(57)【要約】本開示は、胃腸、皮膚、もしくは尿路の疾患および感染症と闘い、抗生物質耐性の伝播を防止し、かつ／または環境病原体を除染するように、生物中の望ましくない核酸を標的とし、分解する能力を付与するための操作された遺伝システムおよび方法を提供する。操作された遺伝システムは、ヒトおよび動物の治療的処置に使用することもできる。望ましくない核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであり得る。一局面では、操作された遺伝システムが提供され、この遺伝システムは、毒性因子、毒素、エフェクター、病原性成分、および／または抗生物質耐性形質をコードする目的の核酸を特異的に標的とし、分解するように設計されたヌクレアーゼモジュール；ならびに１つの宿主細胞から別の宿主細胞に上記システムを拡散させることができる合成可動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）モジュールを含む。
2017512500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された遺伝システムであって、
毒性因子、毒素、エフェクター、病原性成分、および／または抗生物質耐性形質をコードする目的の核酸を特異的に標的とし、分解するように設計されたヌクレアーゼモジュール；ならびに
１つの宿主細胞から別の宿主細胞に前記システムを拡散させることができる合成可動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）モジュール；
を含み、前記ヌクレアーゼモジュールが、前記ＭＧＥモジュール中に位置した遺伝子によってコードされるヌクレアーゼを含む、遺伝システム。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼモジュールが、Ｃａｓタンパク質および１つまたは複数の合成ｃｒＲＮＡを含み、各ｃｒＲＮＡが、前記目的の核酸に由来する標的配列を有するスペーサーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ｃｒＲＮＡ（複数可）が、ＣＲＩＳＰＲアレイから転写され、プロセシングされる、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイが、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下に置かれている、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼモジュールが、前記Ｃａｓタンパク質および前記ｃｒＲＮＡと複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む、請求項２から４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下に置かれている、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよび前記ｃｒＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ中に備えられている、請求項５または６に記載のシステム。
【請求項８】
前記Ｃａｓタンパク質が、構成的または誘導的に発現される、請求項２に記載のシステム。
【請求項９】
前記標的配列が、前記目的の核酸中のプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）に直接隣接している、請求項２に記載のシステム。
【請求項１０】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記ＰＡＭが、前記標的配列の３’側にＮＧＧ配列を有する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼが、前記目的の核酸を標的とし、分解するように設計された転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼが、前記目的の核酸を標的とし、分解するように設計された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記ヌクレアーゼが、前記目的の核酸を標的とし、分解するように設計されたメガヌクレアーゼを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記毒性因子、前記毒素、前記エフェクター、前記病原性成分、および／または前記抗生物質耐性形質が、表１および２に列挙されたものから選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記ＭＧＥモジュールが、トランスポサーゼをコードする遺伝子、およびバクテリオファージ、接合性プラスミド、または接合性トランスポゾンから選択されるＭＧＥを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記トランスポサーゼが、Ｔｎ３またはＴｎ５に由来し、前記ＭＧＥが、Ｔｎ９１６、ＲＫ２、Ｐ１、Ｔｎ５２８０、またはＴｎ４６５１に由来する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
疾患もしくは感染の防止および／もしくは処置、抗生物質耐性の防止および／もしくは処置、抗生物質耐性の伝播の限定、ならびに／または環境病原体の除染に使用するための、請求項１に記載のシステムを含む操作された生物。
【請求項１８】
前記システムが、細菌細胞、古細菌細胞、および／または酵母細胞から選択される宿主中に導入される、請求項１７に記載の操作された生物。
【請求項１９】
胃腸管内で使用するための経口プロバイオティクスである、請求項１８に記載の操作された生物を含む操作されたプロバイオティクス。
【請求項２０】
尿路内で使用するためのプロバイオティクスである、請求項１８に記載の操作された生物を含む操作されたプロバイオティクス。
【請求項２１】
皮膚上で使用するための局所用プロバイオティクスである、請求項１８に記載の操作された生物を含む操作されたプロバイオティクス。
【請求項２２】
前記宿主が、細菌のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、またはＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門から選択される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２３】
前記宿主が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＦＳ５１９、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＣＣＵＧ  ３９９１３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  Ｓｍａｒｌａｂ  ３３０１１８６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＭＰＮ分離株群６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  １２１４８、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＷＨ２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＷＨ３０２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓを含めたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種から選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２４】
前記宿主が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔａｅａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＤＳＭ  ６８７７（ＦＳ４１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ａ２−２０７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１８３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＬ６／１／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＧＭ２／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１９４、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１６６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１７５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＲ１／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ１−８３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−２３１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１６５、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＳ２／１を含めたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種から選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２５】
前記宿主が、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅを含めたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２６】
前記宿主が、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ａｌｌｉｓｏｎｅｌｌａ  ｈｉｓｔａｍｉｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｕｌｌｅｉｄａ  ｍｏｏｒｅｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  ＣＫ０３５、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｄｏｒｅａ  ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｓｐ．  Ｅ２＿２０、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  Ｒ００２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚｉａｅ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｕｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｎｄｓｖａｌｌｅｎｓｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、およびＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓから選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２７】
前記宿主が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２８】
前記宿主が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉから選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項２９】
前記宿主が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＧＢＩ−３０，６０８６、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−１２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ３５６２４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  Ｓｔ１１（またはＮＣＣ２４６１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  Ｌａ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＮＣＣ５３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ５５７３０、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  １７９３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ５２８９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＲ−１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＲＣ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＬ１２８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＬＢＣ８０Ｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ８７００：２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＭＧ  Ｐ  ２２０４３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＢＦＥ  ６１２８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＭＥ−３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＦＥ  １６８５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＢ２１  ＮＣＩＭＢ  ４０５６４から選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項３０】
前記宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株から選択される、請求項１９または２０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項３１】
前記宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１５、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７から選択される、請求項１９、２０、または３０に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項３２】
前記宿主が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択される、請求項２１に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項３３】
前記宿主が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍから選択される、請求項２１に記載の操作されたプロバイオティクス。
【請求項３４】
疾患もしくは感染を防止および／もしくは処置するため、抗生物質耐性を防止および／もしくは処置するため、ならびに／または抗生物質耐性の伝播を限定するための方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項１９から３３のいずれか一項に記載の操作されたプロバイオティクスを投与することを含む、方法。
【請求項３５】
請求項１７に記載の少なくとも１種の操作された生物を含む細胞の集団であって、前記少なくとも１種の操作された生物中のＭＧＥモジュールが、前記集団中の他の細胞内に操作された遺伝システムを伝播させることができる、細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年３月２５日に出願された米国仮出願第６１／９７０，０２４号（この全体の開示は、参考として本明細書に援用される）への優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
政府のライセンス権に関する陳述
本発明は、米国国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）ＳＢＩＲプログラムによって授与された契約番号Ｗ３１Ｐ４Ｑ−１３−Ｃ−００６３の下での政府支援のもとで行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、遺伝子編集のためのプロバイオティクスなどの細胞内に導入することができる操作された遺伝システムを開発するためのシステム、機構、および方法に関する。操作されたプロバイオティクスは、例えば、胃腸、皮膚、または尿路の疾患および感染症の処置、抗生物質耐性の伝播と闘うこと、および環境病原体の除染において使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
次世代配列決定技術は、研究者がマイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）のゲノムコンテンツを迅速かつ正確に調べ、共生微生物および病原性微生物の両方を分類整理することを可能にしている。哺乳動物マイクロバイオームの我々の理解の進展は、病原体および毒性遺伝子の存在および正確な遺伝子型を同定し、健康な個体と病気の個体のマイクロバイオームの組成および構造を区別するための診断ツールとしての次世代配列決定の使用をもたらす可能性が高い。
【０００５】
同様に、合成生物学および代謝工学のツールおよび技術を使用して微生物を操作する能力は、健康なマイクロバイオーム状態を回復させるのに操作された微生物を適用することを考え始めることができるポイントまで進展している。操作された生物は、治療剤製造、生物医学的研究について、より最近では生成物自体としてヒトの健康および獣医学的健康において既に広く使用されている。ヒトおよび動物の健康および疾患をモジュレートする新しいストラテジーを開発するのにマイクロバイオーム発見および合成生物学の分野を併合することが現在では可能である。
【０００６】
この分野において機会が増大している領域の１つは、微生物成分を伴った疾患および感染症をモジュレートするために、プロバイオティクスを使用することによってマイクロバイオームに基づく発見を治療上の影響につなげることである。完全には理解されていないが、多くの皮膚障害は、微生物成分を有すると考えられている。アトピー性皮膚炎から生じる病変は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのような病原体に感染した状態になることが多い。脂漏性皮膚炎は、殺真菌薬を用いた処置が有効であるので、真菌成分を有すると考えられている。火傷は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染していることが多い。
【０００７】
現在、炎症性腸疾患（ＩＢＤおよびＩＢＳ）、肥満、ならびにメタボリック症候群を含めた多くの胃腸疾患状態は、糞便および腸粘膜コミュニティの組成の変化と関連している。プロバイオティクス、または有益な微生物は、腸内微生物叢と宿主との間の共生を改善し、または腸内毒素症（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）の状態を修復するのに使用されている。プロバイオティクスは、免疫応答をモジュレートし、不可欠な栄養分を提供し、または感染性因子の増殖および毒性を抑制する場合がある。特に、腸内微生物叢は、胃腸の健康に影響を与えることが公知であり、この恒常性の混乱は、下痢症などの多くの疾患状態と関連している。下痢症は、１日当たり３回またはそれ超の緩いまたは液体の排便を有する状態としてＷＨＯによって定義されている。この疾患は、通常、感染性因子に起因する急性のもの、または通常、腸に罹患する他の医学的状態、例えば、ＩＢＤ、ＩＢＳ、およびクローン病などと関連した慢性のものであり得る。胃腸管内の微生物バランスの喪失は、一般に、すべての形態の下痢症と関連している。したがって、プロバイオティクスは、疾患の潜在的な治療的または防止的処置として臨床的注目を獲得している。
【０００８】
残念ながら、臨床現場におけるプロバイオティクスの有効性の証拠は、下痢症の防止についてはわずかであり、試験される集団、プロバイオティクスのタイプ、処置の継続時間、および投与量の差異におそらく起因して結果が矛盾することがよくある［Ｇｕａｎｄａｌｉｎｉ、２０１１年］。さらに、多くのプロバイオティクスは、固有の生理的および技術的な弱点によって妨げられ、多くの場合、ほとんどの臨床的に有望な株は、治療剤として適していない。下痢症に対するその影響について試験される最も一般的なプロバイオティクスは、単独で、または互いに組み合わせたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓである。これらの可変的要因のために、現在の野生型プロバイオティクスが、下痢症の成功裏の治療的介入の実行可能な候補となる可能性は低い。
【０００９】
胃腸感染症の処置は、抗生物質耐性の増大によってさらに複雑となっている。院内細菌感染の７０％超が、抗生物質の１つまたは複数のクラスに対する耐性を持つ。抗生物質耐性病原性微生物感染の蔓延は、実践および政策の錯綜に由来する。これまで、薬物耐性病原体の増大は、改善された封じ込めの実践、抗生物質の慎重な使用、ならびに政府主催の抗生物質研究および開発プログラムによって対処されてきた。これらの取り組みにもかかわらず、抗生物質耐性の伝播は、重大な、拡大する脅威であり続けている。
【００１０】
尿路感染症は、女性の５０％および男性の１２％に、彼らの寿命において少なくとも１回罹患し、これらの感染症の８０％は、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）として公知の、あるグループのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによって引き起こされる［Ｂｒｕｍｂａｕｇｈ、２０１２年］。胃腸感染症と同様に、ＵＰＥＣ感染症は、複数の抗生物質に対する耐性と合併していることが多い。尿路感染症を有する女性の２５％が、最初の感染から６〜１２カ月以内に再発性感染症に罹患し、すべての女性の３％が持続的再発性尿路感染症に罹患する。予防的な抗生物質が、持続的再発性尿路感染症を有する女性に対する処置の現在のコースであり、抗生物質耐性の率が上昇したため、医師は、ファーストおよびセカンドライン抗生物質をあきらめざるをえなくなっている。持続性ＵＰＥＣ感染症の合併症に加えて、続発性イースト菌感染症および胃腸感染症などの共存症は、新しい処置を開発することの重要性を増大させる。
【００１１】
したがって、皮膚、胃腸、または尿路の疾患および感染症の処置に対する、これらの薬物耐性微生物の食い止めを含めた新しいストラテジーが必要とされている。さらに、特定の病原体または毒素を標的とするようにプロバイオティクスを適合させる能力は、皮膚、胃腸、または尿路の疾患および／または感染症の新規療法をもたらす。さらに、薬物耐性微生物を標的とする能力をプロバイオティクスに賦与する能力は、大きな治療的価値のものである。
【００１２】
マイクロバイオームの他に、抗生物質耐性細菌またはその他の病原性細菌を持つエリアを除染する必要性もある。動物飼料が、食品サプライに入る薬物耐性微生物の源として同定された［Ａｌｌｅｎ、２０１４年］。治療量以下レベルの抗生物質が動物飼料添加剤として一般に使用されており、この実践は、農業現場および臨床現場における抗生物質耐性微生物の伝播を悪化させている［Ｓｉｌｂｅｒｇｅｌｄ、２００８年］。家畜飼料または動物飼料中の薬物耐性微生物を標的とする操作されたプロバイオティクスは、食品サプライにおける抗生物質耐性遺伝子の伝播を制御する新しいストラテジーである。
有益なプロバイオティクスで動物飼料を処理するストラテジーは、病原性細菌を持つ他の環境の除染に同様に適合させることができる。プロバイオティクスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓなどの生物兵器として使用されている病原性細菌を標的とするように設計することができる。これらのプロバイオティクスは、プロバイオティクスの局所適用および／もしくは摂取によって、または懸念される特定の因子にユニークな遺伝子配列を標的とするようにプロバイオティクスを設計することによって、その特定の因子を正確に標的とし得る。これらの手法は、特定の因子細菌によって汚染された環境サイトの除染に適合させることもできる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｒｕｍｂａｕｇｈ，Ａ．Ｒ．およびＭｏｂｌｅｙ，Ｈ．Ｌ．Ｔ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（２０１２）；１１、６６３〜６７６
【非特許文献２】Ａｌｌｅｎ  ＨＫ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１４）１９：２５〜９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示のシステムおよび方法は、操作されたプロバイオティクスを使用する疾患および感染症の処置などの多くの適用を有する、操作された遺伝システムを提供する。さらに、本開示のシステムおよび方法は、微生物コミュニティ内またはそれ以外の抗生物質耐性、抗生物質耐性の伝播、および／または病原性要素の伝播を低減または排除するのに使用することができる。操作されたプロバイオティクスに加えて、他の細胞も、例えば、遺伝子編集および遺伝子療法を達成するために同様の方法を使用して操作され得る。
【００１５】
ある特定の態様では、本明細書に記載の開示は、微生物集団から望ましくない遺伝子および／または目的の遺伝子エレメントを分解する能力を付与するように操作されたプロバイオティクスを提供する。操作されたプロバイオティクスは、目的の選択された遺伝子（複数可）を標的とし、分解するシステム、微生物コミュニティ全体にわたる遺伝子分解システムの拡散を促進するシステム、ならびに任意選択で、抗生物質を使用することなく操作されたプロバイオティクスおよび／または遺伝子分解システムの維持および／または封じ込めを保証するシステムを含む。様々な実施形態では、目的の標的遺伝子（複数可）は、毒性因子（定着因子（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）および適合性因子（ｆｉｔｎｅｓｓ  ｆａｃｔｏｒ）の両方を含む）、毒素、エフェクター、病原性成分、および／または抗生物質耐性形質をコードする遺伝子エレメントを含む。一部の態様では、操作されたプロバイオティクスは、ヒトの治療的適用または獣医学的適用で使用され得る。
【００１６】
一態様では、操作された遺伝システムであって、毒性因子、毒素、エフェクター、病原性成分、および／または抗生物質耐性形質をコードする目的の核酸を特異的に標的とし、分解するように設計されたヌクレアーゼモジュール、および１つの宿主細胞から別の宿主細胞にシステムを拡散させることができる合成可動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）モジュールを含み、ヌクレアーゼモジュールが、ＭＧＥモジュール内に位置した遺伝子によってコードされるヌクレアーゼを含む、操作された遺伝システムが提供されている。操作された遺伝システムは、細菌細胞などの生物内の目的の核酸を標的とし、分解するのに使用することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼモジュールは、Ｃａｓタンパク質および１種または複数の合成ｃｒＲＮＡを含み、各ｃｒＲＮＡは、目的の核酸に由来する標的配列を有するスペーサーを含む。Ｃａｓタンパク質は、構成的または誘導的に発現させることができる。Ｃａｓタンパク質は、一例では、配列番号１から発現され得る。一例では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。ｃｒＲＮＡ（複数可）は、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下に置かれ得るＣＲＩＳＰＲアレイから転写およびプロセシングされ得る。一例では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、配列番号３を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼモジュールは、Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下に置かれ得る。一例では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号２から転写される。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ中に備えられ得る。ある特定の実施形態では、システムは、複数のガイドＲＮＡを含むことができる。これらのガイドＲＮＡは、複数のヌクレオチド位置で単一遺伝子を標的とする場合があり、または目的の複数の遺伝子を分解の標的とする場合がある。
【００１８】
目的の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、標的配列は、目的の核酸中でプロトスペーサー近接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）に直接隣接していることができる。Ｃａｓタンパク質がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼであるとき、ＰＡＭは、標的配列の３’側にあるＮＧＧ配列を有することができる。
【００１９】
様々な実施形態では、ヌクレアーゼとして、目的の核酸を標的とし、分解するように設計された転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、目的の核酸を標的とし、分解するように設計された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および／または目的の核酸を標的とし、分解するように設計されたメガヌクレアーゼを挙げることができる。
【００２０】
一部の実施形態では、毒性因子、毒素、エフェクター、病原性成分、および／または抗生物質耐性形質は、表１および２に列挙されたものから選択される。例えば、毒性因子は、定着因子または適合性因子であり得る。
【００２１】
ＭＧＥモジュールは、一部の実施形態では、トランスポサーゼ、およびバクテリオファージ、接合性プラスミド、または接合性トランスポゾンから選択されるＭＧＥをコードする遺伝子を含む。例えば、ＭＧＥは、Ｔｎ９１６、ＲＫ２、Ｐ１、Ｔｎ５２８０、またはＴｎ４６５１に由来し得る。
【００２２】
一部の実施形態では、１種または複数のＣＲＩＳＰＲエレメントを、１つのプラスミド中でＭＧＥと組み合わせて、細菌細胞間の移動を促進することができる。プラスミドは、配列番号１７または配列番号１８のようにさらに設計され得る。
【００２３】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエレメントは、レシピエント細胞のゲノムへのＣＲＩＳＰＲエレメントの移動を可能にするトランスポサーゼを含むＭＧＥと組み合わせて、細菌細胞間の移動を促進することができる。例えば、トランスポサーゼは、Ｔｎ３またはＴｎ５転移因子に由来し得る。２つのこのような設計は、配列番号１９および配列番号２０として提供されている。
【００２４】
例示的な態様では、操作された遺伝子標的化および分解システムが提供されている。このシステムは、Ｃａｓタンパク質；１種または複数の合成ｃｒＲＮＡであって、各ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子に由来する目的の配列を有するスペーサーを含み、標的遺伝子は、毒性因子、毒素、エフェクター、病原性成分、および／または抗生物質耐性形質をコードするｃｒＲＮＡ；任意選択で、Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ；ならびに宿主間でシステムを拡散させることができる合成可動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）を含む。
【００２５】
本開示は、疾患もしくは感染症の防止および／もしくは処置、抗生物質耐性の防止および／もしくは処置、抗生物質耐性の伝播の限定、ならびに／または環境病原体の除染に使用するための、本明細書に開示の操作された遺伝システムを含む操作された生物も提供する。一部の実施形態では、操作された遺伝システムは、細菌細胞、古細菌細胞、および／または酵母細胞から選択される宿主中に導入される。
【００２６】
さらに別の態様では、本明細書に記載の操作された生物を含む操作されたプロバイオティクスが提供されている。操作されたプロバイオティクスは、胃腸管内で使用するための経口プロバイオティクス、尿路内で使用するためのプロバイオティクス、および／または皮膚上で使用するための局所用プロバイオティクスであり得る。
【００２７】
様々な実施形態では、胃腸管および／または尿路内で使用するための操作されたプロバイオティクスは、細菌のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、またはＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門から選択される宿主に基づき得る。例えば、宿主は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＦＳ５１９、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＣＣＵＧ  ３９９１３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  Ｓｍａｒｌａｂ  ３３０１１８６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＭＰＮ単離株群６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  １２１４８、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＷＨ２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＷＨ３０２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓを含めたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種から選択され得る。宿主は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔａｅａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＤＳＭ  ６８７７（ＦＳ４１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ａ２−２０７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１８３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＬ６／１／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＧＭ２／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１９４、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１６６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１７５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＲ１／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ１−８３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−２３１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１６５、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＳ２／１を含めたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種から選択することもできる。宿主は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅを含めたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から選択される場合もある。一部の実施形態では、宿主は、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ａｌｌｉｓｏｎｅｌｌａ  ｈｉｓｔａｍｉｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｕｌｌｅｉｄａ  ｍｏｏｒｅｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅ���ｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  ＣＫ０３５、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｄｏｒｅａ  ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｓｐ．  Ｅ２＿２０、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  Ｒ００２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚｉａｅ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｕｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｎｄｓｖａｌｌｅｎｓｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、およびＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓから選択される。ある特定の実施形態では、宿主は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択される。例えば、宿主は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉから選択することができる。宿主は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＧＢＩ−３０，６０８６、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−１２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ３５６２４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  Ｓｔ１１（またはＮＣＣ２４６１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  Ｌａ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＮＣＣ５３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ５５７３０、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  １７９３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ５２８９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＲ−１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＲＣ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＬ１２８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＬＢＣ８０Ｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ８７００：２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＭＧ  Ｐ  ２２０４３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＢＦＥ  ６１２８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＭＥ−３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＦＥ  １６８５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＢ２１  ＮＣＩＭＢ  ４０５６４から選択される場合もある。一実施形態では、宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１５、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７などから選択される。様々な実施形態では、宿主は、菌株の臨床的分離株または環境的分離株であり得る。
【００２８】
一部の実施形態では、皮膚上で使用するための操作されたプロバイオティクスは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択される宿主に基づき得る。例えば、宿主は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍから選択され得る。
【００２９】
さらなる態様では、疾患もしくは感染症を防止および／もしくは処置するため、抗生物質耐性を防止および／もしくは処置するため、ならびに／または抗生物質耐性の伝播を限定するための方法が、本明細書で提供されている。この方法は、それを必要とする被験体に有効量の本明細書に記載の操作されたプロバイオティクスを投与することを含む。様々な実施形態では、被験体は、ヒトまたは動物であり得る。
【００３０】
さらに別の態様では、上記システムおよび方法は、環境サイトにおける微生物集団中の毒性因子、病原性要素、および／または抗生物質耐性遺伝子の出現または伝播を限定するのに使用することができる。一部の実施形態では、環境サイトは、動物飼料、飼育場、または他の材料、または動物もしくは家畜がよく訪れる場所である。他の実施形態では、環境サイトは、ヒトがよく訪れる建築物または場所、例えば、病院または他の臨床現場などである。
【００３１】
さらに別の態様では、上記システムおよび方法は、哺乳動物（例えば、ヒトまたは動物）細胞に遺伝システムを送達するのに使用することができる。操作された細胞は、目的の選択された遺伝子（複数可）を標的とし、分解するためのヌクレアーゼモジュール、および細胞の集団全体にわたる遺伝子分解システムの拡散を促進するためのＭＧＥモジュールを含むことができる。例えば、細菌細胞またはウイルスを、ヌクレアーゼモジュールおよびＭＧＥを含有し、哺乳動物細胞に侵入するように操作することができる。様々な実施形態では、目的の標的遺伝子（複数可）は、疾患因子をコードする遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、遺伝子療法で使用され得る。
【００３２】
本明細書に開示の少なくとも１種の操作された生物または操作されたプロバイオティクスを含む細胞の集団であって、少なくとも１種の操作された生物またはプロバイオティクス中のＭＧＥモジュールが、集団中の他の細胞内に操作された遺伝システムを伝播させることができる細胞の集団も本明細書に提供されている。時間をわたって、細胞の集団は、細胞の集団中の目的の核酸を標的とし、分解することができる操作された遺伝システムに供される。このように、１つの操作された細胞または細胞の小さい群で細胞の集団を「ワクチン接種」すると、細胞の集団の望ましくない形質と有効に闘い、またはこれらを排除し、それによって例えば、胃腸、皮膚、もしくは尿路の疾患および感染症の処置、抗生物質耐性の伝播の防止、ならびに／または環境病原体の除染を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、操作されたプロバイオティクスから微生物コミュニティの他のメンバーへの遺伝子標的化および分解システムの伝播を記述する基本モデルを含む３つの式を列挙する。Ｐ（ｔ）およびＦ（ｔ）は、それぞれ遺伝子標的化および分解システムを含む、および含まない亜集団を表す。Ｒ（ｔ）は、利用可能な増殖資源のプールを表す。他の変数は、表１１に定義されている。
【００３４】
【図２】図２は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＣＡＴ、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＣ＿００９１４１  ４０８２４．．．４１４８３）の概略図を表す。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いた標的化に適した部位は、暗灰色でアノテートされている。選択された標的部位および目的の遺伝子特徴は、薄灰色でアノテートされている。
【００３５】
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化システムの３つのエレメント：ＣＲＩＳＰＲアレイ転写カセット（図３Ａ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ転写カセット（図３Ｂ）、およびＣａｓ９発現カセット（図３Ｃ）の例示的な設計を表す。ＣＲＩＳＰＲアレイは、１種または複数のスペーサーを含有し得る。１スペーサー設計が（図３Ａ）に示されており、一方、５スペーサー設計が（図３Ｄ）に示されている。代替の設計では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび標的スペーサーが組み合わされて単一ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ転写カセットになっている（図３Ｅ）。
【００３６】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、目的の抗生物質耐性形質をコードするプラスミド（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列またはＣＡＴ、配列番号４）を用いて、操作されたプロバイオティクス株  対  対照株をチャレンジした結果を示す。チャレンジプラスミド（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｐｌａｓｍｉｄ）はまた、観察の便宜上、蛍光タンパク質をコードするように設計されている。操作されたプロバイオティクス株は、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）、およびＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムをコードする。システムは、ＣＡＴ遺伝子を標的とするように設計されている。対照株は、操作されたプロバイオティクス株と同様であるが、それは、ＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を省く。操作されたプロバイオティクス株および対照株は、形質転換によってチャレンジされる。操作されたプロバイオティクスは、プラスミドで形質転換し、クロラムフェニコールプレート上で増殖させた後（図４Ａ）、対照株（図４Ｂ）に対してコロニーの数が低減されており、遺伝子標的化および分解システムの有効性を示す。図４Ｃおよび図４Ｄでは、形質転換細胞を、ＣＲＩＳＰＲ成分の１つ（しかし、すべてではない）を選択するカナマイシンプレート上で増殖させたことを除いて同様の実験からの結果が示されている。細胞生存能は、低減されず、蛍光性コロニーは、図４Ｃにおいて目に見えず、操作されたプロバイオティクスが形質転換されるプラスミドを選択しないで１００％有効であることを示す。
【００３７】
【図５】図５は、それぞれ目的の抗生物質耐性形質をコードする一セットの５つの異なるプラスミド（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列またはＣＡＴ、配列番号４〜８）を用いて、操作されたプロバイオティクス株  対  対照株をチャレンジした結果を示す。チャレンジプラスミドのすべてはまた、便宜上、様々な蛍光タンパク質をコードするように設計されている。操作されたプロバイオティクス株は、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）、およびＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムをコードする。システムは、ＣＡＴ遺伝子を標的とするように設計されている。対照株は、操作されたプロバイオティクス株と同様であるが、それは、ＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を省く。操作されたプロバイオティクス株および対照株は、形質転換によってチャレンジされる（パネルの上の行は、配列番号４〜６に対応し、パネルの下の行は、配列番号７〜８に対応する）。操作されたプロバイオティクスは、プラスミドで形質転換し、クロラムフェニコールプレート上で増殖させた後（各パネルの左）、対照株（各パネル中の右）よりコロニーの数が低減されている。各パネルは、各チャレンジ実験の反復結果を含む（各パネルの上および下）。
【００３８】
【図６】図６は、操作されたプロバイオティクスの標的でない目的の抗生物質耐性形質をコードするプラスミドを用いて、操作されたプロバイオティクス株  対  対照株をチャレンジした結果を示す。操作されたプロバイオティクス株は、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）、およびＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムをコードする。システムは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列を標的とするように設計されている。対照株は、操作されたプロバイオティクス株と同様であるが、それは、ＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を省く。操作されたプロバイオティクス株および対照株は、テトラサイクリン耐性遺伝子をコードするプラスミド（配列番号９）を用いた形質転換によってチャレンジされる。操作されたプロバイオティクス株（左）および対照株（右）は、プラスミドで形質転換し、テトラサイクリンプレート上で増殖させた後、コロニーの数の観察可能な差異がないことを示す。各プレートの上半分は、各プレートの下半分上に蒔いた形質転換ミックスの１：１０００希釈である。単位面積当たりの同様のコロニー密度は、操作されたプロバイオティクスが対照株に対して細胞生存能または受容能力の低減を被らないことを示す。
【００３９】
【図７】図７は、既存の望ましくない遺伝子を除去するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムの能力を試験するために、異なる配列を標的とした様々なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて標的株をチャレンジした結果を示す。標的株は、Ｃａｓ９発現カセットをコードする低コピープラスミド（配列番号１）、ならびにＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＣＡＴ）および蛍光タンパク質をコードする高コピープラスミド（配列番号４）を含む。各列は、異なるｇＲＮＡコンストラクトからの形質転換結果を介したチャレンジの結果を示す。列１〜４（配列番号１０〜１３）および６〜７（配列番号１５〜１６）におけるｇＲＮＡは、ＣＡＴ遺伝子を標的とし、一方、列５におけるｇＲＮＡ（配列番号１４）は、標的株中に存在しないオフターゲット遺伝子を標的とした。列１〜４および６〜７は、ｇＲＮＡのプロモーター駆動転写の同一性、プラスミド、およびｇＲＮＡの標的部位の点で異なる。上の行は、それぞれＣａｓ９およびｇＲＮＡプラスミドを選択したアプラマイシンおよびアンピシリン上に蒔いた形質転換体からの結果を示す。下の行は、アプラマイシン、アンピシリン、およびクロラムフェニコール上に蒔いた形質転換体からの結果を示す。コロニー増殖の不均質な分布は、寒天プレートにわたる抗生物質濃度の変動を反映する。
【００４０】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、操作されたプロバイオティクスの例示的な設計の概略図を表す。図８Ａは、抗生物質フリー選択および封じ込め機構を含む完全な可動性遺伝子標的化および分解システムを表す（暗灰色ボックスおよび標識したマーカーによって表した）。図８Ｂは、ラフィノースによって制御されるｒａｆオペロンに由来する選択および封じ込め機構の例示的な設計を表す。
【００４１】
【図９】図９は、Ｅ．ｃｏｌｉの共生株、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＥＣＯＲ）から選択された株において展開したときのデバイスの性能を表す。これらの株は、広範な実験室進化を受けておらず、したがって健康なヒトの腸内で見つかるＥ．ｃｏｌｉに厳密に関係する。図９は、デバイスがこの脈絡においてＣＡＴプラスミドの取込みを防止することを実証する。＊増殖は、２つの列において特徴付けられている。「Ｅ」列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの実験室株を用いた以前の実験に基づいて予期される増殖表現型を示し、一方、「Ｏ」列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの共生株を用いたこの実験において観察された増殖表現型を示す。両方の列において、−記号は、例示した条件下で増殖がないことを表し、一方、＋記号は、通常の増殖を表す。これらの列の右の写真は、これらの株の実際の増殖表現型を示す。これらのデータから、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの実験室株および共生株の両方において同様に挙動することが明白である。
【００４２】
【図１０】図１０は、ｒａｆオペロンに基づく選択機構についての追加の設計スキームを表す。ｒａｆオペロンの代わりに蛍光性Ｇｅｍｉｎｉレポーターを発現する対照設計も表されている。簡単にするために、ｒａｆＢおよびｒａｆＤの発現を制御するリボソーム結合部位は、この図において示されていない。
【００４３】
【図１１】図１１は、選択モジュールとしての構成的ｒａｆオペロンの性能を例示する。Ｇｅｍｉｎｉの列は、図１０に示したＧｅｍｉｎｉ対照プラスミドを含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ培養物を表す。Ｒａｆオペロンの列は、図１０に示した構成的なＲａｆ選択プラスミドを含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ培養物を表す。１：１ミックスの列は、等量のＧｅｍｉｎｉおよびＲａｆオペロンＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を接種したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ培養物を表す。１：４ミックスの列は、１単位のＧｅｍｉｎｉ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉと４単位毎のＲａｆオペロンＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの比で接種したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ培養物を表す。示したすべての培養物を、同じ合計量のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで接種し、測定の前に終夜テリフィックブロス中で増殖させた。各列の陰影は、各培養物に適用したラフィノースの量を例示する。より低い蛍光は、Ｒａｆオペロン株がＧｅｍｉｎｉ株を負かしていることを示す。Ｒａｆオペロンは、１．０％のラフィノース濃度でＧｅｍｉｎｉ株に対して有意な増殖優位性をもたらす。この優位性は、１：１および１：４混合試料におけるＧｅｍｉｎｉ蛍光の喪失によって示唆されるより潜在的に大きい。なぜなら、Ｇｅｍｉｎｉ株が、より高い濃度のラフィノースでより高い蛍光シグナルを同時に呈しながら、より高い濃度のラフィノース中でわずかにより低い密度に増殖するように思われるためである。
【００４４】
【図１２】図１２は、ＥＣＯＲコレクションに由来する共生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株中の構成的Ｒａｆオペロンの性能を示す。アッセイは、Ｇｅｍｉｎｉ対照プラスミドのホストとなっている実験室Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株と１：１の比で混合した各列におけるＥＣＯＲ株を用いて図１１のように設定した。ＥＣＯＲ−０８およびＥＣＯＲ−５１はともに、ラフィノースの存在下で明らかな増殖優位性を示す。
【００４５】
【図１３】図１３は、デバイスのための更新された単一プラスミド設計を表す。ＣＲＩＳＰＲモジュールを、Ｌａｃ抑制因子によって調節されるように更新して、ラクトースまたはラクトース類似体、例えば、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドまたは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどの非存在下でＣＲＩＳＰＲデバイスの活性化を防止した。Ｃａｓ９タンパク質を、深赤蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質（図１３中で「ＦＰ」）と任意選択で融合して、Ｃａｓ９発現のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを可能にすることができる。ＣＲＩＳＰＲモジュールは、細菌細胞間でコンジュゲートすることができる可動性プラスミド（ＭＧＥモジュール）のペイロード領域（配列番号１７および１８）内に宿されており、任意選択で、このモジュールは、細菌細胞のゲノム内へのペイロード領域および含有されたＣＲＩＳＰＲモジュールの移動のための構成的トランスポサーゼ（配列番号１９および２０）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示は、胃腸、皮膚、もしくは尿路の疾患および／もしくは感染症のための治療的処置として、抗生物質耐性の伝播と闘うための作用物質として、かつ／または環境病原体を除染するためのツールとしての、操作されたプロバイオティクスを開発および使用するための方法およびシステムに関する。
【００４７】
定義
本明細書において、用語「核酸」、「核酸分子」、および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用される場合があり、一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）の両方のＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含む。本明細書において、用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、および「オリゴ」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチド、またはこれらの類似体を含めた様々な長さを有し得るヌクレオチドのポリマー形態を含むが、それだけに限らないように意図されている。例えば、オリゴは、５〜約２００ヌクレオチド、１０〜約１００ヌクレオチド、または２０〜約５０ヌクレオチドの長さであり得る。しかし、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。本開示で使用するためのオリゴは、完全に設計することができる。核酸分子は、完全長ポリペプチドもしくはその任意の長さの断片をコードする場合があり、または非コード性であり得る。
【００４８】
核酸は、ヌクレオチドの天然に存在するまたは合成ポリマー形態を指すことができる。本開示のオリゴおよび核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドから形成され、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子を形成し得る。代わりに、天然に存在するオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）におけるものなどの、これらの性質を変更するための構造的修飾を含み得る。この用語は、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、類似体、および記載されている実施形態に適用可能な場合、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。本開示で有用なヌクレオチドとしては、例えば、天然に存在するヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド）、またはヌクレオチドの天然もしくは合成修飾、または人工塩基がある。修飾は、安定性を増大させるためのホスホロチオエート化塩基も含み得る。
【００４９】
「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性ルールによって塩基対合することができるものである。本明細書において、用語「相補配列」は、以下に示したヌクレオチド比較方法およびアルゴリズムによって評価され得る場合、またはタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるとして定義される場合、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【００５０】
本明細書において、用語「遺伝子」は、ポリペプチド、タンパク質、または非翻訳ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の発現に必要な情報を含有する核酸を指す。遺伝子がタンパク質をコードする場合、それは、プロモーターおよび構造遺伝子オープンリーディングフレーム配列（ＯＲＦ）、ならびにタンパク質の発現に関与する他の配列を含む。遺伝子が非翻訳ＲＮＡをコードする場合、それは、プロモーターおよび非翻訳ＲＮＡをコードする核酸を含む。
【００５１】
本明細書において、用語「ゲノム」は、コード配列および非コード配列の両方を含むＤＮＡ（またはある特定のウイルス種についてＲＮＡ）中でコードされる生物の遺伝情報全体を指す。様々な実施形態では、この用語は、生物の染色体ＤＮＡ、ならびに／または、小器官、例えば、ミトコンドリアもしくは葉緑体、および／もしくは染色体外プラスミド、および／もしくは人工染色体などの中に含有されているＤＮＡを含み得る。「天然遺伝子」または「内在性遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する宿主細胞に先天的である遺伝子を指し、一方、「外来遺伝子」または「異種遺伝子」は、宿主細胞に先天的でない調節配列および／またはコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。一部の実施形態では、異種遺伝子は、変異配列、または調節配列および／もしくはコード配列の一部を含み得る。一部の実施形態では、調節配列は、目的の遺伝子と異種または同種であり得る。異種調節配列は、その性質上、それが形質転換宿主細胞内で調節している同じ遺伝子（複数可）を調節するように機能することはない。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書において、「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード性配列）、その範囲内、またはその下流（３’非コード性配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連したコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター（例えば、活性化因子、抑制因子）結合部位、ステムループ構造などを含み得る。
【００５２】
本明細書に記載するように、遺伝子エレメントは、任意のコード性または非コード性核酸配列であり得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質をコードする核酸である。遺伝子エレメントは、オペロン、遺伝子、遺伝子断片、プロモーター、エクソン、イントロン、調節配列、またはこれらの任意の組合せであり得る。遺伝子エレメントは、１もしくは数コドンという短いものであり得、または機能的成分（例えば、タンパク質をコードする）および／もしくは調節成分を含んでより長くてもよい。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質のオープンリーディングフレーム全体、あるいはオープンリーディングフレーム全体およびそれに付随した１つもしくは複数の（またはすべての）調節配列を含む。当業者は、遺伝子エレメントを、モジュラー遺伝子エレメントまたは遺伝子モジュールとして見ることができることを認識するはずである。例えば、遺伝子モジュールは、調節配列もしくはプロモーターもしくはコード配列、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、少なくとも２つの異なる遺伝子モジュール、および少なくとも２つの組換え部位を含む。真核生物では、遺伝子エレメントは、少なくとも３つのモジュールを含むことができる。例えば、遺伝子モジュールは、調節因子配列、もしくはプロモーター、コード配列、およびポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｌｙｌａｔｉｏｎ）テール、またはこれらの任意の組合せであり得る。プロモーターおよびコード配列に加えて、核酸配列は、それだけに限らないが、リーダー、シグナル配列、および転写ターミネーターを含めた制御モジュールを含み得る。リーダー配列は、コーディング核酸配列の５’末端に作動可能に連結した非翻訳領域である。シグナルペプチド配列は、ポリペプチドを細胞の分泌経路に導く、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードする。
【００５３】
一般に理解されているように、コドンは、ポリペプチド鎖中の特定のアミノ酸残基をコードする、または翻訳の終結のための（終止コドン）一連の３つのヌクレオチド（トリプレット）である。６４の異なるコドン（アミノ酸をコードする６１のコドンと３つの終止コドン）が存在するが、わずか２０の異なる翻訳されるアミノ酸が存在する。コドンの数の過剰は、多くのアミノ酸が１つを超えるコドンによってコードされることを可能にする。異なる生物（および小器官）は、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの１つについて特定の優先性または偏りを示すことが多い。したがって、コドン使用の相対的な頻度は、生物および小器官に応じて変動する。一部の場合では、宿主生物内で異種遺伝子を発現させる場合、使用されるコドンおよび宿主内のコドン使用頻度に適合するように遺伝子配列を修飾することが望ましい。特に、異種遺伝子の信頼できる発現に関して、宿主のｔＲＮＡレベル、特に、飢餓中にチャージされたままであるｔＲＮＡのレベルと相関するコドンを使用することが好適であり得る。さらに、希有な同族のｔＲＮＡのコドンを有するコドンは、タンパク質折り畳みおよび翻訳速度に影響する場合があり、したがってやはり使用され得る。宿主のコドン使用の偏りおよび相対的なｔＲＮＡ存在量に従って設計された遺伝子は、コドン使用について「最適化されている」と呼ばれることが多く、それは、発現レベルを増大させることが示されている。最適コドンはまた、より速い翻訳速度および高い精度を達成するのに役立つ。一般に、コドン最適化は、タンパク質のアミノ酸配列への変化をもたらさないサイレント変異を伴う。
【００５４】
遺伝子エレメントまたは遺伝子モジュールは、天然の生物のゲノム、もしくは合成ポリヌクレオチド、またはこれらの組合せに由来し得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントモジュールは、異なる生物に由来する。本明細書に記載の方法にとって有用な遺伝子エレメントまたはモジュールは、様々な源、例えば、ＤＮＡライブラリー、ＢＡＣ（細菌人工染色体）ライブラリー、新規の化学合成、商業的な遺伝子合成、またはゲノムセグメントの切り出しおよび修飾などから得ることができる。次いでこのような源から得られた配列は、標準的な分子生物学および／または組換えＤＮＡ技術を使用して修飾することで、修飾された、部分的に合成の、または完全に合成のゲノムを含めた大きい生成物核酸中への再導入、またはその構築のための所望の修飾を有するポリヌクレオチドコンストラクトを生成することができる。ゲノムまたはライブラリーから得られるポリヌクレオチド配列を修飾するための例示的な方法としては、例えば、部位指向変異誘発；ＰＣＲ変異誘発；任意選択でライゲーションと組み合わせて制限酵素を使用する配列の部分の挿入、欠失、もしくは交換；ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え；および部位特異的な組換え；またはこれらの様々な組合せがある。他の実施形態では、本明細書に記載の方法によって有用な遺伝子配列は、合成オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。合成オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法を使用して生成され得る。
【００５５】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、固有または天然核酸配列と９９％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満の配列同一性を共有する。同一性は、比較の目的で整列される場合のある各配列中の位置を比較することによってそれぞれ決定することができる。比較される配列中の等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されているとき、分子は、その位置で同一であり；等価な部位が同じまたは類似したアミノ酸残基（例えば、立体的および／もしくは電子的性質において類似）によって占有されているとき、分子は、その位置で相同（類似）と呼ばれ得る。相同性、類似性、または同一性の百分率としての表現は、比較される配列によって共有される位置における同一または類似したアミノ酸の数の関数を指す。相同性、類似性、または同一性の百分率としての表現は、比較される配列によって共有される位置における同一または類似したアミノ酸の数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺ  ＦＡＳＴＡを含めた様々な整列アルゴリズムおよび／またはプログラムが使用される場合があり、ＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、例えば、デフォルトの設定を用いて使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄを通じて入手可能である。一実施形態では、２つの配列のパーセント同一性は、１のギャップ重みを用いてＧＣＧプログラムによって判定することができ、例えば、各アミノ酸ギャップは、それが２つの配列間に単一のアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチがある場合に重み付けられる。整列についての他の技法が記載されている［Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９９６年］。好ましくは配列中のギャップを許容する整列プログラムが配列を整列させるのに利用される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列整列においてギャップを許容するアルゴリズムの一タイプである［Ｓｈｐａｅｒ、１９９７年］。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ整列方法を使用するＧＡＰプログラムを、配列を整列させるのに利用することができる。代替のサーチストラテジーは、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用し、これは、ＭＡＳＰＡＲコンピューター上で実行される。ＭＰＳＲＣＨは、超並列コンピューター上で配列にスコアを付けるのにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する。
【００５６】
本明細書において、語句「相同組換え」は、類似したヌクレオチド配列を有する核酸分子が会合し、ヌクレオチド鎖を交換するプロセスを指す。したがって、第２の核酸分子の予め規定された位置での相同組換えに関与するのに有効な第１の核酸分子のヌクレオチド配列は、第１の核酸分子と第２の核酸分子の規定された位置との間でのヌクレオチド鎖の交換を促進するヌクレオチド配列を有することができる。したがって、第１の核酸は、一般に、ヌクレオチド塩基対形成を推進するのに第２の核酸分子の部分と十分に相補的であるヌクレオチド配列を有することができる。相同組換えは、２つの組換えパートナー核酸中に相同配列を必要とするが、いずれの特異的配列も必要としない。相同組換えは、宿主ゲノム中に異種核酸および／または変異を導入するのに使用することができる。このようなシステムは、典型的には、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが起こる宿主細胞ゲノム内で標的配列と十分な相同性を有する、発現される異種核酸と隣接する配列に依拠し、送達される核酸を宿主ゲノム中に組み込ませる。相同組換えを推進するのに必要なこれらのシステムおよび方法は、当業者に公知である。
【００５７】
目的の核酸配列または目的の遺伝子は、天然の生物のゲノムに由来し得ることが認識されるべきである。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、天然の生物のゲノム、または宿主ゲノム、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．から切り取られ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素切り取りおよびｉｎ  ｖｉｖｏ切り取りならびに増幅によって大きいゲノム断片を切り取ることが可能であることが示されている。例えば、ＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組換えシステムおよびＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えシステムが、配列決定の目的で大きいゲノム断片を切り取るのに効率的に使用されている［Ｙｏｏｎ、１９９８年］。一部の実施形態では、切り取りおよび増幅技法を使用して、人工ゲノムまたは染色体アセンブリーを促進することができる。一部の実施形態では、切り取ったゲノム断片を、操作されたプロモーターおよび／または他の遺伝子発現エレメントとアセンブルし、宿主細胞のゲノム中に挿入することができる。
【００５８】
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、任意の長さの連続したアミノ酸の配列を指す。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、または「酵素」は、用語「ポリペプチド」と本明細書で互換的に使用される場合がある。ある特定の場合では、「酵素」は、触媒的活性を有するタンパク質を指す。
【００５９】
本明細書において、別段の記載のない限り、用語「転写」は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を指し；用語「翻訳」は、ｍＲＮＡ鋳型からのポリペプチドの合成を指す。翻訳は一般に、ｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列および構造によって調節される。１つの調節配列は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）であり、これは、ｍＲＮＡの効率的で正確な翻訳を推進する。原核生物のＲＢＳは、シャイン−ダルガノ配列、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端のＵＣＣＵコア配列と相補的である５’ＵＴＲのプリンリッチ配列である（３０Ｓの小さいリボソームサブユニット内に位置している）。様々なシャイン−ダルガノ配列が原核生物のｍＲＮＡ中に見つかっており、一般に、ＡＵＧ開始コドンから約１０ヌクレオチド上流にある。ＲＢＳの活性は、ＲＢＳと開始ＡＵＧとを分離するスペーサーの長さおよびヌクレオチド組成によって影響を受け得る。真核生物では、コザック配列は、短い５’非翻訳領域内にあり、ｍＲＮＡの翻訳を指示する。コザックコンセンサス配列を欠くｍＲＮＡも、それが安定な二次構造を欠く中程度に長い５’−ＵＴＲを有する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムで効率的に翻訳され得る。Ｅ．ｃｏｌｉのリボソームは、シャイン−ダルガノ配列を優先的に認識するが、真核生物のリボソーム（ｒｅｔｉｃ溶解産物中に見つかるものなど）は、シャイン−ダルガノまたはコザックリボソーム結合部位を効率的に使用することができる。
【００６０】
本明細書において、用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」は、目的のヌクレオチド配列にライゲーションされるとき、目的のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、必ずしもではないが典型的には、それがそのｍＲＮＡへの転写を制御する目的のヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。プロモーターは、構成的に活性であり得（「構成的プロモーター」）、または化学物質、熱、もしくは光などの他の因子によって制御され得る。「誘導プロモーター」の活性は、生物要因または非生物要因の存在または非存在によって誘導される。本開示の態様は、誘導プロモーターが使用されるが、外因性誘導因子の添加が要求されない「自己誘導性（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」または「自己誘導」システムに関する。一般に使用される構成的プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１（エタノールによって抑制される）、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６、Ｔ７（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする）、およびＳＰ６（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする）がある。一般的な誘導プロモーターとしては、ＴＲＥ（テトラサイクリンまたはその誘導体によって誘導性；ＴｅｔＲ抑制因子によって抑制性）、ＧＡＬ１＆ＧＡＬ１０（ガラクトースで誘導性；グルコースで抑制性）、ｌａｃ（ｌａｃ抑制因子（ＬａｃＩ）の非存在下で構成的；ＩＰＴＧまたはラクトースによって誘導され得る）、Ｔ７ｌａｃ（Ｔ７およびｌａｃのハイブリッド；ｌａｃオペレーターによっても制御されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする；ＩＰＴＧまたはラクトースによって誘導され得る）、ａｒａＢＡＤ（抑制因子ＡｒａＣに結合して、転写を活性化するようにそれを切り換えるアラビノースによって誘導性；ＣＡＰ結合部位を介した、または抗誘導因子フコースの競合的結合によるグルコースの存在下での抑制された異化産物抑制）、ｔｒｐ（ＴｒｐＲ抑制因子に結合するとトリプトファンによって抑制性）、ｔａｃ（ｌａｃおよびｔｒｐのハイブリッド；ｌａｃプロモーターのように調節される；例えば、ｔａｃＩおよびｔａｃＩＩ）、ならびにｐＬ（温度で調節される）がある。プロモーターは、宿主に応じて原核生物または真核生物プロモーターであり得る。一般的なプロモーターおよびこれらの配列は、当技術分野で周知である。
【００６１】
プロモーターは、モジュラーアーキテクチャを有し、モジュラーアーキテクチャは、変更され得ることが認識されるべきである。細菌プロモーターは、典型的には、コアプロモーターエレメントおよび追加のプロモーターエレメントを含む。コアプロモーターは、転写を開始するのに要求されるプロモーターの最小限の部分を指す。コアプロモーターは、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、および一般的な転写因子結合部位を含む。「転写開始部位」は、転写される第１のヌクレオチドを指し、＋１と指定される。開始部位の下流のヌクレオチドは、＋１、＋２などと番号付けられ、開始部位の上流のヌクレオチドは、−１、−２などと番号付けられる。追加のプロモーターエレメントは、コアプロモーターの５’（すなわち、典型的には、開始部位の３０〜２５０ｂｐ上流）に位置しており、転写の頻度を調節する。近位プロモーターエレメントおよび遠位プロモーターエレメントが特異的転写因子部位を構成する。原核生物では、コアプロモーターは通常、２つのコンセンサス配列、−１０配列または−３５配列を含み、これらは、シグマ因子によって認識される。−１０配列（第１の転写されたヌクレオチドから１０ｂｐ上流）は、典型的には長さが約６ヌクレオチドであり、典型的にはヌクレオチドのアデノシンおよびチミジンから構成される（プリブノーボックスとしても公知）。このボックスの存在は、転写の開始に本質的である。コアプロモーターの−３５配列は、典型的には長さが約６ヌクレオチドである。−３５配列のヌクレオチド配列は、典型的には４つのヌクレオシドのそれぞれから構成される。この配列が存在すると、非常に高い転写率が可能になる。一部の実施形態では、−１０および−３５配列は、約１７ヌクレオチドの間隔があけられている。真核生物プロモーターは、原核生物プロモーターより多様であり、転写開始部位の数キロベース上流に位置し得る。一部の真核生物プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含有し、これは、典型的には転写開始部位の４０〜１２０塩基以内に位置している。特定の結合タンパク質によって認識される１つまたは複数の上流活性化配列（ＵＡＳ）は、転写の活性化因子として作用することができる。これらのＵＡＳ配列は、典型的には転写開始部位の上流に見つかる。ＵＡＳ配列とＴＡＴＡボックスとの間の距離は、高度に可変であり、最大で１ｋｂであり得る。
【００６２】
本明細書において、用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと会合したとき複製をすることができ、細胞内または細胞間に遺伝子配列を移動させることができる任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、エピソーム、ウイルス、ビリオンなどを指す。ベクターは、形質転換細胞またはトランスフェクション細胞の同定に使用するのに適した選択モジュールを含有し得る。例えば、選択モジュールは、抗生物質耐性、蛍光性、酵素、および他の形質をもたらし得る。第２の例として、選択モジュールは、栄養要求性欠損を補完し、または培養培地中にない極めて重要な栄養分を供給し得る。ベクターのタイプとしては、クローニングベクターおよび発現ベクターがある。本明細書において、用語「クローニングベクター」は、宿主細胞内で自発的に複製することができ、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／または部位特異的組換えの部位によって特徴付けられるプラスミドもしくはファージＤＮＡ、または他のＤＮＡ配列を指す。外来ＤＮＡ断片は、断片の複製およびクローニングをもたらすためにこれらの部位でベクター中にスプライシングされ得る。用語「発現ベクター」は、その中にクローニングされた遺伝子を発現することができるベクターを指す。このような発現は、宿主細胞内に、またはＩＶＰＳシステム中で形質転換された後に起こり得る。クローニングされたＤＮＡは、通常、１つまたは複数の調節配列、例えば、プロモーター、活性化因子／抑制因子結合部位、ターミネーター、エンハンサーなどに作動可能に連結されている。プロモーター配列は、構成的、誘導性、および／または抑制性であり得る。
【００６３】
本明細書において、用語「宿主」または「宿主細胞」は、任意の原核生物または真核生物単細胞（例えば、酵母、細菌、古細菌など）の細胞または生物を指す。宿主細胞は、複製可能発現ベクター、クローニングベクター、または任意の異種核酸分子のレシピエントであり得る。宿主細胞は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種などの原核細胞、または酵母などの真核生物単細胞生物であり得る。異種核酸分子は、それだけに限らないが、目的の配列、転写調節配列（プロモーター、エンハンサー、抑制因子など）、および／または複製起点を含有し得る。本明細書において、用語「宿主」、「宿主細胞」、「組換え宿主」、および「組換え宿主細胞」は、互換的に使用される場合がある。このような宿主の例については、［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１年］を参照。
【００６４】
１種または複数の核酸配列を従来の形質転換技法によって標的原核生物または真核細胞に送達するために標的とすることができる。本明細書において、用語「形質転換」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、コンジュゲーション、電気穿孔、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、オプトポレーション（ｏｐｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、注射などを含めた、外因性核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を標的細胞内に導入するための様々な当技術分野で認識されている技法を指すように意図されている。適当な形質転換媒体としては、それだけに限らないが、水、ＣａＣｌ２、カチオン性ポリマー、脂質などがある。標的細胞を形質転換するのに適した材料および方法は、［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１年］および他の実験室マニュアル中に見つけることができる。
【００６５】
本明細書において、用語「選択モジュール」または「レポーター」は、目的の別の遺伝子またはタンパク質の調節配列に付加され得、その結果、宿主細胞または生物内で発現されると、レポーターが比較的容易に選択、同定、および／または測定され得るある特定の特性を付与することができる、遺伝子、オペロン、またはタンパク質を指す。レポーター遺伝子は、ある特定の遺伝子が宿主細胞または生物中に導入され、またはこれらの中で発現されたか否かの指標として使用されることが多い。一般に使用されるレポーターの例としては、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質、栄養要求性選択モジュール、β−ガラクトシダーゼ（細菌遺伝子ｌａｃＺによってコードされる）、ルシフェラーゼ（ホタル由来）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；細菌由来）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ；一般に植物中で使用される）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；クラゲ由来）がある。レポーターまたは選択モジュールは、選択可能またはスクリーニング可能であり得る。選択モジュール（例えば、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子）は、人為淘汰に適した形質を付与する遺伝子であり、典型的には、選択可能な選択モジュールを発現する宿主細胞は、細胞増殖に有毒または阻害性である選択剤から保護される。スクリーニング可能な選択モジュール（例えば、ｇｆｐ、ｌａｃＺ）は一般に、研究者が望まれる細胞（選択モジュールを発現する）と、望まれない細胞（選択モジュールを発現しない、または不十分なレベルで発現する）とを区別することを可能にする。
【００６６】
用語「毒性因子」、「毒素」、「エフェクター」、または「病原性成分」は、本明細書において、そうでなければ共生生物に疾患を引き起こさせることを可能にするか、または微生物コミュニティを混乱させる分子を指す。共生細菌ゲノム（ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｏｍｅ）からのこれらの因子もしくはこれらをコードする遺伝子エレメント（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む）の除去、または共生細菌ゲノムからのプラスミドもしくはこれらをコードする他の可動性遺伝子エレメントの喪失は、宿主細菌を非病原性状態に回復させると理解されている。これらの因子には、それだけに限らないが、病原体が宿主中のニッシェに定着し、宿主の免疫系を逃れ、宿主の免疫応答を阻害し、宿主を損傷させ、細胞に出入りし、または宿主から栄養を得ることを可能にする任意の分子が含まれる。例えば、このような因子の１つのタイプは、侵入の適切な入口での病原体の確立を助ける定着因子である。病原体は通常、外部環境と接触している宿主組織に定着する。ヒト宿主中の侵入の部位としては、尿生殖路、消化管、気道、および結膜がある。これらの領域に感染する生物は、通常、発達した組織付着機構、および表面における宿主防御の一定の圧力を克服し、またはそれに耐えるいくらかの能力を有し、これらに関与する因子は、定着因子と同定されている。
【００６７】
用語「病原性要素」は、本明細書において、そうでなければ共生生物に疾患を引き起こさせることを可能にするか、または微生物コミュニティを混乱させる遺伝子エレメント（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む）を指す。共生細菌ゲノムからの病原性要素の除去、または共生細菌ゲノムからの病原性要素を伝播させているプラスミドもしくは他の可動性遺伝子エレメントの喪失は、宿主細菌を非病原性状態に回復させると理解されている。病原性要素としては、それだけに限らないが、病原性アイランドがある。病原性要素（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む）は、毒性因子、毒素、エフェクター、または病原性成分をコードし得る。
【００６８】
用語「可動性遺伝子エレメント」または「ＭＧＥ」は、ゲノム内（細胞内移動性）または細胞間（細胞間移動性）のＤＮＡの動きを媒介する酵素および他のタンパク質（例えば、トランスポサーゼ）をコードする遺伝子エレメントを指す。例としては、トランスポゾン、プラスミド、バクテリオファージ、および病原性アイランドがある。ＭＧＥは、天然に存在し、または操作されている場合がある。ＭＧＥは、細胞型特異的、組織特異的、生物特異的、または種特異的（例えば、細菌特異的もしくはヒト特異的）であり得る。ＭＧＥはまた、細胞型、組織、生物、および／または種に対して非特異的であり得る。
【００６９】
用語「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）」、「操作すること（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、または「操作された」は、本明細書において、生体分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質などの遺伝子操作もしくは修飾、またはバイオテクノロジーの技術分野で一般に公知の同様の技法を指す。
【００７０】
本記載全体にわたって提供される遺伝子座タグおよび受託番号は、国立保健研究所、米国によって維持されているＮＣＢＩデータベース（国立バイオテクノロジー情報センター）に由来する。受託番号は、２０１４年１月１６日のデータベース中に提供されている。
【００７１】
組換え核酸技術、微生物学、代謝工学、ならびに分子および細胞生物学の分野で使用される他の用語は、本明細書において、該当する技術分野における当業者によって一般に理解されることになる。
【００７２】
分解のための標的遺伝子
一態様では、本開示は、操作されたプロバイオティクスによる分解のための好適な標的を構成する目的の遺伝子を提供する。多くの微生物種は、天然の健康な微生物叢の一部として共生生物として存在する株、ならびに疾患を引き起こすことができる病原性株および／またはビルレントな株を有する。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、共生生物としてヒトの腸内に存在するが、病原性株も公知である。Ｅ．ｃｏｌｉ病原体の主要なカテゴリーとしては、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）、腸管組織侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、散在性接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴ（ＥＡＳＴ）がある［Ｋａｐｅｒ、２００４年］。Ｅ．ｃｏｌｉ病原体の他のカテゴリーは、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）を含めた腸外（ＥｘＰＥＣ）であることが公知である。病因のこれらの様々な機構にも関わらず、これらの疾患のそれぞれは、共生Ｅ．ｃｏｌｉと概ね同様である株によって引き起こされ、これらの株は、各疾患を担う少数の特定の毒性属性によって区別される。これらの毒性属性をコードする遺伝子エレメントは、新しい株中に容易に移動して、新しい毒性因子組合せを創り出すことができる可動性エレメント上で頻繁に見つかる。したがって、微生物集団中の選択および進化の基本単位であるのは、特定の株または種ではなく、これらの遺伝子エレメント自体である。一部の実施形態では、毒性属性をコードする遺伝子は、本開示の操作されたプロバイオティクスの遺伝子標的である。例示的な毒性因子（定着因子および適合性因子の両方を含む）、毒素、およびエフェクターは、表１で以下に示されている。列挙した因子および毒素の多くは、複数のバリアントおよび／またはタイプを有することに留意されたい。毒性属性をコードする同様のセットの遺伝子が、病原性株を含む他の微生物種についてまとめられ得る。
【表１−１】
2017512500.tif 000003
【表１−２】
2017512500.tif 000004
【表１−３】
2017512500.tif 000005
【００７３】
皮膚疾患および感染症と関連した分解のための例示的な標的遺伝子としては、トキシックショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１、アクセッションＪ０２６１５）およびブドウ球菌スーパー抗原様タンパク質１１（ＳＳＬ１１、アクセッションＣＰ００１９９６  ４７００２２．．４７０６１５）をコードする遺伝子がある。他の毒性因子としては、ブドウ球菌エンテロトキシン、例えば、エンテロトキシンタイプＧ２（ｓｅｇ２）、エンテロトキシンＫ（ｓｅｋ）、エンテロトキシンＨ（ｓｅｈ）、エンテロトキシンタイプＣ４（ｓｅｃ４）、エンテロトキシンＬ（ｓｅｌ）、およびエンテロトキシンＡ（ｓｅａ）など；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｕ５０（アクセッションＢＡ００００１７．４）に由来するオープンリーディングフレームＳＡＶ０８１１、ＳＡＶ１１５９、ＳＡＶ１２０８、ＳＡＶ１４８１、ＳＡＶ２３７１、ＳＡＶ２５６９、ＳＡＶ２６３８、ＳＡＶ０６６５、ＳＡＶ０１４９、ＳＡＶ０１６４、ＳＡＶ０８１５、ＳＡＶ１３２４、ＳＡＶ１８１１、ＳＡＶ１８１３、ＳＡＶ１０４６、ＳＡＶ０３２０、ＳＡＶ２０３５、ＳＡＶ０９１９、ＳＡＶ２１７０、ＳＡＶ１９４８、ＳＡＶ２００８、ＳＡＶ１８１９、ＳＡＶ０４２２、ＳＡＶ０４２３、ＳＡＶ０４２４、ＳＡＶ０４２８、ＳＡＶ２０３９、ＳＡＶ１８８４、ＳＡＶ０６６１によってコードされる毒性遺伝子がある。皮膚感染症に共通の抗生物質耐性遺伝子としては、ベータ−ラクタム誘導性ペニシリン結合タンパク質のメチシリン耐性遺伝子ＰＢＰ遺伝子（ｍｅｃＡ、アクセッションＹ００６８８）がある。列挙した遺伝子のホモログは、分解のための追加の標的遺伝子を提供する。
【００７４】
多くの場合では、抗生物質耐性の機構は、単一または少数の遺伝子によってコードされる。毒性属性をコードする遺伝子と同様に、抗生物質耐性形質をコードする遺伝子エレメントは、遺伝子水平移動によって混合種微生物集団を通じて伝播することが多い。自己の宿主細胞に、臨床的に関連した抗生物質耐性表現型を付与する多くの遺伝子は、以前に同定されている。一部の実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、本開示の操作されたプロバイオティクスのための遺伝子標的を構成する。例示的な抗生物質耐性遺伝子は、表２で以下に示されている。
【表２−１】
2017512500.tif 000006
【表２−２】
2017512500.tif 000007
【００７５】
他の望ましくない、かつ／または悪質な遺伝子および／または遺伝子エレメントも標的とされ得る。例えば、がんなどの遺伝子異常性によって引き起こされる疾患では、このような遺伝子異常性は、分解の標的とされ得る。結果として、遺伝子療法を達成することができる。標的化は、遺伝子分解が所望の細胞型または組織に限定されるように、細胞型特異的または組織特異的（例えば、細胞型特異的または組織特異的ＭＧＥを使用することによって）であり得る。
【００７６】
望ましくない遺伝子の標的化および分解
一部の実施形態では、望ましくない遺伝子の標的化および分解は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ、ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓの頭字語）によって媒介され得る。ＣＲＩＳＰＲは、１９８７年に最初に記載された［Ｉｓｈｉｎｏ、１９８７年］。ＣＲＩＳＰＲは、原核生物におけるファージ防御において機能的な役割を果たす［Ｂａｒｒａｎｇｏｕ、２００７年；Ｈｏｒｖａｔｈ、２００８年；Ｄｅｖｅａｕ、２００８年］。簡単に言えば、ＣＲＩＳＰＲは、以下のように働く。ファージ感染または浸潤性遺伝子エレメントに曝露されるとき、細菌集団の一部のメンバーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の反復配列間に外来ＤＮＡに由来する短い配列（「スペーサー」）を組み込む。タンデムになったリピートとスペーサーの組み合わされた単位は、「ＣＲＩＳＰＲアレイ」と呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲアレイは、転写され、次いでプロセシングされて、それぞれが単一のスペーサーおよび隣接する反復配列を含有する短いｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）になる。スペーサーは、外来ＤＮＡ（スペーサーと塩基対形成することができる対応するプロトスペーサーを含有する）に由来し、一般に、娘細胞によって安定に受け継がれ、その結果、同じ配列を有するファージまたは浸潤性ＤＮＡエレメントに後に曝露されるとき、株は、感染に対して耐性である。ＣＲＩＳＰＲは、反復配列を分離しているスペーサーに対して特異性を示す同族Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質（複数可）とともに作動することが公知である［Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００９年；Ｈｏｒｖａｔｈ、２００９年；Ｋｕｎｉｎ、２００７年］。Ｃａｓタンパク質（複数可）は、ｃｒＲＮＡとともに作動して、入ってくる外来ＤＮＡの切断を媒介し、この場合ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とのエフェクター複合体を形成し、複合体を外来ＤＮＡに導き、次いでこれは、Ｃａｓタンパク質によって切断される［Ｂｈａｙａ、２０１１年］。ＣＲＩＳＰＲ活性化のいくつかの経路があり、これらのうちの１つは、ｃｒＲＮＡの成熟において役割を果たすｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ、やはりＣＲＩＳＰＲアレイから転写される）を必要とする。次いで、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成し、外来ＤＮＡへのＣａｓ９のガイドとして作用する［Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ、２０１１年］。ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない他の経路も存在する。
【００７７】
合成生物学者は、最近、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼおよび関連したＲＮＡが、細菌、酵母、およびヒト細胞内でゲノムを編集するように、別の目的に用いることができることを実証した［ＤｉＣａｒｌｏ、２０１３年；Ｊｉａｎｇ、２０１３年；Ｃｏｎｇ、２０１３年；Ｍａｌｉ、２０１３年；Ｊｉｎｅｋ、２０１３年］。これらの技法はすべて、特定の遺伝子座で二本鎖切断を導入するためにＣａｓ９ヌクレアーゼの使用に依拠する。Ｃａｓ９の結合特異性は、別個のＲＮＡ分子、ｃｒＲＮＡによって規定されるので、Ｃａｓ９は、ほとんどすべての２０〜３０塩基対配列を認識および切断するように導くことができる。ＣＲＩＳＰＲ標的化が短い配列を必要とするため、同族のＣＲＩＳＰＲコンストラクト中に目的のオリゴヌクレオチドを挿入するだけで、Ｃａｓ９の標的を変更することが可能である。
【００７８】
一部の態様では、本開示は、目的の遺伝子（複数可）を分解の標的とするように設計された異種遺伝システムを含むように操作されたプロバイオティクスを提供する。一部の実施形態では、異種遺伝システムは、Ｃａｓヌクレアーゼを目的の１つまたは複数の遺伝子（複数可）を標的とするように設計された合成ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓデバイスをコードする。異種遺伝システムは、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする遺伝子、転写およびプロセシングされて１つまたは複数のｃｒＲＮＡになるＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートが隣接した、標的ＤＮＡに由来する１つまたは複数のスペーサーを含有するＣＲＩＳＰＲアレイ、ならびに任意選択で、Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡとの複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡを含む。目的の標的遺伝子（複数可）内の配列（複数可）（プロトスペーサー）にＣａｓヌクレアーゼを標的化させることによって、目的の遺伝子（複数可）は、細胞内での切断、したがって後続のその分解の標的とされ得る。
【００７９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの実行可能な標的配列は、選択される特定のＣａｓヌクレアーゼに基づいて決定される。目的の配列（プロトスペーサー）は、「プロトスペーサー近接モチーフ」（ＰＡＭ）に直接隣接していなければならない［Ｊｉｎｅｋ、２０１２年］。一部の実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼが使用され得る［Ｊｉａｎｇ、２０１３年；Ｃｏｎｇ、２０１３年；Ｍａｌｉ、２０１３年；Ｊｉｎｅｋ、２０１３年；Ｊｉｎｅｋ、２０１２年］。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９は、ＰＡＭ「ＮＧＧ」が目的の配列の３’側にあることを必要とし、ここで「Ｎ」は、任意のヌクレオチドであり得る。「ＮＧＧ」モチーフは、核酸配列中で非常に一般的であり、したがって、本発明者らが目的の本質的にあらゆる遺伝子を、操作されたプロバイオティクスのための標的として選択することを可能にする。
【００８０】
ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列（複数可）に隣接するダイレクトリピート配列の要件に起因して高度に反復性である。したがって、ＣＲＩＳＰＲアレイは、可能性がある組換え事象に起因して不安定であり得る［Ｊｉａｎｇ、２０１３年］。この問題を取り除くために、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを組み合わせて、プロセシングされたｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する単一ＲＮＡ配列（「ガイドＲＮＡ」）にしてもよいことが示された。ガイドＲＮＡに基づく設計は、様々な宿主内でゲノム編集に使用されるとき有効であることが実証された［ＤｉＣａｒｌｏ、２０１３年；Ｃｏｎｇ、２０１３年；Ｍａｌｉ、２０１３年］。したがって、一部の実施形態では、操作されたプロバイオティクスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、目的の遺伝子（複数可）を分解の標的とするように設計された１つまたは複数の合成ガイドＲＮＡ（複数可）を含む。
【００８１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに加えて、代替のヌクレアーゼを使用して、目的の遺伝子を分解の標的とすることができる。例えば、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、特定のＤＮＡ配列に結合し、それをカットするように設計することができるモジュラータンパク質ヌクレアーゼである［Ｃｅｒｍａｋ、２０１１年；Ｔｉｎｇ、２０１１年］。例示的なＴＡＬＥＮは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている［Ｊｏｕｎｇ、２０１２年］に総説されている。同様に、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、特定のＤＮＡ配列に結合し、それをカットするように設計することができる別のクラスのモジュラータンパク質ヌクレアーゼである［Ｗｒｉｇｈｔ、２００６年］。例示的なＺＦＮは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている［Ｕｒｎｏｖ、２０１０年］に総説されている。メガヌクレアーゼも、特定のＤＮＡ配列に結合し、それをカットするように使用および設計することができる。例示的なメガヌクレアーゼは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている［Ｓｉｌｖａ、２０１１年］に総説されている。
【００８２】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ分子を標的とするように設計され得る。ガイドＲＮＡ（複数可）は、ＤＮＡを標的とするように設計されたガイドＲＮＡと類似している一本鎖ＲＮＡを標的とするように設計されてもよいが、ＰＡＭは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとしてトランスで提供される［Ｏ’  Ｃｏｎｎｅｌｌ、２０１４年］。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズし、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の非標的鎖を含む。ＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが切断を促進するためのＰＡＭ配列をもたらす限り、ＰＡＭ配列を含む必要はない。実際には、一本鎖ＲＮＡ中にＰＡＭ配列が存在しないと、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがコードＤＮＡ配列を標的とすることが不可能となる。
【００８３】
様々な実施形態では、ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮまたはメガヌクレアーゼは、操作されたプロバイオティクス中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの代用とされる場合があり、ただし、ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮまたはメガヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を分解の標的とするように設計されている。当業者に一般に理解されているように、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、モジュラータンパク質ドメインからなり、各ドメインは、特定のＤＮＡ塩基対に結合特異性を付与している。個々のモジュラーＴＡＬＥＮドメインは、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｃ」、または「Ｇ」ヌクレオチドを標的とすることができる。したがって、モジュラーＴＡＬＥＮドメインの融合タンパク質を含む操作されたＴＡＬＥＮは、任意かつ特定の塩基対配列を標的とするように設計することができる［Ｃｅｒｍａｋ、２０１１年］。同様に、ＺＦＮの個々のモジュラードメインは、様々な３塩基対配列を標的とする。操作されたＺＦＮは、特定の９塩基対配列を標的とする３つのＺＦＮモジュールから典型的には構成される融合タンパク質である［Ｍａｅｄｅｒ、２００８年］。メガヌクレアーゼは、長さが１０またはそれ超の塩基対のＤＮＡ配列を標的とし、この認識配列が目的の遺伝子中に存在し、標的化された細胞コミュニティのゲノム中の他のどの場所にも存在しない場合、メガヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの代用とされ得る［Ｓｉｌｖａ、２０１１年］。
【００８４】
操作された遺伝子水平移動
遺伝子水平移動は、微生物集団内の毒性属性および抗生物質耐性表現型の移動の主要な機構である。例えば、ヒト腸フローラのメタゲノム分析は、遺伝子水平移動は、外部環境よりヒトマイクロバイオーム内でより広く行きわたっていることを示す［Ｓｍｉｌｌｉｅ、２０１１年］。ヒト胃腸管の高い細胞密度は、それを遺伝子移動に高度に貢献させる［Ｌｅｙ、２００６年］。トラスポゾン、プラスミド、バクテリオファージ、および病原性アイランドを含めた可動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）は、別の共生微生物による毒性属性の取得を担う［Ｋａｐｅｒ、２００４年］。遺伝子水平移動は、細菌内の３つの機構のうちの１つによって主に達成される。第１に、レシピエント細菌へのドナー細菌のコンジュゲーションを介したプラスミドの伝達。第２に、プラスミドまたは核酸断片の形態での遊離ＤＮＡを用いた細胞の形質転換。第３に、バクテリオファージによって媒介される形質導入。
【００８５】
一部の態様では、本開示は、微生物集団内で遺伝子分解システムを伝播させるように設計された異種遺伝システムを含むように操作されたプロバイオティクスを提供する。一部の実施形態では、異種遺伝システムは、微生物集団内の他の微生物の株および種に遺伝子分解システムを拡散させることができる合成可動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）を含む。したがって、操作されたプロバイオティクス自体は、集団から目的の遺伝子（複数可）を除去し、かつ／または微生物集団中の他の株にＭＧＥを移動させるために、微生物集団中で十分長く存続する必要があるだけである。公知のＭＧＥのタイプとしては、接合性トランスポゾン、接合性プラスミド、およびバクテリオファージがある。例示的な可動性遺伝子エレメントを表３で以下に示す。
【表３】
2017512500.tif 000008
【００８６】
接合性トランスポゾンは、単一ＤＮＡ断片上で拡散機能およびトランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｖｅ）機能を組み合わせるコンパクトな自己伝染性可動性エレメントである［Ｔｓｕｄａ、１９９９年；Ｓａｌｙｅｒｓ、１９９５年］。接合性トランスポゾンは一般に、細菌ゲノム上に存在し、自身を切り出し、コンジュゲーションを介してレシピエント細胞に移動することができる。例示的な接合性トランスポゾンとしては、Ｔｎ９１６がある。
【００８７】
接合性プラスミドは、本開示のＭＧＥの代替の実施形態を提供する。一部の実施形態では、接合性プラスミドは、ＩｎｃＰ−１プラスミドである。なぜなら、これらがその広い宿主域および高効率自己伝達の両方について公知であるためである［Ａｄａｍｃｚｙｋ、２００３年］。異なる宿主内で維持される例示的なＩｎｃＰ−１プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＲＫ２０１３）（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（ｐＳＳ５０）（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびグラム陽性Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａについて、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａへと接合したＲＫ２がある。一部の実施形態では、ＭＧＥは、ｐｉｒ因子およびｔｒａ因子がプラスミドから操作されたプロバイオティクスの染色体に移されたＲＫ２適合性接合性プラスミドに由来する。ｐｉｒ＋およびｔｒａ＋である宿主細胞は、ＲＫ２  ｍｏｂエレメントを持つプラスミドの新しい株への移動を可能にする。ｐｉｒ因子およびｔｒａ因子は、宿主細胞によってトランスで提供されるので、ＲＫ２プラスミドは、これらの因子を欠くレシピエント株内でさらに増えることができない。したがって、ＲＫ２プラスミドの伝播は、操作されたプロバイオティクスと直接接触する株のみに限定される。
【００８８】
接合性プラスミドは、プラスミドの部分がレシピエント細胞のゲノムに安定に移動されることを可能にするトランスポゾンを任意選択で含み得る。例えば、Ｔｎ５トランスポゾンに由来するｔｎｐトランスポサーゼは、ＩＳ５０反復配列が隣接したＤＮＡ配列をトランスロケーションさせる［Ｐｈａｄｎｉｓ、１９８６年］。トランスポゾンリピート（「逆方向リピート」と標識されている）間のトランスポゾンリピート（図１３中で「ペイロード領域」と呼ばれる）間に任意のＤＮＡを配置すると、レシピエント細菌細胞のゲノムを含めた他のＤＮＡ分子へのペイロード領域のトランスロケーションがもたらされる。トランスポゾンを伴った接合性プラスミドを含む典型的な設計の概略図を図１３に例示する。ｌａｃプロモーターが図１３に示されているが、当業者は、他の誘導プロモーターも使用することができることを理解するはずである。例示的な配列が配列番号１９および配列番号２０として含められている。
【００８９】
バクテリオファージは、本開示のＭＧＥの代替の実施形態を提供する。例示的なバクテリオファージとしては、バクテリオファージＰ１、感染すると溶原性または溶解性状態に入ることができるテンペレートファージがある。先の公開された結果は、Ｐ１が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＳｅｒｒａｔｉａを含めたグラム陰性菌の中で広い宿主域を有することを示唆する［Ｍｕｒｏｏｋａ、１９７９年］。それでもやはり、バクテリオファージは、プラスミドのような他のＭＧＥより狭い宿主域を有する傾向がある。したがって、一部の実施形態では、伝達ベクターとしてのバクテリオファージの使用は、その宿主域を広くするためにバクテリオファージの追加の操作を必要とし得る。例えば、バクテリオファージは、ＭＧＥから６ｂｐの回文配列を排除し、短い部位を保護するためにメチラーゼ（複数可）を添加することによって宿主制限修飾システムを迂回するために、広い宿主域複製起点を含めることによってその複製範囲を拡張するために、かつ／またはディスプレイ分解酵素（ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ）を添加することによって細胞外マトリックスに侵入するバクテリオファージの能力を増強するために操作され得る。
【００９０】
操作されたプロバイオティクスのための生物または宿主細胞
宿主細胞または生物は、本明細書に開示するように、細菌細胞（グラム陰性またはグラム陽性）、古細菌、および酵母細胞などの哺乳動物胃腸系または哺乳動物尿路内で生存、存続、および／または定着することができる真核生物または原核生物系から選択され得る。適当な生物として、細菌のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、またはＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門（上界）に属する細菌を挙げることができる。好適な実施形態では、宿主細胞／生物は、実験室で培養可能である。一部の実施形態では、宿主細胞／生物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＦＳ５１９、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＣＣＵＧ  ３９９１３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  Ｓｍａｒｌａｂ  ３３０１１８６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＭＰＮ分離株群６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  １２１４８、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＷＨ２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＷＨ３０２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓを含めたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種から選択することができる。一部の実施形態では、宿主細胞／生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔａｅａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＤＳＭ  ６８７７（ＦＳ４１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ａ２−２０７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１８３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＬ６／１／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＧＭ２／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１９４、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１６６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１７５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＲ１／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ１−８３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−２３１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ａ２−１６５、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＳ２／１を含めたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種から選択することができる。一部の実施形態では、宿主細胞／生物は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ��含めたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から選択することができる。一部の実施形態では、宿主細胞／生物は、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ａｌｌｉｓｏｎｅｌｌａ  ｈｉｓｔａｍｉｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｕｌｌｅｉｄａ  ｍｏｏｒｅｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  ＣＫ０３５、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｄｏｒｅａ  ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｓｐ．  Ｅ２＿２０、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  Ｒ００２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚｉａｅ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｕｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｎｄｓｖａｌｌｅｎｓｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、およびＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓから選択することができる。
【００９１】
一部の実施形態では、宿主細胞または生物は、公知の天然のプロバイオティクス株から選択することができる。例示的なプロバイオティクス種としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属するものがある。例示的なプロバイオティクス株としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＧＢＩ−３０，６０８６、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−１２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ３５６２４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  Ｓｔ１１（またはＮＣＣ２４６１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  Ｌａ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＮＣＣ５３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ５５７３０、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  １７９３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ５２８９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＲ−１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＲＣ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＬ１２８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＬＢＣ８０Ｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ８７００：２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＭＧ  Ｐ  ２２０４３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＢＦＥ  ６１２８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＭＥ−３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＦＥ  １６８５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＢ２１  ＮＣＩＭＢ  ４０５６４がある。
【００９２】
一部の実施形態では、宿主細胞または生物は、実験室または共生のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株に由来する。例示的なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を以下に示す（表４）。株Ｗは、共生株に最も酷似していると考えられている実験室株である［Ａｒｃｈｅｒ、２０１１年］。株Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７は、商標名Ｍｕｔａｆｌｏｒの下でヒトにおけるプロバイオティクスとして長く使用されている［Ｇｒｏｚｄａｎｏｖ、２００４年］。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＥＣＯＲ）は、健康な哺乳動物の腸から単離された共生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株のコレクションである［Ｏｃｈｍａｎ、１９８４年］。ＥＣＯＲ株は、これらの単離以来実質的な実験室進化を受けておらず、したがってモデル共生株として使用される。
【表４】
2017512500.tif 000009
【００９３】
一部の実施形態では、宿主細胞または生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に由来する。例示的なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉがある。
【００９４】
宿主細胞または生物は、本明細書に開示するように、細菌細胞（グラム陰性またはグラム陽性）、古細菌、および酵母細胞などの皮膚に生存、存続、および／または定着することができる真核生物または原核生物系から選択され得る。適当な生物として、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する細菌を挙げることができる。好適な実施形態では、宿主細胞／生物は、実験室内で培養可能である。一部の実施形態では、宿主細胞／生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択することができる。例示的な種としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍがある。
【００９５】
宿主細胞または生物は、本明細書に開示するように、細菌細胞（グラム陰性またはグラム陽性）、古細菌、および酵母細胞などの除染される環境または物質に生存、存続、および／または定着することができる真核生物または原核生物系から選択され得る。
【００９６】
本明細書に論じた生物または細胞系統の様々な操作された株および／または変異も使用することができることに留意されるべきである。
【００９７】
操作されたプロバイオティクスの抗生物質フリー維持および封じ込め
一部の態様では、本開示は、可動性遺伝子標的化および分解システムを含む操作されたプロバイオティクスおよび／または異種遺伝システムの維持について選択するための機構を提供する。慣例的に、宿主細胞または生物中のプラスミド維持は、抗生物質耐性カセットを含めること、および微生物集団に抗生物質を適用することによって選択される。しかし、本開示の操作されたプロバイオティクス中に抗生物質耐性カセットを含めることは、それがカセットの望まれない伝播に至り得るので望ましくない。さらに、例えば、胃腸マイクロバイオーム中の抗生物質の使用は、他の共生株を淘汰してしまうが、これは、特に病院環境内では、病原性株による再定着を推進し得る［Ｆｅｋｅｔｙ、１９８１年］。好適な実施形態では、操作されたプロバイオティクスおよび／または異種遺伝システムは、抗生物質耐性に基づかない選択優位性を付与する１つまたは複数の遺伝子をコードする核酸を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、核酸は、操作されたプロバイオティクスが由来する親、野生型宿主細胞、または生物によって使用されていない特定の炭素源（複数可）を利用する能力を付与する１つまたは複数の遺伝子をコードする。これらの炭素源利用遺伝子（複数可）を含めると、対応する炭素源の存在下で増殖されるとき、異種遺伝システムを担持する任意の細胞に選択優位性が付与される。しかし、微生物集団中の他の株は選択されない。なぜなら、他の炭素源がこれらの増殖のために利用可能であるためである。対応する炭素源の非存在下では、炭素源利用遺伝子（複数可）を複製、転写、および翻訳する負担は、操作されたプロバイオティクスの適合性を限定する追加の利益を有する。このように、可動性遺伝子標的化および分解システムを含む操作されたプロバイオティクスおよび／または異種遺伝システムは、特定の条件（炭素源の存在）下での維持および拡散のために選択され、他の条件（炭素源の非存在）下での封じ込めおよび喪失のために選択され得る。炭素源のプロバイオティクスとの共投与は、プロバイオティクス処置の伝播および継続時間を制御するための手段として使用することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、炭素源利用遺伝子（複数可）は、ｒａｆオペロンに由来する。ｒａｆオペロンは、三糖ラフィノースを異化する能力を付与し、複数の接合性プラスミド上で見つかっている［Ａｓｌａｎｉｄｉｓ、１９８９年；Ｐｅｒｉｃｈｏｎ、２００８年］。ｒａｆオペロンでは、ラフィノースは、ＲａｆＲ抑制因子によるラフィノース異化遺伝子の抑制を阻害する［Ｕｌｍｋｅ、１９９７年；Ａｓｌａｎｄｉｓ、１９８９年］。ラフィノース利用遺伝子としては、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードするｒａｆＡ、パーミアーゼをコードするｒａｆＢ、インベルターゼをコードするｒａｆＤ、およびポリンをコードするｒａｆＹがある。例示的なｒａｆオペロン遺伝子を以下に示す（表５）。
【表５】
2017512500.tif 000010
【０１００】
一部の実施形態では、炭素源利用遺伝子（複数可）は、ｃｓｃオペロンに由来する。ｃｓｃオペロンは、糖スクロースを異化する能力を付与する［Ａｒｃｈｅｒ、２０１１年］。ｃｓｃオペロンは、制御因子をコードするｃｓｃＲ、スクローストランスポーターをコードするｃｓｃＢ、インベルターゼをコードするｃｓｃＡ、フルクトキナーゼをコードするｃｓｃＫを含む。例示的なｃｓｃオペロン遺伝子を以下に示す（表６）。
【表６】
2017512500.tif 000011
【０１０１】
一部の実施形態では、炭素源利用遺伝子（複数可）は、ｘｙｌオペロンに由来する。ｘｙｌオペロンは、糖キシロースを異化する能力を付与する［Ｓｏｎｇ、１９９７年］。例示的なｘｙｌオペロン遺伝子を以下に示す（表７）。
【表７】
2017512500.tif 000012
【０１０２】
一部の実施形態では、炭素源利用遺伝子（複数可）は、ａｒａオペロンに由来する。ａｒａオペロンは、糖アラビノースを異化する能力を付与する［Ｍｉｙａｄａ、１９８４年］。例示的なａｒａオペロン遺伝子を以下に示す（表８）。
【表８】
2017512500.tif 000013
【０１０３】
一部の態様では、本開示は、本開示の操作されたプロバイオティクスによる追加の可動性遺伝子エレメントの取込みに対して選択するための機構を提供する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｌｏｌｅｒａｅ、およびＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａを含めた様々な菌株は、これらの染色体上でコードされる１つまたは複数の毒素−抗毒素システムを含有することが公知である。事前の試験は、染色体に組み込まれた毒素−抗毒素システムは、接合性プラスミドを含む外来ＤＮＡから細胞を保護する機能を果たし得ることを示唆する［Ｓａａｖｅｄｒａ  Ｄｅ  Ｂａｓｔ、２００８年］。したがって、一部の実施形態では、本開示の操作されたプロバイオティクスは、マイクロバイオーム中の他の株に由来する外来ＤＮＡの取込みおよび維持を制限するために、染色体に組み込まれた毒素−抗毒素システムを含む。例示的な毒素−抗毒素システム、これらの同族の毒素によって標的とされるエレメント、および毒素によって混乱させられる細胞過程を以下に示す（表９）［Ｖａｎ  Ｍｅｌｄｅｒｅｎ、２００９年］。毒素−抗毒素システムは、細胞過程を標的とする毒素タンパク質を産生し、抗毒素（典型的にはＲＮＡまたはタンパク質）は、毒素が標的化された細胞プロセスを混乱させることを防止する。例えば、ＭａｚＦシステムでは、ＭａｚＦ毒素タンパク質は、ＲＮＡ翻訳を混乱させ、ＭａｚＥ抗毒素タンパク質は、ＭａｚＦに結合して毒性活性を改善する。
【表９】
2017512500.tif 000014
【０１０４】
一部の態様では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース遺伝子標的化および分解システムの機能的発現を選択するための機構を提供する。対応するゲノムＤＮＡをインタクトなままにしておきながら、内因性ｍＲＮＡ転写物を分解する天然ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが存在することが実証された［Ｓａｍｐｓｏｎ、２０１３年］。これは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＦＴＮ＿１１０３  ｍＲＮＡと複合体を形成するｓｃａＲＮＡ分子によってＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ中で達成されている。ｓｃａＲＮＡは、折り畳まれたＦＴＮ＿１１０３  ｍＲＮＡに特異的に結合し、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡを選択的に分解し、ＦＴＮ＿１１０３  ＤＮＡ配列を分解しない。一部の実施形態では、機能的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース遺伝子標的化および分解システムを選択する機構は、操作されたプロバイオティクスの染色体中に組み込まれた致死遺伝子、および致死遺伝子をインタクトなままにしておきながら、致死遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを分解の標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。したがって、一部の実施形態では、致死遺伝子は、毒素コード遺伝子ｍａｚＦであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、その予測されたｍＲＮＡ二次構造に基づいてｍａｚＦ  ｍＲＮＡ毒素を分解の標的とするように設計されている。代替の実施形態では、Ｃａｓ遺伝子は、抗毒素をコードするｍａｚＥ遺伝子と同じ場所に配置され（ｃｏ−ｌｏｃａｔｅ）、かつ／または同時転写される。この実施形態では、機能ではなく、Ｃａｓ遺伝子の維持および／または発現についての選択がある。
【０１０５】
一部の実施形態では、操作されたプロバイオティクスは、以下のうちの２つまたはそれ超を含み得る：１つまたは複数の標的化および分解システム、１つまたは複数の可動性遺伝子エレメント、１つまたは複数の抗生物質フリー維持または封じ込めモジュール、および１つまたは複数の機能的選択モジュール。例えば、操作されたプロバイオティクスは、１つまたは複数の標的化および分解システム、ならびに１つまたは複数の抗生物質フリー維持または封じ込めモジュールを含み得るが、可動性遺伝子エレメントを含まない。代わりに、操作されたプロバイオティクスは、１つまたは複数の標的化および分解システム、ならびに１つまたは複数の機能的選択モジュールを含み得るが、可動性遺伝子エレメントを含まない。
【０１０６】
一部の実施形態では、操作されたプロバイオティクスは、ヌクレアーゼ、ＭＧＥ、および抗生物質フリー選択モジュールをコードする遺伝システムを含み得る。３つすべてのモジュールを含有する遺伝システムは、ＭＧＥを介して、微生物コミュニティ中で宿主細胞から目的の細胞に移動する機能を果たし得る。ヌクレアーゼは、目的の遺伝子を分解の標的とすることができ、抗生物質フリー選択モジュールは、意図された微生物コミュニティ中での遺伝システムの伝播を促進する手段を提供する。
【０１０７】
一部の実施形態では、操作されたプロバイオティクスは、ヌクレアーゼおよび抗生物質フリー選択モジュールをコードする遺伝システムを含み得る。これらのモジュールを含有する遺伝システムは、プロバイオティクス株を、ヌクレアーゼによって分解の標的とされる望まれない遺伝子エレメントの取得から保護するように機能を果たし得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、操作されたプロバイオティクスは、ＭＧＥおよび抗生物質フリー選択モジュールをコードする遺伝システムを含み得る。これらのモジュールを含有する遺伝システムは、意図された微生物コミュニティ中のＭＧＥの宿主域に適合する細菌種の増殖を促進するように機能を果たし得る。これらの遺伝システムは、追加の遺伝子エレメント、例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子、または転写抑制因子などを任意選択で含み得る。
【０１０９】
本開示によって提供される配列
表１０は、本明細書に開示の配列番号１〜２０の概要を提供する。
【表１０】
2017512500.tif 000015
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、例示的な目的のために本明細書に提供されており、限定的であるように意図されていない。例えば、以下の実施例は、プロバイオティクス操作に注目しているが、他の細胞も、同様の方法および設計を使用して操作することができる。
【０１１１】
実施例１：微生物集団内の遺伝子標的化および分解システムの拡散のモデル
操作されたプロバイオティクスから微生物コミュニティの他のメンバーへの遺伝子標的化および分解システムの伝播を記載するための基本モデルを公式化することができる（図１）。式中、Ｐ（ｔ）およびＦ（ｔ）は、それぞれ遺伝子標的化および分解システムを含む、および含まない亜集団を表す。Ｒ（ｔ）は、利用可能な増殖資源のプールを表す。このモデルは、可動性遺伝子エレメント拡散の以前に確証されたモデルから導出される［Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、２０００年；Ｓｔｅｗａｒｔ、１９７７年］。他の変数を、表１１のように定義する。
【表１１】
2017512500.tif 000016
【０１１２】
モデルは、定着を達成するのに要求される操作されたプロバイオティクスの最初の接種物密度、胃腸系における遺伝子標的化および分解システムの滞留時間、およびビルレントな／抗生物質耐性遺伝子の有効なクリアランスのために要求される操作された微生物細胞とビルレントな／抗生物質耐性微生物細胞との比の決定を支持する。
【０１１３】
実施例２：目的の遺伝子中の候補標的部位
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムは、目的の遺伝子内の特定の部位を標的とし得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼに由来するシステムの場合では、標的配列は、配列ＮＧＧのすぐ５’側に存在しなければならず、ここで「Ｎ」は、任意のヌクレオチドであり得る。図２は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＣＡＴ、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＣ＿００９１４１  ４０８２４．．．４１４８３）の概略図を表す。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いた標的化に適した部位は、暗灰色でアノテートされている。選択された標的部位および目的の遺伝子特徴は、薄灰色でアノテートされている。選択される標的部位は、目的の遺伝子内の重要な機能的モチーフまたは構造モチーフと一致するように選択される。
【０１１４】
実施例３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムの設計および構築
３つの成分が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムの適切な機能に必要である：Ｃａｓ９タンパク質自体、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートが隣接した１つまたは複数の標的ＤＮＡ「スペーサー」を含有するＣＲＩＳＰＲアレイ、ならびにＣａｓ９およびＣＲＩＳＰＲアレイから転写されるｃｒＲＮＡと複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ。図３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化システムの例示的な設計を表す。ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＣＲＩＳＰＲアレイに基づき、これを、目的の遺伝子である、実施例２に記載のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＣＡＴ）を標的とするように設計する。ＣＲＩＳＰＲアレイ（図３Ａ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（図３Ｂ）をともに、誘導プロモーターの制御下に置く。Ｃａｓ９タンパク質は、構成的に発現され得る（図３Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲアレイの代替の設計では、ＣＡＴ遺伝子を標的とした５スペーサーアレイを構築した（図３Ｄ）。しかし、異なる長さのアレイに対応する複数のバンドが、商業的な遺伝子合成によって合成されたアレイのゲル電気泳動中に観察された。本発明者らが商業的な遺伝子合成プロバイダーからこのＤＮＡ設計のクローン集団を得ることができなかったという事実は、この５スペーサーアレイ設計が反復単位間の組換えに脆弱であることを示唆する。代替の設計では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび標的スペーサーを組み合わせて、構築するのがより容易であり、組換えに対して脆弱性がより低い単一ガイドＲＮＡ（図３Ｅ）とする。
【０１１５】
実施例４：侵入する抗生物質耐性遺伝子をはねつけることができる操作されたプロバイオティクス株
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現カセット（配列番号１）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）、およびＣＲＩＳＰＲアレイ（配列番号３）を含む操作されたプロバイオティクス株を設計および構築した。ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＣＡＴ）中の単一の３０塩基対部位を標的とするように設計した。対照株としての役割を果たすように、ＣＲＩＳＰＲアレイを省いた第２の操作された株を構築した。
【０１１６】
両方の株を、ＣＡＴおよび蛍光タンパク質をコードするプラスミド（配列番号４）を用いた形質転換によってチャレンジした。操作されたプロバイオティクス株は、ＣＡＴを含む遺伝子発現カセットをコードするプラスミドをはねつけるのに有効であることが見出された（図４）。本発明者らは、抗生物質クロラムフェニコールで選択すると、コロニー形成単位が１／１０４〜１／１０５に減少することを観察した（図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ操作されたプロバイオティクスおよび対照株からの結果を示す）。選択の非存在下では、操作されたプロバイオティクスは、ＣＡＴ遺伝子をコードするプラスミドをはねつけるのに１００％有効である（図４Ｃおよび４Ｄは、それぞれ操作されたプロバイオティクスおよび対照株からの結果を示す）。
【０１１７】
操作されたプロバイオティクスおよび対照株を、それぞれがＹ．ｐｅｓｔｉｓ  ＣＡＴ遺伝子をコードする５つの異なるプラスミド設計（配列番号４〜８）でチャレンジした。各場合において、操作されたプロバイオティクスは、対照株と比較して、クロラムフェニコール選択の存在下でもプラスミドを成功裏にはねつけた（図５）。
【０１１８】
観察された結果が、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするプラスミドの維持に由来する細胞受容能力の低減ではなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムの活性の結果であったことを検証するために、操作されたプロバイオティクスおよび対照株の両方を、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ  ＣＡＴ遺伝子をコードしないが、テトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子（配列番号９）をコードしたプラスミドでチャレンジした。テトラサイクリンプレート上で形質転換し、増殖させた後に得られたコロニーの数に有意な差異はなかった（図６）。これらの結果は、操作されたプロバイオティクスが目的の標的遺伝子に特異的であることを示す。
【０１１９】
この効果がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの実験室株に特異的であったか否かを決定するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムの宿主として共生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＥＣＯＲ−４４およびＥＣＯＲ−６１を使用して実験を繰り返した。これらの株をＣＡＴ発現プラスミドでチャレンジした後、本発明者らは、共生株が、抗生物質クロラムフェニコールで選択すると、コロニー形成単位において１／１０４〜１／１０５の減少を同様に示すことを観察した（図９）。
【０１２０】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システムを使用する以前に取得された抗生物質耐性遺伝子の除去
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現カセットをコードする低コピープラスミド（配列番号１）、ならびにＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ  ＩＰ２７５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＣＡＴ）および蛍光タンパク質をコードする高コピープラスミド（配列番号４）を含む標的株を設計および構築した。標的株を、異なる配列を標的としたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コンストラクト（配列番号１０〜１６）を用いた形質転換によって引き続いてチャレンジした。ＣＡＴ遺伝子を標的としたｇＲＮＡ（配列番号１０〜１３および配列番号１５〜１６）でチャレンジした標的株は、蛍光およびクロラムフェニコール耐性の喪失を示し、一方、異なる遺伝子を標的としたｇＲＮＡ（配列番号１４）は、標的株の蛍光またはクロラムフェニコール耐性表現型に影響を与えなかった（図７）。それぞれがＣＡＴ遺伝子内の異なる２０塩基対配列を標的とした２つの異なるオンターゲットｇＲＮＡを試験した。両方は、有効であり、ｇＲＮＡの転写を駆動するプロモーターの正体にもｇＲＮＡを伝播させているプラスミドの正体にも関係なくオフターゲット活性の証拠を示さなかった。オフターゲットｇＲＮＡは、有害な活性のいかなる証拠も示さなかった。これらの結果は、設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、標的株から望ましくないＤＮＡエレメントを特異的に標的とし、除去することができることを示唆する。
【０１２１】
実施例６：操作されたプロバイオティクスの設計
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子標的化および分解システム、ならびにｒａｆオペロンに由来する選択および封じ込め機構を含む操作されたプロバイオティクスを設計した（図８）。遺伝子標的化および分解システム、ならびに選択および封じ込め機構は、微生物コミュニティ内の他の細胞のゲノム中への拡散および組込みを促進するために、逆方向リピートに挟まれ、可動性の起点（ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ  ｏｒｉｇｉｎ）およびトランスポゾンが隣接している（図８Ａ）。図８Ｂは、ｒａｆオペロンに基づく選択モジュール設計を示し、ここでラフィノースは、ｒａｆＡ、ｒａｆＢ、ｒａｆＤ、およびｒａｆＹ遺伝子の転写を阻害する。
【０１２２】
実施例７：操作されたプロバイオティクス増殖の抗生物質フリー推進
炭素利用オペロンは、抗生物質を使用することなく、競合する菌株に対して操作されたプロバイオティクス株の増殖を推進する手段として使用されている。例えば、本発明者らは、ｒａｆオペロンが、ラフィノースの存在下で増殖させるとき、宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株に増殖優位性を付与することを実証した。図１０は、どのようにｒａｆオペロンを、構成的に（「構成的選択モジュール」）、またはラフィノースの存在に基づいて誘導性の様式で（「誘導性選択モジュール」）機能するように操作することができるかを例示する。図１０中の「Ｇｅｍｉｎｉ対照」設計は、ハイブリッド蛍光レポーターＧｅｍｉｎｉがｒａｆオペロンの代わりに発現されることを除いて、構成的選択モジュールおよび誘導性選択モジュールと同一である対照プラスミドである［Ｍａｒｔｉｎ、２００９年］。
【０１２３】
構成的選択モジュールを含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの実験室株を、Ｇｅｍｉｎｉ対照プラスミドを含有する株と競合させた。ラフィノースが増殖培地中で１．０％の濃度（体積当たりの重量）で存在するとき、構成的選択モジュールを含有する株は、代わりにＧｅｍｉｎｉ対照プラスミドを含有する同一の株より高い最終力価まで増殖する（図１１）。
【０１２４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの一部の共生株は、構成的選択モジュールで形質転換されるとき、Ｇｅｍｉｎｉ対照株より早く増殖する。例えば、共生株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＣＯＲ−０８およびＥ．ｃｏｌｉ  ＥＣＯＲ−５１（それぞれ構成的選択モジュールで形質転換された）は、Ｇｅｍｉｎｉ対照プラスミドで形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの実験室株より早く増殖する（図１２）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの実験室株は、図１２中で使用した増殖条件により良好に適合され、したがって、この実験で試験した他のＥＣＯＲ株も、哺乳動物の腸または同様の環境中で増殖させるとき、ラフィノースにより増殖優位性を呈し得る。
【０１２５】
他の実施形態
実施例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに注目してきた。それでもやはり、目的の望ましくない遺伝子を標的とし、分解する能力を付与するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する重要な概念は、当業者が理解するはずであるように、他の共生株および／またはプロバイオティクス株、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを含めた他の原核生物、または真核生物単細胞生物などに拡張可能である。
【０１２６】
実施例は、単なる例として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を分解の標的とすることに注目してきた。それでもやはり、目的の１つまたは複数の遺伝子を標的とし、分解するために操作されたプロバイオティクスを使用する重要な概念は、当業者が理解するはずであるように、他の核酸、例えば、病原性の、ビルレントな、毒性因子、代替の抗生物質耐性形質をコードする遺伝子エレメント、または他の望ましくない遺伝子エレメントなどに拡張可能である。それは、当業者が理解するはずであるように、他の核酸、例えば、目的の遺伝子から転写されるＲＮＡ、病原性要素、または非コード性遺伝子エレメントなどにも拡張可能である。
【０１２７】
本開示の様々な態様は、単独で、組合せで、または上記において記載した実施形態に具体的に論じられていない様々なアレンジメントで使用されてもよく、したがって、上記の記載で示した、または図面に例示したコンポーネントの詳細およびアレンジメントにその適用において限定されない。例えば、一実施形態に記載した態様を、他の実施形態において記載した態様と任意の様式で組み合わせてもよい。
【０１２８】
請求項要素を修飾するための特許請求の範囲における順序の用語、例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、１つの請求項要素の別のものに対するいずれの優先、優位、もしくは順序も、または方法の行為が実施される時間的順序をそれ自体で暗示せず、ある特定の名称を有する１つの請求項要素を、請求項要素を区別するために同じ名称を有する（しかし、順序の用語を使用するために）別の要素と区別するための単に標識として使用されている。
【０１２９】
また、本明細書で使用した言い回しおよび専門用語は、記載の目的のためであり、限定的であると見なされるべきでない。本明細書での「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」、「含有する」、「伴う」、およびこれらの変形の使用は、その後に列挙される項目、およびこれらの均等物、ならびに追加の項目を包含するように意味する。
【０１３０】
均等物
本開示はとりわけ、合成生物学についての新規の方法およびシステムを提供する。主題開示の具体的な実施形態を論じてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的でない。本開示の多くのバリエーションは、本明細書を点検すると当業者に明らかとなる。本開示の全範囲は、特許請求の範囲の均等物の全範囲とともに特許請求の範囲、およびこのようなバリエーションとともに明細書を参照することによって決定されるべきである。
【０１３１】
参照による組込み
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出した配列表（ファイル名：「１３４３９５＿０１０５０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」；作成日：２０１５年３月２５日；サイズ：１２１，５８７バイト）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３２】
本明細書で参照したすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれていると具体的に示されているのと同じ程度に、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【化１】
2017512500.tif 000017
【化２】
2017512500.tif 000018
【化３】
2017512500.tif 000019
【図１】
2017512500.tif 000020
【図２】
2017512500.tif 000021
【図３】
2017512500.tif 000022
【図４】
2017512500.tif 000023
【図５】
2017512500.tif 000024
【図６】
2017512500.tif 000025
【図７】
2017512500.tif 000026
【図８】
2017512500.tif 000027
【図９】
2017512500.tif 000028
【図１０】
2017512500.tif 000029
【図１１】
2017512500.tif 000030
【図１２】
2017512500.tif 000031
【図１３】
2017512500.tif 000032
【配列表】
2017512500000001.app
【国際調査報告】
2017512500.tif 000033
2017512500.tif 000034
2017512500.tif 000035
2017512500.tif 000036