(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大した保存安定性を有し、式：
0004199830.tif 000061
［式中、Ｒ3Ｒ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つジオキセタン環にスピロ融合して環式の又は多環式の環基を形成するために任意に共に接合できる非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、
式中、Ｒ2は、付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、
式中Ｚは、フッ素原子と１−４炭素アルキル基からなる群から選択され、
Ｍは、水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンから選択され、
式中Ｘは光を生成するための活性化剤によって除去可能な保護基である］
を有するジオキセタン。
【請求項２】
増大した保存安定剤を有し、式：
0004199830.tif 000062
［式中、Ｒ5は、ジオキセタン環にスピロ融合され且つ６から３０までの炭素原子を含有し且つ付加的な置換基を任意に含むことができる環式及び多環式アルキル基からなる群から選択され、
式中、Ｒ2は、付加的な置換基を任意に含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、
式中Ｚは、フッ素原子と１−４炭素アルキル基からなる群から選択され、
Ｍは、水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンから選択され、
式中Ｘは光を生成するための活性化剤によって除去可能な保護基である］
【請求項３】
式：
0004199830.tif 000063
を有する請求項２記載のジオキセタン。
【請求項４】
式中、ＯＸ基が、Ｏ-Ｍ+基［ここでＭは水素、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムイオンからなる群から選択される］、ＯＯＣＲ8基［ここでＲ8は、炭素原子２から８を含み且つヘテロ原子を任意に含むアルキル及びアリール基からなる群から選択される］、ＯＰＯ3-2塩、ＯＳＯ3-塩、β−Ｄ−ガラクトシドキシ、及びβ−Ｄ−グルクロニジロキシ基からなる群から選択されることを特徴とする請求項１，２又は３のいずれか１項記載のジオキセタン。
【請求項５】
増大した保存安定性を有し、式：
0004199830.tif 000064
のジオキセタン。
【請求項６】
増大した保存安定性を有し、式：
0004199830.tif 000065
のジオキセタン。
【請求項７】
増大した保存安定性を有し、水性溶媒中に、
（ａ）式：
0004199830.tif 000066
［式中、Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つジオキセタン環にスピロ融合して環式の又は多環式の環基を形成するために任意に共に接合できる非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、
式中、Ｒ2は、付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、
式中Ｚは、フッ素原子と１−４炭素アルキル基からなる群から選択され、
Ｍは、水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンから選択され、
式中Ｘは光を生成するための活性化剤によって除去可能な保護基である］
を有する安定なジオキセタン；及び
（ｂ）増強剤の不在において生成される量に比べてジオキセタンと活性化剤との反応によって生じる光の量を増加させる非ポリマーのカチオン性増強物質、
を備える光生成用組成物。
【請求項８】
上記増強物質が、式：
0004199830.tif 000067
［式中、Ａのそれぞれは、ＰとＮ原子からなる群から独立して選択され、
式中、Ｌｉｎｋは、置換又は非置換アリール、アルキル、アルケニル及びアルキニル基からなる群から選択される少なくとも２つの炭素原子を含む有機の結合基であり、且つＬｉｎｋはヘテロ原子を任意に含むことができ、
式中Ｒ3は１から２０炭素原子を含有する低級アルキル又はアラルキルから選択され、且つ
式中Ｙはアニオンである］
の２カチオン性表面活性剤である請求項７記載の組成物。
【請求項９】
上記増強物質が、式：
0004199830.tif 000068
［式中、Ｌｉｎｋはフェニレンである］
を有するニカチオン性界面活性剤である請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
ジオキセタンが、式：
0004199830.tif 000069
［式中、Ｒ5は、ジオキセタン環にスピロ融合され且つ６から３０までの炭素原子を含有し且つ付加的な置換基を任意に含むことができる環式及び多環式アルキル基からなる群から選択される］
を有するジオキセタンである請求項７，８又は９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ5が、アダマンチル基と置換されたアダマンチル基からなる群から選択される請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
ジオキセタンが式：
0004199830.tif 000070
を有する請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
ジオキセタンが式：
0004199830.tif 000071
を有する請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
式：
0004199830.tif 000072
［式中、Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つジオキセタン環にスピロ融合して環式の又は多環式の環基を形成するために任意に共に接合できる非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、
式中、Ｒ2は、付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、
式中Ｚは、フッ素原子と１−４炭素アルキル基からなる群から選択され、
式中各Ｒ’は１−４炭素のアルキル基であり、
各Ｙはハロゲン原子、置換したまたは非置換のアルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、及びトリアルキルシリルオキシ基から選択される］
を有するジオキセタン。
【請求項１５】
式：
0004199830.tif 000073
［式中、Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つジオキセタン環にスピロ融合して環式の又は多環式の環基を形成するために任意に共に接合できる非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、
式中、Ｒ2は、付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、
式中Ｚは、フッ素原子と１−４炭素アルキル基からなる群から選択され、
式中各Ｒ’は１−４炭素のアルキル基である］
を有するジオキセタン。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（１）発明の分野
本発明は、１，２−ジオキセタン（1,2-dioxetane）を総括的に安定化させるための且つ化学ルミネッセンスを生起するための、酵素を含む、化学試薬によって誘発される（triggered）ことのできる化合物に関する。ジオキセタンは、アルコキシ置換基の部分である１つ又はそれ以上のイオン化可能基を含有する。該ジオキセタンは、該ジオキセタンの保存安定性を改善する該アルコキシ置換基上の水素原子の一つを置換してフッ素原子又は低級アルキル基を更に含む。本発明は、特に、そのようなジオキセタンの合成方法に更に関係する。
本発明の合成方法によって作製されるジオキセタンは、該ジオキセタン、カチオン性界面活性剤及び誘発される化学ルミネッセンスの量を増強する付加的な蛍光体（fluorescer）とを含む組成物において利用される。本発明のジオキセタンと増強された組成物は、発光（化学ルミネッセンス）のための方法において、及び分析物の存在又は量を検出するための分析方法において利用される。重要なことは、該イオン化可能な基がより水溶性のジオキセタンとすることができ、且つカプセル化学分析システムにおける予期しない化学的な繰り越し（carryover）の問題を解消し、同時にフッ素原子又は低級アルキルの存在がジオキセタンの保存安定性を改善する。
（２）関連技術の開示
ａ．酵素的に誘発可能なジオキセタン。酵素的に誘発可能（triggerable）なジオキセタンの第１の実施例は、米国特許出願（A.P.Schaap,米国特許出願第887,139号）と連続出版物（A.P.Schaap,R.S.Handley,and B.P.Giri,Tetrahedron Lett.,935（1987）;A.P.Schaap,M.D.Sandison,and R.S.Handley,Tetrahedron Lett.,1159（1987）及びA.P.Schaap,Photocem.Photobiol.,47S 50S,（1988））中に開示されている。アリールオキシド置換基で保護されて生じる高度安定アダマンチル-置換ジオキセタンは、ジオキセタンの分解の割合を劇的に増加する強力な電子ドナー化アリールオキシアニオンを与えるための酵素と水性緩衝液の両方の作用によって光の放射を伴って分解するのを誘発する。その結果、化学ルミネッセンスは、ジオキセタンの保護された形態の緩やかな熱分解から生じるより高い規模の幾つかのオーダーの強さで放出される。Scaapによる米国特許第5,068,339号は、蛍光体（fluorescer）へのエネルギー転移を経て化学ルミネッセンスを増大する結果となる蛍光体基に共有結合される酵素的に誘発可能なジオキセタンの分解が記載される。Bronsteinによる米国特許第5,112,960号と5,220,005号及びＰＣＴ出願（WO88/00695）には、アダマンチル基で置換されて生じる誘発可能なジオキセタンが記載されている。Edwardsによる米国特許第4,952,707号には、ホスフェート置換ジオキセタンが開示される。BronsteinによるＰＣＴ出願（WO94/26726）には、酵素標識ＯＸ基とアリール環上の付加的な基で、非共役位置が置換されたフェニル又はナフチル基を生じるアダマンチルジオキセタンが記載される。
他の誘発可能なジオキセタンは、WangによるＰＣＴ出願（WO94/10258）中に記載される。Wangの中に記載されたジオキセタンは、モノ-置換及びフェニル-ＯＸ基で置換して良いアルコキシ基を含む、ここで１又はそれ以上の非-水素基は誘発可能なＯＸ基に加えてベンゼン環置換基上にある。
ジオキセタンは、芳香族カルボン酸、典型的にはヒドロキシ安息香酸又はヒドロキシナフトエ酸の又はその他のヒドロキシアリールケトンのメチルエステルを備える光放出性カルボニル化合物を生成する先の公知文献全てが記載される。
本出願人により1995年7月31日付で提出された米国同時継続出願第08/509,305号（’305出願）は、水溶性の改善が示され且つ参考によってここに完全に合併されるヒドロキシジオキセタン（hydroxy dioxetane）である、二置換ジオキセタンが開示される。
ｂ．誘発可能なジオキセタンからの化学ルミネッセンスの界面活性剤による増強。アンモニウム界面活性剤と蛍光体とを含む水溶性物質の存在における安定な１，２−ジオキセタンの酵素-誘発分解からの化学ルミネッセンスの増強は報告されている（A.P.Schaap,H.AkhavanとL.J.Romano,Clin.Chem.,35（9）,1863（1989））。蛍光体ミセルは、ヒドロキシ-置換ジオキセタンを介在してセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）と５−（Ｎ−テトラデカノイル）アミノ-フルオレセインを備え、且つエキサイト状態のエステルのアニオン性形態からミセルの疎水性包囲体内部のフルオレセインへのエネルギーの効率的な移動の効力により多量に生じる化学ルミネッセンスの４００倍の増加に至る。
Schaapによる米国特許第4,959,182号及び5,004,565号中には、第四級アンモニウム界面活性剤ＣＴＡＢによって形成されるミセルの存在において安定なジオキセタンの化学的及び酵素的な誘発から化学ルミネッセンスの増強の付加的な実施例が記載される。蛍光体ミセルはまた、ヒドロキシ-及びアセトキシ-置換ジオキセタンの塩基-誘発分解からの光放出も増加する。
Voytaによる米国特許第5,145,772号は、ペンダント状第四級アンモニウム基単独又はフルオレセインとの混合物と共にポリマーの存在中で１，２−ジオキセタンから酵素的に生成する化学ルミネッセンスの増強を開示する。他の物質は、ウシアルブミンと第四級アンモニウム界面活性剤のような球状タンパク質を含む化学ルミネッセンスの増強が報告される。別なカチオン性ポリマー化合物は、化学ルミネッセンス増強剤として不十分な効果であり；非イオン性ポリマー化合物は一般に効果が無く、且つアニオン性ポリマーは、光放射を有意に減少させる。BronsteinによるＰＣＴ出願（WO 94/21821）は、増強添加物と共に前記のポリマー性の第四級アンモニウム界面活性剤増強物の混合物の使用を開示する。
ＣＴＡＢの存在においてピラニンによる増強と非誘発ジオキセタンの触媒作用は開示される（Martin Josso,Ph.D.Thesis,Wayne State University（1992）,Diss.Abs.Int.,Vol.53,No.12B,p.6305）。
Akhavan-Taftiによる米国特許第5,393,469号は、蛍光エネルギー受容体で任意に置換されたポリマーの第四級ホスホニウム塩の存在において１，２−ジオキセタンから酵素学的に生成される化学ルミネッセンスの増強を開示する。
欧州特許出願第94108100.2は、２カチオン性ホスホニウム塩の存在中で１，２−ジオキセタンから酵素学的に生成される化学ルミネッセンスの増強を開示する。誘発可能なジオキセタンからの化学ルミネッセンスの増強のためのアニオン性の蛍光体と２カチオン性増強剤の組合せを開示するものはない。本発明のタイプの置換されたジオキセタンの増強の実例がないことは報告されている。
ｃ．水溶性を改善した誘発可能ジオキセタン。酵素学的に誘発可能なジオキセタンは、免疫アッセイ、遺伝子発現実験、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、ＤＮＡ配列及び感染性剤中の拡散配列の同定を含む各種の適用における標識酵素のための基質として広範囲に及ぶ使用を現に経験している。これらの化合物の使用が成長するにも関わらず、幾つかの分析方法においてこれらの使用が制限されている。保護を外した形態のヒドロキシジオキセタンである誘発可能なジオキセタンは、より水溶性であることが望まれる。後述の構造において示す通り、それは、水性溶液中に高度に溶解するアルカリホスファターゼによってジオキセタンリン酸エステルの脱リン酸化によって形成されるヒドロキシジオキセタン、及び化学ルミネッセンス増強物質を含む組成物であることが殊に望ましい。そのようなジオキセタンと組成物は、加水分解酵素の検出又は加水分解酵素の接合のための分析方法のある種の溶液において重要である。
0004199830.tif 000002
本発明の更なる背景として、且つ後述の実施例においてより完全に説明するように、カプセル化学分析（capsule chemistry analysis）の原理に基づく自動化された装置の使用を実行するアッセイにおける通常の化学ルミネッセントジオキセタン試薬の使用は、一つの流体画分から他方への試薬の繰り越し（carryover）の結果を生じ、潜在的に精密でない測定、間違った結果、及び非-再現性のために不正確となることが見出されている。カプセル化学分析は米国特許第5,399,497号中に開示され、ここに参考により完全に合併される。繰り越し問題に打ち勝つための他の可能性のある手段の中で、ヒドロキシジオキセタンの水溶性の改善、特にカプセル化学分析システムの隣接した流体分画内に介在するこのルミネッセント反応の排除又は最小限の繰り越し能力が要求されている。
何らかの可溶化基を併合していない市販品使用におけるジオキセタン化合物には、アルコキシ基が付加される。そうした、これらのジオキセタンは繰り越しゼロが要求される分析方法への使用が好ましくない。ジオキセタンへの可溶化基の併合の示唆はなされている（米国特許第5,220005号）。アダマンチル置換基上に置換されるカルボキシ基を持つジオキセタンがクレームされているが、しかしながらそのようなジオキセタンの調製は記載がない。重要なことは、何らかのジオキセタン可溶性及び他の特性に関してカルボキシル基に付加される効果が記載がないことである。どれほど多くの可溶化基が要求され又は個々の有効な能力が授与されるか、当該分野における教示は無い。光の放出を起こす又は他方では光の生成を妨げる保護基の除去を妨げる可溶化基の使用は、価値がないものであろう。同様のルミネッセント反応の間に除去されるであろう可溶化基は利用できないであろう。
本出願人による同時継続出願’305において、一つのイオン性可溶化基の併合はホスフェートジオキセタン（phosphate dioxetane）の脱リン酸化によって生成したヒドロキシジオキセタンに関連付けられる繰り越し問題を排除するためには不満がある。ヒドロキシジオキセタンが高い水溶性となるホスフェートジオキセタンとそのようなホスフェートジオキセタンを含有する増強された組成物が、この問題の解消に提供される。それは、繰り越し問題に対する解決を提供するジオキセタンは、室温での不十分な保存安定性（storae stability）を示すことを次に発見した。かくして、ヒドロキシジオキセタンの高い可溶性と長期の保存安定性の両方を有するジオキセタンは当該分野で知られていない。
本出願人による、08/748,107出願は、フッ素原子又は低級アルキル基による２つのイオン性可溶化基を生じるアルコキシ基上の水素原子の置換がこれらのジオキセタンの保存安定性を劇的に改善することを開示する。本発明において、改善された製造方法、それに用いる中間体（intermediates）も同じく開示する。
目的
水性溶液中で高度に溶解される、誘発酵素の作用で形成されるヒドロキシジオキセタン生成物である、改善された保存安定性を持つ酵素的に誘発される１，２−ジオキセタンを提供することが、本発明の目的である。優れた保存安定性を提供するジオキセタン構造のアルコキシ置換基に配置されるフッ素原子又は低級アルキル基の何れか一方と２つ又はそれ以上の水-可溶化イオン基とで置換された１，２−ジオキセタンを提供することが本発明の第２の目的である。２つ又はそれ以上のイオン性の水-可溶化基を持つフッ素又は低級アルキル基-置換ジオキセタン、非ポリマーのカチオン性増強剤および増強された化学ルミネッセンスの提供のための、任意な蛍光体とを備える組成物を提供することが本発明の更なる目的である。カプセル化学分析システムを実行するアッセイにおいて使用する場合に、試薬繰り越しの問題を排除するとともに延長された保存安定性を有するジオキセタンと組成物を提供することが、本発明の更なる目的である。ジオキセタン構造のアルコキシ置換基に配置されるフッ素原子又は低級アルキル基の何れか一方と２つ又はそれ以上の水-可溶化イオン基とで置換された１，２−ジオキセタンの調製のための合成プロセスとそれに用いる中間体を提供することが本発明の更に別な目的である。
【図面の簡単な説明】
図１は繰り越しが問題となるような測定におけるカプセル化学分析システムのダイアグラムである。
図２は後述の実施例中により完全に記載された通りの繰り越しに起因すると考えるルミネッセンスの観測を示すカプセル化学分析システムにおける隣り合った分画のプロファイルである。
図３は後述の実施例中により完全に記載された通りの実験において観測された繰り越しが自然の光でないことを確かめる、隣り合った分画の更なるプロファイルである。
図４は後述の実施例中により完全に記載された通りの実験において観測された繰り越しが本質において化学的なものである事実を確かめる、隣り合った分画の更なるプロファイルである。
図５は、フッ素-置換ジオキセタン、塩素-置換ジオキセタン、メチル-置換ジオキセタン及びハロゲン原子を含まない参考のジオキセタンの２５℃での分解の相対比率を表現するグラフである。
好適な実施態様の開示
本発明は、改善された保存安定性を持ち、且つ誘発酵素の作用で形成されるヒドロキシジオキセタン生成物が水性溶液中で高度に安定であり、且つ化学ルミネッセンスを生成するための酵素によって誘発可能とされる、ジオキセタンに関する。そのような誘発可能なジオキセタンは、米国特許第5,399,497号中に記載されたようなカプセル化学分析システムにおける隣り合う分画（adjacent segments）中へのヒドロキシジオキセタンのルミネッセントの繰り越しを排除又は最小限にする。繰り越しは、カプセル化学システム中で分離する流体として供されるフッ化炭素油中の低い水溶性の光放射材料の可溶化（solubilization）、析出（deposition）、沈殿（precipitation）から生じることができる。試薬の繰り越しは、不正確な測定、間違った結果及び不良な生成特性（irreproducibility）のための不正確さに通じることができる。
同時継続出願’305において、下記のジオキセタン１が水性溶液中のアルカリホスファターゼの化学ルミネッセント検出用に特に有効であることが発見されている。
0004199830.tif 000003
比較のために、単一のイオン化可能基が併合されたジオキセタン２が調製される。このジオキセタンは上述の繰り越し問題を排除することはできない。
米国特許第5,399,497号中に開示される試験システムにおけるジオキセタン１の使用は、繰り越し問題の完全な排除に通じる。しかしながら、水性緩衝液中でジオキセタン１の溶液が不十分な保存安定性を示すことが続いて思いがけずに発見された。アルカリ性緩衝液中のジオキセタン１溶液は、２５℃で２週間の保存の後、著しい分解を示した。事実、ジオキセタン１は、アルコキシ基上にイオン性可溶化基の無い下記に示す関連化合物、Lumigen PPDよりも著しく安定性を欠くことが見出される。
0004199830.tif 000004
本出願人が承知している限り、１の低い安定性の原因の化学的なジオキセタンの当該分野における教示はない。その保存安定性、同時にそれの別な有益な特性を改善するために構造的に１を修正する手段は、参考によって個々に完全に合併される本出願人による同時継続出願第08／748,107号中に開示されている。
定義：
保存安定性とは、自然発生的な反応のためにジオキセタンが分解する割合に関し、且つ本質的な特性である。誘発可能な（triggerable）ジオキセタンの分解はまた、保護基の除去を触媒する微量の薬剤の存在によって誘導することもでき、かくして分解が開始される。ジオキセタンの保存安定性は、周期的な間隔で周知のサンプル中に存在するジオキセタンの量を測定することによって評価することができる。その測定は、ジオキセタンの量に関連付けが可能な特性の測定として知られる何れかの形態で行うことができる。分光光度法、ＮＭＲ分光法及び類似下ような技法が典型的である。簡便な手段は、標準に設定された条件の下で該反応によって生成した光の量を測定することによる。放出される光の量又は強度の減退はジオキセタン化合物の損失のシグナルとなる。
保存安定性は、純粋な形態及び緩衝溶液中で溶液又は組成物としての両方におけるジオキセタンの安定性に関する。その組成物は、生成される光の量を増加させるための又は酵素的な誘発剤の活性を改善するための各種の添加物をも含めることができる。組成物中のジオキセタンが理にかなっている一定期間、環境温度で著しい分解を受けないことが望ましい。自動化された分析装置において使用されるべき組成物は、望ましくは少なくとも１週間、安定とすべきである。０−５℃での冷却状態について、少なくとも２−３ヶ月の間、著しい分解が観測されないことが望ましい。より望ましくは、自動分析装置に使用するべき組成物は、約２−４週の保存安定性の観測される指標において２−３％を越えない変化を示すようにするべきである。
保存安定性の問題の解消は、式Ｉを有するジオキセタンにおいて見出される：
0004199830.tif 000005
式中Ｚは、フッ素原子と１−４炭素のアルキル基からなる群から選択され、及びＭは、水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンからなる群から選択され、式中Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つ該ジオキセタンに安定性を提供する非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、式中Ｒ2は、ハロゲン、アルキル、置換（substituted）アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、アミノ及びアルキルアミノ基から選択される付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、及び式中Ｘは、分解されたオキシアニオン-置換（oxyanion-substituted）ジオキセタンと生成した光と二つのカルボニル-含有化合物、その一つは下記に示すような２つのカルボキシレート基を含むオキシアニオン-置換エステルである、を形成するための活性化剤によって除去することができる保護基である。
0004199830.tif 000006
ＭがＨである時、それぞれのジオキセタン化合物が、カルボン酸官能基がイオン化するｐＨ、すなわちｐＨ≧約７となるｐＨの条件の下でのみ使用されることが好ましいであろうことを認める。好ましいＭは、アルカリ金属イオン、最も好ましくはナトリウムイオンである。
別な実施態様において基Ｒ3とＲ4は、熱安定性を提供し且つ付加的な非-水素置換基を含めることができる６から３０までの炭素原子を含む、ジオキセタン環にスピロ融合される環式又は多環式アルキル基Ｒ5中に一緒に組み合わされる。
0004199830.tif 000007
該基Ｒ5は、より好ましくは多環基、好ましくはアダマンチル基又は、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、フェニル、置換フェニル、アミノおよびそれらに共有結合するアルキルアミノ基から選択される１つ又はそれ以上の置換基Ｒ6を有するアダマンチル基である。
0004199830.tif 000008
別の実施態様において、Ｒ2はフェニル又はナフチル基である。Ｒ2は、ＯＸ基が下記に示すようなジオキセタン環のメタ位に配置されたフェニル基であることが特に好ましい。該フェニル環は、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、フェニル、置換フェニル、アミノおよびアルキルアミノ基から独立して選択される付加的な置換基Ｒ7を含めることができる。幾つかの典型的な構造が説明のために包含される：
0004199830.tif 000009
下記に示すようにＲ6がＨ又はＣｌであり且つＲ7がＣｌである後者２つの構造式の化合物は、更に好適な化合物として認められる。
0004199830.tif 000010
ＯＸ基の特性は、それが使用されるべき分析において使用する誘発剤によって影響され且つヒドロキシル、ＯＭ基（ここでＭは水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム若しくは第四級ホスホニウムイオン）、ＯＯＣＲ8基（ここでＲ8は、炭素原子２から８を含み且つヘテロ原子を任意に含むアルキル及びアリール基から選択される）、ＯＰＯ3-2塩、ＯＳＯ3-塩、β−Ｄ−ガラクトシドキシ及びβ−Ｄ−グルクロニジロキシ基から選択されてよい。
式：
0004199830.tif 000011
（式中、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｍ及びＺは上述した通りである）を有する本発明のジオキセタンは、本出願人による同時継続出願No.08/748,107中に開示された方法及びジオキセタン化学の分野において周知の別な方法を用いて調製することができる。例えば、下記の式を有するケトンとエステル（式中、ＲＧは入れ替え可能な（replaceable）原子又は基であり、Ｘ’は水素又はアルキル基又はトリアルキルシリル基のような入れ替え可能な原子又は基である）は中間体ビニルエーテルを形成するための低価（low-valent）チタニウム試薬によって結合することができる。入れ替え可能な基は、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲン原子、硫酸、トシレート、メシレート及びトリフレートのようなスルホン酸、第４級アンモニウム基、及びアジドのような脱離基を含む。
0004199830.tif 000012
中間体ビニルエーテルは、ビニルエーテルリン酸塩前駆体に１又はそれ以上の工程のプロセスにおいて変換される。１つの入れ替え可能な基を他の入れ替え可能な基に入れ替える合成の簡便さを望んで良い。基ＲＧは、エステル基のケン化の後でＺ-置換マロン酸エステルとの反応によってＣＺ（ＣＯＯＭ）2フラグメントで入れ替えられる。基Ｘ’は、ＸとＸ’が、Ｘ’の除去及びＸ基又はＸ基の保護形態を加える試薬との反応によって同一でない場合において、基Ｘに変換される。例えばＸ’がＨでありＸがＰＯ3Ｎａ2である時、リン酸化剤との反応によって続発する脱プロトン化のための塩基との処理は、二ナトリウム塩へのトリエステルの加水分解によってリン酸塩に変換されるトリエステル-保護ビニルエーテルリン酸を生成する。この多工程プロセスにおいて、二つ又はそれ以上の操作は、同じプロセス工程において生じさせて良く、例えばカルボン酸エステルとリン酸エステルの加水分解は同じ工程中で達成することができる。
0004199830.tif 000013
ビニルエーテルリン酸塩前駆体は、例えば色素増感（dye sensitization）によって生成される一重項酸素の添加を含めた周知の反応によってジオキセタンに直接変換される。
0004199830.tif 000014
これらのプロセスのそれぞれは、下記の特有な実施例における説明によって例証される。特に、スキーム１は先に述べた748,107出願において開示され且つ例示された上述した工程に従い、ジオキセタン３−５の調製のために使用される合成経路を概略的に表現する。
0004199830.tif 000015
本発明の好適な実施態様は、増強された保存安定性を有する式ＩＶ：
0004199830.tif 000016
（式中、Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つジオキセタン環にスピロ融合されて環式の又は多環式の環基を形成するために任意に共同で接合できる非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、式中、Ｒ2は、付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、式中Ｚは、ハロゲン原子と１−４炭素のアルキル基からなる群から選択され、及びＭは、水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンからなる群から選択される）
のジオキセタン塩化合物を調製するための製造方法であり、
ａ）式：
0004199830.tif 000017
［式中、ＲＧは、Ｚ-置換マロン酸エステルと、式：
0004199830.tif 000018
（式中Ｒ’は１−４炭素のアルキル基である）を有するマロネート-置換アルケン化合物を生成するための塩基とを持つ除去可能な基である］
を有する第一のアルケン化合物を反応させること；
ｂ）式ＷＰ（Ｏ）Ｙ2を有するリン酸化試薬と上記マロネート-置換アルケンとを反応させること（式中、Ｗはハロゲンから選択され且つＹはハロゲン原子であり、式：
0004199830.tif 000019
を有するリン酸化アルケン化合物を形成するためのものである）；
ｃ）式Ｙ’−ＯＨ（式中、Ｙ’は、式：
0004199830.tif 000020
を有する第２のリン酸化アルケン化合物を形成するための置換又は非置換アルキル基から選択される）のヒドロキシル化合物と上記リン酸化アルケン化合物とを反応させること；
ｄ）式Ｍ-Ｑ（式中、Ｑは、式：
0004199830.tif 000021
を有するアルケン塩化合物を形成するための塩基性アニオンである）の塩基と、水性溶媒中で上記第２のリン酸化アルケン化合物を加水分解すること；及び
ｅ）ジオキセタン塩化合物を形成するために水性溶液中で酸素と上記アルケン塩化合物の存在中、照射感作によって該アルケン塩化合物を光酸素化すること；
の各工程を備える。
この方法は、Ｒ3とＲ4が、ジオキセタン環と式：
0004199830.tif 000022
を有するジオキセタン塩化合物にスピロ融合して環式又は多環式環基Ｒ5を形成するように一緒に結合されるジオキセタンを調製するために使用されることがより好ましい。別の好適な方法において、基Ｒ2はメタ-フェニル基であり、Ｚはハロゲン又は１−４炭素原子を有するアルキル基であり、より好適なＺは、Ｆ又はＣＨ3であり、且つＭはアルカリ金属イオン、より好適なＭはＮａである。
増強された保存安定性を有する式ＩＶの化合物：
0004199830.tif 000023
（式中、Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子によって任意に置換でき且つジオキセタン環にスピロ融合されて環式の又は多環式の環基を形成するために任意に共同で接合できる非環式の、環式の及び多環式の有機の基からなる群から各々選択され、式中、Ｒ2は、付加的な置換基を含めることができるフェニル及びナフチル基からなる群から選択されるアリール環基であり、式中Ｚは、ハロゲン原子と１−４炭素のアルキル基からなる群から選択され、及びＭは、水素、アルカリ金属イオン又は第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンからなる群から選択される）
は、次の工程：
ａ）式：
0004199830.tif 000024
［式中、ＲＧは、Ｚ-置換マロン酸エステルと、式：
0004199830.tif 000025
（式中Ｒ’は１−４炭素のアルキル基である）を有するマロネート-置換アルケン化合物を生成するための塩基とを持つ除去可能な基である］
を有する第一のアルケン化合物を反応させること；
ｂ）式：
0004199830.tif 000026
を有するマロネート-置換ジオキセタンを形成するための酸素とマロネート-置換アルケン化合物の存在中で照射感作によって上記マロネート-置換アルケンを光酸素化すること；
ｃ）式ＷＰ（Ｏ）Ｙ2を有するリン酸化試薬と上記マロネート-置換ジオキセタンとを反応させること、（式中、ＷとＹは、式：
0004199830.tif 000027
を有するリン酸化ジオキセタン化合物を形成するために、ハロゲン原子、置換又は非置換アルコキシ、アリールオキシ、アラルキロシキ及びトリアルキルシリロキシ基から各々選択される）；及び
ｄ）式Ｍ-Ｑ（式中、Ｑはジオキセタン塩化合物を形成するための塩基性アニオンである）の塩基とともに水性溶媒中で上記リン酸化ジオキセタンを加水分解すること、
を備える改善された方法によって有利に製造することができる。
この方法は、Ｒ3とＲ4が、ジオキセタン環と付加的な置換基を含むことができる式：
0004199830.tif 000028
を有するジオキセタン塩化合物にスピロ融合して環式又は多環式環基Ｒ5を形成するように一緒に結合されるジオキセタンを調製するために使用されることがより好ましい。別の好適な方法において、基Ｒ2は付加的な置換基を含むことができるメタ-フェニル基であり、Ｚはハロゲン又は１−４炭素原子を有するアルキル基であり、より好適なＺは、Ｆ又はＣＨ3であり、且つＭはアルカリ金属イオン、より好適なＭはＮａであるジオキセタンの製造のために使用される。
Ｚ-置換マロン酸エステルＣＨＺ（ＣＯＯＲ’）2を持つ第一のアルケン化合物と、マロネート-置換アルケン化合物を生成するための塩基との反応は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ-ジメチルアセトアミド、求核塩基、好ましくはナトリウム又はカリウム水素化物を用いて貧溶媒化したＮ-メチルピロリドンのような極性非プロトン性溶媒中で実施される。その反応は好ましくは、反応時間を減じるために昇温条件で、一般には５０と１５０℃の間、より実用的には８０と１２０℃の間で実行される。除去可能な（removable）基は、Ｃｌ、ＢｒとＩから選択されるハロゲン原子、硫酸塩、トシレート、メシレート及びトリフレートのようなスルホン酸塩、第四級アンモニウム基、及びアジドのような脱離基を含む。
ここに記載された改善された方法において、光酸素化する工程は、748,107出願中に開示されたような総合的な方法（overall process）の最終工程としてのホスフェートアルカンの光酸素化に代えてマロネート-置換アルケンを介して実行される。この工程において、フェニル基を生じるマロネート-置換アルケン化合物は、有機溶媒中に溶解され且つマロネート-置換ジオキセタンを形成するために増感剤と酸素の存在中で照射される。可視光を用いる、光による増感剤と酸素の照射は、マロネート-置換アルケンのビニルエーテル型二重結合と反応する一重項酸素を生成する。その増感剤は、溶媒中に溶解させ又は、好ましくは当該分野において通常用いられるようなポリマー性粒子上に固定化することができる。一重項酸素を生成するために利用される増感剤は、限定されないが、ローズベンガル、メチレンブルー、エオシン、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）、ＴＰＰの金属複合体、殊に亜鉛とマンガンとＣ60を含むことができる。好適な有機溶媒は、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3及びＣＣｌ4のようなハロカーボン、重水素化（deuterated）ハロカーボン、低分子量ケトンとそれの重水素化類似物、脂肪族及び芳香族炭化水素とそれらの重水素化類似物を含む。最も好適にはＣＨ2Ｃｌ2である。有機溶媒中での光酸素化の誘導は、一重項酸素のライフタイムが最小化される反応媒体が有利に提供される。これは反応時間を著しく減じることと、より直ちに完成に進展させるための光酸素化を許すことの効果を有する。生成物の分離は、多くの場合において要求される簡単な増感剤の濾過と溶媒の留去と同じく容易になされる。
式ＷＰ（Ｏ）Ｙ2（ここでＷはハロゲンから選択され、Ｙはリン酸化ジオキセタン化合物を形成するためのハロゲン原子、飽和又は不飽和アルコキシ基及びトリアルキルシロキシ基である）を有するリン酸化試薬と上記マロネート-置換ジオキセタンを反応させる工程は、有機溶媒、好ましくはＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨＣｌ3及びＣＣｌ4のようなハロカーボン、ジエチルエーテル又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のようなエーテル中でアミン塩基の存在中、実行される。利用されるアミン塩基は、限定されないが、ピリジンとトリエチルアミンを含む。Ｙが置換又は非置換アルコキシ基、アリーロキシ、アラルキシロキシ、又はトリアルキルシリロキシ基である時、Ｙ基の典型例は、実施例のために、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3のようなアルコキシ、及びその類似物、シアノエトキシ（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）又はトリメチルシリルエトキシ（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3）のような置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ、トリメチルシリロキシ及び有機化学の当業者に一般に周知のような他のものを含む。二つの基Ｙは試薬
0004199830.tif 000029
中で生成するエチレンジオキシのような単一な基として一緒に結合することもできる。好適な基Ｙは、シアノエトキシ基である。より好適な実施態様において、Ｙはハロゲンであり、好ましくはＹとＷは両方ともＣｌである。
該リン酸化工程は、約−７８℃から約２５℃の範囲の温度で溶媒中で実行される。約０−５℃の温度が特に便利である。リン酸化剤ＷＰ（Ｏ）Ｙ2は、反応溶液が高温となることが原因とならないように制御された方式において添加される。そのリン酸化試薬は添加の間、アミン塩基、好ましくはピリジンによって好適に同伴される。
加水分解又は脱保護工程は、式Ｍ-Ｑ（ここでＱは、ジオキセタン化合物を形成するために保護基Ｙ及びＲ’の除去の原因となるための十分な量の塩基アニオンである）の塩基と共に水性溶媒中でリン酸化ジオキセタンの加水分解によって達成される。その溶媒は、水、水性緩衝液又は水と１種又はそれ以上の有機溶媒との混合物を含めることができる。好適な有機溶媒は、水-混合可能なメタノール、エタノール、アセトン及びＴＨＦのような溶媒である。４当量の塩基が典型的には要求され、しかしながら簡便性のために、過量を使用することができる。保護基の除去は、好ましくは連続して又は同時に実施することができる。特別な基ＹとＲ’及び塩基に基づいて、部分的に加水分解された中間体を分離することを可能として良く又はしなくて良い。
塩基性の脱保護剤の選択は、部分的に、除去するべき基ＹとＲ’の本質によって決定されるであろう。その脱保護剤は、ビニルエーテルホスフェート塩が最初に調製され又は保護されたジオキセタンが調製されるプロセスにおけるジオキセタン環基の分解のプロセスにおけるビニルエーテル基の加水分解のような望ましくない副反応の原因とならないようにもする必要がある。好適な脱保護剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムt-ブトキシド、アンモニア、アンモニア水及びその類似物のような有機及び無機の塩基を含む。別の好適な脱保護剤は、シアニドイオン、フルオリドイオンのような求核試薬を含む。
他の実施態様において、リン酸化試薬とマロネート-置換ジオキセタンとを反応させる工程は、
ａ）式ＷＰ（Ｏ）Ｙ’2を有するリン酸化試薬とマロネート-置換ジオキセタンとを反応させること（式中、ＷとＹ’は、式：
0004199830.tif 000030
を有するジオキセタンホスホリルハライド化合物を形成するためのハロゲン原子である）；及び
ｂ）式Ｙ−ＯＨ（式中、Ｙはリン酸化ジオキセタン化合物を形成するための置換又は非置換アルキル基から選択される）のヒドロキシル化合物とジオキセタンホスホリルハライド化合物とを反応させること、
を備える。
該ジオキセタンホスホリルハライド化合物は、少なくとも２当量、好ましくは過量のヒドロキシル化合物Ｙ−ＯＨとの反応によって、リン酸化ジオキセタン化合物に変換される。ヒドロキシル化合物Ｙ−ＯＨとして利用できる典型的な化合物は、限定されないが、メタノール、エタノールのような低級アルコール、３−ヒドロキシプロピオニトリル（ＨＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）と２−トリメチルシリルエタノールのような置換低級アルコール、フェノール、置換フェノール、ベンジルアルコール及びその他の一般に周知であるものを含む。
別な態様において、本発明は、本ジオキセタンを調製するための方法において使用される合成中間体に関する。特に、下記の新規なアルケン中間体化合物が有用である。
0004199830.tif 000031
付加的な下記の新規ジオキセタン化合物は、本ジオキセタン化合物の調製における合成中間体として有用である。
0004199830.tif 000032
この改善された方法による本発明のジオキセタンの典型的な合成をスキーム２中に示す。
0004199830.tif 000033
上述した合成方法における式：
0004199830.tif 000034
（式中、ＲＧは除去可能な基である）を有する出発材料（アルケン前駆体）は、当該分野において周知の方法によって調製することができる。一つの方法において、ビニルエーテル官能基は、米国特許第4,983,779号と4,982,192号中に開示されたケトンＲ3Ｒ4Ｃ＝ＯとエステルＨＯＲ2ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2-Ｇ（式中、ＧはＲＧと同一として良い基又はＲＧによって置き換えられ又はＲＧに変換されることができる基で良い）のＴｉ-介在カップリングにより調製される。ＲＧがヨウ素原子であり、Ｇが塩素原子である典型的な合成方法が以下に与えられる。簡略化のために、そのカップリング反応のエステル化合物は、ヒドロキシル基がシリルエステル又はアルキルエーテルのようなマスクされた形態において存在する保護形態において使用されるであろう。カップリング反応の後、遊離のヒドロキシル基は標準の合成手段を用いて解放される。これらのアルケン前駆体は、先に報告されたこのタイプのビニルエーテルの調製ではない新規の方法によっても製造できることが、本出願人によって更に発見されている。先のＴｉ-介在方法は、付加的な複雑さとコストが付加されるＧ又はＲＧを生じる個々のエステル化合物の調製に要求される一方で、該新規の方法は、市販の出発材料から調製することができる通例のビニルエーテル中間体を利用する。
新規の方法によってアルケン前駆体を調製するための反応の実施例が下記に示される。低級アルキルビニル化合物（低級アルキル、Ｒ9、ここではＣ1−Ｃ4の直鎖又は分枝アルキル基を示す）は、望ましいアルケン前駆体を生成するための、例えば式ＨＯＣＨ2ＣＨ2Ｇを有する一つのような、他のアルコールＲ10-ＯＨの少なくとも１モル当量の存在中で水銀塩の触媒的な量と共に反応される。
0004199830.tif 000035
式ＣＨ2＝ＣＨＯＲaを有する非置換ビニルエステルから、式ＣＨ2＝ＣＨＯＲbへの変換は周知であり且つ、例えばW.H.WatanabeとL.E.Conlon,J.Am.Chem.Soc.79,2828（1957）に記載され、本方法において用いる三置換アルケンの水銀塩-触媒反応による調製は、本出願人の知見が最も最初に報告されたものである。
この反応方法において、Ｒ3とＲ4は、ヘテロ原子と任意に置換することができ且つジオキセタン環にスピロ-融合される環式又は多環式環基Ｒ5を形成するように一緒に結合することができる、非環式、環式及び多環式の有機の基から各々選択され、Ｒ2は任意な置換基を含んで良いフェニルとナフチル基から選択されるアリール基である。本発明のジオキセタンへのアルケン前駆体の調製のためのこの水銀-触媒反応の使用の実施例は、
0004199830.tif 000036
（式中、Ｇは塩素原子である）である。水銀塩はビニルエーテル基に触媒的に作用する何れかのＨｇ（II）塩であり、好ましくは酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩のような弱酸の塩である。水銀塩は触媒的な量、典型的にはアルケンのモル当たり０．０１から０．５モル、より典型的には０．０５から０．２５とされる。アルコール化合物Ｒ10-ＯＨは、何れかのアルカノール、置換アルカノール、ベンジルアルコール、アリルアルコールのような不飽和アルコールとすることができる。アルコールは、アルケンのモル当たり少なくとも２モル、好ましくはアルケンのモル当たり少なくとも５モルの過量において使用される。好適な方法において、アルコールは反応溶媒として使用される。反応は、限定されないが典型的には環境温度より高く、溶媒の沸点までとされる。好適な反応温度は約７０−１２０℃の範囲内である。反応物の可溶性の改善又は極性又は沸点の変更を意図する付加的な溶媒を使用することができる。
上述した水銀-触媒ビニルエーテル交換反応は本発明の水溶性三置換ジオキセタンへの更なる仕上げのために使用される中間体の調製における特別な仕様が見出されると同時に、アルケン又はビニルエーテル化合物の広い多様性の調製により全般的に適用可能である。
特有な実施態様
ジオキセタン１のフッ素-置換類似物、３と同一物、塩素-置換類似物４及びメチル-置換類似物５は調製されており、且つそれらの安定性を数週間以上に渡り評価した。全ての溶液は同じ組成で調製され、ジオキセタンの種類のみ異なる。安定性は試験溶液の固定された量及びアルカリホスファターゼの固定された制限量で、２５℃での光強度の停滞を測定する化学ルミネッセント酵素アッセイによって評価される。思いがけず、ジオキセタン３と５を含む水溶液は実質的に１よりもより安定であり、４はそうでなかった。ジオキセタン３と５の溶液は２５℃で４週間の後、本質的に分解を受けていない。驚くべきことに、ジオキセタン４の保存安定性は、１よりも実際に悪かった。
0004199830.tif 000037
これら４つのジオキセタンの特性におけるこの相違の原因は、目下のところ理解できない。ジオキセタン３と４は、それらが異なるハロゲン置換基を有することによってのみ構造的に相違する時に保存安定性におけるそのような顕著な相違を示すであろう。本出願人はこれらの結果を説明又は予言するようなジオキセタン化学の分野における教示が無いことに気付いた。
さらに又、ジオキセタン３についての試験は、ジオキセタン１のように、カプセル化学分析システムにおいて、それが繰り越しの原因とならないことを示す。２つのカルボキシレートとフッ素原子又は低級アルキル基の一方を含む置換基を生じる３及び５のようなジオキセタンとそのようなジオキセタンを含む組成物は、それ故にカプセル化学分析システムにおいて使用される他の周知のジオキセタンと組成物に対して優っている。
本発明の別な態様において、増大された化学ルミネッセンスを提供する化合物が提供される。増大された組成物は、高度な分析的感受性が要求される分析において有利となる。ジオキセタン分解反応の効率的な化学ルミネッセンスの増大と同時に、自然なジオキセタン分解からの無関係な光放出を維持すること又は減じることは、感受性を増強又は改善できる一つの手法である。
それ故に本発明はまた、カチオン性増強剤（cationic enhancer）と、化学ルミネッセンスを生成するために誘発することができる増大された安定性を有する上述した通りの安定な１，２−ジオキセタンとを備える組成物に関する。増大された化学ルミネッセンスを提供するためのそのような組成物は、水性溶液中に上述した通りのジオキセタン、及び増強剤の不在において生成される量に比して活性化剤とジオキセタンとの反応によって生成する光の量を増加させる非ポリマー性カチオン増強物質とを備える。その増強物質は式：
0004199830.tif 000038
（式中、Ａのそれぞれは、ＰとＮ原子からなる群から独立して選択され、式中、Linkは、置換又は非置換アリール、アルキル、アルケニル及びアルキニル基からなる群から選択される少なくとも２つの炭素原子を含む有機の結合基であり、且つLinkはヘテロ原子を任意に含むことができ、式中Ｒ3は１から２０炭素原子を含有する低級アルキル又はアラルキルから選択され、且つ式中Ｙはアニオンである）の２カチオン性（dicationic）表面活性剤である。特に好ましい増強物質は、式：
0004199830.tif 000039
（式中、Linkはフェニレンである）を有する２カチオン性表面活性剤である。
増大された化学ルミネッセンスを提供するための本発明の組成物は、補充の増強剤として少なくとも１種の蛍光体を任意に含んで良い。利用される蛍光体は、エネルギー転移を通して生成される光の量を増加させることが可能なそれらの化合物である。アニオン性蛍光体が殊に有効であり、それはカチオン性増強剤との好適な静電的中間作用によると確信される。特に好適な蛍光体は、アニオン性化合物であり且つ限定されないがピラニンとフルオレセインを含む。
本発明の各種の態様をより明確に開示するために、特有の実施態様を記載した、制限されることのない以下の実施例は、本発明を説明する目的のために提示される。
実施例
実施例１．ジオキセタン１の調製
ジオキセタン［４−（３，３−ビスカルボキシプロポキシ）−４−（３−ホスホリロキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］，４ナトリウム塩は、本出願人による米国特許第5,631,167号中に記載された反応のシーケンスによって調製される。中間体のアルケン［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−ヨウ化エトキシ）−メチレン］トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］までの合成は、本質的に米国特許第5,013,827号と5,068,339号中に記載された通りに誘導される。
0004199830.tif 000040
実施例２．ジオキセタン２の調製
ジオキセタン［４−（３−カルボキシプロポキシ）−４−（３−ホスホリロキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］（２）は、本出願人による米国特許第5,631,167号中に記載された反応のシーケンスによって調製される。中間体のアルケン［（３−カルボキシプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）−メチレン］−トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカンまでの合成は、本質的に米国特許第5,013,827号と5,068,339号中に記載された通りに誘導される。
0004199830.tif 000041
実施例３．ジオキセタン３の調製
このジオキセタンは、下記の反応のシーケンスによって調製される。中間体アルケン［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−ヨウ化エトキシ）−メチレン］トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］までの合成は実施例１中の開示された通り誘導される。
0004199830.tif 000042
（ａ）［（（３，３−ビスカルボエトキシ）−３−フルオロプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレントリシクロ［3.3.1.13,7］デカンの合成。水素化ナトリウム（６０％油中分散物７５ｍｇ）がヘキサンで油分が無くなるまで洗浄され、真空下で乾燥され、そして無水ＤＭＳＯ４ｍｌを加える。ジエチルフルオロマロネート（０．３ｇ）が添加され、Ａｒの下で１５分間攪拌される。無水ＤＭＳＯ５ｍｌ中、ヨードエトキシアルケン（０．５ｇ）の溶液が該反応混合物中に加えられる。１００℃に加熱され且つ２時間攪拌され、反応される。冷却後、該混合物は３０ｍｌの酢酸エチルで希釈される。その酢酸エチル溶液は水で３−４回抽出され、乾燥して濃縮される。その粗材料はヘキサン中５−２０％酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーされる。目的の化合物（０．２５ｇ）が４５％の収量で得られる：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２８（ｔ、６Ｈ）、１．６６−１．９５（ｍ、１２Ｈ）、２．４５（ｔ、１Ｈ）、２．５２（ｔ、１Ｈ）、２．６７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５２（ｔ、２Ｈ）、４．２３−４．３０（ｑ、４Ｈ）、６．７４−７．２２（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000043
（ｂ）［（（３，３−ビスカルボエトキシ）−３−フルオロプロポキシ−（３−（ビス-（２-シアノエチル）ホスホリロキシ）フェニル）メチレン］トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンの合成。アルゴンの層下に１０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を収容するフラスコが氷浴中で冷やされる。ピリジン（１．７１ｍｌ）が添加され続いてＰＯＣｌ3（０．６１ｍｌ）がゆっくり加えられ、そして１５分間継続して攪拌される。１０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の工程（ａ）からのアルケン（０．９７２ｇ）が滴下混合される。氷浴が除かれ、溶液は２．５時間攪拌される。この溶液に１．７１ｍｌのピリジンと１．４４ｍｌの２−シアノエタノールが加えられる。その反応混合物は１２−１５時間攪拌され白色沈殿の状態とされる。その混合物はＣＨ2Ｃｌ2で希釈されそして４ｘ５０ｍｌの水で洗浄される。そのＣＨ2Ｃｌ2抽出物は乾燥され濃縮される。粗生成物は、ヘキサン中７５％酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーで精製される。全量１．２ｇの油状物（８８％）が得られる：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２９（ｓ、６Ｈ）、１．７９−１．９７（ｍ、１２Ｈ）、２．４６−２．５３（２ｔ、２Ｈ）、２．６３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．８３（ｔ、４Ｈ）、３．２０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５０（ｔ、２Ｈ）、４．２４−４．３１（ｑ、４Ｈ）、４．３５−４．５１（ｍ、４Ｈ）、７．１３−７．３６（ｍ、４Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−９．４９（ｐ）。
0004199830.tif 000044
（ｃ）［（３，３−ビスカルボキシ-３-フルオロプロポキシ）−（３−ホスホリロキシフェニル）メチレン］トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］、４ナトリウム塩の合成。工程（ｂ）からのアルケン（１．２ｇ）は２０ｍｌのアセトン中に溶解される。４ｍｌの水中、２９７ｍｇの水酸化ナトリウムの溶液が加えられる。その溶液は沈殿が形成される時点まで一晩攪拌される。その液体はデカンテーションされ、そしてその固体はアセトンの１０ｘ５ｍｌで洗浄される。真空下で乾燥した後、白色の固体（１．０ｇ）が得られる：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．７５−１．８９（ｍ、１２Ｈ）、２．２９（ｔ、２Ｈ）、２．３７（ｔ、２Ｈ）、２．５７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５６（ｔ、２Ｈ）、６．９９−７．３０（ｍ、４Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．６９（ｓ）。
0004199830.tif 000045
（ｄ）［４−（３，３−ビスカルボキシ）-３-フルオロプロポキシ）−４−（３−ホスホリロキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］，４ナトリウム塩（３）の合成。工程（ｃ）からのアルケン（３４８．６ｍｇ）は１０ｍｌのＤ2Ｏ中に溶かされる。ポリマー結合ローズベンガル（５００ｍｇ）がp-ジオキサン中に懸濁され、そして上記水溶液に加えられる。その反応混合物は５−８℃に冷却され、酸素のバブリングが開始され、その混合物は5milカプトン（KAPTON）フィルターを通してナトリウムランプによって照射される。トータルで２．５時間の後、ポリマービーズが濾別され、その溶液は乾燥した白色の固体（３）となるまで濃縮される。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．９３−１．７９（ｍ、１２Ｈ）、２．１９（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．４１−２．４９（ｍ、２Ｈ）、２．９７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４０−３．４９（ｍ、２Ｈ）、７．１９−７．４２（ｍ、４Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．５７５（ｓ）。
実施例４．ジオキセタン４の調製
このジオキセタンは、下記の反応のシーケンスによって調製される。中間体アルケン［（３−ヒドロキシフェニル）−（３，３−ビスカルボエトキシ）プロポキシメチレン］トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］までの合成は実施例１中の開示された通り誘導される。
0004199830.tif 000046
（ａ）［（（３，３−ビスカルボエトキシ）−３−クロロプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレントリシクロ［3.3.1.13,7］デカンの合成。（３，３−ビスカルボエトキシプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレントリシクロ［3.3.1.13,7］デカン（１．２ｇ）の乾燥ＴＨＦ１０ｍｌ溶液は、アルゴン下−７８度で、２５−３０ｍｌＴＨＦ中２．４当量ＬＤＡ中に加えられる。−７８℃で３０分間攪拌することによって反応され、そして乾燥ＴＨＦ１５ｍｌ中、Ｎ-クロロサクシンアミド（０．５８ｇ）の溶液と共に処理される。その反応は室温に暖めて１時間以上でなされ、かつ追加の時間攪拌される。ＴＨＦは真空下で除去され、残査は１００ｍｌ酢酸エチルに溶かされる。その有機性溶液は水で洗浄され、乾燥され且つ濃縮される。その粗材料はカラムクロマトグラフィーによって分離される。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２３（ｔ、６Ｈ）、１．７０−２．００（ｍ、１２Ｈ）、２．５７（ｔ、２Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５６（ｔ、２Ｈ）、４．２２（ｑ、４Ｈ）、６．６５−７．２５（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000047
（ｂ）［（（３，３−ビスカルボエトキシ）−３−クロロプロポキシ−（３−（ビス-（２-シアノエチル）ホスホリロキシ）フェニル）メチレン］トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンの合成。アルゴンの層下に２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を収容するフラスコが氷浴中で冷やされる。ピリジン（１．５ｇ）が添加され続いてＰＯＣｌ3（１．８２ｇ）がゆっくり加えられ、そして１５分間継続して攪拌される。工程（ａ）からのアルケン（１．５ｇ）と、２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に１．５ｇのピリジンが滴下混合される。氷浴が除かれ、溶液は１時間攪拌される。その溶液は再度氷浴で冷却され、３．０ｇのピリジンと２．８ｇの２−シアノエタノールが加えられる。その反応混合物は１２−１５時間攪拌され白色沈殿の状態とされる。その混合物はＣＨ2Ｃｌ2で希釈され水で洗浄される。そのＣＨ2Ｃｌ2抽出物は乾燥され濃縮される。粗生成物は、ヘキサン中５０％酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーで精製される。全量１．４ｇの油状物が得られる：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２７８（ｔ、６Ｈ）、１．８０−１．９７（ｍ、１２Ｈ）、２．５６５（ｔ、２Ｈ）、２．６３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．８２６（ｔ、４Ｈ）、３．２０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５５６（ｔ、２Ｈ）、４．２７１（ｑ、４Ｈ）、４．４０−４．４７（ｍ、４Ｈ）、７．１５−７．３６（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000048
（ｃ）［（３，３−ビスカルボキシ-３-クロロプロポキシ）−（３−ホスホリロキシフェニル）メチレン］トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］、４ナトリウム塩の合成。工程（ｂ）からのアルケン（０．９ｇ）は２５ｍｌのアセトン中に溶解される。３ｍｌの水中、０．２２ｇの水酸化ナトリウムの溶液が加えられる。その溶液は沈殿が形成される時点まで一晩攪拌される。その液体はデカンテーションされ、そしてその固体はアセトンで洗浄される。白色の固体が濾過され、更なるアセトンで洗浄され真空下で乾燥される：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．７７−１．９２（ｍ、１２Ｈ）、２．４２２（ｔ、２Ｈ）、２．５９（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．６３５（ｔ、２Ｈ）、７．０２−７．３３（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000049
（ｄ）［４−（３，３−ビスカルボキシ）-３-クロロプロポキシ）−４−（３−ホスホリロキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］，４ナトリウム塩（４）の合成。工程（ｃ）からのアルケン（３５ｍｇ）は１．０ｍｌのＤ2Ｏ中に溶かされる。ポリマー結合ローズベンガル（５００ｍｇ）がp-ジオキサン-ｄ8の１．０ｍｌ中に５分間浸され、そして上記水溶液に加えられる。その反応混合物は０℃に冷却され、酸素のバブリングが開始され、その混合物は、ＮＭＲによって決定される通り４を生成するために、5milカプトン（KAPTON）フィルターを通してナトリウムランプによって４５分間照射される。その混合物は濾過され、その溶液は酵素アッセイのための緩衝液中に希釈される。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．０５−１．９６（ｍ、１２Ｈ）、２．１９（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．６０−２．６２（ｍ、２Ｈ）、３．０７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５６−３．５８（ｍ、２Ｈ）、７．２５−７．４４（ｍ、４Ｈ）。
実施例５．ジオキセタン５の調製
このジオキセタンは下記の反応のシーケンスによって調製される。中間体アルケン［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−ヨウ化エトキシ）メチレン］トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］までの合成は実施例１中の開示された通り誘導される。
0004199830.tif 000050
（ａ）［（（３，３−ビスカルボエトキシブトキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレントリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成。水素化ナトリウム（６０％油中分散物０．８６６ｇ）がヘキサンで油分が無くなるまで洗浄され、真空下で乾燥され、そして無水ＤＭＳＯ１５ｍｌを加える。ジエチルメチルマロネート（２．４ｇ）が添加され、Ａｒの下で１５分間攪拌される。無水ＤＭＳＯ１５ｍｌ中、ヨードエトキシアルケン（２．８ｇ）の溶液が該反応混合物中に加えられる。１００℃に加熱され且つ２時間攪拌され、反応される。冷却後、該混合物は３０ｍｌの酢酸エチルで希釈される。その酢酸エチル溶液は水で３−４回抽出され、乾燥して濃縮される。その粗材料はヘキサン中５−２０％酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーされる。目的の化合物（０．８０ｇ）が２５％の収量で得られる：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２０８（ｔ、６Ｈ）、１．３４７（ｓ、３Ｈ）、１．７６−１．９６（ｍ、１２Ｈ）、２．２０（ｔ、２Ｈ）、２．６６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４１（ｔ、２Ｈ）、４．０９−４．１７（ｑ、４Ｈ）、６．７８−７．２６（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000051
（ｂ）［（（３，３−ビスカルボエトキシブトキシ）−３−（ビス-（２-シアノエチル）ホスホリロキシ）フェニル）メチレン］トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンの合成。アルゴンの層下に１５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を収容するフラスコが氷浴中で冷やされる。ピリジン（１．３８ｇ）が添加され続いてＰＯＣｌ3（０．８ｇ）がゆっくり加えられ、そして１５分間継続して攪拌される。１５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の工程（ａ）からのアルケン（０．８ｇ）が滴下混合される。氷浴が除かれ、溶液は１時間攪拌される。この溶液に１．３８ｇのピリジンと１．２４ｇの２−シアノエタノールが加えられる。その反応混合物は１２−１５時間攪拌され白色沈殿の状態とされる。その混合物はＣＨ2Ｃｌ2で希釈されそして４ｘ５０ｍｌの水で洗浄される。そのＣＨ2Ｃｌ2抽出物は乾燥され濃縮される。粗生成物は、ヘキサン中７５％酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーで精製される。全量０．５５ｇの油状物（５０％）が得られる：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２０８（ｔ、６Ｈ）、１．３４（ｓ、３Ｈ）、１．７８−１．９７（ｍ、１２Ｈ）、２．１８（ｔ、２Ｈ）、２．６１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．８１（ｔ、４Ｈ）、３．２１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４１（ｔ、２Ｈ）、４．０９−４．１６（ｑ、４Ｈ）、４．３７−４．４６（ｍ、４Ｈ）、７．１４−７．３４（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000052
（ｃ）［（３，３−ビスカルボキシブトキシ）−（３−ホスホリロキシオキシフェニル）メチレン］トリシクロ−［３．３．１．１3,7］デカン］、４ナトリウム塩の合成。工程（ｂ）からのアルケン（０．４７ｇ）は１４ｍｌのアセトン中に溶解される。１．５ｍｌの水中、０．１１７ｇの水酸化ナトリウムの溶液が加えられる。その溶液は沈殿が形成される時点まで一晩攪拌される。その液体はデカンテーションされ、そしてその固体はアセトンの１０ｘ５ｍｌで洗浄される。真空下で乾燥した後、白色の固体（０．３８３ｇ、９２％）が得られる：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．０９（ｓ、３Ｈ）、１．７５−１．９０（ｍ、１２Ｈ）、２．００（ｔ、２Ｈ）、２．５７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４７（ｔ、２Ｈ）、７．０１−７．２９（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000053
（ｄ）４−（３，３−ビスカルボキシブトキシ）−４−（３−ホスホリロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［３．３．１．１3,7］デカン］，４ナトリウム塩（５）の合成。工程（ｃ）からのアルケン（６５ｍｇ）は３ｍｌのＤ2Ｏ中に溶かされる。ポリマー結合ローズベンガル（３５ｍｇ）がp-ジオキサン中に懸濁され、そして上記水溶液に加えられる。その反応混合物は５−８℃に冷却され、酸素のバブリングが開始され、その混合物は（５）を生成するために１時間、5milカプトン（KAPTON）フィルターを通してナトリウムランプによって照射される。ポリマービーズが濾別され、その溶液は試験のためのストック溶液調製のために使用される。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．９２−１．３３（ｍ、５Ｈ）、１．３８−２．２１（ｍ、１３Ｈ）、２．９２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１９−３．３２（ｍ、２Ｈ）、７．１４−７．７３（ｍ、４Ｈ）。
実施例６．ジオキセタン３の代替の調製
該ジオキセタンは、出発材料として［（３−ヒドロキシフェニル）メトキシメチレン−トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンを用いて下記に開示される反応のシーケンスによって調製される。この化合物は米国特許第4,983,779号中の記載の通りに調製することができる。
（ａ）アルケン［（３−ヒドロキシフェニル）メトキシメチレン−トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン（１２ｇ）は２−クロロエタノール１００ｍｌを加え、攪拌する。Ｈｇ（ＯＡｃ）2の触媒量（２．８ｇ）がアルゴン雰囲気下で混合物に添加される。１１０℃で５時間攪拌し反応させる。室温に冷却後、クロロエタノールが真空下で除去される。その固体はＥｔＯＡｃ中に溶解され、水で洗浄される。ＥｔＯＡｃ層はＮａ2ＳＯ4で乾燥され、［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−クロロエトキシ）メチレン］トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンを生成するために濃縮される。
（ｂ）ヨウ素原子による上記化合物中の塩素原子の置換は、本質的に米国特許第5,013,827号と5,068,339号中に記載された通り行われる。
（ｃ）［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−ヨードエトキシ）メチレン］トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンからの［（３−ヒドロキシフェニル）−（３，３−ビスカルボキシ-３-フルオロプロポキシメチレン］トリシクロ［3.3.1.13,7］デカンの合成は、上記実施例３中に記載される。
0004199830.tif 000054
（ｄ）工程（ｃ）からのフッ化マロネートアルケン（０．３７５ｇ）は、１５ｍｌＣＨ2Ｃｌ2中のca.１ｍｇメチレンブルーで光酸素化される。Ｏ2バブリングと共に−７８℃に冷却後、その溶液は、5milカプトン（KAPTON）フィルターを通してナトリウムランプによって４５分間照射され室温に暖めさせる。ＣＨ2Ｃｌ2は留去され、残査は［４−（３，３−ビスカルボエトキシ−３−フルオロプロポキシ）-４−（３−ヒドロキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［3.3.1.13,7］デカン］を生成するように溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＥｔＡｃを用いてクロマトグラフィーされる：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ０．９７−１．０２（ｍ、１Ｈ）、１．２１−１．３３（ｍ、７Ｈ）、１．４５−１．９１（ｍ、１０Ｈ）、２．２３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．４８−２．８０（ｍ、２Ｈ）、２．９６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．３５−３．４４（ｍ、１Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．２１−４．４０（ｍ、４Ｈ）、６．８５−７．４０（ｍ、４Ｈ）。
0004199830.tif 000055
（ｅ）先の工程からのジオキセタンは、次の方法によってリン酸化される。アルゴン下、無水ピリジン２ｍｌとＣＨ2Ｃｌ2１０ｍｌが０℃に冷やされ、０．４２４ｇのＰＯＣｌ3の１０ｍｌＣＨ2Ｃｌ2溶液が滴下により添加される。１５分後、１０ｍｌＣＨ2Ｃｌ2中の該ジオキセタン０．４２４ｇの溶液が滴下により添加される。その溶液は室温まで暖めさせ、且つ４時間攪拌される。その溶液は再び０℃に冷やされ、１０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に０．７５ｇのシアノエタノールの溶液が滴下により添加される。この溶液は２．５時間攪拌し、室温まで暖めさせる。乾固するために濃縮した後、その残査は溶離剤としてヘキサン中５０−１００％酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーされる。その溶媒は次いで真空中で除去され無色の油状物を得る。該ジオキセタンは次いで１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶かされ、タイプＩ水（type I water）で３回洗浄される。その有機層は次いでＮａ2ＳＯ4で乾燥され、濾過され、且つリン酸化ジオキセタンを生成するために濃縮される：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ０．９０−０．９５（ｍ、１Ｈ）、１．２４−１．３３（ｍ、７Ｈ）、１．４６−２．２０（ｍ、１１Ｈ）、２．５０−２．８６（ｍ、６Ｈ）、２．９６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．３２−３．４１（ｍ、１Ｈ）、３．６２−３．７３（ｍ、１Ｈ）、４．２０−４．４８（ｍ、８Ｈ）、７．３０−７．７０（ｍ、４Ｈ）；31Ｐ（ＣＤＣｌ3）−９．５３（ｐ）。
0004199830.tif 000056
（ｆ）１０ｍｌのタイプＩ水中のＮａＯＨ４７．２ｍｇ溶液と１０ｍｌアセトンと、該ジオキセタンとを、アルゴン下で一晩反応させることによってそのアルキル基が除去される。溶媒は形成されている油状物残査からデキャンタされる。その油は、２ｍｌのアセトンで２回洗浄し、次いで粉末状の白色固体を生成するために別の１０ｍｌのアセトンと粉砕される。固体のジオキセタン３は、吸引濾過によって捕集され、別な２０ｍｌのアセトンで洗浄される。
代替の手順において、工程（ｄ）のジオキセタン生成物は、次の方法によって直接ジオキセタン３に変換することができる。無水ピリジン２ｍｌとＣＨ2Ｃｌ2１０ｍｌの溶液はアルゴン下、０℃に冷やされ、そしてＣＨ2Ｃｌ2の１０ｍｌ中０．４２４ｇのＰＯＣｌ3溶液が滴下により加えられる。１５分後、ＣＨ2Ｃｌ2の１０ｍｌ中０．４２４ｇの該ジオキセタン溶液が滴下により加えられる。その溶液は室温に暖められ、４時間攪拌される。リン酸塩が形成され、そしてそのエステル基は、タイプＩ水１ｍｌ中、４７．２ｍｇの水酸化ナトリウム溶液と１０ｍｌのアセトンと、生じるジクロロホスフェートジオキセタンとを、アルゴン下で一晩反応させることによって加水分解される。溶媒が生成物を含む残査から除去される。生成物は次いでアセトンで洗浄され、必要があれば、粉末の白色固体を生成させるためアセトンで粉砕される。ジオキセタン３が吸引濾過によって捕集される。
実施例７．カプセル化学分析システム中の試薬繰り越し問題の発見
以下に記載した実験は、光の放出（ルミネッセンス）を測定するために形作られた検出システムと共に、Kumarらの米国特許第5,399,497号中に本質的に記載されたようなプロトタイプのカプセル化学分析システムで実行される。該方法と装置は、テフロンチューブ、該チューブは内表面上のフッ化炭素油の分離層を有する、を通して流体セグメント（fluid segments）の流れを供給することを備える。サンプルと試薬は、このチューブ内に吸引され（aspirated）、且つ生じた液体セグメントは該チューブを通して移される。不均一イムノアッセイ法によって要求される分離工程と洗浄工程は、一方の水性セグメントから他方へ磁性粒子を移動させる磁力によって容易になされる。検出システムは、フォトンカウンターとファイバーが光捕集の効率を最大限とするための上記テフロンチューブの周囲に直接配置されているファイバー光学リードヘッド（fiber optic read head）を備える。
TECHNICON IMMUNO 1R TSH method（Bayer Corporation,Tarrytown,NY,USA）が、発光原性試薬（liminogenic reagents）の試験をするための典型的なイムノアッセイ法として使用される。該方法の原理は、フルオレセイン-標識抗体を含む第１の試薬（Ｒ１）、及び抗体-アルカリホスファターゼ（ALP）接合体を含んだ第２の試薬とを同時に、抗原ＴＳＨを含む試験品をインキュベートすることを含む。それぞれの抗体は、「サンドウィッチ」の形成が二つの抗体とＴＳＨ抗原との間で開始されるように、ＴＳＨ抗原上の異なるエピトープのために特異的とされる。抗-フルオレセイン結合を含む磁性粒子は、サンドウィッチをカプセルするために使用され、且つ該粒子は、その後に非結合試薬を除去するために洗浄される。該粒子は、次いでＡＬＰのための気質を含んだ発光原性試薬にさらされ、そしてルミネッセンスが測定される。
発光原性Ｒ３試薬は、０．２ｍＭのＣＳＰＤ（２ナトリウム３-（４-メトキシスピロ｛１，２-ジオキセタン-３，２’-（５’-クロロ）トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン｝-４-イル）フェニルホスフェート，（Tropix,Inc.,Bedford,MA,USA）、３ｍＭのピラニン（ヒドロキシピレンスルホン酸）、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ10.0）、０．１％トリトンＸ-100及び０．１％ＮａＮ3を備える。カプセル化学分析上の結果のシーケンスは図面の図１中に表現される。流体カプセル又は試験パッケージは、６つの液体セグメントを備え、各々は２８μｌの体積を有する。磁性粒子（TECHNICON IMMUNO 1 systemにおいて使用される磁性粒子１．４μｌは粒子洗浄緩衝液（25mMトリス、ｐ７．５、０．２ＭのＮａＣｌ、０．１％トリトンX-100と保存料を含む）する流体の残りと共に、第１のセグメント（ＭＰ）内に吸引される）。Ｒ１（ＴＳＨに対するフルオレセイン-標識抗体を含む血清ベースの溶液の１０．４μｌ）、Ｒ２（ALPと接合されたＴＳＨに対する抗体を含む血清ベースの溶液の１０．４μｌ）及びＳ（血清サンプルの７．２μｌ）が第２のセグメント中に吸引される。次の２つのセグメント（Ｗ１とＷ２）は上記ＭＰセグメントにおいて用いたと同じ洗浄緩衝液を備える。第４のセグメントは、上述した組成物の、発光原性基質とルミネッセンス増強剤である鍵成分（key elements）を持つ、Ｒ３である。第６のセグメントは、隣接した試験を分離するのに用いられる、内部-試験緩衝液（上述した粒子の緩衝液と同様である）である。磁力移送は図１中の矢印によって表す。これらの移送は１又は２の磁力移送アッセンブリ（Ｍ１とＭ２）によって促進される。１３分間のインキュベートの後、サンドウィッチ構造が生じている間に、Ｍ１が獲得を開始するように、R1+R2+R3セグメント内の磁性粒子に移送される。６分間の付加的な期間の後、Ｍ２が第１の洗浄セグメント内に粒子に移送される。１２秒の付加的期間の後、Ｍ２は第２の洗浄セグメント内の粒子に移送される。１２秒間の別な期間の後、Ｍ２はＲ３セグメント中の粒子に移送され、このセグメントからの光放出がルミノメーターのリードヘッドを通して往復して通過する水性セグメントの流れとして検出される。
テフロンチューブが光に対し透明であることから、光ピッピング（light piping）（又は「光の繰り越し」）に伴う問題が予期される。特に、フォトンが放出されるＲ３セグメントに隣接するいつかの試験は、テフロン材料が入り込むことができ、チューブの長さを下って伝搬され、且つ重要な試験の信号の測定の間を通して検出器内に散在される。しかしながら、信号が隣接した試験において検出されると同時に、それは予期される手法において生じることはない。試験Ｎと距離をおいて急速に衰えるどころか、光出力のピークは、図面の図２中に示す通り、隣接した試験パッケージのＲ３セグメントの周囲を中心として観測される。図２において、試験Ｎは概ね毎秒７．５ミリオンカウント（cps）の、高いレベルのルミネッセンスを生じる。試験Ｎ−１とＮ−２は、試験Ｎの以前のチューブ内に吸引され、ルミノメーターを通してこの試験に先行し、且つ試験Ｎ＋１とＮ＋２は試験Ｎ以後に続発する。該分析システムは、流れの中でそれぞれ個別の空気及び液体セグメントのためにカウントされるフォトンが記録される。図２中のプロファイルは、ＡＬＰの不在において誘導されるバックグラウンドの流みエッセンスのためのそれぞれを捕捉する５つの試験の１０回繰り返しパネルの平均を表す。それぞれのデータ点から減じられる試薬のブランク値は、各々５つの試験の１０回繰り返しパネルから得られた平均である。繰り越し信号の大きさ（magnitude）は、パーツパーミリオン（ｐｐｍ）において表される、試験Ｎ中のピークｃｐｓによってそれぞれの隣接試験中のピークｃｐｓを分割することによって計算される。
この反応のための別な可能性のある説明は、意図しない手法における隣接した試験内に試験ＮからのＡＬＰの物理的な繰り越しである。これは、例えば、チューブを通して液体セグメントのスムースな動きを混乱させることができる、壁上に析出された微粒子からなる材料をそのチューブが含むならば、生じることができる。しかしながら、隣接試験のＲ３セグメント中の１０ｍＭ無機リン酸塩の配置は、隣接試験中の信号の大きさに関して影響を及ぼさない。このリン酸塩の量がこれらの試験条件の下で少なくとも９０％においてＡＬＰを阻害していることから、その物理的な繰り越しの可能性は除外される。
光学的な繰り越しを更に除外するために、フルオレッセント増強剤ピラニンは、試験Ｎのみから省略されるが、しかしその隣接試験中には存在する。その結果、試験Ｎ中の信号の大きさは、概ね１０のファクターによって低下される。しかしながら、図面の図３中に示す通り、隣接試験におけるピークの高さは、著しく変わってはいない。その繰り越し信号が隣接試験において釣り合って変化しないと言う事実は、この繰り越しが光学的なものでないことを明確に示す。
繰り越しの付加的な及び非予測的なタイプは、繰り越し問題の原因とされる。ヒドロキシジオキセタン中間体は、そのような繰り越しが隣接した試験のＲ３セグメント内への油分を経て溶解されたヒドロキシジオキセタン中間体を移送するためとされるように、テフロンチューブの内壁を被覆するために使用されたフッ化炭素油中に十分に溶解されることが見出された。このプロセスは、ｐＨ１０での１ＭＤＥＡからｐＨ７でのトリスまでの隣接試験におけるセグメントの緩衝液を変更することにより試験される。ｐＨ７では、これらＲ３セグメント中に溶解したヒドロキシジオキセタン中間体は安定であり、光を放射することはない。図面の図４に示す通り、このｐＨの変更はルミネッセンスの側方帯の完全な排除の結果を生じる。Ｎ＋１とＮ−１における残余の微小な繰り越しは、予想される光学的繰り越しに帰される。これらの結果は、隣接試験におけるピーク中の光放出の源が隣接する試験のＲ３セグメント内へのＣＳＰＤから誘導されたヒドロキシジオキセタンの「化学的な繰り越し」であることを証明している。
実施例８．ジカルボキシ酸-置換ジオキセタン１により観測される化学的繰り越しの排除。
表１は、反応中間体の化学的繰り越しについて３つの別のジオキセタンを用いた効果を示す。LUMIGEN PPD［４−（メトキシ）−４−（３−ホスホリロキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１3,7］−デカン、（Lumigen,Inc.,Southfield,MI,USA）、ジオキセタン２、モノカルボン酸誘導体及びジオキセタン１、ジカルボン酸誘導体は、同じ濃度で試験組成物中にそれぞれ使用される。該ppmの欄は、反応の最悪のケースを表す、Ｎ＋１試験のための信号である。変更していない親化合物、ＰＰＤの繰り越しは、ＣＳＰＤで観測されるものよりも２倍以上高いことが見出される。驚いたことに、モノカルボン酸誘導体、ジオキセタン３は、化学的繰り越しの大きさにおいて、ただ８４％の減少を示した。これは、単一の電荷基がフッ化油中の反応性中間体の可溶化を完全に防ぐために不十分であることを示している。しかしながら、ジカルボン酸誘導体は、二つの電荷基が望ましい反応を達成するために完全に充足することを示す、１００％の有効性である。
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実施例９．増強剤の役割
ジオキセタン１に基づく試薬の最適化の一部として、幾つかの増強剤が検討される。ｐＨ９．６で、増強剤Ａ（１-トリオクチルホスホニウムメチル-４-トリブチルホスホニウムメチルベンゼンジクロライド）は、６．２のファクターによってルミネッセント信号を増加させ、増強剤Ｂ（ポリ（ビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロライド））は１９．７のファクターによって信号を増加させる。ｐＨ１０で、増強剤Ａは４．８のファクターによって信号を増加させ、増強剤Ｂは１８．９のファクターによって信号を増加する。増強剤Ｂが高い光強度を達成するにもかかわらず、増強剤Ａは、それが低分子量のモノマー性化合物であることから、分析システム上で使用するために好適である。ポリマー性化合物は、殊にもしそれらがポリカチオン性であると、分析システムの操作のための意味のある問題を引き起こすであろう沈殿の原因となる、血清成分と相互作用する。
フルオレセインとピラニンの両方は、増強剤Ａとの組合せにおいて補充の蛍光体として有効であることが見出される。単に、これらの蛍光体は、約１０倍の増強を達成するために相対的に高濃度（3mM）で使用する必要がある。しかしながら、増強剤Ａとの組合せにおいて、増強剤の不在中で必要とされるよりも蛍光体の１００倍の低濃度で匹敵する増強が得られるという相乗効果が観測される。表２と３は、各々増強剤Ａの１ｍｇ／ｍｌの存在においてピラニンとフルオレセインによる増強の大きさを示す。
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実施例１０．カプセル化学分析システムのための最適化された処方
上述した観測はカプセル化学分析システムのための最適化された処方の発展を生じさせている。この処方は、０．１−１ｍＭのジオキセタン１、０−０．０５ｍＭピラニン、０．１−５ｍｇ／ｍｌ増強剤Ａ、０−１ｍＭのＭｇ+2、０．１−１Ｍの２-アミノ-２-メチル-１-プロパノール（ｐＨ１０．０）及び０．０１−１％トリトンX-100とを備える。この処方の使用は、化学的な繰り越しの問題の完全な排除と増強された成果との結果を生じる。
実施例１１．酵素アッセイにより測定される１，３，４及び５の安定性。
０．１ｍｇ／ｍｌ増強剤Ａ、０．８８ｍＭのＭｇ+2、０．２Ｍの２-アミノ-２-メチル-１-プロパノール、ｐＨ１０．０、０．１％トリトンX-100及び０．５ｍＭのジオキセタン１，３，４及び５を備える、それぞれの処方が調製され、不透明なポリエチレンボトル中、４℃、２５℃及び４０℃で保管される。それぞれのボトルから２４の１００μｌ分割が、９６穴プレートの穴に分注し、且つその溶液は３７℃でインキュベートされる。各々の穴に、８ｘ１０-17モルのＡＰを含む溶液１０μｌが注入され、そして５時間を越えて光強度が記録される。データは２４穴全ての平均とされる。その実験は、各々のジオキセタンのために示された時間的間隔で繰り返される。図５中のその結果は、２５℃で３つの処方の安定性の比較を示す。図５中に示す通り、フッ素-置換ジオキセタン３は、塩素-置換ジオキセタン４及び非-置換ジオキセタン１よりも本質的に良好な保存安定性を示すことが見出される。ジオキセタン３と５は、４０℃で１又は４よりも本質的により安定である。
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実施例１２．３の効力
ジオキセタン３に併合する試薬の検出は、実施例７中に記載した通りの試験システムにおいて評価される。その試験材料は、磁性粒子上に捕捉されたフルオレセイン-標識アルカリホスファターゼ接合体とされる。３を含む試薬を用いたＡＰのためのアッセイは、ジオキセタン１を用いた結果に比較して、感受性、ダイナミックレンジ及び正確さを伴う結果を導いた。
先の各実施例は説明のためのみのものであり、減縮を意図するものではない。発明の範囲は添付されたクレームと均等物によってのみ示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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