(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検鳥から得た血清をウイルス抗原と接触させて免疫学的反応により鳥インフルエンザウイルス感染を検査する方法において、
（ａ）鳥インフルエンザウイルスの構造タンパク質ＮＰが、ＮＰ遺伝子をＳｆ２１細胞中で発現させて得た組換えタンパク質であって、前記タンパク質をウイルス抗原として用いて自然感染鳥検体及びワクチン接種鳥検体をスクリーニングする工程と、
（ｂ）ワクチン接種血清に対する反応性の低い鳥インフルエンザウイルス非構造タンパク質ＮＳ１またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドが、ＮＳ１遺伝子をＳｆ２１細胞中で発現させて得た組換えタンパク質またはポリぺプチドであって、スクリーニング工程で陽性な検体血清を前記ＮＳ１タンパク質またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドと接触させて、自然感染鳥検体のみを識別する工程を含むことを特徴とする鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
【請求項２】
ＮＳ１タンパク質またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドが、ＮＳ１遺伝子を有するトランスファーベクターをバキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ２１にトランスフェクトして得た組換えタンパク質またはポリぺプチドである請求項１に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
【請求項３】
トランスファーベクターがｐＡｃＹＭ１であり、バキュロウイルスがＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺである請求項２に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
【請求項４】
免疫学的反応をウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、免疫凝集法、またはそれらの組み合せにより行なう請求項１〜３のいずれか１項に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
【請求項５】
鳥が家禽である請求項１〜４のいずれか１項に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
【請求項６】
家禽が鶏である請求項５に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、鳥インフルエンザ感染の検査方法、特に鳥インフルエンザに自然感染した家禽をワクチン接種した家禽と識別する検査方法に関する。
【背景技術】  近年、鳥インフルエンザ感染が世界各地で流行しており、その防除対策が求められている。鳥インフルエンザの防除対策の一つは、鳥（家禽類）へのワクチン接種であるが、ワクチン接種を行なった場合、ワクチンによる抗体上昇が起こるため、従来識別できていた自然感染鳥が識別できなくなるという問題が生じる。そのため、鳥へのワクチン接種の実施は、政府管理の下、ＤＩＶＡ（Ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｔｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌｓ（ワクチン接種を受けた動物と感染動物の区別））システムを導入した上で行なうことが国際機関によって勧告されている（ＦＡＯ／ＯＩＥ／ＷＨＯ  鳥インフルエンザ防除に関する専門家諮問会議勧告（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（２００４年２月））。
現在採用されているＤＩＶＡシステムは、流行中のウイルスとはＮＡ亜型が異なるヘテロワクチンを用いる手法である。すなわち、一般にインフルエンザウイルスはウイルス粒子の外殻表面に、それぞれＨＡ（ヘマグルチニン）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）からなる突起を有し、この組み合せによってＨ１Ｎ１（ＨＡ亜型＝１、ＮＡ亜型＝１）、Ｈ３Ｎ２（ＨＡ亜型＝３、ＮＡ亜型＝２）等の多数の抗原型に分類される。ある抗原型に属するインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）が流行している場合、同じ抗原型のワクチンを接種すると、抗原（Ｈ１、Ｎ１）に対する抗体価は、ワクチン接種鳥でも自然感染鳥でも等しく上昇するため両者の区別が困難になる（これがＤＩＶＡが必要とされる理由である。）。
現行のＤＩＶＡシステムでは、ＮＡ亜型が異なるヘテロワクチン（例えば、ＮＡ亜型＝２）を用いることで両者の識別を実現している。しかし、上記の手法では、ヘテロワクチンと同じＮＡ亜型のウイルスによる流行が始まった場合、ワクチン接種鳥と自然感染鳥との識別はできなくなり、自然感染鳥の完全な識別は困難である。また、この方法では、ワクチン接種群には、非接種群をおとり鳥として飼養し、自然感染の有無を見る必要がある。さらに、東南アジア諸国等では、流行種と同一抗原型のホモワクチン接種が行政のコントロールを受けずに未管理状態で行なわれており、こうした国々で上記のＤＩＶＡシステムを事後的に導入しても自然感染鳥の識別は困難である。
一方、ウイルスの非構造タンパク質をウイルス感染診断用のマーカーとして利用することが、いくつかの疾病で提案されている〔具体的には、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３，２１５１−２１５４（１９９２））、手足口病（Ｎｅｉｔｚｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４，７９９−８０４（１９９１））、馬インフルエンザ（Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５，２５５−２６３（１９９７）、Ｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．８２，１１１−１１９（２００１））〕。しかし、鳥インフルエンザの非構造タンパク質をウイルス感染の診断に提案した例はない。また、鳥インフルエンザウイルスの非構造タンパク質をＤＩＶＡ用マーカーとして利用するためには、自然感染ではその抗体価が上昇して、ワクチン接種ではその抗体価が上昇しないものでなければならない。鳥インフルエンザについて、従来、これらの検討はなされていない。
【発明の開示】
従って、本発明は、自然感染鳥をワクチン接種鳥と区別して識別するための鳥インフルエンザウイルス検査方法の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、鳥インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）と非構造タンパク質ＮＳ１の両者についてウイルス感染識別マーカーとしての可能性を検討した。その結果、構造タンパク質であるＮＰは、ワクチン接種鳥と天然感染鳥に区別なく反応するが、非構造タンパク質であるＮＳ１は、ワクチン接種鳥には反応せず、天然感染鳥にのみ反応することを見出した。すなわち、非構造タンパク質ＮＳ１がＤＩＶＡシステムの識別用抗原として利用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法を提供する。
１．被検鳥から得た血清をウイルス抗原と接触させて免疫学的反応により鳥インフルエンザウイルス感染を検査する方法において、ワクチン接種血清に対する反応性の低い鳥インフルエンザウイルス非構造タンパク質ＮＳ１またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをウイルス抗原として用いて、自然感染鳥のみを識別することを特徴とする鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
２．被検鳥から得た血清をウイルス抗原と接触させて免疫学的反応により鳥インフルエンザウイルス感染を検査する方法において、
（ａ）鳥インフルエンザウイルスの構造タンパク質をウイルス抗原として用いて自然感染鳥検体及びワクチン接種鳥検体をスクリーニングする工程と、
（ｂ）スクリーニング工程で陽性な検体血清をワクチン接種血清に対する反応性の低い鳥インフルエンザウイルス非構造タンパク質ＮＳ１またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドと接触させて、自然感染鳥検体のみを識別する工程を含むことを特徴とする鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
３．ＮＳ１タンパク質またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドが、ＮＳ１遺伝子をインフルエンザウイルス以外の宿主中で発現させて得た組換えタンパク質またはポリペプチドである前記１または２に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
４．宿主が昆虫細胞である前記３に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
５．ＮＳ１タンパク質が改変ＮＳ１タンパク質である前記３または４に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
６．改変ＮＳ１タンパク質がＣ末端にヒスチジンタグを有する改変タンパク質である前記５に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
７．免疫学的反応をウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、免疫凝集法、またはそれらの組み合せにより行なう前記いずれかの項に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
８．鳥が家禽である前記いずれかの項に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
９．家禽が鶏である前記８に記載の鳥インフルエンザウイルス感染の検査方法。
発明の効果
本発明の方法によれば、簡便な検査により鳥インフルエンザウイルスへの感染が判定できる。また、本発明の方法によれば、不活性化ホモワクチンを利用していても自然感染鳥とワクチン接種鳥の識別が可能であるため、先進諸国のみならず東南アジア地域等でも利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、鳥インフルエンザウイルスの非構造タンパク質ＮＳ１を抗原として用いる、ＤＩＶＡシステム用の鳥インフルエンザウイルス感染検査方法を提供する。
鳥インフルエンザウイルスを含むＡ型インフルエンザウイルスは、宿主細胞膜由来の脂質二重膜よりなる外被（エンベロープ）で囲まれた直径１００〜２５０ｎｍの粒子中に、核タンパク質（ＮＰ）、ＲＮＡ及びウイルスＲＮＡポリメラーゼ（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ）を含む。ＲＮＡは、８セグメント型で、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ（ウイルスＲＮＡポリメラーゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニンスパイク）、ＮＰ（核タンパク質）、ＮＡ（ノイラミニダーゼスパイク）、Ｍ（外被及びイオンチャネル）、ＮＳのコード領域に分かれている。ＮＳは非構造タンパク質であるＮＳ１と現在では構造タンパク質であると考えられるＮＳ２とをコードしている。
本発明では、ウイルス抗原として非構造タンパク質ＮＳ１またはそのアミノ酸配列の一部からなるポリペプチド（以下、ＮＳ１ポリペプチドと略記することがある。）を用いる。ＮＳ１は、馬インフルエンザに関して、Ｍ１タンパク質（外被を裏打ちしているタンパク質）の翻訳促進、ｍＲＮＡの核外輸送の調節機能を有するとの説もあるが、複製やウイルスリボヌクレアーゼの発現に不要だとする報告もあり（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４，５６６９−５６７３（１９９０））、その機能の詳細は不明である。いずれにせよ、後述の実験例で確認できるように、ＮＳ１タンパク質は生存ウイルス感染状態では発現するが、ワクチン中の含量は微量である。
本発明において、ＮＳ１タンパク質は、流行中の鳥インフルエンザウイルスから得てもよいし、他の抗原型の鳥インフルエンザウイルスから得てもよい。ＮＳ１タンパク質は、好ましくはＮＳ１遺伝子をインフルエンザウイルス以外の宿主中で発現させて得たものである。
鳥インフルエンザウイルスからのＮＳ１遺伝子の単離は常法により行なうことができる。典型的には、鳥インフルエンザウイルスの全ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写により合成し、ＮＳ１をコードする第８セグメントに特異的なプライマーを用いてＮＳ１コード領域を含むポリヌクレオチドを得る。第８セグメントに特異的なプライマーは、例えば、Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６，２２７５−８９（２００１）に記載されている。
発現系は、昆虫細胞、酵母のほか、大腸菌やバチルスなどの細菌、哺乳類細胞系のいずれでもよいが、発現タンパク質の翻訳後修飾や立体構造が本来のものに近いことや、大量に安定した抗原が得られることなどから、昆虫細胞の利用が好ましい。
昆虫細胞におけるＮＳ１遺伝子の発現は、ＮＳ１遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクターに挿入し、バキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞にコトランスフェクトさせ、ＮＳ１遺伝子を有する組換えバキュロウイルスを得てもよいし、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｌｕｃｋｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，４５６６（１９９３））等を用いてもよい。得られた組換えバキュロウイルスを宿主昆虫細胞に感染させることにより、昆虫細胞内に組換えＮＳ１タンパク質が得られる。
ＮＳ１タンパク質は、天然のＮＳ１タンパク質と同じ構造でもよいし、精製や免疫学的反応に適するように改変したものでもよい。一例として挙げれば、ＮＳ１タンパク質のＣ末端にポリヒスチジンタグ（通常、Ｈ６）を付加することにより、抗原性に影響を及ぼすことなく精製を容易に行なうことができる。抗原性に影響を及ぼさない限り、他の融合タンパク質（例えば、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）等を付加したもの）を用いてもよい。
このようにして得たＮＳ１タンパク質を用いて鳥インフルエンザウイルスを識別する免疫学的方法は、ＮＳ１タンパク質を抗原として用いる任意の抗原抗体反応である。すなわち、ＮＳ１タンパク質を、膜、カラム、基板、粒子、分子等に固定するか、特定の領域（例えば、ウェル内）に配置し、感染が疑われる鳥血清をこれに接触させ、鳥血清中のＮＳ１タンパク質抗体とＮＳ１タンパク質とを反応させて識別する。識別は、光学的、化学的、物理的方法のいずれでもよい。
好ましい抗原抗体反応としては、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、免疫凝集法等が挙げられる。
ＮＳ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した競合ＥＬＩＳＡ法を用いてもよい。これは、プレートに貼り付けたＮＳ１抗原と被検血清とを反応させ、次いでＮＳ１特異的モノクローナル抗体を添加する方法であり、もし、被検血清中にＮＳ１タンパク質に対する抗体が含まれていれば、ＮＳ１抗原はそれによってカバーされ、後から添加したＮＳ１特異的モノクローナル抗体はＮＳ１タンパク質に張り付くことができない。この競合ＥＬＩＳＡ法を用いると、検査する血清がどのような動物（アヒル、ガチョウ、ダチョウ、鶏、カモなど）由来のものでも、モノクローナル抗体を認識する抗マウス抗体により検出が可能である。
ウェスタンブロット法は常法により行なうことができる。すなわち、上述のようにしてＮＳ１遺伝子を発現させた宿主細胞（例えば、昆虫細胞）から全タンパク質を取り出し、これをアクリルアミドゲル上に展開し適当な転写膜上に転写する。ブロッキング後、血清を接触させ、発色試薬を加えＮＳ１バンドが検出されるかどうかを確認する。ＮＳ１タンパク質（２７〜２８ｋＤａ）の識別は対照（ＮＳ１遺伝子を導入しない宿主細胞から得た全タンパク質試料）との対比によって行なうことができる。対照試料は、例えば、ＮＳ１遺伝子を持たないバキュロウイルス（野生株のＡｃＮＰＶなど）を昆虫細胞に感染させて得る。
ウェスタンブロット法は、ＮＳ１タンパク質標準試料との反応によって行なってもよい。ＮＳ１タンパク質標準試料としては、好ましくは精製の容易なＨｉｓ−ｔａｇ付きＮＳ１タンパク質（ＮＳ１Ｈｉｓ）をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー等により精製したものを用いる。
本発明の目的では、ウェスタンブロット法にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いることができる。アクリルアミドゲル中のアクリルアミド濃度は１０〜１５％程度である。転写膜としてはニトロセルロースメンブレンを用いることができるが、ナイロンメンブレンやＰＶＤＦメンブレン等を用いてもよい。膜転写後、市販の酵素標識−抗鶏ＩｇＧ（検体が鶏由来の場合）を反応させ、さらに発色基質を加えることによってＮＳ１バンドの発色の有無を調べる。
ＥＬＩＳＡ法その他の抗原抗体反応への変更及び修正は当業者が容易になし得る。
また、本発明の検査方法では、構造タンパク質、特に核タンパク質（ＮＰ）を抗原として用いた検査をスクリーニング工程として先行させてもよい。すなわち、ＮＰを抗原として用いた検査で感染またはワクチン接種検体を非感染非ワクチン接種検体から識別し、陽性検体（感染／ワクチン接種検体）について非構造タンパク質ＮＳ１またはＮＳ１ポリペプチドを抗原として用いた検査を行なって自然感染検体とワクチン接種検体を識別する。
本発明の方法は、鳥、好ましくは家禽類、特に鶏に適用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明で用いる鳥インフルエンザウイルス構造タンパク質ＮＳ１の発現を示すクマシーブリリアントブルー染色（図１（Ａ））とウェスタンブロット（図１（Ｂ））の結果を示す写真である。
図２は、本発明で用い得る鳥インフルエンザウイルス核タンパク質ＮＰの発現を示すクマシーブリリアントブルー染色（図２（Ａ））とウェスタンブロット（図２（Ｂ））の結果を示す写真である。
図３は、本発明の方法により鳥インフルエンザウイルス感染鶏とワクチン接種鶏とを識別したウェスタンブロットの結果を示す写真である。
【実施例】  以下、本発明を実施例、比較例によってより詳細に説明する。なお、以下の実施例１及び参考例１において、鳥インフルエンザウイルスとしては、北里大学獣医畜産学部家禽疾病学教室での分離株＃４７８（Ｈ１Ｎ１）（Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｏｍｏｒｉ／４７８／０３：Ｈ１Ｎ１）を用いた。また、実施例２の鳥インフルエンザウイルス自然感染血清としては、動物衛生研究所でＡＩＶ（株名不明Ｈ９Ｎ２）感染６週後に採血した血清を用いた。実施例２の不活性化ウイルスは、北海道大学から分与されたＡ／Ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／９／９９：Ｈ９Ｎ２をホルマリン処理したものであり、高度免疫鶏とは、この不活化ウイルスをフロイントのコンプリートアジュバントとともに鶏に３回免疫して得られた血清である。
実施例１：ＮＳ１タンパク質の製造
（１）ＮＳ１遺伝子のクローニングと改変
１０日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に被検鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）液をシリンジを使って接種し、３７℃で２日間培養した。卵殻を消毒してから開卵して漿尿液を採取し、遠心分離して細胞片を沈殿させた。得られた上清からＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（株式会社ニッポンジーン）を用いマニュアル記載のプロトコルに準拠して全ＲＮＡを抽出した。ＡＩＶの８本の分節（セグメント）ＲＮＡの３’配列すべてに共通なプライマー（Ｕｎｉ１２：（ａｇｃａａａａｇｃａｇｇ（配列番号１））を用い、逆転写酵素（パーキンエルマージャパン）によりｃＤＮＡを合成した。逆転写（ＲＴ）の条件は、室温（２５℃）で１５分間、続いて４２℃６０分間で行ない、９９℃で酵素を不活化した。
次いで、ＮＳ１をコードする第８セグメントに特異的なプライマー（Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６，２２７５−８９（２００１））：
５’−ｔａｔｔｃｇｔｃｔｃａｇｇｇａｇｃａａａａｇｃａｇｇｇｔｇ−３’（配列番号２）；
５’−ａｔａｔｃｇｔｃｔｃｇｔａｔｔａｇｔａｇａａａｃａａｇｇｇｔｇｔｔｔｔ−３’（配列番号３）
を用い、上記ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行ない第８セグメントｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で４分間で開始した後、９４℃２０秒間、５８℃３０秒間、７２℃２分間を３０サイクル繰返し、最終ステップは７２℃５分間とした。
ＰＣＲで増幅した断片を、ＴＡクローニングキットを用いてクローニングベクターｐＣＲ２．１へとクローニングした。配列決定後（配列番号４）、ＮＳ１コード領域を挟むように新たにプライマー（配列番号５：ｃｇｇａｔｃＣＡＴＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧ、配列番号６：ｇａｇａａｃａａｔｔｇａｇｔｃａｇａａｇｔｔＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴｔｇａｇｇａｔｃｃｇ）を設計し、プラスミドにクローニングされた第８セグメントからＮＳ１領域のみを増幅させた。ＰＣＲ条件は、９４℃で４分間で開始した後、９４℃２０秒間、５８℃３０秒間、７２℃２分間を３０サイクル繰返し、最終ステップは７２℃５分間とした。なお、上記プライマーの一方（配列番号６）は、ＮＳ１遺伝子の３’末端を改変し、ＮＳ１のカルボキシ末端に６個のヒスチジンからなるＨｉｓ−Ｔａｇが付加されるようにプライマーを設計したものである。
（２）ＮＳ１を発現するバキュロウイルスの作製
ＰＣＲ後、増幅遺伝子をクローニングし、バキュロウイルス用トランスファーベクターｐＡｃＹＭ１（ウイルス学研究所、オックスフォード、英国：ＮＥＲＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）に挿入した。得られたプラスミドをバキュロウイルスＤＮＡ（ＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ）と共に昆虫細胞Ｓｆ２１（ウイルス学研究所）にトランスフェクトした。実験操作はバキュロウイルス発現実験マニュアル（Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ）のプロトコルに準拠した。相同組換えにより組換えバキュロウイルスＡｃＡＩＮＳ１Ｈｉｓを得た。
（３）ＮＳ１タンパク質の発現
ＮＳ１遺伝子を有するトランスファーベクターをバキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺのＤＮＡと共に、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、昆虫細胞Ｓｆ２１にトランスフェクトした。４日後に培養上清を回収し、プラック法によりウイルスをクローニングした。親株であるＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺは、Ｘ−ｇａｌ存在下で青色プラックを形成するが、組換えバキュロウイルスでは白色プラックを形成する。プラッククローニングを２回繰り返し、リコンビナントウイルスＡｃＡＩＮＳ１Ｈｉｓを得た。
ＮＳ１の発現を確認するために、ＡｃＡＩＮＳ１ＨｉｓをＳｆ２１細胞に感染させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブリリアントブルー染色するか、ニトロセルロース膜に転写後、抗ポリヒスチジン抗体（ＳＩＧＭＡ）を用いヒスチジンタグ付加タンパク質を検出した。その結果、図１（Ａ）のように、約２７ｋＤａの位置に特異的にタンパク質発現が認められ、このタンパク質は図１（Ｂ）で示すように、抗ポリヒスチジン抗体で検出された。
参考例１：ＮＰタンパク質の製造
ＮＰタンパク質発現のための組換えバキュロウイルスはＮＳ１と同様に作製した。ＮＰタンパク質遺伝子をコードしている第５セグメントをクローニングするため、鋳型は＃４７８ｃＤＮＡを用い、プライマーはＦｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６，２２７５−８９（２００１）を参考に：ＴＡＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧａｇｃａａａａｇｃａｇｇＧＴＡ（配列番号７）とＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴａｇｔａｇａａａｃａａｇｇＧＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号８）を用いた。配列決定後、ＮＰタンパク質遺伝子のみを増幅させるため、ｇａｇｇａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｇｔｃｃｃａａｇｇｃａｃ（配列番号９）とｇａｇｇａｔｃｃｔｔａａｔｔｇｔｃａｔａｃｔｃｃｔｃｔｇｃ（配列番号１０）を用いた。
得られたＮＰ遺伝子をＮＳ１同様バキュロウイルスに入れ、組換えバキュロウイルスＡｃＡＩＮＰを得た。ＡｃＡＩＮＰを昆虫細胞に感染させ、ＮＰタンパク質を得た。
実施例２：ＮＳ１タンパク質を用いた鳥インフルエンザウイルス感染の識別
実施例１で得た組換えウイルスＡｃＡＩＮＳ１ＨｉｓをＳｆ２１細胞に接種し、培養３〜４日後に細胞を回収した。細胞（約１０６ｃｅｌｌ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｌａｅｍｍｌｉの電気泳動用緩衝液８０μｌに再浮遊させ、１００℃沸騰水中で５分間加熱した。
得られた細胞溶解液を１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲル・スラブ電気泳動（１００Ｖで１時間）にかけ、全タンパク質を展開した。展開後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング液（スキムミルク−１０ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０−０．２ｍｌ、ＰＢＳ−２００ｍｌ）でタンパク質未吸着部分をブロックした。対照として、親株であるＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺをＳｆ２１細胞に感染させ、同様の操作を行った。
鳥インフルエンザ感染鶏血清、不活性化ウイルス高度免疫鶏血清を上記ブロッキング液で２５倍、５０倍、２５０倍に希釈後、上記タンパク質転写ニトロセルロース膜にかけ、室温（約２０℃）で１時間反応させた。次いで、ブロッキング液で膜を洗浄後、２次抗体（酵素標識−抗鶏ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）をブロッキング液で適宜希釈後反応させ、さらに、ブロッキング液で膜を洗浄後、発色基質（Ｂｍ  ｂｌｕｅ  ＰＯＤ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を加え、ＮＳ１Ｈｉｓのバンドが認識されるかどうか発色を見た。
鳥インフルエンザ感染鶏血清では、５０倍希釈までＮＳ１Ｈｉｓバンド（約２７ｋＤａ）の発色が見られたのに対し、不活性化ウイルス高度免疫鶏血清ではいずれの希釈倍率でもＮＳ１Ｈｉｓバンドの発色は認められなかった。また、ＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ感染細胞については全く発色はなく、抗原性を有しないことが確認できた。
実施例３：ＮＳ１タンパク質を用いた鳥インフルエンザウイルス感染の識別
希釈倍率を５０〜１２５０倍とした他は実施例と同様にして実験を行なった。結果を図３に示す。鳥インフルエンザ（ＡＩＶ）感染血清では、希釈倍率５０倍で明確なＮＳ１Ｈｉｓバンドの発色が見られる（図中拡大部分）。
比較例２：ＮＰタンパク質を用いた鳥インフルエンザウイルス感染の識別
参考例１で得た組換えウイルスＡｃＡＩＮＰをＳｆ２１細胞に接種し、培養３〜４日後に細胞を回収した。細胞（約１０６ｃｅｌｌ）を、Ｌａｅｍｍｌｉの電気泳動用緩衝液８０μｌに再浮遊し、ＮＳ１Ｈｉｓタンパク質同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブリリアントブルー染色するか、ニトロセルロース膜に転写後、ウエスタンブロッティングにより発現を確認した。
その結果、鳥インフルエンザ感染鶏血清、不活性化ウイルス高度免疫鶏血清は、いずれの希釈倍率でもＮＰバンド（５６ｋＤａ）の発色が認められた。対照（非感染・非免疫検体）血清では発色は見られなかった。このように、ＮＰ抗原による免疫学的反応では、自然感染鶏とウイルス接種鶏の区別はできないが、非感染鶏や非免疫鶏からの識別感度は高い。従って、ＮＳ１による識別前に自然感染鶏検体及びウイルス接種鶏検体をスクリーニングする工程として有用である。また、ＥＬＩＳＡ反応でも有効である。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、簡便な方法により鳥インフルエンザウイルス自然感染鳥をワクチン接種鳥から区別して識別できる。このため、国際的な遵守が緊急の課題となっているＤＩＶＡシステムを広範囲に実施するための検査方法として高い有用性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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