(57)【要約】  二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ分子およびがんの処置におけるその使用。二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ分子は、結合して、Ｐ−カドヘリン腫瘍細胞関連抗原とＣＤ３  Ｔ細胞抗原とを認識する２つのエピトープ結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む。【図１】2017520575.tif 000086
2017520575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、
ａ．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂとを含むドメイン１、および
ｉｉ．第１のヘテロ二量体促進ドメイン
を含み、
ｂ．第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．サブドメイン２Ａとサブドメイン２Ｂとを含むドメイン２、および
ｉｉ．第２のヘテロ二量体促進ドメイン
を含み、
サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａが、抗Ｐ−カドヘリン抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）と、抗Ｐ−カドヘリン抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）とを含むＰ−カドヘリンＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２Ｂが、抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン（ＣＤ３  ＶＬ）と、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合ドメイン（ＣＤ３  ＶＨ）とを含むＣＤ３  ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する、または
サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａが、ＣＤ３  ＶＬとＣＤ３  ＶＨとを含むＣＤ３  ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨとＰ−ＣＡＤ  ＶＬとを含むＰ−カドヘリンＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２】
サブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬまたはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン１Ｂが、サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、ＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２Ｂがサブドメイン１Ａについて選択されるＶＬドメインに応じてＰ−ＣＡＤ  ＶＬまたはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２Ａが、サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ、またはサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、ＣＤ３  ＶＨを含む、請求項１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３】
サブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、サブドメイン１ＢがＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む、請求項１または２に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項４】
サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン１ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、サブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、サブドメイン２ＡがＣＤ３  ＶＨを含む、請求項１または２に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項５】
サブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン１Ｂが、サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２Ｂが、サブドメイン１Ａについて選択されるＶＨドメインに応じてＰ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２Ａが、サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含む、請求項１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項６】
サブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、サブドメイン１ＢがＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む、請求項１または５に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項７】
サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン１ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、サブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、サブドメイン２ＡがＣＤ３  ＶＬを含む、請求項１または５に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項８】
第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインのアミノ酸配列が、ノブまたはホールを形成するように、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項９】
第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが両方ともノブもしくは両方ともホールではなく、および／または第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインがＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域を形成する、請求項８に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１０】
ノブを形成するＩｇＧ  Ｆｃ領域が配列番号６３の配列を含み、ホールを形成するＩｇＧ  Ｆｃ領域が配列番号６４の配列を含む、請求項８または９のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１１】
第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが、グルタミン酸および負に荷電したアルファ−ヘリックスコイルを含むＥ−コイル領域またはリシンおよび正に荷電したヘリックスコイルを含むＫ−コイル領域を含み、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが両方ともＥ−コイル領域または両方ともＫ−コイル領域ではない、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１２】
Ｅ−コイル領域が配列番号６１の配列を含み、および／またはＫ−コイル領域が配列番号６２の配列を含む、請求項１１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１３】
サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって連結され、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって連結されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１４】
グリシン−セリンリンカー（リンカー１）が、配列番号６８または配列番号６９の配列を含む、請求項１３に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１５】
サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してＶＬ／ＶＨエピトープ結合ドメインを形成せず、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してＶＬ／ＶＨエピトープ結合ドメインを形成しない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１６】
第１のヘテロ二量体促進ドメインがサブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む、および／または第２のヘテロ二量体促進ドメインがサブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１７】
第１のヘテロ二量体促進ドメインおよび／または第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、少なくとも１つのグリシン残基をさらに含む、請求項１６に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１８】
第１のヘテロ二量体促進ドメインおよび／または第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）の配列を含む、請求項１７に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項１９】
第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）の配列を含む、請求項１８に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２０】
第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）の配列を含む、請求項１８に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２１】
第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）を含み、または第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２が、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含む、請求項１８に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２２】
ａ．ヒトＰ−カドヘリンの細胞外ドメイン３（ＥＣＤ３）に結合する、
ｂ．Ｐ−カドヘリン上のエピトープに結合するが、Ｅ−カドヘリンもしくはＶＥ−カドヘリン上のエピトープには結合しない、
ｃ．ヒトＰ−カドヘリン上のエピトープに結合するが、マウスＰ−カドヘリン上のエピトープには結合しない、
ｄ．長い血清および腫瘍半減期を示す、または
ｅ．増大したＰ−カドヘリン発現レベルもしくは増大した受容体密度レベルの存在下で、より低いＥＣ５０を示す、
請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２３】
ａ．ＸＬ１．１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．３−ＸＬ１．４−ＸＬ１．５−ＸＬ１．６−ＸＬ１．７−ＸＬ１．８−ＸＬ１．９−ＸＬ１．１０−ＸＬ１．１１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．１３を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１配列、
ｂ．ＸＬ２．１−ＸＬ２．２−ＸＬ２．３−ＸＬ２．４−ＸＬ２．５−ＸＬ２．６−ＸＬ２．７を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２配列、
ｃ．Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３配列  ＸＬ３．１−ＸＬ３．２−ＸＬ３．３−ＸＬ３．４−ＸＬ３．５−ＸＬ３．６−ＸＬ３．７−ＸＬ３．８−ＸＬ３．９−ＸＬ３．１０−ＸＬ３．１１、
ｄ．ＸＨ１．１−ＸＨ１．２−ＸＨ１．３−ＸＨ１．４−ＸＨ１．５−ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０またはＸＨ１．５、ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１配列、
ｅ．ＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０またはＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０−ＸＨ２．１１−ＸＨ２．１２−ＸＨ２．１３−ＸＨ２．１４−ＸＨ２．１５−ＸＨ２．１６−ＸＨ２．１７を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２配列、および
ｆ．ＸＨ３．１−ＸＨ３．２−ＸＨ３．３−ＸＨ３．４−ＸＨ３．５−ＸＨ３．６−ＸＨ３．７−ＸＨ３．８−ＸＨ３．９を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３配列
を含み、ここで、ＸＬ３．３がＷであり、ＸＨ１．８がＧであり、ＸＨ２．５がＹであり、ＸＨ３．１がＩであり、ＸＨ３．７がＦである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２４】
ＸＬ１．８がＧであり、ＸＬ２．２がＮであり、ＸＬ２．３がＮであり、ＸＬ３．２がＴであり、ＸＨ２．６がＮであり、ＸＨ２．１６がＱであり、ＸＨ３．５がＮであり、ＸＨ３．９がＩである、請求項２３に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２５】
ａ．配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬのＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号４５もしくは４６の配列を含むＣＤ３  ＶＨのＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３
ｃ．配列番号４７の配列を含むＣＤ３  ＶＬのＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３、ならびに／または
ｄ．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨのＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２６】
ａ．Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号３５もしくは３６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号３７もしくは３８の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号３９、４０、４１、４２、４３もしくは４４の配列を含む、
ｂ．ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号４８の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号４９もしくは５０の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号５１の配列を含む、
ｃ．ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号５５の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号５６の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号５７の配列を含む、および／または
ｄ．Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号２５もしくは３３の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号２６もしくは３４の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２の配列を含む、
請求項２５に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２７】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号４１の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号２８の配列を含む、請求項２５または２６に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２８】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号４２の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号２９の配列を含む、請求項２５または２６に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項２９】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２は配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号４３の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号３０の配列を含む、請求項２５または２６に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３０】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号３９の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号３１の配列を含む、請求項２５または２６に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３１】
ａ．Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬが配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３の配列を含み、
ｂ．ＣＤ３  ＶＨが配列番号４５または４６の配列を含み、
ｃ．ＣＤ３  ＶＬが配列番号４７の配列を含み、
ｄ．Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４の配列を含む、
請求項１から３０のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３２】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬが配列番号５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨが配列番号６の配列を含む、請求項３１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３３】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬが配列番号７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨが配列番号８の配列を含む、請求項３１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３４】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬが配列番号９の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨが配列番号１０の配列を含む、請求項３１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３５】
Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬが配列番号１５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨが配列番号１６の配列を含む、請求項３１に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３６】
Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が配列番号９０の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９１の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３７】
Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が配列番号９２の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９３の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３８】
Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が配列番号８８の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号８９の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項３９】
Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖が図３０Ａ、図３０Ｂ、図３１Ａ、図３１Ｂ、図３２Ａまたは図３２Ｂに記載の配列を含む二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項４０】
第１および第２のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合している、請求項１から３９のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項４１】
Ｐ−カドヘリンに結合し、請求項１から４０のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディと競合する、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項４２】
治療有効量の請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項４３】
それを必要とする患者に、請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディまたは請求項４２に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者におけるＰ−カドヘリン関連障害を処置する方法。
【請求項４４】
Ｐ−カドヘリン関連障害ががんである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
がんが、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、膀胱がん、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、およびグリア芽腫からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
それを必要とする患者に、請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体または請求項４２に記載の医薬組成物を投与することを含み、細胞溶解性Ｔ細胞応答が活性化される、患者におけるＰ−カドヘリン関連障害を処置する方法。
【請求項４７】
療法における使用のための請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項４８】
療法における使用のための医薬品の製造における請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの使用。
【請求項４９】
療法が、Ｐ−カドヘリン関連障害の処置である、請求項４７または４８に記載の使用のための二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項５０】
Ｐ−カドヘリン関連障害ががんである、請求項４９に記載の使用のための二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項５１】
がんが、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、膀胱がん、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、およびグリア芽腫からなる群から選択される、請求項５０に記載の使用のための二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項５２】
療法が細胞溶解性Ｔ細胞応答を活性化する、請求項４７または４８に記載の使用のための二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項５３】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを組換え産生する単離された宿主細胞。
【請求項５４】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項５４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５６】
二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの産生をもたらす条件下で請求項５３に記載の宿主細胞を培養すること、および培養上清から二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを精製することを含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを産生する方法。
【請求項５７】
結晶構造が、サブドメイン１Ｂの２３９位のシステイン残基（Ｃｙｓ２３９）およびサブドメイン２Ａの２４６位のシステイン残基（Ｃｙｓ２４６）を含むシステイン残基対の間のジスルフィド結合によって安定化される小型の球状構造として構築されており、結晶が原子座標の決定のためにＸ線を回折して、約２．０オングストロームより良好な分解能を提供する、請求項１から４１のいずれか一項に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ。
【請求項５８】
Ｐ−カドヘリンに結合する抗体であって、
ａ．ＸＬ１．１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．３−ＸＬ１．４−ＸＬ１．５−ＸＬ１．６−ＸＬ１．７−ＸＬ１．８−ＸＬ１．９−ＸＬ１．１０−ＸＬ１．１１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．１３を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１配列、
ｂ．ＸＬ２．１−ＸＬ２．２−ＸＬ２．３−ＸＬ２．４−ＸＬ２．５−ＸＬ２．６−ＸＬ２．７を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２配列、
ｃ．Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３配列  ＸＬ３．１−ＸＬ３．２−ＸＬ３．３−ＸＬ３．４−ＸＬ３．５−ＸＬ３．６−ＸＬ３．７−ＸＬ３．８−ＸＬ３．９−ＸＬ３．１０−ＸＬ３．１１、
ｄ．ＸＨ１．１−ＸＨ１．２−ＸＨ１．３−ＸＨ１．４−ＸＨ１．５−ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０またはＸＨ１．５、ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１配列、
ｅ．ＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０またはＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０−ＸＨ２．１１−ＸＨ２．１２−ＸＨ２．１３−ＸＨ２．１４−ＸＨ２．１５−ＸＨ２．１６−ＸＨ２．１７を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２配列、および
ｆ．ＸＨ３．１−ＸＨ３．２−ＸＨ３．３−ＸＨ３．４−ＸＨ３．５−ＸＨ３．６−ＸＨ３．７−ＸＨ３．８−ＸＨ３．９を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３配列
を含み、ここで、ＸＬ３．３がＷであり、ＸＨ１．８がＧであり、ＸＨ２．５がＹであり、ＸＨ３．１がＩであり、ＸＨ３．７がＦである、抗体。
【請求項５９】
ＸＬ１．８がＧであり、ＸＬ２．２がＮであり、ＸＬ２．３がＮであり、ＸＬ３．２がＴであり、ＸＨ２．６がＮであり、ＸＨ２．１６がＱであり、ＸＨ３．５がＮであり、ＸＨ３．９がＩである、請求項５８に記載の抗体。
【請求項６０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の配列を含む軽鎖可変領域のＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２およびＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４の配列を含む重鎖可変領域のＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２およびＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３を含む、請求項５８または５９に記載の抗体。
【請求項６１】
ａ．配列番号３５または３６の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号３７または３８の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号３９、４０、４１、４２、４３または４４の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号２５または３３の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２６または３４の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６２】
ａ．配列番号３５または３６の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号３７または３８の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号３９、４０、４１、４２、４３または４４の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号２５の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２６の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６３】
ａ．配列番号３５の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号３７の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号４２の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号２５の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２６の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号２９の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項５８から６２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６４】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３の配列を含む軽鎖可変領域、ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４の配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５８から６３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６５】
配列番号５の配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸および／または配列番号６の配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６４に記載の抗体。
【請求項６６】
配列番号７の配列を含む軽鎖可変領域および／または配列番号８の配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６４に記載の抗体。
【請求項６７】
配列番号９の配列を含む軽鎖可変領域および／または配列番号１０の配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６４に記載の抗体。
【請求項６８】
配列番号１５の配列を含む軽鎖可変領域および／または配列番号１６の配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６４に記載の抗体。
【請求項６９】
Ｐ−カドヘリンに結合し、請求項５８から６８のいずれか一項に記載の抗体とＰ−カドヘリンへの結合について競合する抗体。
【請求項７０】
治療有効量の請求項５８から６９のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項７１】
それを必要とする患者に、請求項５８から６９のいずれか一項に記載の抗体または請求項７０に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者におけるＰ−カドヘリン陽性がんを処置する方法。
【請求項７２】
療法における使用のための請求項５８から６９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７３】
療法における使用のための医薬品の製造における請求項５８から６９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７４】
請求項５８から６９のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項７５】
請求項７４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７６】
請求項７５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年７月１日に出願された米国仮特許出願第６２／０１９，７６２号および２０１５年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／１４８，９２０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子出願され、．ｔｘｔ形式で電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０１５年６月１２日に作成された「ＰＣ７２０５４Ａ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」の表題の、２４８ＫＢのサイズを有する配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディおよびがんの処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍細胞殺傷を媒介するＴ細胞動員を行うことができる二重特異的分子を生成するために様々な戦略が開発されてきた。しかしながら、そのような分子を生産するための多くの努力は、不十分な生産性および低い安定性のため制限されてきた。これらの問題に取り組むために、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ（登録商標））タンパク質としても知られる、共有結合した二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ構造に基づくＦｖ由来戦略が開発された（米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号、第２００９／００６０９１０号および第２０１０／０１７４０５３号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
二重特異的抗体を生成することに伴う課題を克服し、標的抗原を発現する腫瘍細胞に結合し、ＣＤ３活性化によってＴ細胞を動員および活性化する高度に特異的かつ強力な薬剤を提供し、がんのための革新的かつ有効な処置をもたらす二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【０００７】
本発明は、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖ならびに第２のポリペプチド鎖を含み、ａ．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ．サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂとを含むドメイン１、およびｉｉ．第１のヘテロ二量体促進ドメインを含み、ｂ．第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ．サブドメイン２Ａとサブドメイン２Ｂとを含むドメイン２、およびｉｉ．第２のヘテロ二量体促進ドメインを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａが、抗Ｐ−カドヘリン抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）と、抗Ｐ−カドヘリン抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）とを含むＰ−カドヘリンＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２Ｂが、抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン（ＣＤ３  ＶＬ）と、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合ドメイン（ＣＤ３  ＶＨ）とを含むＣＤ３  ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する、またはサブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａが、ＣＤ３  ＶＬとＣＤ３  ＶＨとを含むＣＤ３  ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨとＰ−ＣＡＤ  ＶＬとを含むＰ−カドヘリンＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【０００８】
本発明の別の態様において、サブドメイン１Ａは、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬまたはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン１Ｂは、サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、ＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２Ｂは、サブドメイン１Ａについて選択されるＶＬドメインに応じてＰ−ＣＡＤ  ＶＬまたはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２Ａは、サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ、またはサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、ＣＤ３  ＶＨを含む。
【０００９】
本発明の特定の態様において、サブドメイン１ＡはＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、サブドメイン１ＢはＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２ＢはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２ＡはＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、ここで、サブドメイン１ＡのＰ−ＣＡＤ  ＶＬとサブドメイン２ＡのＰ−ＣＡＤ  ＶＨは、Ｐ−カドヘリンのエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１ＢのＣＤ３  ＶＨとサブドメイン２ＢのＣＤ３  ＶＬは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
【００１０】
特定の態様において、サブドメイン１ＡはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン１ＢはＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、サブドメイン２ＢはＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、サブドメイン２ＡはＣＤ３  ＶＨを含み、ここで、サブドメイン１ＡのＣＤ３  ＶＬとサブドメイン２ＡのＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１ＢのＰ−ＣＡＤ  ＶＨとサブドメイン２ＢのＰ−ＣＡＤ  ＶＬは、Ｐ−カドヘリンのエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
【００１１】
別の態様において、サブドメイン１Ａは、抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＨ）のいずれかのＶＨ結合ドメインを含み、サブドメイン１Ｂは、サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合ドメインを含み、ここで、サブドメイン２Ｂは、サブドメイン１Ａについて選択されるＶＨドメインに応じてＰ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２Ａは、サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含む。
【００１２】
特定の態様において、サブドメイン１ＡはＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、サブドメイン１ＢはＣＤ３  ＶＬを含み、サブドメイン２ＢはＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン２ＡはＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、ここで、サブドメイン１ＡのＰ−ＣＡＤ  ＶＨとサブドメイン２ＡのＰ−ＣＡＤ  ＶＬは、Ｐ−カドヘリンのエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１ＢのＣＤ３  ＶＬとサブドメイン２ＢのＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
【００１３】
特定の態様において、サブドメイン１ＡはＣＤ３  ＶＨを含み、サブドメイン１ＢはＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含み、サブドメイン２ＢはＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含み、サブドメイン２ＡはＣＤ３  ＶＬを含み、ここで、サブドメイン１ＡのＣＤ３  ＶＨとサブドメイン２ＡのＣＤ３  ＶＬは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成し、サブドメイン１ＢのＰ−ＣＡＤ  ＶＬとサブドメイン２ＢのＰ−ＣＡＤ  ＶＨは、Ｐ−カドヘリンのエピトープに特異的に結合することができるＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
【００１４】
本発明はさらに、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインのアミノ酸配列が、ノブまたはホールを形成するように、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインは両方ともノブもしくは両方ともホールではない、および／または第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインは、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域を形成する。別の態様において、ノブを形成するＩｇＧ  Ｆｃ領域は配列番号６３の配列を含み、ホールを形成するＩｇＧ  Ｆｃ領域は配列番号６４の配列を含む。
【００１５】
本発明はさらに、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが、グルタミン酸および負に荷電したアルファ−ヘリックスコイルを含むＥ−コイル領域またはリシンおよび正に荷電したヘリックスコイルを含むＫ−コイル領域を含み、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインが両方ともＥ−コイル領域または両方ともＫ−コイル領域ではない、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。一態様において、Ｅ−コイル領域は配列番号６１の配列を含み、および／またはＫ−コイル領域は配列番号６２の配列を含む。
【００１６】
本発明はさらに、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって連結されていてもよく、ＶＬ／ＶＨエピトープ結合ドメインを形成するように結合せず、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって連結されていてもよく、ＶＬ／ＶＨエピトープ結合ドメインを形成するように結合しない、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。本発明の一態様において、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）は、配列番号６８または配列番号６９の配列を含む。
【００１７】
本発明はさらに、第１のヘテロ二量体促進ドメインがサブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）を含み、および／または第２のヘテロ二量体促進ドメインがサブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインおよび／または第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、少なくとも１つのグリシン残基をさらに含む。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインおよび／または第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）の配列を含む。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）の配列を含む。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）の配列を含む。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）の配列を含み、または第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含む。
【００１８】
本発明は、ヒトＰ−カドヘリンの細胞外ドメイン３（ＥＣＤ３）に特異的に結合する二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。本発明はさらに、Ｐ−カドヘリン上のエピトープに特異的に結合するが、Ｅ−カドヘリンまたはＶＥ−カドヘリン上のエピトープには結合しない二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。本発明はまた、ヒトＰ−カドヘリン上のエピトープに特異的に結合するが、マウスＰ−カドヘリン上のエピトープには結合しない二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００１９】
本発明は、長い血清および腫瘍半減期を示す二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。薬物動態分析を、ＥＬＩＳＡなどの様々なアッセイによって行うことができる。本発明はさらに、増大したＰ−カドヘリン発現レベルまたは増大した受容体密度レベルの存在下で、より低いＥＣ５０を示す二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。ＥＣ５０を、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイによって決定することができる。
【００２０】
本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬのＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号４５もしくは４６の配列を含むＣＤ３  ＶＨのＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４７の配列を含むＣＤ３  ＶＬのＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨのＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３を含む二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００２１】
本発明は、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号３５もしくは３６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号３７もしくは３８の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号３９、４０、４１、４２、４３もしくは４４の配列を含む、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号４８の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号４９もしくは５０の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号５１の配列を含む、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号５５の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号５６の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号５７の配列を含む、ならびに／またはＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号２５もしくは３３の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号２６もしくは３４の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００２２】
本発明の一態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１は配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２は配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３は配列番号４１の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１は配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２は配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３は配列番号２８の配列を含む。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１は配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２は配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３は配列番号４２の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１は配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２は配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３は配列番号２９の配列を含む。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１は配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２は配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３は配列番号４３の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１は配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２は配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３は配列番号３０の配列を含む。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１は配列番号３５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２は配列番号３７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３は配列番号３９の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１は配列番号２５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２は配列番号２６の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３は配列番号３１の配列を含む。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ、配列番号４５または４６の配列を含むＣＤ３  ＶＨ、配列番号４７の配列を含むＣＤ３  ＶＬ、および配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。一態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは配列番号５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号６の配列を含む。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは配列番号７の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号８の配列を含む。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは配列番号９の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号１０の配列を含む。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは配列番号１５の配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号１６の配列を含む。
【００２４】
本発明はさらに、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が配列番号９０の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９１の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。本発明はさらに、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が配列番号９２の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９３の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００２５】
本発明はさらに、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が配列番号８８の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号８９の配列を含む、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、第１および第２のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合していてもよい二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、図３０Ａ、図３０Ｂ、図３１Ａ、図３１Ｂ、図３２Ａまたは図３２Ｂに記載の配列を含む第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。本発明の別の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、表５に記載の第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖および第３のポリペプチド鎖を含む。
【００２８】
本発明は、限定されるものではないが、フルオロフォアまたは放射性核種を含む検出可能な標識にコンジュゲートすることができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００２９】
本発明は、Ｐ−カドヘリンに結合し、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディと競合する二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００３０】
本発明はさらに、治療有効量の本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、それを必要とする患者に、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディまたは本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを含む医薬組成物を投与することを含む、患者におけるＰ−カドヘリン関連障害を処置する方法を提供する。本発明はさらに、それを必要とする患者に、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディまたは本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを含む医薬組成物を投与することを含み、細胞溶解性Ｔ細胞応答が活性化または誘導される、患者におけるＰ−カドヘリン関連障害を処置する方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、療法における使用のための本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。本発明はさらに、療法における使用のための医薬品の製造における本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの使用を提供する。別の態様において、療法は、Ｐ−カドヘリン関連障害の処置である。本発明はさらに、細胞溶解性Ｔ細胞応答を活性化または誘導する療法における使用のための本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００３３】
一態様において、Ｐ−カドヘリン関連障害は、がんである。別の態様において、がんは、Ｐ−カドヘリンを発現するまたはＰカドヘリン陽性のがんである。がんとしては、限定されるものではないが、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、膀胱がん、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、およびグリア芽腫が挙げられる。
【００３４】
本発明はさらに、本明細書に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを組換え産生する単離された宿主細胞、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、およびそのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００３５】
本発明はさらに、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの産生をもたらす条件下で本明細書に開示される宿主細胞を培養すること、および培養上清から二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを精製することを含む、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを産生する方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、結晶構造が、サブドメイン１Ｂの２３９位のシステイン残基（Ｃｙｓ２３９）およびサブドメイン２Ａの２４６位のシステイン残基（Ｃｙｓ２４６）からなるシステイン残基対の間のジスルフィド結合によって安定化される小型の球状構造として構築されており、結晶が原子座標の決定のためにＸ線を回折して、約２．０オングストロームより良好な分解能を提供する、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００３７】
本発明はさらに、Ｐ−カドヘリンのエピトープとＣＤ３のエピトープとに特異的に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディであって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、配列番号４７の配列を含む抗ＣＤ３抗体のＶＬ結合ドメイン（ＣＤ３  ＶＬ）を含むサブドメイン１Ａ、および配列番号６の配列を含む抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合ドメイン（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）を含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含み、サブドメイン１Ａおよびサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよく、ＶＬ／ＶＨエピトープ結合ドメインを形成するように結合しない、ならびに第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、配列番号５の配列を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび配列番号４５の配列を含むＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含み、サブドメイン２Ｂおよびサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよく、ＶＬ／ＶＨエピトープ結合ドメインを形成するように結合せず、結晶構造が、サブドメイン１Ｂの２３９位のシステイン残基（Ｃｙｓ２３９）およびサブドメイン２Ａの２４６位のシステイン残基（Ｃｙｓ２４６）を含むシステイン残基対の間のジスルフィド結合によって安定化される小型の球状構造として構築されており、結晶が原子座標の決定のためにＸ線を回折して、約２．０オングストロームより良好な分解能を提供する、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。
【００３８】
別の態様において、本明細書に記載の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、約４０オングストロームにより互いに分離した２つの抗原結合部位を含有し、結合部位は二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの直角に反対側に位置してもよい。
【００３９】
本発明はさらに、本明細書に開示される結晶構造に基づいて二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ内でジスルフィド結合を形成するシステイン残基のさらなる位置を同定する方法であって、結晶構造が、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基対との置換のためのアミノ酸残基対の位置について分析される、方法を提供する。本発明の特定の態様において、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基対との置換のためのアミノ酸残基対の位置を、アミノ酸位置Ｇｌｎ１２１（ＶＨ１Ｂ）Ｇｌｙ１６０（ＶＬ１Ａ）、Ｖａｌ１２９（ＶＨ１Ｂ）Ｇｌｙ２４４（ＶＬ１Ａ）、Ｖａｌ１２３（ＶＨ１Ｂ）Ｇｌｙ１６０（ＶＬ１Ａ）、Ｇｌｙ１２６（ＶＨ１Ｂ）Ｓｅｒ２４２（ＶＬ１Ａ）、およびＡｌａ１２７（ＶＨ１Ｂ）Ｓｅｒ２４２（ＶＬ１Ａ）からなる群から選択することができる。ジスルフィド結合は、溶媒接近性を減少させ、リンカーの長さを減少させることができる。
【００４０】
本発明はさらに、より安定なドメイン間結合を形成する試みにおいて二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディバリアントを操作する方法であって、操作が本明細書に開示される結晶構造に基づくドメイン間接触面におけるアミノ酸部位特異的突然変異誘発によるものであり、アミノ酸部位特異的突然変異誘発により大きな内部の空隙／ホールが満たされる、方法を提供する。本発明の特定の態様において、部位特異的突然変異誘発は、小さいアミノ酸を、嵩高い芳香族側鎖を有するアミノ酸に置き換えることによって、アミノ酸側鎖の体積を増大させることができる。本発明の別の態様において、小さいアミノ酸を、位置Ａｌａ４４（ＶＬ１Ａ）、Ｖａｌ２１３（ＶＨ２Ａ）、Ｌｅｕ２３８（ＶＨ２Ａ）、またはＭｅｔ２３１（ＶＬ２Ｂ）のアミノ酸からなる群から選択することができる。本発明の別の態様において、嵩高い芳香族側鎖を有するアミノ酸を、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンからなる群から選択することができる。
【００４１】
本発明はさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＰ−カドヘリンに結合する抗体を提供する。
【００４２】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号３５または３６の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３７または３８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号３９、４０、４１、４２、４３または４４の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号２５または３３の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２６または３４の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００４３】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号３５または３６の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３７または３８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号３９、４０、４１、４２、４３または４４の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号２５の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２６の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００４４】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号３５の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３７の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号４２の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号２５の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２６の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２９の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３の配列を含む軽鎖可変領域、ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４の配列を含む重鎖可変領域を含む、Ｐ−カドヘリンに結合する抗体を提供する。本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号５の配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸および／または配列番号６の配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号７の配列を含む軽鎖可変領域および／または配列番号８の配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号９の配列を含む軽鎖可変領域および／または配列番号１０の配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の別の態様において、本明細書に開示される抗体は、配列番号１５の配列を含む軽鎖可変領域および／または配列番号１６の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４６】
本発明はさらに、Ｐ−カドヘリンに結合し、本明細書に開示される抗体とＰ−カドヘリンへの結合について競合する抗体を提供する。
【００４７】
本発明はさらに、治療有効量の本明細書に開示される抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、それを必要とする患者に、本明細書に開示される抗体または本明細書に開示される抗体を含む医薬組成物を投与することを含む、患者におけるＰ−カドヘリン関連障害を処置する方法を提供する。本発明はさらに、療法における使用のための本明細書に開示される抗体を提供する。本発明はさらに、療法における使用のための医薬品の製造における本明細書に開示される抗体の使用を提供する。
【００４９】
一態様において、Ｐ−カドヘリン関連障害は、がんである。別の態様において、がんは、Ｐ−カドヘリンを発現するまたはＰカドヘリン陽性のがんである。がんとしては、限定されるものではないが、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、膀胱がん、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、およびグリア芽腫が挙げられる。
【００５０】
本発明はさらに、本明細書に開示される抗体をコードする核酸を提供する。本発明の別の態様において、核酸は、配列番号９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４および１１６からなる群から選択される配列を含んでもよい。本発明のさらなる態様において、核酸は、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３および１１５からなる群から選択される配列を含んでもよい。本発明はさらに、本明細書に開示される核酸を含むベクターおよび本明細書に開示されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００５１】
本発明はさらに、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬがＸＬ１．１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．３−ＸＬ１．４−ＸＬ１．５−ＸＬ１．６−ＸＬ１．７−ＸＬ１．８−ＸＬ１．９−ＸＬ１．１０−ＸＬ１．１１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．１３（式中、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表５７、表５８、または表５９の３列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＸＬ２．１−ＸＬ２．２−ＸＬ２．３−ＸＬ２．４−ＸＬ２．５−ＸＬ２．６−ＸＬ２．７（式中、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表６０、表６１または表６２の３列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＸＬ３．１−ＸＬ３．２−ＸＬ３．３−ＸＬ３．４−ＸＬ３．５−ＸＬ３．６−ＸＬ３．７−ＸＬ３．８−ＸＬ３．９−ＸＬ３．１０−ＸＬ３．１１（式中、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表６３、表６４または表６５の３列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨがＸＨ１．１−ＸＨ１．２−ＸＨ１．３−ＸＨ１．４−ＸＨ１．５−ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０またはＸＨ１．５、ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０（式中、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表４８、表４９または表５０の３列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０−ＸＨ２．１１−ＸＨ２．１２−ＸＨ２．１３−ＸＨ２．１４−ＸＨ２．１５−ＸＨ２．１６−ＸＨ２．１７またはＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０（式中、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表５１、表５２または表５３の３列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＸＨ３．１−ＸＨ３．２−ＸＨ３．３−ＸＨ３．４−ＸＨ３．５−ＸＨ３．６−ＸＨ３．７−ＸＨ３．８−ＸＨ３．９（式中、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表５４、表５５または表５６の３列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディまたは抗体を提供する。
【００５２】
一態様において、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表５７の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表５８の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表５９の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表６０の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表６１の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表６２の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表６３の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表６４の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表６５の３列目に記載のアミノ酸残基である。
【００５３】
別の態様において、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表４８の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表４９の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表５０の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表５１の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表５２の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表５３の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表５４の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表５５の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表５６の３列目に記載のアミノ酸残基である。
【００５４】
本発明はさらに、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬがＸＬ１．１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．３−ＸＬ１．４−ＸＬ１．５−ＸＬ１．６−ＸＬ１．７−ＸＬ１．８−ＸＬ１．９−ＸＬ１．１０−ＸＬ１．１１−ＸＬ１．２−ＸＬ１．１３（式中、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表６９の３列目または４列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＸＬ２．１−ＸＬ２．２−ＸＬ２．３−ＸＬ２．４−ＸＬ２．５−ＸＬ２．６−ＸＬ２．７（式中、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表７０の３列目または４列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＸＬ３．１−ＸＬ３．２−ＸＬ３．３−ＸＬ３．４−ＸＬ３．５−ＸＬ３．６−ＸＬ３．７−ＸＬ３．８−ＸＬ３．９−ＸＬ３．１０−ＸＬ３．１１（式中、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表７１の３列目または４列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＬ  ＣＤＲ３配列を含み、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨがＸＨ１．１−ＸＨ１．２−ＸＨ１．３−ＸＨ１．４−ＸＨ１．５−ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０またはＸＨ１．５、ＸＨ１．６−ＸＨ１．７−ＸＨ１．８−ＸＨ１．９−ＸＨ１．１０（式中、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表６６の３列目または４列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０−ＸＨ２．１１−ＸＨ２．１２−ＸＨ２．１３−ＸＨ２．１４−ＸＨ２．１５−ＸＨ２．１６−ＸＨ２．１７またはＸＨ２．１−ＸＨ２．２−ＸＨ２．３−ＸＨ２．４−ＸＨ２．５−ＸＨ２．６−ＸＨ２．７−ＸＨ２．８−ＸＨ２．９−ＸＨ２．１０（式中、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表６７の３列目または４列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＸＨ３．１−ＸＨ３．２−ＸＨ３．３−ＸＨ３．４−ＸＨ３．５−ＸＨ３．６−ＸＨ３．７−ＸＨ３．８−ＸＨ３．９（式中、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表６８の３列目または４列目に記載のアミノ酸残基である）を含むＰ−ＣＡＤ  ＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む、本明細書に開示される二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディまたは抗体を提供する。
【００５５】
一態様において、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表６９の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ１．１〜ＸＬ１．１３はそれぞれ独立に、表６９の４列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表７０の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ２．１〜ＸＬ２．７はそれぞれ独立に、表７０の４列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表７１の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＬ３．１〜ＸＬ３．１１はそれぞれ独立に、表７１の４列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表６６の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ１．１〜ＸＨ１．１０はそれぞれ独立に、表６６の４列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表６７の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ２．１〜ＸＨ２．１７はそれぞれ独立に、表６７の４列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表６８の３列目に記載のアミノ酸残基である。別の態様において、ＸＨ３．１〜ＸＨ３．９はそれぞれ独立に、表６８の４列目に記載のアミノ酸残基である。
【００５６】
さらに、本発明は、ＸＨ１．８がＧである、ＸＨ２．５がＹである、ＸＨ３．１がＩである、ＸＨ３．７がＦである、ＸＬ３．３がＷである、ＸＨ２．６がＮである、ＸＨ２．１６がＱである、ＸＨ３．５がＮである、ＸＨ３．９がＩである、ＸＬ１．８がＧである、ＸＬ２．２がＮである、ＸＬ２．３がＮである、ＸＬ３．２がＴである、および／またはＸＬ３．４がＤであるものを提供する。本発明はまた、本明細書に記載の態様の任意の組合せを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、「ノブインホール」結合により結合するように最適化されたＦｃ領域を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインとを有するＬＰ−ＤＡＲＴ  Ｐ−カドヘリン／ＣＤ３二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの４つの代替表示の略図を提供する図である。
【図２】図２は、第１のヘテロ二量体促進ドメインが、第２のポリペプチド鎖（２）の第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣ末端ペプチドと共に安定性のためのジスルフィド結合を形成するＣ末端ペプチドを含む第１のポリペプチド鎖（１）を有する、Ｔ細胞（ＣＤ３抗原を介する）および腫瘍細胞（Ｐ−カドヘリン抗原を介する）を同時に標的化および活性化するＶＦ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの略図を提供する図である。
【図３】図３は、第１のヘテロ二量体促進ドメイン（以下に詳述される配列番号７０または配列番号７１など）と第２のヘテロ二量体促進ドメイン（第１のヘテロ二量体促進ドメインの選択に応じて、配列番号７１または配列番号７０など）とがシステイン残基を含む、第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）とを有する構築されたＶＦ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの略図を提供する図である。
【図４】図４は、第１のヘテロ二量体促進ドメインが負に荷電したアルファヘリックスコイル（Ｅ−コイル）を形成するグルタミン酸リッチ領域を含む第１のポリペプチド鎖（１）と、第２のヘテロ二量体促進ドメインが正に荷電したヘリックスコイル（Ｋ−コイル）を形成するリシンリッチ領域を含む第２のポリペプチド鎖（２）とを有する構築されたＥＫ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの略図を提供する図である。
【図５】図５は、「ノブインホール」結合により結合するように最適化されたＦｃ領域を含む、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインとを有する構築されたＬＰ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの略図を提供する図である。
【図６】図６は、ＭＰ３−ＤＡＲＴと呼ばれるＦｃドメインを有する代替的な二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの構造を提供する図である。二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、ＦｃドメインのＮ末端側に結合し、かくして、「Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴ」と呼ばれる。Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴは、略図として示される第１、第２および第３のポリペプチド鎖を含む。Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴの最終の構造が示される。
【図７】図７は、ＭＰ３−ＤＡＲＴと呼ばれるＦｃドメインを有する代替的な二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの構造を提供する図である。二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、ＦｃドメインのＣ末端側に結合し、かくして、「Ｃ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴ」と呼ばれる。Ｃ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴは、略図として示される第１、第２および第３のポリペプチド鎖を含む。Ｃ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴの最終の構造が示される。
【図８】図８は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性と、相対的細胞表面Ｐ−カドヘリン発現とを比較する線形回帰分析を提供する図である。
【図９】図９は、マウスＨＣＴ１１６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１７７ＥＫ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１０】図１０は、マウスＨＣＴ１１６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＥＫ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１１】図１１は、マウスＨＣＴ１１６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５４ＥＫ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１２】図１２は、マウスＨＣＴ１１６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる３５ＥＫ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１３】図１３は、マウスＨＣＴ１１６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１４】図１４は、マウスＨＣＴ１１６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１５】図１５は、マウスＤｕ１４５前立腺がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１６】図１６は、マウスＨ１６５０肺がんモデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、確立された腫瘍＋移植されたヒトＴ細胞モデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示し、図１７Ｅは、腫瘍体積の一元配置ＡＮＯＶＡ分析を示す図である。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、確立された腫瘍ヒトＴ細胞養子移入モデルにおいて腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図１９】図１９は、Ｐ−カドヘリン陽性患者由来結腸直腸腫瘍異種移植片において腫瘍体積を減少させる１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力を示す図である。
【図２０】図２０は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の１５３ＬＰ−ＤＡＲＴ媒介性用量依存的増加を示す図である。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｄは、フルオロフォア標識された１５３ＬＰ−ＤＡＲＴおよびＴ細胞の特性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを提供する図である。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、長期的ＦＭＴ画像化を用いたＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける１５３ＬＰ−ＤＡＲＴの生体分布および標的化を提供する図である。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｃは、ＦＭＴ画像化試験からの薬物動態データ（ＥＬＩＳＡ）を示す図である。
【図２４】図２４Ａは、ＦＭＴ画像化（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を用いるＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおける、フルオロフォア標識された、および標識されていないＴ細胞のＴ細胞活性の評価を示し、図２４Ｂは、フルオロフォア標識されたＴ細胞の細胞トラッキング動態を示す図である。
【図２５】図２５は、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨドメインに共有結合させた「６ＸＨＩＳ」と命名されたＣ末端Ｈｉｓタグと、ＣＤ３  ＶＨドメインに共有結合させた「ＦＬＡＧ」と命名されたＣ末端ＦＬＡＧとを有する、結晶分析のために設計されたＤＡＲＴ構築物の略図を提供する図である。
【図２６】図２６は、結晶学的３５ＤＡＲＴタンパク質の結晶構造の絵図を提供する図である。
【図２７】図２７は、抗ＣＤ３  ＣＤＲ領域と抗Ｐ−ＣＡＤ  ＣＤＲ領域のための抗原結合部位を示す結晶学的３５ＤＡＲＴタンパク質の絵図を提供する図である。
【図２８】図２８は、様々なアミノ酸で側鎖体積を増大させながら満たすことができる大きい内部空隙／ホールを含有するドメイン間接触面における、部位特異的突然変異誘発によるより安定なドメイン間結合を有する結晶学的３５ＤＡＲＴタンパク質バリアントの略図を提供する図である。
【図２９】図２９は、ジスルフィド結合の溶媒接近性を減少させるため、ならびに、リンカーの長さを減少させるための様々なジスルフィド結合位置（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部位）を有する結晶学的３５ＤＡＲＴタンパク質の結晶構造の絵図を提供する図である。
【図３０】図３０Ａおよび図３０Ｂは、本発明のＶＦ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの第１および第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を提供する図である。
【図３１】図３１Ａおよび図３１Ｂは、本発明のＥＫ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの第１および第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を提供する図である。
【図３２】図３２Ａおよび図３２Ｂは、本発明のＬＰ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの第１および第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を提供する図である。
【図３３】図３３は、本発明のＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの第１および第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を提供する図である。
【図３４】図３４は、Ｐ−カドヘリン−細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｐ−カドヘリン１５３ＬＰ−ＤＡＲＴのエピトープマッピングのためのＦｃ融合タンパク質構築物を提供する図である。
【図３５】図３５は、完全長Ｐ−カドヘリンエピトープ配列（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２２２２３、ＣＡＤＨ３、ヒトカドヘリン−３）を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、細胞溶解性Ｔ細胞の動員および活性化のための、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合ドメインとを含む新規二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを記載する。二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、Ｆｃドメインをさらに含んでもよい。さらに、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディがＰ−カドヘリンを発現する腫瘍細胞に対して、Ｔ細胞の細胞傷害性をうまく指向化し、それを活性化することが本明細書で示される。さらに、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延長する増強された薬物動態特性を有し、Ｐ−カドヘリン発現腫瘍の存在下でＣＤ３複合体によりポリクローナルＴ細胞集団と連動し、それを活性化するように設計された。
【００５９】
本発明は、ヒトファージディスプレイライブラリーに由来するＰ−カドヘリンに対する完全ヒト一本鎖抗体結合ドメインの単離および特徴付けを記載する。本発明はさらに、Ｐ−カドヘリンとＣＤ３に同時に結合することができる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを作出するために、以前に記載されたＤＡＲＴ形式（Ｍｏｏｒｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１７（１７）：４５４２〜４５５１、２０１１）で、抗ＣＤ３抗体の抗原結合ドメインにこれらのＰ−カドヘリン結合ドメインを共有結合させることを提供する。さらに、本発明の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディとしても知られる抗Ｐ−カドヘリン／抗ＣＤ３  ＤＡＲＴタンパク質は、Ｐ−カドヘリンを発現する細胞へのＴ細胞の細胞傷害性をうまく指向化し、これを活性化する。
【００６０】
別途定義しない限り、本明細書で使用される当技術分野の全ての用語、表記および他の科学用語または専門用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合、一般的に理解される意味を有する用語は、明確性および／または容易な参照のために本明細書で定義され、本明細書にそのような定義が含まれていても、当技術分野で一般に理解されるものと実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本発明の実施は、別途指摘しない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、１９９９、２００１までの補遺を含む）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９８７、２００１までの補遺を含む）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１）などの文献で完全に説明されている。
【００６１】
Ｐ−カドヘリン（カドヘリン−３、ＣＤＨ３）は、発生および組織恒常性の間にカルシウム依存的細胞間接着を調節する古典的カドヘリンスーパーファミリーの膜貫通糖タンパク質に属する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１４８：３９９〜４０３（２０００））。カドヘリン細胞内ドメインは、細胞質カテニンと直接相互作用し、アクチン細胞骨格ネットワークに連結し、安定な細胞相互作用のための分子的基礎を提供する。カドヘリン／カテニン複合体、ならびにこの構造によって制御されるシグナリング経路は、細胞増殖、分化、運動、および生存に対するその影響により、細胞運命の決定を誘導する主要な調節機構である（Ｃａｖａｌｌａｒｏら、２０１１）。古典的カドヘリンは、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎ−カドヘリン（ＣＤＨ２）およびＰ−カドヘリン（ＣＤＨ３）を含む。正常組織中でのＰ−カドヘリン発現は低く、主に筋上皮細胞および重層上皮の基底層に限定される。Ｐ−カドヘリンの発現上昇が、乳がん、胃がん、子宮内膜がん、膵臓がんおよび結腸直腸がんを含む様々な腫瘍において報告されており、進行疾患を有する患者の低い生存率の良好な予後因子である（Ｈａｒｄｙら、２００２；Ｉｍａｉら、２００８；Ｐａｒａｄｅｓら、２００５；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎら、２００４；Ｔａｎｉｕｃｈｉら、２００５）。遺伝子発現プロファイリングおよび免疫組織化学分析により、さらに、肺がん（限定されるものではないが、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん）、卵巣がん、頭頸部がん、甲状腺がんおよび膀胱がんが示唆された。
【００６２】
ＣＤ３（分化抗原群３）は、εδ、εγおよびζζ二量体を形成する４つの異なる鎖ε、δ、γおよびζを含むＴ細胞共受容体タンパク質複合体である。
【００６３】
これらの二量体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と結合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲおよびＣＤ３分子は一緒になってＴＣＲ複合体を含む。抗ＣＤ３抗体は、内因性リンホカイン産生の活性化によって細胞傷害性Ｔ細胞の生成を惹起し、腫瘍標的を選択的に殺傷することができる（Ｙｕｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：４７７０−４７７４（１９８９））。
【００６４】
より具体的には、Ｔ細胞は、抗原特異的免疫応答を誘導することができるＴＣＲ複合体を発現する（Ｓｍｉｔｈ−Ｇａｒｖｉｎら、２００９）。抗原は、免疫応答を刺激することができる腫瘍細胞およびウイルス感染細胞によって発現されるペプチドである。細胞内で発現された抗原は、主要組織適合クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子に結合し、表面に輸送され、そこでそれらはＴ細胞に曝露される。抗原との複合体にあるＭＨＣクラスＩへのＴＣＲの結合親和性が十分である場合、免疫シナプスの形成が開始される。免疫シナプスを介するシグナリングは、εδ、εγおよびζζ二量体を形成するＣＤ３共受容体によって媒介される。これらの二量体は、ＴＣＲと結合し、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生成する。このシグナリングカスケードは、抗原を発現する細胞のＴ細胞媒介性殺傷を指令する。細胞傷害性は、Ｔ細胞から標的細胞へのグランザイムＢおよびパーフォリンの放出および移入によって媒介される。
【００６５】
理論によって束縛されるものではないが、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディにより、Ｔ細胞は、ＴＣＲと、抗原との複合体にあるＭＨＣクラスＩとの相互作用の必要性を回避することができ、その代わりに、Ｔ細胞上で発現されるＣＤ３（ＣＤ３イプシロンなど）および腫瘍上で発現されるＰ−カドヘリンの直接同時連動を介してＴ細胞を標的細胞に向け直すと考えられる。
【００６６】
本明細書で使用される「エフェクター機能」は、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの抗ＣＤ３結合ドメインと、細胞傷害性Ｔ細胞との相互作用の結果生じる生化学的事象を支援する能力を意味する。
【００６７】
本明細書で使用される用語「抗体」および「複数の抗体」とは、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ科抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異的Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄおよび抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片または結合ドメインを指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
【００６８】
本明細書で使用される用語「二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ」とは、両抗体結合ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれ、それぞれのポリペプチド鎖中のＶＬおよびＶＨドメインが異なる抗体に由来する、それぞれ、少なくとも１つの抗体ＶＬドメインと１つの抗体ＶＨドメインまたはそれらの断片を含む、２つ以上のポリペプチド鎖またはタンパク質の複合体を指す。
【００６９】
本明細書で使用される用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」および類似の用語は、抗原（例えば、エピトープまたは免疫複合体）に特異的に結合し、別の分子には特異的に結合しない、分子、例えば、結合ドメインを指す。抗原に特異的に結合する分子は、当技術分野で公知のアッセイ、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、または他のアッセイによって決定された場合、より低い親和性を有する他のペプチドまたはポリペプチドに結合することができる。好ましくは、抗原に特異的に結合する分子は、他のタンパク質とは交差反応しない。
【００７０】
本明細書で使用される用語「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」または「可変ドメイン」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などは、免疫学の技術分野におけるその通常の意味を有し、天然に存在する免疫グロブリン中のドメインおよび組換え結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを指す。天然に存在する免疫グロブリンの基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、２つの軽鎖と２つの重鎖とを有する四量体である。それぞれの鎖のアミノ末端（Ｎ末端）部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端（Ｃ末端）は、定常領域を規定する。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とを含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する重鎖定常領域とを含む。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、一般的には構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定する、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメント（しかし、ある特定のフレームワーク残基も抗原と接触してもよい）とを含む。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の構造：ｎ−ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４−ｃに配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲとを含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）およびクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
【００７１】
「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は一般に、ヒトＩｇＧ−１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びるものと定義される。重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に置くことにより、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域をＩｇＧ１配列と整列させることができる。
【００７２】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」または類似する用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは通常、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによるアミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びる。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは通常、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによるアミノ酸３４２からアミノ酸４４７まで伸びる。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、それが別のドメインと近くで対形成していない点でユニークである。むしろ、２つのＮ連結分枝状炭水化物鎖は、無傷の天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメインの間に置かれる。
【００７３】
結合タンパク質、結合ドメイン、または抗体（本明細書で広く定義される）を言う場合、各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、コンタクト、および／もしくはコンフォメーション定義または当技術分野で周知のＣＤＲ決定の任意の方法に従う。抗体ＣＤＲを、Ｋａｂａｔらによって元々定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃを参照されたい。ＣＤＲの位置を、Ｃｈｏｔｈｉａその他によって元々記載された構造ループ構造として同定することもできる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲ同定に対する他の手法は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて誘導される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に記載された、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「コンタクト定義」を含む。ＣＤＲの「コンフォメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法においては、ＣＤＲの位置を、抗原結合に対するエンタルピー寄与を作る残基と同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらに他のＣＤＲ境界定義は、特定の残基または残基群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響しないという予測または実験的知見を考慮すると、短くするか、または長くすることができるが、それらは、上記の手法の１つに厳密に従わなくてもよく、それにもかかわらずＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部と重複してもよい。本明細書で使用されるＣＤＲは、手法の組合せを含む、当技術分野で公知の任意の手法によって定義されたＣＤＲを指してもよい。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用してもよい。１を超えるＣＤＲを含有する任意の所与の態様について、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、コンタクト、および／またはコンフォメーション定義のいずれかに従って定義することができる。
【００７４】
ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列もしくは結合ドメイン）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【００７５】
用語「モノクローナル抗体」とは、それが産生される方法ではなく、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指す。本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの結合ドメインに由来するモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用などの当技術分野で公知の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、当技術分野で公知のものを含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができる。
【００７６】
また、抗体を、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特定の態様において、そのようなファージを利用して、レパートリーまたは組合せ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される、ＦａｂおよびＦｖまたはジスルフィド結合安定化Ｆｖなどの、抗原結合ドメインを展示させることができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、抗原を用いて選択または同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３などの線状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質との組換え融合されたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン、またはその断片を作製するのに使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９５）、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｏｆ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１〜５０に開示されたものが挙げられる。
【００７７】
複数のＩｇＧアイソタイプ、およびそのドメインの機能的特徴は、当技術分野で周知である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。本発明の方法における使用のための特定のＩｇＧアイソタイプに由来する２つ以上のドメインの選択および／または組合せは、ＦｃγＲに対する親和性などの親アイソタイプの任意の公知のパラメータに基づくものであってよい。例えば、ＦｃγＲＩＩＢへの限定的な結合を示すか、または結合しないＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来する領域またはドメインの使用は、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディが活性化受容体への結合を最大化し、阻害的受容体への結合を最小化するために遺伝子操作することが望まれる場合、特に有用であり得る。同様に、Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩＡに優先的に結合することが知られるＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ３に由来するＦｃ領域またはドメインの使用を、当技術分野で公知のＦｃアミノ酸改変と組み合わせて、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強する、エフェクター機能活性、例えば、補体活性化またはＡＤＣＣが最大化されるように二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ分子を遺伝子操作することができる。同様の様式で、Ｆｃ領域のエフェクター機能を最小化または除去するＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域またはドメイン中で突然変異を作製することができる。
【００７８】
用語「エピトープ」とは、１つまたは複数の抗体の抗原結合領域で抗体によって認識され、結合され得る分子の部分を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有することが多い。本明細書で使用される用語「抗原性エピトープ」は、当技術分野で周知の任意の方法、例えば、従来のイムノアッセイによって決定された場合に抗体が特異的に結合することができるポリペプチドの一部と定義される。「非線状エピトープ」または「立体的エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内の非連続的ポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。一度、抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することができる。探索プロセスの間に、抗体の生成および特徴付けは、望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。次いで、この情報から、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを達成するための手法は、互いに競合するか、または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見出すために競合および交差競合試験を行うことである。
【００７９】
１つの方法は、抗体が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９の第１１章に記載された、抗体−抗原複合体の結晶構造の解析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイなどの、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングし、特徴付けるための当技術分野で公知の多くの方法がある。さらなる例においては、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。さらなる例においては、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメインスワッピング実験およびアラニン走査突然変異誘発を実施して、エピトープ結合に必要な、十分な、および／または必須の残基を同定することができる。抗原結合ドメイン相互作用の結合親和性およびオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例は、標識された抗原のインキュベーションと、標識された抗原に結合した分子の検出とを含むラジオイムノアッセイである。抗原に対する本発明の分子の親和性および結合オフレートを、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析により飽和データから決定することができる。
【００８０】
抗原に対する本発明の分子の親和性および結合特性を、最初に、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ干渉法、または免疫沈降アッセイなどの、抗原結合ドメインに関する当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（生化学または免疫学に基づくアッセイ）を使用して決定することができる。本発明の分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに基づくアッセイにおけるものと類似するｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける結合特性（本明細書に記載および開示されるものなど）を有してもよい。しかしながら、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに基づくアッセイにおいては所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除しない。
【００８１】
本明細書で使用される用語「結合親和性（ＫＤ）」は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すことが意図される。ＫＤは、「オフレート（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の、結合速度、すなわち「オンレート（ｋｏｎ）」に対する比である。したがって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤが小さいほど、結合の親和性が強いということである。したがって、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比較して弱い結合親和性を示す。抗体のＫＤ値を、当技術分野で良好に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、典型的には、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。ＢＩＡｃｏｒｅ動的分析は、分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）が表面上に固定されたチップからの抗原の結合および解離を分析することを含む。抗体のＫＤを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ干渉法、典型的には、ＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによるものである。
【００８２】
本明細書で使用される用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡ分子の組合せまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、およびＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体を含む。そのような類似体を、例えば、限定されるものではないが、イノシンまたはトリチル化された塩基を含むヌクレオチド類似体を使用して生成することができる。そのような類似体はまた、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を横断する高い能力などの、分子に有益な属性を与える改変骨格を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖、二本鎖であってもよく、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含有してもよく、三本鎖部分を含有してもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００８３】
本発明はまた、抗体のポリペプチドおよび結合領域を含む、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディをコードするポリヌクレオチドも含む。当技術分野で公知の任意の方法により、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
【００８４】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディをコードするポリヌクレオチドは、以下のものを含んでもよい：バリアントのコード配列のみ、バリアントのコード配列と、機能的ポリペプチドなどのさらなるコード配列、またはシグナルもしくは分泌配列もしくはプロタンパク質配列；抗体のコード配列と、イントロンなどの非コード配列または抗体のコード配列の５’および／もしくは３’の非コード配列。用語「二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディをコードするポリヌクレオチド」は、バリアントのさらなるコード配列を含むポリヌクレオチドだけでなく、さらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも包含する。特定の宿主細胞／発現系について最適化されたポリヌクレオチド配列を、所望のタンパク質のアミノ酸配列から容易に取得することができることが当技術分野で公知である（ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙを参照されたい）。
【００８５】
本明細書で使用される用語「がん」とは、細胞の異常な制御されない増殖の結果生じる新生物または腫瘍を指す。いくつかの態様において、がんは、局在化されたままである良性腫瘍を指す。他の態様においては、がんは、近隣の身体構造に侵襲し、破壊し、遠隔部位に拡散した悪性腫瘍を指す。いくつかの態様において、がんは、特定のがん抗原と関連する。
【００８６】
本明細書で使用される「治療有効量」とは、疾患または障害を処置または管理するのに十分な治療剤の量を指す。治療有効量は、疾患の開始を遅延させる、または最小化する、例えば、がんの拡散を遅延させる、または最小化するのに十分な治療剤の量を指してもよい。治療有効量はまた、疾患の処置または管理において治療利益を提供する治療剤の量を指してもよい。さらに、本発明の治療剤に関する治療有効量は、疾患の処置または管理において治療利益を提供する、単独の、または他の療法と組み合わせた治療剤の量を意味する。
【００８７】
本明細書で使用される用語「予防剤」とは、障害の防止、または障害の再発もしくは拡散の防止において使用することができる任意の薬剤を指す。予防有効量は、限定されるものではないが、過剰増殖性疾患の素因がある患者、例えば、がんに対して遺伝的に素因がある患者、または以前に発がん物質に曝露された患者などの患者において、過剰増殖性疾患、特に、がんの再発もしくは拡散、またはそのようなものの出現を防止するのに十分な予防剤の量を指してもよい。予防有効量はまた、疾患の防止において予防利益を提供する予防剤の量を指してもよい。さらに、本発明の予防剤に関する予防有効量は、疾患の防止において予防利益を提供する、単独の、または他の薬剤と組み合わせた予防剤の量を意味する。
【００８８】
本明細書で使用される用語「防止する」、「防止すること」および「防止」とは、予防剤または治療剤の投与の結果としての、対象における障害の１つまたは複数の症状の再発または開始の防止を指す。
【００８９】
本明細書で使用される用語「組み合わせた」とは、１より多い予防剤および／または治療剤の使用を指す。用語「組み合わせた」の使用は、障害を有する対象に予防剤および／または治療剤が投与される順序を限定するものではない。換言すれば、組合せ療法を、治療剤で別々に、連続的に、または同時的に処置することによって行うことができる。
【００９０】
本発明の分子の組換え発現
一度、本発明の分子（すなわち、結合ドメイン）をコードする核酸配列が得られたら、分子の産生のためにベクターを、当技術分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。
【００９１】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の天然において付随する、または異種性のプロモーター領域を含む、抗体コード配列に作動可能に連結された発現制御ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核プロモーター系であってもよいが、原核宿主のための制御配列を使用することもできる。一度、ベクターが適切な宿主細胞株に組み込まれたら、宿主細胞を、ヌクレオチド配列を発現させるのに、必要に応じて、抗体の収集および精製にとって好適な条件下で増殖させる。真核細胞株としては、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞株、形質転換されたＢ細胞、またはヒト胚性腎臓細胞株が挙げられる。
【００９２】
二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ
以前に述べた通り、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディとは、両抗体結合ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれ、それぞれのポリペプチド鎖中のＶＬおよびＶＨドメインが異なる抗体に由来する、それぞれ、少なくとも１つの抗体ＶＬドメインと１つの抗体ＶＨドメインまたはそれらの断片を含む、２つ以上のポリペプチド鎖またはタンパク質の複合体を指す。特定の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、ＶＬとＶＨドメインの両方を含有するポリペプチド鎖の二量体または四量体を含む。多量体タンパク質を含む個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって多量体の少なくとも１つの他のペプチドに共有結合していてもよい。
【００９３】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ（登録商標））プラットフォーム技術（米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号、同第２００９／００６０９１０号および同第２０１０／０１７４０５３号）を利用して抗ＣＤ３（ＣＤ３）結合ドメインに共有結合させた抗Ｐ−カドヘリン（Ｐ−ＣＡＤ）結合ドメインを含む。ＤＡＲＴ技術は、優れた安定性、最適な重鎖と軽鎖の対形成および抗原認識を有してもよい分子をもたらす共有結合を提供する。さらに、最小リンカーサイズおよび含量は、免疫原性のための潜在能力を低下させることができる。本発明のＤＡＲＴタンパク質は、Ｔ細胞（ＣＤ３）と腫瘍細胞（Ｐ−ＣＡＤ）を同時に標的化し、Ｐ−カドヘリンを発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞の細胞傷害性をうまく指向化し、これを活性化する。
【００９４】
二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのそれぞれのポリペプチド鎖は、抗体結合ドメインが自己構築に制約がかかるように共有結合（リンカー１）されていてもよいＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。さらに、それぞれのポリペプチド鎖は、複数のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進し、異なるポリペプチド鎖のホモ二量体化の確率を低下させる、ヘテロ二量体化ドメインを含む。ヘテロ二量体化ドメインは、ポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。ヘテロ二量体化ドメインは、１、２、３、４、５、６以上のアミノ酸残基の長さであるシステインリンカー（リンカー２）を含んでもよい。２つのポリペプチド鎖の相互作用は、２つのＶＬ／ＶＨ対を産生し、２つのエピトープ結合ドメイン、すなわち、二価分子を形成することができる。ＶＨまたはＶＬドメインはポリペプチド鎖内の任意の位置に制約がかからない、すなわち、アミノまたはカルボキシ末端に限定されず、また、互いにその相対的位置に限定されない、すなわち、ＶＬドメインはＶＨドメインに対してＮ末端にあってもよく、その逆も然りである。唯一の限定は、機能的ダイアボディを形成するために相補的ポリペプチド鎖が利用可能であるということである。ＶＬおよびＶＨドメインが異なる抗原に特異的な抗体に由来する場合、機能的二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの形成には、２つの異なるポリペプチド鎖の相互作用、すなわち、ヘテロ二量体の形成が必要である。対照的に、２つの異なるポリペプチド鎖が、例えば、一方がＶＬＡとＶＨＢ（Ａは第１のエピトープであり、Ｂは第２のエピトープである）を含み、他方がＶＬＢとＶＨＡを含む組換え発現系において自由に相互作用する場合、２つの異なる結合部位は、ＶＬＡ−ＶＨＡおよびＶＬＢ−ＶＨＢを形成してもよい。全ての二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディポリペプチド鎖対について、２つの鎖の誤整列または誤結合は、例えば、ＶＬ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＨドメインの相互作用の可能性である。しかしながら、機能的二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの精製は、当技術分野で公知の、または本明細書に例示される任意の親和性に基づく方法、例えば、アフィニティクロマトグラフィーを使用して適切に二量体化された結合部
位の免疫特異性に基づいて容易に管理される。
【００９５】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、２つの別々の、異なるエピトープに同時に結合することができる。ある特定の態様においては、少なくとも１つのエピトープ結合部位は、免疫エフェクター細胞上で発現される、例えば、Ｔリンパ球上で発現されるＣＤ３決定基にとって特異的である。一態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ分子は、エフェクター細胞決定基に結合し、また、エフェクター細胞を活性化する。一態様において、エピトープ結合ドメインは、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん（限定されるものではないが、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、膀胱がん、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、およびグリア芽腫と関連するＰ−カドヘリン腫瘍関連抗原に結合することができる。
【００９６】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、一般に免疫グロブリンまたは抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。本発明の方法において使用される結合ドメインが由来する抗体は、鳥類および哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含む任意の動物起源に由来するものであってもよい。好ましくは、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用される「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから、またはヒト遺伝子に由来する抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【００９７】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを、様々な方法で特徴付けることができる。特に、本発明の分子を、抗原に免疫特異的に結合する能力についてアッセイすることができる。次いで、抗原に免疫特異的に結合すると同定された分子を、抗原に対するその特異性および親和性についてアッセイすることができる。
【００９８】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成および結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含む、当技術分野で周知の様々な方法を使用して産生することができる。所望の核酸配列を、組換え法（例えば、所望のポリヌクレオチドのより以前に調製されたバリアントのＰＣＲ突然変異誘発）により、または固相ＤＮＡ合成により産生することができる。通常、組換え発現法が使用される。一態様において、本発明は、抗ＣＤ３  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の態様において、本発明は、抗Ｐ−カドヘリンＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重性のため、様々な核酸配列がそれぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし、本発明は、本明細書に記載の結合タンパク質をコードする全ての核酸を含む。
【００９９】
リンカー／ペプチド
二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのポリペプチド鎖は、様々なリンカーおよびペプチドを含んでもよい。リンカーおよびペプチドは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９個以上のアミノ酸であってもよい。ある特定の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのポリペプチド鎖は、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）を含んでもよい。別の態様において、リンカー１は、限定されるものではないが、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９）の配列を含んでもよい。
【０１００】
ある特定の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのポリペプチド鎖は、システインリンカー（リンカー２）を含んでもよい。別の態様において、リンカー２は、少なくとも１個のグリシン残基をさらに含んでもよい。一態様において、リンカー２は、限定されるものではないが、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）およびＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）から選択される配列を含んでもよい。ある特定の態様において、リンカー２は、ＣＰＰＣＰ（配列番号６０）の配列を有するトランケートされたＩｇＧ１ヒンジ領域と少なくとも１個のグリシン残基を含んでもよい。別の態様において、リンカー２は、限定されるものではないが、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）およびＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）の配列を含んでもよい。
【０１０１】
ある特定の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのポリペプチド鎖は、リンカー３を含んでもよい。一態様において、リンカー３は、限定されるものではないが、ＫＡＰＳＳＳＰＭＥ（配列番号７７）の配列を含んでもよい。
【０１０２】
ある特定の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのポリペプチド鎖は、ペプチド１を含んでもよい。ある特定の態様において、ペプチド１は、ＣＰＰＣＰ（配列番号６０）の配列を有するトランケートされたＩｇＧ１ヒンジ領域を含んでもよい。一態様において、ペプチド１は、限定されるものではないが、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９６）の配列を含んでもよい。
【０１０３】
ＶＦ−ＤＡＲＴ
本発明の態様において、図２および図３に示されるような、ＶＦ−ＤＡＲＴとして知られる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）とを含む。
【０１０４】
一態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）もしくは抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合領域を含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含んでもよく、サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１０５】
別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ｂとサブドメイン１Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含んでもよく、サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１０６】
一態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。さらなる態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。
【０１０７】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）サブドメイン１Ａについて選択されたＶＬドメインに応じて抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＬ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体のＶＬ結合領域（ＣＤ３  ＶＬ）を含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）、またはそのようなサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１０８】
別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはそのようなサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１０９】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。さらなる態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。
【０１１０】
ＶＦ−ＤＡＲＴの別の態様において、サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａは結合して、ＣＤ３またはＰ−カドヘリン上のエピトープに結合する、ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを有する、第１の結合部位を形成してもよく、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２Ｂは結合して、Ｐ−カドヘリンまたはＣＤ３上のエピトープに結合する、ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを有する、第２の結合部位を形成してもよい。
【０１１１】
第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）は、例えば、第１および第２のヘテロ二量体促進ドメインの中に位置するシステイン残基で、互いに共有結合していてもよい。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２中のシステイン残基と第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２中のシステイン残基は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されていてもよい。
【０１１２】
本発明の態様において、ＣＤ３  ＶＬは配列番号４８の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨは配列番号４７および配列番号８９からなる群から選択される配列であってもよい。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３からなる群から選択される配列であってもよく、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群から選択される配列であってもよい。一態様において、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）は、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９）からなる群から選択される配列を含んでもよい。本発明の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含んでもよく、第２のヘテロ二量体促進ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）の配列を含んでもよい。本発明の別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）の配列を含んでもよく、第２のヘテロ二量体促進ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含んでもよい。
【０１１３】
本明細書に記載の様々なＰ−カドヘリンおよびＣＤ３抗体を含むＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖の配列を図３０Ａおよび図３０Ｂに提供する。
【０１１４】
Ｅ／Ｋコイル領域を含有するＥＫ−ＤＡＲＴ
また、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの２つの異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体形成を、反対のメンバーに対する親和性およびそれ自身に対する反発力を有するドメインの使用によって促進することもできる。そのようなドメインの例は、コイルドコイルドメインである。例えば、第１のポリペプチド鎖（１）は、負に荷電したアルファ−ヘリックスコイル（Ｅ−コイル）を形成するグルタミン酸リッチ領域を有する第１のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよく、第２のポリペプチド鎖（２）は、正に荷電したヘリックスコイル（Ｋ−コイル）を形成するリシンリッチ領域を有する第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよく、これは、ヘテロ二量体形成を促進する静電的相互作用を可能にする。Ｅ−コイルは別のＥ−コイル含有ポリペプチドに対する反発力を有する、およびＫ−コイルについてはその逆であるため、ホモ二量体形成を減少させることができる。
【０１１５】
本発明の態様において、図４に示されるような、ＥＫ−ＤＡＲＴとして知られる二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）とを含む。
【０１１６】
一態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合領域を含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）、および（ｉｉ）リンカー２に共有結合されたＥ−コイル領域を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１１７】
別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）サブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）、および（ｉｉ）リンカー２に共有結合されたＥ−コイル領域を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１１８】
一態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。さらなる態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。
【０１１９】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）サブドメイン１Ａについて選択されたＶＬドメインに応じて抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＬ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体のＶＬ結合領域（ＣＤ３  ＶＬ）を含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）、またはサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）、および（ｉｉ）リンカー２に共有結合されたＫ−コイル領域を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１２０】
別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）サブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）、および（ｉｉ）リンカー２に共有結合されたＫ−コイル領域を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１２１】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。さらなる態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。
【０１２２】
ＥＫ−ＤＡＲＴの別の態様において、サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａは結合して、ＣＤ３またはＰ−カドヘリン上のエピトープに結合する、ＶＬ／ＶＨ結合ドメイン領域を有する第１の結合部位を形成してもよく、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２Ｂは結合して、Ｐ−カドヘリンまたはＣＤ３上のエピトープに結合する、ＶＬ／ＶＨ結合ドメイン領域を有する第２の結合部位を形成してもよい。
【０１２３】
第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）は、例えば、第１および第２のヘテロ二量体促進ドメインの中に位置するシステイン残基で、互いに共有結合していてもよい。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２中のシステイン残基と第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２中のシステイン残基は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結していてもよい。
【０１２４】
本発明の態様において、ＣＤ３  ＶＬは配列番号４８の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨは配列番号４７および配列番号８９からなる群から選択される配列であってもよい。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３からなる群から選択される配列であってもよく、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群から選択される配列であってもよい。一態様において、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）は、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９）からなる群から選択される配列を含んでもよい。本発明の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインおよび第２のヘテロ二量体ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）の配列を含んでもよい。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号６１）の配列を含むグルタミン酸リッチ領域（Ｅ−コイル）をさらに含む。別の態様において、第２のヘテロ二量体促進ドメインは、ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号６２）の配列を含むリシンリッチ領域（Ｋ−コイル）をさらに含む。
【０１２５】
表１および図３１Ａおよび図３１Ｂは、本明細書に記載の様々なＰ−カドヘリンおよびＣＤ３抗体を含むＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖の配列を提供する。
【０１２６】
【表１】
2017520575.tif 000003
【０１２７】
Ｆｃ領域またはその一部を含む二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディ
本発明は、Ｆｃ領域もしくはドメイン、またはその一部を含む二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを包含する。ある特定の態様において、Ｆｃ領域、またはその一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域の１つまたは複数の定常ドメイン（例えば、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）を含む。他の態様において、本発明は、Ｆｃ領域またはその一部が同等の野生型Ｆｃ領域またはその一部と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換）を含む、Ｆｃ領域またはその一部を含む分子を包含する。バリアントＦｃ領域は、当技術分野で周知であり、当技術分野で周知の任意の結合活性またはエフェクター機能アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ分析、またはＡＤＣＣにおいてアッセイされるバリアントＦｃ領域を含む抗体の表現型を変化させるために主として使用される。そのようなバリアントＦｃ領域、またはその一部は、Ｆｃ領域またはその一部を含む本発明のダイアボディ分子により示される血漿半減期および安定性を延長させることができる。他の態様において、本発明は、当技術分野で公知の任意のＦｃバリアントの使用を包含する。
【０１２８】
ある特定の態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸に対する１つまたは複数の改変は、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する、Ｆｃ領域、したがって、本発明のダイアボディ分子の親和性およびアビディティを減少させる。特定の態様において、本発明は、バリアントＦｃ領域が、バリアントＦｃ領域だけが１つのＦｃγＲに結合する野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩＡである、バリアントＦｃ領域、またはその一部を含むダイアボディを包含する。別の特定の態様において、本発明は、バリアントＦｃ領域が、バリアントＦｃ領域のみが１つのＦｃγＲに結合する野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＡである、バリアントＦｃ領域、またはその一部を含むダイアボディを包含する。別の特定の態様において、本発明は、バリアントＦｃ領域が、バリアントＦｃ領域のみが１つのＦｃγＲに結合する野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＢである、バリアントＦｃ領域、またはその一部を含むダイアボディを包含する。ある特定の態様において、本発明は、バリアントが、当業者には公知で本明細書に記載の方法を使用して測定した場合、Ｆｃ領域を含まない、または野生型Ｆｃ領域を含む分子と比較して、低下したＡＤＣＣ活性（もしくは他のエフェクター機能）および／または増加したＦｃγＲＩＩＢへの結合（ＣＤ３２Ｂ）を付与する、または媒介する、バリアントＦｃ領域を含む分子を包含する。
【０１２９】
本発明はまた、２つ以上のＩｇＧアイソタイプに由来するドメインまたは領域を含むＦｃ領域の使用も包含する。当技術分野で公知のように、Ｆｃ領域のアミノ酸改変は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能および／または結合活性に大きく影響し得る。しかしながら、選択されるＩｇＧアイソタイプの文脈で実装された場合、機能的特徴におけるこれらの変化をさらに改良および／または操作することができる。同様に、アイソタイプＦｃの天然の特徴を、１つまたは複数のアミノ酸改変によって操作することができる。複数のＩｇＧアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）は、そのヒンジおよび／またはＦｃ領域のアミノ酸配列における差異のため、血清半減期、補体固定、ＦｃγＲ結合親和性およびエフェクター機能活性（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を含む異なる物理的および機能的特性を示す。ある特定の態様において、アミノ酸改変およびＩｇＧ  Ｆｃ領域は、所望の特徴を有するダイアボディを操作するためにその対応する別々の結合および／またはエフェクター機能活性に基づいて独立に選択される。多くの態様において、アミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域を、ＩｇＧ１の文脈において本明細書に記載される、または当技術分野で公知の結合および／またはエフェクター機能活性について別々にアッセイした。ある特定の態様においては、アミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、ダイアボディ分子または他のＦｃ含有分子（例えば、および免疫グロブリン）の文脈において類似する機能、例えば、低下したＡＤＣＣ活性（もしくは他のエフェクター機能）および／または増加したＦｃγＲＩＩＢへの結合を示す。他の態様において、本発明は、当技術分野で公知のアミノ酸改変と、改変および／または領域が本明細書に記載のように独立にアッセイされた場合には検出可能ではなかった新規特性を示す選択されたＩｇＧ領域との組合せを含むバリアントＦｃ領域を包含する。
【０１３０】
ＬＰ−ＤＡＲＴ
本発明の態様において、ＬＰ−ＤＡＲＴと呼ばれる、Ｆｃ領域を有する二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディが図１および図５に示される。ＬＰ−ＤＡＲＴは、ＩｇＧのＦｃドメインに融合された、標的抗原とＣＤ３とに結合する２つのｓｃＦｖドメインを含んでもよい。本発明の一態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合された、Ｐ−カドヘリンとＣＤ３イプシロンとに結合する２つのｓｃＦｖドメインを含んでもよい。特に、図１Ａおよび図１Ｂは、抗Ｐ−カドヘリン／抗ヒトＣＤ３  ＬＰ−ＤＡＲＴの４つの代替表示を示し、図５は、構築されたＬＰ−ＤＡＲＴの一般図を示す。ＬＰ−ＤＡＲＴは、第１および第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインがノブ（突起）またはホール（空洞）を含むように変化された、免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリンＦｃ領域を含むことを除いて、ＶＦ−ＤＡＲＴまたはＥＫ−ＤＡＲＴについて上記された構造と類似する。ＬＰ−ＤＡＲＴのＦｃ部分に対する改変を、以下に記載する。
【０１３１】
本発明の態様において、図１Ａ、図１Ｂおよび図５に示されるような、ＬＰ−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）とを含む。
【０１３２】
一態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合領域を含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）、ならびに（ｉｉ）リンカー２に共有結合されたノブＦｃ鎖（突起）またはホールＦｃ鎖（空洞）を含むように変化させたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含んでもよい。
【０１３３】
別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）、ならびに（ｉｉ）リンカー２に共有結合されたノブＦｃ鎖（突起）またはホールＦｃ鎖（空洞）を含むように変化させたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含んでもよい。
【０１３４】
一態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。さらなる態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。
【０１３５】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）サブドメイン１Ａについて選択されたＶＬドメインに応じて抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＬ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体のＶＬ結合領域（ＣＤ３  ＶＬ）を含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）、またはそのようなサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）、ならびに（ｉｉ）リンカー２に共有結合された、そのような第１のヘテロ二量体領域がホールＦｃ鎖（空洞）を含む場合、ノブＦｃ鎖（突起）、またはそのような第１のヘテロ二量体領域がノブＦｃ鎖（突起）を含む場合、ホールＦｃ鎖（空洞）を含むように変化させたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１３６】
別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ、またはそのようなサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）、ならびに（ｉｉ）リンカー２に共有結合された、そのような第１のヘテロ二量体領域がホールＦｃ鎖（空洞）を含む場合、ノブＦｃ鎖（突起）、またはそのような第１のヘテロ二量体領域がノブＦｃ鎖（突起）を含む場合、ホールＦｃ鎖（空洞）を含むように変化させたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１３７】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。さらなる態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。
【０１３８】
ＬＰ−ＤＡＲＴの別の態様において、サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａは結合して、ＣＤ３またはＰ−カドヘリン上のエピトープに結合するＶＬ／ＶＨ結合ドメイン領域を有する第１の結合部位を形成してもよく、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２Ｂは結合して、Ｐ−カドヘリンまたはＣＤ３上のエピトープに結合するＶＬ／ＶＨ結合ドメイン領域を有する第２の結合部位を形成してもよい。
【０１３９】
第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）は、例えば、第１および第２のヘテロ二量体促進ドメイン内に位置するシステイン残基で、互いに共有結合されていてもよい。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２中のシステイン残基と第２のヘテロ二量体促進ドメインのリンカー２中のシステイン残基は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されていてもよい。
【０１４０】
本発明の態様において、ＣＤ３  ＶＬは配列番号４８の配列を含んでもよく、ＣＤ３  ＶＨは配列番号４７および配列番号８９からなる群から選択される配列であってもよい。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３からなる群から選択される配列であってもよく、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群から選択される配列であってもよい。一態様において、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）は、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９）からなる群から選択される配列を含んでもよい。
【０１４１】
本発明の別の態様において、システインリンカー（リンカー２）は、ＣＰＰＣＰ（配列番号６０）の配列を有するトランケートされたＩｇＧ１ヒンジ領域と、ヒンジ領域の前の少なくとも１個のグリシン残基を含んでもよい。一態様において、リンカー２は、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）およびＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）からなる群から選択される配列を含んでもよい。
【０１４２】
一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号６３の配列を含むノブＦｃ鎖（突起）、または配列番号６４の配列を含むホールＦｃ鎖（空洞）を含むように変化させたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含んでもよい。別の態様において、第２のヘテロ二量体促進ドメインは、そのような第１のヘテロ二量体領域がホールＦｃ鎖（空洞）を含む場合、配列番号６３の配列を含むノブＦｃ鎖（突起）、またはそのような第１のヘテロ二量体領域がノブＦｃ鎖（突起）を含む場合、配列番号６４の配列を含むホールＦｃ鎖（空洞）を含むように変化させたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含んでもよい。
【０１４３】
表２および図３２Ａおよび図３２Ｂは、本明細書に記載の様々なＰ−カドヘリンおよびＣＤ３抗体を含むＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を提供する。配列番号１１７〜１２４は、括弧内で参照される対応するヌクレオチド配列を提供する。
【０１４４】
【表２−１】
2017520575.tif 000004
【０１４５】
【表２−２】
2017520575.tif 000005
【０１４６】
ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３におけるエフェクターヌル突然変異およびＣ末端Ｌｙｓの除去
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を改変して、翻訳後に切断されることが多いＣ末端リシン残基を除去し、ならびに、ＦｃγＲＩＩＩへの結合のためエフェクター機能をオブラート（ｏｂｌａｔｅ）する標準的なプライマー特異的ＰＣＲ突然変異誘発を使用して突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを導入した（エフェクターヌル表現型）。
【０１４７】
ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３におけるノブインホール突然変異
「ノブインホール」は、ヘテロ二量体化のために抗体重鎖ホモ二量体を操作するための当技術分野で公知の有効な設計戦略である。この手法においては、「ノブ」バリアントを、ＩｇＧ１のＦｃ領域の一方の鎖中で、小さいアミノ酸をより大きいもの、例えば、Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗに置き換えることにより取得した。「ノブ」を、大きい残基をより小さいもの、例えば、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０８Ｖに置き換えることにより作出されたＦｃ領域の相補鎖のＣＨ３ドメイン中、「ホール」に挿入するように設計した。
【０１４８】
ノブインホールの指定は、突起および空洞の指定と同様であり、互換的に使用することができる。
【０１４９】
「突起」または「ノブ」は、第１のポリペプチドの接触面から突出し、したがって、ヘテロ二量体を安定化するために隣接する接触面（すなわち、第２のポリペプチドの接触面）における代償的空洞に位置することができ、それによって、例えば、ホモ二量体よりもヘテロ二量体形成を好む少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。突起は元の接触面中に存在するか、または合成的に導入してもよい（例えば、接触面をコードする核酸を変化させることによる）。通常、第１のポリペプチドの接触面をコードする核酸を、突起をコードするように変化させる。これを達成するために、第１のポリペプチドの接触面中の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸を、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「インポート」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換える。置き換えられる元の残基数の上限は、第１のポリペプチドの接触面中の残基の総数である。
【０１５０】
突起の形成のためのある特定のインポート残基は、一般的には天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）から選択される。
【０１５１】
「空洞」または「ホール」とは、第２のポリペプチドの接触面から凹所にあり、したがって、第１のポリペプチドの隣接する接触面上の対応する突起を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の接触面中に存在するか、または合成的に導入してもよい（例えば、接触面をコードする核酸を変化させることによる）。通常、第２のポリペプチドの接触面をコードする核酸を、空洞をコードするように変化させる。これを達成するために、第２のポリペプチドの接触面中の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸を、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「インポート」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換える。置き換えられる元の残基数の上限は、第２のポリペプチドの接触面中の残基の総数である。
【０１５２】
空洞の形成のためのある特定のインポート残基は、通常、天然のアミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）から選択される。
【０１５３】
「元の」アミノ酸残基は、元の残基よりも小さいか、または大きい側鎖体積を有してもよい「インポート」残基によって置き換えられるものである。インポートアミノ酸残基は、天然または非天然のアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、前者である。「天然の」アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされる残基である。「非天然」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる残基を意味する。天然アミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよび例えば、Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）に記載のものなどの他のアミノ酸残基類似体である。本発明の方法は、少なくとも１つの元のアミノ酸残基を置き換えることを含むが、１より多い元の残基を置き換えてもよい。通常、第１または第２のポリペプチドの接触面中の全残基を超えない数の残基が、置き換えられる元のアミノ酸残基を構成し得る。
【０１５４】
突起またはノブは、空洞またはホール中に「位置することができる」、これは、それぞれ第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの接触面上の突起および空洞の空間的位置ならびに突起および空洞のサイズが、突起が接触面での第１および第２のポリペプチドの正常な結合を大きく乱すことなく空洞中に位置するようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐなどの突起は、典型的には接触面の軸から垂直に伸長しないため、突起と、対応する空洞との整列は、Ｘ線結晶解析または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるものなどの三次元構造に基づく突起／空洞対のモデリングに依拠する。これを、当技術分野において広く受け入れられている技術を使用して達成することができる。
【０１５５】
したがって、得られるＦｃ領域のヘテロ二量体化を好むために、それぞれのＦｃ鎖が、表３に提供されるような、１セットの突然変異、ノブ（もしくは突起）Ｆｃ鎖（配列番号６３）についてはＹ３４９ＣとＴ３６６Ｗ、またはホール（もしくは空洞）Ｆｃ鎖（配列番号６４）についてはＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するように、相補的突然変異を導入した。好適な哺乳動物宿主中に同時トランスフェクトした場合、配列番号６３および６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、主に、１つのホール（または空洞）Ｆｃ鎖と結合した１つのノブ（または突起）Ｆｃ鎖を有する二重特異的ヘテロ二量体であるＦｃ領域を産生する。
【０１５６】
【表３】
2017520575.tif 000006
【０１５７】
重複プライマー伸長ＰＣＲを使用して、３’ＢｓｐＥＩ部位を含有するそれぞれのＤＡＲＴ鎖にノブ（突起）およびホール（空洞）Ｆｃ鎖をサブクローニングする際に使用するために５’ＢｓｐＥＩ制限酵素認識配列ＴＣＣＧＧＡ（配列番号６７）を導入した。この制限部位は、ＤＡＲＴ−Ｆｃ接合部にアミノ酸セリンおよびグリシン（ｓｅｒ−ｇｌｙ）のインフレーム挿入をコードする。抗Ｐ−カドヘリン／抗ＣＤ３  ＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質を、実施例６に記載のように構築した。
【０１５８】
本発明の抗Ｐ−カドヘリン／抗ＣＤ３  ＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質は、熱安定性試験において凝集に対して安定であり、ヒトＣＤ３とＰ−カドヘリンの両方を標的化する強力な二重特異的ダイアボディ−Ｆｃ融合物である。ノブインホールＦｃドメインは、ＣＨＯ細胞中での改善された発現および高純度の所望のヘテロ二量体をもたらす改善された精製を可能にする。Ｆｃドメイン内で操作された突然変異は、ＦｃγＲ結合を無効化し、かくして、ＡＤＣＣ媒介性Ｔ細胞枯渇を潜在的に回避する。さらに、ＤＡＲＴタンパク質へのＦｃドメインの組込みは、臨床的に認可されたモノクローナル抗体と比較した場合、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および強制凝集アッセイにより示されたように分子の安定性を増強する。さらに、Ｆｃドメインは、薬物動態プロファイルを改善する。
【０１５９】
ＭＰ３  ＤＡＲＴ
図６および図７は、それぞれ、Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴおよびＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの略図である。そのようなＭＰ３−ＤＡＲＴタンパク質は、３つのポリペプチド鎖：第１のポリペプチド鎖（１）、第２のポリペプチド鎖（２）および第３のポリペプチド鎖（３）から構成される。
【０１６０】
本発明の態様において、図６に示されるようなＮ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合領域を含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）のＶＨ結合領域、またはそのようなサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＨ）のいずれかのＶＨ結合領域を含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１を含む第１のポリペプチド鎖（１）を含んでもよく、（ｉ）サブドメイン１Ｂ上にシステインリンカー（リンカー２）、（ｉｉ）リンカー２上にシステインペプチド１ならびに（ｉｉｉ）ペプチド１に共有結合されたＩｇＧドメインのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１６１】
本発明の別の態様において、図７に示されるようなＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）システインペプチド１、（ｉｉ）ＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域、ならびに（ｉｉｉ）Ｆｃ領域上のリンカー３を含む第１のヘテロ二量体促進ドメインと、（ｉ）抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合領域を含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）のＶＨ結合領域、またはそのようなサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＨ）のＶＨ結合領域のいずれかを含むサブドメイン１Ｂを含み、サブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン１Ａとサブドメイン１Ｂがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン１、ならびに（ｉｖ）サブドメイン１Ｂ上のシステインリンカー（リンカー２）を含む第１のポリペプチド鎖（１）を含んでもよい。
【０１６２】
別の態様において、Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴまたはＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴの第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン１ＡがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含む、またはそのようなサブドメイン１ＡがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。
【０１６３】
一態様において、Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴまたはＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴの第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを有するサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。さらなる態様において、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを有するサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。別の態様において、第１のポリペプチド鎖（１）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン１Ａおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン１Ｂを含むドメイン１を含んでもよい。
【０１６４】
一態様において、Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴまたはＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴの第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＭＰ３−ＤＡＲＴの第１のポリペプチド鎖について選択されるＶＬドメインに応じて、抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３  ＶＬ）のいずれかのＶＬ結合領域を含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＬを含む場合、抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨ結合領域（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）を含む、またはそのようなサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＬを含む場合、抗ＣＤ３抗体のＶＨ結合領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含むサブドメイン２Ａを含み、サブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａが結合してエピトープ結合部位を形成しないようにサブドメイン２Ｂとサブドメイン２Ａがグリシン−セリンリンカー（リンカー１）によって共有結合されていてもよいドメイン２を含んでもよく、サブドメイン２Ａ上にシステインリンカー（リンカー２）を含む第２のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１６５】
別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨまたはＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂ、（ｉｉ）そのようなサブドメイン２ＢがＣＤ３  ＶＨを含む場合、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含む、またはそのようなサブドメイン２ＢがＰ−ＣＡＤ  ＶＨを含む場合、ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。
【０１６６】
一態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＨを有するサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。さらなる態様において、（ｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）ＣＤ３  ＶＬを有するサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。別の態様において、第２のポリペプチド鎖（２）は、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨを含むサブドメイン２Ｂおよび（ｉｉ）Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬを含むサブドメイン２Ａを含むドメイン２を含んでもよい。
【０１６７】
一態様において、Ｎ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴまたはＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴの第３のポリペプチド鎖（３）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）システインペプチド１ならびに（ｉｉ）ＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む第３のヘテロ二量体促進ドメインを含んでもよい。
【０１６８】
本発明の一態様において、サブドメイン１Ａとサブドメイン２Ａは結合して、ＣＤ３またはＰ−カドヘリン上のエピトープに結合する、ＶＬ／ＶＨ領域を有する、第１の結合部位を形成し、サブドメイン１Ｂとサブドメイン２Ｂは結合して、Ｐ−カドヘリンまたはＣＤ３上のエピトープに結合する、ＶＬ／ＶＨ領域を有する、第２の結合部位を形成してもよい。
【０１６９】
第１のポリペプチド鎖（１）と第２のポリペプチド鎖（２）は、例えば、第１および第２のヘテロ二量体促進ドメイン内に位置するシステイン残基で、互いに共有結合されていてもよい。一態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメイン上のリンカー２中のシステイン残基と、第２のヘテロ二量体促進ドメイン上のリンカー２中のシステイン残基は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されていてもよい。
【０１７０】
第１のポリペプチド鎖（１）の第１のヘテロ二量体促進ドメインと、第３のポリペプチド鎖（３）の第３のヘテロ二量体促進ドメインは互いに結合して、免疫グロブリンＦｃ領域を形成してもよい。第１のポリペプチド鎖（１）と第３のポリペプチド鎖（３）は、例えば、第１および第３のヘテロ二量体促進ドメイン内に位置するシステイン残基で、互いに共有結合されていてもよい。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメイン上のペプチド１中のシステイン残基と、第３のヘテロ二量体促進ドメイン上のペプチド１中のシステイン残基は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されていてもよい。
【０１７１】
本発明の態様において、ＣＤ３  ＶＬは配列番号４８の配列を含んでもよく、ＣＤ３  ＶＨは配列番号４７および配列番号８９からなる群から選択される配列であってもよい。別の態様において、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３からなる群から選択される配列であってもよく、Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群から選択される配列であってもよい。一態様において、グリシン−セリンリンカー（リンカー１）は、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９）からなる群から選択される配列を含んでもよい。
【０１７２】
本発明の態様において、システインリンカー（リンカー２）は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）およびＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）からなる群から選択される配列を含んでもよい。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）の配列を含んでもよく、第２のヘテロ二量体促進ドメインのシステインリンカー（リンカー２）は、ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７１）の配列を含んでもよい。
【０１７３】
ある特定の態様において、第３のヘテロ二量体促進領域のリンカー３は、ＫＡＰＳＳＳＰＭＥ（配列番号７７）の配列を含んでもよい。
【０１７４】
ある特定の態様において、第１および第３のヘテロ二量体促進領域上のペプチド１は、ＣＰＰＣＰ（配列番号６０）の配列を有するトランケートされたＩｇＧ１ヒンジ領域を含んでもよい。一態様において、ペプチド１は、限定されるものではないが、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９６）の配列を含んでもよい。
【０１７５】
本明細書に記載のノブおよびホール戦略をＭＰ３−ＤＡＲＴ構築物中で使用して、第１および第３のポリペプチド鎖の適切な対形成を確保することができる。本明細書に記載のＬＰ−ＤＡＲＴと同様、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を改変して、翻訳後に切断されることが多いＣ末端リシン残基を除去し、ならびに、ＦｃγＲＩＩＩへの結合のためエフェクター機能をオブラートするためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異（エフェクターヌル表現型）を導入することができる。一態様において、ノブは、Ｔ３６６Ｗ改変を含有するように天然のＩｇＧ  Ｆｃ領域を改変することによって作出される。別の態様において、ホールは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ改変を含有するように天然のＩｇＧ  Ｆｃ領域を改変することによって作出される。好ましくは、第１のポリペプチド鎖はノブを含み、第３のポリペプチド鎖はホールを含む。第３のポリペプチド鎖の任意のホモ二量体からＭＰ３−ＤＡＲＴ（商標）を精製するのを助けるために、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのプロテインＡ結合部位を、好ましくは、４３５位でのアミノ酸置換（Ｈ４３５Ｒ）により突然変異させる。かくして、第３のポリペプチド鎖の任意のホモ二量体はプロテインＡに結合しないが、ＭＰ３−ＤＡＲＴ（商標）は第１のポリペプチド鎖上のプロテインＡ結合部位を介してプロテインＡに結合するその能力を保持する。したがって、表４に提供されるように、ノブ（または突起）Ｆｃ鎖は、配列番号６５の配列を有してもよく、ホール（または空洞）Ｆｃ鎖は、配列番号６６の配列を有してもよい。
【０１７６】
【表４】
2017520575.tif 000007
【０１７７】
表５は、本明細書に記載の様々なＰ−カドヘリンおよびＣＤ３−１抗体を用いて構築された例示的なＮ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴおよびＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴタンパク質の第１（１）、第２（２）および第３（３）のポリペプチド鎖を記載する。配列番号１２５〜１５８は、表５に記載のＮ末端およびＣ末端ＭＰ３−ＤＡＲＴ二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのポリペプチド鎖１、２および３に関するアミノ酸およびヌクレオチド配列（括弧内を参照）を提供する。
【０１７８】
【表５】
2017520575.tif 000008
【０１７９】
操作されたシステイン残基
ある特定の態様において、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディのそれぞれのポリペプチド鎖を、本発明の別のポリペプチド鎖上の対応するシステイン残基と相互作用して、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステイン残基を含むように操作することができる。鎖間ジスルフィド結合は、ダイアボディ分子を安定化するのに役立ち、組換え系における発現および回収を改善し、安定で一貫した製剤をもたらし、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの単離および／または精製された産物の安定性を改善することができる。システイン残基を、ポリペプチド鎖の任意の部分に、単一のアミノ酸として、またはより大きいアミノ酸配列、例えば、ヒンジ領域の一部として導入することができる。特定の態様において、少なくとも１つのシステイン残基を、ポリペプチド鎖のＣ末端に存在するように操作する。
【０１８０】
がんの処置
本発明は、対象におけるがんの処置、防止または管理のための方法および組成物であって、治療有効量の本発明に従って操作された二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを対象に投与することを含み、この分子はがん抗原にさらに結合する、方法および組成物を包含する。本発明の分子は、原発性腫瘍およびがん細胞の転移の防止、阻害、増殖の減少および／または退縮にとって特に有効であり得る。特定の作用機構によって束縛されることを意図するものではないが、本発明の分子は、腫瘍消失、腫瘍減少またはその組合せをもたらし得るエフェクター機能を媒介することができる。
【０１８１】
したがって、本発明は、Ｐ−カドヘリンがん抗原およびＴ細胞上のＣＤ３抗原を免疫特異的に認識するように二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを操作することによってＰ−カドヘリンがん抗原を特徴とするがんを防止または処置する方法を提供する。本発明に従って操作された二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、抗ＣＤ３抗体により誘導される活性化されたキラーＴ細胞による細胞傷害活性を有するため、それらはがんの防止または処置にとって有用である。
【０１８２】
したがって、本発明の態様は、それを必要とする患者におけるＰ−カドヘリン陽性がんを処置する方法であって、がんが乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん（限定されるものではないが、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、膀胱がん、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、およびグリア芽腫からなる群から選択される、方法を提供する。
【０１８３】
本発明はまた、本明細書で定義されるがんを処置する方法における使用のための本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを提供する。さらに、本発明は、本明細書で定義されるがんの処置のための薬剤の製造における本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの使用を提供する。
【０１８４】
特定の態様において、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの非存在下でのがん細胞の増殖と比較して、がん細胞の増殖を少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％阻害する、または減少させる。
【０１８５】
特定の態様において、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの非存在下よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％良好に細胞を殺傷する、またはがん細胞の増殖を阻害する、もしくは減少させる。
【０１８６】
本発明は、限定されるものではないが、現在の標準的な、および実験的な化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、または手術などのがんの処置または防止のための当業者には公知の他の療法と組み合わせて本発明の分子を投与することをさらに包含する。いくつかの態様において、本発明の分子を、がんの処置および／または防止のための、治療または予防有効量の１つもしくは複数の薬剤、治療抗体または当業者には公知の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０１８７】
したがって、がんを処置するための方法は、それを必要とする患者に、化学療法剤と組み合わせて有効量の本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを投与することを含む。そのような組合せ処置を、別々に、連続的に、または同時的に投与してもよい。好適な化学療法剤としては、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、アスパラギナーゼ、ＢＣＮＵ、ブレオマイシン、カリケアミシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、窒素マスタード、ニトロソウレア、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、タキソール、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。
【０１８８】
本明細書で提供される用量および投与頻度は、治療有効および予防有効の用語によって包含される。用量および頻度は、投与される特定の治療剤または予防剤、がんの重症度および型、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に応じて、それぞれの患者に特異的な因子に従ってさらに変化してもよい。当業者であれば、そのような因子を考慮し、例えば、文献中で報告され、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５６版、２００２）で推奨された用量に従うことによって、好適なレジメンを選択することができる。
【０１８９】
本発明の二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディは、選択される投与様式にとって適切であるように製剤化される投与のための医薬組成物、ならびにバッファー、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定剤、担体などの薬学的に許容できる希釈剤または賦形剤の形態にあってもよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．、第１８版、１９９５は、医師には一般的に知られる製剤化技術の概要を提供する。
【０１９０】
これらの医薬組成物を、がんを処置するために一般的に意図される目的を達成する当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。投与経路は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、および関節内注射および輸注を含む投与様式を指すと本明細書で定義される、非経口によるものであってもよい。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、存在する場合、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存してもよい。
【０１９１】
本発明の範囲内にある組成物は、二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディががんを処置するための望ましい医学的効果を達成するのに有効である量で存在する全ての組成物を含む。個体の必要性は患者間で変化してもよいが、全ての成分の有効量の最適な範囲の決定は、通常の技術を有する医師の能力の範囲内にある。
【０１９２】
本発明は、上記の方法において使用することができるキットを提供する。一態様において、キットは、１つまたは複数の容器中に、がんの処置にとって有用な１つまたは複数の他の予防剤または治療剤をさらに含む。ある特定の態様において、他の予防剤または治療剤は、化学療法剤である。他の態様において、予防剤または治療剤は、生物学的治療剤またはホルモン治療剤である。
【０１９３】
本発明の医薬組成物、予防剤または治療剤のいくつかの態様は、好ましくは、ヒトにおける使用の前に、所望の治療活性について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞培養系中で、およびげっ歯類動物モデル系などの動物モデル生物中で試験される。
【０１９４】
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および効能を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、それをＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す予防剤および／または治療剤が好ましい。
【０１９５】
さらに、当業者には公知の任意のアッセイを使用して、がんの処置または防止のための本明細書に開示される療法または組合せ療法の予防的および／または治療的有用性を評価することができる。
【０１９６】
生物学的寄託物
本発明の代表的な材料を、２０１３年１２月２０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０８０９を有するベクター１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ  Ａは、Ｐ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴ（Ｆｃ融合ダイアボディ）Ａ鎖をコードする組換えヒトＤＮＡ挿入物を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０８１０を有するベクター１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ  Ｂは、Ｐ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴ（Ｆｃ融合ダイアボディ）Ｂ鎖をコードする組換えヒトＤＮＡ挿入物を含む。寄託物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ  （Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ）の条項の下で作製した。これは、寄託日から３０年間にわたって寄託物の生きた培養物の維持を確保するものである。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣにより利用可能となり、Ｐｆｉｚｅｒ  ＩｎｃとＡＴＣＣとの合意を受け、いずれが第１であっても、関連する米国特許の保証の際または任意の米国もしくは外国特許出願の公開の際に寄託物の培養物の子孫の永続的かつ無制限の利用可能性を公衆に保証し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １２２およびそれに準拠する委員会の規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照する３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １．１４を含む）に従って権利を与えられる米国特許商標庁長官によって決定される者にその子孫の利用を保証する。
【０１９７】
本出願の譲受人は、寄託上の材料の培養物が好適な条件下で培養した場合に死滅する、または失われる、または破壊されるべきである場合、その材料は通知をもって同じものの別のものと即座に交換されることに同意した。寄託された材料の利用可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限の下で特許された権利に違反して本発明を実施するライセンスと解釈されるべきではない。
【０１９８】
本発明を実行するための特定の態様の以下の実施例は、例示目的のみで提供されるものであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１９９】
（実施例１）
Ｐ−カドヘリン抗体および二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディの生成
二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを、それぞれの組換え産生、精製および結合特性を評価するために構築した。アフィニティ精製された二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディを、本明細書に記載の組換え発現系によって産生した。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ分析により、共有結合による二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディが、両方の標的抗原、Ｐ−カドヘリンおよびＣＤ−３に対する親和性を示し、両抗原に同時に結合することができることがさらに示された。
【０２００】
Ａ．ファージディスプレイ
Ｐ−カドヘリンの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）部分を、当技術分野で公知の技術を利用して、非免疫化ヒトドナーに由来するｓｃＦｖから構成されるファージディスプレイライブラリーを用いて同定した。標準的なＥＬＩＳＡ技術により、ファージ表面上に発現されるｓｃＦｖの結合を、Ｐ−カドヘリンタンパク質構築物およびＰ−カドヘリン発現細胞上で測定した。
【０２０１】
Ｂ．配列決定分析
ｓｃＦｖ断片を、従来の方法を使用して、未精製の細菌グリセロールストックとして、または精製されたプラスミドとして、プライマー５’ＧＧＡＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡ３’（配列番号５８）および５’ＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧ３’（配列番号５９）を用いて配列決定した。
【０２０２】
Ｃ．ＤＡＲＴへの変換
強い組換えＰ−カドヘリンまたは細胞表面結合（バックグラウンドまたは陰性細胞結合の３倍を超える）を示したｓｃＦｖ断片を、ＤＡＲＴタンパク質中へのサブクローニングのために選択した。ＤＡＲＴの設計およびクローニング方法は、以前に記載されている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３９９：４３６〜４４９、２０１０；Ｍｏｏｒｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１７（１７）：４５４２〜５１、２０１１）。ファージディスプレイライブラリーから新規抗Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖを適合させるための方法は、以下の通りである：ＶＨについてはＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩおよびＶＬについてはＢｓｓＨＩＩ／ＢａｍＨＩを組み込むプライマーを用いる標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、断片を増幅した。製造業者の仕様書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って対応する制限酵素で断片を切断した。
【０２０３】
ＤＡＲＴ発現ベクターを生成するために、抗Ｐ−カドヘリンＶＨ（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＨ）またはＶＬ（Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ）ｓｃＦｖを、ゲル精製（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）し、抗ＣＤ３  ＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）またはＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）ｓｃＦｖを含有する哺乳動物発現ベクター中に別々にライゲートした。
【０２０４】
図２および図３に示されるような、ＶＦ−ＤＡＲＴの生成のために、ＤＡＲＴ発現ベクターは、それぞれ、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）またはＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）などのシステインリンカー（リンカー２）を有する第１および第２のヘテロ二量体促進ドメインをさらに含んでいた。
【０２０５】
図４に示されるような、ＥＫ−ＤＡＲＴを生成するために、ＤＡＲＴ発現ベクターは、それぞれ、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７２）などのシステインリンカー（リンカー２）およびＥ−コイルドメイン（配列番号６１）またはＫ−コイルドメイン（配列番号６２）を有する第１および第２のヘテロ二量体促進ドメインをさらに含んでいた。
【０２０６】
図１および図５に示されるような、ＬＰ−ＤＡＲＴを生成するために、ＤＡＲＴ発現ベクターは、それぞれ、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）、またはＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）などのシステインリンカー（リンカー２）および「ノブ」Ｆｃ鎖（配列番号６３）または「ホール」Ｆｃ鎖（配列番号６４）を有する第１および第２のヘテロ二量体促進ドメインをさらに含んでいた。
【０２０７】
ファージディスプレイライブラリーに由来する新規抗Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖに加えて、抗Ｐ−カドヘリン臨床ｍＡｂ  ＰＦ−０３７３２０１０（Ｚｈａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６（２１）、５１７７〜５１８８、２０１０）に由来するＶＨおよびＶＬドメインも、上記の様々なＤＡＲＴ発現ベクター中にサブクローニングして陽性対照として作用させた。
【０２０８】
次いで、ＤＡＲＴタンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞中に発現ベクターを同時トランスフェクトすることにより哺乳動物細胞中で一過的に発現させた。Ｐ−カドヘリン親和性を保持するＤＡＲＴタンパク質を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にカップリングさせた抗コイルドコイルｍＡｂ  １５Ｆ１を使用してアフィニティ精製した。精製されたＤＡＲＴタンパク質の生化学的特性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣにより評価した。
【０２０９】
表６は、本明細書に記載の技術により生成された抗Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖクローンに関するＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を提供する。クローン２０および３０のＣＤＲに、Ｋａｂａｔに従って下線を付す。配列番号９７〜１１６は、括弧内に参照される対応するヌクレオチド配列を提供する。
【０２１０】
【表６−１】
2017520575.tif 000009
【０２１１】
【表６−２】
2017520575.tif 000010
【０２１２】
表７ａおよび表７ｂは、それぞれ、ＫａｂａｔおよびＡｂＭ番号指定を使用した、生成された抗Ｐ−カドヘリンＶＨ  ｓｃＦｖクローンのＣＤＲ配列を提供する。
【０２１３】
【表７】
2017520575.tif 000011
【０２１４】
【表８】
2017520575.tif 000012
【０２１５】
表７ｃは、生成された抗Ｐ−カドヘリンＶＬ  ｓｃＦｖクローンのＣＤＲ配列を提供する。
【０２１６】
【表９】
2017520575.tif 000013
【０２１７】
表８は、親和性成熟させたＰ−カドヘリンクローン中に見出されるアミノ酸突然変異を示す。データは、解析された結晶構造に基づくＶＬ／ＶＨフォールディングおよびリガンド相互作用に対する潜在的な効果を示唆する。ＣＤＲ結合ポケット内の突然変異は、リガンド相互作用の改善のための可能性を示した。ＣＤＲ結合ポケットの外部に見出された突然変異は、ＶＬ／ＶＨフォールディングの改善のための役割を示唆していた。
【０２１８】
【表１０】
2017520575.tif 000014
【０２１９】
表９は、本明細書に記載の技術により生成された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖクローンのＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を提供する。
【０２２０】
【表１１】
2017520575.tif 000015
【０２２１】
表１０ａおよび表１０ｂは、それぞれ、ＫａｂａｔおよびＡｂＭ番号指定を使用した、生成された抗ＣＤ３  ＶＨ  ｓｃＦｖクローンのＣＤＲ配列を提供する。
【０２２２】
【表１２】
2017520575.tif 000016
【０２２３】
【表１３】
2017520575.tif 000017
【０２２４】
表１０ｃは、生成された抗ＣＤ３  ＶＬ  ｓｃＦｖクローンのＣＤＲ配列を提供する。
【０２２５】
【表１４】
2017520575.tif 000018
【０２２６】
（実施例２）
抗Ｐ−カドヘリン／抗ヒトＣＤ３  ＬＰ−ＤＡＲＴの構築
抗Ｐ−カドヘリン／抗ヒトＣＤ３  ＤＡＲＴタンパク質を、それぞれのＤＡＲＴタンパク質が哺乳動物発現ベクター中へのクローニングのためのそれぞれの末端に制限酵素クローニング部位を含有するようにＰＣＲによって増幅した。表１１ならびに図３３Ａおよび図３３Ｂを参照されたい。
【０２２７】
【表１５】
2017520575.tif 000019
【０２２８】
その後、ＤＡＲＴタンパク質配列をコードする核酸を、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号７３）、ＧＧＴＧＧＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７５）およびＧＧＴＧＧＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）のなどのシステインリンカーを有するＤＡＲＴのＣ末端にそれぞれ接続された、改変されたＦｃ構築物、例えば、「ノブ」Ｆｃ鎖（配列番号６３）および「ホール」Ｆｃ鎖（配列番号６４）をコードするそれぞれの核酸に融合させた。
【０２２９】
ＰＣＲ増幅の後、ＤＡＲＴとＦｃ鎖核酸の両方を、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（５’ＤＡＲＴクローニング部位）またはＥｃｏＲＩ（３’Ｆｃクローニング部位）で消化した。消化されたＤＮＡを、アガロースゲルからの切り出しによって単離した後、室温で３０分間、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化された発現ベクター中へのライゲーションの前に精製した。次いで、ライゲーションをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中に形質転換し、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有するアガロースプレート上、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを計数し、拾い、ＹＴブロス＋１００μｇ／ｍＬカルベニシリン中で一晩増殖させ、標準的な方法を使用してＤＮＡを単離した。次いで、全てのＤＮＡ構築物を、哺乳動物細胞発現の前に両鎖上で配列決定した。次いで、相補的構築物対を、１００万個の細胞／ｍｌのＨＥＫ２９３細胞を含有する１Ｌの対数期培養物中に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、最終濃度０．７５％となるようにトリプトンを添加し、細胞をさらに５日間増殖させた後、回収した。次いで、使用済みの培養液を収集し、遠心分離して細胞破片を除去した後、２０μｍフィルターを通過させた。次いで、当技術分野で公知の技術を利用してタンパク質精製を実施した。抗Ｐ−カドヘリン／抗ヒトＣＤ３  ＬＰ−ＤＡＲＴの図例を、図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【０２３０】
（実施例３）
Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖ−ＦｃおよびＤＡＲＴタンパク質の結合特性
Ｐ−カドヘリンタンパク質構築物およびＰ−カドヘリン発現細胞に対する、Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物（ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合したＰ−カドヘリンＶＨおよびＶＬ）およびＤＡＲＴタンパク質の結合特性を、標準的なＥＬＩＳＡ技術を使用して分析した。表１２中のデータは、ファージ由来Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物が、組換えヒトＰ−カドヘリンには強く結合するが、マウスＰ−カドヘリンには検出可能に結合しなかったことを示す。
【０２３１】
【表１６】
2017520575.tif 000020
【０２３２】
細胞に基づくＥＬＩＳＡにおける、様々なＰ−カドヘリン発現細胞型に対するＰ−カドヘリンｓｃＦｖ−Ｆｃの結合特性を、表１３に示す。ファージ由来Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物は、Ｈ１６５０細胞ならびにＳＷ４８０−ｈｕＰｃａｄおよびＣＨＯ−ｈｕＰｃａｄ細胞型への強い結合を示した。
【０２３３】
【表１７】
2017520575.tif 000021
【０２３４】
表１４に示されるように、本発明の抗Ｐ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、Ｈ１６５０細胞上の細胞表面に発現されたＰ−カドヘリンおよび組換えヒトＰ−カドヘリン−ＦｃへのＥＬＩＳＡ形式での強い結合を示したが、他のカドヘリンファミリーメンバーであるＥ−カドヘリンおよびＶＥ−カドヘリンには結合を示さなかった。ＥＫ−ＤＡＲＴは、Ｅ／Ｋコイルドメイン構築物である。ＰＦ  ＥＫ−ＤＡＲＴは、実施例１に記載される抗Ｐ−カドヘリン臨床ｍＡｂ  ＰＦ−０３７３２０１０に由来するＶＨおよびＶＬを使用する陽性対照である。表１４中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２３５】
【表１８】
2017520575.tif 000022
【０２３６】
（実施例４）
ＤＡＲＴタンパク質の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
Ｐ−カドヘリンおよびＣＤ３に対するＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００バイオセンサー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＳＰＲによって分析した。抗原ｈｕＣＤ３εδおよびヒトＰ−カドヘリン−Ｆｃまたはヒト／カニクイザル／マウスＰ−カドヘリン−ＥＣＤを、製造業者により推奨されるようにアミンカップリングキットによってＣＭ−５センサーチップ上に固定した。表１５は、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）Ｐ−カドヘリンＥＣＤに対するファージ由来ＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の結合親和性を示し、表１６は、ヒト可溶性ＣＤ３タンパク質に対するファージ由来ＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の結合親和性を示す。表１５および表１６中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質はＣＤ３−２を含む。
【０２３７】
【表１９】
2017520575.tif 000023
【０２３８】
【表２０】
2017520575.tif 000024
【０２３９】
表１７において、Ｂｉａｃｏｒｅデータは、ＣＤ３−２を含む親３５ＥＫ−ＤＡＲＴと比較した、ｃｙｎｏ  Ｐ−カドヘリンＥＣＤに対する、ＣＤ３−２を含む最適化されたＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の結合親和性を示す。表１７中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２４０】
【表２１】
2017520575.tif 000025
【０２４１】
表１８において、Ｂｉａｃｏｒｅデータは、可溶性ＣＤ３δεに対する、親３５ＥＫ−ＤＡＲＴおよび最適化されたＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の結合親和性を示す。表１８中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２４２】
【表２２】
2017520575.tif 000026
【０２４３】
様々なＤＡＲＴ形式のｐＨ７．４でのｃｙｎｏ  Ｐ−カドヘリンに対する結合親和性を、表１９に示す。Ｐ−カドヘリンクローン１５３  ＶＨおよびＶＬ結合ドメインを含むＶＦ、ＥＫ、ＬＰ、ＭＰ３−Ｃ末端およびＭＰ３−Ｎ末端形式中のＤＡＲＴタンパク質を比較した。１５３  ＶＦ−ＤＡＲＴは、最も高い結合親和性および最も速いオンレートを示した。ＫＤは、１５３  ＥＫ−ＤＡＲＴおよび１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質と類似していた。１５３  ＭＰ３−ＤＡＲＴタンパク質は、より遅いオンレートにより示されるようにｃｙｎｏ  Ｐ−カドヘリンに対するわずかにより低い結合親和性を有していた。活性％（Ｒｍａｘ）は、全ての１５３  ＤＡＲＴタンパク質について低く、類似していた。表１９中の全てのＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む１５３ＥＫ−ＤＡＲＴ以外、ＣＤ３−１を含む。
【０２４４】
【表２３】
2017520575.tif 000027
【０２４５】
様々なＤＡＲＴ形式のｐＨ７．４でのｓｈＣＤ３（可溶性ヒトＣＤ３）に対する結合親和性を、表２０に示す。Ｐ−カドヘリンクローン番号１５３  ＶＨおよびＶＬ結合ドメインを含むＶＦ、ＥＫ、ＬＰ、ＭＰ３  Ｃ末端およびＭＰ３  Ｎ末端形式中のＤＡＲＴタンパク質を比較した。１５３  ＶＦ−ＤＡＲＴは、最も速いオンレートおよび最も高いｓｈＣＤ３に対する結合親和性を示した。１５３  ＥＫ、ＬＰおよびＭＰ３  ＤＡＲＴタンパク質は、ｓｈＣＤ３に対する類似した親和性を有していた。ｓｈＣＤ３に関する活性％（Ｒｍａｘ）は、ｃｙｎｏ  Ｐ−カドヘリンについて観察されたものよりも良好であった。表２０中の全てのＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む１５３  ＥＫ−ＤＡＲＴ以外、ＣＤ３−１を含む。
【０２４６】
【表２４】
2017520575.tif 000028
【０２４７】
（実施例５）
Ｐ−カドヘリンＤＡＲＴタンパク質の特徴付け
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を使用して、ファージ由来ＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の熱安定性を特徴付けた。表２１は、Ｐ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質が６５℃より高いＴｍ１遷移を有する好ましい温度プロファイルを有していたことを示す。強制凝集分析は、４０℃でＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の温度ストレスに対する耐性を示す。表２１中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２４８】
【表２５】
2017520575.tif 000029
【０２４９】
親和性成熟させたＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質のさらなる生物物理学的特性を、表２２ａに示す。これらの分子の理論的ｐＩは、約８．５である。表２２ａ中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２５０】
【表２６】
2017520575.tif 000030
【０２５１】
表２２ｂは、親和性成熟させたＰ−カドヘリンＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質の機能的特徴付けを示す。２つの型の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイからのデータは、Ｅ−Ｋコイルを含まない二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディが細胞傷害性を保持することを示していた。リガンドに対するより高い親和性は、ＥＫ−ＤＡＲＴにおいて見られた通り、ＣＴＬにおけるより高い効力と対応していた。表２２ｂ中の全てのＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−１を含む。
【０２５２】
【表２７】
2017520575.tif 000031
【０２５３】
表２２ｃは、親和性成熟させたＰ−カドヘリンＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質の生物物理学的特徴付けデータを含む。ＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質の分析は、６５℃まで凝集の有意な増加は検出されないことを示していた。データは、ＶＦ−ＤＡＲＴ形式は、Ｔｍ１に影響することなく、低温で強制凝集プロファイルを改善させたことを示唆する。ＬＣ／ＭＳデータは、発現および精製後に適切なヘテロ二量体形成を示した。表２２ｃ中の全てのＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−１を含む。
【０２５４】
【表２８】
2017520575.tif 000032
【０２５５】
（実施例６）
Ｐ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質の特徴付け
表２３は、親クローンＰ−ＣＡＤ  ３５およびＣＤ３−２を用いて生成された８つの異なるＰ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴ構築物（番号１〜番号８）に関する様々な機能的および生物物理学的データをまとめる。
【０２５６】
例えば、ＬＰ−ＤＡＲＴ番号１の第１のポリペプチド鎖（１）は、記号表示：ＣＤ３  ＶＬｘＰ−ＣＡＤ  ３５  ＶＨ−ノブを有し、ここで、ＣＤ３  ＶＬは、配列番号４７の抗ＣＤ３−２抗体ＶＬ結合領域を指し、Ｐ−ＣＡＤ  ３５  ＶＨは、配列番号６の抗Ｐ−カドヘリン抗体クローン３５  ＶＨ結合領域を指し、「ノブ」は、配列番号６３のＦｃノブ鎖を指す。ＬＰ−ＤＡＲＴ番号１の第２のポリペプチド鎖（２）は、記号表示：Ｐ−ＣＡＤ  ３５ＶＬｘＣＤ３ＶＨ−ホールを有し、ここで、Ｐ−ＣＡＤ  ３５ＶＬは配列番号５の抗Ｐ−カドヘリン抗体クローン３５ＶＬ結合領域を指し、ＣＤ３  ＶＨは配列番号４６の抗ＣＤ３−２抗体ＶＨ結合領域を指し、「ホール」は配列番号６４のＦｃホール鎖を指す。配列ＣＰＰＣＰ（配列番号６０）および少なくとも１つのグリシン残基を有するトランケートされたＩｇＧ１ヒンジを有する様々なシステインリンカー（リンカー２）を分析した。ＬＰ−ＤＡＲＴ構築物番号１〜番号８を、親３５ＥＫ−ＤＡＲＴと比較した。
【０２５７】
データは、ＤＡＲＴ部分とＦｃドメインの間のより短いリンカー（リンカー２）はそれぞれのリガンドに対するより高い親和性およびＣＴＬアッセイにおけるより高い効力と相関することを示していた。これは、より短いリンカー（リンカー２）が、ＦｃドメインがＤＡＲＴ部分上のリガンド結合部位を妨害するのを防ぐことを示唆していた。データはまた、ＬＰ−ＤＡＲＴ番号５からＬＰ−ＤＡＲＴ番号８までにおいて示されるＣＤ３  ＶＬｘＰ−ＣＡＤ  ３５  ＶＨ−ホールおよびＰ−ＣＡＤ  ３５  ＶＬｘＣＤ３  ＶＨ−ノブの向きが、ＬＰ−ＤＡＲＴ生成にとって最適であることも示唆していた。
【０２５８】
【表２９】
2017520575.tif 000033
【０２５９】
表２４は、高親和性Ｐ−カドヘリンＶＨおよびＶＬ結合ドメインならびに高親和性抗ＣＤ３  ＶＨおよびＶＬ結合ドメインを含むいくつかのＰ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能的特徴付けを示す。データは、Ｐ−カドヘリンＶＦ−ＤＡＲＴおよびＥＫ−ＤＡＲＴ形式について観察された相関と同様、親和性の増大がＣＴＬ効力の増大と相関することを示している。表２４中の全てのＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−１を含む。３３、３４および３５の親クローンに関して、１５３ＬＰ−ＤＡＲＴはマウスＰ−カドヘリンに結合しなかった。
【０２６０】
【表３０】
2017520575.tif 000034
【０２６１】
表２５は、いくつかのＰ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質の生物物理学的特徴付けを示す。Ｐ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質のＤＳＣは、Ｐ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴおよびＶＦ−ＤＡＲＴタンパク質について得られたものと類似するＴｍ１値を示した。強制凝集分析により、Ｐ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴ形式よりも低温での改善された安定性および臨床ｍＡｂと類似する全体のプロファイルが示唆された。ＬＣ／ＭＳデータにより、発現および精製後の適切なヘテロ二量体形成が示された。表２５中の全てのＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−１を含む。
【０２６２】
【表３１】
2017520575.tif 000035
【０２６３】
表２６は、ｃｙｎｏ  Ｐ−カドヘリンＥＣＤおよび可溶性ＣＤ３δεに対する、Ｐ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴおよび１５４  ＬＰ−ＤＡＲＴの結合のＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲデータを提供する。データは、対応するＥＫ−ＤＡＲＴの親和性と比較してそれぞれのリガンドに対する親和性のわずかな減少があったことを示す。表２６中の全てのＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−１を含む。
【０２６４】
【表３２】
2017520575.tif 000036
【０２６５】
（実施例７）
Ｐ−カドヘリン発現の定量
Ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のためにルシフェラーゼを発現するように操作されたがん細胞株上でのＰ−カドヘリン発現の定量
フローサイトメトリー実験を行って、１０種のがん細胞株のパネルにわたる内因性細胞表面Ｐ−カドヘリン発現の相対レベルを決定するために抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂ（ＰＦ−０３７３２０１０）結合を評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験のために全ての腫瘍細胞株を、ルシフェラーゼを発現するように操作した。一定範囲のＰ−カドヘリン受容体発現を示す腫瘍細胞株を、飽和ＦＡＣＳ結合について記載されたように収集した。試料あたり２．５ｘ１０５個の細胞を、９６ウェル丸底ポリプロピレンプレートに移した。１：１のｍＡｂ：ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）比でコンジュゲートされた５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）標識された抗ヒトＰ−カドヘリンｍＡｂ（ＰＦ−０３７３２０１０）または対照マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされたＰＥを用いて、室温で３０分間、細胞を染色した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファー＋１０ｎｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを用いて再懸濁した後、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを含むＬＳＲＩＩを用いて取得した。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、０．５ｍＬのＦＡＣＳバッファーを使用して再構成し、腫瘍細胞試料と同じ電圧設定を用いるＬＳＲＩＩを使用して取得した。両ビーズおよび腫瘍細胞のＰＥ幾何平均蛍光強度を使用して、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔに関する製造業者に処方されたプロトコールに従って細胞あたりに結合したＰＥ標識抗体の数（ＡＢＣ）を算出した。受容体密度と細胞傷害性ＥＣ５０との間の線形回帰曲線のフィッティングを、それぞれの腫瘍細胞株に関する５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬのＰＥ標識抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂでのＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅアッセイにより決定された平均受容体密度のＬｏｇ１０値と、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを使用した同じ標的腫瘍細胞株に関する平均ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性ＥＣ５０のＬｏｇ１０値とをプロットすることにより決定した。
【０２６６】
広範囲の細胞表面Ｐ−カドヘリン発現が、パネルにわたって観察され、抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂは、表２７に示されるように、乳がん、肺がんおよび結腸直腸がんなどの様々ながん型に由来する細胞株に結合した。対照的に、対照ｍＡｂは、感知できるほどの結合を示さなかった。ＭＦＩ＝平均蛍光強度、ＡＢＣ＝細胞あたりに結合した抗体。
【０２６７】
【表３３】
2017520575.tif 000037
【０２６８】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のためのがん細胞株上でのＰ−カドヘリン発現の定量
フローサイトメトリー実験を行って、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のためのがん細胞株のパネルにわたる内因性細胞表面Ｐ−カドヘリン発現の相対レベルを決定するために抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂ（Ｐｆｉｚｅｒ  ＰＦ−０３７３２０１０）結合を評価した。一定範囲のＰ−カドヘリン受容体発現を示す腫瘍細胞株を、飽和ＦＡＣＳ結合のために記載されたように収集した。試料あたり２．５ｘ１０５個の細胞を、９６ウェル丸底ポリプロピレンプレートに移した。１：１のｍＡｂ：ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）比でコンジュゲートされた５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）標識された抗ヒトＰ−カドヘリンｍＡｂまたは対照マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされた７．５μｇ／ｍＬのＰＥを用いて、室温で３０分間、細胞を染色した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファー＋１０ｎｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを用いて再懸濁した後、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを含むＬＳＲＩＩを用いて取得した。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーを使用して再構成し、腫瘍細胞試料と同じ電圧設定を用いるＬＳＲＩＩを使用して取得した。両ビーズおよび腫瘍細胞の平均ＰＥ幾何平均蛍光強度を使用して、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔに関する製造業者に処方されたプロトコールに従って細胞あたりに結合したＰＥ標識抗体の数（ＡＢＣ）を算出した。
【０２６９】
広範囲の細胞表面Ｐ−カドヘリン発現が、結腸直腸がんおよび乳がんに由来する細胞株上で観察され、表２８に示されるように、ＨＣＴ１１６＞ＳＵＭ１４９＞ＳＷ４８０＞Ｌｓ１７４Ｔ＞ＳＷ６２０に従って順位付けた。対照的に、アイソタイプ対照ｍＡｂは、いずれの細胞型にも感知できるほどの結合を示さなかった。
【０２７０】
【表３４】
2017520575.tif 000038
【０２７１】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイ
Ａ．ＥＫ−ＤＡＲＴ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ
強力な組換えＰ−カドヘリン／ＣＤ３タンパク質結合および強力な結合シグナル（バックグラウンドまたはＥＣ５０の３倍を超える≒ＰＦ０３７３２０１０−ＤＡＲＴ）を示すＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質を、以前に記載された、Ｔ細胞により指向化された細胞殺傷アッセイ（Ｍｏｏｒｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１７（１７）：４５４２〜４５５１、２０１１）においてスクリーニングした。表２９は、本発明のＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質に関する効率的な、Ｔ細胞により指向化された細胞傷害性を示す。３０：１のＥ：Ｔ比でのヒトＰＢＭＣの存在下で、ヒトＰ−カドヘリンを過剰発現するように操作されたＣＨＯ細胞および高レベルのＰ−カドヘリンを内因的に発現するがん細胞株（Ｈ１６５０）は、ＬＤＨ放出アッセイを使用して測定された場合、２４時間のインキュベーション後にＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質によって両方とも効率的に溶解された。４０時間までのインキュベーション時間の延長は、Ｐ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴ分子を用いて再指向化されたＴ細胞による殺傷の作用機構によって予測された通り細胞殺傷の効力をさらに増加させた。対照的に、Ｐ−カドヘリン発現の欠如に基づいて予測された通り、親ＣＨＯ細胞株上で殺傷は観察されなかった。表２９中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２７２】
【表３５】
2017520575.tif 000039
【０２７３】
ヒトＰ−カドヘリンおよび構成的に発現されるルシフェラーゼリポーター構築物を発現する腫瘍細胞に対する最適化されたＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質の、Ｔ細胞により指向化された細胞傷害性を、表３０に示す。表３０中の全てのＥＫ−ＤＡＲＴタンパク質は、ＣＤ３−２を含む。
【０２７４】
【表３６】
2017520575.tif 000040
【０２７５】
Ｂ．ＬＰ−ＤＡＲＴ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ
１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの媒介性細胞殺傷を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイによって評価した。エフェクター（Ｔ細胞）の標的（ＣＨＯ細胞）に対する比が１０：１であるＣＨＯ親細胞およびＣＨＯ  Ｐ−カドヘリン細胞を、増大する濃度の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの存在下でＣＤ３＋  Ｔ細胞と共にインキュベートした。細胞生存能力を４８時間後に測定し、半数効果濃度（ＥＣ５０）を算出したところ、０．４１ｐＭであった。その結果、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴはＣＨＯ  Ｐ−カドヘリン細胞上では強力な殺傷を示すが、ＣＨＯ親細胞上では陰性対照を超える活性は検出されないことが示された。したがって、ＣＴＬ活性は、Ｐ−カドヘリン発現に依存していた。
【０２７６】
１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの媒介性細胞殺傷を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイによって評価した。ヒトＰ−カドヘリンおよび構成的に発現されるルシフェラーゼリポーター構築物を発現する腫瘍細胞に対する最適化された１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴタンパク質の、Ｔ細胞により指向化された細胞傷害性を分析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、増大する濃度の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの存在下で、エフェクター（Ｔ細胞）の標的（がん細胞）に対する比が３：１であるがん細胞株のパネルと共にインキュベートした。細胞生存能力を７２時間後に測定し、表３１に示されるように、それぞれのがん細胞株に関する半数効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。データは、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴががんモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を媒介することを示す。ＥＣ５０＝半数効果濃度、Ｓ．Ｄ．＝標準偏差、ｐＭ＝ピコモル濃度、ＮＡ＝活性なし。
【０２７７】
【表３７】
2017520575.tif 000041
【０２７８】
Ｃ．ＣＴＬ活性と、細胞表面Ｐ−カドヘリン発現レベルとの比較
一定範囲のＰ−カドヘリン受容体発現を示すセクションＡからの腫瘍細胞株を収集し、試料あたり２．５ｘ１０５個の細胞を、９６ウェル丸底ポリプロピレンプレートに移した。１：１のｍＡｂ：ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）比でコンジュゲートされた５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）標識された抗ヒトＰ−カドヘリンｍＡｂ（Ｐｆｉｚｅｒ  ＰＦ−０３７３２０１０）または対照マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされたＰＥを用いて、室温で３０分間、細胞を染色した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファー＋１０ｎｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを用いて再懸濁した後、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを含むＬＳＲＩＩを用いて取得した。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、０．５ｍＬのＦＡＣＳバッファーを使用して再構成し、腫瘍細胞試料と同じ電圧設定を用いるＬＳＲＩＩを使用して取得した。両ビーズおよび腫瘍細胞のＰＥ幾何平均蛍光強度を使用して、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔに関する製造業者に処方されたプロトコールに従って細胞あたりに結合したＰＥ標識抗体の数（ＡＢＣ）を算出した。
【０２７９】
受容体密度と細胞傷害性ＥＣ５０との間の線形回帰曲線のフィッティングを、それぞれの腫瘍細胞株に関する５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬのＰＥ標識抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂでのＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅアッセイにより決定された平均受容体密度のＬｏｇ１０値と、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを使用した同じ標的腫瘍細胞株に関する平均ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性ＥＣ５０のＬｏｇ１０値とをプロットすることにより決定した。図８に示されるように、より低いＥＣ５０と、細胞表面への抗Ｐ−カドヘリンｍＡｂの結合の増加との間に有意な関係があった。Ｐ値＝０．０１２７。これは、ＣＴＬ活性がＰ−カドヘリン発現レベルと相関していたことを示す。
【０２８０】
（実施例９）
ヒトＰＢＭＣ再構成異種移植試験
強力な、Ｔ細胞により指向化された細胞傷害性（１０ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０）を示す様々なＤＡＲＴタンパク質を、以下に記載されるような異種移植再構成実験においてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【０２８１】
Ａ．ヒト全血からのＰＢＭＣおよびＴ細胞の単離
健康なヒトドナーに由来するＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用することによって全血から単離した。簡単に述べると、全血を、滅菌ＰＢＳで１：１に希釈した。３５ｍＬの希釈された血液を、５０ｍＬチューブ中の１５ｍＬのＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（商標）Ｐｌｕｓ上に載せ、チューブを１４００ｒｐｍで２０分間、ブレーキをオフにして遠心分離した。２つの相の間の淡黄色の被覆層を、５０ｍＬチューブ中に収集し、６００ｘｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間、チューブを遠心分離することによって、４５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ色素排除法により生細胞数を決定した。ＰＢＭＣを、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００μ／１００μ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））中、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。
【０２８２】
Ｂ．Ｔ細胞の単離および活性化
ヒトＴ細胞を、ＲｏｓｅｔｔａＳｅｐ  Ｔ細胞単離キット中に提供される製造業者のプロトコールに従ってヘパリン処理された全血から単離した。次いで、精製されたＴ細胞を、細胞を抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３；１μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（６６μｇ／ｍＬ）抗体に４８時間曝露することによって活性化した。刺激後、細胞を、ＩＬ−２（７．６ｎｇ／ｍＬ）の存在下で最大３週間、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。
【０２８３】
Ｃ．腫瘍モデル
ヒトＴ細胞と腫瘍細胞（ＨＣＴ１１６、Ｄｕ１４５またはＨ１６５０）を１：５の比（それぞれ、１ｘ１０６個および５ｘ１０６個）で混合し、２００μＬの滅菌生理食塩水中に懸濁し、試験０日目（ＳＤ０）に皮下注射した。様々なＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−２）、ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）または対照ＤＡＲＴ（ＣＤ３−２）タンパク質を、対照と共に、ＳＤ０、１、２、および３に、１００μＬの尾静脈注射により静脈内（ＩＶ）投与した。それぞれの処置群は８匹の動物を含有していた。
【０２８４】
ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １７７  ＥＫ−ＤＡＲＴ：Ｐ−ＣＡＤ  １７７  ＥＫ−ＤＡＲＴを、４つの処置群に０．５、０．２、０．１または０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、ビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた、または＋Ｔ細胞）を、１つの処置群（０ｍｇ／ｋｇ）に投与した。
【０２８５】
ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １５３  ＥＫ−ＤＡＲＴ：Ｐ−ＣＡＤ  １５３  ＥＫ−ＤＡＲＴを、４つの処置群に０．５、０．２、０．１または０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、ビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた、または＋Ｔ細胞）を、１つの処置群（０ｍｇ／ｋｇ）に投与した。
【０２８６】
ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １５４  ＥＫ−ＤＡＲＴ：Ｐ−ＣＡＤ  １５４  ＥＫ−ＤＡＲＴを、４つの処置群に０．５、０．２、０．１または０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、ビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた、または＋Ｔ細胞）を、１つの処置群（０ｍｇ／ｋｇ）に投与した。
【０２８７】
ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  ３５  ＥＫ−ＤＡＲＴ：Ｐ−ＣＡＤ  ３５  ＥＫ−ＤＡＲＴを、４つの処置群に０．５、０．２、０．１または０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、ビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた、または＋Ｔ細胞）を、１つの処置群（０ｍｇ／ｋｇ）に投与した。
【０２８８】
ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ：処置群に、０．５、０．２、０．１もしくは０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ、またはビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた、または＋Ｔ細胞）を投与した。
【０２８９】
ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ：処置群に、１００、１０、１、０．１、もしくは０．０１μｇ／ｋｇの用量のＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ、またはビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた）、ビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞のみを埋め込まれた、または＋Ｔ細胞）または４４２０−ｈＸＲ３２  ＬＰ−ＤＡＲＴ（１００μｇ／ｋｇ）対照を投与した。
【０２９０】
Ｄｕ１４５腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ：処置群に、１００、１０、１、０．１、もしくは０．０１μｇ／ｋｇの用量のＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ、またはビヒクル対照（Ｄｕ１４５細胞のみを埋め込まれた）、ビヒクル対照（ＨＣＴ１１６細胞を埋め込まれた＋Ｔ細胞）または４４２０−ｈＸＲ３２  ＬＰ−ＤＡＲＴ（１００μｇ／ｋｇ）対照を投与した。
【０２９１】
Ｈ１６５０腫瘍モデルにおけるＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ：処置群に、１００、１０、１、０．１、もしくは０．０１μｇ／ｋｇの用量のＰ−ＣＡＤ  １５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ、またはビヒクル対照（Ｈ１６５０細胞のみを埋め込まれた）、ビヒクル対照（Ｈ１６５０細胞のみを埋め込まれた＋Ｔ細胞）または４４２０−ｈＸＲ３２  ＬＰ−ＤＡＲＴ（１００μｇ／ｋｇ）対照を投与した。
【０２９２】
Ｃ．データ収集および統計分析
動物の体重：腫瘍細胞注射の時点で開始して試験完了まで週に２回、個々の動物の体重を記録した。
【０２９３】
瀕死／死亡：一般的な瀕死について週に２回および死亡について毎日、動物を観察した。総括的観察および体重減少を含む因子に基づいて薬物関連または技術的なものとして動物の死を評価した。動物の死を、毎日記録した。
【０２９４】
腫瘍体積：腫瘍埋込みの１週間以内に開始し、試験完了まで継続して週に２回、個々の腫瘍体積を記録した。
【０２９５】
【数１】
2017520575.tif 000042
技術的な死または薬物関連死を経験する動物は、データ算出から除外（ｃｅｎｓｏｒ）した。
【０２９６】
腫瘍増殖阻害：腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）値を、式：
【０２９７】
【数２】
2017520575.tif 000043
を使用して、処置された動物を含有する各群について算出した。部分もしくは完全応答を経験する動物、または技術的な死もしくは薬物関連死を経験する動物は、ＴＧＩの算出から除外した。化合物活性に関するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの基準は、ＴＧＩ＞５８％である（Ｃｏｒｂｅｔｔら（２００４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ；Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ；Ｈｕｍａｎａ  ９９〜１２３）。
【０２９８】
部分／完全腫瘍応答：１日目に１ｍｍ３未満の寸法の腫瘍を有する個々のマウスを、部分応答（ＰＲ）を有すると分類し、腫瘍退縮率（％ＴＲ）値を、式：
【０２９９】
【数３】
2017520575.tif 000044
を使用して決定した。触診可能な腫瘍がない個々のマウスを、完全応答（ＣＲ）を受けていると分類した。
【０３００】
腫瘍体積統計値：統計分析を、腫瘍体積を比較する処置群と対照群との間で実行した。これらの分析のために、二元配置分散分析、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を用いた。全ての分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア（バージョン５．０２）を使用して実施した。技術的な死または薬物関連死を経験する個々の動物からの体重および腫瘍データは、分析から除外した。しかしながら、部分応答または完全応答を報告する動物からの腫瘍データを、これらの算出に含有させた。
【０３０１】
Ｄ．ＨＣＴ１１６腫瘍モデルの結果
ＨＣＴ１１６細胞株を、活性化Ｔ細胞と予め混合し、上記で詳述されたように試験０日目（ＳＤ０）にＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマノックアウトマウス（Ｎ＝８匹／群）中に皮下（ＳＣ）的に埋め込んだ。様々なＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴ、ＬＰ−ＤＡＲＴまたは対照ＤＡＲＴタンパク質を用いる処置を、腫瘍細胞／Ｔ細胞混合物を埋め込んだのと同じ日［（ＳＤ０）］に開始した後、合計４回の毎日の注射のためにさらに３日間、毎日の注射を行った。動物を、４つの用量レベル（０．５、０．２、０．１、および０．０５ｍｇ／ｋｇ）でＰ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴ、ＬＰ−ＤＡＲＴまたは対照ＤＡＲＴタンパク質で処置した。結果を、図９〜図１４に示す。
【０３０２】
ビヒクル処置群（ＨＣＴ１１６細胞のみ、または＋Ｔ細胞）のＨＣＴ１１６腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏで相対的に侵攻性の増殖プロファイルを示した。試験２０日目（ＳＤ２０）に、ビヒクル処置群の腫瘍の平均体積は約１２５ｍｍ３であり、試験３５日目（ＳＤ３５）までに、腫瘍は約４５０ｍｍ３の平均体積に到達した。試験４５日目（ＳＤ４５）の実験の終わりまでに、腫瘍は約７５０ｍｍ３の平均体積に到達した。ＨＣＴ１１６腫瘍の増殖は、試験したＰ−カドヘリンＤＡＲＴタンパク質の多くについて全ての用量レベルで有意に阻害された。ＳＤ４５の実験の終わりまでに、腫瘍の平均体積は、約５００〜１００ｍｍ３の範囲であった１７７  ＥＫ−ＤＡＲＴを除いて、全ての処置について約１００〜０ｍｍ３の範囲であった。
【０３０３】
Ｅ．Ｄｕ１４５の結果
Ｄｕ１４５細胞株を活性化Ｔ細胞と予め混合し、上記で詳述されたようにＳＤ０にＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマノックアウトマウス（Ｎ＝８匹／群）にＳＣ的に埋め込んだ。１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴによる処置を、腫瘍細胞／Ｔ細胞混合物を埋め込んだのと同じ日［（ＳＤ０）］に開始した後、合計４回の毎日の注射のためにさらに３日間、毎日の注射を行った。動物を、５つの用量レベル（１００、１０、１、０．１、および０．０１μｇ／ｋｇ）の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで処置した。結果を図１５に示す。
【０３０４】
ビヒクル処置群（Ｄｕ１４５細胞のみ、または＋Ｔ細胞）のＤｕ１４５腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏで相対的に侵攻性の増殖プロファイルを示した。Ｄｕ１４５腫瘍の増殖は、１００、１０および１μｇ／ｋｇの用量レベルの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで有意に阻害され、実験の終わり（ＳＤ７４）までに、腫瘍の平均体積は０ｍｍ３であった。０．１μｇ／ｋｇの用量レベルの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで、Ｄｕ１４５腫瘍の増殖は有意に阻害され、実験の終わり（ＳＤ７４）までに、腫瘍の平均体積は約５００ｍｍ３であった。
【０３０５】
Ｆ．Ｈ１６５０の結果
Ｈ１６５０細胞株を活性化Ｔ細胞と予め混合し、上記で詳述されたようにＳＤ０にＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマノックアウトマウス（Ｎ＝８匹／群）にＳＣ的に埋め込んだ。１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴによる処置を、腫瘍細胞／Ｔ細胞混合物を埋め込んだのと同じ日［（ＳＤ０）］に開始した後、合計４回の毎日の注射のためにさらに３日間、毎日の注射を行った。動物を、５つの用量レベル（１００、１０、１、０．１、および０．０１μｇ／ｋｇ）の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで処置した。結果を図１６に示す。
【０３０６】
ビヒクル処置群（Ｈ１６５０細胞のみ、または＋Ｔ細胞）のＨ１６５０腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏで相対的に侵攻性の増殖プロファイルを示した。Ｈ１６５０腫瘍の増殖は、１００、１０および１μｇ／ｋｇの用量レベルの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで有意に阻害され、実験の終わり（ＳＤ４９）までに、腫瘍の平均体積は５０ｍｍ３であった。０．１μｇ／ｋｇの用量レベルの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで、Ｈ１６５０腫瘍の増殖は有意に阻害され、実験の終わり（ＳＤ４９）までに、腫瘍の平均体積は約４００ｍｍ３であった。
【０３０７】
様々なＥＫ−ＤＡＲＴ、ＬＰ−ＤＡＲＴおよび対照ＤＡＲＴタンパク質が、投与を埋込みの日に開始し、連続３日以上にわたって継続した場合、Ｗｉｎｎモデルの文脈においてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳＣ的に埋め込まれたＨＣＴ１１６、Ｄｕ１４５およびＨ１６５０腫瘍の増殖を効率的に阻害した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって確立された基準に基づけば、０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベル（ＴＧＩ＞５８）の様々なＤＡＲＴタンパク質が３つのモデルにおいて活性であると考えられる。
【０３０８】
（実施例１０）
確立された腫瘍ヒトＰＢＭＣ生着モデル
定量的フローサイトメトリー分析に基づいてＰ−カドヘリン高（ＨＣＴ１１６）、中（ＳＷ４８０）、低（Ｌｓ１７４Ｔ）および陰性（ＳＷ６２０）発現と分類されるヒト結腸直腸がんの４つの別々の異種移植腫瘍モデルを確立した。ＨＣＴ１１６は、最も高い相対レベルの細胞表面Ｐ−カドヘリン発現（４３，８０１ＡＢＣ、表２８）を示し、ＳＷ４８０は相対的に中レベルの細胞表面Ｐ−カドヘリン発現（１２，６６５ＡＢＣ、表２８）を示し、Ｌｓ１７４Ｔは相対的に低レベルの細胞表面Ｐ−カドヘリン発現（４，１６０ＡＢＣ、表２８）を示す。
【０３０９】
ＮＯＤスキッドガンマ（ＮＳＧ）動物の右側面に、０日目に５ｘ１０６個のＨＣＴ１１６、５ｘ１０６個のＳＷ４８０、２ｘ１０６個のＬｓ１７４Ｔまたは５ｘ１０６個のＳＷ６２０腫瘍細胞を皮下的に埋め込んだ。予測される腫瘍増殖に基づく無作為化の７日前（５日目）に、ＰＢＳ中の０．２ｍＬの細胞懸濁液の腹腔内注射によって、５ｘ１０６個の新鮮に単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を動物に接種した。ＰＢＭＣ埋込みの１週間後（１２日目）、腫瘍体積を全ての試験動物について測定し、フローサイトメトリーのために血液試料を収集した。それぞれの試料に由来する赤血球を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｌｙｓｅ溶液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で溶解し、得られた細胞ペレットをヒトＣＤ３、ヒトＣＤ４、およびヒトＣＤ８について染色し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを含むＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＬＳＲＩＩを使用するフローサイトメトリーにより分析した。前方散乱対側方散乱ゲーティングにより決定される全リンパ球のパーセントとしてのヒトＣＤ３＋細胞を、それぞれの動物について確立した。腫瘍測定物を、デジタルＶｅｒｎｉｅｒカリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ａｕｒｏｒａ、ＩＬ）を使用して収集し、改変楕円体計算式１／２（幅２ｘ長さ）の使用により体積を算出した。
【０３１０】
２パラメータ無作為化を使用して、腫瘍体積とヒトＣＤ３＋細胞生着値との間の均等加重を提供するｎ＝１０匹の動物／群の処置群を確立した。それぞれの動物の尾静脈側面に、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）、０．５ｍｇ／ｋｇの陰性対照二重特異的（ＦＩＴＣおよびＣＤ３イプシロンに対するヘテロ二量体ダイアボディＦｃ融合タンパク質）またはビヒクルとしてのＤＰＢＳを静脈内投与した。隔週の腫瘍測定を収集して、移植片対宿主疾患の兆候（例えば、体重減少、脱毛、猫背の姿勢）に関する連続的モニタリングと共に、腫瘍増殖阻害対対照を評価した。
【０３１１】
時間に対してプロットされた腫瘍体積（ｍｍ３）を示す腫瘍増殖プロットを図１７Ａ〜１７Ｄに示し、対応するデータ表を以下の表３２〜３５に示す。データは、毎週の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ投与がＨＣＴ１１６（高）、ＳＷ４８０（中）腫瘍モデルについては最も高い用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍退縮をもたらし、Ｌｓ１７４Ｔ（低）腫瘍モデルについては最も高い用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）で中程度の効能をもたらしたことを示す。陰性対照二重特異的の投与は、ビヒクル処置されたマウスと比較して腫瘍阻害の増加を示さなかった。ＨＣＴ１１６腫瘍モデルにおいて、図１７Ａは、０．０５および０．５ｍｇ／ｋｇ用量の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴで、それぞれ、６１．９％および１０５．１％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示す。図１７Ａ〜１７Ｄは、確立された異種移植腫瘍の腫瘍増殖阻害がＰ−カドヘリンレベル発現に依存していたことをさらに示す。
【０３１２】
【表３８】
2017520575.tif 000045
【０３１３】
【表３９】
2017520575.tif 000046
【０３１４】
【表４０】
2017520575.tif 000047
【０３１５】
【表４１】
2017520575.tif 000048
【０３１６】
図１７Ｅは、ビヒクル対照群とのＤｕｎｎｅｔ多重比較検定を用いるＨＣＴ１１６腫瘍モデルの埋込み後２５日目に収集された腫瘍体積（ｍｍ３）の一元配置ＡＮＯＶＡ分析を示す。データは、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴを用いる０．０５ｍｇ／ｋｇと０．５ｍｇ／ｋｇ用量群の両方において有意な腫瘍増殖阻害（＊ｐ＜０．０５）を示す。
【０３１７】
Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ処置されたＨＣＴ１１６腫瘍があるＮＳＧ動物の薬物動態分析の結果を、表３６に示す。動物に０．０５または０．５ｍｇ／ｋｇの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの単回ＩＶ用量を投与し、血清および腫瘍を収集するための投与後の示された時点でｎ＝３群において安楽死させた。ＬＰ−ＤＡＲＴのアッセイを、標準曲線に対するサンドイッチＥＬＩＳＡによって実施した。１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴは、長い血清および腫瘍半減期を示した。
【０３１８】
【表４２】
2017520575.tif 000049
【０３１９】
（実施例１１）
確立された腫瘍ヒトＴ細胞養子移入モデル
ＨＣＴ１１６（結腸）およびＳＵＭ１４９（乳）のヒトＴ細胞の養子移入を用いる腫瘍増殖阻害を分析した。ＨＣＴ１１６は、最も高い相対レベルの細胞表面Ｐ−カドヘリン発現（４３，８０１ＡＢＣ、表２８）を示し、ＳＵＭ１４９は相対的に中レベルの細胞表面Ｐ−カドヘリン発現（１５，４２６ＡＢＣ、表２８）を示す。Ｔ細胞を、２Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ−１、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、および２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａを用いて０．５ｘ１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１ｘ１０６個のビーズ／ｍｌ（２個のビーズ／細胞）でＴ細胞に添加し、製造業者のプロトコールに従って細胞を１週間培養した。回収の時点で、ビーズを磁石で除去し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの接種のために１ｘ１０７細胞／ｍｌでＤＰＢＳ中に細胞を再懸濁した。
【０３２０】
異種移植試験のために、ＮＳＧマウスに、０．２ｍＬの総注射容量で、５ｘ１０６個のＨＣＴ１１６細胞を脇腹に、または５ｘ１０６個のＳＵＭ１４９細胞を乳房脂肪体に接種した。ＨＣＴ１１６細胞をＤＰＢＳ中に懸濁したが、ＳＵＭ１４９細胞を増殖培地中に懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）と１：１で混合した。
【０３２１】
腫瘍測定物を、デジタルＶｅｒｎｉｅｒカリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ａｕｒｏｒａ、ＩＬ）を使用して収集し、改変楕円体計算式１／２（幅２ｘ長さ）の使用により体積を算出した。マウスを無作為化し、一度、腫瘍が増殖期に達したら、初期用量を投与し、２ｘ１０６個の培養されたＴ細胞／マウスを次の日に接種した。マウスに、０．２ｍＬのボーラス注射で毎週、最大５回投与し、全ての化合物およびＴ細胞の投与は、それぞれの動物の尾静脈側面を介する静脈内であった。移植片対宿主疾患の兆候（例えば、体重減少、脱毛、猫背の姿勢）に関する連続モニタリングと共に、隔週の腫瘍測定物を収集した。
【０３２２】
ＨＣＴ１１６（結腸）のヒトＴ細胞の養子移入を用いる腫瘍増殖阻害を表１８Ａ（表３７）に示し、ＳＵＭ１４９（乳）を図１８Ｂ（表３８）に示す。１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）の毎週の投与は、最も高い用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍退縮を伴う用量応答をもたらし、より低い用量（０．０５ｍｇ／ｋｇ）で最終的な再発を伴う腫瘍静止状態をもたらした。陰性対照ＬＰ−ＤＡＲＴの投与は、ビヒクル処置されたマウスと比較して腫瘍阻害の増加を示さなかった。実施例１０の上記の生着Ｔ細胞モデルと比較して、養子Ｔ細胞移入モデルは、マウスがＧＶＨＤに屈服する前に１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ投与の延長を可能にする（それぞれ、２週および６週以上）。
【０３２３】
【表４３】
2017520575.tif 000050
【０３２４】
【表４４】
2017520575.tif 000051
【０３２５】
（実施例１２）
Ｐ−カドヘリン陽性患者由来異種移植（ＰＤＸ）
Ｐ−カドヘリン陽性ＰＤＸのｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖阻害を分析した。Ｐ−カドヘリン陽性患者由来結腸直腸腫瘍異種移植片、ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２６０を、抗Ｐ−カドヘリン抗体を用いるＦＦＰＥ腫瘍試料の陽性染色によって同定した。ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２６０腫瘍組織をＮＳＧ動物に埋め込み、大まかに１００ｍｍ３まで増殖させた。動物をｎ＝７の用量群に無作為化し、ビヒクル、０．０５ｍｇ／ｋｇの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）、または０．５ｍｇ／ｋｇの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）を毎週投与した。初回投与の１日後、全ての動物に２ｘ１０６個のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加させたヒトＴ細胞を投与した。
【０３２６】
ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２６０の腫瘍増殖阻害を、図１９Ａ（表３９）に示す。０．０５ｍｇ／ｋｇの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ用量群は７匹の動物のうちの３匹が完全応答を示し、０．５ｍｇ／ｋｇの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ用量群は７匹の動物のうちの７匹が完全応答を示した。データは、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴがＰ−カドヘリン陽性結腸腫瘍ＰＤＸの強力な腫瘍増殖阻害を示すことを示している。
【０３２７】
【表４５】
2017520575.tif 000052
【０３２８】
（実施例１３）
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の用量依存的蓄積
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が生着し、変化するレベルの１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）（ｎ＝３）を投与したＨＣＴ１１６腫瘍があるマウスを、投与の６日後に安楽死させて、腫瘍浸潤ヒトＣＤ３＋リンパ球を評価した。腫瘍試料を、ヒト腫瘍細胞解離バッファーを含有するｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に収集し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する柔らかいヒト腫瘍のための製造業者に提言されたプロトコールを使用して単一細胞懸濁にかけた。次いで、細胞懸濁液を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＤＰＢＳを用いて洗浄し、生細胞数をトリパンブルー色素排除および血球計により決定した。各試料から１ｘ１０６個の生細胞を、２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に収集し、氷上で３０ｍｉｎ、ＣＤ３  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。洗浄後、ヨウ化プロピジウムを、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを含むＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用する分析の直前に各試料に添加した。
【０３２９】
データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）により分析し、総生細胞事象のＣＤ３＋細胞のパーセントを、グループ化されたプロットにおいてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを使用して、未処置対照試料に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。図２０および表４０に示される結果は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の用量依存的増加を示す。さらに、腫瘍組織のヒトＣＤ３の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色（示さず）は、Ｐ−カドヘリン陽性腫瘍およびヒトＴ細胞を有する動物の１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ処置がＣＤ３＋リンパ球の腫瘍内蓄積をもたらすことを示した。
【０３３０】
【表４６】
2017520575.tif 000053
【０３３１】
（実施例１４）
ＦＭＴ画像化を使用するＰ−カドヘリンＬＰ−ＤＡＲＴの生体分布および腫瘍標的化
皮下ＨＣＴ１１６異種移植が確立されたＮＳＧまたは無胸腺ヌードマウスを使用した。Ｔ細胞の生着を含む試験は、健康なヒトボランティアから単離されたＴ細胞を受けた。腫瘍が３００〜５００ｍｍ３に達した時、生体分布試験を開始した。Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＣＤ３−１）または陰性対照−ＤＡＲＴ（非標的化ドメインｘＣＤ３結合ドメイン）を、１〜２．７５のフルオロフォアの二重特異的標識に対する比で、近赤外フルオロフォアＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬ（ＶＴ６８０）とコンジュゲートさせ、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ−ＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬおよび対照−ＬＰ−ＤＡＲＴ−ＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬを得た。
【０３３２】
標識化効率を、分光光度計により決定した。輸送試験において使用されるＴ細胞を、ＣｅｌｌＶｕｅ８１５（ＣＶ８１５）で標識した。細胞表面Ｐ−カドヘリン発現およびＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ結合を、フローサイトメトリーにより決定した。Ｔ細胞活性を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイを用いて測定した。ＦＭＴ画像化を、標識された二重特異的の注射後、縦方向に実施した。データを、ＴｒｕｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して分析した。血漿および組織を、ＥＬＩＳＡによるＰＫ分析のために様々な時点で収集した。
【０３３３】
Ａ．標識された生物分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付け
ＶＴ６８０標識化が分子特性に影響したかどうかを決定するために、品質対照試験を実施した：ＦＡＣＳ分析および分子活性のための細胞傷害アッセイによる細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合。この特性をＶＴ６８０標識された、および標識されていない対照ＬＰ−ＤＡＲＴおよびＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴについて比較した。ＣＶ８１５で標識されたＴ細胞について、Ｔ細胞増加およびまたエフェクター細胞に対する細胞傷害性を評価した。表４１は、生体分布試験のために使用された分子を示す。ＤＯＬ＝標識化の程度。
【０３３４】
【表４７】
2017520575.tif 000054
【０３３５】
結合能力を評価するための直接可溶性Ｐ−カドヘリンＥＬＩＳＡ：図２１Ａは、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴに対するＶＴ６８０標識化がＰ−カドヘリン結合に対して最小の効果を有していたことを示す。最小の減少はＤＯＬ依存的であった。対照−ＬＰ−ＤＡＲＴ（標識された、または標識されていない）はＰ−カドヘリンに結合しなかった。
【０３３６】
結合能力を評価するための直接可溶性ＣＤ３  ＥＬＩＳＡ：図２１Ｂは、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴに対するＶＴ６８０標識化がＣＤ３イプシロン／デルタタンパク質への結合を有意に減少させたことを示す。結合の減少はＤＯＬ依存的であった。対照ＬＰ−ＤＡＲＴは、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴよりも低い結合を有していた。ＶＴ６８０標識化は、ＣＤ３イプシロン／デルタへの結合を有意に減少させた。
【０３３７】
ルシフェラーゼを発現するＨＣＴ１１６細胞を、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの滴定に対して１０：１のエフェクター：標的比で２４時間のアッセイにおいて精製されたヒトＴリンパ球「エフェクター」細胞と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性のための「標的」細胞として利用した。図２１Ｃに示される細胞傷害性プロットは、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴを２．０ＤＯＬにてＶＴ６８０で標識した場合、細胞傷害性が低下したことを例示する。
【０３３８】
細胞標識化色素による標識化後の細胞生存能力およびＴ細胞の増加の比較：ドナーから単離されたヒトＴ細胞を、蛍光細胞追跡色素−ＶｉｖｏＴｒａｃｋ６８０およびＣｅｌｌＶｕｅ８１５（ＣＶ８１５）で標識した。図２１Ｄは、ＶｉｖｏＴｒａｃｋ６８０もＣＶ８１５も、Ｔ細胞の細胞生存能力または増加に影響しなかったことを示す。
【０３３９】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＭＴ画像化およびＰＫ分析データ
ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおけるＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの生体分布および標的化を、縦方向のＦＭＴ画像化を使用して分析した。５０％マトリゲル中の１００万個のＨＣＴ１１６細胞を、メスのｎｕ／ｎｕマウス（８週齢）のＳＱ脇腹に注射した。腫瘍を、約３００〜５００ｍｍ３のサイズまで増殖させた。動物に、１ｎモルのＶＴ６８０に等しいプローブ（ＶＴ６８０で標識された生物分子）を注射した（表４１）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＭＴ画像化（全身）を、注射後５ｍｉｎ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈおよび２４０ｈで縦方向に実施した。血液（血漿）試料を、それぞれの時点で収集した。断続的な時点および試験の終わりに、動物を安楽死させ、ＰＢＳ／生理食塩水をかん流させて、血管区画から血液を除去した。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺および脳）をｅｘ  ｖｉｖｏで画像化した。ＦＭＴデータを、ＴｒｕｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して分析した。ｅｘ  ｖｉｖｏでの画像化の後、将来のＰＫ分析のために組織を簡易凍結した。血漿および組織試料のＰＫ分析を、ＥＬＩＳＡにより実施した。Ｔ細胞の生着を、生体分布試験においては実施しなかった。
【０３４０】
ＦＭＴ画像化は、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴがＨＣＴ１１６腫瘍を特異的に標的化することを示した。非侵襲的ｉｎ  ｖｉｖｏＦＭＴ画像化は、対照ＬＰ−ＤＡＲＴと比較して高レベルのＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ蓄積を示した（画像は示さない）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの動態から、腫瘍中のピーク蓄積は、図２２Ａに示されるように、注射の約９６時間後であることが示された。様々な組織、腫瘍および血管区画からの蓄積および消失の複合を示す全身分布および消失データは、図２２Ｂに示されるように、Ｐ−カドヘリン１５３ＬＰ−ＤＡＲＴと対照−ＬＰ−ＤＡＲＴとの間で全体的な有意差を示さなかった。
【０３４１】
図２２Ｃおよび図２２Ｄに示されるように、４８、９６および２４０時間での腫瘍および選択された組織のｅｘ  ｖｉｖｏでの分析により、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴが組織中に浸透することが示された。腫瘍は、全ての時点で対照−ＬＰ−ＤＡＲＴと比較してＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの２０〜３０倍高い蓄積を示した。注射の２４０時間後で、依然として測定可能なＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴが腫瘍中で検出された。様々な臓器（肝臓（図２２Ｄ）、腎臓、脾臓、肺および脳（データは示さない））における蓄積のｅｘ  ｖｉｖｏでの比較は、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴまたは陰性対照ＤＡＲＴの間で差異を示さなかった。
【０３４２】
ＦＭＴデータと薬物動態学的方法との比較を行って、ＦＭＴ画像化のプロファイルを確認した。ＦＭＴ試験からの試料を、日常的な薬物動態学的方法であるＥＬＩＳＡによって評価した。腫瘍および肝臓からのＰＫデータは、上記のＦＭＴ画像化データと類似する傾向を示した。図２３Ａに示されるように、血漿プロファイルは、対照−ＬＰ−ＤＡＲＴと比較してＰ−Ｃａｄ−ＬＰ−ＤＡＲＴの約２〜３倍長い血漿曝露を示した。図２３Ｂに示されるように、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍試料の評価は、Ｐ−Ｃａｄ−ＬＰ−ＤＡＲＴの蓄積の約７倍の増加を示した。図２３Ｃに示されるように、ｅｘ  ｖｉｖｏでの肝臓試料の評価は、４８時間で蓄積の増加を示したが、９６時間と２４０時間とでは有意差はなかった。
【０３４３】
Ｃ．生着したＴ細胞の細胞追跡
ＦＭＴ画像化を使用するＨＣＴ１１６モデルにおける生着したＴ細胞の細胞追跡を行った。５０％マトリゲル中の１００万個のＨＣＴ１１６細胞を、メスのＮＳＧマウス（８週齢）のＳＱ脇腹に注射した。腫瘍が約３００〜５００ｍｍ３のサイズであった時、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ（ＶＴ６８０で標識された、または標識されていない）を、ＳＱ経路により注射した。薬物を注射した２４時間後、ＣＶ８１５で標識された５００万個のＴ細胞をＩＶ経路により注射した。細胞生着後、ＦＭＴ画像化を縦方向に実施した。Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ−ＶＴ６８０およびＴ細胞−ＣＶ８１５群について６８０ｎｍおよび８００ｎｍレーザーを使用して連続画像化を実施した。
【０３４４】
ＣｅｌｌＶｕｅ標識されたＴ細胞を用いる細胞輸送試験は、腫瘍中でのＴ細胞とＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの同時局在化を示した。図２４Ａに示されるように、ＣＶ８１５で標識された、および標識されていないＴ細胞のＴ細胞活性の評価は、フルオロフォアによるＴ細胞の標識化がＴ細胞の細胞傷害能力に対する影響を有さなかった（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）ことを示している。図２４Ｂに示されるように、ＦＭＴ画像化による腫瘍中でのフルオロフォア標識されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの輸送の動態は、Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ注射群において細胞生着後７日目でＴ細胞輸送および蓄積の有意な増加を示す。
【０３４５】
ＦＭＴ画像（示さず）は、細胞生着後５日目および７日目でＶｉｖｏＴａｇ６８０標識されたＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの標的化およびＣＶ８１５標識されたＴ細胞の腫瘍への輸送を示した。この群は、ＣＶ８１５標識されたＴ細胞＋ＶｉｖｏＴａｇ６８０で標識されたＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴを受けた。１．０のＤＯＬを有するＰ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ−ＶＴ６８０を使用した。１．０のＤＯＬは、Ｐ−カドヘリンおよびＣＤ３タンパク質への結合に与える影響が最小限であることが示された。
【０３４６】
（実施例１５）
結晶および構造の決定
結晶化試験のために、図２５に示される精製されたＤＡＲＴタンパク質を使用した。特に、ヘテロ二量体促進ドメインを含まず、Ｐ−ＣＡＤ  ３５  ＶＨドメインに共有結合された「６ＸＨＩＳ」と指定されたＣ末端ＨｉｓタグＨＨＨＨＨＨ（配列番号７８）およびＣＤ３  ＶＨドメインに共有結合された「ＦＬＡＧ」と指定されたＣ末端ＦＬＡＧ配列ＧＧＣＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７９）を有するＤＡＲＴタンパク質（クローン３５  Ｐ−ＣＡＤ  ＶＬ／ＶＨ結合ドメインとクローンＣＤ３結合ドメインとを有する）を、結晶解析のために設計した（以後、「結晶３５ＤＡＲＴ」と指定する）。
【０３４７】
精製された結晶３５ＤＡＲＴを、ＴＢＳを含有するタンパク質溶液中に９．６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。１５％ＰＥＧ８Ｋおよび０．５Ｍ硫酸リチウムを含有する状態から、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶を取得した。六角平面状結晶は、セルパラメータａ＝ｂ＝１４２．８１Å、ｃ＝６２．６９Åを有する三方晶系空間群Ｐ３２１との対称一致を有し、１つの結晶３５ＤＡＲＴ分子は結晶学的非対称単位にあった。２５％エチレングリコールを含有するリザーバ溶液を使用して結晶を凍結保護し、液体窒素中で簡易凍結した。２．０Åの解像度に設定されたデータを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）のＩＭＣＡビーム線１７−ＩＤで単一の凍結結晶から収集した。データを処理し、ａｕｔｏＰＲＯＣおよびＳＣＡＬＡを使用してスケールした。最終的なデータセットは、９．９の平均冗長性および１４．２％のＲｓｙｍで９６．８％完了していた。
【０３４８】
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＰＤＢエントリーコード、１ｍｏｅから調製された一本鎖Ｆｖ断片モデルから出発するＰＨＡＳＥＲとの分子置換により、構造を決定した。結晶３５ＤＡＲＴ分子の４つのサブユニットのそれぞれについて別々に検索することにより、解を得た。手動調整の数回の反復およびＣＯＯＴを使用するモデル再構築およびａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用する結晶学的精密化により、１７．６％の結晶学的Ｒｗｏｒｋおよび２０．５％のＲｆｒｅｅ（ここで、Ｒｗｏｒｋ＝｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜であり、ＲｆｒｅｅはＲｗｏｒｋと等しいが、精密化プロセスから省略される無作為に選択された５％の反射について算出される）を有する最終的な結晶３５ＤＡＲＴモデルが得られた。
【０３４９】
最終結晶３５ＤＡＲＴモデルは、２つの鎖、重鎖（Ｈ）と軽鎖（Ｌ）を含み、鎖Ｈの残基は１〜１１０、１１７〜２３９であり、鎖Ｌの残基は２〜１１０、１１６〜２４６であった。モデル中に存在する非タンパク質原子は、５７４個の水分子および５個の硫酸イオンを含んでいた。リンカー領域中の失われるアミノ酸（１１残基）は、十中八九、障害に起因する、電子密度の欠如のため、構造中にモデル化されなかった。
【０３５０】
図２６は、結晶３５ＤＡＲＴタンパク質の結晶構造の図を示す。結晶中、結晶３５ＤＡＲＴは、以前に公開されたダイアボディ構造（図２７）（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６：３４１〜３５１（２００３）；Ｐｅｒｉｓｉｃら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２（１２）：１２１７〜１２２６（１９９４）を参照されたい）とはかなり異なる非常にコンパクトな球状構造として構築されていた。それはサブユニット間で予想外に広い接触面を有し、２つのポリペプチド鎖の間のジスルフィド結合、Ｃｙｓ２３９（ＶＨ１Ｂ）−Ｃｙｓ２４６（ＶＬ２Ａ）による構造の安定化に関する明確な証拠を有していた。４つのサブユニット、ＶＬ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＬ２ＢおよびＶＨ２Ａは全て、結合接触面に寄与し、多くの寄与は両鎖のフレームワークアミノ酸残基から生じるものであった。後者の観察は、多様な腫瘍関連抗原への結合を示す、他のＣＤＲ配列と共に構築された、他のＤＡＲＴタンパク質が、結晶３５ＤＡＲＴと類似する構造および類似するドメイン接触面を有し得ることを示唆していた。
【０３５１】
相対的に緊密な充填にも拘わらず、結晶３５ＤＡＲＴ接触面は、重鎖と軽鎖ドメインの間の高い程度の鎖間結合を特徴とするＦａｂ分子中の天然の接触面ほど大きく濃縮されておらず、補完的な形状でもなかった。結晶３５ＤＡＲＴにおいては、他方における突起により補完されなかった一方の鎖またはドメインにおけるいくらかの沈下は、結晶構造中で結合した水で充填された、小さい内部充填欠陥および大きい空隙をもたらした（図２８）。
【０３５２】
結晶３５ＤＡＲＴ上の２つの抗原結合部位は、互いに約４０Å離れており、分子の直角に反対側に位置していた。この文脈において、「直角に反対側」とは、結晶３５ＤＡＲＴ上の２つの結合部位が約９０°の角度で互いに反対であったことを意味する。
【０３５３】
抗ＣＤ３  ＣＤＲ領域はサブユニット接触面から遠くに位置していたが、抗Ｐ−ＣＡＤ  ＣＤＲ領域はより近接した領域内にあった（図２７を参照されたい）。
【０３５４】
さらに、新規一本鎖ＤＡＲＴ（ｓｃＤＡＲＴ）バリアントを生成して、２鎖ダイアボディミスペアリングの問題に取り組んだ（様々なＶＨおよびＶＬ鎖方向性を結晶構造に基づいて使用することができる）。さらなるシステイン残基を操作して、ｓｃＤＡＲＴタンパク質内で共有結合を誘導し、一本鎖ダイアボディの安定性をさらに改善した。この方法は、それぞれの部位の質を順位付けるためのさらなる分析を使用するＤａｎｉら（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１６（３）：１８７〜１９３（２００３））の変形であった。様々なジスルフィド結合位置もまた、この方法を使用して操作して、ジスルフィド結合の溶媒接近性を減少させ、ならびにリンカーの長さを減少させた。例えば、立体化学的に最適なジスルフィドの導入のためのモデリング位置は、システイン突然変異誘発のための以下のアミノ酸残基対を示唆した（図２９を参照されたい）：Ｇｌｎ１２１（ＶＨ１Ｂ）Ｇｌｙ１６０（ＶＬ１Ａ）、Ｖａｌ１２９（ＶＨ１Ｂ）Ｇｌｙ２４４（ＶＬ１Ａ）、Ｖａｌ１２３（ＶＨ１Ｂ）Ｇｌｙ１６０（ＶＬ１Ａ）、Ｇｌｙ１２６（ＶＨ１Ｂ）Ｓｅｒ２４２（ＶＬ１Ａ）、およびＡｌａ１２７（ＶＨ１Ｂ）Ｓｅｒ２４２（ＶＬ１Ａ）。
【０３５５】
さらに、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）安定性予測プロトコールおよびＲｏｓｅｔｔａ  ｖ２．３安定性プロトコールを使用して、ＤＡＲＴバリアント（ｓｃＤＡＲＴバリアントを含む）を、ドメイン間結合の安定性をさらに改善する試みにおいて、大きい内部空隙／ホール（図２６）を埋めるドメイン間接触面における部位特異的突然変異誘発により操作した。例えば、相対的に小さいアミノ酸を、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのような嵩高い芳香族側鎖で置き換えることにより、位置Ａｌａ４４（ＶＬ１Ａ）、Ｖａｌ２１３（ＶＨ２Ａ）、Ｌｅｕ２３８（ＶＨ２Ａ）、またはＭｅｔ２３１（ＶＬ２Ｂ）での側鎖体積を増大させる。さらに操作されたのは、部位特異的バイオコンジュゲーション手法のために結晶構造に基づいて様々な位置を精査する単一表面システイン突然変異体であった。
【０３５６】
（実施例１６）
Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴのエピトープマッピング
Ｐ−カドヘリン１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴの結合エピトープを同定するために、可溶性Ｐ−カドヘリン−細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｆｃ融合タンパク質構築物を生成した。それぞれのＰ−カドヘリン−Ｆｃ構築物は、図３４に示されるように、シグナルペプチド、プロペプチドおよびヒンジに遺伝的に融合されたＰ−カドヘリンＥＣＤサブドメイン領域（ＥＣＤ１、ＥＣＤ１−２、ＥＣＤ１−３、ＥＣＤ１−４、またはＥＣＤ１−５）ならびに切断性リンカーを介してヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでいた。ＥＣＤ−Ｆｃ構築物を生成するために使用されるＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、ＥＣＤ４およびＥＣＤ５  Ｐ−カドヘリンサブドメイン断片は、図３５に示され、表４２にさらに特徴付けられるように、完全長ｐ−カドヘリンエピトープ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２２２２３、ＣＡＤＨ３、ヒトカドヘリン−３）中で同定された配列と一致する。
【０３５７】
【表４８】
2017520575.tif 000055
【０３５８】
全ての構築物を、ＤＮＡ配列決定により確認して、製造業者の方法に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ＨＥＫ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に一過的にトランスフェクトし、５〜７日にわたって発現させた。プロペプチドのプロセッシングの増強のために、ＰＡＣＥ切断酵素を含有する発現ベクターを、Ｐ−カドヘリン含有ベクターと共に同時トランスフェクトした。目的の可溶性タンパク質を標準的なプロテインＡクロマトグラフィー技術（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、次いで、ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して精製した。精製されたタンパク質を、市販の抗ヒトＰ−カドヘリンモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用する結合ＥＬＩＳＡにより純度および活性について特徴付けた。精製されたＰ−カドヘリンＥＣＤ−Ｆｃ構築物をタンパク質ＥＬＩＳＡにおいて使用して、Ｐ−カドヘリンのどのＥＣＤサブドメインが１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴに結合するかを決定した。
【０３５９】
表４３は、ＥＣＤ−Ｆｃ構築物の適切な発現およびフォールディングを確認するために使用されるポリクローナルＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と共に、生成されたＰ−カドヘリンＥＣＤ−Ｆｃ構築物に対する、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴ、および様々な他の抗Ｐ−カドヘリンＤＡＲＴ分子の結合の結果を示す。この結果は、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴがＥＣＤ１−ＦｃまたはＥＣＤ１−２−Ｆｃに結合しなかったが、ＥＣＤ３を含有する全ての構築物（ＥＣＤ１−３−Ｆｃ、ＥＣＤ１−４−ＦｃおよびＥＣＤ１−５−Ｆｃ）に結合したことを示す。このデータは、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴがＥＣＤ３内でヒトＰ−カドヘリンに結合することを示す。
【０３６０】
【表４９】
2017520575.tif 000056
【０３６１】
表２４（上記）に示されたように、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴは、マウスＰ−カドヘリンに結合しない、したがって、１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴは、マウスＰ−カドヘリンＥＣＤ３（配列番号１７２）と配列が異なるヒトＰ−カドヘリンのＥＣＤ３（配列番号１６４）上のエピトープを認識する。表４４は、ヒトおよびマウスＰ−カドヘリンＥＣＤ−３のアラインメントを示し、これらのオルトログ間の差異を例示する。（；）は類似する残基を表し、（．）は異なる残基を表し、（−）は非常に異なる残基を表す。
【０３６２】
【表５０】
2017520575.tif 000057
【０３６３】
結合エピトープおよび結合親和性がＴ細胞再標的化細胞傷害アッセイにおける効力に対する効果を有するかどうかを決定するために、様々な抗Ｐ−カドヘリンＥＫ−ＤＡＲＴに関する細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）アッセイの結果を分析した。細胞傷害値（表２９を参照されたい）を、ＢｉａｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡによって可溶性および細胞表面に発現されるＰ−カドヘリンに対する結合親和性と比較した（表１４〜１６、２４を参照されたい）。ＰＦ−ＤＡＲＴは、１桁のｎＭの結合親和性でＥＣＤ２中のＰ−カドヘリンに結合し、ｎＭ未満のＣＴＬ細胞傷害活性を有する。３５  ＥＫ−ＤＡＲＴ（１５３  ＥＫ−ＤＡＲＴの親クローン）は、約３５ｎＭの結合親和性でＥＣＤ３中のＰ−カドヘリンに結合し、これはＰＦ−ＤＡＲＴのものよりもほぼ３５倍低いが、依然として類似する効力（ｎＭ未満）で殺傷する。このデータは、細胞膜により近いＥＣＤ３における結合が、より高いＣＴＬにおけるより効力をもたらすことを示唆している。１５３  ＬＰ−ＤＡＲＴはまた、３５  ＥＫ−ＤＡＲＴ（０．５ｎＭ）よりもはるかに強い結合親和性でＥＣＤ３中のＰ−カドヘリンに結合し、最も高いＣＴＬ活性（ｐＭ未満）を示す。
【０３６４】
（実施例１７）
抗Ｐ−カドヘリンＣＤＲのパラトープマッピング
相補性決定領域（ＣＤＲ）中のどのアミノ酸（ＡＡ）残基がヒトＰ−カドヘリンへのｓｃＦｖ  １５３結合に関与するかをさらに理解するために、全ての非アラニンＣＤＲ  ＡＡを、平行部位特異的突然変異誘発によって個別にアラニンに突然変異させた。
【０３６５】
部位特異的突然変異誘発
６３のオリゴ（長さ３３〜４５塩基）を設計した（表４５）。オリゴの長さを、同等の融点（Ｔｍ）予測値を有するようにそれぞれのオリゴについて調整した。それぞれのオリゴを、クローン１５３  ｓｃＦｖのセンス鎖の逆相補体であり、「ＡＧＣ」（アラニンコドンの逆相補体、ＧＣＴ）のいずれかの側の１５〜２１塩基に隣接するように設計した。
【０３６６】
【表５１−１】
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【０３６７】
【表５１−２】
2017520575.tif 000059
【０３６８】
一本鎖ＤＮＡを、公開されたプロトコール（Ｔｏｎｉｋｉａｎ  Ｒら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（６）：１３６８〜８６）を使用して産生した。簡単に述べると、ファージ発現ベクターを、製造業者のプロトコール（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）に従ってＣＪ２３６エレクトロコンピテント細胞中に形質転換し、０．０５％の細胞をＬＢ／Ａｍｐプレート上に塗布した。一晩増殖させた後、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および１ｅ＋１０のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ粒子を添加した２ｘＴＹ／２％グルコース中で増殖させた６つの１ｍＬ培養物に、独立したクローンを接種し、３７℃で２時間増殖させた後、カナマイシンを２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃でさらに４時間振盪した後、混濁を示す培養物をプールし、２Ｌバッフルフラスコ中、１２０ｍＬの培養液（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、０．２５μｇ／ｍＬウリジンを添加した２ｘＴＹ／２％グルコース）中で増加させた。一晩増殖させた後、培養上清を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）によりレスキューし、２０ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを１００ｍＬの上清に添加し、ＰＥＧ沈降によってファージを精製した。精製されたファージ（１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁されたもの）を溶解し、一本鎖ウラシルＤＮＡを製造業者のプロトコールに従って精製した（ＱｉａｐｒｅｐスピンＭ１３キット、カタログ番号２７７０４）。ＤＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）により定量した。
【０３６９】
オリゴを、トリス−ＥＤＴＡバッファー（２００μＬ中の５０μＭ）中、正常形態で注文した。次に、２００ｐｍｏｌｅの各オリゴ（４μＬ）を、３７℃で９０分間、９６ウェル形式でリン酸化し、６５℃で２０分間、熱不活化した。反応混合物は以下のものを含有していた：４μＬのオリゴ、２μＬの１０ｘＰＮＫバッファー、２μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１１μＬの水、２μＬのＴ４  ＰＮＫ（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）。部位特異的突然変異誘発反応を、以下のように９６ウェル形式で設定した：２．２μＬの一本鎖ウラシル鋳型ＤＮＡ（２００ｎｇ）、２μＬのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｃｘバッファー、２μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．４μＬのＮＡＤ＋、０．１６μＬのｄＮＴＰ、１０μＬの水、０．２μＬ（０．５単位のＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  Ｃｘ）、１μＬのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、２μＬの２０倍希釈されたリン酸化反応液（０．９ｐｍｏｌｅ）。反応物を以下のようにインキュベートした：９５℃で３ｍｉｎ、５５℃で９０ｓｅｃ、６８℃で１５ｍｉｎ、４５℃で１５ｍｉｎ。次に、１μＬ（１ｐｍｏｌｅ）の５’リン酸化されたＯｍｐＡオリゴを添加し、反応物を以下のようにさらにインキュベートした：９５℃で３０ｓｅｃ、５５℃で４５ｓｅｃ、６８℃で１０ｍｉｎ、４５℃で１５ｍｉｎ。これらのインキュベーションの後、２μＬの２単位のＵＤＧ：ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよび５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素ミックスを添加して、最初は３７℃で６０ｍｉｎ、次いで、６５℃で２０ｍｉｎ、鋳型を消化した。最後に、各反応物（合計６３の反応物）からの２μＬをプールし、配列決定のために０．３μＬをＥＲ２７３８エレクトロコンピテント細胞中にエレクトロポレーションした。
【０３７０】
ＥＬＩＳＡにおける使用のためのｓｃＦｖを発現するファージの調製
ｓｃＦｖを、ファージ粒子の表面上で発現させることができる。表面上にｓｃＦｖを発現するファージを調製するために、２％グルコース／１００μｇ／ｍＬアンピシリンと共に１ｍＬの２Ｘ  ＴＹ培地を含有する９６ディープウェルプレートに、ＱＰｉｘ（商標）２コロニーピッカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を使用して解凍されたグリセロールストック（１ウェルあたり１個のクローン）からの０．５〜１μＬを接種し、３７℃（９００ｒｐｍ）で約４時間増殖させた。次に、５μＬの１：２９ヘルパーファージ希釈液（８．３ｘ１０１３ｐｆｕ）を添加し、プレートを振盪せずに３７℃でさらに３０分間インキュベートした後、３００ｒｐｍで１時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、培地を、カナマイシン／非グルコース含有培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２Ｘ  ＴＹ）と交換した。プレートを２５℃（９００ｒｐｍ）で一晩増殖させ、遠心分離後、上清中にファージを回収した。
【０３７１】
ヒトＰ−カドヘリン−Ｆｃに対するｓｃＦｖタンパク質の結合を測定するためのＥＬＩＳＡ
Ｐ−カドヘリン−ＥＣＤ１−３−Ｆｃタンパク質または陰性対照タンパク質を、ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋中２μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＣＴ）上に４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を使用してプレートを３回洗浄し、３％ミルク／ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋中、室温で１時間ブロックした。上記のように調製されたファージ試料を室温で１時間、ブロックされたプレートに添加した。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋で３回、プレートを洗浄した後、二次抗体（抗Ｍ１３−ＨＲＰ  １：２０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を添加した。プレートを室温でさらに１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋で６回洗浄した。ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）を使用してシグナルを展開し、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０３７２】
ヒトＰ−カドヘリンへの結合の評価
ヒトＰ−カドヘリン−Ｆｃタンパク質への抗Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖ  １５３アラニン突然変異体のファージ調製物の結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。データを総結合シグナル（ＯＤ４５０）および親クローン１５３と比較した結合のパーセントとしてプロットした。次いで、Ｚ−スコアを、クローン１５３の結合パーセントの標準偏差に基づいて算出した。このアッセイに関するデータを、表４６および表４７に提示する。
【０３７３】
結果は、ファージ上でのｓｃＦｖの良好な発現を示し、クローン１５３の予想された結合活性を示す。Ａｌａへの突然変異はヒトＰ−カドヘリン結合に負に影響し、−１未満のＺ−スコアを有するため、ある特定のＣＤＲ残基が重要であると考えられる。Ａｌａへの突然変異は−０．２〜−１．０のＺ−スコアをもたらすため、ある特定のＣＤＲ残基は中程度に重要であると考えられる。これらの結果は、Ｈ１．８、Ｈ２．５、Ｈ３．１、Ｈ３．７およびＬ３．３はヒトＰ−カドヘリン結合にとって重要なＡＡであるが、Ｈ２．６、Ｈ２．１６、Ｈ３．５、Ｈ３．９、Ｌ１．８、Ｌ２．２、Ｌ２．３、Ｌ３．２およびＬ３．２は結合にとって中程度に重要であることを示唆している。
【０３７４】
【表５２】
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【０３７５】
【表５３】
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【０３７６】
本明細書に提供されるアラニン走査データおよび構造情報（実施例１５）は、抗Ｐ−カドヘリンｓｃＦｖ  １５３中の有意な数のＣＤＲ残基を、抗原結合に有意に影響させることなく置換することができることを示唆している。かくして、さらなる分析を行って、Ｐ−カドヘリン結合に有意に影響させることなくどのＣＤＲ残基を置換することができるかを決定した。表４８〜６５は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．０  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ予測アルゴリズムを使用したそれぞれの位置に関する予測されたデルタデルタＧ（ＤＤＧ）安定性を示す。安定性スコア（ＤＤＧ）は、タンパク質安定性に対する突然変異の予測された効果を示す。
【０３７７】
【表５４】
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【０３７８】
【表５５】
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【０３７９】
【表５６】
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【０３８０】
【表５７】
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【０３８１】
【表５８】
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【０３８２】
【表５９】
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【０３８３】
【表６０】
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【０３８４】
【表６１】
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【０３８５】
【表６２】
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【０３８６】
【表６３】
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【０３８７】
【表６４】
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【０３８８】
【表６５】
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【０３８９】
【表６６】
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【０３９０】
【表６７】
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【０３９１】
【表６８】
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【０３９２】
【表６９】
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【０３９３】
【表７０】
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【０３９４】
【表７１】
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【０３９５】
表６６〜７１は、それぞれのＣＤＲ位置でのヒト配列のＡｂｙｓｉｓ分析の結果を示す。抗Ｐ−カドヘリン１５３に由来するそれぞれのＣＤＲを、データベースからのヒト抗体配列に由来する対応するＣＤＲと比較した。このデータベースは、ＰＤＢ、Ｋａｂａｔデータベース、ＩＭＧＴデータベース、ＶＢＡＳＥ、およびＰｆｉｚｅｒの内部データベースを含むいくつかのデータベースに由来する全てのヒト配列を組み合わせたものである。このベータベース中のヒト抗体配列は、Ａｂｙｓｉｓを用いて番号付けられたＫａｂａｔであり、ＣＤＲ残基の頻度を、抗Ｐ−カドヘリンクローン１５３に見出されるものと同じ長さのＣＤＲのみを使用して算出した。表６６〜７１は、列挙される残基がヒト配列の少なくとも５％または１０％中に存在するそれぞれの位置での代替的なアミノ酸を示す。元のＰ−カドヘリン１５３残基もまた、それらが５％超または１０％超のカテゴリーに該当しない場合であっても、３列目および４列目に含まれる。
【０３９６】
【表７２】
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【０３９７】
【表７３】
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【０３９８】
【表７４】
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【０３９９】
【表７５】
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【０４００】
【表７６】
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【０４０１】
【表７７】
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【０４０２】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０３】
本発明を特定の実施形態を参照して開示してきたが、当業者であれば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変更を考案することができることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態および等価な変更を含む。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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