(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドから構成され、かつシュードモナス・アエルギノーザ (Pseudomonas aeruginosa) 菌が保有するＤＮＡに対して特異的な交差反応性を示す、ことを特徴とするプローブ。
【請求項２】
配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドから構成され、かつシュードモナス・アエルギノーザ (Pseudomonas aeruginosa) 菌が保有するＤＮＡに対して特異的な交差反応性を示す、ことを特徴とするプローブ。
【請求項３】
配列番号：６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドから構成され、かつシュードモナス・アエルギノーザ (Pseudomonas aeruginosa) 菌が保有するＤＮＡに対して特異的な交差反応性を示す、ことを特徴とするプローブ。
【請求項４】
以下の工程、すなわち；
(ａ) 臨床検体より生体由来の食細胞を取得し、
(ｂ) 得られた食細胞を支持担体の表面に固定し、
(ｃ) 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
(ｄ) 溶菌酵素およびプロテアーゼ阻害剤を用いて、当該食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを取得し、
(ｅ) 界面活性剤の存在下、ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載のプローブとを用いて、in situハイブリダイゼーションを行い、および
(ｆ) 出現したハイブリダイゼーションシグナルによって、シュードモナス・アエルギノーザ菌を検出する、
工程を含む、ことを特徴とするシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出方法。
【請求項５】
前記臨床検体が、ヒトから採取した血液である請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記工程(ａ)〜(ｆ)を反復した後に、(ｇ) ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする、工程をさらに含む請求項４または５に記載の検出方法。
【請求項７】
以下の工程、すなわち；
(Ａ) 臨床検体より生体由来の食細胞を取得し、
(Ｂ) 得られた食細胞を支持担体の表面に固定し、
(Ｃ) 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
(Ｄ) 溶菌酵素およびプロテアーゼ阻害剤を用いて、当該食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを取得し、
(Ｅ) 得られた染色体ＤＮＡを、アルカリ変性および中和処理し、
(Ｆ) 界面活性剤の存在下、ストリンジェントな条件下で、当該染色体ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載のプローブとを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーションを行い、および
(Ｇ) 出現したハイブリダイゼーションシグナルによって、シュードモナス・アエルギノーザ菌を同定する、
工程を含む、ことを特徴とするシュードモナス・アエルギノーザ菌の同定方法。
【請求項８】
前記臨床検体が、ヒトから採取した血液である請求項７に記載の同定方法。
【請求項９】
以下の工程、すなわち；
(１) 臨床検体に含まれている感染症原因菌の染色体ＤＮＡを取得し、
(２) 請求項１乃至３のいずれかに記載のプローブを構成するポリヌクレオチドの少なくとも一部からなるプライマーを調製し、
(３) 当該染色体ＤＮＡと当該プライマーとの共存下でポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、および
(４) 増幅されたＤＮＡを検出する、
工程を含む、ことを特徴とするシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出方法。
【請求項１０】
以下の要素(ｉ)〜(iv)、すなわち；
(ｉ) リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ-アセチルムラミダーゼ、および、ザイモラーゼからなるグループから選択される少なくとも一つの溶菌酵素；
(ii) 請求項１乃至３のいずれかに記載の少なくとも一つのプローブ；
(iii) プロテアーゼ阻害剤；および
(iv) 界面活性剤
を含む、ことを特徴とするシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出および／または同定のためのキット。
【請求項１１】
シュードモナス・アエルギノーザ菌の検出および／または同定のためのＤＮＡチップであって、チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されている請求項１乃至３のいずれかに記載のプローブからなることを特徴とするＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）菌の検出技術の改良に関し、詳細には、シュードモナス・アエルギノーザ菌の検出のための新規のプローブ、これらプローブを利用したシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出方法、およびこれら方法の関連技術に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
シュードモナス・アエルギノーザ菌とは、「緑膿菌」とも称される細菌であり、主に、自然界の水系、土壌、動植物の生体内などに生息するグラム陰性桿菌である。
【０００３】
シュードモナス・アエルギノーザ菌は、一般的には、健常者に対しては病原性を示さないが、熱傷を原因とする菌血症や、カテーテル留置患者における尿路感染症、それに、人工呼吸器を装着した患者など、局所的感染防御能または全身的感染防御能が低下している患者に対してその病原性をよく発揮する。  また、この細菌は、院内感染肺炎の原因菌であるとともに、日和見感染症の代表的な起因菌である。
【０００４】
また、シュードモナス・アエルギノーザ菌は、臨床的には、敗血症や心内膜炎といった全身性感染症や、肺炎、脳髄膜炎、慢性膀胱炎などの局所感染症の起因菌でもある。  特に、悪性腫瘍、白血病、膠原病などでの原疾患およびそれらに対する治療のために生体の感染防衛機構が低下している状態の患者が、この細菌に感染すると、敗血症へ進展する。  この状態がさらに進行すると、ショックや、汎発性血管内凝固症候群(DIC)、成人呼吸促進症候群(ARDS)などを合併し、多臓器障害となり、死に至る場合がよくある。  特に、シュードモナス・アエルギノーザ菌を原因とする敗血症にあっては、実に、53.6％もの患者が除菌されずに死亡するに至っている。  そして、この細菌による感染症の場合、起因菌が判明する以前の経験的治療が無効である場合も多く、初期治療の失敗が、予後不良の原因であるともされている。
【０００５】
シユードモナス・アエルギノーザ菌の同定にあっては、通常、ヒツジやウマなどの脱線維血液を５％添加した血液寒天平板培地に検体を直接塗抹してこれを培養し、次いで、培地上に発育したコロニー周囲の溶血環の性状を観察する手法が採られている。  しかしながら、実際のところ、起因菌の確定は容易に実施しえないのが通常である。  これはすなわち、コロニーの形状は培養条件により大きく異なり、その菌種の特定が困難な場合が多いことによる。  また、菌の培養に長時間を有する上に、薬剤感受性成績の結果を得るまでには、さらに３〜４日の培養が必要であることも、迅速な診断を難しくしている。  加えて、感染症を疑われた時点で大量に抗生物質を投与されている場合には、たとえ検体中に菌が含まれていても、細菌の増菌・増殖が抑えられている場合があり、実際のところ、これらの検体から菌を培養できる可能性は極めて低いものとなっている。
【０００６】
一方、感染症における食細胞の機能に着目した方法として、血液試料中の白血球成分が集中してなるバフィーコート（Buffy coat）の塗抹染色標本を作製して、これを検鏡する方法がある。  一般に、バフィーコート標本で菌が検出される頻度は、成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に30％程度にとどまるが、新生児の場合、10例中７例（70％）で菌を検出している報告もある。  このように、塗抹標本を検鏡することによって得られる末梢血での菌の有無に関する情報は、治療における大きな指針となっている。
【０００７】
しかしながら、この方法によると、標本作製の前処理操作として、少なくとも検体からの菌の選択的分離に１〜２日、増菌に１日、固定操作に１日以上、合計で３〜４日の時間を要している。  現実には、菌が発育するまで培養を続けることになるので、前処理操作に一週問以上要する場合が多く、さらに、菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌が混入しても区別できない場合もある。  そして、重要なことに、このような事情から、培養すべき検体中の多くの菌は食細胞に取り込まれて、投与された抗生物質の作用で死滅または静止の状態にあるため、培養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、臨床検体を用いた培養による実際の菌の検出率は10％前後と非常に低い数値になる。  換言すれば、臨床的にシュードモナス・アエルギノーザ菌による感染症の可能性が疑われた患者の血液を、さらに一昼夜以上培養して検査しても、結局のところ、その90％は菌の存在すら判明していないのが現状である。
【０００８】
それ故、起因菌の確定と、それに即した抗生物質の選択が要求されているにもかかわらず、臨床的にシュードモナス・アエルギノーザ菌による感染症の可能性が疑われた投階で、検出結果が出るのを待たずに治療に踏み込んでいるのが、大方の臨床現場での実情である。  すなわち、起因菌不明のまま、最も広範囲な種類の菌に対して有効な抗生物質を投与し、１〜２日間様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである。
【０００９】
その他に、免疫学的側面に着目した方法として、(i)ラテックス凝集法、(ii)共同凝集法、(iii)酵素免疫測定法、(iv)金粒子測定法、(v)リボソーム免疫測定法などの手法を用いて、シュードモナス・アエルギノーザ菌を検出する迅速診断法が開発されている。  しかし、これら免疫学的検査法は、測定結果が培養法による結果と一致せず、偽陽性や偽陰性を示す場合がよくあることや、手技が煩雑であるなどの問題点が残されている。
【００１０】
このように、シユードモナス・アエルギノーザ菌が関与する感染症にあっては、迅速・確実な診断が求められているにもかかわらず、従来の診断方法では、十分対応できていなかったのが実情である。
【００１１】
このような諸問題を解決するために、本出願人は、貪食細胞に貪食された外来微生物の検出および／または同定のための方法を発明した（特公平７−40号）。すなわち、この方法によれば、貪食細胞中に存在する外来微生物由来の遺伝子は、これら遺伝子に対して特異的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いたin situハイブリダイゼーションによって検出される。  具体的には、この方法は、生体由来の臨床検体より取得した食細胞を固定し、これら食細胞に対して細胞膜の透過性を亢進させるための処理を施し、食細胞内に取り込まれた感染症原因菌のDNAを露出し、ストリンジェントな条件下で感染症原因菌のDNAにハイブリダイゼーション可能な検出用DNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションを行い、および、ハイブリダイズシグナルの出現の有無によって感染症原因菌を検出および／または同定する、との一連の工程を含む。
【００１２】
敗血症が疑われた患者の血液を、この方法に従って検査したところ、血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出し、さらに24時間以内に判定を終えることができたことから、この方法は感染症分野において脚光を浴びている。
【００１３】
また、本出願人は、シュードモナス・アエルギノーザ菌が保有するDNAと特異的に反応するプローブも発明している（特許第2965544号）。  それらプローブは、シュードモナス・アエルギノーザ菌の存在を的確に検出し、なおかつ検出精度も高い。  そのため、患者に投与する抗生物質を選択する上での、貴重な判断材料を提供する可能性が注目されている。
【００１４】
このように、本願発明は、シュードモナス・アエルギノーザ菌の検出感度および／またはシュードモナス・アエルギノーザ菌に対する特異性がさらに改善された新規プローブ、特に、ハイブリダイゼーション用プローブの提供に加え、これらプローブを利用することで、従前の検出方法よりも検出効率ならびに検出感度に優れた検出方法や検出手段の実現をも、その目的としている。
【００１５】
【課題を解決するための手投】
本発明は、従来技術で認識されていた上掲の不都合に鑑みて発明されたものであって、その要旨とするところは、シュードモナス・アエルギノーザ菌に対して特異的な交差反応を示し、かつ(a) 配列番号：３乃至６のいずれかに記載の塩基配列；(b) 塩基配列(a)と70％以上の相同性を有する塩基配列；または、(c) 塩基配列(a)および/または(b)に対して相補的な塩基配列を含む、シュードモナス・アエルギノーザ菌の検出用プローブにある。
【００１６】
また、本発明によれば、前述した検出用プローブを用いたシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出方法も提供される。  この検出方法は、(a) 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、(b) 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、(c) 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、(d) ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとの間でin situハイブリダイゼーションを行い、および(e) ハイブリダイゼーションシグナルを検出する工程を含む。
【００１７】
さらに、本発明の他の態様によれば、感染症原因菌の検出方法が提供される。
【００１８】
この検出方法は、(1) 感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、(2) 本発明の検出用プローブを構成する塩基配列の少なくとも一部からなるプライマーを調製し、(3)得られた染色体ＤＮＡと当該プライマーとの共存系にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、および(4) 増幅されたＤＮＡを検出する工程を含む。
【００１９】
そして、本発明のさらに他の態様によれば、食細胞に貪食された外来微生物の遺伝子を観察する方法が提供される。  この観察方法は、(i) 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、(ii) 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、(iii) 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、(iv) ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとのin situハイブリダイゼーションを行い、(v) ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、(vi) 工程(i)〜(v)を繰り返して実施し、および(vii) ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする工程を含む。
【００２０】
加えて、本発明のさらに他の態様によれば、本発明の検出用プローブ、食細胞含有検体調製器具、支持担体、細胞膜用化学処理剤、ＤＮＡ露出処理剤、ハイブリダイゼーション用具およびハイブリダイゼーションシグナル検出器具を含むシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出キットが提供される。
【００２１】
そして、本発明のさらに別の態様によれば、チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されてなる本発明の検出用プローブまたはその断片とを具備したＤＮＡチップが提供される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を詳細に説明する。
【００２３】
定  義
まず、本明細書で使用する「臨床検体」の語は、生体由来の食細胞が含まれる臨床検体を総称するものであり、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰などの体液が挙げられる。  また、糖尿病、腎障害、肝障害などの病態によっては、尿、腹水、透析排液などの他に、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の洗浄液にも生体由来の食細胞が含有されるため、これらも臨床検体の範疇に包含される。  加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いることができる。  これはすなわち、食細胞の一つであるマクロファージには、単球、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、固定マクロファージ、遊離マクロファージ、ハンゼマンマクロファージ、炎症性マクロファージ、肝クッパー細胞、脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、血液のみならず、これらを含有する組織までもが本発明の臨床検体として用いることができることによる。  例えば、腎炎が疑われる患者から、腎生検に従って腎組織を採取し、トリプシン等の酵素を用いることによって細胞を剥離してこの組織内に存在する食細胞を取得し、得られた食細胞を用いることで、腎炎の原因微生物を検出および同定することができる。
【００２４】
次に、本明細書で使用する「食細胞」の語は、外来微生物を含めた異物を自身の細胞内に取り込むことのできる細胞を指すものであって、例えば、マクロファージ、単球、好中球、好酸球などが挙げられる。  また、Ｕ937細胞、HL60細胞などの食細胞系も、本発明において好適に使用することができる。
【００２５】
食細胞（白血球）画分は、公知の方法によって臨床検体から取得することができる。  例えば、約５mlのヘパリン加静脈血（白血球数の少ない場合は10ml）を採取し、この血液と血液分離試薬［塩化ナトリウム225mgとデキストラン（分子量 200,000〜300,000）1.5ｇを含み、滅菌精製水にて全量を25mlに調製したもの］とを４：１程度の割合で混和した後、約10℃〜約40℃で、約15分〜約120分間、好ましくは、約37℃で、約30分間静置することによって、白血球画分（上層）を取得することができる。
【００２６】
食細胞の固定
このようにして得た白血球画分を、約０℃〜約20℃にて、約100×ｇ〜約500×ｇで、約３分〜約60分間、好ましくは、約４℃にて、約140×ｇ〜約180×ｇで、約10分間遠心分離することによって、白血球を得ることができる。
【００２７】
遠心分離の際に赤血球が混入してしまった場合には、溶血操作を行うのが好ましい。  例えば、白血球のペレットに滅菌精製水１mlを加えて懸濁した後、直ちに、過剰量のPBS［塩化ナトリウム18.24ｇ、リン酸一水素ナトリウム12水和物6.012ｇおよびリン酸二水素ナトリウム二水和物1.123ｇを含み、かつ滅菌精製水で全量を120mlに調製したもの（以下、単に『PBS原液』と称する）を、滅菌精製水で
20倍に希釈して得たもの］（以下、単に『PBS』と称する）を加えて等張化した後、再度、約４℃の温度下にて、約140×ｇ〜約180×ｇで、約10分間遠心分離する。
【００２８】
あるいは、このような遠心分離を行わなくとも、貪食細胞が本質的に有する接着能力を利用して、以下のようにして、スライドグラスに接着させることもできる。  白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。  具体的には、白血球を支持できる担体（支持担体）に白血球のペレットを載置し、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た液）に20分間程度浸した後、約50％〜約90％、好ましくは、約75％のエタノール液に約５分間浸して、完全に風乾する。
【００２９】
このような支持担体としては、不溶性素材から形成されたものが好ましく、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂など）、多糖類（セルロース、アガロースなど）が好適に使用できる。  不溶性支持担体の形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができる。
【００３０】
特に、本発明の実施態様において好ましい支持担体として、スライドグラスがある。  このようなスライドグラスとして、例えば、スライドグラス（商品番号MS311BL：日本エアーブラウン社製）がある。  このMS311BLスライドグラスは、その表面に、直径５mmの円形ウェルを14個有している。
【００３１】
また、実際の適用を考慮すれば、支持担体への細胞の接着性を改善する目的で、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APS、SIGMA社）を、その表面にコートしてなるAPSコートスライドグラスが好ましい。  その他に、ポリ-L-リジンやゼラチンをコートしてなるスライドグラスも好適に使用できる。  これらAPSコートスライドグラスの作製手順は、まず、スライドホルダーにスライドグラスを固定する。  固定したスライドグラスを、希釈した中性洗剤に30分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に除去し、精製水で洗浄した後に、高温（100℃以上）で十分に乾燥させ、その後、室温で放置冷却する。  次いで、スライドグラスを２％
APS含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する。  さらに再度、スライドグラスを１〜10％APS含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾を行った後、約20℃〜約60℃、好ましくは約42℃で乾燥させることで、APSコートスライドグラスが得られる。
【００３２】
APSコートスライドグラス表面に白血球を支持させる場合、各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹して、風乾するのが好ましい。  固定化する食細胞の密度（ｘ個/ml）は、約５×106個/ml＜ｘ個/ml＜約１×108個/ml、好ましくは、約１×107個/ml≦ｘ個/ml≦約５×107個/mlに調整する。  また、これに対応して、APSコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個/ウェル(直径５mm)）は、約2.5×104個/ウェル＜ｙ個/ウェル＜約５×105個/ウェル、好ましくは、約５×104個/ウェル≦ｙ個/ウェル≦約2.5×105個/ウェルに調整する。
【００３３】
具体的には、白血球画分を、約４℃にて、約140×ｇ〜約180×ｇで、10分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のPBSを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【００３４】
そして、約５×104個/ウェル〜約2.5×105個/ウェルの細胞数となるようにPBSで調製した白血球懸濁液５μlを、APSコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾させることによって、白血球がその表面に固定支持されたAPSコートスライドグラスが調製される。
【００３５】
細胞膜の透過性亢進処理
食細胞の細胞膜の透過性を亢進させるための処理を行う。  この処理方法として、白血球が固定支持されたAPSコートスライドグラスを、PBSに約３〜約30分間浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン1.25ｇ、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重1.068〜1.075(20/4℃)、pH（５w/v%) 5.5〜7.5）1.25ml、PBS原液25mlを混合し、滅菌精製水にて全量50mlに調製したもの）を、滅菌精製水で約２〜約50倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で約３〜約30分間振とうする方法を用いることができる。
【００３６】
内在細菌ＤＮＡの取得
次に、食細胞内に存在する感染症原因菌のDNAを得る。  具体的には、まず、スライドグラス１枚につき酵素試薬（N-アセチルムラミダーゼ、リゾチームおよび／またはリゾスタフィン；以下、単に『酵素試薬』と称する）に対して、酵素試薬溶解液（フェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)含有ジメチルスルフォキシド(DMSO)を、PBSで100倍希釈したもの］を１ml加えて酵素試液を調製した。  その後、約20℃〜約60℃、好ましくは、約37℃〜約42℃の湿潤箱内で、この酵素試薬１mlを白血球塗抹部位に滴下して、約10〜約60分間静置して、感染症原因菌のDNAを露出する。  その後、0.2mol/lの塩酸を含むPBS（PBS原液に塩酸を加え、滅菌精製水で20倍希釈して、塩酸の終濃度を0.2mol/lに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で約３〜約30分間振とうする。  DMSOは、５％以上の濃度でリゾチームおよびリゾスタフィンの活性を低下させる可能性があるため、５％未満の濃度で使用するのが好ましい。
【００３７】
食細胞の形態を保持させる物質であるPMSF以外に、他の公知のプロテアーゼ阻害剤、例えば、トシルリジンクロロメチルケトン(TLCK)およびそれらの混合物などを用いることもできる。  そのような場合は、DMSOなどの溶解剤を適宜変更すればよい。
【００３８】
酵素試薬として用いられる各酵素の力価範囲は、次の通りである。  リゾスタフィンの力価範囲は、約１単位/ml〜約1,000単位/ml、好ましくは、約10単位/ml〜約100単位/mlである。  また、N-アセチルムラミダーゼの力価範囲は、約10単位/ml〜約10,000単位/ml、好ましくは、約100単位/ml〜約1,000単位/mlである。そして、リゾチームの力価範囲は、約1,000単位/ml〜約1,000,000単位/ml、好ましくは、約10,000単位/ml〜約100,000単位/mlである。  なお、原因菌が真菌である場合には、ザイモラーゼの力価範囲は、約50〜約500単位/ml、好ましくは、約
100単位/ml〜約500単位/mlである。  また、ザイモラーゼを使用する場合、PMSFまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を併用するのが特に好ましい。
【００３９】
また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の菌体成分の違い、すなわち、ペプチドグリカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、使用酵素を適宜選択することができる。  特に、グラム陽性菌とグラム陰性菌の種別にかかわらず、より効果的に菌体を溶菌させるために、２種類以上の酵素を使用することもできる。  リゾチーム、リゾスタフィン、およびＮ−アセチルムラミダーゼの３種類の酵素を混合した酵素試薬を使用することによって、１種類の酵素に依った場合と比較して溶菌活性が高まる。
【００４０】
酵素試薬の至適酵素処理温度は、約26℃〜約59℃、好ましくは、約37℃〜約42℃に設定する。  また、酵素試薬の酵素処理時間は、少なくとも約15分以上、好ましくは、約15分〜約120分、あるいは、少なくとも約20分以上、好ましくは、約30分〜約60分とする。
【００４１】
N-アセチルムラミダーゼに関しては、Enterococcus faecalisの熱処理乾燥粉末ならびにN-アセチルムラミダーゼと共に、２mmol/l 塩化マグネシウムを含む５mmol/lトリス塩酸緩衝液（pH 6.0）中にて、37℃で、５分間反応させた場合、600nmでの吸光度が下がる現象が認められる。  また、S. salivarius (IFO 3350)の熱処理細胞を、37℃、pH 7.0の条件下で、１分間に１μｇを溶菌する酵素活性を１単位とした場合、2,000単位/mg以上の活性を示すN-アセチルムラミダーゼを使用することが望ましい。
【００４２】
リゾチームに関しては、Micrococcus luteusとリゾチームと共に、PBS中にて、37℃で、５分間反応させた場合、600nmの吸光度が下がる現象が認められる。
【００４３】
また、Micrococcus luteusを、35℃、pH 6.2の条件下で、１分間に540nmの吸光度を0.001下げる時の酵素活性を１単位とした場合、50,000単位/mg以上の活性を示すリゾチームを使用することが望ましい。
【００４４】
リゾスタフィンに関しては、Staphylococcus epidermidisとリゾスタフィンが共に、PBS中にて、37℃で、５分間反応させた場合、600nmの吸光度が下がる現象が認められる。  また、S. aureusを、37℃、pH 7.5の条件下で、10分間で、 620nmの吸光度を0.240から0.125に下げる酵素活性を１単位とした場合、500単位/mg以上の活性を示すリゾスタフィンを使用することが望ましい。
【００４５】
ザイモラーゼ（商品名：ザイモリエイス、生化学工業）は、Arthrobacter lutesu1の培養液から調製された酵素で、酵母生細胞の細胞壁に対する溶解活性が大きい。  ザイモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関与する必須酵素は、β-1,3-グルカン・ラミナリペンタオヒドロラーゼ（lanimaripentaohydrolase）であり、これは、β-1,3-結合のグルコースポリマーに作用して、主生成物としてラミナリペンタオースを生成する。  ザイモリエイス-100Tは、硫安分画に精製され、さらにアフィニティークロマトグラフィーにより精製された酵素であって（Kitamura, K. et al., J. Ferment. Technol., 60, 257, 1982）、100,000単位/ｇの活性を有している。  しかしながら、この酵素の活性は、基質となる酵母の種類、培養条件および生育時期により変化することが知られている（Kitamura, K. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 20, 323, 1974；Kitamura, K. et al., Agric. Biol. Chem., 45, 1761, 1981； Kitamura, K. et al., Agric. Biol. Chem., 46, 553, 1982）。  ザイモリエイス-100Tは、β-1,3-グルカナーゼを約1.0×107単位/ｇ、プロテアーゼを約1.7×104単位/ｇ、そして、マンナーゼを約6.0×104単位/ｇを含み、DNaseおよびRNaseは認められない（Kitamura, K. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 57, 1972）。  また、ザイモリエイスの至適pHは約5.5〜約8.5であり、約6.5〜約7.5のpHが特に至適性に優れており、至適温度は約25〜約55℃であり、約35〜約45℃の温度が特に望ましい。  さらに、酵母（対数増殖期細胞）に対する溶菌スペクトラム（属名）として、Ashbya、Candida、Debaryomyces、Eremothecium、Endomyces、Hansenula、Hanseniaspora、Kloekera、Kluyveromyces、Lipomyces、Helschkowia、Pichia、Pullularia、Torulopsis、Saccharomyces、Saccharomycopsis、Saccharomycodes、Schwanniomycesなどがある。  特に、カンジダ属には、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラシロシス、カンジダ・ガラクタ、カンジダ・ギリエルモンジ、カンジダ・クルセイ、クリプトコッカス・ネオフォーマンス等がある。
【００４６】
これらの属に属する菌も、本発明の適用対象に加えることができる。
【００４７】
ザイモラーゼの賦活剤として、SH化合物、例えば、システイン、2-メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどを用いることができる。  ザイモラーゼは、ビール酵母懸濁液を基質として、約25℃の温度下で、約２時間置いた反応液（ザイモラーゼ：0.05〜0.1mg/溶液mlの１ml、基質：ビール酵母懸濁液（２mg乾燥重量/ml）３ml、緩衝液：M/15リン酸緩衝液（pH 7.5）５mlを含み、滅菌精製水１mlで全量を10mlに調製したもの）でのＡ800を30％減少するに必要な酵素活性を１単位とする。  なお、ザイモリエイス-100Tは、約100,000単位/ｇの活性を有している。
【００４８】
酵素試薬溶解液として用いられる（プロテアーゼから白血球を保護してその形態を保持させるために添加される）PMSFは、約10μmol/l 以上の濃度で効果が認められ、約0.1mmol/l 以上の濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていたことから、約10μmol/l〜約10mmol/l、好ましくは、約0.1mmol/l〜約１mmol/lの範囲であることが好ましい。  また、ジメチルスルフォキシド(DMSO)の濃度としては、約５％未満の濃度で使用でき、約２％以下の濃度が好ましく、約１％程度の濃度が最も好ましい。  従って、酵素試薬溶解液としては、0.1mol/l PMSF含有DMSOを、PBSで約100〜約1,000倍希釈して調製したものが好ましい。
【００４９】
感染症原因菌のDNAを得た後に、細胞膜タンパク質のアセチル化工程を加えてもよい。  具体的には、アセチル化試薬（トリエタノールアミン7.46ｇと適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を50mlとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で約２〜約50倍に希釈し、好ましくは、約10倍に希釈して、無水酢酸の終濃度を約0.1〜約3.0％、好ましくは、約0.8％に調製したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で５〜30分間振とうする。  その後、スライドグラスを、75％、85％、98％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５０】
また、アセチル化工程の後に、感染症原因菌のDNAをアルカリ処理する工程を挿入することができる。  これにより、感染症原因菌のDNAは、一本鎖のDNAになる。  具体的には、スライドグラスを、約10mmol/l 〜約300mmol/l、好ましくは約
70mmol/lの濃度の水酸化ナトリウムを含むPBS（PBS原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で約20倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を70mmol/l に調製したもの）に約２〜約５分間浸して、アルカリ処理を行う。  その後、スライドグラスを、75％、85％、98％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５１】
In situハイブリダイゼーション
ストリンジェントな条件下にて、感染症原因菌のDNAとハイブリダイゼーション可能な検出用DNAプローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行う。
【００５２】
In situハイブリダイゼーションを実施するにあたって、まず、プローブ希釈液を用いて調製した検出用DNAプローブ含有液（プローブ液）を塗抹部位に塗布し、約25℃〜約50℃、好ましくは、約37℃〜約42℃の湿潤箱内で、約１〜約３時間、好ましくは、約２時間静置させる。  その後、ハイブリダイゼーション洗浄液［ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム13.15ｇとクエン酸三ナトリウム２水和物6.615ｇとを含み、滅菌精製水にて全量を75mlに調整したもの、以下、単に、『ハイブリダイゼーション原液』と称する）を、ハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：45：50の割合で混合して調製したもの］を３つの染色ビンに用意し、それぞれを順に、約35〜約45℃、好ましくは、約42℃で、約10分間ずつ浸す。  その後、PBSに浸したままで、振とう機上で、約５〜約30分間振とうさせる。  詳細には、プローブ希釈液は、サケ精子DNA 600μl、100×デンハート溶液50μl、前出のハイブリダイゼーション原液500μl、ホルムアミド2250μl、50％硫酸デキストラン1000μlを含んでいる。  プローブ液には、15ngの各検出用DNAプローブを含有せしめるのが好ましく、プローブ希釈液にて全量を50μlとするのが望ましい。
【００５３】
シュードモナス・アエルギノーザのプローブ濃度は、約0.6〜約1.8ng/μl、好ましくは、約0.6〜約1.2ng/μlとする。  また、約0.06ng/μlの濃度では検出が不調（以下、「不適」と称する）であり、また、約0.6ng/μlの濃度では検出可能（以下、「適」と称する）であったことから、少なくとも約0.1ng/μl以上の濃度に調整すべきである。  さらに、約2.4ng/μlの濃度では「不適」であり、また、約1.8ng/μlの濃度では「適」であったため、約2.2ng/μl以下の濃度に調整すべきである。  また、陽性コントロールおよび陰性コントロールの至適濃度は、それぞれ約0.4〜約2.0ng/μlおよび約0.6〜約2.0ng/μlとし、好ましくは、両者共に約0.6〜約1.0ng/μlの濃度とする。
【００５４】
また、ハイブリダイゼーションの試験時間は、少なくとも約30分以上、好ましくは、約60分以上、より好ましくは、約90分以上とする。  最も好ましくは、ハイブリダイゼーション時間を120分〜900分に設定すべきである。
【００５５】
In situハイブリダイゼーションの実施において、検出感度を高める観点からして、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤の使用が好ましい。  SDSの好ましい濃度は、約１％以下、好ましくは、約0.1％〜約0.5％、より好ましくは約0.25％である。  SDSは、ハイブリダイゼーションの際に用いる溶液に添加されていればよく、プローブ希釈液またはプローブ液に事前に混合して用いてもよい。
【００５６】
また、DNAプローブとしては、約350〜約600塩基長、好ましくは、約350〜約550塩基長、最も好ましくは、約350〜約500塩基長の長さを有する１種以上のDNAプローブとするのが好ましい。  これはすなわち、食細胞内へのプローブの導入を円滑にし、かつ取り込まれている外来微生物の遺伝子への確実な接触が許容されることによる。  ところで、プローブの塩基長は、必ずしも前出の範囲に限定される必要はなく、プローブの塩基長分布におけるピーク値が、主としてこの数値内に入っていればよいことを意味するものである。  これらプローブは、１種だけを利用してもよく、また、１種以上を併用してもよい。  １種以上のプローブとは、一つの菌種に対してハイブリダイズ可能な複数種のプローブであってもよく、あるいは、一つの菌種に対するプローブは１種であるが、菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数種となっていてもよく、これらの場合、プローブの種類が１種以上になることを制限するものではない。
【００５７】
なお、プローブは、食細胞自体との交差反応性に乏しい（ハイブリダイズしない）配列を有するＤＮＡ断片を含むものとすることが好ましく、プローブの起源種と異なる他の菌種に由来する遺伝子とハイブリダイズするものであってはならない。
【００５８】
例えば、サブトラクション法を用いれば、短時間で特異プローブを作成することができる。  これらプローブは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン(DIG)-11-dUTP）等の非放射性同位体標識用物質を用いて、定法のニックトランスレーション法に従って、調製およびラベルすることができる。  プローブの鎖長は、ニックトランスレーション反応において添加するDNaseＩとDNAポリメラーゼＩの量比を変化させることによって、最も効率よく標識付け可能なように制御できる。
【００５９】
一例として、本願発明のプローブPA-13-３（配列番号：６）の２μgを効率よくラベル化し、また、外来微生物DNAと効率よくin situハイブリダイズ可能なプローブ鎖長（350〜600）にするためには、全量100μlの反応液中に、10U/μlのDNAポリメラーゼＩの２μlに対し、全量100μlの反応液中に約10〜約350mU、好ましくは、約25〜約200mU、より好ましくは、約50〜約150mUに調製されたDNaseＩを６μl存在するように調製する。  この場合、各酵素の容量および反応液全量などは、上記した至適反応条件の比率が一定である限り、適宜変更してもよい。
【００６０】
換言すれば、全量100μlでの20ＵのDNAポリメラーゼＩに対して、DNaseＩの濃度を、約10〜約350mU、好ましくは、約25〜約200mU、より好ましくは、約50〜約150mUの濃度に調整する。  さらに換言すれば、１単位のDNAポリメラーゼＩに対して、約0.5/1000〜約17.5/1000、好ましくは、約1.25/1000〜約10/1000、より好ましくは、約2.5/1000〜約7.5/1000単位のDNaseＩを用いてニックトランスレーション反応を行うのが望ましい。  また、１μgのDNAに関して着眼すれば、10ＵのDNAポリメラーゼＩに対して、DNaseＩを約５〜約175mU、好ましくは、約12.5〜約100mU、より好ましくは、約25〜約75mUにすればよい。  他のプローブに関しては、上記した至適反応条件を参考にして、DNA量、DNAポリメラーゼＩおよびDNaseＩに関する至適反応条件を決定することができる。  加えて、効率よくラベル化でき、しかも外来微生物DNAと効率よくin situハイブリダイゼーションできるプローブ鎖長（約350〜約600塩基長）に調節することもできる。
【００６１】
ところで、in situハイブリダイゼーションを実施する際に用いられる「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ホルムアミド約30％〜約60％、好ましくは、約50％の存在下、約30〜約50℃、好ましくは、約38〜約42℃でインキュベートし、その後、洗浄を行う条件である。
【００６２】
In situハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの工程を加えることもできる。  具体的には、湿潤箱内でスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２mlとPBS原液0.5mlを含み、かつ滅菌精製水にて全量を10mlに調製したもの）１mlを塗抹部位に滴下し、約15〜約60分間静置する。  その後、ブロッキング試薬を除去する。
【００６３】
ハイブリダイズシグナルの検出
菌由来の遺伝子（ゲノムDNAまたはRNA）とハイブリダイズした結果に生じるシグナルを検出するために、定法の抗原−抗体反応等を利用した呈色反応を行う。
【００６４】
すなわち、ハイブリダイゼーションを終えた試料を充分に洗浄した後に、ブロッキング処理を行い、次いで、抗FITC抗体、抗ジゴキシゲニン抗体などの接合物、例えば、アルカリホスファターゼ接合物を用いて処理し、その後、接合物の発色系にてシグナルを発色して、ハイブリダイゼーションの状況を確認する。  例えば、プローブとして、ジゴキシゲニン-11-dUTPでラベルしたプローブを用いた場合、抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ接合物を用い、一般に使用されるアルカリホスファターゼに対する基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート等）を利用して検出すればよい。
【００６５】
呈色反応の後に洗浄して得た塗沫標本は、ナフトールブラック、Fast Green（20mg/50ml、Wako Chemicals社製）等で対比染色を行い、光学顕微鏡によって検鏡すると細胞内シグナルが観察される。
【００６６】
詳細には、ハイブリダイゼーションによるシグナルを得るには、例えば、検出用DNAプローブとしてジゴキシゲニン標識DNAプローブを用いる場合には、標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液1.05単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン746mg、塩化ナトリウム17.5mg、塩化マグネシウム６水和物20.3mg、塩化亜鉛1.36mg、ウシ血清アルブミン1000mgおよび適量の塩酸を含み、かつ滅菌精製水適量にて全量を100mlに調製したもの）12.6μlにて全量を14μlに調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン8.48mg、塩化ナトリウム6.14mgおよび塩酸適量を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を0.7mlに調製したもの）で約10〜約200倍、好ましくは、約50倍に希釈した標識抗体液を調製し、これを塗抹部位に10μlずつ滴下し、約15〜約60分間静置する。  その後、標識抗体洗浄液（１mlのポリソルベート20と50mlのPBS原液を含み、かつ滅菌精製水にて全量を100mlに調製したもの）を約２〜約50倍、好ましくは、約10倍に希釈した溶液に浸し、そのままの状態で、振とう機上で約５〜約30分間振とうする。  この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン6.06ｇ、塩化ナトリウム2.92ｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を50mlに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物5.08ｇを含み、かつ滅菌精製水にて全量を50mlに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、そのままの状態で振とう機上で約５〜約30分間振とうする。
【００６７】
その後、スライドグラス１枚につき発色試薬（ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルフォスフェイト(BCIP)）１mlを、0.2μmシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジでろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱中で約10℃〜約45℃、好ましくは、約37℃で、約15〜約60分間遮光静置する。  その後、発色試薬洗浄液（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン606mg、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物186mgおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を50mlに調製したもの）を約２〜約50倍、好ましくは、約10倍に希釈した溶液に約２〜約10分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンFCF(食用緑色３号)50mgを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を50mlに調製したもの）を約２〜約50倍、好ましくは、約10倍に希釈した溶液、それに約0.1〜約５％、好ましくは、約１％の酢酸溶液に浸す。  その後、前出の発色試薬洗浄液を約２〜約50倍、好ましくは、約10倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾する。  また、発色試薬は、個別に調製した試薬でもよい。
【００６８】
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、ブロッティング用メンブレンに、ジゴキシゲニンをラベルしたDNAを１ngブロットし、ブロッキング後、10,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液で処理し、発色基質（NBT/BCIP）を反応させると、DNAのブロッティング部位が発色し、ジゴキシゲニンがラベルされていないDNAで同様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが望ましい。  また、抗ジゴキシゲニン抗体は、ヒツジ由来のものが好ましい。  詳細には、免疫処置したヒツジ血清より、イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマトグラフィーを経て精製したものが好ましい。
【００６９】
発色試薬（NBT/BCIP溶液、pH 9.0〜10.0）として、ニトロテトラゾリウムブルー(NBT)3.3mg、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルフォスフェイト(BCIP)1.65mg、N,N-ジメチルホルムアミド99μg、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン121mg、適量の塩酸、塩化ナトリウム58.4mg、および塩化マグネシウム６水和物101.6mgを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を10mlに調製したものが好ましい。  この発色試薬としては、アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク質をブロッティング用メンブレンにブロットし、発色試薬でメンブレンを遮光室温で処理すると、ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れる試薬が好ましい。
【００７０】
このような対比染色を行う場合、シグナルと細胞のコントラストをさらに明確にさせるため、食用色素、例えば、黄色４号（タートラジン）を使用することができる。  その理由として、基質によって紫色を呈色し、また、ナフトールブラックにより青色を呈色するなど、発現した色が互いに類似していると、明確な対比染色が行いにくいことが挙げられる。  これまでに試されなかった食用色素を用いたところ、対比染色時の色相の差異が明確になり、実用的であることが判明した。
【００７１】
ところで、ジゴキシゲニンを標識化する方法として、ニックトランスレーション法を用いることができる。  また、ジゴキシゲニンを標識化するその他の方法として、ＰＣＲ法、ランダムプライマーラベリング法、in vitroトランスクリプションラベリング法、ターミナルトランスフェラーゼラベリング法なども使用可能である。
【００７２】
交差反応の有無の判定は、光学顕微鏡で鏡検（×1,000）した際に、単一ウェルにおいて、対比染色液によって染色された細胞において、青紫色の発色が１つでも認められた場合に陽性と判定する。
【００７３】
また、検出用プローブの調製方法は、特許第2965544号を参照することで明らかになろう。
【００７４】
さらに、本発明のプローブ（PA-２-31、配列番号：３）を、例えば、ワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、ワーキングセルバンク（PA-２-31）を、白金耳または使い捨てプラスチックループ等で釣菌して、これを滅菌シャーレ内に置いた50μg/mlアンピシリン含有L-ブロス固形培地に画線塗抹する。  一晩培養した後、シングルコロニーを採取し、50μg/mlアンピシリン含有のL-ブロス培地５mlに植菌して、37℃で終夜振とう培養する（前培養）。  次いで、前出の固形培地400mlが入った培養用フラスコに、前培養液を2.5mlずつ植菌して、約37℃で終夜振とう培養する（本培養）。
【００７５】
そして、PA-２-31のプラスミドＤＮＡを抽出すべく、本培養した培養液を約４℃にて、約4,000×ｇで10分間遠心分離して集菌する。  培養上清を除去し、STE（10mmol/l トリス塩酸(pH 8.0)、１mmol/l エチレンジアミン−四酢酸２ナトリウム塩(EDTA)、0.1mmol/l 塩化ナトリウム）を20ml加えて菌体を再懸濁し、約４℃にて、4,000×ｇで10分間遠心分離して集菌する。  10mg/mlリゾチームを含む溶液−１（50mmol/l グルコース、25mmol/l トリス塩酸(pH 8.0)、10mmol/l EDTA）５mlを加え、菌体を懸濁して、室温で５分間放置する。  溶液−２（0.2mmol/l 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)）10mlを加え、転倒混和して、氷上で10分間放置する。  氷冷した溶液−３（３mol/l 酢酸カリウム(pH 4.8)）7.5mlを加え、転倒混和して氷上で10分間放置する。  高速冷却遠心機を用いて、約４℃にて、約45,000×ｇで30分間遠心分離した後、上清を回収し、室温になるまで放置する。  その後、0.6容量（約24ml）のイソプロパノールを加え、転倒混和して、室温で15分以上放置する。  高速冷却遠心機を用いて、約25℃にて、約28,000×ｇで30分間遠心分離した後、上清を捨て、70％エタノールでペレットを洗浄し風乾する。  風乾した後、TE（10mmol/l トリス塩酸(pH 8.0)、1mmol/l EDTA）を８ml加えて、溶解する（プラスミドDNAの抽出）。
【００７６】
次に、PA-２-31含有プラスミドDNAの精製を行う。  得られたプラスミドDNAに、10mg/mlエチジウムブロマイド800μlおよび塩化セシウム8.6ｇを加え、転倒混和して溶解させる。  その溶解液を超遠心用チューブに入れ、キャップまたはシールをする。  垂直型ローターにより、約20℃にて、500,000×ｇで５時間超遠心した後、紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用して、プラスミドDNAのバンドを分取する。  分取したプラスミドDNA溶液に、等量のTE飽和 l-ブタノールを加えて転倒混和し、微量高速遠心機を用いて、約15,000×ｇで、５分間遠心分離し、上清を取り除く。  この操作を繰り返し、プラスミドDNA溶液中のエチジウムブラマイドを取り除く。  次に、TEを加えて1.5mlの体積とし、脱塩カラム（NAP-10）で脱塩する。  脱塩したプラスミドDNA溶液に、３mol/l 酢酸ナトリウム溶液を30μl加えて混和した後、３倍量の99.5％エタノールを加えて転倒混和し、−20℃で、30分以上放置する。  その後、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、15,000×ｇで20分間遠心分離して上清を除いた後、冷70％エタノールを加えて懸濁する。  そして、再度、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、15,000×ｇで20分間遠心分離して上清を除き、プラスミドDNAの沈渣を減圧下で乾固させる。  プラスミドDNAに100μlのTEを加えて完全に溶解させ、260nmの吸光度で濃度を測定する（PA-２-31含有プラスミドDNAの精製）。  その後、PA-２-31含有プラスミドDNAの制限酵素処理、およびアガロース電気泳動によるPA-２-31のサイズチェックを行う。
【００７７】
PA-２-31含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理およびアガロース電気泳動によるPA-２-31の精製を行う。  そのために、分子量確認が終了したPA-２-31含有プラスミドDNA１mgを、制限酵素HindIII単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、37℃で、1.5時間以上の時間をかけて反応を進行せしめることにより消化する。
【００７８】
プラスミドDNAを消化した後、反応液の一部を0.8％アガロースで電気泳動して、消化が完全に終了したことを確認する。  消化を確認した後、分取用の0.8％アガロースゲルで電気泳動し、PA-２-31のバンドを採取する。  採取したPA-２-31をアガロースゲルから抽出および精製して、吸光度計にてその濃度を測定する。
【００７９】
精製したPA-２-31の一部を、0.8％アガロースゲルで電気泳動し、シングルバンドであることを確認する。
【００８０】
PA-２-31のラベル化を行う。  そのために、精製したPA-２-31の２μgを用いて、以下の表１に記載の組成を有する反応液において、ジゴキシゲニンの標識付けを行う。
【００８１】
【表１】
0004104377.tif 000002
【００８２】
表１において、「Ｘ」とは、プローブ原液の濃度に応じて好ましいプローブ濃度となるように添加することができる容量を指し、この容量に伴い精製水量Ｙを決定して最終容量を調整する。
【００８３】
標識付した後、反応液にTEを100μl 加えて反応を停止させる。  反応停止液をスピンカラムに注入し、約４℃にて、約380×ｇで約10分間遠心分離して、遊離のヌクレオチドを除く。  次に、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、TEで約10
ng/μl に調製する。
【００８４】
標識付けを確認するために、標識付けしたPA-２-31の0.5μlをメンブレンに滴下して、風乾する。  ブロッキング試薬にこのメンブレンを浸し、室温で30分間ブロッキングする。  0.1mol/l トリス塩酸（pH 7.5）と0.15mol/l 塩化ナトリウムで5,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液に、そのメンブレンを室温で30分間浸す。  0.1mol/l トリス塩酸（pH 7.5）および0.15mol/l 塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、室温で約10分間振とうして、２回洗浄する。  0.5mol/l トリス塩酸（pH 9.5）、0.15mol/l 塩化ナトリウム、50mmol/l 塩化マグネシウムに、室温下で、メンブレンを約10分間浸す。  室温および遮光下で、発色試薬にメンブレンを、約10分間浸す。  メンブレンをTEに浸し、発色を停止させる。  スポット下部分の青紫色の発色で、標識付の確認を行う。
【００８５】
１mlのディスポーザブルシリンジに、少量の滅菌済みグラスウールを充填してスピンカラムを作製する。  １mmol/l トリス塩酸（pH 7.5）、１mmol/lのEDTA、0.1％ SDSで膨潤させたセファデックスG-50をシリンジに詰める。  15mlのディスポーザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、約４℃にて、約320×ｇで約10分間遠心分離し、余分の緩衝液を落とす。  ディスポーザブルコニカルチューブからシリンジを抜き、排出された緩衝液を捨てた後、1.5mlのエッペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に入れ、その上にシリンジを入れる。
【００８６】
ドットブロットハイブリダイゼーション
プローブの特異性を確認するために、以下の手順に従って、ドットブロットハイブリダイゼーションを行う。
【００８７】
まず、スポットした各ゲノムDNAを変性するために、定法に従い0.5mol/l 水酸化ナトリウム、1.5mol/l 塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙（ワットマン社製３MM）上に、調製した各種細菌ゲノム100ng をナイロンメンブレン（ポールバイオダインタイプＢ、日本ポール社製）にスポットし、風乾したメンブレンを10分間静置する。  次に、0.5mol/l トリス塩酸（pH 7.5）、1.5mol/l 塩化ナトリウム溶液で飽和した前出の濾紙上に10分間静置して変性DNAを中和する。  さらに２×SSC（Standard Saline Citrate）溶液で飽和した前記濾紙上に５分間静置し、洗浄する。
【００８８】
そして、メンブレンを風乾し、２×SSC溶液にメンブレンを浸し、５分間浸透する。  定法に従い、プラスチックバッグ内でプレハイブリタイゼーション溶液にメンブレンを浸し、42℃で、60分間親和させる。  プラスチックバッグ内でプローブ400ngを含むハイブリタイゼーション溶液の15mlにメンブレンを浸し、42℃で、一晩反応させる。  次に、２×SSC、0.1％ SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する（この工程を２回繰り返す）。  その後、0.1×SSC、0.1％SDS溶液にメンブレンを浸し、60℃で、10分間洗浄する（この工程を３回繰り返す）。  ２×SSC溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する。  メンブレンを３％ウシ血清アルブミン、１％ブロッキングバッファー（ベーリンガー社製）、0.1mol/l トリス塩酸（pH 7.5）、0.15mol/l 塩化ナトリウムを含む溶液にメンブレンを浸し、30分間緩慢に振とうする。
【００８９】
次いで、アルカリフォスフアターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）を、0.1mol/l トリス塩酸（pH 7.5）および0.15mol/l 塩化ナトリウム溶液で5,000倍希釈した溶液にメンブレンを浸し、30分間緩慢に振とうする。  次に、0.1mol/l トリス塩酸（pH 7.5）、0.15mol/l 塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、15分間振とうする（この工程を２回繰り返す）。  0.1mol/l トリス塩酸（pH 9.5）、0.1mol/l 塩化ナトリウム、５mmol/l 塩化マグネシウムを含む溶液にメンブレンを浸し、５分間振とうする。  NBT-BCIP溶液（GIBCO BRL社製）にメンブレンを浸し、遮光下で発色反応させる。  TE（10mmol/l トリス塩酸（pH8.0）、１mmol/L EDTA）にメンブレンを浸し、発色反応を止め、風乾する。  プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液の組成を、以下の表２に示す。
【００９０】
【表２】
0004104377.tif 000003
【００９１】
前述したin situハイブリダイゼーション工程において使用される界面活性剤としては、公知の界面活性剤が使用できる。
【００９２】
界面活性剤は、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に大別される。
【００９３】
アニオン界面活性剤とは、陰イオン界面活性剤とも称されるものであって、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。  界面活性剤の分子中の親油基をＲとして表現すると、RCOONa、RSO3Na、RSO4Naの式で表される。  RCOONaのように弱酸性基を含有するものでは、その水溶液は加水分解しやすく弱アルカリ性を呈するが、RSO3Na, RSO4Naなどの強酸性基を有するものでは、その水溶液は、加水分解を受けにくく、中性を呈する。  陰イオン性であるから、多量の陽イオン性物質の存在で界面活性を失うことがあり、また強酸性にした時にも失活する。
【００９４】
非イオン性界面活性剤とは、親水基が非イオン性のものをいう。  親水基として酸化エチレン基(-CH2CH2O-)が多用され、この官能基の数が多くなるに従って、親水性が増す。  反対に、親油基の炭素数が増加すると、親油性が増加する。
【００９５】
従って、親水性・親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴である。  非イオン性界面活性剤は、水中で電離せず、無機塩の影響も受けにくいため、生体に及ぼす作用も少ない。  しかも、洗浄作用は、強力で、泡立ちは比較的少ないため、洗剤のみならず、医薬品、化粧品、食品などの様々な用途で使用される。  水溶性の非イオン性界面活性剤は、温度が上昇すると、ある時点で水に溶解しにくくなり、水溶液が濁り出すが、これは親水基と水との水素結合が切断されるために生じる。
【００９６】
カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤とも称され、これは、水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。  カチオン界面活性剤は、一般に洗浄作用は大きくはないが、細菌などのアニオン性のものと強く結合するため、殺菌作用が大きい。  また、繊維やプラスチックでの帯電防止能もある。  代表的なカチオン界面活性剤であるドデシルトリメチルクロリド［C12H25(CH3)3N］Clは水溶性であるが、一方で、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド［(C12H25)2(CH3)2N］Clは水に溶解しにくく、水中では２分子膜状のベシクルを形成し、これはベンゼンには溶解する。
【００９７】
両性界面活性剤とは、分子内にアニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。  水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。  従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアルカリ性側にある場合にはアニオン界面活性剤として、酸性側にある場合にはカチオン界面活性剤として作用する。  等電点で水溶性は最低となり、表面張力も最も低下する。  両性界面活性剤は、殺菌剤、帯電防止剤などの用途に用いられている。
【００９８】
また、アニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型およびリン酸エステル型に分類され、非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型およびアルカノールアミド型に分類される。  カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型および第四級アンモニウム塩型に分類され、両性界面活性剤は、カルボキシベタイン型、２−アルキルイミダゾリンの誘導型およびグリシン型に分類される。
【００９９】
さらに、アニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、N-アシルサルコシン塩およびN-アシルグルタミン酸塩に細分される。  それぞれの代表例として、脂肪酸モノカルボン酸塩として、ラウリン酸ナトリウムおよび薬用石鹸が、N-アシルサルコシン塩として、N-ラウロイルサルコシンナトリウム、N-アシルグルタミン酸塩、それに、N-ラウロイルグルタミン酸二ナトリウムなどがある。  また、スルホン酸型は、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル(分岐鎖) ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物およびN-メチル-N-アシルタウリン塩に細分される。  その代表例として、ジアルキルスルホコハク酸塩として、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルカンスルホン酸塩はドデカンスルホン酸ナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩には直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが、また、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸塩として、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、N-メチル-N-アシルタウリン塩としてはN-メチル-N-ステアロイルタウリンナトリウムなどがある。
【０１００】
また、硫酸エステル型は、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分される。  その代表例として、アルキル硫酸塩として、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびセチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミンなどがある。  また、リン酸エステル型は、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸塩に細分される。  その代表例として、アルキルリン酸塩として、モノラウリルリン酸二ナトリウムがある。
【０１０１】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩には、リン酸ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル(8MOL)がある。
【０１０２】
非イオン性界面活性剤のエステル型は、脂肪酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。  それぞれの代表例として、脂肪酸グリセリンとして、モノステアリン酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンとしてはモノステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート20（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、ポリソルベート60およびポリソルベート80、脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。  また、エーテル型は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールに細分される。  その代表例として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルエーテルなどがあり、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとして、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがある。  また、エステルエーテル型は、脂肪酸ポリエチレングリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。  それそれの代表例として、脂肪酸ポリエチレングリコールには、オレイン酸ポリエチレングリコールが、また、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、パルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどがある。  また、アルカノールアミド型は、脂肪酸アルカノールアミドだけであり、ラウリン酸ジエタノールアミドがその代表例である。
【０１０３】
カチオン界面活性剤のアルキルアミン塩型には、モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩およびトリアルキルアミン塩があり、モノステアリルアミン塩酸塩がその代表例である。  また、第四級アンモニウム塩型は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウム、および塩化アルキルベンザルコニウムに細分される。それぞれの代表例として、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムが、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウムとして、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムが、また、塩化アルキルベンザルコニウムとして、塩化ラウリルベンザルコニウムがある。
【０１０４】
両性界面活性剤のカルボキシベタイン型には、アルキルベタインしかなく、ラウリルベタインが、その代表例である。  また、2-アルキルイミダゾリンの誘導型としては、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインだけであり、2-ウンデシル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインが、その代表例として挙げられる。  また、グリシン型として、アルキル（またはジアルキル）ジエチレントリアミノ酢酸があり、その代表例として、ジオクチルジエチレントリアミノ酢酸がある。
【０１０５】
さらに、上掲のものに加えて、Triton X-100、ラウリルサルコシン、サポニン、BRIJ35、アルキルアリルポリエーテルアルコール、高級アルコール硫酸化物、N-ココイル-L-アルギニンエチルエステルDL-ピロリドンカルボン酸塩、N-ココイル-N-メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、スクワラン、ステアリルアルコール、ステアリン酸ポリオキシル40、セタノール、セトマクロゴール1000、セバシン酸ジエチル、ノニルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニウム、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシル35ヒマシ油、マクロゴール400、N-ヤシ油脂肪酸アシルL-アルギニンエチル・DL-ピロリドンカルボン酸塩、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウロマクロゴール、メチルセルロース、CMC（カルボキシメチルセルロース）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油20およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、CHAPS、デオキシコール酸、ジギトニン、n-ドデシルマルトシド、ノニデットＰ40、n-オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ラウリル酸シュクロース、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n,n-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート等も利用することができる。
【０１０６】
上掲の各種界面活性剤は、in situハイブリダイゼーションの工程において使用されることが重要であり、その使用方法は特に限定されない。  例えば、プローブ液またはプローブ希釈液中に混合されていてもよいし、プローブ液とは別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、プローブ液を塗抹部位に塗布する前、同時または後に添加してもよいし、当業者は適宜変更することができる。
【０１０７】
なお、本発明において、必要に応じて、陽性コントロールフローブを調製することもできる。  例えば、まず、U937細胞（ATCC CRL-1593.2）のゲノムDNAの抽出と精製を行うために、37℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、RPMI1640培地（25ml）を入れた細胞培養フラスコ（175cm3）内でU937細胞を培養する。  U937培養液を50mlの遠沈管に入れ、４℃にて、220×ｇで10分間遠心分離し、U937細胞を回収する。  細胞を10mlのPBSで懸濁洗浄し、再度４℃にて、180×ｇで10分間遠心分離し、細胞を回収する。  その後、上清を廃棄して、細胞を１mlの200μg/mlプロテネースＫ含有１％SDS含有TE溶液で懸濁し、37℃で30分間放置する。  フェノール抽出を３〜４回繰り返し、除蛋白を行う。  エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、500μlの2.5μｇリボヌクレアーゼ含有滅菌精製水に溶解し、42℃で30分間放置する。  フェノール抽出を２〜３回繰り返し、除蛋白を行う。  エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、500μlのTEに溶解する。  その後、吸光度計により濃度を測定し、ジゴキシゲニンラベルに供することにより、陽性コントロールプローブを作製することができる。  また、陽性コントロールプローブは、U937ゲノムを100ngスポットしたメンブレンに、陽性コントロールプローブをドットハイブリダイゼーションした時に、ハイブリッド形成が確認できるものを用いるのがよい。
【０１０８】
同様に、必要に応じて、陰性コントロールプローブを公知の方法で調製することもできる。
【０１０９】
その他の実施態様
本発明の検出方法を利用したシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出および／または同定用キットも、本発明によって提供される。  本発明のキットによれば、DNAを得る工程で使用される酵素（ＤＮＡ露出処理剤）が、少なくとも、リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼからなるグループから選択される１種以上の酵素、界面活性剤が添加されたプローブ液、それに、１種以上の検出用DNAプローブを具備している。  本発明のキットには、以下の実施例に例示するような、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、プローブ液、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液-1、発色前処理液-2、発色試薬、対比染色液、PBS原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、APSコートスライドグラス、プローブ希釈液、バッファーＡ等を利用することが可能である。  これらの内、少なくとも、酵素試薬とプローブ液とを含むことが好ましい。  また、クロロホルム、エタノール、無水酢酸、DMSO、PMSF、ホルムアミド、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等の各種試薬を用いることも可能である。  さらに、低速遠心機、恒温器、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、0.2μmシリンジトップフィルターなどの器具を装備していてもよい。
【０１１０】
本発明によれば、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる、食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。
【０１１１】
また、本発明によれば、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌を特定する方法も提供される。  この方法によれば、様々な敗血症が疑われた患者血液の診断に実際に応用したところ、投与された抗菌薬の影響を受けることなく、血液培養法に比べて約４倍の感度で起因菌を検出することができ、検出菌株の一致率は良好であることが明らかになっている。  そして、血液培養では、検査に少なくとも３日以上、通常は14日程度を要するのに比較して、本発明の方法によれば全操作完了までに約８時間という極めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができる。  従って、この方法によれば、敗血症または菌血症などの、速やかに、かつ的確な対処が必要とされる感染症の診断や予後診断のモニター等において有用マーカーが提供されるのである。
【０１１２】
また、本発明のプローブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、PCR法によるDNAの増幅によって、感染症原因菌の同定も可能となるのである。
【０１１３】
さらに、本願発明のプローブまたはその断片をDNAチップに組み込んで利用できることも明らかである。  そうすれば、DNAチップを用いて、シュードモナス・アエルギノーザ菌の存在の確定が可能となる。
【０１１４】
加えて、本発明で開示した塩基配列は、シュードモナス・アエルギノーザ菌のゲノミックDNAをランダムにクローニングして得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。  さらに、野性株が保有するDNAに変異部分が存在することは当然考えられるが、一般的に、本発明のプローブと70％程度、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上のホモロジーを有する塩基配列は、本発明の目的を達成することができると考えられるので、本発明にはこれら相同配列も当然に包含されるものである。
【０１１５】
【実施例】
本発明を、実施例に沿って以下に詳細かつ具体的に説明するが、これら実施例の開示に基づいて、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【０１１６】
実施例１：シュードモナス・アエルギノーザ菌検出用プローブの調製
臨床菌株シユードモナス・アエルギノーザ菌を、Brain Heart Infusion(BHI)培地で一晩培養し、培養菌体を集菌して、溶菌工程においてN-アセチルムラミダーゼSGを加えた。  そして、Saito-Miura変法（"Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenoltreatment"，Biochem. Biophys. Acta vol．72，pp.619-629（1963))に準じて、ゲノミックDNAを抽出した。
【０１１７】
抽出したDNA 10μgを、10Ｕの制限酵素HindIIIで完全消化し、ベクターpGEM-3Z(PROMEGA社製）にランダムクローニングした。  クローン化されたプラスミドDNAを、後出の実施例３-(1)に記載の方法に従って抽出し、ナイロンフィルターに転写した。  シュードモナス・アエルギノーザ標準菌株のゲノミックDNAをジゴキシゲニン-11-dUTPでラベルしたものをプローブとして用い、サザンブロット・ハイブリダイゼーションを実施した。  すなわち、ナイロンフィルターを45％ホルムアミド、５×SSC、42℃の条件下で終夜ハイブリダイゼーションを行った後、実施例２に記載の方法に従って、ナイロンフィルターの洗浄と発色を実施した。  その結果、シュードモナス・アエルギノーザ菌ゲノミックDNAと特異的に反応した４種のプローブ(DNA断片）が選抜された。
【０１１８】
ここで選抜された各プローブを、プローブPA-２-31、PA-３-12、PA-４-15、PA-13-３と命名した。
【０１１９】
実施例２：プローブの種特異性の検討
実施例１で選抜した各プローブと各種感染症原因菌株のDNAとの反応性を、以下の方法により検討した。
【０１２０】
まず、検討対象菌株として、下記表３に列挙した臨床分離株および寄託菌株を準備（全64種類）した。
【０１２１】
【表３Ａ】
0004104377.tif 000004
【０１２２】
【表３Ｂ】
0004104377.tif 000005
【０１２３】
そして、各臨床菌株に関して、実施例１に記載の方法に従って、各菌株が保有するDNAを抽出し、抽出したDNAの一定量（例えば、10〜100ng）をナイロンフィルターにスポットして、アルカリ変性したものをドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの試料とした。  次いで、Digoxigenin-11-dUTP（BRL社製）でラベルしたプローブで、マニアティスのマニュアル（T. Maniatis, et al., Molecular Cloning（A Laboratory Manual Second Edition), Cold Spring Harbour Laboratory (1989))に従い、45％ホルムアミド、５×SSC、42℃の条件下で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。  終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料に関して、マニュアルに従い、55℃にて0.1×SSC、0.1％SDSによる20分間の洗浄を２回行った後に、Anti-Dig-ALP conjugates（BRL社製）で検出および発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認した。
【０１２４】
得られた結果は、図２〜５に示すとおりである。  図１は、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーションを行った各フィルターにスポットしておいたDNAの菌株の配置を示しており、図２は、プローブPA-２-31、図３は、プローブPA-３-12、図４は、プローブPA-４-15、そして、図５は、プローブPA-13-３を用いてハイブリダイゼーションを行ない、発色させた後の結果を示す。
【０１２５】
図１〜５に示した結果から明らかなように、いずれのプローブもシュードモナス・アエルギノーザ菌に由来するDNAに対してのみ反応性を示し、シュードモナス属の他の菌種由来のDNAに対して反応性（ハイブリッドの形成）が認められず、その種特異性が確認された。
【０１２６】
実施例３：塩基配列の解析
実施例２で種特異性が確認されたプローブ（計４本）の塩基配列を、下記の方法に従って決定した。
【０１２７】
(1) プラスミドDNAの調製
サブクローン化された（塩基配列を決定すべき）挿入断片をpGEM-3Z(Promega)に含んだ Escherichia coli K-12，JM109形質転換体を、５mlのLuria-BactaniMedium（bacto-tryptone，10ｇ/1l；bacto-yeast extract、５ｇ/1l；塩化ナトリウム、10ｇ/1l；5N 水酸化ナトリウムでpH 7.0に調整）に植菌し、一晩培養した。  培養液を遠心分離（5,000rpm、５分間）して集菌した。  沈殿物に2.5mg/mlの濃度でリゾチーム（Sigma）を含む50mMグルコース/50mM Tris-HCl（pH 8.0)/10mM EDTA溶液を100μl 加え、室温で５分間放置した。  得られた懸濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム（Sigma）を含む0.2Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて混合した。  ５Ｍ酢酸カリウム水溶液（pH 4.8）150μl をさらに加えて混合し、15分間氷冷した。  そして、遠心分離（15,000rpm、15分間）して得た上清を、フェノール/CHCl3処理し、上清に２倍量のエタノールを加え、さらに遠心分離（12,000rpm、５分間）して沈澱を得た。  この沈澱物を、10mM Tris-HCl（pH 7.5)/0.1mM EDTA溶液100μl に溶解し、10mg/ml RNaseＡ（Sigma）溶液を加え、室温で15分間放置した。  この調製物に0.1Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（pH 4.8）を300μl加え、フェノール/CHCl3処理し、上清にエタノールを加えて沈殿を得た。  この沈澱物を乾燥し、10μlの蒸留水に溶解したものをDNA試料とした。
【０１２８】
(2) 塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理を、AutoRead（登録商標）Sequencing Kit（ファルマシア製）を用いて行った。
【０１２９】
まず、鋳型となるDNAの濃度が、32μl 溶液中に５〜10μgとなるように調整した。  1.5mlのミニチューブ（エッペンドルフ）に、鋳型DNA32μlを移し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を８μl 加えて穏やかに混合した。  そして、軽く遠心した後、室温で10分間放置した。  ３Ｍ酢酸ナトリウム（pH 4.8）７μl と蒸留水４μl を加え、さらにエタノールを120μl 加えて混合し、エタノール・ドライアイス上で15分間放置した。  そして、15分間遠心分離して沈澱したDNAを集め、注意しながら上清を除去した。  得られた沈殿物を70％エタノールで洗浄し、10分間遠心分離した。  そして、注意しながら再度上清を除去し、減圧条件下で沈澱物を乾燥した。
【０１３０】
沈殿物を蒸留水10μlに溶解し、蛍光性のプライマー〔Fluorescent Primer, Universal Primer；5'-Fluorescein-d［CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号：１)]-3'、(1.6 pmol/μl ；0.42A260unit/ml)；Reverse Primer，5'-Fluorescein-d［CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号：２)]-3' (2.1 pmol/μl；0.42A260unit/ml)〕２μl（0.42A260unit/ml、４〜６pmol）とアニーリング用緩衝液２μlを加え穏やかに混合した。  そして、軽く遠心した後、65℃で５分間熱処理を行い、素早く37℃の条件下に置き、そこで10分間保温した。  保温後10分以上室温で放置し、軽く遠心した。  そして、延長用緩衝液１μlとジメチルスルホキシド３μlを加えたものを試料とした。  ４本のミニチューブに、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴと記入し、それぞれのチューブにＡ Mix（ddATPをdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの）、Ｃ Mix（ddCTPをdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの）、Ｇ Mix（ddGTPをdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの）およびＴ Mix（ddTTPをdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの）を、2.5μl ずつ分注した。  なお、それぞれの溶液は使用時までは水中で保存し、使用時には37℃で１分間以上保温してから使用した。  希釈したT7 DNAポリメラーゼ（Pharmacia；６〜８units/２μl）２μlを、DNA試料に加え、ピペッティングもしくは穏やかな混合により、完全に混合した。  混合後すぐに、この混合液を4.5μlずつ保温しておいた４種の溶液に分注した。  なお、分注に際しては、新しいチップを用いた。  37℃で５分間保温し、停止溶液を５μlずつそれぞれの反応液に加えた。  この分注においても、新しいチップを用いた。  90℃で２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。
【０１３１】
そして、電気泳動には、１レーン当たり４〜６μlを泳動した。
【０１３２】
(3) 塩基配列の決定
シュードモナス・アエルギノーザ菌が保有するDNAに対して特異性を有する４つのプローブ（実施例１〜２）の塩基配列の決定を、泳動温度45℃、泳動時間６時間として、A.L.F. DNA Sequencerシステム（ファルマシア社製）を用いて行った。  各上流と下流から明らかになった配列から順次プライマーをデザインし、上記の操作を繰り返した。
【０１３３】
その結果、プローブPA-２-31（配列番号：３）、プロープPA-３-12（配列番号：４）、プローブPA-４-15（配列番号：５）、およびプローブPA-13-３（配列番号：６）の塩基配列それぞれの全容が、明らかになった。
【０１３４】
実施例４：シユードモナス・アエルギノーザ菌の臨床検体からの検出
(1) 採血・血液検体の処理
臨床検体として、敗血症が疑われた患者より採取した血液10検体(検体Ａ〜Ｊ)を用いた。  各患者からヘパリン加静脈血10mlを採取し、採取した血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム225mg、デキストラン（分子量：200,000〜300,000）1.5ｇ、滅菌精製水にて全量25mlに調製したもの）を４：１の割合で混和した後、37℃で30分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得した。  このようにして得た白血球画分を４℃にて160×ｇで10分間遠心分離することで、白血球を得た。  次に、得られた白血球のペレットに滅菌精製水１mlを加えて懸濁し、直ちに過剰量のPBS（塩化ナトリウム18.24ｇ、リン酸一水素ナトリウム12水和物6.012ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水和物1.123ｇ、滅菌精製水にて全量120mlにしたもの（PBS原液）を滅菌精製水にて20倍に希釈したもの）を加えて等張化した後、再度４℃下で、160×ｇで10分間遠心分離した。
【０１３５】
(2) 白血球の固定
3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS、SIGMA社)をスライドグラス（商品番号MS311BL、日本エアーブラウン社製）にコートしたAPSコートスライドグラスを使用した。
【０１３６】
APSコートスライドグラスの作製に当たって、まず、スライドホルダーにスライドグラス（MS311BL）を固定した後、希釈した中性洗剤中に30分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（100℃以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却した。  その後、スライドグラスを２％APS含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後、風乾した。  さらに再度、スライドグラスを２％APS含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した。  その後、風乾する操作を行った後に、42℃で乾燥させることで、APSコートスライドグラスを作製した。
【０１３７】
白血球画分を、４℃にて160×ｇで10分間遠心分離することにより得た白血球ペレットに、少量のPBSを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【０１３８】
細胞数が１×105個/ウェルとなるようにPBSで調製した白血球懸濁液５μlを、APSコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより、白血球をAPSコートスライドグラスに支持させた。
【０１３９】
その後、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た固定液）に20分間浸した後、75％エタノール液に５分間浸し、完全に風乾させた。
【０１４０】
(3) 白血球細胞膜の透過性亢進処理
PBSに10分間浸した後、酵素前処理試薬（サポニン1.25ｇ、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重1.068〜1.075(20/4℃)、pH(５w/v%) 5.5〜7.5）1.25ml、PBS原液25mlを混合し、滅菌精製水で全量を50mlに調製したもの）を滅菌精製水で10倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で10分間振とうさせた。
【０１４１】
(4) 菌体壁の溶菌酵素処理
スライドグラス１枚につき酵素試薬（N-アセチルムラミダーゼ1,000単位/ml、リゾチーム100,000単位/mlおよび/またはリゾスタフィン100単位/ml）に酵素試薬溶解液（PBSで0.1mol/l フェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)含有ジメチルスルフォキシド(DMSO)を100倍希釈して調製したもの）を１ml加えて酵素試液を調製した。  その後、感染症原因菌のDNAを得るために、37℃〜42℃の湿潤箱中で、この酵素試液１mlを白血球塗抹部位に滴下し、30分間静置することによって、感染症原因菌のDNAを露出した。  その後、0.2mol/l 塩酸含有PBS（PBS原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて20倍希釈し、塩酸の終濃度を0.2mol/l に調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で10分間振とうさせた。
【０１４２】
(5) 細胞膜タンパク質のアセチル化
アセチル化試薬（トリエタノールアミン7.46ｇと適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を50mlとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で10倍希釈し、無水酢酸の終濃度を0.8％に調整したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で10分間振とうした。  その後、75％、85％、98％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させた。
【０１４３】
(6) 菌体DNAのアルカリ処理［二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性］
スライドグラスを、70mmol/l 水酸化ナトリウム含有PBS（PBS原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で20倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を70mmol/l に調製したもの）に３分間浸した。  その後、75％、85％、98％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させた。
【０１４４】
(7) ハイブリダイゼーション
プローブ希釈液（0.25％SDS、サケ精子DNA600μl、100×デンハート溶液50μl、ハイブリダイゼーション原液500μl、ホルムアミド2250μl、50％硫酸デキストラン1000μlが含まれる）にて調製したジゴキシゲニン標識DNAプローブ15ngを含有する液（プローブ液、1.0ng/μl）を塗抹部位に塗布し、37℃〜42℃の湿潤箱内に２時間静置させた。  ジゴキシゲニン標識DNAプローブは、ニックトランスレーション法で調製した。  その後、ハイブリダイゼーション洗浄液（ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム13.15ｇ、クエン酸三ナトリウム２水和物6.615ｇ、滅菌精製水にて全量75mlに調製したもの、前出）をハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：45：50の割合で混合して調製したもの）を３つの染色ビンに用意し、順次42℃で10分間ずつ浸した。  その後、PBSに浸し、そのまま振とう機上で10分間振とうさせた。
【０１４５】
ジゴキシゲニンを標識付けしたDNAプローブは、PA-２-31およびPA-13-３のプローブ配列を用いて、ニックトランスレーション法により調製した。
【０１４６】
(8) ブロッキング
In situハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの操作を行った。
【０１４７】
具体的には、湿潤箱内にてスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２mlとPBS原液0.5mlを含み、滅菌精製水で全量を10mlに調製したもの）１mlを塗抹部位に滴下し、これを30分間静置した。  その後、ブロッキング試薬を除去した。
【０１４８】
(9) 標識抗体との反応
標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液1.05単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン746mg、塩化ナトリウム17.5mg、塩化マグネシウム６水和物20.3mg、塩化亜鉛1.36mg、ウシ血清アルブミン1000mgおよび塩酸適量を含み、滅菌精製水適量で全量を100mlに調製したもの）12.6μlにて全量を14μlに調製したもの）を、標識抗体希釈液（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン8.48mg、塩化ナトリウム6.14mgおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を0.7mlに調製したもの）で50倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に10μlずつ滴下し、これを30分間静置させた。  その後、標識抗体洗浄液（１mlのポリソルベート20と50mlのPBS原液を含み、滅菌精製水で全量を100mlに調製したもの）を10倍に希釈した溶液に浸し、そのまま振とう機上で10分間振とうさせた。  この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン6.06ｇ、塩化ナトリウム2.92ｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を50mlに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物5.08ｇを含み、滅菌精製水で全量を50mlに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で10分間振とうさせた。
【０１４９】
(10) シグナル検出
スライドグラス１枚につき発色試薬［ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルフォスフェイト(BCIP)溶液、pH 9.0〜10.0：NBT 3.3mg、BCIP 1.65mg、N,N-ジメチルホルムアミド99μg、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン121mg、適量の塩酸、塩化ナトリウム58.4mgおよび塩化マグネシウム６水和物101.6mgを含み、適量の滅菌精製水で全量を10mlに調製したもの］１mlを、0.2μmシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で、37℃で、30分間遮光静置させた。  その後、発色試薬洗浄液（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン606mg、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物186mgおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を50mlに調製したもの）を10倍に希釈した溶液に５分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンFCF(食用緑色３号)50mg、滅菌精製水にて全量50mlに調製したもの）を10倍に希釈した溶液および１％酢酸溶液に浸した。  その後、前記発色試薬洗浄液を10倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾させた。
【０１５０】
(11) 判  定
判定は、光学顕微鏡で鏡検（×1,000）した場合に、単一のウェル内の対比染色液により染まった細胞に於いて、青紫色の発色シグナルが１つでも認められた場合に「陽性」と判定した。  その結果、本発明の方法により、10検体の内の２検体でシュードモナス・アエルギノーザ菌を検出した。
【０１５１】
その一例を、図６の矢印に示した。  なお、図６に例示した結果は、PA-２-31およびPA-13-３を組み合わせて混合プローブとし、これにニックトランスレーションを適用して得たプローブを用いた場合のものである。  また、本発明者らは、PA-２-31、PA-３-12、PA-４-15またはPA-13-３を単体で用いても、あるいはこれらの一部または全部を混合して用いても、臨床検体からシュードモナス・アエルギノーザ菌を検出することが可能であることを証明している。
【０１５２】
実施例５：塗抹固定する至適白血球（貪食細胞）数の検討
APSコートスライドグラスのウェル（直径５mmの円形ウェル）に塗抹する至適白血球数の検討を行った。
【０１５３】
ヘパリン加健常ヒト血液10mlを採取し、実施例４(1)の記載に従って白血球を採取した。  次に、得られた白血球を、適量のPBSを用いて懸濁した後、血球計算盤を用いて１ml当たりの白血球数を測定し、(a)１×108個/mlを始点として、(b)５×107個/ml、(c)１×107個/ml、(d)５×106個/ml、(e)１×106個/ml、(f)５×105個/ml、および(g)１×105個/mlの希釈系列を調製した後、各々５μl をスライドグラスに塗抹した。  風乾した後、カルノア固定（実施例４(2)参照）を行い、直ちに対比染色液で染色し、実施例４(11)に記載した方法を用いて判定を行った。
【０１５４】
その結果、細胞数が１×108個/mlでは細胞数が過剰であり、検出不適であった。  また、５×106個/ml以下では、ウェルに観察される細胞数が少なく、検出不適であった。  よって、固定化する食細胞の密度（ｘ個/ml）が、５×106個/ml＜ｘ個/ml＜１×108個/ml、好ましくは、1×107個/ml≦ｘ個/ml≦５×107個/mlに調製したものを使用するのが好ましいことが判明した。  また、これに対応して、APSコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個/ウェル(直径５mm))は、2.5×104個/ウェル＜ｙ個/ウェル＜５×105個/ウェル、好ましくは５×104個/ウェル≦ｙ個/ウェル≦2.5×105個/ウェルとなるように調製するのがよいことも判明した。
【０１５５】
試料(a)〜(f)に関する実験結果を、図７(a)〜(f)に示した。
【０１５６】
なお、試料(g)に関する実験結果の記載は省略してある。
【０１５７】
実施例６：溶菌酵素の選択
S. aureus (ATCC 12600)、S. epidermidis (ATCC 14990)、P. aeruginosa (ATCC 10145)、E. faecalis (ATCC 19433)、E. coli (ATCC 11775)を溶菌する酵素条件を検討した。
【０１５８】
S. aureus および S. epidermidisに対しては、溶菌酵素としてリゾスタフィン（Bur. J. Biochem., 38, 293-300, 1973）を使用した。  また、E. faecalisに対しては、N-アセチルムラミダーゼ（Archs. Oral Biol., 23, 543-549, 1978）とリゾチーム（生化学工業）を使用した。  また、P. aeruginosaおよびE. coliについては、70mmol/l の水酸化ナトリウム含有PBS（前出）を使用した。
【０１５９】
上記各種細菌を、５mlのBHI（ブレインハートインフュージョン（DIFCO社製)）液体培地に植菌し、37℃で、８時間以上培養した。  培養した菌液を４℃、2,000×ｇで10分間遠心分離して集菌した。  このようにして集めた菌をPBSに懸濁し試料とした。  溶菌は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度600nmにおける菌液の濁度の減少により評価した。
【０１６０】
その結果、S. aureus および S. epidermidisは、リゾスタフィンによって溶菌した。  P. aeruginosaおよびE. coliについては、70mmol/l の水酸化ナトリウム含有PBS（前出）によって溶菌したため、酵素処理は不要であった。  また、E. faecalisについては、N-アセチルムラミダーゼ単独よりも、リゾチームと併用した方が優れた溶菌活性が得られることが判明した。  また、貪食作用を受けて取り込まれた菌が、例えば、P. aeruginosaおよびE. coliなどである場合には、アルカリ処理に際して菌の細胞壁が溶解され、遺伝子が露出した状態となるので、必ずしもこの酵素処理を行う必要はない。  また、アルカリ処理は、実施例４(6)に記載の手順に従って行うこともできる。  しかしながら、確実に菌の細胞壁を溶解するのであれば、酵素処理を行う方がよいと考えられる。
【０１６１】
本発明において外来微生物を溶解するために使用される前処理用の各酵素は、前述したような細菌株に対して有効であるのみならず、他のスタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、バシルス属およびミクロコッカス属を初めとする他の菌種等でも有効である。  また、かような酵素は、各々単独で用いることもできるが、菌が特定できていない臨床検体を使用する場合には、混合した場合の方が有効である。
【０１６２】
なお、図８に、(a) S. aureusおよびS. epidermidis、(b) P. aeruginosaおよびE. coli、ならびに(c) E. faecalisに関して実施した試験結果を示した。
【０１６３】
実施例７：酵素溶解液に関する検討（DMSOの至適濃度の検討）
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは白血球の形態を劣化させるので、白血球の形態を保持させるために添加するPMSFの溶解剤である、DMSOの酵素活性に及ぼす影響を検討した。
【０１６４】
E. faecalisを50mlのBHI液体培地（前出）に植菌し、37℃で８時間以上培養した。  この培養液を、４℃で、2,000×ｇで10分間遠心分離して集菌し、PBSにて懸濁した後、オートクレーブ（120℃、10分）で熱処理を行った。  次に、４℃で、2,000×ｇで10分間遠心分離し、上清を捨て、１mlのPBSで沈渣を懸濁させた後、凍結乾燥させた。  この凍結乾燥試料を、０〜10％DMSO含有５mmol/l トリス-塩酸（pH 6.0）、２mmol/l 塩化マグネシウムで懸濁し、N-アセチルムラミダーゼに対する試料とした。  また、Micrococcus luteus（JCM 1464）を、５mlのBHI液体培地（前出）に植菌し、37℃で８時間以上培養した。  培養した菌液を４℃で、2,000×ｇで10分間遠心分離して集菌した。  上清を捨て、菌のペレットを５mlのPBSで懸濁洗浄し、再度４℃にて、2,000×ｇで10分間遠心分離して集菌した。
【０１６５】
このようにして集めた菌を、０〜10％DMSO含有PBSで懸濁し、リゾチームに対する試料とした。  一方、S. epidermidisをリゾチームの場合と同様にして培養、集菌し、０〜10％DMSO含有PBSで懸濁し、リゾスタフィンに対する試料とした。
【０１６６】
酵素活性は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度600nmにおける試料の濁度の減少により評価した。  ただし、本試験でのそれぞれの酵素力価は、(a) N-アセチルムラミダーゼ 300単位/ml、(b) リゾチーム 10,000単位/ml、(c) リゾスタフィン50単位/mlとし、酵素活性に対するDMSOの影響を検討した。  それぞれの酵素活性を、単位時間当たりにおける菌濁度（O.D.＝600nm）の減少で評価した結果、DMSOは、N-アセチルムラミダーゼ活性に対しては殆ど影響を与えなかったが、リゾチームおよびリゾスタフィンに対しては、共に５％以上のDMSOで活性の低下が認められた。  また、２％以下のDMSOの濃度では、酵素活性の低下は認められなかった。  ゆえに、PMSFを溶解させるDMSO濃度は少なくとも５％未満、好ましくは２％以下、さらには１％程度とするのが好ましい。
【０１６７】
その検討結果を、図９(a)〜(c)および下記表４に示した。
【０１６８】
【表４】
0004104377.tif 000006
【０１６９】
実施例８：酵素溶解液に関する検討（PMSFの至適濃度の検討）
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは、白血球の形態を劣化させるので、白血球の形態を保持させるために添加するPMSF（PIERCE社製）の効果を検討した。
【０１７０】
100μlのDMSO（和光純薬社製）にPMSFを溶解し、PMSFの終濃度が無添加〜１mmol/l となるようにPBSで10mlに希釈した。  この溶液に、プロテアーゼの力価が0.2単位/mlとなるよう、プロテイネースＫ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加した。  ヘパリン加健常ヒト血液５mlを採取し、実施例４(1) に記載の方法に従って白血球を採取した。  次に、白血球を適当量のPBSで懸濁して、血球計算盤で細胞数を計測し、細胞数を、約５×104〜約2.5×105個/ウェルに調製し、その５μlをAPSコートスライドグラスのウェルに塗抹し、風乾した後、実施例４(2)に記載のカルノア固定法に従って固定した。
【０１７１】
このサンプルを用いて、実施例４(3)および(4)に記載の方法に従って試験を行った。  １μmol/l 〜１mmol/l のPMSFの濃度で試験を実施した結果、10μmol/l以上の濃度で効果が認められ、0.1mmol/l 以上のPMSF濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていた。
【０１７２】
その結果を、プロテアーゼ0.2単位/mlのみ(図10(a))、PMSF１μmol/ml添加(図10(b))、PMSF 10μmol/ml添加(図10(c))、PMSF 0.1mmol/ml添加(図10(d))、およびPMSF １mmol/ml添加(図10(e))に、それぞれ示した。
【０１７３】
実施例９：溶菌酵素ザイモラーゼの至適力価の検討
カンジダ・アルビカンスを溶菌して、そのDNAを得るためのザイモラーゼの至適力価を検討した。
【０１７４】
カンジダ・アルビカンスをYPD培地に植菌し、30℃で一昼夜培養した。  その後、基質としてカンジダ・アルビカンスをPBSにて懸濁した溶液（基質１）と、カルノア固定した後に、70％エタノールに浸し、風乾し、PBSにて懸濁した溶液（基質２）の２種類を調製した。
【０１７５】
反応は、ザイモラーゼ/PBSを0.5ml、基質を1.5ml、そしてM/15リン酸緩衝液を2.5mlを含み、0.5mlの滅菌精製水で全量を5.0mlに調製したものを用いた。  その後、37℃で、２時間反応させ、OD800を測定した。  また、ザイモラーゼ（ザイモリエイス-100T)濃度として、０mg/ml、0.01mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、１mg/ml、2.5mg/ml、５mg/mlのものを用いた。
【０１７６】
その結果、基質１を用いた場合のそれぞれのOD800値は、0.533、0.521、0.553、0.554、0.548、0.417、0.394、0.288、0.163、0.113であり、基質２を用いた場合のそれぞれのOD800値は、0.445、0.411、0.359、0.282、0.232、0.146、0.115、0.096、0.08、0.057であった。  基質１および基質２共に、0.5mg/ml〜５mg/ml、特に、１mg/ml〜５mg/mlの濃度範囲が有効であることが判明した。
【０１７７】
すなわち、ザイモラーゼの使用量は、50単位/ml〜500単位/ml、特に100単位/ml〜500単位/mlであることが好ましい。  また、菌が特定できていない臨床検体を使用する場合には、真菌である場合も考慮してザイモラーゼを適宜添加するのが好ましい。
【０１７８】
実施例10：至適酵素処理条件（力価）の検討
(1) 貪食サンプルの作製
(i) Ｕ９３７細胞の調製
37℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、RPMI 1640培地（25ml）を入れた細胞培養フラスコ（175cm3）内でU937細胞（ヒト単球株化細胞、ATCC CRL-1593.2）を培養した。  次に、U937細胞培養液を50mlの遠沈管に入れ、４℃、220×ｇで10分間遠心分離し、U937細胞を回収した。  その後、回収したU937細胞を、200μlのPBSで懸濁し、血球計算盤で細胞数を計算し、細胞数を約１×104個/μl〜約２×104個/μlに調製した。
【０１７９】
(ii) 細菌貪食サンプルの調製
S. aureus、S. epidermidis、P. aeruginosa、E. faecalis、E. coli（いずれも前出）を、各々５mlのBHI培養液に植菌し、37℃で８時間以上培養した。
【０１８０】
培養した菌液を、４℃、2,000×ｇで10分間遠心分離して集菌した。  上清を捨てた後、菌のペレットを５mlのPBSで懸濁し、再度４℃、2,000×ｇで10分間遠心分離して集菌した。  集菌した菌を５mlのPBSで懸濁した後、PBSにて希釈して、吸光度計により菌液の濁度（O.D.＝600nm）を、S. aureus（0.01〜0.03）、S. epidermidis（0.01〜0.03）、P. aeruginosa（0.02〜0.03）、E. faecalis（0.01〜0.03）、E. coli（0.02〜0.03）にしたものを15ml調製した。  このようにして得た菌液は、別々の175cm3の培養用フラスコに移し、30分間室温で静置した。
【０１８１】
ヘパリン加健常ヒト血液50mlを採取し、血球分離試薬を４：１の割合で加え、37℃で30分間静置し、白血球画分を分取し、これをPBSで50mlにした。  培養用フラスコ内の上清を静かに捨て、PBSで希釈した白血球画分を10mlずつフラスコに加え、室温で10分間静置した。  培養用フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を0.02％EDTA含有PBS 10mlで15mlの遠沈管に回収し、４℃、140×ｇ〜180×ｇで10分間遠心分離し、白血球を収集した。  収集した白血球に赤血球の混入が認められたので、１mlの滅菌精製水にて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、PBSを14ml加えて等張化し、再度４℃、140×ｇ〜180×ｇで10分間遠心分離を行い、白血球を収集した。  収集した白血球をPBSで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×104個/μl〜５×104個/μlに調製した。
【０１８２】
このようにして得られた貪食サンプルを、それぞれSA貪食サンプル、SE貪食サンプル、PA貪食サンプル、EF貪食サンプル、EK貪食サンプルとした。
【０１８３】
(iii) 塗抹固定
(i)で得たU937細胞と、(ii)で調製した各細菌貪食サンプルを、APSコートスライドグラスの各ウェルに５μlずつ塗抹し、風乾させた。
【０１８４】
次に、実施例４(2)に記載のカルノア固定液にスライドグラスを20分間浸した後、75％エタノールに５分間浸し、カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、試験に使用するまで４℃で保存した（実施例４(2)参照）。  次いで、固定サンプルの前処理を、実施例４(3)に記載の手順に従って行った。
【０１８５】
(2) 貪食サンプルの規格及び試験方法
(i) 細胞数
各細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定する細胞数を、約5.0×104〜約2.5×105個/ウェルとし、また、U937細胞の細胞数を、約5.0×104〜約1.0×105個/ウェルとした。
【０１８６】
(ii) 貪食率
スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルをアクリジンオレンジ染色液で染色し、蛍光顕微鏡（×1,000）で無作為に約200個の細胞を計測した。
【０１８７】
計測した細胞の中で、細胞内に細菌を貪食している細胞（図11で矢印にて示す、貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞）を陽性細胞とし、以下の数式に従って貪食率を算出した。
【０１８８】
【数１】
0004104377.tif 000007
【０１８９】
この時に算出した各細菌貪食サンプルの貪食率(％)は、10％以上であった。
【０１９０】
(3) 試験方法
実施例10(1)および(2)に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。
【０１９１】
使用したSA貪食サンプルの貪食率は23％であり、約1.98×105個/ウェルであった。  SE貪食サンプルの貪食率は27％であり、約1.74×105個/ウェルであった。
【０１９２】
また、EF貪食サンプルの貪食率は34％であり、約6.40×104個/ウェルであった。  各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例４(3)に記載の方法に従って酵素前処理を行った。  次に、酵素前処理済みのスライドグラスを湿潤箱に置き、各種力価に調製した各酵素溶液１mlを検体塗抹部位に滴下して反応させた。  その後、0.2mol/l 塩酸含有PBS、70％エタノールにそれぞれ10分間浸し、風乾させた。  このスライドグラスを70mmol/l 水酸化ナトリウム含有PBSに３分間、70％エタノールに10分間浸した後に風乾し、１％アクリジンオレンジ染色液で染色した。  その後、蛍光顕微鏡（×1,000）により評価した。
【０１９３】
S. aureusおよびS. epidermidisは、リゾスタフィンで至適力価の検討を行った。  E. faecalisは、N-アセチルムラミダーゼとリゾチームの併用で至適力価を検討するため、N-アセチルムラミダーゼを100単位/mlに固定した場合のリゾチーム至適力価の検討と、リゾチームを10,000単位/mlに固定した場合のN-アセチルムラミダーゼ至適力価の検討を行った。  判定は、酵素処理により菌体が白血球中に確認されなくなるとき「適」とした。
【０１９４】
(4) 結  果
S. aureusの溶菌においては、リゾスタフィンの力価は１単位/mlで十分効果を示すが、S. epidermidisの溶菌には、10単位/ml以上のリゾスタフィン力価が必要であった（表５）。  従って、リゾスタフィンの至適力価を、10単位/ml〜100単位/mlに設定した。
【０１９５】
【表５】
0004104377.tif 000008
【０１９６】
また、E. faecalisの溶菌においては、リゾチームの力価を10,000単位/mlで固定したとき、N-アセチルムラミダーゼ力価が10単位/ml以下では溶菌されなかった（表６）。  リゾチームについては、N-アセチルムラミダーゼ力価を100単位/mlに固定した場合、リゾチーム力価が1,000単位/ml以下では溶菌されなかった（表６）。  従って、N-アセチルムラミダーゼの至適力価は100単位/ml〜1,000単位/ml、リゾチームの至適力価は10,000単位/ml〜100,000単位/mlに設定した。  また、シュードモナス・アエルギノーザに対しても、同様の力価で使用することができる。
【０１９７】
【表６】
0004104377.tif 000009
【０１９８】
実施例10(3)で適と判定した一例を、図12に示す。  図12において、(a) は酵素処理前のS. aureusの貪食サンプル、(b) は酵素処理前のE. faecalisの貪食サンプル、(c) は(a) のサンプルを酵素処理した後、および(d)は(b)のサンプルを酵素処理した後の様子を示している。
【０１９９】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。  それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各酵素の至適力価も同様とした。
【０２００】
実施例11：至適酵素処理条件（温度）の検討
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例10(3)に記載の方法に準じて検討した。  ただし、本試験の酵素処理時間を30分、検討温度は、４℃、25℃、37℃、42℃、60℃とし、各酵素力価は、N-アセチルムラミダーゼ（100単位/ml、生化学工業社製）、リゾチーム（10,000単位/ml、生化学工業社製）、リゾスタフィン（10単位/ml、SIGMA社製）とした。
【０２０１】
各酵素は、実施例６に記載の通り、対象となる菌に対応したものを使用した。
【０２０２】
使用したSA貪食サンプルの貪食率は22％であり、約1.12×105個/ウェルであった。  SE貪食サンプルの貪食率は29％であり、約1.62×105個/ウェルであった。また、EF貪食サンプルの貪食率は23％であり、約1.38×105個/ウェルであった。
【０２０３】
判定は、実施例10(3)に記載の方法に準じて行った。  その結果、S. aureusは、４℃〜60℃の温度範囲において、白血球の菌体は確認されなかった。  S. epidermidisは、処理温度４℃および25℃では白血球中の菌体が残存していたが、37℃以上では菌体が確認されなかった。  また、E. faecalisでは、処理温度４℃、25℃および60℃で菌体が残存していたが、37℃および42℃では確認されなかった。
【０２０４】
これらのことから、至適酵素処理温度を37℃〜42℃に設定した。
【０２０５】
その結果を、表７に示した。
【０２０６】
【表７】
0004104377.tif 000010
【０２０７】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。  それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適温度も同様とした。
【０２０８】
実施例12：至適酵素処理条件（時間）の検討
実施例10(1)および(2)に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。
【０２０９】
検討した時間は、０分、10分、20分、30分、60分、120分とした。
【０２１０】
各酵素は、実施例６に記載の通り、対象となる菌に対応したものを使用した。
【０２１１】
使用したSA貪食サンプルの貪食率は18％であり、約7.80×104個/ウェルであった。  SE貪食サンプルの貪食率は34％であり、約1.10×105個/ウェルであった。また、EF貪食サンプルの貪食率は28％であり、約1.30×105個/ウェルであった。
【０２１２】
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例10(3)に記載の方法に準じて検討した。  ただし、本試験の酵素処理温度は37℃、各酵素力価はN-アセチルムラミダーゼ（100単位/ml）、リゾチーム（10,000単位/ml）、リゾスタフィン（10単位/ml）とした。
【０２１３】
判定は、実施例10(3)に記載の方法に準じて行った。  その結果、S. aureus、S. epidermidis、E. faecalis貪食サンプルのいずれもが、酵素処理時間20分以上（０分および10分においては不適であった）で、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも15分以上、好ましくは20分以上、さらに至適酵素処理時間を30分〜60分とするのが好ましい、ことが明らかとなった。  その結果を、表８に示した。
【０２１４】
【表８】
0004104377.tif 000011
【０２１５】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同一の結果を得ることができた。  それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適時間も同一とした。
【０２１６】
実施例13：プローブ濃度の検討
本発明のin situハイブリダイゼーション反応において、プローブ濃度は、ハイブリッド形成速度に影響を与える主要な因子である。  プローブ濃度が低すぎると反応速度の低下を招き、シグナルが明確でなくなる可能性がある。  また、過剰量のプローブの使用は、非特異的反応を招きかねない。  それ故、各種プローブ液について、至適濃度を検討した。
【０２１７】
まず、実施例10(1)および(2)に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。  使用したSA貪食サンプルの貪食率は24％であり、約1.48×105個/ウェルであった。  SE貪食サンプルの貪食率は28％であり、約2.07×105個/ウェルであった。  PA貪食サンプルの貪食率は18％であり、約1.50×105個/ウェルであった。また、EF貪食サンプルの貪食率は24％であり、約1.72×105個/ウェルであった。EK貪食サンプルの貪食率は12％であり、約1.63×105個/ウェルであった。
【０２１８】
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例10(3)に記載の方法に準じて検討した。  プローブとして、ジゴキシゲニン標識したものを使用し、S. aureus（SA-24、SA-36、SA-77の混合物）、S. epidermidis（SE-３、SE-22、SE-32の混合物）、E. faecalis（EF-１、EF-７、EF-27の混合物）、P. aeruginosa（PA-２-31、PA-13-３の混合物）、E. coli（EC-24、ET-49、KI-50の混合物）に対する各プローブ濃度を、それぞれ0.04ng/μl、0.4ng/μl、1.2ng/μl、1.8ng/μl、2.4ng/μl、３ng/μlに調製した（特許第2798499号参照）。
【０２１９】
貪食サンプルを塗抹したスライドグラス（図13参照）に、上記の各種濃度に調製したプローブ液を使用し、実施例４(3)〜(11)に記載の方法に従って検討した。
ただし、使用したプローブは、各菌に対応したものを使用した。  また、実施例10(4)に示した力価の酵素を３種類混合して用いた。
【０２２０】
その結果、低濃度（0.04ng/μl）ではシグナルが明確でなくなり、高濃度（2.4ng/μlおよび３ng/μl）ではバックグラウンドの増大が認められた。  それ故、SA、SE、PA、EF、EKのプローブ濃度を、0.4〜1.8ng/μl、好ましくは0.4〜1.2ng/μlとした。  また、0.04ng/μlにおいては「不適」であり、0.4ng/μlにおいては「適」であったことから、少なくとも0.1ng/μl以上とするのが好ましい。  さらに、2.4ng/μlでは「不適」であり、1.8ng/μlでは「適」であったことから、2.2ng/μl以下の濃度とすることが、好ましいことが明らかとなった。
【０２２１】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。  このことから、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各プローブの至適濃度も同様とした。
【０２２２】
実施例14：ハイブリダイゼーション温度の検討
ハイブリダイゼーション反応における反応温度は、ハイブリッド形成速度とハイブリッドの安定性に影響を与えるパラメーターである。  ハイブリダイゼーション反応を高温下で行うと、細胞の形態が劣化することが知られていることから、至適温度の検討（４℃、25℃、37℃、42℃、50℃、60℃）を行った。
【０２２３】
まず、実施例10(1)および(2)に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。  使用したSA貪食サンプルの貪食率は31％であり、約1.38×105個/ウェルであった。  SE貪食サンプルの貪食率は42％であり、約1.95×105個/ウェルであった。  PA貪食サンプルの貪食率は15％であり、約1.30×105個/ウェルであった。また、EF貪食サンプルの貪食率は48％であり、約1.05×105個/ウェルであった。EK貪食サンプルの貪食率は17％であり、約1.85×105個/ウェルであった。  貪食サンプルおよびＵ937細胞を塗抹固定したスライドグラス（図14を参照）を使用して、実施例４(3)〜(11)に記載の方法に従い検討した。  ただし、使用したプローブは、対象となる菌に対応したものを使用した（実施例13を参照）。  また、実施例10(4)に示した力価の酵素を、３種類混合して用いた。
【０２２４】
その結果、ハイブリダイゼーション温度が４℃以下では、ハイブリッド形成速度が低下し、各種プローブで安定なシグナルが観察されなかった。  また、60℃においては細胞形態の変化が認められ、安定なシグナルが観察されなかった。
【０２２５】
また、25℃および50℃では、37℃および42℃に比べ、シグナルが明確でなかったが検出することは可能であった。  従って、至適ハイブリダイゼーションの温度は、25℃〜50℃、より好ましくは37〜42℃に設定するとよい。
【０２２６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。  それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適温度も同様とした。
【０２２７】
実施例15：ハイブリダイゼーション時間の検討
実施例10(1)および(2)に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とし、10分、60分、90分、120分、180分、900分間のハイブリダイゼーション時間について検討した。
【０２２８】
使用したSA貪食サンプルの貪食率は47％であり、約1.45×105個/ウェルであった。  SE貪食サンプルの貪食率は47％であり、約1.33×105個/ウェルであった。PA貪食サンプルの貪食率は17％であり、約1.95×105個/ウェルであった。  また、EF貪食サンプルの貪食率は41％であり、約1.45×105個/ウェルであった。  EK貪食サンプルの貪食率は20％であり、約1.23×105個/ウェルであった。
【０２２９】
貪食サンプルおよびＵ937細胞を塗抹固定したスライドグラス（図14に示すものに同じ）を使用して、実施例４(3)〜(11)に記載の方法に従って検討を行った。
【０２３０】
ただし、使用したプローブは、各菌に対応したものを使用した（実施例13参照）。  また、実施例10(4)に示した力価の酵素を、３種類混合して用いた。
【０２３１】
その結果、ハイブリダイゼーション時間が10分ではシグナルが観察されなかったが、60分以上でシグナルが観察され、90分以上で安定したシグナルが観察された。  また、ハイブリダイゼーション時間を900分としても、シグナルの検出には変化は認められなかった。  従って、少なくとも30分以上、好ましくは60分以上、より好ましくは90以上とするのが好ましい。  さらに、至適ハイブリダイゼーション時間として、120分〜900分の時間を設定するのが好ましい。
【０２３２】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。  従って、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適時間も同様とした。
【０２３３】
実施例16：ハイブリダイゼーション溶液に添加する界面活性剤の影響
実施例10(1)および(2)に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。
【０２３４】
貪食率は17.5％であり、約1.90×105個/ウェルであった。  また、実施例10(4)に示した力価の酵素を３種類混合して用いた。  プローブ（PA-２-31およびPA-13-３）希釈液に各種界面活性剤（SDS、ラウリスサルコシン、サポニン、BRIJ35、Tween 20、Triton X-100）を添加し、実施例４(7)の記載に従ってハイブリダイゼーションを行ったところ、0.25％のSDSを添加することにより検出感度が飛躍的に増強した。  また、ラウリルサルコシン、BRIJ 35、ツイーン20（Tween 20）によって検出感度を高めることができた。
【０２３５】
その一例を、図15に示す。  図15(a)は、界面活性剤としてSDSを用い、プローブPA-２-31およびPA-13-３を用いた結果であり、図15(b)は、SDSを用いなかったときの結果である。
【０２３６】
さらに、SDSを種々の濃度で用いた結果、好ましい濃度は、１％以下、より好ましくは0.1％〜0.5％、さらに好ましくは0.25％であることが明らかになった。
【０２３７】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。  ゆえに、臨床検体においてもin situハイブリダイゼーションの工程に界面活性剤、特に、SDSを添加するのが好ましい。
【０２３８】
実施例17：ハイブリダイゼーションの際に使用するプローブ鎖長の検討
Pseudomonas aeruginosaプローブ（PA-13-３、配列番号：６）を用いて、ジゴキシゲニンにてラベル化を行った。
【０２３９】
まず、精製したDNAプローブ１μｇを、10×L.B.（0.5mol/l トリス塩酸(pH 7.5）５μl、50mmol/l 塩化マグネシウム、0.5mgウシ血清アルブミン）５μl、100mmol/l ジチオスレイトール５μl、dNTPs（Ａ、Ｇ、Ｃ）各１nmol、ジゴキシゲニン-dUTP（Dig-dUTP）0.5nmol、dTTP各0.5nmol、DNase３μl（20mU、40mUおよび60mU相当量）、10Ｕ/μl DNAポリメラーゼ１μlを含み、適量の滅菌精製水で全量を50μlとなるように調製した。  15℃、２時間でジゴキシゲニンラベル化を行った。  ラベル化した後、５分間煮沸して反応を停止させた。  反応停止液をスピンカラム（CENTRI-SEP COLUMUNS CS901、PRINCETON SEPARATIONS, INC.）に注入し、25℃で２分間遠心分離（3,000×ｇ）を行い、遊離しているヌクレオチドを除去した。
【０２４０】
そして、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、３％アガロースゲルにて電気泳動してサイズを確認した。  次に、サザンブロッティング法によりアガロースゲル中のDNAをニトロセルロース膜に転写させた。  その後、２％ブロッキング試薬（ロシュ社製）に30分間浸した後、１/5,000量のアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を加えて30分間浸した。  次に、100mmol/lのトリス塩酸（pH 7.5）、150mmol/l塩化ナトリウムにて10分間振とうし、２回洗浄した。  そして、100mmol/lのトリス塩酸（pH 9.5）、150mmol/l塩化ナトリウムにて10分間振とうして洗浄した。  その後、前出のNBT/BCIP溶液に浸して発色させた。  最後に、精製水に浸し、発色を止めて乾燥させた。
【０２４１】
その結果を、図16に示す。  図16から明らかなように、20mUのDNase（図16(a)のレーン１）を用いて、主として約350〜600塩基長に分布するように切断した場合に、ラベル効率が高いことが示された。  こうして得られた検出用プローブを、貪食サンプルや感染症患者からの臨床検体を用いた本発明の感染症原因微生物の検出方法において使用し、ハイブリダイゼーションを行ったところ、優れた感度でシグナルが検出された。  従って、効率よくPseudomonas aeruginosa菌を検出する上で、ハイブリダイゼーションに使用するプローブの鎖長としては、約350〜600塩基長、好ましくは350〜550塩基長、そして、最も好ましくは350〜500塩基長が良いことが判明した。
【０２４２】
実施例18：ハイブリダイゼーションの際に使用するプローブの検討
実施例10(1)および(2)に記載の方法で作成した、PA貪食サンプルを検体として、検出用プローブについての検討を行った。
【０２４３】
検出用プローブとして、PA-２-31、PA-３-12、PA-４-15、PA-13-３を用い、実施例17の記載に従ってジゴキシゲニンラベル化し、約350〜600塩基長を有するように調製したものを、それぞれ単独で、界面活性剤非存在下でのハイブリダイゼーションに供した。  そうしたところ、各プローブを単独で使用しても、シュードモナス・アエルギノーザ菌を検出することができた。  一方、PA-２-31とPA-13−３を混合した方が、それら単独で使用した場合よりも、シグナルが明瞭に検出され、検出感度が高められた。
【０２４４】
他のプローブの組み合わせまたは３種以上のプローブの組み合わせにおいても、同様のことが判明している。
【０２４５】
【発明の効果】
このように、本発明の検出用プローブによれば、それをin situハイブリダイゼーションに適用することで、２時間以下という短時間の内に、検出対象菌に対して安定なシグナルを発現することができるため、迅速かつ的確な検査結果をもたらすことが可能となる。
【０２４６】
また、これにより、シュードモナス・アエルギノーザ菌のみならず、敗血症や菌血症などの疾患に対する診断材料を医療現場に迅速に提供でき、人命救助の観点からも多大な貢献が期待されるものである。
【０２４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  試料細菌ＤＮＡの配置を示す図である。
【図２】  PA-２-31プローブを用いたドットブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図３】  PA-３-12プローブを用いたドットブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図４】  PA-４-15プローブを用いたドットブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図５】  PA-13-３プローブを用いたドットブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図６】  PA-２-31およびPA-13-３による混合プローブを用いたシュードモナス・アエルギノーザ菌の検出系での光学顕微鏡（×1,000）による発色シグナル（矢印）を示す図である。
【図７】  (a)〜(f)は、それぞれ、様々な白血球細胞密度で固定した試料の外観を示す図である。
【図８】  (a) S. aureusとS. epidermidisに対する溶菌酵素の経時的活性、(b) P. aeruginosaとE. coliに対するアルカリ剤に対する活性、および(c) E. faecalisに対する溶菌酵素の経時的活性を示すグラフである。
【図９】  (a) N-アセチルムラミダーゼ 300単位/ml、(b) リゾチーム10,000単位/ml、および(c) リゾスタフィン50単位/mlに対するDMSOの濃度依存的効果を示すグラフである。
【図１０】  (a) プロテアーゼ 0.2単位/mlのみ、(b) PMSF１μmol/ml、(c) PMSF 10μmol/ml、(d) PMSF 0.1mmol/ml、および(e) PMSF１mmol/mlに対するPMSFの添加効果を示す図である。
【図１１】  (a)〜(e)は、それぞれ、本発明に従って調製した貪食サンプルが、細菌が食細胞によって貪食されて形態変化を起こしていることを指し示す図である。
【図１２】  (a)  酵素処理前のS. aureusの貪食サンプル、(b) 処理前のE. faecalisの貪食サンプル、(c) (a)を酵素処理して得た後のサンプル、および(d)は(b)を酵素処理して得た後の貪食サンプルに対する酵素処理の効果を示す図である。
【図１３】  In situハイブリダイゼーションでのる至適プローブ濃度を調べるために用いた貪食サンプル塗抹用スライドグラスの概観を示す図である。
【図１４】  In situハイブリダイゼーションでのる至適温度を調べるために用いた貪食サンプル塗抹用スライドグラスの概観を示す図である。
【図１５】  (a)および(b)は、in situハイブリダイゼーション系でのSDS添加効果を示す図である。
【図１６】  (a) は、ジゴキシゲニンラベル化PAプローブPA-13-３の鎖長と標識によるシグナル強度を示すサザンブロットの結果を示すであり、(b) は、電気泳動の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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