(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性状を有するブタ内在性レトロウィルス非感染性ブタ細胞。
(1)N型糖鎖を有さないブタ細胞、
(2)N型糖鎖を有する場合でも、当該N型糖鎖がマンノース分子を有さないブタ細胞、
(3)N型糖鎖を有する場合でも、N型糖鎖分子内の複合型糖鎖の構成比率が、通常のブタ細胞のN型糖鎖分子内の複合型糖鎖の構成比率に比べて５倍以上であるブタ細胞、または
(4)N型糖鎖のマンノース分子にレクチンが結合したブタ細胞。
【請求項２】
ブタ細胞を、
(1)N型糖鎖合成阻害剤で処理；
(2)β-Mannosidaseで処理；
(3)α-Glucosidase I、α-Glucosidase II、α-Mannosidase I、N-Acetylglucosaminyltransferase I 及び α-Mannosidase
II で順次処理；または
(4)レクチンで処理；
することからなる請求項１記載のブタ内在性レトロウィルス非感染性ブタ細胞の調製方法。
【請求項３】
α-Mannosidase I、N-Acetylglucosaminyltransferase I及び
α-Mannosidase II からなる群の酵素の１または２以上の遺伝子を用いて形質転換したブタ細胞からなる請求項１記載のブタ内在性レトロウィルス非感染性ブタ細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はブタ内在性レトロウィルス非感染性ブタ細胞、即ちブタ内在性レトウィルスをヒト細胞に感染させないブタ細胞とその調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臓器移植は極めて有用な治療法である。臓器移植には同種移植と異種移植があり、各々に長所と短所がある。ヒトからヒトへの同種移植の場合にはドナーの数に限りがある。
一方、ブタからヒトへの異種移植の場合には移植片の多量供給は可能であるが、移植片は速やかに拒絶される。このような異種移植に伴う超急性拒絶（HAR）、急性血管拒絶（AVR）等の拒絶反応を克服するために、ブタにヒト補体制御因子を発現させる方法（例えば、特許文献１）、ブタ細胞の異種抗原、即ちブタ細胞の糖鎖の非還元末端に存在するGalα1-3Gal配列（以下、α-Gal抗原）を減少させる方法（例えば、特許文献２）、ブタ細胞のα-Gal抗原の生成に係わるα-1,3ガラクトシル転移酵素の遺伝子をノックアウトする方法が開発されている（例えば、非特許文献１〜３）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平11-239430号公報
【特許文献２】
特開平2002-291372号公報
【非特許文献１】
Science 2002, 295, 1089
【非特許文献２】
Nat. Biotechnol. 2002, 20, 251
【非特許文献３】
Transplantation 2003, 75, 430
【０００４】
一方、異種移植に伴う別のリスクとして人獣共通感染症が危惧されている。外来性の人獣共通感染症の病原体はブタ獣群をSPF化することなどによって排除できるが、ブタ内在性レトロウィルス（以下、PERVという）はブタゲノム中に存在しメンデルの法則に従って子孫に遺伝するので、排除は困難である。現に全品種のブタがPERVのRNAを発現しており、ブタゲノム中にはPERVプロウィルスが少なくとも50コピーもある。ただし、その大多数の遺伝子座には欠損があり、完全なウィルスを複製する遺伝子座は少ない。従ってPERVのRNAが発現しているからといって、必ずしも感染性を有するPERVが産生されることを意味する訳ではない。なおPERVの遺伝子配列が知られており（例えば、特許文献３）、gagおよびpro/pol配列の変異は少ないがenv配列には変異が多く、これに基づいてPERVはA、BとC型に区分されている。
【０００５】
【特許文献３】
特表2000-501942号公報
【０００６】
PERVはブタに疾病を生じない。また生存ブタ由来組織を用いて治療された160名はPERVに感染していなかった（非特許文献４）。一方、ブタ腎臓由来細胞株PK15やPERVを感染させたヒト胎児腎臓由来細胞株HEK293からヒト培養細胞株にPERVがin vitroで感染したことから、ブタ臓器をヒトに移植した場合に、PERVがヒトにin vivo感染し疾病を起こさないか、ヒトの体内で増殖したウィルスは突然変異を起こして新しいウィルスにならないか、そのウィルスがブタ移植片を移植された患者に感染するだけでなく患者と接触する医療従事者や家族に感染しないかなどと危惧されている。
【０００７】
【非特許文献４】
Science 1999, 285, 1236
【０００８】
異種移植に伴うPERVによる感染症を回避する方法のうち、レシピエント(ヒト)を処置する方法としては逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤の投与などが考えられ、一方ドナー動物（ブタ）を処置する方法としては、交配によるPERV遺伝子を有さないブタ系統の育種、ブタPERV遺伝子のノックアウト、アンチセンスやリボザイムの適用も考えられるが現在迄のところ成功例は得られていない（非特許文献５）。
【０００９】
【非特許文献５】
Xenotransplantation 2002, 9, 242
【００１０】
PERVがヒト細胞に感染する際には、他のエンベロープを有するウィルスと同様に、ヒト細胞に存在する1種またはそれ以上のPERVレセプターとPERVレセプターが認識するPERV粒子上の１種またはそれ以上の物質（以下、PERVリガンドという）を介すると想定される。しかしPERVレセプターとリガンドの詳細は現在迄のところ明らかにされていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は従来技術に存在する上記課題を解決するためになされたものであり、本発明者はPERVのヒト細胞への感染性を検討したところ、PERV粒子のN型糖鎖構造がPERVリガンドとして作用しており、係るPERV粒子のN型糖鎖の由来となるブタ細胞のN型糖鎖構造を修飾することにより、PERVのヒト細胞への感染性を喪失又は著しく低減し得ることを見出して本発明を完成した。
即ち、本発明は、ヒト細胞にPERVを感染させないブタ細胞とその調製方法を提供する。より詳細には、異種移植に伴い生じると危惧されているブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染を生じさせないブタ細胞とその調製方法を提供する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するための本発明の要旨は、下記の性状の何れかを有するPERV非感染性ブタ細胞である。
(1)N型糖鎖を有さないブタ細胞、
(2)N型糖鎖を有する場合でも、当該N型糖鎖がマンノース分子を有さないブタ細胞、
(3)N型糖鎖を有する場合でも、当該N型糖鎖分子内のマンノース分子が７または６から成る糖鎖（以下、Man(7)またはMan(6)と表記する）が多数のポピュレーションを構成するブタ細胞、
(4)N型糖鎖を有する場合でも、当該N型糖鎖分子内のマンノース分子が５以下から成る糖鎖（以下、Man（≦5）と表記する）が多数のポピュレーションを構成するブタ細胞、
(5)複合型N型糖鎖が多数のポピュレーションを構成するブタ細胞、または
(6)N型糖鎖のマンノース分子にレクチンが結合したブタ細胞。
また、本発明のPERV非感染性ブタ細胞の調製方法であって、α-Glucosidase I、α-Glucosidase II、α-Mannosidase I、α-Mannosidase II及びN-Acetylglucosaminyltransferase Iからなる群の酵素の１つまたは２以上を組み合わせてブタ細胞を処理することからなる。
さらに、本発明のPERV非感染性ブタ細胞は、α-Glucosidase I、α-Glucosidase II、α-Mannosidase I、α-Mannosidase II及びN-Acetylglucosaminyltransferase Iからなる群の酵素の１つまたは２以上の遺伝子を用いて形質転換したブタ細胞からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ブタ細胞からヒト細胞にPERVが感染する際には、PERVがブタ細胞内で複製され、その粒子がブタ細胞外に放出される。またPERV粒子がブタ細胞外に放出される際には、他のエンベロープを有するウィルスと同様に、PERVエンベロープの構成成分の一部としてブタ細胞膜が被覆される。さらにPERV粒子が標的細胞に接着する際には、PERVエンベロープの構成成分がリガンドとして利用される。そこで本発明者はブタの細胞膜、特にその構成成分の1つである糖鎖に着目して鋭意検討した。そして後記の実施例が示すように、ブタ細胞から複製されたPERVがヒト細胞に感染する際には、ブタ細胞のN型糖鎖、即ちPERV粒子に存在するN型糖鎖の関わっていることを見出した。
【００１４】
N型糖鎖は小胞体内で高マンノース型（Glc(3)Man(9)GlcNac(2)）として形成され、高次構造が形成された後にゴルジ体へ輸送される。またその一部は一定の過程で消化修飾される（図１）。詳細には、Glc(3)Man(9)GlcNac(2)にα-Glucosidase I、続いてα-Glucosidase IIが作用してMan(9)GlcNac(2)が生じ、次にα-Mannosidase Iが作用して順次Mannoseが消化されMan(5)GlcNac(2)が生じる（以下、これらの糖鎖を高マンノース型糖鎖と総称する）。次にN-Acetylglucosaminyltransferase I（GnT-I）が作用してアセチルゴルコサミンが導入され、次にα-Mannosidase IIが作用して順次Mannoseが消化されマンノースコアを有するGlcNAcMan(3)GlcNacが生じる。これに更にGnT-IIやGnT-IVが作用してアセチルゴルコサミンが導入されると共に分岐が生じ、さらにGalactosyltransferase、FucosyltransferaseまたはSylialtransferaseが作用して各種の糖鎖が生合成される（以下、これらの糖鎖を複合型糖鎖と総称する）。
【００１５】
本発明者は、本発明者はPERVのヒト細胞への感染性を検討したところ、次の要件の少なくとも一つを満たすブタ細胞から放出されるPERVはヒト細胞に感染しない、または感染が抑制されることを見出した。
(1)N型糖鎖を有さないブタ細胞、
(2)N型糖鎖を有する場合でも、当該N型糖鎖がマンノース分子を有さないブタ細胞、
(3)N型糖鎖を有する場合でも、Man(7)またはMan(6)が多数のポピュレーションを構成するブタ細胞、
(4)N型糖鎖を有する場合でも、Man（≦5）が多数のポピュレーションを構成するブタ細胞、
(5)複合型N型糖鎖が多数のポピュレーションを構成するブタ細胞、または
(6)N型糖鎖のマンノース分子にレクチンが結合したブタ細胞。
【００１６】
本発明は上記知見から得られた条件を満たすブタおよびブタ細胞並びにその調製方法である。本発明は異種移植のドナーであるブタまたはブタ細胞を処置して得られ、PERV自体のゲノムまたはPERVプロウイルスのゲノムに直接的または間接的に作用せずに得られるという特徴を有する。
【００１７】
N型糖鎖は膜蛋白質のアスパラギン残基の側鎖アミド基に糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）がN-グリコシド結合した糖鎖である。本発明のブタ細胞およびその調製方法は、上記知見から得られた条件を満たす限り、膜蛋白質のアスパラギン残基の前後のアミノ酸残基が何れであるかを問わない。
【００１８】
N型糖鎖分子内のMan(7)またはMan(6)が多数のポピュレーションを構成するとは、本発明のブタ細胞のN型糖鎖分子内のMan(7)またはMan(6)の構成比率が、通常のブタ細胞のN型糖鎖分子内のMan(7)またはMan(6)の構成比率に比べて統計学的有意に多数であり、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上の多数である状態をいう。
【００１９】
N型糖鎖分子内のMan（≦5）が多数のポピュレーションを構成するとは、本発明のブタ細胞のN型糖鎖分子内のMan（≦5）の構成比率が、通常のブタ細胞のN型糖鎖分子内のMan（≦5）の構成比率に比べて統計学的有意に多数であり、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上の多数である状態をいう。
【００２０】
N型糖鎖分子内の複合型糖鎖が多数のポピュレーションを構成するとは、本発明のブタ細胞のN型糖鎖分子内の複合型糖鎖の構成比率が、通常のブタ細胞のN型糖鎖分子内の複合型糖鎖の構成比率に比べて統計学的有意に多数であり、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上の多数である状態をいう。
【００２１】
本発明のブタ細胞は、α-Glucosidase I、α-Glucosidase II、α-Mannosidase I、α-Mannosidase II及びN-Acetylglucosaminyltransferase Iからなる群の酵素の１つまたは２以上を組み合わせてブタ細胞を処理することによって調製することができる。ブタ細胞を処理する際の反応条件、例えば、酵素／基質比率、温度、時間、ｐH、イオン強度、金属イオン、及び、静置処理、振盪処理または灌流処理等の反応条件としては、公知の至適条件を適宜選択すれば良い。
【００２２】
本発明のブタ細胞は、PERVのヒト細胞への感染が抑制される限り、N型糖鎖分子内のマンノース分子数に関わらず、当該マンノースと特異的に結合し得る物質（例えば、Concanavarin Aなどのレクチン等）で処理し、異種移植に供することができる。
【００２３】
本発明のブタ細胞は、α-Glucosidase I、α-Glucosidase II、α-Mannosidase I、α-Mannosidase II及びN-Acetylglucosaminyltransferase Iからなる群の酵素の１つまたは２以上の遺伝子を用いて形質転換し、それらの遺伝子を過剰発現させることによって調製することができる。これら酵素の遺伝子はブタゲノムに由来するものが好適であるが、これに限定されない。ブタ細胞を形質転換するために導入する遺伝子構築や、導入方法、導入条件等は公知の至適条件を選択することができる。
また本発明のブタ細胞として、上記遺伝子構築を用いるマイクロインジェクション法により作製されたトランスジェニックブタの臓器の細胞、並びに、上記遺伝子構築を用いて形質転換した細胞またはトランスジェニックブタの細胞をドナー細胞とする核移植法により作製されたクローンブタの臓器の細胞を利用することができる。これらのトランスジェニックブタまたはクローンブタを作製する方法としては、公知の至適条件を適宜選択することができる（例えば、特開2002-291372号公報、第６回日本異種移植研究会抄録集 2003; 36）。
さらに、上記の遺伝子構築を作製する際に組織特異的なプロモーターを採用すれば（例えば、肝臓特異的な発現を目的とする際には、アルブミンのプロモーター）、組織特異的にヒト細胞にPERVを感染させないブタの臓器が得られ、その臓器の細胞を利用することができる。
【００２４】
本発明のブタ細胞にはヒトに異種移植可能な全てのブタの臓器、組織の細胞が含まれる。本発明の移植には、ブタの臓器、組織または細胞の移植、ブタの臓器、組織または細胞を用いる体外灌流も含まれる。また本発明のブタ細胞は異種移植に伴う拒絶反応を回避するために、上記の遺伝子改変されたブタの細胞から調製することができ、免疫隔離能を有する被覆材で被覆することができる。
また、本発明のブタ細胞は、前述のようなヒト補体制御因子を発現させ得るブタ細胞であってもよい。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のブタ細胞はN型糖鎖が修飾されており、ヒト細胞に感染可能なPERVウィルス粒子の形成を阻止するので、異種移植に伴うブタからヒトへのPERV感染の可能性の排除に役立てることができる。
また、本発明の調製方法によれば、上記の特性を有するブタ細胞を簡便且つ確実に調製することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
PERV感染を容易に判定するためのブタ細胞株とヒト細胞株へのPERV感染実験系
竹内のレトロウィルスシュウドアッセイ法に準じて（ウィルス 1999; 49(1): 11）、PERV感染を容易に判定し得るブタ細胞株を調製した。即ち、ブタ血管内皮細胞株（SEC）またはブタ肝臓から分離したブタ肝細胞(HEP)にβ-ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子を導入し、さらにPERV-AまたはPERV-Bを感染させてPERV感染能を有するブタ細胞株（以下、PERV(A)-SEC、PERV(B)-SECまたはPERV(B)-HEPと記す）を調製した。
【００２７】
実施例２
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（１）  N型糖鎖合成阻害剤であるTunicamycin（TM、10μg/mL）または脂質糖鎖合成阻害剤である(±)-threo-1-Phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol hydrochloride (PDMP、40μM)を含有させた10％FCS加DMEMを用いて、PERV(B)-SECを5％CO2条件下、37℃18時間培養した。
それらの培養液を0.8μｍφフィルターでろ過して得た培養上清（TMまたはPDMP処理されたSECの細胞膜を被覆したPERV-Bウィルス粒子が存在する）の500μL/wellおよびPolybrane（8μg/mL）をPERV易感染性細胞株として知られているヒト胎児腎臓由来細胞株HEK293（予め1 x 105 cells/wellを播種し2日間培養したもの）に添加し、37℃4時間共培養し、洗浄した。HEK293を更に2日間培養した後に、固定、洗浄し、発色基質5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside（X-Gal）による染色を指標としてBlue Forming Unit（BFU）を計測した。また、各試験区と対照区のBFUを比較し、その割合（％）を感染細胞指数（ICI）として求めた。
その結果、PDMP処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染に影響しなかったが（ICI＝91）、TM処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染を阻害することが確認された（ICI=0）。これらのことから、PERV(B)-SECからヒト細胞株HEK293へのPERV-B感染にPERVエンベロープ、換言すれば宿主であるブタ細胞のN型糖鎖の関わっていることが明らかになった。
また、PERV(A)-SECおよびPERV(B)-HEPについても上記と同様に処理したところ、上記と同様の試験結果を得た。
【００２８】
実施例３
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（２）  N型糖鎖は膜蛋白質のアスパラギン残基の側鎖アミド基にN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）が２分子結合し、更にMannoseがβ1,4結合したものを基本的な骨格とする糖鎖である（図１）。そこで、実施例２に記載のN型糖鎖合成阻害剤をβ-Mannosidase（0.67 u/mL）に代えると共にPERV(B)-SECの培養時間を2時間に代えた以外は実施例２と同様にしてICIを求めた。
その結果、β-Mannosidase処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染を阻害することが確認された（ICI＝0）。このことから、PERV(B)-SECからヒト細胞株HEK293へのPERV-B感染にPERVエンベロープ、換言すれば宿主であるブタ細胞のN型糖鎖の関わっていることが明らかになった。
【００２９】
実施例４
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（３）：高マンノース型N型糖鎖と複合型N型糖鎖の比較
N型糖鎖は一旦小胞体内で高マンノース型として形成され（Glc(3)Man(9)GlcNac(2)）、その後一部の糖分子が一定の過程で消化修飾される。このような修飾に関わる酵素群およびそれら酵素群の阻害剤が知られている（図１）。
そこで、実施例２に記載のN型糖鎖合成阻害剤を、α-Glucosidase Iの阻害剤であるCastanospermine（10 μg/mL）、α-Glucosidase IIの阻害剤である1-Deoxynojirimycin (1-DNM; 1 mM)、α-Mannosidase Iの阻害剤である1-Deoxymannojirimycin (1-DMM; 1 mM)、またはα-Mannosidase IIの阻害剤であるSwainsonin（2 μg/mL）に代えた以外は実施例２と同様にしてICIを求めた。
その結果、高マンノース型N型糖鎖の形成を阻害するCastanospermineと1-DNMによる処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染力を減少し（前者のICI＝65、後者のICI=60）、逆に高マンノース型N型糖鎖から複合型N型糖鎖への移行を阻害する1-DMMとSwansoninによる処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染を増強することが確認された（前者のICI＝222、後者のICI=191）。言換えれば、細胞内に高マンノース型糖鎖を蓄積するとPERV-B感染能も増えることが確認された。
これらのことから、PERV(B)-SECからヒト細胞株HEK293へのPERV-B感染にPERVエンベロープ、換言すれば宿主であるブタ細胞のN型糖鎖、特にN型糖鎖種のうち、複合型よりも高マンノース型の関わっていることが明らかになった。
【００３０】
実施例５
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（４）：高マンノース型N型糖鎖のグルコース分子の影響
実施例３に記載のβ-MannosidaseをN型糖鎖Glc(3)Man(9)GlcNac(2)のグルコース分子を消化するα-Glucosidaseに代えた以外は実施例３と同様にしてICIを求めた。
その結果、α-Glucosidaseによる処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染に影響しないことが確認された（ICI＝114）。このことから、PERV(B)-SECからヒト細胞株HEK293へのPERV-B感染にPERVエンベロープ、換言すれば宿主であるブタ細胞の高マンノースN型糖鎖のGlucose分子は関わっていないことが明らかになった。
【００３１】
実施例６
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（５）：高マンノース型N型糖鎖のマンノース分子数の影響
実施例３に記載のβ-Mannosidaseをα-Mannosidaseに代えた以外は実施例３と同様にしてICIを求めた。またα-Mannosidase の酵素量を1、2、4と8単位に変えて処理した。
その結果、α-Mannosidase による処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染力を減少させ、酵素量を1、2、4と8単位に増加させる程、感染力の減少の程度が増加することが確認された（それぞれのICI＝29、5、1と0）。このことから、PERV(B)-SECからヒト細胞株HEK293へのPERV-B感染にPERVエンベロープ、換言すれば宿主であるブタ細胞のN型糖鎖、特にマンノース分子数が関わっていることが明らかになった。
【００３２】
実施例７
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（６）： 
実施例２に記載のN型糖鎖合成阻害剤をα-D-Mannose残基に親和性を有するレクチンConcanavalin A (ConA)またはα-Galactose残基に親和性を有するレクチンGriffonia simplicifolia isolectin B4 (GSI-B4)に代えた以外は実施例２と同様にしてICIを求めた。
その結果、GSI-B4処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染に影響しないが（ICI＝104）、ConA処理はPERV(B)-SECからHEK293へのPERV-B感染を阻害することが確認された（ICI＝0）。これらのことから、PERV(B)-SECからヒト細胞株HEK293へのPERV-B感染にPERVエンベロープ、換言すれば宿主であるブタ細胞のマンノース糖鎖の関わっていることが明らかになった。
【００３３】
実施例８
ブタ細胞からヒト細胞へのPERV感染にN型糖鎖が関わっていることの証明（７）： 形質転換SECのヒト細胞へのPERV感染阻止
α-Mannosidase I、N-Acetylgalctosaminyltarnsferase Iまたはα-Mannosidase IIのｃDNAとｐCXプロモーター（特開2002-291372号公報参照）からなる遺伝子構築を作製し、これをエレクトロポレーション法を用いてPERV(B)-SECを形質転換した。そして実施例2に記載のN型糖鎖合成阻害剤を用いない以外は実施例2の記載と同様にしてICIを求めた。その結果、形質転換細胞からHEK293へのPERV-Bの感染を抑制することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  N型糖鎖の生合成経路（N型糖鎖分子種とその代謝に関わる酵素と阻害剤）を示す図である。
【図１】
0004167129.tif 000002