(57)【要約】  本発明は、ヒト・タウに結合する新規抗体、およびこれらの抗体を使用してヒト・タウを定量するためのアッセイを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸２２０−２２４からなるヒト・タウのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
配列番号２０（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１（ＣＤＲＬ２）および配列番号２２（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号２６（ＣＤＲＨ１）、配列番号２７（ＣＤＲＨ２）および配列番号２８（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
配列番号２４の軽鎖可変領域および配列番号３０の重鎖可変領域を含む、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
モノクローナル抗体１０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核酸であって、該抗体軽鎖可変領域が配列番号２４のものであり、抗体重鎖可変領域が配列番号３０のものである、単離された核酸。
【請求項６】
請求項５記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
アミノ酸１８９−１９４からなるヒト・タウのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号３８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３９（ＣＤＲＨ２）および配列番号４０（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む、請求項８記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
配列番号３６の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインを含む、請求項８記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
モノクローナル抗体１９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項８記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核酸であって、該抗体軽鎖可変領域が配列番号３６のものであり、抗体重鎖可変領域が配列番号４２のものである、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
配列番号９記載の単離されたタウ１６６ペプチド。
【請求項１６】
配列番号９のペプチドをコードする単離された核酸で宿主細胞をトランスフェクトすることにより製造される、配列番号９の単離されたタウ１６６ペプチド。
【請求項１７】
請求項１６記載の単離されたタウ１６６ペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと生物学的サンプルを、ヒト・タウと該抗体またはその抗原結合性フラグメントとの免疫複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および
（ｂ）形成した免疫複合体を検出すること
を含む、生物学的サンプル中のヒト・タウを定量する方法。
【請求項２０】
該抗体がモノクローナル抗体１０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）請求項８〜１１のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと生物学的サンプルを、ヒト・タウと該抗体またはその抗原結合性フラグメントとの免疫複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および
（ｂ）形成した免疫複合体を検出すること
を含む、生物学的サンプル中のヒト・タウを定量する方法。
【請求項２２】
該抗体がモノクローナル抗体１９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
脳脊髄液サンプル中のヒト・タウを定量するための方法であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／タウ複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのヒト・タウを捕捉すること、および
（ｂ）請求項８〜１１のいずれか１項記載の検出可能な様態で標識された抗体またはその抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／タウ複合体を、捕捉抗体／タウ／検出可能標識抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたタウを検出すること
を含む方法。
【請求項２４】
捕捉抗体がモノクローナル抗体１０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントであり、検出可能な様態で標識される抗体がモノクローナル抗体１９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
固体支持体が、磁気粒子、ミクロスフェア、磁気ミクロスフェア、ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルからなる群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
固体支持体が磁気ミクロスフェアである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
検出可能な様態で標識された抗体が、放射性同位体、酵素、ビオチン、色素、蛍光標識および化学発光標識からなる群から選択される試薬で標識されている、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
試薬がビオチンである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ビオチンがストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートに結合する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断するための方法であって、該方法が、
（ａ）請求項２３記載の方法を用いて該患者の脳脊髄液サンプル中のヒト・タウの量を定量すること、および
（ｂ）工程（ａ）におけるヒト・タウの濃度を決定すること
を含み、
１８４ｐｇ／ｍＬより大きな値が該患者におけるＡＤの診断を示す、方法。
【請求項３１】
（ｃ）該患者の脳脊髄液サンプル中のＡβ１−４２の量を定量すること、および
（ｄ）該患者のサンプルにおけるヒト・タウ／Ａβ１−４２の比を決定すること
を更に含み、
０．２１５より大きな比の値が該患者におけるＡＤの診断を示す、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）において、６Ｅ１０、１２Ｆ４、１−１１−３、Ｇ２−１１および４Ｇ８からなる群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体またはこれらの抗体のいずれかの抗原結合性フラグメントを使用して、Ａβ１−４２の量を定量する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）において、
（ｉ）Ａβ１−４２のＣ末端のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／Ａβ１−４２複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのＡβ１−４２を捕捉すること、および
（ｉｉ）Ａβ１−４２のＮ末端のエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体またはその抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／Ａβ１−４２複合体を、検出可能標識抗体／Ａβ１−４２／捕捉抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたＡβ１−４２を検出すること
により、脳脊髄液サンプル中のＡβ１−４２の量が定量される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）（ｉ）において使用する抗体がモノクローナル抗体１−１１−３であり、工程（ｃ）（ｉｉ）において使用する抗体がモノクローナル抗体６Ｅ１０である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）請求項３０、３１、３２、３３および３４のいずれか１項記載の診断方法を用いて、治療を要する患者を選択すること、および
（ｂ）ＡＤ治療用物質の治療的有効量を該患者に投与すること
を含む、アルツハイマー病の治療を要する患者におけるアルツハイマー病の治療方法。
【請求項３６】
ＡＤ治療用物質がＢＡＣＥ−１インヒビターである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＢＡＣＥ−１インヒビターが、
【化１】
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からなる群から選択される化合物もしくはその互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＢＡＣＥ−１インヒビターが、構造
【化２】
2017512056.tif 000026
を有する化合物もしくはその互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ＢＡＣＥ−１インヒビターが、
【化３】
2017512056.tif 000027
からなる群から選択される化合物もしくはその互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントと、
（ｂ）請求項８〜１１のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントと
を含むキット。
【請求項４１】
成分（ａ）の単離された抗体が、磁気ミクロスフェアに結合したｍＡｂ  １０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントであり、成分（ｂ）の単離された抗体がビオチン化ｍＡｂ  １９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項４０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・タウ［ｈ−タウ（Ｔａｕ）］に特異的に結合し、生物学的サンプル中のｈ−タウの定量に有用な抗体に関する。本発明はまた、これらの抗体を使用するアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の最も一般的な原因であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶および認知機能の低下の増進により特徴づけられる進行性神経変性障害である。ＡＤにおいて存在する神経病理学的特徴には、Ａβペプチド（最も優勢なのはＡβ１−４２ペプチドである）から構成されるアミロイド斑および神経原線維変化（ＮＦＴ）が含まれる。
【０００３】
特に、ＮＦＴは対らせん状細線維（ＰＨＦ）からなり、そしてこれは微小管関連タンパク質ｈ−タウ（ｈ−Ｔａｕ）から構成される。通常、ｈ−タウは、ニューロン内にタンパク質および栄養素を分布させるために必須である、微小管の中心的細胞ネットワークを安定化する。しかし、ＡＤ患者においては、ｈ−タウは高リン酸化されて、その正常機能が破壊され、それがＰＨＦへと凝集する可能性が増大し、最終的にはＮＦＴが形成される。ＮＦＴの形成はシナプスおよびニューロンの喪失を招き、したがって最終的に認知症の発生に寄与すると仮定されている。
【０００４】
脳の細胞外空間はＣＳＦと直接接触しているため、脳内の生化学的変化はＣＳＦにも影響を及ぼす（Ｂｌｅｎｎｏｗら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．６０５−６１３，２００３）。ＡＤ患者のＣＳＦにおいては、正常被験者と比べてｈ−タウタンパク質のレベルが高いことを、研究は示しており（Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｅｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６１，ｐｐ．１８２８−１８３４，１９９３；Ｂｌｅｎｎｏｗら，前掲，Ｈａｍｐｅｌら，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３０−４０，２０１０）、したがって、ｈ−タウは、ＡＤを診断するためのバイオマーカーとして使用されている（Ｈａｍｐｅｌら，前掲）。ＡＤ患者におけるＣＳＦのｈ−タウのレベルの上昇はＮＦＴの病理と相関することも示されている（Ｔａｐｉｏｌａら，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９６１−３９６３，１９９７）。
【０００５】
最近の研究は、ＣＳＦにおけるＡβ１−４２の濃度の減少と組合された、ＣＳＦにおけるｈ−タウの濃度の上昇の測定が、ＡＤの診断を補助しうることも示している（Ｔａｐｉｏｌａら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６６，ｐｐ．３８２−３８９，２００９）。更なる研究は、ＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ１−４２の比が、アミロイド斑の病理を有する個体を特定するのに有用であることも示している（Ｆａｇａｎら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１１３７−１１４４，２０１１）。ＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ１−４２の比は、軽度のＡＤを有する非認知症高齢者における将来の認知機能低下を予測することも示されている（Ｆａｇａｎら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６４，ｐｐ．３４３−３４９，２００７）。
【０００６】
前記のＣＳＦバイオマーカーはアミロイド病理、神経変性を反映することが示されており、認知機能低下を予測しうることを考慮すると、それは無症候性または軽症のＡＤ患者の特定において重要となる可能性があり、そのような患者は新規治療介入の恩恵を受ける可能性が最も高い。
【０００７】
これらのＣＳＦバイオマーカーの前記用途の要件は患者のＣＳＦ中に存在するバイオマーカーの正確な定量である。特にｈ−タウは、以下の理由により、定量することが困難なタンパク質である。ｈ−タウには、３５２〜４４１アミノ酸の種々のサイズの、６個の異なるアイソフォームが存在し、全ては選択的ｍＲＮＡスプライシングにより単一遺伝子から誘導される（Ｈｉｍｍｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１３８１−１３８８，１９８９；図１を参照されたい）。前記の６個のｈ−タウアイソフォームは微小管結合ドメインの個数（３または４個）およびそれぞれ２９アミノ酸のアミノ末端インサートの個数（０、１または２個）において互いに異なっている（Ｇｏｅｄｅｒｔら，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５１９−５２６，１９８９）。ｈ−タウタンパク質における不均一性は、リン酸化、ユビキチン化、酸化などを含む翻訳後修飾により生じる。また、ｈ−タウは健康な個体における約３００ｎｇ／ＬからＡＤ患者における９００ｎｇ／Ｌまでの低濃度でＣＳＦ中に存在する（ＢｌｅｎｎｏｗおよびＨａｍｐｅｌ，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．６０５−６１３，２００３）。
【０００８】
ＣＳＦ中のｈ−タウを定量するために、モノクローナル抗体を使用するイムノアッセイが開発されている（Ｈａｍｐｅｌら，前掲；およびＫａｎｇら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５９，ｐｐ．９０３−９１６，２０１３）。ＣＳＦ中のｈ−タウの分子的不均一性および低濃度、ならびにＡＤの種々の病期の患者でのＡＤの診断におけるｈ−タウバイオマーカーの重要性および将来の認知機能低下を予測するためのその使用を考慮すると、ＣＳＦにおけるｈ−タウの全アイソフォームを正確に定量しうる詳細に特徴づけられたアッセイを開発することが尚も絶えず必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概括
本発明は、ｈ−タウの６個の公知アイソフォーム、すなわち、ｈ−タウ−４４１、４１２、４１０、３８３、３８１および３５２（以下の表１に示されている、それぞれ配列番号２〜７；図１も参照されたい）におけるアミノ酸配列において保存されたｈ−タウの領域（アミノ酸１０４−２７７）内のエピトープに特異的に結合する抗体、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。
【表１】
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【００１０】
本発明者らは、ｈ−タウアッセイにおいて一緒に使用された場合に、ＣＳＦ中のｈ−タウの６つのアイソフォームの全てを定量するのに必要な感度（分析性能）および健常対照からＡＤ患者を識別する能力（診断性能）（特に、ＡＤ治療用物質での治療のための患者を選択することを目的としたもの）の両方を有する抗体のペアの開発に関心を持った。前記特性を有する抗体のペアを得るために、３つの免疫原、すなわち、ｈ−タウ４４１、ｈ−タウ３５２およびタウ１６６ペプチド（これは、ｈ−タウの保存領域のアミノ酸１０４−２６９（配列番号９）に伸長する合成ペプチドである）を使用した。本発明者らは、免疫原としてタウ１６６ペプチドを使用した場合、その他の２つの免疫原を使用して産生された親クローンの量と比較して、ｈ−タウの保存領域に特異的に結合する抗体を有する、より多数の親クローンが産生されることを見出した。特に、ｈ−タウの保存領域に特異的な抗体に関して該クローンをスクリーニングした際に、免疫原としてタウ１６６ペプチドを使用して産生され該保存領域に特異的である２つの新規ｍＡｂ  １０Ｈ８および１９Ｇ１０を特定した。ｍＡｂ  １０Ｈ８は、ｈ−タウのアミノ酸２２０−２２４に対応する５アミノ酸エピトープＴＲＥＰＫ（配列番号１１）に特異的に結合する。ｍＡｂ  １９Ｇ１０は、ｈ−タウのアミノ酸１８９−１９４に対応する６アミノ酸エピトープＰＫＳＧＤＲ（配列番号１２）に特異的に結合する（ｍＡｂ  １０Ｈ８および１９Ｇ１０のエピトープのアミノ酸配列に関しては、それぞれ、表２および３も参照されたい）。特に、ｈ−タウアッセイにおける検出抗体としてのｍＡｂ  １９Ｇ１０と捕捉抗体としてのｍＡｂ  １０Ｈ８とをペアにした場合、このようにしてペアにされたｍＡｂ  １０Ｇ８および１９Ｇ１０は、ＣＳＦ中のｈ−タウの全アイソフォームの定量に関して、８つの異なる抗体ペアのうちで最高の臨床感度および特異性の両方を、そしてｈ−タウに対して産生されたｍＡｂの他のペアと比較して、ＡＤ患者を正常患者から識別する最高の能力を示すことを、本発明者らは見出した（実施例１）。抗体の産生のための免疫原としてアイソフォームｈ−タウ４４１およびｈ−タウ３５２を使用することは公知であるが、ｈ−タウの全アイソフォームを認識してＣＳＦ中のそれらの定量を可能にする抗体を選択的に産生させるための免疫原としてタウ１６６ペプチドを使用することは初めてだと考えられる。
【００１１】
１つの態様においては、本発明は、アミノ酸２２０−２２４（アミノ酸２２０から２２４まで）（配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００１２】
１つの実施形態においては、ｈ−タウのアミノ酸２２０−２２４からなるエピトープに結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号２０（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１（ＣＤＲＬ２）および配列番号２２（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号２６（ＣＤＲＨ１）、配列番号２７（ＣＤＲＨ２）および配列番号２８（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲまたは該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体は前記ＣＤＲの１以上における１、２、３、４、５および６個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸２２０−２２４（配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００１３】
もう１つの実施形態においては、ｈ−タウのアミノ酸２２０−２２４からなるエピトープに結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号２４の軽鎖可変領域および配列番号３０の重鎖可変領域または該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体はこれらの配列の一方または両方における１〜２０個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸２２０−２２４（配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００１４】
もう１つの態様においては、本発明は、アミノ酸１８９−１９４（配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００１５】
もう１つの実施形態においては、ｈ−タウのアミノ酸１８９−１９４からなるエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号３８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３９（ＣＤＲＨ２）および配列番号４０（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲまたは該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体は前記ＣＤＲの１以上における１、２、３、４、５および６個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸１８９−１９４（配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００１６】
もう１つの実施形態においては、ｈ−タウのアミノ酸１８９−１９４からなるエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは配列番号３６の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインまたは該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体はこれらの配列の一方または両方における１〜２０個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸１８９−１９４（配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００１７】
他の態様においては、本発明は、これらの抗体の可変軽鎖および重鎖をコードする核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、該発現ベクターを含む宿主、および該抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供する。
【００１８】
もう１つの態様においては、本発明は、特に、本発明の抗体を製造するための免疫原としての使用のための、単離されたタウ１６６ペプチド（配列番号９）を提供する。１つの実施形態においては、本発明はまた、タウ１６６ペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１９】
もう１つの態様においては、本発明は、前記抗体の一方または両方を使用してｈ−タウを定量するための方法、ならびにＡＤの診断における、およびＡＤ治療用物質、例えばＢＡＣＥ−１インヒビターでの治療のためのＡＤ患者の選択における使用のための、これらの抗体を含むキットを提供する。
【００２０】
１つの実施形態においては、本発明は、アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断するための方法であって、該方法が、
（ａ）該患者の脳脊髄液サンプル中のヒトタウの量を定量し、この場合、これを、
（１）（ｉ）配列番号２０（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１（ＣＤＲＬ２）および配列番号２２（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号２６（ＣＤＲＨ１）、配列番号２７（ＣＤＲＨ２）および配列番号２８（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体、ならびに
（ｉｉ）配列番号２４の軽鎖可変領域および配列番号３０の重鎖可変領域を含む単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体
からなる群から選択される、ｈ−タウのアミノ酸２２０−２２４からなるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／タウ複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのヒトタウを捕捉し、
（２）（ｉ）配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号３８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３９（ＣＤＲＨ２）および配列番号４０（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体、ならびに
（ｉｉ）配列番号３６の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインを含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体
からなる群から選択される、アミノ酸１８９−１９４からなるエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体または抗体フラグメントと該捕捉抗体／タウ複合体を、捕捉抗体／タウ／検出可能標識抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたタウを検出することにより行い、
（ｂ）工程（ａ）におけるヒトタウの濃度を決定することを含み、ここで、１８４ｐｇ／ｍＬより大きな値が該患者におけるＡＤの診断を示す、方法を提供する。
【００２１】
アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断する前記方法のもう１つの実施形態においては、該方法は更に、
（ｃ）該患者の脳脊髄液サンプル中のＡβ１−４２の量を定量し、
（ｄ）該患者のサンプルにおけるヒトタウ／Ａβ１−４２の比を決定すること
を含み、ここで、０．２１５より大きな比の値は該患者におけるＡＤの診断を示す。
【００２２】
更にもう１つの態様においては、アルツハイマー病の治療を要する患者におけるアルツハイマー病の治療方法を提供する。該方法は、
（ａ）前記診断方法を用いて、治療を要する患者を選択し、
（ｂ）ＡＤ治療用物質の治療的有効量を該患者に投与すること
を含む。
【００２３】
アルツハイマー病を治療する前記方法の１つの実施形態においては、ＡＤ治療用物質は、構造
【化１】
2017512056.tif 000007
【００２４】
を有するＢＡＣＥ−１インヒビター、その互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である。
【００２５】
発明の詳細な説明
定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用語を以下に明確に定義する。本明細書中の他の箇所で特に定められていない限り、本明細書中で用いる全ての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。
【００２６】
添付の特許請求の範囲を含む本出願において用いる単数形表現は、文脈に明らかに矛盾しない限り、その複数形対象物を含む。
【００２７】
「Ａβ１−４２ペプチドまたはＡβ１−４２」は、β−およびγ−セクレターゼによるアミロイドベータＡ４タンパク質アイソフォームａ前駆体タンパク質（配列番号１９）のタンパク質分解切断により産生される、アミノ酸６７２−７１３に対応する４２アミノ酸のペプチド（配列番号１８）を意味する。
【００２８】
ＡＤ治療用物質の「投与」または「投与する」は、治療を要する患者にＡＤ治療用物質を与えることを意味する。
【００２９】
本明細書中で用いる「アルツハイマー病またはＡＤ」は、脳内のＡβ斑またはＮＦＴの形成または沈着に関連したニューロン分解から生じる認知症または認知障害の範囲を意味し、前臨床アルツハイマー病、アルツハイマー病による軽度認知障害、早発性アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病（これらに限定されるものではない）を含むアルツハイマー病の範囲から、アルツハイマー病による認知症の進行性認知障害（Ｊａｃｋら，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．，Ｍａｙ  ７（３），ｐｐ．２５７−２６２，２０１１）およびＡｐｏ４対立遺伝子の存在に関連した疾患までを包含する。
【００３０】
本明細書中で用いる「ＡＤ治療用物質」は、ＡＤまたはその症状の根本的な病態生理の１以上に対処する治療または介入を意味する。
【００３１】
ＡＤ治療用物質の例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：本明細書に記載されているＢＡＣＥ−１インヒビター、ＢＡＣＥ−１インヒビターＣＴＳ−２１１６６（ＣｏＭｅｎｔｉｓ  Ｉｎｃ．）、ＡＺＤ３２９３（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、Ｅ−２６０９（Ｅｉｓａｉ）、ＴＡＫ−０７０（Ｔａｋｅｄａ）およびＨＰＰ−８５４（Ｔｒａｎｓｔｅｃｈ）、ガンマセクレターゼインヒビター（例えば、ＷＯ２００７／０８４５９５およびＷＯ２００９／００８９８０に記載されているもの）、ガンマセクレターゼモジュレーター（例えば、ＷＯ２００８／１５３７９３およびＷＯ２０１０／０５６８４９に記載されているもの）、ソラネズマブ（ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）（商標名Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））、ＡＣＣ−００１（ワクチン）、ムスカリンアンタゴニスト（例えば、ｍ１アゴニスト（例えば、アセチルコリン、オキソトレモリン（ｏｘｏｔｒｅｍｏｒｉｎｅ）、カルバコール（ｃａｒｂａｃｈｏｌ）またはＭｃＮａ３４３）またはｍ２アンタゴニスト（例えば、アトロピン、ジシクロベリン（ｄｉｃｙｃｌｏｖｅｒｉｎｅ）、トルテロジン（ｔｏｌｔｅｒｏｄｉｎｅ）、オキシブチニン（ｏｘｙｂｕｔｙｎｉｎ）、イプラトロピウム（ｉｐｒａｔｒｏｐｉｕｍ）、メトクトラミン（ｍｅｔｈｏｃｔｒａｍｉｎｅ）、トリピタミン（ｔｒｉｐｉｔａｍｉｎｅ）またはガラミン（ｇａｌｌａｍｉｎｅ））；コリンエステラーゼインヒビター（例えば、アセチル−および／またはブチリルコリンエステラーゼインヒビター、例えば、ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、ガランタミン（ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ）（Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標））およびリバスチジミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｉｍｉｎｅ）（Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標））；Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体アンタゴニスト（例えば、Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標）（メマンチン（ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）ＨＣｌ；Ｆｏｒｒｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；コリンエステラーゼインヒビターとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体アンタゴニストとの組合せ；非ステロイド抗炎症剤；神経炎症を軽減しうる抗炎症剤；抗アミロイド抗体（例えば、バピニューゼマブ（ｂａｐｉｎｅｕｚｅｍａｂ）、Ｗｙｅｔｈ／Ｅｌａｎ）；ビタミンＥ；ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト；ＣＢ１受容体インバースアゴニストまたはＣＢ１受容体アンタゴニスト；抗生物質；成長ホルモン分泌促進物質；ヒスタミンＨ３アンタゴニスト；ＡＭＰＡアゴニスト；ＰＤＥ４インヒビター；ＧＡＢＡＡインバースアゴニスト；アミロイド凝集のインヒビター；グリコーゲンシンターゼキナーゼベータインヒビター；アルファセクレターゼ活性の促進物質；ＰＤＥ−１０インヒビター；タウキナーゼインヒビター（例えば、ＧＳＫ３ベータインヒビター、ｃｄｋ５インヒビターまたはＥＲＫインヒビター）；タウ凝集インヒビター（例えば、Ｒｅｍｂｅｒ（登録商標））；ＲＡＧＥインヒビター（例えば、ＴＴＰ  ４８８��ＰＦ−４４９４７００））；抗ベータアミロイドワクチン；ＡＰＰリガンド；インスリンをアップレギュレーションする物質、コレステロール低下剤、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（例えば、スタチン、例えば、アトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、メバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（Ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ））および／またはコレステロール吸収インヒビター（例えば、エゼチミブ（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ））、またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターとコレステロール吸収インヒビターとの組合せ（例えば、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標））；フィブラート（ｆｉｂｒａｔｅ）（例えば、クロフィブラート（ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、クロフィブリド（Ｃｌｏｆｉｂｒｉｄｅ）、エトフィブラート（Ｅｔｏｆｉｂｒａｔｅ）およびアルミニウムクロフィブラート）；フィブラートおよびコレステロール低下剤および／またはコレステロール吸収インヒビターの組合せ；ニコチン受容体アゴニスト；ナイアシン；ナイアシンおよびコレステロール吸収インヒビターおよび／またはコレステロール低下剤の組合せ（例えば、Ｓｉｍｃｏｒ（登録商標）（ナイアシン／シンバスタチン；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ＬＸＲアゴニスト；ＬＲＰ模倣物質；Ｈ３受容体アンタゴニスト；ヒストンデアセチラーゼインヒビター；ｈｓｐ９０インヒビター；５−ＨＴ４アゴニスト（例えば、ＰＲＸ−０３１４０（Ｅｐｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））；５−ＨＴ６受容体アンタゴニスト；ｍＧｌｕＲ１受容体モジュレーターまたはアンタゴニスト；ｍＧｌｕＲ５受容体モジュレーターまたはアンタゴニスト；ｍＧｌｕＲ２／３アンタゴニスト；プロスタグランジンＥＰ２受容体アンタゴニスト；ＰＡＩ−１インヒビター；ベータアミロイド（Ａｂｅｔａ）流出を誘導しうる物質、例えばゲルソリン（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）；金属−タンパク質減弱化合物（例えば、ＰＢＴ２）；およびＧＰＲ３モジュレーター；および抗ヒスタミン物質、例えばジメボリン（Ｄｉｍｅｂｏｌｉｎ）（例えば、Ｄｉｍｅｂｏｎ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒ）。
【００３２】
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、所望の生物活性を示す、抗体の任意の形態を意味しうる。したがって、それは最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体（これらに限定されるものではない）を含む。
【００３３】
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしての、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００３４】
各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は一般に同じである。
【００３５】
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、特定のエピトープへの結合が可能になるように、フレームワーク領域により整列されている。一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義に基づいている。
【００３６】
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列により抗体のＣＤＲ領域を定めている）を参照されたい。また、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（構造により抗体のＣＤＲ領域を定めている）も参照されたい。本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる語は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。
【００３７】
本明細書中で用いる抗体１０Ｈ８は、以下の表２に記載されている軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ配列番号２４および３０）を含む、ハイブリドーマサブクローンＭＥＢクローン１０Ｈ８．２５．６．１０Ｈ８（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）により産生される抗体である。
【表２】
2017512056.tif 000008
2017512056.tif 000009
【００３８】
本明細書中で用いる抗体１９Ｇ１０は、以下の表３に記載されている軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ配列番号３６および４２）を含む、ハイブリドーマサブクローンＭＥＢ．１９Ｇ１０．１０．５（マウスアイソタイプＩｇＧ２ｂ）により産生される抗体である。
【表３】
2017512056.tif 000010
2017512056.tif 000011
【００３９】
本明細書中で用いる抗体が「ｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する」と言えるのは、それがｈ−タウの公知の６個のアイソフォーム上のそのエピトープには結合するが、ｈ−タウ上の他のエピトープには結合しない場合である。
【００４０】
本明細書中で用いる抗体が「Ａβ１−４２のＮ末端またはＣ末端のエピトープに特異的に結合する」と言えるのは、それがそのエピトープには結合するが、Ａβ１−４２上の他のエピトープには結合しない場合である。
【００４１】
本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、抗体の抗原結合性フラグメント、すなわち、完全長抗体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ；ナノボディ（登録商標）、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは重鎖定常領域、例えばヒト定常領域、例えばγ１、γ２、γ３もしくはγ４ヒト重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダもしくはカッパヒト軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。例えば、限定的なものではないが、ヒト重鎖定常領域はγ１であることが可能であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。
【００４３】
本明細書中で用いる「生物学的サンプル」はいずれかのタイプの流体または組織サンプルを意味する。本発明におけるアッセイにおいて使用されうる典型例としては、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）および脳組織の抽出物が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で用いる「捕捉抗体」は、ｈ−タウを構成するアイソフォームの全てを生物学的サンプルから回収するために、開示されているアッセイにおいて使用される抗体を意味する。１つの態様においては、本明細書中で用いる捕捉抗体は、アミノ酸ＴＲＥＰＫ（アミノ酸２２０−２２４、配列番号１１）からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する。１つの実施形態においては、ｈ−タウ上の前記エピトープに結合する捕捉抗体はｍＡｂ  １０Ｈ８である。もう１つの態様においては、本明細書中で用いる捕捉抗体はＡβ１−４２のＮ末端および／またはＣ末端のエピトープに特異的に結合する。１つの実施形態においては、捕捉抗体は、アミノ酸ＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１８のアミノ酸３３−４２に対応する配列番号１６）を含むＡβ１−４２のＣ末端のエピトープに特異的に結合する。もう１つの実施形態においては、Ａβ１−４２上の前記エピトープに結合する捕捉抗体はウサギｍＡｂ  １−１１−３である。
【００４５】
本明細書中で用いる「制御配列」なる語は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、所望により、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公知である。
【００４６】
「検出可能な様態で標識された抗体」は、抗体を検出しうる試薬で標識された抗体を意味する。該試薬には、放射性同位体、酵素、ビオチン、色素、蛍光標識および化学発光標識（後記のとおり）が含まれうるが、これらに限定されるものではない。「検出可能な様態で標識された抗体」は、捕捉抗体により保持されたｈ−タウまたはＡβ１−４２の量を検出するために使用される。１つの態様においては、本明細書中で用いる検出可能な様態で標識された抗体は、アミノ酸１８９−１９４（ＰＫＳＧＤＲ、配列番号１２）からなる、ｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する。１つの実施形態においては、ｈ−タウ上の前記エピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体はｍＡｂ  １９Ｇ１０である。もう１つの態様においては、本明細書中で用いる検出可能な様態で標識された抗体はＡＢ１−４２のＮ末端および／またはＣ末端のエピトープに特異的に結合する。１つの実施形態においては、検出可能な様態で標識された抗体は、アミノ酸ＥＦＲＨＤＳ（アミノ酸３−８、配列番号１７）を含む、Ａβ１−４２のＮ末端のエピトープに特異的に結合する。もう１つの実施形態においては、Ａβ１−４２の前記エピトープに結合する検出可能な様態で標識された抗体はｍＡｂ  ６Ｅ１０である。
【００４７】
「ジアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。同一鎖上の２つのドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペア形成を強要され、２つの抗原結合部位を形成する。ジアボディは、例えばＥＰ  ４０４，０９７、ＷＯ  ９３／１１１６１およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８に更に詳しく記載されている。操作された抗体変異体の概説としては、全般的には、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１１２６−１１３６を参照されたい。
【００４８】
「ドメイン抗体」なる語は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーにより共有結合されて２価ドメイン抗体を形成する。２価ドメイン抗体の、２個のＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的化しうる。
【００４９】
「エピトープ」は、本発明の抗ｈ−タウ抗体または他の抗ｈ−タウ抗体により認識され結合されうる、ｈ−タウ上のアミノ酸のセグメント、あるいは抗体により認識され結合されうる、Ａβ１−４２上のアミノ酸のセグメントを意味する。
【００５０】
「Ｆａｂフラグメント」は１個の軽鎖ならびに１個の重鎖のＣＨ１および可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とはジスルフィド結合を形成し得ない。「Ｆａｂフラグメント」は抗体のパパイン切断の産物でありうる。
【００５１】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２個の重鎖フラグメントを含有する。それらの２個の重鎖フラグメントは２以上のジスルフィド結合により、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合している。
【００５２】
「Ｆａｂ’フラグメント」は１個の軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１個の重鎖の部分または断片、そしてまた、ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域を含有し、その結果、２個のＦａｂ’フラグメントの、２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成しうる。
【００５３】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２個の軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の部分を含有する２個の重鎖を含有し、その結果、それらの２個の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、それらの２個の重鎖の間のジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ’フラグメントから構成される。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は抗体のペプシン切断の産物でありうる。
【００５４】
「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００５５】
本明細書中で用いる「ｈ−タウ」は、ｈ−タウ（Ｔａｕ）の６個の公知アイソフォームを含むｈ−タウを意味する。ｈ−タウの定量は、ｈ−タウの６個の公知アイソフォームから得られるｈ−タウの量に関するものである。
【００５６】
「単離された抗体」は精製状態を指し、そような文脈において、分子が、他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質、例えば細胞残渣および増殖培地を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような物質の完全な非存在または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味するものではないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験用途または治療用途を実質的に妨げる量で存在してはならない。
【００５７】
「単離された核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの何らかの組合せであって、単離されたポリヌクレオチドが天然で見出される場合のポリヌクレオチドの全部または一部に付随していないもの、またはそれが天然で連結されていないポリヌクレオチドに連結されているものを意味する。本開示の目的においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は無傷染色体を含まないと理解されるべきである。特定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定されている配列に加えて、１０個まで又は更には２０個以上の他のタンパク質またはその一部もしくは断片のコード配列を含むことが可能であり、または挙げられている核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、および／またはベクター配列を含むことが可能である。
【００５８】
核酸が「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列に対して機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に、「機能的に連結（されている）」は、連結されているそれらのＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、かつ、リーディングフレームが一致していることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は簡便な制限部位における連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００５９】
本明細書中で用いる「Ｋｄ」は、当技術分野で公知のとおり、特定の抗体−抗原相互作用の「解離定数」を意味する。
【００６０】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体またはｍＡｂ」なる語は実質的に均一な抗体の集団を意味し、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる考えられうる自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して特異的であることが多い可変ドメイン、特にＣＤＲ内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
【００６１】
「ポリクローナル抗体」は、１以上の他の非同一抗体のなかで又は存在下で産生された抗体を意味する。一般に、ポリクローナル抗体は、例えば、関心のある免疫原（これは、全てが該免疫原に対するものである異なる抗体の集団を産生する）で処理された動物のＢ−リンパ球のような異なるＢ−リンパ球の集合体から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化動物、例えば脾臓、血清または腹水から直接得られる。
【００６２】
本明細書中で用いる「塩」なる語は、無機酸および／または有機酸で形成される酸性塩、ならびに無機塩基および／または有機塩基で形成される塩基性塩を示す。また、本発明の化合物が塩基性部分（限定的なものではないが例えば、ピリジンまたはイミダゾール）と酸性部分（限定的なものではないが例えば、カルボン酸）との両方を含む場合、両性イオン（「内部塩」）が形成されることがあり、本明細書中で用いる「塩」なる語に含まれる。医薬上許容される（すなわち、無毒性の生理的に許容される）塩が好ましいが、他の塩も有用である。本明細書に記載されているＢＡＣＥ−１インヒビターの塩は、例えば、塩が沈殿する媒体のような媒体または水性媒体中でＢＡＣＥ−１インヒビターを酸または塩基の或る量（例えば、同等量）と反応させ、ついで凍結乾燥させることにより形成されうる。
【００６３】
典型的な酸付加塩には、酢酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩としても公知である）などが含まれる。また、塩基性医薬化合物からの医薬上有用な塩の形成に適していると一般にみなされる酸は、例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ．（２００２）Ｚｕｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｓ．Ｂｅｒｇｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６（１）１−１９；Ｐ．Ｇｏｕｌｄ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９８６）３３  ２０１−２１７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＴｈｅ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｂｏｏｋ（Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（それらのウェブサイト上））に記載されている。
【００６４】
典型的な塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム、リチウムおよびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩、有機塩基（例えば、有機アミン）、例えばジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミンとの塩、ならびにアミノ酸、例えばアルギニン、リジンなどとの塩が含まれる。塩基性窒素含有基は、ハロゲン化低級アルキル（例えば、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチルおよびブチル）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、ジエチルおよびジブチル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリルおよびステアリル）、ハロゲン化アルアルキル（例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル）などのような物質で第四級化されうる。
【００６５】
全てのそのような酸塩および塩基塩は医薬上許容される塩であると意図され、全ての酸および塩基塩は、本明細書に記載されている対応ＢＡＣＥ−１インヒビターの遊離形態と同等であるとみなされる。
【００６６】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体なる語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントであって、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖内に存在するものを意味する。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの総説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。また、国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号を参照されたい。
【００６７】
「治療」または「治療する」なる語は、所望の薬理学的および／または生理的効果を得るためのＡＤ治療用物質の任意の投与を意味する。該効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防するという点で予防的であることが可能であり、ならびに／または疾患および／もしくは該疾患に起因する有害な効果の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であることが可能である。治療は、（１）該疾患の病理または総体症状を経験している又は示している患者、例えばヒトにおける該疾患を抑制すること（すなわち、病理および／または総体症状の更なる進展を阻止すること）、あるいは（２）該疾患の病理または総体症状を経験している又は示している患者における該疾患を改善すること（すなわち、病理および／または総体症状を逆転させること）を含む。
【００６８】
いずれかの特定の疾患症状を軽減するのに有効であるＡＤ治療用物質の量（「治療的有効量」とも称される）は、患者の病態、年齢および体重ならびに対象または患者において所望の応答を該薬物が惹起する能力のような要因に応じて変動しうる。疾患症状が軽減したかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって典型的に用いられるいずれかの臨床的測定により評価されうる。
【００６９】
典型的な抗ｈ−タウ抗体および抗原結合性フラグメントの物理的および機能的特性
本発明は、単離された抗ｈ−タウ抗体およびその抗原結合性フラグメント、ならびにこれらの抗体およびその抗原結合性フラグメントを使用して、生物学的サンプル、例えばＣＳＦ中のｈ−タウを定量する方法を提供する。本発明の抗ｈ−タウ抗体の例には、マウスアイソタイプＩｇＧ１のｍＡｂ  １０Ｈ８（表２を参照されたい；それぞれ配列番号２４および３０の軽鎖および重鎖可変領域）およびマウスアイソタイプＩｇＧ２ｂの１９Ｇ１０（表３を参照されたい；それぞれ配列番号３６および４２の軽鎖および重鎖可変領域）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
１０Ｈ８および１９Ｇ１０抗体は、ｈ−タウのアミノ酸１０４−２７７（図１を参照されたい）に伸長する、ｈ−タウの全６個のアイソフォームにより共有される保存領域に位置する非同一エピトープに特異的に結合する。
【００７１】
１つの態様においては、配列番号１１に記載されているアミノ酸２２０−２２４（ＴＲＥＰＫ）からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。米国特許第５，８６１，２５７号は、ｈ−タウのアミノ酸Ｐｒｏ  ２１８〜Ｌｙｓ  ２２４に対応するアミノ酸ＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号１３）を含むｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合するｍＡｂ  ＡＴ１２０を記載している。ｍＡｂ  １０Ｈ８により例示される、エピトープＴＲＥＰＫ（配列番号１１）に特異的に結合する本発明の抗体は、それぞれのエピトープにおける相違を考慮すると、米国特許第５，８６１，２５７号に記載されているｍＡｂ  ＡＴ１２０とは異なる抗体であると考えられている。これに関して、ｍＡｂ  ＡＴ１２０のエピトープマッピング（米国特許第５，８６１，２５７号の第１９〜２０欄にわたる段落を参照されたい）は、ｍＡｂ  ＡＴ１２０はペプチド配列ＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ（配列番号１４）とは反応するが、ｍＡｂ  ＡＴ１２０はペプチド配列ＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ（配列番号１５）とは反応しないことを示した。ｍｂ  ＡＴ１２０のこれらの及び追加的なペプチドマッピングの結果は、ｍＡｂ  ＡＴ１２０によって特異的に結合されるエピトープがＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号１３）であり、ｍＡｂ  １０Ｈ８により例示される本発明の抗体によって特異的に結合されるエピトープＴＲＥＰＫ（配列番号１１）ではないことを示した（ｍＡｂ  １０Ｈ８に関するエピトープマッピングの結果を示す実施例２を参照されたい）。
【００７２】
もう１つの実施形態においては、配列番号１１（ＴＲＥＰＫ）のエピトープに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号２０（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１（ＣＤＲＬ２）および配列番号２２（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号２６（ＣＤＲＨ１）、配列番号２７（ＣＤＲＨ２）および配列番号２８（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲまたは該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体は前記ＣＤＲの１以上における１、２、３、４、５および６個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸２２０−２２４（配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００７３】
もう１つの実施形態においては、配列番号１１（ＴＲＥＰＫ）のエピトープに結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号２４の軽鎖可変領域および配列番号３０の重鎖可変領域または該抗体の変異体を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体の変異体は一方または両方の配列における１〜２０個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸２２０−２２４（配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００７４】
もう１つの態様においては、配列番号１１（ＴＲＥＰＫ）のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントはｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントである。特に有用な実施形態においては、該ｍＡｂは、ハイブリドーマサブクローン クローン１０Ｈ８．２５．６．１０Ｈ８により産生されるｍＡｂ  １０Ｈ８（マウスＩｇＧ１アイソタイプを有する、それぞれ配列番号２４および３０の可変軽鎖および重鎖）またはｍＡｂ  １０Ｈ８の抗原結合性フラグメントである。
【００７５】
もう１つの実施形態においては、配列番号１１（ＴＲＥＰＫ）のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは免疫グロブリンのいずれかのクラス、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのものであり、これらの幾つかは更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類されうる。特に有用な実施形態においては、ｍＡｂ  １０Ｈ８はマウスＩｇＧ１アイソタイプを有する。
【００７６】
もう１つの実施形態においては、配列番号１１（ＴＲＥＰＫ）のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは低いマイクロモル（１０−６）〜ナノモル（１０−７〜１０−９）の範囲のＫｄ値で結合する。１つの実施形態においては、ｍＡｂ  １０Ｈ８は約１７ｎＭのＫｄでｈ−タウに結合する（実施例３を参照されたい）。
【００７７】
もう１つの態様においては、配列番号１２に記載されているアミノ酸１８９−１９４（ＰＫＳＧＤＲ）からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００７８】
１つの実施形態においては、配列番号１２（ＰＫＳＧＤＲ）のエピトープに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号３８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３９（ＣＤＲＨ２）および配列番号４０（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲまたは該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体は前記ＣＤＲの１以上における１、２、３、４、５および６個のアミノ酸置換を含むが、配列番号１１のアミノ酸２２０−２２４からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００７９】
もう１つの実施形態においては、配列番号１２（ＰＫＳＧＤＲ）のエピトープに結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号３６の軽鎖可変領域および配列番号４２の重鎖可変領域または該抗体の変異体を含む。１つの実施形態においては、該抗体の変異体はこれらの配列の一方または両方における１〜２０個のアミノ酸置換を含むが、アミノ酸１８９−１９４（配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに結合する能力を保有している。
【００８０】
もう１つの態様においては、配列番号１２（ＰＫＳＧＤＲ）のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントはｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントである。特に有用な実施形態においては、該ｍＡｂは、ハイブリドーマサブクローン クローン１９Ｇ１０．１０．５．１９Ｇ１０により産生されるｍＡｂ  １９Ｇ１０（マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプを有する、それぞれ配列番号３６および４２の可変軽鎖および重鎖）またはｍＡｂ  １９Ｇ１０の抗原結合性フラグメントである。
【００８１】
もう１つの実施形態においては、配列番号１２（ＰＫＳＧＤＲ）のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは免疫グロブリンのいずれかのクラス、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのものであり、これらの幾つかは更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類されうる。
【００８２】
特に有用な実施形態においては、配列番号１２（ＰＫＳＧＤＲ）のエピトープに結合する単離された抗体（例えば、ｍＡｂ  １９Ｇ１０）またはその抗原結合性フラグメントはＩｇＧ２ｂアイソタイプを有する。
【００８３】
もう１つの実施形態においては、配列番号１２（ＰＫＳＧＤＲ）のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは低いマイクロモル（１０−６）〜ナノモル（１０−７〜１０−９）の範囲のＫｄ値で結合する。もう１つの実施形態においては、ｍＡｂ  １９Ｇ１０は約６．３ｎＭのＫｄでｈ−タウに結合する（実施例３を参照されたい）。
【００８４】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞
もう１つの態様においては、アミノ酸２２０−２２４（ＴＲＥＰＫ、配列番号１１）からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの可変軽鎖および重鎖をコードする単離された核酸を提供する。１つの実施形態においては、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核酸を提供し、ここで、該抗体軽鎖可変領域は配列番号２４のものであり、抗体重鎖可変領域は配列番号３０のものである。
【００８５】
もう１つの態様においては、アミノ酸１８９−１９４（ＰＫＳＧＤＲ、配列番号１２）からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの可変軽鎖および重鎖をコードする単離された核酸を提供する。１つの実施形態においては、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核酸を提供し、ここで、該抗体軽鎖可変領域は配列番号３６のものであり、抗体重鎖可変領域は配列番号４２のものである。
【００８６】
もう１つの態様においては、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターを提供し、ここで、該核酸は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に該宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。したがって、１つの実施形態においては、配列番号２５および配列番号３１の単離された核酸の一方もしくは両方、または配列番号３７および配列番号４３の単離された核酸の一方もしくは両方を含む発現ベクターを提供する。
【００８７】
また、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。また、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供し、該製造方法は、該抗体または抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを含有する宿主細胞を培地内で培養し、該抗原またはその抗原結合性フラグメントを該宿主細胞または培地から単離することを含む。
【００８８】
タウ１６６ペプチド
もう１つの態様においては、タウ１６６ペプチドとして公知の配列番号９の単離されたペプチドを提供し、これは、本発明の抗体を製造するための免疫原として使用される。タウ１６６ペプチドは、標準的な組換え法を用いて製造されうる。例えば、タウ１６６ペプチドをコードする単離された核酸を適当な発現ベクター内にクローニングすることが可能である。１つの実施形態においては、タウ１６６ペプチドをコードする単離された核酸は配列番号１０である。ついで該組換えベクターをいずれかの適当な宿主細胞内に導入する。１つの実施形態においては、宿主細胞はｓｆ９（昆虫）細胞である。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である（実施例１を参照されたい）。ついで、該宿主細胞から発現されたタウ１６６ペプチドを標準的な方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．１６（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹを参照されたい）により宿主細胞から精製することが可能である。
【００８９】
抗体およびその抗原結合性フラグメントの製造方法
抗体を製造するために、適当な動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、サルまたは他の哺乳動物をタウ１６６ペプチドで免疫化して、抗体分泌細胞を産生させる。１つの実施形態においては、動物、例えばマウスをタウ１６６ペプチド、および免疫応答を増強するために使用するアジュバントで免疫化する。アジュバントの例には、フロイントアジュバント（完全および不完全）、無機塩、例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、界面活性物質、キトサン、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション（免疫化プロトコルに関しては実施例１を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。もう１つの実施形態においては、タウ１６６ペプチドを別の免疫原性分子または「担体タンパク質」に結合させることにより、タウ１６６ペプチドに対する免疫応答を増強することが可能である。担体タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン、コレラトキソイドおよびそれらの免疫原性断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。ペプチド免疫原を担体タンパク質に結合させる場合の指針に関しては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．１１．１５（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｈ．５（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【００９０】
本発明の親（例えば、げっ歯類）抗ｈ−タウ  ｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞は、当技術分野で一般に公知の方法により製造されうる。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）により最初に開発されたハイブリドーマ技術およびトリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６およびＨａｇｉｗａｒａら（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２およびＣｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８０：２０２６−２０３０）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）およびサイトパルス大チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｃｕｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）を使用する電場に基づく電気融合が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、マウス脾細胞を単離し、標準的なプロトコルに従い、ＰＥＧで又は電気融合によりマウス骨髄腫細胞系と融合させる。ついで、生じたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることが可能である。例えば、タウ１６６抗原で免疫化されたマウスからの脾臓リンパ球の単細胞浮遊液を、例えばバッファー（ｐＨ８．０）中の５０％  ポリエチレングリコール−１５００（ＰＥＧ−１５００）溶液を使用して、ＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞と融合させることが可能である。ついで融合細胞をマイクロタイタープレート上にプレーティングし、ＨＡＴ（ナトリウム−ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの液体混合物）で補足されたハイブリドーマ培地内で約２週間インキュベートすることが可能である。ついで、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような良く知られた方法により、抗体分泌ハイブリドーマを特定するために、各プレートからの培養上清をスクリーニングすることが可能である。該抗体分泌ハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングすることが可能である。スクリーニングされたハイブリドーマが所望の抗ｈ−タウ抗体に関して尚も陽性である場合には、それを少なくとも２回サブクローニングすることが可能である。サブクローニングは限界希釈により実施可能であり、この場合、該ハイブリドーマ細胞を細胞の最終濃度（例えば、２．５細胞／ｍＬ）までの系列希釈により培地内で希釈する。該細胞のアリコート、例えば２００μＬ（ウェル当たり約１／２の細胞）を各ウェル内にプレーティングし、約２週間インキュベートする。ついで各ウェル内の単一ハイブリドーマ細胞を顕微鏡的に特定し、その単一ハイブリドーマからの上清を本発明の抗ｈ−タウ抗体に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることが可能である。所望のサブクローンを���択し、抗体産生のために増殖させ、あるいは液体窒素冷凍庫内で凍結させることが可能である。研究のために必要な場合には、凍結ハイブリドーマのバイアルを解凍し、ハイブリドーマ培地内で増殖させて、抗体を産生させ、それを精製することが可能である。本発明の抗ｈ−タウ抗体の製造方法は実施例１に記載されている。
【００９１】
本発明の抗ｈ−タウ抗体は組換え法によって（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７発現系において）も製造されうる。この実施形態においては、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸をｐＥＴ系プラスミド内に挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７系内で発現させることが可能である。当技術分野で公知である組換え抗体を製造するための幾つかの方法が存在する。抗体の組換え製造のための方法の一例は米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するためのいずれかの公知方法により行われうる。哺乳類細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、遺伝子銃注入および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを包含する。また、ウイルスベクターにより哺乳類細胞内に核酸分子を導入することが可能である。細胞を形質転換する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。
【００９２】
抗ｈ−タウ抗体は、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている方法のいずれかによっても合成されうる。
【００９３】
本明細書に開示されている抗体またはフラグメントの発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系を包含する。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞系を包含する。哺乳類宿主細胞はヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を包含する。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するのかを決定することにより選択される。使用されうる他の細胞系としては、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合、該宿主細胞における該抗体の発現、またはより好ましくは、該宿主細胞が培養される培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって該宿主細胞を培養することにより、該抗体を製造する。
【００９４】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。更に、生産細胞系からの本発明の抗体（またはそれ由来の他の部分）の発現は幾つかの公知技術により増強されうる。例えば、グルタミンシンターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、一定条件下で発現を増強するための一般的アプローチである。ＧＳ系は欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５号および第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号において全体的または部分的に考察されている。
【００９５】
診断アッセイ、治療方法およびキット
もう１つの態様においては、生物学的サンプル中のｈ−タウを定量する方法を提供し、該方法は、
（ａ）生物学的サンプルを本発明の抗ｈ−タウ抗体、例えばｍＡｂ  １０Ｈ８またはｍＡｂ  １９Ｇ１０または該抗体の変異体（前記のもの）またはそれらの抗原結合性フラグメントと、ｈ−タウおよび該抗体またはその抗原結合性フラグメントの間の免疫複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、
（ｂ）形成した免疫複合体を検出することを含む。
【００９６】
前記方法は、前記の生物学的サンプル、例えばＣＳＦ、血漿、全血、血清または脳組織の抽出物中のｈ−タウを定量するために使用されうる。
【００９７】
ｈ−タウを定量するための前記方法の１つの実施形態においては、本発明の抗ｈ−タウ、例えばｍＡｂ  １０Ｈ８またはｍＡｂ  １９Ｇ１０または該抗体の変異体を固相上にコーティングし、ついで生物学的サンプルを該固相と接触させる。この方法において使用されうる固相の例としては、マイクロタイターウェル、プラスチックチューブ、膜、ラテックス粒子、磁気粒子、ミクロスフェアおよびビーズが挙げられる。生物学的サンプル中のｈ−タウは該抗体に結合し、ｈ−タウの量は直接または間接法により決定されうる。
【００９８】
該直接法は、ｈ−タウ／抗ｈ−タウ抗体複合体自体の存在、したがってｈ−タウの存在および量を、該抗体またはその抗原結合性フラグメントに標識を結合させることにより検出することを含む。標識の例としては、放射性同位体（例えば、１４Ｃ、３５Ｓ、Ｉ１２５および３Ｈ）、検出可能な反応産物を有する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼなど）、蛍光標識（例えば、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアナート、レゾルフィンなど）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム塩、ルミノール、イソルミノールなど）および生物発光化合物（例えば、ルシフェリン、エクオリンなど）が挙げられる。
【００９９】
間接法においては、本発明の抗ｈ−タウ抗体は、マウス抗ｈ−タウ抗体に対するアフィニティを有する物質（例えば、ヤギ抗マウスまたはウサギ抗マウスＩｇＧ）、または前記のとおり放射性、蛍光性または化学発光性である検出可能な試薬で標識された二次抗体と抗ｈ−タウ抗体を反応させ、二次抗体の存在を検出することにより間接的に標識されうる。
【０１００】
もう１つの実施形態においては、ｈ−タウのアミノ酸１０４−２７７に伸長するｈ−タウの保存領域に対してそれぞれが特異的である抗ｈ−タウ抗体のペアを使用して、ｈ−タウの量を定量する。抗体のペアの一方は本発明の抗ｈ−タウ抗体、例えばｍＡｂ  １０Ｈ８もしくはｍＡｂ  １９Ｇ１０またはそれらの２つの抗体の変異体であり、該ペアを構成する他方の抗体もｈ−タウに特異的である。よく知られた抗ｈ−タウ抗体、特に、アミノ酸１０４−２７７に伸長するｈ−タウの保存領域上のエピトープに結合するｍＡｂの例としては、タウ５、ＢＴ２およびＨＴ７（Ｃｏｖａｎｃｅにおいて商業的に入手可能）が挙げられる。抗体のペアの一方は「捕捉」抗体として使用可能であり、該ペアの他方は「検出可能な様態で標識された抗体」として使用可能である。したがって、１つの実施形態は、生物学的サンプル中のｈ−タウを検出するために二重抗体サンドイッチ法を用い、ここで、ｈ−タウは、捕捉抗体、すなわち、ｍＡｂ  １０Ｈ８もしくはｍＡｂ  １９Ｇ１０または該抗体の変異体と、検出可能な様態で標識された抗体、すなわち、ＢＴ２との間でサンドイッチ化され（挟まれ）、該捕捉抗体は固相上に固定化されている。
【０１０１】
該二重サンドイッチ法の１つの実施形態は、本発明の抗ｈ−タウ抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を含む酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。例えば、ＥＬＩＳＡは以下の工程を含む：
（ａ）本発明の抗ｈ−タウ抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えばｍＡｂ  １０Ｈ８もしくはｍＡｂ  １９Ｇ１０またはこれらの抗体の変異体で固相（例えば、マイクロタイタープレートウェルの表面）をコーティングすること；
（ｂ）ｈ−タウの存在に関して試験されるべきサンプルを該固相に適用すること；
（ｃ）該プレートを洗浄して、該サンプル中の未結合物質を除去すること；
（ｄ）ｈ−タウ抗原、例えばタウ５、ＢＴ２またはＨＴ７に同様に特異的である検出可能な様態で標識された抗ｈ−タウ抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用すること；
（ｅ）該固相を洗浄して、未結合標識抗体を除去すること；
（ｆ）標識抗体が酵素結合体である場合には、蛍光シグナルへと酵素により変換される化学物質を適用すること；および
（ｇ）標識抗体の存在を検出すること。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡの一例としては、検出可能な様態で標識される抗体はペルオキシダーゼで標識され、これはＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な変色をもたらす。
【０１０３】
二重抗体サンドイッチアッセイの特に有用な実施形態においては、アミノ酸１０４−２７７に伸長するｈ−タウの保存領域上の非同一エピトープにそれぞれが特異的に結合する本発明の抗ｈ−タウ抗体（例えば、ｍＡｂ  １０Ｈ８およびｍＡｂ  １９Ｇ１０またはこれらの抗体の変異体）のペアを使用して、ＣＳＦのサンプル中のｈ−タウの量を定量する。アミノ酸２２０−２２４（ＴＲＥＰＫ、配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する抗体、例えばｍＡｂ  １０Ｈ８または該抗体の変異体を「捕捉抗体」として使用し、アミノ酸１８８−１９４（ＰＫＳＧＤＲ、配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する抗体、例えば１９Ｇ１０または該抗体の変異体を「検出可能な様態で標識される（または標識された）抗体」として使用する。ＣＳＦサンプル中のｈ−タウを定量するためのこの方法は、
（ａ）アミノ酸２２０−２２４（ＴＲＥＰＫ、配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する抗体、例えば１０Ｈ８または該抗体の変異体またはそれらの抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／ｈ−タウ複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのｈ−タウを捕捉し、
（ｂ）アミノ酸１８９−１９４（ＰＫＳＧＤＲ、配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体、例えば１９Ｇ１０または該抗体の変異体またはそれらの抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／ｈ−タウ複合体を、捕捉抗体／ｈ−タウ／検出可能標識抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたｈ−タウを検出することを含む。
【０１０４】
前記のとおり、固体支持体の例としては、マイクロタイターウェル、プラスチックチューブ、膜、ラテックス粒子、磁気粒子、磁気微粒子、ミクロスフェアおよびビーズが挙げられる。固体支持体のための適当な物質には、ナイロン、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、スチレン、カルボキシル化スチレンおよび繊維含有紙、例えば濾紙、クロマトグラフィー紙およびガラス繊維紙が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
特に有用な実施形態においては、固体支持体は磁気ミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸから商業的に入手可能なカルボキシル化ポリスチレン微粒子またはビーズであるＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）である（例えば、米国特許第７，７１８，２６２号、第６，５１４，２９５号、第６，５９９，３３１号、第６，６３２，５２６号、第６，９２９，８５９号、第７，４４５，８４４号、第８，２８３，０３７号および第８，５６８，８８１号を参照されたい）。「検出可能な様態で標識される抗体」を標識するための試薬には、放射性同位体、酵素、ビオチン、色素、蛍光標識および化学発光標識が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に有用な実施形態においては、該試薬は、ストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートに結合されるビオチンである。
【０１０６】
生物学的サンプル、例えばＣＳＦ中のｈ−タウを定量するための前記方法の一例は、ビーズに基づく技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用い、この場合、ｍＡｂ  １０Ｈ８（「捕捉抗体」）を磁気ミクロスフェアに結合させる。該結合ミクロスフェアを９６ウェルプレートのウェル内で種々の濃度のｈ−タウ（標準として使用される）またはＣＳＦサンプルと共にインキュベートし、ついでビオチン化ｍＡｂ  １９Ｇ１０（「検出可能な様態で標識された抗体」）を加えてｍＡｂ  １０Ｈ８／ｈ−タウ／ビオチン化ｍＡｂ  １９Ｇ１０複合体を形成させる。該ビオチン化複合体の検出は、該ビオチン化抗体に結合するストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートの存在下のインキュベーションにより行う。ｘＭＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ装置（ＦｌｅｘＭａｐ  ３Ｄ，Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）は、特異的ミクロスフェアを特定するための分類レーザー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｌａｓｅｒ）（６３８ｎＭ）、およびコンジュゲートに結合したフィコエリトリン分子を励起させるための第２レポーターレーザー（５３２ｎＭ）を使用する。該複合体に結合したフィコエリトリンからの蛍光出力を、検出器（５６５ｎＭ〜５８５ｎＭ）またはＣＣＤ（電荷結合素子）イメージング検出器を使用して測定し、ＣＳＦサンプル中のｈ−タウの種々の濃度から作成された検量線で読取られたＣＳＦサンプル中のｈ−タウの量と直接的に関連づける。
【０１０７】
もう１つの態様においては、ＡＤを有する疑いのある患者においてＡＤを診断するための方法を提供する。この方法は、例えば、ＡＤ治療用物質、例えばＢＡＣＥ−１インヒビターでの治療のための患者を選択するために使用されうる。該方法は、
（ａ）患者から得られた生物学的サンプル中のｈ−タウの量を定量し、この場合、これを、
（ｉ）アミノ酸２２０−２２４（ＴＲＥＰＫ、配列番号１１）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する抗体、例えば１０Ｈ８または該抗体の変異体またはそれらの抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／ｈ−タウ複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのｈ−タウを捕捉し、
（ｉｉ）１８９−１９４（ＰＫＳＧＤＲ、配列番号１２）からなるｈ−タウのエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体、例えば１９Ｇ１０または該抗体の変異体またはそれらの抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／ｈ−タウ複合体を、捕捉抗体／タウ／検出可能標識抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたｈ−タウを検出することにより行い、
（ｃ）工程（ａ）で得たサンプル中のｈ−タウの濃度を決定することを含み、ここで、１８４ｐｇ／ｍＬより大きな値は該患者におけるＡＤの診断を示す。
【０１０８】
ｈ−タウの量を定量することにより、ＡＤを有する疑いのある患者においてＡＤを診断する方法は、例えば実施例４および５に記載されている。
【０１０９】
１つの実施形態においては、アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断するための前記方法は、
（ａ）該患者の脳脊髄液サンプル中のヒトタウの量を定量し、この場合、これを、
（１）（ｉ）配列番号２０（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１（ＣＤＲＬ２）および配列番号２２（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号２６（ＣＤＲＨ１）、配列番号２７（ＣＤＲＨ２）および配列番号２８（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体、ならびに
（ｉｉ）配列番号２４の軽鎖可変領域および配列番号３０の重鎖可変領域を含む単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体
からなる群から選択される、ｈ−タウのアミノ酸２２０−２２４からなるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／タウ複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのヒトタウを捕捉し、
（２）（ｉ）配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号３８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３９（ＣＤＲＨ２）および配列番号４０（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体、ならびに
（ｉｉ）配列番号３６の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインを含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは該抗体の変異体
からなる群から選択される、アミノ酸１８９−１９４からなるエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体または抗体フラグメントと該捕捉抗体／タウ複合体を、捕捉抗体／タウ／検出可能標識抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたタウを検出することにより行い、
（ｂ）工程（ａ）におけるヒトタウの濃度を決定することを含み、ここで、１８４ｐｇ／ｍＬより大きな値は該患者におけるＡＤの診断を示す。
【０１１０】
ＡＤを有する疑いのある患者においてＡＤを診断する前記方法のもう１つの実施形態においては、該方法は更に、
（ｃ）該患者のＣＳＦサンプル中のＡβ１−４２の量を定量し
（ｄ）該患者のサンプルにおけるｈ−タウ／Ａβ１−４２の比を決定する工程を含み、ここで、０．２１５より大きな比の値は該患者におけるＡＤの診断を示す。
【０１１１】
工程（ｃ）において、ＣＳＦサンプル中のＡβ１−４２の量は、ｈ−タウの定量に関して前記で記載されているとおりのイムノアッセイにおいて、Ａβ１−４２のＮ末端および／またはＣ末端のエピトープに特異的に結合する商業的に入手可能な抗体を使用して定量されうる。商業的に入手可能な抗体の例には、ｍＡｂ  ６Ｅ１０（Ｎ末端，Ｃｏｖａｎｃｅ）、ｍＡｂ  １２Ｆ４（Ｃ末端，Ｃｏｖａｎｃｅ）、ｍＡｂ  １−１１−３  Ｃ末端，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標））、ｍＡｂ  Ｇ２−１１（Ｃ末端，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびｍＡｂ  ４Ｇ８（Ｎ末端，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
１つの実施形態においては、ＣＳＦ中のＡβ１−４２の量を定量する前記方法の工程（ｃ）は、
（ｉ）Ａβ１−４２のＣ末端のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）とサンプルを、捕捉抗体／Ａβ１−４２複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、サンプルからのＡβ１−４２を捕捉し、
（ｉｉ）Ａβ１−４２のＮ末端のエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体またはその抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／Ａβ１−４２複合体を、検出可能標識抗体／Ａβ１−４２／捕捉抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたＡβ１−４２を検出することを含む。
【０１１３】
一例としては、工程（ｃ）において、サンドイッチＥＬＩＳＡ系を使用してＣＳＦ中のＡβ１−４２を測定することが可能であり、この場合、商業的に入手可能なｍＡｂ、例えばｍＡｂ  ６Ｅ１０を捕捉抗体として使用し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ｍＡｂ  １２Ｆ４を検出可能標識抗体として使用する。この系においては、９６ウェルプレートを一晩のインキュベーションによりｍＡｂ  ６Ｅ１０でコーティングし、ついで該プレートをバッファーで洗浄して、未結合ｍＡｂ  ６Ｅ１０を除去することが可能である。ついで種々の濃度の標準ＡＢ１−４２ペプチドおよび希釈サンプルを、ＡＰが結合した検出可能標識抗体と共にインキュベートし、ついでＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）化学発光基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を加える。化学発光はＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定されうる。
【０１１４】
特に有用な実施形態においては、工程（ｃ）におけるＡβ１−４２を定量する方法は、ビーズに基づく技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用い、この場合、「捕捉抗体」として使用されるｍＡｂ  １−１１−３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標））を磁気ミクロスフェア上に結合させる。該結合ミクロスフェアを９６ウェルプレートのウェル内で種々の濃度のＡβ１−４２（標準として使用される）またはＣＳＦサンプルと共にインキュベートし、ついでビオチン化ｍＡｂ  ６Ｅ１０（「検出可能な様態で標識された抗体」）を加えてｍＡｂ  １−１１−３／Ａβ１−４２／ビオチン化ｍＡｂ  ６Ｅ１０複合体を形成させる（工程（ｂ）（ｉｉ））。該ビオチン化複合体の検出は、該ビオチン化抗体に結合するストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートの存在下のインキュベーションにより行う。ｘＭＡＰ技術の装置（ＦｌｅｘＭａｐ  ３Ｄ，Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）は、特異的ミクロスフェアを特定するための分類レーザー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｌａｓｅｒ）（６３８ｎＭ）、およびコンジュゲートに結合したフィコエリトリン分子を励起させるためのレポーターレーザー（５３２ｎＭ）を使用する。該複合体に結合したフィコエリトリンからの蛍光出力を、検出器（５６５ｎＭ〜５８５ｎＭ）またはＣＣＤ（電荷結合素子）イメージング検出器を使用して測定し、ＣＳＦサンプル中のＡβ１−４２の種々の濃度から作成された検量線で読取られたＣＳＦサンプル中のＡβ１−４２の量と直接的に関連づける。
【０１１５】
患者のＣＳＦ中のｈ−タウおよびＡβ１−４２の量の定量の後、該患者のＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ１−４２の比を決定する（工程（ｄ））。前記のとおり、最近の研究は、ＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ１−４２の比が、アミロイド斑病理を有する個体の特定に有用であることを示している（Ｆａｇａｎら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１１３７−１１４４，２０１１）。ＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ１−４２の比は非認知症高齢者および軽度ＡＤを有する成人における将来の認知機能低下を予測することも示されている（Ｆａｇａｎら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６４，ｐｐ．３４３−３４９，２００７）。したがって、ＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ１−４２の比は、ＡＤ修飾物質での治療のための患者を選択する際の補助として使用可能であり、実施例６に記載されているとおりに決定された（実施例５ならびに図２および３も参照されたい）。
【０１１６】
もう１つの態様においては、ＡＤの治療を要する患者においてＡＤを治療する方法を提供し、該方法は、
（ａ）ｈ−タウおよび／またはｈ−タウ／Ａβ１−４２比を定量する前記診断方法を用いて、治療を要する患者を選択し、
（ｂ）ＡＤ治療用物質の治療的有効量を該患者に投与することを含む。
【０１１７】
１つの実施形態においては、ＡＤ治療用物質は前記のものから選択される。
【０１１８】
１つの実施形態においては、ＡＤ治療用物質はＢＡＣＥ−１インヒビターである。ＢＡＣＥ−１は、アルツハイマー病の治療のための、受け入れられた治療標的となっている。例えば、ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．３６（Ｓｅｐｔ．２００７）は、ＢＡＣＥ−１酵素活性の部分的低下およびそれに付随したＡβレベルの低下がＡβ誘導性ＡＤ様病理の劇的な抑制を招くことを示しており、したがって、β−セクレターゼがＡＤにおける治療介入の標的となる。Ｏｈｎｏら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｏ．２６（２００７），１３４−１４５は、５ＸＦＡＤマウスにおけるＢＡＣＥ−１の遺伝的欠失がＡβ産生を抑止し、アミロイド沈着を阻止し、大脳皮質および海馬台（５ＸＦＡＤマウスにおいて最も重篤なアミロイド症を示す脳領域）で見出されるニューロン喪失を防ぎ、５ＸＦＡＤマウスにおける記憶障害を救うと報告している。該グループはまた、ＡβがＡＤにおけるニューロン死を最終的に引き起こすと報告しており、ＢＡＣＥ−１抑制がＡＤの治療アプローチとして妥当だと確認されたと結論づけている。Ｒｏｂｅｒｄｓら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１２，１３１７−１３２４は、β−セクレターゼ活性の抑制または喪失が顕著な表現型欠損をもたらさない一方で、Ａβの付随的減少を誘導することを確認している。Ｌｕｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ  ２００１は、ＢＡＣＥ−１欠損マウスが正常表現型を有し、β−アミロイド産生を消失していることを報告している。
【０１１９】
ＡＤを治療するための前記方法の１つの実施形態においては、ＢＡＣＥ−１インヒビターは、ＷＯ２０１１０４４１８１に記載されている化合物、例えば、
【化２】
2017512056.tif 000012
【０１２０】
からなる群から選択される化合物もしくは互変異性体または該化合物もしくは該互変異性体の医薬上許容される塩である。
【０１２１】
もう１つの実施形態においては、ＢＡＣＥ−１インヒビターは、構造
【化３】
2017512056.tif 000013
【０１２２】
を有するベルベセスタット（ｖｅｒｕｂｅｃｅｓｔａｔ）またはその互変異性体である。ベルベセスタットの医薬上許容される塩も想定される。適当な許容される塩には、ＨＣｌおよびトシル酸塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
もう１つの実施形態においては、ＢＡＣＥ−１インヒビターは、ＷＯ２００８／１０３３５１に記載されている化合物、例えば、
【化４】
2017512056.tif 000014
【０１２４】
からなる群から選択される化合物もしくは互変異性体または該化合物もしくは該互変異性体の医薬上許容される塩である。
【０１２５】
また、
【化５】
2017512056.tif 000015
【０１２６】
なる部分を有する前記化合物は、異なる互変異性体で存在しうる。全てのそのような形態がこれらのＢＡＣＥ−１インヒビターの範囲内に含まれる。したがって、例えば、式：
【化６】
2017512056.tif 000016
【０１２７】
およびその互変異性体：
【化７】
2017512056.tif 000017
【０１２８】
に合致するＢＡＣＥ−１インヒビターは共に前記のＢＡＣＥ−１インヒビターの範囲内に含まれると意図される。
【０１２９】
前記ＡＤ治療用物質、例えばＢＡＣＥ−１インヒビターを患者に投与するための適当な用量は、当業者、例えば担当医師、薬剤師または他の熟練者によって容易に決定可能であり、患者の健康状態、年齢、体重、投与頻度、他の有効成分との併用および／または該化合物が投与される適応症に応じて変動しうる。用量はＡＤ治療用物質約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲でありうる。１つの実施形態においては、投与量はＡＤ治療用物質約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。もう１つの実施形態においては、単位用量の製剤中のＡＤ治療用物質の量は個々の適用に応じて約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇ〜約２５ｍｇの範囲で改変または調節されうる。もう１つの実施形態においては、経口投与のための典型的な推奨１日投与レジメンは２〜４分割量における約１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、好ましくは１ｍｇ／日〜２００ｍｇ／日の範囲でありうる。
【０１３０】
もう１つの実施形態においては、ＡＤ治療用物質は、構造
【化８】
2017512056.tif 000018
【０１３１】
を有するＢＡＣＥ−１インヒビター、その互変異性体または該化合物もしくは該互変異性体の医薬上許容される塩であり、所望により、製剤化に適した医薬上許容される賦形剤を含有し、ここで、該用量は、１日１〜４回投与される５ｍｇ、１０ｍｇ、１２ｍｇ、４０ｍｇ、６０ｍｇまたは１００ｍｇ／用量である。有用な実施形態においては、この特定のＢＡＣＥ−１インヒビターの用量は１日当たり１回で４０ｍｇまたは６０ｍｇである。
【０１３２】
前記のとおり、前記ＡＤ治療用物質の投与の量および頻度は、患者の年齢、状態およびサイズならびに治療される症状の重症度のような要因を考慮して、担当臨床家の判断に従い調節される。
【０１３３】
ＡＤ治療用物質がＢＡＣＥ−１インヒビターである実施形態においては、ＢＡＣＥ−１インヒビターはもう１つのＡＤ治療用物質と共に使用されうる。ＢＡＣＥ−１インヒビターは、１以上の追加的なＡＤ治療用物質と共に使用される場合、一緒に又は連続的に投与されうる。連続的に投与される場合、ＢＡＣＥ−１インヒビターは、当業者による判断により、１以上の追加的なＡＤ治療用物質の前または後で投与されうる。
【０１３４】
一定の用量として製剤化される場合、そのような組合せ体は、本明細書に記載されている投与量範囲内のＢＡＣＥ−１インヒビターおよび投与量範囲内のその他の医薬上活性な物質または治療を使用する。
【０１３５】
したがって、１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つのＢＡＣＥ−１インヒビターもしくはその互変異性体またはＢＡＣＥ−１インヒビターもしくは互変異性体の医薬上許容される塩の或る量と、前記の１以上の追加的なＡＤ治療用物質の有効量との組合せを含む。
【０１３６】
前記ＢＡＣＥ−１インヒビターの薬理学的特性は、ＷＯ２０１１／０４４１８１に例示されている幾つかの薬理学的アッセイにより確認されうる。
【０１３７】
前記ＡＤ治療用物質から医薬組成物を製造する場合、不活性の医薬上許容される担体は固体または液体でありうる。固体形態の製剤には、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤および坐剤が含まれる。散剤および錠剤は約５〜約９５％の有効成分を含みうる。適当な固体担体は当技術分野で公知であり、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトースが挙げられる。錠剤、散剤、カシェ剤およびカプセル剤は、経口投与に適した固体剤形として使用されうる。医薬上許容される担体の例および種々の組成物の製造方法の例はＡ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに見出されうる。
【０１３８】
液体形態の製剤には、溶液（水剤）、懸濁剤および乳剤（エマルション）が含まれる。一例として、経口注射には水または水−プロピレングリコール溶液が使用可能であり、あるいは経口溶液、懸濁剤および乳剤には甘味剤および乳白剤が加えられうる。液体形態の製剤には鼻腔内投与用の溶液も含まれうる。
【０１３９】
吸入に適したエアゾール製剤には溶液および粉末形態の固体が含まれることが可能であり、これらは医薬上許容される担体、例えば不活性圧縮ガス、例えば窒素と組合されうる。
【０１４０】
経口または非経口投与用の液体形態の製剤へと使用直前に変換されることが意図される固体形態の製剤も含まれる。そのような液体形態には溶液、懸濁液および乳剤が含まれる。
【０１４１】
前記ＡＤ治療用物質は経皮的にも運搬可能でありうる。経皮組成物はクリーム剤、ローション剤、エアゾール剤および／または乳剤の形態をとることが可能であり、この目的に当技術分野で通常に使用されるマトリックスまたはリザーバー型の経皮パッチ内に含まれうる。
【０１４２】
前記ＡＤ治療用物質は皮下運搬されることも可能である。
【０１４３】
１つの実施形態においては、ＡＤ治療用物質、例えばＢＡＣＥ−１インヒビターは経口投与される。
【０１４４】
幾つかの実施形態においては、１以上のＡＤ治療用物質を含む医薬製剤は単位投与形で製造されることが有利でありうる。そのような形態においては、該製剤は、適当な量（例えば、所望の目的を達成するための有効量）の有効成分を含有する適切なサイズの単位用量へと細分される。
【０１４５】
もう１つの態様においては、例えば前記のとおりのアルツハイマー病の診断およびＡＤ治療のための患者の選択のような目的のために生物学的サンプル中のｈ−タウの量を定量するためのキットを提供する。該キットは、
（ａ）アミノ酸２２０−２２４からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えば、ｍＡｂ  １０Ｈ８もしくは該抗体の変異体（前記のとおり）またはそれらの抗原結合性フラグメント、および
（ｂ）アミノ酸１８９−１９４からなるｈ−タウ上のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えば、ｍＡｂ  １９Ｇ１０もしくは該抗体の変異体（前記のとおり）またはそれらの抗原結合性フラグメントを含む。
【０１４６】
該キットの１つの実施形態においては、該キットの成分（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えばｍＡｂ  １０Ｈ８は前記の固相支持体（例えば、磁気ミクロスフェア）に連結され、該キットの成分（ｂ）、例えばｍＡｂ  １９Ｇ１０はビオチン化される。
【０１４７】
もう１つの実施形態においては、前記キットは、前記のＡβ１−４２ペプチドに特異的な抗体のペアを含む第２キットと共に使用されうる。第２キットのもう１つの実施形態においては、Ａβ１−４２に特異的な抗体は、磁気ミクロスフェアに結合したｍＡｂ  １−１１−３、およびビオチン化ｍＡｂ  ６Ｅ１０である。
【０１４８】
前記キットは更に、特定の目的（例えば、ＡＤ治療用物質、例えばＢＡＣＥ−１インヒビターでの治療のための患者を選択する目的のためのＡＤ患者の診断）のために該抗体を使用するための説明を含みうる。該キットは、個々の用途において通常使用されるバッファーおよび他の試薬、ならびに標識を検出するための物質、例えば酵素標識に対する酵素基質、二次標識、例えば二次抗体をも含みうる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、６個の公知ｈ−タウアイソフォーム（それぞれｈ−タウ４４１、ｈ−タウ４１２、ｈ−タウ４１０、ｈ−タウ−３８１、ｈ−タウ３８３およびｈ−タウ３５２）のアミノ酸配列（配列２〜７）を示す。ｍＡｂ  １０Ｈ８に対するエピトープ（ｈ−タウのアミノ酸２２０−２２４に対応するＴＲＥＰＫ（配列番号１１））およびｍＡｂ  １９Ｇ１０に対するエピトープ（ｈ−タウのアミノ酸１８９−１９４に対応するエピトープＰＫＳＧＤＲ（配列番号１２））が太枠内に示されている。
【図２】図２はＣＳＦ  Ａβ４２、タウおよびタウ／Ａβ４２に関する推定ＲＯＣ曲線（１００＊感度対１００＊（１−特異性））を示す。８０％の感度および６０％の特異性における基準線が示されている。
【図３】図３は、対数目盛を用いた、ＣＳＦ  ｈ−タウ／Ａβ４２に関する予想閾値に対する、感度、特異性およびＰＥＴ（フルテメタモール視覚的読取り）との一致総量（total agreement）の推定を示す。感度（実線）および特異性（実線）が９５％  下側信頼限界（破線）と共に示されている。一致総量（実線）の推定はノンパラメトリック密度評価に基づいている。垂直線（実線）は、許容可能な感度および特異性性能を達成するＣＳＦウィンドウ（０．１６９、０．３６０）を示す。このウィンドウ内の一致総量を最大にする値（０．２１５）も垂直線で示されており、最上部の軸上に示されている。
【０１５０】
実施例
実施例１
モノクローナル抗体１０Ｈ８および１９Ｇ１０の製造
１．タウ１６６抗原の製造
１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを含有するＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地内に最近の形質転換からのコロニーを接種することにより、タウ１６６ペプチド（抗原）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）内で発現させた。接種後、該培養を飽和状態まで３７℃で一晩成長させた。該一晩培養を使用して、６×２Ｌを０．０７（Ａ６００）の初期光学濃度で接種した。該培養を、２２５ＲＰＭで振とうしながら、０．６（Ａ６００）の光学濃度まで、３７℃でインキュベートした。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド）を同じ温度で１ｍＭの最終濃度まで加えることにより、タンパク質発現を誘導した。誘導の４時間後（Ａ６００＝０．６３）、該培養物を９１８０×ｇで１０分間の遠心分離により回収した。
【０１５１】
回収された細胞ペーストを５００ｍＬの細胞溶解バッファー（ＴＢＳ−Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ８．０）＋  プロテアーゼインヒビター）に懸濁させた。得られた溶液を手短にホモジナイズし、マイクロフルイダイザーに３回通過させることにより細胞溶解した。ライセートを２０，０００×ｇで２０分間の遠心分離により清澄化した。
【０１５２】
１５ｍＬのカラム床体積を有する２．５ｃｍ  Ｅｃｏｎｏ−カラム上のＮｉ−ＮＴＡ（ＮＴＡ−ニトリロトリ酢酸）クロマトグラフィーを使用して、タウ１６６ペプチドを該ライセートから精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ  ｈｉｓ結合カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）をバッファーＡ（１０ｍＭ  イミダゾール，ｐＨ８．０）中で前平衡化した。可溶性ライセート画分中のタウ１６６ペプチドを１５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂に４℃で２時間、バッチ結合させた。該樹脂を２．５ｃｍ  Ｅｃｏｎｏ−カラム内に集め、以下の順序で洗浄した；１０カラム体積のバッファーＡ、１０カラム体積のバッファーＢ（１０ｍＭ  イミダゾール，０．５％  トリトン  Ｘ−１００，ｐＨ  ８．０）、１０カラム体積のバッファーＣ（１０ｍＭ  イミダゾール，０．５％  デオキシコール酸Ｎａ，ｐＨ  ８．０）、そして最後に１０カラム体積のバッファーＡ。以下のとおりに段階勾配（ステップグラジエント）を用いて、タウ１６６ペプチドを溶出した：１０カラム体積のバッファーＤ（２５ｍＭ  イミダゾール，ｐＨ  ８．０）、１０カラム体積のバッファーＥ（３００ｍＭ  イミダゾール，ｐＨ  ８．０）。５ｍＬ画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、関心のあるタンパク質を含有する溶出画分をプールし、バッファーＤでの洗浄に付した。
【０１５３】
該Ｎｉ−ＮＴＡプールを２．６ｃｍ×６０ｃｍ  ＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ  ７．４）で前平衡化されたもの）上に注入した。５ｍＬ画分を１．１カラム体積上で集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、関心のあるタンパク質を含有する画分をプールした。このプールからのタンパク質を、３０００ｋＤａ  ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）の遠心分離装置（ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して２倍濃縮した。ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に再懸濁されたタウ１６６ペプチドの最終ストックを濃度に関して分析し、アリコートを−８０℃で凍結させた。
【０１５４】
２．免疫化プロトコル
３８日間のスケジュールのプロトコルを用いるハイブリドーマ融合における使用に備えて、動物を免疫化した。簡潔に説明すると、該プロトコルの第１日に、完全フロイントアジュバント中の５０μｇのタウ１６６抗原を使用してマウスに注射した。ついで２８日後、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇの抗原を該マウスに再び注射した。１０日後、該動物から採血し、スクリーニング抗原、すなわち、タウ１６６ペプチドに対する血清のＥＣ５０希釈力価の測定により該動物の免疫応答を判定した。５０，０００を超える力価値を有する動物を融合プロトコルにおける使用のために選択した。該動物に５０μｇの抗原を連続した３日間にわたって追加抗原接種（ブースター接種）し、ついで第４日に融合プロトコールにおける使用のために該動物を犠死させた。
【０１５５】
３．融合プロトコル
ハイブリドーマ融合法は、選択された動物脾細胞の融合相手としてＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞系を利用した。ＳＰ２／０をその対数増殖期に使用した。それは融合時点で＞９０％生存可能である。マウス脾臓を、選択されたマウスから集め、潅流し、浸漬軟化させ、引っ張った。該細胞を集め、計数した。ＳＰ２／０を計数し、１：５〜１：２のＳＰ２／０対脾細胞の融合比が可能となるように適量を集めた。
【０１５６】
両方の細胞調製物を別々にＤＭＥＭ／Ｆ１２中で２回洗浄し、ついで一緒にし、３回目の洗浄に付した。上清をデカントし、得られたペレットを残存培地に穏やかに再懸濁させた。１ｍｌの加温ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を１分間にわたって該ペレットに滴下し、ついで１分間静置させた。ついで次の３分間にわたって合計１０ｍＬの培地を該懸濁液に加え、該懸濁液を３７℃の水浴内で５分間インキュベートした。該細胞を遠心沈殿させ、２０％  フェタルクローン（Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ）および２×ＨＡＴ（ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリンおよびチミジンの液体混合物）を含有する融合培地に再懸濁させた。ついで該細胞を９６ウェル培養プレート上にプレーティングし、３７℃でインキュベートした。７日後、２０％  追加的な１０５μｌのＦｅｔａｌｃｌｏｎｅおよび１×ＨＡＴを含有する培地を該培養に加え、該プレートを更に７日間インキュベートした。この時点で、該培地の８０％を該ウェルから除去し、新鮮培地と交換した。該プレートを更に７日間インキュベートし、ついで各ウェルからの上清をスクリーニング抗原に対する抗体反応性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【０１５７】
４．ＥＬＩＳＡスクリーニング
抗原のスクリーニングのために、ビオチン化タウ１６６ペプチドをストレプトアビジンコート化９６ウェル培養プレートの表面に結合させ、ウェルを１５０μｌの１％  ＢＳＡでブロッキングした。該抗原コート化およびブロック化プレート上の融合プレートからの５０μｌの培養上清および５０μｌの１％  ＢＳＡブロッキング剤をインキュベートすることにより、スクリーニングを行った。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートおよびＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］）水溶性ＨＲＰ基質を使用して、検出を行った。培養ウェルは、それらが０．５より大きな吸光度を示した場合に、抗体産生に関して「陽性」とみなされた。これらの陽性ウェル内の細胞を９６ウェルプレートから集め、２４ウェル培養プレート内に２０％  ＦｅｔａｃｌｏｎｅおよびＨＴを含有する０．５ｍｌの培地上にプレーティングした。陽性ウェルを７日間の増殖に付し、ついで追加的な０．５ｍｌのＨＴ培地を含有する第２のウェルへと拡張し、更に３日間の増殖に付した。選択された抗体がＩｇＧであることを確認するために、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰの両方を使用して、ウェルをスクリーニング抗原に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ついで、０．５を超える吸光度を示すＩｇＧ抗体のみに陽性であったウェルはサブクローニングが考慮された。
【０１５８】
タウ１６６を抗原として使用して９個のｍＡｂを開発し、これらのうちの６個を８個の異なるペアとして試験した。ＮＨＶおよびＡＤ患者のＣＳＦにおけるｈ−タウ濃度を測定することにより、全てのこれらのペアをそれらの診断性能に関して試験した。ＲＯＣ曲線およびそれらの対応ＡＵＣ（曲線下面積）値を計算した。最高ＡＵＣ値を有する抗体ペアは１０Ｈ８および１９Ｇ１０であることが判明した。このことは、正常被験者をＡＤ被験者から識別する場合に、それらが、試験されたペアの残りのものより優れていることを示している。したがって、これらの２つのｍＡｂを更なる開発のために選択した。
【０１５９】
５．サブクローニング
２４ウェルプレートの２ウェル内に拡張されたマウスＩｇＧに対する陽性体としてスクリーニングされたウェルからの細胞を、それらが５０％コンフルエントかつ９０％を超える生存度になるまでインキュベートした。該細胞をプールし、計数した。ついで十分な細胞を取り出して、２０％  Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ培地内に４０ｍｌの５細胞／ｍｌを含有する懸濁液を得た。残りの細胞を再び凍結させた。３×９６ウェルプレート上で１０５μｌ／ウェル（０．５細胞／ウェルと同等）で該細胞をプレーティングした。該プレートを約１週間インキュベートし、ついで追加的な１０５μｌの培地を加え、更に１週間、またはそれらが＞２５％コンフルエントになるまでの増殖に付した。増殖細胞の単一「コロニー」を含有するウェルを、既に記載されているとおりにヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を使用するＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために選択した。スクリーニングされたクローンの９０％以上がタウ１６６抗原に対して陽性となるまで、スクリーニング抗原に関して陽性であったウェルを使用して、該プロセスを繰返した。この時点で、陽性クローンのサブセットを１２ウェル培養プレート内の１ｍｌの培地へと拡張した。該細胞を複数ウェル内で増殖させ、再び凍結させた。これらのクローンの選択物から細胞バンクを作製した。
【０１６０】
６．ＧＭＰ（医薬品製造品質管理基準）細胞バンクの作製
凍結サブクローンからＧＭＰ細胞バンクを作製した。小容量の培養を１０％  Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ培地内で増殖させて、バンク化前品質スクリーニングにおける使用のためのサンプルを得た。このスクリーニングはバイオバーデン無菌性試験およびマイコプラズマ検出試験を含む。試験結果を受領した後、ＱＣ試験および細胞バンクの作製のために細胞を再び凍結させた。
【０１６１】
品質試験に合格した細胞のアリコートを増殖させ、５×１０６  ｃ／ｍｌにてバンク化バイアルのための適当な体積に増量した。バンク化前に該培養をアイソタイプ決定した。該細胞を２４〜７２時間ごとに計数し、培地内の５×１０４  ｃ／ｍｌへの希釈による増殖に付した。適当な体積の培養が得られている場合には、細胞を計数し、生存度が９１％以上であれば、該バンク化を進めた。細胞培養を遠心沈殿させ、上清を廃棄した。適当な量の細胞凍結培地（９０％  Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ，１０％  ＤＭＳＯ）に細胞を再懸濁させた。該細胞を直ちに低温チューブ内に配置し、−７０で＞２４〜７２時間放置し、ついで液体窒素中で保存した。液体窒素中で少なくとも２４時間の後、バンク化後ＱＣを行った。充填プロセスの初期、中期および終期からの代表的な細胞バイアルを解凍し、増殖させた。充填の初期および終期からの培養の時間の倍化を行った。中期充填サンプルから増殖させた培養のアイソタイプ決定を行い、該培養を回収し、バンク後マイコプラズマ試験へと送り、サンプルをバイオバーデン無菌性試験のために送った。該バンクは、全ての品質結果が合格し陰性であった場合に解放された。
【０１６２】
７．１０Ｈ８および１９Ｇ１０抗体産生
解放されたＧＭＰ細胞バンクから抗体産生を行った。バンク化細胞のバイアルを解凍し、１０％  Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ培地内で培養した。培養を２４〜７２時間ごとに計数し、必要に応じて、５×１０４  細胞／ｍｌへと培養を希釈することにより増殖させた。該培養を適当な体積に増殖させ、計数し、生存度が３０％以上でだと決定されたら、上清を集めた。培養を３０００×ｇで２０分間遠心させ、上清を適当な保存容器内にデカントした。この段階で、ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナルアイソタイプ決定キット（Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、上清をアイソタイプ決定し、ついで精製まで２〜８℃で保存した。
【０１６３】
８．精製
ＧＭＰ細胞バンクからの培養から増殖させた上清を、専用プロテインＡカラム上のＡＫＴＡ液体クロマトグラフィー系を用いて精製した。抗体を、ｐＨ８．８のバッファーを該カラムに結合させ、ｐＨ３．３のバッファーを使用して溶出した。産物（１０Ｈ８または１９Ｇ１０）をバッファー透析し、濃縮し、最終バッファーはＰＢＳ（ｐＨ７．４）であった。産物（１０Ｈ８または１９Ｇ１０）を試験し、ＨＰＬＣにより９０％を超える純度を有していた。タンパク質濃度をＡ２８０（２８０ｎＭでタンパク質濃度を測定する吸光アッセイ）により測定した。産物を５００μｇのアリコート中で２．０ｍｇ／ｍｌで保存し、−１０℃〜−２５℃で保存した。ｍＡｂ  １０Ｈ８は、マウスＩｇＧ１アイソタイプを有する、それぞれ配列番号２４および３０の可変軽鎖および重鎖配列を有する。ｍＡｂ  １９Ｇ１０は、マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプを有する、それぞれ配列番号３６および４２の可変軽鎖および重鎖配列を有する。
【０１６４】
実施例２
１０Ｈ８および１９Ｇ１０のエピトープマッピング
ＪＰＴペプチド・テクノロジーズ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）ペプチドマイクロアレイを使用して、クローン１０Ｈ８および１９Ｇ１０のエピトープマッピングを完了した。この技術は、ガラス表面に化学選択的かつ共有結合的に固定化された精製合成ペプチドを使用することにある。立体障害により引き起こされる偽陰性を回避するために、最適化親水性リンカー部分をガラス表面と抗原由来ペプチド配列との間に挿入する。使用されるペプチドはアミノ酸１０４〜アミノ酸２６９（タウ１６６）の１６６アミノ酸のタウ中央領域タンパク質配列に伸長するものであった。同時に１または２アミノ酸下流に伸長する１５アミノ酸長のペプチドをこの実験において使用した。
【０１６５】
該アッセイは、自動化ＴＥＣＡＮ  ＨＳ４Ｘ００マイクロアレイ・プロセシング・ステーションを使用して行った。マイクロアレイを洗浄し、ブロッキングバッファーと共に３０℃で６０分間、ついで、ブロッキングバッファー中で希釈されたクローン１０Ｈ８および１９Ｇ１０と共に３０℃で１２０分間インキュベートした。マイクロアレイを洗浄し、ブロッキングバッファー中で希釈された二次抗体と共に３０℃で４５分間インキュベートし、ついで乾燥させた。高分解能蛍光スキャナーを使用して定量を行った。スポット認識ソフトウェアＧｅｎｅＰｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、得られたイメージを分析し、定量した。各スポットに関して平均シグナル強度を抽出し、任意蛍光単位で表した。
【０１６６】
１０Ｈ８および１９Ｇ１０のエピトープマッピングの結果を表４および５に示す。第１欄は、ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）マイクロアレイ実験において使用した推定エピトープを含有するペプチドを示し、第２欄はその実験からの任意蛍光単位を示す。任意蛍光単位の太数字は強力な反応性を示し、したがってエピトープの存在を示す。この反応性に基づいて、ｍＡｂ  １０Ｈ８に対するエピトープはアミノ酸ＴＲＥＰＫからなり、ｍＡｂ  １９Ｇ１０に対するエピトープはアミノ酸ＰＫＳＧＤＲからなると結論づけられた。
【表４】
2017512056.tif 000019
2017512056.tif 000020
【表５】
2017512056.tif 000021
2017512056.tif 000022
【０１６７】
実施例３
ｍＡｂ  １０Ｈ８および１９Ｇ１０の相対結合アフィニティの測定
固定化ｈ−タウ４４１を捕捉タンパク質として使用するＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ３センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により、１０Ｈ８および１９Ｇ１０  ｍＡｂの結合アフィニティ（Ｋｄ）を決定した。
【表６】
2017512056.tif 000023
【０１６８】
実施例４
ｈタウおよびＡβ１−４２の定量
ｈ−タウアッセイのためのｈ−タウ４４１標準体の製造
ｈ−タウ４４１の配列（配列番号１）をｐｅｔ３Ａベクター内にＮＤＥ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ切断部位においてクローニングした。Ｈｉｓタグ、ＴＥＶ切断部位およびｈ−タウ４４１配列は表１に示されている。該ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）内に形質転換し、ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ結合カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、ｈ−タウ４４１の精製を完了した。
【０１６９】
ｈ−タウアッセイ
ｈ−タウアッセイは、ビーズに基づく技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用い、この場合、２工程のカルボジイミド反応プロトコルを用いて、１．０ｍＬのＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ミクロスフェアに対して１００μｇのｍＡｂ  １０Ｈ８の比で、タウ特異的ｍＡｂ（ｍＡｂ１０Ｈ８，Ｍｅｒｃｋ）を磁気ミクロスフェア上に結合させた。該２工程法においては、まず、ミクロスフェアの表面上のカルボキシル基をカルボジイミド誘導体ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）で活性化して、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩）で安定化される中間体を形成させる。ついで該中間体をタンパク質の第１級アミドと反応させてアミド結合を形成させ、それによりミクロスフェアの表面上で安定複合タンパク質を得る。該アッセイにおいて、該結合ミクロスフェアを９６ウェルプレートのウェル内で標準物質（ｈ−タウ４４１：１５．６〜１０００ｐｇ／ｍＬ）またはＣＳＦサンプルと共に、振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ついで、２０倍モル過剰で標識されたｈ−タウに特異的なビオチン化ｍＡｂ（ｍＡｂ  １９Ｇ１０，Ｍｅｒｃｋ）を該反応に加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートし、ついで、該ビオチン化抗体に結合するストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）コンジュゲート（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ）と共に３０分間インキュベートした。インキュベーション工程のそれぞれの間に、磁気洗浄系を用いて２×１５０μＬでの洗浄（ＰＢＳ−ＴＢＮ）を行った。該反応の完了後、該ミクロスフェアを１００μＬの洗浄バッファーに再懸濁させ、ついで、特異的ミクロスフェアを特定するために分類レーザー（６３８ｎｍ）または分類励起（６２１ｎｍ）を、そして該コンジュゲートに結合したフィコエリトリン分子を励起するためにレポーターレーザー（５３２ｎｍ）またはレポーター励起（５１１ｎｍ）を用いるｘＭＡＰ装置（ＦｌｅｘＭａｐ  ３Ｄ，Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で直ちに分析した。蛍光出力を、作成された検量線で読取られたサンプル中のｈ−タウの濃度と直接的に関連づける。
【０１７０】
Ａβ１−４２アッセイ
Ａβ１−４２アッセイも、ビーズに基づく技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用い、２工程のカルボジイミド反応プロトコルを用いて、ｍＡｂ  １−１１−３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を磁気ミクロスフェア（ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ミクロスフェア）上に結合させた。該２工程法においては、まず、ミクロスフェアの表面上のカルボキシル基をカルボジイミド誘導体ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）で活性化して、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩）で安定化される中間体を形成させる。ついで該中間体をタンパク質の第１級アミドと反応させてアミド結合を形成させ、それによりミクロスフェアの表面上で安定複合タンパク質を得る。該アッセイにおいて、該結合ミクロスフェアを９６ウェルプレートのウェル内で標準物質（標準Ａβ１−４２：５．４７〜７００ｐｇ／ｍＬ）またはＣＳＦサンプルと共に、振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ついで、２０倍モル過剰で標識されたビオチン化６Ｅ１０  ｍＡｂ（Ｃｏｖａｎｃｅ）を該反応に加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートし、ついで、該ビオチン化抗体に結合するストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）コンジュゲート（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ）と共に３０分間インキュベートした。インキュベーション工程のそれぞれの間に、磁気洗浄系を用いて２×１５０μＬでの洗浄（ＰＢＳ−ＴＢＮ）を行った。該反応の完了後、該ミクロスフェアを１００μＬの洗浄バッファーに再懸濁させ、ついで、特異的ミクロスフェアを特定するために分類レーザー（６３８ｎｍ）または分類励起（６２１ｎｍ）を、そして該コンジュゲートに結合したフィコエリトリン分子を励起するためにレポーターレーザー（５３２ｎｍ）またはレポーター励起（５１１ｎｍ）を用いるＸＭＡＰ装置で直ちに分析した。蛍光出力を、作成された検量線で読取られたサンプル中のＡβ１−４２アナライトの濃度と直接的に関連づける。
【０１７１】
実施例５
ＡＤ診断とｈ−タウレベルおよびｈ−タウ／Ａβ４２比との間の相関性
実施例４に記載されているｈ−タウアッセイを用いて、代表的な健常対照（ｎ＝１８８）およびＡＤ被験者（ｎ＝１５５）の集合において、ヒト個体のＣＳＦ中のｈ−タウレベルを決定した。施設の指針に従い、ＣＳＦを集めた。健常対照（ＨＣ）およびＡＤ患者は性別（ＡＤに関しては男性４５％およびＨＣにおいては男性４５％）および年齢（平均年齢はＡＤにおいては６４歳、健常ボランティアにおいては６７歳）において類似していた。以下の表７に示すとおり、平均ＣＳＦ  ｈ−タウ濃度はＡＤ被験者（２０８±８３）においては健常対照被験者（１２６±３９）と比べて高かった。ｈ−タウ／Ａβ１−４２の平均比は健常対照においては０．１７５±０．０９６であったが、それはＡＤにおいては０．６１３±０．３０２であった。この生データは、ＡＤまたはＨＣである被験者を識別するためにｈ−タウレベルまたは比を用いることが可能であることを表している。
【表７】
2017512056.tif 000024
【０１７２】
実施例６
ｈ−タウおよびｈ−タウ／Ａβ１−４２比のカットオフ値を確定するための方法
統計分析計画
ＣＳＦサンプルを国際的な５箇所からの１８８名のＨＣおよび１５５名のＡＤ被験者から集め、前記のｈ−タウおよびＡβ１−４２アッセイを用いてアッセイした。カットオフを確定するために２工程アプローチを用いた。第１に、ｈ−タウ／Ａβ１−４２比を用いて少なくとも８０％の感度および６０％の特異性でＡＤをＨＣから識別する、ＡＤと健常対照とを最も良く識別する可能なカットオフ値の範囲を決定した。ＨＣからのサンプルとＡＤ被験者からのサンプルとを識別するＣＳＦにおけるアッセイの性能を特徴づけるために、受信者動作特性（ＲＯＣ；Ｐｅｐｅ，Ｍ．Ｓ．Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．２００３  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎを参照されたい）曲線法を用いた。第２に、ＡＤおよび他の認知機能低下の原因に関して評価されている認知障害を有する成人患者におけるＡβ老人斑の存在を推定するための脳のイメージングに関して承認されたＶｉｚａｍｙｌ（商標）（１８Ｆ−フルテメタモール）を使用するポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージング（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｖｉｚａｍｙｌ（商標）パッケージインサート，２０１３年１０月改訂）を行い、結果を用いて、確定範囲内の特異的カットオフ値を選択した。Ｖｉｚａｍｙｌ（商標）のＦＤＡ承認ラベルに記載されている、これらの脳領域のイメージの配向および表示のための推奨方法に従い、イメージを陽性または陰性スキャンとして評価した。第１段階における感度および特異性の評価ならびに第２段階におけるＰＥＴの一致の推定の両方のために、アミロイドＰＥＴイメージングを有するＡＤ被験者および健常対照を用いた。本発明者らの感度および特異性基準を満たしアミロイドＰＥＴとの一致を最大にしたウィンドウ内のＣＳＦ  ｈタウおよびｈタウ／Ａβ１−４２値はｈタウに関しては１８４ｐｇ／ｍＬ、そしてｈタウ／Ａβ１−４２に関しては０．２５１の比であった（図２および３）。
【図１】
2017512056.tif 000028
【図２】
2017512056.tif 000029
【図３】
2017512056.tif 000030
【配列表】
2017512056000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月2日(2016.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸２２０−２２４からなるヒト・タウのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
配列番号２０（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１（ＣＤＲＬ２）および配列番号２２（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号２６（ＣＤＲＨ１）、配列番号２７（ＣＤＲＨ２）および配列番号２８（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
配列番号２４の軽鎖可変領域および配列番号３０の重鎖可変領域を含む、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
モノクローナル抗体１０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
アミノ酸１８９−１９４からなるヒト・タウのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）の３個の軽鎖ＣＤＲならびに配列番号３８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３９（ＣＤＲＨ２）および配列番号４０（ＣＤＲＨ３）の３個の重鎖ＣＤＲを含む、請求項５記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
配列番号３６の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインを含む、請求項５記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
モノクローナル抗体１９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項５記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと生物学的サンプルを、ヒト・タウと該抗体またはその抗原結合性フラグメントとの免疫複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および
（ｂ）形成した免疫複合体を検出すること
を含む、生物学的サンプル中のヒト・タウを定量する方法。
【請求項１０】
該抗体がモノクローナル抗体１０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項５〜８のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと生物学的サンプルを、ヒト・タウと該抗体またはその抗原結合性フラグメントとの免疫複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および
（ｂ）形成した免疫複合体を検出すること
を含む、生物学的サンプル中のヒト・タウを定量する方法。
【請求項１２】
該抗体がモノクローナル抗体１９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
脳脊髄液サンプル中のヒト・タウを定量するための方法であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／タウ複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのヒト・タウを捕捉すること、および
（ｂ）請求項５〜８のいずれか１項記載の検出可能な様態で標識された抗体またはその抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／タウ複合体を、捕捉抗体／タウ／検出可能標識抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたタウを検出すること
を含む方法。
【請求項１４】
捕捉抗体がモノクローナル抗体１０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントであり、検出可能な様態で標識される抗体がモノクローナル抗体１９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体が、磁気粒子、ミクロスフェア、磁気ミクロスフェア、ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
固体支持体が磁気ミクロスフェアである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
検出可能な様態で標識された抗体が、放射性同位体、酵素、ビオチン、色素、蛍光標識および化学発光標識からなる群から選択される試薬で標識されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
試薬がビオチンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ビオチンがストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートに結合する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病の診断を補助するための方法であって、該方法が、
（ａ）請求項１３記載の方法を用いて該患者の脳脊髄液サンプル中のヒト・タウの量を定量すること、および
（ｂ）工程（ａ）におけるヒト・タウの濃度を決定すること
を含み、
１８４ｐｇ／ｍＬより大きな値が該患者におけるＡＤの診断を示す、方法。
【請求項２１】
（ｃ）該患者の脳脊髄液サンプル中のＡβ１−４２の量を定量すること、および
（ｄ）該患者のサンプルにおけるヒト・タウ／Ａβ１−４２の比を決定することを更に含み、
０．２１５より大きな比の値が該患者におけるＡＤの診断を示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）において、６Ｅ１０、１２Ｆ４、１−１１−３、Ｇ２−１１および４Ｇ８からなる群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体またはこれらの抗体のいずれかの抗原結合性フラグメントを使用して、Ａβ１−４２の量を定量する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）において、
（ｉ）Ａβ１−４２のＣ末端のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは固体支持体上に固定化されている）と該サンプルを、捕捉抗体／Ａβ１−４２複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、該サンプルからのＡβ１−４２を捕捉すること、および
（ｉｉ）Ａβ１−４２のＮ末端のエピトープに特異的に結合する検出可能な様態で標識された抗体またはその抗原結合性フラグメントと該捕捉抗体／Ａβ１−４２複合体を、検出可能標識抗体／Ａβ１−４２／捕捉抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、捕捉されたＡβ１−４２を検出すること
により、脳脊髄液サンプル中のＡβ１−４２の量が定量される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）（ｉ）において使用する抗体がモノクローナル抗体１−１１−３であり、工程（ｃ）（ｉｉ）において使用する抗体がモノクローナル抗体６Ｅ１０である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＡＤ治療用物質を含む、アルツハイマー病の治療のための医薬組成物であって、
当該治療が、
（ａ）請求項２０、２１、２２、２３および２４のいずれか１項記載の方法を用いて、治療を要する患者を選択すること、および
（ｂ）前記ＡＤ治療用物質の治療的有効量を該患者に投与すること
を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
ＡＤ治療用物質がＢＡＣＥ−１インヒビターである、請求項２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＢＡＣＥ−１インヒビターが、
【化１】
2017512056.tif 000031
からなる群から選択される化合物もしくはその互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＢＡＣＥ−１インヒビターが、構造
【化２】
2017512056.tif 000032
を有する化合物もしくはその互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＢＡＣＥ−１インヒビターが、
【化３】
2017512056.tif 000033
からなる群から選択される化合物もしくはその互変異性体または該化合物もしくは互変異性体の医薬上許容される塩である、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項３０】
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントと、
（ｂ）請求項５〜８のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントと
を含むキット。
【請求項３１】
成分（ａ）の単離された抗体が、磁気ミクロスフェアに結合したｍＡｂ  １０Ｈ８またはその抗原結合性フラグメントであり、成分（ｂ）の単離された抗体がビオチン化ｍＡｂ  １９Ｇ１０またはその抗原結合性フラグメントである、請求項３０記載のキット。
【国際調査報告】
2017512056.tif 000034
2017512056.tif 000035
2017512056.tif 000036