(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）および（ｉｉ）のDNAを含み、かつ、下記（ｉ）および（ｉｉ）のDNAが、融合された転写産物および翻訳産物を発現するように結合されている、DNA構築物。
（ｉ）任意のポリペプチドをコードするDNA
（ｉｉ）（ｉ）のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を安定化させる機能を有するポリペプチドをコードするDNAであって、RNA結合タンパク質をコードするDNAと該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとの組み合わせであるDNA
【請求項２】
（ｉ）および（ｉｉ）のDNAの融合された転写産物が終止コドンを欠損するように改変されている、請求項１に記載のDNA構築物。
【請求項３】
RNA結合タンパク質をコードするDNAが複数個並置されており、かつ該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが複数個並置されている、請求項１に記載のDNA構築物。
【請求項４】
複数個並置されたRNA結合タンパク質をコードするDNAが、互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質をコードするDNAであり、かつ、複数個並置されたRNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAが互いに異なる複数個のRNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAである、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項５】
請求項１に記載のDNA構築物の調製に用いるための、下記（ｉ）または（ｉｉ）のDNA構築物。
（ｉ）任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAであって、RNA結合タンパク質をコードするDNAと該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとの組み合わせであるDNAを含むDNA構築物
（ｉｉ）任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するDNAであって、RNA結合タンパク質をコードするDNAと該RNA結合タンパク質が結合するRNAをコードするDNAとの組み合わせであるDNAと、該任意のポリペプチドをコードするDNAをクローニングするためのクローニング部位とを含むDNA構築物
【請求項６】
請求項１に記載のDNA構築物における（ｉ）および（ｉｉ）のDNAを発現させることを特徴とする、（ｉ）および（ｉｉ）のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を製造する方法。
【請求項７】
無細胞系で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法により製造される複合体。
【請求項９】
特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）請求項１に記載のDNA構築物における（ｉ）および（ｉｉ）のDNAを発現させることにより、（ｉ）および（ｉｉ）のDNAの転写産物と翻訳産物を含む複合体を形成させる工程
（ｂ）該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｃ）該標的物質に結合した複合体を回収する工程
【請求項１０】
該標的物質が担体に固定されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１もしくは５に記載のDNA構築物、または請求項８に記載の複合体を含む、請求項９に記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物との複合体を形成させる方法、該方法に用いる核酸構築物、該方法により形成される複合体、並びに該方法を利用した機能性タンパク質および該タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡのスクリーニングに関する。
背景技術
一群のアミノ酸のランダムな配列から機能性タンパク質を選択および同定する方法は、近年その重要性が高まっている。ファージディスプレイ法やツーハイブリッド法などのような特定の機能性タンパク質の選択に有効なスクリーニング系の多くは、生細胞を利用する（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．他  Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４０，２４５−２４６．Ｈａｒａｄａ，Ｋ．他  Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８０，１７５−１７９．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｃ．他  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，１４，４５８−４６７．Ｓｃｈａｔｚ，Ｐ．Ｊ．他  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６，２６７，１７１−１９１．Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．他  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９７，１５，５５３−５５７．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．他  Ｃｈｅｍ，Ｒｅｖ．１９９７，９７，３９１−４１０．）。このような選択系においては、選択したタンパク質（表現型）をコードする配列情報（遺伝子型）は、適切な表現型を提示する各細胞に導入されたＤＮＡから決定される。遺伝子型と表現型の連結は、ランダムな配列から機能性タンパク質を選択する際における一つの重要な決定因子である。
しかし、このような方法が生細胞に依存する限り、配列ライブラリーの多様性には限界がある。例えば、トランスフェクションの効率が低いこと、提示されるタンパク質のサイズに限界があること、並びに、細胞に対して有害なタンパク質の選択は不可能であるために対象となるタンパク質の性質に制限があることを理由として、ライブラリーの多様性に限界が生じる。
これらの問題を克服するために、無細胞系でタンパク質を選択するためのいくつかの方法が開発されている（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４，９１，９０２２−９０２６．Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．他  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６，２６７，１９５−２０７．Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４，４９３７−４９４２．Ｈｅ，Ｍ．他  Ｎｕｃｌｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５，５１３２−５１３４．Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．他  ＦＥＥＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７，４１４，４０５−４０８．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４，１２２９７−１２３０２．Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９８，９５，１４１３０−１４１３５．Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．他  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９８，１６，６５２−６５６．Ｄｏｉ，Ｎ．他  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９，４５７，２２７−２３０．Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  ＦＥＥＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９，４５０，１０５−１１０．Ｍａｋｅｙｅｖ，Ｅ．Ｖ．他  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９，４４４，１７７−１８０．Ｈｅ，Ｍ．他  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１，１０５−１１７．Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ，Ｃ．他  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１，１１９−１３５．Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１８，１２８７−１２９２．Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００，３２８，４０４−４３０）。
具体的には、リボゾームディスプレイ法、タンパク質−ｍＲＮＡ共有結合融合法、およびミセル法などが挙げられる。しかし、現在利用可能な無細胞系は、多様性を減縮させる操作を含むので、一般的には実用化が困難である。
例えば、リボゾームディスプレイ法においては、翻訳されたタンパク質とそのタンパク質をコードするｍＲＮＡとの比較的安定な複合体が、リボゾームにより形成される。これは、終止コドンの欠失により複合体からのタンパク質の遊離が遅くなるためである。このような条件下では、終結因子はリボゾーム複合体からのタンパク質の遊離を効率よく誘導できない。しかしながら、この方法では、タンパク質の選択の可否は該複合体の半減期に依存するため（終止コドンの欠損下でのタンパク質の遊離は、限界的な程度まで遅れるだけである）、選択を短時間で終了しなければならない。実際、完全な状態のｍＲＮＡ−リボゾーム−タンパク質複合体の維持は容易ではない。
大腸菌を用いたリボソームディスプレイは、例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｊａｎ  ２；９８（１）：７５−８０；Ｈａｎｅｓ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｉｖｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂｙ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｄｅｃ；１８（１２）：１２８７−９２；Ｈａｎｅｓ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００；３２８：４０４−３０；及びＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９  Ｄｅｃ  １０；２３１（１−２）：１１９−３５に記載されており、ウサギ網状赤血球系を用いたリボソームディスプレイは、例えば、Ｈｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂｙ  ＡＲＭ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９  Ｄｅｃ  １０；２３１（１−２）：１０５−１７；及びＢｉｅｂｅｒｉｃｈ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｍＲＮＡ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ−ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｍＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００  Ｄｅｃ  １５；２８７（２）：２９４−８に記載されており、小麦胚芽系を用いたリボソームディスプレイは、Ｇｅｒｓｕｋ  ＧＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｐｏｌｙｓｏｍｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７  Ｍａｒ  １７；２３２（２）：５７８−８２に記載がある。
タンパク質−ｍＲＮＡ共有結合融合法では、翻訳されたタンパク質は、３’末端がピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）で標識されている各ｍＲＮＡと共有結合する。この方法には、通常、ｍＲＮＡにピューロマイシンを結合させるための化学合成が必要であるが、この工程により利用可能なライブラリーのサイズが減少する。タンパク質−ｍＲＮＡ共有結合融合法に関する文献としては、Ｋｅｅｆｅ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒａｎｄｏｍ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１  Ａｐｒ  ５；４１０（６８２９）：７１５−８；Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３７５０−５；Ｌｉｕ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００；３１８：２６８−９３；及び、Ｃｈｏ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ＯＲＦｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｍａｒ  ２４；２９７（２）：３０９−１９などが挙げられる。
ミセル法では、化学的修飾を受けた個々のＤＮＡ分子が一個づつ、一つのコロイド状ミセルにパッケージングされて、転写および翻訳を受けるが、その修飾されたＤＮＡはミセルの内腔でそのコードするタンパク質と結合する。しかし、個々のミセルにＤＮＡ１分子がパッケージングされるように設計して反応混合物を希釈することにより、配列ライブラリーの多様性が減縮する。従って、無細胞系は、生細胞を用いる系に比べると、より多くの配列を試験できるという利点を有するものの、現在利用可能な無細胞系では、配列のプールのかなりの部分が十分に探索されていない。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、配列の多様性を減縮させることなく、一群のアミノ酸のランダムな配列から機能性タンパク質を選択しうる方法を提供することにある。また、本発明は、このような機能性タンパク質の選択を可能とするために、無細胞系においても、遺伝子型と表現型の安定的な連結を行いうる方法を提供することをも目的とする。さらに、本発明は、このような遺伝子型と表現型の安定的な連結に利用しうる核酸構築物を提供することをも目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために、無細胞系において、遺伝子型と表現型の安定的な連結を試みた。
第１の手法は、遺伝子型と表現型の安定的な連結のために、ＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの強い相互作用を利用するものである。一例として、ＴＡＲ（ｔｒａｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｉｏｎ；トランス活性化応答領域）として知られているＴａｔ（ｔｒａｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ；トランス活性化）タンパク質と相互作用するＲＮＡより強い強度でＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質に結合するアプタマー（Ｔａｔアプタマーと呼ぶ）を選択した（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｒ．他  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２０００，５，３７１−３８８）。ＴａｔアプタマーとＴａｔ由来のペプチド（ＲＥペプチド、３８アミノ酸、またはＣＱペプチド、３６アミノ酸）との相互作用は非常に強く、その解離定数（Ｋｄ）はｎＭ以下の範囲である。本発明者らは、この相互作用を利用して遺伝子型と表現型の連結を行うために、ＴａｔアプタマーとＴａｔ由来のペプチドをコードするＤＮＡがＤＨＦＲ遺伝子に連結されたＤＮＡ構築物を調製し、ＤＨＦＲ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と翻訳産物（タンパク質）が安定的な複合体を形成しうるかを検証した。
その結果、ＴａｔアプタマーとＴａｔ由来のペプチドの相互作用が、ネットワーク構造を形成しない限り、ＤＨＦＲ遺伝子の遺伝子型と表現型、つまり転写産物と翻訳産物を連結するために有用であることを見出した。ＤＮＡ構築物におけるアプタマーとペプチドモチーフの数の増加や、転写産物が終止コドンを欠損するようなＤＮＡ構築物の改変は、この複合体の安定性の向上に有効であった。
また、他の一例として、ＭＳ２コートタンパク質二量体と、それに対応する特異的結合モチーフＲＮＡ配列との相互作用を利用して、遺伝子型と表現型の連結を試みたところ、安定的なＭＳ２コートタンパク質遺伝子の転写産物と翻訳産物の複合体を形成することができた。
さらに、本発明者らは、遺伝子型と表現型の安定的な連結のために、上記のＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの相互作用に代えて、ＤＮＡ結合タンパク質とＤＮＡとの相互作用の利用を考えた。即ち、ＤＮＡ結合タンパク質と任意のペプチドとのキメラペプチドをコードするｍＲＮＡと該ＤＮＡ結合タンパク質が結合する領域を含むＤＮＡとの複合体である核酸構築物を調製し、該核酸構築物におけるｍＲＮＡを翻訳させれば、翻訳産物が該核酸構築物におけるＤＮＡに結合し、これにより該翻訳産物と該核酸構築物との安定的な複合体を形成しうると考えた。
第２の手法は、遺伝子型と表現型の安定的な連結のために、リボソームの不活性化を利用するものである。リボソームの不活性化のために、一例として、リシンＡ鎖を選択した。リシンはヒマ由来の細胞毒性を持つタンパク質でリボソームを不活性化することでタンパク質の合成を停止させる。サブユニットであるリシンＡ鎖は、極めて特異的に２８Ｓ  ｒＲＮＡに存在するα−サリシン部位のＮ−グルコシド結合を加水分解し、リボソームを不活性化する。ラットの２８Ｓ  ｒＲＮＡでは、４３２４番目のアデノシンが加水分解を受ける。リシンに不活性化されたリボソームはｍＲＮＡ鎖上に停止する。本発明者は、リシンＡ鎖によるリボソーム相互作用を利用して遺伝子型と表現型の連結を行うために、リシンＡ鎖をコードするＤＮＡが、ＤＨＦＲ遺伝子、ＧＳＴ遺伝子、あるいはストレプトアビジン遺伝子に連結されたＤＮＡ構築物を調製し、それら遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と翻訳産物（タンパク質）が安定的な複合体を形成しうるかを検証した。
その結果、リシンＡ鎖によるリボソームの不活性化が、これら遺伝子の転写産物と翻訳産物の複合体の安定化に有効であることを見出した。立体障害を回避するための翻訳産物へのスペーサーペプチドの挿入は、リボソームの不活性化に有効であった。
また、ＤＨＦＲ遺伝子、ＧＳＴ遺伝子、またはストレプトアビジン遺伝子を含む上記ＤＮＡ構築物を利用して調製された複合体は、それぞれＭＴＸリガンド、グルタチオン−セファロースまたはビオチン−アガロースに選択的に結合した。この事実は、特定の遺伝子の表現型に相互作用しうる分子を標的物質として、上記手法により形成された複合体の中から、該標的物質に結合する機能性タンパク質およびそれをコードするｍＲＮＡをスクリーニングすることが可能であることを示すものである。本発明の手法は、スクリーニングの対象となるペプチドのアミノ酸配列の多様性を減縮させることなく、機能性タンパク質およびそれがコードするｍＲＮＡの効率的な選択を可能とする。また、転写産物と翻訳産物を含む複合体の安定化を、該転写産物および翻訳産物をコードするＤＮＡと該安定化に寄与するＤＮＡとの融合という遺伝子操作で行い、一連の選択工程には複雑な化学合成の工程は含まれておらず、簡便に操作できる点も本方法のさらなる利点である。
即ち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）  下記（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡを含み、かつ、下記（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡが、融合された転写産物および翻訳産物を発現するように結合されている、ＤＮＡ構築物。
（ｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡの転写産物と翻訳産物を含む複合体を安定化させる機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（２）  （ｉｉ）のＤＮＡが、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである、（ｉ）に記載のＤＮＡ構築物。
（３）  リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの下流にスペーサーペプチドをコードするＤＮＡが結合されている、（２）に記載のＤＮＡ構築物。
（４）  任意のポリペプチドをコードするＤＮＡとリボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの間にリンカーペプチドをコードするＤＮＡが挿入されている、（２）に記載のＤＮＡ構築物。
（５）  （ｉｉ）のＤＮＡが、ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡと該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡとの組み合わせである、（１）に記載のＤＮＡ構築物。
（６）  （ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡの融合された転写産物が終止コドンを欠損するように改変されている、（５）に記載のＤＮＡ構築物。
（７）  ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡが複数個並置されており、かつ該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡが複数個並置されている、（５）に記載のＤＮＡ構築物。
（８）  複数個並置されたＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡが、互いに異なる複数個のＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡであり、かつ、複数個並置されたＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡが互いに異なる複数個のＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡである、（７）に記載の核酸構築物。
（９）  下記（ｉ）のｍＲＮＡと下記（ｉｉ）のＤＮＡの複合体である核酸構築物。
（ｉ）ＤＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡと任意のポリペプチドをコードするＲＮＡとの融合ｍＲＮＡ
（ｉｉ）（ｉ）の融合ｍＲＮＡの翻訳産物が結合するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ。
（１０）  （ｉ）のｍＲＮＡと（ｉｉ）のＤＮＡがハイブリダイズすることにより複合体を形成している、（９）に記載の核酸構築物。
（１１）  （ｉ）のｍＲＮＡの３’側領域と（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域がハイブリダイズしている、（９）に記載の核酸構築物。
（１２）  （１）に記載のＤＮＡ構築物の調製に用いるための、下記（ｉ）または（ｉｉ）のＤＮＡ構築物。
（ｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡを含むＤＮＡ構築物
（ｉｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡと、該任意のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング部位とを含むＤＮＡ構築物
（１３）  （１）に記載のＤＮＡ構築物における（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡを発現させることを特徴とする、（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡの転写産物と翻訳産物を含む複合体を製造する方法。
（１４）  （９）に記載の核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を（９）に記載の核酸構築物における（ｉｉ）のＤＮＡに結合させることを特徴とする、該翻訳産物と（９）に記載の核酸構築物との複合体を製造する方法。
（１５）  （ｉ）のｍＲＮＡと（ｉｉ）のＤＮＡがハイブリダイズすることにより複合体を形成している核酸構築物を用いる、（１４）に記載の方法。
（１６）  （ｉ）のｍＲＮＡの３’側領域と（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いる、（１４）に記載の方法。
（１７）  （１５）に記載の方法により製造された複合体における（ｉｉ）のＤＮＡを伸長する方法であって、該複合体に逆転写酵素を接触させて、（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことを含む方法。
（１８）  （１６）に記載の方法により製造された複合体における（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域を伸長する方法であって、該複合体に逆転写酵素を接触させて、（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に（ｉｉ）のＤＮＡをプライマーとして逆転写反応を行うことを含む方法。
（１９）  無細胞系で行われる、（１３）から（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）  （１３）に記載の方法により製造される複合体。
（２１）  （１４）から（１８）のいずれかに記載の方法により製造される複合体。
（２２）  特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）（１）に記載のＤＮＡ構築物における（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡを発現させることにより、（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡの転写産物と翻訳産物を含む複合体を形成させる工程
（ｂ）該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｃ）該標的物質に結合した複合体を回収する工程
（２３）  特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）（９）に記載の核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を（９）に記載の核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と（９）に記載の核酸構築物を含む複合体を形成させる工程
（ｂ）該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｃ）該標的物質に結合した複合体を回収する工程
（２４）  特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）（１０）に記載の核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を（１０）に記載の核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と（１０）に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡを伸長する工程
（ｃ）該特定の標的物質と、工程（ｂ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｄ）該標的物質に結合した複合体を回収する工程
（２５）  特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）（１１）に記載の核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を（１１）に記載の核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と（１１）に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡをプライマーとして逆転写反応を行うことにより、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域を伸長する工程
（ｃ）該特定の標的物質と、工程（ｂ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｄ）該標的物質に結合した複合体を回収する工程
（２６）  特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）（１０）に記載の核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を（１０）に記載の核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と（１０）に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程
（ｂ）該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｃ）該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡを伸長する工程
（ｄ）該標的物質に結合している複合体を回収する工程
（２７）  特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡをスクリーニングする方法であって、下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）（１１）に記載の核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を（１１）に記載の核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と（１１）に記載の核酸構築物とを含む複合体を形成させる工程
（ｂ）該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させる工程
（ｃ）該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡをプライマーとして逆転写反応を行うことにより、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域を伸長する工程
（ｄ）該標的物質に結合している複合体を回収する工程
（２８）  該標的物質が担体に固定されている、（２２）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９）  （１）もしくは（１２）に記載のＤＮＡ構築物、または（２０）に記載の複合体を含む、（２１）に記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
（３０）  （９）に記載の核酸構築物、または（２１）に記載の複合体を含む、（２３）から（２７）のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
以下、本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
（１）核酸構築物
本発明のＤＮＡ構築物は、（ｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および（ｉｉ）該ＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡを含むものである。該ＤＮＡ構築物においては、上記（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡが、融合された転写産物および翻訳産物を発現するように結合されている。
「任意のポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、その転写産物と翻訳産物の複合体の形成を行いたい所望のＤＮＡを意味する。機能性タンパク質のスクリーニングにおいては、例えば、ｃＤＮＡライブラリーやランダムライブラリーを好適に用いることができる。
転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡの種類は特に限定されない。好適なＤＮＡの第一の例としては、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
本明細書で言う「リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチド」とは、リボソーム自体を破壊してそれを不活性化するポリペプチドのみならず、リボソームをｍＲＮＡ上で停止することによりリボソームの翻訳機能を停止させることができるポリペプチドも包含する。
このようなポリペプチドの具体例としては、Ｎ−グリコシラーゼ又はＲＮａｓｅが挙げられる。Ｎ−グリコシラーゼの具体例としては、Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＡＰ）（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｎ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）、Ｌｕｆｆｉｎ（Ｌｕｆｆａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、Ｂｒｙｏｄｉｎ（Ｂｒｙｏｎｉａ  ｄｉｏｉｃａ）、Ｄｉａｎｔｈｉｎ（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ａｎｇｕｉｎａ）、ａ−Ｍｏｍｏｒｃｈａｒｉｎ（Ｍｏｍｏｒｄｉａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）、Ｓａｐｏｒｉｎ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、Ｒｉｃｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ（ＲＴＡ）（ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、Ａｂｒｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ（Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）、Ｍｉｓｔｌｅｔｏｅ  ｌｅｃｔｉｎ  Ｉ（ＭＬＩ）（Ｖｉｓｃｕｍ  ａｌｂｕｍ）、Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ  ＡＩ、またはＤｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ（ＤＴ）Ａ−ｃｈａｉｎが挙げられる。ＲＮａｓｅの具体例としてはα−Ｓａｒｃｉｎが挙げられる。
なお、ｒｉｃｉｎについては、Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｉｃｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ．Ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｉｃｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  ｒＲＮＡ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８８  Ｊｕｎ  ２５；２６３（１８）：８７３５−９に記載され、α−ｓａｒｃｉｎについては、Ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ．Ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８３  Ｆｅｂ  ２５；２５８（４）：２６６２−７に記載され、Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＡＰ）については、Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９９  Ｎｏｖ；８（１１）：２３９９−４０５に記載されている。
本発明のＤＮＡ構築物の好ましい態様の一つにおいては、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの下流にスペーサーペプチドをコードするＤＮＡが結合されている。この「スペーサーペプチド」とは、リボソームによる翻訳が終了する前に、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドが、リボソームをｃｉｓで攻撃できるようにするためのペプチドである。スペーサーペプチドは、それ自体折りたたまれないペプチドであることが好ましい。スペーサーペプチドは、翻訳された、リボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドが、リボソームをｃｉｓで攻撃することを保証することができる鎖長を有する。鎖長は、通常、５０から２００アミノ酸であり、好ましくは１００アミノ酸から１４０アミノ酸である。
また、本発明のＤＮＡ構築物の他の好ましい態様において、本発明のＤＮＡ構築物上の任意のポリペプチドをコードするＤＮＡとリボソームを不活性化する機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの間にリンカーペプチドをコードするＤＮＡが挿入されている。この「リンカーペプチド」とは、本発明のＤＮＡ構築物からの翻訳産物（融合タンパク質）において、融合されるポリペプチド同士が立体障害によりそのフォールディングが阻害されるのを回避するために、融合されるポリペプチドの間に挿入されるポリペプチドである。リンカーペプチドの鎖長さに特に制限はないが、一般的には、１０から３０アミノ酸程度のペプチドが用いられる。
転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡの好適な第二の例としては、ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡと該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡとの組み合わせが挙げられる。このようなＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡ配列との組み合わせを使用する場合、ＤＮＡ構築物中に、ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡが複数個並置されており、かつ該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡが複数個並置されていることが好ましい。これによりＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの相互作用を強化することができる。
またさらに好ましくは、複数個のＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡとして、互いに異なる複数個のＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡを使用し、複数個の該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡとして、上記した互いに異なる複数個のＲＮＡ結合タンパク質が結合する互いに異なるＲＮＡをコードするＤＮＡを使用する。このような互いに異なる複数個のＤＮＡを使用することにより、異なる複合体の間におけるネットワーク構造の形成が妨げることができる。
ＲＮＡ結合タンパク質と該ＲＮＡ結合タンパク質が結合するＲＮＡの組み合わせの具体例としては、Ｔａｔタンパク質とＴＡＲ  ＲＮＡもしくはＴａｔアプタマー、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥ  ＲＮＡもしくはＲｅｖアプタマー、Ｕ１Ａ  ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎとＵ１Ａ  ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎアプタマーもしくはＵ１Ａ  Ｓｎ  ＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質若しくはその変異体とそれが認識するＲＮＡなどが挙げられる。また、ＭＳ２コートタンパク質とそれに対応する特異的結合モチーフのＲＮＡ配列を本発明に用いることも可能である。
なお、Ｔａｔ−ＴＡＲ又はＴａｔ  ａｐｔａｍｅｒについては、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｔａｔｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２０００  Ｍａｙ；５（５）：３７１−８８に記載され、Ｒｅｖ−ＲＲＥ複合体については、Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ−ＲＲＥ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｌｔｅｒｅｄ−ｓｐｅｃｉｔｉｃｉｔｙ  ｒｅｖ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｃｅｌｌ．１９９６  Ｏｃｔ  ４；８７（１）：１１５−２５に記載され、Ｕ１Ａ  ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎについては、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  １．９２  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ１Ａ  ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ＲＮＡ  ｈａｉｒｐｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９４  Ｄｅｃ  １；３７２（６５０５）：４３２−８に記載されている。
また、Ｚｎ  Ｆｉｎｇｅｒタンパク質とＲＮＡの相互作用に関する文献としては、Ｆｒｉｅｓｅｎ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｊｕｌ；５（７）：５４３−６；ＭｃＣｏｌｌ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９  Ａｕｇ  １７；９６（１７）：９５２１−６；Ｆｒｉｅｓｅｎ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩＩＡ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ａｐｒ  ２５；２７２（１７）：１０９９４−７；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＦＩＩＩＡ．Ｃｅｌｌ．１９９２  Ｎｏｖ  １３；７１（４）：６７９−９０；Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３  Ａｐｒ  ２３；２６０（５１０７）：５３０−３；及びＪｏｈｏ  ＫＥ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＴＦＩＩＩＡ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｔｏ  ５Ｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ．Ｃｅｌｌ．１９９０  Ａｐｒ  ２０；６１（２）：２９３−３００などが挙げられる。
本発明のＤＮＡ構築物の他の好ましい態様においては、該ＤＮＡ構築物から発現する融合された転写産物が終止コドンを欠損するように該ＤＮＡ構築物が改変されている。これにより転写産物と翻訳産物を含む複合体からのリボソームの遊離を遅延させ、複合体を安定化することができる。
上記本発明のＤＮＡ構築物は、例えば、転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡを、任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターに挿入することにより調製することができる。また、転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡと該任意のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング部位とを含むベクターの該クローニング部位に、任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入することにより調製することもできる。
本発明は、また、このようにして上記ＤＮＡ構築物を調製するために用いる、▲１▼任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、および▲２▼任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡと、該任意のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング部位とを含むＤＮＡ構築物、を提供する。
本発明における、ｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物は、（ｉ）ＤＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡと任意のポリペプチドをコードするＲＮＡとの融合ｍＲＮＡと、（ｉｉ）（ｉ）の融合ｍＲＮＡの翻訳産物が結合するＤＮＡ領域を含むＤＮＡとの複合体である。該核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡと（ｉｉ）のＤＮＡは、好ましくはハイブリダイズ（水素結合）することにより複合体を形成している。ハイブリダイズする塩基対の数は、該核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡと（ｉｉ）のＤＮＡとが安定的に結合しうる限り特に制限はないが、好ましくは１０塩基対以上である。
該核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行えば、該ｍＲＮＡに対応するＤＮＡを合成することができる。これにより転写産物と翻訳産物に加えて、それらをコードするＤＮＡを複合体の構成要素とすることができる。
該核酸構築物が、（ｉ）のｍＲＮＡの３’側領域と（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域がハイブリダイズしている核酸構築物として調製されている場合には、（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に（ｉｉ）のＤＮＡをプライマーとした逆転写反応を行うことが可能である。
（ｉｉ）のＤＮＡを逆転写反応のプライマーとせず、他のプライマーを用いる場合には、核酸構築物において（ｉ）のｍＲＮＡと（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域同士がハイブリダイズしている必要はなく、５’側領域同士がハイブリダイズしてもよい。この場合、逆転写反応を行うためには、反応系にプライマー（（ｉ）のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）を添加することが必要である。
本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物の調製のための、ｍＲＮＡとＤＮＡとの結合に関しては、文献（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２００１  Ｎｏｖ  ２３；５０８（３）：３０９−１２）を参照のこと。
（２）転写産物と翻訳産物の複合体の製造方法
本発明は、また、上記した転写産物と翻訳産物の複合体を製造する方法を提供する。この製造方法の一つの態様においては、上記ＤＮＡ構築物を適当な転写・翻訳系に添加または導入することにより、（ｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡと（ｉｉ）該ＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡとの融合ＤＮＡを発現させることを特徴とする。この融合ＤＮＡの発現で生じる転写産物と翻訳産物は、翻訳産物に含まれるリボソームを不活性化するポリペプチドの作用により、あるいは、翻訳産物に含まれるＲＮＡ結合タンパク質と転写産物に含まれるその結合部位との相互作用により、安定的な複合体を形成する。
この製造方法の他の態様においては、上記ＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物を適当な転写・翻訳系に添加または導入することにより、該核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、その翻訳産物を該核酸構築物における（ｉｉ）のＤＮＡに結合させることを特徴とする。翻訳産物に含まれるＤＮＡ結合タンパク質と該核酸構築物における（ｉｉ）のＤＮＡとの相互作用により、安定的な複合体が形成される。該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行い、（ｉｉ）のＤＮＡを伸長させることにより、該ｍＲＮＡに対応するＤＮＡを合成することができる。（ｉ）のｍＲＮＡの３’側領域と（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いた場合には、（ｉｉ）のＤＮＡをプライマーとして逆転写反応を行うことができる。
本方法で用いる転写・翻訳系としては、無細胞転写・翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞転写・翻訳系又は生細胞などは、本発明の核酸構築物を添加し又は導入することによって、該核酸構築物からの転写産物および翻訳産物の発現（ｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物を用いる場合には、翻訳産物の発現）を保証するものである限り制限されない。本方法では、好ましくは無細胞の転写・翻訳系、特に好ましくは、細胞抽出物から構成される転写・翻訳系を使用することができる。
無細胞転写・翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞転写・翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる。また、生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。
本方法により得られる、転写産物と翻訳産物を含む複合体も本発明の範囲内である。このような複合体は安定に存在することができ、後述するように特定の標的物質と相互作用するポリペプチドやそれをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡのスクリーニングなどに供することができる。
（３）特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡのスクリーニング方法
本発明は、また、特定の標的物質に結合するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡをスクリーニングする方法を提供する。
本発明の方法の第一の態様は、本発明のＤＮＡ構築物を用いる態様である。この態様においては、まず、上記ＤＮＡ構築物における（ｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡと（ｉｉ）該ＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡとの融合ＤＮＡを発現させ、該融合ＤＮＡの転写産物と翻訳産物を含む複合体を形成させ（工程（ａ））、次いで、特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させ（工程（ｂ））、次いで、該標的物質に結合した複合体を回収する（工程（ｃ））。
本発明の方法の第二から第四の態様は、本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物を用いる態様である。
第二の態様は、逆転写反応を行う工程を含まない態様である。第二の態様においては、まず、本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させることにより、翻訳産物を該核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させ、該翻訳産物と該核酸構築物を含む複合体を形成させ（工程（ａ））、次いで、該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させ（工程（ｂ））、次いで、該標的物質に結合した複合体を回収する（工程（ｃ））。
本発明の方法の第三および第四の態様は逆転写反応を行う工程を含む態様である。第三の態様は、標的物質と複合体との結合前に、逆転写反応を行う態様であり、第四の態様は、標的物質と複合体との結合後に、逆転写反応を行う態様である。
本発明の方法の第三の態様においては、まず、本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を該核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と該核酸構築物とを含む複合体を形成させ（工程（ａ））、次いで、工程（ａ）で形成された複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行うことにより、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡを伸長させ（工程（ｂ））、次いで、該特定の標的物質と、工程（ｂ）で形成された複合体とを接触させ（工程（ｃ））、次いで、該標的物質に結合した複合体を回収する（工程（ｄ））。
本発明の方法の第四の態様においては、本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物における（ｉ）のｍＲＮＡを翻訳させ、翻訳産物を該核酸構築物における（ｉｉ）に記載のＤＮＡに結合させることにより、該翻訳産物と該核酸構築物とを含む複合体を形成させ（工程（ａ））、次いで、該特定の標的物質と、工程（ａ）で形成された複合体とを接触させ（工程（ｂ））、次いで、該標的物質に結合した複合体に逆転写酵素を接触させて、該複合体における（ｉ）のｍＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことにより、該複合体における（ｉｉ）のＤＮＡを伸長させ（工程（ｃ））、次いで、該標的物質に結合している複合体を回収する（工程（ｄ））。
本発明の方法の第三または第四の態様において、（ｉ）のｍＲＮＡの３’側領域と（ｉｉ）のＤＮＡの３’側領域がハイブリダイズしている核酸構築物を用いた場合には、逆転写反応を（ｉｉ）のＤＮＡをプライマーとして簡便に行うことができる。
本発明の方法における、標的物質としては特に限定されず、スクリーニングの目的に応じて種々の標的物質を用いることができる。標的物質の具体例としては、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、リガンド、酵素、抗体、又は環境汚染物質などが挙げられる。標的物質として、例えば、リガンドを用いれば、該リガンドに結合する受容体をスクリーニングすることができ、オーファン受容体のリガンドの同定などに有用である。複合体の回収を容易にするために、標的物質を担体に固定しておくことが好適である。また、目的に応じて、複数種の標的物質が配置された基盤を用いて、スクリーニングを行ってもよい。
本発明のスクリーニングの一例としては、以下の方法を挙げることができる。本発明の核酸構築物を転写・翻訳後（ｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物を用いる場合には、翻訳後）、アガロース等の固相担体に結合した標的物質の懸濁液を添加し、一定期間保持することにより標的物質と目的遺伝子の産物とを結合させる。未結合のｍＲＮＡとタンパク質を含む上清を、混合液から除去し、適当な緩衝液で固相担体を洗浄する。固相担体に結合したｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）を、尿素を含む溶液で高温にて溶出させることにより単離することができる。
また、本発明は、本発明のスクリーニングに用いるためのキットを提供する。本発明のＤＮＡ構築物を用いたスクリーニングのためのキットには、例えば、▲１▼本発明のＤＮＡ構築物、▲２▼本発明のＤＮＡ構築物を調製するための、（ｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡを含むＤＮＡ構築物または（ｉｉ）任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物と翻訳産物の複合体を安定化させる機能を有するＤＮＡと該任意のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング部位とを含むＤＮＡ構築物、▲３▼本発明のＤＮＡ構築物の発現により形成される複合体、のいずれか一つまたは複数の評品を含むことができる。
また、本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物を用いたスクリーニングのためのキットには、例えば、▲１▼本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物、▲２▼本発明のｍＲＮＡとＤＮＡとからなる核酸構築物の発現により形成される複合体（逆転写反応を行うことにより複合体中のｍＲＮＡに対応するＤＮＡが合成されたものを含む）、のいずれか一つまたは双方の評品を含むことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されることはない。
［実施例１］
Ａ．方法
（Ａ−１）３種のタンパク質［ＤＨＦＲ−（ＲＥ）ｎ］の調製
ＤＨＦＲ−（ＲＥ）１−３融合タンパク質の調製に際して、プラスミドｐＴＺＤＨＦＲ２０由来（Ｂｌａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．Ｉｎ  Ｆｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｔｅｒｉｎｓ；Ｂｌａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．；Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ，，Ｅｄｓ．；Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５；ｐｐ．１９１−２５３）の、ＰｓｔＩ部位をその３’末端に有するＤＨＦＲの遺伝子を、プラスミドｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に挿入した。ＲＥペプチド（３８アミノ酸；ＲＫＫＲＲ  ＱＲＲＲＰ  ＰＱＧＳＱ  ＴＢＱＶＳ  ＬＳＫＱＰ  ＴＳＱＳＲ  ＧＤＰＴＧ  ＰＫＥ（配列番号３））をコードするセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングさせ、ｒＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて伸長した。得られたｄｓＤＮＡをＰｓｔＩ部位とＥｃｏＴ２２Ｉ部位で切断して、ＰｓｔＩ部位でＤＨＦＲ遺伝子の３’側に挿入した。ＰｓｔＩとＥｃｏＴ２２Ｉの制限部位は連結し、連結した部位はＰｓｔＩまたはＥｃｏＴ２２Ｉのいずれでも切断されないので、ＲＥペプチドをコードする配列をＤＨＦＲの遺伝子の３’末端にあるＰｓｔＩ部位に連続的に結合させて、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）１からｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３までを得た。これらのプラスミドを用いて大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフェクションし、得られた菌をＬＢ培地５００ｍｌ中で３０℃にてインキュベートした。対数増殖期に、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１ｍＭ添加して、３０℃で４時間インキュベートした。タンパク質は、ポリヒスチジンタグを付加したポリペプチドとして発現させた。ＨｉｓＴｒａｐＴＭキレーティングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を取扱説明書に従って使用して、タンパク質を精製し、ＨｉＴｒａｐＴＭ脱塩システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて低分子物質を除いた。さらに、分解されたタンパク質を除くために、ＨｉＴｒａｐＴＭＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）陽イオン交換ＨＰＬＣを行った。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。結果を図１に示す。精製タンパク質の濃度は、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で測定した。
（Ａ−２）３種のタンデムＲＮＡアプタマー［（Ａｐｔ）ｎ］の調製
タンデムＴａｔアプタマー［（Ａｐｔ）１−３］の調製のために、センスとアンチセンスのオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＣＧ−３’（配列番号４）および５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号５））を合成した。これらのオリゴヌクレオチドをアニールさせて、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．）を用いて連結することにより、タンデムにつながったＴａｔアプタマー［（Ａｐｔ）１−３］を得た。１〜３個のＴａｔアプタマーをコードする連結したＤＮＡ配列を、クローニング（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｇｎ  Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）した後、単離した。１〜３個のアプタマーをコードするＤＮＡを、Ｔ７  Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、転写した。
（Ａ−３）解離定数（Ｋｄ）の測定
ゲル移動度シフトアッセイのために、各々の転写アプタマー［（Ａｐｔ）１−３］を１５％ポリアクリルアミド変性ゲルによるＰＡＧＥにより単離して、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ１９；Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で３７℃で１時間処理して、５’末端を脱リン酸化した。その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを３７℃で１時間作用させて、該アプタマーを３２Ｐで標識し、ＰＡＧＥ（１５％ポリアクリルアミド）により精製した。一定の濃度の５’末端標識化アプタマーに４０ｎＭのｔＲＮＡを加えて、Ｔａｔ結合緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，および０．１％  ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０］中で９５℃で３分間処理して変性させ、室温に放置して再生させ、続いて、Ｔａｔ結合緩衝液中の過剰濃度範囲内のＤＨＦＲ−（ＲＥ）１−３を総容量が１０μｌになるように混合し、３０℃で一時間以上処理した。遊離のＲＮＡ、および、タンパク質に結合したＲＮＡ、またはペプチドに結合したＲＮＡは、５〜１５％の非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて０．５×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸／ＥＤＴＡ）緩衝液中で電気泳動することにより分離し、解析した。
（Ａ−４）ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３（野生型）、ｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３（変異型）、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３（対照）の構築
ＤＨＦＲのコア領域に部位特異的変異を導入するために、４つのオリゴヌクレオチド（５’−ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＴＡ−３’（配列番号６）、５’−ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣ−３’（配列番号７）、５’−ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ−３’（配列番号８）、および５’−ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＣＧＧ−３’（配列番号９））を調製した。これらのオリゴヌクレオチドとメガプライマーＰＣＲ突然変異誘発法を用いて、ＤＨＦＲの遺伝子に２つの変異を導入することにより、ｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３を構築した。次に、タンデムの３つのアプタマー配列（Ａｐｔ）３を、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３とｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３内のＲＥペプチドの下流にあるＥｃｏ  ＲＩ部位に導入し、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３（野生型）、およびｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３（変異型）を得た。
（Ａ−５）（Ａｐｔ）３と（ＲＥ）３との相互作用による、遺伝子型と表現型の連結
３２Ｐで標識されたキャップ化（キャップ構造アナログ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ｍＲＮＡを得るために、直鎖状プラスミド［ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３（野生型）、ｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３（変異型）、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３（対照）］を、Ｔ７ＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅＴＭキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて３７℃で２時間処理して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させた。標識化ｍＲＮＡをＮＩＣＫＴＭカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で精製した。ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３（野生型）、またはＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３（変異型）をコードするキャップ化ｍＲＮＡ  １μｇを、３０℃で２０分間ウサギ網状赤血球細胞溶解液２０μｌ中で翻訳させた（Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。対照として、アプタマーを含まないｍＲＮＡを翻訳させた（対照）。それぞれのタンパク質は、３５Ｓで標識した。翻訳後、結合緩衝液［１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μｌ  ｔＲＮＡ］１８０μｌと、無水コハク酸で予め処理してＭＴＸ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の正電荷を中和しておいたＭＴＸ−アガロースビーズ懸濁液２０μｌとを細胞溶解液に添加し、３０分間４℃にて結合させた。未結合のｍＲＮＡとタンパク質を含む上清２００μｌを、混合液から除去し、結合緩衝液１８０μｌで２回ＭＴＸ−ビーズを洗浄した。結合したｍＲＮＡとタンパク質を、ＳＤＳを含む溶液と一緒に高温（９５℃）で溶出させることによりＭＴＸ−ビーズから単離した。その後、各サンプルを１５％ゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
（Ａ−６）ストレプトアビジンｍＲＮＡとＤＨＦＲ  ｍＲＮＡの混合物のプールから、ストレプトアビジンをコードするｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択
ｐＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３の構築は、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３の構築に準じて行った。簡単に述べると、ＣＱペプチド（３６アミノ酸；ＣＦＴＴＫ  ＡＬＧＩＳ  ＹＧＲＫＫ  ＲＲＱＲＲ  ＲＰＰＱＧ  ＳＱＴＢＱ  ＶＳＬＳＫＱ）（配列番号１０）をコードするセンスとアンチセンスのオリゴヌクレオチドを合成し、得られたＣＱペプチドを含む断片をＤＨＦＲ配列とアプタマー配列の間に導入した。ストレプトアビジンをコードする鋳型ＤＮＡは既報である。ストレプトアビジン遺伝子を含むＤＮＡ断片はＣＱペプチド配列の上流にＤＨＦＲ遺伝子と置換して挿入した。それぞれの３２Ｐで標識したＲＮＡ［ストレプトアビジン−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３とＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３］は上記の通り調製した。３種のｍＲＮＡの組み合わせ（ストレプトアビジンまたはＤＨＦＲをコードするｍＲＮＡをそれぞれ１：１の比で混合したｍＲＮＡ、または、対照としていずれかのｍＲＮＡ）（各組み合わせにおいて、総量１．２５μｇ）を、３０℃で２０分間細胞溶解液中（２５μｌ）にて翻訳させた。翻訳後、結合緩衝液［２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、７０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０μｌ  ｔＲＨＡ］１８０μｌと、ビオチン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の懸濁液２０μｌとを細胞溶解液に添加し、１０分間氷上にて結合させた。未結合のｍＲＮＡとタンパク質を含む上清（２００μｌ）を、混合液から除去し、結合緩衝液１８０μｌでビオチン−ビーズを２回洗浄した。結合したｍＲＮＡを、尿素を含む溶液とともに高温（９５℃）にて溶出させることによりビオチン−ビーズから単離した。その後、各サンプルを、４％ゲルの変性ＰＡＧＥに供した。
（Ａ−７）機能性タンパク質の選択における、リボゾームディスプレイ系と（ＲＥ）３と（Ａｐｔ）３との強い相互作用の組み合わせ
上記の、ＤＨＦＲ遺伝子（ｐＤＨＦＲ）を含むｐＥＴ３０ａとｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３のプラスミドを、各々３２Ｐで標識したｍＲＮＡ［ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３、ＤＨＦＲ＋Ｓｔｏｐ、およびＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ］を調製するための鋳型として使用した。３２Ｐで標識したｍＲＮＡを翻訳し、上述と同様、ＭＴＸ−ビーズによる選択に供した。結合したｍＲＮＡを、高温にて溶出し、ＭＴＸ−ビーズから単離した。選択されたｍＲＮＡの相対量は、３２Ｐで標識したｍＲＮＡのカウントおよびＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
ｐ（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３−ＤＨＦＲをｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３と同様の方法で構築した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写に用いる直鎖状ＤＮＡは、Ｔ７プロモーター配列を含有する各鋳型プラスミド［ｐ（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３−ＤＨＦＲ、およびｐＤＨＦＲ］からのＰＣＲ産物として調製した。ｍＲＮＡは、上述の方法で調製した。大腸菌の各終結因子（大腸菌のＲＥ１〜ＲＥ３）についてポリクローナルＩｇＧ抗体を別々に調製した。最初のプールのｍＲＮＡ総量は、２μｇであった。そして、直鎖状鋳型用大腸菌抽出液系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を３７℃で１０分間行った。翻訳反応を止めるために、翻訳産物を氷上で１分間静置して、上述の通り、ＭＴＸ−ビーズを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を行った。回収されたｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製し、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）により逆転写を行った。この逆転写されたサンプル、つまりｃＤＮＡをＰＣＲ（ＥｘＴａｑ；Ｔａｋａｒａ）で増幅し、２．０％のアガロース電気泳動によって分析した。半定量分析を行うために、アガロースゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、Ｆｌｕｏｒｏ  Ｉｍａｇｅｒ  ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により解析した。（ＲＥ）３と（Ａｐｔ）３との相互作用の強度は、ＲＴ−ＰＣＲ産物として回収されたｍＲＮＡの相対量に基づいて、推定した。
Ｂ．結果及び考察
（Ｂ−１）タンデムにつながったアプタマーとＴａｔ由来ペプチドとの相互作用の増強
機能性タンパク質のモデルとして、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を選択した。その理由はその性質が良く解析されているためである（Ｂｌａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．他Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ．１９１−２５３．Ｔａｉｒａ，Ｋ．他  Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９８７，１２，２７５−２７８．Ｔａｉｒａ，Ｋ．他  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８８，３１，１２９−１３７．Ｉｗａｋｕｒａ，Ｍ．他  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，１１７，４８０−４８８．Ｆｕｊｉｔａ，Ｓ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４，３９１−３９６．Ｈａｍａｄａ，Ｍ．他  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，１２３，６８４−６９２）。数個のアプタマーとＴａｔ由来ペプチド（ＲＥ）の結合親和力への影響を調べるために、３種のタンパク質［ＤＨＦＲ−（ＲＥ）ｎ］（図１）と、３種のタンデムＲＮＡアプタマー［（Ａｐｔ）ｎ］（図２Ａ）を調製した。この場合の「ｎ」は１〜３の範囲内であり、それぞれのモチーフのコピー数に相当する。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のバンドを図１に示した。各タンパク質が予想通りＤＨＦＲ活性を有していることを確認し、ＲＥペプチドモチーフの結合が、ＤＨＦＲドメインの正確なフォールディングを干渉しないことを証明した。それぞれのアプタマーの適切な二次構造を維持するため、Ｔａｔアプタマーを６つのアデノシンヌクレオチドを介して互いにタンデムに結合させて、（Ａｐｔ）２と（Ａｐｔ）３を得た。非変性ゲルを用いたＰＡＧＥの後の精製ＲＮＡを、図２Ａの対照のレーン（Ｃ）に示す。図２Ａのゲルは、ＴａｔアプタマーはＤＨＦＲと相互作用しないことを示している。このゲルは、濃度を増加させた野生型ＤＨＦＲ（個々の場合において、ゲルの上に三角形で示す通り、Ｃのレーンから右へ、ＤＨＦＲの濃度を増加させた。）と混合してもアプタマーの移動度は変化しなかったことを示す。
アプタマー（Ａｐｔ）１−３のゲル移動度は、融合タンパク質ＤＨＦＲ−（ＲＥ）１−３と混合すると、変化した（図２Ｂ〜２Ｄ）。これらの実験で、３２Ｐ標識化アプタマー（最終濃度３０ｐＭ）を過剰量の各融合タンパク質と混合し、形成した複合体の量をイメージアナライザーで定量した。見かけのＫｄ値は、ｎ＝１、ｎ＝２、およびｎ＝３で、それぞれ、２４ｎＭ、２００ｐＭ、および１６ｐＭ未満と計算された。試験した組み合わせの中で、（Ａｐｔ）３とＤＨＦＲ−（ＲＥ）３との相互作用が最も強かった［Ｋｄ（ａｐｔ）＜１６ｐＭ］。この複合体は、複数のコンホメーションをとるようであったが、アプタマーとＲＥペプチドの両方の数が増加すると、より強い相互作用が得られた。ＲＮＡ−タンパク質複合体の安定性の維持、即ち、ＲＮＡとタンパク質との極めて強い相互作用が、遺伝子型と表現型との連結において重要な因子であるため、（Ａｐｔ）３とＤＨＦＲ−（ＲＥ）３のモチーフを用いて、以下の実験を行った。
（Ｂ−２）（Ａｐｔ）３と（ＲＥ）３との相互作用による遺伝子型と表現型の連結
（Ａｐｔ）３とＤＨＦＲ−（ＲＥ）３を利用できるどうかを確かめるために、２種類のプラスミドを調製した。プラスミドは、野生型および変異型のＤＨＦＲ−（ＲＥ）３融合タンパク質をコードするもので、コードされるｍＲＮＡと翻訳されるタンパク質を、図３Ａに示した［野生型，ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３；変異型，ｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３］。
それぞれのプラスミドは、タンデムにつながった３つのＲＥペプチド［（ＲＥ）３］を有するＤＨＦＲをコードする配列、ならびにタンデムにつながった３つのＴａｔアプタマー（Ａｐｔ）３の配列を含んでいる。ｐＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３に由来する変異型タンパク質［ＭｕＤＨＦＲ−（ＲＥ）３］は、ＤＨＦＲの活性部位でＡｓｐ２７からＡｌａ２７、および、Ｐｈｅ３１からＡｌａ３１というアミノ酸置換を２箇所に有している点で、ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３に由来する野生型のタンパク質［ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３］と異なる。これらの変異により、メトトレキセート（ＭＴＸ）への結合能が喪失する（Ｂｌａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．他Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ．１９１−２５３．Ｔａｉｒａ，Ｋ．他  Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９８７，１２，２７５−２７８．Ｔａｉｒａ，Ｋ．他  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８８，３１，１２９−１３７．Ｉｗａｋｕｒａ，Ｍ，他  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，１１７，４８０−４８８．Ｆｕｊｉｔａ，Ｓ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４，３９１−３９６．Ｈａｍａｄａ，Ｍ．他  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，１２３，６８４−６９２．）。第二の対照として、野生型のＤＨＦＲ−（ＲＥ）３融合タンパク質をコードし、アプタマー配列をコードしないプラスミド（ｐＤＨＦＲ−（ＲＥ）３）を調製した。この翻訳産物であるＤＨＦＲ−（ＲＥ）３は、そのｍＲＮＡと相互作用できない（図３Ａ、右）。
遺伝子型と表現型の連結のために、（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３間の相互作用を利用できる場合には、野生型の系（図３Ａ、左）においてのみ、翻訳後にその反応液をＭＴＸ−アガロースビーズと混合すると、タンパク質（ＤＨＦＲ）とそのｍＲＮＡの両方が、ＭＴＸ−アガロースビーズに結合して回収されるはずである。対照的に、変異体の系（図３Ａ、真中）では、変異型ＤＨＦＲは、ＭＴＸに結合できないように設計されているために、ＭＴＸ−アガロースビーズへ結合させてもタンパク質（ＤＨＦＲ）とそのｍＲＮＡは何れも回収されないはずである。また、第２の対照の系（図３Ａ、右）では、（Ａｐｔ）３アプタマーがないために、ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３は、そのｍＲＮＡと相互作用できないので、ＭＴＸアガロースビーズへ結合させた場合、タンパク質（ＤＨＦＲ）だけが回収され、ｍＲＮＡは回収されないはずである。
Ｔ７ポリメラーゼを用いてそれぞれのプラスミドから、３２Ｐで標識した３種のキャップ化ｍＲＮＡを調製し、それらを鋳型として用いて、ウサギ網状赤血球細胞溶解液中で各タンパク質に翻訳させた。翻訳の際、各タンパク質は、３５Ｓ−メチオニンで標識した。翻訳後、適切な結合緩衝液とＭＴＸ−アガロースビーズを、各細胞溶解液に添加して、４℃で３０分間結合反応を進行させた（この場合低温で行うのは、細胞溶解液中のＲＮａｓｅによりｍＲＮＡの分解率を減らすためである）。結合していないｍＲＮＡとタンパク質を含む、結合溶液の上清を除いて、ＭＴＸ−アガロースビーズを結合緩衝液で二回洗浄した。溶出緩衝液中で加熱（９５℃）してビーズから溶出させた産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。翻訳後の各細胞溶解液を調べることにより、翻訳されたタンパク質と投入したｍＲＮＡの量は、どの場合でも一致する（図３Ｂ、レーン１〜３）ことを確認した。
溶出した産物の分析は、予測どおり、ＤＨＦＲは野生型および対照の系（図３Ｂ、レーン４および６）で検出され、変異型タンパク質はほとんど検出されなかった（図３Ｂ、レーン５）。野生型ＤＨＦＲおよび対照ＤＨＦＲの回収率は、それぞれ、変異型ＤＨＦＲの回収率の９倍および１６倍高かった（図３Ｃ、左）。さらに、ＭＴＸとの結合後はＭＴＸビーズは幾分か正電荷を帯びているので、本実験においては、ｍＲＮＡのＭＴＸビーズへの非特異的結合を完全に防ぐことはできなかったが（図３Ｂ、レーン５と６）、野生型の系でのみ、ｍＲＮＡが検出された（図３Ｂ、レーン４）。野生型のｍＲＮＡの収量は、バックグランド（つまり、非特異的に結合した変異ｍＲＮＡおよび対照ｍＲＮＡ）の量に対して２．５倍高いだけであった（図３Ｃ、右図）。バンドを定量すると、タンパク質とｍＲＮＡの量がバックグラウンドのレベルをかなり上回っていることが明らかになった。これらの結果は、図３Ａに模式的に示した相互作用の有効性を実証するものである。
（Ｂ−３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのストレプトアビジンに結合したｍＲＮＡの選択
標的タンパク質の選択において、（Ａｐｔ）３とＤＨＦＲ−（ＲＥ）３が適切に機能するならば、識別可能な２種のｍＲＮＡを同時に翻訳した場合、それぞれのタンパク質は、そのｍＲＮＡと特異的に結合するはずである。ＭＴＸアガロースビーズは、正電荷を帯びており、関係のないｍＲＮＡの非特異的結合を完全に排除できないため（図３Ｂおよび図３Ｃ）、代わりに、ビオチン−アガロースビーズを試した。陽性対照としては、ｐＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３プラスミド内のＤＨＦＲの遺伝子をストレプトアビジンの遺伝子で置換した新しいプラスミド、ｐＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３を構築した（ＲＥおよびＣＱは共にＴａｔ−由来ペプチドであり、同じ機能を有する）（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｒ．他  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２０００，５，３７１−３８８．）。この系（図４）では、ｐＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３とｐＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３に由来するｍＲＮＡの混合物を最初に用いて行った場合、ＤＨＦＲではなく、翻訳されたストレプトアビジンがビオチン−アガロースビーズに結合するはずである（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｍ．他  Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９７５，２９，８５−１３３）。
ｐＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３とｐＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３から、Ｔ７ポリメラーゼを用いて、２種類の３２Ｐで標識したキャップ化ｍＲＮＡを調製した。転写されたｍＲＮＡを細胞溶解液中で別々に翻訳し（図４Ｂ、レーン１と２）、あるいは１：１の比率で混合したものを翻訳して（図４Ｂ、レーン３）、それぞれのｍＲＮＡをビオチン−アガロースビーズで選択した。この工程は、図３に示した実験で用いた工程と基本的に同様であり、翻訳後に適切な結合緩衝液とビオチン−アガロースビーズを各細胞溶解液に添加して、４℃で１０分間結合反応を進行させた。その後、結合していないｍＲＮＡとタンパク質を含む結合溶液の上清を除いて、ビオチン−アガロースビーズを結合緩衝液で二回洗浄した。高温（９５℃）で溶出緩衝液によりビーズから結合産物を溶出し、選択されたｍＲＮＡを同定するために、４％変性ＰＡＧＥにより分析した（図４Ｂ）。
ビオチンビーズに結合した各ｍＲＮＡを定量すると、結合したストレプトアビジンをコードするｍＲＮＡ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡ）の収量が、ＤＨＦＲをコードするｍＲＮＡ（ＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡ；レーン１と２）の収量よりも３倍高かった。それぞれのｍＲＮＡを１：１で混合した群からビオチンビーズに結合したｍＲＮＡを単離した場合、ｐＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡが選択された（レーン３）。この結果は、その強いＲＮＡ−タンパク質間の相互作用が、機能性タンパク質の選択に有効であることを実証する。
（Ｂ−４）機能性タンパク質の選択における、リボゾームディスプレイ系と（ＲＥ）３と（Ａｐｔ）３との強い相互作用の組み合わせ
ＲＮＡ−タンパク質間の強い相互作用を用いて、機能的ストレプトアビジンが選択できたので（図４）、リボゾームディスプレイ系と組み合わせることにより、さらに改良できないかを検討した。リボゾームディスプレイ系では、終止コドンの欠損により複合体からのタンパク質の遊離が遅れるので（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４，４９３７−４９４２．Ｈｅ，Ｍ．他  Ｎｕｃｌｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５，５１３２−５１３４．）、リボゾームは、翻訳したタンパク質、およびそのそれぞれのｍＲＮＡと比較的安定な複合体を形成する。本発明の系で終止コドンの削除の影響を調べるために、終止コドンが欠損したＤＨＦＲ  ｍＲＮＡ（ＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ，図５Ａの右図）を調製した。対照として、終止コドンを有するＤＨＦＲ  ｍＲＮＡ（ＤＨＦＲ＋Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ，図５Ａの中図）を用いた。
細胞溶解液中で翻訳して選択した後、ＭＴＸ−ビーズに結合したｍＲＮＡの量を３種のｍＲＮＡ（即ち、ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３、ＤＨＦＲ＋Ｓｔｏｐ、およびＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ）について比較した。翻訳の際に、終止コドンを有するＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡは、（ＲＥ）３と（Ａｐｔ）３間の相互作用により、翻訳されたＤＨＦＲタンパク質と結合する。また、終止コドンが存在するのでリボゾームはｍＲＮＡから遊離するため、このタンパク質−ｍＲＮＡ複合体には、リボゾームは関与していない。これら３種のｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球細胞溶解液中で翻訳し、図３に記載したのと同じ条件下でＭＴＸ−アガロースビーズに露出した。選択されたｍＲＮＡの相対量は、３２Ｐで標識したＲＴ−ＰＣＲ産物と、元の結合したｍＲＮＡのカウントから検出した（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ＰＣＲ産物の分析（図５Ｂ）は一度しか行わなかったので、図５Ｃに示したｍＲＮＡのレベルの定量の方が信頼性が高い。図５Ｃに示した結果は、４回の独立して行った実験の平均である。平均すると、ＤＨＦＲ＋Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ（図５Ｃ、レーン２）のバックグランドのレベルより、選択されたＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡ（図５Ｃ、レーン１）は２．５倍高濃度であり、一方、ＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡの濃度は１．４倍であった（図５Ｃ、レーン３）。従って、この系では、各ｍＲＮＡとその産物との複合体の安定性においては、（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３相互作用が、終止コドンの削除より効果的であった。
リボゾームディスプレイ法は、機能性抗体を各々の抗原に対して選択する場合には、かなり有効に機能する（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．他  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１８，１２８７−１２９２．）。しかし、今回の結果（図５Ｃ）は、終止コドンの削除により形成するリボゾーム−ｍＲＮＡ−タンパク質複合体の安定性は、ＤＨＦＲのような一般的なタンパク質の選択には十分でないことを示唆する。リボゾームディスプレイ系において適切な抗体を短時間に選択するには、抗体とその抗原とのかなり強い相互作用が必要なのかもしれない。
（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３相互作用と、リボゾームディスプレイ系を組み合わせることは、各ｍＲＮＡとその産物の複合体の安定性を向上させるのに有利である。この目的のために、（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３領域がＤＨＦＲの遺伝子の上流に位置する別のプラスミドを調製した（図６）。さらに、終止コドンの削除により複合体をさらに安定化させるために、終結因子である大腸菌のＲＦ１、ＲＦ２、およびＲＦ３に対するポリクローナルＩｇＧ抗体を調製した（Ｍｏｆｆａｔ，Ｊ．Ｇ．他Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  １９９１，７３，１１１３−１１２０．）。（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３領域にある終止コドンが３’末端にくることを避けるために、（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３領域を５’末端に設定したので、本発明では、各ｍＲＮＡの翻訳を（Ａｐｔ）３と（ＲＥ）３の間にＳＤ配列を配置することにより、大腸菌Ｓ３０抽出液中で行った。
終結因子に対するポリクローナルＩｇＧ抗体の存在下（図６のレーン１と３）、および非存在下（図６のレーン２と４）で、ＭＴＸ−ビーズに結合したｍＲＮＡの量を、２種のｍＲＮＡ、つまりＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ（図６のレーン１と２）および（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３ＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ（図６のレーン３と４）について比較した。翻訳されたｍＲＮＡは、図３に記載したのと同じ条件で、ＭＴＸ−アガロース−ビーズの選択に供した。選択されたｍＲＮＡの相対量は、ＲＴ−ＰＣＲ（図６Ｂおよび図６Ｃ）により検出した。図６Ｃに示した結果は、独立して行った２回の実験の平均である。これらの結果は、（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３相互作用とリボゾームディスプレイ系の組み合わせが、特に終結因子に対するポリクローナルＩｇＧ抗体の存在下では、ｍＲＮＡ−リボゾーム複合体の安定化に有効であることを実証する。
（Ｂ−５）ＲＮＡ−タンパク質ネットワークの存在の可能性
上記した実験結果から、アプタマー／ペプチド間の強い相互作用がリボソームディスプレイ複合体を安定化させ、この種の相互作用が機能性タンパク質の選択に有用であることが実証された。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの結果から見て（図２）、タンパク質の選択の効率はそれほど高くはないことが予想される。即ち、図７Ａの上の図に示すようなＲＮＡ−タンパク質ネットワークの形成により、ライブラリーからのタンパク質の選択は困難になる可能性がある。この問題は、図７Ａの下の図に示すようなアプタマーとペプチドの異なる組み合わせを使用することにより解消することができる。
［実施例２］
Ａ．材料と方法
（Ａ−１）Ｒｉｃｉｎ−Ａ鎖がｆｕｓｉｏｎしたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びストレプトアビジン（ＳｔＡｖ）発現ベクターの構築
ＰＴＺＤＨＦＲ２０由来のＤＨＦＲ遺伝子をｐＥＴ３０ａのマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＤＨＦＲを構築した。さらにｐＣＡＮＴＡＢＥ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来のｇｅｎｅＩＩＩ（ｇｅｎｅＩＩＩ配列については、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９７  Ｍａｙ  １３；９４（１０）：４９３７−４２）配列のうち、１−４０４番目までのアミノ酸（ｌｏｎｇ  ｓｐａｃｅｒ）と１９５−３１５番目までを含むアミノ酸（ｓｈｏｒｔ  ｓｐａｃｅｒ）をコードする２種類の配列を下記のプライマーで増幅し、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＰｓｔＩで切断し、それぞれＤＨＦＲ遺伝子の下流のＰｓｔ  Ｉ部位に挿入した。用いたプライマーはｌｏｎｇ  ｓｐａｃｅｒ  ｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＣ−３’（配列番号１１），ｌｏｎｇ  ｓｐａｃｅｒ  ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＧＴＴＡＧ−３’（配列番号１２），ｓｈｏｒｔ  ｓｐａｃｅｒ  ｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１３），ｓｈｏｒｔ  ｓｐａｃｅｒ  ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＡＡ−３’（配列番号１４）。次にｌｉｎｋｅｒとしてｇｅｎｅＩＩＩ配列の２１２−２５８番目のグリシン及びセリンをコードする配列を下記のプライマーで増幅し、ＳｃａＩ及びＥｃｏＲＶで切断し、ＤＨＦＲ遺伝子とｓｐａｃｅｒの間のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。このリンカーの上流には新たにＮｈｅＩサイトが、下流にはＮｃｏＩサイトが挿入された。用いたプライマーはｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＣＧ−３’（配列番号１５），ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＣＣＧ−３’（配列番号１６）。次にｐＵＴＡ（Ｔｅｘａｓ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｏｆ．Ｒｐｂｅｒｔｕｓ  Ｊ．）由来のリシンＡ鎖をコードする配列を下記のプライマーで増幅し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶで切断し、ＤＨＦＲ遺伝子とｓｐａｃｅｒの間のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶに挿入した。用いたプライマーはｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＡＴ−３’（配列番号１７），ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＣＧ−３’（配列番号１８）。リシンを不活性化するような変異（Ｇｌｕ−１７７，Ａｒｇ−１８０，Ｇｌｕ−２０８をＧｌｎ−１７７，Ｈｉｓ−１８０，Ａｓｐ��２０８）を加えたものも同様に挿入した（ｐＤＬＲＳ，ｐＤＬＲＬ）。最後にＤＨＦＲをＧＳＴ及びＳｔＡｖに置換するために、ｐＧＥＸ−４ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来のＧＳＴ遺伝子及びｐＧＳＨ由来のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ遺伝子を増幅し、ＸｂａＩ及びＮｈｅＩサイトで切断し、プラスミドのＸｂａＩ及びＮｈｅＩサイトに挿入した（ｐＧＬＲＳ，ｐＧＬｍＲＳ，ｐＳＬＲＳ，ｐＳＬＲＬ，ｐＳＬｍＲＳ）。用いたプライマーはＧＳＴ用として、ｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧ（配列番号１９）、ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  ＧＣ（配列番号２０）、ＳｔＡｖ用として、ｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＣ−３’（配列番号２１），ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＧＣＡ−３’（配列番号２２）。
ｐＳＬＲＬ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｒｉｃｉｎ−ＧｅｎｅＩＩＩ（ｌｏｎｇ））のＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示し、ｐＳＬＲＳ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｒｉｃｉｎ−ＧｅｎｅＩＩＩ（Ｓｈｏｒｔ））のＤＮＡ配列を配列表の配列番号２に示す。
配列番号１の塩基配列の構成は以下の通りである。
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ；５０７６−８１５５
Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；４９８７−５００４
ｌａｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒ；５００７−５０３０
ＳＤ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；５０６１−５０６７
Ｓｔｅｐｔａｃｉｄｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；５１２１−５６００
Ｌｉｎｋｅｒ；５６０１−５７６８
Ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ；５７６９−６５７２
Ｓｐａｃｅｒ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＧｅｎｅＩＩＩ（Ｌ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；６５７３−７８５６
配列番号２の塩基配列の構成は以下の通りである。
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ；５０７６−７００７
Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；４９８７−５００４
ｌａｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒ；５００７−５０３０
ＳＤ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；５０６１−５０６７
Ｓｔｅｐｔａｃｉｄｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；５１２１−５６００
Ｌｉｎｋｅｒ；５６０１−５７６８
Ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ；５７６９−６５７２
Ｓｐａｃｅｒ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＧｅｎｅＩＩＩ（Ｓ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；６５７３−７００７
（Ａ−２）Ｂｉｏｔｉｎアフィニティカラム及びＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅアフィニティーカラムによるｍＲＮＡの結合及び選択
各プラスミド（ｐＤＬＲＳ，ｐＤＬＲＬ，ｐＳＬＲＳ，ｐＳＬＲＬ，ｐＳＬｍＲＳ，ｐＧＬＲＳ，ｐＧＬｍＲＳ）はＸｈｏＩで切断された後、Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ存在下でＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＴ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒより転写された。場合によってはα３２Ｐ−ＣＴＰによってアイソトープ標識した。これらのｍＲＮＡはＲａｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて翻訳した。反応は２５μｌのスケールでＲＮＡ、１μｇを翻訳した。溶液の組成は添付のプロトコルに従った。３０℃で１０分間インキュペーションし、反応溶液２０μｌにＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ストレプトアビジンの選択の場合、５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．９），３００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，２％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（Ｙｕｋｉｚｉｒｕｓｈｉ）；ＧＳＴの選択の場合、ｐＨ７．４，１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ａｎｄ  １％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を８０μｌ加え、あらかじめＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで数回洗浄したＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を１０μｌ加えた。場合によっては、結合及び洗浄のステップの後に結合しているＲＮＡの量をアイソトープのカウントにより定量した。室温で１０分間インキュペーションした後、上澄みを取り除き、２００μｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。その後、結合しているＲＮＡを回収するために１００μｌのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ストレプトアビジンの選択の場合、５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．９），３００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，２％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ，３Ｍ  Ｇｕａｎｉｓｉｎｅ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；ＧＳＴの選択の場合、ｐＨ７．４，１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ａｎｄ  １％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，３Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ２５０ｍＭＥＤＴＡ）を加え、室温で１０分激しく撹拌し、遠心して、上澄みを回収した。この操作を２回繰り返した。回収したＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。精製したＲＮＡはＲｉｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルに従って５μＭのｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒで逆転写され、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）によってＰＣＲを行った。ｕｐ及びｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒは１μＭ加えた。用いたプライマーはｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ−３’（配列番号２３），ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣ−３’（配列番号２４）。
Ｂ．結果と考察
（Ｂ−１）リシンＡ鎖がフュージョンしたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びストレプトアビジン（ＳｔＡｖ）発現ベクターの構築
ＤＨＦＲ、ＧＳＴ、ＳｔＡｖタンパク質はその性質がよく研究されているタンパク質である。ＤＨＦＲはＳｔＡｖとＢｉｏｔｉｎの結合のｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとして用いるために挿入された。ＬｉｎｋｅｒはＤＨＦＲ、ＧＳＴ及びＳｔＡｖとリシンが立体障害により、ｆｏｌｄｉｎｇが阻害されるのを避けるために導入した。この配列はＧｅｎｅＩＩＩ遺伝子上にコードする配列でグリシン及びセリンを多くコードする。リシンはリボソームを不活性化させるドメインであるＡ鎖のみを導入した。変異リシンは２８Ｓ  ｒＲＮＡに存在するα−サリシン部位のＮ−グルコシド結合を加水分解する活性が完全に失われている。リシンの下流にはＧｅｎｅＩＩＩ遺伝子により挿入した配列がＳｐａｃｅｒとして挿入された。これはリボソームによるタンパク質の翻訳が終了する前にリシンがリボソームをｃｉｓで攻撃できるようにするためである。ｌｏｎｇ及びｓｈｏｒｔの２種類のＳｐａｃｅｒを挿入したプラスミドを構築した（図９Ａ）。
（Ｂ−２）リシンＡ鎖による翻訳阻害
リシンＡ鎖が活性を持ち、リボソームの翻訳活性を阻害し、リボソームを停止させることが出来るかどうか確かめるために、上記にて構築したプラスミド（ｐＳＬｍＲＳ，ｐＳＬＲＳ，ｐＳＬｍＲＬ，ｐＳＬＲＬ）をテンプレートとして転写、翻訳を行った。まずプラスミドのＳｐａｃｅｒ配列の下流にあるＸｈｏＩサイトで切断し、直鎖状のｄｓＤＮＡにし、Ｔ７ポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを転写した。Ｌｙｓａｔｅ中で翻訳できるように５’末端にキャップを導入した。４種類のｍＲＮＡをそれぞれ適切な条件下で翻訳し、生成したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した（図９のＢ及びＣ）。その結果、リシン配列に変異を加えた、活性のないリシンを融合したタンパク質の発現量が野生型のリシンを融合したタンパク質の発現量より多かった（ＳＬｍＲＳ，ＳＬｍＲＬ）。これはリシンがリボソームを阻害したため、タンパク質の翻訳量が少なくなっていると考えられる。よって本発明者が構築したリシン融合タンパク質はリボソームを停止させる活性を持っていることが間接的に確認された。また、Ｓｐａｃｅｒの配列が長くなるとタンパク質の発現が少なくなる事が分かった。
（Ｂ−３）ＢｉｏｔｉｎアフィニティカラムによるｍＲＮＡの結合
ｐＤＬＲＳ，ｐＳＬＲＳ，ｐＳＬｍＲＳを上記と同様に、Ｓｐａｃｅｒ配列の下流にあるＸｈｏＩサイトで切断し、直鎖上のｄｓＤＮＡにし、Ｔ７ポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを転写した。Ｌｙｓａｔｅ中で翻訳できるように５’末端にキャップを導入し、またＲＮＡの定量のためにα−ＣＴＰでボディーラベルした。３種類のｍＲＮＡをそれぞれ適切な条件下で翻訳し、Ｂｉｏｔｉｎが結合したアガロース（Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ）と結合させた。数回Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅの洗浄を繰り返し、結合していないｍＲＮＡを取り除いた。また結合、及び洗浄のステップにおいてＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅと結合したｍＲＮＡを定量した。ＢｉｏｔｉｎはＳｔＡｖと高い親和性を持つ。
ＤＬＲＳ  ｍＲＮＡが翻訳された場合、リシンがリボソームを停止させ、タンパク質−ｍＲＮＡ複合体が形成されるが、ＤＨＦＲはＢｉｏｔｉｎと結合しないため、ｍＲＮＡがほとんどＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合しないと考えられる（図１０Ｂの左）。その一方でＳＬＲＳ  ｍＲＮＡはＳｔＡｖがＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合し、ｍＲＮＡが回収されると期待される（図１０Ｂの真中）。ＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡは活性を持たないリシンが挿入されているため、ＳｔＡｖはＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合するが、ｍＲＮＡ上のＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）の末端に終止コドンが入っているため、ｍＲＮＡとタンパク質が複合体を形成しにくくなると考えられる（図１０Ｂの右）。もし上記で述べたようにＳＬＲＳ  ｍＲＮＡのみが選択的に回収されるなら、本発明のシステムはタンパク質の選択に非常に有効であると考えられる。
洗浄を繰り返し、非特異的にアガロースに結合しているｍＲＮＡを取り除いていくと、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡが選択的に結合した（図１０Ｃ）。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡの３０％がビオチンアガロースに結合し、回収された。これは従来より行われているリボソームディスプレイによるｍＲＮＡの回収率の０．０１５％の２０００倍の効率であり、ランダムプールの多様性を確保するために大きな利点があると考えられる。その一方で、ＤＬＲＳ  ｍＲＮＡ及びＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡは０．３％以下しか結合しなかった。さらにリシンを不活性化するとｍＲＮＡの回収効率がＤＬＲＳ  ｍＲＮＡの場合と同じレベルまで落ちることから、リシンがリボソームを停止させることでタンパク質−ｍＲＮＡ複合体をより安定にしていると考えられる。またＬｙｓａｔｅを用いているため大腸菌の系に比べてＲＮＡの分解が少ないのかもしれない。また３回の洗浄によってＳＬＲＳ  ｍＲＮＡはＤＬＲＳ  ｍＲＮＡ及びＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡに対して１００倍以上濃縮される（図１０Ｃ）。これはリボソームディスプレイの濃縮効率と同等の濃縮効率である。即ち、本発明のシステムはリボソームディスプレイ法と比べて同等以上の効率でタンパク質を選択できる系であることを示唆している。
さらに異なる選択モデルについても検証した。上記にて構築したプラスミド（ｐＧＬＲＳ，ｐＳＬＲＳ，ｐＳＬｍＲＳ）より転写して得られたＧＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡを用いて上記と同様の手法に従って翻訳しその産物をそれぞれＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合させた（図１１）。もしタンパク質の選択システムが正しく働いているならばＳＬＲＳ  ｍＲＮＡのみがＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合すると考えられる（図１１Ａ真中）。又、（ｐＳＬＲＳ，ｐＧＬＲＳ，ｐＧＬｍＲＳ）より転写して得られたＳＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＧＬｍＲＳ  ｍＲＮＡを用いて上記と同様の手法に従って翻訳し、その産物をそれぞれＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた（図１２）。この場合は、ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡのみがＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合すると考えられる（図１２Ａの真中）。洗浄を繰り返し、非特異的に結合しているｍＲＮＡを取り除いていくと、それぞれＳＬＲＳ  ｍＲＮＡとＧＬＲＳ  ｍＲＮＡが選択的に結合していることが分かる（図１１Ｂ及び図１２Ｂ）。それぞれの場合に置いて、ｍＲＮＡの回収率は５．１％（Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ）及び１．３％（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）だった。濃縮効率はそれぞれ＞２５倍、＞６倍だった。よってこれらの結果からも本発明のシステムはリボソームディスプレイ法と比べて同等以上の効率でタンパク質を選択できることが示唆され、また様々なタンパク質に応用できるという可能性が示唆された。
（Ｂ−４）Ｂｉｏｔｉｎアフィニティカラムによるタンパク質のＳｅｌｅｃｔｉｏｎ
前記したように４種類のプラスミド（ｐＳＬＲＬ，ｐＤＬＲＬ，ｐＳＬＲＳ，ｐＤＬＲＳ）より４種類のｍＲＮＡ（ＳＬＲＬ  ｍＲＮＡ，ＤＬＲＬ  ｍＲＮＡ，ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＤＬＲＳ  ｍＲＮＡ）を転写した。ＳＬＲＬ  ｍＲＮＡ，ＤＬＲＬ  ｍＲＮＡではリシンの下流に、より長いｓｐａｃｅｒを挿入した。これらのｍＲＮＡをそれぞれ適切な条件下で翻訳し、Ｂｉｏｔｉｎが結合したアガロースと結合させた（図１３のＡ）。またＳＬＲＬ  ｍＲＮＡとＤＬＲＬ  ｍＲＮＡ、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡとＤＬＲＳ  ｍＲＮＡをそれぞれ１：１の量で混合し（各０．５μｇ）これらも同様に適切な条件下で翻訳し、Ｂｉｏｔｉｎが結合したアガロースと結合させた。３回アガロースを洗浄した後、ｍＲＮＡをＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒによって分離した。このｍＲＮＡを精製し、逆転写、ＰＣＲによって増幅した。その結果、ＳｔＡｖをコードするｃＤＮＡが１５ｃｙｃｌｅのＰＣＲで選択的に増幅した（図１３のＢ）。ＤＨＦＲをコードするｃＤＮＡはＰＣＲを２５ｃｙｃｌｅ行っても増幅が見られなかった。また１：１で混合した場合においてもＳｔＡｖをコードするｃＤＮＡが選択的に増幅した。即ち、本発明のシステムにおいてＳｔＡｖタンパク質が正常に選択され、その遺伝子が回収されていることが示唆される。またタンパク質とｐｈｅｎｏｔｙｐｅに相当するｇｅｎｏｔｙｐｅのｍＲＮＡが正しく結合していることを示している。興味のある点として、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡの方がＳＬＲＬ  ｍＲＮＡに比べて効率よくアガロースに結合している。
コントロールとしてそれぞれのｍＲＮＡを一定量（０．０２５μｇ）逆転写、ＰＣＲした。またＳＬＲＬ  ｍＲＮＡとＤＬＲＬ  ｍＲＮＡ、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡとＤＬＲＳ  ｍＲＮＡをそれぞれ１：１の量で混合し（各０．０１２５μｇ）同様に逆転写、ＰＣＲした。これによってｃＤＮＡの増幅が濃度に依存していることが確かめられた。またｍＲＮＡを逆転写せずにＰＣＲのみを行った場合ｃＤＮＡは増幅しなかったため、ＤＮＡのＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎはないことが確かめられた。
また同様の選択の手法に従ってＧＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡをそれぞれ１：１の量で混合したプールを適切な条件下で翻訳し、Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ又はＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合させた。Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合させた場合、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡが選択され（図１４Ａ）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた場合、ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡが選択されると考えられる（図１４Ｂ）。コントロールとしてＳＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡ，ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡをそれぞれ転写してＢｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合させ（図１４Ａ）、又、ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＧＬｍＲＳ  ｍＲＮＡ，ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡをそれぞれ転写してＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた（図１４Ｂ）。３回アガロースを洗浄した後、ｍＲＮＡをＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒによって分離した。このｍＲＮＡを精製し、逆転写、ＰＣＲによって増幅した。その結果、１：１で混合したＧＬＲＳ  ｍＲＮＡ，ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡのプールを用いて翻訳し、Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅに結合させた場合ＳｔＡｖをコードするｃＤＮＡがＰＣＲで選択的に増幅し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた場合、ＧＳＴをコードするｃＤＮＡがＰＣＲで選択的に増幅した。よってこの結果からもタンパク質とｐｈｅｎｏｔｙｐｅに相当するｇｅｎｏｔｙｐｅのｍＲＮＡが正しく結合していることを示された。
［実施例３］
リボソームディスプレイシステムの一般的な適用可能性を評価するために、本発明者はリボソーム−ｍＲＮＡ複合体の安定性を、停止コドンの存在下および非存在下、さらにはリボソーム−ｍＲＮＡ複合体の内部における翻訳されたペプチドとそのｍＲＮＡとの間の追加的な相互作用の存在下および非存在下で検討した。
本発明者が利用した追加的な相互作用は、直列式に融合したＭＳ２コートタンパク質（ＭＳｐ）二量体と、それに対応する特異的結合モチーフのＲＮＡ配列（Ｃバリアント（またはＣｖ）と命名）との間の相互作用である。
具体的には、図１６に示す構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写・翻訳し、これにより形成された複合体をＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて選択した。
その結果、ｍＭＳｐ−Ｃｖ相互作用を追加的に導入することにより、システムの効率が改善され（図１８）、選択後のｍＲＮＡの回収率は、３回の反復洗浄後で０．４６％であり、ｍＭＳｐ−Ｃｖ相互作用のない場合の回収率０．２４％に比べて明らかに優位であった。本発明者は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価される、ヒスチジンタグをコードするｍＲＮＡの量とヒスチジンタグをコードしないｍＲＮＡの量との比として選択性を定義したが、算出された選択性は３（Ｃｖなし）から６（Ｃｖあり）に高まった。したがって、ｍＭＳｐ−Ｃｖ相互作用の導入により、標的ｍＲＮＡの収率だけでなく、ポリソームディスプレイシステムの選択性も改善された。
産業上の利用の可能性
ＴａｔアプタマーとＴａｔ由来ペプチド（ＲＥとＣＱ）に対するリンカーを選択した結果、ＲＮＡとタンパク質との極めて強い相互作用が、ネットワーク構造を避けることにより、遺伝子型と表現型の結合に利用できる可能性が実証された。このような相互作用を利用することにより強いＲＮＡ−タンパク質間相互作用を選択でき、操作できるはずである。さらに、より長い半減期をも有するタンパク質とｍＲＮＡの複合体を生成でき、選択がかなり容易になる。リボゾームディスプレイ系などの他の手法は、リボゾーム−ｍＲＮＡ複合体の天然の半減期を変えることは困難である。
さらに、本発明の手法は、単に融合遺伝子から終止コドンを削除することによってリボゾームディスプレイ系と組み合わせることができる。その結果、図６のレーン３に示したように、２つの部位で結合する結果として、有意により安定なタンパク質−ｍＲＮＡ複合体が得られる。
また、本発明の選択手法は操作が単純で直接的であるという利点を有する。
リシン遺伝子をＳｔＡｖ遺伝子の下流に接続することでリシンによりリボソームを停止させ、効率よくｇｅｎｏｔｙｐｅとｐｈｅｎｏｔｙｐｅを結合させることが本発明により実証された。これによって極めて高い効率で目的のｍＲＮＡを選択することができる。リシン遺伝子の下流にあるｓｐａｃｅｒ配列はｌｏｎｇ及びｓｈｏｒｔの２種類構築したが、短いｓｐａｃｅｒ配列を挿入したほうが効率よくｍＲＮＡが回収されることがわかった。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡの場合、回収効率は３０％でこれは従来にないほどの高回収率だった。またこの選択システムによってＳＬＲＳ  ｍＲＮＡはＤＬＲＳ  ｍＲＮＡに対して１００倍以上濃縮されることが示された。
上記した本発明のシステムを用いることによりランダムＤＮＡプールより新規機能タンパク質を効率よくスクリーニングすることが可能である。
【配列表】
0004106441.tif 000002
0004106441.tif 000003
0004106441.tif 000004
0004106441.tif 000005
0004106441.tif 000006
0004106441.tif 000007
0004106441.tif 000008
0004106441.tif 000009
0004106441.tif 000010
0004106441.tif 000011
0004106441.tif 000012
0004106441.tif 000013
0004106441.tif 000014
0004106441.tif 000015
0004106441.tif 000016
0004106441.tif 000017
0004106441.tif 000018
0004106441.tif 000019
0004106441.tif 000020
0004106441.tif 000021
0004106441.tif 000022
0004106441.tif 000023
【図面の簡単な説明】
図１は、精製したＤＨＦＲ−（ＲＥ）１−３融合タンパク質および野生型（ｗｔ）ＤＨＦＲを示す模式図とＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルの写真である。精製した組換え型タンパク質（約１００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色して可視化した。
レーン１、マーカー；
レーン２、野生型ＤＨＦＲ；
レーン３、ＤＨＦＲ−（ＲＥ）１；
レーン４、ＤＨＦＲ−（ＲＥ）２；
レーン５、ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３
左側にマーカータンパク質の分子量を示す。ＤＨＦＲと一つ目のＲＥペプチドの間と、ＲＥと隣接するＲＥペプチドの間に、ポリグリシンリンカーを挿入した。精製のためにポリヒスチジン（Ｈｉｓ）をＤＨＦＲのＮ末端に連結した。
図２は、解離定数（Ｋｄ）の測定の結果を示す図および写真である。それぞれのレーンＣには、アプタマーのみをロードした。黒い矢印は、タンパク質−ＲＮＡ複合体を示し、白い矢印は遊離のＲＮＡを指す。複合体と遊離のＲＮＡの相対量は、３２Ｐの放射能から計算した。平衡解離定数は、ペプチドの濃度に対する遊離のＲＮＡまたは複合体のＲＮＡの濃度から最小二乗法により求めた理論曲線から決定した。ひし形は、遊離のＲＮＡの相対量を示し、四角形は複合体の相対量を示す。各パネルにおいて、細長い黒い三角形は、タンパク質の濃度の上昇を示している。
（Ａ）（Ａｐｔ）１−３と野生型ＤＨＦＲとの相互作用の欠如を示す写真である。それぞれのレーンＣには１ｎＭの（Ａｐｔ）１−３をロードし、細長い三角形で示すように、２０、１００、５００ｎＭの野生型ＤＨＦＲを加えた。
（Ｂ）（Ａｐｔ）１とＤＨＦＲ−（ＲＥ）１の結合を示す図および写真である。３０ｐＭの（Ａｐｔ）１（レーンＣ）に、細長い三角形で示すとおり、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６、３２ｎＭのＤＨＦＲ−（ＲＥ）１を混合した。
（ＣおよびＤ）（Ａｐｔ）２−３とＤＨＦＲ−（ＲＥ）２−３タンパク質の結合を示す図および写真である。３０ｐＭの（Ａｐｔ）２または（Ａｐｔ）３ＲＮＡ（レーンＣ）に、細長い三角形で示すように、０．０３、０．０６、０．１２、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６ｎＭのタンパク質を混合した。
図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける（Ａｐｔ）３と（ＲＥ）３との相互作用を用いる機能性タンパク質の選択のモデルを示す図および写真である。
（Ａ）転写されたＲＮＡと翻訳されたタンパク質とメトトレキセート結合アガロースビーズ（ＭＴＸリガンド）との相互作用の模式図である。
（Ｂ）ＭＴＸ−ビーズによるＤＨＦＲ−（ＲＥ）３タンパク質およびｍＲＮＡ（野生型）の濃縮を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の写真である。各サンプルは、１５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。レーン１〜３、それぞれの翻訳反応の後、１μｌの細胞溶解液をロードした。レーン４〜６、ＭＴＸ−ビーズに結合したｍＲＮＡおよびタンパク質を含む溶出液を１０μｌロードした。レーン１と４は野生型タンパク質を示す；レーン２および５は変異型タンパク質を示す；そしてレーン３と６には対照サンプルをロードした。
（Ｃ）（Ｂ）に示したタンパク質とｍＲＮＡの定量結果を示す図である。
図４は、ストレプトアビジンとＤＨＦＲ  ｍＲＮＡの混合物のプールからのストレプトアビジンをコードするｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択を示す図および写真である。
（Ａ）転写されたＲＮＡと翻訳されたタンパク質とビオチン結合アガロースビーズ（ビオチンリガンド）との相互作用の模式図である。
（Ｂ）ビオチンアガロースビーズによるストレプトアビジン−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡの濃縮を示す変性ＰＡＧＥの結果の写真である。翻訳およびその後の選択の後、各サンプルを４％ゲルにおける変性ＰＡＧＥに供した。
レーン１；単離したストレプトアビジン−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡ。ストレプトアビジンをコードするｍＲＮＡ（１．２５μｇ）を細胞溶解液中で翻訳し、ビオチンビーズで選択した。
レーン２；単離したＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３ｍＤＮＡ。ＤＨＦＲをコードするｍＲＮＡ（１．２５μｇ）を細胞溶解液中で翻訳し、ビオチンビーズで選択した。ＤＨＦＲはビオチンビーズと相互作用しないと予想されるため、結合したＤＨＦＲ−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡのレベルは、非特異的な（バックグランドの）相互作用のレベルを示す。
レーン３；単離したストレプトアビジン−（ＣＱ）３−（Ａｐｔ）３とＤＨＦＲのｍＲＮＡ（上のバンド；ＤＨＦＲ  ｍＲＮＡ、下のバンド；ストレプトアビジン）。ストレプトアビジンまたはＤＨＦＲのそれぞれをコードするｍＲＮＡを１：１の比で混合したものを溶解液中で翻訳し、ビオチンビーズで選択した。
図５は、ウサギ網状赤血球細胞溶解液中の機能性ＤＨＦＲの選択における、（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３とリボゾームディスプレイ系との相互作用の強度の比較を示す図および写真である。
（Ａ）転写されたＲＮＡと翻訳されたタンパク質とメトトレキセート結合アガロースビーズ（ＭＴＸリガンド）との相互作用の模式図である。
（Ｂ）ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３、ＤＨＦＲ−ＳｔｏｐまたはＤＨＦＲ＋Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡのＭＴＸ−ビーズでの濃縮を示すための、ＲＴ−ＰＣＲ産物を２％アガロースで電気泳動した結果を示す写真である。ＰＣＲ反応は、２０サイクル行った。各サンプルを、２％のＳｅａ  Ｋｅｍ  ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ，Ｒｉｃｅｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ  ＵＳＡ）に供した。レーン１、ＤＨＦＲ−（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３ｍＲＮＡからのＰＣＲ産物；レーン２、ＤＨＦＲ＋Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡからのＰＣＲ産物；レーン３、ＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡからのＰＣＲ産物。ＰＣＲ産物の分析を一度行ったが、図５Ｃに示すｍＲＮＡのレベルの定量の方が、より信頼性が高い。
（Ｃ）濃縮されたｍＲＮＡの定量の結果を示す図である。選択されたｍＲＮＡの相対量は、３２Ｐ標識化ｍＲＮＡのカウントにより検出した。それぞれのレーンの番号は、図５Ｂのレーンの番号に相当する。結果は、独立して行った４回の実験の平均である。
図６は、大腸菌Ｓ３０株抽出液中における、（ＲＥ）３−（Ａｐｔ）３の相互作用とリボゾームディスプレイ系とを組み合わせることによる、各ｍＲＮＡとその産物の複合体の安定性の増大を示す図および写真である。
（Ａ）転写されたＲＮＡと翻訳されたタンパク質とメトトレキセート結合アガロースビーズ（ＭＴＸリガンド）との相互作用の模式図である。
（Ｂ）終結因子（大腸菌のＲＦ１、ＲＦ２、およびＲＦ３）に対するポリクローナルＩｇＧ抗体の存在下（レーン１およびレーン３）、または非存在化（レーン２およびレーン４）の、ＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ（レーン１およびレーン２）および（Ａｐｔ）３−（ＲＥ）３−ＤＨＦＲ−Ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ（レーン３およびレーン４）の、ＭＴＸ−ビーズでの濃縮を示すための、ＲＴ−ＰＣＲ産物を２％アガロースで電気泳動した結果を示す写真である。選択されたｍＲＮＡは、図５に記したものと同様の条件で、ＭＴＸ−アガロースビーズに供した。
（Ｃ）（Ｂ）に示したＲＴ−ＰＣＲ産物の定量の結果を示す図である。結果は、独立して行った２回の実験の平均である。
図７Ａは、ＲＮＡ−タンパク質間の結合のネットワーク化の可能性を示す図である。原理的にはタンデムに結合させたＴａｔ（ＲＥ）ペプチドとアプタマーは分子内だけではなく、分子間でも結合する。分子間で結合した場合、ＲＮＡ−タンパク質の結合がネットワーク化してしまう。同じペプチド及びアプタマーをタンデムに連結するのではなく、異なるペプチド及びアプタマーを連結することでこの分子間の相互作用を最小限に抑える事ができる。
図７Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能性タンパク質の選択方法の第１の実施態様の模式図である。結合性タンパク質が生成され、転写、翻訳、親和性選択、そしてＰＣＲという工程を何度も繰り返すことにより濃縮される。翻訳工程において、タンデムアプタマー（Ａｐｔ）３は、タンデムＲＥペプチド（ＲＥ）３と、きわめて高い親和性により結合する。該結合が、タンパク質とそのｍＲＮＡを結合させる。実施例１においては、ＤＨＦＲおよびストレプトアビジンを選択ステップの標的として用いたが、任意のタンパク質をタンデムアプタマー（Ａｐｔ）３およびタンデムＲＥペプチド（ＲＥ）３と組み合せて用いることができる。
図８は、リシンを用いたＩｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質選択システムのモデルを示す図である。ＤＮＡのランダムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを用意する。この配列の３’末端側にはリシンの配列及びスペーサー配列が挿入されている。転写・翻訳を行うと、ライブラリーのタンパク質に続いてリシンが翻訳され、このリシンが分子内反応でリボソームを不活性化し、リボソームの翻訳を停止させる。その結果ＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体が形成される。この複合体のＲＮＡはタンパク質の遺伝情報をコードしているので、特定の機能タンパク質を選択すると、そのタンパク質の遺伝情報を持ったＲＮＡを共に回収することができる。このＲＮＡを逆転写・ＰＣＲすることで増幅し、その遺伝情報を読みとることで選択されたタンパク質の配列を知ることが出来る。又、より選択圧をかけるために上記のサイクルを繰り返すことができる。
図９Ａは、タンパク質の選択システムのモデル系に用いたＤＮＡ配列を示す図である。５’側よりＴ７プロモーター、ストレプトアビジン若しくはＧＳＴ配列、リンカー配列、リシンＡ鎖配列若しくはリシンＡ鎖配列の一部に変異を加えた不活性型リシンＡ鎖の配列、Ｍ１３ファージＧｅｎｅ  ＩＩＩ遺伝子由来のスペーサー配列（３６０ｂｐ若しくは１２１２ｂｐ）の順に遺伝子が挿入されている。ストレプトアビジン及びＧＳＴ配列は選択の対象となるタンパク質。リンカー配列はペプチドリンカーをコードし、ストレプトアビジン及びＧＳＴとリシンＡ鎖の立体障害を解消するために挿入した。スペーサー配列はリボソームが他のタンパク質のｆｏｌｄｉｎｇや活性が阻害されないようにするため挿入した。
図９Ｂは、ＳＬｍＲＳ，ＳＬＲＳ，ＳＬｍＲＬ，ＳＬＲＬ遺伝子の翻訳を示す模式図である。ＳＬｍＲＳ，ＳＬｍＲＬ遺伝子はリシンが機能しないため、ＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体が形成されない。よって、タンパク質がリボソームから解離し、効率よくタンパク質が創られる。
図９Ｃは、ＳＬｍＲＳ，ＳＬＲＳ，ＳＬｍＲＬ，ＳＬＲＬ遺伝子から翻訳されたタンパク質を示す写真である。Ｓ３５−メチオニンでラベルし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を検出した。リンカーが短い方がタンパク質が多く創られた。リシンが不活性化している場合、より多くのタンパク質が創られた。ＳＬＲＬ遺伝子からはほとんどタンパク質が検出されなかった。
図１０Ａは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＳＬＲＳ）の選択を示す模式図である。一方、ＤＨＦＲをコードしたｍＲＮＡはビオチンアガロースに結合しない（ＤＬＲＳ）。またリシンを不活性化した場合もストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡはビオチンアガロースに結合しない（ＳＬｍＲＳ）。
図１０Ｂは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡの回収量を示す図である。翻訳後、ビオチンアガロースに結合させた後、結合していないｍＲＮＡを洗浄し、残ったｍＲＮＡの量を測定した。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡは３回の洗浄後、翻訳に使用したｍＲＮＡの量の３０％がビオチンアガロースに結合した。一方、ＤＬＲＳ、ＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡは３回の洗浄後、ほとんど結合が見られなかった。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡは３回の洗浄後、１００倍以上濃縮された。
図１１Ａは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＳＬＲＳ）の選択を示す模式図である。一方、ＧＳＴをコードしたｍＲＮＡはビオチンアガロースに結合しない（ＧＬＲＳ）。またリシンを不活性化した場合もストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡはビオチンアガロースに結合しない（ＳＬｍＲＳ）。
図１１Ｂは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡの回収量を示す図である。翻訳後、ビオチンアガロースに結合させた後、結合していないｍＲＮＡを洗浄し、残ったｍＲＮＡの量を測定した。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡは４回の洗浄後、翻訳に使用したｍＲＮＡの量の５％がビオチンアガロースに結合した。一方、ＧＬＲＳ、ＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡは４回の洗浄後、ほとんど結合が見られなかった。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡは４回の洗浄後、２５倍以上濃縮された。
図１２Ａは、グルタチオンセファロースによるＧＳＴタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＧＬＲＳ）の選択を示す模式図である。一方、ストレプトアビジンをコードしたｍＲＮＡはグルタチオンセファロースに結合しない（ＳＬＲＳ）。またリシンを不活性化した場合もＧＳＴタンパク質をコードしたｍＲＮＡはグルタチオンセファロースに結合しない（ＧＬｍＲＳ）。
図１２Ｂは、グルタチオンセファロースによるＧＳＴタンパク質をコードしたｍＲＮＡの回収量を示す図である。翻訳後、グルタチオンセファロースに結合させた後、結合していないｍＲＮＡを洗浄し、残ったｍＲＮＡの量を測定した。ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡは４回の洗浄後、翻訳に使用したｍＲＮＡの量の１．２％がグルタチオンセファロースに結合した。一方、ＳＬＲＳ、ＧＬｍＲＳ  ｍＲＮＡは４回の洗浄後、ほとんど結合が見られなかった（０．２％以下）。ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡは４回の洗浄後、６倍以上濃縮された。
図１３Ａは、ビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＳＬＲＳ、ＳＬＲＬ）の選択を示す模式図である。一方、ＤＨＦＲをコードしたｍＲＮＡはビオチンアガロースに結合しない（ＤＬＲＳ，ＳＬＲＬ）。ＳＬＲＳ，ＤＬＲＳのスペーサーの長さはＳＬＲＬ，ＤＬＲＬのスペーサーの長さに比べて短い。
図１３Ｂは、ストレプトアビジン及びＤＨＦＲタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＳＬＲＳ＋ＤＬＲＳ及びＳＬＲＬ＋ＤＬＲＬ）の混合プールからビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質（ＳＬＲＳおよびＳＬＲＬ）をコードしたｍＲＮＡの選択を示す写真である。ｍＲＮＡのプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、結合したｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。その結果、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡ及びＳＬＲＬ  ｍＲＮＡが増幅した。一方、ＳＬｍＲＳ（Ｌ）ｍＲＮＡ及びＤＬＲＳ（Ｌ）ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって増幅しなかった。ＳＬＲＳ（Ｌ）ｍＲＮＡとＤＬＲＳ（Ｌ）ｍＲＮＡを１：１で混合したプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＳＬＲＳ（Ｌ）ｍＲＮＡが選択的に増幅した。スペーサーが短い方が効率よく選択ができた。
図１４Ａは、ストレプトアビジン及びＧＳＴタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＳＬＲＳ＋ＧＬＲＳ）の混合プールからビオチンアガロースによるストレプトアビジンタンパク質（ＳＬＲＳ）をコードしたｍＲＮＡの選択を示す写真である。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、結合したｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。その結果、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡが増幅した。一方、ＳＬｍＲＳ  ｍＲＮＡ及びＧＬＲＳ  ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって増幅しなかった。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡとＧＬＲＳ  ｍＲＮＡを１：１で混合したプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡが選択的に増幅した。
図１４Ｂは、ストレプトアビジン及びＧＳＴタンパク質をコードしたｍＲＮＡ（ＳＬＲＳ＋ＧＬＲＳ）の混合プールからグルタチオンアガロースによるＧＳＴタンパク質（ＧＬＲＳ）をコードしたｍＲＮＡの選択を示す写真である。ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡを翻訳し、グルタチオンアガロースに結合させた後、結合したｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。その結果、ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡが増幅した。一方、ＧＬｍＲＳ  ｍＲＮＡ及びＳＬＲＳ  ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって増幅しなかった。ＳＬＲＳ  ｍＲＮＡとＧＬＲＳ  ｍＲＮＡを１：１で混合したプールを翻訳し、ビオチンアガロースに結合させた後、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＧＬＲＳ  ｍＲＮＡが選択的に増幅した。
図１５は、想定される環状化ポリソームディスプレイシステムの予想図である。
図１６Ａは、本発明者の新規選択システムのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用のテンプレートとして調製した構築物を示す図である。以下のテンプレートＤＮＡを設計した：ｄＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋），（Ｉ）；ｄＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋），（ＩＩ）；ｄＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（−），（ＩＩＩ）；ｄＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（−），（ＩＶ）。ｄＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋）とｄＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋）にはいずれも終止コドンがあるが、ｄＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（−）とｄＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（−）にはない。予想される長さはそれぞれ１７８６ｂｐ（Ｉ）、１７２３ｂｐ（ＩＩ）、１７１６ｂｐ（ＩＩＩ）および１６５３ｂｐ（ＩＶ）であった。
図１６Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳の確認結果を示す写真である。レーン１、ｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋）の翻訳産物；レーン２、ｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋）の翻訳産物；レーン３、ｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（−）の翻訳産物；レーン４、ｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（−）の翻訳産物。予想される分子量はそれぞれ５５．７ｋＤａ（レーン１および３）と５３．５ｋＤａ（レーン２および４）であった。
図１７は、本発明者の新規システムの効率を評価するために行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の結果を示す写真である。ＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のパターンを示している。レーン１〜３およびレーン５〜７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択後に各ｍＲＮＡプールから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物を示している。レーン１、初期ｍＲＮＡプールがｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋）のみを含むもの；レーン５、初期ｍＲＮＡプールがｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（−）のみを含むもの。以上のレーンは選択に関する陽性対照となる。レーン２、初期ｍＲＮＡプールがｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋）のみを含むもの；レーン６、初期ｍＲＮＡプールがｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（−）のみを含むもの。この２つのレーンは選択に関する陰性対照となる。レーン３、初期ｍＲＮＡプールがｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋）とｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋）の１：１混合物であったもの；レーン７、初期ｍＲＮＡプールがｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（−）とｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（−）の１：１混合物であったもの。この２つのレーンは選択効率を示す。レーン４、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択前のｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋）とｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋）の１：１混合物から増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物；レーン８、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択前のｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（−）とｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（−）の１：１混合物から増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物。
図１８は、システムにｍＭＳ２ｐ−Ｃｖ相互作用を含めることとｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択との間の相関を示す図である。横軸は、選択の溶出ステップ前のペレット化したＮｉ−ＮＴＡアガロースに伴う放射能と投入した放射標識ｍＲＮＡの放射能との比として定義した収率を示す。各ｍＲＮＡの収率は２つの独立した実験による結果の平均値である。
（Ｉ）ヒスチジンタグを持つ陽性対照。Ｃｖを持つがＭＳｐは持たない（ｒＣｖＨ（＋）Ｄ（＋））。
（ＩＩ）ヒスチジンタグを持つ陽性対照。ＣｖとＭＳｐを一つづつ持つ（ｒＣｖＨ（＋）ｍＭ１Ｄ（＋））。
（ＩＩＩ）ヒスチジンタグを持つ陽性対照。Ｃｖを一つ、ＭＳｐを二つ持つ（ｒＣｖＨ（＋）ｍＭ２Ｄ（＋））。
（ＩＶ）ヒスチジンタグを持たない陰性対照。ＣｖとＭＳｐを二つ持つ（ｒＣｖＨ（−）ｍＭ２Ｄ（＋））。
【図１】
0004106441.tif 000024
【図２】
0004106441.tif 000025
【図３】
0004106441.tif 000026
【図４】
0004106441.tif 000027
【図５】
0004106441.tif 000028
【図６】
0004106441.tif 000029
【図７】
0004106441.tif 000030
【図８】
0004106441.tif 000031
【図９】
0004106441.tif 000032
【図１０】
0004106441.tif 000033
【図１１】
0004106441.tif 000034
【図１２】
0004106441.tif 000035
【図１３】
0004106441.tif 000036
【図１４】
0004106441.tif 000037
【図１５】
0004106441.tif 000038
【図１６】
0004106441.tif 000039
【図１７】
0004106441.tif 000040
【図１８】
0004106441.tif 000041