(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i）少なくとも８０％の純度を有するグリセロールモノオレアート、
ii）アシル鎖が１個又はそれ以上の不飽和結合を有していてよい、炭素原子数８又は１８の脂肪酸及び
iii）水
を、アジュバントとして含有し、さらに
i）の濃度は水１００ｍLあたり０．１〜５０ｇであり、ii）の濃度は水１００ｍLあたり１〜２０ｇであり、そして抗原成分はジフテリアトキソイド、インフルエンザ及びロタウイルスから選ばれることを特徴とする、
抗原及び（又は）ワクチンを動物に粘膜投与するための薬剤。
【請求項２】
少なくとも９０％のグリセロールモノオレアート含有量を有する、請求の範囲１記載の薬剤。
【請求項３】
少なくとも９５％のグリセロールモノオレアート含有量を有する、請求の範囲１又は２記載の薬剤。
【請求項４】
抗原がヒト又は海洋動物を含めた動物に適する抗原及び（又は）ワクチンの中から選ばれた抗原及び（又は）ワクチンを含む、請求の範囲１記載の薬剤。
【請求項５】
薬剤が次のグループ：保存剤及び浸透圧調節剤、ｐＨ-調節剤、有機溶剤、疎水剤、酵素阻害剤、水分吸収ポリマー、界面活性剤及び吸収促進剤、酸化防止剤等々の１種又はいくつかから選ばれた他の医薬賦形剤を含有する、請求の範囲１記載の薬剤。
【請求項６】
薬剤が他のアジュバントを含有する、請求の範囲１記載の薬剤。
【請求項７】
薬剤が鼻、口、膣、直腸又は腸の粘膜投与に適する形態である、請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載の薬剤。
【請求項８】
薬剤が鼻の粘膜投与に適する形態である、請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載の薬剤。
【請求項９】
最終製剤１００ｇは、
ジフテリアトキソイド、インフルエンザ及びロタウイルスから選ばれる抗原／ワクチン成分                                  ０．０１〜９０ｇ、
アジュバントとして用いる
グリセロールモノオレアート                      ０．１〜５０ｇ、
アジュバントとして用いる
炭素原子数８又は１８の脂肪酸                    １〜５０ｇ、
水                                              ０．０１〜９９ｇ、
ＰＢＳ／塩類液                                  ０．０１〜９９ｇ
及び場合により１種またはそれ以上のアジュバント及び（又は）賦形剤を含有することを特徴とする、粘膜投与用ワクチン又は抗原製剤。
【請求項１０】
抗原成分がジフテリアトキソイド、インフルエンザ及びロタウイルスから選ばれる抗原及び（又は）ワクチンをヒト又は海洋動物を含めた動物に粘膜投与するための薬剤を製造するために、アジュバントとして、
i）グリセロールモノオレアート、
ii）アシル鎖が１個又はそれ以上の不飽和結合を有していてよい、炭素原子数８又は１８の脂肪酸及び
iii）水
から選ばれる化合物を、上記i）及びii）の量が薬剤全容量に対して０．０１〜１５ｇ/１００ｍｌの量で使用する方法。
【請求項１１】
少なくとも９０％のグリセロールモノオレアート含有量を有する、請求項の範囲１０記載の化合物を使用する方法。
【請求項１２】
少なくとも９５％のグリセロールモノオレアート含有量を有する、請求の範囲１０記載の化合物を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗原及び（又は）ワクチンの投与のための新規薬剤に関する。投与の好ましい方法は、粘膜を介するものであるが、非経口投与も使用される。更に本発明は、この様な薬剤中にアジュバント又は賦形剤として（下記の様な）特定の化合物を使用することに関する。
背景
種々のタイプの生物（たとえば腫腸細胞、細菌、ウィルス及び寄生体）から得られる多数の特異抗原は、この何年間にわたってクローニング技術によって製造されている。しかしこれらの抗原は、その高い特異性にかかわらずしばしば弱い免疫原である。
予防接種の後に良好な保護を得るために、これらの弱い抗原に対して免疫システムを促進し、活性化する免疫刺激システムが必要とされる。
現在、主に動物実験に使用されるアジュバントは、非常に異質な物質のグループ；無機物質、オイルエマルション、荷電ポリマー、中性物質又は微生物から得られる物質を包含する。
現在、ヒトに使用される高い有効性を有する安全なアジュバントを得るために、研究開発に於て多大な努力がなされている。しかし、現在この目的のために、広範囲にわたるアジュバントは存在しない。
水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムは、ヒトに使用された最初の２つの無機物質である。得られた免疫応答は、粒子の表面上に沈澱した抗原の徐々の脱着の結果である。その後、これらのアルミニウム塩によって、食菌作用細胞が引きつけられ、免疫応答の更なる促進を生じることが示された。しかしこれらの塩は安全ではない。というのは肉芽腫形成が報告されているからである（Slater.等, Br. J. Dermatol.(1982)Vol. 107, page. 103-108.）。更にアルミニウム塩はすべての抗原に使用することができない。というのはすべての抗原が表面上に吸着されないからである。
1944年にフロイント（Freund）が、植物油、鉱物油、洗剤及び死菌細菌を有する混合物から成るアジュバントを示した。得られる促進（エンハンスメント）は、オイルエマルションからの抗原の徐々の遊離のゆえに部分的である。しかしながらフロイントアジュバントは肉芽腫形成、自動免疫反応の誘発及び非-生体内分解鉱油のゆえにヒトに使用することができない。またその作用を調節するのが困難である。フロイントアジュバント中の活性物質は単離され、Ｎ-アセチルムラミル-Ｌ-アラニンイソグルダマート（しばしばムラミル-ジペプチド（ＭＤＰ）と呼ばれる。）であることが示されている。
ポリメタアクリレート及びポリスチレン粒子の粒子サイズのアジュバント作用依存性を、マウス（Kreuter等、Vaccine,(1986）第４巻、125-129）で、基準抗原として卵白アルブミンを使用して、免疫応答の引き続きの効力検定を用いて調べる。粒子サイズは６２〜３０６ｎｍの間を変化する。その結果は、より小さい粒子がより大きいものよりも免疫応答を促進することである。より小さい粒子は、０．２％Ａｌ（ＯＨ）3よりも良い効果を生じる。すべての調製物は、液体調製物に比べてより高い応答を引き出す。より大きい粒子に比べて、より高い免疫応答を生じる、より小さい粒子を有する微粒子システムの同様な実験は科学文献中で知られている。
抗原に対する免疫応答の促進に今日使用される、ほとんどすべてのシステムは粒子であるか又は抗原と一緒に粒子を形成する。“Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach”（Ed: Powell & Newman, Plenum Press, 1995）なる本に、公知のすべてのアジュバントがその免疫活性とその化学的特性について記載されている。その本に記載されている様に、現在テストされたアジュバントの８０％より多くが、粒子であるか又は抗原と共に（ほとんどの場合たん白質）粒子を形成するポリマーである。粒子を形成しないアジュバントの種類は、免疫学的に単一の物質として作用する物質グループであり、このグループは微粒子アジュバントシステムの投与後、免疫学的活性化の結果として免疫システムによって通常の条件下で形成される物質から成る。
アジュバントとして微粒子システムを用いて、抗原を徐々に生体内分解しうる特性を有するマトリックスに結合させるか又はこれと混合する。この様なマトリックスシステムを用いるのが極めて重要であるのは、このマトリックスが有害な代謝産物を生じないことである。この観点から選択するならば、使用されるマトリックスの主な種類は、主として身体から生じる物質である。この事情から、これらの要求を満足させるわずかなシステムしか役に立たない。身体から生じる、これらのグループの物質の組合せ又は身体から生じる物質の組合せ及び生体適合性ポリマーも使用することができる。リピドは、好ましい物質である。というのはこれがこれを生体内分解性にする構造を示しかつこれがすべての生物膜中で最も重要な部分であるという事実を示すからである。
リピドは極性又は非極性として特徴づけられる。本発明で最も重要であるリピドは、極性リピドである。というのはこれが水中で微粒子システムを生じる能力があるからである。このリピドを定義する他の方法は、分子中に１個の疎水性部分と１個の親水性部分を有するその化学構造のゆえに両親媒性としてあることである。極性リピドの主要グループの例は、モノグリセリド、脂肪酸、ホスホリピド及びグリコスフィンゴリピドである。これらの主要グループは、アシル鎖の長さ及びアシル鎖の飽和度合によって更に特徴づけられる。アシル鎖中の炭素原子の数は６〜２４個の範囲であり、不飽和結合の数は、変化させることができるので、リピドの化学組成に関して無限の数の組合せがある。
微粒子リピドシステムを更に、科学文献で議論されている異なるグループ、たとえばリポソーム、エマルション、クボソーム（cubosome）、コキレート、ミセル等々に分けることができる。
多くのシステムで、リピドは自発的にか又は強制的に安定なシステムを生じることができる。しかしある種の環境下で他の界面活性剤を、安定性を得るために添加しなければならない。この様な界面活性系は、非リピド特性であることができるが、その分子構造中に疎水性部分及び親水性部分を有する極性リピドの特性を有する。
重要であると示されている他のファクターは、リピドが種々の物理化学的相を示すことであり、種々のテスト系でこの相が粘膜に投与後生物学的物質の吸収を促進することを示している。
古典的免疫学に於て及び種々のタイプの感染物、たとえば細菌、ウィルス及び寄生体に対する予防接種との組合せで、広く一般に存在する定説はワクチンを皮下に又は筋肉内に投与することである。しかし近年、研究によれば粘膜に備っている極めて有効な免疫学的システムを身体は有しているのが分っている。ワクチンを経口、鼻内、直腸内及び膣内に投与することは示されている。古典的免疫化に対するのと同様に、粘膜予防接種にあたり、アジュバントの添加による免疫学的応答の促進も必要である。
ワクチン（抗原）が非経口的に投与される古典的免疫学に於けると同様に、粘膜免疫で免疫学的応答を体液の及び（又は）細胞の応答の発展に向けることに多大な興味がある。もし体液応答が得られるならば、特定のクラスの抗体を得る方法でその応答を導くことが重要となる。この様な目標を達成するために、特異免疫刺激剤を抗原及びアジュバントの製剤に添加することができる。
免疫を刺激する物質の種々のタイプが得られる。あるタイプはたん白質、たとえばＰＨＡ，ＣｏｎＡ，ＳＥＡ又は種々のタイプのインターフェロン又はインターロイキンによって表わされる。物質の他のタイプは、上述した様にＭＤＰによって表わされる。他のグループはリピド誘導体として特徴づけることができる。というのはこれらが両親媒性である分子構造を示すからである。この様な物質の１つの例は、ＭＰＬと呼ばれる。他の類似の物質はQuil Aである。これらのカテゴリー中に分類することができる多くの物質は、上述した様に、“Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach”なる本に記載されている。
抗体の特定のクラス又はサブクラスに免疫学的応答を向けて免疫処理をより効果的にすることができるか又は抗原に対する強いＴ-細胞応答を誘発することができることは極めて価値があることである。
本発明の説明
驚くべきことに、本発明者は、混合された抗原及び（又は）ワクチンと共に次のアジュバント１又は２種を含有する薬剤の非経口又は粘膜投与が、混合された抗原／ワクチンに対する免疫応答を改善することを見い出した。動物への抗原及び（又は）ワクチンの非経口又は粘膜投与用上記薬剤は、
ａ）一般式
0004147328.tif 000002
（式中、Ｒ1及びＲ2はＨであり、Ｒ3は炭素原子６〜２４個、好ましくは８〜２０個、更に好ましくは１４〜２０個を有するアシル基１個であり、このアシル鎖は不飽和結合を有していてよい。）
のモノグリセリド
ｂ）一般式
ＣＨ3−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、“ｎ”は４〜２２、好ましくは８〜１８の間を変化してよく、アシル鎖は１個又はそれ以上の不飽和結合を有していてよい。）
の脂肪酸から選ばれた物質１種又はそれ以上を含有する。
モノグリセリド中、アシル鎖は通常、Ｒ1又はＲ3位にある。しかし一般にグリセロール分子中で１〜２個の炭素原子の間でアシル移動があり、結果として約９０％がＲ3位に、１０％がＲ2位にある。従って８０％より大きい純度、好ましくは９０％より大きい純度、更に好ましくは９５％以上の純度を有するDanisco lngredients（デンマーク）から得られた、希釈された１-モノグリセリドを本発明では使用する。グリセリド含有率は最大３％であり、トリグリセリドと脂肪酸含有率は１．０％より少ない。本発明によるモノグリセリドは８０％より多い、好ましくは９０％以上の特異的脂肪酸を通常含有する。
本発明の薬剤は、次のグループ；
保存剤及び浸透圧調節剤、ｐＨ-調節剤、有機溶剤、疎水剤、酵素阻害剤、水分吸収ポリマー、界面活性剤及び吸収促進剤、酸化防止剤等々の１種又はいくつかから選ばれる他の医薬賦形剤を含有してよい。
本発明の薬剤は、ヒト又は海洋動物を含めた動物に適するすべての抗原及び（又は）ワクチンの中から選ばれた抗原及び（又は）ワクチンを含有してよい。
本発明では、抗原と混合する場合、抗原に対して免疫活性を促進し、それによって種々のワクチン薬剤中でアジュバントとして作用するリピドを論ずる。特に本発明は、鼻内、経口、膣又は直腸投与によって免疫学的に活性化される粘膜の予防接種用薬剤の使用を含む。本発明は更に非経口投与用リピドシステムの使用を含む、非経口投与にも、粘膜投与にも使用することができる本発明に記載されているアジュバントの使用は、ヒトに限定されない。たとえば牛、豚、ニワトリ等々の免疫処置に獣医学分野での使用が同様に重要である。更に魚の養殖の分野で、非経口及び粘膜ワクチンを投与することにますます興味が深っている。
この分野で、投与は飼料中にこの薬剤を混入させることによって行うことができる。更に、抗原及びアジュバントを含有するワクチン製剤中、魚を、限られた時間泳がせて、えらを介して粘膜経路によって免疫処置することができる。
科学文献中に、特定のリピドと共に粘膜に投与後、生物学的に活性な物質の吸収をどのように促進するかを示す報告がある。例として、Li & Mitra(Pharm. Res. vol 13:1, 1996）には、リポソームの形でホスホリピドと混合されたインスリンを肺に投与することが記載されている。この文献には、その作用がアシル鎖の長さ及び粒子の電荷に依存することが示されている。最適な長さは炭素原子１０個であり、電荷は正であるのが好ましい。負に電荷された粒子でさえも有効であるが、中性系はより悪い。
同一方法で、de Haan等(Vaccine, 13:2, 155-62, 1995）には、リポソームと抗原赤血球凝集素の混合物が記載されている。混合物をラットに鼻内投与し、その後正の免疫学的応答を検出することができる。Gupta等（Vaccine, 14:3, 219-25, 1995）には、ジフテリアトキソイドと非ホスホリピドをベースとするリポソームシステムの混合物をウサギに非経口投与して、免疫応答を生じる。これはミョウバン吸着されたジフテリアトキソイドである標識された生成物と同一のレベルである。
多数の科学リポートでも、抗原を捕らえるか又はリポソームに吸着される粘膜にリポソームを投与した後に、良好な免疫応答が得られることが示される。
結腸癌（Caco-2）から得られるヒト細胞系についての生体内研究で、標準物質、マンニトールでテストされる最良の浸透作用は、炭素原子１０個の鎖長でみられることが分る。この場合、リピドは脂肪酸の塩からなる。これらのリピドの得られた混合物は、水ミセルと共に生じる（Lindmark等, J. Pharm. Exp. Ther. 275, 958-65, 1995）。
リポソームはホスホリピドから成り、一般にに有機溶剤を伴う比較的長く、扱いにくい処理によって調製される。更にホスホリピドは高価である。
本発明に於て以下に示すように、同様な免疫応答は抗原とリピド製剤との混合によってのみ得ることができる。この製剤は実質上より安価であるあまり複雑でないリピドを含有し、極めて簡単な方法で、商業ベースで調製することができる。
ある程度本発明に類似する他のシステムは、トリグリセリドを主体とする製剤である。しかしこれらのシステムは、界面活性剤を安定化するために使用されるトリグリセリドのエマルションとして科学的に定義される。安定剤としてホスホリピド又は両親媒性分子の他のタイプ、たとえばトウィーン（登録商標）を、通常使用する。更に、このようなエマルションの外観は一般に乳状であり、約１μｍのオイル小滴の大きさを示す。これらの界面活性剤が優れたアジュバントであることは、当業者によく知られている。オイルエマルションのアジュバント性質は第一に界面活性剤の特徴に起因し、トリグリセリド調合物の特徴に起因しない。
ＰＣＴ／ＤＫ９４／０００６２中に、粘膜を介して哺乳類に抗原及び（又は）ワクチンを一般的に投与する製剤が記載されている。この出願には、例中に免疫応答を促進する唯一の製剤がカプリル／カプリン酸グリセリドとポリオキシエチレンソルビタンモノエステル（トウィーン２０）（登録商標）の組合であると記載されている。
本発明の例として、モノグリセリドと脂肪酸の組合せが免疫システムを刺激し、抗体を産生し、保護免疫を誘発する。更に、本発明は、上述の製剤が非経口投与によって高い抗体力価を生じることができることを示す。
それ故に、微粒子リピドシステムが混合された抗原及び（又は）ワクチンに対する免疫応答を改良することができるので、モノグリセリド及び（又は）脂肪酸を有する剤を用いて粘膜経路を介して又は非経口のどちらかで動物に抗原及び（又は）ワクチンを投与することを見い出したことは驚くべきことである。モノグリセリドは、１-アシル-グリセリドの一般式を有するグループから選ばれる。その際アシル鎖中の炭素の数は８〜２４、好ましくは１２〜１８の間を変化する。アシル鎖は飽和されているか又は飽和されていないかのどちらかであってよい。モノグリセリドの濃度は水１００ｍｌあたり０．１〜５０ｇ、好ましくは水１００ｍｌあたり１〜２０ｇの範囲であってよい。脂肪酸濃度は薬剤１００ｍｌあたり０．１〜５０ｇ、好ましくは水１００ｍｌあたり１〜２０ｇの範囲であってよい。モノグリセリドと脂肪酸を一緒に調合する場合、脂肪酸中のモノグリセリドの百分率は１〜９９％、好ましくは１０〜９０％の間を変化することができる。
モノグリセリド及び（又は）脂肪酸を抗原及び（又は）ワクチンと一緒に投与した後に免疫応答を促進することは、従来技術のどこからも示唆されない。
本発明は、抗原と適するリピドの混合物が身体を刺激し、保護免疫を発生することを示す。本発明の他の利点は、簡単な調製方法であり、捕集（entrapment）方法に比べて材料（抗原）は全く処理で失われない。その例として、リポソーム中で捕集する方法で回収は通常は１０〜２０％であることが挙げられる。残りは処理中に失われる。
最終製剤１００ｇは、
抗原／ワクチン成分０．０１〜９０ｇ、
モノグリセリド      ０．１〜９０ｇ、
脂肪酸              ０．１〜９０ｇ、
水                ０．０１〜９９ｇ、
ＰＢＳ／塩類液    ０．０１〜９９ｇ
及び場合により１種またはそれ以上のアジュバント及び（又は）賦形剤を含有するワクチン又は抗原製剤である。
更に、
ａ）少なくとも８０％モノグリセリド含有率を有し、かつ一般式
0004147328.tif 000003
（式中、Ｒ1及びＲ2はＨであり、Ｒ3は炭素原子６〜２４個を有するアシル基１個であり、このアシル鎖は１個又はそれ以上の不飽和結合を有していてよい。）
を有するモノグリセリド調製物及び
ｂ）一般式
ＣＨ3−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、“ｎ”は４〜２２の間を変化してよく、アシル鎖は１個又はそれ以上の不飽和結合を有していてよい。）
の脂肪酸から選ばれた化合物を、ヒト又は海洋動物を含めた動物に抗原及び（又は）ワクチンを非経口又は粘膜投与するための薬剤中の添加剤／賦形剤として薬剤全容量に対して０．０１〜１５ｇ／１００ｍｌの量で使用することができる。上記の使用される化合物は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のモノグリセリド調製物含有率を有する。
また、モノグリセリド調製物のアシル鎖は、炭素原子８〜２０個、好ましくは１４〜２０個を有し、このアシル鎖は１個又はそれ以上の不飽和結合を有していてよく、脂肪酸のアシル鎖が、炭素原子８〜２０個、好ましくは１４〜２０個を有し、このアシル鎖は、１個又はそれ以上の不飽和結合を有する。
上述の文献中のリポートは、リポソームと抗原を混合することによって免疫応答は粘膜への投与後に検出されにことを示す。
しかしながら、以下に示すように本発明の例は、このシステムをより安定で、安価であるリピドの使用によって更に簡単にすることができ、そしてこのリピドをより便利なかつ簡単な方法で粒子に形作ることができることを示す。
本発明を次の例によって例示する。これらの例は、抗原の共投与（co-administration）の原則、これに関連する免疫刺激物質又はアジュバントとしての粒子作用の組合せを示す。
例１
グリセロールモノオレアート３ｇを、リン酸塩緩衝された塩類液ｐＨ７．４中に０．６％プルロニック（Pluronic）−１２７（登録商標）５０ｍｌに加えて、グリセロールモノオレアートの懸濁液を製造し、その後この混合物を、４分間プロープソニケーターで音波処理する。得られた乳状懸濁液は、光学顕微鏡によって測定される約２μｍの最大サイズの粒子を含有する。
例２
グリセロールモノオレアートの負電荷ミセル懸濁液を、オレイン酸０．５ｇと０．３５Ｍ  ＮａＯＨ５ｍｌとの混合物によって製造し、５秒間プローブソニケーターで音波処理する。その後グリセロールモノオレアート３ｇと０．９％ＮａＣｌ５０ｍｌを加え、次いで混合物４分間プローブ音波処理する。グリセロールモノオレアートのモノエステル含有率は、９２％オレアートと６％リノレン酸を含有するアシル鎖で９５％以上である。ｐＨを８．３に調整する。得られた完全に澄明な均質な溶液は、可視検査で測定される約０．２μｍ以下のサイズの粒子を含有する。澄明な溶液が得られる場合、粒子サイズは約０．２μｍ以下であり、僅かに乳白光の帯青色外観は約０．２〜０．５μｍのサイズを示し、外観が乳状である場合、サイズは約０．８μｍ以上である。
例３
グリセロールモノオレアートの正電荷ミセル懸濁液を、ラウリル-アミン０．５ｇと０．５Ｍ  ＨＣｌ  ３．５ｍｌを混合し、５秒間音波処理して、製造する。その後グリセロールモノオレアート３ｇ及び水５０ｍｌを加え、次いで混合物を４分間プローブ音波処理をする。ｐＨを０．５Ｍ  ＨＣｌを用いて４〜５に調整する。得られた完全に澄明な均質溶液は、約０．２μｍ以下のサイズの粒子を含有する。
例４
例１による粒子混合物及びジフテリアトキソイドをマウスに皮下投与し、２１日後追加免疫する。３０日後、ジフテリアトキシンに対するＩｇＧ抗体及びVero細胞を用いる中和力価（ＮＴ）に関して検定する血液サンプルが得られる。ミョウバン（ｎ＝５）及びグリセロールモノオレアート（ｎ＝５）グループからの血清をプールし、検定する。鼻内ブーストを受けるマウス及び応答マウス（５匹のうちの３匹）を、個々の基準に基づいて検定する。任意のユニットで、表１中にＩｇＧ力価及び中和力価を示す。結果からＩｇＧも防御抗体も、ミョウバン（Ａｌ（ＰＯ4）3）上に吸着されたジフテリアトキソイドを含有する市販製品を受けるコントロールグループと比較するのと同じレベルであることが分る。更に高いＩｇＧ力価は高い中和力価が常につきものであり、防御免疫にとって重要である抗原部位を薬剤が破壊しないことを示すことが分る。
0004147328.tif 000004
例５
粒子を例２に従って２００ｍＭモノグリセリド及び２００ｍＭ脂肪酸の最終濃度で製造する。ジフテリアトキソイド（２．９μｌ，４．４ｍｇ／ｍｌ）をミセル懸濁液２００μｌと混合し、マウスに皮下投与し、２１日後に皮下に追加免疫を行う。トキソイドの一次投与も追加投与も、１０μｇである。３０日後ジフテリアトキシンに対するＩｇＧ抗体に関して検定する血液サンプルが得られる。結果（表２）から、グリセロールモノオレアート（ＭＯ）とオレイン酸（Ｃ  １８：１）を有する薬剤に対して任意のＩｇＧ力価は、ミョウバン（Ａｌ（ＰＯ4）3）上に吸着されたジフテリアトキソイドを有する現在市販されている製品を受けるコントロールグループと比較するのと同じレベルであることが分る。モノグリセリドと脂肪酸の他の組合せは、僅かに拒否応答を示し、これはアシル鎖の拒否長さと相互関係を示す（Ｍ１２＝チウリル-１-グリセラート；Ｍ１０＝カプリン-１-グリセラート；Ｃ１２＝ラウリル酸；Ｃ１０＝カプリン酸；Ｃ８＝カプリル酸）。Ｎ．Ｄ．＝行われなかった；これらのグループ中５匹のマウスだけであることを示す。
0004147328.tif 000005
例６
例４に於けると同一の処理を行うか、皮下の代りに鼻内に追加免疫投薬量を投与する。ジフテリアトキソイドの投薬量は一次免疫でも、鼻内追加免疫投与も１０μｇである。同一実験で、投薬量−応答は、３つの異なる量のリピド（表３参照）を投与した場合、得られることが証明される。任意のＩｇＧ力価を表４中に示す。より低いＩｇＧ力価はより低い濃度のリピドでみられる投薬量−応答効果の他に、より低い投薬量を受容するグループ中で応答に関する比較的高い可変性もみられる。この可変性は、アジュバント効果が高い力価を得ることに対してばかりでなく、応答の可変性の減少に関してもみられることを示す、より高い投薬量レベルでみられない。
0004147328.tif 000006
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例７
主に中位の長さのアシル鎖（組成Ａ）と長いアシル鎖（組成Ｂ）を含有する、２つの異なるリピド薬剤をテストする。組成を表５中に示す。
0004147328.tif 000008
薬剤をマウスに皮下又は鼻内に投与３週間後に追加免疫で皮下又は鼻内に投与する。血液サンプルをもう１週間後採取する。任意のＩｇＧ力価を表６に示す。
表６の結果は、一次投与も、鼻内経路での追加免疫投与も良好な応答を得るために、組成Ｂが好ましいことを証明する。
0004147328.tif 000009
例８
グリセロールモノオレアート（２００ｍＭ）とカプリル酸（２００ｍＭ）の混合物を、ホルマリンで不活性化されたインフルエンザウィルス（菌株ＳＤＡ／９４）と混合し、最初にマウスに皮下投与し、次いで３週間後鼻内追加免疫を行う。投薬量は０．０５μｇＨＡであり、血液サンプルを追加免疫投与３週間後に採取し、ＨＡに対する凝集反応力価（ＨＩ）に関して検定する。結果（表７）から、ウィルスをアジュバントと一緒に受けるグループ中のＨＩ力価がＰＢＳ中でウィルスを受けるグループに比較してより高いレベルであることが分る。
0004147328.tif 000010
例９
例２によるミセルをホルマリンで殺傷されたrotaウィルス粒子と混合し、次いで雌性マウスに投与する。３回の免疫処置後、マウスを妊娠させ、その後新生マウスを生きているrotaウィルスで鼻内で免疫性をテストする。数値は、そのグループ中の全動物数に比較して、免疫性テスト後保護を獲得する動物を示す。この免疫性テストの結果を表８に示す。
0004147328.tif 000011
この結果から明らかな様に、３回の筋肉内投与後も、一次筋肉内免疫処置、次いで２回の鼻内投与後も良好に保護される。
例１０
リピド薬剤の毒性を評価するために、これをラット鼻腔内に投与する。その後ラットを殺し、鼻粘膜を光、蛍光及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）のために準備する。例１及び例２の薬剤をテストする。グリセロールモノオレアート／プルロニック懸濁液は、ＳＥＭを用いて粘膜表面中で最小の変化を示す。光又は蛍光電子顕微鏡下で効果が検出されない。グリセロールモノオレアートとオレイン酸を含有するミセルは、粘膜中で何らの変化を誘発することができない。
例１１
Caco-２細胞――これはコロン細胞から由来するヒト細胞株である――は、上皮単層として生長させることができる。これらの細胞は、上皮細胞を通って生物学的物質を運搬するのに影響を与えることができる種々の物質を調べるのにしばしば使用され、一連の実験システムで消化管から血流への吸収に関する生体内データとの良好な相互関係を生じることを示す。細胞への輸送用標識物質として、Ｎａ-フルオレセン又はマンニトールを使用する。本発明のリピド薬剤を用いた実験は非毒性濃度でCaco-２細胞への促進された輸送を示す。