(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する、配列番号１１のアミノ酸配列を含む配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントからなる、単離されたＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項２】
単離されたペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項３】
単離されたペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項４】
単離されたペプチドが、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項５】
単離されたペプチドが、エンドソーム標的シグナルを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項６】
エンドソーム標的シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む、請求項５に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項７】
単離されたペプチドが、非水解性である、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項８】
単離されたペプチドがＤ−アミノ酸を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ2］−ケトメチレン・ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレン・ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｏ］−ペプチド結合を含むペプチド、および−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｓ］−チオメチレン・ペプチド結合を含むペプチドからなる群より選択される、請求項７に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項９】
単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドと、請求項１〜８のいずれかに記載された単離されたＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドとを含む、免疫応答を誘導するための組成物。
【請求項１０】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドとＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドとが、ポリトープポリペプチドとして結合される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、エンドソーム標的シグナルを含む、請求項９〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
エンドソーム標的シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のペプチド、請求項３に記載のペプチド、請求項４に記載のペプチド、および請求項５に記載のペプチドからなる群より選択されるペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸が配列番号１からなるものではない、前記核酸。
【請求項１６】
核酸が、配列番号１３を含む、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
プロモーターに作動可能に結合させた請求項１５または１６に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
核酸が配列番号１３を含む、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子をコードする核酸をさらに含む、請求項１７または１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載の発現ベクター、請求項１８に記載の発現ベクター、および請求項１９に記載の発現ベクターからなる群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォームされた、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１７に記載の発現ベクターおよび請求項１８に記載の発現ベクターからなる群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォームされた宿主細胞であって、該宿主細胞がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子を発現する、宿主細胞。
【請求項２２】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドに特異的なＣＤ４+Ｔリンパ球でＴリンパ球母集団を選択的に富化する方法であって、単離したＴリンパ球母集団を、該ＣＤ４+Ｔリンパ球で単離されたＴリンパ球母集団を選択的に富化するのに十分な量の、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する剤と接触させることを含み、該剤がＭＡＧＥ−３タンパク質またはそのＨＬＡクラスＩＩ結合フラグメントと接触させた抗原提示細胞である、前記方法。
【請求項２３】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＡＧＥ−３タンパク質またはそのＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＭＡＧＥ−３の発現を定量する方法であって、対象から単離された生物学的サンプルを、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドに特異的な抗体と接触させ、該抗体とＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドとの間の相互作用を、ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患の決定因子として同定することを含み、前記疾患が癌である、前記方法。
【請求項２７】
ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＬＡクラスＩＩ分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドの発現を定量する方法であって、対象から単離された生物学的サンプルを、ＨＬＡクラスＩＩ分子と、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドとの複合体に結合する抗体と接触させ、該複合体と該抗体との間の結合を、ＨＬＡクラスＩＩ分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドの発現により特徴づけられる疾患の決定因子として同定することを含み、前記疾患が癌である、前記方法。
【請求項３０】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療するための医薬であって、該疾患を改善するのに十分な量の、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドを含み、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項３３】
ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を改善するのに十分な量のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドをさらに含む、請求項３２に記載の医薬。
【請求項３４】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドとＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドとが、ポリトープポリペプチドとして結合される、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドがエンドソーム標的シグナルを含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載の医薬。
【請求項３６】
エンドソーム標的シグナルがヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む、請求項３５に記載の医薬。
【請求項３７】
ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項３２〜３６のいずれかに記載の医薬。
【請求項３８】
ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項３２〜３７のいずれかに記載の医薬。
【請求項３９】
ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療するための医薬であって、ＨＬＡクラスＩＩ分子と、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体の存在を対象に選択的に富化する剤を、該疾患を改善するのに十分な量含み、前記剤が請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドであり、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項４０】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項３９に記載の医薬。
【請求項４１】
ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項３９または４０に記載の医薬。
【請求項４２】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドがエンドソーム標的シグナルを含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の医薬。
【請求項４３】
エンドソーム標的シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む、請求項４２に記載の医薬。
【請求項４４】
ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療するための医薬であって、該疾患を改善するのに十分な量の自己由来ＣＤ４+Ｔリンパ球を含み、ここで該ＣＤ４+Ｔリンパ球がＨＬＡクラスＩＩ分子と、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体に対し特異的であり、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項４５】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項４４に記載の医薬。
【請求項４６】
ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項４４または４５に記載の医薬。
【請求項４７】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドの変異体を同定する方法であって、
請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチド、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドに結合するＨＬＡクラスＩＩ分子、およびＨＬＡクラスＩＩ分子により提示されるＭＡＧＥ−３  ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドにより刺激されるＴ細胞を選択し、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドの最初のアミノ酸残基を変異して変異体ペプチドを調製し、
ＨＬＡクラスＩＩ分子への変異体ペプチドの結合、およびＴ細胞の刺激作用を定量することを含み、ここで前記調製された変異体ペプチドがＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、ＨＬＡクラスＩＩ分子により提示されたときにＴ細胞を刺激するか否かによって、ＨＬＡクラスII分子に結合し、かつ、ＨＬＡクラスII分子によって提示されたときにＴ細胞を刺激する変異体ペプチドを同定する、前記方法。
【請求項４８】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドによるＴ細胞の刺激作用と同定された変異体によるＴ細胞の刺激作用とを、同定された変異体によるＴ細胞の刺激作用の有効性決定因子として比較する工程をさらに含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドに選択的に結合する単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプチドが、抗体、または、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメントおよびＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドに対し選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメントからなる群より選択される抗体フラグメントである、単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
ＨＬＡクラスＩＩ分子と、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体を選択的に結合する、単離されたＣＤ４+Ｔリンパ球。
【請求項５３】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項５２に記載の単離されたＣＤ４+Ｔリンパ球。
【請求項５４】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項５２または５３に記載の単離されたＣＤ４+Ｔリンパ球。
【請求項５５】
ＨＬＡクラスＩＩ分子と、請求項１〜８のいずれかに記載のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体を含む、単離された抗原提示細胞。
【請求項５６】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項５５に記載の単離された抗原提示細胞。
【請求項５７】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩＩ−結合ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項５５または５６に記載の単離された抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はＨＬＡクラスII分子によりTリンパ球に結合し提示される腫瘍関連遺伝子産物ＭＡＧＥ−３のフラグメントに関する。該ペプチド、かかるペプチドをコードする核酸分子、ならびに関連抗体およびＣＤ４+Ｔリンパ球は、とりわけ診断および治療の分野において有用である。
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物の免疫系が外来または異質の物質を認識し、反応する過程は複雑である。その系の有用な局面はＴ細胞応答であり、それは一部、ＣＤ４またはＣＤ８細胞表面タンパク質のいずれかに陽性の成熟Ｔリンパ球からなる。Ｔ細胞はヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）または主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれるペプチドまたは分子の他の細胞上細胞表面複合体を介して他の細胞を認識し、相互作用する。該ペプチドはより大きな分子から誘導され、該細胞により処理加工されて、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子をも提示する。メイル（Male）ら、Advanced Immunology（J. P. リピンコット・カンパニー、１９８７）、特に第６〜１０章参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体の相互作用は制限されており、ＨＬＡ分子とペプチドの特異複合体に対する特異Ｔ細胞を必要とする。もし特異Ｔ細胞が存在しなければ、パートナー複合体が存在したとしてもＴ細胞応答はない。同様に、もし該特異複合体が存在しなければ、Ｔ細胞が存在しても応答は起こらない。上記のメカニズムは外来物質に対する免疫系の応答、自己免疫病理、また、細胞性異常に対する応答に関与している。
【０００３】
外来抗原に対するＴ細胞応答は細胞溶解性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球双方を包含する。ＣＤ８+細胞毒性または細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とは、それが活性化されたとき、ＨＬＡクラスＩ分子により提示される適切な抗原を提示する細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞はマクロファージと抗原産生Ｂ細胞を刺激するサイトカインを分泌するＴ細胞であり、該Ｂ細胞は細胞表面のＨＬＡクラスII分子により適切な抗原を提示する。
【０００４】
Ｔ細胞が外来物質を認識するメカニズムは癌にも関係している。自己由来のメラノーマを対象とする多数の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンが記載されている。幾つかの事例では、これらのクローンにより認識される抗原が特徴付けされている。デ・プラエン（De Plaen）ら、Immunogenetics ４０：３６０〜３６９（１９９４）には、「ＭＡＧＥ」ファミリー（腫瘍特異抗原をコードする遺伝子のファミリー）が記載されている。（ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４、１９９２年１１月２６日公開も参照されたい）。これら遺伝子の発現産物はペプチドに処理加工され、それが次いで細胞表面上に提示される。これが特異ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解に導く。該遺伝子は「腫瘍排除抗原前駆体」または「ＴＲＡＰ」分子をコードすると言われており、そこから誘導されるペプチドは「腫瘍排除抗原」または「ＴＲＡ」と呼ばれる。この遺伝子ファミリーのさらなる情報についてはトラバーサリー（Traversari）ら、Immunogenetics ３５：１４５（１９９２）；バン・デル・ブルッゲン（Van der Bruggen）ら、Science ２５４：１６４３（１９９１）を参照されたい。米国特許第５，３４２，７７４号も参照されたい。
【０００５】
米国特許第５，４０５，９４０号には、ＭＡＧＥノナペプチドがＨＬＡ−Ａ１分子により提示されると開示している。特定のＨＬＡ分子に対する特定ペプチドの特異性が既知であるならば、１つのＨＬＡ分子に結合し、他のものには結合しない特定のペプチドが予測される。異なる個体は異なる表現型をもつので、このことは重要である。結果として、特定のペプチドが特異ＨＬＡ分子に対するパートナーであることを同定することが診断および治療の一部となり得る一方、これらは特定のＨＬＡ表現型をもつ個体にとって唯一関連するものである。この領域の研究がさらに必要なのは、細胞の異常性が1個の特定のＨＬＡ表現型に限定されず、標的とした治療法が問題の異常細胞表現型について何らかの知識を必要とするからである。
【０００６】
米国特許第５，５９１，４３０号には、さらに単離されたＭＡＧＥ−３ペプチドがＨＬＡ−Ａ２分子により提示されると開示している。したがって、ある1個のＴＲＡＰは複数のＴＲＡを産生することが可能である。
【０００７】
上記の文献はＨＬＡクラスＩ分子により提示される腫瘍排除抗原の単離および／または特徴付けにつき記載している。これらのＴＲＡはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化と増殖を誘導し、ＣＴＬがＴＲＡをコードする腫瘍関連遺伝子（例えば、ＭＡＧＥ遺伝子）を発現する腫瘍細胞を認識する。
【０００８】
抗腫瘍免疫におけるＣＤ４+Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）の重要性は動物モデルにおいて証明されており、そこではこれらの細胞が共同作業およびエフェクター機能を発揮するのみならず、免疫記憶を維持するのにも重要である（総説；トパリアン（Topalian）、Curr. Opin. Immunol. ６：７４１〜７４５、１９９４）。さらに、これらの研究は腫瘍特異免疫性が劣るのは不適切なTヘルパー細胞の活性化によるという論点を支持している。
【０００９】
最近証明されたことは、チロシナーゼ遺伝子がＨＬＡクラスII分子により提示されるペプチドをコードし、そのペプチドがＣＤ4+Ｔリンパ球を刺激することである（トパリアン（Topalian）ら、１９９４；イー（Yee）ら、J. Immunol. １５７：４０７９〜４０８６、１９９６；トパリアンら、J. Exp. Med. １８３：１９６５〜１９７１、１９９６）。
【００１０】
今回発見されたことは、ＭＡＧＥ−3遺伝子がＨＬＡクラスII結合ペプチドであるさらなる腫瘍排除抗原をコードしていることである。これらのペプチドは、ＨＬＡクラスII分子を有する抗原提示細胞により提示された場合、ＣＤ4+Ｔリンパ球の活性化と増殖を効率的に誘導する。
本発明につき以下の記載により詳細に述べる。
【００１１】
（発明の要約）
本発明はＨＬＡクラスII分子に結合する単離されたＭＡＧＥ−3ペプチドおよびかかるペプチドの機能的変異体を提供し、該機能的変異体はＭＡＧＥ−３ペプチド配列に対する1個または２以上のアミノ酸の付加、置換または欠失したものからなる。本発明はまた、かかるペプチドをコードする単離された核酸分子、これらの核酸分子を含む発現ベクター、これら核酸分子をトランスフェクトした宿主細胞、およびこれらペプチドおよび該ペプチドとＨＬＡクラスII抗原提示分子との複合体に対する抗体を提供する。該ペプチドとＨＬＡクラスII抗原提示分子との複合体を認識するＴリンパ球も提供される。前記分子を包含するキットとワクチン組成物もさらに提供される。これらはＭＡＧＥ−３の発現を特徴とする疾患の診断または治療に使用することができる。ＭＡＧＥファミリーのポリペプチドおよび核酸のメンバーは、有意な配列同一性および機能的相同性（例えば、腫瘍抗原および前駆体として）を共有することが知られているので、本発明はＭＡＧＥ−３以外のＭＡＧＥファミリーメンバーから誘導されるＨＬＡ結合ペプチドをも包含する。したがって、本明細書に含まれるＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドについての開示、かかるペプチドを含む組成物、およびかかるペプチドの同定および使用法も、ＭＡＧＥ腫瘍関連抗原ファミリーの他のメンバーに当てはまることが理解される。
【００１２】
本発明の１側面によると、単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、ＨＬＡクラスII分子に結合する配列番号２のアミノ酸配列のフラグメント、または1個または２以上のアミノ酸の付加、置換または欠失を含むその機能的変異体からなるものが提供される。１態様における単離されたペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。特定の態様において、単離されたＨＬＡクラスII結合ペプチドは配列番号３、配列番号４、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。好適な態様において、単離されたペプチドは配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。さらに好ましくは、単離されたペプチドは配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。特定の態様において、単離されたペプチドはエンドソーム標的シグナル、好ましくはヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む。本発明の他の態様において、単離されたＨＬＡクラスII結合ペプチドは非水解性である。好ましい非水解性ペプチドはＤ−アミノ酸を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ2］−ケトメチレン・ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレン・ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｏ］−ペプチド結合を含むペプチド、および−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｓ］−チオメチレン・ペプチド結合を含むペプチドからなる群より選択される。
【００１３】
本発明の他の側面によると、単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドと単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを含む組成物が提供される。特定の態様において、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドとＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドはポリトープポリペプチドとして結合される。他の態様において、組成物中の単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的変異体からなる。好ましくは、組成物中の単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。より好ましくは、単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。前記組成物の特定態様において、単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドはエンドソーム標的シグナルを含む。好ましくは、エンドソーム標的シグナルはヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む。
【００１４】
本発明の他の側面によると、前記ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドのいずれかをコードする単離された核酸が提供される。好ましくは、該核酸は配列番号１３を含む。
【００１５】
本発明のさらに他の側面によると、発現ベクターが提供される。該発現ベクターはプロモーターに作動可能に結合させた前記単離核酸のいずれかを含む。好適な態様において、該核酸は配列番号１３を含む。他の態様において、該発現ベクターはさらにＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子をコードする核酸を含む。
【００１６】
さらに本発明の他の側面によると、上記発現ベクターのいずれかをトランスフェクトまたはいずれかでトランスフォームした宿主細胞が提供される。ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子を発現し、また上記発現ベクターのいずれかをトランスフェクトまたはいずれかでトランスフォームした宿主細胞が提供される。
【００１７】
本発明の他の側面によると、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに特異的なＣＤ４+Ｔリンパ球でＴリンパ球母集団を選択的に富化する方法が提供される。該方法は単離したＴリンパ球母集団を、該ＣＤ４+Ｔリンパ球で単離したＴリンパ球母集団を選択的に富化するのに十分な量の、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を提示する剤と接触させることからなる。特定の態様において、該剤は、ＭＡＧＥ−３タンパク質またはそのＨＬＡクラスII結合フラグメントと接触させた抗原提示細胞である。好適な態様において、ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子であり、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。前記方法の特定態様において、単離されたＭＡＧＥ−３タンパク質またはそのＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的シグナルを含む。好ましくは、エンドソーム標的シグナルはヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む。
【００１８】
本発明のさらなる側面によると、ＭＡＧＥ−３の発現を特徴とする疾患の診断法が提供される。該方法は対象から単離した生物学的サンプルをＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに特異的な剤と接触させ、該剤とＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドとの間の相互作用を該疾患の決定因子として同定することからなる。特定の態様において、該ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好適な態様において、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。
【００１９】
本発明の他の側面によると、ＨＬＡクラスII分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの発現により特徴づけられる疾患の診断法が提供される。該方法は対象から単離した生物学的サンプルを該複合体に結合する剤と接触させ、該複合体と該剤との間の結合を疾患の決定因子として同定することからなる。幾つかの態様において、ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などであって、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。
【００２０】
ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療する方法が本発明の他の側面において提供される。該方法は該疾患を改善するのに十分な量のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを対象に投与することからなる。特定の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。特定の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的シグナル、好ましくは、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分からなる。
【００２１】
本発明のさらに他の側面によると、ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療する方法が提供される。該方法はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドおよび該疾患を改善するのに十分な量のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを対象に投与することからなる。特定の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好ましくは、該ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。上記方法の特定態様において、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ−結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドはポリトープポリペプチドとして結合される。さらに他の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的シグナル、好ましくは、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分からなる。
【００２２】
本発明のさらに他の側面によると、ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療する方法が提供される。該方法は、ＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの複合体の存在を対象に選択的に富化する剤を、該疾患を改善するのに十分な量、対象に投与することからなる。好ましくは、ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などである。特定の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。特定の態様において、該剤はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを含む。好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的シグナルを含む。好ましくは、エンドソーム標的シグナルはヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的部分を含む。
【００２３】
ＭＡＧＥ−３の発現により特徴づけられる疾患を有する対象のさらなる治療法が本発明の他の側面において提供される。該方法は該疾患を改善するのに十分な量の自己由来ＣＤ４+Ｔリンパ球を対象に投与することからなり、その場合、ＣＤ４+Ｔリンパ球はＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドからなる複合体に対し特異的である。好ましくは、ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などである。特定の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。
【００２４】
本発明の他の態様によると、単離されたポリペプチドが提供される。該単離されたポリペプチドは選択的にＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに結合するが、その条件として単離されたポリペプチドはＨＬＡクラスII分子ではないものとする。特定の態様において、単離されたポリペプチドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。他の態様において、単離されたポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメントまたはＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに対し選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメントからなる群より選択される抗体フラグメントである。
【００２５】
本発明のさらに他の側面によると、単離されたＣＤ４+Ｔリンパ球が提供される。単離されたＣＤ４+Ｔリンパ球は選択的にＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドからなる複合体に結合する。好ましくは、ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子である。一部の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好ましくは、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。
【００２６】
本発明のさらに他の側面によると、単離された抗原提示細胞が提供される。単離された抗原提示細胞はＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドからなる複合体を含んでいる。好ましくは、ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子である。特定の態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体からなる。好適な態様において、該ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される。
【００２７】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの機能的変異体を同定する方法が本発明の他の側面により提供される。該方法によると、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチド、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに結合するＨＬＡクラスII結合分子、およびＨＬＡクラスII結合分子により提示されるＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドにより刺激されるT細胞が選択される。ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの最初のアミノ酸残基を突然変異に付し、変異体ペプチドを調製する。次いで、ＨＬＡクラスII結合分子への変異体ペプチドの結合、およびＴ細胞の刺激作用が定量されるが、その際、ＨＬＡクラスII結合分子への変異体ペプチドの結合およびＨＬＡクラスII結合分子により提示される変異体ペプチドによるＴ細胞の刺激作用は、変異体ペプチドが機能的変異体であることを示す。好適な態様において、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる。より好ましくは、該ペプチドは配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる。特定の態様において、該方法はさらにＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドによるＴ細胞の刺激作用と機能的変異体によるＴ細胞の刺激作用を、機能的変異体によるＴ細胞の刺激作用の有効性決定因子として比較する工程からなる。
【００２８】
本発明はまた、上記医薬または本明細書全体に記載の医薬の１種または２以上を含む医薬製剤を提供する。かかる医薬製剤は医薬的に許容し得る希釈担体または賦形剤を含んでもよい。
本発明のこれらの目的および他の目的を本発明の詳細な説明との関連でさらに詳細に説明する。
【００２９】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＭＡＧＥ−３に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞系を得るために用いるプロトコールの図式である。
図２は、ＣＤ４-Ｔ細胞系Ｂ６およびＦ３が、組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質を処理加工した自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞を認識したことを示すグラフである。
図３は、外来性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞のＣＤ４+Ｔ細胞クローンによる認識が、抗−ＨＬＡ ＤＲモノクローナル抗体により阻害されることを示すグラフである。
図４は、ＣＤ４+クローンＢ６／３４、Ｂ６／３７、Ｆ３／３７およびＦ３／４０による認識について、ＭＡＧＥ−３ペプチドのスクリーニング結果を詳細に示すグラフである。
図５は、ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（MAGE−３111-126、配列番号３）またはＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−３115-130、配列番号４）でパルスしたＣＤ４’クローンＢ６／３４およびＢ６／３７ＥＢＶ−ＢによるＴＮＦとＩＮＦ−γ産生刺激を描出するグラフである。
図６は、ペプチドＭＡＧＥ−３111-126またはＭＡＧＥ−３115-130でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞がクローンＢ６／３４およびＢ６／３７の増殖を誘導したことを示すグラフである。
図７は、ペプチドＭＡＧＥ−３115-130に対するＣＤ４’クローンＢ６／３７の応答がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２に制限されることを示すグラフである。
図８は、ＭＡＧＥ−３115-130から誘導される末端切除ペプチドでパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞に対するクローンＢ６／３７の反応性を示すグラフである。
図９は、ＣＤ４Ｔ細胞クローン４２６／Ｂ６．３７（抗−ＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３）による末端切除ＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
図１０は、ＣＴＬクローン４３４／１（抗−ＭＡＧＥ−３．Ａ１）による末端切除ＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
図１１は、ＣＴＬ４３４／１（抗−ＭＡＧＥ−３．Ａ１）による末端切除ＭＺ２ＥＢＶの溶解を示す。
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＤ４Ｔ細胞クローン４２６／Ｂ６．３７（抗−ＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３）およびＣＴＬクローン４３４／１（抗−ＭＡＧＥ−３．Ａ１）による形質導入ＭＺ２−ＭＥＬ．４３の認識をそれぞれ示す。
図１３は、不変鎖（Ｉｉ）とＬＡＭＰ−１ ＭＡＧＥ−３融合タンパク質のレトロウイルス構築物の模式図である。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明はＨＬＡクラスII分子により提示される単離されたＭＡＧＥ−３ペプチドを提供するが、該ペプチドはＣＤ４+Ｔリンパ球の増殖と活性化を促進する。本明細書において、かかるペプチドは「ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド」および「ＨＬＡクラスII結合ペプチド」と呼称する。したがって、本発明の１側面は配列番号１１のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドである。
【００３１】
下記例はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドであるペプチドの単離を示す。これら例示のペプチドは配列番号１で示される核酸の処理加工された翻訳産物である。当業者がそういうものとして認識するように、翻訳産物はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとなり、それが提示のための最終形状に処理されるが、該産物はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを包含する長さの鎖長または配列のものであればよい。下記例に示すように、少なくとも１０個のアミノ酸であって、かつ、ＭＡＧＥ−３タンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列と同じ大きさのペプチドまたはタンパク質が適切に処理加工されて、ＨＬＡクラスII分子により提示され、ＣＤ４+Ｔリンパ球を刺激するのに有効となる。ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、例えば、配列番号１１のペプチドはそのいずれかの末端または両端に付加した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または１１以上のアミノ酸を有していてもよい。かかるペプチドの抗原性部分は生理的条件下、ＨＬＡクラスII分子による提示のために切り出される。さらなるＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ならびにＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドは、当業者が本明細書の記載に従い同定することができる。
【００３２】
実施例に記載の手法を利用し、ＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドを同定することができる。このように、例えば、正常供血者の樹枝状細胞などの抗原提示細胞に組換えＭＡＧＥタンパク質（またはそのフラグメント）を導入することができるが、その処理は、該細胞をＭＡＧＥポリペプチドと接触させるか、または該細胞に対象のＭＡＧＥタンパク質発現用の核酸分子を導入することにより行う。次いで、該抗原提示細胞を用い、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを認識する特異ＣＤ４リンパ球の活性化と増殖を細胞外で誘発することができる。該ペプチドの配列は、次いで、実施例記載のとおりに、例えば、ＣＤ４リンパ球の活性化と増殖を刺激するのに用いたＭＡＧＥタンパク質のペプチドフラグメントで細胞を刺激することにより決定することができる。あるいは、抗原提示細胞にＭＡＧＥタンパク質から誘導されるペプチドを導入してもよい。例えば、ＨＬＡクラスII分子に結合する共通アミノ酸配列に基づき、候補ＨＬＡクラスII結合ペプチドであるＭＡＧＥファミリータンパク質から誘導されるペプチド配列を予測することができる。この点に関しては、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３１８２およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０１３７３を参照されたい。このように選択されるペプチドを本明細書記載のアッセイ法に使用し、特異ＣＤ４リンパ球の誘発とペプチドの同定が可能である。ＨＬＡクラスII結合ペプチドを選択・試験する追加的な方法は技術上既知である。
【００３３】
上述のように、本発明はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を包含する。本明細書にて使用する場合、「機能的変異体」またはＨＬＡクラスII結合ペプチドの「変異体」は、ＨＬＡクラスII結合ペプチドの一次アミノ酸配列に１または２以上の修飾があり、かつ、本明細書に記載したＨＬＡクラスIIおよびＴ細胞レセプター結合性を保持するペプチドである。ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を創製する修飾は、例えば、１）ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体の性質、例えば、発現系におけるペプチドの安定性またはＨＬＡ−ペプチド結合などのタンパク質−タンパク質結合の安定性を増強すること；２）ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに対し新たな活性または性質を与えること、例えば、抗原性エピトープの付加または検出可能な部分を付加すること；または３）同一または同様のＴ細胞刺激性を生じる異なるアミノ酸配列を与えること；により実施される。ＭＡＧＥ−３（同様にＭＡＧＥファミリー）ＨＬＡクラスII結合ペプチドに対する修飾は該ペプチドをコードする核酸に対して実施可能であり、欠失、点突然変異、末端切除、アミノ酸置換およびアミノ酸付加を包含する。あるいは、修飾は該ポリペプチドに直接実施することも可能であり、例えば、切断、リンカー分子の付加、ビオチンなど検出可能な部分の付加、脂肪酸の付加、アミノ酸を他のアミノ酸に置換することなどである。変異体はペプチドのライブラリーから選択することも可能であり、それはランダムペプチドであっても、１以上の位置に置換を有するＭＡＧＥペプチドの配列に基づくペプチドであってもよい。例えば、ペプチド・ライブラリーはＨＬＡクラスII分子に結合したＭＡＧＥペプチドの複合体との競合アッセイに使用することができる（例えば、ＭＡＧＥペプチドを導入した樹枝状細胞）。ＭＡＧＥペプチドがＨＬＡクラスII分子に結合するのと競合するペプチドについて配列決定し、他のアッセイ（例えば、ＣＤ４リンパ球増殖）に用いてＭＡＧＥペプチドの機能的変異体としての安定性を決定することができる。
【００３４】
修飾はＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチド・アミノ酸配列の全部または一部を含む融合タンパク質、例えば、本明細書記載の不変鎖−ＭＡＧＥ−３融合タンパク質などをも包含する。本発明はこのようにＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドおよびヒト不変鎖（Ｉｉ）などのエンドソーム標的シグナルを含む融合タンパク質を包含する。下記開示のように、ヒト不変鎖のエンドソーム標的部分をＭＡＧＥ−３へ融合することにより、ＭＡＧＥ−３が効率的にＨＬＡクラスIIペプチドの提示経路に目標を定めることとなる。ヒト不変鎖の「エンドソーム標的部分」または他の標的ポリペプチドとは、第二のポリペプチドに融合または結合したときに、第二のポリペプチドのエンドソーム局在化を増加させる分子の当該部分である。このように、エンドソーム標的部分はヒト不変鎖Ｉｉなどの標的ポリペプチドの全配列または小部分のみを含むものであってもよい。当業者は標的分子のエンドソーム標的部分を容易に決定することができる。
【００３５】
驚くべきことに、ＬＡＭＰ−１タンパク質のエンドソーム標的部分を融合しても、ＨＬＡクラスIIペプチドの提示経路に対するＭＡＧＥ−３の標的化が有意に増大することはなかった。したがって、本発明はＭＡＧＥ−３と、ＬＡＭＰ−１ではないヒト不変鎖Ｉｉとの融合タンパク質が、ＨＬＡクラスIIペプチドの提示経路に効率的に目標を定めるという予期せざる知見を包含する。さらなるエンドソーム標的シグナルは当業者が同定し得るものであり、ＭＡＧＥ−３またはそのＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合部分に融合し、次いで、ＨＬＡクラスIIペプチドの提示経路に対する標的化について、極めて通常の実験手法によりテストすることができる。
【００３６】
ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列は天然産または非天然産由来のものであり、すなわち、それらは天然のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチド分子からなるか、あるいは修飾されたアミノ酸配列であって、それが提示されたときに安定性を保持してヘルパーＴ細胞を刺激し、かつ、ＨＬＡ ＤＲＢ１／１３分子などのＨＬＡクラスII分子に結合する性質を保持する鎖長のものからなる。例えば、これに関連するＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとそれに無関係のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３、４、９、１０および１１に示されたアミノ酸配列の合成ペプチド、標識ペプチド、ＭＡＧＥ−３発現癌の対象から単離したペプチド、ＭＡＧＥ−３を発現する培養細胞から単離したペプチド、非ペプチド分子に結合したペプチド（例えば、ある種の薬物送達システム）および配列番号１１のアミノ酸配列を含む他の分子であってもよい。
【００３７】
好ましくは、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは非水解性である。かかるペプチドを提供するために、非水解性ペプチドのライブラリーからＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを選択することができるが、例えば、１個または２以上のＤ−アミノ酸を含むペプチドまたはアミノ酸に結合する１個またはそれ以上の非水解性ペプチド結合を含むペプチドなどである。あるいは、ＣＤ４’Ｔリンパ球を誘発するのに最適なペプチドを選択し、かかるペプチドを必要に応じて修飾しプロテアーゼによる水解能力を減じることが可能である。例えば、タンパク質分解開裂に対する感受性を決定するために、ペプチドを標識して細胞抽出物または精製プロテアーゼと培養し、次いで単離してどのペプチド結合がタンパク水解に感受性であるかを、例えば、ペプチドとタンパク分解フラグメントの配列を決定することにより決定することができる。あるいは、潜在的に感受性のペプチド結合は、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列を一連のプロテアーゼの既知開裂部位特異性と比較することにより同定することができる。かかるアッセイの結果に基づき、タンパク分解に感受性の個々のペプチド結合は、ペプチドの生体外合成により非水解ペプチド結合に置換えることができる。
【００３８】
多くの非水解性ペプチド結合は、かかる結合を含むペプチドの合成手法と共に技術的に既知である。非水解性結合は−ｐｓｉ［ＣＨ2ＮＨ］−還元アミドペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ2］−ケトメチレン・ペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレン・ペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｏ］−ペプチド結合、および−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｓ］−チオメチレン・ペプチド結合を包含する。
【００３９】
ペプチドの非ペプチド類似体、例えば、安定化構造を備えたものまたは生分解性を減じたものも考慮される。ペプチド疑似類似体は選択したＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに基づき、１個または２以上の残基を非ペプチド部分に置換えることにより調製することができる。好ましくは、非ペプチド部分はその生来のコンホメーションを保持するか、または好ましい、例えば、生物活性なコンホメーションを安定化するペプチドを可能とする。かかるペプチドは分子または細胞ベースの結合アッセイ法で試験し、コンホメーションおよび／または活性に対する置換基の影響を評価することができる。ペプチドから非ペプチド疑似類似体を調製する方法の一例が、ナッハマン（Nachman）ら、Regul. Pept. ５７：３５９〜３７０（１９９５）に記載されている。
【００４０】
もし変異体が配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列に変化を含むものであるなら、同類アミノ酸置換を有するＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体が典型的で好ましいであろう、すなわち、置換は当初のアミノ酸の性質、例えば、電荷、疎水性、コンホメーションなどを保持する。アミノ酸の同類置換の例としては、以下のグループ内でのアミノ酸の中でなされた置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００４１】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を同定する他の方法はストロミンガーおよびヴッヒェルプッフニヒ（Strominger and Wucherpfennig）の公開ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３１８２）に提供されている。これらの方法はアミノ酸配列モチーフの展開に依存しており、それに対し潜在的なエピトープを比較することができる。各モチーフはアミノ酸配列の限定されたセットを描写し、そこで各（関係）位置での残基が（ａ）単一の残基に限定されるか、（ｂ）制限された残基のセットの中で変わることを許されるか、または（ｃ）すべての可能な残基の中で変わることを許される。例えば、モチーフは、第１位置の残基が、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはフェニルアラニン残基のいずれか１つであること；第２位置の残基がヒスチジンであらねばならないこと；第３位置の残基がいずれのアミノ酸残基であってもよいこと；第４位置の残基が、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン残基のいずれか１つであること；また第５位置の残基がリジンであらねばならないことを特定する。
【００４２】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体に対する配列モチーフは、主要組織適合性遺伝子複合体ＨＬＡ−ＤＲタンパク質の結合ドメインもしくは結合ポケットおよび／または本明細書記載のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドのＴ細胞レセプター（「ＴＣＲ」）接点を分析することにより開発することができる。ＨＬＡクラスII結合ポケットの形成に関与する残基の詳細な構造分析を提供することにより、ＭＡＧＥペプチドがＨＬＡクラスIIタンパク質のいずれかに結合する配列モチーフを予測することが可能となる。
【００４３】
これらの配列モチーフを探索、評価、またはデザインの基準として用いることにより、特定のＨＬＡ分子に結合する、また、Ｔ細胞レセプターと相互作用してＴ細胞応答を誘導する、理に適った可能性を有する一連のペプチド（例えば、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、特に本明細書記載のＭＡＧＥ−３ペプチド、およびその機能的変異体）を同定することが可能となる。これらのペプチドは合成可能であり、本明細書記載の活性について試験することができる。これらモチーフの用途は、純正配列相同性（抗原性として同一であるが、配列が全く異なる多くのペプチドは除く）または無制限の「同類」置換（臨界高次保存部位において異なる多くのペプチドを含む）に対立するものとして、病気の治療に潜在的に応用可能なペプチドを当業者が評価することのできる方法を表す。
【００４４】
ストロミンガーおよびヴッヒェルプッフニヒ（Strominger and Wucherpfennig）のＰＣＴ出願およびそこに引用された文献は、そのすべてが引用により取り込まれるが、そこにＨＬＡクラスIIペプチドの残基と接触するＨＬＡクラスIIおよびＴＣＲの結合ポケットを開示している。ＨＬＡクラスIIおよび／またはＴＣＲの結合ポケットに結合する見込みのある残基を一定のものとするか、あるいは特定の置換のみを可能とすることにより、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体をＨＬＡクラスIIおよびＴ細胞レセプターに持続的に結合するように調製することができる。
【００４５】
このように、さらにＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスIIペプチド、特にＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドおよびその機能的変異体を同定する方法が提供される。一般に、ＭＡＧＥタンパク質は上述の分析に付され、ペプチド配列が選択され、次いで上記の試験に付される。ＭＡＧＥ−３に関して、例えば、該方法はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに結合するＨＬＡクラスII結合分子、およびＨＬＡクラスII結合分子によって提示されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドにより刺激されるＴ細胞を選択することからなる。好ましい態様において、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる。より好ましくは、該ペプチドは配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列からなる。ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの最初のアミノ酸残基を変異させ、変異体ペプチドを調製する。該アミノ酸残基は、上記ストロミンガーおよびヴッヒェルプッフニヒ（Strominger and Wucherpfennig）のＰＣＴ出願に記述されたＨＬＡとＴ細胞レセプター接合点の原理に従い変異させることができる。変異体ペプチドを調製する方法はいかなる方法も採用し得るが、例えば、変異体ペプチドの合成、変異核酸分子を用い変異体ペプチドを組換えにより産生させる方法などである。
【００４６】
変異体ペプチドがＨＬＡクラスII結合分子に結合し、Ｔ細胞を刺激することは、標準的手法に従い決定される。例えば、以下に例示するように、変異体ペプチドはＭＡＧＥ−３ペプチドに結合するＨＬＡクラスII分子を含む抗原提示細胞と接触させ、変異体ペプチドと抗原提示細胞との複合体を形成させることができる。この複合体は次いでＨＬＡクラスII結合分子により提示されるＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを認識するＴ細胞と接触させることができる。Ｔ細胞はＭＡＧＥ−３の発現を特徴とする症状の対象から得ることができる。Ｔ細胞による変異体ペプチドの認識は、ＴＮＦまたはＩＦＮγ産生などのＴ細胞刺激の指標を測定することにより決定することができる。同様の手法を他のＭＡＧＥファミリー ＨＬＡクラスII結合ペプチドの同定と特徴付けのために実施することができる。
【００４７】
ＨＬＡクラスII結合分子に変異体ペプチドを結合させ、ＨＬＡクラスII結合分子により提示される変異体ペプチドによりＴ細胞を刺激すると、変異体ペプチドが機能的変異体であることが分かる。この方法はまた、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と変異体ペプチドによるＴ細胞の刺激とを、機能的変異体によるＴ細胞刺激の有効性を決定するものとして比較する工程からなる。機能的変異体をＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと比較することにより、Ｔ細胞刺激性の上昇したペプチドを調製し得る。
【００４８】
前記いずれかの方法で調製したＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの変異体は、要すれば、配列決定してアミノ酸配列を決定し、かくしてかかる変異体をコードするヌクレオチド配列を推定することができる。
【００４９】
また、本発明の一部はＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはその変異体をコードするこれら核酸配列および上記ヌクレオチド配列からなる核酸分子にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする他の核酸配列である。本明細書にて使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は技術上周知のパラメーターをいう。核酸のハイブリダイゼーションパラメーターはかかる方法を集約した、例えば、以下の文献に見出される。分子クローニング：実験室マニュアル；サムブルーク（J．Sambrook）ら、編纂、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９；または分子生物学における最新のプロトコール、オウスベル（F.M. Ausubel）ら、編纂、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ・インク、ニューヨーク。より詳しくは、ストリンジェントな条件とは、本明細書にて使用する場合、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％ファイコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃でハイブリダイゼーションすることをいう。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムである；また、ＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを転写した膜は室温にて２×ＳＳＣで洗浄し、次いで６５℃で０．１×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて洗浄する。
【００５０】
他にも使用し得る条件、試薬、等々があるが、これらも同程度のストリンジェンシーに帰着する。当業者はかかる条件に習熟しており、それをここでは記載しない。しかし、理解すべきことは、当業者であれば、当該条件を操作することが可能であって、その方法で本発明のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸の相同染色体および対立遺伝子を明確に同定し得ることである。当業者はまた、定法どおりに分離したかかる分子発現のための細胞とライブラリーをスクリーニングすること、次いで関連する核酸分子を単離し、配列決定する方法論に精通している。
【００５１】
一般に、相同染色体および対立遺伝子は、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド（配列番号３、４、９、１０または１１など）またはかかるペプチドをコードする核酸に対し、典型的には少なくとも５０％のアミノ酸同一性および／または少なくとも４０％のヌクレオチド同一性をそれぞれ共有する。ある場合には、相同染色体および対立遺伝子は、少なくとも５０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも６５％のアミノ酸同一性を共有し、さらに他の場合には、少なくとも６０％ヌクレオチド同一性および／または少なくとも７５％のアミノ酸同一性を共有する。前記核酸の相補鎖も本発明に包含される。
【００５２】
ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸をスクリーニングするに際し、核酸のハイブリダイゼーション、例えば、サザーンブロットまたはノーザンブロットが32Ｐプローブと共に前記条件を用い実施し得る。ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードするＤＮＡが最終的に転写された膜を洗浄した後、該膜をＸ線フィルム上に置き、放射活性シグナルを検出することができる。
【００５３】
本発明はまた、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの同一アミノ酸残基をコードする代替コドン含有核酸配列の使用を包含する。例えば、本明細書に記載のように、ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（配列番号３）はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドである。ロイシン残基（配列番号３のアミノ酸Ｎｏ．６、１０、１１および１２）はコドンＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡおよびＵＵＧによりコードされる。６種のコドンはそれぞれロイシン残基をコードする目的にとって等価である。このように、当業者に明らかなことは、ロイシンをコードするヌクレオチドトリプレットはいずれを採用してタンパク質合成装置に指令しても、生体外または生体内でロイシン残基を組込むことができることである。同様に、配列番号３のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを構成する他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドトリプレットは以下のとおりである：ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＡＡおよびＡＡＧ（リジンコドン）；ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧおよびＧＵＵ（バリンコドン）；ＧＡＡおよびＧＡＧ（グルタミンコドン）；ＣＡＣおよびＣＡＵ（ヒスチジンコドン）；ＵＵＣおよびＵＵＵ（フェニルアラニンコドン）；およびＵＡＣおよびＵＡＵ（チロシンコドン）。他のアミノ酸残基は同様に多様なヌクレオチド配列によりコードされてもよい。このように、本発明は、遺伝子コードの縮重のために本来のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチド・コード核酸とはコドン配列において異なる変性核酸を包含する。
【００５４】
また理解されることは、本発明は発現ベクターの配列の使用、並びに、宿主細胞および細胞系へのトランスフェクトを包含することであり、これら細胞系は原核細胞系（例えば、大腸菌）または真核細胞系（例えば、樹枝状細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現系）である。発現ベクターは、関連する配列、すなわち上記の配列がプロモーターに作動可能に連接していることを必要とする。ヒトＨＬＡ−ＤＢＲ１／１３２０分子がＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを提示することが判明しているので、発現ベクターはＨＬＡ−ＤＢＲ１／１３分子をコードする核酸配列を含んでいてもよい。（他のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドについては、異なるＨＬＡ分子を用いることができる）。ベクターが両方の配列を含んでいる場合には、それを用いて、通常いずれか一方を発現しない細胞にトランスフェクトすることができる。ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドコーディング配列は、例えば、宿主細胞がすでにＨＬＡ−ＤＢＲ１／１３分子を発現している場合、単独で使用することができる。勿論、２つのコーディング配列を含むベクターは要すればＨＬＡ−ＤＢＲ１／１３分子を発現しない宿主細胞中で使用することができるので、使用し得る宿主細胞に特に制限はなく、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸はＨＬＡ−ＤＢＲ１／１３分子を発現する抗原提示細胞中で使用することができる。本明細書にて使用する場合、「ＨＬＡ−ＤＢＲ１／１３分子」は以下のサブタイプを包含する：ＤＲＢ１*１３０１、ＤＲＢ１*１３０２、ＤＲＢ１*１３０３１、ＤＲＢ１*１３０３２、ＤＲＢ１*１３０４、ＤＲＢ１*１３０５、ＤＲＢ１*１３０６、ＤＲＢ１*１３０７、ＤＲＢ１*１３０８、ＤＲＢ１*１３０９、ＤＲＢ１*１３１０、ＤＲＢ１*１３１１、ＤＲＢ１*１３１２、ＤＲＢ１*１３１４、ＤＲＢ１*１３１５、ＤＲＢ１*１３１６、ＤＲＢ１*１３１７、ＤＲＢ１*１３１８、ＤＲＢ１*１３１９、ＤＲＢ１*１３２０、ＤＲＢ１*１３２１、ＤＲＢ１*１３２２、ＤＲＢ１*１３２３およびＤＲＢ１*１３２４。
【００５５】
本明細書にて使用する場合、「ベクター」は異なる遺伝子環境間の移送のためにまたは宿主細胞での発現のために、そこに所望の配列を制限および連結反応により挿入し得る多くの核酸のいずれであってもよい。ベクターはＲＮＡベクターも利用し得るが、一般にはＤＮＡから構成される。ベクターとしてはプラスミド、ファージミド、およびウイルスゲノムを包含するが、これらに限定されるものではない。クローニングベクターは宿主細胞中で複製可能なものであり、また、さらに１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位により特徴づけられるものであるが、該制限部位ではベクターが確定的な様式で切断され、そこに所望のＤＮＡ配列を連接し、新しい組換えベクターが宿主細胞での複製能力を保持するようにする。プラスミドの場合には、所望配列の複製は宿主細菌内でのプラスミドのコピー数が増加するにつれて何度も起こるか、あるいは宿主が有糸分裂により再生するまでは１宿主あたり１度のみ起こる。ファージの場合には、複製は溶菌期には活発に起こり、また溶原期には消極的である。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を制限および連結反応により挿入し得るものであり、該ＤＮＡ配列は調節配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ転写物として発現し得るようにする。ベクターはさらに、細胞が該ベクターによりトランスフォームされているかいないか、またはトランスフェクトされているかいないかの判定使用に適当な１個または２以上のマーカーを含んでもよい。マーカーは、例えば、抗性物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性を増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当該技術において既知の標準的アッセイ法によりその活性を検出し得る酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、およびトランスフォームまたはトランスフェクト細胞、宿主、コロニーまたはプラーク（例えば、緑色蛍光タンパク質）の表現型に可視的に影響する遺伝子を包含する。好適なベクターは自己複製可能なベクター、および作動可能に連結しているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物を発現し得るベクターである。
【００５６】
好ましくは、発現ベクターは、ＭＡＧＥファミリーポリペプチド（例えば、ＭＡＧＥ−３）またはそこから誘導されるＨＬＡクラスII結合ペプチドを該タンパク質またはペプチド発現細胞のエンドソームに合わせた配列を含む。ＨＬＡクラスII分子は、ＨＬＡクラスII分子に対し他の分子への結合を妨げる不変鎖（Ｉｉ）を含む。この不変鎖はエンドソーム内で切断され、それによってＨＬＡクラスII分子によるペプチドの結合を可能とする。したがって、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドおよびその前駆体（例えば、ＭＡＧＥ−３タンパク質）はエンドソームに合わせるのが好ましく、それによってＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドがＨＬＡクラスII分子に結合するのを増強する。分子をエンドソームに向かわせる標的シグナルは当該技術において既知であるが、これらのシグナルを好適に発現ベクターに組込ませ、エンドソーム標的シグナルを含む融合タンパク質を産生するようにする。サンダーソン（Sanderson）ら（Proc. Nat’l. Acad. Sci. ＵＳＡ、９２：７２１７〜７２２１、１９９５）、ウー（Wu）ら（Proc. Nat’l. Acad. Sci. ＵＳＡ、９２：１１６７１〜１１６７５、１９９５）およびトムソン（Thomson）ら（J. Virol.、７２：２２４６〜２２５２、１９９８）はエンドソーム標的シグナル（不変鎖Ｉｉおよびリソソーム会合膜タンパク質ＬＡＭＰ−１を含む）およびエンドソームおよび／またはリソソーム細胞画室に抗原を方向づけるその用法について記載している。実施例に開示するように、不変鎖−ＭＡＧＥ−３融合タンパク質が好ましい。
【００５７】
不変鎖などのエンドソーム標的シグナルもまたＭＡＧＥ−３タンパク質またはペプチドに非ペプチド結合（すなわち、非融合タンパク質）を介して結合させ、特異的にＭＡＧＥ−３を標的とすること可能な接合体を調製することができる。共有結合の特殊例は二官能性架橋分子を使用する場合のものも包含する。架橋分子はホモ二官能性であってもヘテロ二官能性であってもよく、その分子の性質に応じて結合される。ホモ二官能性架橋剤は２つの同じ反応性基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤は連続的接合反応を可能とする２つの異なる反応性基をもつものとして定義される。種々のタイプの市場入手可能な架橋剤は１個または２以上の以下の基と反応し得る；一級アミン、二級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニルおよびカルボハイドレート。当業者は、結合すべき分子の化学的性質および１個または複数個の結合の好ましい性質に基づき、過度の実験をすることなしにエンドソーム標的部分に結合する好適な分子を確認することができる。
【００５８】
本明細書にて使用する場合、コーディング配列および調節配列は「作動可能に」結合されることをいうが、その場合、コーディング配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下にあるようにそれらの配列を共有結合により結合する。該コーディング配列を機能的タンパク質に翻訳することが必要な場合、２つのＤＮＡ配列を作動可能に結合するというが、その場合、もし５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコーディング配列を転写に至らしめ、また、もし２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異を誘導せず、（２）コーディング配列を転写に向けるプロモーター領域の能力を阻害せず、または（３）タンパク質に翻訳されるべき対応ＲＮＡ転写物の能力を阻害しないならば、という条件つきである。このように、プロモーター領域が当該ＤＮＡ配列の転写を果たし、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるという条件のもとで、プロモーター領域はコーディング配列に作動可能に結合される。
【００５９】
遺伝子発現に必要な調節配列の細かい性質は種間または細胞型間で変わり得るが、一般に必要により転写と翻訳それぞれの開始に関わる５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含んでいる。特に、かかる５’非転写調節配列は作動可能に結合した遺伝子の転写制御プロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は要すればエンハンサー配列または上流活性化配列を含んでいてもよい。本発明のベクターは５’リーダーまたはシグナル配列を任意に含んでいてもよい。適切なベクターの選択および設計は当業者の能力と判断内のものである。
【００６０】
発現のために必要なすべての要素を含む発現ベクターは市販入手可能であり、当業者既知である。例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９を参照されたい。細胞は、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする非相同ＤＮＡ（ＲＮＡ）を細胞に導入することにより遺伝子工学的に調製される。当該非相同ＤＮＡ（ＲＮＡ）は転写エレメントの作動可能制御のもとに置き、宿主細胞中の非相同ＤＮＡの発現を可能とする。本明細書に記載するように、かかる発現構築物はまた、エンドソーム標的シグナル、好ましくはヒト不変鎖またはその標的フラグメントをコードするヌクレオチド配列をも任意に含む。
【００６１】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現の好適な系は、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡから入手可能）などのものであって、選択可能なマーカー、例えば、Ｇ４１８抵抗性を供与する遺伝子（安定的に移入された細胞系の選択を容易にする）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含むものである。さらに、霊長類またはイヌ細胞系での発現に適しているのはｐＣＥＰベクター（インビトロゲン）であり、エプシュタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）を複製の起源として含み、多数コピー型染色体外因子としてのプラスミドの維持を容易にする。もう一つの発現ベクターは、ポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドであり、生体外での転写を効率的に促進する。該プラスミドはミシズマおよびナガタ（Mishizuma and Nagata）（Nuc. Acids Res. １８：５３２２、１９９０）が記載しており、そのトランスフェクション実験での使用については、例えば、デムリン（Demoulin）(Mol. Cell Biol. １６：４７１０〜４７１６、１９９６)が開示している。さらに他の好適な発現ベクターは、ストラットフォード−ペリコウデット（Stratford-Perricaudet）が記載しているアデノウイルスであり、このものはＥ１およびＥ３タンパク質を欠いている（J. Clin. Invest. ９０：６２６〜６３０、１９９２）。アデノＰ１Ａ組換え体としてのアデノウイルスの使用については、Ｐ１Ａに対する免疫化のためのマウスへの皮内注射についてワーニアー（Warnier）らが記載している（Int. J. Cancer、６７：３０３〜３１０、１９９６）。
【００６２】
本発明はまた、いわゆる発現キットを包含し、該キットは当業者が所望の発現ベクターを調製することを可能とする。かかる発現キットは少なくとも２つの以前に検討した物質の少なくとも個々に分割した部分からなる。他の成分は所望どおりに加えればよい。
【００６３】
本明細書に記載するように、本発明は多くの用途を有し、その一部を本明細書に記載する。以下の用途はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドについて記載するが、同様に他のＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドの用途についても当てはまる。第一に、本発明はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現により特徴づけられる疾患を当業者が診断するのを可能にする。これらの方法は生物学的サンプル中のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体の発現を定量することからなる。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは複合体に対する結合パートナー、例えば、抗体などで検定することにより定量し得る。
【００６４】
本発明はまた、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現により特徴づけられる疾患の対象を当業者が治療することを可能とする。治療はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を対象内に富化する剤を投与し、次いでかかる複合体に特異的なＣＤ４−Ｔリンパ球を投与することからなる。前記治療に有用な剤はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドおよびその機能的変異体、かかるＭＡＧＥ−３ペプチドを含むエンドソーム標的融合タンパク質、かかるタンパク質およびペプチドを発現する核酸（該核酸を含むウイルスを包含）、かかるペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体（例えば、ＨＬＡ ＤＲＢ１／１３０２）、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を担持する抗原提示細胞などを包含する。本発明はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに特異的なＣＤ４’Ｔリンパ球に対するＴリンパ球の母集団を選択的に富化することを当業者に可能とする。
【００６５】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの単離はＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸の単離を可能とする。核酸を用い、細胞外または原核もしくは真核宿主細胞内でＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを産生させることができる。当業者周知の様々な方法を利用し、単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを得ることができる。例えば、発現ベクターを細胞内に導入し、該ペプチドの産生を誘導するこができる。他の方法では、ｍＲＮＡ転写物を細胞内にマイクロインジェクションするか、あるいは他の方法で導入し、コードされたペプチドの産生を誘導することもできる。網状赤血球ライゼート系などの細胞不含抽出液中ｍＲＮＡの翻訳系を用い、ペプチドを産生させることができる。本発明のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含むペプチド類は生体外で合成してもよい。当業者は単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを得るために、既知ペプチド単離法を容易に使用することができる。これらの方法は、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティクロマトグラフィーなどであるが、これらに限定されるものではない。これら単離されたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、または該ペプチドとＨＬＡクラスII分子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子との複合体は、アジュバントなどの物質と組合わせて、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現により特徴づけられる疾患の治療に有用なワクチンを製造することができる。さらに、ワクチンは細胞の表面上にＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド／ＨＬＡ複合体を提示している細胞、例えば、樹枝状細胞、Ｂ細胞、非増殖性移入体などから調製することができる。細胞をワクチンとして用いるすべての場合において、これらはＣＤ４+リンパ球を刺激するのに必要な成分の一方または両方に対するコーディング配列をトランスフェクトした細胞であるか、またはトランスフェクションを必要とせずに両方の分子をすでに発現している細胞である。ワクチンはまたＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはその前駆体をコードする裸のＤＮＡまたはＲＮＡを包含し、それらは生体外で生産され、そして注射、粒子衝撃、鼻吸引および他の方法により投与される。「裸の核酸」型ワクチンは裸の核酸がコードする該ペプチドに特異的なＣＴＬの生成を含む免疫応答を刺激することが証明されている（Science ２５９：１７４５〜１７４８、１９９３）。ワクチンはまたウイルス、リポソーム、または他の粒子（薬物送達に有用なポリマー粒子を含む）にパッケージ化した核酸をも包含する。
【００６６】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド並びにＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を用い、当該技術上周知の標準的技法により抗体を生産することもできる。抗体生産の一般的原理について報告している標準的参考文献は以下のとおりである：カッティ（Catty, D.）、抗体、実際的方法、第１巻、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ（１９８８）；クライン（Klein, J.）、免疫学：細胞−非細胞識別の科学、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９８２）；ケンネット（Kennett, R.）ら、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、生物分析の新次元、プレナム・プレス、ニューヨーク（１９８０）；キャンプベル（Campbell，A.）、モノクローナル抗体の技術、実験室技法および生化学と分子生物学、第１３巻（バードン（Burdon, R.）ら、編纂）、エルスビアー・アムステルダム（１９８４）；およびアイゼン（Eisen, H.N.）、微生物学、第３版、デイビス（Davis, B.I.）ら、編纂（ハーパー・アンド・ロウ、フィラデルフィア）（１９８０）。
【００６７】
このように、本発明の抗体は種々の方法、例えば、タンパク質、タンパク質のフラグメント、該タンパク質またはそのフラグメントを発現する細胞および適切なＨＬＡクラスII分子などを動物に投与し、ポリクローナル抗体を誘導するなどにより調製される。モノクローナル抗体の産生は当該技術において周知の技法に従う。本明細書に詳述するように、かかる抗体を用い、例えば、タンパク質を発現する組織を同定すること、またはタンパク質を精製することができる。また、抗体は特定の影像用標識試薬または抗癌剤、例えば、メトトレキセート、放射性ヨード化化合物、リシンなどの毒物、他の細胞増殖抑制性または細胞溶解性薬剤等々に結合することもできるが、これらに限定されるものではない。また、本発明により調製される抗体は、好ましくは、本明細書に記載の当該ペプチド／ＨＬＡ複合体に特異的である。
【００６８】
「疾患」または「症状」を本明細書にて用いる場合、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドが発現されている病的状態をいう。かかる疾患は癌、例えば、メラノーマ、頭部、頚部、肺または食道の偏平上皮癌、結腸直腸癌、骨肉腫、頭部または頚部の非偏平上皮癌、卵巣腫瘍、リンパ性白血病、膀胱癌、前立腺癌などである。
【００６９】
本開示に基づく幾つかの治療方法は、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチド提示細胞に対して対象免疫系の応答を誘導することを前提とする。かかる方法の一つはＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体に特異的な自己由来ＣＤ４+Ｔ細胞を、組織に表現型の異常細胞をもつ対象に投与することである。かかるＣＤ４+Ｔ細胞を細胞外で発生分化させることは当業者の技術範囲内のことである。一般に、対象から採取した細胞のサンプル、例えば、血液細胞を、該複合体を提示し、ＣＤ４-Ｔリンパ球を刺激する細胞と接触させ、増殖させる。標的細胞はトランスフェクタント、例えば、ＣＯＳ細胞、またはＨＬＡクラスII分子を担持する抗原提示細胞、例えば、樹枝状細胞またはＢ細胞である。これらのトランスフェクタントは対象のＣＤ４+Ｔリンパ球と組合わせたときに、その表面の所望の複合体を提示し、その増幅を刺激する。ＣＯＳ細胞は他の適切な宿主細胞同様、あまねく入手し得る。ＣＤ４+Ｔリンパ球の特異産生については下記のとおりである。クローンとして増殖したＣＤ４Ｔリンパ球を次いで対象に投与する。ＣＤ４+Ｔリンパ球は対象の免疫応答を刺激し、それによって所望の治療目的を達成する。
【００７０】
上記治療法はすくなくとも幾つかの対象の異常細胞が関連のＨＬＡ／ペプチド複合体を提示していることを前提とする。これは非常に簡単に定量することができるが、それはこの分野の技術者が特定のＨＬＡ分子を提示する細胞の同定法に、同様に、関連する配列、この場合はＭＡＧＥ−３配列であるが、このＤＮＡを発現する細胞をいかに同定するかについて精通しているからである。
【００７１】
前記の治療法が本発明により利用し得る唯一の治療形態という訳ではない。ＣＤ４+Ｔリンパ球は様々な方法で生体内刺激することができる。その方法の一つが該複合体を発現する非増殖性細胞を使用することである。この方法に使用する細胞は通常該複合体を発現する細胞、例えば、樹枝状細胞または該複合体の提示に必要な遺伝子の一方または両方をトランスフェクトした細胞である。チェン（Chen）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８８：１１０〜１１４、１９９１）は治療プログラムにＨＰＶ−Ｅ７ペプチドを発現するトランスフェクト細胞の使用についてこの方法を例示している。多様な細胞型が用い得る。同様に、対象の遺伝子の一方または両方を担持するベクターを使用し得る。ウイルスまたは細菌のベクターがとりわけ好ましい。例えば、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸は、特定の組織または細胞型においてＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現を指令するプロモーターおよびエンハンサーに作動可能に結合することができる。該核酸は発現ベクター内に組込まれる。発現ベクターは未修飾の染色体外核酸、プラスミド、またはＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸などの外来性核酸を挿入し得るように構築または修飾したウイルスゲノムなどである。ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードする核酸はレトロウイルスゲノムに挿入してもよく、それによって該核酸が標的組織または細胞型のゲノムに組込まれるのを容易にする。これらの系において、対象の遺伝子は微生物、例えば、ワクチニアウイルス、レトロウイルスまたは細菌ＢＣＧ、およびその物質の事実上の「感染」宿主細胞により担持される。得られる細胞は対象の複合体を提示し、自己由来ＣＤ４+Ｔ細胞により認識され、次いで増殖する。
【００７２】
同様の効果はＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをアジュバントと組合わせてＨＬＡクラスII提示細胞への生体内取込みを容易にすることにより達成される。もしＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドがＨＬＡクラスII結合部分より大きければ、それを要すれば処理加工してＨＬＡ分子のペプチドパートナーを産生させることが可能である一方、ＴＲＡはさらにプロセシングする必要もなく提示される。一般に、対象は皮内注射により有効量のＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを受ける。当該技術の標準的免疫化プロトコールに従い、最初の投与に続きブースター投与を行う。
【００７３】
ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをＨＬＡクラスII提示細胞に取込ませ易くする好適な方法は、エンドソーム標的シグナルをクラスII結合ペプチド含有ＭＡＧＥ−３ポリペプチドに結合させる（例えば、融合させる、接合させる）ことによる。特に好ましいのはヒト不変鎖Ｉｉを含むＭＡＧＥ−３融合タンパク質である。
【００７４】
上記組成物またはプロトコールのいずれもが細胞溶解性Ｔリンパ球応答誘導のためにＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含むことができる。例えば、以下に説明するように、ＭＡＧＥ−３タンパク質は細胞中で処理加工されてＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスII両方の応答を生じる。数種のかかるペプチドがＵＳ特許５，５８５，４６１および５，５９１，４３０、並びにゴウグラー（Gaugler）ら（J. Exp. Med. １７９：９２１〜９３０、１９９４）、バン・デル・ブルーゲン（van der Bruggen）ら（Eur. J. Immunol. ２４：３０３８〜３０４３、１９９４）、およびハーマン（Herman）ら（Immunogenetics ４３：３７７〜３８３、１９９６）に記載されている。ＨＬＡクラスＩおよびクラスII分子に結合するＭＡＧＥ−３ペプチド（またはかかるペプチドをコードする核酸）を投与することにより、Ｔヘルパー細胞とＴキラー細胞が誘発され、免疫応答性が改善されることになる。
【００７５】
さらに、非−ＭＡＧＥ−３腫瘍関連ペプチドを投与し、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスIIを介して免疫応答性を増大させることができる。癌細胞が１種または２以上の腫瘍関連遺伝子を発現することは十分に立証されている。特定の対象がさらなる腫瘍遺伝子を発現しているかどうか、そして前記のＭＡＧＥ−３組成物およびワクチンにおけるかかる遺伝子の発現産物から誘導されるＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスII結合ペプチドを含んでいるかどうかを決定することは、当業者にとって通常の実験範囲内のことである。
【００７６】
とりわけ好ましいのは、「ポリトープ」として知られる一連のエピトープをコードする核酸である。該エピトープは連続したまたは重なり合った様式で並んでおり（例えば、トムソン（Thomson）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ９２：５８４５〜５８４９，１９９５；ギルバート（Gilbert）ら、Nature Biotechnol. １５：１２８０〜１２８４、１９９７、参照）、本来のフランキング配列をもつものまたはもたないものとあるが、要すれば無関係のリンカー配列により隔てられていてもよい。ポリトープは処理加工され、免疫応答を生成する免疫系により認識される個々のエピトープを生成する。
【００７７】
このように、例えば、ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは他の腫瘍拒絶抗原からのペプチド（例えば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドの調製による）と、およびＭＡＧＥ−３ ＨＬＡクラスＩ結合ペプチド（その一部を下記掲載する）と組合わせ、「ポリトープ」を形成することができる。免疫応答を誘発または増強するために投与し得る代表的な腫瘍関連ペプチド抗原は腫瘍関連遺伝子およびコードされたタンパク質から誘導される；例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−７、ＭＡＧＥ−８、ＭＡＧＥ−９、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１１、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＢＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３，ＭＡＧＥ−Ｘｐ４、チロシナーゼ、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、メラン−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７などである。例えば、腫瘍特異抗原性ペプチドは以下の表Ｉに掲載したものを含む。
【００７８】
【表１】
0004106179.tif 000002
【００７９】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスII結合ペプチドの他の例は当業者既知であり（例えば、クーリー（Coulie）、Stem Cells １３：３９３〜４０３、１９９５、参照）、そこに記載のものと同様の方法で本発明において使用することができる。当業者は分子生物学の標準的手法に従い、1種またはそれ以上のＭＡＧＥ−３ペプチドおよび1種または２以上の前記腫瘍拒絶ペプチドからなるポリペプチドまたはかかるポリペプチドをコードする核酸を調製することができる。
【００８０】
このように、ポリトープは２種またはそれ以上の潜在的に免疫原性または免疫応答性刺激ペプチドのグループであり、種々の配列で結合し合うことができる（例えば、鎖状に連接する、部分的に重ね合わせる）。該ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）は標準的免疫プロトコールに従い、例えば、動物に投与し、免疫応答の促進、増強および／または刺激におけるポリトープの有効性を試すことができる。
【００８１】
該ペプチドは直接またはフランキング配列を用いて互いに接合し、ポリトープを形成することができる。ポリトープをワクチンとして使用することは技術上周知である（トムソン（Thomson）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ９２（１３）：５８４５〜５８４９，１９９５；ギルバート（Gilbert）ら、Nature Biotechnol. １５（１２）：１２８０〜１２８４、１９９７；トムソンら、J. Immunol. １５７（２）：８２２〜８２６、１９９６；タム（Tam）ら、J. Exp. Med. １７１（１）：２９９〜３０６、１９９０）。例えば、タムは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII結合エピトープ両方からなるポリトープは、マウスモデルにおいて抗体と防御的免疫性を成功裏に生成したことを示した。タムはまた、エピトープの「ひも」からなるポリトープが処理加工されて個々のエピトープを生じ、それがＭＨＣ分子により提示されて、ＣＴＬにより認識されることを証明した。このように、エピトープの種々の数と組合わせを含むポリトープを調製し、ＣＴＬによる認識と免疫応答を増強させる有効性について試験することができる。
【００８２】
腫瘍はセットの腫瘍抗原を発現し、その特定のサブセットのみが特定対象の腫瘍に発現されるということが知られている。ポリトープは特定の対象に発現された腫瘍拒絶抗原のサブセットを提示するエピトープの異なる組み合わせに対応して調製することができる。ポリトープはまた腫瘍タイプにより発現されることの知られている腫瘍拒絶抗原の広範囲スペクトルを反映させて調製することもできる。ポリトープはかかる治療を必要とする対象にポリペプチド構造として、または技術上既知の核酸送達システムを使用して導入することができる（例えば、オールソップ（Allsopp）ら、Eur. J. Immunol. ２６（８）：１９５１〜１９５９、１９９６）。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙ−ウイルス様粒子、アデノ関連ウイルス、プラスミド、細菌、等々がかかる送達に用い得る。ポリトープ送達システムはマウスモデルにより試験し、該送達システムの有効性を決定することができる。該システムはヒトの臨床試験でも試験することができる。
【００８３】
免疫プロトコールの一部として、免疫応答を高める物質を癌ワクチンの核酸またはペプチド成分と共に投与してもよい。かかる免疫応答高揚化合物はアジュバントまたはサイトカインとして分類してもよい。アジュバントは抗原の受容部分を刺激し（細胞外またはマクロファージ内）、マクロファージを活性化し、そしてリンパ球の特定セットを刺激することにより免疫応答を高める。多様なアジュバントが当該技術上周知である；特別な例としては、ＭＰＬ（スミスクライン・ビーチャム）、サルモネラ・ミネソタＲｅ５９５リポ多糖の精製と酸水解により得られる同族体、ＱＳ２１（スミスクライン・ビーチャム）、キリヤ・サポナリア（Quillja saponaria）から精製された精製ＱＡ−２１サポニン、ＤＱＳ２１（ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９に記載）（スミスクライン・ビーチャム）、ビタミンＥ，および生分解性油、例えば、スクワレンおよび／またはトコフェロール、から調製される種々の油中水懸濁液などである。サイトカインはリンパ球刺激性の結果として予防接種プロトコールにも有用である。かかる目的に有用な多くのサイトカインが当業者既知であり、例えば、ワクチンの防御効果を増強することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（Science ２６８：１４３２〜１４３４、１９９５）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８などである。
【００８４】
多数のさらなる免疫応答増強化合物が存在し、これらは予防接種プロトコールに使用することができる。これらはタンパク質または核酸のいずれかの形態で提供される同時刺激性分子を包含する。かかる同時刺激性分子はＢ７−１およびＢ７−２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）分子を包含し、樹状細胞（ＤＣ）上に発現され、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２８分子と反応する。この相互作用は抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激（シグナル１）Ｔ細胞に対し同時刺激を与え、Ｔ細胞増殖とエフェクター機能を増大する。Ｂ７はまたＴ細胞上のＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と相互作用するが、ＣＴＬＡ４とＢ７リガンドを含む研究結果は、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用が抗腫瘍免疫性とＣＴＬ増殖作用を増強すると述べている（ツエン（Zheng）ら、Proc. Nat’l Acad. Sci. ＵＳＡ ９５：６２８４〜６２８９、１９９８）。
【００８５】
Ｂ７は一般に腫瘍細胞上に発現されず、したがって、それらはＴ細胞にとって有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）ではない。Ｂ７発現の誘導は腫瘍細胞がより効率的にＣＴＬ増殖とエフェクター機能を刺激することを可能とする。Ｂ７／ＩＬ−６／ＩＬ−１２の同時刺激を組合わせると、Ｔ細胞母集団中のＩＦＮ−ガンマおよびＴｈ１サイトカインプロフィールを誘発して、さらに高揚したＴ細胞活性に至らしめることが示されている（ガジェウスキー（Gajewski）ら、J. Immunol. １５４：５６３７〜５６４８、１９９５）。Ｂ７による腫瘍細胞トランスフェクションは養子移入免疫療法に対する生体外ＣＴＬ増殖に関連してワング（Wang）らにより考察されている（J. Immunother. １９：１〜８、１９９６）。Ｂ７分子に対する他の送達メカニズムは核酸（裸のＤＮＡ）免疫法（キム（Kim）ら、Nature Biotechnol. １５：７：６４１〜６４６、１９９７）およびアデノとポックスなどの組換えウイルス（ウエンドナー（Wendtner）ら、Gene Ther. ４：７２６〜７３５、１９９７）を含む。これらのシステムはすべてＢ７と他の選択した分子、例えば、本明細書にて考察した抗原または抗原のフラグメント（ポリトープを含む）またはサイトカインとの同時発現用発現カセットの構築と使用を可能にする。これらの送達システムは生体外での適切な分子の誘導に、また生体内予防接種の局面に対し使用することができる。抗−ＣＤ２８抗体を生体外または生体内でのＴ細胞の直接刺激に使用することも考えられる。
【００８６】
リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）はＡＰＣおよびある種腫瘍細胞上で発現され、Ｔ細胞上で発現されたＣＤ２と相互作用する。この相互作用はＴ細胞ＩＬ−２とＩＦＮ−ガンマの産生を誘導し、Ｂ７／ＣＤ２８同時刺激相互反応を補完するが、それに置換わるものではない（パラ（Parra）ら、J. Immunol.、１５８：６３７〜６４２、１９９７；フェントン（Fenton）ら、J.Immunother.、２１：９５〜１０８、１９９８）。
【００８７】
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は白血球上に発現され、ＡＰＣおよびある種腫瘍細胞上に発現されたＩＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用はＴ細胞ＩＬ−２とＩＦＮ−ガンマの産生を誘導し、Ｂ７／ＣＤ２８同時刺激相互反応を補完するが、それに置換わるものではない（フェントンら、１９９８）。ＬＦＡ−１はＢ７について上に考察した種々の方法により予防接種プロトコールに提供し得る同時刺激分子のさらなる例である。
【００８８】
完全ＣＴＬ活性化およびエフェクター機能はＴｈ細胞ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）分子およびＤＣにより発現されるＣＤ４０分子間の相互作用を介したＴｈ細胞の介助を必要とする（リッジ（Ridge）ら、Nature ３９３：４７４、１９９８；ベンネット（Bennett）ら、Nature ３９３：４７８、１９９８；シェーンベルガー（Schoenberger）ら、Nature３９３：４８０、１９９８）。この同時刺激シグナルのこのメカニズムはＢ７のアップレギュレーションとＤＣ（ＡＰＣ）による会合したＩｌ−６／ＩＬ−１２産生に関与しているようである。このようにＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用はシグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）とシグナル２（Ｂ７−ＣＤ２８）との相互作用を補完する。
【００８９】
ＤＣ細胞を直接刺激するために抗−ＣＤ抗体を使用すると腫瘍関連抗原への応答を高めることが期待されるが、該抗原は通常炎症の環境外で遭遇するか、または非専門のＡＰＣ（腫瘍細胞）により提示される。この状況において、Ｔｈ介助およびＢ７同時刺激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原パルスＤＣベース治療法の関係で、またはＴｈエピトープが既知の腫瘍関連抗原前駆体内に限定されていない状況において用いられる。
【００９０】
本発明の治療用組成物を投与する場合、医薬的に許容し得る製剤として投与される。かかる製剤は常套的に医薬的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合し得る担体、アジュバントおよびサイトカインなどの補助的免疫増強剤、および任意に他の治療剤を含有していてもよい。
【００９１】
本発明の製剤は有効量投与する。有効量は、医薬製剤が単独またはさらなる用量で所望の応答を刺激する量である。癌治療の場合、所望の応答で癌の進行を阻害する。このことは疾患の進行を一時的に減速することをも含むが、より好ましくは疾患の進行を永久に停止させることである。免疫応答を誘導する場合、所望の応答とは、採用したＭＡＧＥ−３免疫原に特異的な抗体またはＴリンパ球が増加することである。これら所望の応答は常套の方法によりモニターするか、本明細書で考察した本発明の診断方法に従いモニターすることができる。
【００９２】
本発明の治療用組成物を用いて免疫応答を刺激したい場合には、それは血清中抗体価の増加、細胞毒性リンパ球のクローン性増殖、または他のある種所望免疫性応答に至る体液性抗体応答の刺激を意味する。免疫原の用量は投与形態に応じて、１ナノグラム／キログラムないし１００ミリグラム／キログラムの範囲で有効であると思われる。好ましい範囲は体重１キログラム当たり５００ナノグラムと５００マイクログラムの間であると思われる。絶対量は投与のために選択した物質、投与が単回か複数回か、また、対象個々人のパラメーター、例えば、年齢、身体状態、サイズ、体重および病状を含め、様々なファクターに依存する。これらのファクターは当業者既知であり、通常の実験法を超えることなく処理し得る。
【００９３】
（実施例）
我々はＨＬＡクラスII分子との関連で遺伝子ＭＡＧＥ−３によりコードされ、Ｔ細胞により提示される抗原性ペプチドを同定した。その戦略は正常血液提供者の樹状細胞に組換えＭＡＧＥ−３タンパク質を装入し、それら抗原提示細胞を用いて生体外での特異ＣＤ４リンパ球の活性化と増殖を誘導することからなる。そのプロトコールを以下の（Ａ、Ｂ、Ｃ）および図１で説明する。
【００９４】
Ａ．  ヒト血液のプロセシング
末梢血は地区血液バンクから標準バフィーコート製剤（非癌対象）として入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はリンホプレップ（ニコメッド・ファーマ、オスロ、ノルウェー）上の遠心分離により単離した。血小板によるＰＢＭＣの汚染を最少とするために、該製剤をまず室温、２０分／１０００ｒｐｍで遠沈した。殆どの血小板を含む上層２０〜２５ｍｌを除去したのち、遠沈管を室温で２０分／１５００ｒｐｍで遠沈した。ＰＢＭＣは２−アミノエチルイソチオウロニウム（シグマ）処理ヒツジ赤血球でロゼット形成させ、Ｔ細胞から分離した。リンパ球分離ＰＢＭＣを、培養フラスコ中（ファルコン）、３７℃で２時間、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１．５ｍＭ）および１％自己由来血清を補填したＲＰＭＩ １６４０培地中（完全培地）、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で付着させた。非付着細胞を廃棄し、付着細胞を完全培地中、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下培養した。培養物は２日目および４日目に培地５ｍｌを除き、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新たな培地を添加して培養した。５日目に、非付着細胞集団を富化樹枝状細胞の供給源として用いた。
【００９５】
ロゼット形成Ｔ細胞をＮＨ4Ｃｌ（１６０ｍＭ）で処理してヒツジ赤血球を溶解し、洗浄した。ＣＤ４−Ｔリンパ球をマグネットマイクロビーズ（ミルテニイ・バイオテック、ドイツ）に結合した抗−ＣＤ８モノクローナル抗体を用いて、製造業者推奨のダイナル・マグネットにより選別、負の選択によりロゼット形成Ｔ細胞から単離した。
【００９６】
Ｂ．  サイトカイン
ヒト組換えＩＬ−２はバイオジェン（ジュネーブ、スイス）により供与された。ヒト組換えＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１２は我々の実験室で入手した。ヒトＩＬ−７はジェンザイム（ケンブリッジ、ＭＡ）から購入した。ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦはサンド（サンド薬品（株）、バーゼル、スイス）から供与された。ヒト組換えＴＮＦ−αはＲ＆Ｄシステム（アビンドン、イギリス）から購入した。
【００９７】
Ｃ．  タンパク質補給と混合リンパ球−樹枝状細胞培養
組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質（Ｈｉｓタグ保持ＭＡＧＥ−３）はスミス・クライン・コーポレーション製薬会社（リクセンザート、ベルギー）が製造し、標準的クロマトグラフィー手法により精製した。自己由来樹枝状細胞は、１％自己由来血清、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）補填ＲＰＭＩ培地中、組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）の存在下、３７℃、５％ＣＯ2中１８〜２０時間培養した。Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質−パルス樹枝状細胞を洗浄し、１丸底マイクロウエル当たり１０4個ずつ、１０％ヒト血清、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）およびＬ−グルタミン（１．５ｍＭ）補填イスコブ培地２００μｌ中、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、１０5個のＣＤ４+Ｔリンパ球に添加した。ＣＤ４-Ｔリンパ球はＨｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質で新たにパルスした自己由来樹枝状細胞で弱く再刺激し、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）補填培地中で増殖させた。
【００９８】
実施例１：ＣＤ４Ｔ細胞系とＭＡＧＥ−３特異クローンの取得
増殖途上のＣＤ４Ｔ細胞を含む微量培養物について、Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞により刺激したときのＴＮＦの産生能を培養開始から３５日間評価した；自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞は、２０μｇ／ｍｌのＨｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質または陰性コントロールとしての卵アルブミン（シグマ）の存在下に１８〜２０時間培養した。本明細書でいうＥＢＶ−Ｂ細胞とはエプシュタイン・バー・ウイルスで不死化したＢ細胞である。ＥＢＶ−Ｂ細胞は技術上標準的手法に従って調製した。タンパク質パルスＥＢＶ−Ｂ細胞を洗浄し、１丸底マイクロウエル当たり５，０００個ずつ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０％ヒト血清およびＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）補填イスコブ培地１５０μｌ中、２，５００個のＣＤ４+Ｔリンパ球に添加した。１８〜２０時間後、上清を採取し、以前に記載したＴＮＦ−感受性ＷＥＨＩ１６４−１３細胞に対する毒性を試験することによりＴＮＦ含量を評価した。ＴＮＦを特異的に産生するＣＤ４+細胞系（図２）は、刺激細胞として外来性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞系および支持細胞として同種異型ＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ）を用い、限界希釈によりクローン化した。ＣＤ４Ｔ細胞系は、Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞および５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２補填培地中のＬＧ２−ＥＢＶで弱く再刺激することにより培養維持された。
【００９９】
ＣＤ４Ｔ細胞クローンは、外来性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞に対する特異性につき試験した；ＥＢＶ−Ｂ細胞（５００，０００／ｍｌ）はＭＡＧＥ−３組換えタンパク質２０μｇ／ｍｌの存在下、３７℃で１８〜２０時間培養した。タンパク質パルスＥＢＶ−Ｂ細胞を洗浄し、１丸底マイクロウエル当たり５，０００個ずつ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０％ヒト血清およびＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）補填イスコブ培地１５０μｌ中、２，５００個のＣＤ４+Ｔリンパ球に添加した。１８〜２０時間後、上清を採取し、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γの分泌につき評価した。ＩＦＮ−γの産生はメジニックス・ダイアグノスティック−バイオソース（フロイラス、ベルギー）からの試薬を用い、我々の実験室で開発したＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。簡単に述べると、アッセイは標準的ＥＬＩＳＡであり、細胞上清と培養するに先立って、プラスティック・マイクロタイタープレートのウエルにＩＦＮ−γ抗体を被覆させ、産生されたＩＦＮ−γ量を定量した。他のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法を用いても産生されたＩＦＮ−γを測定することができた。数種のＭＡＧＥ−３特異クローンはＢ６系から入手した（図３）。
【０１００】
ＭＡＧＥ−３エピトープはＨＬＡ−ＤＲ分子によりＣＤ４クローンに提示される（図３）：ＭＡＧＥ−３パルスＥＢＶ−Ｂ細胞は、ＭＡＧＥ−３特異ＣＤ４+クローンと共に、１／２０希釈で用いた保存−遊離モノクローナル抗体の連続的存在下、８％ＣＯ2中、３７℃２４時間培養した。（ＨＬＡ−ＤＲに対する）モノクローナル抗体２Ｂ６は認識能を失ったが、一方、（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対する）認識はモノクローナル抗体Ｗ６／３２の存在下不変である。
【０１０１】
実施列２：ＭＡＧＥ−３ ＨＬＡ−ＤＲ制限ペプチドの同定
これらＣＤ４クローンにより認識されるＭＡＧＥ−３ペプチドを同定するために、ＭＡＧＥ−３タンパク質配列の一部に対応する１６アミノ酸のペプチドを合成し、自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞に導入し、その認識を試験した（図４および５）。合成ペプチドはＤＭＳＯ（メルク）に溶解し、最終濃度５００μＭまたは５０μＭで用いた。ＥＢＶ−Ｂ細胞（１丸底マイクロウエル当たり５，０００個）は異なるペプチドの存在下８％ＣＯ2内３７℃で２時間培養した。ＣＤ４’クローンは次いで１ウエル当たり２，５００細胞ずつ添加した。アッセイ培地はＬ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０％ヒト血清およびＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）補填イスコブ培地であった。１８〜２０時間後、上清を採取し、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの分泌につき評価した。ＩＦＮ−γの産生はメジニックス・ダイアグノスティック−バイオソース（フロイラス、ベルギー）からの試薬を用い、我々の実験室で開発したＥＬＩＳＡ試験法（２０〜４０００ｐｇ／ｍｌ）により測定した。
【０１０２】
一連の実験において、ペプチドは非生理的濃度５００μＭでスクリーニングした。非生理的濃度のペプチドはＴ細胞クローンの非特異活性化に導くことが可能である。事実、ペプチドＭＡＧＥ−３159-174（図４、ペプチド３３５；配列番号６）は、５００μＭで用いたとき、クローンＢ６／３４およびＢ６／３７の活性化を誘発したが、このペプチドは５０μＭで用いたときにこれらのクローンを活性化するのに有効ではなかった（図５）。それに対し、ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（ＭＡＧＥ−３111-126；図４、ペプチド３２３；配列番号３）およびＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−３115-130；配列番号４）は、生理的濃度で用いたとき、クローンＢ６／３４およびＢ６／３７によるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生を特異的に促進した。これら２種のペプチドはまたＢ６クローンの増殖を誘発することも可能であった（図６）。
【０１０３】
実施例３：ＭＡＧＥ−３特異ＣＤ４+クローンＢ６／３４により利用されたＨＬＡ制限要素の決定
Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞に応答してのこれらＣＤ４+クローンによるサイトカイン分泌はＨＬＡ−ＤＲに限定される。クローンＢ６／３７により利用されたＨＬＡ制限要素をさらに明らかにするために、さらなるＥＢＶ−Ｂ細胞系をぺプチド提示に用いた。ＡＵＭＡ−ＥＢＶ、ＬＢ１５５５−ＥＢＶ、ＧＥＲＬ−ＥＢＶのＨＬＡ血清型が明らかにしたことは、３種の細胞型すべてが共有するクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２に制限されたことである。さらに、ＡＤＥＴ−ＥＢＶはＭＡＧＥ−３115-130ペプチドを有効に提示することが判明し、また、これら細胞のＨＬＡ血清型はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１であることが判明した。ＭＡＧＥ−３115-130でパルスしたときに、上記のように他の数種のＥＢＶ−Ｂ細胞系がクローンＢ６／３４およびＢ６／３７を刺激する能力についてスクリーニングし、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２両方が該ペプチドを提示し得ることを確認し、あるいは他のＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３提示分子を明らかにする。
【０１０４】
実施例４：Ｂ６／３７クローンをなお刺激し得る最少ペプチドの決定
ＨＬＡ−クラスＩ制限ぺプチドと違い、クラスII制限ペプチドはその鎖長が顕著に変わり、そのアミノ末端およびカルボキシ末端双方で伸長を可能とする。我々はペプチドＭＡＧＥ−３111-126およびＭＡＧＥ−３115-130の双方が、クローンＢ６／３４およびＢ６／３７を特異的に刺激し、一方、ペプチドＭＡＧＥ−３107-122およびＭＡＧＥ−３119-134はこれらのクローンを活性化し得ないことを証明した。したがって、ＭＡＧＥ−３115-126ペプチド（ＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ；配列番号９）がＢ６／３４およびＢ６／３７クローンの活性化にとって必要な最少１２アミノ酸モチーフである。期待どおりに、ペプチドＭＡＧＥ−３115-126はクローンＢ６／３７によるＩＦＮ−γの有意な産生を誘導する（図８）。１個またはそれ以上の残基を欠失させ短くしたペプチドも作製した。短縮ペプチドの幾つか、例えば、ＭＡＧＥ−３116-126（配列番号１０）およびＭＡＧＥ−３117-126（配列番号１１）もクローンＢ６／３７によるＩＦＮ−γの産生を誘導した（図８）が、減量したＭＡＧＥ−３118-126（配列番号１２）はＩＦＮ−γ有意量の産生を誘導しなかった。
【０１０５】
実施例５：ＭＡＧＥ−３融合タンパク質の調製と使用
ＭＡＧＥ−３タンパク質は、不変鎖（Ｉｉ）とのまたはリソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）との融合タンパク質としてＥＢＶ Ｂ細胞系Ｍ２２ＥＢＶ（ＨＬＡ Ａ１ ＤＲ１３）で発現させ、ＨＬＡクラスII分子におけるＭＡＧＥ−３誘導ペプチドの提示を標的とした。Ｉｉ ＭＡＧＥ−３を形質導入すると、ＨＬＡクラスIIにおいてペプチドを提示したが、これはＭＡＧＥ−３ ＤＲ１３エピトープと反応するＣＤ４Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ＣＤ４ ４２６／Ｂ６．３７による認識により測定される。さらに、ＥＢＶ Ｂ細胞でのＩｉ ＭＡＧＥ−３の発現はＨＬＡクラスＩにおけるペプチド提示に至ったが、これはＭＡＧＥ−３．Ａ１特異ＣＴＬクローンＬＢ７０５ ４３４／１の活性化により定量された。これに対し、ＭＡＧＥ−３−ＬＡＭＰ−１融合タンパク質の発現はＨＬＡ分子においてＭＡＧＥ−３ペプチドの提示を僅かに増強しただけであった。したがって、ＩｉをＭＡＧＥ−３に結合してワクチンとして使用し、ＩＬＡクラスＩおよびクラスII両方においてＭＡＧＥ−３誘導ペプチドの提示を誘導することができる。
【０１０６】
プラスミドと融合構築物のクローニング
ＭＡＧＥ−３：ＭＡＧＥ−３ ｃＤＮＡおよびペプチドを配列番号１および配列番号２としてそれぞれ表示する。
ヒト不変鎖：ヒト不変鎖コーディングｃＤＮＡを含むＩｉｐＳＶ５１Ｌと命名されたプラスミドはピーターズ博士（J. Pieters）からの恵与による（バーゼル免疫学研究所、バーゼル、スイス、J. Cell Science １０６：８３１〜８４６、１９９３）。
ＬＡＭＰ１：プラスミドｐＣＭＶ−ｓｉｇ Ｅ７−ＬＡＭＰ１はウー博士（T. Wu）からの恵与による（ジョーン・ホプキンス大学、ボルチモア、ＭＤ、米国；Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ９２：１１６７１〜１１６７５、１９９５）。
ｐＭＦＧ：プラスミドｐＭＦＧはダノス博士（O. Danos）からの恵与による（ソマティックス・テラピー・コーポレーション、アラメダ、ＣＡ、米国）。
【０１０７】
ｐＭＦＧ−ＭＡＧＥ−３の構築
ＭＡＧＥ−３ ｃＤＮＡはコーディング配列の５’および３’末端に適当な制限酵素認識部位を導入した後、ｐＭＦＧベクターに移入した。ＮｃｏＩ部位を５’部位に、ＢｇＩII部位を３’部位にＰＣＲにより導入した；その際、プライマーとしてＮｃｏＩ−センス：５’−ＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１４）およびＢｇＩII−アンチセンス：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１５）〔下線はＮｃｏＩとＢｇＩIIに対する認識部位〕を使用した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にクローン化し、標準法に従い配列決定した。ＮｃｏＩ−ＢｇＩII増幅産物を酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで開裂したｐＭＦＧにクローン化した。
【０１０８】
ｐＭＦＧ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−３の構築
ヒト不変鎖ポリペプチド（ｈｕ−Ｉｉ；残基１〜８０）のアミノ末端（細胞質尾部およびトランスメンブラン領域）は、ｌｉｐＳＶ５１Ｌを鋳型として用いるＰＣＲにより増幅した。以下のプライマーを用いた：ｈｕ−Ｉｉセンス：５’−ＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＡＣ−３’（配列番号１６）およびｈｕ−Ｉｉアンチセンス：５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣ−３’（配列番号１７）〔下線はＮｃｏＩとＢａｍＨＩに対する認識部位〕。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にクローン化し、標準法に従い配列決定した。ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ増幅産物を酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで開裂したｐＭＦＧにクローン化し、ｐＭＦＧ−Ｉｉとした。
【０１０９】
末端切除Ｉｉ−ｃＤＮＡの３’末端でＡＴＧコドンに置換わり、枠内にＢａｍＨＩ部位をもつＢｇＩII認識部位をＭＡＧＥ−３ ｃＤＮＡの５’−末端にＰＣＲにより導入した。その際、プライマーとして、ＢｇＩII−センス：５’−ＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１８）およびＢｇＩII−アンチセンス（配列番号１５）〔下線はＢｇIIIに対する認識部位〕を用いた。ＰＣＲ産物（ＢｇIII．ＭＡＧＥ−３．ＢｇIII）をｐＣＲ２．１にクローン化し、標準法に従い配列決定した。
【０１１０】
組換えプラスミドｐＭＦＧ−ＩｉをＢａｍＨＩで再開裂し、ＢｇIII．ＭＡＧＥ−３．ＢｇIII増幅産物を適合末端に接合した。枠内右方向にＭＡＧＥ−３ ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを制限フラグメント分析により同定した。
【０１１１】
ｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−３．ＬＡＭＰ−１の構築
ＬＡＭＰ−１タンパク質のシグナルペプチドおよびＬＡＭＰ−１のトランスメンブラン・ドメインと細胞質尾部をコードするｃＤＮＡは、ｐＣＭＶ−ｓｉｇＥ７−ＬＡＭＰ１を鋳型として用いるＰＣＲにより増幅した。ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチド用に設定されたプライマーは以下のとおりであった：Ｓｉｇセンス：５’−ＣＣＣＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣ−３’（配列番号１９）およびＳｉｇアンチセンス：５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡ−３’（配列番号２０）〔下線はＮｃｏＩとＢａｍＨＩに対する認識部位〕。このｃＤＮＡ３’末端でのＢａｍＨＩ部位はＢｇIII．ＭＡＧＥ−３．ＢｇIIIフラグメントの５’末端にＢｇIII部位をもつ枠内にある。増幅産物をｐＭＦＧにクローン化し、ｐＭＦＧ−Ｓｉｇを調製した。
【０１１２】
ＬＡＭＰ−１のトランスメンブラン・ドメインと細胞質尾部の増幅用に設定されたプライマーは以下のとおりであった：ＬＡＭＰ−１センス：５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡＴＣＣＣＣ−３’（配列番号２１）およびＬＡＭＰ−１アンチセンス：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＡＧＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２２）〔下線はＢａｍＨＩとＢｇIIIに対する認識部位〕。増幅産物は標準法に従い配列決定し、ｐＭＦＧ−Ｓｉｇにクローン化し、シグナルペプチドとトランスメンブラン配列の結合位置でユニークＢａｍＨＩ部位をもつプラスミドｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＬＡＭＰ−１を得た。プラスミドｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−３．ＬＡＭＰ−１を生成させるために、ＢｇIII．ＭＡＧＥ−３．ＢｇIII ｃＤＮＡから単離したＢｇIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＢａｍＨＩで開裂したｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＬＡＭＰ−１にクローン化した。このクローニング工程にて、アミノ酸２４０〜３１４をコードするＭＡＧＥ−３の３’末端が切除された。
【０１１３】
細胞系、培地および試薬
フェニックスＡＭＰＨＯ細胞系（ノラン博士（Nolan）の恵与、スタンフォード大学、医学部、ＣＡ、米国）は高力価両種性レトロウイルス産生細胞系であり、ＲＳＶプロモーターとｐＰＧＫヒグロ選択可能なマーカーとをもつモロニーＧａｇＰｏｌ−ＩＲＥＳ−Ｌｙｔ２構築物で２９３Ｔ細胞を安定にトランスフェクションすることにより生成されたものである。これらの細胞には、次いで、ＣＭＶプロモーターにより駆動、ジフテリアトキシン抵抗遺伝子（ｐＨＥＤ−７）で同時選択したモロニー両種性エンベロープ遺伝子を安定的に移入した。この産生性細胞系はヘルパーウイルス不含である。
【０１１４】
フェニックスＡＭＰＨＯ細胞を培養し、１７５ｃｍ2フラスコ中、１０％加熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン補填ＤＭＥＭ（ライフ・テクノリジー、ゲーント、ベルギー）に継代した。
【０１１５】
ＭＺ２−ＥＢＶ Ｂ細胞系はメラノーマ対象ＭＺ２のＢ細胞（ＨＬＡ Ａ１ Ａ２９ ＤＲ０１０１ ＤＲ１３０２）からＥＢＶでの感染により生成させた。同様に、ＬＧ２−ＥＢＶ Ｂ細胞系は非癌対象ＬＧ２（ＨＬＡ Ａ２４ Ａ３２ ＤＲ７ ＤＲ１４）から生成させた。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は対象ＭＺ２からのメラノーマ細胞系である。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系およびＭＺ２−ＭＥＬ．４３は、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ）、０．２４ｍＭ Ｌ−アスパラギン、０．５５ｍＭ Ｌ−アルギニンおよび１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＡＡＧ）補填イスコブ改変ダルベッコ（ＩＤ）培地中で培養した。
【０１１６】
細胞毒性Ｔ細胞クローンＬＢ７０５ＣＴＬ４３４／１をＭＡＧＥ−３．Ａ１エピトープに向け、ＣＤ８+Ｔ細胞の初代培養で非癌対象ＬＢ７０５（ＨＬＡ Ａ１ Ａ２）およびＭＡＧＥ−３．Ａ１ペプチドでパルスした照射自己由来ＰＢＬ（末梢血リンパ球）から生成させた。ＣＤ４Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ＣＤ４ ４２６／Ｂ６．３７はＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３エピトープを認識し、対象ＬＢ１５５５ＤＥＳＡ（ＨＬＡ ＤＲ３ ＤＲ１３０２）のＴ細胞および精製ＭＡＧＥ−３タンパク質と前培養した自己由来単球誘導樹枝状細胞の初代培養により同定した。Ｔ細胞クローンは、１０％熱不活化ヒト血清（ＨＳ）、ＡＡＧおよび５０Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２（ｒｈ ＩＬ−２）補填ＩＤ中、放射支持細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ、プールしたヒトＰＢＬ）および特異的刺激細胞（ＣＴＬ４３４／１に対するＭＺ２−ＭＥＬ−４３、またはＣＤ４Ｔ細胞クローン４２６／Ｂ６．３７に対するＭＡＧＥ−３タンパク質と前培養したＤＥＳＡ−ＥＢＶ）の存在下に培養した。
【０１１７】
高力価ＭＡＧＥ−３コーディング組換えレトロウイルスの生成
ＭＡＧＥ−３コーディング・レトロウイルス・ベクタープラスミド、ＭＦＧ−ＭＡＧＥ−３、ＭＦＧ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−３、ＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−３．ＬＡＭＰおよびＭＧＦ−ＥＧＦＰ（増強グリーン蛍光タンパク質レポーターをコード）をフェニックスＡＭＰＨＯパッケイジング細胞にトランスフェクションにより導入した。ＭＧＦレトロウイルス・ベクターはモロニー・マウス白血病ウイルスから誘導され、薬物抵抗マーカーを欠いているか、挿入されたｃＤＮＡ以外の他の潜在的抗原性タンパク質を発現しない（リビエール（Riviere）、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ９２：６７３３〜６７３７、１９９５）。トランスフェクション手法はグラハムおよびバン・デル・エブ（Graham and van der Eb) (Virology ５４：５３６〜５３９）のリン酸カルシウム−介在トランスフェクション・プロトコールの改良法である。
【０１１８】
トランスフェクションの２４時間前、１０．８×１０6フェニックスＡＭＰＨＯ細胞を７５ｃｍ2組織培養フラスコ（ファルコン）中、細胞増殖培地１４ｍｌに塗布した。細胞を添加した後、フラスコを前後にゆるやかに振盪し、細胞をフラスコ底部に均等に分散させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。トランスフェクション時、細胞が７０〜８０％の集密度に達したとき、培地を除き、２５ｍＭクロロキン含有フェニックスＡＭＰＨＯ細胞増殖培地の新たなもの１４ｍｌに置き換えた（シグマ・ケミカル(株）、セントルイス、ＭＯ、米国）。トランスフェクション・カクテルは５０ｍｌ試験管内で、４０μｇのレトロウイルス・ベクタープラスミドＤＮＡを水に加え、最終容量１５７５μｌに希釈して調製した。このＤＮＡ溶液に２Ｍ ＣａＣｌ2（シグマ）２２５μｌを加えた。次いで、１８００μｌの２ｘＨｅＢＳ（蒸留水に溶解した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭデキストロース、２８０ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4；０．２μフィルターで濾過し、−２０℃で保存）を該ＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液に滴下し、自動ピペットで１５秒間激しく泡立てた。ＤＮＡ／ＣａＣｌ2／ＨｅＢＳ混合物を細胞上に直ちに滴下し、フラスコをゆるやかに渦巻き状に回してＤＮＡ／ＣａＰＯ4粒子の均一な混合を確実にした。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で７ないし９時間培養し、クロロキン含有培地を新鮮なフェニックスＡＭＰＨＯ細胞増殖培地と取り替えた。レトロウイルス上清収得の約２４時間前に、フェニックスＡＭＰＨＯ培地を除き、２．５％ＦＣＳのみを含有するＥＢＶ細胞増殖培地（イスコブ培地）９ｍｌにゆるやかに置き換えた。トランスフェクションの４８時間後、レトロウイルス上清を取得するために、細胞から培地を除き、０．４５μフィルターで濾過して細胞片を除去した。取得・濾過後、ウイルス含有培地を氷上に保ち、適当な容量に分割して１５ｍｌポリプロピレン管に入れ、−８０℃で保存した。ＭＦＧ−ＥＧＦＰ移入したフェニックスＡＭＰＨＯ細胞はトランスフェクションの有効性につきＦＡＣＳ分析により検定した。
【０１１９】
ＥＢＶ細胞系のレトロウイルス形質導入
ＥＢＶ形質転換細胞は、該細胞を感染カクテル中に再懸濁し、遠心分離することにより感染させた。標的細胞を６０ｎｍ組織培養プレート（ファルコン）にて１．０×１０6細胞の密度で感染カクテル４ｍｌ中再懸濁した。該プレートはＩＥＣ遠心機ロータータイプ２２８にて、３２℃、１２００ｒｃｆで２時間遠心した。形質導入すべき各プレートに対し、注入カクテル４ｍｌは、ＥＢＶ細胞増殖培地にてウイルス上清を１：２に希釈し、プロタミン硫酸塩（レオ）を最終濃度６μｇ／ｍｌとなるように添加し調製した。湿潤インキュベーター中３７℃でさらに２時間培養した後、遠心し、細胞を標的細胞増殖培地４ｍｌに移した。この形質導入サイクルは細胞の塗布後直ちに実施し、２４時間および４８時間目で繰り返した。感染ＥＢＶ細胞は、３回目の感染サイクルの２４時間後および４８時間後にＦＡＣＳ分析により、ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現に対して検定した。
【０１２０】
インターフェロン−γの産生アッセイ
５０００個のＴ細胞、ＬＢ７０５ ＣＴＬ４３４／１、または３０００個のＴ細胞、クローンＬＢ１５５５ＣＤ４２６／Ｂ６．３７を洗浄し、丸底９６穴プレート中、１０％ＨＳ、ＡＡＧおよび５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２含有ＩＤ培地１００μｌ中にて、５０００個のレトロウイルス形質導入ＭＺ２−ＥＢＶのＥＢＶ Ｂ細胞、またはＬＧ２−ＥＢＶ Ｂ細胞の存在下に一夜培養した。同時培養はすべて３回繰り返し実施した。培養上清５０μｌをＩＦＮ−γの存在につきＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ、バイオソース）により検定した。要約して述べると、抗ヒトＩＦＮ−γＡｂで予め被覆したＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、培養上清５０μｌおよびビオチニル化抗ヒトＩＦＮ−γＡｂ（ＩＤ中１：１２５０、１０％ＨＳ、ＡＡＧ）と共に室温（ＲＴ）で２時間培養した。３回洗浄した後、プレートを１ウエル当たり５０μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン（ＰＢＳ／０．５ＢＳＡ中１：３０００）とＲＴ、３０分培養し、ＴＭＢ基質により検出し、Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した。光学濃度を４５０ｎｍで読み取った。４０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを含むサンプルを１：２に希釈し、標準として用いた。
【０１２１】
細胞毒性アッセイ
ＥＢＶ Ｂ細胞１×１０6個をＮａ251ＣｒＯ4２５μＣｉにて３７℃、６０〜９０分間標識した。細胞を洗浄し、１×１０4個／ｍｌに再懸濁した。コントロールアッセイにおいては、ＭＡＧＥ−３．Ａ１ペプチドを１μＭの濃度で細胞懸濁液に加えた。ＬＢ７０５ＣＴＬ４３４／１ Ｔ細胞を、Ｖ型９６穴プレート中１ウエル当たり１０００個の標識標的細胞と、標的細胞に対するエフェクター比を３０ないし１および１０倍希釈として培養した。４時間後、クロム放出（ＥＲ）を１部１００μｌ上清にて測定した。培地のみ、または１％トリトン中にて培養した標的細胞を、それぞれ、最少（ＳＲ）および最大（ＭＲ）51Ｃｒ放出とみなした。サンプル中の実験的51Ｃｒ放出百分比を
（ＥＲ−ＳＲ／ＭＲ−ＳＲ）×１００％
として計算した。
【０１２２】
Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ＣＤ４ ４２６／Ｂ６．３７による形質導入ＥＢＶ Ｂ細胞系の認識
Ｍ２２ＥＢＶは、ＭＦＧ Ｉｉ ＭＡＧＥ−３（ＭＺ２ＥＢＶ−Ｉｉ ＭＡＧＥ−３）、ＭＦＧ ＳｉｇＭＡＧＥ−３ ＬＡＭＰ（ＭＺ２ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−３ ＬＡＭＰ）、ＭＦＧ ＭＡＧＥ−３（ＭＺ２ ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−３）またはＭＦＧ ＥＧＦＰ（ＭＡ２ ＥＢＶ−ＥＧＦＰ）にて形質導入した。形質導入した細胞はＭＡＧＥ−３．Ａ１エピトープと反応するＣＤ４Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ＣＤ４ ４２６／Ｂ６．３７の存在下に一夜培養した。該Ｔ細胞クローンはＭＺ２−ＥＢＶ−Ｉｉ ＭＡＧＥ−３を認識し、ＥＬＩＳＡで測定した培養上清中のＩＦＮ−γ放出により定量された（図９）。それに対し、ＭＺ２ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−３ ＬＡＭＰはＩＦＮ−γの弱い産生を誘導しただけであった。コントロール・トランスフェクション体、ＭＺ２ ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−３およびＭＺ２ ＥＢＶ−ＥＧＦＰ、およびＬＧ２ＥＢＶ（未開示）はＣＤ４Ｔ細胞により認識されなかった。これらの結果はＩｉ ＭＡＧＥ−３がＨＬＡクラスIIによる提示のために処理加工される一方、ＭＡＧＥ−３タンパク質のみではＨＬＡクラスII抗原提示経路に達しないことを示している。
【０１２３】
ＬＢ７０５ＣＴＬ４３４／１による形質導入ＥＢＶ Ｂ細胞系の認識
ＭＺ２ＥＢＶ−Ｉｉ ＭＡＧＥ−３およびＭＺ２ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−３ ＬＡＭＰの両方が、一夜同時培養の後、ＭＡＧＥ−３．Ａ１特異ＣＴＬクローンＬＢ７０５ ＣＴＬ４３４／１により同程度に認識された（図１０）。培養上清中でのＩＦＮ−γ放出はＥＬＩＳＡにより測定した。ＭＺ２ＥＢＶ−Ｉｉ ＭＡＧＥ−３はＣＴＬのみによる高度のＩＦＮ−γ産生を引き出したが、このことはＩｉに融合したＭＡＧＥ−３タンパク質の発現がＨＬＡクラスＩ経路においてなおプロセシングに導き得ることを示している。
【０１２４】
ＭＡＧＥ−３、ＩｉＭＡＧＥ−３、ＳｉｇＭＡＧＥ−３ ＬＡＭＰまたはＧＦＰでレトロウイルスにより形質導入したＭＺ２−ＥＢＶのＬＢ７０５ＣＴＬ４３４／１による溶解につき、４時間の51Ｃｒ放出アッセイにおいて、種々のエフェクター対標的細胞（Ｅ／Ｔ）比にて試験した。並行して、ＭＡＧＥ−３．Ａ１ペプチドをＴ細胞活性化のための陽性コントロールとして加えた。ＭＺ２ＥＢＶ−Ｉｉ ＭＡＧＥ−３およびＭＺ２ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−３ ＬＡＭＰは共にＭＺ２ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−３同様に、ＬＢ７０５ＣＴＬ４３４／１により溶解された。溶解の百分比はＭＡＧＥ−３．Ａ１ペプチド存在下での標的細胞溶解に等しかった（図１１）。
【０１２５】
ＭＺ２−ＭＥＬ４３によるＨＬＡクラスIIにおけるＭＡＧＥ−３誘導ペプチドの提示
ＨＬＡクラスII分子におけるＭＡＧＥ−３ペプチドの提示にＩｉが関与するのをさらに確認するために、メラノーマ細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．４３にＭＦＧ Ｉｉ ＭＡＧＥ−３（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３−ＩｉＭＡＧＥ−３）またはＭＦＧ ＥＧＦＰ（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３−ＥＧＦＰ）を形質導入した。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３はＭＡＧＥ−３タンパク質を内因性として発現するが、ＨＬＡクラスIIにおいてＭＡＧＥ−３誘導ペプチドを提示しない。しかし、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３をＭＦＧ−Ｉｉ ＭＡＧＥ−３で形質導入すると、それが一夜同時培養後にはＣＤ４Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ＣＤ４ ４２６／Ｂ６．３７により認識される（図１２Ａ）。培養上清中のＩＦＮ−γ放出はＥＬＩＳＡにより測定した。その結果は、内因性に発現されたＭＡＧＥ−３とは反対に、ＩｉＭＡＧＥ−３がＨＬＡクラスIIでの提示のために処理加工され得ることを示している。親および形質導入したＭＺ２−ＭＥＬ．４３は共にＣＴＬクローンＬＢ７０５ＣＴＬ４３４／１を活性化した（図１２Ｂ）が、これはＨＬＡクラスＩ経路におけるＭＡＧＥ−３融合の提示を示すものである。
【０１２６】
本発明の他の側面は当業者に明瞭であり、ここに繰り返す必要はない。本明細書に引用した文献はそれぞれその全文を引用により取り込む。
採用した用語および表現は説明の用語として使用したものであって、制限のためではなく、開示、記載された態様の均等物またはその部分を排除するような用語および表現として用いる意図はない。種々の改変が本発明の範囲内で可能であることが認められるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＭＡＧＥ−３に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞系を得るために用いるプロトコールの図式である。
【図２】  ＣＤ４-Ｔ細胞系Ｂ６およびＦ３が、組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質を処理加工した自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞を認識したことを示すグラフである。
【図３】  外来性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞のＣＤ４+Ｔ細胞クローンによる認識が、抗−ＨＬＡ ＤＲモノクローナル抗体により阻害されることを示すグラフである。
【図４】  ＣＤ４+クローンＢ６／３４、Ｂ６／３７、Ｆ３／３７およびＦ３／４０による認識について、ＭＡＧＥ−３ペプチドのスクリーニング結果を詳細に示すグラフである。
【図５】  ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（MAGE−３111-126、配列番号３）またはＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−３115-130、配列番号４）でパルスしたＣＤ４’クローンＢ６／３４およびＢ６／３７ＥＢＶ−ＢによるＴＮＦとＩＮＦ−γ産生刺激を描出するグラフである。
【図６】  ペプチドＭＡＧＥ−３111-126またはＭＡＧＥ−３115-130でパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞がクローンＢ６／３４およびＢ６／３７の増殖を誘導したことを示すグラフである。
【図７】  ペプチドＭＡＧＥ−３115-130に対するＣＤ４’クローンＢ６／３７の応答がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２に制限されることを示すグラフである。
【図８】  ＭＡＧＥ−３115-130から誘導される末端切除ペプチドでパルスした自己由来ＥＢＶ−Ｂ細胞に対するクローンＢ６／３７の反応性を示すグラフである。
【図９】  ＣＤ４Ｔ細胞クローン４２６／Ｂ６．３７（抗−ＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３）による末端切除ＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１０】  ＣＴＬクローン４３４／１（抗−ＭＡＧＥ−３．Ａ１）による末端切除ＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１１】  ＣＴＬ４３４／１（抗−ＭＡＧＥ−３．Ａ１）による末端切除ＭＺ２ＥＢＶの溶解を示す。
【図１２Ａ】  ＣＤ４Ｔ細胞クローン４２６／Ｂ６．３７（抗−ＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３）の認識を示す。
【図１２Ｂ】  ＣＴＬクローン４３４／１（抗−ＭＡＧＥ−３．Ａ１）による形質導入ＭＺ２−ＭＥＬ．４３の認識を示す。
【図１３】  不変鎖（Ｉｉ）とＬＡＭＰ−１ ＭＡＧＥ−３融合タンパク質のレトロウイルス構築物の模式図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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