(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドが４、５または６個のアミノ酸の長さであり、結合性ドメインがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれることを特徴とする、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んでなる組成物。
【請求項２】
基質が支持物質に結合したペプチドを含んでなり、ペプチドが４、５または６個のアミノ酸の長さであり、ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。
【請求項３】
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的にはタンパク質−リガンド相互作用を同定することに関し、具体的にはフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲンのアフィニティー精製法に使用することができるペプチドリガンドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィブリノーゲンは血餅の主要タンパク質、フィブリンの血漿前駆物質である。フィブリノーゲンはジスルフィドによって結合された３対のポリペプチド（Ａα、Ｂβ、およびγ）を含む糖タンパク質である。ＡαおよびＢβ鎖がトロンビンで分解されると、フィブリノーゲンはフィブリンに転化し、血液凝固が始まる。フィブリノーゲンは、通常はフィブリングルーまたはシーラントと呼ばれる止血製剤中での使用のために商業的に使用されてきた。
【０００３】
フィブリノーゲン濃厚物の製造は、全血漿、寒冷沈降物、または組織グルー中での使用のためのＣｏｈｎフラクションＩから、沈殿法によって行われてきた。最も粗製の製剤では単に、自己血漿から通常に製造された寒冷沈降タンパク質を、フィブリンシーラントとしての使用のために直接に使用する（Ｋｉｎｇｄｏｎ等，１９９４）。大規模製造法は、示差溶解度をもたらすエタノール（Ｂｌｏｍｂａｃｋ  ａｎｄ  Ｂｌｏｍｂａｃｋ，１９５６）、硫酸アンモニウム（Ｔａｋｅｄａ，１９６６）またはβ−アラニンおよび／またはグリシン（Ｊａｋｏｂｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｅｒｕｌｆ，１９７３）の使用に依存する。これらの濃厚物は、因子ＸＩＩＩとフィブロネクチンを含む他の多種類の血漿タンパク質、並びにまたあまり望ましくないプラスミン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン分解産物（断片ＤおよびＥ）およびフィブリンプロトマーの混合物である。血液凝固できるフィブリノーゲンを得るためには、ε−アミノカプロン酸の添加によるプラスミンの阻害が通常必要である。
【０００４】
クロマトグラフィー的単離法では、ゲル濾過またはイオン交換樹脂を使用して中間純度の濃厚物を製造する（Ｆｕｒｌａｎ、１９８４の総説）。限外濾過もまた一つの方法として特許請求された（Ｋｏｐｆ  ａｎｄ  Ｍｏｒｓｅ，１９９３）。血漿からフィブリノーゲンを高純度増強するために、アフニティー法もまた導入された。フィブリノーゲンを精製するために、フィブリノーゲン分解産物およびフィブリンのプロトフィブリルもまた共精製されるが（Ｄｅｍｐｆｌｅ  ａｎｄ  Ｈｅｅｎｅ，１９８７ｂ）、プロタミンが使用された（Ｄｅｍｐｆｌｅ  ａｎｄ  Ｈｅｅｎｅ，１９８７ａ）。固定化単量体フィブリンがフィブリノーゲンと結合して精製することが示された（Ｍａｔｔｈｉａｓ等、１９７５）。抗生物質、リストセチン（Ｒｉｓｔｏｃｅｔｉｎ）が固定化され、フィブリノーゲンを結合するのに使用された（Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８０）。免疫アフィニティークロマトグラフィーが開発され、特に分析的応用に有用である（Ｍｅｒｓｋｅｙ等、１９８０；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３）。
【０００５】
ペプチドリガンドクロマトグラフィー  Ｋｕｙａｓ等（１９９０年）は、ＧＰＲＰＫ−セファロース（配列番号：４）のカラム上で血漿からフィブリノーゲンを精製した。ペプチドＧＰＲＰは、トロンビンによる分解時に露呈されたフィブリノーゲンＡα−鎖のカルボキシ側の相似体（ＧＰＲＶＶＥＲＨＫ（配列番号：５））である。この配列は、フィブリノーゲンのγ鎖上のカルボキシ末端配列による初期重合のための結合性領域である。（アミノ酸略語は該技術分野で通常使用される通りであり、Ｓｃｈｏｌｚ等、１９９３年に記載されている。）
【０００６】
【発明の構成】
本発明者等は今回、フィブリノーゲンに結合する能力を特徴とする一群のペプチドを発見した。これらのペプチドはＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有する。本明細書中で使用する場合、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインとは、周囲溶液中でフィブリノーゲンと結合するのに立体化学的に利用できるペプチド配列並びにｐＨ、イオン強度および溶媒組成の制御された条件下で中位ないし強い結合活性でフィブリノーゲンと連結する配座を採るペプチド配列を意味する。結合活性は、上記に挙げられた配列に隣接するアミノ酸を変えることによって、そして／またはアミノ酸の末端欠失によって、増強または低下させることができる。結合活性はさらに、ｐＨ、イオン強度または溶媒組成の上記の条件を変えることによって、改変することができる。
【０００７】
利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するさらに好適なペプチドの配列はＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（それぞれ、配列番号：１、２、および３）であり、最も好適なペプチドの配列はＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕである。これらのペプチドは、Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｂｕｅｔｔｎｅｒの名称の米国特許出願番号第０８／４３８，３３１号明細書（１９９５年５月１０日出願）に記載のスクリーニング法を使用して単離され、そして同定された。本発明者等もまた、フィブリノーゲン含有溶液を、本明細書中に開示されたペプチドをその上に結合した基質上に通過させ、次いでフィブリノーゲンを溶出することを含んでなるこのと特徴とする、フィブリノーゲンを精製するアフィニティークロマトグラフィー法にペプチドを使用する方法を記載する。
【０００８】
本明細書中に記載されたペプチドＦＬＬＶＰＬ、ＰＬＬＶＰＬおよびＦＡＬＶＰＬをタンパク質配列データベースと比較したが、フィブリノーゲンに関連する血液凝固成分と相互作用することが知られているタンパク質との相同性を示さない。ＦＬＬＶＰＬに対する完全整合物（ｅｘａｃｔ  ｍａｔｃｈｅｓ）は、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の仮定的膜タンパク質、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の小節形成性タンパク質、およびウシのナトリウム依存性リン酸輸送体に対するインターロイキン−６受容体（マウスおよびヒト）である。ＰＬＬＶＰＬに対する完全整合物は、クラミディア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＣＭＰ−２−ケト−３−デオキシオクツロソン酸シンテターゼ（ｋｄｓＢ）およびＣＴＰシンテターゼ（ｐｙｒＧ）遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のミスマッチ修復プロティンｍｕｔＬタンパク質、ヒトアデノウイルス２後期Ｌ２ｍｕコアプロティン前駆体、スタフィロコッカス・アウレウム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ｐＩ２５８の仮定的１４Ｋタンパク質（ｍｅｒオペロン）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の仮定的タンパク質、ヒトのミトコンドリア読み取り枠（ＯＲＦ）タンパク質、ブラキダニオ・レリオ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）（縞模様の魚）のＰＯＵ−ｃ転写因子、およびシネコシスチス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．）のＨ＋輸送性ＡＴＰシンターゼ（ＥＣ３．６．１．３４）鎖ａである。ＦＡＬＶＰＬに対する完全整合物は、ヒトＭＬＬ−ＡＦ４  ｄｅｒ（１１）融合タンパク質、ヒト１４０ｋｄセリン／プロリンに富むタンパク質、ＡＦ−４ｍＲＮＡによってコードされたヒトタンパク質、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のプロティンｌｍｂＥ、およびミスカンタス・ストリークウイルス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）のＶＯタンパク質である。
【０００９】
【発明の具体的な態様】
材料
フィブリノーゲンに対するポリクローンウサギ抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）およＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から購入した。第二抗体抱合体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ、および色素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰとＦａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からのものであった。ヒトのフィブリノーゲンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  ＡＢ（Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｆｍｏｃアミノ酸はＮｏｖｏｂｉｏｃｈｅｍからのものであった。他のすべての化学品は試薬等級またはそれ以上のものであった。
【００１０】
一般的方法
ペプチドライブラリーのスクリーニングは、微孔質ＨＰＬＣ（ＭｉｃｒｏｍｅＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）上の２．１ｍｍ×１５ｃｍカラム中で行った。ペプチドおよび６量体組合せライブラリーは、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（Ｔｏｔｄａ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で修飾されたＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ，Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上で、Ｂｕｅｔｔｎｅｒ等（１９９６）に記載の標準Ｆｍｏｃ化学を使用して合成した。ペプチドはＧｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ４２２を使用してロボット的に合成した。上記のスキームで達成されたペプチド密度は通常０．２〜０．５ｍモル／ｇ樹脂の範囲内であった。
【００１１】
アフィニティークロマトグラフィー方式でペプチドをスクリーニングする場合、立体障害のためにフィブリノーゲン結合性の容量が低くなる危険を少なくするために、いくらか低いペプチド密度がより望ましい。かかる望ましい密度は、アフィニティークロマトグラフィーの通常の技術で実施する場合、０．０５〜０．２ｍモル／ｇ樹脂（１０〜４０ｍｇ／ｍｌ樹脂）の範囲内である。Ｔｏｔｄａリンカー上で合成されるペプチドの密度を調節するために、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン対ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニンの各種比率を含有する混合物をＴｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに結合させた。混合物は、等濃度のストックＦｍｏｃ−Ｌ−アラニンの、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン中への系列希釈（１：０、１：５、１：１０、１：２５、および１：１２５）によって作成した。全アミノ酸濃度は、約２．５ｍモル／ｇ樹脂（Ｔｏｔｄａの５倍）に一定に保持した。当該技術分野で実施される標準Ｆｍｏｃ条件を使用して混合物を結合させた後、Ｆｍｏｃ保護基をアルカリによって解放したが、他方アルカリ耐性ｔ−Ｂｏｃは解放されなかった。この残留ｔ−Ｂｏｃ誘導化Ｌ−アラニンは第一級アミンを欠き、さらなるペプチド合成に利用できなかった。次いで、ペプチドを樹脂上でＦｍｏｃ誘導化アミノ酸を使用して合成し、次いで酸条件下（残留ｔ−Ｂｏｃも解放した）で脱保護した。樹脂のバッチ上のペプチドの密度は、標準方法による乾燥秤量試料の全アミノ酸分析によって決定した。最適ペプチド密度は、１：１０のＦｍｏｃ対ｔ−Ｂｏｃの混合物を用いて達成された。
【００１２】
可溶性結合性リガンドとして可溶性の精製ペプチドが必要である場合、Ｒｉｎｋ樹脂（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｈｅｍ）を合成に使用した。ペプチドを切断し、脱保護し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。別法として、アフィニティークロマトグラフィーに必要である幾つかのペプチドは、脱保護し、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基の除去なしにＲｉｎｋ樹脂から切断し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに結合させた。ペプチドの純度は分析用逆相ＨＰＬＣによって評価し、組成はＦＡＢ質量分析法によって確認した。
【００１３】
分析方法
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、８％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）の操作法に従って、レーン当たり４μｇタンパク質を負荷して行なった。ゲルからタンパク質の移動は、未不使用膜結合部位を遮蔽するためにカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用するＴｏｗｂｉｎ等（１９７９）の方法によって行った。結合抗体は、化学発光性基質ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、ＸＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露出することによって検出した。
【００１４】
免疫比濁法は、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ（Ｍａｒｂｕｒｇ，ＤＥＵ）から購入した検査キットを用いて、Ｂｅｈｒｉｎｇ比濁計、ＢＮＡ型を使用して行った。
【００１５】
等温滴定比色法は、精製された可溶性ペプチド（５ｍＭ）またはＡ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｇｏｐｅａｒｌ上に直接に合成されたペプチド（１．４ｍＭ）のいずれかを使用して、精製フィブリノーゲン（５０μＭ）を用いて、Ｔｙｌｅｒ−Ｃｒｏｓｓ等（１９９３）の技術の改良法によって行った。測定はすべて、３０℃で、３０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で、Ｏｍｅｇａ滴定比色計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて行った。
【００１６】
フィブリノーゲンに対する結合性ペプチドの発見
米国特許出願番号第０８／４３８，３３１号明細書（引用することによって本明細書中に取り込まれている）中で使用されたものと同様の分析法を使用して、フィブリノーゲンと結合するペプチドを推論した。この分析法は、ペプチドライブラリー免疫染色クロマトグラフィー分析法またはＰＥＬＩＣＡＮ法と呼称される。要するに、６量体組合せペプチドライブラリーを、Ｔｏｔｄａによるアミノ化、次いで塩基易動性リンカーヒドロキシメチル安息香酸の添加、そして最終的にグリシン残基の添加によって逐次修飾された、約０．１ｍモル／ｇ樹脂の最終置換密度のＴｏｓｏＨａａｓクロマトグラフィー樹脂、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｇ−ＨＭＢＡ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）上で直接にに合成した。ライブラリーは、２０種の天然アミノ酸の中の１８種（システインおよびメチオニンを除く）を用いて、Ｆ−ｍｏｃ化学を使用して合成した。アミノ末端をメチルスルホニルエチルカルボニル基で部分的に保護した。
【００１７】
樹脂（０．５ｍｌ）への最初の接触物は、平衡緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８と０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ−２０）、次いで洗浄緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌを含有する平衡緩衝液）からなった。次いで、樹脂を、検出系の各個成分と順次接触させた。これらの成分は、即ち、抗ヒトフィブリノーゲン（アフニティー精製されたＩｇＧフラクション）、アルカリホスファターゼと複合化した第二抗体、およびＢＣＩＰ／ＮＢＴブルー色素であった。すべてのタンパク質は平衡緩衝液中にあり、次いで洗浄緩衝液中にあった。
【００１８】
さらに、樹脂を、上記およびＢｕｅｔｔｎｅｒ等（１９９６）に記載のように、平衡緩衝液中の０．６２５μｇのフィブリノーゲン（２ｎＭ）と接触させ、次いで染料としてファースト・レッド（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）を使用する検出系と接触させた。
【００１９】
検出系と非特異的相互作用を示した青ビーズは、カラム全体に０．１％以下で均一に見出され；赤ビーズはカラム全体に０．０１％以下で均一に見出された。各個ビーズを単離し、ペプチドを、メタノール中の２０％トリエチルアミンを用いて２時間の音波処理によりビーズから切断した。切断されたペプチドを乾燥し、Ｅｄｍａｎ分解法によって配列決定した。アミノ酸配列データを以下に示す（表１）。不明確なコールがあったサイクルについては、最高の応答をもつアミノ酸を第一行にリストし、それより低い収量をもつものをその後の行にリストした。
【００２０】
【表１】
0004104691.tif 000002
【００２１】
結合性確認分析法は、Ｔｏｔｄａ次いでアラニン残基で修飾された、０．２ｍモル／ｇ樹脂の最終置換密度のＴｏｙｏｐｅａｒ  ｌ６５０Ｍ  Ｃｈｅｌａｔｅ樹脂（Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）上に直接に合成された各個ペプチド配列を使用して、微孔質ＨＰＬＣ上のカラムクロマトグラフィー方式で行った。樹脂への接触物（図１および図２、それぞれＰＬＬＶＬおよびＦＬＬＶＰＬの場合）として、Ａ）平衡緩衝液（上記と同じ）、洗浄緩衝液（上記と同じ）、溶出緩衝液（２．５％酢酸）のみ；Ｂ）平衡緩衝液中のヒト血清アルブミン（ｈＳＡ；０．５ｍｇ）、次いで洗浄および溶出緩衝液；Ｃ−Ｅ）平衡緩衝液中の精製フィブリノーゲンの段階的に増大する用量（２５０、５００および１０００μｇ）、次いで洗浄および溶出緩衝液）が挙げられる。終点は、フィブリノーゲン接触物中の酸溶出液の用量依存性増加であり、定量は２８０ｎｍでの吸光度の積分によった（図２）。
【００２２】
【表２】
0004104691.tif 000003
【００２３】
樹脂ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに対するフィブリノーゲンの結合には用量依存性増加があり、ＦＡＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに対する場合は程度が低かった。これらの樹脂を、平衡緩衝液中のフィブリノーゲン（１００μｇ）およびｈＳＡ（０．５ｍｇ）との混合物と、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、低い非特異性結合に使用されまたウイルス不活性化剤として使用される非イオン性界面活性剤の存在または不在下で接触させた。樹脂を洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ−２０なし）および２％酢酸で洗浄した。酸溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果（図３Ａ、レーン４−５およびレーン７−８）は、ＰＬＬＶＰＬおよびＦＬＬＶＰＬ樹脂に結合したタンパク質の大部分は、精製フィブリノーゲン標準（レーン１０）と共に移動する、フィブリノーゲンと同じ分子量（３４０，０００）を持つものであることをで示した。このタンパク質は出発混合物（図３Ａ、レーン３）から大きく濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）されていた。ヒトフィブリノーゲンに対する抗体を用いるウエスタンブロットの結果、このタンパク質の本性がフィブリノーゲンと確認された（図３Ｂ）。緩衝液系中のＴｗｅｅｎ−２０の存在は、酸溶出液中に回収されたタンパク質の量によって示されるように、フィブリノーゲンのいずれのペプチドへの結合にも影響しなかった。それ故、Ｔｗｅｅｎは、カラムを洗浄することによって、フィブリノーゲン溶液から除去した。
【００２４】
【表３】
0004104691.tif 000004
【００２５】
溶液相結合性等温式は、精製された可溶性ペプチドおよび精製フィブリノーゲンについて、等温滴定熱量計を使用して行った（表３）。配列ＰＬＬＶＰＬは、使用された条件下で、フィブリノーゲンに対し、ＦｌｌＶＰＬよりも弱い溶液結合性を示した。アミノ末端でＰからＦに変化すると、解離定数は１５０倍以上低下した。ＰＬＬＶＰＬはフィブリノーゲン分子当たり約３〜４部位に結合した。これらの相互作用は大きい正のエントロピーを有し、それは、配座変化がペプチドまたはフィブリノーゲン中に起こったことを示すことができる。配列ＦＬＬＶＰＬはフィブリノーゲン上の約１部位で結合し、この結合はまた非常に大きい正のエントロピーを有した。両ペプチドの結合反応は、正のエンタルピー（ΔＨ）によって示されるように、吸熱性であり、試験された条件下で熱力学的に有利であった（負のΔＧ）。異常に高いエントロピーは、配座変化がペプチドのフィブリノーゲンとの会合を推進することができることを示す。
【００２６】
Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上で合成されたＦＬＬＶＰＬの見掛の解離定数は、可溶性ペプチドより１００倍以上減少した。エンタルピーおよびエントロピーの大きさが増加したことは、可溶性ペプチドと比較して、フィブリノーゲンへの結合が同様の機構であることを示唆している。結合の遊離エネルギーは有利であった。
【００２７】
【実施例】
実施例１
ＦＬＬＶＰＬおよびＰＬＬＶＰＬ樹脂の使用による血漿からのフィブリノーゲンの精製
ヒト血漿を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する平衡緩衝液中で１：２に希釈した。洗浄および溶出条件は上記の通りであった。約１．０ｍｌを、ペプチド樹脂ＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−ＴｏｙｏｐｅａｒｌおよびＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上に注入した（それぞれ、図４および図５）。酸処理を使用して、タンパク質をペプチド樹脂から解放した。新しく凍結および融解し、寒冷沈降物を遠心分離によって除去した全血漿を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３Ａ、レーン２）。血漿は、ゲルの頂部近辺にフィブリノーゲンのバンドを含有し、その本性はウエスタンブロット法によって確認された（図３Ｂ、レーン２）。酸溶出液は高度に精製されたフィブリノーゲンを含有した（図３Ａおよび図３Ｂ、レーン６およびレーン９）。
【００２８】
ＦＬＬＶＰＬ樹脂分離からの酸溶出液フラクションを、１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０でｐＨを中性の調節した後、フィブリノーゲンおよび他の数種の血漿タンパク質について、免疫比濁分析法によって分析した（表４）。
【００２９】
【表４】
0004104691.tif 000005
【００３０】
この分析法を使用することによって、酸溶出液中には、フィブリノーゲンおよび少量のＩｇＭ以外の血清タンパク質は全く検出されなかった。免疫反応性フィブリノーゲンの回収率が低いのは（５８．８％）、低ｐＨへの露呈による抗原性の減少を反映している。他のすべての試験血漿タンパク質は検出限界以下であった。
【００３１】
実施例２
結合性配列のさらなる特性決定
Ｎ−アセチル化アミノ末端を有するおよび有しないペプチドＰＬＬＶＰＬおよびＦＬＬＶＰＬを、約０．２ｍモル／ｇ樹脂の密度のＡｌａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上に直接に合成した。これらの樹脂のフィブリノーゲンと結合する能力は上記の通りに決定した。フィブリノーゲンをＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに結合させるためには、遮蔽されていない（遊離）アミノ末端が必要であった。ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌを使用する別の実験において同様の結果が得られた（表５）。
【００３２】
【表５】
0004104691.tif 000006
【００３３】
結合に必要な最小配列を同定するために、ＰＬＬＶＰＬおよびＦＬＬＶＰＬのカルボキシル−およびアミノ−末端からの切断物を、Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂上に直接に合成した。表６は、クロマトグラフィー方式で段階的に増大する用量のフィブリノーゲンと接触させた樹脂からの溶出液の定量結果を示す。
【００３４】
【表６】
0004104691.tif 000007
【００３５】
完全長のペプチド（例えば、６量体）は、１Ｍ  ＮａＣｌによって解放された量の増加がより少ないが比例的であったが、低ｐＨで解放された量に反映されているように、３種類の注入量のすべて（２５０、５００および１０００μｇ）の場合にフィブリノーゲンに最も緊密に結合した。Ｃ−末端からの切断によって、１Ｍ  ＮａＣｌによって解放された量がより多いことによって示されるように、フィブリノーゲンへの結合の緊密性が低いペプチドが得られた。Ｎ−末端切断ペプチドの場合に同様の結果が観察された。これらの結果は、試験された条件下でのフィブリノーゲンへの最適の結合のためには、６種のアミノ酸の完全ペプチド配列が必要であることを示している。追加的には、ペプチドの長さの改変によって、低ｐＨによるよりもさらに温和な溶出条件が可能になることができる。４個のアミノ酸の長さであるペプチド（４量体）は良好に結合し、５個のアミノ酸の長さであるペプチド（５量体）はさらに好適であり、６個のアミノ酸の長さであるペプチド（６量体）は最も好適である。７個（７量体）またはそれ以上のアミノ酸の長さであり、本明細書中に開示された配列を含有するペプチドもまた、結合性ドメインが上記のようにフィブリノーゲンによって結合されるのに利用しやすいまたは有効である場合、フィブリノーゲンと結合するのに適していることが予想される。
【００３６】
実施例３
結合相互作用のさらなる特性決定
ペプチドＦＬＬＶＰＬを、０．２ｍモル／ｇ樹脂の密度のＡ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上に直接に合成した。寸法１．０×６．４ｃｍ（約５ｍｌカラム容量）のカラムを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたは１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８のいずれか、１．０ｍＭ  ＥＧＴＡ、および０．１、０．２または１．０Ｍ  ＮａＣｌのいずれかで平衡させた。フィブリノーゲン（２５ｍｇ；５．０ｍｌ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８、および０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１ｍＭ  ＥＧＴＡ中のカラムに適用した。これらの条件下では、適用された吸光度（２８０ｎｍ）の約５〜８％はカラムに結合しなかった。従って、結合はイオン強度の増加によっては影響されず、このことは、ペプチド−タンパク質相互作用での疎水性結合の顕著な役割を示唆している。
【００３７】
フィブリノーゲン（２５ｍｇ；５．０ｍｌ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８、および０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１ｍＭ  ＥＧＴＡ中のカラムに適用した。結合緩衝液中の非イオン性界面活性剤（５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で溶出した結果、適用されたタンパク質の４０％が解放され、このことは、結合における疎水性相互作用の役割を示唆している。反対に、イオン性（２％コール酸ナトリウム）界面活性剤で溶出すると、１４％だけが解放された。
【００３８】
フィブリノーゲン（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８、および０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１ｍＭ  ＥＧＴＡ中のカラムに適用された）の溶出は、親水性化合物、ポリエチレングリコール（１０％）を使用することによっては全く観察されなかった。１０ｍＭホウ酸ナトリウムでｐＨを１０に上昇させることによって、適用されたフィブリノーゲンの約８％のみが溶出されたに過ぎない。直線勾配でｐＨをさらに上昇させると（ｐＨ６．８から１２．０に）、フィブリノーゲンの約２５％が解放された。他方、６．８から４．０へのｐＨ勾配を使用した結果は、ｐＨ４．２でフィブリノーゲンの約６６％が解放された。
【００３９】
ＦＬＬＶＰＬのフィブリノーゲンへの結合機構に対する疎水性相互作用の貢献をさらに評価するために、フィブリノーゲン（２５ｍｇ；５．０ｍｌ）を、疎水性結合に有利である高塩条件下でペプチドに適用し、そして低イオン強度下で解放させた。ペプチド樹脂を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、および１．０ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ６．８で平衡させた。同一緩衝液中のフィブリノーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の５ｍｌをカラムに適用し、２カラム容量の同一緩衝液で洗浄した。次いで、樹脂を、１０カラム容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０と接触させ、次いで２％酢酸（４カラム容量）と接触させた。溶出プロフィールを図６に示す。適用されたタンパク質の約７．２％（２８０ｎｍでの吸光度による）はカラムと相互作用せず、流出および洗浄フラクション中に回収された。低イオン強度および低ｐＨ（４．０）では、タンパク質の約７８。３％が解放された。しかし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０溶液が０．１ＭＮａＣｌを含有する第二実験においては、適用されたタンパク質の５％のみが溶出された。酸処理では、両実験で回収されたタンパク質の残部が解放された。ｐＨ４．０溶出液を、０．４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ１１のストック溶液でｐＨを中性化した後、α−トロンビンで処理すると、可視しうる血餅が形成した。中性化された酸溶出液中の全回収タンパク質の約８８．９％はα−トロンビンで凝固可能であった。
【００４０】
これらの結果は、フィブリノーゲンとＦＬＬＶＰＬとの相互作用が、タンパク質のＮ−末端の第一級アミンとのイオン性相互作用の外に、疎水性引力によって推進されることを示している。さらに、これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィーで有用である、フィブリノーゲンのための結合および溶出戦略を示している。
【００４１】
結論
本発明者等はフィブリノーゲンのアフィニティー精製のための新規のペプチドの使用を示した。これらの新規のペプチドは利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有し、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られ、そして精製された形態で容易に製造することができる。さらに、保存的置換、末端残基の欠失、および／または末端部分の添加によるペプチドの修飾が、結合の選択性を変えるための有用な技術であることが予想される。
【００４２】
なお、本発明の主たる特徴および態様を以下に記載する。
【００４３】
１．結合性ドメインがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよりなる群から選ばれることを特徴とする、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んでなる組成物。
【００４４】
２．ペプチドが５量体（５−ｍｅｒ）である上記１に記載の組成物。
【００４５】
３．ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれる上記２に記載の組成物。
【００４６】
４．ペプチドが６量体である上記１に記載の組成物。
【００４７】
５．ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＬｅｕおよびＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれる上記４に記載の組成物。
【００４８】
６．ペプチドが４量体、５量体、６量体、および７量体よりなる群から選ばれる上記１に記載の組成物。
【００４９】
７．結合性ドメインがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＬｅｕおよびＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれる、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んでなる組成物。
【００５０】
８．基質が支持物質に結合したペプチドを含んでなり、ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。
【００５１】
９．基質が支持物質に結合したペプチドを含んでなり、ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。
【００５２】
１０．Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれるペプチド。
【００５３】
１１．Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれるペプチド。
【００５４】
【表７】
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【００５５】
【表８】
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【００５６】
【表９】
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【００５７】
【表１０】
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【００５８】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：２）上でのクロマトグラフィー的分離の溶出プロフィール（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。Ａ）緩衝液、タンパク質なし；Ｂ）０．５ｍｇ  ｈＳＡ；Ｃ）２５０μｇフィブリノーゲン；Ｄ）５００μｇフィブリノーゲン；Ｅ）１０００μｇフィブリノーゲン。フィブリノーゲンは約１７μｌ／分で１０分間に適用し、次いでカラムを平衡緩衝液で８６５μｌ／分で４分間洗浄し、次いで１．０Ｍ  ＮａＣｌを含有する平衡緩衝液で５分間、３．０Ｍ  ＮａＣｌでさらに５分間、０．１Ｍでさらに５分間洗浄した。タンパク質は、２％酢酸を使用することによって、３０〜３５の間に溶出した。
【図２】ペプチドＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１）上でのクロマトグラフィー的分離の溶出プロフィール（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。線の表示は図１と同一である。溶出条件は図１と同一である。
【図３】Ａは血漿、フィブリノーゲンとｈＳＡの混合物、およびクロマトグラフィー的分離からの酸溶出液のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動）の結果を表す図面に代わる写真である。レーン１、分子量標準；レーン２、ヒト血漿；レーン３、フィブリノーゲン／ｈＳＡ混合物；レーン４、ＰＬＬＶＰＬ−樹脂（配列番号２）に適用されたフィブリノーゲン／ｈＳＡ混合物（Ｔｗｅｅｎなし）からの酸溶出液；レーン５、酸溶出液、レーン４と同一（Ｔｗｅｅｎあり）；レーン６、ヒト血漿の酸溶出液；レーン７−９、ＦＬＬＶＰＬ−樹脂（配列番号：１）を使用するレーン４−６と同一；レーン１０、フィブリノーゲン標準。ＢはＡに示したものの重複ゲルのウエスタンブロット分析（すなわち、同上の電気泳動）の結果を表す図面に代わる写真である。
【図４】ＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：２）に適用された全血漿の溶出プロフィール（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。溶出条件は図１と同一である。
【図５】ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１）に適用された全血漿の溶出プロフィール（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。溶出条件は図１と同一である。
【図６】ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１）に適用されたフィブリノーゲンの、中性ｐＨ（６．８）での高い塩濃度（１Ｍ  ＮａＣｌ）の条件下の溶出プロフィール、および低ｐＨ（４．０）での低いイオン強度（１０ｍＭ酢酸ナトリウム）による溶出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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