(57)【要約】  本発明は、新規ＪＮＫ阻害剤分子の使用及び療法によるヒト又は動物の身体の処置方法におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物の身体の疾患の処置における使用のための、
ａ）以下の一般式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ８（配列番号１）
（式中、Ｘ１はアミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｑ及びｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｇ及びｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸Ｋ、Ｒ、ｋ及びｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４はアミノ酸Ｐ及びＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５はアミノ酸Ｔ、ａ、ｓ、ｑ、ｋから選択されるアミノ酸であるか、又は存在せず、
Ｘ６はアミノ酸Ｔ、Ｄ及びＡから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７はアミノ酸Ｎ、ｎ、ｒ及びＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８はＦ、ｆ及びｗから選択されるアミノ酸であり、
ここで、大文字で与えられるアミノ酸残基はＬ−アミノ酸を示し、小文字で与えられるアミノ酸残基はＤアミノ酸残基を示すが、
但し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１個はＤ−アミノ酸である）
の阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤と、
ｂ）ａ）で定義された配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むが、但し、配列番号１に関して、配列番号１との配列同一性を有するそのような阻害的（ポリ）ペプチド配列は、４位に配列番号１のＬ−アルギニン（Ｒ）残基並びに８位及び１０位に配列番号１の２個のＬ−ロイシン（Ｌ）残基を維持し、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する前記配列中の残りのアミノ酸の少なくとも１個はＤ−アミノ酸である、ＪＮＫ阻害剤と
からなる群から選択されることを特徴とするＪＮＫ阻害剤。
【請求項２】
Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１個がＤ−アミノ酸である請求項１に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３】
配列番号２から２７のいずれか１つから選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する阻害的（ポリ）ペプチド配列を含む請求項１又は２に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４】
前記阻害的（ポリ）ペプチド配列が配列番号２から２７のいずれか１つから選択される請求項１から３のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５】
配列番号８又は配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有する阻害的（ポリ）ペプチド配列を含む請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６】
トランスポーター配列を含む請求項１から５のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項７】
前記阻害的（ポリ）ペプチド配列と前記トランスポーター配列とが重複する請求項６に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項８】
前記トランスポーター配列が配列番号２８から３０のいずれか１つに記載の交互のＤ−及びＬ−アミノ酸の配列を含む請求項６又は７に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項９】
前記トランスポーター配列が配列番号３１から１７０のいずれか１つから選択される請求項６から８のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１０】
前記トランスポーター配列が配列番号３１から３４、４６、４７及び５２から１５１のいずれか１つから選択される請求項６から９のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１１】
前記トランスポーター配列が前記阻害的（ポリ）ペプチド配列のすぐＮ末端側又はすぐＣ末端側に位置する請求項６から１０のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１２】
ａ）配列番号１７１から１９０のいずれか１つに記載の配列、又は
ｂ）配列番号１７１から１９０の少なくとも１つと少なくとも５０％の配列同一性を有するが、但し、配列番号１７１から１９０のいずれか１つとの配列同一性を有する前記配列が、
ｉ）配列番号１に対応するその配列ストレッチ中の４位にＬ−アルギニン（Ｒ）残基を維持し、
ｉｉ）配列番号１に対応するその配列ストレッチ中に２個のＬ−ロイシン（Ｌ）を維持し、
ｉｉｉ）配列番号１に対応するその配列ストレッチ中のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７又はＸ８位に少なくとも１個のＤ−アミノ酸を示す、
配列
を含む請求項６から１１のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１３】
ａ）配列番号１７２の配列、又は
ｂ）配列番号１７２と５０％の配列同一性を有するが、但し、配列番号１７２と５０％の配列同一性を有する前記配列が、
ｉ）配列番号１に対応するその配列ストレッチ中の４位にＬ−アルギニン（Ｒ）残基を維持し、
ｉｉ）配列番号１に対応するその配列ストレッチ中に２個のＬ−ロイシン（Ｌ）を維持し、
ｉｉｉ）配列番号１に対応するその配列ストレッチ中のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７又はＸ８位に少なくとも１個のＤ−アミノ酸を示す、
配列
を含む請求項６から１２のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１４】
療法によるヒト又は動物の身体の処置のための方法における使用のための、
ａ）ＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９１）、ＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９２）、ＲＲＰＴＴＬＮＬＦ及び／又はＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）からなる配列群から選択される配列を含む阻害的（ポリ）ペプチドと、
ｂ）配列番号３１から３４及び配列番号４６から１５１から選択されるトランスポーター配列と
を含むことを特徴とするＪＮＫ阻害剤。
【請求項１５】
療法によるヒト又は動物の身体の処置のための方法における使用のための、配列番号１９４又は配列番号１９５の配列を含むことを特徴とするＪＮＫ阻害剤。
【請求項１６】
前記方法が療法によるヒト身体の処置のためのものである請求項１から１５のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１７】
前記ＪＮＫ阻害剤が、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、経腸、経口、直腸、局所、経鼻、局部、鼻内、表皮、パッチ送達により、滴下により、硝子体内、結膜下、及び／又は鼓室内投与される請求項１から１６のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１８】
前記使用が、一般の糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、一般の腎症、特に、膜性腎症又は糖尿病性腎症、一般の腎炎、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎又は急性腎炎、並びに微小変化型疾患及び巣状分節状糸球体硬化症から特に選択される腎臓疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１９】
前記使用が、皮膚疾患、特に、炎症性皮膚疾患、より具体的には、湿疹、乾癬、皮膚炎、座瘡、口腔内潰瘍、紅斑、扁平苔癬、サルコイドーシス、血管炎及び成人線状ＩｇＡ病、特に、アトピー性皮膚炎又は接触性皮膚炎から選択される疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２０】
前記使用が、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、補体第２成分欠損症関連疾患、クッシング症候群、ドゴー病、有痛脂肪症、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、新生児溶血性疾患、クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常症、消化管類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、橋本脳症、妊娠性類天疱瘡、Ｈｕｇｈｅｓ−Ｓｔｏｖｉｎ症候群、低ガンマグロブリン血症、ランバート・イートン筋無力症候群、硬化性苔癬、限局性強皮症、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋緊張病、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｐａｒｒｙ−Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、むずむず脚症候群、後腹膜線維化症、自己免疫性多内分泌症候群２型、全身硬直症候群、Ｓｕｓａｃ症候群、熱性好中球性皮膚症、シデナム舞踏病、血小板減少症、及び白斑から選択される疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２１】
前記使用が、急性散在性脳脊髄炎、抗合成酵素症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経障害、膵炎、特に、自己免疫性膵炎、ビッカースタッフ型脳炎、ブラウ症候群、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、骨髄炎、特に、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、巨細胞性動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、血管炎、特に、皮膚小血管性血管炎又は蕁麻疹様血管炎、皮膚炎、特に、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬剤誘発性エリテマトーデス、円盤状紅斑性狼瘡、腱付着部炎、好酸球性筋膜炎、胃腸炎、特に、好酸球性胃腸炎、結節性紅斑、特発性肺線維症、胃炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、汗腺膿瘍、特発性炎症性脱髄疾患、筋炎、特に、封入体筋炎、膀胱炎、川崎病、扁平苔癬、ルポイド肝炎、Ｍａｊｅｅｄ症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織疾患、脊髄炎、特に、神経脊髄炎、例えば、視神経脊髄炎、甲状腺炎、特に、オード甲状腺炎、リウマチ、特に、回帰性リウマチ、パーソナージュ・ターナー症候群、静脈周囲性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、肝硬変、特に、原発性胆汁性肝硬変、胆管炎、特に、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、ラスムッセン脳炎、軟骨炎、特に、多発性軟骨炎、例えば、再発性多発性軟骨炎、反応性関節炎（ライター病）、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、血清病、脊椎炎、特に、強直性脊椎炎、脊椎関節症、高安動脈炎、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、及び肉芽腫症、特に、ウェゲナー肉芽腫症から選択される炎症疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２２】
前記使用が、タウオパシー及びアミロイドーシス及びプリオン病から選択される疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２３】
前記使用が、ポリープの処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２４】
前記使用が、歯肉炎、骨壊死（例えば、顎骨の）、インプラント周囲炎、歯髄炎、及び歯周炎から選択される疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２５】
前記使用が、肺、心臓、肝臓、骨髄、縦隔、後腹膜、皮膚、腸、関節、及び肩の線維症から特に選択される線維性疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２６】
前記使用が、様々な形態の認知症、例えば、前頭側頭型認知症及びレビー小体型認知症、統合失調症、脊髄小脳失調症、脊髄小脳萎縮症、多系統萎縮症、運動ニューロン疾患、大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺又は遺伝性痙性対麻痺から選択される疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２７】
前記使用が、角膜手術後の炎症、非感染性角膜炎、網脈絡膜炎症、及び交感性眼炎から選択される眼に関連する疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２８】
前記使用が、特に、心臓、腎臓、及び皮膚（組織）、肺、膵臓、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢（指、手、足、顔、鼻など）、あらゆる型の骨、心臓弁、血管、並びに腸移植の断片から選択される、組織又は臓器移植の結果生じる疾患及び／又は障害の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２９】
前記使用が、乾癬の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３０】
前記使用が、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症の治療及び／又は予防のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３１】
前記使用が、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の治療及び／又は予防のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３２】
前記使用が、ドライアイ疾患、特に、シェーグレン症候群ドライアイ又は非シェーグレン症候群ドライアイ、最も好ましくは、シェーグレン症候群ドライアイの処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３３】
ＪＮＫ阻害剤が、０．０１μｇ／眼〜１０ｍｇ／眼、より好ましくは、０．１μｇ／眼〜５ｍｇ／眼、更により好ましくは、１μｇ／眼〜２ｍｇ／眼、特に好ましくは、５０μｇ／眼〜１．５ｍｇ／眼、最も好ましくは、１００μｇ／眼〜１ｍｇ／眼の範囲の用量で適用される請求項３２に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３４】
ＪＮＫ阻害剤が滴下により適用される請求項３２又は３３に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３５】
ＪＮＫ阻害剤が、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間にわたって、反復的に、例えば、毎日、２日又は３日又は週毎に適用される請求項３２から３４のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３６】
前記使用が、網膜症、特に、糖尿病性網膜症、動脈高血圧誘発性高血圧性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び過粘稠度関連網膜症の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３７】
前記使用が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型又は非滲出型加齢黄斑変性の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３８】
前記使用が、臓器移植、特に、心臓、腎臓、及び皮膚（組織）移植、心臓、腎臓又は皮膚（組織）移植時の移植片拒絶の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３９】
前記使用が、関節症／関節炎、特に、反応性関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、及び乾癬性関節炎の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４０】
前記使用が、糸球体腎炎の処置のためのものである請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４１】
ＪＮＫ阻害剤が配列番号１７２の配列からなる請求項１から４０のいずれかに記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４２】
請求項１から１５のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項４３】
請求項１８から４０に記載の疾患／障害のいずれかの処置のための使用のための請求項４２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素阻害の分野、特に、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の（ポリ）ペプチド阻害剤に関する。特に、本発明は、様々な疾患の処置におけるこれらのＪＮＫ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化群のメンバーである。これらのキナーゼは、細胞増殖及び分化の制御、より一般的には、環境刺激に対する細胞の応答に関与してきた。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに応答して、また、いくつかのクラスの細胞表面受容体の関与によって活性化される。これらの受容体は、サイトカイン受容体、セルペンチン受容体及び受容体チロシンキナーゼを含んでもよい。哺乳動物細胞中では、ＪＮＫは発がん性形質転換などの生物学的プロセス及び環境ストレスに対する適応反応の媒介に関与してきた。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟及び分化などの免疫応答の調節、並びに免疫系による破壊について同定された細胞におけるプログラム細胞死の実行と関連してきた。このユニークな特性は、ＪＮＫシグナリングを、薬学的介入を開発するための有望な標的にする。いくつかの神経障害のうち、ＪＮＫシグナリングは虚血性脳卒中及びパーキンソン病に特に関与するが、以下に更に記載される他の疾患にも関与する。更に、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８アルファは、ＪＮＫ−ｃ−Ｊｕｎ経路と拮抗することによって細胞増殖を負に調節することが示された。したがって、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８アルファは、正常な細胞増殖及びがん細胞増殖の抑制において活性であると考えられ、更に、がん疾患におけるＪＮＫの関与を証明する（例えば、非特許文献１を参照されたい）。また、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）によりもたらされる神経障害性疼痛に関与し、ＳＮＬはＪＮＫ、特に、ＪＮＫ１の遅く持続的な活性化を誘導するが、ｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ活性化はＳＮＬ後に脊髄ミクログリア中に見出され、２１日目までに基底レベル近くまで低下することも示された（非特許文献２）。２００７年に、非特許文献３は、概説において、ｃ−Ｊｕｎキナーゼ／ストレス活性化経路、海馬ニューロンの興奮毒性、肝臓虚血、再かん流、神経変性疾患、聴力低下、難聴、神経管出生異常、がん、慢性炎症疾患、肥満、糖尿病、特に、インスリン耐性糖尿病における関与などの、疾患におけるＪＮＫシグナリングの関与を考察し、高い特異度を有し、毒性がない選択的ＪＮＫ阻害剤が、様々な疾患の処置にとって必要である可能性があると提唱した。
【０００３】
したがって、ＪＮＫシグナリング経路の阻害又は中断は、ＪＮＫシグナリングと強く関連する障害に対抗するための有望な手法である。しかしながら、今までのところ知られるＪＮＫシグナリング経路の阻害剤はほんのわずかしか存在しない。
【０００４】
先行技術において既に公知であるＪＮＫシグナリング経路の阻害剤としては、例えば、上流キナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）、例えば、タンパク質キナーゼのＡＴＰ結合部位と競合することによってキナーゼ活性に直接影響するＪＮＫの低分子化学的阻害剤（ＳＰ６００１２５及びＡＳ６０１２４５）、並びにＪＮＫとその基質との相互作用のペプチド阻害剤（例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる非特許文献４、特許文献１を参照されたい）が挙げられる。特許文献１は、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質の塩基性輸送配列に由来するいわゆるＴＡＴトランスポーター配列と、ＩＢ１のアミノ酸阻害配列とを含む、低分子細胞透過性融合ペプチドを開示する。
【０００５】
特許文献１は、特に、２つの特異的配列、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ、ここでは配列番号１９６）及びＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｄｑｓｒｐｖｑｐｆｌｎｌｔｔｐｒｋｐｒｐｐｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇ、ここでは配列番号１９７）を開示し、後者はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１のレトロ−インベルソ配列である。ＨＩＶ  ＴＡＴ由来トランスポーター配列のため、これらの融合ペプチドは、標的細胞中により効率的に輸送され、そこでそれらはタンパク質分解的分解まで有効なままである。
【０００６】
ＪＮＫのＡＴＰ非依存的ペプチド阻害剤は通常、より特異的な阻害剤であるため、それらはＪＮＫを阻害するようになる場合、第１選択であることが多い。しかしながら、特許文献１に開示されたペプチド阻害剤であっても、あらゆる目的にとって最適であるわけではない。例えば、Ｌアミノ酸のみからなる化合物Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ここでは配列番号１９６）は、急速にタンパク質分解的に分解される。この問題を克服するために、特許文献１の発明者らは、Ｄアミノ酸を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ここでは配列番号１９７）も提言した。より正確には、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１のレトロ−インベルソ配列を示す。Ｄ−アミノ酸の組込みは、立体化学の変化が機能の喪失をもたらし得るという事実によって難しくなっている。ｉ）Ｄ−アミノ酸のみの使用、ｉｉ）逆ペプチド配列における使用が、元の配列中に１つ又は複数のＤ−アミノ酸を組み込むよりも元のペプチドに対して許容されるコンフォメーション類似体をもたらす可能性がより高いため、レトロ−インベルソ手法を用いて、前記リスクを軽減することができる。それにもかかわらず、特許文献１の場合、この手法は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１と比較して阻害能力の有意な低下をもたらした（図４を参照されたい）。更に、レトロ−インベルソペプチドは、タンパク質分解的消化に対して極端に安定であり、結果として、例えば、時間依存実験における制御された消化はほぼ不可能である。
【０００７】
ＪＮＫ阻害剤は、様々な疾患状態のための処置として当技術分野で考察、提唱されており、試験が成功している。１９９７年には既に、Ｄｉｃｋｅｎｓらは、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ阻害剤ＪＩＰ−１を記載し、特に、プレＢ細胞のＢｃｒ−Ａｂｌにより引き起こされる形質転換の状況における、例えば、慢性骨髄性白血病の処置のための治療戦略のための候補化合物としてＪＩＰ−１を提唱した（非特許文献５）。
【０００８】
２００１年に、Ｂｏｎｎｙ及び共同研究者は、ＪＮＫの細胞透過性ペプチド阻害剤が、ＩＬ−１β誘導性アポトーシスから膵臓β細胞を長期間保護し、したがって、糖尿病の過程における自己免疫性破壊においてβ細胞を保持することができることを確認することを公開した（非特許文献６）。
【０００９】
非特許文献７は、興奮毒性、神経細胞死、低酸素症、虚血、外傷性脳損傷、てんかん、神経変性疾患、ニューロン及び内耳聴覚細胞のアポトーシスなどの状況におけるＪＮＫ阻害剤Ｄ−ＪＮＫＩ−１及び他のＪＮＫ阻害剤の阻害作用も考察した。
【００１０】
特許文献２において、ＪＮＫシグナリングのＪＩＰ−１由来阻害剤が、パーキンソン病又はアルツハイマー病などの神経変性疾患；脳卒中及び関連する記憶障害、関節炎などの自己免疫疾患；炎症を特徴とする他の状態；白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの悪性腫瘍；肝臓及び腎臓などの臓器への酸化的損傷；心疾患；並びに移植拒絶の処置のために提唱されている。
【００１１】
非特許文献８は、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼのペプチド阻害剤が興奮毒性及び脳虚血に対して保護することを公開した。
【００１２】
Ａｓｓｉらは、別の特異的ＪＮＫ阻害剤、ＳＰ６００１２５が急性マウス大腸炎において腫瘍壊死因子−αの生成及び上皮細胞のアポトーシスを標的とすることを公開した。著者らは、ＪＮＫの阻害がヒト炎症性腸疾患の処置において有用であると結論付けた（非特許文献９）。
【００１３】
非特許文献１０では、腫瘍の成長におけるＪＮＫシグナリングの役割がより詳細に考察されている。
【００１４】
非特許文献１１は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）がインスリンシグナリングカスケードのフィードバック阻害を媒介することを示し、ＪＮＫシグナリングの阻害が糖尿病患者におけるインスリン耐性を軽減するための良好な治療手法であると提唱した。
【００１５】
非特許文献１２は、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼのペプチド阻害剤がｉｎ  ｖｉｖｏで心筋虚血−再かん流傷害及び梗塞サイズを軽減することを発見した。前記研究の著者らは、細胞内転位を媒介するヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質の１０アミノ酸のＴＡＴ配列に連結された、膵島−脳−１／ＪＮＫ相互作用タンパク質−１の最小ＪＮＫ結合ドメインの２０アミノ酸の配列を含有する２つのドメインペプチドであるペプチド阻害剤、Ｄ−ＪＮＫＩ−１を使用した。著者らは、前記阻害剤の存在に起因するＪＮＫ活性及びリン酸化の低下が虚血及びアポトーシスの段階でラットにおける心機能の保持において重要であると結論付けた。
【００１６】
更なるグループは、ＪＮＫの低分子ペプチド阻害剤がＪＮＫシグナリング経路の阻害によりＭＰＴＰ誘導性黒質ドーパミン作動性傷害に対して保護することを公開した（非特許文献１３）。著者らは、ＴＡＴペプチドに融合したマウスＪＩＰ−１の残基１５３〜１６３を含むペプチドが、ＪＮＫシグナリング経路の阻害によりＭＰＴＰ傷害に対する神経保護を提供し、パーキンソン病のための治療手法を提供すると結論付けた。
【００１７】
聴覚損傷について、非特許文献１４は、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ活性化の阻害剤であるＣＥＰ−１３４／ＫＴ７５１５による聴覚、聴覚有毛細胞及びニューロンのレスキューを記載した。著者らは、一般に、ＪＮＫシグナリングカスケードにおける治療的介入が内耳傷害を処置するための機会を提供することができると提言した。ＪＮＫ阻害ペプチドを投与することによる聴力低下の処置は、例えば、特許文献３にも開示されている。
【００１８】
特に、網膜疾患及び加齢黄斑変性について、非特許文献１５は、治療手法としてＪＮＫ阻害を使用することを同様に提言した。ＪＮＫ阻害に依拠する同様の考えは、例えば、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、中心性滲出性脈絡網膜症、網膜色素線条、網膜色素上皮剥離、多巣性脈絡膜炎、新生血管黄斑症、未熟児網膜症、網膜色素変性、レーバー病、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、中心性漿液性網脈絡膜症、網膜細動脈瘤、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、スタルガルト病、脈絡膜硬化症、先天性脈絡膜欠如、卵黄様黄斑ジストロフィー、小口病、白点状眼底、白点状網膜炎、及び脳回転状網膜脈絡膜萎縮の処置のために特許文献４に開示されている。
【００１９】
非特許文献１６は、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼが涙腺分泌のインターロイキン−１β誘導性阻害を媒介することを同定した。彼らは、ＪＮＫが涙腺分泌のＩＬ−１β媒介性阻害及びその後のドライアイにおいて中枢的な役割を果たすと結論付けた。
【００２０】
ブドウ膜炎について、非特許文献１７は、有効な処置としてＤ−ＪＮＫＩ１を使用することを提言した。
【００２１】
ＩＢＤ（炎症性腸疾患）について、非特許文献１８は、その中でのＪＮＫシグナル伝達経路の役割を強調し、前記疾患状態の処置のためにペプチド性ＪＮＫ阻害剤を使用することを提唱した。
【００２２】
非特許文献１９は、ＪＮＫ阻害剤Ｄ−ＪＮＫＩ−１がウイルス性脳炎からマウスを保護するのに有効であることを示し、したがって、ウイルス性脳炎のための有望かつ新規な処置戦略としてＪＮＫ阻害を提言する。
【００２３】
非特許文献２０は、同じＪＮＫ阻害剤Ｄ−ＪＮＫＩ−１を使用し、Ｄ−ＴＡＴではなく、Ｄ−ＪＮＫＩ−１（１０ｎｇ／マウス）を用いる予備処置が、中枢ＴＮＦアルファにより誘導される病気の３つ全ての指標を有意に阻害することを見出し、サイトカインにより誘導される疾病行動を背景に発症する大鬱病性障害を処置するための手段としてＪＮＫ阻害を提言した。
【００２４】
特許文献５では、ＪＮＫ阻害による神経変性疾患である脊髄性筋萎縮症の処置が提唱された。
【００２５】
上記の導入部分は、選択された刊行物に基づいて、様々な疾患の処置におけるＪＮＫ阻害剤の有用性を強調するものである。したがって、ヒト（及び動物）の疾患の処置における使用のためのＪＮＫ阻害剤について当技術分野で一定の必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０３１２８０
【特許文献２】ＷＯ９８／４９１８８
【特許文献３】ＷＯ０３／１０３６９８
【特許文献４】ＷＯ２０１０／１１３７５３
【特許文献５】ＷＯ２０１０／１５１６３８
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ  ３９、ｎｏ．６、Ｊｕｎｅ  ２００７
【非特許文献２】Ｚｈｕａｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｒｃｈ  ２９、２００６、２６（１３）：３５５１〜３５６０頁
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１３４１〜１３４８頁
【非特許文献４】Ｋｕａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５、ｖｏｌ．４、ｎｏ．１、６３〜６７頁
【非特許文献５】Ｄｉｃｋｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９９７；２７７（５３２６）：６９３〜６９６頁
【非特許文献６】Ｂｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０、２００１、７７〜８２頁
【非特許文献７】Ｂｏｎｎｙら、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００５、５７〜６７頁
【非特許文献８】Ｂｏｒｓｅｌｌｏら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００３、（９）、１１８０〜１１８６頁
【非特許文献９】Ａｓｓｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；２００６、１１８（１）：１１２〜１２１頁
【非特許文献１０】Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、２００３、２（３）、１９９〜２０１頁
【非特許文献１１】Ｌｅｅ  Ｙｏｎｇ  Ｈｅｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３、２７８（５）、２８９６〜２９０２頁
【非特許文献１２】Ｍｉｌａｎｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００７；１９２（４）：Ｈ１８２８〜Ｈ１８３５頁
【非特許文献１３】Ｐａｎら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１０、９０、１５６〜１６７頁
【非特許文献１４】Ｐｉｒｖｏｌａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２０（１）；４３〜５０頁
【非特許文献１５】Ｒｏｄｕｉｔら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２００８、１３（３）、３４３〜３５３頁
【非特許文献１６】Ｚｏｕｋｈｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、９６、１２６〜１３５頁
【非特許文献１７】Ｔｏｕｃｈａｒｄら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２０１０、５１（９）；４６８３〜４６９３頁
【非特許文献１８】Ｒｏｙら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００８、１４（２）、２００〜２０２頁
【非特許文献１９】Ｂｅｃｋｈａｍら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００７  Ｊｕｌ；８１（１３）：６９８４〜６９９２頁
【非特許文献２０】Ｐａｌｉｎら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）．２００８  Ｍａｙ；１９７（４）：６２９〜６３５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、特定の疾患の処置のための更なるＪＮＫの（ペプチド）阻害剤を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に記載の主題によって、本発明者により解決される。
【００３０】
以下に、添付の図面の簡単な説明を記載する。図面は本発明をより詳細に例示することを意図するものである。しかしながら、それらはいかなる意味でも本発明の主題を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により精査された、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。図１Ａ：配列番号１９３、２、３、５、６及び７によるＪＮＫ１の阻害を示す。
【図１Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により精査された、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。図１Ｂ：配列番号１９３、２、３、５、６及び７によるＪＮＫ２の阻害を示す。
【図１Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により精査された、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。図１Ｃ：配列番号１９３、２、３、５、６及び７によるＪＮＫ３の阻害を示す。
【図２】本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤（配列番号１９３、２、３、５、６及び７）の阻害効能を例示する表である。ｎＭ範囲のＩＣ５０値、対応する平均の標準誤差及び実施された実験回数（ｎ）が記載される。
【図３Ａ】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。阻害効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定された。図３Ａ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１及び１９７によるＪＮＫ１の阻害を示す。
【図３Ｂ】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。阻害効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定された。図３Ｂ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１及び１９７によるＪＮＫ２の阻害を示す。
【図３Ｃ】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。阻害効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定された。図３Ｃ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１及び１９７によるＪＮＫ３の阻害を示す。
【図３Ｄ】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。阻害効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定された。図３Ｄ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０及び１９７によるＪＮＫ１の阻害を示す。
【図３Ｅ】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。阻害効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定された。図３Ｅ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０及び１９７によるＪＮＫ２の阻害を示す。
【図３Ｆ】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能の図である。阻害効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定された。図３Ｆ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０及び１９７によるＪＮＫ３の阻害を示す。
【図４】ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列とトランスポーター配列との融合タンパク質である、本発明によるいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害効能を例示する表である。ｎＭ範囲のＩＣ５０値、対応する平均の標準誤差（ＳＥＭ）及び実施された実験回数（ｎ）が記載される。
【図５】５０％ヒト血清中での配列番号１７２、１９６及び１９７を有するＪＮＫ阻害剤の安定性を示す図である。配列番号１９６を有するＪＮＫ阻害剤は、６時間以内にアミノ酸残基に全て分解された（Ａ）。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、１４日後にのみ完全に分解された（Ｂ）。配列番号１９７を有するＪＮＫ阻害剤は、少なくとも３０日まで安定であった（Ｂ）。
【図６Ａ】配列番号３０に記載されたＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸パターンを有するＴＡＴ由来トランスポーター構築物を使用する内在化実験を示す図である。分析されたトランスポーター配列は、配列番号５２〜９４＋配列番号４５、４７、４６、４３及び９９（図６Ａ）に対応する。見られるように、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒを有する全てのトランスポーター（配列番号３１）が、Ｌ−ＴＡＴトランスポーター（配列番号４３）よりも高い内在化能力を示した。Ｈｅｌａ細胞を、１０ｍＭのそれぞれのトランスポーターと共に９６ウェルプレート中で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を酸性バッファー（０．２Ｍグリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファーの添加により細胞を破壊した。次いで、それぞれの抽出物の蛍光強度（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を読み取った後、バックグラウンドを差し引くことにより、内在化されたペプチドの相対量を決定した。
【図６Ｂ】配列番号３０に記載されたＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸パターンを有するＴＡＴ由来トランスポーター構築物を使用する内在化実験を示す図である。分析されたトランスポーター配列は、配列番号５２〜９４＋配列番号１００〜１４７（図６Ｂ）に対応する。見られるように、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒを有する全てのトランスポーター（配列番号３１）が、Ｌ−ＴＡＴトランスポーター（配列番号４３）よりも高い内在化能力を示した。Ｈｅｌａ細胞を、１０ｍＭのそれぞれのトランスポーターと共に９６ウェルプレート中で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を酸性バッファー（０．２Ｍグリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファーの添加により細胞を破壊した。次いで、それぞれの抽出物の蛍光強度（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を読み取った後、バックグラウンドを差し引くことにより、内在化されたペプチドの相対量を決定した。
【図７】配列番号１７２の配列を有するＪＮＫ阻害剤が、ＴＨＰ１−ＰＭＡ分化マクロファージにおいてＬＰＳにより誘導されるサイトカイン及びケモカインの放出を遮断することを示す図である。図７Ａ：ＴＮＦ放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６ｈ  ３ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ）。図７Ｂ：ＴＮＦ−α放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６ｈ  １０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ）。図７Ｃ：ＩＬ６放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６ｈ  １０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ）。図７Ｄ：ＭＣＰ１放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６ｈ  ３ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ）。
【図８】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）及びＳＰ６００１２５よりも高い効力で、ＴＨＰ１分化マクロファージにおいてＬＰＳにより誘導されるＩＬ６の放出を遮断することを示す図である。ＬＰＳを６ｈ（１０ｎｇ／ｍｌ）添加した。
【図９】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）及びＳＰ６００１２５よりも高い効力で、ＴＨＰ１分化マクロファージにおいてＬＰＳにより誘導されるＴＮＦαの放出を遮断することを示す図である。ＬＰＳを６ｈ（１０ｎｇ／ｍｌ）添加した。
【図１０】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）及びＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）よりも高い効力で、ＰＭＡ分化マクロファージにおいてＬＰＳにより誘導されるＩＬ−６の放出を遮断することを示す図である。ＬＰＳを６ｈ添加した。
【図１１】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）及びＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）よりも高い効力で、ＰＭＡ分化マクロファージにおいてＬＰＳにより誘導されるＴＮＦαの放出を遮断することを示す図である。
【図１２】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、３ｎｇ／ｍｌで、初代ラット全血細胞においてＬＰＳにより誘導されるＴＮＦαの放出を遮断することを示す図である。様々なレベルのＬＰＳ（ｎｇ／ｍｌ）での、対照、１μＭの配列番号１７２、３μＭの配列番号１７２、及び１０μＭの配列番号１７２に関する結果を記載する。
【図１３】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、ＰＭＡ／イオノマイシンに応答して初代ヒトＴ細胞によるＩＬ−２分泌を遮断することを示す図である。
【図１４】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に応答して初代ヒトＴ細胞によるＩＬ−２分泌を遮断することを示す図である。使用したＪＮＫ阻害剤を、その配列番号１７２及び１９７により示す。
【図１５】初代ラットリンパ節精製Ｔ細胞中でのＣＤ３／ＣＤ２８により誘導されるＩＬ−２放出の配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤による用量依存的阻害を示す図である。対照ラットを屠殺し、リンパ節を摘出した。Ｔ細胞を更に精製し（磁気陰性選択を使用する）、２００，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中にプレーティングした。細胞を抗ラットＣＤ３抗体及び抗ラットＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍＬ）で処理した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、ＣＤ３／ＣＤ２８処理の１ｈ前に培養物に添加し、ＩＬ−２放出を処置の２４ｈ後の上清で評価した。
【図１６】初代ラットリンパ節精製Ｔ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８により誘導されるＩＬ−２放出の用量依存的阻害：いくつかのＪＮＫ阻害剤、すなわち、配列番号１７２、１９７及びＳＰ６００１２５の比較を示す図である。
【図１７】ＰＭＡ＋イオノマイシンで刺激されたラット全血におけるＩＬ−２放出の用量依存的阻害を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激の１ｈ前に添加した。３つの用量の活性化因子を４ｈ添加した（２５／５００ｎｇ／ｍＬ、５０／７５０ｎｇ／ｍＬ及び５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）。ＩＬ−２放出を、上清で評価した。１０μＭの配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、３つの試験した活性化因子濃度でＰＭＡ−イオノにより誘導されるＩＬ−２放出を効率的に低下させた。
【図１８】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＩＬ−６放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＬＰＳ（０．０２ｎｇ／ｍＬ）で４ｈの全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＬＰＳにより誘導されるＩＬ−６放出を低下させた。
【図１９】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＩＬ−２放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍＬ及び５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）で４ｈの全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＰＭＡ＋イオノマイシンにより誘導されるＩＬ−２放出を低下させた。
【図２０】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＩＦＮ−γ放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍＬ及び５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）で４ｈの全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＰＭＡ＋イオノマイシンにより誘導されるＩＦＮ−γ放出を低下させた。
【図２１】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＴＮＦ−α放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍＬ及び５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）で４ｈの全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＰＭＡ＋イオノマイシンにより誘導されるＴＮＦ−α放出を低下させた。
【図２２】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＴＮＦ−α放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍＬ）で３日間の全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＰＨＡ−Ｌにより誘導されるＴＮＦ−α放出を低下させた。
【図２３】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＩＬ−２放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍＬ）で３日間の全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＰＨＡ−Ｌにより誘導されるＩＬ−２放出を低下させた。
【図２４】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害及びＴＮＦ−α放出を示す図である。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度、すなわち、１、３及び１０μＭで、ＣＤ３＋／−ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍＬ）で３日間の全血刺激の１ｈ前に添加した。配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、用量依存的様式でＣＤ３／ＣＤ２８により誘導されるＴＮＦ−α放出を低下させた。
【図２５】ＣＦＡ（完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）により足の腫れを誘導した後の配列番号１９７（１０μｇ／ｋｇ）及び配列番号１７２（１０μｇ／ｋｇ）を有するＪＮＫ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症特性の写真である。足の腫れを、左後足で誘導し、右後足は処置しなかった。
【図２６】ＣＦＡ（完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）により足の腫れを誘導した後の配列番号１９７（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝４）及び配列番号１７２（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝３）を有するＪＮＫ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症特性のグラフ表示である。処置後の左後足の測定された外周が示される。
【図２７】ＣＦＡ（完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）により足の腫れを誘導した後の配列番号１９７（１０μｇ／ｋｇ）及び配列番号１７２（１０μｇ／ｋｇ）を有するＪＮＫ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症特性のグラフ表示である。ＣＦＡにより足の腫れを誘導した１時間後に測定されたｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン放出が示される。
【図２８】静脈内投与後のアルビノラット（エンドトキシン誘発性ブドウ膜炎モデル、ＥＩＵ）における異なる量の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の投与の臨床評価を示す図である。左から右に向かって：ビヒクル、０．０１５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２；０．１８ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２；１．８ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２、２ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１９７及び２０μｇのデキサメタゾン（眼への結膜下注射により直接投与される）。臨床スコア（平均及びＳＥＭ）が示される。
【図２９】１４日間のラット慢性確立ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における毎日の静脈内投与後の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。０日目から１４日目までの体重変化が示される。左から右に向かって：正常対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）、疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）、５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２；１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２；０．１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２、０．０１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の配列番号１７２、０．０５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）のデキサメタゾン。臨床スコア（平均及びＳＥＭ）が示される。ｎ＝４／正常群、ｎ＝８／処置群；＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に対する一元配置ＡＮＯＶＡのｐ≦０．０５。
【図３０】１４日間のラット慢性確立ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における毎日の静脈内投与後の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。時間に対する足首の直径（ｉｎ）が示される。ｎ＝４／正常群、ｎ＝８／処置群；＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に対する二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡのｐ≦０．０５。
【図３１】１４日間のラット慢性確立ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における毎日の静脈内投与後の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨吸収に関する足首の組織学的スコアが示される。ｎ＝８／処置群；＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定のｐ≦０．０５。
【図３２】１４日間のラット慢性確立ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における毎日の静脈内投与後の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨吸収に関する膝の組織学的スコアが示される。ｎ＝８／処置群；＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定のｐ≦０．０５。
【図３３】ＥＩＵ誘導の２４時間後及びＥＩＵ誘導前の様々な時点での配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）の投与後の細隙灯による臨床スコアリングを示す図である。左から右に向かって：ビヒクル（０時間）；ＥＩＵ誘導の４週前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２週前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の１週前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の４８時間前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２４時間前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前のデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）。平均±ＳＥＭ。＊ビヒクルに対するｐ＜０．０５、＊＊ビヒクルに対するｐ＜０．０１。
【図３４】ＥＩＵ誘導の２４時間後及びＥＩＵ誘導前の様々な時点での配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）の投与後に定量された切片あたりのＰＭＮ細胞の数を示す図である。左から右に向かって：ビヒクル（０時間）；ＥＩＵ誘導の４週前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２週前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の１週前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の４８時間前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２４時間前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前の配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前のデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）。平均±ＳＥＭ。＊ビヒクルに対するｐ＜０．０５、＊＊ビヒクルに対するｐ＜０．０１。
【図３５】スコポラミン誘導性ドライアイ症候群を罹患する動物に関する平均算出ＴＢＵＴ  ＡＵＣ値を示す図である。ビヒクル、配列番号１９７の配列を有する３つの異なる濃度の全−Ｄ−レトロ−インベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド、配列番号１７２の配列を有する３つの異なる濃度のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドで処置された動物に関する結果、及びシクロスポリンで処置された動物に関する結果を示す。
【図３６】スコポラミン誘導性ドライアイを罹患する動物に関する平均算出ＰＲＴＴ  ＡＵＣ（７〜２１日目）を示す図である。ビヒクル、配列番号１９７の配列を有する３つの異なる濃度の全−Ｄ−レトロ−インベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド、配列番号１７２の配列を有する３つの異なる濃度のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドで処置された動物に関する結果、及びシクロスポリンで処置された動物に関する結果を示す。
【図３７】スコポラミン誘導性ドライアイ症候群を罹患する動物に関する平均組織学的角膜病変スコアを示す図である。ビヒクル、配列番号１９７の配列を有する３つの異なる濃度の全−Ｄ−レトロ−インベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド、配列番号１７２の配列を有する３つの異なる濃度のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドで処置された動物に関する結果、及びシクロスポリンで処置された動物に関する結果を示す。
【図３８】ＡＤＲ投与後８、１４、２９、４１及び５６日目のアドリアマイシン（ＡＤＲ）誘導性腎症モデルにおけるラットの血中タンパク質（Ａ）及び尿素レベル（Ｂ）により評価された腎機能を示す図である。第１群（「ＡＤＲ」）及び第２群（「ＡＤＲ＋配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤」）を、０日目にＡＤＲで処置して腎症を誘導したが、第３群（「ＮａＣｌ」）は０．９％のＮａＣｌを投与した。更に、第２群（「ＡＤＲ＋配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤」）を、０日目に配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤で処置したが、第１群及び第３群はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を投与した。
【図３９】過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色されたアドリアマイシン（ＡＤＲ）誘導性腎症モデルにおけるラットの腎臓切片を示す図である（元の倍率は４０倍）。左側に示される切片については、ラットをＡＤＲ投与後８日目に屠殺したが、左側に示される切片については、ラットを５６日目に屠殺した。ＡＤＲは「ＡＤＲ」群及び「ＡＤＲ＋ＸＧ１０４」群にのみ投与したが、「ＮａＣｌ」群は０．９％ＮａＣｌのみを投与した。「ＡＤＲ＋ＸＧ１０４」群は０日目に配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（すなわち、「ＸＧ１０４」は配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤を指す）で処置したが、他の群（「ＡＤＲ」及び「ＮａＣｌ」）はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を投与した。
【図４０】０日目にＡＤＲ及びビヒクルで処置された「ＡＤＲ」群（上パネル）と、０日目にＡＤＲ及び配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤で処置された「ＡＤＲ＋ＸＧ１０４」群（下パネル）に関する、ＡＤＲ投与後８日目（左の４つのパネル）及び５６日目（右の４つのパネル）でのＭａｓｓｏｎのトリクロム（青色）を用いて評価されたＡＤＲ腎症における腎臓線維症を示す図である。元の１０倍の倍率を、それぞれの日について左パネルに記載し、元の４０倍の倍率をそれぞれの日について右パネルに記載する。
【図４１】イミキモドの６日間連続適用後のマウスにおけるイミキモド誘導性乾癬モデルにおける耳の炎症に関する平均群等級を示す図である。「平均等級」とは、顕微鏡的組織学的評価項目（実施例１４を参照されたい）を指す。配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の３つの用量（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）を試験した（それぞれ、「ＸＧ−１０４  ０．０２ｍｇ／ｋｇ」群、「ＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ／ｋｇ」群及び「ＸＧ−１０４  ２ｍｇ／ｋｇ」群）。プレドニゾロン及びデキサメタゾンを陽性対照として用いた。ＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ／ｋｇ群、プレドニゾロン及びデキサメタゾンは、ビヒクル対照群との有意差を示した。
【図４２】傷を付けないクランプで４０ｍｉｎ、両方の腎茎をクランプすることにより、Ｇ２群及びＧ３群のラットにおいて腎虚血を誘導したが、Ｇ１群のラットにおいては虚血を誘導しなかった。Ｇ３群のラットは、単回用量の２ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）（ビヒクルとしての０．９％ＮａＣｌ中）を受け、Ｇ１及びＧ２群のラットは、それぞれ、傷を付けないクランプによる両方の腎茎のクランピング期間の１時間後（再かん流後）、０日目に尾静脈へのＩＶ注射によってビヒクルを投与した。血清クレアチニン及び尿素は、虚血なしのビヒクル処置対照（Ｇ１）と比較して、虚血の２４ｈ後にビヒクル処置虚血ラット（Ｇ２）中で増加した。他方で、ＸＧ−１０４で処置された虚血マウス（Ｇ３）は、未処置の虚血ラット（Ｇ２）と比較して低い血清クレアチニン及び低い尿素を示した。
【図４３】ＸＧ−１０４は乾癬に関するＫ５．ＳＴＡＴ３ｃモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで乾癬表現型の発症を遮断するという実施例２０に関して示す図である。野生型又はＫ５ＳＴＡＴ３ｃマウスを、テープを剥がす前にビヒクル（食塩水）又はＸＧ−１０４化合物で処置した後、ビヒクル又はＸＧ−１０４で毎日処置した。５日後、マウスを屠殺し、病変部位から生検を採取して、アカントーシス（表皮の肥厚化）を定量した。アカントーシスの定量を、２つの独立した実験について別々に（Ａ）及び合わせて（Ｂ）示す。点は個々のマウスからの平均値を表す（Ａ及びＢ）。一元配置ＡＮＯＶＡ検定を実施して、有意性を分析した。
【図４４】実施例２０に関する、食塩水又はＸＧ−１０４で処置されたＫ５．ＳＴＡＴ３ｃマウスの代表的な組織像を示す図であり、ＸＧ−１０４は、乾癬に関するＫ５．ＳＴＡＴ３ｃモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで乾癬表現型の発症を遮断することを示している。
【図４５】実施例１９に関する、ＭＴＳアッセイを使用したＨｅｐＧ２（Ａ）及びＬＣ／ＰＲＦ／５（Ｂ）腫瘍細胞株に対するＸＧ−１０４の細胞傷害活性の測定の結果を示す図である。
【図４６】実施例２３に関する、試験設計を示す図である。
【図４７】実施例２３に関する両側ＩＲのラットモデルにおける尿細管損傷に対するビヒクル及びＸＧ−１０４（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。＊＊＊Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定ｎｓによる第１群（疑似／ビヒクル）に対するＰ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による第２群（ＩＲ／ビヒクル）に対する＋Ｐ＜０．０５。
【図４８】実施例２３に関する、両側ＩＲのラットモデルにおける総尿細管組織学的スコアに対するビヒクル及びＸＧ−１０４（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。総尿細管スコアは、変性及び壊死、尿細管円柱、尿細管上皮空胞形成並びに再生（好塩基性尿細管）などの全ての尿細管変化を表す。＊＊＊Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による第１群（疑似／ビヒクル）に対するＰ＜０．００１；＋一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による第２群（ＩＲ／ビヒクル）に対するＰ＜０．０５。
【図４９】実施例２３に関する、ヘマトキシリン／エオシン染色された腎臓切片の代表的な画像：第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）との間の比較を示す図である。動物５３（左上）、動物１５（右上）、動物４６（左下）、及び動物１８（右下）：第２群（ビヒクル）及び第３群（ＸＧ−１０４）における尿細管変性／壊死及び尿細管円柱の１０倍の代表的な微小写真。１〜４のスコアを有する動物を示す。群間の主な差異は、第２群における尿細管壊死及び円柱の重症度が第３群において観察されるものよりも一般に高いということである。第２群においては、病変は部分的に、又は皮質の大部分に伸びる。比較して、第３群においては、病変は皮髄境界部に限られる。病変は、活発な壊死、細胞尿細管円柱、硝子円柱、及び時折の好塩基性尿細管からなる。
【図５０】実施例２４に関する、試験設計（Ａ）及び異痛症及び痛覚過敏症を評価するためのＡＵＣ法（Ｂ）を示す図である。
【図５１】実施例２４に関する、ＣＹＰ注射の２４ｈ後の侵害受容パラメータに対するＸＧ−１０４（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖ．）及びイブプロフェン（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖ．）処置の効果を示す図である。ＣＹＰ注射の２４ｈ後の侵害受容閾値（Ａ）、侵害受容スコア（Ｂ）、ＡＵＣ１〜８ｇ（Ｃ）、又はＡＵＣ８〜６０ｇ（Ｄ）。
【図５２】実施例２４に関する、ＣＹＰ注射の２４ｈ後の膀胱壁の厚さ並びに浮腫及び出血スコアに対するＸＧ−１０４（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖ．）及びイブプロフェン（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖ．）処置の効果を示す図である。ＣＹＰ注射の２４ｈ後の膀胱壁の厚さ（Ａ）、浮腫スコア（Ｂ）、又は出血スコア（Ｃ）。結果を、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０）として表す。ビヒクル処置群に対する、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定及び対応のないｔ検定のｎｓ＝ｐ＞０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５３】実施例２５に関する、ＣＹＰ注射の２４ｈ後の侵害受容パラメータに対するＸＧ−１０４（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）及びイブプロフェン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）処置の効果を示す図である。ＣＹＰ注射の２４ｈ後の侵害受容閾値。結果を、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０）として表す。ビヒクル処置群に対する、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ａ）、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ（Ｂ）、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定及び対応のないｔ検定（Ｃ）、又は対応のないｔ検定（Ｄ）の＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５４】実施例２６に関する、神経細胞アポトーシスに対するＸＧ−１０４の効果を示す図である。（Ａ）２μＭ又は２５μＭのＡβ１−４２（Ａβ４２）に５時間曝露した初代マウス皮質ニューロン培養物のイムノブロット分析。ニューロンを、５μＭ又は１０μＭの特異的阻害剤ＸＧ−１０４で予備処理したか、又は予備処理しなかった。（Ｂ）２μＭのＡβ４２でＪＮＫ活性の改変を示さない対応するヒストグラム。５μＭ及び１０μＭのＸＧ−１０４による予備処理は、ＪＮＫ活性をそれぞれ２９．２％及び６０％低下させた。ニューロンの２５μＭのＡβ４２による処理は、ＪＮＫ活性を１４％増加させた。５μＭ及び１０μＭのＸＧ−１０４による予備処理は、ＪＮＫ活性をそれぞれ１７．５％及び５９．６％減少させた。両方のＡβ４２細胞ストレス条件において、１０μＭのＸＧ−１０４濃度が、ＪＮＫ活性を低下させるのにより有効であった。（Ｃ）神経細胞アポトーシスは、アポトーシス中に増加する切断されたＰＡＲＰタンパク質のレベルによって測定される。両方のＡβ４２ストレス条件は、自発的アポトーシスを有意に悪化させなかった。５μＭ及び１０μＭのＸＧ−１０４による予備処理は、２μＭのＡβ４２を用いた場合、ＰＡＲＰ切断をそれぞれ４６．８％及び８０．２％低下させ、２５μＭのＡβ４２を用いた場合、それぞれ６９％及び８０．６％低下させた。
【図５５】実施例２６に関する、「ＪＮＫｉ」（図５５中）と呼ばれる、ＸＧ−１０４によるＰＫＲダウンレギュレーション及び／又はＪＮＫ阻害後の神経細胞アポトーシスの減少を示す図である。（Ａ）１０μＭのＪＮＫｉ化合物によるＪＮＫの予備阻害後又は阻害しなかった後に２μＭのＡβ４２により処理された、ＷＴ及びＰＫＲ−／−マウスの初代神経細胞培養物中のＪＮＫ及びｃ−Ｊｕｎ活性化、カスパーゼ３及びＰＡＲＰ切断活性化断片のレベルのイムノブロットの結果。（Ｂ−Ｄ）ＪＮＫ活性の対応するヒストグラム（Ｂ）、ホスホｃ−Ｊｕｎの対応するヒストグラム（Ｃ）、トータルｃ−Ｊｕｎの対応するヒストグラム（Ｄ）。（Ｅ−Ｇ）アポトーシスは、切断されたカスパーゼ３のレベルにより測定する（Ｅ）、細胞培養上清中で測定されたカスパーゼ３活性のレベルにより測定する（Ｆ）、切断されたＲＡＲＰのレベルにより測定する（Ｇ）。データは平均±ＳＥＭ（条件あたりｎ≧３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
ＪＮＫ阻害剤
第１の態様において、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の疾患の処置のため、特に、本明細書に開示される疾患／障害の処置のための方法における使用のための、
以下の一般式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ８（配列番号１）
（式中、
Ｘ１はアミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｑ及びｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｇ及びｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸Ｋ、Ｒ、ｋ及びｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４はアミノ酸Ｐ及びＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５はアミノ酸Ｔ、ａ、ｓ、ｑ、ｋから選択されるアミノ酸であるか、又は存在せず、
Ｘ６はアミノ酸Ｔ、Ｄ及びＡから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７はアミノ酸Ｎ、ｎ、ｒ及びＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８はＦ、ｆ及びｗから選択されるアミノ酸であるが、
但し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個はＤ−アミノ酸である、好ましくは、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個又は４個はＤ−アミノ酸である）
の阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤に関する。
【００３３】
本発明によるＪＮＫ阻害剤の阻害的（ポリ）ペプチド配列は、Ｌ−アミノ酸を含み、多くの実施形態においては、Ｄ−アミノ酸を含む。別途特定されない限り、Ｌ−アミノ酸残基は、本明細書では大文字で示されるが、Ｄ−アミノ酸残基は小文字で示される。グリシンは大文字又は小文字で示してもよい（Ｄ−又はＬ−グリシンは存在しないため）。本明細書に開示されるアミノ酸配列は、別途特定されない限り、常にＮ末端からＣ末端に向かって（左から右へ）記載される。与えられるアミノ酸配列は、Ｃ及び／又はＮ末端で改変又は非改変、例えば、Ｃ末端でのアセチル化及び／又はＮ末端でのアミド化若しくはシステアミドによる改変を行ってもよい。本明細書に開示されるアミノ酸配列のＣ及び／又はＮ末端におけるそのような想定できるが任意の改変は、明確化のために、特に示さない。
【００３４】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の（ポリ）ペプチド阻害剤である。前記阻害剤は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のキナーゼ活性を阻害する、すなわち、例えば、ＪＮＫ活性を遮断することにより、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２及び／又はＥｌｋ−１などのＪＮＫ基質のリン酸化の程度を抑制する、又は低下させる。当業者は、本明細書で使用される用語「阻害剤」はｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）分子及び／又はキナーゼ活性を不可逆的に破壊する化合物を含まないことを理解できる。したがって、本発明の阻害剤のＪＮＫ阻害活性は、典型的には、競合的又は非競合的な様式でＪＮＫに結合する化合物を指す。更に、本明細書で使用される用語「ＪＮＫ活性の阻害」は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のキナーゼ活性の阻害を指す。
【００３５】
更に、本明細書で使用される場合、ＪＮＫ阻害剤は、アミノ酸のポリマー、すなわち、（ポリ）ペプチド配列の少なくとも１つの機能単位を含む。更に、この少なくとも１つの機能的なアミノ酸のポリマーは、ＪＮＫ活性の阻害を提供する。前記阻害的（ポリ）ペプチド配列のアミノ酸モノマーは通常、ペプチド結合により互いに連結されるが、阻害活性（ＪＮＫ活性の阻害）が全体として失われることがない、すなわち、得られる化学的実体が依然として本明細書に機能的に定義されるＪＮＫ阻害剤として適格であるという条件で、前記ペプチド結合又は側鎖残基の（化学的）改変が許容される。用語「ポリ（ペプチド）」は、（ポリ）ペプチド単位の長さを限定すると解釈されるべきではない。好ましくは、本発明のＪＮＫ阻害剤の阻害的（ポリ）ペプチド配列は、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、又は１２アミノ酸未満である。好ましくは、阻害的（ポリ）ペプチド配列は、１０個以上のアミノ酸残基、より好ましくは、１１個以上のアミノ酸残基を有する。
【００３６】
更に、本発明の「ＪＮＫ阻害剤」は、ＪＮＫ活性を阻害し、例えば、ｃ−Ｊｕｎ基質（配列番号１９８）のヒトＪＮＫ媒介性リン酸化の阻害に関して、
ａ）ヒトＪＮＫ１の阻害に関して３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、更により好ましくは１０００ｎＭ未満、更により好ましくは５００ｎＭ未満、更により好ましくは２５０ｎＭ未満、更により好ましくは２００ｎＭ未満、更により好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満、
ｂ）ヒトＪＮＫ２の阻害に関して３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、更により好ましくは１０００ｎＭ未満、更により好ましくは５００ｎＭ未満、更により好ましくは２５０ｎＭ未満、更により好ましくは２００ｎＭ未満、更により好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満、及び／又は
ｃ）ヒトＪＮＫ３の阻害に関して３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、更により好ましくは１０００ｎＭ未満、更により好ましくは５００ｎＭ未満、更により好ましくは２５０ｎＭ未満、更により好ましくは２００ｎＭ未満、更により好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満
のＩＣ５０値を示す。
【００３７】
いくつかの適用では、阻害剤は、上記の定義によるＪＮＫ１ではなく、上記の定義によるヒトＪＮＫ２及び／又はヒトＪＮＫ３を阻害することが好ましい。
【００３８】
ＪＮＫ活性が阻害されるか否かを、当業者は、容易に評価することができる。当技術分野で公知のいくつかの方法が存在する。一例は、放射性キナーゼアッセイ又は非放射性キナーゼアッセイ（例えば、Ａｌｐｈａスクリーン試験；例えば、Ｇｕｅｎａｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、２００６；１１：１０１５〜１０２６頁を参照されたい）である。
【００３９】
したがって、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、例えば、配列番号２〜配列番号２７のいずれかの阻害的（ポリ）ペプチド配列を含んでもよい（表１を参照されたい）。
【００４０】
【表１】
2017520569.tif 000002
【００４１】
本発明によるＪＮＫ阻害剤は、配列番号１〜２７から選択される配列、特に、配列番号８との少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤（バリアント）であってもよいが、但し、好ましくは、配列番号１〜２７から選択されるそれぞれの配列に関して、配列同一性を有するそのような阻害的（ポリ）ペプチド配列は、
ａ）４位のＬ−アルギニン（Ｒ）残基を維持する、
ｂ）８位及び１０位（配列番号２５〜２７に関しては７位及び９位）の２個のＬ−ロイシン（Ｌ）残基を維持する、
ｃ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置並びに配列番号２〜２７中のそれぞれの位置に１、２、３、４、５又は６個のＤ−アミノ酸を示す、より好ましくは、配列番号１のＸ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置並びに配列番号２〜２７中のそれぞれの位置に１、２、３又は４個のＤ−アミノ酸を示す、並びに
ｄ）ＪＮＫ活性を依然として阻害する（すなわち、本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤である）。
【００４２】
確かに、本明細書に開示されるバリアント（特に、上記の定義内で、配列番号１〜２７から選択される配列とのある特定の程度の配列同一性を共有する阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤バリアント）は、好ましくは、それぞれの参照配列との１００％未満の配列同一性を共有する。
【００４３】
前記定義を考慮して、また、明確化のために、好ましくは、配列番号１〜２７を含むＪＮＫ阻害剤の変化したバリアントでなくてもよい残基（上記定義のａ）及びｂ）を参照されたい）は、表１中で下線を付される。
【００４４】
非同一のアミノ酸は、好ましくは、保存的アミノ酸置換の結果である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換は、群のメンバー間での置換が分子の生物活性を保持するような、十分に類似する物理化学的特性を有する群内のアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，  Ｒ．（１９７４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８５、８６２〜８６４頁を参照されたい）。特に、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、アミノ酸が同じクラスのアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、正又は負に荷電した側鎖を有するアミノ酸、側鎖中に芳香族基を有するアミノ酸、水素架橋に進入することができる側鎖、例えば、ヒドロキシル機能を有する側鎖を有するアミノ酸など）を起源とする置換である。保存的置換は、本発明の場合、例えば、塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）を別の塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）に置換すること、脂肪族アミノ酸残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）を別の脂肪族アミノ酸残基に置換すること、芳香族アミノ酸残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を別の芳香族アミノ酸残基に置換すること、トレオニンをセリンで、又はロイシンをイソロイシンで置換することである。更なる保存的アミノ酸交換は、当業者には公知である。好ましくは、異性体形態を維持するべきであり、例えば、Ｋは好ましくはＲ又はＨに置換され、ｋは好ましくはｒ及びｈに置換される。
【００４６】
ＪＮＫ阻害剤バリアントに関する上記定義内の更なる可能な置換は、例えば、以下のものである：
ａ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及び／又はＸ８の１つ、２つ又はそれ以上若しくは配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置がＡ又はａに置換される；
ｂ）配列番号１のＸ１若しくはＸ８又は配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置が欠失される；
ｃ）配列番号１のＸ５又は配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置がＥ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｆ又はＫである；
ｄ）配列番号１のＸ５又は配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置がＥ、Ｌ、Ｖ、Ｆ又はＫである；又は
ｅ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３の１、２若しくは３つ又は配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置が天然アミノ酸である。
【００４７】
本明細書で使用される用語「配列同一性％」は、以下のように理解する必要がある：配列間の最大相関を得るよう、比較しようとする２つの配列を整列させる。これは、一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入して、アラインメントの程度を増強することを含んでもよい。次いで、同一性％を、比較されるそれぞれの配列の全長にわたって（いわゆるグローバルアラインメント）（これは、同じか、若しくは類似する長さの配列にとって特に好適である）又はより短い規定の長さにわたって（いわゆるローカルアラインメント）決定することができる（これは、等しくない長さの配列にとってより好適である）。上記の状況において、クエリアミノ酸配列に対する少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列の配列が、対象アミノ酸配列がクエリアミノ酸配列のそれぞれの１００アミノ酸あたり最大５個のアミノ酸変化を含んでもよいことを除いて、クエリ配列と同一であることを意味することが意図される。換言すれば、クエリアミノ酸配列に対する少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸配列を得るために、対象配列中の最大５％（１００個のうちの５個）のアミノ酸残基を、挿入するか、又は別のアミノ酸で置換するか、又は欠失させてもよい。配列同一性を決定するために、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への置換（及びその逆）は、それが単に全く同じアミノ酸のＤ−（又はＬ−異性体）である場合であっても、非同一の残基をもたらすと考えられる。
【００４８】
２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野で周知である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを使用することによって決定することができる。使用することができる数学的アルゴリズムの好ましいが非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０：５８７３〜５８７７頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブサイトのＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能なＢＬＡＳＴ又はＮＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０頁又はＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５：３３８９〜３４０２頁も参照されたい）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３、６３〜９８頁；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５、２４４４〜２４４８頁）中に組み込まれている。ある特定の程度まで他の配列と同一である配列を、これらのプログラムにより同定することができる。更に、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３８７〜３９５頁）中で利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰプログラムを使用して、２つのポリペプチド配列間の同一性％を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７、１９５〜１９７頁）の「部分的相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最良の単一領域を発見するものである。
【００４９】
確かに、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、本明細書で定義されるＪＮＫ活性を阻害する能力が失われていない限り、上記の阻害的（ポリ）ペプチド配列に加えて、更なる配列又は配列エレメント、ドメイン、標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識）、エピトープなどを含んでもよい。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、トランスポーター配列を含んでもよい。本明細書で使用される「トランスポーター配列」は、生体膜を横断して結合する分子の転位を提供する（ポリ）ペプチド配列である。したがって、トランスポーター配列を含む本発明によるＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、生体膜を横断して転位することができる（例えば、コンジュゲートしたカーゴ化合物）。したがって、本発明のそのようなＪＮＫ阻害剤は、細胞、細胞内コンパートメント、及び／又は細胞の核により容易に進入することができる。
【００５０】
前記トランスポーター配列は、例えば、好ましくは共有結合により、ＪＮＫ阻害剤の阻害的（ポリ）ペプチド配列のＮ末端に（例えば、直接的に）又はＣ末端に（例えば、直接的に）連結することができる。また、トランスポーター配列と阻害的（ポリ）ペプチド配列は、離れた位置にあってもよく、例えば、中間配列又はリンカー配列により隔てられていてもよい。また、特に、ＪＮＫ阻害剤がより複雑な分子（例えば、いくつかのドメインを含む、多量体コンジュゲートなどである）である場合、トランスポーター配列は、ＪＮＫ阻害剤分子中の全体として阻害的（ポリ）ペプチド配列とは他の場所に位置してもよいことも企図される。また、トランスポーター配列と阻害的（ポリ）ペプチド配列は重複してもよいことも企図される。しかしながら、ＪＮＫ阻害的部分のＪＮＫ阻害活性を維持する必要がある。そのような重複する場合の例は、以下に更に記載される。
【００５１】
本発明のＪＮＫ阻害剤と共に使用するためのトランスポーター配列は、限定されるものではないが、ＨＩＶ  ＴＡＴ（ＨＩＶ）、例えば、ＴＡＴタンパク質（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０４，６０４号及び第５，６７４，９８０号に記載されている）などの天然タンパク質、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペスウイルス（Herpes  simplex））（例えば、ＷＯ９７／０５２６５；Ｅｌｌｉｏｔｔ及びＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜２３３頁（１９９７）に記載されている）、非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１〜１０６９５頁（１９９２））に由来するトランスポーター配列、アンテナペディア、特にドロソフィラ・アンテナペディア（Drosophila  antennapedia）（例えば、そのアンテナペディア担体配列）、ＦＧＦ、ラクトフェリンなど、又は塩基性ペプチド、例えば、少なくとも５若しくは少なくとも１０若しくは少なくとも１５アミノ酸、例えば、５〜１５アミノ酸、好ましくは１０〜１２アミノ酸の長さを有するペプチドに由来するトランスポーター配列から選択することができる。そのようなトランスポーター配列は、好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％若しくは更には９０％の塩基性アミノ酸、例えば、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンを含むか、又は例えば、ＶＰ２２に由来する、ＰＴＤ−４タンパク質若しくはペプチドに由来する、ＲＧＤ−Ｋ１６に由来する、ＰＥＰＴ１／２若しくはＰＥＰＴ１／２タンパク質若しくはペプチドに由来する、ＳｙｎＢ３若しくはＳｙｎＢ３タンパク質若しくはペプチドに由来する、ＰＣ阻害剤に由来する、Ｐ２１由来タンパク質若しくはペプチドに由来する、又はＪＮＫ１タンパク質若しくはペプチドに由来する、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ９；配列番号１５２）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ８；配列番号１５３）、ＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ７；配列番号１５４）、ＲＲＲＲＲＲ（Ｒ６、配列番号１５５）、ＲＲＲＲＲ（Ｒ５、配列番号１５６）などのアルギニンに富むペプチド配列から選択することができる。
【００５２】
本発明のＪＮＫ阻害剤における使用のためのトランスポーター配列の例は、特に、限定されるものではないが、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する塩基性トランスポーター配列である。好ましくは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質の塩基性トランスポーター配列は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０４，６０４号及び第５，６７４，９８０号に記載された、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する配列を含んでもよい。この状況において、完全長ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質は、ＨＩＶ  ＴＡＴ遺伝子の２個のエクソンによりコードされる８６個のアミノ酸残基を有する。ＴＡＴアミノ酸１〜７２はエクソン１によりコードされ、アミノ酸７３〜８６はエクソン２によりコードされる。完全長ＴＡＴタンパク質は、２個のリシン及び６個のアルギニンを含有する塩基性領域（アミノ酸４９〜５７）と、７個のシステイン残基を含有するシステインリッチ領域（アミノ酸２２〜３７）により特徴づけられる。塩基性領域（すなわち、アミノ酸４９〜５７）は、核局在化にとって重要であると考えられた。Ｒｕｂｅｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１〜８頁（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３  １１８１〜１１８７頁（１９８９）。システインリッチ領域は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで金属結合ダイマーの形成を媒介し（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：７０〜７３頁（１９８８）；Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：６２９７〜６３００頁（１９８８））、トランス活性化因子としてのその活性にとって必須である（Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３１４３頁（１９８８）；Ｓａｄａｉｅ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１頁（１９８９））。他の調節タンパク質と同様、Ｎ末端領域は細胞内プロテアーゼに対する保護に関与してもよい（Ｂａｃｈｍａｉｒ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ５６：１０１９〜１０３２頁（１９８９））。本発明のＪＮＫ阻害剤における使用のための好ましいＴＡＴトランスポーター配列は、好ましくは、ＴＡＴ塩基性領域アミノ酸配列（天然のＴＡＴタンパク質のアミノ酸４９〜５７）の存在；ＴＡＴシステインリッチ領域アミノ酸配列（天然のＴＡＴタンパク質のアミノ酸２２〜３６）の非存在及びＴＡＴエクソン２によりコードされるカルボキシ末端ドメイン（天然のＴＡＴタンパク質のアミノ酸７３〜８６）の非存在により特徴づけられる。より好ましくは、本発明のＪＮＫ阻害剤中のトランスポーター配列を、ＴＡＴ残基４８〜５７若しくは４９〜５７を含有するアミノ酸配列又はそのバリアントから選択することができる。
【００５３】
好ましくは、所与の本発明のＪＮＫ阻害剤中のトランスポーター配列は、例えば、プロテアーゼに対する安定性を改善するために、Ｄ−アミノ酸も示す。特に好ましくは、Ｄ−及びＬ−アミノ酸を変化させる特定の順序を示すトランスポーター配列である。Ｄ−及びＬ−アミノ酸を変化させるそのような順序（モチーフ）は、限定されるものではないが、配列番号２８〜３０のいずれか１つのパターンに従ってもよい：
ｄｌＬＬＬｘｄｍＬＬＬｙｄｎ（配列番号２８）；
ｄＬＬＬｄ（ＬＬＬｄ）ａ（配列番号２９）；及び／又は
ｄＬＬＬｄＬＬＬｄ（配列番号３０）；
（式中、
ｄはＤ−アミノ酸であり；
ＬはＬ−アミノ酸であり；
ａは０〜３、好ましくは０〜２、より好ましくは０、１、２又は３、更により好ましくは０、１、又は２、最も好ましくは１であり；
ｌ、ｍ及びｎは互いに独立に１又は２、好ましくは１であり；
ｘ及びｙは互いに独立に０、１又は２、好ましくは１である）。
【００５４】
Ｄ−及びＬ−アミノ酸の前記順序（モチーフ）は、トランスポーター配列が合成される時、関連するようになる、すなわち、アミノ酸配列（すなわち、側鎖残基の型）は未変化のままであるが、それぞれの異性体は代替される。例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴに由来する公知のトランスポーター配列は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４３）である。それへの配列番号３０のＤ−／Ｌ−アミノ酸順序の適用により、ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ（配列番号４６）が得られる。
【００５５】
特定の実施形態においては、本発明のＪＮＫ阻害剤のトランスポーター配列は、ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）：
（式中、
ｒはＤ−鏡像異性アルギニンであり；
Ｘは任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含む）であり；
それぞれのＸは個別に、また配列番号３１内の他の任意のＸとは独立に選択してもよい）
に記載の少なくとも１つの配列を含んでもよい。好ましくは、配列番号３１内の前記６個のＸのＬ−アミノ酸のうちの少なくとも４個は、Ｋ又はＲである。別の実施形態においては、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、トランスポーター配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３２）（式中、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は互いに独立に選択される任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含む）である）を含む。同様に、本発明によるＪＮＫ阻害剤のトランスポーター配列は、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３３）（式中、Ｘ４はＱであり、Ｘ５はＲであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに独立に選択される任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含む）である）を含んでもよい。本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３４）（式中、１、２、３、４、５又は６個のＸアミノ酸残基は、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＫであり、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＱであり、Ｘ５がＲであり、Ｘ６がＲである、からなる群から選択されるが、上記の基から選択されなかった残りのＸアミノ酸残基は任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含む）であってもよく、互いに独立に選択される。Ｘ１は、次いで、好ましくはＹであり、及び／又はＸ４は好ましくはＫ若しくはＲである。
【００５６】
本発明のＪＮＫ阻害剤分子中での使用のためのトランスポーター配列の例を、限定されるものではないが、以下の表２に与えられる配列（配列番号３１〜１７０）又はその任意の断片若しくはバリアント若しくは化学的に改変された誘導体（好ましくは、それは生体膜を横断して転位する機能を保持する）から選択することができる。
【００５７】
【表２−１】
2017520569.tif 000003
【表２−２】
2017520569.tif 000004
【表２−３】
2017520569.tif 000005
【表２−４】
2017520569.tif 000006
【表２−５】
2017520569.tif 000007
【００５８】
上記のように、トランスポーター配列を、表２の上記配列の断片又はバリアントから選択することもできる（但し、そのような断片又はバリアントは、好ましくは生体膜を横断する転位を提供する機能を保持する）。この特定の状況において、これらのトランスポーター配列のバリアント及び／又は断片は、好ましくは、表２に定義されたそのようなトランスポーター配列との、配列の全長にわたって、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。この特定の状況において、表２に定義されたトランスポーター配列の「断片」は、好ましくは、そのトランケートされた配列、すなわち、元の配列のアミノ酸配列と比較してＮ末端、Ｃ末端及び／又は配列内的にトランケートされたアミノ酸配列と理解されるべきである。
【００５９】
更に、上記で定義されたトランスポーター配列又はその断片の「バリアント」は、好ましくは、バリアントのアミノ酸配列が、１つ又は複数の置換（又は必要に応じて、挿入及び／又は欠失）されたアミノ酸などの、１つ又は複数の突然変異において、本明細書に定義される元のトランスポーター配列又はその断片と異なる配列と理解されるべきである。好ましくは、上記に定義されたそのようなトランスポーター配列のバリアントは、それぞれの元の配列と比較して同じ生物学的機能又は特異的活性を有する、すなわち、例えば、細胞又は核への輸送を提供する。この状況において、上記で定義されたそのようなトランスポーター配列のバリアントは、例えば、約１〜５０、１〜２０、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５、４、３、２又は１個のアミノ酸の変更を含んでもよい。上記で定義されたそのようなトランスポーター配列のバリアントは、好ましくは、保存的アミノ酸置換を含んでもよい。保存的アミノ酸置換の概念は、当技術分野で公知であり、ＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列について既に上記されており、したがって、ここでも適用される。
【００６０】
本発明のＪＮＫ阻害剤中に組み込まれるトランスポーター配列の長さは変化してもよい。一部の実施形態においては、本発明によるＪＮＫ阻害剤のトランスポーター配列は１５０個未満、１４０個未満、１３０個未満、１２０個未満、１１０個未満、１００個未満、９０個未満、８０個未満、７０個未満、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、及び／又は１０個未満のアミノ酸長であることが企図される。
【００６１】
当業者は、特定のトランスポーター配列が本発明によるＪＮＫ阻害剤の状況において依然として機能的であるかどうかを、容易に決定することができる。例えば、トランスポータードメインを含むＪＮＫ阻害剤を、細胞中で容易に検出することができる標識、例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、放射性標識、酵素、フルオロフォア、エピトープなどに融合することができる。次いで、トランスポーター配列と標識とを含むＪＮＫ阻害剤を、細胞中にトランスフェクトするか、又は培養上清に添加し、生物物理学的及び生化学的な標準的な方法（例えば、フローサイトメトリー、（免疫）蛍光顕微鏡など）を使用することにより、細胞膜の透過をモニタリングすることができる。
【００６２】
トランスポーター配列を含む本発明によるＪＮＫ阻害剤の特定例を、表３に記載する。
【００６３】
【表３】
2017520569.tif 000008
【００６４】
上記のように、本発明の特定の実施形態においては、トランスポーター配列と阻害的（ポリ）ペプチド配列は重複してもよい。換言すれば、トランスポーター配列のＮ末端は阻害的（ポリ）ペプチド配列のＣ末端と重複してもよく、又はトランスポーター配列のＣ末端は阻害的（ポリ）ペプチド配列のＮ末端と重複してもよい。後者の実施形態が特に好ましい。好ましくは、トランスポーター配列は、１、２又は３個のアミノ酸残基により、阻害的（ポリ）ペプチド配列と重複する。そのようなシナリオにおいては、所与のトランスポーター配列は、１位（Ｘ１）、１位及び２位（Ｘ１、Ｘ２）、１位、２位及び３位（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３）で配列番号１又はその対応するバリアントと重複してもよい。
【００６５】
配列番号１７４、１７５、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８８、１８９及び１９０は、トランスポーター配列と阻害的（ポリ）ペプチド配列とが重複する本発明によるＪＮＫ阻害剤の例であり、例えば、ｒＫＫＲｒＱＲＲｒＲＰＴＴＬＮＬｆ（配列番号１７４）は、配列番号４６（下線部）と配列番号１１（斜体部）の重複である。
【００６６】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、配列番号１７１〜１９０に記載のＪＮＫ阻害剤のいずれか１つのバリアントであるＪＮＫ阻害剤から選択することもできる。好ましくは、そのようなバリアントは、配列番号１７１〜１９０、特に配列番号１７２の配列と少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するが、但し、配列番号１７１〜１９０の前記配列内の阻害的（ポリ）ペプチド配列（配列番号１の参照阻害的（ポリ）ペプチド配列及び配列番号２〜２７の特定例を参照されたい）に関して、そのような配列は、
ａ）阻害的（ポリ）ペプチド配列内の４位にＬ−アルギニン（Ｒ）残基を維持する、
ｂ）阻害的（ポリ）ペプチド配列内の８位及び１０位（配列番号２５〜２７に関しては７位及び９位）に２個のＬ−ロイシン（Ｌ）残基を維持する、
ｃ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７及び／又はＸ８からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置及び配列番号２〜２７中のそれぞれの位置で少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個のＤ−アミノ酸を示す、より好ましくは、配列番号１のＸ３、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置及び配列番号２〜２７中のそれぞれの位置で少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個又は４個のＤ−アミノ酸を示す、並びに
ｄ）ＪＮＫ活性を阻害する（すなわち、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤である）、
配列同一性を有する。
【００６７】
前記定義を考慮して、また、明確化のために、好ましくは配列番号１７１〜１９０を含むＪＮＫ阻害剤のバリアント中で変更されない残基（上記定義におけるａ）及びｂ）を参照されたい）は、表３中で下線を付される。
【００６８】
配列番号１７１〜１９０を含むＪＮＫ阻害剤のバリアント中の非同一のアミノ酸は、好ましくは、保存的アミノ酸置換の結果である（上記を参照されたい）。確かに、上記の更なる可能な置換もまた、配列番号１７１〜１９０を含むＪＮＫ阻害剤のバリアントについて企図される。同様に、本発明は確かに、阻害的（ポリ）ペプチド配列中にない、又は阻害的（ポリ）ペプチド配列中に限定されない元の配列に由来するが、トランスポーター配列中にバリアント残基を示す、配列番号１７１〜１９０に記載のＪＮＫ阻害剤のいずれか１つのバリアントも企図する。トランスポーター配列のバリアント及び断片について、本明細書のそれぞれの開示が関連する。
【００６９】
前記したように、本発明によるＪＮＫ阻害剤のトランスポーター配列及びＪＮＫ阻害的（ポリ）ペプチド配列は、必ずしも互いに直接連結されるとは限らない。それらを、例えば、中間配列又は連結（ポリ）ペプチド配列によって連結することもできる。阻害的（ポリ）ペプチド配列と、トランスポーター配列などの他の（機能的）配列とを分離する好ましい中間配列又は連結配列は、ヘキサマー、ペンタマー、テトラマー、トリペプチド又はジペプチド又は単一のアミノ酸残基のような、１０アミノ酸長未満の短いペプチド配列からなる。特に好ましい中間配列は、全てＬ−アミノ酸形態のみであるか、若しくはＤ−アミノ酸形態のみであるか、又はＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸が混合した、１、２又はそれ以上のコピーのジ−プロリン、ジ−グリシン、ジ−アルギニン及び／又はジ−リシンである。あるいは、他の公知のペプチドスペーサー又はリンカー配列を同様に用いることができる。
【００７０】
本発明による特に好ましいＪＮＫ阻害剤は、配列番号８（又は上記で更に定義された範囲及び制限を有する、配列番号８との配列同一性を共有する配列）と、トランスポーター配列とを含む。トランスポーター配列は、好ましくは、配列番号３１〜１７０のいずれか１つ又は本明細書で定義されたそのバリアント、更により好ましくは、配列番号３１〜３４及び配列番号４６〜１５１のいずれか１つから選択される。本発明によるＪＮＫ阻害剤の特に好ましい実施形態は、配列番号８と配列番号４６（又は上記で定義された範囲及び制限内でそれに対するそれぞれの配列同一性を共有する配列）を含むＪＮＫ阻害剤である。好ましい例は、本明細書で定義されるトランスポーター配列及び／又は阻害的（ポリ）ペプチド配列において変化する配列番号１７２の配列又はそのそれぞれのバリアントを含むＪＮＫ阻害剤である。
【００７１】
更なる態様において、本発明は、
ａ）ＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９１）、ＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９２）、ＲＲＰＴＴＬＮＬＦ及び／又はＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）からなる配列群から選択される配列を含む阻害的（ポリ）ペプチドと、
ｂ）トランスポーター配列、好ましくは、表２に開示されたトランスポーター配列又はそのバリアント／断片から選択される、更により好ましくは、配列番号３１〜３４及び配列番号４６〜１５１又はそのそれぞれのバリアント若しくは断片から選択されるトランスポーター配列と
を含むＪＮＫ阻害剤に関する。
【００７２】
トランスポーター配列と阻害的（ポリ）ペプチド配列は重複してもよい。本発明の前記実施形態のための好ましいトランスポーター配列は、特に、好ましくは、阻害的（ポリ）ペプチド配列のＮ末端に（共有的に）連結された（例えば、直接的に）、配列番号４６のトランスポーター配列である。
【００７３】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（配列番号１９４）、又は配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（配列番号１９５）を含むか、又はそれからなるＪＮＫ阻害剤であってもよい。
【００７４】
更なる態様において、本発明は、ｒＫＫＲｒＱＲｒ（配列番号１４８）、ｒＫＫＲｒＱＲｒＫ（配列番号１４９）、及び／又はｒＫＫＲｒＱＲｒＲ（配列番号１５０）からなる配列群から選択されるトランスポーター配列を含む（ポリ）ペプチドに関する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、本明細書に開示される配列又は所与の配列番号を「含む」は、通常、（少なくとも）１コピーの前記配列が、例えば、ＪＮＫ阻害剤分子中に存在することを意味する。例えば、１つの阻害的（ポリ）ペプチド配列は通常、ＪＮＫ活性の十分な阻害を達成するのに十分なものである。しかしながら、得られる分子がＪＮＫ活性を阻害する全体的な能力が無効化されない限り（すなわち、それぞれの分子が依然として本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤である限り）、２コピー以上のそれぞれの配列（例えば、異なるか、若しくは同じ型の２コピー以上の阻害的（ポリ）ペプチド配列及び／又は異なるか、若しくは同じ型の２コピー以上のトランスポーター配列）を、本発明の（ポリ）ペプチドのために用いることができることが本発明によって企図される。
【００７６】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、当技術分野で周知の方法、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）戦略を使用する固相ペプチド合成による化学的合成、すなわち、Ｆｍｏｃ脱保護とＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングのサイクルの連続周回により取得又は生成することができる。そのようなペプチド合成を提供する市販のサービスは、多くの会社、例えば、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ社（Ｓｔｒａβｂｏｕｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって提供されている。
【００７７】
本発明による使用のためのＪＮＫ阻害剤は、任意選択で、特に、阻害的（ポリペプチド）配列のアミノ酸残基で更に改変してもよい。可能な改変は、例えば、
（ｉ）放射性標識、すなわち、放射性リン酸化又は硫黄、水素、炭素、窒素などを用いる放射性標識；
（ｉｉ）有色色素（例えば、ジゴキシゲニンなど）；
（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）；
（ｉｖ）化学発光基；
（ｖ）固相上への固定のための基（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ビオチン、ストレプタグ、フラッグタグ、抗体、エピトープなど）；
（ｖｉ）ＰＥＧ化；
（ｖｉｉ）グリコシル化；
（ｖｉｉｉ）ヘシル化；
（ｉｘ）プロテアーゼ切断部位（例えば、ＪＮＫ阻害剤の制御放出のため）；
（ｘ）ペプチド主鎖改変（例えば、（ΨＣＨ２−ＮＨ）結合）；
（ｘｉ）アミノ酸側鎖残基の保護；
（ｘｉｉ）Ｎ−及び／又はＣ−末端の保護（例えば、Ｎ末端アミド化又はＣ末端アセチル化）；
（ｘｉｉｉ）（ｉ）〜（ｘｉｉ）の下で記載された２つ以上の要素の組合せ
からなる群の項目（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）の１つ又は複数から選択することができる。
【００７８】
（ｉ）〜（ｘｉ）から選択される改変及び（ｉ）〜（ｘｉ）の下で記載された２つ以上の要素の組合せが特に好ましい。この状況において、本発明は、更なる態様において、（ｉ）〜（ｘｉ）から選択される改変で改変された、又は（ｉ）〜（ｘｉ）の下で記載された２つ以上の要素の組合せで改変された本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤、及びそのような改変されたＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物（以下を参照）に関する。
【００７９】
医薬組成物
本発明に従って定義されたＪＮＫ阻害剤を、本明細書に定義される任意の疾患の予防又は治療において適用することができる医薬組成物に製剤化することができる。典型的には、本発明に従って使用されるそのような医薬組成物は、活性成分として、本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤、特に、本明細書に定義される、配列番号１による阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むか、又はそれからなるＪＮＫ阻害剤を含む。好ましくは、活性化合物は、任意選択で、任意の好適なトランスポーター配列との（共有的）コンジュゲーション（リンカー配列を介する、又はそれを用いない）にある、配列番号２〜２７のいずれか１つの阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むか、又はそれからなるＪＮＫ阻害剤である；トランスポーター配列が結合される場合、配列番号１７１〜１９０のいずれか１つに記載の配列のいずれか、又は本明細書で定義されるそのバリアント、好ましくは、配列番号１７２の配列、又は本明細書で定義されるそのバリアントを選択することができる。
【００８０】
本発明の発明者らは、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤が、特に、トランスポーター配列に融合された場合、本発明の疾患に関与する細胞中への特に顕著な取込み率を示すことを更に見出した。したがって、対象に投与される医薬組成物中のＪＮＫ阻害剤の量を、限定されるものではないが、その組成物内で低用量に基づいて用いることができる。したがって、投与される用量は、ＤＴＳ−１０８などの、当技術分野で公知のペプチド薬（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｍｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８、２１４５〜５３頁）についてよりもはるかに低いものであってもよい。それにより、例えば、潜在的な副反応の軽減及び費用の軽減が、本発明の（ポリ）ペプチドによって達成される。
【００８１】
好ましくは、例えば、対象に１日ベースで投与される（体重１ｋｇあたりの）用量は、約１０ｍｍｏｌ／ｋｇまで、好ましくは約１ｍｍｏｌ／ｋｇまで、より好ましくは約１００μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは約１０μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは約１μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは約１００ｎｍｏｌ／ｋｇまで、最も好ましくは約５０ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲にある。
【００８２】
したがって、用量範囲は、好ましくは、約０．０１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約０．１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１．０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は前記値のいずれか２つの組合せであってもよい。
【００８３】
この状況において、上記医薬組成物を使用する場合の処置の処方、例えば、用量に関する決定などは、典型的には、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び医師に公知の他の因子を考慮に入れる。上記の技術及びプロトコールの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）、１９８０に見出すことができる。したがって、本発明に従って使用される医薬組成物の成分に関する「安全かつ有効な量」は、本明細書に定義されるＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の正の改変を有意に誘導するのに十分である、これらの化合物の各々又は全部の量を意味する。しかしながら、同時に、「安全かつ有効な量」は、重篤な副作用を回避する、すなわち、利益とリスクとの合理的な関係を許容する程度に十分に少ないものである。これらの限界の決定は、典型的には、合理的な医学的判断の範囲内にある。そのような成分の「安全かつ有効な量」は、付随する医師の知識及び経験の範囲内で、処置しようとする特定の状態、また、処置しようとする患者の年齢及び身体状態、状態の重症度、処置の期間、付随する療法の性質、使用される特定の薬学的に許容される担体の性質、並びに同様の因子に関連して変化する。本発明による医薬組成物は、ヒトのために、また、獣医学的目的のために本発明に従って使用することができる。
【００８４】
本発明に従って使用される医薬組成物は、１つ又は複数のＪＮＫ阻害剤に加えて、当業者に周知の（適合性の）薬学的に許容される担体、賦形剤、バッファー、安定剤又は他の材料を更に含んでもよい。
【００８５】
これに関連して、「（適合性の）薬学的に許容される担体」という表現は、好ましくは、液体又は非液体ベースの組成物を含む。用語「適合性」とは、本明細書で使用される医薬組成物の構成要素が、通常の使用条件下で組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が起こらないような様式で、上記に定義された薬学的に活性な成分及び１つの別の成分と混合され得ることを意味する。薬学的に許容される担体は、勿論、それらを、処置される人への投与にとって好適なものにするのに十分に高い純度及び十分に低い毒性を有する必要がある。
【００８６】
本明細書で使用される医薬組成物が液体形態にある場合、薬学的に許容される担体は、典型的には、１つ又は複数の（適合性の）薬学的に許容される液体担体を含む。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される液体担体として、例えば、発熱源を含まない水；等張性食塩水、すなわち、０．９％ＮａＣｌの溶液、又は緩衝化（水性）溶液、例えば、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液など、例えば、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びカカオ由来油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸などを含んでもよい。特に、本明細書で使用される医薬組成物の注射及び／又は輸注のために、バッファー、好ましくは、水性バッファー、及び／又は０．９％ＮａＣｌを使用することができる。
【００８７】
本明細書で使用される医薬組成物が固体形態で提供される場合、薬学的に許容される担体は、典型的には、１つ又は複数の（適合性の）薬学的に許容される固体担体を含む。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される固体担体として、例えば、１つ若しくは複数の適合性の固体若しくは液体充填剤若しくは希釈剤を含んでもよく、又は人への投与にとって好適である、封入化合物を同様に使用することができる。そのような（適合性の）薬学的に許容される固体担体のいくつかの例は、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；例えば、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプンなどのデンプン；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末化トラガカント；モルト；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固形流動促進剤；硫酸カルシウムなどである。
【００８８】
（適合性の）薬学的に許容される担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存してもよい。（適合性の）薬学的に許容される担体の選択は、したがって、原理的には本発明に従って使用される医薬組成物が投与される様式によって決定することができる。様々な可能な投与経路は、参照により本明細書に組み込まれるＦＤＡの「投与経路」一覧（ＦＤＡ：Ｄａｔａ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  −  Ｄｒｕｇ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  −  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ−ＤＲＧ−００３０１；Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ００４）に列挙されている。特に、非ヒト動物のための適切な投与経路を選択するための更なる指針を、これも参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｒｎｅｒ  ＰＶら（２０１１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．５０、Ｎｏ  ５、６００〜６１３頁に見出すことができる。投与経路に関する好ましい例としては、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、若しくは経皮経路などの非経口経路（例えば、注射による）、又は経口、若しくは直腸経路などの経腸経路、経鼻、若しくは鼻内経路などの局部経路、又は表皮経路若しくはパッチ送達などの他の経路が挙げられる。また、（特に、眼に関連する疾患については）滴下、硝子体内、及び結膜下投与も企図される。同様に、投与は、例えば、耳に関連する疾患を処置する場合はいつでも、鼓室内で行ってもよい。
【００８９】
本発明に従って使用される医薬組成物は、例えば、全身的に投与することができる。一般に、全身投与のための経路としては、例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、又は経粘膜経路などの非経口経路（例えば、注射及び／又は輸注による）、並びに経口、消化管又は直腸経路などの経腸経路（例えば、錠剤、カプセル、坐剤として、栄養管、胃瘻造設術による）が挙げられる。全身投与により、システム全体の作用を達成することができ、非常に都合のよいことが多いが、状況に応じて、望ましくない「副作用」も誘発し得る、及び／又は局所投与と比較してより高濃度の本発明によるＪＮＫ阻害剤が必要となり得る。全身投与は一般に、そのシステム全体の作用のため、本明細書に記載の疾患／障害の予防及び／又は治療にとって適用可能である。全身投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、経口及び直腸投与であり、静脈内及び経口投与が特に好ましい。
【００９０】
本発明に従って使用される医薬組成物は、例えば、局部的、例えば、局所的に投与することもできる。局所投与は、典型的には、皮膚又は粘膜などの体表面への適用を指すが、より一般的な用語「局部投与」は、身体の特定の部分での、及び／又はそれへの適用を更に含む。局所適用は、本明細書に定義される皮膚及び／又は皮下組織の疾患及び／又は障害並びにある特定の口腔疾患及び／又は粘膜と関連する、若しくは粘膜によって接近可能である疾患の治療及び／又は予防にとって特に好ましい。
【００９１】
局部投与のための経路としては、例えば、経鼻、又は鼻内経路などの吸入経路、眼科用薬物及び耳用薬物、例えば、点眼薬及び点耳薬、体内の粘膜を介する投与など、又は表皮経路、経皮経路（皮膚への適用）又はパッチ送達などの他の経路、並びに他の局部適用、例えば、治療しようとする臓器又は組織への注射及び／又は輸注などが挙げられる。局部投与においては、副作用は典型的には大部分回避される。ある特定の投与経路、例えば、吸入は、局部効果と全身効果の両方を提供することができることは注目すべきである。
【００９２】
本発明に従って使用される医薬組成物のための投与経路を、予防又は治療しようとする疾患／障害に応じて、望ましい適用位置に従って選択することができる。
【００９３】
例えば、経腸投与は、適用位置としての消化管を指し、経口（ｐ.ｏ．）、消化管及び直腸投与を含み、それにより、これらのものは典型的には全身投与経路であり、一般に、本明細書に記載の疾患の予防／治療に適用可能である。更に、本明細書に記載される消化管の疾患／障害、例えば、消化管の炎症疾患、代謝疾患、特に、消化管のがん及び腫瘍疾患などを予防及び／又は治療するためには、経腸投与が好ましい。例えば、経口経路は通常、患者にとって最も簡便であり、かかる費用が最も低い。したがって、経口投与は、適用可能な場合、簡便な全身投与として好ましい。経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態にあってもよい。錠剤は、ゼラチンなどの上記で定義された固体担体と、任意選択でアジュバントとを含んでもよい。経口投与のための液体医薬組成物は一般に、水、鉱油、動物又は植物油、鉱油又は合成油などの、上記で定義された液体担体を含んでもよい。生理食塩溶液、デキストロース又は他のサッカリド溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有させてもよい。
【００９４】
更に、経腸投与はまた、腸に達しない消化管に近い適用位置、例えば、舌下、唇下、頬又は歯肉内適用も含む。そのような投与経路は、口腔病学、すなわち、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防することができる口腔の疾患／障害、例えば、一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；インプラント周囲炎；一般的な歯周炎、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵攻性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；並びに／又は顎関節障害における適用にとって好ましい。これらの投与経路によって本発明に従って治療及び／又は予防される特に好ましい疾患は、歯周炎、特に、慢性歯周炎、粘膜炎、口腔剥離性障害、口腔扁平苔癬、尋常性天疱瘡、歯髄炎、口内炎、顎関節障害、及びインプラント周囲炎から選択される。
【００９５】
例えば、歯茎（歯肉）への注射による、例えば、歯肉内投与が、例えば、歯周炎を予防及び／又は治療するための口腔病学適用において好ましい。例えば、口腔の障害／疾患、特に、歯周炎を、１００ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの（体重１ｋｇあたり）用量の本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む上記で定義された医薬組成物の舌下、唇下、頬又は歯肉内適用、特に、歯肉内適用によって予防又は治療することができる。
【００９６】
あるいは、本明細書に記載の口腔の疾患を、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤又はそれぞれの医薬組成物の全身投与、好ましくは、局所投与によって治療及び／又は予防することもできる。
【００９７】
更に、経腸投与はまた、厳密な経腸投与、すなわち、腸への直接的投与も含み、全身並びに局部投与のために用いることができる。
【００９８】
更に、本発明による疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療において使用される、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することができる。そのような投与経路は、特に、硬膜外（ペリデュラル）、ＣＳＦ内（脳脊髄液内）、脳室内（イントラベントリキュラー）、くも膜下及び大脳内投与、例えば、特定の脳領域への投与を含み、それにより、血液脳関門に関する問題を回避することができる。処置しようとする疾患／障害が本明細書で特定される神経疾患、神経系疾患及び／又は神経変性疾患である場合、そのようなＣＮＳ投与経路が好ましい。
【００９９】
更に、本発明による疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療において使用される、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、眼に、眼の中に、又は眼の上に投与することができる。そのような投与経路は、局所、例えば、結膜上に適用される点眼、並びに、例えば、注射、輸注及び／又は滴下による硝子体内（ＩＶＴ）、結膜下、及び後方強膜近傍（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）投与並びに／又は局部持続放出薬物送達（例えば、結膜下経路の場合）を含み、それにより、点眼（局所適用のため）、硝子体内（ＩＶＴ）及び結膜下投与経路が特に好ましい。結膜下経路は、硝子体内経路よりも安全で侵襲性が低いが、硝子体内経路は、結膜及び眼窩の血管及び組織の存在のため、結膜下経路よりも全身曝露が少ない。
【０１００】
眼への／眼の中への局部投与は、本明細書に開示される治療及び／又は予防しようとする眼に関連する疾患／障害、例えば、特に、滲出型又は非滲出型の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜色素線条；前部虚血性視神経症；前部ブドウ膜炎；白内障、特に、加齢型白内障；中心性滲出性脈絡網膜症；中心性漿液性網脈絡膜症；霰粒腫；先天性脈絡膜欠如；脈絡膜炎；脈絡膜硬化症；結膜炎；毛様体炎；糖尿病性網膜症；ドライアイ症候群；眼内炎；上強膜炎；眼感染症；白点状眼底；脳回転状網膜脈絡膜萎縮；麦粒腫；眼瞼の炎症疾患；脈絡膜の炎症疾患；毛様体の炎症疾患；結膜の炎症疾患；角膜の炎症疾患；虹彩の炎症疾患；涙腺の炎症疾患；眼窩骨の炎症疾患；強膜の炎症疾患；硝子体の炎症疾患；ブドウ膜の炎症疾患；網膜の炎症疾患；中間部ブドウ膜炎；虹彩炎（ｉｒｉｔｉｔｉｓ）；角膜炎；レーバー病；多巣性脈絡膜炎；眼筋の筋炎；新生血管黄斑症（例えば、高度近視、傾斜乳頭症候群、脈絡膜骨腫などにより引き起こされる）；ＮＭＤＡ誘導性網膜毒性；非慢性又は慢性炎症性眼疾患；小口病；視神経疾患；眼窩蜂巣炎；全眼球炎；全ブドウ膜炎；後発白内障；後嚢混濁（ＰＣＯ）（白内障術後合併症）；後部ブドウ膜炎；眼内炎症、特に、術後眼内炎症；増殖性硝子体網膜症；網膜動脈閉塞；網膜剥離；網膜疾患；網膜傷害；網膜細動脈瘤；網膜色素上皮剥離；網膜静脈閉塞；網膜炎；網膜色素変性；白点状網膜炎；網膜症、特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症；強膜炎；スタルガルト病；炎症化した眼外傷及び／又は眼外傷端部の処置；眼の手術又は外傷後の眼内炎症の処置；ブドウ膜炎；卵黄様黄斑ジストロフィーなどにとって特に好ましい。
【０１０１】
ドライアイの処置のために、涙液欠乏性ドライアイ又は涙液蒸発性ドライアイ疾患に対処するのが好ましい。涙液欠乏性ドライアイは、シェーグレン症候群ドライアイ又は非シェーグレン症候群ドライアイを指してもよい。非シェーグレン症候群ドライアイは、一次若しくは二次涙腺機能不全又は涙腺管の閉塞により引き起こされ得る。涙液蒸発性ドライアイは、内在性の原因、例えば、マイボーム腺機能不全、低い瞬目率若しくは瞼裂の障害、又は外来性の原因、例えば、眼表面障害、レンズ着用若しくはアレルギー性鼻炎を有し得る。特に、シェーグレン又は非シェーグレンドライアイ症候群は、本発明によって処置される。
【０１０２】
特に、ドライアイ症候群、ブドウ膜炎、特に、前部及び／又は後部ブドウ膜炎、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型及び非滲出型のＡＭＤ、網膜症、特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症、並びに術後又は外傷後の眼炎症、特に、術後又は外傷後の眼内炎症は、好ましくは、滴下、例えば、点眼薬による眼の中への及び／又は眼の上への局部投与並びに／又は例えば、注射若しくは滴下による硝子体内及び／又は結膜下投与により、本発明に従って使用されるＪＮＫ阻害剤によって予防及び／又は治療される。滴下投与、例えば、点眼薬、及び／又は例えば、注射による結膜下投与は、好ましい投与経路である。
【０１０３】
これらの投与経路について、特に、滴下、例えば、点眼薬、硝子体内及び／又は結膜下投与について、本発明によるそれぞれの医薬組成物は、好ましくは、１０ｎｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、更により好ましくは１μｇ〜５ｍｇ、特に好ましくは１００μｇ〜１ｍｇの範囲、例えば、０．１、０．２又は０．４ｍｇの眼あたりの用量の本発明によるＪＮＫ阻害剤、好ましくは、配列番号１７２の配列に記載のＪＮＫ阻害剤を含む。そのような用量の単回投与又はより多くの投与、特に、２、３、４若しくは５回投与が好ましく、その後の用量を処置スケジュールの異なる日に投与することができる。
【０１０４】
例えば、ヒトにおける硝子体内及び／又は結膜下投与については、ＪＮＫ阻害剤の単回用量（眼あたり）は、好ましくは、１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１．５ｍｇ、より好ましくは５００μｇ〜１μｇ、最も好ましくは８００μｇ〜１ｍｇの範囲にある。特に、結膜下注射のための注射容量は、例えば、１００μｌ〜５００μｌ、例えば、２５０μｌであってもよい。
【０１０５】
ヒトにおける滴下、例えば、点眼薬については、ＪＮＫ阻害剤の単回用量（眼あたり）は、好ましくは、１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜１．５ｍｇ、より好ましくは５０μｇ〜１ｍｇ、最も好ましくは１００μｇ〜６００μｇの範囲にある。滴下による治療及び／又は予防においては、単回用量又は反復用量は、数週間、好ましくは２〜４週間、より好ましくは３週間にわたって、好ましくは、毎日、例えば、１日２〜４回を毎日、好ましくは１日３回を毎日投与することができる。そのような投与は、例えば、ドライアイ症候群を治療及び／又は予防するのに特に有用である。
【０１０６】
特に、点眼薬としての局所眼投与については、必要に応じて、両眼又は一方の眼のみに適用することができ、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物は、典型的には、溶液、好ましくは、例えば、（滅菌）０．９％ＮａＣｌを含む眼科用溶液である。そのような医薬組成物は、特に、０．００１％〜１０％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、好ましくは０．０１％〜５％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、より好ましくは０．０５％〜２％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、更により好ましくは０．１％〜１％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤を含む。前記点眼薬は、１回又は反復的に投与してもよく、反復投与が好ましい。一般に、投与は、必要性に依存し、例えば、要求に応じてもよい。反復投与においては、後の用量を、処置スケジュールの異なる日に投与してもよく、同じ日に、単回用量又は１回より多い単回用量、特に、２、３、４又は５、好ましくは２又は３回用量を投与してもよく、そのような反復投与は、好ましくは、１又は複数の時間、例えば、２、３、４、５、６、７又は８時間の間隔を空ける。
【０１０７】
更に、本明細書に記載の眼疾患は、勿論、本発明によるＪＮＫ阻害剤の全身適用によって治療及び／又は予防することもできる（本明細書に記載の他の疾患／障害にも適用される）。眼疾患における全身投与、特に、静脈内投与のための用量は、好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの範囲である。そのような用量は、例えば、ブドウ膜炎を治療及び／又は予防するのに特に有用であり、処置スケジュールは単回用量又は反復用量を含んでもよく、後の用量を処置スケジュールの異なる日に投与してもよい。
【０１０８】
例えば、ブドウ膜炎の治療及び／又は予防において、特に、静脈内で、１回より多い用量を適用する場合、その用量は、典型的には、少なくとも１日の間隔、好ましくは少なくとも２日の間隔、より好ましくは少なくとも３日の間隔、更により好ましくは少なくとも４日、少なくとも５日、又は少なくとも６日の間隔、特に好ましくは少なくとも１週間の間隔、最も好ましくは少なくとも１０日の間隔を空ける。
【０１０９】
典型的には、予防及び／又は治療しようとする疾患並びにそれぞれの薬物動態に従って選択される、本発明によるＪＮＫ阻害剤の使用のための他の投与経路としては、限定されるものではないが、例えば、特に、乾癬、湿疹、皮膚炎、座瘡、口腔内潰瘍、紅斑、扁平苔癬、サルコイドーシス、血管炎、及び成人線状ＩｇＡ病から選択される、本明細書で定義される（本明細書に記載される）皮膚疾患のための経皮適用（皮膚上への）及び／又は病変内適用（皮膚病変中への）；例えば、呼吸器系の疾患及び特に、肺疾患、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、呼吸器系を含む慢性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、炎症性肺疾患、肺炎、及び肺線維症のための経鼻投与；例えば、関節炎、特に、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎及び関節リウマチ、並びに関節症、及び変形性関節症における関節内投与（関節腔への）；例えば、泌尿器系、特に、膀胱の疾患のための膀胱内投与（すなわち、膀胱への）；心臓内投与、静脈内投与、膣内投与、及び皮内投与が挙げられる。
【０１１０】
一般に、投与方法は、上記の様々な因子、例えば、選択される薬学的担体及び薬学的調製物（例えば、液体、錠剤などとしての）の性質並びに投与経路に依存する。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物を、液体として、例えば、０．９％ＮａＣｌ中の本発明によるＪＮＫ阻害剤の溶液として調製することができる。液体医薬組成物を、様々な方法により、例えば、スプレー（例えば、吸入、鼻内などの経路のため）として、局所適用のための流体として、ボーラス注射などの注射により、例えば、ポンプを使用する輸注により、滴下によるだけでなく、ｐ．ｏ．により、例えば、ドロップ又は飲用溶液として、パッチ送達系などにおいて投与することができる。したがって、投与のために、特に、注射及び／又は輸注のために、様々なデバイス、例えば、注射筒（予め充填された注射筒など）；注射デバイス（例えば、ＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥＴ（商標）及びＧＥＮＪＥＣＴＴ（商標）デバイス）；輸注ポンプ（例えば、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）など）；インジェクターペン（ＧＥＮＰＥＮＴ（商標）など）；無針デバイス（例えば、ＭＥＤＤＥＣＴＯＲ（商標）及びＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；又は自己注射器を使用することができる。
【０１１１】
使用される医薬組成物の好適な量は、動物モデルを用いる日常的な実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、限定されるものではないが、例えば、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、スナネズミ、ブタ、及び非ヒト霊長類モデルが挙げられる。投与のため、特に、注射及び／又は輸注のための好ましい単位剤形としては、水、生理食塩水又はその混合物の滅菌溶液が挙げられる。そのような溶液のｐＨは、約７．４に調整するべきである。投与のため、特に、注射及び／又は輸注のための好適な担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸及びコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所適用のための好適な薬学的に許容される担体としては、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用にとって好適であるものが挙げられる。化合物を経口投与しようとする場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位剤形である。経口投与のために使用することができる、単位剤形の調製のための薬学的に許容される担体は、先行技術において周知である。その選択は、本発明の目的にとって重要ではない、味、費用及び保存性などの二次的な考察に依存し、当業者は、困難なく行うことができる。
【０１１２】
静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚若しくは皮下注射及び／又は輸注、又は罹患部位での注射及び／又は輸注、すなわち、局部的注射／輸注のために、活性成分は、発熱源を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態にある。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、特に、０．９％ＮａＣｌ、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤及び／又は他の添加物を含有させることができる。それが個体に投与される本発明による他の薬学的に有用な化合物であるポリペプチド、ペプチド、又は核酸分子であろうとなかろうと、投与は好ましくは「予防有効量」又は「治療有効量」（場合によって）にあり、これは個体に対して利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置されるものの性質及び重症度に依存する。例えば、ヒトにおけるｉ．ｖ．投与のために、体重１ｋｇあたり１ｍｇまでの単回用量、より好ましくは、体重１ｋｇあたり５００μｇまで、更により好ましくは体重１ｋｇあたり１００μｇまで、例えば、体重１ｋｇあたり１００ｎｇ〜１ｍｇの範囲、より具体的には、体重１ｋｇあたり１μｇ〜５００μｇの範囲、更により具体的には、体重１ｋｇあたり５μｇ〜１００μｇの範囲が好ましい。そのような用量は、例えば、注射及び／又は輸注として、特に、輸注として投与することができ、輸注の持続時間は、例えば、１〜９０ｍｉｎ、好ましくは１０〜７０ｍｉｎ、より好ましくは３０〜６０ｍｉｎで変化する。
【０１１３】
更に、本発明に従って使用される医薬組成物は、更に、すなわち、本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤のいずれか１つ若しくは複数、及び／又は上記で定義されたそのバリアント、断片若しくは誘導体、核酸、細胞又はベクター及び／又は核酸をトランスフェクトされた細胞に加えて、任意選択で、それぞれの疾患においても有用である、更なる「活性成分」も含んでもよい。これに関連して、本発明による医薬組成物は、本発明による疾患の療法において、更なる「活性成分」を含む更なる医薬組成物と組み合わせることもできる。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物を、独立型療法として、又はコルチコステロイド、好ましくはグルココルチコイド、例えば、デキサメタゾンと組み合わせて、術後眼内炎症において使用することができる。更に、例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤及び／又はキメラペプチドを含む医薬組成物は、好ましくは、独立型療法として、又はＰＫＲ阻害剤と組み合わせて、任意選択で、本発明によるＪＮＫ阻害剤及びアミロイド低下剤を含むＰＫＲ阻害剤に加えて、アルツハイマー病及び／又は軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩの予防及び／又は治療において使用することができる。ＰＫＲ阻害剤は、特に、ペプチド、例えば、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐによる「ＳＣ１４８１」である。アミロイド低下剤としては、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）及びモジュレーター（ＧＳＭ）が挙げられる。現在、臨床試験にあるそのようなアミロイド低下剤の非限定例を、Ｖａｓｓａｒ  Ｒ．（２０１４）  ＢＡＣＥ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．；６（９）：８９頁及び／又はＪｉａ  Ｑ、Ｄｅｎｇ  Ｙ、Ｑｉｎｇ  Ｈ（２０１４）  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｒ  ｂｅｙｏｎｄ  β−ａｍｙｌｏｉｄ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．  ２０１４；２０１４：８３７１５７頁から読み出すことができ、例えば、ピオグリタゾン、ＣＴＳ−２１１６６、ＭＫ８９３１、ＬＹ２８８６７２１、ＡＺＤ３２９３、Ｅ２６０９、ＮＩＣ５−１５、ベガセスタット、ＣＨＦ５０７４、ＥＶＰ−０９６２、アトルバスタチン、シンバスタチン、エタゾレート、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣｇ）、Ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（ＥＬＮＤ００５／ＡＺＤ１０３）、トラミプロセート（３ＡＰＳ）、ＰＢＴ２、Ａｆｆｉｔｏｐｅ  ＡＤ０２、及びＡｆｆｉｔｏｐｅ  ＡＤ０３が挙げられる。組合せ療法の場合、組み合わされる活性成分のための別々の医薬組成物がより良好な個々の用量にとって好ましいが、便宜上、組み合わされる活性成分を含む単一の医薬組成物も想定できる。組み合わされる活性成分のための別々の医薬組成物の場合、本発明によるＪＮＫ阻害剤の投与は、別々の医薬組成物中に含まれる他の活性成分、例えば、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤又はグルココルチコイドの投���の前、間（同時若しくは重複投与）又は後であってもよい。ＪＮＫ阻害剤の投与「前」の投与は、好ましくは、ＪＮＫ阻害剤の投与が始まる前の２４ｈ以内、より好ましくは１２ｈ以内、更により好ましくは３ｈ以内、特に好ましくは１ｈ以内、最も好ましくは３０ｍｉｎ以内を意味する。ＪＮＫ阻害剤の投与「後」の投与は、好ましくは、ＪＮＫ阻害剤の投与が終了した後の２４ｈ以内、より好ましくは１２ｈ以内、更により好ましくは３ｈ以内、特に好ましくは１ｈ以内、最も好ましくは３０ｍｉｎ以内を意味する。
【０１１４】
本発明によるＪＮＫ阻害剤の使用における特に好ましい態様は（例えば、更なるトランスポーター配列を潜在的に含む、配列番号２〜２７の配列のいずれかによる阻害的（ポリ）ペプチド配列、好ましくは、配列番号１７１〜１９０のいずれか１つによる配列のいずれか、又は本明細書に定義されるそのバリアント、より好ましくは配列番号１７２の配列、又は本明細書に定義されるそのバリアントを含む）（限定されるものではないが）以下の疾患／障害の予防及び／又は治療を含む。
【０１１５】
（ｉ）口腔及び／又は顎骨の疾患、特に、（ｉ）一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；（ｉｉ）インプラント周囲炎；（ｉｉｉ）一般的な歯周炎、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵攻性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；（ｉｖ）一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；（ｖ）歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；（ｖｉ）一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；（ｖｉｉ）粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；（ｖｉｉｉ）一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；並びに（ｉｘ）特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；並びに／又は顎関節障害から選択される口腔及び／又は顎骨の炎症疾患。それにより、歯周炎、インプラント周囲炎、歯肉炎、口内炎及び粘膜炎が好ましく、歯周炎が特に好ましい；ここで、口腔及び／又は顎骨の疾患の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは、２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、好ましくは、歯肉内又は局所、特に好ましくは、歯肉内に適用される。
【０１１６】
（ｉｉ）特に、（ｉ）糸球体腎炎、例えば、非増殖性糸球体腎炎、特に、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、巣状分節状糸球体ヒアリン変性及び／又は硬化症、巣状糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、及び／又は菲薄基底膜病、及び増殖性糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット糸球体腎炎（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型）、管外糸球体腎炎（半月体形成性糸球体腎炎）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、特に、Ｉ型ＲＰＧＮ、ＩＩ型ＲＰＧＮ、ＩＩＩ型ＲＰＧＮ、及びＩＶ型ＲＰＧＮ、急性増殖性糸球体腎炎；感染後糸球体腎炎、及び／又はＩｇＡ腎症（ベルガー病）；急性腎炎症候群；急速進行性腎炎症候群；反復性及び持続性血尿；慢性腎炎症候群；ネフローゼ症候群；特定の形態学的病変を有するタンパク尿；糸球体炎；糸球体症；糸球体硬化症；（ｉｉ）一般に、急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」又は「急性腎臓不全」とも呼ばれる）、特に、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、若しくは他のＡＫＩ；又は（ｉｉｉ）特に、膜性腎症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎症、鎮痛薬性腎症、ＣＦＨＲ５腎症、造影剤誘導腎症、アミロイド腎症、逆流性腎症及び／又はメソアメリカ腎症糖尿病性腎症、糖尿病性腎症から選択される腎症から選択される腎臓疾患（腎疾患）。それにより、好ましくは、予防及び／又は治療される障害／疾患は、糸球体腎炎又は急性腎臓傷害であり、ここで、腎臓疾患（腎臓病）の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で、適用可能な場合、反復的に、例えば、数日若しくは数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０日間及び／又は週間にわたって毎日又は毎週適用され、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．で適用される。
【０１１７】
（ｉｉｉ）眼の疾患、特に、（ｉ）ドライアイ症候群；（ｉｉ）ブドウ膜炎、特に、前眼部、中間部及び／又は後眼部ブドウ膜炎、交感性ブドウ膜炎及び／又は全ブドウ膜炎、好ましくは、前部及び／又は後部ブドウ膜炎；（ｉｉｉ）滲出性及び／又は非滲出性加齢黄斑変性を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、好ましくは、滲出型若しくは非滲出型の加齢黄斑変性；（ｉｖ）特に、糖尿病性網膜症、（動脈高血圧誘発性）高血圧性網膜症、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症；それにより、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）が好ましく、糖尿病性網膜症が特に好ましい；並びに／又は（ｖ）特に、眼に対して、及び／又は眼の中で行われた手術の後、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、及び／又は特に、複雑な眼の手術の後の涙器を含む手術の後並びに／又は複雑でない眼の手術の後の、眼の術後炎症；それにより、術後眼内炎症が好ましい；ここで、眼の疾患の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、単回適用、例えば、注射若しくは滴下により、好ましくは、０．０１μｇ／眼〜１０ｍｇ／眼、より好ましくは、０．１μｇ／眼〜５ｍｇ／眼、更により好ましくは、１μｇ／眼〜２ｍｇ／眼、特に好ましくは、５０μｇ／眼〜１．５ｍｇ／眼、最も好ましくは、１００μｇ／眼〜１ｍｇ／眼の範囲の用量で適用されるが、必要に応じて、反復的に、例えば、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間にわたって、毎日、２若しくは３日毎に、若しくは毎週適用され、好ましくは、眼の中若しくは眼の上に、好ましくは、硝子体内若しくは結膜下、より好ましくは、結膜下に適用される；並びに／又はＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、両眼若しくは片目のみに適用してもよい点眼薬として適用される；ここで、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物は、典型的には、例えば、（滅菌）０．９％ＮａＣｌを含む溶液、好ましくは、眼科用溶液であり、医薬組成物は、特に、ドライアイ症候群を治療及び／又は予防するための、特に、０．００１％〜１０％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、好ましくは、０．０１％〜５％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、より好ましくは、０．０５％〜２％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、更により好ましくは、０．１％〜１％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤を含む；及び／又はＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、全身的に、特に、静脈内に適用され、それにより、用量は、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの範囲であり、それにより、そのような投与は、例えば、ブドウ膜炎を治療及び／又は予防するのに特に有用であり、それにより、処置スケジュールは、単回用量又は反復用量を含み、それにより、後の用量は処置スケジュールの異なる日に投与することができる。
【０１１８】
（ｉｖ）特に、一般的な乾癬、例えば、尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、貨幣状乾癬、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬；一般的な類乾癬、例えば、大斑型類乾癬、小斑型類乾癬、網状類乾癬、苔癬状粃糠疹及びリンパ腫様丘疹症；バラ色粃糠疹；扁平苔癬及び他の丘疹落屑性障害、例えば、毛孔性紅色粃糠疹、光沢苔癬、線状苔癬、念珠状紅色苔癬、及び小児丘疹性先端皮膚炎から選択される皮膚の疾患、特に、丘疹落屑性障害。好ましくは、予防及び／又は治療される障害／疾患は、乾癬、例えば、尋常性乾癬、貨幣状乾癬、尋常性乾癬、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬である；ここで、皮膚疾患の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは５０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で、適用可能な場合、反復的に、数日間又は数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間及び／又は週間にわたって、例えば、毎日、又は毎週、好ましくは、毎日適用され、好ましくは、全身、例えば、ｉ．ｖ．、ｐ．ｏ．又はｓ．ｃ．、及び／又は局所、経皮、及び／又は病変内に（例えば、皮膚病変中に）適用される。
【０１１９】
（ｖ）特に、一般的な関節炎、変形性関節症（変性関節疾患）、敗血症性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び関連する自己免疫疾患及び関節炎から選択される、関節炎及び関節の疾患／障害；ここで、皮膚疾患の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは５０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で、適用可能な場合、反復的に、数日間又は数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間以上及び／又は週間以上にわたって、例えば、毎日、又は毎週適用され、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．、ｐ．ｏ．又はｓ．ｃ．で、特に好ましくは、ｉ．ｖ．で適用される。
【０１２０】
（ｖｉ）特に、（ｉ）一般的な肝臓がん及び肝臓癌、特に、肝臓転移、肝臓細胞癌、肝細胞癌、ヘパトーマ、肝内胆管癌、胆管癌、肝芽腫、（肝臓の）血管肉腫、及び他の特定の、若しくは非特定の肝臓の肉腫及び癌腫；（ｉｉ）前立腺がん及び／又は前立腺癌；並びに／又は（ｉｉｉ）一般的な結腸がん及び結腸癌、特に、盲腸癌、虫垂癌、上行結腸癌、肝湾曲部癌、横行結腸癌、脾湾曲部癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、結腸の重複部位の癌腫及び／又は結腸の悪性カルチノイド腫瘍から選択される、がん及び腫瘍疾患；ここで、がん及び腫瘍疾患の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ［マウス用量！］の範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で、適用可能な場合、反復的に、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週間にわたって、例えば、毎日、２又は３日又は週毎に適用され、好ましくは、全身的に、例えば、ｐ．ｏ．、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．で適用される。
【０１２１】
（ｖｉｉ）泌尿器系の疾患及び／又は障害、特に、尿管炎；尿路感染（膀胱感染、急性膀胱炎）；一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、ハナー潰瘍、三角炎及び／又は出血性膀胱炎；尿道炎、特に、非淋菌性尿道炎若しくは淋菌性尿道炎；膀胱痛症候群；ＩＣ／ＰＢＳ；尿道症候群；並びに／又は後腹膜線維化症；好ましくは、ＩＣ／ＰＢＳ；ここで、泌尿器系の疾患及び／又は障害の治療及び／又は予防のために、好ましくは、ＩＣ／ＰＢＳの治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、（ｉ）全身的に、より好ましくは静脈内に、例えば、静脈内注射により、１００ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、好ましくは、単回用量で投与されるが、適用可能な場合、好ましくは、反復的に、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間にわたって、例えば、毎日、２若しくは３日若しくは週毎に投与される；又はＪＮＫ阻害剤はまた、好ましくは、（ｉｉ）膀胱内に、より好ましくは、膀胱内輸注により、好ましくは、１０μｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０μｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは、０．１〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．５〜５００ｍｇ、更により好ましくは１〜１００ｍｇ、特に好ましくは２〜１０ｍｇの単回用量で適用されるが、適用可能な場合、好ましくは、反復的に、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間にわたって、例えば、毎日、２若しくは３日若しくは週毎に投与される。
【０１２２】
（ｖｉｉｉ）神経障害、神経系障害又は神経変性障害、特に、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症、及び／又は軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害；ここで、神経障害、神経系障害又は神経変性障害の治療及び／又は予防のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、適用可能な場合、１回又は反復的に、好ましくは、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって毎週（週１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって隔週（２週に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって６週間毎に（６週間毎に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって２カ月毎に（２カ月に１回）又は数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって３カ月毎に（３カ月に１回）、より好ましくは、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって毎週（週１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって隔週（２週に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月１回）、更により好ましくは、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月１回）投与され、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．、ｐ．ｏ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．又はＣＳＦ内（脳脊髄液内）で適用され、更に、神経障害、神経系障害又は神経変性障害、特に神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症、及び／又は軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の治療及び／又は予防のために、本発明のＪＮＫ阻害剤を、独立型療法として投与してもよいが、本発明のＪＮＫ阻害剤を、他の薬剤、例えば、ＰＫＲ阻害剤、例えば、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐによる「ＳＣ１４８１」と組み合わせて、任意選択で、本発明によるＪＮＫ阻害剤及びアミロイド低下剤を含むＰＫＲ阻害剤に加えて投与することもでき、それにより、アミロイド低下剤は、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）及びモジュレーター（ＧＳＭ）を含み、現在、臨床試験にある、そのような阻害剤の例を、Ｖａｓｓａｒ  Ｒ．（２０１４）  ＢＡＣＥ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔ��ｅｒ．；６（９）：８９頁又はＪｉａ  Ｑ、Ｄｅｎｇ  Ｙ、Ｑｉｎｇ  Ｈ（２０１４）  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｒ  ｂｅｙｏｎｄ  β−ａｍｙｌｏｉｄ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．  ２０１４；２０１４：８３７１５７頁から読み出すことができる。
【０１２３】
本明細書に定義される疾患の予防及び／又は治療は、典型的には、上記で定義された医薬組成物の投与を含む。本発明のＪＮＫ阻害剤は、対象におけるＪＮＫ活性をモジュレートする。用語「モジュレート」は、特に、例えば、更なるトランスポーター配列を潜在的に含む、配列番号２〜２７の配列のいずれかによる阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むか、又はそれからなる少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤を使用する、又は、トランスポーター配列が結合する場合、好ましくは、配列番号１７１〜１９０のいずれか１つによる配列のいずれか、又は本明細書に定義されるそのバリアント、特に好ましくは、配列番号７１２による配列、又は本明細書に定義されるそのバリアントを使用する、細胞中の天然のｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＮＦＡＴ４結合部位の競合的阻害剤としての、本明細書に開示される疾患のいずれかにおけるｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２又はＮＦＡＴ４のリン酸化の抑制を含む。用語「モジュレート」はまた、限定されるものではないが、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、又はＮＦＡＴ４及びｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２及びｃ−ｆｏｓから作られるＡＰ−１複合体などのその関連するパートナーから作られる転写因子のヘテロ−及びホモ複合体の抑制も含む。
【０１２４】
上記に開示された医薬組成物を用いる対象の処置は、典型的には、対象への前記医薬組成物の（「治療有効」）量を（ｉｎ  ｖｉｖｏで）投与することにより達成することができ、ここで、対象は、例えば、ヒト対象又は動物であってもよく、ヒトが特に好ましい。動物は、好ましくは、非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ又はブタである。用語「治療有効」とは、医薬組成物の活性成分が本明細書で考察される疾患及び障害を改善するのに十分な量のものであることを意味する。
【０１２５】
別の好ましい実施形態によれば、本発明のＪＮＫ阻害剤、例えば、更なるトランスポーター配列を潜在的に含む、配列番号２〜２７の配列のいずれかによる阻害的（ポリ）ペプチド配列を含むか、又はそれからなるＪＮＫ阻害剤（トランスポーター配列が結合する場合、配列番号１７１〜１９０のいずれか１つによる配列のいずれか、又は本明細書に定義されるそのバリアントが好ましく、配列番号１７２による配列、又は本明細書に定義されるそのバリアントが特に好ましい）は、移植前に組織又は臓器の処置のために使用することができる。好ましくは、移植しようとする臓器及び／又は組織の単離、輸送、かん流、埋め込みなどのための溶液は、好ましくは、１〜１０００μＭの範囲、より好ましくは１０〜５００μＭの範囲、更により好ましくは５０〜１５０μＭの範囲の濃度の、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む。本発明のこの態様について、移植片は、腎臓、心臓、肺、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、又は皮膚移植片である。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤を、膵島の単離のための溶液中に含有させることができる。そのような溶液を、例えば、単離前に膵管中に注射することができる。更に、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含有する溶液が臓器及び／又は組織の単離、輸送、かん流、移植などにおいて適用される場合、特に、虚血時間が１５ｍｉｎを超える場合、より好ましくは、虚血時間が２０ｍｉｎを超える場合、更により好ましくは虚血時間が少なくとも３０ｍｉｎである場合、好ましい。これらの虚血時間を温虚血及び／又は冷虚血時間に適用することができるが、それらを温虚血時間（ＷＩＴ）にのみ適用する場合、それが特に好ましく、ＷＩＴは、ドナーの死の間、特に、交差クランピングの、又は心臓が鼓動していないドナーにおける心停止の時間から、冷かん流が開始されるまでに経過する時間の長さ及び氷からの臓器の取り出しから、再かん流までの、埋め込みの間の虚血を指す。
【０１２６】
疾患及び障害
本発明は、療法によるヒト又は動物の身体、特に、ヒト身体の処置のための方法における、上記に開示されたＪＮＫ阻害剤又はそれを含有する医薬組成物の特異的使用（又は使用方法）に関する。上記のように、ＪＮＫシグナリングは、多くの多様な疾患状態及び障害に関与し、前記シグナリングの阻害はこれらの多くについて提唱され、成功裏に試験されてきた。本発明者らは、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤が、以下に開示される疾患の処置のための有効なＪＮＫ阻害剤であることを見出した。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、療法によるヒト又は動物の身体の処置は、それぞれの対象の任意の種類の治療的処置を指す。それは、例えば、疾患又は症状の開始、すなわち、典型的には、患者における疾患の発現前の防止（予防）を含む。この用語はまた、所与の疾患の症状の「単なる」処置も含み、すなわち、処置は疾患及び症状の基礎となる原因を必ずしも治癒させることなく、疾患と関連する症状を軽減することにより発病を改善する。確かに、疾患の基礎となる原因の治癒もまたこの用語に包含される。この用語はまた、それぞれの疾患の進行を遅延させる、又は更には停止させる処置も包含する。
【０１２８】
一実施形態においては、本発明によるＪＮＫ阻害剤を、例えば、予測できる障害の潜在的な開始の前、例えば、計画的な外科的介入又は計画的なストレス刺激への曝露の前に予防的に投与することができる。外科的介入は、例えば、それぞれの創傷又は近隣の組織の炎症のリスクを持ち得る。放射線のようなストレス刺激への曝露は、罹患した組織及び細胞のアポトーシスを誘導し得る。そのようなシナリオでは、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、例えば、前もって約４週間まで少なくとも１回投与してもよい。ＪＮＫ阻害剤は、例えば、前もって少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間又は４週間投与してもよい。
【０１２９】
本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防される疾患及び障害は、急性的又は慢性的なものであってもよい。
【０１３０】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、一般に、眼の疾患、骨の疾患、神経疾患、神経系疾患、神経変性疾患、皮膚の疾患、免疫及び／又は自己免疫疾患、眼の疾患、口腔の疾患、腎臓の疾患、泌尿器系の疾患、炎症疾患、代謝疾患、心血管疾患、増殖性疾患（特に、がん及び腫瘍）、耳の疾患、腸の疾患、呼吸器系の疾患（例えば、肺疾患）、感染症、及び様々な他の疾患などの、様々な臓器の疾患の治療及び／又は予防のために使用することができるが、本発明は、特に、以下の疾患を指す。
【０１３１】
本発明の分子により治療及び／又は予防される疾患のうち、皮膚疾患及び皮下組織の疾患、特に、炎症性皮膚疾患、より具体的には、湿疹、乾癬、皮膚炎、座瘡、口腔潰瘍、紅斑、扁平苔癬、サルコイドーシス、血管炎及び成人線状ＩｇＡ疾患から選択される皮膚疾患が記載される。皮膚炎は、例えば、アトピー性皮膚炎又は接触皮膚炎を包含する。特に、本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防される皮膚疾患及び皮下組織の疾患を、一般的な丘疹落屑性障害、特に、一般的な乾癬、例えば、尋常性乾癬、貨幣状乾癬、尋常性乾癬、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬、一般的な類乾癬、例えば、大斑型類乾癬、小斑型類乾癬、網状類乾癬、苔癬状粃糠疹及びリンパ腫様丘疹症；バラ色粃糠疹；扁平苔癬及び他の丘疹落屑性障害、例えば、毛孔性紅色粃糠疹、光沢苔癬、線状苔癬、念珠状紅色苔癬、及び小児丘疹性先端皮膚炎；湿疹；一般的な皮膚炎、特に、アトピー性皮膚炎、例えば、ベニエー痒疹、アトピー性又は広範性神経皮膚炎、曲げ湿疹、乳児湿疹、内因性湿疹、アレルギー性湿疹、他のアトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、例えば、頭部脂漏、乳児脂漏性皮膚炎、他の脂漏性皮膚炎、おむつ皮膚炎、例えば、おむつ紅斑、おむつ発疹及び乾癬様おむつ発疹、特に、金属に起因する、接着剤に起因する、化粧品に起因する、皮膚と接触した薬物に起因する、染料に起因する、他の化学製品に起因する、皮膚と接触した食品に起因する、食品以外の植物に起因する、動物のフケに起因する、及び／又は他の薬剤に起因する、アレルギー性接触皮膚炎、特に、洗剤に起因する、油及びグリースに起因する、溶媒に起因する、化粧品に起因する、皮膚と接触した薬物に起因する、他の化学製品に起因する、皮膚と接触した食品に起因する、食品以外の植物に起因する、金属に起因する、及び／又は他の薬剤に起因する、刺激性接触皮膚炎、非特定接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、皮膚炎、例えば、内部的に摂取された物質に起因する、特に、薬物及び医薬品に起因する、摂取された食品に起因する、他の物質に起因する、全身及び局部皮膚発疹、貨幣状皮膚炎、壊疽性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾燥肌皮膚炎、人工皮膚炎、口囲皮膚炎、皮膚及び皮下組織の放射線関連障害、鬱滞性皮膚炎、慢性単純性苔癬及び痒疹、掻痒、発汗異常症、皮膚自己感作、感染性皮膚炎、間擦性紅斑及び／又は白色粃糠疹；蜂巣炎（皮膚を含む細菌感染）；リンパ管炎、特に、急性又は慢性リンパ管炎；一般的な脂肪織炎、特に、血管炎を伴わない小葉性脂肪織炎、例えば、以前はウェーバー・クリスチャン病と呼ばれた急性脂肪織炎及び全身性結節性脂肪織炎、血管炎を伴う小葉性脂肪織炎、血管炎を伴わない中隔性脂肪織炎及び／又は血管炎を伴う中隔性脂肪織炎；リンパ節炎、特に、急性リンパ節炎；毛巣嚢胞及び毛巣瘻；一般的な膿皮症、特に、壊疽性膿皮症、増殖性膿皮症、壊疽性皮膚炎、膿性皮膚炎、敗血性皮膚炎及び化膿性皮膚炎；紅色陰癬；臍炎；天疱瘡、特に、尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、���ラジル天疱瘡、紅斑性天疱瘡、薬物誘発性天疱瘡、ＩｇＡ天疱瘡、例えば、角層下膿疱症及び表皮内好中球ＩｇＡ天疱瘡、及び／又は腫瘍随伴性天疱瘡；一般的な座瘡、特に、尋常性座瘡、集簇性座瘡、痘瘡状座瘡、粟粒性壊死性座瘡、熱帯性座瘡、小児座瘡、若年性女子表皮剥離性座瘡、ピッカー座瘡、及び／又はケロイド座瘡；口腔及び他の皮膚潰瘍；一般的な蕁麻疹、特に、アレルギー性蕁麻疹、特発性蕁麻疹、寒冷及び高温に起因する蕁麻疹、皮膚描記性蕁麻疹、振動性蕁麻疹、コリン性蕁麻疹、及び／又は接触性蕁麻疹；一般的な紅斑、特に、多形性紅斑、例えば、非水疱性多形性紅斑、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症（ライエル）、及びスティーブンス・ジョンソン症候群−中毒性表皮壊死症重複症候群、結節性紅斑、中毒性紅斑、遠心性環状紅斑、有縁性紅斑及び／又は他の慢性模様状紅斑；日焼け及び紫外線照射に起因する他の急性皮膚変化；非イオン化放射線への慢性曝露に起因する皮膚変化；放射線皮膚炎；毛嚢炎；毛包周囲炎；偽性毛嚢炎；化膿性汗腺炎；サルコイドーシス；血管炎；成人線状ＩｇＡ疾患；酒さ、特に、口囲皮膚炎、鼻瘤、及び他の酒さ；並びに／又は皮膚及び皮下組織の卵胞嚢胞、特に、粉瘤腫、毛嚢胞、トリコデルマ嚢胞、多発性脂腺嚢腫、皮脂嚢胞及び／又は他の卵胞嚢胞から選択することができる。
【０１３２】
本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置することができる好ましい皮膚疾患の例は、乾癬及び紅斑性狼瘡である。より一般的な用語では、好ましくは、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防することができる皮膚疾患及び皮下組織の疾患は、丘疹落屑性障害である。これらのものとしては、類乾癬、バラ色粃糠疹、扁平苔癬並びに他の丘疹落屑性障害、例えば、毛孔性紅色粃糠疹、光沢苔癬、扁平苔癬、念珠状紅色苔癬、及び小児丘疹性先端皮膚炎が挙げられる。好ましくは、本発明によるＪＮＫ阻害剤により治療及び／又は予防される疾患は、乾癬及び類乾癬の群から選択され、それにより、乾癬が特に好ましい。乾癬の例としては、尋常性乾癬、貨幣状乾癬、尋常性乾癬、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬が挙げられる。類乾癬の例としては、大斑型類乾癬、小斑型類乾癬、網状類乾癬、苔癬状粃糠疹及びリンパ腫様丘疹症が挙げられる。
【０１３３】
特に、心臓、腎臓、及び皮膚（組織）、肺、膵臓、肝臓、血液細胞（例えば、血小板、白血球、赤血球などの任意の種類の血液細胞）、骨髄、角膜、事故で切断された四肢（指、手、足、顔、鼻など）、あらゆる型の骨、心臓弁、血管、腸の断片又は腸そのものの組織又は臓器移植時の（抗炎症）処置が、本発明の分子により処置可能である。そのような処置は、例えば、移植片対宿主又は宿主対移植片反応が臓器／組織移植時に起こる場合はいつでも適切であると考えられる。また、本発明の分子の使用を、特に、皮膚（又は膵臓、肝臓、肺、心臓、腎臓）移植片対宿主又は宿主対皮膚（又は膵臓、肝臓、肺、心臓、腎臓）移植片反応の場合における移植手術を行う場合はいつでも用いることができる。
【０１３４】
神経変性疾患のうち、特に、慢性炎症、タウオパシー及びアミロイドーシス並びにプリオン病と関連するものが、本発明の分子によって対処される。他のそのような神経変性疾患は、様々な型の認知症、例えば、前頭側頭型認知症及びレビー小体型認知症、統合失調症及び双極性障害、脊髄小脳失調、脊髄小脳萎縮症、多系統萎縮症、運動ニューロン疾患、大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺又は遺伝性痙性対麻痺を指す。別の分野の適応は、疼痛（例えば、神経障害型、偶発型、突出型、心因型、幻想型、慢性型又は急性型の疼痛）である。別の分野の使用は、特に、膀胱機能の喪失（例えば、尿失禁、過活動膀胱、間質性膀胱炎若しくは膀胱がん）を処置するための膀胱疾患又は口内炎の処置である。
【０１３５】
本発明の分子は、線維性疾患又は線維症並びに、特に、肺、心臓、肝臓、骨髄、縦隔、後腹膜、皮膚、腸、関節、及び肩線維症の処置のために用いられる。
【０１３６】
口腔及び顎／下顎の炎症疾患は一般に、本発明の分子によって処置可能であるが、歯肉炎、骨壊死（例えば、顎骨の）、インプラント周囲炎、歯髄炎、及び歯周炎が、治療目的でのこれらの本発明の分子の使用にとって特に好適である。特に、本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防される口腔又は顎骨の疾患及び／又は障害を、一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；インプラント周囲炎；一般的な歯周炎、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵攻性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；並びに／又は顎関節障害から選択することができる。
【０１３７】
更に、ポリープは、本発明の分子を使用することによって効率的に処置可能である。
【０１３８】
また、腎臓の炎症性又は非炎症性病態生理も、本発明の分子を使用することによって効率的に処置される。特に、疾患は、一般的な糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、一般的な急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」又は「急性腎臓不全」とも呼ばれる）、特に、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、又は他のＡＫＩ；一般的な腎症、特に、膜性腎症又は糖尿病性腎症、一般的な腎炎、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎又は急性腎炎、並びに微小変化型疾患及び巣状分節状糸球体硬化症からなる群から選択される。更に、本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防される腎臓の疾患及び／又は障害（腎疾患）を、一般的な糸球体腎炎、例えば、非増殖性糸球体腎炎、特に、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、巣状分節状糸球体ヒアリン変性及び／又は硬化症、巣状糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、及び／又は菲薄基底膜病、及び増殖性糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型）、管外糸球体腎炎（半月体形成性糸球体腎炎）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、特に、Ｉ型ＲＰＧＮ、ＩＩ型ＲＰＧＮ、ＩＩＩ型ＲＰＧＮ、及びＩＶ型ＲＰＧＮ、急性増殖性糸球体腎炎；感染後糸球体腎炎、及び／又はＩｇＡ腎症（ベルガー病）；急性腎炎症候群；急速進行性腎炎症候群；反復性及び持続性血尿；慢性腎炎症候群；ネフローゼ症候群；特定の形態学的病変を有するタンパク尿；糸球体炎；糸球体症；糸球体硬化症；一般的な急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」若しくは「急性腎臓不全」とも呼ばれる）、特に、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、若しくは他のＡＫＩ；慢性腎臓病；一般的な腎症、特に、膜性腎症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎症、鎮痛薬性腎症、ＣＦＨＲ５腎症、造影剤誘導腎症、アミロイド腎症、逆流性腎症及び／又はメソアメリカ腎症；一般的な腎炎、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎若しくは急性腎炎、びまん性増殖性腎炎、及び／又は巣状増殖性腎炎、尿細管間質性腎炎、感染性間質性腎炎、腎盂炎、腎盂腎炎、間質性腎炎；尿細管症、尿細管炎、特に、ＲＴＡ（ＲＴＡ１及びＲＴＡ２）、ファンコニ症候群、バーター症候群、ギッテルマン症候群、リドル症候群、腎性尿崩症、腎乳頭壊死、水腎症、膿腎症及び／又は急性尿細管壊死慢性腎疾患（ＣＫＤ）；グッドパスチャー症候群（抗糸球体基底膜抗体病）；多発性血管炎を伴う肉芽腫症；顕微鏡的多発性血管炎；並びに／又はチャーグ・ストラウス症候群から選択することができる。
【０１３９】
糸球体腎炎とは、いくつかの腎疾患を指し、それにより、多くの疾患が腎臓中の糸球体又は小血管のいずれかの炎症を特徴とするが、必ずしも全ての疾患が炎症成分を有するとは限らない。急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」又は「急性腎臓不全」とも呼ばれる）は、腎臓機能の突然の消失であり、腎虚血／再かん流傷害モデルにおいて調査されることが多い。腎症、すなわち、腎臓の損傷又は腎臓の疾患は、非炎症性腎症であるネフローゼ、及び炎症性腎臓病である腎炎も含む。
【０１４０】
本発明の分子により効率的に処置される疾患又は障害のうち、より多数の疾患又は障害を、炎症プロセスと関連付けることができるが、必ずしもそのような炎症プロセスと関連する必要があるとは限らない。以下の疾患又は障害が、本発明の分子の使用により処置可能であるとこれに関して特に開示される：アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、補体第２成分欠損症関連疾患、クッシング症候群、ドゴー病、有痛脂肪症、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、新生児溶血性疾患、クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常症、消化管類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、橋本脳症、妊娠性類天疱瘡、Ｈｕｇｈｅｓ−Ｓｔｏｖｉｎ症候群、低ガンマグロブリン血症、ランバート・イートン筋無力症候群、硬化性苔癬、限局性強皮症、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋緊張病、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｐａｒｒｙ−Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、むずむず脚症候群、後腹膜線維化症、自己免疫性多内分泌症候群２型、全身硬直症候群、Ｓｕｓａｃ症候群、熱性好中球性皮膚症、シデナム舞踏病、血小板減少症、及び白斑。
【０１４１】
任意の種類の炎症性眼疾患を、本発明の分子の使用によって処置することができるが、以下の眼関連疾患が特に開示される：角膜手術後の炎症、非感染性角膜炎、網脈絡膜炎症、及び交感性眼炎。より一般的な用語では、本明細書に記載されるＪＮＫ阻害剤を使用して、特に、ブドウ膜炎、特に、前部、中間部及び／又は後部ブドウ膜炎、交感性ブドウ膜炎及び／又は全ブドウ膜炎；一般的な強膜炎、特に、前部強膜炎、角膜辺縁性強膜炎、後部強膜炎、及び角膜障害を伴う強膜炎；一般的な上強膜炎、特に、一過性周期性上強膜炎及び結節性上強膜炎；網膜炎；一般的な結膜炎、特に、急性結膜炎、粘液膿性結膜炎、アトピー性結膜炎、中毒性結膜炎、偽膜性結膜炎、漿液性結膜炎、慢性結膜炎、巨大乳頭結膜炎、濾胞性結膜炎、春季結膜炎、眼瞼結膜炎、及び／又は瞼裂斑炎；一般的な非感染性角膜炎、特に、角膜潰瘍、表層角膜炎、黄斑角膜炎、糸状角膜炎、雪眼炎、点状角膜炎、角結膜炎、例えば、曝露性角結膜炎、ドライアイ症候群（乾性角結膜炎）、神経栄養性角結膜炎、結節性眼炎、フリクテン性角結膜炎、春季角結膜炎及び他の角結膜炎、間質性結膜炎及び深層角膜炎、硬化性角膜炎、角膜血管新生及び他の角膜炎；一般的な虹彩毛様体炎、特に、急性虹彩毛様体炎、亜急性虹彩毛様体炎及び慢性虹彩毛様体炎、原発性虹彩毛様体炎、再発性虹彩毛様体炎及び続発性虹彩毛様体炎、水晶体起因性虹彩毛様体炎、フックス虹彩異色性毛様体炎、フォークト・小柳症候群；虹彩炎；一般的な脈絡網膜炎症、特に、限局性脈絡網膜炎症及び播種性脈絡網膜炎症、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網膜脈絡膜炎、後部毛様体炎、原田病、感染症及び寄生虫疾患における脈絡網膜炎症；特に、眼に対して、及び／又は眼の中で行われた手術の後、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、及び涙器を含む手術の眼の術後炎症、特に、術後眼内炎症、好ましくは、複雑な眼の手術及び／又は複雑ではない眼の手術の後の術後眼内炎症、例えば、処置後のブレブの炎症；眼の網膜を損傷する炎症疾患；網膜血管炎、特に、イールズ病及び網膜血管周囲炎；一般的な網膜症、特に、糖尿病性網膜症、（動脈高血圧誘発性）高血圧性網膜症、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症；濾過胞炎；眼内炎；交感性眼炎；麦粒腫；霰粒腫；眼瞼炎；まぶたの皮膚炎及び他の炎症；涙腺炎；涙管炎、特に、急性及び慢性涙小管炎；涙嚢炎；眼窩の炎症、特に、眼窩の蜂巣炎、眼窩の骨膜炎、眼窩のテノン嚢炎、眼窩の肉芽腫及び眼窩筋炎；化膿性内眼球炎及び寄生虫性眼内炎；並びに一般的な黄斑及び／又は後極の変性と関連する疾患及び／又は障害、特に、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型若しくは非滲出型の加齢黄斑変性、滲出性及び／又は非滲出性加齢黄斑変性、及び白内障から選択される、眼の炎症性及び非炎症性疾患を治療及び／又は予防することができる。
【０１４２】
「非滲出型」の進行性ＡＭＤは、網膜の下の網膜色素上皮層の萎縮の結果生じ、眼の中心部分の光受容体（桿体及び錐体）の喪失により失明を引き起こす。新血管の「滲出型」の進行性ＡＭＤは、ブルッフ膜を介して、脈絡膜毛細血管における異常な血管増殖（脈絡膜血管新生）に起因する失明を引き起こし、最終的には、黄斑下の血液及びタンパク質の漏出をもたらす。これらの血管からの出血、漏出、及び瘢痕化は、未処置のまま放置した場合、最終的には光受容体に対する不可逆的損傷及び急速な失明を引き起こす。本発明の分子は、両方の型のＡＭＤを処置するのに好適である。
【０１４３】
特に、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、ドライアイ症候群（ＤＥＳ）を治療及び／又は予防することができる。乾燥角膜炎、眼球乾燥症、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）又は乾性角膜とも呼ばれる、ドライアイ症候群（ＤＥＳ）は、眼の乾燥により引き起こされ、次いで、涙液産生の減少又は涙液層蒸発の増加により引き起こされる眼疾患である。ドライアイ症候群の典型的な症状は、乾燥、焼けるような眼の痛み及び砂が入ったような眼の刺激である。ドライアイ症候群は、眼の表面の炎症と関連することが多い。ドライアイ症候群が未処置のままであるか、又は重症になった場合、それは視力低下又は更には失明をもたらす眼の損傷を引き起こし得る合併症をもたらし得る。未処置のドライアイ症候群は、特に、眼の上皮における病理学的事例、扁平上皮化生、杯細胞の喪失、角膜表面の肥厚化、角膜びらん、点状角膜症、角膜上皮欠損、角膜潰瘍、角膜血管新生、角膜瘢痕化、角膜菲薄化、及び更には角膜穿孔をもたらし得る。本発明によるＪＮＫ阻害剤を、例えば、加齢、糖尿病、コンタクトレンズ若しくは他の原因に起因する、及び／又は眼の手術若しくは外傷の後、特に、単にレーザー眼科手術と一般的に呼ばれるレーシック（レーザー光線による近視手術）の後のドライアイ症候群の治療及び／又は予防において用いることができる。
【０１４４】
ドライアイの標準的な処置は、人工涙液、シクロスポリン（特に、シクロスポリンＡ；例えば、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））；自己血清点眼薬；潤滑眼軟膏剤の投与及び／又は例えば、点眼薬若しくは眼軟膏剤の形態での（コルチコ）ステロイドの投与を含んでもよい。したがって、本発明はまた、本明細書で定義されたＪＮＫ阻害剤と、ドライアイの標準処置、特に、上記の処置のいずれか１つとの組合せ投与を含む、ドライアイ症候群の処置方法における本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤の使用にも関する。特に好ましいのは、シクロスポリンＡ、最も好ましくは人工涙液との組合せである。組合せ投与は、平行投与及び／又は事後投与（最初に本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、次いで、（コルチコ）ステロイドの投与、又はその逆）を含む。確かに、事後投与と平行投与を組み合わせてもよく、例えば、処置を本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤から開始し、処置の経過の後の時点で、（コルチコ）ステロイドを平行して投与する、又はその逆である。
【０１４５】
特に、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、眼の強膜、角膜、虹彩、毛様体、網膜及び／又は脈絡膜の炎症疾患を治療及び／又は予防することができる。好ましくは、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、ブドウ膜炎、すなわち、ブドウ膜の炎症を治療及び／又は予防することができる。ブドウ膜は、眼の中央の有色素血管構造からなり、虹彩、毛様体、及び脈絡膜を含む。典型的には、ブドウ膜炎は、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、及び／又は全ブドウ膜炎として分類され、それにより、後者は、ブドウ膜の全ての層の炎症である。更に、ブドウ膜炎は、一方の眼への外傷後の両眼の両側性びまん性肉芽腫性ブドウ膜である、交感性眼炎（交感性ブドウ膜炎）を含む。本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置される特に好ましい前部ブドウ膜炎としては、虹彩毛様体炎及び虹彩炎が挙げられる。虹彩炎は、前室及び虹彩の炎症である。虹彩毛様体炎は、虹彩炎と同じ症状を呈するが、硝子体腔における炎症も含む。本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて予防及び／又は治療される虹彩毛様体炎の例としては、限定されるものではないが、急性虹彩毛様体炎、亜急性虹彩毛様体炎、及び慢性虹彩毛様体炎、原発性虹彩毛様体炎、再発性虹彩毛様体炎、及び続発性虹彩毛様体炎、水晶体起因性虹彩毛様体炎、フックス虹彩異色性毛様体炎、フォークト・小柳症候群が挙げられる。扁平部炎としても知られる、中間部ブドウ膜炎は、特に、扁平部への炎症物質の「雪だまり（ｓｎｏｗｂａｎｋｉｎｇ）」又は沈着を伴うこともある、硝子体腔における細胞の炎症である硝子体炎を含む。後部ブドウ膜炎としては、特に、網膜及び脈絡膜の炎症である脈絡網膜炎、並びに脈絡膜炎（脈絡膜のみ）が挙げられる。より一般的な用語では、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を使用して、一般的な脈絡網膜炎、例えば、限局性及び／又は播種性脈絡網膜炎症、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜脈絡膜炎、後部毛様体炎、原田病、感染症及び寄生虫疾患における脈絡網膜炎症並びに／又は網膜炎、すなわち、網膜の炎症を治療及び／又は予防することができる。網膜炎、特に、網膜血管炎、例えば、イールズ病及び網膜血管周囲炎に加えて、一般に眼の網膜を損傷する炎症疾患が含まれる。本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防される眼の強膜、角膜、虹彩、毛様体、網膜及び／又は脈絡膜の更なる炎症疾患としては、強膜炎、すなわち、強膜の炎症、例えば、前部強膜炎、角膜辺縁性強膜炎、後部強膜炎、角膜障害を伴う強膜炎及び穿孔性強膜軟化症；上強膜炎、特に、一過性周期性上強膜炎及び結節性上強膜炎；並びに角膜の炎症である角膜炎、特に、角膜潰瘍、表層角膜炎、黄斑角膜炎、糸状角膜炎、雪眼炎、点状角膜炎、角結膜炎、例えば、曝露性角結膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、好中球性角結膜炎、結節性眼炎、フリクテン性角結膜炎、春季角結膜炎及び他の角結膜炎、間質性角膜炎及び深層角膜炎、硬化性角膜炎、角膜血管新生及び他の角膜炎が挙げられる。
【０１４６】
更に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、眼の術後（若しくは「処置後」）又は外傷後炎症を治療及び／又は予防するのに特に有用である。「術後」とは、特に、眼に対して、及び／又は眼の中で行われた手術、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、及び／又は涙器を含む手術を指す。好ましくは、「術後」において言及される手術は、複雑な眼の手術及び／又は複雑ではない眼の手術である。特に好ましくは、例えば、（限定されるものではないが）処置後のブレブの炎症であってもよい、術後又は外傷後眼内炎症を治療及び／又は予防するための本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤の使用である。
【０１４７】
本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防される別の特に好ましい眼疾患は、網膜症である。網膜症の非限定例としては、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症（例えば、動脈高血圧誘発性）、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症が挙げられる。本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、それぞれ、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症の治療及び／又は予防にとって特に好ましい。
【０１４８】
以前は水晶体後部線維増殖症（ＲＬＦ）として知られた、未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、一般に、新生児集中治療を受けている未熟児で生まれた新生児が罹患する眼の疾患である。それは、瘢痕化及び網膜剥離をもたらし得る網膜血管の無秩序な増殖によって引き起こされると考えられている。ＲＯＰは、軽度で寛解することがあるが、重症例では失明をもたらし得る。そのようなものとして、全ての早産児は、ＲＯＰのリスクがあり、非常に低い出生時体重は更なる危険因子である。酸素毒性と相対的低酸素状態の両方が、ＲＯＰの発症に寄与し得る。本発明の分子は、ＲＯＰを処置するのに好適である。
【０１４９】
更に、本発明の分子は、あらゆる型の網膜症、特に、糖尿病誘発性網膜症、動脈高血圧誘発性高血圧性網膜症、放射線誘発性網膜症（イオン化放射線への曝露に起因する）、日光誘発性日光網膜症（日光への曝露）、外傷誘発性網膜症（例えば、プルチェル網膜症）及び異常タンパク血症を引き起こす障害において見られるような過粘稠度関連網膜症を処置するのに特に好適である。
【０１５０】
更に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、関節炎並びに関節の関連疾患及び／又は障害を治療及び／又は予防するのに特に有用である。関節炎は、１つ又は複数の関節の炎症を含む関節障害の形態である。１００を超える異なる形態の関節炎が存在する。最も一般的な形態である変形性関節症（変性関節疾患）は、関節への外傷、関節の感染、又は加齢の結果である。他の関節炎形態は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び関連する自己免疫疾患である。敗血性関節炎は、関節感染により引き起こされる。関節痛が原発性であり、主な特徴と考えられるいくつかの疾患が存在する。一般に、ある人が「関節炎」を有する場合、それは、彼らが、変形性関節症、関節リウマチ、痛風及び偽痛風、敗血性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、スティル病を含むこれらの疾患の１つを有することを意味する。関節痛はまた、他の疾患の症状であってもよい。この場合、関節炎は主疾患にとって二次性のものであると考えられる；これらのものとしては、乾癬（乾癬性関節炎）、反応性関節炎、エーラー・ダンロス症候群、ヘモクロマトーシス、肝炎、ライム病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、発熱を繰り返す高免疫グロブリンＤ血症、サルコイドーシス、ウィップル病、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ウェゲナー肉芽腫症（及び他の多くの血管炎症候群）、家族性地中海熱及び全身性エリテマトーデスが挙げられる。未分化関節炎は、周知の臨床疾患カテゴリーに適合しない関節炎であり、おそらく確定リウマチ疾患の初期段階である。
【０１５１】
特に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて治療及び／又は予防することができる、関節炎と関連する疾患及び／又は障害を、化膿性関節炎、特に、ブドウ球菌性関節炎及び多発性関節炎、肺炎球菌性関節炎及び多発性関節炎、他の連鎖球菌性関節炎及び多発性関節炎、並びに他の細菌に起因する関節炎及び多発性関節炎；一般的な感染症及び寄生虫疾患における関節の直接的感染；感染後及び反応性関節症、特に、腸バイパス形成術後の関節症、赤痢後関節症、免疫化後関節症、ライター病、及び他の反応性関節症；炎症性多発性関節症、特に、リウマチ因子を伴う関節リウマチ、例えば、フェルティ症候群、関節リウマチを伴うリウマチ性肺疾患、関節リウマチを伴うリウマチ性血管炎、関節リウマチを伴うリウマチ性心疾患、関節リウマチを伴うリウマチ性筋疾患、関節リウマチを伴うリウマチ性多発性神経障害、他の臓器及び系の障害を伴う関節リウマチ、臓器又は系の障害を伴わないリウマチ因子を伴う関節リウマチ；他の関節リウマチ、例えば、リウマチ因子を伴わない関節リウマチ、成人スティル病、リウマチ性滑液包炎、リウマチ結節、炎症性多発性関節症、腸疾患性関節症；若年性関節炎、例えば、詳細不明の若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、全身型若年性関節リウマチ、若年性リウマチ性多発性関節炎（血清反応陰性）、及び少関節型若年性関節リウマチ；慢性痛風、例えば、特発性慢性痛風、鉛誘発性慢性痛風、薬物誘発性慢性痛風、腎障害に起因する慢性痛風、；痛風、例えば、特発性痛風、鉛誘発性痛風、薬物誘発性痛風、腎障害に起因する痛風；他の結晶性関節症、例えば、家族性及び他の軟骨石灰化症；他の関節症、例えば、カシン・ベック病、絨毛結節性滑膜炎（色素性）、回帰性リウマチ、間欠性関節水腫、外傷性関節症；他の関節炎、例えば、多発性関節炎及び単関節炎；他の関節症、例えば、シャルコー関節；変形性関節症、特に、多発性変形性関節症、例えば、一次性全身性（変形性）関節症、ヘバーデン結節、ブシャール結節、二次性多発性関節炎及びびらん性関節炎、臀部の変形性関節症、膝の変形性関節症、第一手根中手関節の変形性関節症、一次性、二次性及び外傷後変形性関節症；並びに他の関節障害、特に、手指及び足指の後天的変形、例えば、槌指、ボタン穴変形、スワンネック変形、外反母趾、膝蓋骨の障害、膝関節内障、関節強直、寛骨臼突出；並びに他の関節障害、例えば、関節血症、関節瘻、動揺関節（ｆｌｉａｌ  ｊｏｉｎｔ）、及び骨棘から選択することができる。
【０１５２】
本発明の分子の使用により処置される炎症関連疾患の更なるクラスは、以下のもの：急性播種性脳脊髄炎、抗合成酵素症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経障害、膵炎、特に、自己免疫性膵炎、ビッカースタッフ型脳炎、ブラウ症候群、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、骨髄炎、特に、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、巨細胞性動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、血管炎、特に、皮膚小血管性血管炎又は蕁麻疹様血管炎、皮膚炎、特に、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬物誘発性全身性エリテマトーデス、円板状紅斑性狼瘡、腱付着部炎、好酸球性筋膜炎、胃腸炎、特に、好酸球性胃腸炎、結節性紅斑、特発性肺線維症、胃炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、汗腺膿瘍、特発性炎症性脱髄疾患、筋炎、特に、封入体筋炎、膀胱炎、川崎病、扁平苔癬、ルポイド肝炎、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織疾患、脊髄炎、特に、神経脊髄炎、例えば、視神経脊髄炎、甲状腺炎、特に、オード甲状腺炎、リウマチ、特に、回帰性リウマチ、パーソナージュ・ターナー症候群、静脈周囲性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、肝硬変、特に、原発性胆汁性肝硬変、胆管炎、特に、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、ラスムッセン脳炎、軟骨炎、特に、多発性軟骨炎、例えば、再発性多発性軟骨炎、反応性関節炎（ライター病）、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、血清病、脊椎炎、特に、強直性脊椎炎、脊椎関節症、高安動脈炎、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、及び肉芽腫症、特に、ウェゲナー肉芽腫症である。
【０１５３】
本発明の最も好ましい実施形態においては、本発明の分子は、以下の疾患又は障害：皮膚の持続性又は急性炎症疾患、特に、乾癬、ドライアイ疾患（ドライアイ症候群）、ブドウ膜炎、眼の網膜を損傷する持続性又は急性炎症疾患、網膜症、特に、糖尿病性網膜症又は他の疾患により引き起こされる網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型又は非滲出型の加齢黄斑変性、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、口腔の持続性又は急性炎症疾患、特に、インプラント周囲炎、歯髄炎、歯周炎、組織又は臓器移植時、特に、心臓、腎臓、及び皮膚（組織）移植時の抗炎症処置、心臓、腎臓又は皮膚（組織）移植時の移植片拒絶、炎症性脳疾患及び／又はタウオパシーの処置のために、特に、一般的なアルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症、代謝障害、腎臓の疾患、特に、糸球体腎炎及び急性腎臓傷害、及び関節症／関節炎、特に、反応性関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、及び乾癬性関節炎の処置のために使用される。
【０１５４】
したがって、特に好ましい実施形態においては、予防及び／又は治療される障害／疾患は、神経変性疾患、特に、タウオパシー、好ましくは、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症である。
【０１５５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶障害及び認知症と共に進行性の認知低下をもたらす破壊的な神経変性障害である。神経病理学的病変は、β−アミロイド（Ａβ）ペプチドにより形成される老人斑の細胞外沈着、及び高リン酸化タウタンパク質から構成される細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）を特徴とする（Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓら、２００９、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １１８：５〜３６頁）。アミロイドカスケード仮説によれば、ＡＤにおける神経変性は、ベータ部位ＡＰＰ切断酵素１（ＢＡＣＥ１）及びプレセニリン１の活性を介してプロセシングする異常なアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と関連し、Ａβ斑を形成する前に線維状Ａβペプチドに蓄積する毒性Ａβオリゴマーの産生をもたらし得る。Ａβの蓄積は、シナプス機能障害、ＮＦＴ形成をもたらすキナーゼ活性の変化、ニューロン脱落及び認知症をもたらし得る（Ｈａｒｄｙ及びＨｉｇｇｉｎｓ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１８４〜５頁）。したがって、ＡＤの発病は、Ａβの蓄積によって誘発されると考えられ、Ａβは様々なサイズのものであってよいオリゴマーに自己凝集し、実質及び血管中で拡散斑及び老人斑を形成する。Ａβオリゴマー及び斑は強力なシナプス毒性を有し、プロテアソーム機能を遮断し、ミトコンドリア活性を阻害し、細胞内Ｃａ２＋レベルを変化させ、炎症プロセスを刺激する。Ａβの正常な生理機能の喪失はまた、ニューロン機能障害に寄与すると考えられる。Ａβは、微小管関連タンパク質タウのリン酸化を調節するシグナリング経路と相互作用する。タウの高リン酸化は、軸索内輸送の調節におけるその正常な機能を破壊し、神経原線維変化（ＮＦＴ）及び毒性種の可溶性タウの蓄積をもたらす。更に、プロテアソームによる高リン酸化タウの分解は、Ａβの作用によって阻害される。したがって、これらの２つのタンパク質及びその関連するシグナリング経路は、ＡＤのための重要な治療標的である。
【０１５６】
Ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、３つの遺伝子ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３によりコードされ、ｍＲＮＡ選択的スプライシングによって１０の異なるアイソフォームとして発現されるセリン−トレオニンタンパク質キナーゼであり、それぞれのアイソフォームは短い形態（４６ｋＤａ）及び長い形態（５４ｋＤａ）として発現される（Ｄａｖｉｓ、２０００、Ｃｅｌｌ  １０３：２３９〜５２頁）。ＪＮＫ１及びＪＮＫ２は遍在性であるが、ＪＮＫ３は主に脳において発現される（Ｋｙｒｉａｋｉｓ及びＡｖｒｕｃｈ、２００１、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８１：８０７〜６９頁）。ＪＮＫは、紫外線ストレス、サイトカイン及びＡβペプチドなどの細胞外刺激によるＭＡＰキナーゼ活性化を介するリン酸化により活性化され（ｐＪＮＫ）、それらは遺伝子発現調節、細胞増殖及びアポトーシスなどの複数の機能を有する（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ及びＲｅｄｄｙ、２００８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７：６２４５〜５１頁）。
【０１５７】
本発明によれば、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、タウの高リン酸化、したがって、ニューロン脱落を減少させると推測される。したがって、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、タウオパシーを治療及び／又は予防するのに有用であり得る。タウオパシーは、ヒトの脳におけるタウタンパク質の病理学的凝集と関連する神経変性疾患のクラスである。最も知られるタウオパシーは、タウタンパク質がタウタンパク質の高リン酸化により形成される神経原線維変化（ＮＦＴ）の形態でニューロン内に沈着するアルツハイマー病（ＡＤ）である。ＡＤにおけるＮＦＴの関与の程度は、ブラークステージによって定義される。ブラークステージＩ及びＩＩは、ＮＦＴの関与が主に脳の内側嗅領域（ｔｒａｎｓｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）に限定される場合に使用され、海馬などの辺縁領域の関与がある場合にはステージＩＩＩ及びＩＶが使用され、広範囲に及ぶ新皮質の関与がある場合にはステージＶ及びＶＩが使用される。これは、異なって進行する老人斑関与の程度と混同されるべきではない。したがって、ＪＮＫ阻害剤を、タウオパシー、特に、ＮＦＴが関与するアルツハイマー病、例えば、ブラークステージＩを有するＡＤ、ブラークステージＩＩを有するＡＤ、ブラークステージＩＩＩを有するＡＤ、ブラークステージＩＶを有するＡＤ及び／又はブラークステージＶを有するＡＤを治療及び／又は予防するために本発明に従って使用することができる。
【０１５８】
更なるタウオパシー、すなわち、神経原線維変化（ＮＦＴ）が一般的に観察され、したがって、本発明によるＪＮＫ阻害剤によって治療及び／又は予防することができる状態としては、ＰＨＦ（対になったらせん状フィラメント）タウよりもむしろ真っ直ぐなフィラメントを有する進行性核上麻痺；ボクサー認知症（慢性外傷性脳症）；検出可能なβ−アミロイド斑を含まない、第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症及びパーキンソン病；Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病（グアム−パーキンソン認知症複合）；ＡＤと類似するＮＦＴを含むが、斑は有さない神経原線維変化型老年期認知症；神経節膠腫及び神経節細胞腫；髄膜血管腫症；亜急性硬化性全脳炎；並びに／又は鉛脳症、結節硬化症、ハラーフォルデン・シュパッツ病、及びリポフスチン症が挙げられる。本発明によるＪＮＫ阻害剤によって治療及び／又は予防することができる更なるタウオパシーとしては、ピック病；大脳皮質基底核変性症；嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）；前頭側頭型認知症及び前頭側頭葉変性症が挙げられる。ピック病及び大脳皮質基底核変性症においては、タウタンパク質は、膨張した、又は「風船化した」ニューロン内に封入体の形態で沈着する。アルツハイマー病の型として考えられることもあり、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、及びまたピック病などの他のタウオパシーと同時に存在し得る別の型の認知症である嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）は、脳組織の顕微鏡検査上での豊富な嗜銀顆粒及びコイル体の存在を特徴とする。非アルツハイマー型タウオパシーは、「ピック複合」として一緒に分類されることもある。
【０１５９】
また、本発明によれば、本発明によるＪＮＫ阻害剤によって予防及び／又は治療される障害／疾患が、軽度認知障害（ＭＣＩ）、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩであることも好ましい。典型的には、軽度認知障害（ＭＣＩ）は、アルツハイマー病とは異なる、すなわち、軽度認知障害（ＭＣＩ）は、典型的には、アルツハイマー病ではないが、それ自体、Ｆ０６．７においてＩＣＤ−１０によって分類される疾患である。ＩＣＤ−１０（Ｆ０６．７）においては、ＭＣＩは、記憶障害、学習困難、及び短い期間を超えて仕事に集中する能力の低下を特徴とする障害と記載される。精神的作業が試みられる場合に精神的疲労の顕著な感覚があることが多く、新しい学習が、客観的に成功している場合であっても、主観的には難しいとわかっている。これらの症状はいずれもそれほど重篤ではなく、認知症（Ｆ００−Ｆ０３）又はせん妄（Ｆ０５．−）のいずれかの診断を行うことができる。この障害は、脳と全身の両方で様々な感染及び身体障害に先行する、付随する、又はその後に続くものであってもよいが、脳の関与の直接的証拠は必ずしも存在しない。それを、その異なる病因、より厳密な範囲の一般的にはより軽度の症状、及び通常はより短い持続期間により、脳炎後症候群（Ｆ０７．１）及び脳震とう後症候群（Ｆ０７．２）と区別することができる。軽度認知障害（ＭＣＩ）、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩは、記憶及び思考技術を含む認知能力の、わずかであるが顕著で測定可能な低下を引き起こす。ＭＣＩは、個体の年齢及び教育に基づいて予測されるが、その日常活動を妨害するには有意に十分ではないものを超えるあらゆる型の認知障害の開始及び進化を含む。ＭＣＩの診断は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ  ＭＳ、ＤｅＫｏｓｋｙ  ＳＴ、Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｄ、Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ、Ｆｅｌｄｍａｎ  ＨＨ、Ｆｏｘ  ＮＣ、Ｇａｍｓｔ  Ａ、Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＤＭ、Ｊａｇｕｓｔ  ＷＪ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＲＣ、Ｓｎｙｄｅｒ  ＰＪ、Ｃａｒｒｉｌｌｏ  ＭＣ、Ｔｈｉｅｓ  Ｂ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＣＨ（２０１１）Ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｏｒｋｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．；７（３）：２７０〜９頁により記載されている。ＭＣＩは、あらゆる型の認知症の開始時にあってもよく、又は認知症の臨床症状をもたらすことなく時間と共に消失し得る一時的な（ｅｐｈｅｍｅｒｉｃ）形態の認知障害を示す。ＭＣＩを有する人は、アルツハイマー病又は別の認知症を発症するリスクが高く、特に、アルツハイマー病を発症するリスクが高いが、認知症、特に、アルツハイマー病を必ず発症するとは限らない。軽度認知障害を処置するための薬剤は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって現在認可されていない。アルツハイマー病の症状を処置するために認可された薬物は、ＭＣＩの認知症への進行を遅延させるか、又は防止する際にいかなる持続的な利益も示していない。
【０１６０】
また、本発明のＪＮＫ阻害剤は、特に、尿管炎；尿路感染（膀胱感染、急性膀胱炎）；一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、ハナー潰瘍、三角炎及び／又は出血性膀胱炎；尿道炎、特に、非淋菌性尿道炎若しくは淋菌性尿道炎；膀胱痛症候群；ＩＣ／ＰＢＳ；尿道症候群；並びに／又は後腹膜線維化症、特に、一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎から選択される泌尿器系の疾患及び／又は障害の処置のために使用することもできる。これに関連して、間質性膀胱炎（ＩＣ）が症状及び重症度において非常に異なることがわかっており、したがって、多くの研究者が、それが１つではなく、いくつかの疾患であると考えている。近年では、科学者は、ＩＣの最も厳密な定義を満たさなくてもよい痛みのある泌尿器症状を伴う事例を記載するために用語「膀胱痛症候群」（ＢＰＳ）又は「疼痛膀胱症候群」（ＰＢＳ）を使用し始めている。用語「ＩＣ／ＰＢＳ」は、感染又は尿路結石などの他の原因に帰することができない尿路疼痛の全ての事例を含む。間質性膀胱炎、又はＩＣの用語は、典型的には、例えば、米国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所（ＮＩＤＤＫ）により確立された、全てのＩＣ基準を満たす事例を記述する場合にのみ使用される。
【０１６１】
また、本発明のＪＮＫ阻害剤は、代謝障害の処置、例えば、糖尿病（１型又は２型、特に、１型）、ファブリ病、ゴーシェ病、低体温症、異常高熱、低酸素症、脂質性組織球増殖症、リピドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピック病、肥満、及びウォルマン病の処置のために使用することもできる。より一般的には、代謝障害は、遺伝型のものであってよく、又は炭水化物代謝の後天的障害、例えば、グリコーゲン蓄積症、アミノ酸代謝の障害、例えば、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型、尿素サイクル異常症又は尿素サイクル障害、例えば、カルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症、有機酸代謝の障害（有機酸尿）、例えば、アルカプトン尿症、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝の障害、例えば、中鎖アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤと短縮されることが多い）、ポルフィリン代謝の障害、例えば、急性間欠性ポルフィリン症、プリン又はピリミジン代謝の障害、例えば、レッシュ・ナイハン症候群、ステロイド代謝の障害、例えば、リポイド先天性副腎過形成、又は先天性副腎過形成、ミトコンドリア機能の障害、例えば、キーンズ・セイアー症候群、ペルオキシソーム機能の障害、例えば、ツェルヴェーガー症候群、又はリソソーム蓄積障害、例えば、ゴーシェ病又はニーマン・ピック病であってよい。
【０１６２】
また、本発明のＪＮＫ阻害剤は、特に、一般的な固形腫瘍；一般的な血液腫瘍、特に、白血病、例えば、急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、前骨髄球性白血病（Ｍ３）、単球性白血病、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）及び骨髄単球性白血病（Ｍ４）；骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫；リンパ腫、例えば、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、バーキットリンパ腫、及びホジキン症候群；膵臓がん、特に、膵臓癌；卵巣がん、特に、卵巣癌；一般的な肝臓がん及び肝臓癌、特に、肝臓転移、肝臓細胞癌、肝細胞癌、ヘパトーマ、肝内胆管癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫（肝臓の）、及び他の特定又は不特定の肝臓の肉腫及び癌腫；皮膚がん；メラノーマ、特に、悪性メラノーマ；扁平上皮癌；グリア芽腫；一般的な結腸がん及び結腸癌、特に、盲腸癌、虫垂癌、上行結腸癌、肝湾曲部癌、横行結腸癌、脾湾曲部癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、結腸の重複部位の癌腫及び／又は結腸の悪性カルチノイド腫瘍；前立腺がん及び前立腺腫瘍、特に、前立腺癌から選択される、新生物、特に、がん（悪性新生物）及び／又は腫瘍疾患；並びに特に、聴神経鞘腫、肺癌；腺癌；肛門癌；気管支癌；頸部癌；子宮頸がん；星状細胞腫；基底細胞腫；Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換を伴うがん；膀胱がん；芽細胞腫；骨肉腫；脳転移；脳腫瘍；乳がん；カルチノイド；子宮頸がん；子宮体癌；頭蓋咽頭腫；ＣＵＰ症候群；ウイルス誘発性腫瘍；ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；赤白血病（Ｍ６）；食道がん；胆嚢がん；消化管がん；消化管間質腫瘍；消化管腫瘍；泌尿生殖器がん；緑内障；グリオーマ；頭頸部腫瘍；Ｂ型肝炎誘発性腫瘍；肝細胞又は肝細胞性癌；肝癌；ヘパトーマ；ヘルペスウイルス誘発性腫瘍；ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫；ＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫；インスリノーマ；腸がん；カポジ肉腫；腎臓がん；腎臓癌；喉頭がん；白血病；眼瞼腫瘍；肺がん；リンパがん；乳腺癌；マントル細胞リンパ腫；神経線維腫症；髄芽細胞腫；髄膜腫；中皮腫；非小細胞癌；非小細胞肺癌；食道がん；食道癌；乏突起膠腫；パピローマウイルス誘発性癌；陰茎がん；下垂体部腫瘍；形質細胞腫；直腸腫瘍；直腸癌；腎細胞癌；網膜芽腫；肉腫；シュネーベルガー病；小細胞肺癌；小腸がん；小腸腫瘍；軟部組織腫瘍；棘細胞がん；扁平上皮癌；胃がん；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫；甲状腺がん；甲状腺癌；舌がん；未分化ＡＭＬ（ＭＯ）；尿道がん；子宮がん；膣がん；フォン・ヒッペル・リンドウ病；外陰部がん；ウィルムス腫瘍；色素性乾皮症から選択される更なるがん及び／又は腫瘍疾患の処置のために使用することもできる。
【０１６３】
当業者は、上記の疾患状態及び障害が１つを超える上記の疾患クラスに属してもよいことを容易に理解できる。例えば、気管支癌は、確かに、増殖性疾患だけでなく、肺疾患を含む呼吸器系の疾患群にも属する。したがって、個々の疾患の上記分類は、限定的又は結論的であると考えられるのではなく、例示的な性質だけのものであると考えられる。あるクラスに記載される個々の疾患状態は事実上、別のクラスの疾患状態における処置としての本発明のＪＮＫ阻害剤の適用のための好適な例でもあることを除外しない。当業者は、異なる疾患状態及び障害を一致する分類に容易に割り当てることができる。
【０１６４】
最後に、上記のように、本発明は、様々な疾患状態及び障害の治療及び／又は予防のための本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤の使用を企図する。本発明は、非ヒト動物を免疫するため、例えば、モノクローナル抗体の生成のために本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤を使用することを企図しない。そのような方法は、ここでは、療法による動物体の処置のための方法であるとは考えない。
【０１６５】
組織及び臓器移植
別の態様によれば、本発明は、移植前の組織又は臓器移植片の（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの）処置のための本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤を提供する。用語「移植前」は、単離の時間及びかん流／輸送の時間を含む。したがって、「移植前」の組織又は臓器移植片の処置は、例えば、単離中及び／又はかん流中及び／又は輸送中の処置を指す。特に、組織又は臓器移植片の単離に使用される溶液並びに組織又は臓器移植片のかん流、輸送及び／又はさもなければ処置に使用される溶液は、好ましくは、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含有することができる。
【０１６６】
移植において、許容される冷虚血時間（ＣＩＴ）及び許容される温虚血時間（ＷＩＴ）は、重要な役割を果たす。ＣＩＴは、ドナーから臓器が取り出される間、特に、冷溶液による臓器のかん流／処置の時間から、レシピエントへのその移植までに経過する時間の長さである。ＷＩＴは、一般に、常温条件下での細胞及び組織の虚血を記述するために使用される用語である。特に、ＷＩＴは、ドナーの死亡の間、特に、交差クランピング又は心臓が鼓動していないドナーにおける心停止の時間から、冷かん流が開始されるまでに経過する時間の長さを指す。更に、ＷＩＴはまた、氷からの臓器の取り出しから、再かん流までの、埋め込みの間の虚血を指してもよい。同種移植においては、通常、脳死ドナーを起源とする移植片は、典型的には、ＷＩＴにはかけられないが、８〜１２ｈのＣＩＴ（調達病院から単離実験室までの輸送に必要な時間）を有する一方、心臓が鼓動していないドナーからの移植片は、典型的には、より長いＷＩＴ及びまた８〜１２ｈのＣＩＴに曝露される。しかしながら、そのような移植は、ＷＩＴに起因する損傷に関する関心のため、現在は日常的に使用されていない。自己移植においては、ＷＩＴを行ってもよいが、ＣＩＴは通常限られる（例えば、慢性膵炎を有する患者における膵島自己移植においては、典型的には１〜２ｈ）。
【０１６７】
ドナーに応じて、臓器及び／又は組織は、移植前に可変量の時間にわたって血液をかん流させず、虚血をもたらす。虚血は、移植、例えば、腎臓移植に付随する不可避の事象である。虚血変化は、重症血行動態障害と関連する脳死から始まる：頭蓋内圧の増大は徐脈及び心拍出量の減少をもたらす；クッシング反射は、頻脈及び血圧の上昇を引き起こす；短期間の安定化後、全身血管抵抗は低血圧と共に低下し、心停止をもたらす。フリーラジカル媒介性傷害は、炎症性サイトカインを放出させ、先天性免疫を活性化する。これらの変化−初期先天性応答及び虚血組織損傷は全て、適応反応の発達において役割を果たし、次いで、移植片拒絶をもたらし得ると提言されている。移植前の様々な期間の臓器及び／又は組織の低温保存は、虚血組織損傷を増大させる。虚血傷害の最終段階は、再かん流の間に起こる。虚血傷害のエフェクター相である再かん流傷害は、初期の損傷の数時間又は数日後に生じる。修復及び再生プロセスは、細胞アポトーシス、自食作用、及び壊死と共に起こる；臓器の運命は、細胞死又は再生が優勢になるかどうかに依存する。全プロセスは、虚血−再かん流（Ｉ−Ｒ）傷害と記載されている。それは、移植される臓器又は組織の初期だけでなく、後期機能にも大きく影響する。したがって、Ｉ−Ｒ傷害の防止は、ドナーの事前処置による臓器回収の前に既に開始することができる。
【０１６８】
移植片を、本発明によるＪＮＫ阻害剤により（予備）処置して、宿主に移植されるまで、その生存性及び機能性を改善することができることがわかった。本発明のその態様について、移植片は、特に、腎臓、心臓、肺、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、又は皮膚移植片である。
【０１６９】
更に、更なる態様において、本発明は、移植中又は移植後の、組織若しくは臓器移植片、又は組織若しくは臓器移植を受けた動物若しくはヒトの処置のための本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤を提供する。用語「移植後」とは、特に、臓器又は組織、例えば、腎臓の再かん流を指し、それにより、再かん流は、例えば、それぞれの血流のクランプを外すことにより始まる。移植後の本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いる処置は、特に、再かん流後の最大４時間、好ましくは再かん流後の最大２時間、より好ましくは再かん流後の最大１時間及び／又は移植の次の日での時間間隔を指す。移植後、例えば、腎臓移植後の処置のために、本発明によるＪＮＫ阻害剤を、例えば、全身的に、特に、静脈内に、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは、０．５〜２ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、単回用量又は反復用量として、本明細書に記載の医薬組成物として組織又は臓器移植を受けた動物又はヒトに投与することができる。
【０１７０】
本発明のその態様について、移植片は、特に、腎臓、心臓、肺、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、又は皮膚移植片である。
【０１７１】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な改変が、前記説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にある。
【０１７２】
本明細書で引用された全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、又は等価である方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御するものとする。更に、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１７４】
以下では、本発明の種々の実施形態及び態様を例示する特定の実施例を示す。しかし、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態の範囲に限定されないものとする。実際、本発明の種々の改変は、本明細書に記載のものに加えて、前述の説明、添付の図面及び以下の実施例から当業者には容易に明らかになる。このような全ての改変が、添付の特許請求の範囲内に入る。
【実施例１】
【０１７５】
ＪＮＫ阻害剤配列番号１７２の合成
例示的な実施例として、配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤の合成を以下に示す。当業者には、前記合成がまた、本発明による任意の他のＪＮＫ阻害剤の合成について用いられ、かつ容易に適合され得ることは公知である。
【０１７６】
配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーを用いて固相ペプチド合成によって製造した。ペプチドと樹脂との間のリンカーは、Ｒｉｎｋアミドリンカー（ｐ−［Ｆｍｏｃ−２，３−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）であった。ペプチドは、連続的Ｆｍｏｃ脱保護及びＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングサイクルによって合成した。合成の終わりに、完成したペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって直接切断して、粗Ｃ末端アミドを得、次いで、これを分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。精製した画分を、均一なバッチ中にプールし、これをイオン交換クロマトグラフィーによって処理してその酢酸塩を得た。次いで、そのペプチドを凍結乾燥した。
【０１７７】
１．１  ペプチドの固相合成
注記した場合以外は、製造は、空気濾過環境中、室温（２２℃±７℃）で行った。合成の規模は、約１ｇという精製されたペプチドの期待収率について、樹脂に対して０．７ミリモルの出発アミノ酸であった。合成は、機械的撹拌及び／又は窒素バブリングを用いるガラス濾板（ｆｒｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｋ）を装備した３０〜５０ｍＬのリアクター中で、手動で行った。
【０１７８】
１．２  樹脂の調製
ｐ−メチルベンズヒドリルアミド樹脂（ＭＢＨＡ−樹脂）を最初に、ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド／ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｌｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を用いて窒素下で洗浄した。次いでその洗浄された樹脂を、ＰｙＢＯＢ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）／ジイソプロピル−エチルアミン／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール中で、Ｒｉｎｋアミドリンカー（ｐ−［Ｆｍｏｘ−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）にカップリングして、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂を得た。
【０１７９】
１．３  アミノ酸のカップリング
アミノ酸を、以下のサイクルを用いて樹脂にカップリングした：
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂を、３５％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ジメチルホルムアミド中で、続いてジメチルホルムアミドで洗浄することによって脱保護した。その脱保護反応は、約１６分かかった。Ｆｍｏｃ−脱保護のアミノ酸（例えば、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（５０／５０）中の２当量のアミノ酸及びＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）をその樹脂に添加し、続いて、２当量のカップリング剤ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加した。カップリング反応は、添加されるそれぞれのアミノ酸に応じて、１時間から一晩かかった。容積は、各サイクル後に、０．５ｍＬ／１００ｍｇのペプチド樹脂を基準に算出し、調節した。カップリング後、その樹脂を、ＤＭＦを用いて３回洗浄した。カップリングの完了は、一級アミンに対してニンヒドリン試験（又はＫａｉｓｅｒ試験１）及び二級アミンに対してクロラニル試験２によって試験した。いくつかの場合には、クロラニル試験は、安全性の対照としてニンヒドリン試験を伴ってもよい。カップリング試験が反応の不完全性を示した場合、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン及びジイソプロピルエチルアミン中の、過剰量未満（０．５〜１当量）のアミノ酸、ＰＹＢＯＰ、ＨＯＢＴを用いて、カップリングを繰り返した。樹脂の官能性を、測定し、一般には、樹脂のもともとのローディング次第で、０．６〜０．２ｍｅｑ／ｇであった。最後のアミノ酸がカップリングした後、ペプチド樹脂を、通常どおり脱保護し、次いで、ＤＣＭを用いて５回洗浄した後に、３０℃、減圧下で、オーブン中で乾燥した。そのペプチド樹脂を乾燥した後、固相合成の収率を、樹脂の最初のローディングから算出した理論上の重量増大と比較した、ペプチド樹脂の重量増大の比として算出した。その収率は、１００％に近い場合がある。
【０１８０】
１．４  切断及び脱保護
ペプチドを、室温で４時間、ＴＦＡ／Ｋ試薬とも呼ばれる、トリフルオロ酢酸／１，２−エタンジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｔｈｉｏｌ）／チオアニソール／水／フェノール（８８／２．２／４．４／４．４／７（ｖ／ｖ））の混合物中で樹脂から切断した。その反応容積は、ペプチド樹脂１００ｍｇあたり１ｍＬであった。この試薬への樹脂の添加の間、その混合温度を３０℃未満に維持するように調節した。
【０１８１】
１．５  樹脂からのペプチドの抽出：
ペプチドを、ガラス濾板（ｆｒｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｃ）を通した濾過によって樹脂から抽出した。ロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）でその容積の１／３まで濃縮した後、そのペプチドを、冷ｔ−ブチルメチルエーテルで沈殿させ、濾過した。次いで、その粗ペプチドを、３０℃、減圧下で乾燥した。
【０１８２】
１．６  分取ＨＰＬＣ精製：
次いで、粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣによって、≧９５％の純度に精製した。その精製された画分を、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｖａｐｏｒａｔｏｒ）で濃縮し、凍結乾燥した。
【０１８３】
１．７  イオン交換クロマトグラフィー
配列番号１７２の配列を有する、精製されたペプチドの濃縮された凍結乾燥のプールを、水中に溶解し、Ｄｏｗｅｘアセテート、５０〜１００メッシュ樹脂上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【０１８４】
合成に必要な出発試薬は以下であった：
【０１８５】
2017520569.tif 000009
【０１８６】
本発明の他のＪＮＫ阻害剤は、同様の方式で調製してもよい。
【実施例２】
【０１８７】
本発明による選択されたＪＮＫ阻害剤の阻害有効性
以下では、本発明によるＪＮＫ阻害剤の阻害有効性をどのように測定したかを記述する標準的な操作手順を示す。この方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、非放射性標準化アッセイにおいて、候補化合物がＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ特異的基質のリン酸化を低下させる能力を測定することが可能になる。更に、阻害性効果（ＩＣ５０）及びＪＮＫの選択化合物のＫｉを決定する方法が図示される。この方法は、候補化合物が、ＪＮＫ活性を阻害するか否かを確証するために適切である。そして当業者は、その具体的な目的及び必要性のために以下の方法を適合する方法を確実に理解する。
【０１８８】
２．１  材料
アルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）試薬及びプレート：
−  Ｈｉｓ−ＪＮＫ１（ｒｅｆ  １４−３２７、Ｕｐｓｔａｔｅ、１００μｌ中に１０μｇ：濃度：２．２μＭ）最終５ｎＭ
−  Ｈｉｓ−ＪＮＫ２（ｒｅｆ  １４−３２９、Ｕｐｓｔａｔｅ、１００μｌ中に１０μｇ：濃度：２μＭ）最終５ｎＭ
−  Ｈｉｓ−ＪＮＫ３（ｒｅｆ  １４−５０１、Ｕｐｓｔａｔｅ、１００μｌ中に１０μｇ：濃度：１．８８μＭ）最終５ｎＭ
−  抗ホスホ−ｃＪｕｎ（ｒｅｆ  ０６−８２８、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロットＤＡＭ１５０３３５６、濃度：４４．５μＭ）最終１０ｎＭ
−  ビオチン−ｃＪｕｎ（２９−６７）：
配列：ビオチン−ＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＳＬＫＰＨＬＲＡＫＮＳＤＬＬＴＳＰＤＶＧ（配列番号１９８）、ロット１００５０９（ｍｗ４３８２．１１、Ｐ  ９９．２８％）Ｈ２Ｏ中に溶解、濃度：１０ｍＭ）最終３０ｎＭ
−  ＡＴＰ（ｒｅｆ  ＡＳ００１Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット５０８６０Ｂ、濃度１００ｍＭ）最終５μＭ
−  ＳＡＤビーズ（ｒｅｆ  ６７６０６１７Ｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ロット５４０−４６０−Ａ、濃度５ｍｇ／ｍｌ）最終２０μｇ／ｍｌ
−  ＡｐｒｏｔＡビーズ（ｒｅｆ  ６７６０６１７Ｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ロット５４０−４６０−Ａ、濃度５ｍｇ／ｍｌ）最終２０μｇ／ｍｌ
−  Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ  ３８４ウェルホワイトプレート（ｒｅｆ  ６００７２９９、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ロット６５４２８０／２００８）
−  ペプチド希釈のための９６ウェルプレート（ｒｅｆ  ８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
−  ＴｏｐＳｅａｌｓ−Ａ（ｒｅｆ  ６００５１８５、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ロット６５６７３）
−  生物発光エネルギー移動読み取り
−  生物発光エネルギー移動は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
【０１８９】
ピペット：
−  電子ＥＤＰ３ピペット２０−３００（Ｒｅｆ  １７００７２４３；Ｒａｉｎｉｎ）を用いて、プレート中に酵素抗体混合物（Ｅｎｚｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｘ）、基質ＡＴＰ混合物（Ｓｕｂｔｒａｔｅ−ＡＴＰ  ｍｉｘ）及びビーズを充填した。
−  ＰＩＰＥＴＭＡＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａマルチチャネル８Ｘ２０（Ｒｅｆ  ２１０４０；Ｇｉｌｓｏｎ）を用いて、プレート中に、阻害性化合物を充填した。
【０１９０】
バッファー及び溶液
−  キナーゼバッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、（１％ＤＭＳＯ）
−  停止バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ  ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｋ（ＮａＯＨの代わりにＫＯＨを用いてｐＨ８）、０．３％ＢＳＡ
−  ＪＮＫ希釈キナーゼバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０３％Ｂｒｉｊ−３５、２７０ｍＭ  スクロース、０．１％β−メルカプトエタノール。
【０１９１】
２．２  方法
ペプチドの阻害性効果を評価するために、標準のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（例えば、Ｇｕｅｎａら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、２００６；１１：１０１５〜１０２６頁を参照のこと）を行った。異なる成分を調製し、引き続き示したとおり混合した。そのプレートを密閉して、以下のとおりインキュベートした：
５μｌ  ＪＮＫ＋抗体
５μｌ  ＴＰキナーゼ±阻害剤  プレインキュベーション  ３０分
５μｌ  ビオチン−ｃＪｕｎ＋ＡＴＰ  インキュベーション  ２４℃で６０分
１０μｌ  ビーズＳＡＤ＋ＡプロテインＡ  インキュベーション  ２４℃暗野で６０分
【０１９２】
混入を回避するために、混合物は、ウェルの異なるコーナーでピペットを用いて添加した。各々の混合物によるプレートの充填後、そのプレートをタッピングして（片側を保持して、反対側をテーブルにタップして）、混合物をウェルの壁に落とした。
【０１９３】
生物発光エネルギー移動は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
【０１９４】
全ての化合物は、ＪＮＫの各々のアイソフォームについて３つの独立した実験において少なくとも三連で試験すべきである。試験すべき化合物の可能性のある濃度は、０、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、及び１００μＭであった。対照は、ＪＮＫなしか、又は基質（ｃ−Ｊｕｎ）なしのいずれかの試料であった。
【０１９５】
混合物調製
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３  ５ｎＭ
Ｂｉｏｔｉｎ−ｃＪｕｎ  ３０ｎＭ
ＡＴＰ  ５μＭ；抗ホスホ−ｃＪｕｎ（Ｓ６３）１０ｎＭ
Ｂｉｌｌｅ  ＳＡＤ／ＡプロテインＡ  ２０μｇ／ｍｌ
【０１９６】
抗体［最終］＝１０ｎＭ（抗ホスホｃＪｕｎ（Ｓ６３））
検出部分：［混合物］×５（２５μｌの最終容積中で５μｌ）
［ストック］＝４４．５μＭ（ｒｅｆ  ０６−８２８、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロットＤＡＭ１５０３３５６）
１０ｎＭ→キナーゼバッファー中で５０ｎＭ
【０１９７】
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３［最終］＝５ｎＭ
反応部分：［混合物］×３（１５μｌの最終容積中で５μｌ）
［ストック］＝ＪＮＫ１について２．２μＭ（ｒｅｆ  １４−３２７、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロットＤ７ＫＮ０２２ＣＵ）
ＪＮＫ２について２．０μＭ（ｒｅｆ  １４−３２９、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロット３３２２１ＣＵ）
ＪＮＫ３について１．８８μＭ（ｒｅｆ  １４−５０１、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロットＤ７ＣＮ０４１ＣＵ）
５ｎＭ→抗体バッファー中で１５ｎＭ
【０１９８】
阻害剤：
反応部分：［混合物］×３（１５μｌの最終容積中で５μｌ）
［ストック］＝１０ｍＭ
１００μＭ→キナーゼバッファー中で３００μＭ
３０μＭ→キナーゼバッファー中で９０μＭ
１０μＭ→キナーゼバッファー中で３０μＭ
・・・
０．０３ｎＭ→キナーゼバッファー中で０．０９ｎＭ
及び０ｎＭ→キナーゼバッファー
【０１９９】
２系列の１０倍連続希釈を９６ウェルプレート中で行い、１つは、３００μＭ〜０ｎＭで開始し、２番目は、９０μＭ〜０．０３ｎＭで開始した。ペプチドは、３８４プレート中に、８チャネルマルチピペット（ｒｅｆ  Ｆ１４４０１、Ｇｉｌｓｏｎ、８Ｘ２０）を用いて添加する。
【０２００】
ＡＴＰ［最終］＝５μＭ
反応時間：［混合物］×３（１５μｌの最終容積中で５μｌ）
［ストック］＝１００ｍＭ（ｒｅｆ  ＡＳ００１Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット５０８６０Ｂ）
５μＭ→キナーゼバッファー中で１５μＭ
【０２０１】
Ｂｉｏｔｉｎ  ｃ−Ｊｕｎ［最終］＝３０ｎＭ
反応部分：［混合物］×３（１５μｌの最終容積中で５μｌ）
［ストック］＝１０ｍＭ
３０ｎＭ→ＡＴＰバッファー中で３０ｎＭ
【０２０２】
ビーズＳＡＤ／ＡプロテインＡ［最終］＝２０μｇ／ｍｌ（Ｌｉｇｈｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）
検出部分：［混合物］×２．５（２５μｌの最終容積中で１０μｌ）
［ストック］＝５ｍｇ／ｍｌ→２０μｇ／ｍｌ  停止バッファー中で５０μｇ／ｍｌ
暗屋（緑色の光）の中、又は暗野中の混合物。
【０２０３】
ＩＣ５０曲線の分析：
この分析は、以下の式を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアによって行った：
Ｓ字形用量応答（制約なし）。
Ｙ＝ボトム＋（トップ−ボトム）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）））
【０２０４】
異常値データは、グラブス（Ｇｒｕｇｇ’ｓ）検定を用いて回避した。
【０２０５】
ＩＣ５０の比較：
この分析は、以下の検定を用いるＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアによって行った：一元ＡＮＯＶＡ検定の後に、テューキー多重比較検定を続けた。Ｐ＜０．０５を、有意とみなした。
【０２０６】
ＪＮＫについてのＡＴＰのＫｍ及びビオチン−ｃＪｕｎ特異的ペプチドのＫｍは、レポートＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ標準化アッセイで決定した。
【０２０７】
ＫｉとＩＣ５０との間の数学的関係（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［基質］／基質のＫｍ））を用いて、Ｋｉ値を算出してもよい。
【実施例３】
【０２０８】
内在化実験及び分析
３．１  取り込み実験の材料及び方法
ａ）細胞株：
この実験に用いた細胞株は、ＨＬ−６０（Ｒｅｆ  ＣＣＬ−２４０、ＡＴＣＣ、ロット１１６５２３）であった。
【０２０９】
ｂ）培養培地及びプレート
ＲＰＭＩ（Ｒｅｆ  ２１８７５−０９１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット８２９６）又はＤＭＥＭ（Ｒｅｆ  ４１９６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット１３４８１）に以下を補充した：
１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  Ａ６４９０６−００９８、ＰＡＡ、ロットＡ１５−１５１）：２００８年４月４日に、５６℃で、３０分非動化。
１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＲｅｆＳ８６３６、Ｓｉｇｍａ、ロット５６Ｋ２３８６）
ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｒｅｆ  Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ、ロット１０６Ｋ２３２１）
ＰＢＳ  １０Ｘ（Ｒｅｆ  ７００１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット８２７７）：無菌Ｈ２Ｏで１×希釈
トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡ（Ｒｅｆ  Ｌ−１１６６０、ＰＡＡ、ロットＬ６６００７−１１９４）
６ウェルの培養プレート（Ｒｅｆ  １４０６７５、Ｎｕｎｃ、ロット１０２６１３）
２４ウェル培養プレート（Ｒｅｆ  １４２４７５、Ｎｕｎｃ、ロット０９５８４９）
９６ウェル培養プレート（Ｒｅｆ  １６７００８、Ｎｕｎｃ、ロット０８３３１０）
タンパク質用量決定用の９６ウェルプレート（Ｒｅｆ  ８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
蛍光測定のための９６ウェルプレート（Ｒｅｆ  ６００５２７９、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）
【０２１０】
ｃ）溶液
ポリ−Ｄ−リシンコーティング溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９０１１  ロット０９５Ｋ５１０４）：１×ＰＢＳ中で２５μｇ／ｍｌの最終希釈
酸性洗浄バッファー：０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０
Ｒｉｐａ溶解バッファー：１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２００μＭのＮａ３ＶＯ２、０．１％ＳＤＳ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｅｆ  １１８７３５８０００１、Ｒｏｃｈｅ、ロット１３７３２７００）
【０２１１】
ｄ）顕微鏡及び蛍光プレートリーダー
細胞は、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ；Ｚｅｉｓｓ；２０Ｘ）を用いて観察しカウントした。
蛍光は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて読み取った。
【０２１２】
ｅ）方法
ＦＩＴＣ標識されたペプチド内在化は、懸濁細胞で調べた。細胞は、ポリ−ＤＬ−リシンコーティングしたディッシュ中に、１×１０６細胞／ｍｌの濃度でプレーティングした。次いでプレートを、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で２４時間インキュベートした後に、既知濃度のペプチドを添加した。ペプチド添加後、その細胞を、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で、３０分、１時間、６時間又は２４時間インキュベートした。次いで、細胞を酢酸バッファー（０．２Ｍ  グリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）を用いて２回洗浄して、細胞表面吸着ペプチドを除去した（Ｋａｍｅｙａｍａら、（２００７）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、８８、９８〜１０７頁を参照のこと）。酸性バッファーを用いたのは、塩基性アミノ酸が豊富なペプチドは細胞表面上に強力に吸着し、内在化されたペプチドの過大評価につながる場合が多いからである。こうして、酸性バッファーを用いる細胞洗浄を使用して、細胞表面に吸着されたペプチドを除去した。
【０２１３】
酸洗浄を、Ｆａｂ／細胞浸透性ペプチドコンジュゲートの細胞取り込みを決定するのに行い、続いて、２回のＰＢＳ洗浄を行った。細胞は、ＲＩＰＡ溶解バッファーの添加で破砕した。次いで、内在化されたペプチドの相対量を、バックグラウンドの差引き及びタンパク質含量正規化の後に蛍光によって決定した。
したがってこのステップは以下の通りである：１．細胞培養
２．酸性洗浄及び細胞抽出物
３．蛍光プレートリーダーによるペプチド内在化の分析
【０２１４】
ｆ）細胞培養及びペプチド処理
６ウェル培養プレートは、３ｍｌのポリ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９０１１；ＰＢＳ中に２５μｇ／ｍｌ）を用いて、２４ウェルプレートは、６００μｌを用いて、及び９６ウェルプレートは、１２５μｌを用いてコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で、４時間インキュベートした。
【０２１５】
４時間後、そのディッシュを、それぞれ６、２４又は９６のウェルプレートについて、３．５ｍｌのＰＢＳ、７００μｌ又は１５０μｌのＰＢＳを用いて、２回洗浄した。
【０２１６】
細胞を、懸濁細胞について１’０００’０００細胞／ｍｌのプレーティング密度で２．４ｍｌの培地（ＲＰＭＩ）中、ディッシュにプレーティングした。接種後、そのプレートを、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で、２４時間インキュベートした後、ペプチドを添加した。付着細胞は、処理の日には９０〜９５％の密度でなければならず、ＤＭＥＭ中にプレーティングした。
【０２１７】
【表５】
2017520569.tif 000010
【０２１８】
その細胞を、所望の濃度のＦＩＴＣ標識ペプチド（Ｈ２Ｏ中で１０ｍＭの濃度のストック溶液）で処理した。
【０２１９】
ペプチド添加後、その細胞を、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で、０〜２４時間（例えば、３０分、１時間、６時間又は２４時間）インキュベートした。
【０２２０】
酸性洗浄及び細胞抽出物：
抽出物を氷上で冷却した。
【０２２１】
懸濁細胞（又はディッシュによく付着しない細胞）：
細胞を「ファルコン１５ｍｌ」に移行する。最大の細胞を回収するために、ディッシュを１ｍｌのＰＢＳで洗浄する。
最大２４００ｒｐｍで２分細胞を回収する。
１ｍｌの冷ＰＢＳ中に細胞を懸濁する。
細胞をコーティングした「エッペンドルフチューブ」（１ｍｌのポリＤ−Ｌｙｓで４時間コーティングし、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した）に移す。
１ｍｌの冷酸性洗浄バッファーを用いて３回洗浄し、最大２４００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
「エッペンドルフ」中の細胞の広がりに注意する。
１ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄して、中和する。
５０μｌの溶解ＲＩＰＡバッファーを添加する。
かき混ぜながら氷上で３０分〜１時間インキュベートする。
【０２２２】
付着細胞：
３ｍｌ、１ｍｌ又は２００μｌ（それぞれ、６、２４又は９６ウェルプレートについて）の冷酸性洗浄バッファーを用いて３回洗浄する。ディッシュからはがれる細胞に注意する。
１ｍｌの冷ＰＢＳ（それぞれ、６、２４又は９６ウェルプレートについて）を用いて２回洗浄して、中和する。
５０μｌの溶解ＲＩＰＡバッファーを添加する。
かき混ぜながら氷上で３０分〜１時間インキュベートする。
冷スクラッパーを用いて細胞をスクラップする。２４及び９６ウェルのプレートを、４０００ｒｐｍで４°で１５分間、直接遠心分離して細胞破片を除去した。次いで、上清（２４又は９６ウェルのプレートについてそれぞれ、１００又は５０ｍｌ）を、直接、ダーク９６ウェルプレートに移した。そのプレートを、蛍光プレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
溶解液を、コーティングした「エッペンドルフ」（１ｍｌのポリＤ−Ｌｙｓで４時間コーティングし、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した）に移す。
次いで、溶解した細胞を４℃で、１００００ｇで３０分間遠心分離して、細胞破片を除去した。上清を除去して、−８０℃で、コーティングした「エッペンドルフチューブ」（１ｍｌのポリＤ−Ｌｙｓで４時間コーティングし、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した）に保存した。
【０２２３】
蛍光プレートリーダーによるペプチド内在化の分析：
各々のタンパク質抽出物の含量を、製造業者の指示に従って、標準ＢＣＡアッセイ（Ｋｉｔ  Ｎ°２３２２５、Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。
各々の試料の相対的な蛍光を、各試料の１０μｌを、蛍光プレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）での読み取り、バックグラウンドの差引き、及びタンパク質濃度による正規化の後に決定する。
【０２２４】
３．２  取り込み実験
ＨＬ−６０細胞株の細胞へのＦＩＴＣ−標識ＴＡＴ由来トランスポーター構築物の時間依存性の内在化（取り込み）は、配列番号５２〜９６、４３及び４５〜４７の配列トランスポーターペプチドを用いて上記のとおり行った。これらの配列は、表４に以下に列挙する。
【０２２５】
【表６−１】
2017520569.tif 000011
【表６−２】
2017520569.tif 000012
【０２２６】
上記の表では、Ｄアミノ酸が、それぞれのアミノ酸残基の前に小文字の「ｄ」によって示される（例えば、ｄＲ＝Ｄ−Ａｒｇ）。
【０２２７】
少数の配列に関しては、合成は、技術的理由により最初のアプローチでは失敗した。これらの配列は、図６に、１、２、３、４、５、６、７、８、４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、８５、８６、８７、８８、８９、及び９０として略記してある。全ての残りの配列を、内在化実験に用いた。
【０２２８】
結果を図６に示す。
【０２２９】
図６でわかるとおり、インキュベーションの２４時間後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有する全てのトランスポーターが、Ｌ−ＴＡＴトランスポーター（配列番号４３）よりも高い内在化能力を示した。Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレート中で１０ｍＭ  ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−由来トランスポーターとともに２４時間インキュベートした。次いで、その細胞を、酸性バッファー（０．２Ｍ  グリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）を用いて２回、及びＰＢＳを用いて２回洗浄した。細胞を、ＲＩＰＡ溶解バッファーの添加によって破壊した。次いで、内在化されたペプチドの相対量を、各々の抽出物の蛍光強度の読み取り（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、続いて、バックグラウンドの差引きによって決定した。
【０２３０】
図６でわかるとおり、１つの位置が、最高のトランスポーター活性、及びトランスポーター活性の動態の改善に重要であると思われる：２位のＹ（配列番号１４２に対応するペプチド番号９１）。
【０２３１】
この実験の結果からの結論は以下のとおりである：
・  ２４時間インキュベーション後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有する全てのトランスポーター（可能性のある配列の選択については表２を参照のこと）は、Ｌ−ＴＡＴトランスポーター（配列番号４３）よりも高い内在化能力を示した（図６）。これらの結果によって、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）が完全に確証される。
・  １つの位置は、最高のトランスポーター活性に関して重要である（図６）：２位のＹ（配列番号１４に対応する配列９１）。
【０２３２】
したがって、表４に示されるこのようなＴＡＴ由来配列が好ましく、これは、特に、この配列が９ａａを示し、かつコンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有する場合、２位でＹを示す。
【実施例４】
【０２３３】
サイトカイン及びケモカイン放出の測定
以下では、ヒト細胞（血液、ＷＢＣ、ＰＢＭＣ、精製された初代リンパ球、細胞株、・・・）からのリガンド誘発性分泌後、いくつかのヒトサイトカインの放出量をどのように測定したかを記述する手順を示す。
【０２３４】
用いた技術は、抗体の２つの層（すなわち、捕捉抗体及び検出抗体）の間の抗原の量を測定することを可能にするサンドイッチＥＬＩＳＡである。少なくとも２つの抗体がサンドイッチ中で作用するので、測定される抗原は、抗体に結合可能な少なくとも２つの抗原性部位を含まなければならない。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれが、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおいて、捕捉抗体及び検出抗体として用いられてもよい。モノクローナル抗体は、抗原中のわずかな相違の微細な検出及び定量を可能にする単一のエピトープを認識する。ポリクローナルは、できる限り多くの抗原を引き下ろすための捕捉抗体として用いられることが多い。サンドイッチＥＬＩＳＡの利点は、試料を分析前に精製する必要がなく、このアッセイは、極めて鋭敏であり得る（直接又は間接的よりも最大２〜５倍鋭敏である）ということである。
【０２３５】
この方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／細胞培養において、本発明のＪＮＫ阻害剤の効果を決定してもよい。非毒性用量で、化合物の有効性は、非処理試料と比較したサイトカインレベルの低下（光学密度（４５０ｎｍでの吸光度）の変動）によって示され、ＥＬＩＳＡによってモニターされる。結果は、ｎｇ／ｍｌで表される。
【０２３６】
４．１  材料
・  ９６ウェルプレート：
上清収集のため（Ｒｅｆ  ８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
ＥＬＩＳＡのため（Ｆ９６  ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｅｆ  ４４２４０４、Ｎｕｎｃ）
・  ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ：９６ウェルマイクロプレートシール（Ｒｅｆ  ６００５８５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
・  ＥＬＩＳＡ試薬
コーティングバッファーＥＬＩＳＡ：０．１Ｍ  炭酸ナトリウム（ＮａＣａｒｂｏｎａｔｅ）ｐＨ９．５（＝１リットルのＨ２Ｏ中、７．１３ｇのＮａＨＣＯ３（ｒｅｆ  ７１６２７、Ｆｌｕｋａ）＋１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（ｒｅｆ  ７１３４５、Ｆｌｕｋａ）、濃縮ＮａＯＨを用いてｐＨ９．５に）
洗浄バッファー  ＥＬＩＳＡ：１×ＰＢＳ  ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０。１リットルの１×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０×：ｒｅｆ  ７００１１、ＧＩＢＣＯ）を調製し、１００ｕｌのＴｗｅｅｎ２０（ｒｅｆ  Ｐ１３７９、Ｓｉｇｍａ）を、磁気撹拌装置で混合しながらゆっくり添加する）
アッセイ希釈液：１×ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  Ａ１５−１５１、ＰＡＡ、５６℃で、３０分非動化）
ＤＡＫＯ  ＴＭＢ（ｒｅｆ  Ｓ１５９９、ＤＡＫＯ）：市販の基質溶液
停止溶液：１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４（→２００ｍｌについて＝１７７ｍｌのＨ２Ｏ＋２３ｍｌのＨ３ＰＯ４  ８５％（ｒｅｆ  ３４５２４５、Ａｌｄｒｉｃｈ）。
・  ＥＬＩＳＡキット（２０プレートについての試薬）
ＩＦＮ−γ：ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５１４２、ＤＢ）。
ＩＬ−１β：ヒトＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡセットＩＩ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５７９５３、ＢＤ）
ＩＬ−１０：ヒトＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡセットＩＩ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５１５７、ＤＢ）。
ＩＬ−１２：ヒトＩＬ−１２（ｐ７０）ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５１８３、ＤＢ）。
ＩＬ−１５：ヒトＩＬ−１５  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５９２６８、ＤＢ）。
ＩＬ−２：ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５１９０、ＤＢ）。
ＩＬ−４：ヒトＩＬ−４  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５１９４、ＤＢ）。
ＩＬ−５：ヒトＩＬ−５  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５２０２、ＤＢ）。
ＩＬ−６：ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡセットＩ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５２２０、ＤＢ）。
ＩＬ−８：ヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５２４４、ＤＢ）。
ＭＣＰ−１：ヒトＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５１７９、ＢＤ）
ＴＮＦ−α：キットヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ｒｅｆ  ５５５２１２、ＤＢ）。
・  吸光度読み取り：吸光度は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
・  リピート式ピペット、デジタルピペット又はマルチチャネルピペット。
【０２３７】
４．２  方法
試料の調製
この試料は、培養されたヒト細胞（典型的には、全血、ＷＢＣ、ＰＢＭＣ、ＷＢＣの精製されたサブタイプ、癌性細胞株）由来の培養培地上清である。遠心分離（４００ｇ  ５分  ４℃）によって粒子状物質を除去し、直ちにアッセイするか、又は試料を−２０℃で保管する。凍結解凍サイクルの反復は避ける。
【０２３８】
使用の１時間前、氷上で試料を解凍し、これらを遠心分離する。ステップ１１では、アッセイ中の試料をプレートに直接希釈する（最初にアッセイ希釈液次いで試料を添加し、ピペットで上下する）。
【０２３９】
標準の調製
凍結乾燥した標準を室温に温めた後、バイアルを注意深く開けて、材料の喪失を回避する。提唱される容積の脱イオン水を有する凍結乾燥された標準を再構成して、ストック標準を得る。この標準を、希釈する前に、少なくとも１５分間平衡にさせる。穏やかにボルテックスして混合する。再構成後、１バイアルあたり５０μｌでポリプロピレンバイアル中に標準のストックを直ちにアリコートし、−２０℃で最大６カ月間凍結する。必要な場合は、アリコートにする前／凍結する前に最大８時間、２〜８℃で保管する。再構成された標準は室温に置かない。
使用直前に、試薬希釈液中で２倍階段希釈を用いて１０点の標準曲線を調製する。４０００ｐｇ／ｍｌという高い標準が推奨される。
【０２４０】
検出混合物の調製
ビオチン／ＳＡｖ試薬の一工程インキュベーション。必要な容積の検出抗体をアッセイ希釈液に添加する。使用前１５分以内に、必要な量の酵素試薬を添加し、ボルテックスするか、又はよく混合する。推奨される希釈については、ロットに特定の指示／分析証明書を参照のこと。使用後に残りの作業用検出物を廃棄する。
【０２４１】
捕捉抗体でのコーティング
１．コーティングバッファー中で希釈した１ウェルあたり１００μＬの捕捉抗体を用いてＰＶＣマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。推奨される抗体コーティング希釈については、ロットに特定の指示／分析証明書を参照のこと。
２．プレートを接着性プラスチックでカバーし、４℃で一晩インキュベートする。
３．コーティング溶液を除去し、ウェルを１５０μｌの洗浄バッファーで充填することによってプレートを洗浄する。
４．溶液又は洗浄液を、シンク上でプレートをはじく（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）ことによって除去する。
５．そのプロセスを２回繰り返し、合計３回洗浄する。
６．最終の洗浄後、ペーパータオル上でプレートを叩くことによって残りの洗浄バッファーを除去する。
【０２４２】
ブロッキング
７．コーティングされたウェル中の残りのタンパク質結合部位を、１ウェルあたり１００μｌの試薬希釈液を添加することによってブロックする。
８．プレートを接着性プラスチックでカバーし、室温で１時間インキュベートする。
９．インキュベーションの間、標準の調製を開始する。
【０２４３】
試料の添加
１０．ステップ３のとおり、１５０μｌの洗浄バッファーを用いて１回洗浄する。プレートはこれで試料添加のために準備される。
１１．アッセイ希釈における５０μｌの適切に希釈された試料を、各々のウェルに添加する。正確な定量的結果のために、常に、未知の試料のシグナルを標準曲線のものに対して比較する。標準（三連）及びブランクを、正確性を保証するために各々のサイトカインで試行しなければならない。
１２．プレートを接着性プラスチックでカバーし、室温で２時間インキュベートする。
【０２４４】
検出抗体及び二次抗体とのインキュベーション
１３．ステップ３と同様に１５０μｌの洗浄バッファーを用いてプレートを４回洗浄する。
１４．推奨される希釈で（ロットに特定の指示／分析証明書を参照のこと）で各々のウェルに５０μｌの検出混合物（アッセイ希釈液中の検出抗体＋二次ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体）を添加する。
１５．接着性プラスチックでプレートをカバーし、室温で、光防御して１時間インキュベートする。
１６．ステップ３のとおり１５０μｌの洗浄バッファーを用いてプレートを６回洗浄する。
１７．各々のウェルに５０μｌのＤＡＫＯ  ＴＭＢ溶液を添加し、密閉せずに、暗所で、室温で、１５〜２０分間、インキュベートする。
１８．各々のウェルに５０μｌの停止溶液を添加する。プレートを穏やかにタップして、徹底的な混合を保証する。
１９．プレートミキサーで、５００ｒｐｍで５分間、プレートを混合する。
２０．４５０ｎｍで光学密度を読み取る。（プログラム：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＿ＥＬＩＳＡ、ＦｕｓｉｏｎＡｌｐｈａプレートリーダー）。
【０２４５】
データ分析
各々の標準の対照及び各々の試料についての三連の読み取りを平均する。平均ゼロ標準光学密度（Ｏ．Ｄ．）を差引きする。Ｏ．Ｄの対数に対してサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を作成し、最良適合線を、回帰分析によって決定してもよい。試料を希釈した場合、標準曲線からの濃度読み取りには、希釈係数を掛けなければならない。標準曲線は、アッセイした試料の各々のセットについて作成すべきである。異常値のデータは、グラブス検定を用いて回避した。次いで、ＳＤの２倍のインターバルになかったデータは破棄した。陽性対照が、以前に観察されたデータを示した場合、独立した実験を考慮する。独立した実験をプールする（Ｎ＞３）。
データは、阻害剤処理なしで、誘発した条件と比較して、ｐｇ／ｍｌのサイトカイン放出又は％で示す。
【実施例５】
【０２４６】
ＴＨＰ１分化−サイトカイン放出のための刺激
以下では、ＬＰＳによって６時間チャレンジされたヒトのＰＭＡ分化したＴＨＰ１細胞からのサイトカイン産生をどのように誘発して、本発明のＪＮＫ阻害剤、特に配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤が刺激誘発性のサイトカイン放出を低下する能力を試験したかを記述する手順を示す。ＴＨＰ１細胞を、サイトカイン放出の読み出しのために異なるリガンドによってｅｘ−ｖｉｖｏで刺激した。非毒性用量では、ＪＮＫ阻害剤有効性は、非処理試料と比較したサイトカインレベルの低下で示され、ＥＬＩＳＡでモニターされる。化合物の毒性は、紫色を生じるテトラゾリウム（ｔｒｅｔａｚｏｌｉｕｍ）塩（ＭＴＳ）のホルマザンへの還元によって評価する。
【０２４７】
手順：
ａ．材料
・  細胞株：ＴＨＰ−１（Ｒｅｆ  ＴＩＢ−２０２、ＡＴＣＣ、ロット５７７３１４７５）
・  培養培地、試薬及びプレート
ＲＰＭＩ（Ｒｅｆ  ２１８７５−０９１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）以下を補充：
１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  Ａ１５−１５１、ＰＡＡ）：５６℃で３０分非動化した。
１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｒｅｆ  Ｈ０８８７、Ｓｉｇｍａ）
５０Ｍ  β−メルカプトエタノール（Ｒｅｆ  ６３６９０、Ｆｌｕｋａ：１４．３Ｍでストックする）：−２０℃でストックされた、ＰＢＳ中５０ｍＭ  アリコートを５６０μｌ添加
１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｒｅｆ  Ｓ８６３６、Ｓｉｇｍａ）
ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｒｅｆ  Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ）
次いで、ＲＰＭＩ培地を、０．２２Ｍのフィルター（Ｒｅｆ  ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過する。
ＰＢＳ  １０×（Ｒｅｆ  ７００１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：無菌Ｈ２Ｏで１×希釈した
ＤＭＳＯ：Ｒｅｆ  ４１４４４、Ｆｌｕｋａ
ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート、Ｒｅｆ  Ｐ１５８５、Ｓｉｇｍａ、濃度１ｍＭ＝−２０℃でＤＭＳＯ中で６１６．８ｕｇ／ｍｌ）。ＲＰＭＩ中で最終濃度の１００ｎＭで直接用いる（１０ｍｌの培地中で１ｕｌ）。
ＬＰＳウルトラピュア（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、Ｒｅｆ  ｔｌｒｌ−ｅｋｌｐｓ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、濃度５ｍｇ／ｍｌ）：ＬＰＳのストック溶液：４℃で、ＰＢＳ中で３μｇ／ｍｌ。直接用いて、ＲＰＭＩ培地中で４０ｎｇ／ｍｌの４×濃縮溶液を調製する（分１８００μｌ／プレート；５プレート：１２５μｌのＬＰＳ３ｇ／ｍｌ＋９２５０μｌのＲＰＭＩ）。
９６ウェルプレート：
接着細胞培養のため（Ｒｅｆ  １６７００８、Ｎｕｎｃ）
上清を収集するため（Ｒｅｆ  ８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
ＥＬＩＳＡのため（Ｆ９６  ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｅｆ  ４４２４０４、Ｎｕｎｃ）
コーティング溶液：ポリ−Ｄ−リシン（Ｒｅｆ  Ｐ９０１１、Ｓｉｇｍａ）：１×ＰＢＳ中で２５μｇ／ｍｌに最終希釈
【０２４８】
・  ＥＬＩＳＡ試薬及びキット
コーティングバッファーＥＬＩＳＡ：０．１Ｍ  炭酸ナトリウムｐＨ９．５（＝１リットルのＨ２Ｏ中、７．１３ｇのＮａＨＣＯ３（ｒｅｆ  ７１６２７、Ｆｌｕｋａ）＋１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（ｒｅｆ  ７１３４５、Ｆｌｕｋａ）、濃縮ＮａＯＨを用いてｐＨ９．５に）
洗浄バッファーＥＬＩＳＡ：１×ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｒｅｆ  Ｐ１３７９、Ｓｉｇｍａ、ロット０９４Ｋ００５２）（＝１リットルの１×ＰＢＳを調製し、磁気攪拌機で混合しながら、１００ｕｌのＴｗｅｅｎ２０をゆっくり添加する）
アッセイ希釈：１×ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  Ａ１５−１５１、ＰＡＡ、５６℃で、３０分、非動化）。
ＤＡＫＯ  ＴＭＢ（ｒｅｆ  Ｓ１５９９、ＤＡＫＯ）：市販の基質溶液
停止溶液：１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４（→２００ｍｌのために＝１７７ｍｌのＨ２Ｏ＋２３ｍｌの８５％Ｈ３ＰＯ４（ｒｅｆ  ３４５２４５、Ａｌｄｒｉｃｈ）。
ＴＮＦ−：ＫｉｔヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（ｒｅｆ  ５５５２１２、ＤＢ）。
・  細胞毒性測定：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６試薬（ｒｅｆ  Ｇ３５８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・  対照化合物：ＳＰ６００１２５（ｒｅｆ  ＡＬＸ−２７０−３３９−Ｍ０２５、Ａｌｅｘｉｓ、濃度：２０ｍＭ  ＤＭＳＯ）
・  吸光度読み取り：吸光度は、ＦｕｓｉｏｎＡｌｐｈａプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
・  リピート式ピペット、デジタルピペット、又はマルチチャネルピペット。
・  ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ：９６ウェルマイクロプレートシール（Ｒｅｆ  ６００５８５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
【０２４９】
ｂ．方法
ウェルのコーティング
プレートを、２００μｌのポリＤ−リシン（１×）でコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で２時間インキュベートした。
【０２５０】
細胞プレーティング
２時間後、ウェルを、２００ｌの１×ＰＢＳを用いて２回洗浄した（直ちに用いるか、又は使用するまで３７℃で２００ｌの１×ＰＢＳとともに置いておく、ただし３日以下）。
細胞をカウントした。所望の数の細胞を採取し、必要な量の培地に再懸濁して、１’０００’０００細胞／ｍｌの希釈を得た。１００ｎＭ  ＰＭＡを添加して、懸濁単球から接着マクロファージへのＴＨＰ１の分化を誘発した。その細胞を、１００ｌの培地中で、１００’０００細胞／ウェルのプレーティング密度でウェルにプレーティングした。接種後、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度で３日間インキュベートして、それらを分化させた後に、実験薬物を添加した。
【０２５１】
細胞処理
３日後、接着細胞を顕微鏡で観察した。ＰＭＡを含有する培地を吸引し、ＰＭＡなしの１００ｌの新鮮なＲＰＭＩ培地で置き換えた（１×ＰＢＳによる洗浄工程なし）。
【０２５２】
実験薬を、Ｈ２Ｏ又はＤＭＳＯ中で１０ｍＭの濃度で調製し、−８０℃で保管した。各々の毎日の使用の前に、ＪＮＫ阻害剤の１アリコートを解凍し、希釈して、ＲＰＭＩ培地中で４×濃縮溶液（１２０Ｍ）にし、次いでＲＰＭＩ中で所望の濃度にした。ＳＰ６００１２５を希釈して、ＲＰＭＩ培地中で４×濃縮溶液（４０Ｍ）にし、次いで０．８％ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ中で所望の濃度にした。
【０２５３】
プレートを、５０μｌの培地、又は４×の最終の所望の薬物濃度の溶液で処理した（ＪＮＫ化合物については、０、１００ｎＭ、１、３、１０若しくは３０Ｍの最終、又はＳＰ６００１２５陽性対照については、０、１０、１００ｎＭ、１、３若しくは１０Ｍの最終）。薬物添加後、プレートを、更に１時間、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％の相対湿度でインキュベートした。
【０２５４】
１時間後、ＴＮＦの分泌を、ＬＰＳウルトラピュアの５０ｌの４×濃縮希釈（３ｎｇ／ｍｌ最終）の添加によって誘発した。
【０２５５】
アッセイ
６時間後、１００ｌの上清を、新しい９６ウェルプレートに移した。これらのプレートを密閉し、−２０°でサイトカインの分泌のＥＬＩＳＡによる分析まで−２０°で保管した（例えば、実施例４を参照のこと）。
【０２５６】
化合物の細胞毒性効果は、ＭＴＳ吸光度で評価し（例えば、実施例４を参照のこと）、細胞は、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０ＣＦＬ；Ｚｅｉｓｓ；１０Ｘ）を用いて観察した。
【０２５７】
データ分析
データの分析は、ＥＬＩＳＡで示したとおり行った（実施例４を参照のこと）。要するに、ＥＬＩＳＡに関して：各々の標準の対照及び各々の試料について三連の読み取りを平均する。平均ゼロ標準光学密度（Ｏ．Ｄ）を差引きする。Ｏ．Ｄの対数に対してサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を作成し、最良適合線を、回帰分析によって決定してもよい。試料を希釈した場合、標準曲線からの濃度読み取りには、希釈係数を掛けなければならない。標準曲線は、アッセイした試料の各セットについて作成しなければならない。異常値データは、グラブス検定を用いて回避した。次いで、ＳＤの２倍のインターバルになかったデータを破棄した。陽性対照が以前に観察されたデータを示した場合、独立した実験を考慮する。独立した実験をプールする（Ｎ＞３）。
【０２５８】
細胞毒性効果の評価に関して：サイトカイン放出実験分析について考慮した各々の独立した実験の各々のプレートで、培地単独の吸光度の平均を、バックグラウンドとみなし、各々の吸光度値に対して差引きした。各々の化合物の非処理細胞の三連の平均を、１００％生存率とみなした。各々の化合物の三連の平均を、その１００％で正規化した。異常値データは、グラブス検定を用いて回避した。次いで、ＳＤの２倍のインターバルになかったデータを破棄した。独立した実験をプールする（Ｎ＞３）。
【０２５９】
条件の全ての統計学的比較は、以下の検定を用いるＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアで行った：１元ＡＮＯＶＡ検定の後にテューキー多重比較検定を続けた。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【実施例６】
【０２６０】
初代ラット又はヒト全血細胞における配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤及びＴＮＦα放出
全血は、クエン酸ナトリウムを含む事前標識した真空チューブに接続した静脈穿刺を用いて、麻酔したラット又はヒト健常ボランティアから収集する。チューブを、７〜８回反転させて穏やかに混合し；次いで刺激するまでＲＴで保持する。配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤を調製して、ＰＢＳ中で６倍濃縮し、３０μｌ／ウェルの混合物を９６ウェルプレートに添加する。全血をＰＢＳ中で１：２に希釈し、１２０μｌの希釈した血液を、ＰＢＳ単独か又は配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤を事前に添加したかのいずれかの各々のウェルに添加する。全血を３７℃；８５ｒｐｍ（Ｓｔｕａｒｔ  ＯｒｂｉｔａｌインキュベーターＳＩ５００）で６０分間インキュベートする。活性化因子（ＬＰＳ）を調製し、３０μｌ／ウェルのＬＰＳを６倍濃縮する。６０分のインキュベーション後、ＬＰＳを血液に添加し、血液をピペットで上下して混合し、次いでかき混ぜながら（８５ｒｐｍ）、３７℃で４時間保持する。４時間のインキュベーション後、このプレートを、約７７０ｇ、４℃で、事前に冷却した遠心分離器中で１５分間遠心分離する。上清を最終的に収集し、サイトカイン測定まで−２０℃で保持する。次いで、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を、標準的なＥｌｉｓａキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製：ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａｓ；又はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製：ＢＤ  Ｏｐｔｅｉａ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ）を用いて測定した。結果は、測定したサイトカインの上清のｐｇ／ｍｌとして表す。
【０２６１】
同様の実験を活性化因子／刺激因子としてＬＰＳの代わりにＰＭＡ＋イオノマイシンを用いて行った。
【実施例７】
【０２６２】
本明細書に開示される特定のＪＮＫ阻害剤の半減期
配列番号１９６、１９７、及び１７２の配列を有するＪＮＫ阻害剤（０．１ｍＭの最終濃度）をヒト血清（１×ＰＢＳ中で１０％及び５０％）中で消化した。その実験は、Ｔｕｇｙｉら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００５、４１３〜４１８頁）に記載のとおり行った。残りのインタクトなペプチドは、ＵＰＬＣ−ＭＳによって定量した。安定性は、配列番号１９６、１９７、及び１７２について同じく、ただし２つの別のアッセイで評価した。配列番号１９６を有するＪＮＫ阻害剤は、６時間内にアミノ酸残基に完全に分解されたが、配列番号１７２を有するＪＮＫ阻害剤は、１４日後にのみ完全に分解された。配列番号１９７を有するＪＮＫ阻害剤は、３０日後まだ安定であった。
【実施例８】
【０２６３】
ラット初代Ｔ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８−誘発性ＩＬ−２放出の配列番号１７２の配列を有するＪＮＫ阻害剤による用量依存性の阻害
対照動物を屠殺し、リンパ節（ＬＮ）を回収して、完全なＲＰＭＩ培地中で保持した。ＬＮを、５ｍｌピストンを用いて７０μｍフィルター上で完全なＲＰＭＩでスマッシュした。数滴の培地を添加して、濾過器を湿潤に維持した。細胞を４５０ｇ、４℃で７分間、遠心分離した。ペレットを、５ｍｌの新鮮な培地中に再懸濁した。細胞を、細胞濾過器を再度通過させた。細胞のアリコートをカウントし、一方では、細胞を１４００ｒｐｍ、４℃で再度１０分間遠心分離した。細胞を、ＭＡＣＳバッファー中に再懸濁した（１０７個の細胞あたり、８０μｌのＭＡＣＳバッファー）。一千万個の細胞あたり、１０μｌの抗ラットＭＨＣマイクロビーズを添加し、細胞を、４°〜８℃で１５分間インキュベートした。細胞を、１５ｍｌのＭＡＣＳバッファーで洗浄し、７００ｇ、４℃で７分間遠心分離した。ペレットを、１０８個の細胞あたり５００μｌのＭＡＣＳバッファー中に再懸濁した。動物１匹あたり１つのＬＳカラムを、ＭＡＣＳセパレーターの磁場に置いた。カラムを最初に、３ｍｌのＭＡＣＳバッファーですすいだ。１つのチューブを、氷中でカラムの下に置いて、細胞＝Ｔ細胞を収集した（ネガティブ選択、それによって、我々は、溶出されるものを収集する）。細胞懸濁物を添加して、溶出物を氷上に収集した。カラムを、３ｍＬのＭＡＣＳバッファーを用いて３回洗浄した。溶出したＴ細胞を、７００ｇ、４℃で７分間遠心分離した。再懸濁した細胞をカウントし、１００μｌの完全培地中で２０００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレートを、２μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体を用いて実験前日にプレコーティングし、実験日、プレートを、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。細胞を、１００μｌの（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤（配列番号１７２）を用いて処理して、１時間、２倍濃縮した後に、リガンド活性化した。（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤（配列番号１７２）による予備処理の１時間後、次いで細胞を、２４時間、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体で刺激した。刺激の２４時間後、上清を収集し、分析するまで−２０℃で保管した。次いで、サイトカインを、標準的なＥｌｉｓａキットを用いて測定した。結果は、測定されたサイトカインの上清のｐｇ／ｍｌとして表す。
【０２６４】
更なる実験では、本質的に上記で示されるのと同じプロトコールを用いたが、配列番号１７２を有する（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤に加え、配列番号１９７の配列を有するＪＮＫ阻害剤、及び薬物分子ＳＰ６００１２５も試験し、それによってＣＤ３／ＣＤ２８−誘発性ＩＬ−２放出の阻害に対するそれらの阻害剤の効果を比較することを可能にした。
【実施例９】
【０２６５】
ヒト全血中でのＪＮＫ阻害剤及びＴＮＦα／ＩＬ−２放出：
ヒト健常ボランティア由来の全血を、クエン酸ナトリウムを含有する事前標識した真空チューブに接続した静脈穿刺を用いて収集した。そのチューブを７〜８回反転させて穏やかに混合する；次いで、刺激するまでＲＴで保持する。３５０μｌのＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓを１，２ｍｌ−９６−ウェルプレートに添加した。１０倍濃縮の配列番号１７２を、ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ（１ウェルあたり５０μｌ）中に調製した。５０μｌを、１．２ｍｌ−９６ウェルプレートに添加した。次いで、５０μｌの全血を、培地単独又はＪＮＫ阻害剤のいずれかを以前に添加した各々のウェルに添加した。全血を、３７℃、５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ中に希釈した５０μｌ／ウェルのリガンドを、１０倍濃縮した最終希釈に対応して調製した。インキュベーションの６０分後、リガンドを添加し；次いで、血液をピペットで上下することによってウェルを混合した。全血を、３７℃で３日間インキュベートした（１日１回、各々のウェルをピペットで上下することによってウェルを混合した）。インキュベーションの終わりに、プレートを混合し、次いで、事前に冷却した遠心分離器中で２５００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。次いで、サイトカインを、標準的なＥｌｉｓａキットを用いて測定した。結果は、測定したサイトカインの上清のｐｇ／ｍｌとして表す。
【０２６６】
同様の実験を、わずかに改変して行った。ＣＤ３／ＣＤ８刺激の場合、ＣＤ３抗体を、ＰＢＳ中で、一晩４℃で２μｇ／ｍＬでコーティングした。実験の日、ウェルを、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、使うまで３７℃でＰＢＳ中に置いておいた。ＣＤ２８抗体を、２μｇ／ｍＬの最終濃度で配列番号１７２に１時間後に添加した；上清を、刺激の３日後に収集した。
【実施例１０】
【０２６７】
エンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）のラットモデルにおける抗炎症性力価
配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の抗炎症性力価を、静脈内投与後にアルビノラットで試験した（ＥＩＵ／ＬＰＳモデル）。この研究の目的は、エンドトキシン誘発性ブドウ膜炎アルビノラットモデルにおける炎症性応答に対する配列番号１７２の単回静脈内注射（０．０１５、０．１８、及び１．８０ｍｇ／ｋｇ）の効果を決定して、先行技術の配列番号１９７のＪＮＫ阻害剤（２ｍｇ／ｋｇ）で得たものに対するそれらの影響を比較することであった。更に対照として、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｃ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（「参照」）及びビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を使用した。
【０２６８】
６０（６０）例の雄性Ｌｅｗｉｓラットを、各々１０（１０）匹の動物の６（６）つの群に無作為に分けた。０．９％ＮａＣｌ（ビヒクル、「対照」）、２ｍｇ／ｋｇの配列番号１９７、及び３つの濃度（１．８０ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ及び０．０１５ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１７２を、ＥＩＵ誘発の直前（誘発の日）に静脈内注射によって投与した。したがって、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｃデキサメタゾン）（２０μｇ／眼、５μｌ；「参照」）を、ＥＩＵ誘発の直前（誘発の日）に両眼に、単回の結膜下注射によって投与した。ＥＩＵは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ、１ｍｇ／ｋｇ）の足蹠注射によって誘発した。ＬＰＳ注射の２４時間後、炎症性応答を、臨床スコアリングによって評価した。
【０２６９】
臨床的な眼の炎症の強度は、各々の眼について０〜４のスケールでスコア付けした。
等級０  炎症なし
等級１  わずかな光彩及び結膜の血管拡張
等級２  フレアを伴う軽度の光彩及び結膜の血管拡張
等級３  フレアを伴う強度の光彩及び結膜の血管拡張
等級４  強度の炎症反応
（＋１）フィブリン形成及び瞳孔閉鎖
【０２７０】
ＬＰＳ誘発の２４時間後、ビヒクルで処置したラットの臨床スコアは、３．６±０．２（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２０）、中央値が４（範囲、２〜５）であった。眼の炎症の重症度における有意な低下（ｐ＜０．００１）は、配列番号１９７（２ｍｇ／ｋｇ）を用いた誘発及び静脈内処置後２４時間で検出され（平均スコア：２．２±０．３、中央値：２）、これは、ビヒクル群で観察されたスコアと比較したＥＩＵスコアの４０％低下に相当していた。配列番号１７２による静脈内処置はまた、ほぼ同じ用量（１．８０ｍｇ／ｋｇ）で、眼の炎症の重症度を４２％、有意に低下した（平均スコア：２．１±０．３、中央値：２、ｐ＝０．００１）。それより下の用量（０．１８及び０．０１５ｍｇ／ｋｇ）は、それぞれ炎症を３３％（平均スコア：２．４±０．３、中央値：２）及び３６％（平均スコア：２．３±０．３、中央値：２）低下した。その低下は、ｐ＜０．００１で有意であった。
【０２７１】
陽性対照薬として用いられるデキサメタゾン（２０μｇ／眼）による結膜下処置も、臨床スコアを７９％、有意に低下した（平均スコア：０．８±０．２、中央値：０．５、ｐ＜０．００１）。
【０２７２】
これらの実験条件下で、配列番号１９７の２ｍｇ／ｋｇの単回の静脈内注射は、前眼房で観察されたエンドトキシン誘発性炎症を部分的に防いだと言うことができる。比較して、０．０１５、０．１８、１．８０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された配列番号１７２もまた、前眼房中でエンドトキシン誘発性炎症を低下した。
【実施例１１】
【０２７３】
慢性的に樹立したＩＩ型コラーゲン関節炎のラットモデルにおける１４日後のＪＮＫ阻害剤の静脈内投与後の用量応答性効果
ラットコラーゲン関節炎は、前臨床若しくは臨床研究のいずれかのもとにあるか、又はこの疾患の治療剤として現在用いられている、多くの抗関節炎剤の前臨床試験のために広く用いられている、多発性関節炎の実験モデルである。このモデルの特徴は、信頼できる発病及び頑強な進行、容易に測定可能な多関節炎症、パンヌス形成に関連する顕著な軟骨破壊、並びに軽度から中度の骨再吸収及び骨膜の骨増殖である。
【０２７４】
ラットにおいて樹立されたＩＩ型コラーゲン関節炎で生じる、炎症（足の腫脹）、軟骨破壊、及び骨再吸収の阻害のための１４日間（関節炎ｄ１〜１４）について毎日投与された（ＱＤ）配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の静脈内（ＩＶ）有効性は、前記実験モデルで決定した。
【０２７５】
動物（関節炎について１群あたり８匹）を、イソフルランで麻酔し、２ｍｇ／ｍｌのウシＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有する３００μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を尾の基部に及び背中の２つの部位に第０及び６日に注射した。研究の第１０日に（関節炎ｄ０）、関節炎の発病が生じ、ラットを処置群に無作為化した。各々の群への無作為化は、足首関節の腫脹が少なくとも１つの後足で明らかに樹立された後に行った。
【０２７６】
ＩＩ型コラーゲン関節炎が樹立された雌性Ｌｅｗｉｓラットを、ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、配列番号１７２（０．０１、０．１、１、若しくは５ｍｇ／ｋｇ）、又は参照化合物デキサメタゾン（Ｄｅｘ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）を用いて、静脈内（ＩＶ）経路で関節炎第１〜１４日に毎日（ＱＤ）処置した。動物を、関節炎第１４日に終わらせた。有効性評価は、動物の体重、毎日の足首のノギス測定、曲線下面積（ＡＵＣ）で表した足首の直径、最終足重量、並びに選択された群の足首及び膝の組織病理学的評価に基づいた。
【０２７７】
関節のコラーゲン関節炎の足首及び膝のスコアリングは、以下の基準に従って、炎症、パンヌス形成及び骨再吸収について０〜５の所定のスコアである。
【０２７８】
膝及び／又は足首の炎症
０      正常
０．５  最小限局性炎症
１      滑膜／関節周囲組織における炎症性細胞の最小湿潤
２      軽度湿潤
３      中度浮腫を伴う中度湿潤
４      顕著な浮腫を伴う顕著な湿潤
５      重度の浮腫を伴う重度の湿潤
【０２７９】
足首のパンヌス
０      正常
０．５  軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、辺縁領域にのみ影響し、かつ少数の関節にのみ影響する
１      軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、主に辺縁領域に影響する
２      軽度湿潤（辺縁領域の脛骨又は足根骨の１／４未満）
３      中度湿潤（辺縁領域で罹患した脛骨又は小さい足根骨の１／４〜１／３）
４      顕著な浸潤（辺縁領域で罹患した脛骨又は足根骨の１／２〜３／４）
５      重度の浸潤（辺縁領域で罹患した脛骨又は足根骨の３／４超、全体的な構造の重度の変形）
【０２８０】
膝のパンヌス
０      正常
０．５  軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、辺縁領域にのみ影響し、かつ少数の関節にのみ影響する
１      軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、約１〜１０％の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
２      軽度炎症（脛骨又は大腿骨の表面又は軟骨下領域の最大１／４にわたって広がる）、約１１〜２５％の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
３      中度浸潤（脛骨又は大腿骨の表面又は軟骨下領域のうち１／４を超えて、ただし１／２未満まで広がる）、約２６〜５０％の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
４      顕著な浸潤（脛骨又は大腿骨の表面のうち１／２〜３／４まで広がる）、約５１〜７５％の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
５      重度の浸潤  約７６〜１００％の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
【０２８１】
足首の軟骨損傷（小さい足根骨に対する強調）
０      正常
０．５  Ｔブルー染色の最小の低下、辺縁領域にのみ影響し、かつ少数の関節にのみ影響する
１      最小＝トルイジンブルー染色の最小から軽度の損失で、明白な軟骨細胞喪失もコラーゲン崩壊もない
２      軽度＝トルイジンブルー染色の軽度の喪失で、限局性の軽度（表層性）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴う
３      中度＝トルイジンブルー染色の中度の喪失で、多巣性の中度（中間領域までの深さ）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴い、より小さい足根骨が、１／２〜３／４の深さまで罹患し、全層喪失はまれな領域である
４      顕著＝トルイジンブルー染色の顕著な喪失で、多巣性の顕著な（深部領域までの深さ）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴い、１又は２つの小さい足根骨表面が、軟骨の全層喪失を有する
５      重度＝トルイジンブルー染色の重度の拡散喪失で、多巣性の重度の（潮汐点までの深さ）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴い、２つを超える軟骨表面が罹患する。
【０２８２】
膝の軟骨損傷
０      正常
０．５  Ｔブルー染色の最小の低下、辺縁領域にのみ影響する
１      最小＝トルイジンブルー染色の最小から軽度の損失で、明白な軟骨細胞喪失もコラーゲン崩壊もない
２      軽度＝トルイジンブルー染色の軽度の喪失で、限局性の軽度（表層性）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴い、罹患した軟骨の５０％の深さのわずかな小さい領域がある場合がある
３      中度＝トルイジンブルー染色の中度の喪失で、多巣性から散在性であって中度（中間領域までの深さ）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴い、１〜２の小さい領域の全層喪失がある場合があり、表面の全幅の１／４未満であって、かつ全表面の全幅の２５％以下に罹患している
４      顕著＝トルイジンブルー染色の顕著な喪失で、多巣性から拡散であって、顕著な（深部領域までの深さ）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を伴うか、又は１表面でのほぼ全層喪失及び他での部分喪失を伴い、合わせて全表面の幅の５０％未満の全層喪失がある。
５      重度＝トルイジンブルー染色の重度の散在で、多巣性の重篤な（潮汐点までの深さ）軟骨細胞喪失及び／又はコラーゲン崩壊を、大腿骨及び／又は脛骨の両方で伴い、合わせて全表面の幅のうち５０％よりも大きい全層喪失がある。
【０２８３】
足首の骨再吸収
０      正常
０．５  最小の再吸収は、辺縁領域にのみ罹患し、少数の関節にのみ罹患する
１      最小＝再吸収の小領域、低倍率では容易に明らかにならず、破骨細胞はまれ
２      軽度＝再吸収の領域がより多く、低倍率では容易に明らかにならず、破骨細胞はより多く、辺縁領域では脛骨又は足根骨の１／４未満が再吸収される
３      中度＝皮質で全層欠損のない髄質小柱及び皮質骨の明白な再吸収、ある程度の髄質小柱の喪失、低倍率で明白な病変、破骨細胞がより多く、脛骨又は足根骨のうち１／４〜１／３が辺縁領域で罹患
４      顕著＝全層が、皮質骨で欠損しており、残りの皮質表面の輪郭のゆがみを伴う場合が多く、髄様骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、脛骨又は足根骨のうち１／２〜３／４が辺縁領域で罹患
５      重度＝全層が、皮質骨で欠損しており、残りの皮質表面の輪郭のゆがみを伴う場合が多く、髄様骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、脛骨又は足根骨のうち３／４超が辺縁領域で罹患、全体的な構造の重度のゆがみ
【０２８４】
膝の骨再吸収
０      正常
０．５  最小の再吸収は、辺縁領域にのみ影響する
１      最小＝再吸収の小領域、低倍率では容易に明らかにならず、軟骨下骨の総関節幅のうち約１〜１０％が罹患
２      軽度＝再吸収の領域がより多く、軟骨下骨の明確な喪失、軟骨下骨の総関節幅のうち約１１〜２５％が罹患
３      中度＝軟骨下骨の明白な再吸収、軟骨下骨の総関節幅のうち約２６〜５０％が罹患
４      顕著＝軟骨下骨の明白な再吸収、軟骨下骨の総関節幅のうち約５１〜７５％が罹患
５      重度＝破壊に起因する全関節のゆがみ、軟骨下骨の総関節幅のうち約７６〜１００％が罹患
【０２８５】
結果：
疾患対照群における疾患の重症度は、第１〜５日で増大し、第４〜５日では、一日の増大が最大であった。次いで、漸増的な増大は、より小さく、第７日にピークであった。そのポイントから前へ、急性の腫脹は一般には低下し、キャリパーの測定は低下した。処置群は、この一般的なパターンに同様に従った。
【０２８６】
体重低下が全ての疾患群で観察されたが、正常な対照群は、体重が増加した。体重低下は、ビヒクル処置した疾患対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置したラットでは、有意に（２５％、ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５）阻害された。スチューデントのｔ検定を用いて疾患対照と比較した場合、体重低下の阻害もまた、１ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（２１％、ｐ＜０．０５）又はＤｅｘ（２１％、ｐ＜０．０５）で処置したラットで有意であった。配列番号１７２での処置の結果は、このパラメータについて用量反応性であった。
【０２８７】
毎日の足首の直径測定は、疾患対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（第４〜１２日、ｐ＜０．０５）又はＤｅｘ（ｄ３〜１４、ｐ＜０．０５）で処置したラットについては正常に向けて有意に（２元ＲＭ  ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５）低下した。
【０２８８】
足首の直径のＡＵＣは、疾患対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（４３％低下）、１ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（２７％）、又はＤｅｘ（９７％）で処置したラットに関しては正常に向けて有意に（ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５）低下した。配列番号１７２での処置の結果は、このパラメータに関して用量反応性であった。
【０２８９】
最終の足の重量は、疾患対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（２６％低下）又はＤｅｘ（１１４％）で処置したラットに関して正常に向けて有意に（ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５）低下した。配列番号１７２での処置の結果は、このパラメータに関して用量反応性であった。
【０２９０】
相対的な肝臓重量は、疾患対照と比較していずれの処置群のラットでも有意に影響されなかった（ＡＮＯＶＡによる）。
【０２９１】
体重に対する脾臓重量は、疾患対照と比較して、Ｄｅｘで処置したラットについて有意に（ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０５）低下した。Ｄｅｘ処置したラットの相対的な脾臓重量はまた、正常な対照と比較しても有意に低下した。相対的な脾臓重量は、配列番号１７２で処置されたラットでは有意に影響されなかった。
【０２９２】
体重に対する胸腺重量は、疾患対照と比較して、Ｄｅｘで処置したラットについて有意に（ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０５）低下した。Ｄｅｘ処置したラットの相対的な胸腺重量はまた、正常な対照と比較しても有意に低下した。相対的な胸腺重量は、配列番号１７２で処置されたラットでは有意に影響されなかった。
【０２９３】
全ての足首の組織病理学パラメータは、疾患対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（合計スコアの２５％低下）で処置したラットについて、正常に向けて有意に（マン・ホイットニーＵ検定による）低下した。
【０２９４】
全ての膝組織病理学パラメータは、疾患対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２（合計スコアの７３％低下）で処置したラットについて、正常に向けて有意に（マン・ホイットニーＵ検定による）低下した。
【０２９５】
この研究の結果によって、配列番号１７２（５ｍｇ／ｋｇ）での毎日の静脈内処置が、ラットにおいて、樹立されたＩＩ型コラーゲン関節炎に関連する臨床及び組織病理学パラメータに有意な有益な効果を有することが示された。配列番号１７２（１ｍｇ／ｋｇ）での処置は、結果として、有意に低下した足首の直径のＡＵＣを生じた。足首の直径に対する有益な効果は、疾患対照動物において第７日以後の腫脹の低下にかかわらず、最大第１２日まで観察された。配列番号１７２での処置の結果は、用量反応性であった。
【０２９６】
配列番号１７２での処置は、デキサメタゾンと異なり臓器の重量に有害な影響を有さなかった。
【実施例１２】
【０２９７】
配列番号１９７の全−Ｄ−レトロ−インベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド及び配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドの、マウスにおけるドライアイのスコポラミン誘発性モデルにおける３つの用量での効果
研究の概念
この研究の目的は、２つの異なる化合物である、配列番号１９７の全−Ｄ−レトロ−インベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド及び配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドの、スコポラミン誘発性ドライアイのマウスモデルにおける３つの用量レベルでの効果を評価することであった。
【０２９８】
配列番号１９７及び配列番号１７２のペプチドを、ドライアイのこのマウスモデルにおいて有効性に関して試験した。このペプチドは両方とも、低、中及び高用量で試験した。配列番号１９７のペプチドに関しては、低、中及び高用量レベルについて処方試料で測定した濃度は、それぞれ、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．２５％（ｗ／ｖ）及び０．６％（ｗ／ｖ）であり、配列番号１７２のペプチドに関しては、低、中及び高用量レベルについて処方試料で測定した濃度は、それぞれ、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）及び０．６％（ｗ／ｖ）であった。陰性対照としても役立つビヒクルは、注射用０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）であった。
【０２９９】
この研究は、全部で９つの群の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスから構成され、これは、各々１２匹のマウスの８つの群と、４匹のマウスの追加の群とを含んだ。両側性の短期間のドライアイを、スコポラミン臭化水素酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）注射（皮下（ＳＣ）、毎日４回、０．５ｍｇ／用量、第０〜２１日）及びマウスを一定気流の乾燥環境への曝露の組合せによって誘発した。第１日に開始して、１〜８群のマウスは、２１日間、毎日３回（ＴＩＤ）、ビヒクル（０．９％滅菌生理食塩水；陰性対照物）；配列番号１９７のペプチド（０．０６％、０．２５％及び０．６％）、配列番号１７２のペプチド（０．０５％、０．２％及び０．６％）；又はシクロスポリン（０．０５％；陽性対照、免疫系の活性を低下するために用いられる免疫抑制薬物）の両側の局所の眼（両眼；ＯＵ）投与（５μＬ／眼／用量）を用いて処置した。
【０３００】
生存中（処置）期間の間、臨床的な観察を、毎日１回記録した；角膜フルオレセイン染色による細隙灯検査（ＳＬＥ）、涙液層破壊時間試験（ＴＢＵＴ）、及びフェノールレッド糸試験（ＰＲＴＴ）を、１週間に３回行った。第２２日に剖検を行った；眼、眼瞼、結膜及び涙腺を、各々の動物の両眼から収集した。右眼（右眼、ｏｃｕｌｕｓ  ｄｅｘｔｅｒ；ＯＤ）由来の組織を固定し、次いで顕微鏡で評価した。左眼（左眼、ｏｃｕｌｕｓ  ｓｉｎｉｓｔｅｒ；ＯＳ）由来の組織を、液体窒素中で急速凍結し、後に分析ができるように−８０℃で凍結保存した。
【０３０１】
【表７】
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【０３０２】
方法
１．用量調製
配列番号１９７の（ポリ）ペプチドは、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス）から、３００．６５ｍｇの乾燥粉末を含有する１．５ｍＬの透明なプラスチックのマイクロフュージバイアルとして入手した。
【０３０３】
配列番号１７２の（ポリ）ペプチドは、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス）から、３０２．７ｍｇの乾燥粉末を含有する１．５ｍＬの透明なプラスチックのマイクロフュージバイアルとして入手した。
【０３０４】
研究開始の前に、配列番号１７２の（ポリ）ペプチド及び配列番号１９７の（ポリ）ペプチドは、滅菌生理食塩水（ビヒクル）中で処方した。各々の濃度での投与溶液は、０．２μｍフィルターを用いて滅菌し、複数の事前標識バイアルにアリコートし、−２０℃で凍結した。配列番号１９７のペプチドの処方試料中で測定した濃度は、０．０５８％、０．２５％及び０．６２４％であって、０．０６％、０．２５％及び０．６％に丸めた。配列番号１７２のペプチドの処方試料中で測定した濃度は、０．０５３％、０．２１７％及び０．５６２％であって、０．０５、０．２％及び０．６％に丸めた。
【０３０５】
投与の各々の日に、１セットの投与溶液を解凍し、その日の用量投与のために用いた。対照（ビヒクル、シクロスポリン）を投与のために準備した；用量調製は必要がなかった。
【０３０６】
２．細隙灯検査（ＳＬＥ）
研究に入る前に、各々の動物に、ＳＬＥ及び間接的な眼科検査を、局所適用フルオレセインを用いて実施した。眼科的知見は、ドレイズスケール眼科スコアリングを用いて記録した。ＳＬＥ及びドレイズスコアリングは、生存中の期間中、１週間に３回繰り返した。
【０３０７】
３．涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）試験及びその後の角膜検査
ＴＢＵＴ試験は、角膜へのフルオレセインの適用後の完全なまばたきと、涙液層中の第一のランダムな乾燥スポットの出現との間の時間経過の秒数を測定することによって毎週３回行った。ＴＢＵＴを行うために、０．１％液体ナトリウムフルオレセインを、結膜嚢に滴下し、眼瞼を手技的に３回閉じ、次いで、角膜を覆う連続のフルオレセイン含有涙液層を開いたまま保持し、層が破壊する（乾燥スポット又はストリークの出現）のに必要な時間（秒）を記録した。少なくとも９０秒後、０．１％フルオレセインの滴を角膜に更に再滴下した後、角膜上皮の損傷を、コバルトブルーフィルターを有する細隙灯を用いて等級付けし；次いで角膜をドレイズ眼スケールについてスコア付けした。
【０３０８】
４．フェノールレッド糸涙液試験（ＰＲＴＴ）
涙液生成を、ＰＲＴＴ試験ストリップ（Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ；メニコン、日本、名古屋）を用いて、両眼で週に３回測定した。その日の最初の処置の前に、細隙灯生体顕微鏡のもとで３０秒間各々の眼の結膜円蓋の外眼角に糸を適用した。トレッドの上の涙移動（すなわち、濡れた綿の糸の長さ）は、ミリメートルのスケールを用いて測定した。
【０３０９】
５．剖検及び病理
第２２日の剖検では、眼球、涙腺、眼瞼、及び結膜を含む各々の動物由来の両眼を切除した。右眼及び関連の組織を、改変ダビッドソン溶液中への浸漬、続いて、１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）へ移すことによって固定した。この右眼の固定した組織を、脱水し、パラフィンに包埋し、３〜５μｍの厚みで切片にし、スライドに装填した組織をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。染色したスライドを、光学顕微鏡で評価した。詳細かつ完全な組織病理学的評価を、眼の全部分で行い、少なくとも２つの切片のレベルを、各々の右眼について組織病理学的に検査した。角膜、結膜及び角膜の上皮（杯状細胞を含む）、並びに涙腺には特に注意を払った。これらの組織は、０〜４のスケールに基づいて損傷についてスコア付けし、ここで０は正常、１は最小、２は軽度、３は中度、４は重度であった。各々の角膜について、スコアは、角膜の上皮の厚み及び角膜炎症に基づいた。結膜を侵食及び炎症について、並びに杯状細胞の有無についてスコア付けした。
【０３１０】
結果
スコポラミン（０．５ｍｇ／用量）の毎日４回のＳＣ投与は、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで、水性涙液生成容積の低下及び涙の物理化学的特性の変化で特徴付けられる、ドライアイ症候群を誘発し、それらのマウスは、眼を効果的に潤滑にして保護することを可能にする安定な涙液層を維持することが難しくなった。
【０３１１】
１．涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）試験（Ｔｅａｔ）及び角膜検査
涙液層破壊時間試験（ＴＢＵＴ）は、ドライアイの誘発の前、並びにドライアイ誘発後第２、４、７、９、１１、１４、１６、１８及び２１日に再度行った。スコポラミンの投与（ドライアイ誘発）の開始後、ＴＢＵＴ平均値は、全ての動物で低下し始めたが、第６群（配列番号１７２の中間用量）ではより緩徐に低下するようであった。第５、６、７群（配列番号１７２のペプチドの低用量、中用量及び高用量）及び第８群（シクロスポリン）のＴＢＵＴの平均最下点は、第７日に生じ、同様の値に達した（それぞれ、６．６±０．４、６．７±０．４、６．７±０．３、及び６．４±０．４ｓ）。その後、これらの群のＴＢＵＴ平均は、第９日にピークまで増大した。第６群及び第７群（配列番号１７２の中用量及び高用量群）のＴＢＵＴ平均は、第８群、シクロスポリン群（８．５±０．３ｓ）よりも高い値まで上昇した（それぞれ、１０．０±０．７ｓ及び９．９±０．８ｓ）が、第５群、配列番号１７２の低用量のピークＴＢＵＴ平均（８．０±０．４ｓ）は、第８群（シクロスポリン）のものよりわずかに低かった。中用量及び高用量の配列番号１９７処置動物、第３群及び第４群のＴＢＵＴ平均は、投与の開始後に低下し続けて、第９日に最下点に達したが、低用量の第２群は、第９日に増大した。配列番号１７２処置動物の低用量、中用量及び高用量（それぞれ、第２群、第３群及び第４群）のＴＢＵＴ平均は、ビヒクル群を上回り、一般には、配列番号１７２処置動物の低用量、中用量及び高用量の平均より下であった。
【０３１２】
第７日から第２１日のＴＢＵＴ値に関する曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、種々の処置をビヒクル対照と比較した場合、配列番号１７２のペプチドの中用量、低用量、及び高用量（それぞれ、０．０５％、０．２％及び０．６％）での処置、第５群、第６群及び第７群、並びにシクロスポリン（０．０５％）で処置した動物、第８群は、ＴＢＵＴ  ＡＵＣの有意な増大を示した（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ＡＮＯＶＡ）。配列番号１７２のペプチドは、ＴＢＵＴの用量依存性の増大を生じると思われ、ここで中用量及び高用量は、同様の効果を生じることが多い。更に、シクロスポリン処置群と、配列番号１７２の３つの用量水準で処置した群と、非誘発性の群（第５、６、７、８及び９群）との間のＴＢＵＴ  ＡＵＣには有意な相違はなかった。この知見によって、配列番号１７２のペプチドの３つの用量全て及びシクロスポリンが、このドライアイモデルにおけるＴＢＵＴ変化の背景にある眼科学的変化の改善又は逆転において、ほぼ等しく有効であったことが示唆される。
【０３１３】
配列番号１９７のペプチドの低用量、中用量及び高用量のレベルで処置した群（第２〜４群）は、ＴＢＵＴにおいてわずかに一般的に用量依存性の増大を示し、この増大は、配列番号１７２又はシクロスポリンで処置された動物よりもほぼ２日遅く増大を開始した。
【０３１４】
【表８】
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【０３１５】
２．フェノールレッド糸涙液試験（ＰＲＴＴ）
ＰＲＴＴ試験は、ドライアイの誘発前、並びに第２、４、７、９、１１、１４、１６、１８及び２１日に再度行った。第０日から第４日のＰＲＴＴ値は、ドライアイを誘発させた全てのマウスで低下し、このことは、スコポラミンの投与及びブロワーで生み出された気流の増大した乾燥環境への曝露後に、涙液の生成が低下したことを示している。ほとんどの群でのＰＲＴＴの最下点は、ほぼ第７日に生じた。ＰＲＴＴは、ビヒクル対照群（第１群）で低下を続け、第１４日に最下点に達した。最下点の後、全てのドライアイ群で増大があった。これらの知見によって、化合物処置の開始より１日早いスコポラミン処置の開始は、ドライアイ症候群に関連する眼の生理学的変化を開始するのに十分であったことが示される。シクロスポリン処置群がほぼ第７日にまたがって他の群と同様のＰＲＴＴの低下を示した場合でさえも、次いで第１１〜１４日にはピークまで増大し、その後わずかに低下した。最終のＰＲＴＴ試験（第２１日）では、シクロスポリン（第８群）、並びに第６群及び第７群は全て、同様のＰＲＴＴ値を有し、これによって、中用量及び高用量の配列番号１７２のペプチドの処置の両方とも、このマウスドライアイモデルで水性涙液生成の増大においてシクロスポリンと同様の治療効果を有することが示唆される。
【０３１６】
低用量、中用量又は高用量の配列番号１７２のペプチドで処置した動物は、ビヒクル処置動物と比較して有意により多く水性涙液を生じた。したがって、ＴＢＵＴと同様に、配列番号１７２のペプチドは、このモデルにおける水性涙液の生成において一般的に用量関連の有意な増大を生じた。
【０３１７】
低用量、中用量又は高用量のレベルの配列番号１９７のペプチドで処置した群（０．０６％、０．２５％及び０．６％、それぞれ第２、３及び４群）は、ＰＲＴＴにおいて一般的に用量依存性の増大を示した。
【０３１８】
【表９】
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【０３１９】
３．組織病理学
ここでは、組織学的変化は、一般に角膜に限定された。角膜における知見は、角膜の上皮表面の角質化、角膜上皮の肥厚、角膜上皮の細胞充実度の増大、上皮細胞代謝回転と一致した基底上皮層の有糸分裂の軽度の頻度増大から構成された。これらの知見は、角膜乾燥及び角膜表面刺激作用に対する生理学的適応応答の指標である。表面潰瘍化、角膜実質浮腫及び角膜への炎症性浸潤は、この研究では見られなかった。第９群、未処置群（正常なマウス、スコポラミン処置なし）における眼は、正常限界内であった。全ての群にまたがって散らばった眼瞼のある程度の最小の非化膿性炎症があったが、眼の結膜、網膜、涙腺及び他の部分は、正常な限界内であった。杯状細胞は、全ての群で限界内であると思われた。杯状細胞は、涙がより強く、より粘着性の膜を形成することを助ける、ムチンの主なプロデューサーである。
【０３２０】
軽度から中度の角膜変化が、未処置の正常な眼の群（第９群）を除いて全ての群で注目され、第１群、ビヒクル処置群、及び第２群、低用量の配列番号１９７のペプチドでは、他の処置群に比較して、わずかに重症度が高かった。これらの知見は、角膜に対する涙液産生の増大のポジティブな有益効果と一致していた。
【０３２１】
いずれかの他の処置が、シクロスポリンに対して「同様のスコア低下」を生じたか否かを決定するために、種々の処置群の組織学的スコアを、シクロスポリン群における組織学的スコアと比較した場合、第４、６及び７群は、シクロスポリン群スコアと有意に異なることはないことが見出された。したがって、これらの３つの処置、中用量及び高用量の配列番号１７２のペプチド、及び高用量の配列番号１９７のペプチドは、シクロスポリン後に、このマウスドライアイモデルと関連する角膜の変化を軽減／緩和するのに最も有効であった。
【実施例１３】
【０３２２】
ラットにおけるアドリアマイシン誘発性腎症に対するＪＮＫ阻害剤の効果
アドリアマイシン処置は、ラット及びマウスにおいて糸球体疾患を誘発し、ヒト巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を模倣する。このモデルでは、管状及び間質性の炎症病変が、部分的には重度のタンパク尿に起因して、疾患経過の間に生じる。治療がなければ、腎臓疾患は、８週間以内に末期腎不全に進行する。有足細胞損傷は、糸球体硬化症につながるシークエンスの最初の段階の１つである。この研究の目的は、ＪＮＫ阻害剤が、腎の病変及び腎不全の発達を防げるか否かを検討することであった。
【０３２３】
方法
３０例の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をこの研究で用いた（１０匹のラットの３つの群に分けた）。腎症は、第０日のアドリアマイシン１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内注射によって誘発された。配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（２ｍｇ／ｋｇ；０．９％ＮａＣｌ中）又はビヒクルを、第０日に尾静脈に静脈内投与した。投与容積は０．２ｍｌであった。
【０３２４】
以下の表は、ランダムな割り付けをまとめている：
【０３２５】
【表１０】
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【０３２６】
各日に、全ての動物の一般的な挙動及び外観を観察した。動物の健康をモニターした（瀕死の動物、体重の異常で重大な低下、物質の主な不耐性など）。除外したラットはいなかった。
【０３２７】
眼窩後血液を、１群あたり４匹のラットから第７、１４、２８、４２及び５６日に採取した。血清クレアチニン濃度、血液尿及びタンパク尿を、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５０の適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。
【０３２８】
１群あたり２匹のラットを、第７、１４、２８、４２及び５６日に麻酔後に屠殺した。動物の屠殺後、両方の腎臓を採取した。組織病理学的検査のために、固定した組織標品を段階的アルコール溶液中で脱水して、トルエン中で浄化して、パラフィンに包埋した。切片（４μｍ）を、過ヨウ素酸（ＰＡＳ）で染色し、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）トリクローム染色を行って、コラーゲン沈着を検出した。糸球体及び尿細管間質性硬化症を、顕微鏡下で定量した。
【０３２９】
結果を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアを用いて、個別にまとめたデータの表の形式で表した。数値の結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。試験した動物が少数だったので、統計的な解析は行わなかった。
結果：
疾患の進行中の腎機能に対する配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の効果：尿及びクレアチニン血清レベルを測定して、腎臓疾患の経過の間の腎機能を研究した。クレアチニンは、熱量測定の量を邪魔するので、腎機能の繊細な指標である尿素のみを分析した。尿の血清レベルは未処置のラットでは顕著に安定であるが（５ｍｍｏｌ／ｌ未満）、ＡＤＲは尿素レベルの進行性の増大を誘発し、これは第２８日から第４１日の２５ｍｍｏｌ／ｌまで、次いで第５６日の４８ｍｍｏｌ／ｌまで急激に上昇し、これは末期腎不全を反映している（図３８Ｂ）。他方では、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤で処置したラットは、疾患の経過にまたがって１０ｍｍｏｌ／ｌ未満の尿血清レベルを示した（図３８Ｂ）。これらの結果によって、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、腎臓疾患及び腎不全の進行を防ぐことが示唆される。
【０３３０】
組織病理学的知見（ＰＡＳ及びマッソントリクローム染色）：
ＡＤＲ誘発性の構造変化を、光学顕微鏡下で評価した。生理食塩水処置した対照のラットは、形態学的に正常な糸球体及び小管を示した。第８日に、光学顕微鏡の検査によって、ＡＤＲネフローゼ群における巣状分節状糸球体硬化及びタンパク性円柱を有するいくつかの領域が示された。対照的に、いくつかの小管は、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤で処置したラットではタンパク質で充填され、糸球体は、メサンギウム細胞過多がないか又は離散している正常な構造を示したが、小管構造及び間質は、病理学的変化を示さなかった（図３９）。第１４日までに、ＡＤＲ処置ラットは、進行性の糸球体硬化症、ヒアリン沈着、管拡張及び円柱形成を示した。糸球体硬化症の程度は、この群では劇的に悪化して、第２９日及び第４１日までにほとんどの糸球体で、重度の尿細管萎縮及び間質性線維症に関連する、糸球体房とボーマン腔との間の明らかな接着をともなうびまん性になった。第５６日に、びまん性糸球体硬化が、全ての糸球体で観察された（図４０）。しかし、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤処置したラットは、第８日に相対的に正常な外観を有し、ＡＤＲ処置ラットと比較して第５６日に、少数の限局性かつ部分的な糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症を発症した。全体として、これらの結果によって、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が糸球体及び尿細管間質性の線維症の発症を防ぎ、かつこの群における腎機能の保存を説明し得ることが強く示唆される。
【０３３１】
この検証の結果、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、ＡＤＲによって誘発される糸球体及び尿細管間質性損傷の進行を防ぐという証拠が得られる。更に、この分子は、腎機能を保存する。
【実施例１４】
【０３３２】
マウスにおけるイミキモド誘発性乾癬に対するＪＮＫ阻害剤の評価
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８のリガンドであるイミキモド（ＩＭＱ）は、免疫応答の強力な修飾因子である。イミキモドは、多くの動物モデルで強力な抗ウイルス及び抗腫瘍効果が実証されている。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９、１８２、５８３６〜５８４５頁）によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＭＱの局所適用が、乾癬を誘発し、ヒト乾癬病変とよく似ていることが実証された。
【０３３３】
方法
雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、研究開始時に８〜１０週齢）を以下の群（処置スケジュール）に割り当てた：
【０３３４】
【表１１】
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【０３３５】
更に、５匹の動物の群は処置していない（「ナイーブな」群）。
【０３３６】
ＩＭＱの局所適用が、皮膚炎症を誘発したか否かを実証することは、乾癬に特徴的な構造的特徴をともない、ＩＭＱクリーム（約６２．５ｍｇのイミキモドクリーム５％）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの剃毛した皮膚の背及び右耳に６日連続で塗布された（第２〜７日まで）。
【０３３７】
この実験では、２つの陽性対象を利用した。最初に、プレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ（精製水中、ビヒクル：１％ヒドロキシエチルセルロース、０．２５％ポリソルベート８０、及び０．０５％消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ））を、毎日、経口で投与した（「プレドニゾロン」群）。第２に、デキサメタゾンを、静脈内経路を介して第１、４及び７日に、０．５ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル：滅菌０．９％ＮａＣｌ）で投与した。
【０３３８】
配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（「配列番号１７２」）を、０．９％ＮａＣｌ中に溶解した。３つの異なる用量（上記の群の表を参照のこと）を投与するために、連続希釈した（１：１０倍）。配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、易溶解性であり、溶液から析出しなかった。３つの異なる用量の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）を、第１、４及び７日にそれぞれの群に静脈内投与した。
【０３３９】
第８日に、動物を屠殺し、組織（耳）を１０％中性緩衝化ホルマリン中に固定した。組織病理学のために、ヘマトキシリン−及び−エオシン−染色した切片（横断）を準備して、全動物から収集した組織について顕微鏡検査を行った。組織病理学のための方法及び終点は、炎症、表皮過形成、表皮角質増殖（不全角化ではない）が重症度等級で観察され記録されるという点で、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓ（２００９）の論文に同様に記載されており、それによって、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９、１８２、５８３６〜５８４５頁）からのそれぞれの方法論が参照によって本明細書に援用される。組織病理学的等級付けスコアは、二次炎症プロセスを有する動物で皮膚又は耳のいずれかについて除外された（全層の表皮潰瘍）。スコアを群で平均して、標準偏差及び統計学的有意差を算出した。図４１のグラフでは、群平均（＋／−）標準偏差（ＳＤ）が下に描写されることが示される。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の背面からのホルマリン固定、パラフィン包埋した皮膚を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色で染色し、顕微鏡的に評価した。上記の参照からの重要な相違、及びこの研究の観察を詳細に記載するため：角質増殖は、正常角化（核の保持なし）又は不全角化（核が保持される）として具体的に定義してもよい。いずれも種々の解剖学的位置で、種に応じて正常に生じ得る；しかし、両方の条件とも特に疾患状態では十分定義される。ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓの論文は、それらのイミキモド（ＩＭＱ）誘発性乾癬モデルを、ヒトの条件でみられるものと同様の不全角化角質増殖を生じるものとして記載しており、それがこの研究の規定の終点であった。しかし、Ｄａｎｉｌｅｎｋｏら（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００８  ４５：５６３頁）は、多くのげっ歯類乾癬モデルが正常角化角質増殖を有することを示した。現実に、同じ病変が時に、両方の種類の角質増殖を示す場合があり得、この研究におけるげっ歯類は、まれな、多病巣の不全角化を伴う原発性の正常角化角質増殖を有した。より一般的な用語「角質増殖」は終点の等級付けに用いられ、本文中では、どの種類がみられたか（主に正常角化）を記述する。ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓの論文からの別の相違は、それらがヒト患者を、その表皮の顆粒層で顆粒化の減少を有すると記載しているということである（彼らの研究では、げっ歯類の皮膚は、同様であると報告された）；しかし、この研究、及びＤａｎｉｌｅｎｋｏのレビューでは、乾癬の多くのげっ歯類モデルがこの層における顆粒化の増大（顆粒層肥厚）を示すか、又はこの層自体が過形成である。
【０３４０】
顕微鏡的組織病理学的終点は以下のように等級付けした：
１＝ＭＩ＝最小
２＝ＳＬ＝わずか
３＝ＭＯ＝中度
４＝ＭＡ＝顕著
５＝ＳＥ＝重度
【０３４１】
結果
配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤中用量群（統計学的に有意）及び配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤高用量群は、ビヒクル−ＩＭＱ投与群と比較して耳の炎症が低下していた（図４１）。また、陽性対照群、すなわち、プレドニゾロン群及びデキサメタゾン群は、ビヒクル−ＩＭＱ投与群と比較して耳の炎症の低下を示した（両方とも統計学的に有意、図４１）。一般には、真皮に存在した炎症は、より少ない好中球と混合されたリンパ球及びマクロファージから構成された。表皮中の炎症はそれほど一般的でなく、主に好中球であって、角膜内の層（正常角化層）に、及び表皮内にマンロー微小膿瘍（Ｍｕｎｒｏ’ｓ  ｍｉｃｒｏａｂｓｃｅｓｓｅｓ）として存在した。炎症はナイーブな群には存在しなかった。
【０３４２】
耳の表皮過形成の最小低下がまた、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の中用量群で観察され、これは、プレドニゾロン群及びデキサメタゾン群で観察されたものよりわずかに低かった。配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の中用量及びプレドニゾロン群は、ビヒクル−ＩＭＱ投与群のものより低かったが、それらは統計学的に有意ではなかった。表皮角質増殖に関して耳について配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤で処置した用量応答としてあからさまな相違は示されなかったが、配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の低用量群、プレドニゾロン、及びデキサメタゾン群は、ビヒクル−ＩＭＱ投与群と比較して平均等級の低下が最小であった。ナイーブ群は、顕微鏡的に正常であった。
【実施例１５】
【０３４３】
腎虚血／再かん流病変に対するＪＮＫ阻害剤の効果
腎虚血／再かん流（腎Ｉ／Ｒ）障害は、急性腎不全としても公知の、急性腎障害（ＡＫＩ）の一般的に使用されるモデルである。急性腎障害に対する腎Ｉ／Ｒ障害を試験する研究の臨床関連性に加えて、実験的な腎Ｉ／Ｒ障害はまた、腎移植を受けている患者で生じる状態を評価するために用いられる重要なモデルでもある。ドナー次第で、移植された腎臓は、移植前の種々の時間の間、血液をかん流されない。ＡＫＩは、患者でこのような深刻な影響を有し、全ての移植された腎臓は、腎Ｉ／Ｒ障害をある程度まで経験するので、ヒトの健康に対するこの種の研究の臨床的な関連性及び移行の重要性は極めて高い。したがって、この研究の目的は、ラットにおける実験的な腎虚血／再かん流に対して配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の影響を検討することである。
【０３４４】
この目的を達成するために、２６匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（５〜６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、以下の群に割り当てる：
【０３４５】
【表１２】
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【０３４６】
腎虚血は、傷をつけないクランプを用いて両方の腎茎をクランピングすることによって誘発する（壊疽の誘発）。１つの固有の用量の配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（２０００μｇ／ｋｇ）を、第０日に、傷をつけないクランプを用いた両方の腎茎のクランピング期間の１時間後（再かん流後）、尾静脈に静脈内（ＩＶ）投与する。投与容積は２ｍｌ／ｋｇである。ヘパリン（５０００ＩＵ／ｋｇ）を、クランピングの１時間前に腹腔内に投与する。
【０３４７】
各日に、全ての動物の一般的な挙動及び外観を観察する。動物の健康が研究の継続と適合しない場合（瀕死の動物、体重の異常で重大な低下、物質の主な不耐性など）、動物は、治験医師の責任のもとで倫理的に屠殺する。個々のラットは、代謝ケージで飼育する（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）。尿を２４時間ごとに最大７２時間まで収集する。血液試料は、尾静脈から、再かん流前、次いで再かん流の２４時間及び７２時間後に得る。両方の期間の終わりに（２４及び７２時間）、１群あたり５匹のラット（第１群については３匹）を屠殺する。動物屠殺後、両方の腎臓を収集する。１群あたり５匹のラット（第１群については３匹）を各時点で用いる（再かん流後２４時間及び７２時間）。腎機能の評価のために、血清クレアチニン（μｍｏｌ／ｍｌ）又は尿素濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を、適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定する。タンパク尿及びアルブミン尿の評価のために、タンパク尿及びアルブミン尿は、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５０の適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行う。
【０３４８】
組織学的病変の評価は、再かん流２４時間及び７２時間後に行う。光学顕微鏡のために、腎臓をＤｕｂｏｓｑ−Ｂｒａｚｉｌ中で１６時間インキュベートし、脱水し、パラフィンに包埋し、切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で染色する。各々の染色について、３つの切片を分析する。
【０３４９】
免疫組織化学分析のために、腎臓試料を、Ｄｕｂｏｓｑ  Ｂｒａｚｉｌ中で１６時間固定し、引き続き脱水し、パラフィンに包埋する。抗原賦活化は、１５分間、５００Ｗのマイクロ波オーブン中で煮沸中の０．０１Ｍクエン酸バッファー中にスライドを浸漬することによって行う。内因性のペルオキシダーゼ活性をメタノールに含まれる０，３％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロックする。スライドを、アビジン−ビオチン溶液からなるブロッキング試薬とともに３０分間、及び正常なブロッキング血清とともに２０分間インキュベートする。免疫検出のために、スライドを一晩、抗体とともに、次いでビオチン化二次抗体とともにインキュベートする。アビジン−ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）及び３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、色素原として、免疫反応の可視化のために適用する。スライドをヘマトキシリンで対比染色する。一次抗体の省略を陰性対照とみなす。
【０３５０】
免疫蛍光標識は、１０分間アセトン中で固定した腎組織の４ｍｍ厚のクリオスタット切片で行い、３０分間室温で空気乾燥し、次いでＰＢＳ中で３分間インキュベートし、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中でブロックする。その切片を、室温で１時間示した抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、レッドテキサスコンジュゲートの二次抗体とともにインキュベートする。切片は、免疫蛍光分析のために蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で検査する。
【０３５１】
有足細胞の損傷、炎症及び腎線維症に特異的ないくつかのマーカー（ＲｅｌＡ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、マッソントリクローム）の発現を、免疫組織化学及び免疫蛍光によって評価する。腎臓におけるＴＮＦ、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１（ＫＣ）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ−２）及びＭＣＰ１の定量的転写プロファイルを決定する。
【実施例１６】
【０３５２】
ラット歯周炎モデルにおける炎症反応に対するＪＮＫ阻害剤の阻害性効果
この研究の目的は、ラットにおける歯周炎モデルで誘発された炎症に対する配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の影響を検討することである。
【０３５３】
３０匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄性、４２〜５６日齢）を、この研究で用いる（１０匹のラットの４つの群に分ける）。実験的な歯周炎は、１０日間の第０日に第一臼歯（１匹の動物あたり１つの臼歯）の周囲に置いた結紮によって誘発される。１用量の４ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（ビヒクルとして０．９％ＮａＣｌ中）を、第１０日に歯肉内に（ＩＧＶ）投与する。投与容積は１０μｌである。投与は、第一臼歯を囲む付着した歯肉にＩＧＶで行う。
【０３５４】
以下の表は、無作為な割り付けをまとめる：
【０３５５】
【表１３】
2017520569.tif 000019
【０３５６】
各日に、全ての動物の一般的な挙動及び外観を観察する。動物の健康が研究の継続と適合しない場合（瀕死の動物、体重の異常で重大な低下、物質の主な不耐性など）、動物は、治験医師の責任のもとで倫理的に屠殺する。歯周炎の炎症の様相は、第０、１０及び１７日に歯肉組織の巨視的観察によって分析する。プラーク指数及び歯肉炎指数を、第０、１０及び１７日に、臨床スコアリングを用いて、歯周部臨床指数として測定する。
【０３５７】
第１７日に、動物を屠殺し、試料を収集する。歯肉組織を、全動物で生体分子分析のために切り出す。安楽死の後、下顎骨を、組織学的評価のために切り出す。炎症細胞の評価のために、炎症細胞の定量を、組織形態計測学的な測定によって行う。炎症性タンパク質レベルの評価のために、炎症性タンパク質（ｐ−ＪＮＫ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１０、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９）のレベルを、歯肉組織のホモジネートから測定する。組織破壊の評価のために、骨組織破壊を、放射線学的分析（マイクロ−ＣＴ）によって１群あたり３匹の動物で評価する。歯周部の複合体破壊を、組織学的分析によって評価する。骨微細構造の評価のために、骨小柱測定（厚さ、分離）を、第０、１０及び１７日に１群あたり３匹の動物で放射線学的分析（マイクロ−ＣＴ）によって評価する。口腔の細菌の特定のために、歯のポケットにおける細菌集団を、第０、１０及び１７日に、９つの歯周病原菌に対するＤＮＡプローブ（リアルタイムＰＣＲ）によって特定する。コラーゲンのフレームワークのために、総コラーゲン量の測定は、偏光顕微鏡を用いて行う。コラーゲンＩ／コラーゲンＩＩＩ比を、組織形態計測分析によって評価する。
【実施例１７】
【０３５８】
ラットにおけるエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）モデルでの配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の作用期間の評価
２４（１８）の雌性Ｌｅｗｉｓラット（３６の眼）を無作為に、各々３匹の動物の６つの群に分けた。ＥＩＵを、２００μｇのＬＰＳ（サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella  typhimurium）由来のリポポリサッカライド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）（２ｍｇ／ｍｌ）を含有する１００μｌの滅菌の発熱性物質なしの生理食塩水の単回足蹠注射によって誘発した。
【０３５９】
動物を、尾静脈中に１ｍｇ／ｋｇの単回用量（投与溶液１ｍｌ／ｋｇ）で配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の静脈内注射によってＥＩＵ誘発の４８時間、１週、２週又は４週前に処置した。デキサメタゾン２ｍｇ／ｋｇ又はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、ＥＩＵ誘発の直前に静脈内に注射した。
【０３６０】
ＥＩＵに対する配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の効果は、誘発の２４時間後の臨床スコアリング及びＰＭＮ細胞定量を用いて評価した。眼の検査は、細隙灯によって２４時間で、すなわち、このモデルにおける疾患の臨床ピークで行った。臨床的な眼の炎症の強度は、各々の眼について０〜５のスケールでスコア付けした：
等級０：炎症なし、
等級１：最小の虹彩及び結膜の血管拡張があるが、前眼房（ＡＣ）ではフレアも細胞も観察されない、
等級２：中度の虹彩及び結膜の血管拡張があるが、ＡＣではフレアも細胞も証拠がない、
等級３：強度の虹彩の血管拡張の存在、フレア及び細隙灯あたり１０未満の細胞、ＡＣの領域、
等級４：等級３より重度の臨床徴候の存在、ＡＣで１０を超える細胞が、前房蓄膿の形成の有無を伴う、
等級５：強度の炎症反応の存在、ＡＣにおけるフィブリン形成及び瞳孔の完全な閉鎖。
【０３６１】
臨床評価は、盲検方式で行った。
【０３６２】
組織学的に、１８の眼球（動物１匹あたり１つ）を収集し、４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、室温で１時間固定した後に、ＰＢＳ中で一晩すすいだ。翌日、試料を、最適切断温度（ＯＴＣ）の化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｚｏｅｔｅｒｗｏｕｄｅ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）に包埋し、視神経レベルでクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０Ｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用い、組織学のためにスーパーフロストスライドに装着した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）による核染色の後、切片をＰＢＳ／グリセロール（１／１）中に装着し、蛍光光学顕微鏡（ＦＸＡ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ、Ｎｉｋｏｎ、ＵＳＡ）で観察した。デジタル化した顕微鏡写真を、デジタルカメラ（Ｓｐｏｔ、ＢＦＩ  Ｏｐｔｉｌａｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて得た。ＤＡＰＩで染色したそれらの核の形状によって特定したＰＭＮ細胞を、組織学的切片上で定量した。分析は、視神経頭部レベルで１つの眼あたり２つの異なる切片で行った。
【０３６３】
ＬＰＳ誘発の２４時間後、ビヒクル処置ラットの臨床スコアは、４．６±０．２（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８）であった。低下は、（ビヒクル処置した眼の等級  −  試験品で処置した眼の等級）／（ビヒクル処置した眼の等級）として算出した。眼の炎症の重症度における有意な低下（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）が、ＥＩＵ誘発の４８時間前に投与された、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）（１ｍｇ／ｋｇ）での誘発及び静脈内処置の２４時間後に検出され（平均スコア：２．８±０．３）、これは、ビヒクル群において、ＥＩＵ誘発の１週間前に投与された、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）（１ｍｇ／ｋｇ）での誘発及び静脈内処置の２４時間後に観察されたスコア（平均スコア：３．３±０．３）と比較してＥＩＵスコアの４０％（＊＊）低下に相当し、ビヒクル群において、ＥＩＵ誘発の２週間前に投与された、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）（１ｍｇ／ｋｇ）での誘発及び静脈内処置の２４時間後に観察されたスコア（平均スコア：３．０±０．２）と比較してＥＩＵスコアの２７％（＊）低下に相当し、ビヒクル群において観察されたスコアと比較してＥＩＵスコアの３５％（＊＊）低下に相当した。しかし、ＥＩＵ誘発の４週間前に投与された、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）（１ｍｇ／ｋｇ）での誘発及び静脈内処置の２４時間後には有意な低下は観察されず（平均スコア：４．２±０．１）、これは、ビヒクル群において観察されたスコアと比較してＥＩＵスコアの９％低下に相当した。
【０３６４】
陽性対照薬物として用いた、ＥＩＵ誘発の直前のデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）による単回静脈内処置もまた、臨床スコアを６９％、有意に低下した（平均スコア：１．４±０．２、ｐ＜０．０１）。
【０３６５】
組織学的検討において、ＰＭＮ細胞数は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）が、ＥＩＵ誘発の４週間前（ｐ＜０．０５）及び２週間前（ｐ＜０．０１）に投与された場合、有意に低下した。したがって、ＰＭＮ細胞の数は、デキサメタゾンがＥＩＵ誘発の直前に投与された場合、有意に低下した。
【０３６６】
結論：この研究の目的は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）（１ｍｇ／ｋｇ）の、ラットでのエンドトキシン誘発性のブドウ膜炎（ＥＩＵ）モデルにおける抗炎症としての作用期間を評価することであった。ＥＩＵに対するＸＧ−１０４の効果は、誘発の２４時間後の臨床スコアリング及びＰＭＮ細胞定量を用いて評価した。ＬＰＳチャレンジの４８時間、１週間及び２週間後のＸＧ−１０４処置の眼の平均臨床スコアは、それぞれ、４０％、２７％及び３５％低下でビヒクル群の平均スコアから有意に異なった。ＰＭＮ細胞の数は、それぞれ、ＥＩＵ誘発の、２週間及び４週間前にＸＧ−１０４を投与した場合、有意に低下し、それぞれ、ビヒクル処置群と比較して８８％及び６９％低下であった。デキサメタゾンは、ＬＰＳチャレンジの直前に投与した場合、臨床スコア及びＰＭＮ細胞数を有意に低下した。したがって、ＸＧ−１０４の作用期間は、２〜４週間であることが実証された。
【実施例１８】
【０３６７】
腎虚血／再かん流病変に対する配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の効果
腎虚血／再かん流（腎Ｉ／Ｒ）障害は、急性腎不全としても知られる、急性腎障害（ＡＫＩ）の一般的に使用されるモデルである。急性腎障害に対して腎Ｉ／Ｒ障害を検査する研究の臨床関連性に加えて、実験的な腎Ｉ／Ｒ障害はまた、腎移植を受けている患者で生じる状態を評価するために用いられる重要なモデルでもある。ドナー次第で、移植された腎臓は、移植前に種々の時間の間、血液をかん流されない。ＡＫＩは、患者でこのような深刻な影響を有し、全ての移植された腎臓は、腎Ｉ／Ｒ障害をある程度まで経験するので、ヒトの健康状態に対するこの種の研究の臨床的な関連及び移行の重要性は極めて高い。したがって、この研究の目的は、ラットにおける実験的な腎虚血／再かん流に対する配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の影響を検討することである。
【０３６８】
２６（２６）匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（５〜６週齢）を、この研究で用いた（１０匹のラットの２つの群及び６匹のラットの１つの群に分けた）。ラットを、標準のケージで飼育し、食物及び水道水に自由にアクセスさせた。各日に、全動物の一般的な挙動及び外観を観察した。動物の健康をモニターした（瀕死の動物、体重の異常で重大な低下、物質の主な不耐性など）。取り除いたラットはいなかった。
【０３６９】
腎虚血は、傷をつけないクランプを用いて両方の腎茎をクランピングすることによって誘発した。配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の２ｍｇ／ｋｇの単回用量（ビヒクルとして０．９％ＮａＣｌ中）又はビヒクルを、それぞれ、第０日に、傷をつけないクランプを用いた両方の腎茎のクランピング期間の１時間後（再かん流後）、尾静脈にＩＶ注射によって投与した。投与容積は、２ｍｌ／ｋｇであった。ヘパリン（５０００ＵＩ／ｋｇ）を、クランピングの１時間前に腹腔内投与した（全群で）。
【０３７０】
以下の表は、無作為な割り付けをまとめる：
【０３７１】
【表１４】
2017520569.tif 000020
【０３７２】
試料収集のために、ラットを代謝ケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）で個々に飼育した。尿は７２時間で収集した。血液試料は、再かん流の前及び２４時間後に尾静脈から得た。動物の屠殺後、両方の腎臓を収集した。
【０３７３】
タンパク尿及びアルブミン尿の評価のために、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５０の適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。
【０３７４】
腎機能の評価のために、血液を再かん流の２４時間後に尾静脈から収集した。血清クレアチニン（μｍｏｌ／ｍＬ）及び尿素濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を、適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。
【０３７５】
組織学的病変の評価は、再かん流の２４時間及び７２時間後に行った。
【０３７６】
光学顕微鏡のために、腎臓をＤｕｂｏｓｑ−Ｂｒａｚｉｌ中で１６時間インキュベートし、脱水し、パラフィンに包埋し、切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で、又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。
【０３７７】
免疫組織化学のために、腎臓試料を、Ｄｕｂｏｓｑ  Ｂｒａｚｉｌ中で１６時間固定し、引き続き、脱水し、パラフィンに包埋した。抗原賦活化は、１５分間、５００Ｗのマイクロ波オーブン中で煮沸中の０．０１Ｍクエン酸バッファー中にスライドを浸漬することによって行った。内因性のペルオキシダーゼ活性をメタノール中の０，３％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロックした。スライドを、アビジン−ビオチン溶液からなるブロッキング試薬とともに３０分間、及び正常なブロッキング血清とともに２０分間インキュベートした。免疫検出のために、スライドを一晩、抗体とともに、次いでビオチン化二次抗体とともにインキュベートした。アビジンビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）及び３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、色素原として、免疫反応の可視化のために適用した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体の省略を陰性対照とみなした。
【０３７８】
免疫蛍光標識は、１０分間アセトン中で固定した腎組織の４ｍｍ厚のクリオスタット切片で行い、３０分間室温で空気乾燥し、次いでＰＢＳ中で３分間インキュベートし、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中でブロックした。その切片を、室温で１時間、示した抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、レッドテキサスコンジュゲートの二次抗体とともにインキュベートした。切片は、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で検査する。
【０３７９】
更に、有足細胞の損傷、炎症及び腎線維症に特異的ないくつかのマーカー（ＲｅｌＡ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、マッソントリクローム）の発現を、免疫組織化学及び免疫蛍光によって評価した。腎臓におけるＴＮＦα、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１（ＫＣ）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ−２）及びＭＣＰ１の定量的転写プロファイルを決定した。
【０３８０】
結果：
結果を図４２に示す。血清クレアチニン及び尿素は、虚血なしのビヒクル処置対照ラット（Ｇ１）と比較して、虚血２４時間後にビヒクル処置した虚血ラット（Ｇ２）では増大した。他方では、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤で処置された虚血性ラット（Ｇ３）は、未処置の虚血性ラット（Ｇ２）に対して、低い血清クレアチニン及び低い尿素を示した。これらの結果によって、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）は、虚血誘発性腎不全を防ぎ得ることが示唆される。
【実施例１９】
【０３８１】
ヒト肝臓腫瘍細胞株に対する配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の抗腫瘍活性
この研究の目的は、ＭＴＳアッセイを用いて、ヒト肝細胞癌及びヒト肝癌細胞株に対して配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の細胞毒性活性を決定することである。
【０３８２】
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（由来：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ；ＨｅｐＧ２細胞株は、１９７５年に肝細胞癌を有する１５歳のアルゼンチン人少年の腫瘍組織から樹立し、この細胞株におけるＢ型肝炎ウイルスゲノムの証拠はない）、及びヒト肝癌細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（由来：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ；ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を分泌する）を用いる。腫瘍細胞は、３７℃、湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）で単層として増殖する。培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（ｒｅｆ：３３０２、Ｐａｎ）、０．１ｍＭのＮＥＡＡ（ｒｅｆ：ＢＥ１３−１１４Ｅ、Ｌｏｎｚａ）及び１ｍＭのＮａＰｙｒ（ｒｅｆ：ＢＥ１３−１１５Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充されたＥＭＥＭ（ｒｅｆ：ＢＥ１２−６１１Ｆ、Ｌｏｎｚａ）である。細胞は、プラスチックのフラスコに付着される。実験使用のために、腫瘍細胞を、培養フラスコから、カルシウムもマグネシウムもないハンクス培地（ｒｅｆ：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中のトリプシン−ヴェルセン（ｒｅｆ：ＢＥ０２−００７Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を用いた５分の処理によって剥がし、完全培養培地の添加によって中和する。細胞を血球計数器でカウントし、その生存度を０．２５％のトリパンブルー排除アッセイで評価する。
【０３８３】
腫瘍細胞を、平底マイクロタイトレーション９６ウェルプレート（ｒｅｆ  １６７００８、Ｎｕｎｃ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｂｒｕｍａｔｈ、Ｆｒａｎｃｅ）に最適の播種密度でプレーティングし、処置の前に２４時間、＋３７℃、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で１９０μＬの薬物なしの培養培地中でインキュベートする。
【０３８４】
配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の希釈、及び細胞を含有するプレートの分布を手動で行う。処理開始時点で、１０μＬの配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）希釈を、以下の最終濃度でウェルに添加する（両方の細胞株について）：０、３．８×１０−４、１．５×１０−３、６．１×１０−３、２．４×１０−２、９．８×１０−２、０．４、１．６、６．３、２５及び１００μＭ。次いで、細胞を、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）を含有する２００μＬの最終容積の培養培地中で、＋３７℃、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で７２時間インキュベートする。処理の終わりに、細胞傷害性活性をＭＴＳアッセイで評価する。
【０３８５】
配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害性活性は、テトラゾリウム化合物（ＭＴＳ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）及びＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）と命名された電子カップリング試薬を用いてＭＴＳアッセイによって明らかになる。ＭＴＴと同様に、ＭＴＳは、ＭＴＴとは異なり、処理なしで培養培地に直接可溶性であるホルマザン生成物へ細胞によって生体還元される。細胞処理の終わりに、ダルベッコのリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｒｅｆ：１７−５１３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中の、ＭＴＳ（２ｍｇ／ｍＬで２０ｍＬ、ｒｅｆ：Ｇｌｌ  １１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）及びＰＭＳ（０．９２ｍｇ／ｍＬで１ｍＬ、ｒｅｆ：Ｐ９６２５、Ｓｉｇｍａ）の４０μＬの０．２２μｍのＭＴＳの新鮮濾過された合わせた溶液を、各々のウェルに添加する。吸光度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）を、ＶＩＣＴＯＲ３（商標）１４２０多重標識カウンター（Ｗａｌｌａｃ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて各々のウェルにおいて４９０ｎｍで測定する。
【０３８６】
ＭＴＳアッセイの個々のＯＤ値を提供する。細胞傷害性指数（ＩＣ）についての用量応答は、以下のとおり表され：
ＩＣ＝（ＯＤ薬物−曝露されたウェル／ＯＤビヒクル−曝露されたウェル）×１００
ここで、ＩＣ５０とは、細胞増殖の５０％阻害を得るための薬物濃度を指す。ＩＣ５０は、５０％の細胞の細胞傷害性を得るのに必要な薬物濃度である。薬物応答曲線は、ＸＬＦｉｔ５（ＩＤＢＳ、英国）を用いてプロットし、示される。ＩＣ５０決定値は、片対数曲線からＸＬＦｉｔ５ソフトウェアを用いて算出される。各々の個々のＩＣ５０決定値、同様に平均±ＳＤ  ＩＣ５０値も示す。
【０３８７】
図４５は、ＭＴＳアッセイを用いる、ＨｅｐＧ２及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍細胞株に対するＸＧ−１０４の細胞傷害性活性の決定の結果を示す。
【実施例２０】
【０３８８】
乾癬のマウスモデルにおける配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の効果
この研究の目的は、乾癬のＢＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスモデルにおける、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の効果を評価することである。このモデルは、そのケラチン生成細胞が、Ｓｔａｔ３の構成的に活性な形態を発現する、ヘテロ接合性のトランスジェニックマウスを用いる。
【０３８９】
乾癬は、血管の顕著な拡張症を伴う、ケラチン生成細胞及び血管形成の増殖の加速及び分化の変更によって特徴付けられる慢性の炎症性皮膚障害である。これは、皮膚と、Ｔ細胞、樹状細胞及び炎症性サイトカインによって媒介される免疫系との間の相互作用を通じて発症する。疾患のｉｎ  ｖｉｖｏモデリングは、種々の程度の成功を伴って達成されている。異種移植術モデルは、ヒト疾患を最も反映するが、それらは、より込み入っておりかつ複雑である。最もヒトの乾癬に似ているトランスジェニックのマウスモデルの１つは、Ｋ５．ＳＴＡＴ３Ｃモデルである。Ｋ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスは、基底ケラチン生成細胞における転写因子Ｓｔａｔ３の構成的に活性な形態を発現し、テープ剥離の際には、乾癬の特質を組織学的に繰り返す皮膚病変を発症する。ヒト乾癬においてのように、Ｔ細胞は、乾癬の表現型の誘発に重要な役割を果たした。ここで、化合物ＸＧ−１０４の有効性の評価は、乾癬のＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスモデルで行った。
【０３９０】
この目的を達成するために、２つの独立した実験を行い、その各々が１つの実験あたり少なくとも１５匹のマウスである（１群あたり５匹のマウス）。各々の実験では、ＢＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃヘテロ接合性トランスジェニックマウス（Ｔｇ（ＫＲＴ５−Ｓｔａｔ３＊Ａ６６１Ｃ＊Ｎ６６３Ｃ）１Ｊｄｇ；したがって以降では、Ｋ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスと呼ぶ）を、以下の実験群１及び２に無作為に割り付け、野性型の同腹仔を、第３群に割り当てた：
【０３９１】
【表１５】
2017520569.tif 000021
【０３９２】
第１群（ビヒクル、ＢＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃトランスジェニックマウス）：
ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、第０日〜第５日に腹腔内注射によって、１日１回（ＱＤ）与える。
【０３９３】
第２群（ＸＧ−１０４、ＢＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃトランスジェニックマウス）：
配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）を、第０日〜第５日に腹腔内注射によって１日１回（ＱＤ）与える。
【０３９４】
第３群（ビヒクル、ＦＶＢ野性型マウス）
ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、第０日〜第５日に腹腔内注射によって１日１回（ＱＤ）与える。
【０３９５】
第０日には、乾癬は、脱毛後のマウスの背中をテープではがす（１２〜１８回）ことによって誘発する。この目的を達成するために、マウスを、腹腔内にケタミン／キシラジンカクテル（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、剃毛し、脱毛し、皮膚の損傷を、１５回の穏やかなストロークのテープ剥離によって適用した。マウスを第０日麻酔直前、及びその後５日間１日１回、ビヒクル（生理食塩水）又はＸＧ−１０４のいずれかで処置した。マウスを実験の５日後に脱臼により屠殺し、病変を組織学的評価のために切り取った。２つの独立した実験を、１群あたり５匹のマウスで行った（ビヒクル重量；ｔｇビヒクル；ｔｇ  ＸＧ−１０４）。
動物を第０日に１回秤量する。全ての動物は、この研究を通じて、毎日、病気健康の徴候を観察する。第５日に研究が終わった後、約１ｃｍ２の皮膚生検（病変）を、各々のマウスの背中に収集して、最適切断温度（ＯＣＴ）含有モジュールで包埋し、ドライアイス上で凍結し、クリオトームを用いて６μｍのスライスに切片にし、Ｈ＆Ｅで染色する。表皮厚（表皮肥厚症）は、２つの独立した実験によって盲検で組織学的に測定する。１匹のマウスについて１つのスライド及び１０の異なる領域の切片を測定する。
【０３９６】
野性型同腹仔と比較して、テープ剥離は、ビヒクルで処置した全てのＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスで肥厚した表皮（表皮肥厚症）を誘発し、これは、不全角化の顕著な部位を有していた（図４３Ａ）。ＸＧ−１０４による処置は、両方の実験で表皮肥厚症を有意に低下した（図４３Ａ）。両方の実験の値をプールすること（図４３Ｂ）で、統計学的有意差（ｐ＜０．００１）を増大することによって観察に更なる力が加わる。更に、我々は、ビヒクルで処置したマウスと比較して、ＸＧ−１０４処置マウスで皮膚生検の程度を超えてなんら不全角化（角膜層における核の保持）が存在しないことを観察した（図４４）。まとめると、これらのデータによって、ＸＧ−１０４は、Ｋ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスにおける乾癬表現型の誘発を効果的に阻害することができることが示される。
【０３９７】
したがって、この結果は、ＸＧ−１０４処置が、乾癬についてＫ５．ＳＴＡＴ３Ｃマウスにおける乾癬表現型の発症をブロックするために重要であることを確認する。
【実施例２１】
【０３９８】
各々の用量レベルの第Ｉ相試験の無作為、二重盲検プラシーボ対照における健常な男性ボランティアに投与される、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の単回及び反復の局所投与の安全性、耐容性及び薬物動態
この研究の主な目的は、健常な男性ボランティアにおけるＸＧ−１０４（配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤）の昇順の用量の単回及び反復の滴下の耐容性及び安全性の決定を評価することであった。この研究の二次的な目的は、健常な男性ボランティアにおけるＸＧ−１０４の昇順の用量の単回及び反復の滴下の全身的な薬物動態を評価することであった。
【０３９９】
ＸＧ−１０４は、滴下のための溶液（０．９％ＮａＣｌ中）として調製した。０．９％ＮａＣｌをプラシーボとして使用した。全部で４９名の対象がこの研究に含まれ、この検証の「単回投与部分」では２８名、及びこの研究の「多数回投与部分」では２１名であった。単回投与部分では、含まれる２８名の対象を、５つの群のうち１つの間で無作為化した：４つのＸＧ−１０４群（０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．４ｍｇ、０．８ｍｇ）（それぞれ、０．２、０．４、０．８及び１．６％）の各々における５名の対象、及びプラシーボ群における８名の対象。多数回投与部分では、含まれる２１名の対象を、４つの群のうちの１つの間で無作為化した：３つのＸＧ−１０４群（０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．４ｍｇ）の各々における５名の対象、プラシーボ群における６名の対象。全ての対象が研究を完了した。
【０４００】
この研究の「単回投与部分」では、０．１、０．２、０．４及び０．８ｍｇ（それぞれ、０．２、０．４、０．８及び１．６％）のＸＧ−１０４の単回局所用量を試験した。ＸＧ−１０４又はプラシーボの単回投与は、第１日（Ｄ１）に行った（右眼に１滴）。単回投与部分では、対象は、約３６時間、すなわち、第−１日（Ｄ−１）夜からＤ２朝まで入院した。第３日に通院による訪問を行って、研究はＤ４の訪問で終わった。
【０４０１】
この研究の「多数回投与部分」では、３つの用量レベルを試験した。用量は、以下のように単回投与部分の結果に応じて選択した：第１群：０．１ｍｇ（０．２％）、第２群：０．２ｍｇ（０．４％）、及び第３群：０．４ｍｇ（０．８％）。ＸＧ−１０４又はプラシーボをｔｉｄ（「ｔｅｒ  ｉｎ  ｄｉｅ」−毎日３回）で、Ｄ１〜Ｄ２１まで各回右眼に１滴投与した。この投与は、ほぼ午前８時、午前１２時、及び午後８時に行った。複数回投与部分では、対象は、Ｄ−１夜からＤ２２朝まで入院し、ここではこの研究の終わりは、Ｄ３６（±２）の訪問であった。更に柔軟にするために、対象は、通院で数回の訪問を行う可能性があった。その場合、訪問は、以下であった：約３６時間、Ｄ−１夜からＤ２朝までの入院、Ｄ２〜Ｄ７の通院による訪問、約３６時間、Ｄ７夜からＤ９朝までの入院、Ｄ９〜Ｄ１４の通院による訪問、約３６時間、Ｄ１４夜からＤ１６朝までの入院、Ｄ１６〜Ｄ２０の通院による訪問、及び約３６時間、Ｄ２０夜からＤ２２朝までの入院。この研究の終わりは、したがって、Ｄ３６（±２）の訪問であった。
【０４０２】
評価した安全性パラメータとしては以下が挙げられた：健康診断；バイタルサイン（ＢＰ、ＰＲ）；１２−リード  ＥＣＧ（心電図）；眼底、眼内圧、細隙灯検査、最高矯正視力、赤み；シルマーの涙液試験、ＴＢＵＴ（涙膜崩壊時間）；臨床検査（血液学、止血、臨床化学と尿検査）；有害事象；及び耐性の評価。
【０４０３】
評価した薬物動態学的パラメータには以下の血漿パラメータが挙げられた：Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ０−１２、ＡＵＣ０−２４、ＡＵＣｔ、ＡＵＣｉｎｆ、Ｋｅｌ、ｔ１／２、％ＡＵＣｅｘｔｒａ、Ｖｄ／Ｆ、Ｃｌ／Ｆ。
【０４０４】
結果：
１．薬物動態学的結果：
この研究では、６００個のヒト血漿試料を分析して、ＸＧ−１０４を定量した。全ての標準的な試料、ＱＣ試料及び検量線パラメータは、合格基準を満たした。しかし、標品試料中で測定した全ての濃度は、ＬＬＯＱ（定量化の下限：＜４０ｎｇ／ｍＬ）未満であった。
【０４０５】
２．安全性の結果：
２．１  単一投与部分
全研究期間の間、２８名の対象のうち１５名が、３４例の有害事象の出現を報告した。これらのうち３２例は、処置時に発現した有害事象（ＴＥＡＥ）であり、２例が非突発的（血液クレアチニンホスホキナーゼ上昇及び首の疼痛）であった。ＴＡＥＡのうちでも、２１例は、ＸＧ−１０４投与後、１１例は、プラシーボ投与後に経験された。全てが軽度の強度であった。最も報告されたＴＥＡＥは、眼の障害であった：１７例が右眼（処置された）で報告され、１３例が左眼（処置なし）で報告された。右眼で報告されたＴＥＡＥのうち、３例はおそらく治験薬物投与（結膜炎（２）及び結膜の充血（１））に関連しており（全て、ＸＧ−１０４  ０．８ｍｇ（１．６％）群）、１４例は無関係（点状角膜炎（１２）：５例がプラシーボ群、２例がＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群、２例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群、２例が、ＸＧ−１０４  ０．４ｍｇ（０．８％）群、１例がＸＧ−１０４  ０．８ｍｇ（１．６％）群；及び０．１ｍｇ（０．２％）で眼の掻痒（１）、及び０．２ｍｇ（０．４％）群で結膜の充血（１））であった。左眼で報告された全てのＴＥＡＥは、治験薬投与とは無関係であった（点状角膜炎（１２）、結膜の充血（１））。この研究中に深刻な有害事象は報告されなかった。臨床的に関連する知見は、臨床検査、バイタルサイン又はＥＣＧパラメータでは観察されなかった。
【０４０６】
ＸＧ−１０４の０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．４ｍｇの単回用量は、十分耐容され、ＸＧ−１０４の０．８ｍｇ（１．６％）の単回用量は、むしろよく耐容された（結膜炎のエピソードが２例）。反復投与における３つの用量レベルについての選択は以下であった：０．１ｍｇ、０．２ｍｇ及び０．４ｍｇ（それぞれ、０．２、０．４及び０．８％）。
【０４０７】
２．２  複数回投与部分
全研究期間の間、２１名の対象のうち１７名が、６６例の有害事象の出現を報告した。これらのうち６５例は、処置時に発現した有害事象（ＴＥＡＥ）であり、１例は、非突発的（点状角膜炎）であった。ＴＥＡＥのうちでも、６１例は、ＸＧ−１０４投与後、４例は、プラシーボ投与後に経験された。全てが軽度から中度の強度であった。最も報告されたＴＥＡＥは、眼の障害であった：４４例が、右眼（処置された）で報告され、１８例が左眼（処置なし）で報告された。右眼で報告されたＴＥＡＥのうち、３例はおそらく治験薬物投与に関連しており（ＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群で結膜炎（２）、及びＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群で眼瞼の刺激（１））、３９例は関係しないようであり（結膜の充血（２１）：６例がＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群、５例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群、及び１０例がＸＧ−１０４  ０．４ｍｇ（０．８％）群；点状角膜炎（１７）：６例がＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群、６例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群、及び５例がＸＧ−１０４  ０．４ｍｇ（０．８％）群；ＸＧ−１０４  ０．４ｍｇ（０．８％）群で結膜炎（１））；２例は、無関係（点状角膜炎（２）：１例がプラシーボ群、及び１例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群）であった。左眼で報告されたＴＥＡＥのうち、１２例は、治験薬投与とは関係しないようであり（結膜充血（７）：２例がＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群、３例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群、及び２例がＸＧ−１０４  ０．４ｍｇ（０．８％）群；点状角膜炎（５）：２例がＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群、１例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群、及び２例がＸＧ−１０４  ０．４ｍｇ（０．８％）群）；６例は、治験投与とは無関係であった（点状角膜炎（６）：１例がプラシーボ群、１例がＸＧ−１０４  ０．１ｍｇ（０．２％）群、及び４例がＸＧ−１０４  ０．２ｍｇ（０．４％）群）。眼科的検査によって、全体的な投与効果が確認され（プラシーボ群では、異常な検査はより低い）、第３日〜第２０日の間で増大していた。
【０４０８】
深刻な有害事象は、この研究の間には報告されなかった。臨床的に関連する知見は、臨床検査、生物学的パラメータ、バイタルサイン又はＥＣＧパラメータで観察されなかった。２１名の健常な男性対象において、ＸＧ−１０４の反復用量のｔ．ｉ．ｄ．（０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．４ｍｇ）はよく耐容された。
【実施例２２】
【０４０９】
ドライアイの治療のためのＪＮＫ阻害剤の有効性及び安全性（臨床第ＩＩ相）
多施設、無作為化、二重盲検、プラシーボ対照の、臨床第ＩＩ相試験を行って、ドライアイの治療のための制御有害環境（ＣＡＥＳＭ）モデルにおいて、環境中で、及びャレンジの間、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）の点眼液の有効性及び安全性を評価した。この研究の目的は、４週のＴＩＤ処置期間の後、ドライアイの徴候及び症状の治療についてプラシーボと比較して、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の点眼液の有効性及び安全性を評価することである。
【０４１０】
「制御有害環境」モデルは、研究下で臨床条件を悪化させる環境チャレンジを提供するように設計し構築された環境である。一般には、制御有害環境（ＣＡＥ）設計を用いて、臨床治験の間、環境、対象の活動、又は両方の組合せを制御し、それによって、ストレスのある環境を提供して、ドライアイの臨床症状及び徴候を悪化させることができる。このようなストレス試験は、短期間に薬理学的効果を達成するのに特に有益である。湿度、温度及び気流は、モニター及び操作できる環境的変数である。活動は、視覚的タスクを含んでもよく、まばたき頻度及び涙液層安定性がモニター可能である。したがって、制御有害事象（ＣＡＥＳＭ）モデルは、ドライアイの治療の検討のための、標準的な眼のチャレンジを（湿度、温度、気流、照明条件及び視覚タスクの調節によって）再現する臨床モデルである。ＣＡＥの重要な側面は、ドライアイ患者の小集団を識別するのにおけるその有用性である。環境的変化によってチャレンジした対象（例えば、ＣＡＥによって示されるもの）は、正常には、ある程度の生理学的補償を伴って反応し、以前の研究によって、これらの機構が環境的チャレンジについて適切に補償する能力は、ドライアイを伴うものにおいて低下されることが示された。
【０４１１】
この研究では、対象は、ドライアイと診断された対象（訪問１の前に少なくとも６カ月間ドライアイについて報告された病歴があり、訪問１の６カ月以内にドライアイ症状について点眼の使用の病歴又は使用の要望を有し、訪問１及び２で、ＣＡＥＳＭ前に評価されたＯｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｃｏｍｆｏｒｔ  ＆  ４−Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅに対して、少なくとも１つの症状において２以上のスコアを報告し、訪問１及び２で、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）スケールに対して結膜の赤みスコア＝１を有し、訪問１及び２、ＣＡＥＳＭ前でＯｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅによる少なくとも１つの領域で総角膜フルオレセイン染色スコア＝２を有するなど）である。
【０４１２】
配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤（「ＸＧ−１０４」）、すなわち、ＸＧ−１０４  ０．２％、ＸＧ−１０４  ０．４％、及びＸＧ−１０４  ０．８％の点眼液の３つの異なる濃度を、プラシーボ（ビヒクル：０．９％ＮａＣｌ）点眼有効性に対して比較する。訪問番号１、２、３及び４は、それぞれ第−７、１、１５、及び２９日に計画する。
【０４１３】
特に、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅで測定した、ベースライン、好ましくは第２９日の訪問４での最も悪い眼の、ＣＡＥＳＭ前からＣＡＥＳＭ後へ下位領域への変化における角膜フルオレセイン染色、及び訪問１と訪問２との間の１週間の試行期間の間に好ましくは記録された対象の日記データから決定され、治療期間の間の訪問４（訪問の日を含まない）に先行する７日間にわたって評価された、最悪のドライアイ症状が、主な転帰の指標として役立つ。
【０４１４】
二次的な転帰の指標は、特に（ｉ）フルオレセイン染色（Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅ及びＮＥＩ  Ｓｃａｌｅを用いる）において、好ましくは訪問３及び４で（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後；領域：中央、上位、下位（訪問３好ましくは訪問４のみは、一次終末点である）、一時的、鼻、角膜全体、結膜全体及び全体）、（ｉｉ）リサミングリーン染色（Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅ及びＮＥＩ  Ｓｃａｌｅを使用）、好ましくは訪問３及び４で（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後並びにＣＡＥＳＭ前からＣＡＥＳＭ後への変化；領域：中央、上位、下位、一時的、鼻、角膜全体、結膜全体及び全体）、（ｉｉｉ）涙液層破壊時間、好ましくは、訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後）で、（ｉｖ）結膜の赤み、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅを用い、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後）で、（ｖ）眼瞼縁の赤み、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅを用い、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後）で、（ｖｉ）涙液浸透圧、好ましくは訪問２及び４（ＣＡＥＳＭ後）で、（ｖｉｉ）まばたき頻度、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）方法論を用い、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前）で、（ｖｉｉｉ）眼球保護指数（ＯＰＩ  ２．０）、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前）で、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）方法論を用いて、（ｉｘ）無麻酔シルマー試験、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前）で、滴下の快適性及び症状評価、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅを無作為化に用いて、好ましくは訪問２及び３で、（ｘ）眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前）で、（ｘｉ）眼の不快性、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅを用い、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後）で、（ｘｉｉ）眼の不快性、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｄｉｓｃｏｍｆｏｒｔ及び４−Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅを用い、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後）で、（ｘｉｉｉ）眼の不快性、Ｏｒａ  Ｃａｌｉｂｒａ（商標）Ｓｃａｌｅを用い、好ましくは訪問３及び４（ＣＡＥＳＭ曝露の間）に、並びに（ｘｉｖ）毎日の日記、である。
【０４１５】
他の事前に特定された転帰の指標としては、特に、視力（ＥＴＤＲＳ）を、好ましくは訪問１、２、３及び４（第−７、１、１５、及び２９日）（ＣＡＥＳＭ前）に、細隙灯生体顕微鏡を、好ましくは訪問１、２、３及び４（第−７、１、１５、及び２９）（ＣＡＥＳＭ前及びＣＡＥＳＭ後）に、有害事象アンケート、拡張眼底検査生体顕微鏡を、好ましくは、訪問１及び４（第−７及び２９日）、並びに眼内圧を、好ましくは訪問１及び４（第−７及び２９日）に含む。
【実施例２３】
【０４１６】
腎臓の両側虚血再かん流のラットモデルにおけるＸＧ−１０４（配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤）の効果
この研究は、腎虚血／再かん流におけるＸＧ−１０４の先行研究（実施例１５）に基づく。この研究の目的は、腎臓の両側虚血再かん流のラットモデルにおける組織学的損傷に対するＸＧ−１０４の効果を評価することであった。
【０４１７】
虚血再かん流（ＩＲ）障害は、複雑な現象であり、ヒトでの血管手術、臓器調達及び移植で遭遇する場合が多い。げっ歯類における腎臓の両側虚血再かん流（ＩＲ）の実験モデルは、腎機能障害及び尿細管変性によって特徴付けられる急性尿細管損傷につながる。本発明のモデルは、腎ＩＲ障害を防ぐ薬物候補の使用のための概念を迅速に証明するために頻用される。
【０４１８】
引き渡し時点で２００〜２５０ｇと秤量した雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。動物は、実験の少なくとも５日前に実験室に運び、その間、実験条件に慣れさせた。この研究には、以下のように各々１１〜１２匹のラットの３つの群を含んだ。
【０４１９】
【表１６】
2017520569.tif 000022
【０４２０】
この試験設計は図４６に示す。
【０４２１】
腎臓の温虚血のプロトコールは、前に記載したものと同様であった（Ｐｅｃｈｍａｎ  ＫＲら、２００９）。要するに、全身麻酔（ペントバルビタール；６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．及びアトロピン；１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）のもとで、両方の腎茎を孤立させて、傷をつけないクランプを用いて４０分間クランプした。この時間の後、クランプを解放して、再かん流を開始した。動物を、手術の間、温度調節システム（ＴＣＡＴ−２ＬＶ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて３７℃で維持した。全ての動物を、両方の血管クランプの解放（再かん流）後、２４時間で屠殺した。ニセの操作の動物は、腎臓血管のクランプなしで同じ外科手順を受けた。
【０４２２】
ＸＧ−１０４又はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、尾静脈に（ｉ．ｖ．）２ｍｇ／ｋｇの用量で、第２の血管クランプの解放の２０分後に投与した。尾静脈への静脈内投与は、１ｍＬ／ｋｇの容積を用いて行った。
【０４２３】
屠殺後、腎臓を取り出し、全ての結合組織及び嚢を浄化して、電子てんびん（ＶＷＲ、Ｆｒａｎｃｅ）で秤量した。１つの腎臓を、１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）に少なくとも２４時間移し、次いで、Ｈｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）で行う更なる組織学的分析のために７０％エタノール中に移した。左右の腎臓は無作為に選択した。腎臓試料を、７２時間の間、１０％ホルマリン中で固定し、７０％エタノールに移し、次いでＨｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）でパラフィンブロック中に包埋した。１ブロックあたり１つの長軸切片（３〜５μｍ）を作成した。パラフィン包埋した組織の腎臓切片は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。全てのスライドを、×２０の倍率で、浜松ホトニクス株式会社（日本、浜松）のＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０  ＨＴを用いてデジタル化した。各々の組織切片を、盲検方式で組織学的に検査して、尿細管の変化が存在するか否かを確認した。次いで、各々の知見の重症度を以下のとおり等級付けした：
尿細管の損傷スコアは、変性／壊死、尿細管上皮空胞形成、再生（塩基性尿細管）、及び尿細管円柱のいずれかから構成された：
０：尿細管の罹患が５％未満（バックグラウンド）
１：罹患した尿細管が５〜２０％
２：罹患した尿細管が２１〜４０％
３：罹患した尿細管が４１〜７５％
４：罹患した尿細管が７５％超
【０４２４】
図４７に示すとおり、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の動物は、ニセ／ビヒクル動物と比較して、尿細管の変性及び壊死、尿細管円柱形成、並びに塩基性尿細管を含む尿細管損傷の有意な増大を示した。ＸＧ−１０４は、尿細管損傷に対する、特に尿細管変性、壊死及び尿細管円柱形成に対する（図４７）、並びに総尿細管スコアに対する（図４８）有意な有益効果を示した。ＸＧ−１０４処置ラット（第３群）とビヒクル（第２群）動物との間の尿細管変性及び壊死に関する主な相違は、罹患した尿細管の数がより少なく、病変がほとんど皮髄境界部に限られており、表在皮質には拡大されないということである。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の腎臓はまた、第２群（ＩＲ／ビヒクル）と比較した場合、尿細管円柱の重症度のスコアが低い。これらの組織学的変化の代表的な画像は、図４９に含まれる。
【０４２５】
特に、第１群（ニセ／ビヒクル）における尿細管変化は、３／１２の動物における単一から少数の塩基性尿細管（スコア１）の存在に限られた（図４７）。この発生率は、ナイーブな若い成体の対照のラットでの予想される正常な限界内であり、元来は偶発的とみなされた。比較して、第２群（ＩＲ／ビヒクル）における全ての動物は、中度から顕著な（スコア３及び４）尿細管上皮の変性及び壊死（３．４５±０．５２）を示した。最も罹患した尿細管は皮髄境界部に集中しており、脱落した及び壊死性の上皮細胞の大きい塊を含有する尿細管によって組織学的に特徴付けられた。尿細管変性の病変はまた、最も重度の病変（スコア４）を有する動物のほとんどの皮質に存在した。尿細管変性に加えて、全ての動物は、管腔に多数の尿細管円柱を示した（スコア３）。少数から中程度の数の塩基性尿細管の存在（スコア１及び２、平均＝１．３６±０．６７）も、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の１０／１１の動物の皮質全体にわたって観察された。塩基性尿細管は、尿細管における早期の上皮再生の指標であった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）に関して、尿細管病変は本質的に、第２群（ＩＲ／ビヒクル）で観察される病変と同じ性質及び外観であったが、一般には分布の重度は低かった。
【０４２６】
より具体的には、平均の尿細管上皮の変性／壊死スコアは、それぞれ、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）では２．６７±０．６５及び２．１８±０．７５であった。第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）との間の主な相違は、第３群ではいく匹かの動物が２というスコアを示したことであった（第３群では５／１２及び第２群では０／１１）。結局、第３群では、第２群の５／１１と比較して、１／１２の動物のみが、スコア４であった。組織学的に、第２群（ＩＲ／ビヒクル）と比較した第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の動物との間の尿細管変性及び壊死に関する主な相違は、罹患した尿細管の数がより少なく、病変がほとんど皮髄境界部に限られており、表在皮質には拡大されなかったということであった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の腎臓はまた、第２群（ＩＲ／ビヒクル）に比較した場合、尿細管円柱に関して示す重度スコアが低かった。実際は、尿細管円柱スコアは、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）では、２．５０±０．５２であった。対照的に、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の尿細管円柱スコアは、３．００±０．００であった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）における塩基性尿細管は、第２群で観察されたものと極めて類似していた。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の平均塩基性尿細管スコアは、それぞれ、１．３３±０．６５及び１．７３±０．４７であり；第２群についてのスコアは、１．３６±０．６７であった（図９７）。
【０４２７】
より具体的には、平均の尿細管上皮の変性／壊死スコアは、それぞれ、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）で２．１８±０．７５であった。第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）との間の主な相違は、第３群ではいく匹かの動物が２というスコアを示したことであった（第３群では８／１１及び第２群では０／１１）。更に、第３群では、１／１１がスコア１であった。結局、第３群では、第２群の５／１１と比較して、１／１１の動物のみが、スコア４であった。組織学的に、第２群（ＩＲ／ビヒクル）と比較した第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の動物との間の尿細管変性及び壊死に関する主な相違は、罹患した尿細管の数がより少なく、病変がほとんど皮髄境界部に限られており、表在皮質には拡大されなかったということであった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の腎臓はまた、第２群（ＩＲ／ビヒクル）に比較した場合、尿細管円柱に関して示す重度スコアが低かった。実際は、尿細管円柱スコアは、それぞれ、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）では、２．０９±０．５４であった。対照的に、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の尿細管円柱スコアは、３．００±０．００であった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）における塩基性尿細管の数は、第２群で観察されたものと極めて類似していた。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）の平均塩基性尿細管スコアは、１．７３±０．４７であり；第２群についてのスコアは、１．３６±０．６７（図９７）であった。
【０４２８】
４つの実験群のいずれでも、尿細管空胞形成は観察されなかった。したがって、第１群（ニセ／ビヒクル）の総尿細管スコアは、少数の動物だけが、なんら他の尿細管の変化なしで塩基性尿細管を示したので、予想より極めて低かった（０．２５±０．４５）。第２群では、総尿細管スコアは、４つの実験群のなかで最高であり、６〜９（７．８２±０．９８）に及んだ。第３群の総尿細管スコアは、第２群（ＩＲ／ビヒクル）で観察されたスコアより比較的低く、スコアは、４〜８（６．００±１．２６）に及んだ。第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）との間で観察される相違は、生物学的に有意とみなした。
【０４２９】
まとめると、ＸＧ−１０４は、尿細管損傷に対して、並びに特に尿細管変性、壊死及び尿細管円柱形成に対して有意な有益な効果を示した。ＸＧ−１０４処置ラット（第３群）とビヒクル（第２群）ＩＲ動物との間の尿細管変性及び壊死に関する主な相違は、罹患した尿細管の数がより少なく、病変がほとんど皮髄境界部に限られており、表在皮質には拡大されなかったということであった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０４）由来の腎臓はまた、第２群（ＩＲ／ビヒクル）に比較した場合、尿細管円柱に関して示す重度スコアが低かった。
【実施例２４】
【０４３０】
意識下のラットで、シクロホスファミドによって誘発した急性膀胱炎モデルに対して膀胱内に投与したＸＧ−１０４（配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤）の効果：内臓痛及び膀胱炎症の評価
本研究の目的は、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、急性のＣＹＰ誘発性膀胱炎における膀胱の疼痛及び炎症に対するＸＧ−１０４（５０ｍｇ／ｍＬ）での膀胱内処置の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）の治療のための治療アプローチを試験するためによく用いられる。
【０４３１】
実験開始時に２１５±２０ｇと秤量した、成体の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いた。動物は、どの実験の開始の前にも少なくとも３日間実験条件に慣れさせた。動物を以下の４つの実験群に割り当てた（１群あたりｎ＝１０の動物）：
【０４３２】
【表１７】
2017520569.tif 000023
【０４３３】
急性膀胱炎を誘発するために、５ｍＬ／ｋｇの最終容積で１５０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＹＰの単回ｉ．ｐ．注射を行った。対照のラットには、ＣＹＰと同じ実験条件下で生理食塩水を投与した（５ｍＬ／ｋｇの最終容積、ｉ．ｐ．）。
【０４３４】
各々の実験の日に、ラットの体重を記録した。次いで、無作為の方式で、５００μＬのＸＧ−１０４（５０ｍｇ／ｍＬ）、イブプロフェン（５０ｍｇ／ｍＬ）又はビヒクルを、イソフルラン麻酔（２％〜３％）のもとで３０分間膀胱内に注入した。
【０４３５】
フォン・フレイフィラメント（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）を用いる、関連の内臓痛のアセスメント：
固定した時刻（行動の応答における潜在的な概日変動を最小限にするために午前）、及び全動物の単一実験者試験を含む標準化された条件を適用して、行動に基づく疼痛の試験の変動性を最小限にした。異痛症及び痛覚過敏症を含む内臓痛を、膀胱付近の下腹部に、５秒の刺激間隔で漸増する力（１、２、４、６、８、１０、２６及び６０ｇ）の１セットの８つの較正したフォン・フレイフィラメントを適用することによって評価した。試験前に、各々の動物の機械的刺激のために設計した腹部領域を剃毛した。次いで、動物を、個々の透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスの下の高くなったワイヤメッシュの床に置いて、フォン・フレイ試験を開始する前に少なくとも３０分間慣れさせた。次いでフィラメントを、フィラメントがわずかに屈曲するのに十分な力でメッシュの床を通じて１〜２秒適用した。各々のフィラメントを３回試験した。注意を払って、膀胱の近辺で下腹部領域内の異なる領域を刺激して、脱感作を回避した。
【０４３６】
非侵襲性挙動を、以下のとおり各々の動物及び各々のフィラメントに関してスコア付けした。
【０４３７】
【表１８】
2017520569.tif 000024
【０４３８】
試験設計は、図５０Ａに図解で示す。要するに、急性膀胱炎を、ＣＹＰ注射（ｉ．ｐ．）で、Ｄ０で誘発した（上記のとおり）。ＸＧ−１０４、イブプロフェン又はビヒクルを、膀胱内に、ＣＹＰ注射の直後に１回投与した（上記のとおり）。フォン・フレイ試験は、以下のとおり非盲検方式で行った：
・  Ｄ−１に、ラットを個々のＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスに最短３０分間、及びフォン・フレイフィラメント適用に慣れさせて、新しい環境によるストレスのレベルを低下させた。
・  Ｄ０に、フォン・フレイ試験をＣＹＰ又は生理食塩水注射の１５分前に行って、基礎の値（Ｄ０、Ｔ＝−１５分）を得た。
・  Ｄ１に、フォン・フレイ試験をＣＹＰ又は生理食塩水注射の２４時間後に行って、ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対する試験化合物の効果を分析した（Ｄ１、Ｔ＝＋２４ｈ）。
・  フォン・フレイ試験（＋２４ｈ）の直後に、ラットを血液試料収集のために麻酔し、次いで以下に記載のとおり屠殺して、膀胱を収集した。
【０４３９】
実験の終わりに、ラットを、ペントバルビタールの注射（５４．７ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ／ラット、ｉ．ｐ．）、続いて頸椎脱臼によって屠殺した。膀胱を迅速に収集し、リポイド組織から浄化した。膀胱を秤量し、嚢の首で切断し、浮腫及び出血のスコア付けを行った（下の表を参照のこと）。最後に、壁の厚さを、嚢の壁を２つの外側のアゴの間において、デジタルノギスを用いて測定した。膀胱浮腫及び出血のスコアは、以下のとおりグレイの基準（Ｇｒａｙら、１９８６）から適応させた：
【０４４０】
【表１９】
2017520569.tif 000025
【０４４１】
侵害受容パラメータは以下のように表される：
【０４４２】
【表２０】
2017520569.tif 000026
【０４４３】
ＡＵＣは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて算出した。異痛症及び痛覚過敏を評価するためのＡＵＣ法は、図５０Ｂに図式的に示される。
【０４４４】
巨視的パラメータは、以下のとおり表される：
【０４４５】
【表２１】
2017520569.tif 000027
【０４４６】
結果：
ＣＹＰ注射の前に、侵害受容パラメータにおいて、３つの異なるＣＹＰ注射の群の間で観察された有意な相違はなかった。ＣＹＰ誘発性内臓痛に対するＸＧ−１０４の効果を分析するために、侵害受容パラメータを、ビヒクル処置群とＸＧ−１０４処置群との間で比較した。ＣＹＰ注射の２４時間後、侵害受容の閾値は、ビヒクルと比較してＸＧ−１０４処置では有意に増大した（ｐ＜０．０１、図５１Ａ）。ＸＧ−１０４処置はまた、ビヒクルと比較してＣＹＰ注射ラットで侵害受容スコアを有意に低下した（ｐ＜０．００１、図５１Ｂ）。更に、ＡＵＣ１−８ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０４処置によって有意に低下された（ｐ＜０．００１、図５１Ｃ）。同様に、ＡＵＣ８−６０ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０４処置によって低下された（ｐ＜０．０１、図５１Ｄ）。ＣＹＰ誘発性内臓痛に対するイププロフェンの効果を分析するために、侵害受容パラメータをビヒクル処置群とイブプロフェン処置群との間で比較した。侵害受容の閾値は、ＣＹＰ注射ラットにおいてビヒクルと比較した場合、イブプロフェン処置によって有意に増大した（ｐ＜０．０１、図５１Ａ）。同様に、イブプロフェン群では、侵害受容スコアの有意な低下が、ビヒクルと比較した場合観察された（ｐ＜０．０１、図５１Ｂ）。更に、ＡＵＣ１−８ｇ及びＡＵＣ８−６０ｇは、ビヒクルと比較した場合、イブプロフェン処置によって有意に低下した（それぞれ、ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５、図５１Ｃ及び図５１Ｄ）。
【０４４７】
更に、泌尿器の壁の厚さは、ＸＧ−１０４処置ラットでは有意に低下された（ｐ＜０．０１、図５２Ａ）。ＸＧ−１０４処置が誘発した泌尿器の壁の厚さ低下は、浮腫スコアの有意な低下を伴っていたが、ビヒクルと比較した場合、出血スコアの有意な変化は観察されなかった（浮腫及び出血スコアについて、それぞれ、ｐ＜０．０５及びｐ＞０．０５、図５２Ｂ及び図５２Ｃ）。イブプロフェンに関しては、また有意な低下も、膀胱壁の厚さで、及び浮腫のスコアで観察された（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５、図５２Ａ、Ｂ）。しかし、イブプロフェン処置群では、出血スコアに関して有意な変化は観察されなかった（ｐ＞０．０５、図５２Ｃ）。赤みを帯びた尿がイブプロフェン処置群のいく匹かの動物で気付かれたことが注目される。
【０４４８】
まとめると、ＸＧ−１０４（５０ｍｇ／ｍＬ）の膀胱内処置は、その注射の２４時間後に、ＣＹＰによって誘発される内臓痛を有意に逆転した。ＸＧ−１０４は、異痛症及び痛覚過敏の両方を効率的に阻害した。分析した炎症パラメータでは、ＸＧ−１０４は、膀胱炎症（壁の厚さ）及び浮腫スコアを低下した。結論として、膀胱内に投与されたＸＧ−１０４は、強力な抗侵害受容効果及び有意な抗炎症特性をＩＣ／ＰＢＳの実験モデルで示した。
【実施例２５】
【０４４９】
意識下のラットで、シクロホスファミドによって誘発した急性膀胱炎モデルに対して膀胱内に投与したＸＧ−１０４（配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤）の効果：内臓痛の評価
本研究の目的は、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、急性のＣＹＰ誘発性膀胱炎における膀胱疼痛に対するＸＧ−１０４（２ｍｇ／ｋｇ）での静脈内処置の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）の治療のための治療アプローチを試験するためによく用いられる。
【０４５０】
実験開始時に２１５±２０ｇと秤量した、成体の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いた。動物は、どの実験の開始の前にも少なくとも３日間実験条件に慣れさせた。動物を以下の４つの実験群に割り当てた（１群あたりｎ＝１０の動物）：
【０４５１】
【表２２】
2017520569.tif 000028
【０４５２】
急性膀胱炎を誘発するために、５ｍＬ／ｋｇの最終容積中で１５０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＹＰの単回のｉ．ｐ．注射を行った。対照のラットには、ＣＹＰと同じ実験条件下で生理食塩水を投与した（５ｍＬ／ｋｇの最終容積、ｉ．ｐ．）。
【０４５３】
各々の実験の日に、ラットの体重を記録した。次いで、無作為の方式で、ＸＧ−１０４（２ｍｇ／ｋｇ）、イブプロフェン（１０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを、静脈内に、１ｍＬ／ｋｇの容積で投与した。
【０４５４】
フォン・フレイフィラメントを用いる、関連の内臓痛のアセスメント：
固定した時刻（行動の応答における潜在的な概日変動を最小限にするために午前）、及び全動物の単一実験者試験を含む標準化された条件を適用して、行動に基づく疼痛の試験の変動性を最小限にした。異痛症及び痛覚過敏症を含む内臓痛を、膀胱付近の下腹部に、５秒の刺激感覚で漸増する力（１、２、４、６、８、１０、２６及び６０ｇ）の１セットの８つの較正したフォン・フレイフィラメントを適用することによって評価した。試験前に、各々の動物の機械的刺激のために設計した腹部領域を剃毛した。次いで、動物を、個々の透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスの下の高くなったワイヤメッシュの床に置いて、フォン・フレイ試験を開始する前に少なくとも３０分間慣れさせた。次いでフィラメントを、フィラメントがわずかに屈曲するのに十分な力でメッシュの床を通じて１〜２秒適用した。各々のフィラメントを３回試験した。注意を払って、膀胱の近辺で下腹部領域内の異なる領域を刺激して、脱感作を回避した。
【０４５５】
非侵襲性挙動を、以下のとおり各々の動物及び各々のフィラメントに関してスコア付けした。
【０４５６】
【表２３】
2017520569.tif 000029
【０４５７】
この試験設計は、上で特定したように、投与経路（膀胱内ではなく静脈内）及び用量においてのみ、実施例２４のものとは異なる（図５０Ａを参照のこと）。要するに、急性膀胱炎を、ＣＹＰ注射（ｉ．ｐ．）で、Ｄ０に誘発した（上記のとおり）。ＸＧ−１０４、イブプロフェン又はビヒクルを、静脈内に、ＣＹＰ注射の直後に１回投与した（上記のとおり）。フォン・フレイ試験は、以下のとおり非盲検方式で行った：
・  Ｄ−１に、ラットを個々のＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスに最短３０分間、及びフォン・フレイフィラメント適用に慣れさせて、新しい環境によるストレスのレベルを低下させた。
・  Ｄ０に、フォン・フレイ試験をＣＹＰ又は生理食塩水注射の１５分前に行って、基礎の値（Ｄ０、Ｔ＝−１５分）を得た。
・  Ｄ１に、フォン・フレイ試験をＣＹＰ又は生理食塩水注射の２４時間後に行って、ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対する試験化合物の効果を分析した（Ｄ１、Ｔ＝＋２４ｈ）。
・  フォン・フレイ試験（＋２４ｈ）の直後に、ラットを血液試料収集のために麻酔し、次いで下に記載のとおり屠殺して、膀胱を収集した。
【０４５８】
侵害受容パラメータは以下のように表わされる：
【０４５９】
【表２４】
2017520569.tif 000030
【０４６０】
ＡＵＣは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて算出した。異痛症及び痛覚過敏を評価するためのＡＵＣ法は、図５０Ｂに図式的に示される。
【０４６１】
結果：
ＣＹＰ注射の前に、侵害受容パラメータにおいて、３つの異なるＣＹＰ注射の群の間で観察された有意な相違はなかった（ｐ＞０．０５）。ＣＹＰ誘発性内臓痛に対するＸＧ−１０４の効果を分析するために、侵害受容パラメータを、独立して、ビヒクル処置群とＸＧ−１０４処置群との間で比較した。ＣＹＰ注射の２４時間後、侵害受容の閾値は、ビヒクルと比較してＸＧ−１０４処置では有意に増大した（ｐ＜０．０１、図５３Ａ）。ＸＧ−１０４処置は、ビヒクルと比較してＣＹＰ注射ラットで侵害受容スコアを有意に低下した（ｐ＜０．００１、図５３Ｂ）。更に、ＡＵＣ１−８ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０４処置によって有意に低下された（ｐ＜０．００１、図５３Ｃ）。同様に、ＡＵＣ８−６０ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０４処置によって有意に低下された（ｐ＜０．０１、図５３Ｄ）。
【０４６２】
まとめると、ＸＧ−１０４（２ｍｇ／ｍＬ）の静脈内処置は、その注射の２４時間後に、ＣＹＰによって誘発される内臓痛をこのように有意に逆転した。ＸＧ−１０４は、異痛症及び痛覚過敏の両方を効率的に阻害した。イブプロフェン（１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与では同様の効果が観察された。結論として、実験的な膀胱炎の前臨床モデルでは、ＸＧ−１０４は、有意な抗侵害受容性特性を示した。
【実施例２６】
【０４６３】
βアミロイド誘発性ニューロンアポトーシス（アルツハイマー病モデル）に対するＸＧ−１０４（配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤）の効果
この研究では、ＪＮＫ活性化に対する、及びＡβ４２細胞ストレス後のニューロンアポトーシスに対するＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０４の効果を決定した。
【０４６４】
この目的を達するために、初代マウス皮質ニューロン培養を、２μＭ又は２５μＭのいずれかのβアミロイド１−４２（Ａβ４２）に５時間曝露して、Ａβ４２細胞ストレスを誘発した。ニューロンを、１０μＭのＪＮＫの特異的な阻害剤、ＸＧ−１０４（配列番号１７２）の有無で前処理した。リン酸化ＪＮＫ（ｐＪＮＫ）、総ＪＮＫ（ＪＮＫ）、切断ＰＡＲＰ及びチューブリン（対照）のレベルを決定した。ｐＪＮＫ／ＪＮＫの比は、ＪＮＫ活性の指標として役立った。アポトーシスの間増大することが公知である、切断されたタンパク質ＰＡＲＰのレベルは、ニューロンアポトーシスの指標として役立った。
【０４６５】
１０μＭのＸＧ−１０４の有無によって前処理され、５時間の間２μＭ又は２５μＭのβアミロイド１−４２（Ａβ４２）のいずれかに曝露した、初代マウス皮質ニューロン培養のイムノブロット分析の結果を、図５４（Ａ）に示す。図５４（Ｂ及びＣ）では、対応するヒストグラムが示され、これは、異なる実験群の総ＪＮＫ（ｐＪＮＫ／ＪＮＫ）に対するリン酸化ＪＮＫの比（Ｂ）、及び切断されたタンパク質ＰＡＲＰのレベル（Ｃ）を示している。興味深いことに、２μＭのＡβ４２の条件では、ＪＮＫ活性の改変は観察されなかった。５μＭ及び１０μＭのＸＧ−１０４による前処理は、ＪＮＫ活性を、それぞれ２９．２％及び６０％低下した（図５４Ｂ）。ニューロンの２５μＭのＡβ４２処理は、ＪＮＫ活性を１４％増大した（図５４Ｂ）。したがって、５μＭ及び１０μＭのＸＧ−１０４での前処理は、ＪＮＫ活性を、それぞれ、１７．５％及び５９．６％低下した。両方のＡβ４２細胞ストレス条件では、１０μＭのＸＧ−１０４濃度は、ＪＮＫ活性を低下するのにより有効であった（図５４Ｂ）。
【０４６６】
ニューロンのアポトーシスは、アポトーシスの間増大する、切断されたタンパク質ＰＡＲＰのレベルによって測定した（図５４Ｃ）。５μＭ及び１０μＭのＸＧ−１０４による前処理は、それぞれＰＡＲＰ切断を４６．８％及び８０．２％低下し、２μＭのＡβ４２及び、２５μＭのＡβ４２ではそれぞれ、６９％及び８０．６％低下した。
【０４６７】
まとめると、このようにＸＧ−１０４は、Ａβ４２によって誘発されるニューロンアポトーシスを低下した。１０μＭ濃度のＸＧ−１０４は、アポトーシスを低下するために５μＭ濃度のＸＧ−１０４よりも１．７倍有効であった。
【実施例２７】
【０４６８】
βアミロイド誘発性のニューロンアポトーシス（アルツハイマー病モデル）に対するＸＧ−１０４（配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤）を単独、又はＰＫＲ下方制御と組み合わせた効果
初代皮質ニューロン培養を得るために、Ｅ１５．５マウス胚をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）６％グルコース中で、氷上で解剖した。胚の皮質を小片に刻んで、ＰＢＳグルコーストリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を用いて２０分間３７℃で処理した。解離した皮質細胞を、Ｂ２７、Ｇｌｕｔａｍａｘ及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で培養した。ニューロンを３７℃、５％ＣＯ２で、ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレコーティングしたペトリ皿上で、培養した。ニューロンを培養して、使用前に（７日）成熟させた。
【０４６９】
Ａβ４２ストレスを誘発するために、２μＭのＡβ１−４２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、皮質ニューロンに対して５時間の間用いた。Ａβ４２−１インバースペプチド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を陰性の対照として用いた。Ａβ１−４２及びＡβ４２−１を、純水中に溶解して、使用前に３７℃で４８時間インキュベートした。
【０４７０】
ＪＮＫを阻害するために、皮質ニューロンを、１０μＭのＸＧ−１０４とともに細胞ストレス処理の１時間前に前処理した。
【０４７１】
イムノブロット分析のために、細胞を、１０ｎＭのＮａＰｉ  ｐＨ７．８、５９ｎＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、０．５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０，１μＭのカリクリンＡ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４及び１×のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する溶解バッファー中で、氷上で溶解した。溶解液を超音波処理して、１５０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。３０マイクログラムのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロース膜に転写した。ＴＢＳ  ５％スキムミルクでブロックした後、膜を、ＪＮＫフル、ｃ−Ｊｕｎ、ＰＫＲ、ｅＩＦ２α（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＵＳＡ）、ｐＪＮＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ）、ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｅＩＦ２α（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＡＲＰ及びチューブリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＵＳＡ）に対する一次抗体でプローブした。ＩＲ  Ｄｙｅｓ  ８００及び７００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）抗体を、二次抗体として用いた。ブロットはＯｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＵＳＡ）で明らかにした。
【０４７２】
カスパーゼ３活性分析のために、変性性及び死滅したニューロン並びに細胞培地を含む培養細胞上清を、接着性のニューロン溶解物と並行して収集した。培養細胞上清を、１５０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを溶解バッファー中で再懸濁し、カスパーゼ３活性を、カスパーゼ３アッセイキット試薬及びプロトコール（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いることによって測定した。
【０４７３】
結果：
Ａβ４２ストレスのＷＴ及びＰＫＲ−／−ニューロンにおけるＸＧ−１０４でのＪＮＫ及びｃ−ＪＮＫ活性の低下
Ａβ４２ペプチドによってストレスを受けたニューロン培養物中で、ＸＧ−１０４の有効性を検討した。ＸＧ−１０４を、１０μＭで用い、Ａβ４２ストレスの誘発の１時間前に細胞培地に添加した。ＷＴニューロンでは、ＪＮＫ活性化は、Ａβ４２ストレスの培養物中で、ＸＧ−１０４への曝露後に低下する（−６０％、図５５Ａ）。ＸＧ−１０４は、ペプチドなしでのストレスのＷＴニューロンと比較して、ｃ−Ｊｕｎリン酸化を低下するために−２９％の有効性（図５５Ｃ）、及びｃ−Ｊｕｎ発現を低下するために−６２％の有効性（図５５Ｄ）を示した。ＰＫＲ−／−ニューロンでは、ＪＮＫ活性化は、Ａβ４２ストレスの培養物中で、ＸＧ−１０４によって低下される（−６０％、図５５Ａ）。ＰＫＲ−／−培養物中では、ＸＧ−１０４の使用は、ｃ−Ｊｕｎ活性化を改変しないが（図５５Ｃ）、ＸＧ−１０４の使用は、Ａβ４２ストレスの誘発後のｃ−Ｊｕｎタンパク質発現の６２％の低下を示した（図５５Ｄ）。
【０４７４】
Ａβ４２ストレスのＷＴニューロンにおけるＪＮＫ阻害後のニューロンのアポトーシスの低下
Ａβ４２ペプチドで処理したＷＴニューロンニューロンの培養物中では、ＸＧ−１０４の使用は、アポトーシスを低下した。ＸＧ−１０４を用いて、Ａβ４２処理のＷＴニューロンと比較して、切断されたカスパーゼ３発現レベルの６１％低下（図５５Ｅ）、カスパーゼ３活性の７８％低下（図５５Ｆ）、及び切断されたＰＡＲＰ発現レベルの７７％低下（図５５Ｇ）が注目された。
【０４７５】
Ａβ４２に起因するニューロンの死滅は、ニューロンにおけるＰＫＲ及びＪＮＫの二重阻害の後に劇的に低下した
Ａβ４２及びＸＧ−１０４によって処理されたＰＫＲ−／−ニューロンでは、ＰＫＲ及びＪＮＫの二重阻害の有効性を、ニューロンのアポトーシスについて評価した。Ａβ４２ストレスのＰＫＲ−／−ニューロンに対するＸＧ−１０４の使用によって、Ａβ４２処理したＰＫＲ−／−ニューロンと比較して、切断されたカスパーゼ３の発現レベルの４２％低下（図５５Ｅ）、カスパーゼ３活性の６１％低下（図５５Ｆ）、及び切断されたＰＡＲＰ発現レベルの８６％低下（図５５Ｇ）が示された。ＰＫＲ及びＪＮＫについて二重に阻害されたニューロンでは、切断されたカスパーゼ３、カスパーゼ３活性及びＰＡＲＰ発現レベルは、処理されたＷＴニューロンと比較して、それぞれ８３％、８７％及び９３％低下した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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