(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤を充填した微粒子を形成するためのシステムであって、
Ａ．所定量の前記薬剤と微粒子形成性の重合体からなる第一の溶液の第一の流れを当該第一の混合チャンバ中に導入するための第一の口、および、当該第一の混合チャンバ内でエマルションを形成するために、乳化剤の第二の流れを前記第一の流れの中に前記第一の流れからずらして導入するための第二の口を含む第一の混合チャンバ、ならびに、
Ｂ．前記第一の混合チャンバに隣接しており、所定量の架橋剤を架橋用溶媒中に含有する架橋用溶液を当該第二の混合チャンバに導入するための第三の口を含んでいる第二の混合チャンバ
からなる、前記システム。
【請求項２】
前記第一と第二の混合チャンバの少なくとも一方が非金属材料である、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記薬剤が、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の１つ以上の機能性ドメイン、１つ以上の生物学的に活性なＩＣＡＭ−１断片、前記生物学的に活性なＩＣＡＭ−１断片のアナログ、これらの組み合わせおよび機能性誘導体、タンパク質、ペプチド、ワクチンならびに水溶性薬剤から成る群の１つである、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記重合体がアルギネートである、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
前記アルギネートが、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウムナトリウム、アルギン酸カリウムおよびアルギン酸プロピレングリコールから成る群の１つである、請求項４記載のシステム。
【請求項６】
前記乳化剤が酢酸エチルおよびヘキサンから成る群の１つである、請求項１記載のシステム。
【請求項７】
前記乳化剤があらかじめ水で湿らせた酢酸エチルからなる、請求項６記載のシステム。
【請求項８】
前記架橋剤が塩化カルシウムである、請求項１記載のシステム。
【請求項９】
前記架橋用溶媒がイソプロピルアルコール、エタノール、アセトン／エタノール混合物から成る群の１つである、請求項１記載のシステム。
【請求項１０】
前記第一の混合チャンバが前記第二の混合チャンバと連続している、請求項１記載のシステム。
【請求項１１】
前記薬剤がＩＣＡＭ−１であり、前記重合体がアルギン酸ナトリウムからなり、前記乳化剤があらかじめ湿らせた酢酸エチルからなり、前記架橋剤が塩化カルシウムからなり、前記架橋用溶媒がエタノール／アセトン混合物からなる、請求項１記載のシステム。
【請求項１２】
薬剤を充填した微粒子の製造方法であって、
Ａ．アルギネートと薬剤からなる第一の溶液の第一の流れを所定の流量で第一の混合ブロック中に導入して薬剤を含有するアルギネート液滴を形成し、
Ｂ．乳化剤の第二の流れを第一の流れからずらして所定の流量で前記第一の混合ブロック中に導入し、
Ｃ．前記第一の混合ブロック内で前記アルギネート液滴と前記乳化剤のエマルションを形成し、
Ｄ．前記エマルションの第三の流れを前記第一の混合ブロックから第二の混合ブロック中に輸送し、
Ｅ．架橋剤を所定の割合で前記第二の混合ブロック中に導入して前記薬剤を含有するアルギネートの微粒子を形成する
ステップからなる、前記方法。
【請求項１３】
架橋剤を導入する前記ステップがさらに、前記架橋剤を前記第三の流れに対して実質的に正接して前記第二の混合ブロック中に導入することを含んでいる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の１つ以上の生物学的に活性な断片、ＩＣＡＭ−１の１つ以上の機能性ドメイン、前記生物学的に活性なＩＣＡＭ−１断片のアナログ、これらの組み合わせおよび誘導体から成る群の１つからなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記アルギネートが、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウムナトリウム、アルギン酸カリウムおよびアルギン酸プロピレングリコールから成るアルギネートの群の１つである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
アルギネートがアルギン酸ナトリウムである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記乳化剤が酢酸エチルおよびヘキサンから成る溶媒の群の１つである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
さらに、架橋ステップの後に、前記微粒子を濯ぎ溶液で濯いで前記微粒子を実質的に脱水するステップを含んでいる、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記濯ぎ溶液が酢酸エチル、イソプロパノール、エタノールおよびこれらの混合物から成る群の１つである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤がＩＣＡＭ−１であり、前記アルギネートがアルギン酸ナトリウムであり、前記乳化剤があらかじめ水で湿らせた酢酸エチルからなり、前記架橋剤が塩化カルシウムからなる、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
薬剤を充填した微粒子の製造方法であって、
Ａ．アルギネートと薬剤からなる第一の流れを所定の流量で第一の混合ブロック中に導入して薬剤を含有するアルギネート液滴を形成し、
Ｂ．乳化剤の第二の流れを前記第一の流れからずらして所定の流量で前記第一の混合ブロック中に導入し、
Ｃ．前記第一の混合ブロック内で前記アルギネート液滴と前記乳化剤のエマルションを形成し、
Ｄ．前記エマルションを前記第一の混合ブロックから一定量の架橋剤を含有する容器中に輸送する、
ステップからなる、前記方法。
【請求項２２】
さらに、前記薬剤を充填した微粒子の固体のものを形成するのに充分な量の時間前記架橋剤内で前記エマルションをインキュベートすることを含んでいる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤がＩＣＡＭ−１であり、前記アルギネートがアルギン酸ナトリウムであり、前記乳化剤があらかじめ水で湿らせた酢酸エチルからなり、前記架橋剤が塩化カルシウムからなる、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
序
技術分野
本発明は、一般に、薬剤を充填した微粒子の製造分野に係り、特に、一定期間にわたって薬剤を持続・制御放出する微粒子を製造する分野に係る。さらに特定的にいうと、本発明は、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の１つ以上の機能性ドメイン、
１つ以上の生物学的に活性なＩＣＡＭ−１断片、このような生物学的に活性なＩＣＡＭ−１断片のアナログ、またはこれらの組合せもしくは機能性誘導体で微粒子を充填するシステムと方法に係る。この微粒子は、鼻腔内に付着し、数時間にわたってＩＣＡＭ−１を持続・制御的に放出する。
発明の背景
近年鼻の中の空間経路（nasal passageway）は、ペプチドやタンパク質のような全身的に活性な薬剤を投与するための代替ルートとして注目されつつある。細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１のようないくつかのタンパク質はこの鼻内空間に送達（deliver）するのが最も良い。
薬剤を鼻内空間（または鼻経路）に送達するのに使用できる微粒子の望ましい大きさの範囲はかなり狭い。すなわち、空気力学的径が約２０〜８０μｍである。微粒子が小さ過ぎて約１０μｍ未満であると、空気の流れに伴なって下降して気管気管支部中に運ばれ得る。したがって、直径が約１０μｍ未満の微粒子は、気管気管支経路を介して薬剤を送達するのに使用できるであろう。微粒子が大き過ぎて約１００μｍより大きいと、そのような微粒子は比較的速く鼻経路から除去される。
局所または全身性作用のための鼻粘膜への薬剤送達は、薬剤を充填した粒子との接触時間によって影響を受ける。ポンプまたは加圧計測用量吸入器（pressurized metered dose inhaler）を用いて投与された鼻用スプレー製剤は主として鼻腔の前部に付着する。
この部分はほとんど繊毛がなく、クリアランスは比較的ゆっくりである。一般に、物質は、粘膜繊毛（mucociliary）作用により、流量を次第に大きくしながら平均して約６ｍｍ／分の速さで鼻甲介から鼻咽頭中へクリアランスされる。鼻からのクリアランスは薬剤を充填した粒子の粒子サイズおよび鼻経路内の付着部位に依存する。繊毛が薄いかまたは繊毛がない鼻腔前部に付着した粒子は、遅い動き（drag）のために、よりゆっくりした速度で接触している粘液からクリアランスされる。
感冒の主たる原因であるヒトライノウイルスはその大部分が、宿主細胞上の受容体として細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）を利用する。ＩＣＡＭ−１は大きなＮ末端細胞外タンパク質、膜貫通アンカー、および短いＣ末端細胞質ドメインをもつ膜内在性タンパク質である。ＩＣＡＭ−１の正常な生理学的機能は、白血球インテグリンリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）の膜結合リガンドとして働き、白血球と各種タイプの細胞との細胞間接着を媒介することである（Greve et al.,“Mechanisms of Receptor-Mediated Rhinovirus Neutralization Defined by Two Soluble Forms of ICAM-1”, J. Virol. 65（11）: 6015-6023（1991）参照）。ＩＣＡＭ−１はヒトライノウイルスと結合するので、切断（truncated）形態のＩＣＡＭ−１、すなわちｔ−ＩＣＡＭ−４５３を、鼻から送達されるライノウイルス感染予防薬として臨床使用することが提案されている。ＩＣＡＭ−１の鼻腔内滞留時間を長くすることによって、反復投与の必要性を最小にできれば望ましいことであろう。
微粒子の生産技術は薬剤送達に広く応用されている。溶媒蒸発や噴霧乾燥を始めとして多くの技術がそのような微粒子を作成するのに利用されている。現在利用できる技術の中で最も簡単なもののひとつは、アルギン酸ナトリウム溶液を塩化カルシウム溶液中に液滴として押出すかまたは噴霧することによってアルギン酸カルシウム微粒子を製造するものである。
タンパク質を始めとする薬剤の制御放出用の微粒子が許容されるためには、直径が小さく（すなわち、１ミリメートルよりかなり小さく）、一定したサイズおよび薬剤分布で製造でき、しかも制御された分解（減成）特性をもつ生成物が必要である。
アルギン酸カルシウム微粒子を製造するひとつの方法は、薬剤を含有するアルギン酸ナトリウム水溶液を有機相に分散させた後、エマルションを形成した液滴を硬化させるべく塩化カルシウムを加えることである。このようなバッチ法で許容され得る薬剤充填粒子を製造するためには、２つの界面活性剤（ソルビタントリオレエートとポリオキシエチレンソルビタントリオレエート）を３：２の比で、濃度を界面活性剤が約１重量／重量（ｗ／ｗ）％の最小濃度として混合物に添加する必要がある（たとえば、“Drug Encapsulation in Alginate Microspheres by Emulsification.”Microencapsulation 9（3）:309-316（1992）を参照されたい）。これ以外の界面活性剤の混合比および濃度では、微粒子のサイズ、凝集の程度、薬剤充填および薬剤放出特性に影響が出る可能性がある。すなわち、このアルギン酸カルシウム微粒子製造法は界面活性剤の種類と濃度による影響を受けやすい。
バッチ法によるエマルション形成および硬化技術では、微粒子のサイズ／形状および薬剤のカプセル封入効率を改善するのに通常界面活性剤が必要である。そのような界面活性剤を使用する結果生じ易い問題として、製品から界面活性剤を洗浄除去し、残留レベルを測定するのが困難であること、残留する界面活性剤が健康に有害な作用を及ぼし得ること、薬剤を浸出させてしまうことなく製品から界面活性剤を洗浄除去するのが困難であること、そして、その微粒子の生物接着（bioadhesion）、膨潤挙動および薬剤放出特性に影響があり得ることがある。
微粒子を製造するための噴霧液滴形成技術では、大きい粒子、すなわち直径１ミリメートル（ｍｍ）を越えるものが生成する傾向がある。噴霧液滴形成技術を用いると約２０〜８０μｍの所望のサイズ範囲の微粒子を製造することができるであろうが、この液滴形成技術は、その技術のスケーリング（scaling）が困難であり、プロセスに可変性（process variability）があり、また製薬プロセスの洗浄適性を欠くために望ましくない。
ミクロスフェアを製造するのに使用できる数多くの化学薬品、重合体および制御放出剤が知られており、市販されている。経鼻送達用のミクロスフェアを製造するのに使われる材料の例は、セルロース重合体、特にセルロースの低級アルキルエーテル、澱粉、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびデキストラン誘導体、タンパク質重合体、たとえばアルブミン、クロモグリシン酸二ナトリウム、セファデックス、またはＤＥＡＥ−セファデックスである。これらには、ミクロスフェアの生物接着または制御放出特性を改善するために、ポリアクリル酸のような他の物質との混合物またはコーティングが包含され得る。たとえば、Illumの米国特許第５，２０４，１０８号を参照されたい。
微粒子を製造するのに使用できる他の材料も知られており、中でもアルギネート、キサンタンガムおよびゲランガム（gellan gum）がある。これら３つの物質はいずれも、腸溶性コーティングとして有効である。アルギネートは均一なフィルムを生成し、ペーパーコーティング、織物コーティングおよび食品などさまざまな産業上利用性があることが知られている。アルギネートフィルムは、通常可溶性のナトリウム塩形態で使用された後胃液によって不溶性のアルギン酸形態に変換されるので、腸溶性コーティングとして特に有用である。薬剤充填量の高い錠剤においてはアルギン酸ナトリウムをアルギン酸カルシウムナトリウムと組合せることによって改良がなされている。
アルギネートはまた、胃液と接触した時にゲルを形成する性質があることから、長年にわたり懸濁液中に使用されている。さらにまた、アルギン酸カルシウムゲルビーズは、食品産業における香味、バイオリアクター用の酵素、生きている細胞、および生きている生物のような各種物質を含有せしめるのに使用されている。アルギン酸カルシウムは、その製造時に温和な条件が用いられること、および試薬の毒性がないために、特に好ましい。
アルギネートは、１，４-結合したβ-Ｄ-マンヌロン酸残基とα-Ｌ-グルロン酸残基をさまざまな割合と配列で含有する一群の共重合体に対する集合的な用語である。アルギネートはカルシウムのような二価のイオンと共にゲルを形成し、このゲル形成特性は重合体鎖中の連続したＬ-グルロン酸残基のブロックの割合と長さに深い関係がある。アルギネートのこれらの特性はMartinsen et al.,“Alginate as Immobilization Material,”Biochemical. Bioeng. 33:79-89（1989）に記載されている。
アルギネートビーズを用いてペプチドやタンパク質をマイクロカプセル化したという報告がいくつかあるが、ほとんどすべての報告でビーズサイズは直径が１００μｍを越えるとされている。またほとんどすべての報告で、アルギネートゲルビーズを調製するには、アルギン酸ナトリウム溶液を塩化カルシウム水溶液中に滴下してビーズを形成している。そのような方法でマイクロカプセル化されたビーズが生成するが、このような方法は、所望のサイズ範囲の微粒子が生成する操作条件の調節が困難であり、スケーリング（scaling）が困難であり、また製薬プロセスの洗浄適性を欠くために、ＩＣＡＭ−１のようなタンパク質を含有する微粒子の工業生産には実用できない。
薬剤を充填したミクロスフェアの調製はIllumの米国特許第５，２０４，１０８号に概略的に記載されている。この特許では、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、デキストランおよびデキストラン誘導体から作成したミクロスフェア中に活性な剤を入れている。最終的なミクロスフェアを架橋し、最後に経粘膜送達用に処理する。しかし、長期にわたって薬剤を鼻経路内に制御放出するように鼻経路に薬剤を送達するミクロスフェアであって、粘膜関門を通過せず、かつ鼻経路から除去されないものが相変わらず必要とされている。
すなわち、薬剤やタンパク質を制御・持続放出するのに使用できる、薬剤、ペプチドまたはタンパク質を充填した微粒子を製造するための方法とシステムが依然として必要とされている。好ましい方法とシステムでは、薬剤を鼻内経路中に送達するための微粒子であって予測可能な充填率をもちサイズの範囲が約２０〜約８０μｍであるものが、約８０〜約１００％の回収率で、しかも薬剤の効力を大きく損なうことなく、確実に生成しなければならない。
発明の概要
本発明は、経鼻経路を介して送達することができる、細胞間接着ＩＣＡＭ−１のようなタンパク質を始めとする薬剤を充填したアルギネート（アルギン酸塩またはエステル）微粒子を製造するためのシステムと方法に係る。
本発明のシステムは半連続流系を含んでおり、この系は薬剤を充填したアルギネートの流れ、最も好ましくは低粘度のアルギン酸ナトリウム（ＬＶＣＲ）を、乳化剤の流れと混合して混合チャンバ内でエマルションを形成するものである。同じかまたは隣接する混合チャンバ内の下流の点で、カルシウム塩のような架橋剤を含有する流れをエマルションに添加する。この架橋プロセスではアルギン酸ナトリウム中のナトリウムがカルシウムで置き換えられて、薬剤が充填された非水溶性のアルギン酸カルシウム微粒子を形成する。収集後微粒子を濾過し、洗浄し、真空オーブン中で乾燥し、必要であれば穏やかな圧力を用いて脱凝集すると、経鼻経路を介して送達できる個々の薬剤充填微粒子が生成する。
本発明のシステムと方法では、空気力学的径が約２０〜約８０μｍで、空気力学的質量メジアン径（ＡＭＭＤ）が好ましくは約４０〜約５０μｍ、ＩＣＡＭ−１充填率が約１０重量％の微粒子が生成する。このシステムの収率は約１００％に達する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の具体例である代表的な混合ブロックの縦断面の概略図である。
図２は、本発明の具体例である方法とシステムの概略を示す。
図３は、本発明の方法のひとつの具体例のフローチャートである。
図４は、本発明の具体例である代表的な混合ブロックの縦断面の概略図である。
図４Ａは、図４の混合ブロックの縦断面を管およびマイラー製継手と共に示す。
図４Ｂは、図４Ａの４Ｂ−４Ｂ線に沿ってとった断面図である。
図４Ｃは、図４Ａの４Ｃ−４Ｃ線に沿ってとった断面図である。
図５は、本発明の具体例であるシステムの第二の混合チャンバを有する代表的な第二の混合ブロックの縦断面図である。
図６は、本発明の具体例であるシステムの第二の混合チャンバを有する代表的な第二の混合ブロックの縦断面図である。
特定態様の説明
本発明は、所望の薬剤またはＩＣＡＭ−１のようなタンパク質の制御放出用に鼻の経路を介して送達できる薬剤を充填した微粒子を製造するための新規なシステムと方法に係る。
鼻経路を利用するほとんどの薬物送達系（ドラッグデリバリーシステム）は薬剤の全身的伝達を増大することを目指している。タンパク質の細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１のメカニズムでは、粒子が宿主系に吸収されることなく、かつ効率的な鼻のクリアランス系によって除去されることなく、鼻経路の表面に止まる必要がある。したがって、ＩＣＡＭ−１の場合、鼻経路に送達することができ、かつＩＣＡＭ−１が吸収その他により除去される前にＩＣＡＭ−１分子が標的のライノウイルス分子に結合するのに充分な時間その経路内に止まるＩＣＡＭ−１充填微粒子を製造するシステムを同定することが重要である。
本明細書に説明するシステムでは、空気力学的径が約２０〜約８０μｍの範囲、好ましくはＡＭＭＤが約４０〜約５０μｍの範囲で概略薬剤充填率が１０重量％である微粒子が、ＩＣＡＭ−１回収率約８０％以上で確実に生成する。
添付図面の図４を参照すると、本発明のシステムの好ましい具体例は、通常、軸方向に連結された円筒状の第一と第二の混合チャンバが配置されている混合ブロックをもっている。第二のチャンバの直径は第一のチャンバの直径より多少大きいのが好ましい。
第一の薬剤／重合体の流れは、第一のチャンバの第二のチャンバから離れた方の端壁に位置する第一の長軸方向の口を介して、軸方向に第一のチャンバ内に導入される。第二の乳化剤の流れは、第一のチャンバの第一の口と同じ端に近接して位置しており第一の流れとほぼ直交して（しかしそれとずらして）第二の流れを注入するための第二の口を介して第一のチャンバ中に導入される。この第二の口は、第一のチャンバの円筒壁に正接して第二の流れを注入するように位置しているのが好ましい。第二の円筒チャンバの第一のチャンバと反対側の端は開放されていて、液体が渦を生じることなく滑らかに第二のチャンバを出ていくことができるようになっている。
第一および第二の流れの流量と第一および第二のチャンバの寸法は、両方のチャンバが注入された液体で満たされるようになっている。すなわち、注入された液体は第一および第二の口から入って第一および第二のチャンバを通って流れ、第二のチャンバの開放端に形成された第三の口から出ていく。第二の口を介して正接方向に注入された乳化剤流は、チャンバを通過する液体流による軸方向の速度成分ももち、そのためほぼ螺旋状に進行する。この結果、第一チャンバ内部で、第一チャンバに入る際に乳化剤と接触する薬剤／重合体溶液によって形成された液滴のエマルションが生成するのに充分な調節された乱流が起こるが、最初に形成された液滴のサイズが大幅に低下することはない。
第二のチャンバ内で液滴は、架橋剤を含む架橋用溶液の流れが第二のチャンバの長軸に直交して（しかしそれとずれて）第二のチャンバ中に注入されるように位置する第四の口を介して導入される架橋剤によって架橋される。第四の口は、第二のチャンバの円筒壁に正接して架橋剤流を注入して架橋剤の螺旋状乱流を形成するように位置しているのが好ましい。このようなシステムの結果はいくつかのパラメーターの影響を受けると思われる。たとえば、極性や親水性のような溶媒特性は混和性、薬剤充填および水性エマルションとの相互作用に影響を与える可能性がある。システムの混合チャンバへの流量は混合ブロック内での混合特性や乱流に影響する可能性があり、その結果微粒子サイズ、微粒子のサイズ分布および混合チャンバ内での凝集の可能性に影響する。架橋剤の濃度は架橋プロセスの速度と完全性に影響を与える可能性がある。洗浄・濾過プロセスは薬剤の浸出、小さい粒子の損失および微粒子の凝集に影響を与える可能性がある。
本明細書で使用する以下の略語および用語は必ずしも限定されるわけではないが以下のように定義される。
「ＩＣＡＭ−１」は、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１を意味するものであり、全長（膜貫通）形態および切断（非膜貫通）形態のＩＣＡＭ−１、特定の生物活性断片、ならびにそれらの機能性アナログの組合せおよび誘導体、特にｔ−ＩＣＡＭ−４５３を含めて示すのに使用する。
「ＬＶＣＲ」は、低粘度のアルギン酸ナトリウムを意味するものとする。
「微粒子」は、標的薬剤と重合体の実質的に中実の小さい凝集体であって、直径が約２０〜約８０μｍであり、サイズと薬剤分布が一定で分解特性が制御されているものを意味するものとする。
「レイノルズ数」は、粘度の影響が流体の速度または流れパターンを調節するのに重要である系のモデルの設計において有意義な無次元数であり、次式で表わされる。
ＤＶＬ／μ
ここで、Ｄは流体の密度に等しく、Ｖは流体の速度に等しく、Ｌは流体が移動していく口またはチャンバの直径に等しく、μは流体の粘度に等しい。
「アルギネート」は、１，４-結合したβ-Ｄ-マンヌロン酸残基とα-Ｌ-グルロン酸残基をさまざまな割合と配列で含有する一群の共重合体を意味するものとする。
「薬剤」は、病気の診断、治療、軽減、処置または予防に使用することを意図したあらゆる物質、たとえば、薬理学的に活性なタンパク質およびペプチド、ならびに小さい分子、ホルモン、ポリペプチド、ワクチンおよびこれらの成分を含めて意味するものとする。
「エマルション」は、酢酸エチルとＬＶＣＲのような２種の不混和性の液体を組合せた結果生じるもので、一方の液体が小さい液滴として他方の液体中に分散しているものを意味するものとする。
図１に断面を示した本発明のシステムの具体例は、軸方向に連結された円筒状の混合チャンバ（１０２、１０８）と、そこに形成された口（１０４、１０６、１１０）とを有する混合ブロック（１００）を含む半連続流システムである。図１に示されているように、混合ブロック（１００）は、第一の混合チャンバ（１０２）を有する第一の混合ブロック（１３２）と、第二の混合チャンバ（１０８）を有する第二の混合ブロック（１３４）とを含んでいる。第二の混合チャンバ（１０８）は、エマルションと架橋剤溶液を通過させるための複数の通路（１１０、１１３）を含んでいる。これら２つのブロック（１３２、１３４）は、可撓性の管または剛性の通路を介して繋がっている別々のブロックでもよい。あるいはまた、図４に関連して以下に論じるように、２つの混合チャンバ（１０２、１０８）は単一の混合ブロックとして一体化してもよい。
好ましい具体例の場合、混合ブロック（１３２、１３４）は、テフロン（Teflon、登録商標）やデルリン（Delrin、登録商標）（いずれも広く市販されている）のような非金属材料で形成されている。あるいは、混合チャンバ（１０２、１０８）の内面を、テフロン（登録商標）やデルリン（登録商標）のような非粘着材料または他の非湿潤性剛性材料で被覆してもよいしまたはこのような材料から形成してもよい。というのは、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カルシウムは金属表面に沈殿する可能性があり、その結果１つ以上の口（１０４、１０６、１１０、１１３）が金属表面をもっているとそれらが遮蔽されることがあり得るからである。たとえば、アセトンまたはエタノール中にカルシウム塩を含有する架橋剤溶液が金属の存在下で重合体と接触すると、その金属の表面効果によって微粒子の凝集が起こり、その口が閉塞されることになる。もう一つの可能性は、チャンバ（１０２、１０８、１１０）と内部の第三の口（１１３）の中にテフロン（登録商標）製の挿入管を使用して金属による表面効果を低減することであろう。
ひとつの態様では、第二の混合チャンバ（１０８）が、そのチャンバ（１０８）内の乱流を増大させるためにインライン形静止ミキサー（１１２）をもっている。このミキサー（１１２）は、流れていくエマルションに曲がった通り道を与える急な端をもつ螺旋でよい。他の装置を用いて、第二のチャンバ（１０８）を通って流れるエマルションおよび／またはそこに流入するエマルションを増やし、そのチャンバ（１０８）内の乱流を増大させてもよい。しかし、さまざまな口（１０４、１０６、１１０、１１３）を通過する流れの流量を調節することによって追加のミキサー装置を用いることなく充分な乱流を作り出すことが可能であろう。
混合ブロック（１００）は工業規模の生産に適したいかなる大きさでもよい。図４に示した具体例の場合、一体型ブロック（４００）はデルリン（登録商標）から製造されており、約７．６ｃｍ×５．１ｃｍ×５．１ｃｍの大きさである。この具体例の場合、フロントチャンバ（４０４）の直径は０．３２ｃｍ（０．１２５インチ）であり、広い方のチャンバ（４０６）の直径は０．４８ｃｍ（０．１９インチ）である。チャンバ（４０２）の内部の全長は約８．４ｃｍ（３．５インチ）である。所望により、パラメーターを適当に調節すればこれ以外のサイズも使用できる。図示した具体例の場合、混合ブロック（４００）は、第一の「パンハンドル（フライパンの柄）」セグメント（４０４）とそれより大きいセグメント（４０６）をもつ単一の混合チャンバ（４０２）をもっている。矢印は、このチャンバ（４０２）に流入し、また流出する流れの方向を示している。混合ブロック（４００）の全長は約５．１ｃｍ、混合チャンバの狭いセグメント（４０４）は直径が約０．３２ｃｍであり、それより大きいセグメント（４０６）では直径が約０．４８ｃｍに広がっている。
基本的に、第一の口（１０４）はブロック（１００）の水平軸に沿っている。後により詳しく述べる薬剤／重合体溶液は、第一の口（１０４）を介して所定の流速で第一の混合チャンバ（１０２）に導入される。第二の口（１０６）は第一のチャンバ（１０２）の内壁に対してほぼ直角に、かつ第一の口（１０４）から流入する流れの線からは外れて位置している。乳化剤はこの口（１０６）を通って所定の流速で第一の混合チャンバ（１０２）に導入され、この第一の混合チャンバ（１０２）内部で薬剤／重合体溶液と共にエマルションを形成する。図４に示した具体例の場合、どちらの口（４０８、４１０）も同じ直径０．０３４ｃｍである。
ひとつの口の内径を他の口の内径と変えて２つの成分の相対流速を調節し、それでも所望の平均直径の微粒子を得ることが可能である。レイノルズ数から予想されるようにひとつの口の内径を少し変えると乱流に影響があり、したがって得られる微粒子のサイズに影響があり得る。
架橋剤溶液を導入するための口（４１２）は、エマルション流の線から外れており、その直径は他の２つの口より少し大きく、約０．１６ｃｍである。
図４Ａ（縮尺は正確ではないが拡大してある）に示されているように、各々の口は、混合チャンバ（４０２）に通じる管（４５０）が嵌合したSwagelok（登録商標）継手のような通常の管用ねじ（ＮＰＴ）継手（４５２）をもっている。ここに図示した例の場合、管（４５０）は各々の口（４０８、４１０、４１２）でＮＰＴ継手（４５２）内に固定されている。口（４０８、４１０）のところで、口の直径は管の内径より小さくて、薬剤／重合体溶液がチャンバ（４０２）に入る際にその流れの分裂がないのが好ましい。
口（４０８、４１０）から流入する溶液のそれぞれの流れによって作り出される乱流の助けにより、ほとんどの重合体が確実に乳化剤と接触することになる。エマルションは形成されると混合チャンバの大きい方のセグメント（４０６）中に移動し、そこで三番目の口（４１２）から流入する架橋剤の流れと出会う。混合チャンバのこのセグメント（４０６）で生じる乱流は、架橋用溶液流と混合チャンバのパンハンドルセグメント（４０４）からのエマルションの流れとによって生成する。得られた微粒子と溶媒は、次いでチャンバの大きい方のセグメント（４０６）の出口（４１４）を介して排出される。
図４Ｃ（縮尺は正確ではないが拡大してある）に、混合チャンバのパンハンドルセグメント（４０４）を示す。この図示した具体例の場合、第一の口（４０８）は長軸に沿っており、薬剤／重合体溶液流をチャンバの「パンハンドル」部分（４０４）に導入する。乳化剤を導入する第二の口（４１０）は、第二の口（４１０）の外壁がチャンバ（４０４）の内壁と直交して薬剤／重合体溶液の流れに対して正接して乳化剤流を導入するように配置されている。図示したように第二の口（４１０）は第一の口（４０８）の線とはずれている。
第二の口（４１０）が第一の口（４０８）からずれている割合は、チャンバ内の（４０４）で薬剤／重合体液滴と乳化剤の乱流が生成するのに充分なものである。口（４０８）および（４１０）からのそれぞれの流れが交差しないのが最も好ましい。口（４０８）からの流れの前方運動と口（４１０）からの流れの正接方向の運動とが相俟って螺旋状の流路を形成し、チャンバの狭い方の部分（４０４）を通ってそのチャンバの大きい方の部分（４０６）へ入り、最後はブロックの出口（４１４）から出ていく。
同様に、図４Ｂに示されているように、第三の口（４１２）が内側のチャンバ（４０６）とほぼ直交し、かつそのチャンバ（４０６）に入るエマルションの流れからずれて位置している。
薬剤／重合体溶液と乳化剤を同じ軸に沿って導入すると、すなわち、２つの溶液を同軸で第一の混合チャンバ内に導入すると、所望のサイズの微粒子が生成しない。第一の混合チャンバ（１０２）内に形成される乱流の量は、乳化剤および薬剤／重合体溶液の導入方向によって影響される。チャンバ（１０２）の壁とほぼ正接して、かつ薬剤／重合体溶液流からずらして乳化剤を導入すると、所望のサイズ範囲の微粒子が生成するのに充分な乱流が作り出される。図５に、第一の混合チャンバ（図示せず）から入口（５０６）を介して第二の混合チャンバ（５０２）内に移動するエマルション中に架橋剤の流れを導入するための第二の混合チャンバ（５０２）を含む別の態様の第二の混合ブロック（５００）を示す。図示した具体例では、標準的な短管デザインを使用してエマルションを第一の混合チャンバ（図示せず）から第二の混合チャンバ（５０２）へ導入する。
図示した混合チャンバ（５０２）の直径は約０．９５ｃｍである。口（５０４）は円筒壁に対して正接して架橋剤を導入するように位置しており、そのためこの中で螺旋状の乱流が生成する。口（５０４）は、エマルションがこのチャンバに入るときに通る口（５０６）からずれていない。
図６に、架橋剤とエマルションが導入される第二の混合チャンバ（６０２）を含む第二の混合ブロック（６００）の別の具体例を示す。この例では、環状の混合ティー（６０４）を使用してエマルションを第一の混合チャンバ（図示せず）から第二の混合チャンバ（６０２）に導入する。
この環状ティー（６０４）の外径は約０．６４ｃｍであり、混合チャンバ（６０２）の内径は約０．９５ｃｍである。架橋剤を導入する際に通過する口（６０６）の直径は約０．９５ｃｍである。
好ましい態様では、重合体として低分子量重合体（ＬＶＣＲ）を、薬剤としてＭＣＡＭ−１を使用する。ＬＶＣＲは約１％（ｗ／ｗ）の濃度で水に溶解し、ＩＣＡＭ−１は最終０．１１％（ｗ／ｗ）のＩＣＡＭ−１濃度で添加する。この結果、最終生成物の理論的ＩＣＡＭ−１充填率は約５〜１５％、最も好ましくは約１０％になる。流量、個々の重合体および充填される個々の薬剤に応じて重合体と薬剤の他の割合も使用できる。薬剤／重合体溶液はまた、特定の薬剤に対して適したタイプの緩衝塩を含有していてもよい。たとえば、ＩＣＡＭ−１を調製・保存するのにＴＲＩＳまたはヒスチジン緩衝液を使用でき、したがってＬＶＣＲ溶液中にはこれらの緩衝液に由来する塩が存在する。また、これらの緩衝液を薬剤／重合体溶液に添加してｐＨおよびＩＣＡＭ−１の可能な分解を抑制することもできる。
微粒子を形成するのに使用する好ましい重合体はMerck & Co., Inc.（Kelco Division, U.S.A., Rahway, N.J.）から市販されているアルギン酸ナトリウムであり、低分子量のアルギン酸ナトリウムが最も好ましい。本発明を実施するのに使用できるアルギン酸ナトリウムとしては、Keltone HV（商標）、Keltone LV（商標）、Kelgin HV（商標）、Kelgin MV（商標）、Kelgin LV（商標）、Manucol DMF（登録商標）、Manucol DH（登録商標）、Manucol LD（登録商標）およびManugel DMB（登録商標）［いずれも、Merck & Co., Inc.（Kelco Division, U.S.A.）から市販されている］がある。他のアルギネートはKibun Chemical ColまたはPronova Biopolymersから入手できる。本発明を実施するには、微粒子から放出される標的薬剤に対して望ましい放出特性をもつか、または特定の薬剤もしくはデリバリーシステムに適した望ましい生物特性をもつ他の重合体を使用できる。
薬剤溶液中に使用できる他の重合体としては、特に、アルギン酸カルシウムナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸プロピレングリコール、キサンタンガムおよびゲランガム、親水性セルロース重合体、および天然タンパク質、ならびに合成重合体がある。重合体の選択は充填される対象の薬剤に依存する。
本発明の好ましい態様のシステムで使用する薬剤はｔ−ＩＣＡＭ−４５３であり、これはＴＲＩＳ−ＨＣｌで緩衝された１〜２％のｔ−ＩＣＡＭ−４５３溶液としてBayer Corporation, Pittsburgh, PAから供給されているものである。この薬剤は最初、個々の薬剤に適した濃度の凍結、凍結乾燥または緩衝溶液形態でよい。凍結薬剤サンプルはその後ＬＶＣＲまたはその他の適当な重合体溶液に添加される。
本発明を実施するには（図１参照）、薬剤／重合体溶液を、第一の口（１０４）を介して、好ましくはTeflon（登録商標）またはその他の非金属材料から製造した管（図示せず）によって、第一の混合チャンバ（１０２）にポンプで注入する。この管は、一端が口（１０４）の中に固定され、他端が流量調節ポンプ（図示せず）に接続されている。薬剤／重合体溶液は、粒子のサイズを大きく低下させることなく重合体液滴を形成するのに充分な乱流を第一のチャンバ内に生成する所定の流量で第一の混合チャンバ（１０２）に導入する。
ほぼ同時に、一端が第二の口（１０６）内に固定されており他端が流量調節ポンプ（図示せず）によって制御されている管（図示せず）を介して、第一の混合チャンバ（１０２）に乳化剤を導入する。ＩＣＡＭ−１を充填した微粒子を製造する好ましい態様の場合、乳化剤は酢酸エチルであり、湿った酢酸エチル（約２．８〜３％）が最も好ましい。乳化剤は、この乳化剤が薬剤の水性溶液を脱水し乳化剤と薬剤／重合体溶液との間の相間相互作用によるビルドアップを生起させるのを防ぐように（水で）飽和されているのが好ましい。特に、ＩＣＡＭ−１システムに酢酸エチルを使用した場合、薬剤／重合体溶液からの水は３％未満の濃度で酢酸エチルに可溶である。この場合、酢酸エチルはアルギネートエマルションを脱水し非常に粘稠なゲルを生成する。この問題は、使用前に酢酸エチルをあらかじめ約２．８％以上のレベルまで湿潤させることによって解決することができる。薬剤が水性溶媒に溶かしてない他の態様では、非飽和で相互作用しない他の乳化剤を使用することが可能であり得る。
本発明のＩＣＡＭ−１の具体例の場合エマルションを形成する溶媒としては酢酸エチルが好ましい。というのは、この溶媒が水と部分的にしか混和しないし、架橋用溶媒とは完全に混和し（後述）、そしてＧＲＡＳ（すなわち米国食品医薬品局合格証）級の食品グレードであり、高純度で安価であるからである。
架橋用溶媒として７０／３０のアセトン／エタノールを使用しＬＶＣＲ／ＩＣＡＭ−１緩衝サンプル中で０．５ｍＭのＴＲＩＳ溶液濃度を使用するシステムの場合、ＩＣＡＭ−１充填率は理論上６６％になる。１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝サンプルを使用するとＩＣＡＭ−１充填率が理論上１００％となる。純粋なエタノール系におけるＩＣＡＭ−１充填率に対する緩衝液濃度の影響はそれ程劇的なものではない。同一の操作条件下で０．５ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液ではＩＣＡＭ−１の充填率が６７％、１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液ではＩＣＡＭ−１の充填率が６５％である。
本発明を実施する際、薬剤／重合体溶液または乳化剤を導入する前に、最初口（１０４）を介して緩衝溶液を第一の混合チャンバ（１０２）に通して、その混合チャンバを予備的に充填しそのシステムに連結したポンプを始動させることができる。溶液と乳化剤を２つの口（１０４、１０６）を介して第一の混合チャンバ（１０２）に同時に導入するとエマルションが形成される。第一の混合ブロック（１０２）に入る補充溶液流によって第一混合ブロック（１０２）内に創製された乱流は、個々の液滴内へ少量の液体（すなわちＬＶＣＲ）を分配する。液滴のサイズはチャンバ内の乱流の量および両者の液体の性質に依存し、チャンバにおけるシステムのレイノルズ数に関連している。レイノルズ数が大きくなればなるほど微粒子のサイズはそれだけ小さくなる。また、２種の溶液が粘稠になればなるほど乱流を生じさせるのがそれだけ困難になる。
微粒子は第一の混合チャンバ（１０２）内で形成されると第二の混合チャンバ（１０８）中に流入する。微粒子を含むエマルションの流れを容易にするために、この第二の混合チャンバ（１０８）は第一の混合ブロック（１０２）に隣接しているのが好ましい。図１に示してあるように、好ましい態様の場合第二の混合チャンバ（１０８）は第一の混合チャンバ（１０２）と連続している。
第二の混合チャンバ（１０８）が第一の混合チャンバ（１０２）と連続していない場合には、エマルションを、第一の混合チャンバ（１０２）から、ある量の架橋剤を含有する拡大した第二の混合チャンバに移せばよい。そのような態様の場合、架橋はほぼ同時、すなわち約２秒以内に起こる。しかし、微粒子組成および架橋剤に応じて、微粒子をさらに脱水するために滞留時間を数時間から数日まで延長してもよい。
図１に示されているように、第二の混合チャンバ（１０８）が第一の混合チャンバ（１０２）と連続している場合、エマルションは第一の混合チャンバ（１０２）から第二の混合チャンバ（１０８）に直接移される。エマルションが第三の口（１１３）を介してチャンバ（１０８）に入ると、架橋剤溶液の流れが第四の口（１１０）を介して所定の流量で第二の混合チャンバ（１０８）に導入される。好ましい態様の場合、第四の口（１１０）は混合チャンバ（１０８）の長軸に垂直で、エマルション流の線からずれていて、エマルションの流れにほぼ正接して架橋用流を導入する。
所望の平均直径と薬剤充填特性を有する微粒子をうまく製造する際の重要なパラメーターは混合チャンバに導入される溶液の流量である。実施例１に記載するＩＣＡＭ−１で充填されたアルギネート微粒子を製造するためのシステムでは、第一の混合チャンバに入る薬剤／重合体溶液の流量は約５〜１０ｍＬ／分であり、乳化剤は約５０〜８０ｍＬ／分の流量で第一の混合チャンバに導入する。１％（ｗ／ｗ）のＬＶＣＲ溶液、あらかじめ湿らせた酢酸エチルおよび塩化カルシウム架橋剤を使用した一連の実験を図１のシステムを用いて実施した。収集し乾燥した後、各サンプルを２５０μｍのスクリーンを通してふるい分けして、起こった凝集量の指標として大きめの粒子をバルクから分離した。次の表１に、回収された２５０ミクロン未満の粉砕生成物の割合を示す。
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さらに２５０ミクロン未満のサイズを有する粒子を、MalvernとHoribaの両方のサイズ分析を用いてさらに分析した。Malvernサイジングは、Malvern Instruments Co., Inc.（Southborough, MA）から入手できるMalverm 2600c液滴・粒子サイザーを用いるレーザー回折原理に基づいた公知のサイジング技術である。Horiba分析は粒子沈殿技術に基づいた公知のサイジング技術であり、Horiba Instruments, Inc.（Irvine, CA）から入手できるHoriba CAPA-700粒子サイズ分布アナライザーを用いて実施する。Horibaアナライザーにおける粒子サイジングは粒子の空気力学特性に基づいており、結果は空気力学的質量メジアン直径（ＡＭＭＤ）および代表的なサイズ範囲の粒子の割合（％）で表わされる。次の表２に、表１から選択したサンプルに関するこの分析の結果を示す。
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粒子のサイズを低下させるほど過大な乱流を生成することなく架橋剤と微粒子を混合するのに充分な乱流を第二の混合チャンバ（１０８）内で作り出すように、架橋剤の流量はできるだけ低いのが好ましい。好ましい態様では、ＩＣＡＭ−１を含む１％（ｗ／ｗ）のＬＶＣＲを約５ｍＬ／分の流量で第一の混合チャンバ内に導入する。あらかじめ湿らせた（水２．８％）酢酸エチルは、約８３ｍＬ／分の流量で第一の混合チャンバ内に導入する。
架橋剤は乳化剤と反応して微粒子を固化させるものならばなんでもよい。好ましい態様では、エマルションを形成するのに水性アルギン酸ナトリウムを用いるときに架橋剤として塩化カルシウムを使用する。他のカルシウム塩も、溶媒または溶媒混合物に可溶である限り使用することができる。架橋プロセスでは、アルギン酸ナトリウム中のナトリウムがカルシウムで置き換えられて、ＩＣＡＭ−１が充填された非水溶性アルギン酸カルシウム微粒子が生成する。この態様の場合、一定量の、微粒子を脱水するアセトンやエチルアルコールのような脱水用溶媒にカルシウム塩を溶解する。架橋剤溶液はアセトン６０％とエタノール４０％の中にＣａＣｌ2を０．８％含むのが好ましい。
ＩＣＡＭ−１／ＬＶＣＲの態様の場合、塩化カルシウムは、最終生成物中に塩化カルシウムの沈殿を生じることなくＬＶＣＲ溶液中のアルギン酸ナトリウムを完全に架橋するのに充分な化学量論的過剰に存在する。塩化カルシウム濃度が高過ぎると、架橋が過大に起こり、個別の微粒子の形成が妨げられる。その場合最終生成物は、架橋した材料の連続マトリックスかまたは大きい（すなわち１〜２ｍｍの）非球状粒子となる。
架橋剤と共に使用できる溶媒としてはアセトンがあり、これはイソプロピルアルコールのような他の溶媒ほど容易にＩＣＡＭ−１を分解することがない。他の薬剤と組合せていろいろな溶媒を使用することができ、そのような溶媒は少なくとも部分的には対象となる薬剤の溶解性に依存し得る。各溶媒にはそれぞれの利点と欠点がある。アセトンは架橋した微粒子を脱水するのは容易であるが、塩化カルシウムを溶解しない。エタノールは本発明のシステムで他の溶媒と容易に混和し塩化カルシウムを容易に溶解するが、薬剤がエタノールに可溶であったりすると、たとえば、ＩＣＡＭ−１充填システムに使用した場合、薬剤充填率が低くなることがある。イソプロピルアルコールを使用すると取扱いが良好な速やかに乾燥する生成物が得られ得るが薬剤充填率が低くなることがある。アセトン／エタノールの組合せ（たとえば、８５／１５、７０／３０、または６５／３５）を使用すると、充填率が高くなるが２種類の溶媒を使用するため生産コストが増大し得る。
溶媒は、そのコスト、プロセスに対する適性、および製薬産業における現在の共用性によって選択する。アセトンは水よりはエタノールと混合し得る。なぜならば、水はほとんどの場合他のプロセス溶媒と不混和性であり最終流出物から分離するからである。
そのような相分離は、ＩＣＡＭ−１が水相に損失する恐れがあり、生成物の凝集が起こり、しかも脱水が不完全になるので、ＩＣＡＭ−１を充填した微粒子にとって望ましくない。塩化カルシウムを溶解すると同時に流出物中の２相混合物を防止するのに充分な量のエタノールが好ましい。
本発明のシステムと方法の成功を決定するのに重要な要因は微粒子中の薬剤の充填率と収率である。ＩＣＡＭ−１の場合、所望の収率は８０％を越える。全体収率の損失としては、プロセスの炉液および濯ぎ炉液中へのＩＣＡＭ−１の損失、ＩＣＡＭ−１の失活に基づく損失、ならびに所望の微粒子サイズ範囲を外れた微粒子画分が包含される。
ＩＣＡＭ−１の充填率を測定するには、ＩＣＡＭ−１を微粒子から浸出させるかまたは微粒子を完全に溶解させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは比濁法によって、または関連業界で現在認識されているかもしくは将来認識されるようになり得る他の方法によって濃度を分析すればよい。
架橋剤溶液として、エタノール、アセトン／エタノール（８５／１５）、アセトン／エタノール（７０／３０）、アセトン／エタノール（６５／３５）およびイソプロパノールを本明細書に記載するＩＣＡＭ−１／アルギン酸ナトリウムのシステムに使用する
ことができる。以下の表３に、架橋剤溶液としてイソプロパノール、アセトン／エタノール（７０／３０）およびエタノールを用いた実験で得られた結果を示す。表３には、１００μｍ未満の粒子の割合と、ＩＣＡＭ−１の充填率に１００μｍ未満の粒子の割合を掛けて計算したＩＣＡＭ−１全体収率とを示す。
表３に示してあるように、アセトン／エタノール（７０／３０）のシステムでは、１０％ＩＣＡＭ−１の充填率がほぼ１００％であり、８２％の微粒子が直径１００μｍ未満であった。乾燥重量収率にふるい分け収率を掛けて決定した全体収率は理論値の８２％であった。
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本発明のシステムを工業的に実施する際、図２に示したように、薬剤／重合体溶液、乳化剤および架橋剤溶液は最初別々の容器（それぞれ、２０２、２０４、２０６）で調製できる。次いで各溶液は、流量調節ポンプデバイス（１１６）を用いて容器（２０２、２０４、２０６）から適当な細孔サイズ、たとえば０．２ミクロンの滅菌フィルター（２０８）を介して移し、別々の滅菌保持タンク（それぞれ、２１２、２１４、２１６）に貯蔵することができる。これらの溶液を混合ブロック（１００）中に導入する前に第二の滅菌ろ過ステップを設けてもよい。
流量調節ポンプデバイス（１１６）、または各溶液に別々の流量が与えられるようにいくつかのインプットとアウトプットを有する単一の流量調節ポンプ装置を用いて、滅菌保持タンク（２１２、２１４、２１６）から適当な口を介して溶液を混合ブロック（１００）中に送出する。これらの溶液を各々の容器から混合ブロック（１００）に移すには可撓性のチューブを使用することができる。
混合ブロック（１００）に導入される各溶液に対する緩衝溶液でインフローポンプデバイス（１１６）を始動させると好ましいであろう。第一の混合チャンバ（１０２）に入る薬剤／重合体溶液の流入は、乳化剤の流入が始まる前に開始してもその後に開始してもよい。場合によっては、薬剤／重合体溶液を導入する前にまず乳化剤を第一の混合チャンバ（１０２）に導入することによって、プロセスの費用効果を高めて混合ブロック（１００）に導入された薬剤の廃棄量を減らすことができる。
図３のフローチャートに、本発明を実施する好ましい方法の概略を示す。好ましくは乳化剤を第一の混合チャンバ（１０２）に導入する（３０４）のと同時に、薬剤／重合体溶液を第一の混合チャンバ（１０２）に導入し（３０２）、こうして微粒子と溶液を含有するエマルションを形成する（３０６）。次にこのエマルションを第二の混合チャンバ（１０８）に移し（３０８）、この時点で架橋剤をチャンバ（１０８）中に導入する（３１０）。
エマルションが第一のチャンバにとどまる時間および架橋された溶液が第二のチャンバにとどまる時間は、それぞれのチャンバに流入する個々の流れの流量の関数である。微粒子の形成と架橋はいずれもほとんど瞬時に、すなわち約２秒以内に生起するので、
いずれのチャンバでもインキュベーション時間は必要とされない。
微粒子と架橋剤溶媒の混合物は混合ブロック（１００）を出たら、所定の最小範囲から外れる微粒子を捕獲するフィルターまたはシーブ（２１８）を通してろ過する（３１２）。好ましい態様の場合、ＩＣＡＭ−１を含有する微粒子は標準的な市販のフィルタ
ー材料を用いてろ過される。このフィルターは約２０μｍを越える直径の粒子を回収でき、約２０μｍ未満の微粒子は洗浄され、おそらくは廃棄物回収容器（１１８）中に入る。あるいは、このフィルター（２１８）で最初たとえば２００μｍより大きい粒子を
ろ過分離し、次のろ過で小さい粒子を除いてもよい。
フィルター（２１８）内の粒子は次に第一の洗浄に処せられる（３１４）。図２に示されているように、ひとつの態様においては、この第一の洗浄ステップ（３１４）では、流量調節ポンプ（１１６）を使用して第一の洗浄溶液を容器（２２４）から滅菌フィルター（２０８）を通して貯蔵容器（２２６）に移す。
第一の洗浄溶液はアセトン類、アルコール類または両者の組合せのような任意の脱水用溶液でよい。約１０％のエタノールおよび約９０％のアセトンまたは９０％のイソプロパノールまたは９０％の酢酸エチルの第一洗浄が好ましい。溶液によっては特定の微粒子を速やかに、かつ充分に脱水できるものがあるが、溶液の中には目的とする微粒子内に充填される薬剤の効力に影響するものがある。第一の洗浄ステップ（３１４）は沈殿させることなく過剰の架橋剤、たとえば塩化カルシウムを除去するためのものである。第一の洗浄ステップ（３１４）は過剰の乳化剤、すなわち酢酸エチルを除去するためのものである。
第一の洗浄ステップ（３１４）の後、第一の洗浄ステップ（３１４）と同様にして第二の洗浄ステップ（３１６）を実施するのが好ましい。すなわち、図２に示されているように、第二の洗浄溶液は流量調節ポンプデバイス（１１６）を介して容器（２２８）から滅菌フィルター（２０８）を通して貯蔵容器（２３０）に移される。第二の洗浄ステップ（３１６）は、第一の洗浄ステップ（３１４）と同じ溶液その他を用いて実施できる。第二の洗浄ステップ（３１６）で使用する溶液はまた微粒子を脱水もし、したがってこのような溶液としては特に純粋なアセトン、イソプロパノールまたは酢酸エチルなどが包含され得る。この第二の洗浄ステップ（３１６）は第一の洗浄溶液の残渣を除くためのものである。したがって好ましい第二の洗浄溶液は１００％アセトンであろう。
微粒子は業界で公知のいくつかの方法を用いて回収できる（２３２）。直接収集法ではサンプルを、ブフナー漏斗フィルターまたは工業生産に使用することができるその他のフィルターに直接収集する。ろ液はフィルターを通して吸引によって引き出され、生成物がフィルターに収集されるにつれて微粒子のケーキが生じる。
もうひとつ別の収集法では、流出流（すなわち微粒子と溶媒）を容器中に収集し、一定の時間（たとえば０〜４８時間）生成物を放置し、次にサンプルをろ過する。微粒子と溶媒の接触時間内に薬剤またはタンパク質が微粒子から浸出する可能性があるが、使用する溶媒系が水に対して高い親和性を有するときには微粒子の付加的な脱水も起こり得る。
第二の洗浄ステップ（３１６）の後、フィルターに残ったフィルターケーキを収集し、乾燥ステップ（３１８）の貯蔵容器に入れる。ろ過された物質は真空乾燥オーブンに長時間、すなわち約５０℃で８時間以上乾燥するのが好ましい。この時間、温度および真空度は微粒子の個々の組成および生産容量に依存する。しかし、微粒子は湿潤大気にさらすと再度水和して５〜１０％もその重量が増すことがある。
最終ステップとして、乾燥した粒子を、たとえば乳鉢系または工業用に適合した類似の系によって脱凝集し（３２０）て微細な粉末状の最終製品とすることができ、必要であればふるい分けして所望のサイズ分布を得ることができる。このプロセスの所望の最終製品は、所望の直径範囲をもち所望の範囲内の薬剤充填率を有する凝集していないある量の微粒子である。
次いで、微粒子製品を、当業者に利用できる公知の標準的な処方を用いて経鼻薬剤送達デバイスに処方することができる。本発明に従って製造した薬剤充填微粒子は鼻内経路に接着する特性をもっており、その中に含まれている薬剤を受容患者の循環系に除放する。微粒子内のアルギネートは鼻内経路に含まれる粘膜と相互作用してゲル様の物質となり、これが、薬剤が放出されるにつれて鼻内の経路の表面に接着する。
本発明を利用した工業的規模の製造プロセスの好ましい態様の場合、２５０グラムの生産プロセスで以下の量の成分を使用できる。すなわち、ＩＣＡＭ−１を約３５グラム、アセトンを約７０リットル、エタノールを約５０リットル、酢酸エチルを約１２０リットル、このプロセスに使用できる。関連した洗浄ステップではアセトンを約１２リットル、エタノールを約１リットル必要とするであろう。図４に示したタイプのいくつかの混合ブロックは平行して使用することができ所望の生産プロセスを達成することができる。あるいは、平行して実施するシステムをさまざまに組み合わせてもＩＣＡＭ−１を充填したアルギン酸カルシウム微粒子を工業生産することができる。
以下の非限定実施例は、以上に記載した本発明のシステムとプロセスの代表的具体例である。
実施例
実施例１
この実施例では、流出物は１％（ｗ／ｗ）のＬＶＣＲおよび０．１１％のＩＣＡＭ−１、乳化剤はあらかじめ湿らせた（水分２．８％）酢酸エチル、架橋剤溶液はエタノール中０．８％の塩化カルシウムである。ＩＣＡＭ−１を充填したＬＶＣＲの場合、望ましい粒子直径範囲は約２０〜８０μｍであり、メジアンが約４０〜５０μｍであるのが最も好ましい。所望のＩＣＡＭ−１充填率は約１０％であり、標的の回収率は約８０〜約１００％である。
図４に示した混合ブロックを用いて、ＬＶＣＲ流の流量を１５〜４５ミリリットル／分（ｍＬ／分）で変化させ、酢酸エチル流の流量を６１〜１０６ｍＬ／分で変化させる。これらのパラメーターを用いて得られた代表的なサンプルのデータを表４に示す。
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実施例２
流出物流を第一の混合チャンバ中に導入するために使用する口の直径が生産される微粒子のサイズと分布にいかなる影響を与えるのか決定するために一連の試験を実施した。
これらの試験は、図４に示したシステムと１％（ｗ／ｗ）のＬＶＣＲ溶液を使用して行なった。ＬＶＣＲ口の内径を０．０３４ｃｍから０．０６９ｃｍまで増大させ、ＬＶＣＲ溶液と酢酸エチル溶液の流量を変化させた。架橋剤の流量は一定に保った。このような試験の結果を次の表５に示す。
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表５の結果は、すべての場合に１５％を越える粒子が１００μｍより大きく、場合によって５０％近くの粒子が直径１００μｍを越えていることを示している。この結果は、粒子サイズがＬＶＣＲの口の直径にのみ依存するのではないことを示している。混合チャンバの内径、流量および内部乱流のような他のパラメーターが粒子サイズに影響する追加の要因であろう。
実施例３
ＩＣＡＭ−１／ＬＶＣＲ溶液用の架橋剤溶液としてイソプロピルアルコールを使用した。データは、架橋用溶液としてイソプロピルアルコールを用いて製造した微粒子がアセトンまたは他のアルコール類を使用して製造した微粒子より速やかに乾燥し、取扱いが良好であることを示している。
この実施例では、図４のブロックで１４ｍＬ／分のＬＶＣＲ流量と６５ｍＬ／分の酢酸エチル流量を使用した。充填されてない重合体溶液を用いると、充填されてない微粒子を５時間で４５グラム（すなわち、０．１６ｇ／分の割合）製造することが可能であった。収集した４５グラムのうち３７．２グラム、すなわち８３％が１００μｍより小さかった。
１００μｍのスクリーンを通してふるい分けした粒子のHoriba装置による粒子のサイジングによるとメジアンサイズが４７μｍとなり、８９％が１００μｍ未満で、４．４％が１０μｍ未満であった。すなわち、充填されてないＬＶＣＲで、４０〜５０μｍの所望のメジアン直径サイズ範囲を有する粒子が得られた。
実施例４
ひとつの実験における本発明のシステムの寿命を試験するために、ＩＣＡＭ−１を含むＬＶＣＲと含まないＬＶＣＲを用いて一組の５０グラムバルク実験を行なった。この実施例では、湿らせた（水分２．８％）酢酸エチルを乳化剤として使用し、１％（ｗ／ｗ）のＬＶＣＲを用いた。ＬＶＣＲ流に対して設定した流量は１５．５ｍＬ／分であり、酢酸エチルと架橋用溶液に対して設定した流量は７０ｍＬ／分であった。ＬＶＣＲ溶液は１０ｍＭヒスチジンまたは１０ｍＭのＴＲＩＳで緩衝し、ＩＣＡＭ−１を用いたときにはＬＶＣＲ溶液には１０重量％のＩＣＡＭ−１も２．３％（ｗ／ｗ）含ませた。
これらの実験の結果を以下の表６にまとめて示す。
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この表６に示したように、ヒスチジンサンプルのＩＣＡＭ−１充填率はＴＲＩＳサンプルと同じ範囲である。他のデータは、アセトンとエタノールの比が変化したときでも充填率が理論値の約８０％にとどまっていることを示している。これらのサンプルのＩＣＡＭ−１充填率は理論充填率の７５％以上で再現性がよかった。
実施例５
この実施例では、最初に真空オーブン中で１２時間または３日間乾燥したサンプルをそれぞれさらに４時間または１０時間再度乾燥した。再乾燥後秤量し、室内環境で平衡に達するまで放置し、再度秤量した。これらの乾燥研究の結果を次の表７に示す。
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最初に１２時間乾燥したサンプルは再乾燥に際して水分を約１０％失った。しかし、これらのサンプルは最初湿潤条件（すなわち４８％ｒＨ）下で処理したものであり、その処理中に受け取った水のみを失ったものとすることができよう。最初に３日間乾燥したサンプルはさまざまな結果を示した。場合によっては、第二の乾燥後ほとんど水損失がない場合が観察された。しかし、他の場合には第二の乾燥後かなりの重量損失が検出された。すべてのサンプルで室内条件で平衡に達した後微粒子の重量が増大した。
特定の方法と組成物に関して本発明を説明して来たが、本発明を考慮する際に変更および修正が当業者には自明であるものと理解されたい。
たとえば、ＩＣＡＭ−１から誘導される小さめのタンパク質断片やペプチドであって、それでもウイルス結合部位を含有しているものは本明細書に記載したカプセル封入および送達に有効であろうということが分かる。
アルギネート微粒子に入れたｔ−ＩＣＡＭ−４５３に関して本発明の好ましい形態を説明したが、他のタンパク質やポリペプチドをアルギネート微粒子に充填するのに適していること、および、ＩＣＡＭ−１をアルギネート以外の物質と共に使用することができることが分かる。ＩＣＡＭ−１を充填した微粒子を製造するための本発明の一般的な方法とシステムを用いて数多くの他の薬剤を充填した他の微粒子を製造することができるということが分かる。
上記に例示した実施例で記載した本発明において数多くの修正と変形が当業者には自明であると期待され、したがって請求の範囲に明記した限定のみが以上の実施例に課せられるべきである。
したがって、請求の範囲には、請求している本発明の範囲内に入る均等な変形はすべて含まれるものとする。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｂ】
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