(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）フィブリノーゲンの溶液を収容するための区画及びその区画に連結した先端部の付いた筒を有する注射器様装置、
ｂ）流入口、流出口及び中間ハウジングを有するカートリッジであって、かつ、前記ハウジングが流入口及び流出口とともに内部空間のフィブリノーゲンの溶液の流れを定めており、そして流入口が前記筒の先端部に付着可能である、カートリッジ、
ｃ）水に不溶性の担体上に固定されたトロンビンを有する担体であって、かつ、前記ハウジングの内部空間内に含まれている、担体、
を含んでなる、流出口から適切な部位へ重合可能なフィブリンの活性化溶液を添加するための装置。
【請求項２】
フィブリノーゲンの溶液がさらに因子ＸIIIを含む請求項１記載の装置。
【請求項３】
トロンビンが共有結合及び非共有結合的相互作用の組み合わせを介して固体担体に接着されることにより固定化されている請求項１記載の装置。
【請求項４】
トロンビンが固体担体に共有結合により固定化されている請求項１記載の装置。
【請求項５】
固体担体が、ガラス、セルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化メタクリル酸塩、架橋アガロース、及びデキストランから選択された物質を含んでなる請求項４記載の装置。
【請求項６】
トロンビンが固体担体に非共有結合的に接着されることにより固定化される請求項１記載の装置。
【請求項７】
固体担体が、ガラス、セルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化メタクリル酸塩、架橋アガロース、及びデキストランから選択された物質を含んでなる請求項６記載の装置。
【請求項８】
流入口、流出口及び中間ハウジングを有するカートリッジを備えたフィブリノーゲンと接触せしめるための装置であって、前記ハウジングが流入口及び流出口とともに内部空間のフィブリノーゲンの溶液の流れを定めており、そして前記流入口が注射器様装置に付着可能であり、かつ、水に不溶性の担体上に固定化された生物学的に活性なトロンビンをさらに含んでなり、前記担体が前記ハウジングの内部空間内に含まれている、ことを特徴とする装置。
【請求項９】
トロンビンが共有結合及び非共有結合の組み合わせを介して担体上に固定化されている請求項８記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に、組織グルーまたはフィブリンシール剤としても知られているフィブリングルーに関する。より具体的には、本発明は、フィブリノーゲンを含んでいる溶液をトロンビンと接触させ、ある部位へその溶液を運搬する前に重合可能なフィブリンを形成する運搬系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィブリングルーは、多年の間知られている。例えば、Ｆｅｒｒｙへの米国特許第２，５３３，００４号は、フィブリンクロットを形成するための、トロンビン溶液と合わせた異なる濃度のフィブリノーゲン溶液の使用を示す。
【０００３】
フィブリングルーは、その主要成分であるα−トロンビン及びフィブリノーゲンに加えて、ヒト血漿から精製した場合にフィブリノーゲンと共に精製する少量の因子XIIIを含む可能性がある。トロンビンの存在下で、可溶性のフィブリノーゲンは、不溶性マトリックスに自己重合する不溶性フィブリンに転化される。トロンビンはまた、因子XIIIを因子XIIIａに転化する。後者は、フィブリンマトリックスを架橋して、組織グルーまたはフィブリングルーの有効性に寄与する高度に架橋したポリマーを生じる。グルー調製物は、出血の確かな停止を可能にし、損傷または組織表面の十分な接着能力を生み出し、接着させた部位またはふさがれた損傷の強く引っ張られる能力を与え、そして、創傷治癒の間の組織グルーの完全な吸収能を与える。フィブリングルーは、出血の制御（止血）のため、縫合糸または傷クリップの添加物または代わりのため、皮膚移植片を接着させるため、穿刺損傷をふさぐため、カテーテルをふさぎそして接着させるため、そして薬剤運搬の発着所（デポット）としての使用のためさえにも用いられている。
【０００４】
フィブリノーゲン及びα−トロンビンは、実際の使用時までこれらの２つのタンパク質を安定化し、そして完全に分離するように調整されなければならない。α−トロンビンは、活性化されたプロテアーゼであるので、溶液中で安定に保存することは特に困難である。Ｓｃｈｗａｒｔｚ等への米国特許第４，２９８，５９８号及び第４，３７７，５７２号、並びにＳｅｅｌｉｃｈへの第４，９０９，２５１号は、フィブリングルー調製物の組成の例を示す。
【０００５】
フィブリングルーのための現在の市販の製剤は、二本の注射器に包装されたα−トロンビン及びフィブリノーゲンの分離した凍結または凍結乾燥調製物を含む。これらの凍結調整物は、製品の二つの成分が凍結状態で保存され、そして輸送されることを必要とする。最後に、現在のフィブリングルーを調合するために用いられる二本の注射器は、通常の注射器よりいくぶんかさばり、扱うのが困難であり、そして使いにくいと感じるかもしれない。
【０００６】
先行技術において、様々な型の塗薬用具が開示されている。例えば、Ｒｅｄｌへの米国特許第４，３５９，０４９号は、多数の注射器本体及び単一の針の付いた連結先端部を含む注射器型の装置を開示する。
【０００７】
改善された塗薬用具が、Ｍｉｌｌｅｒへの米国特許第４，９７４，３６８号において開示された。この塗薬用具は、一緒にまたは別個に作動することのできる一対の注射器管、これらの注射器を互いに平行に保持する部材、及び治療部位へのフィブリングルーの成分の別個の運搬を可能にする２つの針の組み立て部品を含む。
【０００８】
他の装置は、異なる断面積を有し、従って成分の相対的な量を変える筒が付いた注射器を用いる。もう一つの注射器より２ないし９倍大きい面積を有する一つの注射器の断面を示すＥｉｂｌへの米国特許第４，７３５，６１６号を参照。
【０００９】
単一の注射器のフィブリンシール剤が記述されている。例えば、一つの出願において、フィブリノーゲン及びプロトロンビンの混合物が単一の注射器中に含まれ、そして損傷部位で内因性の因子Xａの作用により血餅形成が起こる。フィブリノーゲンと一緒の光で元へ戻せる阻害されたトロンビンに関する特許（両方ともＭｃＮａｌｌｙへの米国特許第５，２１９，３２８号及び第５，３１８，５２４号；ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．９１／００００３）も参照。
【００１０】
１９９５年のＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ｍｅｅｔｉｎｇで、単一の注射器のグルーとして予見されることのできる新規なフィブリンモノマー調製物の２件の報告（アブストラクト番号２１５０及び２１７４）があった。可溶性フィブリンモノマーを形成するためにバトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）がトロンビンの代わりに用いられ、そして次に、バトロキソビンがアフィニティークロマトグラフィーにより除かれた。しかしながら、バトロキソビンは、トロンビンと対照的に、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを切断し、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＢを切断したり、因子XIIIを活性化したりしない。
【００１１】
Ｌｉｎｎａｕへの米国特許第５，３９３，６６６号は、トリプシンによりプロトロンビンを活性化する方法を開示し、その中で、プロトロンビンは、水に不溶性の担体上に固定されたトリプシンで処理され、そして次に、活性化後、固定されたトリプシンから分離される。
【００１２】
フィブリングルーのための単一注射器の運搬系を設計することにおける主要な要求は、フィブリングルーの使用時まで、フィブリノーゲンの溶液を活性化プロテアーゼ、最も好ましくはα−トロンビンから完全に分離する必要性である。フィブリノーゲン及びトロンビンの溶液で、フィブリングルーは、グルー生成の適切な時までフィブリノーゲンをその活性化プロテアーゼから効果的に分離する二本の注射器系を用いることによってのみ、制御されたように生成されることができる。
【００１３】
我々の知っている限りでは、フィブリノーゲンを活性化し、そして重合可能なフィブリンの活性化溶液を単一の注射器で運搬できるようにするために注射器の先端部へ取り付けるためのカートリッジのような固定されたプロテアーゼを有する容器の使用を誰もこれまで提案していない。
【００１４】
【発明の要約】
我々の発明は、可溶性の重合可能なフィブリンの活性化溶液を生じる条件下でフィブリノーゲンの溶液を（好ましくは、因子XIIIと共に）固定されたトロンビンの調製物と接触させ、そして次に、可溶性フィブリンを損傷部位のような適切な部位に適用する工程を含んでなる方法を含む。固定されたトロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに切断し、そして（存在する場合）因子XIIIをタンパク質分解して活性化し、従って、フィブリングルーが液体の形態で適用部位へ運搬されることを可能にし、そしてそこでフィブリンモノマーの重合及びそれに続く架橋が、適時に適切な組織グルーを生成する。
【００１５】
我々の発明は、さらに、活性化及び運搬のためにフィブリングルーの成分を一緒にするための器具または装置を含んでなる。我々の発明は、単一の注射器のような器具または装置からフィブリングルーを運搬するための方法を提供することに特に適する。一本の注射器の運搬系は、損傷部位へフィブリングルーを添加するために、よりかさばる二本の注射器の系より都合よく用いられることができる。
【００１６】
【具体的な態様】
材料及び方法
材料
ヒトトロンビン及びフィブリノーゲンは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ）から購入された。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（商標）陽イオン交換樹脂は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入された。ＰｏｌｙＰｒｅｐ（商標）カラム及びニトロセルロースは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入された。界面活性剤を含まない酢酸セルロース（ＳＦＣＡ）注射器先端フィルター、２５ｍｍ、０．２μｍは、Ｎａｌｇｅｎｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）から購入された。ツベルクリン注射器は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）から購入された。Ａｃｔｉ−Ｄｉｓｋ（商標）５０グルタルアルデヒド（ＧＴＡ）膜カートリッジは、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）から購入された。全ての他の化学薬品は、試薬等級またはそれ以上であった。
【００１７】
一般的な方法
グルタルアルデヒド活性化膜へのトロンビンの共有結合的固定化
５０ｍｍ ＧＴＡ膜が、α−トロンビンの共有結合的接着のために調製された。この膜は、水で洗浄され、そして１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２で平衡化された。２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＰＥＧ、ｐＨ ６．５中の５３，４１８ユニット（１７０９ユニット／ｍｌ；５６０μｇ／ｍｌ）のα−トロンビンを室温で１．５時間１．８ｍｌ／分でＧＴＡカートリッジを通して再循環するために、ペリスタ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）ポンプが用いられた。架橋及び洗浄の前後にＡ280により測定されたように、添加されたα−トロンビンの６４％が、膜に共有結合的に架橋された。これは、（１００％の活性を仮定すると）３４，１８７ユニットの活性を有する１１．２ｍｇのトロンビンを示す。遊離した膜の結合部位は、１Ｍトリス、ｐＨ７．８、続いて１Ｍエタノールアミン、ｐＨ７．８でブロックされた。これらの両方は、室温で１．８ｍｌ／分で１時間再循環された。
【００１８】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（商標）陽イオン交換樹脂上へのトロンビンの吸着
α−トロンビン（３０５５ユニット）が、カラム形態の５ｍｌの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（商標）に吸着された。樹脂は、トロンビンの吸着前に１０ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８で平衡化された。α−トロンビンが、１０ｍｌのＰｏｌｙＰｒｅｐ（商標）カラム中の樹脂に加えられ、そして室温で１０分間結合させられた。１０カラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８で樹脂が洗浄された。
【００１９】
ニトロセルロース上へのトロンビンの吸着
２５ｍｍ円形ディスクのニトロセルロース（ＢｉｏＲａｄ）が、１２５６ユニットに等しい４１１μｇのα−トロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）の溶液中に置かれ、室温で２０分間振盪された。このニトロセルロースは、結合しなかったトロンビンを除くために、室温で２００ｍｌのＰＢＳ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４）中で、各２分、３回洗浄された。
【００２０】
本開示の原理は、図を参照することにより理解されることができる。図１は、好ましくはＦＸIII分子も含む水溶液中のフィブリノーゲン分子２２ａが、（フィブリノーゲン分子２２ａからフィブリノペプチドを切断できる）生物学的に活性のある形態で共有結合したトロンビン分子を含む固定化マトリックス２７を、どのようにして移動またはこれと接触するかを非常に概略的に示す。固定化マトリックス２７に結合したトロンビンを通過またはこれと接触後、フィブリノペプチドがフィブリノーゲン２２ａから切断され、重合可能なフィブリン分子を生じる。次に、活性化されたＦＸIII（ＦＸIIIａ）が、重合しているフィブリンに架橋を導入する。
【００２１】
図２は、トロンビンが、マトリックスを形成する水に不溶性の担体物質に吸着されることを除いて、図１と同じ概略的な流れを示す。このよりゆるい結合は、（存在する場合）次のＦＸIIIの活性化のためにトロンビン分子の少なくともいくらかがフィブリン分子と共に運ばれることを可能にする。
【００２２】
図３は、本開示の原理を例示するために用いられる注射器様装置を示す。図３は、注射器本体１７、並びに親指で押す平板１５及びフィブリノーゲン２２の溶液を含む液体室２１上に位置するプランジャ先端部１９の付いた注射器プランジャ１３からなる単一の筒形注射器１１を含んでなる。注射器１１は、流入口３１（示されない）、流出口３３、及び保持スクリーン２９を有するカートリッジ２５に（例えば、固定可能な摩擦またはＬｕｅｒＬｏｃｋ（商標）型装着、示されない、により）連結可能な流出口２３のより下の末端で終わる。カートリッジ２５内には、図１及び２において示されたようなマトリックス及び固定されたトロンビンがある。カートリッジ２５内に保持された固定化トロンビンは、樹脂ビーズ、多孔性ガラス粒子、タンパク質の固定化に適用されるディスク、ニトロセルロース粒子またはディスクなどのような様々なよく知られた担体上にあることができると理解されることができる。主要な要求は、親指の圧力が親指平板１５にかけられた時に、プランジャ先端部１９がフィブリノーゲン溶液２２を注射器１１から押し出すと、フィブリノーゲン溶液２２がカートリッジ２５を通って流れることができ、そしてその流れが、固定されたトロンビンとフィブリノーゲンの即座の接触を可能にする条件下でなければならないということである。
【００２３】
本発明の原理を例示する実施例において、我々は、市販されているＡｃｔｉ−Ｄｉｓｋ（商標）カートリッジを用い、その現在あるカートリッジ系にトロンビンを固定した。他の２つの実施例において、我々は、市販のフィルターカートリッジの中に固定したトロンビンマトリックスを導入した。カートリッジ２５に対する主要な要求は、注射器の流出末端に付けることができ、そしてフィブリノーゲン溶液２２がそれを通過する時に、固定したトロンビンの固定化担体物質を保持することができるということである。また、図１及び２、並びに以下の実施例において示されるように、トロンビンは、共有結合または非共有結合により固定されることができる。
【００２４】
α−トロンビンは、適当な固体マトリックスに結合した安定な固定化調製物として調整されることができる。本発明の一つの態様において、固定されたトロンビンは、標準的な注射器のＬｕｅｒＬｏｃｋ（商標）先端部に動かないように付けられることのできる小型で取り換え可能なカートリッジ中に含まれる。フィブリノーゲンは、安定な溶液として、好ましくは、ＬｕｅｒＬｏｃｋ（商標）先端部を有する注射器中に調整及び供給され、そして安定性を保証するために凍結されることができる。使用時に、フィブリノーゲン溶液は、その注射器中、環境温度まで暖められ、固定されたα−トロンビンのカートリッジがその注射器の流出先端部に付けられ、そして損傷部位へのフィブリングルーの運搬のためにα−トロンビン含有カートリッジを通してフィブリノーゲン溶液が注射器から押し出される。α−トロンビン含有カートリッジの断続した使用がフィブリンクロットで流出口をふさぐことを生じた場合、注射器筒中に含まれた残りのフィブリノーゲン溶液を用いてフィブリングルーを続けて添加することを可能にするために、ふさがれたカートリッジは、新しいカートリッジにより簡単に取り換えられることができる。この設計は、フィブリングルー注射器の調製時間を最小限にし、単一の注射器からのフィブリングルーの運搬を可能にし、従って、普通の大きさ及び感触の小型の注射器塗薬用具を使用者（例えば、外科医）に提供する。さらなる利点として、この独特な製品設計は、アプロチニンのようなプロテアーゼインヒビターを伴う調整を必要としない。
【００２５】
フィブリノーゲン及び因子ＸIIIを活性化するために用いられるα−トロンビンプロテアーゼは、適当な固体担体に共有結合または非共有結合のいずれかで固定されることができ、あるいは、透過性のある区画内に含まれるＣＬＥＣ（商標）（Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ）の形態であることができる。プロテアーゼは、十分な生物学的活性を保持しながら、様々な形状（例えば、ビーズ、膜、フィルターなど）及び組成（例えば、ガラス、ニトロセルロースまたは他のセルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化したメタクリル酸塩、架橋したアガロース、デキストランなど）の固体担体に共有結合的に固定されることができると考えられる。プロテアーゼが共有結合的に固定される場合、プロテアーゼはその固体の水に不溶性の担体上に完全に保持され、フィブリングルーが添加される時に損傷部位へ押し出されない。
【００２６】
活性化するプロテアーゼはまた、プロテアーゼ及びその担体間の化学的または物理的引力に基づいて、固体担体に非共有結合的に固定されることもできる。これらの引力は、相補的な分子構造の性質のもの（例えば、抗体−抗原相互作用、金属イオン結合、ホウ素化樹脂もしくは固定化レクチンへの糖質の結合、またはアフィニティークロマトグラフィーの他の型）あるいは表面の物理的特性（例えば、疎水性、電荷、水素結合など）に基づく吸着であることができる。
【００２７】
プロテアーゼがその担体へ非共有結合的に接着する場合、担体に結合したプロテアーゼ上へフィブリノーゲン溶液を通す間に、プロテアーゼが、その担体に結合したままであるか、または部分的もしくは完全に遊離されるかのいずれかである条件が考案されることができる。いくつかの用途に対しては、得られるシール剤の質を最適化するために、カートリッジの先端部から損傷部位へプロテアーゼ及びフィブリン／フィブリノーゲンを共に押し出すことができることが好ましいかもしれない。
【００２８】
実際、本発明の理想的な態様は、共有結合的及び非共有結合的に固定された活性化プロテアーゼの組み合わせを含むことができる。活性化プロテアーゼがその固体担体に共有結合または非共有結合されるかどうかにかかわらず、フィブリノーゲンのフィブリンへの活性化の度合いは、担体上に存在する生物学的に活性のある酵素触媒部位の量を変えることにより制御されることができる。
【００２９】
【実施例】
実施例１
共有結合的に固定されたトロンビンによる可溶性フィブリノーゲンのフィブリンへの切断
固定された（結合した）トロンビンを含んでいるＡｃｔｉ−Ｄｉｓｋ（商標）カートリッジを上記のように調製した。次に、膜を室温で２．５ｍｌ／分で１０分間水で洗浄し、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ ７．８で平衡化した。陰性コントロールとして、この平衡化溶液の２００μｌを１０ｍｇ／ｍｌで３００μｌフィブリノーゲンと混合した。何の凝固も観察されなかった。
【００３０】
２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．８中のフィブリノーゲンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を、７００μｌ／分でＡｃｔｉ−ＤｉｓｋR（商標）カートリッジを通して流した。流出物質を集めた。約３ｍｌの溶液をカートリッジに通過させた（２ｍｌ及び１ｍｌ画分として集められた）。両画分とも２分以内に凝固した。これらの実験は、トロンビンを共有結合的に接着した膜を通過しながらフィブリノーゲンがフィブリンに切断され、その結果、膜カートリッジの外部でのフィブリンの重合をもたらすことを示す。
【００３１】
実施例２
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（商標）陽イオン交換樹脂に吸着したトロンビンによる可溶性フィブリノーゲンのフィブリンへの切断
トロンビンを記述したようにＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）樹脂上に固定した（材料及び方法を参照）。トロンビンを吸着した樹脂（１００μｌ）、続いて１００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．８を、０．２μｍ ＳＦＣＡ注射器先端フィルターにピペットで移した。１００ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ ７．８中１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンの１ｍｌサンプルを、１ｃｃのツベルクリン注射器中に添加した。フィブリノーゲン溶液のイオン強度は、この溶液が陽イオン樹脂と接触した時にトロンビンが溶出されるようにであった。
【００３２】
トロンビン吸着樹脂を通してフィブリノーゲンを流した時、注射器及びフィルターカートリッジから出る物質は、フィブリノーゲン／フィイブリン及びトロンビンの混合物を含み、約３０秒のうちにフィブリンクロットの形成を生じた。吸着したトロンビンを含まない陰性コントロールの樹脂は、同じ実験条件下でフィブリノーゲン溶液を凝固できないことを示した。フィブリノーゲンのより希釈された（１ｍｇ／ｍｌ）溶液をトロンビンが吸着した陽イオン樹脂の第二のアリコートを通過させると、４５秒の凝固時間及びより弱く見えるクロットを生じた。注射器先端部のフィルターカートリッジの中へ添加するトロンビンを吸着した陽イオン樹脂の量を減少すると（１０μｌ）、フィブリノーゲンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を上と同じイオン強度で通過させた時に１分の凝固時間をもたらした。
【００３３】
これらの実験は、トロンビンが、陽イオン交換樹脂に非共有結合的に吸着された場合にフィブリノーゲンを切断でき、その結果、フィブリングルーまたはクロット形成を生じることを示す。さらに、フィブリノーゲン及び／またはトロンビンの量を変えることにより、クロット形成の強さ及び時間を変えることができる。異なった凝固特性は、異なる用途のために有用であるかもしれない。
【００３４】
実施例３
ニトロセルロース上に固定されたトロンビンによる可溶性フィブリノーゲンのフィブリンへの切断
膜表面上に固定されたトロンビンを有するニトロセルロース膜を上記のように調製した。このニトロセルロースを切って開けられた２５ｍｍ使い捨てフィルターカートリッジ内部に置き、Ｐａｒａｆｉｌｍ（商標）実験用フィルムで閉じた。トロンビンが膜から洗浄して除かれるかどうかを試験するために、１ｍｌの水をカートリッジに通し、２０ｍｇ／ｍｌで５００μｌのフィブリノーゲン中に集めた。カートリッジを出た物質は、５秒以内にフィブリノーゲンを凝固した。上記のことを水の１ｍｌアリコートでもう４回繰り返し、それぞれ２０秒、４５秒、２分、及び５分の凝固時間をもたらした。
【００３５】
次に、フィブリノーゲンの１ｍｌ溶液を１０ｍｇ／ｍｌ（５ｍＭクエン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ ７．８）でカートリッジを通過させ、１４の別個の画分（１滴／画分）を集めた。最初の３つの画分は凝固せず、これらは、カートリッジ中の水のホールドアップ容積のためにおそらくほとんどフィブリノーゲンを含まなかった。画分＃４は、おそらくホールドアップ容積の水による希釈の結果減少したフィブリノーゲン濃度のために、部分的または弱いクロッを含んだ。画分５から１４は、１．５分後に同程度に強いクロット形成を有するように見えた。
【００３６】
ＰＢＳ中でニトロセルロースを洗浄せずに、むしろニトロセルロースを含んでいるカートリッジに５ｍｌの水を通して上の実験を繰り返した。また、フィブリノーゲンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌをカートリッジに通し、１８秒のうちにクロット形成を生じた。これらの実験は、ニトロセルロースに吸着したトロンビンがフィブリノーゲンをフィブリンに切断することができ、その結果、クロット形成を生じることを示す。
【００３７】
説明
フィブリノーゲンは、自発的重合がフィブリン（グルー）をもたらすフィブリンモノマーにタンパク質分解により切断されなければならない。得られたフィブリングルーの安定性及び強度は、（因子ＸIIIａとして知られている）活性化された因子ＸIIIにより触媒されるフィブリン鎖の架橋により増大される。これらの実施例は、フィブリノーゲン及び因子ＸIIIの両方が、注射器から押し出されながら固定されたα−トロンビンに一時的にさらされると、そのプロテアーゼにより切断され、その結果として活性化されることができる様々な方法を示す。本質的に同様の結果に達するために、同等の方法を用いることができる。
【００３８】
本明細書に開示された発明は、他の有用な治療反応を触媒するために固定化酵素系が用いられることのできる他の系における用途を有すると考えられる。例えば、血栓溶解のためのプラスミンの投与、または止血のための活性化凝固因子（例えば、因子IIａ、Ｖａ、VIIａ、VIIIａ、IXａ、Ｘａ、XIａ、XIIａ、ＸIIIａ）の投与、または抗凝血のための活性化プロテインＣの投与は、本発明の応用から利益を得ることができる。
【００３９】
上記の実施例は本発明を例示することを意図され、そして変形が当該技術分野において熟練したものに見いだされると考えられる。従って、本発明の範囲が以下の請求項によってのみ制限されなければならないことが意図される。
【００４０】
本発明の特徴及び態様を示せば以下のとうりである。
【００４１】
１．  ａ）フィブリノーゲンの溶液のための区画を有するハウジング、
ｂ）重合可能なフィブリンの活性化溶液を生じるフィブリノーゲンの活性化を可能にする条件下で、固定したトロンビンとフィブリノーゲンの溶液を接触させるための手段、及び、
ｃ）所望の部位に、その部位で重合されたフィブリンを生じる条件下で、その活性化溶液を運搬するための手段、
を含んでなる、所望の部位へ重合可能なフィブリンの活性化溶液を適用するための装置。
【００４２】
２．  フィブリノーゲンの溶液がさらに因子ＸIIIを含む上記１の装置。
【００４３】
３．  固体担体に共有結合的に接着されることによりトロンビンが固定される上記１の装置。
【００４４】
４．  固体担体が、ガラス、セルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化したメタクリル酸塩、架橋したアガロース、及びデキストランから選択された物質を含んでなる上記３の装置。
【００４５】
５．  固体担体に非共有結合的に接着されることによりトロンビンが固定される上記１の装置。
【００４６】
６．  固体担体が、ガラス、セルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化したメタクリル酸塩、架橋したアガロース、及びデキストランから選択された物質を含んでなる上記５の装置。
【００４７】
７．  共有結合及び非共有結合的相互作用の組み合わせを介して固体担体に接着されることによりトロンビンが固定される上記１の装置。
【００４８】
８．  ａ）フィブリノーゲンの溶液のための区画及びその区画に連結した先端部の付いた筒を有する注射器様装置、
ｂ）その筒の先端部に付着可能な流入口、流出口、並びに流入口及び流出口で内部空間の流れを定める中間にあるハウジングを有するカートリッジ、並びに、
ｃ）カートリッジハウジングの内部空間内に含まれる、担体上に固定されたトロンビンを有する水に不溶性の担体、
を含んでなる、適切な部位へ重合可能なフィブリンの活性化溶液を添加するための装置。
【００４９】
９．  水に不溶性の担体上に固定された生物学的に活性のあるトロンビンを含んでなる組成物。
【００５０】
１０．  トロンビンが共有結合を介して担体上に固定される上記９の組成物。
【００５１】
１１．  トロンビンが非共有結合を介して担体上に固定される上記９の組成物。
１２．  トロンビンが共有結合及び非共有結合の組み合わせを介して担体上に固定される上記９の組成物。
１３．  ａ）重合可能なフィブリンの活性化溶液を生じる条件下で、固定したトロンビンとフィブリノーゲンの溶液を接触させ、そして、
ｂ）適切な部位へ、その部位で重合したフィブリンを生じる条件下でその活性化溶液を運搬する、
ことを含んでなる、適切な部位へ重合可能なフィブリンの活性化溶液を添加するための方法。
【００５２】
１４．  フィブリノーゲンの溶液がさらに因子ＸIIIを含む上記１３の方法。
【００５３】
１５．  固体担体に共有結合的に結合されることよりトロンビンが固定される上記１３の方法。
【００５４】
１６．  固体担体が、ガラス、セルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化したメタクリル酸塩、架橋したアガロース、及びデキストランから選択された物質を含んでなる上記１５の方法。
【００５５】
１７．  固体担体に非共有結合的に結合されることによりトロンビンが固定される上記１３の方法。
【００５６】
１８．  固体担体が、ガラス、セルロース材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリヒドロキシル化したメタクリル酸塩、架橋したアガロース、及びデキストランから選択された物質を含んでなる上記１７の方法。
【００５７】
１９．  共有結合及び非共有結合の組み合わせを介して固体担体に接着されることによりトロンビンが固定される上記１３の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】マトリックスに共有結合的に結合したトロンビン上へのフィブリノーゲンの通過を示す。
【図２】トロンビンがマトリックスに非共有結合的に固定され、それにより、マトリックスを通してフィブリノーゲン分子を流す間にトロンビンの少なくともいくらかが遊離されることを可能にすることを除いて、図１と同様の工程を示す。
【図３】本開示の原理を例示するために用いられる注射器様装置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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