(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
0004156228.tif 000005
を有するホスファチジルセリンの精製方法であって、
式（１）において、Ｒ１とＲ２は同一であるかまたは異なり、かつ、Ｃ１０−Ｃ３０のアシル基であり；ＸはＯＨまたはＯＭであり、そこにおいてＭはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムより成る群から選ばれ、また、そのセリン部はＤ体、Ｌ体またはラセミ体であり、
前記式（１）を有する前記ホスファチジルセリンは、酵素Ｄ−ホスホリパーゼの存在下にセリンを用いて天然物または合成物に由来するホスファチジルコリンのホスファチジル基転移により製造されたものであり、
水と極性有機溶媒の混合物で炭化水素溶媒の溶液から、溶液中の親水性不純物、蛋白質及び無機塩を抽出除去することから成り、
前記炭化水素溶媒は、脂肪族であり、
前記極性有機溶媒は、第２級アルコールである前記方法。
【請求項２】
前記セリン部は、Ｌ体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の脂肪族の炭化水素溶媒がｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサンまたはシクロヘキサンの中から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の脂肪族の炭化水素溶媒が、精製されるホスファチジルセリン１ｋｇ当たり、４−３０リットルの範囲で使用される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の脂肪族の炭化水素溶媒が、精製されるホスファチジルセリン１ｋｇ当たり、６−１２リットルの範囲で使用される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の第２級のアルコール溶媒が１−５個の炭素原子を含有するアルコールの中から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の第２級のアルコール溶媒がイソプロパノールである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の第２級のアルコール溶媒が、使用される脂肪族の炭化水素溶媒１ｋｇ当たり、０．２−２リットルの範囲で使用される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記の第２級のアルコール溶媒が、使用される脂肪族の炭化水素溶媒１ｋｇ当たり、０．３−１．２リットルの範囲で使用される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用される水の量が、使用される脂肪族の炭化水素溶媒１ｋｇ当たり、０．２−５リットルの範囲である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
使用される水の量が、使用される脂肪族の炭化水素溶媒１ｋｇ当たり、０．３−１リットルの範囲である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出が０−７０℃の範囲の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出が２０−３０℃の範囲の温度で行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式（１）
【化２】
0004156228.tif 000006
を有するホスファチジルセリンの精製方法であって、
式（１）において、Ｒ１とＲ２は同一であるかまたは異なり、かつ、Ｃ１０−Ｃ３０のアシル基であり；ＸはＯＨまたはＯＭであり、そこにおいてＭはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムより成る群から選ばれ、また、そのセリン部はＤ体、Ｌ体またはラセミ体であり、
前記式（１）を有する前記ホスファチジルセリンは、酵素Ｄ−ホスホリパーゼの存在下にセリンを用いて天然物または合成物に由来するホスファチジルコリンのホスファチジル基転移により製造されたものであり、
炭化水素溶媒、水および極性有機溶媒を含有する混合物中で前記式（１）を有する前記ホスファチジルセリンを攪拌することから成り、
前記炭化水素溶媒は、脂肪族であり、
前記極性有機溶媒は、第２級アルコールである前記方法。
【請求項１５】
前記セリン部は、Ｌ体である請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスファチジルセリンの精製方法に関する。ホスファチジルセリンはリン脂質であり、そのリン脂質は特に、各種の特性を有する退縮性脳症候群の治療に使用されるが、特殊なリポソーム処方および天然のレシチンを基にした規定食組成物の製造にも使用される、医薬組成物の製造に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
ホスファチジルセリンは天然に広く存在するリン脂質である。それは、動物性生体中の細胞膜の主成分の一つであり、特に哺乳動物の脳組織中に多量に存在する。医学文献にはホスファチジルセリンの、興味ある特性が述べられている。とりわけ、最も重要な医学文献は、記憶力を改善するのにホスファチジルセリンが有効であることを述べている。
【０００３】
以下の図式に従って、酵素Ｄ−ホスホリパーゼの存在下に、ホスファチジルコリンをセリンでホスファチジル基転移せしめることは、ホスファチジルセリンの工業生産にとって最も簡便な反応である。
【化２】
0004156228.tif 000002
【０００４】
この反応は、ＥＰ  １  ０４８  ７３８号公報に記載されているように、水性環境においても、また、水相ではなく、水と混合しない有機溶媒、好ましくはトルエン、を含有する系においても行うことができる。この２番目の方法はＵＳＰ５，７００，６６８号公報に記載されている。
【０００５】
用いられるホスファチジル基転移がどのような方法であれ、その方法の最終段階で分離されるホスファチジルセリンには、いずれにしても、多量の親水性不純物、例えば、その水相中に存在するセリン、コリンおよびそれらの塩が含まれる。
【０００６】
注目すべき他の特質は、関連文献（Biotechn. Techn., 7, 795(1993)）に記載された方法に従って、Ｄ−ホスホリパーゼタイプの生成物の酵素活性を測定することにより、１グラムの生成物は、どれをとっても、酵素活性として約２国際単位を有することが判明したということである。
【０００７】
厳格な純度基準に対する一般的な要請に従って、その生成物から前記不純物を除去することは大いに重要である。
【０００８】
リン脂質の有機溶液から親水性物質を除去するために汎用される方法は、効果がないことが証明された。実際は、ＵＳＰ５，７００，６６８号公報に記載されているように、得られたリン脂質混合物のトルエン溶液を同量の水で抽出し、次にその相を分離することにより、有機相内のセリン含量とＤ−ホスホリパーゼの活性は、水で抽出する前に発見された数値と比べて、事実上変化がないことが判明している。
【０００９】
同様に、トルエンで調整した、クロマトグラフィーシリカを含有するクロマトグラフィーカラム上で同様な有機溶液を溶離する。そこではトルエンを用いて生成物の溶離が行われ、結果としてセリンが僅かに除去され、そのリン脂質から酵素活性が僅かに除かれる。
【００１０】
もう一つの実験では、セリンゆえに精製すべきホスファチジルセリンの有機溶液にアセトンを添加する。分析してみると、その沈殿生成物は、出発生成物と比べて、セリン／ホスファチジルセリンの比が実質的に変わらない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
それゆえに、本発明は、酵素Ｄ−ホスホリパーゼの存在下にホスファチジルコリンをセリンでホスファチジル基転移して得られ、また、不純物として親水性化合物、蛋白質および無機塩を含有する、ホスファチジルセリンの有効な精製方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
いまや本出願人は、驚くべきことに、極性有機溶媒を系に添加すれば、水抽出により、有機溶媒中のホスファチジルセリン溶液から親水性不純物、蛋白質および無機塩がうまく除去できるということを見出した。
【００１３】
従って本発明の目的は、  式（１）
【化３】
0004156228.tif 000003
を有するホスファチジルセリンの精製方法であって、
式（１）において、Ｒ1とＲ2は同一であるかまたは異なり、かつ、Ｃ10−Ｃ30のアシル基であり；ＸはＯＨまたはＯＭであり、そこにおいてＭはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムより成る群から選ばれ、また、そのセリン部はＤ体、Ｌ体またはラセミ体であって、好ましくはＬ体であり、
水と極性有機溶媒の混合物で炭化水素溶媒の溶液から前記ホスファチジルセリンを抽出することから成る前記方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
ＵＳＰ５，７００，６６８号公報に含まれる記述に従って、水相とトルエン相から構成される２相系において、ホスファチジル基転移により製造されるホスファチジルセリンの特殊な場合には、本発明に従った方法は、反応の最終段階で水相からトルエン相を分離した後で、そのトルエン相に対して直接的に行うことができる。
【００１５】
他の方法に従って製造したホスファチジルセリンの場合には、炭化水素溶媒、水および極性有機溶媒を含有する混合物中でその生成物を攪拌することにより、その精製方法を有利に実施することができる。
【００１６】
この場合にも、親水性不純物はその水相中に見出されるはずであるが、興味あるリン脂質はその炭化水素相中に存在する。
【００１７】
相分離に続いて、アセトンを用いた沈降などのような公知の方法を用いてホスファチジルセリン相を分離することができる。
【００１８】
本方法に従って芳香族溶媒または脂肪族溶媒を炭化水素溶媒として使用することができる。芳香族溶媒の中でもトルエンまたはキシレンが好ましい。脂肪族溶媒の中ではｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサンまたはシクロヘキサンが好ましい。
【００１９】
極性有機溶媒としてアルコール溶媒を使用することができ、そのものには１−５個の炭素原子が含まれる。本発明の好ましい態様に従って、前記アルコール溶媒は第２級アルコールおよび第３級アルコールの中から選ばれる。より好ましくはイソプロパノールが使用される。
【００２０】
本発明に従った抽出は０−７０℃の範囲の温度で、好ましくは２０−３０℃の範囲の温度で行うことができる。
【００２１】
炭化水素溶媒の量は、精製すべきリン脂質１ｋｇに対して、４−３０リットルの範囲、好ましくは６−１２リットルの範囲である。
【００２２】
水と炭化水素溶媒の容積比は、０．２−５の範囲、好ましくは０．３−１の範囲である。極性有機溶媒と炭化水素溶媒の容積比は、０．２−２の範囲、好ましくは０．３−１．２の範囲である。
【００２３】
非環式鎖を変えて前記した方法をホスファチジルセリンに適用することができる。また、その方法により、大豆、西洋アブラナまたは卵黄などの天然物に由来するホスファチジルコリン、およびミリスチン酸、パルミチン酸またはステアリンサンなどの飽和酸、およびオレイン酸またはリノール酸などの不飽和酸などの脂肪酸で合成したホスファチジルコリンをホスファチジル基転移して取り出した生成物を精製することができる。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の目的を限定することなく、完全に本発明を開示するものである。
【００２５】
実施例１
２相系におけるホスファチジルコリンの製造
ホスファチジルコリン３２％とトリグリセライド５０％を含有する、大豆レシチンの非脱油(de-oiled)フラクション４００ｇを、３リットルのトルエンと共にフラスコに入れる。活性が３ＫＵ／ＩであるＤ−ホスホリパーゼの溶液１．３リットル中に、塩化カルシウム２２．７ｇ、三水酸基化された酢酸ナトリウム(trihydrated sodium acetate)２７．６ｇおよびＬ−セリン６２．５ｇが含まれる溶液を別途調製する。その溶液を酢酸でｐＨ４．２とする。前記２つの溶液を合わせて、攪拌条件下に２５℃で８時間保持する。濾過に続いてその相を分離し、そのトルエン相の１／１０を真空条件下に濃縮する（残りの部分は実施例２、３、４、５に記載される実験に使用する）。その残渣を室温でアセトン５００ｍｌに添加する。その生成物を濾過し、乾燥する。このようにしてリン脂質と含量が５０％であるホスファチジルセリンの混合物２７ｇが得られる。
【００２６】
ＴＬＣ分析（溶出液：クロロホルム、メタノール、水およびアンモニアの２８％水溶液の混合物  ３００：１００：１０：１２；  検出器：ニンヒドリン(ninhydrin)）によれば、最終生成物中に１．５％のＬ−セリンが存在する。
【００２７】
Ｄ−ホスホリパーゼが生成物中に存在することは、関連文献(Biotechn. Techn.,7, 795 (1993))に記載された方法で確認される。２．１ＩＵ／ｇの活性が見られる。
【００２８】
実施例２
イソプロパノールと水を用いた抽出によるホスファチジルセリンの精製
実施例１において記載されるように調製されたトルエン溶液３３０ｍｌを使用する。この溶液をイソプロパノール２４０ｍｌや水１５０ｍｌと共に添加する。全体を室温で攪拌して放置する。次にその相を分離する。そのトルエン相を濃縮し、その残渣をアセトン５００ｍｌ中へ攪拌条件下に添加する。
【００２９】
その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．３％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用される検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。
【００３０】
実施例３
イソプロパノールと水の比率を変えた抽出によるホスファチジルセリンの精製実施例１において記載されるように調製されたトルエン溶液３３０ｍｌを使用する。この溶液をイソプロパノール１５０ｍｌや水２４０ｍｌと共に添加する。全体を室温で攪拌して放置する。次にその相を分離する。そのトルエン相を濃縮し、その残渣をアセトン５００ｍｌ中へ攪拌条件下に添加する。
【００３１】
その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．２％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用される検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。
【００３２】
実施例４
イソプロパノールと水を用いた抽出によるホスファチジルセリンの精製
実施例１において記載されるように調製されたトルエン溶液３３０ｍｌを使用する。この溶液をエタノール１５０ｍｌや水１５０ｍｌと共に添加する。全体を室温で攪拌して放置する。次にその相を分離する。そのトルエン相を濃縮し、その残渣をアセトン５００ｍｌ中へ攪拌条件下に添加する。その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．２％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用される検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。
【００３３】
実施例５
水／ｎ−ヘプタンの２相系におけるホスファチジルセリンの調製とイソプロパノールと水を用いた精製
実施例１において原料として用いられる、大豆レシチンと同じタイプのもの４０ｇを、ｎ−ヘプタン３００ｍｌと共にフラスコに装入する。活性が３ＫＵ／Ｉである、Ｄ−ホスホリパーゼの溶液０．１３リットル中に、塩化カルシウム２．３ｇ、三水酸基化された酢酸ナトリウム(trihydrated sodium acetate)２．８ｇおよびＬ−セリン６．３ｇが含まれる溶液を別途調製する。その溶液を酢酸でｐＨ４．２とする。その２つの溶液を合わせて、攪拌条件下に２５℃で２４時間保持する。濾過に続いてその相を分離し、そのヘプタン相を１５０ｍｌのアセトンおよび１５０ｍｌの水を添加する。攪拌と沈降の後で、その相を分離する。そのヘプタン相を低圧で濃縮する。その残渣を室温でアセトン５００ｍｌと共に添加する。その生成物を濾過し、乾燥する。このようにしてリン脂質と含量が４８％であるホスファチジルセリンの混合物２６．５ｇが得られる。
【００３４】
その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．２％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用される検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。
【００３５】
実施例６
有機溶媒の不存在下におけるホスファチジル基転移によりホスファチジルセリンの製造
エチルアルコールで抽出して得たリン脂質と大豆レシチン（その主成分はホスファチジルコリン（６５％）である。）の混合物４０ｇを、水８００ｍｌ中に塩化カルシウム６０ｇを溶解させて調製した溶液と共に分離漏斗に装入する。その混合物は攪拌条件下に２５℃で１時間保持される。４時間後、少なくとも(at rest)７００ｍｌの水相を底部の栓から抜き出す。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液１３０ｍｌ中にＬ−セリン６４ｇを含有する溶液を別途調製する。この溶液を、親液性化形態で１．０ＩＵ／ｍｇの活性を有するＤ−ホスホリパーゼ３００ｍｇと共に添加する。得られた溶液を、予め調製したリン脂質の水溶分散剤に添加する。その混合物を攪拌条件下に４５℃で３時間保持する。その反応生成物を濾過分離する。水洗後そのものの重さは６０ｇである。
【００３６】
部分標本を乾燥してセリンとＤ−ホスホリパーゼを定量測定する。測定結果は、セリンの含量が７重量％であり、Ｄ−ホスホリパーゼの活性が２ＩＵ／ｇである。
【００３７】
実施例７
実施例６で得られたホスファチジルセリンの精製
実施例６で記載するようにして得られた、湿った生成物の部分標本５ｇを、水、炭化水素溶媒（溶媒１）およびアルコール溶媒（溶媒２）を含有する溶媒混合物中に溶解させて精製試験を行った。
【００３８】
全試験において、攪拌および沈降の後では、ホスファチジルセリンは炭化水素相の中にのみ存在する。その炭化水素相を濃縮してアセトンから沈殿させる。乾燥した生成物を分析して、セリンの含量およびＤ−ホスホリパーゼの活性を測定する。後続する表１には、ホスファチジルセリンの精製条件および最終生成物中に存在するセリンとＤ−ホスホリパーゼの量が示される。
【００３９】
【表１】
0004156228.tif 000004
【００４０】
実施例８
ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）の製造および精製
ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）４０ｇをトルエン０．３リットルと共にフラスコに装入する。３ＫＵ／Ｉの活性を有するＤ−ホスホリパーゼの溶液０．１３リットル中に、塩化カルシウム２．３ｇ、三水酸基化された酢酸ナトリウム２．８ｇおよびＬ−セリン６．３ｇを含有する溶液を別途調製する。この溶液を酢酸でｐＨ４．２とする。この２つの溶液を合わせて、攪拌条件下に２５℃で８時間保持する。次に相分離を行い、上部の相を、イソプロパノール２４０ｍｌと水１５０ｍｌと共に添加する。全体を室温で攪拌して放置する。次にその相を分離する。そのトルエン相を濃縮して、攪拌条件下にその残渣をアセトン５００ｍｌに添加する。その固形物を濾別し、真空条件下に乾燥させ、カルシウム塩としてＤＯＰＳ３０ｇを得る。
【００４１】
その生成物にはＬ−セリンが０．２％含まれる。Ｄ−ホスホリパーゼは、本方法で採用する検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。
【発明の効果】
本発明に従って極性有機溶媒を系に添加すれば、水抽出により、有機溶媒中のホスファチジルセリン溶液から親水性不純物、蛋白質および無機塩がうまく除去できる。