(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水不溶性重合体及び（ｂ）前記水不溶性重合体に化学的に結合され、水性環境にさらされる際、前記水不溶性重合体から治療上有効な量で放出される酸化窒素でなる付加物を含有する、創傷の表面に局所的に適用される際、その治癒を促進する高分子創傷治癒促進剤であって、前記付加物が、ポリエチレンイミンセルロースNONOエート及びポリ（エチレンジアミン-コ−１,４-ブタジエングリシジルエーテル）NONOエートでなる群から選ばれるものであることを特徴とする、高分子創傷治癒促進剤。
【請求項２】
水不溶性重合体が、酸化窒素の放出後、生体適合性である、請求項１記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項３】
さらに、低分子量及び高分子量のポリイソブチレン、ゼラチン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、シリカ、綿繊維及び水膨潤性、水不溶性、加水分解レイビル及び薬学上許容されるミクロ粒状の架橋多糖の重合体組成物でなる群から選ばれる吸収包帯剤を含有する、請求項１又は２記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項４】
架橋多糖中の架橋基が、直鎖状イミドカーボネート基、直鎖状カーボネート基及びこれらの混合物でなる群から選ばれるものである、請求項３記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項５】
架橋多糖の原料の多糖が分子量40,000〜1,000,000を有するものである、請求項４記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項６】
架橋多糖の原料の多糖が分子量100,000〜1,000,000を有するものである、請求項５記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項７】
架橋多糖の原料の多糖が分子量200,000〜600,000を有するものである、請求項６記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項８】
架橋多糖の原料の多糖がデキストランである、請求項７記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項９】
さらに、マトリックス物質を包含してなる、請求項３記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項１０】
マトリックスが架橋多糖及び疎水性接着剤重合体マトリックスのブレンドである、請求項９記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項１１】
マトリックスが、無定形、疎水性、化学的に不活性、薬学上の許容性、接着性重合体であり、体温で固体である、請求項１０記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項１２】
マトリックスのガラス転移温度が４５℃以上である、請求項１１記載の高分子創傷治癒促進剤。
【請求項１３】
マトリックスが、ポリイソブチレンスチレン−ブタジエンゴム、ブチルゴム及び低分子量ポリイソブチレンでなる群から選ばれるものである、請求項１２記載の高分子創傷治癒促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
ここに記載の発明は、一般に、制御された治療のためのＮＯの放出を介して創傷の回復を促進しうる水不溶性の高分子NONOエート（NONO ate）錯体に係る。
発明の背景
最近の研究は、酸化窒素（ＮＯ）が生体の生物学的分子であることを示している。ＮＯは、宿主防御、心血管調節、信号トランスダクション、神経伝達及び創傷の治癒の如き各種のプロセスにおいて中心的役割を果たす。酵素酸化窒素シンターゼ（NOS）はＬ−アルギニンをＬ−シトルリン及びＮＯに変化させ、創傷の治癒プロセスに関与する多くの細胞がNOS活性を示している。ＮＯの主な役割は、初期の炎症段階においてマクロファージ又は他の食細胞によって放出された細胞毒又は細胞増殖抑制剤のものであろうと考えられるが、組織の回復におけるＮＯの正確な機能は確立されていない。創傷の内在細胞から放出されるＮＯは独特の細胞のシグナリング経路においても重要であり、新たな血管新生組織として微小循環の回復が形成される。
ＮＯの酸化は不安定な中間体（たとえばN2O3及びN2O4）及びその後安定な代謝生成物であるニトライト（nitrite）（NO2）及びニトレート（nitrate）（NO3）を生成する。これまでの研究は、創傷した又は感染させたラットでは尿中ＮＯ2は無視できるものであること及び尿中ＮＯ3はＮＯ生成の正確な間接的指標であることを示している。
これまでの研究では、切除術により創傷した正常なラットにおける尿中ＮＯ3レベルは創傷時に急激に上昇し、創傷の外部が塞がった後、１８日までの組織の治癒の過程の間、明らかに上昇したままであることが示されている。しかしながら、２つの共通の健康が害されたモデル（ステロイド処置したラット及び実験的に糖尿病を誘発させたラット）は、いずれも創傷の治癒の間、抑制されたＮＯ合成を示した。これは、機能性の生物学的細胞によるＮＯの代謝が組織の治癒の間は臨界的に重要であることを示唆する。さらにNOS阻害剤であるＮG−モノメチル−Ｌ−アルギニン（LMMA）及びＮG−ニトロ−Ｌ−アルギニン（LNA）の局所適用は、正常なラットの創傷におけるＮＯ合成を顕著に低減させ（Ｐ＜0.05）、これは、当該局所適用が正常なＮＯ代謝を変化させることを示す。創傷部位における不十分なＮＯ合成が創傷の治癒における重要な要因であるとすれば、局部的な創傷環境へのＮＯの局所付与は慢性の及び正常な創傷の治癒の両方を促進する新たな治療法となるであろう。ＮＯの局所付与は、現在、いくつかの制御された放出用薬が利用できるため、新たな時代の創傷包帯剤の決定的な手段であろう。
最近、酸化窒素をある種の求核試薬と反応させることによって生成される錯体が新たな種類のＮＯ放出化合物として導入されている。Keefer及びその共同研究者らは、双性イオン系ポリアミン／ＮＯ付加物（「NONOエート」と称される）を合成した。米国特許第5,250,550号において、Keeferらは、有効な心血管剤として、下記の酸化窒素−ポリアミン錯体（薬学的に許容されるその塩を含む）を示した。
0004072736.tif 000002
また、Keeferらに付与された米国特許第5,212,204号は、抗高血圧組成物及び哺乳動物における降血圧法を開示し、この組成物の活性成分は、下記一般式（IV）で表わされる化合物である。
0004072736.tif 000003
式中、Ｊは有機性又は無機性の部分であり、Ｍ+Xは化合物を不安定に又は水不溶性としない薬学上許容されるカチオンである。
これまでのKeefer特許（たとえば米国特許第5,208,233号）も抗高血圧組成物及び哺乳動物における降血圧法を検討しており、下記一般式(Ｖ)で表されることによって特徴づけられる。
0004072736.tif 000004
式中、イオン形の会合が示され、しかもＲ1及びＲ2が相互に結合する場合、下記の基（VI−１〜VI−４）が好適である。
0004072736.tif 000005
ＮＯに関する他の使用が米国特許第5,185,376号に示されており、その中で、分子中に少なくとも１つのＮ−オキソ−Ｎ−ニトロソアミン部分を含有する生理学的に適合性の化合物によるインビボ血小板凝集阻害が示されており、この生理学的適合性化合物は、インビボで、持続されかつ制御可能な様式で酸化窒素を放出する。この用途に関して列挙された化合物は、DEANO（VII）
0004072736.tif 000006
及びポリアミンスペルミン（VIII）
0004072736.tif 000007
の酸化窒素付加生成物、式（IX）
0004072736.tif 000008
のNIPRIDE（ニトロプルシッド）、及び式（Ｘ）
0004072736.tif 000009
のASA（アスピリン）の酸化窒素付加物である。これらのNONOエートは水性媒体中で定量的量のＮＯを放出し、ＮＯ発生の速度及び程度はｐＨ、温度及び求核残基の同一性に左右される。
NONOエートはＮＯ系血管拡張剤として使用され、他の臨床上の用途（たとえば、抗腫瘍治療）を有する。しかしながら、これらの可溶性のアミン系NONOエートを介する創傷へのＮＯの付与は、ＮＯの放出後に残る毒性アミンの溶解性によって面倒になる。
本発明は、不溶性、無毒性であり、新たな種類のNONOエートを創製するために水溶液中において長期間にわたり制御されたＮＯの放出を示す重合体／ＮＯ付加物に係る。高分子NONOエート、すなわちＮＯ−ポリエチレンイミンセルロース（PEIC−NO）は、長期間にわたり水性環境中に有意の量のＮＯを放出する。PEIC−NOは、その低い毒性、適用の容易性、及び比較的長い半減期（約960分）のため、創傷の治癒の研究に関して選択されたものである。さらに、他のセルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース）は、多くの存在するヒドロコロイドの創傷包帯剤の主成分であり、市販されている包帯剤処方へのPEIC−NOの配合が可能である。
発明の要約
本発明によれば、制御された放出様式のＮＯの局所付与システムが提供される。
本発明の目的は、高分子キャリヤーを使用するＮＯ用の局所付与システムを提供することにある。
本発明の他の目的は、創傷の回復を促進するため、創傷に局所的に適用される制御された放出ＮＯを使用することにある。
本発明のさらに他の目的は、局所的に適用された際、創傷に対して治療上有効な量のＮＯを放出するようにＮＯと共に適用される高分子吸収包帯剤物質を使用することにある。
本発明のさらに他の目的は、創傷の表面から移動して潜在的に有害な組織的影響を生ずる可溶性のNONOエート錯体に対して、創傷に治療上有効な量のＮＯを放出する不溶性のNONOエート錯体を使用することにある。
本発明のさらに他の目的は、不溶性の高分子ＮＯ付与システムとしてPEIセルロースNONOエートを使用することにある。
本発明のこれらの及び他の目的は、図面、詳細な説明及び請求の範囲を検討する際に明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
本発明は、特定の部材及び部材の配置において物理的形態をもつことができ、その好適な具体例を明細書に詳細に説明すると共に、添付図面に示す。
図１は、コントロール（創傷に局所的に適用したPEIC）及びサンプル（創傷に局所的に適用したPEIC−NO）を比較して、ＮＯで処置した創傷に関して尿中ニトレートアウトプットが増大することを示すラットにおける日毎の尿中ニトレートアウトプットのプロットである。
図２は、コントロール（創傷に局所的に適用したPEIC）及びサンプル（創傷に局所的に適用したPEIC−NO）を比較して、創傷の治癒速度の差を示すラットにおける創傷の治癒のプロットである。
図３は、コントロール（創傷に局所的に適用したPEIC）及びサンプル（創傷に局所的に適用したPEIC−NO）を比較する時間毎の収縮期血圧のプロットである。
図４は、時間毎のPEIC−NOの放出プロフィールである。
発明の詳細な説明
添付図面（本発明の好適な具体例を説明するためのみのものであって、本発明を制限するためのものではない）を参照すると、図面は、局所的に適用される際、創傷の治癒を促進する治療上有効な量のＮＯを放出する高分子NONOエートの有効性を示す。
現時点で出願人が知っている最良の形態を説明するために、本発明を実施するための最良の形態について述べる。実施例は説明のためのものであり、請求の範囲の精神によって定められるように本発明を制限することを意味しない。
実施例
物質：
ポリエチレンイミンセルロース（PEI−セルロース）をSigma Cemical社（セントルイス、ＭＯ）から購入した（微細又は中間メッシュサイズの陰イオン交換樹脂）。硝酸カリウム（99.999％）及びアセトニトリル（99.5％）をAldrich Chemical社（ミルウォーキー、ＷＩ）から購入した。アルギニン変性（２％）AIN−７６低ニトレート飼料をICN Biochemicals社（クリーブランド、ＯＨ）から購入した。塩化バナジウム（III）をJohnson／Alfa Products社（ウォードヒル、ＭＡ）から購入した。稠密シリコーンゴムフォームについてはVariseal社（パークマン、ＯＨ）によって提供されたものである。滅菌透過性包帯剤Bioclusiv（商標名）をJohnson ＆ Johnson Medical社（アーリントン、ＴＸ）から購入した。溶液の調製及びラットに与えるための水をMilli−Q（商標名）カートリッジ濾過システム（Millipore社、ベッドフォード、ＭＡ）によって精製した。酸化窒素をMatheson Products社（ツインスバーグ、ＯＨ）から購入した。他の試薬等級の物質についてはFisher Scientific社（ピッツバーグ、ＰＡ）から購入した。
実験方法：
動物実験に関するすべての手続はアクロン大学のアニマルケアーコミティーによって了承された。雄のSprague Dawleyラット（７５〜９９ｇ）をZivic Miller社（ゼリーンポール、ＰＡ）から購入した。動物保管設備は１２時間毎に交互に明／暗サイクルを行い、一定湿度（５０〜６０％）及び温度（２１〜２５℃）を保つ。ラットは到着時２週間検疫し、ついで他の室に移し、さらに７日間順化させた。ラットに清潔な寝床付のケージを与え、蒸留し、脱塩した水を無制限に与え、アルギニン２％を含有する注文の低ニトレート（ＮＯ3）飼料を与えた。ラットを代謝ケージに移し、ランダムにコントロール群（ｎ＝６）又は処置群（ｎ＝９）とした。
基礎の尿中ニトレートアウトプットレベルを確定するため、創傷する前に９日間、２４時間間隔で尿を集めた。各採尿バイアルに３モル／ｌ HCl ５ｍｌを添加すること（尿をｐＨ１又はそれ以下に保つ）によって細菌の増殖を阻止した。尿のｐＨが低いことは、ニトレート分析の間、最適なＮＯ分析性能を維持することを助ける。創傷の治癒の過程を通しても２４時間間隔で尿を集めた。サンプルを直ちに使用するか、又は分析まで凍結保存した。
創傷の日には、尿を集め、ラットをネンブタール（Nembutal）（４０ｍｇ／Ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔した。各ラットの背側を剃毛し、ついでイソプロパノールを浸み込ませた滅菌パッドで浄化した。滅菌器具及び無菌技術を使用して、各ラットに、真皮及び筋肉層を切除することによって、２ｃｍ×２ｃｍ平方の充分に深い創傷を形成した。医科用等級の接着剤で裏当てし、かつ４ｃｍ×４ｃｍ平方の孔を有するシリコーンゴムフォームを創傷に近接する皮膚上に置いて、処置剤を保持し、創傷の汚染を防止した。シリコーンウエル（well）は、げっ歯動物においてポスト創傷治癒の初期の間に典型的に見られる皮膚の収縮を妨げる。創傷の処置を行った後、シリコーンウエルをBioclusiveフィルム、ついでVertapで覆った。
処置したラットにNONOエート（PEIC−NO）200ｍｇ及び滅菌１Ｘ PBS 200μｌを与えた。コントロールのラットには、PEIC 200ｍｇ及び滅菌１Ｘ PBS 200μｌを与えた。ラットに、麻酔状態にある間にゲンタマイシン（4.4ｍｇ／Ｋｇ、筋肉内注射）を注射した。術後、各ラットを等温パッド上に置き、麻酔から回復するまで監視し、その後、代謝ケージに戻した。実験の経過を通して盲検調査を行うため、処置用及びコントロール用局所適用をコード付けした。PEI−セルロースNONOエートの合成：
Drago及びKarstetterによって開発された高圧法をわずかに変更して、PEIセルロース（7.0ｇ、15.4ミリモル）をアセトニトリル７０ｍｌと共に、磁石撹拌バーを具備する変形Aceスレッド反応ボトルに入れた。ＮＯ及びＮ2用の２つのガス入口でなり、第３の出口をシステムを開に保つために使用するようにセットした四方ガス弁を介して溶液に１０分間窒素ガスを充填した。すべてのガス接合部は、透明のテフロン管（0.25in OD）及びステンレス鋼スウェージロック結合材でなる。ついで、酸化窒素を圧力７０psigで３０分間供給し、反応ボトルを閉止し、反応を圧力下に維持した。ＮＯガスの供給に関するこの手続きを１日おきに１０日間繰返し行い、その後、過剰のＮＯを排出し、Ｎ2ガスを１５分間供給した。黄色の生成物（6.82ｇ）を濾過によって単離し、アセトニトリル及びついでエーテルで洗浄し、減圧下で１夜乾燥させた。ポリエチレンイミンセルロース重合体は、ｐＨ7.4緩衝剤中でＮＯ約６７ナノモル／重合体ｍｇを放出した。
得られた生成物は下記の式（XI）で表される。
0004072736.tif 000010
ED−BDE NONOエートの合成：
ほぼ等モル量のエチレンジアミン及び１,４−ブタンジグリシジルエーテルを反応させることによって、架橋されたポリ（エチレンジアミン−コ−１,４−ブタンジエチレングリシジルエーテル）を調製した（もろい重合体が生成する）。蒸留水約150ｍｌを添加して蒸留を膨潤させ、その後、濾過し、アセトンで洗浄した。重合体を５０℃でオーブン乾燥した。ｘの値は重合に供した反応体の初期の量に左右される。
アセトニトリル２５ｍｌ中の重合体約0.5ｇに、ＮＯガスを７０psigで２５分間添加した。反応容器への弁を閉じ、反応を４８時間行った。反応器を窒素によって換気、排出し、さらにＮＯを７０psigで３０分間添加した。反応器の弁を閉じた後、反応をさらに２４時間行った。最終生成物を濾取し、エーテルで洗浄した。最終のNONOエート重合体は水に不溶性の白色の固体粉末であった。しかしながら、水と接触する際、このNONOエート重合体はＮＯガスを放出し、当初の共重合体を生成した。ポリ（エチレンジアミン−コ−１,４−ブタンジエチレングリシジルエーテル）重合体は、ｐＨ7.4の緩衝剤中でＮＯ ６５ナノモル／重合体ｍｇを放出した。
上述の反応は下記の如く表される。
0004072736.tif 000011
２つの合成手続について上述したが、これらは現時点で発明者らが認識している最良の形態を表わすものではあるが、検討した特殊な重合体に限定する必要はない。他の重合体の使用（たとえばデキストラン物質の使用）も本発明の範囲内に含まれる。この物質の検討に関しては、他の米国特許出願08／065,742号に含まれており、本発明でも参照する。
ビデオ画像の分析：
創傷直後及びその後３日毎に、ビデオカメラ（ミクロフォーカス６倍のズームレンズを有するNikon VN−3000）及びVHSテープ（FUJI A／V Master Super XG）を使用して、各創傷のビデオ撮影した。各創傷の滅菌１Ｘ PBSで注意深く浄化して残留物を除去した後、自己接着性環状ラベル（直径1.9ｃｍ）を創傷に近接して置いた。これは、ビデオ画像の分析の間における外部標準として機能し、創傷に対するレンズの距離を変化させることを可能にする。創傷及び外部標準が同一の水平面に入るようにカメラのレンズを創傷部位に対して直角に配置し、できる限り大きい画像を与えるようにレンズの焦点を合わせた。
カメラのアウトプット信号をコンピューターGateway 2000 386／16SX（Gateway 2000社、ノーススーシティー、ＳＤ）にインストールしたスペクトラムNTSC＋フレームグラバーボード（Redlake社、モーガンヒル、ＣＡ）にインプットすることによって、創傷の画像のデジタルコンピューター分析を行った。画像分析ソフトウエアーAccuwareを使用して、創傷及び外部標準を示すいくつかの最適な画像を捕捉し、マルチ走査１７インチRGBモニターSamsung CSA7571（Samsung Information Systems America社、サンジョー、ＣＡ）に表示した。創傷及び外部標準の周囲をマウスでトレースし、各画像のピクセル面積を算定した。創傷／外部標準の比を使用して相対的な創傷面積を得た。これはカメラ対創傷の距離に左右されない指標を与える。各々の相対的な創傷面積は元の創傷の関数として表され、創傷の治癒の進行を測定するために時間に対してプロットした。処置したラットとコントロールのラットの間の創傷の治癒における顕著な差異を検定するため、対となる学生による２つの追尾ｔ−テストを使用した。
ニトレートの分析：
窒素酸化物分析器Monitor Labsモデル8440（Lear−Siegler社、エングルウッド、ＣＯ）及びBraman及びHendrixによって記載された方法の変形を利用して、ニトレート（ＮＯ3）について、すべての尿サンプルを分析した。カスタムメードのインピンジャーに、塩化バナジウム（III）（VCl3、0.4モル／ｌ）のHCl 1.5モル／ｌ還元溶液４０〜５０ｍｌを充填した。還元溶液を９５〜100℃に加熱し、流量125ｍｌ／分にセットしたヘリウムで脱気した。テフロン加工した隔膜を介して還元溶液に尿サンプルを注入し、VCl3は存在するＮＯ3をＮＯに還元する。ヘリウム流は、酸性ガスを除去するためにNaOH １モル／ｌを充填した第２のインピンジャーを通して、新たに発生してＮＯを運ぶ。ミクロ測定弁によって分析器の減圧ポンプの流量（すなわち、サンプルの入口流量）を150ｍｌ／分にセットした。分析器入口及びNaOHインピンジャーの間のＴコネクターは、安定したインプット流量を維持するオープンシステムを提供し、分析器入口及びヘリウム流量をマッチングさせる問題を回避する。ＮＯを分析器に導入し、つづく化学発光反応（分析器によって発生されたＯ3とＮＯとの間）によりサンプル当たりのＮＯの量を測定した。既知の濃度のKNO3も注入し、毎日の標準曲線（動物当たりの平均NO3アウトプット（μモル／日）を算定するために使用した）を決定するために使用した。アウトプット信号をHP3392Aインテグレーティングレコーダー（Hewlett Packcard社、エーボンデール、ＰＡ）によって捕捉した。すべての尿サンプルの二重注入を行い、平均値を各動物当たりの毎日のＮＯ3アウトプットとして使用した。処置したラットとコントロールのラットとの間の創傷前後の尿中ＮＯ3濃度の顕著な差異を検定するため、対を構成しない学生による２つの追尾ｔ−テストを使用した。
NONOエートの分析：
クロマトグラフィーデータインテグレーターLC／9540（IBM社、ダンブリー、ＣＴ）に接続した窒素酸化物分析器Monitor Labsモデル8440（Lear−Siegler社、エングルウッズ、ＣＯ）において、PEIC−NOの分析を行った。サンプリングチャンバーは、ＮＯガスがチャンバー内に蓄積することを可能にする二方弁によって変更を加えたガスインピンジャーボトルでなる。サンプリングチャンバーの一方の端をＮＯ分析器に接続し、他の端を流量計及びヘリウムガスタンクに接続した。ヘリウムガスをシステムを通って１０psigで送給し、流量計を150〜200ｍｌ／分に調節した。150ｍｌサンプリングチャンバーにｐＨ7.4のPBS ５０ｍｌを満たし、溶液を１５分間脱気した。PEIC−NOのサンプル１０ｍｇを加え、弁を閉じ、弁を開きかつヘリウムガスを介して生成したＮＯを検出器に排出することによって定期的に読みを得た。
100μモル／ｌのKNO3標準曲線を使用してPEIC−NOから放出されたＮＯの濃度を算定することによって速度論的指標を得た。放出プロフィールは、時間に対して生成したＮＯのランニング合計をプロットすることによって得られたものである。このグラフから無限大におけるＮＯの濃度が測定される。第１段階の反応速度は時間（時間）に対して１ｎ（Conet−Conet）をプロットすることによって算定され、ｋ値及び重合体の半減期を算定することが可能である。
血圧の測定：
遠隔測定装置を自発性の高血圧症（SHR）又はWistar−Kyoto（WKY）ラットに予め埋込んだ。データ獲得システムDataquest IV（Data Sciences社、セントポウル、ＭＮ）を使用して、２４時間の間隔で、収縮期血圧（SBP）、拡張期血圧（DBP）、平均動脈血圧（MAP）、心拍数（ＨＲ）、及び運動活性（ACT）を連続して測定した。麻酔中のラットにおいて正中線腹腔切開を行い、腎臓と腸骨動脈との間の下行大動脈にラジオトランスミッターのフレキシブルカテーテルの先を挿入することによって遠隔測定装置を埋込んだ。トランスミッターを腹腔内に配置し、正中線の切開部を閉じるため腹腔壁を縫合した。動物を１週間各々の回復ケージに置いた。レシーバー（信号を連続して離れた部屋のコンピュータ化データ獲得システムに送る）を各ケージの下に配置した。パラメーターを測定し、２０秒毎から５分毎の間でセーブし、ついで３０分間隔で平均化した。創傷前、創傷時、及びつづくNONOエートの局所適用又は麻酔剤注射（腹腔内投与）後にベースライン血圧を記録した。３日の間隔でNONOエート及び麻酔剤ナトリウムブレビダール（sodium brevital）の３％溶液（５０ｍｇ／Ｋｇ、腹腔内投与）を投与した。収縮期血圧を測定し、NONOエート及びブレビタールの注射の両方について経時的な血圧における顕著な変化を示すため、得られた平均化データを時間に対してプロットした。局所付与されたラット（NONOエート）及び注射されたラット（ブレビタール）に対する収縮期血圧の顕著な差異を検定するため、対をなす学生による２つの追尾ｔ−テストを行った。
検討
創傷からのＮＯの放出を間接的に測定する尿中NO3のプロフィールを図１に示す。日ゼロ（０）は創傷した日であり、各データのポイントは各群に関する毎日の平均の尿中ＮＯ3アウトプットを表わす。創傷前の平均（ｎ＝９日）の尿中ＮＯ3アウトプットは、コントロール及びNONOエート群について、それぞれＮＯ3 6.7±0.34 Ｓ．Ｅ．Ｍ対7.4±0.37 Ｓ．Ｅ．Ｍ μモル／日であった。創傷前では両群について尿中ＮＯ3アウトプットに有意の差異はない。
治癒の初期段階（ｎ＝３日、日０〜２では、平均の尿中ＮＯ3のアウトプットは、コントロール及びNONOエート群について、それぞれＮＯ3 12.4±2.4 Ｓ．Ｅ．Ｍ及び22.5±1.1 Ｓ．Ｅ．Ｍ μモル／日である（Ｐ＜0.019）。日３では、PEIC−NO群は対応するコントロール群の3.5倍の尿中ＮＯ3アウトプットを有していた。日４〜１０（ｎ＝７日）の平均の尿中ＮＯ3アウトプットは、PEIC−NO及びコントロール群について、それぞれＮＯ3 28.1±1.2 Ｓ．Ｅ．Ｍ及び21.0±0.81 Ｓ．Ｅ．Ｍ μモル／日であった（Ｐ＜0.0004）。
しかしながら、創傷後の治癒の初期段階（ｎ＝１１日、日０〜１０）では、平均の尿中ＮＯ3アウトプットは、コントロール及びNONOエートについて、それぞれＮＯ3 17.7±1.5 Ｓ．Ｅ．Ｍ対27.4±1.4 S.E.M μモル／日であり、これは極めて重大である（Ｐ＜0.0002）。治癒の後期段階（ｎ＝１４日、日１６〜２９）における平均の尿中ＮＯ3はコントロール及びNONOエート群について、それぞれＮＯ3 10.2±0.43 Ｓ．Ｅ．Ｍ及び12.3±0.61 Ｓ．Ｅ．Ｍ μモル／日であった（Ｐ＜0.011）。
両群について尿中ＮＯ3アウトプットは創傷後１１日で徐々に低下した。これにもかかわらず、NONOエート群に関する尿中ＮＯ3の生産は日１６〜２５（ｎ＝９日、Ｐ＜0.0001）の間のベースラインよりも７９％高く、日２１では、創傷の外部が約９３％塞がれた。
図２は、コントロールのラット及びPEIC−NO処置したラットの両方に関する創傷治癒のデータを示す。創傷の開いた部分の割合（％）（初期の創傷面積に対して）に基き、PEIC−NO群の治癒はコントロール群に対して日７、１０及び１７において明らかに増大していた（Ｐ＜0.005）。図３はPEIC−NOの局所適用から上昇する象徴的な収縮期血圧プロフィールを示す。収縮期血圧は約４５〜５０分間で６０mmHgに低下し、ついで動物の回復開始に従って上昇し始める。処置後約３時間で収縮期血圧は正常レベルに戻る。しかしながら、収縮期血圧の初期の低下は、PEIC−NO処置したラット及び麻酔剤のみを与えた同じラットの間でほぼ並行していることからわかるように、主に麻酔剤ブレビタールの影響によるものである。これは、NONOエートPEIC−NOが短期間の抗高血圧効果を有することを示す。図４は、高分子PEIC−NOからのＮＯの放出プロフィールを示す。NO−PEICサンプル１０ｍｇは、半減期１６時間でＮＯ 685ｍｇを放出し、これは、NO−PEICが長い時間にわたって生理緩衝剤中で制御されたＮＯの放出を提供することを示す。
創傷の治癒検討で使用した高分子NONOエートは、次の所望の特性、すなわち（１）安定な固体であること、（２）水不溶性であること、（３）レドックスの活性化を生ずることなくＮＯを生ずること、（４）速度論的に良好な挙動を示すこと（第１段階のＮＯの放出）、及び（５）各種の物理的構造に処方されること、を有する。これら創傷の検討において、水溶性ではあるが、高分子手段又はリポソーム内にエンカプセル化されるNONOエートを使用することも可能である。NONOエートが創傷部位に留まり、移動して組織的な副作用を生じないことに主な関心がある。可溶性のNONOエートもイオン相互作用によって重合体に固定される。たとえば、（NONOエートはポリカチオン系ポリアミンから生成されるため）ポリアニオン系樹脂で錯化される。
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この相互作用は、高分子NONOエートによって観察されたものと同様に創傷部位でＮＯドナーを保持できる。
可溶性NONOエートも、創傷包帯剤で使用される一般的な材料内にエンカプセル化される。たとえば、可溶性の固体NONOエートはウレタン重合体内に混入される。これら重合体をフィルムに鋳造するか、成形して包帯剤を生成する。創傷部でＮＯを放出するために要求されるものは、Ｈ+源（ウレタンの部分水和による）及びＮＯ移動のための簡単な経路である。従って、ＮＯドナーを捕捉し、なお局部的なＮＯ放出を達成することが可能である。
NONOエートの外に他のＮＯドナーも考えられる。たとえば、Ｓ−ニトロン化合物も使用できる。たとえば、Ｓ−ニトロン−Ｎ−アセチルペニシラミン（SNAP）は生物学的条件下でＮＯを放出する。この物質は重合体に配合されるか、又は組織的な効果の原因となる移動を生ずることなく、創傷部位でＮＯの放出を許容する制御放出システム内にエンカプセル化される。ＮＯを付与するためにＳ−ニトロンアルブメンの如きタンパク質を使用できる。
他のＮＯドナーは、ＮＯが生成される前に、いくつかの種類の生物学的酸化又は還元を要求する。ニトログリセリン（還元を要求する）の如き化合物は、重合体に固定されるか又はエンカプセル化され、かつ十分に還元される際には創傷にＮＯを提供する。他の類似のSIN−Ｉ（モルシドミン（molsidemine））ＮＯを放出するために酸素からの酸化を要求する。モルシドミン同族体の重合体も、創傷にＮＯを付与するために、好適な条件下で使用される。
すべての障害（皮膚におけるすべての発疹性潰瘍を含む）に対して、局所的に適用したＮＯ高分子錯体の制御された放出を介しての治癒促進の可能性について上述した。これは、可溶性である従来のNONOエート錯体に対して、NONOエートが、水性環境において不溶性であるとの事実を介して達成される。高分子マトリックスへの酸化窒素の配合の利点は、錯体の棚寿命が従来の製品のもの（使用されなければ直ちに分解する傾向にある、すなわち棚寿命をもたない）よりも劇的に増大されることにある。
高分子錯体キャリヤーの他の利点は、消費後、すなわち錯体中の酸化窒素の使用後に残留する重合体が従来技術によって教示されたアミン錯体とは異なり、生体適合性であることである。
しかしながら、高分子錯体キャリヤーはさらに他の物質（たとえば包帯剤）を包含しうる。現在では、急性及び慢性の皮膚の創傷の処置に各種の包帯剤が使用されている。これらの内、臨床上では、ヒドロコロイド包帯剤（HCD）が最も頻繁に使用されている。これら包帯剤の高吸収特性は吸収性及び湿った環境と結びついて、急速な顆粒形成、上皮再形成及び創傷部の閉鎖を導く。
HCD包帯剤の臨床上の用途としては、火傷及び火傷ドナー部位、慢性の静脈潰瘍、褥瘡、癩性潰瘍、表皮水疱症、硬皮症、乾癬及び非感染部分創傷がある。
従来のHCD包帯剤は接着剤混合物（通常、低分子量又は高分子量ポリイソブチレン、及びゼラチン、ペクチン及びカルボキシメチルセルロース、シリカ及び綿繊維の如き吸収剤でなる）を含む。代表的なHCD包帯剤は、たとえば米国特許第3,972,328号（1976年８月３日登録、Chenら）、同第4,253,460号（1981年３月３日、Chenら）及び同第4,538,603号（1985年９月３日、Pawelchakら）に記載されている。
現在では、創傷用フィラー及び包帯剤の処方において各種の吸収剤が使用されている。創傷用包帯剤成分としての選択に当たってこれら吸収剤の重要な特徴は、その流体処理能力である。生物分解性はあまり注目されていない。これに関連して、最近の組織学的研究が、ある種の創傷用包帯剤の使用が外見上治癒された組織において強い非解消性及び深部拡散性の慢性炎症を生ずることを示していることは必ずしも驚くべきことではない。このような炎症は、潜在的に、生理学的条件下において分解して無毒性及び非炎症性の生成物を生ずる包帯剤成分を使用することによって低減される。この情況下では、制御された薬剤付与において一般的にしようされている生物分解性ミクロ球状物（たとえばポリラクチド又はグリコライド）はいずれも、好適な吸収性又は流体処理能力を有していないことが注目されなけらばならない。
創傷にとって有効な吸収剤としては、水膨潤性、水不溶性、加水分解レイビル（hydrolytically labile）及び薬学上許容されるビーズ状又はミクロ粒状の架橋多糖（好ましくはデキストラン）重合体組成物がある。ミクロ粒は本質的に球状であり、ミクロ球状と称される。乾燥された生成物は自由流動粉体である。架橋基は直鎖状イミドカーボネート基、直鎖状カーボネート基又はこれらの混合物である。生成物は２５℃において水不溶性であり、本質的に中性の水性媒体中において少なくとも３７℃の温度で分解されて水溶性の非架橋多糖を生ずる。生成物が本質的に中性の媒体中で分解性であるために、加水分解レイビル（又は加水分解性）として特徴づけられる。加水分解レイビルは、生成物が生物分解性であること、すなわち正常な体温（３７℃）において水性体液（たとえば血液及びリンパ液）の存在下で水溶性生成物に分解されることを示す。
ミクロ球状物は、油中水型分散の水相中、アルカリ条件下（架橋が生ずる）における水溶性の非架橋多糖のジシアンハロゲン化物での架橋によって生成される。好適なジシアンハロゲン化物は臭化ジシアンである。架橋生成物は、多糖鎖及びジシアンハロゲン化物及び塩基との反応によって形成された架橋基でなる。形成された架橋基は、多糖鎖上の水酸基を介して各種の多糖鎖に（又は同じ鎖の遠い部分に）結合された直鎖状のイミドカーボネート基と考えられる。これらのイミドカーボネート基は、活動中に、酸中において直鎖状のカーボネート基に部分的に加水分解される。
架橋生成物は、ジシアンハロゲン化物及び塩基との反応を介して導入されたもの以外の架橋基を本質的に含まない。特に、架橋生成物は非加水分解性架橋基フリーである。
原料の多糖は水溶性であり、約40,000〜約1,000,000以上の分子量を有する。好ましくは、原料の多糖は、約100,000〜約1,000,000、さらに好ましくは約200,000〜約600,000の（平均）分子量を有する。好適な原料多糖はデキストランである。
ミクロ粒は本質的に球状であり、主に約１〜約100ミクロンの範囲である。一般に、ミクロ粒は主に直径約２〜約５０ミクロンの範囲である。最終生成物のミクロ粒状物は自由流動粉末状である。
上述の粒径範囲の球状ミクロ粒を得るために、油中水型分散の水相で活性化反応を行うことが必須である。反応媒体として水（油相なし）を使用する際には、初めにゲルが形成される。有効な生成物を得るためには、エタノールの如き水和溶媒の存在下でこのゲルを破壊しなけらばならない（たとえばブレンダー内において）。このような処理からの最終生成物は球状ではなく、むしろ不規則な形状のアグレゲート状である。
ミクロ球状の生成物は、アグレゲート状の生成物よりも優れたいくつかの利点を提供する。第１に、加工及び処方が容易である。第２に、生成物がより均一である。その結果、本発明の生成物はアグレゲート状の生成物よりも、より均一でかつより予測できる膨潤度、膨潤速度及び水分の存在下における加水分解又は分解速度を発揮する。
本発明の１態様では、高分子NONOエートは、化学的な捕捉（entrapment）が選択した合成法に左右されるが、上述のデキストラン粒上に化学的にグラフトされる。
本発明による創傷用包帯剤は、たとえば、本発明の架橋多糖ミクロ球状物と疎水性接着剤高分子マトリックス物質とのブレンドでなることもでき、該ブレンドは不活性の防水性裏当てシートの一方の側又は表面に塗布される。
上述の吸収剤物質にマトリックス物質を配合することもできる。これは、疎水性、化学的に不活性、薬学上の許容性、接着性及び体温で固状の無定形重合体（ガラス転移温度を有し、融点をもたない）である。この目的のためには、ガラス転移温度は、正常な体温よりも少なくともわずかに高い、たとえば約４５℃以上でなけらばならない。
好適なマトリックス物質は当分野で公知である。マトリックス物質はゴム状（すなわちエラストマー性）及び疎水性である。好適なマトリックス物質としては、各種等級のポリイソブチレンスチレン−ブタジエンゴム、及びブチルゴム（イソブチレンと少量のイソプレンとの共重合体）がある。代表的なマトリックス成分は低分子量のポリイソブチレン（平均分子量約10,000〜約50,000）である。
好適な具体例を参照して本発明を説明した。明細書を読み、理解する際、各種の変化、変更が想起されるであろう。変化、変更が請求の範囲内に含まれるものである限り、本発明はすべての変化、変更を含むものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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