(57)【要約】  本発明は、５ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を含む、皮膚の化粧用途のためのトリュフ抽出物に関する。本発明はまた、皮膚および角質付属器官の老化および光老化の徴候を低減しおよび／または直し、かつ紫外線照射による攻撃から皮膚を保護するように設計された美容方法に関する。
2017520630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を含む、化粧用途のためのトリュフ水性抽出物。
【請求項２】
トゥベル・メラノスポルム（Ｔｕｂｅｒ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ）から得られる、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項３】
子実体から得られる、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項４】
水抽出と、カルボヒドラーゼおよびプロテアーゼの中から選択される酵素で実行される酵素加水分解とによって得られる、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項５】
酵素加水分解後に、酵素不活性化のステップが行われる、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項６】
水、グリセリン、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化グリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物から選択される溶媒中で希釈される、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項７】
水抽出および酵素加水分解によって得られたトリュフ抽出物を含む化粧用組成物であって、前記トリュフ抽出物が、５ｋＤａ未満の分子量を有する化合物と、生理学的に許容可能な媒体とを含む、化粧用組成物。
【請求項８】
前記トリュフ抽出物が、前記組成物の全重量の約０．０００１重量％〜約２０重量％の濃度で使用される、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項９】
前記トリュフ抽出物が、前記組成物の全重量の約０．０００５重量％〜約５重量％の濃度で使用される、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項１０】
局所塗布に適合した形態である、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項１１】
ゲル、クリーム、バルム、ミルク、または気泡製品の形態である、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの他の活性薬剤を更に含む、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項１３】
酸化防止剤、植物の加水分解物、合成ペプチド化合物、日焼け止め剤、抗しわ剤から選択される少なくとも１つの他の活性薬剤を更に含む、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項１４】
皮膚および角質付属器官の老化および光老化の徴候を低減するおよび／または直すための方法であって、水抽出および酵素加水分解によって得られ、５ｋＤａ未満の分子量を有する化合物と生理学的に許容可能な媒体とを含んだトリュフ抽出物を含む化粧用組成物を、皮膚、粘膜および／または表層付属器官に局所的に適用するステップを含む、方法。
【請求項１５】
紫外線照射による攻撃から皮膚を保護するように設計された請求項１４に記載の方法であって、処置される皮膚に化粧用組成物を局所的に適用するステップを含む方法。
【請求項１６】
皮膚細胞におけるＡＴＰレベルを増大させるように設計された請求項１４に記載の方法であって、処置される皮膚にトリュフ抽出物を含む化粧用組成物を局所的に適用するステップを含む方法。
【請求項１７】
皮膚細胞における活性酸素種レベルを低減するように設計された請求項１４に記載の方法であって、処置される皮膚にトリュフを含む化粧用組成物を局所的に適用するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品の分野に関し、より具体的には、スキンケアの分野に関する。本発明は、トリュフ抽出物およびトリュフ抽出物を含む化粧用組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、皮膚および角質付属器官の老化および光老化の徴候を低減するおよび／または直すように設計された美容方法、ならびに紫外線照射による攻撃から皮膚を保護することに関する。
【０００３】
トリュフ抽出物は、単独で、または他の活性薬剤と組み合わせて使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
皮膚は、数個の層（真皮、増殖層、および角質層）から構成される生体臓器であり、身体の表面全体を覆い、保護、感覚、免疫、代謝または体温調節機能を保証するものである。皮膚は、他の臓器と同様に、老化を受ける。
【０００５】
例えば、皮膚の外観は、様々な種類の内部攻撃（疾患および妊娠などのホルモン変化）または外部攻撃（環境因子、例えば、汚染、日光、病原体など）によって変更される。その後、しわおよび小じわ、高色素沈着または低色素沈着のシミ、皮膚の乾燥または更には脱水、表皮の菲薄化、弾性線維症、皮膚トラブル、年齢によるシミなどが現れる場合がある。これらの変化の全ては、皮膚ばかりでなく、爪および毛髪などの角質付属器官にも影響を及ぼす。
【０００６】
細胞内代謝または外部攻撃によって生成される、化学的に不安定であり、非常に反応性の高い種であるフリーラジカルは、老化過程において、より具体的には、酸化され、損傷を受けたタンパク質の形成において重要な役割を果たすことが知られている（Ｈａｒｍａｎら、「Ａｇｉｎｇ：ａ  ｔｈｅｏｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．、１１、２９８−３００）。これらの外部攻撃としては、紫外線照射、毒素、大気汚染、食事性のオキシダントが含まれ得る。紫外線照射の皮膚暴露は、活性酸素種（ＲＯＳ）の広範囲にわたる生成を誘起する。これらは、ＤＮＡ、タンパク質、脂肪酸、および糖類と反応し、酸化的損傷を引き起こし得る。
【０００７】
皮膚においては、紫外線照射に曝された領域で発生する早期老化が観察され、これは、特に、エラスチン、コラーゲン、またはフィブロネクチンに影響を及ぼす、高分子に対する変化の現象（脂質過酸化、タンパク質のカルボニル化）に特徴がある。
【０００８】
酸化的損傷の蓄積から導かれる重要な結果のうちの１つは、細胞のＡＴＰを生成する能力における低減である（Ｐｏｒｔｅｏｕｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９８、２５７（１）：１９２−２０１）。したがって、細胞老化の現象は、細胞が受ける酸化的損傷に関連するが、細胞が生存するために必要なエネルギー産生の過程にも関連する。
【０００９】
真菌は、生物体の広範な科であることが知られている。一部の野生および栽培可能なマッシュルームの子実体は、伝統的な医薬品および化粧品で使用されている薬物化合物を含有する。真菌は、それらの進化の過程で、環境ストレスに抵抗するために様々な特性を発達させ、一部の真菌化合物が、生物体に対する生活環境および自然環境によって引き起こされる損傷を緩和するための作用を有し得ることが知られている。したがって、真菌由来の新しい天然の生理活性化合物に対する研究が強化されている。
【００１０】
例えば、カバノアナタケ（Ｉｎｏｎｏｔｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）マッシュルームは、ＲＯＳに対して細胞を保護する上で重要な要素である、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などの酵素を含有する。
【００１１】
また、トリュフは、免疫および高脂血症の改善などの特定の状態に有効であることも知られている。
【００１２】
セイヨウショウロ属（ｇｅｎｕｓ  Ｔｕｂｅｒ）は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｐｈｙｌｕｍ）に属し、地下生キノコである。セイヨウショウロ属は、トリュフのいくつかの種を含む。これらのトリュフ種は、樹木および灌木と外生根共生を構築し、子実体を形成する地下生菌である。
【００１３】
トリュフ種のいくつかは、それらの子実体の特徴的な香りおよび旨味のために、食物として非常に高価である。これらの種は、「トリュフ」または「本物のトリュフ」と呼ばれ、これらは、有名なフランスおよびイタリア料理で広く使用されている貴重で高価な珍味である。
【００１４】
本明細書の説明において、「トリュフ」とは、以下の種を指す：黒トリュフ（フランスのペルゴールのトリュフとしても公知、学名：トゥベル・メラノスポルム（Ｔｕｂｅｒ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ））、イタリア白トリュフ（学名：トゥベル・マグナトゥム・ピコ（Ｔｕｂｅｒ  ｍａｇｎａｔｕｍ  ｐｉｃｏ））、ブルゴーニュトリュフ（トゥベル・ウンチナタム（Ｔｕｂｅｒ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ））、カラハリトリュフ（テルフェジア・フェイリイ（Ｔｅｒｆｅｚｉａ  ｐｆｅｉｌｉｉ））、ライオントリュフ（テルフェジア・レオニス（Ｔｅｒｆｅｚｉａ  ｌｅｏｎｉｓ））、夏トリュフ（トゥベル・エスティヴァム（Ｔｕｂｅｒ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、冬トリュフ（トゥベル・ブルマーレ（Ｔｕｂｅｒ  ｂｒｕｍａｌｅ））、中国トリュフ（イボセイヨウショウロ（Ｔｕｂｅｒ  ｓｉｎｅｎｓｉｓまたはＴｕｂｅｒ  ｉｎｄｉｃｕｍ）、およびビアンケットまたは白っぽいトリュフ（トゥベル・ボルチー（Ｔｕｂｅｒ  ｂｏｒｃｈｉｉ））。
【００１５】
皮膚の治療のために様々な老化防止化粧品が市場に出ているにもかかわらず、天然成分を活性薬剤として使用する、皮膚、毛髪および／または爪に老化防止もしくは若返りの効果をもたらす有効な局所塗布化粧用組成物に対する要求が未だにある。非天然の、化学的合成製品は、環境に対してまたは人に対して安全ではないと受け取られる場合がある。対照的に、天然製品は、純粋で、優しく、かつ化学的合成製品よりも優れているとされている。植物またはハーブから抽出された多くの天然ベースの製品は、フリーラジカル損傷の作用を中和することができる抗酸化剤／フリーラジカル捕捉剤を含有することが知られている。更に、これらは、真皮における損傷した結合組織構造の合成および修復ならびに表皮におけるバリア機能を刺激する作用物質を含有することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、常に新しい活性成分の需要がある化粧品産業に、天然起源の新しい抽出物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的のために、本発明は、皮膚および／または付属器官の美容処置のためにトリュフ抽出物を提案する。
【００１８】
より具体的には、本発明によると、トリュフ抽出物は、トゥベル・メラノスポルムの子実体から得られる。
【００１９】
本発明者は、ここで、トリュフ（トゥベル・メラノスポルム）の水性抽出物が、例えば、紫外線照射暴露などの外部ストレス後に、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を減少させ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生を増加させ、かつ細胞生存率を増大させることができる活性化粧料であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種産生に及ぼす効果を示す。
【図２】ロテノンによる処置後の実施例２によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種産生に及ぼす効果を示す。
【図３】紫外線Ｂ照射による処置後の実施例１によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種産生に及ぼす効果を示す。
【図４】紫外線Ａ照射による処置後の実施例１によるトリュフ抽出物の線維芽細胞中のＡＴＰレベルに及ぼす効果を示す。
【図５】紫外線Ａ照射による処置後の実施例１によるトリュフ抽出物の線維芽細胞の生存率に及ぼす効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の主なる目的は、５０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を含む、化粧用途のための新規なトリュフ水性抽出物である。
【００２２】
本発明における「トリュフ」は、それらの子実体の特徴的な香りおよび旨味のために、食物として価値が高いセイヨウショウロ属のトリュフ種を指す。トリュフとしては、例えば、黒トリュフ（フランスのペルゴールのトリュフとしても公知、学名：トゥベル・メラノスポルム）、イタリア白トリュフ（学名：トゥベル・マグナトゥム・ピコ）、ブルゴーニュトリュフ（トゥベル・ウンチナタム）、カラハリトリュフ（テルフェジア・フェイリイ）、ライオントリュフ（テルフェジア・レオニス）、夏トリュフ（トゥベル・エスティヴァム）、冬トリュフ（トゥベル・ブルマーレ）、中国トリュフ（イボセイヨウショウロ）、およびビアンケットまたは白っぽいトリュフ（トゥベル・ボルチー）が含まれる。
【００２３】
皮膚とは、皮膚、粘膜、ならびに毛髪、睫毛、および眉毛を含む皮膚付属器官を構成する被覆組織の全てを指す。
【００２４】
本発明が、一般に哺乳動物のために、より具体的にはヒトのために設計されることは明確である。
【００２５】
本発明者は、皮膚および角質付属器官の老化および光老化の皮膚徴候を低減および／または直すために、かつ紫外線照射による攻撃から皮膚を保護するために有用である生物活性を実際に特定した。
【００２６】
「老化および光老化の皮膚徴候」とは、例えば、皮膚の菲薄化、たるみ、保湿性および弛緩の喪失、深いしわおよび小じわ、はりおよび色合いの喪失、皮膚萎縮または紫外線照射への暴露から生じる皮膚の任意の他の内部劣化、肝斑および年齢によるシミなどの、年齢による皮膚および皮膚付属器官の外観における全ての変化を指す。「日光性黒子」、「老年性黒子」、「加齢シミ」、「老人性斑」としても知られる肝斑は、太陽からの紫外線照射への暴露に起因する老化および光老化に関連する皮膚上のシミである。これらは、淡褐色から赤色または黒色の色の範囲におよび、日光が最も頻繁に当たった領域、特に手、顔、肩、腕、および前頭部、頭部が禿げている場合は頭皮に位置する。
【００２７】
本発明によるトリュフ抽出物の生物活性は、例えば、紫外線照射暴露などの外部ストレスの後に、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を減少させ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生を増加させかつ細胞生存率を増大させるためのトリュフの水性抽出物の能力によってインビトロで定義される。
【００２８】
「水性抽出物」とは、水による抽出によって得られた化合物の混合物であると理解される。
【００２９】
「局所塗布」とは、該トリュフ抽出物を含有する組成物の皮膚の表面または粘膜上への塗布または塗り広げであると理解される。
【００３０】
「生理学的に許容可能」とは、本発明による活性薬剤、または該薬剤を含有する組成物が、毒性または不耐性反応を引き起こすことなく、皮膚または粘膜と接触するのに好適であることと理解される。
【００３１】
本発明による活性薬剤は、水抽出、その後の生理活性化合物を放出する酵素加水分解によって得ることができる。好ましくは、酵素加水分解は、カルボヒドラーゼおよびプロテアーゼの中から選択される酵素を用いて行われる。
【００３２】
トリュフ中で見出される多数の化合物は、生理活性を有する可能性が高い。制御された加水分解は、これらの化合物が放出されることを可能にする。
【００３３】
好ましい実施形態では、トリュフ抽出物は、トゥベル種から、より好ましくはトゥベル・メラノスポルムから得られ、より好ましくは、トリュフ抽出物は、トリュフの子実体から得られる。
【００３４】
トリュフは、地下生菌である。それらの進化の過程で、トリュフは、それらの胞子を、気流を介して分散させる能力を喪失し、その代わりに、動物の消費、その後の胞子の分散によって繁殖する。用語「トリュフ子実体（ｔｒｕｆｆｌｅ  ｆｒｕｉｔｉｎｇ  ｂｏｄｙ）」とは、胞子を作り出す構造がその上に生じる多細胞構造である地下生子嚢果を指す。子実体は、真菌のライフサイクルの有性相の一部であり、残りのライフサイクルは、栄養菌糸成長および無性胞子形成によって特徴付けられる。
【００３５】
トリュフ子実体は、インビトロの制御条件下では未だに得ることができないために、子嚢果の発生および成熟をもたらす形態発生事象ならびにそれらの根底にある分子的基盤についての本発明者等の知識はかなり限られている。子実体の形成中の遺伝子発現における変化が記述されている（Ｇａｂｅｌｌａら、２００５）。更に、トリュフの菌糸およびトリュフの子実体は、２つの別個の区画と考えられ、別個の組成および内容物を有することが知られている（Ｔａｎｇら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３２（２０１２）１２０７−１２１３；Ｓｐｌｉｖａｌｌｏら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（２００７）２５８４−２５９８）。
【００３６】
本実施形態の利点の１つは、成熟期に収穫されたトリュフに由来する子実体が、天然の菌糸体またはインビトロで成功した菌糸体と比べて、関心の異なる化合物を高度に濃縮しているということである。
【００３７】
当業者に公知である水抽出または精製の全ての方法を、本発明による抽出物の調製に使用することができる。
【００３８】
第１の段階において、トリュフ材料が水中で粉砕され、水中で柔らかにされる。
【００３９】
水抽出は、室温で、または４０〜９０℃に加熱した水を用いて行うことができる。
【００４０】
好ましい実施形態では、抽出は、５０℃に加熱した水中に２時間漬けて柔らかくすることによって行われる。
【００４１】
この原料溶液は、次いで、制御された条件下で加水分解され、可溶性化合物を生成する。
【００４２】
本発明によると、加水分解は、カルボヒドラーゼもしくはセルラーゼおよびプロテアーゼによって、化学的に、または有利に行われる。カルボヒドラーゼ（例えば、ＶＩＳＣＯＺＹＭ（登録商標）：アラバナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、およびキシラーゼを含む、広範囲のカルボヒドラーゼを含有する多酵素複合体：ＧＬＵＣＡＮＥＸ（登録商標）：酵母（トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ））から抽出されたβグルカナーゼ）、植物により生成されたエンドプロテアーゼ（パパイン、ブロメライン、フィシン）および微生物（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）など）によって生成されたエンドプロテアーゼの使用が、ここに挙げることができる。
【００４３】
加水分解は、数種の酵素で同時に行うことができる、または連続する加水分解ステップを１種の酵素で一度に行うことができる。
【００４４】
好ましい実施形態では、第１の加水分解は、１〜１０％のカルボヒドラーゼ酵素を用いて、摂氏４０〜８０度の温度、および３〜６のｐＨで、１〜２時間行われる。
【００４５】
特に好ましい実施形態では、第１の加水分解は、４％のＶＩＳＣＯＺＹＭＥ（登録商標）またはＧＬＵＣＡＮＥＸ（登録商標）を用いて、５５℃、４．５〜５のｐＨで、２時間行われる。
【００４６】
好ましい実施形態では、第２の加水分解は、１〜１０％のエンドプロテアーゼ酵素を用いて、摂氏４０〜８０度の温度、および３〜６のｐＨで、１〜２時間行われる。
【００４７】
特に好ましい実施形態では、第２の加水分解は、２％のブロメラインを用いて、５５℃、４．５〜５のｐＨで、２時間行われる。
【００４８】
加水分解ステップの後に、得られた溶液は透明ではない。残渣を除去するために、遠心分離および濾過が行われる。気孔率が減少する順の各フィルターを用いる連続的な濾過が行われる。得られた濾液は透明な澄んだ溶液である。
【００４９】
次いで、酵素不活性化のステップが行われる。好ましくは、酵素は、例えば、得られた濾液を４０〜９０℃の、好ましくは８０℃の温度で、数時間から一晩加熱することによって、熱的に不活性化される。
【００５０】
酵素の熱不活性化の後に、残存酵素を更に除去するために、また低分子量を有する化合物を選択するために、追加の濾過を必要に応じて行うことができる。
【００５１】
不活性化および濾過による除去の後に、ほとんど全ての酵素が濾液から除去される。このように、第１の活性濾液が得られる。
【００５２】
得られた活性濾液が、皮膚に対して刺激性またはアレルゲン性であり得る残留酵素を含まないことが好都合である。実際に、パパインなどのタンパク質分解酵素は、皮膚に塗布される場合、非常に刺激性であることが知られている。
【００５３】
清澄化および酵素不活性化の後に、チャコールが濾液に添加される。
【００５４】
実際に、トリュフ抽出物は、化粧用途に好ましくない悪臭の揮発性化合物を放出することが知られている。チャコールは、好都合にも、これらの悪臭の揮発性化合物を吸収する。
【００５５】
例えば、悪臭を除去するために、チャコールＳＸ  ｐｌｕｓ（ＮＯＲＩＴ（登録商標）が、室温において、好ましくは０．１〜１％の濃度で、より好ましくは、０．２５％〜０．５％の濃度で３０分間添加される。
【００５６】
好都合なことに、これらの濃度範囲は、活性分子の一部をチャコールに吸収させることなく、抽出物の好ましくない悪臭を著しく減少させる。
【００５７】
次いで、濾液は、水、グリセリン、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化グリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物などの溶媒、例えば、３０％のグリセリンと０．５％の安息香酸ナトリウムで、乾物１ｋｇ当たり３ｇ／Ｋｇ〜１０ｇ／Ｋｇ、好ましくは５ｇ／Ｋｇの濃度で希釈される。
【００５８】
次いで、必要に応じて、希釈された活性薬剤が、無菌濾過によって、例えば、６５℃のオーブン内で一晩滅菌される。
【００５９】
本発明により得られた抽出物は、定性的および定量的に分析される。
【００６０】
特性は、以下の通りである。
−タンパク質：＜２ｇ／ｋｇ
−糖類：およそ１〜３ｇ／ｋｇ
−アミノ酸：１〜２ｇ／ｋｇ
−フェノール化合物：０．１〜０．３ｇ／Ｋｇ
【００６１】
薄層クロマトグラフィー分析は、本発明者等の最終抽出物が、トリュフ、より具体的には、トゥベル・メラノスポルムにおいて記述されたことに従う、予想されたアミノ酸を含むことを示した。
【００６２】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動法は、得られた抽出物が、５ｋＤａ未満の分子量を有するペプチドから構成されることを示した。
【００６３】
好都合には、制御された加水分解は、トリュフ子実体からの関心の分子へのアクセスを可能にする。本発明による抽出物は、関心の化合物が濃縮され、天然タンパク質および炭水化物の溶解から新たに形成された化合物が濃縮されたトリュフ抽出物である。
【００６４】
本発明による抽出物は、５ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を含む。本発明による抽出物の利点は、小化合物が、アレルゲン性作用を有することなく、より安定かつ再現可能であることである。
【００６５】
この希釈段階後に、活性薬剤は、リポソームまたは化粧品分野で使用される任意の他のマイクロカプセルなどの化粧品または医薬担体中に封入もしくは導入され得るか、あるいは、粉末状有機ポリマーまたはタルクおよびベントナイトなどの鉱物支持体上に吸着され得る。
【００６６】
本発明の第２の態様は、水抽出および制御された加水分解によって得られ、化合物が５ｋＤａ未満の分子量を有する、トリュフ抽出物を含む化粧用組成物である。
【００６７】
好ましい実施形態では、化粧用組成物は、トゥベル・メラノスポルム由来のトリュフ抽出物を含む。
【００６８】
本発明による組成物は、任意の適切な方法で、特に、経口、非経口または局所的に適用することができ、組成物の処方は、特に化粧用または皮膚科学用組成物のために、当業者によって適合されるであろう。本発明による組成物は、局所投与されるように好都合に設計される。したがって、これらの組成物は、生理学的に許容可能な媒体、すなわち、皮膚および表皮付属器官と適合性のある媒体を含有し、化粧用または皮膚科学用の全ての形態に及ぶものでなければならない。
【００６９】
本発明の有利な実施形態によると、本発明による活性薬剤は、有効量で、すなわち、最終組成物の全重量に対して約０．０００１％〜２０％の濃度で、好ましくは約０．００１％〜５％の濃度で、本発明の組成物中に存在する。
【００７０】
これらの組成物は、具体的には、水性、含水アルコールもしくは油性溶液、水中油型乳剤、油中水型乳剤、または多層乳剤の形態で存在することができ、これらはまた、皮膚、粘膜、唇および／または表皮付属器官への塗布に適合したクリーム、懸濁液、または更には粉剤の形態でも存在することができる。これらの組成物は、多少とも流動性でもよく、クリーム、ローション、ミルク、美容液、ポマード、ゲル、ペースト、またはムースの外観を有することができる。これらは、スティックとして固形形態で存在することも可能であり、エアロゾルとして皮膚に適用するステップもできる。これらは、スキンケア製品としておよび／またはメークアップ製品として使用することも可能である。
【００７１】
更に、本組成物は、適用の範囲において想定される任意の従来より使用されている添加剤ならびにそれらの処方に必要な添加剤、例えば、共溶媒（エタノール、グリセリン、ベンジルアルコール、ダンパーなど）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、酸化防止剤、着色剤、太陽光フィルター、顔料、充填剤、防腐剤、香料、臭い吸収剤、エッセンシャルオイル、オリゴエレメンツ、必須脂肪酸、界面活性剤、皮膜形成ポリマー、薬液用フィルターまたは鉱物、保湿剤または温泉水などを含む。水溶性の、好ましくは天然のポリマー、例えば、多糖類またはポリペプチド、メチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースのタイプのセルロース誘導体、もしくは更には合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡまたはＰＶＰ、特にＡｓｈｌａｎｄ社によって販売されるポリマーなどを挙げることができる。
【００７２】
いかなる場合も、当業者であれば、これらの添加剤およびそれらの比率が、本発明による組成物の所望の有利な特性に害を与えない方法で選択されることを確実にするであろう。これらの添加剤は、例えば、組成物の全重量の０．０１％〜２０％の濃度で存在することができる。本発明の組成物が乳剤であるとき、脂肪相は、組成物の全重量に対して５〜８０重量％、好ましくは４〜５０重量％を表す。本組成物で使用される乳化剤および共乳化剤は、関連分野で通常使用されているものから選択されるべきである。例えば、これらは、組成物の全重量に対して０．３〜３０重量％の比率で使用することができる。
【００７３】
本発明による活性薬剤は、単独で、または他の活性成分と併せて使用できることは十分に理解される。
【００７４】
更に、本発明により使用することができる組成物は、好都合には、少なくとも１つの他の活性薬剤を含有する。以下の種類の成分を、非限定的な方法で挙げることができる：他のペプチド活性薬剤、植物抽出物、治癒剤、老化防止剤、抗しわ剤、緩和剤、抗フリーラジカル剤、抗紫外線照射剤、皮膚の高分子合成またはエネルギー代謝を刺激するための薬剤、保湿剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、皮膚の分化、皮膚の色素沈着または色素脱失を調節する薬剤、ならびに爪または毛髪の成長を刺激する薬剤。
【００７５】
抗フリーラジカル剤または酸化防止剤、もしくは皮膚の高分子合成またはエネルギー代謝を刺激するための薬剤が使用されることが好ましい。
【００７６】
より具体的な実施形態では、本発明による組成物は、本発明によるトリュフ抽出物に加えて、下記を含むであろう：
−日焼け止め剤、紫外線および赤外線遮断薬
−抗フリーラジカル剤、
−ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、
−少なくとも１つのシトクロームｃ活性化化合物、および／または；
−１つ（またはそれ以上の）アクアポリン活性化化合物、および／または；
−１つ（またはそれ以上の）サーチュイン活性化化合物、および／または；
−１つ（またはそれ以上の）細胞接着を増加させる化合物、および／または；
−１つ（またはそれ以上の）コラーゲンまたはラミニン型のマトリックスタンパク質の産生を増加させる化合物など；
−１つ（またはそれ以上の）ＨＳＰタンパク質調節化合物；
−１つ（またはそれ以上の）細胞エネルギーを増加させる化合物；
−１つ（またはそれ以上の）色素沈着調節化合物、例えば、酵母、アマランス、亜麻仁、インゲンマメ、カカオ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、菜種、またはエンドウ豆ペプチド抽出物；
−１つ（またはそれ以上の）皮膚バリア機能を改善する化合物；
−１つ（またはそれ以上の）ミトコンドリア保護化合物。
−ビタミンＡ、とりわけ、レチノイン酸、レチノール、プロピオン酸レチノール、パルミチン酸レチノール、
−ビタミンＢ３、とりわけ、ナイシンアミド、トコフェロールのニコチン酸エステル、
−ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パンテノール、
−ビタミンＣ、とりわけ、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、アスコルビルテトラパルミテート、アスコルビルリン酸マグネシウムおよびナトリウム、
−ビタミンＥ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、ＰＰ、およびコエンザイムＱ１０、
−メタロプロテイナーゼ阻害物質、組織メタロプロテイナーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）の活性剤、
−アミノ酸、とりわけ、アルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリンジパルミテート、パルミトイルグリシン、ヒドロキシリシン、メチオニンおよびその誘導体、Ｎ−アシル化アミノ酸、
−ジ、トリ、テトラ、ペンタおよびヘキサペプチドを含む天然または合成ペプチド、ならびにそれらの親油性誘導体、異性体、および金属イオン（すなわち、銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム、およびその他）などの他の分子との錯体、商品名ＭＡＴＲＩＸＹＬ（登録商標）、ＡＲＧＩＲＥＬＩＮＥ（登録商標）、ＣＯＬＬＡＸＹＬ（商標）、ＰＥＰＴＩＤＥ  ＶＩＮＣＩ  ０２（商標）、ＣＨＲＯＮＯＧＥＮ（商標）、ＬＡＭＩＮＩＸＹＬ  ＩＳ（商標）、ＰＥＰＴＩＤＥ  Ｑ１０（商標）で販売されているペプチド、
−ダイズ抽出物、ヒトツブコムギ抽出物、アカブドウ（ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）抽出物、菜種抽出物、亜麻仁抽出物、コメ抽出物、トウモロコシ抽出物、エンドウ豆抽出物、イナゴマメ抽出物、インゲンマメ抽出物、ソラマメ抽出物などの、加水分解または任意の他の方法によって得られるペプチド性植物抽出物、
−酵母抽出物、ブラインシュリンプ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物、
−デヒドロ酢酸（ＤＨＡ）、
−天然または合成フィストステロール、
−αおよびβ−ヒドロキシ酸、シラノール誘導体、
−糖アミン、グルコサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、
−ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイド、例えば、ブドウ抽出物、パイン抽出物、オリーブ抽出物、
−セラミドまたはリン脂質などの脂質、
−スクアレンまたはスクアランなどの獣脂、
−植物油、例えば、アーモンド油、ココナッツ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、亜麻仁油、ピーナッツ油、ひまわり油、小麦胚芽油、トウモロコシ胚芽油、ダイズ油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、カボチャ種子油、月見草油、キビ油、大麦油、ライ麦油、ベニバナ油、トケイソウ油、ヘーゼルナッツ油、ヤシ油、杏仁油、アボカド油、キンセンカ油、エトキシル化植物油、またはシアバター。前述の化合物は、植物のペプチド加水分解物などの天然物でもよく、またはペプチド化合物などの合成物質でもよい。
【００７７】
本発明の第３の態様は、皮膚および角質付属器官の老化および光老化の徴候を低減するおよび／または直すための美容方法であり、方法は、本発明によるトリュフ抽出物を含む組成物を、皮膚、粘膜および／または皮膚付属器官に局所的に適用するステップを含む。
【００７８】
「老化および光老化の皮膚の徴候」とは、例えば、皮膚の菲薄化、たるみ、保湿性および弛緩の喪失、深いしわおよび小じわ、はりおよび色合いの喪失、皮膚萎縮または紫外線照射への暴露から生じる皮膚の任意の他の内部劣化、肝斑および年齢によるシミなどの、年齢による皮膚および皮膚付属器官の外観における全ての変化を指す。
【００７９】
本発明の第４の目的は、紫外線照射による攻撃から皮膚を保護するように設計された美容方法であり、本発明によるトリュフ抽出物を含む化粧用組成物が、処置される皮膚に局所的に塗布される。
【００８０】
本発明の第５の目的は、皮膚細胞におけるＡＴＰレベルを増大させるように設計された美容方法であり、本発明によるトリュフ抽出物を含む化粧用組成物が、処置される皮膚に局所的に塗布される。
【００８１】
本発明の第６の目的は、皮膚細胞におけるＲＯＳレベルを低減するように設計された美容方法であり、本発明によるトリュフ抽出物を含む化粧用組成物が、処置される皮膚に局所的に塗布される。
【００８２】
この美容方法に特有である実施形態もまた、上記説明から結果として生じる。
【００８３】
本発明の更なる利点および特性は、示した例示的で非限定的な実施例を読むことによって、より詳細に認識することができる。
【実施例】
【００８４】
［実施例１  トリュフ抽出物（トゥベル・メラノスポルム）の調製］
１００ｇの黒トリュフ（トゥベル・メラノスポルム）を、１リットルの水中で粉砕する。４％のＶＩＳＣＯＳＹＭ（登録商標）を、この混合物中に添加し、溶液を５０℃で２時間加熱する。ＶＩＳＣＯＳＹＭ（登録商標）は、アラバナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、およびキシラナーゼを含む広範囲のカルボキシラーゼを含有する多酵素複合体である。次いで、２％のブロメラインを溶液に添加し、混合物を５０〜５５℃で２時間加熱する。その後、この溶液を８０℃に２時間加熱することによって、酵素を不活性化させる。
【００８５】
遠心分離後、上清を、気孔率が減少する順の各フィルターで濾過する。精製プロセスは、透明で澄んだ溶液を得るように、気孔率（最大０．２μｍ）が減少する順の各Ｓｅｉｔｚ−Ｏｒｉｏｎフィルターを用いる連続的濾過によって開始する。
【００８６】
清澄化の後に、濾液を６５℃で一晩加熱し、次いでチャコール（ＳＸ  ｐｌｕｓ−０．２５％）を室温で３０分間添加し、悪臭を除去する。次いで、濾液を３０％のグリセリンおよび０．５％の安息香酸ナトリウムで希釈して、６ｇ／Ｋｇ乾物を有する抽出物を得る。
【００８７】
次に、クロスフロー濾過を用いて酵素および高分子量タンパク質を除去することによって、この溶液を精製する。
【００８８】
トリュフ抽出物を、標準手法を用いて分析した。得られたトリュフ抽出物の特性は以下の通りである。乾物１ｋｇ当たり６ｇ／ｋｇ、タンパク質：＜１ｇ／ｋｇ、糖類：２ｇ／ｋｇ、アミノ酸：１．４ｇ／ｋｇ、フェノール化合物：０．１〜０．３ｇ／ｋｇである。
【００８９】
抽出物のタンパク質の分子量を評価するために、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｅ−ｃａｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を行った。トリュフ抽出物を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液中で、還元変性条件下において、７０℃に１０分間加熱する。還元されたタンパク質が、電気泳動中に再酸化しないように、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤溶液を、内部チャンバ（陰極）に添加する。分子量のためのマーカーとして標準ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２と共に、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ泳動緩衝液を用いてタンパク質移動を行う。タンパク質染色を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０を用いて行う。
【００９０】
得られた抽出物は、３．５ｋＤａ未満の分子量を有するペプチドから構成される。
【００９１】
［実施例２  トリュフ抽出物（トゥベル・メラノスポルム）の調製］
１００ｇの黒トリュフ（トゥベル・メラノスポルム）を、１リットルの水中で粉砕する。４％のＧＬＵＣＡＮＥＸ（登録商標）を、この混合物中に添加し、溶液を５０℃で２時間加熱する。ＧＬＵＣＡＮＥＸ（登録商標）は、酵母（トリコデルマ・ハルジアナム）から抽出されたβグルカナーゼである、次いで、２％のブロメラインを溶液に添加し、混合物を５０〜５５℃で２時間加熱する。遠心分離後、上清を、気孔率が減少する順の各フィルターで濾過する。
【００９２】
清澄化の後に、濾液を６５℃で一晩加熱し、次いでチャコール（ＳＸ  ｐｌｕｓ−０．２５％）を室温で３０分間添加し、悪臭を除去する。次いで、濾液を３０％のグリセリンおよび０．５％の安息香酸ナトリウムで希釈して、８ｇ／Ｋｇ乾物を有する抽出物を得る。
【００９３】
次に、クロスフロー濾過を用いて酵素および高分子量タンパク質を除去することによって、この溶液を精製する。
【００９４】
次の段階は、水−グリセリン混合物中での希釈相である。その後、希釈された活性薬剤を、無菌濾過によって滅菌する。
【００９５】
トリュフ抽出物を、標準手法を用いて分析した。得られたトリュフ抽出物の特性は以下の通りである。乾物１ｋｇ当たり８ｇ／ｋｇ、タンパク質：＜１ｇ／ｋｇ、糖類：６．９ｇ／ｋｇ、アミノ酸：１．４ｇ／ｋｇである。
【００９６】
抽出物のタンパク質の分子量を評価するために、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｅ−ｃａｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を行った。トリュフ抽出物を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液中で、還元変性条件下において、７０℃に１０分間加熱する。還元されたタンパク質が、電気泳動中に再酸化しないように、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤溶液を、内部チャンバ（陰極）に添加する。分子量のためのマーカーとして標準ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２と共に、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ泳動緩衝液を用いてタンパク質移動を行う。タンパク質染色を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０を用いて行う。
【００９７】
得られた抽出物は、３．５ｋＤａ未満の分子量を有するペプチドから構成される。
【００９８】
［実施例３  実施例１によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種産生に及ぼす効果］
本試験の目的は、実施例１によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）産生に関する影響を判定することである。
【００９９】
方法：５２歳の欧州人女性の腹部皮膚から抽出した正常なヒト角質細胞を、８ウェル培養ＰＥＲＭＡＮＯＸ（登録商標）プラスチックスライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中に播種した。細胞を、５０μｇ／ｍｌウシ脳下垂体抽出物（Ｇｉｂｃｏ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１ｍｇ／ｍｌのＰＲＩＭＯＣＩＮ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で補充された、実施例１によるトリュフ抽出物の１日当たり２回の適用（それぞれ、ＫＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）中、０．０１％および０．０５％で４８時間）で前処理した。培養基を新しいＫＳＦＭで１時間かけて交換した。インキュベーションの終わりに、５μＭのＭＩＴＯＳＯＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）溶液を、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて更に２０分間インキュベートした。細胞をハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）中で３回洗浄し、ホルムアルデヒド３．７％（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で２０分間固定化させ、その後、０．３μＭのＤＡＰＩ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分間染色することによって、核を出現させた。２０倍の対物レンズを備えた倒立型Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、デジタル画像を取得した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙ取得ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結したＱｉｍａｇｉｎｇ  ＥＸＩブルーカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）で写真を撮影した。全ての値を、平均値±ＳＥＭとして表す。データの統計的有意性を、対応スチューデントのｔ検定により評価した（ｎ＝３、ｐ≦０．０５を有意と見なし、ｐ≦０．０１を非常に有意と見なし、かつｐ≦０．００５を高度に有意と見なした）。
【０１００】
結果：図１により示されるように、未処置の角質細胞と比べて、実施例１による０．０１％のトリュフ抽出物で処置された角質細胞中でＲＯＳ産生の２３％の減少を、未処置角質細胞と比べて、実施例１による０．０５％のトリュフ抽出物で処置された角質細胞中でＲＯＳ酸性の高度に有意な６６％の減少を観察した。
【０１０１】
結論：実施例１によるトリュフ抽出物は、皮膚においてミトコンドリアＲＯＳレベルを減少させる。
【０１０２】
［実施例４  実施例２によるトリュフ抽出物のロテノン誘発ＲＯＳ産生後のミトコンドリア活性酸素種の産生に及ぼす効果］
本試験の目的は、実施例２によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）産生に関する影響を判定することである。ミトコンドリアＲＯＳを、ロテノン、すなわち、電子伝達系複合体阻害物質によって誘発させた。
【０１０３】
方法：５２歳の欧州人女性の腹部皮膚から抽出した正常なヒト角質細胞を、８ウェル培養ＰＥＲＭＡＮＯＸ（登録商標）プラスチックスライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中に播種した。細胞を、５０μｇ／ｍｌウシ脳下垂体抽出物（Ｇｉｂｃｏ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１ｍｇ／ｍｌのＰＲＩＭＯＣＩＮ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で補充されたＫＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）中、実施例２のトリュフ抽出物の１日当たり２回の適用（０．０１％および０．０５％で）４８時間前処理した。次いで、細胞を、４時間にわたって１μＭのロテノン適用に供した。ストレス直後に、培養基を新しいＫＳＦＭで１時間かけて交換した。インキュベーションの終わりに、５μＭのＭＩＴＯＳＯＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）溶液を、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて更に２０分間インキュベートした。細胞をハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）中で３回洗浄し、ホルムアルデヒド３．７％（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で２０分間固定化させ、その後、０．３μＭのＤＡＰＩ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分間染色することによって、核を出現させた。２０倍の対物レンズを備えた倒立型Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、デジタル画像を取得した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙ取得ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結したＱｉｍａｇｉｎｇ  ＥＸＩブルーカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）で写真を撮影した。全ての値を、平均値±ＳＥＭとして表す。データの統計的有意性を、対応スチューデントのｔ検定により評価した（ｎ＝３、ｐ≦０．０５を有意と見なし、ｐ≦０．０１を非常に有意と見なし、かつｐ≦０．００５を高度に有意と見なした）。
【０１０４】
結果：図２に結果を示す。初めに、ロテノン処置が、未処置の比較対照と比べて、角質細胞中のＲＯＳ産生において４５％の増加を生じることを観察した。
【０１０５】
ロテノン処置後、実施例２による０．０１％および０．０５％のトリュフ抽出物によって処置された角質細胞中のＲＯＳ産生の増加が、トリュフ抽出物で処置されずかつロテノンで処置された角質細胞と比べて、それぞれ２７％および４２％低いことを観察した。
【０１０６】
結論：実施例１によるトリュフ抽出物は、ロテノン誘発ＲＯＳのミトコンドリア産生から皮膚を効果的に保護する。
【０１０７】
［実施例５  実施例１によるトリュフ抽出物の紫外線Ｂ誘発ＲＯＳ産生後のミトコンドリア活性酸素種産生に及ぼす効果］
本試験の目的は、実施例１によるトリュフ抽出物のミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）産生に関する影響を判定することである。
【０１０８】
方法：５２歳の欧州人女性の腹部皮膚から抽出した正常なヒト角質細胞を、８ウェル培養ＰＥＲＭＡＮＯＸ（登録商標）プラスチックスライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中に播種した。細胞を、５０μｇ／ｍｌウシ脳下垂体抽出物（Ｇｉｂｃｏ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１ｍｇ／ｍｌのＰＲＩＭＯＣＩＮ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で補充されたＫＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）中、トリュフ抽出物の１日当たり２回の適用（それぞれ、０．０１％および０．０５％で）４８時間前処理した。次いで、細胞を、４時間にわたって７５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢの適用に供した。ストレス直後に、培養基を新しいＫＳＦＭで１時間かけて交換した。インキュベーションの終わりに、５μＭのＭＩＴＯＳＯＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）溶液を、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて更に２０分間インキュベートした。細胞をハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）中で３回洗浄し、ホルムアルデヒド３．７％（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で２０分間固定化させ、その後、０．３μＭのＤＡＰＩ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分間染色することによって、核を出現させた。２０倍の対物レンズを備えた倒立型Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、デジタル画像を取得した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙ取得ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結したＱｉｍａｇｉｎｇ  ＥＸＩブルーカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）で写真を撮影した。全ての値を、平均値±ＳＥＭとして表す。データの統計的有意性を、対応スチューデントのｔ検定により評価した（ｎ＝３、ｐ≦０．０５を有意と見なし、ｐ≦０．０１を非常に有意と見なし、かつｐ≦０．００５を高度に有意と見なした）。
【０１０９】
結果：図３に結果を示す。初めに、紫外線Ｂ照射誘発ストレスが、未処置の比較対照と比べて、角質細胞中のＲＯＳ産生において１８％の増加を生じることを観察した。
【０１１０】
ロテノン処置後、実施例２による０．０１％および０．０５％のトリュフ抽出物によって処置された角質細胞中のＲＯＳ産生の増加が、トリュフ抽出物で処置されずかつ紫外線Ｂ照射された角質細胞と比べて、２９％および６４％低いことを観察した。
【０１１１】
結論：実施例１によるトリュフ抽出物は、紫外線Ｂ誘発ＲＯＳのミトコンドリア産生から皮膚を効果的に保護する。
【０１１２】
［実施例６  実施例１によるトリュフ抽出物の繊維芽細胞中のＡＴＰレベルに及ぼす効果］
本試験の目的は、アデノシン三リン酸（またはＡＴＰ）の細胞内レベルに関する、実施例１によるトリュフ抽出物の影響を判定することである。
【０１１３】
方法：６２歳のドナーからの正常なヒト線維芽細胞を、実施例１によるトリュフ抽出物で、０．００１％にて２４時間にわたって処置し、紫外線Ａ（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射し、次いで、実施例１によるトリュフ抽出物の同一濃度の存在下で、２４時間再度培養する。未処置および非照射の比較対照も同一条件下で行う。
【０１１４】
ＡＴＰアッセイキットは、ホタル（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼに基づくアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）モニタリングシステムである。このアッセイを用いて、培養中で細胞ＡＴＰの総レベルを決定する。このＡＴＰアッセイは、ＡＴＰと添加されたルシフェラーゼおよびＤ−ルシフェリンとの反応によって発生する光の生成に基づいている。発光は、細胞内部のＡＴＰ濃度に比例する。
【０１１５】
ＡＴＰアッセイキットの凍結乾燥基質溶液を、５ｍｌの基質緩衝溶液中で再溶解することによって基質溶液を調製する。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５０μｌの細胞溶解溶液を各ウェルに添加し、プレートを撹拌器上に５分間配置する。各ウェルから２０μｌを取り出し、２０μｌのＭＩＣＲＯ  ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイ希釈基準溶液をそれぞれ含有する９６ウェルプレート中に配置する。５０μｌの基質溶液を各ウェルに添加する。プレートを撹拌器上に５分間配置する。発光を照度計で測定する。
【０１１６】
結果：図４に結果を示す。未処置の線維芽細胞と比べて、実施例１による０．００１％のトリュフ抽出物で処置されかつ紫外線Ａで照射された線維芽細胞中のＡＴＰレベルの９％の増加を観察した。
【０１１７】
結論：実施例１によるトリュフ抽出物は、紫外線Ａストレスに曝された皮膚細胞におけるＡＴＰレベルを効果的に増加させる。
【０１１８】
［実施例７  実施例１によるトリュフ抽出物の線維芽細胞生存率に及ぼす効果］
本試験の目的は、紫外線Ａ照射によるストレスに曝された正常なヒト線維芽細胞に関して実施例１によるトリュフ抽出物の保護効果を判定することである。
【０１１９】
この目的のために、細胞生存率試験を、アラマーブルー生存率アッセイにより行った。
【０１２０】
方法：６２歳のドナーからの正常なヒト線維芽細胞を、実施例１によるトリュフ抽出物で、０．００１％にて２４時間にわたって処置し、紫外線Ａ（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射し、次いで、実施例１によるトリュフ抽出物の同一濃度の存在下で、２４時間再度培養する。
【０１２１】
未処置および非照射の比較対照も同一条件下で行う。実験の終わりに、細胞を、１０％のＡＬＡＭＡＲＶＢＬＵＥ（登録商標）を含有する溶液２００μｌ中でインキュベーションし、次いでインキュベータ内で２時間インキュベーションして、蛍光プレートリーダー上で、５３０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光で蛍光を読み取る。
【０１２２】
ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）試薬の活性成分であるレサズリンは、青色で実質的に非蛍光性である、無毒の細胞透過性化合物である。細胞に進入する際に、レサズリンは、レソルフィンに還元され、レソルフィンは赤色で高蛍光性である化合物である。生存細胞は、レサズリンをレソルフィンに連続的に変換し、細胞を包囲する培地の全体の蛍光および色を増加させる。この場合、蛍光強度は、ミトコンドリア酵素活性ならびに生細胞の数に正比例する。
【０１２３】
結果：図５に結果を示す。アラマーブルー生存率アッセイによる細胞生存率の評価は、実施例１によるトリュフ抽出物が、紫外線Ａ照射後に細胞生存率を１０％まで増加させることを示す。
【０１２４】
結論：実施例１によるトリュフ抽出物は、０．００１％において、細胞生存率を増加させ、皮膚細胞を紫外線Ａ照射の細胞毒性作用から効果的に保護する。
【０１２５】
［実施例８  組成物の調製］
【０１２６】
【表１】
2017520630.tif 000003
【０１２７】
動作モード：
脂肪相の成分を秤量し、撹拌下で７０℃に加熱する。相Ｂを調製し、７０℃に加熱する。相Ａを乳化して相Ｂにする。相Ｃを、撹拌下で約５０℃にて添加する。活性薬剤を４０℃以下で添加する（相Ｄ）。香料を添加し、室温に冷却する。
【０１２８】
【表２】
2017520630.tif 000004
【０１２９】
相Ａおよび相Ｂの構成成分を、別々に７０℃〜７５℃に加熱する。相Ｂを、撹拌下にて相Ａ中で乳化する。相Ｃを、撹拌を増大させながら、４５℃で添加する。次いで、温度が４０℃以下になったときに、相Ｄを添加する。激しく撹拌しながら、２５℃になるまで冷却を続ける。
【０１３０】
【表３】
2017520630.tif 000005
【０１３１】
相Ａを６５〜７０℃で調製し、溶解する。相Ｃを６５〜７０℃に加熱する。ＡＢをＣに尿化する直前に、相Ｂを相Ａに添加する。およそ４５℃で、相Ｄを添加することによって、カルボマーを中和する。次いでＥを、穏やかに撹拌しながら添加し、冷却を２５℃になるまで続ける。次いで、所望の場合、相Ｆを添加する。
【０１３２】
【表４】
2017520630.tif 000006
【０１３３】
相Ａを調製し、撹拌下で７５℃に加熱する。撹拌下でカルボポール、その後キサンタンガムを分散させることによって、相Ｂを調製する。放置させる。７５℃に加熱する。
【０１３４】
７５℃において、ロータースターター撹拌下で、Ａを乳化してＢにする。６０℃において、急速撹拌下で、相Ｃを中和する。４０℃に冷却後に、相Ｄ、続いて相Ｅを添加する（両者共に均一化され、その後透明になる）。穏やかに撹拌しながら冷却を続け、相Ｆを添加する。
【図１】
2017520630.tif 000007
【図２】
2017520630.tif 000008
【図３】
2017520630.tif 000009
【図４】
2017520630.tif 000010
【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月7日(2017.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を含む、化粧用途のためのトリュフ水性抽出物であって、トゥベル・メラノスポルムの子実体から得られる、トリュフ抽出物。
【請求項２】
水抽出と、カルボヒドラーゼおよびプロテアーゼの中から選択される酵素を用いて実施される酵素加水分解とによって得られ、酵素加水分解後に、酵素不活性化ステップが行われる、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項３】
水、グリセリン、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化グリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物から選択される溶媒中で希釈される、請求項１に記載のトリュフ抽出物。
【請求項４】
請求項２に記載のトリュフ抽出物と、生理学的に許容可能な媒体とを含む、化粧用組成物。
【請求項５】
前記トリュフ抽出物が、前記組成物の全重量の約０．０００１重量％〜約２０重量％の濃度で使用される、請求項４に記載の化粧用組成物。
【請求項６】
前記トリュフ抽出物が、前記組成物の全重量の約０．０００５重量％〜約５重量％の濃度で使用される、請求項５に記載の化粧用組成物。
【請求項７】
局所塗布に適合した形態である、請求項４に記載の化粧用組成物。
【請求項８】
ゲル、クリーム、バルム、ミルク、または気泡製品の形態である、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの他の活性薬剤を更に含む、請求項４に記載の化粧用組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの他の活性薬剤が、酸化防止剤、植物の加水分解物、合成ペプチド化合物、日焼け止め剤、抗しわ剤から選択される、請求項９に記載の化粧用組成物。
【請求項１１】
皮膚および角質付属器官の老化および光老化の徴候を低減および／または修正するための方法であって、請求項４に記載の化粧用組成物を、皮膚、粘膜および／または表層付属器官に局所的に適用するステップを含む、方法。
【請求項１２】
皮膚を紫外線照射による攻撃から保護するための請求項１１に記載の方法であって、処置される皮膚に前記化粧用組成物を局所的に適用するステップを含む方法。
【請求項１３】
皮膚細胞におけるＡＴＰレベルを増大させるための請求項１１に記載の方法であって、処置される皮膚に前記化粧用組成物を局所的に適用するステップを含む方法。
【請求項１４】
皮膚細胞における活性酸素種レベルを低減するための請求項１１に記載の方法であって、処置される皮膚に前記化粧用組成物を局所的に適用するステップを含む方法。
【国際調査報告】
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