(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相支持体上に第一および第二の標的種を固定化すること；
固定化された第一および第二の標的種と、第一標的腫に対して特異的に結合する第一のパートナーおよび第二の標的種に対して特異的に結合する第二のパートナーとを接触させ、第一の結合対と第二の結合対を形成すること；
第一の結合パートナーに対するラベルとしてペルオキシダーゼ酵素を付与し、第二の結合パートナーに対するラベルとして第二の酵素を付与すること；
第一の化学発光シグナルを生じるために、第一の結合対を、化学発光ペルオキシダーゼ基質および過酸化化合物と反応させること；
第一の化学発光シグナルを検出することによって、第一の標的種を検出すること；
第二の結合対を、第二の酵素に対する化学発光基質とペルオキシダーゼ酵素のインヒビターを含む組成物と反応させて、第一の化学発光シグナルを停止させて、第二の化学発光シグナルを生じること；および
第二の化学発光シグナルを検出することによって第二の標的種を検出すること、を含む二つの連続的な化学発光反応による第一および第二の標的種を含むと思われるサンプル中の第一および第二の標的種を連続的に検出するための方法。
【請求項２】
第一の特異的結合パートナーが第一のハプテンを用いてラベルされ、第二の特異的結合パートナーが、第一のハプテンと異なる第二のハプテンを用いてラベルされ、ペルオキシダーゼ酵素が第一のハプテンに結合する第三の特異的結合パートナーとの共役体として供給され、第二の酵素が、第二のハプテンに結合する第四の特異的結合パートナーとの共役体として提供される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一および第二のハプテンが、ビオチン、フルオレセインおよびジゴキシゲニンからなる群から独立に選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一の特異的結合パートナーが、ペルオキシダーゼ酵素で直接的にラベルされている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第二の特異的結合パートナーが、第二の酵素で直接的にラベルされている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第二の酵素が加水分解酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
加水分解酵素がアルカリホスファターゼである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
ペルオキシダーゼ酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第一および第二の標的種が、核酸の第一の領域、およびその核酸の第二の領域を含み、第一の特異的結合パートナーがその核酸の第一領域に相補的な第一オリゴヌクレオチドプローブであり、第二の特異的結合パートナーが、核酸の第二領域に相補的な第二オリゴヌクレオチドプローブである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
遺伝的変異の存在を調べるために用いられる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第一および第二標的種は、正常遺伝子の第一ヌクレオチド配列およびその遺伝子の変異を含む第二ヌクレオチド配列を含み、第一の特異的結合パートナーは、第一のヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブであり、第二の特異的結合パートナーは、第二のヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ配列分析に用いられる請求項１記載の方法。
【請求項１４】
第一および第二標的種が、第一および第二タンパクであり、ウェスタンブロットアッセイにおいて用いられる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
第二酵素の化学発光基質が、酵素的引き金を引くジオキセタンである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ジオキセタンが、以下の式：
0004156677.tif 000011
［式中、Ａ1およびＡ2は、ジオキセタンに安定性を付与する基であり、Ａ3は直鎖、分枝鎖または環状アルキル状の、置換されたアルキル、アリールおよび置換されたアリール基から選択され、Ａ4はジオキセタン環と共役しない位置を占めるＯＸ置換基で置換された芳香環基であり、Ｏ−Ｘ結合を切断する酵素とＯＸ置換基との反応が、化学発光を生じる引き金をひくものであり、Ａ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4基から選択されるあらゆる対が、ジオキセタン環に融合した環を形成するように連結されうる。］を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ａ1およびＡ2は、６ないし１０の炭素原子を有する置換または非置換のポリシクロアルキル基として結合され、Ａ3は、１ないし１０の炭素原子を有する置換または非置換アルキル基であり、Ａ4は、置換または非置換のフェニル基であり、ＸはＰＯ32-基、ガラクトシド基またはグルクロニド基から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＯＸ基がホスファート基である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ジオキセタンが以下の式を有する、請求項１８記載の方法。
0004156677.tif 000012
【請求項２０】
化学発光ペルオキシダーゼ基質が、以下の一般式：
0004156677.tif 000013
［式中、Ｒは、アルキル、ヘテロアルキルおよびアラルキル基から選択され、Ｒ1からＲ8は、発光を妨げない基から独立に選択され、基Ｒ1からＲ8の隣接対が、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨを構成して、ベンゾ融合環を形成し、基Ｃ（＝Ｏ）−Ｙはエステル、チオエステルまたはスルホンアミド基である。］を有するＮ-アルキルアクリダン-９-カルボキシラート誘導体から選択された、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
Ｎ-アルキルアクリダン-９-カルボキシラート誘導体が、以下の一般式：
0004156677.tif 000014
［式中、Ｒ3は、Ｈ、Ｃｌまたはメトキシ基から選択される。］を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｙが、２,３,６-トリフルオロフェノキシ基である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ3がＨ原子である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
固相支持体が、試験片、ブロッティング膜、フィルター、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロウェル、試験管およびビーズからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
固相支持体がブロッティング膜である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
過酸化物が、過酸化水素、過酸化尿素および過ホウ酸塩からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
化学発光ペルオキシダーゼ基質および過酸化物が、フェノールエンハンサーをさらに含む水性試薬組成物中に供給されている、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
ペルオキシダーゼ基質を含む組成物が、さらに界面活性剤を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ペルオキシダーゼインヒビターが、過酸化水素を単独またはアジドイオン、シアニドイオン、フッ素イオン、イミダゾール、フェニルヒドラジンおよび過ヨウ素酸塩と組み合わせたものから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
ペルオキシダーゼインヒビターが過酸化水素である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
政府後援の研究に関する声明
米国政府は、本発明において支払い済みのライセンスを有し、認可番号２Ｒ４４ ＤＫ４７７２７−０２および１Ｒ４３ ＣＡ７５８３０−０１により規定される妥当な条件で他人に認可するために特許権者を必要とする限定された状態で権利を有する。合衆国国立衛生研究所により認定された。
発明の分野
本発明は、試験システム中の二つのアナライトの連続的化学発光検出方法に関する。特に、本発明は、アナライトが二つの異なる酵素を用いてラベルされた方法、特に一方の酵素がペルオキシダーゼである方法に関する。この方法は、好ましくは、ブロッティング膜のような固相上のアナライトを分析するために行われる。本発明は、ブロットを除去して再プローブする必要性を排除した、固相上の複数のアナライトを検出するための方法を提供する。本発明の方法は、一回のサザンブロットにおける多様なＤＮＡマーカーまたはプローブの検出、多数のプローブが用いられる法医学的ＤＮＡフィンガープリンティング、一つ以上の鋳型の多様なＤＮＡ配列決定、遺伝子再配列、変異および遺伝子連鎖の検出、ウェスタンブロットにおける多様なタンパクの検出、および当該技術分野で知られた他のアッセイに適している。
発明の背景
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク、抗体、抗原、ハプテン、薬剤、ホルモン、感染成分のようなアナライトの化学発光検出に関する多数の方法が知られている。化学発光検出は、アナライトまたはアナライトに特異的に結合する分子を、化学発光反応を受けるように形成され得る化合物を用いてラベル化することによって実施されうる（直接的ラベリング）。化学発光検出は、添加された化合物の化学発光反応を触媒する酵素または類似した触媒を用いて、アナライトまたはアナライト結合化合物をラベルすることによって実施されうる（酵素ラベリング）。これらの検出方法の人気は、幾分、感度のレベルおよび可能な測定範囲の広さから生じる。他の好ましい特性は、放射性同位元素が不要であることから安全であること、ラベル化の方法および検出装置の選択が多様であることを含む。さらに、通常用いられる形式では、プローブは、ビオチン、フルオレセインおよびジゴキシゲニンのような種々のハプテンを用いてラベルされる。これらのハプテンは、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素と結合した対応するリガンドまたは抗体と結合する。ラベル酵素は、各化学発光基質を用いて検出される。
一回の試験システムで一度に一つ以上のアナライトを検出および／または定量することが、しばしば望まれる。それによって、時間、試薬および材料の節約が実現され、アッセイプロトコールが簡素化される。多数の試験からの情報が必要な場合、例えばある医学的診断方法では、何らかの結論に至るためには二つ以上の試験の結果が組み合わせて分析されなければならない。多数のアナライトの試験を必要とする例示的な技術は、サザンブロットされたＤＮＡの制限酵素ＤＮＡ断片長の多型（ＲＦＬＰ）分析による、法医学の、ヒトの同一性または父系調査試験ためのＤＮＡサンプルの遺伝的フィンガープリンティングである。この技術では、ブロットはいくつかのプローブを用いたプロービングを必要とし、限られた量のＤＮＡが、同一のブロットを多数回にわたって除去および再プロービングすることを必要とする（Adams, D.E.,(1988), Crime Lab Digest 15:106-108; Noppinger, K., G.Duncan, D.Ferraro, S.WatsonおよびJ. Ban, (1992), BioTechniques.13:572-575）。ノーザンブロット解析では、特定の遺伝子の発現は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルで測定され、シグナルは、細胞中で通常不変のα-チューブリンまたはβ-アクチンのようなｍＲＮＡのブロットを再プロービングすることによって標準化される。多数のタンパク抗原のウェスタンブロットでは、一段階でハイブリダイズした抗体が、別のタンパクのデータを得るための付加的な段階において、除去され、別の組の抗体を用いて再度プローブされる。
除去および再プロービングは、膜に結合した標的核酸（Noppinger, K.,G.Duncan, D.Ferraro, S. WatsonおよびJ.Ban, (1992), BioTechniques. 13:572-575）およびタンパク（Krajewski.S.,J.M.ZapataおよびJ.C.Reed, (1996), Anal.Biochem. 236:221-228）の損失を招き、第二およびその次のプロービング工程において検出感度を低減する。試験システムにおいて一つ以上のアナライトの検出および区別を可能にする方法は、上記欠点を防止するだろう。本発明は、一つのブロットで二つの異なる標的アナライトの連続的検出を行い、除去および再プロービング工程を排除することによって、この問題に解答を与える化学発光検出方法を記載する。
多数の化学発光レポーター遺伝子アッセイに関する方法が、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／２４４６０に開示されている。これらのアッセイは、トランスフェクトされた細胞におけるレポーター遺伝子によって発現された二つ以上の酵素の存在または量を検出するために溶液中で行われる。ペルオキシダーゼ酵素は、トランスフェクション実験において一般的に使用されるレポーター酵素でないので、この酵素の使用は開示されていない。
異なる波長の光を同時に生じるための、二つ以上の酵素学的なきっかけとなるジオキセタンを用いる方法は、米国特許第４９３１２２３号に開示されている。光照射は、二つ以上の異なる酵素ラベルから引き金が引かれる。全ての光照射反応が同時に行われるので、種々のシグナルを光学的に区別する手段が必要であり、かくして複雑さを増大する。この試みのさらなる不都合は、発光分光がある程度まで重複しない、多数の異なる蛍光体を見出す困難性である。これが生じると、一つのラベルからのシグナルが、別のラベルからのシグナルの波長領域において部分的に検出される。低い測定精度および正確さが結果として生じる。
米国特許第５６５６２０７号は、アナライトまたはその結合パートナーが化学発光化合物を用いて直接的にラベルされる、溶液中の二つの異なるアナライトの二重化学発光アッセイについて記載する。二つのシグナルが同時に作り出され、動力学的または分光学的に区別される。酵素ラベルは含まれず、各反応を停止または制御するメカニズムは全く開示されていない。
米国特許第５６７２４７５号も、溶液中で二つの異なる化学発光直接ラベルを用いる二重蛍光性結合アッセイを開示する。一方はルミノール誘導体由来であり、他方はアクリジニウムエステル化合物に由来する二つの化学発光シグナルが、ｐＨプロセス条件の変化によって、別個に生成される。酵素ラベルは含まれない。硝酸で溶液を処理する工程が含まれており、このことが、ブロッティング膜上のアナライトの検出に対してこの方法を使用不可にしている。
ブロットされたＤＮＡおよびタンパクの連続的検出の放射能による方法は、刊行物に報告されている。32Ｐ、35Ｓおよびジゴキシゲニンでラベルされたシグナル識別プローブが、同時ハイブリダイゼーションによって、並びに、識別または逐次的オートラジオグラフィー用に使用される（Au L.C., K.J.Chang, C.M.ShinおよびG.W.Teh, BioTechniques.16:680-683 (1994)）。しかしながら、ここでは、シグナルの区別は、本発明のように性質的なシグナルの差異よりもむしろ、シグナルの強度に基づいている。
各工程において、増幅されたルミノールＨＲＰ化学発光基質を用いたウェスタンブロットでの多数の抗原を連続的に化学発光検出する方法が報告されている（Krajewski,S., J.M.ZapataおよびJ.C.Reed. Anal.Biochem.236:221-228 (1996)）。この方法は、ブロット上の多数のアナライトを連続的に検出することが可能であるが、本発明の方法よりも操作上複雑である。各検出工程における抗原−抗体−ＨＲＰ複合体は、化学発光により検出され、次いで、バンド上に着色産物を沈積させる色素形成基質と反応させることにより未反応性にさせられる。この方法は、多数の抗原を連続的に検出することができるが、ブロットを各検出工程で一次および二次抗体を用いて再プローブする必要があるから、本発明の方法よりも扱いにくく、労力を要する。さらに、各工程が、一つのアナライトの存在を調べるために二つの検出試薬の適用を必要とする。
ペルオキシダーゼ活性を阻害または破壊する、いくつかの基質が知られている。これらは、高濃度の過酸化水素、イミダゾール、フェニルヒドラジン、（W. Straus, J.Histochem. Cytochem.,28(7),645-652 (1980)）、フッ化物およびシアン化物イオン（P.Tulkens, R.Wattiaux, Experientia, 24(3), 219-223 (1968)）である。いくつかのインヒビターのリストは、Pierce Chemical Co.,Rockford, IL (1994-95 catalog pp. T-315, 316)に見られる。米国特許第４８１０６３０号は、比色定量検出と組み合わせて、ホースラディシュペルオキシダーゼ複合体を用いてイムノアッセイにおいて血液全体の内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、非イオン性界面活性剤を使用することについて記述している。
発明の概要
本発明の目的は、試験システムにおける二つのアナライトの連続的化学発光検出の方法を提供することである。本発明のその他の目的は、アナライトが二つの異なる酵素でラベルされる方法、特に一方の酵素がペルオキシダーゼである方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、二つの化学発光検出試薬が、二つの酵素ラベル化アナライトと連続的に接触させられる方法を提供することである。さらに別の目的は、第一の検出試薬がペルオキシダーゼとの反応によって化学発光を生じ、かつ、第二の試薬がこの第一の試薬とペルオキシダーゼとの反応から生じる発光を停止させ、第二のラベル酵素からの化学発光を開始させるような方法において用いられる、一対の検出試薬を提供することである。さらなる目的は、ブロッティング膜のような固相上で二つのアナライトを分析する方法を提供することである。さらなる目的は、ブロットを除去および再プローブする必要性のない、ブロッティング膜上の二つのアナライトの分析方法を提供することである。本発明の方法は、一つのサザンブロットにおいて多数のＤＮＡマーカーまたはプローブの検出、より多くのプローブが用いられる法医学的なＤＮＡフィンガープリンティング、多数のＤＮＡ配列決定、遺伝子再配列、変異および遺伝子連鎖の検出、ウェスタンブロットにおける多様なタンパクの検出、および当該技術分野で知られた他のアッセイに適している。
【図面の簡単な説明】
図１。マーカーＤＮＡを含むエチジウムブロミド染色アガロースゲル（１％）。レーン１：３００ｎｇのビオチニル化されたHindIII-制限ラムダＤＮＡ；レーン２：３００ｎｇのdig-ラベルされたEcoRI-制限ＳＰＰＩサイズマーカーＤＮＡ；レーン３：１００ｎｇのビオチニル化されたHindIII-制限ラムダＤＮＡ、および３００ｎｇのdig-ラベルされたEcoRI-制限ＳＰＰＩサイズマーカーＤＮＡ。
図２。図１に示されたブロットされたＤＮＡサイズマーカーの連続的検出。Ａ：ビオチニル化HindIII制限ラムダＤＮＡのＨＲＰ基質（LUMIGEN PS-3）検出；Ｂ：ジゴキシゲニン-ラベル化ＳＰＰＩ ＤＮＡマーカーの検出用のＡＰ基質（ＰＤＲ）を用いてさらに処理された前記ブロット；Ｃ：バンドパターンが図１のエチジウム染色ゲルのものに対応することを示すための、（Ａ）および（Ｂ）におけるバンドの重ね合わせ写真。
図３。ＨＲＰおよびＡＰ基質を用いたＣＦＴＲ遺伝子型の連続的検出の概略図。
図４。ＣＦＴＲ遺伝子型の連続的検出。３つの遺伝子型、Ｎ／Ｎ、Ｎ／△Ｆ508および△Ｆ508／△Ｆ508のＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０の領域のサザンブロットされたＰＣＲ増幅配列を、正常（ビオチンラベル化）および／または変異体（ジゴキシゲニンラベル化）アレルに特異的な一対のラベル化オリゴヌクレオチドを用いて同時にハイブリダイズし、次いでアビジン-ＨＲＰおよび抗ジゴキシゲニン-ＡＰ複合体を用いてインキュベートした。Ａ：正常アレルを含む遺伝子型のＨＲＰ-産生化学発光による検出；レーン１：Ｎ／Ｎ、レーン２：Ｎ／△；Ｂ：変位△Ｆ508アレルを有する遺伝子型のＡＰ-産生化学発光による同一ブロットの検出；レーン２：Ｎ／△およびレーン３：△／△。
好ましい実施態様の記載
定義
結合対  −  多数の非共有的親和力の特徴によって互いに対して特異的結合親和性を有する二つの分子またはその部位。特異的結合対は当該技術分野において周知であり、例として、抗原−抗体、ハプテン−抗体、抗体−抗体、ＤＮＡの相補鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−相補的オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ−相補的オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合タンパク、ビオチン−アビジンまたはストレプトアビジン、レセプター−リガンド、プロテインＡ−ＩｇＧおよびレクチン−炭水化物を含む。
化学発光ペルオキシダーゼ基質  −  可視光を生じる、過酸化物およびペルオキシダーゼの存在下で酸化反応を受ける化合物。いくつかの化学発光ペルオキシダーゼ基質が、（Kricka Ref）に記載されているように、当該技術分野において知られている。最も一般的に用いられるものは、ルミノール、イソルミノール、ルミノールおよびイソルミノールのＮ-アルキルおよびＮ,Ｎ-ジアルキルアミノ誘導体、５-アミノ-６,７,８-トリメトキシジヒドロフタラジンジオン、並びに７-ジメチルアミノ-ナフタラジンジオンのようなベンゾ-融合同族体のようなアミノ-置換ジヒドロフタラジンジオンを含む。その他の化学発光ペルオキシダーゼ基質は、米国特許第５３２４８３５号に開示されているようなピリダジノキノキサリノンを含む。さらに別の化学発光ペルオキシダーゼ基質は、５-ヒドロキシ-および６-ヒドロキシフタラジンジオンのようなヒドロキシ-置換ジヒドロフタラジンジオン、および米国特許第５５５２２９８号に開示されたヒドロキシナフタラジンジオン、並びに米国特許第５４９１０７２号および第５５２３２１２号および第５５９３８４５号に開示されたエステル、チオエステルおよびスルホンイミドを含むあるクラスのＮ-アルキルアクリダン-９-カルボキシラート誘導体を含む。
エンハンサー  −  ペルオキシダーゼ酵素の酸化的または過酸化的機能を促進または延長する物質。最も有効なエンハンサーは、ある芳香族アミンおよびフェノールである。ペルオキシダーゼ反応を増幅することが知られたフェノール化合物は、参照としてここに含めることとする、G.Thorpe, L.Kricka, Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives, J.ScholmerichらEds., pp.199-208 (1987), M. Ii, H.Yoshida, Y.Aramaki, H.Masuya, T.Hada, M.Terada, M.Hatanaka, Y.Ichimori, Biochem.Biophys.Res.Comm.,193(2),540-5(1993)および米国特許第５１７１６６８号および第５２０６１４９号に記載されている。好ましいエンハンサーは、置換されたフェノール、置換および非置換ナフトールからなる群から選択され、ｐ-フェニルフェノール、ｐ-ヨードフェノール、ｐ-ブロモフェノール、ｐ-クロロフェノール、２,４-ジクロロフェノール、ｐ-イミダゾリルフェノール、ｐ-チアゾリルフェノール、ｐ-ヒドロキシアセトアニリド、ｐ-ヒドロキシ桂皮酸、（ｐ-シアノメチルチオ）-フェノールおよびその環状ハロゲン化誘導体、フェノリンドフェノール(phenolindophenol)、２-ナフトール、６-ブロモ-２-ナフトール ６-ヒドロキシベンゾチアゾール、２-シアノ-６-ヒドロキシベンゾチアゾール、ホタルルシフェリンおよびデヒドロルシフェリンを含むが、これらに限定されない。
酵素ラベル  −  特異的結合対の成分と結合した機能的酵素。酵素が、例えば酵素−抗体複合体または酵素−オリゴヌクレオチド複合体のような、特異的な結合パートナーに共有的に結合されていてもよい。酵素が共有結合する補助的な特異的結合パートナーを使用することによって、酵素が標的の特異的結合パートナーと間接的に連結または結合されてもよい。後者の関係の例は、酵素−アビジン複合体と結合したあるＤＮＡ配列のためのビオチン−ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブの使用である。
遺伝的疾患  −  変異または一連の変異のような遺伝的欠陥によって引き起こされた病的状態。変異は点突然変異、一塩基の置換、欠失、挿入、塩基の重複または転移あるいはこれらの組み合わせであってもよい。変異の部位また配置および種類に依存して、変異遺伝子は、発現されてもされなくてもよい。発現される場合は、切断されたタンパク産物または非機能的タンパク産物、もしくは変更されたアミノ酸配列を有するタンパクの産生を導き得る。ある遺伝学的変異は劣性形質であり、それによって、相同染色体の遺伝子の変異アレルまたはコピーの両方が、発症のために存在しなければならない。他の遺伝学的変異は優勢であり、それによって、１コピーのみの遺伝子が、発症のために変異を有する必要がある。１コピーの劣性変異遺伝子を有する個人は、疾患のないキャリアーであるが、１コピーの変異遺伝子を子孫に遺伝させ得る。
ヘテロアルキル  −  少なくとも一つの非末端炭素原子が、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、ＳｅまたはＴｅのような非炭素系ヘテロアトムで置換された分枝鎖状、直鎖状または環状アルキル基。ヘテロアトムは、少なくとも二価でなければならない。
加水分解酵素  −  種々の基の加水分解切断を触媒する酵素。代表的な成分としては、
カルボキシルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼおよびコリンエステラーゼのようなエステラーゼ、
ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ラクターゼおよびＮ-アセチルグルコサミニダーゼのようなグリコシダーゼ、
リパーゼ、ホスホリパーゼ、
酸およびアルカリホスファターゼを含む植物または動物ホスファターゼ、
キモトリプシン、トリプシン、パパイン、およびペプシンのようなプロテアーゼ酵素、および
スルファターゼ酵素を含む。
ペルオキシダーゼ酵素  −  ホースラディッシュペルオキシダーゼ、シトクロムＣ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、Arthromyces ramosusペルオキシダーゼ（ＡＲＰ）および大豆ペルオキシダーゼを含むクラスＥＣ１．１１．１．７に属する酵素。
過酸化物  −  ペルオキシダーゼの一次基質として作用する過酸化水素の源として作用する化合物。例示的な過酸化物は、過酸化水素、尿素過酸化物および過ホウ酸塩、特に過ホウ酸ナトリウムを含む。
サンプル  −  アナライトを検出するために本発明の方法が実施される、血液、血清、尿、唾液、痰、ＣＳＦ、精液および細胞溶解物のようなヒトおよび動物の体液、並びに食物サンプル、水サンプル、植物サンプル、微生物学的資料および法医学的資料を含む材料。当業者が想起するその他の種類のサンプルは、本発明の範囲内であると解する。
固相支持体  −  本発明のアッセイ方法が実施されうる試験媒体。このような支持体は、アッセイの技術分野において知られているような試験片(test strips)、ブロッティング膜、フィルター、顕微鏡のスライドおよびカバーガラスのようなガラスまたはプラスチック表面、マイクロウェル、試験管、ビーズ等を含む。支持体は、物理吸着または共有結合もしくはその両方によって、標的種特異的結合剤対を捕獲または固定し得るものでなければならない。
標的種  −  その存在がプローブされる分子またはその部位。標的種は、特異的結合親和性のある物質と結合しうるものでなければならない。ある実施態様では、標的種は、各々が特異的結合親和性を有する二つの異なる特異的結合パートナーに結合する。例示的な標的種は、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドのような核酸、タンパク、ペプチド、抗体、抗原、ハプテン、細胞表面レセプター、リガンド、ホルモン、ウイルス、細菌等を含む。
試験システム  −  検出されるアナライトまたは標的種が固定化される固相支持体を含む。試験システムは、分析またはアッセイ中の種々のポイントにおいて、このアッセイ法を行った結果として標的種およびラベル酵素に対して特異的に結合する薬剤を含む。
本発明は、二つ以上の酵素ラベル化結合パートナー、および酵素の一つに対する化学発光基質を含む少なくとも二つの試薬を用いた試験システムにおいて二つ以上のアナライトを連続的に検出するための化学発光方法に関する。特に、酵素および試薬の対の選択は、最初の酵素と最初の基質との反応によって放射された化学発光が、酵素インヒビターのような停止試薬を用いて急速に停止され、かつ、この試験システムに第二の酵素基質を添加した際に第二の酵素によって化学発光が生じるように設計される。本発明を実施する好ましいモードでは、停止試薬が、第二の酵素基質を含む組成物中に取り込まれる。二つの検出反応が、介在工程または酵素、共役体またはアナライトを除去することなく実施されうることから、この方法は、例えばブロッティング膜上で、試験システム中の二つ以上のアナライトの検出に有利に適用される。他の操作上の利点については、以下に記載する。
特に、本発明は、
固相支持体上に第一および第二の標的種を固定化すること；
固定化された第一および第二の標的種と、第一標的腫に対して特異的に結合する第一のパートナーおよび第二の標的種に対して特異的に結合する第二のパートナーとを接触させ、第一の結合対と第二の結合対を形成すること；
第一の結合パートナーに対するラベルとしてペルオキシダーゼ酵素を付与し、第二の結合パートナーに対するラベルとして第二の酵素を付与すること；
第一の化学発光シグナルを生じるために、第一の結合対を、化学発光ペルオキシダーゼ基質および過酸化化合物と反応させること；
第一の化学発光シグナルを検出することによって、第一の標的種を検出すること；
ペルオキシダーゼをペルオキシダーゼインヒビターと反応させて、第一の化学発光シグナルを停止させること；
第二の結合対を第二の酵素に対する化学発光基質と反応させて、第二の化学発光シグナルを生じさせること；および
第二の化学発光シグナルを検出することによって第二の標的種を検出すること、を含む二つの連続的な化学発光反応による、二つの標的種を含むと思われるサンプル中の第一および第二の標的種を連続的に検出するための方法に関する。
さらに、本発明は、
固相支持体上に第一および第二の標的種を固定化すること；
固定化された第一および第二の標的種と、第一標的腫に対して特異的に結合する第一のパートナーおよび第二の標的種に対して特異的に結合する第二のパートナーとを接触させ、第一の結合対と第二の結合対を形成すること；
第一の結合パートナーに対するラベルとしてペルオキシダーゼ酵素を付与し、第二の結合パートナーに対するラベルとして第二の酵素を付与すること；
第一の化学発光シグナルを生じるために、第一の結合対を、化学発光ペルオキシダーゼ基質および過酸化化合物と反応させること；
第一の化学発光シグナルを検出することによって、第一の標的種を検出すること；
第二の結合対を、第二の酵素に対する化学発光基質とペルオキシダーゼ酵素のインヒビターを含む組成物と反応させて、第一の化学発光シグナルを停止させて、第二の化学発光シグナルを生じること；
第二の化学発光シグナルを検出することによって第二の標的種を検出すること、を含む二つの連続的な化学発光反応による二つの標的種を含むと思われるサンプル中の第一および第二の標的種を連続的に検出するための方法に関する。
この方法の有効性は、酵素／試薬対に対するいくつかの要求を満たすことにある。過酸化物および化学発光化合物とペルオキシダーゼとの化学発光反応は、急速に停止されうるものでなければならない。これは、二つのうちの一方のみを行うことも有効であるが、酵素の阻害と未反応基質の非発光形態への変換の両方によって最もよく達成される。
第二の試薬／酵素対は、ペルオキシダーゼを阻害してペルオキシダーゼ基質を破壊するように選択された条件を耐えるのに十分に頑丈であるだけでなく、それ自身も化学発光を効率的に生じるものである。第一の酵素的光産生反応を停止する試薬および条件は、試験システムの信頼性を妨げてもいけない。試薬と条件は、アッセイで用いられた固相支持体上に固定された生物学的アナライトを置換、変性または変更してはならない。支持体の物理的な特徴は、不利な影響を受けるものであってはならない。
第一の酵素としてペルオキシダーゼ酵素の選択は、共役体の入手容易性および共役体の調製容易性、基質の利用可能性、早い触媒回転率、およびペルオキシダーゼ活性を阻害する能力に基づいている。好ましいペルオキシダーゼ酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。
ペルオキシダーゼ酵素の基質は、過酸化物と組み合わせて、ペルオキシダーゼと反応した際に化学発光を生じる化合物とすることができる。化学発光ペルオキシダーゼ基質の例は、L.J.KrickaとG.H.G.Thorpe, Luminescence Immunoassay and Molecular Applications, K.Van Dyke and R. Van Dyke, eds.,CRC Press, Boca Raton, 1990, pp.77-98に要約されているルミノールおよび多環式芳香族ジアシルヒドラジドのようなアミノ置換芳香族ジアシルヒドラジドを含むジアシルヒドラジド、米国特許第５５５２２９８号に開示されたヒドロキシ置換芳香族ジアシルヒドラジド、（８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３,４-ｄ-ピリダジン-１,４（２Ｈ、３Ｈ）ジオン（M. Iiら, Biochem.Biophys.Res.Comm.,193(2), 540-5(1993)）、ピリダジノキノキサリノン（米国特許第５３２４８３５号）、１,３-二置換ピラゾロ［４’,３’：５’,６’］ピリド-［２,３-ｄ］-ピラジンジオン（Y. Tominagaら, Tetrahedron Lett.,36, 8641-4(1995)）および米国特許第５４９１０７２号、米国特許第５５２３２１２号および米国特許第５５９３８４５号、および第５６７０６４４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９８／０２４２１に開示されたアクリダン化合物のようなルミノールのヘテロ環式類似体を含む。好ましい実施態様では、ペルオキシダーゼ基質はアクリダン化合物であり、特に以下の一般式を有するＮ-アルキルアクリダン-９-カルボキシラート誘導体から選択されたアクリダンである。
0004156677.tif 000002
［式中、Ｒは、アルキル、ヘテロアルキルおよびアラルキル基から選択され、Ｒ1からＲ8は、発光させる基から独立に選択され、隣接した対の基Ｒ1からＲ8が結合して、融合した芳香環を形成し、基Ｃ（＝Ｏ）Ｙはエステル、チオエステルまたはスルホンアミド基である。］
ペルオキシダーゼ基質は、化学発光の放射を停止するために、急速かつ完全に非発光化合物に変換されうることが望ましい。化学発光を生じることができない対応するカルボン酸または塩に加水分解されうることから、アクリダンカルボキシラート誘導体は、特に有益である。アルカリ性過酸化水素（−ＯＯＨ）との反応も、アクリダンカルボキシラート誘導体を、対応する非発光ペルカルボキシラート(percarboxylate)化合物に変換することができる。
第二の酵素は、好ましくは加水分解酵素であり、好ましくは、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼから選択され、さらに好ましくはアルカリホスファターゼとされる。本発明の方法に望ましいアルカリホスファターゼの特徴は、共役体の利用可能性、共役体の調製容易性、基質の利用可能性、早い触媒回転率、および種々の環境条件に対する丈夫さを含む。例えば、酵素活性が、ｐＨ１０の比較的高濃度のアルカリ性過酸化水素の存在下でさえ不利な影響を受けないことが本発明の研究で測定された。
第二の酵素の基質は、好ましくは酵素的に引き金を引きうるジオキセタンである。好ましいジオキセタンは以下の式を有する：
0004156677.tif 000003
式中、Ａ1およびＡ2は、ジオキセタンに安定性を付与する基であり、Ａ3は直鎖、分枝鎖または環状アルキル状の、置換されたアルキル、アリールおよび置換されたアリール基から選択され、Ａ4は芳香環基、好ましくは置換または未置換のフェニルまたはナフチル基であり、ＯＸは、Ｏ-Ｘ結合を切断してオキシアニオンを生じるように酵素と反応させることによって化学発光の産生の引き金を引き、かつ、ＯＸ置換基がジオキセタン環と共役しない位置を占める芳香環の置換基である。選択されたＡ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4基のあらゆる対が、ジオキセタン環に融合した環を形成するように結合されうる。このタイプの適切なジオキセタンは、当該技術分野において周知であり、例えば米国特許第４８５７６５２号、４９５２７０７号、５０６８３３９号、５１１２９６０号、５１３２２０４号、５２２０００５号、５２４８６１８号、５５７８２５３号、５６０７６２５号、５６３１１６７号、５６５２３４５号および５６７９８０３号、５７０７５５９号およびＰＣＴ出願ＷＯ９６／１５１２２に開示されたジオキセタンを含み、これらの開示を参照としてここに含める。好ましい酵素学的に引き金を引くジオキセタンでは、Ａ1およびＡ2はそれぞれ３ないし８の炭素原子を含む分枝鎖アルキルまたはシクロアルキル基であるか、あるいは６ないし１０の炭素原子を有する置換または非置換のポリシクロアルキル基として結合され、Ａ3は、１ないし１０の炭素原子を有する置換または非置換アルキル基であり、Ａ4は、置換または非置換のフェニル基であり、ＸはＰＯ32-基、ガラクトシド基またはグルクロニド基から選択されるが、ＰＯ32-基が最も好ましい。Ａ1およびＡ2がアダマンチル、ビシクロオクチルまたはビシクロノニル基のようなポリシクロアルキル基として結合するが、アダマンチルが好ましく、非置換または、ハロゲン特に塩素、低級アルキル、アルコキシル、フェニルまたはカルボキシル基から選択された群を用いて置換することができる。基Ａ3は、存在する水素原子の代わりに一つ以上の置換基を含む。代表的な基は、例えば、ハロゲン、特にフッ素および塩素、並びにカルボキシラート、スルホナート、スルファートまたは第四級アンモニウム基のような水溶性の基を含む。基Ａ4は、環の水素原子の代わりに、好ましくは塩素原子またはアルコキシ基のような、一つ以上の置換基を含むこともできる。
ペルオキシダーゼ試薬は、過酸化物源を含む水性バッファー溶液中で一般的に用いられ、化学発光反応の最適な性能に寄与するフェノール性またはその他の当該技術分野で知られたペルオキシダーゼエンハンサーおよび界面活性剤、有機性助溶剤および偶然的な金属不純物によって妨害を妨げるキレート剤のような添加剤を含むことができる。好ましい過酸化物の源は、過酸化水素、過酸化尿素および過ホウ酸塩である。好ましい製剤およびこれらの成分に関する記述は、参照としてここに含められる、本出願人の米国特許第５４９１０７２号、５５２３２１２号および５５９３８４５号に見出される。
加水分解酵素の化学発光検出用のジオキセタン試薬は、当該技術分野で知られた多数の安定な酵素学的に引き金を引くジオキセタンとすることができる。当業者であれば、上記多数の特許によって例証されている、当該技術分野で開示された多くのものの中から適切なジオキセタンを容易に選択することができるだろう。ジオキセタンは、用いられる特定の酵素によって除去されうる基を含んでいなければならない。酵素がアルカリホスファターゼである場合、好ましいジオキセタンは、以下に示す構造を有するLumigen PPDである。
0004156677.tif 000004
酵素がβガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼである場合、ジオキセタンは、リン酸基の代わりに、ジオキセタンの芳香環置換基に酸素原子を介して結合したガラクトシドまたはグルクロニド基を含む。
第二の酵素の検出試薬は、水性バッファー溶液中に第二の酵素の基質、並びに任意にペルオキシダーゼインヒビターを含む。ペルオキシダーゼインヒビターが用いられない場合には、この試薬の組成物は、この試験システムに対するこの試薬の適用が、ペルオキシダーゼ基質を崩壊または非発光性にするものである。好ましくは、第二酵素の検出試薬は、ペルオキシダーゼ阻害と、ペルオキシダーゼ基質の非発光形態への変換の両方を達成することが好ましい。好ましい検出試薬は、一つ以上のペルオキシダーゼインヒビターを、ホスファート置換ジオキセタンを含む試薬に添加することによって調製される。検出試薬は、酵素学的に生じた化学発光のシグナル／バックグラウンド比を改善する界面活性剤エンハンサーを含むことができる。適切な界面活性剤エンハンサーは当該技術分野で知られており、参照としてここに含める本願出願人の米国特許第５４５１３４７号に記載されているようなセチルトリメチルアンモニウムブロミドおよび二カチオン性界面活性剤のような、第四級ホスホニウム塩およびアンモニウム塩、単量体の第四級ホスホニウム塩およびアンモニウム塩を含む重合オニオム塩を含む。適切な重合の第四級ホスホニウム塩は、本願出願人の米国特許第５３９３４６９号に開示されており、その開示を参照としてここに含める。適切な重合の第四級アンモニウム塩は、米国特許第５１４５７７２号および５５４７８３６号に記載されており、その開示を参照としてここに含める。好ましい検出試薬は、（１）アルカリ性バッファー溶液中のジオキセタンLUMIGEN PPDとジホスホニウム塩界面活性剤エンハンサーを含む商業的な試薬LUMI-PHOS PLUS(Lumigen, Southfield, MI)、および（２）ペルオキシダーゼ-触媒化学発光を停止するための適切な試薬を含む。
本発明の実施に使用できるペルオキシダーゼインヒビターは、当該技術分野において知られた化合物を含み、ペルオキシダーゼ酵素、特にホースラディッシュペルオキシダーゼの活性を阻害することが知られた上記化合物を含む。これは、以下に限定することなく、過酸化水素を、単独またはアジドイオン、シアニドイオン、フッ素イオン、イミダゾール、フェニルヒドラジンおよび過ヨウ素酸塩と組み合わせて含む。最も好ましいのは、過酸化水素である。従って、好ましい実施態様は、第二酵素の検出試薬がLUMI-PHOS PLUSを含み、さらに過酸化水素を含む。
他の実施態様では、本発明は、
固相支持体上に第一および第二の標的種を固定化すること；
固定化された第一および第二の標的種と、第一標的腫に対して特異的に結合する第一のパートナーおよび第二の標的種に対して特異的に結合する第二のパートナーとを接触させ、第一の結合対と第二の結合対を形成すること；
第一の結合パートナーに対するラベルとしてペルオキシダーゼ酵素を付与し、第二の結合パートナーに対するラベルとしてアルカリホスファターゼを付与すること；
第一の化学発光シグナルを生じるために、第一の結合対を、アクリダンカルボン酸誘導体および過酸化物化合物と反応させること；
第一の化学発光シグナルを検出することによって、第一の標的種を検出すること；
ペルオキシダーゼをペルオキシダーゼインヒビターと反応させて、第一の化学発光シグナルを停止させること；
第二の結合対をホスファート置換ジオキセタンと反応させて、第二の化学発光シグナルを生じさせること；および
第二の化学発光シグナルを検出することによって第二の標的種を検出すること、を含む二つの連続的な化学発光反応によって、二つの標的種を含むと思われるサンプル中の第一および第二の標的種を連続的に検出する方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、
固相支持体上に第一および第二の標的種を固定化すること；
固定化された標的種を、第一標的腫に対して特異的に結合する第一のパートナーおよび第二の標的種に対して特異的に結合する第二のパートナーとを接触させ、第一の結合対と第二の結合対を形成すること；
第一の結合パートナーに対するラベルとしてペルオキシダーゼ酵素を付与し、第二の結合パートナーに対するラベルとしてアルカリホスファターゼを付与すること；
第一の化学発光シグナルを生じるために、第一の結合対を、アクリダンカルボン酸誘導体および過酸化物化合物と反応させること；
第一の化学発光シグナルを検出することによって、第一の標的種を検出すること；
第二の結合対を、ホスファート置換ジオキセタンおよびペルオキシダーゼ酵素のインヒビターを含む組成物と反応させて、第一の化学発光シグナルを停止させ、第二の化学発光シグナルを生じること；および
第二の化学発光シグナルを検出することによって第二の標的種を検出すること、を含む、第一および第二の標的種を連続的に検出する方法に関する。
本発明の方法は、他の酵素から生じるシグナルを伴わずに、早く、感度よく、かつ特異的に対応する酵素の検出および定量を可能にする一対の酵素検出試薬の設計を要する。特に効果的な第一の酵素基質対は、ＨＲＰおよびLUMIGEN PS-3である。この試薬を用いたブロッティングアプリケーションにおけるＨＲＰ共役体の早くかつ高感度の化学発光検出は、Akhavan-Tafti, H.,R.DeSilva, Z.Arghavani, K.Sugioka, Y.SugiokaおよびA.P.Schaap.1994.p.313-316. A. Cambell, L.Kricka, P.Stanley(Eds.), Bioluminescence and Chemiluminescence Fundamentals and Applied Aspects, J.Wiley and Sons, Chichesterに記載されている。我々は、ＨＲＰとLUMIGEN PS-3との反応が、高濃度の過酸化物を含む高いｐＨのバッファーと、グローイングブロットとを接触させることにより、５倍の効果を介して急速にスィッチオフされうることを見出した。アルカリ性バッファー（ｐＨ≧９．５）は、顕著にペルオキシダーゼ活性を低減するが、高濃度の過酸化物は、ＨＲＰを触媒不活性形態、ＨＲＰ化合物III（Lundin, A.およびL. Hallander. 1987. pp. 555-558. Bioluminescence and Chemiluminescence New Perspectives, J. Scholmerich, R. Andreesen, A. Kapp, M. ErnstおよびW.G.Woods (Eds.), J. Wiley and Sons, Chichester）に変換する。さらに、高いｐＨのバッファーは、ＨＲＰ基質、２,３,６-トリフルオロフェニル １０-メチルアクリジン-９-カルボキシラートのエステル基を、非発光カルボキシラート塩に加水分解することができる。
0004156677.tif 000005
アルカリ性過酸化水素は、ＨＲＰ基質のエステル基を、反応条件下で化学発光を生じることができないペルカルボキシラートアニオンへと変換することができる。
0004156677.tif 000006
ＨＲＰ基質を強アルカリ性の溶液と接触させることは、環の９位に形成された少量のカルボアニオンにＯ2を付加することにより化学発光自動酸化を加速する（F. McCapra, Accts. Chem. Res.,9(6),201-8(1976)）。これらの５つの効果の組み合わせは、光放射の急速かつ完全な消光を可能にする。
特に有効な第二の酵素−基質の組み合わせは、アルカリホスファターゼとLUMI-PHOS PLUS(Lumigen, Inc.)である。LUMI-PHOS PLUSは、超好感度ブロッティングアプリケーションにおける使用に耐えうる試薬であることが証明されている（Budowle, B.,F.S.Baechtel, C.T.Comey,A.M.GiustiおよびL.Klevan, Electrophoresis, 16, 1559-1567 (1995)）。Ｈ2Ｏ2の添加によるLUMI-PHOS PLUSの修正は、アルカリホスファターゼの化学発光検出に対して有用性を維持する安定な試薬を提供した。Lumi-Phos Plus中の少なくとも０．１５％（ｖ／ｖ）までの過酸化物の含有は、化学発光を生じること、またはアルカリホスファターゼ活性を破壊することにおける性能に不利な影響を与えなかった。重大なことに、添加された過酸化物およびこの試薬の比較的高いｐＨは、上記第一の化学発光反応を停止することに使用することができる。
本発明の方法のさらなる実施態様では、アルカリ性バッファー（ｐＨ＞９、好ましくは≧９．５）を用いた簡単な中間洗浄工程を、結合したペルオキシダーゼラベルの検出後、固相支持体をホスファターゼ検出試薬を用いて湿らせる前に用いることができる。中間洗浄バッファーは、任意にペルオキシダーゼインヒビターを含むことができる。プロトコールは簡素化することができ、ペルオキシダーゼ基質の加水分解を引き起こすためにホスファターゼ検出試薬LUMI-PHOS PLUSが高いｐＨ（９．６）で製剤されることから、≧１５分に第二の検出試薬中における膜のインキュベーション時間を単に延長することによって余計な操作を避けることができる。ペルオキシダーゼ−触媒化学発光を停止するのに必要な時間をさらに低減させるために、第二の酵素に対する化学発光基質を含む組成物が高いｐＨ、例えばｃａ．１０を有することが有利である。
ブロッティング技術をベースとする殆どのタイプの適用では、最小量のサンプル、時間および労力を用いて最大の情報を得る必要性がある。除去および再プローブすることは、ある程度で終了に達するが、これらは退屈であり、除去中に膜に結合した鋳型ＤＮＡを損失することから、シグナルが低減し、逆効果を招く。２０ｎｇまでの膜結合標的ＤＮＡが、プローブ除去の方法に依存して、各除去工程中に失われることが予想される。材料および時間の損失および除去および再プロービングの損失は、ブロットが二つの異なるラベル化プローブと同時にハイブリダイズされ、二つの異なる酵素基質を用いて連続的に検出される本発明の方法によって低減される。本発明の方法は、それゆえ、一回のブロットで二つの異なるラベル化ＤＮＡサイズマーカーの連続的化学発光検出方法に対して有利である。例えば、本発明の方法は、一回のサザンブロットで△Ｆ508変位を有するＣＦＴＲ遺伝子型を連続的に検出するために適用できる。
本発明の方法に従って行われた二つの核酸のアナライトを検出するアッセイは、一方はペルオキシダーゼと共役し、他方は第二の異なる酵素と共役する二つの異なるラベル化プローブを同時にハイブリダイズさせ、対応するリガンドまたは抗体を備えた二つのラベルを結合させ、二つの化学発光基質を連続的に添加することにより二つのラベル酵素を連続的に検出することを含む。第一の試薬は、ペルオキシダーゼラベル化バンドの存在を表すペルオキシダーゼ基質を含む。第二の試薬は、第二の酵素でラベル化されたバンドの存在を表す基質を含み、かつ、ペルオキシダーゼが触媒した反応から引き続く発光を妨げる成分をさらに含む。一回のサザンブロットで△Ｆ508変位を有するＣＦＴＲ遺伝子型を検出するための上記試験は、二つの異なるラベル化プローブ、一方は特異的に正常配列に結合するが、他方は特異的に変異配列に結合する、を用いて実施される。
一回のブロットで二つの異なる核酸アナライトを連続的に検出する、その他の多数の適用がある。これらは、法医学の適用において用いられるようなサザンブロッティングによるＲＦＬＰ分析、ノーザン、ウェスタン、サザンブロッティングによる遺伝子発現分析、インシトゥハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定を含む。サザンブロッティングを用いた逐次調査のさらなる適用は、属および種特異的プローブを用いて同時にプロービングし、次いで二つのプローブを連続的に化学発光検出することにより属の亜種を同定すること；二つの異なるラベル化遺伝子プローブを用いて同時にハイブリダイズさせ、連続的に化学発光検出することにより、パルスフィールド勾配電気泳動（ＰＦＧＥ）によって分離された巨大なＤＮＡフラグメントにおける遺伝子連鎖の調査すること；二つの遺伝子プローブを用いてサザンブロットを同時にプロービングし、連続的方法で化学発光検出することによってガンにおける染色体の転座において近位の遺伝子の検出することを含む。
ノーザンおよびウェスタンブロッティングを用いた遺伝子発現の研究において、連続的化学発光検出は、特定の遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパクのレベルを測定し（第一の検出）、かつ、β-アクチンまたはα-チューブリンのような自然なハウスキーピング遺伝子を用いてその発現を標準化する（第二の検出）ために用いることができる。同一のノーザンブロットを第二のプローブを用いて除去および再プロービングすることが、ｍＲＮＡのレベルを調べ、化合物を用いたインキュベーションまたは処理するためになされることに関して、多くの報告が文献中になされている。除去および再プロービングは、ウエスタンブロッティングでも実施される。これは、二つの異なる抗体を用いてブロットを同時にインキュベートすることによって妨げられ、変異検出のためになされるような連続的方法で膜結合タンパクに対する結合を検出することができる。
連続的検出は、配列決定される各ＤＮＡ鋳型の酵素学的プライマー伸長に対して異なるラベル化プライマー（異なるハプテン）を用いることによってＤＮＡ配列決定においても用いることもできる。膜にシークエンシングラダーをブロッティングした後、このブロットは、対応する抗ハプテンＨＲＰおよびＡＰ共役体を用いて処理され、その後、発光させるためにバンドに対しＨＲＰおよびＡＰ基質を用いて連続処理される。利点は、二つの異なる鋳型のプライマー伸長が一本のチューブ中でなされ、ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの各鋳型のＤＮＡ配列ラダーが、連続的な検出によって区別されうることである。
その他の実施態様では、鋳型ＤＮＡのＤＮＡ配列決定プロトコールを、各対が二つの識別可能にラベル化されたプライマーを含む二対の塩基特異的配列決定反応をプールすることによって、４つのレーンを用いる代わりに二つのレーンで行うことができる。例えば、ラベル１を有するプライマーが、ＡおよびＴを示す反応のために用いられ、かつ、ラベル２を有する同一のプライマーが、ＧおよびＣを示す反応に用いられる。ＡおよびＧの反応産物がプールされ、一つのレーンで電気泳動され；ＴおよびＣの反応産物が別のレーンでプールされ、電気泳動される。連続的検出法の適用は、二つのみのレーンで全部で４つのベースの配列を示す。
少なくとも二つのアナライトの検出方法は、一次および二次抗体結合段階のみを必要とし；除去または再プロービングを必要としない。多数のＨＲＰ検出工程および最終的なＡＰ検出工程を含むハイブリッド技術も考えられる。一つの試験システム中の二つ以上のアナライトに対し本発明の連続的検出技術を適用することは、結合リガンドおよび酵素を固相支持体から除去し、本発明の方法に従って新たな連続的検出のための新規の特異的リガンドを用いてこの試験システムを再プロービングすることによって達成されうる。本発明の方法のさらなる拡張は、多数の異なるラベル化プローブ（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール）を用いて同時にプロービングすること、および、先行する工程で生じた化学発光シグナルを阻害して、いくつかの異なる酵素（例えば、ＨＲＰ、ＡＰ、β-ガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼ）を用いてラベル化プローブを連続的に検出することによって、三つまたは四つのアナライトの連続的な化学発光検出に関する。
実施例
実施例１．化学発光基質
化学発光ＨＲＰ検出試薬LUMIGEN PS-3をLumigen, Inc.から入手した。この試薬は、１：４０の比率で二つの溶液を組み合わせることによって調製される。検量線用溶液は、ｐＨ８．０のバッファー中に２,３,６-トリフルオロフェニル １０-メチル-アクリジン-９-カルボキシラート、過酸化物、フェノールエンハンサー化合物、および非イオン性界面活性剤を含む。この試薬に通常含まれるＥＤＴＡは除外した。
化学発光ＡＰ検出試薬は、種々の量の３０％のＨ2Ｏ2をLUMI-PHOS PLUS(Lumigen, Inc.)に添加することによって調製された。０．１５％のＨ2Ｏ2の濃度は、方法開発用に選択された。ホスファターゼ検出試薬（ＰＤＲ）は、１００ｍＬのLUMI-PHOS PLUSに０．５ｍＬの３０％のＨ2Ｏ2を添加することによって調製された。
実施例２．ＤＮＡマーカーの検出
ＤＮＡの連続的検出は、二つの異なるラベル化ＤＮＡサイズマーカー、ビオチニル化HindIII酵素切断ラムダファージＤＮＡ（Life Technologies, Gaithersburg, MD）、およびジゴキシゲニンラベル化EcoRI酵素切断ＳＰＰＩマーカーＤＮＡ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を用いて最初に証明された。これらのサイズマーカーは、エチジウムブロミドを含有する１％アガロースゲルにおいて、別のレーンで個別に、そして、第三のレーンで混合物として分画された（図１）。このゲルを、脱プリン化（０．２５Ｍ ＨＣｌ）、変性（０．５Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）、中和（０．５Ｍ Tris-HCl、ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ）、および中性のHybond Nナイロン膜（Amersham, Arlington Heights, IL）上に真空ブロット（vacublot）した。この膜を、８０℃で２時間焼いた。
このブロットを、最初に１Ｘ洗浄バッファー（０．１Ｍ マレイン酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．３％Tween20）中で１５分間洗浄し、２％のブロッキングバッファー（Blocking Reagent - Boehringer Mannheim,０．１Ｍ マレイン酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に溶解）中で１時間ブロックした。酵素共役体の作業濃度は、２％のブロッキングバッファー中に１：５０００希釈であった。ＤＮＡサイズマーカーを含有するブロットは、アビジン-ＨＲＰ（Pierce, Rockford, IL）および抗ジゴキシゲニン-ＡＰ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）酵素共役体を用いて処理され、ＨＲＰに対してLUMIGEN PS-3およびＡＰに対してＰＤＲという化学発光基質を用いて連続処理される。酵素と基質の両方の処理は室温で行われる；基質インキュベーションは、光に基質を露呈することを低減するために暗室で行われる。酵素共役体処理後、このブロットを１Ｘ洗浄バッファーで２０分間ずつ二回洗浄し、ＨＲＰ基質を用いて５分間反応させた。過剰な基質を、一対の透明なプラスティックシートに挟んでブロットを優しく圧すことによって除去した。このブロットを、一般に数秒から数分間Ｘ線フィルムに曝して、最適なシグナルとバックグラウンドを得た。図２Ａは、ペルオキシダーゼ基質の適用後に得られた像を示す。Lumigen PS-3を用いた処理では（実施例１参照）、化学発光は、アビジン-ＨＲＰ結合ビオチニル化HindIII切断ラムダＤＮＡバンド（レーン１および３）からのみ生じた。
次に、このブロットを、１Ｘ洗浄バッファーと、ＡＰ検出バッファー（１００ｍＭ Tris HCl、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）で５分間ずつすすぎ、実施例１のＰＤＲでさらに５分間処理した。図２Ｂは、ＰＤＲの適用後に得られた像を示す。レーン１および３からのＨＲＰ産生シグナルが終わり、レーン２および３におけるジゴキシゲニンラベル化ＳＰＰＩ-EcoRIサイズマーカーからＡＰ触媒化学発光が始まった。図２Ａと２Ｂのレーンの重ね合わせ（図２Ｃ）が、図１に示されたエチジウムブロミド染色アガロースゲルのレーンに見られるパターンと比較して確かめられるように、レーン３における全てのバンドサイズを示した。
実施例３．ＣＦＴＲ遺伝子型のサザンブロット解析
上記連続的検出方法は、△Ｆ508変位を有するＣＦＴＲ遺伝子の遺伝子型を検出および識別するために適用された。△Ｆ508変位のＣＦＴＲ遺伝子型のＤＮＡ（Coriell Cell Repositories, Camden, NJから入手）、野生型（Ｎ／Ｎ）、ヘテロ接合体（Ｎ／△Ｆ508）、ホモ接合体（△Ｆ508／△Ｆ508）を、変異を含有するエキソン１０の領域に関するプライマー（Oligosら., Wilsonville, ORによって合成されたプライマー）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。このプライマーは、配列：5’ACTTCACTTCTAATGATGATTATG 3’（配列番号：１）および5’CTCTTCTAGTTGGCATGCTTTGAT  3’（配列番号：２）を有する。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡサイズマーカーについて上述したようにサザンブロットした。このブロットを、一方は正常なものに相補的であり、他方は変異アレルに相補的である、一対の異なるラベル化（ビオチンおよびジゴキシゲニン）オリゴヌクレオチドプローブを用いて同時にハイブリダイズした。ラベル化オリゴヌクレオチドは、5’ビオチン-ATATCATCTTTGGTGTTTCCT 3’（配列番号：３）（正常）および5’ジゴキシゲニン-GAAAATATCATTGGTGTTTCC 3’（配列番号：４）（変異体）であった。
このブロットのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの条件は、５２℃で、それぞれ１時間および一晩であり、６Ｘ ＳＳＣ（０．９Ｍ 塩化ナトリウム、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５Ｘ Denhardt’t溶液（０．１％ Ficoll Type 400、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％子ウシ血清アルブミン）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡ（Life Technologies）を含むバッファーを用いた。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、５２℃で、２０分間、それぞれ２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳおよび０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで行った。ＣＦＴＲアレル特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたＤＮＡを含有するブロットを、洗浄、ブロッキング、抗体の結合および検出について上述したように処理した。
増幅された正常（２４ｂｐ）および変異配列産物（２７ｂｐ）を、ブロット上の二つの産物を明確に識別するために十分に分離させた。アビジン-ＨＲＰと抗ジゴキシゲニン-ＡＰ共役体を用いた同時のインキュベーション、並びに、上述したような検出を行うことによって、ＨＲＰ-産生化学発光（図４Ａ）によって正常アレル（Ｎ／ＮおよびＮ／△）を含む遺伝子型を最初に選択的に検出し、第二の工程で、変異△Ｆ508アレルＮ／△および△／△（図４Ｂ）を有する遺伝子型を選択的に検出した。
上記記載および実施例は、例証であって、限定するものではない。本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、開示された特定の化合物および方法を修正することができる。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人: Akhayan-Tafti, Hashem
（ii）発明の名称: 簡素化された連続的化学発光検出
（iii）配列の数: 4
（iv）連絡の住所:
（A）住所: LUMIGEN, INC.
（B）通り: 24485 W. Ten Mile Rd.
（C）都市名: Southfield
（D）州名: MI
（E）国名: USA
（F）郵便番号: 48034
（v）コンピューターが読み込むことのできる形態:
（A）媒体種: フロッピーディスク
（B）コンピューター: IBM PC 互換機
（C）オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
（vi）本出願の情報:
（A）出願番号:
（B）出願日:
（viii）弁理士／代理人の情報:
（A）名称: Handley, Richard S.
（B）登録番号: 38,484
（C）参照/事件整理番号: LUM.4.1-50
（ix）通信情報:
（A）電話: 248-351-5600
（B）ファックス: 248-351-0518
（2）配列番号（SEQ ID NO）:1の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 24 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: 他の核酸
（A）記載: /desc =”プライマー”
（xi）配列: SEQ ID NO:1:
0004156677.tif 000007
（2）配列番号（SEQ ID NO）:2の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 24 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: 他の核酸
（A）記載: /desc =”プライマー”
（xi）配列: SEQ ID NO:2:
0004156677.tif 000008
（2）配列番号（SEQ ID NO）:3の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 21 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: 他の核酸
（A）記載: /desc =”オリゴヌクレオチド”
（xi）配列: SEQ ID NO:3:
0004156677.tif 000009
（2）配列番号（SEQ ID NO）:4の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 21 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: 他の核酸
（A）記載: /desc =”オリゴヌクレオチド”
（xi）配列: SEQ ID NO:4:
0004156677.tif 000010
【図１】
0004156677.tif 000015
【図２】
0004156677.tif 000016
【図３】
0004156677.tif 000017
【図４】
0004156677.tif 000018