(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス１型１７株の変異型であって、１７株のゲノムに関して、その変異型のゲノムが、変異型が神経毒性を欠くように、ＢａｍＨＩｓ領域の内部反復配列ＲL（０．８１−０．８３ｍｕ）内およびその対応領域の末端配列ＲL（０−０．０２ｍｕ）内で修飾されていることを特徴とするＨＳＶ−１ １７株の変異型。
【請求項２】
ゲノムがその各領域において欠失により修飾されている請求項１に記載の変異型。
【請求項３】
１７株のゲノムに関して、少なくとも１００個のヌクレオチドがヌクレオチド１２５０７４と１２５９７２の間の内部配列ＲLにて、およびその対応領域の末端配列ＲLにて欠失している請求項２に記載の変異型。
【請求項４】
欠失が、各々、０．５ないし３ｋｂの大きさである請求項２または３に記載の変異型。
【請求項５】
欠失が、各々、０．７ないし２．５ｋｂの大きさである請求項４に記載の変異型。
【請求項６】
１７１４株（ＥＣＡＣＣ受入れ番号Ｖ９２０１２８０２）である請求項１に記載の変異型。
【請求項７】
１７１６株（ＥＣＡＣＣ受入れ番号Ｖ９２０１２８０３）である請求項１に記載の変異型。
【請求項８】
単純ヘルペスウイルス１型１７株の変異型の製法であって、得られた変異型が神経毒性を欠くように、１７株のＢａｍＨＩｓ領域の内部反復配列ＲL（０．８１−０．８３ｍｕ）およびその対応領域の末端配列ＲL（０−０．０２ｍｕ）が修飾されていることを特徴とする製法。
【請求項９】
無毒性単純ヘルペスウイルスを適当な担体またはアジュバントと混合してなるワクチンであって、単純ヘルペスウイルス株が単純ヘルペスウイルス１型１７株の変異型であり、その変異型のゲノムが、株１７のゲノムに関して、変異型が神経毒性を欠くように、ＢａｍＨＩｓ領域の内部反復配列ＲL（０．８１−０．８３ｍｕ）内およびその対応領域の末端配列ＲL（０−０．０２ｍｕ）内で修飾されていることを特徴とするワクチン。
【発明の詳細な説明】
本発明は、神経毒力を欠く単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）の変異型に関する。このような変異型はヒトにおけるＨＳＶ感染の予防のための弱毒化生菌ワクチンの調製において重要である。
単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）および２型ウイルス（ＨＳＶ−２）は重大なヒトの病原体であり、全人口の８０％以上に感染し、再発性粘膜皮膚障害を起こす。複製後、ＨＳＶは末梢神経系にはいり、未知の機構により活性な複製は終わる。その後、神経細胞において潜伏感染が確立され、これは宿主の存命中存続する。ＨＳＶは潜伏状態から再活性化することができ、感染症が起こる。ＨＳＶは比較的良性の皮膚障害から致命的ウイルス性脳炎まで及ぶ広範囲の病気の原因である。
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方の遺伝子構成を説明するために、既にかなりの研究がなされている。ＨＳＶ−１ゲノムは２成分ＬおよびＳを含む約１５２キロ塩基対の直線状二本鎖ＤＮＡ分子である。各成分は、逆向反復配列を末端とする独自の配列Ｕ1およびＵs’を含む。ＨＳＶ−２ゲノムの構成もにているが、同じではない。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の遺伝子構成の詳細な記載は、McGeoch（１９８７）を参照。
ウイルス性病原性に関する遺伝子の同定およびその厳密な機能の説明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の生物学的理解のためには重要である。ウイルスゲノムの長および短領域の両方の元配列および反復配列において特定の欠失を有する両ＨＳＶ−１型（１７株）およびＨＳＶ−２型（ＨＧ５２株）の多くの変異型は既に単離され、形質化されている（Brownら、１９８４年、HarlandおよびBrown（１９８５）、BrownおよびHarland（１９８７）、MacLeanおよびBrown（１９８７ａおよびｂ）、HarlandおよびBrown（１９８９）参照）。しかし、ＨＳＶの神経毒力を制御する分子機構については余り知られていない。ＪＨ２６０４と称するＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の欠失変異型は、マウスの大脳内接種に関して無毒性である（Tahaら、１９８９ａ参照）。ＪＨ２６０４はゲノムの長反復領域の両複製（即ち、末端長反復（ＴＲL）および内部逆長反復（ＩＲL）領域）中に１４８８塩基対の欠失を有する。
ＲＥ６と称するＨＳＶ−１ １７株／ＨＳＶ−２ ＨＧ５２株組み換え体（Institute of Virology,Glasgowで、Marsdenらにより１９７８年に初めて単離）もマウスにおいて無毒性であると報告されている（Thompsonら、１９８９年参照）。
ａｂおよびｂ’ａ’で示されるＨＳＶ−１、Ｌ成分の逆向反復配列はそれぞれ約９Kbpであり、Ｓ成分のｃ’ａ’およびｃａはそれぞれ約６．５Kbpである。ＬおよびＳ成分の逆向反復配列が共有する配列は、「ａ」配列と表わす。この配列は、ChouおよびRoizman（１９８６）によりプロモーター調節配列およびＬ成分の逆向反復配列のｂ配列にある二倍体遺伝子の転写開始部位を含むと報告されている。ＨＳＶ Ｆ株に関する研究により、転写されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が「ａ」配列およびＩＥ１で示される即時型初期遺伝子間に存在すると報告されている。抗ペプチド血清の使用により、ＯＲＦがＩＣＰ ３４．５蛋白質を特定することを示すことができる（Ackermannら、１９８６年参照）。最近、ChouおよびRoizman（１９９０）は、彼らの新たに予想するＯＲＦは分析した他の２種のＨＳＶ−１株に保持されるが、Glasgow株ＨＳＶ−１（１７）ｓｙｎ+中には保持されないことを報告している。Chouら（１９９０年）は、ＨＳＶ−１の神経毒力部はＩＣＰ ３４．５とコマップし、ＩＣＰ ３４．５の発現を要することを示している。
驚くべきことに、ＲLの末端部が修飾されたＨＳＶ−１ Glasgow １７株変異型は神経毒性を有さないことが判明した。
このような変異型はＣＮＳニューロンにおいて複製できないが、末端組織においては複製できるので、マウスにおいては複製でき、良好な免疫学的細胞性応答を惹起する。この能力はこれらの株のワクチンのポテンシャルを示すものである。
本発明によると、ＨＳＶ−１ １７株の変異型であって、ＨＳＶ−１ １７株のゲノムに関して、その変異型のゲノムが、変異型が神経毒性を欠くように、ＢａｍＨＩｓ領域の内部反復配列ＲL（０．８１−０．８３ｍｕ）内およびその対応領域の末端配列ＲL（０−０．０２ｍｕ）内で修飾されている、変異型が提供される。
該ゲノムはその各領域において欠失により修飾されていることが好ましい。かくして、ＨＳＶ−１ １７株のゲノムに関して、少なくとも１００個のヌクレオチドをヌクレオチド１２５０７４と１２５９７２の間の内部配列ＲLにておよびその対応領域の末端配列ＲLにて欠失させることができる。
本明細書において用いる「修飾された」という語は、１以上のヌクレオチドの欠失、別のヌクレオチドの挿入、または転位などのヌクレオチド配列の他の変更、あるいは置換によるBam ＨＩ ｓフラグメントの分裂を意味する。特に断らない限り、「Ｂａｍ ＨＩｓ」なる語は、本明細書において、ＨＳＶ ＲL領域の約３ｋｂのＢａｍ ＨＩｓフラグメントの各コピーを意味する。
本発明のＨＳＶ−１変異株は自然に単離された欠失変異型であるかまたは望ましい修飾が導入された野生型株であってもよい。かくして、本発明は該発明の変異型の製法であって、得られた変異型が神経毒性を欠くように、ＨＳＶ−１ １７株のＢａｍＨＩｓ領域の内部反復配列ＲL（０．８１−０．８３ｍｕ）内およびその対応領域の末端配列ＲL（０−０．０２ｍｕ）内に修飾を導入することからなる方法を提供する。
ＨＳＶ株におけるこのような修飾は遺伝子操作により、例えば部位特異的変異処理、またはあらかじめ調製した所望の修飾を含むＤＮＡカセットで置換するかあるいは置換せずにゲノムの一部を切除することによりなされる。あるいは、天然の存在するＨＳＶ−１変異型、例えば欠失変異型を単離することができる。
好ましい一態様において、ＨＳＶ−１株は、ａ配列内の１２５０７４npおよび１２５９７２npのAlu ＩサイトおよびそのＴＲLにおける対応する配列間のBam ＨＩ ｓ’領域において最低１００ヌクレオチドが欠失している株である。
より好ましくは、Bam ＨＩ ｓ’領域の０．５〜３kbおよびＴＲLにおける対応部が欠失しており、更に好ましくは、約０．７〜２．５kbが欠失している。
一例においては、ＨＳＶ−１変異型は１７１４と称する株であり、これは１７０２変異型の自発的欠失変異型であって、以下に記載するように、ＲL領域のBam ＨＩ ｓフラグメントの各コピー内で７５９bpが欠失し、非神経毒力に関する欠失は、１２５２１３および１２５９７２のヌクレオチドポジション間に位置する。
このような欠失は「ａ」配列の１８bpのＤＲ1エレメントの完全なコピーを除去し、即時型初期遺伝子１の５’末端の１１０５bp上流で終わる。
別の例においては、ＨＳＶ−１変異型は、１７１６と称する変異型であり、１７１４変異型の７５９bpの欠失が野生型Glasgow１７+株に導入されているものである。
本発明をより明確に理解するために、以下の第１図を参照する。図中：
（ａ）プロトタイプ配列のＨＳＶ−１ゲノム（マップ単位を示す）を示す。
（ｂ）BamＨＩ ｋ（ｓ＋ｑ）の展開を示す。１７１４／１７１６における欠失に接するBamＨＩ（Ｂ）およびAluＩ（Ａ）サイトに印を付けた。全座標は、McGeochら（１９８８）のナンバリングに基づいている。ＩＥ１の５’末端、「ａ」配列、「ａ」配列のＤＲ1／Ｕb境界、１８９bpのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２間の保守的オープンリーディングフレーム（ＲL ＯＲＦ）ならびに１７１４／１７１６における７５９bpの欠失の終点も示す。欠失はＤＲ1／Ｕb境界から広がり、ＲL  ＯＲＦの５’１０７bpが除去される。
本発明は、更に本発明のＨＳＶ−１ １７株の変異型を適当な担体またはアジュバントと混合してなる完全ウイルスワクチンを提供する。かかるワクチンは、免疫防御的でかつ非毒性量の本発明の変異株を含む。かかるワクチンは、該株を単独または他の抗原および／またはアジュバントとともに含んでもよい。
その非病原性により、本発明のウイルスは例外的に更に修飾してもよい。例えば、更に修飾して異型抗原を担うようにしてもよい。ウイルスに遺伝子操作して、ＨＳＶ−２からＨＳＶ−２ ｇＤ等の抗原を発現するようにできる。このようなウイルスは、１型および２型ウイルスの両方に対する抗体およびＣＴＬ応答を惹起し、更に全体の免疫応答を向上させる。同様に、本発明のウイルスにより他の病原体から他の抗原を得ることができる。例えば、ＨＣＭＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７およびＨＩＶならびに他のエンベロープウイルス由来の遺伝子産物を得ることができる。
更に本発明のウイルスは、突然変異、代表的には温度感受性突然変異をカプシド蛋白質Ｐ４０をコードする遺伝子ＵＬ２６ａに導入することにより修飾してもよい（Liu＆Roizman １９９１ ａ＋ｂ）。
非許容温度（典型的には３８．５℃）でのこのような突然変異の結果、軽粒子即ちヌクレオカプシドおよび核酸を有さない、従って感染力を有さないウイルス粒子が過剰に産生される。J of Gen Virology（１９９１）７２ ｐ６６１ Szilagyi and Cunningham参照。
軽粒子は本明細書に記載のウイルスより誘導される。かかるヘルペスウイルス軽粒子は異型抗原を有することができる。例えば、ＨＳＶ−１ １７１６はＨＳＶ−２ ｇＤを発現するように修飾され、またＵＬ２６ａ遺伝子において３８．５℃にて温度感受性突然変異を含むようにも修飾されており、この突然変異体はＨＳＶ−２ ｇＤを含有する軽粒子を過剰に産生する。他のＨＳＶ−２蛋白質はこのようなウイルス、とくにＨＳＶ−２遺伝子産物ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４およびVmw ６５ kDに含まれてもよい。ＨＣＭＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７などの他のヘルペスウイルスおよびＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２等の外被ウイルス由来の膜蛋白質も得られる。例えば、ＨＣＭＶ由来のｇＢ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２由来のｇｐ１２０もウイルス軽粒子に含まれてもよい。理論的には、軽粒子は、ウイルスが細胞内にはいるのを妨げないいかなる異型膜蛋白質も担うことができる。
軽粒子は、Szilagyi＆Cunninghamの方法（前出）の変法により調製できる。簡単にいえば、細胞を５pfu／個で非許容温度（ｎｐｔ）３８．５℃にて感染させ、上清ウイルスを感染の３０時間後に収穫する。この調製物をあらかじめ調製した５〜１５％Ficoll（イーグル培地中で調製）勾配で２時間１２Ｋで遠心分離する。軽粒子帯を２６Ｇニードルを用いて除去し、２０Ｋにて一夜通常細胞増殖培地（Eagles）中でペレット化する。
軽粒子はワクチンの目的に関して有用である。従って、ワクチンは、異型抗原を担う本発明の変異型からの軽粒子を有することができる。
別法として、あるいは前記変法に加えて、本発明の変異ウイルスは突然変異、典型的には欠失を導入することにより修飾してもよく、これにより、ＬＡＴプロモーターの効力がなくなる。このような突然変異により、更に安全性が高まり、潜伏状態からの再活性化の頻度および割合が減少する。
更に、異型抗原の発現に加えて、あるいはそのかわりに、遺伝子ＵＬ２６ａに温度感受性突然変異を編入し、軽粒子の過剰産生を可能にし、その結果存在する潜在的感染性ウイルスの量を減らすことができる。このような軽粒子はウイルス粒子のFicoll遠心分離により感染性ウイルスから分離される。通常、軽粒子帯における軽粒子に対する重粒子の割合は、１：１０3であるが、ＵＬ２６ａ中に突然変異を編入した場合、軽粒子に対する重粒子の割合は典型的には１：１０6のオーダーである。
本発明はまた完全ウイルスワクチンの調製法を提供し、該方法は、本発明の変異株を適当な担体またはアジュバントと混合することからなる。
弱毒化生菌ワクチンの調製のために、標準的方法を用いてもよい。
ヒトにおけるＨＳＶ感染は、この感染の治療を必要とするヒト患者に免疫学的有効量の本発明のワクチンを投与することによって処置することができる。
本発明のワクチンの投与法は、免疫防御量の変異株を送達する適当な経路とすることができる。しかし、ワクチンは好ましくは筋肉内または深皮下経路により非経口投与されるのが好ましい。経口投与または他の非経口経路、たとえば皮内、鼻腔内、または静脈内などの他の投与方法が好ましい場合は用いてもよい。
このようなワクチンの適当な免疫防御的非毒性量は当業者には容易に決定できる。即ち、本発明のワクチンに含まれる免疫防御的非毒性量の本発明の変異株は通常の完全ウイルスワクチン中の抗原の有効量の範囲であってよい。しかし、特定の患者に関する特定の投与レベルは、患者の年令、健康状態、性別および食事；投与時間；投与経路；投与される他の薬剤との相乗効果；および要求される防御の程度を含む種々の要因に左右される。もちろん、必要ならば適当な間隔をおいて投与を繰り返すことが出来る。
以下の実施例で本発明を説明する。
実施例
方法
細胞
乳児ハムスター腎臓クローン１３細胞（ＢＨＫ２１／Ｃ１３）（MacPhersonおよびStoker、１９６２年参照）を通常濃度の２倍のビタミンおよびアミノ酸、５％（ｖ／ｖ）トリプトースホスフェートブロスおよび１０％（ｖ／ｖ）仔牛血清（ＥＴＣ１０）を含むイーグル倍地中で増殖させた。
ウイルス
ウイルスストックを既に記載したようにして（Brownら、１９７３年参照）、ＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞中で成長させ、滴定した。親ＨＳＶ−１株はGlasgow１７株（Brownら、１９７３年参照）であった。通常存在する４つのＨＳＶ−１ Xbalサイトがない１７０２変異型はそれから１７１４が単離される親株である（MacLean and Brown、１９８７ａ参照）。
ウイルスゲノムの制限酵素分析
Lonsdale（１９７９）の方法の変法により制限酵素分析を行った。ＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞を32Ｐiの存在下に、１％（ｖ／ｖ）仔牛血清を含む燐酸塩を含まないEagle培地中で感染させ、３１℃にて４８時間培養した。ウイルスＤＮＡをＳＤＳおよびフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを製造者の推奨する条件を用いて種々の制限酵素で処理した。消化物をＴＢＥ緩衝液（８９mM−Tris、８９mM硼酸、２mM ＥＤＴＡナトリウム）中適当な濃度（０．５〜０．８％）のアガロースゲル上電気泳動により分析する。ゲルを風乾し、Kodak ＸＳ １フィルムにさらした。
ＤＮＡ−ＤＮＡ  ハイブリダイゼーション
制限エンドヌクレアーゼ消化物から得たＤＮＡフラグメントをSouthern（１９７５）の方法によりアガロースゲルからHybondナイロン膜（Amersham）に移し、ＰＡＴ１５３中にクローン化したBam ＨＩ ｋ（ｓ＋ｑ）フラグメントから調製したランダムプライムＤＮＡとハイブリッド形成させた。６５℃にて、７％ＳＤＳおよび０．５Ｍ NaPを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（pH７）中で１６時間ハイブリッド形成を行った。プレハイブリダイゼーションは行わなかった。フィルターを既に記載したようにして洗浄した（Brownら、１９８４年参照）。
動物接種
３週令のＢＡＬＢ／Ｃマウス（Bantin and Kingman参照）に各ウイルスストックを頭蓋内接種した。マウスをエーテルで麻酔し、０．０２５mlの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）５％仔牛血清中適当なウイルス希釈液を大脳左半球の中心部に接種した。４匹のマウスに１０1から１０7pfu／動物の量の各ウイルスを接種した。ウイルスストックは接種の日に必ず再滴定し、接種した正確な力価を測定した。マウスを接種後毎日観察し、２１日までの死亡を基準としてＬＤ50をReed and Muench（１９３８）の公式にしたがって計算した。接種後に死亡した動物から脳を取りだし、均質化し、超音波処理し、得られた懸濁液をＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞に関して滴定した。ウイルスプラークを取りだし、その制限酵素特性を記載したようにして測定した。
ウイルスのin vitroの増殖性
ＢＨＫ２１／Ｃ１３（２×１０6）細胞を５pfu／細胞の多重度で感染させる。３７℃にて４５分間吸収を行い、５％ＣＳを含有する燐酸緩衝食塩水で２回洗浄し、１０％ＣＳを含有する２mlのEagle培地を添加した後、培養を３７℃にて続ける。サンプルを０、２、４、６、８、１２、１６、および２４時間目に収穫し、超音波処理により放出されるウイルスを３７℃で滴定した。
チミジンキナーゼ検定
用いた方法は、JamiesonおよびSubak−Sharpe（１９７４）の方法の変法であった。ＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞を多重度５pfu／細胞で野生型または突然変異ウイルスで模擬感染または感染させた。１時間吸収させ、３７℃にて６時間培養した後、細胞を冷ＰＢＳ中に集め、ペレット化した。ペレットを氷上に５分間保持した溶菌緩衝液（２０mM Tris−HCl pH７．５、２mM MgCl2、１０mM NaCl、０．５％ｖ／ｖNonidet Ｐ４０、６．５mM ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させ、手早く混合し、更に５分間氷上に戻した。サンプルを遠心分離し、上清を保持した。５μlの抽出物を合計容積５０μlの反応緩衝液（０．５Ｍ Na2ＰＯ4pH６、１００mM MgCl2、２mM ｄＴＴＰ、１００mM ＡＴＰ、５μl Me3Ｈチミジン水溶液１ｍCi／ml）と混合した。１時間培養した後、１０μlの１００mM ＥＤＴＡおよび１mMチミジンを添加することにより反応を停止した。サンプルを３分間１００℃にて加熱し、３分間氷上においた。遠心分離後、上清をＤＥ８１ディスク上にスポットし、４mM蟻酸アンモニウム（pH６．０）および１０μＭチミジンで３回洗浄した（各々３７℃にて１０分）。更に２回エタノールで洗浄した後、ディスクを乾燥し、3Ｈチミジンによる放射能を測定した。
野生型Glasgow１７株への欠失の導入
１７１４欠失を野生型１７株へ導入するために、１７１４のクローン化した新規BamＨＩ ｋフラグメントをBamＨＩで直線化し、１７+からの完全なＤＮＡと１、２、５、１０、および２０モル過剰でコトランスフェクションした。得られた個々のプラークを単離し、Lonsdaleの方法（１９７９）によりそのＤＮＡを分析した。欠失変異をうけたウイルスを、ウイルスストックを増殖させる前に更に３回プラーク精製した。
配列分析
１７１４の新規BamＨＩ ｋフラグメントを標準的方法（Maniatis、１９８２年）を用いてｐＧＥＭ ３ｚのBamＨＩサイト中にクローン化した。制限酵素分析を用いて陽性のクローンを同定し、総ＨＳＶ−１ ＤＮＡのサザンブロッティングにより陽性クローンからのランダムプライムＤＮＡを用いて確認した。更に制限酵素分析により、欠失の大きさが約８００bpで、２．８kb AluＩフラグメント中にあることがわかった。このフラグメントをゲルから溶出し、SmaＩで消化し、数個の小フラグメントをＭ１３ｍｐ８中にサブクローン化した。１本鎖鋳型ＤＮＡを調製し、35Ｓ標識ｄＡＴＰを用いてSangerらの方法（１９８０）により配列決定した。配列化生成物を６％アクリルアミド、１×ＴＢＥ、８．３Ｍ尿素ゲル上にかけた。
潜伏状態の研究
３週令のＢＡＬＢ／Ｃマウス（Bantin＆Kingman）に既に記載したようにして右後肢に接種した（Clements＆Subak−Sharpe、１９８３、１９８８年）。接種時にウイルスをＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞に関して滴定して投与する正確な用量を確認した。各ウイルスに関して１００倍希釈を接種し、マウスを試験し、毎日症状を採点した。６週間いきたマウスを潜伏ウイルスの存在に関して試験した。マウスを殺し、解剖し、接種した側から胸神経節（２個）、腰神経節（６個）、および上部仙骨神経節（２個）を切り取り、培地中におき、２日おきに培地を対照ＢＨＫ２１／Ｃ１３に移すことにより感染性ウイルスの放出をスクリーンした。接種したＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞を３７℃にて２日間培養し、その後ウイルスプラークまたはｃｐｅの存在に関して染色し、試験した。
実施例１
（ａ）変異型１７１４の単離およびゲノム分析
ＨＳＶにおける組み換えを研究するために、本発明者らは未選択マーカーとして用いられる特定の制限酵素サイトがないウイルスを構築した（Brownら、１９８４；HarlandおよびBrown、１９８５；MacLeanおよびBrown、１９８７ｃ参照）。ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７０２（MacLeanおよびBrown、１９８７ｃ）（４個のＨＳＶ−１ XbalサイトおよびＴＫ-がない）は部位特異的変異処理により種々のHindIIIサイトを除去するのに用いられる親ウイルスである。１７０２由来であるが、０．９１mu HindIIIサイトがないウイルス分離株Ｈ１由来のＤＮＡを０．１８mu HindIIIサイトがない突然変異誘発プラスミドとコトランスフェクションした。多数の得られた子孫プラークを取り、そのＤＮＡを制限酵素分析に付した。０．１８mu HindIIIサイトがない所望の突然変異体の単離に成功したこと加えて、HindIIIサイトがないことと無関係な異常ＲＥ性を有するウイルス（１７１４）を検出した。
１７１４ＤＮＡのKpnＩ消化によりKpnＩ ｒ（２．４×１０6mw）がなくなり、約１．９×１０6mwの新規バンドがフラグメントｔおよびｕ間に見られた。KpnＩ ｒはＲLの末端部であり（０〜０．０２５muおよび０．８０５〜０．８３mu）、結合フラグメントａ（ｒ＋ｊ）およびｅ（ｒ＋ｋ）を形成した。１７１４ｅフラグメントがそれと等価な野生型フラグメントの直前にあるのがわかるが、ゲルの頂点にあるａにおいて変更は見られなかった。同様に、HpaＩ ｍ（３．６×１０6mw）がなくなり、約３．１×１０6mol wtの新規バンドがｎ以降に検出できた。HpaＩ ｍ（０〜０．０３６muおよび０．７９〜０．８３mu）は結合ａ（ｍ＋ｃ）およびｄ（ｍ＋ｑ）を形成し、これは１７１４中１７+の直前に見られた。１７１４ＤＮＡのBamＨＩ消化により、BamＨＩ ｓ（１．９５×１０6mw）がなくなり、約１．４５×１０6mol wtのｕ／ｖ以降に新規バンドが見られる。結合ｋ（ｓ＋ｑ）を含有するBamＨＩ ｓも検出可能でないが、欠失した結合と考えられる３．５×１０6mol wtの新規バンドが１以下に見られる。
したがって、制限酵素特性により、１７１４は０〜０．０９５muおよび０．８１〜０．８３mu間のＲLの末端部の両コピーにおいて欠失していることがわかった。欠失の大きさは６００〜８００bp間であると考えられた。
ＲLの末端部の両コピーにおける配列の欠失を実証するために、１７１４ＤＮＡのサザンブロット分析を行った。１７+および１７１４ＤＮＡをBamＨＩで消化し、ニトロセルロース膜に移した。１７+ＤＮＡのBamＨＩ ｋフラグメント（ｓ＋ｑ）をランダムにプライム化し、消化したＤＮＡとハイブリッド形成した。１７+トラックにおいて、プローブはｋ、ｑおよびｓとハイブリッド形成したことが判明した。１７１４において、プローブはｋとハイブリッド形成しないが、新規ｋ、更に「ａ」配列を有する新規ｋおよびｑとハイブリダイゼーションした。ｓとハイブリダイゼーションは起こらないが、それ以降の新規ｓとハイブリダイゼーションした。
size-ladderにより欠失は約８００bpであることがわかった。この結果、１７１４がＲLの両コピーにおいて欠失しており、欠失がBamＨＩ ｓ内にあったことが明らかである。
（ｂ）配列分析
ＨＳＶ−１ １７株のBamＨＩ ｋ結合フラグメント（ｓ＋ｑ）は、ヌクレオチド位（ｎ．ｐ．）１２３４５９および１２９４０３間にある（McGeochら、１９８８年参照）。１７１４において、BamＨＩ ｋフラグメントは約８００bp欠失している。この１７１４の新規BamＨＩ ｋフラグメントをｐＧＥＭのBamＨＩサイト中にクローン化する。更に制限酵素分析により、欠失が、欠失変異型１７１４において野生型２．９kbフラグメントと比較して、大きさが約２．１kbであるAluＩフラグメント（１２５０７４〜１２７９６６ｎ．ｐ．）内にあることがわかった。この１７１４由来のAluＩフラグメントをアガロースゲルから溶出し、SmaＩで再消化し、得られたサブフラグメントをＭ１３ｍｐ８中にクローン化した。SmaＩフラグメントのジデオキシ配列決定により欠失の長さが７５９bpであり、ヌクレオチド位１２５２１３および１２５９７２間にあることがわかった。配列決定した残りのSmaＩフラグメントからは突然変異は検出されなかった。
ＲLにおいて唯一の厳密に定義された遺伝子はＩＲLの５’末端が１２４１０８ｎ．ｐ．、即ち欠失の１１０５bp下流にあるＩＥ１である。ＨＳＶ−１ １７株中のＩＲL／ＩＲS「ａ」配列はヌクレオチド位１２５９５４から始まる。１７１４において、「ａ」配列の１つの完全１８bp ＤＲＩエレメント（AGCCCGGGCCCCCCGCGG）を厳密に除去する。
実施例２
（ａ）Balb／cマウスに関する１７１４欠失変異体の神経毒性
本発明者らはすでにＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のＪＨ２６０４欠失変異体が、野生型ウイルスではＬＤ50値が＜１０2pfu／マウスであるのに対して＞１０7pfu／マウスであり、Balb／cマウスに対して非神経毒性であることを示した。ＪＨ２６０４の配列分析により、ゲノム長反復配列の末端部（０〜０．０２muおよび０．８１〜０．８３mu間）中の１４８８bp配列はＨＧ５２株に関する非神経毒性に対応することがわかった。
ＨＳＶ−１ゲノムの等価な部分において１７１４は欠失を有するので、Balb／cマウスにおけるＬＤ50値の測定によりその親１７０２および１７+に比較した１７１４の神経毒性を決定するための実験を行った。異なる用量の１７+、１７０２および１７１４を２５μlづつ３週令のBalb／cマウスの大脳左半球に接種した。脳炎による死を接種後２１日まで採点し、結果を第１表に示す。１７+のelite laboratory stockのＬＤ50値は＜１０1.5pfu／マウスであった。突然変異体１７０２は、ｔｋ陰性であるが（MacLeanおよびBrownら、１９８７ａ参照）、高いＬＤ50値、５×１０2pfu／マウスを示した。１７１４に関して、マウスは１０6pfuの接種物では死なないが、１０7pfuで３／４が死に、ＬＤ50値が７×１０6pfu／マウスであった。従って、欠失変異体１７１４は親１７０２ウイルスより最低２×１０4倍神経毒性が低く、野生型１７+より最低７×１０5倍神経毒性が高かった。１個のプラークを死亡した１７１４感染したマウスの脳から単離し、プラーク単離物のＤＮＡを制限酵素で消化した。ＲＥ特性は１７１４のそれと同じであり、これより野生型汚染物はないことがわかった。粒子：pfu比は、１７+に関しては７２：１、１７１４に関しては５８：１であり、ＨＳＶ−１の値の正常値内である。
（ｂ）１７１４のin vivo増殖
ＨＳＶ−２（ＨＧ５２）変異体ＪＨ２６０４は無毒性である、即ちマウスの脳において複製できず、壊死性脳炎を起こさないことが示された。（Tahaら、１９９０年参照）。１７１４の神経毒性の欠損がマウスの脳における複製が出来ないことによるかどうかを決定するために、１７+（１０2pfu）、１７０２（１０2pfu）および１７１４（１０5pfu）のサンプルを３週令のBalb／cマウスの大脳左半球に接種した。接種後いろいろな時期に、２匹のマウス（各ウイルスにつき）を殺し、その脳を取りだし、−７０℃にて凍結した。脳組織を均質化し、得られた懸濁液を超音波処理し、子孫ウイルスをＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞に関して３７℃にてプラーク滴定により検定した。この結果から、親株１７に関して、接種の１２時間後から６日後の間にウイルスの指数的増加が見られ、最終力価は８×１０6pfu／脳になる。１７０２と同様に、接種の２４時間後に検出可能なウイルスがあり、指数的増殖は６日までに力価が８×１０4pfu／脳に達する。１０5pfuの用量を服用した１７１４に感染した動物において、接種直後に２×１０3pfuが検出可能であった。複製は検出されず、接種３日後までに減少した投与ウイルスは検定可能なウイルスではなかった（＜１０pfu）。
（ｃ）１７１４のin vitro増殖
変異体１７１４はＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞中低多重度で多サイクルで増殖させることにより高力価（＞１０9pfu）に増殖する。ストックを３１℃、３７℃、および３８．５℃にて検定した場合、等しい力価が得られる。増殖パターンを決定するために、１サイクルの増殖実験を３７℃にてＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞中で行った。結果は、１７+および１７０２および１７１４変異体は同じようによく増殖し、最終収率は同じであった。１７１４の通常の１サイクルの増殖パターンは、ＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞中での複製サイクルのどの段階でも減少しない。
ウイルスが宿主に制限されるかどうかを決定するために、２４時間収率実験を多重度５pfu／細胞で感染した細胞系で行った。用いた細胞系は、ＢＨＫ／Ｃ１３（ハムスター）、ＢＳＣ１（サル）、Ｖｅｒｏ（サル）、ＭＤＣＫ（イヌ）、ＨＦＬ（ヒト）、および３Ｔ６（マウス）であった。３７℃で滴定したＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞における２４時間収率をＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞における収率に比較した特定の細胞系中で増殖したウイルスの収率の比として第２表に示す。１７+、１７０２および１７１４は基本的に類似した方法で挙動することがわかる。即ち、ＢＨＫ２１／Ｃ１３、３Ｔ６およびＭＤＣＫ細胞においては同程度に増殖し、Vero細胞においてより良く増殖し、ＨＦＬおよびＢＳＣＩ細胞においては余り増殖しない。マウス３Ｔ６細胞中では複製欠陥が見られず、このことはin vivoでの増殖がないことは種特異性ではないことを意味する。
実施例３
潜伏状態の研究
３週令のBalb／cマウスの右後肢に連続的１０倍希釈の１７+、１７０２および１７１４（４マウス／用量）を接種し、病気の徴候または死を２週間毎日モニターした。接種後６週間目に生き残ったマウスを「方法」（前出）に概要を示したようにして解剖し、神経節を培地を含むマイクロタイターウェルに別々に移した。移植後２日毎に培地の一部分を対照ＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞に移すことにより感染性ウイルスの存在のスクリーニングを行った。細胞を次に３７℃にて２日間培養し、その後ウイルスプラークまたはｃｐｅの存在に関して染色し、試験した。第３表に示した結果により、１０4および１０5pfuの用量の１７+で、２０％の移植した神経節が再活性化されたことがわかる。しかし、接種後すぐに１０4pfuで感染したマウスの１匹および１０5pfuで感染したマウスの３匹が後肢マヒを呈し、殺さなければならなかった。全部死ぬと予想されるのでマウスに１０6pfuの１７+を接種しなかった。１７０２感染マウスに関しては、１０4および１０5pfuの用量で、５％の神経節が再活性化され、１０6pfuの用量で、１７．５％が再活性化された。これは明らかに１７+より効力が劣り、恐らくこの変異体のｔｋ陰性表現型のためであった。１７１４を接種したマウスに関して、１０4pfu感染マウスの神経節は再活性化されず、１０5pfuの感染マウスの１／４０（２．５％）および１０6pfuの感染マウスの２／４０（５％）だけが再活性化された。ウイルスは、移植後６日目に初めて再活性化され、３種のウイルス間で再活性化の時期に明らかな違いは見られなかった。ウイルス再活性化は３グループのマウスにおいて腰神経節に限られた。
ｔｋ陰性表現型を考慮すると、１７１４変異型は潜伏状態の可能性があるが、潜伏状態の確立および／または移植後の再活性化に関して１７０２よりかなり効力が低かった。
実施例４
１７+野生型ゲノムへの１７１４欠失の導入
野生型バックグラウンドにおいて１７１４欠失はない、即ち０．０７、０．２９、０．４５および０．６３muで４個のXbalサイトがゲノム中で欠失し、ウイルスはｔｋ陰性であるので、その非毒性表現型は最低一部はこれらの他の突然変異のためと考えられた。親株１７０２は同じXbal陰性およびｔｋ陰性突然変異を有し、１７+と基本的に等価な毒性表現型を有することはありえなかった。それでも本発明者らは、１７１４における欠失をそれ以外は全体として野生型のゲノムに導入した。１７+ＤＮＡを１０倍過剰の１７１４のプラスミドクローン化BamＨＩ ｋでコトランスフェクションした。得られた１種の子孫プラークを単離し、そのＤＮＡ特性をLonsdale（１９７９）の方法により分析した。１７１６と称する１７１４BamＨＩ特性を有するウイルスを単離し、プラークをさらに３回精製し、ウイルスストックを増殖させた。１７１６がXbalサイトおよびｔｋ活性に関してその野生型バックグラウンドを保持することを確かめるために、１７１６のＤＮＡをXbalで消化し、ｔｋ検定を行った。１７１６はＵLに４個のサイトを有する通常の野生型Xbal特性を有するが、１７１４および１７０２はXbalで消化できなかった。１７+、１７０２および１７１４と比較した１７１６のｔｋ検定の結果を第４表に示し、これより、１７１６はｔｋ合成に関して１７+と同程度に有効であることがわかる。１７１６の神経毒性表現型をBalb／cマウスのＩＣ接種により試験した。１７+および１７１４と比較したＬＤ50値を第５表に示す。ＬＤ50値が７×１０6pfu／マウスで非神経毒性であり、この実験において１７+はＬＤ50値が＜１０pfu／マウスであり、１７１６中で欠失している配列は１７株の神経毒性に対応することがわかる。
１サイクルの１７１６に関する増殖実験の結果から、１７１６は野生型１７+ウイルスと同程度に有効に増殖することがわかる。
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１７+感染マウスに関して、１０4pfuで１匹、１０5pfuで３匹が感染後すぐにマヒを起こし、殺さなければならなかった。
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実施例５
ＨＳＶ−１ １７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+の構築
ＨＳＶ ２ ＨＧ５２株のHindIII １フラグメントを含有する組み換えプラスミド（McGeochら、１９８７ａ）を制限エンドヌクレアーゼBst EIIおよびDra Ｉで消化し、ｎｐ ５８９３でのDra Ｉサイトからｎｐ ８８９３でのBSt EIIサイトまでの３Kbフラグメントを精製した。このフラグメントは３’共通末端遺伝子ＵＬ６（ｇＤ−２）およびＵＳ７（ｇＩ−２）のプロモーター、オープンリーディングフレームおよびポリＡシグナルを含む。Bst EIIサイトの５’突出をクレノウポリメラーゼを用いて平滑末端化した。このｇＤ−２含有フラグメントをＵＬ４３（McGeochら、１９８８年参照）、非必須完全膜蛋白質（Maclean Ｃら、１９９１年参照）を含有するＨＳＶ１のBam ＨＩ／ＥＣoＲ１ ９１６１０／９６７５１ｎｐフラグメントに挿入した。挿入のサイトは、ＵＬ４３の５’末端のNsi Ｉサイト（９４９１１np）であった。Nsi Ｉサイトの５’突出をクレノウポリメラーゼを用いて平滑末端化した。クローニング法はすべてManiatisら（１９８２年）により記載された方法のとおりである。
組み換え体ＵＬ４３ ｇＤ２ ＨＳＶ１フラグメントを、完全ＨＳＶ１ １７１６変異型ＤＮＡと共にコトランスフェクションし、組み換えゲノムを記載したようにして単離した（実施例４およびMacleanら、１９９１年参照）。ｇＤ２を含有するＨＳＶ組み換え体を単離した。このウイルスｇＤ１+ｇＤ２+、ＩＣＰ３４．５−は１７６1として公知である。
実施例６
（ａ）ＨＳＶ−１ １７１６ ＵＬ２６ ｔｓの構築
ｔｓ １２０１のクローンされたＥＣＯＲＩ ｆフラグメント（Prestonら、１９８３年）はｔｓ点突然変異を有するＵＬ２６遺伝子を含有する。これを１７１６中に組み換え、実施例４に既に記載したようにしてＨＳＶ−１７１６ ＵＬ ２６ ｔｓを得る。
ＨＳＶ−１ １７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+ＵＬ２６ ｔｓの構築
（ｂ）前記実施例で得たＨＳＶ−１ １７１６ ＵＬ２６ ｔｓおよびＨＳＶ−１ １７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+を標準的方法（Brownら、１９７３年参照）を用いて組み換え、ＨＳＶ−１ １７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+ＵＬ２６ ｔｓウイルスを得る。
実施例７
１７１６ ｇＤ１+、ｇＤ２+ＬＡＴ Ｐ-および１７１６ ｇＤ１+、ｇＤ２+ＵＬ２６ ｔｓ ＬＡＴ Ｐ-の構築
ＨＳＶ−１ １７０４から単離したフラグメント（Steinerら、１９８９年、JuneJoら、１９９１年参照）は、ＬＡＴプロモーターの両コピー中に９４２bpの欠失を有する。このフラグメントを１７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+および１７１６ ｇＤ１+、ｇＤ２+、ＵＬ２６、ＤＮＡと共にコトランスフェクションし、１個のプラークを分析して、１７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+ＬＡＴ Ｐ-および１７１６ ｇＤ１+ｇＤ２+、ＵＬ２６ ｔｓ、ＬＡＴ Ｐ-を得る。
ＨＳＶ−１ １７１４株およびＨＳＶ １７１６株は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（the European Collection of Animal Cell Cultures）、ワクチン・リサーチ・アンド・プロダクション・ラボラトリーズ（Vaccine Research and Production Laboratories）、パブリック・ヘルス・ラボラトリー・サービシズ（Public Health Laboratory Services at Porton Down, Salisbury Wiltshire ＳＰ４，０Ｊ９，ＵＫ）に１９９２年１月２８日に寄託されており、それぞれ受け入れ番号Ｖ９２０１２８０２号およびＶ９２０１２８０３号で得られる。
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