(57)【要約】【解決手段】  本発明は、プロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じる炎症の治療のための組成物、方法、及び療法に関する。組成物はペプチドと抗ＴＮＦ剤の組合せを含む。ペプチドは特定のアミノ酸配列から構成され、或いは１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって特定のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列から成るペプチドから構成される。治療有効量のペプチド及び抗ＴＮＦ剤の患者への投与は、プロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じた炎症を免疫応答によって抑制するのに効果的である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されたアミノ酸配列から成るペプチド、
（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、及び、
（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチド
から成る群から選択された１つ以上のペプチドと、
抗ＴＮＦ剤と、
を含む組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、
（ｅ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載された複数のペプチドをリンカーによって結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド、及び
（ｆ）前記（ｃ）又は（ｄ）に記載された複数のペプチドをリンカーによって結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド
から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
患者におけるプロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じる炎症を抑制する方法であって、
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチド、
（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、及び、
（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチド
から成る群から選択された１つ以上のペプチドを前記患者に導入するステップと、
抗ＴＮＦ剤を前記患者に導入するステップと、
を含む方法。
【請求項４】
前記ペプチド及び前記抗ＴＮＦ剤は同時に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド及び前記抗ＴＮＦ剤は組成物の形態である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチド及び前記抗ＴＮＦ剤は順次導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されたアミノ酸配列から成るペプチド、
（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、及び、
（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチド
から成る群から選択された１つ以上のペプチドと、
抗ＴＮＦ剤と、
を含む、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチン。
【請求項８】
前記ペプチドは、
（ｅ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載された複数のペプチドをリンカーで結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド、及び、
（ｆ）前記（ｃ）又は（ｄ）に記載された複数のペプチドをリンカーで結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド
から成る群から選択される、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ペプチド及び前記抗ＴＮＦ剤は組成物の形態である、請求項８に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」と称する２０１４年６月２３日出願の米国特許出願第１４／３１２，１６２号の優先権を主張する。当該米国特許出願は、「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と称する２０１１年１２月２２日出願の米国特許出願第１３／３８０，４２５号、「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と称する２０１１年５月２３日出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６２３０５号、及び「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と称する２０１０年５月２７日出願の仮出願第６１／３９６，５７４号の優先権を主張する、これらの関連文献は、引用を以て、それらの全体として本明細書に組み込まれる。
本発明は概して、抗原ペプチドと、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium Acne）に対するそれらの使用とに関する。本発明は更に、抗原ペプチドと抗腫瘍壊死因子（抗ＴＮＦ剤）の組合せと、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するそれらの使用とを含む。本発明はまた、プロピオニバクテリウム・アクネスを保有する患者を治療する方法及び療法にも関する。更に詳しくは、本発明は治療有効量の抗原ペプチド及び抗ＴＮＦ剤を患者に投与することを含む。
【背景技術】
【０００２】
座瘡は、人体の頸部から顔面に及ぶ患者の部位にしばしば現れる既知の炎症性疾患である。通常、座瘡は思春期に最もよく見られるが、座瘡の存在は成人期にも見受けられることが知られている。露出して目に見える人体部分に発生する炎症のため、座瘡はこの疾患に苦しむ人にかなりの心理的影響を及ぼすことがある。
【０００３】
座瘡用に様々な治療薬が開発されてきた。特に、座瘡の病原体であるプロピオニバクテリウム・アクネスに直接作用する薬剤が開発されてきた。
【０００４】
当該技術分野では、プロピオニバクテリウム・アクネスの完全なゲノム配列が決定されており、その結果、プロピオニバクテリウム・アクネスの多くの遺伝子が病原性因子をコードすることが知られている。この情報に基づいて、ワクチンを開発する中で、プロピオニバクテリウム・アクネスのシアリダーゼに関する研究が実施されてきた。
【０００５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は全身を循環するサイトカインである。ＴＮＦは、効果的な免疫監視に不可欠であり、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞の適切な増殖及び機能のために必須である。ＴＮＦの主要な役割は免疫細胞の調節にある。ＴＮＦは、結果的に様々な慢性的症状を生じ得る全身性炎症の原因になり得ることが知られている。ＴＮＦ遮断剤又は阻害剤としても知られる抗ＴＮＦ剤は、身体のＴＮＦの生成を妨げ、その結果、炎症を軽減するのに有効である。
【０００６】
プロピオニバクテリウム・アクネスに対処するために開発されたほとんどの薬剤は、座瘡の原因であるプロピオニバクテリウム・アクネスの細菌性細胞に作用し、抗炎症効果を発揮する。従って、プロピオニバクテリウム・アクネスの再感染があるという状況で、炎症は再び発生する。従って、そのような薬剤の使用は一時的に効果的であるが、それらの使用は薬物耐性菌の出現を誘発し、それは治療をより難しくする。
【０００７】
当該技術分野では、プロピオニバクテリウム・アクネスに対する抗原ペプチドのみならず、患者におけるプロピオニバクテリウム・アクネスを退縮、縮減、又は消失させるために抗原ペプチドを投与する療法及び方法、更に詳しくは座瘡の継続的治療を可能にする療法及び方法をも開発する必要がある。投与の療法及び方法は、適正な期間に効果を発揮することが望ましい。座瘡の継続的治療は、免疫療法即ちワクチンを含む。特定の理論に束縛されるものではないが、効果的な抗座瘡免疫（特定のプロピオニバクテリウム・アクネスの認識及び免疫記憶）を確立することにより、少なくとも同一プロピオニバクテリウム・アクネスの株による再感染時に、結果的にプロピオニバクテリウム・アクネスを即時除去することができると考えられる。従って、免疫療法が継続的な抗炎症効果を発揮できることは、合理的に期待される。
【０００８】
本発明によって、アミノ酸配列から成るペプチド及び抗ＴＮＦ剤が、患者のプロピオニバクテリウム・アクネスによって誘発された炎症を効果的に抑制できることが明らかになった。
【発明の概要】
【０００９】
ある態様では、本発明は、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含む組成物を提供することによって、上記の要求を解決する。ペプチドは、（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されたアミノ酸配列から成るペプチド、（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、及び（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されたアミノ酸配列から成るペプチド、の１つ以上を含む。
【００１０】
組成物に存在するペプチドは、（ｅ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載された複数のペプチドをリンカーで結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド、及び（ｆ）上記（ｃ）又は（ｄ）に記載された複数のペプチドをリンカーで結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド、を含むことができる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、患者のプロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じた炎症を抑制する方法を提供する。該方法は、患者にペプチド及び抗ＴＮＦ剤を導入することを含む。ペプチドは、（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチド、（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド、及び（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチド、の１つ以上を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤は患者に同時に導入される。ペプチド及び抗ＴＮＦ剤は組み合わされて組成物を形成してよく、当該組成物を患者に導入することができる。他の実施形態では、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤は患者に別々に導入することができる。ペプチド及び抗ＴＮＦ剤は患者に順次導入することができる。ペプチド又は抗ＴＮＦ剤の何れか一方を患者に導入し、それに続いて他方を導入することができる。
【００１３】
別の態様では、本発明は、上記のペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含む、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンを提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドが作用可能に連結される発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターの使用は、プロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じる炎症を抑制できるペプチドを提供することを可能にする。
【００１６】
別の態様では、本発明は、特に上記ペプチドを認識する抗体を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンの有効性を判定する方法を提供する。該方法は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、生体から採取した試料に存在するか否かを判定するステップを含む。本発明の方法を使用することにより、ワクチンを生体に投与する前に、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンが生体に有効であるか否かを容易に判定することが可能になる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ロピオニバクテリウム・アクネスによって生じる炎症を治療又は防止する方法を提供し、当該方法は、個体に上記ワクチンを投与するステップを含んでおり、ワクチンは、治療有効量のペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含んでいる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、プロピオニバクテリウム・アクネスによって生じる炎症を治療又は防止する方法を提供する。当該方法は、上記ワクチンを個体に投与するステップを含んでおり、ワクチンが治療有効量のポリヌクレオチド及び抗ＴＮＦ剤を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
好適な実施形態の以下の説明を添付の図面と併せて読むと、本発明を更によく理解することができる。
【００２１】
【図１】プロピオニバクテリウム・アクネスを個々の部位に注入することによって生じた炎症面積の測定結果を示すグラフである。
【００２２】
【図２】プロピオニバクテリウム・アクネスの注入によって生じた炎症面積と注入後の経過時間との間の関係を示す図表である。
【００２３】
【図３】ペプチドの抗炎症効果を検査するステップを示す図表である。
【００２４】
【図４】ペプチドの抗炎症効果の検査結果を示す図表である。
【００２５】
【図５】ペプチドの抗炎症効果の別の検査結果を示す図表である。
【００２６】
【図６】患者から単離された菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列と標準株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を比較した図表である。
【００２７】
【図７】患者から単離したプロピオニバクテリウム・アクネスの注入に対するペプチドの抗炎症効果の検査結果を示す図表である。
【００２８】
【図８】本発明の特定の実施形態に従ってワクチンを接種した座瘡患者の経過観察の写真を示す図表である。
【００２９】
【図９】本発明の特定の実施形態に従ってワクチンを接種した別の座瘡患者の経過観察の写真を示す図表である。
【００３０】
【図１０】本発明の特定の実施形態に従ってワクチンを接種した更に別の座瘡患者の経過観察の写真を示す図表である。
【００３１】
【図１１】本発明の特定の実施形態に従ってワクチンを接種した更にまた別の座瘡患者の経過観察の写真を示す図表である。
【００３２】
添付の配列表に列挙するアミノ酸配列は、標準的な文字略記を用いて示されており、配列表は参照によって本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、患者のプロピオニバクテリウム・アクネスと、その結果生じる炎症とに対処する組成物、方法、及び療法を提供する。組成物、方法、及び療法は抗原ペプチドの使用を含む。特定の実施形態では、抗原ペプチドは、抗ＴＮＦ剤と組み合わせて投与される。抗ＴＮＦ剤の有無に拘わらず、抗原ペプチドは、プロピオニバクテリウム・アクネスの感染に対する免疫応答を誘発すること、及びプロピオニバクテリウム・アクネスによって生じる炎症を低減又は防止することが可能である。本発明の抗原ペプチドは、非常に高い抗原性を有する。従って、抗ＴＮＦ剤の有無に拘わらずペプチドの使用により、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンを提供することができる。
【００３４】
特定の実施形態では、抗ＴＮＦ剤と組み合わせたペプチドの使用は、プロピオニバクテリウム・アクネスの結果生じる炎症の低減又は除去に関して、向上又は改善された結果を生むことができる。本発明に従って使用される抗ＴＮＦ剤は、様々な形態を取ることができる。例えば、抗ＴＮＦ剤は、注射のように導入を容易にするために、液体キャリア又は媒体のような送達機構に組み込むことができる。
【００３５】
本発明に従って使用される抗ＴＮＦ剤は、多種多様な適切な物質を含んでよい。非限定的な例は、抗ＴＮＦ効果又は結果を実証する、例えばＴＮＦによって生じる炎症を低減する任意の物質をも含む。更に、本発明に従って使用される適切な抗ＴＮＦ物質は、当該分野で知られている多種多様な抗ＴＮＦ物質から選択されてよい。特定の実施形態では、エタネルセプト（Entanercept）のような、しかしそれに限らず、融合タンパク質を含むＴＮＦ阻害剤が使用されてよい。エタネルセプトはエンブレル（Enbrel）の商品名で市販されている。
【００３６】
本発明に従って使用されるペプチドは、以下のペプチド（ａ）乃至（ｄ）の１つ以上とされてよい。
【００３７】
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド。
【００３８】
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されたアミノ酸配列から成るペプチドであって、プロピオニバクテリウム・アクネスの増加を抑制する抗体を免疫応答によって生成するペプチド。
【００３９】
（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド。
【００４０】
（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されたアミノ酸配列から成るペプチドであって、プロピオニバクテリウム・アクネスの増加を抑制する抗体を免疫応答によって生成するペプチド。
【００４１】
ここで、「幾つかのアミノ酸」とは、例えば２つ又は３つのアミノ酸とすることができ、より好ましくは、２つのアミノ酸とすることができる。
【００４２】
アミノ酸が置換される実施形態では、好適な置換は、１つのアミノ酸のこのアミノ酸と同じ性質を有する別のアミノ酸への置換であり、例えば１つのアミノ酸のこのアミノ酸と同一側鎖官能基を有する別のアミノ酸への置換（例えばＡｒｇのＬｙｓへの置換、及びＡｓｐのＧｌｕへの置換）、並びに１つの疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸への置換（例えばＶａｌのＩｌｅへの置換）である。
【００４３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されているように、用語「ペプチド」は、「ポリペプチド」又は「タンパク質」と互換可能に使用される。
【００４４】
配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドは、受入番号ＡＡＴ８４０５９でジェンバンク／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪに登録されたアミノ酸配列から成るプロピオニバクテリウム・アクネスの膜タンパク質における、９０番目のアミノ酸残基から１０３番目のアミノ酸残基までのアミノ酸残基に対応する。配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドは、受入番号ＹＰ＿０５６４４５でジェンバンク／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪに登録されたアミノ酸配列から成るプロピオニバクテリウム・アクネスの膜タンパク質における、２６０番目のアミノ酸残基から２７２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸残基に対応する。
【００４５】
一般的に、抗体の生成において、抗原として優れたアミノ酸配列は、親水性アミノ酸配列及び豊富な電荷を有するアミノ酸配列であり、又はターン構造を有することが予測されるアミノ酸配列もそうである。電荷は正又は負のどちらであってもよく、少なくとも５個の電荷をもつアミノ酸を含むことが望ましい。更に、選択されるアミノ酸の長さは、１０乃至１５個の残基に対応することが好ましい。従って配列番号１又は３によって示されるアミノ酸配列が選択される。
【００４６】
これらのペプチドは、生体異物であるプロピオニバクテリウム・アクネスに対する免疫を誘発する。免疫の誘発時に、Ｔｈ２優位の免疫の誘発の結果、特異抗体の生成が誘発されることが推定される。
【００４７】
本発明に従ってペプチドを生成する方法は、化学合成又は発現ベクターを採用してよい。化学合成を採用する実施形態では、本発明のペプチドを周知の合成方法によって生成することができる。非限定的な例は液体ペプチド合成及び固相ペプチド合成を含むが、それらに限定されない。発現ベクターを採用する実施形態では、ペプチドは、発現ベクターが導入された形質転換体から生成されてよく、或いはインビトロ翻訳システムを用いて生成されてよい。例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号２又は４によって示される塩基配列を含むポリヌクレオチド）は発現ベクターに挿入され、発現ベクターは宿主細胞に導入される。目的ペプチドは宿主細胞で産生することができる。本明細書及び特許請求の範囲で使用する用語「形質転換体」は、細胞、組織、及び器官だけでなく、生命体自体をも表す。形質転換体を調製する方法は、組換えベクターを宿主に導入することによる形質転換のような、この技術分野で周知の手順を含む。形質転換される生命体の非限定的な例は、微生物、植物、及び動物を含むが、それらに限らない。宿主細胞への遺伝子の導入は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、及びノーザンハイブリダイゼーションのような、しかしながら、それらに限らず、この技術分野で周知の様々な手順によって確認されてよい。
【００４８】
形質転換体を調製することによって本発明のペプチドが産生される実施形態では、ペプチドは宿主細胞で安定的に発現されることが好ましい。しかしながら、ペプチドは、宿主細胞で過渡的に発現されてよい。こうして産生されたペプチドは、公知の方法によって精製されてよい。ペプチドを精製する適切な方法の非限定的な例は、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィを含むが、それらに限らない。
【００４９】
別の態様では、本発明のペプチドは、以下の通り、リンカーを介して、複数のペプチド（ａ）若しくは（ｂ）を結合することによって、又は複数のペプチド（ｃ）若しくは（ｄ）を結合することによって得られる、多価抗原ペプチド（これは多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）と呼ばれることもある）の形態であってよい。
【００５０】
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド。
【００５１】
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチドであって、プロピオニバクテリウム・アクネスの増加を抑制する抗体を免疫応答によって生成するペプチド。
【００５２】
（ｃ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチド。
【００５３】
（ｄ）配列番号３によって示されるアミノ酸配列から１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加によって誘導されるアミノ酸配列から成るペプチドであって、プロピオニバクテリウム・アクネスの増加を抑制する抗体を免疫応答によって生成するペプチド。
【００５４】
ＭＡＰは、より高い抗原性を示すことが可能なペプチドであり、且つ特異ペプチドのＣ末端にリンカーを付加し、且つリンカーを介して特異ペプチドをＬｙｓに基づいて構成されたＭＡＰ構造（基質）に結合することによって得られる多価ペプチドである。ＭＡＰは、従来の公知の方法によって合成されてよい。１つのＭＡＰ分子に含まれる特異ペプチドの数は特に制限されないが、５以上が好ましい。１つのＭＡＰ分子に含まれる特異ペプチドの数の上限は、抗原性の観点から数が大きいことが好ましいので、制限されない。特定の実施形態では合成技術による制約がある場合があり、従って、ＭＡＰは、特異ペプチドの数を１５分子以下として生成されてよい。
【００５５】
一般的にＣｙｓ残基は、特異ペプチドに付加されるリンカーを構成するアミノ酸として使用される。しかしながら、本発明の特定の実施形態に係るＭＡＰの形のペプチドでは、特異ペプチドとＣｙｓ残基との間にＧｌｙ残基を含むリンカーが使用される。特に、‐ＧｌｙＣｙｓ又は‐ＧｌｙＧｌｙＣｙｓが、リンカーとして特異ペプチドのＣ末端に付加される。例えば‐ＧｌｙＣｙｓは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドのＣ末端に付加され、‐ＧｌｙＧｌｙＣｙｓは、配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドのＣ末端に付加される。Ｇｌｙ残基がＣｙｓ残基と特異ペプチドのＣ末端との間に付加されるので、ＭＡＰ構造に結合するときに特異ペプチドが立体障害を受けないように、Ｃｙｓ残基は回転柔軟性を与えられ、リンカーでＣｙｓ残基は角度を成すことができ、それはＣｙｓ残基がＭＡＰ反応性基に接近することを可能にする。ＭＡＰの形態の本発明のペプチドのためのリンカーは、このリンカーによって制限されず、Ｃｙｓ残基によって構成された一般的リンカーによって制限されてよい。
【００５６】
別の態様では、本発明のペプチドは、以下の通り、ペプチド（ｅ）又は（ｆ）を含むペプチド組成物の形態で提供される。
【００５７】
（ｅ）リンカーを介して複数のペプチド（ａ）又は（ｂ）を結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド。
【００５８】
（ｆ）リンカーを介して複数のペプチド（ｃ）又は（ｄ）を結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチド。
【００５９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語「ペプチド組成物」は、複数のペプチド成分を含む物質を表す。
【００６０】
個々のペプチド成分は、ペプチド組成物を形成するために様々な比率で組み合わされてよい。個々の成分の比率は特に限定されず、例えば１：１（重量比）であってよい。更に、より高い免疫原性を確実にするために、ペプチド組成物は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成る複数のペプチドをリンカーを介して結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチドと、配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成る複数のペプチドをリンカーを介して結合することによって得られる多価抗原ペプチドの形態のペプチドとを含むことが好ましい。
【００６１】
更に本発明は、ペプチド（ａ）〜（ｄ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号２又は４によって示される塩基配列から成るポリヌクレオチドを含むが、それに限定されない。本明細書で使用されているように、用語「塩基配列」は「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と互換可能であり、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略される）の配列として示される。配列番号２によって示される塩基配列は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドをコードし、配列番号４によって示される塩基配列は、配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドをコードする。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡの形態であってよい。当業者は、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報及び該ペプチドをコードする塩基配列情報に基づいて、本発明のポリヌクレオチドを容易に生成することができる。特に、本発明のポリヌクレオチドは、一般的なＤＮＡ合成又はＰＣＲによって生成できる。
【００６３】
更に本発明は、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ペプチドの生成にベクターが使用される場合、ベクターは、ポリヌクレオチドが作用可能に連結される発現ベクターであることが好ましい。本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、語句「作用可能に連結される」とは、目的ペプチドをコードするためのポリヌクレオチドがプロモータのような制御領域の制御下にあり、宿主細胞でペプチドを発現することが可能であることを示す。所望のベクターを構築するために、目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに「作用可能に連結」させる手順は、当該分野でよく知られている。更に、発現ベクターを宿主細胞内に導入する技術もまた当該分野でよく知られている。従って当業者は所望のペプチドを宿主細胞で容易に生成することができる。
【００６４】
本発明のペプチド及び／又は本発明のポリヌクレオチドの使用は、プロピオニバクテリウム・アクネスに対する免疫の誘発を可能にする。更に、抗ＴＮＦ剤と組み合わせた本発明のペプチド及び／又はポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウム・アクネスに対する免疫の誘発を可能にする。即ち、本発明のペプチド及び／若しくはペプチド／抗ＴＮＦ剤組合せ、並びに／又は、本発明のポリヌクレオチド及び／若しくはポリヌクレオチド／抗ＴＮＦ剤組合せは、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンとして働くことができる。従って、本発明のペプチド及び／若しくはペプチド／抗ＴＮＦ剤組合せ、並びに／又は、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド／抗ＴＮＦ剤組合せは、プロピオニバクテリウム・アクネスによる皮内炎症（例えば座瘡及び吹き出物）の抑止を可能にする。
【００６５】
本発明はまた、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンを含み、有効成分として上述したペプチド及び／若しくはペプチド／抗ＴＮＦ剤組合せ、上述したペプチド組成物及び／若しくはペプチド組成物／抗ＴＮＦ剤組合せ、又は上述したポリヌクレオチド及び／若しくはポリヌクレオチド／抗ＴＮＦ剤組合せを含有する。本明細書で使用されているように、用語「ワクチン」は、免疫療法（ワクチン療法）に使用されるワクチンであって、本発明のペプチドに特異的な免疫応答を誘発するワクチンを表す。
【００６６】
本発明のワクチンは、ワクチン組成物の形態で、又はワクチンキットの形態で提供されてよい。ここで、「有効成分を含有するワクチン組成物」及び「有効成分を含有するワクチンキット」は包括的に「有効成分を含有するワクチン」と呼ばれる。「キット」とは、少なくとも１つの成分が１つの物質に含まれ、残りが別の物質に含まれるなど、個々の成分が異なる物質に含まれるようにした形態を表す。ワクチン組成物及びワクチンキットについては本明細書にて後で詳述する。
【００６７】
一般的に用語「ワクチン組成物」とは、「全体として２つ以上の成分が存在し、これらの成分が１つの物質とみなされるワクチン物質」を表す。本発明のワクチンの投与は、例えばペプチド、又はペプチド及び抗ＴＮＦ剤の単回投与であってよく、ペプチドは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３によって示されるアミノ酸配列、又はこれら２つのペプチドの混合物から成る。２つのペプチドの混合物が使用される実施形態では、２つのペプチドの一方に対応するプロピオニバクテリウム・アクネスの抗原タンパク質のアミノ酸配列が変異し、一方のペプチドの抗炎症効果が失われたとしても、もう一方のペプチドは抗炎症効果を発揮することができる。そのような組成物は、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤に加えて他の成分（例えば薬学的に許容できる担体）を含有してよい。
【００６８】
一般的に、ペプチド、抗ＴＮＦ剤、及び何れかの他の成分がワクチン組成物に組み合わされない場合、個々の成分の組合せは、１つの組成物として認識できないが、用語「キット」に包含することができ、キットとして提供することができる。これは、当業者には容易に理解されることである。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明は、本発明のペプチド、並びに／又はペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含むワクチン組成物を提供する。他の実施形態では、ワクチン組成物は、本発明のポリヌクレオチド、並びに／又はポリヌクレオチド及び抗ＴＮＦ剤を含有する。ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるペプチドを発現することが可能な形態であることが好ましく、本発明のポリヌクレオチドが作用可能に連結された発現ベクターの形態で提供されることがより好ましい。上述の通り、本発明のペプチド又は本発明のポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンを調製する際に、有効なワクチン成分として使用される。
【００７０】
本発明のワクチンは、プロピオニバクテリウム・アクネスに対する予防ワクチン又は治療ワクチンとして使用することができる。本明細書及び特許請求の範囲で使用されているように、用語「予防ワクチン」とは、個体が病気に感染するのを防止するために非感染未治療者に投与されるワクチンを表す。本明細書及び特許請求の範囲で使用されているように、用語「治療ワクチン」とは、感染症を改善するため、或いは感染をできるだけ小さくするため、或いは病気の免疫病理学的作用を消失させるために、すでに病気に感染している個体に投与されるワクチンを表す。
【００７１】
有効成分を含有するワクチンを調製する様々な従来の方法は、当業者によく知られており、本発明に係るワクチンを調製するために採用されてよい。ワクチンは、患者に注射されるように溶液又は懸濁液の形態で調製されてよい。代替的に、本発明のワクチンは、患者に注射する前に溶液に溶解又は懸濁されるように、適切な個体形態で調整されてよい。そのような調製は乳化されてよく、或いはリボソーム中で乳化されたタンパク質であってよい。
【００７２】
本発明のワクチン組成物の有効成分は、薬学的に許容でき且つ有効成分と相溶性のある希釈液で混合されてよい。希釈液の好適な例は、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール、及びそれらの混合物を含む。更に、希望する場合、本発明のワクチン組成物は、湿潤剤又は乳化剤及びｐＨ緩衝剤のような少量の補助物質を含んでよい。
【００７３】
本発明のワクチン組成物は様々な経路（例えば鼻腔、粘膜、口腔、膣内、尿道、及び眼球内）を介する注射（皮内注射、皮下注射、及び筋肉内注射を含む）によって投与されてよく、或いはパッチ（経皮的投与）又は座薬等を使用して非経口的に投与されてよい。
【００７４】
本発明のワクチン組成物は、経口的に投与されてよい。経口投与の場合、本発明のワクチン組成物は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン酸ナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウムのような希釈液と組み合わせて使用される。本発明のワクチン組成物は、経口的に投与される場合、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤、又は散薬の形態であってよい。本発明のワクチン組成物が凍結乾燥形態で提供される実施形態では、凍結乾燥物質は、投与前に懸濁液として再構築されてよい。再構築は緩衝液中で行われることが好ましい。
【００７５】
本発明のワクチン組成物は、ワクチンの効果を高めるためにアジュバントを含有してよい。効果的なアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ムラミルジペプチド、菌体内毒素、脂質Ｘ、百日咳菌、コリネバクテリウム・パルバム、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥデキストラン、ブロックコポリマー、及び他の合成アジュバントを含むが、それらに限らない。これらのアジュバントは様々な供給者から市販されている。これらのアジュバントの代表例は、水中油型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、及びこれらのアジュバントと混合されたアジュバントを含む。ヒトに適用することが許可されているアジュバントは、水酸化アルミニウムである。
【００７６】
別の態様では、本発明は、ワクチンキットを提供する。ワクチンキットは、上述したワクチン組成物に対応しており、本発明のペプチド又は本発明のポリヌクレオチドを有効なワクチン成分として含んでよく、且つ抗ＴＮＦ剤を含んでよく、且つ更に１つ以上の任意の成分を含んでよい。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明のワクチンキットは、本発明のペプチド、並びに／又はペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含む。別の実施形態では、本発明のワクチンキットは、本発明のポリヌクレオチド、並びに／又はポリヌクレオチド及び抗ＴＮＦ剤を含有する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるペプチドを発現させることが可能な形態であることが好ましく、本発明のポリヌクレオチドが作用可能に連結される発現ベクターの形態で提供されることがより好ましい。
【００７８】
キットは通常、中に特定の物質が入っている１つ以上の容器（例えば瓶、平板、管、及び皿）のパッケージを含む。キットは、キットを構成する個々の容器の何れかに入っている個々の物質を使用するための指示を有することが好ましい。更に、本発明のキットは、複数の異なる組成物が含まれるパッケージであってよい。組成物の形態は上述の通りであってよく、組成物が溶液の形態である場合、組成物を容器に入れてよい。本発明のキットは、物質Ａ及びＢが混合されて単一の容器に含まれるように、或いはそれぞれの容器に含まれるように設計されてよい。「指示」は、紙又は他の種類の媒体に書き込まれてよく、或いは印字されてよい。代替的に、「使用説明」は、磁気テープ又は電子媒体、例えばコンピュータ可読ディスク又はテープ及びＣＤ‐ＲＯＭの形態であってよい。更に、本発明のキットは希釈液、溶媒、洗浄液、又は他の試薬が入った容器を含んでよい。更にキットは、プロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じる座瘡の防止／処置のために必要な使用説明を予め含んでよい。
【００７９】
上述した本発明のワクチンの使用は、プロピオニバクテリウム・アクネスの感染によって生じる炎症（座瘡）を効率的に防止／処置することを可能にする。
【００８０】
即ち、プロピオニバクテリウム・アクネスによって生じる炎症を処置又は防止する方法は、治療有効量の本発明のペプチド又は治療有効量の本発明のポリヌクレオチドと、任意選択的に治療有効量の抗ＴＮＦ剤を含有するワクチンとを個体に投与ステップを含む。
【００８１】
本明細書で使用する用語「治療有効量」とは、ペプチド又はポリヌクレオチドが所望の治療効果又は予防効果を発揮することを可能にする、ペプチド又はポリヌクレオチドの量を表す。抗ＴＮＦ剤が存在する実施形態では、抗ＴＮＦ剤もまた治療有効量が存在してよい。治療有効量はワクチンが投与される個体の年齢、体重、及び他の健康状態、処置される炎症の状態、及び投与の方法によって異なる場合がある。全ての場合に、最も基本的なレベルの話として、所望の効果とは、本発明の治療法を採用する前の患者の腫瘍組織における腫瘍細胞と比較した場合に、患者の腫瘍組織における腫瘍細胞が退縮、縮小、又は消失することである。皮下投与の特定の実施形態では、ワクチンの投与は、体重１ｋｇ当たり５〜１０μｇのペプチド又は体重１ｋｇ当たり１０〜５０μｇのポリヌクレオチドが１回の投与で与えられてよい。抗炎症作用に充分な免疫応答を誘発するために、ワクチンは複数回、２回以上、患者に投与されてよい。特定の実施形態では、投与は予め定められた間隔で行われる。
【００８２】
別の実施例は以下の通りである。配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドに基づくＭＡＰ及び配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドに基づくＭＡＰの混合物（重量比は１：１である）を含むワクチンの場合、投与は皮下注射を介して、３日乃至５日の間隔で５回程度、生理食塩水の形態で１回の注射毎に各ペプチドが１００〜５００μｇ投与されるように行われてよい。
【００８３】
パッチを介して投与する場合、１回の用量は少量でよく、投与回数は低減されてよく、個体はパッチを使用して自分自身で処置することができる。
【００８４】
本明細書で使用する用語「患者又は個体」とは、個々のヒト、及びヒト以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ブタ、ウシ、及びサル）を表す。
【００８５】
本発明は、本発明のペプチドの何れかを特異的に認識する抗体を提供する。即ち、本発明の抗体は、ペプチドの何れかに特異的に結合することができる。特定の実施形態では、抗体は、（１）配列番号１若しくは３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドに、又は（２）配列番号１若しくは３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドからＭＡＰプロセスによって合成される多価抗原ペプチドに、結合される抗体であることが好ましい。
【００８６】
本明細書で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びそれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦｃフラグメント）を表す。抗体の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、及び抗イディオタイプ抗体を含むが、それらに限らない。
【００８７】
本発明の抗体は、本発明が関係する技術分野で公知の従来の方法によって生成されてよい。例えば抗体は、本発明のペプチドを哺乳動物の生体に投与し、抗体が生体内で産生されるように免疫応答を生じさせることによって得ることができる。この場合に得られる抗体は、一般的にポリクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、本発明のペプチドを使用して従来の公知のハイブリドーマ技術によって産生することができる。代替的に、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ技術又は化学合成の適用によって産生することができる。
【００８８】
本発明の抗体の使用は、本発明のペプチドを容易に精製することを可能にする。例えば、本発明のベクター又は本発明の形質転換体を使用して細胞内で発現させたペプチドを、本発明の抗体を使用してアフィニティ精製することによって、ペプチドを効率的に収集することが可能である。
【００８９】
本発明の抗体は、抗体が本発明のペプチドに特異的に結合することを前提として、どんな抗体でもよい。抗体は、本明細書に特に記載する個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、キメラ抗体を調製する方法、ペプチド抗原を調製する方法等に関して限定されない。従って、上述した方法以外の方法によって得られる抗体も本発明に包含される。
【００９０】
プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンの有効性を判定するための本発明の方法は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、生体から採取した試料中に存在するか否かを検出する検出ステップを含むことだけが必須要件であり、他の特定のステップ並びに使用する器具及び装置に関しては特に限定されない。
【００９１】
ペプチドをコードするポリヌクレオチドが検出ステップで検出される場合、本発明のワクチンの被検者への投与は、プロピオニバクテリウム・アクネスによって生じた炎症の効果的な抑制をもたらした可能性が高いと判定することができる。特に、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドが検出される場合、本発明のワクチンはプロピオニバクテリウム・アクネスに対して有効である可能性があると判定される。
【００９２】
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法は、特に限定されない。例えば、当該方法は、ＰＣＲ増幅による検出、又はＰＣＲ産物の塩基配列を決定することによる検出であってよい。ＰＣＲ産物の塩基配列を決定することによって、ワクチン接種の効果を発揮することができるか否かをより正確に判定することが可能である。ワクチン接種の効果が発揮できるか否かは、ＰＣＲフラグメントが増幅によって生成されるか否かによって判定されてもよい。例えば、上記ポリヌクレオチドを増幅させるための特異的プライマーを使用して、所望の長さのフラグメントが増幅によって生成された場合（ＰＣＲ検出の結果が陽性であった場合）、被検者は上記ポリヌクレオチドを保持するプロピオニバクテリウム・アクネスに感染している可能性が高く、従ってワクチン接種の効果は高く期待されると判定される。他方、所望の長さを持つフラグメントが生成されなかった場合（ＰＣＲ検出の結果が陰性であった場合）、ワクチン接種の効果はほとんど期待されないと判定される。ＰＣＲ増幅の前に、被検者から採取された試料に含まれ得るプロピオニバクテリウム・アクネスを、試料を培養することによって成長させてよい。
【００９３】
プロピオニバクテリウム・アクネスに対する本発明のワクチンを使用するか否かを判定する方法は、生体から採取した試料中のプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列が存在するか否かを検出することによって行われてよい。１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列が存在するか否かの検出は、ＰＣＲ増幅による検出、及びＰＣＲ産物の塩基配列を決定することによる検出であってよい。この決定は、被検者の炎症がプロピオニバクテリウム・アクネスに由来することを示す。これは、ワクチンを使用するための基礎としてよい。
【００９４】
後述する実施例で、プロピオニバクテリウム・アクネスの炎症を引き起こすために予め定められた細菌性細胞濃度以上のプロピオニバクテリウム・アクネスが腹部正中に皮内注射されたマウスのような、ヒト以外の哺乳動物であるモデル動物と、当該モデル動物を作製する方法もまた、本発明に包含される。モデル動物において、プロピオニバクテリウム・アクネスの炎症は、炎症を引き起こす従来の方法より効率的に引き起こされる。抗座瘡薬剤の開発にこれまで使用されてきた判定システムは、薬剤が塗布されるという前提に基づいたシステムである。従ってこれまでは、ワクチンの開発において、ワクチンの効果をインビボで判定できる確実な判定システムは構築されてこなかった。ワクチンの有効性を判定する方法、モデル動物、及びモデル動物を作製する方法は、プロピオニバクテリウム・アクネスに対するワクチンの開発時に使用できることが好ましい。
【００９５】
以下で、実施例に関連して本発明の実施形態を更に詳しく説明する。本発明は、以下の実施例に限定されず、その細部に関して変形されてもよいことに留意されたい。本発明は上記実施形態の記載に限定されず、当業者が特許請求の範囲内で変化されてよい。様々な実施形態で開示した技術的手段の適切な組合せに基づく実施形態は、本発明の技術的範囲に包含される。本明細書に記載した文書は全て、引用を以て本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９６】
［実施例１‐プロピオニバクテリウム・アクネスの培養］
プロピオニバクテリウム・アクネス（以下、「Ｐ．ａｃｎｅｓ」と略す）の株（ＡＴＣＣ６９１９）を、理研バイオリソースセンターから調達した（ＪＣＭカタログ番号６４２５）。調達したＰ．ａｃｎｅｓの株を、センターからの培養条件の情報に従って培養した。特に、嫌気グローブボックスで、Ｐ．ａｃｎｅｓの株を１００ｍｌのＧＡＭ培地（日本水産株式会社製）に懸濁させ、バイアルを用いて３７℃で３日間嫌気培養した。
【００９７】
［実施例２‐Ｐ．ａｃｎｅｓによるマウスの皮膚における皮内炎症の惹起］
脱気した生理食塩水にＰ．ａｃｎｅｓの生細菌細胞を、嫌気状態を維持しながら投入して、５×１０７個／ｍｌ、１×１０８個／ｍｌ、又は５×１０８個／ｍｌのＰ．ａｃｎｅｓの生細菌細胞の懸濁液を調製した。窒素ガスを噴射することによって嫌気状態を維持した。Ｐ．ａｃｎｅｓの生細菌細胞の数は、Ｒａｍｓｔａｄ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，２００６，５，６６‐７２を参考にして、分光光度計によって測定された５５０ｎｍ時の０．９８〜１．０２のＯＤ測定値が５×１０８個／ｍｌに相当するという前提に基づいて算出した。
【００９８】
調製したＰ．ａｃｎｅｓの懸濁液５０μｌを、雄のＢａｌｂ／ｃマウス（９〜１０週齢）の剃毛した腹部正中、頸部、腰背部、尾根背部、及び耳介に皮内注射した。懸濁液を皮内注射した個々の部分の炎症面積（長軸×短軸：ｍｍ２）を予め定められた時間に測定した。各群を５匹で構成した。
【００９９】
その結果、細菌性細胞濃度が５×１０８個／ｍｌであったＰ．ａｃｎｅｓの懸濁液が注射された群では、炎症が明確に確認された。図１は、注射から５日後に観察された個々の部分の炎症面積の結果を示すグラフである。図１に示される通り、炎症は、懸濁液が皮内注射された個々の部分に観察され、腹部正中の皮内部分の炎症面積が最大であった。即ち、マウスの皮内炎症を惹起させる場合、腹部正中への皮内注射が最も効果的であった。耳介の炎症は、観察した部分の中で最も軽微であった。図２は、懸濁液が腹部正中に皮内注射された後の個々の時間における腹部正中の炎症面積の結果を示すグラフである。図２に示される通り、腹部正中の炎症面積は、Ｐ．ａｃｎｅｓの注射後５日目が最大であった。
【０１００】
それと対照的に、細菌性細胞濃度がそれぞれ５×１０７個／ｍｌ及び１×１０８個／ｍｌであったＰ．ａｃｎｅｓの懸濁液が注射された群では、何れの部分でも、また何れの時間でも炎症を全く惹起できなかった。
【０１０１】
［実施例３‐ペプチドの調製］
配列番号１によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドであるＰｅｐＡの粉末、又は配列番号３によって示されるアミノ酸配列から成るペプチドであるＰｅｐＤの粉末を生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、８００μｇ／ｍｌのペプチド溶液を調製した。
【０１０２】
比較例として、ジェンバンク／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪに受入番号ＡＡＴ８１８５２で登録されたアミノ酸配列から成るプロピオニバクテリウム・アクネスの膜タンパク質における１０番目〜２６番目のアミノ酸残基に対応するペプチドであるＰｅｐＢと、ジェンバンク／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪに受入番号ＹＰ＿０５５５１８で登録されたアミノ酸配列から成るプロピオニバクテリウム・アクネスの膜タンパク質における１４５番目〜１６６番目のアミノ酸残基に対応するペプチドであるＰｅｐＣとを使用した。表１は個々のペプチドのアミノ酸配列に関する情報を示す。比較例として使用した配列は、抗体の作製にあたって抗原の有力な候補となるアミノ酸配列であり、即ち親水性アミノ酸及び電荷に富むアミノ酸配列であり、ターン構造を持つアミノ酸配列から選択された。更に、上記受入番号で登録されたアミノ酸配列から成るタンパク質は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｃｎｅｓ，  ａ  Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０５，６７１−６７３に記載されたゲノム解析の結果、発現することが推定されるタンパク質である。
【表１】
2017520556.tif 000003
【０１０３】
［実施例４‐Ｐ．ａｃｎｅｓが惹起した炎症に対するペプチドＰｅｐＡの抗炎症効果］
実施例２において、Ｐ．ａｃｎｅｓが惹起した炎症の面積は、Ｐ．ａｃｎｅｓ（５×１０８個／ｍｌ）を腹部正中に５０μｌ皮内注射してから５日経過後が最大であった。従って、個々のペプチドの抗炎症効果は、同じ条件下で、即ちＰ．ａｃｎｅｓ（５×１０８個／ｍｌ）を腹部正中に５０μｌ皮内注射し、且つ注射から５日後に炎症面積（ｍｍ２単位）を測定することによって、判定された。図３は抗炎症効果を検査するための手順を示す。
【０１０４】
図３は、抗炎症効果を検査するための手順を模式的に示す図である。図３に示される通り、Ｐ．ａｃｎｅｓの生細菌細胞の注射の１８日前（図３の「０」日目）、注射の１１日前（図３の「７」日目）、及び注射の４日前（図３の「１４」日目）に、即ち合計３回にわたって、ＰｅｐＡ（４０μｇ／５０μｌ／１匹）を雄のＢａｌｂ／ｃマウス（ＰｅｐＡの最初の接種時に７週齢）の背部に皮内接種した。次いで、Ｐ．ａｃｎｅｓをマウスの腹部正中に皮内注射し、注射の５日後（図３の「２３」日目）に炎症面積を測定した。各群を１０匹のマウスで構成した。比較例として、ＰＢＳをＰｅｐＡ無しで投与したマウス群、及びＰｅｐＡの代わりにＰｅｐＢ又はＰｅｐＣを投与したマウス群を調製し、同様にＰ．ａｃｎｅｓをこれらの群に注射した。これらの結果を図４に示す。
【０１０５】
図４は、ＰｅｐＡの抗炎症効果の結果を示すグラフである。図４に示される通り、ＰｅｐＡが投与された群は、ＰＢＳが投与された対照群と比較して、統計的に有意な（Ｐ＝０．００８６５（Ｐ＜０．０１））炎症面積の低減を示した。即ち、ＰｅｐＡは統計的に有意にＰ．ａｃｎｅｓが惹起する炎症に対する抗炎症効果を示す。ＰｅｐＢが投与された群の場合、Ｐ＝１である。ＰｅｐＣが投与された群の場合、Ｐ＝０．１６５５である。これらの数字は統計的に有意ではないので、ＰｅｐＢ及びＰｅｐＣは、Ｐ．ａｃｎｅｓが惹起する炎症に対する抗炎症効果を示さないとみなされる。
【０１０６】
上記の結果は、ペプチドＰｅｐＡを含有する組成物が、Ｐ．ａｃｎｅｓに対するワクチン即ち座瘡ワクチンとして有効であることを示す。
【０１０７】
［実施例５‐Ｐ．ａｃｎｅｓが惹起した炎症に対するペプチドＰｅｐＡ及びＰｅｐＤの抗炎症効果］
Ｐ．ａｃｎｅｓを注射する前にマウスに投与されるペプチドがＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、及びＰｅｐＣからＰｅｐＡ及びＰｅｐＤに変更されたことを除いて、実施例４と同じ条件下で炎症惹起システムを用いて、個々のペプチドの抗炎症効果を検査した。結果を図５に示す。
【０１０８】
図５は、ＰｅｐＡ及びＰｅｐＤの抗炎症効果の結果を示すグラフである。図５に示される通り、ＰｅｐＡが投与された群は、実施例４の結果と同様に、ＰＢＳが投与された対照群と比較して、統計的に有意な（Ｐ＝０．００１２（Ｐ＜０．０１））炎症面積の低減を示した。更に、ＰｅｐＤが投与された群は、ＰＢＳが投与された対照群と比較して、統計的に有意な（Ｐ＝０．００１７５（Ｐ＜０．０１））炎症面積の低減を示した。
【０１０９】
上記の結果は、ペプチドＰｅｐＡ又はＰｅｐＤを含有する組成物が、Ｐ．ａｃｎｅｓに対するワクチン即ち座瘡ワクチンとして有効であることを示す。
【０１１０】
［実施例６‐座瘡患者が保有している株の同定］
［１６Ｓ  ｒＤＮＡの抽出］
座瘡患者の患部から採取した膿を、ＧＡＭ平板寒天培地にて３７℃で嫌気培養し、細菌性細胞の一部を採取した。採取した細菌性細胞をＧＡＭ平板寒天培地に移植し、嫌気培養して単一のコロニーを形成させた。単一のコロニーから細菌性細胞を採取し、２０ｍＭのＮａＯＨ水溶液に懸濁させた。懸濁液を９４℃で３分間加熱し、細菌性細胞を溶解させて１６Ｓ  ｒＤＮＡを抽出した。抽出した１６Ｓ  ｒＤＮＡを使用して、患者が感染した細菌性細胞の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、３人の座瘡患者から採取された３組の細菌性細胞の各々に対してそれぞれ決定された。
【０１１１】
［１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の決定］
抽出した１６Ｓ  ｒＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして使用した。更に、プライマーとして、プライマー９Ｆ（フォワードプライマー）：５’‐ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ‐３’（配列番号５）と、プライマー８００Ｒ（リバースプライマー）：５’‐ＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ‐３’（配列番号６）とを使用した。各サイクルを９４℃で３０秒間のステップ、５５℃で６０秒間のステップ、及び７２℃で６０秒間のステップで構成し、３０サイクルで構成されるＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ社製）によって実施された。反応後に、ＰＣＲ産物を精製した。次いで、精製したＰＣＲ産物を使用してサイクルシーケンス反応を実施した。サイクルシーケンス反応で得た産物を精製し、ＡＢ１  ＰＲＩＳＭ  ３１０遺伝子解析システム（アプライド・バイオシステムズ社製）に供し、解析ソフトウェアＢｉｏＥｄｉｔを使用して塩基配列を決定した。サイクルシーケンス反応で使用されるプライマーは、上記のプライマー９Ｆとプライマー５３６Ｒ：５’‐ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ‐３’（配列番号７）であった。各サイクルを９６℃で１０秒間のステップ、５０℃で５秒間のステップ、及び６０℃で４分間のステップで構成し、サイクルシーケンス反応を２５サイクルで構成した。
【０１１２】
［塩基配列決定の結果］
塩基配列決定の結果は、株化された患者由来の３つの分離菌株（患者株１〜３）の各々において、増幅部における１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号１６）が、Ｐ．ａｃｎｅｓのＡＴＣＣ６９１９株における対応する塩基配列（配列番号８）と同一の配列を有することを示した。図６は、患者株１に関する結果を示す。従って、患者由来の３つの分離された細菌細胞はＰ．ａｃｎｅｓであると同定された。
【０１１３】
［実施例７‐患者由来のＰ．ａｃｎｅｓが惹起する炎症に対するペプチドＰｅｐＡの抗炎症効果］
マウスに注射するＰ．ａｃｎｅｓの細菌性細胞が、実施例６で単離した座瘡患者由来のＰ．ａｃｎｅｓの細菌性細胞であることを除いて、実施例５と同じ手順によって、ＰｅｐＡの抗炎症効果を検査した。その結果を図７に示す。
【０１１４】
図７は、ＰｅｐＡによる免疫処置後に、患者株１〜３（Ｐ１‐Ｐ．ａｃｎｅｓ〜Ｐ３‐Ｐ．ａｃｎｅｓ）をマウスの腹部正中に皮内注射し、注射後５日目に炎症面積を測定した結果を示すグラフである。図７に示される通り、ＰｅｐＡを投与した群は、ＰｅｐＡの代わりにＰＢＳを投与した対照群と比較して、患者株１に関してはＰ＝０．０２５２（Ｐ＜０．０５）を、患者株２に関してはＰ＝０．０４７６（Ｐ＜０．０５）を、患者株３に関してはＰ＝０．０２３７（Ｐ＜０．０５）を示した。即ち、ＰｅｐＡの投与は、患者株の各々の注射に関して、炎症面積を統計的に有意に低減することを可能にした。これは、ＰｅｐＡが座瘡ワクチンとして幅広く有効であることを示唆している。
【０１１５】
［実施例８‐座瘡患者由来のＰ．ａｃｎｅｓにおいてＰｅｐＡ又はＰｅｐＤをコードする塩基配列の検査］
ＰｅｐＡ又はＰｅｐＤがワクチンとして効果的に働くためには、標的のＰ．ａｃｎｅｓ株がＰｅｐＡ又はＰｅｐＤを含むタンパク質を有することが望ましい。従って、標的のＰ．ａｃｎｅｓ株がＰｅｐＡ又はＰｅｐＤを含むタンパク質を有するか否かについて、ＰＣＲを実行し、且つＰＣＲ産物の塩基配列を決定して確認することによって検査した。
【０１１６】
［ＰＣＲによるＰｅｐＡの確認］
ここでＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列の検出に使用したプライマーは、プライマーＬ：５’‐ＧＡＴＧＡＡＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡ‐３’（配列番号９）と、プライマーＲ：５’‐ＧＣＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣＧＣＴＡＧＡ‐３’（配列番号１０）であった。ここで実施したＰＣＲは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ社製）を使用して、各サイクルを９５℃で１５秒間のステップ、６０℃で２０秒間のステップ、及び７２℃で３０秒間のステップで構成し、３５サイクルで構成した。
【０１１７】
その結果、検出された患者由来のＰ．ａｃｎｅｓから増幅によって所望の長さのＰＣＲフラグメントが得られ、従ってＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列の存在が推定された。これは、ＰｅｐＡに対応するタンパク質がＰｅｐＡと同一のアミノ酸配列を有することを示唆している。
【０１１８】
更に、２１人のボランティアから採取した試料について、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しているか検査したところ、２１例中１９例が陽性であった。本実施例で使用する用語「陽性」は、特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって所望の長さのフラグメントが生成されたことを示す。本実施例で使用する用語「陰性」は、特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって所望の長さのフラグメントができなかったことを示す。
【０１１９】
同様に、２１人のボランティアから採取した試料について、Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡを有しているかをＰＣＲによって検査した。結果は、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列の検査で陽性であった１９例が１６Ｓ  ｒＤＮＡの検査でも陽性であり、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列の検査で陰性であった２例が１６Ｓ  ｒＤＮＡの検査でも陰性であることを示した。ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列を確認するためのＰＣＲ検出で陰性であった２例の結果は、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列が２人のボランティアに保持されていないことを示すものではなく、Ｐ．ａｃｎｅｓの細菌性細胞の数が非常に少ないので、細菌性細胞を検出できなかったことを示している。以上の結果から、Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡが確認された１９例においては、ＰｅｐＡのアミノ酸配列を含むタンパク質が存在することが示唆された。
【表２】
2017520556.tif 000004
【０１２０】
更に、上記と同様に、別の１１人のボランティアから採取した試料について、Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡを有しているかをＰＣＲによって検査した。結果は、各々の試料がＰ．ａｃｎｅｓ陽性であることを示した。更に、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しているかをこれらの１１例で検査し、１１例全部が陽性であることが明らかになった。表３は、１１例の結果と共に、陽性であることが分かった１９例の結果を示す。
【表３】
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【０１２１】
［ＰｅｐＡ及びＰｅｐＤをコードする塩基配列の確認］
５人のボランティアから採取した試料の各々及び実施例１に記載したＰ．ａｃｎｅｓに関して、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及びＰｅｐＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰｅｐＡをコードするＤＮＡを増幅するにあたって、プライマーＬ（配列番号９）及びプライマーＲ（配列番号１０）をプライマーとして使用した。ＰｅｐＤをコードするＤＮＡを増幅するにあたっては、プライマーｏｍｌＬ：５’‐ＧＧＴＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＣＴＴＣ‐３’（配列番号１４）と、プライマーｏｍｌＲ：５’‐ＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＣＧＡＴＣＴ‐３’（配列番号１５）とをプライマーとして使用した。ここで実施したＰＣＲは、（ｉ）９５℃で５分間のステップ、その後の（ｉｉ）各々が９５℃で１５秒間のステップ、５３℃で２０秒間のステップ、及び７２℃で３０秒間のステップで構成されたサイクルを３５回、並びにその後の（ｉｉｉ）７２℃で７分間のステップ及び２５℃で１０分間のステップで構成した。表４はＰＣＲの結果を示す。
【０１２２】
表４に示される通り、全ての試料において、ＰｅｐＡに関しては所望のサイズのＰＣＲ産物が増幅によって生成された。所望のサイズのＰＣＲ産物が増幅によって生成された事例は「陽性」として示されている。ＰｅｐＤに関しては、患者株Ｄの試料を除いて、所望のサイズのＰＣＲ産物が増幅によって生成された。
【０１２３】
続いて、推定アミノ酸配列を決定するためにＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、遺伝子解析装置（３１３０×ｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）、配列解析ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ  ５．３．１）、及びＫＢ  ＢａｓｅＣａｌｌｅｒ（何れもアプライド・バイオシステムズ社製）を使用して行われた。表４はその結果を示す。表４に示される通り、全ての試料でＰｅｐＡの配列は保存されていた。即ち、こうして得られた推定アミノ酸配列は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列と同一であった。他方、患者株Ｃ及びＥの試料では、ＰｅｐＤの配列は保存されていた。即ち、こうして得られた推定アミノ酸配列は、配列番号３によって示されるアミノ酸配列と同一であった。患者株Ａ及びＢの試料では、推定アミノ酸配列は１つのアミノ酸の変異を有していた。特に、配列番号３によって示されるアミノ酸配列のＮ末端から１１番目に位置するアミノ酸残基がＧｌｎからＬｙｓに変化した。この変異は、上述の実施例で個々のペプチドの抗炎症効果を判定するために使用した理研バイオリソースセンター由来の株でも観察された。患者株Ａは、実施例６における座瘡患者由来の試料である。
【表４】
2017520556.tif 000006
【０１２４】
しかしながら、実施例５及び図５に示される通り、ＰｅｐＤの単回投与は、ＰｅｐＤのアミノ酸配列に変異を含む理研バイオリソースセンター由来の株によって惹起した炎症に対して、抗炎症効果をもたらすことができる。これは、ＰｅｐＤが、１つのアミノ酸の変異を有するＰｅｐＤを含む株によって惹起した炎症に対しても、ワクチンとして有効に働くことができることを示している。
【０１２５】
同様に、表５に示す３０人のボランティアから採取した試料のＰ．ａｃｎｅｓにおいて、ＰｅｐＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及びＰｅｐＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、それぞれのＰＣＲ産物の塩基配列を決定して、それぞれの推定アミノ酸配列を決定した。表５はその結果を示す。
【表５】
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【０１２６】
表５に示される通り、ここで検査した全ての試料で、ＰｅｐＡのアミノ酸配列は完全に保存されていた。表４及び５の結果は、実際の患者由来のＰ．ａｃｎｅｓのＰｅｐＡ配列が非常によく保存されたことを示す。
【０１２７】
他方、検査した３０例中２０例において、ＰｅｐＤのアミノ酸配列は完全に保存されていた（６６．７％）。検査した事例中６例においては、アミノ酸配列が部分的に変異した（１１Ｇｌｎ→Ｌｙｓ）。これは、マウスを用いた試験によってワクチン投与の有効性が明らかになった理研バイオリソースセンター株と同等の部分的変異である。従って、ワクチン効果の有効性の観点から、ＰｅｐＤ配列は３０例中２６例で有効であると推定される（８６．７％）。即ち、ＰｅｐＤ配列はよく保存されていた。
【０１２８】
以上に鑑みて、ＰｅｐＡ及びＰｅｐＤは、患者の細菌性細胞によく保存される配列を有しており、従って患者のためのワクチンとして非常に有効であると考えられる。
【０１２９】
［実施例９‐Ｐ．ａｃｎｅｓに対するワクチンの使用］
［ワクチンの調製］
上述の通り、実験例５でマウスを使用した座瘡炎症惹起試験システムにおいて、２種類の単鎖ペプチド（ＰｅｐＡ及びＰｅｐＤ）は抗炎症効果を有することが明らかになった。これらのペプチドがより効果的に働くようにするために、ＰｅｐＡ及びＰｅｐＤのＭＡＰペプチドをＭＡＰプロセスによって合成した。こうして得られた合成ペプチドは、ＭＡＰ構造に結合されたＰｅｐＡ又はＰｅｐＤの単鎖ペプチドの７〜１３分子から構成された。ＰｅｐＡ及びＰｅｐＤそれぞれのＭＡＰペプチドを混合したＭＡＰペプチド混合液を調製し、ワクチンとして使用した。
【０１３０】
混合液の調製は、次のように行われた。最初に、個々のＭＡＰペプチドを調製し、次いで蒸留水で透析し、凍結乾燥して粉末状にした。次に、それぞれのＭＡＰペプチドの濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように、それぞれの粉末を生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に溶解した（結果的に得られた各々の溶液を以下、「ＰＡ‐ＭＡＰ溶液」と呼ぶ）。ＰＡ‐ＭＡＰ溶液をエンドトキシン検査及び細胞毒性検査にかけた。エンドトキシンの量はＮＩＨによる許容量（５ＥＵ以下／ｋｇ体重／１回の投与）を満たした。更に、細胞毒性検査では、１０μｌの試験ペプチド溶液及び９０μｌの末梢血単核球（プレーンＲＰＭＩ‐１６４０で細胞２×１０６個／ｍｌ）を、３７℃で２４時間共培養した。細胞生存率は、生理食塩水を添加した末梢血単核球を培養した対照と略同等であり（相違は＋／−５％以下）であり、従って毒性は認められなかった。
【０１３１】
［症例１］
調製したＰＡ‐ＭＡＰ溶液の１００μｌを座瘡患者の上腕に、５日間隔で５回皮下接種した。座瘡患者は、実施例８において患者株Ａを保有する患者であった。図８は観察結果を示す。
【０１３２】
図８に示される通り、治療前（初回投与時）は、座瘡菌の皮下増殖のため、皮膚の全領域が膨隆し（図中の矢印で示す）、炎症を合併していた。初回のワクチン接種から１ヶ月後、座瘡の膨隆は依然として観察されたが、２箇所に分割されており、炎症は改善され、局在化した。最後のワクチン接種から３ヶ月後、炎症は徐々に減少し、座瘡は瘢痕に変わり、膨隆も平坦化しつつあった。治療過程にあったため、色素沈着が観察された。ワクチン接種によって生じる有害な現象は観察されなかった。
【０１３３】
[症例２]
実施例８における患者株Ｃを保有する座瘡患者から試料を採取し、ＰＣＲによりＰ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡを増殖することによって、座瘡患者がＰ．ａｃｎｅｓに感染したかを確認した。結果は、座瘡患者がＰ．ａｃｎｅｓ陽性であることを示した。Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡの増殖は、（ｉ）プライマー９Ｆと同一の配列から成るプライマーＬ１と、（ｉｉ）プライマーＲ２：５’‐ＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴ‐３’（配列番号１３）とを使用して、（ｉ）９５℃で５分間のステップ、及びその後の（ｉｉ）９５℃で１５秒間のステップ、５５℃で２０秒間のステップ、及び７２℃で３０秒間のステップで構成されたサイクルを３５回、及び（ｉｉｉ）７２℃で７分間のステップで構成されたＰＣＲによって、行われた。
【０１３４】
調製したＰＡ‐ＭＡＰ溶液の３００μｌを座瘡患者の上腕に、３日間隔で５回皮下接種した。図９は観察結果を示す。
【０１３５】
図９に示される通り、治療前（初回投与時）に観察された頬の炎症の全領域が、初回のワクチン接種から１ヶ月後及び３ヶ月後には改善された。ワクチン接種によって生じる有害な現象は観察されなかった。
【０１３６】
［症例３］
実施例８における患者株Ｄを保有する座瘡患者から試料を採取し、症例２の場合と同じ条件下でＰＣＲによりＰ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡを増幅することによって、座瘡患者がＰ．ａｃｎｅｓに感染したか否かを確認した。結果は、座瘡患者がＰ．ａｃｎｅｓ陽性であることを示した。
【０１３７】
調製したＰＡ‐ＭＡＰ溶液の３００μｌを座瘡患者の上腕に、３日間隔で５回皮下接種した。図１０は観察結果を示す。
【０１３８】
図１０に示される通り、治療前（初回投与時）に観察された鼻の周囲の炎症の全領域が、初回のワクチン接種から１ヶ月後及び３ヶ月後には改善された。ワクチン接種によって生じる有害な現象は観察されなかった。
【０１３９】
［症例４］
実施例８における患者株Ｅを保有する座瘡患者から試料を採取し、症例２の場合と同じ条件下でＰＣＲによりＰ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡを増幅することによって、座瘡患者がＰ．ａｃｎｅｓに感染したか否かを確認した。結果は、座瘡患者がＰ．ａｃｎｅｓ陽性であることを示した。
【０１４０】
調製したＰＡ‐ＭＡＰ溶液の３００μｌを座瘡患者の上腕に、５日間隔で５回皮下接種した。図１１は観察結果を示す。
【０１４１】
図１１に示される通り、治療前（初回投与時）に観察された頬の広い領域の炎症の全領域が、初回のワクチン接種から１ヶ月後及び３ヶ月後には改善された。ワクチン接種によって生じる有害な現象は観察されなかった。
【０１４２】
上記の結果は、ペプチドＰｅｐＡ及びペプチドＰｅｐＤを含有する組成物がＰ．ａｃｎｅｓに対するワクチン即ち座瘡ワクチンとして有効であることを示す。
【０１４３】
本発明の使用は、座瘡の予防及び処置のための免疫療法を可能にする。従って、本発明は医療分野、医薬品分野等に適用可能であり、非常に有用である。
【０１４４】
［実施例１０‐抗ＴＮＦ剤を含む座瘡ワクチンの調製］
５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５５と５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５６とを５０ｍｇの抗ＴＮＦ剤と組み合わせることによって、本発明に係るワクチンを調製した。抗ＴＮＦ剤は商品名エンブレルによる市販品を調達した。対照ワクチンは、５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５５と５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５６とを、抗ＴＮＦ剤無しで組み合わせることによって調製した。全部で１２週間にわたって毎週１回、各々のワクチンを皮下注射によって患者に投与した。全部で４か月にわたって毎月１回、以下の血液試験即ちＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、ヘモグラム、生化学検査、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧサブタイプを実施した。プロピオニバクテリウム抗体価（ＥＬＩＳＡアッセイ）及びサイトカインアッセイを得た。アッセイはＰ．ａｃｎｅｓ菌に対する抗体価及びＴ細胞応答の測定を含んでおり、ワクチンの投与前及び投与後に患者から抹消血試料を使用したワクチンペプチドを得た。
【０１４５】
［実施例１１‐抗ＴＮＦ剤を含む座瘡ワクチンの調製及び投与］
本発明に従って合計８つのワクチンを調製し、ワクチンの各々をプロピオニバクテリウム・アクネスに感染した異なる患者に投与した。投与は、０週目から始めて毎週１回ワクチンを各患者の臀部に注射することから構成された。こうして、初回の投与後毎週、別の注射を患者の臀部に投与した。０週目に８人の患者の各々について感染部位の写真を撮影し、その後４週間毎に経過写真を撮影した。写真は、初期の座瘡斑点の数並びにワクチンへの応答による経時的な座瘡斑点の進行及び／又は退縮を同定するために使用した。加えて、０週目に８人の患者の各々に血液検査を実施し、その後４週間毎に経過の血液検査を実施した。
【０１４６】
ワクチンのうちの６つはペプチド及び抗ＴＮＦ剤の組合せを含み、ワクチンのうちの２つはペプチドだけを含むものであった。即ち、抗ＴＮＦ剤は存在しなかった。０週目で、初期ワクチン即ち６つのペプチド／抗ＴＮＦ剤ワクチンは、５００μｇのペプチド抗ＡＢＦ１５５と、５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５６とを５０ｍｇの抗ＴＮＦ剤（エンブレルの商品名で市販されている）と組み合わせることによって調製された。０週目に、初期ワクチン即ち２つの対照ワクチンは、５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５５と、５００μｇのペプチド抗原ＡＢＦ１５６とを、抗ＴＮＦ剤無しで組み合わせることによって調製された。０週目の後に投与されるワクチンの各々について、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤の量は同じであった。しかしながら、０週目の後に投与されるワクチンの各々における抗ＴＮＦ剤の量は、患者の全身状態に従って調整されてよいであろう。例えば原ワクチンは５０ｍｇの抗ＴＮＦ剤から構成されたが、その後の注射はこの量と同量、より多量、又はより少量を含有してもよかったかもしれない。改善、例えば座瘡斑点の退縮が観察される特定の実施形態では、より少量の抗ＴＮＦ剤が使用されてもよく、患者の状態の悪化、例えば座瘡斑点の数の増加が観察される場合、より多量の抗ＴＮＦ剤が使用されてもよかったであろう。
【０１４７】
患者＃１乃至＃８の各患者のデータを表Ａ乃至Ｈにそれぞれ示す。表Ａ及びＢ（患者＃１及び＃２）に示される通り、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含むワクチンの座瘡患者への投与は、結果的に完全な応答をもたらした。座瘡斑点の数は（０週目の８個から１２週目の０個まで）著しく減少した。表Ｃ（患者＃３）に示される通り、ペプチドだけを含むワクチンの座瘡患者への投与は、結果的に０乃至４週目に安定した疾患応答をもたらした。座瘡斑点の数は（１週目の４個から４週目の４個まで）基本的に変わらなかった。しかしながら、次の１２週間即ち４週目乃至１６週目の注射は、抗ＴＮＦ剤を含むワクチンを使用した。その結果、座瘡斑点の数はこの１２週間にわたって（４週目の４個から１６週目の０個まで）減少した。表Ｄ（患者＃４）に示される通り、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含むワクチンの座瘡患者への投与は、結果的に部分的応答をもたらした。座瘡斑点の数は（０週目の７個から１０週目の３個まで）著しく減少した。表Ｅ（患者＃５）に示される通り、ペプチドだけを含むワクチンの座瘡患者への投与は、結果的に部分的応答をもたらした。座瘡斑点の数は（０週目の５個から１１週目の１個まで）減少した。表Ｆ及びＧ（患者＃６及び＃７）に示される通り、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含むワクチンの座瘡患者への投与は、結果的に部分的応答をもたらした。患者＃６及び＃７の座瘡斑点の数は、（患者＃６の場合、０週目の１４個から１２週目の２個まで、患者＃７の場合、０週目の２個から１２週目の１個まで）減少した。表Ｈ（患者＃８）に示される通り、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤を含むワクチンの座瘡患者への投与は、結果的に安定した疾患応答をもたらした（０週目及び１２週目の斑点の数は同一、即ち５個であった）。
【０１４８】
これらの結果に基づいて、ワクチンに存在するペプチドは抗原として有効であり、抗ＴＮＦ剤は、ワクチンの投与により引き起こされた免疫応答によって過剰誘発される炎症を抑制するのに有効であったことが考えられる。更に、ペプチド及び抗ＴＮＦ剤の組合せは、ワクチンの効力を高めるのに有効であることが示された。
【０１４９】
本発明の幅広い概念から逸脱することなく、上述した実施形態に対し変更を加えることができることを、当業者は理解されるであろう。従って、本発明は開示した特定の実施形態に限定されず、特許請求の範囲に記載する発明の趣旨及び範囲に該当する変形を包含することを意図するものであることを理解されたい。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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