(57)【要約】【課題】本発明は、層（１０、６０）中に設けられたビーズ捕捉キャビティ（２０）のアレイ（３０）を有するマイクロ流体チップ（１００）を提供する。【解決手段】本発明のマイクロ流体チップは、キャビティ（２０）の各々が、それぞれ親水性である一つ以上の側壁（２１〜２４）によって区画される錐形形状を有し、前記層（１０、６０）の厚みの中に止まり穴として延びるキャビティ（２０）を有する。本発明は、かかるチップの作製方法をさらに提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
層中に設けられたビーズ捕捉キャビティのアレイを有する当該層を含むマイクロ流体チップであって、前記キャビティの各々は、それぞれが親水性である一つ以上の側壁によって区画される錐形形状を有し、前記キャビティの各々が前記層の厚みの中に止まり穴として延びる、マイクロ流体チップ。
【請求項２】
前記キャビティの少なくとも一部は、それぞれが親水性である側壁によって形成される角錐形状を有し、望ましくは、この角錐形状は、少なくとも四つの側壁によって基本的に区画される、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記層が、ケイ素など、一つ以上の半導体元素を含み、前記キャビティの前記錐形形状は、前記層中の前記キャビティの作製の異方性エッチング処理に適した幾何的形状を呈する、請求項１または２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
前記キャビティの少なくとも一つ、望ましくはそのほとんどが、平均で１〜４０μｍ、望ましくは２〜２０μｍ、さらに望ましくは２〜１０μｍの間の直径を有するビーズ、望ましくはマイクロビーズでそれぞれ満たされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記アレイの前記キャビティの大多数が、それぞれ、一つだけのビーズで満たされ、望ましくは、前記ビーズは、平均で１〜４０μｍ、望ましくは２〜２０μｍ、さらに望ましくは２〜１０μｍの間の直径を有するマイクロビーズである、請求項４に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項６】
前記キャビティの開口部の平均寸法の、前記キャビティ中のビーズの平均直径に対する比率は、１．０〜２．４の間、望ましくは１．４〜２．０の間である、請求項４または５に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項７】
前記キャビティの平均深さの、前記キャビティ中のビーズの平均直径に対する前記比率は、少なくとも０．５、望ましくは１．０、さらに望ましくは１．３である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項８】
少なくとも一つの前記キャビティの二つ以上のサブグループであって、前記サブグループは、望ましくは、キャビティの前記アレイの行または列であり、少なくとも一つのマイクロチャネルによって連結され、さらに望ましくは、一つ以上の前記サブグループは、底部壁または最上部壁が前記層の表面によって形成されるマイクロチャネル部分の中に区画される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項９】
前記アレイが、キャビティの前記アレイに相対して延びるカバー層によってシールされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１０】
一つ以上のビーズ捕捉キャビティのいくつかのアレイを含み、前記アレイは、望ましくは、マイクロチャネル部分の異なるペアの間に挿入される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１１】
前記いくつかのアレイのうち少なくとも二つのアレイの一つ以上のキャビティそれぞれの中に配置された、少なくとも二つの相異なる種類のビーズを含み、前記相異なる種類のビーズは、望ましくは、サイズ、コーティング、材料もしくは色、またはこれらの組み合わせが異なる、請求項１０に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップの作製方法であって、
層を備えたマイクロ流体チップの本体を準備するステップと、
前記層中にビーズ捕捉キャビティのアレイを作製するステップであって、前記キャビティの各々は、それぞれが親水性の一つ以上の側壁によって区画された錐形形状を有し、前記キャビティの各々は、前記層の厚み中に止まり穴として延びる、前記作製するステップと、
を含む方法。
【請求項１３】
前記アレイを作製するステップは、前記キャビティを得るために、望ましくは自己制限的異方性エッチング処理を使って前記層を異方的にエッチングするステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ビーズ溶液の液滴を滴下させることによって、前記アレイの前記キャビティの中にビーズを配置するステップと、
キャビティの前記アレイに相対させて延ばすなどして配置されたカバー層によって前記アレイをシールするステップであって、望ましくは前記カバー層を積層するステップを含む、前記シールするステップと、
をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、ビーズを配置した後、シールするステップの前に、
ビーズが入ったキャビティの前記アレイを乾燥するステップと、
キャビティ内に捕捉されなかった過剰なビーズを、望ましくは、前記アレイを洗浄液で洗浄することによって、もしくはテープを貼り付けて過剰ビーズを付着させることによって、またはその両方によって除去するステップと、
必要に応じ、ビーズが入ったキャビティの前記アレイを再度乾燥するステップと、
を前述の順序で含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にマイクロ流体チップの分野に関し、具体的には、例えばバイオアナリシス用途のための、ビーズ捕捉キャビティを備えたマイクロ流体チップおよび関連する作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロフルイディクスは、一般に、微細加工されたデバイスを言い、これらデバイスは、液体を送液、サンプリング、混合、分析、および投薬（ｄｏｓｉｎｇ）するために用いられる。これらデバイスの顕著な特徴は、液体がマイクロメートル長のスケールで示す特異な性質に起源する。マイクロフルイディクス中の液体の流れは、通常、層流であり得る。マイクロメートル域の横寸法を持つ構造体を作製することによって、１ナノリットルよりはるかに小さい量を得ることが可能である。大きなスケールでは（反応物質の拡散によって）限定される反応をこれにより加速することができる。これらにより、マイクロフルイディクスは様々な用途に使われる。
【０００３】
多くのマイクロ流体デバイスは、ユーザ・チップ・インターフェースおよび閉流路を有する。閉流路は、リークおよび蒸発に関する問題を最小化しながら、一つのデバイスへの機能要素（例えば、ヒータ、ミキサ、ポンプ、ＵＶ検出器、バルブなど）の組み込みを容易にする。
【０００４】
多くの場合、表面上の受容体が、サンプル中の検出する必要のある特定の検体を結合させるために使われる。結合の後、サンプルおよび妨害化学種は洗い流せばよい。その後、受容体−検体の複合体を（例えば、質量の変化、屈折率などを介して）直接的に、または（蛍光免疫測定などで）間接的に検出することが可能である。マイクロフルイディクスは、分析のため前途有望なデバイスではあるが、マイクロ流体チップ内部に受容体を組み込むことは、現在、非常の難度が高い課題である。
【０００５】
マイクロ流体チップの表面上に受容体をパターン形成するという諸ソリューションが提案されている。さらに詳しくは、捕捉抗体のラインをその上にパターン形成したＰＤＭＳの層を使って、マイクロ流体チップをシールすることが可能である。この場合、捕捉抗体のパターン形成は、ステンシルを使って、溶液から抗体を吸収することによって行われる。しかしながら、かかるアプローチは厄介で、スループットが低く、ステンシルが必要で、別の面では、吸収プロセスに起因して時間がかかる。さらに、ＰＤＭＳは、高価であり、表面を汚染する（約２０分のコンタクト時間後に親水性の表面を疎水性の表面にする）。
【０００６】
長期にわたって知られている他のソリューションは、マイクロビーズに頼るもので、これは諸分析に使われている。前記では、通常、ビーズは受容体でコートされる。これらのビーズ（例えば、磁気ビーズ、または毛細管中の単一のビーズ）は溶液の中で、または、マイクロ流体チップの特定の区域に定置／局在化の後、使用することが可能である。以下の二つのケースに区分することができる。
・  磁気ビーズ：妨害化学種およびサンプルからの分離は、磁石および洗浄を用いて達成できる。しかしながら、磁気ビーズは、非磁気ビーズより高価で準備するのが難しい。さらに、これらのビーズは、不透明で光学／蛍光ベースの分析にはうまく適さない。および
・  非磁気ビーズ：ビーズをマイクロフルイディクス中に局在化／操作するため多くの技法が開発されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、かかる技法は以下のような欠点を有し、以下のいずれかを必要とする：
−  特定の作動手段（電極、磁気構造体、焦点合わせされた光、トランスデューサ、圧電構造体など）、したがって複雑でコスト高である：もしくは
−  マイクロ流体流路の特定の幾何的形状（特殊な曲率の半径、狭窄）、ビーズの有無にかかわらずチップの流体抵抗は著しく異なり得ること、および捕捉されたビーズの安定性はシステマチックな問題であることが留意される。また、特定のサンプル／流体の粘度も問題となり得る。
【０００８】
前述のように、一部のソリューションは、狭窄または「フィルタ」を使用し、これが、ビーズを捕捉するための、マイクロ流体チップ中の流路の直接的な部分となっている。しかしながら、かかるソリューションは、信号の強度と信号の品質との間でのトレードオフをもたらす。ビーズの安定性がひときわ問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ビーズ安定性の問題に対する決定的なソリューションを提案する。
【００１０】
第一態様によれば、本発明は、当該層中に設けられたビーズ捕捉キャビティのアレイを有する層を含むマイクロ流体チップとして具現化され、キャビティの各々は、それぞれが親水性である一つ以上の側壁によって区画される錐形形状を有し、キャビティの各々が前記層の厚みの中に止まり穴として延びる。
【００１１】
諸実施形態において、キャビティの少なくとも一部は、それぞれが親水性である側壁によって形成される角錐形状を有し、望ましくは、この角錐形状は、少なくとも四つの側壁によって基本的に区画される。
【００１２】
望ましくは、前記層が、ケイ素など、一つ以上の半導体元素を含み、キャビティの錐形形状は、層中のキャビティの作製の異方性エッチング処理に適した幾何的形状を呈する。
【００１３】
好適な実施形態において、キャビティの少なくとも一つ、望ましくはそのほとんどが、平均で１〜４０μｍ、望ましくは２〜２０μｍ、さらに望ましくは２〜１０μｍの間の直径を有するビーズ、望ましくはマイクロビーズでそれぞれ満たされる。
【００１４】
望ましくは、前記アレイのキャビティの大多数が、それぞれ、一つだけのビーズで満たされ、望ましくは、このビーズは、平均で１〜４０μｍ、望ましくは２〜２０μｍ、さらに望ましくは２〜１０μｍの間の直径を有するマイクロビーズである。
【００１５】
諸実施形態において、キャビティの開口部の平均寸法の、キャビティ中のビーズの平均直径に対する比率は、１．０〜２．４の間、望ましくは１．４〜２．０の間である。
【００１６】
望ましくは、キャビティの平均深さの、キャビティ中のビーズの平均直径に対する比率は、少なくとも０．５、望ましくは１．０、さらに望ましくは１．３である。
【００１７】
好適な実施形態において、少なくとも一つのキャビティの二つ以上のサブグループであって、このサブグループは、望ましくは、キャビティのアレイの行または列であり、少なくとも一つのマイクロチャネルによって連結され、さらに望ましくは、前記サブグループの一つ以上は、底部壁または最上部壁が前記層の表面によって形成されるマイクロチャネル部分の中に区画される。
【００１８】
望ましくは、このアレイが、キャビティのアレイに相対して延びるカバー層によってシールされる。
【００１９】
諸実施形態において、チップは、一つ以上のビーズ捕捉キャビティのいくつかのアレイを含み、前記アレイは、望ましくは、マイクロチャネル部分の異なるペアの間に挿入される。
【００２０】
望ましくは、該チップは、前記いくつかのアレイのうち少なくとも二つのアレイの一つ以上のキャビティそれぞれの中に配置された、少なくとも二つの相異なる種類のビーズを含み、相異なる種類のビーズは、望ましくは、サイズ、コーティング、材料もしくは色、またはこれらの組み合わせが異なる。
【００２１】
別の態様によれば、本発明は、前述の実施形態のいずれか一つによるマイクロ流体チップの作製方法として具現化され、本方法は、
層を備えたマイクロ流体チップの本体を準備するステップと、
前記層中にビーズ捕捉キャビティのアレイを作製するステップであって、キャビティの各々は、それぞれが親水性の一つ以上の側壁によって区画された錐形形状を有し、キャビティの各々は、前記層の厚み中に止まり穴として延びる、該作製するステップと、
を含む。
【００２２】
望ましくは、該アレイを作製するステップは、キャビティを得るために、望ましくは自己制限的異方性エッチング処理を使って前記層を異方的にエッチングするステップを含む。
【００２３】
諸実施形態において、本方法は、ビーズ溶液の液滴を滴下させることによって、アレイのキャビティの中にビーズを配置するステップと、キャビティのアレイに相対させて延ばすなどして配置されたカバー層によってアレイをシールするステップであって、望ましくはカバー層を積層するステップを含む、該シールするステップと、をさらに含む。
【００２４】
望ましくは、本方法は、ビーズを配置した後シールするステップの前に、ビーズが入ったキャビティのアレイを乾燥するステップと、キャビティ内に捕捉されなかった過剰なビーズを、望ましくは、アレイを洗浄液で洗浄することによってもしくはテープを貼り付けて過剰ビーズを付着させることによって、またはその両方によって除去するステップと、必要に応じ、ビーズが入ったキャビティのアレイを再度乾燥するステップと、を前述の順序でさらに含む。
【００２５】
本発明を具現化するデバイスおよび方法を、非限定の例を用い、添付の図面を参照しながら以降に説明することとする。これら図面に表された技術的フィーチャは必ずしも縮尺比通りではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の特徴のある実施形態による、マイクロ流体チップの簡易化された表現の２Ｄ（上面）図を示す。
【図２】本発明の特徴のある実施形態による、マイクロ流体チップの簡易化された表現の２Ｄ（上面）図を示す。
【図３】諸実施形態に関わる、角錐形キャビティ中に捕捉されたビーズの簡易化された表現の、断面図（上側の図）および上面図（下側の図）を示す。
【図４】諸実施形態に関わる、角錐形キャビティ中に捕捉されたビーズの走査型電子顕微鏡画像である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｆは、本発明の実施形態による、マイクロ流体チップの作製方法の詳細なステップを模式的に表す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本発明の実施形態による、マイクロ流体チップの作製方法の詳細なステップを模式的に表す。
【図７】図５および図６の作製方法の選択されたステップを表し、上側の行は、マイクロ流体チップの断面図を示し、下側の行は対応する上面図を示す。
【図８】同様に、図５および図６の作製方法の別形の選択されたステップを表す。
【図９】同様に、図５および図６の作製方法の別形の選択されたステップを表す。
【図１０】同様に、図５および図６の作製方法の別形の選択されたステップを表す。
【図１１】図５および図６に対応するフローチャートである。
【図１２】諸実施形態に関わる、改良された角錐形キャビティの簡易化された表現の２Ｄ図を示す。最左部の図は上面図であり、他の図は断面図である。
【図１３】本発明の特徴のある実施形態による、マイクロ流体チップの簡易化された表現の２Ｄ（上面）図を示す。
【図１４】本発明の特徴のある実施形態による、マイクロ流体チップの簡易化された表現の２Ｄ（上面）図を示す。
【図１５】本発明の実施形態によって得られたキャビティのアレイ中に捕捉されたビーズの蛍光画像のネガを示す。
【図１６】諸実施形態に関わる、錐形台キャビティ中に捕捉されたビーズの簡易化された表現の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
最初に、図１〜４、および１２〜１４を全般的に参照しながら、マイクロ流体チップ１００に関する、本発明の或る態様を説明する。本チップは、とりわけ、ワーキング層１０、６０を含み、この層は、層中に設けられたビーズ捕捉キャビティ２０（トラップとも言う）のアレイ３０を含む。注目すべきは、キャビティ２０の各々は、一つ以上の側壁２１〜２４によって対応される錐形形状を有する。重要なことは、このまたはこれらの側壁は親水性であり、キャビティ２０のそれぞれが、止まり穴としてワーキング層１０、６０の厚みの中に延びていることである。
【００２８】
ワーキング層１０、６０は、基板層１０またはカバー蓋６０であってよい。これらキャビティは、望ましくは層の厚み中に設けられ、図２に示されるように、層の表面が、マイクロ流体チャネルまたはチャネルの部分１２ａの底部壁または最上部壁となる。
【００２９】
本出願において、「錐形」は、「錘状」すなわち、コーン形状またはコーンに似た形状を有することをも意味する。「錐形形状」は、コーンの一つの一般的定義（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｏｎｅ）に一致させて、平面基底（この平面基底は必ずしも円形でなく、キャビティの開口部２８に相当する）から、基底２８より小さな断面積を有する、例えば先端部または頂部切り口面などの反対側端部に滑らかにテーパする三次元の幾何的形状を意味する。他の定義は、コーンは角錐形の特定の例であると見なす、すなわちコーンを円形の断面を有する角錐形であると定義する。例えば、ｈｔｔｐ：／／  ｍａｔｈｗｏｒｌｄ．ｗｏｌｆｒａｍ．ｃｏｍ／Ｃｏｎｅ．ｈｔｍｌを参照。本明細書では、錐形形状は、特定のケースとして（多角形の基底を有する）角錐形を含むと見なす。すなわち、本明細書での錐形形状は、必ずしも円形の断面を有さない。
【００３０】
但し、作製上の制約から、本錐形形状は頂部切り落とし形になり易く、少なくとも、完全な点状頂点では終端しない。実際上は、後で説明するように錐形台から利点さえ得られる。直前に言及し、後記の実施形態でさらに説明するように、この錐形穴は、望ましくは多角形の基底（この基底はキャビティ２０の開口部に相当する）を有し、したがって（多角形の基底を有する）角錐であるものとする。かかる場合、錐形形状は逆角錐形状と見なせばよい。というのは、ビーズ５０は、ビーズ・トラップのより低いアレイ３０の上面に（液体滴下技法で）直接滴下された液体の小滴から得られることが多く、そのトラップがキャビティ２０であってこれらは最上部が開口している、すなわち内側にくぼんでいるからである。しかしながら、この構成は、カバー蓋中に設けられたキャビティがされるように逆向きにすることが可能である。図８参照。
【００３１】
ビーズ捕捉のため止まり穴状の錐形キャビティを用いることは、本発明人らもテストした、例えば捕捉のために柱状または貫通穴状のキャビティを用いる他のソリューションに比べ、ビーズの安定性に関して驚くほどの利点があることが判明した。すなわち、得られたトラップは、洗浄の後、ビーズ５０を保持する点で前例のない性向を示した。本発明の諸実施形態は、マイクロビーズ（例えば、その表面に受容体を有するビーズであって、生物学的分析で従来から行われているように、かかる受容体が溶液中のリガンドと結合するために使うことの可能なビーズ）に適用され、適度な複雑さを有し、ビーズを定置するために（真空、磁場、または電場のような）追加の手段を必要としない。
【００３２】
このビーズの安定性における顕著な改善の原因はまだ明瞭でない。この改善された安定性は、横方向に、もしくは、キャビティ中にビーズが捕捉されているとき、その下側すなわち錐形穴のとがった方の端のレベルで、またはその両方に生じる界面的もしくは機械的またはその両方の現象（錐形キャビティは、洗浄時に流体（ガスまたは液体）の横方向の面内運動からビーズをよりうまく保護する）に起因する可能性がある。いずれにせよ、錐形キャビティの側壁（群）が機能するためには親水性である必要がある。
【００３３】
本設計および対応する作製方法は、さらに、既知のソリューションの全部ではないにせよほとんどと違って、トラップを覆う前にビーズを定置することを可能にする。
【００３４】
本発明人らは、作製に関し、ビーズ溶液を滴下した後、過剰なビーズを洗浄する前の、ビーズ５０およびトラップ２０の乾燥ステップで、捕捉されたビーズの安定性がさらに大幅に改善されることに気付いた。これは、後記で詳しくコメントすることとする。
【００３５】
いくつかの既知の従来技術のソリューションにおいて（例えば、ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ誌、巻２１、２００５年、３０３〜３１２頁のＳｏｈｎらの論文参照）、「ジャイアント」ビーズ、すなわち本明細書で意図されたビーズより直径で少なくとも一桁大きなビーズ、を補足するために、貫通穴状の角錐形キャビティが作製されている。しかしながら、この場合、作製された角錐形キャビティが開通穴なので、これらは、本出願に対するものよりもはるかに大きな最小深さを有する必要がある。また、かかるソリューションは、ピックアンドプレース工具およびバックサイド真空の適用を必要とし、通常、１〜４０μｍの範囲の直径を有するポリマー・ビーズである本明細書で意図されるようなマイクロビーズなど、より小さなビーズ（かかるビーズは、通常、液体懸濁液から得られる）には応用できない。
【００３６】
本発明は、キャビティ２０中に安定するビーズを得ることを可能にするが、但し、誘電泳動ＤＥＰ電極などの追加的使用を排除するものではない。ＤＥＰ電極は、例えば、必要な場合、ビーズを定位置に戻すため、またはトラップのアレイ３０が配置されるマイクロチャネル中を流れる溶液にビーズをもっとさらすため、ビーズ５０を浮遊させるのに、トラップ中またはその近辺に実際に配置することができる。さらに、諸実施形態において、反射によって蛍光信号を増幅するために、例えばＡｌなど使って、キャビティの表面を金属化してもよい。
【００３７】
ここで、図３、４、１２、および１６をさらに詳細に参照すると、キャビティ２０の一部または全部は、角錐形状、すなわち多角形基底を有する錐形容積体、つまりいくつかの区別可能な側壁２１〜２４によって形成されるキャビティとすることができ、この例では、これらの壁はそれぞれ親水性である。この角錐形状は、例えば四面体としてもよく、四角錐としてもよく、または、もっと複雑にしてもよい。但し、望ましくは、この形は、基本的には（少なくとも）四つの側壁２１〜２４によって区画される。しかして、かかるキャビティ２０は、一般に、理想的には一点に、だが高い可能性で頂部切り口面２９に収束する三角の壁面２１〜２４を有する。キャビティの開口部２８を区画する平面基底は多角形形状を有し、少なくとも三辺形、望ましくは四辺形である。後者の場合、角錐形状は、基本的に少なくとも四つの側壁２１〜２４によって区画される。
【００３８】
なお、これらの壁は、作製工程における障害などに起因することもあり、完全に平面の壁である必要はない。但し、本明細書で開示する好適な作製技法（後記参照）は基本的に前記を防止することに留意する。例えば、フォトリソグラフィ処理に起因するいくつかの残存欠陥はあり得るが、これは実際上希少である。異方性エッチングは結晶面に従うので、むしろ、側壁は一般的に平面的である。例えば、図１２表されているように、マスク（レイアウト）を修正することによって、形状を制御することが可能であり、したがって、少なくとも諸実施形態では、最終的な形状は制御可能であり予測可能にすることができる。例えば、図１２に示されるように、一つ以上の側壁を構造化または成形することが可能である。該図では、特にカバー層が用いられない実施形態に対し、ローカルな液体注入、ビーズ投下および吸引を可能にするなどのため、壁の一つが２３ａ〜ｄに構造化されている。
【００３９】
角錐形状の使用が、円形の錐形キャビティに比べ、ビーズの安定性に関し、さらに「なお一層」良好な結果をもたらすことが判明している。これについての理由は完全には理解されていない。これは、球体ビーズの周辺のコーナー中に残された自由空間が、残存する液体を蒸発可能にすることに起因するのかも知れない。図３の円錐形状による別形を参照。
【００４０】
図４は、角錐形キャビティ中に捕捉されたビーズの走査型電子顕微鏡画像である。この画像において、
−  「ＥＨＴ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｎｓｉｏｎ）」は、キロボルト、ｋＶ単位での電子高電圧を表し、
−  「ＷＤ（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）」は、サンプル表面とレンズ低部との間の作動距離を表し、
−  「Ｍａｇ（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、倍率に対するものであり、
−  「Ｔｉｌｔ  Ａｎｇｌｅ」は、電子銃の軸に対するサンプル台の垂線の角度を表し、そして、
−  「ＳｉｇｎａｌＡ＝ＳＥ２」は、二次電子の検出器が使われていることを示す。
【００４１】
図４を参照すると、諸実施形態において、ワーキング層１０はケイ素など一つ以上の半導体元素を含み、キャビティ２０の角錐形状は、キャビティを得るために用いられる作製工程と調和する幾何的形状を呈し、この工程は異方性エッチング処理を有利に用いる（他の結晶方位、例えば＜１１１＞、は望ましい角錐形状を生成しないことが多いので、通常、＜１００＞の方位を示すシリコン・ウエハが使われる）。ここで、ケイ素が望ましくはあるが、以下の考慮事項が、他の半導体、例を挙げると、例えばＧｅなどＩＶ族元素または例えばＳｉＧｅなどの化合物半導体、他のＩＩＩ〜ＶまたはＩＩ〜ＶＩ族材料、およびそれらそれぞれの酸化物または窒化物に適用される。例えば、ＧａＡｓおよびＧｅは異方的にエッチングが可能である。また、本方法の基底となる原理は、いくつかの金属層およびそれらそれぞれの酸化物に適用することができる。但し、金属層は実用性が低い。具体的には、これらは層厚み中で前述の材料に匹敵する（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）結晶均一性を示さないことがある。それでも、例えばＡｌ２Ｏ３の表面の使用をもくろむ人がいるかもしれない。Ａｌ２Ｏ３は最高１００〜２００ｎｍまでの薄膜誘電体として使用し、スパッタリング、もしくは原子層堆積（ＡＬＤ：ａｔｏｍｉｃ  ｌａｙｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって堆積が可能である。後者はコスト高であるが、高品質の技法である。そうではあるが、マイクロビーズ捕捉に必要な層の厚みが、ＡＬＤの使用を難題としている。
【００４２】
角錐形状は、幸いなことに異方性エッチング処理と相性がいい。キャビティ作製の異方性エッチング処理は、Ｓｉまたは類似の半導体元素に対し、角錐の平面基底（すなわち開口部２８）と隣接する壁面との間に理想的には５４．７°の角度をもたらすことになり、これにより、角錐形の深さ対幅の比率が決まる。かかる処理は、図４に見られるように、キャビティの容易でクリーンな作製を可能にする。但し、この理想的な角度は、小さな欠陥に起因してわずかに変動し得る。
【００４３】
別形において、ドライフィルム・レジストの使用が可能で、さらに一般的には、いくつかのポリマー、プラスチック、および金属も意図することができよう。望ましくは、エポキシベースのドライフィルム・レジストが使用され、これは熱エンボス加工によってパターン取りが可能である。熱エンボス加工は、他のプラスチック材料にも同様に適用することができ（例えば、ＰＭＭＡ、ＣＯＣ、ポリカーボネート）、これらに対しては、通常のパターン設定方法は、角錐形マイクロキャビティを生成するのに適さない可能性が高い。例えば、Ｓｉの異方性エッチングを用いてキャビティのアレイを作製した後、それらのキャビティをＮｉ電気メッキによって充てんすることが可能である。次いで、電気メッキされたＮｉ層が取り出され、後での熱エンボス加工処理に使用されるモールドまたはスタンプ型が形成される。プラスチックに接触するスタンプ型に圧力と熱とを加え、次いで冷却し離型することによって、Ｓｉ中のキャビティの正確な複製がプラスチック中に生成可能である。
【００４４】
ここで図１５をさらに明確に参照すると、諸実施形態において、チップは、そのキャビティ（すなわち、キャビティ２０の少なくとも一部、望ましくは、それらのほとんど）がそれぞれ、ビーズ５０、５１、５２で満たされている。前述したように、かかるビーズは、望ましくはマイクロビーズ、すなわち平均で１〜４０μｍの直径を有するビーズである。本明細書で意図される用途に対しては、２〜２０μｍの間、さらに望ましくは２〜１０μｍの間の直径が望まれる。これらビーズは、望ましくは、例えば、ポリスチレンなどのポリマー・ビーズであるが、但し、原理的にはシリカまたはラテックスのビーズも使用することができよう。
【００４５】
添付の図面に示されているように、キャビティの断面積の寸法は、ビーズの寸法と同程度である。ビーズ捕捉キャビティは、単一のビーズを補足するために特定的に設計されたトラップである。結果として、ビーズは通常、キャビティ壁に二つ（またはそれ以上）の点で接触が可能で、あるいはキャビティのとがった方の端部レベルにくっつくことさえある。本明細書で「キャビティ」は、マイクロチャネルまたは他のマイクロ流体機能とは区別されたオブジェクトとして意図されている。本明細書で提案されたソリューションのおかげで、図１５にみられるように、アレイ３０のキャビティ２０の大多数を、各々、一つだけのビーズ５０、５１、５２で満たすことができる。
【００４６】
ここで、キャビティとビーズとの相対的な寸法についての詳細を述べることとし、これが、捕獲されたビーズの安定性およびトラップの占有率の最適化を可能にする。図３、１２、および１６をさらに明確に参照すると、キャビティ開口部２８の平均（直線）寸法の、平均ビーズ寸法に対する比率は、望ましくは、１．０〜２．４の間であることが必要である。さらに、（占有率に関する）最善の結果は、１．４〜２．４の間の比率（すなわち、平均で４０〜６０％の占有率）であることが観察された。これらの結果は、この比率が１．４〜２．０以内（洗浄の後、平均で、最大６０％までの占有率が観察され得る）のとき、さらに改善される。場合によっては、最大９０％までの占有率が達成可能であろう。それにも関わらず、前述の比率を２．０より低く、望ましくは１．８より低く保っても、同じキャビティへの複数の占有を基本的に防ぐことが可能である。
【００４７】
例えば、本発明人らが、１０μｍ（直径）のビーズに対してまとめた様々な結果によれば、キャビティ２０の開口部２８を区画する平面基底の最大直径は、望ましくは２４μｍより小さく、さらに望ましくは１８μｍより小さくする必要がある。これらの好適な数字は、例えば、図１５に示された蛍光画像によって確かめられる。図１５は、図５および図６を参照して後述する方法により得られたキャビティのアレイ中に捕捉されたビーズの蛍光画像のネガを実際に示している。このチップのキャビティは、Ｓｉ基板に１３μｍ深さのＴＭＡＨエッチングを施して実際に得られたものであり、２００μｍ×５００μｍのアレイが用いられた。ビーズは、（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴＭ）社）のＦｌｕｏｒｏ−ＭＡＸの１０μｍビーズ溶液（希釈せず）約２００ｎＬを各アレイにピペット点滴することによって組み込まれた。しかして、図１５の画像の各々中で１０μｍ直径のビーズが使われている。キャビティの開口部の横方向の寸法（これらの画像では見えない）は、８から１４μｍまで変化し、対応する最終的占有率は５％から６３％に上り、そのピークは、１８〜２０μｍの開口に対する８０〜９０％である。この特定の例に対し、得られた正確なパーセンテージは、８μｍ：５．４％；１０μｍ：２４．４％；１２μｍ：３２．５％；１４μｍ：４６．３％；１６μｍ：５１．６％；１８μｍ：８０．１％；２０μｍ：８９．９％；２２μｍ：７２．２％；および２４μｍ：６３．２％である。但し、１８μｍで複数占有が出現し、それ以上で増加した。しかして、以上から（１０μｍ直径のビーズに対し）開口の寸法の範囲は、例えば１４〜１８μｍ、さらには１６〜１８μｍに制限するとよい。これに合わせ、キャビティ開口部２８の平均寸法の、平均ビーズ直径に対する比率は、１．４〜１．８または１．６〜１．８に制限することができよう。なお、上記の特定の例から生じたパーセンテージ値は先に述べた平均値と異なっている。というのは、後者は様々な実験をまとめたものだからである。
【００４８】
ここで図３および１６を参照すると、キャビティ２０の平均深さの、ビーズ５０の平均直径に対する比率は、望ましくは少なくとも０．５さらに望ましくは１．０、まださらに望ましくは１．３である。例えば、本発明人らによって行われた諸実験は、１０μｍ直径のビーズが、８μｍ×８μｍの開口部に安定して留まることが可能であったことを示しているが、但し、この場合、これらビーズによる最終的な占有率／安定性は準最適であることも判明した。かかる寸法は、自己制限的な異方性エッチング処理を用いた場合、約５μｍの深さであることを示唆している。これらから、平均キャビティ深さの平均ビーズ直径に対する比率は、０．５まで低くすることが可能である。ここで、錐形キャビティが頂点切されていること、および、図１６に示されるように、頂部切り口面２９がビーズを収容するのに十分な大きさであることを前提として、異方的にエッチングされた角錐形に対し、キャビティ中の完全に埋められた（すなわち内蔵された）ビーズを得たい場合には、少なくとも（約）１．０ｄ（このｄはビーズの直径）の深さが必要である。例えば、１０μｍのビーズは、全ての側面が頂点で交わる前にエッチングを停止する時間ベースのエッチングを用いた、開口部が少なくとも１９．３３×１９．３３μｍおよび深さが少なくとも最小１０μｍのキャビティであれば、その中に完全に埋めることが可能である。キャビティが頂点切りされていない場合（キャビティはポイント状の頂点を有する、すなわち自己制限エッチング）、上記の比率は、図３に示されるように、少なくとも約１．３である必要がある。
【００４９】
加えて、本発明人らは、必ずしもビーズがキャビティ中に全部埋まっている必要がないことにさらに気付いた。すなわち、図５および６（正確な尺度でない）に示されるように、ビーズの一部が開口部２８の面の上部に現れても、すなわち突き出ても、十分な安定性を維持することが可能である。したがって、これにより前述の比率は低減できる。
【００５０】
ここで、図１、２、７〜１０、および１３〜１４を参照すると、諸実施形態において、マイクロ流体チップ１００は、例えば、アレイ３０の行または列など、キャビティ２０の二つ以上のサブグループ３２を呈することが可能であり、この場合、二つのサブグループは、少なくとも一つのマイクロチャネル１４で連結される。望ましくは、これらサブグループの一つ以上は、マイクロチャネル部分１２ａ中に区画され、これらの底部壁または最上部壁はワーキング層１０によって区画される。かかる構成は、サブグループ３２間の交差汚染を防止しながら、多重化を可能にする。したがって、これらサブグループを部分的に別離するために、アレイ３０をビーズ５０のサブグループ３２に分割することが望ましい。キャビティのアレイは、例えば、マイクロタイタ・ウエルの典型的な配位に合致するように配置すればよく、マイクロタイタ・プレート上で、ウエルは、９、４．５、または２．２５ｍｍに間隔取りされて二次格子上に配置される。これは、ロボット器具を使った、ビーズの溶液の分注の容易化を可能にする。また、キャビティのアレイの増加された組み込みに対しては、六方格子を選択してもよい。例えば、図１５に示された実験に用いられたチップ設計は、六方格子配置中の蛇行形状のマイクロ流体チャネル（２００μｍ幅、１４μｍ深さ）に沿って分布されたアレイを含み、一つのアレイから他のアレイへのコーナー間の距離は約１．１ｍｍである。この配置は、３ｍｍ×５ｍｍの合計面積内に、１０の別個のアレイ（各々が、２００μｍ×５００μｍの面積を占める）の配置を可能にし、液滴の混融または交差汚染なしに各アレイへのビーズ溶液の２００ｎＬの液滴の分注を可能にする。
【００５１】
次に、図５〜１０に示された「最終」のデバイス中に見られるように、マイクロ流体チップ１００のキャビティ２０のアレイ３０は、アレイ３０に相対して延びるカバー層６０によって望ましくはシールされる。カバー層は、キャビティおよびそれらの内容物を保護し、封止する。カバー層６０は、キャビティ２０にとどまらず、おそらくは、チップ１００上に通常存在する他のマイクロ流体構造体をもシールすることになる。かかるマイクロ構造体の例には、図１および２に示されるように、投入パッド１１、検出抗体（またはｄＡｂ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））配置ゾーン７０、毛細管ポンプ１６、または通気孔１８がある。
【００５２】
なお、カバー層６０は、アレイ３０に相対して延びるが、マイクロ流体チャネルを形成するのに通常はギャップが必要なので、該層は必ずしもキャビティと接触しない。図１０の作製工程では、キャビティの間にマイクロチャネルが配置されるので、これらキャビティはカバー層によってシールされる。しかしながら、本明細書で説明する他の作製技法では、カバー・フィルム６０は、実際にはキャビティには直接接触せず、チャネル層堆積（図７）またはエッチング（図８および９）によって常にギャップが導入される。通常、チャネル深さは、１〜２０μｍの間である。より浅いチャネルは、より高い流体抵抗と低い厚み均一性を発生させようし、一方、より深いチャネルの作製は、より難度が高いかもしくは時間消費的かまたはその両方であろう。一般に、作製可能なフィーチャの横方向の最小寸法は、チャネル作製技法のアスペクト比の限界に起因してチャネルの深さと共に増大する。現在の作製技法（湿式またはドライ・エッチング、またはドライフィルム・レジスト・パターン設定）は、１（例えば、２０μｍ深さチャネル中の２０μｍ幅のフィーチャ）より高いアスペクト比を有する構造体を、大がかりなパラメータ最適化作業なしで、容易に提供するであろう。
【００５３】
この点で、フローの間にビーズが漏れ出さないことを確実にするためにチャネル高さ（または深さ）を調整することが可能である。本ソリューションによって、ビーズの安定性は著しく改良される。それでもなお、マイクロチャネル中の強い流体の流れの存在中では、一部のビーズの喪失の残存リスクが常にあり得よう。ここで、マイクロ流体チャネルの高さがビーズの直径よりもわずかに小さければ（例えば、前述の例では１０μｍより小さい）、フローの間にビーズが漏出することは決してあり得ない。しかしながら、過小なチャネル深さ（例えば１μｍ）は、流体抵抗を増大させ、チップへの合計流体容量（体積）を減少させることになり、過大な深さ（例えば１０μｍより大きい）は一部のビーズを喪失する確率を増大することになろう。また、ビーズの直径よりわずかに小さいチャネル深さを有することは、テープを使って過剰なビーズを除去する場合にも利点となろう（例えば、キャビティ内部のビーズは留まり、チャネル内からはみ出たものはテープに付着することになろう）。
【００５４】
ここで、図１３および１４をさらに明確に参照すると、チップ１００は、（各々が一つ以上のビーズ捕捉キャビティ２０を含む）いくつかのアレイ３０を実際に含むことが可能である。これらのアレイ３０は、望ましくは、マイクロチャネルの部分の異なるペアの間に、すなわち、所与の流路中に並列にまたは直列に挿入される。例えば、これらのチャネル部分は、図１４に示されるように、一つの部分から他の部分への交差汚染を回避するために、とりわけ、並列に分割されたチャネルをから成り得、または（図１３に示されるように）直列に配置され得る。また、これらは、蛇行チャネル（図示せず）のチャネル部分に配置することもできよう。
【００５５】
次に、アレイ（群）３０のキャビティ２０中に配置されたビーズの相異なる種類５１、５２を有利に使用することも可能である。好適な配置技法のおかげで、ビーズ５１、５２は、通常、異なるアレイ３０中に配置される。例えば、二つの異なる種類のビーズを使用することが可能であり、図１３、１４に示されるように、ビーズの一つの種類５１は検体検出に使われ、一方、ビーズの他方の種類５２は、対照用に使われる。先に述べたように、アレイ３０は、求められる実際の用途の如何によって、直列にしても、または並列にしてもよい。本明細書で意図されるほとんどの用途（例えば、バイオアナリシス）において、ビーズはコーティングが異なる。ビーズは、上記をおいても、さらに全般的にサイズ、コーティング、材料もしくは色またはこれらの組み合せについて異なり得る。
【００５６】
なお、従来技術のソリューションのほとんどは、ビーズを（ビーズ溶液の流れを使って）投入する前に、デバイスのシーリングが必要である。これは、相異なる種類のビーズをデバイス中の所定の位置に配置することを、不可能ではないにせよ困難にする。結果的に、これは、バイオアナリシスに対する実際上のステップの増加を示唆している。
【００５７】
別の態様によれば、本発明は、前述のチップ１００の作製方法として具現化することができる。ここで、図５〜１１を参照しながら、作製方法を説明する。最も一般的には、かかる方法は、デバイス１００のワーキング層１０、６０中のビーズ捕捉キャビティ２０のアレイ３０の作製の基本ステップ（ステップＳ２０）を中心題目とする。先に説明したデバイス１００と首尾一貫して、本作製は、キャビティ２０の各々が、それぞれ親水性の一つ以上の側壁２１〜２４によって区画された錐形形状を有することを確実にする。キャビティ２０は、各々、ワーキング層１０、６０の厚みの中に止まり穴として延びる。
【００５８】
選択される材料１０、６０によって、異なるアプローチが可能である。キャビティは、基板層１０、またはカバー層もしくはフィルム６０中に設けることが可能である。前にさらに言及しているように、この作製方法は、異方性エッチング処理、熱エンボスス処理、または、キャビティ２０を得るための任意の他の適切な処理を含んでよい。今までのところ、キャビティに対し達成された品質に関し、異方性エッチング処理が最も有望なように見える。自己制限的異方性エッチング処理は、エッチング速度の変動の影響をより受けにくく、過剰エッチングの場合にも、深さがほとんど一定にとどまることを可能にするので、このエッチング処理は時間ベースのエッチング処理よりも望ましい（最終的な深さはキャビティ開口部２８の寸法によって決まる）。
【００５９】
先にも言及したように、この異方性エッチングは、望ましくは、＜１１０＞方向のフラット有し、しかして、最上面が＜１００＞方向の垂線を有する、＜１００＞ウエハに対して遂行される。このウエハの露出面は、したがって、（１００）平面に平行、すなわち、逆格子ベクトル（Ｓｉに対するダイアモンド構造）基底の（１００）方向に直交する。異方性エッチング処理は、キャビティの作製に加えて、マイクロ流体の諸構造体を作製するためにも使用が可能である（例えば図９および１０）。傾斜した側壁を有することが、例えばチャネルなどマイクロ流体構造体に弊害を及ぼさない場合、＜１００＞の結晶方位を有するＳｉウエハの湿式エッチングの方が、湿式エッチングはバッチ処理に適しており、したがって、処理対象のウエハの数によっては全体として速くできるので、ドライ・エッチング技法より好ましい。なお、一般的には湿式エッチングはドライ・エッチングより遅く、ウエハ毎ではドライ・エッチングの方がはるかに速くできる。しかして、全体的なスループットは一緒に処理されるウエハの数で決まる。
【００６０】
必要な場合、アレイ（群）３０は、（例えば、エタノール、水などを使って）洗浄、もしくは（例えば、エア、酸素またはヘリウム）プラズマ処理、またはその両方を行ってもよい。全ての場合において、ビーズ５０、５１、５２は、ビーズ溶液５５の液滴を、例えばアレイ（群）３０の上面に単に滴下する（Ｓ３２）ことによってキャビティ２０中に配置する（Ｓ３０）ことが可能である。例えば、約２μＬのビーズ原液（通常、１％固体の懸濁液として用意される）をアレイ（群）３０にたらせばよい。
【００６１】
ビーズを配置するステップ（Ｓ３０）後（且つチップをシールするステップ（Ｓ４０）前）に：
−  キャビティ２０を乾燥し（Ｓ３４）（ビーズ５０はキャビティまたは近辺に留まっている）、次いで、
−  例えば、洗浄液でアレイ（群）３０を洗浄して（Ｓ３６ａ）、もしくは過剰なビーズを付着させるテープを貼って（Ｓ３６ｂ）またはその両方によって、過剰なビーズ（すなわち、キャビティ２０内に捕捉されていないビーズ）を除去し（Ｓ３６）、その後、
−  必要に応じて（すなわち、例えば、過剰なビーズを除去するためにテープを貼るだけの場合などには、この最後の乾燥ステップは必ずしも必要でない）、残存するビーズを中に有するキャビティ２０のアレイ３０を再度乾燥する（Ｓ３８）、
ことが推奨される。
【００６２】
本発明人らは、過剰なビーズを除去する前にアレイ３０を乾燥することが、驚くほど高い安定性のあるビーズ５０をもたらすことに気付いた。これによる最終的な占有率への影響はかなりに達することが判明した。この前ステップの乾燥（Ｓ３４）のおかげで、占有率は２０％から６０％へ、他の条件次第ではそれよりさらに改善することが可能である。錐形キャビティは、洗浄および乾燥（例えばＮ２フロー）時の流体（ガスまたは液体）の横方向の面内運動からビーズをより良好に保護すると推測できる。望ましい洗浄液は、例えば、緩衝液または脱イオン水である。もっと一般的には、ビーズまたはその上にコートされているタンパク質に悪影響を与えない任意の液を使えばよい。
【００６３】
最後に、アレイ３０さらに一般的には、チップ１００の一部または全部を、カバー層６０、例えば、良好なシールを確実にするために望ましくは積層されたドライフィルムなどでシールする（Ｓ４０）ことができる。キャビティが、層１０の中に設けられる場合、カバー６０は、キャビティ２０のアレイ３０に相対して延びるように配置され、これにより、閉じられたマイクロ流体チャネル１２、１２ａ、１４、および構造体１６、１８が形成される。
【００６４】
ここで、四つの異なる作製例を詳しく説明する。第一の作製例が図５および図６に示されている。図５および図６の詳細なステップが、別途に、図１１のフローチャート中に記載されている。図７は、この第一作製方法の選択されたステップだけを示し、図８〜１０は、他の可能な作製方法の選択されたステップを示す。図７〜１０の各々において、図の上側の行は、異なった作製段階におけるマイクロ流体チップの断面図を示し、下側の行は対応する上面図を示す。
【００６５】
最初に、図５、６、７、および１１を参照すると、第一作製例では、異方性キャビティエッチングが用いられ、次いでドライフィルム・レジスト・チャネル作製が行われる。詳しくは、
−  ステップＳ１０：マイクロ流体チップ本体が準備され、この本体は層（または基板）１０を含む。
−  ブロックＳ２０：キャビティおよびチャネルの作製：
〇  Ｓ２１、図５Ａ：層１０が酸化され、例えば、ＳｉＯ２層１０ｏを得るためケイ素が熱酸化によって酸化される。得られた電気絶縁層１０ｏは、通常、基板１０全体を覆う。酸化の代わりに、Ｓｉ３Ｎ４などの窒化物を得ることを試みてもよい。
〇  ステップＳ２２、図５Ｂ：酸化物が、例えばドライまたは湿式エッチングを使ってパターン設定される。このため、通常、マスクとしてフォトレジストが使われる（図５Ｂは、酸化物のエッチングおよびフォトレジストを剥離後のチップを模式的に表す）。
〇  次いで、基板層１０は、ステップＳ２４、図５Ｃで、キャビティ２０および他の配置ゾーン７０を得るために異方的にエッチングされる。望ましくは、通常はＴＭＡＨまたはＫＯＨの湿式エッチング液が使用される。Ｓｉエッチングの前に、Ｓｉ表面の自然酸化物の除去のために、通常、短時間酸化物エッチング（例えばＢＨＦ）が行われる。
〇  次に、ステップＳ２５、図５Ｄで、酸化物が剥離される。但し、これは、必要な場合、酸化物を表面に残してもよいので随意である。通常、緩衝酸化物エッチング（例えばＢＨＦ）がこの目的に使われる。その後、ステップＳ２６、図５Ｄで、望ましくは、ドライフィルム・レジスト（ネガ型フォトレジスト）またはエポキシベースのネガ型フォトレジスト（例えばＳＵ−８）を堆積し、露光し、そして現像することによって、チャネルの側壁６２がパターン取りされる。
−  ブロックＳ３０：ビーズ配置（試薬組み込みとも呼ばれる）：
〇  ステップＳ３２、図５Ｅ：ビーズ溶液の液滴がキャビティ・アレイ３０上に滴下される（図１３〜１４に示されるように、異なる種類のビーズをそれぞれのアレイに滴下することができよう。）
〇  ステップＳ３４、図５Ｆ：アレイ３０およびビーズが（望ましくは自然蒸発によって、Ｎ２の流れによって、またはチップを制御された環境もしくは暖められたプレート上に置くことによって）乾燥される。
〇  ステップ３６：過剰ビーズが、望ましくは、（ｉ）例えば、ステップＳ３６ａ、図６Ａで、脱イオン水または緩衝液の流れを使ってこれらを洗浄する、もしくは（ｉｉ）ステップＳ３６ｂ、図６Ｂで、粘着テープまたはＰＤＭＳなどのテープを貼り付けてこれに過剰ビーズをくっ付ける、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方によって、除去される。必要に応じてテープは何回か貼り付ける。そして、
−  Ｓ４０、図６Ｃ：最後に、ステップＳ４２で、チップ１００（特に、キャビティのアレイ（群）３０）が、望ましくは積層されたカバー層６０（例えば、ドライフィルム・レジスト）でシールされる。このため、カバー層６０は、通常、例えば４５〜５０℃に適度に加熱される。このカバー・フィルムは、（ステップＳ４０、図７に見られるように）液体をピペット投入するため、投入パッドのレベルに開口部を有することができる。かかる開口部は切開またはパンチングでパターン取りすればよい。
【００６６】
作製方法の前述の例は、キャビティとチャネルとの作製が分離されているので、フレキシブルな設計を可能にする。かかる方法は循環チャネル構造を可能にすることが、さらに察知できる。しかしながら、かかる方法の短所は、二つのマスクと、洗浄済みのビーズがチャネル内にとどまり得ることとが必要なことである。
【００６７】
ここで図８を参照すると、第二の作製例が表されており、該図では、ビーズは、層１０の代わりに、カバー層６０（例えば、ドライフィルム・レジスト）に組み込まれている。簡潔に言えば、
−  ステップＳ２０ａ：層６０中にキャビティを（例えば、熱エンボス処理で）パターン取りするためモールド型６５が使われる。
−  ステップＳ２０ｂ：パターン取りされた層６０が分離される。
−  ステップＳ３０：ビーズが、これもビーズ溶液の液滴をピペット滴下し、乾燥し、洗浄し、再度乾燥することによって、パターン取りされた層６０のキャビティ中に配置される。
−  ステップＳ４０：最後に、このカバー層６０をチップ上に、望ましくはその上にカバー層６０を積層して配置することによって、ＭＦチップがシールされる。
【００６８】
この方法では、ビーズの組み込みは、基板およびチャネルから独立しており、これは基板１０およびチャネルの設計におけるより高いフレキシビリティを可能にする。ＭＦチップは、マイクロ流体構造体を有することができ、これらは、エッチングされるか（異方性エッチングまたは深反応性エッチング）、または堆積されるか（ドライフィルム・レジスト、ＳＵ−８など）、または熱エンボス処理もしくは成形処理でパターン取りされる。カバー・フィルムは、任意の相応する基板に、事前表面修正もしくは処理をしてまたはせずに、積層すればよい。但し、この方法は、より効率的な蛍光検出のため透明な基板を必要とすることがある。また、ビーズは、基板に組み込まれたビーズと比較して、おそらくは、フィルムからより容易に分離することが可能である。
【００６９】
次に、図９を参照すると、第三の作製例が簡潔に表されており、これは、二ステップのフォトリソグラフィおよび異方性Ｓｉエッチングを用いる：
−  ステップＳ２０ｃ：チャネルが異方性Ｓｉエッチングによってエッチングされる。その後に熱酸化（図示せず）が行われる。次いで
−  ステップＳ２０ｄ：酸化膜へのパターン設定の後、キャビティが異方性Ｓｉエッチングによってエッチングされる。
−  ステップＳ３０：ビーズが組み込まれる。そして
−  ステップＳ４０：チップがシールされる。
【００７０】
かかる作製方法は、トラップ作製とチャネル作製とが分離されるので、フレキシブルな設計を可能にする。しかしながら、これは、より多い作製ステップ（二つのマスクが必要）、および二つのエッチング・ステップの間で追加の熱酸化を必要とする。さらに、この方法では洗浄されたビーズがチャネル内に留まり得ることが必要であろう。
【００７１】
最後に、図１０を参照すると、最後の作製例が表されており、この例は、単一ステップのフォトリソグラフィおよび異方性Ｓｉエッチングに依存している。ステップＳ２０ｅ：単一のフォトリソグラフィ・ステップにおいて、異方性エッチングを使ってチャネルおよびキャビティが同時にエッチングされる。次いで、ステップＳ３０でビーズが組み込まれ、ステップＳ４０でチップがシールされる。かかる方法を使えば、チャネルおよびトラップの両方が一つのエッチング・ステップで作製され、コスト効果的である。また、自己制限的なエッチング処理では、より幅広い開口部はより深いチャネルをもたらし、その逆も可なので、チャネルの幅を調整することによって、チャネルの深さを決めることができる。Ｓ２０ｅ（図１０）に示されるように、各キャビティは、キャビティの幅より小さな幅のマイクロ流体チャネルを介して、相互に、およびマイクロ流体ネットワークに連結が可能である。但し、かかる作製方法は、より厳しい設計ルールを示唆し、キャビティを相互連結するマイクロ流体チャネルの小さな寸法に起因するより高い流体抵抗をもたらす。また、キャビティ内部でのエア・バブル形成のリスクもある。
【００７２】
ここで、本発明の諸実施形態の応用の例を説明する。すなわち、（簡明化のため、チップはカバー・フィルムシールされない）オープン・チャネル・システムにおける単純なリガンド−受容体分析を実証的に説明する：
・  Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＴＭ）製の「スーパーアビジン」コートされたポリスチレンのビーズ（１０μｍ直径）が用いられる。１０μｍのポリスチレン・ビーズは、ビオチンと非常に強力に結合することで知られるタンパク質であるアビジンでコートされている。市販の原液は、ビーズとして１％の固体を含有する。
・  原液は、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０を使って１／５に希釈される（より大きな希釈率も用いることが可能である）。
・  図５Ａ〜５Ｃ（図１１中のステップＳ１０からＳ２４まで）によって得られたキャビティのアレイがそのまま使用される。約２μＬのビーズ溶液がアレイ上に滴下され（完全な乾燥に十分な１〜２分間）乾燥される。
・  アレイおよびビーズは、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０の下で洗浄される（約３０ｍＬで、１０秒間）。
・  次いで、アレイおよびビーズは、ＤＩ水の流れの下で洗浄される（約３０ｍＬで、１０秒間）。
・  次いでアレイは、窒素流の下で乾燥される。
・  アレイおよびビーズは、１５分の間、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０中の１％ＢＳＡの液滴でカバーされる。
・  アレイおよびビーズは、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０と水とを使って洗浄され、窒素流の下で乾燥される。
・  最後に、チップをシールし、保存可能になる。
【００７３】
一般的な分析に対して、ユーザは、次の三つステップを行えばよく、ここでは検体は蛍光標識されたビオチン分子で表現される。
・  アレイおよびビーズは、光から保護しながら、ビオチン−５９０−Ａｔｔｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｒ）社製）の５０μｇ／ｍＬ溶液に１５分間曝される。このステップの過程で、ビオチン−５９０−Ａｔｔｏは、ビーズ上のアビジンと結合する。
・  アレイおよびビーズは、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０および水で洗浄される。これらの洗浄ステップは随意であるが、分析の感度を向上するために適用するとよい。
・  ビオチン−Ａｔｔｏ−５９０（リガンド）の、ビーズ上のアビジン（受容体）への結合は蛍光顕微鏡を使ってモニタされる。いかなる光学的アーチファクトもなしに、単一のビーズ・キャビティに対して単純な信号読み取りおよび解釈が可能である。
【００７４】
本明細書で説明する方法およびデバイスは、マイクロ流体チップの作製に用いることができる。得られたチップは、作製者によって生の形で（例えば、構造化された二層デバイスとして）またはパッケージされた形で流通させることが可能である。後者の場合、チップは、単一のチップ・パッケージ中に搭載すればよい。いずれの場合も、その後、チップは、他の素子と共に（ａ）中間製品、もしくは（ｂ）最終製品の一部として組み込むことができる。
【００７５】
結論として、本発明の諸実施形態は、様々な利点を提供する。例えば、
−  本発明の諸実施形態は、特に、過剰ビーズを除去する前にビーズおよびキャビティ・アレイが乾燥された場合、特徴的に且つ驚くほど安定的な様態で、ビーズを保持することを可能にする。後続の液体および乾燥への曝露の過程で喪失するのはわずかなビーズだけである。分析のためのマイクロフルイディクスおよび受容体のパターン形成に対する長年に亘る世界的な研究の後、マイクロフルイディクスにビーズ（または受容体）を組み込むきわめて効率的な方法がついに発見された。
−  さらに、本設計および対応する作製方法は、トラップを覆う前にビーズを配置することを可能にする。
−  キャビティ毎に単一個のビーズを捕捉するためにビーズに相対してキャビティのアレイを寸法設定することができる。単一ビーズのキャビティは、より簡単な信号読み取りおよび解釈を可能にし、ビーズを収容するため単一の層が必要なだけで、且つ、光学的アーチファクトの発生がより少ない（またはゼロである）。そして、
−  本明細書で提案された作製方法は、高いスループットの製造を可能にする。様々なビーズ組み込み方策が提案されており、これらはマイクロフルイディクスおよび流路のフレキシブルな設計を可能にする。本発明の諸実施形態の基底となる構想は、付随的にいくつかのマイクロ流体フィーチャ（ミラー、プラスチック・チップ作製など）に適合する。
【００７６】
限られた数の実施形態、別形、および添付の図面を参照して、本発明を説明してきたが、当業者には当然のことながら、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、等価物で代替することができる。具体的には、所与の実施形態、別形において言及されたまたは図面中に示された（デバイス様または方法様の）フィーチャは、本発明の範囲から逸脱することなく、別の実施形態、別形、または図面中の別のフィーチャと組み合わせる、またはそれで代替することが可能である。前述の諸実施形態または変形のいずれかに関し説明されたフィーチャの様々な組み合わせは、したがって、添付の特許請求の範囲内にとどまることが意図されている。さらに、本発明の範囲を逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるため、多くのマイナーな修改を加えることも可能である。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものでなく、本発明は、添付の特許請求の範囲に包含される全ての実施形態を含むことが意図されている。加えて、前述において明示で触れた以外の多くの他の別形を考案することが可能である。例えば、本明細書において明示で述べたもの以外の材料を層１０、６０の各々に用いることができよう。加えて、チャネル、投入パッド、通気孔、キャビティなどは、様々な寸法で設けることができよう。
【符号の説明】
【００７７】
１０      基板層
１０ｏ    酸化層
１１      投入パッド
１２      マイクロ流体チャネル（マイクロチャネル）
１２ａ    マイクロチャネル部分
１４      多重化マイクロチャネル
１６      毛細管ポンプ
１８      通気孔
２０      ビーズ捕捉キャビティ
２１〜２４    キャビティの側壁
２４ａ〜ｄ    構造化（多面小面）壁
２８      キャビティ開口部／錐形基底
２９      キャビティ底面
３０      ビーズ捕捉キャビティのアレイ
３２      キャビティのサブグループ（行／列）
５０      ビーズ
５１      検体検出ビーズ
５２      対照用ビーズ
５５      ビーズ溶液（液滴）
６０      カバー層（ドライフィルム）、蓋
６２      チャネル壁
６５      カバー層６０中のエンボス処理キャビティのモールド型
７０      検出抗体（ｄＡｂ）配置のためのキャビティ
７２      配置された検出抗体（ｄＡｂ）
１００    マイクロ流体チップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月29日(2016.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層中に設けられたビーズ捕捉キャビティのアレイを有するマイクロ流体チップであって、前記キャビティの各々は、それぞれが親水性である一つ以上の側壁によって区画される錐形形状を有し、前記キャビティの各々が前記層の厚みの中に止まり穴として延びる、マイクロ流体チップ。
【請求項２】
前記キャビティの少なくとも一部は、それぞれが親水性である、少なくとも４つの側壁によって形成される角錐形状を有する、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記層が、ケイ素など、一つ以上の半導体元素を含み、前記キャビティの前記錐形形状は、前記層中の前記キャビティの作製の異方性エッチング処理に適した幾何的形状を呈する、請求項１または２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
前記キャビティの少なくとも一つが、平均で１〜４０μｍの直径を有するビーズで満たされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記キャビティが、それぞれ、一つだけのビーズで満たされる、請求項４に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項６】
前記キャビティの開口部の平均寸法の、前記キャビティ中のビーズの平均直径に対する比率は、１．０〜２．４の間である、請求項４または５に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項７】
前記キャビティの平均深さの、前記キャビティ中のビーズの平均直径に対する前記比率は、少なくとも０．５である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項８】
少なくとも一つの前記キャビティの二つ以上のサブグループであって、前記サブグループは、望ましくは、キャビティの前記アレイの行または列であり、少なくとも一つのマイクロチャネルによって連結され、さらに望ましくは、一つ以上の前記サブグループは、底部壁または最上部壁が前記層の表面によって形成されるマイクロチャネル部分の中に区画される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項９】
前記アレイが、キャビティの前記アレイに相対して延びるカバー層によってシールされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１０】
一つ以上のビーズ捕捉キャビティのいくつかのアレイを含み、前記アレイは、マイクロチャネル部分の異なるペアの間に挿入される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１１】
前記いくつかのアレイのうち少なくとも二つのアレイの一つ以上のキャビティそれぞれの中に配置された、少なくとも二つの相異なる種類のビーズを含み、前記相異なる種類のビーズは、サイズ、コーティング、材料もしくは色、またはこれらの組み合わせが異なる、請求項１０に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１２】
マイクロ流体チップの作製方法であって、
層を備えたマイクロ流体チップの本体を準備するステップと、
前記層中に、それぞれが、親水性の一つ以上の側壁によって区画された錐形形状を有し、前記層の厚み中に止まり穴として延びるビーズ捕捉キャビティのアレイを作製するステップと、
を含む方法。
【請求項１３】
前記アレイを作製するステップは、前記キャビティを得るために、自己制限的異方性エッチング処理を使って前記層を異方的にエッチングするステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ビーズ溶液の液滴を滴下させることによって、前記アレイの前記キャビティの中にビーズを配置するステップと、
前記キャビティの前記アレイに相対させて延ばすなどして配置されたカバー層によって前記アレイをシールするステップと、
をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記ビーズを配置した後、前記シールするステップの前に、
前記ビーズが入った前記キャビティの前記アレイを乾燥するステップと、
前記キャビティ内に捕捉されなかった過剰なビーズを、前記アレイを洗浄液で洗浄することによって、もしくはテープを貼り付けて過剰ビーズを付着させることによって、またはその両方によって除去するステップと、
を含む、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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