(57)【要約】  本発明は、ＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに結合する抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗体及びその抗原結合断片）、誘導されたＨＥＲ２結合分子（例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）、並びに抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。また、開示する組成物を含む医薬製剤、及びＨＥＲ２媒介性シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、（ｉ）前記第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２抗体結合部位に特異的に結合し、（ｉｉ）前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含む第１ＨＥＲ２抗体結合部位に結合し、（ｉｉｉ）前記第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、ペルツズマブの抗体結合部位とは異なる、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項２】
前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）と軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列
を含む、請求項１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項３】
第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ＶＨ及びＶLを含み、
（ａ）前記ＶＨが、配列番号１５又は４３のアミノ酸を含み；
（ｂ）前記ＶＬが、配列番号１６又は４４のアミノ酸を含み；
且つ、前記第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項４】
前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び／又は前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、以下：（ａ）重鎖定常領域若しくはその断片をさらに含むＶＨと、軽鎖定常領域（ＬＣ）若しくはその断片を含むＶＬ；（ｂ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；（ｃ）ダイアボディ；（ｄ）ミニボディ；（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；又は（ｆ）Ｆ（ａｂ）を含むか、あるいはこれらからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項５】
（ａ）前記重鎖領域又はその断片が、ＩｇＧ定常領域であり；及び／又は（ｂ）前記ＬＣ定常領域が、κ定常領域若しくはλ定常領域である、請求項４に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項６】
前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は親和性最適化抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項７】
（ａ）前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、トラスツズマブ抗体と同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；
（ｂ）前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、トラスツズマブ抗体によるＨＥＲ２との結合を競合的に阻害し；又は
（ｃ）前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、配列番号５４〜５９のいずれか１つのアミノ酸を含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項８】
前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、以下：
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；
（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３
を含むｓｃＦｖである、請求項７に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項９】
（ａ）前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合しているか；
（ｂ）前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合しているか；又は
（ｃ）前記第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、前記第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖内に共有結合によって挿入されている、請求項７又は８に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項１０】
前記重鎖が、Ｆｃドメインを含む定常領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項１１】
前記Ｆｃドメインが、前記二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を低減又は増強することができる少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項１２】
互いに結合した第１及び第２ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、前記第１ポリペプチド鎖が、以下：
（１）［ＴＺS］−［Ｌ1］−［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］
（２）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］−［Ｌ2］−［ＴＺS］
（３）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［Ｌ3］−［ＴＺS］−［Ｌ4］−［ＦｃX］
から選択され、
ここで、
ＴＺは、トラスツズマブ抗体と同じエピトープに結合するｓｃＦｖであり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、及びＬ4は、ペプチドリンカーであり；
ＦｃXは、Ｆｃドメインであり；
BＶＨ及びBＣＨは、それぞれ、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＨ及びＣＨ１領域であり；且つ
前記第２鎖が、配列［BＶＬ］−［ＣＬ］を含み、ここで、BＶＬは、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＬ領域であり、ＣＬは、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択されるＩｇＧ軽鎖定常領域である、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項１３】
BＶＬが、以下：
（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含み；
［ＴＺS］が、以下：
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含み；
前記［Ｆｃｘ］が、以下：
（ｉ）誘導体化可能な基を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換；及び／又は
（ｉｉ）前記二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異を含み；
［BＶＨ］が、以下：
（ｉ）配列番号１と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号２と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号３と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む、
請求項１２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項１４】
前記二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が、以下：
（ａ）ＨＥＲ２標的と結合すると、内在化を誘導する；
（ｂ）内在化後に、有効なリソソーム輸送を促進する；
（ｃ）ＨＥＲ２標的分解を誘導する；
（ｄ）低ＨＥＲ２発現癌細胞において、リガンド誘導によるＡＫＴリン酸化を阻止する；
（ｅ）リガンド誘導のＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化を妨害する；又は、
（ｆ）これらの組み合わせを実施する、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体と、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの治療部分とを含み、任意選択で少なくとも１つのスペーサを含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１６】
各々の治療部分が、前記二重特異性抗体のＦｃ領域内の特定の位置でアミノ酸の側鎖に化学的に結合している、請求項１５に記載のＡＤＣ。
【請求項１７】
前記特定の位置が、２３９、２４８、２５４、２５８、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４３５、４４０、４４１、４４２、４４３、４４６、２３９位と２４０位の間の挿入、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される（アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）、請求項１６に記載のＡＤＣ。
【請求項１８】
前記特定の位置が、２３９、４４２、又はその両方である（アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）、請求項１７に記載のＡＤＣ。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
（ｉ）配列番号３２Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３３Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；又は
（ｖｉ）配列番号４１Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖｉｉ）配列番号３２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖｉｉｉ）配列番号３３Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｘ）配列番号３６Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｘ）配列番号３７Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｘｉ）配列番号４０Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；又は
（ｘｉｉ）配列番号４１Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（前記第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）
を含む、ＡＤＣ。
【請求項２０】
前記治療部分が、細胞毒、放射性同位体、免疫調節薬、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ミクロＲＮＡ、光活性治療薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、ペプチド、脂質、炭化水素、キレート剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のＡＤＣ。
【請求項２１】
前記細胞毒が、ツブリシン、オーリスタチン、メイタンシノイド又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項２０に記載のＡＤＣ。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、又は請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のＡＤＣ、並びに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
ＨＥＲ２発現癌を治療する方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のＡＤＣ、又は請求項２２に記載の医薬組成物を、それが必要な被験者に投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
前記癌が、低ＨＥＲ２発現癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＥＲ２ターゲティング治療薬に対する耐性を治療する方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のＡＤＣ、又は請求項２２に記載の医薬組成物を、それが必要な被験者に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年４月１１日に提出された米国仮特許出願第６１／９７８，５１６号明細書及び２０１５年１月２３日に提出された米国仮特許出願第６２／１０７，０５０号明細書の利益を請求し、これらの開示内容は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合する組成物、並びに癌の治療のための組成物の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファミリーは、細胞増殖、分化及び生存の重要な媒介因子である。受容体ファミリーは、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）などの４つの異なるメンバーを含む。
【０００４】
ＨＥＲ２は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞腫由来の形質転換遺伝子の産物である。ヒト相同体の増幅は、乳癌及び卵巣癌に認められており、予後不良と相関する。ＨＥＲ２の過剰発現（多くの場合、しかし一様ではなく、遺伝子増幅に起因する）は、他の癌（胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓及び膀胱癌など）にも認められている。ＨＥＲ２はまた、前立腺癌でも過剰発現され得る。
【０００５】
ＨＥＲ受容体は、一般に、細胞において多様な組み合わせでみいだされ、ヘテロ二量体化が、様々なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増大させると考えられている（Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３５：１１５−１３２（１９９５））。ＥＧＦα及びＴＧＦは、ＨＥＲ２に結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を刺激して、ヘテロ二量体を形成し、これが、ＥＧＦＲを活性化することによって、ヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移を引き起こす。二量体化及び／又はリン酸基転移は、ＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化すると思われる。Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，（前掲）を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現されると、活性シグナル伝達複合体が形成され、ＨＥＲ２に対して指令された抗体は、この複合体を破壊することができる（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４６６１−１４６６５（１９９４））。
【０００６】
ＨＥＲ２をターゲティングする多数の抗体が当該技術分野において記載されている（例えば、以下を参照のこと：Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１１６５−１１７２（１９８９）；米国特許第５，６７７，１７１号明細書；Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０）；Ｋｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）；Ｓａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２−８２（１９９１）；Ｓｈｅｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７（１９９１）；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：９７９−９８６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５−２６３（１９９３）；Ｐｉｅｔｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９−１８３８（１９９４）；Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１−５３０９（１９９４）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００−５（１９９１）；Ｄ’ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２−７２０６（１９９４）；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６）；並びにＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７）。
【０００７】
様々な特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、以下の文献に記載されている：Ｔａｇｌｉａｂｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−９３７（１９９１）；ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３−５４８（１９８９）；Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１−５３６９（１９９１）；Ｂａｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０−３６２（１９９０）；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１−８６９５（１９９１）；Ｂａｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０−２５８９（１９９２）；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１−４０８（１９９３）；国際公開第９４／００１３６号パンフレット；Ｋａｓｐｒｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１−２７７６（１９９２）；Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０（１９９１）；Ｓｈａｗｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７−１３７３（１９９４）；Ａｒｔｅａｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８−３７６５（１９９４）；Ｈａｒｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０−１５１６７（１９９２）；米国特許第５，７８３，１８６号明細書；並びにＫｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）。
【０００８】
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化バージョンである、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書を参照のこと）は、以前に広範な抗癌療法を受けたことがあるＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌患者において臨床的に活性である（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７−７４４（１９９６））。ＨＥＲシグナル伝達経路をターゲティングするために、ペルツマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（商標）；国際公開第２００１／００２４５号パンフレットを参照のこと）が、マウス抗体２Ｃ４のヒト化バージョンとして開発されたが、これは、他のＨＥＲ受容体とＨＥＲ２の二量体化を阻害し、これによって、ＲＡＳ及びＡＫＴ経路のリガンド駆動リン酸化及び活性化、並びに下流での活性化を阻害する。アド−トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１；ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））は、細胞傷害性薬剤メルタシンに連結したトラスツズマブの抗体薬物複合体であり、これは、トラスツズマブに耐性のＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌患者における使用について承認されている。
【０００９】
乳癌におけるトラスツズマブの治療効果は、十分に立証されているが、厳しく制限されており、腫瘍がＨＥＲ２を過剰発現する乳癌患者の３０％にしか承認されていない。乳癌患者の７０％は、その個々の腫瘍がＨＥＲ２を過剰発現しないか、又はＨＥＲ２を十分に発現しないため、トラスツズマブに応答しないか、又は十分に応答しない。他の癌及び／又は個々の癌では、ＨＥＲ２は、４３〜６９％という有意な割合の患者に過剰発現される。しかし、一般に、ＨＥＲ２発現のレベルは、大部分の腫瘍において概ね低い。さらに、ＨＥＲ２受容体の過剰発現は、遺伝子増幅をコードすることによって引き起こされることが多い（Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５：３４１（２００５））。従って、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体療法は、低ＨＥＲ２発現又は過剰発現のない腫瘍には不十分であるということが今日の統一見解である。さらに、これらの抗ＨＥＲ２抗体に対する耐性も、重要な問題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６７７，１７１号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／００１３６号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，７８３，１８６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８２１，３３７号明細書
【特許文献５】国際公開第２００１／００２４５号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３５：１１５−１３２（１９９５）
【非特許文献２】Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４６６１−１４６６５（１９９４）
【非特許文献３】Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１１６５−１１７２（１９８９）
【非特許文献４】Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０）
【非特許文献５】Ｋｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）
【非特許文献６】Ｓａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２−８２（１９９１）
【非特許文献７】Ｓｈｅｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７（１９９１）
【非特許文献８】Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：９７９−９８６（１９９１）
【非特許文献９】Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５−２６３（１９９３）
【非特許文献１０】Ｐｉｅｔｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９−１８３８（１９９４）
【非特許文献１１】Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１−５３０９（１９９４）
【非特許文献１２】Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）
【非特許文献１３】Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００−５（１９９１）
【非特許文献１４】Ｄ’ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２−７２０６（１９９４）
【非特許文献１５】Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６）
【非特許文献１６】Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７）
【非特許文献１７】Ｔａｇｌｉａｂｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−９３７（１９９１）
【非特許文献１８】ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３−５４８（１９８９）
【非特許文献１９】Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１−５３６９（１９９１）
【非特許文献２０】Ｂａｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０−３６２（１９９０）
【非特許文献２１】Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１−８６９５（１９９１）
【非特許文献２２】Ｂａｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０−２５８９（１９９２）
【非特許文献２３】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１−４０８（１９９３）
【非特許文献２４】Ｋａｓｐｒｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１−２７７６（１９９２）
【非特許文献２５】Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０（１９９１）
【非特許文献２６】Ｓｈａｗｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７−１３７３（１９９４）
【非特許文献２７】Ａｒｔｅａｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８−３７６５（１９９４）
【非特許文献２８】Ｈａｒｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０−１５１６７（１９９２）
【非特許文献２９】Ｋｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）
【非特許文献３０】Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７−７４４（１９９６）
【非特許文献３１】Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５：３４１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
低レベルのＨＥＲ２を発現し、既存の療法に対して耐性を有する特定の癌において有効な抗ＨＥＲ２療法がないことから、より広範囲のレベルのＨＥＲ２を発現する癌細胞に有効に結合して、例えば、以下：（ｉ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は（ｉｉ）抗体薬物複合体（ＡＤＣ）としての抗体に共役したペイロードによる細胞傷害作用及び／又は（ｉｉｉ）シグナル伝達を媒介する受容体の阻害（例えば、受容体二量体化及び／又は受容体内在化を阻害することにより）を介して、上記癌細胞の増殖を阻害することができる改善された抗体が求められる。
【００１３】
従って、本開示の目的は、ＨＥＲ２が高レベルで発現されない癌を含むＨＥＲ２発現癌の治療に用いることができる、ＨＥＲ２媒介性細胞シグナル伝達を有効に阻害する改善された免疫療法薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含む抗ＨＥＲ２結合分子を提供する。さらに、ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、ＶＨ及びＶＬを含む抗ＨＥＲ２結合分子も提供される。一部の態様では、ＶＨが配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、抗体、又はその抗原結合断片を含む。
【００１５】
本開示はまた、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体も提供し、ここで、（ｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２抗体結合部位に特異的に結合し、（ｉｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含む第１ＨＥＲ２抗体結合部位に結合し、（ｉｉｉ）第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、ペルツズマブの抗体結合部位とは異なる。一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にエピトープを含む第２ＨＥＲ２抗体結合部位に結合する。一部の態様では、第２ＨＥＲ２抗体結合部位は、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位と同一である。一部の態様では、第２ＨＥＲ２抗体結合部位は、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位と部分的に重複する。他の態様では、第２ＨＥＲ２抗体結合部位は、トラスツズマブのＨＥＲ抗体結合部位とは異なる。
【００１６】
本開示は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体も提供し、ここで、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号５２における１つ又は複数のアミノ酸残基を含むエピトープでＨＥＲ２に結合する。
【００１７】
一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号５２における１つ又は複数のアミノ酸残基を含むエピトープでＨＥＲ２に結合し、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ドメインＩＶ内のエピトープでＨＥＲ２に特異的に結合する。一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号５３における１つ又は複数のアミノ酸残基を含むエピトープでＨＥＲ２に結合する。
【００１８】
一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列を含む。
【００１９】
いくつかの態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む免疫グロブリン抗原結合ドメインに対して少なくとも１つの異種可変ドメインフレームワーク領域（ＦＷ）を含む。
【００２０】
いくつかの態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含む。
【００２１】
いくつかの態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含む。
【００２２】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の少なくとも１つの異種ＦＷ領域は、（ｉ）配列番号１１を含む可変軽鎖フレームワーク１（ＶＬ−ＦＷ１）アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１２を含むＶＨ−ＦＷ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号１３を含むＶＨ−ＦＷ３アミノ酸配列；（ｉｖ）配列番号１４を含むＶＨ−ＦＷ４アミノ酸配列；又は（ｖｉ）これらの任意の組み合わせを含む第１免疫グロブリン抗原結合ドメインをさらに含む。
【００２３】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号１５を含み；第１又は第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み、且つ、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【００２４】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬアミノ酸配列は、配列番号１６を含み；第１又は第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み、且つ、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【００２５】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号１５を含み；ＶＬアミノ酸配列は、配列番号１６を含み、第１又は第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み、且つ、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【００２６】
一部の態様では、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、これは、以下：（ａ）重鎖定常領域若しくはその断片をさらに含むＶＨと、軽鎖定常領域若しくはその断片を含むＶＬ；（ｂ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；（ｃ）ダイアボディ；（ｄ）ミニボディ；（ｅ）Ｆ（ａｂ’）2；又は（ｆ）Ｆ（ａｂ）を含むか、又はこれらからなる。同じ態様において、重鎖定常領域又はその断片は、ＩｇＧ定常領域である。一部の態様では、ＩｇＧ定常領域又はその断片は、ＩｇＧ１定常領域である。一部の態様では、ＬＣ定常領域は、κ定常領域である。
【００２７】
一部の態様では、ＬＣ定常領域は、λ定常領域である。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体である。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ヒト抗体である。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、キメラ抗体である。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、アフィニティ最適化抗体である。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、エピトープ結合についてトラスツズマブ又はペルツズマブと競合しない。一部の態様では、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なる非重複ＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【００２８】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、（ａ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内でトラスツズマブ抗体と同じエピトープに特異的に結合し；（ｂ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、トラスツズマブ抗体によるＨＥＲ２との結合を競合的に阻害し；及び／又は（ｃ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号５４〜５９からなる群から選択されるアミノ酸を有する、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２９】
一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、以下：（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む、ｓｃＦｖを含む。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖである。一部の態様では、ｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸を含むＶＬとを含む。
【００３０】
一部の態様では、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーを介して共有結合している。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合している。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端との間に挿入されるリンカーを含む。他の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合している。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端の間に挿入されるリンカーを含む。
【００３２】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖内に共有結合により挿入されている。一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域とＣＨ２領域との間に、共有結合により挿入されている。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域と第２免疫グロブリン抗原結合ドメインとの間に挿入されたリンカー、及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ２領域との間に挿入された第２リンカーを含む。
【００３３】
一部の態様では、第１リンカーと第２リンカーは同一である。別の態様では、第１リンカーと第２リンカーは異なる。一部の態様では、リンカーの１つ又は複数が、ペプチドリンカーを含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、又は少なくとも３０のアミノ酸を含む。他の態様では、ペプチドリンカーは、式Ｓｅｒx［（Ｇｌｙ）y−Ｓｅｒ4］z（ｘは、０〜１であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜１０である）を有するペプチドを含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９、２０、２１、又は２２を含む。
【００３４】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃドメインを含み得る重鎖を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。他の態様では、Ｆｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の態様では、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
一部の態様では、Ｆｃドメインは、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の態様では、一部の態様では、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる少なくとも１つの突然変異を含む。一部の態様では、二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸置換である。一部の態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ｆ、Ｓ２３９Ａ、Ｓ２３９Ｃ、又はその任意の組み合わせを含む。
【００３６】
一部の態様では、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、誘導体化可能な基を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一部の態様では、誘導体化可能な基は、スルフヒドリル基である。一部の態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下：Ｓ２３９Ｃ、２４８Ｃ、２５４Ｃ、２７３Ｃ、２７９Ｃ、２８２Ｃ、２８４Ｃ、２８６Ｃ、２８７Ｃ、２８９Ｃ、２９７Ｃ、２９８Ｃ、３１２Ｃ、３２４Ｃ、３２６Ｃ、３３０Ｃ、３３５Ｃ、３３７Ｃ、３３９Ｃ、３５０Ｃ、３５５Ｃ、３５６Ｃ、３５９Ｃ、３６０Ｃ、３６１Ｃ、３７５Ｃ、３８３Ｃ、３８４Ｃ、３８９Ｃ、３９８Ｃ、４００Ｃ、４１３Ｃ、４１５Ｃ、４１８Ｃ、４２２Ｃ、４４０Ｃ、４４１Ｃ、Ｓ４４２Ｃ、４４３Ｃ及び４４６Ｃ、又はこれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、突然変異型Ｆｃドメインは、配列番号２４又は配列番号２５のアミノ酸を含む。
【００３７】
さらに、互いに結合した第１及び第２ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体も提供され、ここで、第１ポリペプチド鎖は、以下：
（１）［ＴＺS］−［Ｌ1］−［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］
（２）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］−［Ｌ2］−［ＴＺS］
（３）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［Ｌ3］−［ＴＺS］−［Ｌ4］−［ＦｃX］
から選択される配列を含み、
ここで、
ＴＺは、トラスツズマブと同じエピトープに結合するｓｃＦｖであり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、及びＬ4は、ペプチドリンカーであり；
Ｆｃｘは、Ｆｃドメインであり；
BＶＨ及びBＣＨは、それぞれ、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＨ及びＣＨ１領域である。いくつかの態様では、異なるエピトープは、配列番号５２における１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。
【００３８】
一部の態様では、ヒンジポリペプチドは、［BＣＨ］と［ＦｃX］を連結する。特定の態様では、ヒンジポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸を含むか、あるいは、アミノ酸から構成される。
【００３９】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２鎖は、配列［BＶＬ］−［ＣＬ］を含み、ここで、BＶＬは、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＬ領域であり、ＣＬは、ＩｇＧ軽鎖定常領域である。一部の態様では、ＣＬは、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択される。一部の態様では、BＶＬは、以下：（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。一部の態様では、BＶＬは、配列番号１６又は配列番号４４のアミノ酸を含む。
【００４０】
他の態様では、ＣＬは、配列番号２７Ａのアミノ酸配列を含むκ軽鎖である。
【００４１】
他の態様では、ＣＬは、配列番号２７Ｂのアミノ酸配列を含むλ軽鎖である。
【００４２】
一部の態様では、［ＴＺS］は、以下：（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様では、［ＴＺS］は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖである。一部の態様では、［ＴＺS］は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、これらは、ペプチドリンカーにより共有結合している。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、［ＴＺS］は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
一部の態様では、［ＦｃX］のアミノ酸配列は、配列番号２３、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２５Ａ、２５Ｂ及び２５Ｃからなる群から選択される。一部の態様では、［Ｌ1］、［Ｌ2］、［Ｌ3］、及び［Ｌ4］のアミノ酸は、独立に、配列番号１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択される。別の態様では、（ｉ）［Ｌ1］は、配列番号２０のアミノ酸を含み；（ｉｉ）［Ｌ2］は、配列番号２０のアミノ酸を含み；（ｉｉｉ）［Ｌ3］は、配列番号２１のアミノ酸を含むと共に；（ｉｖ）［Ｌ4］は、配列番号２２のアミノ酸を含む。
【００４４】
一部の態様では、［BＶＨ］は、以下：（ｉ）配列番号１と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｉｉ）配列番号２と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；及び（ｉｉｉ）配列番号３と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む。一部の態様では、［BＶＨ］は、配列番号１５又は配列番号４３を含む。別の態様では、［BＣＨ］は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
一部の態様では、［BＶＬ］は、以下：（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。一部の態様では、［BＶＬ］は、配列番号１６のアミノ酸を含む。
【００４６】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１ポリペプチド鎖は、以下：配列番号３０、３１Ａ、３１Ｂ、３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ、３７Ａ、３７Ｂ、３７Ｃ、３８、３９Ａ、３９Ｂ、４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４１Ａ、４１Ｂ及び４１Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２ポリペプチド鎖は、配列番号４２Ａ又は４２Ｂのアミノ酸を含む。
【００４７】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２標的と結合すると、内在化を誘導する。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、内在化後に、有効なリソソーム輸送を促進する。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２標的分解を誘導する。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、低ＨＥＲ２発現癌細胞において、リガンド誘導によるＡＫＴリン酸化を阻止する。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、リガンド誘導のＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化を妨害する。
【００４８】
本開示はまた、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、又は本明細書に開示する抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を含み、少なくとも１つの治療部分をさらに含むＡＤＣも提供する。一部の態様では、ＡＤＣは、少なくとも１つの任意選択のスペーサもさらに含む。一部の態様では、少なくとも１つのスペーサは、ペプチドスペーサである。一部の態様では、少なくとも１つのスペーサは、非ペプチドスペーサである。
【００４９】
ＡＤＣのための従来の共役戦略は、リシン又はシステインを介して、ペイロード（例えば、治療部分）を抗体にランダムに共役させることに依るものである。従って、一部の態様では、ＡＤＣを治療部分にランダムに共役させる。特定の態様では、特定の位置の反応性アミノ酸残基を用いて、治療部分と抗体との部位特異的共役によって、均一な化学量を有する均質なＡＤＣ製剤が得られる。一部の態様では、ＡＤＣは、２つ、３つ、若しくは４つ又はそれ以上の治療部分を含む。一部の態様では、治療部分は全て同じである。一部の態様では、各治療部分は、二重特異性抗体のＦｃ領域における特定のＫａｂａｔ位置でアミノ酸の側鎖に化学的に結合させる。一部の態様では、特定のＫａｂａｔ位置は、２３９、４４２、又は両方である。一部の態様では、特定の位置は、Ｋａｂａｔ４４２位、Ｋａｂａｔ２３９位と２４０位間のアミノ酸挿入、又は両方である。一部の態様では、アミノ酸側鎖は、スルフヒドリル側鎖である。一部の態様では、治療部分は、細胞毒、放射性同位体、オーリスタチン、メイタンシノイド若しくはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞毒は、ツブリシンである。いくつかの態様では、ツブリシンは、化合物Ｔ３２である（本明細書では、「ツブリシン１５０８」又は単純に「１５０８」とも呼ぶ）。
【００５０】
本開示はまた、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含有するＡＤＣも提供し、前記抗体は、以下を含む：
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、Ｋａｂａｔ２３９位のシステインアミノ酸に共有結合したツブリシン分子を含む）。
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、Ｋａｂａｔ２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つのツブリシン分子を含む）。
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、Ｋａｂａｔ２３９位のシステインアミノ酸に共有結合したツブリシン分子を含む）。
（ｉｖ）配列番号４１のアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、Ｋａｂａｔ２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つのツブリシン分子を含む）。
【００５１】
本開示はさらに、抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）をコードする単離された核酸分子若しくは核酸分子のセット、又はそれらの補体も提供する。また、こうした核酸分子若しくは核酸分子のセット、又はそれらの補体を含むベクター若しくはベクターのセットも提供される。さらに、単離核酸分子若しくは核酸分子のセット、又はベクター若しくはベクターのセットを含む宿主細胞も提供される。さらにまた、抗ＨＥＲ２結合分子又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を発現する宿主細胞も提供される。さらには、抗ＨＥＲ２結合分子又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を生成する方法であって、宿主細胞を培養するステップ、及び培地から抗体を回収するステップを含む方法も提供される。
【００５２】
本開示はまた、抗ＨＥＲ２結合分子又は抗ＨＥＲ２二重特異性抗体、及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物も提供する。さらに、ＨＥＲ２発現癌を治療する方法であって、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、本明細書に開示するＡＤＣ、又は本明細書に開示する医薬組成物を、それが必要な被験者に投与するステップを含む方法も提供される。一部の態様では、癌は、低ＨＥＲ２発現癌である。一部の態様では、本方法は、少なくとも１種の別の治療薬を投与するステップをさらに含む。一部の態様では、少なくとも１種の別の治療薬は、放射性核種又は化学治療薬である。また、治療薬又は予防薬を、ＨＥＲ２を発現する細胞の表面にターゲティングする方法であって、薬剤を本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、又は本明細書に開示する抗ＨＥＲ２二重特異性抗体と共役させるステップを含む方法も提供される。さらにまた、治療部分の活性を高める方法であって、薬剤を本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、又は本明細書に開示する抗ＨＥＲ２二重特異性抗体と共役させるステップを含む方法も提供される。さらには、治療薬又は予防薬の薬物動態学的特性を改善する方法であって、薬剤を本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、又は本明細書に開示する抗ＨＥＲ２二重特異性抗体と共役させるステップを含む方法も提供される。一部の態様では、治療部分は、細胞毒である。一部の態様では、細胞毒は、ツブリシンである。一部の態様では、ツブリシンは、化合物Ｔ３２である（本明細書では、「ツブリシン１５０８」又は単に「１５０８」とも呼ぶ）。また、ＨＥＲ２ターゲティング治療薬に対する耐性を治療する方法であって、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、又は本明細書に開示するＡＤＣを、それが必要な患者に投与するステップを含む方法も提供される。一部の態様では、患者は、トラスツズマブ及び／又はメイタンシノイドＤＭ１を含有するＨＥＲ２ターゲティング治療薬に対して耐性である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】リード最適化３９Ｓ抗体（ＬＯ）及び親ＡＺ１．３９．１抗体（ＷＴ）のＶＬ及びＶＨ領域のアミノ酸配列に対応する配列アラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の位置が示される。親抗体に対して異なるアミノ酸残基は、ハイライトで示す。ＶＬ領域内の置換されたフレームワーク領域もハイライトで示す。
【図２】生殖系ＩＧＫＶ２Ｄに対する軽鎖フレームワークの変更によって、発現が倍増したことを示している。
【図３】ＨＥＲ２の細胞外ドメインの構造のリボン構造を示す。３９Ｓ、ペルツズマブ及びドメインＩＶ  ｓｃＦｖの結合部位は、矢印で示す。３９Ｓの結合部位は、ペルツズマブとは異なるドメインＩＩ内のアミノ酸を含む。
【図４】ＤＬ−６８０−標識３９Ｓ（２μｇ／ｍｌ）、並びに様々な濃度の非標識モノクローナル抗体（Ｒ３４７対照、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＡＺ１．３９．１及び３９Ｓ）を用いたＦＡＣＳ競合アッセイを示す。
【図５】様々な抗体組み合わせと細胞株ＭＣＦ−７を用いたリガンド依存性増殖を示す図であり、これは、３９Ｓが、トラスツズマブ及び／又はペルツズマブと組み合わせて投与されると、試験細胞株の増殖を相乗的に抑制することを明らかにしている。各実験について、プロットした抗体サンプルは、次の通りである：Ｒ３４７対照、トラスツズマブ、ペルツズマブとトラスツズマブ、３９Ｓ、３９Ｓとトラスツズマブ、並びに３９Ｓとペルツズマブ。
【図６】様々な抗体組み合わせと細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を用いたリガンド依存性増殖を示す図であり、これは、３９Ｓが、トラスツズマブ及び／又はペルツズマブと組み合わせて投与されると、試験細胞株の増殖を相乗的に抑制することを明らかにしている。各実験について、プロットした抗体サンプルは、次の通りである：Ｒ３４７対照、トラスツズマブ、ペルツズマブとトラスツズマブ、３９Ｓ、３９Ｓとトラスツズマブ、並びに３９Ｓとペルツズマブ。
【図７】ＨＥＲ２結合部分（ドメインＩＶ内で結合するシステイン安定化ｓｃＦｖ）が、３９Ｓ抗体の構造内の様々な位置に遺伝子的に融合された二重特異性構築物を示す。ｓｃＦｖは、３９Ｓ抗体の重鎖の各々のカルボキシ末端に融合され（「Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ」と呼ぶ）（図７Ｂ）、３９Ｓ抗体の重鎖の各々のアミノ末端に融合（「Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ」と呼ぶ）（図７Ａ）されているか、又は３９Ｓ抗体の重鎖の各々のＣＨ１及びＣＨ２領域の間に挿入されている（「Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ」と呼ぶ）（図７Ｃ）。
【図８Ａ】Ｂｓ２抗体の重鎖の配列を表す図であり、野生型重鎖、並びにＡＤＣＣ活性又は低減したＡＤＣＣ活性及び／若しくは部位特異的共役を有するＡＤＣの生産のために最適化され得る重鎖における、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３９、２３９−ｉｎｓ、３３０、３３２及び４４２を示す。
【図８Ｂ】Ｂｓ３抗体の重鎖の配列を表す図であり、野生型重鎖、並びにＡＤＣＣ活性又は低減したＡＤＣＣ活性及び／若しくは部位特異的共役を有するＡＤＣの生産のために最適化され得る重鎖における、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３９、２３９−ｉｎｓ、３３０、３３２及び４４２を示す。
【図８Ｃ】Ｂｓ４抗体の重鎖の配列を示す図であり、野生型重鎖、並びにＡＤＣＣ活性又は低減したＡＤＣＣ活性及び／若しくは部位特異的共役を有するＡＤＣの生産のために最適化され得る重鎖における、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３９、２３９−ｉｎｓ、３３０、３３２及び４４２を示す。
【図９Ａ】様々な二重特異性抗体構築物とＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を用いたリガンド依存性増殖アッセイを示す図であり、これは、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨが、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞及びＭＣＦ−７細胞（それぞれ、図９Ａ及び図９Ｂ）において同様の効力を有し、これは、親抗体組み合わせ（３９Ｓとトラスツズマブ）の活性と同等であることを明らかにしている。各実験について、プロットした抗体サンプルは次の通りである：Ｒ３４７対照、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ、及び３９Ｓとトラスツズマブ。
【図９Ｂ】様々な二重特異性抗体構築物とＭＣＦ−７細胞を用いたリガンド依存性増殖アッセイを示す図であり、これは、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨが、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞及びＭＣＦ−７細胞（それぞれ、図９Ａ及び図９Ｂ）において同様の効力を有し、これは、親抗体組み合わせ（３９Ｓとトラスツズマブ）の活性と同等であることを明らかにしている。各実験について、プロットした抗体サンプルは次の通りである：Ｒ３４７対照、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ、及び３９Ｓとトラスツズマブ。
【図１０】抗ＨＥＲ２抗体の存在又は非存在下で、ヘレグリン（ＨＲＧ１）により誘導されるＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化の妨害を測定するための、Ｔ４７Ｄ細胞からのＨＥＲ２の免疫沈降（ＩＰ）、それに続くＨＥＲ２及びＨＥＲ３のウェスタン（ＷＢ）検出を示す。Ｔ４７Ｄ細胞は、対照条件下で（抗体及びＨＲＧ１のいずれもなしで；抗体はないが、ＨＲＧ１と共に；又は対照抗体Ｒ３４７とＨＲＧ１と共に）インキュベートし、並びにＨＲＧ１及び（ｉ）トラスツズマブ、（ｉｉ）ペルツズマブ、（ｉｉｉ）３９Ｓ抗体、又は（ｉｖ）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ二重特異性抗体と一緒にインキュベーション後。
【図１１】１：１の抗体：ＨＥＲ２モル比から得られた免疫複合体のサイズ分離を表す代表的ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィープロフィールを示す。Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨは、多くのＨＥＲ２分子を架橋して、サイズが１７１６ｋＤａという大きな複合体を形成することができるが、トラスツズマブは、最大２つのＨＥＲ２分子しか結合することができず、これによって３２０ｋＤａ複合体を形成する。
【図１２】ＦＡＣＳによる受容体内在化アッセイを表す図であり、これは、図６に示したＨＥＲ２二重特異性抗体の３つのフォーマットが、細胞株ＢＴ−４７４に高速に内在化したことを明らかにしている。グラフにプロットされているのは次の通りである：Ｒ３４７対照、トラスツズマブ、３９Ｓ、トラスツズマブと３９Ｓ、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、及びＢｓＡｂ−３９ＳＨ。ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＲＴ−１１２、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、及びＮＣＩ−Ｎ８７細胞株においても同様の結果が観測された（データは示していない）。
【図１３】ＢＴ−４７４細胞によるＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨの動態を示す。顕微鏡画像は、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ構築物、トラスツズマブ又はＲ３４７対照の添加後、０、３０、６０、１２０、及び３６０分時点で撮影した。ＢＴ−４７４細胞の細胞質は、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＥＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で染色し、抗体は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で標識した。
【図１４】抗体サンプルと共にＢＴ−４７４細胞のインキュベーション後２時間、６時間、及び２４時間でのＨＥＲ２の分解、又はその欠失の度合いを示すウェスタンブロットである。対照としてＧＡＰＤＨを用いた。試験した抗体サンプルは、次の通りである：（レーン１）Ｒ３４７対照抗体、（レーン２）トラスツズマブ、（レーン３）ペルツズマブ、（レーン４）トラスツズマブとペルツズマブ、（レーン５）３９Ｓ、（レーン６）トラスツズマブと３９Ｓ、（レーン７）ペルツズマブと３９Ｓ、（レーン８）トラスツズマブ、ペルツズマブ及び３９Ｓ、（レーン９）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、（レーン１０）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ（均質にアフコシル化したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ）、（レーン１１）Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、（レーン１２）Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ（均質にアフコシル化したＢｓ３Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ）、（レーン１３）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ、及び（レーン１４）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ（均質にアフコシル化したＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）。
【図１５】Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ（パネルＡ）、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ（パネルＢ）及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ（パネルＣ）抗ＨＥＲ２構築物から得られた例示的ＡＤＣの詳細な概略図である。ＡＤＣ構築物のＣＨ２及びＣＨ３ドメインにおいて考えられる２つの操作細胞傷害剤共役部位を丸で示す。所望の薬物対抗体比（ＤＡＲ）が２対１である場合、部位１又は部位２のいずれかを用いてよい。４のＤＡＲが望ましい場合、部位１及び２の両方を使用する。代替及び／又は追加的部位を作製してもよい。二重特異性抗ＨＥＲ２ＡＤＣは、本明細書において、約２のＤＡＲを有するＡＤＣについては、「Ｂｓ２Ａｂ−２Ｔ」、「Ｂｓ３Ａｂ−２Ｔ」及び「Ｂｓ４Ａｂ−２Ｔ」（又は単に「Ｂｓ２−２Ｔ」、「Ｂｓ３−２Ｔ」及び「Ｂｓ４−２Ｔ」）、また、約４のＤＡＲを有するＡＤＣについては、「Ｂｓ２Ａｂ−４Ｔ」、「Ｂｓ３Ａｂ−４Ｔ」及び「Ｂｓ４Ａｂ−４Ｔ」（又は単に「Ｂｓ２−４Ｔ」、「Ｂｓ３−４Ｔ」及び「Ｂｓ４−４Ｔ」）のように略称する。細胞傷害剤が一切ない二重特異性構築物は、図７に記載する名称で呼ばれ、「非武装（ｕｎａｒｍｅｄ）」として識別することもできる。本明細書に記載するように（例えば、図８を参照）、操作した複合体部位は、ＡＤＣＣ機能を低減又は除去するように選択してもよい。これに代わり、又はこれに加えて、抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ活性を低減又は排除する別の突然変異をさらに含んでもよい。あるいは、ＡＤＣは、抗体の往々にして豊富なリシン残基又はネイティブシステイン残基を介して抗体に共役させて、異種抗体−薬物複合体混合物を形成するような古典的共役方法を用いて作製してもよい。
【図１６Ａ】各画像の下に表示する抗体１μｇ／ｍｌで処理したＳＫＯＶ−３細胞の免疫蛍光画像を示し、細胞内微小管ネットワークの破断又はその欠失を明らかにする。微小管染色を示す。次のサンプルを試験した：抗体なしの培地対照（画像ｉ）、Ｒ３４７対照抗体（画像ｉｉ）、トラスツズマブ（画像ｉｉｉ）、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ（画像ｉｖ）、Ｒ３４７−ＤＭ１（細胞傷害剤メイタンシノイドＤＭ１に共役したＲ３４７対照抗体）（画像ｖ）、Ｒ３４７−４Ｔ（４分子の細胞傷害剤ツブリシンに共役したＲ３４７対照抗体）（画像ｖｉ）、Ｔ−ＤＭ１（メイタンシノイドＤＭ１に共役したトラスツズマブ）（画像ｖｉｉ）、及びＢｓ２−４Ｔ（４分子の細胞傷害剤ツブリシンに共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ）（画像ｖｉｉｉ）。
【図１６Ｂ】各画像の下に表示する抗体１μｇ／ｍｌで処理したＪＩＭＴ−１細胞の免疫蛍光画像を示し、細胞内微小管ネットワークの破断又はその欠失を明らかにする。微小管染色を示す。次のサンプルを試験した：抗体なしの培地対照（画像ｉ）、Ｒ３４７対照抗体（画像ｉｉ）、トラスツズマブ（画像ｉｉｉ）、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ（画像ｉｖ）、Ｒ３４７−ＤＭ１（細胞傷害剤メイタンシノイドＤＭ１に共役したＲ３４７対照抗体）（画像ｖ）、Ｒ３４７−４Ｔ（４分子の細胞傷害剤ツブリシンに共役したＲ３４７対照抗体）（画像ｖｉ）、Ｔ−ＤＭ１（メイタンシノイドＤＭ１に共役したトラスツズマブ）（画像ｖｉｉ）、及びＢｓ２−４Ｔ（４分子の細胞傷害剤ツブリシンに共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ）（画像ｖｉｉｉ）。
【図１６Ｃ】各画像の下に表示する抗体１μｇ／ｍｌで処理したＲＴ−１１２細胞の免疫蛍光画像を示し、細胞内微小管ネットワークの破断又はその欠失を明らかにする。微小管染色を示す。次のサンプルを試験した：抗体なしの培地対照（画像ｉ）、Ｒ３４７対照抗体（画像ｉｉ）、トラスツズマブ（画像ｉｉｉ）、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ（画像ｉｖ）、Ｒ３４７−ＤＭ１（細胞傷害剤メイタンシノイドＤＭ１に共役したＲ３４７対照抗体）（画像ｖ）、Ｒ３４７−４Ｔ（４分子の細胞傷害剤ツブリシンに共役したＲ３４７対照抗体）（画像ｖｉ）、Ｔ−ＤＭ１（メイタンシノイドＤＭ１に共役したトラスツズマブ）（画像ｖｉｉ）、及びＢｓ２−４Ｔ（４分子の細胞傷害剤ツブリシンに共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ）（画像ｖｉｉｉ）。
【図１７Ａ】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ２ＡｂフォーマットのＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの両方が、Ｔ−ＤＭ１よりも強力である。
【図１７Ｂ】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ４ＡｂフォーマットのＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性（パネルＢ）を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。Ｂｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの両方が、Ｔ−ＤＭ１よりも強力である。
【図１８Ａ】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ２ＡｂフォーマットのＪＩＭＴ−１ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの両方が、ＪＩＭＴ−１細胞の殺傷において非常に強力であるのに対し、Ｔ−ＤＭ１は活性を全く示さない。
【図１８Ｂ】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ４ＡｂフォーマットのＪＩＭＴ−１ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性（パネルＢ）を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。Ｂｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの両方が、ＪＩＭＴ−１細胞の殺傷において非常に強力であるのに対し、Ｔ−ＤＭ１は活性を全く示さない。
【図１９Ａ】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ２ＡｂフォーマットのＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。Ｂｓ２−４Ｔが、ＺＲ−７５−１細胞の殺傷に最も活性であるのに対し、Ｂｓ２−２Ｔは、より低レベルの活性を有し、Ｔ−ＤＭ１は、殺傷活性を全く示さないか、又は限定的である。
【図１９Ｂ】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ４ＡｂフォーマットのＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性（パネルＢ）を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。Ｂｓ４−４Ｔが、ＺＲ−７５−１細胞の殺傷に最も活性であるのに対し、Ｂｓ４−２Ｔは、より低レベルの活性を有し、Ｔ−ＤＭ１は、殺傷活性を全く示さないか、又は限定的である。
【図２０】Ｔ−ＤＭ１、非共役（非武装）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びトラスツズマブと比較した、ＤＡＲが２又は４のＢｓ２ＡｂフォーマットのＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害活性（パネルＡ）を示す。また、Ｒ３４７（Ｒ３４７対照抗体）、２又は４ツブリシンと共役したＲ３４７（それぞれ、Ｒ３４７−２Ｔ及びＲ３４７４Ｔ）、ＤＭ１と共役したＲ３４７についての曲線も示す。データから、Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔのいずれも、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において活性ではないことがわかり、これは、Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの細胞傷害活性が、標的（ＨＥＲ２）依存的であることを示している。Ｂｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔについても、同様の結果が観測された（データは示していない）。
【図２１Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣ活性の活性を示す。（１）ビヒクル対照、（２）３ｍｇ／ｋｇのＲ３４７−４Ｔ（４ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（３）３ｍｇ／ｋｇのＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（４）３ｍｇ／ｋｇのＢｓ２  ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）、及び（５）０．３、１及び３ｍｇ／ｋｇのＢｓ２−４Ｔ（４ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。
【図２１Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣ活性の活性を示す。（１）ビヒクル対照、（２）３ｍｇ／ｋｇのＲ３４７−４Ｔ（４ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（３）３ｍｇ／ｋｇのＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（４）３ｍｇ／ｋｇのＢｓ４  ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合したＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）、及び（５）０．３、１及び３ｍｇ／ｋｇのＢｓ４−４Ｔ（４ツブリシンと共役したＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。
【図２２】ＳＴ９９６トリプルネガティブ（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−１＋）ＰＤＸ腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣの活性を示す。（１）ビヒクル対照（ＣＴＲＬ）、（２）アイソタイプＲ３４７−２Ｔ  ＣＴＲＬ（２ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（３）アイソタイプＲ３４７−４Ｔ  ＣＴＲＬ（４ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（４）Ｔ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（５）ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合した構築物）、（６）Ｂｓ２−２Ｔ、すなわち、２ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物、又は（７）Ｂｓ２−４Ｔ、すなわち、４ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。投与時間も矢印で示す。様々な処置に応答する腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍体積（ｍｍ3）±ＳＥＭとして表示する。
【図２３】ＳＴ２２５（ＨＥＲ２−３＋）ＢｒＣａ  ＰＤＸ腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣ活性の活性を示す。（１）ビヒクル対照、（２）Ｒ３４７−４Ｔ（４ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（３）Ｔ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（４）ＢＳ２  ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）、及び（５）Ｂｓ２−４Ｔ（４ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。
【図２４】Ｔ−ＤＭ１不応答ＪＩＭＴ−１（ＨＥＲ２−３＋）ＢｒＣａ  ＣＢＸ腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣ活性の活性を示す。（１）ビヒクル対照、（２）Ｒ３４７−４Ｔ（４ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（３）Ｔ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（４）ＢＳ２  ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）、及び（５）Ｂｓ２−４Ｔ（４ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。
【図２５】ＳＴ４５５Ｂトリプルネガティブ（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−１＋）ＢｒＣａ  ＰＤＸ腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣ活性の活性を示す。（１）ビヒクル対照（ＣＴＲＬ）、（２）アイソタイプＣＴＲＬ（４ツブリシン分子と共役したＲ３４７対照抗体）、（３）Ｔ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（４）ＢＳ２  ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物）、及び（５）Ｂｓ２−４Ｔ（４ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。
【図２６Ａ】親ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株（左側パネル）及び獲得Ｔ−ＤＭ１耐性を有するＮＣＩ−Ｎ８７細胞株に対するＢｓ２−４Ｔ及びＴ−ＤＭ１の細胞傷害活性を示す。Ｂｓ２−４Ｔは、親細胞系においてより強力な活性を有し、Ｔ−ＤＭ１耐性細胞の殺傷も依然として活性である。
【図２６Ｂ】Ｔ−ＤＭ１耐性ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍モデルにおける抗ＨＥＲ２  ＡＤＣの活性を示す。非処置マウス、並びに以下：（１）ＡＤＭｉｘ（ツブリシンと混合した構築物）、（２）Ｔ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）、（３）Ｔ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣ）とペルツズマブ、又は（４）Ｂｓ２−４Ｔ、すなわち、４ツブリシンと共役したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ−（ＦＣＣ）構築物で処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度は、括弧内に表示する。様々な処置に応答する腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍体積（ｍｍ3）±ＳＥＭ（ｎ＝７）として表示する。＊Ｐ＜０．００１（非処置対照群と比較したスチューデントｔ検定による）。
【図２７】トラスツズマブでの前処理後の抗ＨＥＲ２  ＡＤＣの活性を示す。（１）ビヒクルＣＴＲＬ（対照）、（２）トラスツズマブの後、Ｂｓ２−４Ｔ、（３）ビヒクルの後、Ｂｓ２−４Ｔ、（４）トラスツズマブの後、Ｂｓ２−４Ｔ、又は（５）ビヒクルの後、Ｂｓ２−４Ｔで処置したマウスに対応する腫瘍増殖曲線を示す。濃度及び投与レジメンは、括弧内に表示する。様々な処置に応答する腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍体積（ｍｍ3）±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として表示する。
【図２８Ａ】二重特異性ＡＤＣのバイスタンダー効果を評価するアッセイの概略図を示す。
【図２８Ｂ】（ｉ）培地のみ；（ｉｉ）Ｒ３４７−Ｔ４対照；（ｉｉｉ）Ｔ−ＤＭ１；（ｉｖ）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨアドミックス（ａｄｍｉｘ）；及び（ｖ）Ｂｓ２−４Ｔで処理した細胞のＦＡＣＳ分析を示す。両象限における細胞数の減少から、Ｂｓ２−４Ｔが、共培養物中のＨＥＲ２発現及びＨＥＲ２ヌル細胞の両方を殺傷することができることがわかり、これは、Ｂｓ２−４Ｔが、バイスタンダー効果を有することを示唆している。対照的に、Ｔ−ＤＭ１は、共培養中のＨＥＲ２−ヌル細胞を殺傷することができず、これは、Ｔ−ＤＭ１にはバイスタンダー効果がないことを示唆している。
【図２９】Ｔ−ＤＭ１及びＲ３４７−４Ｔ（４ツブリシン分子に共役したＲ３４７対照抗体）と比較した、癌幹細胞（ＣＳＣ）スフィア形成に対するＢｓ２−４Ｔの活性（左側パネル）；及びＲ３４−４Ｔ（４ツブリシン分子に共役したＲ２３４対照抗体）と比較した、異種移植腫瘍ＣＳＣに対応するＢｓ２−４Ｔの活性（右側パネル）を示す。
【図３０Ａ】細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（脳転移に由来するヒト乳管上皮腺癌）を用いた、リガンド依存性増殖アッセイを示す図であり、これにより、ＡＤＣＣ増強アフコシル化二重特異性抗体の全てが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗増殖活性を保持することが判明した。各実験において、用いた抗体サンプルは、次の通りであった：Ｒ３４７対照、３９Ｓとトラスツズマブ、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ、及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ。
【図３０Ｂ】細胞株ＭＣＦ−７（ヒト浸潤性乳管腺癌）を用いた、リガンド依存性増殖アッセイを示す図であり、これにより、ＡＤＣＣ増強アフコシル化二重特異性抗体の全てが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗増殖活性を保持することが判明した。各実験において、用いた抗体サンプルは、次の通りであった：Ｒ３４７対照、３９Ｓとトラスツズマブ、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ、及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ。
【図３１Ａ】標的としてのＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と、操作ＮＫエフェクター細胞（安定的にＣＤ１６を発現する）を用いた、ＡＤＣＣ細胞傷害活性アッセイを示す図であり、これによって、アフコシル化二重特異性抗体の各々が、フコシル化糖型を有する同じ構築物と比較して、より強力なＡＤＣＣ活性を有することが判明した。用いた抗体サンプルは、次の通りであった：（１）Ｒ３４７対照、（２）トラスツズマブ、（３）トラスツズマブ＿ａＦｕｃ、（４）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、及び（５）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ。
【図３１Ｂ】標的としてのＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と、操作ＮＫエフェクター細胞（安定的にＣＤ１６を発現する）を用いた、ＡＤＣＣ細胞傷害活性アッセイを示す図であり、これによって、アフコシル化二重特異性抗体の各々が、フコシル化糖型を有する同じ構築物と比較して、より強力なＡＤＣＣ活性を有することが判明した。用いた抗体サンプルは、次の通りであった：（１）Ｒ３４７対照、（２）トラスツズマブ、（３）トラスツズマブ＿ａＦｕｃ、（４）Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、及び（５）Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ。
【図３１Ｃ】標的としてのＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と、操作ＮＫエフェクター細胞（安定的にＣＤ１６を発現する）を用いた、ＡＤＣＣ細胞傷害活性アッセイを示す図であり、これによって、アフコシル化二重特異性抗体の各々が、フコシル化糖型を有する同じ構築物と比較して、より強力なＡＤＣＣ活性を有することが判明した。用いた抗体サンプルは、次の通りであった：（１）Ｒ３４７対照、（２）トラスツズマブ、（３）トラスツズマブ＿ａＦｕｃ、（４）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ、及び（５）Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ＿ａＦｕｃ。
【図３２】ツブリシン１５０８ペイロードの構造を示す。右端のマレイミド基の二重結合は、システイン上に存在するチオール基と容易に反応して、安定した炭素−イオウ結合を形成する。
【図３３】誘導体化可能なプラットフォームとしてＢｓ２Ａｂ−ＦＣＣ構築物を用いた、例示的な部位特異的抗体薬剤共役プロセスを示す。このプロセスは、以下：（ａ）誘導体化可能なアミノ酸（例えば、システイン）のサイズ鎖のキャップを除去するステップ、（ｂ）酸化させるステップ、（ｃ）ペイロード（例えば、ツブリシンなどの細胞傷害剤）を共役するステップ、並びに（ｄ）共役剤及び非反応ペイロードを除去することにより、ポリッシュするステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本開示は、最適化抗ＨＥＲ２抗体、及びそのような最適化抗ＨＥＲ２抗体に由来する二重特異性抗体を提供する。また、こうした最適化抗ＨＥＲ２抗体又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含む、関連のポリヌクレオチド、ベクター、及び医薬組成物も提供される。こうした最適化抗ＨＥＲ２抗体又は二重特異性抗体を作製する方法も提供される。さらに、本開示は、最適化抗ＨＥＲ２抗体又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を使用する方法、例えば、それが必要な被験者の癌を治療する方法も提供する。
【００５５】
本開示はまた、最適化抗ＨＥＲ２抗体から得られる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及びこのような最適化抗ＨＥＲ２抗体から得られる二重特異性抗体も提供する。さらに、こうした最適化抗体由来のＡＤＣ及び二重特異性抗体を作製する方法も提供される。さらにまた、最適化抗ＨＥＲ２抗体由来のＡＤＣ及び二重特異性抗体を使用する方法、例えば、それが必要な被験者における癌を治療する方法も提供される。さらには、化学療法に対して耐性の癌（例えば、Ｔ−ＤＭ１不応答患者又は低応答患者における腫瘍）を有する患者を治療するための；再発、難治性、又は他の療法、特に単一特異性ＡＤＣ療法（例えば、Ｔ−ＤＭ１）による治療に対して不適格な患者を治療するための；あるいは、他の療法（例えば、Ｔ−ＤＭ１）による前処置後に患者を治療するための方法も提供される。
【００５６】
特に、本開示は、低レベルのＨＥＲ２を発現する癌を治療するのに好適な抗ＨＥＲ２結合分子を提供する。
【００５７】
本発明を容易に理解することができるようするために、初めにいくつかの用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載する。
【００５８】
１．定義
本発明を詳しく説明する前に、本発明が、具体的な組成物又はプロセスステップに限定されず、従って、変化し得ることは理解すべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明白に他の意味に解釈すべき場合を除いて、複数の指示対象を包含する。用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、並びに用語「１つ又は複数の」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において置き換え可能に用いることができる。
【００５９】
さらに、「及び／又は」は、本明細書で用いられる場合、２つの指定された特徴若しくは成分の各々の、他方を伴う、又は伴わない具体的な開示として理解すべきである。従って、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」のようなフレーズに用いられる用語及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ（のみ）」、並びに「Ｂ（のみ）」を包含することが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」のようなフレーズに用いられる用語「及び／又は」は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；並びにＣ（のみ）の各々を包含することが意図される。
【００６０】
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語は全て、本開示が関連する分野の通常の技術者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の総合的辞書を提供する。
【００６１】
単位、接頭辞、及び符号は、国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）承認の形態で示す。数値の範囲は、範囲を定める数を包含する。他に指示のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で、左から右へと記載される。本明細書に記載する見出しは、様々な態様の限定ではなく、本明細書の参照により、全体として包含され得るものである。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書の参照により、その全体がさらに詳細に定義される。
【００６２】
本明細書において、用語「含む（こと）」と一緒に態様が記載されているか否かにかかわらず、「〜から構成される」及び／又は「〜から本質的に構成される」に関して記載される、他の類似の態様も提供される。
【００６３】
本明細書において、アミノ酸は、一般に知られているそれらの３文字符号又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される１文字符号のいずれかによって示される。同様に、ヌクレオチドもその一般に認知されている一文字略号で示される。
【００６４】
用語「ＨＥＲ２」及び「ＨＥＲ２受容体」は、本明細書において置き換え可能に用いられ、ＥｒｂＢ２タンパク質と呼ばれる（文献ではＨＥＲ２／ｎｅｕとも呼ばれる）。本明細書で用いる場合、これらの用語は、ＨＥＲ２の変異体（例えば、スプライス変異体）、アイソフォーム、及び相同体（オルソログ及びパラログの両方）を包含することが意図される。一部の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子とＨＥＲ２との結合は、ＨＥＲ２と他のＥｒｂＢファミリーメンバー同士のヘテロマー複合体の形成を阻害する、例えば、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を阻害することによって、ＨＥＲ２を発現する細胞（すなわち、典型的に、腫瘍細胞、また特に、低レベルのＨＥＲ２を発現する癌細胞）の増殖を阻害する。
【００６５】
ＨＥＲ２は、受容体チロシンキナーゼであり、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなるが、ドメインは、以下（ｉ）リガンド結合を担う２つのロイシンリッチドメイン（ドメインＩ／Ｌ１及びドメインＩＩＩ／Ｌ２）、並びに（ｉｉ）受容体二量体化を担う２つのシトシンリッチドメイン（ドメインＩＩ／ＣＲ１及びドメインＩＶ／ＣＲ２）；膜貫通ドメイン；並びに細胞内チロシンキナーゼドメインから構成される。ＨＥＲ２の別のスプライス変異体も存在する。ＨＥＲ２の別のスプライス変異体の例として、ｐ１００及びハースタチン（２つの可溶性形態）、並びに６１１−ＣＴＦ、６８７−ＣＴＦ、６４８−ＣＴＦ及びΔ１６ＨＥＲ２が挙げられる。ＨＥＲ２の可溶性形態は、完全長受容体（ｐ１８５）と相互作用して、受容体二量体化を阻害することができ；６８７−ＣＴＦは、不活性であり；６１１−ＣＴＦと６４８−ＣＴＦは、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を活性化することができ；Δ１６ＨＥＲ２は、ドメインＩＶにアミノ酸６３４〜６４９が欠失しており、このことが、構成的に活性化したＨＥＲ２ホモ二量体の形成を促進する配座の変化を誘導する。成熟ＨＥＲ２の外側部分は、シグナル配列がなく、標準アイソフォーム１の２３〜６５２位に対応する（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０４６２６を参照；また、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｆａｂ．”Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７５６−７６０（２００３）も参照のこと；これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペルツズマブ抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内のエピトープに結合する。ドメインＩＩ内のペルツズマブ結合エピトープに結合しない抗体として、トラスツズマブがあり、これは、ドメインＩＶ内のエピトープに結合する。
【００６６】
用語「阻害する」、「阻止する」、及び「抑制する」は、本明細書において置き換え可能に用いられ、あらゆる統計的に有意な生物活性の低減（活性の完全な阻止を含む）を指す。例えば、「阻害」は、生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の低減を示し得る。従って、用語「阻止」又は「抑制」が、リガンド媒介のＨＥＲ２リン酸化に対する作用を表すために使用される場合、この用語は、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を含むＨＥＲ２結合分子が、非処置（対照）細胞でのリン酸化と比較して、ＥＧＦ様リガンドにより誘導されるＨＥＲ２のリン酸化を統計的に有意に低減する能力を指す。
【００６７】
ＨＥＲ２を発現する細胞は、天然に存在する細胞若しくは細胞株（例えば、癌細胞）であってもよいし、又はＨＥＲ２をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって組換えにより作製することもできる。一態様では、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を含むＨＥＲ２結合分子は、ウェスタンブロッティング、それに続く抗ホスホチロシン抗体でのプロービング、又はＥＬＩＳＡにより測定して、ＨＥＲ２のリガンド媒介リン酸化を少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０５、又は約１００％阻害する。
【００６８】
本明細書で用いるとき、ＨＥＲ２を発現する細胞の「増殖抑制」又は「増殖阻害」という用語は、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を含むＨＥＲ２結合分子が、抗ＨＥＲ２結合分子の非存在下での増殖と比較して、ＨＥＲ２を発現する細胞の増殖を統計的に有意に低減する能力を指す。一態様では、ＨＥＲ２を発現する細胞（例えば、癌細胞）の増殖は、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を含むＨＥＲ２結合分子と細胞を接触させたとき、抗ＨＥＲ２結合分子の非存在下で測定される増殖（対照条件）に対して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％低減することができる。細胞増殖は、例えば、生存細胞の数を計数する、増殖マーカのマーカの存在を検出する、分子（例えば、3Ｈ−チミジンなどの放射性標識分子）の組み込みを測定することにより、腫瘍のサイズ（例えば、体積若しくは重量基準で）を測定することなどにより、当該技術分野で公知の様々な方法に従い測定することができる。いくつかの態様では、増殖抑制は、転移の数、サイズ、又は分布の減少を指す。
【００６９】
本明細書の全体を通して用いられるように、フレーズ「抗ＨＥＲ２結合分子」は、例えば、以下：（ｉ）本願に開示する１．３９．１抗体（国際公開第２００８／０１９２９０号パンフレットを参照）と同じか、若しくはこれに由来するエピトープに結合する抗体及び抗原結合断片、例えば、３９Ｓ抗体及びその抗原結合断片、並びに一般に、そのような抗体及びその抗原結合断片を含む分子；（ｉｉ）別の抗原結合部分を組み込む３９Ｓ抗体、例えば、二重特異性抗体と同じか、若しくはこれに由来するエピトープに結合する抗ＨＥＲ２抗体及び他のＨＥＲ２−結合分子；（ｉｉｉ）細胞傷害性部分（例えば、小分子抗癌剤、放射性核種など）に共役した（ｉ）又は（ｉｉ）の分子の少なくとも１つを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、並びに（ｉｖ）増強したＡＤＣＣを有する（ｉ）又は（ｉｉ）の抗ＨＥＲ２分子を指す。本明細書で用いる場合、用語「３９Ｓ抗体」は、国際公開第２００８／０１９２９０号パンフレットに開示されている１．３９．１抗体に由来するリード最適化モノクローナル抗体を指し、ここで、前記最適化抗体は、配列番号１５のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号１６のアミノ酸を含むＶＬを含む。
【００７０】
本明細書で用いられるように、用語「ツブリシン」は、集合的及び個別の両方で、天然に存在するツブリシン、並びにツブリシンの類似体及び誘導体を指す。説明のためのツブリシンの例は、例えば、国際公開第２００４００５３２６Ａ２号、同第２０１２０１９１２３Ａ１号パンフレット、同第２００９１３４２７９Ａ１号パンフレット、同第２００９０５５５６２Ａ１号パンフレット、同第２００４００５３２７Ａ１号パンフレット、米国特許第７７５４８８５号明細書、同第２０１００２４０７０１号明細書、同第７８１６３７７号明細書、同第２０１１００２１５６８号明細書、及び同第２０１１０２６３６５０号明細書、並びにこれらに記載されている実施例に開示されている。こうした誘導体が、例えば、ツブリシンプロドラッグ、又は１つ又は複数の保護若しくは保護基、１つ又は複数の結合部分を含むツブリシンを包含することは、理解すべきである。
【００７１】
細胞分裂の速度、及び／又は細胞集団内の細胞分裂中の細胞の割合、及び／又は最終分化若しくは細胞死（例えば、チミジン組み込み）による細胞集団からの細胞消失の速度を測定する、当該技術分野で認定されている技術を用いて、細胞の増殖をアッセイすることができる。
【００７２】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、本明細書で置き換え可能に用いられ、全抗体及びそれらの任意の抗原結合断片又は一本鎖並びにこれらの組み合わせ（例えば、二重特異性抗体）を含む。
【００７３】
典型的な抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略称する）と重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略称する）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、１つの軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略称する）と、１つの軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変性の領域にさらに細分することができ、これらの領域には、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＷから構成され、これらは、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４の順に、アミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと宿主組織又は因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）など）の結合を媒介することができる。本開示の例示的な抗体として、典型的な抗体、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせが挙げられ、ここで、例えば、ｓｃＦｖは、典型的な抗体の重鎖及び／又は軽鎖のいずれかのＮ−末端に共有結合している（例えば、ペプチド結合若しくは化学リンカーを介して）か、あるいは、典型的な抗体の重鎖及び／又は軽鎖中に挿入されている。
【００７４】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子を意味し、これは、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はこれらの組み合わせなどの標的を認識して、これに特異的に結合する。本明細書で用いる場合、用語「抗体」は、以下のものを包含する：インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ、多重特異性抗体（少なくとも２つのインタクトな抗体及び／若しくはその抗原結合断片から作製された二重特異性抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、並びに抗体が所望の生物活性を呈示する限りにおいて抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子。
【００７５】
抗体は、その重鎖定常ドメインのアイデンティティー（それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる）に基づいて、５つの主要クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる公知のサブユニット構造及び３次元構成を有する。抗体は、ネイキッドであってもよいし、毒素、放射性同位体などの他の分子と共役させて、ＡＤＣを形成してもよい。
【００７６】
「阻止」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原（例えば、ＨＥＲ２など）の生物活性を阻害又は低減するものである。いくつかの態様では、阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的又は完全に阻害する。望ましくは、生物活性は、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは実に１００％低減される。
【００７７】
用語「抗ＨＥＲ２抗体」又は「抗ＨＥＲ２」は、抗体が、ＨＥＲ２をターゲティングする上で治療薬又は診断試薬として有用であるのに十分な親和性で、ＨＥＲ２に結合することができる抗体を指す。抗ＨＥＲ２抗体と非関連の非ＨＥＲ２タンパク質との結合の程度は、例えば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、又はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（検体として組換えＨＥＲ２を用い、リガンドとして抗体を用いるか、若しくはその逆）、又は当該技術分野で公知の他の結合アッセイにより測定して、抗体とＨＥＲ２との結合の約１０％未満である。いくつかの態様では、ＨＥＲ２に結合する抗体は、解離定数（ＫD）≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、又は≦０．１ｐＭを有する。
【００７８】
用語「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の１部分を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。当該技術分野では、抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることがわかっている。抗体断片の例として、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、線状抗体、一本鎖抗体、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００７９】
「モノクローナル抗体」は、単一抗原決定基、又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均一抗体集団を指す。これは、異なる抗原決定基に対して指令された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体とは対照的である。
【００８０】
用語「モノクローナル抗体」は、インタクトな抗体及び完全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定はしないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物による方法（例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の発現）などの任意の数の方法で作製された抗体を指す。
【００８１】
用語「ヒト化抗体」は、最小非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するように操作された非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲからの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、若しくはハムスター）のＣＤＲからの残基によって置換されたヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。いくつかの実例では、ヒト免疫グロブリンのＦＷ残基は、所望の特異性、及び／又は親和性、及び／又は能力を有する非ヒト種由来の抗体において対応する残基で置換する。
【００８２】
ヒト化抗体は、抗体特異性、及び／又は親和性、及び／又は能力を改善及び最適化するために、ＦＷ領域内及び／又は置換された非ヒト残基内のいずれかでの別の残基の置換によってさらに修飾することもできる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全部若しくは実質的に全部を含有する、少なくとも１つ、典型的には、２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全部を含むのに対し、ＦＷ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも１部分を含んでもよい。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書に記載されている。
【００８３】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を単独で指すか、又はそれらの組み合わせを指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、３つのＣＤＲ領域によって連結された４つのＦＷ領域から構成される。各鎖のＣＤＲは、ＦＷ領域により互いに接近して、且つ他の鎖からのＣＤＲと一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するためには、少なくとも２つの技術がある：（１）種間配列変化に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。さらに、ＣＤＲを決定するために、これら２つのアプローチの組み合わせが用いられることもある。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般に、可変ドメインの１残基（概ね軽鎖の残基１〜１０７と重鎖の残基１〜１１３）を指すとき使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
【００８４】
フレーズ「Ｋａｂａｔに従うアミノ酸位置番号付け」、「Ｋａｂａｔ位置」、及びそれらの文法上の変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いて、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそれらへの挿入に対応する、より少ない又は追加的アミノ酸を含有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入片（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を、また、重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。
【００８５】
【表１】
2017512765.tif 000002
【００８６】
残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列と抗体の配列の相同性の領域でのアラインメントにより決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは、これに代わって、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ−Ｈ１ループの終点は、Ｋａｂａｔ番号付けの取り決めを用いて番号付けすると、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、Ｈ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を配置するためであり；もし、３５Ａ及び３５Ｂのいずれも存在しなければ、ループは３２で終結する；もし、３５Ａのみが存在すれば、ループは３３で終結する；もし、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在すれば、ループは３４で終結する）。ＡｂＭ高度可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの折衷物を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。
【００８７】
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）もまた、ＣＤＲなどの免疫グロブリン可変領域の番号付けシステムを提供している。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＩＭＧＴ番号付けシステムは、５，０００を超える配列のアラインメント、構造データ、及び高度可変ループの特性決定に基づいており、全ての種の可変及びＣＤＲ領域の容易な比較を可能にする。ＩＭＧＴ番号付けスキームによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は、２６〜３５位であり、ＶＨ−ＣＤＲ２は、５１〜５７位であり、ＶＨ−ＣＤＲ３は、９３〜１０２位であり、ＶＬ−ＣＤＲ１は、２７〜３２位であり、ＶＬ−ＣＤＲ２は、５０〜５２位であり、ＶＬ−ＣＤＲ３は、８９〜９７位である。
【００８８】
本発明で論じる全ての重鎖定常領域アミノ酸位置については、番号付けは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８−８５において最初に記載されたＥＵインデックスに従うが、これは、配列決定された最初のヒトｌｇＧ１である、骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載している。ＥｄｅｌｍａｎらのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａにも記載されている。従って、フレーズ「Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックス」又は「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」及び「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う位置・・・」、並びにこれらの文法上の変形は、Ｋａｂａｔ  １９９１に記載されているＥｄｅｌｍａｎらのヒトｌｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。
【００８９】
可変ドメイン（重鎖及び軽鎖の両方）並びに軽鎖定常領域アミノ酸配列に用いられる番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ  １９９１に記載されているものである。
【００９０】
本明細書で用いる場合、Ｆｃ領域は、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインのＮ末端側のフレキシブルなヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、Ｆｃは、Ｊ鎖を包含し得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）並びにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジを含む。
【００９１】
Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端側に残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むことが定義され、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、分離したこの領域、又は抗体、抗体断片、又はＦｃ融合タンパク質に関連する上記領域を示し得る。
【００９２】
抗体の定常領域内のいくつかの異なる位置（例えば、限定はしないが、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる番号付けで、２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８位などのＦｃ位置）に多型が認められていることから、表示する配列と、従来技術での配列との間に若干の差が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在のところ、１８のＧｍアロタイプがわかっている：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）又はＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）又はＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ３、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．４３−７８（１９９０）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．：５０，１９９−２１１）。本発明の抗体は、任意のアロタイプ、イソアロタイプ、又は任意の免疫グロブリン遺伝子のハロタイプを含有してもよく、これらが、本明細書に記載する配列のアロタイプ、イソアロタイプ、又はハロタイプに限定されないことは、特に考慮される。
【００９３】
用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体、又は当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、培養細胞における組換え体発現、又はトランスジェニック動物における発現）を用いて作製された、ヒトにより産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。従って、ヒト抗体という用語は、本来ヒトにより産生されるが、非ヒト系において発現される（例えば、化学合成により生成される；組換えにより微生物、哺乳動物、若しくは昆虫細胞に発現される；又は動物被験者に発現される）抗体（又はその操作された変異体若しくは誘導体）に対応するアミノ酸配列を有する抗体も包含する。従って、ヒト被験者から、又はヒト細胞（例えば、組換え抗体若しくはその断片を発現するハイブリドーマ又は細胞株）から取得した後、動物、例えば、マウスに発現させた抗体は、ヒト抗体と考えられる。このヒト抗体の定義は、インタクトな若しくは完全長抗体、その断片、並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体（例えば、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体）を包含する。
【００９４】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、２つ以上の動物種に由来する抗体を指す。典型的に、軽鎖及び重鎖両方の可変領域は、所望の特異性、及び／又は親和性、及び／又は能力を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の１種に由来する抗体の可変領域に対応するが、定常領域は、別の種（通常、ヒト）に由来する抗体の配列と相同的であり、これによって、当該種における免疫応答の誘発を回避する。
【００９５】
本明細書で用いる用語「エピトープ」は、本明細書に開示するＨＥＲ２抗体又はＨＥＲ２結合分子に結合することができる抗原タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性の表面分子集団から構成され、通常、固有の三次元構造特性、並びに固有の電荷特性を有する。エピトープを認識する抗体又は結合分子の部分は、パラトープと呼ばれる。タンパク質抗原のエピトープは、それらの構造及びパラトープとの相互作用に基づいて、２つのカテゴリー、すなわち立体構造エピトープと線状エピトープに分けられる。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続の区間から構成される。これらのエピトープは、抗原の３次元表面特徴及び形状又は三次構造に基づいて、パラトープと相互作用する。対照的に、線状エピトープは、その一次構造に基づいてパラトープと相互作用する。線状エピトープは、抗原からのアミノ酸の連続的配列によって形成される。
【００９６】
用語「抗体結合部位」は、相補性抗体が特異的に結合する連続的又は不連続的部位（すなわち、エピトープ）を含む抗原（例えば、ＨＥＲ２）中の領域を指す。このように、抗体結合部位は、抗原中に、エピトープ以外の別の領域を含有することができ、これは、結合親和性及び／又は安定性などの特性を決定するか、又は抗原酵素活性若しくは二量体化などの特性に影響を与え得る。従って、２つの抗体が抗原内の同じエピトープに結合する場合であっても、抗体分子が、エピトープ外側のアミノ酸と個別の分子内接触を確立すれば、このような抗体は、個別の抗体結合部位と結合すると考えられる。
【００９７】
「結合親和性」は、概して、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）同士の非共有結合相互作用の総和の力を指す。他に指示のない限り、本明細書で用いる「結合親和性」は、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー同士の１：１相互作用を表す固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫD）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載するものなど、当該技術分野で公知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は、概して、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、概して、より高速で抗原に結合し、より長時間にわたって結合した状態を維持する傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野において公知であり、そのいずれを本開示の目的のために用いてもよい。
【００９８】
「効力」は、他に記載のない限り、通常、ＩＣ50値としてｎＭで表される。ＩＣ50は、抗原結合分子の阻害濃度中央値である。機能性アッセイでは、ＩＣ50は、生物学的応答をその最大値の５０％低減する濃度である。リガンド結合試験の場合、ＩＣ50は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低減する濃度である。ＩＣ50は、当該技術分野で知られる任意の数の手段によって計算することができる。効力の改善は、例えば、３９Ｓ親抗体に対して、測定することにより決定することができる。
【００９９】
本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子の効力の倍率改善（例えば、３９Ｓ親抗体、トラスツズマブ、又はこれらの組み合わせと比較して）は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、又は少なくとも約１８０倍又はそれ以上であってよい。
【０１００】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、細胞傷害性の一形態を指し、この場合、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌免疫グロブリンは、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原担持標的細胞に特異的に結合した後、細胞毒で標的細胞を殺傷することを可能にする。標的細胞の表面に向けられた特定の高度親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を「武装させる（ａｒｍ）」ため、こうした殺傷には必ず必要とされる。標的細胞の溶解は、細胞外であり、直接の細胞−細胞接触を必要とし、補体を必要としない。抗体以外に、Ｆｃ領域を含む他のタンパク質、特にＦｃ融合タンパク質も、抗原担持標的細胞と特異的に結合する能力を有し、細胞媒介性細胞傷害を引き起こすことができるであろうことが考えられる。簡略化のために、Ｆｃ融合タンパク質の活性から生じる細胞媒介性細胞傷害も、本明細書ではＡＤＣＣ活性と呼ぶ。
【０１０１】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、自然界でみいだされない形態であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物は、それらが自然界でみいだされる形態ではない程度まで精製されたものを含む。一部の態様では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。
【０１０２】
用語「被験者」は、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、限定はしないが、特定の治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含む。典型的に、「被験者」及び「患者」という用語は、ヒト被験者に関して述べる場合、本明細書において置き換え可能に用いられる。
【０１０３】
用語「医薬組成物」は、活性成分（例えば、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子）の生物活性が有効であることを可能にするような形態であり、且つ、組成物が投与される被験者に対して許容不可能なほど有毒な別の成分を含有しない製剤を指す。このような組成物は、無菌であってよい。
【０１０４】
本明細書で開示する抗ＨＥＲ２結合分子の「有効量」は、具体的に記載される目的を達成する上で十分な量である。「有効量」は、実験により、並びに記載の目的に関する常用の方法で、決定することができる。
【０１０５】
用語「治療に有効な量」は、被験者又は哺乳動物の疾患若しくは障害を「治療する」上で有効な、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子又は他の薬物の量を指す。
【０１０６】
用語「標識」は、本明細書で用いられるとき、「標識された」抗ＨＥＲ２結合分子を作製するために、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子に直接若しくは間接的に共役させた検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であってもよいし（例えば、放射性同位体標識若しくは蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学的改変を触媒することができる。
【０１０７】
「誘導体化可能な基」及び「誘導体化可能な官能基」のような用語は、置き換え可能に用いられ、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、ＨＥＲ２抗体）と別の物質同士の共有結合の形成を可能にするように反応することができる官能基を指す。一部の態様では、このような物質は、治療部分（例えば、細胞毒）、検出可能な標識、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）などである。誘導体化可能な基の例として、チオール、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、及びアミド、並びにこれらの修飾形態、例えば、活性化又は保護形態が挙げられる。
【０１０８】
「治療する（こと）」又は「治療」又は「治療すること」又は「緩和する（こと）」又は「緩和すること」のような用語は、（１）診断された病状又は障害を治癒する、その進行を緩徐にする、その症状を軽減する、及び／若しくはその進行を停止する治療的措置、並びに（２）対象とする病状又は障害の発生を予防及び／若しくは遅らせる予防若しくは防止措置の両方を指す。従って、治療が必要な者は、障害を既に有する者；障害に罹患しやすい者；及び障害を予防しようとする者を含む。いくつかの態様では、当該患者が、例えば、特定のタイプの癌の完全、部分的、又は一時的寛解を示す場合、本開示の方法に従って、被験者の癌は首尾よく「治療」されている。
【０１０９】
「癌」、「腫瘍」、「癌性」、及び「悪性」は、典型的に、非制御細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、又はそれを表す。癌の例として、限定はしないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病などの癌腫が挙げられる。このような癌のさらに具体的な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸部癌、卵巣癌、肝細胞癌及び肝癌などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌（ホルモン媒介性乳癌、例えば、Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１０５７−１０６５を参照）、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液線癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、様々なタイプの頭部及び頚部癌、並びに粘液を起源とする癌、例えば、粘液性卵巣癌、胆管癌（肝臓）及び乳頭状腎細胞癌が挙げられる。一部の態様では、本明細書で用いる癌という用語は、具体的に、ＨＥＲ２を発現する癌を指す。一部の特定の態様では、癌という用語は、具体的に、低レベルのＨＥＲ２を発現する癌を指す。
【０１１０】
本明細書で用いる「低レベルのＨＥＲ２」は、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）分類を用いて、２＋未満のスコア（例えば、１＋）を示す癌細胞、被験者、若しくは患者、又は例えば、ＦＩＳＨによりそのように判定された癌、癌細胞、被験者、若しくは患者を指す。
【０１１１】
癌におけるＨＥＲ２発現を決定するために、様々な診断／予後予測アッセイが利用可能である。一態様では、ＨＥＲ２過剰発現は、ＩＨＣにより、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を用いて分析することができる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織片をＩＨＣアッセイに付した後、以下のようなＨＥＲ２タンパク質染色強度基準を付与することができる／これに代わり、又は加えて、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚ．により販売）又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，ＩＩ１．）などのＦＩＳＨアッセイをホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織に実施して、腫瘍におけるＨＥＲ２過剰発現の程度（もしあれば）を決定することができる。
【０１１２】
「低い」は、正常より低い、既定の基準又は別の亜群基準よりも相対的に低い亜群基準などの標準より低い基準を指す。例えば、低いＨＥＲ２は、ＨＥＲ２陽性の患者の特定のサンプル群において正常なＨＥＲ２基準よりも低いＨＥＲ２の基準を意味する。正常なＨＥＲ２基準は、当業者が利用可能な任意の方法に従って決定することができる。また、低いＨＥＲ２は、既定の基準、例えば、既定のカットオフよりも低いＨＥＲ２の基準も意味し得る。さらに、低いＨＥＲ２は、低いＨＥＲ２亜群が、別の亜群よりも相対的に低い基準を意味する場合もある。例えば、限定はしないが、本明細書に従い、サンプルを数学的に決定した地点、例えば、限定はしないが、中央値の周辺で分割し、これにより、その基準が高い別の群に対して、基準が低い（すなわち、中央値に満たない）群を形成することによって、２つの異なる患者亜群を形成することができる。ＨＥＲ２は、当業者には周知の任意の方法により、例えば、限定はしないが、ｅＴａｇ法を用いて、又はＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）のような任意の標準的ＩＨＣ法を用いて測定することができる。別の例として、低レベルのＨＥＲ２は、低レベルのＨＥＲ２ホモ二量体を指し、これは、ＨＥＲ２陽性の特定のサンプル又は患者群におけるＨＥＲ２ホモ二量体の正常な基準よりも低いＨＥＲ２ホモ二量体の基準を意味する。低ＨＥＲ２ホモ二量体は、既定の基準、例えば、既定のカットオフより低いＨＥＲ２の基準を意味する場合もある。さらに、低ＨＥＲ２ホモ二量体は、低ＨＥＲ２ホモ二量体亜群が、別の亜群より相対的に低い基準を意味する場合もある。ＨＥＲ２ホモ二量体は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、二量体特異的抗体若しくはｅＴａｇ又は当業者には周知の他の任意の方法により測定することができる。
【０１１３】
本明細書で用いる場合、用語「癌腫」は、上皮細胞の癌を指し、上皮細胞は、身体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である。癌腫の例として、皮膚、肺、結腸、胃、乳房、前立腺及び甲状腺の癌がある。
【０１１４】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書において置き換え可能に用いられ、あらゆる長さのヌクレオチドからなるポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込まれ得る任意の物質であってよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド又はそれらの類似体を含んでもよい。以上の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０１１５】
用語「ベクター」は、宿主細胞に１つ又は複数の目的の遺伝子若しくは配列を送達する、並びに一部の態様では、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例として、限定はしないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソーム、及びプロデューサー細胞のような特定の真核細胞にカプセル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。
【０１１６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において置き換え可能に用いられ、あらゆる長さのアミノ酸からなるポリマーを指す。ポリマーは、線状又は分岐状のいずれであってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって分断されていてもよい。上記用語は、天然に、又は介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の任意の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との共役により、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義には、例えば、アミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸など）、並びに当該技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本開示のポリペプチドは、特定の態様において、抗体を基材とすることから、ポリペプチドは、一本鎖又は結合鎖として存在してもよい。
【０１１７】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により作製されるポリペプチド又はタンパク質を指す。操作宿主細胞に発現される組換え作製ポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術により分離、分画、又は部分的若しくは実質的に精製されたネイティブ若しくは組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために、単離されていると考えられる。本明細書に開示するポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて、組換えにより作製することができる。あるいは、本明細書に開示するタンパク質及びペプチドは、化学的に合成することができる。
【０１１８】
別に指定のない限り、用語「置換された」は、本明細書において、細胞傷害性薬剤、すなわちツブリシンの化学構造に対する修飾に関連して用いられる場合、１つ又は複数の置換基を担持する親基に関する。用語「置換基」は、本明細書において、一般的意味で用いられ、親基に共有結合した、又は適切であれば、融合した化学部分を指す。多種多様な置換基が知られており、その形成方法、並びに様々な親基への導入方法もよく知られている。化学置換基の例については、以下にさらに詳しく説明する。
【０１１９】
フレーズ「任意選択で置換された」は、本明細書において、細胞傷害性薬剤の化学構造に対する修飾に関連して用いられる場合、親基に関し、親基は、置換されていなくても、置換されていてもよい。
【０１２０】
用語「置換された」、「アミノ酸置換」などは、本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられる場合、親ポリペプチドに存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成により、又は当該技術分野で公知の組換え法によって、親ポリペプチド内で置換することができる。従って、「位置Ｘでの置換」又は「位置Ｘでの置換」と言うとき、位置Ｘに存在するアミノ酸の別のアミノ酸残基による置換を指す。一部の態様では、置換パターンは、スキームＡＸＹ（Ａは、位置Ｘに天然に存在するアミノ酸に対応する一文字符号であり、Ｙは、置換アミノ酸残基である）に従い表すことができる。従って、Ｌ２３４Ｆは、２３４位のロイシンアミノ酸（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換を指す。別の態様では、置換パターンは、スキームＸＹ（Ｙは、位置Ｘに天然に存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字符号である）に従い表すことができる。従って、２３９Ｃは、２３９位のネイティブアミノ酸のシステイン（Ｃ）による置換を指す。
【０１２１】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このように、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置換されている場合、置換は、保存的であると考えられる。別の態様では、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に類似した鎖で、保存的に置換することができる。
【０１２２】
非保存的アミノ酸置換としては、以下：（ｉ）陽電性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ若しくはＬｙｓ）で、陰電性残基（例えば、Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ）を置換するか、又はその逆、（ｉｉ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）で、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ若しくはＶａｌ）を置換するか、又はその逆、（ｉｉｉ）システイン若しくはプロリンで他の任意の残基を置換するか、又はその逆、あるいは（ｉｖ）嵩高の疎水性若しくは芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ若しくはＴｒｐ）で、より小さな側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）若しくは側鎖のないもの（例えば、Ｇｌｙ）を置換するか、又はその逆の置換が挙げられる。
【０１２３】
他のアミノ酸置換は、通常の技術者が容易に認識することができる。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システイン及びＤ−システインのいずれか１つから選択することができる。リシンの場合、置換は、Ｄ−リシン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オミチン、又はＤ−オルニチンのいずれか１つであってよい。概して、単離ポリペプチドの特性に変化を誘導すると予想することができる機能的に重要な置換は、以下のものである：（ｉ）極性残基、例えば、セリン若しくはトレオニンで、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、若しくはアラニンを置換する（又はその逆）；（ｉｉ）システイン残基で他の任意の残基を置換する（又はその逆）；（ｉｉｉ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン若しくはヒスチジンで、陰電性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸を置換する（又はその逆）；あるいは、（ｉｖ）嵩高の側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンで、そのような側鎖のないもの、例えば、グリシンを置換する（又はその逆）。以上の非保存的置換の１つが、タンパク質の機能的特性を改変する可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置とも相関する：従って、非保存的置換には、生物学的特性にほとんど又は全く影響を与えないものもある。
【０１２４】
用語「アミノ酸挿入」は、親配列に存在する２つのアミノ酸残基の間に新しいアミノ酸残基を導入することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成により、又は当該技術分野で公知の組換え法によって、親配列に挿入することができる。従って、本明細書で用いられる場合、フレーズ「位置Ｘ及びＹの間の挿入」又は「Ｋａｂａｔ位置Ｘ及びＹの間の挿入」（Ｘ及びＹは、アミノ酸位置に対応する）（例えば、２３９位と２４０位の間のシステインアミノ酸挿入）は、Ｘ及びＹ位置の間のアミノ酸の挿入を指し、さらに、核酸配列において、位置Ｘ及びＹのアミノ酸をコードするコドンの間への、１アミノ酸をコードするコドンの挿入も指す。挿入パターンは、スキームＡＸｉｎｓに従い表すことができ、ここで、Ａは、挿入されるアミノ酸に対応する一文字符号であり、Ｘは、挿入の前の位置である。従って、Ｃ２３９ｉｎｓは、２３９位の後のシステインアミノ酸（Ｃ）の挿入（すなわち、２３９位と２４０位の間の挿入）を指す。
【０１２５】
２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列同士の「配列同一性（％）」という用語は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入しなければならない付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を考慮に入れて、比較ウィンドウにわたって両配列により共有される、同一のマッチする位置の数を指す。マッチする位置は、同一ヌクレオチド又はアミノ酸が、標的及び参照配列の両方に呈示されるあらゆる位置である。ギャップは、ヌクレオチド又はアミノ酸ではないため、標的配列に呈示されるギャップは計数されない。同様に、参照配列からのヌクレオチド又はアミノ酸ではなく、標的配列ヌクレオチド又はアミノ酸が計数されることから、参照配列に呈示されるギャップは計数されない。
【０１２６】
配列同一性のパーセンテージは、両配列中に同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を取得し、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算する。配列の比較、及び２つの配列同士の配列同一性（％）の決定は、オンライン使用及びダウンロード用の両方で容易に入手可能なソフトウェアを用いて達成することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々なソースから、また、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントについて入手可能である。配列同一性（％）を決定する１つの好適なプログラムは、米国国立バイオテクノロジーセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて、２つの配列の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸を比較するのに用いられるのに対し、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するのに用いられる。他の好適なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒであり、これは、バイオインフォーマティックスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、欧州バイオインフォーマティックス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）からもｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａで入手可能である。
【０１２７】
ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列とアラインメントする単一のポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の様々な領域は各々、それら独自の配列同一性（％）を有し得る。配列同一性（％）の値は、少数第１位までに四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に四捨五入され、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に四捨五入される。また、長さの値は常に整数であることにも留意されたい。
【０１２８】
いくつかの態様では、第２アミノ酸に対する第１アミノ酸配列の同一性パーセンテージ「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここで、Ｙは、第１及び第２配列（目視検査又は特定の配列アラインメントプログラムによりアラインメントされる）において同一のマッチとして数えられるアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２配列中の残基の総数である。第１配列の長さが第２配列より長ければ、第２配列に対する第１配列の同一性（％）は、第１配列に対する第２配列の同一性（％）より高くなる。
【０１２９】
当業者であれば、配列同一性（％）の計算のための配列アラインメントの生成が、一次配列データによってのみ駆動されるバイナリ配列−配列比較に限定されないことは理解されよう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントから取得することができる。複数の配列アラインメントを生成する好適なプログラムの１つは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／．から入手可能なＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、これ以外に、例えば、ＥＢＩからも入手可能である。
【０１３０】
また、配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能性データ（例えば、突然変異の位置）、又は系統データなどの異種ソースからのデータと統合することによって生成することができることも理解されよう。多配列アラインメントを生成するために異種データを統合する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ、あるいは、それ以外にもＥＢＩから入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅである。さらにまた、配列の同一性（％）を計算するのに用いられる最終アラインメントは、自動又は手動のいずれかで精選することができることも理解されよう。
【０１３１】
ＩＩ．抗ＨＥＲ２結合分子
本開示は、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はそのＨＥＲ２結合断片を含む分子を提供する。
【０１３２】
ＨＥＲ２の完全長アミノ酸（ａａ）及びヌクレオチド（ｎｔ）配列は当該技術分野で公知である（例えば、ヒトＨＥＲ２については、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０４６２６を参照のこと）。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４（１９８６）；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−１１３９（１９８５）；Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２５９７−２６０１（１９８７）；Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６４９７−６５０１（１９８５）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４−９７６（１９８５）；Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：６１１−６１５（１９９３）；Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１１００５−１１０１８（２００５）；Ａｎｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２５：３２３４−３２４４（２００６）；  Ｂｉｒｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１３９９−１４０２（２００３）；Ｉｖａｎｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ２７：２０５−２１９（２００３）；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７５６−７６０（２００３）；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７−３２８（２００４）；Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１６１４（２００９）；Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１５０３９−１５０４４（２０１０）；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：５２５−５２６（２００４）；Ｇｒｅｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４６：１５３−１５８（２００７）；これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、抗体又はその抗原結合断片である。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はそのＨＥＲ２結合断片を含む分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）3、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ2、（ｓｃＦｖ）2、又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。一部の態様では、抗体は、ＩｇＧタイプ、例えば、ＩｇＧ１タイプのものである。
【０１３４】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、単一特異性である。他の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、二重特異性、三重特異性、四重特異性などである。他の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、多重特異性である。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、一価、二価、三価などである。また他の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、多価である。特定の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、二価であり、例えば、２つのＨＥＲ２に特異的な抗原結合部位を含む抗体である。特定の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、二重特異性であり、すなわち、分子は、２つの異なる抗原（例えば、同じ又は異なる分子上の２つの異なるエピトープ）に特異的に結合することができる。一部の特定の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、二価及び四価、例えば、２つの異なる抗原（例えば、同じ又は異なる分子上の２つの異なるエピトープ）に結合することができる４つの抗原結合部位を含む抗体である。
【０１３５】
いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、１．３９．１抗体（国際公開第２００８／０１９２９０号パンフレットを参照；これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）と実質的に同じ結合部位を有する抗体又はその抗原結合断片を含む。特定の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、配列番号５２の１つ又は複数のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、１．３９．１抗体の結合部位と重複する結合部位を有する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０１３６】
いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、親１．３９．１抗体（国際公開第２００８／０１９２９０号パンフレットを参照）のＶＨ（配列番号４３）及び／又はＶＬ（配列番号４４）と比較して修飾されたＶＨ及び／又はＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片を含む。親抗体に導入された修飾は、親１．３９．１抗体と比較して、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ領域及び／又はＦＷ領域に突然変異（例えば、点突然変異若しくは部分配列全体の置換）を含んでもよい。
【０１３７】
一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＨ−ＣＤＲ１（配列番号４５）は、配列番号１のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１で置換されている。一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＨ−ＣＤＲ１（配列番号４５）は、配列番号１のアミノ酸から構成されるＶＨ−ＣＤＲ１で置換されている。
【０１３８】
他の態様では、親１．３９．１抗体のＶＨ−ＣＤＲ３（配列番号４６）は、配列番号３のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３で置換されている。他の態様では、親１．３９．１抗体のＶＨ−ＣＤＲ３（配列番号４６）は、配列番号３のアミノ酸から構成されるＶＨ−ＣＤＲ３で置換されている。
【０１３９】
一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＨ−ＣＤＲ１（配列番号４５）及びＶＨ−ＣＤＲ３（配列番号４６）は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸及び配列番号３のアミノ酸を含む、又はそれから構成されるＶＨ−ＣＤＲ１及びＶＨ−ＣＤＲ３で置換されている。
【０１４０】
一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ−ＣＤＲ１（配列番号４７）は、配列番号４のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１で置換されている。一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ−ＣＤＲ１（配列番号３）は、配列番号４のアミノ酸から構成されるＶＨ−ＣＤＲ１で置換されている。
【０１４１】
一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ１領域（配列番号４８）は、配列番１１のアミノ酸を含むＶＬ  ＦＷ１で置換されている。一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ１領域（配列番号４８）は、配列番号１１のアミノ酸から構成されるＦＷ１で置換されている。
【０１４２】
他の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ２領域（配列番号４９）は、配列番１２のアミノ酸を含むＦＷ２で置換されている。他の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ２領域（配列番号４９）は、配列番号１２のアミノ酸から構成されるＦＷ２で置換されている。
【０１４３】
他の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ３領域（配列番号５０）は、配列番１３のアミノ酸を含むＦＷ３で置換されている。他の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ３領域（配列番号５０）は、配列番号１３のアミノ酸から構成されるＶＬ  ＦＷ２で置換されている。
【０１４４】
一部の態様では、親１．３９．１抗体のＶＬ  ＦＷ１領域（配列番号４８）及び／又はＦＷ２領域（配列番号４９）及び／又はＦＷ３領域（配列番号５０）は、独立に、配列番号１１、１２、若しくは１３のアミノ酸をそれぞれ含むか、又はそれから構成されるＦＷ１及び／又はＦＷ２及び／又はＦＷ３で置換されている。
【０１４５】
一部の態様では、本開示は、ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＨＥＲ２結合分子を提供する。一部の態様では、本開示は、ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、ＶＨ及びＶＬを含む抗ＨＥＲ２結合分子も提供する。一部の態様では、ＶＨが配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本明細書に開示される抗ＨＥＲ２結合分子は、抗体、又はそのＨＥＲ２結合断片を含む。
【０１４６】
いくつかの態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子は、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含み、ここで、結合分子は、以下：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３
を含む。
【０１４７】
いくつかの態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、抗体ＶＬと抗体ＶＨを含み、ここで、ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される参照ＶＬと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
他の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、抗体ＶＬと抗体ＶＨを含み、ここで、ＶＨは、配列番号１５のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される参照ＶＨと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
他の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、配列番号１６のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される参照ＶＬと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＬを含むと共に、配列番号１５のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される参照ＶＨと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＨをさらに含む。
【０１５０】
一部の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、重鎖定常領域又はその断片を含む。一部の特定の態様では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域である。ＩｇＧ定常領域は、κ定常領域とλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含み得る。
【０１５１】
いくつかの態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、１．３９．１親抗体とほぼ同じか、又は優れた親和性でＨＥＲ２に結合することができる。従って、一態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、１０-6Ｍ未満、又は１０-7Ｍ未満、又は１０-8Ｍ未満、又は１０-9Ｍ未満、又は１０-10Ｍ未満、又は１０-11Ｍ未満、又は１０-12Ｍ未満、又は１０-13Ｍ未満の解離定数、すなわちｋd（ｋoff／kon）で、ＨＥＲ２及びその抗原結合断片に特異的に結合する。
【０１５２】
別の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、１×１０-3ｓ-1未満、又は２×１０-3ｓ-1未満のｋoffで、ＨＥＲ２及び／又はその抗原結合断片に結合する。他の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、１０-3ｓ-1未満、５×１０-3ｓ-1未満、１０-4ｓ-1未満、５×１０-4ｓ-1未満、１０-5ｓ-1未満、５×１０-5ｓ-1未満、１０-6ｓ-1未満、５×１０-6ｓ-1未満、５×１０-7ｓ-1未満、１０-8ｓ-1未満、５×１０-8ｓ-1未満、１０-9ｓ-1未満、５×１０-9ｓ-1未満、又は１０-10ｓ-1未満のｋoffで、ＨＥＲ２及びその抗原結合断片に結合する。
【０１５３】
別の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２結合分子若しくはそのＨＥＲ２結合断片、又は二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）は、少なくとも１０5Ｍ-1ｓ-1、少なくとも５・１０5Ｍ-1ｓ-1、少なくとも１０6Ｍ-1ｓ-1、少なくとも５・１０6Ｍ-1ｓ-1、少なくとも１０7Ｍ-1ｓ-1、少なくとも５・１０7Ｍ-1ｓ-1、少なくとも１０8Ｍ-1ｓ-1、又は少なくとも１０9Ｍ-1ｓ-1の会合速度、すなわちＫonで、ＨＥＲ２及び／又はその抗原結合断片に結合する。
【０１５４】
他の態様では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、前述した配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％類似しており、１、２、３、４、５又はそれ以上の保存的置換を含む。配列番号１６のＶＨ領域及び／又は配列番号１５のＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上の）類似性をそれぞれ有するＶＨ及びＶＬ領域を有する本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、それぞれのコード核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定又はＰＣＲ媒介突然変異誘発）と、これに続く、本明細書に記載する機能性アッセイを用いた保持機能についての改変抗体の試験により取得することができる。
【０１５５】
抗原に対する本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子の親和性及び／又は結合活性は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は放射性免疫検定法（ＲＩＡ）、又は動態学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）を用いて、実験により決定することができる。また、直接結合アッセイ並びに競合結合アッセイフォーマットも容易に使用することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；並びに本明細書に記載する方法を参照されたい。
【０１５６】
ＨＥＲ２抗原と本明細書に開示する特定の抗ＨＥＲ２結合分子の相互作用の親和性測定値は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）下で測定すると変動し得る。従って、親和性及びその他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫD又はＫｄ、ｋon、ｋoff）の測定は、抗ＨＥＲ２結合分子及び抗原の標準液、並びに標準バッファー（当該技術分野で公知であり、例えば、本明細書に記載するバッファーなど）を用いて実施する。
【０１５７】
また、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を用いて測定される親和性は、反応体のどれがチップに結合するかによって変動し得ることもわかっている。これに関して、親和性は、ターゲティング抗ＨＥＲ２結合分子をチップ上に固定化するフォーマット（「ＩｇＧダウン」フォーマットと呼ばれる）を用いるか、又は標的タンパク質（例えば、ＨＥＲ２）をチップ上に固定するフォーマット（「ＨＥＲ２ダウン」フォーマットと呼ばれる）を用いて測定することができる。
【０１５８】
ＩＩＩ．二重特異性抗ＨＥＲ２結合分子
本開示はまた、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体も提供し、ここで、
（ｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２抗体結合部位に特異的に結合し；
（ｉｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含む第１ＨＥＲ２抗体結合部位に結合し；
（ｉｉｉ）第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、ペルツズマブの抗体結合部位とは異なる。
【０１５９】
一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含むＨＥＲ２抗体結合部位に結合する。一部の態様では、第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、１．３９．１又は３９Ｓ抗体のＨＥＲ２抗体結合部位と同一である。一部の態様では、第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、１．３９．１又は３９Ｓ抗体のＨＥＲ２抗体結合部位と部分的に重複する。他の態様では、第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、１．３９．１又は３９Ｓ抗体のＨＥＲ抗体結合部位とは異なる。
【０１６０】
一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にエピトープを含む第２ＨＥＲ２抗体結合部位に結合する。一部の態様では、第２ＨＥＲ２抗体結合部位は、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位と同一である。一部の態様では、第２ＨＥＲ２抗体結合部位は、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位と部分的に重複する。他の態様では、第２ＨＥＲ２抗体結合部位は、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位とは異なる。
【０１６１】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、（ｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２抗体結合部位に特異的に結合し、（ｉｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含み、且つペルツズマブの抗体結合部位とは異なる第１ＨＥＲ２抗体結合部位に結合し、（ｉｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＶとの結合について、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）と競合する。
【０１６２】
本開示は、上に開示した抗ＨＥＲ２結合分子（すなわち、１．３９．１親抗体に由来するリード最適化抗体、例えば、３９Ｓ抗体）と同じエピトープに結合するか、又はこれらに由来する二重特異性抗ＨＥＲ２分子も提供する。一部の態様では、このような二重特異性抗ＨＥＲ２分子は、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、及びこのような二重特異性抗体に由来する分子である。一部の態様では、本明細書に記載するこうした二重特異性抗体由来の分子は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。いくつかの態様では、本明細書に提供されるＡＤＣは、低減したＡＤＣＣ活性を有する。一部の態様では、本明細書に記載する二重特異性抗体由来のこうした分子は、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。
【０１６３】
本開示はまた、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体も提供し、ここで、（ｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；（ｉｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２を配列番号５２の１つ又は複数のアミノ酸残基と結合させる。一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ドメインＩＶ内のエピトープでＨＥＲ２に結合する。他の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２を配列番号５３の１つ又は複数のアミノ酸残基と結合させる。
【０１６４】
従って、一態様において、本開示は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を提供し、ここで、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）と、軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列を含み、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１６５】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む免疫グロブリン抗原結合ドメインのＦＷ領域とは異なる少なくとも１つの異種可変ドメインフレームワーク領域（ＦＷ）を含む。
【０１６６】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸を含む可変軽鎖フレームワーク１（ＶＬ−ＦＷ１）；（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸を含む可変軽鎖フレームワーク２（ＶＬ−ＦＷ２）；（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸を含む可変軽鎖フレームワーク３（ＶＬ−ＦＷ３）；（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸を含む可変軽鎖フレームワーク４（ＶＬ−ＦＷ４）；又は（ｖ）これらの任意の組み合わせを含む。
【０１６７】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸から構成されるＶＬ−ＦＷ１；（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸から構成されるＶＬ−ＦＷ２；（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸から構成されるＶＬ−ＦＷ３；（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸から構成されるＶＬ−ＦＷ４；又は（ｖ）これらの任意の組み合わせを含む。
【０１６８】
他の態様では、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、
（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１５又は配列番号４３のアミノ酸を含み；
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｉｉｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１６９】
他の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、
（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１５又は配列番号４３のアミノ酸から構成され；
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｉｉｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１７０】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、
（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬは、配列番号１６又は配列番号４４のアミノ酸を含み；
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｉｉｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１７１】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、
（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬは、配列番号１６又は配列番号４４のアミノ酸から構成され；
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｉｉｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１７２】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、
（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬは、配列番号１６又は配列番号４４のアミノ酸を含むと共に、ＶＨは、配列番号１５又は配列番号４５のアミノ酸を含み；
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｉｉｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１７３】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、ここで、
（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬは、配列番号１６又は配列番号４４のアミノ酸から構成されると共に、ＶＨは、配列番号１５又は配列番号４３のアミノ酸から構成され；
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｉｉｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１７４】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、以下：
（ａ）重鎖定常領域若しくはその断片をさらに含むＶＨと、軽鎖定常領域（ＬＣ）若しくはその断片を含むＶＬ；
（ｂ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；
（ｃ）ダイアボディ；
（ｄ）ミニボディ；
（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；又は
（ｆ）Ｆ（ａｂ）を含むか、又はこれらからなる。
【０１７５】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の重鎖定常領域又はその断片は、ＩｇＧ定常領域である。一部の態様では、ＩｇＧ定常領域又はその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域である。特定の態様では、ＩｇＧ定常領域は、ＩｇＧ１定常領域である。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、軽鎖定常領域（ＬＣ）を含むＶＬを含み、ここで、ＬＣ定常領域は、κ定常領域である。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、軽鎖定常領域（ＬＣ）を含むＶＬを含み、ここで、ＬＣ定常領域は、λ定常領域である。
【０１７６】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はアフィニティ最適化抗体である。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、例えば、ヒト抗体である。一部の態様では、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスにおいて発現される（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，”Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｅｘｐｅｒ．４９：２０３−２０８，２００１を参照；これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１７７】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、エピトープ結合についてトラスツズマブ又はペルツズマブと競合しない。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。一部の態様では、異なるＨＥＲ２エピトープは、非重複である。
【０１７８】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、（ｉ）トラスツズマブと同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；及び／又は（ｉｉ）トラスツズマブ抗体によるＨＥＲ２との結合を競合的に阻害し；及び／又は（ｉｉｉ）配列番号５４〜５９のいずれか１つのアミノ酸を含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１７９】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の特定の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（ｄｓ−ｓｃＦｖ）を含む。一部の態様では、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、トラスツズマブ抗体と同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０１８０】
安定化ジスルフィドは、システイン残基が、ジスルフィド結合を形成することができるように選択した位置にシステイン置換を導入することによって、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域の間に作製することができる。特に、このようなジスルフィドは、ＶＬ及びＶＨ領域がジスルフィド結合により連結されるようなフレームワーク領域に導入することができる。これらの基準を満たすＶＨ及びＶＬ領域における、代表的ではあるが、非制限的な残基の位置を表２に示す。
【０１８１】
【表２】
2017512765.tif 000003
【０１８２】
本明細書に開示するｓｃＦｖは、天然又は非天然にかかわらず、いずれかの好適な供給源から取得可能であるか、又はそれにより作製され、あるいは、これは、本開示のｓｃＦｖの要求される結合特異性を保持する限りにおいて、組換えｓｃＦｖ、合成ｓｃＦｖ、半合成ｓｃＦｖ、誘導体化ｓｃＦｖ、発酵最適化ｓｃＦｖ、融合タンパク質若しくは同等物、突然変異体若しくはその誘導体であってもよい。これらは、アミノ酸置換を有するか、又はアミノ酸官能基に結合した糖若しくは他の分子を有する、結合特異性を備えたｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖに関して本明細書で用いられる場合、用語「誘導体」又は「誘導体化」は、ｓｃＦｖの化学修飾を包含する。このような修飾の例示するものとして、アルキル、アシル、又はアミノ基による水素の置換がある。
【０１８３】
一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、以下：
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３
を含むｓｃＦｖである。
【０１８４】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、トラスツズマブ抗体と同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合するｓｃＦｖから構成され、トラスツズマブ抗体のＶＨ及びＶＬに由来するＶＨ及びＶＬ（例えば、トラスツズマブ抗体に存在するネイティブＶＨ及び／若しくはＶＬ、又は安定化突然変異を有するＶＨ及び／若しくはＶＬ、例えば、表２に示す突然変異のペア）を含む。Ｇｏｌｄｅｎｇｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９）を参照のこと。従って、一部の態様では、トラスツズマブと同じエピトープに結合するｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸を含むＶＬとを含む。一部の態様では、トラスツズマブと同じエピトープに結合するｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸から構成されるＶＨと、配列番号１８のアミノ酸から構成されるＶＬとを含む。一部の特定の態様では、トラスツズマブと同じエピトープに結合するｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーを介して共有結合される。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９のアミノ酸を含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９のアミノ酸から構成される。
【０１８５】
前述したように、当業者は、トラスツズマブと同じエピトープに結合するｓｃＦｖが、トラスツズマブに由来する配列を含み、こうした配列は、例えば、得られる分子が、トラスツズマブ抗体と同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合することができる限りにおいて、トラスツズマブ抗体の親配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸が欠失又は置換されている突然変異型配列（例えば、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ間に少なくとも１つの安定化ジスルフィドを導入するように設計された突然変異）を含む。
【０１８６】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合している。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端との間に位置する少なくとも１つのリンカーを含む。一部の特定の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端との間に、１つのリンカーを挿入する。
【０１８７】
一部の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合している。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端の間に位置する少なくとも１つのリンカーを含む。特定の態様では、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端との間に、１つのリンカーを挿入する。
【０１８８】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣの配列内に共有結合によって挿入される。一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域とＣＨ２領域との間に、共有結合によって挿入される。一部の態様では、１つ又は複数のリンカーが、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域及び／又はＣＨ２領域と連結する。
【０１８９】
一部の特定の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域と、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインとの間に挿入されたリンカー；並びに（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ２領域との間に挿入された第２リンカーを含む。一部の態様では、第１リンカーと第２リンカーは同一である。一部の態様では、第１リンカーと第２リンカーは異なる。一部の態様では、リンカーの１つ又は複数が、ペプチドリンカーを含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は少なくとも３０アミノ酸を含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、２０超のアミノ酸を含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、式Ｓｅｒx［（Ｇｌｙ）y−Ｓｅｒ4］z（ｘは、０〜１であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜１０である）を有するペプチドを含む。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９、２０、２１又は２２から選択される配列を含む。
【０１９０】
一部の態様では、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、Ｆｃドメインを含む定常領域を含む重鎖を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２領域、及び／又はＣＨ３領域、及び／又はそれらの断片を含む。一部の特定の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２領域とＣＨ領域を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２領域とＣＨ３領域から構成される。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４由来のＦｃドメインである。一部の態様では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、ヒト又はヒト化ＩｇＧ  Ｆｃドメインである。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０１９１】
一部の態様では、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ネイティブ（野生型）ドメインである。一部の態様では、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号２３のアミノ酸を含む。他の態様では、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号２３のアミノ酸から構成される。他の態様では、Ｆｃドメインは、突然変異型ＩｇＧドメイン、例えば、突然変異型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ドメインである。一部の特定の態様では、突然変異型Ｆｃドメインは、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０１９２】
一部の態様では、突然変異型ＩｇＧドメイン、例えば、ヒト又はヒト化ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸置換である。一部の態様では、低減されたＡＤＣＣ活性を有する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、Ｌ２３４Ｆ、Ｓ２３９Ｃ、Ｓ２３９Ａ、２３９位及び２４０位間のシステインアミノ酸挿入、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる多数の突然変異が当該技術分野では公知である。例えば、国際公開第２０１２１７５７５１号パンフレット、同第２０１１１４９９９９号パンフレット、同第２０１１０６６５０１号パンフレット、同第２００００４２０７２号パンフレット、同第２０１１１２０１３４号パンフレット（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている突然変異を参照されたい。低減したＡＤＣＣエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するもの（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）も含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。こうしたＦｃ突然変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上に置換を含むＦｃ突然変異体も含み、このようなものとして、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を含むＦｃ突然変異体がある（米国特許第７，３３２，５８１号明細書；アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
【０１９３】
一部の態様では、突然変異型ＩｇＧドメイン、例えば、ヒト又はヒト化ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体のＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸置換である。一部の態様では、増強されたＡＤＣＣ活性を有する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、Ｓ２３９Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。ＡＤＣＣ活性を増強することができる上記以外の突然変異は、当業者には周知であり、限定はしないが、米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２、及び６〜１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に掲示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、１２、及び１５に掲示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３７０号明細書の図８、９、及び１０に掲示される表；国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットの図８、９、及び１０に掲示される表に例示されているものが挙げられる。
【０１９４】
一部の態様では、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、誘導体化可能な官能基を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでよい。一部の態様では、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、誘導体化可能な官能基を導入する１〜３つのアミノ酸置換を含んでよい。一部の態様では、誘導体化可能な基は、システインアミノ酸のスルフヒドリル側鎖である。特定の態様では、置換されるアミノ酸又は複数のアミノ酸は、抗ＨＥＲ２結合分子の接触可能部位に存在する。これらのアミノ酸をシステインで置換することにより、抗ＨＥＲ２結合分子の接触可能部位に、反応性チオール基が配置され、これを用いて、抗ＨＥＲ２結合分子を他の部分、例えば、薬物部分又はリンカー−薬物部分と共役させることにより、本明細書に詳しく説明するように、免疫コンジュゲートを形成することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書に記載のように作製することができる。
【０１９５】
一部の態様では、誘導体化可能な基は、Ｋａｂａｔ位置：２３９、２４８、２５４、２５８、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４３５、４４０、４４１、４４２、４４３又は４４６、２３９位と２４０位の間に挿入されたアミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせに導入され、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。一部の態様では、誘導体化可能なスルフヒドリル基を導入するアミノ酸又はアミノ酸置換は、以下：Ｓ２３９Ｃ、２４８Ｃ、２５４Ｃ、２５８Ｃ、２７３Ｃ、２７９Ｃ、２８２Ｃ、２８４Ｃ、２８６Ｃ、２８７Ｃ、２８９Ｃ、２９７Ｃ、２９８Ｃ、３１２Ｃ、３２４Ｃ、３２６Ｃ、３３０Ｃ、３３５Ｃ、３３７Ｃ、３３９Ｃ、３５０Ｃ、３５５Ｃ、３５６Ｃ、３５９Ｃ、３６０Ｃ、３６１Ｃ、３７５Ｃ、３８３Ｃ、３８４Ｃ、３８９Ｃ、３９８Ｃ、４００Ｃ、４１３Ｃ、４１５Ｃ、４１８Ｃ、４２２Ｃ、４３５Ｃ、４４０Ｃ、４４１Ｃ、Ｓ４４２Ｃ、４４３Ｃ及び４４６Ｃ、２３９位と２４０位の間のシステインアミノ酸挿入、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。一部の態様では、誘導体化可能なスルフヒドリル基を導入するアミノ酸又はアミノ酸置換は、Ｓ２３９Ｃ及び／又はＳ４４２Ｃである。
【０１９６】
選択的に誘導体化可能な基は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、ペンダントオキシアミノ、又は他の求核基がある。誘導体化可能な基は、１つ又は複数のリンカーを介してポリペプチド鎖に結合することができる。リガンド（例えば、治療部分、検出可能標識、半減期延長ポリマーなど）は、適切な結合化学を用いて、誘導体化可能な基に結合させることができる。このカップリング化学は、例えば、アミド、尿素、チオ尿素、オキシム、アミノアセチルアミドなどを含み得る。
【０１９７】
一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＡＤＣＣ活性を増強する、改変型のグリコシル化を有する。Ｆｃ領域のグリコシル化は、エフェクター機能を増大又は低減するように修飾することができる（例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；同第６，９４６，２９２号明細書；同第７，０６４，１９１号明細書；同第７，２１４，７７５号明細書；同第７，３９３，８３号明細書；同第７，４２５，４４６号明細書；同第７，５０４，２５６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；同第２００３／０００３０９７号明細書；同第２００９／００１０９２１号明細書；ＰＯＴＥＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照のこと)。一部の態様では、Ｆｃドメインは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体Ｆｃドメインである（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号明細書を参照）。一態様では、親細胞により産生される抗体と比較して、１００倍超のＡＤＣＣを有する、高度脱フコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を産生するように操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、Ｌｅｍｎａマイナー）で産生されると、増大したエフェクター機能、特にＡＤＣＣを有するこれらの抗体（例えば、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１−９０８；Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：１５９１−７）。一部の態様では、Ｆｃドメインは、バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造が増加している（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；米国特許出願公開第２００９／００１０９２１号明細書）。
【０１９８】
一部の態様では、突然変異型Ｆｃドメインは、配列番号２４Ａ、２４Ｃ、２５Ａ又は２５Ｃを含む。
【０１９９】
一部の態様では、突然変異型Ｆｃドメインは、配列番号２４Ｂ又は配列番号２５Ｂを含む。
【０２００】
さらに本開示には、互いに結合した第１及び第２ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体も提供され、第１ポリペプチド鎖は、以下：
（１）［ＴＺS］−［Ｌ1］−［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］
（２）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］−［Ｌ2］−［ＴＺS］
（３）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［Ｌ3］−［ＴＺS］−［Ｌ4］−［ＦｃX］
から選択され、
ここで、
ＴＺSは、トラスツズマブ抗体により認識されるものと同じエピトープに結合するｓｃＦｖであり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、及びＬ4は、ペプチドリンカーであり；
Ｆｃｘは、Ｆｃドメインであり；
BＶＨ及びBＣＨは、それぞれ、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＨ及びＣＨ１領域である。
【０２０１】
一部の態様では、異なるエピトープは、配列番号５２内の１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。
【０２０２】
一部の態様では、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープは、配列番号５３における１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。
【０２０３】
一部の態様では、第２ポリペプチド鎖は、［BＶＬ］−［ＣＬ］を含み、ここで、BＶＬは、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＬ領域であり、ＣＬは、ＩｇＧ軽鎖定常領域である。一部の態様では、ＣＬは、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択される。
【０２０４】
一部の態様では、BＶＬは、配列番号１６のアミノ酸を含む。一部の態様では、BＶＬは、配列番号４４のアミノ酸を含む。一部の態様では、BＶＬは、以下：
（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。
【０２０５】
一部の特定の態様では、ＣＬは、配列番号２７Ａのアミノ酸を含む。
【０２０６】
一部の特定の態様では、ＣＬは、配列番号２７Ｂのアミノ酸を含む。
【０２０７】
一部の態様では、［ＴＺS］は、以下：
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｉｖ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０２０８】
一部の態様では、［ＴＺS］は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖである。一部の態様では、［ＴＺS］は、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸を含むか、若しくはそれから構成されるＶＨ、又はその変異体と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸を含むか、若しくはそれから構成されるＶＬ、又はその変異体とを含み、これらは、ペプチドリンカーにより共有結合している。ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ部分を連結するのに好適な多数のリンカー（例えば、ペプチドリンカー）が当該技術分野で公知である。一部の態様では、リンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成されるペプチドリンカーである。他の態様では、［ＴＺS］は、配列番号２８のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される。
【０２０９】
一部の態様では、ヒンジポリペプチドは、［BＣＨ］と［Ｆｃｘ］を連結する。一部の態様では、ヒンジポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される。一部の態様では、［Ｆｃｘ］は、誘導体化可能な基を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の態様では、［Ｆｃｘ］は、誘導体化可能な基を導入する１〜３アミノ酸置換を含む。また別の態様では、［Ｆｃｘ］は、誘導体化可能な基を導入する３つを超えるアミノ酸置換を含む。一部の態様では、全ての誘導体化可能な基は、同一である。他の態様では、少なくとも１つの誘導体化可能な基は、残りの基と異なる。一部の態様では、全ての誘導体化可能な基が異なる。一部の態様では、誘導体化可能な基は、スルフヒドリル基（例えば、システインのスルフヒドリル基）である。一部の態様では、誘導体化可能な基は、保護されている。
【０２１０】
一部の態様では、誘導体化可能な基は、位置：２３９、２４８、２５４、２５８、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４３５、４４０、４４１、４４２、４４３若しくは４４６、又は２３９位と２４０位の間、又はこれらの任意の組み合わせに導入され、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。一部の態様では、誘導体化可能な基は、以下：Ｓ２３９Ｃ、２４８Ｃ、２５４Ｃ、２５８Ｃ、２７３Ｃ、２７９Ｃ、２８２Ｃ、２８４Ｃ、２８６Ｃ、２８７Ｃ、２８９Ｃ、２９７Ｃ、２９８Ｃ、３１２Ｃ、３２４Ｃ、３２６Ｃ、３３０Ｃ、３３５Ｃ、３３７Ｃ、３３９Ｃ、３５０Ｃ、３５５Ｃ、３５６Ｃ、３５９Ｃ、３６０Ｃ、３６１Ｃ、３７５Ｃ、３８３Ｃ、３８４Ｃ、３８９Ｃ、３９８Ｃ、４００Ｃ、４１３Ｃ、４１５Ｃ、４１８Ｃ、４２２Ｃ、４３５Ｃ、４４０Ｃ、４４１Ｃ、Ｓ４４２Ｃ、４４３Ｃ及び４４６Ｃ、２３９位と２４０位の間のシステインアミノ酸挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのシステインアミノ酸置換におけるスルフヒドリル基であり、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。一部の態様では、誘導体化可能なスルフヒドリル基を導入するアミノ酸又はアミノ酸置換は、Ｓ２３９Ｃ及び／又はＳ４４２Ｃである。一部の態様では、誘導体化可能なスルフヒドリル基を導入するアミノ酸又はアミノ酸置換は、２３９位と２４０位の間のシステインアミノ酸挿入及び／又はＳ４４２Ｃである。
【０２１１】
他の態様では、［Ｆｃｘ］は、配列番号２３、２４Ａ、２４Ｃ、２５Ａ又は２５Ｃのいずれか１つのアミノ酸を含む。
【０２１２】
他の態様では、［Ｆｃｘ］は、配列番号２３、２４Ｂ、又は２５Ｂのいずれか１つのアミノ酸を含む。
【０２１３】
いくつかの態様では、［Ｌ1］、［Ｌ2］、［Ｌ3］、及び［Ｌ4］は、配列番号１９、２０、２１、及び２２からなる群から独立に選択されるリンカー配列のアミノ酸を含む。一部の態様では、全てのリンカーが異なる。一部の態様では、リンカーの少なくとも２つが同一である。当業者であれば、リンカーが、ペプチド、非ペプチド、又はペプチド及び非ペプチドリンカーの組み合わせであってよいことを理解されよう。一部の特定の態様では、（ｉ）［Ｌ1］は、配列番号２０のアミノ酸を含むか、それから構成され；（ｉｉ）［Ｌ2］は、配列番号２０のアミノ酸を含むか、それから構成され；（ｉｉｉ）［Ｌ3］は、配列番号２１のアミノ酸を含むか、それから構成され；（ｉｖ）［Ｌ4］は、配列番号２２のアミノ酸を含むか、それから構成される。
【０２１４】
一部の態様では、［BＶＨ］は、以下：
（ｉ）配列番号１と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号２と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号３と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む。
【０２１５】
一部の態様では、［BＶＨ］は、配列番号１５又は配列番号４３のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される。
【０２１６】
一部の態様では、［BＶＬ］は、以下：
（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。
【０２１７】
一部の特定の態様では、［BＶＬ］は、配列番号１６又は配列番号４４のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される。一部の態様では、［BＣＨ］は、配列番号２９のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される。
【０２１８】
一部の特定の態様では、本開示は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を提供し、ここで、（ｉ）第１ポリペプチド鎖は、以下：配列番号３０、３１Ａ、３２Ａ、３２Ｃ、３３Ａ、３３Ｃ、３４、３４Ａ、３５Ａ、３６Ａ、３６Ｃ、３７Ａ、３７Ｃ、３８、３８Ａ、３９Ａ、４０Ａ、４０Ｃ、４１Ａ及び４１Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成され、（ｉｉ）第２ポリペプチド鎖は、配列番号４２Ａ又は４２Ｂの配列を含むか、又はそれから構成され、前記二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、治療部分と共役される。
【０２１９】
一部の特定の態様では、本開示は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を提供し、ここで、（ｉ）第１ポリペプチド鎖は、以下：配列番号３０、３１Ｂ、３２Ｂ、３３Ｂ、３４Ｂ、３５Ｂ、３６Ｂ、３９Ｂ、４０Ｂ、及び４１Ｂからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成され、（ｉｉ）第２ポリペプチド鎖は、配列番号４２Ａ又は４２Ｂの配列を含むか、又はそれから構成され、前記二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、増強したＡＤＣＣ活性を有する。
【０２２０】
ＩＶ．抗体薬物複合体（ＡＤＣ）
本開示は、少なくとも１つの治療部分に共役した、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、若しくはそれに由来する抗体又はそのＨＥＲ２結合断片、あるいは本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）の少なくとも１つを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）も提供する。従って、一部の態様では、ＡＤＣは、少なくとも１つの治療部分（例えば、細胞毒）に共役した、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２抗体を含み、前記二重抗ＨＥＲ２抗体は、（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインと（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列
を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）と軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）を含み、
ここで、
（ａ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片を含み；
（ｂ）第１及び第２グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
【０２２１】
一部の態様では、ＡＤＣの第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号４３のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号４４のアミノ酸とを含むＶＬとを含む免疫グロブリン抗原結合ドメインのＦＷ領域とは異なる少なくとも１つの異種可変ドメインフレームワーク領域（ＦＷ）を含む。
【０２２２】
一部の態様では、ＡＤＣはさらに、少なくとも１つの任意選択のスペーサを含み、これは、抗ＨＥＲ２結合分子のポリペプチド鎖内のアミノ酸の側鎖（例えば、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子の重鎖内のアミノ）と、治療部分との間に挿入することができる。一部の態様では、少なくとも１つのスペーサは、ペプチドスペーサである。他の態様では、少なくとも１つのスペーサは、非ペプチドスペーサである。一部の態様では、スペーサは、酸不安定性スペーサ（例えば、ヒドラジン）のように不安定である。他の態様では、スペーサは、酵素開裂可能なリンカー、例えば、開裂可能なジペプチドである。一部の態様では、スペーサは、開裂不可能（加水分解安定性）であり、例えば、チオエーテルスペーサ又はヒンダードジスルフィドスペーサである。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子のポリペプチド鎖内のアミノ酸の側鎖（例えば、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子の重鎖内のアミノ）と、治療部分との間に挿入されるのは、ＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル−４（マレイミドメチル）シクロヘキサン））である。
【０２２３】
加水分解安定性スペーサは、水中で実質的に安定性であり、長期間にわたって、限定はしないが、生理学的条件下など、有用なｐＨ値の水と反応しない。加水分解不安定性又は分解性スペーサは、水又は水溶液（例えば、血液など）中で分解性である。
【０２２４】
酵素不安定性又は分解性スペーサは、１つ又は複数の酵素によって分解され得る。あくまで例として、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の１つ又は複数との間のリンカー基に分解性スペーサを含み得る。こうした分解性スペーサとして、限定はしないが、ＰＥＧカルボン酸又は活性化ＰＥＧカルボン酸と、生物活性剤のアルコール基との反応により形成されるエステル結合が挙げられ、ここで、このようなエステル基は、概して、生理学的条件下で加水分解して生物活性剤を放出する。他の加水分解による分解性スペーサとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：炭酸結合；アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合；アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応生成物であるオルトエステル；限定はしないが、ＰＥＧなどのポリマーの末端のアミノ基と、ペプチドのカルボキシル基により形成されるペプチド結合；並びに限定はしないが、ポリマーの末端などのホスホロアミダイト基と、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基により形成されるオリゴヌクレオチド結合。
【０２２５】
一部の態様では、ＡＤＣは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の治療部分を含む。一部の特定の態様では、ＡＤＣは、２つ、３つ、又は４つの治療部分を含む。一部の態様では、全ての治療部分は同じである。一部の態様では、少なくとも１つの治療部分が、残りのものとは異なる。一部の態様では、全ての治療部分が異なる。一部の態様では、全てのスペーサ（例えば、ペプチド及び／又は非ペプチドスペーサ）は同じである。一部の態様では、少なくとも１つのスペーサが、残りのものとは異なる。また他の態様では、全てのスペーサが異なる。
【０２２６】
一部の態様では、各治療部分は、抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）のＦｃ領域における特定位置でアミノ酸の側鎖に化学的に共役している。
【０２２７】
一部の態様では、Ｆｃ領域における具体的な位置は、２３９、２４８、２５４、２５８、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４３５、４４０、４４１、４４２、４４３、４４６、２３９位と２４０位の間の挿入、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。
【０２２８】
一部の態様では、Ｆｃ領域における具体的な位置は、２３９、４４２、又はその両方であり、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。一部の態様では、Ｆｃ領域における具体的な位置は、４４２、及び２３９位と２４０位の間のアミノ酸挿入からなり、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。
【０２２９】
一部の態様では、治療部分が共役されているアミノ酸側鎖は、スルフヒドリル側鎖、例えば、システインアミノ酸のスルフヒドリル基である。一部の態様では、少なくとも１つの治療部分を、抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）のＦｃ領域の外側の位置に位置するアミノ酸の側鎖に化学的に共役させる。一部の態様では、全ての治療部分を、抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）のＦｃ領域の外側の位置に位置するアミノ酸の側鎖に化学的に共役させる。一部の態様では、当該技術分野で公知の組換え技術を使用して、少なくとも１つの治療部分を、抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）のポリペプチド鎖に遺伝子学的に組み込む。
【０２３０】
一部の態様では、治療部分は、細胞毒、放射性同位体、放射性同位体、免疫調節薬、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ミクロＲＮＡ、光活性治療薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、ペプチド、脂質、炭化水素、キレート剤又はこれらの組み合わせを含む。
【０２３１】
一部の特定の態様では、細胞毒は、オーリスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。別の特定の態様では、細胞毒は、ツブリシン１５０８である。
【０２３２】
特定の態様では、ＡＤＣは、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含み、前記抗体は、以下を含む：
（ｉ）配列番号３２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３３Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖｉ）配列番号４１Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
【０２３３】
特定の態様では、ＡＤＣは、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含み、前記抗体は、以下を含む：
（ｉ）配列番号６２のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３３Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシンＭＥＤＩ  １５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；あるいは、
（ｖｉ）配列番号４１Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
【０２３４】
本明細書に開示するＡＤＣは、別の分子（例えば、ペプチド、小薬物分子、検出可能分子）に誘導体化又は連結した（例えば、化学的若しくは組換えにより）本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、若しくはそれに由来する抗体、又はその抗ＨＥＲ２結合断片、あるいは、本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体）の少なくとも１つを含む。概して、抗ＨＥＲ２抗体又はその部分は、そのＨＥＲ２結合が、誘導体化又は標識による有害な影響を受けないように誘導体化される。従って、本開示の抗ＨＥＲ２抗体及び抗体部分は、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２結合分子のインタクトな形態及び修飾形態の両方を含むものとする。例えば、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子又はそのＨＥＲ２結合部分は、１つ又は複数の他の分子実体、例えば、細胞傷害性薬剤、医薬品、検出剤、及び／又は抗ＨＥＲ２結合分子と別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）との結合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチドに、機能的に連結する（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合、又はその他により）ことができる。
【０２３５】
一タイプの誘導体化分子は、２つ以上の分子実体、例えば、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子と治療部分（例えば、ツブリシン１５０８などの細胞毒）を架橋結合することにより作製することができる。好適な架橋剤として、ヘテロ二機能性である、すなわち、適切なスペーサにより隔てられた２つの個別に反応性の基を有するもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）；又はホモ二重機能性であるもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。このような架橋剤は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩから入手可能である。上記以外の二重機能性カップリング剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能誘導体（例えば、ジメチルアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、及び二活性（ｂｉｓ−ａｃｔｉｖｅ）フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）が挙げられる。
【０２３６】
別のタイプの誘導体化分子は、検出可能な標識を組み込むことにより作製することができる。有用な検出剤として、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル塩化物、フィコエリスリン、ランタニド蛍光体など）、検出に有用な酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなど）、二次リポータにより認識されるエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）が挙げられる。一部の態様では、検出可能な標識は、少なくとも１つのスペーサアームにより結合させることができる。スペーサアームは、起こり得る立体障害を低減するように様々な長さのものであってよい。
【０２３７】
抗ＨＥＲ２結合分子はまた、放射性標識アミノ酸で標識することもできる。放射性標識は、診断及び治療目的の両方に用いることができる。例えば、Ｘ線又はポジトロン断層法（ＰＥＴ）などの他の診断技術により、ＨＥＲ２発現細胞を検出するために、放射性標識を用いることができる。
【０２３８】
さらに、放射性標識は、ＨＥＲ２発現細胞、例えば、不要な免疫応答を引き起こす細胞に対する毒素として、治療目的で用いることもできる。ポリペプチドについての標識の例として、限定はしないが、次の放射性同位体又は放射性核種が挙げられる：3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ及び131Ｉ。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、イメージングの際に検出可能な常磁性、放射性、又は蛍光性イオンで標識することができる。一部の態様では、常磁性イオンは、クロミウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コハク（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）又はエルビウム（ＩＩＩ）である。他の態様では、放射性イオンは、ヨウ素１２３、テクネチウム９９、インジウム１１１、レニウム１８８、レニウム１８６、銅６７、ヨウ素１３１、イットリウム９０、ヨウ素１２５、アスタチン２１１、及びガリウム６７である。他の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、Ｘ線造影剤、例えば、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、及びビスマス（ＩＩＩ）で標識する。抗ＨＥＲ２結合分子はまた、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基、エチル基、又は炭水化物基などのポリマーで誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するために、例えば、血清半減期を延長する、又は組織結合を増大する上で有用である。
【０２３９】
本明細書で用いる用語「細胞傷害性薬剤」は、広義に定義され、細胞の機能を阻害若しくは阻止する、及び／又は細胞の破壊（細胞死）を引き起こす、及び／又は抗腫瘍／抗増殖作用を及ぼす物質を指す。例えば、細胞傷害性薬剤は、腫瘍細胞の発生、成熟、又は広がりを直接若しくは間接的に予防する。この用語はまた、静細胞作用のみをもたらし、単純な細胞傷害作用は引き起こさない薬剤も包含する。この用語は、以下に詳述するような化学療法薬、並びにその他のＨＥＲ２アンタゴニスト、抗血管新生薬、チロシンキナーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼＡ阻害剤、サイトカインファミリーのメンバー、放射性同位体、並びに毒素、例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素的に活性の毒素も包含する。
【０２４０】
用語「化学療法薬」は、天然又は合成化学化合物を含む用語「細胞傷害性薬剤」のサブセットである。化学療法薬の例として、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキル、並びにアルキル化作用を有する他の化合物、例えば、ニトロソウレア、シスプラチン及びダカルバジン；抗代謝物質、例えば、葉酸、プリン若しくはピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤、例えば、ビンカ（Ｖｉｎｃａ）アルカロイド及びポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害性抗生物質及びカンプトテシン誘導体が挙げられる。他の化学療法薬としては、以下：アミホスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌスチン（ｃａｒｒｎｕｓｔｉｎｅ）（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ドキソルビシン・リポ（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ダウノルビシン、ダウノルビシン・リポ（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトセシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトセシン（ＳＮ３８）、ゲフチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、ペントスタチン、ピポブロマン、ピリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルアロマターゼ阻害剤、並びにこれらの組合せがある。
【０２４１】
ＩＶ．Ａ  ツブリシン
一部の態様では、ＡＤＣは、１つ又は複数のツブリシン分子（以下のツブリシンＡ及びツブリシン１５０８の構造を参照）に共役した本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含む。
【化１】
2017512765.tif 000004
【０２４２】
ツブリシンは、粘液菌種から単離された天然産物の１クラスのメンバーである（Ｓａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５３：８７９−８８５（２０００））。細胞骨格相互作用剤として、ツブリシンは、ツブリン重合を阻害して、細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす細胞分裂毒である（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：４８８８−４８９２（２００４）；Ｋｈａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．７：６７８−６８３（２００６）；Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９６：２３５−２４２（２００６））。ツブリシンは、臨床的に関連するあらゆる伝統的化学療法薬、例えば、エポチロン、パクリタキセル、及びビンブラスチンの細胞増殖阻害にまさる、極めて強力な細胞傷害性分子である。さらに、ツブリシンは、多剤耐性細胞株に対しても効力を有する（Ｄｏｍｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ９：１４１−１４７（２００５））。これらの化合物は、親細胞株の一団に対して試験すると、低ピコモル範囲のＩＣ50で、高い細胞傷害性を示すことから、抗癌治療薬として有利である。例えば、国際公開第２０１２０１９１２３号パンフレット（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ツブリシンコンジュゲートは、例えば、米国特許第７，７７６，８１４号明細書に開示されている。
【０２４３】
一部の態様では、ツブリシン分子又は誘導体は、プロドラッグである。
【０２４４】
ＩＶ．Ｂ  メイタンシン及びメイタンシノイド
一部の態様では、ＡＤＣは、１つ又は複数のメイタンシノイド分子に共役された本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含む。
【０２４５】
メイタンシノイドは、ツブリシン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東部アフリカの低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。その後、特定の微生物も、メイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルのようなメイタンシノイドを産生することがみいだされた（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成メイタンシノール並びにそれらの誘導体及び類似体が、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号明細書；同第４，２４８，８７０号明細書；同第４，２５６，７４６号明細書；同第４，２６０，６０８号明細書；同第４，２６５，８１４号明細書；同第４，２９４，７５７号明細書；同第４，３０７，０１６号明細書；同第４，３０８，２６８号明細書；同第４，３０８，２６９号明細書；同第４，３０９，４２８号明細書；同第４，３１３，９４６号明細書；同第４，３１５，９２９号明細書；同第４，３１７，８２１号明細書；同第４，３２２，３４８号明細書；同第４，３３１，５９８号明細書；同第４，３６１，６５０号明細書；同第４，３６４，８６６号明細書；同第４，４２４，２１９号明細書；同第４，４５０，２５４号明細書；同第４，３６２，６６３号明細書；及び同第４，３７１，５３３号明細書に開示されている。
【０２４６】
メイタンシノイド薬物部分は、以下：（ｉ）発酵により、又は発酵産物の化学修飾、誘導体化により調製するのに比較的利用しやすいこと、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体との共役に好適な官能基との誘導体化が行いやすいこと、（ｉｉｉ）血漿中で安定していること、並びに（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であることから、抗体薬物複合体における魅力的な薬物部分である。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、これを製造する方法、並びにその治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０１０号明細書、同第５，４１６，０６４号明細書、及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）（記載されているメイタンシノイド含有免疫コンジュゲートは、ＤＭ１と呼ばれる）；並びにＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に記載されている。
【０２４７】
トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ，Ｔ−ＤＭ１、商標ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））は、メイタンシノイドメルタンシン（ＤＭ１）に共役したモノクローナル抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））から構成される抗体薬物複合体である。例えば、ＬｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：６４３７−４７（２０１１）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。また、操作されたチオ−トラスツズマブ−ＤＭ１  ＡＤＣが、Ｊｕｎｕｔｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：４７６９−７８（２０１０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２４８】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子いずれの生物活性も有意に低減することなく、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結することにより調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい。抗体分子当たり平均３〜４つの共役メイタンシノイド分子が、抗体の機能又は溶解性にマイナスの影響を与えることなく、標的細胞の細胞傷害性を増強するのに効果を示しているが、抗体当たり１分子の毒素であっても、ネイキッド抗体の使用と比較して細胞傷害性を増強すると予想される。メイタンシノイドは、当該技術分野で公知であり、公知の技術により合成するか、又は天然の供給源から単離することができる。好適なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書に開示されている。
【０２４９】
一部の態様では、メイタンシノイド分子、その変異体、又は誘導体は、プロドラッグである。
【０２５０】
ＩＶ．Ｃ  オーリスタチン及びドラスタチン
一部の態様では、ＡＤＣは、ドラスタチン又はドラスタチンペプチド類似体及び誘導体、オーリスタチンに共役した本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含む（米国特許第５，６３５，４８３号明細書；同第５，７８０，５８８号明細書）。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管運動、ＧＴＰ加水分解、並びに核及び細胞分裂を妨害すること（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３５８０−３５８４（２００１））、並びに抗癌活性を有すること（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）が明らかにされている。ドラスタチン又はオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端に結合することができる（例えば、国際公開第２００２０８８１７２号パンフレットを参照のこと）。
【０２５１】
一部の態様では、オーリスタチン又はドラスタチン、それらの変異体、又は誘導体はプロドラッグである。
【０２５２】
ＩＶ．Ｄ  カリケアミシン
一部の態様では、ＡＤＣは、１つ又は複数のカリケアミシン分子に共役した本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含む。カリケアミシン抗生物質ファミリーのメンバーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことができる。カリケアミシンは、細菌ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）から得られるエンジイン抗生物質の１クラスであり、カリケアミシンγ１が最もよく知られている。他のカリケアミシンは、β１Ｂｒ、γ１Ｂｒ、α２Ｉ、α３Ｉ，β１Ｉ、γ１Ｉ、及びΔ１Ｉである。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４２（７）：１０７０−８７（１９８９）を参照されたい。カリケアミシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号明細書、同第５，７１４，５８６号明細書、同第５，７３９，１１６号明細書、同第５，７６７，２８５号明細書、同第５，７７０，７０１号明細書、同第５，７７０，７１０号明細書、同第５，７７３，００１号明細書、同第５，８７７，２９６号明細書を参照されたい。用いることができるカリケアミシンの構造類似体として、限定はしないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１１が挙げられる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）、並びにアメリカン・サイアナミッド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）に属する前述の米国特許）。
【０２５３】
一部の態様では、カリケアミシン分子、その変異体、又は誘導体は、プロドラッグである。
【０２５４】
ＩＶ．Ｅ  デュオカルマイシン
一部の態様では、ＡＤＣは、１つ又は複数のデュオカルマイシン分子に共役した本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含む。デュオカルマイシンは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌から初めて単離された関連天然産物の１群のメンバーであり、これらは、強力な抗腫瘍薬である。Ｂｏｇｅｒ．（１９９１）．Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｓ：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（５）：３２９−３４９（１９９１）；Ｔｅｒｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５２（２１）：５４４２−６（２０１３）；Ｂｏｇｅｒ＆Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（９）：３６４２−３６４９（１９９５）；Ｃａｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ  １０（１２）：１８５３−７１（２０００）を参照されたい。
【０２５５】
天然のデュオカルマイシンとしては、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、及びＣＣ−１０６５が挙げられる。合成類似体には、アドゼレシン、ビゼレシン、及びカルゼレシン（Ｕ−８０２４４）がある。
【０２５６】
一部の態様では、デュオカルマイシン分子、その変異体、又は誘導体は、プロドラッグである。
【０２５７】
ＩＶ．Ｆ  ピロロベンゾジアゼピン
一部の態様では、薬物は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。ＰＢＤは、比較的小さな分子であり、一部のものは、ＤＮＡの副溝中の特定の配列を認識して共有結合する能力を有するため、抗生物質／抗腫瘍活性を呈示する。いくつかのＰＢＤ及びそれらの誘導体が当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＢＤ二量体（例えば、ＳＪＧ−１３６又はＳＧ２０００）、Ｃ２−不飽和ＰＢＤ二量体、Ｃ２アリール置換を担持するピロロベンゾジアゼピン二量体（例えば、ＳＧ２２８５）、加水分解により活性化されるＰＢＤ二量体プロドラッグ（例えば、ＳＧ２２８５）、及びポリピロール−ＰＢＤ（例えば、ＳＧ２２７４）がある。さらに、ＰＢＤは、国際公開第２０００／０１２５０７号パンフレット、同第２００７／０３９７５２号パンフレット、同第２００５／１１０４２３号パンフレット、同第２００５／０８５２５１号パンフレット、及び同第２００５／０４０１７０号パンフレット、並びに米国特許第７，６１２，０６２号明細書にも記載されており、これら文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
ＩＶ．Ｇ  その他の細胞傷害性薬剤
一部の態様では、ＡＤＣは、他の抗腫瘍薬、例えば、ＢＣＮＵ、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシン又はアドリアマイシン）、タキセン（例えば、パクリタキセル）、ストレプトゾイシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン）、５−フルオロウラシル、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる薬剤のファミリー（米国特許第５，０５３，３９４号及び同第５，７７０，７１０号明細書を参照）、エスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号明細書を参照）に共役した本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含む。ＡＤＣはまた、酵素として活性の毒素及びそれらの断片に共役した本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体若しくはその誘導体、又は本明細書に開示する二重特異性抗ＨＥＲ２抗体の１つ）を含み、用いることができる上記の毒素として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サーシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。例えば、国際公開第１９９３２１２３２号パンフレットを参照。一部の態様では、細胞傷害性薬剤は、光活性化薬物である。
【０２５９】
Ｖ．３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合する抗ＨＥＲ２結合分子
別の態様では、本開示は、３９Ｓ抗体（例えば、３９Ｓ抗体に由来する抗体若しくはその抗原結合断片、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、又はＡＤＣ）が結合するのと同じエピトープに結合する抗ＨＥＲ２結合分子を提供する。
【０２６０】
３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するこうした抗ＨＥＲ２結合分子は、標準的ＨＥＲ２結合アッセイにおいて、３９Ｓ抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する（例えば、統計的に有意な様式で、その結合を競合的に阻害する）能力に基づいて、同定することができる。従って、一態様では、本開示は、ＨＥＲ２とその３９Ｓ抗体抗原結合断片との結合について競合する抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体に由来する抗体若しくはその抗原結合断片、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、又はＡＤＣ）を提供する。例えば、３９Ｓ抗体又は３９Ｓ抗体に由来する結合分子（例えば、二重特異性抗体又はＡＤＣ）の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＨＥＲ２との結合について３９Ｓ抗体と競合し得ることを明らかにするものであり；このような抗ＨＥＲ２結合分子は、非制限的理論によれば、これが競合する３９Ｓ抗体又はその抗原結合断片と同じか、関連する（例えば、構造的に類似する、若しくは空間的に近位の）エピトープに結合することができる。
【０２６１】
一態様では、ＨＥＲ２上で、３９Ｓ抗体又は３９Ｓ抗体由来の結合断片と同じエピトープに結合する抗ＨＥＲ２分子は、ヒトモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、二重特異性抗体（例えば、２つのＨＥＲ２結合領域を含む二重特異性抗体、少なくともその１つは、３９Ｓ抗体と同じエピトープを認識する）、あるいはＡＤＣ（例えば、３９Ｓと同じエピトープを認識する少なくとも１つの抗原結合部分を含むＡＤＣ；又は２つのＨＥＲ２結合領域（その少なくとも１つは、３９Ｓ抗体と同じエピトープを認識する）を含む二重特異性抗体を含むＡＤＣ）である。
【０２６２】
ＶＩ．抗ＨＥＲ２結合分子の作用機構
本開示は、１．３９．１若しくは３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれらに由来するＨＥＲ２結合ドメインを含む抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、若しくはＡＤＣ）を提供し、ここで、そのような抗ＨＥＲ２結合分子は、ＨＥＲ２標的との結合時に、内在化を誘導する。また、１．３９．１若しくは３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれらに由来するＨＥＲ２結合ドメインを含む抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、若しくはＡＤＣ）も提供され、ここで、そのような抗ＨＥＲ２結合分子は、内在化後に有効なリソソーム輸送を促進する。さらに、本開示は、１．３９．１若しくは３９Ｓ抗体と同じか、又はそれらに由来するエピトープに結合するＨＥＲ２結合ドメインを含む抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体、若しくはＡＤＣ）も提供し、ここで、そのような抗ＨＥＲ２結合分子は、ＨＥＲ２標的内在化及び／又は分解を誘導する。
【０２６３】
一部の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、ＨＥＲ２リン酸化を低減、阻止、又は抑制することができる。他の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、リガンド誘導ＡＫＴリン酸化を低減、阻止、又は抑制することができる。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、低ＨＥＲ２発現癌細胞におけるリガンド誘導ＡＫＴリン酸化を低減、阻止、又は抑制することができる。
【０２６４】
また他の態様では、本願に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、リガンド誘導ＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化を軽減、妨害、又は抑制することができる。
【０２６５】
一部の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子を含むＡＤＣは、癌幹細胞（ＣＳＣ）スフィア形成及び／又は増殖を阻害することができる。一部の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、ＣＳＣに対する細胞傷害性作用を発揮する。一部の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子を含むＡＤＣは、低レベルのＨＥＲ２（例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにより、＋１〜＋２）を発現する腫瘍における腫瘍増殖を阻害する、及び／又は腫瘍退縮を誘導することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子を含むＡＤＣは、Ｔ−ＤＭ１耐性の腫瘍における腫瘍増殖を阻害する、及び／又は腫瘍退縮を誘導することができる。
【０２６６】
一部の態様では、ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、ＡＤＣＣ活性が欠失している。特定の態様では、ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、リガンド非依存性作用機構によるＨＥＲ２リン酸化、ＡＫＴリン酸化、及び／又は腫瘍コロニー形成を低減又は抑制することができる。
【０２６７】
ＶＩＩ．抗ＨＥＲ２結合分子の調製
本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、１．３９．１若しくは３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれらに由来する抗体又はその抗原結合断片、これを含む二重抗体及びＡＤＣ）は、当該技術分野で公知の方法により調製することができる。例えば、本明細書に開示する３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合する抗ＨＥＲ２結合分子は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５により記載されるものを用いて作製することができる。
【０２６８】
ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を前述のように免疫して、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、好適な骨髄腫細胞株と融合させることにより、ハイブリドーマ細胞を形成してから、これらを非融合リンパ球及び骨髄腫細胞から選択して取り出すことができる。選択抗原に対して特異的に指令されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、免疫沈降、免疫ブロッティング、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば、放射性免疫検定（ＲＩＡ）；酵素−結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定して、標準的方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養か、又は動物の腹水腫瘍などのｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで増殖させることができる。続いて、ポリクローナル抗体について前述したのと同様に、モノクローナル抗体を培地又は腹水から精製することができる。
【０２６９】
本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、１．３９．１若しくは３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれらに由来する抗体若しくはその抗原結合断片、これを含む二重抗体及びＡＤＣ）は、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されている組換えＤＮＡ法を用いて調製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離した後、従来の手順を用いて、それらの配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを好適な発現ベクター中にクローン化し、これを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞により産生される。さらに、所望の種の組換え抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む分子は、記載されているように、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することもできる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。
【０２７０】
本開示の抗ＨＥＲ２結合分子（例えば、３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれに由来する抗体若しくはその抗原結合断片、これを含む二重抗体及びＡＤＣ）をコードするポリヌクレオチドは、代わりの抗ＨＥＲ２結合分子を生成する組換えＤＮＡ技術を用いたいくつかの異なる方法でさらに修飾することもできる。一部の態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域で、（１）例えば、ヒト抗体の当該領域を置換して、キメラ抗体を産生させる、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドを置換して、融合抗体を産生させることができる。一部の態様では、定常領域を切断又は除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を作製する。可変領域の部位指定又は高密度突然変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【０２７１】
いくつかの態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて、直接調製することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫した不死化ヒトＢリンパ球、又は標的抗原に対して指令される抗体を産生する免疫済み個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球を作製することができる（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照のこと）。次に、不死化Ｂリンパ球中の抗体をコードする１つ又は複数のｃＤＮＡを作製し、抗体の非天然組換えバージョンの発現のために、発現ベクター及び／又は異種宿主細胞に挿入することができる。
【０２７２】
また、抗ＨＥＲ２ヒト抗体又はその抗原結合断片は、ファージライブラリーから選択することができ、ここで、ファージライブラリーは、例えば、以下の文献に記載されているように、異種ファージタンパク質との融合タンパク質として、ヒト抗体又はその断片を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。抗体ファージライブラリーの作製及び使用のための技術は、以下：米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；同第７，２６４，９６３号明細書にも記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７３】
アフィニティ成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は当該技術分野で公知であり、これらを使用して、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片を作製することができる。
【０２７４】
一部の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子は、ヒト化抗体であってもよい。非ヒト又はヒト抗体を操作、ヒト化若しくは再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）する方法を用いることもでき、これらの方法は、当該技術分野で公知である。ヒト化、再表面化又は同様に操作された抗体は、非ヒト、例えば、限定はしないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又はその他の哺乳動物である供給源に由来する１つ又は複数のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、往々にして「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれる残基によって置換されるが、これらの残基は、典型的に、既知のヒト配列の「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」可変、定常若しくは他のドメインから取得される。このような移入配列は、当該技術分野で公知のように、免疫原性を低減するか、あるいは、結合、親和性、結合速度、解離速度、結合活性、特異性、半減期、又はその他の任意の適切な特徴を低減、増強若しくは改変するために用いることができる。概して、ＣＤＲ残基は、ＨＥＲ２結合に影響を与える上で直接、且つ最も実質的に関与している。従って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全部は維持しながら、可変及び定常領域の非ヒト配列は、ヒト又は他のアミノ酸で置換することができる。特定の態様では、ヒトＣＤＲを非ヒト抗体スカフォールドに挿入することにより、動物モデル系において免疫原性が低減した抗体、例えば、「マウス化」抗体を作製する。
【０２７５】
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体は、抗原ＨＥＲ２に対する高い親和性及びその他の好都合な生物学的特性を保持しながら、任意選択でヒト化、再表面化、又は操作することができる。この目標を達成するために、親、操作、及びヒト化配列の３次元モデルを用いた、親配列及び様々な概念的ヒト化及び操作産物の分析方法により、任意選択で、ヒト化（若しくはヒト）、又は操作抗ＨＥＲ２抗体及び再表面化抗体を調製することができる。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者には周知である。
【０２７６】
選択した候補免疫グロブリン配列の予想３次元立体配座構造を図示及びディスプレイするコンピュータプログラムが入手可能である。これらのディスプレイの精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の予測役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原（ＨＥＲ２など）に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する高い親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、フレームワーク残基を共通配列及び移入配列から選択及び組み合わせることができる。
【０２７７】
本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子のヒト化、再表面化又は操作は、公知の任意の方法を用いて実施することができ、こうした方法として、限定はしないが、以下：Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書、同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；同第９０／１４４２４号パンフレット；同第９０／１４４３０号パンフレット；並びに欧州特許第２２９２４６号明細書に記載されているものがあり、これらの各々は、そこに引用されている参照文献を含め、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７８】
いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２抗体断片が提供される。抗体断片の生産のための様々な技術が知られている。伝統的に、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により取得される（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９３）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２抗体断片は、組換えにより作製する。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はその他の宿主細胞に発現させて、そこから分泌させることができ、これにより、これらの断片の大量の生産が可能になる。また、このような抗ＨＥＲ２抗体断片は、前述した抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗ＨＥＲ２抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているように、線状抗体であってもよい。抗体断片の生産のための他の技術は、当業者には明らかであろう。
【０２７９】
３９Ｓ抗体と同じＨＥＲ２エピトープに特異的な一本鎖抗体の生産のための技術を改変することができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照）。さらに、ＨＥＲ２に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、又はその誘導体、断片、類似体若しくは相同体の高速且つ有効な同定を可能にするように、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築方法を改変することもできる（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）を参照）。抗体断片は、当該技術分野の技術により生産することができ、こうした断片として、限定はしないが、以下：（ａ）抗体分子のペプシン消化により生産されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を低減することにより産生されるＦａｂ断片、（ｃ）パパイン及び還元剤による抗体分子の処理により産生されるＦａｂ断片、並びに（ｄ）Ｆｖ断片が挙げられる。
【０２８０】
一部の態様では、特に、抗体断片の場合、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、その血清半減期を延長するように修飾することができる。これは、例えば、抗体若しくは抗体断片における適切な領域の突然変異による、抗体若しくは抗体断片へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、これを抗体若しくは抗体断片にいずれかの末端若しくは中央で（例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成により）融合させることにより、あるいはＹＴＥ突然変異により、達成することができる。抗体又はその抗原結合断片の血清半減期を延長するその他の方法、例えば、ＰＥＧなどの異種分子への共役は、当該技術分野で公知である。
【０２８１】
ヘテロコンジュゲート抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本明細書に開示する３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、若しくはそれに由来する二重特異性抗体、又はＡＤＣは、組換え生物学技術を用いて、並びに合成タンパク質化学における公知の方法（架橋剤を用いるものなど）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、二重特異性抗体又はＡＤＣは、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することにより、化学的に構築することができる。この目的のために好適な試薬は、当該技術分野において公知であり、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートがある。
【０２８２】
いくつかの態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、ＣＨ３ドメインをそれぞれの修飾抗体又はその断片のヒンジ領域に直接融合させるように操作することができることにも留意されたい。他の構築物では、ヒンジ領域と修飾ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサを挿入することができる。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失し、残ったＣＨ３ドメイン（修飾又は非修飾）が、５〜２０アミノ酸スペーサでヒンジ領域に結合している適合性構築物を発現させることができる。このようなスペーサを付加することにより、例えば、定常ドメインの調節エレメントが遊離且つ接触可能なままであること、又はヒンジ領域がフレキシブルなままであることを確実にすることができる。しかし、アミノ酸スペーサは、一部の態様において、免疫原性であり、構築物に対して不要な免疫応答を誘発することを証明できることに留意すべきである。従って、いくつかの態様では、構築物に付加する任意のスペーサは、修飾抗体の所望の生化学的特性を維持するために、比較的非免疫原性であるか、あるいは、完全に除外する場合もある。
【０２８３】
全定常領域ドメインの欠失以外に、抗ＨＥＲ２結合分子は、数個又は１個のアミノ酸の部分的欠失若しくは置換によって取得することもできることも理解されよう。例えば、ＣＨ２ドメインの選択区域での１アミノ酸の突然変異だけで、Ｆｃ結合を実質的に低減し、これによって腫瘍局在化を高めるのに十分となり得る。さらに、上に簡潔に述べたように、開示の抗ＨＥＲ２結合分子の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを増強する１つ又は複数のアミノ酸の突然変異若しくは置換によって修飾することもできる。これに関して、修飾抗体又はその抗原結合断片の立体配置及び免疫原性プロフィールを実質的に維持しながら、保存結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によりもたらされる活性を妨害することが可能である。いくつかの態様は、望ましい特徴（例えば、エフェクター機能の低減若しくは増大）を増強するか、又はより多くの細胞毒若しくは炭水化物結合をもたらす目的で、定常領域に１つ又は複数のアミノ酸を付加することを含み得る。このような態様では、選択した定常領域ドメインから得られる特定の配列を挿入又は複製することもできる。
【０２８４】
ＶＩＩＩ．ＨＥＲ２結合分子をコードするポリヌクレオチド
いくつかの態様では、本開示は、ＨＥＲ２に特異的に結合する本明細書に開示の抗ＨＥＲ２結合分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、抗体又はその断片（例えば、３９Ｓ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれに由来する分子）などの抗ＨＥＲ２結合分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態のいずれであってもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み；二本鎖又は一本鎖のいずれであってもよく、一本鎖の場合には、コード鎖又は非コード鎖（アンチセンス）鎖であってもよい。いくつかの態様では、ＤＮＡは、非天然組換え抗体を産生するために用いられるｃＤＮＡである。
【０２８５】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは単離される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からポリペプチドの発現及び分泌を補助するポリヌクレオチド（天然若しくは異種のいずれか）に同じリーディングフレーム内で融合した成熟ポリペプチドのコード配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダ配列）を含む。リーダ配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、これは、宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成するリーダ配列を有し得る。ポリヌクレオチドは、抗ＨＥＲ２結合分子プロタンパク質をコードすることもでき、これは、成熟タンパク質と追加の５’アミノ酸残基である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞のためのコドン使用頻度を最適化するように改変される。
【０２８６】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、成熟抗ＨＥＲ２結合分子のコード配列、例えば、同じリーディングフレーム内で異種マーカ配列に融合した抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を含み、これは、例えば、コードされたポリペプチドの精製を可能にする。例えば、マーカ配列は、細菌宿主の場合にマーカに融合した成熟ポリペプチドの精製を可能にするｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサ−ヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグであってよい。別の態様では、マーカ配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が用いられる場合、例えば、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってよい。
【０２８７】
本開示はさらに、例えば、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子のＨＥＲ２結合断片、類似体、及び誘導体をコードする記載のポリヌクレオチドの変異体に関する。
【０２８８】
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又は両方に改変を含有してもよい。一部の態様では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生成するが、コードされたポリペプチドの特性又は活性は変えない改変を含有する。一部の態様では、ヌクレオチド変異体は、遺伝子コードの変性に起因するサイレント置換によって生産される。多様な理由で、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主により優先されるものに変更する）ために、ポリヌクレオチド変異体を生産することができる。本明細書に記載するポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
【０２８９】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列は、化学的合成により、例えば、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、構築することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、且つ、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好都合のコドンを選択することにより、設計することができる。標準的方法を適用して、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを合成した後、連結することができる。個別のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的アセンブリのために、５’又は３’突出部を含有する。
【０２９０】
いったんアセンブリングされたら（合成、部位指定突然変異誘発又は別の方法により）、目的とする特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、所望の宿主でのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結させる。適正なアセンブリは、例えば、ヌクレオチド配列決定、制限マッピング、及び好適な宿主における生物活性ポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野では公知のように、宿主におけるトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを達成するために、選択した発現宿主において機能性の転写及び翻訳発現制御配列に遺伝子を作動可能に連結しなければならない。
【０２９１】
いくつかの態様では、組換え発現ベクターを用いて、抗ＨＥＲ２結合分子をコードするＤＮＡを増幅及び発現することができる。組換え発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、これは、哺乳動物、微生物、ウイルス若しくは昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結した抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする、合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する。転写ユニットは、概して、以下のものを含む：（１）遺伝子発現において調節の役割を有する１つ又は複数の遺伝子エレメント、例えば、転写促進因子又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されて、タンパク質に翻訳される構造又はコード配列、並びに（３）以下に詳述する適切な転写及び翻訳開始並びに終結配列。こうした調節エレメントは、転写を制御するためのオペレータ配列を含んでよい。
【０２９２】
通常、複製起点により付与される、宿主において複製する能力、及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子をさらに組み込むことができる。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連しているとき、作動可能に連結される。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダ）のＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌に参加する前駆体として発現されれば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモータは、それが、配列の転写を制御すれば、コード配列に作動可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、それが、翻訳を可能にするように配置されていれば、コード配列に作動可能に連結されている。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダ配列を含む。あるいは、組換えタンパク質が、リーダ又は輸送配列なしで発現される場合、これは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。続いて、任意選択で、発現された組換えタンパク質から上記の残基を切断して、最終生成物を取得することができる。
【０２９３】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に左右される。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとして、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミドがあり、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド及びそれらの誘導体、より広範な宿主プラスミド、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【０２９４】
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片の発現に好適な宿主細胞としては、適切なプロモータの制御下での原核生物、酵母、昆虫又は高等真核生物が挙げられる。原核生物は、グラム陰性若しくはグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）が挙げられる。高等真核生物細胞としては、以下に記載する哺乳動物由来の樹立細胞株が挙げられる。また、無細胞翻訳系を使用することもできる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）により記載されており、その関連開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
抗体生産を含むタンパク質生産方法に関するさらなる情報は、例えば、以下：米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書及び同第６，６６０，５０１号明細書、並びに国際公開第０４００９８２３号パンフレットにみいだすことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９６】
様々な哺乳動物又は昆虫細胞培養系も、組換え抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を発現するために、有利に用いることができる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、こうしたタンパク質が、概して、正しくフォールディングされ、適切に修飾され、かつ完全に機能性であるため、実施することができる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）により記載されているサル腎細胞のＣＯＳ−７株、並びに他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ヒーラ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現しようとする遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサー、並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、並びに５’若しくは３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに転写終結配列を含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）系については、Ｌｕｃｋｏｗ＆Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に論じられている。
【０２９７】
形質転換宿主により産生された抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、任意の好適な方法により精製することができる。このような標準的方法として、例えば、クロマトグラフィー（例：イオン交換、アフィニティ及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質精製のための他のあらゆる標準的方法が挙げられる。アフィニティタグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをタンパク質に結合することにより、適切なアフィニティカラムの通過による容易な精製を可能にすることができる。単離したタンパク質は、例えば、タンパク質分解、核磁気共鳴又はＸ線結晶学を用いて、物理的に特性決定することもできる。
【０２９８】
例えば、組換えタンパク質を培地中に分泌する系からの上澄みを、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外濾過ユニットを用いて濃縮することができる。濃縮ステップ後に、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を使用することもできる。マトリックスは、タンパク質精製において一般に使用されるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はその他のタイプであってよい。これに代わり、カチオン交換ステップを使用することもできる。
【０２９９】
好適なカチオン交換体には、スルホプロリル又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスがある。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた１つ又は複数の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを使用して、ＨＥＲ２結合分子をさらに精製することができる。また、以上の精製ステップの一部又は全部を様々な組み合わせで使用して、均質な組換えタンパク質を取得することもできる。
【０３００】
細菌培養物中に産生された組換え抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、例えば、細胞ペレットからの最初の抽出後、１回又は複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最終精製ステップのために、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。組換えタンパク質の発現に用いる微生物細胞は、任意の好都合な方法（凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用など）により、破砕することができる。
【０３０１】
また、抗体及び他のタンパク質を精製ための当該技術分野で公知の方法には、例えば、米国特許出願公開第２００８０３１２４２５号明細書、同第２００８０１７７０４８号明細書、及び同第２００９０１８７００５号明細書に記載されているものも含まれ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３０２】
ＩＸ．治療用抗ＨＥＲ２結合分子を用いた治療方法
本開示は、ＨＥＲ２発現又はＨＥＲ２発現細胞に関連する疾患を有する患者を治療するために、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、及び誘導体などの使用を伴う方法も提供する。
【０３０３】
「ＨＥＲ２発現細胞」とは、ＨＥＲ２タンパク質を発現する細胞を意味する。細胞中のＨＥＲ２発現を検出及び／又は定量する方法は、当該技術分野では公知であり、限定はしないが、ＰＣＲ技術、免疫組織化学（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（商標））、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。一部の態様では、本明細書に開示する方法は、癌細胞が低レベルでＨＥＲ２を発現する場合の治療及び診断方法に適用される。
【０３０４】
本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子を用いた、様々な疾患及び障害の診断及び治療方法は、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、３９Ｓ抗体、変異体、誘導体、及びＨＥＲ２結合断片；本開示の二重特異性抗ＨＥＲ２分子；並びに本開示のＡＤＣ分子）を指し、これは、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子の所望の特性、例えば、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２活性を中和することができる特性を保持している。
【０３０５】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、ヒトＡＤＣＣを媒介するヒト若しくはヒト化抗ＨＥＲ２結合分子であるか；又はＡＤＣＣを媒介する既知抗ＨＥＲ２抗体を含むか；又はＡＤＣＣを媒介するように操作された抗ＨＥＲ２結合分子を含む。
【０３０６】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子は、ヒトＡＤＣＣを媒介しないヒト若しくはヒト化抗ＨＥＲ２結合分子であるか；又はＡＤＣＣを媒介しない既知抗ＨＥＲ２抗体を含むか；又はＡＤＣＣを媒介しないように操作された抗ＨＥＲ２結合分子を含む。
【０３０７】
一部の態様では、治療は、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の被験者又は患者への適用若しくは投与、あるいは、被験者又は患者由来の単離組織若しくは細胞に対する抗ＨＥＲ２結合分子の適用若しくは投与を含み、ここで、被験者又は患者は、疾患、疾患の症状、又は疾患に対する素因を有する。別の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を含む医薬組成物の被験者又は患者への適用若しくは投与、あるいは、被験者又は患者由来の単離組織若しくは細胞に対する、抗ＨＥＲ２結合分子を含む医薬組成物の適用若しくは投与を含み、被験者又は患者は、疾患、疾患の症状、又は疾患に対する素因を有する。
【０３０８】
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、様々な癌の治療に有用である。一態様では、本開示は、薬剤としての使用、特に、癌の治療又は予防での使用のための抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体に関する。癌の例として、限定はしないが、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、頭部及び頚部扁平上皮癌、黒色腫、膵臓癌、又は前立腺癌が挙げられる。一部の特定の態様では、癌は、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（商標）により決定される、低レベルのＨＥＲ２を発現する。
【０３０９】
本開示の方法に従い、少なくとも１つの抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本明細書の他所で定義する抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を用いて、癌に対する正の治療応答を促進する。癌に関して「正の治療応答」とは、これらの抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の活性に関連する疾患の改善、及び／又は疾患に関連する症状の改善を指す。
【０３１０】
例えば、疾患の改善は、完全な応答として特徴付けることができる。用語「完全な応答」は、いずれかの以前の試験結果の正常化を伴う、臨床的に検出可能な疾患の非存在を指す。あるいは、疾患の改善は、部分的応答として分類することもできる。「正の治療応答」は、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子を投与した結果としての、癌の進行及び／又は持続期間の低減若しくは阻害、癌の重症度の軽減若しくは緩和、及び／又は１つ又は複数の症状の緩和を包含する。
【０３１１】
特定の態様では、上記の用語は、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子の投与後の１つ、２つ又は３つ以上の結果：
（１）癌細胞集団の安定化、低減若しくは排除；
（２）癌増殖の安定化又は低減；
（３）癌形成の障害；
（４）原発性、局所及び／若しくは転移性癌の根絶、除去、又は制御；
（５）死亡率の低下；
（６）無疾患、無再発、及び／又は全生存、生存期間、若しくは生存率の増大；
（７）応答速度、応答の持続性、応答するか、又は寛解期にある患者の数の増加；
（８）入院率の減少；
（９）入院期間の減少；
（１０）癌のサイズ（例えば、体積）が維持され、増加しないか、又は増加が、１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは５％未満、好ましくは２％未満である；並びに
（１１）寛解期にある患者の数の増加。
（１２）他の場合に癌の治療に必要となるアジュバント療法薬（例えば、化学療法薬又はホルモン療法薬）の数の減少
を指す。
【０３１２】
臨床的応答は、スクリーニング技術、例えば、ＰＥＴ、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、組織学、肉眼所見、及び血液化学を用いて評価することができ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどにより検出可能な変化を含むがこれらに限定されない。これらの正の治療応答以外にも、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体による治療を受けている被験者は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
【０３１３】
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、任意の公知の癌治療薬と組み合わせて使用することができ、このような治療薬は、癌、例えば、結腸癌、肺癌、胃癌、頭部及び頚部扁平上皮細胞癌、及び乳癌の治療に有用であることがわかっているか、又はそれに用いられてきた、若しくは現在使用されている薬剤又は薬剤の組み合わせを含む。医薬併用製剤又は投与レジメンの第２薬剤若しくは薬剤の組み合わせは、好ましくは、これらが互いに有害に作用しないように、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子に対して相補的活性を有する。
【０３１４】
抗癌剤は、癌増殖などの悪性疾患を治療するために用いられる薬物を含む。薬物療法は、単独で、又は手術若しくは放射線療法などの他の治療と組み合わせて用いることができる。癌治療では、関連する臓器の種類に応じて、いくつかのクラスの薬物を用いることができる。例えば、乳癌は、一般に、エストロゲンによって刺激されることから、性ホルモンを不活性化する薬物で治療することができる。同様に、前立腺癌も、男性ホルモンであるアンドロゲンを不活性化する薬物で治療することができる。
【０３１５】
本開示の特定の方法で使用される抗癌剤として、中でも、抗体（例えば、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体、ＥＧＦＲに結合する抗体、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３に結合する抗体）、ＩＧＦ１Ｒをターゲティングする小分子、ＥＧＦＲをターゲティングする小分子、抗代謝物質、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管ターゲティング剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、免疫治療薬、ホルモン治療薬、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、化学療法薬、タンパク質キナーゼＢ阻害剤、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、シクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤、ＲＬｒ９、ＣＤ２８９、酵素阻害剤、抗ＴＲＡＩＬ、ＭＥＫ阻害剤などが挙げられる。
【０３１６】
特定の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片は、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）をターゲティングする他の抗体又は抗体断片、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）又はパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。
【０３１７】
別の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、キナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することができる。一部の他の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕに関連するチロシンキナーゼ活性の阻害剤、例えば、ラパチニブと組み合わせて投与することができる。一部の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子は、抗有糸分裂剤と組み合わせて投与することができる。一部の特定の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子は、紡錘体微小管集合体を安定化する薬剤、例えば、パクリタキセル又はドセタキセルと組み合わせて投与することができる。
【０３１８】
併用療法が、別の治療薬の投与と組み合わせた抗ＨＥＲ２結合分子の投与を含む場合、本開示の方法は、個別の製剤又は単一の医薬製剤を用いた同時投与、並びにいずれかの順序での連続的投与を包含する。一部の態様では、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子は、他の薬物と組み合わせて投与し、この場合、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体及び治療薬は、いずれの順序で連続的に、又は同時に（すなわち、一緒に、又は同じ時間枠内で）投与することができる。
【０３１９】
併用療法は、「相乗効果」をもたらすことができ、「相乗的である」、すなわち、活性成分を一緒に用いて達成される効果は、化合物を個別に用いて得られる効果の総和より大きいことが証明されている。相乗効果は、活性成分を（１）同時製剤化して、単位用量併用製剤として同時に投与又は送達するとき；（２）個別の薬剤として交互に、又は同時に送達するとき；又は（３）特定の他のレジメンにより投与するとき、達成される。交互療法で送達する場合、例えば、個別の注射器での複数回の注射により、化合物を順次投与又は送達するとき、相乗効果を達成することができる。一般に、交互療法では、有効用量の各成分を順次、すなわち連続的に投与するが、併用療法の場合には、有効用量の２種以上の活性成分を一緒に投与する。
【０３２０】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤と組み合わせて、相乗的組み合わせで投与することができる。一部の態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗体である。特定の態様では、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）又はＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）（パニツムマブ）である。特定の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕに関連するチロシンキナーゼ活性の阻害剤、例えば、ラパチニブとの相乗的組み合わせで投与することができる。一部の態様では、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子は、抗有糸分裂剤との相乗的組み合わせで投与することができる。一部の特定の態様では、抗有糸分裂剤は、紡錘体微小管集合体を安定化する。一部の特定の態様では、抗有糸分裂剤は、パクリタキセル又はドセタキセルである。
【０３２１】
別の態様は、臨床試験手順の一部としての組織中のタンパク質レベルの診断モニタリングを目的とする、例えば、所与の治療レジメンの効果を決定するための、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の使用である。例えば、検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングさせることによって促進することができる。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｇｒｏｕｐ）、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、及び放射性材料が挙げられる。好適な酵素の例として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びイクオリンが挙げられ；並びに、好適な放射性材料の例として、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、又は3Ｈが挙げられる。
【０３２２】
別の態様は、ＨＥＲ２ターゲティング治療薬、例えば、トラスツズマブなどのＨＥＲ２のドメインＩＶ内のエピトープをターゲティングする抗体に対して耐性の癌患者を治療するための、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の使用である。一部の態様では、治療薬は、トラスツズマブと同じエピトープをターゲティングする部分と、細胞傷害性部分とを含む。一部の態様では、このような細胞傷害性部分は、メイタンシノイドである。一部の特定の態様では、メイタンシノイドは、ＤＭ−１である。
【０３２３】
一部の態様では、本明細書に開示する治療方法は、抗ＨＥＲ２抗体である抗ＨＥＲ２結合分子の投与を含み、抗ＨＥＲ２抗体は、重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）と、軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列
を含む。
【０３２４】
一部の態様では、本明細書に開示する治療方法は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重抗ＨＥＲ２抗体である抗ＨＥＲ２結合分子の投与を含み、ここで、（ｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２抗体結合部位に特異的に結合し、（ｉｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含む第１ＨＥＲ２抗体結合部位に結合し、（ｉｉｉ）第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、ペルツズマブの抗体結合部位とは異なる。
【０３２５】
一部の態様では、本明細書に開示する治療方法は、第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重抗ＨＥＲ２抗体である抗ＨＥＲ２結合分子の投与を含み、ここで、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）と、軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列
を含む。
【０３２６】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４４のアミノ酸配列とを含む免疫グロブリン抗原結合ドメインのＦＷ領域とは異なる少なくとも１つの異種可変ドメインフレームワーク領域（ＦＷ）を含む。一部の態様では、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、以下：
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸を含む可変軽鎖フレームワーク１（ＶＬ−ＦＷ１）；
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸を含むＶＬ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸を含むＶＬ−ＦＷ３；
（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸を含むＶＬ−ＦＷ４；又は
（ｖｉ）これらの任意の組み合わせ
を含む。
【０３２７】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨは、配列番号１５又は４３のアミノ酸を含み；第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＬは、配列番号１６又は４４のアミノ酸を含み；第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子の第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨは、配列番号１５のアミノ酸を含み；ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸を含む。
【０３２８】
一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、（ａ）トラスツズマブと同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；及び／又は（ｂ）トラスツズマブ抗体によるＨＥＲ２との結合を競合的に阻害し；及び／又は（ｃ）配列番号５４〜５９のいずれか１つのアミノ酸を含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子の第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、以下：（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；並びに（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０３２９】
別の態様では、本明細書に開示する治療方法は、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含むＡＤＣである抗ＨＥＲ２結合分子の投与を含み、ここで、前記抗体は、以下を含む：
（ｉ）配列番号３２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３３Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号４１Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
【０３３０】
他の態様では、本明細書に開示する治療方法は、二重抗ＨＥＲ２抗体を含むＡＤＣである抗ＨＥＲ２結合分子の投与を含み、ここで、前記抗体は、以下を含む：
（ｉ）配列番号３２Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３Ｃ３のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分（例えば、ツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖｉ）配列番号６７のアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分（例えば、２つのツブリシン１５０８分子）を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
【０３３１】
Ｘ．医薬組成物及び投与方法
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）を調製し、それが必要な被験者に投与する方法は、当業者には公知であるか、当業者によって容易に決定される。抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）の投与経路は、例えば、例えば、経口、非経口、吸入又は局所投与によるものであってよい。本明細書で用いる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は膣投与を含む。しかし、本明細書での教示内容と適合可能な他の方法において、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）は、有害な細胞集団の部位に直接投与し、これにより、治療薬に対する疾患組織の曝露を高めることができる。
【０３３２】
本明細書で論じる場合、本開示の抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）は、特定のタイプの癌などのＨＥＲ２発現細胞媒介性疾患のｉｎ  ｖｉｖｏ治療のために薬学的に有効な量で投与することができる。医薬組成物は、例えば、水、イオン交換体、タンパク質、バッファー物質、及び塩など、薬学的に許容される担体を含み得る。また、防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。担体は、溶媒又は分散媒であってよい。本明細書に開示する治療方法での使用に好適な製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０３３３】
いずれの場合でも、適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、単独又は他の活性薬剤と組み合わせた、抗ＨＥＲ２抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体、例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）を組み込んだ後、濾過滅菌により無菌注射液を調製することができる。さらに、調製物をパッケージングし、キットの形態で販売することもできる。こうした製品は、関連組成物が、疾患又は障害に罹患した、若しくは罹患しやすい被験者を治療する上で有用であることを示すラベル又はパッケージ挿入片を含んでもよい。
【０３３４】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入物、又は投与ボーラス用量とそれに続く維持用量であってよい。これらの組成物は、特定の定若しくは変動間隔で、例えば、１日１回、又は「必要に応じて」投与することができる。
【０３３５】
組成物は、単回用量、複数回用量として、又は既定の注入期間にわたって投与することができる。投与レジメンはまた、最適な望ましい応答（例えば、治療若しくは予防応答）をもたらすように調節することができる。
【０３３６】
ＨＥＲ２発現細胞媒介性疾患、例えば、結腸癌、肺癌、胃癌、頭部及び頚部扁平上皮癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌を含む特定のタイプの癌の治療のための本開示の組成物の治療有効量は、多くの様々な要因、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒト又は動物のいずれであるか、投与される他の薬剤、並びに処置が予防又は治療のいずれであるかに応じて変動する。一部の特定の態様では、癌は、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（商標）を用いて決定される、低レベルのＨＥＲ２を発現する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。安定性及び効力を最適化するために、当業者には周知の常用的方法を用いて、治療用量を滴定することができる。
【０３３７】
投与しようとする少なくとも１つの抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）の量は、過度の実験を行うことなく、当業者が容易に決定することができる。少なくとも１つの抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）の投与方法及びそれぞれの量に影響を与える要因として、限定はしないが、疾患の重症度、病歴、治療を受けている個体の年齢、身長、体重、健康状態、及び体調が挙げられる。同様に、投与しようとする抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）の量は、投与方法、及び被験者が、単回用量又は複数回用量のいずれで薬剤を受けるかに応じて変わり得る。
【０３３８】
本開示はまた、１タイプの癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、頭部及び頚部扁平上皮癌、黒色腫、膵臓癌、及び前立腺癌を治療するための薬剤の製造における抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）の使用も提供する。一部の特定の態様では、癌は、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（商標）を用いて決定される、低レベルのＨＥＲ２を発現する。
【０３３９】
本開示はさらに、１タイプの癌を治療する目的で、被験者を治療するための薬剤の製造における抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の使用も提供する。一部の特定の態様では、癌は、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（商標）を用いて決定される、低レベルのＨＥＲ２を発現する。いくつかの態様では、薬剤は、少なくとも１つの他の療法で前処置された被験者に用いられる。
【０３４０】
「前処置された」又は「前処置」とは、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）を含む薬剤を受ける前に、被験者が１つ又は複数の他の療法を受けた（例えば、少なくとも１つの他の抗癌療法で治療された）ことを意味する。被験者が、以前の療法（１つ又は複数）による前処置に対しての応答者である必要はない。そのため、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）を含む薬剤を受ける被験者は、以前の療法による前処置、又は前処置が複数の療法を含む場合、以前の療法の１つ又は複数に対して応答した、あまり応答しなかったか、あるいは応答しなかった可能性がある。従って、本開示は、他の療法（例えば、Ｔ−ＤＭ１などの抗体又はＡＤＣによる治療）に対する低応答者又は不応答者である患者を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）を投与するステップを含む。また、癌治療法（例えば、Ｔ−ＤＭ１などの抗体又はＡＤＣによる治療）に対する耐性を予防する方法も提供され、この方法は、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）を投与するステップを含む。
【０３４１】
患者が以前ＨＥＲ２阻害剤で治療されたことがある場合でも、当業者は、ＨＥＲ２阻害剤による治療後に応答を全く示さないかどうかを決定することができる。例えば、阻害剤に対する不応答は、癌による障害の増大、例えば、癌／腫瘍の増殖増大及び／又は腫瘍のサイズ増大、転移の形成（の増大）又は転移の数若しくはサイズの増大に表され得る。不応答はまた、例えば、ネオアジュバント療法の場合、腫瘍又は転移の発生、例えば、腫瘍の切除後、疾患進行までの時間の短縮化、又は腫瘍及び／若しくは転移のサイズの増大でもあり得る。これらのパラメータ又は当該技術分野で公知の他のパラメータに基づき、ペルツズマブ、トラスツズマブ、又はＴ−ＤＭ１などのＨＥＲ２阻害剤による治療に応答しない患者群を識別することができる。次に、こうした患者群を、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）で治療することができる。
【０３４２】
本開示はさらに、例えば、別の療法に対して低応答者又は不応答者である患者を治療する方法も提供する。本明細書で用いる用語「不応答者」は、ＨＥＲ２阻害剤（例えば、ペルツズマブ、トラスツズマブ、又はＴ−ＤＭ１など）を用いた治療に応答し難い個体／患者／被験者を指すことができる。本明細書で用いる「応答し難い」とは、ＨＥＲ２阻害剤による治療を受ける患者において病理学的完全奏効が起こる可能性が低いことを指す。一部の態様では、患者は、初め良好な応答者であり、ＨＥＲ２阻害剤（例えば、ペルツズマブ、トラスツズマブ、又はＴ−ＤＭ１など）を用いた治療の過程で、ＨＥＲ２阻害剤に対する耐性が発生して、治療に対する低応答又は不応答を招く場合もある。
【０３４３】
本明細書で用いる用語「良好な応答者」は、ＨＥＲ２阻害剤（例えば、ペルツズマブ、トラスツズマブ、又はＴ−ＤＭ１など）を用いた治療中、又は治療後に、例えば、連続的イメージング試験に基づき、その腫瘍が増殖、転移、転移の数若しくはサイズの増大などを呈示しない個体、所定の期間（例えば、最初の診断から約１年）にわたって、腫瘍増殖、転移、転移の数若しくはサイズの増大などを経験しない個体、及び／又は特定の寿命（例えば、最初の診断から約２年以上）を経験する個体を指す。
【０３４４】
本明細書で用いる用語「低応答者」は、例えば、ＨＥＲ２阻害剤（例えば、ペルツズマブ、トラスツズマブ、又はＴ−ＤＭ１など）を用いた標準的治療中、又は治療直後に、その腫瘍が増殖若しくは転移する個体、又は腫瘍に起因する有害な臨床作用を経験する個体を指す。
【０３４５】
被験者が「不応答者」、「低応答者」である、又は「応答し難い」（例えば、癌細胞における特定のバイオマーカの存在に基づき）場合、被験者は、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）で治療することができる。
【０３４６】
本開示はまた、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）と、少なくとも１つの他の療法の共投与も提供する。抗ＨＥＲ２結合分子と少なくとも１つの他の療法は、単一の組成物中に一緒に共投与するか、又は個別の組成物として、同時又は重複する時点で一緒に共投与することができる。一部の態様では、抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）は、アジュバント療法として用いることができる。
【０３４７】
本開示はさらに、癌を治療する目的で、被験者を治療するための薬剤の製造における抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、Ｂｓ２−４ＴなどのＡＤＣ）の使用も提供し、この場合、被験者が少なくとも１つの他の療法で治療される前に、抗ＨＥＲ２結合分子を投与する。
【０３４８】
ＸＩ．診断
本開示は、さらに、ＨＥＲ２発現細胞媒介性疾患、例えば、結腸癌、肺癌、胃癌、頭部及び頚部扁平上皮癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌を含む特定のタイプの癌の診断の際に有用な診断方法も提供し、この方法は、個体からの組織若しくは他の細胞又は体液中のＨＥＲ２タンパク質又は転写物の発現レベルを測定し、測定した発現レベルを、正常な組織若しくは体液中の標準的ＨＥＲ２発現レベルと比較するステップを含み、ここで、標準と比較した発現レベルが障害を示す。
【０３４９】
本開示の抗ＨＥＲ２結合分子並びにその抗原結合断片、変異体、及び誘導体は、当業者には周知の古典的免疫組織学的方法（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照）を用いて、生体サンプル中のＨＥＲ２タンパク質レベルをアッセイするために使用することができる。ＨＥＲ２タンパク質発現を検出するのに有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、又はウェスタンブロッティングなどの免疫検定が挙げられる。好適なアッセイについては、本明細書の他所でさらに詳しく説明する。
【０３５０】
「ＨＥＲ２ポリペプチドの発現レベルをアッセイする（こと）」とは、直接（例えば、絶対タンパク質レベルを測定又は評価する）、又は相対的（例えば、第２生体サンプル中の疾患関連ポリペプチドレベルと比較する）のいずれかにより、第１生体サンプル中のＨＥＲ２ポリペプチドのレベルを定性若しくは定量的に測定する、又は評価することを意味する。第１生体サンプル中のＨＥＲ２ポリペプチド発現のレベルを測定又は評価した後、標準ＨＥＲ２ポリペプチドレベルと比較することができ、ここで、標準は、障害のない個体から採取した第２生体サンプルから取得するか、又は障害のない個体の集団から得たレベルを平均することによって決定される。当該技術分野では理解されるように、いったん「標準」ＨＥＲ２ポリペプチドレベルがわかったら、これを比較のための標準として繰り返し使用することができる。
【０３５１】
「生体サンプル」とは、個体、細胞株、組織培養物、又はＨＥＲ２を発現する可能性のある細胞の他のソースから得られるいずれかの生体サンプルを意味する。哺乳動物から組織生検及び体液を採取する方法は、当該技術分野では公知である。
【０３５２】
ＸＩＩ．抗ＨＥＲ２結合分子を含むキット
本開示はさらに、本明細書に記載する方法を実施するのに用いることができる本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を含むキットも提供する。特定の態様では、キットは、１つ又は複数の容器中に少なくとも１つの精製済抗ＨＥＲ２結合分子又はその抗原結合断片を含む。一部の態様では、キットは、検出アッセイを実施するのに必要な、及び／又は十分な成分の全てを含み、これには、全ての対照、アッセイを実施するための指示、並びに分析及び結果の表示に必要な任意のソフトウェアが含まれる。当業者であれば、本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片を、当該技術分野では公知の既定のキットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることを容易に認識されよう。
【０３５３】
ＸＩＩＩ．免疫アッセイ
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の分子の抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくはその誘導体は、当該技術分野では公知の任意の方法により、免疫特異的結合についてアッセイすることができる。用いることができる免疫アッセイは、限定はしないが、いくつか挙げると、ウェスタンブロットなどの技術を用いた競合及び非競合的アッセイ系、放射性免疫検定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」免疫検定、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量測定、蛍光免疫法、プロテインＡ免疫法がある。このようなアッセイは、常用的であり、当該技術分野では公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）Ｖｏｌ．１を参照のこと；これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３５４】
本明細書に開示する抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、本開示の分子の二重特異性ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくはその誘導体は、ＨＥＲ２受容体又はその保存変異体若しくはペプチド断片のｉｎ  ｓｉｔｕ検出のための免疫蛍光、免疫電子顕微鏡又は非免疫学的アッセイのように、組織学的に使用することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的試料を採取し、そこに、標識したＨＥＲ２結合分子、例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくはその誘導体を適用し、好ましくは、標識ＨＥＲ２結合分子（例えば、抗体又は断片）を生体サンプルに重ねることにより適用して、達成することができる。このような手順の使用によって、ＨＥＲ２、又は保存変異体若しくはペプチド断片の存在だけではなく、試験組織におけるその分布も決定することが可能である。本開示を用いて、当業者は、多種多様な組織学的方法（例えば、染色法など）のいずれかを、こうしたｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成するために改変できることを容易に認識されよう。
【０３５５】
抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくはその誘導体の所与のロットの結合活性は、公知の方法に従い決定することができる。当業者は、常用的実験を使用することにより、各々の決定のために効果的且つ最適なアッセイ条件を決定することができる。
【０３５６】
本開示の抗ＨＥＲ２結合分子、例えば、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片、変異体、又はその改変／突然変異型誘導体の結合特性の決定に好適な方法及び試薬は、当該技術分野では公知であり、及び／又は市販されている。このような動態学的分析のために設計された装置及びソフトウェアは、市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫｉｎＥｘａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
【０３５７】
本開示の実施では、他に指示のない限り、細胞生物学、細胞培養物、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を使用するが、これらは、当業者が備えている技能の範囲内である。こうした技術は、文献において十分に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４及び１５５；Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；並びにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）。
【０３５８】
抗体操作の一般原則は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。タンパク質操作の一般原則は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般原則は、以下：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。さらに、当該技術分野では公知であり、詳細には説明されていない免疫学の標準的方法は、概して、以下：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）並びにＭｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）の記載に従う。
【０３５９】
免疫学の一般原則を記載した標準的参照文献として、以下のものが挙げられる：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０３６０】
ＸＩＶ．実施形態
実施形態は、「ＥｎＸｍ」スキームに従って呼称するが、ここで、Ｅは、「実施形態」を意味し；ｎは、実施形態の序数；Ｘは、任意選択であり、Ａ又はＢの場合があり、Ａは、特にＡＤＣ構築物に関する実施形態を示し、Ｂは、増強されたＡＤＣＣを有する構築物に特に関連する実施形態を示し；ｍは、１クラスに含まれる追加的実施形態を示す任意選択の序数枝番（例えば、Ａ１、Ｂ１など）である。
【０３６１】
Ｅ１．第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、（ｉ）第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインは、異なるＨＥＲ２抗体結合部位に特異的に結合し、（ｉｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内にエピトープを含む第１ＨＥＲ２抗体結合部位に結合し、（ｉｉｉ）第１ＨＥＲ２抗体結合部位は、ペルツズマブの抗体結合部位とは異なる、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６２】
Ｅ２．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にエピトープを含む第２ＨＥＲ２抗体結合部位に結合する、Ｅ１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６３】
Ｅ３．第２ＨＥＲ２抗体結合部位が、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位と同一である、Ｅ２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６４】
Ｅ４．第２ＨＥＲ２抗体結合部位が、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位と部分的に重複する、Ｅ２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６５】
Ｅ５．第２ＨＥＲ２抗体結合部位が、トラスツズマブのＨＥＲ２抗体結合部位とは異なる、Ｅ２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６６】
Ｅ６．第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、配列番号５２における１つ又は複数のアミノ酸残基にＨＥＲ２を結合する、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６７】
Ｅ７．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ドメインＩＶ内のエピトープでＨＥＲ２に結合する、Ｅ６に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６８】
Ｅ８．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、配列番号５３における１つ又は複数のアミノ酸残基にＨＥＲ２を結合する、Ｅ６に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３６９】
Ｅ９．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）と軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）配列番号１と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一である可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号２と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一である可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；
（ｉｉｉ）配列番号３と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一である可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；
（ｉｖ）配列番号４と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｖｉ）配列番号６と同一か、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一である可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列
を含む、Ｅ１〜Ｅ８に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７０】
Ｅ１０．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、配列番号４３のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号４４のアミノ酸を含むＶＬとを含む免疫グロブリン抗原結合ドメインのＦＷ領域に関して少なくとも１つの異種可変ドメインフレームワーク領域（ＦＷ）を含む、Ｅ９に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７１】
Ｅ１１．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、以下：
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸を含む可変軽鎖フレームワーク１（ＶＬ−ＦＷ１）；
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸を含むＶＬ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸を含むＶＬ−ＦＷ３；
（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸を含むＶＬ−ＦＷ４；又は
（ｖｉ）これらの任意の組み合わせ
を含む、Ｅ１０に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７２】
Ｅ１２．第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨが、配列番号１５又は４３のアミノ酸を含み；且つ、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７３】
Ｅ１３．第１免疫グロブリン抗原結合ドメイン及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインであって、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬが、配列番号１６又は４４のアミノ酸を含み；且つ、第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、異なるＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７４】
Ｅ１４．ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸を含み；且つＶＬが、配列番号１６のアミノ酸を含む、Ｅ１２又はＥ１３に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７５】
Ｅ１５．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ抗体断片を含む、Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７６】
Ｅ１６．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ抗体断片を含む、Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７７】
Ｅ１７．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、以下：
（ａ）重鎖定常領域若しくはその断片をさらに含むＶＨと、軽鎖定常領域（ＬＣ）若しくはその断片を含むＶＬ；
（ｂ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；
（ｃ）ダイアボディ；
（ｄ）ミニボディ；
（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；又は
（ｆ）Ｆ（ａｂ）
を含むか、又はこれらからなる、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７８】
Ｅ１８．重鎖定常領域又はその断片が、ＩｇＧ定常領域である、Ｅ１７に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３７９】
Ｅ１９．ＩｇＧ定常領域又はその断片が、ＩｇＧ１定常領域である、Ｅ１８に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８０】
Ｅ２０．ＬＣ定常領域が、κ定常領域である、Ｅ１７〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８１】
Ｅ２１．ＬＣ定常領域が、λ定常領域である、Ｅ１７〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８２】
Ｅ２２．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体である、Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８３】
Ｅ２３．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ヒト化抗体である、Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８４】
Ｅ２４．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ヒト抗体である、Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８５】
Ｅ２５．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、キメラ抗体である、Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８６】
Ｅ２６．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、アフィニティ最適化抗体である、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８７】
Ｅ２７．第１免疫グロブリン抗原結合ドメインが、エピトープ結合についてトラスツズマブ又はペルツズマブと競合しない、Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８８】
Ｅ２８．第１及び第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、異なる非重複ＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３８９】
Ｅ２９．（ａ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、トラスツズマブ抗体と同じＨＥＲ２エピトープに特異的に結合し；
（ｂ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、トラスツズマブ抗体によるＨＥＲ２との結合を競合的に阻害し；又は
（ｃ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、配列番号５４〜５９のいずれか１つのアミノ酸を含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９０】
Ｅ３０．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、以下：
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；
（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３
を含むｓｃＦｖである、Ｅ２９に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９１】
Ｅ３１．ｓｃＦｖが、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖである、Ｅ３０に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９２】
Ｅ３２．ｓｃＦｖが、配列番号１７のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸を含むＶＬとを含む、Ｅ３０又はＥ３１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９３】
Ｅ３３．前記ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬが、ペプチドリンカーを介して共有結合している、Ｅ３２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９４】
Ｅ３４．ペプチドリンカーが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、Ｅ３３に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９５】
Ｅ３５．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合している、Ｅ２９〜Ｅ３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９６】
Ｅ３６．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端との間に位置するリンカーを含む、Ｅ３５に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９７】
Ｅ３７．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合している、Ｅ２９〜Ｅ３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９８】
Ｅ３８．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのアミノ末端との間に位置するリンカーを含む、Ｅ３７に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０３９９】
Ｅ３９．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖内に共有結合によって挿入されている、Ｅ２９〜Ｅ３４に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４００】
Ｅ４０．第２免疫グロブリン抗原結合ドメインが、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域とＣＨ２領域との間に、共有結合によって挿入されている、Ｅ３９に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０１】
Ｅ４１．（ｉ）第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ１領域と、第２免疫グロブリン抗原結合ドメインとの間に挿入されたリンカー；及び
（ｉｉ）第２免疫グロブリン抗原結合ドメインと、第１免疫グロブリン抗原結合ドメインのＨＣのＣＨ２領域との間に挿入された第２リンカーを含む、
Ｅ４０に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０２】
Ｅ４２．第１リンカーと第２リンカーが、同一である、Ｅ４１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０３】
Ｅ４３．第１リンカーと第２リンカーが、異なる、Ｅ４１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０４】
Ｅ４４．リンカーの１つ又は複数が、ペプチドリンカーを含む、Ｅ３６、Ｅ３８、及びＥ４１〜Ｅ４３のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０５】
Ｅ４５．ペプチドリンカーが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、又は少なくとも３０のアミノ酸を含む、Ｅ４４に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０６】
Ｅ４６．ペプチドリンカーが、式Ｓｅｒx［（Ｇｌｙ）y−Ｓｅｒ4］z（ｘは、０〜１であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜１０である）を有するペプチドを含む、Ｅ４４又はＥ４５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０７】
Ｅ４７．ペプチドリンカーが、配列番号１９〜２２を含む、Ｅ４６に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０８】
Ｅ４８．重鎖が、Ｆｃドメインを含む定常領域を含む、Ｅ１〜Ｅ４７のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４０９】
Ｅ４９．Ｆｃドメインが、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む、Ｅ４８に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１０】
Ｅ５０．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、Ｅ４８に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１１】
Ｅ５１．ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、Ｅ５０に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１２】
Ｅ５２．ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号２３のアミノ酸を含む、Ｅ５１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１３】
Ｅ５３．ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、Ｅ４８に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１４】
Ｅ５４Ａ．突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる少なくとも１つの突然変異を含む、Ｅ５３に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１５】
Ｅ５４Ｂ．突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異を含む、Ｅ５３に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１６】
Ｅ５５Ａ．二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を低減することができる少なくとも１つの突然変異が、アミノ酸置換である、Ｅ５４Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１７】
Ｅ５５Ｂ．二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異が、アミノ酸置換である、Ｅ５４Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１８】
Ｅ５６Ａ．Ｌ２３４Ｆ、Ｓ２３９Ａ、Ｓ２３９Ｃ、２３９位と２４０位の間のシステインアミノ酸の挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う、Ｅ５５Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４１９】
Ｅ５６Ｂ．Ｓ２３９Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、又はこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う、Ｅ５５Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２０】
Ｅ５７Ａ．前記突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、誘導体化可能な基を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、Ｅ５５Ａ又は５６Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２１】
Ｅ５７Ｂ．Ｆｃドメインが、ＡＤＣＣ活性を増強する改変型のグリコシル化を有する、Ｅ４８〜Ｅ５３、Ｅ５４Ｂ、Ｅ５５Ｂ又は５６Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２２】
Ｅ５８Ａ．前記突然変異型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、誘導体化可能な基を導入する１〜３つのアミノ酸置換を含む、Ｅ５７Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２３】
Ｅ５８Ｂ．Ｆｃドメインが、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体である、Ｅ５７Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２４】
Ｅ５９Ａ．誘導体化可能な基が、スルフヒドリル基である、Ｅ５７Ａ又はＥ５８Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２５】
Ｅ５９Ｂ．Ｆｃドメインが、増大したバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造を有する、Ｅ５７Ｂ又はＥ５８Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２６】
Ｅ６０．少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下：Ｓ２３９Ｃ、２４８Ｃ、２５４Ｃ、２５８Ｃ、２７３Ｃ、２７９Ｃ、２８２Ｃ、２８４Ｃ、２８６Ｃ、２８７Ｃ、２８９Ｃ、２９７Ｃ、２９８Ｃ、３１２Ｃ、３２４Ｃ、３２６Ｃ、３３０Ｃ、３３５Ｃ、３３７Ｃ、３３９Ｃ、３５０Ｃ、３５５Ｃ、３５６Ｃ、３５９Ｃ、３６０Ｃ、３６１Ｃ、３７５Ｃ、３８３Ｃ、３８４Ｃ、３８９Ｃ、３９８Ｃ、４００Ｃ、４１３Ｃ、４１５Ｃ、４１８Ｃ、４２２Ｃ、４３５Ｃ、４４０Ｃ、４４１Ｃ、Ｓ４４２Ｃ、４４３Ｃ、２３９位と２４０位の間のシステインアミノ酸挿入、並びに４４６Ｃ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う、Ｅ５９Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２７】
Ｅ６１Ａ．突然変異型Ｆｃドメインが、配列番号２４Ａ、配列番号２４Ｃ、配列番号２５Ａ又は配列番号２５Ｃのアミノ酸を含む、Ｅ５４Ａ、Ｅ５５Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｅ５９Ａ、又はＥ６０Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２８】
Ｅ６１Ｂ．突然変異型Ｆｃドメインが、配列番号２４Ｂ又は配列番号２５Ｂのアミノ酸を含む、Ｅ５４Ｂ、Ｅ５５Ｂ、Ｅ５６Ｂ、Ｅ５７Ｂ、Ｅ５８Ｂ、Ｅ５９Ｂ、又はＥ６０Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４２９】
Ｅ６２．互いに結合した第１及び第２ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗ＨＥＲ２抗体であって、第１ポリペプチド鎖が、以下：
（１）［ＴＺS］−［Ｌ1］−［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］
（２）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［ＦｃX］−［Ｌ2］−［ＴＺS］
（３）［BＶＨ］−［BＣＨ］−［Ｌ3］−［ＴＺS］−［Ｌ4］−［ＦｃX］
から選択され、
ここで、
ＴＺは、トラスツズマブ抗体と同じエピトープに結合するｓｃＦｖであり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、及びＬ4は、ペプチドリンカーであり；
ＦｃXは、Ｆｃドメインであり；
BＶＨ及びBＣＨは、それぞれ、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＨ及びＣＨ１領域である、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３０】
Ｅ６３．異なるエピトープが、配列番号５２内の１個又は複数のアミノ酸を含む、Ｅ６２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３１】
Ｅ６４．第２ポリペプチド鎖が、配列［BＶＬ］−［ＣＬ］を含み、ここで、ＢＶＬは、トラスツズマブ抗体により認識されるエピトープとは異なるＨＥＲ２エピトープに結合することができる抗体のＶＬ領域であり、ＣＬは、ＩｇＧ軽鎖定常領域である、Ｅ６２又はＥ６３に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３２】
Ｅ６５．ＣＬが、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択される、Ｅ６４に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３３】
Ｅ６６．BＶＬが、以下：
（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、
Ｅ６４又はＥ６５に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３４】
Ｅ６７．BＶＬが、配列番号１６又は４４のアミノ酸を含む、Ｅ６４、Ｅ６５又はＥ６６に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３５】
Ｅ６８．ＣＬが、配列番号２７Ａ又は配列番号２７Ｂのアミノ酸配列を含む、Ｅ６５に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３６】
Ｅ６９．［ＴＺS］が、以下：
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５６のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号５７のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号５９のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む、
Ｅ６２〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３７】
Ｅ７０．［ＴＺS］が、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖである、Ｅ６２〜Ｅ６９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３８】
Ｅ７１．［ＴＺS］が、配列番号１７のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、これらは、ペプチドリンカーにより共有結合している、Ｅ６２〜Ｅ７０のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４３９】
Ｅ７２．ペプチドリンカーが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、Ｅ７１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４０】
Ｅ７３．［ＴＺS］が、配列番号２８のアミノ酸を含む、Ｅ６９〜Ｅ７２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４１】
Ｅ７４．ヒンジポリペプチドが、［BＣＨ］と［Ｆｃｘ］を連結する、Ｅ６２〜Ｅ７２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４２】
Ｅ７５．ヒンジポリペプチドが、配列番号２６のアミノ酸を含むか、あるいは、アミノ酸から構成される、Ｅ７４に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４３】
Ｅ７６Ａ．［Ｆｃｘ］が、誘導体化可能な基を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、Ｅ６２〜Ｅ７５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４４】
Ｅ７６Ｂ．［Ｆｃｘ］が、ＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異を含む、Ｅ６２〜Ｅ７５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４５】
Ｅ７７Ａ．［Ｆｃｘ］が、誘導体化可能な基を導入する１〜３つのアミノ酸置換を含む、Ｅ７６Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４６】
Ｅ７７Ｂ．ＡＤＣＣ活性を増強することができる少なくとも１つの突然変異が、アミノ酸置換である、Ｅ７６Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４７】
Ｅ７８Ａ．誘導体化可能な基が、スルフヒドリル基である、Ｅ７６Ａ又はＥ７７Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４８】
Ｅ７８Ｂ．Ｓ２３９Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、又はこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う、Ｅ７７Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４４９】
Ｅ７８Ｂ１．Ｆｃドメインが、ＡＤＣＣ活性を増強する改変型のグリコシル化を有する、Ｅ６２〜Ｅ７５、Ｅ７６Ｂ、Ｅ７７Ｂ又はＥ７８Ｂに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５０】
Ｅ７８Ｂ２．Ｆｃドメインが、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体である、Ｅ７８Ｂ１に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５１】
Ｅ７８Ｂ３．Ｆｃドメインが、増大したバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造を有する、Ｅ７８１Ｂ又はＥ７８Ｂ２に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５２】
Ｅ７９．少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下：Ｓ２３９Ｃ、２４８Ｃ、２５４Ｃ、２５８Ｃ、２７３Ｃ、２７９Ｃ、２８２Ｃ、２８４Ｃ、２８６Ｃ、２８７Ｃ、２８９Ｃ、２９７Ｃ、２９８Ｃ、３１２Ｃ、３２４Ｃ、３２６Ｃ、３３０Ｃ、３３５Ｃ、３３７Ｃ、３３９Ｃ、３５０Ｃ、３５５Ｃ、３５６Ｃ、３５９Ｃ、３６０Ｃ、３６１Ｃ、３７５Ｃ、３８３Ｃ、３８４Ｃ、３８９Ｃ、３９８Ｃ、４００Ｃ、４１３Ｃ、４１５Ｃ、４１８Ｃ、４２２Ｃ、４３５Ｃ、４４０Ｃ、４４１Ｃ、Ｓ４４２Ｃ、４４３Ｃ、４４６Ｃ、２３９及び２４０位間のシステインアミノ酸挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含み、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う、Ｅ７８Ａに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５３】
Ｅ８０Ａ．［Ｆｃｘ］が、配列番号２３、２４Ａ、２４Ｃ、２５Ａ及び２５Ｃのいずれか１つのアミノ酸を含む、Ｅ６２〜Ｅ７５、Ｅ７６Ａ、Ｅ７７Ａ、Ｅ７８Ａ、又はＥ７９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５４】
Ｅ８０Ｂ．［Ｆｃｘ］が、配列番号２３、２４Ｂ、及び２５Ｂのいずれか１つのアミノ酸を含む、Ｅ６２〜Ｅ７５、Ｅ７６Ｂ、Ｅ７７Ｂ、Ｅ７８Ｂ、Ｅ７８Ｂ１、Ｅ７８Ｂ２、Ｅ７８Ｂ３、又はＥ７９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５５】
Ｅ８１．［Ｌ1］、［Ｌ2］、［Ｌ3］、及び［Ｌ4］が、配列番号１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるアミノ酸を含む、Ｅ６２〜Ｅ７９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５６】
Ｅ８２．（ｉ）［Ｌ1］が、配列番号１９のアミノ酸を含み；
（ｉｉ）［Ｌ2］が、配列番号２０のアミノ酸を含み；
（ｉｉｉ）［Ｌ3］が、配列番号２１のアミノ酸を含み；
（ｉｖ）［Ｌ4］が、配列番号２２のアミノ酸を含む、
Ｅ６２〜Ｅ７９のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５７】
Ｅ８３．［ＢＶＨ］が、以下：
（ｉ）配列番号１と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号１と同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号２と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号２と同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号３と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号３と同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む、
Ｅ６２〜Ｅ８２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５８】
Ｅ８４．［ＢＶＨ］が、配列番号１５又は４３を含む、Ｅ６２〜Ｅ８２のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４５９】
Ｅ８５．［ＢＣＨ］が、配列番号２９を含む、Ｅ６２〜Ｅ８４のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６０】
Ｅ８６．［ＢＶＬ］が、以下：
（ｉ）配列番号４と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号４と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号５と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号５と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
（ｉｉｉ）配列番号６と同一であるか、又は最大１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換以外は配列番号６と同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、
Ｅ６４〜Ｅ８５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６１】
Ｅ８７．［ＢＶＬ］が、配列番号１６又は４４のアミノ酸を含む、Ｅ６４〜Ｅ８５のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６２】
Ｅ８８Ａ．第１ポリペプチド鎖が、以下：配列番号３０、３１Ａ、３２Ａ、３２Ｃ、３３Ａ、３３Ｃ、３４、３５Ａ、３６Ａ、３６Ｃ、３７Ａ、３７Ｃ、３８、３８Ａ、３９Ａ、４０Ａ、４０Ｃ、４１Ａ、又は４１Ｃのいずれか１つのアミノ酸を含み、且つ、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４２Ａ又は４２Ｂのアミノ酸を含み、ここで、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、治療部分と共役している、Ｅ６２〜Ｅ８７のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６３】
Ｅ８８Ｂ．第１ポリペプチド鎖が、以下：配列番号３０、３１Ｂ、３２Ｂ、３３Ｂ、３４、３５Ｂ、３６Ｂ、３７Ｂ、３８、３８Ｂ、３９Ｂ、４０Ｂ、又は４１Ｂのいずれか１つのアミノ酸を含み、且つ、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４２Ａ又は４２Ｂのアミノ酸配列を含み、ここで、二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、増強したＡＤＣＣ活性を有する、Ｅ６２〜Ｅ８７のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６４】
Ｅ８９．二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２標的と結合すると、内在化を誘導する、Ｅ１〜Ｅ８８Ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６５】
Ｅ９０．二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が、内在化後に、有効なリソソーム輸送を促進する、Ｅ８９に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６６】
Ｅ９１．二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２標的分解を誘導する、Ｅ１〜Ｅ８８Ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６７】
Ｅ９２．二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が、低ＨＥＲ２発現癌細胞において、リガンド誘導によるＡＫＴリン酸化を阻止する、Ｅ１〜Ｅ８８Ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６８】
Ｅ９３．二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が、リガンド誘導のＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化を妨害する、Ｅ１〜Ｅ８８Ｂのいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。
【０４６９】
Ｅ９４．免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含む抗ＨＥＲ２結合分子であって、結合分子が、以下：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸を含むＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸を含むＶＬ−ＣＤＲ３
を含む、抗ＨＥＲ２結合分子。
【０４７０】
Ｅ９５．免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含む抗ＨＥＲ２結合分子であって、ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸を含む、抗ＨＥＲ２結合分子。
【０４７１】
Ｅ９６．ＶＨ及びＶＬを含む抗ＨＥＲ２結合分子であって、ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸を含む、抗ＨＥＲ２結合分子。
【０４７２】
Ｅ９７．ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸を含み、且つ、ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸を含む、Ｅ９４又はＥ９５又はＥ９６に記載の結合分子。
【０４７３】
Ｅ９８．抗体、又はその抗原結合断片を含む、Ｅ９４〜Ｅ９７のいずれか１つに記載の結合分子。
【０４７４】
Ｅ９９Ａ．Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体又はＥ９４〜Ｅ９８のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２結合分子と、少なくとも１つの治療部分とを含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【０４７５】
Ｅ１００Ａ．少なくとも１つの任意選択のスペーサをさらに含む、Ｅ９９Ａに記載のＡＤＣ。
【０４７６】
Ｅ１０１Ａ．少なくとも１つのスペーサが、ペプチドスペーサである、Ｅ１００Ａに記載のＡＤＣ。
【０４７７】
Ｅ１０２Ａ．少なくとも１つのスペーサが、非ペプチドスペーサである、Ｅ１００Ａに記載のＡＤＣ。
【０４７８】
Ｅ１０３Ａ．２つ、３つ、又は４つの治療部分を含む、Ｅ９９Ａ〜Ｅ１０２Ａのいずれか１つに記載のＡＤＣ。
【０４７９】
Ｅ１０４Ａ．全ての治療部分が同じである、Ｅ９９Ａ〜Ｅ１０３Ａのいずれか１つに記載のＡＤＣ。
【０４８０】
Ｅ１０５Ａ．各々の治療部分が、二重特異性抗体のＦｃ領域内の特定の位置でアミノ酸の側鎖に化学的に結合している、Ｅ９９Ａ〜Ｅ１０４Ａのいずれか１つに記載のＡＤＣ。
【０４８１】
Ｅ１０６Ａ．特定の位置が、２３９、２４８、２５４、２５８、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４３５、４４０、４４１、４４２、４４３、４４６、２３９位と２４０位の間の挿入、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される（アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）、Ｅ１０５Ａに記載のＡＤＣ。
【０４８２】
Ｅ１０７Ａ．特定の位置が、２３９、４４２、又はその両方である（アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）、Ｅ１０５Ａ又は１０６Ａに記載のＡＤＣ。
【０４８３】
Ｅ１０８Ａ．特定の位置が、４４２、及び２３９位と２４０位の間のアミノ酸挿入である（アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）、Ｅ１０５Ａ又は１０６Ａに記載のＡＤＣ。
【０４８４】
Ｅ１０９Ａ．アミノ酸側鎖が、スルフヒドリル側鎖である、Ｅ１０５Ａ〜Ｅ１０８Ａに記載のＡＤＣ。
【０４８５】
Ｅ１１０Ａ．Ｅ１〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
（ｉ）配列番号３２Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３３Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位のシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；又は
（ｖｉ）配列番号４１Ａのアミノ酸を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含む第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位及び４４２位にそれぞれ位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）
を含む、ＡＤＣ。
【０４８６】
Ｅ１１１Ａ．請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
（ｉ）配列番号３２Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉ）配列番号３３Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｉｉ）配列番号３６Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｉｖ）配列番号３７Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；
（ｖ）配列番号４０Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸に共有結合した治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）；又は
（ｖｉ）配列番号４１Ｃのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第１ポリペプチド鎖と、配列番号４２Ａのアミノ酸を含むか、又はそれから構成される第２ポリペプチド鎖（第１ポリペプチド鎖は、２３９位と２４０位の間に挿入されたシステインアミノ酸及び４４２位に位置するシステインアミノ酸に共有結合した２つの治療部分を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）
を含む、ＡＤＣ。
【０４８７】
Ｅ１１２Ａ．治療部分が、細胞毒、放射性同位体、放射性同位体、免疫調節薬、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ミクロＲＮＡ、光活性治療薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、ペプチド、脂質、炭化水素、キレート剤又はこれらの組み合わせを含む、Ｅ９９Ａ〜Ｅ１１１Ａのいずれか１つに記載のＡＤＣ。
【０４８８】
Ｅ１１３Ａ．細胞毒が、ツブリシン、オーリスタチン、メイタンシノイド又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、Ｅ１１２Ａに記載のＡＤＣ。
【０４８９】
Ｅ１１４．Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体又はＥ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子をコードする、単離核酸分子又は核酸分子のセット、若しくはその補体。
【０４９０】
Ｅ１１５．Ｅ１１４に記載の核酸分子又は核酸分子のセットを含むベクター又はベクターのセット、若しくはその補体。
【０４９１】
Ｅ１１６．Ｅ１１４に記載の単離核酸分子若しくは核酸分子のセット、又はＥ１１５に記載のベクター若しくはベクターのセットを含む宿主細胞。
【０４９２】
Ｅ１１７．Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体又はＥ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子を発現する宿主細胞。
【０４９３】
Ｅ１１８．Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体又はＥ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子を生産する方法であって、Ｅ１１６又はＥ１１７のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養するステップ、及び培地から抗体を回収するステップを含む方法。
【０４９４】
Ｅ１１９．Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、Ｅ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子、又はＥ９９Ａ〜Ｅ１１３Ａ１のいずれか１つに記載のＡＤＣ、並びに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【０４９５】
Ｅ１２０．ＨＥＲ２発現癌を治療する方法であって、Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、Ｅ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子、Ｅ９９Ａ〜Ｅ１１３Ａ１のいずれか１つに記載のＡＤＣ、又はＥ１１９に記載の組成物を、それが必要な被験者に投与するステップを含む方法。
【０４９６】
Ｅ１２１．癌が、低ＨＥＲ２発現癌である、Ｅ１２０に記載の方法。
【０４９７】
Ｅ１２２．少なくとも１つの別の治療薬を投与するステップを含む、Ｅ１２０又はＥ１２１のいずれか１つに記載の方法。
【０４９８】
Ｅ１２３．少なくとも１つの別の治療薬が、放射性核種又は化学療法薬である、Ｅ１２２に記載の方法。
【０４９９】
Ｅ１２４．ＨＥＲ２を発現する細胞に治療部分をターゲティングする方法であって、Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、Ｅ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子、又はＥ９９Ａ〜Ｅ１１３Ａ１のいずれか１つに記載のＡＤＣに融合又は共役させた治療部分を投与するステップを含む方法。
【０５００】
Ｅ１２５．治療部分の活性を増大させる方法であって、Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、Ｅ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子、又はＥ９９Ａ〜Ｅ１１３Ａ１のいずれか１つに記載のＡＤＣに、部分を共役させるステップを含む方法。
【０５０１】
Ｅ１２６．治療部分の薬物動態学的特性を改善する方法であって、Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、Ｅ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子、又はＥ９９Ａ〜Ｅ１１３Ａ１のいずれか１つに記載のＡＤＣに、部分を共役させるステップを含む方法。
【０５０２】
Ｅ１２７．治療部分が、細胞毒、放射性同位体、免疫調節薬、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ミクロＲＮＡ、光活性治療薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、ペプチド、脂質、炭化水素、又はキレート剤である、Ｅ１２２〜Ｅ１２６のいずれか１つに記載の方法。
【０５０３】
Ｅ１２８．細胞毒が、ツブリシン、オーリスタチン、メイタンシノイド又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、Ｅ１２７に記載の方法。
【０５０４】
Ｅ１２９．細胞毒が、下記の構造：
【化２】
2017512765.tif 000005
を有するツブリシン１５０８である、Ｅ１１３Ａに記載のＡＤＣ又はＥ１２８に記載の方法。
【０５０５】
Ｅ１３０．ＨＥＲ２ターゲティング治療薬に対する耐性を治療する方法であって、Ｅ１〜Ｅ９３のいずれか１つに記載の二重特異性ＨＥＲ２抗体、Ｅ９４〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の抗ＨＥＲ２結合分子、又はＥ９９Ａ〜Ｅ１１３Ａ１のいずれか１つに記載のＡＤＣを、それが必要な被験者に投与するステップを含む方法。
【０５０６】
ＸＶ．配列
以下の表３は、配列参照番号（配列番号）、アミノ酸配列及び配列に関するコメントを掲載する。
【０５０７】
【表３−１】
2017512765.tif 000006
【０５０８】
【表３−２】
2017512765.tif 000007
【０５０９】
【表３−３】
2017512765.tif 000008
【０５１０】
【表３−４】
2017512765.tif 000009
【０５１１】
【表３−５】
2017512765.tif 000010
【０５１２】
【表３−６】
2017512765.tif 000011
【０５１３】
【表３−７】
2017512765.tif 000012
【０５１４】
【表３−８】
2017512765.tif 000013
【０５１５】
【表３−９】
2017512765.tif 000014
【０５１６】
【表３−１０】
2017512765.tif 000015
【０５１７】
【表３−１１】
2017512765.tif 000016
【０５１８】
以下の実施例は、例示として提供するものであり、限定として提供するものではない。
【実施例】
【０５１９】
以下の非制限的例を参照することにより、本開示の態様をさらに明瞭にすることができよう。これらの実施例は、本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体を用いる方法を詳細に説明する。当業者には、材料及び方法の両方に対して、本開示の範囲を逸脱することなく、多くの変更を実施できることは明らかであろう。
【０５２０】
ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍を有する乳癌患者の治療に用いるためのいくつかのＨＥＲ２抗体が承認されており、そのようなものとして、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書を参照）、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（商標）；国際公開第２００１／００２４５号パンフレット）及びＴ−ＤＭ１（アド−トラスツズマブエムタンシン、ＫＡＤＣＹＬＡ（商標）、細胞傷害性薬剤、メルタンシン（ＤＭ１）に連結したモノクローナル抗体トラスツズマブから構成される抗体薬物複合体、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ｅｔ．ａｌ．，２０１０，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：３５０−６０）が挙げられる。しかし、これらの治療薬は、低レベルのＨＥＲ２を発現する患者の大部分について適用されない。さらに、これらの療法に応答しないか、又は耐性になる患者も存在する。従って、これらの患者に対処する優れた治療薬に対するアンメット・メディカル・ニーズが存在する。
【０５２１】
以下に記載する具体的な実施例に詳述するように、ＨＥＲ２のドメインＩＩ内の新たに記載されるエピトープに結合する最適化された完全なヒト抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内の既知エピトープに結合するｓｃＦｖと組み合わせることにより、極めて強力な二重特異性抗体が作製された。いくつかの異なる二重特異性抗体立体配置を作製し、試験した。得られたユニークな二重特異性抗体は、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体のいずれにも認められなかった生物活性を呈示する。多くのアッセイにおいて、二重特異性抗体は、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体に対して、相乗的活性も示す。本明細書に記載する二重特異性抗体のいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ活性が、Ｆｃガンマ受容体との結合活性の非存在、又は極めて低減した活性の下で、細胞傷害性薬剤（例えば、ツブリシン１５０８）の添加により、さらに増強される。さらに、本明細書に提供するユニークな抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性も、ＡＤＣＣ活性を増強することにより、例えば、グリコシル化を改変することにより（例えば、ＰＯＴＥＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、ＡＤＣＣ活性が増強した低フコシル化抗体を作製することにより）、増強することができる。これらのデータは、二重特異性抗体が、広範囲のＨＥＲ２レベルを発現する癌（トラスツズマブ、ペルツズマブ若しくはＴ−ＤＭ１による治療に不適格な患者を含む）の治療のための治療用途を有し得ることを示唆している。これ以外にも、二重特異性抗体は、既存の抗ＨＥＲ２療法が成功しなかった癌患者の治療のための治療用途も有し得る。
【０５２２】
実施例１
１．１．リード最適化
ＡＺ１．３９．１は、ヒトＨＥＲ２に対する完全なヒトモノクローナル抗体であり、これは、トラスツズマブ又はペルツズマブのいずれかと結合について競合しない（国際公開第２００８／０１９２９０号パンフレット）。３９Ｓは、以下に詳述するように、ＡＺ１．３９．１から産生されるリード最適化抗体である（図１）。部位指定突然変異誘発を用いて、軽鎖のＣＤＲ１における不対Ｃｙｓ残基をＩｌｅで置換した後、重鎖のＣＤＲ３中で異性化の可能性がある部位（ＤＧ）を、ＤＧをＤＡに変更することにより除去した。得られた変異体は、ＡＺ１．３９．１と同じ結合特異性及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を示した（データは示していない）。より高い親和性の結合剤を作製するために、重鎖のＣＤＲ残基に突然変異誘発を適用した後、突然変異体を哺乳動物においてＩｇＧとして発現させてから、組換えヒトＨＥＲ２細胞外ドメインタンパク質に対するそれらの結合について、キャプチャーＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。野生型対照より有意に高い結合シグナルを有するクローンを配列決定することにより、突然変異情報を明らかにした。同定された突然変異からコンビナトリーライブラリーを構築してから、組換えヒトＨＥＲ２細胞外ドメインタンパク質に対するそれらの結合について、キャプチャーＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。３９Ｓは、最も高い結合活性を有することが判明し、別の配列分析から、３９Ｓは、重鎖のＣＤＲ１中に単一のＮ５Ｓ突然変異を担持することが明らかにされた。ヒトＨＥＲ２に対する３９Ｓの親和性（ＫD）は、ＢＩＡｃｏｒｅにより決定して、約１．０ｎＭであり、対照的に、親１．３９．１抗体の報告されている親和性は、約２．０ｎＭである。従って、単一の突然変異によって、親抗体に対する結合親和性が２倍増加した。抗体発現レベルを改善するために、フレームワーク配列、特に、軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３を、ＩＧＫＶ４−１＋Ｊｋ３．０１からＩＧＶＫ２Ｄ生殖系配列にスワッピング（ｓｗａｐｐｅｄ）したが、その結果、培養７日後に測定したＩｇＧ発現レベルの約２倍増加が得られた（図２）。
【０５２３】
１．２．リード最適化抗体３９Ｓの結合特異性及び種交差反応性
３９Ｓが、その親抗体ＡＺ１．３９．１の結合特異性及び種交差反応性を保持しているか否かを決定するために、ヒトＥｒｂＢファミリー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４）、マウスＨｅｒ２、及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）Ｈｅｒ２の受容体に対する３９Ｓの結合をキャプチャーＥＬＩＳＡにより調べた。手短には、９６ウェルプレートを次の組換え細胞外ドメインタンパク質：ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＨＥＲ４、マウスＨｅｒ２、及びカニクイザルＨｅｒ２のうちの１つでコーティングした。試験しようとする抗体を、５０ｎＭから０．２８ｐＭまでの範囲の段階的１：３連続希釈にて希釈することにより調製した後、ウェルプレートに２回反復で添加した。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄してから、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ  ＨＲＰ結合二次抗体を各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ基質を添加し、５〜２０分間インキュベートすることによって発色させた。反応の終了時に停止液をウェルに添加してから、プレートを４５０ｎｍで読み取りした。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いて、結合シグナル（４５０ｎｍでの吸光度）を抗体濃度に対してプロットした。結果から、３９Ｓは、ＡＺ１．３９．１と同様に、ヒトＨＥＲ２及びカニクイザルＨｅｒ２に結合することができるが、ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、又はマウスＨｅｒ２には結合することができないことがわかる（データは示していない）。
【０５２４】
１．３．３９Ｓエピトープマッピング及び特性決定
ヒトＨＥＲ２のドメインＩＩは、ヒト及びマウスＨｅｒ２分子間でドメインをスワッピングすることにより、３９Ｓのエピトープとして同定した。マウスＨｅｒ２は、３９Ｓによって認識されないが、ヒトＨＥＲ２と８５％の配列同一性を有するため、キメラパートナーとして選択した。表４に掲載するように、ＨＥＲ２の各ドメインをターゲティングするキメラ変異体を構築した（下記の方法を参照）が、これには、ヒトＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶをマウス対応物で置換した４つのノックアウト（ＫＯ、機能欠失型）変異体、並びにヒトＨＥＲ２のドメインＩＩをマウスＨｅｒ２分子に移植した１つのノックイン（ＫＩ、機能獲得型）変異体が含まれる。キメラ変異体の名称は、変異体のタイプ（ＫＯ／ＫＩ）及びスワッピングされたドメインの数を示す。これら変異体に対する３９Ｓの結合プロフィールは、ＳＰＲベースの計器ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）を使用し、抗ヒト及びマウスＨｅｒ２ポリクローナル抗体を用いてセンサー表面上に変異体を捕捉することにより特性決定した（下記の方法を参照）。変異体の発現は、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）を用いて、抗Ｈｉｓポリクローナル抗体によりモニターした。機能欠失型変異体に対する３９Ｓの結合結果から、ドメインＩＩが、エピトープ含有ドメインであることが判明した。３９Ｓは、マウスドメインＩＩをコードするＫＯ＿ＩＩの変異体に結合しなかった（表４）が、マウスドメインＩをコードするＫＯ＿Ｉの変異体への結合を保持した。ヒトドメインＩＩＩ及びＩＶをノックアウトした変異体（ＫＯ＿ＩＩＩ及びＫＯ＿ＩＶ）は、発現しなかったが、これら２つのドメインは、機能獲得型変異体ＫＩ＿ＩＩに関する結合結果に基づき、３９Ｓのエピトープとして排除した。マウスドメインＩ、ＩＩＩ及びＩＶ並びにヒトドメインＩＩをコードする機能獲得型変異体（ＫＩ＿ＩＩ）は、ヒトＨＥＲ２（８４ｐＭ）に対するものと同様の結合親和性（１６８ｐＭ）で、３９Ｓにより認識された。従って、ヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（アミノ酸１４６〜３１０）は、機能欠失型及び機能獲得型変異体の両方により、３９Ｓのエピトープ含有ドメインとして同定された。
【０５２５】
本発明者らは、３９Ｓのエピトープをさらに精査し、ドメインＩＩ中のアミノ酸１９２〜２０８の領域を重要なエピトープ領域として確認した。表４に掲載するように、ヒト及びマウスＨｅｒ２タンパク質の間に異なるアミノ酸配列を有するドメインＩＩの短い領域をターゲティングする１シリーズのキメラヒト／マウス変異体を構築した。次のヒトＨＥＲ２領域（アミノ酸１４６〜２０８、１５９〜１６２、１７１〜１８７、１９２〜２０８、２５０〜２６１、２７６〜２８５、及び２９５〜２９６など）の各々をマウス対応物で置換することにより、７つのノックアウト変異体を作製した。さらに、ヒトＨＥＲ２のアミノ酸１９２〜２０８の領域をマウス分子に移植することにより、１つのノックイン変異体を構築した。変異体の名称は、変異体のタイプ（ＫＯ／ＫＩ）及びアミノ酸番号付きのスワッピング領域を示す。全ての変異体は、抗Ｈｉｓポリクローナル抗体による検出可能なレベルを有した（表４）。３９Ｓは、ヒトＨＥＲ２のアミノ酸１９２〜２０８の領域がマウス残基で置換されたキメラ変異体（ＫＯ＿１４６〜２０８、ＫＯ＿１９２〜２０８）のいずれにも結合しなかった。ヒトＨＥＲ２の他のいずれの領域をマウスアミノ酸で置換しても（ＫＯ＿１５９〜１６２、ＫＯ＿１７１〜１８７、ＫＯ＿２５０〜２６１、ＫＯ＿２７６〜２８５、ＫＯ＿２９５〜２９６）、３９Ｓの結合は影響されなかった。さらに、３９Ｓは、７２ｐＭのＫＤで、ヒト１９２〜２０８をコードするＫＩ変異体（ＫＩ＿１９２〜２０８）に結合し、これは、ヒトＨＥＲ２のＫＤ（８４ｐＭ）と同等であった。以上を考え合わせて、ヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ中のアミノ酸１９２〜２０８の領域を３９Ｓの機能性エピトープとして同定した。
【０５２６】
変異体の名称は、変異体のタイプ（ＫＯ／ＫＩ）及びアミノ酸番号付きのスワッピング領域を示す。アミノ酸位置は、そのシグナルペプチドを除き、成熟ヒトＨＥＲ２配列の番号付けスキームに基づいて示した。全ての変異体の発現レベルは、抗Ｈｉｓポリクローナル抗体によりモニターした。これら変異体に対する３９Ｓの結合プロフィールは、ＳＰＲ測定機器ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）を使用し、抗ヒト及びマウスＨｅｒ２ポリクローナル抗体を用いてセンサー表面上に変異体を捕捉することにより特性決定した。センサー表面上にＨｅｒ２タンパク質を捕捉することにより、測定された３９Ｓの見掛け結合親和性は、チップ表面上に３９Ｓを固定化するフォーマットにおける一価結合親和性より高いと予想される。
【０５２７】
【表４】
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【０５２８】
キメラヒト／マウスＨｅｒ２変異体の構築及び発現は、以下のように構成した。手短には、Ｈｉｓタグ付きキメラヒト／マウスＨｅｒ２変異体をコードするＤＮＡをアセンブリングし、鋳型としてヒト及びマウスＨｅｒ２プラスミドを用いたオーバーラッピングＰＣＲ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）により増幅した。アセンブリングしたＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＥＢＮＡ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）にクローニングした。次に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、２９３フェクチン及び製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従う標準的プロトコルを用いて、様々な構築物に一時的にトランスフェクトした。
【０５２９】
キメラヒト／マウス変異体への３９Ｓの結合特性は、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６測定機器（ＢｉｏＲａｄ）を用いて調べた。標準的アミンカップリングを用いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の抗ヒト又はマウスＨｅｒ２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を、各チャンネルについて約５０００共鳴単位（ＲＵ）で、ＧＬＣバイオセンサーチップの表面に固定化した。細胞培養上澄み中のキメラタンパク質を注射した後、約２００ＲＵ応答で、ＧＬＣ表面上に抗ヒト又はマウスポリクローナル抗体により捕捉した。０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  ３９Ｓを１０ｎＭから０．６２５ｎＭに希釈し（１：２希釈）、６００秒の解離時間で、１８０秒にわたり１００μＬ／分で注射した。キメラ変異体の発現レベルは、３９Ｓの注射と同じ条件下で、抗Ｈｉｓポリクローナル抗体（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）を流すことによりモニターした。グリシンバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を１００μＬ／分で３０秒間注射することにより、表面を２回再生した。全てのセンサーグラムデータをＰｒｏｔｅＯｎ（商標）Ｍａｎａｇｅｒ３．０．１ソフトウェアで処理した。
【０５３０】
ＦＡＣＳに基づく結合競合アッセイを用いて、抗体が、トラスツズマブ及び／又はペルツズマブと同じエピトープに対する結合について競合するか否かを決定した。ＢＴ−４７４細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させてから、２．５×１０5細胞／ウェルを９６ウェルＵ字底プレートに添加した。試験しようとする抗体（Ｒ３４７  ＩｇＧ１アイソタイプ対照、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＡＺ１．３９．１、及び３９Ｓ）を、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識３９Ｓ抗体を含有するＦＡＣＳバッファーで、５００μｇ／ｍＬから１．９ｎｇ／ｍＬまでの範囲の段階的１：４連続希釈にて希釈することにより調製した後、細胞に３回反復で添加した。氷上で１時間の染色後、細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄してから、２％ＰＦＡで固定した。ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ装置により、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを用いて、細胞を分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した後、平均ＭＦＩ±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表示した。
【０５３１】
図４から、３９Ｓが、その親抗体ＡＺ１．３９．１と同じエピトープに結合すること；３９Ｓが、結合についてトラスツズマブ又はペルツズマブと競合しないことがわかる。３９Ｓ、ペルツズマブ及びトラスツズマブの結合部位は、図３に呈示するＨＥＲ２のリボン構造に矢印で示す。
【０５３２】
１．４．３９Ｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
抗体又は抗体組み合わせの抗増殖活性を評価するために、様々なレベルのＨＥＲ２を発現するヒト癌細胞株の一団を選択した。細胞におけるＨＥＲ２発現レベルは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）及び定量的ＦＡＣＳにより決定した（表５）。
【０５３３】
【表５】
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【０５３４】
増殖阻害アッセイ：容量１００μＬの９６ウェルプレートのウェル当たり５，０００〜２０，０００の密度（各細胞株の増殖速度により変動）で血清含有培地に細胞を平板培養した。試験物質を培地で希釈することにより、試験しようとする各用量の抗体又は抗体組み合わせの２倍濃縮物を調製した。最終用量曲線が、段階的１：４連続希釈シリーズで、１０μｇ／ｍＬから０．１５ｎｇ／ｍＬまで変動するように、１００マイクロリットルの各試験物質を細胞に３回反復で添加した。リガンド依存性増殖阻害アッセイのために、細胞を無血清培地中に平板培養した後、試験物質を無血清培地で希釈することにより、試験しようとする各用量の抗体又は抗体組み合わせの４倍濃縮物を調製した。５０マイクロリットルの各試験物質を細胞に３回反復で添加した後、無血清培地で希釈した濃度３２ｎｇ／ｍＬの５０μＬのヘレグリン−β１を細胞に添加することにより、８ｎｇ／ｍＬの最終ヘレグリン−β１濃度を達成し、最終抗体用量曲線は、段階的１：４連続希釈シリーズで、１００μｇ／ｍＬから６．１ｎｇ／ｍＬまで変動した。処理した細胞を３７℃／５％ＣＯ2で４〜７日間（各細胞株の増殖速度に応じて）培養した。ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて、製造者の指示に従って細胞生存率を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データを解析し、非処理対照に対する増殖率（％）として表示した。
【０５３５】
図５から、３９Ｓが、ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド駆動の増殖の阻害においてペルツズマブと類似の活性を有することがわかる。トラスツズマブ又はペルツズマブと組み合わせると、３９Ｓは、トラスツズマブ及びペルツズマブ組み合わせと同等の効力で、リガンド依存性増殖の付加的又は相乗的阻害を示す。同様の結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＲＴ−１１２などの他の細胞株でも認められた（データは示していない）。
【０５３６】
図６から、３９Ｓが、ペルツズマブと同様に、血清含有培地においてＮＣＩ−Ｎ８７細胞増殖を阻害する活性が限定されていることがわかる。しかし、トラスツズマブ又はペルツズマブと組み合わせると、３９Ｓは、細胞増殖の阻害において強力な相乗効果を示す。３９Ｓとトラスツズマブ又はペルツズマブとの相乗効果は、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせで認められたものよりはるかに高い。ＢＴ−４７４細胞においても同様の結果が認められた（データは示していない）。
【０５３７】
実施例２
２．１．二重特異性抗体の構築
Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨのクローニング。二重特異性発現構築物は、抗ＨＥＲ２ドメインＩＶ抗体（ＸがＣである、配列番号１７及び１８）抗ＨＥＲ２抗体３９Ｓ（配列番号１５及び１６）の可変ドメインを、適切な定常領域を含む発現ベクターにクローニングすることによって作製した。抗ＨＥＲ２ドメインＩＶ可変結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として構築した。前述の配列番号１７及び１８（Ｘは、Ｃである）のアミノ酸配列を用いて、最大哺乳動物タンパク質発現のためのコドン最適化ＤＮＡ配列を設計し、合成した。Ｂｓ２Ａｂ及びＢｓ３Ａｂ構築物は、Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９３，６７２−６９２に記載のものと類似した方法を用いて作製した。Ｂｓ４Ａｂ構築物は、国際公開第２０１３０７０５６５Ａ１号パンフレットに記載のものと類似した方法を用いて作製した。最終合成遺伝子は、２つのシステイン突然変異を含み、１つは、軽鎖の１００位に、もう１つは、重鎖の４４位にそれぞれ位置する。これらのシステインは、ｓｃＦｖを安定化するために、ＶＬ及びＶＨドメイン間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。ｓｃＦｖの２つのＶＬ及びＶＨドメインは、２０アミノ酸残基リンカー（Ｇ4Ｓ）4を用いて連結した。Ｂｓ２ＡｂのｓｃＦｖは、１０アミノ酸残基リンカー（Ｇ4Ｓ）2を用いて、重鎖のＮ末端に連結した。Ｂｓ３ＡｂフォーマットのｓｃＦｖは、１０アミノ酸残基リンカー（Ｇ4Ｓ）2を用いて、抗体ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結した。Ｂｓ４Ａｂ骨格中のｓｃＦｖを連結するために、２つの配列リンカー（Ｇ4Ｓ）2を用いた。ＤＮＡ配列を用いて、構築物同一性及び忠実度を決定した。
【０５３８】
図７は、ＨＥＲ２抗原との結合のために作製したＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ二重特異性抗体フォーマット（それぞれ、パネルＡ、Ｂ及びＣ）の各々の概略図を示す。二重特異性抗体は、２つの結合ユニットを有し、その各々が、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。これらの結合ユニットは、図において標識されている。分子は、結合ユニットに対して左右相称である。図に示すように、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨフォーマットは、ｓｃＦｖが、リンカー（例えば、（Ｇ4Ｓ）2）を介して重鎖の可変領域のアミノ末端に融合した二重特異性抗体（Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ）、修飾ヒンジ領域に挿入された二重特異性抗体（Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）、又はＣＨ３のカルボキシ末端に融合された二重特異性抗体（Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ）である。図示する３つの二重特異性構築物は、グリシンセリンリンカー（例えば、（Ｇ4Ｓ）2）を介して抗ＨＥＲ２ドメインＩＩヒトＩｇＧ１に融合した抗ＨＥＲ２ドメインＩＶ結合ｓｃＦｖから構成される。
【０５３９】
Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ構築物のアミノ酸配列を図８に示す（また、配列番号３０、３４、及び３８ネイティブＦｃ領域も参照）。図８Ａは、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨの二重特異性抗体重鎖アミノ酸配列、並びに２及び４薬物負荷の場合のＡＤＣＣ増強及び／又は部位特異的抗体薬物共役のために考えられる置換部位を示す。抗ＨＥＲ２ドメインＩＶ  ｓｃＦｖは、ＶＬ−（Ｇ4Ｓ）4リンカー−ＶＨフォーマットであり、（Ｇ4Ｓ）2リンカーを介して抗ＨＥＲ２ドメインＩＩ抗体重鎖のアミノ末端に遺伝子的に連結している。図に示すアミノ酸置換及び／又は挿入は、ＡＤＣＣ増強及び部位特異的共役のために、抗体のＣＨ２及びＣＨ３において実施することができる。図８Ｂは、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨの二重特異性抗体重鎖アミノ酸配列、並びに２及び４薬物負荷の場合のＡＤＣＣ増強及び／又は部位特異的抗体薬物共役のために考えられる置換部位を示す。抗ＨＥＲ２ドメインＩＶ  ｓｃＦｖは、ＶＬ−（Ｇ4Ｓ）4リンカー−ＶＨフォーマットであり、（Ｇ4Ｓ）2リンカーを介して抗ＨＥＲ２ドメインＩＩ抗体重鎖のカルボキシ末端に遺伝子的に連結している。図に示すアミノ酸置換及び／又は挿入は、ＡＤＣＣ増強及び部位特異的共役のために、抗体のＣＨ２及びＣＨ３において実施することができる。図８Ｃは、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨの二重特異性抗体重鎖アミノ酸配列、並びに２及び４薬物負荷の場合のＡＤＣＣ増強及び／又は部位特異的抗体薬物共役のために考えられる置換部位を示す。抗ＨＥＲ２ドメインＩＶ  ｓｃＦｖは、ＶＬ−（Ｇ4Ｓ）4リンカー−ＶＨフォーマットであり、２つの（Ｇ4Ｓ）2リンカーを介して抗ＨＥＲ２ドメインＩＩ抗体重鎖の修飾ヒンジ領域に挿入されている。図に示すアミノ酸置換及び／又は挿入は、ＡＤＣＣ増強及び部位特異的共役のために、抗体のＣＨ２及びＣＨ３において実施することができる。
【０５４０】
２．２．二重特異性抗体の結合特異性及び種交差反応性
ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＨＥＲ４、マウスＨｅｒ２、又はカニクイザルＨｅｒ２の組換え細胞外ドメインタンパク質に対する二重特異性抗体の結合特異性及び種交差反応性を、実施例１に記載したキャプチャーＥＬＩＳＡにより決定した。結果から、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨを含む、試験した全ての二重特異性抗体が、ヒトＨＥＲ２及びカニクイザルＨｅｒ２に、同様の効力で結合することができ、これらのいずれも、ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、又はマウスＨｅｒ２に対する結合を示さない（データは示していない）ことが判明し、このことは、二重特異性抗体が、親モノクローナル抗体の種交差反応性の結合特異性を保持することを示唆している。
【０５４１】
ヒトＨＥＲ２及びカニクイザルＨｅｒ２に対する二重特異性抗体の結合速度をＢＩＡｃｏｒｅにより決定した（データは示していない）。ヒトＨＥＲ２に対する親和性（ＫD）は、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨについては１１３ｐＭであり、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨについては２３６ｐＭである。
【０５４２】
２．３．二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
リガンド駆動の細胞増殖を阻害する二重特異性抗体の活性は、実施例１に記載した方法を用いて決定した。結果から、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨが、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（図９Ａ）及びＭＣＦ−７細胞（図９Ｂ）において同様の効力を有し、これは、親抗体組み合わせ（３９Ｓとトラスツズマブ）の活性と同等であることがわかる。ＮＣＩ−Ｎ８７及びＲＴ−１１２を含む別の細胞株でも、同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５４３】
２．４．二重特異性抗体によるＨＥＲ２：ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の妨害
Ｔ４７Ｄ細胞を採取し、洗浄した後、無血清培地に再懸濁させた。密度１×１０6細胞／ウェルで、細胞を６ウェルプレートに接種した後、３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。翌日、濃度５００ｎＭの試験抗体（Ｒ３４７  ＩｇＧ１アイソタイプ対照、トラスツズマブ、ペルツズマブ、３９Ｓ、及びＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ）で細胞を１時間前処置した。前処理後、ヘレグリン−β１を最終濃度８ｎｇ／ｍＬで添加してから、細胞を３７℃／５％ＣＯ2で５分間インキュベートした。続いて、細胞を氷冷１×ＰＢＳで２回洗浄して、マウス抗ヒトＨＥＲ２（クローン４４Ｅ７）抗体及びＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＰｉｅｒｃｅ  Ｃｌａｓｓｉｃ  ＩＰ  Ｋｉｔを用いて、製造者の指示に従い、溶解及び免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質サンプルを、２−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉバッファー中に溶出させ、標準的プロトコルを用いたウェスタンブロットにより分析した。ウェスタンブロット分析において、ＨＥＲ２を検出するために、ウサギ抗ヒトＨＥＲ２（クローン２９Ｄ８）抗体を用い、また、ＨＥＲ３を検出するためには、ウサギ抗ヒトＨＥＲ３（Ｃ−１７）ポリクローナル抗体を用いた。
【０５４４】
図１０から、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及び３９Ｓが、ペルツズマブと同様に、リガンド刺激によって誘導されるＨＥＲ２：ＨＥＲ３ヘテロ二量体化を妨害できることがわかる。
【０５４５】
２．５．二重特異性抗体によるＨＥＲ２のクラスター形成
二重特異性抗体が、ＨＥＲ２と架橋して、大きな複合体を形成することができるか否かを調べるために、組換えヒトＨＥＲ２細胞外ドメインタンパク質を様々なモル比でＢｓ２Ａｂ−３９ＳＨ又はトラスツズマブと混合した後、室温で３０分間インキュベートした。形成された免疫複合体をＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し；次に、そのサイズを多角度光散乱（ＭＡＬＳ）アッセイにより分析した。
【０５４６】
図１１から、１：１の抗体：ＨＥＲ２モル比から得られた代表的データを示す（他のモル比でのデータは示していない）。結果から、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨが、多くのＨＥＲ２分子と架橋して、サイズが１７１６ｋＤａという大きなタンパク質複合体を形成することができるのに対し、トラスツズマブは、２つのＨＥＲにしか結合することができず、最大で３２０ｋＤａの複合体を形成することがわかる。Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨでも同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５４７】
２．６．二重特異性抗体による内在化及びリソソーム輸送の増強
抗体内在化をＦＡＣＳにより測定した。Ｔ１５０フラスコからＢＴ−４７４細胞を採取し、氷冷培地中に再懸濁させた後、１×１０6細胞／ウェルで９６ウェルＵ字底プレートに添加した。細胞を４℃での遠心分離によりペレット化した。培地をフリックオフにより除去し（ｆｌｉｃｋｅｄ  ｏｆｆ）、１０μｇ／ｍＬの試験抗体又は抗体組み合わせ（Ｒ３４７  ＩｇＧ１アイソタイプ対照、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＡＺ１．３９．１、３９Ｓ、トラスツズマブ＋３９Ｓ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、ペルツズマブ＋３９Ｓ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ＋３９Ｓ、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）を含有する１５０μＬの氷冷培地中に、細胞ペレットを３回反復で再懸濁させた。細胞を氷上で１時間インキュベートした後、洗浄して、非結合抗体を除去した。細胞のアリコートを氷上に維持し；残りは、３７℃／５％ＣＯ2で様々な時間（３０分、１時間、２時間、又は４時間）インキュベートした後、直ちに氷上で冷却した。細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、４％ＰＦＡで２０分固定した。固定の後、抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８で細胞を染色してから、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ装置及びＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアにより分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。受容体−抗体複合体内在化を、非処理対照から得られたＭＦＩのバックグラウンド値により差し引いた後、氷冷上のものに対する３７℃での平均蛍光強度（ＭＦＩ）喪失率（％）として計算した。
【０５４８】
図１２から、二重特異性抗体（Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）は、どの単独の単一特異性抗体又は抗体組み合わせよりも、はるかに高速且つ強度の内在化を誘導することができることがわかる。ペルツズマブ、ＡＺ１．３９．１、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、ペルツズマブ＋３９Ｓ、及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ＋３９Ｓは、３９Ｓのそれと同等か、又はそれより低い内在化プロフィールを有したが、グラフには示していない。細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＲＴ−１１２でも、同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５４９】
共焦点顕微鏡検査法を用いて、抗体内在化及びリソソーム輸送を視覚化した。Ｔ１５０フラスコからＢＴ−４７４細胞を採取し、氷冷培地中に再懸濁させた後、２．５×１０5細胞／ウェルで９６ウェルＵ字底プレートに添加した。４℃での遠心分離により細胞をペレット化した。培地をフリックオフにより除去し、１０μｇ／ｍＬの試験抗体（例えば、Ｒ３４７  ＩｇＧ１アイソタイプ対照、トラスツズマブ、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）の存在下で、１５０μＬの氷冷培地に細胞ペレットを再懸濁させた。３７℃／５％ＣＯ2で様々な時間（３０分、２時間、４時間、又は６時間）にわたり細胞をインキュベートした後、直ちに氷上で冷却した。細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて、製造者の指示に従い、固定及び透過性化した。暗所にて抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８、並びにマウス抗ヒトＬＡＭＰ−１（クローンＨ４Ａ３）、続いて抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７で細胞を染色した。染色後、細胞を陽電荷スライド上にサイトスピンし、ＤＡＰＩを含有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔと共にカバーガラスを載せた。次に、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ及びＬｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅソフトウェアスイートにより細胞を視覚化した。
【０５５０】
図１３は、抗体内在化及びリソソームへの輸送を示す。Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨのいずれも、内在化をほとんど若しくは全く示さないトラスツズマブよりもはるかに高速の内在化及び強力なリソソーム輸送を促進する（Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨについては、データを示していない）。
【０５５１】
ウェスタンブロット分析を用いて、ＨＥＲ２のリソソーム分解をモニターした。ＢＴ−４７４細胞を採取し、洗浄した後、培地に再懸濁させた。５×１０4細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに細胞を接種してから、３７℃／５％ＣＯ2で、濃度５００ｎＭの試験抗体（Ｒ３４７  ＩｇＧ１アイソタイプ対照、トラスツズマブ、ペルツズマブ、３９Ｓ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、トラスツズマブ＋３９Ｓ、ペルツズマブ＋３９Ｓ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ＋３９Ｓ、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）により２時間、６時間、又は２４時間にわたって処理した。処理終了時に、細胞を氷冷１×ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔバッファー中で製造者の指示に従い溶解させた。各溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより測定した。各溶解物中の等量のタンパク質をウェスタンブロット中のゲルにロードした。ＨＥＲ２及びＧＡＰＤＨを検出するために、それぞれウサギ抗ヒトＨＥＲ２（クローン２９Ｄ８）抗体及びウサギ抗ヒトＧＡＰＤＨ（クローンＤ１６Ｈ１１）抗体を用いた。
【０５５２】
図１４から、二重特異性抗体（Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、又はＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）による治療が、ＢＴ−４７４細胞において有意なＨＥＲ２分解をもたらし、単一特異性抗体又は抗体組み合わせは、ＨＥＲ２分解を全く、又は限定的にしか誘導しないことがわかる。
【０５５３】
実施例３
３．１．部位特異的共役及びＦｃガンマ受容体結合活性のための部位特異的突然変異体のクローニング
標準的オーバーラッピングＰＣＲ法を用いて、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｓ２３９Ｃ及びＳ４４２Ｃを独立に、又は組み合わせて（Ｌ２３４Ｆ−Ｓ２３９Ｃ（ＦＣ）及びＬ２３４Ｆ−Ｓ２３９Ｃ−Ｓ４４２Ｃ（ＦＣＣ））、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨのＦｃ部分に導入した。定方向クローニングを促進するための制限部位を含むプライマーは、所望の突然変異及びフランキングプライマーを含有するように設計し、これらを用いて、特定の突然変異を含有するＦｃ断片を増幅した。規定の制限部位を用いて、修飾Ｆｃ  ＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターにクローニングした。Ｆｃ突然変異の同一性をＤＮＡ配列分析により確認した。
【０５５４】
図１５は、部位特異的共役のためのアミノ酸置換を有する３つの抗ＨＥＲ２二重特異性抗体（Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）を示す図である。さらに、Ｆｃガンマ受容体結合を最小限にするために、抗体重鎖（図には示していない）のＣＨ２へのＬ２３４Ｆ置換を用いる。２ＤＡＲが望ましい場合には、システイン置換を部位１（例えば、Ｓ２３９Ｃ）又は部位２（例えば、Ｓ４４２Ｃ）で実施し、４ＤＡＲの場合には、両部位にシステイン置換を実施する。二重特異性薬物構築物は、本明細書において、Ｂｓ２−２Ｔ／Ｂｓ２−４Ｔ、Ｂｓ３−２Ｔ／Ｂｓ３４Ｔ、及びＢｓ４−２Ｔ／Ｂｓ４−４Ｔとも呼ばれる。
【０５５５】
得られた二重特異性抗体は、以下に記載する（実施例５を参照）のと本質的に同様に、ツブリシン１５０８ペイロードに共役させた。
【０５５６】
３．２．二重特異性ＡＤＣの結合特異性及び種交差反応性
ツブリシン１５０８の共役が、結合特異性及び種交差反応性を改変するか否かを決定するために、実施例１に記載したキャプチャーＥＬＩＳＡにより、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＨＥＲ４、マウスＨｅｒ２、及びカニクイザルＨｅｒ２の組換え細胞外ドメインタンパク質に対する二重特異性ＡＤＣの結合特異性を確認した。結果から、共役が、二重特異性ＡＤＣの抗原結合特異性及び種交差反応性を変化させなかったことがわかる。Ｂｓ２−４Ｔ及びＢｓ４−４Ｔのいずれも、その非共役形態と同じ効力で、ヒトＨＥＲ２及びカニクイザルＨｅｒ２に結合することができ；これらのいずれも、ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、又はマウスＨｅｒ２に対する結合を示さない（データは示していない）。ヒトＨＥＲ２に対する二重特異性ＡＤＣの結合速度は、ＢＩＡｃｏｒｅにより決定し、結果から、ヒトＨＥＲ２に対する親和性（ＫD）が、Ｂｓ２−４Ｔについては、１２０ｐＭであり、Ｂｓ４−４Ｔについては、２７１ｐＭであることがわかる。
【０５５７】
３．３．二重特異性ＡＤＣによる細胞内微小管ネットワークの破断
抗ＨＥＲ２ＡＤＣによる細胞内微小管ネットワークの破断を調べるために、３つの細胞株：ＳＫＯＶ−３、ＪＩＭＴ−１、及びＲＴ１１２（それぞれ、Ｔ−ＤＭ１適格、Ｔ−ＤＭ１不応答体、Ｔ−ＤＭ１不適格を代表する）を選択した。１日目に、トリプシン処理により細胞を採取し、培地に再懸濁させた後、６×１０4細胞／ウェルの密度で８ウェルチャンバスライドに接種した。スライドを３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。２日目に、培地を吸引して、非結合細胞を全て除去してから、５ｎＭ  ＡＤＣを含有する試験しようとする新鮮な培地を細胞に添加した。スライドを３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。３日目に、各チャンバを１×ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を４％ＰＦＡで２０分間固定した。固定の終了時にチャンバを取り出し、標準的免疫蛍光手順に従ってスライドを染色した。手短には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて、細胞を透過性化した後、Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳで洗浄した。ウサギ抗ヒトαＴｕｂｌｉｎ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８（クローン１１Ｈ１０）をＤＡＫＯ抗体希釈剤中に１：１００で希釈してから、スライドに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、ＤＡＰＩ含有のＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔと共にカバーガラスをスライドに載せた。染色した細胞は、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ及びＬｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅソフトウェアスイートにより視覚化した。
【０５５８】
図１６Ａから、Ｔ−ＤＭ１適格患者を代表する細胞株であるＳＫＯＶ−３において、Ｔ−ＤＭ１及びＢｓ２−４Ｔの両方が微小管ネットワークを破断することができることがわかる。同様の結果が、ＳＫＢＲ−３細胞において観察された（データは示していない）。
【０５５９】
図１６Ｂから、Ｔ−ＤＭ１不応答患者を代表する細胞株であるＪＩＭＴ−１において、Ｂｓ２−４Ｔのみが細胞内微小管ネットワークを破断することができることがわかる。
【０５６０】
図１６Ｃから、Ｔ−ＤＭ１不適格患者を代表する細胞株であるＲＴ−１１２において、Ｂｓ２−４Ｔが細胞内微小管ネットワークを破断することができるのに対し、Ｔ−ＤＭ１は不活性であることがわかる。
【０５６１】
３．４．二重特異性ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
二重特異性ＡＤＣの細胞傷害活性を評価するために、様々なレベルのＨＥＲ２を発現するヒト癌細胞株の一団を使用した（実施例１の表５）。手短には、細胞を採取し、再懸濁させた後、容量１００μＬの９６ウェルプレートのウェル当たり５，０００〜２０，０００の密度（各細胞株の増殖速度により変動）で血清含有培地に細胞を平板培養した。試験物質を培地で希釈することにより、試験しようとする各用量の抗体又はＡＤＣの２倍濃縮物を調製した。最終用量曲線が、段階的１：４連続希釈シリーズで、５ｎＭから０．０８ｐＭまで変動するように、１００マイクロリットルの各試験物質を細胞に３回反復で添加した。処理した細胞を３７℃／５％ＣＯ2で、各細胞株の増殖速度に応じて３〜４日間培養した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて、製造者の指示に従い細胞生存率を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより、データを解析し、非処理対照に対する増殖率（％）として表示した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによるシグモイド（Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ）非線形回帰分析を用いて、ＥＣ50値を決定し、これらを表６にまとめた。
【０５６２】
【表６】
2017512765.tif 000019
【０５６３】
図１７Ａは、Ｔ−ＤＭ１適格患者を代表するヒト乳癌細胞株であるＳＫＢＲ−３において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの両方が、ＳＫＢＲ−３細胞において、Ｔ−ＤＭ１よりも強力であることがわかる。
【０５６４】
図１７Ｂは、Ｔ−ＤＭ１適格患者を代表するヒト乳癌細胞株であるＳＫＢＲ−３において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの両方が、ＳＫＢＲ−３細胞において、Ｔ−ＤＭ１よりも強力であることがわかる。
【０５６５】
図１８Ａは、Ｔ−ＤＭ１適格ではあるが、不応答の患者を代表するヒト乳癌細胞株であるＪＩＭＴ−１において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの両方が、ＪＩＭＴ−１細胞の殺傷において非常に効力があるのに対し、Ｔ−ＤＭ１は活性を全く示さないことがわかる。
【０５６６】
図１８Ｂは、Ｔ−ＤＭ１適格ではあるが、不応答の患者を代表するヒト乳癌細胞株であるＪＩＭＴ−１において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの両方が、ＪＩＭＴ−１細胞の殺傷において非常に効力があるのに対し、Ｔ−ＤＭ１は活性を全く示さないことがわかる。
【０５６７】
図１９Ａは、Ｔ−ＤＭ１不適格患者を代表するヒト乳癌細胞株であるＺＲ−７５−１において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ２−４Ｔが、ＺＲ−７５−１細胞の殺傷に最も活性であるのに対し、Ｂｓ２−２Ｔは、より低レベルの活性を有し、Ｔ−ＤＭ１は、殺傷活性を全く、又は限定的にしか示さないことがわかる。
【０５６８】
図１９Ｂは、Ｔ−ＤＭ１不適格患者を代表するヒト乳癌細胞株であるＺＲ−７５−１において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ４−４Ｔが、ＺＲ−７５−１細胞の殺傷に最も活性であるのに対し、Ｂｓ４−２Ｔは、より低レベルの活性を有し、Ｔ−ＤＭ１は、殺傷活性を全く、又は限定的にしか示さないことがわかる。
【０５６９】
図２０は、ＨＥＲ２発現のないヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８において、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの細胞傷害活性を示す。データから、Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔのいずれも、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において活性ではないことがわかり、これは、Ｂｓ２−２Ｔ及びＢｓ２−４Ｔの細胞傷害活性が、標的（すなわち、ＨＥＲ２）依存的であることを示している。Ｂｓ４−２Ｔ及びＢｓ４−４Ｔについても、同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５７０】
３．５．二重特異性ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
細胞株ベースの異種移植片（ＣＢＸ）腫瘍モデル及び患者由来異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍モデル：マウス実験は全て、国際実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）（ＡＡＡＬＡＣ）により公表された指針及びＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコルに従って実施した。４〜８週齢の無胸腺ヌードマウスを実験に使用した。皮下ＣＢＸモデルの場合、特定の継代ロットの培養物から採取した腫瘍細胞を動物の右わき腹の片側のみに注射した。同所性ＣＢＸモデルの場合、動物の右わき腹の脂肪体に１匹当たり５×１０6細胞（５０％マトリゲル中に懸濁）を注射することにより、異種移植片を定着させた。ＰＤＸモデルの場合、各々特定の継代ロットから移植した宿主動物から採取した腫瘍断片を動物の片側のわき腹に移植した。その予定開始日の約１週間前に始まる各実験について、実験前腫瘍体積を記録した。腫瘍が、適切な腫瘍体積開始（ＴＶＩ）範囲（典型的に、１５０〜２５０ｍｍ3）に達したら、動物をランダムに処置及び対照群に分けた後、投与を開始した。他に指定のない限り、動物には、静脈内又は腹腔内注射により試験物質を週１回投与した。動物は毎日観察し、週２回腫瘍寸法及び体重を測定し、記録した。腫瘍体積は、次の式：腫瘍体積＝π÷６（長さ×幅2）を用いて算出する。腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍体積（ｍｍ3）±ＳＥＭとして表示した。
【０５７１】
図２１Ａから、低濃度（１ｍｇ／ｋｇ）であっても、Ｂｓ２−４Ｔは、Ｔ−ＤＭ１不適格患者を代表するヒト乳癌ＣＢＸ腫瘍モデルであるＭＤＡ−ＭＢ−３６１において、Ｔ−ＤＭ１（３ｍｇ／ｋｇ）及び様々な対照（全て３ｍｇ／ｋｇ）と比較し、高いｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有することがわかる。データは、Ｂｓ２−４Ｔが、用量依存的腫瘍阻害を誘導し、３ｍｇ／ｋｇ用量でＢｓ２−４Ｔは、完全な腫瘍退縮を誘導したのに対し、Ｔ−ＤＭ１は限定的な活性を示したことを明らかにしている。３ｍｇ／ｋｇではＢｓ４−４Ｔも、Ｔ−ＤＭ１と比較して高いｉｎ  ｖｉｖｏ活性を発揮した（図２１Ｂ）。
【０５７２】
図２２は、ＳＴ９９６モデルにおいて、Ｂｓ２−４Ｔ及びＴ−ＤＭ１と比較したＢｓ２−２Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。ＳＴ９９６は、トリプルネガティブ乳癌患者（ＨＥＲ２  ＩＨＣ：１＋；ＥＲ−；ＰＲ−）に由来する初代ＰＤＸモデルである。データは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＢｓ２−２Ｔが、頑健な腫瘍増殖阻害を誘導したが、その抗腫瘍効力は、Ｂｓ２−４Ｔと比較してやや低かったことを明らかにしている。対照的に、Ｔ−ＤＭ１は、ＳＴ９９６モデルにおいて活性を全く示さなかった。別の低ＨＥＲ２発現ＰＤＸモデルＳＴ７３８、ＳＴ４５５Ｂ、及びＳＴ８２１においても同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５７３】
図２３は、Ｔ−ＤＭ１適格患者を代表するヒト乳癌ＰＤＸ腫瘍モデルである、ＳＴ２２５モデルにおいて、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。データは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＢｓ２−４Ｔが、完全且つ持続的な腫瘍退縮を誘導したことを明らかにしている。対照的に、Ｔ−ＤＭ１は、処置段階中に腫瘍静止を誘導したにすぎず、処置を停止すると腫瘍は急速に再増殖した。
【０５７４】
図２４は、Ｔ−ＤＭ１適格であるが、不応答患者を代表するヒト乳癌ＣＢＸ同所性腫瘍モデルである、ＪＩＭＴ−１モデルにおいて、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。データは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＢｓ２−４Ｔが、完全且つ持続的な腫瘍退縮を誘導したことを明らかにしている。対照的に、Ｔ−ＤＭ１又はＴ−ＤＭ１とペルツズマブの組み合わせは、活性を全く示さなかった。
【０５７５】
図２５は、ＳＴ４５５Ｂモデルにおいて、Ｔ−ＤＭ１及び様々な対照と比較したＢｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。ＳＴ４５５Ｂは、トリプルネガティブ乳癌患者（ＨＥＲ２  ＩＨＣ：１＋、ＥＲ−、ＰＲ−）に由来する初代ＰＤＸモデルである。データは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＢｓ２−４Ｔが、完全な腫瘍退縮を誘導したのに対し、Ｔ−ＤＭ１は、活性を全く示さなかったことを明らかにしている。図２５に示される知見をさらに展開するために、本発明者らは、比較的低レベルのＨＥＲ２発現（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにより、＋１〜＋２）を有する乳癌患者由来の別の１６のＰＤＸモデルにおいてもＢｓ２−４Ｔを調べた。これらのモデルの選択には、試験における腫瘍サブタイプの多様性を最大にするために、その他の基準、例えば、ＨＥＲ２発現の異種性の程度、ＥＲ／ＰＲ状態及び組織病理学的クラスなども考慮した。表７は、これらの１７の異なるＰＤＸ乳癌モデルにおけるＢｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。Ｂｓ２−４Ｔは、腫瘍の組織病理学的サブクラス及びＥＲ／ＰＲ状態とは関係なく、強力な抗腫瘍活性を示した。１ｍｇ／ｋｇの用量では、腫瘍モデルの４１％が、腫瘍退縮を示し、６％が腫瘍静止を示した。３ｍｇ／ｋｇ用量では、モデルの７１％が、腫瘍退縮を示し、１２％が腫瘍静止を示した。
【０５７６】
これらの試験は、多種多様な乳癌モデルについて、単一特異性ＡＤＣ療法（例えば、Ｔ−ＤＭ１）と比較した、本発明の二重特異性ＡＤＣの優れた活性を証明するものである。特に、本発明の二重特異性ＡＤＣは、低レベルのＨＥＲ２発現を有する癌モデル及びＴ−ＤＭ１不応答患者のモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有する。
【０５７７】
表７：ＨＥＲ２低／Ｔ−ＤＭ１不適格患者を代表するＰＤＸ乳癌モデルの一団におけるＢｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ効果のまとめ。Ｂｓ２−４Ｔ処置に対して最大応答を示す時点で、投与を開始した腫瘍体積（ＴＶＩ）と比較して腫瘍体積が減少していれば、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、ＴＶＩに対する腫瘍変化率（％）として表す。それ以外の場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、ビヒクル対照に対する腫瘍変化率（％）として表す。処置に対する応答性は、腫瘍体積が＞２０％減少した場合には「退縮」、腫瘍体積が＜２０％減少した場合には「静止」、また、腫瘍体積が＞２０％増加した場合には「進行」と等級付けした。
【０５７８】
【表７】
2017512765.tif 000020
【０５７９】
３．６．獲得Ｔ−ＤＭ１耐性を有する腫瘍モデルにおける二重特異性ＡＤＣの活性
５μｇ／ｍＬまで徐々に増加するＴ−ＤＭ１濃度での連続的処理により、Ｔ−ＤＭ１に対する獲得耐性を有するＮＣＩ−Ｎ８７細胞を作製した。Ｔ−ＤＭ１と比較したＢｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を実施例３に記載のように親及び耐性細胞株の両方で調べた。図２６Ａに示す結果から、Ｂｓ２−４Ｔ及びＴ−ＤＭ１のいずれも、親ＮＣＩ−Ｎ８７細胞において活性であるが、Ｂｓ２−４Ｔの方がＴ−ＤＭ１よりも強力であることがわかる（左側パネル）。耐性細胞株では、Ｔ−ＤＭ１は活性を失っているが、Ｂｓ２−４Ｔは耐性細胞の殺傷も依然として活性である（右側パネル）。他の耐性細胞株（ＢＴ−４７４、ＳＫＯＶ−３、及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１など）も、Ｔ−ＤＭ１を用いた連続的処理によって作製し、これらの耐性細胞株でも、Ｂｓ２−４Ｔによる同様の細胞傷害活性を観測した（データは示していない）。
【０５８０】
獲得Ｔ−ＤＭ１耐性を有するｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを定着させるために、免疫欠損マウスにＴ−ＤＭ１耐性ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を皮下注射した。腫瘍担持マウスを３ｍｇ／ｋｇのＴ−ＤＭ１で処置した。ｉｎ  ｖｉｖｏＴ−ＤＭ１耐性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ耐性に完全には翻訳されなかったと思われ、これは、動物間での腫瘍増殖の相当な差に表わされている。そのため、大型の難治性腫瘍（体積約１０００ｍｍ3）を有するマウスを選択し、３ｍｇ／ｋｇのＴ−ＤＭ１による毎週処置の存在下で、腫瘍が絶えず増殖するまで、腫瘍組織断片を新しいマウスに継代させた。３継代の後、安定した耐性腫瘍が発達し、これらの腫瘍を断片化し、マウスに移植して、Ｂｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価した。図２６Ｂに示されるように、反復Ｔ−ＤＭ１処理から再発した腫瘍は、Ｔ−ＤＭ１に対して耐性であるだけでなく、Ｔ−ＤＭ１とペルツズマブ組み合わせ処置に対しても不応答性であった。対照的に、Ｂｓ２−４Ｔは、処置後に頑健且つ持続的腫瘍退縮を誘導したが、これは、Ｔ−ＤＭ１再発／難治性患者のための有効な療法薬としてのその可能性を示唆するものである。
【０５８１】
図２６Ｂから、Ｂｓ２−４Ｔが、Ｔ−ＤＭ１耐性ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を誘導することがわかる。Ｂｓ２−４Ｔ（３ｍｇ／ｋｇ）、Ｔ−ＤＭ１（３ｍｇ／ｋｇ）又は他の対照抗体／ＡＤＣ（ペルツズマブが１０ｍｇ／ｋｇである以外は、３ｍｇ／ｋｇ）の計４回用量の毎週の静脈内投与に応答する腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍体積（ｍｍ3）±ＳＥＭ（ｎ＝７）として示す。*Ｐ＜０．００１（非処置対照群と比較したスチューデント検定による）。
【０５８２】
３．７．二重特異性ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、トラスツズマブの前処理により減弱されない
無胸腺ヌードマウスの片側わき腹にＳＴ２２５  ＰＤＸ腫瘍断片を移植した。マウスをランダムに、処置及び対照群に分けて、腫瘍体積が２００〜２５０ｍｍ3に達したら、投与を開始した。処置群においては、マウスにビヒクルバッファー又はトラスツズマブ（３ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した。３日後、マウスは、Ｂｓ２−４Ｔの毎週静脈内注射を計４回用量で受けた。図２７から、トラスツズマブの前処置が、ＳＴ２２５  ＰＤＸモデルにおけるＢｓ２−４Ｔの抗腫瘍活性を減弱しないことがわかり、これは、トラスツズマブ又はＴ−ＤＭ１に対して再発／難治性である患者を治療するためにＢｓ２−４Ｔを使用する場合、休薬期間を必要としない可能性があることを示唆している。ＳＴ２２５は、ＨＥＲ２過剰発現を有する初代乳癌ＰＤＸモデルである。様々な処置に応答する腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍体積（ｍｍ3）±ＳＥＭ（ｎ＝７）として図２７に示す。
【０５８３】
３．８．二重特異性ＡＤＣのバイスタンダー効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で安定にトランスフェクトし、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で安定にトランスフェクトした。両細胞株を採取し、洗浄してから、培地に再懸濁させた後、６ウェルプレートの同じウェルに共培養物として接種した。対照として、各細胞株を異なる６ウェルプレートに単一培養物として接種した（図２８Ａ）。まちまちの増殖速度を調節するために、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は、５×１０5細胞／ウェルで接種し、またＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、２×１０5細胞／ウェルで接種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で２日間インキュベートした。培地を吸引し、５ｎＭの試験抗体又はＡＤＣを含有する新鮮な培地を細胞に添加した後、プレートを３７℃／５％ＣＯ2で４日間インキュベートした。処置終了時に、各ウェル中の細胞を収集し、洗浄してから、１００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた後、２％ＰＦＡで固定した。細胞は、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ装置及びＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアにより分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアでデータを解析した。
【０５８４】
図２８Ｂから、Ｂｓ２−４Ｔが、共培養中のＨＥＲ２過剰発現及びＨＥＲ２ヌル細胞の両方を殺傷することができることがわかり、これは、Ｂｓ２−４Ｔが、バイスタンダー効果を有することを示唆している。対照的に、Ｔ−ＤＭ１は、共培養中のＨＥＲ２−ヌル細胞を殺傷することができず、これは、Ｔ−ＤＭ１にはバイスタンダー効果がないことを示唆している。対照として、Ｂｓ２−４Ｔ及びＴ−ＤＭ１の両方が、単一培養中のＮＣＩ−Ｎ８７細胞の強力な殺傷を示したが、Ｂｓ２−４Ｔ又はＴ−ＤＭ１のいずれも、単一培養中のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の殺傷は示さなかった（データは示していない）。
【０５８５】
３．９．癌幹細胞に対する二重特異性ＡＤＣの活性
癌幹細胞スフィアアッセイ：２０％ＦＢＳを補充したライボビッツＬ−１５培地において、標準的組織培養条件下でＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を培養した。細胞をトリプシン処理により採取し、ＰＢＳで２回洗浄してから、幹細胞培地（ＳＣＭ：２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、５ｍｇ／ｍＬのインスリン、０．４％ＢＳＡ及び１％ノックアウト血清置換で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）中にｍＬ当たり３０，０００細胞まで再懸濁させた。初期スフィアを形成するために、１ｍＬの細胞を２４ウェル超低接着表面（Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）プレートに平板培養し、１０ｐＭのＲ３４７−４Ｔ、Ｔ−ＤＭ１又はＢｓ２−４Ｔのいずれかで処置した後、プレートを３７℃／５％ＣＯ2で４日間インキュベートした。処置終了時に、初期スフィアを採取し、０．０５％トリプシンを用いて解離させた後、初期スフィア培養物と同じ抗体処置を含むＳＣＭ中に３０，０００細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。次に、細胞を９６ウェル超低接着表面（Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）プレートに３回反復で平板培養し、４日間インキュベートした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて、製造者の指示に従いスフィア細胞生存率を決定した。データは、非処置対照に対するＣＳＣスフィア形成の倍数として表示する。図２９（左側パネル）から、Ｂｓ２−４Ｔは、ＣＳＣスフィア形成を８４％阻害し、Ｔ−ＤＭ１は、ＣＳＣスフィア形成の阻害に全く活性がなかったことがわかる。ＢＴ−４７４、ＪＩＭＴ−１及びＴ４７Ｄを含む他の細胞株においても同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５８６】
Ｂｓ２−４Ｔで処置した異種移植腫瘍における癌幹細胞の評価：Ｂｓ２−４Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価するＭＤＡ−ＢＭ−３６１異種移植片試験からの腫瘍を切除して、４ｍｍの切片に切断した後、Ｃｒｙｏｓｔｏｒを用いて、凍結保存した。凍結腫瘍切片を３７℃で解凍し、ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した後、滅菌スカルペルブレードを用いてさらに細かく刻んだ。単一細胞懸濁液を取得するために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地ｍＬ当たり２００単位の超高純度コラゲナーゼＩＩＩと腫瘍切片を混合した。腫瘍懸濁液を３０分毎に機械破砕しながら、３７℃で約１時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、７０μｍナイロンメッシュを通して細胞を濾過し、ＨＢＳＳで２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を４０μｍセルストレーナに通過させた後、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて計数した。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｌｄｅｆｌｕｏｒキットを用いて、また、製造者の指示に従い、ＣＳＣの基準として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性について細胞をアッセイした。細胞をＬＳＲＩＩフローサイトメータに通過させ、ＦｌｏｗＪｏで解析した。図２９（右側パネル）から、Ｂｓ２−４Ｔでの処置によって、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌異種移植片モデルにおけるＣＳＣが５４％低減していることがわかる。
【０５８７】
実施例４
４．１．アフコシル化二重特異性抗体の生産及び特性決定
ＰＯＴＥＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、二重特異性抗体を発現させることにより、ＡＤＣＣ活性が増強されたアフコシル化抗体を作製した。表８は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）及びＣｌｑに結合する、フコシル化を伴う（＿Ｆｕｃ）、及びフコシル化なしの（＿ａＦｕｃ）Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ及びＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ二重特異性抗体並びにトラスツズマブのＢＩＡｃｏｒｅにより測定したＫD（ｎＭ）を示し、この表から、アフコシル化抗体は、ＦｃγＲＩ、並びにＦｃγＲＩＩＩａの両対立遺伝子に対する結合が増強していることがわかる。
【０５８８】
【表８】
2017512765.tif 000021
【０５８９】
平衡結合定数の測定：ヒトＦｎガンマ受容体：ヒトＦｃγＲに対する抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の結合についての結合定数（ＫD）をＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６計器で測定した。手短には、計器製造者により概説されるように、標準的アミノカップリング化学を用いて、ＧＬＣセンサーチップ上に二重特異性抗体を高密度で固定化した。ＩｇＧの最終表面積は、約３０００ＲＵと測定された。また、タンパク質を除いた同じ固定化プロトコルを用いて、センサーチップ上に参照フローセルを調製した。各ＦｃγＲのストック溶液は、計器バッファー（５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］／Ｔｗｅｅｎ／エチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］バッファー）中に４０００ｎＭ、１６，０００ｎＭ、又は３２，０００ｎＭのいずれかで調製した後、同じバッファー中に連続的に希釈する（１：３）ことにより、各受容体について所望の濃度シリーズ：１．８２ｎＭ〜４，０００ｎＭ（ＦｃγＲＩ）、１９７．５ｎＭ〜１６，０００ｎＭ（ＦｃγＲＩＩＡ）、３９５．１ｎＭ〜１６，０００ｎＭ（ＦｃγＲＩＩｂ）、２１．９ｎＭ〜１６，０００ｎＭ（ｈＦｃｇＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ）、及び３９５〜３２，０００ｎＭ（ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ）を得た。各濃度のＦｃγＲを二重特異性抗体及び参照細胞表面の両方に対して２５μＬ／分の流量で８分間注射し、その間、結合データを収集した。注射と注射の間に、６０秒パルスの５ｍＭ  ＨＣｌで表面を再生した（すなわち、結合ＦｃγＲを除去した）。注射シリーズ全体を通して、数回のバッファー注射も挿入した。その後、参照細胞データと一緒にこれらのバッファー注射の１つを用いて、「二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）」（Ｍｙｓｚｋａ，１９９９）と一般に呼ばれる技術によって、注射のあらゆる人為的結果（例えば、非特異的結合）について結合データを補正した。全ての結合データを収集した後、個別のデータセットを各濃度（Ｃ）での結合（平衡応答［Ｒｅｑ］）について平均してから、１：１結合等温線（ｉｓｏｔｈｅｒｍ）（Ｒｅｑ対Ｃ）プロットに当てはめた。これから、供給業者の評価ソフトウェア、バージョン３．１．０．６を用いて、平衡結合定数、ＫDを導き出した。
【０５９０】
平衡結合定数の測定：ヒトＦｃＲｎタンパク質：ヒトＦｃＲｎタンパク質（ｈｕＦｃＲｎ）に対する二重特異性抗体の結合の親和性（ＫD）をＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６計器で測定した。手短には、前述したように、標準的アミノカップリング化学を用いて、ＧＬＣセンサーチップ上に二重特異性抗体を高密度で固定化した。ｈｕＦｃＲｎタンパク質のストック溶液は、計器バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌと、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６）中に３０００ｎＭで調製した後、同じバッファーで連続的に希釈する（３：１）ことにより１．３７ｎＭまで調製した。各濃度のｈｕＦｃＲｎを、連続して連結されている二重特異性抗体及び参照細胞表面上に、２５μＬ／分の流量で１６分間順次注射した。結合データを収集した後、各受容体又はバッファーブランクの注射と注射の間に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４の６０秒注射を実施して、ＩｇＧ表面を再生した（すなわち、結合ｈｕＦｃＲｎタンパク質を除去した）。注射シリーズ全体を通して、数回のバッファー注射も挿入した。その後、参照細胞データと一緒にこれらのバッファー注射の１つを用いて、「二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）」（Ｍｙｓｚｋａ，１９９９）によって、注射の人為的結果（例えば、非特異的結合）について生データセットを補正した。全ての結合データを収集した後、個別のデータセットを各濃度（Ｃ）での結合（Ｒｅｑ）について平均してから、１：１結合等温線（ｉｓｏｔｈｅｒｍ）（Ｒｅｑ対Ｃ）プロットに当てはめた。これから、ベンダーのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、ｖ４．１．を用いて、平衡結合定数、ＫDを導き出した。結果から、二重特異性抗体が、従来のＩｇＧ１と同等である類似したＫD値を有することがわかる。
【０５９１】
４．２．アフコシル化二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
リガンド駆動の細胞増殖の阻害におけるアフコシル化二重特異性抗体の活性を、実施例１に記載の方法を用いて決定した。結果から、アフコシル化Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、アフコシル化Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、及びアフコシル化Ｂｓ４Ａｂ−３９ＳＨは、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（図３０Ａ）及びＭＣＦ−７細胞（図３０Ｂ）において類似した抗増殖効力を有し、これは、親抗体組み合わせ（３９Ｓとトラスツズマブ）の活性とも同等である。ＮＣＩ−Ｎ８７及びＲＴ−１１２を含む他の細胞株においても同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５９２】
４．３．アフコシル化二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性増強
ＦｃγＲＩＩＩａを発現するヒト天然キラー（ＮＫ）細胞株であるＫＣ１３３３をエフェクター細胞として使用し、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞株をＡＤＣＣアッセイにおける標的細胞として使用して、抗ＨＥＲ２抗体のＡＤＣＣ活性を評価する。両細胞株を採取し、洗浄してから、アッセイ培地に再懸濁させた。ＫＣ１３３３は、１×１０6細胞／ｍＬの密度で、またＭＤＡ−ＭＢ−３６１は、４×１０5細胞／ｍＬで再懸濁させた。５０マイクロリットルの各細胞株を９６ウェルＵ字底プレートに添加して、１：２．５の標的：エフェクター比を達成した。試験物質をアッセイ培地で希釈することにより、各用量の抗体の３倍濃縮物を調製した。最終用量曲線が、段階的１：４連続希釈シリーズで、１０μｇ／ｍＬから０．１５ｎｇ／ｍＬまで変動するように、５０マイクロリットルの各試験物質を細胞に３回反復で添加した。プレートを遠心分離することにより、各ウェル中の細胞をペレット化した後、３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。翌日、各ウェルの上澄み中のＬＤＨを、ＰｒｏｍｅｇａのＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて、製造者の指示に従い定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データを解析し、非処理対照に対する細胞傷害率（％）として表示した。
【０５９３】
図３１Ａ〜３１Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞におけるトラスツズマブ及びアフコシル化トラスツズマブに対するアフコシル化二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を示す。データは、アフコシル化抗体のＡＤＣＣ活性が、そのフコシル化形態よりも高く、アフコシル化二重特異性抗体同士のＡＤＣＣ効力の等級が、Ｂｓ２Ａｂ−３９Ｓ＿ａＦｕｃ＞Ｂｓ４Ａｂ−３９Ｓ＿ａＦｕｃ＞Ｂｓ３Ａｂ−３９Ｓ＿ａＦｕｃであることを示している。ＢＴ−４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｔ４７Ｄ、及びＪＩＭＴ−１を含む他の細胞株においても同様の結果が観測された（データは示していない）。
【０５９４】
実施例５
５．１．ツブリシン１５０８ペイロード合成
共役のための図３２に示すツブリシン１５０８細胞毒ペイロードの合成を以下の例示的実施例に詳述するが、実施例において、別途記載のない限り、以下の通りとする：
（ｉ）別途記載のない限り、操作を室温又は周囲温度、すなわち、１８〜２５℃で実施した場合；温度は、摂氏（℃）で表示する；
（ｉｉ）溶液は、無水硫酸ナトリウム又は硫酸マグネシウムで乾燥させ；有機溶媒の蒸発は、減圧（４．５〜３０ｍｍＨｇ）下、最大３０℃の浴温で、回転蒸発器を用いて実施した；
（ｉｉｉ）クロマトグラフィーは、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーを意味し；薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲルプレート上で実施した；
（ｉｖ）概して、反応のコース後に、ＴＬＣ又は液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＣ）を実施したが、反応時間は、例示のために付与するにすぎない；
（ｖ）最終生成物は、満足なプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル及び／又は質量スペクトルデータを有する；
（ｖｉ）収率は、例示のために付与するにすぎず、必ずしも入念なプロセス展開により得ることができるものとは限らない；さらに多くの物質が必要な場合、調製を繰り返した；
（ｖｉｉ）記載されていれば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）データは、内標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対し、百万分率（ｐｐｍ）で表示される主要診断プロトンについてのデルタ（δ）値の形態を取り、別途記載のない限り、ｄ6−ＤＭＳＯにおいて３００又は４００ＭＨｚで決定される；
（ｖｉｉｉ）化学記号は、その通常の意味を有する；
（ｉｘ）溶媒比は、体積：体積（ｖ／ｖ）として表示する；
（ｘ）化合物の精製は、以下の方法の１つ又は複数を用いて実施した：
ａ）常用のシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー；
ｂ）Ｉｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）分離システム：ＲｅｄｉＳｅｐ順相フラッシュカラム、流量、３０〜４０ｍｌ／分（ＩＳＣＯ  ＭＰＬＣ）を用いたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー；ＩＳＣＯ逆相カラムを追加のこと
ｃ）ＧｉｌｓｏｎセミプレップＨＰＬＣ分離システム：ＹＭＣパックＯＤＳ−ＡＱカラム、１００×２０ｍｍ、Ｓ５μｍ  １２ｎｍ、溶媒としての水（０．１％トリフルオロ酢酸）及びアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）、２０分ラン；
【０５９５】
化合物Ｔ１
【化３】
2017512765.tif 000022
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）及び水（４０．０ｍＬ）中の（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチルピペリジン−２−カルボン酸（２ｇ、１３．９７ｍｍｏｌ）の溶液に、パラホルムアルデヒド（２．５２ｇ、２７．９４ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（１０％）（０．８ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣから、反応は完了していなかった。さらに１当量のパラホルムアルデヒド（２．５２ｇ、２７．９４ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物をさらに２４時間攪拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを示したため、反応混合物を濾過し、ＭｅＯＨ（２×３０ｍＬ）を含む触媒で洗浄した。濾過物を真空下で濃縮させて、白色の固体として粗生成物を取得し、これをエーテル（３×３０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で一晩乾燥させることにより、白色の固体として（２Ｒ，４Ｒ）−１，４−ジメチルピペリジン−２−カルボン酸（Ｔ１）（１．８７０ｇ、８５％）を取得した。ＬＣ−ＭＳ：１５８（Ｍ＋１）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，酸化ジュウテリウム）δ  ｐｐｍ  ０．９７（ｄ，Ｊ＝５．５２Ｈｚ，３Ｈ），１．５４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１．７１−１．８７（ｍ，３Ｈ），１．９１−２．０７（ｍ，１Ｈ），２．８４（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｔｄ，Ｊ＝８．４１，３．７６Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ）．
【０５９６】
化合物Ｔ２
【化４】
2017512765.tif 000023
室温で攪拌しながら、アセトン（１Ｌ）及び水（１Ｌ）中の（Ｒ）−３−アミノ−４−メチルペンタン酸（市販のもの）（１３３．０ｇ、１．０モル）及びＮａ2ＣＯ3（２１２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２４３．０ｇ、１．１モル）を滴下しながら添加した。反応混合物を一晩攪拌した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物を水（１Ｌ）で希釈してから、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×３）で洗浄した。水相を２Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨ＝３まで酸性化し、得られた混合物をＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた抽出物を塩水（８００ｍＬ×１）で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）した後、濃縮することにより、油として化合物（Ｔ２）（２４４．０ｇ、９７％収率）が得られ、これをそれ以上精製せずに次のステップで用いた。
【０５９７】
化合物Ｔ３
【化５】
2017512765.tif 000024
０℃で攪拌しながら、ＣＨ2Ｃｌ2（１．４Ｌ）中の化合物（Ｔ２）（１４０．０ｇ、０．６１モル）及びＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（７４．１ｇ、０．７６モル）の懸濁液に、トリエチルアミン（６７ｇ、０．６１モル）を添加した。懸濁液を０．５時間攪拌してから、ＥＤＣＩ（７４ｇ、０．６１モル）を０℃で少量ずつ添加した。反応混合物を０℃で２時間攪拌した後、水（８００ｍＬ）を添加した。有機相を分離し、５％ＫＨＳＯ４溶液（８００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（８００ｍＬ×３）及び塩水（８００ｍＬ×１）で洗浄してから、乾燥させた（無水Ｎａ2ＳＯ4）後、乾燥まで濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：５）により残留物を精製することによって、油として化合物（Ｔ３）（１４１．０ｇ、８４％収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ５．２６（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．１５（ｓ，３Ｈ），２．６０〜２．８０（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｍ，１Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
【０５９８】
化合物Ｔ４
【化６】
2017512765.tif 000025
０℃で攪拌しながら、ＤＭＦ（１．１Ｌ）中の化合物（Ｔ３）（５５．０ｇ、０．２モル）の溶液に、ヨードエタン（２５０．０ｇ、１．６モル）を添加した。次に、ＮａＨ（６０％懸濁液、２４．０ｇ、０．６０モル）を０℃で少量ずつ添加し、反応混合物を室温まで昇温させてから、１２時間攪拌した。反応物を水（２Ｌ）で注意深くクエンチングした後、ＥｔＯＡｃ（２Ｌ）を添加した。有機相を分離し、５％ＫＨＳＯ４溶液（８００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（８００ｍＬ×３）及び塩水（８００ｍＬ×３）で洗浄してから、乾燥させた（無水Ｎａ2ＳＯ4）後、乾燥まで濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１０）により残留物を精製することによって、油として化合物（Ｔ４）（３５．１ｇ、５８％収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ３．７０（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．３０（ｍ，５Ｈ），２．５０−２．９５（ｍ，２Ｈ），１．９０−２．２０（ｍ，１Ｈ），１．４０〜−．５５（ｍ，９Ｈ），１．１０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
【０５９９】
化合物Ｔ５
【化７】
2017512765.tif 000026
１時間にわたり攪拌しながら、Ｎ2下、−７８℃でドライＴＨＦ（５００ｍＬ）中の２−ブロモ−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル）チアゾール（７４ｇ、０．２４モル）の（Ｗｉｐｆ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００７，９（８），ｐ．１６０５に記載のように調製された）溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（１０６ｍｌ、ヘキサン中２．５Ｎ、０．１７モル）を滴下しながら添加した。懸濁液をさらに３０分間懸濁した後、ドライＴＨＦ（３００ｍＬ）中の化合物（Ｔ４）（５１．０ｇ、０．１７モル）の溶液を−７８℃で３０分間にわたり滴下しながら添加した。反応混合物を−７８℃で１時間攪拌してから、室温まで昇温させて、１２時間攪拌した。反応物を２０％水性塩化アンモニウム溶液（１Ｌ）でクエンチングした後、減圧下で有機相溶媒を除去した。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機相を、５％ＫＨＳＯ4溶液（８００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（８００ｍＬ×３）及び塩水（８００ｍＬ×１）で洗浄してから、乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）後、乾燥まで濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１０）により粗生成物を精製することによって、油として化合物（Ｔ５）（５８．１ｇ、７３％収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ７．５３（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），０．８０−１．２０（ｍ，１８Ｈ），０．１４（ｓ，６Ｈ）．
【０６００】
化合物Ｔ６
【化８】
2017512765.tif 000027
攪拌しながら、メタノール（５００ｍＬ）中の化合物（Ｔ５）（４７．１ｇ、０．１モル）の溶液に、ＬｉＢＨ4（４．８ｇ、０．２２モル）を室温で０．５時間にわたり少量ずつ添加した。懸濁液を２時間攪拌してから、減圧下で溶媒を除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ）に溶解させ、得られた溶液を、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（５００ｍＬ×３）及び塩水（５００ｍＬ×１）で洗浄してから、乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）後、乾燥まで濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：６）により粗材料を精製することによって、化合物（Ｔ６）（１３．５ｇ、２８％収率）及びその異性体（Ｔ６’）（２１．０ｇ、４５％収率）が得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ｐｐｍ−０．０６−０．０５（ｍ，６Ｈ）０．７６−０．８９（ｍ，１５Ｈ）１．１２（ｔ，Ｊ＝６．９７Ｈｚ，３Ｈ）１．３９（ｓ，９Ｈ）１．５５−２．０５（ｍ，３Ｈ）２．８６−３．２１（ｍ，２Ｈ）３．７６−３．９６（ｍ，１Ｈ）４．７３（ｄ，Ｊ＝１．１３Ｈｚ，４Ｈ）７．０１（ｓ，１Ｈ）．
【０６０１】
化合物Ｔ７
【化９】
2017512765.tif 000028
１０分かけて攪拌しながら、ピリジン（５００ｍＬ）中の化合物（Ｔ６）（３４．０ｇ、７２ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（４５．２ｇ、０．５８モル）を０℃で滴下しながら添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、１２時間攪拌した。反応物を水（２００ｍＬ）でクエンチングした後、減圧下で溶媒を除去した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（８００ｍＬ）で処理した後、得られた混合物を、５％ＫＨＳＯ4溶液（８００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（８００ｍＬ×３）及び塩水（８００ｍＬ×１）で洗浄してから、乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）後、乾燥まで濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１０）により粗材料を精製することによって、油として化合物（Ｔ７）（２５．７ｇ、６９％収率）が得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ７．１５（ｍ，１Ｈ），５．９５（ｍ，１Ｈ），４．８４（ｓ，２Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），１．７０（ｍ，１Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），０．８０〜１．１０（ｍ，１５Ｈ），０．０８（ｓ，６Ｈ）．
【０６０２】
化合物Ｔ８
【化１０】
2017512765.tif 000029
攪拌しながら、０℃でＴＨＦ（３００ｍＬ）中の化合物（Ｔ７）（２５．７ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム（６５．３ｇ、０．２５モル）の溶液を滴下しながら添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、４時間攪拌した。水（８００ｍＬ）を添加してから、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（８００ｍＬ）で処理した後、得られた混合物を、５％ＫＨＳＯ4溶液（８００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（８００ｍＬ×３）及び塩水（８００ｍＬ×１）で洗浄してから、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）後、乾燥まで濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：４）により粗材料を精製することによって、油として化合物（Ｔ８）（１９．５ｇ、９８％収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．２６（ｍ，１Ｈ），５．９５（ｍ，１Ｈ），４．８３（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，１Ｈ），３．１７（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ），１．１０−１．３０（ｍ，３Ｈ），０．８０−１．０５（ｍ，６Ｈ）．
【０６０３】
化合物Ｔ９
【化１１】
2017512765.tif 000030
ジクロロメタン（３００ｍＬ）中の化合物（Ｔ８）（２０．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に、デス・マーチン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ）試薬（３２．７ｇ、７５ｍｍｏｌ）を添加した後、反応混合物を室温で１２時間攪拌した。混合物を、水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ、３００ｍＬ×３）、チオ硫酸ナトリウム（１Ｎ、３００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３００ｍＬ×３）及び塩水（３００ｍＬ×１）でそれぞれ洗浄した。有機相を乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）後、乾燥まで濃縮することにより、対応するアルデヒドを取得した。
【０６０４】
この粗アルデヒドをｔｅｒｔ−ブチルアルコール（５００ｍＬ）に溶解させた後、水（３００ｍＬ）中の塩化ナトリウム（８０％、３６．４ｇ、３２０ｍｍｏｌ）及びリン酸二水素ナトリウム一水和物（１０５ｇ、０．７７モル）の溶液を室温で１時間かけて滴下しながら添加した。反応混合物を３時間攪拌した後、塩酸溶液（０．１Ｎ、５００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×１）で抽出した後、合わせた有機相を、５％ＫＨＳＯ4溶液（５００ｍＬ×３）及び塩水（５００ｍＬ×１）で洗浄してから、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた後、乾燥まで濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝１００：５）により残留物を精製することによって、化合物（Ｔ９）（１５．４ｇ、５８％収率）が得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ９．９０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ），５．９６（ｍ，１Ｈ），４．０７（ｍ，１Ｈ），３．１５（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），１．７５（ｍ，１Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．２０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
【０６０５】
化合物Ｔ１０
【化１２】
2017512765.tif 000031
０℃で、ＤＣＭ（６０ｍＬ）中の２−（（１Ｒ，３Ｒ）−１−アセトキシ−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（エチル）アミノ）−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボン酸（Ｔ９）（６．５ｇ、１５．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（３０ｍＬ）を滴下しながら添加した。混合物を０℃で１時間攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させることにより、粗生成物（Ｔ１０）を取得した。粗生成物は、それ以上精製することなく、次のステップ反応に用いた（７．２グラム）。ＬＣ−ＭＳ：３１５（Ｍ＋１）．
【０６０６】
化合物Ｔ１１
【化１３】
2017512765.tif 000032
アセトン（３００ｍＬ）及び水（１５０ｍＬ）の混合物中の２−（（１Ｒ，３Ｒ）−１−アセトキシ−３−（エチルアミノ）−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボン酸４、トリフルオロ酢酸塩（Ｔ１０）（５ｇ、１１．６７ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（９．８０ｇ、１１６．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）炭酸塩（３．９４ｇ、１１．６７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。塩酸により混合物を（ｐＨ２）まで酸性化した後、アセトンを真空下で蒸発させた。生成物をＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、０．１％ＨＣｌ溶液（２００ｍＬ）、塩水（２００ｍＬ）で洗浄してから、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた後、真空下で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＭｅＯＨは０％から５％まで）により残留物を精製することによって、白色の固体として２−（（１Ｒ，３Ｒ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（エチル）アミノ）−１−アセトキシ−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボン酸（Ｔ１１）（３．５３ｇ、５４．６％収率）が得られた。ＬＣ−ＭＳ：５３７．２（Ｍ＋１）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ｐｐｍ  ０．８４（ｄ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，３Ｈ），０．９２−１．０５（ｍ，５Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝３．０１Ｈｚ，１Ｈ），１．７３（ｄｔ，Ｊ＝１０．２３，６．４３Ｈｚ，１Ｈ），１．９２−２．０５（ｍ，１Ｈ），２．１２−２．２７（ｍ，４Ｈ），２．２８−２．４４（ｍ，１Ｈ），２．９０−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｔ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），４．１２−４．３２（ｍ，１Ｈ），４．４７−４．８２（ｍ，２Ｈ），５．９５（ｄｄ，Ｊ＝１０．９２，２．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．２９−７．４５（ｍ，４Ｈ），７．５５−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．８１（ｍ，２Ｈ），８．２２−８．２９（ｍ，１Ｈ）．
【０６０７】
化合物Ｔ１２
【化１４】
2017512765.tif 000033
ジクロロメタン（１．５Ｌ）中のＢｏｃ−Ｌ−４−ニトロ−フェニルアラニン（１８００ｇ、０．５８モル）及びメルドラム酸（Ｍｅｌｄｒｕｍ’ｓ  ａｃｉｄ）（９２ｇ、０．６４モル）の溶液に、ＤＭＡＰ（１０６ｇ、０．８６モル）を添加した。得られた溶液をＮ２雰囲気下、−５℃で冷却させた後、１時間にわたりジクロロメタン（１Ｌ）中のＤＣＣ（２４０ｇ、１．１６モル）を添加した。混合物を０〜５℃で一晩攪拌した。次に、沈殿したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素を濾過により除去した後、濾過物を５％水性ＨＣｌ（１Ｌ×３）、及び塩水（１Ｌ×１）で洗浄してから、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。濾過によりＭｇＳＯ4を除去した後、有機相を乾燥まで濃縮させた。残留物をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１、５００ｍＬ）と一緒に粉砕した後、乾燥させることにより、黄色の固体として化合物（Ｔ１２）（１３０．０ｇ、５１％収率）を得た。
【０６０８】
化合物Ｔ１３
【化１５】
2017512765.tif 000034
Ｎ２雰囲気下、−５℃で、ジクロロメタン（１．５Ｌ）中の化合物（Ｔ１２）（１３０．０ｇ、０．２９８モル）の溶液に、ＡｃＯＨ（４００ｍＬ）を添加した。固体ＮａＢＨ4（２２．７ｇ、０．５９７モル）を２時間かけて少量ずつ添加した（ガス放散及び発熱）。−５℃でさらに３時間攪拌した後、ＴＬＣにより、反応が完了したことが示された。混合物を塩水（１Ｌ）でクエンチングした。有機層を分離して、水（１Ｌ×２）、水性飽和ＮａＨＣＯ３（１Ｌ×３）及び塩水（１Ｌ×３）で順次洗浄してから、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。濾過物を乾燥まで濃縮させることにより、黄色の固体として化合物（Ｔ１３）（７０．３ｇ、５５％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５８（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｍ，２Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｓ，３Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）．
【０６０９】
化合物Ｔ１４
【化１６】
2017512765.tif 000035
アセトン（４００ｍＬ）及びＤＭＦ（４００ｍＬ）中の化合物（Ｔ１３）（７０．３ｇ、０．１６７モル）の溶液に、Ｋ2ＣＯ3（３５ｇ、０．２５モル）及びＭｅＩ（３６ｇ、０．２５モル）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。ＴＬＣにより、出発材料が消費されたことが示された。水（２Ｌ）を添加して、混合物をさらに１時間攪拌した。沈殿した固体を濾過により収集し、水で洗浄してから、乾燥させることにより、薄黄色の固体として化合物（Ｔ１４）（３４．５ｇ、５５％収率）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ８．１７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｍ，２Ｈ），１．７３（ｓ，３Ｈ），１．７３（ｓ，３Ｈ），１．５２（ｓ，３Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）．
【０６１０】
化合物Ｔ１５
【化１７】
2017512765.tif 000036
化合物（Ｔ１４）（３４．５ｇ、７９．１ｍｍｏｌ）をトルエン（５００ｍＬ）に溶解させた。溶液を還流下で４０時間加熱した。ＴＬＣにより、反応の完了が示された。溶媒を除去することにより、化合物（Ｔ１５）（３０ｇ）を取得し、これをそれ以上精製せずに次のステップに用いた。
【０６１１】
化合物Ｔ１６
【化１８】
2017512765.tif 000037
ＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中の化合物（Ｔ１５）（３０ｇ、７９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ2ＣＯ3（２２ｇ、０．１６モル）を添加した。混合物を室温で３時間攪拌した。ＴＬＣにより、完全な転化が示された。溶媒を除去し、残留物をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、塩水（５００ｍＬ×３）で洗浄してから、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。濾過によりＭｇＳＯ4を除去後、有機相を乾燥まで濃縮させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１０）によりさらに精製して、１：１ジアステレオマー混合物として化合物（Ｔ１６）（２３．５ｇ、２ステップで８１％収率）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
【０６１２】
化合物Ｔ１７
【化１９】
2017512765.tif 000038
５０ｇの化合物（Ｔ１６）を、流量６０ｍｌ／分で移動相Ａ９０％二酸化炭素及び相Ｂイソプロパノール１０％を用いた、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＤ  ２１×２５０ｍｍ、５μカラムでのＳＦＣ（超臨界流体クロマトグラフィー）を使用するキラルクロマトグラフィーに付した。４０℃で分離を実施した後、２７０ｎＭで検出した。ベースライン分離を実施した後、２つの画分を分離した。ピークＢは所望の化合物（Ｔ１７）であり、これは、固体２７．４ｇ（５５％）として得られた。
【０６１３】
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ  カラム  ４．６×２５０ｍｍ、５μ、０．１％ジエチルアミン調節剤を含むヘキサン中１０％１：１メタノール：イソプロパノールで、＞９９：１ジアステレオマー過剰率。
【０６１４】
ＬＣ／ＭＣ（２分、Ａｃｉｄ＿ＣＶ１０．ｏｌｐ法３６７（Ｍ＋１）、１．１６分。
【０６１５】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ4）δ  ｐｐｍ  ８．１６（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ）７．４６（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ）３．７９−３．９３（ｍ，１Ｈ）３．６８（ｓ，３Ｈ）２．９０−２．９９（ｍ，１Ｈ）  ２．７１−２．８１（ｍ，１Ｈ）２．４７−２．５９（ｍ，１Ｈ）１．８１−１．９５（ｍ，１Ｈ）１．５５−１．６６（ｍ，１Ｈ）１．３２（ｓ，９Ｈ）１．２１−１．２５（ｍ，２Ｈ）１．１６（ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，３Ｈ）．
【０６１６】
化合物Ｔ１８
【化２０】
2017512765.tif 000039
６Ｎ  ＨＣｌ水溶液（８．０ｍＬ、２６３．３０ｍｍｏｌ）中の（２Ｓ，４Ｒ）−メチル４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−５−（４−ニトロフェニル）ペンタノエート（Ｔ１７）（３．５ｇ、９．５５ｍｍｏｌ）の溶液をマイクロ波により１３０℃で３０分間加熱した。反応混合物を凍結乾燥させることにより、固体として（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−２−メチル−５−（４−ニトロフェニル）ペンタン酸（Ｔ１８）を得た。この生成物をそれ以上精製せずに次のステップ反応で使用した。（３．２ｇ）。ＬＣ−ＭＳ：２５３（Ｍ＋１）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，酸化ジュウテリウム）δ  ｐｐｍ  １．１２（ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，３Ｈ），１．６２−１．７６（ｍ，１Ｈ），１．９０−２．０２（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．６８（ｍ，１Ｈ），３．０２−３．１１（ｍ，２Ｈ），３．５８−３．６９（ｍ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ）．
【０６１７】
化合物Ｔ１９
【化２１】
2017512765.tif 000040
アセトン（３０ｍＬ）及び水（１５ｍＬ）の混合物中の化合物（Ｔ１８）（０．４３ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（１．２５１ｇ、１４．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル２，５−ジオキソピロリジン−１−イル炭酸塩（０．５０２ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。塩酸により混合物をｐＨ２まで酸性化した後、アセトンを真空下で蒸発させた。生成物をＤＣＭ（３×６０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、１Ｎ  ＨＣｌ溶液（４０ｍＬ）、塩水（４０ｍＬ）で洗浄してから、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた後、真空下で蒸発させた。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー、ＤＣＭ中０％から１００％のＥｔＯＡｃにより残留物を精製することによって、白色の固体として（２Ｓ，４Ｒ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−２−メチル−５−（４−ニトロフェニル）ペンタン酸（０．６３０ｇ、８９％）（Ｔ１９）が得られた。ＬＣ−ＭＳ：４７５．５（Ｍ＋Ｈ）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ｐｐｍ  ０．８１−１．０６（ｍ，１Ｈ），１．０８−１．２８（ｍ，２Ｈ），１．３３−１．７５（ｍ，１Ｈ），１．７７−２．１１（ｍ，１Ｈ），２．３６−２．６９（ｍ，２Ｈ），２．７６−３．１８（ｍ，１Ｈ），３．４３−４．０８（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．１９（ｍ，１Ｈ），４．２１−４．５３（ｍ，２Ｈ），４．５４−４．８０（ｍ，１Ｈ），７．１８−７．５８（ｍ，８Ｈ），７．６６−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．９５−８．１７（ｍ，２Ｈ），８．６７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）．
【０６１８】
化合物Ｔ２０
【化２２】
2017512765.tif 000041
ＤＣＭ（４．５ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−２−メチル−５−（４−ニトロフェニル）ペンタン酸（０．３８０ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）（Ｔ１９）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．４１９ｍＬ、２．４０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で５分攪拌した後、塩化２−クロロトリチル樹脂（０．５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。混合物を室温で一晩振盪し、得られた樹脂をＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、室温にてＤＩＥＡ（０．４１９ｍＬ、２．４０ｍｍｏｌ）及びＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：１、５ｍＬ）で３０分間処理した。得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、高真空下で一晩乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析した。得られた樹脂（Ｔ２０）を次のステップ反応に使用した。ＬＣ−ＭＳ：４７５（Ｍ＋１）
【０６１９】
化合物Ｔ２１
【化２３】
2017512765.tif 000042
樹脂（Ｔ２０）（０．５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２０％ピペリジンを添加した。混合物を室温で６分間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが示された。得られた樹脂（Ｔ２１）を次のステップ反応に使用した。ＬＣ−ＭＳ：２５３（Ｍ＋Ｈ）．
【０６２０】
化合物Ｔ２２
【化２４】
2017512765.tif 000043
樹脂（Ｔ２１）（０．５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−（（１Ｒ，３Ｒ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（エチル）アミノ）−１−アセトキシ−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボン酸（３）（１．１０８ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．４２８ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチルピリジン（０．５００ｍＬ、３．７６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．６５６ｍＬ、３．７６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。混合物を室温で２時間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが示された。得られた樹脂（Ｔ２２）を次のステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：７７１（Ｍ＋Ｈ）．
【０６２１】
化合物Ｔ２３
【化２５】
2017512765.tif 000044
樹脂（Ｔ２２）（０．５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２０％ピペリジンを添加した。混合物を室温で６分間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、ＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ２３）を次の反応ステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：５４９（Ｍ＋１）．
【０６２２】
化合物Ｔ２４
【化２６】
2017512765.tif 000045
ＤＣＭ（１２０ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルペンタン酸（Ｆｍｏｃ−イソロイシン）（７ｇ、１９．８１ｍｍｏｌ）及びピリジン（１．６０２ｍＬ、１９．８１ｍｍｏｌ）の溶液に、カニューラを介して、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のＤＡＳＴ（３．１１ｍＬ、２３．７７ｍｍｏｌ）の溶液を１０分かけて添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、ＤＣＭ（８０ｍＬ）で希釈し、氷冷水（２×２００ｍＬ）で洗浄してから、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した後、真空下で蒸発させることにより、白色の固体として（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２Ｓ，３Ｓ）−１−フルオロ−３−オキソペンタン−２−イルカルバメート（６．６５ｇ、９４％）を取得した。Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｆ（５ｍｇ）を無水ＭｅＯＨ（０．３ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．０３０ｍＬに溶解させ、室温で１５分間反応させることにより、エステル化試験を実施して、定量的酸フッ化物形成を確認した。混合物を真空下で蒸発させ、ＬＣＭＳにより分析したところ、１％未満のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨが存在することが判明した。
【０６２３】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ｐｐｍ  ０．８３−１．１２（ｍ，６Ｈ）１．１８−１．３７（ｍ，１Ｈ）１．４２−１．５９（ｍ，１Ｈ）２．０１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）４．２６（ｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，１Ｈ）４．４４−４．６３（ｍ，３Ｈ）５．２０（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，１Ｈ）７．３１−７．３９（ｍ，２Ｈ）７．４０−７．４７（ｍ，２Ｈ）７．６１（ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ）７．８０（ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，２Ｈ）．
【０６２４】
化合物Ｔ２５
【化２７】
2017512765.tif 000046
樹脂（Ｔ２３）（０．５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２Ｓ，３Ｓ）−１−フルオロ−３−メチル−１−オキソペンタン−２−イルカルバメート（Ｔ２４）（０．５６９ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４．８９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．４１９ｍＬ、２．４０ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。混合物を室温で一晩振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、高真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣ／ＭＳにより分析したところ、ＬＣＭＳにより反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ２５）を次の反応ステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：８８４（Ｍ＋Ｈ）．
【０６２５】
化合物Ｔ２６
【化２８】
2017512765.tif 000047
樹脂（Ｔ２５）（０．５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２０％ピペリジンを添加した。混合物を室温で６分間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、ＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ２６）を次の反応ステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：６６２（Ｍ＋１）．
【０６２６】
化合物Ｔ２７
【化２９】
2017512765.tif 000048
樹脂（Ｔ２６）（０．５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の（２Ｒ，４Ｒ）−１，４−ジメチルピペリジン−２−カルボン酸（１）（０．２５２ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．６０８ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチルピリジン（０．３２０ｍＬ、２．４０ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．４１９ｍＬ、２．４０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で２時間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが示された。得られた樹脂（Ｔ２７）を次の反応ステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：８０１（Ｍ＋１）．
【０６２７】
化合物Ｔ２８
【化３０】
2017512765.tif 000049
樹脂（Ｔ２７）に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＩ）二水和物（１．８０５ｇ、８．００ｍｍｏｌ）、及び酢酸ナトリウム（０．１９７ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で４時間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×６ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×６ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×６ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ２８）を次のステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：７７１（Ｍ＋Ｈ）．
【０６２８】
化合物Ｔ２９
【化３１】
2017512765.tif 000050
樹脂（Ｔ２８）（０．２ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（４ｍＬ）中の（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（市販のもの）（０．３００ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．２４３ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチルピリジン（０．１２８ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．１６８ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で２時間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×２ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×２ｍＬ）、及びＤＣＭ（３×２ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ２９）を次のステップ反応に使用した。ＬＣ−ＭＳ：１２２１（Ｍ＋１）．
【０６２９】
化合物Ｔ３０
【化３２】
2017512765.tif 000051
樹脂（Ｔ２９）（０．２ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の２０％ピペリジンを添加した。混合物を室温で６分間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×３ｍＬ）、ＭｅＯＨ（３×３ｍＬ）、ＤＣＭ（３×３ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ３０）を次のステップ反応に使用した。ＬＣ／ＭＳ：９９９（Ｍ＋Ｈ）．
【０６３０】
化合物Ｔ３１
【化３３】
2017512765.tif 000052
樹脂（Ｔ３０）（０．２ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の２，５−ジオキソリルピロリジン−１−イル  ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ−１−イル）ヘキサノエート（０．１４８ｇ、０．４８ｍｍｏｌの溶液、続いてＮ−メチルモルホリン（０．１０６ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。混合物を室温で２時間振盪し、得られた樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×３ｍＬ）、ＤＣＭ（３×３ｍＬ）で洗浄してから、真空下で乾燥させた。樹脂から少量の化合物を切り取り、ＬＣＭＳにより分析したところ、反応が完了したことが判明した。得られた樹脂（Ｔ３１）は、次のステップに使用した。ＬＣ−ＭＳ：１１９２（Ｍ＋１）．
【０６３１】
化合物Ｔ３２（ツブリシン１５０８）
【化３４】
2017512765.tif 000053
樹脂（Ｔ３１）（０．２ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（１ｍＬ）、及びＴＦＡ（１ｍＬ）を室温で添加した。混合物を室温で２０分間振盪した後、濾過した。樹脂をＤＣＭ／ＴＦＡ（１：１、３×２ｍＬ）で洗浄してから、濾過物を真空下で乾燥させた。逆相ＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ2Ｏ（０．１％ＴＦＡを含有）、ＡＣＮは、１４分で５％から７５％）により残留物を精製した。純粋な画分を凍結乾燥することにより、白色の固体として（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−（（１Ｒ，３Ｒ）−１−アセトキシ−３−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（２Ｒ，４Ｒ）−１，４−ジメチルピペリジン−２−カルボキサミド）−Ｎ−エチル−３−メチルペンタンアミド）−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボキサミド）−５−（４−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）フェニル）−２−メチルペンタン酸（Ｔ３２）（０．０９５ｇ、２２．４８％）を取得した。ＬＣ−ＭＳ：１０９２［Ｍ＋１］；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ｐｐｍ  ７．９９（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），６．６６（ｓ，２Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝１０．７９Ｈｚ，１Ｈ），４．５０−４．６１（ｍ，１Ｈ），４．２１−４．３５（ｍ，２Ｈ），３．９２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，２Ｈ），３．１５−３．３５（ｍ，４Ｈ），３．０４（ｄｔ，Ｊ＝３．５８，１．８５Ｈｚ，１Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝７．６５Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，２Ｈ），２．６２（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），２．３８−２．５２（ｍ，２Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝１１．５４Ｈｚ，１Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），２．０４−２．１１（ｍ，４Ｈ），１．７０−２．００（ｍ，７Ｈ）１．４２−１．６９（ｍ，１１Ｈ），１．３４−１．４０（ｍ，１Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，３Ｈ），１．１６−１．２４（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．１４（ｍ，７Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，３Ｈ），０．７９（ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，３Ｈ）．
【０６３２】
５．２．ツブリシン１５０８の共役
化合物Ｔ３２（ツブリシン１５０８）は、リンカー及びマレイミド基を含み、マレイミド基は、抗体のチオール残基に容易に共役して、チオール−マレイミド結合を形成する。マレイミド基を含む細胞毒（例えば、ツブリシン１５０８）は、本発明の抗ＨＥＲ２抗体（例えば、Ｂｓ２Ａｂ−３９ＳＨ、Ｂｓ３Ａｂ−３９ＳＨ、又はＢｓ４Ａｂ−３９ＳＨ）に組み込んだ特定のシステイン残基に共役させることができる。これに代わり、又は任意選択で、古典的な共役方法を用いて、細胞傷害剤を記載の抗体に結合させてもよい。ネイティブリシン及びシステイン残基との共役方法は、当該技術分野では公知である。部位特異的共役（操作システイン残基での）及び古典的共役（ネイティブシステイン残基での）のための代表的方法は、以下に記載する。
【０６３３】
代表的な部位特異的抗体薬物共役方法を図３３に概説するが、これは、以下：（ａ）誘導体化可能なアミノ酸（例えば、システイン）のサイズ鎖のキャップを除去するステップ、（ｂ）酸化させるステップ、（ｃ）ペイロード（例えば、ツブリシン１５０８などの細胞傷害剤）を共役させるステップ、並びに（ｄ）共役試薬及び非反応ペイロードを除去することにより、ポリッシュするステップを含む。例えば、操作システインとの共役は、１ｍＭチレンジアミン四酢酸を含む１×ＰＢＳ中で抗体を製剤化することにより、達成することができる。抗体当たり４０当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を添加して、３７℃で３時間インキュベートすることにより、軽度の還元を用いて、遊離チオールを生成する。１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む１×ＰＢＳ中での３回の連続的透析を用いて、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を除去する（あるいは、脱塩カラムを用いてもよい）。約２０当量のデヒドロアビエチン酸（ｄｈＡＡ）の添加、続いて室温で約４時間のインキュベーションにより、抗体鎖間ジスルフィド結合を再形成させる。複合体の調製の場合、ジメチルスルホキシドを１０％ｖ／ｖまで抗体に添加し、２Ｔ及び４Ｔ薬物負荷のそれぞれについて、ジメチルスルホキシド中の８又は１２当量のツブリシン１５０８ペイロードを添加した後、室温で約１時間インキュベートする（あるいは、４℃で約１６時間インキュベートする）。ペイロード当たり約４モル当量のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応物をクエンチングした。セラミックヒドロキシアパタイトにより、製造者の推奨事項に従い、共役抗体から遊離ペイロードを除去した。所望であれば、最終生成物をバッファー交換に付してもよい。共役抗体は、非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、純度及び重鎖との共役を確認することができる。
【０６３４】
薬物をネイティブシステイン残基にランダムに共役させた抗体薬物複合体は、抗体の部分的還元、それに続く所望のリンカー−薬物の反応によって調製される。濃度５ｍｇ／ｍＬの抗体は、約３モル当量のＤＴＴ（ｐＨ８．０）の添加、それに続く約３７℃で約２時間のインキュベーションにより部分的に還元する。次に、還元反応物を氷中で冷却させ、例えば、透析濾過により余剰ＤＴＴを除去する。次に、リンカー−薬物をリンカー−薬物／チオール（モル比約１：１０）に添加する。共役反応は、約１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯの存在下で実施する。共役の後、余剰の遊離システイン（リンカー−薬物に対して約２倍モル比）を添加して、非反応リンカー−薬物をクエンチングすることにより、システイン−リンカー−薬物付加物を生成する。反応混合物を精製した（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより）後、ＰＢＳ中へのバッファー交換に付してもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー及び還元逆相クロマトグラフィーなどの標準的方法を用いて、薬物負荷分布を決定する。
５．３．化学略語
Ａｃ          アセチル
ＡＣＮ        アセトニトリル
Ｂｏｃ        二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル
ｔ−Ｂｕ      ｔｅｒｔ−ブチル
Ｂｚｌ        ベンジル（Ｂｚｌ−ＯＭｅは、メトキシベンジルであり、Ｂｚｌ−Ｍｅは、メチルベンゼンである）
Ｃｂｚ又はＺ  ベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ−Ｃｌ及びＺ−Ｂｒは、それぞれ、クロロ−及びブロモベンジルオキシカルボニルである）
ＤＡＳＴ      ジエチルアミノイオウトリフルオリド
ＤＣＭ        ジクロロメタン
ＤＩＡＤ      アゾジカルボン酸ジイソプロピル
ＤＩＣ        Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ      ジエチルイソプロピルアミン
ＤＭＦ        Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＴＴ        ジチオトレイトール
ＥｔＯＡｃ    酢酸エチル
Ｅｔ２Ｏ      ジエチルエーテル
Ｆｍｏｃ      ９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ      １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム  ３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＣｌ        塩酸
ＬＣ−ＭＳ    液体クロマトグラフィー−質量分析
ＭｅＯＨ      メタノール
Ｎａ２ＣＯ３  重炭酸ナトリウム
ＮａＨＣＯ３  炭酸水素ナトリウム
ＰＡＢ        パラ−アミノベンジルオキシカルボニル
ＲＴ          室温
ＴＥＡ        トリエチルアミン
ＴＦＡ        トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ        テトラヒドロフラン
ＴＬＣ        薄層クロマトグラフィー
【０６３５】
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用する全ての参照文献、並びにそこに引用されている文献は、それらがまだ実施されていない範囲まで、あらゆる目的のために、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０６３６】
同等物
上に記載される明細書は、当業者が実施形態を実施するのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって考慮される最善の態様を表現するものである。しかし、上述のものが本文でいかに詳細に呈示されようとも、これらの実施形態は、様々な様式で実施することができ、特許請求の範囲がこれら全ての同等物を包含することは、理解されよう。
【図１】
2017512765.tif 000054
【図２】
2017512765.tif 000055
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017512765.tif 000060
【図８Ａ】
2017512765.tif 000061
【図８Ｂ】
2017512765.tif 000062
【図８Ｃ】
2017512765.tif 000063
【図９Ａ】
2017512765.tif 000064
【図９Ｂ】
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【図１０】
2017512765.tif 000066
【図１１】
2017512765.tif 000067
【図１２】
2017512765.tif 000068
【図１３】
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【図１４】
2017512765.tif 000070
【図１５】
2017512765.tif 000071
【図１６Ａ】
2017512765.tif 000072
【図１６Ｂ】
2017512765.tif 000073
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
2017512765.tif 000079
【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
2017512765.tif 000083
【図２２】
2017512765.tif 000084
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2017512765.tif 000087
【図２６Ａ】
2017512765.tif 000088
【図２６Ｂ】
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【図２７】
2017512765.tif 000090
【図２８Ａ】
2017512765.tif 000091
【図２８Ｂ】
2017512765.tif 000092
【図２９】
2017512765.tif 000093
【図３０Ａ】
2017512765.tif 000094
【図３０Ｂ】
2017512765.tif 000095
【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
2017512765.tif 000097
【図３１Ｃ】
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【図３２】
2017512765.tif 000099
【図３３】
2017512765.tif 000100
【配列表】
2017512765000001.app
【国際調査報告】
2017512765.tif 000101
2017512765.tif 000102
2017512765.tif 000103