(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからの光を結像するための光システム用焦点調整システムであって、前記システムは、
ａ）光路に沿って前記サンプルからの光ビームを受取りかつ検出するための光検出器であり、それぞれがそれに当たる前記光ビームの強度を表す光強度信号を独立して生成する、少なくとも二つの部分を有している光検出器、
ｂ）前記サンプルから来る前記光ビームを焦点調整するための、前記サンプルと前記光検出器との間の前記光路の少なくとも１つのレンズ、
ｃ）前記サンプルからの光を受取ることから前記光検出器の前記部分の全てではなく少なくとも一つを遮るための、前記サンプルと前記光検出器との間の前記光路に配置されたナイフエッジ、
ｄ）前記サンプルを保持するためのステージ、及び
ｅ）前記システムの前記焦点を調整するために焦点信号に応答して前記光路に沿って前記少なくとも一つのレンズ又は前記ステージを制御可能に移動するための焦点機構、
を有し、
前記システムは、
ｆ）光調整信号に応答して前記光ビームの前記エリアを制御可能に調整するための、前記サンプルと前記光検出器との間の前記光路に配置された光調整器、及び
ｇ）ｉ）前記サンプルの像が焦点からずれている方向及び量を表す焦点エラー信号を生成するために前記光検出器の実質的に両方の部分から光強度信号を取り去ることと、
ｉｉ）前記焦点エラー信号の絶対値が第１の所定の許容値よりも大きい場合には、前記光調整器に前記光ビームの前記エリアを低減させるために光調整信号を生成ることと、
ｉｉｉ）前記焦点機構に前記方向にかつ前記焦点エラー信号をゼロに近づけるために十分な量だけ前記システムの前記焦点を調整させるために焦点信号を生成することと、
によって、前記光強度信号に応答して前記光調整信号及び前記焦点信号を生成するためのコントローラ、
を更に備えていることを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、自動化焦点調整システムに関し、特に光走査システムの超高速自動焦点調整システムに関する。
【０００２】
関連技術の説明
組合せ化学及び生物定量法の開発により、自動化結像が非常に重要になってきている。ＷＯ９９／０８２３３及びＷＯ９８／４７００６に開示されているようなシステムで広範囲なテストを実行することができる。これらのテストのあるもの、特に蛍光及び反射光に基づくものは、米国特許第５，９００，９４９号に開示されたような共焦点システムを用いる。そのようなシステムでは、光は、蛍光又は燐光を発するか、或いは単に光を反射するために、サンプルを励起すべくシステムの光学部品を通して供給される。次いで、結果として生じた発光、反射又は散乱した光は、米国特許第５，９００，９４９号に示したように、光源の側の個別の光システムを通して、又は半鍍銀ミラー又はダイクロイック・ビーム・スプリッタにより、光源として同じ最初の光システムを通って戻る反射又は発光を通して、検出される。
【０００３】
一般的な走査システム（図１に示す）では、焦点が合った光線は、サンプルを横切って移動しかつ合成反射又は蛍光光が検出される。蛍光システムは、サンプル又はサンプル中の色素を励起するために、適切な波長、λｅｘの光源１０を一般的に含む。この光は、ソース光学部品１２を通って焦点が合されかつサンプル１６上に走査レンズ２６を介してミラー１４によって偏光される。蛍光を発するか又はサンプルから反射される光は、半透明鏡又はダイクロイック・ビーム・スプリッタ１５を介して検出光学部品１８に戻る。代替的に、発光又は蛍光した光は、米国特許第５，９００，９４９号に示すように、システムの側から検出することができる。次いで、検出光学部品１８を通過する光は、ＣＣＤ又は同等な素子２０を用いて検出され、ＣＣＤ又は同等な素子からの出力は、分析のためにコンピュータ２２に供給される。モータ２４は、サンプル１６を横切って励起ビームを走査するためにミラー１４を移動するために用いられる。次いで、励起ビーム、モータ、光学部品及びシステムの残りの部分は、サンプル１６の関連部分を走査するためにコンピュータ２２によって制御される。
【０００４】
本来の共焦点システムでは、システムは、実質的に焦点が合っていない光を排除する。図２に示すように、そのような共焦点システムの光は、一般的に走査レンズ２６を通してミラー１４によって偏光される。共焦点システムは、図２に示すように、非常に小さい被写界深度ｄを一般的に有する。サンプル１６は、サンプル１６を横切る走査に対して、走査フィールド２９、即ち、被写界深度ｄにあり、走査の範囲を横切る。システムの焦点距離は、ｆであり、かつ値の相対的な大きさは、ｆ＞＞ｄ＞＞λである。走査の範囲は、システムにより、数十マイクロメータからセンチメータまで変化する。
【０００５】
共焦点システムのまったく平坦でかつ水平な面に対して、一度収集システムとサンプルが焦点を合わされたならば、＋ｚ又は−ｚ軸（図２に示すように、上又は下）に沿った焦点調整をもはや必要としない。光ビームが走査された場合には、ミラー１４の回転が公称焦点面から光ビームを移動させないようなシステムの設計を想定する、即ち、走査フィールド２９がサンプルが配置されるエリアにおいて略平坦である。
【０００６】
明らかなように、サンプルは、走査中、焦点が連続的に合っていなければならない。自動又は手動でこれを行う一つの技法は、たった一度だけ、定常合焦ビームの下でサンプルに焦点を合わせ、そしてそれをｘ−ｙ変換ステージ上で移動させることによってサンプルを走査する。走査中ずっとサンプルが上下に移動しないので、サンプルから対物レンズまでの距離は、一定のままである。この方法は、多くの結像製作者によって用いられている。
【０００７】
光スキャナ用自動焦点調整システムは、図３ａ、ｂ、ｃに示しかつ１９９６年にマグロー・ヒル（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）よって出版された米国光学ハンドブック第１巻（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．１）（ＣＤ−ＲＯＭ版）のセクション３１．４に詳細に記述されるように、サンプルに焦点を合わせるために半遮断又は掩蔽技法をよく用いる。そのようなシステムでは、サンプル１６から反射又は発光された光４１は、レンズ２６を通過する。レンズ２６を通過する光の大部分は、次いで、分析のために検出光学部品に向けられるが、図１に示すように、光のあるものは、図３ａ、ｂ、ｃの上部に詳細に示された、低反射ビーム・スプリッタ４０によって自動焦点調整システム４２に向けられる。（説明を明確にするために、ビーム・スプリッタ４０は、図３ａ、ｂ、ｃから省略されている）。
【０００８】
図３ｂに示すように、サンプル１６に焦点が合っている場合には、光４１は、平行にされて、レンズ４６を通過する光４７は、焦点４９に正確に焦が合わされる。サンプル１６がレンズ２６からあまりにも遠い場合（−ｚ方向）には、光４１は、図３ａに示すように、収束しすぎる傾向がある。サンプル１６がレンズ２６にあまりにも近い場合（＋ｚ方向）には、光４１は、図３ｃに示すように、発散しすぎる傾向がある。
【０００９】
一般的な自動焦点調整システムでは、光ビーム４１の半分は、ナイフエッジ４４によって遮られる。光４１の残りの部分は、光４７になるためにレンズ４６を通過して光検出器４８に衝突する。光検出器４８は、光検出器４８の焦点４９に中心がある半分Ａ、Ｂを一般的に有し、各半分Ａ、Ｂは、独立検出領域として役割を果たす。
【００１０】
図３ｂに示すように、正確に焦点が合ったときには、光４７は、半分Ａ、Ｂの間の、光検出器４８の中心４９に衝突するか、または少なくとも半分Ａ、Ｂに均等に衝突する。対照的に、図３ａに示すように、サンプル１６がレンズ２６からあまりにも遠いときには、光４７の多くは、Ａよりも光検出器部分Ｂに衝突し、そして同様に、図３ｃに示すように、サンプル１６がレンズ２６にあまりにも近いときには、光４７の多くは、Ｂよりも光検出器Ａに衝突する。従って、レンズ２６に対するサンプル１６の位置は、光検出器部分Ａ及びＢによって生成される相対信号強度を分析することによって決定することができる。これは、あらゆる適当な方法を通して行うことができるが、焦点エラー信号（ＦＥＳ）５０を生成するために回路５１の光検出器の二つの部分Ａ及びＢの出力の値を引き算することによってうまく行うことができる。
【００１１】
理論では、ＦＥＳ５０の絶対値は、サンプル１６が焦点からずれている距離を表し、ＦＥＳ５０の正又は負の値は、サンプル１６が焦点からずれている方向を表す。サンプル１６に焦点が合っているときには、光４７は、光検出器の中心４９に衝突するか、又はＦＥＳ５０の値が０でありかつｚ軸調整が不要であるという結果を伴って、少なくとも部分Ａ、Ｂ間で均衡される（値は、正確に０である必要はないということが理解される−−０の周辺のある範囲が０に等しいと通常考えられる）。光４７の多くが検出器の半分Ｂに衝突する場合（図３ａに示すように）には、ＦＥＳ５０は、正の信号であり、ｚ変換ステージが−ｚ方向にずれているということを示し、ステージは、システムに焦点を合わせるために＋ｚ方向に移動されるべきである。サンプル１６がレンズ４６にあまりに近い場合には、より多くの光４７がＢよりもＡに衝突し、かつＦＥＳ５０は、負であり、ステージが＋ｚ方向に焦点がずれているということを示し、ステージは、システムに焦点を合わせるために−ｚ方向に移動されるべきである。このような方式でＦＥＳ信号に応答するＺ軸変換ステージが市販されている。
【００１２】
発明の概要
サンプルを保持するための新しい材料を研究しているときに、発明者は、サンプル表面自体がかなり起伏するときに従来技術のシステムを焦点調整することに伴う問題に直面した。図４に示すように、サンプル１６の表面が滑らかでない場合には、全体としてサンプル１６がレンズ２６から同じ距離にあったとしても、表面の一部分は、焦点がずれている。これは、走査ビーム及び走査ステージ・システムの両方にあてはまる。
【００１３】
特に、図４は、基板１６の表面に配置された一組のＤＮＡオリゴヌクレオチド・プローブ３０を示す。そのようなプローブは、たいていの場合、様々なＤＮＡ構造の存在又は欠如を識別するために固定化クリップ型ＤＮＡ断片と組合せる化学システムである。
【００１４】
図４で明らかなように、基板の最小厚みであるベース高さｈが存在するが、基板の表面の高さのばらつきΔｈも存在する。用いる基板により、Δｈは、焦点が合った光ビーム３４に対する被写界深度ｄよりもかなり大きい。その結果、ＤＮＡプローブ３０は、基板１６の垂直移動がなくても焦点が合っているか又はずれている。
【００１５】
そのような基板起伏は、最小化できるが、通常かなりの機械加工又はシリコン・ウェハまたはガラスのような相当に高価な材料の使用を必要とする。ＷＯ９９／５３３１９に教示されているような、安価な材料は、とりわけそのような起伏面を有すると思われるが、使用することが大いに望ましい。
【００１６】
従って、図４に示すように、サンプル表面の高さのばらつきΔｈが被写界深度ｄよりも大きい場合には、プローブ３０を被写界深度ｄ内に保つために、あるシステムを設置しなければならないか、又は像の領域は、非共焦点システムでぼやけ、または共焦点システムで暗くなる。そのようなシステムは、異なる深度で容易に再び焦点を合わせることができるように構成されていなければならないが、同時に、システムは、かなり高速でなければならない。これは、集束レンズを移動することによって行うことができるが、圧電ステージ、ソレノイド又はボイス・コイルに取付けられたステージ、又は変換ステージのような、ステージを移動することによってより一般的に行われる。いずれの場合でも、ステージの位置は、コンピュータの出力に応答する。
【００１７】
問題は、システムが再び焦点を合わせなければならない回数である。例えば、５秒で５１２画素×５１２画素の像（フレーム）を取り込むために、自動焦点変更は、画素から画素までの自動焦点をたった１９マイクロセカンド（５秒を５１２×５１２画素で割ったもの）で行わなければならない。これは、超高速自動焦点システムを必要とする。
【００１８】
発明者は、実際には、ＦＥＳの絶対値が、サンプルが焦点からあまりずれていない場合にのみ、サンプルが焦点からずれている距離を表すということを理解している。サンプルが焦点からあまりにもずれている場合には、方向は、ＦＥＳの正又は負の値から決定することができるが、ＦＥＳが飽和してしまう、即ち、ＦＥＳが安定状態に到達してしまうので、適切な焦点位置までの距離は、正確に決定することができない。ＦＥＳが飽和したときには、ＦＥＳの絶対値は、飽和レベルだけを表しかつ正確な焦点までの距離をもはや表さない。次いで、システムまたはオペレータは、焦点を合わせるためにサンプルを移動するための程度を“推量”しなければならない、即ち、サンプルをある任意の量だけ移動する。最初の移動が十分に大きくない場合には、別の推量が必要であり、それがあまりにも大きい場合には、反対方向への移動が必要である。この繰返し推量は、システムが一つの点から次の点まで走査するときにシステムが再び焦点を合わせることができるスピードをかなり制限する。
【００１９】
従って、本発明は、半遮断自動焦点システムをサンプルに供給される光の量における変化と組合せることによって一貫した高速焦点調整を提供する。
【００２０】
本発明の第１の実施形態は、ＦＥＳが曖昧であるときを決定し、かつＦＥＳが曖昧であるときに光検出器に到達する光の量を変更することによって高速焦点調整を達成する。特に、ＦＥＳが曖昧である場合には、光ビームの径又はエリアは、ある所定量だけ低減される。これは、次いでＦＥＳを不飽和にしかつシステムにレンズ又はサンプルを最適焦点に比較的近い位置まで素早く移動させる。次いで、光ビーム径又はエリアは、バックアップしながら増大することができ、そして最終的な焦点調整が行われうる。
【００２１】
本発明の第２の実施形態は、正確な焦点までのおおよその距離を決定するための追加の機構を供給することによって高速焦点調整を達成する。これは、光検出器に衝突する光ビームの径方向オフセットを直接検出することができる光検出器を供給することによって行われ、距離は、光検出器の両側の信号間の差の絶対値に依存しないで決定することができる。
【００２２】
更にまた、両方の実施形態は、システムが素早く焦点を合わせることができる距離を最大化するために組合せられる。
【００２３】
上記実施形態のいずれによっても、結果は、かなり高速で焦点を合わせることができ、かつ通常の半遮断システムだけによって行われるよりも平均してかなり高速で焦点を合わせることができる二段階処理である。圧電高速応答システム、及び適合高速電子制御回路又はソフトウェアのような非常に高速なｚステージ制御との組合せにより、システムは、走査システムに対して望ましい高速応答時間を達成することができる。
【００２４】
明らかなように、そのような高速自動焦点を有することは、起伏表面を有するより安価な基板の使用を許容し、同時に結果として生じる生成物の高速画像取り込みを許容する。
【００２５】
好適な実施形態の説明
簡単に言えば、発明者は、ＦＥＳが飽和するので従来技術の半遮断システムによる問題が生じるということを理解した。従って、本発明は、光検出器に入射する光のエリアを低減し、かつそれによってシステムが適切に動作する捕獲領域を拡げる機構を提供する。代替的に、本発明は、光検出器に入射する光ビームの径方向の拡がりを決定することによってサンプルが焦点からずれる距離を測定する機構を提供する。
【００２６】
本発明の第１の実施形態を図５ａ、ｂに示す。図５ａ、ｂにおいて、図３ａ、ｂ、ｃで示したものに類似する素子は、プライム記号（′）を有する同じ番号で示されている。
【００２７】
本発明のこの実施形態によれば、アイリス５２は、レンズ２６′とナイフエッジ４４′との間で、主要光学部品１８に向って進行している光と干渉を起すことを回避するためにビーム・スプリッタ４０よりもレンズ４６′の近くに追加されるのが好ましい。図５ａに示すように、アイリス５２が全開されるときには、図３ａ、ｂ、ｃにおいて光検出器４８に既に到達していた光４７′の全ては、まだ光検出器４８′に到達している。発明者によって理解されているように、サンプル１６′が焦点からあまりにもずれている場合には、ＦＥＳ５０′の絶対値は、ＦＥＳ５０′が飽和しているかまたはほとんど飽和しているということを示すある所定値よりも上である。これが起ったときには、コンピュータ２２′は、図５ｂに示すように、光検出器４８′に到達する光の量を低減するためにアイリス５２を収縮するために光低減信号（デジタルまたはアナログのいずれか）を生成する。
【００２８】
このような方式でアイリス５２を供給しかつ使用することの効果は、図６を参照して示すことができる。図６の応答曲線６０は、（図３ａ、ｂ、ｃからの）ＦＥＳ５０の強度対サンプル１６が焦点からずれる距離のグラフである。グラフの例は、５ｃｍの焦点距離を有する走査レンズ２６、４８８ｎｍの光波長、２ｍｍの対物レンズにおけるビーム径、走査レンズ２６から走査光学部品を通って１ｃｍのレンズ４６までの公称距離、及び±１に正規化されたＦＥＳ５０の出力を有する、２ｍｍの検出器レンズ４６におけるアパーチャを用いる。正確な焦点位置（図で０のところに示した）から約±５００μｍの捕獲範囲６１内で、回路５１は、ＦＥＳ５０の絶対値が正確な焦点位置からの距離のよい指標であるような出力を供給する。約±５００μｍを超えると、ＦＥＳ５０は、飽和に近づきそして飽和し、かつＦＥＳ５０の絶対値は、もはや正確な焦点位置からの距離を正しく表さない。その結果、システムに対する実効捕獲範囲６１は、正確な焦点位置から±５００μｍよりわずかに少ない。
【００２９】
応答曲線６０に対するシステムと比較して光検出器４８′に到達している光ビーム４７′の径を５０％低減するために検出器レンズ４６′のアパーチャが１ｍｍであるように収縮されたアイリス５２で、図５ｂからのＦＥＳ５０′のグラフである、応答曲線６２とこれとを比較する。応答曲線６２の捕獲領域６３は、おおよそ±２５００μｍ、または捕獲領域６１の大きさのおおよそ５倍の精度である。これは、システムが適切な方向及びサンプルに焦点を合わせるためにｚ−ステージが移動されるべき量の両方を決定することができるより広い範囲を供給する。一度その段階が実行されたならば、アイリス５２は、再び開くことができかつ全入射光ビームを用いて微焦点調整が行われる。
【００３０】
透過光を低減する素子は、アイリス５２である必要はない−光低減は、可動プリズムのようなあらゆる適切な機構、又はサンプル１６′と光検出器４８′との間の光透過を制御するために電磁気的に制御することができる液晶のセグメンテッド・リングのような材料によって達成することができる。更に、アイリス５２がレンズ２６′とナイフエッジ４４′との間に配置されて示されているが、アイリス５２は、サンプル１６′と光検出器４８′との間のどこにでも配置することができるということが理解されるであろう。しかしながら、レンズ２６′とナイフエッジ４４′との間に光低減素子を配置することは、光検出器４８′全体の使用を許容するという利点を有し、光低減素子を光検出器４８′に近づけて配置することは、光検出器４８′の一部を遮ることができる。
【００３１】
システムの焦点がかなりずれている場合には、本発明のシステムでさえも、アイリス５２が再び開かれたときには飽和を回避するために最適合焦位置にシステムを十分近づけられないということがあり得る。次いで、これは、解像力モードの発振を結果としてもたらし、アイリスが収縮されたり開放されたりを繰り返す。これを防ぐために、アイリス５２は、いくつかのアパーチャ・サイズ（又は連続的変化）を許容するように設定されたステッパー・モータ又は連続モータによって駆動することができ、アイリス５２は、システムが全入射光ビームを受け入れるために焦点を合わせるために十分近づくまで一つのアパーチャ・サイズから次のサイズに移動することができる。代替的に、ソフトウェア・ヒステリシス・システムは、連続発振を制限するために用いることができる。これらの技法は、複数の段階を必要とするが、従来の半遮断システムで同じことを試みることよりもよい。
【００３２】
本発明による第２の実施形態を図７に示す。図７において、図３ａ、ｂ、ｃで示したものに類似する素子は、ダブル・プライム記号（″）を有する同じ番号で示されている。
【００３３】
光検出器４８の半分Ａ、Ｂが焦点中心４９から光検出器の外部端まで拡張しているが、図７に示す光検出器４８″の類似素子は、一連の素子Ａ−ｎ、．．．、Ａ−１、Ａ０、Ｂ０、Ｂ＋１、．．．、Ｂ＋ｎに分割される。各素子は、独立して動作しかつそれ自体のＦＥＳ回路５１Ａ−ｎ、．．．、５１Ａ−１、５１Ａ０、５１Ｂ０、５１Ｂ＋１、．．．、５１Ｂ＋ｎに接続され、ＦＥＳ回路は、その結果、アナログ／デジタル変換器５４を通ってコンピュータ２２″に接続され、コンピュータは、ｚ−ステージ位置を制御する。
【００３４】
光検出器４８″の複数の素子により、光検出器４８″に入射する光ビーム４７″の中心からのオフセットは、素子Ａ−ｎ、．．．、Ａ−１、Ａ０、Ｂ０、Ｂ＋１、．．．、Ｂ＋ｎによって検出された光の分布に基づき正確な精度で検出することができる。これは、その結果、サンプル１６″が焦点からずれている量の概算を与える。
【００３５】
明らかなように、第１及び第２の実施形態は、組合せることができ、システムが素早く焦点を合わせることができる被写界深度に対するより広い範囲を供給する。
【００３６】
これらの例示的実施形態は、本発明の範疇を決して限定するものではないということが理解されるであろう。焦点調整処理における段階は、ここに記述された順番で厳密に実行されることを必ずしも必要としない。同じ目標を達成するあらゆる順番が作用する。本発明の他の変更は、上述した説明を考慮して当業者に明らかであろう。これらの説明は、本発明を明瞭に開示する実施形態の特定の例を単に供給することを意図するものである。従って、本発明は、説明した実施形態又は特定の要素、寸法、材料又はそれに含まれた構成の使用に限定されない。添付した特許請求の範囲の精神及び範疇内に入る本発明の全ての代替的変更及び変形を含む。
【図面の簡単な説明】
本発明は、以下の図面を参照して説明される。
【図１】  一般的な先行技術の光走査システムの略図である。
【図２】  図１の光走査システムの走査部分の略図である。
【図３ａ】  焦点合わせの異なるステージにおける一般的な先行技術の半遮蔽焦点調整システムの略図である。
【図３ｂ】  焦点合わせの異なるステージにおける一般的な従来技術の半遮蔽焦点調整システムの略図である。
【図３ｃ】  焦点合わせの異なるステージにおける一般的な従来技術の半遮蔽焦点調整システムの略図である。
【図４】  光走査システムによって走査される可能なサンプルの略断面図である。
【図５ａ】  本発明による第１の実施形態により変更された図３ａ、ｂ、ｃの半遮蔽焦点調整システムの略図である。
【図５ｂ】  本発明による第１の実施形態により変更された図３ａ、ｂ、ｃの半遮蔽焦点調整システムの略図である。
【図６】  図３ａ、ｂ、ｃ及び図５ａ、ｂのそれぞれの焦点調整システムに対する焦点エラー信号対デフォーカスの量のグラフである。
【図７】  本発明による第２の実施形態により変更された図３ａ、ｂ、ｃの半遮蔽焦点調整システムの略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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