルプ、又は炭素繊維なども使用される。好ましくはポリエチレンテレフタレートからなる不織布を用いることができる。ウェブを形成する方式は、一般的には、湿式、乾式、及び直接式に大別される。直接式は紡糸直結式ともいわれる方法で、溶融高分子溶液から紡糸された繊維を集めて直接ウェブとする工程を含む。直接式に含まれる方法としては、スパンレース法、スパンボンド法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、ステッチボンド法などを挙げることができるが、本発明にはメルトブロー法でつくられた超極細繊維不織布が最も適している。【００３２】
２価金属イオンを固相基材表面に固定化する手段は特に限定されないが、例えば、２価金属イオンと錯体を形成する配位基を有する固相基材表面に対して２価金属イオンを固定化する手段を挙げることができる。一般的に２価金属と錯体を形成可能な配位基としてはアルコール、フェノール、エノール、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、キノン、エーテル、エステル、アミド、ニトロソ化合物、ニトロ化合物、Ｎ−オキシド、スルホン酸、次亜燐酸、亜燐酸、アルソン酸、第一アミン、第二アミン、第三アミン、アゾ化合物、シッフ塩基、オキシム、イミン、又はエナミンなどが例示でき、これらの配位基の１種又は2種以上を組み合わせて２価金属イオンを固定化することができる。これらの配位基を有する固相基材としては有機若しくは無機合成高分子、天然高分子、又はこれらを化学修飾した高分子、あるいはこれらの基を有する高分子をコーティングした固相基材などが挙げられる。【００３３】
固相基材表面に捕捉された核酸を鋳型として特定塩基配列の核酸を増幅させることにより、その特定塩基配列を有する核酸が試料中に存在しているか否かを判定することができ、これにより試料中に含まれる特定塩基配列を有する核酸の検出を行なうことができる。核酸の増幅には、ＰＣＲに代表される特定の標的核酸配列を増幅させる方法を用いることができ、ＰＣＲ以外にＬｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）  Ａｓｓａｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＴ）、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲＣＡＴ）、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）などの方法を用いてもよい。もっとも、核酸の増幅方法はこれらに限定されるものではない。Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ、ＲＣＡＴ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮなどはＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ（一定温度）で増幅反応を行い、その他のＰＣＲ、ＬＣＲなどはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｉｎｇ（温度サイクリング）で増幅反応を行うことができる。【００３４】
核酸の増幅に用いる核酸合成反応とは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼなどを用いてプライマー特異的に起こす５’→３’ＤＮＡ又はＲＮＡ合成反応のことである。本明細書において、核酸とはＤＮＡ及びＲＮＡのほか、非天然型の核酸塩基を含むＤＮＡ及びＲＮＡを含む概念である。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。またプライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸伸長反応で特定の塩基配列を検出する方法には、例えば前述のＳＮＰｓタイピング技術のＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｉｏｎ法、ＬＡＭＰ法などがある。【００３５】
増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する方法としては、例えば、核酸の合成反応に伴って生じるピロリン酸とマグネシウムの反応物の沈殿を波長６５０ｎｍの光の透過度、つまり濁度の変化によって検出する方法、又はインターカレーター性蛍光色素を含む反応液において増幅された核酸へのインターカレーションに伴う蛍光強度変化によって検出する方法などがある。インターカレーター性蛍光色素としては、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ビスベンチミド、ジアミノフェニルインドール、アクチノマイシン、チアゾール、又はクロモマイシン、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。【００３６】
２価金属に親和性を有する高分子としては、例えば、側鎖に２価金属イオンと錯体を形成することが可能な配位基を有する高分子を用いることができる。一般的に、２価金属と錯体を形成可能な配位基としては、アルコール、フェノール、エノール、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、キノン、エーテル、エステル、アミド、ニトロソ化合物、ニトロ化合物、Ｎ−オキシド、スルホン酸、次亜燐酸、亜燐酸、アルソン酸、第一アミン、第二アミン、第三アミン、アゾ化合物、シッフ塩基、オキシム、イミン、又はエナミンなどが例示できる。２価金属に親和性を有する高分子は、これらの配位基を２種以上有していてもよい。これらの配位基を有する高分子としては有機若しくは無機合成高分子、又は天然高分子、あるいはこれらを化学修飾した高分子などが挙げられる。【００３７】
以下、上記の本発明の３つの形態のそれぞれについてより具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の説明の特定の部分に限定されることはない。
従来法としてフィルターに不織布（ポリエチレンテレフタレート（PET）不織布、Ａ０４０Ｃ０１旭化成株式会社）を使用し、核酸の不織布に対する捕捉効率を観測すると、試料が適当な塩を含む精製ゲノムＤＮＡ溶液のみの時では非常に高いが、試料中にタンパク質を共存させると極端に低下する。これに対して、同じ試料に２価金属化合物である塩化マグネシウムを添加した後、水酸化ナトリウムを加えることにより試料のｐＨを１２以上に高めると、核酸の不織布に対する捕捉効率が劇的に回復する。同様な検討を不織布上に捕捉した核酸についてＬＡＭＰ増幅反応を行わせ、その反応時間で比較すると、アルカリ条件下でマグネシウム化合物を共存させることにより核酸の増幅反応時間が大幅に短縮され、増幅の鋳型となる核酸がフィルター上に効率的に捕捉されることが示された。【００３８】
本発明の方法における特徴の１つは、カオトロピック塩やエタノール、フェノール、クロロホルムなどの有機溶媒を使わず、２価金属化合物及びアルカリ溶液という非常に安価で一般的な試薬を添加することにより、簡便、迅速、且つ効率的にタンパク質などを含んだ試料から核酸を捕捉することができる点にある。【００３９】
またもう1つの特徴はアルカリ条件下において、２価金属化合物を添加した試料に含まれる核酸を固相基材表面に捕捉した後、その核酸を溶出することなく直接ＰＣＲなどの核酸合成反応や、あるいはそれに続く特定の核酸塩基配列の検出を行うことができる点にある。すなわち、核酸の抽出及び精製から核酸合成、あるいは核酸の抽出及び精製から特定の核酸塩基配列の検出までを同一フィルター上で実現できる。この特徴により、試料中の核酸の抽出から検査に至る全工程が著しく単純化され、さらに溶出操作が不要なため処理時間も著しく短縮することができる。また固相基材としての不織布をアレイ状に配置し、あるいは同一の不織布上にアレイ状に核酸をスポットすることにより、多項目検出を簡単に行うことも可能である。【００４０】
２価金属化合物の添加量としては多いほうが望ましいが、一般的にアルカリ条件下では２価金属イオンは水酸化物を形成する。例えばマグネシウム水酸化物の水への溶解度は非常に低く、１ｍＭ以下程度であることが知られている。２価金属化合物の添加量は水酸化物の溶解度を勘案して適宜決定すべきである。例えばマグネシウム化合物の添加量が１ｍＭ以上になると、固相基材としてフィルターを用いて試料を吸引する際に、水酸化物の目詰まりによって吸引抵抗が高くなり、フィルター上への核酸捕捉が困難になることがある。もっとも吸引抵抗の度合いについてはフィルターの孔径を大きくすることで対応が可能である。そのためマグネシウム化合物の添加量の上限はこの限りではない。一方、本発明の特徴として、非常に低濃度の２価金属化合物の添加によりフィルターへの核酸捕捉効率の向上が達成できる点が挙げられる。これは水酸化物沈殿によるフィルターの目詰まりを避ける上で非常に好都合である。例えば添加するマグネシウム化合物の濃度としては０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上である。【００４１】
また本発明のもう1つの特徴である試料の高ｐＨ条件については、２価金属化合物の添加による核酸の捕捉効率向上効果はｐＨ１２以上の場合に達成できることが示された。例えば、試料に水酸化ナトリウムなどの強塩基を添加してｐＨ１４程度に調製することが望ましい。水酸化ナトリウムなどの塩基の濃度については捕捉するフィルターなどの固相基材の耐アルカリ強度にもよるが、例えば５０ｍＭ以上１Ｍ以下であることが望ましい。核酸捕捉後のフィルターは中性条件の緩衝液で洗浄することにより、フィルター表面及び内部のｐＨを低下させることができ、捕捉された核酸を各種酵素反応などに供することも可能となる。【００４２】
２価金属イオンと核酸との相互作用については多くの研究がなされているが、ほとんどの金属イオンは高ｐＨ下で水酸化物となり沈殿を形成してしまうため高ｐＨ条件下で核酸と金属イオンの相互作用を検討した例はない。本発明においてはマグネシウム化合物の添加により、アルカリゲル電気泳動において極端に泳動度が低下するほど核酸の大きさ、形が変化することが示唆された。高ｐＨ条件下ではマグネシウムイオンを介して核酸が会合するため見かけ上の分子量が増大しており、フィルターなどの固相基材を濾過材として用いた場合に核酸の捕捉効率が高まるものと考えられる。上記の効果はｐＨ１１以下では実質的に観測されない。核酸とマグネシウムとの相互作用については一般的に２本鎖核酸の燐酸基への結合が知られているが、高ｐＨ条件下、水酸化物沈殿を形成しない程度の濃度においてマグネシウムイオンが核酸同士を会合させる現象については未だ報告はない。またこのように会合した核酸をフィルターなどの固相基材に捕捉した例も未だない。【００４３】
また、高ｐＨ条件下において２価金属イオンにより形成される核酸の会合体については、ＥＤＴＡを加えることにより会合が阻害されることが判明した。会合の形成はＥＤＴＡなどのキレート剤添加により容易に阻害され、又は会合体が破壊されて捕捉効率が低下する。試料によっては生体由来成分中に各種の有機酸類などの金属イオンに対するキレート能を有する成分が含まれることがある。この問題点については高ｐＨにおいて水酸化物の溶解度が高い金属化合物を過剰に添加することにより回避することが可能である。高ｐＨにおいて水酸化物の溶解度が高い金属としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属が挙げられる。例えば０．１ｍＭのマグネシウム化合物を含む試料に対して１ｍＭのＥＤＴＡを添加した後、１０ｍＭのストロンチウム化合物を添加するとｐＨを１２以上に調整した試料から効率的に核酸を捕捉できることが示された。【００４４】
さらに本発明の方法における特徴の１つとして、２価金属イオンにより形成される核酸の会合体は、その形成が２価金属イオンに親和性を有する高分子の添加により促進することが挙げられる。例えば血清などの高濃度のタンパク質（７％程度）を含む試料においては２価金属イオンと核酸の会合体の形成効率が低下し、固相基材への核酸の捕捉率の低下が見られる。該試料に２価金属イオンに親和性を有する高分子を添加すると２価金属イオンと核酸の会合体の形成効率が上昇し、固相基材への核酸の捕捉率が向上することが示された。【００４５】
一般に細胞抽出液には核酸の他に生体試料由来のタンパクを含んでいる。試料中にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（終濃度  ０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加することにより、タンパクの除去も可能であるが、試料の処理工程が増えるため一般的には望ましくない。本発明の方法では、タンパク共存下で核酸を効率的に固相基材上に捕捉することが可能であることから、核酸捕捉の前に試料をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理する工程は通常は不要である。もっとも、高濃度のタンパクを含む試料、例えば血液などの場合には固相基材としてPET不織布からなるフィルターを用いると目詰まりを起こす可能性が高いので、より安全に吸引するためにはＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加することが望ましい場合もある。本発明においては２価金属イオンを介して核酸の会合体が形成され、該会合体のサイズが大きくなるので、核酸の捕捉に用いるフィルターの孔径を大きくすることも可能である。従って、より孔径の大きいフィルターを用いて目詰まりを減らすことも可能である。【００４６】
また本発明の方法のさらに別の特徴は、細胞から核酸を遊離させて溶液状態で固相基材表面に接触させることから、どのような種類の細胞にも応用できる汎用性の高い方法であるという点にある。前述したように、細胞としてはヒト白血球のような真核細胞、大腸菌のような原核細胞、あるいはウイルスなどからの核酸の捕捉に用いることができる。細胞を直接フィルターなどの固相基材に捕捉して溶解する方法では、細胞の種類に応じてフィルターの特性や吸着条件を至適化する必要がある。また細胞を破壊することなくフィルターに結合させなければならないので濾過の流速に制限があり、通常はフィルターをゆっくり通す必要がある。本発明の方法において固相基材としてフィルターを用いる場合には、細胞抽出液などの試料を溶液状態としてフィルターに通すことから、流速を早くすることが可能である。【００４７】
また本発明の方法において、固相基材として不織布からなるフィルターを用いる場合には、アルカリ条件下において２価金属イオンを介して形成された核酸の会合体は、試料溶液をフィルターに通過させるだけで容易にフィルター上に捕捉される。フィルターの会合体保持能力の範囲内であれば、試料中に含まれる細胞数や試料容量に制限はない。一方、ＦＴＡTMのような細胞溶液を基材にしみ込ませてから細胞を溶解する方法では、基材が吸収できる試料容量が処理量の上限となるので、大容量の試料から核酸を抽出する目的にはあまり適さない。例えば、細胞濃度が低い大容量の試料から、試料中に含まれる全細胞の核酸を回収したい場合は、遠心など他の手段であらかじめ細胞を濃縮する必要がある。本発明の方法において固相基材としてフィルターを用いる場合には、このような試料容量に関する制限はない。また不織布は単位面積当たり多数の細胞あるいは大容量の試料を処理できるので、容易に単位面積当たりの核酸固定量（核酸密度）を増加することができる。従って、不織布からなるフィルターは本発明の方法に最も好適に用いることができる。フィルターへの核酸固定量が多くなれば検出も容易になるので、核酸増幅反応による感染症診断のように高い感度が要求される場合、又は核酸増幅が好ましくないような検査において、試料の入手が比較的容易であり、かつ大量の試料をフィルターで処理する場合などには、本発明の方法は特に有用である。【００４８】
また、試料中の核酸が分解しない限り、任意の手段で保存された試料を用いて本発明の方法を行うことができる。例えば、細胞を含む試料としては、採取又は調製直後のものを用いてもよく、あるいは凍結保存した試料を用いてもよい。血液の場合、新鮮血又は凍結保存血のいずれを用いても核酸を捕捉及び検出できる。【００４９】
本発明のさらに別の態様によれば、不織布からなるフィルターに対して低濃度（０．１ｍＭ程度）塩化マグネシウムの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液をあらかじめ不織布に通水した後、水酸化ナトリウムで処理したタンパクを含む核酸試料を該不織布に通水させると、核酸の不織布に対する捕捉率が劇的に回復する。一方、同濃度の塩化マグネシウム水溶液をあらかじめ不織布に通水させても核酸の捕捉率は回復しない。つまり、これはマグネシウムが不織布に対して吸着するにはアルカリ条件が必要であることを示す。【００５０】
一般にＰＥＴ不織布は高ｐＨ条件下では加水分解を受けやすく、加水分解を受けたＰＥＴ表面にはカルボキシル基、水酸基などの存在割合が増している。２価金属イオンはＰＥＴ不織布上でこのようなキレート能を持った官能基に配位して不織布上に固定化されているものと推定され、従って、本発明の方法では、固相上に固定化された２価金属イオンが試料液相中の核酸を捕捉する主体的な役割を担っている。例えば、不織布からなるフィルターを０．１２５Ｎの水酸化ナトリウム溶液で加水分解した後、マグネシウム、亜鉛、マンガンなどの２価金属化合物水溶液に浸漬してこれらの２価金属イオンをフィルター上に固定化した不織布においてもｐＨ１２以上に調製したタンパク質を含む核酸試料を該不織布に通水させると、核酸の不織布に対する捕捉効率が劇的に向上する。さらに別の形態では、キレート能を有するカルボキシル基を多く持つＰｏｌｙ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄを不織布にコーティングし、２価金属イオンを含む水溶液を通水させることによっても２価金属イオンを固定化したフィルターを作製することができる。また該フィルターを２枚ないし４枚積層した多層化フィルターを調製することにより固相基材上に固定化される２価金属イオンの量が増大し、それに比例して核酸の捕捉効率を高めることができる。【００５１】
一方、２価金属イオンを固定化した不織布を用いても、アルカリ処理をしていない試料に対してはタンパク質共存下で核酸を効率的に不織布に捕捉することはできない。これは固相基材上に固定化された２価金属イオンが液相中の核酸と結合するためには核酸がアルカリ条件下で変性していることが必要であることを示している。これらのことから２価金属イオンと核酸とは高ｐＨ条件下で結合力が非常に高まることが示された。【００５２】
本発明の方法では２価金属イオンを固定化した不織布などの固相基材に対してｐＨを高めてアルカリ変性させた核酸を接触させることを特徴としており、この手段によりタンパク質を含む試料においても非常に高い捕捉率を実現することが可能となる。さらにアルカリ条件下で変性させた核酸を不織布に通水させ、不織布に捕捉した核酸についてLAMP増幅反応を行わせると、２価金属イオンを固定化させた不織布は、２価金属イオンを固定化させていない不織布に比較して、核酸の増幅反応時間が大幅に短縮されており、増幅の鋳型となる核酸が不織布上に効率的に捕捉されていることが示された。また核酸の捕捉後、フィルターを中性条件の緩衝液等で洗浄することにより、フィルター近傍のｐＨを下げて捕捉された核酸を各種の酵素反応に供することも可能である。【００５３】
また、不織布をはじめとする固相基材としてフィルター類を核酸の増幅反応溶液に浸漬して増幅反応を行わせた場合、核酸の増幅酵素等がフィルター上に吸着することによりある一定の割合で反応効率が低下する場合がある。あらかじめ核酸を捕捉したフィルターに酵素吸着抑制剤をコーティングすることにより、核酸増幅酵素等がフィルターに吸着することによって生ずる反応効率の低下を抑えることが可能である。酵素吸着抑制剤としてはウシ血清アルブミンなどが挙げられる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
例１：不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較（マグネシウム吸着条件）
不織布を直径５ｍｍの円盤状に切り抜き二個のイエローチップ（ＱＳＰ  Ｐｉｐｅｔ  Ｔｉｐ  Ｙｅｌｌｏｗ  １−２００μＬ）を切断し、その間に不織布を挟み込むことにより、不織布を先端に固定化したカラムを作製した。不織布としては旭化成株式会社の製品Ａ０４０Ｃ０１を使用した（以下、「不織布固定化カラム」という。）。カラムの構造を図１に示す。試料は淋菌由来精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）２０ｐｇを生理食塩水あるいは０．３％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ−Ａ２１５３）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。アルカリ処理は該試料に８Ｎ  ＮａＯＨを１５０μＬ添加し最終濃度を１Ｎとした。不織布固定化カラムに１０ｍＬのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。図２中、(3)及び(4)の実験については塩化マグネシウム（ＷＡＫＯ）０．１ｍＭの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液あるいは水溶液をそれぞれ１ｍＬずつ試料吸引する前に不織布固定化カラムに通水した。試料を吸引した後、さらにＴＢＳ  バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍＬを吸引して洗浄をおこなった。【００５５】
ＬＡＭＰ反応は次のように行った。ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、及び３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、及び３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列とを有するオリゴヌクレオチドである。これらのインナープライマー、アウタープライマー、及び、ループプライマーの設計方法は、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。核酸を増幅するＬＡＭＰ反応のターゲット配列として淋菌のＯＲＦ１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ８６１１３）遺伝子を選択し、ＬＡＭＰ反応の増幅オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。配列番号１のＦＩＰプライマー、配列番号２のＢＩＰプライマー、配列番号３のＦ３プライマー、配列番号４のＢ３プライマー、配列番号５のＦｌｏｏｐプライマー、配列番号６のＢｌｏｏｐプライマーをデザインして、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。【００５６】
ＬＡＭＰ増幅の反応液には、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーをそれぞれ２．５μＭ、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーをそれぞれ２０μＭ、ＦＬプライマーとＢＬプライマーをそれぞれ３０μＭ、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．８Ｍ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、６．４  ｕｎｉｔｓのＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含み、ＭｇＳＯ4濃度が８ｍＭになるように加えた。洗浄後の不織布固定化カラムを上記ＬＡＭＰ増幅の反応液５０μＬを入れた  Ｌｏｏｐａｍｐ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅ（栄研化学）に不織布部分が反応液に浸るようにセットした。不織布固定化カラムとＬＡＭＰ反応液が入ったＬｏｏｐａｍｐ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅをプチはち（トミー工業）にて５秒間、軽く遠心処理した後、ＬｏｏｐＡｍｐリアルタイム濁度計ＬＡ−２００（テラメックス）にセットして６４℃、１時間反応を行いながら濁度変化を測定した。ＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を縦軸として比較をおこなった。【００５７】
結果を図２に示す。ＢＳＡを含むサンプルでは不織布上の核酸における増幅時間が遅い、つまり核酸の捕捉率が低いことが分かる。一方、塩化マグネシウムのＮａＯＨ溶液を事前に吸引するとＢＳＡを含まないサンプルと同等に増幅時間が短く、核酸の捕捉率が高いことが示された。しかしこの効果は塩化マグネシウム水溶液では見られなかった。図２中、(1)ないし(4)は不織布に吸引した試料、１試料につきＮ＝３回ずつ吸引及び測定を行なった結果を示す。
(1)淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(2)淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(3)０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2／１Ｎ  ＮａＯＨを吸引後、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(4)０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2／生理食塩水を吸引後、淋菌精製ゲノムＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ【００５８】
例２：マグネシウム吸着不織布への核酸捕捉効率
０．１％Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ、以下ＰＬＧ）の水溶液に不織布（Ａ０４０Ｃ０１）を室温条件下で一晩浸漬した後、乾燥させてコーティングをおこなった。Ｃｙ３蛍光ラベル（Ｍｉｒｕｓ）したλＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）２０ｎｇ／μＬを４μＬ（８０ｎｇ）０．３％ＢＳＡ生理食塩水溶液１ｍＬに溶解した。アルカリ処理は該試料に８Ｎ ＮａＯＨを７５μＬ添加し最終０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液とした。ＤＮＡのラベル化はＭｉｒｕｓ  Ｌａｂｅｌ  ＩＴ  Ｃｙ３  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ添付プロトコルに沿っておこなった。不織布を固定化したカラムに１０ｍＬのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。実験は各サンプルにつき、２回ずつおこなった。図３中、(2)については０．１％ＰＬＧコートした不織布に試料吸引前にあらかじめ１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液１ｍＬを吸引しておいた。全サンプル吸引後、カラムを分解して不織布を取り出し蛍光測定用スライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）の裏面からメンディングテープを用いて貼り付けた。不織布を貼り付けたスライドガラスをマイクロアレイスキャナ（ＧＳＩ  ＬＵＭＯＮＩＣＳ  ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ）にセットし、蛍光イメージ及び蛍光強度の測定を行った。【００５９】
結果を図３に示す。不織布にＢＳＡを含む試料を直接通水したものは不織布上への核酸捕捉がほとんど観測されず、不織布上へのＤＮＡの捕捉効率が共存するタンパク質の影響により著しく低下していることが示された。一方、ＰＬＧコートした不織布にマグネシウムを吸着させたものについてはＢＳＡを含むサンプルにおいても不織布上に核酸が効率的に捕捉されていることが示された。図３中の数字は蛍光強度を示し、(1)及び(2)は不織布の種類を示し、１種類につき２スポット（Ｎ＝２）とした。【００６０】
例３：不織布上ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅反応時間の比較（ポリマーコート不織布と多層化フィルターの効果）
試料として淋菌由来精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）２０ｐｇを生理食塩水あるいは０．３％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ−Ａ２１５３）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させたものを用いた。ＰＬＧポリマーの不織布へのコーティングは例２と同様である。ＰＬＧコートした不織布を２枚又は４枚積層し、例１の図１のようにイエローチップに挟み込んで多層化フィルターを作製した。ポジティブコントロール以外の実験については例２と同様に試料吸引前にあらかじめ１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液１ｍＬを吸引しておいた。不織布固定化カラムに１０ｍＬのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応の濁度測定は全て例１と同様である。【００６１】
結果を図４に示す。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間である。マグネシウム溶液を接触させた不織布同士ではＰＬＧコートしたものの方が核酸の捕捉効率が高まっており、マグネシウムの吸着にカルボキシル基が有用であることが示唆された。またフィルターを多層化することにより核酸の捕捉率は高まることが判明した。図４中、(1)ないし(5)についてＮ＝３回ずつ吸引及び測定を行なった。
(1)不織布（１枚・未処理）、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ[ポジティブコントロール]
(2)不織布（１枚・未処理）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液を吸引後、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(3)不織布（１枚・０．１％Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄコート）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液を吸引後、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ
(4)不織布（２枚・０．１％Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄコート）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液を吸引後、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(5)不織布（４枚・０．１％Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄコート）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液を吸引後、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ【００６２】
例４：マグネシウム吸着不織布上の核酸増幅効率（試料のアルカリ処理有無の影響）
試料として、淋菌由来精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）２０ｐｇを０．３％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ−Ａ２１５３）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解したものを用いた。アルカリ処理を行う場合には該試料に８Ｎ  ＮａＯＨを１５０μＬ添加し最終濃度を１Ｎとした。例２と同様にＰＬＧコートした不織布に対して試料吸引前にあらかじめ１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液１ｍＬを吸引しておいた。不織布固定化カラムに１０ｍＬのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応の濁度測定は全て例１と同様である。【００６３】
結果を図５に示す。縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間である。マグネシウムを吸着させたＰＬＧコート不織布において、タンパクを含む試料から核酸を捕捉するためには試料をアルカリ処理することが必要であることが示された。図５中、左の白いカラムは生理食塩水、右の着色カラムは１Ｎ  ＮａＯＨの結果を示す。１条件につきＮ＝３回ずつ吸引及び測定を行なった。【００６４】
例５：タンパク含有試料における不織布の核酸捕捉効率
不織布を直径５ｍｍの円盤状に切り抜き二個のイエローチップ（ＱＳＰ  Ｐｉｐｅｔ  Ｔｉｐ  Ｙｅｌｌｏｗ  １−２００μＬ）を切断し、その間に不織布を挟み込むことにより、不織布を先端に固定化したカラムを作製した。不織布としては旭化成株式会社の製品Ａ０４０Ｃ０１を使用した（以下、「不織布固定化カラム」という。）。カラムの構造を図１に示す。Ｃｙ３蛍光ラベル（Ｍｉｒｕｓ）したλＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）１０ｎｇ／μＬを４μＬ（４０ｎｇ）を生理食塩水又は０．３％ＢＳＡ生理食塩水溶液１ｍＬに溶解した。ネガティブコントロールの際は純水を４μＬ添加した。ＤＮＡのラベル化はＭｉｒｕｓ  Ｌａｂｅｌ  ＩＴ  Ｃｙ３  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ添付プロトコルに従っておこなった。不織布を固定化したカラムに１０ｍＬのテルモシリンジを接続して各試料を全量吸引した。実験は各試料につき２回ずつおこなった。吸引後、カラムを分解して不織布を取り出し蛍光測定用スライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）の裏面からメンディングテープを用いて貼り付けた。不織布を貼り付けたスライドガラスをマイクロアレイスキャナ（ＧＳＩ  ＬＵＭＯＮＩＣＳ  ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ）にセットし、蛍光イメージ及び蛍光強度の測定を行った【００６５】
結果を図６に示す。０．３％のウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ−Ａ２１５３）以下ＢＳＡ、を含む試料では含まない試料に比べて極端に蛍光強度が低下していた。つまり不織布上へのＤＮＡの捕捉効率が共存するタンパク質の影響により著しく低下していることが示された。図中、
(1)λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水
(2)生理食塩水[ネガティブコントロール]
(3)λＤＮＡ／生理食塩水[ポジティブコントロール]
を示す。【００６６】
例６：マグネシウム／ＮａＯＨ処理試料における不織布の核酸捕捉効率
例１で使用したＣｙ３蛍光ラベル化λＤＮＡ１０ｎｇ／μＬを４μＬを生理食塩水あるいは０．３％ＢＳＡ生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。マグネシウムを添加する場合は該試料１ｍＬに対し１００ｍＭ塩化マグネシウム（ＷＡＫＯ）を１μＬ添加し、最終濃度を０．１ｍＭとした。その後、該試料に８Ｎ ＮａＯＨを７５μＬ添加し最終０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液とした。不織布固定化カラムで各試料を例１と同様に吸引し、スライドガラスに不織布を貼付した後、例１と同様に蛍光イメージを測定した。実験は各試料につき２回ずつおこなった。【００６７】
結果を図７に示す。ＮａＯＨ処理した溶液においても０．３％ＢＳＡを含む試料では不織布上へのＤＮＡの捕捉率が低下していた。しかしＢＳＡを含む試料でも０．１ｍＭの塩化マグネシウムを添加した試料についてはＢＳＡを含まないものと同等の捕捉率が観測された。図中、
(1)λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ＋０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2／生理食塩水／０．５Ｎ  ＮａＯＨ
(2)λＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／０．５Ｎ  ＮａＯＨ
(3)生理食塩水／０．５Ｎ  ＮａＯＨ[ネガティブコントロール]
(4)λＤＮＡ／生理食塩水／０．５Ｎ  ＮａＯＨ[ポジティブコントロール]
を示す。【００６８】
例７：マグネシウム／ＮａＯＨ処理試料における不織布上の捕捉核酸の増幅効率
淋菌由来精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）２０ｐｇを生理食塩水あるいは０．３％ＢＳＡ生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。マグネシウムを添加する場合は該試料１ｍＬに対し、１００ｍＭ塩化マグネシウムを１μＬ添加し最終濃度０．１ｍＭとした。アルカリ処理は該試料に８Ｎ  ＮａＯＨを１５０μＬ添加し最終濃度を１Ｎとした。これらＤＮＡを含む試料全量を不織布固定化カラムで吸引し、さらにＴＢＳ  バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍＬを吸引して洗浄をおこなった。【００６９】
ＬＡＭＰ反応は次のように行った。ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、及び３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、及び３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列とを有するオリゴヌクレオチドである。これらのインナープライマー、アウタープライマー、及び、ループプライマーの設計方法は、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。核酸を増幅するＬＡＭＰ反応のターゲット配列として淋菌のＯＲＦ１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ８６１１３）遺伝子を選択し、ＬＡＭＰ反応の増幅オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。配列番号１のＦＩＰプライマー、配列番号２のＢＩＰプライマー、配列番号３のＦ３プライマー、配列番号４のＢ３プライマー、配列番号５のＦｌｏｏｐプライマー、配列番号６のＢｌｏｏｐプライマーをデザインして、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。【００７０】
ＬＡＭＰ増幅の反応液には、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーをそれぞれ２．５μＭ、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーをそれぞれ２０μＭ、ＦＬプライマーとＢＬプライマーをそれぞれ３０μＭ、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．８Ｍ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、６．４  ｕｎｉｔｓのＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含み、ＭｇＳＯ4濃度が８ｍＭになるように加えた。洗浄後の不織布固定化カラムを上記ＬＡＭＰ増幅の反応液５０μＬを入れた  Ｌｏｏｐａｍｐ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅ（栄研化学）に不織布部分が反応液に浸るようにセットした。不織布固定化カラムとＬＡＭＰ反応液が入ったＬｏｏｐａｍｐ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅをプチはち（トミー工業）にて５秒間、軽く遠心処理した後、ＬｏｏｐＡｍｐリアルタイム濁度計ＬＡ−２００（テラメックス）にセットして６４℃、１時間反応を行いながら濁度変化を測定した。ＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間を縦軸として比較をおこなった。【００７１】
結果を図８に示す。ＢＳＡを含む試料では不織布上の核酸における増幅時間が遅い、つまり核酸の捕捉率が低いが、マグネシウムを添加した系ではＢＳＡを含まない試料と同等に増幅時間が短く、核酸の捕捉率が高いことが示された。図中、１試料につきＮ＝３回ずつ吸引及び測定を行なった結果を示し、
(1)淋菌精製ゲノムＤＮＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(2)淋菌精製ゲノムＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
(3)淋菌精製ゲノムＤＮＡ＋０．３％ＢＳＡ＋０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2／生理食塩水／１Ｎ  ＮａＯＨ
を示す。【００７２】
例８：不織布上の捕捉核酸の増幅効率におけるマグネシウム濃度の影響
淋菌精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）２０ｐｇを０．３％ＢＳＡ生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。該試料に１Ｍ  ＭｇＣｌ2を１０μＬ（最終濃度約１０ｍＭ）、５μＬ（同５ｍＭ）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2を１０μＬ（同１ｍＭ）、５μＬ（同０．５ｍＭ）、１μＬ（同０．１ｍＭ）と添加した。アルカリ処理は該試料に８Ｎ  ＮａＯＨを１５０μＬ添加し最終濃度を１Ｎとした。これらＤＮＡを含む試料全量を不織布固定化カラムで吸引し、さらにＴＢＳ  バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍＬを吸引して洗浄をおこなった。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応の濁度測定は全て例７と同様である。結果を図９に示す。１ｍＭまでの濃度のマグネシウムの添加ではＢＳＡ共存下でも核酸の高い捕捉率が達成されていることが示された。【００７３】
例９：不織布上の捕捉核酸の増幅効率におけるｐＨの影響
淋菌精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）２０ｐｇを０．６％ＢＳＡ生理食塩水５００μＬに溶解させた。次に各１Ｍのバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．０、８．０、９．０、炭酸バッファー  ｐＨ１０．０、１１．０）あるいは１Ｎ  ＮａＯＨを加えて１ｍＬ試料とした。これらＤＮＡを含む試料全量を不織布固定化カラムで吸引し、さらにＴＢＳバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍＬを吸引して洗浄をおこなった。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応の濁度測定は全て例７と同様である。結果を図１０に示す。図中の結果は１試料についてＮ＝３回ずつ吸引及び測定を行なった結果を示し、縦軸はＬＡＭＰ増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（６５０nmにおける吸光度）が０．１になるまでの時間である。ｐＨ１４付近、つまり強アルカリ処理の試料においてマグネシウムの添加効果ははっきりと示された。【００７４】
例１０：アルカリゲル電気泳動でのマグネシウム添加効果
アガロース（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｕｒｅ）を０．０５Ｎ  ＮａＯＨに溶解させて０．５％アガロースゲルを調製した。λＤＮＡ１００ｎｇ/μＬを３μＬ（３００ｎｇ）、これにＢＳＡを添加する場合は１％ＢＳＡを３μＬ、ＭｇＣｌ2を添加する場合は１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を１μＬ、最後に全ての試料に対して０．５Ｎ  ＮａＯＨを１μＬ加えて各々全量１０μＬに純水でメスアップした。試料１０μＬあたり２μＬの４×ローディングバッファー（５２％シュークロース、０．１％ブロモクレゾールグリーン、０．１６８％キシレンシアノール、２００ｍＭ  ＮａＯＨ）を加えて全量を各レーンにアプライした。泳動バッファーとして０．０５Ｎ  ＮａＯＨ液にゲルを浸漬して電気泳動を５０Ｖ、３時間おこなった後、中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に３０分浸漬して中和した。中和バッファーに溶解させたエチジウムブロマイドで３０分染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ２０００ｉ/ＶＧＡで撮影した。結果を図１１に示す。核酸とマグネシウムイオンが共存した試料についてＥＤＴＡを加えた時を除いて、泳動度が極端に低下していた。このことからアルカリ条件下、核酸とマグネシウムが共存することにより核酸の会合が生じて核酸のみかけサイズが増大していること、及びＥＤＴＡの存在下においては会合が生じないことが示された。【００７５】
例１１：アルカリゲル電気泳動でのマグネシウム添加濃度の影響
使用したアガロースゲル及び泳動バッファーは例１０と同じである。λＤＮＡ１００ｎｇ/μＬを３μＬ（３００ｎｇ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2水溶液を各々１、２、３、４、５μＬ添加して各々全量１０μＬに純水でメスアップした。試料１０μＬあたり２μＬの４×ローディングバッファー（５２％シュークロース、０．１％ブロモクレゾールグリーン、０．１６８％キシレンシアノール、２００ｍＭ  ＮａＯＨ）を加えて全量を各レーンにアプライした。泳動バッファーとして０．０５Ｎ  ＮａＯＨ液にゲルを浸漬して電気泳動を５０Ｖ、３時間おこなった後、中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に３０分浸漬して中和した。中和バッファーに溶解させたエチジウムブロマイドで３０分染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ２０００ｉ/ＶＧＡで撮影した。結果を図１２に示す。共存するマグネシウムイオンの濃度が上昇するのに伴って泳動可能な大きさの核酸が減少し、泳動度が低い大きな核酸成分が増大していることが示された。【００７６】
例１２：ｐＨ８条件におけるゲル泳動でのマグネシウム添加効果
アガロース（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｕｒｅ）を４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸バッファーに溶解させて０．５％アガロースゲルを調製した。λＤＮＡ１００ｎｇ/μＬを３μＬ（３００ｎｇ）、これにＢＳＡを添加する場合は１％ＢＳＡを３μＬ、ＭｇＣｌ2を添加する場合は１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を１μＬ加えて、各々全量１０μＬに純水でメスアップした。試料１０μＬあたり２μＬの４×ローディングバッファー（５２％シュークロース、０．１％ブロモクレゾールグリーン、０．１６８％キシレンシアノール）を加えて全量を各レーンにアプライした。４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸バッファーにゲルを浸漬して電気泳動を５０Ｖ、３０分おこなった後、エチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ２０００ｉ/ＶＧＡで撮影した。結果を図１３に示す。核酸とマグネシウムイオンの相互作用による泳動度低下は中性条件では観察されず、アルカリ条件下に特有の現象であることが示された。【００７７】
例１３：不織布上の捕捉核酸の増幅効率における各種２価金属イオン固定化不織布の比較
３×３ｃｍシート状にカットした不織布を０．２５Ｎ ＮａＯＨとアセトニトリルの１：１混合液からなる加水分解処理液５ｍLに浸漬し、６０℃で１時間、揺らしながらインキュベートした。その後、純水に浸漬して１０分間揺らしながらの洗浄を２回繰り返した。１０ｍＭの２価金属塩化物（塩化亜鉛、塩化マグネシウム、塩化マンガン）の水溶液に加水分解処理した不織布を浸漬し、室温で一晩放置した後、純水に浸漬して１０分間揺らしながらの洗浄を２回繰り返し、その後、室温で一晩乾燥させて各種２価金属イオンを固定化した不織布を作製した。試料はＢＣＧ菌由来の精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇを生理食塩水又は０．３％のヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡ）（ＳＩＧＭＡ）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。該サンプルに８Ｎ  ＮａＯＨを３０μＬ添加し最終濃度を０．２Ｎとした。これらＤＮＡを含む試料全量を各種不織布で吸引した後、ＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬを吸引して洗浄をおこなった。洗浄後の不織布固定化カラムのＬＡＭＰ増幅についてプライマーセット以外はＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応は例７と同様である。プライマーセットについては核酸を増幅するＬＡＭＰ反応のターゲット配列として結核菌群の１６Ｓ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００９６２、Ｘ５８８９０、Ｘ５５５８８、ＡＦ４８０６０５）遺伝子を選択し、ＬＡＭＰ反応の増幅オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。配列番号７のＦＩＰプライマー、配列番号８のＢＩＰプライマー、配列番号９のＦ３プライマー、配列番号１０のＢ３プライマー、配列番号１１のＦｌｏｏｐプライマー、配列番号１２のＢｌｏｏｐプライマーをデザインして、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。
結果を図１４に示す。マグネシウムを固定化した不織布以外にも亜鉛、マンガンを固定化した不織布においてもタンパク含有試料中の核酸の捕捉率が高いことが示された。図中(1)ないし(5)は使用した不織布に固定化した金属イオン種、吸引したＳａｍｐｌｅの順に示し、各試料についてＮ＝３回ずつ吸引及び測定を行なった結果を示す。
(1)未固定化、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ[試料−１]
(2)未固定化、淋菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＨＳＡ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ[試料−２]
(3)亜鉛、試料−２
(4)マグネシウム、試料−２
(5)マンガン、試料−２
を示す。【００７８】
例１４：不織布上に捕捉した核酸のＰＣＲ増幅反応
試料はＢＣＧ菌由来の精製ゲノムＤＮＡ２００ｐｇを生理食塩水又は０．３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。該サンプルに８Ｎ  ＮａＯＨを３０μＬ添加し最終濃度を０．２Ｎとした。これらＤＮＡを含む試料全量を未処理あるいはマグネシウムイオンを固定化した不織布で吸引した後、ＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬを吸引して洗浄をおこなった。マグネシウムを固定化した不織布の作製法は例１３と同様である。ＰＣＲのプライマーについては結核菌群の１６Ｓ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ遺伝子の配列を選択し、増幅産物のサイズが１ｋｂｐとなるようにデザインした配列番号１３、１４を、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。洗浄後の不織布固定化カラムを０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、上記プライマー各０．５μＭ、３％  Ｔｗｅｅｎ２０及びＥｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ (ＴＡＫＡＲＡ)キットより付属のＢｕｆｆｅｒ、Ｅｘ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．２５ｕｎｉｔｓからなる５０μＬのＰＣＲ反応液に浸漬した。これをＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ)で９５℃  ５分、１Ｃｙｃｌｅ：９５℃  ２０秒、５５℃  ２０秒、７２℃  ２０秒、３０Ｃｙｃｌｅ；７２℃  ７分  反応させた。それぞれのＰＣＲ反応終了後、各反応液９μＬに１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１μＬ加えて混和し、全量を１％のアガロースで電気泳動にかけた。電気泳動を１００Ｖ、３０分おこなった後、エチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ２０００ｉ/ＶＧＡで撮影した。【００７９】
結果を図１５に示す。ＨＳＡを含んだ試料を吸引した不織布の中でマグネシウムを固定化した不織布ではＰＣＲの増幅産物のバンドが確認できたが、マグネシウムを固定化していない不織布では増幅産物が確認できず、鋳型となる試料中の核酸が不織布に捕捉されなかったことが示唆された。以上からマグネシウムを固定化した不織布により、タンパク含有試料中の核酸が捕捉可能で、かつ該不織布上に捕捉された核酸がＰＣＲ増幅反応にも適用可能であることが示された。【００８０】
例１５：ＥＤＴＡ及び２価金属イオン共存試料における不織布上捕捉核酸の増幅効率
試料はＢＣＧ菌由来の精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇを生理食塩水又は０．３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。該サンプルにＥＤＴＡを加える場合は１ｍＭ、塩化ストロンチウムを加える場合は１０ｍＭ、塩化マグネシウムを加える場合は０．１ｍＭを添加し、各サンプルにそれぞれ８Ｎ  ＮａＯＨを３０μＬ添加し最終濃度を０．２Ｎとした。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応は例１３と同様である。【００８１】
結果を図１６に示す。ＥＤＴＡによるマグネシウムと核酸との会合体形成の阻害がストロンチウムの添加により抑制され、ＥＤＴＡのようなキレート成分の存在下でもタンパク含有試料中の核酸の捕捉が可能であることが示された。図中(1)ないし(5)は不織布に吸引した試料を示し、縦軸は濁度０．１となるまでの経過時間を示す。
各試料につきＮ＝３回ずつ吸引、測定した。
(1)ＢＣＧ菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ[ポジティブコントロール、試料−１]
(2)ＢＣＧ菌精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇ＋０．３％ＨＳＡ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ（試料−２）
(3)試料−２＋０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2
(4)試料−２＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2
(5)試料−２＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋１０ｍＭ  ＳｒＣｌ2＋０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2
を示す。【００８２】
例１６：尿試料における不織布上捕捉核酸の増幅効率
淋菌（ＡＴＣＣ７００８２５）をチョコレート寒天培地上で２日間培養し、回収した菌の縣濁液を生理食塩水により１００万倍に希釈した。希釈した菌液１０μＬを生理食塩水あるいは健常人の尿５００μＬにそれぞれ添加した。該サンプルに８Ｎ  ＮａＯＨを７５μＬ添加し最終濃度を１Ｎとした。例２と同様に未処理の不織布及びＰＬＧをコーティングした不織布にマグネシウムを通水したマグネシウム固定化不織布の２種類を用意して、該尿試料をそれぞれの不織布で全量吸引した後、ＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬを吸引して洗浄した。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応は例７と同様である。
結果を図１７に示す。ＰＬＧをコーティングした不織布にマグネシウムを固定化したカラムの方が明らかに未処理の不織布カラムに比べて不織布上捕捉核酸の増幅時間が短く、尿試料中の核酸の捕捉効率が高いことが示された。【００８３】
例１７：ＢＳＡ含有洗浄液を使用した不織布上の捕捉核酸の増幅効率
試料はＢＣＧ菌由来の精製ゲノムＤＮＡ２０ｐｇを０．３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ）生理食塩水溶液１ｍＬに溶解させた。該サンプルに８Ｎ  ＮａＯＨを３０μＬ添加し最終濃度を０．２Ｎとした。例１３と同様にマグネシウムを固定化した不織布を作製し、上記試料の全量を吸引した後、０％、０．３％、１％のＢＳＡのＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ溶液１ｍＬを吸引して洗浄した。洗浄後の不織布固定化カラムを例１３と同様にＬＡＭＰ増幅反応にかけた。
結果を図１８に示す。洗浄液にＢＳＡが含まれているほどＬＡＭＰ増幅反応時間が短縮されることから、核酸を捕捉した不織布をＢＳＡでコーティングすることにより核酸の増幅反応が早まることが示された。【００８４】
例２０：金属イオン親和性高分子を添加した試料における不織布上の核酸増幅効率
試料は淋菌由来の精製ゲノムＤＮＡ１００ｐｇを生理食塩水あるいは７％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ）生理食塩水溶液２５０μＬに溶解させた。該サンプルに塩化マグネシウムを添加する場合は０．５ｍＭ加えた。該サンプルに金属イオン親和性高分子を加える場合は分子量８０００のポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）（ＳＩＧＭＡ）２０％水溶液を該サンプルに５０μＬ添加した。各サンプルにそれぞれ８Ｎ  ＮａＯＨを７．５μＬ添加し最終濃度を０．２Ｎとした。不織布固定化カラムで上記試料の全量を吸引した後、ＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬで洗浄した。ＬＡＭＰ増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応は例７と同様である。
結果を図１９に示す。７％という高濃度のタンパク中ではマグネシウムを添加するだけでは核酸の捕捉率は高くはなく、ＬＡＭＰ増幅反応時間が長い。マグネシウムと金属イオン親和性高分子を共存させることにより、ＬＡＭＰ増幅反応時間が短くなり、核酸の捕捉率が高まることが示唆された。以上から金属イオン親和性高分子はマグネシウムと核酸との会合体形成作用を促進することが示された。
図中(1)ないし(4)は吸引した試料を示し、各試料につきＮ＝３回ずつ吸引、測定した。
(1)淋菌精製ゲノムＤＮＡ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ（ポジティブコントロール、試料−１）
(2)淋菌精製ゲノムＤＮＡ＋７％ＨＳＡ／生理食塩水／０．２Ｎ  ＮａＯＨ（試料−２）
(3)試料−２＋０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2
(4)試料−２＋３．３％  ＰＥＧ（８Ｋ）＋０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の方法によれば、核酸を含む試料から従来の方法よりも簡便かつ高収率に核酸を捕捉して回収することができる。また、本発明の方法は、従来の核酸増幅技術に使用可能な迅速かつ簡便な核酸調製法として利用できる。
【図１】
0004084828.tif 000002
【図２】
0004084828.tif 000003
【図３】
0004084828.tif 000004
【図４】
0004084828.tif 000005
【図５】
0004084828.tif 000006
【図６】
0004084828.tif 000007
【図７】
0004084828.tif 000008
【図８】
0004084828.tif 000009
【図９】
0004084828.tif 000010
【図１０】
0004084828.tif 000011
【図１１】
0004084828.tif 000012
【図１２】
0004084828.tif 000013
【図１３】
0004084828.tif 000014
【図１４】
0004084828.tif 000015
【図１５】
0004084828.tif 000016
【図１６】
0004084828.tif 000017
【図１７】
0004084828.tif 000018
【図１８】
0004084828.tif 000019
【図１９】
0004084828.tif 000020
【配列表】
0004084828000001.app