【手続補正書】
【提出日】平成20年1月24日(2008.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面にペプチドまたはペプチド誘導体由来のものが共有結合で結合しており、該ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合している官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
【請求項２】
該固体表面が樹脂からなる請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項３】
該固体表面が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
【化１】
2006208012.tif 000001
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ３またはＣＨ2を表す。）
【請求項４】
該ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合している官能基がアシル基である請求項１から３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項５】
選択結合性物質が核酸である請求項１から４のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
（１）固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面にペプチドまたはペプチド誘導体由来のものが共有結合で結合しており、該ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合している官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
（２）該固体表面が樹脂からなる(１)に記載の選択結合性物質固定化担体
（３）該固体表面が下記一般式（１）を構造単位として有する（１）に記載の選択結合性物質固定化担体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ３またはＣＨ2を表す。）
（４）該重合体に結合している官能基がアシル基である(１)から(３)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
（５）選択結合性物質が核酸である(１)から(４)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明により、固体表面に結合したペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを介して選択結合性物質を固定化された選択結合性物質固定化担体を提供でき、選択結合性物質の選択的結合シグナルを増幅させることが可能となる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明者らは、鋭意実験を重ねた結果、図１に示すようにペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを固体表面に形成させ、そのペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合しているアシル基と核酸を共有結合により固定化し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させることを見いだした。これらの中でも特に固体表面への導入の容易さやコスト面からアミノ酸から形成されるオリゴペプチドまたはポリペプチドがより好ましく用いることができる。また、ペプチドはペプチド結合関与部位以外が、ホルミルメトキシカルボニルやｔ−ブトキシカルボニル等で保護されているペプチド誘導体でも良い。本発明でペプチドまたはペプチド誘導体由来のものの重合度は、特に制限はないが、作製の容易さから１〜１０００が好ましい。このペプチドまたはペプチド誘導体由来のものは次に挙げる反応経路で表面に形成することが可能である。まず、固体表面に足がかりとなる官能基を生成する。ついでこの官能基と結合できる官能基を有するペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを結合させる。そしてペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合している中の官能基と結合できる官能基を有する選択結合性物質と反応させることにより、固体基板上にペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを介して選択結合性物質を固定化することができる。ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合されている官能基はペプチドまたはペプチド誘導体由来のものの主鎖末端でも良いし、側鎖末端でも良い。分岐構造を持つペプチドまたはペプチド誘導体由来のものの場合は枝分かれ端でも良い。官能基の種類としては、特にアシル基（ＲＣＯ−：Ｒは炭化水素）が、その作製の容易さや選択結合性物質の固定化の観点から好ましく用いることができる。ここでアシル基を有するアシル化合物としては、アルデヒド基（ＲＣＯＨ）、カルボキシル基（ＲＣＯＯＨ）カルボシキル基の水素原子が置換した各種カルボン酸塩（ＣＯＯＭ：ＭはＮａやＫなど金属）やエステル（ＲＣＯＯＲ’）があり、またカルボキシル基のヒドロキシ基が置換した酸アミド（ＲＣＯＮＨ２）、酸アジド（ＲＣＯＮ３）、酸塩化物（ＲＣＯＣｌ）酸無水物、ニトリル（ＲＣＮ）などが挙げられる。また、アミノ基やチオール基と縮合反応を促進するアシル化合物としてアシル基にマレイミド基やスクシイミド基などが挙げられる。この固体基板上へのペプチドまたはペプチド誘導体由来のものの固定化方法は、具体的には以下のようになる。すなわち、カルボキシル基を固体の表面に生成し、エステル活性化剤などでカルボキシル基を活性化し、その後、アミノ基およびカルボキシル基を持つアミノ酸のアミノ基を、表面の活性化カルボキシル基と反応させることにより、固体表面にカルボキシル基を生成させることができる。ここでエステル活性化剤の例としてはスクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキ���スクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルフォツクシイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシクシイミド（ＮＨＳ）などが挙げられる。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)や４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と固体表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された固体表面を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合しているカルボキシル基を活性化しておいても良い。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
前述した方法により、固体表面にペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを介して選択結合性物質を固定化することにより、固体表面に直接固定化した場合に比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体と高いハイブリダイゼーション効率を提供する選択結合性物質固定化担体を得ることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
比較例１、実施例１
（DNA固定化基板１、２の作製）
重合体分子固定化PMMA基板の作製スキームを図２に示す。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１mm、平均分子量３万）を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１５時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、基板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。次いで（Ａ）Ｎ−ヒドロキシスルホツクシイミド（以降Sulfo-NHSと略す）１００ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)３５０ｍｇを２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）バッファー（０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。（Ｂ）１時間撹拌後、上記基板をアミノ酸の一種であるグリシン８０ｍｇを含むホウ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間攪拌後、ＤＮＡ固定化基板１を作製した（比較例１）。また、上記（Ａ）、（Ｂ）の操作をさらに３回繰り返すことにより、ＰＭＭＡ表面にグリシン４分子結合した、ＤＮＡ固定化基板２を得た（実施例１）。
実施例２
（DNA固定化基板３の作製）
重合体分子固定化PMMA基板の作製スキームを図３に示す。
実施例１と同様の方法でＰＭＭＡ基板表面にカルボキシル基を生成させた。次いで（ａ）Sulfo-NHS１００ｍｇ、ＥＤＣ３５０ｍｇをＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで１時間撹拌撹拌した。（ｂ）ＭＥＳ（ｐＨ８．３）にグリシン８０ｍｇを溶解させ、ＥＤＣ３５０ｍｇを加え１時間攪拌し、ポリペプチドであるグリシン重合体を作製した。（ｃ）上記基板を（ｂ）で調整したグリシン重合体溶液に浸漬し、２時間攪拌した後、ＤＮＡ固定化基板３を得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
比較例２
（DNA固定化基板７の作製）
比較として、実施例１と同様の操作でＰＭＭＡ基板上に加水分解によりカルボキシル基を生成させ、ＤＮＡ固定化基板７とした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
比較例３
（DNA固定化基板８の作製）
実施例４と同様の操作でアミノ基を導入したガラス表面に無水コハク酸を反応させることによりカルボキシル基を生成させＤＮＡ固定化基板８とした。
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）、のＤＮＡを合成した。5’-ACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCATCTGGA-3’。この配列番号１のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【表１】
2006208012.tif 000002
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
比較例１のＤＮＡ固定化基板１、比較例２のＤＮＡ固定化基板７と比較して、グリシン４分子やポリグリシンを介してＤＮＡ固定化したＤＮＡ固定化基板２、３は高効率なハイブリダイゼーションが観察された。また、ＤＮＡ固定化基板４の結果から、ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものの末端がスクシンイミド基で修飾されていてもほぼ同様の効果が確認された。ＤＮＡ固定化基板５の結果からアミノ酸がアラニンの場合においてもグリシンと同様の効果あることが確認された。さらに、ＤＮＡ固定化基板６と８を比較して、ガラス基板を用いた場合でも、重合体を介してＤＮＡを固定化することによりハイブリダイゼーションの高効率化が確認された。これらのことからいずれの基板においても、固体基板上にペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを固定化し、ペプチドまたはペプチド誘導体由来のものに結合したアシル基とＤＮＡのアミノ基を縮合させて固定化することにより、ハイブリダイゼーション効率が飛躍的に向上することが示された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１】固体基板上でのペプチドまたはペプチド誘導体由来のものを介して選択結合性物質の固定化
【図２】ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム１
【図３】ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム２
【図４】ガラス表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム４
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
１  固体基板
２  ペプチドまたはペプチド誘導体由来のもの
３  選択結合性化合物
４  ＰＭＭＡ基板
５  スクシンイミド基
６  グリシンまたはアラニン
７  末端アミノ化ＤＮＡ
８  グリシン重合体
９  ガラス基板
１０  無水コハク酸