(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−クロロ−４−メチルチオ酪酸の変異原性に対する、グリシンベタインからなる変異原性抑制剤。
【請求項２】
顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤に製剤化された請求項１に記載の変異原抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発癌性などを有する変異原性物質の変異原を抑制する抗変異原性組成物に関する。より詳細には、本発明は、グリシンベタインを含有してなる抗変異原性組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、２−クロロ−４−メチルチオ酪酸（ＣＭＢＡ）に変異原性があることが報告されている。２−クロロ−４−メチルチオ酪酸（ＣＭＢＡ）は次式、
【０００３】
【化１】
0004044227.tif 000002
【０００４】
で表される化合物であり、この物質は、さんまを亜硝酸と食塩で処理することにより、さんま中に存在するメチオニン（４−メチルチオ−２−アミノ酪酸）から生成されることが報告されている（Chen,W., et al., Nature, 374, 599 (1995);Chen,W., et al., Chem. Res. Toxicol., 9, 58-66 (1996)）。
【０００５】
さらに、動物実験の結果によると、ＣＭＢＡが胃癌の原因となる可能性もあることも報告された（Weisburger,J.H., et al., J. Natl. Cancer Inst., 64, 163-167 (1980);Furihata,C. et al., Cance Lett., 108, 129-135 (1996)）。
さんまなどの魚類の成分に変異原性を有するもととなる物質があるということは、魚類を多食する日本人にとっては重大な問題である。したがって、さんまなどの魚類に含有される物質から誘発される変異原性を有する物質の変異原性を抑制する抗変異原性の物質が必要とされてきている。
一方、グリシンベタインは、次式
【０００６】
【化２】
0004044227.tif 000003
【０００７】
で表されるグリシンのＮ−トリメチル体の両性化合物であり、食品添加物などとして知られている（例えば、特公昭６１−１１１３号、特開平６−２２５７２８号など）。また、グリシンベタインは、レントゲン造影剤の消化器管内の凝固変化や粘度上昇の抑制剤（特公昭５５−３７９７３号）や、二日酔い症状の改善剤（特公平４−３２８０２号）や、血糖値上昇抑制剤（特開平８−１３３９７０号）や、水酸基ラジカルに起因する疾患、特に心疾患の治療剤（特開平１０−９５７３１号）などの医薬用途や、経口セファロスポリン製剤の添加物（特公平８−１８９８７号、特公平８−１８９８８号）や抗レトロウイルス剤の原料成分（特公平５−７１５６９号）として知られている化合物である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な抗変異原性を有する物質を提供するものである。より詳細には、さんまなどの魚類に含有される物質から誘発される変異原性物質ＣＭＢＡに対して抗変異原性を有する物質を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グリシンベタインを含有してなる抗変異原性組成物に関する。より詳細には、変異原性物質が、２−クロロ−４−メチルチオ酪酸（ＣＭＢＡ）である抗変異原性組成物に関する。
【００１０】
本発明者らは、２−クロロ−４−メチルチオ酪酸（ＣＭＢＡ）の変異原性を抑制できる物質を探索していたところ、ビールがＣＭＢＡの変異原性を抑制することを見出した。
即ち、変異原性の試験に使用されているサルモネラ菌ＴＡ１００（サルモネラチフィムリウムＴＡ１００（Salmonella typhimurium TA100））を用いて、ＣＭＢＡにビールを加えたところ、変異体の生成が大幅に減少することを見出した。
【００１１】
この抑制率は、ビールの０．１ｍｌ又は０．２ｍｌにおいて約３０％であったので（図１参照）、ビール中の抗変異原性活性物質の抽出を行った。
このビールを凍結乾燥し、１００ｍｌのビールから３．５ｇの固形成分が得られた。この固形成分７ｍｇ（ビール０．２ｍｌ相当分）を添加した場合もほぼ同様な結果が得られた（図１参照）。このことから、この固形成分の中に抗変異原性活性を有する物質が存在していることがわかった。
【００１２】
次に、凍結乾燥したビールの固形成分を、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いて精製し、これを逆相クロマトグラフィーにより分離して、抗変異原性活性を有する単一フラクションを得た（無色結晶として７ｍｇ）。
この結晶をマススペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにより同定したところ、グリシンベタインであることがわかった。
【００１３】
このグリシンベタイン０．５ｍｇを添加すると約９５％の抑制率を示した。これはＣＭＢＡに対する化学量論量のやや過剰量である。さらに、市販のグリシンベタインを用いても同様な結果が得られた（図１参照）。
また、この試験において、ビールもグリシンベタインも細胞毒性はみられなかった。
【００１４】
ビールを０．１ｍｌ添加したときと０．２ｍｌ添加したときとで、ほぼ同じ抑制率がみられた（図１参照）ことから、グリシンベタインの効果を抑制する成分がビールに含まれていることが考えられた。事実、１μモルのグリシンベタインの添加により３μモルのＣＭＢＡの変異原性が約１６％にまで減少したのに対して、これにさらにビール０．６ｍｌ相当量のビール凍結乾燥物を添加することにより、変異原性は約５５％にまで戻ってしまった。
【００１５】
さらに、本発明者らは、グリシンベタインの抗変異原性のメカニズムを検討した。このために、まず２ｍＭのグリシンベタインを含むｐＨ７．４の生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中でサルモネラ菌ＴＡ１００を３７℃で４時間処理し、混合物を遠心分離し、サルモネラ菌をＰＢＳで洗浄した後、これにＣＭＢＡ３μモルを混合したところ、変異体のコロニーが生成した。この時の変異原性は、グリシンベタインを添加処理しない場合の約４４％であった（図２参照）。
この結果は、グリシンベタインの抗変異原性が細胞外で起こっているのでないことを示唆している。
【００１６】
また、反対に先にＣＭＢＡで４時間処理をして、次いでグリシンベタインを添加した場合には、グリシンベタインでの処理をしない場合のコントロールに対して変異原性の減少はみられなかった。このことから、グリシンベタインが、ＣＭＢＡによる変異原性が生起した後に、これを修復するものではないことがわかった。
【００１７】
ＣＭＢＡで誘発される変異原性のメカニズムは充分解明されてはいないが、ＣＭＢＡは直接作用する変異原であり、即ち、細胞外の代謝による活性化を必要とするものではないし、この化合物が化学的に非常に安定なものであることも知られている（Chen,W., et al., Chem. Res. Toxicol., 9, 58-66 (1996)）。例えば、４ｍＭのＣＭＢＡと４ｍＭのグリシンベタインとを、ｐＨ７．４で３７℃で３時間処理しても、ＨＰＬＣによってもＣＭＢＡの変化を観察することはできなかった。
【００１８】
また、サルモネラ菌を用いたアッセイによれば、グリシンベタインは他の直接的に作用する変異原性を有する物質、即ち、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（サルモネラ菌ＴＡ１００による）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（サルモネラ菌ＴＡ１００による）、ベンゾ（ａ）ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキサイド（サルモネラ菌ＴＡ１００による）、及び、３−ヒドロキシアミノ−１−メチル−５Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］インドール（サルモネラ菌ＴＡ９８による）の変異原性を抑制するものでもなかった。さらに、グリシンベタインの類縁体、即ち、コリン、γ−ブチロベタイン及びＮ−メチルグリシンは、ＣＭＢＡに対する抗変異原性を示さないものであった。これらのことは、グリシンベタインのＣＭＢＡに対する抗変異原性が特異的なものであることを示唆しているようでもある。
【００１９】
グリシンベタインはヒトなどの動物や植物に含有されている天然物である。ビールの原料であるオオムギにもグリシンベタインが含有されていることが知られており、ビールのグリシンベタインはビールの原料である天然物に由来している。グリシンベタインは細胞がメチオニンを合成する際の、ホモシステインのメチル化剤として作用していることが知られている（Garrow,T.A., J. Biol. Chem., 271, 22831-22838 (1996)）。メチオニンのアミノ基が塩素で置換されたメチオニン誘導体であるＣＭＢＡに対するグリシンベタインの抗変異原性活性は、グリシンベタインのこのような生理学的作用に起因するものであろうと考えられる。
【００２０】
また、本発明者らは、異なるブランドのビールについても同様の試験を行ったが、いずれのブランドのビールも同様の抗変異原性を示した。
グリシンベタインのＣＭＢＡに対する抗変異原性は、細胞外及び細胞内の両方において生起するものである。
【００２１】
本発明のグリシンベタインは抗変異原性を有し、より詳細にはＣＭＢＡに対する抗変異原性を有し、胃癌などの癌の予防に有用である。また、さんまなどの魚類の摂取に伴うＣＭＢＡによる変異原性の予防に特に有用である。
本発明の抗変異原性組成物は、グリシンベタイン単独であってもよいが、グリシンベタインに製薬上許容される担体又は食品として許容されるものを配合添加したものである。本発明の抗変異原性組成物は、公知の方法により混合、加工して製造することができる。
【００２２】
また、本発明のグリシンベタインは、公知の手段により合成により製造されたものであってもよいが、植物や動物に含有されているものをそのまま又は必要に応じて加工したもの（例えば、ビール又はその凍結乾燥したものなど。）であってもよい。
したがって、本発明の抗変異原性組成物におけるグリシンベタインは、天然物又はその加工品に含有されてなるものであってもよい。
【００２３】
本発明の抗変異原性組成物は経口投与、非経口投与のいずれによっても行うことができるが、通常は食品などのように経口投与が好ましい。本発明の抗変異原性組成物の投与量は、患者の症状や投与目的によっても異なるが、１日当たり０．０１ｍｇから数ｇまでの投与ができる。グリシンベタインは食品添加物などとして使用されているものであり、食品添加物として投与することもできる。
本発明の抗変異原性組成物は、グリシンベタインをそのまま又は他の担体などを混合して使用することもできるが、公知の方法により顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤に製剤化することもできる。また、他の食品に配合して使用することもできる。
【００２４】
【実施例】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１（ＣＭＢＡの変異原性試験）
サルモネラチフィムリウムＴＡ１００（Salmonella typhimurium TA100）（Ames,B.N., et al., Mutation Res., 31, 347-364 (1975)）にＬ−メチオニンから合成したＣＭＢＡ（Chen,W., et al., Chem. Res. Toxicol., 9, 58-66 (1996)）３μｍｏｌを添加した。
ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中でサルモネラ菌ＴＡ１００をＣＭＢＡで３７℃、２０分間処理した後、軟寒天とともに最小グルコース寒天培地にまき、３７℃で３日間インキュベートして復帰突然変異体のコロニーをカウントした。
この結果１，０４０個の復帰突然変異体が生成した。このとき、ＣＭＢＡを添加しなかったものは、１１０個の復帰突然変異体が生成した。
【００２６】
実施例２（ビールの抗変異原性試験）
実施例１と同様にＣＭＢＡ３μｍｏｌを用いて、これにビール（市販品）の０．０２ｍｌ、０．１ｍｌ及び０．２ｍｌをそれぞれ添加した。また、このビールを凍結乾燥したもの（１００ｍｌのビールから３．５ｇの固形成分が得られた。）を０．２ｍｌ相当分添加したものも同様に試験した。
ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中でサルモネラ菌ＴＡ１００をＣＭＢＡとビール（またはその凍結乾燥物）で３７℃、２０分間処理した後、軟寒天とともに最小グルコース寒天培地にまき、３７℃で３日間インキュベートして復帰突然変異体のコロニーをカウントした。
ＣＭＢＡのみの場合を１００％としてそれぞれの場合の変異原性の結果を図１に示す。この結果によると、ビール０．０２ｍｌを添加した場合は約１３％、ビール０．１ｍｌを添加した場合は約３０％、ビール０．２ｍｌを添加した場合は約２２％の抑制率がみられた。ビール凍結乾燥物の場合には約２４％の抑制率がみられた。
【００２７】
実施例３（ビールの抗変異原性フラクションの分離）
凍結乾燥したビールの固形成分を、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いて精製し、これを逆相クロマトグラフィーにより分離して、抗変異原性活性を有する単一フラクションを得た（無色結晶として７ｍｇ）。
ビール１００ｍｌの凍結乾燥物（３．５ｇ）を６０ｍｌの水に溶かし塩酸でｐＨ２に調整した後、陽イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ４、１０Ｘ１２０ｍｍ）に通した。カラムを０．０１Ｎ塩酸５０ｍｌで洗浄後、水５０ｍｌ、５％アンモニア水溶液７０ｍｌで溶出した。この溶出液を凍結乾燥した後５％アンモニア水溶液に溶かし、陰イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｄｏｗｅｘ  １−Ｘ８、１０ｘ１２０ｍｍ）に通した。つぎに、このカラムを５％アンモニア水溶液で溶出し、素通り溶液と合わせた。この溶液をＳｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に通し、水で洗浄したものと合わせた後、逆相高速液体クロマトグラフィーによってさらに分離した。カラムにはＪ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｍ８０（２０ｘ２５０ｍｍ、ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ）を用いた。溶離液には５％メタノール溶液を用い、流速は４ｍｌ／ｍｉｎ、検出は示差屈折計（３５℃）で行った。その結果、抗変異原活性を有する単一ピークが１３．５分に溶出した。この単一ピークを集め、凍結乾燥して無色の結晶を得た。
この結晶をマススペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにより同定したところ、グリシンベタインであった。
ビールから単離したグリシンベタインと、標品グリシンベタインの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図３及び図４に示す。これらのスペクトルはＤＳＳ（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｓｉｌａｐｅｎｔａｎｅ−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を内部標準として、重水中で測定した。
【００２８】
実施例４（グリシンベタインの抗変異原性試験）
実施例１と同様にＣＭＢＡ３μｍｏｌを用いて、これに前記ビールから得たグリシンベタイン０．０２ｍｇ（ビール０．３ｍｌ相当量）、０．５ｍｇ（ビール７ｍｌ相当量）、及び合成のグリシンベタイン０．５ｇをそれぞれ添加した。
ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中でサルモネラ菌ＴＡ１００をＣＭＢＡとグリシンベタインで３７℃、２０分間処理した後、軟寒天とともに最小グルコース寒天培地にまき、３７℃で３日間インキュベートして復帰突然変異体のコロニーをカウントした。
ＣＭＢＡのみの場合を１００％としてそれぞれの場合の変異原性の結果を図１に示す。この結果によると、ビールからのグリシンベタイン０．０２ｍｇを添加した場合は約４５％、ビールからのグリシンベタイン０．５ｍｇを添加した場合は約９５％、合成のグリシンベタイン０．５ｍｇを添加した場合は約９４％の抑制率がみられた。
【００２９】
実施例５（グリシンベタインの添加順序による抗変異原性試験）
前培養したサルモネラ菌を５倍濃縮して生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した菌液０．１ｍｌに、グリシンベタイン、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、Ｄ−グルコースを最終濃度がそれぞれ２ｍＭ、０．０７Ｍ、０．１５Ｍとなるように加えて総容量を１ｍｌとした。振盪しながら３７℃で４時間インキュベートした後、反応混合液を遠心分離して上清の試薬を除去し、沈殿のサルモネラ菌にＰＢＳを加えて２回洗浄した。最後にサルモネラ菌を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）５００μｌに懸濁し、３μｍｏｌのＣＭＢＡおよび軟寒天を加えて最小グルコース寒天培地にまいた。３７℃で３日間インキュベートした後、復帰突然変異体のコロニーをカウントした。
この時の変異原性は、グリシンベタインを添加処理しない場合の約４４％であった。この結果（表１中の試料番号II）及びコントロールの結果を併せて下記の表１に示す。
【００３０】
実施例６（グリシンベタインの添加順序による抗変異原性試験）
実施例６は、実施例５の操作におけるグリシンベタインとＣＭＢＡの処理を逆にしたものである。すなわち、２ｍＭ（２μｍｏｌ）グリシンベタインの代わりに３ｍＭ（３μｍｏｌ）ＣＭＢＡを反応混合液中に加え、３μｍｏｌＣＭＢＡの代わりに２μｍｏｌグリシンベタインを加えて寒天培地にまいた。
この結果（表１中の試料番号Ｖ）と、コントロールの結果を併せて表１に示す。
【００３１】
【表１】
0004044227.tif 000004
【００３２】
実施例７（他の変異原性物質に対するグリシンベタインの抗変異原性試験）
サルモネラ菌を用いたアッセイによれば、グリシンベタインは他の直接的に作用する変異原性を有する物質、即ち、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（サルモネラ菌ＴＡ１００による）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（サルモネラ菌ＴＡ１００による）、ベンゾ（ａ）ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキサイド（サルモネラ菌ＴＡ１００による）、及び、３−ヒドロキシアミノ−１−メチル−５Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］インドール（サルモネラ菌ＴＡ９８による）の変異原性を抑制するものでもなかった。
即ち、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中でサルモネラ菌ＴＡ１００を種々の変異原物質とグリシンベタインで３７℃、２０分間処理した後、軟寒天とともに最小グルコース寒天培地にまき、３７℃で３日間インキュベートして復帰突然変異体のコロニーをカウントした。
この結果を次の表２に示す。
【００３３】
【表２】
0004044227.tif 000005
【００３４】
実施例８（ＣＭＢＡに対する抗変異原性試験）
グリシンベタインの類縁体、即ち、コリン、γ−ブチロベタイン及びＮ−メチルグリシンは、ＣＭＢＡに対する抗変異原性を示さないものであった。
即ち、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中でサルモネラ菌ＴＡ１００をＣＭＢＡと種々のグリシンベタイン類縁体で３７℃、２０分間処理した後、軟寒天とともに最小グルコース寒天培地にまき、３７℃で３日間インキュベートして復帰突然変異体のコロニーをカウントした。
この結果を図５に示す。図５中の白丸印は本発明のグリシンベタインを示し、白四角印はＮ，Ｎ−ジメチルグリシンを示し、白三角印はＮ−メチルグリシンを示し、白菱形印はグリシンを示し、黒丸印は酢酸コリンを示し、黒四角印はγ−ブチロベタインをそれぞれ示す。
【００３５】
【発明の効果】
本発明は、さんまなどの魚類に含有されている物質から誘発される変異原性物質ＣＭＢＡに対する有効な抗変異原性物質を提供するものである。本発明の抗変異原性物質であるグリシンベタインは天然の植物や動物が含有するものであり、また、食品添加物などとして広く使用されているものでり、安全性も高く、安全で有効な抗変異原性組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ビール及びグリシンベタインを添加したときのＣＭＢＡに対する抗変異原性を、無添加の場合を１００％としてグラフ化したものである。
【図２】図２は、グリシンベタインを先に添加した場合の抗変異原性を、無添加の場合を１００％としてグラフ化したものである。
【図３】図３は、ビール中の抗変異原性活性を有する物質（グリシンベタイン）の１Ｈ−ＮＭＲのチャートを示す。
【図４】図４は、ビール中の抗変異原性活性を有する物質（グリシンベタイン）の１３Ｃ−ＮＭＲのチャートを示す。
【図５】図５は、各種グリシンベタイン類縁体のＣＭＢＡに対する抗変異原性活性を示す。図５中の白丸印は本発明のグリシンベタインを示し、白四角印はＮ，Ｎ−ジメチルグリシンを示し、白三角印はＮ−メチルグリシンを示し、白菱形印はグリシンを示し、黒丸印は酢酸コリンを示し、黒四角印はγ−ブチロベタインをそれぞれ示す。
【図１】
0004044227.tif 000006
【図２】
0004044227.tif 000007
【図３】
0004044227.tif 000008
【図４】
0004044227.tif 000009
【図５】
0004044227.tif 000010