(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学物質を用いて生化学的検査を行なうための検査基板であって、前記生化学的検査に必要なそれぞれ１種類の生化学物質のみが固定面に固定化された複数の微小基板を、１つの搭載手段に搭載し、
前記微小基板は、前記固定面の裏面を搭載手段側に向けて搭載されており、
前記裏面には、前記搭載手段に搭載された状態で読み取り可能で、前記１種類の生化学物質に対応する識別記号が付与されていることを特徴とする検査基板。
【請求項２】
前記搭載手段は、平板状のトレーに複数の凹み部を有し、該凹み部に前記微小基板が嵌め入れて固定されており、
前記凹み部は、表裏が貫通し、且つ、微小基板の係止部を有することを特徴とする請求項１に記載の検査基板。
【請求項３】
前記搭載手段は、平板状のトレーに複数の凹み部を有し、該凹み部に前記微小基板が嵌め入れて固定されており、
前記凹み部は、有底で前記トレーが透明体であることを特徴とする請求項１に記載の検査基板。
【請求項４】
前記微小基板の全面には固定すべき生化学物質に応じた表面層が形成されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の検査基板。
【請求項５】
前記識別符号は、前記微小基板の底面に形成された表面層をレーザービームにより部分的に溶解して付与されたものであることを特徴とする請求項４に記載の検査基板。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸、核酸誘導体、タンパク質、糖質、細胞、細胞断片などの生化学物質を含む生化学的検査に使用するための検査基板と、これに使用する生化学物質固定用の微小基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子操作技術の分野では、多彩な生物の全遺伝子機能や僅かなヌクレオチド多型の差、あるいはタンパク質の多様性などを効率的に解析するための技術開発が進んでおり、これらの分野では、遺伝子の極く一部を固定して操作するための検査基板が利用されている。検査基板の例として、ＤＮＡチップは、スライドガラス等の担体に多数のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ分子を整列させたマイクロアレイである。検査基板を用いる生体物質解析技術は、ＤＮＡ以外の生体分子、例えば、タンパク質や化学物質にも適用することができ、創薬研究、疾病の診断法やその予防法の開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】
ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって決定できるという発見に始まった。ＤＮＡチップ、マイクロアレイの作製技術が開発され、（多数の）遺伝子発現を対象としてその変異や多型などを短時間で効率よく調べることが可能となった。ＤＮＡチップは、種々の遺伝子に対応した多数のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡの断片（プローブともいう）を、チップの固体表面に整列させて固定化し、固定した多数のプローブをマトリックスに形成した素子である。通常、１枚のＤＮＡチップ上には、数千から数万のオリゴヌクレオチド個体が固定化されていた。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いる方法では、複製連鎖反応を用いて、試料としてのｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を合成し、断片化した後に各断片に蛍光標識をつけて標識断片とする。これらの標識断片をＤＮＡチップに接触させ、固定化させてあるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションさせる。標識断片は配列が相補的なオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片に保持され、過剰量の標識断片は、洗浄操作で除去される。その後、蛍光測定によって保持された標識断片の量及び位置を検出し、対応するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の種類を調べる。この方法は配列既知の遺伝子の発現をモニタするのに適している。ｃＤＮＡの代わりに、ゲノムＤＮＡの断片を標識して、同様にプローブとのホモロジーを調べることもできる。
【０００５】
ＤＮＡチップの製造方法は、大別して次の３種類がある。第１の方法では、光化学的に除去できる保護基で修飾した複数のリンカーを、アミノ基などを介して、固相表面に結合させて配列しておく。フォトリソグラフィー技術は、半導体製造技術で開発されたものであるが、この技術を応用して、所望のリンカー固定位置のみを照射できるマスクを介して光照射し、保護基を除去する。次に、光化学的に除去できる保護基をもつ単量体を導入して脱保護された部位に限って最初のカップリング反応を行なう。これによって、その部分だけオリゴヌクレオチドが伸長される。このようなフォトリソグラフィー及び単量体の導入を多数回にわたり、繰り返すことにより、所望のオリゴヌクレオチドマトリックスを形成する。
【０００６】
これとは別に狙った部位にモノヌクレオチド誘導体を次々とインクジェット法などで吹き付けて重合させ、それぞれの部位に異なったオリゴヌクレオチド等を合成する方法もある。
【０００７】
第２の方法は、固定化するオリゴヌクレオチドを予め準備し、そのオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片をガラスやポリマー膜などの基板表面に微量滴下し、その位置に共有結合等によって固定化する。例えば、基板表面にイソチオシアネート基を導入しておき、オリゴヌクレオチドの末端をアミノ基にしておけば、イソチオシアネート基固定位置にオリゴヌクレオチドを共有結合によって容易に固定化することができる。
【０００８】
第３の方法では、固定化するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片を予め準備し、それをガラスやポリマー膜などの基板の表面に微量滴下し、その滴下位置に吸着作用を利用して固定化する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記の第１の方法では、オリゴヌクレオチドを伸長するごとに、フォトリソグラフィー及び単量体の導入を繰り返さなければならず、あるいは毎回デザインに従って決められたヌクレオチド誘導体を滴下して重合させる動作を繰り返さねばならない。この種のＤＮＡチップを作製するのに長時間を要し、且つ、それぞれ異なる配列のオリゴヌクレチドを１つの基板上に作製するにはマスクや操作の複雑さから製造コストが高くなった。
【００１０】
上記の第２の方法と第３の方法とは、いずれの方法においても、化学合成または複製連鎖反応などにより増幅した複数種のオリゴヌクレオチドを専用のスポッティング装置に取り込み、固相表面に順次配列して滴下するので、１つの基板上に種種のオリゴヌクレチドを滴下するには、その数だけのスタンプピンを揃えて交換使するか、またはスタップピンを洗浄して使用しなければならなかった。この点で装置や作業上の大きな問題があった。特に、スタップピンを洗浄して再度使用する場合には、完全な洗浄がなされないと、異なるオリゴヌクレチドが混ざり正確な検査ができなくなるという事態に至る。このような操作の複雑さからＤＮＡチップを作製するのに長時間を要し、これらの方法でも製造コストが高くなるという問題があった。また、上記のＤＮＡチップの製造方法では、いずれの方法においても、同じオリゴヌクレオチドマトリックスをもつＤＮＡチップを大量に製造する場合、各ＤＮＡチップに同じ操作を繰り返して１枚ずつ製造する必要があるので、その製造コストがさほど低下しない問題があった。
【００１１】
また、検査の際には、症状および検査目的に応じて、多数の組み合わせがあり、適宜それぞれに応じたＤＮＡ配列が用意されるべきであるが、これには製造コストが多くかかるために、数千から数万のオリゴヌクレオチドが固定化されている汎用的なＤＮＡ識別用基板が用いられている。
しかしながら、このような非常に多種のＤＮＡについて相補的な結合が行われるために、被検査ＤＮＡの多数の複製培養、及びそれぞれに蛍光体等の識別官能基を付与する必要があり、結果として、被検査ＤＮＡの相補結合の量は少なくなり、相補速度が遅くなり、結果を得るまでに長時間を要し且つ費用がかかるという問題があった。さらに、ＤＮＡ検査は個人のプライバシーが関連する事項であり、人個人が必要とする検査のみ行う要求に答えることができなかった。
【００１２】
本発明は、核酸、核酸誘導体、タンパク質、および化学物質、糖質、細胞などの生化学物質を検出、選別又は入手するために用いる基板を、極力小型化し、被検査物質の量を削減するとともに、反応速度を促進し、検査時間および経費の削減を計り、短縮することができる検査基板を提供するものである。
本発明は、検査基板を用いて、吸着、化学的相互作用、ハイブリダイズ等により、その表面に固定化してある物質を特異的に相互作用する核酸、核酸誘導体、タンパク質、化学物質、糖質細胞を純化、分取することのできる検査基板を提供するものである。
さらに、本発明は、上記生化学物質を検出するために用いる検査基板の調製時間を出きるだけ短縮して、基板製造コストを低減することのできる検査基板を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の検査基板は、生化学物質を用いて生化学的検査を行なうための検査基板であって、前記生化学的検査に必要なそれぞれ１種類の生化学物質のみが固定面に固定化された複数の微小基板を、１つの搭載手段に搭載したことを特徴とするものである。
【００１４】
さらに本発明は、前記微小基板は、前記固定面の裏面を搭載手段側に向けて搭載されており、前記裏面には、前記搭載手段に搭載された状態で読み取り可能で、前記１種類の生化学物質に対応する識別記号が付与されていることを特徴とする
【００１５】
ここに生化学物質は、この明細書では、核酸、核酸誘導体、タンパク質、糖質を含む。また、生化学的物質には、細胞、細胞断片及び、細胞構成物質を含むものとする。
【００１６】
本発明の微小基板は、このような生化学物質の中から選んだ１種類だけを表面に固定した微小基板を含むが、このような微小基板が予め多数調製して準備され、各微小基板にそれぞれ異なる多数の種類の生化学物質をそれぞれ固定されている。生化学的検査の要求により、予め準備した微小基板の中から、必要な種類の生化学物質を固定した微小基板だけを選択して、検査基板として配列され、検査基板がその検査に提供される。
【００１７】
ここに、生化学的検査とは、上記の生化学的物質を利用する全ての検査、試験、実験、その他の操作が含まれる。生化学的検査には、核酸、核酸誘導体、タンパク質、糖質、細胞、細胞断片又は化学物質を用いて、これら化学物質を検出、純化若しくは分別する過程を含む。このような検査は、例示すれば、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析、および創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして非常に期待される核酸、核酸誘導体、タンパク質、糖質、細胞および化学物質を検出、定量するため、あるいはタンパク質や細胞の相互作用、吸着、抗原抗体反応等の容易な検出を通して基板の固定物質と相互作用する物質を純化、分取するために用いる基板に関する。
【００１８】
本発明の検査基板では、このような特定種類の生化学物質を表面に固定した複数の微小基板と、これら微小基板を配列して保持する搭載手段とから成り、検査基板は、予め、検査に必要な生化学物質の集合だけを配置することができ、検査基板を使用すれば、必要な検査のみを迅速且つ低額で実施することが可能になる。
【００１９】
このような搭載手段は、微小基板を多数配列できる平板状の基台が利用できる。基台は、微小基板を配置すべき場所に微小基板の外形に対応する形状の凹みを予め多数設けたトレーが利用できる。凹み部に定置することにより、微小基板の位置付けと定置が可能になる。
また、搭載手段は、容器状であってもよく、容器は、微小基板が装入可能で、開放のまま、ないし密閉可能なものが利用できる。例示すれば、ガラス管や樹脂管がある。
【００２０】
本発明において、微小基板には、微小基板又は微小基板に固定される生化学物質を識別するための標識、即ち識別用の符号が付記されているものが好ましい。識別符号は、微小基板の表面、底面あるいは側面に、微小基板を識別して特定し、又は、微小基板上に固定されるべき又は固定された生化学物質を特定する符号として付記される。このような識別符号は、予め、基板表面に書き込まれており、その後の生化学物質の固定操作、配列操作、及び所要の検査工程で、読み取取りながら、コンピュータ制御の下で、誤操作の防止を図り、自動機械による処理を効率的に実施することができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の微小基板は、１個の微小基板には、予め特定の１種類の生化学物質しか表面に固定されないので、生化学物質の固定に要する表面、即ち、固定面を備えれば特に、外形は限定されないけれど、生化学物質の固定面は平滑な平面であることが好ましい。
【００２２】
各微小基板には特定の１種類の生化学物質が予め固定されて、備蓄され、検査に際しては、多数の微小基板が配列されて検査に提供される。これら多数の微小基板は、搭載手段に配列されて、検査基板として提供する。他方の搭載基板は、好ましくは、平板状であり、その上面に、上記の微小基板が多数、配置される。多数配置するために、微小基板は、縦横に行列状に配列することもできる。
検査基板の１つの例として、図１に、外形矩形状の多数の微小基板２．．．を、搭載手段として、外形矩形状のトレー３の上面に搭載した検査基板１を示す。
【００２３】
微小基板について、各微小基板には、表面の固定面には、特定の１種類の生化学物質が固定されるが、固定面は、表面粗さＲａが０．５μｍ以下の平滑面であることが好ましい。この表面粗さの規定は、特に、検査過程で、生化学物質の蛍光標識を利用して蛍光判定が使用される検定基板には、特に好ましい。即ち、表面粗さＲａ０．５μｍを越える表面粗さであると、検査過程で蛍光により検査を行なう際、蛍光発色のための励起光が表面で散乱されて、蛍光判定が困難になるからである。また、固定面が平面であることは、検査精度を向上させる。特に、表面粗さＲａ０．２μｍ以下の平滑面であることが好ましい。
【００２４】
微小基板は、ポリマー、セラミックス、シリコンから形成することができる。
これらの材料は、特に、疎水性であるか、又は親水性に乏しいことが好ましい。
ポリマーを例示すれば、酢酸セルローズ系、ポリビニル系、ポリエステル系ポリマーなど利用できる。
ポリビニル系ポリマーには、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートがある。
ポリエステル系ポリマーには、例えば、ポリエチレンテレフタレートやビスフェノールＡのポリカーボネートがある。
【００２５】
セラミックスは、酸化物焼結体を含み、例えば、アルミナ、サファイア、シリカ、ジルコニア、チタニア、ムライト、炭化ケイ素などが利用できる。セラミックスには、ガラスを含み、例えば、珪酸系ガラス、ホウ珪酸系ガラス、が利用される。シリカ層を表面に持つガラスも好ましく用いられる。
微小基板の材料には、金属、特に、不活性で耐食性の高い金属ないし亜金属、これらの合金を含む。例えば、この材料は、シリコンその他の半導体材料が利用できる。
【００２６】
特に、ガラス、シリコン及びセラミックスの微小基板が利用され、これらの材料は、上記の如く平滑にする表面処理が容易であり、蛍光スキャニング装置による解析も容易となる利点がある。
【００２７】
微小基板は、このような材料から、固定面に平滑な平面を有し、形状は特に問わないが、通常は、上面が矩形状の薄板を利用することができる。外形寸法は、例示すれば、縦横の長さが０．２〜３．０ｍｍの範囲で、その厚さが、０．１〜２．０ｍｍの範囲のものが利用できる。図３（Ａ）には、このような外形矩形状の微小基板２０を示す。
【００２８】
微小基板の製造においては、上記材料から、微小基板より相対的に大きな板材、例えば、平板、を形成し、適宜、分割して、微小基板にすることができる。分割には、ダイソーなどの切断刃を利用して、板材を切断し、切り出すことができる。例示すれば、シリカガラス、サファイアガラスやシリコン、ポリマーなどの平板から、ダイソーにより切り出す。
【００２９】
好ましい分割の方法には、上記の板材ないし平板を形成する際に、予めその表面に格子状の割り溝を設けて、後に、割り溝を折り曲げて多数の矩形状の微小基板に分割する方法を採用することができる。
割り溝による分割は、シリカガラス、サファイアガラス、シリコンやセラミックスなどの比較的脆性的な材料には好ましく適用することができる。
板材ないし平板には、分割する前に後述する識別記号の付記や、必要な表面処理などを施したあと、割り溝に沿って分割し微小基板２０を得る。
【００３０】
微小基板は、固定すべき生化学物質に応じて、予め、微小基板の固定面に形成した表面層を含むものか好ましい。図３（Ｃ）は、上記矩形状の微小基板２０の全面に表面層６を形成した例を示す。表面層６は、生化学物質を微小基板の固定面２１上に確実に固定するための結合層として利用するものである。微小基板２０の材料が疎水性であるか、あるいは親水性に乏しいものであるときは、上記の表面層６は、核酸、核酸誘導体、タンパク質、糖質、細胞、細胞断片ないしその他の化学物質などの固定されるべき物質と、静電結合や共有結合により結合して、微小基板上の固定を確実にするものである。
【００３１】
固定面上の表面層には、金、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイミンなどのポリ陽イオン物質の薄膜を利用できる。微小基板４を表面処理して薄膜を形成することができる。また、薄膜は、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を有するシランカップリング剤によってその表面処理して形成することもできる。ポリ−Ｌ−リシン等を用いる処理に、シランカップリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。
【００３２】
固定面又はその上に形成した上記薄膜上に、さらに表面層を形成することもできる。このような表面層は、電荷を有する親水性の高分子物質を含む層や架橋剤からなる層を含む。上記の固体表面の表面層は、微小基板中に上記のシランカップリング剤又は親水性ないし架橋性の高分子を含有ないし含浸させることにより、形成することもできる。
【００３３】
この実施形態の微小基板には、予め、識別符号５が付与されている。識別符号は、基板を識別するものでも、固定すべき物質を表示するものでもよいが、識別符号を検出してデータと照合して解読することにより、基板又は、固定された物質を識別するものである。
【００３４】
識別符号は、微小基板の表面ないし固定面のほか、裏面又は側面などの任意の位置に付与することができる。識別符号は、公知のものが利用でき、微小基板のいずれか外面に表記して、文字、数字、記号、その他の符号や、光学的又は磁気的に読み取り可能なコード情報、例えば、二次元的、三次元的なバーコード、ないしドットコードなどがある。特に、微小基板が小さなものであるから、識別符号は、微細な形態にして光学的に又は磁気的な検出可能なものが好ましい。図３（Ｂ）には、二次元的コードから成る識別符号５を、微小基板２の底面２４に形成した例を示している。
【００３５】
識別符号は、インクや塗料などにより文字、数字、記号や上記のバーコードを印刷することにより表示することができる。この場合に使用するインクや塗料は、検査工程で生物試料を溶解または懸濁させる溶媒に対する耐薬品性・耐食性がある塗膜材料から選ぶのが好ましい。好ましくは、紫外線硬化型樹脂含有インクを塗膜して、識別符号を表した紫外線パターンを照射するか、あるいはレーザ走査して印刷することもできる。
【００３６】
また、識別符号は、インクなどによる印刷以外に、光学的に検出可能なものとして、レーザ照射により微小基板の面に直接に描くことも利用できる。図３（Ｂ）の例は、レーザビームにより、パターン化したドット符号５の配列を微小基板２０の底面２４に彫り込んだ例を示している。
さらに、磁気的に検出可能な識別符号としては、基板上に磁気層を形成し、磁気ヘッドにより磁化させて記号化し、読み取り可能にしたものも採用できる。
【００３７】
レーザ照射により表示する識別符号は、照射面に走査レーザービームの熱により固相担体表面を部分的に溶解して、所要のマークを彫刻して描くものが、耐薬品性を考慮しなくて良いので、好都合である。
他方、レーザ照射の識別符号場合には、彫り込まれた符号のエッジ部が盛り上がる現象が見られる。図３（Ｂ）においては彫りこまれたドット符号の回り、即ち、エッジ部が、環状に隆起する。この盛り上がりは３μｍ以下が好ましく、更には１μｍ以下がより好ましい。エッジ部の高さ３μｍ以上の盛上りがあると、識別符号５が彫られた多数の微小基板を保管する際に、基板同士の当りによりエッジ盛り上がり部が擦られ、欠落粒子（あるいは「パーティクル」）として剥離し、パーティクルが、その後の検査および純化その他の作業操作を困難にする恐れがあるからである。
【００３８】
図３（Ｄ）は、微小基板２０の固定面２１上の表面層上に、生化学物質７が固定された微小基板２を模式的に示している。固定に際しては、種々の方法が利用され、例えば、スタンプピン法やインクジェット法がある。スタンプピン法では、例示すれば、先端にスリットを形成したスタンプピンを用いるスリット方式や針先の尖端に溶液を付着させるピン方式や、直径１ｍｍ以下のリング内に溶液を膜状に張り、その中をピン先で貫くピン−リング方式などが広く利用できる。
生化学物質は、微小基板２０上への固定に先だって、予め処理して、その分子末端に、基板表面の薄膜ないしは表面層と静電結合または共有結合するように、相互作用に関与しうる官能基を導入しておくことが好ましい。そのような官能基は、チオール基、アミノ基、アルデヒド基、カルボン酸基、ビオチンを挙げることができる。特に、官能基は、チオール基、アミノ基が好ましい。
【００３９】
以上の如く固定化調製した各微小基板２には、図３（Ｄ）に示すように、その固定面２１の表面上に、核酸などの上記生化学物質７が１種類だけ固定される。１個の微小基板に同じまたは異なった生化学物質７の一種のみを固定した微小基板２は、多数の生化学物資を網羅するように多数準備される。そして、検査、試験、実験などの目的と仕様に応じて、必要な特定の種類と量の生化学物質を固定した基板だけが多数選ばれる。選ばれた微小基板は、搭載手段として、例えば、上記トレー３上に配列して搭載され、あるいは、選択した多数の微小基板は、適当な容器に組み入れられて、検査基板１とされる。
【００４０】
搭載手段については、多数の検査工程における検査基板の利用の形態によって異なるけれども、セラミックス、ポリマーないし金属から平板状ないし皿状に形成することができる。搭載手段には、上面に、外形が微小基板に対応する凹み部を備えており、それぞれの凹み部内に、上記選択された一組の微小基板を順次載置して定置され、検査基板とされる。以後の管理、検査は、検査基板を単位として実施される。
【００４１】
図２は、搭載手段として、平板状のトレー３の例を示しいる。トレー３の上面には、上記の矩形状微小基板２の外形の下部が嵌るように形成した多数の凹み部３２を備えている。上記の如く要求により、生化学物質ごとに選ばれた多数の微小基板２ａ・・・・２ｆは、トレー３の表面に形成した多数の凹み部３２・・・・のそれぞれに嵌め入れて定置し、図１に示すような検査基板１とされる。凹み部３２としては、表裏に貫通し、且つ、微小基板の係止部（例えば、段差）を有する形状にすることができ、凹み部３２に嵌め入れた微小基板２の底面が、トレー３の底面３３側から視認できるので、微小基板の底面側の識別符号を、トレーの裏側から読みとることができる。あるいは、トレー３をガラスの透明体で形成してもよく、凹み部を有底にして、ガラスを通して読み取ることもできる。
尤も、微小基板は、それぞれの識別符号により識別されて所定の凹み部に定置される場合には、その後の微小基板の識別符号を読みとることは不要にすることもでき、この場合には、上記の如く、読み取りを考慮したトレーの構造は必ずしも必要でなくなる。
【００４２】
これらの微小基板を利用した検査基板は、核酸を固定して使用するＤＮＡ基板として広く利用することができる。核酸以外の生化学物質、例えば、抗体、を固定化し、その抗体に相互作用する抗原、糖質、細胞等を検出し、選択純化し、または分取することにも利用される。また、例えば、化学物質を固定化し、それに相互作用を起こす抗原、糖質、細胞等を検出し、純化し、あるいは分取することも可能である。
【００４３】
【実施例】
［実施例１］
この実施例では、基板材料にアルミナを選んで微小基板を調製した。アルミナ平板は、寸法６５×４０ｍｍ、厚み０．２mmの外形を有し、表面には、縦０．６ｍｍ間隔、横０．３５ｍｍ間隔で多数の直交する多数の割り溝が形成されている。アルミナ平板は、バレル研磨およびサンドブラスト処理により、面粗さＲａが０．２μｍ、０．３５μｍ、０．５μｍおよび０．６μｍにしたアルミナ板を得た。
【００４４】
このアルミナ平板に対して、蛍光光度分析装置を用いて励起波長５３２ｎｍおよび６３０ｎｍで、バンド幅１．５ｎｍの光を照射し、各波長の蛍光スペクトルを測定した。面粗さＲａが０．２μｍのアルミナ平板に対しては、蛍光標識として良く用いられるＣｙ３およびＣｙ５の検出波長である５７０および６６０ｎｍには、吸収極大ピークは観察されなかった。これら蛍光標識を用いて検査する基板として使用可能であることが判った。表面粗さＲａが大きくなると、励起波長の反射光のバンド幅が広くなる傾向があり、表面粗さＲａが０．６μｍになると、反射光バンド幅は、蛍光検出波長域まで広がり、５７０および６６０ｎｍの波長光が基板からの反射光とそれぞれ重なってしまい、検査の精度を低下させることがわかった。
【００４５】
割り溝が施された上記のアルミナ基板に、レーザービーム走査により識別符号を彫刻した。アルミナ基板の表面で、割り溝で区画された領域の内側であって、０．５５×０．２５ｍｍ角の各領域に、数千種にもおよぶ生化学物質とその他の検査体の種類を考慮し、ＹＡＧレーザービームを走査して、２次元バーコードを掘り込んだ。掘り込んだ２次元バーコードのレーザ読取りを確認して、０．５秒で読取りが可能であり、識別符号５として有効であった。
【００４６】
識別符号を掘り込んだ表面を表面形状顕微鏡を用いて表面起伏を観察し、レーザビームを照射して表面に形成したスポット孔のエッジ部の盛り上がり量ないし高さを測定した。レーザー照射出力を落とし、イメージセンサーでコード読取り可能な掘り込み深さで、ビームスポット孔の回りのエッジ部の盛り上がりは０．８μｍであった。
【００４７】
エッジ部の盛り上がりは、摩耗なしい剥離、脱落が生じやすいが、この点について、種々高さの盛り上がりを持つ基板を重ねあわせ６０サイクルの横振動を１分間与える試験をして、その後の盛り上がり部の高さを測定した。その結果、５μｍの盛り上がりでは試験後４．７μｍまで磨耗しており、３μｍ以下では殆ど変化が見られなかった。このことから、レーザビームによる基板に付す識別符号５としてはエッジ部の盛り上がりは３μｍ以下であれば、基板の擦れによる磨耗はなく、欠落粒子に起因した検査への影響はないことが確認された。
【００４８】
［実施例２］
実施例１の知見を下にして、表面粗さＲａ０．３５μｍの平面を有し、割り溝付きアルミナ基板の裏面にレーザーにて識別記号５を彫刻したあと、割り溝に従って分割して、長さ０．５８mm、幅０．３０ｍｍ、厚み０．２０ｍｍの微小基板２０を多数作り、これらを利用して、以下の処理を行った。
【００４９】
微小基板２０の洗浄のために、２０％水酸化ナトリウム水溶液と９５％エタノールとの混合液中に上記分割された微小基板４を浸漬して室温で２時間で振とうし、次いで、蒸留水で洗い流して洗浄した。
【００５０】
微小基板２０に表面層６を形成するために、アミノプロピルトリメトキシシランの２％エタノール溶液に浸し、室温で１時間振とうし、その後取り出して、エタノールで洗浄した。その後、乾燥器にて１１０℃で１５分間、加温乾燥させ、シラノ化合物薄膜で被覆した微小基板２０を得た。
【００５１】
この微小基板２０を活性エステル化を行なった後、微小基板の固定面上に、２５の塩基配列をもつオリゴヌクレチドを１種類だけ点着して、塩基数２５のオリゴヌクレチドを固定化した微小基板２を得た。
【００５２】
この微小基板２をトレー３上に載置し、微小基板２に固定化されたオリゴヌクレチドに相補的なフルオレセイン結合オリゴヌクレチドを基板上に添加してハイブリダイゼーションさせた後、余分なフルオレイン結合オリゴヌクレチドをエタノールにて洗い落とした。乾燥したあと、微小基板の固定面の蛍光測定を行なった。上記オリゴヌクレチドを点着した微小基板においては、波長４７３ｎｍの明確な蛍光が認められ、検出に充分有用であることが判った。
【００５３】
［実施例３］
実施例２と同様の手順で、塩基数の異なるオリゴヌクレチドをそれぞれ１種類だけ固定化した基板２を多数調製し、おのおの２個の基板を内径０．５ｍｍの透明なガラス管に挿入し、検体となるオリゴヌクレチドの塩基数を検出する検査基板１を調製した。 透明ガラス管に組み入れた微小基板は、微小基板２の底面に施した二次元バーコードの識別符号５をレーザ読取装置を用いて、読み取って確認することができた。
【００５４】
［実施例４］
実施例２に示したアルミナ平板から分割して、同様にアルカリ洗浄した微小基板４の表面に、以下の手順で、ポリＬ−リシン薄膜形成を行なった。まず、微小基板は、ポリＬ−リシン希釈液に浸し１時間放置し、液から取りだし遠心分離機を用いて５００ｒｐｍの回転数で１分間遠心分離し、余分なポリＬ−リシン溶液を除いた。その語、吸引式恒温器に入れ４０℃にて５分間乾燥させ、保管容器に移し室温で２週間保持してポリＬ−リシン薄膜を微小基板２０に十分に定着させて、表面層６を形成した。
【００５５】
このポリＬ−リシン薄膜形成の微小基板２０は、点着用のガラストレーに並べ、各微小基板２０には、予め調製された濃度約１μｇ／μリットルのＤＮＡ溶液を点着した。点着後、各微小基板は、後処理溶液で処理し、エノールで洗浄した後に、乾燥して、１種類のＤＮＡ７のみを固定した基板２を作製した。同様にして、異なる種類のＤＮＡのみが固定された基板２を、順次調製した。ＤＮＡを固定した多数の微小基板２をガラストレーに載置したまま、ガラスケース内に保管し室温で保存した。こうして微小基板ごとに異なる種類のＤＮＡだけが固定された多数の微小基板が準備された
【００５６】
検査に際しては必要な項目のみを検査するのに対応して必要な組み合わせのＤＮＡが要求されるので、要求に従って該当するＤＮＡの組を、上記準備された多数のＤＮＡ基板から識別符号により確認しながら選択し、一組の選択した微小基板をトレー３上に配列して、検査基板１とした。トレー上には、基板ザイズの凹み部が配置されており、微小基板の固定が容易である。こうして検査の要求に応じて、検査に必要な項目からＤＮＡを固定した微小基板を選択して検査を行うことが可能となった。組みこむべき微小基板の確認と選択は、ガラスケースを通して、レーザ読み取り装置により識別符号５を判別してなされた。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の微小基板は、検査に必要に生化学物質、例えば、核酸、核酸誘導体、タンパク質、糖質、細胞、細胞断片などの１種だけを１個の微小基板に固定化するので、このような多数の微小基板を予め多数準備し、検査その他の操作に所要の生化学物質の配列を、上記微小基板から選択して配列することができ、従って生化学物質を検出するために用いる検査基板の製造時間を短縮するこができ、製造コストの低減が可能となる。
【００５８】
微小基板は、単一の生化学物質を固定するものであるから、極めて小さい基板に小型化することができ、検査の準備においては、このような微小基板を検査目的に対応するように最小数を選択して配列すればよいから、被検査物質の量を削減するとともに、目的とする項目以外の発現がないことより検査時間および経費の削減が可能となる。
【００５９】
検査基板は、各微小基板に１種類の生化学物質のみを固定した微小基板を選択して、多数の選択した微小基板を搭載手段に配置することにより構成されるので以後の検査工程での処理操作とその管理が容易になる。
【００６０】
特に、各微小基板には識別符合を付しておれば、微小基板の調製と配列、その後の検査工程では、逐次、識別符号を読み取って、微小基板と固定した生化学物質を特定して、誤操作を回避しながら、検査工程を実施することができる。
【００６１】
本発明の検査基板を使用することにより、微小基板の表面に固定化した物質と特異的に相互作用する核酸、核酸誘導体、タンパク質、化学物質、糖類、細胞などを、吸着、化学的相互作用、ハイブリタイズなどの操作により、目的に応じて、純化と分取をすることが容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例に係る検査基板の外観図。
【図２】  本発明の実施例に係る微小基板の群とトレーとを示す外観図。
【図３】微小基板の外観図であって、（Ａ）は微小基板の外形を、（Ｂ）は識別符号を底面に付した微小基板を、（Ｃ）は表面層を形成した微小基板を、（Ｄ）は固定面に生化学物質を固定した微小基板を、それぞれ示す。
【符号の説明】
１    検査基板
２    微小基板
３    トレー
５    識別符号
６    表面層
【図１】
0004167431.tif 000002
【図２】
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【図３】
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