(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医学装置の表面にコーティングを形成する方法であって、当該コーティングは生物適合性を表面に提供し、以下の順の工程：
（ａ）過ヨウ素酸塩を、１，２−ジヒドロキシ部位（moiety）を含む糖蛋白質と化合して１，２−ジヒドロキシ部位を酸化することによりアルデヒド官能物質を形成し；
（ｂ）表面を形成する適切なバイオ材料を有する医学装置を用意するが、当該表面はアミン部位が露出されており；
（ｃ）アルデヒド官能物質とアミン部位を化合してアルデヒド官能物質をアミン部位に結合させることによりイミン部位を形成させ；そして
（ｄ）イミン部位を還元剤と反応させてアミン結合を形成するが、アミン結合は糖蛋白質を表面上に固定化し、そして固定化された糖蛋白質がコーティングを形成すること
からなる方法。
【請求項２】
装置が、移植可能な医学装置、血液酸素供給器、血液ポンプ、輸血用チューブ、血管移植片、ステント、ペースメーカー導線、心臓弁、カテーテル、およびガイドワイヤからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
糖蛋白質が、抗凝血蛋白質、抗血栓蛋白質、血液凝固蛋白質、血小板蛋白質、抗炎症蛋白質、抗体、イムノグロブリン、防御蛋白質、酵素、ホルモン、成長因子、球状蛋白質、血液蛋白質、制御蛋白質、輸送蛋白質、繊維状蛋白質、構造蛋白質、膜蛋白質、細胞接着蛋白質、プロテオグリカン、毒素およびリガンドからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
糖蛋白質が天然の糖蛋白質である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
表面の少なくとも一部がチューブ、棒、膜、バルーン、バッグおよびシートの少なくともひとつを形成する、請求項５記載の方法。
【請求項６】
表面が、金属、チタニウム、チタニウム合金、スズ−ニッケル合金、形状記憶合金、酸化アルミニウム、プラチナ、プラチナ合金、ステンレス鋼、ＭＰ３５Ｎステンレス鋼、エルギロイ（elgiloy）、ステライト（stellite）、熱分解炭素、シルバーカーボン、ガラス状炭素、ポリマー、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、シリコーンエラストマー、フルオロポリマー、ポリアクリレート、ポリイソプレン、ポリテトラフルオロエチレン、ゴム、セラミックス、ヒドロキシアパタイト、ヒト蛋白質、ヒト組織、動物蛋白質、動物組織、骨、皮膚、歯、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリン、木、セルロース、圧縮カーボンおよびガラスからなる群から選択される生物適合性材料を少なくともひとつ含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
過ヨウ素酸塩が、過ヨウ素酸、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸アルカリ金属および過ヨウ素カリウムの少なくともひとつを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
還元剤が硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウムおよびアミンボランの少なくともひとつを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ｐＨ４−９の水溶液中で過ヨウ素酸塩を１，２ジヒドロキシ部位含有物質と化合する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
０−５０℃の温度を有する水溶液中で過ヨウ素酸塩を１，２ジヒドロキシ部位含有物質と化合する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ６−１０の水溶液中でアルデヒド官能物質とアミン官能物質を化合する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
０−５０℃の温度を有する水溶液中でアルデヒド官能物質とアミン官能物質を化合する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨ６−１０の水溶液中で還元剤とイミン部位含有物質を化合する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
０−５０℃の温度を有する水溶液中で還元剤とイミン部位含有物質を化合する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
医学装置の表面にコーティングを架橋結合する方法であって、当該コーティングは生物適合性を表面に提供し、以下の順の工程：
（ａ）糖蛋白質を表面上に固定化するが、糖蛋白質がコーティングを形成し、そして糖蛋白質が１，２−ジヒドロキシ部位およびアミン部位を含み；
（ｂ）過ヨウ素酸塩を上記コーティングに適用することにより、１，２−ジヒドロキシ部位を酸化して、アルデヒド部位を形成し；
（ｃ）アルデヒド部位をアミン部位と化合させることにより、イミン部位を形成させ；そして
（ｄ）イミン部位を還元剤と反応させてアミン結合を形成することにより第二アミンを形成し、それにより、コーティングの少なくとも一部を架橋結合させること
からなる方法。
【請求項１６】
装置が、移植可能な医学装置、血液酸素供給器、血液ポンプ、輸血用チューブ、血管移植片、ステント、ペースメーカー導線、心臓弁、カテーテル、およびガイドワイヤからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
糖蛋白質が、抗凝血蛋白質、抗血栓蛋白質、血液凝固蛋白質、血小板蛋白質、抗炎症蛋白質、抗体、イムノグロブリン、防御蛋白質、酵素、ホルモン、成長因子、球状蛋白質、血液蛋白質、制御蛋白質、輸送蛋白質、繊維状蛋白質、構造蛋白質、膜蛋白質、細胞接着蛋白質、プロテオグリカン、毒素およびリガンドからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
糖蛋白質が天然の糖蛋白質である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
過ヨウ素酸塩が、過ヨウ素酸、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸アルカリ金属および過ヨウ素カリウムの少なくともひとつを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
還元剤が硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウムおよびアミンボランの少なくともひとつを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
ｐＨ４−９の水溶液中で過ヨウ素酸塩を１，２ジヒドロキシ部位含有物質と化合する、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
０−５０℃の温度を有する水溶液中で過ヨウ素酸塩を１，２ジヒドロキシ部位含有物質と化合する、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
ｐＨ６−１０の水溶液中で還元剤とイミン部位含有物質を化合する、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
０−５０℃の温度を有する水溶液中で還元剤とイミン部位含有物質を化合する、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
酸化工程を光の不在下で行う、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
酸化工程を光の不在下で行う、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
表面の少なくとも一部がチューブ、棒、膜、バルーン、バッグおよびシートの少なくともひとつを形成する、請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
表面が、金属、チタニウム、チタニウム合金、スズ−ニッケル合金、形状記憶合金、酸化アルミニウム、プラチナ、プラチナ合金、ステンレス鋼、ＭＰ３５Ｎステンレス鋼、エルギロイ（elgiloy）、ステライト（stellite）、熱分解炭素、シルバーカーボン、ガラス状炭素、ポリマー、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、シリコーンエラストマー、フルオロポリマー、ポリアクリレート、ポリイソプレン、ポリテトラフルオロエチレン、ゴム、セラミックス、ヒドロキシアパタイト、ヒト蛋白質、ヒト組織、動物蛋白質、動物組織、骨、皮膚、歯、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリン、木、セルロース、圧縮カーボンおよびガラスからなる群から選択される生物適合性材料を少なくともひとつ含む、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学装置の表面に糖蛋白質を付着させるための酸化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
長年にわたり、生きているヒトまたは動物の体組織または体液に接触する多くの医学装置（例えば、ペースメーカー、血管移植片、ステント、心臓弁等）が開発され、製造され、そして臨床において使用されてきた。このような装置の大きな問題は、それらの表面が組織および体液、例えば涙、尿、リンパ液、血液、血液生成物および血液由来のその他の液体および固体からの蛋白質層に吸着しやすいことである。この吸着蛋白質層の組成および組織は、管理されているのでないとすれば、さらなる生物反応に影響すると考えられる。副作用、例えば血栓症および炎症が、多くの装置の使用寿命を減じうる。
【０００３】
移植可能な医学装置も多くのバクテリア種による体への感染の場所として機能しやすい。装置に関連したこれらの感染は、これらの生物が装置表面に接着してコロニーを形成する傾向により促進される。その結果、内科医および医学工業における大きな興味は、典型的に装置の移植と同時に起こる副作用を促進する傾向の少ないバイオ分子の表面を開発することである。
【０００４】
医学装置に関連した不所望な副作用を最小にするためのひとつのアプローチは、さまざまなバイオ分子を、体が受容する細胞層の付着および成長のための表面に付着させることである。例えば成長因子、細胞付着蛋白質および細胞付着ペプチド等のバイオ分子がこの目的に使用されてきた。さらに、抗血栓症剤、抗血小板、抗炎症剤、抗微生物剤等のバイオ分子もバイオ材料関連の副作用の軽減に使用されてきた。
【０００５】
多くのアプローチからは、そのようなバイオ分子を付着させることが示唆された。これらのアプローチは、典型的には、カップリング剤、例えばグルタルアルデヒド、臭化シアン、ｐ−ベンゾキノン、無水琥珀酸、カルボジイミド、ジイソシアネート、クロロ蟻酸エチル、ジピリジルジスルフィド、エピクロロフィドリン、アジド、とりわけ、基体表面へのバイオ分子のカップリングのための付着ビヒクル（vehicles）として機能するものの使用を必要とする。例えば、水溶性カルボジイミドを用いたバイオ分子の共有結合は、ホフマン（Hoffman）ら（「不活性ポリマー表面上の放射線移植されたヒドロゲルへのバイオ分子の共有結合（Covalent Binding of Biomolecules to Radiation-Grafted Hydrogels on Inert Polymer Surfaces）」、Trans．Am．Soc．Artif．Intern．Organs.，18，10-18（1972））、およびイトー（Ito）ら（「細胞接着ペプチドの固定化による細胞吸着増強のための物質（Materials for Enhancing Cell Adhesion by Immobilization of Cell-Adhesive Peptide）」、J．Biomed．Mat．Res.，25，1325-1337（1991））に記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
カップリング分子によりしばしばバイオ物質表面をカップリングするバイオ分子の一つは、蛋白質である。蛋白質は、アミノ酸残基よりなるポリペプチドである。一般的に、確立されたカップリング法は末端アミノ基を含む蛋白質のリジンアミノ酸残基を通して基質表面に蛋白質をカップリングする。この結合方法は、幾つかの固有の問題を有する。例えば、多くのリジン残基が蛋白質表面上に存在するならば、複数の付着が生じうる。複数の付着部位は、バイオ物質表面上の蛋白質の複数のコンフォメーションに至りうる。カップリング特異性の欠如は、カップリングされる蛋白質の生物活性を崩壊または破壊しうる。さらに、カップリング分子がバイオ物質表面に不安定性を付与して、カップリング層中に付着した蛋白質の埋没の可能性を増加させうる。カップリング分子も、蛋白質分子間に不所望な架橋結合を作ることにより蛋白質の生物特性を破壊するか、または表面の機能部位間に架橋結合を作り、付着を阻害しうる。カップリング分子の使用もバイオ物質表面への蛋白質の付着の特異性を低下させる傾向があり、それにより付着工程にわたってコンフォメーションの制御を損失する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、基体表面にバイオ物質を共有結合させるための改良法を提供する。特定すれば、本発明は、バイオ物質上に固定された糖蛋白質を有する医学装置の製造法を提供する。該方法は、以下の工程：過ヨウ素酸塩と１，２−ジヒドロキシモイエティを含む糖蛋白質とを化合してアルデヒド作用物質を形成し；該アルデヒド作用物質と第一アミンモイエティを含む物質とを化合してイミンモイエティを通して２つの物質を結合させ；そして、イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二アミン結合を通して医学装置のバイオ物質表面上に固定化糖蛋白質を形成することからなる。
【０００８】
好ましくは、上記方法は、以下の工程：過ヨウ素酸塩と１，２−ジヒドロキシモイエティを含む物質とを化合し、ｐＨ約４−９の約０−５０℃の温度の水溶液中でアルデヒド作用物質を形成し；該アルデヒド作用物質と第一アミンモイエティ含有バイオ物質とを化合して、イミンモイエティを通して基体表面上に糖蛋白質を固定化し；そして、イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二アミン結合を通して医学装置の基体表面上に固定化糖蛋白質を形成することからなる。
【０００９】
本発明の方法は、１，２−ジヒドロキシモイエティおよび第一アミンモイエティの両者を含む糖蛋白質を架橋結合するためにも使用されうる。該方法は、以下の工程：過ヨウ素酸塩と糖蛋白質を化合して１，２−ジヒドロキシモイエティを酸化してアルデヒドモイエティを形成し；該アルデヒドモイエティとイミンモイエティを形成する第一アミンモイエティと化合し；そして、イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二アミンおよび架橋された物質を形成することからなる。この架橋された物質は、カップリングバイオ分子のための基質として使用されうる。例えば、アルデヒド含有バイオ分子を架橋物質の表面上の遊離アミンモイエティに付着するか、またはアミン含有バイオ分子を架橋物質の表面上の遊離アルデヒドモイエティに付着することができる。
【００１０】
「糖蛋白質」は、糖質（carbohydrate）基を含む配合蛋白質（conjugated protein）として定義される。典型的な糖蛋白質は、N-グリコシド結合によりアスパラギンアミノ酸残基に結合しているかまたはO-グリコシド結合によりスレオニンアミノ酸残基に結合しているひとつ以上のオリゴサッカライドユニットを含む。アスパラギンに直接結合したサッカライドユニットは典型的にはN-アセチルグルコサミンであるが、N-アセチルグルコサミンはセリンまたはスレオニン残基に結合したサッカライドユニットになる傾向がある。糖蛋白質に結合したオリゴサッカライドはさまざまな糖質ユニットを含みうる。また、蛋白質の生物学上の活性部位から離れた部位に位置する傾向がある。即ち、糖蛋白質のオリゴサッカライドモイエティは、典型的には蛋白質の生物学上の特性に対してほとんど又は全く作用を示さないように修飾される。本発明に使用されるのに適切な糖蛋白質は１，２ジヒドロキシモイエティを含む少なくとも一つの糖質を含む。
【００１１】
「バイオ物質」は、体内または体の上におかれるかまたは体液に接触するようにデザインおよび構築された物質として定義される。理想的には、バイオ物質は、体に不所望な反応、例えば血液凝固（clotting）、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物反応（拒絶）または炎症反応を誘導せず、意図する目的の為に作用するのに必要な物理特性を有し、容易に精製、製作および滅菌でき、体に移植または接触している間、物理特性および作用を実質的に維持する。本発明に使用するのに適切なバイオ物質はアミンモイエティを含む。
【００１２】
「医学装置」は、操作の間、組織、血液、または他の体液に接触する表面を有する装置として定義され、体液は続いて患者に使用される。例えば、血液に接触してその血液が次に患者に戻されるような外科手術用体外装置、例えば血液酸素供給器、血液ポンプ、血液センサー、輸血用チューブ等を含みうる。また、これはヒトまたは動物の体に接触して血液に移植された体内人工器官、例えば血管移植片、ステント、ペースメーカー導線、心臓弁等の血管または心臓に移植されるものも含みうる。また、一時的な血管の用途のための装置、例えばカテーテル、ガイドワイヤ等の監視または修復の目的で血管または心臓におかれるものも含みうる。
【００１３】
本発明は、医学装置に関連する多くの問題を解決することを目的とする。本発明は、基体表面例えば、医学装置に使用するためのバイオ物質の表面に糖蛋白質を共有結合させるための酸化法を含む。本発明は、架橋された物質を生産するための酸化法も提供する。
【００１４】
１，２ジヒドロキシモイエティを有する糖質を有する蛋白質は過ヨウ素酸塩を用いて酸化されうるが、過ヨウ素酸塩は過ヨウ素酸またはその塩、例えば過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または他の過ヨウ素酸のアルカリ金属塩として提供されうる。典型的には、理論量の過ヨウ素酸塩を用いて１，２ジヒドロキシモイエティを酸化するが、過剰量を用いてもよい。そのような糖蛋白質の酸化は、糖蛋白質内に反応性アルデヒドモイエティを形成する。
【００１５】
酸化は、水溶液中で、好ましくは水性バッファー溶液中で、糖蛋白質の生物特性を破壊しない温度において実施される。一般には、約４−９のｐＨを有するバッファーを、特定のｐＨ感受性糖蛋白質に所望な約６−８のｐＨにおいて使用できる。一般に、酸化は、約０−５０℃の温度、好ましくは約４−３７℃の温度で実施される。糖蛋白質に依存して、酸化反応は短くて数分長くて数日実施されうる。一般には、酸化は２４時間以内で完了する。長時間の酸化反応は過酸化を防ぐために「暗黒下」で実施することが好ましい。
【００１６】
酸化工程の処理時間および温度は逆の関係になる傾向がある。即ち、処理温度が高いほど相対的な処理時間は短くなる。時間および温度の制限は、糖蛋白質の生物学上の安定性に対する処理効果により支配される。上記範囲外の処理条件も本発明の範囲である。特定の系のための正確な条件を決定する広い範囲があり、そしてこれらの条件は本明細書に記載される情報を読んだ当業者により日常の実験にて容易に決定されうる。
【００１７】
酸化に続き、反応溶液は基体への付着前に４℃に保存される。典型的には、中性域ｐＨまたは弱酸性ｐＨにおける反応溶液の貯蔵安定性は１−１４日に、そして保存が暗黒であればときどき数カ月に及ぶ。
【００１８】
その結果得られるアルデヒドモイエティは、糖蛋白質の共有結合のための基体表面上の部位と相互作用する。これらの基体表面付着部位はアミンモイエティを含み、アルデヒドモイエティと反応してイミンを形成する。バイオ分子がカップリングされる基体表面は、所望の数の糖蛋白質を付着するための十分な密度のアミンモイエティを含むべきである。
【００１９】
表面にアミンを含まない基体は、当業者に知られている多くの方法により容易にアミン化されうる。例えば、アミンはアンモニアガスで材料をプラズマ処理することにより提供可能であり、ホルムズとシュワルツ（Holmes and Schwartz）、「アンモニアプラズマを用いた超高強度ポリエチレンのアミン化（Amination of Ultra-high Strength Polyethylene using Ammonia Plasma）」、Composites Science and Technology，38，1-21（1990）に記載されている。別法として、当業者にはよく知られている方法により、アクリルアミドを基体表面にグラフトしたのちに化学修飾を用いてアミンを導入することによりアミンは提供されうる。ポリビニルアミンまたはポリアルキルイミンも、米国特許第4,521,564号（ソロモネ（Solomone）ら）に教示された方法に従い、ポリウレタン表面に共有結合されうる。別法としては、例えば米国特許第5,053,048号（ピンチャック（Pinchuk））に記載されたようにアミノシランを表面に結合できるし、米国特許第3,826,678号（ホフマン（Hoffman））に記載されたようにグラフト化されたアクリルアミド含有ポリマーを照射グラフティングにより結合できるし、米国特許第5,344,455号（ケオ（Keogh）ら）に記載されたようにグラフト化されたN-（3-アミノプロピル）メチルアクリルアミド含有ポリマーをセリウムイオングラフティングにより結合できる。
【００２０】
典型的には、アルデヒドモイエティ（RCHO）が第一アミンモイエティ（R'NH2）と反応した場合、相対的には不安定なイミンモイエティ（R'N=CHR）である反応生成物の間に平衡が確立される。このカップリング反応は酸化に関して前記されたのと同じ条件下で実施でき、損傷から糖蛋白質を保護するようにデザインされる。糖蛋白質とバイオ物質表面の間の結合を安定化するためには、続くイミンモイエティの還元アルキル化を還元剤（即ち、安定剤）、例えば硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウム、およびアミンボランを用いて第二アミン（R'NH-CH2R）を形成することにより実施する。この反応は、酸化に関する前記と同じ条件下で実施することもできる。典型的には、しかしながら、カップリングおよび安定化反応は、中性または弱塩基性溶液中において約０−５０℃の温度で実施される。好ましくは、カップリングおよび安定化反応のためのｐＨは約６−１０、そして温度は約４−３７℃である。これらの反応（カップリングおよび安定化）は、ほんの数分間または何時間もの間、続けさせることができる。普通、反応は２４時間で完了する（即ち、カップリングされるかまたは安定化される）。
【００２１】
一般に、本発明に用いられる糖蛋白質は、抗凝血および抗血栓剤；血液凝固蛋白質；血小板製剤；抗炎症剤；抗体；イムノグロブリン；防御蛋白質；酵素；ホルモン；成長因子；球状蛋白質；血液蛋白質；制御蛋白質；輸送蛋白質；繊維状蛋白質；構造蛋白質；膜蛋白質；細胞接着蛋白質；プロテオグリカン類；毒素類；およびリガンド類でありうる。糖蛋白質は合成由来であるかまたは天然発生物でありうる。糖蛋白質が１，２ジヒドロキシモイエティを含む限り、本発明の方法によりアミン化バイオ物質表面に結合されうる。
【００２２】
いくつかの糖蛋白質は、疎水性基体表面と接触するようにさせた場合、コンフォメーションの変化を受けやすい。これらコンフォメーションの変化は内在化された非極性基の露出に至り、糖蛋白質と上記表面の間の疎水性相互作用に通じる。これら疎水性相互作用は、通常、溶液中で糖蛋白質を取り巻いている水分子の排出を引き起こしうる。蛋白質と表面の間の水分子の排出は疎水性相互作用を強化して、蛋白質のさらなるコンフォメーション変化を引き起こしうる。糖蛋白質が経験するコンフォメーション変化の程度により、その生物学的特性を破壊するかまたは破壊しないかもしれない。したがって、疎水性相互作用の傾向がある糖蛋白質を結合させる場合は、基体表面の疎水性を考慮に入れなければならない。これらの場合、バイオ物質表面に疎水性環境を作り、それにより、バイオ分子の生物学的特性を破壊しうる糖蛋白質と表面の間のあらゆる不所望な疎水性相互作用を妨害するすことが好ましい。多くの表面誘導化技術、例えばグラフティング技術は、疎水性基体表面を作るためのものとして、当業者にはよく知られている。例えば、セリウムイオン誘導、オゾン暴露、コロナ放電、ＵＶ照射およびイオン化照射（60Ｃｏ、Ｘ線、高エネルギー電子、プラズマガス放電）に基づく技術が知られている。
【００２３】
本発明の方法により修飾されうる基体は、チタニウム／チタニウム合金、ＴｉＮｉ（形状記憶／超弾性）、酸化アルミニウム、プラチナ／プラチナ合金、ステンレス鋼、ＭＰ３５Ｎ、エルギロイ（elgiloy）、ハイネス（haynes）２５、ステライト（stellite）、熱分解炭素、銀またはガラス状炭素；ポリマー、例えばポリアミド類、ポリカーボネート類、ポリエーテル類、ポリエステル類、ポリエチレン類またはポリプロピレン類を含むポリオレフィン類、ポリスチレン類、ポリウレタン類、ポリビニルクロリド類、ポリビニルピロリドン類、シリコーンエラストマー類、フルオロポリマー類、ポリアクリレート類、ポリイソプレン類、ポリテトラフルオロエチレン類、およびゴム；ミネラル類またはセラミックス類、例えばヒドロキシアパタイト；ヒトまたは動物の蛋白質または組織例えば骨、皮膚、歯、コラーゲン、ラミニン、エラスチンまたはフィブリン；有機物質、例えば、木、セルロース、または圧縮カーボン；および他の物質例えばガラス、または類似物を含む。これらの物質を用いて作られるバイオ物質はコート化または非コート化、並びに誘導化または非誘導化でありうる。
【００２４】
本発明の方法を用いて、管、シート、棒および適切な形態の物品を含むあらゆる形状または形態の基体を修飾して、多くの医学装置、例えば、血管グラフト、大動脈グラフト、動脈または静脈の血管、血管ステント、透析膜、チューブまたはコネクター、血液酸素供給器のチューブまたは膜、超透析膜、大動脈内バルーン、血液バッグ、カテーテル、縫合糸、ソフトまたはハード組織人工器官、合成人工器官、人工心臓弁、組織接着剤、心臓ペースメーカー導線、人工臓器、気管内チューブ、目のためのレンズ例えばコンタクトまたは眼内レンズ、血液取り扱い装置、言語（apheresis）装置、診断および監視用カテーテルおよびセンサー、バイオセンサー、歯科装置、薬剤送達システム、またはあらゆる種類の体内移植片に使用される。
【００２５】
当業者には理解されるとおり、糖蛋白質または糖蛋白質コーティングは本発明の方法により架橋結合されうる。即ち、第一アミンモイエティおよび１，２ジヒドロキシモイエティの両者を含む糖蛋白質または糖蛋白質コーティングを架橋結合することにより、所望の物理特性並びに生物特性を提供することができる。アルデヒド（１，２ジヒドロキシモイエティの酸化の結果としての）と、基体または基体コーティングに含まれるアミンとの架橋結合により形成されるイミンは、上記のとおりに還元剤を用いることにより安定化されうる。例えば、構造糖蛋白質を架橋結合することにより、基体または基体コーティングとして使用されうる物質を形成することができる。また、本明細書に記載される糖蛋白質は、架橋結合された物質に結合することもできる。あるいは、糖蛋白質を含むアミンを架橋物質中でアルデヒドモイエティに付着させうる。
【００２６】
本発明のすべての側面において使用可能な物質の例はフィブリノーゲンである。フィブリノーゲンは構造蛋白質であり、過ヨウ素酸塩源を用いて酸化されることによりペンダントアルデヒドモイエティを形成することができるオリゴサッカライドを含む。その結果得られるアルデヒドモイエティを用いて、アルデヒドとフィブリノーゲンに含まれる近くのリジン残基の間に形成される結合を通してフィブリノーゲンを架橋結合することができる。その結果得られるイミン結合は、次に温和な還元剤例えば、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウム、またはアミンボランを用いて還元することができる。これらの架橋結合はフィブリノーゲンおよび／またはフィブリン（トロンビン重合フィブリノーゲン）に所望の生物および／または物理特性、例えば機械強度、抗免疫原性、生物安定性をカップリング剤の使用なしに提供しうる。即ち、本発明の方法は、共通に用いられる細胞毒性カップリング剤であるグルタルアルデヒドを用いる必要性を減じて、フィブリノーゲン分子を架橋結合することにより、その物理および生物特性を制御する。
【００２７】
フィブリノーゲン／フィブリンの酸化により形成されるアルデヒドモイエティを使用して、さまざまなアミン含有バイオ分子をフィブリノーゲン／フィブリン基体にカップリングすることもできる。また、フィブリノーゲン／フィブリン分子に沿ってアルデヒドモイエティを作る能力は、アミン含有基体表面への共有結合を可能にする。そのようなフィブリノーゲン／フィブリンコートされた基体表面は、例えば、細胞散布表面、細胞結合表面、細胞分離表面、組織固定、フィブリノーゲン／フィブリンコートステントまたはフィブリノーゲン／フィブリンコート血管グラフトまたはフィブリノーゲン／フィブリン接着剤として用いることができる。
【００２８】
以下に記載される実施例は基体表面としてのポリマーフィルムまたは組織培養プレートへの処理を包含するが、本発明を限定することを意図しない。
【００２９】
【実施例】
実施例１
ウシフィブリノーゲンの過ヨウ素酸塩による酸化
シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖蛋白質ウシフィブリノーゲンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中でインキュベートした。以下の４つのフィブリノーゲン溶液を作成して、さまざまな量の過ヨウ素酸塩を用いてフィブリノーゲンの酸化を調査した：（１）0.03mMフィブリノーゲン、0.2mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4；（２）0.03mMフィブリノーゲン、0.1mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4；（３）0.03mMフィブリノーゲン、0.05mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4；および（４）0.03mMフィブリノーゲン、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4。４つのフィブリノーゲン溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベートした。その結果得られた溶液各500μlを、0.8ｇのNaOH，0.2ｇの4-アミノ-3-ヒドラジノ-5-メルカプト-1，2，4-トリアゾル（シグマケミカル社（セントルイス、MO）から商標名PURPALDで市販されている）を20ml脱イオン水中に含有する溶液２mlに加え、そして室温において15分間激しく撹拌した。ディッキンソンとヤコブセン（Dickinson and Jacobsen）、Chem．Commun.，1719（1970）は、分光光度計を用いて550nmにおいて測定されうる、紫からマゼンタ色の6-メルカプト-5-トリアゾル−(4，3-b)-s-テトラジンを生成するための、アルデヒドとPURPALDとの特異的且つ過敏な反応を記載した。室温にて15分間の撹拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。サンプル４をブランクとして用いた。550nmにおいて得られたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.54、サンプル２が0.53、そしてサンプル３が0.51であったことから、すべてのサンプルに関してフィブリノーゲンが首尾よく酸化されてアルデヒド基を形成したことが示される。
【００３０】
実施例２
ウシビトロネクチンの過ヨウ素酸塩による酸化
シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖蛋白質ウシビトロネクチンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中でインキュベートした。以下の２つのビトロネクチン溶液を作成した：（１）0.001mMビトロネクチン、0.05M NaIO4および（４）0.001mMビトロネクチン。２つのビトロネクチン溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベートした。その結果得られた溶液各100μlを、実施例１で記載された２mlのPURPALD溶液に加えて、室温において30分間激しく撹拌した。室温にて30分間の撹拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。PURPALD溶液をブランクとして用いた。550nmにおいて得られたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.09そしてサンプル２が0.04であったことから、ビトロネクチンが首尾よく酸化されてアルデヒド基を形成したことが示される。
【００３１】
実施例３
ウシフィブロネクチンの過ヨウ素酸塩による酸化
シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖蛋白質ウシフィブロネクチンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中でインキュベートした。以下の２つのフィブロネクチン溶液を作成した：（１）0.002mMフィブロネクチン、0.05M NaIO4、0.5M NaCl、0.05 M Tris，pH7.5；および（２）0.002mMフィブロネクチン、0.5M NaCl、0.05 M Tris，pH7.5。両溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベートした。その結果得られた溶液各100μlを、実施例１で記載されたPURPALD溶液２mlに加えて、室温において30分間激しく撹拌した。室温にて30分間の撹拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。PURPALD溶液をブランクとして用いた。550nmにおいて得られたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.81、そしてサンプル２が0.0であったことから、サンプル１のフィブロネクチンは首尾よく酸化されてアルデヒド基を形成したことが示される。
【００３２】
実施例４
フィブロネクチンのアミン化基体への付着
フィブロネクチンを基質表面に共有結合させた。結合技術は、セリウムイオン（CeIV）を用いて、オゾン処理されたポリスチレン組織培養プレート上への、アクリルアミド（AAm）およびN-（3-アミノプロピル）メタクリルアミド（APMA）モノマーのグラフト共重合により開始する。CeIVイオンは、オゾン処理されたシリコーンおよびポリスチレン表面およびアクリルアミドのグラフト共重合を誘導する非処理ポリウレタン上にフリーラジカルを作る。基体表面上に生じる表面アミネーション（APMAとAAmのグラフト共重合）の量は、陰性電荷染料分子であるポンソーで染色することにより測定された。グラフト後、フィブロネクチンを、アミン含有誘導化基体表面とカップリングさせた。フィブロネクチンを最初にメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）で酸化して、反応性アルデヒドモイエティを形成する。次に、これらのアルデヒドモイエティを使用して、基体表面上に存在する第一アミノモイエティにフィブロネクチンを共有結合させた。次に、シアノ硼水素化ナトリウム（NaCNBH3）を用いてイミン結合を安定化した。これら各工程に必要な特定の方法は以下に記載される。
【００３３】
ポリスチレン製の24ウエルの組織培養プレートを30分間オゾン反応容器中に置いて、オゾン含有酸素1.3cm3／分の速度で流すことによりオゾン処理した。オゾン含有酸素はコロナ放電装置を通して酸素を流すことにより作り、流れる酸素を8000Ｖ電気ポテンシャルに暴露した。オゾン処理後、窒素パージした脱イオン水中にプレートを30分間室温で浸した。窒素パージした脱イオン水中に30分間浸した後、プレートは、硝酸アンモニウムセリウム（IV）（アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Co.）、ミルウオーキー、WI）を用いて、アクリルアミド（AAm）およびN-（3-アミノプロピル）メタクリルアミド（APMA）モノマー（イーストマンコダック社（Eastman Kodak Co.）、ロチェスター、NY）でグラフトした。グラフト溶液は、11.2Ｍ AAm，1.1Ｍ APMA，400mM 硝酸、および40mM 硝酸アンモニウムセリウム（IV）脱イオン水溶液からなった。プレートは、３時間65℃の窒素パージオーブン中でグラフトさせた。グラフト後、プレートを脱イオン水で激しく洗浄した。グラフトされたプレートは、次にポンソーＳ染料を用いて試験された。染色後、１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いてポンソーＳ染料を表面から除き、分光光度計で520nmにおいて定量した。520nmにおいて得られたサンプルの吸光度は非誘導化プレートに関して0.00であり、表面−誘導化プレートに関しては1.44であった。結果が示すとおり、表面誘導化プレートは表面上に第一アミンを含む。
【００３４】
シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖蛋白質ウシフィブリノーゲンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中でインキュベートした。以下のフィブロネクチン溶液：0.002mM フィブロネクチン、0.05M NaIO4、0.5M NaCl、0.05M Tris，pH7.5を作成した。該溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベートした。その結果得られた溶液を、すぐにアミン含有表面誘導化組織培養プレート各々に加えた（約１ml溶液／ウエル）。フィブロネクチン溶液を、該誘導化組織培養プレートウエル中で一晩室温にてインキュベートした。インキュベート後、ウエルをリン酸バッファー塩（PBS）溶液で激しく洗浄した。アミン含有表面誘導化組織培養プレート表面へのフィブロネクチンの付着は、陽性荷電染料分子であるトルイジンブルー染料を用いて評価された。この染料は、基質表面上の陰性荷電にイオン結合する。したがって、トルイジンブルーのフィブロネクチン誘導化表面への結合はフィブロネクチンの陰性荷電による。各プレートのウエルを１％トルイジンブルー脱イオン水溶液で満たした。室温にて５分間インキュベート後、染料溶液を除去し、ウエルを徹底的にPBSで洗浄した。各ウエル中の染料を結合した表面は、次に１％SDS脱イオン水溶液中でプレートを機械的に激しく震盪することにより溶出した。ウエルから溶出した染料の量は630nmにおいて分光光度計で測定した。630nmにおいて得られた非誘導化サンプルプレートに関しての吸光は0.05であり、AAm/APMA誘導化サンプルプレートに関しては0.54であり、そしてフィブロネクチン誘導化サンプルにプレートに関しては1.83であったことから、フィブロネクチンが首尾よく酸化されて基質表面に共有結合したことが示される。
【００３５】
実施例５
ＥＬＩＳＡおよびフィブロネクチン結合表面への細胞接着
ペレタン（Pellethane）2363-55Dの形態のポリウレタンをダウケミカル社（Dow Chemical Co.）、（ミッドランド、MI））から得て、フィルムに伸ばした。このフィルムを１cm2のサンプルディスクに切り出した。次にサンプルディスクをエタノールで洗浄してCeIVイオンを用いて、AAmおよびAPMAモノマーで表面グラフトした。グラフト溶液は、11.2M AAm，1.1M APMA，400mM 硝酸および40mM 硝酸アンモニウムセリウム（IV）脱イオン水溶液からなった。サンプルディスクをグラフト溶液中に入れ、１時間室温でグラフトさせた。グラフト後、サンプルディスクを徹底的に脱イオン水で洗浄した。次に、その結果得られたAPMA/AAm表面誘導化サンプルディスクに、２つの方法を用いてフィブロネクチンをカップリングさせた。
【００３６】
第一の方法または過酸化法は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによりフィブロネクチンを酸化することを含んだ。フィブロネクチン（0.1mg/ml）を暗黒中で１μg/mlのメタ過ヨウ素酸ナトリウム脱イオン水溶液に３時間室温で暴露した。次に、APMA/AAm表面誘導化サンプルディスクを酸化フィブロネクチン溶液に入れて、24時間室温においた。次に、サンプルディスクを脱イオン水で徹底的に洗浄した。次に、サンプルを24時間室温において３mg/mlシアノ硼水素化ナトリウム脱イオン水溶液中でインキュベートした。次に、サンプルディスクを脱イオン水で徹底的に洗浄した。
【００３７】
第二の方法はグルタルアルデヒドをカップリング剤として用いた。この方法は、APMA/AAm誘導化サンプルディスクを２％グルタルアルデヒド脱イオン水溶液中に２時間室温で浸すことを含んだ。次に、サンプルディスクを脱イオン水で徹底的に洗浄した。洗浄後、次に、サンプルディスクを0.1mg/mlフィブロネクチン脱イオン水溶液中で24時間室温においてインキュベートした。次に、サンプルディスクを３mg/mlシアノ硼水素化ナトリウム脱イオン水溶液中で24時間室温においてインキュベートした。次に、サンプルディスクを脱イオン水で徹底的に洗浄した。
【００３８】
次に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を実施して、抗体がサンプル表面にカップリングしたフィブロネクチンを認識する可能性を測定した。サンプルディスクは、10mM Tris，0.15M NaClおよび0.05％ツイーンからなる洗浄バッファー（pH7.4）で20分間室温において洗浄した。次に、サンプルディスクを、10mM Tris，0.15M NaCl，0.05％ツイーンおよび0.05％ゼラチンからなるブロッキングバッファー（pH7.4）で30分間37℃において洗浄し、洗浄バッファーで３回10分間洗浄した。次に、サンプルディスクを、10mM Tris，0.15M NaClおよび２μg/mlマウスモノクローナル抗フィブロネクチン抗体（シグマケミカル社、セントルイス、MO）からなる一次抗体溶液（pH7.4）中で37℃１時間インキュベートした。次に、サンプルディスクを洗浄バッファーで３回洗浄した（洗浄あたり10分間）。次に、サンプルディスクを、１時間、10mM Tris，0.15M NaClおよび0.5ng/ml抗マウスIgGペルオキシダーゼ抗体配合物（シグマケミカル、セントルイス、MO）かならるペルオキシダーゼ標識二次抗体溶液（pH7.4）中でインキュベートした。次に、サンプルディスクを洗浄バッファーで３回洗浄した（洗浄あたり10分間）。次に、サンプルディスクを、0.4mg/ml ｏ−フェニルジアミンジヒドロクロリドおよび0.2μl/ml 30％過酸化水素を含むリン酸-クエン酸バッファー（pH5.0）中で15分間室温においてインキュベートした。リン酸−クエン酸バッファーは、脱イオン水中の50mM リン酸二塩基ナトリウムおよび25mM クエン酸からなった。15分間のインキュベートの後、過酸化反応を３Ｍ HClで停止して、得られた溶液の吸光を492nmにおいて分光測定した。次に、APMA/AAm誘導化サンプルディスクをこの実験の対照として用いた。分光分析から得られたサンプルの吸光は、グルタルアルデヒドでカップリングされたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘導化サンプルに関しては0.016±0.038であり、過ヨウ素酸塩で酸化されたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘導化サンプルに関しては0.204±0.068であった。これらの結果から、過ヨウ素酸塩酸化法がサンプル表面へのフィブロネクチンの付着においてよりうまくいったことを示す。
【００３９】
細胞接着アッセイも実施して、フィブロネクチン誘導化サンプル表面への細胞接着の可能性について測定した。サンプルディスクは、リン酸バッファー塩（PBS）（pH7.4）中に２mg/mlオバルブミンを含むブロッキングバッファー中で１時間37℃においてインキュベートした。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、MD）から得られてダルベッコを修飾した10％ウシ胎児血清含有イーグル培地（DMEM）中に維持されたマウス繊維芽細胞（C3T3）をトリプシン：EDTAを用いて回収して２mg/mlのオバルブミンを含む血清不含DMEM中に懸濁した。次に、この細胞を、２回洗浄して、計数してから２mg/mlオバルブミン含有血清不含DMEM中に５×104細胞/mlの密度になるように懸濁した。次に、サンプルディスクを細胞懸濁液中に１時間37℃でインキュベートした。非吸着細胞をPBS洗浄により除去した。次に、サンプルディスクを３％パラホルムアルデヒド溶液中で30分間固定した。次に、吸着細胞を、１％トルイジンブルー染料および３％パラホルムアルデヒドを含むPBS中で染色した。染色後、サンプル表面を光学顕微鏡で細胞吸着に関して試験した。試験において、APMA/AAm誘導化サンプルおよびグルタルアルデヒドカップリングフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘導化サンプルは細胞を吸着しなかったことがわかった。対照的に、過ヨウ素酸塩で酸化されたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘導化サンプルには、細胞は吸着しなかったことがわかった。
【００４０】
実施例６
フィブリノーゲンの吸着
シグマケミカル社（セントルイス、MO）から得られたブタフィブリノーゲンをこれもシグマケミカル社から得られたメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）ならびにアルドリッチケミカル社（ミルウオーキー、WI）から得られたシアノ硼水素化ナトリウム（NaCNBH3）中でインキュベートした。以下のフィブリノーゲン溶液：0.03mMフィブリノーゲン、0.02M NaIO4、0.02M NaCNBH3，0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4を作成した。該溶液を激しく撹拌して24ウエルの組織培養プレート中においた（約１mlのフィブリノーゲン溶液／ウエル）。次に、プレートを暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベートした。２時間後、溶液は濁り、極めて粘性が高くなったことが観察されたため、フィブリノーゲンが架橋結合されたことが示された。次に、サンプルをさらに22時間暗黒下で撹拌した。インキュベート後、架橋されたフィブリノーゲンは、実施例１に記載されたPURPALD溶液を用いて残余のアルデヒドに関して試験された。PURPALDアッセイの結果から、わずかに残ったアルデヒドが存在したため、アルデヒドと、フィブリノーゲン分子と共に存在するアミンとの間の共有架橋の形成が示唆された。
【００４１】
以下のウシフィブリノーゲン（シグマケミカル社、セントルイス，MO）溶液：0.02mMフィブリノーゲン、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4を作成した。作成後、溶液を４分割した。次に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（0.05mM）をサンプル３および４に加えた。全部で４つのフィブリノーゲン溶液を次に２時間震盪しながら室温においてインキュベートした。次に、0.02mMのNaCNBH3をサンプル２および４に加えた。再び、４つのフィブリノーゲン溶液を２時間室温において反応させた。各50μlのサンプルを、次に、62.5mM Tris-HCl，５％ b-メルカプトエタノール、10％グリセロールおよび2.3％ SDSからなるSDS-PAGEバッファー溶液450μl中に入れた。サンプルを３分間ボイルした。各10μlのサンプルを、次に、４−15％グラジエントゲルにのせてO'Farrell「蛋白質の高解像二次元電気泳動」、J．Biol．Chem．250，4007-4021（1974）に記載された方法に従い、SDS-PAGEを実施した。電気泳動後、ゲルをクマジーブリリアントブルーで染色して、ゲル上に含ませた分子量標準を参照して溶出蛋白質の特徴を決定した。SDS-PAGEの結果から、サンプル４中のフィブリノーゲン分子は安定な共有架橋結合を形成したことが示された。対照的に、NaIO4を含まなかったサンプル中のフィブリノーゲン分子は架橋結合を形成しなかったことが示された。
【００４２】
本発明は特定の態様および実施例に関連して記載されてきたが、本発明はそれらに限定される必要はないこと、および莫大な他の態様、実施例、用途、修飾およびそれら態様、実施例および用途からの変更は特許請求の範囲に包含されることは、当業者には認識される。本明細書において引用された各々の特許および刊行物の全開示は引用により本明細書の一部をなす。