(57)【要約】  本発明は、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインを含むワクチンに関する。これらのワクチンは、フィラリア線虫感染症の予防および／または治療に使用され得る。本発明は、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインを含む新規なタンパク質、および医薬組成物にも関する。本発明は、イヌ対象における、さらにはヒト対象におけるフィラリア線虫感染症の予防および／または治療に使用され得る。
2017512066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのワクチンとしての使用のための、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはかかるドメインと少なくとも７０％の同一性を共有するバリアントを含むポリペプチド。
【請求項２】
複数のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項１に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも２つのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項２に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項４】
複数の同じＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項２に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項５】
複数の異なるＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項６】
天然のものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項７】
人工のものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項８】
キメラポリペプチドである、請求項７に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項９】
前記ＳｈＫドメインまたはそのバリアントを隔てる人工スペーサーを含む、請求項７または請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記スペーサーがポリ−Ｌ−リジンを含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
追加のワクチン抗原をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１２】
前記追加のワクチン抗原が、ＳｈＫドメインを含まない抗原由来である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記追加のワクチン抗原が、前記ポリペプチドに組み込まれたＳｈＫドメインと同じフィラリア線虫由来である、請求項１１または請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのワクチンとしての使用のための、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはかかるドメインと少なくとも７０％の同一性を共有するバリアントを含むポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、予防および／または治療しようとする感染症と関連しているフィラリア線虫からのＳｈＫドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項１６】
前記ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドが、Ｌ．シグモドンティスからのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項１７】
フィラリア線虫感染症によって引き起こされるイヌ疾患の予防および／または治療のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項１８】
イヌ心糸状虫症の予防および／または治療のための、請求項１７に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項１９】
前記ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドが、Ｄ．イミティスからのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項１７または請求項１８に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２０】
フィラリア線虫感染症によって引き起こされるヒト疾患の予防および／または治療のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２１】
リンパ管フィラリア症（「象皮症」とも称される）；オンコセルカ症（「河川盲目症」とも称される）；およびロア糸状虫症からなる群から選択される疾患の予防および／または治療のための、請求項２０に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２２】
ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドが、リンパ管フィラリア症の予防および／または治療における使用のためのものであり、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫およびブルギア・チモリからなる群から選択されるフィラリア線虫からのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含む、請求項２１に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２３】
ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドが、リンパ管フィラリア症の予防および／または治療における使用のためのものであり、バンクロフト糸状虫からのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項２２に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２４】
ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドが、オンコセルカ症の予防および／または治療における使用のためのものであり、回旋糸状虫からのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含む、請求項２１に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２５】
ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドが、ロア糸状虫症の予防および／または治療における使用のためのものであり、ロア糸状虫からのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項２４に記載の使用のためのポリペプチドまたは核酸。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２７】
請求項７〜１３または１５〜２５のいずれか１項に記載の人工ポリペプチドをコードする、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
請求項２６または請求項２７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２９】
大腸菌における発現に適合させた、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項１〜１３または１５〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１４〜２７のいずれか１項に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２８または請求項２９に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項３３】
ワクチンとしての使用のために製剤化された、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
注入のために製剤化された、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
フィラリア線虫感染症を予防するかつ／または治療する方法であって、かかる予防および／または治療を必要としている対象に、請求項１〜１３または１５〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドの治療有効量を提供するステップを含む方法。
【請求項３６】
前記対象がイヌであり、前記フィラリア線虫感染症が心糸状虫症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドがＤ．イミティスからのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象がヒトであり、前記フィラリア線虫感染症が、リンパ管フィラリア症、オンコセルカ症、およびロア糸状虫症からなる群から選択される疾患を引き起こす、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患がリンパ管フィラリア症であり、前記ポリペプチドが、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、およびブルギア・チモリからなる群から選択されるフィラリア線虫からのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患がリンパ管フィラリア症であり、前記ポリペプチドが、バンクロフト糸状虫からのＳｈＫドメインを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患がオンコセルカ症であり、前記ポリペプチドが、回旋糸状虫からのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患がロア糸状虫症であり、前記ポリペプチドが、ロア糸状虫からのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドの前記治療有効量が、前記ポリペプチドの投与によって提供される、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドの前記治療有効量が、前記ポリペプチドをコードする核酸の投与によって提供される、請求項３５〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのワクチン、およびかかるワクチンを使用した予防および／または治療の方法に関する。本発明は、フィラリア線虫感染症の予防および／または治療における使用に適した新規なタンパク質にも関する。本発明は、さらに、本発明のタンパク質、またはかかるタンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物に関する。本発明の様々な態様が、イヌ対象における、さらにはヒト対象におけるフィラリア線虫感染症の予防および／または治療に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、ヒトと獣医学的動物対象の両方に頻繁に見られる感染病原体である。フィラリア線虫（糸状虫上科（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する）は、約６３０万の障害調整生命年の世界衛生負荷の原因であり、これは、ヒトに影響する蠕虫に起因し得る病的状態の最も大きい単一成分に相当する。主要なフィラリア性疾患であるリンパ管フィラリア症およびオンコセルカ症のためのワクチンは存在しないが、これは、部分的には、ヒト寄生性種が実験マウスにおいてそれらの生活環を完了することができないために、フィラリアに対する防御免疫に関する研究が制約されてきたからである。しかしながら、過去２０年間にわたり、げっ歯類フィラリアのリトモソイデス・シグモドンティス（Ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓ  ｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）が一般的な実験モデルになった。ＢＡＬＢ／ｃマウスがその発達および生殖に完全に許容的なためである。
【０００３】
リンパ管フィラリア症（ＬＦ）または「象皮症」は、アフリカ、南アジア、太平洋、ラテンアメリカおよびカリブ海にわたって分布し、この被害の９２％を占め、一方、残りは、主にサハラ以南のアフリカにおけるオンコセルカ症または「河川盲目症」によって引き起こされる。主要なヒトフィラリア性病原体は、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）（ＬＦ症例の９０％の原因である）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）およびブルギア・チモリ（Ｂｒｕｇｉａ  ｔｉｍｏｒｉ）（ＬＦの地理的に制限された原因）、および回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）（ヒトオンコセルカ症の唯一の病原体）である。加えて、ロア糸状虫（Ｌｏａ  ｌｏａ）は、西および中央アフリカにおける約１千３百万人に影響を与え、比較的軽度の疾患を通常引き起こすが、感染は、化学療法後の重症および時折致命的な有害事象と関連していた。フィラリア性寄生虫は、主に、慢性的病的状態の引き金となるものであり、これは、ＬＦにおける脚、生殖器および乳房の身体障害的膨張；またはオンコセルカ症における視力障害および重症皮膚炎として顕在化する。さらに、フィラリア性寄生虫は、小動物獣医学における主要な問題でもあり、ＵＳＡだけで約５０万のイヌが潜在的に致命的な心糸状虫症疾患の原因であるディロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）に感染している。
【０００４】
現在、ヒトフィラリア性疾患の制御は、ほとんど完全に３つの駆虫性薬物（イベルメクチン、ジエチルカルバマジンおよびアルベンダゾール）に依存している一方、心糸状虫症の予防も、イベルメクチンまたは他の大環状ラクトンでのイヌおよびネコの予防的治療に頼っている。回旋糸状虫およびＤ．イミティスにおける潜在的なイベルメクチン抵抗性の報告は、フィラリア線虫に対するワクチン開発における研究努力を継続することの重要性を強調した。しかしながら、合理的なワクチン設計は、これらの後生動物寄生虫の固有の複雑さと、吸血性節足動物による第１期幼虫（ミクロフィラリア、Ｍｆ）の取込み、ベクターにおける２回の脱皮、新しい脊椎動物宿主への第３期幼虫（Ｌ３）の伝染、および２回のさらなる脱皮を経て初めてこの寄生虫が、種特異的な腸管外好発部位において雌雄異株成虫として成熟するというその多段階の生活環とによって、数十年間制約されてきた。さらに、フィラリア線虫の多くの種における絶対細菌内部共生体（ウォルバキア）の存在によって、これらの病原体への免疫原性刺激の別のレベルが加わるが、その影響は、依然として十分に明らかになってはいない。マレー糸状虫、Ｄ．イミティスおよびＬ．ロアに関するアノテートされたゲノム配列の公表後、フィラリア線虫のタンパク質レパートリーの我々の理解は、全身抽出物（ＷＢＥ）と排泄分泌産物（ＥＳＰ）の両方のプロテオミクス解析によってかなり広がったが、現在までに段階特異的フィラリア性セクレトームを調べたのは２つの研究（両方ともマレー糸状虫）のみである。ワクチン設計において、ＥＳＰタンパク質の同定および各主要な生活環段階におけるそれらの発現の決定は、動物モデルにおける効力スクリーニングに関する候補の優先順位付けを促進し得る。
【０００５】
その天然宿主（コットンラット、アラゲコトンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））において１９４０年代中に最初に使用された、フィラリア研究に関する最も一般的なげっ歯類モデルの１つは、分類学的にその名称は不正確ではあるがＬ．カリニと以前命名されたリトモソイデス・シグモドンティスである。基礎免疫学的研究とワクチンスクリーニングの両方に関するこのモデルの有用性は、マレー糸状虫および実に全ての他のフィラリア種とは異なり、Ｌ．シグモドンティスが免疫適格性実験マウスにおいてその生活環を完了し得るという発見で根本的に変化した。したがって、過去２０年間にわたって、このモデルに対し、確立されたノックアウト株を含めたマウス免疫学の能力を目一杯利用して、フィラリア性寄生虫が用いる基本的な免疫調節性機構、ワクチン接種の種々のモードへのそれらの感受性、およびつい最近では、炎症誘発性病態および自己免疫疾患を緩和するそれらの能力に関する問題が取り組まれてきた。特に、Ｌ．シグモドンティスモデルは、フィラリア性免疫回避における制御性Ｔ細胞の役割を明らかにする上で中心的な役割を果たし、成虫負荷だけでなく、血流中を循環しているＭｆの密度によって測定される繁殖力に及ぼす様々なワクチン戦略の影響の評価を可能にした。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのワクチンとしての使用のための、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含むポリペプチドを提供する。
【０００７】
第２の態様では、本発明は、フィラリア線虫タンパク質の複数のＳｈＫドメインまたはかかるドメインのバリアントと、ＳｈＫドメインまたはバリアントを隔てる人工スペーサーとを含む人工ポリペプチドを提供する。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０００９】
第４の態様では、本発明は、フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのワクチンとしての使用のためのフィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含むポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
第６の態様では、本発明は、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含むポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
第７の態様では、本発明は、フィラリア線虫感染症を予防するかつ／または治療する方法であって、かかる予防および／または治療を必要としている対象に、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含むポリペプチドの治療有効量を提供するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明のこれらの様々な態様は、フィラリア線虫からのＳｈＫドメインを含有するポリペプチド、またはかかるポリペプチドをコードする核酸が、疾患の発症と関連しているフィラリア線虫に関する防御免疫を与えることができるという本発明者らの知見から生じる。
【００１４】
以下で考察されるように、本発明の様々な態様は、ヒト対象における、またはイヌなどの獣医学的対象におけるフィラリア線虫感染症の予防および／または治療における有用性を有する。
【００１５】
［本発明の詳細な記述］
＜定義＞
曖昧さの回避のために、ここで、本発明の記述において使用されるいくつかの用語に関し、定義を提供する。
【００１６】
「フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメイン」
フィラリア線虫（糸状虫上科に属するもの）は、最も一般的にはヒトと、それほどではないにせよ、他の動物宿主における疾患の原因となるものである。多くの情報がフィラリア線虫のプロテオームに関して入手可能である。
【００１７】
イソギンチャク類スティコダクチラ・ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）によって産生されるスティコダクチラ毒素とのそれらの類似性によりそのように称されるＳｈＫドメインは、特徴的なスペーシングを有する６つのシステイン残基を含有する。アミノ酸配列に存在するＳｈＫドメインは、バイオインフォマティクス手法を使用して容易に同定される。例えば、それらは、識別子「ＰＦ０１５４９」によってＰｆａｍデータベースにおいて、および識別子「ＩＰＲ００３５８２」によってＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースにおいて定義される。
【００１８】
本発明者らは、全般にわたって配列の観点でかなり著しく変動するフィラリア線虫種からのタンパク質が、著しくより高いレベルのＳｈＫドメインの類似性を共有することを見出した。これは、第１のフィラリア線虫病原体由来のＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）を含むポリペプチドを、第２の、異なる、フィラリア線虫病原体への感染によって引き起こされる疾患の予防および／または治療において使用する可能性を切り開く。
【００１９】
フィラリア線虫タンパク質におけるＳｈＫドメインは、本明細書の配列情報および比較の節に説明されている。ここで、種々の線虫のＳｈＫドメイン内の配列同一性の増加した程度が見られ得るように（タンパク質全体によって共有される配列同一性と比較して）、ＳｈＫドメイン内の６つのシステインの特徴的な配置が見られ得る。
【００２０】
明細書で他で考察されるように、Ｌ．シグモドンティスＳｈＫドメインタンパク質ｎＬｓ＿０４０５９は、そのＳｈＫドメインが本発明の様々な態様において用いられ得るフィラリア線虫タンパク質の例となる。このタンパク質からのＳｈＫドメインまたはこのタンパク質のオルソログ、またはそのバリアントは、本発明の様々な態様において用いられ得る。
【００２１】
適したＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含むｎＬｓ＿０４０５９オルソログが図１２に示されている。これらは、Ｌ．シグモドンティス（例えば、アイソフォームｎＬＳ．２．１．２．ｔ０４０５９（遺伝子ＩＤ  ｎＬｓ．２．１．２．ｇ０４０５９種リトモソイデス・シグモドンティス（ＰＲＪＥＢ３０７５）位置ｎＬｓ．２．１．ｓｃａｆ００２４４：１２２１８−１６２２８）、マレー糸状虫（例えば、アイソフォームＢｍ８１５７ｂ（遺伝子ＩＤ  ＷＢＧｅｎｅ００２２８４１８、種マレー糸状虫（ＰＲＪＮＡ１０７２９）、位置Ｂｍａｌ＿ｖ３＿ｓｃａｆｆｏｌｄ１１０：１１２１５６−１１６３０４）、Ｂｍ８１５７ｄ（遺伝子ＩＤ  ＷＢＧｅｎｅ００２２８４１８種マレー糸状虫（ＰＲＪＮＡ１０７２９）位置Ｂｍａｌ＿ｖ３＿ｓｃａｆｆｏｌｄ１１０：１１２１５６−１１６３０４）、Ｂｍ８１５７ｃ（遺伝子ＩＤ  ＷＢＧｅｎｅ００２２８４１８、種マレー糸状虫（ＰＲＪＮＡ１０７２９）位置Ｂｍａｌ＿ｖ３＿ｓｃａｆｆｏｌｄ１１０：１１２１５６−１１６３０４）およびＢｍ１２８９６ａ）、Ａ．ヴィテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）（例えば、アイソフォームｎＡＶ．１．０．１．ｔ０９７４２、（遺伝子ＩＤ  ｎＡｖ．１．０．１．ｇ０９７４２、種アカンソケイロネマ・ヴィテアエ（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ  ｖｉｔｅａｅ）（ＰＲＪＥＢ４３０６）位置ｎＡｖ．１．０．ｓｃａｆ００１３５：５８５６５−６２７９０）、Ｄ．イミティス（例えば、アイソフォームｎＤｉ．２．２．２．ｔ０３４０２（遺伝子ＩＤ  ｎＤｉ．２．２．２．ｇ０３４０２種ディロフィラリア・イミティス（ＰＲＪＥＢ１７９７）位置ｎＤｉ．２．２．ｓｃａｆ０００５１：１４２０７１−１４５５８８）、およびｎＤｉ．２．２．２．ｔ０４３１４（遺伝子ＩＤ  ｎＤｉ．２．２．２．ｇ０４３１４、種ディロフィラリア・イミティス（ＰＲＪＥＢ１７９７）位置ｎＤｉ．２．２．ｓｃａｆ０００８３：４８２５１−５２８０６）、Ｌ．ロア（例えば、アイソフォームＥＪＤ７４９３０．１（遺伝子ＩＤ  ＬＯＡＧ＿１７８２５、種ロア糸状虫（ＰＲＪＮＡ６００５１）位置ＪＨ７１２１９９：２２６７３−２３３３４）、およびＥＪＤ７４９３１．１（遺伝子ＩＤ  ＬＯＡＧ＿１７８２６、種ロア糸状虫（ＰＲＪＮＡ６００５１）位置ＪＨ７１２１９９：２４３１３−２６５６９）、Ｏ．オチェンギ（Ｏ．  ｏｃｈｅｎｇｉ）（例えば、アイソフォームｎＯｏ．２．０．１．ｔ１２２２０（遺伝子ＩＤ  ｎＯｏ．２．０．１．ｇ１２２２０種オンコセルカ・オチェンギ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｏｃｈｅｎｇｉ）（ＰＲＪＥＢ１８０９）位置ｎＯｏ．２．０．Ｓｃａｆ０９９９３：２４４−１６６８）、ｎＯｏ．２．０．１．ｔ０６１７２（遺伝子ＩＤ  ｎＯｏ．２．０．１．ｇ０６１７２、種オンコセルカ・オチェンギ（ＰＲＪＥＢ１８０９）位置ｎＯｏ．２．０．Ｓｃａｆ０１８４４：１０８３０−１１９３９）、およびｎＯｏ．２．０．１．ｔ０６３４３（遺伝子ＩＤ  ｎＯｏ．２．０．１．ｇ０６３４３、種オンコセルカ・オチェンギ（ＰＲＪＥＢ１８０９）位置ｎＯｏ．２．０．Ｓｃａｆ０１９４３：３１７７−７０６９）、回旋糸状虫（例えば、アイソフォームＯＶＯＣ  ００００２３２７０１．���、およびＯＶＯＣ  ０００１０２３０１．１）およびバンクロフト糸状虫（例えば、アイソフォームＷＵＢＧ  １７８３４Ｔ０、およびＷＵＢＧ０５１５２Ｔ０）などのフィラリア線虫由来のタンパク質を含む。
【００２２】
先行する段落において同定された全ての遺伝子ＩＤ配列は、ＷｏｒｍＢａｓｅ  ＰａｒａＳｉｔｅデータベースバージョン１（２０１４年９月）からである。
【００２３】
簡潔さのために、本明細書は、「フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメイン」および「Ｓｈｋドメイン」という用語を、互換的に使用する。
【００２４】
「ドメインの『バリアント』」
本開示の目的のために、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインのバリアントは、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインとの少なくとも７０％の同一性を共有する配列を包含すると考えられるべきである。任意選択的に、バリアントは、ＳｈＫタンパク質との少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性を共有し得る。適した実施形態では、バリアントは、フィラリア線虫タンパク質のＳｈｋドメインとの少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を共有し得る。
【００２５】
Ｌ．シグモドンティスＳｈＫドメインタンパク質ｎＬｓ＿０４０５９（配列番号：１）とフィラリア性病原体におけるそのオルソログ間の同一性の全体のレベルは、３１％（バンクロフト糸状虫における）から５１％（回旋糸状虫における）にわたることを念頭に置くべきである。しかしながら、種間の個々のＳｈＫドメイン間の同一性のレベルは、常に７０％、好ましくは８５％を超える。
【００２６】
有用なワクチンとして機能するために、本発明のポリペプチドは、防御免疫応答を誘発する能力を示すべきであることが理解されよう。適切には、バリアントは、それが由来するＳｈＫドメインの免疫原性能力の少なくとも７０％を保持し得る。実際に、バリアントは、それが由来するＳｈＫドメインの免疫原性能力の少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらに少なくとも９５％を保持し得る。適切には、バリアントは、それが由来するＳｈＫドメインよりも大きい免疫原性能力を有し得る。
【００２７】
「予防および／または治療」
本発明の医学的使用、治療の方法、および医薬組成物は、対象におけるフィラリア線虫感染症の確立を予防する防御免疫を確立するために使用され得る。この用語が本開示において使用されるように、この予防的使用は、フィラリア線虫感染症の「予防」を典型的に示す。
【００２８】
本発明のこれらの様々な態様の利点は、フィラリア線虫寄生虫への感染を以前経験した対象にも適用可能である。本開示の目的のために、既存の感染症と関連している疾患が軽減される本発明のかかる適用は、フィラリア線虫感染症の「治療」を表すと考えられ得る。
【００２９】
フィラリア線虫感染症の予防および／または治療は、フィラリア線虫感染症と関連している疾患の対応する予防および／または治療をもたらす。
【００３０】
「本発明のポリペプチド」
本開示の文脈では、「本発明のポリペプチド」への言及は、本発明の第２の態様の人工ポリペプチドだけでなく、本発明の第１の態様によって定義される医学的使用のためのポリペプチド（フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのワクチンとしての）も包含すると解釈されるべきである。
【００３１】
以下でさらに考察されるように、本発明の第１の態様の医学的使用は、天然にあるポリペプチドを用い得る、または本発明の第２の態様のものなどの人工ポリペプチドを利用し得る。
【００３２】
簡潔さのために、本発明の以下の実施形態の大部分は、本発明の第１の態様の医学的使用のためのポリペプチドであろうと、または本発明の第２の態様の人工ポリペプチドであろうと、本発明のポリペプチドの文脈で主に考察される。しかしながら、本発明のポリペプチドに関してここで述べられる考察は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、核酸（考慮すべきことがかかる核酸配列によってコードされるポリペプチドに適用可能であり得る）、医薬組成物、および治療の方法などの本発明の他の態様にも適用可能であることが理解されるべきである。
【００３３】
上で参照されたように、本発明のポリペプチドまたは核酸は、ワクチンとしての使用に適しており、ここで、ワクチンは、フィラリア線虫感染症の予防および／または治療のためのものである。
【００３４】
適した実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｌ．シグモドンティスからのＳｈＫドメインを含み得る。ここで述べられた結果が例示するように、本発明者らは、Ｌ．シグモドンティスからのＳｈＫドメインを含むポリペプチド（および特にかかるポリペプチドをコードする核酸）が、驚くべきことに、Ｌ．シグモドンティス以外のフィラリア線虫による感染症に関して防御免疫を与えるワクチンとして働くことができると確信している。
【００３５】
上記のものを損なうことなく、適した実施形態では、本発明によるポリペプチドは、予防および／または治療しようとするフィラリア線虫感染症からのＳｈＫドメイン（またはかかるＳｈＫドメインのバリアント）を含む。
【００３６】
適切には、本発明のポリペプチドは、イヌ心糸状虫症の予防および／または治療における使用のためのものとすることができる。かかる実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ．イミティスからのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含み得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、ヒト対象における疾患の予防および／または治療における使用のためのものとすることができ、ここで、疾患は、リンパ管フィラリア症（「象皮症」とも称される）、オンコセルカ症（「河川盲目症」とも称される）、およびロア糸状虫症からなる群から選択される。
【００３８】
適切には、リンパ管フィラリア症の予防および／または治療における使用のための本発明のポリペプチドは、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫およびブルギア・チモリからなる群から選択されるフィラリア線虫からのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含む。これら３つのフィラリア線虫のうち、バンクロフト糸状虫は、リンパ管フィラリア症症例の約９０％の原因であり、したがって、バンクロフト糸状虫からのＳｈＫドメインを含むポリペプチドは、リンパ管フィラリア症の予防および／または治療における使用に好ましい可能性がある。
【００３９】
本発明のポリペプチドがオンコセルカ症の予防および／または治療における使用のためのものである実施形態では、それは、回旋糸状虫からのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含み得る。
【００４０】
ロア糸状虫症の予防および／または治療における使用のための適したポリペプチドは、ロア糸状虫からのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含み得る。
【００４１】
適した実施形態では、本発明のポリペプチドは、複数のＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含む。したがって、非限定的な例として、本発明のポリペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含み得る。適した実施形態では、本発明のポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含み得る。
【００４２】
本発明によるポリペプチドが複数のＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）を含む場合では、それは、複数の同じＳｈＫドメイン（または同じＳｈＫドメインのバリアント）を含み得る。同じＳｈＫドメインのバリアントを利用する実施形態では、これらのバリアントは、同じバリアントであってもよいし、複数の異なるバリアントを含んでもよい。
【００４３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、複数のＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）を含み、それは、複数の異なるＳｈＫドメイン（またはこれらの異なるドメインのバリアント）を含み得る。適切には、複数のＳｈＫドメインの各１つは、異なっていてもよいし、あるいは、ポリペプチドは、複数の異なるドメイン間に単一ＳｈＫドメインの２つ以上のコピーを含み得る。
【００４４】
単に例として、Ｄ．イミティスの場合、天然にあるＳｈＫドメインタンパク質は、６つのＳｈＫドメインを含有し、そのそれぞれがそれ独自の特徴的な配列を有する。本発明のポリペプチドは、これらの６つのＳｈＫドメインのそれぞれを含み得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、天然タンパク質に見出される配列の第６番目などの同じＳｈＫ配列の６つのコピーで構成された６つのＳｈＫドメインを含み得る。
【００４５】
Ｄ．イミティスの天然ＳｈＫドメインタンパク質に見出される第６番のＳｈＫ配列は、本発明のポリペプチドに含まれるべき（直接的に、またはバリアント形で）好ましいＳｈＫドメインを表し得る。したがって、適した実施形態では、本発明のポリペプチドは、第６番のＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）に加えて、天然タンパク質のＳｈＫドメイン１から５から選択される１つまたは複数のＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）を含み得る。
【００４６】
本発明のポリペプチドがＤ．イミティス由来の単一ＳｈＫドメインのみを含む場合では、この単一ＳｈＫドメインは、Ｄ．イミティスのＳｈＫドメインタンパク質からの第６番のＳｈＫドメイン（またはこのドメインに基づくバリアント）とすることができる。
【００４７】
先行する段落において述べられた考慮すべきことは、Ｄ．イミティスに見出されるＳｈＫドメインのバリアントを含む本発明のポリペプチドにも適用されることが理解されよう。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、分枝タンパク質とすることができる。適した実施形態では、タンパク質の各枝は、抗原性配列を保有し得る。これらの抗原性配列のいくつか、潜在的に全ては、ＳｈＫドメインまたはそれらのバリアントを含み得る。
【００４９】
適した実施形態では、本発明のポリペプチドは、追加の抗原が提供される対象に防御免疫を与えることができる追加の抗原をさらに含み得る。適切には、かかるポリペプチドは、ＳｈＫドメインを含まない追加の抗原を含み得る。
【００５０】
適した実施形態では、かかるポリペプチドに組み込まれた追加の抗原は、さらなる線虫抗原とすることができる。適切には、防御免疫を与える能力がある追加の抗原は、ポリペプチドに組み込まれたＳｈＫドメインと同じフィラリア線虫由来である。
【００５１】
上で参照された実施形態の一部は、ＳｈＫドメインを含む天然にあるポリペプチドによって提供され得る。適した実施形態では、本発明の様々な態様または実施形態に従って用いられるポリペプチドは、天然にあるポリペプチドとすることができる。
【００５２】
上で参照された実施形態のいくつかは、ＳｈＫドメインを含む人工ポリペプチドによってのみ提供され得る。上記のように、本発明の第２の態様は、フィラリア線虫タンパク質の複数のＳｈＫドメイン、またはそのバリアント、およびＳｈＫドメインまたはバリアントを隔てる人工スペーサーを含む人工ポリペプチドを提供する。
【００５３】
適した人工スペーサーは、ＳｈＫドメインを免疫系の細胞に曝露するのに役立ち、それによって、防御免疫の発達を可能にする。スペーサー自体は、防御免疫の発達に寄与する必要はなく、それ自体は、免疫学的に不活性とすることができる。
【００５４】
人工スペーサーは、人工タンパク質内で、ＳｈＫドメイン、またはバリアントを隔てるのに役立つ、天然タンパク質におけるＳｈＫドメイン間に見出される天然にある配列以外の任意のスペーサーとすることができる。適した実施形態では、本発明の人工ポリペプチドにおける使用に適した人工スペーサーは、ＳｈＫドメインまたはバリアントを隔てるアミノ酸残基配列を含み得る。適した実施形態では、スペーサーは、ポリ−Ｌ−リジンを含み得る。
【００５５】
本発明の人工ポリペプチドは、人工ポリペプチドに組み込まれたＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）の数によって必要とされる複数の人工スペーサーを含み得る。
【００５６】
適した実施形態では、本発明の様々な態様または実施形態に従って用いられるポリペプチドは、本発明の第２の態様の人工ポリペプチドなどの人工ポリペプチドとすることができる。
【００５７】
適切には、本発明の人工ポリペプチドは、キメラポリペプチドとすることができる。本発明の人工ポリペプチドは、ＳｈＫドメイン、またはそのバリアント、およびＳｈＫドメインが由来するポリペプチドには見出されない追加の抗原を含み得る。単に例として、本発明の人工タンパク質は、ＳｈＫドメイン（またはそのバリアント）およびＳｈＫドメインが由来する線虫からの追加の抗原、またはＳｈＫが由来するもの以外の線虫からの追加の抗原、または線虫以外の供給源由来である追加の抗原を含み得る。ＳｈＫドメインまたはそのバリアント、およびＳｈＫドメインが由来したフィラリア線虫以外の供給源からの追加の抗原を含む本発明のキメラポリペプチドは、２つ以上の病原体に対する防御免疫を誘発することができる。
【００５８】
本発明の人工ポリペプチドは、複数の同じＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含み得る。あるいは、本発明の人工ポリペプチドは、複数の異なるＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含み得る。
【００５９】
適した実施形態では、本発明の人工ポリペプチドは、追加のワクチン抗原をさらに含む。適切には、追加のワクチン抗原は、ＳｈＫドメインを含まない抗原に由来し得る。
【００６０】
本発明の人工ポリペプチドは、ポリペプチドに組み込まれたＳｈＫドメインと同じフィラリア線虫に由来する追加のワクチン抗原を含み得る。
【００６１】
本発明の人工ポリペプチドに組み込まれ得る、適した追加のワクチン抗原の例には、システインプロテイナーゼ阻害剤（ＣＰＩ）および／または大量幼虫転写物（ＡＬＴ）が含まれる。本明細書で他で考察されたように、これらのタンパク質は、メスのフィラリア線虫によって分泌される分泌免疫調節物質であり、ワクチン接種によってこれらの免疫調節物質を標的とすると、ミクロフィラリア血症が大きく低減される。したがって、本発明の人工ポリペプチドにこれらの追加のワクチン抗原を導入すると、本発明のポリペプチドによって提供される驚くべき利益を上回る治療的利点を与えることが予想される。本発明のＳｈＫドメイン含有ポリペプチドと組み合わせたＣＰＩおよび／またはＡＬＴを含むワクチンを用いた、回旋糸状虫感染宿主に対する治療的ワクチン接種は、成虫負荷が依然として影響を受けない場合でさえ、ミクロフィラリア産生のさらなる抑制をもたらし、疾患の進行を予防し、病的状態を減少させ、伝染を遮断し得る。
【００６２】
さらに、適した実施形態では、ワクチンとしてフィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインまたはそのバリアントを含むポリペプチドを利用する本発明のポリペプチド、医学的使用、または治療の方法は、ＣＰＩおよび／またはＡＬＴを含むワクチンと共に使用され得ることが理解されよう。適切には、本発明のポリペプチドは、ＣＰＩおよび／またはＡＬＴと同じワクチンで提供され得る。あるいは、本発明のポリペプチドならびにＣＰＩおよび／またはＡＬＴは、別々のワクチンで提供され得る。
【００６３】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、本発明の第２の態様による人工ポリペプチドをコードし得る。
【００６４】
本発明は、本発明の核酸を含むベクターも提供し、かかるベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌における発現に適合され得る。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の核酸を含み得る。核酸は、ベクターの形で提供され得る。
【００６６】
本発明の適した医薬組成物は、ワクチンとしての使用のために製剤化され得、注入を含む（がこれに限定されない）投与の任意の適切な経路に関して製剤化され得る。
【００６７】
とは言うものの、投与の適した経路は、経口（例えば、経口摂取による）；頬側；舌下；経皮（例えば、パッチ、ギプスなどによるものを含めた）；経粘膜（例えば、パッチ、ギプスなどによるものを含めた）；鼻腔内（例えば、点鼻薬による）；眼性（例えば、点眼薬による）；肺（例えば、口または鼻を通した、例えば、エアロゾル経由で使用する、例えば、吸入またはガス注入療法による）；直腸（例えば、坐薬または浣腸による）；腟（例えば、ペッサリーによる）；例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、関節内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節腔内、くも膜下、および胸骨内を含めた注入による非経口；例えば、皮下または筋肉内デポまたはリザーバ移植片によるものを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明による医薬組成物は、本発明のポリペプチドまたは核酸がミョウバンアジュバントで、またはウイルス様粒子で送達されるように製剤化され得る。
【００６９】
上で参照されたように、本発明の第７の態様は、フィラリア線虫感染症を予防するかつ／または治療する方法であって、かかる予防および／または治療を必要としている対象に、フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含むポリペプチドの治療有効量を提供するステップを含む方法を提供する。簡潔には、かかる方法は、本開示において、「治療の方法」と称され得るが、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、かかる治療の方法は、フィラリア線虫感染症を予防するための予防的使用も包含すると考えられるべきである。
【００７０】
ここで記載された本発明の様々なポリペプチドは、かかる治療の方法において使用されるのに適したポリペプチドを表し、かかるポリペプチドの性質に関連して述べられた様々な考慮すべきことは、かかる治療の方法における使用のためのポリペプチドにも適用可能であることが理解されよう。
【００７１】
本発明の治療の方法は、獣医学的対象にも適用可能である。本発明の方法の適した実施形態では、対象はイヌであり、予防および／または治療しようとするフィラリア線虫感染症は、心糸状虫症である。心糸状虫症を予防するかつ／または治療することが望まれる方法では、本方法において提供されるポリペプチドは、Ｄ．イミティスからのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを適切に含む。
【００７２】
本発明の治療の方法は、ヒト対象にも適用可能である。適切には、対象がヒトである場合、予防および／または治療しようとするフィラリア線虫感染症は、リンパ管フィラリア症、オンコセルカ症、およびロア糸状虫症からなる群から選択される疾患を引き起こすものである。
【００７３】
予防および／または治療しようとする疾患がリンパ管フィラリア症である本発明の実施形態では、ポリペプチドは、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫およびブルギア・チモリからのＳｈＫドメインまたはそのバリアントを適切に含む。
【００７４】
バンクロフト糸状虫は、リンパ管フィラリア症症例の約９０％の原因であり、したがって、リンパ管フィラリア症の予防および／または治療に関する方法は、バンクロフト糸状虫からのＳｈＫドメインを含むポリペプチドを利用することが好ましい可能性がある。
【００７５】
適切には、オンコセルカ症を予防するかつ／または治療することが望まれる本発明の方法は、回旋糸状虫からのＳｈＫドメイン、またはそのバリアントを含むポリペプチドを利用し得る。
【００７６】
ロア糸状虫症を予防するかつ／または治療することが望まれる本発明の方法は、ロア糸状虫からのＳｈＫドメインまたはかかるドメインのバリアントを含むポリペプチドを利用し得る。
【００７７】
当業者は、本発明による治療の方法の適した実施形態では、ポリペプチドの治療有効量が、ポリペプチドの投与によって提供されることを理解するはずである。治療有効量は、必要に応じて、単回または複数回の頻度の投与を通して提供され得る。適切には、本発明のかかる実施形態は、必要な量のポリペプチドの提供に関して本発明の医薬組成物を利用し得る。
【００７８】
本発明は、ポリペプチドの治療有効量が、ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、例えば、適したベクターにおける核酸の提供によって提供される治療の方法も包含する。かかる実施形態では、レシピエント対象の細胞による核酸の発現は、治療有効量のタンパク質の産生につながり、したがって、防御免疫の発達につながる。治療の方法のこれらの実施形態は、核酸を含む医薬組成物を利用し得、これも本発明の態様である。
【００７９】
本発明のポリペプチド、バリアント、または核酸の治療有効量の決定において考慮し得る因子は、問題の薬剤の性質（すなわち問題の薬剤がポリペプチドであるのか、そのバリアントであるのか、または核酸であるかどうか）；問題の薬剤の活性；予防および／または治療しようとする感染の重症度；予防および／または治療を必要とする対象の大きさ；および薬剤が投与される経路を含み得る。
【００８０】
単に例として、ＳｈＫドメイン、またはそのバリアント、またはかかるポリペプチドもしくはバリアントをコードする核酸を含むポリペプチドの治療有効量は、１．５ｇ〜１μｇとすることができる。適した治療有効量は、５００ｍｇ〜１００ｍｇなどの１５００ｍｇ〜１ｍｇ；例えば、１０００ｍｇ〜５０ｍｇとすることができる。あるいは、適した治療有効量は、２５ｍｇ〜１０ｍｇなどの１００ｍｇ〜１ｍｇ；例えば、５０ｍｇ〜５ｍｇとすることができる。さらなる適した実施形態では、適した治療有効量は、２５０μｇ〜１０μｇなどの５００μｇ〜１μｇ；例えば、４００μｇ〜５μｇとすることができる。単に例として、適した治療有効量は、１５０μｇ〜２０μｇなどの２００μｇ〜１５μｇ、１００μｇ〜２５μｇ、または５０μｇ〜３０μｇとすることができる。適切には、治療有効量は、約４０μｇとすることができる。
【００８１】
フィラリア線虫感染症を予防するかつ／または治療する治療の過程内で、ＳｈＫドメイン、またはそのバリアント、またはかかるポリペプチドもしくはバリアントをコードする核酸を含むポリペプチドは、１回または複数回の投与で提供され得る。投与の頻度は、２４時間毎に１回、週１回、月１回、またはさもなければ必要に応じて、提供され得る。
【００８２】
ここで、本発明は、以下の実験結果および図を参照してさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１ａ】以下の研究１におけるワクチン接種と非ワクチン接種マウス間の寄生虫負荷の差を示す図である。
【図１ｂ】Ｌ．シグモドンティスの生活段階間のＥＳＰタンパク質の分布を示す図である。調べられた生活段階のそれぞれにおいて共有されており、かつ、段階特異的なＥＳＰタンパク質のベン図である。
【図２】Ｌ．シグモドンティスの完全な理論的プロテオームに対するＥＳＰタンパク質のＰｆａｍ濃縮分析を示す図である。濃縮倍が各生活環段階に関して示され、ＤＵＦ２９０は、トランスサイレチン様タンパク質ファミリーを表す。
【図３】対応する体細胞抽出物と比較した、Ｌ．シグモドンティスＥＳＰタンパク質の相対的存在量を示す図である。ＥＳＰタンパク質（２つ以上の生物学的反復試料に存在する、ｐ＜０．０５および＜１％ＦＤＲで検出される２つ以上のペプチド）をイオン強度（ｉＢＡＱ）によって定量化し、インタクトな線虫の体細胞抽出物（ｘ軸）に存在する同じタンパク質のｉＢＡＱ存在量と比較した。個々の存在量値をその個々の試料（生活段階）の合計された全存在量で割ることによって標準化した。標準化された存在量比をタンパク質の濃縮を評価するためのガイドとして使用した（ＥＳＰ／ＷＢＥ）。データは、各生活段階データセット内で標準化されているので、生活段階間で直接的にタンパク質存在量を比較することは妥当でないことに注意されたい。
【図４】Ｌ．シグモドンティスの成虫期におけるＥＳＰタンパク質存在量（ｉＢＡＱ）の比較である。各ＥＳ調製物（Ａ、ＡＭ；Ｂ、ＧＡＦ；Ｃ、ＰＡＦ）における上位３５の最も大量のタンパク質を標準化されたｉＢＡＱ存在量によってランク付けし（灰色の棒）、ＷＢＥにおける対応する存在量を積み重ねられた形式での比較（黒い棒）に関して表示する。個々のタンパク質存在量値を試料毎の合計された全存在量によって標準化した。アスタリスクは、予測されたシグナルペプチドを有するタンパク質を示し、非古典的経路を通した予測された分泌がプラス記号によって示される。
【図５】Ｌ．シグモドンティスの幼虫期におけるＥＳＰタンパク質存在量（ｉＢＡＱ）の比較である。各ＥＳＰ調製物（Ａ、ｖＬ３；Ｂ、ｉＭｆ）におけるタンパク質を標準化されたｉＢＡＱ存在量によってランク付けし（灰色の棒）、ＷＢＥにおける対応する存在量を積み重ねられた形式での比較（黒い棒）に関して表示する。個々のタンパク質存在量値を試料毎の合計された全存在量によって標準化した。アスタリスクは、予測されたシグナルペプチドを有するタンパク質を示し、非古典的経路を通した予測された分泌がプラス記号によって示される。
【図６】Ｌ．シグモドンティスのタンパク質ｎＬｓ＿０４０５９からのＳｈＫドメインおよび他のフィラリア種におけるそのオルソログは、明らかに異なる配列サインを有する。Ｌ．シグモドンティス、マレー糸状虫、Ｌ．ロア、バンクロフト糸状虫、Ｏ．オチェンギ、Ｄ．イミティス、アカンソケイロネマ・ヴィテアエおよびブタ回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の完全な理論的プロテオームにおいて同定された全ＳｈＫドメインを抽出し、アラインメントし、配列ロゴは、（全ＳｈＫ）全５３１ドメイン、（０４０５９）ｎＬｓ＿０４０５９およびそのオルソログからの全ドメイン、（１〜６）ｎＬｓ＿０４０５９およびそのオルソログからのアラインメントされたオルソロガスドメイン１から６に由来した。ｎＬｓ＿０４０５９オルソログは、ブタ回虫に見出されなかった。ｎＬｓ＿０４０５９ドメインは、比較的短いので、ｎＬｓ＿０４０５９由来ドメインに関する配列ロゴにおけるギャップがある。全てのパネルにおけるナンバリングは、完全なＳｈＫアラインメントに基づく。
【図７】マレー糸状虫成虫の公開された研究において検出された成虫ＥＳタンパク質の数およびＬ．シグモドンティス成虫セクレトームに存在するオルソログとの比較である。研究特異的および共有されたタンパク質は、両方の成虫性別からの組み合わせられたデータを表す。タンパク質同定は、各個々の研究によって引用されたものであり、統計的カットオフは、統一されていないことに注意されたい。Ｌ．シグモドンティスタンパク質のマレー糸状虫オルソログをそれぞれの理論的プロテオーム（ビットスコア＞５０）の相互ＢＬＡＳＴによって同定した。３つの以前公開された研究（マレー糸状虫）および現在の研究（Ｌ．シグモドンティス）にわたる成虫線虫ＥＳＰにおけるオルソログの分布を（Ａ）に表示し、種特異的（非オルソロガス）タンパク質の分布を（Ｂ）に要約する。
【図８】リトモソイデス・シグモドンティスの排泄分泌調製物および全身抽出物に関するタンパク質プロファイルのヒートマップである。この図に示された樹状図を対での距離に基づく階層的クラスタリングによって作成した。ＥＳＰ、排泄分泌産物；ＷＢＥ、全身抽出物；ＧＡＦ、産卵期の成虫メス；ＰＡＦ、産卵期前の成虫メス；ＡＭ、成虫オス；ｉＭＦ、未熟ミクロフィラリア；ｖＬ３、ベクター由来第３期幼虫。
【図９】リトモソイデス・シグモドンティスからのタンパク質ｎＬｓ＿０４０５９のドメイン組織化を示す図である。シグナルペプチド（イタリック体で表示された）、それぞれ６つのシステイン残基（強調された）を含有する６つのＳｈＫ毒素様ドメイン（開いた四角形）、および予測されたプロペプチド切断部位（下線付き）を強調するアミノ酸配列の線形表現。Ｃ末端でのドメイン６は、２つのリジルチロシン二分子（太字）を含有する点で特異である。
【図１０】Ｌ．シグモドンティスのタンパク質ｎＬｓ＿０３５７７および他のフィラリア線虫におけるそのオルソログにおけるアミノ酸配列アラインメントである。ｎＬｓ＿０３５７７の相同体を配列決定された線虫ゲノムからのタンパク質データベースのＢＬＡＳＴｐ探索および唇乳頭糸状虫（Ｓｅｔａｒｉａ  ｌａｂｉａｔｏｐａｐｉｌｌｏｓａ）（Ｇ．Ｋｏｕｔｓｏｖｏｕｌｏｓ、Ｂ．Ｍａｋｅｐｅａｃｅ、Ｍ．Ｂｌａｘｔｅｒ；未公開）に関するトランスクリプトーム組立によって同定した。相同体は、フィラリア線虫以外に見出されなかった。タンパク質配列をＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａでアラインメントし、同一性を色のスケール（緑、高；黄、中；赤、低）によって示す。
【図１１】Ｌ．シグモドンティスのタンパク質ｎＬｓ＿０３５７７および他のフィラリア線虫におけるそのオルソログの有根系統樹である。ｎＬｓ＿０３５７７の相同体を配列決定された線虫ゲノムからのタンパク質データベースのＢＬＡＳＴＰ探索および唇乳頭糸状虫（Ｇ．Ｋｏｕｔｓｏｖｏｕｌｏｓ、Ｂ．Ｍａｋｅｐｅａｃｅ、Ｍ．Ｂｌａｘｔｅｒ；未公開）に関するトランスクリプトーム組立によって同定した。相同体は、フィラリア線虫以外に見出されなかった。タンパク質配列をＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａでアラインメントし、このアラインメントを、ＭｒＢａｙｅｓバージョン３．２を使用した系統発生解析に供した。２百万ジェネレーション解析の最終百万ジェネレーションからの全ての第１００ジェネレーションを組み合わせて、示されたコンセンサスを引き出した。事後確率を枝着色（赤：ｐｐ＝１）によって示す。樹は、公認の分類法および核小サブユニットリボソームＲＮＡ系統学に従ってＳ．ラビアトパピロッサ（Ｓ．ｌａｂｉａｔｏｐａｐｉｌｌｏｓａ）を根とする。
【図１２】フィラリア線虫における予測されたタンパク質間のＳｈＫドメインの有根系統樹である。ｎＬｓ＿０４０５９オルソログからの６つのＳｈＫドメインに関する有根部分木を示す。ノードサポートを枝上の色（赤：事後確率＝１）によって示す。マレー糸状虫では、ドメイン１を２つの明らかに異なるアイソフォームクラスターによって表し、そのうちの１つ（Ｂｍ１）は、この種およびバンクロフト糸状虫にのみ見出される。
【図１３】フィラリア線虫およびブタ回虫における予測されたタンパク質間のＳｈＫドメインの無根系統樹である。
【図１４】成虫リトモソイデス・シグモドンティスの標識および非標識標本におけるビオチンの分布である。固定された虫切片をストレプトアビジン−ＦＩＴＣでインキュベートした。Ａ、ビオチン標識研究。Ｂ、非標識対照標本。スケールバーは、２０μｍを表す。
【実施例】
【００８４】
［実験結果］
［研究１］
フィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメインを含むポリペプチドがワクチンとしてフィラリア線虫感染症に関する防御免疫を与える能力、およびかかるポリペプチドをコードする核酸がワクチンとして役立つ適合性を以下の研究によって実証した。例示的ワクチンとして使用されるＬ．シグモドンティスＳｈＫドメイン含有タンパク質を本研究の目的のためにＬｓＳｈＫと命名した。
【００８５】
免疫化および感染を、実験群あたり５匹の動物を用い、６〜７週齢で開始して、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて行った。マウスを個々に換気されたケージにおいて収容し、３０または４０のＬ．シグモドンティス感染幼虫（ｉＬ３）を皮下に感染させた。未処置の、非感染動物を維持し、免疫学的読取りのための対照として同時に試料採取した。
【００８６】
全てのクローニングをｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨に従って行った。ＬｓＳｈＫ（遺伝子ＩＤ  ｎＬｓ．２．１．２．ｔ０４０５９−ＲＡ）を特異的プライマーを使用して成虫Ｌ．シグモドンティスのｃＤＮＡ調製物から増幅した。ＬｓＳｈＫ配列の上流に単鎖抗ＤＥＣ２０５抗体（ＤＥＣ）を含有する融合構築物をＤｒ．Ｒａｌｐｈ  Ｓｔｅｉｎｍａｎから親切にも提供された既製の構築物から作製した。簡潔に述べると、目的の遺伝子のＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｂ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＫ）で消化し、次いで、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩ消化抗マウスｄｅｃ−２０５単鎖抗体−卵白アルブミン構築物（ＤＥＣ−ＯＶＡ）または抗体対照Ｉｇ−ＯＶＡ中にライゲートして、それぞれ、ＯＶＡ遺伝子の断片を置換した。全てのプラスミドを配列決定して、同一性を確認した。
【００８７】
プラスミドを２７Ｇ針で左脚の前脛骨筋に注入し、その後すぐに、設定として８パルス、２００Ｖ／ｃｍ、４０ｍｓ持続時間、４６０ｍｓ間隔を使用してＥＣＭ８３０  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ＋Ｔｗｅｅｚｅｒｔｒｏｄｅｓ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）でのエレクトロポレーションを行った。各マウスを、５０μｌのＰＢＳにより送達された、等量の各プラスミド種で作られた４０μｇの総ＤＮＡで、２週間間隔をあけて２回免疫化した。結果として、各個々のプラスミドの量は、接種材料に組み込まれた種々のプラスミドの数が増加するにつれて減少した。しかしながら、各１つの量は、最小有効用量を超えたままであった。
【００８８】
寄生虫生存を実験エンドポイントで決定した。成虫フィラリアを１０ｍｌの冷たいＰＢＳ中の胸膜腔洗浄液から単離し、熱い７０％エタノール中で固定し、計数した。保護を：
（主な感染動物における平均負荷量−ワクチン接種動物の平均負荷量）／主な感染動物における平均負荷量
として計算した。
【００８９】
ミクロフィラリアを、倒立顕微鏡下、５７０μｌのＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により固定後の３０μｌの血液中で計数した。
【００９０】
それらは、応答変数の分布を特定することにおけるより高い柔軟性および最尤法を通したより良いモデルフィッティングを可能にするので、一般化線形モデルを使用して、寄生虫学パラメーターに及ぼす種々のワクチン製剤の効果を比較した。
【００９１】
本研究の結果を図１に示す。
【００９２】
本発明者らは、感染後６０日において、ＬｓＳｈＫワクチンが成虫負荷量に及ぼす中程度の効果（約４０％減少）を有したことを見出したが、これは、境界的な統計的有意性（ｐ＝０．０７）であった。しかしながら、ワクチン接種群は、血液中に検出されるミクロフィラリアを有しなかった一方、主な感染群（空のプラスミドベクターのみを投与された）は、ｍｌあたり約８３０寄生虫のミクロフィラリアミア中央値を示した（ｐ＝０．００５）。これは、ワクチンとしてのＳｈＫドメインの医学的使用が、成虫メスの虫を殺菌することを通して、またはそれらが血流に達し得る前に移動性ミクロフィラリアを殺すことによって、その治療的使用を達成することを示唆している。
【００９３】
［研究２］
本発明は、寄生虫生活環にわたるモデルフィラリア線虫（リトモソイデス・シグモドンティス）の定量的セクレトーム分析を行う研究の以下の詳細を考慮すれば、当業者によってさらに理解され得る。
【００９４】
＜２．１要約＞
フィラリア線虫（糸状虫上科）は、約６３０万の障害調整生命年の年間の世界衛生負荷の原因であり、これは、ヒトに影響する蠕虫に起因し得る病的状態の最も大きい単一成分に相当する。主要なフィラリア性疾患である、リンパ管フィラリア症およびオンコセルカ症のためのワクチンは存在しないが、これは部分的には、ヒト寄生性種が実験マウスにおいてそれらの生活環を完了することができないために、フィラリアに対する防御免疫に関する研究が制約されてきたからである。しかしながら、げっ歯類フィラリアのリトモソイデス・シグモドンティスが一般的な実験モデルになった。ＢＡＬＢ／ｃマウスがその発達および生殖に完全に許容的なためである。本発明において、本発明者らは、５つの生活環段階にわたるＬ．シグモドンティスからの排泄分泌産物の包括的分析を提供する。強度に基づく定量化を適用して、本発明者らは、３０２のユニークな排泄分泌タンパク質の存在量を決定したが、そのうちの６４．６％は、産卵期の成虫メス線虫からのみ定量可能な量で存在していた。この生活環段階は、未熟な第１期幼虫（ミクロフィラリア）と共に、ワクチン候補として以前評価されていない４つのタンパク質である、予測された２８．５ｋＤａフィラリア特異的タンパク質、ゾナドヘシンおよびＳＣＯスポンジン様タンパク質、ビテロゲニン、および６つのメトリジン様ＳｈＫ毒素ドメインを含有するタンパク質を放出した。メス線虫は、絶対共生生物であるウォルバキア由来の２つのタンパク質も放出した。特に、全ての寄生虫段階からの排泄分泌産物は、トランスサイレチン様タンパク質ファミリーのいくつかの特徴付けられていないメンバーを含有した。さらに、ビオチン標識化は、プリン性シグナル伝達に関与する酸化還元タンパク質および酵素が成虫線虫角質上で濃縮されたことを明らかにした。ヒト感染性フィラリア線虫マレー糸状虫のセクレトーム（３つの独立した公開された研究において以前報告された）とのＬ．シグモドンティス成虫セクレトームの比較は、潜在的免疫調節物質の考慮すべき根底にある多様性を示唆する差異を同定した。Ｌ．シグモドンティス排泄分泌産物において同定された分子は、フィラリア性感染症に対するワクチン接種だけでなく、アレルギーおよび自己免疫疾患の寛解に関する見込みを示している。
【００９５】
＜２．２導入＞
フィラリア線虫は、公衆衛生に及ぼす全体的な影響の観点から、ヒトの最も重要な蠕虫寄生虫であり、約６３０万の障害調整生命年の年間の世界負荷を有する（１）。リンパ管フィラリア症（ＬＦ）または「象皮症」は、アフリカ、南アジア、太平洋、ラテンアメリカおよびカリブ海にわたる人口に影響し、この被害の９２％を占める。残りは、主にサハラ以南のアフリカにおけるオンコセルカ症または「河川盲目症」によって引き起こされる。主要なヒトフィラリア性病原体は、バンクロフト糸状虫（ＬＦ症例の９０％の原因である）、マレー糸状虫およびブルギア・チモリ（ＬＦの地理的に制限された原因）、および回旋糸状虫（ヒトオンコセルカ症の唯一の病原体）である。加えて、ロア糸状虫は、西および中央アフリカにおける約１千３百万人に影響を与える。この寄生虫は、比較的軽度の疾患を通常誘発するが、駆虫性化学療法後の重症、時折致命的な有害事象と関連していた（２）。フィラリア性寄生虫は、主に、慢性的病的状態を駆動の引き金となるものであり、これは、ＬＦにおける脚、生殖器および乳房の身体障害的膨張；またはオンコセルカ症における視力障害および重症皮膚炎として顕在化する。フィラリアは、小動物獣医学における主要な問題でもあり、ＵＳＡだけで約５０万のイヌが潜在的に致命的な心糸状虫症疾患の原因であるディロフィラリア・イミティスに感染している（３）。しかしながら、家畜化された有蹄動物では、フィラリア性感染症は、一般に全く良性である（４）。
【００９６】
現在、ヒトフィラリア性疾患の制御は、ほとんど完全に３つの薬物（イベルメクチン、ジエチルカルバマジンおよびアルベンダゾール）に依存している。心糸状虫症の予防も、イベルメクチンまたは他の大環状ラクトンでのイヌおよびネコの予防的治療に頼っている。回旋糸状虫（５）およびＤ．イミティス（６）における可能性のあるイベルメクチン抵抗性の報告は、フィラリア線虫に対するワクチン開発における研究努力を継続することの重要性を強調した。しかしながら、合理的なワクチン設計は、これらの後生動物寄生虫の固有の複雑さおよびそれらの多段階の生活環によって数十年間制約されてきた（７）。さらに、多くのフィラリア種は、絶対細菌内部共生体（ウォルバキア）を保有し、これも、感染中に免疫応答を刺激し得る（８）。これらの疾患の予防および治療を改善する世界的努力の一環として、線虫（９〜１１）およびそれらのウォルバキア（１０、１２、１３）の配列決定、および生物全体と排泄分泌産物（ＥＳＰ）の両方のプロテオミクス解析（１４、１５）を含めた大規模なプロジェクトが行われた。加えて、２つの研究（どちらもマレー糸状虫に関する）によって、生活環段階特異的セクレトームが調べられている（１６、１７）。ワクチン設計において、ＥＳＰタンパク質の同定および各主要な生活環段階におけるそれらの発現の決定は、動物モデルにおける効力スクリーニングに関する候補の優先順位付けを促進し得る。
【００９７】
フィラリア分野における研究の進行への１つの障壁は、遺伝的に扱いやすい、近交系宿主においてヒト寄生虫の完全な生活環を維持できないことである。フィラリア性生活環は、吸血性節足動物による第１期幼虫（ミクロフィラリア、Ｍｆ）の取込み、このベクターにおける２回の脱皮、その後の新しい脊椎動物宿主への第３期幼虫（Ｌ３）の伝染を伴う。線虫が、種特異的な腸管外好発部位において雌雄異体の成虫として成熟する前に、２回のさらなる脱皮が最終的な宿主において生じる。しかしながら、Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄフィラリアリトモソイデス・シグモドンティスの完全な生活環は、近交系マウスを含めた実験げっ歯類において維持され得る（１８）。この種は、その天然宿主（コットンラット、アラゲコトンラット）において初めて研究された（１９）［Ｌ．カリニ（Ｌ．ｃａｒｉｎｉｉ）としてのこれらの分離菌の以前の命名は、分類学的に不正確である（２０）］。定義されたノックアウト株を含めたマウス免疫学の完全な力を利用して、このモデルは、フィラリア性寄生虫によって用いられる基本的な免疫調節性機構（２１）、ワクチン接種の種々のモードへのそれらの感受性、炎症誘発性病態および自己免疫疾患を緩和するそれらの能力（２２）、ならびに成虫線虫負荷および繁殖力に及ぼす様々なワクチン戦略の影響（２３）（２４）に関する問題に取り組んできた。Ｌ．シグモドンティスモデルは、フィラリア性免疫回避における制御性Ｔ細胞の役割を明らかにする上で中心的な役割を果たした（２５）。
【００９８】
強度に基づく絶対的定量化（ｉＢＡＱ）プロテオミクスから派生した方法（ａ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ）と組み合わせて、新しく決定されたゲノム配列の資源を活用して、本発明者らは、ベクター由来Ｌ３（ｖＬ３）、成虫オス（ＡＭ）、産卵期前の成虫メス（ＰＡＦ）、産卵期の成虫メス（ＧＡＦ）、および未熟なＭｆ（ｉＭｆ）におけるＬ．シグモドンティスの段階特異的セクレトームを調べた。生活環を通したＥＳＰプロファイルにおける動的変化を同定することに加えて、本発明者らは、Ｌ．シグモドンティスおよびマレー糸状虫の成虫セクレトームの、特に、マレー糸状虫におけるオルソログを欠くメスのＬ．シグモドンティスによって放出される２つの新規なタンパク質の存在量の間に重要な差異があることを示す。他の寄生性線虫において観察されたように、本発明者らは、トランスサイレチン様ファミリー（ＴＴＬ）タンパク質がＥＳＰにおいて特に支配的であることを見出す。子宮液の漏出は、本発明者らがＧＡＦのＥＳＰにおいて検出するタンパク質の顕著な多様性を説明し得、本発明者らは、ワクチン治験において、および抗炎症性メディエーターとして評価することが正当化されるいくつかの新規なタンパク質に光を当てる。
【００９９】
＜２．３実験手順＞
（倫理的考慮）
Ｍｕｓｅｕｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄ’Ｈｉｓｔｏｉｒｅ  ＮａｔｕｒｅｌｌｅでのｖＬ３作製に必要な動物における全ての実験手順は、倫理委員会「Ｃｕｖｉｅｒ」（ｎ°６８−００２）によって承認され、ＥＵ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０１０／６３／ＵＥおよび関連する国の法令（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｄｅｃｒｅｔ  ｎ°  ２０１３−１１８、２０１３年２月１日）を厳守して行った。全ての他の寄生虫段階を、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ａｃｔ）１９８６プロジェクトライセンスおよび地域の倫理審査委員会の推奨に従ってＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈで維持された動物から収集した。
【０１００】
（寄生虫およびタンパク質調製物）
Ｌ．シグモドンティスの生活環を、ダニベクターであるイエダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ  ｂａｃｏｔｉ）から収集されたｖＬ３に感染したスナネズミ（メリオネス・ウングイクラツス（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ））において維持した。７０〜９０日後、ＧＡＦおよびＡＭは、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での洗浄によって胸膜腔から回収し、一方、ＰＡＦは負荷後３２日に回収した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遊離されたｉＭｆを収集するために、ＧＡＦ培養培地を２４ｈ後に除去し、１，９００ｇで２０分間（４℃）遠心分離した。血液由来ミクロフィラリア（ｂＭｆ）を培養前に２５％Ｐｅｒｃｏｌｌ懸濁液上への血液（感染後＞７５日のスナネズミの心穿刺からの）のオーバーレイ、１，９００ｇで２０分間（４℃）の遠心分離、およびＰＤ  １０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通るｂＭｆ画分の通過によって得た。ｖＬ３幼虫をダニベクターから直接分析し、培養容器への移動前にＲＰＭＩ１６４０中で３回洗浄した。
【０１０１】
各寄生虫段階のセクレトームにおけるタンパク質の相対的存在量を決定するために、ＥＳＰおよび全身抽出物（ＷＢＥ）を抽出し、別々に分析した。全ての寄生虫段階を超低付着フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において３７℃（５％ＣＯ２）で、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１％グルコースで補充された血清を含まないＲＰＭＩ１６４０中でインキュベートし、鏡検によってインキュベーション中に生存可能であることを確認した。培地を２４ｈ毎に交換し、使用済み培地を２４ｈおよび４８ｈで回収し、低タンパク質結合性Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ管（ポリプロピレンコポリマー；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｌｇｅｎｅ）において１，９００ｇで２０分間（４℃）遠心分離して、残骸を除去した。上清からのタンパク質を精製するために、水酸化シリカスラリー（ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を３０μｌ／ｍｌで加え、高速で２分間ボルテックス混合した。各２４ｈインキュベーション試料に使用された樹脂をそれぞれの４８ｈ試料に再利用して、−８０℃での保存前にＥＳＰを濃縮した。可溶性ＷＢＥ（限定された量のＥＳＰが入手可能であったので、ＥＳＰの代用品として使用した）を使用した最初の実験は、同等の非結合物質（データは示さず）と比較して、樹脂結合タンパク質を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイルの視認できる差異は示さなかった。分析をＧＡＦに関して四連、ＡＭに関して三連、ＰＡＦ、ｉＭｆおよびｖＬ３に関して二連で別々のＥＳＰバッチで行った。
【０１０２】
可溶性ＷＢＥを、微量遠心機管において小さい乳棒を使用して、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、１％ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ界面活性剤（Ｗａｔｅｒｓ）およびｃＯｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）中のホモジネーションによって調製した。この後に、微小プローブでのＶｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  ＶＣＸ１３０ＰＢソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、１０サイクルの氷上での超音波処理を続けた（氷上での３０秒のインキュベーションと交互の１０秒の超音波処理）。ホモジネートされた試料を１３，０００ｇで２０分間（４℃）遠心分離し、上清を保持した。ＷＢＥ調製物を、ＧＡＦおよびＡＭを除く全ての段階に関して寄生虫の単一プールから得、ＧＡＦおよびＡＭについては２つの生物学的反復試料が入手可能であった。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。
【０１０３】
（生きた虫の表面ビオチン化）
１０匹の成虫オスおよび５匹のメス線虫の試料を前もって冷却したＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、緩やかに撹拌しながら４℃で１ｍＭのＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＰＢＳのみ（負の対照）で３０分間インキュベートした。ビオチン化溶液を除去し、反応をＰＢＳ中の１００ｍＭグリシンでクエンチし、線虫をＰＢＳ−グリシン中で３回洗浄した。標識線虫を−８０℃で保管した。表面タンパク質を各１ｈ間（室温）、ＰＢＳ緩衝液単独、１．５％オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ）、０．５％ＳＤＳ、次いで４Ｍ尿素（全てＰＢＳ中）中の連続的なインキュベーションによって抽出した。各ステップで放出されたタンパク質を回転式混合により室温で２ｈ間、３０μｌの高能力ストレプトアビジン−アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でインキュベートした。結合したビオチン化タンパク質を回収するために、上清を除去し、ビーズをＰＢＳ中で３回、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中で３回洗浄し、３０分間、５０℃で５０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中でインキュベーションした。上清を除去し、ＤＴＴを１０倍に希釈し、３７℃で終夜０．２μｇプロテオミクスグレードトリプシン（Ｓｉｇｍａ）により消化した。生じたペプチドを、ＭＳ分析の前に製造者の指示に従って、Ｃ１８逆相スピンフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、濃縮した。
【０１０４】
寄生虫表面の効率的かつ特異的標識化を確認するために、上記のようにビオチンおよび対照標識化に供した後、ＡＭおよびＧＡＦを７０％の熱いエタノール中で固定した。パラフィン包埋切片（４μｍ）を脱パラフィンし、再水和し、１ｈ間（室温）、ＰＢＳ（遮断緩衝液）中の１％ＢＳＡおよび０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で遮断し、その後、緩やかに撹拌しながらのＰＢＳ中の２回の５分洗浄を行った。切片を１ｈ間（室温）、遮断緩衝液での１／１，０００希釈でストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートし、３回洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ抗退色試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でマウントした。画像を、ＦＩＴＣチャネルを明視野照明と組み合わせて、Ｚｅｎ  ２０１２ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用してＡｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ．Ｍ２蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）上で得た。
【０１０５】
（プロテオミクスに関する試料調製物）
結合ＥＳＰを含有するＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎを２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで２回洗浄し、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ、２５ｍＭ重炭酸アンモニウムに懸濁した。樹脂試料を１０分間、８０℃で加熱し、１０分間、６０℃で３ｍＭ  ＤＴＴで還元し、冷却し、次いで、３０分（室温）間、９ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）でアルキル化し、光から保護した。全てのステップを断続的なボルテックス混合で行った。次いで、試料を撹拌しながら終夜３７℃で０．２μｇプロテオミクスグレードトリプシンを使用して消化し、５分間、１３，０００ｇで遠心分離し、上清を除去した。樹脂を０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ、２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで２回洗浄し、上清をプールした。ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦを除去するために、試料を２ｈ間、３７℃でＴＦＡ（最終濃度、１％）を使用して沈殿させ、１ｈ間（４℃）、１２，０００ｇで遠心分離した。ペプチド上清を製造者の指示に従って、Ｃ１８逆相スピンフィルターを使用して、濃縮した。ＷＢＥ試料を還元し、上記のようにアルキル化し、３７℃で終夜、５０：１のタンパク質：トリプシン比でトリプシンで消化し、沈殿させて、ＥＳＰ調製物に関してＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦを除去した。
【０１０６】
（ＮａｎｏＬＣ  ＭＳ  ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ分析）
ペプチド溶液（２μｌ）を以前報告されたように（１３、２６）、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ＭＳと連動したｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ−ｎＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、オンラインナノフローＬＣによって分析した。Ｔｈｅｒｍｏ  ＲＡＷファイルをＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＬＣ−ＭＳ（バージョン４．１、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）中にインポートし、スペクトルデータをＭＧＦファイルに変換し、以前詳述されたように（２６）Ｍａｓｃｏｔ（バージョン２．３．０２、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）探索エンジンを使用したペプチド同定のためにエクスポートした。タンデムＭＳデータを、げっ歯類宿主（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、Ｕｎｉｐｒｏｔリリース２０１２＿０８、１６，６２６タンパク質配列；およびメリオネス・ウングイクラツス、Ｕｎｉｐｒｏｔリリース２０１２＿０８、２２３タンパク質配列）および一般的な混入物データベース（ＧＰＭＤＢ、ｃＲＡＰバージョン２０１２．０１．０１、１１５タンパク質配列）に関する予測されたプロテオームと一緒に、Ｌ．シグモドンティスゲノムおよびそのウォルバキア共生生物、ｗＬｓ［ｈｔｔｐ：／／ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．ｏｒｇ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓ＿ｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ、リリースｎＬｓ  ２．１．２、１０，２４６タンパク質配列（Ｍ．Ｂｌａｘｔｅｒ、Ｓ．Ｋｕｍａｒ、Ｇ．Ｋｏｕｔｓｏｖｏｕｌｏｓ；未公開）；およびリリースｗＬｓ  ２．０、１，０４２タンパク質配列（２７）から得た］からのタンパク質予測に対して探索した。探索パラメーター、許容可能改変および偽陽性率を以前報告されたように（１３、２６）定義した。Ｍａｓｃｏｔ探索結果をＸＭＬファイルとしてＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＬＣ−ＭＳ中にインポートし、以下の基準に従って分析した。つまり、タンパク質同定を記録するには少なくとも２つのユニークなペプチドを必要とし、ＥＳＰデータセットに含まれるには、個々のタンパク質は、２つ以上の生物学的反復試料で存在しなければならなかった。タンパク質存在量をｉＢＡＱ方法によって計算した。すなわち、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓアウトプットからの全てのピーク強度の合計を理論的に観察可能なトリプシンペプチドの数で割った（２８）。ＥＳＰおよびＷＢＥに関して、タンパク質存在量を、タンパク質ｉＢＡＱ値を対応する試料に関する合計されたｉＢＡＱ値で割ることによって標準化し、報告された存在量は、生物学的反復試料の平均である。ｉＢＡＱ値ではなく標準化されたペプチド強度を使用して、対照とビオチン化虫表面調製物間の倍変化を計算した。質量分析データをデータセット識別子ＸＸＸＸＸＸＸＸＸでＰＲＩＤＥパートナーリポジトリ（２９）を通してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｅｎｔｒａｌ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｘｃｈａｎｇｅ．ｏｒｇ）に寄託した。
【０１０７】
（タンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析）
ＥＳＰにおいて同定されたタンパク質のドメイン含有量を、Ｐｆａｍ（ｖ．２７．０）を使用し、カットオフとしてギャザリング閾値（ｇａｔｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を用いて評価した。Ｌ．シグモドンティスの完全な予測されたプロテオームと比較した、ＥＳＰタンパク質におけるＰｆａｍドメインの濃縮に関する超幾何試験をＲプログラミング環境内でｐｈｙｐｅｒツールキットを使用して行った（３０）。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆ＨｏｃｈｂｅｒｇステップアップＦＤＲコントロール手順を計算された、調整されたＰ値に適用した（３１）。大量の特徴付けられていないタンパク質の構造的相同体を、Ｐｈｙｒｅ２タンパク質折畳み認識サーバーによってＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ非重複タンパク質データベース（ＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴ探索；Ｅ値カットオフ１−０３）およびＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ探索）と比較して同定した（３２）。選択された大量ＥＳＰタンパク質の保存ドメイン構造もＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ  ４で調べた（３３）。ベン図を、ＶＥＮＮＴＵＲＥ（３４）を使用して作成した一方、ヒートマップに関して、階層的クラスター分析をＧＥＮＥ−Ｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＧＥＮＥ−Ｅ）における（１−ｒ）距離メトリックを使用して行った。古典的Ｎ末端シグナルペプチド、非古典的分泌サイン、ミトコンドリア標的配列、Ｏ−グリコシル化部位およびプロペプチド切断部位の予測を、それぞれ、ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０サーバー（３５）、ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ  ２．０サーバー（３６）、ＭｉｔｏＰｒｏｔ（３７）、ＮｅｔＯＧｌｙｃ  ４．０サーバー（３８）およびＰｒｏＰ  １．０サーバー（３９）を使用して行った。Ｌ．シグモドンティスタンパク質のマレー糸状虫オルソログを５０のビットスコアカットオフでの相互ＢＬＡＳＴを使用して決定した。
【０１０８】
ＳｈＫドメインを、ドメインおよびｈｍｍｅｒに関するＰｆａｍ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデル（バージョン３．１ｂ．１）を使用して、フィラリアマレー糸状虫（９）、Ｄ．イミティス（１０）、Ｌ．シグモドンティス、オンコセルカ・オチェンギ、アカンソケイロネマ・ヴィテアエ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．ｏｒｇ／ｇｅｎｏｍｅｓ／；Ｂｌａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、未公開で入手可能なドラフト未公開ゲノム）、バンクロフト糸状虫およびＬ．ロア（１１）、ならびに回虫目線虫ブタ回虫（４０）（フィラリア種に関するアウトグループである）の完全な予測されたプロテオームにおいて同定した。各ドメインを切り取り、合計５３１の明らかに異なるドメインを同定し、これをＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａを使用してアラインメントした（４１）。このアラインメントを吟味することにより、諸ドメインの一部が誤ってアラインメントされた（したがって、他のものと位置を合わせた６つのシステイン残基を有さなかった）ことが明らかになり；これらを手動で修正した。アラインメントをＭｒＢａｙｅｓ（バージョン３．２）（４２）を使用して系統発生シグナルに関して分析し、それぞれ４つの鎖の２回のランを２百万ジェネレーションに関して行った。最初の百万ジェネレーションをＴｒａｃｅｒ（バージョン１．５；Ａ．Ｒａｍｂａｕｔ、未公開：ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｒａｃｅｒ／）における検査後にバーンインとして廃棄し、コンセンサスツリーを１００ジェネレーション毎に採取した残りの１０，０００試料から推測した。配列ロゴを、ＷｅｂＬｏｇｏサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／）（４３）を使用して、全５３１ＳｈＫドメイン、ｎＬｓ＿０４０５９およびオルソログからの全てのドメイン、およびオルソロガスドメインの６つの明らかに異なるセットのそれぞれに関して作成した。
【０１０９】
＜２．４結果＞
（寄生虫生活環段階にわたるＥＳＰにおけるタンパク質の分布）
本発明者らは、Ｌ．シグモドンティスおよびｗＬｓゲノムアセンブリから予測されたタンパク質配列に対して生活環段階あたり約１２０，０００ＭＳスペクトルを探索した。合計３０２の定量可能なフィラリア性タンパク質（すなわち、２つ以上の生物学的反復試料において２つ以上のユニークなペプチドによって表される）を５つの生活環段階にわたってＥＳＰにおいて検出した。これらの大部分（１９５タンパク質、６４．６％）をＧＡＦにおいてユニークに同定した（図１ｂ）。プロテオミクスプロファイルの階層的クラスタリングは、ＥＳＰとＷＢＥを明確に分離した（図８）。ｖＬ３のＥＳＰデータプロファイルは、他のＥＳＰ調製物のものだけでなく、ｖＬ３−ＷＢＥのものとも明らかに異なっていた（図８）。ｉＭｆが、ＧＡＦのＥＳＰではなくＰＡＦのＥＳＰにより近くクラスタリングされたことは意外であったが、ＰＡＦおよびｉＭｆのＥＳＰデータセットの複雑度がはるかに低いことを反映している可能性がある。驚くべきことには、ＧＡＦを除けば、それぞれ６つ未満の段階特異的タンパク質がＥＳＰにおいて観察された（表１）。ｖＬ３では、これらの段階特異的タンパク質には、活性関連分泌タンパク質１（ＡＳＰ−１）および大量幼虫転写物タンパク質１（ＡＬＴ−１）を含めた、他のフィラリア種のＬ３から元々同定された高度に発現されるワクチン候補が含まれていた。他の生活環段階に制限されたタンパク質の機能的同一性は、予想外であった。したがって、ＰＡＦは、２つのクチクラタンパク質およびＧＡＦからのＥＳＰにおいて観察されなかった２つの抗酸化タンパク質を放出した（表１）。任意のＥＳＰにおいて定量可能であった唯一のｗＬｓ由来タンパク質は、ＧｒｏＥＬＳシャペロニン複合体の２つの構成成分であり、これらは、ＰＡＦおよびＧＡＦからの調製物において単独で見出された（表３）。
【０１１０】
本発明者らは、Ｌ．シグモドンティスの完全な予測されたプロテオームと比較した、タンパク質ドメイン過剰出現を決定することによって、種々の生活環段階とのＥＳＰの機能的違いを調べた。最も大きい濃縮倍スコアをＡＭ  ＥＳＰにおいて観察し、これは、主要な精子タンパク質（ＭＳＰ）線維タンパク質２ｂ（ＭＦＰ２ｂ）ドメインを有する３つのタンパク質、およびＴＴＬファミリードメインを有する１０のタンパク質を含有した（図２）。ＴＴＬファミリーもｉＭｆ（７つのタンパク質）およびＰＡＦ（９つのタンパク質）において過剰出現した。特に、ＰＡＦは、中間径フィラメントおよびラミンテールドメイン（それぞれ３つのメンバー）に関する著しい濃縮を示した。ＧＡＦからのＥＳＰでは、ラミンテールおよび免疫グロブリンＩセットドメイン、ならびに２つのプロテアソームおよび２つのラミニンファミリーに関して濃縮されていた（図２）。全体的に見て、ｉＭｆ、ＡＭおよびＰＡＦは、ｖＬ３およびＧＡＦよりも多くの割合のタンパク質を、ＷＢＥにおいて比較的低い存在量で分泌した（図３）。しかしながら、全ての生活環段階は、ＥＳＰにおいて非常に大量であったタンパク質がＷＢＥにおいてまれである傾向があり、逆もまた同じであるという点で、ＷＢＥとは明瞭に異なるセクレトミックプロファイルを示した（図４、図５）。ＥＳＰにおけるタンパク質の同定は、分泌を示唆する配列特性と強く相関しており、３１．１％のＥＳＰタンパク質配列は、古典的シグナルペプチドで開始すると予測される一方、さらなる３０．５％は、内部の、非古典的分泌サインを含有すると予測された。
【０１１１】
（成虫寄生虫によって放出される大量タンパク質）
ＧＡＦのＥＳＰは、最も複雑な組成を示し、この段階によって分泌される大量タンパク質の大部分は、特徴付けられていなかった、または非常に限定された機能的情報と関連している保存ドメインを含有した（図４ｂ）。支配的ＧＡＦ−ＥＳＰタンパク質（ｎＬｓ＿０３５７７）は、フィラリア線虫に固有であり、細菌Ｐ型ＡＴＰアーゼへの非常に弱い類似性のみを示した（表４および５）。１２の明らかに異なるＴＴＬファミリータンパク質をＧＡＦのＥＳＰにおいて同定したが（図４ｂ）、２つのみがこの生活環段階に固有であった。ＰＡＦおよびｉＭｆのＥＳＰにおいても十分に表された別の大量ＧＡＦ−ＥＳＰタンパク質（ｎＬｓ＿０８８３６）は、そのカルボキシ末端部においてフォンビルブランド因子ｄ型（ＶＷＤ）およびシステインリッチ（Ｃ８）ドメインを含有した。ｎＬｓ＿０８８３６に関して同定された最良のマッチは、ブタ回虫からのアポリポホリンであったが、ｎＬｓ＿０８８３６は、予想されたアミノ末端リポタンパク質ドメインを欠き、カルボキシ末端部は、予測されたゾナドヘシン様またはＳＣＯ−スポンジンタンパク質への弱い類似性を示した（表４および５）。６つのメトリジン様ＳｈＫ毒素ドメインを含有したタンパク質（ｎＬｓ＿０４０５９）であるｎＬｓ＿０４０５９は、ＧＡＦのＥＳＰにおいて中程度に大量であり、ＰＡＦ、ＡＭおよびｉＭｆセクレトームにおいても観察された（図９、１１、１２）。ＳｈＫドメインは、広い系統発生分布を有する一方、ｎＬｓ＿０４０５９において明白な特定のパターンは、フィラリアに限定されている（表４および５；このタンパク質の詳細な分析に関して以下を参照されたい）。ＧＡＦのＥＳＰに存在する追加のタンパク質は、他のフィラリア種からの以前報告されたＥＳＰ抗原の相同体であった。しかしながら、ＲＡＬ−２（４４）、ＳＸＰ−１（４５）、Ｓ３（４６）およびＣＣＧ−１（４７）は、機能的に不明瞭なままであった。
【０１１２】
ＥＳＰの機能が明らかにされている構成成分には、小さいシステインプロテアーゼ阻害剤［ＣＰＩ（４８）］、オメガクラスグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ（４９）］、ＭＳＰ（５０）、およびミクロフィラリア鞘タンパク質（５１）が含まれていた（図４ｂ）。加えて、他のフィラリア種の成虫メスからのＥＳＰにおいて大量にあることが既知であるタンパク質である、Ａｖ３３およびＥＳ−６２のＬ．シグモドンティス相同体を同定した。Ａｖ３３は、ブタ回虫（５２）からのアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤と類似している一方、ＥＳ−６２は、分泌ロイシルアミノペプチダーゼである（５３）。リボフラビン代謝に関与しており、フラビンモノヌクレオチドおよび／またはピリドキサール５−リン酸などの補欠分子族の加水分解における役割を有し得る分泌酸性ホスファターゼ（５４、５５）は、ＰＡＦのＥＳＰにおいて顕著であった。ＧＡＦのＥＳＰタンパク質の３つは、推定上の脂質結合性領域を有した。つまり、ＭＬ−ドメインタンパク質は、コレステロールおよび脂質Ａと相互作用することが報告されており（５６、５７）、保存フィラリア性抗原Ｏｖ１６は、推定上のホスファチジルエタノールアミン結合性ドメイン（５８）を有し、新規かつ高度に大量のビテロゲニン（ｎＬｓ＿０７３２１）は、アミノ末端脂質輸送ドメインを含有した。
【０１１３】
特に多様なＧＡＦのものと比較して、ＰＡＦ、ＡＭおよびｉＭｆのＥＳＰにおける最も大量のタンパク質の同一性における広範なオーバーラップがあった。これらの複雑度がより低いＥＳＰ混合物は、それにもかかわらず、個々の段階において過剰出現する支配的構成成分を含有した。ＰＡＦでは、大量に存在するタンパク質には、いくつかの糖分解酵素および２つの熱ショックタンパク質、ならびにガレクチン（β−ガラクトシド結合性タンパク質１）およびＣ型レクチンとアセチルコリン受容体ドメインの両方を含有する非常にまれなタンパク質であるｎＬｓ＿０３３５０が含まれていた（図４ｃ）。ＡＭ  ＥＳＰの、大量に存在する構成成分には、ＭＦＰ２の３つのアイソフォーム（５９）および細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（６０）およびセリンプロテアーゼ阻害剤（６１）などの精子または精液において高度に発現されることが既知であるタンパク質が含まれていた（図４ａ）。しかしながら、ＡＭのＥＳＰは、ＲＡＬ−２（４４）、線虫分泌タンパク質２２Ｕ（６２）および免疫原性タンパク質３（６３）などのいくつかの以前報告されたが特徴付けられていないタンパク質も含有した。新規なＫＨ（ＲＮＡ結合性）ドメインタンパク質は、他のフィラリア種における相同体だけでなく、精子形成クロマチンと関連している（６４）シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのＶａｓａ  ＤＥＡＤ−ボックスヘリカーゼＧＬＨ−２との弱い相同性も有していた（表４）。
【０１１４】
（幼虫寄生虫によって放出される大量タンパク質）
ｂＭｆ段階からのＥＳＰの特徴付けは、特別な問題を提起した。２段階精製プロセスおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの長期の培養にもかかわらず、ｂＭｆ  ＥＳＰにおいて頑健に定量化されたタンパク質の９２．４％（６６のうち６１）は、げっ歯類宿主由来であった。同定された支配的血清構成成分は、フィブロネクチン、補体Ｃ３、血清アルブミン、ヘモペキシン、プラスミノーゲンおよびセルロプラスミンであったが、より少ない量のＩｇＭも検出された（表６）。５つの定量可能な寄生虫由来分子のうち、３つは、ＴＴＬタンパク質であった。Ｍｆ由来ＥＳＰをより徹底的に特徴付けるために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＡＦ培養物からｉＭｆを収集し、それらをメス線虫から分離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションを続けた。この手順は、線虫起源のタンパク質の検出を３６に増加させた（図５ｂ）が、予想されたように、ｉＭｆのＥＳＰにおける支配的タンパク質は、ＧＡＦ  ＥＳＰのプロファイルを綿密に反映した（図４ｂ）。興味深いことに、ｂＭｆにおいて観察された２つの最も大量の寄生虫ＥＳＰタンパク質であるＴＴＬタンパク質および線虫に特異的な特徴付けられていないタンパク質（ｎＬｓ＿０３４４３）は、ｉＭｆのＥＳＰに存在しなかった（表６）。ｉＭｆにおけるユニークではないが、比例的に濃縮されたタンパク質は、２つのガレクチン（β−ガラクトシド結合性タンパク質１および２）、脂肪酸およびレチノイド結合性タンパク質（ＦＡＲ−１）、ならびにヌクレオシド二リン酸キナーゼを含み（図５ｂ）、それらの全ては、フィラリア性生活環を通して発現されることが既知である（６５、６６）。加えて、胚発生中に子宮上皮から分泌されるＬｓ１１０（６７）が、ｉＭｆのＥＳＰにおいて検出されたが、ｉＭｆのＷＢＥにおいては検出されなかった。逆に、主要な鞘タンパク質Ｓｈｐ１ａおよびＳｈｐ４がｉＭｆのＷＢＥにおいて見出されたが、分泌されなかった（補足表Ｓ１）。ｉＭｆのＥＳＰの別の特有の特性は、２つのプロテオグリカンコアタンパク質である、Ｃ．エレガンスからのＵＮＣ−５２と中程度の類似性を示したパールカン様タンパク質（表４図５ｂ）（６８）；および、Ｃ．エレガンスＣＰＧ−２と遠縁に当たる、６つのペリトロフィン−Ａキチン結合性ドメインを含有するコンドロイチンプロテオグリカン（ＣＰＧ）（６９）の過剰出現であった（表３および４）。しかしながら、Ｃ．エレガンスからの予測されたムチンＳＲＡＰ−１との弱い類似性（表４）を示した大きい（約２５０ｋＤａの予測された質量）プラスミノーゲンアップル線虫（ＰＡＮ）ドメインタンパク質（７０）は、ｉＭｆのＥＳＰにおけるプロテオグリカンの両方よりもより大量であった（図５ｂ）。最後に、他のフィラリア線虫およびブタ回虫におけるより遠縁およびブリグサ線虫におけるオルソログを有する明らかに新規なペロキシダシン様タンパク質（表４）もｉＭｆのＥＳＰにおいて同定された（図５ｂ）。
【０１１５】
ｖＬ３段階からのＥＳＰは、本発明者らの研究において最も多様性の低いデータセットであったけれども、高度に大量のタンパク質の特有のレパートリーを示した。したがって、ｖＬ３のＥＳＰは、この段階において固有に発現され、濃縮されることが既知である以前特徴付けられたフィラリア性タンパク質［ＡＳＰ−１（７１）、ＡＬＴ−１（７２）、およびカテプシンＬ様プロテアーゼなど（７３）］、および他の段階からのＥＳＰにおいてよく表された他の抗原（ＲＡＬ−２、ＣＰＩ−２、Ｏｖ１６およびβ−ガラクトシド結合性タンパク質）からなった（図５ａ）。線虫分泌タンパク質２２Ｕは、Ｌ．シグモドンティスｖＬ３のＥＳＰ調製物において中程度に大量であった（図５ａ）が、明らかに、他のフィラリア種のｖＬ３において発現されない（６２）。この段階は、それらが哺乳動物宿主に適応し、第３の脱皮を経るまで分泌活性の観点から静止状態であり得る。脱皮Ｌ３からのＥＳＰの分析は、マレー糸状虫におけるｖＬ３のＥＳＰからよりも５倍多いタンパク質を同定した（１７）。
【０１１６】
（新規な、フィラリア特異的ＥＳＰタンパク質の系統分類学）
ＧＡＦのＥＳＰにおける最も大量のタンパク質、ｎＬｓ＿０３５７７は、古典的Ｎ末端シグナルペプチドを除いて、２８．５ｋＤａの予測されたＭＷを有し、保存ドメインが欠如している謎の、特徴付けられていない分子である。シグナルペプチドの下流に、中程度から高レベルの配列保存がＮ末端部分においてフィラリア上科にわたって明白であった（図１０）。しかしながら、Ｃ末端セグメントは、低い複雑さを示し、フィラリア間で高度に可変であり、この領域のみに多岐にわたるマレー糸状虫における２つのアイソフォームを有した（図１０）。Ｌ．シグモドンティスタンパク質は、６つの潜在的Ｎ結合および１１のＯ結合グリコシル化部位、ならびに位置３１および１４７でのプロペプチド切断部位を含有することが予測された。前者の切断部位は、モチーフにおける一部の変動にもかかわらず、フィラリア上科内で完全に保存されていた一方、後者（コンセンサスの位置１５４にある）は、Ｌ．シグモドンティスにユニークであった。これらの観察は、ｎＬｓ＿０３５７７のいくつかのプロセシングされたアイソフォームがＬ．シグモドンティスによって分泌された可能性があることを示唆している。ｎＬｓ＿０３５７７オルソログの系統発生解析は、このタンパク質がフィラリア上科に制限されており、ブタ回虫または他の非フィラリア線虫における類似物を有さないことを確認した。系統樹の根元（ｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒｅｅ）は、Ｃ末端部分におけるシグナルの欠如により、はっきりとしなかった（図１１）。しかしながら、ｎＬｓ＿０３５７７は、げっ歯類フィラリア、Ａ．ヴィテアエにおけるオルソログで明確にクラスター化された一方、Ｄ．イミティスおよびオンコセルカ種におけるオルソログは、最も遠いグループ化を形成した（図１１）。
【０１１７】
ＳｈＫドメインタンパク質ｎＬｓ＿０４０５９は、ｖＬ３を除いて全てのＥＳＰ調製物において同定された特に特有の分子であった。１つの他のＬ．シグモドンティスＳｈＫドメインタンパク質である、アスタシンプロテアーゼｎＬｓ＿０３３６８は、ＧＡＦのＥＳＰのみのまれな構成成分であった（表３）。ＳｈＫドメイン（またはＳＸＣもしくは６つのシステインドメインとしても既知であるメトリジン様毒素ドメイン）は、刺胞毒において最初に同定されたが、線虫プロテオームにおいて特に大量であり（７４）、ここで、それは、分泌タンパク質と関連している。原型ＳｈＫペプチド（刺胞動物スティコダクチラ・ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）からの）は、電位開口型カリウムチャネルを遮断する１型毒素であり、合成類似体が自己免疫疾患のための治療薬として現在開発中であり、ここで、エフェクターメモリーＴリンパ球によって発現されるＫｖ１．３チャネルが特異的に標的とされる（７５）。ｎＬｓ＿０４０５９は、任意のＥＳＰ調製物において特に大量ではなかったけれども、全ての哺乳動物由来段階のセクレトームおよびその珍しいドメイン構造でのその存在（図９）は、潜在的に免疫調節性の役割を示唆している。
【０１１８】
ｎＬｓ＿０４０５９タンパク質は、Ｌ．シグモドンティスにおける任意のタンパク質のＳｈＫドメインの最も大きい数（６つ）を有する。本発明者らは、それぞれ６つのＳｈＫドメインを含有する、全ての他のフィラリア線虫ゲノムにおけるオルソロガス遺伝子を同定した（図１２）。ｎＬｓ＿０４０５９様ＳｈＫドメインは、全てのフィラリア性およびブタ回虫ＳｈＫドメインの明らかに異なるサブセットを形成し（図１２および１３）、特に最後３つの普遍的に保存されたシステイン残基の周囲の保存の著しいパターンを有する（図６）。プロリン残基（アラインメントの位置３２だが、ｎＬｓ＿０４０９５ドメインの残基１７での）もｎＬｓ＿０４０５９ドメインにおいて著しく保存されていたが（図６）、５３１ドメインのセット全体に共通ではない。ｎＬｓ＿０４０５９およびそのオルソログでは、６つのＳｈＫ反復は、５つの低複雑性スペーサー（２７〜１０４アミノ酸）によって隔てられている（図９）。一部のスペーサードメインは、保存されていたが、他のものは、パターンおよび低複雑性の長さ、セリンリッチ領域の変動を示した。スペーサードメインは、他のタンパク質との明らかな類似性を有さないが、回虫目イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ）のＳｈＫムチンとの相似性（７６）によって、それらは、Ｏ−結合グリカン装飾のレシピエントであり得る。ｎＬｓ＿０４０５９上に６５の潜在的Ｏ−グリコシル化部位がある。しかしながら、ｇｅＬＣ  ＭＳによって、本発明者らは、ｎＬｓ＿０４０５９が、排他的に、無修飾成熟タンパク質の予想分子量（約５２ｋＤａ）でのみ移動したことを見出したことから、ｎＬｓ＿０４０５９がムチン様構造をとらないことが分かる（データは示さず）。このタンパク質は、Ｃ末端ＳｈＫドメイン内に位置する２つのリジルチロシン二分子も含有した（図９）。リジルチロシン二分子は、カリウムチャネルへの１型刺胞動物ペプチド毒素の結合に必須であるので（７７）、これは、Ｋｖ１チャネル遮断活性と関連し得る。特に、ＳｈＫドメイン６における１つのリジルチロシン二分子は、他の種における多くの（全てではないけれども）オルソログにおいて保存されている（図６）。
【０１１９】
（成虫線虫表面と関連しているタンパク質）
線虫角質は、寄生虫とその宿主の免疫系間の決定的なインターフェースである（７８）。表面結合タンパク質は、おそらく放出された物質の受動的吸着によってＥＳＰを単純に反映し得る、またはエキソプロテオームの明らかに異なる構成成分を含み得る。生きたＡＭおよびＧＡＦ線虫をスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンで表面標識インキュベートし、分画した。固定線虫切片の免疫蛍光画像処理は、ビオチン標識化が大部分はクチクラ層に制限されたことを確認した（図１４）。低レベルの内在性ビオチンが予想されたように内部構造内に存在した。本発明者らは、ビオチン標識ＡＭ抽出物に存在するが非標識対照に存在しない５つのタンパク質およびビオチン標識ＧＡＦにおける１１のタンパク質を同定した（表２）。加えて、さらなる４つの（ＡＭ）および３９の（ＧＡＦ）タンパク質が非標識対照と比較して、ビオチン標識試料において５０倍を超えて濃縮された（表７）。これは、これらの分子は寄生虫の表面上に大量にあるが、内在性ビオチンとも関連し得ることを示唆している。両方の性別におけるＥＳＰとビオチン標識タンパク質プロファイル間の考慮すべきオーバーラップがあった。しかしながら、ＡＭおよびＧＡＦは、表面標識抽出物に固有に存在する、それぞれ、２および１２のタンパク質を示した（表２、表７）。逆に、ｎＬｓ＿０３５７７、ビテロゲニンｎＬｓ＿０７３２１、特徴付けられていないタンパク質Ｓ３およびＥＳ−６２などの非常に大量のＥＳＰタンパク質の多くは、ビオチン標識抽出物において検出されなかった。
【０１２０】
表面結合タンパク質の著しい特性は、プリン性シグナル伝達に関与する２つのエクト酵素の存在であった。これらは、ＡＭ抽出物に支配的なアデニル酸キナーゼおよびＧＡＦ抽出物に排他的に見出されるプリンヌクレオシドホスホリラーゼであった（７９）（表２、表７）。補体成分１，ｑ小成分結合性タンパク質の相同体がＧＡＦ表面標識抽出物において同定された。ヒト相同体のように、Ｌ．シグモドンティスタンパク質は、Ｎ末端ミトコンドリアインポートシグナル配列を含有したが、前者は、リンパ球、内皮細胞、樹状細胞および血小板の表面上を含めた、多くのミトコンドリア外位置（８０）において発現される。プリン性シグナル伝達は、リンパ球輸送を調節することが既知である一方（７９）、補体成分１ｑ受容体は、ブラジキニンの産生を介して血管拡張に関与するので（８０）、これらのタンパク質は、免疫調節における役割を果たし得る。
【０１２１】
ＡＭからの表面抽出物は、アクチン結合性タンパク質、カルポニンの相同体を含有し、これは、成虫回旋糸状虫における横紋筋と角質の両方に局在していた（８１）。ＧＡＦ表面抽出物は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびロイシンリッチ反復ファミリータンパク質である２つのタンパク質を含有し、これらの両方は、フィラリアおよびＣ．エレガンスにおける角質合成と以前関連づけられた（８２、８３）。ストレス応答−関連タンパク質も、ピルビン酸代謝のいくつかの酵素のように、ＧＡＦにおいてよく出現した（チオレドキシンペルオキシダーゼ（８４）、アルデヒド脱水素酵素、チオレドキシン様タンパク質および熱ショックタンパク質を含む）（表２および表７）。特に、内部共生体由来ウォルバキア表面タンパク質は、ＧＡＦにおける表面ビオチン化に利用可能であることが見出された。
【０１２２】
（成虫マレー糸状虫のセクレトームとの比較）
マレー糸状虫のいくつかの生活環段階からのＥＳＰは、以前に報告されている（１４、１６、１７）。これらの３つの研究では、唯一の共通段階は、成虫であった［一緒に培養された両方の性別を含む（１４）］。成虫Ｌ．シグモドンティスＥＳＰにおいて同定された２９７のタンパク質のうち、９２．６％は、マレー糸状虫におけるオルソログを有していた。しかしながら、これらのマレー糸状虫オルソログの大部分（６１．６％）は、マレー糸状虫セクレトームにおいて観察されなかった（図７ａ）。Ｐｆａｍドメインの分析は、この固有のデータセットにおける任意の著しい濃縮を示すことができなかった（データは示さず）。逆に、各マレー糸状虫研究は、驚くべき数の研究特異的分泌タンパク質を明らかにしたけれども、３つ全てのマレー糸状虫セクレトームにおいて報告されたタンパク質のオルソログが成虫Ｌ．シグモドンティスＥＳＰにおいても検出された（図７ａ）。この共通コアには、ロイシルアミノペプチダーゼ、エノラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、β−ガラクトシド結合性タンパク質１、アセチルコリン受容体タンパク質、シクロフィリン−５およびマクロファージ遊走阻止因子−１が含まれていた。マレー糸状虫オルソログを欠いた２２のＬ．シグモドンティス成虫ＥＳＰタンパク質（図７ｂ）には、分泌タンパク質Ｌｓ１１０および２つのスーパーオキシドジスムターゼアイソフォームと一緒に、最も大量のＧＡＦのＥＳＰ分子の２つ（ビテロゲニンｎＬｓ＿０７３２１およびＶＷＤタンパク質ｎＬｓ＿０８８３６）が含まれていた。マレー糸状虫セクレトーム研究は、Ｌ．シグモドンティスにおけるオルソログを有さない合計９０のタンパク質を同定したけれども（図７ｂ）、１つのみ（クチクラグルタチオンペルオキシダーゼ）が３つ全ての研究において観察された。統一された定量化方法が本発明者らのＬ．シグモドンティスおよび公開されたマレー糸状虫研究に使用されなかったので、成虫マレー糸状虫およびＬ．シグモドンティスが個々のＥＳＰタンパク質に関する分泌のそれらのレベルの点で異なるかどうかを決定することは困難である。しかしながら、ランク存在量の関しては、トリオースリン酸イソメラーゼ、マクロファージ遊走阻止因子−１、およびγ−グルタミルトランスペプチダーゼが成虫マレー糸状虫において全体的に過剰出現することが報告された一方；成虫Ｌ．シグモドンティスＥＳＰには、特徴付けられていないタンパク質ｎＬｓ＿０３５７７（Ｂｍ１＿３８４９５のオルソロガス）、ＴＴＬタンパク質ｎＬｓ＿０９７５０（Ｂｍ１＿４３６３５のオルソロガス）、ならびにＡｖ３３およびＳ３の相同体に関して濃縮された（表３）。各種間で相対的に明らかに等しく大量であったタンパク質は、ロイシルアミノペプチダーゼならびにＣＰＩ−２およびＯｖ１６の相同体が含まれていた。
【０１２３】
＜２．５考察＞
（モデルフィラリア線虫のセクレトームを定量化する）
フィラリア線虫は、ヒト個体群における罹患の著しい負担を強いる、ペット動物の重大な病原体である。有効な抗フィラリア性薬物が存在する一方、これらへの遺伝的抵抗性の進化の不安は、常に存在し（５、６）、治療の代替経路が必要である。感染を予防し、かつ疾患を治療することができることが好ましく、したがって、抗フィラリア性ワクチンは、医学的および獣医学的治療選択肢に加えて、きわめて価値があろう（８５）。寄生虫によってそれらの宿主に放出されるＥＳＰは、数十年間、ワクチン開発の標的であったが、フィラリア線虫におけるこれらの分子の理解は、限定されている。以前の研究は、フィラリア性ＥＳＰに存在することが推測されるタンパク質を列挙したが、それらの存在量の定量的評価は、これまでは、強度に基づく手法を使用して調査されてはいない。モデルげっ歯類フィラリア線虫Ｌ．シグモドンティスを使用して、線虫生活環にわたる物質を調製し、したがって、種々の脊椎動物寄生性段階を詳細に調べることが可能である。ＥＳＰの半定量的ＭＳ分析を適用し、本発明者らは、分泌タンパク質を同定し、それらの存在量を決定し、本発明者らの分析を２つ以上の固有なペプチドを使用して頑健に定量化できる３０２のタンパク質に限定した。
【０１２４】
（成虫線虫のセクレトーム）
Ｌ．シグモドンティスでは、ＧＡＦは、ＥＳＰプロテオミクス多様性の大部分の原因であった。調査した他の４つの生活環段階は、ＧＡＦのＥＳＰに存在しなかった１１のタンパク質（全体の３．６％）のみをもたらした。この知見は、Ｍｆがユニークなタンパク質の最も大きい割合をもたらすことを見出した、成虫、ＭｆおよびＬ３を比較し、単一ペプチドヒットから得られたデータを組み込むマレー糸状虫セクレトームの定性的分析と対照をなす（１７）。しかしながら、マレー糸状虫ＧＡＦ、ＡＭおよびＭｆセクレトームの以前の評価は、生じたユニークなヒットの数はＧＡＦで最も大きかったと結論づけ（１６）、これは、方法論的差異がこれらの対照的な結果の根底にあり得ることを示唆している。ＧＡＦ  ＥＳＰの多様性は、体細胞成虫ＥＳＰだけでなく、子宮内での卵形成、受精および胚発生のプロセスに由来する生殖器系から放出されるタンパク質も含有する物質であることと整合する（全てのフィラリア性病原体は、卵胎生である）。
【０１２５】
線虫精子は、好気性損傷に極めて感受性である（８６）。ＡＭのＥＳＰは、スーパーオキシドジスムターゼ、セリンプロテアーゼ阻害剤およびグルタレドキシン様タンパク質を含めた、オキシダントおよび他のストレッサーに対する精子の保護における役割を示唆するタンパク質を含有した。グルタレドキシンは、チオール含有抗酸化タンパク質であり、Ｃ．エレガンスＧＬＲＸ−２１は、セレン毒性を緩和することにおいて主要な役割を果たす（８７）。哺乳動物精液は、セレンを蓄積し、これは過剰な場合、精子運動性を妨害し得る（８８）。セリンプロテアーゼ阻害剤の相同体は、運動性の獲得中にブタ回虫によって分泌され、周囲の精細胞の活性化を阻害することによって、精子競争に寄与する（８９）。好気性培養中の精子の溶解は、ＡＭのＥＳＰにおいて、ならびにＰＡＦ、ＧＡＦおよびｉＭｆから得られたＥＳＰにおいて観察される高レベルのＭＳＰを説明し得る。メス線虫は、最初のＭｆが作製される数週間前に受精され（９０）、ＰＡＦのＥＳＰにおけるＭＳＰの優位は、メスの生殖器系からの精子の漏出が分娩前に生じることを示している。
【０１２６】
いくつかの固有な抗酸化タンパク質（ヌクレオレドキシン様タンパク質−２、グルタチオン還元酵素および翻訳的に制御された腫瘍タンパク質）がＰＡＦのＥＳＰにおいて見出され、これは、この段階中の保護に関する強化された要求を示唆している。マレー糸状虫では、大きいチオレドキシンに似ているヌクレオレドキシン様タンパク質の相同体（９１）がＥＳＰに存在するが、段階特異的発現を示さない（９２）。２つの固有な角質生合成関連タンパク質もＰＡＦによって放出され、これは、クチクラリモデリングがそれらの成長の最終段階中に生じることを示唆している。これは、交尾中の免疫駆動酸化ストレスまたは損傷への増加した感受性をもたらし得る（９３）。ＰＡＦのＥＳＰにおいて過剰出現した熱ショックタンパク質は、マレー糸状虫成虫線虫ＥＳＰにおいて過去に検出された（９４）。
【０１２７】
（成熟ミクロフィラリアセクレトームは、宿主タンパク質によって支配される）
多くのフィラリア線虫では、ミクロフィラリアは、卵殻から生ずる内層および子宮の末梢部における分泌物によって生じた外層を含むタンパク質性の鞘に封入されている。５つの主要な構造タンパク質がＬ．シグモドンティス鞘において同定され、その一部は、発生中の胚において合成され、他のものは、子宮上皮において合成されるが（５１）、これらのうちのいずれも、ｉＭｆのＥＳＰにおいて見出されず、これは、それらが安定な構成成分であることを示している。多くの宿主血清タンパク質が培養中のｂＭｆから放出された。これらは、寄生虫表面との特異的な相互作用に由来する可能性が高く、これは、宿主を活用する線虫と寄生虫を認識する宿主免疫系との間の緊張をおそらく反映している。５つの血清構成成分がＬ．シグモドンティスＭｆ鞘のＳＤＳ抽出によって放出された唯一のタンパク質であり（９５）、ヒト血清アルブミンがバンクロフト糸状虫Ｍｆの鞘表面上に検出されたが（９６）、これはブルギア種Ｍｆにおいて一般に検出されないことから（９７）、Ｍｆ表面における宿主の発見は新規ではない。Ｌ．シグモドンティス鞘は、最大７０ｋＤａの分子に対して透過性であり（９８）、したがって、培養への移行後に一部の宿主タンパク質を保持する可能性がある。しかしながら、本発明者らがｂＭｆのＥＳＰにおいて検出したいくつかの大量血清タンパク質は、これよりも相当に大きく（例えば、セルロプラスミンおよびフィブロネクチン）、したがって、鞘表面上に吸着されるまたは取込み前にタンパク分解によりプロセシングされなければならない。ヘモペキシンおよびセルロプラスミンは、それぞれ、ヘムおよび銅輸送における役割を有し（９９）、したがって、それらは、寄生虫によって必須補因子の供給源として活用され得る。
【０１２８】
Ｌｓ１１０［子宮腔に局在し、ｉＭｆ上に不定に存在するが、ｂＭｆに存在しないタンパク質（６７）］および２つの可能性のあるプロテオグリカンコアタンパク質を含めた、いくつかの寄生虫由来産物がｉＭｆによって分泌されると同定された。したがって、大きい糖タンパク質（約２００ｋＤａ）がマレー糸状虫ＥＳＰから報告された（１００）。パールカン様プロテオグリカンの最も近いＣ．エレガンス相同体であるＵＮＣ−５２は、発生中の胚およびその後の段階における咽頭および肛門を含めた、収縮組織の基底膜の主要な構成成分である（６８）。Ｌ．シグモドンティスｉＭｆ由来ＣＰＧ様タンパク質は、キチン結合性ドメインを有することが予測されており、卵殻および鞘発達において機能し得る。Ｃ．エレガンスでは、ＣＰＧは、卵殻の中央キチン層に結合する内層を形成し、多精受精を防ぐための障壁（１０２）を形成する胚の周囲の囲卵腔を維持する（１０１）。Ｌ．シグモドンティスでは、キチンは、卵母細胞および接合体において検出されたが、ｉＭｆ鞘には存在しない（１０３）。子宮内でのＭｆ鞘発達中のキチンの分解は、高度に可溶性である根底にあるＣＰＧを周囲の環境に放出し得る（１０１）。ｉＭｆのＥＳＰにおいて濃縮された他の新規なタンパク質２つの起源および役割は、あまり明らかではない。ＰＡＮドメインタンパク質のＣ．エレガンスにおける最も近い相同体は、ＳＲＡＰ−１であり、これは、成長中の幼虫の下皮、中枢神経系および産卵口において発現され、脱皮中に角質表面上へ分泌される（１０４）。Ｃ．エレガンスでは、ペロキシダシンＰＸＮ−２は、細胞外マトリックスに位置し、後期胚伸長、筋付着、および運動ニューロン軸索ガイダンス選択に必要とされる（１０５）。
【０１２９】
（産卵期の成虫メス線虫によって放出される大量の特徴付けられていないタンパク質）
本発明者らは、ＧＡＦおよびｉＭｆのＥＳＰにおいて支配的に見出される、以前には報告されていない４つの大量に分泌または排泄されるタンパク質を同定した。Ｐ型ＡＴＰアーゼとの著しい一致を示した（がＡＴＰアーゼドメインを欠いている）ｎＬｓ＿０３５７７、および哺乳動物精子の頭部に位置するＶＷＤタンパク質であるゾナドヘシンとの一部の類似性を示したｎＬｓ＿０８８３６（１０６）の２つは、他のタンパク質と僅かな類似性しか有さない。しかしながら、本発明者らは、ｎＬｓ＿０８８３６がＣ．エレガンスゾナドヘシン−ドメインタンパク質、ＤＥＸ−１のオルソログではないことに注目する（１０７）。第３の新規なタンパク質であるｎＬｓ＿０７３２１は、ビテロゲニンである。Ｃ．エレガンスでは、ビテロゲニンは、腸において排他的に発現され、ここで、それらは、コレステロールを結合し、体腔を通してそれを生殖腺に輸送する（１０８）。その後、卵母細胞は、受容体媒介エンドサイトーシスによってタンパク質およびそのカーゴ脂質を内部移行し、卵黄顆粒にそれを貯蔵する（１０８）。いくつかのビテロゲニンが卵生胃腸管線虫、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）の成虫由来のＥＳＰにおいても同定された（１０９）。第４のタンパク質であるＳｈＫドメインタンパク質ｎＬｓ＿０４０５９は、ドメインの数とそれらの特異的配列の両方において、線虫におけるこのモチーフを含有する他のタンパク質とは明らかに異なっていた。その相対的存在量、特殊性および調査された全てのフィラリア種における存在は、それが、ヒトフィラリア性疾患とイヌ心糸状虫症の両方に関する実現可能なワクチン候補であり得ることを示唆している。ｉｎ  ｖｉｖｏでのその役割は、刺胞動物ＳｈＫ毒素の活性と類似した様式でメモリーＴ細胞のＫｖ１チャネルを阻害することによって、獲得免疫の発達に干渉することであり得る（７５）。
【０１３０】
謎のＴＴＬファミリーが動物寄生性および植物寄生性線虫の両方からのＥＳＰにおいて最も典型的かつ広範な発見物の１つとして見出された（１１０）。Ｃ．エレガンスでは、６３のトランスサイレチン遺伝子があり、これらの多くは、感染性の負荷に応答して分泌され、明らかに上方調節されるが、ＴＴＲ−５２のみが、生理学的機能が認められている［アポトーシス細胞の食作用（１１１）］。植物寄生虫ラドホルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）では、最も大量のＬ．シグモドンティスＴＴＬタンパク質の１つに厳密に類似しているＲｓ−ｔｔｌ−２（ｎＬｓ＿０７５７６；本発明者らの研究においてｖＬ３を除く全ての段階からのＥＳＰにおいて見出された）は、腹神経索に局在していた（１１２）。第２のＲ．シミリスＴＴＬファミリーメンバーであるＲｓ−ｔｔｌ−１は、産卵口領域においてのみ発現され（１１２）、この分子（ｎＬｓ＿０７３３２）の相同体は、ｉＭｆ  ＷＢＥのみにおいて検出された。さらに、反芻動物寄生虫オステルターグ胃虫（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｏｓｔｅｒｔａｇｉ）では、ＴＴＬファミリー（Ｏｏ−ＴＴＬ−１）は、ＥＳＰの主要な構成成分であり、成虫の偽性体腔液に免疫局在し得る（１１３）。本発明者らの研究では、Ｏｏ−ＴＴＬ−１のＬ．シグモドンティス相同体（ｎＬｓ＿０９７５０）は、ｖＬ３のものを除く全てのＥＳＰ調製物において大量にあった。
【０１３１】
（線虫および内部共生体産物の供給源としての子宮液）
フィラリア線虫から排泄または分泌されるタンパク質は、多くの経路に由来し得る。食道腺からの経口分泌および肛門からの糞便物質の放出に加えて、線虫は、前感覚腺（双器）（１１４）および分泌ポアからも物質を分泌し、また、交尾およびＭｆの放出中に生殖門から物質を排泄し得る。タンパク質は、特に脱皮中に、トランスクチクラ分泌を通して下皮からも放出され得（１１５）、エキソソーム放出も重要であり得る（１１６）。本発明者らのデータから、本発明者らは、産卵口排泄がＧＡＦおよびＰＡＦにおけるＥＳＰタンパク質の主要な供給源であり、ｉＭｆが、子宮上皮から分泌されるタンパク質でコーティングされていることを示唆する。この解釈は、ＧＡＦおよびＰＡＦのＥＳＰにおけるＭＳＰおよびビテロゲニンの存在量によってだけでなく、回旋糸状虫では桑実期における胚によってのみ産出されるオメガクラス分泌ＧＳＴアイソフォームが、ＧＡＦのＥＳＰにのみ排他的に存在することによっても支持される（４９）。同様に、オス線虫におけるＥＳＰタンパク質は、おそらく主に精液から生じる。Ａ．ヴィテアエに感染したげっ歯類からの免疫血清は、発生中の胚と、貯精嚢と精嚢の両方における精子上間の流体チャネルを含めた、オスおよびメスの生殖腺組織と最も強く反応する（１１７）。
【０１３２】
フィラリアのウォルバキア内部共生体の役割、つまり、それらは栄養上の共生生物であり、エネルギーまたは補助因子の提供を通して線虫を支持しているのか、または寄生虫の免疫学的回避機構の部分であるのか、またはその両方であるのか？（１３）は、不明瞭なままである。ウォルバキアが子宮液（１１８）、変性胚内（１１９）に存在し得る、または分泌ポアを通して出得る（１２０）ことが提唱された。加えて、それらは、角質などの細菌細胞を欠く構造体中にタンパク質を分泌し得る（１２１）。ウォルバキア由来タンパク質は、マレー糸状虫分泌産物において非常に低い量で存在した（１７）。本発明者らは、ＰＡＦおよびＧＡＦのＥＳＰにおいてウォルバキアＧｒｏＥＬＳ構成成分を同定したが、他の生活環段階においては同定しなかった。ＧｒｏＥＬは、ウォルバキアにおける最も大量のタンパク質であり（１３、１５）、ＥＳＰにおけるその検出は、例えば、メスの子宮では、変性卵母細胞または胚からの細菌細胞全体の放出を通して、または分泌を通してであり得る。シャペロニンとしてのＧｒｏＥＬは、サイトゾルに制限されていると予想されているが、ＧｒｏＥＬ相同体は、一部の細菌種の表面上で「こっそり働く」ことが報告された（１２２）。本発明者らはまた、マレー糸状虫において報告されたように（１２１）、成虫Ｌ．シグモドンティスの表面標識化によってウォルバキア表面タンパク質を検出した。このタンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体２および４の推定上のリガンドであり（１１９）、これらの知見は、ウォルバキアがフィラリアへの免疫応答を改変し、おそらく誤った方向に導くという仮説を支持している（１２３）。ウォルバキアＧｒｏＥＬも炎症誘発性Ｔｏｌｌ様受容体を刺激するかどうかは評価されていないが、先例が他の細菌に存在し（１２４）、このタンパク質に対する抗体がＬＦにおける病態と関連している（１２５）。
【０１３３】
（Ｌ．シグモドンティスセクレトームおよびフィラリア症に関するワクチン開発）
数十年間、ヒトおよび獣医学的フィラリア症に関するワクチン開発は、Ｌ３段階に焦点を置いてきたが、これは、照射されたＬ３が防御免疫を誘発することにおいて非常に有効であり（２３、１２６）、強い抗Ｌ３免疫は、寄生虫確立を遮断し得ることによる。Ｌ３は、ヒトおよび獣医学的病原体と非常に類似した遺伝子レパートリーを発現するので、リトモソイデスは、Ｌ３ワクチン研究に関する優れたモデルである（１２７）。Ｌ．シグモドンティスのＬ３からのＥＳＰの分析は、この段階に関するステレオタイプのセクレトームプロファイルを明らかにするのを助ける。しかしながら、明らかにされた寄生虫抗原（単独であろうとまたは組合せであろうと）はどれも、いずれのフィラリア性系においても、照射されたＬ３と同等のレベルの保護を再現性良く達成しなかった（７）。さらに、成虫線虫の単一のペアは、生産的感染を生じ得るので、Ｌ３のみに対するワクチンは、潜在的に克服できない問題に直面する。
【０１３４】
Ｍｆを標的とすることは、伝染を遮断する、およびオンコセルカ症の場合、疾患病態を減少させる可能性を有する。さらに、Ｍｆ段階は、いくつかのワクチン接種治験においてＬ３よりも防御免疫応答に対して脆弱であることが示されている（１２８〜１３０）。ＤＮＡワクチンとして送達されたＡＬＴ−１およびＣＰＩ−２の組合せでのワクチン接種は、循環ＭｆレベルをＬ．シグモドンティスにおいて最大９０％減少させた。重要なことに、この保護は、抗原の免疫調節性ドメインが（コード配列の変異または欠失によって）切除された場合にのみ達成され、成虫線虫負荷が著しく減少しなかった場合でさえも維持された。単一成虫メスの虫の移植が未処置の宿主における注入されたＭｆの排除を防ぐのに十分であるので、この現象は、おそらく天然（活性）タンパク質の免疫調節性効果によるものであった（１３１）。本発明者らは、ＧＡＦによって分泌される他の大量の分子の多くがＭｆ生存を促進することにおける役割を同様に有し得、「抗繁殖力」ワクチン接種戦略において標的にされ得る可能性があることを示唆する。さらに、ＧＡＦ角質の表面標識化によって同定されたタンパク質はまた、許容的環境を作り出すことに関与し得（７９、８０）；したがって、これらの分子に対するワクチン接種は、宿主相同体とは十分に異なる場合、寄生虫確立を妨害し得る。
【０１３５】
＜２．６結論＞
本発明者らは、特にＧＡＦ段階のＬ．シグモドンティスが外部環境に著しい多様性のタンパク質を放出し、これらの分子の大部分は、特徴付けられていないことを示した。これらのタンパク質の多くは、胚形成の基本的な態様に関与し得るけれども、サブセットは、宿主免疫応答から線虫（および特に循環Ｍｆ）を保護する活性免疫調節剤である可能性が高い。大量ＥＳＰタンパク質、ＣＰＩは、寄生性線虫においてだけでなく、Ｃ．エレガンスにおいても、卵形成および受精における基本的な役割を果たすので、ＣＰＩは、この二重の機能性に関する原型の１つであり得る（１３２）。これは、その免疫調節性の性質が、根本的に異なる環境への二次的適応の例であることを示唆している。したがって、ＧＡＦによって放出される薬種は、フィラリア症の免疫学的予防および化学療法のために標的とするべき分子の理想的なセットを提供し得；さらに、炎症誘発性および自己免疫疾患に取り組むための新しい化合物を提供し得る（２２）。
【０１３６】
【表１】
2017512066.tif 000003
【０１３７】
【表２Ａ】
2017512066.tif 000004
【表２Ｂ】
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【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
2017512066.tif 000007
【０１４０】
【表５】
2017512066.tif 000008
【０１４１】
【表６Ａ】
2017512066.tif 000009
【表６Ｂ】
2017512066.tif 000010
【表６Ｃ】
2017512066.tif 000011
【０１４２】
【表７Ａ】
2017512066.tif 000012
【表７Ｂ】
2017512066.tif 000013
【０１４３】
［参考文献］
【表８Ａ】
2017512066.tif 000014
【表８Ｂ】
2017512066.tif 000015
【表８Ｃ】
2017512066.tif 000016
【表８Ｄ】
2017512066.tif 000017
【表８Ｅ】
2017512066.tif 000018
【表８Ｆ】
2017512066.tif 000019
【表８Ｇ】
2017512066.tif 000020
【表８Ｈ】
2017512066.tif 000021
【表８Ｉ】
2017512066.tif 000022
【表８Ｊ】
2017512066.tif 000023
【表８Ｋ】
2017512066.tif 000024
【表８Ｌ】
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【０１４４】
＜配列情報および比較＞
【化１】
2017512066.tif 000026
【０１４５】
上記のものは、リトモソイデス・シグモドンティスからのＳｈＫドメイン含有タンパク質ｎＬｓ＿０４０５９の例示されたドメイン構造である。シグナルペプチド（イタリック体）、それぞれ６つのシステイン残基（強調）を含有する６つのＳｈＫ毒素様ドメイン（一重線枠）、および予測されたプロペプチド切断部位（下線）を示すアミノ酸配列の一次構造表現。Ｃ末端でのドメイン６は、２つのリジルチロシン二分子（太字）を含有する点で独特である。
【化２】
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【０１４６】
上で例示されたものは、ＳｈＫドメイン含有タンパク質ｎＬｓ．２．１．２．ｔ０４０５９−ＲＡ（リトモソイデス・シグモドンティスから）とｎＤｉ．２．２．２．ｔ０３４０２−ＲＡ（ディロフィラリア・イミティスから）間の配列アラインメント比較を提供する。
【０１４７】
２つの配列間の全体的な同一性は、５２．８％のみであるが、これら２つのフィラリア線虫タンパク質のＳｈＫドメイン（強調された）間に共有された同一性は、相当に高いことが理解され得る。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
2017512066.tif 000035
【図６】
2017512066.tif 000036
【図７】
2017512066.tif 000037
【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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