(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｌ４蛋白の応答配列の下流に、プロモーター、およびマウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目を含むアミノ酸配列もしくはヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ。
【請求項２】
マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目を含むアミノ酸配列またはヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目を含むアミノ酸配列のＮ末端に、Ｆａｓ抗原のシグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列を結合させた請求項１記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項３】
Ｆａｓ抗原のシグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列が、マウスＦａｓ抗原の−２１番目から１４番目までのアミノ酸配列であるか、またはヒトＦａｓ抗原の−１６番目から２３番目までのアミノ酸配列である請求項２記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１記載のプラスミドＤＮＡと、Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域を含むアミノ酸配列のＣ端末に細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列を結合させた融合蛋白であるエフェクター蛋白をコードするＤＮＡの両ＤＮＡで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
細胞核内受容体がステロイド受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
細胞核内受容体がＰＰＡＲα受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項７】
細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトＰＰＡＲα受容体の１６７番目から４６８番目までのアミノ酸配列またはマウスＰＰＡＲα受容体の１６７番目から４６８番目までである請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
細胞核内受容体がＰＰＡＲδ受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項９】
細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトＰＰＡＲδ受容体の１３９番目から４４１番目までのアミノ酸配列またはマウスＰＰＡＲδ受容体の１３８番目から４４０番目までである請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
細胞核内受容体がＰＰＡＲγ受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項１１】
細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトＰＰＡＲγ１受容体の１７６番目から４７８番目までのアミノ酸配列、マウスＰＰＡＲγ１受容体の１７４番目から４７５番目までのアミノ酸配列、ヒトＰＰＡＲγ２受容体の２０４番目から５０６番目までのアミノ酸配列またはマウスＰＰＡＲγ２受容体の２０４番目から５０５番目までである請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
細胞核内受容体がレチノイドＸ受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項１３】
細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目までのアミノ酸配列、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目までのアミノ酸配列またはマウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目までのアミノ酸配列である請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
細胞核内受容体がレチノイン酸受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項１５】
細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目までのアミノ酸配列、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目までのアミノ酸配列またはマウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までのアミノ酸配列である請求項１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
細胞核内受容体がビタミンＤ３受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項１７】
細胞核内受容体が甲状腺ホルモン受容体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項４〜１７のいずれかに記載された形質転換体を用いることを特徴とする細胞核内受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項４〜１７のいずれかに記載された形質転換体が、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９またはヒトガン細胞ＨｅＬａであることを特徴とする請求項１８記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、（ｉ）新規なレポーター遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ、（ii）前記プラスミドＤＮＡと公知のエフェクター蛋白をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体、（iii）前記両ＤＮＡを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治療剤、および（iv）前記形質転換体を用いる細胞核内受容体のリガンドの検出方法に関する。
さらに詳しくは、（ｉ）新規なレポーター遺伝子、すなわち酵母の基本転写因子であるＧａｌ４蛋白の応答配列（以下、ＵＡＳと略記する。）を複数回繰り返したエンハンサーエレメント下流に、必要最小限のプロモーター、さらに遺伝子発現効果を検出するためにＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ、（ii）前記プラスミドＤＮＡと公知のエフェクター蛋白、すなわちＧａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域を含むアミノ酸配列のＣ端末に、細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列を結合させた融合蛋白をコードするＤＮＡの２つで形質転換された形質転換体、（iii）前記両ＤＮＡを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治療剤、および（iv）前記形質転換体を用いる細胞核内受容体のリガンドの検出方法に関する。
背景技術
最近、サイトカインやホルモンに代表される、重要な生理活性を有する液性因子の受容体が遺伝子操作によって解明され、多くの受容体が単離、同定されてきた。それらの中には、例えば、細胞核内受容体と総称される脂溶性ホルモンの受容体がある。種々の細胞核内受容体のアミノ酸配列を解析した結果、それらは共通の基本構造を有するリガンド依存性の転写因子であり、ひとつの遺伝子ファミリーを形成することが明らかとなった。すなわち、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロジェン受容体、エストロジェン受容体などのステロイド受容体、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、さらにペルオキシソーム増殖薬活性化受容体、ビタミンＤ3受容体や甲状腺ホルモン受容体からなるファミリーである。これらの受容体については、リガンド結合部位、標的ＤＮＡの配列を認識する部位などの機能領域が明確に分離していることがわかっており［Science, 240, 889（1988）参照］、その相同性から単離はされたが、リガンドが依然として不明である受容体も存在する。
最近、脂肪細胞分化マーカー遺伝子の発現誘導にかかわる転写因子の研究において、核内受容体であるペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（以下、ＰＰＡＲ受容体と略記する。）が注目されている。ＰＰＡＲ受容体は、さまざまな動物種からｃＤＮＡがクローニングされ、複数のアイソフォーム遺伝子が見出され、哺乳類ではα、δ、γの３種類が知られている。さらに、γ型は脂肪組織、免疫細胞、副腎、脾臓、小腸で、α型は肝臓、網膜で発現し、δ型は組織特異性が見られず普遍的に発現していることも知られている。
一方、Ｆａｓ抗原は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関与することが明確に示された膜蛋白である。ヨネハラ（Yonehara）等は、ヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、種々のヒト細胞に対し致死活性を示す抗Ｆａｓ抗体を得た［J. Exp. Med., 169, 1747（1989）参照］。抗Ｆａｓ抗体の認識する細胞表面分子のｃＤＮＡが単離され、ヒトＦａｓ抗原の構造が決定された［Cell, 66, 233（1991）参照］。このＦａｓ抗原は３３５個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側１６個のアミノ酸はシグナルペプチドと推定されている。分子の中央には疎水性アミノ酸１７個よりなる膜貫通領域が存在し、Ｎ末端側１５７個のアミノ酸が細胞外領域、Ｃ末端側１４５個のアミノ酸が細胞質領域と考えられる。
Ｆａｓ抗原の構造は、ガン壊死因子（ＴＮＦ）の受容体と類似しているため、Ｆａｓ抗体によるアポトーシスはＴＮＦの作用と類似したメカニズムで起こるものと推定されている。Ｆａｓ抗原の機能領域も次第に明らかにされ、アポトーシスのシグナル伝達に必須の領域（機能発現領域）は１７５番目から３０４番目までのアミノ酸配列部分であることがわかっている［J. Biol. Chem., 268, 10932（1993）参照］。さらに、マウスのＦａｓ抗原についても、そのアミノ酸配列が明らかになっており［J. Immunology, 148, 1274（1992）参照］、ヒトのＦａｓ抗原に対して全体として49.3％のホモロジーを有している。また機能発現領域は、ヒトＦａｓ抗原の該領域に相当する、１６６番目から２９１番目までのアミノ酸配列であると考えられている。
受容体はリガンド結合領域とシグナル伝達領域を有している。リガンド結合領域にリガンドが結合すると、シグナル伝達領域の立体構造が変化し、シグナルが別の蛋白やＤＮＡに伝達される。
最近、ある受容体のリガンド結合領域と、異種の蛋白質のシグナル伝達領域とを結合した融合蛋白におけるシグナル伝達に関する研究が盛んに行なわれている。
例えば、ステロイド受容体のひとつであるエストロジェン受容体のリガンド（すなわち、エストロジェン）結合領域とヒトガン遺伝子ｃ−Ｍｙｃのシグナル伝達領域との融合蛋白をコードする遺伝子で形質転換された細胞は、エストロジェンの刺激によって細胞がガン化し、異常増殖することが判明した［Nature, 340, 66（1989）参照］。
同様の実験が、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロジェンの各受容体のリガンド結合領域とＥ１Ａ（アデノウイルス）、ｃ−Ｆｏｓ、ｖ−Ｍｙｂ、Ｃ／ＥＢＰ、ｖ−Ｒｅｌ、ＧＡＴＡ−１，２，３、ＧＡＬ４−ＶＰ１６、Ｒｅｖ（ＨＩＶ）、ｃ−Ａｂ１の各蛋白質の機能発現領域との融合蛋白において行なわれており［Cell, 54, 1073（1988）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,5114（1991）、EMBO J., 10, 3713（1991）、Science, 251, 288（1991）、EMBO J., 11, 4641（1992）、Genes Dev.（in press）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657（1993）、ibid., 87, 7787（1990）、EMBO J., 12, 2809（1993）参照］、いずれも核内受容体に対応するリガンドが結合されることによってシグナルが伝達されることが確認されている。
垣塚らは、前記した融合蛋白をガン治療に応用する目的でシグナル伝達蛋白としてＦａｓ抗原を用いる方法を報告している（特開平7-316200号参照）。この方法は、機能発現領域だけでなく膜貫通領域も含めた１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列部分を、細胞核内受容体のリガンド結合領域と融合させるものである。その結果、核内受容体リガンド結合領域のアミノ酸配列に相互作用するリガンドが有効に検出できる。
一方、エヴァンス（R. M. Evans）らはＧａｌ４応答配列下流に基質を化学発光または可視色素の産物に変換するか、または置換基を導入する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたはクロラムフェニコールアセチル転移酵素等）を用いたレポーターと、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとＰＰＡＲ受容体リガンド結合領域とを融合した蛋白を細胞内に導入するレポーターアッセイの方法を報告している（ＰＣＴ国際出願国際公開9640128号参照）。また、外来性のＰＰＡＲ受容体蛋白を発現させ、または内在性のＰＰＡＲ受容体蛋白と、上記のレポーター、ただしこの場合はＰＰＡＲ受容体応答配列（以下、ＰＰＲＥと略記する。）下流に上記の酵素を用いたレポーターを導入するアッセイの方法が報告されている（Cell, 83, 803（1995）参照）。これらのアッセイ系は、細胞核内受容体の転写因子としての機能を評価できる検出系である。
しかし、これらの方法は、活性検出に時間を要し、リガンドや被験化合物の効果を高速スクリーニングすることが困難である。かつ、細胞内にＤＮＡを導入する際に一過性導入であるため実験間の安定性に難があり、比較しにくいという問題がある。
発明の開示
本発明者らは、細胞核内受容体のリガンドに結合する化合物を高速スクリーニングする目的で検討を重ねた結果、Ｆａｓ蛋白を発現させるレポーターアッセイを用いることにより、目的を達成することを見出した。
すなわち、Ｆａｓ構造蛋白の機能領域を用いたレポーターとＧａｌ４のＤＮＡ結合領域と核内受容体（特に、ＰＰＡＲ受容体）リガンド結合領域とを融合した蛋白をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをマウス繊維芽細胞Ｌ９２９細胞内に安定導入した。核内受容体のリガンド結合領域のアミノ酸配列にリガンドや化合物が結合しない状態では細胞が増殖するが、リガンドや化合物が結合した場合はＦａｓ蛋白が発現誘導され、細胞死が生じた。この細胞死を起こした細胞を生存細胞と洗浄分離した後、生存細胞を色素染色し、その吸光度を測定することにより、細胞核内受容体のリガンド結合領域と相互作用し、かつ機能的に転写因子活性を上昇、あるいは減少させる化合物を高速でスクリーニングすることに成功した。
本発明の高速スクリーニング方法は、これまでまったく知られていない新規な方法である。
本発明の方法は、レポーターとしてＦａｓ構造蛋白機能領域を用い、Ｆａｓ蛋白を発現させ細胞死を起こさせて測定するものであって、レポーターとして化学発光（特に、ルシフェラーゼ）または可視色素を生む酵素（特に、β−ガラクトシダーゼ）を用い、酵素の発現量（酵素活性）を測定するエヴァンス（R. M. Evans）らの方法とは全く異なるものである。
標準的な実験方法における比較においては、エヴァンス（R. M. Evans）らの方法では第１日目に細胞にＤＮＡを導入し、血清刺激を行なった後、必要に応じて再播種し、４６〜４８時間後（第３日目）に被験化合物を加え、その２４時間後（最終日）にルシフェラーゼ活性を測定する最短４日のスケジュールである。また、細胞内にＤＮＡを導入する際の一過性導入では実験間の安定性や比較が問題になる。各測定を標準化するために別の酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを共導入する場合もあるが操作は繁雑になる。さらに、ルシフェラーゼを用いる方法は個々の値の振れが大きいため数多い例数が必要である（通常ｎ数を３〜４要す。）。あるいは、上述したように同時に導入した内標遺伝子（β−ガラクトシダーゼ等）で標準化する必要がある。
一方、本発明では細胞が準備されていれば、第１日目に被験化合物を加え、翌日の後半（３６時間後）には細胞を色素染色によって測定できる最短２日のスケジュールである。また、Ｌ９２９細胞（同一クローン）を使用するため実験間の比較が容易である。さらに、安定導入細胞を用いる本方法は個々の値の振れが小さいため数多い例数が必要とならない（通常ｎ数が１〜２で十分判別できる。）。
すなわち、本発明の方法によれば、細胞核内受容体の機能を変化させうるリガンドや化合物の高速評価が可能であり、操作自体が簡便である。また、個々の値の振れが小さく、実験間の比較ができ、非常に安定している。以上のことは、特に多検体高速評価において威力を発揮する。さらに実際汎用されている自動測定器（ロボット）では標準仕様として吸光度測定器が付属されているので、ロボット対応型の化合物評価系といえる。このことは先行技術からみて全く予期できないことであり、今回本発明者らが実験により初めて確認したことである。また、本発明の方法では酵素基質を全く必要としないため、大幅なコストダウンが図られる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＰＡＲγリガンド応答性のＬ９２９細胞を用いた殺細胞アッセイを行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。図中（Ａ）はＰＰＡＲγリガンド応答細胞の場合を示し、（Ｂ）は正常細胞の場合を示す。
第２図は、ＰＰＡＲγリガンド応答性のＬ９２９細胞を用いた殺細胞アッセイを行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。図中（Ａ）はＰＰＡＲγリガンド応答細胞の場合を示し、（Ｂ）は正常細胞の場合を示す。
第３図は、ＰＰＡＲαリガンド応答性のＬ９２９細胞を用いた殺細胞アッセイを行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。図中（Ａ）はＰＰＡＲαリガンド応答細胞の場合を示し、（Ｂ）は正常細胞の場合を示す。
第４図は、ＰＰＡＲδリガンド応答性のＬ９２９細胞を用いた殺細胞アッセイを行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。図中（Ａ）はＰＰＡＲδリガンド応答細胞の場合を示し、（Ｂ）は正常細胞の場合を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、
（ｉ）新規なレポーター遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ、
（ii）前記プラスミドＤＮＡと公知のエフェクター蛋白をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体、
（iii）前記両ＤＮＡを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治療剤、および
（iv）前記形質転換体を用いる細胞核内受容体のリガンドの検出方法に関する。
本発明においては、Ｆａｓ抗原および細胞核内受容体は、哺乳動物由来のもの、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット由来のものが用いられる。Ｆａｓ抗原および細胞核内受容体は、好ましくは互いに同じ種のものが用いられるが、異なった種のものを用いてもよい。本発明では互いに異なった種のものを用いてもシグナル伝達が行えることが確認されている。例えば、ヒトのＦａｓ抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、マウスのＦａｓ抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、ヒトのＦａｓ抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、マウスのＦａｓ抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、ヒトのＦａｓ抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せ、またはマウスのＦａｓ抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せが好適に用いられる。
本発明に用いられるＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列、および細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列としては、各領域に相当する部分だけを用いてもよいが、それ以外に、各領域に相当する部分の両端（Ｎ末端および／またはＣ末端）に、フランキング領域（機能領域に関与しない領域、アミノ酸配列にして数１０個、好ましくは６０個以下）を含んだものを用いてもよい。さらに、所望の場合には、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域のＮ末端には、シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列を結合していてもよい。各領域に相当するアミノ酸配列としては、天然のアミノ酸配列だけでなく、本来のＦａｓ抗原が有するアポトーシス機能または細胞核内受容体が有するリガンド結合機能を損なわない程度に、アミノ酸が欠損、置換、付加および／または挿入されたものを用いることができる。
本発明で用いられるＦａｓ抗原のうち、ヒトＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列としては、１４５番目のＳｅｒから３１９番目のＶａｌがあり、マウスＦａｓ抗原では１３６番目のＳｅｒから３０５番目のＬｅｕまでの配列が好適に用いられる。また、シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列としては、ヒトＦａｓ抗原では−１６番目から２３番目までの配列、そしてマウスＦａｓ抗原では−２１番目から１４番目までの配列が好適に用いられる。
本発明で用いられるエフェクター蛋白中の細胞核内受容体としては、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロジェン受容体、エストロジェン受容体等のステロイド受容体、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体、ビタミンＤ3受容体、または甲状腺ホルモン受容体が挙げられる。好適には、ヒトまたはラットのエストロジェン受容体、ヒトまたはマウスのレチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体βまたはレチノイドＸ受容体γあるいはヒトまたはマウスのレチノイン酸受容体α、レチノイン酸受容体βまたはレチノイン酸受容体γ、ヒトまたはマウスのＰＰＡＲα受容体、ヒトまたはマウスのＰＰＡＲδ受容体、ヒトまたはマウスのＰＰＡＲγ受容体が用いられる。
それぞれ受容体のリガンド結合領域は既に知られており［Science, 240, 889（1988）、Mol. Endocrinology, 6, 1634（1992）、Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431（1996）、J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157（1994）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7355（1994）参照］、例えば、ヒトグルココルチコイド受容体では５２８番目から７７７番目まで、ヒトプロゲステロン受容体では６８０番目から９３４番目まで、ヒトミネラルコルチコイド受容体では７３４番目から９８４番目まで、ヒトアンドロジェン受容体では６７６番目から９１９番目まで、ヒトエストロジェン受容体では３１１番目から５５１番目まで、ラットエストロジェン受容体では３０７番目から５５７番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体αでは２２５番目から４６２番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体βでは２９７番目から５２６番目まで、マウスレチノイドＸ受容体αでは２３０番目から４６７番目まで、マウスレチノイドＸ受容体βでは１７１番目から４１０番目まで、マウスレチノイドＸ受容体γでは２２９番目から４６３番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αでは１９８番目から４６２番目まで、ヒトレチノイン酸受容体βでは１９１番目から４４８番目まで、ヒトレチノイン酸受容体γでは２００番目から４５４番目まで、マウスレチノイン酸受容体αでは１９８番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体βでは１９０番目から４４８番目まで、マウスレチノイン酸受容体γでは２００番目から４５８番目まで、ヒトビタミンＤ3受容体では１９２番目から４２７番目まで、ヒト甲状腺ホルモン受容体αでは１８３番目から４１０番目まで、ヒト甲状腺ホルモン受容体βでは２３２番目から４５６番目まで、ヒトＰＰＡＲγ（ヒトＰＰＡＲγ１サブタイプ）受容体の２８０番目から４７８番目まで、マウスＰＰＡＲγ（マウスＰＰＡＲγ１サブタイプ）受容体の２７８番目から４７５番目まで、ヒトＰＰＡＲα受容体の２７３番目から４６８番目まで、マウスＰＰＡＲα受容体の２７３番目から４６８番目まで、ラットＰＰＡＲα受容体の２７３番目から４６８番目まで、ヒトＰＰＡＲδ受容体の２４６番目から４４１番目まで、またはマウスＰＰＡＲδ受容体の２４５番目から４４０番目までのアミノ酸である。
好適には、ヒトエストロジェン受容体の３１１番目から５５１番目まで、ラットエストロジェン受容体の３０７番目から５５７番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目まで、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目まで、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目まで、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目まで、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目まで、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目まで、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目まで、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目まで、ヒトＰＰＡＲγ（ヒトＰＰＡＲγ１サブタイプ）受容体の１７６番目から４７８番目まで、マウスＰＰＡＲγ（マウスＰＰＡＲγ１サブタイプ）受容体の１７４番目から４７５番目まで、ヒトＰＰＡＲα受容体の１６７番目から４６８番目まで、マウスＰＰＡＲα受容体の１６７番目から４６８番目まで、ラットＰＰＡＲα受容体の２１６７番目から４６８番目まで、ヒトＰＰＡＲδ受容体の１３９番目から４４１番目まで、またはマウスＰＰＡＲδ受容体の１３８番目から４４０番目までの配列が用いられる。
より好適には、ヒトエストロジェン受容体の２８１番目から５９５番目まで、ラットエストロジェン受容体の２８６番目から６００番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目まで、ヒトＰＰＡＲγ（ヒトＰＰＡＲγ１サブタイプ）受容体の１６６番目から４７８番目まで（ヒトＰＰＡＲγ２サブタイプでは１９４番目から５０６番目に相当する）、マウスＰＰＡＲγ（マウスＰＰＡＲγ１サブタイプ）受容体の１６４番目から４７５番目まで（マウスＰＰＡＲγ２サブタイプでは１９４番目から５０５番目に相当する）、ヒトＰＰＡＲα受容体の１５７番目から４６８番目まで、マウスＰＰＡＲα受容体の１５７番目から４６８番目まで、ラットＰＰＡＲα受容体の１５７番目から４６８番目まで、ヒトＰＰＡＲδ受容体の１２９番目から４４１番目まで、またはマウスＰＰＡＲδ受容体の１２８番目から４４０番目までの配列が用いられる。
本発明において用いられる、より好ましいエフェクター蛋白としては、
（ｉ）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトＰＰＡＲγ１受容体の１７６番目のセリン（Ｓｅｒ）から４７８番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、
（ii）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスＰＰＡＲγ１受容体の１７４番目のセリン（Ｓｅｒ）から４７５番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、
（iii）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトＰＰＡＲγ２受容体の２０４番目のセリン（Ｓｅｒ）から５０６番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、
（iv）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスＰＰＡＲγ２受容体の２０４番目のセリン（Ｓｅｒ）から５０５番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、
（ｖ）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトＰＰＡＲα受容体の１６７番目のセリン（Ｓｅｒ）から４６８番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、
（vi）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスＰＰＡＲα受容体の１６７番目のセリン（Ｓｅｒ）から４６８番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、
（vii）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトＰＰＡＲδ受容体の１３９番目のセリン（Ｓｅｒ）から４４１番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白、および
（vii）Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域の１番目から１４７番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスＰＰＡＲδ受容体の１３８番目のセリン（Ｓｅｒ）から４４０番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター蛋白が挙げられる。
本発明のレポータープラスミド内に繰り返し構造として含まれるＧａｌ４蛋白の応答配列であるＵＡＳとしては既に知られているものを用いた（Cell, 83, 803（1995）およびCell, 83, 813（1995）参照）。すなわち、５′−ＣＧＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３′の配列を数回、具体的には３回以上、好ましくは４回、より好ましくは５回繰り返した配列である。
本発明のプロモーターとしてはＳＶ４０、ＨＳＶ、ＬＴＲ、メタロチオネインプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターである。好ましくは、ＴＫプロモーターである。より具体的には、プラスミドｐＴＫβ（クロンテック社、Cat. No. 6179-1）に用いられているように（ｐＴＫβのマップで１６５番目から９４５番目までに相当）、転写開始点を１としてＴＫプロモーターのｍＲＮＡの−７２７番目から５６番目までが好ましい。より好ましくはＴＫプロモーターのｍＲＮＡの−１０５番目から５１番目までである。
本発明には、本発明のレポータープラスミドをコードするＤＮＡも含まれる。よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、アミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
本発明には、本発明のレポータープラスミドをコードするＤＮＡのうちＦａｓ蛋白ポリペプチドとして同一となるＤＮＡ配列全ての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、融合蛋白の生産性が向上することがある。
本発明のレポータープラスミドをコードするＤＮＡは、以下の方法に従って作製することができる。
すなわち、
（ｉ）Ｆａｓ抗原と細胞核内受容体のアミノ酸配列のうち、必要とする領域を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により増幅し、
（ii）適当なベクターに、Ｆａｓ抗原より得られたＰＣＲ生成物を組み込み、続いて、細胞核内受容体より得られたＰＣＲ生成物を組み込むことにより行なわれる。
より詳細に説明すると、
工程（ｉ）は融合に必要な部品をＰＣＲ法により増幅する工程である。Ｆａｓ抗原の場合は、膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成し、プライマーとして用いる。また、細胞核内受容体の場合は、リガンド結合領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成し、プライマーとして用いる。
得られたプライマーの５′末端には特定の制限酵素サイトを設けておく。またＰＣＲ法のテンプレートとしては、相当する哺乳動物、例えば、ヒト、マウス等の細胞または細胞株より単離、精製したｍＲＮＡを使用することができる。ＰＣＲ法は、公知の方法により行なわれる。最近ではＰＣＲ自動化装置も普及しているので、該装置が好適に用いられる。
工程（ii）は、発現ベクター中でＧａｌ４のＤＮＡ結合領域と核内受容体リガンド結合領域に相当するＤＮＡを融合する工程である。本工程に用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、いずれであっても好適に用いられる。また、直接発現ベクターに組み込むことも可能である。
哺乳動物細胞で発現させる場合、適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域、次いで細胞核内受容体の当該ＰＣＲ産物を挿入して発現ベクターを作製する。好適には、ｐＣＭＸ（Cell, 66, 663（1991）に記載されている。）やｐＳＶ（Anal. Biochem., 188, 245（1990）に記載されている。）が用いられる。
引き続き、工程（iii）はレポータープラスミドを製造する工程である。本工程に用いられるプラスミドベクターは前述したように大腸菌内で機能するものや枯草菌内で機能するもの、いずれであってもよい。また、直接発現ベクターに組み込むことも可能である。５′上流からＧａｌ４応答配列の繰り返し構造、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、Ｆａｓ構造蛋白をコードするＤＮＡの順にタンデムに配座したＤＮＡを含むプラスミドはその由来が大腸菌で機能するベクターであるか、哺乳動物細胞で機能するベクターであるかによって目的がかなえられる。前述したように、例えばｏｒｉ領域とプロモーター制御因子、そしてひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子を含んでいてもよい。哺乳動物細胞を用いる場合には、前記の哺乳動物細胞内で機能するプラスミドを用いて適当な哺乳動物細胞を形質転換し、これを適当な培地で培養することによって、これらの細胞がＦａｓ蛋白発現依存性に死滅する検定細胞となる。
哺乳動物細胞で発現させる場合には、所望によりＦａｓ抗原のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列のＰＣＲ産物をプロモーターのすぐ下流に挿入することができる。
本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウイルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチサイジンＳ耐性遺伝子）を含んでいてもよい。
また、本発明の蛋白発現系としては、前記の哺乳動物細胞内で機能する発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウス繊維芽細胞、ヒトガン細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とする融合蛋白を生産することができる。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
産業上の利用可能性
このようにして得られた本発明のプラスミドＤＮＡは、ガンまたは自己免疫疾患治療剤として用いることができる。すなわち、本発明のプラスミドＤＮＡを含む発現ベクターをガン病巣部または自己免疫疾患病巣部にターゲティング法（例えば、リポソーム内に封じ込めて）により局所的に投与する。このベクターは病巣部のガン細胞内に侵入し、遺伝子に入り込む。しかる後に、本発明のエフェクター蛋白の一部を構成する細胞核内受容体に対応するリガンド（例えば、該受容体としてレチノイドＸ受容体を用いた場合には９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸受容体を用いた場合にはビタミンＡ）を投与し、エフェクターを活性化させることによって、Ｆａｓ蛋白が発現するようになる。ガン細胞内で生産されたＦａｓ蛋白によってアポトーシスのシグナルが伝達され、かくしてガン細胞は死滅する。
さらに、本発明のプラスミドＤＮＡは、細胞核内受容体に対するアゴニスト、またはアンタゴニストのスクリーニング法として広範に利用することができる。すなわち、本発明に用いられるエフェクター蛋白（Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域下流に種々の核内受容体のリガンド結合領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターＤＮＡ）をコードするＤＮＡおよびレポーターＤＮＡを含む発現ベクターを導入している細胞に、検体を添加する。もし細胞が死ねば、検体はアゴニスト活性を有していることを示し、またアゴニスト存在下に細胞が生存すれば、検体はアンタゴニスト活性を有していることが判明する。
本発明のスクリーニング方法では細胞核内受容体の機能を変化させうるリガンドや化合物の高速評価が可能であり、効果（結果）が細胞死となって表われるので、その判定が容易であり、操作自体も簡便である。さらに、エフェクター蛋白としてＧａｌ４のＤＮＡ結合領域下流に種々の核内受容体のリガンド結合領域をコードするＤＮＡを配置することによって、リガンド未知のオーファン受容体を含む核内受容体に作用する化合物の検索ができる一般性のある方法である。もちろん、オーファン核内受容体の生理的リガンドの探索も可能である。具体的には予想されうる生理的リガンド候補や血清の部分分画標品を上記細胞に添加し、細胞死の有無によってリガンドの同定やリガンド活性を担う分画の精製に利用できる。
また、本発明の方法は個々の値の振れが小さく、実験間の比較ができ、非常に安定している。以上のことは、特に多検体高速評価において威力を発揮する。さらに実際汎用されている自動測定器（ロボット）では標準仕様として吸光度測定器が付属されているので、ロボット対応型の化合物評価系といえる。さらに、この本発明のスクリーニング方法は酵素基質を全く必要としないため、大幅なコストダウンが図れる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施例によって、より詳細かつ具体的に説明するが、もちろんこれによって本発明が制限されるものではない。
実施例１：マウスＦａｓ抗原のＰＣＲ生成物の調製
フクナガ（Fukunaga）らの報告（J. Immunology, 148, 1274（1992）参照）または垣塚（Kakizuka）らの公開特許（特開平7-316200号参照）に従い、マウスＦａｓ抗原の構造により以下のプライマーを調製した。
Ｆ１：１３１番目から１４３番目までのアミノ酸配列：ＰｒｏＣｙｓＴｈｒＡｌａＴｈｒＳｅｒＡｓｎＴｈｒＡｓｎＣｙｓＡｒｇＬｙｓＧｌｎの構造に相当し、５′側の一部に制限酵素ＨｉｎｄIIIサイトを導入したセンスプライマー：５′−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣ−３′（配列番号１）を合成した。
Ｒ１：２９８番目から３０６番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：ＡｓｎＧｌｕＡｓｎＧｌｎＧｌｙＧｌｎＣｙｓＬｅｕＧｌｕおよび３′非翻訳領域の一部に相当し、さらに３′側の一部にＢａｍＨIサイトを導入したアンチセンスプライマー：５′−ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴ−３′（配列番号２）を合成した。
マウスＴ細胞株、ＲＬＭ−１１（Cell, 68, 1109（1992）に記載）より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｆ１とＲ１をＰＣＲプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（Perkin Elmer社GeneAmp PCR System 9600）を使用して、９５℃で１８０秒×１→（９５℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で６０秒）×１５→７２℃で１８０秒の条件でＲＴ−ＰＣＲを行なった。結果、約５２０ｂｐの断片（以下、ＭＦａｓと記す。）を得、ｐBluescript（商品名，プロメガ社）マルチクローニングサイトＨｉｎｄIII、ＢａｍＨI制限酵素部位に組み込んだ（以下、ｐＢＳＭＦａｓと略記する。）。
実施例２：ヒトＰＰＡＲα、γまたはδ受容体のＰＣＲ生成物の調製
マクハジェ（R. Mukherjee）ら（J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157（1994）参照）、グリーン（M. E. Greene）ら（Gene Expreesion, 4, 281（1995）参照）またはエルブレヒト（A. Elbrecht）ら（Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431（1996）参照）またはシュミット（Mol, Endocrinol., 6, 1134（1992）参照）に記載されたヒトＰＰＡＲα、γまたはδの受容体の構造より以下のプライマーを調製した。
Ｆ２：ヒトＰＰＡＲαの５′非翻訳領域とＮ末端アミノ酸Ｍｅｔ1−Ｖａｌ2に相当するセンスプライマー：５′−ＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＧＡＴＧＧＴ−３′（配列番号３）を合成した。
Ｒ２：ヒトＰＰＡＲαの３′非翻訳領域とアミノ酸停止コドンを含むアンチセンスプライマー：５′−ＡＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡ−３′（配列番号４）を合成した。
Ｆ３：ヒトＰＰＡＲγ（γ１サブタイプ）の５′非翻訳領域とＮ末端アミノ酸Ｍｅｔ1−Ｍｅｔ8に相当するセンスプライマー：５′−ＡＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＡ−３′（配列番号５）を合成した。
Ｒ３：ヒトＰＰＡＲγ（γ１サブタイプ）の３′非翻訳領域に相当するアンチセンスプライマー：５′−ＡＡＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴ−３′（配列番号６）を合成した。
Ｆ４：ヒトＰＰＡＲδの５′非翻訳領域とＮ末端アミノ酸Ｍｅｔ1−Ｇｌｕ6に相当するセンスプライマー：５′−ＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡ−３′（配列番号７）を合成した。
Ｒ４：ヒトＰＰＡＲδの３′非翻訳領域に相当するアンチセンスプライマー：５′−ＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴ−３′（配列番号８）を合成した。
ギブコＢＲＬ（GIBCO BRL）社のスーパースクリプト・ヒューマンリバーｃＤＮＡライブラリー（Superscript Human Liver cDNA Library，商品名，Cat. No. 10422-012）をｃＤＮＡライブラリーとしてＦ２とＲ２、Ｆ３とＲ３あるいはＦ４とＲ４をＰＣＲプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（Perkin Elmer社GeneAmp PCR System 9600）を使用して、９５℃で１２０秒×１→（９５℃で６０秒、６０℃で９０秒、７２℃で１２０秒）×３０→７２℃で１８０秒の条件でＰＣＲを行なった、その結果、1450ｂｐのヒトＰＰＡＲα、1469ｂｐのヒトＰＰＡＲγ、1367ｂｐのヒトＰＰＡＲδを得、ノバゲン（Novagen）社のＴ−ベクター（ｐＴ７Blue−Ｔ vector, Cat. No. 69836-1）に組込み全塩基配列を確認した。
実施例３：エフェクター蛋白発現系：Ｇａｌ４蛋白と核内受容体リガンド結合領域の融合蛋白（Ｇａｌ４キメラ受容体蛋白）をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築
東洋インキ社のピカジーン・ベーシックベクター２（Pica Gene Basic Vector 2（登録商標），ＰＧＢＶ２，Cat. No. 309-04821）を基本ベクターとして用い、構造遺伝子としてＧａｌ４キメラ受容体蛋白がＳＶ４０プロモーター支配下に発現するベクターを構築した。すなわち、ＰＧＢＶ２のルシフェラーゼ構造遺伝子を制限酵素ＮｃｏI、ＸｂａIで切出し、以下のように作製したＧａｌ４キメラ受容体蛋白をコードするｃＤＮＡを挿入することで完成した。
（１）Ｇａｌ４転写因子のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡの発現ベクターへの組込み
酵母の基本転写因子Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡをｐＧＢＴ９（クロンテック社、Cat. No. K1605-A）を鋳型としてＧａｌ４の１番目から１４７番目までのアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を実施例２と同反応条件でＰＣＲ増幅した。用いたプライマーは下記Ｆ５とＲ５である。
Ｆ５：Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域Ｎ末端側１番目から８番目までのアミノ酸および５′側の一部にＨｉｎｄIIIサイトと哺乳動物細胞内で有効に蛋白発現させる目的でコザック（kozak）配列を付したセンスプライマー：５′−ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＣ−３′（配列番号９）を合成した。
Ｒ５：Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域Ｃ末端側１４１番目から１４７番目までのアミノ酸および５′側の一部にＮｃｏIサイトを付したアンチセンスプライマー：５′−ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＴＡＣＡＧＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧ−３′（配列番号１０）を合成し、実施例２と同反応条件でＰＣＲ増幅した。その結果、約４６５ｂｐの増幅ＤＮＡ断片は全塩基配列を確認し、ＰＧＢＶ２ベクター内のＨｉｎｄIII／ＮｃｏI部位と組換した（以下、ｐＧＶgalと略記する。）。
（２）ヒトＰＰＡＲγリガンド結合領域をコードするＤＮＡ断片の獲得およびＧａｌ４−ヒトＰＰＡＲγキメラ受容体蛋白発現ベクターの構築
実施例２に従ってヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離したヒトＰＰＡＲγ全長ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＰＰＡＲγリガンド結合領域を含むＳｅｒ176からＴｙｒ478をコードするＤＮＡ断片を下記プライマーを合成し、実施例１と同反応条件でＰＣＲ増幅した。
Ｆ６：Ｓｅｒ176からＭｅｔ185、５′側にＮｃｏIサイト、ＳＶ４０Ｔ抗原由来の核移行シグナル（ＡｌａＰｒｏＬｙｓＬｙｓＬｙｓＡｒｇＬｙｓＶａｌＧｌｙ）、およびＢａｍＨIサイトを順に並べたセンスプライマー：５′−ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＡＧＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＣＧＧＡＴ−３′（配列番号１１）を合成した。
Ｒ６：Ｇｌｕ472からＴｙｒ478、ＳａｌＩサイトに続いて発現蛋白質の検出用にエピトープタグシークエンスとしてインフルエンザのヘマグルチニンエピトープ（ＴｙｒＰｒｏＴｙｒＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａ）、翻訳停止コドンおよびＸｂａIサイトを順に並べたアンチセンスプライマー：５′−ＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＧＧＧＣＡＣＧＴＣＧＴＡＧＧＧＧＴＡＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣ−３′（配列番号１２）を合成した。
前記したｐＧＶgalのＧａｌ４ＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡ下流のＮｃｏI／ルシフェラーゼ構造遺伝子下流のＸｂａI部位からルシフェラーゼ構造遺伝子を切出し、ヒトＰＰＡＲγリガンド結合領域をコードするＤＮＡ断片とを入れ替え、目的とするエフェクター蛋白の発現ベクターを得た（以下、ｐＧＶgal／γＬＢＤと略記する。）。
（３）ヒトＰＰＡＲαリガンド結合領域をコードするＤＮＡ断片の獲得およびＧａｌ４−ヒトＰＰＡＲαキメラ受容体蛋白発現ベクターの構築
ヒトＰＰＡＲαリガンド結合領域を含む下記プライマーを合成し、実施例２と同反応条件でＰＣＲ増幅し、ＰＰＡＲαリガンド結合領域構造遺伝子を合成した。このようにして得られたＰＰＡＲαリガンド結合領域構造遺伝子を前記で合成したｐＧＶgal／γＬＢＤベクターの制限酵素サイトのＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ部位を両制限酵素の消化によりＰＰＡＲγリガンド結合領域構造遺伝子のみを切出したものへ挿入し、Ｇａｌ４−ヒトＰＰＡＲαキメラ受容体蛋白発現ベクターを構築した（以下、ｐＧＶgal／αＬＢＤと略記する。）。
Ｆ７：ヒトＰＰＡＲαアミノ酸のＳｅｒ167からＡｒｇ175に相当し、その５′側にＢａｍＨIサイトを有するセンスプライマー：５′−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＣＧＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＡＣＧＡ−３′（配列番号１３）を合成した。
Ｒ７：ヒトＰＰＡＲαアミノ酸のＧｌｎ461からＴｙｒ468に相当し、その５′側にＳａｌＩサイトを有するアンチセンスプライマー：５′−ＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧ−３′（配列番号１４）を合成した。
（４）ヒトＰＰＡＲδリガンド結合領域をコードするＤＮＡ断片の獲得およびＧａｌ４−ヒトＰＰＡＲδキメラ受容体蛋白発現ベクターの構築
ヒトＰＰＡＲδリガンド結合領域を含む下記プライマーを合成し、実施例２と同反応条件でＰＣＲ増幅し、ＰＰＡＲδリガンド結合領域構造遺伝子を合成した。このようにして得られたＰＰＡＲδリガンド結合領域構造遺伝子を前記で合成したｐＧＶgal／γＬＢＤベクターの制限酵素サイトのＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ部位を両制限酵素の消化によりＰＰＡＲγリガンド結合領域構造遺伝子のみを切出したものへ挿入し、Ｇａｌ４−ヒトＰＰＡＲδキメラ受容体蛋白発現ベクターを構築した（以下、ｐＧＶgal／δＬＢＤと略記する。）。
Ｆ８：ヒトＰＰＡＲδアミノ酸のＳｅｒ139からＡｒｇ147に相当し、その５′側にＢａｍＨIサイトを有するセンスプライマー：５′−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＣＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＧＧ−３′（配列番号１５）を合成した。
Ｒ８：ヒトＰＰＡＲδアミノ酸のＧｌｎ434からＴｙｒ441に相当し、その５′側にＳａｌＩサイトを有するアンチセンスプライマー：５′−ＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧ−３′（配列番号１６）を合成した。
実施例４：レポーター遺伝子：Ｇａｌ４転写因子応答配列下にＴＫプロモーター、さらにＭＦａｓ構造遺伝子を配したレポータープラスミドの構築
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター支配下の発現ベクターｐＴＫβ（クロンテック社、Cat. No. 6179-1）を用いた。ｐＴＫβのβガラクトシダーゼ構造遺伝子上流および下流のＮｏｔＩサイトを消化し、平滑化した。次に挿入するＤＮＡ断片であるＭＦａｓ蛋白をコードするＤＮＡをｐＢＳＭＦａｓからＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩの両制限酵素で消化し、切出した後、平滑化した。両ＤＮＡ断片をライゲートし、ＴＫプロモーター下流にＭＦａｓ構造遺伝子が順方向に連結したクローンを選択した。得られた約4400ｂｐのプラスミドｐＴＫ−ＭＦａｓはＴＫプロモーター支配下にＭｆａｓ蛋白をコードするＤＮＡを配している。次いでプラスミドｐＴＫ−ＭＦａｓのＴＫプロモーター上流のＳａｌIサイトを消化し、平滑化後、マルチクローニングサイトをリンカーＤＮＡ（配列番号１７、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ−ｏｔＩ）：
0004044969.tif 000002
として挿入し、ｐＴＫ−ＭＦａｓ−ＭＬ１（５′−ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ−３′）とした。
基本単位（ＵＡＳ）を４回繰り返し、両側末端にＳａｌＩサイト／ＳａｃＩサイトをもつＧａｌ４応答配列：５′−Ｔ（ＣＧＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ）×４ ＡＧＣＴ−３′（配列番号１８）をｐＴＫ−ＭＦａｓ−ＭＬ１マルチクローニングサイト内のＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位へ挿入することによってエンハンサー領域とした。その結果、４×ＵＡＳに続いてＴＫプロモーター、ＭＦａｓ構造遺伝子を配するｐ４×ＵＡＳ−ＴＫ−ＭＦａｓ（約4600ｂｐ）を構築した。
得られた発現ベクターｐＳＶgal／αＬＢＤ、ｐＳＶgal／γＬＢＤまたはｐＳＶgal／δＬＢＤのいずれかとレポータープラスミドおよびｐＳＶ2bsr（科研製薬株式会社、Cat. No. KK-500）を、各々制限酵素ＡａｔII処理による線形化、ＮｏｔＩ処理による線形化、未処理（非線形の状態のまま）の操作後、量比１：１：0.1にて、リポフェクトアミン（Lipofect AMINE, GIBCO社，Cat. No. 18324-012）を用いて、マウス線維芽細胞Ｌ９２９に導入した。Exp. Cell Res., 197, 229（1991）に記載された方法（ブラスチサイジンＳ選択）にて安定導入された細胞を選択した。
実施例５：リガンド応答クローンの選択
１〜２週間の選択後、観測されたコロニーを限界希釈法にてセルクローニングし、増殖させた。例えば、各サブクローン２×１０4個／１００μｌの割合で１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む最少イーグル培地（Earle's MEM）に浮遊させ、９６穴マイクロタイタープレートに分配し、５％炭酸ガス中で３７℃で４〜６時間培養した。ＰＰＡＲγリガンドとして知られているＣＳ−０４５およびＢＲＬ−49653（Cell, 83, 863（1995）、Endocrinology, 137, 4189（1996）およびJ. Med. Chem., 39, 665（1996）参照）、ＰＰＡＲαリガンドとして知られているカルバサイクリンおよびＥＴＹＡ（J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157（1994）、Cell Structure and Function, 18, 267（1993）、Gene & Development, 10, 974（1996）およびEur. J. Biochem., 233, 242（1996）参照）、ＰＰＡＲδリガンドとして知られているカルバサイクリン（Gene & Development, 10, 974（1996）参照）およびメルク社化合物（ＰＣＴ国際出願国際公開9728149号の実施例７化合物参照）を用いてリガンド添加条件で有意に死滅する細胞を選択した。すなわち、これらの化合物の最終濃度１０μＭの２倍濃度の試料１００μｌを同培養ウェル中に添加し、さらに４０時間培養した。上清を捨てた後に、クリスタルバイオレット液（0.75％クリスタルバイオレット−0.25％ＮａＣｌ−1.75％ホルムアルデヒドの５０％エタノール液）に、室温で２０分間浸し、ホスフェートバッファーセーライン（ＰＢＳ）によるプレート洗浄を２回繰返して生存細胞を染色した（Cell, 66, 233（1991）参照）。プレートは直接マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍの吸光度を測定した。
実施例６：ＰＰＡＲγ、αおよびδリガンドのプラスミド安定導入Ｌ９２９細胞を用いた殺細胞アッセイ
実施例５で得られた最も応答能の高いクローンを上記の方法で培養し、この培養細胞を用いて、上記の化合物を上記の方法で細胞死を起こさせ、生残細胞を染色し、吸光度を測定した。細胞死は２４時間後から有意に出現し、３６〜４０時間ではプラトー域に到達して完結した。
ＣＳ−０４５およびＢＲＬ−49653でＰＰＡＲγリガンド応答クローンを４０時間処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第１図（Ａ）に示し、同様にコントロール細胞（Ｌ９２９）を化合物処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第１図（Ｂ）に示す。カルバサイクリンおよびＷｙ−14643でＰＰＡＲγリガンド応答クローンを４０時間処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第２図（Ａ）に示し、同様にコントロール細胞（Ｌ９２９）を化合物処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第２図（Ｂ）に示す。
また、カルバサイクリン、ＥＴＹＡ、Ｗｙ−14643およびＣＳ−０４５でＰＰＡＲαリガンド応答クローンを４０時間処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第３図（Ａ）に示し、同様にコントロール細胞（Ｌ９２９）を化合物処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第３図（Ｂ）に示す。
さらに、カルバサイクリン、メルク社化合物、ＥＴＹＡ、およびＣＳ−０４５でＰＰＡＲαリガンド応答クローンを４０時間処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第４図（Ａ）に示し、同様にコントロール細胞（Ｌ９２９）を化合物処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第４図（Ｂ）に示す。
なお、各図とも、溶媒のみを添加し、化合物を添加しない時の生細胞数の割合を１００％として表示している。
第１図から明らかなように、エフェクター蛋白Ｇａｌ４−ヒトＰＰＡＲγキメラ受容体蛋白の発現ベクターを安定導入した細胞ではＰＰＡＲγアゴニストとして知られているＣＳ−０４５およびＢＲＬ−49653はＬ９２９細胞に対し、直接的な毒性を示さないが、応答細胞を有意に死滅させ、しかも用量依存的な細胞死を示した。しかも、同じＰＰＡＲγアゴニストであってもＰＰＡＲγ蛋白との結合親和性が高い、あるいは転写活性化能の大きな化合物（Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431（1996）参照）ほど低濃度から著明な殺細胞作用を示した。
第２図から明らかなように、ＰＰＡＲαアゴニストとして知られているカルバサイクリンやＰＰＡＲα受容体アゴニストとして知られているＷｙ−14643に対しては毒性を示さない各々１０μＭ、１００μＭ以下の濃度では細胞死を示さない。特に、カルバサイクリンがＰＰＡＲγアゴニスト活性を示さない１０μＭ以下の濃度（Genes & Development, 10, 974（1996）参照）では、このＰＰＡＲγリガンド応答細胞では全く細胞死を示さない。
第３図から明らかなように、ＰＰＡＲαアゴニストとして知られているカルバサイクリン、ＥＴＹＡおよびＷｙ−14643に対しては用量依存的な細胞死を示す。一方、ＰＰＡＲγアゴニストとして知られているＣＳ−０４５に対しては毒性を示さない１０μＭ以下の濃度では細胞死を示さない。しかも、同じＰＰＡＲαアゴニストであってもＰＰＡＲα蛋白との結合親和性が高い、あるいは転写活性化能の大きな化合物ほど低濃度から著明な殺細胞作用を示した。
第４図から明らかなように、ＰＰＡＲδアゴニストとして知られているカルバサイクリンおよびメルク化合物に対しては用量依存的な細胞死を示す。一方、ＰＰＡＲγアゴニストとして知られているＣＳ−０４５やＰＰＡＲαアゴニストとして知られているＥＴＹＡに対しては毒性を示さない１０μＭ以下の濃度では細胞死を示さない。しかも、同じＰＰＡＲδアゴニストであってもＰＰＡＲδ蛋白との結合親和性が高い、あるいは転写活性化能の大きな化合物ほど低濃度から著明な殺細胞作用を示した。
以上の第１図、第２図、第３図および第４図の結果から、機能的なＭＦａｓペプチドの過発現によって細胞死がメディエートされること、ＰＰＡＲγリガンド応答細胞はＰＰＡＲγリガンドの作用強度に、ＰＰＡＲαリガンド応答細胞はＰＰＡＲαリガンドの作用強度に、またＰＰＡＲδリガンド応答細胞はＰＰＡＲδリガンドの作用強度に、よく相関して細胞死を起こすことが判明した。さらに、ＰＰＡＲのみならず他の核内受容体を用いた場合も、またヒトのみならず別の動物種由来のＰＰＡＲを用いた場合でも細胞死は生じた。本発明のレポーターアッセイを用いれば、プラスミドを安定導入したリガンド高応答クローンの獲得によって、核内受容体リガンドを容易にかつ、特異的に評価できる。しかもレポーターアッセイで評価しうる被験化合物の作用量は本発明のシステムにおける殺細胞作用を示す濃度域と極めて一致しており、各リガンドの作用強度も併せて評価することができる優れた方法である。
配列リスト
配列番号：１
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：７
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：８
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：９
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：６２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：６９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：８５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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