(57)【要約】本発明は、ＩｇＡ多重特異性結合分子に関する。具体的には、本発明は、二重特異性を含む多重特異性の、ＩｇＡ重鎖配列を含む結合分子、ならびにそれらの調製及び使用のための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの結合単位及び少なくとも２つの結合特異性を含む、多重特異性結合分子であって、前記結合単位の各々が、結合標的に対する結合領域に複合された２つのＩｇＡ重鎖定常領域配列を含む、多重特異性結合分子。
【請求項２】
二重特異性である、請求項１に記載の多重特異性結合分子。
【請求項３】
前記結合単位の各々が、単一特異性（ＡＡ、ＢＢ）であり、各々が、異なる結合標的（それぞれ、Ａ及びＢ）に結合する、請求項２に記載の多重特異性結合分子。
【請求項４】
前記２つの結合単位のうちの一方が、単一特異性（ＡＡ）であり、他方の結合単位が、二重特異性であり、二重特異性結合単位の結合特異性のうちの一方が、単一特異性結合単位の結合特異性（ＡＢ）と同じである、請求項２に記載の多重特異性結合分子。
【請求項５】
前記結合単位の各々が、二重特異性であり、各々が、同じ２つの結合特異性（ＡＢ、ＡＢ）を有する、請求項２に記載の多重特異性結合分子。
【請求項６】
前記結合単位の各々が、二重特異性であり、結合分子が、３つの結合特異性（ＡＢ、ＡＣ）を有する、請求項１に記載の多重特異性結合分子。
【請求項７】
前記結合単位の各々が、二重特異性であり、結合分子が、４つの結合特異性（ＡＢ、ＣＤ）を有する、請求項１に記載の多重特異性結合分子。
【請求項８】
ＩｇＡ抗体であり、前記結合領域配列が、ＩｇＡ重鎖可変領域配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多重特異性結合分子。
【請求項９】
ＩｇＡ１である、請求項８に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１０】
配列番号１の重鎖定常領域配列を含む、請求項９に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１１】
ＩｇＡ２である、請求項８に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１２】
配列番号２の重鎖定常領域配列を含む、請求項１１に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１３】
端と端とをつなぐ構成で２つのＩｇＡ結合単位を含み、各々が、ＩｇＡ重鎖可変領域配列に融合されたＩｇＡ重鎖定常領域配列を含む、請求項８に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１４】
ＩｇＡＪ領域を更に含む、請求項９に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１５】
前記Ｊ領域が、配列番号３の配列を含む、請求項１４に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１６】
前記ＩｇＡ重鎖定常領域配列が、少なくともＣＡ３ドメインを含む、請求項８に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１７】
２つの結合単位のうちの少なくとも一方においてＩｇＡ重鎖可変領域配列と会合した少なくとも１つのＩｇＡ軽鎖可変領域配列を更に含む、請求項１６に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１８】
２つの結合単位の各々においてＩｇＡ重鎖可変領域配列と会合したＩｇＡ軽鎖可変領域配列を含む、請求項１６に記載の多重特異性結合分子。
【請求項１９】
２つの結合単位のうちの少なくとも一方が、二重特異性であり、非対称の界面が、２つの異なるＩｇＡ重鎖定常領域間で作り出される、請求項１６に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２０】
非対称の界面が、ノブ・イントゥ・ホールカップリング及び／または塩橋カップリングによって作り出される、請求項１９に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２１】
非対称の界面が、表１及び２に記載される１つ以上の修飾によって作り出される、請求項２０に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２２】
前記軽鎖可変領域配列が、軽鎖と重鎖との間に非対称の界面を作り出すことによって、その一致する重鎖可変領域にカップリングされる、請求項１７または請求項１８に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２３】
非対称の界面が、ＣｒｏｓｓＭａｂ技法、ノブ・イントゥ・ホールカップリング、及び／または塩橋カップリングによって作り出される、請求項２２に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２４】
毒素に複合される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２５】
化学療法剤に複合される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２６】
複合体化が融合によるものである、請求項２４または請求項２５に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２７】
複合体化が化学リンカーによるものである、請求項２４または請求項２５に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２８】
前記ＩｇＡ抗体がキメラまたはヒト化抗体である、請求項８〜２７のいずれか１項に記載の多重特異性結合分子。
【請求項２９】
呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）の異なる抗原に特異的に結合する、多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３０】
二重特異性である、請求項２９に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３１】
ＲＳＶ  Ｆに対する２つの結合部分及びＲＳＶ  Ｇに対する２つの結合部分を含む、請求項３０に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３２】
ＲＳＶ  Ｇに対する結合部分が、配列番号１０の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３３】
ＲＳＶ  Ｆに対する結合部分が、配列番号１２の重鎖可変領域配列及び配列番号１３の軽鎖可変領域配列を含む、請求項３１または請求項３２に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３４】
異なるインフルエンザＡウイルス抗原に特異的に結合する、多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３５】
二重特異性であり、各インフルエンザＡウイルス抗原への２つの結合部分を含む、請求項３４に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３６】
第１のインフルエンザＡウイルス抗原への結合部分が、配列番号１４の重鎖可変領域配列及び配列番号１５の軽鎖可変領域配列を含む、請求項３５に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３７】
第２のインフルエンザＡウイルス抗原への結合部分が、配列番号１６の第１の可変領域配列を含む、請求項３５または請求項３６に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３８】
第２のインフルエンザＡウイルス抗原への結合部分が、配列番号１７の第２の可変領域配列を含む、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項３９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の異なる抗原に特異的に結合する、多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４０】
二重特異性である、請求項３９に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４１】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに対する２つの結合部分及び毒素Ｂに対する２つの結合部分を含む、請求項４０に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４２】
毒素Ａへの結合部分が、配列番号１８の重鎖可変領域配列を含む、請求項４１に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４３】
毒素Ａへの結合部分が、配列番号１９の軽鎖可変領域配列を含む、請求項４２に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４４】
毒素Ｂへの結合部分が、配列番号２０の第１の可変領域配列を含む、請求項４２または請求項４３に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４５】
毒素Ｂへの結合部分が、配列番号２１の第２の可変領域配列を含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の多重特異性二量体ＩｇＡ抗体。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の多重特異性ＩｇＡ結合分子を少なくとも約７０％含む、組成物。
【請求項４７】
有効量の請求項１〜４５のいずれか１項に記載の多重特異性ＩｇＡ結合分子を、薬学的に許容される担体と混和して含む、薬学的組成物。
【請求項４８】
微生物感染の治療のための請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
前記微生物感染が細菌感染である、請求項４８に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
細菌感染がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染である、請求項４９に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
ウイルス感染の治療のための請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
ウイルス感染が呼吸器ウイルス感染である、請求項５１に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
呼吸器ウイルス感染がインフルエンザウイルス感染である、請求項５２に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
呼吸器ウイルス感染が呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）感染である、請求項５２に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多重特異性ＩｇＡ結合分子を投与することを含む、対象における微生物感染の治療のための方法。
【請求項５６】
対象がヒト患者である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
多重特異性ＩｇＡ結合分子がＩｇＡ抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＩｇＡ抗体が二量体二重特異性ＩｇＡ抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＩｇＡ抗体がヒト化またはキメラ抗体である、請求項５７または請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
微生物感染が細菌感染である、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
細菌感染がｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
微生物感染がウイルス感染である、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
ウイルス感染が呼吸器ウイルス感染である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
呼吸器ウイルス感染がインフルエンザウイルス感染である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
呼吸器ウイルス感染が呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）感染である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
対象における微生物感染の治療のための医薬の調製における、有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多重特異性ＩｇＡ結合分子の使用。
【請求項６７】
対象がヒト患者である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
多重特異性ＩｇＡ結合分子がＩｇＡ抗体である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
ＩｇＡ抗体が二量体二重特異性ＩｇＡ抗体である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
前記ＩｇＡ抗体がヒト化またはキメラ抗体である、請求項６８または請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
微生物感染が細菌感染である、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７２】
細菌感染がｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染である、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
微生物感染がウイルス感染である、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７４】
ウイルス感染が呼吸器ウイルス感染である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
呼吸器ウイルス感染がインフルエンザウイルス感染である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
呼吸器ウイルス感染が呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）感染である、請求項７３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年２月１０日出願の米国仮特許出願第６１／９３７，９８４号の優先権及び利益を主張するものであり、該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピー（２０１５年２月１０日作成）は、ＩＧＭ−０００３ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、７３，８７９バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、ＩｇＡ多重特異性結合分子に関する。具体的には、本発明は、二重特異性を含む多重特異性の、ＩｇＡ重鎖配列を含む結合分子、ならびにそれらの調製及び使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト化抗体の到来以来、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）等の抗体の治療的使用は、腫瘍学、関節リウマチ等の炎症障害、及び多くの他の適応症の治療を含む、医学分野に革命をもたらしてきた。米国においては、３０種を超えるヒトまたはヒト化抗体が臨床使用のために認可されており、６００種を超える新たな抗体または抗体様分子が種々の開発段階にある。幾つかの抗体は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の、それらの作用が疾患の病理過程の一部である、可溶性の標的分子上で拮抗機能を有する。代替的に、抗体は、癌等のある特定の疾患において病的細胞を結合、遮断、及び／または病的細胞の破壊を誘発することができる。これらの治療抗体の主な機能は、Ｆａｂ領域を通した結合、及びＦｃドメイン（それはまた抗体の長期の循環半減期を媒介もする）を介したエフェクター機能の動員である。小分子薬物と比較した抗体の主要な利点のうちの１つは、それらの精巧な特異性であり得る。抗体は、非常に類似した相同体を除外して、癌遺伝子生成物等の選択されたタンパク質抗原を非常に正確に標的化することができ、良好な安全性プロフィールを可能にする。よって、抗体は、特異的な単一標的化機能を明確な特徴とする。
【０００５】
この分野が進歩するにつれて、抗体機能は、より高い親和性、より長い半減期、及び／またはよりよい組織分布を提供するため等の、クリエイティブなタンパク質操作の手段、ならびに有毒なペイロード送達を介した細胞破壊の集中度を高めるための小分子及び大分子技術の組み合わせ（例えば、抗体−薬物複合体）を通して向上されてきた。抗体機能を改善するための別のアプローチでは、１つのＩｇＧ分子が２つの抗原に結合することを可能にする、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）構造の二価結合を活用する。実際、ある特定の用途において、２つの異なる標的抗原に同時に結合することによって有用な機能を発揮する、非対称の抗体の大きな潜在性が存在する。この必要性に取り組むために、２つの異なる抗原に結合することができ、自然界でかつて見たことのない機能を可能にする単一分子を生み出すために、多様な構築物が作製されてきた。この二重特異性アプローチの一例は、それぞれＴ細胞及びＢ細胞上にあるＣＤ３及びＣＤ１９受容体に結合する、「ブリナツムマブ」（ＭＴ１０３）である。この細胞傷害性Ｔ細胞の癌性Ｂ細胞へのテザリングは、Ｂ細胞性白血病の有効な治療を可能にする。
【０００６】
しかしながら、二重特異性抗体の構築、発現、及び作製には大きな技術的困難がいまだに存在する。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に同時に結合するそれらの能力に起因して、有望な治療剤と見なされているものの、それらの実用性は、安定性及び製造の複雑さの問題のために限定されている。
【０００７】
異種性の重鎖をマッチングし、加えて重鎖及び軽鎖の適切な対のマッチングを行って、二重特異性ＩｇＧを効率的に生み出すために、タンパク質操作の種々の形態が使用されてきた。更に、選択されたヘテロ二量体化ドメイン及び２つの最小の抗原結合部位からなる最小サイズの組換え構築物を使用した、クアドローマ、化学的ヘテロ複合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、組換え構築物を含む、種々の二重特異性抗体形式。
【０００８】
しかしながら、これらの努力の全ては、困難に満ちていた。
【０００９】
故に、二重特異性治療用抗体の開発に向けられる努力にもかかわらず、二重及び多重特異性抗体のより効率的で柔軟性のある作製につながり得、それによって、かかる治療薬の発見とその臨床的導入との間のタイムラインを短縮し、また多数の特異性及び／または結合価を有する新たな種類の抗体形式の設計及び作製を可能にする、より効率的なプラットフォームを開発するための多大な必要性がいまだに存在する。
【００１０】
これは、細菌及びウイルス感染を含む感染に対する身体の第１の特異的な免疫防御におけるＩｇＡの関与、ならびに粘膜免疫系の液性部分への二量体ＩｇＡ抗体の寄与を考慮すると、ＩｇＡ抗体にとって特に当てはまる。二重及び多重特異性ＩｇＡ抗体はしたがって、呼吸器ウイルス感染、胃腸管の種々の細菌感染の治療、及び癌の免疫療法における大きな潜在性を有する。故に、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に対する二重特異性ＩｇＡ抗体は、肺のＲＳＶ感染の治療において実用性を見出し、インフルエンザウイルスに対する二重特異性ＩｇＡ抗体は、インフルエンザの治療に有効であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及びＢに対する二重特異性ＩｇＡ抗体は、入院患者の感染性下痢のほとんどの原因であるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を治療するのに有用である。
【発明の概要】
【００１１】
一態様において、本発明は、２つの結合単位及び少なくとも２つの結合特異性を含む、多重特異性結合分子に関し、該結合単位の各々が、結合標的に対する結合領域に複合された２つのＩｇＡ重鎖定常領域配列を含む。
【００１２】
一実施形態において、該多重特異性結合分子は、二重特異性である。特定の実施形態において、二重特異性結合分子内で、該結合単位の各々は、単一特異性（ＡＡ、ＢＢ）であり、各々が、異なる結合標的（それぞれ、Ａ及びＢ）に結合する。別の実施形態において、二重特異性結合分子内で、該２つの結合単位のうちの一方は、単一特異性（ＡＡ）であり、他方の結合単位は、二重特異性であり、該二重特異性結合単位の該結合特異性のうちの一方が、該単一特異性結合単位の該結合特異性と同じである（ＡＢ）。なおも別の実施形態において、二重特異性結合分子内で、該結合単位の各々は、二重特異性であり、各々が、同じ２つの結合特異性（ＡＢ、ＡＢ）を有する。更なる実施形態において、二重特異性結合分子内で、該結合単位の各々は、二重特異性であり、該結合分子は、３つの結合特異性（ＡＢ、ＡＣ）を有する。依然として更なる実施形態において、二重特異性結合分子内で、該結合単位の各々は、二重特異性であり、該結合分子は、４つの結合特異性（ＡＢ、ＣＤ）を有する。
【００１３】
具体的な実施形態において、該多重特異性結合分子はＩｇＡ抗体であり、該結合領域配列が、ＩｇＡ重鎖可変領域配列を含む。
【００１４】
更なる実施形態において、該ＩｇＡ抗体は、２つのＩｇＡ結合単位を含み、各々が、ＩｇＡ重鎖可変領域配列に融合されたＩｇＡ重鎖定常領域配列を含み、任意選択的にＩｇＡ  Ｊ領域を更に含む。
【００１５】
別の実施形態において、該ＩｇＡ重鎖定常領域配列は、少なくともＣＡ３ドメインを含む。
【００１６】
なおも別の実施形態において、該多重特異性結合分子、例えば二重特異性ＩｇＡ抗体は、該２つの結合単位のうちの少なくとも一方において、好ましくは該２つの結合単位の各々において、該ＩｇＡ重鎖可変領域配列と会合した少なくとも１つのＩｇＡ軽鎖可変領域配列を更に含む。
【００１７】
一実施形態において、該２つの結合単位のうちの少なくとも一方が二重特異性である場合、非対称の界面が、表１及び２に記載される１つ以上の修飾によって等で、例えばノブ・イントゥ・ホールカップリング及び／または塩橋カップリングによって、２つの異なるＩｇＡ重鎖定常領域間に作り出される。
【００１８】
更なる実施形態において、少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む多重特異性（例えば二重特異性）ＩｇＡ抗体内で、該軽鎖可変領域配列は、例えば、ＣｒｏｓｓＭａｂ技法、ノブ・イントゥ・ホールカップリング、及び塩橋カップリングのうちの１つ以上を使用して、該軽鎖と重鎖との間に非対称の界面を作り出すことによって、その一致する重鎖可変領域にカップリングされる。
【００１９】
本発明の全ての実施形態において、該多重特異性結合分子は、毒素に及び／または化学療法剤に複合されてもよく、該複合体化は、融合によるもの及び／または化学リンカーによるものであってもよい。
【００２０】
本発明の全ての実施形態において、該多重特異性ＩｇＡ抗体は、キメラまたはヒト化もしくはヒトであってもよい。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本発明の多重特異性結合分子を少なくとも約７０％含む、組成物に関する。
【００２２】
更なる具体的な実施形態において、本発明は、二量体二重特異性ＩｇＡ結合分子に関し、該結合単位の各々が、単一特異性（ＡＡ、ＢＢ）であり、各々が、異なる結合標的（それぞれ、Ａ及びＢ）に結合する。別の実施形態において、該２つの結合単位のうちの一方は、単一特異性（ＡＡ）であり、他方の結合単位は、二重特異性であり、該二重特異性結合単位の該結合特異性のうちの一方が、該単一特異性結合単位の該結合特異性と同じである（ＡＢ）。更なる実施形態において、該結合単位の各々は、二重特異性であり、各々が、同じ２つの結合特異性（ＡＢ、ＡＢ）を有する。依然として更なる実施形態において、該結合単位の各々は、二重特異性であり、該結合分子は、３つの結合特異性（ＡＢ、ＡＣ）を有する。なおも別の実施形態において、該結合単位の各々は、二重特異性であり、該結合分子は、４つの結合特異性（ＡＢ、ＣＤ）を有する。全ての実施形態において、該結合分子は好ましくは、好ましくは軽鎖を含む、好ましくはＪ鎖を含む、二量体二重特異性ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）抗体である。
【００２３】
具体的な実施形態において、該多重特異性結合分子は、端と端とをつなぐ構成で２つのＩｇＡ結合単位を含み、各々が、ＩｇＡ重鎖可変領域配列に融合されたＩｇＡ重鎖定常領域配列を含み、任意選択的にＩｇＡ  Ｊ領域、例えば、配列番号３の配列を含むＪ領域を更に含む。
【００２４】
全ての実施形態において、該ＩｇＡ重鎖定常領域配列は好ましくは、少なくともＣＡ３ドメインを含む。
【００２５】
全ての実施形態において、本明細書における多重特異性結合分子は、該２つの結合単位のうちの少なくとも一方において該ＩｇＡ重鎖可変領域配列と会合した少なくとも１つのＩｇＡ軽鎖可変領域配列を更に含む。
【００２６】
別の実施形態において、該結合単位のうちの少なくとも一方は、二重特異性であり、非対称の界面が、２つの異なるＩｇＡ重鎖定常領域間に作り出される。全ての実施形態において、該非対称の界面は、表１及び２に記載される１つ以上の修飾を用いて等で、ノブ・イントゥ・ホールカップリング及び／または塩橋カップリングによって作り出されてもよい。
【００２７】
全ての実施形態において、該多重特異性結合分子内で、該軽鎖可変領域配列は、存在する場合、該軽鎖と重鎖との間に非対称の界面を作り出すことによって、その一致する重鎖可変領域にカップリングされてもよい。全ての実施形態において、該非対称の界面は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技法、ノブ・イントゥ・ホールカップリング、及び／または塩橋カップリングによって作り出されてもよい。
【００２８】
種々の更なる実施形態において、該多重特異性結合分子は、毒素または化学療法剤に複合されてもよく、複合体化は、例えば、共有結合によって、例えば融合によってまたは化学リンカーによって達成され得る。
【００２９】
全ての実施形態において、本発明の多重特異性、例えば二重特異性ＩｇＡ抗体は、キメラまたはヒト化であり得る。
【００３０】
更なる実施形態において、本発明は、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）の異なる抗原に特異的に結合する、多重特異性二量体ＩｇＡ抗体に関する。本抗体は好ましくは、二重特異性であり、ＲＳＶ  Ｆに対する２つの結合部分及びＲＳＶ  Ｇに対する２つの結合部分を含む。具体的な実施形態において、ＲＳＶ  Ｇに対する該結合部分は、配列番号１０の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域を含む。別の具体的な実施形態において、ＲＳＶ  Ｆに対する該結合部分は、配列番号１２の重鎖可変領域配列及び配列番号１３の軽鎖可変領域配列を含む。
【００３１】
更なる実施形態において、本発明は、異なるインフルエンザＡウイルス抗原に特異的に結合する、多重特異性二量体ＩｇＡ抗体に関する。本抗体は好ましくは、二重特異性であり、各インフルエンザＡウイルス抗原への２つの結合部分を含む。具体的な実施形態において、第１のインフルエンザＡウイルス抗原への該結合部分は、は、配列番号１４の重鎖可変領域配列及び配列番号１５の軽鎖可変領域配列を含む。別の具体的な実施形態において、第２のインフルエンザＡウイルス抗原への該結合部分は、配列番号１６の第１の可変領域配列を含む。なおも別の具体的な実施形態において、該第２のインフルエンザＡウイルス抗原への該結合部分は、配列番号１７の第２の可変領域配列を含む。
【００３２】
更なる実施形態において、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の異なる抗原に特異的に結合する、多重特異性二量体ＩｇＡ抗体に関する。本抗体は好ましくは、二重特異性である。好ましい実施形態において、該抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに対する２つの結合部分及び毒素Ｂに対する２つの結合部分を含む。具体的な実施形態において、毒素Ａへの該結合部分は、配列番号１８の重鎖可変領域配列を含む。別の具体的な実施形態において、毒素Ａへの該結合部分は、配列番号１９の軽鎖可変領域配列を含む。更に具体的な実施形態において、毒素Ｂへの該結合部分は、配列番号２０の第１の可変領域配列を含む。なおも別の具体的な実施形態において、毒素Ｂへの該結合部分は、配列番号２１の第２の可変領域配列を含む。
【００３３】
別の態様において、本発明は、本明細書における多重特異性ＩｇＡ結合分子のいずれかを少なくとも約７０％含む、組成物に関する。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、有効量の本明細書における多重特異性ＩｇＡ結合分子のいずれかを含む、薬学的組成物に関する。種々の実施形態において、該薬学的組成物は、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染、呼吸器ウイルス感染、例えばインフルエンザウイルス感染もしくは呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）感染等の、細菌、ウイルス、及び真菌感染を含む微生物感染の治療のためのものであってもよい。
【００３５】
依然として更なる態様において、本発明は、上に及び本開示全体を通して列挙されるありとあらゆる感染を具体的に含む、細菌、ウイルス、及び真菌感染を含む微生物感染を治療するための、治療方法及び薬学的組成物の調製のための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＩｇＡ、二量体ＩｇＡ、及び分泌ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の概略構造を示す。  ［図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ］ＩｇＧ１ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２重鎖定常領域のアライメントを示す。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域配列は、Ｊ００２２８（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２９：６７１−６７９（１９８２）、配列番号２２）からであり、ヒトＩｇＡ１重鎖定常領域配列（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８７６−ＩＧＨＡ１−ＨＵＭＡＮ、配列番号１）及び付番は、ＰＤＢ  ２ＱＥＪ（Ｒａｍｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：１５０５１−１５０５６（２００７））から及びＩｇＡ  ＢＵＲ（Ｐｕｔｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５４：２８６５−２８７４（１９７９））からであり、ヒトＩｇＡ２重鎖定常領域配列の付番は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８７７−ＩＧＨＡ２＿ＨＵＭＡＮ（配列番号２）に対応する。
【図２Ａ】重鎖定常領域配列の一部としてのヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のＦｃ  ＣＧ１／ＣＡ１重鎖定常ドメインのアライメントを示す。
【図２Ｂ】重鎖定常領域配列の一部としてのヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のＦｃ  ＣＧ２／ＣＡ２重鎖定常ドメインのアライメントを示す。
【図２Ｃ】重鎖定常領域配列の一部としてのヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のＦｃ  ＣＧ３／ＣＡ３重鎖定常ドメインのアライメントを示す。
【図３−１】［表１］ノブ・ホール及び電荷導入位置にあるＩｇＡ  ＣＡ３ドメイン界面残基を示す。セット番号１、ノブ、ＣＡ３番号１の突然変異を有するヒトＩｇＡ２の配列は、配列番号４に示され、セット番号１、ホール、ＣＡ３番号２の突然変異を有するヒトＩｇＡ２の配列は、配列番号５に示される。
【図３−２】［表１］ノブ・ホール及び電荷導入位置にあるＩｇＡ  ＣＡ３ドメイン界面残基を示す。セット番号１、ノブ、ＣＡ３番号１の突然変異を有するヒトＩｇＡ２の配列は、配列番号４に示され、セット番号１、ホール、ＣＡ３番号２の突然変異を有するヒトＩｇＡ２の配列は、配列番号５に示される。
【図４】［表２］潜在的な電荷交換のためのＩｇＡ  ＣＡ３ドメイン界面残基を示す。
【図５−１】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−２】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−３】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−４】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−５】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−６】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−７】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−８】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−９】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【図５−１０】［表３］本出願において参照されるポリペプチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００３８】
値の範囲が提供される場合、文脈上別途明らかに示されない限り、下限単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその指定範囲内の任意の他の指定値または介在値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、本発明に包含されるより小さい範囲内に含めることができ、指定範囲内の任意の特に除外された限界の対象となる。
【００３９】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、本出願において使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００４０】
本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、それらの刊行物が関連して引用される、方法及び／または材料を開示し、説明する。
【００４１】
「抗原」という用語は、その実体または断片を指し、抗体に結合するか、または細胞免疫反応を誘発することができる。免疫原は、生物において、具体的には動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物において免疫反応を引き起こすことができる抗原を指す。抗原という用語は、抗原決定基またはエピトープとして知られる領域を含む。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、抗体の産生を引き起こし、かつ／または免疫原の抗原に対して向けられたＴ細胞及び／もしくは他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
【００４３】
免疫反応は、治療される障害を緩和または軽減するように投与された本発明の免疫原性組成物に反応して、個体が十分な抗体、Ｔ細胞、及び他の反応性免疫細胞を産生するときに起こる。
【００４４】
免疫原性という用語は、本明細書で使用される場合、レシピエントに投与されたときに免疫反応（体液性または細胞性）を引き起こす抗原の能力の尺度を指す。本発明は、対象のヒトキメラまたはヒト化抗体の免疫原性を低減する手法に関する。
【００４５】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、１本鎖分子、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖ）を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と交換可能に使用される。塩基性４鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。
【００４６】
ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合されるが、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに結合される。各Ｈ及びＬ鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いてα及びγ鎖の各々の場合、３つの定常ドメイン（ＣＨ）を、μ及びεアイソタイプの場合、４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその反対端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと整合され、ＣＬは、重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインと整合される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対合は、一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。
【００４７】
血清ＩｇＡは単量体であるが、重合することもできる。その分泌形態において、ＩｇＡは、尾片を含むことができ、分泌成分によって会合され得る、Ｊ鎖によって結合された２〜５個の塩基性４鎖単位を含む。分泌成分（ｓＩｇＡ）と会合される、尾片、二量体ＩｇＡ、及び分泌ＩｇＡの構造は、図１に示される。ＩｇＡ抗体は、「ＩｇＡ」の定義において明示的に含まれる、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブクラスに更に区分することができる。
【００４８】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに別個の型のうちの１つに割り当てることができる。
【００４９】
図２Ａ〜２Ｃは、それぞれヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のＦｃ  ＣＧ１／ＣＡ１、ＣＧ２／ＣＡ２、及びＣＧ３／ＣＡ３定常ドメインのアライメントを示す。図面において、ヒトＩｇＧ１配列は、Ｊ００２２８からであり（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２９：６７１−６７９（１９８２））、ＩｇＧ配列は、ＰＤＢ  １ＯＱＯからのＰＤＢ  １ＯＱＯβ鎖（ｓ）及びα−ヘリックス（ｈ）の割り当てに従って付番される。ヒトＩｇＡ配列及び付番は、ＰＤＢ  ２ＱＥＪ（Ｒａｍｓｌａｎｄ  Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：１５０５１−１５０５６（２００７）から、及びＩｇＡ  ＢＵＲ（Ｐｕｔｎａｍ  Ｗ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２８６５−２８７４（１９７９））からである。ヒトＩｇＧ１定常領域配列は、配列番号１９を割り当てられ、ＩｇＡ１定常領域配列は、配列番号１として示され、ヒトＩｇＡ２定常領域配列は、配列番号２として示される。本開示全体を通して、アミノ酸位置は、これらのアライメントに従って付番される。
【００５０】
異なるクラスの抗体の構造及び特性に関する更なる詳細については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００５１】
別途明記しない限り、「抗体」という用語は、具体的に天然ヒト及び非ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＭ抗体を含み、天然型異型を含む。
【００５２】
「ＩｇＡ」抗体という用語は、分泌成分の有無に関わらず、二量体及び多量体形態を含む全てのサブクラス、すなわちＩｇＡ１及びＩｇＡ２抗体を具体的に含むように本明細書において使用される。２つのサブクラスのうち、ＩｇＡ２は、その短いヒンジ領域がそれを特定の細菌プロテアーゼに対して耐性にするため、ＩｇＡ１よりも安定している。この短いヒンジは、細菌表面上の抗原に対するＩｇＡ２のより良い多価結合を促進する、堅固な非平面構造も説明する。本発明の目的で、ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２であってもよく、好ましくは二量体であり、２つの尾片は、好ましくはＪ鎖によって接続される（図１、配列番号３を参照）。本発明のＩｇＡ結合分子において、Ｊ鎖は、完全長天然Ｊ鎖であってもよいが、Ｊ鎖が官能性である限り、Ｊ鎖断片を具体的に含む、置換、挿入、欠失、切断などのアミノ酸改変を含むこともできる。完全長天然Ｊ鎖の包含が、本発明の目的で好ましい。
【００５３】
修飾されたＪ鎖に関連して「官能性」という用語は、Ｊ鎖が天然Ｊ鎖、例えば天然ヒトＪ鎖の一次官能性を保持すること、具体的に、ＩｇＡの効率的重合（二量体化）及びかかるポリマー（二量体）の、分泌成分（ＳＣ）／ポリマー（ｐ）ＩｇＲへの結合を可能にする能力を意味する。
【００５４】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在する可能性がある、考えられる天然型突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に対して向けられる。更に、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるような抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、または組み換えＤＮＡ方法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載される技法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００５５】
本明細書におけるモノクローナル抗体としては、具体的に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられ、その重鎖及び／または軽鎖の部分は、特定の種から誘導された、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残部は、それらが所望の生物活性を呈する限り、別の種から誘導された、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列、ならびにかかる抗体の断片と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００５６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含む抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基は、非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト霊長類の超可変領域からの残基によって置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基もまた、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内またはドナー抗体内で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれも含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、及びＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照されたい。
【００５７】
「種依存性抗体」は、第１の哺乳動物種からの抗原に対して、それが第２の哺乳動物種からのその抗原の相同体に対して有するよりも強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、及び最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対して、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。種依存性抗体は、上に定義される様々な種の抗体のうちのいずれかであり得るが、好ましくはヒト化またはヒト抗体である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「抗体変異体」または「抗体異型」は、参照抗体のアミノ酸残基のうちの１つ以上が修飾された参照抗体のアミノ酸配列異型を指す。参照抗体は、例えば、天然抗体であり得るが、天然抗体の既知の異型でもあり得る。かかる変異体は、必ず参照抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態において、抗体変異体は、参照抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または類似性は、配列同一性の最大パーセントを達成するために、必要に応じて、配列をアライメントし、ギャップを導入した後、参照抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づいて同じ基からのアミノ酸残基）の候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部の伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列同一性または類似性に影響を及ぼすとは解釈されないものとする。
【００５９】
本明細書における「単離された」抗体は、組み換え宿主細胞内のその天然環境の成分から特定及び分離され、ならびに／または回収されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用を干渉するであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質、ならびに生成の望ましくない副産物を挙げることができる。故に、二重または多重特異性ＩｇＡ抗体の場合、望ましくない副産物は、単一特異性結合単位（ＡＢ結合単位を含む二重特異性抗体の場合、ＡＡ及び／またはＢＢ）を含み、多量体は、所望の数のサブユニットを含まない。好ましい実施形態において、二重または多重特異性抗体は、（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法によって決定して、９５重量％超、もしくは９８重量％超、もしくは９９重量％超まで、（２）アミノ酸配列の使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性まで精製される。従来、単離された二重特異性結合分子、例えば抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００６０】
「特異的結合」または「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的な」という用語は、標的分子（抗原）、例えば、特定のポリペプチド、ペプチド、または他の標的（例えば、糖タンパク質標的）上のエピトープに対する抗体の結合を指し、測定できるほどに非特異的相互作用とは異なる結合を意味する（例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミンまたはカゼインに結合することであり得る）。特異的結合は、例えば、対照分子に対する抗体の結合と比較して、標的分子に対する抗体の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非標識化標的に類似する対照分子との競合によって決定することができる。この場合、特異的結合は、プローブに対する標識化標的の結合が、過剰な非標識化標的によって競合的に阻害される場合に示される。「特異的結合」または「〜に特異的に結合する」、または特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的な」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、少なくとも約２００ｎＭ、代替として少なくとも約１５０ｎＭ、代替として少なくとも約１００ｎＭ、代替として少なくとも約６０ｎＭ、代替として少なくとも約５０ｎＭ、代替として少なくとも約４０ｎＭ、代替として少なくとも約３０ｎＭ、代替として少なくとも約２０ｎＭ、代替として少なくとも約１０ｎＭ、代替として少なくとも約８ｎＭ、代替として少なくとも約６ｎＭ、代替として少なくとも約４ｎＭ、代替として少なくとも約２ｎＭ、代替として少なくとも約１ｎＭ、またはそれを超える、標的に対するＫｄを有する分子によって示され得る。ある特定の場合において、「特異的結合」という用語は、分子が任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する、結合を指す。
【００６１】
「結合親和性」は、分子の単一結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総計の強度を指す。別途指示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体及び抗原）の構成員間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭであり得るか、またはそれより強い。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野において既知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般にゆっくり抗原に結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般により速く抗原に結合し、より長く結合されたままである。結合親和性を測定する様々な方法は、当該技術分野において既知である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、例えば、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用し、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、抗体及び標的対に適切な技法により測定される解離定数を指す。
【００６３】
「複合体」、「複合された」、及び「複合体化」という用語は、任意及び全ての形態の共有結合または非共有結合的連結を指し、制限なしに、直接的な遺伝子または化学融合、リンカーまたは架橋剤を介したカップリング、及び非共有結合的会合が挙げられ、共有結合的連結が好ましい。
【００６４】
「多重特異性ＩｇＡ」という用語は、本明細書では最も広義に使用され、２つ以上の結合特異性を有するＩｇＡ抗体を指す。故に、「多重特異性」という用語は、「二重特異性」、例えば、二重特異性抗体または二重特異性結合単位を含み、各々が異なる抗原（ＡＡ、ＢＢ）に結合する２つの単一特異性サブユニット、または各々が２つの異なる抗原（ＡＢ、ＡＢ）に結合する２つの二重特異性サブユニットを含むＩｇＡ二量体を含む。
【００６５】
「結合単位」という用語は、本明細書において、各々が少なくともＣＡ３ドメインを含み、かつ各々が結合標的、例えば標的抗原に対する結合領域（抗体可変領域）に複合される、ＩｇＡ重鎖定常領域ポリペプチドの対を含む分子を指すように使用される。一実施形態において、本発明の二量体ＩｇＡ分子は、各結合単位が異なる結合標的（ＡＡ、ＢＢ）に対する結合特異性を有する、２つの単一特異性結合単位からなる。別の実施形態において、本発明の二量体ＩｇＡ分子において、２つの結合単位のうちの少なくとも１つは、２つの異なる結合特異性を有する（すなわち、二重特異性、例えば、ＡＡ、Ａ、ＢまたはＡＡ、ＢＣである）。別の実施形態において、２つの結合単位の各々は、２つの特異性を有し、これは同じであり得るか（ＡＢ、ＡＢ）または異なり得る（例えば、ＡＣ、ＣＤもしくはＡＢ、ＡＣ）。
【００６６】
「二重特異性ＩｇＡ抗体結合単位」は、最も広義に使用され、具体的に、可変ドメイン配列（ＶＨ）に融合された、少なくともＣＡ３定常ドメインを含むＩｇＡ抗体重鎖定常領域ポリペプチドの対を包含し、各可変ドメイン配列は、会合した抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列の有無に関わらず、異なる標的に結合する。一実施形態において、二重特異性ＩｇＡ抗体は、各々が１つの抗原上の異なるエピトープまたは２つの異なる抗原上のエピトープに結合することができる、２つのＶＨＶＬ抗原結合領域を含む。二重特異性ＩｇＡ抗体結合単位は、単一種からの完全長であり得るか、またはキメラ化もしくはヒト化され得る。
【００６７】
「完全長ＩｇＡ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＡ１またはＣα１）、抗体定常重鎖定常ドメイン２（ＣＡ２またはＣα２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＡ３またはＣα３）からなるポリペプチドである。本発明による二重または多重特異性完全長ＩｇＡ抗体は、分泌成分の有無に関わらず、各々が単一特異性または二重特異性であり得る２つの単量体（結合単位）を含む。故に、本発明の多重特異性ＩｇＡ抗体は、結果として得られるＩｇＡ抗体が少なくとも２つの結合特異性を有する限り、単一特異性及び二重特異性結合単位を含んでもよい。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、該重鎖または軽鎖のＣ末端における最後のアミノ酸を示す。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端は、該重鎖または軽鎖のＮ末端における最初のアミノ酸を示す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「原子価」という用語は、抗体内の指定数の結合部位の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。故に、本発明による二重特異性ＩｇＡ抗体において、各結合単位が二価である場合、二重特異性ＩｇＡ抗体は４原子価を有する。
【００６９】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能な任意の分子決定基を含む。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的活性表面グルーピングを含み、ある特定の実施形態において、特定の３次元構造特徴及び／または特定の電荷特徴を有することができる。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。「結合領域」は、結合分子によって結合された結合標的上の領域である。
【００７０】
「ポリエピトープ特異性」は、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は、１つのみのエピトープに結合する能力を指す。一実施形態により、二重特異性ＩｇＭ抗体は、少なくとも１０−７Ｍ、または１０−８Ｍ、またはそれより良好な親和性で各エピトープに結合する。
【００７１】
「標的」または「結合標的」という用語は、最も広義に使用され、それらが自然界に存在するときの生物学的機能を有するポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、及び他の分子を具体的に含む。「標的」は、例えば、二重特異性結合単位が、２つの異なる細胞型、同じ細胞型の異なる亜集団（例えば、異なるＢ細胞集団）、または単一細胞上の２つの異なる実体を標的とする細胞であり得る。
【００７２】
本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は、典型的に、様々な程度で抗原に対する結合部位の親和性に寄与する、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）、ならびに３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の広がりは、配列間の可変性及び／または抗体／抗原複合体からの構造情報に従ってそれらの領域が定義されたアミノ酸配列の編集データベースとの比較によって決定される。より少ないＣＤＲからなる（すなわち、結合特異性は、３つ、４つ、または５つのＣＤＲによって決定される）官能性抗原結合部位も本発明の範囲内に含まれる。６つのＣＤＲからなる完全セットより少ないものは、幾つかの結合標的に結合するために十分であり得る。故に、場合によっては、ＶＨまたはＶＬドメイン単独のＣＤＲが十分となる。更に、ある特定の抗体は、抗原に対する非ＣＤＲ関連結合部位を有してもよい。かかる結合部位は、本定義内に具体的に含まれる。
【００７３】
「界面」という用語は、本明細書で使用される場合、第２のＩｇＡ重鎖定常領域内の１つ以上の「接触」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基）と相互作用する「接触」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基、例えば炭水化物基など）を第１のＩｇＡ重鎖定常領域内に含む領域を指すように使用される。
【００７４】
「非対称の界面」という用語は、第１及び第２のＩｇＡ重鎖定常領域などの２つの抗体鎖間、かつ／またはＩｇＡ重鎖定常領域とその一致する軽鎖との間に形成された（本明細書で上に定義される）界面を指すように使用され、第１及び第２の鎖内の接触残基は設計によって異なり、相補性接触残基を含む。非対称の界面は、ノブ／ホール相互作用、及び／または塩橋カップリング（電荷交換）、及び／または当該技術分野において既知の他の技法によって、例えば、α重鎖をその一致する軽鎖にカップリングするためのＣｒｏｓｓＭａｂ手法によって作り出すことができる。
【００７５】
「空洞」または「ホール」は、第２のポリペプチドの界面から陥没し、したがって第１のポリペプチドの隣接した界面上の対応する突起（「ノブ」）を収容する、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。この空洞（ホール）は、元の界面内に存在し得るか、または合成的に導入されてもよい（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）。通常、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように改変される。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面内の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸は、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡと置換される。複数の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。置換される元の残基の数に対する上限は、第２のポリペプチドの界面内の残基の総数である。空洞の形成のための好ましい移入残基は、通常は天然型アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、及びグリシン（Ｇ）から選択される。最も好ましいアミノ酸残基は、セリン、アラニン、またはトレオニンであり、最も好ましくはアラニンである。好ましい実施形態において、突起の形成のための元の残基は、チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトリプトファン（Ｗ）などの大きな側鎖体積を有する。
【００７６】
「元の」アミノ酸残基は、元の残基よりも小さいまたは大きい側鎖体積を有し得る「移入」残基によって置換されるものである。移入アミノ酸残基は、天然型または非天然型のアミノ酸残基であり得るが、好ましくは前者である。
【００７７】
「非天然型」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基（複数可）に共有結合することができる残基を意味する。非天然型アミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び例えば、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体である。かかる非天然型アミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）及び上記Ｅｌｌｍａｎらの手順を使用することができる。つまり、これは非天然型アミノ酸残基を用いてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することに続いて、ＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を必要とする。本発明の方法は、ある特定の実施形態において、ＩｇＭ重鎖内の少なくとも１つの元のアミノ酸残基を置換することを必要とするが、１つよりも多くの元の残基を置換することができる。通常、第１または第２のポリペプチドの界面内の残基の総数以下が、置換される元のアミノ酸残基を含む。置換のための好ましい元の残基は、「埋め込まれる」。「埋め込まれる」とは、残基が本質的に溶媒にアクセスできないことを意味する。好ましい移入残基は、潜在的な酸化またはジスルフィド結合の誤対合を防ぐために、システインではない。
【００７８】
突起は、空洞内に「位置付け可能」であり、これは第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドそれぞれの界面上の突起及び空洞の空間位置、ならびにその突起及び空洞のサイズが、界面における第１及び第２のポリペプチドの正常会合を著しく妨害することなく、突起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐなどの突起は、典型的に界面の軸から垂直に伸長せず、好ましい立体配座を有しないため、突起の、対応する空洞とのアライメントは、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるものなどの３次元構造に基づいて、突起／空洞対をモデル化することに依存する。これは、分子モデル化の技法を含む、当該技術分野において広く許容されている技法を使用して達成することができる。
【００７９】
「元の核酸」とは、突起または空洞をコードするために「改変」（すなわち、遺伝子操作または突然変異）され得る、対象のポリペプチドをコードする核酸を意味する。元の核酸または開始核酸は、天然型核酸であり得るか、または以前の改変に供された核酸（例えば、ヒト化抗体断片）を含んでもよい。核酸を「改変する」とは、元の核酸が、対象のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを挿入、欠失、または置換することによって突然変異される。通常、元の残基をコードするコドンは、移入残基をコードするコドンによって置換される。この方法でＤＮＡを遺伝子的に修飾するための技法は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ．Ｅｄ．，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．１９９１）において検討されており、例えば、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発が挙げられる。
【００８０】
突起または空洞は、合成手段によって、例えば、組み換え技法、インビトロペプチド合成、前述の非天然型アミノ酸残基を導入するための技法によって、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技法の幾つかの組み合わせによって、第１または第２のポリペプチドの界面に「導入され」得る。したがって、「導入される」突起または空洞は、「非天然型」か、または「非天然」であり、それが天然にまたは元のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）内に存在しないことを意味する。
【００８１】
好ましくは、突起を形成するための移入アミノ酸残基は、比較的少数（例えば、約３〜６個）の「回転異性体」を有する。「回転異性体」は、アミノ酸側鎖のエネルギー的に好ましい立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数は、Ｐｏｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５−７９１（１９８７）において検討されている。
【００８２】
「宿主細胞」という用語は、本出願で使用される場合、本発明に従って抗体を産生するように操作され得る、任意の種類の細胞系を示す。一実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が宿主細胞として使用される。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物」という表現は、交換可能に使用され、かかる指示物の全ては、子孫を含む。故に、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、転換の数に関係なく、一次対象細胞、及びそれから誘導された培養物を含む。意図的または不慮の突然変異に起因して、全ての子孫がＤＮＡ含有量では厳密に同一でない場合があることも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生体活性を有する異型子孫が含まれる。
【００８４】
核酸は、別の拡散配列との機能的関係に置かれるとき、「操作可能に結合される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に結合され、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に結合され、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に操作可能に結合される。一般に、「操作可能に結合される」は、結合されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合は、隣接し、かつ読み取り枠内にある。しかしながら、エンハンサーは、隣接する必要がない。結合は、都合の良い制限部位での結紮によって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の実践に従って使用される。
【００８５】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、ヒト患者などの対象において標的疾患を治療するために有効な薬物または薬物の組み合わせの量を指す。有効量の薬物は、標的疾患を治癒し、かつ／またはその重症度及び／もしくは期間を低減することができ、部分反応（ＰＲ）または完全反応（ＣＲ）を引き起こすことができる。
【００８６】
詳細な説明
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、大部分の哺乳動物の粘膜分泌物中に存在する抗体の主要クラスとして、吸入され、消化された病原体による侵襲に対する重要な第１の防御線を表す。ＩｇＡはまた、多くの種の血清中に著しい濃度で見出され、粘膜表面を侵害した病原体の排除を媒介する第２の防御線として機能する。ＩｇＡのＦｃ領域に特異的な受容体、ＦｃαＲは、ＩｇＡエフェクター機能の主要媒体である。
【００８７】
ヒトＩｇＡは、２つのサブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２をもたらす、２つの異なるＩｇＡ重鎖定常領域（Ｃα）遺伝子を有することができる。ＩｇＡ１とＩｇＡ２との間の主な差異は、２つのＦａｂアームとＦｃ領域との間にあるヒンジ領域に帰する。ＩｇＡ１は、ＩｇＡ２内に存在しないアミノ酸の重複した長さのアミノ酸の挿入に起因して、伸長されたヒンジ領域を有する。ヒトＩｇＡ１重鎖定常領域の配列は、配列番号１として示される。ヒトＩｇＡ２重鎖定常領域の配列は、配列番号２として示される。
【００８８】
ＩｇＡは、二量体を形成する能力を有し、各々が２つの重鎖及び軽鎖を含む２つの単量体単位は、ジスルフィド橋及びＪ（接続）鎖の組み込みによって安定化された、端と端とをつなぐ構成で配置される。天然ヒトＪ鎖の配列は、配列番号３として示される。粘膜部位において局所的に生成される二量体ＩｇＡは、ポリマー免疫グロブリン受容体（ｐIｇＲ）との相互作用によって、上皮細胞境界を越えて分泌物中に輸送される。このプロセス中、ｐIｇＲは切断され、分泌成分（ＳＣ）と呼ばれる主要断片は、ＩｇＡ二量体に共有結合されるようになる。
【００８９】
本発明の多重特異性ＩｇＡ分子は、ＩｇＡ抗体の二量体形態に基づき、ＩｇＡ重鎖配列の２つの対が、会合した軽鎖配列の有無に関わらず存在し得る。好ましい実施形態において、本明細書のＩｇＡ結合分子は、二重特異性であり、Ｊ鎖を含む２つのＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）二量体からなる。
【００９０】
本発明の多重特異性ＩｇＡ抗体は、分子が全体として少なくとも２つの結合特異性を有する限り、単一及び二重特異性結合単位を含むことができる。
【００９１】
故に、一実施形態において、本明細書におけるＩｇＡ抗体は、二重特異性であり、各々が異なる結合標的に対して結合特異性を有する、２つの単一特異性結合単位（ＡＡ、ＢＢ）からなる。
【００９２】
別の実施形態において、本明細書におけるＩｇＡ抗体は、各結合単位が同じ２つの結合標的（ＡＢ、ＡＢ）に結合して二重特異性ＩｇＡ抗体を形成する、２つの二重特異性結合単位を含む。
【００９３】
更なる実施形態において、本発明のＩｇＡ抗体中に存在する１つの結合単位は、単一特異性（ＡＡ）であるが、他の結合単位は二重特異性（ＢＣ）であり、３つの（Ａ、Ｂ、Ｃ）結合特異性を有するＩｇＡ抗体をもたらす。
【００９４】
異なる実施形態において、各結合単位は二重特異性であるが、１つの特異性は重複しており（例えば、ＡＢ、ＡＣ）、３つの（Ａ、Ｂ、Ｃ）結合特異性を有するＩｇＡ抗体をもたらす。
【００９５】
なおも更なる実施形態において、各結合単位は、異なる結合特異性（ＡＢ、ＣＤ）を有する二重特異性である。故に、ＩｇＡ分子は、４つの（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）結合特異性を有する。
【００９６】
本明細書におけるＩｇＡ結合分子の結合単位は、少なくともＣＡ３（Ｃα３）ドメインを含み、追加としてＣＡ２（Ｃα２）ドメインを含んでもよい。
【００９７】
一実施形態において、本発明の多重特異性ＩｇＡ抗体は、完全ＩｇＡ重（α）鎖定常ドメインを含み、１つ以上の修飾を用いて２つの重鎖間に非対称の界面を作り出す。
【００９８】
更なる実施形態において、本発明の多重特異性ＩｇＡ抗体は、完全天然Ｊ鎖を含む。Ｊ鎖は、それがＩｇＡの重合を促進するため、及びこれらのポリマー中のその存在が、ＳＣ／ｐIｇＲに対するそれらの親和性に必要であると考えられるため、ＳＩｇＡの生成における主要タンパク質である。本明細書における多重特異性ＩｇＡ抗体は、断片または修飾されたＪ鎖が天然Ｊ鎖の機能を保持する限り、Ｊ鎖断片または他の方法で修飾されたＪ鎖を含むことができ、特にＩｇＡの効率的な重合及び分泌成分（ＳＣ）／ポリマー（ｐ）ＩｇＲに対するかかるポリマーの結合を可能にする。Ｊ鎖の構造−機能関係に関する更なる詳細については、例えば、Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（９）：５１８５−５１９２を参照されたい。
【００９９】
２つの異なるα重鎖を有するＩｇＡ分子を生成するために（すなわち、結合単位のうちの少なくとも１つが二重特異性である）、２つの異なる結合特異性を有する２つの一致するα重鎖を互いにカップリングするための方法が見出されなければならない。加えて、結合領域を形成するために軽鎖が必要とされる場合、各重鎖をその一致する軽鎖とカップリングして、所望の結合特異性を提供するための方法が見出されなければならない。
【０１００】
カップリングは、ある特定の残基間の塩橋対電荷スイッチング（電荷交換または電荷反転とも称される）によって、及び／または２つの鎖間にノブ・ホール相互作用を作り出すことによって達成することができる。重鎖は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技法を使用することによって、それらの一致する軽鎖と対合することもできる。最適な結果を達成するために、異なる手法を組み合わせることもできる。
【０１０１】
１．ノブ・イントゥ・ホール技法
本発明の五量体または六量体二重特異性結合分子の収率を向上させるために、ＩｇＡ重鎖定常領域、例えば、Ｃα３ドメインは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９（１９９６）６１７−６２１、及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６（１９９８）６７７−６８１において幾つかの実施例とともに詳細に記載される、「ノブ・イントゥ・ホール」技法によって改変することができる。この方法において、２つのＩｇＡ重鎖定常ドメインの相互作用表面は、異なる結合特異性を有する２つの重鎖、及び／または重鎖とその一致する軽鎖との間のヘテロ二量体化を増加させるように改変される。２つの重鎖ドメインの各々は、「ノブ」であり得るが、一方は「ホール」である。ジスルフィド橋の導入は、ヘテロ二量体を安定させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６（１９９８）６７７−６８１、Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）、収率を増加させる。同様に、一致する重鎖及び軽鎖は、この技法によって互いにカップリングされ得る（Ｚｈｕ，Ｚ．、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．、Ｚａｐａｔａ，Ｇ．、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．６：７８１−７８８（１９９７））。
【０１０２】
この手法に従って、二重特異性ＩｇＡ抗体内の他の重鎖の対応するドメインの元の界面に接する１つの重鎖のＣα（例えば、Ｃα３）ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されてもよく、それにより界面内に突起を作り出し、それを他のＩｇＡ重鎖定常領域内の対応するドメインの界面内の空洞に位置付けることができる。同様に、第２のＩｇＡ重鎖は、第１のＩｇＡ重鎖の定常領域内の対応するドメインとの界面内のアミノ酸残基を、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換することによって改変することができ、それにより２つの重鎖領域間の界面内にホール（空洞）を作り出す。
【０１０３】
ノブ・ホール位置にあるヒトＩｇＡ  Ｃα３ドメイン界面残基を表１に示す。この表は、図４に示される付番に従って、図４に示されるＣα３配列の示された位置にある天然残基、ならびにノブ・ホール対を作り出すために使用され得る潜在的突然変異を特定する。故に、例えば、Ｃα３ドメインにおいて、３５２位にある天然ロイシン（Ｌ）残基は、メチオニン（Ｍ）に突然変異され得るか、または３６８位にある天然トレオニン（Ｔ）残基は、トリプトファン（Ｗ）に突然変異されてノブを作り出すことができ、ノブ突然変異は、アミノ酸位置３５２、３６８、及び４１４に対して列挙されるホールの任意の組み合わせと組み合わせることができる。
【０１０４】
セット番号１〜６に列挙されるノブ・ホール突然変異は、表１に記載される様々な組み合わせで使用できることが強調される。更に、列挙される突然変異は、表２に列挙される電荷交換突然変異などの他のノブ・ホール及び／または電荷交換及び／または電荷導入突然変異と組み合わせることができる。故に、表１に記載されるノブ・ホール突然変異のうちの１つ以上は、本明細書において下に論じられるように、表２に列挙される電荷交換突然変異のうちの１つ以上と組み合わせることができる。故に、表１に記載される任意のセットを選択することができ、それを任意の順序または組み合わせで表２からのいずれかのセットと混合することができる。
【０１０５】
２．塩橋対電荷スイッチング（電荷交換）
対向する電荷は互いに引き寄せ、類似の電荷は互いに跳ね返す。アミノ酸分子の電荷は、ｐＨ依存性であり、αアミノ基（Ｎ）、αカルボキシ基（Ｃ）、及び遊離アミノ酸の側鎖に対して決定されるｐＫ値を特徴とし得る。局所環境は、アミノ酸がタンパク質またはペプチドの一部であるとき、側鎖のｐＫａを改変することができる。
【０１０６】
アミノ酸分子の電荷特性は、分子の全体電荷が中性であるｐＨである、等電点（ｐI）も特徴とし得る。アミノ酸は、それらの側鎖内で互いに異なるため、ｐIは、側鎖のｐＫの差を反映する。
【０１０７】
大部分のアミノ酸（２０個のうち１５個）は、６に近いｐIを有するため、それらは中性の全体電荷を有すると見なされる。Ａｓｐ及びＧｌｕは負電荷を帯び、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇは正電荷を帯びる。
【０１０８】
電荷交換または電荷導入突然変異のための位置及びアミノ酸残基は、表２に列挙される。上述されるように、これらの突然変異以上、または突然変異のセットを、ノブ・ホール突然変異の１つ以上のセットと組み合わせて、２つの異なるＩｇＡ重鎖間及び／またはＩｇＡ重鎖とその一致する軽鎖との間に所望の非対称の界面を提供する。
【０１０９】
好ましくは、２つの異なるＩｇＡ重鎖定常領域間の非対称の界面は、１つのＩｇＡ重鎖内の最大８、例えば、１〜８、もしくは１〜７、もしくは１〜６、もしくは１〜５、もしくは１〜４、もしくは１〜３、もしくは１〜２の突然変異、または２つのＩｇＡ重鎖内の２〜１０、もしくは２〜９、もしくは２〜８、もしくは２〜７、もしくは２〜６、もしくは２〜５、もしくは２〜４、もしくは２〜３の組み合わされた突然変異によって作り出される。
【０１１０】
３．ＣｒｏｓｓＭａｂ技法
上述されるように、ノブ・イントゥ・ホール技法または電荷交換は、抗体重鎖のヘテロ二量体化を可能にする。軽鎖及びそれらの同種重鎖の適切な会合は、二重特異性抗体結合単位の半分の抗原結合断片（Ｆａｂ）内の重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの交換によって達成することができる。交差は、ＩｇＡ抗体の二重特異性結合単位の半分内の完全ＶＨ−ＣＨ及びＶＬ−ＣＬドメインの交差、ＶＨ及びＶＬドメインのみの交差、またはＣＡ及びＣＬドメインの交差として起こり得る。この「交差」は、抗原結合親和性を保持するが、軽鎖誤対合が起こり得なくなるほど２つのアームが異なるようにする。更なる詳細については、ＩｇＧ抗体に関連して、例えば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８（２７）：１１１８７−１１１９２を参照されたい。
【０１１１】
４．多重特異性ＩｇＡ結合分子の生成
（ノブ・イントゥ・ホール、電荷交換及び／またはＣｒｏｓｓ−Ｍａｂ技法に従って）所望の突然変異を有する二重特異性ＩｇＡ抗体結合単位の重鎖のコード配列は、適切なヌクレオチド電荷を抗体ＤＮＡに導入することによって、またはヌクレオチド合成によって生成されてもよい。次に、抗体は、組み換え手段によって生成され得る。
【０１１２】
組み換え体生成のための方法は、当該技術分野において広く知られており、抗体の後次単離を伴う原核及び真核細胞内のタンパク質発現、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞内の抗体の発現のために、それぞれの修飾重鎖及び任意選択で軽鎖をコードする核酸は、標準方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で行われ、抗体は、細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。抗体の組み換え体生成のための一般的な方法は、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３−２０２、Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１−２８２、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１−１６１、Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０−８８０のレビュー論文に記載されている。
【０１１３】
二重特異性抗体は、例えば、タンパク質Ａ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離される。
【０１１４】
本発明の方法は、所望の五量体または六量体構造の代わりに、二重特異性結合単位の単一特異性抗体、抗体断片、単量体、二量体、三量体、及び／または四量体などの製造プロセスの様々な副産物と組み合わせて、二重特異性ＩｇＡ抗体などの二重特異性ＩｇＡ結合分子を主成分として含む組成物をもたらす。生成された組成物は、一般に、所望の五量体または六量体二重特異性結合分子、例えば抗体を、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％含有し、それらは、当該技術分野において既知の方法によって更に精製され、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の純度を有する生成物を生み出す。
【０１１５】
多重特異性ＩｇＡ抗体及び他の多重特異性、二重特異性などの結合分子は、類似様式で生成され得る。
【０１１６】
５．多重特異性ＩｇＡ結合分子の用途
本発明の多重特異性、例えば二重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば抗体は、幅広い治療的及び診断的用途を有する。
【０１１７】
ＩｇＡは、身体の体液免疫系及び粘膜表面における保護機能の主な構成要素を構成し、粘膜免疫性の維持において重要な役割を果たす。ＩｇＡは、二量体及びより高次のオリゴマーの形態で、細胞膜を横切って効率的に輸送され、それが感染に対して第１の特異的免疫学的防御を形成する、外部分泌物に放出される。ＩｇＡは、直接殺滅、凝集、上皮付着及び侵襲の阻害、酵素及び毒素の不活性化、オプソニン化、ならびに補体活性化を含む様々な機序によって、細菌感染に対抗することが示されてきた。分泌物中のＩｇＡは、粘膜表面を標的とするウイルス疾患からも保護する。更なる詳細については、例えば、Ｍｏｓｔｏｗ，Ｋ．Ｅ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１２：６３−８４を参照されたい。
【０１１８】
故に、本発明の多重特異性ＩｇＡ抗体は、微生物、例えば細菌、ウイルス、または真菌感染の治療に固有に適している。
【０１１９】
微生物感染の例としては、制限なしに、細菌感染、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染または多剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染、真菌感染、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種によって引き起こされた感染が挙げられる。ウイルス感染の例としては、制限なしに、呼吸器ウイルスによる感染、例えば、インフルエンザウイルス感染（ｆｌｕ）及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染が挙げられる。
【０１２０】
多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば、本発明の二量体二重特異性ＩｇＡ抗体を追加として使用し、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫欠損ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、ウェストナイルウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすウイルスなどによる感染を治療することができる。多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば、本発明の二量体二重特異性ＩｇＡ抗体を使用して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｅｐｓｉｌｏｎ毒素  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  Ｐｅｓｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ毒素Ｂなどの更なる細菌の株に対して治療することもできる。
【０１２１】
好ましい実施形態において、多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本発明の二量体二重特異性ＩｇＡ抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療のために使用される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、通常はヒト腸内微生物叢の微量成分である、芽胞形成グラム陽性細菌である。しかしながら、高齢者、幼児、または抗生物質治療を受ける免疫不全の個人において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、深刻な下痢、大腸炎、及び死亡につながる劇症になり得る。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の管理は、初期抗生物質の中止及びメトロニダゾール、バンコマイシン、またはフィダキソマイシンによる治療を必要とする。初期治療は、多くの場合良好であるが、患者は、３０％の割合で治療に対する不完全な反応または感染の再発のいずれかを有する。故に、より有効な治療法に対する大きな必要がある。
【０１２２】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの病因は、主に腸内の生物によって分泌される２つの毒素、すなわち毒素Ａ及び毒素Ｂに起因する。これらの毒素は、構造が類似しており、いずれも細胞骨格構造を維持するために必要とされる脱グリコシル化限界ＧＴＰａｓｅによって細胞円形化、分離、及び細胞死を引き起こす。毒素Ａ及び毒素Ｂを強力に中和するモノクローナル抗体が特定され、これらの抗体は、動物モデル及びヒト臨床試験の両方において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療に有望であった。動物研究において、毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれかを中和する個々のモノクローナル抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素により媒介された毒性を阻害することができなかったが、両方の抗体のカクテルは、著しい保護をもたらす。毒素Ａ及び毒素Ｂを特異的に標的とする二重特異性ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡの固有の特性に起因して、著しい追加の利益をもたらす。
【０１２３】
別の好ましい実施形態において、多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば、本発明の二量体二重特異性ＩｇＡ抗体は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の治療に使用される。ＲＳＶは、深刻な下気道疾患を引き起こす普遍的呼吸器ウイルスであり、幼児及び高齢者において肺炎及び気管支炎の主な原因である。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ビリオンの表面上の２つの主要糖タンパク質、付着糖タンパク質（Ｇ）、及び融合糖タンパク質（Ｆ）は、感染の初期段階を制御する。Ｇは、気道の線毛性細胞を標的とし、Ｆは、ビリオン膜を標的細胞膜と融合させる。タンパク質Ｆに対する抗体は、例えば、米国特許第５，８２４，３０７号及び同第６，８１８，２１６号に記載されている。タンパク質Ｇに対する抗体は、例えば、米国特許第７，７３６，６４８号に記載されている。本発明の二重特異性ＩｇＡ二量体は、ＩｇＡの固有の特性に起因して、肺に有効に送達されるその能力を含む、重要な追加の利益をもたらす。
【０１２４】
更に好ましい実施形態において、多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば、本発明の二重特異性ＩｇＡ抗体は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染の治療に使用される。インフルエンザ感染（「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａまたはｔｈｅ  ｆｌｕ）」とも称される）は、ヒト及び家禽動物において最も一般的な疾患のうちの１つである。３つの型のインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、及びＣ型）が疾患を引き起こす。インフルエンザウイルス表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、広い抗原変異性を呈し、インフルエンザ亜型を分類するための基礎である。ＨＡは、ビリオンエンベロープの表面上に出現し、細胞へのウイルス侵入に関与する。ＨＡは、約５６０個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖（ＨＡ０）として最初に合成される膜貫通タンパク質であり、これは後次にタンパク質分解的に分割され、２つのサブユニットＨＡ１及びＨＡ２を形成する。サブユニットは、ジスルフィド結合を通じて接続されたままであり、タンパク質は、ビリオン及び感染した細胞の表面上にホモ三量体として出現する。ＲＡ  Ｌａｍｂ，ＲＭ  Ｋｒｕｇ，Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  （ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ，ＤＥ  Ｇｒｉｆｆｉｎ（Ｅｄｓ．）ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｎ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００１，ｐｇｓ．１４８７−１５３１を参照）。ＨＡ１は、ＨＡの球形ヘッド領域を形成し、ＨＡ亜型間の抗原変異性の大部分に関与する。ＨＡ１は、宿主細胞上のウイルス受容体と相互作用する。ＨＡ２は、ウイルススパイクの線維性ステムを形成し、ビリオンエンベロープと宿主細胞膜との間の融合に関与すると考えられる。様々な異なるＨＡ亜型の中で、ステム領域がより保存される。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８９：３６６−３７３，１９８１、Ｓｋｅｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：５３１−５６９，２０００を参照）。
【０１２５】
ヒトの体内で循環するインフルエンザウイルスの抗原変異性は毎年異なり、故に毎年のワクチン接種が必要とされ、季節ワクチンは、所与の年に最も普及する亜型の予測に基づいて調製される。あいにく、予測は常に正しいとは限らない。更に、インフルエンザウイルスの広域流行株は、定期的に動物保有体からヒト集団に飛び移る。かかる広域流行株、例えばＨ５Ｎ１は、慎重な制御がなければ深刻な疾患の蔓延を引き起こし得る。故に、当該技術分野において、インフルエンザウイルス疾患及び蔓延を制御するための追加の療法の必要性が残る。
【０１２６】
代替手法として、インフルエンザ感染を予防するか、またはウイルス中和を通じて既存の感染を治療することができる抗体に基づく療法が開発中である。インフルエンザウイルス感染から保護する大部分の中和抗体の一次標的は、ＨＡの球形ヘッド領域であるが、この領域の抗原変異性は課題を提起する。近年、インフルエンザＡ及びＢウイルスのＨＡの保存されたステム領域を認識する広域交差中和抗体が特定されたが、臨床研究における有用性は証明されていない。（例えば、国際公開第２００８／０２８９４６号、同第２０１０／１３０６３６号、及び米国公開第２０１４０１２０１１３Ａ１号を参照）。ＩｇＡ骨格のポリクローナル混合物は、インフルエンザウイルスに対して強化された中和能力を有することが示されている（Ｈｅ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０３０９９−１４、２０１５年１月１４日にオンライン投稿された承認原稿）。
【０１２７】
二重特異性及び多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本発明の多重または二重特異性二量体抗体は、様々なインフルエンザウイルス及びインフルエンザウイルス亜型上の異なる抗原を標的とするように設計することができ、故にインフルエンザの管理のための有効なツールを提供する。
【０１２８】
多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本発明のＩｇＡ抗体は、多くの更に広範囲の用途を有する。
【０１２９】
一実施形態において、多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本明細書における抗体は、例えばＶＥＧＦ、ＴＮＦα、またはＩＬ６などの同じ可溶性標的上の２つ以上の部位に結合する。目的は、例えば、タンパク質上の複数の部位に拮抗すること、及び／または所与の標的に対する結合力を増加させることであり得る。
【０１３０】
別の実施形態において、多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本明細書における抗体は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）などの同じ細胞表面（受容体）標的上の２つの以上の部位に結合する。故に、例えば二重特異性結合分子は、ＨＥＲ２分子上の４Ｄ５及び２Ｃ４エピトープの両方を標的とし得る。この手法は、所与の標的に対する生物作用能及び／または結合力を増加させることができる。
【０１３１】
なおも別の実施形態において、多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本発明の抗体は、例えばＴＮＦα及びＩＬ６、ＶＥＧＦα及びＡｎｇ２、または２つのサイトカインなどの２つ以上の異なる可溶性標的（球形タンパク質またはペプチド）に結合する。この手法は、特定経路のより完全な遮断、いわゆる「サイトカインストーム」の遮断、または酵素及びその基質、例えば第ＩＸａ因子及び第Ｘ因子の調整をもたらし得る。
【０１３２】
更なる実施形態において、多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本明細書における抗体は、血管新生因子及び新生血管特異的受容体などの１つ以上の可溶性標的及び１つ以上の細胞表面受容体標的に結合することができる。この手法の目的は、特定部位または組織における送達及び遮断の増加でもあり得る。
【０１３３】
なおも更なる実施形態において、多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本明細書における抗体は、例えばＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）などの２つ以上の異なる細胞表面受容体標的に結合するように設計される。これは、特異性及び選択性の強化、かつ／または所与の経路のより完全な遮断をもたらし得る。
【０１３４】
多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本発明の抗体は、例えばＴＮＦα及び血清アルブミン、またはＶＥＧＦ及び血清アルブミンなどの１つの可溶性標的または細胞表面受容体標的、及び滞留時間の長い標的に結合するように設計することもできる。これらの分子は、アルブミン特異性を有しない結合分子よりも長い循環半減期を有すると予想される。
【０１３５】
更なる実施形態において、多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば本明細書における抗体は、例えばＶＥＧＦα及びヒアルロン酸などの１つ以上の可溶性標的及び１つ以上のマトリックスタンパク質または基質に結合することができる。得られる二重特異性結合分子は、例えば、眼内空間におけるそれらの増加した滞留時間に起因して、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）などの眼の病態の抗血管新生療法において実用性を見出すことができる。
【０１３６】
二重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば１つの可溶性または受容体標的、及び輸送体受容体（すなわち、トランスフェリン受容体）、例えば抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ（エクソンＩＩＩを欠失した突然変異体形態）に結合する抗体は、抗トランスフェリン特異性と組み合わされて神経膠芽腫を見出し、血管脳障壁を越える抗体送達において実用性を見出すことができる。
【０１３７】
他の多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば抗体は、Ｂ細胞及びＴ細胞などの２つ以上の異なる細胞型に結合することができる。かかる抗体は、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）または非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞及び／もしくはＴ細胞関連疾患もしくは状態において実用性を見出すことができる。
【０１３８】
全ての実施形態において、二量体二重特異性ＩｇＡ抗体の使用が好ましい。
【０１３９】
標的抗原に会合する、有効量の、多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば任意及びすべての上述される関連病態の治療のための二重特異性二量体ＩｇＡ抗体を含む薬学的組成物は、かかる病態の治療のための方法及び使用とともに、明白に本発明の範囲内である。
【０１４０】
６．組成物、薬学的組成物、及び治療の方法
一態様において、本発明は、本明細書における精製された多重特異性ＩｇＡ抗体を含む組成物に関する。該組成物は、一般に、所望の二重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば抗体を、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％含有する。組成物は、薬学的組成物であってもよく、二重特異性結合分子、例えば抗体は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と混和されている。
【０１４１】
様々な実施形態において、本発明の薬学的組成物は、有効量の、多重特異性ＩｇＡ抗体などの多重特異性ＩｇＡ結合分子、例えば上に列挙される病態または疾患の治療のための本発明の二量体二重特異性ＩｇＡ抗体を含む。全ての実施形態において、二量体二重特異性ＩｇＡ抗体の使用が好ましい。
【０１４２】
本発明の薬学的組成物は、当該技術分野において既知の様々な方法によって投与され得る。熟練者によって理解されるように、投与の経路及び／または形態は、標的疾患または病態及び所望の結果に応じて異なる。ある特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物を、その不活性化を防ぐ材料でコーティングするか、または化合物を共投与することが必要であり得る。例えば、該化合物は、適切な担体、例えば、リポソームまたは希釈剤中で対象に投与されてもよい。薬学的に許容される希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。薬学的担体としては、滅菌注射剤または分散剤の即座調製のための滅菌水性溶液または分散剤及び滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において既知である。
【０１４３】
該組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び／または分散剤などの補助剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順、ならびに様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含の両方によって確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。加えて、注入可能な剤形の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の包含によってもたらされ得る。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定患者、組成物、及び投与形態に対して、該患者に毒性とならずに所望の治療反応を達成するために有効な活性成分の量を得るように変化してもよい。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の分泌速度、治療期間、他の薬物、用いられる特定組成物と組み合わせて使用される化合物及び／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康、及び以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存する。
【０１４５】
組成物は、該組成物がシリンジによって送達可能である程度に滅菌かつ流動性でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張緩衝生理食塩液である。
【０１４６】
本明細書で述べられる全ての刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に明白に組み込まれ、刊行物が関連して引用される方法及び／または材料を開示し、説明する。本明細書で引用される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対して引用されている。ここでは、本発明者らが、より以前の優先日または以前の発明日によって、該刊行物よりも前日付であると主張する権利がないことを認めるものと解釈されてはならない。更に、実際の公開日は、示されるものとは異なる場合があり、独立した認証を必要とする。
【０１４７】
以下の実施例、配列表、及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲内に記載される。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載される手順に修正を行うことができることが理解される。
【実施例】
【０１４８】
実施例１
１．設計された突然変異によるＤＮＡコンストラクトの生成
ａ．材料及び方法：設計された突然変異によりＤＮＡコンストラクトを生成する
ｂ．ＤＮＡコンストラクトの合成
設計された突然変異によるＤＮＡコンストラクトは全て、商業ベンダー（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）によって合成され、それぞれの発現ベクターにサブクローニングするために、両端に適合性制限部位を有する。
ｃ．発現ベクターを構成する
合成されたＤＮＡコンストラクトを、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に１μｇ／ｍＬで再懸濁する。ＤＮＡ（１μｇ）を酵素消化に供し、合成された遺伝子を電気泳動によって担体プラスミドＤＮＡから分離する。消化されたＤＮＡを、標準分子生物学技法によって、前消化されたプラスミドＤＮＡ（α鎖の場合、ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＡ１、κ鎖の場合、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に結紮する。結紮されたＤＮＡを、競合細菌に形質転換し、複数の選択的抗生物質とともにＬＢプレートに置く。幾つかの細菌コロニーを採取し、ＤＮＡ調製物を標準分子生物学技法によって作製する。調製されたＤＮＡを、配列決定によって検証する。設計されたＤＮＡ配列と１００％のＤＮＡ配列マッチを有する細菌クローンのみを、プラスミドＤＮＡの調製、及び後次に細胞形質移入に使用する。
ｄ．異なるサイズのα鎖
２つの異なるα鎖（Ａ及びＢ）を一緒にカップリングすることができることを証明するために、別個の分子量及びリガンド特異性を有する２つの異なるα鎖を構成する。
ｅ．Ａ鎖は、ヒトα鎖のＣＡ１と融合されたキメラＯＫＴ３（抗ＣＤ３）ＶＨ領域のための完全長α鎖で構成される。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
（配列番号２３）
Ａ鎖は、約５５ｋＤの分子量を有し、ＣＤ３（１０９７７−Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＴ細胞の可溶性ε鎖に結合することができる。
ｆ．Ｂ鎖は、ヒトα鎖の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）−ヒンジ−ＣＡ２−ＣＡ３と融合されたｃＭｙｃタグを有する。
ＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＧＧＧＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
（配列番号２４）
Ｂ鎖は、約２８ｋＤの分子量を有し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ４または他の抗ｍｙｃ抗体に結合することができる。
ｇ．代替Ｂ鎖は、ヒトα鎖のヒンジ−ＣＡ２で融合されたＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＣＬ（ＶＨ＋ＣＬ）リツキシマブ（抗ＣＤ２０）の完全長α鎖を有する。
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
（配列番号２５）
Ｂ鎖は、約５５ｋＤの分子量を有し、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞に結合することができる。
ｈ．異なる軽鎖カップリング
ｉ．天然キメラＯＫＴ３κ鎖
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＡＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号２６）
ｊ．リツキシマブに対するＣｒｏｓｓＭａｂＶＬ−ＣＨ１
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ
（配列番号２７）
軽鎖は、約２５ｋＤの分子量を有する。
ｋ．異なる発現ベクターの異なる選択マーカー
異なる選択マーカーは、共形質移入のために使用される異なる発現ベクター上で使用される。ＩｇＡ生成に関連する全ての必須発現ベクターに対応するために、複数の薬物が細胞の選択に使用される。特定のＤＮＡをこれらのベクターにクローニングするために、標準分子生物学技法が使用される。
ｌ．α鎖はゼオシン選択を利用する（抗ｚｎ−１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。ゼオシンは、１００μｇ／ｍＬの濃度で使用される。Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子を含有するプラスミドによる形質移入後、次に細胞を、１００μｇ／ｍＬでゼオシンを含有するＯｐｔｉ−ＣＨＯ媒体中でインキュベートして、安定した形質移入体を選択する。
ｍ．κ鎖はブラスチシジンＳ選択を利用する（抗ｂｌ−１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。ブラスチシジンＳは、１０μｇ／ｍＬの濃度で使用される。ｂｓｒ遺伝子を含有するプラスミドによる形質移入後、次に細胞を１０μｇ／ｍＬでブラスチシジンＳを含有するＯｐｔｉ−ＣＨＯ媒体中でインキュベートして、安定した形質移入体を選択する。
ｎ．タンパク質の発現、精製、及び特徴付け
ｏ．形質移入
ｐ．ＩｇＡは、等モル比または可変モル比（５〜１０倍差）での、２９３細胞またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞への幾つかの異なる発現ベクターの共形質移入によって作製される。発現ベクターのためのＤＮＡをＰＥＩと混合し、次にＣＨＯ−Ｓ細胞に添加する。ＣＨＯ−Ｓ細胞によるＰＥＩ形質移入は、確立された技法に従って行う（「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ  ８７，５５３−５４５」を参照）。
ｑ．タンパク質の精製
ｒ．ジャカリン−アガロース（カタログ番号ｇｅｌ−ｊａｃ−５、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）
形質移入されたＣＨＯ−Ｓ細胞の上清からのＩｇＡタンパク質は、製造者のプロトコルに従い、親和性ジャカリン−アガロースによって精製される。
ｓ．カプト−Ｌ（カタログ１７−５４７８−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ＣＨＯ−Ｓ細胞上清中にκ鎖を含有する形質移入されたＩｇＡタンパク質は、製造者のプロトコルに従い、カプト−Ｌ親和性マトリックスによって精製される。
ｔ．ゲル電気泳動
ｕ．非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
ｖ．非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、サイズに従って天然ＩｇＡ及びその操作された形態を分離する。ホモ二量体重鎖（ＡＡ）及びそれらの軽鎖からなるＩｇＡは、約１６０ｋＤａ分子量のタンパク質バンドを生成する。より短いバージョンのホモ二量体重鎖（ＢＢ）からなるホモ二量体ＩｇＡは、例えばｃＭｙｃタグ付きＩｇＡ−Ｆｃとともに、著しく低い分子量のタンパク質バンドを生成する。ヘテロ二量体重鎖（ＡＢ）からなるＩｇＡは、ＢＢより多く、ＡＡよりも少ない分子量を有する複数のタンパク質を生成する。
ｗ．ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＩｇＡタンパク質試料に２５℃で３０分間、ゲル上に負荷する前に添加する。ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ３〜１２％ビス−トリスゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｎｏｖｅｘトリス−酢酸塩ＳＤＳ走行緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ）とともに使用する。色素の最前部がゲルの底部に到達するまで、ゲルを走行させる。
ｘ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元する
ｙ．ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＮｕＰａｇｅ還元剤ジチオトレイトール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＩｇＡタンパク質試料に添加し、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０３２２）上に負荷する前に８０℃で１０分間加熱する。ＮｕＰａｇｅ  ＭＥＳ  ＳＤＳ走行緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０００２）をゲル電気泳動に使用する。色素の最前部がゲルの底部に到達するまで、ゲルを走行させる。
ｚ．電気泳動が完了した後、ゲルを装置から除去し、コロイドブルー染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マニュアル番号ＬＣ６０２５）を使用してゲルを染色する。
ａａ．ゲルバンドの定量
タンパク質ゲルを乾燥させ、次に画像走査装置を使用してデジタル化する。Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを用いてゲル画像を処理し、特定バンド内のタンパク質の量は、ゲル定量関数を使用して決定することができる。
ｂｂ．二重特異性調製物中の様々なｍＡｂを特定／定量するための質量分光分析
ｃｃ．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用する安定性分析
ｄｄ．二重特異性機能分析
ｅｅ．２つのリガンドに対するＥＬＩＳＡ分析
ＯＫＴ３（鎖Ａ）及びｃＭｙｃペプチド（鎖Ｂ）を有するＩｇＡを、ＥＬＩＳＡ分析によって、可溶性ＣＤ３εタンパク質捕捉及び抗ｃＭｙｃ（９Ｅ１０）検出を用いてアッセイする。可溶性ＣＤ３εタンパク質を、ＥＬＩＳＡプレート上に１５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中２ｍｇ／ｍＬでコーティングし、続いてＰＢＳ中３％のＢＳＡで遮断する。形質移入されたＩｇＡ−ＯＫＴ３−ｃＭｙｃを含有する上清（１００μＬ）を、遮断したＥＬＩＳＡプレートに２５℃で４時間添加する。ＰＢＳで洗浄した後、９Ｅ１０抗体をＥＬＩＳＡプレートに室温で２時間添加する。ＰＢＳでの洗浄に続いて、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを添加する。二重特異性ＩｇＡの存在は、ＨＲＰ基質を添加した後、ＯＤ４５０で読み取ることによって検出される。
ｆｆ．標的結合のＦＡＣＳ分析
Ｔ細胞に対するＩｇＡ−ＯＫＴ３−ｃＭｙｃ結合は、Ｔ細胞株（Ｐｅｅｒ、陽性細胞株）及びＢ細胞株（Ｄａｕｄｉ、陰性対照細胞株）に対する抗体の結合によって確認される。洗浄後、ローダミン標識された９Ｅ１０を細胞懸濁液に添加する。細胞標的結合は、ＣＤ３抗原の有無に関わらず、陽性及び陰性対照細胞の両方のＭＦＩによって検出される。
ｇｇ．二重特異性結合の蛍光顕微鏡アッセイ
設計されたＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性ＩｇＡの二重特異性結合を、２つの異なる生体染色色素によって各細胞型に関して前標識されたＣＤ３陽性細胞及びＣＤ２０陽性細胞の２つの集団を一緒にするその能力によって検証する。例えば、
ｈｈ．ＣＤ３陽性細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）を標識する緑色蛍光サイトゾル生体染色色素（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）カルセイングリーンＡＭ）
ｉｉ．ＣＤ２０陽性Ｂ細胞細胞株（Ｄａｕｄｉ）を標識する赤色蛍光サイトゾル生体染色色素（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）カルセインレッド−オレンジ、ＡＭ）
【０１４９】
実施例２
二重特異性二量体ＩｇＡの肺への輸送
二重特異性二量体ＩｇＡが肺に送達される能力は、様々な方法によって調査することができる。例えば、３〜４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、ＰＢＳ中のヒトＩｇＧ１／κまたは二量体ＩｇＡ／κを、最大５０ｍｇ／ｌｇの用量でＩＶ注入する。代替的に、ヒトまたはマウス抗ＣＤ２０抗体を使用することができる。注入後４時間で、血液試料を収集し、血漿について処理する。犠牲死させる直前に、マウスに麻酔をかけて失血させる。頸部リンパ節の除去に続いて、気管を露出し、上気管及び鼻腔を２００μＬのＰＢＳで洗浄することによって鼻洗浄試料を収集する。カテーテルを気管に挿入し、肺を１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄することによって（合計３ｍＬ、遠心分離によって清澄化）、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料を収集する。プロテアーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオリドを、収集後に全ての試料に１ｍＭの濃度で添加し、全ての試料を分析まで−２０℃以下で保管する。
【０１５０】
各試料中の試験抗体の濃度をＥＬＩＳＡによってアッセイする。簡潔には、マウスＩｇで交差吸収されたヤギポリクローナル抗ヒトκ軽鎖抗体を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル上に終夜４℃でコーティングし、次に未反応の部位を、３％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで遮断する。代替的に、プレートを可溶性形態のヒトＣＤ２０でコーティングしてもよい。洗浄後、連続希釈した試験試料及び標準物質をプレートに適用し、３７℃で１時間インキュベートする。次にプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、マウスＩｇに対して交差吸収されたアルカリホスファターゼ複合重鎖特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡでインキュベートする。マウス試験抗体の場合、固定化したＣＤ２０を捕捉に使用し、アルカリホスファターゼ複合重鎖特異的ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡを検出に使用する。ｐ−ニトロフェニルホスフェートでプレートを現像し、４０５ｎｍの光学密度（ＯＤ）で読み取る。ＩｇＡ及びＩｇＧ標準曲線からの結果に基づいて、各試料中の試験抗体の濃度を計算する。
【０１５１】
実施例３
ＲＳＶ  Ｆ及びＧ抗原に対する二重特異性二量体ＩｇＡ抗体
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、深刻な下呼吸器管疾患を引き起こす固有の呼吸器ウイルスであり、幼児及び高齢者において肺炎及び気管支炎の主な原因である。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ビリオンの表面上の２つの主要糖タンパク質、付着糖タンパク質（Ｇ）、及び融合糖タンパク質（Ｆ）は、感染の初期段階を制御する。Ｇは、気道の線毛性細胞を標的とし、Ｆは、ビリオン膜を標的細胞膜と融合させる。
【０１５２】
本実施例に従って、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合することができる配列を有する１つの重鎖及び軽鎖の組み合わせ、ならびにＲＳＶ  Ｇタンパク質に結合することができる配列を有する別の重鎖及び軽鎖の組み合わせからなる固有の二量体ＩｇＡ分子を操作する。実施例１に記載される技術を使用するこれらの抗体の発現は、ＲＳＶ  Ｆの２つの結合部分及びＲＳＶ  Ｇの２つの結合部分を有する単一ＩｇＡ分子をもたらす。
【０１５３】
表１に列挙されるセット＃１、ノブ、ＣＡ３  ＃１突然変異（太字）を含む、二重特異性ヒト抗ＲＳＶ  ＩｇＡ２抗体のＲＳＶ  Ｇ結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号１０として示される。ＲＳＶ  Ｇタンパク質結合部分のヒトκ軽鎖可変領域配列は、配列番号１１として示される。
【０１５４】
セット＃１、ホール、ＣＡ３  ＃２、ＣＡ１突然変異を含む、操作されたＩｇＡ２抗体重鎖（配列番号８）に融合された二重特異性抗体の抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質結合部分の可変軽鎖領域配列のＣｒｏｓｓＭａｂバージョンは、配列番号１２として示される。操作されたκ定常軽鎖ドメイン（配列番号９）に融合された抗ＰＳＶ  Ｆタンパク質結合部分の可変重鎖領域配列のＣｒｏｓｓＭａｂバージョンは、配列番号１３として示される。
【０１５５】
ＲＳＶ  Ｇ及びＲＳＶ  Ｆ抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗ＲＳＶ  ＩｇＡ抗体の結合は、試薬が特定抗原及び二重特異性抗体の性質に応じて修飾されることを除いて、本質的に実施例１．ｅｅに記載されるように評価する。例えば、Ｆタンパク質及びＧタンパク質に結合するＲＳＶ二重特異性ＩｇＡ抗体を評価するためのＥＬＩＳＡにおいて、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（またはその適切な断片）は固定化され、ＥＬＩＳＡ捕捉に使用されるが、ビオチニル化可溶性ＲＳＶ  Ｇタンパク質（またはその適切な断片）は、検出に使用される。代替的に、Ｇタンパク質を捕捉に使用することができ、可溶性ビオチニル化Ｆタンパク質を検出に使用してもよい。二重特異性ＩｇＡの存在は、アビジン−ＨＲＰ及び基質を添加した後、ＯＤ４５０ｎｍで読み取ることによって検出される。
【０１５６】
ＲＳＶの培養及びインビトロＲＳＶウイルス中和アッセイは、米国特許第７７３６６４８号に記載されるものなどの様々な標準技法を使用して行うことができる。つまり、ＨＥｐ２細胞は、１２ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルで播種される。翌日、抗体の連続希釈液が培地中で生成される。約２００ＰＦＵ／ウェルのＲＳＶを、ウサギ補体血清の存在下で抗体に添加し、室温で１時間インキュベートする。次に、抗体−ウイルス混合物をＨＥｐ２細胞に２００μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートして感染を可能にする。この感染期間に続いて、培地を除去し、１％メチルセルロースを含有する培地を全てのウェルに添加する。プレートを３５℃で６日間インキュベートし、その後、細胞を固定し、次のようにプラーク数決定のために染色する。メチルセルロースを細胞層から吸引し、細胞を１００％メタノール中に室温で３０分間固定する。次に、プレートをＰＢＳ中の５％乳汁で３回洗浄する。一次抗体を、ＰＢＳ＋５％乳汁タンパク質中の１：５００希釈液（ヤギ抗ＲＳＶポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  カタログ番号ＡＢ１１２８））で１時間添加する。プレートをＰＢＳ中の５％乳汁で再度３回洗浄する。次に、二次抗体を、ＰＢＳ中の５％乳汁タンパク質の１：５００希釈液（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅウサギ抗ヤギ抗体ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ複合）で１時間添加する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４０２））。プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄する。１工程クロロナフトール基質（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０１２）を１ウェル当たり２００μＬで１０分間添加することによって、プラークを可視化する。プレートを水で洗浄し、空気乾燥させる。各ウェル内のプラークを手検測によって数える。
【０１５７】
インビボＲＳＶ中和研究、例えばＣｏｌｌａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００９（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８３＿６３３８−６３４５）に記載されるマウス予防研究は、様々な標準技法を使用して行うことができる。簡潔には、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、試験される抗体（二重特異性ＩｇＡ抗体ならびに陽性及び陰性対照）を、最大５０ｍｇ／ｋｇの用量で注入する。２４時間後（予防モデル）、マウスに１０６ＰＦＵのＲＳＶ長株ウイルスを鼻腔内感染させる。代替的に、ウイルス攻撃後最大数日間、抗体を投与してもよい（治療モデル）。５日後、動物を犠牲死させ、それらの肺を切除する。ウイルス負荷は、５日目に（ｉ）肺組織１グラム当たりのＰＦＵ、または（ｉｉ）トリゾール抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して肺組織からＲＮＡを抽出した後の定量的ＰＣＲによって、定量する。ウイルスＮ遺伝子複製数は、組織試料のアクチンｍＲＮＡ含有量のパーセントとして表現される。対照動物は、いかなる抗ＲＳＶ  ｍＡｂも受容しないか、または非免疫アイソタイプ対照ｍＡｂを受容するかのいずれかである。
【０１５８】
実施例４
インフルエンザ抗原に対する二重特異性二量体ＩｇＡ抗体
インフルエンザ感染（「インフルエンザ」または「ｔｈｅ  ｆｌｕ」とも称される）は、ヒト及び家禽動物において最も一般的な疾患のうちの１つである。３つの型のインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、及びＣ型）が疾患を引き起こす。インフルエンザウイルス表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、広い抗原変異性を呈し、インフルエンザ亜型を分類するための基礎である。ＨＡは、ビリオンエンベロープの表面上に出現し、細胞へのウイルス侵入に関与する。ＨＡは、約５６０個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖（ＨＡ０）として最初に合成される膜貫通タンパク質であり、これは後次にタンパク質分解的に分割され、２つのサブユニットＨＡ１及びＨＡ２を形成する。サブユニットは、ジスルフィド結合を通じて接続されたままであり、タンパク質は、ビリオン及び感染した細胞の表面上にホモ三量体として出現する。ＲＡ  Ｌａｍｂ，ＲＭ  Ｋｒｕｇ，Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．（ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ，ＤＥ  Ｇｒｉｆｆｉｎ（Ｅｄｓ．）ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｎ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００１，ｐｇｓ．１４８７−１５３１を参照）。ＨＡ１は、ＨＡの球形ヘッド領域を形成し、ＨＡ亜型間の抗原変異性の大部分に関与する。ＨＡ１は、宿主細胞上のウイルス受容体と相互作用する。ＨＡ２は、ウイルススパイクの線維性ステムを形成し、ビリオンエンベロープと宿主細胞膜との間の融合に関与すると考えられる。
【０１５９】
本実施例に従い、インフルエンザＡウイルスのＨＡサブユニット上の２つの異なる抗原に結合することができる配列を有する、１つの重鎖及び軽鎖の組み合わせからなる固有の二量体ＩｇＡ分子を操作する。実施例１に記載される技術を使用するこれらの抗体の発現は、各ＨＡエピトープの２つの結合部分を有する単一ＩｇＡ分子をもたらす。代替的に、ＨＡ及びＮＡ上のエピトープに向けられた二重特異性ＩｇＡ抗体を構成することができる。
【０１６０】
表１に列挙されるセット＃１、ノブ、ＣＡ３  ＃１突然変異（太字）を含む、二重特異性ヒト抗インフルエンザＩｇＡ抗体の第１のＨＡ結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号１４として示される。重鎖可変領域と会合したヒトκ軽鎖可変領域配列は、配列番号１５として示される。
【０１６１】
セット＃１、ホール、ＣＡ３  ＃２、ＣＡ１突然変異を含有する、操作されたＩｇＡ２抗体重鎖（配列番号８）に融合された二重特異性抗体の第２のＨＡ結合部分の可変軽鎖領域配列のＣｒｏｓｓＭａｂバージョンは、配列番号１６として示される。操作されたκ定常軽鎖ドメイン（配列番号９）に融合された第２のＨＡ結合部分の可変重鎖領域配列のＣｒｏｓｓＭａｂバージョンは、配列番号１７として示される。
【０１６２】
２つの抗原に対する二重特異性抗インフルエンザＩｇＡ抗体の結合は、試薬が特定抗原及び二重特異性の性質に応じて修飾されることを除いて、本質的に実施例１に記載されるように評価する。例えば、ＨＡ及びＮＡに結合するインフルエンザ二重特異性ＩｇＡを評価するためのＥＬＩＳＡにおいて、１つのインフルエンザタンパク質またはペプチドは固定化され、ＥＬＩＳＡ捕捉に使用されるが、異なるインフルエンザタンパク質またはペプチドは、ビオチニル化され、検出に使用される。二重特異性ＩｇＡの存在は、アビジン−ＨＲＰ及び基質を添加した後、ＯＤ４５０ｎｍで読み取ることによって検出される。
【０１６３】
インフルエンザウイルスの培養及びインビトロインフルエンザウイルス中和アッセイは、Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．２００８（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３，ｅ３９４２）に記載されるものなどの様々な標準技法を使用して行うことができる。簡潔には、ＭＤＣＫ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃で維持する。実験の日に、９６ウェル形式のＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＦＣＳ、１％ＰＳ、及び１ｍｇ／ｍＬのＴＰＣＫトリプシン（非Ｈ５ウイルス）を補充したＭＥＭ中で培養する。２倍に連続希釈した抗体を、等量のウイルス接種原と混合し、続いて３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、混合物（約１００  ＴＣＩＤ５０）をコンフルエントなＭＤＣＫ単層に添加する。細胞変性効果（ＣＰＥ）の審査前に、細胞を７２時間培養する。ＣＰＥは、陽性対照（ウイルス播種した細胞）及び陰性対照（模擬播種した細胞）と比較する。個々のウェル内のＣＰＥの非存在は、保護として定義される。
【０１６４】
インビボ保護研究は、Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．２００８（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ３，ｅ３９４２）に記載されるものなどの様々な標準技法を使用して行うことができる。簡潔には、７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、試験される抗体（二重特異性ＩｇＡ抗体ならびに陽性及び陰性対照）を、最大５０ｍｇ／ｋｇ（予防モデル）の用量でＩＰ注入する。２４時間後、マウスに致死量のウイルス（典型的に１０倍〜２５倍ＬＤ５０）を鼻腔内播種し、２１日間観察する。代替的に、ウイルス攻撃後最大数日間、抗体を投与してもよい（治療モデル）。臨床兆候を、採点システム（０＝臨床兆候なし、１＝粗コーティング、２＝粗コーティング、低反応、対処中は受動的、３＝粗コーティング、巻き上げ、強制呼吸、対処中は受動的、４＝粗コーティング、巻き上げ、強制呼吸、無反応）により採点し、生存していると記録する。体重を監視してもよい。対照動物は、典型的に、攻撃後１２日から１５日以内に死亡する。
【０１６５】
実施例５
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ及びＢに対する二重特異性二量体ＩｇＡ抗体
前述のように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、通常はヒトの腸内の微生物叢の微小成分である、芽胞形成グラム陽性細菌である。しかしながら、高齢者、幼児、または抗生物質治療を受ける免疫不全の個人において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、深刻な下痢、大腸炎、及び死亡につながる劇症になり得る。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の管理は、初期抗生物質の中止及びメトロニダゾール、バンコマイシン、またはフィダキソマイシンによる治療を必要とする。初期治療は、多くの場合良好であるが、患者は、３０％の割合で治療に対する不完全な反応または感染の再発のいずれかを有する。故に、より有効な治療法に対する大きな必要がある。
【０１６６】
本実施例に従い、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａに結合し、中和することができる配列を有する１つの重鎖及び軽鎖の組み合わせ、ならびに毒素Ｂに結合し、中和するように設計された第２の重鎖及び軽鎖の組み合わせからなる固有の二量体ＩｇＡ分子を操作する。本明細書に記載される技術を使用するこれらの抗体の発現は（実施例１を参照）、全身投与時にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の腸部位に有効に通行することができる、毒素Ａに対する２つの結合部分及び毒素Ｂに対する２つの結合部分を有する単一ＩｇＡ分子をもたらす。かかる固有のＩｇＡ分子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ反復感染の治療に対する用量反応を向上させるか、または致死的Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患の対象における初期治療の有効性を向上させる。
【０１６７】
表１に列挙されるセット＃１、ノブ、ＣＡ３  ＃１突然変異（太字）を含む、二重特異性ヒト抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗体の毒素Ａ結合部分の重鎖可変領域配列は、表１８として示される。重鎖可変領域と会合したヒトκ軽鎖可変領域配列は、配列番号１９として示される。
【０１６８】
セット＃１、ホール、ＣＡ３  ＃２、ＣＡ１突然変異を含む、操作されたＩｇＡ２抗体重鎖（配列番号８）に融合された二重特異性抗体の毒素Ｂ結合部分の可変軽鎖領域配列のＣｒｏｓｓＭａｂバージョンは、配列番号２０として示される。操作されたκ定常軽鎖ドメイン（配列番号９）に融合された毒素Ｂ結合部分の可変重鎖領域配列のＣｒｏｓｓＭａｂバージョンは、配列番号２１として示される。
【０１６９】
試薬が特定抗原及び二重特異性の性質に応じて修飾されることを除いて、２つの抗原に対する二重特異性抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＩｇＡ抗体の結合を、本質的に実施例１．ｅｅに記載されるように評価する。例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ及び毒素Ｂ（またはその適切な断片）に結合する二重特異性ＩｇＡを評価するためのＥＬＩＳＡにおいて、毒素Ａ（またはその適切な断片）は固定化され、ＥＬＩＳＡ捕捉に使用されるが、ビオチニル化毒素Ｂ（またはその適切な断片）は、検出に使用される。代替的に、毒素Ｂは、捕捉に使用することができ、可溶性ビオチニル化毒素Ａは、検出に使用されてもよい。二重特異性ＩｇＡの存在は、アビジン−ＨＲＰ及び基質を添加した後、ＯＤ４５０ｎｍで読み取ることによって検出される。
【０１７０】
インビトロＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ及び毒素Ｂ毒素中和アッセイは、Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，６３３９−６３４７）に記載されるものなどの様々な標準技法を使用して行うことができる。簡潔には、ＩＭＲ−９０肺線維芽細胞が異なる濃度の毒素Ａまたは毒素Ｂの存在下でインキュベートされるとき、細胞は円形化し、細胞培養皿への付着を喪失する。この細胞変性効果（ＣＰＥ）は、細胞の目視検査によって決定され、０〜４のＣＰＥスコアは、その目視検査の結果に基づいて決定される。中和を試験するために、ＩＭＲ−９０細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートの１ウェル当たり１×１０５細胞で播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃で１２時間インキュベートする。毒素Ａ（６ｎｇ／ｍＬ）または毒素Ｂ（２０ｐｇ／ｍＬ）を、様々な濃度の抗体で１時間インキュベートし、細胞培養物に添加して、インキュベーションを３７℃で１８時間継続する。次に、細胞変性効果を顕微鏡的に決定し、０（０％円形化細胞）、１（２５％円形化細胞）、２（５０％円形化細胞）３（７５％円形化細胞）、または４（１００％円形化細胞）として採点し、結果をＣＰＥ対抗体用量としてプロットする。滴定曲線から、抗体のＩＣ５０を計算することができる。
【０１７１】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの培養及びインビボＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ及び毒素Ｂ中和アッセイは、Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，６３３９−６３４７）に記載されるハムスター保護モデルなどの様々な標準技法を使用して行うことができる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより誘導された致死性に対する保護の場合、シリアンゴールデンハムスター（７０〜８０ｇ）の群に抗体の４全量（二重特異性ＩｇＡ抗体ならびに陽性及び陰性対照）を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞の投与の３日前から開始して４日間、腹腔内的に付与する。クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞攻撃の２４時間前に腹腔内投与し、次にハムスターに１４０  Ｂ１芽胞を標準小動物給餌針を使用して胃内投与して攻撃する。対照動物は、典型的に攻撃後７２時間以内に死亡する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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