(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を有効成分とする脳機能改善剤。（但し、式中Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸残基をそれぞれ示し、ｎは１または２の整数を示す。）
【請求項２】
乳糖とＮ−アセチルノイラミン酸またはその塩とをβ−ガラクトシダーゼにより糖転移反応させて生成される一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を使用する請求項１記載の脳機能改善剤。（但し、式の意味は前記と同様である。)
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳中のリン脂質やガングリオシドの代謝を促進する新規な脳機能改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ガングリオシドは、脳中に多く存在することから神経系において何らかの役割を果たしているものと考えられている。
その理由としては、(1) 脳組織中のガングリオシド含量は、他のどの組織中のガングリオシド含量よりも多く、脳の進化の過程や脳組織の構築の過程で特徴的な変化を示す。特に、乳児期において脳組織中のガングリオシド量は増加し、加齢に伴って減少することが知られている（蛋白質・核酸・酵素, vol.35, pp.535-545, 1990) 。
【０００３】
(2) ガングリオシドは、ドーパミン、セロトニン、アセチルコリン等の神経伝達物質の放出を促進する（神奈木ら, 複合糖質, pp.124-135, メジカルビュー社発行, 1994) 。すなわち、ガングリオシドは、神経分化やシナプス機能を促進する作用を有することから、神経障害に対する治療効果が期待されている。例えば、パーキンソン病は、筋肉の硬直と運動の減少をもたらす疾病であり、高齢者にその患者が多く、痴呆になることもあり得るとされている。このパーキンソン病のモデル実験として、マウスに、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を注射し、ドーパミン含量を50％程度に減少させた後、ガングリオシドを投与したところ、ドーパミン含量の回復と行動の改善とが認められたことが明らかにされている(Hadjiconstantinou,M., J. Neurochem, vol.51, pp.1190-1196, 1988)。また、脳虚血障害は、ニューロンの死と脱落とをもたらし、その結果として、記憶や知能等の脳の機能が失われて痴呆状態となる。この障害に対してもガングリオシドの投与が有効であり、ガングリオシドの投与により脳浮腫や行動が改善され、死亡率も低下したという報告がなされている（Lombardi,G., Lett., vol.134, pp.171-174, 1992)。
【０００４】
(3) ガングリオシドは、脳シナプス機能の促進にも働くといわれている。すなわち、ラットの脳から調製したシナプトソームを高カリウムで脱分極刺激すると伝達物質の放出が起こる。この際、シナプトソームを予めガングリオシドで処理しておくと伝達物質であるアセチルコリンの放出が促進されることが知られている（Bliss,T.V.P., Nature, vol.361, pp.31-39, 1993)。
【０００５】
このガングリオシドに結合しているシアル酸は、ノイラミン酸のアシル体の総称で、生物界に広く存在する酸性の糖質であり、哺乳動物の生体内でラクトース−６−リン酸からＮ−アセチルマンノサミンを経由して合成される。このシアル酸は、ガングリオシドや糖蛋白質の構成成分として脳や中枢神経系に特に多く含まれており、シアル酸含量が成長期（乳児期）に急激に増加することから、脳や中枢神経系組織の機能発現や発達に重要な役割を果たしていると考えられている。例えば、 Carlsonらは、シアル酸を乳児期のラットに経口投与すると大脳や小脳のシアル酸含量が増加することを明らかにしている (Carlson,S.E., J. Nutr., vol.116, pp.881-886, 1986)。また、Morganらは、シアル酸の投与で記憶学習能が向上したという結果を報告している(Morgan,B.L.G., J. Nutr., vol.110, pp.416-424, 1980)。しかしながら、シアル酸の経口投与による脳中シアル酸含量の増加は決して高いものではなく、脳や中枢神経系組織の機能発現や発達に効果を示すより優れたシアル酸化合物の開発が望まれている。
【０００６】
一方、リン脂質は生体膜の重要な構成成分であり、コレステロールと共に疎水性の脂質二重層膜を作っている。この脂質二重層は、単なる隔壁にとどまらず種々の生理機能をも備えている。例えば、神経機能との関連では、脳スライスにリン脂質を添加するとアセチルコリンの放出が起こることが知られている。また、リン脂質を動物に投与する実験においては、老齢における記憶障害の改善やアセチルコリン放出活性の回復が認められたという報告がなされている（Magil,S.G. et al., J. Nutr., vol.111, p.166, 1981)。さらに、脳中のリン脂質は、加齢と共に減少することが知られている。そして、この現象により膜の流動性が減少し、それに伴って神経伝達速度も低下すると考えられている（蛋白質・核酸・酵素, vol.35, p.527, 1990)。したがって、リン脂質の生体組織内での代謝を促進することは、脳中のリン脂質をも増加させることにつながり、非常に意義深いことと考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、全脳中のリン脂質含量やガングリオシド含量の増加を促進する効果を有する物質について、鋭意研究を進めていたところ、乳糖とＮ−アセチルノイラミン酸とを原料としてβ−ガラクトシダーゼの糖転移反応により合成した一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖（但し、式中Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸残基を示し、ｎは１又は２の整数を示す。以下、同じ）が、全脳中のリン脂質やガングリオシドの代謝を促進すること、すなわち、脳中のリン脂質とガングリオシドの総量を増加させる効果を有することを見出した。
【０００８】
そして、このＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を投与することにより、脳機能を改善することができることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を有効成分とする脳機能改善剤を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明では有効成分として一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を使用する。このオリゴ糖は、ガラクトースとＮ−アセチルノイラミン酸とが結合したオリゴ糖であって、乳糖とＮ−アセチルノイラミン酸またはその塩とを原料としてβ−ガラクトシダーゼの糖転移反応により合成される。
【００１０】
この一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖には、以下の構造を有するオリゴ糖が含まれる。
(1) Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→８）−Ｎ−アセチルノイラミン酸
(2) Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→９）−Ｎ−アセチルノイラミン酸
(3) Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→８）−Ｎ−アセチルノイラミン酸
【００１１】
シアル酸は一般的に糖鎖の非還元末端に位置し、様々な生理機能を発揮することが知られているが、本発明の有効成分として使用する一般式 (Ｇａｌ)n−Ｎｅｕ５Ａｃで表されるＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖（以下、単にＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖という）中に含まれるシアル酸は、糖鎖の還元末端に位置するという特徴を有する。なお、このような糖鎖構造を有する物質については、ラットの胎児期の神経細胞に存在することが報告されているのみであり、その生理機能が注目されている (Higuchi et al., Liebigs Ann. Chem., pp.1-10, 1991)。
【００１２】
次に、本発明の有効成分のＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖の調製方法について具体的に説明する。
【参考例１】
特開平7-316177号公報の記載に従ってＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を製造した。すなわち、乳糖1,000gとＮ−アセチルノイラミン酸ナトリウム560gとを温水3,500gに溶解し、酢酸でpHを 6.0に調整した後、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans)由来のβ−ガラクトシダーゼ (大和化成) 500mg を加え、40℃で48時間反応させた。そして、この反応液を 100℃で１分間加熱して酵素反応を停止させた後、アニオン交換樹脂(Dow 1; 酢酸型、室町化学) を充填した直径40cm×長さ70cmのカラムに通液し、生成したＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖と未反応のＮ−アセチルノイラミン酸を樹脂に吸着させた。次に、このカラムに充分量の脱イオン水を通液して酵素反応で生成したガラクトオリゴ糖及びその他の中性糖を除去した後、０〜0.3Mの酢酸ナトリウム溶液を用いたグラジェント溶出により、樹脂に吸着したＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を溶出した。なお、この溶出条件により未反応のＮ−アセチルノイラミン酸とＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖とを完全に分離することが可能となった。さらに、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を含む溶出画分を電気透析 (モデルTS−24型、膜面積：カチオン膜、アニオン膜共に960dm2、トクヤマ社) で脱塩し、減圧濃縮した後、凍結乾燥してＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖の白色粉末250g (純度95％) を得た。
【００１３】
本発明における脳機能改善作用について試験例を示して説明する。
【試験例１】
参考例１で得られたＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を使用し、全脳中の脂質量の変化について調べた。なお、実験動物として８週齢のＳＤ系雄ラット（日本チャールズリバー）を使用した。まず、全てのラットを標準食(AIN-93 G)で７日間予備飼育した後、１群６匹からなる４群に分け、表１に示した組成の飼料をそれぞれの群に投与した。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
ラットの飼育は、湿度60％、室温24℃、light-darkコントロール12時間の条件下で行い、ラットに飼料及びイオン交換水を自由に摂取させて２週間飼育した。そして、２週間後、ラットをエチルエーテルで麻酔して全脳を摘出し、全脳の重量を測定した後、凍結乾燥して全脳中の各脂質含量を分析した。その結果を表２に示す。
【００１６】
全脳中の各脂質の分析は以下のように行った。
全脂質の抽出
ラットから摘出した全脳の試料(1〜1.5g) に30倍量のクロロホルム：メタノール：水(4:8:3) からなる溶媒を加えて５分間ホモジナイズした後、10分間遠心分離して抽出液を得た。さらに、遠心分離の残査にクロロホルム：メタノール：水(4:8:3) からなる溶媒30ml加えて再抽出して抽出液を得た。そして、この両抽出液をあわせて 100mlに定容し、これを脂質分析用の試料とした。
【００１７】
ガングリオシドの分析
(1) 陰イオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィー
ＤＥＡＥ−セファデックスA-25（酢酸型、ファルマシア社）８mlをカラムに充填し、２倍量のクロロホルム：メタノール：水(4:8:3) で平衡化した後、脂質抽出液50mlを通液してガングリオシド等の酸性物質を吸着させた。次に、クロロホルム：メタノール：水（4:8:3)からなる溶媒80mlで非吸着物質を溶出した後、クロロホルム：メタノール：5M酢酸ナトリウム(30:60:8) からなる溶媒60mlで酸性物質を溶出して回収した。
【００１８】
(2) 弱アルカリ分解及び透析
上記(1) で回収した溶出液を濃縮した後、0.5M水酸化ナトリウムを含むメタノール溶液20mlを加え、37℃で２時間放置してエステル脂質を加水分解した。そして、酢酸で中和した後、メタノールを除去し、混在する不純物を透析により除去した。なお、透析は５℃で２日間行い、透析終了後、内液を濃縮及び凍結乾燥して粗ガングリオシドを得た。
【００１９】
(3) シリカゲルカラムクロマトグラフィー
クロロホルム：メタノール(85:15) からなる溶媒に懸濁し、脱気したイアトロビーズ (イアトロン社) 2.5gをガラスカラムに充填した後、クロロホルム：メタノール(85:15) １mlに溶解した粗ガングリオシドを通液してガングリオシドを吸着させた。次に、クロロホルム：メタノール(85:15）からなる溶媒30mlで不純物を溶出した後、クロロホルム：メタノール(3:7) からなる溶媒50mlでガングリオシドを溶出した。そして、溶媒を除去した後、一定量に定容して定量用の試料とした。
【００２０】
(4) ガングリオシド中に含まれる総シアル酸量の分析
定量用の試料から一定量を分取し、窒素ガスで乾燥した後、レゾルシノール塩酸試薬２mlを加えて撹拌し、 100℃で30分間加熱して発色させた。そして、直ちに冷却した後、酢酸ブチル：１−ブタノール(85:15) からなる溶液４mlを加えて色素を抽出し、580 nmの吸光度を測定することにより、ガングリオシド中に含まれる総シアル酸量を定量した。
【００２１】
(5) ガングリオシド組成の分析
定量用の試料から一定量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に注入し、以下の測定条件でガングリオシド組成を分析した。
カラム; Aquasil SS (６mm×200mm)
溶離液; アセトニトリル：イソプロピルアルコール：50mMテトラアンモニウムクロリド水溶液(20:68:12)〜(5:43:52）のグラジェント溶出
検出器; UV 208nm
【００２２】
脂質の分析
トリグリセライドの分析は、トリグリセライド−テストワコー (アセチルアセトン法、和光純薬) を使用して行った。また、リン脂質の分析は、リン脂質−テストワコー (過マンガン酸塩灰化法、和光純薬) を使用して行った。さらに、コレステロールの分析は、デタミナTC555(酵素法、協和メディックス) を使用して行った。
その結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
表中の値は平均値±標準偏差であり、単位はmg/g全脳湿重量である。
全脳中のリン脂質量及びガングリオシド含量は、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖投与群で対照群、乳糖投与群及びＮ−アセチルノイラミン酸投与群に対して有意に増加していた。なお、全脳中のリン脂質脂肪酸組成及びガングリオシド組成に変化は認められなかった。
【００２５】
【試験例２】
参考例１で得られたＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を使用し、全脳中のガングリオシド含量の違いによる学習行動の改善に及ぼす影響を調べる目的で水迷路実験を行った。なお、実験動物として８週齢のＳＤ系雄ラット（日本チャールズリバー）を使用した。まず、全てのラットを標準食(AIN-93 G)で７日間予備飼育した後、１群６匹からなる４群に分け、試験例１の表１に示した組成と同様の飼料をそれぞれの群に投与した。ラットの飼育は、湿度60％、室温24℃、light-darkコントロール12時間の条件下で行い、ラットに飼料及びイオン交換水を自由に摂取させて10日間飼育した。
【００２６】
そして、図１に示したような“water filled multiple T-maze"で、縦及び横の長さがそれぞれ 120cm、深さが40cmの水槽にＴ字型迷路を組み合わせ、11ヶ所の盲路を配置して、石崎の方法(Ishizaki, Exp. Anim., vol.27, pp.9-12, 1978) により水温23〜24℃で水迷路実験を行った。まず、実験の前に直進水路で５試行した後、水迷路で翌日から４日間連続して３回試行（総計15回）し、水迷路の出発点から目標点に到達するまでの所要時間を測定した。その結果を図２に示す。
【００２７】
水迷路実験開始１〜３日目において出発点から目標点に到達するまでの所要時間は、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖投与群で対照群及び乳糖投与群に対して有意に短かった。また、水迷路実験開始２日目において出発点から目標点に到達するまでの所要時間は、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖投与群でＮ−アセチルノイラミン酸投与群に対して有意に短かった。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明では、脳機能改善剤の有効成分としてＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を使用する。このＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖は、担体、その他製剤に用いられる慣用の成分とともにあるいはそのまま製剤にする。製剤の形態としては、通常糖衣錠、タブレット等の錠剤、顆粒剤、液剤、カプセル等として、経口的に投与するとよい。また、この脳機能改善剤を栄養組成物等を含む飲食品に配合して使用してもよい。このような飲食品としては、ヨーグルト、チーズ、パン、ドリンク飲料等を例示することができる。なお、全脳中のリン脂質やガングリオシドの代謝を促進して脳機能改善効果を発揮させるためには、成人一日当たり少なくとも 10mg/kg体重、望ましくは30〜100mg/kg体重のＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖を摂取させればよい。
【００２９】
【実施例１】
参考例１で得られたＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖1.1gを日本薬局方の内服用ゼラチンカプセル０００号に充填し、脳機能改善剤を製造した。
【００３０】
【実施例２】
脱脂粉乳３kgに温水19.4kgを加えて撹拌し、95℃で10分間殺菌した後、42℃まで冷却した。この還元脱脂乳にラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus
bulugaricus)とストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus) の混合スターターMRC-32を接種し、42℃で４時間発酵させて培養物を調製した。一方、水 7.3kgに異性化糖５kg、ペクチン125g、参考例１で得られたＮ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖110gを加えて撹拌溶解し、90℃で10分間殺菌した後、10℃まで冷却して糖質溶液を調製した。そして、撹拌しながらこの糖質溶液に上記の培養物を添加し、均一に混合した後、ホモゲナイゼーで均質化し、１リットル容量の紙容器に充填して、脳機能改善効果を賦与したドリンクヨーグルトを製造した。
【００３１】
【発明の効果】
Ｎ−アセチルノイラミン酸結合オリゴ糖は、全脳中のリン脂質やガングリオシドの代謝を促進する効果を有し、学習行動改善等の脳機能改善効果を示すので、医薬や飲食品の素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例２で使用するＴ字型水迷路の平面図を示す。
【符号の説明】
１〜１１  盲路番号
【図２】試験例２におけるＴ字型水迷路の出発点から目標点に到達するまでのラットの所要時間を示す。
【図１】
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【図２】
0004044630.tif 000005