(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有するウラシルチミンデヒドロゲナーゼ。
（１）作用
ウラシル＋電子受容体(酸化型)＋水→バルビツール酸＋電子受容体(還元型)
（２）基質特異性
ウラシル、チミン、５−アルキルウラシル、５−ハロゲンウラシルに対して作用する。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ
至適ｐＨは８．５付近であり、ｐＨ６．５〜１２において３０℃で３０分加熱しても失活しない。
（４）至適温度
至適温度は５０℃付近。
（５）熱安定性
ｐＨ８において４０℃〜５０℃で３０分加熱しても失活しない。
（６）阻害
ＳＨ阻害剤である、ひ酸ナトリウム、ｐ−クロロメルクリベンゾエートによって阻害を受け、電子伝達阻害剤であるＫＣＮによって阻害を受け、重金属イオンであるＣｕ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｈｇ2+によって著しい阻害を受ける。
（７）活性化
セリウムによって活性化を受ける。
（８）分子量
ゲルろ過法による分子量は３５５，０００。
（９）サブユニットの分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニットの分子量は、９０，０００、３５，０００及び２５，０００。
（１０）ミカエリス定数
ミカエリス定数（Ｋｍ）はウラシルに対して０．８３ｍＭ、チミンに対して０．７１ｍＭ。
【請求項２】
以下の部分アミノ酸配列を有する請求項１記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼ。
（１）分子量３５，０００のサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ
（２）内部アミノ酸配列：
（その１）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ
（その２）Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
（その３）Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ
【請求項３】
請求項１又は２記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼを生産する能力を有するロドコッカス属に属する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とするウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項４】
前記微生物がロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３１３２又はロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３１９１である請求項３記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項５】
ウラシルチミンデヒドロゲナーゼを微生物より採取するとき該酵素の安定剤としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを加えることを特徴とする請求項３または４記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ及びその製造方法に関する。ウラシルチミンデヒドロゲナーゼは、ウラシル及びチミンの酸化反応を触媒する酵素であり、ヌクレオシドホスホリラーゼやヌクレオシドトランスフェラーゼによる塩基交換反応を利用したプリンヌクレオシド化合物の製造の効率化に有用である。プリンヌクレオシド化合物の製造において、本酵素は、ピリミジンヌクレオシドとプリン塩基との塩基交換により生成されるピリミジン塩基を、塩基交換を触媒する酵素の基質になり得ない化合物に変換する役割を果たす。なお、塩基交換反応による該プリンヌクレオシド化合物の製造方法の詳細は、例えば特開平１１−４６７９０に開示されている。また、本酵素はピリミジン化合物の定量に利用することも可能である。
【０００２】
【従来の技術】
ウラシルチミンデヒドロゲナーゼは微生物に存在することが知られているが、該酵素に関する記載及び報告は次のようなものがある。▲１▼Hayaishi, O. &; Kornberg, A. : J.Biol. Chem., 197, 717-732(1952)、▲２▼Hayaishi, O. : Meth. Enzymol., 2, 492-493(1955)、▲３▼Wang, T.P. &; Lampen, J.O. : J. Biol. Chem. 194, 785-791(1952)、▲４▼Bharat, N.P. &; West, T.P. : FEMS Microbiol. Lett., 40, 33-36(1987)。しかしながら、これまでウラシルチミンデヒドロゲナーゼは精製困難な酵素の一つとされ、途中まで精製されたことはあっても、単離されたことはなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定の理化学的性質を有するウラシルチミンデヒドロゲナーゼを提供すること、及びウラシルチミンデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物から該酵素を安定的に製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述の課題を解決すべく、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を鋭意探索した結果、微生物から該酵素を安定的に得る方法を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００６】
▲１▼．次の理化学的性質を有するウラシルチミンデヒドロゲナーゼ。
（１）作用
ウラシル＋電子受容体(酸化型)＋水→バルビツール酸＋電子受容体(還元型)
（２）基質特異性
ウラシル、チミン、５−アルキルウラシル、５−ハロゲンウラシルに対して作用する。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ
至適ｐＨは８．５付近であり、ｐＨ６．５〜１２において３０℃で３０分加熱しても失活しない。
（４）至適温度
至適温度は５０℃付近。
（５）熱安定性
ｐＨ８において４０℃〜５０℃で３０分加熱しても失活しない。
（６）阻害
ＳＨ阻害剤である、ひ酸ナトリウム、ｐ−クロロメルクリベンゾエートによって阻害を受け、電子伝達阻害剤であるＫＣＮによって阻害を受け、重金属イオンであるＣｕ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｈｇ2+によって著しい阻害を受ける。
（７）活性化
セリウムによって活性化を受ける。
（８）分子量
ゲルろ過法による分子量は３５５，０００。
（９）サブユニットの分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニットの分子量は、９０，０００、３５，０００及び２５，０００。
（１０）ミカエリス定数
ミカエリス定数（Ｋｍ）はウラシルに対して０．８３ｍＭ、チミンに対して０．７１ｍＭ。
【０００７】
▲２▼．以下の部分アミノ酸配列を有する上記▲１▼記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼ。
（１）分子量３５，０００のサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ
（２）内部アミノ酸配列：
（その１）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ
（その２）Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
（その３）Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ
【０００８】
▲３▼．上記▲１▼又は▲２▼記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とするウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【０００９】
▲４▼．前記微生物がロドコッカス属に属する微生物である上記▲３▼記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００１０】
▲５▼．前記微生物がロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３１３２又はロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３１９１である上記▲３▼記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００１１】
▲６▼．ウラシルチミンデヒドロゲナーゼを微生物より採取するとき該酵素の安定剤としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを加えることを特徴とする上記▲３▼〜▲５▼の何れか１記載のウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
［ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ］
本発明において、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼの単離に成功し、該酵素が上述の▲１▼および▲２▼に記載の性質を有することを見出した。
【００１４】
本発明の酵素は、ウラシルをバルビツール酸に酸化する反応を触媒する。
ウラシル＋電子受容体(酸化型)＋水→バルビツール酸＋電子受容体(還元型)
また本発明の酵素は、チミン（５−メチルウラシル）を５−メチルバルビツール酸に酸化する反応を触媒する。
チミン＋電子受容体(酸化型)＋水→５−メチルバルビツール酸＋電子受容体(還元型)
ここで電子受容体は、電子を受け取ってそれ自体は還元され、電子供与体（ウラシルもしくはチミン）を酸化するものであれば特に限定されない。
【００１５】
本発明のウラシルチミンデヒドロゲナーゼの基質特異性は、ウラシル、チミンのほかに、ピリミジン骨格を有する物質、なかでも５位が置換されたウラシルを挙げることができる。５位が置換されたウラシルとして、５−アルキルウラシル、５−ハロゲンウラシル、５−ニトロウラシルなどが挙げられる。５位が置換されたウラシル以外にピリミジン骨格を有する物質として、４−（３Ｈ）−ピリミドンなどが挙げられる。より詳細には、５−アルキルウラシルとして、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシルなどが挙げられ、５−ハロゲンウラシルとして、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシルなどが挙げられる。また、チミンのメチル基、５−アルキルウラシルのアルキル基が更に別の置換基（例えばハロゲン）で置換された物質、例えば５−トリフルオロメチルウラシルなども基質として挙げることができる。
【００１６】
本発明のウラシルチミンデヒドロゲナーゼは、ＳＨ阻害剤（例えば、ひ酸ナトリウム、ｐ−クロロメルクリベンゾエート）により阻害を受け、更に電子伝達阻害剤（例えば、ＫＣＮ）により阻害を受ける。また、本発明の酵素は、重金属イオン（例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｈｇ2+）により著しい阻害を受ける。なお、本発明においてＳＨ阻害剤とは、酵素のＳＨ基と反応してその活性を阻害する化合物をいい、電子伝達阻害剤とは、電子伝達系で起こる反応を阻害する化合物、とりわけ電子伝達系に関与するシトクロムｃオキシダーゼの活性を阻害する化合物をいう。
【００１７】
本発明の酵素の他の性質（至適ｐＨ、至適温度、分子量、サブユニットの分子量、ミカエリス定数、該酵素の活性化剤など）は、上述の▲１▼および▲２▼の記載や後述する実施例の記載のとおりであり、酵素の性質の詳細については、これらの記載を参照されたい。
【００１８】
［ウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造方法］
本発明におけるウラシルチミンデヒドロゲナーゼの生産菌は、本発明における理化学的性質を有するウラシルチミンデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物であれば特に制限されないが、好ましくは、ロドコッカス属に属する微生物が挙げられる。より具体的に好ましくはロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＪＣＭ  ３１３２、ロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３１９１が挙げられる。ＪＣＭは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株であることを示す。本菌株はＪＣＭ菌株カタログ第７版（１９９９）に掲載されている。
【００１９】
本菌株の培養は、ロドコッカス属に属する微生物の通常行われる条件で行えばよい。培地としては炭素源及び窒素源としてトリプトン、酵母エキスを含む培地を用い、培養は振盪培養又は通気撹拌培養で行い、培養温度は２８℃で行うことが好ましい。ウラシルチミンデヒドロゲナーゼの生産のために、微生物は例えば、１〜２日間培養する。
【００２０】
培養物からウラシルチミンデヒドロゲナーゼを採取するには、通常用いられる方法に従って行えばよい。例えば、遠心分離などによって集菌した菌体を超音波あるいはガラスビーズなどで機械的に破砕した後、遠心分離などにより細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を得る。次に、硫安、芒硝などの塩析法、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどによる金属凝集法、プロタミン、エチレンイミンポリマーなどによる凝集法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどによるクロマトグラフ法、ゲル電気泳動法などを用いて、本酵素を採取することができる。
【００２１】
採取中、酵素の安定化を目的として、酵素を含む溶液にＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を加えることが好ましい。使用量は、０．１〜３．０ｍＭであり、好ましくは、０．１〜１．０ｍＭである。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１：ウラシルチミンデヒドロゲナーゼの製造
＜本酵素生産菌の培養＞
ウラシル２ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、リン酸一カリウム１ｇ、酵母エキス０．２ｇ、バクトトリプトン（ディフコ社製）０．２ｇ、シーソルト（日本たばこ産業社製）０．５ｇ及び水１ＬからなるｐＨ７の培地を用いた。２Ｌの三角フラスコに培地０．５Ｌを入れ滅菌した後にロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＪＣＭ  ３１３２の菌体を添加し、２８℃で４日間振とう培養した。培養終了後、湿菌体を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により集菌した。
【００２４】
＜本酵素の採取＞
上述で得られた湿菌体を０．１ｍＭのＮＡＤＰＨと０．１ｍＭのジチオスレイトールを含む２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．８）に懸濁し、超音波で菌体を破砕した。菌体破砕液を超遠心分離（３０，０００ｇ、１０分）を行い、上清をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア社製）を充填したカラムに添加し活性画分を分取した。限外ろ過で濃縮した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）を充填したカラムに添加し活性画分を分取した。限外ろ過で濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００（ファルマシア社製）を充填したカラムに添加し活性画分を分取した。限外ろ過で濃縮した後、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５（ファルマシア社製）を充填したカラムに添加し活性画分を分取した。限外ろ過で濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  Ｓ−６（ファルマシア社製）を充填したカラムに添加し活性画分を分取した。限外ろ過で濃縮し、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ（以下、本酵素という）０．１ｍｇを得た。
【００２５】
精製の要約を表１に示す。本酵素の比活性は８．６Ｕ／ｍｇタンパク質であった。１Ｕは１分間に１μmolのウラシルを加水分解する酵素量を表す。
【００２６】
本酵素の活性測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりウラシルの分解又はバルビツール酸の生成を定量分析することにより行った。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：Cosmosil 5C18AR-11（ナカライテスク製）、4.6×250mm
溶媒：150mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.4)
送液量：1ml/min
検出器：UV254nm
【００２７】
【表１】
0004072667.tif 000002
【００２８】
実施例２：ウラシルチミンデヒドロゲナーゼの安定剤としてのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの効果
実施例１で得られた湿菌体（２０重量％）を０．５ｍＭのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下及び非存在下で、ｐＨ７（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液）、ｐＨ１０．３（０．１Ｍホウ酸緩衝液）及びｐＨ１１．６（０．１Ｍホウ酸緩衝液）に懸濁し、４℃で保存した。そこから経時的にサンプリングし、超音波細胞破砕により無細胞抽出液とした後、無細胞抽出液０．０１ｍｌ、５ｍＭのウラシル及び１ｍＭメチレンブルーを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の０．１ｍｌ溶液を３０℃で１０分間反応させ、分解した基質を定量した。
【００２９】
その結果、表２に示すように、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを添加することによってウラシルチミンデヒドロゲナーゼ活性の安定化が認められた。
【００３０】
【表２】
0004072667.tif 000003
【００３１】
実施例３：本酵素の理化学的性質
（１）作用及び基質特異性
本酵素０．１μｇ、表３に示す５ｍＭの各種基質及び１ｍＭメチレンブルーを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の０．１ｍｌ溶液を３０℃で１０分間反応させ、分解した基質を定量した。結果を表３に示す。本酵素はウラシル、チミンの他、ウラシルのアルキル化物、ウラシルのハロゲン化物、５−ニトロウラシル及び４−（３Ｈ）−ピリミドンなどに作用した。ウラシルのアルキル化物としては５−エチルウラシル、５−プロピルウラシルが挙げられ、ウラシルのハロゲン化物としては５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシルなどが挙げられる。
【００３２】
【表３】
0004072667.tif 000004
【００３３】
（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ
本酵素０．１μｇ、５ｍＭウラシル及び１ｍＭメチレンブルーを含む、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．７〜８．７）又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．７）の１ｍｌ溶液を３０℃で１０分間反応させ、生成したバルビツール酸を定量した結果、活性の最適ｐＨは８．５であった。
また、本酵素をｐＨ３〜１２の間で３０℃で３０分加熱した後、残存する酵素活性を測定した結果、ｐＨ６．５〜１２において安定であった。
【００３４】
（３）至適温度
本酵素０．１μｇ、５ｍＭウラシル及び１ｍＭメチレンブルーを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の１ｍｌ溶液を２０〜７０℃の各種温度で１０分間反応させ、生成したバルビツール酸を定量した結果、至適温度は５０℃であった。
【００３５】
（４）熱安定性
本酵素を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）中で各々４０、５０、６０℃においてインキュベートし、３０分経過後における残存する酵素活性を測定した。酵素活性は、本酵素０．１μｇ、５ｍＭウラシル及び１ｍＭメチレンブル−を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の１ｍｌ溶液を３０℃で１０分間反応させ、生成したバルビツール酸を定量して求めた。その結果、４０〜５０℃において酵素活性の減少は認められなかった。
【００３６】
（５）阻害及び活性化
本酵素０．１μｇ、５ｍＭのウラシル及び１ｍＭメチレンブルーを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の０．１ｍｌ溶液に、表４に示す２ｍＭの各種阻害剤を添加し３０℃で１０分間反応させ、分解した基質を定量することにより阻害剤による影響を調べた。結果を表４に示す。ＳＨ阻害剤である、ひ酸ナリトウム［ＮａＡｓＯ2］、ｐ−クロロメルクリベンゾエート［ｐＣＭＢ］によって阻害を受け、電子伝達阻害剤であるＫＣＮによって阻害を受け、重金属イオンであるＣｕ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｈｇ2+によって著しい阻害を受けた。また、セリウムによって著しく活性化を受けた。
【００３７】
【表４】
0004072667.tif 000005
【００３８】
（６）セリウムによる活性化
本酵素０．１μｇ、２．５ｍＭのウラシル、チミン又は５−フルオロウラシル及び１ｍＭ各種電子受容体を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の０．１ｍｌ溶液に、硫酸セリウム０．５ｍＭを添加し、３０℃で１０分間反応させ、分解した基質を定量することによりセリウムによる酵素の活性化を調べた。結果を表５に示す。各反応系でセリウムを添加することにより、添加しなかったものの１．９１〜５．３９倍の酵素活性の向上が認められた。
【００３９】
【表５】
0004072667.tif 000006
【００４０】
（７）分子量
ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ−３０００ＳＷ（東ソー社製）を用いるゲルろ過法で分子量を測定した。標準蛋白質には、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（分子量４４０，０００）、Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（分子量１４０，０００）、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（分子量６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量４３，０００）、Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（分子量２０，１００）を用いた。その結果、分子量は３５５，０００であった。
【００４１】
（８）サブユニットの分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動法によりサブユニットの分子量を測定した。標準蛋白質には、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（分子量９４，０００）、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（分子量６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量４３，０００）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｇｙｄｒａｓｅ（分子量３０，０００）、Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（分子量２０，１００）、α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（１４，４００）を用いた。その結果、サブユニットの分子量は９０，０００と３５，０００と２５，０００であった。
【００４２】
（９）サブユニット組成
分子量９０，０００をＬ、分子量３５，０００をＭ、分子量２５，０００をＳとしたとき、Ｌ2Ｍ2Ｓ2又はＬ3Ｍ2Ｓ1である。
【００４３】
（１０）ミカエリス定数
本酵素０．１μｇ、０．０３３〜１．０ｍＭウラシル又はチミン、及び１．０ｍＭメチレンブルーを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の０．１ｍｌ溶液を３０℃で１０分間反応させ、生成したバルビツール酸又は５−メチルバルビツール酸を定量した。ウラシルに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は０．８３ｍＭ、チミンに対するミカエリス定数は０．７１ｍＭであった。
【００４４】
実施例４：本酵素のアミノ酸配列
本酵素の部分アミノ酸配列を定法により決定した。結果は以下のようであり、これまで知られているCarbon monoxide dehydrogenase、Xanthine dehydrogenase、Nicotine dehydrogenase及びQuinone oxidoreductaseと相同性が認められた。
【００４５】
（１）分子量３５，０００のサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ
（２）内部アミノ酸配列：
（その１）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ
（その２）Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
（その３）Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、今まで単離することができなかったウラシルチミンデヒドロゲナーゼを微生物から安定的に製造することが可能となった。本酵素の性質を明らかにすることによってその使用方法が提供され、今後、核酸関連分野の反応に広く利用することができる。