(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノプロテインＰまたは当該タンパク質含有画分に、血漿カリクレイン、factor XIIa、factor XIaおよびプラスミンより選択されるセリンプロテアーゼを作用させることを特徴とする、細胞死抑制活性を有するペプチド断片の調製方法。
【請求項２】
セレノプロテインＰに対し重量比１／１０以下のセリンプロテアーゼを添加し、ついで３７℃にて１５分〜２４時間保温することを含む、請求項１ に記載の調製方法。
【請求項３】
セレノプロテインＰより細胞死抑制活性を有するペプチド断片を生成せしめるための、血漿カリクレイン、factor XIIa、factor XIaおよびプラスミン より選択されるセリンプロテアーゼの使用。
【請求項４】
セレノプロテインＰまたはセレノプロテインＰ含有画分にセリンプロテアーゼを作用させてセレノプロテインＰ断片含有溶液を得、ついで該セレノプロテインＰ断片含有溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィー、抗セレノプロテインＰ断片モノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー、および／または金属キレートクロマトグラフィーに供することを含む、細胞死抑制活性を有するペプチド断片の精製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は、医療用医薬品および試薬の分野に属し、新たな機能を有するタンパク質の調製方法に関する。詳細には、細胞死抑制活性を有するタンパク質あるいはその断片から、より活性の強いペプチド断片またはペプチド断片群を調製する方法に関する。さらに詳細には、断片化の方法として、酵素を用いた加水分解反応を利用し、強い細胞死抑制活性を有する分子量３．５万以下のペプチド断片またはペプチド断片群を調製する方法に関する。当該方法は、細胞死抑制活性を有するタンパク質の大量調製に用いられ、種々の疾患、たとえば細胞死に関連した疾患に対する病態悪化阻止、予防または治療剤を調製する際に効果的に使用され得る。
背景技術
細胞死は、高等生物の神経系、内分泌系、免疫系における基本的な制御に重要な働きをしているばかりでなく、多くの疾病に深く関わっていることが指摘されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｃ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２６７，ｐ．１４５６−１４６２（１９９５））。たとえば、全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患、神経細胞死による神経変性疾患、臓器移植に伴う臓器移植傷害等、これらはアポトーシスが関与する細胞死の影響による疾患として捉えることができる。
細胞を培養する際、主として培養細胞自身に由来、もしくは添加物に由来する物質による細胞に対するストレスが原因で細胞死が誘導されるが、同じ条件で全ての細胞に対する細胞死が誘導されるわけではない。通常、そのような環境に適応する細胞には、ストレスによる細胞死誘導シグナルを閾値以下に保つために必要なタンパク質が、細胞内外にすでに発現されているか、新たに誘導されている筈である。それらのタンパク質としては転写因子、合成酵素、代謝酵素、酸化還元酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、転移酵素、アポトーシス抑制タンパク質等が考えられる。つまり、個々の細胞でストレスに対する感受性に差が生じるのは、それらのタンパク質の発現量に差があるためであると予想される。そこで、細胞死の機序がそれぞれ異なるにせよ、あるストレスによる細胞死に対して抑制する因子を系外から添加することにより、その細胞死誘導のシグナルを閾値以下に保つことが可能であれば、培養細胞の場合だけではなく、生体内でも同様のストレスが生じた場合に起こる細胞死を抑制することが可能と考えられる。
ある種の培養細胞を無血清培養したとき、血清アルブミン画分を添加して培養すると、これに含まれる脂肪酸がストレスとなり、この細胞に細胞死を誘導させることができる。この細胞死は、ヒト血漿を添加することによって抑制することができ、最近ヒト血漿からその活性物質が単離、同定された。この物質は、セレノプロテインＰと呼ばれるセレニウム含有タンパク質のカルボキシル末端（以下「Ｃ末端」と略す）領域の断片であった（再公表公報ＷＯ  ００／３１１３１（平成１０年特許願第３４７８６３号））。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
血漿中のセレノプロテインＰは、分子量約６万の糖タンパク質で、１０残基のセレノシステインを含むと考えられている。セレノプロテインＰは、大きく２つのドメイン、すなわち過酸化脂質還元能を持ち一つのセレノシステインを含んだＮ末端側のドメインと、残る９つのセレノシステインを含みセレン伝搬機能を有することが示唆されているＣ末端側のドメインに分かれている。さらにこれらドメインの間には２つのヒスチジン残基に富む領域があり、これを介して細胞表面の陰性荷電リン脂質やヘパリンなど硫酸化プロテオグリカンに結合すると考えられている（Ｓａｉｔｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４６，ｐ．４０９−４１３（２０００））。前述のヒト血漿から得られたセレノプロテインＰ断片は、このヒスチジン残基に富む領域を含まないＣ末端側のペプチド断片であった。
ところで、上記セレノプロテインＰのＣ末端側断片の単離・同定に際して細胞死抑制活性のスクリーニング方法として好適に用いられた系は、アルブミン添加無血清培地を用いた、ヒト巨核芽球系のＤａｍｉ細胞の培養系であった。Ｄａｍｉ細胞はＲＰＭＩ  １６４０、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２を等量混合した培地（０．１％ＢＳＡおよび０．０５μＭβ−メルカプトエタノール含）により継代可能であるが、アルブミン不含培地ではほとんど増殖しない。この時、培地中に０．０１から０．５％のヒト血清アルブミンが存在する条件下では、細胞は正常に増殖するが、４日目以降に全ての細胞が突然死する。この培養系に試料を添加することによって、試料に含まれる細胞死抑制活性を測定することが可能である。
また、単離、同定されたセレノプロテインＰ断片を抗原として、モノクローナル抗体を作製し、これを用いた簡便な精製方法も確立された。当該モノクローナル抗体を用いた簡便な精製方法は、ヒト正常血漿のヘパリン吸着画分を原料とし、硫安分画、当該モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー精製からなる。この方法で精製した場合も、セレノプロテインＰは精製工程中に断片化を受け、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量３．５万以下に相当するバンドをからなる一連のタンパク質群として精製された。これらのバンドについて、タンパク質のアミノ末端（以下、「Ｎ末端」と略す）配列解析を実施したところ、２６０位のリジン残基に始まる分子と、２９２位のトレオニン残基から始まる分子が含まれていた。
驚くべきことに、このセレノプロテインＰのＣ末端側の断片は、完全長のセレノプロテインＰに比較して、より高い細胞死抑制活性を有していた。しかし、セレノプロテインＰは、上述の精製工程中に、ヒト血漿に由来する何らかの酵素で限定分解されたものと考えられたが、その酵素がどのようなものであるかまったく不明であった。また、精製したセレノプロテインＰ断片は単一の分子としてではなく、数本のバンドとして得られたため、いずれの分子が高い細胞死抑制活性を有するのか不明であった。さらに、このような方法で得られたセレノプロテインＰ断片は、調製ごとに含まれる各バンドの割合が変わり、再現性に乏しかった。このような、強力な細胞死抑制活性を持つセレノプロテインＰ断片を医薬品に応用するためには、これらセレノプロテインＰ断片化の過程を制御し、安定かつ恒常的に一定の品質のものを調製する方法が切望された。
（その解決方法）
前述のごとく、セレノプロテインＰは精製工程で限定分解を受けて断片化されるが、本願発明者らは、いかなる酵素がこれに関与しているかを調査するため、まず、精製工程に種々の酵素阻害剤を導入して調べた。鋭意検討の結果、セリンプロテアーゼの特異的かつ強力なインヒビターとして知られる、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）を用いることで、セレノプロテインＰの断片化が完全に抑制されるという知見を見出した。従って、この断片化にはセリンプロテアーゼ、もしくはこれによって二次的に活性化される何らかのプロテアーゼが深く関与していると考えられた。
次に所望の酵素を検索するために、本願発明者らは血漿中に含まれるセリンプロテアーゼに着目し、これらをセレノプロテインＰと反応させ、いかなる酵素がセレノプロテインＰを限定分解するかを検索した。基質であるセレノプロテインＰに対して、重量比で１０分の１となるように各種酵素を添加し、一定時間反応させた後、一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理液にて処理し、非還元条件下で電気泳動した。セレノプロテインＰを限定分解しているかを、クマシーブリリアントブルーで染色して観察した。セリンプロテアーゼとしては、血漿カリクレイン、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ、ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ、ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ、トロンビン、プラスミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、トリプシン、好中球エラスターゼを用いた。
その結果、分解の程度に差はあるものの、用いた大部分のセリンプロテアーゼ処理によって、分子量３．５万以下に相当するバンドの出現が確認された。このことは、セレノプロテインＰのある特定の領域に、セリンプロテアーゼに鋭敏な部位が存在することを示唆している。
また、これらセリンプロテアーゼの中でも、とりわけ血漿カリクレイン、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ、プラスミンはセレノプロテインＰを効率的に分解することが判明した。これらの酵素の反応条件は、通常酵素反応に用いられる条件であれば特に限定するものではなく、添加する酵素の量によって反応時間を制御することも、逆に反応時間によって添加する酵素の量を制御することも可能である。好適な一例としては、基質であるセレノプロテインＰに対し重量比１／１０以下、例えば重量比約１／２０量の酵素を添加し、３７℃にて１５分〜２４時間保温することによって、所望のセレノプロテインＰ断片を生成させることができる。
また、こうして得られた反応産物は、切断前に比較して、明らかに細胞死抑制活性が上昇しており、所望のセレノプロテインＰ断片が生成していることが確認された。
発明を実施するための最良の形態
本発明によって供された、酵素を利用したセレノプロテインＰ断片調製方法は、前述のように特に何らかの切断操作を行わず、再現性に問題のあったセレノプロテインＰ断片調製とは異なり、その断片化の過程を制御することを初めて可能とする。
さらに、こうして得られた反応産物を出発材料にして、通常用いられるクロマトグラフィーの手法を組み合わせることにより、所望のセレノプロテインＰ断片の精製が可能である。クロマトグラフィーの手法としては、通常用いられる手法が適用され特に限定されるものではないが、たとえばゲルろ過や限外濾過膜分画など分子量の差を利用する方法の他、イオン交換、疎水、逆相、アフィニティー、金属キレート等のクロマトグラフィーを用いた手法等、いずれの方法でも好適である。
より好適には、ゲルろ過クロマトグラフィーを利用して、分子量３．５万以下のセレノプロテインＰ断片を精製する方法、あるいはセレノプロテインＰ断片に特異的に結合するモノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーが利用される。また、金属キレートクロマトグラフィーを利用すれば、所望のセレノプロテインＰ断片がヒスチジンに富む領域を実質的に欠失していることを利用して、未切断のセレノプロテインＰと分離することが可能である。好適には、これらを組み合わせて用いることによって、効率的に所望のセレノプロテインＰ断片の精製が可能となる。
以上述べた方法を用いることによって、所望のセレノプロテインＰ断片を一定の品質で、安定かつ恒常的に生産することがはじめて可能となった。
以下に、本発明をより明確に特徴づけるために実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
（完全長セレノプロテインＰの精製）
血漿からのセレノプロテインＰの精製は、Ｓａｉｔｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７４，ｐ．２８６６−２８７１（１９９９）に準じて以下のように行った。
ヒト新鮮凍結血漿２リットルを温浴槽内で完全に融解し、低温室に置いた。これにＰＥＧ４０００の１００ｇを少量ずつ添加しながら撹拌し、全量添加後さらに１時間撹拌を続けた。これを１０，０００ｇにて２０分間遠心した。上清を回収し、ＡＰ２５（ミリポア）にてろ過した。ヘパリンセファローズ（アマシャムファルマシアバイオテク）１００ｍＬを充填したカラムを、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で平衡化し、これに得られたろ液を全量アプライした。２０倍量の平衡化バッファーで洗浄した後、塩濃度を０．１５Ｍから０．６Ｍまでの濃度勾配を作製することによって、吸着タンパク質をグラジエント溶出した。溶出画分は５ｍＬずつ分取し、各フラクションに含まれるセレノプロテインＰの量をＥＬＩＳＡで確認し、セレノプロテインＰを含むフラクションをプールした。精製工程中におけるセレノプロテインＰ断片化を避けるため、ＤＦＰを終濃度５ｍＭとなるよう添加した。
次に、この画分を２０ｍＭトリス緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））で６倍に希釈した。この段階で総量０．７５〜１Ｌとなった。これを、同じ２０ｍＭトリス緩衝液で平衡化した４０ｍＬのＱセファローズ（アマシャムファルマシアバイオテク）カラムにアプライした。２５０〜３００ｍＬの平衡化バッファーで洗浄し、塩濃度０．２５Ｍまでのグラジエントで溶出した。グラジエントには２５０ｍＬの緩衝液を用いた。得られたフラクションをＥＬＩＳＡで定量し、セレノプロテインＰを含むフラクションをプールした。また、このプール画分にも、ＤＦＰを終濃度５ｍＭとなるよう添加した。
引き続き、得られたプール画分に、終濃度２ｍＭとなるようイミダゾールを添加し、４ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン）カラムにアプライした。このカラムは、あらかじめ２０ｍＭトリス緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２ｍＭイミダゾール）で平衡化した。アプライ終了後、洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ）３０ｍＬで洗浄し、溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。溶出画分は１ｍＬずつ分取し、２８０ｎｍの吸光度で、吸収の観察されたピークをプールした。この画分を、２．５ｍＬまでＳｐｅｅｄＶａｃ（ＳＡＲＶＡＮＴ）を用いて遠心濃縮した。この濃縮画分にも、ＤＦＰを終濃度５ｍＭとなるよう添加した。ヘパリンセファローズクロマトグラフィーからＮｉ−ＮＴＡアガロース溶出画分までの精製収量を下の表１に示した。
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最後に、濃縮したセレノプロテインＰ画分は、リン酸緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク）にアプライし、脱塩、バッファー置換した。こうして得られたセレノプロテインＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量約６７，０００の移動度を示し、そのほとんどが全長型のセレノプロテインＰと考えられた。これを以降の切断酵素を検索する実験に用いた。
実施例２
（全長セレノプロテインＰの酵素消化）
実施例１で得られたセレノプロテインＰの４μｇに対し、重量比で１／１０量のタンパク質分解酵素を添加し、３７℃にて、２４時間反応させた。反応に用いたバッファーはＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））で、カルシウム要求性のプロテアーゼの場合は、これに５ｍＭのＣａＣｌ２を添加した。プロテアーゼとして、セリンプロテアーゼである血漿カリクレイン、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ、ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ、ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ、αトロンビン、活性化プロテインＣ、プラスミン、好中球エラスターゼ、およびトリプシンについて実施した。反応終了後、サンプルに当量のＳＤＳ処理液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、０．００１％ブロムフェノールブルー、１５％グリセリン）を添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開後、クマシーブリリアントブルーで染色した。図１にＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動像を示す。未反応サンプルは、あらかじめＳＤＳ処理液を反応チューブに用意し、実験サンプルと同量の酵素、基質を添加して調製した。
この実験の結果、いずれのプロテアーゼによっても、強い細胞死抑制活性を持つセレノプロテインＰ断片（再公表公報ＷＯ  ００／３１１３１（平成１０年特許願第３４７８６３号））と近似した、分子量１万〜３．５万以下のバンドの出現が認められた。また、未消化のセレノプロテインＰの残存量から、これら酵素の中でも、特に血漿カリクレイン、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ、ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ、プラスミンが効率よくセレノプロテインＰを消化することが判明した。
実施例３
（セレノプロテインＰ断片の細胞死抑制活性）
実施例２で得られた試料に含まれるセレノプロテインＰ断片が、全長セレノプロテインＰに比較して、その細胞死抑制活性が増強しているかを確認するため、以下に述べる細胞死抑制活性測定系で評価した。
０．０５μＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．１％ＢＳＡを含有する無血清培地ＳＦＯ３（三光純薬社製）で継代可能なＤａｍｉ細胞（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌ．７２，ｐ．１９６８−１９７７（１９８８）：１×１０６ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ／３ｍＬ）の１ｍＬに、ＲＰＭＩ１６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１：２：２混合培地（ＳＡ培地）を２ｍＬ添加後、３日間培養し、測定時に当該細胞を回収した。回収した細胞を、４μＭリノール酸を含むＳＡ／０．０５％脱脂ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）により２回洗浄し、同培地で３×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように懸濁後、この細胞懸濁液を試料添加ウェルのみ２００μＬ、段階希釈のためのウェルには１００μＬずつ、９６ｗｅｌｌプレートに分注した。サンプル添加ウェルに、試料を２μＬ添加して撹拌した後、１００μＬ細胞懸濁液が入ったウェルに対して段階希釈した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで４から５日間培養し、判定した。Ｄａｍｉ細胞は、この系では培養４日目以降、活性のない試料を添加したｗｅｌｌの細胞は死滅し、活性のある試料を添加したｗｅｌｌの細胞は生存し続けるので、評価の尺度としては、生細胞が被検試料の何倍希釈まで存在するか、という希釈倍率を用いた。従って、以下の表記で、数値が高いほど細胞死抑制活性が高い。
実施例２で得られた、セレノプロテインＰ断片を含む試料では、全長セレノプロテインＰに比較して、少なくとも希釈倍率で１．５〜３倍の活性上昇が観察された。このことから、本発明で用いた前述の酵素で、実際に強い細胞死抑制活性を有するセレノプロテインＰ断片の調製が可能であることが示された。
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実施例４
（全長セレノプロテインＰのカリクレインとプラスミンによる消化実験）
実際にセレノプロテインＰ断片を調製するに当たり、セレノプロテインＰに反応させる酵素の量、反応時間などはそれぞれの酵素の基質に対する効率に依存する。そこで、セレノプロテインＰ断片の酵素消化効率について、血漿カリクレインとプラスミンを取り上げて、酵素消化を継時的に観察することにより、その特徴を明らかにした。酵素の添加量は、実施例２に準じた。血漿カリクレインでは、反応開始から０、２、４、６、８、１０、１２および２４時間後に、プラスミンでは反応開始から０、５、１０、１５、２０、２５、３０および６０分後に、それぞれ検体を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して、切断の進行の程度を観察した。図２に当該ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動像を示す。その結果、いずれの酵素でも、セレノプロテインＰが継時的に切断され、分子量およそ２万前後に位置するセレノプロテインＰ断片の生成が観察された。
この結果、断片調製に用いる酵素の種類に応じた反応条件を適宜設定することにより、所望のセレノプロテインＰ断片を調製することが可能であることが示された。
実施例５
（セレノプロテインＰ断片の精製方法）
酵素による限定分解によって生じたセレノプロテインＰ断片は、以下の方法で精製可能である。強い細胞死抑制活性を持つセレノプロテインＰ断片（セレノプロテインＰのＣ末端側分子）は、セレノプロテインＰのヒスチジン残基に富む領域を実質的に欠失しているために、金属キレートカラムへの結合能を失っている。これを利用することで、セレノプロテインＰのＣ末端側分子の調製が可能である。
まず、セレノプロテインＰの１ｍｇに対し、血漿カリクレイン５０μｇを添加し、３７℃にて２４時間反応させ、セレノプロテインＰを限定分解させた。反応終了時にＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるよう添加して、カリクレインを失活させた。これに終濃度２ｍＭとなるようイミダゾールを添加し、あらかじめ平衡化バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭイミダゾール（ｐＨ８））で平衡化しておいた３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルへアプライした。さらに、洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８））３０ｍＬでカラムを洗浄し、これら非吸着画分および洗浄画分を回収した。カリクレインで限定分解された後に生ずる、セレノプロテインＰ断片のＣ末端側の分子は、実質的にヒスチジンに富む領域を欠失しているため、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲルへ結合しない。そのため、目的のＣ末端分子は、このクロマトグラフィーの非吸着および洗浄画分に回収できる。また、Ｎ末端側の分子は、溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８））を用いることにより、このカラムから回収可能である。
この非吸着および洗浄画分を、セントリフローを用いた濃縮とＰＢＳ希釈を繰り返すことにより、濃縮およびバッファー置換を行った。最終的に１ｍＬまで濃縮し、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２ＨＲ１０／３０カラムにアプライし、ゲルろ過した。ゲルろ過はＰＢＳをバッファーとし、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで、２２０ｎｍの波長でモニターした。この結果、主に２つのピークが現れ、第１のピークはＮ末端側のセレノプロテインＰと切断されずに残った全長セレノプロテインＰで、第２のピークはＣ末端側の分子であった（図３参照）。また、上記ゲルろ過工程で得られたピーク画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像を図４に示す。
実施例６
（セレノプロテインＰ断片の精製方法）
セレノプロテインＰのＣ末端断片を、より特異的かつ効率的に精製する方法として、モノクローナル抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好適な方法である。利用するモノクローナル抗体としては、セレノプロテインＰのＣ末端側の分子を抗原として認識しうるものが望ましいが、より好適には、強い細胞死抑制活性を持つセレノプロテインＰ断片をマウスに免役して得られたモノクローナル抗体が用いられる。たとえばこれを臭化シアンで活性化したセファローズゲルへ結合させて作成した、モノクローナル抗体結合ゲルが好適に用いられる。このようなゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより、セレノプロテインＰを酵素で限定分解した溶液から直接、あるいは上記実施例５で調製した、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲルの非吸着および洗浄画分から精製可能である。
実施例５と同条件で得られたＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルの非吸着および洗浄画分を、ＰＢＳ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で平衡化した１．５ｍＬのモノクローナル抗体アフィニティーカラムへ、直接アプライした。およそ８ｍＬのＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で溶出させた。溶出画分はおよそ１０分の１量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。これらのクロマトグラフィーにおいて、カラムの素通り画分と洗浄画分をプールした後、ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮し、ＰＢＳに対して透析した。一方、溶出画分は２２０ｎｍの吸収を示した画分をプールし、同様に濃縮、透析した。電気泳動の結果、素通りと洗浄画分からはセレノプロテインＰのＮ末端側のフラグメントが、また溶出画分からはセレノプロテインＰのＣ末端側のフラグメントが、それぞれ検出された（図５参照）。これらを実施例３の細胞死抑制活性で比較評価するため、あらかじめそれぞれの検体に含まれるセレン含量を原子吸光度計で測定し、系の中へセレン元素１ｐｐｍ等量を加えて、細胞死抑制活性を測定した。
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セレノプロテインＰのＣ末端フラグメントで、セレン元素１あたりの全長分子の数倍の細胞死抑制活性が認められた。
【図面の簡単な説明】
図１は、セレノプロテインＰを種々のセリンプロテアーゼで限定分解した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像（代表例）を示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：セレノプロテインＰ、レーン３：セレノプロテインＰ＋血漿カリクレイン（０時間）、レーン４：セレノプロテインＰ＋血漿カリクレイン（２４時間）、レーン５：セレノプロテインＰ＋ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ（０時間）、レーン６：セレノプロテインＰ＋ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ（２４時間）、レーン７：セレノプロテインＰ＋ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ（０時間）、レーン８：セレノプロテインＰ＋ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ（２４時間）、レーン９：セレノプロテインＰ＋プラスミン（０時間）、レーン１０：セレノプロテインＰ＋プラスミン（２４時間）。
図２は、セレノプロテインＰを血漿カリクレインまたはプラスミンで限定分解した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。Ａ：血漿カリクレインによるセレノプロテインＰの経時的限定分解、Ｂ：プラスミンによるセレノプロテインＰの経時的限定分解。
図３は、セレノプロテインＰ断片の精製工程におけるゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。
図４は、セレノプロテインＰ断片の精製工程におけるゲルろ過クロマトグラフィーで得られたフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。レーン１：図３のピーク２、レーン２：図３のピーク１。
図５は、セレノプロテインＰ断片の精製工程におけるモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーで得られたフラクションの電気泳動像を示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：セレノプロテインＰ、レーン３：Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーアプライ試料、レーン４：モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィー吸着画分、レーン５：モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィー非吸着画分。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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