(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層して、前記基板の表面を予めプラスに帯電させた状態で、この基板上に血液を展開し、マイナスに帯電している血液中の赤血球を前記基板の表面にイオン結合させることによって、血液中から赤血球を分離除去し、分離除去された血液を光学的に分析する血液の分析方法。
【請求項２】
血液の流路を形成した基板上に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層し、さらに前記流路を形成した基板の表面をカバーする基板を設け、前記流路を血液が流れるにしたがって、前記流路の上流側で赤血球をイオン結合させ、下流側で赤血球が分離除去された血液を収集し、血液の分析を行うようにした血液の分析方法。
【請求項３】
棒状の毛細管の内壁に、陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層して、前記内壁の表面を予めプラスに帯電させた状態で、血液を毛細管内で移動させることにより、マイナスに帯電した赤血球を毛細管流の上流側でイオン結合させ、下流側で赤血球が分離除去された血液を得、血液の分析を行うようにした血液の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血液から赤血球を簡便、迅速に分離除去する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液成分を分光学的に分析するためには、妨害物質となる血液中の赤血球を除去した血漿あるいは血清を用いなければならない。従来、赤血球を分離除去するために、遠心分離法を利用して赤血球を沈降させ、上清の血漿あるいは血清を分取することが行われてきた。
【０００３】
しかし近年では、メンブレンフィルタによって赤血球を濾過することで、遠心分離器を用いることのない、簡便で小型の分析装置が普及するようになった。これは例えば血糖値の自己管理測定装置として、糖尿病患者の間に普及しており、採取した血液をメンブレンフィルタに添加して赤血球を濾過し、試薬との呈色反応を分光学的に分析するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらメンブレンフィルタを用いた赤血球の分離除去方法では、物理的に赤血球を除去するためフィルターの目詰まりが生じる。このため血液を濾過するときに血液の浸透速度が徐々に遅くなり、分析に時間がかかる問題がある。またメンブレンフィルタは吸水性あるいは保水性があるために、必要以上に多量の血液を採取しなければならないという問題もある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明は、基板の表面に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層した層を形成することにより、基板の表面を陰イオン交換物質によりプラスに帯電させておき、その表面に血液を展開して、マイナスに帯電している赤血球を陰イオン交換物質にイオン結合させることで、血液から赤血球を分離除去したことを特徴とするものである。
【０００６】
これによれば、化学的に赤血球を分離除去するため、目詰まりの問題は生じない。また基板へは、血液が浸透することはなく、またイオン交換物質層の保水能もメンブレンフィルタと比較にならないほど極めて小さいため、メンブレンフィルタに比べ採取する血液の量も少なくてすむ。そして分析は、赤血球が陰イオン交換物質に結合した後の血液を用いて行うが、この表面の血液を試薬領域まで導いて反応させて行うことができる。
【０００７】
ここで血液が流れやすくなるように流路を形成した基板の表面や毛細管の内壁に、陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層しておけば、血液が流れるに応じて、流れの上流側で赤血球がイオン結合するため、下流側では赤血球を分離除去することができる。この下流側に予め試薬領域を形成しておけば分析を行うことができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の請求項１に記載された発明の一実施の形態について、図１、図２を用いて説明する。
【０００９】
図１は本発明の分離除去方法の動作原理を示す概念図であり、基板となるガラス基板４には、陽イオン交換物質３と陰イオン交換物質２を交互に積層した状態を模式的に表している。ガラス基板４の表面は、予めシラン及び塩酸処理によりプラスに、陽イオン交換物質３の表面はマイナスに、陰イオン交換物質の表面はプラスに、それぞれ帯電している。そして１はガラス基板４の表面に滴下された血液の赤血球を示しており、その表面はマイナスに帯電している。
【００１０】
ここでガラス基板４の表面にプラスイオンが露出するよう化学修飾処理する方法について具体的に説明する。まずガラス基板を５パーセントの３−アミノプロピルトリエトキシルシランに浸漬した後、１規定の塩酸に浸漬することで、基板表面をプラスに帯電させる。
【００１１】
次にポリスチレンスルホン酸（以下、ＰＳＳと略す）の３ｍｇ／ｍｌ溶液中に、プラスに帯電した先のガラス基板を浸漬することで、陽イオン交換物質３であるＰＳＳの層がイオン結合により形成され、その表面はマイナスに帯電する。
【００１２】
そして最後にポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略す）の１．５ｍｇ／ｍｌ溶液中に先のガラス基板を浸漬することで、その表面に陰イオン交換物質２であるＰＥＩの層が陽イオン交換物質３の表面にイオン結合される。これにより結果的に外表面に陽イオンが露出するように、すなわち基板の外表面がプラスに帯電するように化学修飾することができる。
【００１３】
このように陽イオン交換物質および陰イオン交換物質を交互に積層して形成する理由は、基板表面を安定かつ均一にプラスに帯電することが可能となるためである。これに比べ、単にシラン処理後、塩酸に浸漬してガラス基板の表面をプラスに帯電させたり、ガラス基板に陰イオン交換物質のみを形成したものは、表面を安定かつ均一にプラスに帯電した状態を保持することができないのである。
【００１４】
ここで図１のガラス基板を用い、生理食塩液により希釈した血液中に浸漬した場合の赤血球結合能を図２に示す。図２は、１ｃｍ2当たりの赤血球の結合数を測定したものであり、顕微鏡下にてその数を計測した。比較例として、無修飾のガラス基板を比較例１、上記のシラン処理まで施したガラス基板を比較例２、さらに塩酸処理まで施したガラス基板を比較例３、ＰＳＳ処理まで施したガラス基板を比較例４として示した。
【００１５】
血液を生理食塩液により希釈して赤血球数が１ｍｌ当たり３×１０7個になるように調製した液３ｍｌ中にそれぞれ修飾したガラス基板を浸漬して、その赤血球結合数を測定した。
【００１６】
本実施の形態のガラス基板の場合、赤血球は基板１ｃｍ2当たりおよそ５０００個結合するのに対し、比較例１及び４においてはその１０分の１以下の結合能しかない。これはガラス基板への赤血球の物理的吸着のみの効果であり、安定性及び再現性に乏しい。また比較例２及び３において比較例１及び４と比べ若干の結合能を示しているが、これはシラン化合物のアミノ基に由来し、イオン解離の状態に左右されるため、これも安定性及び再現性に乏しい。
【００１７】
また本実施の形態で示したＰＥＩ層に再びＰＳＳ層を形成すると赤血球結合能は１０分の１以下にまで低下する。そしてこのＰＳＳ層に再度ＰＥＩ層を形成すると赤血球結合能は元に回復する。すなわちＰＥＩのプラスの電荷が、赤血球結合に決定的な役割を果たしているのである。
【００１８】
上記のように本実施の形態で示すガラス基板では、ガラス基板の表面に赤血球をイオン結合により吸着させれば、血液の上層は赤血球の分離除去された血液となるので、この状態で分光学的に分析を行うことができる。
【００１９】
（実施の形態２）
図３には、基板上に血液を移動させるための流路を形成することにより、赤血球が分離除去された血液を容易に分析できるようにした一実施の形態を示している。
【００２０】
図３の分析装置において、シリコン基板１０の表面には、半導体加工技術により毛細管状の流路１２と、分析に必要な血液を受け入れる検体導入口１１と、赤血球が分離除去された血液を保持する検体反応部１３を形成している。この献体導入口１１と検体反応部１３とは、流路１２の溝によりつながっている。
【００２１】
この検体反応部１３に酵素及び酵素反応検出試薬を点着しておく。例えば、この検体反応部にグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びＯ−ジアニシジンなどを点着しておけば、血液中のグルコースが分光学的に検出可能となる。
【００２２】
そして流路１２には上述の実施の形態１で説明したようにイオン交換物質を作成しておく。そして、これらシリコン基板１０の表面をカバーするためのガラス基板９を、陽極接合法等の方法によりシリコン基板１０の面と接着し蓋をする。なおガラス基板９には、検体導入口１１と検体反応部１３の部分を開口しておく。このような方法によれば、血液が流路１２を流れることに応じて赤血球の分離除去が容易に行え、分離された血漿や血清試料が検体反応部１３に収集されて同時に分析を行えるという利便性がある。
【００２３】
（実施の形態３）
図４は、内径５０μｍ、長さ７０ｍｍのガラス管５の内側を上述の実施の形態１のようにして化学修飾し、血液を展開したときの分離除去状態を示したものである。図において、８は滴下した血液であり、この血液８にガラス管５の下端をつけると、血液は毛細管現象によりガラス管５内を上昇していき、５０ｍｍ展開した時点で、赤血球と血漿や血清との分離を開始する。
【００２４】
７はイオン結合によりガラス管の内壁に吸着した赤血球を示しており、６は分離除去された血液を示している。この６の部分の血液を用いることで、分光分析などを行うことができる。またこの６で示す領域に反応試薬などを塗布しておけば、この領域における発色反応を容易に測定することができ便利である。
【００２５】
なお、以上の実施の形態１〜３の説明では陽イオン交換物質としてＰＳＳを用いた例で説明したが、その他、ＰＳＳの塩、ポリアニリンプロパンスルホン酸及びその塩、ポリアスパラギン酸及びその塩、ポリグルタミン酸及びその塩も同様に使用可能である。陰イオン交換物質としてＰＥＩを用いた例で説明したが、その他、ポリアリルアミン及びその塩酸塩、ポリ塩化ジメチルジアリルアンモニウム、ポリリシン及びその塩、ポリアルギニン及びその塩についても同様に実施可能である。
【００２６】
また、各イオン交換物質の濃度、積層回数、積層する基板は実施の一例であり、その濃度、積層回数及び基板を限定するものでなく、その目的に応じて改変可能である。例えば、陽イオン交換物質と陰イオン交換物質の間に酵素あるいは抗体などをサンドイッチ状に挿入させ（例えば、Biotechnology and Bioengineering vol.51 P163〜167 1996年）、血液が流路を移動している途中で酵素あるいは抗体反応をさせたり、血液中の赤血球以外の不純物を除去することも可能である。例えば、アスコルビン酸オキシダーゼあるいはビリルビンオキシダーゼを挿入させることにより血液中に混在するアスコルビン酸及びビリルビンの除去が可能となる。
【００２７】
また上記実施の形態では基板としてガラスあるいはシリコンを用いた例で説明したが、プラスチック樹脂も基板として利用可能である。
【００２８】
【発明の効果】
以上のように本発明は、基板の表面に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層して、その表面をプラスに帯電させておくことで、マイナスに帯電した赤血球を分離除去するようにしたものである。これによれば、メンブレンフィルタの目詰まりの問題や血液の量の問題はなく、イオン結合により赤血球を即座に基板の表面に吸着させて迅速に分離除去することができる。
【００２９】
またこのように陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層しておけば、安定かつ均一にその性能を維持することができ、また毛細管現象などを利用して血液を移動させるようにすれば、自動的に赤血球を分離除去して分析できるという利便性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態における赤血球の分離除去方法を示す模式図
【図２】本発明の一実施の形態におけるイオン交換物質の修飾処理を施したガラス基板の赤血球結合数を測定したグラフ
【図３】本発明の実施の形態に基づき作製可能な血液分析装置の一例を示す模式図
【図４】本発明の実施の形態における毛細管現象を利用した赤血球の分離除去方法を示す模式図
【符号の説明】
１  赤血球
２  陰イオン交換物質
３  陽イオン交換物質
４  ガラス基板
５  ガラス毛細管
６  血液の展開により分離した血漿あるいは血清
７  ガラス管内側表面に結合した赤血球
８  展開用血液検体
９  ガラス基板
１０  シリコン基板
１１  検体導入口
１２  流路
１３  検体反応部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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