(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のレプチン部分に結合した１以上の低分子量デキストラン部分を有し、該デキストラン部分が１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有するデキストラン−レプチン結合体。
【請求項２】
前記デキストラン部分が１ｋＤ〜１０ｋＤの分子量を有する請求項１に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項３】
前記デキストラン部分が１ｋＤ〜７ｋＤの分子量を有する請求項２に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項４】
前記デキストラン部分が６ｋＤの分子量を有する請求項１に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項５】
１個のデキストラン部分が１以上のレプチン部分に結合している請求項１に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項６】
２個以上のデキストラン部分が１以上のレプチン部分に結合している請求項１に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項７】
複数のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合している請求項１に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項８】
前記レプチン部分が（配列番号１のアミノ酸配列に従って）、
（ａ）位置２８のグルタミニル残基がなくても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の３２箇所のうちの１〜３２箇所で置換された異なるアミノ酸を有する小項目（ａ）のアミノ酸配列；
（ｃ）位置１００および１３８のアミノ酸がＧｌｎで置換された小項目（ｂ）のアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）（ｉ）アミノ酸９８〜１４６；
（ｉｉ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｉｉｉ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６でアミノ酸１００〜１１１の１〜１２個がアミノ酸９９とアミノ酸１１２の間で順番通りに置き換わっているもの；
（ｉｖ）アミノ酸位置１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１３箇所のうちの１〜１３箇所が別のアミノ酸によって置換されている小項目（ｉ）の切断レプチン類縁体；
（ｖ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の２５箇所のうちの１〜２５箇所が別のアミノ酸に置き換わっている小項目（ｉｉｉ）の切断レプチン類縁体；
（ｖｉ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の３２箇所のうちの３２箇所が別のアミノ酸に置き換わっている小項目（ｉｉｉ）の切断レプチン類縁体；
（ｖｉｉ）Ｎ末端メチオニル残基を有する小項目（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの切断レプチン類縁体
から選択される切断レプチン蛋白類縁体；
からなる群から選択される請求項１に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項９】
（ａ）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；
（ｂ）１個のデキストラン部分が２個以上のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；
（ｃ）２個以上のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；ならびに
（ｄ）２個以上のデキストラン部分が２個以上のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体
をいずれかの組合せで含むデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項１０】
（ａ）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；
（ｂ）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；および
（ｃ）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているもの
をいずれかの組合せで含む請求項９に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項１１】
主として
（ａ）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；および
（ｂ）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているもの
からなる請求項１０に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項１２】
（ａ）１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有するデキストラン部分を活性化する段階；
（ｂ）アミノ末端アミンがまだプロトン化されず、レプチン蛋白上の他の位置のアミン基はプロトン化されるだけの酸性のｐＨで、還元条件下にレプチン部分に活性化デキストラン部分を結合させてアミン結合を形成する段階；
（ｃ）デキストラン−レプチン結合体を得る段階；および
（ｄ）適宜にデキストラン−レプチン結合体を精製する段階
を有する方法によって製造されるデキストラン−レプチン結合体。
【請求項１３】
医薬的に許容される担体中に請求項１ないし８のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
医薬的に許容される担体中に請求項９ないし１１のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体混合物を含む医薬組成物。
【請求項１５】
肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の治療のための医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項１ないし８のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の治療のための医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項９ないし１１のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体混合物を含む医薬組成物。
【請求項１７】
配列番号１のアミノ酸配列を有し、位置２８のグルタミニル残基が欠落していても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い１以上のレプチン部分にＮ末端で結合した１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有する１以上のデキストラン部分を有するデキストラン−レプチン結合体。
【請求項１８】
前記デキストラン部分が６ｋＤの分子量を有する請求項１７に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項１９】
（ａ）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；
（ｂ）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；および
（ｃ）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているもの
をいずれかの組合せで含むデキストラン−レプチン結合体混合物であって、
該デキストラン−レプチン結合体の該デキストラン部分が１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有し、
配列番号１のアミノ酸配列を有し、位置２８のグルタミニル残基が欠落していても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部分に、Ｎ末端で結合していることを特徴とするデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項２０】
前記デキストラン部分が６ｋＤの分子量を有する請求項１９に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項２１】
医薬的に許容される担体中に請求項１７又は１８のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
（ａ）１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有するデキストラン部分を活性化する段階；
（ｂ）アミノ末端アミンがまだプロトン化されず、レプチン蛋白上の他の位置のアミン基はプロトン化されるだけの酸性のｐＨで、還元条件下にレプチン部分に活性化デキストラン部分を結合させてアミン結合を形成する段階；
（ｃ）デキストラン−レプチン結合体を得る段階；および
（ｄ）適宜にデキストラン−レプチン結合体を精製する段階
を有する方法によって製造されるデキストラン−レプチン結合体であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有し、位置２８のグルタミニル残基が欠落していても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部分に、前記デキストラン部分がＮ末端で結合しているデキストラン−レプチン結合体。
【請求項２３】
肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の治療のための医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項１７又は１８のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
配列番号１のアミノ酸配列を有する１以上のレプチン部分にＮ末端で結合した１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有する１以上のデキストラン部分を有するデキストラン−レプチン結合体であって、位置１００および１３８のアミノ酸がグルタミンで置き換わっており、位置２８のグルタミニル残基が欠落していても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良いデキストラン−レプチン結合体。
【請求項２５】
前記デキストラン部分が６ｋＤの分子量を有する請求項２４に記載のデキストラン−レプチン結合体。
【請求項２６】
（ａ）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；
（ｂ）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体；および
（ｃ）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているもの
をいずれかの組合せで含むデキストラン−レプチン結合体混合物であって、
前記デキストラン−レプチン結合体の前記デキストラン部分が１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有し；位置１００および１３８のアミノ酸がグルタミンで置き換わっている配列番号１のアミノ酸配列を有し、位置２８のグルタミニル残基が欠落していても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部分にＮ末端で結合しているデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項２７】
前記デキストラン部分が６ｋＤの分子量を有する請求項２６に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。
【請求項２８】
医薬的に許容される担体中に請求項２４ないし２５のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
（ａ）１ｋＤ〜２０ｋＤの分子量を有するデキストラン部分を活性化する段階；
（ｂ）アミノ末端アミンがまだプロトン化されず、レプチン蛋白上の他の位置のアミン基はプロトン化されるだけの酸性のｐＨで、還元条件下にレプチン部分に活性化デキストラン部分を結合させてアミン結合を形成する段階；
（ｃ）デキストラン−レプチン結合体を得る段階；および
（ｄ）適宜にデキストラン−レプチン結合体を精製する段階
を有する方法によって製造されるデキストラン−レプチン結合体であって、
位置１００および１３８のアミノ酸がグルタミンで置き換わっている配列番号１のアミノ酸配列を有し、位置２８のグルタミニル残基が欠落していても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部分に、前記デキストラン部分がＮ末端で結合しているデキストラン−レプチン結合体。
【請求項３０】
肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の治療のための医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項２４又は２５のいずれかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は広義には蛋白修飾の分野に関するものであり、より具体的には類縁体を含むレプチン蛋白類へのデキストラン部分の付着の分野に関するものである（本明細書で使用される「蛋白」という用語は別段の断りがない限り、「ポリペプチド」または「ペプチド」と同義である）。別の態様において本発明は、デキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、関連する組成物ならびにそのような組成物の製造方法および使用方法も提供するものである。
【０００２】
（背景技術）
肥満の分子的基礎はほとんど解明されていないが、「ＯＢ遺伝子」およびそれのコードされた蛋白（「ＯＢ蛋白」または「レプチン」）の同定によって、身体が体脂肪沈着を調節するのに使用する機序について若干理解が進んだ（「Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof」という名称のＰＣＴＷＯ９６／０５３０９（引用によってその全内容が本明細書に含まれるものとする）；Zhang et al., Nature 372: 425-32 (1994)参照；さらにNature 374: 479 (1995)での修正も参照（後者２文献も引用によって本明細書に含まれる））。ＯＢ蛋白はｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産生物の産生における欠陥のために肥満のマウス）と正常な野生型マウスの両方においてin vivoで活性である。その生理活性は、特に体重減少において発現される（概論として、Barinaga,″Obese″ Protein Slims Mice″ Science 269: 475-76 (1995)参照）。ＯＢ蛋白、類縁体、誘導体および哺乳動物およびヒトを含む動物の体重および肥満症抑制のための調節剤としてのそれの使用については、ＷＯ９６／０５３０９（前記）に詳細に開示されている（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／４０９１２、ＷＯ９７／０６８１６、９７／１８８３３、ＷＯ９７／３８０１４、ＷＯ９８／０８５１２およびＷＯ９８／２８４２７も参照）。ＯＢ蛋白または本明細書での呼称でのレプチンは、ヒトにおいて体重減少を起こす（Greenberg et al., ″Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by SC injection in lean and obese subjects″；１９９８年６月１４日のイリノイ州シカゴでの第５８回Annula Meeting and Scientific Sessions of the American Diabetes Associationでの発表のポスター）。
【０００３】
例えば浸透ポンプによってあるいは循環時間が長くなるようにレプチンを化学的に修飾することで全身循環にレプチン蛋白を連続投与することで、体重減少に必要な用量を低減することが知られている（例：「ＯＢ蛋白組成物および方法」という名称のＰＣＴ  ＷＯ９６／４０９１２（引用によって本明細書に含まれる））。一般に、蛋白の製剤および化学修飾が追求する利点には、ある一定の環境下で、治療効果のある蛋白の安定性および循環時間の向上ならびに免疫原性低下などがあり得る。蛋白修飾および融合蛋白について記述した総説がフランシスによって書かれている（Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (May 1992)（Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UKが出版））。化学部分を結合させるための各種手段が現在利用可能である（例えば、「N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods」という名称の特許協力条約（ＰＣＴ）国際公開番号ＷＯ９６／１１９５３（引用によってその全内容が本明細書に含まれる）参照）。このＰＣＴ公開には特に、水溶性ポリマーの蛋白Ｎ−末端への選択的付着が開示されている。
【０００４】
ポリエチレングリコール類は、蛋白修飾に使用することができる水溶性ポリマーの一種である（前述のＷＯ９６／１１９５３参照。これにはＮ末端モノペギル化（monopegylated）顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）およびＮ末端モノペギル化コンセンサスインターフェロン（「Ｎ末端モノペギル化」とは、蛋白部分がＮ末端で１個のポリエチレングリコール部分に結合していることを示している）も開示されている。）。ポリエチレングリコール部分を用いて、Ｇ−ＣＳＦならびに巨核球成長・発達因子（「ＭＧＤＦ」）などの一部の治療効果を有する蛋白について非常に良好な成果を得ることができる（Sheridan & Menchaca, ″Overview of the Safety and Biologic Effects of PEG-rHuMGDF in Clinical Trials,″ in Stem Cells 16 (suppl.2): 193-98 (1998)）。
【０００５】
多糖ポリマーは、蛋白修飾に使用することができる別の種類の水溶性ポリマーである。デキストラン類は、主としてα１−６連結によって連結したグルコースの個々のサブユニットからなる多糖ポリマーである。デキストラン自体は多くの分子量範囲で入手可能であり、約１キロダルトン（「ｋＤ」）から約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である（「約」という用語は、一部のデキストラン分子は記載の分子量よりわずかに重く、一部はそれ以下である場合があることから、代表的な市販の医薬用デキストラン製造品における平均分子量を示すのに使用される）。デキストランは蛋白修飾に好適な水溶性ポリマーである（前述のＷＯ９６／１１９５３および前述のＷＯ９６／０５３０９参照）。治療効果のあるまたは診断用の免疫グロブリン類に結合したデキストランを使用することも報告されている。発明の名称が「Polysaccharide-Modified Immunoglobulins Having Reduced Immunogenic Potential or Improved Pharmacokinetics」である欧州特許（「ＥＰ」）公開番号０３１５４５６（引用によって本明細書に含まれる）には、デキストラン類などの修飾された低分子量多糖類に連結した免疫グロブリンまたはそれの断片が報告されている。
【０００６】
血漿増量剤として大量のデキストラン溶液を用いる点についてはかなりの経験がある（例えば、Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., at 804-05 (Mack Publishing Co.: Easton, PA (1990)参照；引用によって本明細書に含まれる）。分子量約４０、７０および７５ｋＤのデキストラン類などの比較的大きい分子量のデキストラン類を含む溶液は入手可能であり、グラム単位で投与される。デキストラン−鉄溶液も貧血の治療に使用される。
【０００７】
グラム単位で投与されると分子量の大きいデキストラン類は腎臓空胞を生じると報告されている（例えば、Diomi et al., Annals of Surgery 172: 813-24 (1970)（イヌにおける腎臓空胞化を報告）；Maunsbach et al., Laboratory Investigation 11: 421-32 (1962)（ラットにおける腎臓空胞化を報告）参照；さらには、Engberg, Acta Chir. Scand., 142: 172-80 (1976)も参照）。特定の例ではポリエチレングリコール−蛋白結合体も腎臓空胞誘発に関連していた（Bendele et al., Toxicological Sciences 42: 152-57 (1998)）。腎臓空胞は現在では臨床的に関連あるとは理解されていないが、医薬組成物は許容されない解剖学的変化を起こさずに有効でなければならない。そこで、分子量の大きいデキストラン類およびポリエチレングリコールポリマー類は全ての治療効果を有する蛋白の化学修飾に利用可能であるとは限らない。
【０００８】
臨床的状況で大分子量デキストランを使用することの別の欠点は、患者におけるアナフィラキシー反応の可能性である（例えば、総説についてはRichter et al., Immunology Today3: 132-38 (1982)（引用によって本明細書に含まれるものとする）ならびにそこに引用されている参考文献参照）。ある種の患者は、これらの大分子量デキストランに結合する既形成抗体を全身循環に有する場合があると考えられている。大分子量の臨床用デキストランをＩｇＧクラスのこれら既形成デキストラン反応性抗体（「ＤＲＡ」）力価が高い小さい（しかし予測できない）患者小群に投与するとアナフィラキシーショックが生じ、場合によっては死亡する。臨床用デキストランは有害な免疫複合体を生じ、それが補体を活性化して、白血球および血小板の凝集が起こると考えられている。凝集物は肺内に取り込まれ、血管作用性介在物質の放出によって、アナフィラキシー反応が生じると考えられる（前述のRichter et al., at 136）。
【０００９】
このリスクを克服するため、分子量が約１０００Ｄであるデキストランを含むデキストラン溶液が、既形成ＤＲＡのハプテン阻害薬として研究されている。６グルコース単位のデキストラン断片（分子量９９０）がin vivo実験用の１価ハプテン製造物として好適であることが認められている（前述のRichter et al., at 136 et seq）。アナフィラキシー反応低減のためのハプテン阻害の使用は、血液増量剤について非常に奏功している（例えば、Ljungstrom, Infusionsther Transfusionsmed 20: 206-10 (1993)；引用によって本明細書に含まれる）。１９８３年から１９９２年にかけて、プロミット（Promit；登録商標）という名称の市販製造品の使用によって重度デキストラン誘発アナフィラキシー反応（「ＤＩＡＲ」）の発生率が劇的に低下したと報告されている。２５０万回の投与当たり１回の発生率で致死反応が報告された。
【００１０】
上記のＥＰ０３１５４５６には、免疫グロブリン類への結合への分子量約６ｋＤのデキストラン類の使用が報告されている。デキストランに結合した治療上有用であると考えられるモノクローナル抗体が、所望の免疫反応性を維持しながら免疫原性を低減させ、所望の薬物動態特性を有し得ることが報告されている（Mikolajczyk et al., Bioconjugate Chem. 7: 150-58 (1996)（Ｆａｂ′−βラクタマーゼ結合体のＦａｂ′成分）；Fagnani et al., Nuclear Medicine Comm., 16:362-69 (1995)(マウス抗癌胎仔抗原モノクローナル抗体のＦａｂ′断片）；Fagnani et al., Cancer Res., 50: 3638-45 (1990)（マウスおよびウサギの免疫グロブリン類）も参照）。
【００１１】
従って、循環する既形成ＤＲＡを有する患者に対してアナフィラキシー性ではないデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物を有することが望ましいと考えられる。さらに、未修飾のレプチンと比較して、長い循環時間、効力および溶解度の向上という所望の特性を示すデキストラン−レプチン結合体を有することが特に望ましいと考えられる。本発明は、ポリエチレングリコールまたはアナフィラキシー誘発性デキストラン類に関連するリスクがなく、化学修飾レプチン蛋白の長所を有するデキストラン−レプチン結合体を提供するものである。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、ある種の相対的に低分子量のデキストラン−レプチン結合体が驚くべきことに、効力および循環時間の向上という所望の特性を有し、自然のヒトレプチンと比較して溶解度上昇および注射部位反応の低減などの他の望ましい特性を有するという所見に基づいたものである。さらに、ある種のポリエチレングリコール−レプチン結合体で認められる腎臓空胞化という欠点は本デキストラン−レプチン結合体では認められなかった。
【００１３】
以下に示す実施例は、（ａ）未修飾の組換えメチオニルヒトレプチン（「ｒｍｅｔＨｕ−レプチン」）と比較して向上した効力；（ｂ）未修飾のｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した血漿循環時間延長；（ｃ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した生理ｐＨでの水溶解度の向上；（ｄ）注射部位反応が軽度であるか皆無であること：（ｅ）デキストラン−レプチン結合体の非免疫原性；および（ｆ）腎臓空胞化誘発がないことという特性を有するデキストラン−レプチン結合体を示すものである。
【００１４】
従って１実施態様において本発明は、１以上のレプチン部分に結合した１以上の低分子量デキストラン部分を有し、該デキストラン部分が約１ｋＤ〜約２０ｋＤの分子量を有するデキストラン−レプチン結合体を提供する。好ましくは、医薬品の商業的製造を容易にするため、前記デキストラン部分は約１ｋＤ〜約１０ｋＤ、より好ましくは約１ｋＤ〜約７ｋＤの分子量を有する。特に好ましいデキストラン部分は、以下の実施例に例示しているように、約６ｋＤである。
【００１５】
本発明の別の態様では、１個の低分子量デキストラン部分が１以上のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体が提供される。本発明のさらに別の態様では、１以上の低分子量デキストラン部分が１以上のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体が提供される。そこで本発明は、１）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体、２）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体および３）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているものという少なくとも３種類の支配的なデキストラン−レプチン結合体類の組合せを含むデキストラン−レプチン結合体混合物をその範囲に含むものである。好ましくは本発明のデキストラン−レプチン結合体は主として、１）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体および２）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているものを含むものである。
【００１６】
誘導体化の程度を高めると（すなわち、レプチン部分に追加のデキストラン部分を付加させる）、アナフィラキシー誘発可能性に関して悪影響を与えることなく、上記のデキストラン−レプチン結合体の性能特性を高めることができることが想到される。そこで、複数のデキストラン部分をレプチン部分に結合させたデキストラン−レプチン結合体は本発明の範囲に含まれる。そのような複数デキストラン−レプチン結合体は、上記のものと同じ望ましい特性を示すものと考えられる。
【００１７】
さらに別の態様において本発明は、医薬的に許容される担体中に本発明のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物に関するものである。好ましくは本発明の医薬組成物は、１）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体および２）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているものを含むものである。特に好ましいデキストラン部分は、以下のデキストラン−レプチン結合体で例示しているように約６ｋＤである。
【００１８】
本発明はさらに、上記のようなデキストラン−レプチン結合体の製造方法に関するものでもある。
【００１９】
本発明はさらに、上記のようなデキストラン−レプチン結合体および結合体混合物を用いた患者治療方法に関するものでもある。
【００２０】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチン（「レプチン」）およびデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体（「デキストラン−レプチン」）のＥｎｄｏｌｙｓ−Ｃ消化ペプチドマッピング記録であり；図１Ｂは、Ｅｎｄｏａｓｐ−Ｎ消化ペプチドマッピング記録である。各記録における矢印は、未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンのＮ末端ペプチドを示す。
【００２１】
図２は、６ｋＤデキストランレプチン結合体のかなりの割合が二量化していることを示す、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルを示している。列１は分子量標準であり（Mark 12, Novex, San Diego, CA）；列２は対照としての未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンであり；列３はデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体混合物であり；列４はイオン交換クロマトグラフィー後のデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体である。
【００２２】
図３は、（ａ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチン（「レプチン」）および（ｂ）Ｎ−末端デキストランｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体（「ｄｅｘ−レプチン」）についての、１日１回投与試験で第７日終了後の、用量に対する緩衝液対照と比較した体重減少量に関するマウスデータを示すグラフである。
【００２３】
図４は、単回投与試験における未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体の持続的体重減少効果についてのマウスデータを示すグラフである。体重減少は、時間（日）に対する緩衝液対照と比較した体重減少％として測定している。
【００２４】
図５は、単回投与ラット試験での未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての血液循環時間を示すものである。図５Ａは静脈注射データを示しており、図５Ｂは皮下注射データを示している。
【００２５】
図６は、（ａ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンおよび（ｂ）１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての、１日１回投与試験で第７日終了後の、時間に対する緩衝液対照と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフである。
【００２６】
図７は、（ａ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンおよび（ｂ）１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての、単回投与での、時間に対する緩衝液対照と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフである。
【００２７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は特に、効力が向上し、血漿循環時間が延長し、腎臓空胞形成がないという長所を有するデキストラン−レプチン結合体を提供するものである。本発明のデキストラン−レプチン結合体の別の長所には、溶解度の向上および注射部位反応の低減などがある。
【００２８】
デキストラン類
本発明の実施において使用される低分子量デキストラン類には、約１ｋＤ〜約２０ｋＤの分子量を有するデキストラン類、より好ましくは約１ｋＤ〜約１０ｋＤの範囲の分子量を有するデキストラン類が含まれる。さらに好ましいものとしては、約１ｋＤ〜約７ｋＤの分子量を有するデキストランである。ヒト用の医薬品の商業的製造を容易にする上で特に好ましいデキストランは、約６ｋＤの分子量を有するものである（「約」という用語は、「背景」の欄で前述した意味で使用）。平均すると、６ｋＤデキストラン１モルは３３．３個のグルコースサブユニットからなる。
【００２９】
同様の理由でさらに好ましくは未分岐デキストランである。「自然」デキストランはリューコノストック属細菌が産生する。「臨床」デキストランは、自然デキストランの脱重合によって製造される。場合によっては、α１−３連結によって連結されたグルコース分子のある種の側鎖基が形成されるようにデキストラン部分を製造することができる。そのような側鎖基の形成は当業界では一般的に「分岐」と称される。現時点で完全に解明されているわけではないが、そのような側鎖基を有する大分子量デキストラン部分の方がヒトにおけるアナフィラキシーを起こしやすいと考えられる。理論に拘束されるものではないが、低分子量デキストランでは分岐、特に複数の分岐すなわちデキストラン１分子当たり複数のα１−３側鎖基の可能性が低いと考えられている。複数の分岐が、大きい免疫複合体形成の原因となるデキストラン上の既形成デキストラン反応性抗体の凝集を起こすと仮定されていることから、その点は非常に重要である。従って好ましくは、ヒト用治療薬の場合、本発明で想到される組成物におけるデキストラン部分は、グルコースサブユニット間が主としてα１−６連結であって、α１−３側鎖基が少ないものである。リューコノストック−メゼンテロイデス株ＮＲＲＬ  Ｂ  ５１２が産生する臨床デキストランがアナフィラキシー反応を低減することが明らかになっている（Richter et al.,前述）。
【００３０】
そこで、本発明のデキストラン−レプチン結合体で使用される低分子量デキストランの重要な特性は、循環既形成ＤＲＡの力価が高い患者に対して非アナフィラキシー性であるという点である。
【００３１】
デキストランの活性化
デキストラン部分を「活性化」して、それをレプチン蛋白部分に結合させることができるようにする。そのような活性化法は当業者には公知であり、特にはレプチン蛋白上に存在する化学部分と結合を形成することができる化学部分をデキストランに導入するという方法などがある（概論については、Larsen Advanced Drug Delivery Reviews 3: 103-54 (1989)；引用によって本明細書に含まれる）。「活性化」デキストランという用語は、複数の反応性基を有するデキストランを指す。デキストラン上の「活性化」化学部分の種類は、デキストラン部分を蛋白部分に結合させたい方法によって決まる。例えば、デキストラン部分にアルデヒド基を付加させて、アミン結合を形成するための還元条件下でデキストラン部分をレプチン部分に結合させることができる。
【００３２】
特に好ましい活性化方法は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化である。公知の手順に従ってデキストランを酸化して、複数のアルデヒド基を持たせる（Battersby et al., J. Contr. Rel., 42: 143-56 (1996); Fabnani et al., (1990), supra；引用によって本明細書に含まれる）。好ましい酸化方法は、後述の実施例に開示されている。過ヨウ素酸塩のグルコースサブユニットに対するモル比は、所望の酸化程度に応じて変動し得る。一般に、過ヨウ素酸塩のグルコースサブユニットに対するモル比は、約０．０２：１〜約３：１、好ましくは約０．１：１〜約１．５：１で変動し得る。デキストランのグルコースサブユニットの約５％〜約５０％を酸化することが想到される。このパーセントは総反応混合物についての平均を表し、個々のデキストラン部分はそれより低いまたはそれより高いパーセントを有し得る。約１０％のグルコースサブユニットがアルデヒド基を有することが特に好ましい。「酸化」デキストランという用語は、複数のアルデヒド基を有するデキストランを指す。
【００３３】
レプチン蛋白へのデキストランの付着
デキストラン部分は、蛋白の機能性領域または抗原性領域に対する効果を考慮して、レプチン部分に結合しなければならない。デキストラン部分の結合方法は変わり得るものであって、多くの方法を当業者は利用できる。例えば、デキストランを蛋白部分に共有結合的に結合させることができる。共有結合は、遊離アミンまたはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基で形成することができる。好適なアミン基を有するアミノ酸残基には、レジン残基およびレプチン蛋白部分のＮ末端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カルボキシル基を有するアミノ酸には、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および蛋白部分のＣ末端アミノ酸残基などがあり得る。スルフヒドリル基もデキストラン部分の結合のための反応性基として使用することができる。別法として、例えば挿入または部位指向性突然変異原性によって、蛋白部分に反応性基を導入することができる。商業的製造を容易にする上で、蛋白部分のＮ末端での結合のように、アミノ基での結合が好ましい。
【００３４】
概してアルデヒド活性化デキストランは、アミン結合を形成する還元条件下でレプチン部分に結合することができる（Larsen, supra；Fagnani et al. (1990), supra参照；ＰＣＴＷＯ９６／１１９５３も参照）。デキストラン部分のレプチン部分に対するモル比は約５：１〜約１００：１の範囲であり、好ましくは約２０：１である。好ましくは反応混合物のｐＨを約４．８程度に維持して、酸化デキストラン部分とレプチン部分の結合がＮ末端部位特異的となるようにする。ｐＨは、レプチン部分のアミノ末端アミンがまだプロトン化されないことで、レプチン部分の他の位置にあるアミノ基がプロトン化されて非反応性となっている中で反応性であるようにするだけの酸性でなければならない。
【００３５】
当業者であれば、他の既存の反応性基を用いてあるいは上記の開示のようにレプチン部分に別の反応性基を導入して、反応混合物のｐＨ上昇のように反応パラメータを変えることで複数反応性レプチン部分を得ることが可能であることが想到される。当業者であれば、いくつかの公知の化学的結合方法のいずれかを組み合わせて複数反応性レプチン部分を得る方法は明らかであろう。
【００３６】
デキストラン部分は、「架橋」試薬とも称される化学的連結基や各種長さのアミノ酸のいずれであっても、「連結基」部分によってレプチン部分に結合させることもできる。そのような化学的連結基は当業界では公知であり、同種二官能性化学連結基（すなわち、連結基の各端部に同じ反応性基）および異種二官能性化学連結基（すなわち、連結基の各端部に異なる反応性基）などがある。当業者であれば十分に理解しているように、反応性基の種類、反応性末端間の距離、レプチン部分からのデキストラン部分の開裂を生じさせ得る内部代謝可能結合などの連結基の他の有用な特徴などを考慮して、化学連結基の選択を行うことができる（例えば、架橋試薬のリストについてのPierce Product Catalog, 1997 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL）およびそれに引用されている参考文献参照）。化学連結基は、本セクションで前述したいずれかの反応性基を介してレプチン部分に結合させることができる。当業者であれば十分に理解しているように、立体配座すなわち可撓性ならびにペプチドの大きさを考慮して、ペプチド連結基を選択することができる（例えば、Neve et al., Cytokine 8: 365-70 (1996)；Hallewell et al., J. Biol. Chem., 264: 5260-68 (1989)参照；概論については、Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-76 (1978)参照）。アミノ酸連結基配列には以下のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
（ａ）ａｌａ，ａｌａ，ａｌａ；
（ｂ）ａｌａ，ａｌａ，ａｌａ，ａｌａ；
（ｃ）ａｌａ，ａｌａ，ａｌａ，ａｌａ，ａｌａ；
（ｄ）ｇｌｙ，ｇｌｙ；
（ｅ）ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ；
（ｆ）ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ；
（ｇ）ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｇｌｙ；
（ｈ）ｇｌｙ，ｐｒｏ，ｇｌｙ；
（ｉ）ｇｌｙ，ｇｌｙ，ｐｒｏ，ｇｌｙ，ｇｌｙ；
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）の小部分のいずれかの組合せ。
【００３８】
融合蛋白としてのレプチン部分の発現によって、アミノ酸連結基配列をレプチン部分のＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合させることができる。
【００３９】
デキストラン−レプチン結合体
デキストラン−レプチン結合体の組成
本発明のデキストラン−レプチン結合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、質量分析、ＲＰ−ＨＰＬＣペプチドマッピングおよびＮ末端配列分析などの当業界で公知の方法を用いて特性決定することができる。一般に、上記の方法に従ってレプチン部分にデキストランを結合させた後には、反応混合物中に少なくとも３種類のＮ末端デキストラン−レプチン結合体が存在することが認められている。その３種類とは、１）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているもの、２）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているものおよび３）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているものである。デキストラン２個−レプチン２個の化学種は１対のデキストラン−レプチン結合体が互いに結合することで形成されると考えられている。代表的には、最後の２種類が反応混合物の約６５〜８５％を構成しており、第１の化学種は代表的には反応混合物の５〜１０％に相当する。残りの少量の化学種はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、未反応のレプチンおよび比較的高分子量のものである。これらは公知の方法を用いて混合物から除去することができる。精製後、上記２種類の二量体が代表的にはデキストラン−レプチン結合体の約７０〜９０％を構成する。
【００４０】
デキストラン−レプチン結合体が二量体を形成する性質を低下させたい場合には、当業者であれば、二量体形成への指向性が低い前記のようなレプチン類縁体を製造できることが想到される。
【００４１】
レプチン蛋白類
本発明のデキストラン−レプチン結合体に使用されるレプチンの種類は、上記で引用し、引用によって全内容が本明細書に含まれるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／０５３０９に記載のものから選択することができる。その公開の図３（その明細書では配列番号４としている）には、ヒトレプチン（ヒト「ＯＢ」蛋白と称する）について誘導された推定アミノ酸配列全長を示してある。アミノ酸には１〜１６７の番号を付してある。信号配列開裂部位はアミノ酸２１（Ａｌａ）の後に位置することから、成熟（mature）蛋白はアミノ酸２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６７（Ｃｙｓ）に広がる。本発明の開示において、本明細書では異なる番号割り付けを行っており、アミノ酸位置１は成熟蛋白の始点にあるバリン残基である。成熟組換えメチオニルヒトレプチンについてのアミノ酸配列は本明細書では配列番号１として示してあり、成熟蛋白の最初のアミノ酸はバリンであり、メチオニル残基は位置−１にある（以下の配列には含まれていない）。
【００４２】
【化１】
0004199421.tif 000002
しかしながら、本発明におけるレプチン部分に関しては、位置−１のメチオニル残基は存在していなくても良い。
【００４３】
別形態として、１４５アミノ酸を有し、配列番号１のｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して位置２８のグルタミンが存在しないヒトレプチンの自然変異体を用いることができる。
【００４４】
概して、ヒトでの医薬用途向けのレプチン部分は、ヒトでの治療に用いることができる（以下の動物レプチンも参照）。そこで、活性を経験的に調べて、どのレプチン部分を用いることができるかを決定することができる。ＷＯ９６／０５３０９に記載のように、自然型でのレプチン蛋白または断片（酵素開裂産物など）その他の切断型ならびに類縁体におけるレプチン蛋白はいずれも生理活性を保持し得る。そのような形を本発明のデキストラン−レプチン結合体のレプチン部分として用いることができる。ただし、そのような変化した形については試験を行って、所望の特性を調べなければならない（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／４０９１２、ＷＯ９７／０６８１６、９７／１８８３３、ＷＯ９７／３８０１４、ＷＯ９８／０８５１２およびＷＯ９８／２８４２７（これらは引用によってその全内容が本明細書に含まれる）も参照）。
【００４５】
マウス配列と異なるアミノ酸を置き換えるように、組換えヒト配列におけるアミノ酸残基を変えることで、組換えヒトレプチンの類縁体を製造することができる。マウスレプチンは、特に成熟蛋白として、さらには特にＮ末端でヒトレプチンとかなり相同性が高い。組換えヒト蛋白はマウスにおいて生理活性を有することから、そのような類縁体はヒトにおいて活性である可能性が高いと考えられる。例えば、配列番号１で表される自然ヒトレプチンのアミノ酸配列では、位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５における１以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることができる。マウス蛋白の相当する位置のアミノ酸（Zhang et al., 1994, supra参照）または別のアミノ酸を選択することができる。
【００４６】
さらには、ラットＯＢ蛋白配列に基づいて「コンセンサス」分子を得ることができる（Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 209: 944-52 (1995)；引用によって本明細書に含まれる）。ラットＯＢ蛋白は４、３２、３３、３５、５０、６８、７１，７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５の位置（配列番号１の番号割り付けを使用）でヒトＯＢ蛋白と異なる。これらの各種位置の１以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することができる。下線を施した位置は、マウスＯＢ蛋白とラットＯＢ蛋白がヒトＯＢ蛋白と異なっており、従って変更に特に好適であるものである。これらの位置の１以上で、相当するラットＯＢ蛋白からのアミノ酸または別のアミノ酸を置き換えることができる。
【００４７】
成熟ヒトＯＢ蛋白とは異なるラットおよびマウスの両方のＯＢ蛋白からの位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。相当するラットまたはマウス配列で認められるアミノ酸などの別のアミノ酸で１以上の上記アミノ酸が置き換わった配列番号１によるＯＢ蛋白も有効である場合がある。
【００４８】
さらに、成熟ヒトＯＢ蛋白とは異なるアカゲザルＯＢ蛋白で認められるアミノ酸（括弧内で、１文字のアミノ酸略称で識別）は、８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）である。組換えヒトＯＢ蛋白はカニクイザルにおいて活性であることから、１以上のアカゲザルの各種アミノ酸が括弧内のアミノ酸などの別のアミノ酸に置き換わった配列番号１によるヒトＯＢ蛋白は有効である可能性がある。留意すべき点として、ある種のアカゲザル各種アミノ酸も上記のマウスおよびラット類で認められるものである（位置３５、６８、８９、１００、１０８および１１８）。そこで、位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の位置で、１以上のアミノ酸配列が別のアミノ酸によって置き換わっているマウス／ラット／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子（配列番号１の番号割り付けを使用）を得ることができる。下線を施した位置は、３種類の動物全てがヒトＯＢ蛋白と異なっているものである。特に好ましいヒトレプチン類縁体は、位置１００（Ｔｒｐ）または１３８（Ｔｒｐ）、より好ましくはその両方の位置のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはＧｌｎによって置き換わったものである。
【００４９】
他の類縁体は、蛋白アミノ酸配列の一部を欠失させることで得ることができる。例えば、成熟蛋白はリーダー配列（−２２〜−１）を欠いている。
【００５０】
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６；
（ｉｉ）アミノ酸１〜９９および（連結した）１１２〜１４６；
（ｉｉｉ）アミノ酸１〜９９および（連結した）１１２〜１４６で１以上のアミノ酸１００〜１１１がアミノ酸９９とアミノ酸１１２の間で順番通りに置き換わっているもの
という切断型のヒトＯＢ蛋白分子（配列番号１の番号割り付けを使用）を得ることができる。
【００５１】
さらに上記切断型は、ヒトＯＢ蛋白とは異なる（マウス、ラットまたはアカゲザルＯＢ蛋白で）変化した１以上のアミノ酸を有することもできる。さらに変更は、ペプチド様体またはＤ−アミノ酸類などの変化させたアミノ酸の形であることができる。
【００５２】
さらには、酸性度、電荷、疎水性、極性、大きさまたは当業者には公知の他の特性に従って「保存的」であるアミノ酸置換を有する上記の蛋白も含まれる。これらを以下の表１に示す（概論として、Creighton, Proteins, passim (W. H. Freeman and Company, N.Y., 1984)；Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991)参照；これらは引用によって本明細書に含まれる）。
【００５３】
【表１】
0004199421.tif 000003
【００５４】
従って、本発明のデキストラン−レプチン結合体は（本明細書の配列番号１に示したアミノ酸配列に従って）、
（ａ）位置２８のグルタミニル残基がなくても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１以上で置換された異なるアミノ酸を有する小項目（ａ）のアミノ酸配列；
（ｃ）位置１００および１３８のアミノ酸がＧｌｎで置換された小項目（ｂ）のアミノ酸配列；
（ｄ）
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６；
（ｉｉ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｉｉｉ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６で１以上のアミノ酸１００〜１１１がアミノ酸９９とアミノ酸１１２の間で順番通りに置き換わっているもの；
（ｉｖ）１以上のアミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５が別のアミノ酸によって置換されている小項目（ｉ）の切断レプチン類縁体；
（ｖ）１以上のアミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５が別のアミノ酸に置き換わっている小項目（ｉｉｉ）の切断レプチン類縁体；
（ｖｉ）１以上のアミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５が別のアミノ酸に置き換わっている小項目（ｉｉｉ）の切断レプチン類縁体；
（ｖｉｉ）Ｎ末端メチオニル残基を有する小項目（ｉ）〜（ｖｉ）の切断レプチン類縁体
から選択される切断レプチン蛋白類縁体；
（ｅ）１以上の保存アミノ酸置換を有する小項目（ａ）〜（ｄ）のいずれかのレプチン蛋白；
から選択することができる。
【００５５】
レプチン蛋白、類縁体および関連する分子は以下の刊行物に報告されている。しかしながら、報告の組成物の活性に関しては記載がない。
【００５６】
米国特許５５２１２８３号；５５２５７０５号；５５３２３３６号；５５５２５２２号；５５５２５２３号；５５５２５２４号；５５５４７２７号；５５５９２０８号；５５６３２４３号；５５６３２４４号；５５６３２４５号；５５６７６７８号；５５６７８０３号；５５６９７４３号；５５６９７４４号；５５７４１３３号；５５８０９５４号；５５９４１０１号；５５９４１０４号；５６０５８８６号；５６１４３７９号；５６９１３０９号；５７１９２６６号（Eli Lilly and Company）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／２３５１３；ＷＯ９６／２３５１４；ＷＯ９６／２３５１５；ＷＯ９６／２３５１６；ＷＯ９６／２３５１７；ＷＯ９６／２３５１８；ＷＯ９６／２３５１９；ＷＯ９６／２３５２０；ＷＯ９６／２３８１５；ＷＯ９６／２７３８５；ＷＯ９６／３４１１１；ＷＯ９６／３７５１７；ＷＯ９７／００８８６；ＥＰ７２５０７８；ＥＰ７２５０７９；ＥＰ７４４４０８；ＥＰ７４５６１０；ＥＰ８３５８７９（Eli Lilly and Company）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／２２３０８（Zymogenetics）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３１５２６（Amylin Pharmaceuticals, Inc.）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３４８８５；ＷＯ９７／４６５８５（Smithlkine Beecham PLC）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３５７８７（Chiron Corporation）；
ＰＣＴ  ＷＯ９７／１６５５０（Bristol-Myers Squibb）；
ＰＣＴ  ＷＯ９７／２０９３３（Schering Corporation）；
ＥＰ７３６５９９（Takeda）；
ＥＰ７４１１８７（F. Hoffman LaRoche）。
【００５７】
これらの引用文献が有用なレプチン蛋白または類縁体、あるいは関連する組成物もしくは方法を提供する限りにおいて、そのような組成物および／または方法を、併用投与（特定の投与計画で一緒にまたは別個に）などの本発明のデキストラン−レプチン結合体と組み合わせて用いることができる。上記の条件で、これら刊行物は引用によって本明細書に含まれるものとする。
【００５８】
具体的に想到されるものとしては、位置２８のグルタミニル残基がなくても良く、さらには（ａ）Ｎ末端のみでデキストラン部分にまたは（ｂ）レプチン蛋白のＮ末端以外の位置で別のデキストラン部分との組合せでＮ末端でデキストラン部分に結合したＮ末端メチオニル残基を有していても良い配列番号１のアミノ酸配列である組換えヒトレプチン（「ｒＨｕ−レプチン」）というデキストラン−レプチン結合体がある。特に、本発明のデキストラン−レプチンのデキストラン部分は、約１ｋＤ〜約２０ｋＤ、詳細には約１ｋＤ〜約１０ｋＤ、さらに詳細には約１ｋＤ〜約７ｋＤの範囲の分子量、最も詳細には約６ｋＤの分子量を有することができる。具体的に想到されるものとしては、ｒｍｅｔＨｕ−レプチンにＮ末端で結合した６ｋＤデキストラン部分から構成されるデキストラン−レプチン結合体がある。本発明のデキストラン−レプチン結合体のデキストラン部分は好ましくは、α１−３分岐を低減する菌株から得られるものである。
【００５９】
具体的に想到されるものとしては、
（ａ）１個のデキストラン部分が１個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体
（ｂ）１個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体および
（ｃ）２個のデキストラン部分が２個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているもので、
前記デキストラン部分が、位置２８のグルタミニル残基を欠いていても良く、さらにはＮ末端にメチオニル残基を有していても良い配列番号１のアミノ酸配列を有するレプチン部分にＮ末端で結合しているものを組み合わせて含むデキストラン−レプチン結合体混合物もある。
【００６０】
動物レプチン
上記の治療効果を有するヒトレプチン以外に、ある種の動物レプチンも動物の治療用に利用可能である。ネコレプチンがＷＯ９７／３２０２２に開示されている（これは引用によって本明細書に含まれる）。他の動物種がＷＯ９６／３６６４４、ＥＰ７４３３２１（ブタおよびウシ）；ＷＯ９８／０４２８８（ウシ）；ＷＯ９８／０４６９０（ブタ）（これらはいずれも引用によって本明細書に含まれるものとする）に開示されている。
【００６１】
医薬組成物
本発明のさらに別の態様では、本発明のデキストラン−レプチン結合体の医薬組成物ならびに治療用にそのような医薬組成物を用いる治療方法が提供される。そのような医薬組成物は、ボラス注射または注入（例：静注または皮下注射）によって投与することができたり、あるいは経口、経鼻、経皮その他の形態で投与することができる。概して本発明には、医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／または担体とともに有効量の本発明のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物が含まれる。そのような医薬組成物には、各種緩衝剤含有量（例：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗浄剤および可溶化剤（例：Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例：チメルソル（Thimersol）、ベンジルアルコール）および増量物質（例：乳糖、マニトール）などの添加剤が含まれ、ポリ酢酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状製造物へのあるいはリポソーム類への材料の組み込みを行う（例えば、ＰＣＴ  ＷＯ９６／２９９８９参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。ヒアルロン酸も用いることができ、それは循環中での持続期間延長の効果を有すると考えられる。そのような組成物は、物理的状態、安定性、in vivo放出の速度、ならびに本発明のデキストラン−レプチン結合体のin vivoクリアランス速度に影響を与え得る（例えば、Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pp.1435-1712参照；引用によって本明細書に含まれる）。組成物は液体の形で製造することができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末で製造することができる。埋め込み式徐放製剤も想到され、経皮製剤などがある。
【００６２】
ＰＣＴ  ＷＯ９５／２１６２９（引用によって全内容が本明細書に含まれるものとする）に記載のような経口製剤が想到される。そのＰＣＴ公開には、デキストラン部分によって修飾された蛋白を含む化学修飾された蛋白の経口投与について記載されている。そこに開示の組成物および方法は本発明に応用して、本発明のデキストラン−レプチン結合体の経口投与製剤を得ることができる。
【００６３】
本発明のデキストラン−レプチン結合体の肺投与も想到され、本発明のデキストラン−レプチン結合体の製剤および使用についてはＰＣＴ  ＷＯ９４／２００６９に開示の組成物および方法が有用である。化学修飾Ｇ−ＣＳＦの肺投与を開示しているＷＯ９４／２００６９は引用によって本明細書に含まれるものとする。
【００６４】
本発明のデキストラン−レプチン結合体は最も有利には、平均粒径１０μｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの粒剤で製剤することで、遠位肺に最も有効に搬送するようにしなければならない。
【００６５】
本発明のデキストラン−レプチン結合体の経鼻投与も想到される。経鼻投与によって、肺に薬剤を堆積させる必要なく、鼻に治療薬を投与することで、血流に蛋白を直接入れることができる。経鼻投与用製剤には、デキストランまたはシクロデキストリンなどのデキストリンを含むものなどがある。他の粘膜を通る輸送を介した投与も想到される。
【００６６】
用量
当業者であれば、投与および所望の治療効果の観察によって、有効な用量を確認することができる。好ましくは結合体の製剤は、レプチン部分約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜レプチン部分１０ｍｇ／ｋｇ／日が所望の治療効果を生じるようなものとする。有効用量は、経時的に診断手段を用いて求めることができる。例えば、血液中（または血漿もしくは血清中）のレプチン量を測定する診断手段を最初に用いて、レプチン蛋白の内因性レベルを求めることができる。そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッセイなどの抗体アッセイの形のものとすることができる。内因性レプチン蛋白の量を最初に定量し、基底線値を求める。治療用量は、内因性および外因性レプチン蛋白部分（すなわち、自己産生もしくは投与のいずれかで身体内に認められる蛋白、類縁体または誘導体）の量が治療期間にわたって継続するように決定する。従って用量は、治療期間を通じて変動し得るものであり、例えば最初は治療効果が認められるまで相対的に高い用量を用い、相対的に低い用量を用いて治療効果を維持する。
【００６７】
使用方法
治療
治療的使用には、体重調節、糖尿病の治療もしくは予防、血中脂質の低減（および関連する状態の治療）、除脂肪体重増加およびインシュリン感受性向上などがある。さらに本発明の組成物は、上記状態の治療または改善のための１以上の医薬品の製造に使用することができる。
【００６８】
体重調節
本発明の組成物および方法を体重減少に用いることができる。別の観点で見ると本発明の組成物を所望の体重または脂肪症レベルの維持に用いることができる。マウスモデルで示されているように（下記参照）、本発明のデキストラン−レプチン結合体を投与することで体重が減少する。体重低下は主として脂肪組織すなわち脂肪のものである。そのような体重減少は、以下に示すような併用条件の治療に関連し得るものであることから、治療的応用を構成するものである。さらに、体重調節が専ら容姿改善のためのものである場合には、本発明において美容上の使用が提供される。
【００６９】
糖尿病治療
本発明の組成物および方法は、ＩＩ型糖尿病の予防または治療において用いることができる。ＩＩ型糖尿病と肥満との間に相関がある可能性があることから、本発明を用いて体重を減少させることによって（または所望の体重を維持したり、あるいは脂肪レベルを低下もしくは維持することで）、糖尿病の進行を緩和または予防することもできる。さらに、体重低下を生じるだけの用量がなくとも、本発明の組成物を用いて、糖尿病を予防または改善することができる。
【００７０】
血中脂質の調節
本発明の組成物および方法を用いて、血中脂質レベルを調節することができる。高脂血症（脂肪血症；異脂肪症とも称される）は、循環血中に異常に多量の脂質が存在する状態である。理想的には、血中脂質レベルの低下のみが望ましい状況あるいは血中脂質レベルの維持が望まれる状況では、用量は体重減少を生じるほどのものとはならない。そこで、肥満患者の療法の初期においては、体重減少と同時に血中脂質レベルの低下が得られるような用量を投与することができる。十分な体重減少が得られたら、体重の再増加を防止することができるが、所望の血中脂質レベルまたは他の本明細書に記載の状態を維持することができるだけの用量を投与することができる。それらの用量は、レプチン蛋白の効果が可逆的であることから経験的に求めることができる（例：Campfield et al., Science 269,: 546-549 (1995) at 547）。そこで、体重減少が望ましくない場合に体重減少を生じる用量が認められる場合には、それより低い用量を投与して、所望の血中脂質レベルを得るようにし、しかも所望の体重を維持するようにすることができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／０６８１６参照；引用によって本明細書に含まれる）。
【００７１】
除脂肪体重の増加またはインシュリン感受性の向上
理想的には、除脂肪体重増加のみが望まれる場合、用量は体重減少を起こさない程度のものとなる。そこで、肥満者の治療の初期においては、体重減少と同時に脂肪組織減少／除脂肪体重増加が得られるような用量を投与することができる。十分な体重減少が得られたら、体重の再増加を防止することはできるが、所望の除脂肪体重増加を維持（または除脂肪体重減少の防止）できる用量を考慮することができる。体重低下を伴わない除脂肪体重増加は、患者が糖尿病治療のために投与を受けるインシュリン（または可能性として、アミリン、アミリン拮抗薬もしくは作働薬、あるいはチアゾリジンジオン類その他の可能な糖尿病治療薬）量を減らすように行うことができる。全体的な強さを高めるには、同様の用量面での検討が可能である。全体的強さの上昇を同時に伴う除脂肪体重増加は、体重低減を生じないだけの用量で得ることができる。赤血球（および血中酸素）増加および骨吸収低下もしくは骨粗鬆症低下などの他の利点も、体重減少を伴わずに得ることができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／１８８３３参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。
【００７２】
併用療法
本発明の組成物および方法は、食事の変更および運動などの他の療法と併用することができる。糖尿病治療に有用なものなどの他の医薬品（例：インシュリンおよび可能性としてアミリン、それらの拮抗薬もしくは作働薬、チアゾリジンジオン類（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０８５１２参照；引用によって本明細書に含まれる）、あるいは他の可能性のある糖尿病治療薬など）、コレステロールおよび血圧低下薬（血中脂質レベルを低下させるものまたは他の心血管薬など）、活動向上薬（例；アンフェタミン類）、利尿薬（脂質排出用）ならびに食欲抑制剤（ニューロペプチドＹ受容体に作用する薬剤またはセロトニン再取り込み阻害薬など）が使用可能である。そのような投与は同時に行うことができるか、あるいは順次行うことができる。さらに本発明の方法を、身体の全体的外観を変えるための美容手術（例：体重減少のための脂肪吸引もしくはレーザー手術、あるいは身体の見かけ上の大きさを増すための埋込手術など）の手術と併用することができる。バイパス術などの心臓手術または動脈閉塞などの脂肪沈着物による血管の閉塞が原因である有害な状態を緩和するための他の手術の健康上の利点を、本発明の組成物および方法を併用することで高めることができる。超音波法またはレーザー法などの胆石除去法も、本発明の治療法の前、最中または後に行うことができる。さらに本発明の方法を、骨折の手術もしくは治療、筋肉損傷の手術もしくは治療、その他の除脂肪組織体重増加によって改善されると考えられる治療法に対する補助的方法として用いることができる。
【００７３】
レプチンの製造方法
本発明で使用されるレプチン部分は、原核細胞または真核細胞で製造することができる。ただし、後述の実施例で使用されるレプチン部分については、商業的製造上容易であることから細菌が好ましい。さらには、所望の蛋白をコードする内因性遺伝子の調節に影響を与える自然もしくは導入調節要素を制御することで得られるものなどの、ヒト細胞で産生されるレプチンを使用することもできる。本発明のデキストラン−レプチン結合体で有用なレプチン部分の組換え発現については、ＷＯ９６／４０９１２に記載されており、それは引用によって、そこに引用されている全てのベクターおよび宿主株寄託物とともに本明細書に含まれるものとする。
【００７４】
結合体の精製
本発明の特定のデキストラン−レプチン結合体は、蛋白精製に関して当業界で公知の方法を用いて、デキストラン−レプチン結合体混合物から単離することができる。カチオン交換クロマトグラフィーを行うことで、１段階精製法を容易に行うことができる（例えば、Ralph et al., Biochemistry 34: 4889-97 (1995)参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。本発明のデキストラン−レプチン結合体の精製において有用な別の公知の精製方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィーが関与する（例えば、Pharmacia Biotech′s HiTrap HIC Test Kit Instructions, 71-7147-00, ed. AF. at 1-19 (1993; Uppsala, Sweden)参照；引用によって本明細書に含まれる）。
【００７５】
以下に記載の最初の実施例群では、６ｋＤのデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体を用いて、（１）活性；（２）自然ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較したin vivoでの循環時間増加；（３）生理的条件下での溶解度上昇（自然ｒｍｅｔＨｕ−レプチンとの比較）；（４）注射部位反応のない点；（５）霊長類における免疫原性応答の少ない点；ならびに（６）腎臓空胞化がない点を示してある。以下の実施例の第２の群では、１７．５ｋＤデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体を用いて、上記と同じ性能特性の一部を示してある。
【００７６】
実施例
動物
以下の実験で用いた試験動物は、マウスの場合ケージ当たり５匹、ラットの場合ケージ当たり２匹で飼育した。いずれの動物にも自由に飼料摂取させた。実験期間を通じて１２時間明／暗サイクルを維持した。動物に関しては、実験動物ケアに関する許容規範に従ってケアを行った。
【００７７】
デキストラン−レプチンの投与
被験組成物またはプラシーボのいずれかの投与を、動物頸部の背側首筋への皮下（「ｓｃ」）注射によって、あるいは留置カテーテルを介して尾静脈へ静脈注射することで（「ｉｖ」）行った。デキストラン−レプチン結合体の用量はいずれも、結合体のレプチン蛋白濃度を測定することで計算した。
【００７８】
レプチン蛋白
本実験には、組換えメチオニルヒトレプチン（ｒｍｅｔＨｕ−レプチン）を用いた。
【００７９】
実施例１
本実施例は、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体の製造を示すものである。
【００８０】
デキストランの活性化
６ｋＤデキストラン（ピーク分子量６ｋＤで多分散度薬１．７７ｋＤ）を購入した（Fluka Chemical Corp., Ronkonkoma, NY）。デキストランを活性化して、アルデヒド基を付加した。すなわち、０．３５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムを氷上で１０ｍＭ四ホウ酸ナトリウムにゆっくり加え、ｐＨをｐＨ３．０に調節した。６ｋＤデキストラン１２０ｇを上記溶液４００ｍＬに加え、混合物を室温で２４時間撹拌した。過ヨウ素酸塩のグルコースサブユニットに対するモル比は０．２６：１であった。撹拌を継続しながら、エチレングリコール７３．６ｍＬを加え、混合物をさらに２時間撹拌した。酸化デキストランを蒸留・脱イオンＨ２Ｏに対して強く透析した。
【００８１】
活性化の前後で、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いてデキストランを調べて、デキストラン部分の安定性を確認した。活性化後、活性化デキストラン部分上のアルデヒド数を、当業者に公知の方法を用いて定量した（Zhao & Heindel, Pharm. Res., 8, 400-02 (1991)）。他のデキストラン類も同様にして分析・活性化した。
【００８２】
デキストランのレプチン蛋白への付加
すなわちｒｍｅｔＨｕ−レプチンを、１０ｍｇ／ｍＬ酸化デキストラン、４０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）と混合した４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）中で約１ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液とした。デキストラン部分のレプチン部分に対する最終モル比は２０：１であった。混合物を室温で１時間にわたって回転台上で撹拌した。１ｍｇ／ｍＬＮａＢＨ３ＣＮの４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）溶液をＮａＢＨ３ＣＮ／デキストランのモル比１０：１で加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、低温室（４℃）に移し、撹拌を続けた。１０ｍｇ／ｍＬＮａＢＨ４の４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）溶液で、ＮａＢＨ４／酸化グルコース単位のモル比２．５：１（１０％または３．３モルの酸化グルコース単位／６ｋＤデキストラン１モル）にてデキストラン−レプチン結合体を処理した。氷上での撹拌を続けながらＮａＢＨ４溶液を滴下した。
【００８３】
特性決定
結合体のデキストラン置換の測定を行った。デキストラン−レプチン結合体の純度および大体の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【００８４】
酸化デキストラン部分の活性化アルデヒド基の結合がレプチン部分のＮ末端に結合したことを確認した。すなわち、デキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体および未修飾のｒｍｅｔＨｕ−レプチンを、２つの別個の実験でエンドプロテアーゼによって、それぞれレジン残基（ＥｎｄｏＬｙｓ−Ｃ）またはアスパラギン酸残基（ＥｎｄｏＡｓｐ−Ｎ）で切断した。サンプルを、それぞれ酵素／基質比１：５０および１：７５で、２５℃にてそれぞれ８時間および７時間消化させた。得られたペプチド断片について、ＹＭＣ  Ｃ−８カラム（内径２．１ｍｍ）を用いてＲＰ−ＨＰＬＣによってマッピングし、溶媒Ａ）０．１％ＴＦＡのＨＰＬＣ用水溶液および溶媒Ｂ）０．１％ＴＦＡの９０％ＨＰＬＣ用アセトニトリルという２種類の溶媒の勾配を用いて、１００％Ａで５分間；９０％Ａと１０％Ｂで８０分間；５０％Ａと５０％Ｂで５分間；１０％Ａと９０％Ｂで１０分間溶離を行った。カラムは２５℃に維持し、０．２ｍＬ／分で溶離した（Ralph et al., supra）。未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して、Ｅｎｄｏｌｙｓ−Ｃ消化したデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体のペプチドマッピング（図１Ａ）は、約１４分で１個のピークが消失していることを示していた。同様に、Ｅｎｄｏａｓｐ−Ｎ消化でのペプチドマッピング（図１Ｂ）は、約１６分で１個のピークが消失していることを示していた。未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンからのこれらペプチドについてはＮ末端で配列決定を行って同定し、プロテアーゼ消化によって生じたＮ末端ペプチドであることを確認した。そこで、レプチン部分へのデキストラン部分の結合は、Ｎ末端ペプチド選択的であった。さらに、Ｎ末端配列決定から約９８．６％遮断Ｎ末端が明らかになり、デキストランがｒｍｅｔＨｕ−レプチンに結合していることを示していた。
【００８５】
さらに、反応の性向が二量体形成指向的であったこと、すなわち２個のレプチン部分への１個のデキストラン部分に付加または２個のレプチン部分への２個のデキストラン部分の付加があったことを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。図２からわかる通り、かなりの割合のデキストラン−レプチン結合体が二量体の形を取っている（列３は、デキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体混合物である）。基材としてシナピン酸を用いる遅延抽出ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、列３の主要帯域が両方の二量体物（すなわち、１個のデキストラン部分−２個のレプチン部分、２個のデキストラン部分−２個のレプチン部分）からなることが確認された。未反応のｒｍｅｔＨｕ−レプチンおよび微量に形成された相対的に高分子量の化学種の一部は、イオン交換クロマトグラフィーによって、二量体結合体の大半およびモノマー結合体の少量から分離した（列４はイオン交換クロマトグラフィー後のデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体を示している）。
【００８６】
実施例２
本実施例は、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体の効力が未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して向上していることを示すものである。実施例１のデキストラン−レプチン結合体について、正常マウスでの体重減少誘発における効力を調べた。
【００８７】
８〜１０週齢で体重約２０ｇの正常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、１日１回７日間にわたって、被験デキストラン−レプチン結合体（上記の実施例１に記載のもの）、未修飾レプチンまたはプラシーボ（リン酸緩衝生理食塩水「ＰＢＳ」）のいずれかを注射した。デキストラン−レプチン結合体と未修飾レプチンの両方について、用量１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを調べた。試験期間を通じて体重をモニタリングした。
【００８８】
デキストラン−レプチン結合体投与群についての試験終了後（７日目）の体重変化を未修飾レプチン投与群と比較した。体重減少を、緩衝液対照に対する体重減少量として計算した（（緩衝液群体重−サンプル群体重）／緩衝液群体重×１００）。デキストラン−レプチン結合体の効力は、用量１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇで未修飾レプチンと比較して有意に高かった。さらに、デキストラン−レプチン結合体には用量−応答が認められた。ＰＢＳ緩衝液対照と比較した試験終了後の体重減少パーセントを、デキストラン−レプチン結合体および未修飾レプチンの両方についてｍｇ／ｋｇでの用量に対してプロットした。単純対数曲線に対してデータを適合させ、７％体重減少を得る上でのＥＤ５０（５０％最大体重減少を得るのに必要な用量）を仮定することで、図３に示したように、デキストラン−レプチン結合体および未修飾レプチンについてのＥＤ５０値がそれぞれ４ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇであると近似することができる。従ってデータから、本発明のデキストラン−レプチン結合体の効力が未修飾レプチンのほぼ５倍であることがわかる。
【００８９】
実施例３
本実施例は、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体の持続性体重減少効果を示すものである。８〜１０週齢で体重約２０ｇの正常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、デキストラン−レプチン結合体または未修飾レプチンのいずれかを用量１００ｍｇ／ｋｇで、第０日のみに皮下注射した。図４でわかる通り、デキストラン−レプチン結合体の体重減少効果は４〜５日間続いてピーク体重減少は２倍増加したが、未修飾レプチンの体重減少効果は１〜２日しか続かなかった。
【００９０】
ラットにおける薬物動態試験では、デキストラン−レプチン結合体が未修飾レプチンよりかなり長く血中に留まることが明らかになった。体重２００〜２５０ｇのカテーテルを取り付けた雄ラット（Wistar Kyoto）に、被験デキストラン−レプチン結合体（上記の実施例１に記載のもの）または未修飾レプチンを皮下注射または静脈注射（「ｉｖ」）で１０ｍｇ／ｋｇの単一用量で注射した。注射後一定の間隔で留置カテーテルから採血を行った。図５Ａからわかる通り、静脈注射したデキストラン−レプチン結合体は注射後７２時間にわたって血中に留まったが、未修飾レプチンは注射後約８〜１２時間で完全に消失した。いずれの分子も二相クリアランスを示したが、デキストラン−レプチン結合体についての初期相半減期と特に後期相半減期のいずれも有意に長くなっており、結合デキストランが血流からのレプチン蛋白のクリアランスを遅延させることを示している。そこで、デキストラン−レプチン結合体のin vivoでの血漿循環時間は、未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンの循環時間と比較して長くなった。
【００９１】
同様に図５Ｂから明らかなように、皮下注射したデキストラン−レプチン結合体は注射後９６時間にわたって血中に留まったが、未修飾レプチンについては注射後約１８〜２４時間という比較的急速なクリアランスであった。
【００９２】
実施例４
本実施例は、未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体が生理的条件下で高い溶解度を有することを示すものである。デキストラン−レプチン結合体と未修飾レプチンのサンプルを蛋白精製後に取った。サンプルをｐＨ７のダルベッコのＰＢＳ中に４℃で終夜透析した。未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンおよびデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体のそれぞれの希釈液（約１〜２ｍｇ／ｍＬのレプチン蛋白）を、アミコン・セントリプレプ（Amicon Centriprep；登録商標）１０（Beverly, MA）濃縮システムを用いて濃縮した。約０．５ｍＬの容量が得られるまで、４℃で３４００ｒｐｍにて期間を短縮した繰り返しサイクルでサンプルを遠心した。バイオラッド（BioRad）試薬（Hercules, CA）を用いるブラッドフォード（Bradford）アッセイ（Anal. Biochem., 72: 248-54 (1976)）によって、蛋白濃度を三連で測定した。未収色ｒｍｅｔＨｕ−レプチン溶液は中性ｐＨのＰＢＳ中で約２〜３ｍｇ／ｍＬで蛋白沈殿を示し始めると考えられるが、デキストラン−レプチン結合体は８０ｍｇ／ｍＬでなお可溶であった。さらに高い濃度では、デキストラン−レプチン結合体溶液は取り扱いが困難になった。当業者には明らかなように、緩衝系、温度、界面活性材およびイオン強度などのパラメータを調節することで、溶解度条件を至適化することができる。
【００９３】
実施例５
本実施例は、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体の注射部位反応が軽減されることを示すものである。正常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり３匹のマウス）に、実施例１で製造したデキストラン−レプチン結合体（ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．１）および未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチン（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、５％ソルビトール、ｐＨ４．０溶液）を２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ（それぞれ５ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬの濃度）の用量で１日１回７日間にわたって注射した。注射部位サンプルを８日目に採取した。動物の注射部位をいくつかの組織病理学的パラメータ、すなわち壊死、炎症（単核と化膿）、沈着レプチン、線維増殖および巨大細胞について分析した。そのような評価に基づくと、デキストラン−レプチン結合体は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で注射した場合であっても、注射部位で非常に良好に耐容された。レプチン沈着を示す証拠や注射跡周囲の組織壊死はなかった。未修飾レプチンと比較して、未修飾レプチンの臨床的に許容される濃度より高い濃度で注射部位反応は良好に耐容された。デキストラン−レプチン結合体の許容される注射部位反応についての上限濃度はまだ求めていない。
【００９４】
実施例６
本実施例は、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体に対して霊長類で免疫原性応答がないことを示すものである。チンパンジーに、実施例１で製造した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体を毎週３回４週間にわたって０．１ｍｇ／ｋｇで皮下注射投与し、チンパンジーの血清をＥＬＩＳＡによって分析した。デキストラン−レプチン結合体には、ＩｇＧ応答もＩｇＭ応答もほとんど認められなかった。高いバックグラウンド抗体レベルが認められたことから、阻害試験を行ってそれらの抗体がデキストラン（６ｋＤまたは７０ｋＤ）、６ｋＤデキストラン−レプチン結合体またはレプチン蛋白自体に対して反応性であるか否かを調べた。採血前サンプルおよび試験終了（２９日目）サンプルを用いた阻害試験で阻害に有意差は示されず、抗体反応性が既形成抗体指向性であることが示された。詳細には、７０ｋＤデキストランは完全阻害を示し、６ｋＤデキストランは部分阻害を示した。さらに、デキストラン−レプチン結合体も完全阻害を示し、未修飾レプチン蛋白単独では阻害を示さなかった。これらの結果は、抗体活性がデキストランに対してのものであったことを示している。最も可能性の高いものとしては、分岐デキストラン（７０ｋＤ）のエピトープが標的であった。その結果は、抗体活性がレプチン蛋白自体に対するもののではなかったことを明瞭に示している。
【００９５】
実施例７
本実施例は、モノポリエチレングリコール−レプチン結合体などの先行技術による水溶性ポリマー結合体と比較して、本発明の６ｋＤデキストラン−レプチン結合体に腎臓空胞形成がないことを示すものである。すなわち、マウス（群当たり３匹）に、実施例１で製造した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体および未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンを１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で１日１回７日間にわたって注射した。第８日にサンプルを回収した。管状空胞形成の評点を行った。いずれの用量でもデキストラン−レプチン結合体では腎臓空胞形成の誘発はなかった。組織病理学的所見は、未修飾レプチンで認められるものと同等であった。それとは対照的に、用量１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのモノペギル化レプチンは、同じ条件下でそれぞれ軽度および顕著な空胞形成を誘発した。
【００９６】
実施例８
本実施例は、本発明の別のデキストラン−レプチン結合体の製造および体重減少特性を示すものである。デキストランレプチン結合体を、６ｋＤデキストランに代えて１７．５ｋＤデキストランを用いた以外、実施例１の方法に従って製造した。１７．５ｋＤデキストランはフルカケミカル（Fluka Chemical Corp.）から購入した。
【００９７】
１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体について、正常マウスでの体重減少誘発における効力を調べた。８〜１０週齢で体重約２０ｇの正常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、被験１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体、未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンまたはプラシーボ（リン酸緩衝生理食塩水、「ＰＢＳ」）のいずれかを１日１回７日間にわたって注射した。１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体および未修飾レプチンの両方について、１０ｍｇ／ｋｇ用量を調べた。試験期間を通じて体重をモニタリングした。
【００９８】
１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体投与群についての試験期間中の体重減少を、未修飾レプチン投与群と比較した。図６からわかる通り、デキストラン−レプチン結合体の効力は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で未修飾レプチンより高かった。
【００９９】
１７．５ｋＤデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体の持続性体重減少効果についても調べた。１７．５ｋＤデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体または未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンのいずれかを用量１００ｍｇ／ｋｇのみで第０日に皮下注射した。図７からわかるように、デキストラン−レプチン結合体の体重減少効果は５〜６日続き、ピーク体重減少では１倍および１．５倍の増加があったのに対して、未修飾レプチンの体重減少効果は３〜４日間だけ続いた。
【０１００】
そこで本実施例により、体重減少に関して未修飾ｒｍｅＨｕ−レプチンと比較して本発明の１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体では効力が高くなっていることがわかる。
【０１０１】
実施例９
本実施例は、モノポリエチレングリコール−レプチン結合体などの先行技術による水溶性ポリマー結合体と比較して、本発明の１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体に腎臓空胞形成がないことを示すものである。マウスに、実施例７の手順に従って、１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体または未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンを１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で注射した。いずれの用量でも１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体では腎臓空胞形成の誘発はなかった。組織病理学的所見は、未修飾レプチンで認められるものと同等であった。
【０１０２】
実施例１０
本実施例は、デキストランによるアナフィラキシー反応を起こしやすい患者からのヒト抗体について、本発明のデキストラン−レプチン結合体に応答がないことを推定するものである。実験を行って、本発明のデキストラン−レプチン結合体が、循環する既形成デキストラン反応性抗体の力価が高い患者に対して非アナフィラキシー性であることを示す。
【０１０３】
多様な重度のアナフィラキシー反応（ＡＲ）を経験したことのある循環既形成ＤＲＡの力価が高い患者から血清を採取する。正常者からの血清も対照として採取する。
【０１０４】
in vitro試験
ＤＲＡ反応性についてのin vitro試験には、受動的赤血球凝集などの公知の方法がある（例えば、Hedin et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 52: 145-49 (1976)参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。ＤＲＡの力価はＡＲの重度と正の相関関係にあることが明らかになっている（Richter et al., supra, at 134-35参照）。
【０１０５】
例えば、デキストラン反応者の血清を受動的赤血球凝集アッセイで調べて、ＤＲＡ反応性血清が本発明のデキストラン−レプチン結合体と反応するか否かを調べる。すなわち、本発明のデキストラン−レプチン結合体が表面に吸収されている赤血球ならびに陰性対照として別個に未修飾レプチンおよび低分子量デキストランと陽性対照としての７０ｋＤデキストランを吸収した赤血球をＤＲＡ血清とインキュベートし、凝集の徴候について赤血球を観察する。ＤＲＡ血清は本発明の実施で使用される低分子量デキストランに対する親和性が低くなっており、ないしは低分子量デキストランは抗体凝集およびカスケード効果を起こさないことから、赤血球の凝集は起こらない。
【０１０６】
in vivo試験
別法として、動物試験を行って、本発明の低分子量デキストラン−レプチン結合体を用いた場合のＤＲＡ反応性を求める。最初に、アナフィラキシーを誘発するだけの用量で、デキストラン交差反応性抗血清および／または高分子量デキストラン（例：７０ｋＤデキストラン）に対する抗血清を用いて動物を感作する。次に動物について、本発明のデキストラン−レプチン結合体に曝露する。皮膚発現、急速な血圧降下、呼吸促迫、心停止などのアナフィラキシー反応の徴候を観察する。既形成ＤＲＡは本発明の実施で使用される低分子量デキストランとは反応性でないことから、アナフィラキシー反応の徴候は認められない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチン（「レプチン」）およびデキストラン−ｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体（「デキストラン−レプチン」）のＥｎｄｏｌｙｓ−Ｃ消化ペプチドマッピング記録である。
【図１Ｂ】  Ｅｎｄｏａｓｐ−Ｎ消化ペプチドマッピング記録である。各記録における矢印は、未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンのＮ末端ペプチドを示す。
【図２】  ６ｋＤデキストランレプチン結合体のかなりの割合が二量化していることを示す。
【図３】  （ａ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチン（「レプチン」）および（ｂ）Ｎ−末端デキストランｒｍｅｔＨｕ−レプチン結合体（「ｄｅｘ−レプチン」）についての、１日１回投与試験で第７日終了後の、用量に対する緩衝液対照と比較した体重減少量に関するマウスデータを示すグラフである。
【図４】  単回投与試験における未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体の持続的体重減少効果についてのマウスデータを示すグラフである。体重減少は、時間（日）に対する緩衝液対照と比較した体重減少％として測定している。
【図５Ａ】  単回投与ラット試験での未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての血液循環時間を示すものであり、静脈注射データを示している。
【図５Ｂ】  単回投与ラット試験での未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較した６ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての血液循環時間を示すものであり、皮下注射データを示している。
【図６】  （ａ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンおよび（ｂ）１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての、１日１回投与試験で第７日終了後の、時間に対する緩衝液対照と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフである。
【図７】  （ａ）未修飾ｒｍｅｔＨｕ−レプチンおよび（ｂ）１７．５ｋＤデキストラン−レプチン結合体についての、単回投与での、時間に対する緩衝液対照と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフである。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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