(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己増殖能を有し、CD34陽性及びGPIIb/IIIa陰性の表現型を示す、急性巨核球性白血病細胞由来の細胞株。
【請求項２】
前記急性巨核球性白血病細胞がCMK細胞である請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
受託番号FERM BP-4227として寄託されている細胞株である請求項２記載の細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、特定の表現型及び自己増殖能を有し、場合によってはさらに自己分化能をも有するヒト白血病細胞株に関する。本細胞株は造血系に関与する因子、すなわち、造血幹細胞の自己複製、巨核球の増殖や分化、また血小板の産生に関与する因子のアッセイに有用である。これらの因子が取得できれば、骨髄移植やがんの化学療法や放射線療法後の血小板減少などに広く応用されうる。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞の自己複製因子については、現在までに確立されたアッセイ法はない。しかし、マウスでは脾コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｓ）測定法や芽球コロニー形成細胞培養法（Ｂｌａｓｔ  ｃｏｌｏｎｙ  アッセイ）などが応用されている。ヒトでは、骨髄あるいは末梢血単核細胞中のＣＤ３４陽性細胞が単離され、コロニー法あるいは液体培養法に供されている。
【０００３】
巨核球の増殖や分化、または血小板産生に関与する因子は、骨髄巨核球前駆細胞由来のコロニー（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）形成法やアセチルコリンエテラーゼ（Ａｃｈ  Ｅ）活性測定法あるいはプロイディー（ＤＮＡ量）の測定等によりアッセイされている。また、骨髄中の巨核球の単離法が進歩したため、巨核球を直接用いることも可能となった。
【０００４】
ヒト由来の因子は種特異性の点からできる限りヒトの系でアッセイすることが望ましい。しかし、ヒトの骨髄細胞は一般的に入手が困難であるし、しかもＣＤ３４陽性細胞や巨核球は頻度が低く、それぞれ骨髄単核細胞の約１％および０．０５％〜０．５％でしかない。さらに、巨核球は物理的刺激に弱く壊れやすい。また、ＣＦＵ−Ｍｅｇコロニー形成法は、時間がかかり（ヒトでは約２週間）、しかも均一な結果を得ることが困難である。
【０００５】
そこで、ヒト由来の因子の探索に簡便で常時実施可能なアッセイ系としてヒト株化細胞を利用することが試みられている。しかし、培養中に細胞自身の性質に変化がみられ、種々の因子に対する反応性が低下したり、さらには反応性にバラツキが生じ、均一なアッセイ結果を得られない場合も多い。そのため、本来の性質を保持しているうちに大量の細胞を凍結保存しておき、性質や反応性に変化が生じたら、新たな細胞を融解して使用する等の対策がなされている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、上記の様な実情に鑑み、簡便で常時実施可能な、かつ信頼しうる均一な結果が得られるヒト由来の因子の探索アッセイ系を取得すべく、細胞の性質や因子に対する反応性の変化の原因を鋭意研究した結果、培養中に一部の細胞が自発的に分化し、不均一な性質の細胞集団となることが原因の１つであることを解明した。そして、細胞表面に存在している分化抗原（分化に伴い消長する分子）の有無に着目して細胞をクローニングすることにより、目的のアッセイに有用な細胞株を取得し、本発明の完成に至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定の表現型を示し自己増殖能を有し、場合によってはさらに自己分化能も有するヒト白血病細胞株に関する。すなわち、本発明は、骨髄性白血病細胞由来の細胞であって、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の表現型を示す細胞株、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株、並びにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株に関する。
【０００８】
自己増殖能を有するヒト白血病細胞とは、特定の表現型を保持したまま増殖し、長期間安定である細胞であり、さらに自己分化能をも有する細胞とは一定期間の培養により増殖しつつも自己分化し表現型が変化する細胞を意味する。例えば骨髄性白血病細胞、好ましくは急性巨核球性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞等に由来する細胞があげられる。
【０００９】
特定の表現型を示し自己増殖能を有し、場合によってはさらに自己分化能も有するヒト白血病細胞株は、骨髄性白血病細胞、好ましくは急性巨核球性白血病細胞、例えばＣＭＫ細胞、ＵＴ−７細胞、Ｍ−０７細胞等、または慢性骨髄性白血病細胞、例えばＫＵ８１２細胞（理化学研究所細胞銀行Ｎo.ＲＣＢ４９５）等より取得できる。
【００１０】
本発明のヒト白血病細胞株は、特定の表現型を保持したまま長期間培養でき、しかも造血幹細胞や巨核球系細胞に反応する種々の因子（サイトカイン）に反応することによって、各種造血系に関与する因子、すなわち、造血幹細胞の自己複製、巨核球の増殖や分化、また血小板の産生に関与する因子のアッセイに有用である。
【００１１】
本発明において表現型とは、分化抗原により特定される表現型をいい、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の表現型、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型並びにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性等の表現型があげられる。この表現型により分化過程における段階が特定される。したがって、本発明の表現型の選択により構築された細胞株を用いれば、特定された分化過程段階における、所望の活性因子のアッセイが、特に煩雑困難な技術を用いることなく、通常の技術を用いて可能となる。
【００１２】
例えば、上記例示した表現型により特定される細胞株は、それぞれ特定の分化過程段階、すなわち多分化能を有する初期の分化段階、一段分化して分化の方向が巨核球系へと決定した段階、およびさらに一段分化した巨核芽球の段階にあると考えられ、造血幹細胞の自己複製因子、巨核球の増殖分化因子や血小板産生因子のアッセイに用いることができる。
【００１３】
すなわち、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の表現型を示す細胞株は、ＣＤ３４が陽性のまま長期間培養可能なことより、造血幹細胞の自己複製因子の探索アッセイなどに有用である。
また、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株は、増殖しつつも一定期間の培養中に自己分化してＣＤ３４陰性の表現型を示すようになるため、巨核球の増殖や分化に関与する因子の探索アッセイに有用である。
【００１４】
さらに、ＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株は、巨核球の成熟を促進させる巨核球増幅因子や巨核球から血小板を産生させる因子の探索アッセイに有用である。
なお、ＣＤ３４とは分子量が１０５〜１２０ｋＤの糖タンパクであり、別名Ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎとも呼ばれ造血幹細胞のマーカーとして利用され、分化に伴い消失する抗原である。
【００１５】
また、ＧＰIIｂ／III ａとは血小板膜糖タンパク質であり、ＧＰIIｂ（分子量約１３０ｋＤのＨ鎖と約２３ｋＤのＬ鎖で構成）分子とＧＰIII ａ（分子量約９５ｋＤ）分子の１：１の複合体である。血小板と巨核球に特異的に発現しており、巨核球の分化に伴い増強される分化抗原である。各陽性および陰性は、通常の方法にしたがい、それぞれ、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体および抗ＧＰIIｂ／III ａモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって確認できる。
【００１６】
本発明の細胞株は、例えば、ＣＤ３４陽性細胞およびＧＰIIｂ／III ａ陽性細胞が混在したヒト骨髄性白血病細胞から、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体および抗ＧＰIIｂ／III ａモノクローナル抗体を用いた免疫磁気ビーズ法あるいはフローサイトメトリーによる細胞ソーティング法、もしくは限界希釈法によるクローニングにより、通常の方法にしたがって、取得できる。
【００１７】
例えば、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の表現型を示す細胞株、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株、並びにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株は、それぞれ急性巨核球性白血病細胞、例えばＣＭＫ細胞を限界希釈法により再クローニングし、すなわち１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、９６穴マイクロプレートに一穴あたり０．３個の濃度で播種し、得られたクローンをフローサイトメトリーにより解析して得ることができる。
【００１８】
なお、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の表現型を示す細胞株並びにＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を有する細胞株は、それぞれHuman myeloid leukemic cell Ｓ６  ＳＢＭ３３２及びHuman myeloid leukemic cell Ｓ５  ＳＢＭ３３３と命名されて、１９９３年３月９日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−４２２７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−４２２８として寄託されている。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例によってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
実施例１．
（１）
液体窒素中（−１９６℃）に凍結保存していたＣＭＫ細胞を３７℃にて融解後、１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し、経時的にＣＤ３４とＧＰIIｂ／III ａの陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにて測定した。ＣＤ３４は培養１週目では陽性率は約８０％あったが、培養に伴い減少し１３週目には約３０％となった。一方、ＧＰIIｂ／III ａは培養１週間目では陽性率は約３０％であり、培養に伴い増加し１３週目には８０％強となった。これらの結果から、ＣＭＫ細胞は自己増殖能だけでなく、自己分化能をも有する可能性が示された。結果を図１に示す。
【００２０】
（２）
自己増殖能だけでなく自己分化能をも有する可能性が示唆されたＣＭＫ細胞を再クローニングし、得られたクローンをフローサイトメトリーにより解析した。すなわち、ＣＭＫ細胞を１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、９６穴マイクロプレートに一穴あたり０．３個の濃度で播種し、得られたクローンをフローサイトメトリーにより解析した。
【００２１】
その結果、得られたクローンはＣＤ３４とＧＰIIｂ／III ａの発現の有無により、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性（クローンＳ６）、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性（クローンＳ５）、並びにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性（クローンＳ１０）の３群に分類できた。結果を図２に示す。
【００２２】
（３）
新規に得られたクローンＳ６（ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性）とクローンＳ１０（ＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性）の増殖能を比較検討した。両細胞とも１０5 個／mlの濃度で培養を開始し、経時的に細胞数を測定した。
クローンＳ６は明らかにＳ１０より増殖能は高かった。また、クローンＳ５（ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性）はほぼＳ６と同じ増殖能を示した。結果を図３に示す。
【００２３】
（４）
新規クローンＳ６（ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性）とＳ１０（ＣＤ３４陰性およびＧＰIIｂ／III ａ陽性）の形態学的特徴を示した。Ｓ６は付着性がまったく無く、幼若細胞に特徴的な芽球様形態を示す。Ｓ１０はＳ６よりも胞体が大きく球状で、約３０％の細胞が付着性を示し、そのほとんどの細胞は伸展し突起を形成する。結果を図４及び図５に示す。
【００２４】
また、Ｓ５（ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性）は培養初期には芽球様細胞と球状細胞が認められ、約１０％の細胞が付着性を示す。その後、培養に伴いＳ１０の表現型（ＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性）およびＳ１０と同様の形態を示すようになる。すなわち、Ｓ１０はＳ５の通常の培養により得ることができる。
【００２５】
実施例２．
（１）
造血系に関与する種々のサイトカインのクローンＳ６（ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性）とＳ１０（ＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性）の増殖におよぼす影響を 3Ｈ・ＴｄＲの取り込み法により検討した。すなわち、９６穴マイクロプレートにて１０％ＦＣＳ存在下、５×１０3 個の細胞に表１に示す濃度の各サイトカインを加え、４８時間培養後、０．５μＣｉの 3Ｈ・ＴｄＲを添加し、４時間後のアイソトープの取り込みを測定した。
【００２６】
0004052680.tif 000002
【００２７】
全般的にＳ１０はＳ６に比べてサイトカインに対する反応性が高く、とくに巨核球の増殖に関与すると考えられるＩＬ−１１やＳＣＦに対しては２倍以上の増殖が認められた。
したがって、Ｓ６あるいはＳ１０の増殖促進を指標として、造血に関与する因子、すなわち造血幹細胞の自己複製因子や巨核球の増殖因子などを探索アッセイに本発明の細胞株は有用である。
【００２８】
（２）
クローンＳ６（ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性）は長期間の培養によっても表現型の変化を示さない。しかし、潜在的な分化能を有する可能性もあり、ＴＰＡによる分化誘導を試みた。すなわち、Ｓ６を１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地の１０5 個／mlの濃度で懸濁し、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）（１０-7Ｍ）（シグマ社製）を添加し、経時的に細胞を採取し、ＣＤ３４とＧＰIIｂ／III ａの発現をフローサイトメトリーにより解析した。
【００２９】
ＴＰＡ添加１日でＧＰIIｂ／III ａの劇的な増強が観察され、その後３日目にＣＤ３４の減少が始まり、さらに７日目までにＣＤ３４は減少し、ＧＰIIｂ／III ａは増強した。すなわち、Ｓ６は潜在的な分化能を有していることが確認された。したがって、Ｓ６は造血幹細胞の自己複製因子だけでなく、巨核球の分化因子の探索アッセイに有用である。結果を図６に示す。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の細胞株は、造血系に関与する因子、すなわち、造血幹細胞の自己複製、巨核球の増殖や分化、また血小板の産生に関与する因子の探索アッセイに有用である。例えば、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の表現型を示す細胞株Ｓ６並びにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示す細胞株Ｓ１０は、長期間の培養によってもその表現型の変動を示さないので、造血に関与する因子の探索アッセイにも安定して使用でき、これまでに使用されてきた公知の細胞株に比べて有用である。
【００３１】
さらにＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の表現型を示すＳ５は自己分化能をも有することから、巨核球の増殖や分化に関与する因子のアッセイのみならず、巨核球の分化のメカニズムの解明にも応用でき、またＳ６は現在まで解明されていないＣＤ３４の機能やそのリガンドの探索にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＭＫ細胞の培養中におけるＣＤ３４陽性細胞及びＧＰIIｂ／III ａ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の細胞（クローンＳ６）、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の細胞（クローンＳ５）、並びにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の細胞（クローン１０）の、ＣＤ３４抗体及びＧＰIIｂ／III ａ抗体を用いて得られたフローサイトメトリー図を示すグラフである。
【図３】図３は、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の細胞（クローンＳ６）とＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の細胞（クローンＳ１０）の増殖能を比較したグラフである。
【図４】図４は、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の細胞（クローンＳ６）の形態学を示すものであり、生物の形態を示す図面に代る写真である。
【図５】図５は、ＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の細胞（クローンＳ１０）の形態学的特徴を示すものであり、生物の形態を示す図面に代る写真である。
【図６】図６は、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陰性の細胞（クローンＳ６）をＴＰＡ（１０-7Ｍ）の存在下に培養した場合に、ＣＤ３４陽性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の細胞（クローンＳ５）に分化し、さらにＣＤ３４陰性及びＧＰIIｂ／III ａ陽性の細胞（クローン１０）に分化することを示す、フローサイトメトリー図である。
【図１】
0004052680.tif 000003
【図２】
0004052680.tif 000004
【図３】
0004052680.tif 000005
【図４】
0004052680.tif 000006
【図５】
0004052680.tif 000007
【図６】
0004052680.tif 000008