(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容され得る担体中に懸濁された突然変異化ヘルペスウイルスを含むワクチンであって、該ヘルペスウイルスが哺乳動物細胞に感染することができ、そして該ヘルペスウイルスでワクチン接種された哺乳動物中で防御免疫応答を引き出すことができ、該ヘルペスウイルスが以下の蛋白質：ＨＳＶ−１  ＩＣＰ２７、ＨＳＶ−１  ＩＣＰ８又はそれらのホモログのうち、少なくとも一つをコードする遺伝子において突然変異していることに特徴を有し、該突然変異が該ウイルスを複製欠損にならしめ、ここで該ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７であるワクチン。
【請求項２】
該蛋白質がＨＳＶ−１  ＩＣＰ２７またはそのホモログであり、及び／又は該ヘルペスウイルスがｎ５０４Ｒである請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
該蛋白質がＨＳＶ−１  ＩＣＰ８またはそのホモログであり、及び／又は該ヘルペスウイルスがｄ３０１である請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
該ヘルペスウイルスがさらに１種以上の異種遺伝子をコードするものである請求項１記載のワクチン。
【請求項５】
該ヘルペスウイルスがウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の野生型をコードするものである請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の突然変異化ヘルペスウイルスを構築し、そして該ヘルペスウイルスを薬学的に許容され得る担体中に懸濁させることを含むヘルペスウイルスワクチンの製造方法。
【請求項７】
治療において使用するための請求項１〜５いずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
治療がヘルペスウイルスに対してヒトを免疫化する方法である、請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
治療において使用するための治療剤を製造するための、請求項１〜５いずれか１項において記載のワクチンの使用。
【請求項１０】
治療がヘルペスウイルスに対してヒトを免疫化する方法である、請求項９記載のワクチンの使用。
【請求項１１】
ワクチンの製造のための請求項１〜５いずれか１項において記載の突然変異化ヘルペスウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明の分野はヘルペスウイルスワクチンである。
本発明は米国政府の助成を受けてなされたものであり、同政府は本発明において一定の権利を有する。
ヘルペスウイルスは二十面体ヌクレオキャプシドに包まれたエンベロープ２本鎖ＤＮＡ含有ウイルスである。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）をはじめとする少なくとも７種類のヘルペスウイルスがヒトの疾患に関与している。一般に、ヘルペスウイルスには、増殖の場となる宿主に潜伏感染を引き起こす能力を有するという共通の性質がある。
ＨＳＶ−１はもっともよく研究されているヘルペスウイルスの一つである。ＨＳＶ−１は生産的感染の際に、厳密に調節された遺伝子発現パターンを示す［フィールズとクナイプ（Fields and Knipe）, Virology, 1990, Raven Press, NYに総説がある］。このウイルスによってコードされる７０〜８０個の遺伝子の一部は発現のキネティックスに基づいて分類される。各クラスの遺伝子の発現は、先行クラスの遺伝子の発現に依存する。まず、ウイルスのα遺伝子すなわち即時早期遺伝子が発現され、次いで、ウイルスのβ遺伝子すなわち早期遺伝子が発現され、さらにγ遺伝子すなわち後期遺伝子が発現される。γ遺伝子は発現がウイルスＤＮＡ複製に依存する程度に応じて更にγ−１とγ−２遺伝子に分類される。
数種類のウイルスタンパク質がＨＳＶ−１遺伝子の発現を調節することが示されている。ＩＣＰ４遺伝子産物はβ遺伝子とγ遺伝子の発現に不可欠である［デルカら（DeLuca et al.）, 1985, J. Virol. 56:558］。ＩＣＰ２７遺伝子産物はγ遺伝子の発現とウイルスＤＮＡの複製に必要である［マッカーシーら（McCarthy et al.）, 1989, J. Virol, 63:18］。主なＤＮＡ結合タンパク質であるＩＣＰ８はβ遺伝子産物であるが、このものもウイルスＤＮＡの複製とγ遺伝子の発現に必要である［ガオとクナイプ（Gao and Knipe）, 1989, J. Virol. 63:5258；クインランら（Quinlan et al.）, 1984, Cell 36:657］。
ヘルペスウイルスによって引き起こされるヒトの疾患は軽度のものから重度のものまで様々であるが、これらのウイルスへの感染が命にかかわることもある。
普通の疾患予防手段の一つにワクチン接種がある。単離免疫原や生の減弱化ウイルスを原料とする様々なワクチンが下記のヘルペスウイルスを予防する手段として提案されている：ＨＳＶ−−ロイズマン（Roizman）、米国特許第４８５９５８７号、メイグニエルら（Meignier et al.），（1988）J. Inf. Dis. 3:603-613；ＶＺＶ−−タカハシら（Takahasi et al.）（1975）Biken J. 18:25-33；ＣＭＶ−−エレックとステルン（Elek and Stern）（1974）Lancet 1:1-5およびプロトキンら（Plotkin et al.）（1975）Infect. Immun. 12:521-527］。
発明の概要
本発明は、薬学的に許容される担体に懸濁した突然変異誘発ヘルペスウイルスからなるヘルペスウイルスワクチンであることに特徴がある。この突然変異誘発ヘルペスウイルスは、ワクチン接種対象の哺乳類の細胞に感染する能力があり、その哺乳類において防御免疫応答を惹起する能力がある。突然変異はウイルス複製に不可欠のタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子で起きるので、この突然変異はウイルス複製を欠損させる。具体的には、防御すべき宿主において標的細胞に感染する能力を一般に保持するという意味で、そのウイルスは生きている。感染しても子孫は作らないが、そのウイルスは、たとえば感染細胞が産生するウイルス誘導免疫原やウイルスコード化免疫原を介して、防御免疫応答を惹起する。防御とは、ワクチン接種後の野生型ウイルスによる感染が予防されるか期間的および程度的に緩和されるように、宿主がワクチンに対する免疫応答を獲得することをいう。とくに潜伏感染が予防される。標準的な動物実験を利用して防御を確認することができる。たとえばＨＳＶの場合、マウスやウサギのモデルを使って防御能力を調べることができる［コーエンら（Coen et al.）, Proc. Nat'l. Acad. Sci.（1989）86:4736-3740］。ＨＳＶ−２の場合は、標準マウス足蹠モデルやモルモット膣モデルを使うことができる。
好ましい態様においては、本発明のヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７である。突然変異は、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７またはＨＳＶ−１のＩＣＰ８をコードする遺伝子、またはＨＳＶ−１以外のヘルペスウイルスにおけるこれらの遺伝子の対応するホモログにおけるものが好ましい。ワクチンに使用するのに好ましい変異体ヘルペスウイルスは、ｎ５０４Ｒまたはｄ３０１である。ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子とＩＣＰ８遺伝子の両方、または対応するＨＳＶ−１以外のヘルペスウイルスの対応する２つのホモログ遺伝子の両方において、突然変異を有するものであることがさらに好ましい。変異体ヘルペスウイルスは、親のヘルペスウイルスと無関係の病原体に対する防御を誘導するワクチン発現ベクターとなるように、１個以上のヘテロ遺伝子を含むように工学的に操作してもよい。変異体ヘルペスウイルスは野生型のウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含んでいることが好ましい。
本発明の第二の側面は、上記突然変異化ヘルペスウイルスを構築し、それを薬学的に許容される担体中に懸濁することによってヘルペスウイルスワクチンを作成する方法に特徴がある。
本発明の他の側面は、上記突然変異化ヘルペスウイルスワクチンを投与することによってヘルペスウイルスに対してヒトを免疫することも含むものである。
詳細な説明
まず図面について説明する。
図１は、野生型ＨＳＶ−１または本発明の複製欠損変異体であるｄ３０１とｎ５０４の接種を受けたマウスの抗体応答を示すグラフである。本発明の範囲外である第３の変異体（ｄ１２０）を接種した場合の結果も開示している。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群８匹）に、１０6プラーク形成単位（ｐｆｕ）の野生型ＨＳＶ−１または変異体であるｄ１２０、ｄ３０１、またはｎ５０４のいずれかを腹腔内チャレンジ投与した。接種２週後、これらのマウスから得た血清に含まれるＨＳＶ−１特異的ＩｇＧ2aをＥＬＩＳＡで定量した。データは、平均値とその標準誤差で示した。この実験のデータは合計４つの実験を代表するものである。
図２は、野生型ウイルスまたは複製欠損変異体であるｄ１２０、ｄ３０１、またはｎ５０４のいずれかの接種を受けたマウスのＴ細胞応答を示すグラフである。各ウイルスの接種を受けたマウスから得たＴ細胞を、１細胞あたり１ｐｆｕの感染多重度で、ＵＶ照射ＨＳＶ−１または小水庖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）と共に、インキュベートした。免疫しなかったマウスから得たＴ細胞を陰性対照とした。データは、平均値とその標準誤差で示した。この実験は合計３つの実験を代表するものである。
図３は、複製欠損変異体の接種を受けた後で野生型ウイルスのチャレンジ投与を受けたマウスの生存率を示すグラフである。各群のマウスに、１０6ｐｆｕのｄ１２０（６匹）、ｄ３０１（６匹）、ｎ５０４（６匹）、または同等量のプソラレン不活化野生型ＨＳＶ−１（５匹）の腹腔内接種を行なった。対照マウス（９匹）には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。接種６週後に、すべてのマウスに５ｘ１０7ｐｆｕのＨＳＶ−１（ｍｐ株）の腹腔内チャレンジ投与を行なった。ほとんどのマウスはチャレンジ投与後７〜１１日目に死亡した。生存率はチャレンジ投与後４週にわたり記録した。この実験は合計４つの実験を代表するものである。
図４は、野生型のＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子と変異体のそれの位置と構造を示すダイアグラムである。（Ａ）野生型遺伝子とｌａｃＺ挿入変異体の遺伝子の構造。ＨＳＶ−１ゲノムの表現型配置を上部に示す。野生型およびｄ２７−ｌａｃＺ１ゲノム由来のＰｓｔＩ制限酵素断片を下部に示す。細い線はウイルスゲノムのユニーク（Ｕ）領域を示し、白抜きバーはリピート領域（Ｒ）を示し、斜線バーは大腸菌ｌａｃＺ配列を示す。上の矢印は６３ｋＤａのＩＣＰ２７タンパク質のコード配列を示し、下の矢印は約１３７ｋＤａのＩＣＰ２７−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質のコード配列を示す。（Ｂ）野生型、ナンセンス、および欠失変異体遺伝子の構造。ＩＣＰ２７変異体遺伝子は、制限酵素断片（括弧）を欠失させるか、３つの読み取り枠すべてに終止コドンを含むＸｂａＩまたはＮｈｅＩオリゴヌクレオチドリンカー（それぞれＸとＮ）を挿入することによって構築した。矢印は、野生型ＩＣＰ２７タンパク質（上）またはナンセンス変異体によってコードされた切断型ＩＣＰ２７を示す。制限部位は次のとおりである。Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｈ、ＨｐａＩ；Ｒ、ＲｓｒＩＩ；Ｓｔ、ＳｔｕＩ；Ｓｓ、ＳｓｐＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｎ、ＮｈｅＩ。
図５は、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７変異体ゲノムのサザーンブロットハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムである。精製ウイルスＤＮＡをＰｓｔＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル上の電気泳動に付し、ナイロンフィルターに移した。フィルターを、ＩＣＰ２７をコードするＨＳＶ−１ゲノム領域由来の６．１ｋｂのＰｓｔＩ挿入断片を含むプラスミドの32Ｐ標識ＤＮＡをプローブとして調べた。図の左側の数字は標準ＤＮＡサイズマーカーの相対位置である。
図６は、変異体ウイルス感染細胞で発現されたＩＣＰ２７関連ポリペプチドのウエスタンブロット分析の結果である。感染後（ＰＩ）１０時間（ｈ）目に感染ベロ細胞から全タンパク質を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースフィルターに電気泳動的に移した。Ｈ１１１３をプローブとして、フィルターを調べた。図の右側の数字は標準タンパク質サイズマーカーの相対位置である。
図７は、変異体ＩＣＰ２７分子の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。ベロ細胞にモック感染（ＡとＢ）させるか、野生型ウイルス（ＣとＤ）、ｎ２６３Ｒ（ＥとＦ）、ｎ４０６Ｒ（ＧとＨ）、またはｎ５０４Ｒ（ＩとＪ）を感染させた。４ｈＰＩ（感染４時間後）の時点で、細胞を固定し、抗体Ｈ１１１３を用いて免疫蛍光顕微鏡標本を作成した。パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉは免疫蛍光顕微鏡写真であり、パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊは対応する位相差顕微鏡写真である。
図８は、ＩＣＰ２７変異体のウイルスＤＮＡ複製能力を示すオートラジオグラムである。ベロ細胞にモック感染させるか、または野生型ＨＳＶ−１もしくは様々な変異体を感染させた。ウイルス吸着後ただちに（１ｈＰＩ）、または感染サイクルの終点付近（１６ｈＰＩ）の時点で、全細胞ＤＮＡを調製した。等量の各ＤＮＡ試料を５倍希釈列とし、得られた希釈液をスロットブロットマニホルドを用いてニトロセルロースフィルターにかけた。フィルターを、ｐＳＨＺ［ナベルら（Nabel et al.）（1988）Science、他所に引用］に由来する32Ｐ標識ＤＮＡをプローブとして調べた。
図９は、ＩＣＰ２７変異体感染細胞におけるタンパク質合成を示すオートラジオグラムである。ベロ細胞にモック感染させるか、または野生型ＨＳＶ−１もしくは様々なＩＣＰ２７変異体を感染させた。３、６または９ｈＰＩの時点で［35Ｓ］−メチオニンで３０分間標識した後、細胞を集めた。タンパク質を溶解物から抽出し、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーに付した。各パネルの右側に様々なＨＳＶ−１タンパク質の相対位置を示す。
図１０は、Ｖ２７細胞におけるＩＣＰ２７変異体の生育による異常タンパク質合成の相補を示すオートラジオグラムである。ベロまたはＶ２７細胞にモック感染させるか、野生型ＨＳＶ−１または様々なＩＣＰ２７変異体を感染させた。図９について説明したようにして、１５ｈＰＩの時点で細胞を［35Ｓ］−メチオニンで３０分間標識し、タンパク質合成を分析した。図の右側に数種類のＨＳＶ−１タンパク質の位置を示す。
図１１は、ＩＣＰ２７変異体感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡの蓄積を示すオートラジオグラムである。ベロ細胞にモック感染させるか、または野生型ＨＳＶ−１もしくは様々なＩＣＰ２７変異体を感染させた。９ｈＰＩの時点で、細胞質ＲＮＡを調製した。等量のＲＮＡを、ＩＣＰ２７（Ａ）、ＩＣＰ４（Ｂ）、またはｇＣ（Ｃ）のｍＲＮＡに対して特異的な32Ｐ標識プローブを用いて、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析に付した。レーンは、モック感染細胞（レーン２）、または４００μｇ／ｍｌのホスホノ酢酸（レーン１）、ｄ２７−１（レーン３）、ｎ５９Ｒ（レーン４）、ｎ５０４Ｒ（レーン５）、または野生型ＨＳＶ−１（レーン６）の存在下で野生型ＨＳＶ−１で感染させた細胞のＲＮＡを含むものである。各パネルの右側にウイルスＲＮＡとリボソームＲＮＡの相対位置を示す。
図１２は、ＩＣＰ８ナンセンス突然変異（ｎ）、欠失突然変異（ｄ）、および点突然変異（ｐｍ）の位置を示すダイアグラムである。ＨＳＶ−１ゲノム上のＩＣＰ８コード領域の位置を図の上部に示す。示した制限酵素部位は、ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）、およびＳａｌＩ（Ｓ）である。
図１３は、野生型ＨＳＶ−１、ＨＤ−２、およびｎ２のＤＮＡのサザーンブロットハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムである。野生型ＨＳＶ−１、ＨＤ−２、およびｎ２を感染させた細胞から得たＤＮＡをＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ（レーン１、２、３）、およびＫｐｎＩ（レーン４、５、６）で消化し、ＫｐｎＩ消化ｐＳＧ１８−ＳａｃＩ（レーン７）とともに電気泳動に付した。このＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し、32Ｐ標識プラスミドｐＩＣＰ８にハイブリダイズさせた。図の左側に標準サイズマーカーの相対位置を示す。
図１４は、変異体感染細胞から得たＩＣＰ８特異的ポリペプチドのウエスタンブロット分析のオートラジオグラムである。ホスホノ酢酸の存在下、ベロ細胞に各ウイルスを感染させ、６ｈＰＩの時点で細胞を集めた。細胞抽出物に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに電気泳動的に移した。このフィルターを、ＩＣＰ８に対するウサギポリクローナル抗血清をプローブとして調べた。図の左側に標準サイズマーカーの相対位置を示す。
図１５は、ウイルスＤＮＡ複製の分析のフルオログラムである。ベロ細胞にモック感染させるか（レーン１）、またはホスホノ酢酸の非存在下（レーン２〜４）、もしくはホスホノ酢酸（レーン５）、ｐｍ１（レーン６）、ｎ１０（レーン７）、ｎ２（レーン８）、ｄ１０２（レーン９）、ｄ１０１（レーン１０）、またはｄ３０１（レーンｌｌ）の存在下、ベロ細胞に野生型ウイルスを感染させ、６〜１０ｈＰＩの間、［3Ｈ］−チミジンで標識した。全ＤＮＡを単離し、各試料１０μｇ［レーン３（５μｇ）とレーン４（１μｇ）を除く］をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。電気泳動終了後、ゲルを１．０Ｍサリチル酸ナトリウムで処理してフルオログラフィーを行なった。
図１６は、１本鎖ＤＮＡセルロースへのＩＣＰ８の結合状態を示している。ホスホノ酢酸の存在下に、ベロ細胞に野生型（Ａ）またはｐｍ１（Ｂ）を感染させ、４〜６ｈＰＩの間、［35Ｓ］−メチオニンで標識した。１本鎖ＤＮＡセルロースカラム上で分離された様々なタンパク質画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。レーン１は全細胞溶解物を、レーン２は高塩分ＤＮアーゼ抽出で得たペレットを、レーン３は透析後のペレットを、レーン４はカラムに負荷した抽出物を、レーン５〜１０は素通り液と洗液を、レーン１１は０．３ＭのＮａＣｌ溶出物を、レーン１２は０．５ＭのＮａＣｌ溶出物を、レーン１３は１．０ＭのＮａＣｌ溶出物を、レーン１４は４．０ＭのＮａＣｌ溶出物を示す。各パネルの右側に野生型または突然変異化ＩＣＰ８の相対位置を示す。
図１７は、変異体ＩＣＰ８ポリペプチドの細胞内分布を示す顕微鏡写真である。ベロ細胞に野生型またはＩＣＰ８変異体ウイルスを感染させた。４ｈＰＩの時点で細胞を固定し、透過性を高め、７９３抗ＩＣＰ８モノクローナル抗体とローダミン複合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（パネルＡ〜ＦおよびＨ）、または抗ＩＣＳＰ１１／１２ポリクローナル血清とフルオレセイン複合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（パネルＧ）のいずれかとともにインキュベートした。免疫蛍光顕微鏡写真：Ａ、モック感染細胞；Ｂ、ホスホノ酢酸存在下での野生型感染細胞；Ｃ、ｎ１０−感染細胞；Ｄ、ｄ１０２−感染細胞；Ｅ、ｐｍ１−感染細胞；Ｆ、ｄ３０１−感染細胞；Ｇ、ｎ２−感染細胞；Ｈ、ｄ１０１−感染細胞。
Ｉ．ワクチンとして有用なウイルス変異体の作成
本発明によれば、特定の変異体について以下に説明する方法と同様の方法を用いて、ワクチンの候補となりえる有用なヘルペスウイルス変異体を構築し試験することができる。そのような変異体の構築は、４種類のヒトヘルペスウイルスすなわちＨＳＶ−１、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶの全ＤＮＡ配列が知られているという事実［マックゲオックら（McGeoch et al.）, 1988, J. Gen. Virol. 69:1531；マックゲオックら（McGeoch et al.）, 1985, J. Mol. Biol. 181:1；マックゲオックら（McGeoch et al.）, 1986, Nucl. Acids Res. 14:1727；ダビソンら（Davison et al.）, 1986, J. Gen. Virol. 67:1759；バエルら（Baer et al.）, 1984, Nature 310:207；チーら（Chee et al.）, 1990, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 154:125］、および上記以外のヒトヘルペスウイルスにおける遺伝子のうちの多くのものの制限酵素マップ、部分配列、および正確な位置も知られているという事実［フィールズとクナイプ（Fields and Knipe），1990，同上］があるので容易である。さらに、ゲノムライブラリーが入手可能であり、多くの異なるヘルペスウイルス特異的遺伝子をコードする大量のプラスミドも入手可能である［フィールズとクナイプ（Fields and Knipe）, Virology, 1990, Raven Press, N.Y.、および同文献中に引用されている文献を参照］。
一般に、ワクチン候補として有望な変異体ウイルスを得る方法は、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７またはＩＣＰ８遺伝子におけるウイルス変異体作成について以下に説明するものと同じステップを行なう。まず、適当な突然変異をコードするウイルスＤＮＡを含むプラスミドであって、相同組替えを受けるウイルスＤＮＡによってフランキングされているものを構築する。次に、このＤＮＡを、突然変異を導入しようとするゲノムウイルスＤＮＡとともに動物細胞に同時トランスフェクションをする。突然変異は、これらの細胞中でウイルスＤＮＡが複製される際に相同組替えのプロセスによってこの親のゲノムに導入される。以下に説明する技術を適宜組み合わせたものを使って、子孫ウイルスに突然変異が起きているかどうかについてスクリーニングを行なう。たとえば、当該遺伝子の発現がウイルス複製に不可欠である場合は、突然変異化遺伝子の野生型相補コピーを発現する細胞系においてのみ複製する能力を有する子孫ウイルスを選択することができる。次いで、これらのウイルスを、たとえばサザーンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法、特異的ｍＲＮＡ種の発現などによって、スクリーニングすることができる。このような技術は分子ウイルス学の分野では常法であり、以下に引用するサムブルークら（Sambrook et al.）の分子クローニングマニュアルに詳細に述べられている。
ウイルスワクチンの一般的目標は、疾患に対する防御を拡大することと（生涯にわたることもある）、初期副作用と長期副作用をなくすことである。ワクチンは、防御のための体液性抗体と細胞性免疫の両方を誘導するものでなければならない。生のウイルスワクチンは、ワクチン接種を受けた者から接種を受けていない者に広がることがなく、ワクチン接種を受けた者に潜伏感染を引き起こさないものでなければならない。
本明細書で説明するような変異体ヘルペスウイルスは一般にこれらの基準を満たす。具体的には、本発明のワクチン候補は少なくとも下記の性質を有するものでなければならない。すなわち、導入先の宿主においてそれ自体が生存でき、かつ生存可能な子孫ウイルスを生じる能力を実質的に欠いているものでなければならない。また、その宿主において防御免疫応答を誘導する能力を有するものでなければならない。複製能力がないため（相補遺伝子を発現する支持宿主細胞系由来のものなどの当該タンパク質の外来ソースの非存在下で）子孫ウイルスを生じる能力を欠いているが、防御免疫応答が誘導される程度に抗原決定基を発現する能力を有するものであれば、どのような生存ヘルペスウイルスでもワクチン候補となりうる。したがって、上記したものなど突然変異化ＩＣＰ２７遺伝子やＩＣＰ８遺伝子を保持するＨＳＶ−１株はワクチン候補となりうる。これらの株は、ゲノム内にさらに突然変異を導入することによってさらに改良することができる。たとえば、ＩＣＰ２７やＩＣＰ８と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子にさらに欠失を有するウイルスを作成することができる。これらのウイルスは以下のようにして構築し、試験することができる。さらに突然変異を加えることで、安定ウイルスもできる。
当該分野に習熟せる者であれば、ＩＣＰ２７タンパク質とＩＣＰ８タンパク質の両方または一方におけるその他の適当な突然変異を本発明に適用することができることを理解するであろう。以下に示す実験を用いて、そのような突然変異を有する候補ウイルスをスクリーニングすることができる。好ましい候補突然変異は、上記ＩＣＰ８ドメインとＩＣＰ２７ドメインの両方または一方に突然変異を導入されたものであって、しかも以下に説明する実験によって示されるように目的の変異体表現型を保持するものである。
同様に、複数のウイルス遺伝子に突然変異を有するウイルスを作成することができる。これらのウイルスは、１つのウイルス遺伝子だけに突然変異を導入されたウイルス株と比べて、安全性の点と、拡散能力を欠くという点で大いに有利である。これらのウイルスの例としては、ＩＣＰ２７遺伝子にすでに突然変異を有するウイルスのゲノムにＩＣＰ８遺伝子の突然変異が導入された株などが挙げられるが、これらに限定されない。逆に、ＩＣＰ８遺伝子にすでに突然変異を有するウイルスのゲノムにＩＣＰ２７遺伝子の突然変異が導入されたウイルス株を構築することもできる。そのようなウイルスを複製するために、野生型のＩＣＰ２７遺伝子とＩＣＰ８遺伝子の両方を発現する能力のある細胞系を作成する。複数のヘルペスウイルス遺伝子を発現する細胞系を作成する手順は当該分野において公知であって上記したものと類似のものであり、トランスフェクションを受けた細胞がトランスフェクション混合物に含まれる遺伝子のそれぞれを取り込むことがわかっている［クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe），（1983）Mol. Cell. Biol. 5:957-963参照］。
防御免疫応答を惹起する原因となるウイルス特異的産物の大多数は、感染細胞内で発現されるとともに一般にウイルス粒子の表面にも見られうるタンパク質と糖タンパク質である。ヘルペスウイルスの場合、主な抗原決定基の一部はウイルスゲノムによってコードされる糖タンパク質である。いずれのヘルペスウイルスでも、異なるヘルペスウイルスによってコードされるのが普通である単数または複数の糖タンパク質を発現する能力のあるワクチン候補株を構築することができる。たとえば、通常はＨＳＶ−２またはその他のヒトヘルペスウイルスによってコードされる単数または複数の糖タンパク質をコードし発現する能力のあるＨＳＶ−１の変異体株（ＩＣＰ２７とＩＣＰ８の両方または一方の遺伝子に突然変異を有する）を作成することができる。そのようなウイルスは、通常の分子生物学的手法と上記手順を用いて構築される。
そのような例の１つを以下に簡単に説明する。ＨＳＶ−２特異的糖タンパク質をコードする単数または複数の遺伝子を、たとえばＨＳＶ−１特異的チミジンキナーゼ、より好ましくは糖タンパク質ｃＤＮＡ、またはウイルスの複製に不可欠ではないＨＳＶ−１ゲノムのその他の領域など、約１００〜３００ｂｐのＨＳＶ−１特異的ＤＮＡで一端をフランキングすることができる。多くの抗ＨＳＶ化合物の活性化にチミジンキナーゼ遺伝子の産物が必要であるため［フィールズとクナイプ（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｋｎｉｐｅ）、他所に引用］、この遺伝子の無傷のコピーをワクチン株内に保持するのが有利であるかもしれない。この雑種ＤＮＡを、ＩＣＰ８遺伝子とＩＣＰ２７遺伝子の一方または両方に突然変異を有する感染性ＨＳＶ−１特異的ＤＮＡとともに細胞に同時トランスフェクションをさせる。次いで、子孫ウイルスを得て、上記のようにフランキング配列によって決定した特異的ＨＳＶ−１座位に単数または複数のＨＳＶ−２遺伝子の挿入があるものを探すスクリーニングを行なう。次いで、これらのウイルスが防御免疫応答を惹起する能力があるかどうか以下に説明するようにして評価することができる。このようなウイルスはＨＳＶ−１ウイルスとＨＳＶ−２ウイルスの両者に対して特異的な抗原決定基を発現する能力があるかもしれないので、両方のウイルスから個体を防御するうえで有用となりうる。同様に、その他のヒトヘルペスウイルス、またはウイルス、細菌、真菌、寄生虫などその他の感染体によって発現されるのが普通である抗原をコードする遺伝子を複製欠損ＨＳＶ−１の遺伝的骨格に組込んで、単回のワクチン接種で多重防御を得ることができる。
ＨＳＶ−２は、ＤＮＡ配列とタンパク質産物がＨＳＶ−１によってコードされるものと相同である多くの遺伝子をコードすることが知られている［フィールドとクナイプ（Field and Knipe）、他所に引用］。実際、ＨＳＶ−２は、非常によく似たＤＮＡ配列をもつ遺伝子をコードし、また、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子やＩＣＰ８遺伝子に非常によく似た遺伝子をコードする。これらＨＳＶ−２のＩＣＰ２７やＩＣＰ８のホモログのタンパク質産物は、ＨＳＶ−１のものと非常によく似た性質を有する［モーセら（Morse et al.）（1978）J. Virol. 26:389-410；マースデンら（Marsden et al.），（1978）J. Virol. 28:624-642参照］。したがって、これらの遺伝子のいずれか１つまたは両方に突然変異を有するＨＳＶ−１について説明したものと同じやり方でＨＳＶ−２の変異体株を作成することができる。このような変異体もＨＳＶ−２のワクチン候補である。さらに、その他のヘルペスウイルスや感染体に対して特異的な糖タンパク質をコードする遺伝子を、各株がＨＳＶ−２糖タンパク質に加えてこれらのヘテロ遺伝子を発現する能力を有するようにこれらの変異体株の遺伝的骨格に挿入することができる。
ＨＳＶ−２ゲノムは、組織培養で細胞を形質転換する能力があることが示されている２つの異なるＤＮＡ領域をその長さ方向に有する。これらの領域をｍｔｒＩＩとｍｔｒＩＩＩと呼び、ＨＳＶ−２ゲノム上のそれらの正確な位置が知られている［ガロウエイら（Galloway et al.）, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4736；アリら（Ali et al.）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8257］。ＨＳＶ−２のワクチン株がイン・ビボで細胞を形質転換する能力がある可能性を排除するために、相同組替えによってこれらのＤＮＡ領域を形質転換性のないＨＳＶ−１配列と置換することができる。そのような配列の置換は、以下に説明する特異的ＨＳＶ−１遺伝子の改変の作成に使用されるものと同様の手順を用いて行なわれる。
ＨＳＶ−１やＨＳＶ−２以外のヘルペスウイルスも、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子やＩＣＰ８遺伝子に対して相同性が高い遺伝子をコードする。ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７ホモログをコードするウイルスとしては、ＶＺＶ、ＥＢＶ、およびヒト以外のウマヘルペスウイルス１型などが挙げられ［ダビソンら（Davison et al.）, 1986, J. Gen. Virol. 67:1759；バエルら（Baer et al.）, 1984, Nature 310:207；ホールデンら（Holden et al.）, 1992, J. Virol. 66:664］、ＨＳＶ−１のＩＣＰ８ホモログをコードするウイルスとしては、ＶＺＶ、ＥＢＶ、およびＣＭＶなどが挙げられる［ダビソンら（Davison et al.）, 1986, J. Gen. Virol., 67:1759；バエルら（Baer et al.）, 1984, Nature 310:207；チーら（Chee et al.）, 1990, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 154:125］。したがって、上記方法を用いれば、ＩＣＰ２７またはＩＣＰ８をコードする遺伝子に突然変異を有するＨＳＶ−１株について上記したものと同様の性質を有するかもしれない候補ワクチン株をこれらのウイルスから作成することができる。
本発明のワクチンは、ＩＣＰ２７遺伝子やＩＣＰ８遺伝子、あるいはそれぞれのホモログに突然変異を有するヘルペスウイルスに限定されない。生存可能でありながら複製を欠損していて、しかも防御免疫応答を惹起するものであれば、いかなるウイルス変異体でもワクチン候補となる。カプシドタンパク質をコードする遺伝子に突然変異を有するウイルスもワクチン候補である。
たとえば、いくつかの糖タンパク質免疫原が開示されている［サルミエントら（Sarmiento et al.）（1979）J. Virol., 29:1159（「ｇＢ」）；コーカーら（Coker et al.），（1978）J. Virol. 47:172-181（「ｇＤ」）；デサイら（DeSai et al.）（1988）J. Gen. Virol. 69:1147-1156（「ｇＨ」）］。これらの糖タンパク質免疫原を、たとえばＩＣＰ２７やＩＣＰ８などの突然変異化骨格に挿入してもよい。同様に、カプシドタンパク質変異体も有用であることがある。
投与と用量：
当該分野に習熟せる者であれば、常法を用いて用量を最適化することができることを理解するであろう。一般に、ワクチンは適当な滅菌緩衝液中に処方され、１０3〜１０9ＰＦＵ／ｋｇの用量で投与される（たとえば皮下、筋肉内、または皮内注射による）。
細胞免疫を誘導するとともに致死的感染に対する防御をもたらすＨＳＶ−１の複製欠損変異体の具体例
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。当該分野に習熟せる者であれば、以下に挙げる構築物の具体例は、ワクチンの基本的性質を保持したまま上記発明の範囲内で様々に変更できることを理解するであろう。
方法
以下の材料と方法を下記実施例で使用した。
マウス
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをTaconic Laboratory社（Germantown, NY）から購入し、６〜１２週齢で使用した。０．５ｍｌのＰＢＳまたはウイルスをＰＢＳに懸濁したもの０．５ｍｌをマウスに腹腔内注射した。
ウイルス
既報［クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe）, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:957］に従い、ＨＳＶ−１野生型株ＫＯＳ１．１とｍＰ株をベロ細胞上で増殖させ、検定した。他所で引用したガオら（Gao et al.）に従い、ＩＣＰ８をコードする遺伝子に突然変異を有するウイルス（ｄ３０１という）を作成した。ＩＣＰ２７遺伝子に突然変異を有するウイルス（ｎ５０４Ｒという）を下記のようにして作成した。突然変異化ＩＣＰ４遺伝子をコードするウイルス（ｄ１２０）をデルカら（DeLuca et al.）［1985, J. Virol. 56:558］に従い作成した。ホーンら（Horn et al.）［1989, J. Virol. 63:4157］に従い、ＶＳＶを増殖させた。すべてのウイルスストックは−７０℃で保存し、各ストックの一部を直前に融解したものを各実験に使用した。５ｃｍ隔てた位置に置いた３０ＷのＵＶ光源（Ｇ３０Ｔ８、General Electric社）を用いて、各ウイルスに０℃で４５分間照射することで、ＵＶ照射ＨＳＶ−１とＶＳＶを調製した。プソラレン不活化ウイルスはLee Biomolecular社（San Diego, CA）によって作成された。
Ｔ細胞活性のアッセイ
３〜４週前に１０6ｐｆｕの野生型ＨＳＶ−１、またはＩＣＰ４かＩＣＰ２７かＩＣＰ８の遺伝子に突然変異を有するウイルス変異体を腹腔内接種したマウスから免疫脾臓細胞を採取した。ＰＢＳを接種したマウスを陰性対照とした。上記マウスから採取した脾臓細胞をフィコール−ハイパック（Ficoll-hypaque）勾配沈降法で処理して、赤血球と多形核白血球を除去した。脾臓細胞をＢリンパ球特異的抗体とともに４℃で３０分間インキュベートすることで、混合物からＢリンパ球を除去した。次いで、細胞を洗い、磁石コア［Advanced Magnetics社（Cambridge, MA）］を含むヤギ−ラット抗体被覆ラテックス−ポリマービーズとともにインキュベートした。次いで、磁石［バイオマグセパレーター（BioMag Separator）、Advanced Magnetics社］を用いて、磁石ビーズに結合したＪ１１−ｄ２陽性細胞を除去した。９５％以上がＴ細胞からなる混合物に残留する細胞を洗い、９６穴丸底培養プレート［ヌンク社（Nunc）、Roskilde, Denmark］中で合計量０．２ｍｌとなるように１穴あたり１０5個の細胞濃度でインキュベートした。細胞試料は４反復でプレート培養した。応答を示した細胞をＵＶ照射野生型ＨＳＶ−１で刺激した。ウイルスを加えない対照細胞を並行に作成した。細胞を、５％子ウシ血清（Hyclone Labs社、５６℃で１時間不活化した血清）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gibco社）、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco社）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Gibco社）、１０-4ｍＭの２−メルカプトエタノール（Sigma社）、および２ｍＭのグルタミン（Gibco社）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（Hazelton社）中でインキュベートした。細胞は、１０％のＣＯ2の存在下で３７℃で３日間インキュベートした。１穴あたり１μＣｉの濃度の［3Ｈ］−チミジン（New England Nuclear社）を６時間加え、スクラトロンセルハーベスター（Skratron Cell Harvester）を用いて細胞を集めた。液体シンチレーションカウンター（Beta Trac 6895、TM Analytic社）を用いて、各試料中の放射活性量を測定した。
抗体アッセイ
感染マウスから得た血清試料について、ＥＬＩＳＡによりＨＳＶ−１特異的抗体が含まれているかどうかを調べた。用いたプロトコルは、齧歯類血清用に手を加えた以外はカーロンとホイットレー（Kahlon and Whitley（1988, J. Inf. Dis. 158:925）記載のものと同じであった。マイクロタイタープレート（Linbro／Titertek社）を１０7ｐｆｕのＨＳＶ−１をＰＢＳに懸濁したものの１：５０希釈液０．１ｍｌで１夜処理した。上記のようにして各ウイルスで免疫化されたマウスの血清は、そのマウスを眼窩後方で放血させることによって得た。ＨＳＶ−１被覆マイクロプレートを３回洗い、血清１：１００希釈液１００μｌ、次いで１：３希釈液とともに室温で１夜インキュベートした。マイクロプレートを再び洗い、１：２５０の希釈率のヤギ抗マウスＩｇＧ2アルカリホスファターゼ（Southern Biotechnology社）とともに３７℃で３時間インキューベートした。１ｍｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ基質（Sigma 104）を添加してから３０分後に、７５μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。実験結果は、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを用いて得た。野生型ＨＳＶ−１免疫マウスの血清のプールを陽性対照とし、免疫化しなかったマウスの血清のプールを陰性対照とした。マウス血清は個別に処理し、データは平均とその標準誤差として示した。
結果
複製欠損ウイルスの使用；死亡例なし
複製欠損ウイルス（すなわちＩＣＰ８またはＩＣＰ２７をコードする遺伝子に突然変異を有するウイルス）をマウスに接種したときに致死的であるかどうかを調べるために、マウスに生きた状態の野生型ＨＳＶ−１または変異体ウイルスｄ３０１またはｎ５０４を注射した。１０8ｐｆｕという大量の各変異体を投与されたマウスは健康そうであり、ウイルスの影響を受けなかった。１０7ｐｆｕの野生型ＨＳＶ−１の投与を受けた同腹仔はすべて死亡した。
変異体ウイルスの接種を受けたマウスにおけるＨＳＶ−１特異抗体の誘導
変異体ウイルスがマウス体内でＨＳＶ−１特異抗体を誘導する能力があったかどうかを調べるために、接種２週後の上記マウスから血清を採取し、ＨＳＶ−１特異抗体の存在を調べた。これらのマウスの血清中にＨＳＶ−１特異抗体が検出できたが、抗体レベルは、野生型ウイルスの接種を受けたマウスの血清中の抗体レベルより著しく低いという結果が繰り返し得られた。ｄ３０１の接種を受けたマウスから得た血清よりも、ｎ５０４の接種を受けたマウスから得た血清の方が抗体レベルが明らかに高かった。新たに行なった２回目の実験で、接種後２週目と４週目のいずれの時点でも同様の結果が得られた。
ＨＳＶ−１βタンパク質の発現がこれらの抗体の誘導に必要かどうかを調べるために、１０6ｐｆｕのβタンパク質もγタンパク質も発現しないＩＣＰ４欠失変異体ｄ１２０をマウスに接種した。対照レベルを超えるＨＳＶ−１特異抗体レベルがこれらのマウスで検出できたが、これらのレベルはＩＣＰ８変異体やＩＣＰ２７変異体の接種を受けたマウスの血清で見られたものより有意に低かった（図１）。
ウイルス変異体の接種を受けたマウスにおけるＴ細胞応答の誘導
変異体（それぞれは後期ウイルス遺伝子産物の産生を欠損している）のＨＳＶ−１特異的Ｔ細胞応答誘導能力を調べるために、接種マウスから得た脾臓Ｔ細胞のウイルス抗原に対する応答をイン・ビトロで調べた。マウスに、生きた野生型（ＫＯＳ１．１）ウイルスまたは複製欠損変異体であるｄ１２０、ｄ３０１、およびｎ５０４を１０6ｐｆｕ投与した。３週後に、各群のマウスから得たＴ細胞をＵＶ照射ＨＳＶ株ｍＰの存在下でイン・ビトロでインキュベートした。非特異的Ｔ細胞刺激の効果の対照として、無関係のウイルスであるＶＳＶに対するＴ細胞の応答も評価した。ＶＳＶで免疫したマウスの脾臓Ｔ細胞は、ＶＳＶに応答して増殖したが、ＨＳＶ−１に応答して増殖することはなかった。バックグランドを超えるレベルのＴ細胞活性の刺激が、各複製欠損ウイルスの接種を受けたマウスから得た脾臓Ｔ細胞中で見られた（図２）。これらの結果は、変異体ウイルスをマウスに免疫すると、野生型ウイルスによる免疫の後で誘導されるものより低いレベルのＴ細胞刺激が誘導されたことが示唆される。にもかかわらず、これらの変異体ウイルスは相当なＴ細胞反応性を誘導した（図２）。
複製欠損ウイルスによる防御免疫の誘導
致死的ＨＳＶ−１に対する複製欠損ウイルスの防御免疫誘導能力を評価するために、マウスに上記複製欠損変異体のそれぞれを１０6ｐｆｕ接種した。３〜６週後に（実験ごとに異なる）、すべてのマウスに致死量（５ｘ１０7ｐｆｕ）のＨＳＶ−１毒性株（ｍＰ）をチャレンジ投与した。３つの独立した実験で、変異体ｄ３０１またはｎ５０４の接種を受けたマウスは生存率が１００％となり、野生型ウイルスによるチャレンジから防御された。一方、野生型ウイルスだけを接種した対照マウスは、生存率が２０％未満であった。その後３つの変異体ウイルス（ｄ１２０、ｄ３０１、ｎ５０４）のすべてを用いて行なった実験で、対照マウス（ＰＢＳ注射）９匹のうち１匹だけが生存したのに対し、ＩＣＰ２７変異体またはＩＣＰ８変異体をあらかじめ接種したマウスでは野生型ウイルスのチャレンジ投与後の生存率が１００％であった。即時早期遺伝子だけを発現するＩＣＰ４変異体（ｄ１２０）ですら大多数のマウスを防御した。一方、ＵＶ照射ウイルスは最小の防御効果を示し、プソラレン不活化ウイルスで免疫化しても、マウスは致死的チャレンジから防御されなかった（図３）。
要するに、ＨＳＶ−１の複製欠損変異体は上記ウイルスの接種を受けたマウスにおいて体液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導する能力がある。これらの変異体をマウスに接種すると、これらのマウスを致死量の野生型ＨＳＶ−１によるチャレンジから防御する。細胞性免疫は、単純ヘルペスウイルスの感染からの防御にとくに重要であるので［ホイットレー（Whitley）, 1990, In:Virology, ed. Fields and Knipe, Raven Press, p 1843-1887］、そのような免疫を誘導する能力のあるも質であればいかなるものでもワクチン候補となりうる。上記したものなどの候補ワクチンも、複製を欠損するウイルスを含むので、とくに有用である。これらのウイルスは子孫ウイルスを生じえないので、従来の減弱生ウイルスワクチンよりかなり安全である。上記したものなどの変異体ウイルスは、野生型相補型の遺伝子を発現しない細胞中では複製できない。したがって、それらの変異体ウイルスは最初の感染の場から広がることはできない。ヘルペスウイルスの病原性に関するこの知見の重要な意味合いの一つは、上記変異体ウイルスはそれらの導入先である宿主に潜伏感染を引き起こすことができにくいということである。ｄ３０１またはｎ５０４のいずれかを角膜に接種されたマウスにおいて、これらのマウスから得た三叉神経節をイン・シチュ・ハイブリダイゼーションで潜伏期関連の転写と発現について調べたところ、潜伏感染の検出を示す証拠がないという事実は、この説と一致する［コーエンら（Coen et al.）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4736 et seq.（１９８９）参照］。
上記研究で用いられたものなどのウイルス変異体および候補ウイルスワクチンとして有用なそれ以外の変異体の構築とキャラクタライゼーションについて以下に説明する。
ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子の突然変異をコードするウイルスの構築とキャラクタライゼーション
細胞、ウイルス、感染、トランスフェクション
細胞のウイルス感染と細胞のＤＮＡトランスフェクションをベロ細胞またはＶ２７細胞中で実施した。ベロ細胞は、American Type Culture Collection, Rockville, Md.から入手した。Ｖ２７細胞の誘導について以下に説明する。ＨＳＶ−１の野生型株であるＫＯＳ１．１をすべての実験で用いた。１細胞あたり１０ｐｆｕの多重度で細胞に感染させた。以下に示すようにしてホスホノ酢酸（ＰＡＡ）二ナトリウム（Abbott Laboratories社, North Chicago, Ill.）を４００μｇ／ｍｌの濃度となるよう培地に加えた。マーカー転移実験における細胞のウイルスＤＮＡトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈澱法［ライスとクナイプ（Rice and Knipe）, 1988, J. Virol. 62:3814］を用いてＶ２７細胞中で行なった。
ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子の安定組み込みコピーを有するＶ２７細胞系を下記のようにして単離した。直径１００ｍｍのプレートにほぼ全面に成育したベロ細胞を、薬物Ｇ４１８耐性を付与するプラスミドであるｐＳＶ２ｎｅｏ［サザーンとベルグ（Southern and Berg）, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327］の０．８μｇおよびＨＳＶ−１のＩＣＰ２７をコードするプラスミドであるｐＢＨ２７［ライスとクナイプ（Rice and Knipe）, 1988, J. Virol. 62:3814］の４または１０μｇでトランスフェクトさせた。２日後、細胞を１：９の比率で１ｍｌあたり６００μｇのＧ４１８を含む培地に継代した。２〜４週後にＧ４１８耐性コロニーを単離し、大量培養を行なった。得られた細胞系について、ＩＣＰ２７変異体ｔｓＹ４６［サックスら（Sacks et al.）1985, J. Virol. 55:796］およびｔｓＬＧ４［サンドリ−ゴルディンら（Sandri-Goldin et al.）, 1981, J. Virol. 38:41］のプラーク形成を支持する能力に基づき、非許容温度でのＩＣＰ２７発現を調べた。このアッセイでは、１７個の単離株のうち６株が陽性であった。これらの細胞系のうちの１つをＶ２７と名付け、ＩＣＰ２７変異体の単離に用いた。サザーンブロット分析で、Ｖ２７細胞は半数体ゲノムの１等量あたり約１個のＩＣＰ２７遺伝子コピーを有することが示された。
ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７変異体の作成
ＩＣＰ２７はＨＳＶ−１の複製に不可欠の遺伝子であるため［サックスら（Sacks et al.）, 1985, J. Virol. 55:796］、ＩＣＰ２７に突然変異を有するウイルスは致死的表現型を有する。そこで、Ｖ２７細胞を用いてそのような変異体を増殖させた。
大腸菌ｌａｃＺ遺伝子をＨＳＶ−１染色体に挿入すると、ウイルス変異体の単離手段として有用である［カルミカエルとウエラー（Carmichael and Weller）, 1989, J. Virol. 63:591；ゴールドシュタインとウエラー（Goldstein and Weller）, 1988, J. Virol. 62:196］。ｌａｃＺ遺伝子の産物であるβ−ガラクトシダーゼを発現するウイルスプラークを、β−ガラクトシダーゼの発色基質であるＸ−ｇａｌの存在下で、色（青）を指標として同定することができる。以下に詳細に説明するように、まず、ＩＣＰ２７コード配列にフレーム内挿入されたｌａｃＺ遺伝子を有するβ−ガラクトシダーゼ発現性ＨＳＶ−１変異体を単離した。次いで、このウイルスを、特異的に突然変異させたＩＣＰ２７対立遺伝子をウイルスゲノムに導入するためのマーカー転移実験の受容体として使用した。新たに導入したＩＣＰ２７遺伝子を有する組替え体は、親の青色プラークのバックグランドに対して透明なプラークとして同定した。
ＨＳＶ−１のｌａｃＺ挿入変異体を作成するために、ｌａｃＺコード領域がＩＣＰ２７遺伝子の欠失バージョンに挿入された組替えプラスミドを構築した。次いで、この融合遺伝子を、感染性ＨＳＶ−１のＤＮＡとともにＶ２７細胞に同時トランスフェクションをさせた。トランスフェクション培養物由来の子孫ウイルスを、Ｘ−ｇａｌの存在下でＶ２７細胞上にプレート移植したところ、約３％のプラークが青色になった。１つの青色プラークを採取し、得られたウイルスクローンをｄ２７−ｌａｃＺ１と名付けた。サザーンブロット分析で、ｄ２７−ｌａｃＺ１はＷＴのＩＣＰ２７遺伝子のＩＣＰ２７−ｌａｃＺ融合遺伝子での置換と一致するゲノム構造を有することがわかった（図４Ａ）。また、ｄ２７−ｌａｃＺ１−感染細胞はＷＴのＩＣＰ２７を発現せずその代わりにＩＣＰ２７−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質について予測されたサイズと一致する約１３７ｋＤａのポリペプチドを発現した。ｄ２７−ｌａｃＺ１ウイルスのストックは、ベロ細胞上ではプラーク形成ができなかったが（＜２ｘ１０3ｐｆｕ／ｍｌ）、Ｖ２７細胞上では効果的にプラークを形成した（２ｘ１０8ｐｆｕ／ｍｌ）。ｄ２７−ｌａｃＺ１の単離に関する実験の詳細について以下に説明する。
プラスミドｐＰｓ２７ｐｄ１［ライスら（Rice et al.）, 1989, J. Virol. 63:3399］はＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡに由来する６．１キロベース（ｋｂ）のＰｓｔＩ挿入断片を含んでいる。この断片は、ＩＣＰ２７遺伝子全体ならびに隣接配列を含んでいる（図４Ａ）。ＩＣＰ２７遺伝子に欠失を有するとともにｌａｃＺ遺伝子の挿入を受けているｐＰｓ２７ｐｄ１誘導体を下記のようにして構築した。ＳａｌＩで消化することによって、ＩＣＰ２７コード領域中でｐＰｓ２７ｐｄ１を線状化した。次いで、約０．５ｋｂのＤＮＡが各端から除去されるように、ＤＮＡをＢａｌ３１で処理した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片［アウスベルら（Ausubel et al.）, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY］を用いる充填反応（ｆｉｌｌ-ｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で、両端を修復した。このＤＮＡをＢｇｌＩＩリンカー（New England BioLabs, Inc.社, Beverly, Mass.）につなぎ、得られた連結物をＢｇｌＩＩで消化し、再連結し、大腸菌の形質転換に使用した。それぞれＩＣＰ２７遺伝子と同じ方向にｌａｃＺ遺伝子が挿入された４つのプラスミド単離物が得られた。
上記４つのプラスミドＤＮＡのそれぞれをＰｓｔＩで消化し、ＷＴのＨＳＶ−１のＤＮＡとそれぞれ混合し、Ｖ２７細胞にトランスフェクトさせた。４日後に、培養物を集め、得られたウイルスストックを、１％新生ウシ血清と０．１％ヒト免疫グロブリンを含む培地１９９（GIBCO Laboratories社, Grand Island, N.Y.）の液体重層条件下でＶ２７細胞上にプレート移植した。２日後、培地を１ｍｌあたり１％の新生ウシ血清、０．５％のアガロース、３００μｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、Boehringer Mannheim Biochemicals社, Indianapolis, Ind.）を含む培地１９９と交換した。生じた４つのウイルスストックのうちの１つが高率（約３％）で青色プラークを生じた。１つの青色プラークを３回精製し、得られたウイルスクローンをｄ２７−ｌａｃＺ１と名付けた。ｄ２７−ｌａｃＺ１のＤＮＡのサザーンブロット分析で、ＷＴのＩＣＰ２７遺伝子はＩＣＰ２７−ｌａｃＺ融合遺伝子で置換されていることがわかった（図４Ａ）。また、ウイルスＤＮＡのサザーンブロット分析ならびに親プラスミド（ｐＰｓｄ２７−ｌａｃＺ１と命名）の制限酵素分析で、ｄ２７−ｌａｃＺ１において約０．８ｋｂがＩＣＰ２７遺伝子から欠失していることがわかった。
ＩＣＰ２７遺伝子に欠失またはナンセンス突然変異を含むＨＳＶ−１変異体の構築
クナイプら（Knipe et al.）, J. Virol. 63:3400 et seq.記載の一般的説明に従い、ＩＣＰ２７遺伝子に欠失またはナンセンスコドン挿入を有する５つのプラスミドを作成した。図４Ｂ参照。各プラスミド中のウイルスＤＮＡ挿入断片をベクター配列から分離し、ｄ２７−ｌａｃＺ１ＤＮＡとともにＶ２７細胞に同時トランスフェクションさせた。生じた子孫ウイルスをＸ−ｇａｌの存在下でＶ２７細胞上にプレート移植したところ、一部（約１〜５％）が透明プラークを形成した。透明プラークを形成したウイルスを単離し、免疫蛍光アッセイまたは以下に述べるＤＮＡ制限分析によって、新規導入ＩＣＰ２７対立遺伝子を検出するスクリーニングを行なった。各変異体ごとに、陽性プラークを３回精製した。ＩＣＰ２７欠失変異体の可能性のあるものをｄ２７−１と名付けた。ナンセンス変異体の可能性のあるものをｎ５９Ｒ、ｎ２６３Ｒ、ｎ５０４Ｒと名付けた。変異体の名称に付ついている数字は、各切断タンパク質に存在すると予想されるアミノ末端ＩＣＰ２７残基の数に相当する。一方、野生型タンパク質は５１２個のアミノ酸残基からなる。
サザーンブロットハイブリダイゼーションにより組替えウイルスゲノムのキャラクタライゼーションを行ない、各ウイルスが適当な突然変異を含むことが確認された。ウイルスＤＮＡを感染Ｖ２７細胞から単離し、サザーンブロットでＰｓｔＩとＸｂａＩの制限酵素パターンを調べた。野生型ＩＣＰ２７遺伝子を含む６．１ｋｂのＰｓｔＩＨＳＶ−１ＤＮＡ断片をプローブとして用いた。この断片は、ＨＳＶ−１ゲノムのＬ成分の繰り返し配列の一部を含んでいるので（図４Ａ）、野生型ＨＳＶ−１ＤＮＡを調べたところ、２つのバンドが明白に見られた。これらのバンドは、６．１ｋｂのＩＣＰ２７断片とその他のＵL−ＲLジャンクションに由来する３．３ｋｂの断片であった（図５）。一方、５つのＩＣＰ２７変異体ＤＮＡはいずれも６．１ｋｂの断片を欠損していたが、３．３ｋｂの断片を含んでいた。変異体ｄ２７−１は、予想された１．６ｋｂの欠失に一致する約４．６ｋｂの新規ＤＮＡ断片を含んでいた。残りの４つの変異体はそれぞれ２つの新規バンドを含んでおり、それらの合計サイズは、各変異体ゲノム中の適当な位置にあるＸｂａＩ部位の挿入と一致して約６．１ｋｂであった。さらに、上記変異体ゲノムのいずれも、親のｄ２７−ｌａｃＺ１ＤＮＡだけに存在する８．４ｋｂのＰｓｔＩ断片を含んでいなかった。
プラークアッセイを行なって、変異体がベロ細胞中で生育可能かどうかを調べた。５つの変異体はいずれも、試験可能な最低希釈率でベロ細胞上にプラークを形成することができなかったが（表１）（それ以下の希釈率では細胞単層が破壊された）、各変異体はＶ２７細胞上で効果的にプラークを形成した。Ｖ２７ゲノム中に存在することが知られている唯一の無傷ＨＳＶ−１遺伝子はＩＣＰ２７遺伝子の野生型コピーであるため、これらの結果は、各変異体における致死的欠損がこの野生型ＩＣＰ２７によってトランス相補されることを示している。
0004044131.tif 000002
これらの変異体の単離実験の詳細を以下に説明する。
ＩＣＰ２７遺伝子における欠失突然変異とナンセンス突然変異をプラスミドｐＰｓ２７ｐｄ１に工学的に導入した（図４Ｂ）。４０６Ｒと５０４Ｒの突然変異を有するプラスミド（それぞれｐＰｓ−４０６ＲとｐＰｓ−５０４Ｒという）をライスら（Rice et al.）［1989, J. Virol. 63:3399］の記載に従い構築した。プラスミドｐＰｓｄ２７−１は、ｐＰｓ２７ｐｄ１をＢａｍＨＩとＳｔｕＩで消化し、ＢａｍＨＩによるＤＮＡ３’陥凹末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で埋め、得られた大型ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで再び環状化することで構築した。プラスミドｐＰｓ−５９ＲとｐＰｓ−２６３Ｒは、上記プラスミドｐＢＨ−５９ＲとｐＢＨ−２６３Ｒに由来する変異体の２．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片を、ｐＰｓ２７ｐｄ１のＷＴの２．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片で置換することによって構築した。
以下のようにして組替え体ウイルスを構築した。上記プラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、それぞれをｄ２７−ｌａｃＺ１ウイルスＤＮＡと混合し、Ｖ２７細胞にトランスフェクとさせた。３〜５日後に子孫ウイルスを集め、上記のようにしてＸ−ｇａｌの存在下でＶ２７細胞上にプレート移植した。０．５〜５％の頻度で見られた透明プラークを採取し、ＩＣＰ２７遺伝子突然変異を獲得したかどうかを決めるスクリーニングを行なった。
２通りの方法でプラーク単離物をスクリーニングした。プラーク単離物であるｄ２７−１、ｎ５９Ｒ、およびｎ２６３ＲをＶ２７細胞中で３回精製した後、Ｖ２７細胞の感染に使用した。感染細胞から粗ウイルスＤＮＡを調製した［ガオとクナイプ（Gao and Knipe）, 1989, J. Virol. 63:5258］。各ＤＮＡ試料のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素パターンを調べて、各突然変異の存在を確認した。ｎ４０６Ｒとｎ５０４Ｒの場合、初期プラーク単離物を用いて小型のウイルスストックを調製した。次いで、ガラスカバースリップ上で培養したベロ細胞に各ウイルスを感染させた。感染細胞を固定し、抗ＩＣＰ２７モノクローナル抗体を用いて免疫蛍光染色を行なった［アッカーマンら（Ackerman et al.）, 1984, J. Virol. 52:108］。次いで、ｎ４０６Ｒとｎ５０４Ｒの単離物をさらに２回プラーク精製し、各突然変異体の大型ストックをＶ２７細胞中で調製した。
突然変異化ＩＣＰ２７ポリペプチドの発現と細胞内局在化
次に、突然変異体について、ＩＣＰ２７−関連ポリペプチドの発現があるかどうかを調べた。ベロ細胞にモック感染させるか、各ウイルスを感染させ、１０時間ＰＩの時点で細胞抽出物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ニトロセルロースに移し、モノクローナル抗体Ｈ１１１３と反応させた（図６）。モック感染細胞、ｄ２７−１−感染細胞、ｎ５９Ｒ−感染細胞の抽出物ではＩＣＰ２７−関連ポリペプチドは検出されなかった。約３８ｋＤａのタンパク質がｎ２６３−感染細胞抽出物で検出され、約５２ｋＤａのタンパク質がｎ４０６−感染細胞の抽出物で検出された。ｎ５０４Ｒを感染させた細胞は、６３ｋＤａの野生型タンパク質と同時泳動されるＩＣＰ２７−関連ポリペプチドを産生した。切断タンパク質のサイズは、ＩＣＰ２７遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて予想されたサイズとおおよそ一致していた［マックゲオクら（McGeoch et al.）, 1988, J. Gen. Virol. 69:1531］。
ウイルスゲノム上で発現された変異体タンパク質の細胞内分布を調べるために、各変異体を感染させたベロ細胞を４ｈＰＩの時点で集め、固定し、モノクローナル抗体Ｈ１１１３を用いて免疫蛍光顕微鏡標本を作成した。野生型ウイルスを感染させた細胞は、核の１カ所以上の部分が相対的に強く染色されるという局在化された核染色を示した（図７ＣとＤ）。これらの部分は、核小体など特定の核領域とは対応していなかった。ｄ２７−１またはｎ５９Ｒを感染させた細胞では、バックグランドレベルを超える染色は見られなかった。ｎ２６３Ｒを感染させた細胞は核染色を示し、ウイルス感染細胞同様に核の一部が相対的に強く染色された（図７ＥとＦ）。これらの部分は核小体に対応しているようであった。ｎ４０６Ｒを感染させた細胞も核染色を示したが、染色パターンは野生型ウイルス感染細胞のものと２点で異なっていた（図７ＧとＨ）。まず、ほとんどの細胞では、ｎ４０６ＲによってコードされたＩＣＰ２７タンパク質は核小体領域からほとんど排除されていた。次に、多くのｎ４０６Ｒ感染細胞はむしろ点状の染色パターンを示し、突然変異を受けたタンパク質が球状クラスター状態で核内に濃縮されていた。ｎ５０４Ｒを感染させた細胞も核染色を示したが、この場合、タンパク質は野生型ウイルス感染細胞で見られたものよりも拡散したパターンを示す核全体に存在しているようであった。これらの結果は、ｎ２６３Ｒ、ｎ４０６Ｒ、およびｎ５０４Ｒによってコードされた突然変異型ＩＣＰ２７が細胞核に効果的に局在化されたものの、核内蓄積のパターンの点で互いに異なり、野生型ウイルスとも異なっていたことを示している。
ＩＣＰ２７変異体を感染させた細胞におけるウイルスＤＮＡの合成
次に、ウイルスＤＮＡ複製に関してＩＣＰ２７変異体の表現型を決定した。各変異体のウイルスＤＮＡ合成表現型を決定するために、ベロ細胞にモック−感染させるか、各変異体を感染させた。１時間の吸着期間の後で、単層を温かい培地でよく洗って未吸着ウイルスを除去した。１ｈＰＩまたは１６ｈＰＩの時点でチャルベルグ（Challberg）の方法［チャルベルグ（Challberg）1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9094］により全ＤＮＡを調製した。精製したＤＮＡは、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づき定量した。ＤＮＡを室温で３０分間、１００ｍＭの水酸化ナトリウム中で希釈、変性させた。等量の１２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを合わせたもの）を加え、スロットブロットマニホルド［シュライヒャーとシュエル（Schleicher and Schuell, Keene, N.H.）を用いてＤＮＡをニトロセルロースフィルターにかけた。フィルターを加熱し、ＤＮＡをランダムプライマー標識法で調製した32Ｐ標識ＨＳＶ−１特異的プローブにハイブリダイズさせた。プローブとしては、ＩＣＰ０遺伝子を含むｐＳＨＺ［ナベルら（Nabel et al.）, 1988, Science 239:1299］またはＶｍｗ６５の遺伝子を含むｐＲＢ３４４１［マックナイトら（McKnight et al.）, 1986, Cancer Cells 4:163］などを用いた。ＨＳＶ−１変異体であるｄ１０２はＩＣＰ８遺伝子に大きな欠失を有するのでＤＮＡを複製できないが［ガオとクナイプ（Gao and Knipe）, 1989, J. Virol. 63:5258］、これを陰性対照としてこれらの実験で使用した。ウイルスＤＮＡは野生型ウイルス−感染細胞において高レベルで複製した。一方、ｄ１０２−感染細胞では、ウイルスＤＮＡ複製の証拠は見られなかった。５つのＩＣＰ２７変異体はいずれも感染過程でウイルスＤＮＡを複製する能力があった（図８）。
これらの結果を定量化するために、各スロットにハイブリダイズした放射活性量をシンチレーションカウンターを用いて測定し、データを表２にまとめた。これらの結果によれば、変異体をＤＮＡ複製に関して２種類の表現型クラスに分けることができた。変異体ｄ２７−１、ｎ５９Ｒ、ｎ２６３Ｒ、およびｎ４０６Ｒを含む第１のクラスは、ＤＮＡ合成率と複製ＤＮＡの安定性によって測定される量的指標である感染細胞中のウイルスＤＮＡ蓄積レベルを測定した実験で部分欠損を示した。
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ＩＣＰ２７変異体感染細胞におけるウイルスタンパク質合成のパターン
ＩＣＰ２７遺伝子における突然変異がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を調べるために、変異体感染細胞におけるウイルスタンパク質合成を調べた。３、６、または９ｈＰＩの時点で、モック−感染またはＨＳＶ−１−感染ベロ細胞を培地１ｍｌあたり１５μＣｉの［35Ｓ］メチオニンで標識した。タンパク質を細胞から抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーで可視化した（図９）。３および６ｈＰＩの時点で、ｎ４０６Ｒ以外のＩＣＰ２７変異体は野生型ウイルス感染細胞で見られたパターンに質的に似たタンパク質合成パターンを示した。ｎ４０６Ｒを感染させた細胞はＩＣＰ６、ＩＣＰ８、ｇＢ前駆体（ｐｇＢ）など数種類のタンパク質を欠損しているようであったが、９ｈＰＩの時点では、５つのＩＣＰ２７変異体のいずれを感染させた細胞も野生型ウイルスと比べて量的にも質的にも異なるウイルスタンパク質合成を示した。５つの変異体は９ｈＰＩの時点でのウイルスタンパク質合成に関して４つの表現型クラスに分類できた。変異体ｄ２７−１とｎ５９Ｒは、何度実験してもタンパク質合成パターンの点で常に互いに識別不能であった。これらの変異体はどちらもほとんどのβタンパク質を高レベルで発現したが、ＩＣＰ５とＩＣＰ２５を含む数種類のγ−１タンパク質の発現レベルは（野生型のレベルと比べて）より低かった（図９、９ｈＰＩ）。変異体ｎ２６３Ｒは、９ｈＰＩの時点でのタンパク質合成パターンがｄ２７−１およびｎ５９Ｒのものと非常に似ていたが、この変異体は数種類のγ−１タンパク質の発現量が少し多かった。変異体ｎ４０６Ｒを感染させた細胞においてＩＣＰ６、ＩＣＰ８、およびｐｇＢをはじめとする多くのウイルスタンパク質のレベルが明らかに大幅な低下を示したという点で、この変異体はウイルスタンパク質合成に関し異常な表現型を有していた。９時間ＰＩの時点でｄ２７−１−感染細胞と比べてγ−１タンパク質であるＩＣＰ５とＩＣＰ２５のレベルが高くなったので、この効果はすべてのウイルスタンパク質にあてはまるものではなかった。変異体ｎ５０４ＲはＩＣＰ１／２やＩＣＰ１５などのβタンパク質とγ−１タンパク質を高レベルで発現した。
野生型ウイルス感染細胞においては、９時間ＰＩの時点で、αタンパク質であるＩＣＰ４とＩＣＰ２７の発現が顕著に低下した（図９）。この現象は、細胞に５つのＩＣＰ２７変異体のいずれを感染させた場合にもみられなかった。また、ｎ５０４Ｒ−感染細胞ではＩＣＰ２７ポリペプチドの発現は止められなかった（その他の変異体のいずれも、ＷＴのＩＣＰ２７と共泳動されるタンパク質をコードしないので、これはＩＣＰ２７タンパク質合成速度の直接比較が可能な唯一のケースである）。ｎ４０６Ｒ以外のＩＣＰ２７変異体もＩＣＰ６やＩＣＰ８をはじめとする多くのβタンパク質の発現を負調節する能力を欠いていた。これらの結果は、ＩＣＰ２７がα遺伝子とβ遺伝子の発現に負の調節作用を及ぼすことを示唆するものである。
変異体ウイルス感染細胞で見られたウイルスＤＮＡ合成の欠損が野生型タンパク質の発現によって修復可能かどうかを調べるために、以下の実験を行なった。ベロ細胞またはＶ２７細胞に野生型ウイルスまたは変異体の一つを感染させた。１５ｈＰＩの時点で感染細胞タンパク質を［35Ｓ］メチオニンで標識し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーで分析した（図１０）。ベロ細胞中１５時間ＰＩの時点で見られた各変異体のタンパク質発現パターンは、９時間ＰＩの時点での上記パターンと同様であったが、Ｖ２７細胞に各変異体を感染させたところ、野生型ウイルスのものにさらに類似したタンパク質合成パターンが見られた。
ＩＣＰ２７変異体ウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡの蓄積
変異体感染細胞において発現された定常レベルのウイルスｍＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼーションで分析した。各変異体を感染させた細胞をノニデットＰ−４０処理することによってＲＮＡを単離した後、フェノール−クロロホルムで抽出した。このＲＮＡをエタノールで沈殿させ［クレシグら（Klessig et al.）, 1975, J. Virol. 16:1850］、緩衝液に懸濁し、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩ（Bethesda Research Laboratories社, Gaithersburg, Md.）で消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで再沈殿させた。１０マイクログラムの各ＲＮＡ試料を変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル上の電気泳動に付した［サムブルックら（Sambrook et al.）, supra］。電気泳動終了後、ＲＮＡをジーンスクリーン（GeneScreen）フィルター（DuPont, NEN Research Products社, Boston, Mass.）に移した。次いで、ＲＮＡの32Ｐ標識プローブへのハイブリダイゼーションを行なった［ライスとクレシグ（Rice and Klessig）, 1984, J. Virol. 49:35］。プローブとしては、ｐＢＨ２７（ＩＣＰ２７遺伝子をコードする）［ライスとクナイプ（Rice and Knipe）、本明細書の他所に引用］、ｐＫ１−２（ＩＣＰ４遺伝子をコードする）［デルカとシャッファー（DeLuca and Schaffer）, 1987, Nucl. Acids Res. 15:4491］、およびｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−Ｉ−Ｉ（ｇＣ遺伝子をコードする）［フリンクら（Frink et al.）, 1983, J. Virol. 45:634］などを用いた。ウルトラスキャン（Ultrascan）レーザーデンシトメーターとオンラインインテグレーター（LKB Instruments, Inc.社, Rockville, Md.）を用いて濃度測定法でオートラジオグラムを分析した。
具体的には、モック−感染させたベロ細胞、野生型ウイルスを感染させたベロ細胞、または変異体ｎ５９Ｒ、ｄ２７−１、またはｎ５０４Ｒを感染させたベロ細胞からＲＮＡを抽出した。野生型ウイルス感染は、ＨＳＶ−１ウイルスＤＮＡ合成の特異的阻害剤であるＰＡＡの存在下または非存在下で行なった。９時間ＰＩの時点で感染細胞から細胞質ＲＮＡを単離した。ノーザンブロット転写を行なった後、フィルターをＩＣＰ２７（図１１Ａ）、ＩＣＰ４（図１１Ｂ）、またはｇＣ（図１１Ｃ）のｍＲＮＡに対して特異的な放射標識ＤＮＡをプローブとして調べた。モック−感染細胞やｄ２７−１−感染細胞（図１１Ａ、レーン２と３）では、ＩＣＰ２７特異的ｍＲＮＡは見られなかった。ｎ５９Ｒやｎ５０４Ｒを感染させた細胞から単離したＲＮＡ（図１１Ａ、レーン４と５）は野生型ウイルス感染細胞から得たＲＮＡ（図１１Ａ、レーン６）より２〜３倍多い量の２．０ｋｂのＩＣＰ２７ｍＲＮＡを含んでいた。この結果は、９ｈＰＩの時点でｎ５０４Ｒ−感染細胞で見られたＩＣＰ２７タンパク質合成レベルの上昇と定性的に一致していた。
ＩＣＰ２７特異的ｍＲＮＡで得た結果とは対照的に、ほぼ等量のＩＣＰ４ｍＲＮＡがｄ２７−１−、ｎ５９Ｒ−、および野生型ウイルス−感染細胞で見られたが（図１１Ｂ、レーン３、４、６）、ｎ５０４Ｒ−感染細胞は野生型ウイルス−感染細胞より１．６倍多い量のＩＣＰ４ｍＲＮＡを蓄積しただけであった（図１１Ｂ、レーン５と６）。９時間ＰＩの時点で野生型ウイルス感染細胞にＩＣＰ４タンパク質がほとんどあるいは全く見られなかったことから、これらの結果はやや予想外であった。ＩＣＰ４の合成はＩＣＰ２７変異体感染細胞で容易に検出されたので（図９、９ｈＰＩ）、９時間ＰＩの時点でのＩＣＰ４の発現レベルは細胞質ＩＣＰ４転写物のレベルを反映していないことになる。このことは、ＩＣＰ４のｍＲＮＡは野生型ウイルス感染細胞よりもＩＣＰ２７変異体感染細胞における方がより効果的に翻訳されることを示唆している。
γ−２遺伝子をコードするｇＣに対して特異的なｍＲＮＡの蓄積を変異体感染細胞で調べた。ＰＡＡによりウイルスＤＮＡ複製を阻害すると、野生型ウイルス感染細胞中に蓄積するｇＣのｍＲＮＡの量が大幅に減った（図１１Ｃ、レーン１と６；オートラジオグラム露出時間を延長すると、レーン１にｇＣのｍＲＮＡが検出できた）。ｄ２７−１−、ｎ５９Ｒ−、またはｎ５０４Ｒ−感染細胞はいずれも検出可能レベルのｇＣのｍＲＮＡを発現しなかった（図１１Ｃ、それぞれレーン３と４と５）。このことは、感染時にＷＴレベルのＤＮＡを複製した変異体ｎ５０４Ｒの場合にとくに興味深い。γ−２遺伝子の発現には、ウイルスＤＮＡとウイルスをコードするトランス作用性因子すなわちＩＣＰ２７の両方が複製される必要がある。
ＨＳＶ−１のＩＣＰ８遺伝子における変異体の構築とキャラクタライゼーション
ＩＣＰ８発現細胞系の単離
デルカら（DeLuca et al.）［1985, J. Virol. 56:558］の記載と実質的に同じやり方で、ベロ細胞をプラスミドｐＳＧ１８−ＳａｃＩ［リーとクナイプ（Lee and Knipe）, 1983, J. Virol. 46:909；クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe）, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:957］またはｐ８Ｂ−Ｓ［ガオら（Gao et al.）, 1988, Virology 163:319］およびｐＳＶｎｅｏ［サザーンとベルグ（Southern and Berg）, 1986, J. Mol. Appl. Genet. 1:327］で形質転換した。抗生物質Ｇ４１８を含む培地で培養した後、２１個の薬物耐性コロニーを単離し、増幅し、ＩＣＰ８変異体であるｔｓ１３、ｔｓ１８、およびｔｓＨＡ１［コンレーら（Conley et al.）, 1981, J. Virol. 37:413；ホランドら（Holland et al.）, 1984, J. Virol. 49:947］の生育を相補する能力についてスクリーニングを行なった。非許容温度では、これらのｔｓ変異体は、ＩＣＰ８遺伝子を受け取った培養物に由来する２１の細胞系のうち７細胞系においてプラークを形成したが、ｐＳＶ２ｎｅｏのみでトランスフェクトされた細胞に由来するＮｅｏr細胞中ではプラークを形成しなかった。それぞれプラスミドｐ８Ｂ−ＳとｐＳＧ１８−ＳａｃＩでトランスフェクトされた細胞に由来する細胞系であるＢ１０とＳ２は最高レベルの相補をもたらしたので、これらを選んでさらに調べた（表３）。野生型ウイルスは両方の温度においてＢ１０細胞とＳ２細胞のみならずＮｅｏr細胞においてもプラークを形成した。変異体ウイルスｔｓ１３、ｔｓ１８、およびｔｓＨＡ１は３３．５℃の温度でのみＮｅｏr細胞中で効果的にプラークを形成したが、Ｂ１０細胞とＳ２細胞中では両方の温度で野生型と同等の効率でプラークを形成した。サザーンブロットハイブリダイゼーションを行なってこれらの細胞系におけるＩＣＰ８遺伝子のコピー数を求めたところ、Ｂ１０細胞とＳ２細胞はそれぞれ半数体ゲノム１個あたり約１コピーと１０コピーを含んでいた。
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いずれの実験でも、単層培養物に野生型または変異体ウイルスを１細胞あたり２０ｐｆｕの多重度で感染させた。
プラスミド
プラスミドｐ８Ｂ−Ｓ、ｐＳＶ８、ｐｍ１およびそれらのヌクレオチド番号付与体系が記載されている［ガオら（Gao et al.）, 1988, Virology 163:319；スーとクナイプ（Su and Knipe）, 1987, J. Virol. 61:615］。プラスミドｐ８Ｂ−Ｓは、ＩＣＰ８プロモーターを含む５．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片（マップ単位０．３７４〜０．４１１）をｐＵＣ１８にクローニングすることによって構築した。プラスミドｐＳＶ８は、５．５ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（マップ単位０．３７４〜０．４０９）をサルウイルス４０早期プロモーターの下流に挿入することによって構築した。プラスミドｐｍ１は、ＩＣＰ８遺伝子のコドン４９９と５０２をグリシンでなくシステインをコードするように変化させることによって、プラスミドｐＳＶ８から誘導した。この研究で使用した変異体ＩＣＰ８プラスミドは、５．５ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（マップ単位０．３７４〜０．４０９）がそれぞれｐＵＣ１９またはｐＳＰ６４に挿入されたｐＩＣＰ８またはｐＳＰＩＣＰ８から誘導したものである。プラスミドｓｐＩＣＰ８を線状化し（ＳｍａＩによる部分消化によって行なった）、その後にそれぞれヌクレオチド４０８４と３６９５の部位において３つの読み取り枠すべてに終止コドンを有する１４ヌクレオチドＸｂａＩリンカー（５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−３’、New England BioLabs, Inc. 社, Beverly, Mass.）を挿入することによって、プラスミドｐｎ１０とｐｎ２を作成した。したがって、ｐｎ１０は最初の１１６０個のアミノ酸残基をコードし、ｐｎ２はＩＣＰ８の最初の１０２９個のアミノ酸残基、ならびにＸｂａＩリンカー配列によってコードされる４つの付加アミノ酸Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐをコードする。２００１塩基対（ｂｐ）のＮｏｔＩ断片（ヌクレオチド１３９５〜３３９６）の内部読み取り枠内欠失によってプラスミドｐｄ３０１を作成した。プラスミドｐｄ１０１とｐｄ１０２は以下のようにして構築した。ＳｍａＩによる部分消化でプラスミドｐＳＰＩＣＰ８を線状化し、１２ヌクレオチドＢｇｌＩＩリンカー５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’をそれにつないだ。ＢｇｌＩＩ（ヌクレオチド６５２の位置にあるＳｍａＩ部位から変換）およびＢａｍＨＩ（ヌクレオチド２２９４）による消化で１６４２ｂｐの欠失を作成して、プラスミドｐｄ１０１を得た。したがって、ｐｄ１０１は残基１７〜５６３に対応するコドンを欠いているが、ＢｇｌＩＩリンカー配列によってコードされる１つのＡｒｇコドンが挿入されている。ＢｇｌＩＩ（ヌクレオチド６５２と１８４０の位置にあるＳｍａＩ部位から変換）による消化で１，１８８ｂｐの欠失を作成して、プラスミドｐｄ１０２を得た。したがって、ｐｄ１０２はＩＣＰ８をコードする配列の残基１７〜４１１に対応するコドンを欠いているが、ＢｇｌＩＩリンカー配列中の３つの付加アミノ酸Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコードする。プラスミドｐｄ１０１とｐｄ１０２はいずれもＩＣＰ８ポリ（Ａ）シグナルの下流のヌクレオチド４４１９の位置に１４ヌクレオチドのＸｂａＩリンカーを有している。ヌクレオチド４０８４と１８４０の付近にはその他のＳｍａＩ部位が存在するので、ｐｎ１０とｐｄ１０２の両方の配列を決めて、正確な突然変��部位を決定した。
変異体ウイルスの構築
ＩＣＰ８の機能ドメインを決定するために、数種類の突然変異をＩＣＰ８遺伝子のコード領域に導入した（図１２）。すなわち、（ｉ）ナンセンス突然変異（ｐｎ１０とｐｎ２）、（ｉｉ）内部欠失（ｐｄ３０１、ｐｄ１０１、ｐｄ１０２）、および（ｉｉｉ）部位特異的突然変異（ｐｍ１）［ガオら（Gao et al.）, 1988, Virology 163:319］である。マーカー転移後の組替え体ウイルスのスクリーニングを容易にするために、ＩＣＰ２７変異体の作成について上記したのと同様の方法でＩＣＰ８コード領域にｌａｃＺ遺伝子が挿入された変異体ウイルスを構築した。この組替え体ウイルス（ＨＤ−２と名付けた）は、Ｘ−Ｇａｌの存在下でＩＣＰ８発現細胞系で青色プラークを形成したが、ベロ細胞ではプラークを形成しなかった。様々な変異体ＩＣＰ８をコードするＤＮＡをこの親株に組替え、生じた子孫を白色プラークから単離した。白色プラークは２〜３９％の頻度で出現した。ＨＤ−２のＤＮＡとｐｄ１０１またはｐｄ１０２でトランスフェクトさせた細胞における白色プラークの出現頻度はバックグランドを超えなかった。これはおそらく、ｐｄ１０１またはｐｄ１０２とＨＤ−２のＤＮＡの間の組替えに利用可能なウイルス配列の量が制限されていたことによるものであった。
以下のタイプの分析を行なって、上記組替え体ウイルスがＩＣＰ８遺伝子に適当な突然変異を有することを証明した。ウイルスＤＮＡを単離し、適当な制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分析した。サザーンブロット分析を行なってウイルスＤＮＡ中に突然変異が存在することを証明するとともに、変異体ウイルス集団の純度を測定した。たとえば、野生型ＤＮＡの８．２ｋｂのＢａｍＨＩ  Ｇ断片（図１３、レーン１）はＸｂａＩリンカー（レーン３）が存在するため、ＢａｍＨＩとＸｂａＩによる消化でｎ２ＤＮＡ中の６．８ｋｂと１．４ｋｂの断片に分割した。ＢａｍＨＩ  ＧとＶ（２．３ｋｂｐ）のジャンクション領域はＨＤ−２中のｌａｃＺ遺伝子で置換されたので、ＨＤ−２のＤＮＡをＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化したところ、１２．６ｋｂの断片が得られた（図１３、レーン２）。ＫｐｎＩで消化した野生型（図１３、レーン４）、ＨＤ−２（レーン６）およびｎ２（レーン５）のＤＮＡを比較したところ、野生型のＤＮＡとｎ２のＤＮＡは互いに類似していたが、ｌａｃＺ挿入のためにＨＤ−２のＤＮＡ（レーン６）のそれとは異なっていることがわかった。
ＩＣＰ８遺伝子に突然変異を有するウイルスの単離実験の詳細について以下に説明する。
ＩＣＰ８遺伝子にｌａｃＺ挿入を有する変異体ウイルスＨＤ−２を以下のようにして単離した。ｐＩＣＰ８から７８０−ｂｐのＸｈｏＩ断片を欠失させた後、このプラスミドをＢａｌ  ３１で短時間消化し、このＤＮＡの両端にＢｇｌＩＩリンカーをつなぎ、ｌａｃＺ遺伝子（Pharmacia, Inc. 社, Piscataway N.J.）を挿入した。ｐＭＣ１８７１のｌａｃＺ遺伝子は転写プロモーターを含んでおらず、最初の８つの非必須アミノ末端コドンも欠いている。ＩＣＰ８：ｌａｃＺプラスミド混合物を野生型ウイルスＤＮＡとともにＢ１０細胞にトランスフェクトさせた。子孫ウイルスを単離し、０．１％ヒト免疫血清を含む１％子ウシ血清を添加した培地１９９中のＢ１０細胞またはＳ２細胞上にプレート移植して、３７℃で１〜２日培養した。次いで、β−ガラクトシダーゼ活性を検出するために、１ｍｌあたり４００μｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含む１．０％アガロースを添加した培地１９９と元の培地を交換し、インキュベーションを８〜１６時間続けた。組替え体ウイルスは青色プラークとして同定し、約０．１〜０．５％の頻度で単離した。ＨＤ−２と名付けた１つの変異体単離物のプラーク精製を行なった。
この研究では、ｄ３０１以外のすべての変異体ウイルス作成の親ウイルスとしてＨＤ−２を用いた。感染性ＨＤ−２のＤＮＡを突然変異化ＩＣＰ８遺伝子をコードするプラスミドとともに同時トランスフェクションを行った後、Ｘ−Ｇａｌの存在下で増殖させた白色プラークから組替え体ウイルスを単離した。
変異体ウイルスｄ３０１は、感染性野生型ウイルスのＤＮＡおよび２，００１ｂｐのＮｏｔＩ断片がＩＣＰ８コード配列から欠失しているプラスミドｐｄ３０１とともにＢ１０細胞を同時トランスフェクションさせることによって構築した（図１２）。このトランスフェクションでできた子孫ウイルスについて、ベロ細胞ではなくＢ１０細胞における複製能力を試験した。
変異体ウイルスの生育特性
図１２に示した各変異体ウイルスはベロ細胞中では複製能力がなく、Ｂ１０細胞またはＳ２細胞中に存在するＩＣＰ８遺伝子の野生型コピーによる相補が必要であった。各変異体ウイルスは、これらのＩＣＰ８発現細胞系における野生型レベルと同等のレベルまで複製した。変異体ウイルスが形成したプラークのサイズは、野生型ウイルスが形成したものよりやや小さかった。さらに、いずれの場合も、Ｂ１０細胞またはＳ２細胞中で増殖させた変異体ウイルスはそれ自体の変異体表現型を維持していた。
変異体ウイルスによるＩＣＰ８の発現
上記のようにしてウエスタンブロッティングにより、変異体感染細胞におけるウイルスタンパク質合成を調べた。ウサギポリクローナル血清３−８３［クナイプら（Knipe et al.）, 1987, J. Virol. 61:276］またはマウスモノクローナル抗体１０Ｅ−３［ローズら（Rose et al.）, 1986, J. Gen. Virol. 67:1315］を用いてＩＣＰ８を検出した（図１４）。変異体ウイルスごとに特定されるＩＣＰ８ポリペプチドのサイズは予想されたサイズと一致していた。マウスモノクローナル抗体１０Ｅ−３は、変異体ｐｍ１、ｄ１０１、ｄ１０２、およびｄ３０１によって発現されたＩＣＰ８ポリペプチドと反応したが、ｎ１０とｎ２によって発現されたものとは反応しなかった（表４）。このことは、この抗体の少なくとも一部が、ＩＣＰ８のカルボキシル末端の３６個のアミノ酸の中に含まれているエピトープと反応することを示唆している。これらの結果は、ｄ１０１、ｄ１０２、およびｄ３０１がフレーム内欠失を有することも示している。
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変異体ウイルス感染細胞におけるウイルスＤＮＡの複製
非許容条件下での各変異体ウイルス感染細胞におけるＤＮＡ複製を調べるために、ベロ細胞に各ウイルスを感染させ、６〜１０時間ＰＩの間、［3Ｈ］−チミジンを培養物に加えた。細胞を集め、ＤＮＡを単離した。各ＤＮＡ試料をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。ＨＳＶ−１のＤＮＡポリメラーゼを優先的に阻害する化合物であるホスホノ酢酸の存在下で培養した野生型ウイルスの場合（図１５、レーン５）と同様、各変異体はウイルスＤＮＡを複製できなかった（図１５、レーン６〜１１）。野生型におけるＤＮＡ複製レベルを図１５のレーン４に示した。
ウイルスＤＮＡ分析実験の詳細を以下に示す。
（ｉ）ＤＮＡの調製：クナイプら（Knipe et al.）［1979, J. Virol. 29:698］に従い、プラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡを調製した。サザーンブロット分析に使用したウイルスＤＮＡは、以下のようにして精製した。後期ＰＩ時間の時点で感染細胞を凍結融解させた後、０〜４℃で３０秒間にわたり４８０ｘｇで超音波処理した。生じた上清を２３，５００ｘｇの遠心分離にかけた。ペレットをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：２４：１）で３回抽出した。エタノール沈殿させた後、ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶かした。
（ｉｉ）ウイルスＤＮＡ合成の測定：細胞に適当なウイルスを感染させ、１ｍｌあたり２０μＣｉの［3Ｈ］チミジンで６〜１０時間標識し、全ＤＮＡをチャルベルグ（Challberg）の方法［1986, Proc. Natl. Acad. Sci. US 83:9094］によって単離した。ＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。電気泳動終了後、ゲルを１．０Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理してフルオログラフィーを行なった［チャンバーライン（Chamberlain）, 1979, Anal. Biochem. 98:132］。
突然変異化ＩＣＰ８のＤＮＡ結合特性
変異体ＩＣＰ８分子のＤＮＡ結合特性を調べる前に、個々のポリペプチドの溶解性を測定したところ（表５）、非常に変動が大きいことがわかった。次いで、可溶性の突然変異化ＩＣＰ８分子のＤＮＡ結合特性を１本鎖ＤＮＡセルロース上のクロマトグラフィーで調べた。４〜６時間ＰＩの間［35Ｓ］メチオニンで細胞を標識すること以外は既報［クナイプら（Knipe et al.）, 1981, J. Virol. 44:736］と同じ方法に従い、感染細胞抽出物の１本鎖ＤＮＡセルロースクロマトグラフィーを行なった。タンパク質を１本鎖ＤＮＡセルロースを含むカラムにかけ、濃度上昇勾配のＮａＣｌで溶出させた。野生型ウイルスと変異体ｐｍ１を比較した実験の結果を図１６に示す。野生型ウイルス感染細胞中で発現されたＩＣＰ８のほとんどはカラムに結合し（図１６Ａのレーン４と５を比較）、次いで０．５Ｍ濃度のＮａＣｌで溶出された（レーン１２）。一方、ｐｍ１感染細胞中で発現されたＩＣＰ８はほとんどカラムに結合しなかった（図１６Ｂのレーン４と５を比較）。ｎ１０感染細胞中で発現されたＩＣＰ８は、野生型ＩＣＰ８と同じ効率と強度で１本鎖ＤＮＡセルロースに結合した。ｄ３１０感染細胞中で発現されたＩＣＰ８で最低レベルの結合（２１％）が見られた。アミノ末端欠失変異体であるｄ１０１とｄ１０２によってコードされたＩＣＰ８はそれぞれ７２％と７５％のレベルでＤＮＡセルロースに結合した。これらの結果によれば、ＩＣＰ８のアミノ酸残基５６４〜１１６０部分がＤＮＡ結合に必要な領域を含むと結論づけられる。
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ウイルス変異体によってコードされたＩＣＰ８分子の核局在化
野生型ＩＣＰ８は感染細胞中で効率的に核に局在化する［フェンウイックら（Fenwick et al.）, 1978, J. Gen. Virol. 39:519；クナイプとスパング（Knipe and Spang）, 1982, J. Virol. 43:314；クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe）, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:315；クインランとクナイプ（Quinlan and Knipe）, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:957］。ｎ２以外のすべての変異体ウイルスの場合は、７９３抗ＩＣＰ８モノクローナル抗体の１：１０希釈液とローダミン複合ヤギ抗マウス抗体の１：１００希釈液を用いるクインランとクナイプ（Quinlan and Knipe）［1983, Mol. Cell. Biol. 3:315］の方法に従って実施した間接免疫蛍光法で、野生型と変異体のＩＣＰ８分子の細胞内分布を調べた。ｎ２のＩＣＰ８の検出は、抗ＩＣＳＰ１１／１２ポリクローナル血清［パウエルら（Powell et al.）, 1981, J. Virdl. 39:894］の１：３０希釈液とフルオレセイン複合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンの１：２００希釈液を用いて行った。結果を図１７に示す。ｎ１０は、カルボキシル末端から最後の３６個のアミノ酸を欠損していて野生型ＩＣＰ８と同程度に効果的にＤＮＡに結合するＩＣＰ８ポリペプチドをコードしたが、核には局在せず、感染細胞の細胞質内に留まっていた（図１７Ｃ）。一方、ＤＮＡとの結合が弱いｐｍ１のＩＣＰ８ポリペプチドは主に核に存在することがわかった（図１７Ｅ）。これらの結果は、ＩＣＰ８の核局在化シグナル（単数または複数）がＤＮＡ結合機能と分離していることを明白に証明している。
ｄ１０１によってコードされたＩＣＰ８は核に局在し（図１７Ｈ）、ＤＮＡと結合する能力もあったが（表５）、このウイルスはウイルスＤＮＡ複製能力がなかった。この変異体の表現型は、ＩＣＰ８はＤＮＡとの結合以外の核機能を有していることを示す遺伝的証拠を提供するものである。
ＩＣＰ８変異体の表現型特性を下記の表６にまとめる。
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他の態様は以下のクレームに含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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