(57)【要約】本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに特異的に結合する抗体を提供する。本抗体は、ラミニンα４とＭＣＡＭとの結合を阻害する能力を有する。本抗体は、その他の用途の中でも、望ましくない免疫応答の阻害、癌の処置、または肥満症若しくは肥満関連疾患の処置に使用され得る。【選択図】図７Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内のエピトープに特異的に結合し、ラミニンα４とＭＣＡＭとの結合を阻害する抗体。
【請求項２】
ＬＧ１内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＬＧ２内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＬＧ３内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ＬＧ１及びＬＧ２の両方が残基を提供するエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ＬＧ２及びＬＧ３の両方が残基を提供するエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＬＧ１及びＬＧ３の両方が残基を提供するエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＬＧ１、ＬＧ２、及びＬＧ３のすべてが残基を提供するエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ラミニンα４とインテグリンとの結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記インテグリンがインテグリンα６β１である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１５の成熟重鎖可変領域及び配列番号１６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１９Ｃ１２と競合するか、または配列番号２５の成熟重鎖可変領域及び配列番号２６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１Ｃ１と競合するか、または配列番号３５若しくは３６の成熟重鎖可変領域及び配列番号３７の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ａ１２と競合するか、または配列番号５０の成熟重鎖可変領域及び配列番号５１の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ｂ５と競合するか、または配列番号６０若しくは６１の成熟重鎖可変領域及び配列番号６２の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１２Ｄ３と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３とラミニンα４上の同じエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含み、各ＣＤＲが、１９Ｃ１２の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号：１５及び１６）、１Ｃ１の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２５及び２６）、５Ａ１２の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号３５／３６及び３７）、５Ｂ５の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号５０及び５１）、または１２Ｄ３の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号６０／６１及び６２）由来の対応するＣＤＲと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１〜１４または７５〜７６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
キメラ、ヒト化、ベニア化、またはヒト抗体である、請求項１〜１５または７５〜７６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
ヒトＩｇＧ１カッパアイソタイプを有する、請求項１〜１６または７５〜７６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
ラミニンα４に特異的に結合するヒト化またはキメラ１９Ｃ１２抗体であって、１９Ｃ１２が、配列番号１５の成熟重鎖可変領域及び配列番号１６の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である、前記抗体。
【請求項１９】
前記１９Ｃ１２重鎖可変領域（配列番号１５）の３つのＣＤＲを含むヒト化重鎖及び前記１９Ｃ１２軽鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む、請求項１８に記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
配列番号８１または配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域及び配列番号８５または配列番号８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域を含む、請求項１８に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
前記１９Ｃ１２重鎖可変領域（配列番号１５）の３つのＣＤＲ及び前記１９Ｃ１２軽鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含む、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
位置Ｌ９、Ｌ２２、及びＬ８５のうち少なくとも１つが、それぞれＡ、Ｓ、及びＴによって占有され、位置Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ４８、Ｈ９１、及びＨ１０８のうち少なくとも１つが、それぞれＬ、Ｖ、Ａ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｆ、及びＴによって占有される、請求項２１に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
位置Ｌ９、Ｌ２２、及びＬ８５が、それぞれＡ、Ｓ、及びＴによって占有され、位置Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ４８、Ｈ９１、及びＨ１０８が、それぞれＬ、Ｖ、Ａ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｆ、及びＴによって占有される、請求項２２に記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
位置Ｌ１、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００のうち少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２５】
位置Ｈ１、Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４３、及びＨ６９のうち少なくとも１つが、それぞれＥ、Ｉ、Ｋ、Ｅ、及びＬによって占有される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２６】
位置Ｌ１、Ｌ４９、及びＬ６８が、それぞれＮ、Ｃ、及びＲによって占有される、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項２７】
位置Ｌ１がＮによって占有される、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項２８】
位置Ｌ１、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００が、それぞれＮ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項２９】
位置Ｌ１、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００が、それぞれＮ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項３０】
位置Ｌ７７がＰによって占有される、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項３１】
位置Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００が、それぞれＰ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項３２】
位置Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４３、及びＨ６９が、それぞれＩ、Ｋ、Ｅ、及びＬによって占有される、請求項２５に記載のヒト化抗体。
【請求項３３】
位置Ｈ１がＥによって占有される、請求項２５に記載のヒト化抗体。
【請求項３４】
配列番号８１または配列番号８２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び配列番号８５または配列番号８８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項３５】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号８１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号８５のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項３６】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号８１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号８６のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項３７】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号８１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号８８のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項３８】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号８２のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号８８のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項３９】
完全抗体である、請求項１〜３８または７５〜７６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】
単鎖抗体、Ｆａｂ、またはＦａｂ’２断片である、請求項１〜３８または７５〜７６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】
前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合され、前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合される、請求項１８〜３９のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項４２】
前記重鎖定常領域が天然ヒト重鎖定常領域の変異形態であって、前記天然ヒト重鎖定常領域と比較して、Ｆｃγ受容体との結合が低下した変異形態である、請求項４１に記載のヒト化抗体。
【請求項４３】
前記重鎖定常領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項４１または４２に記載のヒト化抗体。
【請求項４４】
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号８９の配列を有する重鎖定常領域に融合され、かつ／または前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号９０の配列を有する軽鎖定常領域に融合される、請求項４１に記載のヒト化抗体。
【請求項４５】
配列番号１５及び１６からの前記成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける任意の差異がそれぞれ、位置Ｈ６０〜Ｈ６５に存在する、請求項１８〜４４または７７のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項４６】
請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４７】
請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載されるような抗体の前記重鎖及び／または軽鎖（複数可）をコードする、核酸。
【請求項４８】
配列番号９１〜９２、９５〜９６、９９〜１０１、１０５〜１０６、１０９〜１１１、または１１５〜１２３のいずれか１つを含む配列を有する、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４９】
請求項４７、４８、または７８のいずれか１項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４９に記載の組換え発現ベクターで形質転換される、宿主細胞。
【請求項５１】
抗体のヒト化方法であって、
（ａ）マウス抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を決定することと、
（ｂ）前記マウス抗体重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸及び前記マウス抗体軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、
（ｃ）宿主細胞中で前記核酸を発現させて、ヒト化抗体を産生することと、を含み、
前記マウス抗体が１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３である、前記方法。
【請求項５２】
ヒト化、キメラ、またはベニア化抗体の産生方法であって、
（ａ）前記抗体の前記重鎖及び軽鎖をコードする核酸で形質転換した細胞を培養し、これにより前記細胞に前記抗体を分泌させることと、
（ｂ）細胞培養培地から前記抗体を精製することと、を含み、
前記抗体が１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３のヒト化、キメラ、またはベニア化形態である、前記方法。
【請求項５３】
ヒト化、キメラ、またはベニア化抗体を産生する細胞株の作製方法であって、
（ａ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターならびに選択可能マーカーを細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクターのコピー数が増加した細胞を選択する条件下で前記細胞を増殖させることと、
（ｃ）前記選択した細胞から単一細胞を単離することと、
（ｄ）抗体の収率に基づいて選択した単一細胞からクローニングした細胞を保存することを含み、
前記抗体が１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３のヒト化、キメラ、またはベニア化形態である、前記方法。
【請求項５４】
選択的条件下で前記細胞を増殖させることと、天然に発現し、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間を分泌する細胞株をスクリーニングすることと、を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
患者の望ましくない免疫応答の抑制方法であって、請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体を効果的なレジームで前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
前記望ましくない免疫応答が、ＭＣＡＭ発現細胞の炎症部位への浸潤を特徴とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＭＣＡＭ発現細胞がＴＨ１７細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記望ましくない免疫応答が自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記疾患が、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、スティフマン症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、セリアック病、乾癬、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、またはブドウ膜炎である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記望ましくない免疫応答が移植片対宿主病である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記望ましくない免疫応答が移植片拒絶である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記望ましくない免疫応答が、アレルギー、アレルギー応答、またはアレルギー性疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記アレルギー、アレルギー応答、またはアレルギー性疾患が、アレルギー性接触皮膚炎である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記アレルギー、アレルギー応答、またはアレルギー性疾患が喘息である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
癌を有するまたは癌の危険性がある患者における前記癌の処置方法または前記癌の予防方法であって、請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体を効果的レジームで前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項６６】
前記癌が、黒色腫、神経膠腫、膠芽腫、肺癌、または乳癌である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記癌が転移性である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
生体サンプルにおけるラミニンα４とＭＣＡＭとの結合の阻害方法であって、前記生体サンプルを、有効量の請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項６９】
生体サンプルにおけるラミニンα４とインテグリンα６β１との結合の阻害方法であって、前記生体サンプルを、有効量の請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項７０】
生体サンプルにおける細胞接着の阻害方法であって、前記生体サンプルを、有効量の請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項７１】
前記細胞接着が、前記ラミニンα４のＧドメインの前記ＬＧ１〜３モジュールにより媒介される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記生体サンプルが癌細胞を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
患者の血管新生の阻害方法であって、請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体を効果的レジームで前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項７４】
前記患者が癌を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
配列番号１５の成熟重鎖可変領域及び配列番号１６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１９Ｃ１２と競合するか、または配列番号２５若しくは１４１の成熟重鎖可変領域及び配列番号２６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１Ｃ１と競合するか、または配列番号３５の成熟重鎖可変領域及び配列番号３７の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ａ１２と競合するか、または配列番号５０の成熟重鎖可変領域及び配列番号５１の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ｂ５と競合するか、または配列番号６０若しくは６１の成熟重鎖可変領域及び配列番号６２の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１２Ｄ３と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７６】
３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含む抗体を含み、各ＣＤＲが、１９Ｃ１２の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１５及び１６）、１Ｃ１の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２５／１４１及び２６）、５Ａ１２の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号３５及び３７）、５Ｂ５の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号５０及び５１）、または１２Ｄ３の前記重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号６０／６１及び６２）由来の対応するＣＤＲと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７７】
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号８９、１３８、若しくは１５０の配列を有する重鎖定常領域に融合される、かつ／または前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号９０若しくは１３９の配列を有する軽鎖定常領域に融合される、請求項４１に記載のヒト化抗体。
【請求項７８】
配列番号９１〜９２、９５〜９６、９９、１０１、１０５〜１０６、１０９〜１１１、１１５〜１２３、１４６、１４８、１４９、または１５１のいずれか１つを含む配列を有する、請求項４６に記載の核酸。
【請求項７９】
肥満症または肥満関連疾患を有するまたはその危険性がある患者における前記肥満症または肥満関連疾患の処置方法またはその予防方法であって、請求項１〜４５または７５〜７７のいずれか１項に記載の前記抗体を効果的レジームで前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項８０】
前記肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、プラダー・ウィリー症候群、頭蓋咽頭腫、バルデー・ビードル症候群、コーエン症候群、またはＭＯＭＯ症候群である、請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１２日出願の米国出願第６１／９５２，１２９号、２０１４年７月１１日出願の米国出願第６２／０２３，７５３号、２０１４年１０月２４日出願の米国出願第６２／０６８，２８６号、及び２０１４年１２月２日出願の米国出願第６２／０８６，６００号の利益を主張し、その各々の内容全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
ファイル４５９０１３ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ内に記載された配列表は１９９キロバイトで、２０１５年３月５日に作成されたものであり、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ＴＨ１７細胞（Ｔヘルパー１７細胞）と称されるＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットは、多数の望ましくない免疫応答及び自己免疫疾患、特にＴ細胞のＣＮＳ浸潤を伴う神経炎症状態、例えばヒトでの多発性硬化症及びマウスでの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などの病因に関与してきた。例えば、Ｃｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７４４−７４８（２００３）；Ｉｖｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２６：１１２１−１１３３（２００６）を参照のこと。ＴＨ１７細胞は、ＩＬ−１７及びＩＬ−２２を含む多数の選択的サイトカインを分泌し、組織において特異的に動員され、浸潤すると報告されている。
【０００４】
ＭＣＡＭは、ＴＨ１７細胞上に発現し、リガンドのラミニンα４に結合すると報告されている（ＷＯ２０１２１７００７１）。ＭＣＡＭに対する抗体は、ＥＡＥの疾患進行を阻害すると報告されている。Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（７）：ｅ４０４４３（２０１２）を参照のこと。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内のエピトープに特異的に結合し、ラミニンα４とＭＣＡＭとの結合を阻害する抗体を提供する。いくつかの抗体は、ＬＧ１内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、ＬＧ２内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、ＬＧ３内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、ＬＧ１及びＬＧ２の両方が残基を提供するエピトープに結合するか、またはＬＧ２及びＬＧ３の両方が残基を提供するエピトープに結合するか、またはＬＧ１及びＬＧ３の両方が残基を提供するエピトープに結合するか、またはＬＧ１、ＬＧ２、及びＬＧ３のすべてが残基を提供するエピトープに結合する。いくつかの抗体は、ラミニンα４とインテグリン、例えばα６β１などとの結合を阻害する。
【０００６】
いくつかの抗体は、配列番号１５の成熟重鎖可変領域及び配列番号１６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１９Ｃ１２と競合するか、または配列番号２５の成熟重鎖可変領域及び配列番号２６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１Ｃ１と競合するか、または配列番号３５若しくは３６の成熟重鎖可変領域及び配列番号３７の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ａ１２と競合するか、または配列番号５０の成熟重鎖可変領域及び配列番号５１の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ｂ５と競合するか、または配列番号６０若しくは６１の成熟重鎖可変領域及び配列番号６２の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１２Ｄ３と競合する。いくつかの抗体は、配列番号１５の成熟重鎖可変領域及び配列番号１６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１９Ｃ１２と競合するか、または配列番号２５若しくは１４１の成熟重鎖可変領域及び配列番号２６の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１Ｃ１と競合するか、または配列番号３５の成熟重鎖可変領域及び配列番号３７の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ａ１２と競合するか、または配列番号５０の成熟重鎖可変領域及び配列番号５１の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体５Ｂ５と競合するか、または配列番号６０若しくは６１の成熟重鎖可変領域及び配列番号６２の成熟軽鎖可変領域を特徴とする抗体１２Ｄ３と競合する。いくつかの抗体は、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３とラミニンα４上の同じエピトープに結合する。いくつかの抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含み、各ＣＤＲは、１９Ｃ１２の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１５及び１６）、１Ｃ１の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２５及び２６）、５Ａ１２の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号３５／３６及び３７）、５Ｂ５の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号５０及び５１）、または１２Ｄ３の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号６０／６１及び６２）由来の対応するＣＤＲと少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含み、各ＣＤＲは、１９Ｃ１２の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１５及び１６）、１Ｃ１の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２５／１４１及び２６）、５Ａ１２の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号３５及び３７）、５Ｂ５の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号５０及び５１）、または１２Ｄ３の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号６０／６１及び６２）由来の対応するＣＤＲと少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの抗体は、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０００７】
上記抗体のいずれも、モノクローナル抗体であり得る。いずれも、キメラ、ヒト化、ベニア化、またはヒト抗体であり得る。いずれも、ヒトＩｇＧ１カッパアイソタイプを有し得る。
【０００８】
本発明は更に、ラミニンα４に特異的に結合するヒト化またはキメラ１９Ｃ１２抗体を提供し、１９Ｃ１２は、配列番号１５の成熟重鎖可変領域及び配列番号１６の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である。場合により、抗体は、１９Ｃ１２重鎖可変領域（配列番号１５）の３つのＣＤＲを含むヒト化重鎖及び１９Ｃ１２軽鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む。場合により、配列番号１５及び１６からの成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける任意の差異はそれぞれ、位置Ｈ６０〜Ｈ６５に存在する。
【０００９】
場合により、抗体は、配列番号８１または配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域及び配列番号８５または配列番号８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域を含む。場合により、抗体は、１９Ｃ１２重鎖可変領域（配列番号１５）の３つのＣＤＲ及び１９Ｃ１２軽鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含む。場合により、位置Ｌ９、Ｌ２２、及びＬ８５のうち少なくとも１つが、それぞれＡ、Ｓ、及びＴによって占有され、位置Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ４８、Ｈ９１、及びＨ１０８のうち少なくとも１つが、それぞれＬ、Ｖ、Ａ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｆ、及びＴによって占有される。場合により、位置Ｌ９、Ｌ２２、及びＬ８５は、それぞれＡ、Ｓ、及びＴによって占有され、位置Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ４８、Ｈ９１、及びＨ１０８は、それぞれＬ、Ｖ、Ａ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｆ、及びＴによって占有される。場合により、位置Ｌ１、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００のうち少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。場合により、位置Ｈ１、Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４３、及びＨ６９のうち少なくとも１つが、それぞれＥ、Ｉ、Ｋ、Ｅ、及びＬによって占有される。場合により、位置Ｌ１、Ｌ４９、及びＬ６８は、それぞれＮ、Ｃ、及びＲによって占有される。場合により、位置Ｌ１は、Ｎによって占有される。場合により、位置Ｌ１、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００は、それぞれＮ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。場合により、位置Ｌ１、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００は、それぞれＮ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。場合により、位置Ｌ７７は、Ｐによって占有される。場合により、位置Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００は、それぞれＰ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。場合により、位置Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４３、及びＨ６９は、それぞれＩ、Ｋ、Ｅ、及びＬによって占有される。場合により、位置Ｈ１は、Ｅによって占有される。
【００１０】
いくつかのヒト化抗体は、配列番号８１または配列番号８２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び配列番号８５または配列番号８８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む。場合により、成熟重鎖可変領域は配列番号８１のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号８５のアミノ酸配列を有する。場合により、成熟重鎖可変領域は配列番号８１のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号８６のアミノ酸配列を有する。場合により、成熟重鎖可変領域は配列番号８１のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号８８のアミノ酸配列を有する。場合により、成熟重鎖可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号８８のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
上記抗体のいずれも、完全抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、またはＦａｂ’２断片であり得る。上記抗体のいずれかにおいて、成熟軽鎖可変領域は軽鎖定常領域に融合され得、成熟重鎖可変領域は重鎖定常領域に融合され得る。場合により、重鎖定常領域は、天然ヒト重鎖定常領域と比較して、Ｆｃγ受容体との結合が低下した天然ヒト重鎖定常領域の変異形態である。場合により、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。場合により、成熟重鎖可変領域は、配列番号８９の配列を有する重鎖定常領域に融合され、かつ／または成熟軽鎖可変領域は、配列番号９０の配列を有する軽鎖定常領域に融合される。場合により、成熟重鎖可変領域は、配列番号８９、１３８、若しくは１５０の配列を有する重鎖定常領域に融合され、かつ／または成熟軽鎖可変領域は、配列番号９０若しくは１３９の配列を有する軽鎖定常領域に融合される。
【００１２】
本発明は更に、上記抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明は更に、上記抗体のいずれかの重鎖及び／または軽鎖（複数可）、例えば配列番号９１〜９２、９５〜９６、９９〜１０１、１０５〜１０６、１０９〜１１１、及び１１５〜１２３のいずれかなどをコードする核酸を提供する。本発明は更に、上記抗体のいずれかの重鎖及び／または軽鎖（複数可）、例えば配列番号９１〜９２、９５〜９６、９９、１０１、１０５〜１０６、１０９〜１１１、１１５〜１２３、１４６、１４８、１４９、または１５１のいずれかなどをコードする核酸を提供する。
【００１４】
本発明は更に、上記のような核酸を含む組換え発現ベクター、及び組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
【００１５】
本発明は更に、抗体のヒト化方法であって、（ａ）マウス抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を決定することと、（ｂ）マウス抗体重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸及びマウス抗体軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、（ｃ）宿主細胞中で核酸を発現させて、ヒト化抗体を産生することと、を含み、このマウス抗体が１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３である方法を提供する。
【００１６】
本発明は更に、ヒト化、キメラ、またはベニア化抗体の産生方法であって、（ａ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で形質転換した細胞を培養し、これにより細胞に抗体を分泌させることと、（ｂ）細胞培養培地から抗体を精製することと、を含み、この抗体が１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３のヒト化、キメラ、またはベニア化形態である方法を提供する。
【００１７】
本発明は更に、ヒト化、キメラ、またはベニア化抗体を産生する細胞株の作製方法であって、（ａ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターならびに選択可能マーカーを細胞に導入することと、（ｂ）ベクターのコピー数が増加した細胞を選択する条件下で細胞を増殖させることと、（ｃ）選択した細胞から単一細胞を単離することと、（ｄ）抗体の収率に基づいて選択した単一細胞からクローニングした細胞を保存することと、を含み、この抗体が１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３のヒト化、キメラ、またはベニア化形態である方法を提供する。場合により、本方法は更に、選択的条件下で細胞を増殖させることと、天然に発現し、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間を分泌する細胞株をスクリーニングすることと、を含む。
【００１８】
本発明は更に、患者の望ましくない免疫応答の抑制方法であって、上記抗体のいずれかを効果的レジームで患者に投与することを含む方法を提供する。場合により、望ましくない免疫応答は、ＭＣＡＭ発現細胞の炎症部位への浸潤を特徴とする。場合により、ＭＣＡＭ発現細胞はＴＨ１７細胞である。場合により、望ましくない免疫応答とは、自己免疫疾患、例えば糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、スティフマン症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、セリアック病、乾癬、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、若しくはブドウ膜炎など、または移植片対宿主病若しくは移植片拒絶、またはアレルギー、アレルギー応答、若しくはアレルギー性疾患、例えばアレルギー性接触皮膚炎若しくは喘息などである。
【００１９】
本発明は更に、癌を有するまたは癌の危険性がある患者における、癌の処置方法または癌の予防方法であって、上記抗体のいずれかを効果的レジームで患者に投与することを含む方法を提供する。場合により、癌は、黒色腫、神経膠腫、膠芽腫、肺癌、または乳癌である。場合により、癌は転移性である。
【００２０】
本発明は更に、肥満症または肥満関連疾患を有するまたはその危険性がある患者における、肥満症または肥満関連疾患の処置方法またはその予防方法であって、上記抗体のいずれかを効果的レジームで患者に投与することを含む方法を提供する。場合により、肥満関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、プラダー・ウィリー症候群、頭蓋咽頭腫、バルデー・ビードル症候群、コーエン症候群、またはＭＯＭＯ症候群である。
【００２１】
本発明は更に、生体サンプルにおけるラミニンα４とＭＣＡＭとの結合の阻害方法であって、生体サンプルを、有効量の上記抗体のいずれかと接触させることを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は更に、生体サンプルにおけるラミニンα４とインテグリンα６β１との結合の阻害方法であって、生体サンプルを、有効量の上記抗体のいずれかと接触させることを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明は更に、生体サンプルにおける細胞接着の阻害方法であって、生体サンプルを、有効量の上記抗体のいずれかと接触させることを含む方法を提供する。場合により、細胞接着は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールにより媒介される。場合により、生体サンプルは癌細胞を含む。
【００２４】
本発明は更に、患者の血管新生の阻害方法であって、上記抗体のいずれかを効果的レジームで患者に投与することを含む方法を提供する。場合により、患者は癌を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＥＬＩＳＡ  ｈＭＣＡＭ−Ｆｃ捕捉ブロッキングアッセイにより評価した、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を遮断するＩｇＧ対照抗体、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３の能力を示す。
【００２６】
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ＬＡＭＡ４  ｐＤｉｓｐｌａｙフローサイトメトリーブロッキングアッセイにより評価した、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を遮断するＩｇＧ対照抗体、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３の能力を示す。
【００２７】
【図３】ｈＭＣＡＭ．ＣＨＯフローサイトメトリーブロッキングアッセイにより評価した、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を遮断するＩｇＧ対照抗体、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３の能力を示す。
【００２８】
【図４】図４Ａ〜図４Ｅは、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、及び１２Ｄ３抗体それぞれの相対的結合及びオン／オフ速度能力を示す。
【００２９】
【図５】ＩｇＧ対照抗体、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３とＬＡＭＡ４提示ヒト２９３細胞との結合を示す。
【００３０】
【図６】対照として使用するタウタンパク質と共にＥＬＩＳＡにより評価した、ＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質と結合するＬＡＭＡ４Ｇドメインの切断型組換えバリアントの能力を示す。
【００３１】
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ＬＧ１〜５、ＬＧ１〜３、及びＬＧ４〜５を有するＬＡＭＡ４バリアント（図７Ａ）、ならびにＬＧ１〜３、ＬＧ１を除去したＧドメイン、ＬＧ２を除去したＧドメイン、及びＬＧ３を除去したＧドメインを有するＬＡＭＡ４バリアント（図７Ｂ）を提示する２９３細胞の、フローサイトメトリーにより評価した結合を示す。
【００３２】
【図８】図８Ａ〜図８Ｅは、減少比（５：１、１：１、及び１：５）の競合するブロッキング抗体の存在下における、ＬＡＭＡ４提示２９３細胞との５Ａ１２、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ｂ５、及び１２Ｄ３抗体それぞれの、フローサイトメトリーによる結合の評価を示す。
【００３３】
【図９】ＬＡＭＡ４媒介ＷＭ−２６６−４細胞接着を遮断する１９Ｃ１２及びマウスＩｇＧ２ｂ対照の能力を示す。
【００３４】
【図１０】フローサイトメトリー分析により実証した、インテグリンα６β１発現２９３細胞とのＬＡＭＡ４結合を遮断する１９Ｃ１２の能力を示す。
【００３５】
【図１１】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４とＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞との結合を遮断するキメラ１９Ｃ１２、Ｈ１＋ＣｈｉＬ、及びＨ２＋ＣｈｉＬの能力を示す。
【００３６】
【図１２】ＬＡＭＡ４Ｇドメインの組換えバリアントを提示する２９３細胞に結合するキメラ１９Ｃ１２、Ｈ１＋ＣｈｉＬ、及びＨ２＋ＣｈｉＬの能力についてのフローサイトメトリー評価を示す。
【００３７】
【図１３】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４とＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞との結合を遮断する、位置Ｌ４９にアミノ酸置換を有するヒト化１９Ｃ１２バリアントの能力を示す。
【００３８】
【図１４】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４提示２９３細胞に結合する、位置Ｌ４９にアミノ酸置換を有するヒト化１９Ｃ１２バリアントの能力を示す。
【００３９】
【図１５】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４とＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞との結合を遮断するキメラ１９Ｃ１２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６の能力を示す。
【００４０】
【図１６】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４提示２９３細胞に結合するキメラ１９Ｃ１２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６の能力を示す。
【００４１】
【図１７】図１７Ａ及び図１７Ｂは、ＦｏｒｔｅＢｉｏにより評価した、キメラ１９Ｃ１２ならびにヒト化１５Ｆ７バリアントのＨ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６の相対的結合及びオン／オフ速度を示し、１７Ａでは抗ＨｉｓセンサーにＨｉｓ−ＬＡＭＡ４を負荷した後の１９Ｃ１２抗体の結合及び解離を示し、１７Ｂではヤギ抗ヒトＦｃセンサーに抗体を負荷した後のＨｉｓ−ＬＡＭＡ４の結合及び解離を示す。
【００４２】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｃは、ＦｏｒｔｅＢｉｏにより評価した、キメラ１９Ｃ１２ならびにヒト化１５Ｆ７バリアントのＨ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６の相対的結合及びオン／オフ速度能力を示し、１８Ａ〜Ｃにおける抗体濃度は、それぞれ３３．３ｎＭ、１６．７ｎＭ、及び８．３３ｎＭである。
【００４３】
【図１９】図１９Ａ及び図１９Ｂは、ラミニン４１１またはＢＳＡ対照で処置した、及び１９Ｃ１２、４Ｂ７、ｒ２１０７、またはｍＩｇＧ２ｂ対照で処置したヒト黒色腫細胞における、ｐＡｋｔ対Ａｋｔの相対レベル比を示す。図１９Ａは個々の各サンプルの比を示し、図１９Ｂは各群（ｎ＝３）の平均値及び標準誤差を示す。
【００４４】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略号、及びアミノ酸の３文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で始まり、３’末端へと進む（すなわち、各ラインの左から右へ）、標準規則に従う。各ヌクレオチド配列の１本鎖のみが示されているが、表示された鎖の任意の参照によって、相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、カルボキシ末端へと進む（すなわち、各ラインの左から右へ）、標準規則に従う。
【００４５】
配列番号１は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１６３６３により提供されるような、ラミニンα４のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列番号２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ００１０９８６７６により提供されるような、ラミニンα４のアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ００１０９８６７７により提供されるような、ラミニンα４のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
配列番号４は、ラミニンα４のＧドメインのアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号５は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５０】
配列番号６は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ２モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号７は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ３モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列番号８は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５３】
配列番号９は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号１０は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ５モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５５】
配列番号１１は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールのアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号１２は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ４３１２１により提供されるような、ＭＣＡＭのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号１３は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２３２２９により提供されるような、インテグリンα６のアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号１４は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０５５５６により提供されるような、インテグリンβ１のアミノ酸配列を示す。
【００５９】
配列番号１５は、マウス１９Ｃ１２成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号１６は、マウス１９Ｃ１２成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００６１】
配列番号１７は、１９Ｃ１２重鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６２】
配列番号１８は、１９Ｃ１２軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６３】
配列番号１９は、マウス１９Ｃ１２重鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号２０は、マウス１９Ｃ１２重鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００６５】
配列番号２１は、マウス１９Ｃ１２重鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００６６】
配列番号２２は、マウス１９Ｃ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００６７】
配列番号２３は、マウス１９Ｃ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００６８】
配列番号２４は、マウス１９Ｃ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００６９】
配列番号２５は、マウス１Ｃ１成熟重鎖可変領域、バージョン１のアミノ酸配列を示す。
【００７０】
配列番号２６は、マウス１Ｃ１成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００７１】
配列番号２７は、１Ｃ１重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１のアミノ酸配列を示す。
【００７２】
配列番号２８は、１Ｃ１軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００７３】
配列番号２９は、マウス１Ｃ１重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００７４】
配列番号３０は、マウス１Ｃ１重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００７５】
配列番号３１は、マウス１Ｃ１重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００７６】
配列番号３２は、マウス１Ｃ１軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００７７】
配列番号３３は、マウス１Ｃ１軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００７８】
配列番号３４は、マウス１Ｃ１軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００７９】
配列番号３５は、マウス５Ａ１２成熟重鎖可変領域、バージョン１のアミノ酸配列を示す。
【００８０】
配列番号３６は、マウス５Ａ１２成熟重鎖可変領域、バージョン２のアミノ酸配列を示す。
【００８１】
配列番号３７は、マウス５Ａ１２成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００８２】
配列番号３８は、５Ａ１２重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１のアミノ酸配列を示す。
【００８３】
配列番号３９は、５Ａ１２重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２のアミノ酸配列を示す。
【００８４】
配列番号４０は、５Ａ１２軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００８５】
配列番号４１は、マウス５Ａ１２重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００８６】
配列番号４２は、マウス５Ａ１２重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００８７】
配列番号４３は、マウス５Ａ１２重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００８８】
配列番号４４は、マウス５Ａ１２重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００８９】
配列番号４５は、マウス５Ａ１２重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００９０】
配列番号４６は、マウス５Ａ１２重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００９１】
配列番号４７は、マウス５Ａ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００９２】
配列番号４８は、マウス５Ａ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号４９は、マウス５Ａ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【００９４】
配列番号５０は、マウス５Ｂ５成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００９５】
配列番号５１は、マウス５Ｂ５成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００９６】
配列番号５２は、５Ｂ５重鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００９７】
配列番号５３は、５Ｂ５軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００９８】
配列番号５４は、マウス５Ｂ５重鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【００９９】
配列番号５５は、マウス５Ｂ５重鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０１００】
配列番号５６は、マウス５Ｂ５重鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０１０１】
配列番号５７は、マウス５Ｂ５軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０１０２】
配列番号５８は、マウス５Ｂ５軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０１０３】
配列番号５９は、マウス５Ｂ５軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
配列番号６０は、マウス１２Ｄ３成熟重鎖可変領域、バージョン１のアミノ酸配列を示す。
【０１０５】
配列番号６１は、マウス１２Ｄ３成熟重鎖可変領域、バージョン２のアミノ酸配列を示す。
【０１０６】
配列番号６２は、マウス１２Ｄ３成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０１０７】
配列番号６３は、１２Ｄ３重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１のアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
配列番号６４は、１２Ｄ３重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２のアミノ酸配列を示す。
【０１０９】
配列番号６５は、１２Ｄ３軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
配列番号６６は、マウス１２Ｄ３重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
配列番号６７は、マウス１２Ｄ３重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０１１２】
配列番号６８は、マウス１２Ｄ３重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
配列番号６９は、マウス１２Ｄ３重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０１１４】
配列番号７０は、マウス１２Ｄ３重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０１１５】
配列番号７１は、マウス１２Ｄ３重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０１１６】
配列番号７２は、マウス１２Ｄ３軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０１１７】
配列番号７３は、マウス１２Ｄ３軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０１１８】
配列番号７４は、マウス１２Ｄ３軽鎖の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０１１９】
配列番号７５は、ＮＣＢＩアクセッションコードＢＡＣ０１５３０．１により提供されるような、ヒトＶＨアクセプターＦＲのアミノ酸配列を示す。
【０１２０】
配列番号７６は、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＢＡ７１３６７．１により提供されるような、ヒトＶＬアクセプターＦＲのアミノ酸配列を示す。
【０１２１】
配列番号７７は、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＢＩ７４１６２．１により提供されるような、ヒトＶＬアクセプターＦＲのアミノ酸配列を示す。
【０１２２】
配列番号７８は、復帰突然変異またはその他の突然変異を有しない、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０１２３】
配列番号７９は、復帰突然変異またはその他の突然変異を有しない、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０１２４】
配列番号８０は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域バージョン１（Ｈ１）のアミノ酸配列を示す。
【０１２５】
配列番号８１は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域バージョン２（Ｈ２）のアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
配列番号８２は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域バージョン３（Ｈ３）のアミノ酸配列を示す。
【０１２７】
配列番号８３は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン１（Ｌ１）のアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
配列番号８４は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン２（Ｌ２）のアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
配列番号８５は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン３（Ｌ３）のアミノ酸配列を示す。
【０１３０】
配列番号８６は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン４（Ｌ４）のアミノ酸配列を示す。
【０１３１】
配列番号８７は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン５（Ｌ５）のアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
配列番号８８は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン６（Ｌ６）のアミノ酸配列を示す。
【０１３３】
配列番号８９は、例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０１３４】
配列番号９０は、Ｎ末端アルギニンを有しない、例示的なヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０１３５】
配列番号９１は、マウス１９Ｃ１２成熟重鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１３６】
配列番号９２は、マウス１９Ｃ１２成熟軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１３７】
配列番号９３は、１９Ｃ１２重鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１３８】
配列番号９４は、１９Ｃ１２軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１３９】
配列番号９５は、マウス１Ｃ１成熟重鎖可変領域、バージョン１の核酸配列を示す。
【０１４０】
配列番号９６は、マウス１Ｃ１成熟軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１４１】
配列番号９７は、１Ｃ１重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１の核酸配列を示す。
【０１４２】
配列番号９８は、１Ｃ１軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１４３】
配列番号９９は、マウス５Ａ１２成熟重鎖可変領域、バージョン１の核酸配列を示す。
【０１４４】
配列番号１００は、マウス５Ａ１２成熟重鎖可変領域、バージョン２の核酸配列を示す。
【０１４５】
配列番号１０１は、マウス５Ａ１２成熟軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１４６】
配列番号１０２は、５Ａ１２重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１の核酸配列を示す。
【０１４７】
配列番号１０３は、５Ａ１２重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２の核酸配列を示す。
【０１４８】
配列番号１０４は、５Ａ１２軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１４９】
配列番号１０５は、マウス５Ｂ５成熟重鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１５０】
配列番号１０６は、マウス５Ｂ５成熟軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１５１】
配列番号１０７は、５Ｂ５重鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１５２】
配列番号１０８は、５Ｂ５軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１５３】
配列番号１０９は、マウス１２Ｄ３成熟重鎖可変領域、バージョン１の核酸配列を示す。
【０１５４】
配列番号１１０は、マウス１２Ｄ３成熟重鎖可変領域、バージョン２の核酸配列を示す。
【０１５５】
配列番号１１１は、マウス１２Ｄ３成熟軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【０１５６】
配列番号１１２は、１２Ｄ３重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１の核酸配列を示す。
【０１５７】
配列番号１１３は、１２Ｄ３重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２の核酸配列を示す。
【０１５８】
配列番号１１４は、１２Ｄ３軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を示す。
【０１５９】
配列番号１１５は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域バージョン１（Ｈ１）の核酸配列を示す。
【０１６０】
配列番号１１６は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域バージョン２（Ｈ２）の核酸配列を示す。
【０１６１】
配列番号１１７は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖可変領域バージョン３（Ｈ３）の核酸配列を示す。
【０１６２】
配列番号１１８は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン１（Ｌ１）の核酸配列を示す。
【０１６３】
配列番号１１９は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン２（Ｌ２）の核酸配列を示す。
【０１６４】
配列番号１２０は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン３（Ｌ３）の核酸配列を示す。
【０１６５】
配列番号１２１は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン４（Ｌ４）の核酸配列を示す。
【０１６６】
配列番号１２２は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン５（Ｌ５）の核酸配列を示す。
【０１６７】
配列番号１２３は、ヒト化１９Ｃ１２軽鎖可変領域バージョン６（Ｌ６）の核酸配列を示す。
【０１６８】
配列番号１２４は、ＬＧｄｅ３、すなわちＬＧ３を除去したラミニンα４のＧドメインの変異体のアミノ酸配列を示す。
【０１６９】
配列番号１２５は、ＬＧｄｅ１、すなわちＬＧ１を除去したラミニンα４のＧドメインの変異体のアミノ酸配列を示す。
【０１７０】
配列番号１２６は、ＬＧｄｅ２、すなわちＬＧ２を除去したラミニンα４のＧドメインの変異体のアミノ酸配列を示す。
【０１７１】
配列番号１２７は、ラミニンα４のＧドメインの核酸配列を示す。
【０１７２】
配列番号１２８は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１モジュールの核酸配列を示す。
【０１７３】
配列番号１２９は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ２モジュールの核酸配列を示す。
【０１７４】
配列番号１３０は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ３モジュールの核酸配列を示す。
【０１７５】
配列番号１３１は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールの核酸配列を示す。
【０１７６】
配列番号１３２は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４モジュールの核酸配列を示す。
【０１７７】
配列番号１３３は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ５モジュールの核酸配列を示す。
【０１７８】
配列番号１３４は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールの核酸配列を示す。
【０１７９】
配列番号１３５は、ＬＧｄｅ３、すなわちＬＧ３を除去したラミニンα４のＧドメインの変異体の核酸配列を示す。
【０１８０】
配列番号１３６は、ＬＧｄｅ１、すなわちＬＧ１を除去したラミニンα４のＧドメインの変異体の核酸配列を示す。
【０１８１】
配列番号１３７は、ＬＧｄｅ２、すなわちＬＧ２を除去したラミニンα４のＧドメインの変異体の核酸配列を示す。
【０１８２】
配列番号１３８は、ＩｇＧ１  Ｇ１ｍ３アロタイプの例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０１８３】
配列番号１３９は、Ｎ末端アルギニンを有する、例示的なヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０１８４】
配列番号１４０は、Ｃ末端リジンを有しない、例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０１８５】
配列番号１４１は、マウス１Ｃ１成熟重鎖可変領域、バージョン２のアミノ酸配列を示す。
【０１８６】
配列番号１４２は、１Ｃ１重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２のアミノ酸配列を示す。
【０１８７】
配列番号１４３は、マウス１Ｃ１重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０１８８】
配列番号１４４は、マウス１Ｃ１重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０１８９】
配列番号１４５は、マウス１Ｃ１重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０１９０】
配列番号１４６は、マウス１Ｃ１成熟重鎖可変領域、バージョン２の核酸配列を示す。
【０１９１】
配列番号１４７は、１Ｃ１重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２の核酸配列を示す。
【０１９２】
配列番号１４８は、ＩｇＧ１  Ｇ１ｍ３アロタイプの例示的なヒトＩｇＧ１定常領域の核酸配列を示す。
【０１９３】
配列番号１４９は、Ｎ末端アルギニンを有する、例示的なヒトカッパ軽鎖定常領域の核酸配列を示す。
【０１９４】
配列番号１５０は、ＩｇＧ１  Ｇ１ｍ３アロタイプの例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０１９５】
配列番号１５１は、Ｎ末端アルギニンを有しない、例示的なヒトカッパ軽鎖定常領域の核酸配列を示す。
【０１９６】
定義
モノクローナル抗体またはその他の生物学的実体は、典型的には単離形態で提供される。これは、抗体またはその他の生物学的実体が、典型的には少なくとも５０重量％の純度の干渉タンパク質、及びその抗体などの作製または精製から生じるその他の混入物であることを意味するが、モノクローナル抗体を、過剰量の薬学的に許容される担体（複数可）または抗体の使用を容易にすることを目的としたその他の賦形剤と組み合わせる可能性もある。時として、モノクローナル抗体は、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％または９９重量％の純度の干渉タンパク質及び作製または精製からの混入物である。多くの場合、単離したモノクローナル抗体またはその他の生物学的実体は、その精製後も残存する主要な巨大分子種である。
【０１９７】
抗体の、その標的抗原への特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合は、検出可能な程により大きく、少なくとも１つの非関連標的に対して生じる非特異的結合と区別可能である。特異的結合は、特定の官能基間の結合形成または特定の空間的適合（例えば、鍵と鍵穴型）の結果であり得るが、非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は、抗体が１つ及び唯一の標的と結合することを必ずしも示唆する訳ではない。
【０１９８】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初に切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現する。シグナルペプチドを伴わない可変領域は、成熟可変領域と称されることがある。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを伴わない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。
【０１９９】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと定義する。軽鎖及び重鎖内において、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７（その全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０２００】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、完全抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同じである。鎖のすべては、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列されて、特異的エピトープとの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７  ａｎｄ  １９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。Ｋａｂａｔは、広く使用されている番号付け規則（Ｋａｂａｔ番号付け）も提供し、この規則では、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基が同じ番号を割り当てられる。
【０２０１】
「抗体」という用語は、完全抗体及びその結合断片を含む。典型的には、断片は、標的への特異的結合について、その断片が由来する完全抗体と競合し、断片は分離した重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｄａｂ、ナノボディ、及びＦｖを含む。断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または完全免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離によって作製され得る。「抗体」という用語は、二重特異性抗体及び／またはヒト化抗体も含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照のこと）。いくつかの二重特異性抗体では、２つの異なる重鎖／軽鎖対は、ヒト化１９Ｃ１２重鎖／軽鎖対、及び１９Ｃ１２が結合するものとは異なるラミニンα４上のエピトープに対して特異的な重鎖／軽鎖対を含む。
【０２０２】
いくつかの二重特異性抗体では、１つの重鎖軽鎖対は、以下で更に開示されるようにヒト化１９Ｃ１２抗体であり、重軽鎖対は、血液脳関門上に発現する受容体、例えばインスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体などに結合する抗体由来である（Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８８：４７７１−４７７５，１９９１；Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７，１９９３）。このような二重特異性抗体は、受容体媒介トランスサイトーシスによって、血液脳関門を通過して輸送され得る。二重特異性抗体の脳への取り込みは、二重特異性抗体を操作し、血液脳関門受容体に対するその親和性を低下させることにより、更に増進され得る。受容体に対する親和性の低下は、脳内により広範な分布をもたらした（例えば、Ａｔｗａｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４３，２０１１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４４，２０１１を参照のこと）。
【０２０３】
例示的な二重特異性抗体は、（１）各軽鎖及び重鎖が、短いペプチド結合によって一列に並んだ２つの可変ドメインを含有する、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（２）２つの一本鎖ダイアボディの融合体であり、標的抗原の各々に対して２つの結合部位を有する４価の二重特異性抗体をもたらすＴａｎｄａｂ、（３）ｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせであり、多価分子をもたらすフレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）、（４）プロテインキナーゼＡにおける「二量化及びドッキングドメイン」に基づくいわゆる「ドックアンドロック」分子であって、Ｆａｂに適用した場合、異なるＦａｂ断片に連結した２つの同一Ｆａｂ断片から成る３価の二重特異性結合タンパク質を生成することができる分子、（５）例えばヒトＦｃ領域の両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子でもあり得る。二重特異性抗体の調製に有用なプラットフォームの例としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｆｃａｂ及びＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ組換えＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。
【０２０４】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸または１つ以上のタンパク質の３次折り畳みによって近接した非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（線状エピトープとしても知られる）は典型的に、変性溶媒に曝露しても保持されるが、３次折り畳みによって形成されるエピトープ（構造エピトープとしても知られる）は典型的に、変性溶媒での処理で失われる。エピトープは典型的に、特有の空間的構造中に少なくとも３、より一般的には少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。
【０２０５】
同じまたは重複するエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原への別の抗体の結合と競合する能力を示す、単純なイムノアッセイで同定され得る。抗体のエピトープは、その抗原に結合した抗体の、接触残基を同定するＸ線結晶学によっても確定され得る。あるいは、１つの抗体の結合を低下させるまたは排除する抗原中のすべてのアミノ酸突然変異が、他方の結合を低下または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。１つの抗体の結合を低下または排除するいくつかのアミノ酸突然変異が、他方の結合を低下または排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【０２０６】
抗体間の競合は、試験下の抗体が共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照のこと）。競合結合アッセイで測定する際に、過剰な試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）が、参照抗体の結合を少なくとも５０％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。いくつかの試験抗体は、参照抗体の結合を少なくとも７５％、９０％または９９％阻害する。競合アッセイで同定される抗体（競合する抗体）としては、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び立体障害が生じるほど十分に参照抗体が結合するエピトープの近位にある隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。
【０２０７】
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、付形剤、または補助剤が、製剤のその他の成分と適合し、そのレシピエントにとって実質的に有害ではないことを意味する。
【０２０８】
「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒト及びその他の哺乳動物対象を含む。
【０２０９】
個体が少なくとも１つの既知の危険因子（例えば、遺伝子的、生化学的、家族歴、状況的曝露）を有し、その危険因子を有する個体では、危険因子を有しない個体よりも疾患発症の危険性が統計的に著しく高くなる場合、個体は疾患の危険性が増加する。
【０２１０】
「生体サンプル」という用語は、生物源、例えばヒトまたは哺乳動物対象内の、またはそれらから得られる生体材料のサンプルを指す。このようなサンプルは、臓器、細胞小器官、組織、組織の切片、体液、末梢血、血漿、血清、細胞、分子、例えばタンパク質及びペプチドなど、ならびにそれらに由来する任意の部分または組み合わせであり得る。生体サンプルという用語は、サンプルを処理することにより得られる任意の材料も包含し得る。得られた材料は、細胞またはそれらの子孫を含み得る。生体サンプルの処理は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、固定、干渉成分の不活化などのうち１つ以上を含んでよい。
【０２１１】
「症状」という用語は、対象によって知覚されるような、歩行変調などの疾患の主観的証拠を指す。「兆候」は、医師によって観察されるような疾患の客観的証拠を指す。
【０２１２】
アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的で、アミノ酸は以下の通りにグループ分けされる：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及びグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス内のアミノ酸間での置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを別のメンバーと交換することを含む。
【０２１３】
配列同一性パーセンテージは、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって最大限に整列させた抗体配列で決定される。整列後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較されている場合、対象抗体領域と参照抗体領域との間の配列同一性パーセンテージは、対象抗体領域及び参照抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占有される位置の数を、ギャップを除外した２つの領域の整列させた位置の総数で除算し、１００を乗算してパーセンテージに変換したものである。
【０２１４】
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていないその他の要素を含んでよい。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、その抗体を単独でまたはその他の成分と組み合わせて含有してよい。
【０２１５】
値の範囲の指定は、その範囲内のまたはその範囲を規定するすべての整数、及びその範囲内の整数によって規定されるすべての部分範囲を含む。
【０２１６】
文脈から別の意味が明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の標準測定誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【０２１７】
統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０２１８】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１種の化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」という用語は、それらの混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【０２１９】
Ｉ．概要
本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに特異的に結合する抗体を提供する。本抗体は、ラミニンα４とＭＣＡＭとの、及び場合によりインテグリンα６β１との結合を阻害する能力を有する。本抗体は、その他の用途の中でも、望ましくない免疫応答の阻害、癌の処置、または肥満症若しくは肥満関連疾患の処置に使用され得る。
【０２２０】
ＩＩ．標的分子
ラミニンは、細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーであり、基底膜の主な非コラーゲン成分である。ラミニンは、その他のプロセスの中でも、細胞接着、分化、遊走、シグナル伝達、神経突起伸長、及び転移を含む生物学的プロセスに関与すると報告されている。ラミニンは、３つの鎖、すなわちアルファ鎖、ベータ鎖、及びガンマ鎖のヘテロ三量体タンパク質である。これら３つの鎖は、各々が異なる鎖により形成される３つの短腕、及び３つすべての鎖で構成される長腕から成る十字形構造を形成する。哺乳動物では、５つの異なるアルファ鎖、３つの異なるベータ鎖、及び３つの異なるガンマ鎖が同定され、これらは１５種の異なるヘテロ三量体の組み合わせを構成することができる。
【０２２１】
ラミニンアルファ鎖は、大きなＣ末端の球状ドメイン（Ｇドメイン）を有し、このドメインは、約２００個のアミノ酸の５つの一列に並んだ相同ラミニンＧ様モジュール（ＬＧ１〜５）を有する。例えば、ラミニンα４のＧドメインは、アミノ酸位置８３３〜１８２０（配列番号４）としてＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３により定義され、ラミニンα４の５つのＬＧモジュールは、以下の通りにＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３により定義される：ＬＧ１（配列番号５）はアミノ酸位置８３３〜１０３５を含み、ＬＧ２（配列番号６）はアミノ酸位置１０４７〜１２２７を含み、ＬＧ３（配列番号７）はアミノ酸位置１２３４〜１４０２を含み、ＬＧ４（配列番号９）はアミノ酸位置１４６９〜１６４０を含み、ＬＧ５（配列番号１０）はアミノ酸位置１６４７〜１８２０を含む。いくつかの場合には、Ｇドメインは配列番号４であり得、その他の場合には、ＧドメインはＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置８３３〜１８２０を含み得る。いくつかの場合には、ＬＧ１モジュールは配列番号５であり得、その他の場合には、ＬＧ１モジュールは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置８３３〜１０３５を含み得る。いくつかの場合には、ＬＧ２モジュールは配列番号６であり得、その他の場合には、ＬＧ２モジュールは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１０４７〜１２２７を含み得る。いくつかの場合には、ＬＧ３モジュールは配列番号７であり得、その他の場合には、ＬＧ３モジュールは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１２３４〜１４０２を含み得る。いくつかの場合には、ＬＧ４モジュールは配列番号９であり得、その他の場合には、ＬＧ４モジュールは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１４６９〜１６４０を含み得る。いくつかの場合には、ＬＧ５モジュールは配列番号１０であり得、その他の場合には、ＬＧ５モジュールは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１６４７〜１８２０を含み得る。ＬＧ１〜３モジュール（配列番号８）は、リンカードメインによってＬＧ４〜５モジュール（配列番号１１）に連結される。ラミニンα４鎖（ＬＡＭＡ４、ラミニンサブユニットα４、ラミニン−１４サブユニットアルファ、ラミニン−８サブユニットアルファ、及びラミニン−９サブユニットアルファとしても知られる）は、２００ｋＤａであり、最短のバリアントである。α１、α２、及びα５鎖と比較して、ラミニンα４は切断型Ｎ末端を有する。ラミニンα４は、成人で、及び発達途中の両方で広く分布する。ラミニンα４は、ラミニン−８（ラミニン４１１またはアルファ４／ベータ１／ガンマ１）、ラミニン−９（ラミニン４２１またはアルファ４／ベータ２／ガンマ１）、及びラミニン−１４（ラミニン４１１またはアルファ４／ベータ１／ガンマ１）中に存在する。
【０２２２】
文脈から別の意味が明らかでない限り、ラミニンα４またはその断片、ドメイン、若しくはモジュールへの言及は、それらのアイソフォーム及び対立遺伝子バリアントを含む天然ヒトアミノ酸配列を含む。例示的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１６３６３及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ００１０９８６７６及びＮＰ００１０９８６７７（それぞれ配列番号１、２、及び３）と称される。いくつかの抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内のエピトープに結合する。エピトープは、エピトープを形成する残基が、ＬＧ１及びＬＧ２、ＬＧ２及びＬＧ３、ＬＧ１及びＬＧ３、またはＬＧ１、ＬＧ２、及びＬＧ３のすべてに由来するように、ＬＧ１内、ＬＧ２内、ＬＧ３内に存在するか、または分かれ得る。
【０２２３】
ラミニンα４は、ＭＣＡＭ及びインテグリンα６β１の両方に結合することができる。ＭＣＡＭ（黒色腫細胞接着分子、ＣＤ１４６及びＭＵＣ１８としても知られる）は、細胞接着、及び血管組織における細胞間結合での内皮単層の結合に関与すると報告される免疫グロブリンスーパーファミリーに属する１１３ｋＤＡの細胞表面糖タンパク質である。ＭＣＡＭは、多くの癌、例えば黒色腫及び前立腺癌を含む固形腫瘍などの腫瘍進行を促進するとも報告されている。ＭＣＡＭは、同型／同種親和性様式で相互作用することが知られ、その他のリガンドにも結合する場合がある。ＭＣＡＭは、シグナルペプチド、５つの免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、及び短い細胞質尾部を有する。Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９８９１−９８９５（１９８９）。文脈から別の意味が明らかでない限り、ＭＣＡＭまたはその断片若しくはドメインへの言及は、それらのアイソフォーム及び対立遺伝子バリアントを含む天然ヒトアミノ酸配列を含む。例示的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ４３１２１（配列番号１２）と称される。
【０２２４】
インテグリンは、細胞と隣接する細胞との、または細胞外マトリックスとの付着を媒介する膜貫通受容体である。インテグリンは、２つのサブユニット、すなわちアルファサブユニット及びベータサブユニットで構成されるヘテロ二量体である。哺乳動物では、少なくとも１８個のアルファサブユニット及び８個のベータサブユニットが報告されている。アルファ及びベータサブユニットの異なる組み合わせによって、いくつかの特有なインテグリンが生成され得る。インテグリンは、細胞遊走、細胞分化、及びアポトーシスを含む、いくつかの生物学的プロセスにおいて多様な役割を有すると報告されている。それらの活性は、腫瘍細胞の転移能及び侵襲能を調節するとも報告されている。
【０２２５】
インテグリンα６β１は、アルファ６サブユニット（ＩＴＧＡ６、インテグリンアルファ−６、インテグリンアルファ鎖６、ＣＤ抗原様ファミリーメンバーＦ、ＣＤ４９ｆ、及びＶＬＡ−６としても知られる）及びベータ１サブユニット（ＩＴＧＢ１、インテグリンベータ−１、インテグリンベータ鎖１、フィブロネクチン受容体サブユニットベータ、糖タンパク質ＩＩＡ、ＧＰＩＩＡ、ＶＬＡ−４サブユニットベータ、及びＣＤ２９としても知られる）を有する。インテグリンα６β１は、細胞遊走、胚発生、白血球活性化、及び腫瘍細胞侵襲性に関与すると報告されている。インテグリンα６β１は、血小板、白血球、及び多くの上皮細胞上のラミニン受容体であるとも報告されている。文脈から別の意味が明らかでない限り、インテグリンα６β１、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、またはそれらの断片若しくはドメインへの言及は、それらのアイソフォーム及び対立遺伝子バリアントを含む天然ヒトアミノ酸配列を含む。アルファ６サブユニットの例示的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２３２２９（配列番号１３）と称される。ベータ１サブユニットの例示的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０５５５６（配列番号１４）と称される。
【０２２６】
ＩＩＩ．免疫障害
上記の標的分子は、様々な望ましくない免疫応答に関与する。
【０２２７】
望ましくない免疫応答を伴う免疫障害の１つのカテゴリーとは、自己免疫疾患である。自己免疫疾患としては、全身性自己免疫疾患、臓器または組織特異的自己免疫疾患、及び自己免疫型発現を示す疾患が挙げられる。これらの疾患では、身体は、自身の抗原の１つに対して細胞性及び／または体液性免疫応答を引き起こし、その抗原を破壊して、身体機能の障害及び／または致死的結果をもたらす可能性がある。細胞応答は、存在する場合、Ｂ細胞若しくはＴ細胞またはその両方であり得る。ＴＨ１７細胞は、インターロイキン（ＩＬ）−１７及びＩＬ−２２の産生を特徴とするＴヘルパー細胞系統であり、組織に入り込み、ヒトでの多発性硬化症及びマウスでの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む、病原性自己免疫応答を促進させると報告されている。例えば、Ｃｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７４４−７４８（２００３）；Ｉｖｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２６：１１２１−１１３３（２００６）を参照のこと。ＴＨ１７細胞は、組織に対するそれらの特異的動員及び組織の浸潤により、炎症応答を開始または伝播させる可能性がある。
【０２２８】
自己免疫疾患の例としては、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多腺性自己免疫症候群、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）、インスリン抵抗性糖尿病（２型糖尿病）、免疫介在性不妊症、自己免疫性アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、スティフマン症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、側頭動脈炎、ベーチェット病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、線維筋痛症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎、高安動脈炎、脂肪織炎、類天疱瘡、原因不明の血管炎、ａｎｃａ陰性血管炎、ａｎｃａ陽性血管炎、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、全身性壊死性血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、ＣＲＥＳＴ症候群、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、好酸球性胃腸炎、非定型局所皮膚炎、心筋症、感染後症候群、感染後心内膜炎、セリアック病、多発性硬化症、サルコイドーシス、及び乾癬が挙げられる。
【０２２９】
別の望ましくない免疫応答は、移植片拒絶である。同種異系細胞または臓器（例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓及び骨髄）を、宿主に移植する（すなわち、ドナー及び受容者が同種からの異なる個体である）場合、宿主の免疫系は、移植片中の外来抗原に対して免疫応答を開始し（宿主対移植片病）、移植組織の破壊をもたらす可能性がある。自己免疫疾患と同様に、ＴＨ１７細胞は移植片拒絶に関与すると報告されている。Ｈｅｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５（４）：４５６−６１（２０１０）を参照のこと。
【０２３０】
関連する望ましくない免疫応答は、「移植片対宿主」病（ＧＶＨＤ）に関与する免疫応答である。ＧＶＨＤは、免疫担当細胞を同種レシピエントに移植する場合に生じる、潜在的な致死的疾患である。この状況では、ドナーの免疫担当細胞は、レシピエント体内で組織を攻撃する可能性がある。皮膚、消化管上皮、及び肝臓の組織が頻繁に標的となり、ＧＶＨＤの過程において破壊される可能性がある。この疾患は、骨髄移植などにおいて免疫組織が移植されている場合に特に重篤な問題を提示するが、より重症度の低いＧＶＨＤも、心臓及び肝臓移植を含むその他の症例において同様に報告されている。自己免疫疾患と同様に、ＴＨ１７細胞はＧＶＨＤを媒介すると報告されている。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１３（６）：１３６５−１３７４（２００９）を参照のこと。
【０２３１】
その他の免疫障害としては、アレルギー、アレルギー応答、及びアレルギー性疾患若しくは障害が挙げられる。アレルギー性疾患は、抗原に対するアレルギー性及び／またはアトピー性免疫反応を特徴とする。それらは典型的には、多数の好酸球の流入、肥満細胞の蓄積、及びＩｇＥの産生増加を特徴とする慢性炎症と関連する。アレルギー性疾患の例としては、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギー性接触皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎が挙げられる。喘息は、慢性炎症、気道過敏性、ならびに再発性喘鳴、咳嗽、及び息切れの症状を特徴とする気道の炎症性障害である。自己免疫疾患と同様に、ＴＨ１７細胞は、喘息の病因（Ｃｏｓｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ  ６６：９８９−９９８（２０１１）を参照のこと）ならびにアレルギー及びアレルギー性疾患の病因（Ｏｂｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ５７：１２１−１３４（２００８）を参照のこと）に関与すると報告されている。
【０２３２】
ＩＶ．抗体
Ａ．結合特異性及び機能特性
本発明は、ラミニンα４タンパク質内のエピトープに結合する抗体を提供する。より具体的には、本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内のエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ラミニンα４のＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３によって定義されるように、ＬＧ１（配列番号５）はアミノ酸位置８３３〜１０３５を含み、ＬＧ２（配列番号６）はアミノ酸位置１０４７〜１２２７を含み、ＬＧ３（配列番号７）はアミノ酸位置１２３４〜１４０２を含み、ＬＧ１〜３（配列番号８）はアミノ酸位置８３３〜１４０２を含む。エピトープは、エピトープを形成する残基が、ＬＧ１及びＬＧ２、ＬＧ２及びＬＧ３、ＬＧ１及びＬＧ３、またはＬＧ１、ＬＧ２、及びＬＧ３のすべてに由来するように、ＬＧ１内、ＬＧ２内、ＬＧ３内に存在するか、または分かれ得る。エピトープは、ＬＧ１〜３内の特定のセグメント、例えば位置８３３〜８８３、８８４〜９３４、９３５〜９８５、９８６〜１０３６、１０３７〜１０８７、１０８８〜１１３８、１１３９〜１１８９、１１９０〜１２４０、１２４１〜１２９１、１２９２〜１３４２、及び１３４３〜１４０２の範囲のラミニンα４ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３からのセグメントなどに存在し得る。エピトープは線状であり得、例えば、ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ１〜３、ＬＧ１〜２、ＬＧ２〜３、または上で規定したセグメント若しくは隣接するセグメント対のいずれかからの、２〜５、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、５〜１０、５〜１５、または５〜２０個の連続アミノ酸のエピトープなどである。エピトープはまた、構造エピトープであり得、例えばＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ１〜３、及び上で規定したセグメントのいずれかの任意の組み合わせからの、２〜５、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、５〜１０、５〜１５、または５〜２０個の非連続アミノ酸を含む。
【０２３３】
１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、及び１２Ｄ３と称される抗体は、５つのこのような例示的マウス抗体である。これらの５つのモノクローナル抗体はそれぞれ、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内に特異的に結合する。これらの抗体は更に、それらの、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールに対する有意な結合の欠如（例えば、実験誤差内で無関係な対照抗体と同じ結合、またはＬＧ４〜５モジュールに特異的な抗体の、少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、若しくは１０分の１である結合（例えば、フローサイトメトリー結合アッセイによる測定で））を特徴とする。いくつかの抗体は、それらの、その他のラミニンアルファ鎖、例えばラミニンα１、ラミニンα２、ラミニンα３、及びラミニンα５に対する有意な結合の欠如（例えば、実験誤差内で無関係な対照抗体と同じ結合、または関連するその他のラミニンアルファ鎖に特異的な抗体の、少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、若しくは１０分の１である結合（例えば、フローサイトメトリー結合アッセイによる測定で））も特徴とする。特定のタンパク質、モジュール、またはドメインに結合する能力は、実施例にて提供される例示的なアッセイ形式を使用して実証されてよい。
【０２３４】
本抗体は、実施例２に示すように、単剤としての抗体が、ラミニンα４とＭＣＡＭとの結合を阻害する能力を有することも特徴とする。好ましい抗体は、実施例４に示すように、ラミニンα４とインテグリンα６β１との結合を阻害する能力も有する。抗体は、ラミニンα４と、ラミニンα４が結合することができるその他のインテグリン、例えばインテグリンα３β１などとの結合を阻害する能力も有し得る。結合の阻害は結合アッセイにおいて実証されてよく、このアッセイでは、本発明の抗体を組換えラミニンα４タンパク質、ラミニンα４陽性マウス脳組織、またはラミニンα４提示細胞とプレインキュベートし、その後、組換えＭＣＡＭ若しくはＭＣＡＭ発現細胞または組換えインテグリンα６β１若しくはインテグリンα６β１発現細胞を、ラミニンα４に結合するそれらの能力について更に評価する。阻害を示す例示的なアッセイ形式は、実施例にて提供される。場合により、試験抗体の阻害は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内に結合しない無関係な対照抗体と比較して、または任意の抗体を欠く賦形剤と比較して実証され得る。
【０２３５】
いくつかの抗体は、ラミニンα４媒介細胞接着を阻害する能力も有する。例示的な細胞接着アッセイは、実施例に記載される。
【０２３６】
いくつかの抗体は、ラミニンα４誘導ｐＡｋｔ活性化を阻害する能力も有する。例示的なアッセイは、実施例に記載される。
【０２３７】
阻害は、結合、細胞接着及び／またはラミニンα４により媒介されるその他の機能活性を、単独でまたはＭＣＡＭ、インテグリンα６β１、若しくはその機能活性のいずれかに必要な他のものとの組み合わせのいずれかで、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％〜７５％または３０％〜７０％）阻害することを意味する。阻害は通常、抗体が約２０ｕｇ／ｍｌの濃度で存在する場合に実証され得る。いくつかの抗体は、ＭＣＡＭに結合するラミニンα４の少なくとも５０％の阻害、インテグリンα６β１に結合するラミニンα４の少なくとも５０％の阻害、またはラミニンα４媒介細胞接着、好ましくはラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールにより媒介される細胞接着の少なくとも５０％の阻害を示す。
【０２３８】
いくつかの抗体は、動物モデルまたは臨床試験で示すように、免疫障害または癌を阻害することができる。移植片対宿主病に対する活性を試験するための例示的な動物モデルは、ヒト免疫担当細胞を取り込んだ免疫不全マウスを利用する異種移植モデル、例えばＩｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８７：１６５４−１６５８（２００９）に記載されているモデルなどである。乾癬の例示的な動物モデルは、Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１５７１−１５８０で記載されているＳＣＩＤ／乾癬モデルである。多発性硬化症及び一般的なＴ細胞媒介自己免疫疾患の例示的なモデルは、Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（７）：ｅ４０４４３（２０１２）に記載されている実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルである。癌細胞の特定の特徴に関する細胞に基づくアッセイ、例えば増殖アッセイ、成長アッセイ、生存アッセイ、遊走アッセイ、侵襲アッセイ、及びその他のものなどが、広く利用可能である。同様に、ヒト癌細胞を免疫不全実験動物、例えばマウス若しくはラットなどに注入する癌の動物モデル、または実験動物がヒト癌遺伝子を発現する、若しくは実験動物の腫瘍抑制遺伝子をノックアウトしたトランスジェニックモデルが、広く利用可能である。
【０２３９】
いくつかの抗体は、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３と称される抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する。これらの抗体の重鎖及び軽鎖成熟可変領域の配列は、それぞれ配列番号１５及び１６、２５及び２６、３５／３６及び３７、５０及び５１、ならびに６０／６１及び６２と称される。１Ｃ１の重鎖成熟可変領域の別バージョンは、配列番号１４１である。このような結合特異性を有する他の抗体を、ラミニンα４、または所望のエピトープを含むその一部分でマウスを免疫化すること、及び得られた抗体を、場合により１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３と競合する、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールへの結合についてスクリーニングすることにより産生することができる。次いで、このようなアッセイにより同定された抗体を、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールには特異的に結合するがＬＧ４〜５モジュールには結合しない能力について、実施例に記載されるように、または別の方法でスクリーニングすることができる。抗体を、ラミニンα４とＭＣＡＭとの結合を阻害する能力について、実施例に記載されるように、または別の方法でスクリーニングすることもできる。抗体を、ラミニンα４とインテグリンα６β１との結合を阻害する能力について、実施例に記載されるように、または別の方法でスクリーニングすることもできる。抗体を、ラミニンα４媒介細胞接着を阻害する能力について、実施例に記載されるように、または別の方法でスクリーニングすることもできる。
【０２４０】
１つ以上の規定した残基を含むエピトープに結合する抗体を、これらの１つ以上の残基を含むラミニンα４の断片で免疫化することにより生成することができる。断片は、例えば、配列番号８からの１００、５０、２５、１０または５個以下の連続アミノ酸を有し得る。このような断片は通常、配列番号８の少なくとも５、６、７、８または９個の連続残基を有する。断片を、断片に対する抗体応答の誘発を助ける担体に連結させる、かつ／またはこのような応答の誘発を助けるアジュバントと組み合わせることができる。あるいは、所望の残基に結合する抗体を、全長ラミニンα４（配列番号１）若しくはラミニンα４の全長Ｇドメイン（配列番号４）若しくはラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール（配列番号８）またはこれらのいずれかの断片で免疫化することにより得ることができる。次いで、このような抗体を、Ｇドメインの異なるＬＧモジュール、例えばＬＧ１〜３、ＬＧ１〜５、ＬＧ４〜５、ＬＧｄｅ３、ＬＧｄｅ１、ＬＧｄｅ２、ＬＧ１、ＬＧ２、若しくはＬＧ３（それぞれ配列番号８、４、１１、１２４、１２５、１２６、５、６、及び７）などを含有するラミニンα４のバージョンに対する特異な結合、または規定した残基の変異体と比較した、野生型ラミニンα４に対する特異な結合についてスクリーニングすることができる。Ｇドメインの異なるＬＧモジュールを有するラミニンα４のバージョンに対するスクリーニングは、ラミニンα４のＧドメイン内の特定のＬＧモジュールに結合する抗体をマッピングする。変異体に対するスクリーニングは、より正確に結合特異性を定義し、抗体の結合が特定の残基の突然変異誘発により阻害される抗体、及びその他の例示した抗体の阻害剤特性を共有する可能性がある抗体の同定を可能にする。
【０２４１】
選択したマウス抗体（例えば、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３）の結合特異性を有するヒト抗体はまた、ファージディスプレイ方法の変更例を使用して産生され得る。Ｗｉｎｔｅｒ、ＷＯ９２／２０７９１を参照のこと。本方法は、ヒト抗体の産生に特に好適である。本方法では、選択したマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかを出発物質として使用する。例えば、軽鎖可変領域を出発物質として選択する場合、メンバーが、同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発物質）及び異なる重鎖可変領域を表示するファージライブラリを構築する。重鎖可変領域は、例えば再配列したヒト重鎖可変領域のライブラリから得ることができる。ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに対して強力な特異的結合（例えば、少なくとも１０８、好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）を示すファージを選択する。次いで、このファージからの重鎖可変領域は、更なるファージライブラリを構築するための出発物質として機能する。このライブラリでは、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち、第１のディスプレイライブラリから同定された領域）及び異なる軽鎖可変領域を表示する。軽鎖可変領域は、例えば再配列したヒト可変軽鎖領域のライブラリから得ることができる。再度、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに対して強力な特異的結合を示すファージを選択する。得られた抗体は通常、マウス出発物質と同じまたは類似したエピトープ特異性を有する。
【０２４２】
その他の抗体は、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３などの例示的な抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発によって得ることができる。成熟重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、若しくは１２Ｄ３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であり、その機能特性を維持するモノクローナル抗体、ならびに／または少数の機能的にわずかなアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失、若しくは挿入により各抗体とは異なるモノクローナル抗体もまた、本発明に含まれる。１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３の対応するＣＤＲと９０％、９５％、９９％または１００％同一であり、Ｋａｂａｔによって定義されるような、少なくとも１つまたは６つすべてのＣＤＲを有するモノクローナル抗体もまた含まれる。
【０２４３】
本発明は、完全にまたは実質的に１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３に由来するいくつかまたはすべて（例えば、３、４、５、及び６つ）のＣＤＲを有する抗体も提供する。このような抗体は、完全に若しくは実質的に１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、若しくは１２Ｄ３の重鎖可変領域に由来する少なくとも２つ、通常は３つすべてのＣＤＲを有する重鎖可変領域、及び／または完全に若しくは実質的に１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、若しくは１２Ｄ３の軽鎖可変領域に由来する少なくとも２つ、通常は３つすべてのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含み得る。抗体は、重鎖及び軽鎖の両方を含み得る。ＣＤＲが４、３、２、または１つ以下の置換、挿入、または欠失を含有する場合、ＣＤＲＨ２（Ｋａｂａｔによって定義される場合）が、６、５、４、３、２、または１つ以下の置換、挿入、または欠失を有し得ることを除いて、ＣＤＲは実質的に、対応する１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３のＣＤＲに由来する。このような抗体は、成熟重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、若しくは１２Ｄ３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有し、それらの機能特性を維持し、かつ／または少数の機能的にわずかなアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失、若しくは挿入により１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、若しくは１２Ｄ３とは異なり得る。
【０２４４】
Ｂ．非ヒト抗体
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに対する、その他の非ヒト抗体、例えばマウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラット抗体の産生は、例えばラミニンα４またはその断片で動物を免疫化することによって実施され得る。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，１９８８）（あらゆる目的のために参照によって組み込まれる）を参照のこと。このような免疫原は、ペプチド合成によって、または組換え発現によって天然源から得ることができる。場合により、免疫原は、担体タンパク質と融合して、またはさもなければ複合して投与され得る。場合により、免疫原は、アジュバントと共に投与され得る。以下に記載されるように、いくつかの種類のアジュバントを使用することができる。完全フロイントアジュバントに続く不完全アジュバントが、実験動物の免疫化に好ましい。ウサギまたはモルモットは典型的に、ポリクローナル抗体の産生に使用される。マウスは典型的に、モノクローナル抗体の産生に使用される。抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールへの特異的結合についてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、ラミニンα４バリアント、例えばＧドメインのＬＧ１〜３モジュール、ＧドメインのＬＧ１〜５モジュール、及びＧドメインのＬＧ４〜５モジュールを含有するラミニンα４バリアントなどの集合体に対する抗体の結合を決定し、どのラミニンα４バリアントが抗体に結合するかを決定することによって実施され得る。結合は、例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによって評価され得る。
【０２４５】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体とは、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲを、ヒト「アクセプター」抗体配列に移植した遺伝子組換え抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ，ＵＳ５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９、Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ６，４０７，２１３、Ａｄａｉｒ，ＵＳ５，８５９，２０５及び６，８８１，５５７、Ｆｏｏｔｅ，ＵＳ６，８８１，５５７を参照のこと）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖細胞系領域配列であり得る。従って、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体に由来するいくつかまたはすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合、完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する可変領域フレームワーク配列及び定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来する少なくとも１、２及び通常は３つすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域配列に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来する少なくとも１、２及び通常は３つすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域配列に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域を有する。ナノボディ及びｄＡｂ以外、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体内のＣＤＲは、対応する残基（Ｋａｂａｔによって定義される通り）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が各ＣＤＲ間で同一である場合、実質的に非ヒト抗体内の対応するＣＤＲに由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔによって定義された対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合、実質的にそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。
【０２４６】
ヒト化抗体は多くの場合、マウス抗体由来の（好ましくはＫａｂａｔによって定義されるような）６つすべてのＣＤＲを組み込んでいるが、それらは、すべてのＣＤＲよりも少ない（例えば、少なくとも３、４、または５つのＣＤＲ）マウス抗体由来のＣＤＲでも作製され得る（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【０２４７】
いくつかの抗体では、ＣＤＲの一部、すなわちＳＤＲと呼ばれる結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットのみが、ヒト化抗体内の結合を保持するために必要である。抗原に接触せず、ＳＤＲ内に位置しないＣＤＲ残基は、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）外に存在するＫａｂａｔＣＤＲの領域から、分子モデリングによって及び／若しくは実験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４に記載されているように、先行研究に基づいて同定され得る（例えば、ＣＤＲ  Ｈ２内の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要ではないことが多い）。このようなヒト化抗体では、１つ以上のドナーＣＤＲ残基が存在しない、またはドナーＣＤＲ全体が欠如している位置にて、その位置を占有するアミノ酸は、アクセプター抗体配列において（Ｋａｂａｔ番号付けにより）対応する位置を占有アミノ酸であり得る。ＣＤＲ内のドナーアミノ酸に対するアクセプターのこのような置換をいくつ含むかは、競合する考察のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体内のマウスアミノ酸数を減少させ、結果として潜在的な免疫原性を減少させる点で有利な可能性がある。しかしながら、置換はまた、親和性の変化を引き起こし得るので、親和性の著しい低下を好ましくは回避する。ＣＤＲ内の置換の位置及び置換するアミノ酸も、実験的に選択され得る。
【０２４８】
ヒトアクセプター抗体配列は、場合により多くの既知のヒト抗体配列中から選択され、ヒトアクセプター配列可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間に高い配列同一性（例えば、６５〜８５％の同一性）を提供することができる。
【０２４９】
重鎖のアクセプター配列の一例は、ＮＣＢＩアクセッションコードＢＡＣ０１５３０．１（配列番号７５）を有するヒト成熟重鎖可変領域である。このアクセプター配列は、マウス１９Ｃ１２重鎖と同じカノニカル形態を有する２つのＣＤＲを含む。軽鎖のアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＢＡ７１３６７．１及びＡＢＩ７５１６２．１（それぞれ配列番号７６及び７７）を有するヒト成熟軽鎖可変領域である。これらのアクセプター配列は、マウス１９Ｃ１２軽鎖と同じカノニカル形態を有する３つのＣＤＲを含む。
【０２５０】
ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、ＣＤＲ構造及び／または抗原との結合に及ぼす可能性のあるそれらの影響に基づいて、置換のために選択され得る。及ぼす可能性のあるこのような影響の調査は、モデリング、特定位置のアミノ酸の特徴に関する検査、または特定のアミノ酸の置換若しくは突然変異誘発の影響の実験的観察によって行われる。
【０２５１】
例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間でアミノ酸が異なる場合、アミノ酸が以下の通りであると合理的に期待される場合には、ヒトフレームワークアミノ酸はマウス抗体由来の等価フレームワークアミノ酸で置換され得る：
（１）直接、抗原と非共有結合する、
（２）Ｋａｂａｔではなく、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるようにＣＤＲ領域に隣接する、若しくはＣＤＲ内に存在する、
（３）さもなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域から約６オングストローム以内である）、（例えば、同種の既知免疫グロブリン鎖の解析済み構造上で軽鎖または重鎖をモデリングすることにより同定される）、または
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与する残基である。
【０２５２】
Ｑｕｅｅｎ，ＵＳ５，５３０，１０１によって定義されるようなクラス（１）〜（３）からのフレームワーク残基は、交互にカノニカル残基及びバーニア残基と称されることがある。ＣＤＲループの構造を決定するのに役立つフレームワーク残基は、カノニカル残基と称されることがある（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ＆Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−８１５（１９９６））。抗原結合ループ構造を支持し、抗原への抗体の適合を微調整する役割を果たすフレームワーク残基は、バーニア残基と称されることがある（Ｆｏｏｔｅ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌ  ２２４：４８７−４９９（１９９２））。
【０２５３】
置換の候補であるその他のフレームワーク残基は、潜在的なグリコシル化部位を生成する残基である。更に、置換のその他の候補は、その位置のヒト免疫グロブリンには稀なアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価な位置からのアミノ酸、またはより典型的なヒト免疫グロブリンの等価な位置からのアミノ酸で置換され得る。
【０２５４】
例示的なヒト化抗体は、マウス１９Ｃ１２抗体のヒト化形態であり、Ｈｕ１９Ｃ１２と称される。マウス抗体は、配列番号１５及び配列番号１６をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖及び軽鎖可変領域を含む。本発明は、３つの例示したヒト化成熟重鎖可変領域、すなわちＨｕ１９Ｃ１２ＶＨｖ１（Ｈ１、配列番号８０）、Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨｖ２（Ｈ２、配列番号８１）、及びＨｕ１９Ｃ１２ＶＨｖ３（Ｈ３、配列番号８２）を提供する。本発明は更に、６つの例示したヒト成熟軽鎖可変領域、すなわちＨｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ１（Ｌ１、配列番号８３）、Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ２（Ｌ２、配列番号：８４）、Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ３（Ｌ３、配列番号８５）、Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ４（Ｌ４、配列番号８６）、Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ５（Ｌ５、配列番号８７）、及びＨｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ６（Ｌ６、配列番号８８）を提供する。
【０２５５】
いくつかの理由、例えばＣＤＲ構造及び／または抗原への結合に影響を与え得ること、重鎖及び軽鎖間の相互作用、定常領域との相互作用を媒介すること、望ましいまたは望ましくない翻訳後修飾の部位であること、ヒト可変領域配列におけるその位置に対する異常残基であり、それゆえ免疫原性となり得ること、ならびにその他の理由により、以下の２４箇所の可変領域フレームワークの位置、すなわちＬ１（Ｄ１Ｎ）、Ｌ９（Ｌ９Ａ）、Ｌ２２（Ｎ２２Ｓ）、Ｌ４９（Ｓ４９Ｃ）、Ｌ６８（Ｇ６８Ｒ）、Ｌ７６（Ｓ７６Ｄ）、Ｌ７７（Ｓ７７Ｐ）、Ｌ７８（Ｌ７８Ｖ）、Ｌ７９（Ｑ７９Ｅ）、Ｌ８５（Ｌ８５Ｔ）、Ｌ１００（Ｑ１００Ａ）、Ｈ１（Ｑ１Ｅ）、Ｈ１１（Ｖ１１Ｌ）、Ｈ１２（Ｋ１２Ｖ）、Ｈ１６（Ｓ１６Ａ）、Ｈ２０（Ｖ２０Ｉ）、Ｈ２７（Ｇ２７Ｙ）、Ｈ２８（Ｔ２８Ａ）、Ｈ３８（Ｒ３８Ｋ）、Ｈ４３（Ｑ４３Ｅ）、Ｈ４８（Ｍ４８Ｉ）、Ｈ６９（Ｉ６９Ｌ）、Ｈ９１（Ｙ９１Ｆ）、及びＨ１０８（Ｍ１０８Ｔ）が、実施例にて更に規定されるように、６つの例示したヒト成熟軽鎖可変領域及び３つの例示したヒト成熟重鎖可変領域における置換の候補と考えられた。位置Ｌ４９は、その他のアミノ酸、例えばＩ、Ｔ、Ａ、Ｍ、Ｑ、またはＥなどで置換することもできるが、これはシステインへの置換と比較して、さらに安定性を改善する場合がある。
【０２５６】
本明細書において他の箇所のように、最初に述べた残基は、ＫａｂａｔのＣＤＲをヒトアクセプターフレームワークに移植することにより形成されるヒト化抗体の残基であり、次に述べた残基は、このような残基を置換すると考えられる残基である。従って、可変領域フレームワーク内では、最初に述べた残基はヒトであり、ＣＤＲ内では、最初に述べた残基はマウスである。
【０２５７】
例示した抗体は、例示した成熟重鎖及び軽鎖可変領域の任意の順列または組み合わせを含む（例えば、ＶＨｖ１／ＶＬｖ１またはＨ１Ｌ１、ＶＨｖ１／ＶＬｖ２またはＨ１Ｌ２、ＶＨｖ１／ＶＬｖ３またはＨ１Ｌ３、ＶＨｖ１／ＶＬｖ４またはＨ１Ｌ４、ＶＨｖ１／ＶＬｖ５またはＨ１Ｌ５、ＶＨｖ１／ＶＬｖ６またはＨ１Ｌ６、ＶＨｖ２／ＶＬｖ１またはＨ２Ｌ１、ＶＨｖ２／ＶＬｖ２またはＨ２Ｌ２、ＶＨｖ２／ＶＬｖ３またはＨ２Ｌ３、ＶＨｖ２／ＶＬｖ４またはＨ２Ｌ４、ＶＨｖ２／ＶＬｖ５またはＨ２Ｌ５、ＶＨｖ２／ＶＬｖ６またはＨ２Ｌ６、ＶＨｖ３／ＶＬｖ１またはＨ３Ｌ１、ＶＨｖ３／ＶＬｖ２またはＨ３Ｌ２、ＶＨｖ３／ＶＬｖ３またはＨ３Ｌ３、ＶＨｖ３／ＶＬｖ４またはＨ３Ｌ４、ＶＨｖ３／ＶＬｖ５またはＨ３Ｌ５、及びＶＨｖ３／ＶＬｖ６）またはＨ３Ｌ６）。例えば、Ｈ２Ｌ３抗体は、以下に記載されるように８つの重鎖復帰突然変異またはその他の突然変異及び１１個の軽鎖復帰突然変異を含み、ラミニンα４に結合し、キメラ１９Ｃ１２抗体と実質的に同じレベルでラミニンα４とのＭＣＡＭ結合を阻害する（図１５〜１８を参照のこと）。同等の結果が、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６抗体で確認される（図１５〜１８を参照のこと）。
【０２５８】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈ２（配列番号８１）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｌ３（配列番号８５）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す、Ｈ２Ｌ３ヒト化１９Ｃ１２抗体のバリアントを提供する。いくつかのこのような抗体では、Ｈ２Ｌ３における復帰突然変異またはその他の突然変異のうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個すべてが保持される。本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈ３（配列番号８２）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｌ６（配列番号８８）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す、Ｈ３Ｌ６ヒト化１９Ｃ１２抗体のバリアントも提供する。いくつかのこのような抗体では、Ｈ３Ｌ６における復帰突然変異またはその他の突然変異のうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６すべてが保持される。いくつかの抗体では、Ｖｈ領域における位置Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ４８、Ｈ９１、及びＨ１０８のうち少なくとも１つが、それぞれＬ、Ｖ、Ａ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｆ、及びＴによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｈ領域における位置Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ４８、Ｈ９１、及びＨ１０８は、それぞれＬ、Ｖ、Ａ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｆ、及びＴによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｈ領域における位置Ｈ１、Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４３、及びＨ６９のうち少なくとも１つが、それぞれＥ、Ｉ、Ｋ、Ｅ、及びＬによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｈ領域における位置Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４３、及びＨ６９は、バージョンＨ１などにおいて、それぞれＩ、Ｋ、Ｅ、及びＬによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｈ領域における位置Ｈ１は、バージョンＨ３などにおいてＥによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ９、Ｌ２２、及びＬ８５のうち少なくとも１つが、それぞれＡ、Ｓ、及びＴによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ９、Ｌ２２、及びＬ８５は、それぞれＡ、Ｓ、及びＴによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ１、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００のうち少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ１、Ｌ４９、及びＬ６８は、バージョンＬ１などにおいて、それぞれＮ、Ｃ、及びＲによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ１は、バージョンＬ２などにおいてＮによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ１、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００は、バージョンＬ３などにおいて、それぞれＮ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ１、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００は、バージョンＬ４などにおいて、それぞれＮ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ７７は、バージョンＬ５などにおいてＰによって占有される。いくつかの抗体では、Ｖｋ領域における位置Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、及びＬ１００は、バージョンＬ６などにおいて、それぞれＰ、Ｖ、Ｅ、及びＡによって占有される。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、Ｈ２Ｌ３のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり得、それらはマウスドナー抗体のものと同じである。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ）によって定義され得るが、好ましくはＫａｂａｔによって定義される通りである。
【０２５９】
本発明は、その他の例示したＨｕ１９Ｃ１２抗体のバリアントも提供する。このようなバリアントは、例示したヒト化１９Ｃ１２  Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ３、Ｈ１Ｌ４、Ｈ１Ｌ５、Ｈ１Ｌ６、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ５、Ｈ２Ｌ６、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４、Ｈ３Ｌ５、またはＨ３Ｌ６抗体の成熟軽鎖及び重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す成熟軽鎖及び重鎖可変領域を有する。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、マウスドナー抗体のものと同一または実質的に同一であり得る。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ）によって定義され得るが、好ましくはＫａｂａｔによって定義される通りである。その他のこのようなバリアントは典型的に、少数（例えば、典型的には１、２、３、５、１０、または１５以下）の置換、欠失または挿入によって、例示したＨｕ１９Ｃ１２抗体の配列と異なる。このような差異は、通常フレームワーク内に存在するが、ＣＤＲ内にも生じ得る。
【０２６０】
ヒト化１９Ｃ１２バリアントの更なる種類に関する１つの可能性は、可変領域フレームワークにおける更なる復帰突然変異である。ヒト化ｍＡｂ内のＣＤＲと接触しないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスｍＡｂまたはその他のマウス若しくはヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸置換を保有し得、多くの潜在的なＣＤＲ接触残基であっても、置換の影響を受けやすい。ＣＤＲ内のアミノ酸であっても、例えば、可変領域フレームワークをもたらすために使用されるヒトアクセプター配列の対応する位置で見られる残基で、変更される場合がある。加えて、代わりのヒトアクセプター配列を、例えば、重鎖及び／または軽鎖のために使用することができる。異なるアクセプター配列を使用する場合、上で推奨した復帰突然変異の１つ以上が行われない場合もあるが、それは対応するドナー及びアクセプター残基が既に同じで復帰突然変異を伴わないためである。
【０２６１】
好ましくは、Ｈｕ１９Ｃ１２の置換または復帰突然変異（保存的であってもなくても）は、ヒト化ｍＡｂの結合親和性または効力、すなわちラミニンα４とＭＣＡＭ及び／またはインテグリンα６β１との結合を阻害するその能力に対して実質的な影響を有しない（例えば、バリアントヒト化１９Ｃ１２抗体の、本実施例に記載されたいくつかまたはすべてのアッセイにおける効力が、本質的に同じである、すなわち実験誤差内でマウス１９Ｃ１２またはＨ２Ｌ３の効力と同じである）。
【０２６２】
Ｄ．キメラ及びベニア化抗体
本発明は更に、非ヒト抗体、特に実施例の１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、または１２Ｄ３抗体のキメラ及びベニア化形態を提供する。
【０２６３】
キメラ抗体とは、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域を、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域と組み合わせた抗体である。このような抗体は、実質的にまたは完全にマウス抗体の結合特異性を保持し、約３分の２がヒト配列である。
【０２６４】
ベニア化抗体はヒト化抗体の一種であり、非ヒト抗体のいくつか及び通常すべてのＣＤＲならびにいくつかの非ヒト可変領域フレームワーク残基を保持するが、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープに寄与する場合もあるその他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）を、ヒト抗体配列の対応する位置からの残基で置換しているものである。結果として、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換によってよりヒト様にされた抗体が得られる。１９Ｃ１２抗体のベニア化形態が、本発明に含まれる。
【０２６５】
Ｅ．ヒト抗体
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに対するヒト抗体が、以下に記載される様々な技術によって提供される。いくつかのヒト抗体は、競合結合実験によって、上記Ｗｉｎｔｅｒのファージディスプレイ方法によって、またはさもなければ、特定のマウス抗体、例えば実施例に記載されているマウスモノクローナル抗体の１つなどと同じエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体は、ラミニンα４、例えばＧドメインのＬＧ１〜３モジュールのみを含有するラミニンα４バリアントなどの断片のみを標的抗原として使用することにより、かつ／またはラミニンα４バリアント、例えばＧドメインのＬＧ１〜３モジュール、ＧドメインのＬＧ１〜５モジュール、及びＧドメインのＬＧ４〜５モジュールを含有するラミニンα４バリアントなどの集合体に対して抗体をスクリーニングすることにより、特定のエピトープ特異性についてスクリーニングすることもできる。
【０２６６】
ヒト抗体を作製する方法としては、ＯｅｓｔｂｅｒｇらのＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号、及びＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ方法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７（１９９３）；ＵＳ５，８７７，３９７，ＵＳ５，８７４，２９９，ＵＳ５，８１４，３１８，ＵＳ５，７８９，６５０，ＵＳ５，７７０，４２９，ＵＳ５，６６１，０１６，ＵＳ５，６３３，４２５，ＵＳ５，６２５，１２６，ＵＳ５，５６９，８２５，ＵＳ５，５４５，８０６，Ｎａｔｕｒｅ  １４８，１５４７−１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６），Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ９１／１０７４１（１９９１）を参照のこと）ならびにファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１ならびにＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７，ＵＳ５，８７７，２１８，ＵＳ５，８７１，９０７，ＵＳ５，８５８，６５７，ＵＳ５，８３７，２４２，ＵＳ５，７３３，７４３及びＵＳ５，５６５，３３２を参照のこと）が挙げられる。
【０２６７】
Ｆ．定常領域の選択
キメラ、ヒト化（ベニア化を含む）、またはヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結され得る。定常領域の選択は、抗体依存性補体及び／または細胞媒介性細胞傷害が望ましいか否かに、部分的に依存する。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、補体媒介性細胞傷害を有するが、ヒトアイソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は有しない。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも強力な細胞媒介性エフェクター機能を誘導する。抗体への含有に好適なヒトＩｇＧ１定常領域は、配列番号８９の配列を有し得る。配列番号８９のＣ末端リジンは除去され得、その場合、ＩｇＧ１定常領域は配列番号１４０のアミノ酸配列を有する。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。抗体への含有に好適なヒトカッパ軽鎖定常領域は、配列番号１３９の配列を有し得る。配列番号１３９は、配列番号１４９の核酸配列によってコードされ得る。配列番号１３９のＮ末端アルギニンは除去され得、その場合、カッパ軽鎖定常領域は配列番号９０のアミノ酸配列を有する。配列番号９０は、配列番号１５１の核酸配列によってコードされ得る。抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含有する四量体として、分離した重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖとして、または重鎖及び軽鎖可変ドメインがスペーサーにより連結された単鎖抗体として発現し得る。
【０２６８】
ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変異型及びイソアロタイプ変異型を示す。すなわち、定常領域は異なる個体において１つ以上の多形位置にて相違し得る。イソアロタイプを認識する血清が１つ以上のその他のアイソタイプの非多形領域に結合する点で、イソアロタイプはアロタイプと異なる。従って、例えば、別の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１のＧ１ｍ３アロタイプのものであり、配列番号１３８のアミノ酸配列を有する。配列番号１３８は、配列番号１４８の核酸配列によってコードされ得る。ＩｇＧ１  Ｇ１ｍ３アロタイプの別の重鎖定常領域は、配列番号１５０のアミノ酸配列を有する。ヒト定常領域への言及は、任意の天然アロタイプまたは天然アロタイプにおいて多形位置を占有する残基の任意の順列を有する定常領域を含む。
【０２６９】
軽鎖及び／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における１つまたはいくつかのアミノ酸、例えば重鎖のＣ末端リジンなどは、分子の一部またはすべてにおいて欠損または誘導体化されてよい。置換は定常領域において行われ得、補体媒介性細胞傷害若しくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能が低下若しくは増加するか（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８３４，５９７号；及びＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：４００５，２００６を参照のこと）、またはヒトにおいて半減期を延長させる（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照のこと）。例示的な置換としては、抗体の半減期を増加させるための、位置２５０のＧｌｎ及び／または位置４２８のＬｅｕ（ＥＵ番号付け）が挙げられる。位置２３４、２３５、２３６及び／または２３７のいずれかでの置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体への親和性を低下させる（例えば、ＵＳ６，６２４，８２１を参照のこと）。ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５、及び２３７でのアラニン置換は、エフェクター機能を低下させるために使用され得る。場合により、ヒトＩｇＧ２における位置２３４、２３６及び／または２３７は、アラニンで置換され、位置２３５はグルタミンで置換される。例えば、ＵＳ５，６２４，８２１を参照のこと。いくつかの抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９、及び３３１のうち１つ以上での突然変異が使用される。いくつかの抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる位置３１８、３２０、及び３２２のうち１つ以上での突然変異が使用される。いくつかの抗体では、位置２３４及び／若しくは２３５はアラニンで置換され、かつ／または位置３２９はグリシンで置換される。いくつかの抗体では、配列番号１５０などにおいて位置２３４及び２３５はアラニンで置換される。いくつかの抗体では、アイソタイプはヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
【０２７０】
Ｇ．組換え抗体の発現
抗体発現細胞株（例えば、ハイブリドーマ）を使用して、キメラ及びヒト化抗体を産生する多数の方法が知られている。例えば、抗体の免疫グロブリン可変領域は、周知の方法を使用してクローニングして配列を決定することができる。１つの方法では、重鎖可変ＶＨ領域を、ハイブリドーマ細胞から調製されるｍＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。コンセンサスプライマーを、５’プライマーとしての翻訳開始コドンを包含するＶＨ領域リーダーペプチド及びｇ２ｂ定常領域特異的３’プライマーに用いる。例示的なプライマーは、Ｓｃｈｅｎｋら（以下、「Ｓｃｈｅｎｋ」）による米国特許公開公報第ＵＳ２００５／０００９１５０号に記載されている。複数の、個別に誘導されたクローン由来の配列を比較し、増幅中に改変が導入されていないことを確認する。ＶＨ領域の配列を、５’ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲ法及び３’ｇ２ｂ特異的プライマーによって得られたＶＨ断片の配列を決定することにより決定または確認することもできる。
【０２７１】
軽鎖可変ＶＬ領域を、類似の方法でクローニングすることができる。１つの手法では、翻訳開始コドンを包含するＶＬ領域にハイブリダイズするように設計された５’プライマー及びＶ−Ｊ結合領域下流のＣｋ領域に特異的な３’プライマーを使用して、コンセンサスプライマーセットをＶＬ領域の増幅のために設計する。第２の手法では、５’ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングする。例示的なプライマーは、上記Ｓｃｈｅｎｋに記載されている。次いで、クローニングした配列を、ヒト（または、その他の非ヒト種）定常領域をコードする配列と組み合わせる。ヒト定常領域をコードする例示的な配列としては、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする配列番号８９、及びヒトカッパ軽鎖定常領域をコードする配列番号９０が挙げられる。
【０２７２】
１つの手法では、重鎖及び軽鎖可変領域を、各ＶＤＪまたはＶＪ連結の下流にスプライスドナー配列をコードするように再構成して、哺乳動物発現ベクター、例えば重鎖用のｐＣＭＶ−ｈγ１及び軽鎖用のｐＣＭＶ−Ｍｃｌなどにクローニングする。これらのベクターは、挿入された可変領域カセットの下流にエキソン断片としてヒトγ１及びＣｋ定常領域をコードする。配列検証後、重鎖及び軽鎖発現ベクターをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトして、キメラ抗体を産生することができる。トランスフェクションから４８時間後に馴化培地を収集し、抗体産生についてはウェスタンブロット分析または抗原結合についてはＥＬＩＳＡによってアッセイする。キメラ抗体は、上記の通りにヒト化させる。
【０２７３】
キメラ、ベニア化、ヒト化、及びヒト抗体は、典型的には組換え発現によって産生される。組換えポリヌクレオチド構築物としては典型的に、天然関連または異種発現制御要素を含む、抗体鎖のコード配列に機能的に連結される発現制御配列、例えばプロモーターなどが挙げられる。発現制御配列は、真核生物または原核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター内のプロモーター系であり得る。一旦ベクターが適切な宿主内に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集及び精製に好適な条件下で維持される。
【０２７４】
これらの発現ベクターは典型的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの必須部分のいずれかとして、宿主生物内で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換したそれらの細胞を検出することができるように選択マーカー、例えばアンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。
【０２７５】
Ｅ．ｃｏｌｉは、抗体、特に抗体断片を発現させるのに有用な原核生物宿主の１つである。酵母などの微生物もまた、発現に有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、所望の発現制御配列、複製起点、終結配列などを有する好適なベクターを含む酵母宿主である。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトース及びガラクトース利用を担う酵素由来のプロモーターが挙げられる。
【０２７６】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはそれらの断片をコードするヌクレオチドセグメントの発現に使用され得る。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照のこと。無傷異種タンパク質を分泌する多数の好適な宿主細胞株が開発され、これらの細胞株としては、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０及びＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫が挙げられる。細胞は、非ヒト細胞であり得る。これらの細胞に対する発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびに必要な処理情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列などを含み得る。発現制御配列としては、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターを挙げることができる。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。
【０２７７】
あるいは、抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入と、それに続くトランスジェニック動物のミルク中での発現のために、導入遺伝子内に組み込むことができる（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、米国特許第５，３０４，４８９号、米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。好適な導入遺伝子としては、乳腺特異的遺伝子、例えばカゼインまたはベータラクトグロブリンなどに由来するプロモーター及びエンハンサーと機能的に連結される軽鎖及び／または重鎖のためのコード配列が挙げられる。
【０２７８】
関心対象のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じた方法によって宿主細胞へと移すことができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に一般に利用されるが、リン酸カルシウム処置、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、バイオリスティック法、またはウイルスに基づくトランスフェクションは、その他の細胞宿主に使用され得る。哺乳動物細胞の形質転換に使用されるその他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション法、及びマイクロインジェクション法の使用が挙げられる。トランスジェニック動物の作製のために、導入遺伝子を受精卵母細胞中に微量注入することができるか、または胚幹細胞のゲノムに組み込むことができ、このような細胞の核を除核卵母細胞に移すことができる。
【０２７９】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクター（複数可）を細胞培養に導入した後、細胞プールを、無血清培地において増殖生産性及び生成物品質についてスクリーニングすることができる。次いで、生産性の最も高い細胞プールに対してＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングを実施し、モノクローナル株を生成することができる。７．５ｇ／Ｌ培養物を超える生成物力価に相当する、細胞当たり１日５０ｐｇまたは１００ｐｇを超える特定の生産性を使用することができる。単一細胞クローンにより産生された抗体を、濁度、濾過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ−ＳＥＣ、糖質−オリゴ糖マッピング、質量分析、及び結合アッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅについて試験することもできる。次いで、選択したクローンを複数のバイアル内に保存し、後で使用するために凍結保存することができる。
【０２８０】
抗体が発現したら、プロテインＡ捕捉、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該技術の標準手順に従って抗体を精製することができる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照のこと）。
【０２８１】
抗体を商業生産するために、コドン最適化、プロモーターの選択、転写要素の選択、ターミネーターの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞バンキング、コピー数増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、またはタンパク質力価の向上を含む方法を用いることができる（例えば、ＵＳ５，７８６，４６４、ＵＳ６，１１４，１４８、ＵＳ６，０６３，５９８、ＵＳ７，５６９，３３９、Ｗ０２００４／０５０８８４、Ｗ０２００８／０１２１４２、Ｗ０２００８／０１２１４２、Ｗ０２００５／０１９４４２、Ｗ０２００８／１０７３８８、及びＷ０２００９／０２７４７１、ならびにＵＳ５，８８８，８０９を参照のこと）。
【０２８２】
Ｈ．核酸
本発明は更に、上記重鎖及び軽鎖のいずれか（例えば、配列番号９１〜９２、９５〜９６、９９〜１０１、１０５〜１０６、１０９〜１１１、及び１１５〜１２３）をコードする核酸を提供する。配列番号１４６、１４８、１４９、及び１５１は、上記重鎖及び軽鎖をコードする核酸の更なる例である。典型的には、本核酸は、成熟重鎖及び軽鎖に融合したシグナルペプチドもコードする（例えば、配列番号１７、２７、３８、３９、５２、６３、及び６４（重鎖）ならびに配列番号１８、２８、４０、５３、及び６５（軽鎖）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、それぞれ配列番号９３、９７、１０２、１０３、１０７、１１２、及び１１３（重鎖）、ならびにそれぞれ配列番号９４、９８、１０４、１０８、及び１１４（軽鎖）によってコードされ得る）。シグナルペプチド（重鎖）の更なる例は、配列番号１４２のアミノ酸配列を有し、配列番号１４７によってコードされ得る。核酸のコード配列は、調節配列と機能的に連結され、コード配列、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどを確実に発現させることができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、単離形態で生じ得るか、または１つ以上のベクターにクローニングされ得る。核酸は、例えば固体状態合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって合成され得る。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、１つの連続した核酸として、例えば発現ベクター内で連結され得るか、または分離して、例えばそれ自体の発現ベクターに各々クローニングされ得る。
【０２８３】
Ｉ．複合化抗体
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに特異的に結合する複合化抗体は、破壊のために癌若しくは腫瘍細胞を標的とすること、自己免疫疾患に関与する細胞を標的とすること、または様々な望ましくない免疫応答を抑制することに有用であり得る。このような抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール発現により、少なくとも部分的に媒介される任意のその他の疾患を標的とすることにも有用であり得る。例えば、このような抗体は、その他の治療的部分、その他のタンパク質、その他の抗体、及び／または検出可能な標識と複合化され得る。ＷＯ０３／０５７８３８；ＵＳ８，４５５，６２２を参照のこと。このような治療的部分は、患者の望ましくない状態または疾患、例えば癌、自己免疫疾患、または望ましくない免疫応答などを処置する、闘う、治す、予防する、または改善するために使用され得る任意の剤であり得る。治療的部分としては、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、放射線療法剤、免疫調節剤、または抗体の活性を促進若しくは増強させる任意の生物学的に活性な剤を挙げることができる。細胞毒性剤は、細胞に対して毒性がある任意の剤であり得る。細胞増殖抑制剤は、細胞増殖を阻害する任意の剤であり得る。免疫調節剤は、免疫応答の発生または維持を刺激または阻害する任意の剤であり得る。放射線療法剤は、放射線を発する任意の分子または化合物であり得る。このような治療的部分が、本明細書に記載される抗体などのラミニンα４特異的抗体に結合される場合、結合した治療的部分は、ラミニンα４発現細胞またはラミニンα４結合パートナーを発現する細胞、例えばＭＣＡＭ発現細胞などに対して、その他の細胞に対するよりも特異的親和性を有することになる。結果として、複合化抗体の投与は、その他の周囲の細胞及び組織に対する影響を最小限にしながら、このような細胞を直接標的とする。このことは、それら単独で投与するには有毒すぎる治療的部分に対して特に有用であり得る。加えて、より少量の治療的部分が使用され得る。
【０２８４】
いくつかのこのような抗体は、免疫毒素として機能するように改変され得る。例えば、米国特許第５，１９４，５９４号を参照のこと。例えば、植物由来の細胞毒素であるリシンは、二官能性試薬を使用することにより、すなわち抗体に対してＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を使用し、かつリシンに対して３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルを使用することにより、抗体に結合され得る。Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１６）：４４６９−４４７６（１９９８）を参照のこと。この結合により、リシンのＢ鎖結合活性が喪失するが、リシンのＡ鎖の毒性及び抗体の活性のいずれも損なわれない。同様に、リボソーム集合の阻害剤であるサポリンは、化学的に挿入したスルフヒドリル基間のジスルフィド結合によって抗体に結合され得る。Ｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：１２１５−１２２２（２００４）を参照のこと。
【０２８５】
いくつかのこのような抗体は、放射性同位体に連結され得る。放射性同位体の例としては、例えば、イットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、及びビスマス２１３が挙げられる。放射性同位体と抗体との連結は、従来の二官能性キレートで実施されてよい。放射性銀−１１及び放射性銀−１９９連結については、硫黄ベースのリンカーが使用されてよい。Ｈａｚｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：１−７（１９９４）を参照のこと。銀放射性同位体の連結は、アスコルビン酸による免疫グロブリンの還元を伴う場合がある。１１１Ｉｎ及び９０Ｙなどの放射性同位体については、イブリツモマブチウキセタンが使用され得る。イブリツモマブチウキセタンはこのような同位体と反応し、それぞれ１１１Ｉｎ−イブリツモマブチウキセタン及び９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタンを形成することになる。Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９１−Ｓ９５（２００１）を参照のこと。
【０２８６】
いくつかのこのような抗体は、その他の治療的部分に連結され得る。このような治療的部分は、例えば、細胞毒性または細胞増殖抑制性であり得る。例えば、抗体は、メイタンシン、ゲルダナマイシンなどの毒性化学療法薬、チューブリン結合剤（例えば、アウリスタチン）などのチューブリン阻害剤、またはカリケアマイシンなどの副溝結合剤と複合化され得る。その他の代表的な治療的部分としては、癌若しくは望ましくない免疫応答（例えば、自己免疫疾患）、または癌若しくは望ましくない免疫応答（例えば、自己免疫疾患）の症状の処置、管理、若しくは改善に有用であると知られている剤が挙げられる。このような治療薬の例は、本明細書内の他の箇所に開示されている。
【０２８７】
抗体は、その他のタンパク質とも結合され得る。例えば、抗体はＦｙｎｏｍｅｒと結合され得る。Ｆｙｎｏｍｅｒは、ヒトＦｙｎＳＨ３ドメインに由来する小さな結合タンパク質（例えば、７ｋＤａ）である。それらは安定かつ可溶性であり得、かつシステイン残基及びジスルフィド結合を欠き得る。Ｆｙｎｏｍｅｒを抗体と同じ親和性及び特異性の標的分子に結合するように操作することができる。それらは、抗体に基づく多特異的融合タンパク質の作製に好適である。例えば、Ｆｙｎｏｍｅｒを抗体のＮ末端及び／またはＣ末端に融合させて、異なる構造を有する二重及び三重特異性ＦｙｎｏｍＡｂを作製することができる。Ｆｙｎｏｍｅｒは、最適特性を有するＦｙｎｏｍｅｒを効率的に選択することができようにする、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、及び細胞に基づくアッセイを使用したスクリーニング技術により、Ｆｙｎｏｍｅｒライブラリを使用して選択され得る。Ｆｙｎｏｍｅｒの例は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６−３２０４（２００７）；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０：５７−６８（２００７）；Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．４：４９７−５０８（２０１１）；Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９（Ｐｔ６）：１１２４−１１３７（２０１３）；及びＢｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１３：２０３０−２０３９（２０１４）で開示されている。
【０２８８】
本明細書で開示される抗体はまた、１つ以上のその他の抗体に結合または複合化され得る（例えば、抗体ヘテロ複合体を形成するために）。このようなその他の抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール内の異なるエピトープに結合し得るか、または異なる標的抗原に結合し得る。
【０２８９】
抗体は、検出可能な標識とも結合され得る。このような抗体は、例えば、癌若しくは望ましくない免疫応答（例えば、自己免疫疾患）を診断するために、癌若しくは望ましくない免疫応答（例えば、自己免疫疾患）の進行をモニタするために、かつ／または処置の有効性を評価するために使用され得る。このような抗体は、癌若しくは望ましくない免疫応答（例えば、自己免疫疾患）を有するか、若しくはそれらに罹患しやすい対象において、またはこのような対象から得られた適切な生体サンプルにおいて、このような判断を行う際に有用であり得る。抗体に結合または連結することができる代表的な検出可能な標識としては、様々な酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなど；補欠分子族、例えばストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンなど；蛍光材料、例えばウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなど；発光材料、例えばルミノールなど；生物発光材料、例えばルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンなど；放射性材料、例えば放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、ビスマス２１３、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎなど；様々な陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属；非放射性常磁性金属イオン；ならびに放射性標識された、または特定の放射性同位体に複合化された分子が挙げられる。
【０２９０】
治療的部分、その他のタンパク質、その他の抗体、及び／または検出可能な標識は、当該技術分野において既知の技術を使用してマウス抗体、キメラ抗体、ベニア化抗体、またはヒト化抗体に、中間体（例えば、リンカー）によって直接的または間接的に結合または複合化されてよい。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，」ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，」ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，」ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，」ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。好適なリンカーとしては、例えば、開裂可能なリンカー及び開裂不可能なリンカーが挙げられる。酸性若しくは還元条件下で、特定のプロテアーゼに曝露して、またはその他の規定した条件下で、結合した治療的部分、タンパク質、抗体、及び／または検出可能な標識を放出する異なるリンカーを用いることができる。
【０２９１】
Ｖ．治療用途
本発明の抗体またはその他のアンタゴニストは、様々な望ましくない免疫応答、好ましくは炎症部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤、より好ましくはＴＨ１７細胞の浸潤を伴う免疫応答を抑制するために使用され得る。内皮基底膜中にラミニンα４を配置することによって、組織への内皮浸透を試みるＴＨ１７細胞の接着を増大させることにより、または適切な侵入機構にシグナル伝達するための接着に基づくゲーティング系として機能することによって、ラミニンα４が機能することが証明される。実施例で実証されるように、ＭＣＡＭとラミニンα４との結合は、単独でまたはインテグリンα６β１とラミニンα４との結合を組み合わせたいずれかで、このプロセスに寄与し得る。
【０２９２】
望ましくない免疫応答を特徴とする免疫障害のいくつかのカテゴリーは、セクションＩＩＩに記載されている。例えば、本発明の抗体により処置可能な１つの免疫障害とは、移植片拒絶である。特に、抗体は、受容者の同種抗原誘導免疫応答を遮断するのに有用である。本発明の抗体により処置可能な別の免疫障害は、ＧＶＨＤである。本発明の抗体により処置可能な別の免疫障害は、自己免疫疾患のカテゴリーであり、例えば糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、スティフマン症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、セリアック病、乾癬、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、及びブドウ膜炎などである。本発明の抗体により処置可能なその他の免疫障害としては、アレルギー、アレルギー応答、ならびにアレルギー性疾患、例えば喘息及びアレルギー性接触皮膚炎などが挙げられる。
【０２９３】
本発明の抗体により処置可能なその他の障害としては、癌が挙げられる。癌は、造血器悪性腫瘍または固形腫瘍、すなわち過度な細胞成長または増殖に起因する細胞の腫瘤であり、良性または悪性のいずれかで、前癌類を含み得る。癌は、良性、悪性、または転移性であり得る。転移癌とは、癌が最初に現れた場所から体内の別の場所へと広がった癌を指す。転移癌細胞により形成された腫瘍は、転移性腫瘍または転移と呼ばれ、これは癌細胞が体内のその他の部分へと広がるプロセスを指すのにも使用される用語である。一般に、転移癌は、原発癌、または原発性癌と同じ癌細胞の名称及び同じ癌細胞の種類を有する。癌の例としては、固形腫瘍、例えば黒色腫、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫などが挙げられる。癌としては、血液悪性腫瘍、例えば白血病、またはリンパ腫などのリンパ性悪性腫瘍なども挙げられる。このような癌のより詳細な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌または胃の癌、膵臓癌、神経膠腫、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓の癌または腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、及び頭頸部癌が挙げられる。抗体は、癌を有するまたは癌の危険性がある患者において、癌の処置または癌の予防をもたらすために使用され得る。いくつかの場合には、患者は、脳癌または別の種類のＣＮＳ若しくは頭蓋内腫瘍を有する。例えば、患者は、星状細胞腫瘍（例えば、星細胞腫、退形成星細胞腫、膠芽腫、毛様細胞性星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、多形黄色星細胞腫）、乏突起膠細胞腫瘍（例えば、乏突起膠腫、退形成乏突起膠腫）、上衣細胞腫瘍（例えば、上衣腫、退形成上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下腫）、混合性神経膠腫（例えば、混合乏突起星細胞腫、退形成乏突起星細胞腫）、原因不明の神経上皮腫瘍（例えば、極性海綿芽細胞腫、星状芽細胞腫、大脳神経膠腫症）、脈絡叢の腫瘍（例えば、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌腫）、ニューロン若しくは混合性ニューロン神経膠腫瘍（例えば、神経節細胞腫、小脳異形成性神経節細胞腫、神経節膠腫、退形成神経節膠腫、線維形成性乳児神経節膠腫、中枢性神経細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、嗅神経芽細胞腫）、松果体実質腫瘍（例えば、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、混合性松果体細胞腫／松果体芽細胞腫）、または神経芽細胞若しくは神経膠芽細胞要素が混合した腫瘍（例えば、髄様上皮腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、上衣芽細胞腫）を有し得る。いくつかの場合には、患者は、黒色腫、神経膠腫、膠芽腫、肺癌、または乳癌を有する。処置は、癌の成長及び／または転移の阻害を含み得る。いくつかの場合には、患者は転移癌を有する、または転移癌の危険性がある。いくつかの場合には、転移癌は、前立腺癌、肺癌、または膵臓癌であり得る。本発明は特に、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールが細胞接着に関与する癌の処置に適している。抗体とラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールとの結合は、癌の侵襲能または転移能に影響を与え得る。このような結合は、細胞増殖、成長、抗細胞死、血管新生、または癌のそ��他の特徴に関与するシグナル伝達機構にも影響を与え得る。いくつかの場合には、抗体は、内皮のＤｌｌ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を変化させることにより血管新生を中断させるか、または阻害する。いくつかの場合には、抗体による血管新生の中断または阻害は、ラミニンα４とインテグリン、例えばインテグリンα２、インテグリンα６、またはインテグリンβ１を含むインテグリンなどとの間の相互作用を中断させることを含む。抗体は、Ａｋｔ活性化の阻害により腫瘍成長を阻害し、それに続く細胞生存／増殖シグナル伝達も阻害することができる。
【０２９４】
抗体−薬物複合体は、典型的には癌細胞またはその他の標的細胞内への取り込み後に、連結した剤の細胞毒性または細胞増殖抑制効果を含む追加の作用機序を有し得る。抗体−薬物複合体はまた、腫瘍関連マクロファージ毒性を誘導する場合もある。
【０２９５】
本発明の抗体により処置可能なその他の障害としては、肥満症及び肥満関連疾患、例えば肥満関連希少疾患などが挙げられる。肥満症は、過度な食物エネルギー摂取、身体活動の不足、及び／または遺伝的感受性により引き起こされる疾患である。体格指数（ＢＭＩ）＞３５は重度の肥満症を示し、ＢＭＩ＞４０は病的肥満症を示し、ＢＭＩ＞４５は超肥満症を示す。肥満関連疾患としては、肥満に関連する、肥満により引き起こされる、または肥満に起因する疾患及び障害が挙げられる。肥満関連疾患の例としては、心血管疾患、２型糖尿病、睡眠時無呼吸症、癌、変形性関節症、喘息、脂肪肝、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられる。
【０２９６】
ＮＡＳＨは、肝炎及び脂肪蓄積を特徴とする。第一危険因子は、肥満症、糖尿病、及び脂質異常症である。肝硬変及び肝細胞癌には強い関連がある。ＮＡＳＨは、ＡＳＴ／ＡＬＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）とアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）との濃度比）の上昇に関連し、多くの場合無症状である。ＮＡＳＨの処置としては、生活様式の変化（食事及び運動）、肥満手術、ならびに吸収低下（Ｘｅｎｉｃａｌ／Ａｌｌｉ（リパーゼ阻害剤））、食欲抑制（Ｂｅｌｖｉｑ、Ｂｙｅｔｔａ、Ｓｙｍｌｉｎ、Ｑｓｙｍｉａ）、及び代謝刺激（Ｂｅｌｏｒａｎｉｂ）を含む機序を有する医薬品が挙げられる。
【０２９７】
肥満関連希少疾患の例としては、プラダー・ウィリー症候群（例えば、過食を伴う）、頭蓋咽頭腫（例えば、過食を伴う）、バルデー・ビードル症候群、コーエン症候群、及びＭＯＭＯ症候群が挙げられる。プラダー・ウィリー症候群は、１５番染色体の遺伝子欠失／サイレンシングにより引き起こされる稀な遺伝子疾患である。症状としては、神経認知症状（知的障害、自閉症的行動、制御不能な食欲（視床下部））、緩慢な代謝、及び内分泌障害（例えば、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、副腎不全（ＡＤ））が挙げられる。
【０２９８】
抗体は、障害の発症を遅らせ、重症度を低減し、更なる悪化を阻害し、かつ／または少なくとも１つの兆候若しくは症状を改善する、投与量、投与経路及び投与頻度を意味する効果的レジームで投与される。既に患者が障害に罹患している場合、このレジームは治療上有効なレジームと称され得る。患者が、一般集団と比較して障害の危険性が上昇しているが、未だ症状を現していない場合、本レジームは予防上有効なレジームと称され得る。いくつかの場合には、治療的または予防的有効性は、既存対照または同じ患者における過去の経験と比較して、個々の患者で観察され得る。その他の場合には、治療的または予防的有効性は、未処置患者の対照集団と比較した、処置患者の集団における前臨床または臨床試験において実証され得る。
【０２９９】
抗体の例示的な投与量は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）または固定投与量として１０〜１５００ｍｇである。投与量は、その他の要因の中でも患者の状態、及び処置が行われた場合はこれまでの処置への応答、すなわちその処置が予防的または治療的であるか否か、かつその障害が急性または慢性であるか否かに依存する。
【０３００】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所的、鼻腔内または筋肉内投与であり得る。いくつかの抗体は、静脈内投与または皮下投与により体循環へ投与され得る。静脈内投与は、例えば、３０〜９０分などの時間にわたる注入によるものであり得る。
【０３０１】
投与頻度は、その他の要因の中でも循環中の抗体の半減期、患者の状態及び投与経路に依存する。頻度は、患者の状態の変化または処置されている障害の進行に応じて、毎日、毎週、毎月、年４回、または不規則な間隔であり得る。静脈内投与の例示的な頻度は、連続的な処置原因にわたって毎週〜年４回であるが、より多いまたはより少ない頻度の投薬も可能である。皮下投与については、例示的な投薬頻度は毎日〜毎月であるが、より多いまたはより少ない頻度の投薬も可能である。
【０３０２】
投与される投与量の数値は、障害が急性または慢性であるか否か、及び処置に対する障害の応答に依存する。急性障害または慢性障害の急性憎悪には、１〜１０用量で多くの場合十分である。時として、急性障害または慢性障害の急性憎悪には、ボーラス単回用量、場合により分割形態のもので十分である。急性障害または急性憎悪の再発には、処置が繰り返され得る。慢性障害には、抗体は規則的間隔で、例えば毎週、隔週、毎月、年４回、６か月ごとに少なくとも１、５若しくは１０年間にわたって、または患者の生涯にわたって投与され得る。
【０３０３】
非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは無菌で実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与の投与量）で提供され得る。医薬組成物は、１種以上の生理学的及び薬学的に許容される担体、希釈剤、付形剤または補助剤を使用して製剤化され得る。製剤化は、選択した投与経路に依存する。注射では、抗体は水溶液中で、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水若しくは酢酸バッファー（注射部位での不快感を軽減するため）などで製剤化され得る。溶液は、製剤化剤、例えば懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤などを含有し得る。あるいは、抗体は、使用前に好適な賦形剤、例えば発熱物質非含有滅菌水で構成される凍結乾燥形態であり得る。
【０３０４】
本明細書に記載される抗体での処置は、処置されている障害に対して効果的なその他の処置と組み合わせることができる。免疫障害の処置について、従来の処置としては、肥満細胞脱顆粒阻害剤、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、ならびにより強力な抗炎症薬、例えばアザチオプリン、シクロホスファミド、リューケラン（ｌｅｕｋｅｒａｎ）、ＦＫ５０６及びシクロスポリンなどが挙げられる。Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）を含む生物学的抗炎症剤も、使用され得る。癌の処置に使用される場合、抗体は、化学療法、放射線、幹細胞処置、手術、またはＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、若しくはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、及びＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などを含むその他の生物製剤を用いた処置と組み合わせることができる。化学療法剤としては、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはメルファラン、カルボプラチナ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、メトトレキサート、フルダラビン、及びシタラビン、エトポシドまたはトポテカン、ビンクリスチン及びビンブラスチンが挙げられる。
【０３０５】
ＶＩ．その他の用途
本抗体は、研究との関連で、ラミニンα４を検出するために使用され得る。本抗体は、研究との関連で、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール、またはそれらの断片を検出するためにも使用され得る。本抗体は、ラミニンα４、若しくはより具体的には、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール、またはそれらの断片を検出する際の、実験室研究用の研究試薬としても使用され得る。このような使用では、本抗体は、蛍光分子、スピン標識分子、酵素、または放射性同位体で標識され得、ラミニンα４、若しくはより具体的には、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュール、またはそれらの断片のアッセイを実施するのに必要なすべての試薬を備えたキットの形態で提供され得る。本抗体を使用して、ラミニンα４、ラミニンα４を含有するラミニン、またはラミニンα４の結合パートナーを、例えばアフィニティクロマトグラフィーによって精製することもできる。
【０３０６】
本抗体は、生体サンプルにおけるラミニンα４とＭＣＡＭとの結合を阻害するためにも使用され得る。阻害は結合アッセイにおいて実証されてよく、このアッセイでは、本発明の抗体を組換えラミニンα４タンパク質、ラミニンα４陽性組織、またはラミニンα４提示細胞とプレインキュベートし、その後、組換えＭＣＡＭまたはＭＣＡＭ発現細胞をラミニンα４に結合するそれらの能力について更に評価する。阻害を示す例示的なアッセイ形式は、実施例にて提供される。場合により、試験抗体の阻害は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに結合しない無関係な対照抗体と比較して、または任意の抗体を欠く賦形剤と比較して実証され得る。いくつかの場合には、ラミニンα４とＭＣＡＭとの結合は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％〜７５％または３０％〜７０％）阻害される。
【０３０７】
本抗体は、生体サンプルにおけるラミニンα４とインテグリンα６β１との結合を阻害するためにも使用され得る。阻害は、本発明の抗体の存在下または不存在下においてラミニンα４に結合するインテグリンα６β１発現細胞の能力を評価する、結合アッセイにおいて実証されてよい。阻害を示す例示的なアッセイ形式は、実施例にて提供される。場合により、試験抗体の阻害は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに結合しない無関係な対照抗体と比較して、または任意の抗体を欠く賦形剤と比較して実証され得る。いくつかの場合には、ラミニンα４とインテグリンα６β１との結合は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％〜７５％または３０％〜７０％）阻害される。
【０３０８】
本抗体は、生体サンプルにおける細胞接着を阻害するためにも使用され得る。好ましくは、細胞接着はラミニンα４に依存する。例えば、細胞接着は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールにより媒介される。例示的な細胞接着アッセイは、実施例に記載される。いくつかの場合には、細胞接着は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％〜７５％または３０％〜７０％）阻害される。
【０３０９】
本抗体は、生体サンプルにおけるラミニンα４誘導ｐＡｋｔ活性化を阻害するためにも使用され得る。例示的なアッセイは、実施例に記載される。いくつかの方法では、ラミニンα４誘導ｐＡｋｔ活性化は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％〜７５％または３０％〜７０％）阻害される。
【０３１０】
上記または下記で引用するすべての特許申請、ウェブサイト、その他の刊行物、アクセッション番号などは、個々の項目が、参照によって組み込まれていると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、それらの内容全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる。ある配列の異なるバージョンが、異なる時点でアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日におけるアクセッション番号に関連付けられたバージョンの配列を意味する。有効出願日は、実際の出願日、またはアクセッション番号に言及する優先権出願がある場合はその出願日のうちのいずれか早い方を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、別段の指示がない限り、本出願の有効出願日に公開されている最新バージョンを意味する。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、別段の具体的な指示がない限り、任意のその他のものと組み合わせて使用され得る。本発明を、明確化及び理解を促すことを目的として例証及び例示によってある程度詳細に記載してきたが、何らかの変更及び修正を、添付の特許請求の範囲内で実施してもよいことは明らかであろう。
【実施例】
【０３１１】
実施例１．循環組換えＭＣＡＭ細胞外ドメイン及び抗ＬＡＭＡ４抗体は、ＣＮＳにおける主なＴ細胞侵入点である脈絡叢に特異的に局在化する
ＭＣＡＭの機能は腫瘍及び自己免疫モデルにおいて述べられ、ＭＣＡＭ発現は、腫瘍及びＴＨ１７細胞に接着性及び浸潤性表現型を付与すると報告されている。更に、ラミニン４１１のα４鎖は、ＭＣＡＭのリガンドであると報告されている。結果として、ＬＡＭＡ４−／−マウス及びＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を標的とする抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体の両方を使用することにより、ＬＡＭＡ４は、自己免疫マウスモデルにおけるＴ細胞浸潤及び関連するＣＮＳ炎症症状に関するＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４接着の媒介に重要であると報告されている。例えば、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２２９５−２３０３（１９９７）、Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．７（７）：ｅ４０４４３（２０１２）、及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１５：５１９−５２７．（２００９）を参照のこと。これらの報告は、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４の相互作用がＣＮＳのＴＨ１７細胞浸潤にとって重要であることを示しているが、モノクローナル抗ＬＡＭＡ４抗体を使用してＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合の相互作用を標的とすることが、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を遮断し、その後ＣＮＳのＴ細胞浸潤を遮断することに有効であるか否かは不明であった。従って、（１）ＭＣＡＭ発現Ｔ細胞の初期ＣＮＳ侵入点（複数可）が位置する非炎症脳内の場所、及び（２）循環抗ＬＡＭＡ４抗体が、この初期ＣＮＳ侵入点（複数可）を通過することができるか否かを判定することが、大きな関心事であった。
【０３１２】
ＭＣＡＭ＋Ｔ細胞の初期ＣＮＳ侵入点を同定するために、ＭＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質を生成し、健康なマウスに静脈注射した。ＣＮＳにおける脈絡脈管構造の汎ラミニン及びＭＣＡＭの染色を行った。染色によって、ＭＣＡＭ−ＦｃはＣＮＳ内の脈絡叢脈管構造に特異的に局在化するが、Ｆｃ対照タンパク質は局在化しないことが示された。脈絡組織のＬＡＭＡ４及び汎ラミニンの染色、ならびに脈絡組織のＬＡＭＡ４及びＭＣＡＭの染色も行った。染色によって、ＬＡＭＡ４及びＭＣＡＭは脈絡内皮基底膜に共局在化するが、汎ラミニン陽性基底膜には局在化しないことが示された。これらの結果は、ＬＡＭＡ４がＭＣＡＭとの内皮基底膜接着及び循環ＭＣＡＭ発現Ｔ細胞の脈管接着／遊走の両方を媒介する可能性があることを示唆した。
【０３１３】
ＭＣＡＭ−Ｆｃは脈絡内皮周囲の基底膜に特異的に蓄積するように見えるので、本ＭＣＡＭ−Ｆｃ局在化は、循環到達可能なＬＡＭＡ４タンパク質により促進されると仮定した。ＣＮＳにおける脈絡脈管構造の汎ラミニン及びＬＡＭＡ４の染色を行った。染色によって、静脈内投与した抗ＬＡＭＡ４抗体は（アイソタイプ対照抗体と比較して）、ＭＣＡＭ−Ｆｃと同一の方法で脈絡叢脈管構造／基底膜網状組織に特異的に局在化したことが示された。これらの結果は、ＴＨ１７細胞がＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４促進機構により脈絡叢を介して脳へ侵入するモデルと一致する。このモデルを更に支持するために、脈絡組織のＬＡＭＡ４及びＣＤ４の染色を行った。この染色によって、ＬＡＭＡ４＋脈絡基底膜を通過し、炎症したマウス脳内の間質空間に侵入するＣＤ４＋Ｔ細胞が検出された。
【０３１４】
実施例２．抗ＬＡＭＡ４抗体は、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を遮断する
ＬＡＭＡ４に対するモノクローナル抗体は、材料及び方法に記載の通りに生成した。モノクローナル抗体とＬＡＭＡ４との間の特異的結合を、ＬＡＭＡ４−／−マウス組織に対して野生型組織を染色するモノクローナル抗体の能力を評価することにより確認した。６５０と直接複合化した抗体５Ａ１２は、ＬＡＭＡ４陽性マウス組織の特異的染色を示したが、バックグラウンドレベルを超えてＬＡＭＡ４−／−組織を染色することはなかった。
【０３１５】
ＬＡＭＡ４に対するモノクローナル抗体を、ＬＡＭＡ４とそのリガンドであるＭＣＡＭとの結合を遮断するそれらの能力について試験した。ＩｇＧ対照抗体、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３を、組換えＬＡＭＡ４タンパク質、ＬＡＭＡ４陽性の健康なマウス脳組織、またはＬＡＭＡ４提示ヒト２９３細胞とプレインキュベートした。次いで、組換えＭＣＡＭ−ＦｃまたはＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞を、方法における材料に記載の通り、ＥＬＩＳＡ（図１）、ＬＡＭＡ４  ｐＤｉｓｐｌａｙフローサイトメトリーブロッキングアッセイ（図２Ａ及び図２Ｂ、それぞれより高い及びより低い抗体濃度を示す）、ｈＭＣＡＭ．ＣＨＯフローサイトメトリーブロッキングアッセイ（図３）、及びマウス脳組織ブロッキングアッセイにより実証されるように、ＬＡＭＡ４に結合するそれらの能力について評価した。マウス脳組織ブロッキングアッセイでは、抗体を２．５ｕｇ／ｍｌまたは０．０４ｕｇ／ｍｌの濃度で使用した。これらのアッセイはすべて、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３が、ＭＣＡＭとＬＡＭＡ４との結合を遮断することができることを示した。
【０３１６】
抗体ブロッキングをＬＡＭＡ４抗体結合活性と比較するために、相対的結合及びオン／オフ速度を、図４及び表１にそれぞれ示すようにＦｏｒｔｅＢｉｏ及びＢｉａｃｏｒｅにより分析した。１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、及び１２Ｄ３抗体のＦｏｒｔｅＢｉｏ分析を、それぞれ図４Ａ〜Ｅに示す。抗体濃度は１００ｎＭで一定に保ち、ＬＡＭＡ４の濃度は図４Ａ〜Ｅに示すように変動させた。各ＬＡＭＡ４濃度について、２本の線を図４Ａ〜Ｅに提示する。太線は生データを表し、細線は生データの統計的フィッティングを表す。ＦｏｒｔｅＢｉｏ及びＢｉａｃｏｒｅ分析の両方で、抗体結合活性はブロッキング活性と相関すると実証している。１９Ｃ１２は最も結合力が強く、一方で１２Ｄ３は最も弱かった。これらの結果を検証するために、ＩｇＧ対照抗体、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、及び１２Ｄ３とＬＡＭＡ４提示ヒト２９３細胞との結合を、図５に示すように試験した。再び、１９Ｃ１２が最適な結合抗体であることが示された。
【表１】
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【０３１７】
これらのデータは、クローン１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３のすべてが、ヒトＭＣＡＭとそのリガンドであるＬＡＭＡ４との結合を特異的に遮断することが可能であること、及びＴＨ１７細胞と脈管構造とのＭＣＡＭ媒介接着を阻害し、かつ中枢神経系へのＴＨ１７細胞の遊走を遮断することによって、多発性硬化症の処置に有用であり得ることを示す。
【０３１８】
実施例３．ＭＣＡＭ結合及びブロッキング抗ＬＡＭＡ４モノクローナル抗体のエピトープ決定
ＭＣＡＭ結合に必要なＬＡＭＡ４エピトープ（複数可）／ドメイン（複数可）を決定するために、組換えＭＣＡＭ−Ｆｃ（またはＦｃ対照）タンパク質を、ヤギ抗ヒトＦａｂによりプレートに一晩あらかじめ結合させた。ＬＡＭＡ４Ｇドメインの切断型組換えバリアント（及びタウ対照タンパク質）を、材料及び方法に記載の通りに、かつ図６に示すように、ＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質と結合するそれらの能力についてアッセイした。結果を、ｙ軸上に任意単位（Ａ．Ｕ．）で提示する。Ｆｃ対照タンパク質は、いずれのＬＡＭＡ４バリアントとも結合しなかったのに対して、ＬＧモジュール１〜５及び１〜３を含有するＬＡＭＡ４バリアントは、ＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質と強力に結合することができた。ＬＧモジュール４〜５を含有するＬＡＭＡ４バリアントは、ＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質と結合せず、タウタンパク質も同様であった。従って、ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールは、ＬＡＭＡ４−ＭＣＡＭ相互作用を媒介する。
【０３１９】
これらのＥＬＩＳＡに基づく結果を検証するために、ＬＡＭＡ４提示ヒト胎児腎細胞（２９３）と組換え６５０標識ＭＣＡＭ−Ｆｃとの結合を、図７Ａ及び図７Ｂに示すように、フローサイトメトリーにより評価した。図７Ａは、ＬＧ１〜５、ＬＧ１〜３、及びＬＧ４〜５を有するＬＡＭＡ４バリアントを提示する２９３細胞の結合を示す。図７Ｂは、ＬＧ１〜３、ＬＧｄｅ１（ＬＧ２３）、ＬＧｄｅ２（ＬＧ１３）、及びＬＧｄｅ３（ＬＧ２３）を有するＬＡＭＡ４バリアントを提示する２９３細胞の結合を示す。ＬＧｄｅ１は、ＬＧ１を除去した全長Ｇドメイン（すなわち、ＬＧ１〜５）を有し、ＬＧｄｅ２は、ＬＧ２を除去した全長Ｇドメインを有し、ＬＧｄｅ３は、ＬＧ３を除去した全長Ｇドメインを有する。組換えＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質は、ＬＡＭＡ４バリアントのＬＧ１〜５、ＬＧ１〜３、及びＬＧｄｅ１（ＬＧ２３）を発現する２９３細胞に特異的に結合することができたが、ＬＡＭＡ４バリアントのＬＧ４〜５、ＬＧｄｅ２（ＬＧ１３）、またはＬＧｄｅ３（ＬＧ１２）を発現する２９３細胞には結合することができなかった。これらの結果は、ＭＣＡＭ−ＬＡＭＡ４結合を遮断する抗ＬＡＭＡ４モノクローナル抗体は、ＧドメインのＬＧ２及びＬＧ３モジュール内に結合することができることを示している。加えて、１Ｃ１、５Ａ１２、５Ｂ５、１９Ｃ１２、及び１２Ｄ３は、ＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質と同じ様に結合し、このことは、ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールが、ＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質結合及びこれらの抗ＬＡＭＡ４ブロッキング抗体の結合の両方を媒介することを実証している。
【０３２０】
競合実験を実施して、エピトープ結合により５Ａ１２、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ｂ５、及び１２Ｄ３抗体を区別した。抗体とＬＡＭＡ４提示ヒト胎児腎細胞（２９３）との結合を、マウスＩｇＧ１を陰性対照として使用し、ブロッキング抗体対６５０標識結合抗体の減少比（５：１、１：１、及び１：５）を用いて評価した。５Ａ１２、１９Ｃ１２、１Ｃ１、５Ｂ５、及び１２Ｄ３抗体の結合を、それぞれ図８Ａ〜Ｅに示すように、フローサイトメトリーにより評価した。５つすべてのブロッキング抗体は、ＬＡＭＡ４結合について互いに競合することができ、各々、５：１比（（ブロッキング抗体）：（結合抗体））でより高いブロッキング有効性を有し、比が減少するにつれてブロッキング有効性は低下する。これらの結果は、抗ＬＡＭＡ４抗体のすべてがＬＡＭＡ４タンパク質上の類似のエピトープと結合することを示している。
【０３２１】
実施例４．抗ＬＡＭＡ４抗体の１９Ｃ１２は、インテグリンα６β１結合及びヒト黒色腫細胞接着を遮断する
標的となるＬＡＭＡ４−ＭＣＡＭ結合の機能的結果を抗ＬＧ１〜３抗体により決定するために、組換えＬＡＭＡ４コーティングＥＬＩＳＡプレートを２０ｕｇ／ｍｌの１９Ｃ１２（またはマウスＩｇＧ２ｂ対照）でインキュベートし、次いで材料及び方法に記載の通りに、かつ図９に示すように、ヒト黒色腫細胞株ＷＭ−２６６−４と結合するそれらの能力についてアッセイした。結果を、ｙ軸上に任意単位（Ａ．Ｕ．）で提示する。マウスＩｇＧ２ｂ対照は、ＬＡＭＡ４媒介細胞接着を遮断しなかったのに対して、１９Ｃ１２は、ＬＡＭＡ４媒介ヒト黒色腫細胞接着をおよそ８０％阻害することができた。これらの結果は、抗ＬＧ１〜３抗体が、腫瘍細胞接着、増殖、及び転移に必要な細胞接着事象を遮断することができることを示している。
【０３２２】
１９Ｃ１２が、ＭＣＡＭ及びインテグリン干渉の両方によりＬＡＭＡ４媒介細胞接着を遮断することができるという仮説を試験するために、ＬＡＭＡ４結合（ラミニン４１１としてそのガンマ１鎖及びベータ１鎖と複合した）を、図１０に示すように、インテグリンα６β１発現ヒト２９３細胞を使用してフローサイトメトリー分析により評価した。ＬＡＭＡ４はインテグリン過剰発現細胞と相互作用し、Ｐ４領域の比較によって示すように、１９Ｃ１２はインテグリンα６β１発現２９３ヒト細胞とのＬＡＭＡ４結合を完全に遮断することができたが、マウスＩｇＧ２ｂ対照は結合を遮断することができなかった。
【０３２３】
別の実験では、接着２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート内において３ｕｇのインテグリンベータ１及び１ｕｇのインテグリンアルファ６プラスミドで一過的にトランスフェクトした。１ｍＭのＭｎＣｌ２＋を使用して、インテグリンを活性化させた。ヒトインテグリンα６β１を発現する一過的にトランスフェクトした接着２９３Ｔ細胞は、ラミニン４１１（アルファ４、ベータ１、ガンマ１）に結合することをフローサイトメトリーにより示した。抗ＬＡＭＡ４−６５０抗体を使用して、結合したラミニン４１１を検出した。結合を、ＭＣＡＭ−Ｆｃ、５ｍＭのＥＤＴＡ、または１９Ｃ１２により阻害した。Ｆｃ単独、バッファー、及びマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照は、対照として機能し、結合を阻害しなかった。これらのデータは、ＭＣＡＭ及びインテグリンα６β１が、ＬＡＭＡ４の類似領域を認識することを示している。
【０３２４】
これらのデータは、抗ＬＧ１〜３抗体が、ＭＣＡＭ及びインテグリン分子の両方とのＬＡＭＡ４相互作用を阻害することにより、ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫細胞接着を遮断することを示し、標的となるＬＧ１〜３が、腫瘍成長及び転移を緩徐にすることに有効であり得ることを示している。
【０３２５】
実施例５．ヒト化１９Ｃ１２抗体の設計
ヒト化のための起点またはドナー抗体は、マウス抗体１９Ｃ１２である。成熟ｍ１９Ｃ１２の重鎖可変アミノ酸配列を、配列番号１５として提供する。成熟ｍ１９Ｃ１２の軽鎖可変アミノ酸配列を、配列番号１６として提供する。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１９、２０、及び２１として提供する（Ｋａｂａｔによって定義される通り）。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、それぞれ配列番号２２、２３、及び２４として提供する（Ｋａｂａｔによって定義される通り）。Ｋａｂａｔ番号付けを、本実施例の全体を通して使用する。
【０３２６】
ｍ１９Ｃ１２の可変カッパ（Ｖｋ）はマウスＫａｂａｔサブグループ５に属し、これはヒトＫａｂａｔサブグループ１に対応する。ｍ１９Ｃ１２の可変重鎖（Ｖｈ）はマウスＫａｂａｔサブグループ５ａに属し、これはヒトＫａｂａｔサブグループ１に対応する。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１を参照のこと。Ｖｋにおいて、１７残基ＣＤＲ−Ｌ１はカノニカルクラス３に属し、７残基ＣＤＲ−Ｌ２はカノニカルクラス１に属し、９残基ＣＤＲ−Ｌ３はカノニカルクラス１に属する。Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５，１９９６を参照のこと。５残基ＣＤＲ−Ｈ１はカノニカルクラス１に属し、１７残基ＣＤＲ−Ｈ２はカノニカルクラス２に属する。Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５，１９９６を参照のこと。ＣＤＲ−Ｈ３はカノニカルクラスを有しないが、６残基ループはおそらく、Ｓｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５５：１８８−９７（１９９９）の規則によると、ねじれた基部を有する。
【０３２７】
ＶｋドメインとＶｈドメインとの間の界面における残基は、通常のものである。
【０３２８】
ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３３−７，２００５）内のタンパク質配列について検索を実施し、１９Ｃ１２の大まかな構造モデルを提供することになるであろう構造を見出した。デングウイルス血清型１、２、及び３に対する抗体の結晶構造を、Ｖｋ構造に使用した。これは、ループに１９Ｃ１２と同じカノニカル構造を保持する（ｐｄｂコード２Ｒ２９、分解能３．０Ａ）。ヒトライノウイルス１４（ＨＲＶ１４）に対する抗体（ｐｄｂコード１ＦＯＲ、分解能２．７Ａ）の重鎖を、Ｖｈ構造に使用した。これは、ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２に、１９Ｃ１２ＶＨの構造と同じカノニカル構造を含有し、ねじれた基部を有する同じ長さのＣＤＲ−Ｈ３も含有する。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅを使用して、１９Ｃ１２Ｆｖの大まかな構造をモデル化した。
【０３２９】
ＣＤＲを「組み合わせた」１９Ｃ１２Ｆｖを用いたＮＣＢＩからの非冗長タンパク質配列データベースの検索によって、マウスＣＤＲを移植するのに好適なヒトフレームワークの選択が可能となった。Ｖｈについては、ＮＣＢＩアクセッションコードＢＡＣ０１５３０．１（配列番号７５）を有する、１本のヒトＩｇ重鎖を選択した。これは、１９Ｃ１２のＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２のカノニカル形態を共有し、Ｈ３は長さが１０残基であり、予測したねじれた基部を有する。Ｖｋについては、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＢＡ７１３６７．１（配列番号７６）及びＡＢＩ７４１６２．１（配列番号７７）を有する、２本のヒトカッパ軽鎖を選択した。それらは、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のカノニカルクラスが、親Ｖｋのクラスと同じである。復帰突然変異またはその他の突然変異を有しないヒト化１９Ｃ１２重鎖及び軽鎖可変領域配列を、配列番号７８及び７９として提供する。
【０３３０】
異なる置換の順列を含有する３つのヒト化重鎖可変領域バリアント及び６つのヒト化軽鎖可変領域バリアントを構築した（Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨｖ１〜３（配列番号８０〜８２）及びＨｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ１〜６（配列番号８３〜８８））（表２〜５）。選択したヒトフレームワークに基づいた復帰突然変異及びその他の突然変異を有する、例示的なヒト化Ｖｈ及びＶｋ設計を、それぞれ表２及び表３に示す。表２及び表３における最初の縦列の灰色網掛け領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるようなＣＤＲを示し、表２及び表３における残りの縦列の灰色網掛け領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲを示す。配列番号８０〜８８は、表４に示すように復帰突然変異及びその他の突然変異を含有する。Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨｖ１〜３及びＨｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ１〜６における、位置Ｈ１、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ３８、Ｈ４３、Ｈ４８、Ｈ６９、Ｈ９１、Ｈ１０８、Ｌ１、Ｌ９、Ｌ２２、Ｌ４９、Ｌ６８、Ｌ７６、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ７９、Ｌ８５、及びＬ１００のアミノ酸を、表５に列挙する。
【表２】
2017512772.tif 000004
2017512772.tif 000005
2017512772.tif 000006
2017512772.tif 000007
2017512772.tif 000008
【表３】
2017512772.tif 000009
2017512772.tif 000010
2017512772.tif 000011
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2017512772.tif 000013
2017512772.tif 000014
【表４】
2017512772.tif 000015
2017512772.tif 000016
【表５】
2017512772.tif 000017
2017512772.tif 000018
【０３３１】
置換の候補として軽鎖可変領域内の上記位置を選択する理論的根拠は、以下の通りである。
【０３３２】
Ｄ１Ｎ：ＮはＬＣＤＲ１と接触し、重要であり得る。ＮはヒトＩｇＧフレームワーク内では稀であるので、Ｄをいくつかのその他のバージョンで試した。
【０３３３】
Ｌ９Ａ：Ａは、ヒトフレームワーク内においてＤよりも頻度が高い。
【０３３４】
Ｎ２２Ｓ：Ｓは軽鎖内でＦ７１と接触し、これはカノニカル残基である。
【０３３５】
Ｓ４９Ｃ：Ｃは、ＬＣＤＲ２と接触する場合がある。Ｓを、いくつかのその他のバージョンで試した。
【０３３６】
Ｇ６８Ｒ：Ｒは軽鎖内でＦ７１と接触し、これはカノニカル残基である。しかしながら、Ｇは、ヒトフレームワーク内においてＲよりも頻度が高い。従って、Ｒをいくつかのバージョンで試し、Ｇをその他のバージョンで試した。
【０３３７】
Ｓ７６Ｄ：Ｓは、ヒトフレームワーク内においてＤよりも頻度が高い。Ｄは、重要な構造残基であるＰに近接してＰと接触する場合があるので、Ｄをいくつかのバージョンで試した。
【０３３８】
Ｓ７７Ｐ：プロリンのシス−トランス異性化は、タンパク質の折り畳みの律速段階において重要な役割を果たす。Ｐをいくつかのバージョンで試し、Ｓをその他のバージョンで試した。
【０３３９】
Ｌ７８Ｖ：Ｖは、ＶＬ  Ｐ７７と接触する場合があり、それゆえ折り畳みに影響を及ぼす場合がある。Ｌを、いくつかのその他のバージョンで試した。
【０３４０】
Ｑ７９Ｅ：Ｅは、ＶＬ  Ｐ７７と接触する場合があり、それゆえ折り畳みに影響を及ぼす場合がある。Ｑを、いくつかのその他のバージョンで試した。
【０３４１】
Ｌ８５Ｔ：Ｔは、ヒトフレームワーク内においてＶよりも頻度が高い。
【０３４２】
Ｑ１００Ａ：ＡはＶＬ  Ｙ８７、すなわち界面の重要点と接触するので重要である。Ｑを、いくつかのその他のバージョンで試した。
【０３４３】
置換の候補として重鎖可変領域内の上記位置を選択する理論的根拠は、以下の通りである。
【０３４４】
Ｑ１Ｅ：これは突然変異であるが、復帰突然変異ではない。ピログルタメート（ｐＥ）へのグルタメート（Ｅ）転換は、グルタミン（Ｑ）からの転換よりも緩徐に生じる。ｐＥ転換でグルタミン中の１級アミンを喪失するため、抗体はより酸性になる。不完全な転換は、抗体に不均一性をもたらし、この不均一性は電荷に基づく分析方法を使用すると複数のピークとして観察され得る。不均一性の差は、プロセス制御の欠如を示す場合がある。
【０３４５】
Ｖ１１Ｌ：Ｌは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＶよりも頻度が高い。
【０３４６】
Ｋ１２Ｖ：Ｖは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＫよりも頻度が高い。
【０３４７】
Ｓ１６Ａ：Ａは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＳよりも頻度が高い。
【０３４８】
Ｖ２０Ｉ：Ｉ及びＶは、ヒトＩｇＧフレームワーク内において同様の頻度であるため、Ｉをいくつかのバージョンで試し、Ｖをその他のバージョンで試した。
【０３４９】
Ｇ２７Ｙ：この残基は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるようなＨＣＤＲ１内に存在するため、Ｙを使用して結合能を維持した。
【０３５０】
Ｔ２８Ａ：この残基は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるようなＨＣＤＲ１内に存在するため、Ａを使用して結合能を維持した。
【０３５１】
Ｒ３８Ｋ：Ｒは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＫよりも頻度が高いが、ＫはＨＱ３９及びＨＷ４７、すなわち２つのカノニカル残基と接触するため、Ｋをいくつかのバージョンで試し、Ｒをその他のバージョンで試した。
【０３５２】
Ｑ４３Ｅ：Ｑは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＥよりも頻度が高いが、ＥはＬＹ８７、すなわち界面残基と接触するため、Ｅをいくつかのバージョンで試し、Ｑをその他のバージョンで試した。
【０３５３】
Ｍ４８Ｉ：Ｉは、界面残基（ＨＶ３７及びＨＷ４７）及びＨＣＤＲ２残基を含む複数の重要な残基と接触するので重要である。
【０３５４】
Ｉ６９Ｌ：Ｉは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＬよりも頻度が高いが、ＬはＨＣＤＲ２と接触するため、Ｉをいくつかのバージョンで試し、Ｌをその他のバージョンで試した。
【０３５５】
Ｙ９１Ｆ：Ｆは界面残基であり、これは重要である。
【０３５６】
Ｍ１０８Ｔ：Ｔは、ヒトＩｇＧフレームワーク内においてＭよりも頻度が高い。
【０３５７】
６つのヒト化軽鎖可変領域バリアント及び３つのヒト化重鎖可変領域バリアントは、以下の通りである。
【０３５８】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬバージョン１（Ｄ１Ｎ、Ｌ９Ａ、Ｎ２２Ｓ、Ｓ４９Ｃ、Ｇ６８Ｒ、及びＬ８５Ｔ復帰突然変異は小文字）：
ｎＩＶＬＴＱＳＰａＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩｓＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩｃＬＡＳＳＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳｒＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡｔＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８３）。
【０３５９】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬバージョン２（Ｄ１Ｎ、Ｌ９Ａ、Ｎ２２Ｓ、及びＬ８５Ｔ復帰突然変異は小文字）：
ｎＩＶＬＴＱＳＰａＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩｓＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＬＡＳＳＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡｔＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８４）。
【０３６０】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬバージョン３（Ｄ１Ｎ、Ｌ９Ａ、Ｎ２２Ｓ、Ｓ４９Ｃ、Ｇ６８Ｒ、Ｓ７６Ｄ、Ｓ７７Ｐ、Ｌ７８Ｖ、Ｑ７９Ｅ、Ｌ８５Ｔ、及びＱ１００Ａ復帰突然変異は小文字）：
ｎＩＶＬＴＱＳＰａＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩｓＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩｃＬＡＳＳＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳｒＴＤＦＴＬＴＩｄｐｖｅＡＥＤＡＡｔＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＰＴＦＧａＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８５）。
【０３６１】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬバージョン４（Ｄ１Ｎ、Ｌ９Ａ、Ｎ２２Ｓ、Ｓ７７Ｐ、Ｌ７８Ｖ、Ｑ７９Ｅ、Ｌ８５Ｔ、及びＱ１００Ａ復帰突然変異は小文字）：
ｎＩＶＬＴＱＳＰａＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩｓＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＬＡＳＳＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳｐｖｅＡＥＤＡＡｔＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＰＴＦＧａＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８６）。
【０３６２】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬバージョン５（Ｌ９Ａ、Ｎ２２Ｓ、Ｓ７７Ｐ、及びＬ８５Ｔ復帰突然変異は小文字）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰａＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩｓＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＬＡＳＳＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳｐＬＱＡＥＤＶＡｔＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８７）。
【０３６３】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＬバージョン６（Ｌ９Ａ、Ｎ２２Ｓ、Ｓ７７Ｐ、Ｌ７８Ｖ、Ｑ７９Ｅ、Ｌ８５Ｔ、及びＱ１００Ａ復帰突然変異は小文字）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰａＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩｓＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＬＡＳＳＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳｐｖｅＡＥＤＡＡｔＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＰＴＦＧａＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８８）。
【０３６４】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨバージョン１（Ｖ１１Ｌ、Ｋ１２Ｖ、Ｓ１６Ａ、Ｖ２０Ｉ、Ｇ２７Ｙ、Ｔ２８Ａ、Ｒ３８Ｋ、Ｑ４３Ｅ、Ｍ４８Ｉ、Ｉ６９Ｌ、Ｙ９１Ｆ、及びＭ１０８Ｔ復帰突然変異は小文字）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥｌｖＫＰＧａＳＶＫｉＳＣＫＡＳＧｙａＦＳＴＹＷＭＮＷＶｋＱＡＰＧｅＧＬＥＷｉＧＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴｌＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹｆＣＡＲＳＤＧＹＹＤＹＷＧＱＧＴｔＶＴＶＳＳ（配列番号８０）。
【０３６５】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨバージョン２（Ｖ１１Ｌ、Ｋ１２Ｖ、Ｓ１６Ａ、Ｇ２７Ｙ、Ｔ２８Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｙ９１Ｆ、及びＭ１０８Ｔ復帰突然変異は小文字）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥｌｖＫＰＧａＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧｙａＦＳＴＹＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷｉＧＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹｆＣＡＲＳＤＧＹＹＤＹＷＧＱＧＴｔＶＴＶＳＳ（配列番号８１）。
【０３６６】
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨバージョン３（Ｑ１Ｅ突然変異ならびにＶ１１Ｌ、Ｋ１２Ｖ、Ｓ１６Ａ、Ｇ２７Ｙ、Ｔ２８Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｙ９１Ｆ、及びＭ１０８Ｔ復帰突然変異は小文字）：
ｅＶＱＬＱＱＳＧＡＥｌｖＫＰＧａＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧｙａＦＳＴＹＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷｉＧＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹｆＣＡＲＳＤＧＹＹＤＹＷＧＱＧＴｔＶＴＶＳＳ（配列番号８２）。
【０３６７】
実施例６．ヒト化１９Ｃ１２抗体の結合速度分析
Ｈｕ１９Ｃ１２ＶＨｖ１〜３（Ｈ１〜Ｈ３）から選択した重鎖及び／またはＨｕ１９Ｃ１２ＶＬｖ１〜６（Ｌ１〜Ｌ６）から選択した軽鎖を含む、ヒト化１９Ｃ１２抗体の結合機能及び結合速度を特徴付けた。
【０３６８】
１９Ｃ１２バリアントのキメラ１９Ｃ１２、Ｈ１＋ｃｈｉＬ、及びＨ２＋ｃｈｉＬ、ならびにバッファーのみを、ＬＡＭＡ４とそのリガンドであるＭＣＡＭとの結合を遮断するそれらの能力（図１１に示す通り）、及びＬＡＭＡ４提示細胞（全長、ＬＧ１〜３、ＬＧ４〜５、または非トランスフェクト対照）と結合するそれらの能力（図１２に示す通り）について試験した。ＭＣＡＭ／ＬＡＭＡ４ブロッキング活性を試験するために、抗体を６５０標識ラミニン４１１（ＬＡＭＡ４を含有する組換えラミニン三量体）でプレインキュベートし、次いでＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞を、材料及び方法に記載の通りに６５０標識ラミニン４１１に結合するそれらの能力について評価した。「４１１無し」及び「４１１」対照条件は、それぞれ１００％及び０％のブロッキング活性を記録した。ＬＡＭＡ４結合能を試験するために、連続希釈した抗体をＬＡＭＡ４提示ヒト２９３細胞でプレインキュベートし、続いて抗ヒト６５０二次抗体でインキュベートした。蛍光シグナルをフローサイトメトリー分析により評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。ブロッキング及び結合実験は、すべての１９Ｃ１２バリアントが、ＬＧ１〜３に対するそれらのＬＡＭＡ４Ｇドメイン特異性及びＭＣＡＭとＬＡＭＡ４との結合を遮断するそれらの能力を保持したことを実証している。
【０３６９】
１９Ｃ１２可変軽鎖の位置Ｌ４９を、その他のアミノ酸、例えばＩ、Ｔ、Ａ、Ｍ、Ｑ、またはＥ（表６を参照のこと）などで置換したが、その理由とは、それらはシステインへの置換と比較して改善された安定性を付与する場合があるからである。１９Ｃ１２システイン置換バリアントを、ＬＡＭＡ４提示細胞と結合するそれらの能力（図１３）及びＬＡＭＡ４とそのリガンドであるＭＣＡＭとの結合を遮断するそれらの能力（図１４）について試験した。ＬＡＭＡ４結合能を試験するために、連続希釈した抗体をＬＡＭＡ４提示ヒト２９３細胞でプレインキュベートし、続いて抗ヒト６５０二次抗体でインキュベートした。ＭＣＡＭ／ＬＡＭＡ４ブロッキング活性を試験するために、抗体を６５０標識ラミニン４１１（ＬＡＭＡ４を含有する組換えラミニン三量体）でプレインキュベートし、次いでＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞を、材料及び方法に記載の通りに６５０標識ラミニン４１１に結合するそれらの能力について評価した。「４１１無し」及び「４１１」対照条件は、それぞれ１００％及び０％のブロッキング活性を記録した。蛍光シグナルをフローサイトメトリー分析により評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。１９Ｃ１２システイン置換バリアントは、それらのＭＣＡＭブロッキング及びＬＡＭＡ４結合活性を様々な度合いで保持している。
【表６】
2017512772.tif 000019
【０３７０】
１９Ｃ１２バリアントのキメラ１９Ｃ１２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、Ｈ３Ｌ６、及びアイソタイプ対照を、ＬＡＭＡ４とそのリガンドであるＭＣＡＭとの結合を遮断するそれらの能力（図１５）及びＬＡＭＡ４提示細胞と結合するそれらの能力（図１６）について試験した。ＬＡＭＡ４結合能を試験するために、連続希釈した抗体をＬＡＭＡ４提示ヒト２９３細胞でプレインキュベートし、続いて抗ヒト６５０二次抗体でインキュベートした。ＭＣＡＭ／ＬＡＭＡ４ブロッキング活性を試験するために、抗体を６５０標識ラミニン４１１（ＬＡＭＡ４を含有する組換えラミニン三量体）でプレインキュベートし、次いでＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞を、材料及び方法に記載の通りに６５０標識ラミニン４１１に結合するそれらの能力について評価した。「４１１無し」及び「４１１」対照条件は、それぞれ１００％及び０％のブロッキング活性を記録した。蛍光シグナルをフローサイトメトリー分析により評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。すべての１９Ｃ１２バリアントは、キメラ１９Ｃ１２と比較した場合に、それらのＭＣＡＭブロッキング及びＬＡＭＡ４結合活性を保持した。
【０３７１】
相対的結合及びオン／オフ速度を、ＦｏｒｔｅＢｉｏにより分析した。図１７Ａでは、抗Ｈｉｓセンサーに１０ｕｇ／ｍｌの精製Ｈｉｓ−ＬＡＭＡ４を負荷し、続いて１０ｕｇ／ｍｌのキメラ１９Ｃ１２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６を負荷した。結合及び解離を分析した。図１７Ｂでは、ヤギ抗ヒトＦｃセンサーにキメラ１９Ｃ１２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６を１０ｕｇ／ｍｌ負荷し、続いて１０ｕｇ／ｍｌのＨｉｓ−ＬＡＭＡ４を負荷した。結合及び解離を分析した。図１８Ａ〜Ｃでは、抗Ｈｉｓセンサーに１０ｕｇ／ｍｌのＬＡＭＡ−Ｈｉｓを負荷し、続いてキメラ１９Ｃ１２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６抗体を負荷した。図１８Ａ〜Ｃにおける抗体の濃度は、それぞれ３３．３ｎＭ、１６．７ｎＭ、及び８．３３ｎＭであった。これらの抗体の結合及び解離を比較した。表７は、ＦｏｒｔｅＢｉｏによって異なる濃度で検出された異なる抗体の結合速度（ｋｏｎ）、解離速度（ｋｄｉｓ）、及び結合親和性定数（Ｋｄ）についてまとめている。ヒト化バリアントのＨ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６の結合速度、解離速度、及び結合親和性定数は、すべてキメラ１９Ｃ１２抗体と同等であった。
【表７】
2017512772.tif 000020
【０３７２】
次いで、抗体のＢｉａｃｏｒｅ全結合速度分析を実施した。Ｆａｂ断片を材料及び方法に記載の通りに生成し、ＳＰＲ分析を材料及び方法に記載の通りに実施した。詳細な結合速度パラメータ（結合速度（ｋａｓｓｏｃ）、解離速度（ｋｄｉｓｓｏｃ）、及び結合親和性定数（Ｋｄ））を、キメラ１９Ｃ１２及びヒト化Ｈ２Ｌ３のＦａｂに対して決定した。ヒト化１９Ｃ１２バリアントであるＨ２Ｌ３の結合速度パラメータは、キメラ１９Ｃ１２のものと同等であった（表８を参照のこと）。
【表８】
2017512772.tif 000021
【０３７３】
加えて、結合親和性定数（ＫＤ）の定常状態近似を、キメラ１９Ｃ１２ならびにヒト化バリアントのＨ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、及びＨ３Ｌ６のＦａｂに対して決定した。この場合も、ヒト化１９Ｃ１２バリアントの結合速度パラメータは、キメラ１９Ｃ１２のものと同等であった（表９を参照のこと）。
【表９】
2017512772.tif 000022
【０３７４】
加えて、ヒト化１９Ｃ１２バリアントＨ２Ｌ３及びＨ３Ｌ６に対する結合親和性定数（ＫＤ）の定常状態近似を、抗ヒトＦｃセンサー上にヒト化１９Ｃ１２ＩｇＧを負荷し、遊離ラミニンα４と結合抗体との結合を分析することにより決定した（表１０を参照のこと）。このＢｉａｃｏｒｅアッセイにおけるＨ２Ｌ３及びＨ３Ｌ６ヒト化１９Ｃ１２バリアントの結合パラメータ（表１０を参照のこと）は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により観察された結合パラメータと同等であった（表７を参照のこと）。
【表１０】
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【０３７５】
１９Ｃ１２ヒト化バリアント（１９Ｃ１２ｃｈｉ、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ２Ｌ６、Ｈ３Ｌ６及びアイソタイプ対照）とＬＡＭＡ４との間の特異的結合を、ＬＡＭＡ４．ＫＯマウス脳に対して野生型マウス脳を染色するバリアントの能力を評価することにより、更に試験した。ＬＡＭＡ４に対するヒト化モノクローナル抗体を、材料及び方法に記載の通りに生成した。灌流及び新鮮凍結したＷＴ及びＬＡＭＡ４．ＫＯマウス脳を凍結切断し、アセトン固定して、ＬＡＭＡ４一次抗体、続いて抗ヒト５９４二次抗体で染色した。１９Ｃ１２キメラ及びヒト化バリアントのすべてが、ＬＡＭＡ４陽性マウス脳脈管構造の特異的染色を示したが、バックグラウンドアイソタイプ抗体対照レベルを超えてＬＡＭＡ４．ＫＯ組織を染色することはなく、このことは、１９Ｃ１２ヒト化バリアントのすべてが、組織内でＬＡＭＡ４特異的結合活性を保持することを実証している。
【０３７６】
最後に、耐凝集性について１９Ｃ１２バリアントを試験した。抗体サンプルを３７℃のインキュベーター内で４週間保存し、その間にアリコートを各測定の直前に無菌状態で取り出した。動的光散乱測定を、Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ動的光散乱機器において、石英キュベット内の１０マイクロリットルサイズ容量で行った。すべての測定値を３７℃で取得し、各測定値は５秒の取得時間で１０回取得した。Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ７．０ソフトウェアにより、Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ｓｐｈｅｒｅｓモデルを使用して正規化を行った。３７℃での最大４週間のインキュベーションで、単量体抗体の最小限の損失が確認された（表１１を参照のこと）。加えて、異なる抗体バリアント間で認識できる程の差はなかったことが分かった。
【表１１】
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【０３７７】
実施例７．抗ＬＡＭＡ４抗体１９Ｃ１２での処置により、マウス異種移植モデルにおいてＬＡＭＡ４腫瘍分布の形態変化を伴って、インビボでの黒色腫腫瘍成長が緩やかになる
ＳＣＩＤマウス（処置群当たりｎ＝１０）に、ＷＭ２６６．４ヒト黒色腫腫瘍細胞を皮下移植した。動物に、抗体（すなわち、１９Ｃ１２または対照抗体）を１キログラム当たり１、１０、または３０ミリグラムの用量で腹腔内注射により週に１回投薬し、腫瘍体積を、移植後日数（ＤＰＩ）２０日目から開始して週に２回測定した。投薬、製剤化、及び測定を３人の異なる研究者で実施したが、３人とも盲検状態であった。８Ｇ９を、マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照として使用した。
【０３７８】
血管炎症（血管炎）を、抗体処置マウスからの新鮮凍結心臓組織を使用して評価し、ＣＤ３１及びＣＤ３抗体を使用して共染色した。心臓血管内にＣＤ３陽性Ｔ細胞が存在しないために、検出可能な心臓血管炎が存在しなかったと結論づけた。
【０３７９】
ＬＡＭＡ４腫瘍形態を評価するために、抗体処置マウスから新鮮凍結ＷＭ２６６．４異種移植腫瘍組織（処置群当たりｎ＝２）を切断し、抗ＬＡＭＡ４ポリクローナル抗体で染色した。１９Ｃ１２処置マウスが、対照マウスと比較して腫瘍間質空間内でより小さく、かつより明るくＬＡＭＡ４陽性構造を示し、この効果が用量依存的であったことを見出した。
【０３８０】
これらのデータは、マウス異種移植モデルにおいて、ＬＡＭＡ４腫瘍分布の形態変化を伴う、ヒト黒色腫腫瘍成長の用量依存的阻害を実証している。実施例４及び９からの細胞接着データと組み合わせると、これらのデータは、ＬＡＭＡ４のＭＣＡＭ及びインテグリンα６β１結合活性が、腫瘍接着及び腫瘍成長の両方に寄与することを示唆している。
【０３８１】
実施例８．抗ＬＡＭＡ４抗体１９Ｃ１２は、ヒト患者の乳房腫瘍及び皮膚黒色腫組織を染色する
新鮮凍結ヒト乳房腫瘍マイクロアレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、健康な乳房組織の３つのサンプルを含む）を、１９Ｃ１２で染色した。マウスＩｇＧ１抗体を、対照として使用した。乳房腫瘍の大部分が１９Ｃ１２抗体で陽性に染色されたが、マウスＩｇＧ１対照抗体は組織を染色しなかった。１９Ｃ１２抗体は、健康な乳房組織を染色しなかった。
【０３８２】
新鮮凍結ヒト黒色腫皮膚腫瘍及び肺転移（ならびに対照の健康な肺及び皮膚組織）を、１９Ｃ１２及びマウスＩｇＧ対照抗体で染色した。マウスＩｇＧ対照抗体は組織を染色しなかったが、１９Ｃ１２は、試験したすべての組織において反応性が高かった。１９Ｃ１２シグナルは、対応する健康な組織と比較して、腫瘍組織でより強かった。
【０３８３】
実施例９．抗ＬＡＭＡ４抗体１９Ｃ１２は、いくつかの異なる腫瘍型においてインビトロで腫瘍細胞接着を遮断する
ＥＬＩＳＡプレートを、１０ｕｇ／ｍｌの組換えヒトラミニン４１１を用いて４℃で一晩プレコートし、洗浄し、１％ＢＳＡ／ＭＥＭで遮断して、０．１％ＢＳＡ／ＭＥＭ中２０ｕｇ／ｍｌの抗体を用いて１時間室温でインキュベートした。様々な腫瘍細胞株を、Ｖｅｒｓｅｎｅを使用して埋没から剥離させ、０．１％ＢＳＡ／ＭＥＭで洗浄して、３００，０００細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞懸濁液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、インキュベーター内において３７℃で１．５時間接着させ、洗浄し、クリスタルバイオレットで染色し、マイクロプレートリーダーで分析して細胞接着の程度を測定した。非コーティングウェル、細胞無しのウェル、バッファー、及びマウスＩｇＧを対照条件として使用した。その結果、１９Ｃ１２がいくつかの異なる腫瘍型においてインビトロで腫瘍細胞接着を遮断することを示した。
【０３８４】
実施例１０．抗ラミニン抗体は、ラミニン４１１誘導ｐＡｋｔ活性化を阻害する
ＷＭ２６６．４ヒト腫瘍黒色腫細胞を２４時間血清飢餓状態にし、次いで１０ｕｇ／ｍｌのラミニン４１１（ガンマ１鎖及びベータ１鎖と複合したＬＡＭＡ４）及び２０ｕｇ／ｍｌの１９Ｃ１２、４Ｂ７（ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールに結合する抗体）、ｒ２１０７（抗ＭＣＡＭ）、またはｍＩｇＧ２ｂ対照抗体を用いて、３０分間無血清細胞培養培地中に再懸濁した。ＢＳＡタンパク質を、ラミニン４１１の対照として使用した。次いで、細胞を遠心沈殿させ、イムノブロット分析用に溶解させた。ｐＡｋｔ及び全Ａｋｔレベルを、イムノブロットにより評価した。これらのレベル比（ｐＡｋｔ／Ａｋｔ）を、図１９Ａ及び図１９Ｂに示す。各条件（ｍＩｇＧ２Ｂ＋ラミニン４１１、１９Ｃ１２＋ラミニン４１１、４Ｂ７＋ラミニン４１１、ｒ２１０７＋ラミニン４１１、及びｍＩｇＧ２ｂ＋ＢＳＡ）を、３回反復して試験した。図１９Ａは個々のサンプルの結果を示し、図１９Ｂは各条件の平均値及び標準誤差を示す。図１９Ｂに示すように、ラミニン４１１は、ＢＳＡ対照と比較してｐＡｋｔシグナル伝達を誘導し（すなわち、ｐＡｋｔ／Ａｋｔ比がより高い）、抗ラミニン抗体は、ラミニン４１１誘導ｐＡｋｔ活性化を部分的に遮断した（１９Ｃ１２で約５０％の阻害、及び４Ｂ７で約３０％の阻害）。対照的に、ｒ２１０７（抗ＭＣＡＭ）は、ラミニン４１１誘導ｐＡｋｔ活性化を阻害しなかった。
【０３８５】
実施例１１．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対するラミニン４１１及び抗ラミニン抗体の効果
ＮｏｔｃｈリガンドのＤｌｌ４転写／翻訳では、インテグリン結合、及びそれに続くホスホ−Ａｋｔシグナル伝達を必要とするため、抗ＬＡＭＡ４抗体を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対する効果について試験した。ＨＵＶＥＣ、ＷＭ２６６．４、及びＲＡＷ細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのラミニン４１１（ガンマ１鎖及びベータ１鎖と複合したＬＡＭＡ４）及び２０ｕｇ／ｍｌの１９Ｃ１２、１５Ｆ７（ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールに結合する抗体）、４Ｂ７（ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールに結合する抗体）、ｒ２１０７（抗ＭＣＡＭ）、またはｍＩｇＧ２ｂ対照抗体を用いて、２４時間細胞培養培地中に再懸濁した。ＢＳＡタンパク質を、ラミニン４１１の対照として使用する。細胞を遠心沈殿させ、切断／活性化Ｎｏｔｃｈ１、Ｄｌｌ４、ＭＣＡＭ、アクチン、ｐＡｋｔ、及びＡｋｔのイムノブロット分析用に溶解させる。加えて、Ｈｅｙ１、ＭＣＰ−１（炎症において単球走化性）、ＭＣＡＭ、ＬＡＭＡ４、及びＧＡＰＤＨのｑＰＣＲ分析を行った。
【０３８６】
実施例１２．インビボ肥満症モデルにおける抗ラミニン抗体の効果
Ａｋｔシグナル伝達はＮｏｔｃｈシグナル伝達にとって重要であり、かつＮｏｔｃｈシグナル伝達は脂肪細胞の成長を促進させるので、ＬＡＭＡ４に対する抗体を、体重増加／減少ならびに脂肪細胞代謝及び脂肪分解に対する効果について、インビボ肥満症モデルで試験した。マウスの高脂肪食（ＨＦＤ）によって促進される体重増加を、抗ＭＣＡＭ及びラミニン４１１抗体に応じて評価した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、高脂肪食（例えば、４５％ｋｃａｌ％脂肪のげっ歯類食餌、例えばＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃからの製品番号Ｄ１２４５１など）を自由摂取させた。４つの実験群、すなわち（１）対照Ｉｇで処置したマウス、（２）抗ＭＣＡＭ抗体（例えば、ｒ２１０７）で処置したマウス、（３）ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４〜５モジュールに結合する抗体（例えば、４Ｂ７）で処置したマウス、及び（４）ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１〜３モジュールに結合する抗体（例えば、１９Ｃ１２）で処置したマウスを試験した。各群に１０匹のマウスを用意し、各マウスを３〜４か月間、１０ｍｇ／ｋｇ／週の抗体で処置する。体重測定を、２〜４週間ごとに行う。
【０３８７】
脂肪組織に対するＬＡＭＡ４の局在化を評価するために、抗ＬＡＭＡ４抗体（アイソタイプ対照抗体と比較して）を、マウスに静脈内投与する。次いで、染色を行って、脂肪組織に対する局在化を評価する。
【０３８８】
実施例１３．材料及び方法
ＤＮＡ構築物
ｐＣＭＶ促進Ｃ末端Ｍｙｃ／ｆｌａｇタグ付き細胞接着分子構築物を、Ｏｒｉｇｅｎｅから入手した（ＴｒｕｅＯＲＦ  Ｇｏｌｄクローン：ＮＭ＿０００２１０、ＮＭ＿００２２０４、ＮＭ＿００２２１１、ＮＭ＿００１００６９４６、ＮＭ＿００２９９８、ＮＭ＿００２９９９．２）。
【０３８９】
ＬＡＭＡ４ノックアウトマウス
ＬＡＭＡ４欠損マウスを、Ｄｒ．Ｋａｒｌ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ（カロリンスカ大学）から最初に入手した。
【０３９０】
組換えＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質及びｈＭＣＡＭ．ＣＨＯ細胞株の生成  ＭＣＡＭ−Ｆｃを、ヒトまたはマウスＭＣＡＭの細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１に融合することにより社内で生成し、標準的な技術を使用してＣＨＯ細胞内で作製／精製した。ｈＭＣＡＭ．ＣＨＯ細胞株を、全長ヒトＭＣＡＭ遺伝子を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクションにより生成し、ネオマイシンを使用して安定発現のために選択し、フローサイトメトリー分類を使用して高発現するものを分類した。
【０３９１】
ＥＡＥマウス組織
ＥＡＥ研究のために、８〜１６週齢のＳＪＬマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）を、ＣＦＡ中で乳化したＰＬＰ１３９−１５１ペプチドで免疫化した。疾患の進行を毎日モニタし、標準的な技術により盲検様式で記録した。マウスを、ＰＬＰ免疫化から３５日後に犠牲死させ、脳及び脊髄を免疫細胞の浸潤について分析した。脳及び脊髄をＯＣＴで急速凍結し、以下に記載されるように蛍光顕微鏡法により分析した。
【０３９２】
抗体生成
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した組換えマウスラミニン４（Ｌａｍａ４）及びＤｒ．Ｋａｒｌ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ（カロリンスカ大学）から最初に入手した１０週齢のＬａｍａ４欠損マウスを使用して、抗体を発現させた。精製ラミニンα４（ＬＡＭＡ４）を、ＲＩＢＩアジュバント中１０μｇのＬＡＭＡ４／２５μｌのアジュバントで懸濁させた。マウスをイソフルランで麻酔し、３匹のマウスを、各後肢足蹠または後肢踵関節からＲＩＢＩアジュバント中５ｕｇのＬａｍａ４で免疫化したが、２匹のマウスは、ＲＩＢＩアジュバント中１２．５ｕｇのＬａｍａ４で踵関節から２７ゲージ針を用いて免疫化した。上の手順後、０、４、１２、１６及び２０日目にマウスに注射した。２４日目に動物を安楽死させ、膝窩及び鼠経リンパ節を無菌フード内で除去する。節を切り離し、ＰＥＧ融合の代わりに電気融合を含むＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎプロトコールの修正版を使用して、ＳＰ２／０と融合させる。融合細胞を９６ウェルプレートに播種し、成長させる。
【０３９３】
細胞の半分〜４分の３がコンフルエントになったら、スクリーニングを開始する。簡潔に述べると、Ｃｏｓｔａｒ  ＲＩＡ／ＥＩＡプレートを、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬ、５０ｕｌ／ウェルでウサギ抗Ｈｉｓタグ（Ａｎａｓｐｅｃ番号２９６７３）を用いて１時間コーティングした。次いでプレートを、２５０ｕｌ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１５分間遮断し、次いで除去した。Ｈｉｓタグ付きＬａｍａ４を、０．２５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕｌ／ウェルで１時間プレートに添加し、次いで２回洗浄した。融合プレートからの７５ｕＬの上清を添加し、１時間インキュベートして、プレートを２回洗浄した。ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ番号１１５−０３５−１６４）を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＴＢＳＴ中１：２０００希釈で１時間添加し、次いで５回洗浄した。プレートを、５０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ番号ＴＭＢＷ２４）で５分間反応させ、１５ｕＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで読み取った。ＯＤが１．０超のウェルを、追加のスクリーニングのために選択した。ＥＬＩＳＡにより陽性と判明したウェルからの細胞を、成長させて凍結した。上清を、以下に記載される追加のスクリーニング用に準備した。以下に記載される一定の基準を満たすウェルからの細胞を、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ＦＬを使用してクローニングし、企業が推奨する設定を使用してスクリーニングし、単一細胞クローンを見出した。これらを増殖させて、上清から抗体を精製した。
【０３９４】
ｈＭＣＡＭ．ＣＨＯフローサイトメトリーブロッキングアッセイ
組換えラミニン４１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、５ｕｇ／ｍｌ最終）を、抗ＬＡＭＡ４抗体で室温にて１５〜３０分間プレインキュベートした。ｈＭＣＡＭ．ＣＨＯ細胞をＥＤＴＡで再懸濁し、４１１抗体混合物で３７℃にて３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中１％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を６５０複合化抗汎ラミニン抗体（１：１０００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で再懸濁し、４℃にて２０分間インキュベートして、再度洗浄した。細胞を、標準的な手順を使用して、フローサイトメトリーにより汎ラミニン反応性について分析した。
【０３９５】
ＬＡＭＡ４  ｐＤｉｓｐｌａｙフローサイトメトリー結合／ブロッキングアッセイ
ヒトＬＡＭＡ４のＧドメイン１〜５及びバリアントを、ｐＤｉｓｐｌａｙ発現構築物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にクローニングし、標準的な手順を使用して２９３細胞に一過的にトランスフェクトした。抗ＬＡＭＡ４抗体を、４℃で３０分間細胞とインキュベートし、続いて１０ｕｇ／ｍｌの６５０複合化マウスＭＣＡＭ−Ｆｃまたは抗マウス６５０のいずれかで４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を、標準的な手順を使用して、フローサイトメトリーにより抗ラミニンまたはｍＭＣＡＭ−Ｆｃ結合について分析した。
【０３９６】
マウス脳組織ブロッキングアッセイ
新鮮凍結マウス脳を、クライオスタット上で１０ｕｍの厚さに切断し、氷冷アセトン中で固定して、０．２％ＴｒｉｔｏｎＰＢＳ中５％正常ヤギ血清で遮断した。次いで、脳組織を抗ＬＡＭＡ４抗体でプレインキュベートし、ＰＢＳ中で素早く洗浄して、組換え４８８複合化ｈＭＣＡＭ−Ｆｃ（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、１ｕｇ／ｍｌ）を、室温にて２０分間組織に添加した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ＰＢＳ中で数回洗浄した後、切片をＰｒｏｌｏｎｇ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に載せた。
【０３９７】
ｈＭＣＡＭ−Ｆｃ捕捉ブロッキングアッセイ
２．５ｕｇ／ｍｌの組換えｈＭＣＡＭ−Ｆｃ、またはＦｃ対照（Ｂｅｔｈｙｌ）を使用して、最初に２．５ｕｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で一晩プレコートしておいた９６ウェルプレートをコーティングし、２％ＢＳＡ＋０．０５％ＴＢＳ−Ｔで遮断した。室温での１時間のインキュベーション後、抗ＬＡＭＡ４抗体で室温にて１５〜３０分間プレインキュベートしておいた０．２５ｕｇ／ｍｌの組換えマウスＬＡＭＡ４−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、室温で１時間プレートに添加した。洗浄ステップ後、抗ＨＩＳ−ＨＲＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０００）を１時間添加し、洗浄し、ＴＭＢ基質（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）で処置して、２Ｎ硫酸でクエンチした。
【０３９８】
ＭＣＡＭ−Ｆｃ及び抗ＬＡＭＡ４抗体の静脈内ホーミング実験
５ｍｇ／ｋｇのＭＣＡＭ−Ｆｃ、５ｍｇ／ｋｇのヒトＦｃ対照、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＡＭＡ４ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ３８３７）、及び１０ｍｇ／ｋｇのヤギＩｇＧ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢ−１０８−Ｃ）を、ＳＦＬ／Ｊマウスに静脈注射した。１時間後、動物にＰＢＳで経心腔的灌流を行い、脳を解剖して急速凍結した。
【０３９９】
ＬＡＭＡ４断片精製
Ｈｉｓタグ付きＬＡＭＡ４Ｇドメイン断片を標準的な手順によってクローニングし、２９３細胞中で一時的に発現させた。タンパク質を、ニッケル−ＮＴＡカラムを使用して精製した。
【０４００】
蛍光顕微鏡／標準的な免疫蛍光法
マウス組織をＯＣＴ内で急速凍結し、１０ｕＭで切断した。切片を冷アセトンで固定し、抗汎ラミニン（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＭＣＡＭ−Ｆｃ、抗ＭＣＡＭ、抗ＣＤ４（Ｄａｋｏ）または抗ＬＡＭＡ４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した。
【０４０１】
一過的にトランスフェクトした２９３Ｔフローサイトメトリーブロッキングアッセイ
組換えラミニン４１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、５ｕｇ／ｍｌ最終）を、抗ＬＡＭＡ４抗体で室温にて１５〜３０分間プレインキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）トランスフェクト細胞をＥＤＴＡで懸濁し、１ｍＭのＭｎＣｌ２と共に４１１抗体混合物で３７℃にて３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中１％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を６５０複合化抗汎ラミニン抗体（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で再懸濁し、４℃にて２０分間インキュベートして、再度洗浄した。細胞を、標準的な手順を使用して、フローサイトメトリーにより汎ラミニン反応性について分析した。
【０４０２】
ヒト黒色腫細胞接着アッセイ
１０ｕｇ／ｍｌの組換えｍＬＡＭＡ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、４℃で一晩９６ウェルプレートをコーティングした。ＰＢＳでの洗浄ステップ後、ウェルを１％ＢＳＡ／ＭＥＭで室温にて１時間遮断した。０．１％ＢＳＡ／ＭＥＭ中２０ｕｇ／ｍｌの抗ＬＡＭＡ４抗体を、室温で１時間プレートに添加した。ＷＭ−２６６−４細胞をＥＤＴＡで再懸濁し、洗浄して、０．１％／ＭＥＭ中３００，０００細胞／ｍｌで再懸濁し、続いてチューブキャップを外したまま３７℃の組織培養インキュベーター内に１０分置いた。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中１％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を６５０複合化抗汎ラミニン抗体（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で再懸濁し、４℃にて２０分間インキュベートして、再度洗浄した。抗体溶液を除去せずに、細胞懸濁液をウェルに添加し、キャップを外したまま組織培養インキュベーター内で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄ステップ後、細胞をグルタルアルデヒド／クリスタルバイオレット溶液で染色／固定し、その後５７０ｎｍでプレートリーダー分析を行った。
【０４０３】
Ｆａｂ断片の生成
すべての抗体のＦａｂ断片を、製造業者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って、Ｆａｂ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキットを使用して生成した。遊離Ｆｃの除去及び完全最終生成物の検証をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニタし、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して濃度を決定した。
【０４０４】
親和性のＳＰＲ測定
ＳＰＲ分析をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して実施し、異なるラミニン抗体の結合を比較した。Ｆａｂ調製物のために、抗６ｘＨｉｓ抗体（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、アミンカップリングによりセンサーチップＣ１上に固定化し、ヒトＨｉｓ−ラミニンα４、マウスＨｉｓ−ラミニンα４（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）、及び非関連６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質（反応対照として）を、２５ＲＵの最大結合を確保するレベルで捕捉した。３００〜０．４１ｎＭの範囲の様々な濃度のＦａｂ調製物を、流れるバッファー（ＨＢＳ＋０．０５％Ｐ−２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中において５０ｕｌ／分の流速で、捕捉リガンド上を、結合のために２４０秒、及び解離のために異なる持続時間並べて通過させた。データは、捕捉部分からのリガンドの解離を説明するためにＨｉｓタグ付きリガンドを含有しない非関連センサー、及び０ｎＭのアナライト濃度の両方を二重参照した。次いで、データを不均一リガンドモデルまたはグローバル１：１フィットのいずれかを使用して分析した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2017512772.tif 000033
【図５】
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【図６】
2017512772.tif 000035
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2017512772.tif 000037
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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