(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)医薬有効量のコルチコトロピン放出因子（CRF）、(b)製剤が液体形態にある時に製剤のpHを2.0〜5.0または6.0〜9.0に維持するように作用する1mM〜50mMの濃度の緩衝剤、ここで前記緩衝剤の陰イオンは酢酸イオン、リン酸イオン、コハク酸イオン及び乳酸イオンから成る群から選ばれる、及び(c)1％〜10％の濃度のアルコール、ここで前記アルコールはマンニトール、ソルビトール、リボトール、アラビトール、キシリトール、イノシトール、ガラクチトール、メタノール、エタノール及びグリセロールからなる群から選ばれる、
を含むコルチコトロピン放出因子（CRF）の医薬製剤。
【請求項２】
1mMから100mMまでの濃度のメチオニン、アルギニン、リシン、システイン、グルタチオン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸を更に含む請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項３】
アミノ酸がメチオニンである請求の範囲第２項に記載の製剤。
【請求項４】
前記メチオニンが10mMから50mMまでの濃度である請求の範囲第３項に記載の製剤。
【請求項５】
1％から10％までの濃度の糖を更に含む請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項６】
糖がグルコース、蔗糖、ラクトース、フルクトース、トレハロース及びマンノースからなる群から選ばれる請求の範囲第５項に記載の製剤。
【請求項７】
0.05mMから1mMまでの濃度の第二鉄塩または第二銅塩を更に含む請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項８】
0.5mMから2.0mMまでの濃度の塩化マグネシウムまたは塩化亜鉛を更に含む請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項９】
化学的に適合性の防腐剤を更に含む請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記化学的に適合性の防腐剤がベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、クレゾール、メチルパラベン及びプロピルパラベンからなる群から選ばれる請求の範囲第９項に記載の製剤。
【請求項１１】
(a)医薬有効量のコルチコトロピン放出因子（CRF）、(b)1mMから100mMまでの濃度のアミノ酸、ここで前記アミノ酸はメチオニン、アルギニン、リシン、システイン、グルタチオン及びグルタミン酸からなる群から選ばれる、及び(c)1％〜10％の濃度のアルコール、ここで前記アルコールはマンニトール、ソルビトール、リボトール、アラビトール、キシリトール、イノシトール、ガラクチトール、メタノール、エタノール及びグリセロールからなる群から選ばれる、
を含むコルチコトロピン放出因子（CRF）の医薬製剤。
【請求項１２】
前記アミノ酸がメチオニンである請求の範囲第１１項に記載の製剤。
【請求項１３】
コルチコトロピン放出因子ペプチドを(a)(i)製剤が液体形態にある時に製剤のpHを2.0〜5.0または6.0〜9.0に維持するように作用する1mM〜50mMの濃度の緩衝剤、ここで前記緩衝剤の陰イオンは酢酸イオン、リン酸イオン、コハク酸イオン及び乳酸イオンからなる群から選ばれる、または(ii)1mMから100mMまでの濃度のアミノ酸、ここで前記アミノ酸はメチオニン、アルギニン、リシン、システイン、グルタチオン及びグルタミン酸からなる群から選ばれる、及び(b)1％〜10％の濃度のアルコール、ここで前記アルコールはマンニトール、ソルビトール、リボトール、アラビトール、キシリトール、イノシトール、ガラクチトール、メタノール、エタノール及びグリセロールからなる群から選ばれる、を含む溶液に溶解することを特徴とするコルチコトロピン放出因子ペプチドの医薬製剤の調製方法。
【請求項１４】
製剤に1mMから100mMまでの濃度のメチオニン、アルギニン、リシン、システイン、グルタチオン及びグルタミン酸からなる群から選ばれたアミノ酸を添加することを特徴とする液体製剤中のコルチコトロピン放出因子の安定性の増進方法。
【請求項１５】
前記アミノ酸がメチオニンである請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
治療有効量の請求の範囲第１項または第１１項に記載の製剤を含有する哺乳類の炎症または浮腫を減少するための医薬組成物。
【請求項１７】
静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、鼻内径路または肺経路により投与する形態にある請求の範囲第１６項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は液体形態で時間の延長された期間にわたって改良された安定性を有するコルチコトロピン放出因子(CRF)の新規な製剤に関するものであり、これらはこのような貯蔵中に有意な医薬活性を保持し、かつこれらは医薬上許される。更に、本発明はこのような新規な医薬製剤の調製方法に関する。
発明の背景
コルチコトロピン放出因子(CRF)は下垂体−副腎軸の刺激の原因の主要視床下部ホルモンとして1981年に最初に同定された内在性41アミノ酸ペプチドである(Vale,W.ら，Science 213:1394-1397(1981))。更に最近、CRFは浮腫及び炎症の強力なインヒビターとして周辺の非エンドクリン機能介在性生物活性を有することが示されていた(Wei,E.T.ら，Ciba Foundation Symposium 172:258-276(1993))。これが一連の実験で確認され、その実験ではCRFの全身投与が血漿成分の血管漏出及び損傷または炎症媒介物質に応答する関連組織膨潤を抑制することが示されていた(Wei,E.T.ら，European J. of Pharm. 140:63-67(1987), Serda,S.M.ら，Pharm.Res. 26:85-91(1992)及びWei,E.T.ら，Regulatory Peptides 33:93-104(1991))。また、CRFは当業界でコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)、コルチコリベリン、コルチコレリン及びCRF-41として知られている。
CRF神経ペプチドはヒツジの視床下部のエキスから最初に単離され(oCRF; Vale,W.ら，Science 213:1394-1397(1981))、続いてラット(rCRF; Rivier,J.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4851-4855(1983))、ブタ(pCRF; Schally,A.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5197-5201(1981)及びヒト(hCRF; Shibahara,S.ら，EMBO J. 2:775-779(1983))を含む多数のその他の哺乳類の視床下部から同定され、単離された。ヒツジ、ラット及びヒトからのCRFペプチドのアミノ酸配列の比較は、ラットペプチド及びヒトペプチドが同じであり、両方がヒツジペプチドとは7つのアミノ酸位置で異なり、その相違が主としてペプチドのＣ末端領域中で生じることを示した(Hermus,A.ら，J.Clin.Endocrin.and Metabolism 58:187-191(1984)及びSaphier,P.ら，J.Endocrin. 133:487-495(1993))。
CRFはヒトの種々の異なる用途について安全かつ有益な医薬薬剤であることが示された。詳しくは、CRFのin vivo投与がヒトの高コルチゾール症及び低コルチゾール症の原因を解明することを助けるのに広範に使用され、内因性鬱病及びクッシング病を含む視床下部−下垂体−副腎軸を冒す種々のその他の疾患の極めて有益な診断上及び研究上の手段である(Chrousos,G.ら，N.Eng.J.Med. 310:622(1984)及びLytras,N.ら，Clin.Endocrinol. 20:71(1984))。実際に、CRFのin vivo投与は、前下垂体機能の障害が疑われる全ての症例で前下垂体のコルチコトロピン機能を試験するのに有益である。これは下垂体腫瘍または頭蓋咽頭腫を患う患者、下垂体不全、汎下垂体機能低下または空の鞍形凹窩症候群が疑われている患者、並びに下垂体領域へのトラウマ損傷または術後損傷を患う患者及び下垂体領域の放射線療法を受けた患者に適用される。こうして、CRFは明らかに視床下部−下垂体−副腎(HPA)軸の診断分析に実用性を有する。
重要な周辺用途について、CRFはまたin vivo抗炎症活性を有する。CRFペプチドの抗炎症活性に関して、CRFは皮膚中の後毛管細静脈に選択的に作用することが明らかである種々の炎症媒介物質により誘発される血管漏出を阻止する。また、CRFは筋肉、脳微小血管、及び肺胞毛管中の毛管からの損傷誘発漏出及び炎症媒介物質誘発漏出を抑制する。これらの観察は、CRFが微細循環により作用して内皮細胞保全性を保存または回復し、それにより液体流出及び血管内間隙からの白血球輸送並びに損傷の部位における蓄積を抑制する。
CRFペプチドの新規な抗炎症活性に鑑みて、多数の臨床上の指示が明らかである。例えば、CRFペプチドが用途のあり得る臨床上の指示として、慢性関節リウマチ、脳腫瘍または癌に対する放射線に二次的な浮腫、卒中、頭部トラウマもしくは脊髄損傷により生じる浮腫、術後の浮腫、喘息及びその他の呼吸疾患並びに眼の類嚢胞黄斑浮腫が挙げられる。
上記in vivo用途における使用について、CRFは皮下、静脈内、筋肉内またはエアゾールとしての鼻内を含む種々の手段により被験者に投与し得る。このような投与の種々の手段は通常多種の異なるCRF製剤の調製を必要とする。しかしながら、一般に、in vivo投与に使用されるCRFペプチド製剤が合成され、固形凍結乾燥粉末として貯蔵され、これが使用直前に医薬上許される液体に再生される。このような製剤が通常好ましい。何とならば、凍結乾燥製剤は一般にそれらの液体相対品よりも良好な経時の医薬活性を維持することが当業者により認められているからである。しかしながら、凍結乾燥製剤は、それらが使用直前に再生を必要とし、それ故、臨床セッティングまたは外来セッティングで使用することが更に困難である点で不利である。更に、凍結乾燥製剤は一般に製造するのが更に困難かつ高価である。何とならば、それらがそれらの調製中に凍結乾燥の余計な工程を必要とするからである。
CRFペプチドの種々の実験製剤（既に凍結乾燥された物質から再生されるか否かを問わない）がヒト及び動物の両方への投与に使用された。例えば、CRFの例示製剤は0.0001NのHCl-154mMのNaCl、0.1％のラクトース、0.25％のヒト血清アルブミン(HSA)、0.5mMのアスコルビン酸及び0.9％のベンジルアルコール(DeCherney,G.ら，J.Clin.Endocrin. and Metabolism 61:273-279(1985)及びDeCherney,G.ら，J.Clin.Endocrin. and Metabolism 64:1211-1217(1987))、pH2.0の食塩水(Hermus,A.ら，Clin.Endocrin. 21:589-595(1984)及びHermus,A.ら，Eur.J.Clin.Pharmacol. 31:531-534(1987))、0.9％の食塩水中の0.02％のHCl及び10％のアルブミン(Holsber,F.ら，Neuroendocrinology 48:32-38(1988))、0.05Mの酢酸及び5％のマンニトール(Koide,Y.ら，J.Clin.Endocrin.及びMetabolism 63:329-335(1986))、0.1％のBSA及び0.01％のアスコルビン酸を含む0.04Mのリン酸緩衝液(pH7.3)(Lee,S.ら，Alcohol.Clin.Exp.Res.17:1009-1013(1993))、0.001NのHCl-154mMのNaCl、0.9％のベンジルアルコール、10％のマンニトール及び0.25％のHSA(Orth,D.ら，J.Clin.Endocrin. and Metabolism 55:1017-1019(1982))並びに滅菌水＋5％のマンニトール(Schulte,H.ら，J.Clin. Endocrin. and Metabolism 58:192-196(1984)及びSchurmeyer,T.ら，J.Clin. Endocrin. and Metabolism 59:1103-1108(1984))を含む。
しかしながら、上記CRF製剤は種々の理由のために大規模の商用の医薬使用に不適である。例えば、上記製剤の多くはそれらの化学的製剤化、pHなどのために皮下または鼻内投与される場合にかなりの刺激を生じ得る。更に、上記製剤の多くは、凍結乾燥されず、使用直前に再生されない場合には、CRFペプチドが或る種の添加剤の存在下で或るpHで時間の延長された期間にわたって貯蔵される場合に分解及び医薬活性の同時の損失を高度に受け易いという事実を説明することができない。更に、CRFは或るpH、特に約5-6の範囲のpHで比較的不溶性である。上記のように、貯蔵中のかなりの分解を避けようと試みて、上記製剤の多くが使用直前に生理学的に適合性の液体として再生される凍結乾燥物質として実際に調製される。
こうして、適度の可溶性を有し、かつ時間の延長された期間にわたって貯蔵中に安定であるCRFの改良された医薬製剤を提供することができることにかなりの関心がある。それ故、本発明の目的はペプチドの認められる分解または医薬効力のかなりの損失なしに時間の延長された期間にわたって液体形態で貯蔵し得るCRFの医薬製剤を調製することである。このような液体製剤は凍結乾燥及び使用前のペプチドのその後の再生を省き、こうして更に都合の良い投与を可能にする。このような液体製剤を開発する際に、製剤の投与の様式、その液体製剤中のCRFペプチドの溶解性、種々のpH、温度等における液体としての貯蔵の延長された期間にわたるペプチドの安定性を考慮する必要がある。
本発明の更に別の目的は医薬上許されるCRFの製剤（それらが特に皮下経路及び鼻内経路により投与された時に被験者にかなりの刺激をもたらさないことを意味する）を調製することである。
本発明の更に別の目的は本発明の新規な医薬製剤の調製方法及び哺乳類の炎症及び浮腫を減少するためのこのような製剤の使用方法を提供することである。
本発明のその他の目的、特徴及び特性は以下の説明及び請求の範囲を考慮した後に更に明らかになるであろう。
本明細書に引用される刊行物及びその他の材料は本発明の背景を明らかにし、その通例に関して付加的な詳細を与えるのに使用される。本明細書で言及される刊行物の夫々が本明細書に参考として明らかにそのまま含まれる。
発明の要約
本発明は許される溶解性を有するCRFの新規な製剤の同定及び調製に基くものであり、これらは時間の延長された期間にわたって液体として貯蔵された時に安定であり、これらはこのような貯蔵中に有意な医薬活性を失わず、かつ／またはそれらが投与された時に刺激に関して良く寛容される点でそれらは医薬上許される。こうして、本発明の一局面は(a)医薬有効量のCRF、(b)液体形態にある時に製剤のpHを約2.0〜約5.0または約6.0〜約9.0に維持するように作用する約1mM〜約50mMの濃度の緩衝剤、ここで前記緩衝剤の陰イオンは酢酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、コハク酸イオン、クエン酸イオン、ホウ酸イオン、酒石酸イオン、フマル酸イオン及び乳酸イオンからなる群から選ばれる、及び(c)約1％〜約10％の濃度のアルコール、ここで前記アルコールはマンニトール、ソルビトール、リボトール、アラビトール、キシリトール、イノシトール、ガラクチトール、メタノール、エタノール及びグリセロールからなる群から選ばれるを含むCRFの医薬上許される製剤に関する。
本発明の別の局面において、種々の成分が必要により上記製剤中に含まれてもよく、緩衝剤を置換してもよい。このような添加剤として、アミノ酸、例えば、メチオニン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、システイン、グルタチオン等が挙げられる。アミノ酸は一般に約1mMから約100mMまでの範囲の濃度で存在する。
本発明の更に別の局面において、種々の糖が必要により上記製剤中に含まれてもよい。このような糖として、例えば、グルコース、蔗糖、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース等が挙げられる。添加剤糖は一般に約1％から約10％までの範囲の濃度で存在する。
本発明の更に別の局面において、潜在的な安定化化合物、例えば、鉄(III)塩、銅(II)塩、マグネシウム塩及び亜鉛塩等が上記製剤に添加されてもよい。これらの潜在的な安定剤はCRFペプチドの分解に対する保護効果を与え、一般に、約0.05mMから約1mMまでの範囲の濃度で存在する。
本発明の更に別の局面において、酸化防止剤、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)等または化学的に適合性の防腐剤、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン等がまた上記製剤に添加されてもよい。また、このような化合物は溶液中のCRFペプチドの分解に対する保護効果を与え、夫々の汚染物質の成長を抑制し得る。
本発明のその他の局面は本発明の新規な医薬製剤の調製方法及び種々の濃度のアミノ酸を添加することにより製剤中のCRFの安定性を増進し、それによりCRFペプチドの分解の速度を低下する方法に関する。
本発明の別の局面は治療有効量の本発明の一種以上の新規なCRF製剤を投与することを特徴とする哺乳類の炎症及び浮腫の減少方法に関する。
その他の局面が当業者に容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図1はヒツジCRFペプチドのアミノ酸配列と比較してヒト及びラットのCRFペプチドのアミノ酸配列を示す。アミノ酸はそれらの通常の1文字表示として表される。太字で示され、下線を施されているヒツジ配列中のアミノ酸はヒト／ラットCRF配列とは異なるものである。
図2は液体製剤中の30℃の貯蔵中のCRFの分解の相対速度を示し、試験した液体製剤は1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩（“pH4.0”）、1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩、5％のマンニトール（“pH4/マンニトール”）及び1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩、5％のソルビトール（“pH4/ソルビトール”）である。
図3は液体製剤中の4℃の貯蔵中のCRFの分解の相対速度を示し、試験した液体製剤は1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩（“●”）、1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩、5％のマンニトール（“■”）及び1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩、5％のソルビトール（“▲”）である。
図4は2℃〜8℃で経時にわたって貯蔵された時のバッチ番号NTI94004中のCRFペプチドの分解の相対速度を示す。
図5は2℃〜8℃で経時にわたって貯蔵された時のバッチ番号NTI95004中のCRFペプチドの分解の相対速度を示す。
図6は経時にわたって下記の液体製剤中で40℃のCRFペプチドの分解の相対速度を示す。20mMの酢酸塩及び5％のマンニトール中の1mg/mlのCRF（対照）（＿＿＿＿）、対照＋10mMのメチオニン（．．．．．．）及び対照＋50mMのメチオニン（−−−−−−）。
図7は経時にわたって下記の液体製剤中で40℃のCRFペプチドの分解の相対速度を示す。20mMの酢酸塩及び5％のマンニトール中の1mg/mlのCRF(対照)（＿＿＿＿）、10mMの酢酸塩及び5％のマンニトール中の1mg/mlのCRF（−−−−−−）、5mMの酢酸塩及び5％のマンニトール中の1mg/mlのCRF（．．．．．．）及び20mMのメチオニン及び5％のマンニトール（−・−・−・−・）。
図8は経時にわたって下記の液体製剤中で40℃のCRFペプチドの分解の相対速度を示す。20mMの酢酸塩と5％のマンニトール（対照）（＿＿＿＿）、20mMのメチオニンと5％のマンニトール（．．．．．．）及び50mMのメチオニンと5％のマンニトール（−−−−−−）中の1mg/mlのCRF、pH4.0。
発明の詳細な説明
本発明は時間の延長された期間にわたって液体として貯蔵された時に安定であり、このような貯蔵中に有意な医薬活性を失わず、かつ／またはそれらが投与された時に刺激に関して良く寛容される点で医薬上許されるCRFの新規な製剤の同定及び調製に基いている。また、本発明はこのような製剤の調製方法、このような製剤中のCRFペプチドの安定性の増進方法及び哺乳類の炎症及び浮腫を減少するためのこのような製剤の使用方法に関する。
本明細書に使用される“コルチコトロピン放出因子”、“CRF”、“コルチコトロピン放出ホルモン”、“CRH”、“コルチコリベリン”、“コルチコレリン”、“CRF-41”という用語またはその文法上の均等物は機能的定義を有し、天然の無傷のCRFペプチドの一種以上の生物活性を共有するペプチドを表す。このような生物活性として、例えば、ACTHの放出を刺激する能力、in vivoで浮腫を抑制する能力及びCRF受容体に結合する能力が挙げられる。上記用語の夫々は41アミノ酸のヒト、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ及び魚のコルチコトロピン放出因子ペプチド並びにその他の哺乳類からのCRFペプチド（天然源抽出及び精製から単離されたか否かを問わない）及び組換え細胞培養系からのCRFペプチドまたはペプチド合成技術を使用して合成されたCRFペプチドを表すことが意図される。また、これらの用語は天然CRFペプチド、例えば、ウロコルチン(Vaughan,J.ら，Nature 378:287-292(1995)、Donaldson,C.J.ら，Endocrinology 137(5):2167-2170(1996)及びTurnbull,A.V.ら，Eur.J.Pharm. 303:213-216(1996))、ウロテンシンＩ(Lederis,K.ら，Science 218:162-164(1982))及びサウバジン(Montecucchi,P.C.ら，Int.J.Pep.Prot.Res. 16:191-199(1980))の一種以上の生物活性を共有するその他のCRF関連ペプチドを表すことが意図される。本発明の製剤中に使用されるCRFペプチドは固相ペプチド合成技術または液相ペプチド合成技術を使用して合成されることが好ましいが、CRFペプチドのその他の源が当業者に容易に入手し得る。ヒト、ラット及びヒツジのCRFペプチドのアミノ酸配列が図1に示される。“コルチコトロピン放出因子”及び“CRF”等の用語は生物活性CRF均等物、例えば、全アミノ酸配列中一種以上のアミノ酸を異にするペプチド並びにCRFの置換、欠失、挿入及び修飾アミノ酸変異体（これらは無傷CRFペプチドと通常関連する生物活性を実質的に保持する）を含む。
本発明の製剤に関して使用される場合の“医薬上許される”という用語は、製剤が被験者（製剤があらゆる既知の投与レジメにより投与される）中で刺激の許容できないレベルをもたらさないことを表す。刺激の許容できないレベルを構成するものは当業者により容易に測定でき、紅斑及び焼痂形成並びに製剤の投与と関連する浮腫の程度を考慮するであろう。
本発明の新規な製剤は、一部、治療有効量のCRFペプチドを含む。“治療有効量”は、製剤が通常の投与レジメによりこのような投与を要する個体に投与された時に、所望の薬理効果または治療効果をもたらす濃度のCRFを含むことを意味する。一般に、製剤中のCRFの治療有効量は約0.1mg/mlから10mg/mlまでの範囲である。CRFの治療有効量は約0.5mg/mlから約5mg/mlまでの範囲であることが好ましく、約0.5mg/mlから約3mg/mlまでの範囲であることが更に好ましい。
本発明の新規な製剤は、一部、緩衝剤を更に含む。ここで意図される緩衝剤はそれらの陰イオン物体として酢酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、コハク酸イオン、クエン酸イオン、ホウ酸イオン、酒石酸イオン、フマル酸イオン、乳酸イオン等を有する緩衝剤を含む。およその電気中性を保持するために、負に帯電された陰イオン種はほぼ等しい量の正に帯電された対イオンの存在により釣り合わされてもよい。ここに使用される対イオンは生理学上許されるものであり、ナトリウム(Na)、カリウム(K)、カルシウム(Ca)、アンモニウム(NH4)等を含む。しかしながら、このような陰イオン性緩衝液はアミノ酸、例えば、メチオニン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、システイン、グルタチオン等により完全に置換されてもよい。このようなアミノ酸は弱塩基であるが、それらは本発明の製剤に適した緩衝能を与える。
本発明の新規な製剤中に使用される緩衝剤は生理学上許され、一般に約1mMから約50mMまでの濃度の範囲である。しかしながら、使用される緩衝剤は約5mMから約30mMまでの濃度の範囲であることが好ましく、約5mMから約20mMまでの濃度の範囲であることが更に好ましい。更に、使用される緩衝剤は比較的低いイオン濃度を有することが好ましいが、高いイオン濃度の緩衝剤がまた使用されてもよい。
また、種々の緩衝剤が凍結乾燥の方法にかけられる時に或る程度まで揮発されてもよいことが知られている。このようなものとして、CRFを含む製剤が凍結乾燥される場合には、不揮発性緩衝剤が好ましい。使用される不揮発性緩衝液の例として、陰イオン物体、例えば、コハク酸イオン、酒石酸イオン、リン酸イオン等を有する緩衝剤が挙げられる。
本発明の新規な製剤中の緩衝剤の機能は、一部、液体形態にある時に製剤のほぼ一定のpHを維持することである。一般に、約2.0〜約5.0または約6.0〜約9.0の範囲のpHが使用し得るが、液体製剤のpHは約3.0から約4.5まで、または約6.5から約8.0までの範囲であることが好ましい。本発明の液体製剤のpHは約3.8から約4.2まで、または約7.0から約7.5までの範囲であることが更に好ましい。酸性pHが使用されることが最も好ましい。実際に、あらゆる有機または無機の酸が本発明の液体製剤のpHを下げるのに使用し得るが、但し、前記酸が溶液中のCRFペプチドの安定性または溶解性にかなり有害な効果を有しないことを条件とする。使用し得る酸の例示の例として、HCl、H3PO4、H2SO4、酢酸等が挙げられる。
また、CRFペプチドの医薬製剤へのアルコールまたは糖アルコールの添加が時間の延長された期間にわたる貯蔵中のペプチドの安定性及び製剤が個体に投与される時の刺激の可能性に有益な効果を有することが測定された。このようなものとして、本発明の新規な製剤は、一部、アルコールを更に含む。本発明の製剤に使用されるアルコールとして、マンニトール、ソルビトール、リボトール、アラビトール、キシリトール、イノシトール、ガラクチトール、メタノール、エタノール、グリセロール等が挙げられる。一般に、本発明の新規な製剤中に使用されるアルコールの濃度は約1％から約10％まで、好ましくは約3％から約7.5％まで、更に好ましくは約4％から約6％までの範囲である。
本発明のCRFを含む製剤はほぼ生理学的であるオスモル濃度を有することが好ましいが、非生理学的オスモル濃度を有するものが使用されてもよい。“生理学的オスモル濃度”は、製剤のオスモル濃度が投与の生理学的部位で通常見られるものであることを意味する。また、製剤に添加されるアルコールまたは糖アルコールの量及び型がその製剤のオスモル濃度に影響することが知られており、こうして、添加剤アルコールの量及び型が製剤のオスモル濃度を適当な生理学的範囲にするように選ばれる。また、オスモル濃度は生理学的に適合性の塩の製剤への添加により影響されることがあり、それ故、実際に生理学的に適合性の塩の添加がCRFを含む製剤のオスモル濃度を変える際の使用について意図される。使用される塩は生理学的に適合性であり、かつCRF安定性または溶解性に実質的な低下効果を有しないものである。
本発明の製剤はまた必要により活性な安定なCRFペプチド製剤の調製を好ましくは損なわない量かつ有効な安全な医薬投与に適した量のその他の成分を含んでもよい。
一般に、溶液中のCRFペプチドの分解の主たる経路はペプチド中に存在するメチオニン残基の酸化による。分解のその他の源として、ペプチド結合加水分解及び脱アミド化が挙げられる。本発明者らは、本発明の製剤への遊離アミノ酸の添加がCRFペプチドの安定性を増進するように機能することを測定した。遊離メチオニンの添加はその系中で起こる酸化イベントに付加的な利用できる部位を与えることによりCRFの安定性を増進する。それ故、酸化についてのこれらの付加的な利用できる部位の存在はおそらくCRFペプチドそれ自体に起こる酸化イベントの数を有効に減少し、こうして、溶液中のペプチドの安定性を増進する。
このようなものとして、本発明の一実施態様において、遊離アミノ酸が単独または組み合わせて本明細書に記載された製剤に添加されてこれらの製剤中のCRFペプチドの安定性を増進する。使用されるアミノ酸として、メチオニン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、システイン、グルタチオン等が挙げられる。一般に、遊離アミノ酸は夫々約1mMから約100mMまで、好ましくは夫々約5mMから約80mMまで、更に好ましくは夫々約20mMから約50mMまでの範囲の濃度で添加される。このようなアミノ酸は本発明の製剤中に陰イオン緩衝剤に加えてもよく、または緩衝剤を置換してもよい。
別の実施態様において、還元性及び非還元性の両方の種々の糖が本発明の液体製剤に添加されてもよい。このようなものとして、本明細書に使用される“糖”という用語は、例えば、グルコース、蔗糖、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース等を含む還元糖及び非還元糖の両方を表す。一般に、糖は約1％〜約10％、好ましくは約3％〜約7.5％、更に好ましくは約4％〜約6％の濃度で本発明の製剤中に存在する。
更に別の実施態様において、潜在的な安定化化合物が本発明の製剤に添加されてCRFペプチドに対し安定効果を更に与える。使用される化合物として、鉄(III)塩、マグネシウム塩、銅(II)塩及び亜鉛塩等が挙げられる。鉄(III)塩、マグネシウム塩、銅(II)塩及び亜鉛塩の如き化合物が約0.05mMから約5.0mMまで、更に好ましくは約0.1mMから約1.0mMまでの範囲の濃度で本発明の製剤に添加されることが好ましい。
更に、本発明の新規な製剤は必要により酸化防止剤化合物、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)等を含んでもよい。一般に、酸化防止剤化合物は約0.01mMから約5.0mMまで、好ましくは約0.05mMから約2.0mMまでの範囲の濃度で使用される。
また、本発明の新規な製剤は必要により当業界で知られている化学的に適合性の防腐剤を有効濃度で含んでもよい。“化学的に適合性”は、防腐剤が液体製剤または凍結乾燥製剤中に存在する場合にCRFペプチドの分解の速度をかなり増大しないことを意味する。現在記載された液体製剤に使用される化学的に適合性の防腐剤の例示の例として、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン等が挙げられる。
更に、本発明の改良された製剤は必要によりCRFペプチドの活性安定性を更に増進するために約0.001％〜約1％の量の一種以上のノニオン系洗剤、例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80等を含んでもよい。加えて、当業者に公知のその他の医薬上許される賦形剤がまた本発明の製剤の一部を形成してもよい。これらとして、例えば、キレート剤、例えば、二ナトリウムエデテート(EDTA)及びその他の種々の補助溶媒成分、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。
本発明の製剤は液体形態または固体形態で存在し得る。製剤は臨床セッティングにおいて投与の容易さを可能にするために液体形態であることが好ましい。しかしながら、固体形態である場合、製剤が凍結乾燥されることが好ましい。
本発明の製剤はそれ自体知られている一般に利用可能な医薬組み合わせ技術を使用することにより製剤の成分を合わせることにより調製される。
本発明の製剤は時間の延長された期間にわたって約2℃〜8℃で貯蔵される時に安定である。“安定”は、CRFペプチドが24ケ月にわたって2℃〜8℃で貯蔵された時に20％未満分解され、また12ケ月にわたって2℃〜8℃で貯蔵された時に10％未満分解されることを意味する。CRFペプチドの分解％は製剤をHPLC分析にかけ、CRFペプチドに相当するピークの下の面積を全ての検出可能なピークの下の合計面積により割ることにより測定される。製剤のCRFペプチドは24ケ月にわたって2℃〜8℃で貯蔵された時に10％未満分解され、また12ケ月にわたって2℃〜8℃で貯蔵された時に5％未満分解されることが好ましく、24ケ月にわたって2℃〜8℃で貯蔵された時に5％未満分解されることが更に好ましい。
下記の実施例は本発明の種々の実施態様を単に説明するために示されるものであり、本明細書に開示された主題の限定であることを目的とするものではない。
実験
実施例1：CRFペプチドの合成
公知のメリフィールド固相ペプチド合成技術を使用して、CRFペプチドを合成することができる。詳しくは、CRFペプチド配列の第一カルボキシ末端アミノ酸をアミン結合により不溶性ポリスチレン（ベンズヒドリルアミン誘導体）樹脂に結合し、続いてペプチドの残りのアミノ酸を順次結合する。アミノ酸残基を化学的に保護してアミノ酸サブユニットの反応性側鎖間の望ましくないカップリング反応に対し保護する。ペプチドの合成が一旦完結すると、液体フッ化水素を使用してペプチドを樹脂から開裂し、アミノ酸サブユニットの既に保護された反応性部位を脱保護する。
一旦、完全に合成されると、次いでC-18樹脂及び酢酸／アセトニトリル緩衝液系を使用して粗CRFペプチドを逆相クロマトグラフィーにより精製する。更に純粋なフラクションをC-18半分取クロマトグラフィーを使用する更なる精製のために溜める。このカラムからの溶離は酢酸／アセトニトリル及び／または重炭酸アンモニウム／アセトニトリル緩衝液系を使用する。最も純粋なフラクションを溜め、凍結乾燥する。次いで精製ペプチドをその液体製剤の調製に供するまで-25℃〜-15℃でガラス容器中で貯蔵する。
実施例2：合成ペプチドからのCRFの液体製剤の調製
上記実施例1で合成された固体CRFペプチドから、20mMの酢酸塩緩衝液及び5％のマンニトール中1mg/mlのCRFのpH4.0の液体製剤を以下のようにして調製した。固体CRFペプチドを冷蔵庫貯蔵から除去し、少なくとも30分間にわたって室温で平衡にする。CRFペプチドが平衡している間に、滅菌水1,100ml及び氷酢酸1.36mlを無菌の2リットルフラスコに添加し、その溶液を最低5分間混合する。次いでその溶液を滅菌水で1,200mlまでにし、少なくとも更に5分間混合する。これが“酢酸”溶液を形成する。
酢酸溶液を混合しながら、酢酸ナトリウム三水和物1.088gを滅菌水300mlに溶解し、その溶液を滅菌水で400mlまでにし、少なくとも5分間混合する。これが“酢酸ナトリウム”溶液を形成する。次いで、無菌の2リットルフラスコ中で、酢酸溶液1,100ml及び酢酸ナトリウム溶液240mlを合わせ、最低5分間混合し、次いで残りの酢酸溶液を使用してpHを4.0に調節してpHを下げ、または残りの酢酸ナトリウム溶液を使用してpHを上げる。次いでこの溶液を濾過した窒素で少なくとも30分間スパージする。これが“緩衝”液を形成する。
一旦、窒素で少なくとも30分間スパージすると、緩衝液800mlを2リットルのメスシリンダーに移し、マンニトール55gを添加する。次いでマンニトールが完全に溶解されるまでこの溶液を少なくとも10分間混合し、その間その溶液を窒素でスパージし続ける。次いで酢酸溶液を添加してpHを下げ、または酢酸ナトリウム溶液を添加してpHを上げることによりこの溶液のpHを4.0に調節する。これが“緩衝剤／マンニトール”溶液を形成する。
緩衝剤／マンニトール溶液を一旦pH4.0に調節すると、固体CRF1.1g（正味のペプチド重量）を添加し、CRFが完全に溶解されるまでその溶液を混合する。窒素フラッシュをこの時間中溶液上で維持する。添加したCRFが一旦完全に溶解されると、その溶液の容積を緩衝剤／マンニトール溶液で1,100mlまでにし、溶液上で窒素フラッシュを維持しながら混合する。これが“CRF／緩衝剤／マンニトール”溶液を形成する。
次いでCRF／緩衝剤／マンニトール溶液を無菌の0.22ミクロンの細孔サイズのデュラポア膜フィルターで濾過し、その間窒素フラッシュを濾過溶液上で維持する。次いで無菌の貯蔵バイアルを濾過した窒素でフラッシュし、CRF／緩衝剤／マンニトール溶液0.5ml〜2.0mlをバイアルにアリコートにし、次いでこれらに栓をし、シールし、2℃〜8℃で貯蔵する。得られる液体製剤は20mMの酢酸塩緩衝液、pH4.0及び5％のマンニトール中1.0mg/mlのCRFである。
実施例3：種々の緩衝液中のCRFの溶解性
商用の医薬目的に有益な液体製剤を開発するよう努めて、種々の異なる緩衝液中のCRFの溶解性を測定するために設計した実験を行った。詳しくは、CRFをその他の賦形剤添加剤の存在下または不在下で次第に増加する量で種々の異なる濃度及びpHで種々の異なる緩衝液に添加し、CRF製品の溶解性を測定した。表1はNaCl及びマンニトールの如き種々の賦形剤の存在下または不在下で種々のリン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液及び酢酸塩緩衝液中のCRFの溶解性を測定するこれらの実験の結果を要約する。CRF溶解性を溶液1ml中のCRFの総重量mgで表す。
0004147329.tif 000002
0004147329.tif 000003
表1に示された結果は、CRFがpH2〜3.6でリン酸塩緩衝液中に非常に可溶性であり、pH5〜6でそれ程可溶性ではなくなることを示す。pHが7.0以上に上昇される時に、CRFの溶解性は増大することが明らかである。
更に、表1に示された結果は、CRFがpH4〜6でクエン酸塩緩衝液中で非常に不溶性(0.2mg/ml以下)であることを示す。
最後に、CRFはNaClを添加しないでpH4〜5で酢酸塩緩衝液中で非常に可溶性であり、一方、150mMのNaClの添加は酢酸塩緩衝液中でCRF溶解性をかなり低下するように作用する。5％のマンニトールの添加は試験したいずれのpHでもCRFの溶解性に有害に影響しないことが明らかである。
次に、或る種の緩衝液は凍結乾燥された時に揮発されることがあることが知られているので、更なる実験を上記のようにして行って種々のその他の不揮発性緩衝液中のCRFの溶解性を調べた。これらの実験の結果を表2に示す。
0004147329.tif 000004
表2に示された結果は、CRFが試験したアスコルビン酸緩衝液、乳酸緩衝液、コハク酸緩衝液及びリン酸塩緩衝液中で極めて可溶性であることを示す。溶解性は試験した酒石酸緩衝液中でかなり低下された。
実施例4：アスコルビン酸系緩衝液、コハク酸系緩衝液及びリン酸塩系緩衝液中のCRF安定性の研究
CRFがアスコルビン酸系緩衝液、コハク酸系緩衝液及びリン酸塩系緩衝液中で非常に可溶性であることを示す表2に示された結果に基いて、異なる濃度のCRFを有する製剤をその3種の緩衝液の夫々中で調製し、これらの製剤中のCRFペプチドの分解の速度を4℃または30℃で5日間の貯蔵後に測定した。夫々の製剤において、緩衝剤塩を20mMにセットし、マンニトールが5％で存在した。夫々の製剤中のCRFの濃度を貯蔵前に測定し、そして試験した夫々の温度で貯蔵中5日後に再度測定することにより分解の速度を測定した。これらの実験の結果を表3に示す。
0004147329.tif 000005
表3に示された結果は、アスコルビン酸系製剤が4℃及び30℃の両方でCRFの安定性に有害であるが、コハク酸系製剤及びリン酸塩系製剤が可溶化CRFペプチドのかなりの分解をもたらさなかったことを示す。
実施例5：液体製剤中のCRF安定性に関するマンニトール及びソルビトールの効果を分析する研究
実験を行って4℃または30℃における長期貯蔵中のCRFの液体製剤の安定性に関する5％のマンニトールまたは5％のソルビトールの効果を測定した。詳しくは、下記の液体製剤を調製し、4℃または30℃における貯蔵中の安定性について分析した。
1mg/ml CRF、pH4.0酢酸塩(20mM)
1mg/ml CRF、pH4.0酢酸塩(20mM)、5％のマンニトール
1mg/ml CRF、pH4.0酢酸塩(20mM)、5％のソルビトール
1mg/ml CRF、pH4.5酢酸塩(20mM)
1mg/ml CRF、pH4.5酢酸塩(20mM)、5％のマンニトール
1mg/ml CRF、pH4.5酢酸塩(20mM)、5％のソルビトール
サンプルの夫々を種々の時点でHPLCにより分析し、検出した全てのピークの下の合計面積と比較してCRFに相当するピークの下の面積を計算することにより夫々の時点で起こったペプチド分解の量を測定することにより、試験した夫々の製剤中のペプチドの安定性を測定した。
これらの実験から得られた結果は、4℃及び30℃における貯蔵中2−4週後に、pH4.0製剤がpH4.5製剤と同等に安定であることを示し、それ故、pH4.5製剤がその研究から打ち切られた。
30℃で行われたpH4.0製剤に関する研究の結果を図2に示す。詳しくは、図2に示されたデータは、30℃における貯蔵の2週後に、pH4.0のマンニトールを含む製剤がソルビトールを含む製剤よりも大きい安定性に関するわずかな傾向を示したことを示す。しかしながら、マンニトールを含む製剤及びソルビトールを含む製剤の両方が添加剤アルコールを欠いている製剤よりもかなり安定であった。この同じパターンが30℃における貯蔵の12週中に一致して観察された。こうして、これらのデータは、マンニトールまたはソルビトールの如きアルコールの添加が30℃で液体として貯蔵された時のCRFの分解に対し保護を与えるように作用することを示す。
4℃で行われた研究の結果を図3に示す。詳しくは、図3に示されたデータは、マンニトールを含む製剤及びソルビトールを含む製剤の両方が2ケ月、3ケ月及び5ケ月の時点で添加剤アルコールを欠いている製剤よりもかなり安定であったことを示す。それ故、これらの結果は、CRFの液体製剤へのマンニトールまたはソルビトールの如きアルコールの添加が4℃で液体として貯蔵された時のCRFの分解に対し保護を与えるように作用することを示す。
実施例6：貯蔵中のCRFの安定性に関する研究
20mMの酢酸塩緩衝液及び5％のマンニトール中1mg/mlのCRFを含むpH4.0の液体製剤（バッチ番号NTI94004及びNTI95004）、10mMのリン酸塩緩衝液及び5％のマンニトール中1mg/mlのCRFを含むpH7.4の液体製剤（バッチ番号17210394）及び10mMのリン酸塩緩衝液及び5％のマンニトール中0.5mg/mlのCRFを含むpH7.4の液体製剤（バッチ番号29210694）の独立のバッチを調製し、2℃−8℃における時間の種々の期間にわたる貯蔵後のそれらの安定性について調べた。サンプルを時間の所望の期間にわたる貯蔵後にHPLC分析にかけ、検出した全てのピークの下の合計面積と比較してCRFに相当するピークの下の相対面積を測定することにより、液体製剤の安定性％を測定した。表4並びに図4及び5に示された結果は、酢酸塩緩衝液及びリン酸塩緩衝液の両方中のCRFの液体製剤が2℃−8℃で時間の延長された期間にわたって比較的安定であることを示す。
0004147329.tif 000006
CRFを含む製剤の二つの独立のバッチ（バッチNTI-02-03191及びNTI-07-05122）を調製し、凍結乾燥し、-20℃〜-15℃で時間の種々の期間にわたって貯蔵し、食塩水中で再生し、貯蔵後にそれらの安定性％について試験した。凍結乾燥の前に、液体製剤は0.2mg/mlのCRF、0.1％のHCl及び10mg/mlのマンニトールからなった。-20℃〜-15℃で凍結乾燥形態で貯蔵の3年後に、バッチNTI-02-03191は上記のHPLC分析により97％より大きく安定であることが示された。-20℃〜-15℃で貯蔵の3年後に、バッチNTI-07-05122は上記のHPLC分析により95％より大きく安定であることが示された。
実施例7：医薬製剤に関する研究
一連の研究を行って種々の異なる液体製剤中のCRFペプチドの経時安定性に関する異なる物質の効果を評価した。CRF液体製剤の多種の独立の組を別々に分析した。液体製剤の夫々の組において、20mMの酢酸塩緩衝液及び5％のマンニトール中1mg/mlのCRFからなる初期pH4.0の液体製剤（“対照”製剤）を使用し、種々の成分をそれに添加し（表5中“添加”）、または幾つかの場合に、初期製剤中の一種以上の或る種の成分を置換した（表5中“置換”）。次いで製剤の夫々の組中の夫々の製剤を40℃で貯蔵し、CRFペプチドの分解の程度を種々の時点でHPLC分析により測定した。製剤の夫々別々の組を同時の対照液体製剤とともに実験した。
これらの実験の結果を表5に示す。表5に示された定量的結果は、組Ａ−Ｈの夫々に関する最終時点が数日から8週以上まで変化した夫々の実験の最も最近の時点から得られた結果である。アッセイ及び純度の結果の両方を同時の対照に対する％として表す。アッセイを基準標準物質に対するCRF濃度として測定し、純度をサンプル中のその他の検出可能なCRF関連ピークの純度に対するCRF HPLCピークの純度として測定する。
0004147329.tif 000007
0004147329.tif 000008
0004147329.tif 000009
表5に示された結果は、アミノ酸、例えば、メチオニン、アルギニン、リシン及びグルタミン酸の添加が液体製剤中のCRFペプチドの分解に対する保護を与えることを示す。遊離アミノ酸はペプチドの分解のメカニズム及び速度を変化するものと考えられる。添加剤メチオニンの場合、アミノ酸は酸化の置換部位として作用し、それによりCRFそれ自体の酸化を減少する。こうして、添加剤メチオニンはCRFペプチドの保護効果を示す。
更に、潜在的な安定剤マグネシウム塩、第二銅塩または亜鉛塩の添加は液体製剤中のCRFの分解に対する安定化効果を与え、一方、塩化第一銅の添加はCRF安定性に有害な効果を有することが明らかである。
また、表5に示された結果は、メタノールまたはグリセロールの如き種々のアルコールがCRFの安定性に有害な効果を有しないで液体製剤中のマンニトールを有効に置換することができ、更に、液体製剤中のマンニトール濃度がかなり有害な効果を有しないで1％〜10％の間で変化し得ることを示す。更に、表5に示された結果は、対照の酢酸塩系緩衝液に代えてメチオニンまたはコハク酸塩系緩衝液の使用が液体製剤中のCRF安定性にかなり有害な効果を有しないことを示す。
最後に、表5に示された結果は、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)の如き酸化防止剤化合物の添加が液体製剤中のCRFの安定性にかなり有害な効果を有しないことを示す。
実施例8：CRF安定性に関する添加剤メチオニンの効果を測定するための研究
追従実験を行って本発明のCRF製剤へのメチオニンの添加により与えられる保護効果を確かめた。図6は対照液体製剤（20mMの酢酸塩及び5％のマンニトール）vs10mMまたは50mMのメチオニンが対照製剤に添加される製剤中の40℃における貯蔵中のCRFペプチドの分解の相対速度を示す。サンプルを時間の所望の期間にわたる貯蔵後にHPLC分析にかけ、検出された全てのピークの下の合計面積と比較してCRFに相当するピークの下の相対面積を測定することにより、液体製剤の“面積％”を測定した。
図6に示された結果は、CRF製剤への10mMのメチオニンの添加が40℃におけるペプチドの分解に対する小さな保護効果を与えるが、対照製剤への50mMのメチオニンの添加がかなり増大された保護効果を与えることを示す。
図7は種々の酢酸塩濃度及び／またはメチオニン濃度の存在下の40℃におけるCRFの安定性を示す。図7に示された結果は、酢酸塩に代えて20mMのメチオニンの置換が対照製剤と較べてかなりの保護効果を与えることを示す。
最後に、図8はまた40℃におけるCRFペプチドの製剤中の酢酸塩に代えて20mMまたは50mMのメチオニンの置換がCRFペプチドが分解される速度をかなり低下するように作用することを示す。
実施例9：凍結乾燥粉末vs再生液体としてのCRFの安定性を測定するための研究
実験を行って凍結乾燥粉末（“粉末”形態）として貯蔵された時vsその凍結乾燥粉末から再生された液体製剤（“液体形態”）中で貯蔵された時のCRF安定性の相違を測定した。これらの実験について、2種の異なるCRF製剤を凍結乾燥粉末として調製し、夫々の一部を液体として再生した。次いでペプチドの粉末形態及び液体形態の両方を30℃または40℃で6週の期間にわたって貯蔵し、その貯蔵期間中に起こったCRF分解の量を測定した。試験した製剤は(1)10mMのコハク酸塩、pH4.0及び5％のマンニトール中の0.2mg/mlのCRF（“コハク酸塩”製剤）及び(2)10mMのリン酸塩緩衝液、pH7.4及び5％のマンニトール中の0.2mg/mlのCRF（“リン酸塩”製剤）であった。これらの実験の結果を表6に示す。表6に示された数字は分析された夫々の時点における初期CRF濃度の％を表す。“ND”は濃度測定がこれらの時点で行われなかったことを意味する。
0004147329.tif 000010
表6に示されたデータは、CRFの液体溶液がCRFの凍結乾燥粉末と同様に経時安定であると考えられることを示す。これらのデータは、凍結乾燥製剤がそれらの液体相対品よりも経時安定であるという当業界の一般の承認に鑑みて驚くべきことである。
実施例10：皮下及び静脈内の刺激スクリーニング
実験を行ってCRFペプチドを有し、または欠いている種々の製剤の刺激可能性を測定した。最初に、2種のCRFを含む製剤を調製し、単一投与としてラットに皮下投与し、投与部位における刺激の程度を投与後の種々の時点で観察した。下記の製剤の刺激可能性を分析した。
1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩緩衝液、5％のマンニトール
1mg/mlのCRF、pH4.0、20mMの酢酸塩緩衝液、5％のソルビトール
これらの実験の結果は、分析した製剤の両方が単一投与として皮下投与された時に試験動物に非刺激性であることを示した。7日間にわたってラットに毎日皮下投与された時、刺激が実際に観察されなかったが、これらの製剤は注射部位の顕微鏡検査後に刺激可能性を示した。
次に、添加剤CRFを欠いている種々の液体ビヒクルの刺激可能性をウサギ皮内刺激モデルで試験した。このモデルでは、試験ウサギの背中を剃り、夫々の試験製剤ビヒクル0.2mlをウサギの背中の5つの異なる部位に皮内注射し、注射部位を紅斑／焼痂形成及び浮腫の存在について注射後24時間、48時間及び72時間で観察する。夫々の観察時点で、紅斑／焼痂形成を表7に示されたように0〜4のスケールでスコアーをつける。
0004147329.tif 000011
更に、夫々の観察時点で、ブランクまたは抽出液体からの非炎症性（機械的）浮腫を除く浮腫形成を表8に示されるように0〜4のスケールでスコアーをつける。
0004147329.tif 000012
研究の完結後に、5つの注射部位の夫々及び三つのの異なる観察時点の夫々で紅斑／焼痂形成スコアー及び浮腫スコアーを加え、その合計スコアーを夫々の部位及び夫々の観察時点(2)で付けられたスコアーの数で割り、夫々の時点で観察された注射部位の数(5)を掛け、観察時点の数(3)を掛けることにより“平均刺激スコアー”を試験した夫々の製剤について測定する。種々の異なるCRF製剤ビヒクルの平均刺激スコアーを表9に示す。
0004147329.tif 000013
これらの結果は、pH4.0、20mM酢酸塩緩衝液ビヒクルが比較的高い平均刺激スコアーを示すが、そのビヒクルへのマンニトールの如きアルコールの添加が液体製剤の刺激効果を有意に低下する効果を有することを示す。マンニトールがpH7.4でリン酸塩緩衝液と混在して使用される場合、同じ保護効果が観察される。
同様の実験を行ってCRF製剤の刺激可能性に関する添加剤メチオニンの効果を測定した。種々の異なる製剤ビヒクルを試験する実験の結果を表10に示す。
0004147329.tif 000014
表10に示された結果は、メチオニンを含む製剤がメチオニンを欠いている同様の製剤よりも一般に小さい刺激性であることを示す。また、酢酸塩に代えてメチオニンの置換はそれ程刺激性ではない製剤をもたらす。
本発明の好ましい実施態様の以上の説明は例示及び説明の目的のために示された。それらは排他的であることを目的とせず、または本発明を開示された正確な形態に限定することを目的とせず、多くの改良及び変化が上記教示に鑑みて可能である。当業者に明らかであり得るこのような改良及び変化は本発明の範囲内にあることが意図されている。
【図１】
0004147329.tif 000015
【図２】
0004147329.tif 000016
【図３】
0004147329.tif 000017
【図４】
0004147329.tif 000018
【図５】
0004147329.tif 000019
【図６】
0004147329.tif 000020
【図７】
0004147329.tif 000021
【図８】
0004147329.tif 000022