(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有し、魚介類の免疫賦活、感染予防、抗ストレス効果を発現することを特徴とする魚介類用薬剤。
【請求項２】
請求項１記載の魚介類用薬剤を添加したものであることを特徴とする魚介類用飼料。
【請求項３】
バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有する発酵混合体から、溶媒を用いて前記代謝物や前記生成物を溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状としたことを特徴とする魚介類用薬剤。
【請求項４】
請求項３記載の魚介類用薬剤を添加したものであることを特徴とする魚介類用飼料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、魚介類用の薬剤及び該薬剤を添加した飼料に係わり、殊に、免疫賦活、感染症予防、抗ストレスに著効を示す薬剤とこの薬剤を適宜の割合で添加した飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、魚介類殊に魚類や甲殻類の増養殖産業が発展するに伴って、ウイルス性並びに細菌性疾病が多発し、甚大な被害をもたらしている。ウイルス病については、特にマダイ、ブリ、カンパチなどのイリドウイルス感染症及びエビ類の急性ウイルス血症（ＰＶＡ）による経済的被害が大きいが、治療薬は未だ開発されていない。細菌性疾病については、ブリの腸球菌症、類結節症、ブリ・マダイ・ニジマス・アユ・エビ類のビブリオ病、ヒラメのエドワジエラ感染症による経済的被害が大きい。これらの細菌性疾病の治療薬として、多数の抗生物質及び合成抗菌剤が用いられているが、近年、抗菌性物質に対して耐性菌が出現し、充分な治療効果が得られない状況にある。また、使用した薬剤の魚類及び甲殻類への残留による公衆衛生上の問題が生じていることから、化学療法に依存しない防疫対策が強く望まれている。また、真珠母貝や牡蠣などの養殖貝類においても、近年ウイルス性疾病が多発して養殖業者は莫大な被害を被っているが、斃死した貝を廃棄処分する以外に手立てがないのが現状である。
【０００３】
一方、魚類や甲殻類の免疫機能を増強する目的で、ビィフィズス菌由来のペプチドグリカンやキノコ由来のβ−１，３−グルカンなどの多糖類を利用することは、既に知られている。しかし、本発明のように、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養によって得られるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物、及び異なる種類のペプチドの相乗作用によって、魚類や甲殻類の免疫機能をより活性化する方法は知られていない。また、魚類や甲殻類にこれらの代謝物を投与することによって、抗ストレス作用が発揮されることも知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前述したように、養殖魚介類には多くの疾病が発生し、それによる年間被害額は２５０億円にも及んでいる。この背景には、養殖魚介類が狭い環境で飼育されることによるストレスの負荷、及び免疫機能の低下が挙げられる。このような現状に鑑み、本発明は養殖魚介類のストレスを緩和するとともに、これらの魚介類が本来備えている免疫機能を活性化して疾病を予防し、健康且つ安全な魚類、甲殻類、及び貝類を育成するための物質を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養の結果得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や混合培養に使用した発酵副原料の発酵中間物質や発酵残渣物質、更にはバチルス胞子からなる混合体（以下、発酵混合体と言う）、または、それらから分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物を飼料に添加して、魚類及び甲殻類に投与したところ、魚類・甲殻類が本来的に持っている様々な免疫機能が活性化されるとともにストレスが緩和され、ウイルスや細菌による感染を防御することを確認し、本発明を完成した。また、貝類の場合、これらの菌体等を溶解分散した水に適時浸漬することによりウイルスや細菌による感染を防御することを確認した。そして、本発明の魚介類用薬剤は、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有し、魚介類の免疫賦活、感染予防、抗ストレス効果を発現することを特徴とするものである。また、本発明の魚介類用薬剤は、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有する発酵混合体から、溶媒を用いて前記代謝物や前記生成物を溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状とした。ことを特徴とするものである。また、本発明は、魚介類用飼料において、これらの魚介類用薬剤を添加したものであることを特徴とするものである。
【０００６】
使用法としては、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体を、魚類や甲殻類の体重１ｋｇあたり１日量として、０．５〜１００ｍｇを飼料等に混合して投与することが望ましい。より効果が高いのは１〜５０ｍｇであり、１０ｍｇ前後が最も効果が高い。また、上記の培養菌体から分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物の場合、魚類、エビ類の体重１ｋｇ当たり１日量として０．０５〜２．０ｍｇ、殊に０．２ｍｇ〜１．０ｍｇを飼料に混合して投与することが最も望ましい。
【０００７】
尚、本発明で言う発酵混合体とは、前記したようにバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養の結果得られた、ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を含む、発酵中間物質や発酵残渣物質、バチルス胞子などからなる混合物のことを言う。ここに代謝物とは、菌体の活動や胞子化、殊に胞子化に伴い分泌されるものを言い、これには抗生作用を有する環状ペプチドや一部のポリペプチドなどが含まれる。また生成物とは、栄養源の分解物や該分解物同志の反応生成物例えばアンモニア、硫化水素、アミノ酸、アミノ酸とカルボシル基を有する物質との反応により生じるポリペプチドなどが含まれる。そして、発酵混合体中に含まれているポリペプチドや環状ペプチド等を含む代謝物や生成物質は、希エタノールや水等の溶媒に溶出させ、それらのみを回収して薬剤として利用できる。更に、発酵混合物には、籾殻炭等の発酵副原料やその消化物も含まれる。そして、その特徴は極めて高濃度の代謝物を含有していることにある。即ち、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスは、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化と言う増殖サイクルを繰り返し行なって優先化し、その活動や胞子化に伴い分泌される代謝物の濃度を増大させるものである。
【０００８】
バチルス・プミラスが、抗菌物質や抗生物質、生理活性物質を産生することは知られている（特公昭５７−６９１３、特公昭６１−１２９１４、特許２５６４７９）。また、バチルス・ツリンゲンシスが線虫類毒素を産生することも知られている（特開昭６４−６７１９２）。しかし、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスを混合培養すること、及び混合培養の結果、魚介類の免疫賦活、感染予防、抗ストレスに著効のある物質を高濃度に産生すること、更に代謝物が相乗的に作用することは知られていない。また、バチルス・ツリンゲンシスが免疫賦活物質を産生することも知られていない。
【０００９】
一般に、バチルスは好気性ないし通性嫌気性条件と適度の温度と湿度のもとで、蛋白質、糖質、脂質、尿素・尿酸等の栄養分を、菌種に応じて分解資化して成長し、増殖条件の欠如とともに内胞子を形成し、やがて解体して胞子となる。胞子は悪環境条件にも強く、生命を維持して増殖条件の出現とともに発芽して、同様の過程を繰り返して菌密度（胞子密度）を高める。そして、菌が代謝して増殖するに際して、代謝物を産出する。
【００１０】
中でも、バチルス・ツリンゲンシスは殊に多糖類の分解性能に優れ、バチルス・プミラスは単糖類や蛋白質の分解性能に優れる。従って、この両者を混合培養した場合、栄養分解の分担が行なわれ、相互に助長し合って増殖する。そして、貧栄養状態を出現させた場合、桿菌状態や糸状体にあるバチルスは死滅するが、残存していたバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの胞子が生命を維持しており、バチルス死細胞壁や細胞質、胞子の脱け殻等に含まれる多糖類はバチルス・ツリンゲンシスが分解・資化し、分解により得られた単糖類や蛋白質はバチルス・プミラスが分解・資化し、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスが相互に助長し合って優先化していく。そして、増殖過程を繰り返した結果、これらバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの菌体や胞子密度は１０10〜１０12個／ｇにも及ぶが、貧栄養状態（消化発酵、貧栄養下での発酵）を繰り返し出現させた場合には、休眠胞子としてその密度が１０2 〜１０4 個／ｇと自然分布状態にまで減少している。
【００１１】
本発明の特徴は、このように両バチルスの性質を利用して、魚介類の免疫賦活、感染予防、抗ストレス効果のある代謝物を高濃度に含む薬剤を提供すること、及び該薬剤を添加した魚介類用飼料を提供することにある。尚、動物体内においてバチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスが発芽して活動したり、動物に有害な影響を及ぼすことは皆無である（ＥＰＡ報告、ＷＨＯ報告等）。また、バチルス胞子はその状態で動物体内を通過するに過ぎないことも実験で確かめられている。一方、本発明における代謝物の分離・精製は、本発明の発酵混合体から水とアルコールを用いて抽出するとか、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニテイクロマトグラフィーによって得られた免疫活性化画分をスーパーロースでゲル濾過する方法などにより行なわれる。
【００１２】
本発明の対象となる魚類とは、ブリ、マダイ、トラフグ、ヒラメ、ニジマス、ウナギ等、全ての海産魚類、淡水魚類を含む。甲殻類とは、全てのエビ類、カニ類を含む。また貝類とは、真珠母貝（アコヤ貝）、牡蠣、帆立貝等全ての貝を含む。感染症とは、イリドウイルス感染症、ラブドウイルス病、神経壊死症、赤血球封入体症候群、伝染性造血器壊死症、エビ類の急性ウイルス血症、連鎖球菌症、腸球菌症、類結節症、ビブリオ病、エドワジエラ症、シュードモナス感染症、滑走細菌症、水カビ病、白点病などのほか、全てのウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染症を言う。尚、本発明の飼料は特に限定されるものではなく、粉末飼料、固型飼料、モイストペレット飼料、ドライペレット飼料、ＥＰ飼料、生餌など、魚介類の種類に応じて使用される飼料であれば、どのような飼料でも構わない。貝類の場合、一般に飼料は使用されないので、本発明の薬剤を懸濁した海水に貝類を浸漬するのも一方法である。
【００１３】
本発明の薬剤や飼料は、各種の養殖魚介類以外に、水族館その他で飼育されている魚介類、家庭で飼育されている鑑賞魚等にも使用できることはいうまでもない。
【００１４】
【実施例】
（実施例  １）  魚類の免疫機能に対する増強作用
試験方法：
平均体重３４０ｇのブリを１０尾ずつの４群に分け、本発明の１、２、３区にはバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体をブリの体重１ｋｇ当たり１日量として、それぞれ１、１０、５０ｍｇとなるようにモイストペレットに混合して７日間投与した。４区の対照区には、発酵混合体を含まないモイストペレットを与えた。発酵混合体の投与開始後３日目及び７日目に各区５尾ずつのブリから頭腎を摘出し、０．２５％ＮａＣｌ添加ＲＰＭ１−１６４０−ＨＡＨ培地を入れたプラスチックシャーレ内で血球細胞を分離し、細胞濾過器に通して細胞懸濁液を得た。この液をpercoll 不連続密度勾配上に重層した後、１，６００ｒｐｍ、２０分間（４℃）の遠心分離を行って、白血球層を得た。この層を採取後、遠心洗浄して１０％ＦＢＳを含む０．２５％ＮａＣｌ添加ＲＰＭ１−１６４０−Ｈ培地に懸濁し白血球の細胞数を１．０×１０7 細胞／ｍｌに調整した。この白血球懸濁液５００μｌと、ブリ血清でオプソニン化しておいた酵母の懸濁液（１．０×１０8 細胞／ｍｌ）５００μｌをシリコン処理したガラス試験管に入れ、１０分おきに攪拌しながら２５℃で６０分間インキュベートした。インキュベート終了後、ブリ１個体当たり５枚の塗抹標本を作成し、ライト染色を施してオイキットで封入した。更に、光学顕微鏡によって１標本あたり２００細胞の血球を無作為に観察し、白血球の酵母貪食数を調べ、下式によって貪食率、１細胞当たりの酵母取り込み数及び貪食指数を求めた。
貪食率        ：酵母を取り込んだ白血球数／観察白
血球総数×１００
平均取り込み数：白血球に取り込まれた酵母数／酵母
を取り込んだ白血球数
貪食指数      ：（酵母を取り込んだ白血球数／観察
白血球総数）×（白血球に取り込ま
れた酵母数／観察白血球総数）×１００
【００１５】
試験結果：本発明区及び対照区におけるブリ白血球の貪食率、平均取り込み数及び貪食指数を、表１に示した。表１から明らかなように、発酵混合体を３日間投与したブリに於ける白血球の酵母貪食率、平均取り込み数、貪食指数は、いずれも１０ｍｇ区、５０ｍｇ区、１ｍｇ区、対照区の順で高く、１０ｍｇ区の貪食率、平均取り込み数及び貪食指数、及び５０ｍｇ区の貪食率、貪食指数には、対照区のそれらとの間に明らかに有意の差が見られた。また、発酵混合体を７日間投与した場合、１ｍｇ区の貪食率、平均取り込み数及び貪食指数も、対照区のそれらとの間に明らかに有意の差が見られた。以上のことから、魚類に本発明の発酵混合体を投与することにより、白血球の貪食活性が高まることが明らかになった。
【表１】
0004052534.tif 000002
【００１６】
（実験例  ２）  魚類の免疫機能に対する相乗的増強作用
試験方法：  平均体重２７５ｇのブリを５尾ずつの６群に分け、本実験の１、２、３、４、５区には、バチルス・ツリンゲンシスの培養によって得られたポリペプチド等代謝物（以下、Ｂ．Ｔ．と略す）と、バチルス・プミラスの培養によって得られた環状ペプチド等の代謝物（以下、Ｂ．Ｐ．と略す）を、表２の割合でモイストペレットに混合して、７日間投与した。また、６区の対照区には代謝物を含まない（無添加）モイストペレットを与えた。７日間投与後、各区５尾ずつのブリから頭腎を摘出し、実施例１と同じ方法によって白血球の酵母貪食数を調べ、貪食率、１細胞当たりの酵母取り込み数及び貪食指数を求めた。
【００１７】
試験結果：
本実験区及び対照区に於けるブリ白血球の貪食率、平均取り込み数及び貪食指数を表２に示した。代謝物Ｂ．Ｔ．及びＢ．Ｐ．をブリの体重１ｋｇ当たりの１日量として０．２ｍｇずつの合計０．４ｍｇを７日間投与したブリにおける白血球の酵母貪食率、平均取り込み数及び貪食指数は、対照区と比べて有意に高かった。また、Ｂ．Ｔ．０．２ｍｇとＢ．Ｐ．０．２ｍｇを併用した区のこれらの値は、Ｂ．Ｔ．のみ又はＢ．Ｐ．のみを投与した全ての区に比べて高かった。代謝物の０．４ｍｇ（Ｂ．Ｔ．０．２ｍｇ＋Ｂ．Ｐ．０．２ｍｇ）は、発酵混合体約１０ｍｇから精製される量であることから、実施例１の発酵混合体１０ｍｇ投与区において、ブリの免疫機能が著しく活性化された原因は、発酵混合体に含まれる異なるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物の相乗作用によるものであることが、示唆された。
【表２】
0004052534.tif 000003
【００１８】
（実施例  ３）  魚類の免疫機能に対する相乗的増強作用
試験方法：
平均体重２７５ｇのブリを５尾ずつの６群に分け、本発明の１区、２区にはバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体から分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物を、表３の割合でモイストペレットに混合して、７日間投与した。また、３区の対照区には代謝物を含まないモイストペレットを与えた。７日間投与後、各区５尾ずつのブリから頭腎を摘出し、実施例１と同じ方法によって白血球の酵母貪食数を調べ、貪食率、１細胞当たりの酵母取り込み数及び貪食指数を求めた。尚、代謝物の分離・精製は、発酵混合体からイオン交換クロマトグラフィー及びアフィニテイクロマトグラフィーによって得られた免疫活性化画分をスーパーロースでゲル濾過する方法によった。
【００１９】
試験結果：
本発明区及び対照区に於けるブリ白血球の貪食率、平均取り込み数及び貪食指数を表３に示した。代謝物をブリの体重１ｋｇ当たりの１日量として、０．２ｍｇ及び０．４ｍｇを７日間投与したブリにおける白血球の酵母貪食率、平均取り込み数及び貪食指数は、対照区と比べて有意に高かった。代謝物の０．４ｍｇは、発酵混合体約１０ｍｇから精製される量であることから、実施例１の発酵混合体１０ｍｇ投与区において、ブリの免疫機能が著しく活性化された原因は、発酵混合体に含まれる異なるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物の相乗作用によるものであることが、示唆された。
【表３】
0004052534.tif 000004
【００２０】
（実施例  ４）  ブリの腸球菌症に対する予防効果
試験方法：平均体重１３０ｇのブリを２０尾ずつの６群に分け、本発明の１、２、３区にはバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体（表では、混合体と表記）、をブリの体重１ｋｇ当たり１日量として、それぞれ１、１０、５０ｍｇを、また対照１区にはバチルス・ツリンゲンシス（ＢＴ）のみの発酵混合体をブリの体重１ｋｇ当たり１日量として１０ｍｇ、対照２区にはバチルス・プミラス（ＢＰ）のみの発酵混合体を同じく１０ｍｇとなるようにモイストペレットに混合して毎日投与した。対照３区には、これらの物質を含まない（無添加）モイストペレットを与えた。投与開始後７日目にブリの腸球菌症の原因菌であるEn-terococcus seriolicidaをブリ１尾当たり７×１０6 細胞となるように腹腔内接種し、接種後１５日間の斃死率を求めた。
【００２１】
試験結果：
本発明区及び対照区における病原菌接種後のブリの累積斃死尾数と斃死率を表４に示した。また、図１は経過日数とブリの腸球菌症に対する生存数及び生存率の関係を示すグラフである。病原菌接種後１５日間の斃死率は、対照３区が７５％であったのに対して、本発明区のそれは１０〜３０％と何れも低く、対照３区と各発明区との間には有意の差が認められた。特に、発酵混合体１０ｍｇ区は、発酵混合体１ｍｇ区及び５０ｍｇ区よりも斃死率が著しく低率であったことから、本発酵混合体の最適投与量は、魚体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ付近であると考えられる。また、本発明の発酵混合体１０ｍｇ区の斃死率は、単一菌種ＢＴ又はＢＰ１０ｍｇ区のそれよりも有意に低かった。この原因については、ＢＴとＢＰを混合培養することによる相互作用により得られるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物が、魚類の免疫機能を相乗的に活性化するための適正量に達した結果であると推察される。このように、本発明の物質は、魚類の免疫機能を高めることによって、病原体による感染を有効に防御することが明らかになった。
【表４】
0004052534.tif 000005
【００２２】
（実施例  ５）  魚類に対する抗ストレス作用
試験方法：平均体重２４０ｇのマゴイを１０尾ずつの３群に分け、本発明区の１区にはバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体をマゴイの体重１ｋｇ当たり１日量として１０ｍｇとなるように混合した飼料を２０日間投与した。２区及び３区には発酵混合体を含まない飼料を与えた。そして、１区及び２区に対しては水温変化ストレスを２０日間負荷させ、３区は常時２５℃の水温下で飼育した。即ち、１区及び２区には、２５℃から３０℃、３０℃から２５℃、２５℃から２０℃、２０℃から２５℃、２５℃から３０℃へと、それぞれ１２時間かけて水温の上昇と下降ストレスを２０日間負荷させた。２０日間のストレス負荷後、マゴイの心臓から採血し、赤血球数、ヘマトクリット値及びヘモグロビン量を測定して水温変化ストレスによる生理的影響を調べた。
【００２３】
試験結果：
本発明区及び対照区における水温変化ストレス負荷後の赤血球数、ヘマトクリット値及びヘモグロビン量を表５に示す。魚類に水温変化ストレスを負荷させると、血液性状が変化することが知られている。マゴイに、２０日間にわたって激しい水温変化ストレスを負荷させたところ、２区のストレス負荷対照区の赤血球数、ヘマトクリット値及びヘモグロビン量は著しく低下し貧血状態を呈したのに対し、本発明区はストレスを負荷させない３区と同様の血液性状を示した。このように、本発明の発酵混合体は魚類の免疫機能を高めるだけでなく、抗ストレス作用を有することが明らかになった。
【表５】
0004052534.tif 000006
【００２４】
（実施例  ６）  エビ類の生体防御機能に対する増強作用
試験方法：
平均体重２５ｇのクルマエビを１０尾ずつの４群に分け、本発明区の１、２、３区にはバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体をエビの体重１ｋｇ当たり１日量として、それぞれ１、１０、５０ｍｇとなるように飼料に混合して７日間投与した。４区の対照区には、発酵混合体を含まない飼料を与えた。７日間投与後、抗凝固剤としてのＬ−システインを含むＫ−１９９培地を入れた注射器を用いてエビの胸洞から採血し、遠心分離によって血球を得た。懸濁液１ｍｌ当たり５×１０5 細胞の血球と１×１０8 個のラテックスビーズ（直径１．９８６μｍ）を混合し、２５℃で３０分間反応させたのち、グルタールアルデヒドで固定後、洗浄風乾した。風乾後、ギムザ液で染色し、オイキットを用いてスライドガラス上に固定した。この標本をエビ１尾当たり５枚作製し、落射蛍光顕微鏡を用いて標本１枚当たり２００個の血球を無作為に観察し、血球のラテックスビーズ貪食数を調べ、実施例１と同様の計算式によって貪食率、１細胞当たりのビーズ取り込み数及び貪食指数を求めた。
【００２５】
試験結果：
本発明区及び対照区におけるエビ血球の貪食率、平均取り込み数及び貪食指数を表６に示した。発酵混合体を７日間投与したクルマエビにおける血球のラテックスビーズ貪食率、平均取り込み数及び貪食指数は、何れの本発明区も対照区に比べて高く、有意な差が見られた（Ｐ＜０．０５）。また、発明区の中では１０ｍｇ区の貪食活性が最も高く、次いで５０ｍｇ区、１ｍｇ区の順であり、魚類の白血球に対する作用と同じ傾向が見られた。以上のことから、クルマエビに本発明の発酵混合体を投与することによって血球の貪食活性が高まることが明らかになった。
【表６】
0004052534.tif 000007
【００２６】
（実施例  ７）  クルマエビの急性ウイルス血症に対する予防効果
試験方法：
平均体重８．５ｇのクルマエビを２０尾ずつの４群に分け、本発明区の１、２、３区にはバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体をエビの体重１ｋｇ当たり１日量として、それぞれ１、１０、５０ｍｇとなるように飼料に混合して１７日間投与した。４区の対照区には、発酵混合体を含まない飼料を投与した。
【００２７】
発酵混合体投与開始後８日目に、クルマエビ急性ウイルス血症の原因ウイルスであるＰＲＤＶ（Penaeid rod-shaped DNA virus）によって攻撃試験を行なった。攻撃方法は、本病によって斃死した体重約１０ｇのクルマエビ３尾の頭胸部の甲皮を剥がしたのち、４０ｍｌの滅菌海水中でホモジナイズし、遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間、４℃）によって得られた上清１ｍｌを２リットルの海水に加えた。この中に、発酵混合体投与後８日目のエビを２時間浸漬することによって攻撃した。攻撃後１０日間の斃死状況を観察し、斃死エビについてはＰＣＲ法及び病理学的検査を行なってＰＲＤＶによる斃死であることを確認した。
【００２８】
試験結果：
本発明区及び対照区におけるＰＲＤＶによる攻撃後のクルマエビの累積斃死尾数と斃死率を表７に示した。また、図２はクルマエビのＰＲＤＶに対する感染後生存数と生存率の関係を示すグラフである。ＰＲＤＶによる攻撃後、対照区は１０日以内に１００％が斃死したのに対し、本発明区の斃死率は発酵混合体１０ｍｇ区が１５％、発酵混合体５０ｍｇ区が３０％、発酵混合体１ｍｇ区が３５％であり、対照区と各発明区との間には有意な差が見られた（Ｐ＜０．０５）。特に、発酵混合体１０ｍｇ区は発酵混合体１ｍｇ及び発酵混合体５０ｍｇ区よりも斃死率が低かったことから、本発酵混合体のエビ類に対する最適投与量は、魚類と同様に、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ付近であると考えられる。このように、本発明の物質はエビ類の生体防御機能を高めることによって、ウイルスによる感染を防御することが明らかになった。
【表７】
0004052534.tif 000008
【００２９】
（実施例  ８）  エビ類に対する抗ストレス作用
試験方法：容積が６０×４０×３０（高さ）ｃｍ3 の水槽３個に、砂を５ｃｍの厚さに敷きつめ、底面濾過装置を取付てエアレーションを施した。この水槽に、平均体重１５ｇのクルマエビを１区及び２区には４０尾、３区には２０尾収容した。本発明区の１区には、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体をエビの体重１ｋｇ当たり１日量として１０ｍｇとなるように混合した飼料を毎日与え、１ケ月間飼育した。２区及び３区には、発酵混合体を含まない飼料を投与した。飼育期間中の水温は、１、２、３区とも２３±１℃であった。１ケ月間飼育した後に、各区１０尾ずつのエビの胸洞から採血し、血リンパ液中のＭｇイオン濃度をXylidyl Blue法（マグネシウムＢキット、和光純薬製）によって測定した。
【００３０】
試験結果：
本発明区及び対照区における過密ストレス負荷前後の血リンパ液中のＭｇイオン濃度を表８に示した。ストレスを受けたエビ類では、血リンパ液中のＭｇイオン濃度が増加することが知られている。クルマエビに、過密ストレスを負荷させたところ、２区のストレス負荷対照区はＭｇイオン濃度の著しい上昇が見られたのに対し、本発明区（発酵混合体１０ｍｇ区）は、ストレスを負荷させない３区と同様に、低いＭｇイオン濃度を維持した。このように、本発明の発酵混合体はエビ類の生体防御能を高めるだけでなく、抗ストレス作用を有することが明らかになった。
【表８】
0004052534.tif 000009
【００３１】
（実施例  ９）  抽出物によるクルマエビの生体防御作用
実施例６及び実施例７で示したように、本発明の発酵混合体には、クルマエビの生体防御機能を高めまた急性ウィルス血症を予防する作用を有することが明らかである。そこで、発酵混合体のどの物質がクルマエビの生体防御能を増強しているのかを知るために、発酵混合体、水とアルコールで抽出した蛋白質、及び水に不溶の芽胞を含む残渣、の３者を別々にクルマエビに注射して、生体防御能の指標としてのフェノールオキシダーゼ活性を調べた。
【００３２】
試験方法：
（検体の内訳）バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養区（Ａ区）１，０００ｍｇから水とエチルアルコールを用いた抽出によって、蛋白質（Ｂ区）６５ｍｇ（６．５％）を得た後、水に不溶の芽胞及び残渣（Ｃ区）９３５ｍｇ（９３．５５）を回収し、各検体を試験に供した。（クルマエビに対する検体接種方法）平均体重２０ｇのクルマエビを各区５尾ずつの合計２０尾用い、滅菌５０％海水に懸濁又は溶解した検体を、エビの体重１ｋｇ当たり発酵混合体（Ａ区）を１０ｍｇ、蛋白質（Ｂ区）を０．６５ｍｇ、芽胞を含む残渣（Ｃ区）を９．３５ｍｇとなるように、第３腹節筋肉内に接種した。また、対象区には、検体を含まない滅菌５０％海水を接種した。（生体防御能の測定）各検体を接種したのち２４時間後に、エビの胸洞から採血し、血球を分離した。血球数を１．０×１０6 細胞／ｍｌに調整後、超音波によって血球を破壊し、この血球破壊液９００μｌに、基質溶液としてＬ−ＤＯＰＡ液（Ｌ−ＤＯＰＡ２．９ｍｇ／ｍｌ含有）１００μｌを加え、６０℃で１時間反応させたのち、分光光度計を用いて４９０ｎｍに於ける吸光度を測定し、フェノールオキシダーゼ活性とした。
【００３３】
試験結果：
各検体を接種したクルマエビにおけるフェノールオキシダーゼ活性を表９に示した。エビの生体防御能が活性化されているか否かは、フェノールオキシダーゼ活性を測定することによって明確になることが知られている。本実施例において、３種類の検体をクルマエビに接種したところ、Ａ及びＢ区のフェノールオキシダーゼ活性が有意（Ｐ＜０．０１）に上昇したことから、発酵混合体（Ａ区）中の生体防御能促進物質は、ペプチド等の蛋白質であることが明らかになった。
【表９】
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【００３４】
（実施例  １０）  マガキのウイルス性疾病に体する予防効果
試験方法及び結果：バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの発酵混合体を２％濃度で海水に分散・溶解した。この海水に、２年生のマガキ１０個を入れたカゴ５組（計５０個）を、６０分間浸漬した後、試験養殖イカダに戻す。この操作を、１回／週で３ケ月繰り返した。この試験養殖イカダを装着する海水槽中にウイルス性疾病で斃死したマガキ２個を投入しておく。しかし、カゴ中のマガキにはウイルス性疾病が殆ど発生せず、斃死率は２％（１個）であった。これに対し、同様に２年生のマガキ１０個を入れたカゴ５組（計５０個）を対象区として無処理のまま海水槽中に浸漬しておいたところ、１４個が斃死（斃死率２８％）した。
【００３５】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明はバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物を有効成分として含有する魚介類用薬剤、及び該薬剤を添加した魚介類用飼料に関するものである。
【００３６】
そしてこの薬剤は、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養の結果得られた発酵混合体中に含まれる異なる種類あるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物が示す相乗作用の結果、魚類、甲殻類及び貝類に対して、免疫賦活、感染症予防、抗ストレスに極めて優れた効果をもたらす。そのため、養殖魚介類の疾病や斃死が確実に防止され、養殖業界に多大な貢献をなすものである。
【００３７】
また本発明の薬剤は、ごく少量の投与量で免疫賦活、感染症予防、抗ストレスに優れた効果を示すため低コストであり、従来の高価な抗生物質を不要にする大きな効果がある。しかも、本発明の薬剤は添加する飼料の種類を選ばず、しかも魚類・甲殻類の飼料に単に添加するだけでよいため手間もかからず、魚類・甲殻類に対して効率良く供与することができるなど、種々優れた効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  経過日数とブリの腸球菌症に対する生存数及び生存率の関係を示すグラフである。
【図２】  経過日数とクルマエビのＰＲＶＤに対する感染後生存数と生存率の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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