(57)【要約】  本発明はヒトＦｃ受容体に結合する多量体融合タンパク質に関する。本発明は、このタンパク質を含む治療組成物、及び免疫不全の治療におけるその使用にも関する。融合タンパク質は、３０９位でのシステイン残基の非存在下ではテイルピースを含む。
2017512063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のポリペプチド単量体単位を含む多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３０９位にシステイン以外の任意のアミノ酸残基を含み、単量体単位を集合させて多量体にするテイルピースにそのＣ末端で融合しており、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、抗体可変領域を含まない、
上記多量体融合タンパク質。
【請求項２】
抗体ＦｃドメインがＩｇＧに由来する、請求項１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から２までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５】
３５５位にアルギニン残基を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項６】
３５５位にシステイン残基を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項７】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３５５位のグルタミン残基がアルギニン残基（Ｑ３５５Ｒ）又はシステイン残基（Ｑ３５５Ｃ）で置換されているＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項８】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項９】
テイルピースがＩｇＭ又はＩｇＡに由来する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１０】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域がそのＮ末端にヒンジ領域を有する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１１】
ヒンジ領域が突然変異配列ＣＰＰＣを含む、請求項１０に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１２】
６又は１２ポリペプチド単量体単位を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１３】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、２３４位のロイシン残基及び／又は３３１位のプロリン残基が別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から６まで及び請求項９から１２までに記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１４】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、２３４位のロイシン残基がフェニルアラニン残基で置換されており、３３１位のプロリン残基がセリン残基で置換されている（Ｌ２３４Ｆ／Ｐ３３１Ｓ）ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１３までに記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１５】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、２３４位のフェニルアラニン残基、２９６位のフェニルアラニン残基、３２７位のグリシン残基、３３０位のセリン残基及び３３１位のセリン残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１２までに記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１６】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１２まで又は１５のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１７】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されており、２９６位のフェニルアラニン残基がチロシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ／Ｆ２９６Ｙ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１２まで又は１５のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１８】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３２７位のグリシン残基がアラニン残基で置換されており、３３０位のセリン残基がアラニン残基で置換されている（Ｇ３２７Ａ／Ｓ３３０Ａ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１２まで又は１５のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項１９】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３２７位のグリシン残基がアラニン残基で置換されており、３３１位のセリン残基がプロリン残基で置換されている（Ｇ３２７Ａ／Ｓ３３１Ｐ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１２まで又は１５のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２０】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３３０位のセリン残基がアラニン残基で置換されており、３３１位のセリン残基がプロリン残基で置換されている（Ｓ３３０Ａ／Ｓ３３１Ｐ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１２まで又は１５のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２１】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むハイブリッドである、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２２】
２３４位のフェニルアラニン残基、２９６位のフェニルアラニン残基、３２７位のグリシン残基、３３０位のセリン残基及び３３１位のセリン残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換されている、それぞれの重鎖Ｆｃ領域である、請求項２１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２３】
２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されており、２９６位のフェニルアラニン残基がチロシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ／Ｆ２９６Ｙ）、請求項２１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２４】
抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用の阻害の効力を増加させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２５】
Ｆ２３４Ｌ、Ｆ２３４ＬとＦ２９６Ｙ、Ｇ３２７Ａ、Ｇ３２７ＡとＳ３３１Ｐ、Ｓ３３０ＡとＳ３３１Ｐ、及びＧ３２７ＡとＳ３３０Ａからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項２４に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２６】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む、請求項２５に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２７】
サイトカイン放出を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２８】
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４ＦとＰ３３１Ｓ、Ａ３２７Ｇ、及びＹ２９６Ｆからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項２７に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項２９】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む、請求項２８に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３０】
血小板活性化を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３１】
Ｌ２３４Ｆ、及びＬ２３４ＦとＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項３０に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３２】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む、請求項３１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３３】
そのＦｃ受容体結合プロファイルを変化させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３４】
ＦｃＲｎに結合する、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３５】
ＦｃＲｎへのその結合を増加させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３６】
Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０８Ｃ、Ｖ３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｐ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項３５に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３７】
ＦｃγＲＩＩｂへのその結合を増加させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から３６までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３８】
Ｅ２５８Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｅ、及びＬ３２８Ｆからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項３７に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項３９】
ＦｃγＲへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４０】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、及びＬ３２８Ｒからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項３９に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４１】
Ｃ１ｑへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から４０までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｋ３２２Ａ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、及びＬ２３４ＦとＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項４１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４３】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む、請求項４２に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４４】
ＦｃドメインがＩｇＧ４に由来し、ＦｃγＲ結合を増加させる１つ又は複数の突然変異をさらに含む、請求項１から４３までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４５】
Ｆｃドメインが、３０８位のバリン残基をシステイン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｃ）突然変異している、請求項１から４４までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４６】
ヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合が、コアヒンジ配列ＣＰＰＣをＳＰＰＳに突然変異させることにより除去されている、請求項１から４５までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４７】
テイルピース中のジスルフィド結合が、５７５位のシステイン残基をセリン、スレオニン又はアラニン残基で置換することにより（Ｃ５７５Ｓ、Ｃ５７５Ｔ、又はＣ５７５Ａ）除去されている、請求項１から４６までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４８】
コアヒンジ配列ＣＰＰＣがＳＰＰＳに突然変異し、５７５位のテイルピースシステイン残基がセリン、スレオニン又はアラニン残基で置換されている（Ｃ５７５Ｓ、Ｃ５７５Ｔ、又はＣ５７５Ａ）、請求項１から４７までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項４９】
実質的に非共有結合のドメイン間相互作用を含む、請求項４８に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５０】
ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化部位が、２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ２９７Ｑ）で置換することにより除去されている、請求項１から４９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５１】
テイルピース中のグリコシル化部位が、５６３位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ５６３Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ５６３Ｑ）で置換することにより除去されている、請求項１から５０までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５２】
ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化部位とテイルピース中のグリコシル化部位が両方とも、２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基又はグルタミン残基で置換し、５６３位のアスパラギン残基をアラニン残基又はグルタミン残基で置換することにより（Ｎ２９７Ａ／Ｎ５６３Ａ又はＮ２９７Ａ／Ｎ５６３Ｑ又はＮ２９７Ｑ／Ｎ５６３Ａ又はＮ２９７Ｑ／Ｎ５６３Ｑ）除去されている、請求項１から５１までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５３】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、配列番号２６〜３０のうちのいずれか１つのアミノ酸６〜２２２若しくは配列番号３２〜４７のうちのいずれか１つのアミノ酸６〜２２２に与えられる配列又は配列番号３０と３１のアミノ酸６〜３３３に与えられる配列を含む又はそれからなる、請求項１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５４】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、配列番号３〜２５のうちのいずれか１つに与えられる配列を有するヒンジ領域をさらに含む、請求項５３に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５５】
それぞれのポリペプチド単量体単位が、それぞれのポリペプチド鎖が配列番号２６〜４７のうちのいずれか１つに与えられる配列を含む又はそれからなる２つの同一なポリペプチド鎖を含む又はそれからなる、請求項１に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５６】
六量体又は主に六量体である、請求項１から５５までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５７】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域中の３０９位のアミノ酸がロイシンである、請求項１から５６までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５８】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が３１０位にヒスチジン残基を含む、請求項１から５７までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項５９】
精製されている六量体である、請求項１から５８までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。
【請求項６０】
１よりも多い多量体形態で請求項１から５８までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質を含む混合物であって、多量体融合タンパク質の六量体形態について濃縮されている上記混合物。
【請求項６１】
混合物の８０％を超える分が六量体である、請求項６０に記載の混合物。
【請求項６２】
請求項１から６１までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖、又はその成分部分をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項６３】
配列番号５０〜５９のうちのいずれか１つに与えられる配列を含む又はそれからなる、請求項６２に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項６４】
請求項６２又は請求項６３に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項６５】
請求項６４に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６６】
請求項１から５９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質の産生のための工程であって、請求項６５に記載の宿主細胞をタンパク質発現及び多量体への集合に適した条件下で培養することと、多量体融合タンパク質を単離し、場合によって精製することとを含む、上記工程。
【請求項６７】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、請求項１から５９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項６８】
他の活性成分をさらに含む、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
治療において使用するための、請求項１から５９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質又は請求項６７若しくは６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
免疫不全の治療において使用するための、請求項１から５９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質又は請求項６７若しくは６８に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
免疫不全の治療のための医薬を調製するための、請求項１から５９までのいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質の使用。
【請求項７２】
免疫不全が免疫性血小板減少症、ギラン・バレー症候群、川崎病、及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーから選択される、請求項７０又は７１に記載の使用。
【請求項７３】
サイトカイン放出を調節する１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から５９までのいずれかに記載の多量体融合タンパク質。
【請求項７４】
Ｃ１ｑへの結合を調節する１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から５９までのいずれかに記載の多量体融合タンパク質。
【請求項７５】
血小板活性化を調節する１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から５９までのいずれかに記載の多量体融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトＦｃ受容体に結合する多量体融合タンパク質に関する。本発明は、多量体融合タンパク質を含む治療組成物及び免疫不全の治療におけるその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫不全は、異なる兆候、症状、原因及び発症機序を有する多種多様な疾患を包含する。これらの疾患の多くは、病原性抗体及び／又は病原性免疫複合体の積極的関与を特徴とする。ＩＴＰ（免疫性血小板減少症、免疫性血小板紫斑病、特発性血小板減少症紫斑病と不定に呼ばれる）などの一部の疾患では、病原性抗体の標的抗原（Hoemberg, Scand HJ Immunol, Vol 74(5), p489-495, 2011）及び疾患過程はある程度はよく理解されている。そのような免疫不全は多くの場合、様々な従来の薬剤を単独療法として又は組み合わせて治療されている。そのような薬剤の例は、多数の副作用に関連している副腎皮質ステロイド、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）及び抗Ｄである。
【０００３】
抗体は、多くの場合、免疫グロブリンと呼ばれるが、２つの同一な重（Ｈ）鎖及び２つの同一な軽（Ｌ）鎖を含み、鎖間ジスルフィド結合により共に保持されているＹ字型の分子である。それぞれの鎖は、配列が異なり抗原結合の原因となる１つの可変ドメイン（Ｖ）からなる。それぞれの鎖は少なくとの１つの定常ドメイン（Ｃ）からもなる。軽鎖では、単一の定常ドメインがある。重鎖では、アイソタイプに応じて、少なくとも３つ、時に４つの定常ドメインがある（ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤは３つを有し、ＩｇＭ及びＩｇＥは４つ有する）。
【０００４】
ヒトでは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭと呼ばれる５つの異なるクラス又はアイソタイプの免疫グロブリンがある。これらのクラスすべてが基本的な４鎖Ｙ字型構造を有しているが、その重鎖は異なり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２と呼ばれる２つのサブクラスにさらに細区分することができる。ＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と呼ばれる４つのサブクラスがある。
【０００５】
抗体のＦｃドメインは典型的には、それぞれの重鎖のうち二量体化してＦｃドメインを形成する少なくとも最後の２つの定常ドメインを含む。Ｆｃドメインは、主にＦｃＲｎへの結合を通じて抗体半減期を決定すること、身体全体への分布、補体を固定する能力、及び細胞表面Ｆｃ受容体への結合を含む、抗体エフェクター機能を提供する原因である。
【０００６】
抗体アイソタイプ間の違いはＦｃドメインが最も明白であり、これにより抗原に結合すると異なるエフェクター機能が始動される。構造の違いは抗体の重合状態の違いももたらす。したがって、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＤは一般に単量体であり、ＩｇＭは五量体と六量体の両方として存在し、ＩｇＡは主に血清中では単量体として漿粘液性分泌物中では二量体として存在する。
【０００７】
静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、何千人もの健常な血液ドナー由来のプールされた免疫グロブリンである。ＩＶＩＧは、低ＩｇＧレベルの患者において日和見感染を予防するためのＩｇＧ補充療法として最初に使用された（Baerenwaldt, Expert Rev Clin Immunol, Vol 6(3), p425-434, 2010に概説されている）。ＩＴＰを抱えた小児におけるＩＶＩＧの抗炎症特性の発見後（Imbach, Helv Paediatri Acta, Vol 36(1), p81-86, 1981）、ＩＶＩＧは現在、ＩＴＰ、ギラン・バレー症候群、川崎病、及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーの治療に認可されている（Nimmerjahn, Annu Rev Immunol, Vol 26, p513-533, 2008）。
【０００８】
病原性免疫複合体に関連している疾患では、成分免疫グロブリン画分のわずかな部分が不釣り合いに効果的であることが提唱されてきた。微量（典型的には１〜５％）のＩｇＧがＩＶＩＧ内に多量体形態で存在していることが観察されている。この多量体画分の大多数は二量体であり、三量体及びさらに高次の形態はもっと少量であると考えられている。レシピエント抗イディオタイプ抗体の結合による注入後に追加の二量体が形成される可能性があることも提唱されてきた。１つの説は、これらの多量体形態が、増強されたその結合力のせいで、低親和性Ｆｃγ受容体への結合をめぐって免疫複合体と競合するというものである（Augener, Blut, Vol 50, p249-252, 1985; Teeling, Blood Vol 98(4), p1095-1099, 2001; Machino, Y., Clin Exp Immunol, Vol 162(3), p415-424, 2010; Machino, Y. et al., BBRC, Vol 418, p748-753, 2012）。別の説は、ＩＶＩＧ内のＩｇＧのシアル酸グリコフォーム、特にさらに高いレベルのα２−６シアル酸形態の存在がＦｃγ受容体活性化状態の変化を引き起こすというものである（Samuelsson, Science, Vol 291, p484-486, 2001; Kaneko, Science, Vol 313, p670-673, 2006; Schwab, European J Immunol Vol 42, p826-830, 2012; Sondermann, PNAS, Vol 110(24), p9868-9872, 2013）。
【０００９】
病原性抗体に関連している疾患では、ヒトに投与された極めて大用量のＩＶＩＧ（１〜２ｇ／ｋｇ）がＦｃＲｎにより遂行される正常なＩｇＧ恒常性機序を効果的に無効にすることが提唱されてきた。実際上、ドナーＩＶＩＧによりレシピエントＩｇＧを大量希釈すると、異化反応が増強され患者の病原性抗体の血清半減期が短くなる。その有効性について提唱されている他の機序には、病原性抗体の抗イディオタイプ中和及び補体因子の一過的減少が含まれる（Mollnes, Mol Immunol, Vol 34, p719-729, 1997; Crow, Transfusion Medicine Reviews, Vol 22(2), p103-116, 2008; Schwab, I. and Nimmerjahn, F. Nature Reviews Immunology, Vol 13, p176-189, 2013）。
【００１０】
ＩＶＩＧの臨床利用には著しい不都合がある。ＩＶＩＧは、製造方法及びドナープールの固有の違いのせいで製造業者間で製品品質が変わりやすい（Siegel, Pharmacotherapy Vol 25(11) p78S-84S, 2005）。ＩＶＩＧは、典型的には１〜２ｇ／ｋｇの桁で極めて大用量で与えられる。この大用量は長期の注入期間を必要とし（４〜８時間、複数日にわたる場合もある）、これは患者には不快になることがあり、注入関連有害事象をもたらすことがある。重篤有害事象が起こることがあり、ＩｇＡ欠損個体での反応はよく理解されている。ＩＶＩＧを受けている患者でサイトカイン放出が観察されることもあるが、これは用量及び注入速度を慎重に制御することにより大部分が最小化する。患者あたりの大量使用及びヒトドナーへの依存の結果として、ＩＶＩＧの製造は高価であり世界的な供給は非常に制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
まとめると、ＩＶＩＧの不都合は、病原性抗体及び病原性免疫複合体の疾患生物学を妨害することができる分子の臨床供給、投与及び有効性の点から改善の必要性が存在することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＩＶＩＧ療法の潜在的代替法として使用するための重合体Ｆｃ融合タンパク質は文献に記載されている（Mekhaiel et al; Nature Scientific Reports 1:124, published 19th October 2011）。Ｍｅｋｈａｉｅｌらは、六量体ｈＩｇＧ１−Ｆｃ−ＬＨ３０９／３１０ＣＬテイルピースを記載している。このタンパク質は、３０９位のロイシンがシステインで置換され、３１０位のヒスチジンがロイシンで置換されている二重突然変異を含む。
【００１３】
Ｌ３０９Ｃ／Ｈ３１０Ｌ二重突然変異は単量体単位の重合には不可欠であると発明当時は考えられていた（Mekhaiel et al; 2011）。しかし、驚くべきことに、本発明者らはＬ３０９Ｃ／Ｈ３１０Ｌ二重突然変異の非存在下でも集合して効率的に多量体になる多量体融合タンパク質を作り出した。
【００１４】
３０９位にシステイン残基がなければ多量体融合タンパク質の単離及び精製が単純化され、したがってその製造性が改善される。３０９位にシステイン残基がなければ免疫原性の可能性も減少することができる。さらに、本発明の多量体融合タンパク質の安全性及び有効性を大いに改善する追加の改変が説明される。
【００１５】
したがって、本発明ではＩＶＩＧ及び先行技術代替物の不都合の多くを解決する、製造性が改善され有効性が高まった改良多量体融合タンパク質を提供する。このタンパク質は、慎重に制御された条件下で大量に産生することができ、供給が制限され品質が変化しやすいという問題をなくす。さらに、有効性が高まったことでもっと少用量の投与が可能になり、有害事象のリスクが減少する。
【００１６】
Ｍｅｋｈａｉｅｌらにより記載されたタンパク質は主にワクチンとしての使用のために開発され、典型的には、抗原、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、薬物、リガンド、受容体、サイトカイン又はケモカインなどの「融合パートナー」と呼ばれる異なるタンパク質に融合された。一例では、本発明のタンパク質は融合パートナーを含まない。
【００１７】
ＩｇＭ又はＩｇＡのいずれか由来のカルボキシル末端テイルピースが全ＩｇＧ分子定常領域のカルボキシル末端に付加され、組換えＩｇＭ様ＩｇＧを産生する先行技術において重合体融合タンパク質が記載されている（Smith R.I.F. and Morrison, S.L. Biotechnology, Vol 12, p683-688, 1994; Smith R.I.F. et al, J Immunol, Vol 154, p2226-2236, 1995; Sorensen V. et al, J Immunol, Vol 156, p2858-2865, 1996）。研究されたＩｇＧ分子は可変領域を含むインタクトな免疫グロブリンであった。これとは対照的に、本発明の多量体融合タンパク質は抗体可変領域を含まない。
【００１８】
したがって、本発明では、ＩＶＩＧ及び先行技術代替物の不都合の多くを解決する、製造性が改善され安全性及び有効性が高まった改良多量体融合タンパク質を提供する。このタンパク質は、慎重に制御された条件下で組換え的に大量に産生することができ、供給が制限され品質が変化しやすいという問題をなくす。さらに、安全性及び有効性が高まったことでもっと少用量の投与が可能になり、有害事象のリスクが著しく減少する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の多量体融合タンパク質は集合的に「Ｆｃ多量体」と名付けられており、この２つの用語は本明細書では互換的に使用される。
【００２０】
他の方法で定義されなければ、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で言及される出版物及び特許はすべて参照により組み込まれる。
【００２１】
本明細書に記載される実施形態のいずれでも組み合わせることができることは認識されるであろう。
【００２２】
本明細書では、他の方法で明記されていなければ、ＥＵ付番方式を使用して抗体ドメイン中の残基に言及する。この方式は最初、Edelman et al, 1969により考案され、Kabat et al, 1987に詳細に説明されている。
Edelman et al, 1969；「全γＧ免疫グロブリン分子の共有結合構造（Ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｔｉｒｅ  γＧ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、PNAS Biochemistry Vol.63 pp78-85．
Kabat et al, 1987；「免疫学的に興味深いタンパク質の配列において（ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、US Department of Health and Human Services, NIH, USA.
【００２３】
当業者には既知であるように、特定の抗体アイソタイプについて位置番号及び／又はアミノ酸残基が与えられている場合、他の任意の抗体アイソタイプにおける対応する位置及び／又はアミノ酸残基に適用できることが意図されている。ＩｇＭ又はＩｇＡに由来するテイルピース中のアミノ酸残基に言及する場合、当技術分野の従来的慣習に従って、与えられた位置番号は天然に存在するＩｇＭ又はＩｇＡにおける残基の位置番号である。
【００２４】
本発明は、２つ以上のポリペプチド単量体単位を含む多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３０９位にシステイン以外の任意のアミノ酸残基を含み、単量体単位を集合させて多量体にするテイルピースにそのＣ末端で融合しており、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、抗体可変領域を含まない、
上記多量体融合タンパク質を提供する。
【００２５】
一例では、本発明の多量体融合タンパク質は融合パートナーをさらに含む。用語「融合パートナー」は１つ又は複数の抗体可変ドメインを明確に排除する。典型的には用語「融合パートナー」とは抗原、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、薬物、リガンド、受容体、サイトカイン又はケモカインのことである。
前記融合パートナーは、存在している場合には、それぞれの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。融合パートナーは重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に直接融合させることができる。代わりに、融合パートナーは、存在する場合にはヒンジを含んでいてもよい介在アミノ酸配列により間接的に融合させることができる。例えば、短いリンカー配列を融合パートナーと重鎖Ｆｃ領域の間に与えることができる。
【００２６】
一例では、本発明のタンパク質は融合パートナーを含まない。
【００２７】
特に、本発明の多量体融合タンパク質は１つ又は複数の抗体可変領域を含まず、典型的にはこの分子はＶＨもＶＬ抗体可変領域も含まない。一例では、本発明の多量体融合タンパク質はＦａｂ断片を含まない。
【００２８】
本発明の多量体融合タンパク質のそれぞれのポリペプチド単量体単位は抗体Ｆｃドメインを含む。
【００２９】
本発明の抗体Ｆｃドメインは適切ないかなる種に由来していてもよい。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはヒトＦｃドメインに由来している。
【００３０】
抗体Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、及びＩｇＭを含む、抗体の適切ないかなるクラス由来でもよい。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはＩｇＧ１に由来する。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはＩｇＧ４に由来する。
【００３１】
抗体Ｆｃドメインは、それぞれが重鎖Ｆｃ領域と呼ばれる２つのポリペプチド鎖を含む。この２つの重鎖Ｆｃ領域は二量体化して抗体Ｆｃドメインを作り出す。抗体Ｆｃドメイン内の２つの重鎖Ｆｃ領域は互いに異なっていてもよいが、これらのＦｃ領域は通常は互いに同一であることは認識されるであろう。したがって、用語「重鎖Ｆｃ領域」が下の本明細書で使用される場合、この用語は、同一の重鎖Ｆｃ領域と二量体化して抗体Ｆｃドメインを作り出す単一の重鎖Ｆｃ領域を指すのに使用される。
【００３２】
典型的にはそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は２つ若しくは３つの重鎖定常ドメインを含む又はそれからなる。
【００３３】
天然の抗体では、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域は、２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）で構成されており、ＩｇＥ及びＩｇＭの重鎖Ｆｃ領域は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）で構成されている。これらは二量体化してＦｃドメインを作り出す。
【００３４】
本発明では、重鎖Ｆｃ領域は、１つ又は複数の異なるクラスの抗体、例えば、１つ、２つ又は３つの異なるクラス由来の重鎖定常ドメインを含むことができる。
【００３５】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３６】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３７】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ３に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３８】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３９】
本発明の多量体融合タンパク質は集合的に「Ｆｃ多量体」と名付けられており、この２つの用語は本明細書では互換的に使用される。
【００４０】
本発明者らは、ＣＨ３ドメインが本発明の多量体融合タンパク質の単量体単位の重合を制御するのに重要な役割を果たしていることを思いがけず見出した。重合は、Ｆｃ領域の由来となるＩｇＧサブクラスに応じて変化することが思いがけず見出された。ＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体は非常に効率的に集合して六量体になり、この分子のおおよそ８０％が六量体形態で存在していた。これとは対照的に、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体はもっと低いレベルの六量体を形成した。ＣＨ２ドメインが１つの特定のＩｇＧサブクラスに由来しＣＨ３ドメインが異なるＩｇＧサブクラスに由来するハイブリッドＦｃ領域を含むＦｃ多量体を調べると、六量体を形成する能力が主にＣＨ３ドメインによりコードされていることが明らかになった。ＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインの存在は六量体化を著しく増加させる。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ１に由来しＣＨ２ドメインがＩｇＧ４に由来するハイブリッドＦｃ多量体はＩｇＧ１野生型と全く同じくらい効率的に集合し、この分子のおおよそ８０％が六量体として見出された（例４及び図３）。したがって、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインをＩｇＧ１のＣＨ３ドメインで置き換えると、野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体と比べて六量体化のレベルが改善される。こうして得られるハイブリッドは、ＩｇＧ４の望ましい特性の多くを保持しつつ高レベルの六量体形成という利点を有する。
【００４１】
さらに、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインは熱安定性を与えることで知られている（Garber and Demarest, Biochem and Biophys Res Comm, Vol 355 p751-757 2007）。したがって、ＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むハイブリッドＦｃ多量体は改善された安定性も有することになる。
【００４２】
したがって、一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００４３】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００４４】
したがって、一実施形態では、本発明は、２つ以上のポリペプチド単量体単位を含む多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３０９位にシステイン以外の任意のアミノ酸残基を含み、単量体単位を集合させて多量体にするテイルピースにそのＣ末端で融合しており、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含み、場合によりポリペプチド単量体単位が抗体可変領域を含まない、
上記多量体融合タンパク質を提供する。
【００４５】
本発明者らは、ＣＨ３ドメインの３５５位のアミノ酸が六量体化に極めて重要であることを立証してきた。ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの３５５位に通常見出されるアルギニン残基は、特に効率的な六量体化を促進することが分かっていた。本明細書の下に記載される例４を参照されたい。
【００４６】
したがって、一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は３５５位にアルギニン残基を含む。
【００４７】
ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの３５５位に通常見出されるアルギニン残基をシステイン残基で置換すると（Ｒ３５５Ｃ）野生型ＩｇＧ１を超えて六量体形成が増加した。本明細書の下に記載される例４を参照されたい。
【００４８】
したがって、一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は３５５位にシステイン残基を含む。
【００４９】
ＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む本発明のＦｃ多量体では、３５５位のグルタミン残基をアルギニン残基で置換すると（Ｑ３５５Ｒ）六量体化が著しく増加される。したがって、ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体の比較的低い六量体化という問題は、単一のアミノ酸置換により解決することが可能である。これには、こうして得られるＦｃ多量体が、ＩｇＧ４の特徴的特性を保持しつつ極めて効率的に集合して六量体になるという利点がある。
【００５０】
したがって、一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、３５５位のグルタミン残基が別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００５１】
したがって、一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、３５５位のグルタミン残基がアルギニン残基（Ｑ３５５Ｒ）又はシステイン残基（Ｑ３５５Ｃ）で置換されているＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００５２】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＭ  ＣＨ４ドメインは典型的にはＣＨ３ドメインとテイルピース間に位置している。
【００５３】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びにＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む。
【００５４】
本発明の重鎖Ｆｃ領域を産生するのに使用するための重鎖定常ドメインは、上記の天然に存在する定常ドメインの変異体を含むことができることは認識されるであろう。そのような変異体は、野生型定常ドメインと比べて１つ又は複数のアミノ酸変異を含むことができる。一例では、本発明の重鎖Ｆｃ領域は、野生型定常ドメインとは配列が異なる少なくとも１つの定常ドメインを含む。変異定常ドメインは野生型定常ドメインと比べて長くても短くてもよいことは認識されるであろう。好ましくは、変異定常ドメインは野生型定常ドメインと少なくとも５０％同一である又は類似している。用語「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置でもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。用語「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置でもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンの代わりにロイシンを使ってもよい。多くの場合互いに置き換えることが可能である他のアミノ酸には、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５５】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991）。一例では、変異定常ドメインは野生型定常ドメインに少なくとも６０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも７０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも８０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも９０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも９５％同一である又は類似している。
【００５６】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域は、ポリペプチド単量体単位を集合させて多量体にするテイルピースにそのＣ末端で融合している。
【００５７】
ＩｇＭ及びＩｇＡは、共通Ｈ２Ｌ２抗体単位の共有結合多量体としてヒトにおいて天然に存在している。ＩｇＭはＪ鎖を組み込んでいる場合は五量体として、又はＪ鎖を欠く場合は六量体として存在する。ＩｇＡは単量体及び二量体形態として存在する。ＩｇＭ及びＩｇＡの重鎖は、テイルピースとして知られる、Ｃ末端定常ドメインまでの１８アミノ酸伸長を有する。このテイルピースには、重合体中の重鎖間にジスルフィド結合を形成するシステイン残基が含まれ、重合において重要な役割を有すると考えられている。テイルピースはグリコシル化部位も含有する。
【００５８】
本発明のテイルピースは適切ないかなるアミノ酸配列でも含むことができる。本発明のテイルピースは天然に存在する抗体中に見出されるテイルピースでもよく、又は代わりに、天然のテイルピースとは長さ及び／若しくは組成が異なる改変されたテイルピースであってもよい。他の改変されたテイルピースは完全に合成的でもよく、長さ、柔軟性及びシステイン組成などの多量体化のために所望の特性を有するように設計することもできる。
【００５９】
テイルピースは適切ないかなる種に由来してもよい。抗体テイルピースは進化的に保存されており、硬骨類などの原始的な種を含む大半の種に見出される。一実施形態では、本発明のテイルピースはヒト抗体に由来する。
【００６０】
一実施形態では、テイルピースは、表１に示されるヒトＩｇＭ又はＩｇＡ由来の１８アミノ酸テイルピース配列のすべて又は一部を含む。
【００６１】
テイルピースは重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に直接融合させることができる。代わりに、テイルピースは介在アミノ酸配列によって間接的に融合させることができる。例えば、短いリンカー配列をテイルピースと重鎖Ｆｃ領域の間に与えてもよい。
【００６２】
本発明のテイルピースは、上記の天然の配列の変異体又は断片を含むことができる。ＩｇＭ又はＩｇＡテイルピースの変異体は典型的には、表１に示される１８アミノ酸位置のうちの８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７における天然の配列と同一であるアミノ酸配列を有する。断片は典型的には８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７アミノ酸を含む。テイルピースはハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＡテイルピースでもよい。変異体の断片も想定している。
【表１】
2017512063.tif 000003
【００６３】
本発明のそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は、場合により、そのＮ末端に天然の又は改変されたヒンジ領域を有することができる。
【００６４】
天然のヒンジ領域は、天然に存在する抗体中のＦａｂとＦｃドメイン間に通常見出されると考えられるヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域は天然のヒンジ領域とは長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サメ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギヒンジ領域などの他の種由来のヒンジ領域を含むことが可能である。他の改変されたヒンジ領域は、重鎖Ｆｃ領域のクラス又はサブクラスとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含むことができる。代わりに、改変されたヒンジ領域は、天然のヒンジの一部又はリピート中のそれぞれの単位が天然のヒンジ領域に由来する反復単位を含むことができる。追加の代替物では、天然のヒンジ領域は、１つ若しくは複数のシステイン若しくは他の残基をセリン若しくはアラニンなどの中性の残基に変換することにより、又は適切に置かれた残基をシステイン残基に変換することにより改変することができる。そのような手段により、ヒンジ領域のシステイン残基の数を増やす又は減らすことができる。他の改変されたヒンジ領域は完全に合成的でもよく、長さ、システイン組成及び柔軟性などの所望の特性を有するように設計することもできる。
【００６５】
いくつかの改変されたヒンジ領域が既に、例えば、ＵＳ５６７７４２５、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１に記載されており、これらの特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
適切なヒンジ配列の例は表２に示されている。
【００６７】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域はそのＮ末端にインタクトなヒンジ領域を有する。
【００６８】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域及びヒンジ領域はＩｇＧ４に由来し、ヒンジ領域は突然変異配列ＣＰＰＣ（配列番号１１）を含む。ヒトＩｇＧ４のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含有するＩｇＧ１と比べた場合、配列ＣＰＳＣ（配列番号１２）を含有する。ＩｇＧ４配列中に存在するセリン残基はこの領域の柔軟性を増加させ、したがって、ＩｇＧ分子内のもう一方の重鎖に架橋して鎖間ジスルフィドを形成するのではなく分子の部分が同一タンパク質鎖内でジスルフィド結合（鎖内ジスルフィド）を形成する（Angal S. et al, Mol Immunol, Vol 30(1), p105-108, 1993）。セリン残基をプロリンに変えてＩｇＧ１と同じコア配列を与えると、ＩｇＧ４ヒンジ領域における鎖間ジスルフィドの完全な形成が可能になり、したがって、精製された製品中の不均一性が減じられる。この改変されたアイソタイプはＩｇＧ４Ｐと名付けられる。
【表２】
2017512063.tif 000004
【００６９】
本発明の多量体融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２又はそれよりも多いポリペプチド単量体単位を含むことができる。そのようなタンパク質は代わりに、それぞれ、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、十二量体、等と呼ばれることもある。
【００７０】
多量体融合タンパク質は、一定範囲の数のポリペプチド単量体単位を有する、異なるサイズの多量体融合タンパク質の混合物を含むことができる。
【００７１】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は６又は１２ポリペプチド単量体単位を含む。
【００７２】
一例では、本発明の多量体融合タンパク質は六量体である。
【００７３】
したがって、一例では、本発明は、６ポリペプチド単量体単位からなる多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が抗体Ｆｃドメインとテイルピース領域からなり、
それぞれの抗体Ｆｃドメインが、３０９位のアミノ酸残基がシステイン以外の任意のアミノ酸残基である２つの重鎖Ｆｃ領域からなり、場合によって、それぞれの重鎖Ｆｃ領域がＮ末端にヒンジ領域を有し、
テイルピース領域がそれぞれの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に融合されており単量体単位を集合させて多量体にする、
上記多量体融合タンパク質を提供する。
【００７４】
一例では、本発明の多量体融合タンパク質は精製された六量体である。一例では、用語「精製された」は、８０％よりも多い六量体、例えば、９０％又は９５％よりも多い六量体を意味する。試料中の六量体の量は、本明細書の下に記載される分析的サイズ排除クロマトグラフィーなどの任意の適切な方法を使用して決定することが可能であることは認識されるであろう。
【００７５】
一例では、本発明は、本発明の多量体融合タンパク質を１つよりも多い多量体、例えば、六量体及び十二量体の形態で含む混合物であるが、前記多量体融合タンパク質の六量体形態について濃縮されている上記混合物を提供する。
【００７６】
一例では、そのような混合物は８０％よりも多い六量体を含むことができる。一例では、そのような混合物は８５％、９０％、又は９５％よりも多い六量体を含むことができる。
【００７７】
本発明のそれぞれのポリペプチド単量体単位は２つの個別のポリペプチド鎖を含む。特定のポリペプチド単量体単位内の２つのポリペプチド鎖は互いに同じでもよく、又は互いに異なっていてもよい。一実施形態では、２つのポリペプチド鎖は互いに同じである。
【００７８】
同様に、特定の多量体融合タンパク質内のポリペプチド単量体単位は互いに同じでもよく、又は互いに異なっていてもよい。一実施形態では、ポリペプチド単量体単位は互いに同じである。
【００７９】
一実施形態では、ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖は図２に提供されるアミノ酸配列を、場合によっては、代替のヒンジ又はテイルピース配列と一緒に含む。
【００８０】
したがって、一例では、本発明は、２つ以上、好ましくは６つのポリペプチド単量体単位を含む又はそれからなる多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が２つの同一なポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖が配列番号２６〜４７のいずれか１つに与えられる配列を含む又はそれからなり、
それぞれのポリペプチド単量体単位が抗体可変領域を含まない、
上記多量体融合タンパク質も提供する。
【００８１】
一例では、本発明は、２つ以上、好ましくは６つのポリペプチド単量体単位を含む又はそれからなる多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が２つの同一なポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選択される配列を含み又はそれからなり、
場合により、それぞれのポリペプチド単量体単位が抗体可変領域を含まない、
上記多量体融合タンパク質も提供する。
【００８２】
ヒンジ及びテイルピースが配列番号２６〜４７に与えられる配列とは異なっていることがある一例では、本発明は、２つ以上ポリペプチド単量体単位を含む多量体融合タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸６〜２２２若しくは配列番号３２〜４７のいずれか１つのアミノ酸６〜２２２に与えられる配列又は配列番号３０若しくは３１のアミノ酸６〜３３３に与えられる配列を含み又はそれからなり、単量体単位を多量体に集合させるテイルピースにそのＣ末端で融合されており、
ポリペプチド単量体単位が抗体可変領域を含まない、
上記多量体融合タンパク質を提供する。
【００８３】
典型的には、Ｃ末端でのテイルピースに加えて、それぞれの重鎖Ｆｃ領域はＮ末端にヒンジ配列をさらに含む。
【００８４】
本発明の多量体融合タンパク質は、本明細書の下に記載するように、タンパク質の機能的特性、例えば、ＦｃＲｎ若しくは白血球受容体などのＦｃ受容体への結合、補体への結合、改変されたジスルフィド結合構築又は変化したグリコシル化パターンを変化させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。これらの突然変異のいずれでも適切な任意の方法で組み合わせて所望の機能的特性を実現する、及び／又は他の突然変異と組み合わせてタンパク質の機能的特性を変化させることは認識されるであろう。
【００８５】
本発明では、特に免疫不全の治療において使用するのに適したＦｃ多量体を作り出した。Ｆｃ多量体は以下の特性を有するように操作した。
【００８６】
免疫不全の治療において使用するためのＦｃ多量体タンパク質の効力はできる限り高いほうがよい。効力は、例６に記載される抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用の阻害を測定することにより決定することができる。
【００８７】
望まれない副作用はできる限り低いほうがよい。望まれない副作用は、それぞれ例８、１５及び１６に記載されるサイトカイン放出、Ｃ１ｑ結合及び血小板活性化を測定することにより決定することができる。
【００８８】
ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み追加の突然変異が全くない野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体のほうが、免疫不全の治療において使用するのに適していない可能性がある。なぜならば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は高い効力の食作用阻害を示すが、サイトカイン放出、Ｃ１ｑ結合及び血小板活性化によって測定した場合、高レベルの望ましくない副作用も示すからである。
【００８９】
ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体が生じる望ましくない副作用のレベルは非常に低いが、その効力はＩｇＧ１の効力と比べて低い。にもかかわらず、図７で示されるように、野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体の効力はそれでもＩＶＩＧの効力よりも有意に高い。
【００９０】
一例では、本発明は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体の両方の望ましい特性を組み合わせように操作されており、望ましくない特性がないＦｃ多量体タンパク質も提供する。下の表３に示されるように、これらのＦｃ多量体は望ましくない副作用を許容レベルにまで減少させつつ、効果的レベルの効力を示す。これらのＦｃ多量体は免疫不全の治療において使用するのに特に有用であると予想される。
【表３】
2017512063.tif 000005
【００９１】
一例では、本発明は、非改変の親多量体融合タンパク質と比べた場合、サイトカイン放出を減少させ及び／又は血小板活性化を減少させ及び／又はＣ１ｑ結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む多量体融合タンパク質を提供する。一例では、非改変の親はＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する本発明の多量体融合タンパク質である。
サイトカイン放出、血小板活性化及びＣ１ｑ結合は当技術分野で既知の任意の適切な方法により測定することができる。一例では、サイトカイン放出は全血サイトカイン放出アッセイにおいて測定される。
一例では、血小板活性化は、活性化マーカーとしてＣＤ６２ｐを使用してフローサイトメトリーにより測定される。
一例では、Ｃ１ｑ結合はＥＬＩＳＡにより測定される。
【００９２】
一例では、本発明は、非改変の親多量体融合タンパク質と比べた場合、抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用の阻害の効力を増加させる１つ又は複数の突然変異を含む多量体融合タンパク質を提供する。一例では、非改変の親は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はＩｇＧ４由来のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを含有する本発明の多量体融合タンパク質である。
【００９３】
抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用の阻害を測定するのに適したアッセイは当技術分野では既知であり、本明細書の実施例に記載されている。
【００９４】
したがって、一例では、本発明の多量体融合タンパク質のそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は、２３４位のロイシン残基及び／又は３３１位のプロリン残基及び／又は３２７位のアラニン及び／又は２９６位のチロシンが別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００９５】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、２３４位のロイシン残基がフェニルアラニン残基で置換されており、３３１位のプロリン残基がセリン残基で置換されている（Ｌ２３４Ｆ／Ｐ３３１Ｓ）ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００９６】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むハイブリッドである。
【００９７】
一例では、本発明の多量体融合タンパク質のそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメイン並びに２３４位のフェニルアラニン残基、２９６位のフェニルアラニン残基、３２７位のグリシン残基、３３０位のセリン残基及び３３１位のセリン残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４又はＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００９８】
一例では、本発明の多量体融合タンパク質のそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメイン並びにＦ２３４、Ｆ２３４とＦ２９６、Ｇ３２７、Ｇ３２７とＳ３３１、Ｓ３３０とＳ３３１、及びＧ３２７とＳ３３０からなる群から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸残基又はアミノ酸の対が別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４又はＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００９９】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１００】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されており、２９６位のフェニルアラニン残基がチロシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ／Ｆ２９６Ｙ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１０１】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、３２７位のグリシン残基がアラニン残基で置換されており、３３０位のセリン残基がアラニン残基で置換されている（Ｇ３２７Ａ／Ｓ３３０Ａ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１０２】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、３２７位のグリシン残基がアラニン残基で置換されており、３３１位のセリン残基がプロリン残基で置換されている（Ｇ３２７Ａ／Ｓ３３１Ｐ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１０３】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、３３０位のセリン残基がアラニン残基で置換されており、３３１位のセリン残基がプロリン残基で置換されている（Ｓ３３０Ａ／Ｓ３３１Ｐ）ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１０４】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含み、２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ）ハイブリッドである。
【０１０５】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含み、２３４位のフェニルアラニン残基がロイシン残基で置換されており、２９６位のフェニルアラニンがチロシン残基で置換されている（Ｆ２３４Ｌ／Ｆ２９６Ｙ）ハイブリッドである。
【０１０６】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含み、３２７位のグリシン残基がアラニン残基で置換されており、３３０位のセリン残基がアラニン残基で置換されている（Ｇ３２７Ａ／Ｓ３３０Ａ）ハイブリッドである。
【０１０７】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含み、３２７位のグリシン残基がアラニン残基で置換されており、３３１位のセリン残基がプロリン残基で置換されている（Ｇ３２７Ａ／Ｓ３３１Ｐ）ハイブリッドである。
【０１０８】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含み、３３０位のセリン残基がアラニン残基で置換されており、３３１位のセリン残基がプロリン残基で置換されている（Ｓ３３０Ａ／Ｓ３３１Ｐ）ハイブリッドである。
【０１０９】
本発明の多量体融合タンパク質は、対応するポリペプチド単量体単位及び／又は天然の免疫グロブリンと比べて、１つ又は複数のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への改変された結合を示すことができる。任意の特定のＦｃ受容体への結合は増加することもあれば減少することもある。一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は、そのＦｃ受容体結合プロファイルを変える１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「突然変異」は、１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含むことができる。
【０１１１】
ヒト細胞は、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ及びグリカン受容体から選択されるいくつかの膜結合ＦｃＲを発現することが可能である。一部の細胞は可溶性（外部ドメイン）ＦｃＲを発現することもできる（概説は、Fridman et al., (1993) J Leukocyte Biology 54: 504-512）。ＦｃγＲは、ＩｇＧ結合の親和性（高／低）及び生物学的効果（活性化する／阻害する）によりさらに分割することが可能である。ヒトＦｃγＲＩは唯一の「高親和性」受容体であると広く考えられており、その他はすべて中程度〜低いと考えられている。ＦｃγＲＩＩｂはその細胞内ＩＴＩＭモチーフのおかげで「阻害」機能性を有する唯一の受容体であり、その他はすべてＩＴＡＭモチーフのおかげで「活性化する」又は共通のＦｃγＲ−γ鎖と対合すると考えられている。ＦｃγＲＩＩＩｂも、活性化性であるが、ＧＰＩアンカーを経て細胞と会合する点で独特である。全体では、ヒトは６つの「標準」ＦｃγＲ：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂを発現する。これらの配列に加えて、多数の配列又はアロタイプ変異体がこれらのファミリーに広がっている。これらの一部は重要な機能的結果を有することが見出されており、したがってそれ独自の受容体サブタイプであると考えられることもある。例には、ＦｃγＲＩＩａＨ１３４Ｒ、ＦｃγＲＩＩｂＩ１９０Ｔ、ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩｂＮＡ１、ＦｃγＲＩＩＩｂＮＡ２、ＦｃγＲＩＩＩｂＳＨが含まれる。それぞれの受容体配列はＩｇＧの４サブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対して異なる親和性を有することが明らかにされている（Bruhns Blood (1993) Vol 113, p3716-3725）。他の種はいくらか異なる数及び機能性のＦｃγＲを有しており、マウス系は現在まで最もよく研究されており、４つのＦｃγＲ：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶを含む（Bruhns, Blood (2012) Vol 119, p5640-5649）。細胞上のヒトＦｃγＲＩは通常は、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ４に対するその親和性（約１０−８Ｍ）及び血清中のこれらＩｇＧの濃度（約１０ｍｇ／ｍｌ）のせいで正常な血清条件では単量体ＩｇＧにより「占有されている」と考えられている。したがって、その表面にＦｃγＲＩを抱えている細胞は、結合している多特異性のＩｇＧを通して代理的にその抗原性環境を「スクリーニングする」又は「試料採取する」ことができると考えられている。ＩｇＧサブクラスに対する親和性がもっと低い（約１０−５〜１０−７Ｍの範囲で）その他の受容体は通常は「占有されていない」と考えられている。したがって、低親和性受容体は、抗体関連免疫複合体の検出及びこれによる活性化に対して固有に感受性である。抗体免疫複合体中のＦｃ密度が増加すると、低親和性ＦｃγＲへの結合「力」の機能的親和性が増加する。これはいくつかの方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証されてきた（Shields R.L. et al, J Biol Chem, Vol 276(9), p6591-6604, 2001; Lux et al., J Immunol (2013) Vol 190, p4315-4323）。これは、ヒトにおいてＩＴＰを治療するための抗ＲｈＤの使用における主要な作用様式の１つとも含意されてきた（Crow Transfusion Medicine Reviews (2008) Vol 22, p103-116）。
【０１１２】
多くの細胞型が複数種のＦｃγＲを発現しており、したがってＦｃγＲを抱えている細胞へのＩｇＧ又は抗体免疫複合体の結合は、生物学的文脈に応じて、複数の複雑な結果を有することが可能である。最も簡単には、細胞は活性化性、阻害性又は混合されたシグナルのいずれかを受けることが可能である。これにより、食作用（例えば、マクロファージ及び好中球）、抗原プロセッシング（例えば、樹状細胞）、減少したＩｇＧ産生（例えば、Ｂ細胞）又は脱顆粒（例えば、好中球、マスト細胞）などの事象が生じることがある。ＦｃγＲＩＩｂからの阻害性シグナルは活性化性シグナルのそれよりも優位に立つことが可能であることを支持するデータが存在する（Proulx Clinical Immunology (2010) 135:422-429）。
【０１１３】
サイトカインは、免疫系の細胞を調節する又はウイルス感染した若しくは前癌性の宿主細胞などの標的細胞の死滅をもたらす極めて強力なタンパク質のファミリーである。治療タンパク質として単独で又はターゲティング部分への融合後に使用するためにその高レベルの効力が調べられてきた。ＩＬ−２、ＴＮＦα、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγはすべてヒトにおいて使用するために調べられてきた。その極端な効力は、重篤な又は生命を脅かす病態の患者においては使用がかなり制限される広範囲の副作用又は有害事象により証明された。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカインの産生は、抗体又は免疫グロブリンなどの治療タンパク質の全身投与後に誘発されることがある。サイトカイン産生は短命であり、注入又は皮下注射による投与中及びその直後などの一時的になることがある。例えば、静脈内免疫グロブリンの注入により、一般的な注入関連事象：発熱、悪寒及び嘔吐と関連するＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＦＮγが産生されることが知られている（Aukrust P et al, Blood, Vol 84, p2136-2143, 1994）。サイトカイン産生は、例えば、いわゆる「腫瘍崩壊症候群」におけるように、エフェクター細胞の活性化のせいで寿命がもっと長くなり薬物作用様式に関係する場合がある。極端な例は、薬物の投与により「サイトカインストーム」が引き起こされる場合に生命を危うくすることであった（Suntharalingam G et al, N Engl J Med, Vol 355, p1018-1028, 2006）。
【０１１５】
操作された組換えタンパク質のサイトカイン放出リスクを理解し最小化する明白な必要性が存在する。抗体のＦｃドメインを含有し、機能的に多価になることができる組換えタンパク質は特別な注意が必要である。
【０１１６】
多量体Ｆｃドメインの本研究では、全血サイトカイン放出アッセイを配置し、サイトカイン放出を最小化することを目的として変異原性の効果を調べた（例７）。
【０１１７】
血小板（Platelets (thrombocytes)）は血液中に非常に大量に存在する小さな無核細胞である。血小板は、凝固因子及び他の細胞と共に、血餅を形成することにより出血の休止に関与する。血小板はいくつかの疾患に関与している。低い血小板数「血小板減少症」はいくつかの要因により引き起こされることがあり、挫傷及び出血が増加する。偶発的な凝固「血栓症」には、脳卒中及び深部静脈血栓症などの事象が含まれる。ヒト及び非ヒト霊長類血小板はその表面でＦｃγＲＩＩａを発現するが、マウス血小板はこれを発現しない。血小板は、予め形成されている「密顆粒」及び「アルファ顆粒」により並びに強力なイムノカイン及びヒスタミン、セロトニン、トロンボキサン、ＰＡＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦγＩＬ１βと他にも多数などの他の分子の放出によって血管損傷に極めて迅速に応答することが可能である（Semple Nature Reviews Immunology 2011 11: 265-274）。
【０１１８】
血小板はヒトに投与される薬物の毒性学に機構的に関与してきた。ある種の抗体は、その標的抗原とＦｃドメインの両方が血小板と相互作用して、血小板を活性化し、血栓症を引き起こすことができるので、特に興味深いことが分かっていた（Horsewood 1991 78(4):1019-1026）。抗ＣＤ４０  Ｍａｂについては直接二重結合機序が提唱されてきた（Langer Thrombosis and Haemostasis 2005 93:1127-1146）。代わりに、血栓症は、「ＨＩＴ症候群」（ヘパリン起因性血小板減少症）におけるなどの血小板と相互作用することが可能である標的分子と抗体が架橋することにより間接的に引き起こされることがある。未分画ヘパリンはおおよそ１２％のレシピエントにおいて静脈血栓症と関連していた（Levine Chest 2006 130: 681-687）。ＶＥＧＦを標的にするＭａｂなどの他の例では、作用機序は、ヘパリンがＶＥＧＦと抗体と血小板の間で架橋として作用することを含む可能性がある（Scappaticci 2007 J National Cancer Institute 99:1232-1239; Meyer J. Thrombosis and Haemostasis 2009 7:171-181）。血栓症はＩｇＧの凝集によっても引き起こされることがあり、したがってＩｇＧを生産する場合には製品品質が重要であり、おそらく多量体Ｆｃドメインを生産する場合には特に重要である（Ginsberg J. Experimental Medicine 1978 147:207-218）。
【０１１９】
血小板活性化は血栓症の前兆であるが、必ずしも血栓症に関与するわけではない。血小板活性化はセロトニン放出アッセイにより又はＣＤ６２ｐ、ＣＤ６３若しくはＰＡＣ−１などの活性化マーカーを追跡することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで追跡することが可能である。血小板凝集は、全血、血小板豊富な血漿又は洗浄血小板凝集アッセイにより直接ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察することが可能である。血小板上でのヒトＦｃγＲＩＩａ発現のトランスジェニックマウスを使用すれば、血栓症又は減少した凝固をｉｎ  ｖｉｖｏで研究することも可能である。多量体Ｆｃドメインタンパク質の構築は、血栓症に関して予見可能なリスクをもたらし、したがって、本発明では、Ｆｃ操作及び血小板活性化アッセイはＦｃ多量体の安全性を理解し保証するために配置されている。
【０１２０】
ＦｃＲｎは成人及び小児の血清中におけるＩｇＧの長い半減期を維持するのに重大な役割を有する。この受容体は酸性ベシクル（ｐＨ＜６．５）でＩｇＧに結合して、ＩｇＧ分子を分解から保護し、次にｐＨが７．４と高いとＩｇＧ分子を血液中に放出する。
【０１２１】
ＦｃＲｎは白血球Ｆｃ受容体と似ておらず、それどころかＭＨＣクラスＩ分子に構造的類似性がある。ＦｃＲｎは、３つの細胞外ドメインを含む膜結合鎖に非共有結合しているβ２ミクログロブリン鎖で構成されているヘテロ二量体である。炭水化物鎖を含む、これらのドメインの１つは、β２ミクログロブリンと共に、ＦｃのＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の部位と相互作用する。相互作用はＩｇＧ上のｐＨ＜６．５で正に荷電しているヒスチジン残基に架けられた塩橋を含む。ｐＨがさらに高いと、Ｈｉｓ残基はその正の電荷を失い、ＦｃＲｎ-ＩｇＧ相互作用は弱くなってＩｇＧが解離する。
【０１２２】
ＩＶＩＧ療法の潜在的代替法として使用するための重合体Ｆｃ融合タンパク質はこれまで文献に記載されているが、このタンパク質はヒトＦｃＲｎには結合しない。したがって、このタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏでは機能性が減少する（Mekhaiel et al; Nature Scientific Reports 1:124, published 19thOctober 2011）。
【０１２３】
Ｍｅｋｈａｉｅｌらは、重合体ヒトＦｃ融合タンパク質である六量体ｈＩｇＧ１−Ｆｃ−ＬＨ３０９／３１０ＣＬテイルピースを記載している。このタンパク質は３０９位のロイシンがシステインで置換され、３１０位のヒスチジンがロイシンで置換されている二重突然変異を含む。Ｈ３１０はヒトＦｃＲｎへの結合には重大なので、Ｍｅｋｈａｉｅｌにより記載されているタンパク質はヒトＦｃＲｎに結合することができない。
【０１２４】
Ｌ３０９Ｃ／Ｈ３１０Ｌ二重突然変異は単量体単位の重合には不可欠であると、発明当時は考えられていた（Mekhaiel et al; 2011）。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、Ｌ３０９Ｃ／Ｈ３１０Ｌ二重突然変異がなくても効率的に集合して多量体になる多量体融合タンパク質を作り出した。
【０１２５】
Ｌ３０９Ｃ突然変異により作り出されるシステイン残基は、隣接する単量体単位上のＬ３０９Ｃシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成すると考えられている。これらのジスルフィドはＨ３１０のすぐ近くに位置しているので、その存在によりＦｃＲｎ結合が妨害される可能性がある。本発明の多量体融合タンパク質では、Ｌ３０９Ｃ突然変異がないのでＦｃＲｎへの無妨害の結合が可能になる。
【０１２６】
さらに、３０９位にシステイン残基がないと、多量体融合タンパク質の単離及び精製が単純化し、したがってその製造性が改善される。３０９位にシステイン残基がないと免疫原性の可能性も減少する可能性がある。
【０１２７】
さらに、３１０位に、及び好ましくは４３５位にもヒスチジン残基を保持することにより、本発明の多量体融合タンパク質はヒトＦｃＲｎに結合することができ、分解から保護されて、半減期が長くなり機能性はさらに大きくなる。
【０１２８】
したがって、一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質はヒトＦｃＲｎに結合する。
【０１２９】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は３１０位に、及び好ましくは４３５位にもヒスチジン残基を有する。これらのヒスチジン残基はヒトＦｃＲｎ結合に重要である。一実施形態では、３１０位及び４３５位のヒスチジン残基は天然の残基であり、すなわち、３１０位及び４３５位は突然変異していない。代わりに、これらのヒスチジン残基の１つ又は両方は突然変異の結果として存在していてもよい。
【０１３０】
本発明の多量体融合タンパク質は、ＦｃＲｎへのその結合を変化させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。変化した結合は、結合の増加であっても結合の減少であってもよい。
【０１３１】
一実施形態では、多量体融合タンパク質は、対応する天然の免疫グロブリンよりも大きな親和性及び結合力でＦｃＲｎに結合するように１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１３２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５０位のスレオニン残基をグルタミン残基で置換することにより（Ｔ２５０Ｑ）突然変異している。
【０１３３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５２位のメチオニン残基をチロシン残基で置換することにより（Ｍ２５２Ｙ）突然変異している。
【０１３４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５４位のセリン残基をスレオニン残基で置換することにより（Ｓ２５４Ｔ）突然変異している。
【０１３５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５６位のスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｔ２５６Ｅ）突然変異している。
【０１３６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０７位のスレオニン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｔ３０７Ａ）突然変異している。
【０１３７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０７位のスレオニン残基をプロリン残基で置換することにより（Ｔ３０７Ｐ）突然変異している。
【０１３８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をシステイン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｃ）突然変異している。
【０１３９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｆ）突然変異している。
【０１４０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をプロリン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｐ）突然変異している。
【０１４１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３１１位のグルタミン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｑ３１１Ａ）突然変異している。
【０１４２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３１１位のグルタミン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｑ３１１Ｒ）突然変異している。
【０１４３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４２８位のメチオニン残基をロイシン残基で置換することにより（Ｍ４２８Ｌ）突然変異している。
【０１４４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４３３位のヒスチジン残基をリシン残基で置換することにより（Ｈ４３３Ｋ）突然変異している。
【０１４５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４３４位のアスパラギン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｎ４３４Ｆ）突然変異している。
【０１４６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４３４位のアスパラギン残基をチロシン残基で置換することにより（Ｎ４３４Ｙ）突然変異している。
【０１４７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５２位のメチオニン残基をチロシン残基で、２５４位のセリン残基をスレオニン残基で、２５６位のスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）突然変異している。
【０１４８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をプロリン残基で、４３４位のアスパラギン残基をチロシン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ｙ）突然変異している。
【０１４９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５２位のメチオニン残基をチロシン残基で、２５４位のセリン残基をスレオニン残基で、２５６位のスレオニン残基をグルタミン酸残基で、４３３位のヒスチジン残基をリシン残基で、４３４位のアスパラギン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）突然変異している。
【０１５０】
一実施形態では、多量体融合タンパク質は、対応する天然の免疫グロブリンよりも低い親和性及び結合力でＦｃＲｎに結合するように１つ又は複数の突然変異を含む。一実施形態では、３１０位のヒスチジン残基は別のアミノ酸残基に突然変異している。一例では、３１０位のヒスチジン残基はロイシン残基で置換される（Ｈ３１０Ｌ）。
【０１５１】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃＲｎ結合を変化させ得ることは認識されるであろう。
【０１５２】
本発明の多量体融合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩｂへのその結合を増加させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。ＦｃγＲＩＩｂはヒトにおける唯一の阻害性受容体であり、Ｂ細胞上で見出される唯一のＦｃ受容体である。Ｂ細胞及びその病原性抗体は多くの免疫疾患の核心にあり、したがって、多量体融合タンパク質はこれらの疾患に対して改善された療法を提供することができる。
【０１５３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３８位のプロリン残基をアスパラギン酸残基で置換することにより（Ｐ２３８Ｄ）突然変異している。
【０１５４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５８位のグルタミン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２５８Ａ）突然変異している。
【０１５５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６７位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｓ２６７Ａ）突然変異している。
【０１５６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６７位のセリン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｓ２６７Ｅ）突然変異している。
【０１５７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２８位のロイシン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｌ３２８Ｆ）突然変異している。
【０１５８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５８位のグルタミン酸残基をアラニン残基で、２６７位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２５８Ａ／Ｓ２６７Ａ）突然変異している。
【０１５９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６７位のセリン残基をグルタミン酸残基で、３２８位のロイシン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）突然変異している。
【０１６０】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃγＲＩＩｂ結合を増加させ得ることは認識されるであろう。
【０１６１】
本発明の一実施形態では、ＦｃγＲへの減少した結合を示す多量体融合タンパク質を提供する。ＦｃγＲへの減少した結合は、病原性抗体に関連する免疫疾患の治療において使用するための改善された療法を提供することができる。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質はＦｃγＲへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１６３】
一実施形態では、ＦｃγＲへの結合を減少させる突然変異は、ＩｇＧ１に由来するＦｃドメインを含む本発明の多量体融合タンパク質において使用される。
【０１６４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３４Ａ）突然変異している。
【０１６５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のフェニルアラニン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｆ２３４Ａ）突然変異している。
【０１６６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１６７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３６位のグリシン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｇ２３６Ｒ）突然変異している。
【０１６８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ２９７Ｑ）で置換することにより突然変異している。
【０１６９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９８位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｓ２９８Ａ）突然変異している。
【０１７０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２８位のロイシン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｌ３２８Ｒ）突然変異している。
【０１７１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のロイシン残基をアラニン残基で、２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１７２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のフェニルアラニン残基をアラニン残基で、２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１７３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３６位のグリシン残基をアルギニン残基で、３２８位のロイシン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ）突然変異している。
【０１７４】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃγＲ結合を減少させ得ることは認識されるであろう。
【０１７５】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩへのその結合に影響を与えることなくＦｃγＲＩＩＩａへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１７６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３９位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｓ２３９Ａ）突然変異している。
【０１７７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６９位のグルタミン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２６９Ａ）突然変異している。
【０１７８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９３位のグルタミン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２９３Ａ）突然変異している。
【０１７９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９６位のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｙ２９６Ｆ）突然変異している。
【０１８０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０３位のバリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｖ３０３Ａ）突然変異している。
【０１８１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２７位のアラニン残基をグリシン残基で置換することにより（Ａ３２７Ｇ）突然変異している。
【０１８２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３３８位のリシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｋ３３８Ａ）突然変異している。
【０１８３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３７６位のアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｄ３７６Ａ）突然変異している。
【０１８４】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃγＲＩＩＩａ結合を減少させ得ることは認識されるであろう。
【０１８５】
本発明の多量体融合タンパク質は、補体へのその結合を変化させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。変化された補体結合は結合の増加であってもよいし結合の減少であってもよい。
【０１８６】
一実施形態では、このタンパク質はＣ１ｑへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。古典的な補体経路の開始は、抗原結合ＩｇＧ及びＩｇＭのＣＨ２ドメインへの六量体Ｃ１ｑタンパク質の結合から始まる。本発明の多量体融合タンパク質は抗原結合部位を持たず、したがって、Ｃ１ｑへの著しい結合を示すとは予想されないであろう。しかし、Ｃ１ｑ結合を減少させる１つ又は複数の突然変異の存在により、抗原会合の非存在下では補体を活性化しないことが保証され、したがって安全性がさらに大きな改善された療法が提供されることになる。
【０１８７】
したがって、一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質はＣ１ｑへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１８８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３４Ａ）突然変異している。
【０１８９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１９０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３５位のロイシン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｌ２３５Ｅ）突然変異している。
【０１９１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３７位のグリシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｇ２３７Ａ）突然変異している。
【０１９２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２２位のリシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｋ３２２Ａ）突然変異している。
【０１９３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３３１位のプロリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｐ３３１Ａ）突然変異している。
【０１９４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３３１位のプロリン残基をセリン残基で置換することにより（Ｐ３３１Ｓ）突然変異している。
【０１９５】
一実施形態では、多量体融合タンパク質はＩｇＧ４に由来するＦｃドメインを含む。ＩｇＧ４はＩｇＧ１よりも天然に低い補体活性化プロファイルを有するが、ＦｃγＲのさらに弱い結合も有する。したがって、一実施形態では、ＩｇＧ４を含む多量体融合タンパク質は、ＦｃγＲ結合を増加させる１つ又は複数の突然変異も含む。
【０１９６】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＣ１ｑ結合を減少させ得ることは認識されるであろう。
【０１９７】
本発明の多量体融合タンパク質は、システイン残基を作り出す又は除去する１つ又は複数の突然変異も含むことができる。システイン残基は、ポリペプチド単量体単位の個々の対間にジスルフィド架橋を形成することにより、多量体融合タンパク質の自発的集合に重要な役割がある。代わりに、システイン残基は遊離のＳＨ基の化学修飾に使用することができる。したがって、システイン残基の数及び／又は位置を変えることにより、多量体融合タンパク質の構造を改変して改善された治療特性を有するタンパク質を産生することが可能である。
【０１９８】
本発明の多量体融合タンパク質は３０９位にシステイン残基を含まない。３０９位のアミノ酸残基はシステイン以外のいかなるアミノ酸残基でもよい。一実施形態では、３０９位のアミノ酸残基は、対応する天然に存在する抗体中に見出される野生型残基である。例えば、天然に存在するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４中の３０９位に見出される野生型残基はロイシン残基であり、天然に存在するＩｇＧ２に見出される野生型残基はバリン残基である。
【０１９９】
一実施形態では、抗体Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をシステイン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｃ）突然変異している。
【０２００】
本発明の一実施形態では、含むジスルフィド結合及び／又はグリコシル化部位がもっと少なく、製造性が改善されている多量体融合タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、ジスルフィド結合構造及び翻訳後グリコシル化パターンの複雑さが少なく、したがって、製造するのがもっと簡単であり費用も少なくなる。
【０２０１】
一実施形態では、ヒンジ領域の２つのジスルフィド結合は、コアヒンジ配列ＣＰＰＣをＳＰＰＳに突然変異させることにより除去されている。
【０２０２】
一実施形態では、テイルピース中のジスルフィド結合は、５７５位のシステイン残基をセリン、スレオニン又はアラニン残基で置換することにより（Ｃ５７５Ｓ、Ｃ５７５Ｔ、又はＣ５７５Ａ）除去されている。
【０２０３】
一実施形態では、コアヒンジ配列ＣＰＰＣはＳＰＰＳに突然変異し、５７５位のテイルピースシステイン残基はセリン、スレオニン又はアラニン残基で置換されている（Ｃ５７５Ｓ、Ｃ５７５Ｔ、又はＣ５７５Ａ）。
【０２０４】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は、実質的に非共有結合ドメイン間相互作用を含む。
【０２０５】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は、産物の実質的な割合が六量体になるように細胞内で発現される。
【０２０６】
実質的な割合は、好ましくは５０％以上、例えば、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜１００％である。
【０２０７】
一実施形態では、ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化部位は、２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ２９７Ｑ）で置換することにより除去されている。改善された製造性に加えて、これらのアグリコシル突然変異体は本明細書の上に記載されるＦｃγＲ結合を減少もさせる。
【０２０８】
一実施形態では、テイルピース中のグリコシル化部位は、５６３位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ５６３Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ５６３Ｑ）で置換することにより除去されている。
【０２０９】
一実施形態では、ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化部位とテイルピース中のグリコシル化部位は両方とも、２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基又はグルタミン残基で置換し、５６３位のアスパラギン残基をアラニン残基又はグルタミン残基で置換することにより（Ｎ２９７Ａ／Ｎ５６３Ａ又はＮ２９７Ａ／Ｎ５６３Ｑ又はＮ２９７Ｑ／Ｎ５６３Ａ又はＮ２９７Ｑ／Ｎ５６３Ｑ）除去されている。
【０２１０】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせられることは認識されるであろう。
【０２１１】
本発明は、本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖、又はその成分部分をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。ＤＮＡ配列は、例えば、化学処理により産生される合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せを含むことができる。
【０２１２】
本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列は当業者に周知である方法により得ることが可能である。例えば、ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の一部又はすべてをコードするＤＮＡ配列は、決定されているＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づいて、望み通りに合成することができる。本発明に従った適切なＤＮＡ配列の例は配列番号５０〜５９に提供されている。
【０２１３】
分子生物学の標準技法を使用して本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成技法を使用して完全に又は一部合成することができる。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を必要に応じて使用してもよい。
【０２１４】
本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖、又はその成分部分をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。
【０２１５】
ベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。この点に関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０２１６】
本発明の多量体融合タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。いかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも本発明の多量体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば、大腸菌（E.coli）系及び酵母類（Saccharomyces）若しくはピキア（Pichia）などの他の微生物系を使用することができる、又は真核、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系も使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ細胞が含まれる。本発明において使用するのに適した種類のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）には、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと一緒に使用することができるＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などの、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、又はグルタミンシンセターゼ選択可能マーカーと一緒に使用することができるＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞を含む、ＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が含まれうる。他の適切な宿主細胞にはＮＳＯ細胞が含まれる。
【０２１７】
本発明は、本発明に従った多量体融合タンパク質の産生のための工程であって、融合タンパク質の発現及び多量体への集合に適した条件下で本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養することと、多量体融合タンパク質を単離し、場合によって精製することとを含む、上記工程も提供する。
【０２１８】
本発明の多量体融合タンパク質は宿主細胞から良好なレベルで発現される。したがって、多量体融合タンパク質の特性は商業的処理に貢献する。
【０２１９】
本発明の多量体融合タンパク質は、任意の適切な方法を使用して作製することができる。一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質は、凝集を最小化する条件下で産生することができる。一例では、凝集は培養培地、培養液上清、又は精製培地に保存剤を添加することにより最小化することができる。適切な保存剤の例には、Ｎメチルマレイミド、ヨード酢酸、βメルカプトエタノール、βメルカプトエチルアミン、グルタチオン、又はシステインなどのチオールキャッピング剤が含まれる。他の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などのジスルフィド阻害剤、又はｐＨ６．０より下への酸性化が含まれる。
【０２２０】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され抗体は溶出されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーを非結合様式で実施するステップを含む上記工程が提供される。
【０２２１】
一実施形態では、精製はＦｃＲｎ、ＦｃγＲ又はＣ反応性タンパク質カラム上での親和性捕獲を用いる。
【０２２２】
一実施形態では、精製はプロテインＡを用いる。
【０２２３】
この工程において使用するのに適したイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給される）が含まれる。このステップは、例えば、ｐＨ約８で実施することができる。
この工程は、例えば、４．５などの約４〜５のｐＨで実施される、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕獲ステップをさらに含むことができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給される）などの樹脂を用いることができる。次に、抗体又は断片は、例えば、２００ｍＭの濃度で塩化ナトリウムなどのイオン食塩水を用いて樹脂から溶出させることが可能である。
したがって、クロマトグラフィーステップ（単数又は複数）は、必要に応じて１回又は複数回の洗浄ステップを含むことができる。
精製工程は、ダイアフィルトレーションステップなどの、１つ又は複数の濾過ステップも含むことができる。
【０２２４】
必要な数のポリペプチド単量体単位を有する多量体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより、分子サイズに応じて分離することが可能である。
【０２２５】
したがって、一実施形態では、エンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡから実質的に精製された、特にエンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡがない或いは実質的にない本発明に従った精製された多量体融合タンパク質が提供される。
【０２２６】
上で使用される精製された形態は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも純粋な、などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０２２７】
エンドトキシンが実質的にないことは一般的に、ｍｇ産物当たり０．５又は０．１ＥＵなどのｍｇ抗体産物当たり１ＥＵ又はそれよりも少ないエンドトキシン含有量を指すことを意図されている。
【０２２８】
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡが実質的にないことは一般的に、必要に応じて、ｍｇ当たり１００μｇ又はそれよりも少ない、特にｍｇ当たり２０μｇなどの、ｍｇの抗体産物当たり宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含有量４００μｇ又はそれよりも少ないことを指すことを意図されている。
【０２２９】
本発明の多量体融合タンパク質は病態の治療及び／又は予防において有用なので、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて本発明の多量体融合タンパク質を含む医薬又は診断用組成物も提供する。したがって、医薬を製造するための本発明のタンパク質の使用が提供される。組成物は、通常は薬学的に許容される担体を含むことになる無菌の医薬組成物の一部として普通は供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。
【０２３０】
本発明は医薬又は診断用組成物の調製のための工程であって、本発明の多量体融合タンパク質を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加し混合することを含む上記工程も提供する。
【０２３１】
多量体融合タンパク質は医薬又は診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分又はステロイド若しくは他の薬物分子などの非抗体成分を含む他の活性成分を伴っていてもよい。
【０２３２】
医薬組成物は、治療的有効量の本発明の多量体融合タンパク質を適切に含む。本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的にされた疾患若しくは状態を治療する、寛解する若しくは予防するのに、又は検出可能な治療的若しくは予防的効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。いかなる医療でも、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにおいて又は動物モデルにおいて、通常は齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類においてのいずれかで評価することが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定することが可能である。
【０２３３】
ヒト対象のための正確な治療的有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び頻度、複合薬（単数又は複数）、反応感受性並びに療法に対する耐性／応答に依拠することになる。この量は通例の実験法により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇなどの０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇになる。医薬組成物は、都合よく、用量当たり予め決められた量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で提供することができる。
【０２３４】
本開示に従った多量体融合タンパク質の治療用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは明らかな毒性学的効果は全く示していない。
【０２３５】
本発明に従った多量体融合タンパク質の一実施形態では、単一用量は循環ＩｇＧレベルの最大９０％の減少を提供することができる。
【０２３６】
組成物は患者に個別に投与してもよいし、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、順次に又は別々に）投与してもよい。
【０２３７】
一実施形態では、本開示に従った多量体融合タンパク質は、ステロイド、特にプレドニゾンなどの免疫抑制剤療法と一緒に用いられる。
【０２３８】
一実施形態では、本開示に従った多量体融合タンパク質はリツキシマブ又は他のＢ細胞療法と組み合わせて用いられる。
【０２３９】
一実施形態では、本開示に従った多量体融合タンパク質は、任意のＢ細胞若しくはＴ細胞調節剤又は免疫調節剤と一緒に用いられる。例には、メトトレキサート、ミコフェノール酸及びアザチオプリンが含まれる。
【０２４０】
本発明の多量体融合タンパク質が投与される用量は、治療する状態の性質、存在する疾患の程度及び多量体融合タンパク質が予防的に使用されているのか既存の状態を治療するために使用されているのかどうかに依拠する。
【０２４１】
投与頻度は多量体融合タンパク質の半減期及びその効果の持続時間に依拠することになる。多量体融合タンパク質の半減期が短ければ（例えば、２〜１０時間）、１日当たり１回又は複数回の投与をする必要がある。代わりに、多量体融合タンパク質の半減期が長ければ（例えば、２〜１５日間）及び／又は持続性の薬力学的効果があれば、１日に１回、１週間に１回又は１若しくは２か月ごとに１回投与するだけでよい。
【０２４２】
一実施形態では、用量は隔週で、すなわち、月２回送達される。
【０２４３】
本明細書で用いられる半減期は、循環中、例えば、血清／血漿中の分子の持続時間を指すことが意図されている。
【０２４４】
本明細書で用いられる薬力学とは、本開示に従った多量体融合タンパク質の生物学的作用のプロファイル、特に持続時間のことである。
【０２４５】
薬学的に許容される担体はそれ自体が組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘発するべきではなく、毒性をもつべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きくゆっくり代謝される巨大分子であってもよい。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０２４６】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在していてもよい。そのような担体を使えば、医薬組成物は患者が経口摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することが可能になる。
【０２４７】
投与のための適切な形態には、例えば、注射又は注入による、例えば、ボーラス注射又は持続注入による、非経口投与に適した形態が含まれる。産物が注射又は注入目的である場合、産物は、油性又は水性媒体中で懸濁液、溶液又は乳濁液の形態をとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有していてもよい。タンパク質はナノ粒子の形態であってもよい。代わりに、抗体分子は、使用前に適切な無菌液で再構成するために乾燥形態であってもよい。
【０２４８】
処方された後は、本発明の組成物は対象に直接投与することが可能である。治療される対象は動物でも可能である。しかし、１つ又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象への投与のために適応される。
【０２４９】
適宜、本開示に従った製剤では、最終製剤のｐＨは多量体融合タンパク質の等電点の値には類似しておらず、例えば、タンパク質のｐＩが８〜９又はそれよりも上の範囲である場合、製剤ｐＨの７は適切であることがある。理論に縛られたくはないが、これにより最終的には、最終製剤に改善された安定性を与えることができ、例えば、多量体融合タンパク質が溶液のままであると考えられる。
【０２５０】
一例では、４．０〜７．０の範囲のｐＨでの医薬製剤は、１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示に従ったタンパク質分子、１〜１００ｍＭの緩衝液、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定化剤、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定化剤と５〜５００ｍＭの等張化剤、又はｃ）５〜５００ｍＭの等張化剤を含む。
【０２５１】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮的（transdermal）、経皮的（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されない任意の数の経路により投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射液として調製することができる。注射に先立って液体媒体中の溶液又は懸濁液に適した固形形態も調製することができる。
【０２５２】
組成物の直接送達は一般に、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に注射により達成される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は病変内に投与することも可能である。投薬治療は単一用量予定でも複数用量予定でもよい。
【０２５３】
組成物中の活性成分はタンパク質分子になることは認識されるであろう。したがって、活性成分は胃腸管中での分解に感受性になる。したがって、組成物を胃腸管を使用する経路により投与するつもりであれば、組成物は、タンパク質を分解から保護するが胃腸管により吸収された後はタンパク質を放出する薬剤を含有する必要がある。
【０２５４】
薬学的に許容される担体についての徹底的な考察はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０２５５】
適切な可吸入調製物には、可吸入粉末、推進用ガスを含有する計量エアロゾル又は推進用ガスのない可吸入液が含まれる。活性物質を含有する本開示に従った可吸入粉末は、活性物質のみから又は活性物質と生理的に許容される賦形剤の混合物からなっていてもよい。これらの可吸入粉末は、単糖類（例えば、グルコース又はアラビノーズ）、二糖類（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ糖及び多糖類（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含むことができる。単糖類又は二糖類は適切に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特にその水和物の形態であるが、水和物の形態だけに限るわけではない。
【０２５６】
肺における沈着のための粒子は、１〜９ミクロン、例えば、１〜５μｍなどの１０ミクロン未満の粒子サイズが必要である。活性成分（例えば、抗体又は断片）の粒子サイズは極めて重要である。
【０２５７】
可吸入エアロゾルを調製するために使用することが可能である推進用ガスは当技術分野では既知である。適切な推進用ガスは、ｎプロパン、ｎブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン若しくはシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロゲン化炭化水素の中から選択される。上記推進用ガスは単独で又はその混合物で使用してもよい。
【０２５８】
特に適した推進用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。ハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適切である。
【０２５９】
推進用ガス含有可吸入エアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤などの他の成分及びｐＨを調整するための手段も含有していてよい。これらの成分はすべて当技術分野では既知である。
【０２６０】
本発明に従った推進用ガス含有可吸入エアロゾルは最大５重量％の活性物質を含有することができる。本発明に従ったエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２６１】
代わりに、肺への局所投与は、例えば、ネブライザー、例えば、圧縮機に接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．製のＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）圧縮機に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）などの装置を用いて液体溶液又は懸濁製剤の投与によるものでもよい。
【０２６２】
本発明の多量体融合タンパク質は溶媒中に分散して、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の多量体融合タンパク質は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することが可能である。当技術分野で既知の緩衝液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、１ｍｌの水当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ  ＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇクエン酸ナトリウムを含有することができる。懸濁剤は、例えば、凍結乾燥させたタンパク質を用いることが可能である。
【０２６３】
治療懸濁液又は溶液製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含有することが可能である。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアに被包することが可能である。製剤は一般に、無菌製造工程を用いることから実質的に無菌で提供されることになる。
【０２６４】
これには、製剤のために使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による生産及び無菌化、無菌緩衝溶媒溶液中のタンパク質の無菌懸濁液、及び当業者にはよく知られている方法による無菌容器内への製剤の分注が含まれ得る。
【０２６５】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単一用量単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、体積、例えば、２ｍＬの溶媒／溶液緩衝液に単位用量を含有する。
【０２６６】
本明細書に開示される多量体融合タンパク質は、噴霧療法による送達に適している場合もある。
【０２６７】
本発明のタンパク質は遺伝子治療の使用により投与できることも想定している。これを実現するためには、適切なＤＮＡ成分の制御下でタンパク質分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列は、ポリペプチド鎖がＤＮＡ配列から発現されてｉｎ  ｓｉｔｕで構築されるように、患者内に導入される。
【０２６８】
一実施形態では、治療において使用するために本発明の多量体融合タンパク質を提供する。
【０２６９】
一実施形態では、免疫不全の治療において使用するために本発明の多量体融合タンパク質を提供する。
【０２７０】
一実施形態では、免疫不全の治療のための医薬を調製するための本発明の多量体融合タンパク質の使用を提供する。
【０２７１】
本発明の多量体融合タンパク質を使用して治療することができる免疫不全の例には、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、川崎病及びギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）が含まれる。
【０２７２】
本発明は、自己免疫疾患、例えば、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、ＡＮＣＡ関連血管炎、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫高脂血症、自己免疫免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、軸索及び爪ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋症、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、拡張型心筋症、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性血管中心性線維症（Eosinophilic angiocentric fibrosis）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）ウェゲナー参照、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎（Hashimoto's encephalitis）、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性低補体血症性尿細管間質性腎炎（Idiopathic hypocomplementemic tubulointestitial nephritis）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連疾患、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、キュットナー腫瘍、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、ミクリッツ症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、結合組織増殖症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オーモンド病（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、異常タンパク性多発ニューロパチー（Paraproteinemic polyneuropathies）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群（Parry Romberg syndrome）、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、尋常性天疱瘡、大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲脳髄膜炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、１型、２型及び３型自己免疫多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、��発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症（オーモンド病）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚炎、白斑、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、温特発性溶血性貧血（Warm idiopathic haemolytic anaemia）及びウェゲナー肉芽腫症（現在では、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）の制御において使用するための多量体融合タンパク質（又は多量体融合タンパク質を含む組成物）も提供する。
【０２７３】
一実施形態では、本開示に従った多量体融合タンパク質及び断片は、癲癇又は発作の治療又は予防に用いられる。
【０２７４】
一実施形態では、本開示に従った多量体融合タンパク質及び断片は、多発性硬化症の治療又は予防に用いられる。
【０２７５】
一実施形態では、本開示に従った多量体融合タンパク質及び断片は、
・抗ＨＬＡ抗体に起因する移植ドナーミスマッチ
・胎児及び新生児同種免疫性血小板減少症、ＦＮＡＩＴ（又は新生児同種免疫性血小板減少症、ＮＡＩＴＰ若しくはＮＡＩＴ若しくはＮＡＴ、又は胎児母体同種免疫性血小板減少症、ＦＭＡＩＴＰ若しくはＦＭＡＩＴ）
を含む同種免疫疾患／徴候の治療又は予防に用いられる。
【０２７６】
追加の徴候には、ヒト患者及び多量体融合タンパク質療法と他の療法、ＩＶＩｇ、リツキサン、血漿交換療法の組合せからのＦｃ含有生物製剤薬の急速なクリアランスが含まれる。例えば、多量体融合タンパク質療法はリツキサン療法に続いて用いることができる。
【０２７７】
一実施形態では、本開示の多量体融合タンパク質は、
・慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）
・ギラン・バレー症候群
・異常タンパク性多発ニューロパチー
・視神経脊髄炎（ＮＭＯ、ＮＭＯスペクトル障害又はＮＭＯスペクトル疾患）、及び
・重症筋無力症
などの神経学障害の治療又は予防に用いられる。
【０２７８】
一実施形態では、本開示の多量体融合タンパク質は、
・水疱性類天疱瘡
・尋常性天疱瘡
・ＡＮＣＡ関連血管炎
・拡張型心筋症
などの皮膚科障害に用いられる。
【０２７９】
一実施形態では、本開示の多量体融合タンパク質は、
・特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
・血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
・温特発性溶血性貧血
・グッドパスチャー症候群
・抗ＨＬＡ抗体に起因する移植ドナーミスマッチ
などの免疫学又は血液学障害に用いられる。
【０２８０】
一実施形態では、障害は、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＣＩＤＰ、ギラン・バレー症候群、異常タンパク性多発ニューロパチー、難治性癲癇、ＩＴＰ／ＴＴＰ、溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、ＡＢＯミスマッチ、ループス腎炎、腎血管炎、強皮症、繊維性肺胞炎、拡張型心筋症、グレーブス病、１型糖尿病、自己免疫性糖尿病、天疱瘡、強皮症、ループス、ＡＮＣＡ血管炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群及び関節リウマチから選択される。
【０２８１】
一実施形態では、障害は、自己免疫性多腺性内分泌症候群１型（autoimmune polyendocrine syndrome types 1）（ＡＰＥＣＥＤ又はウィタカー症候群）及び２型（シュミット症候群）、汎発性脱毛症、筋無力症クリーゼ、甲状腺クリーゼ、甲状腺関連眼病、甲状腺眼障害、自己免疫性糖尿病、自己抗体関連脳炎及び／又は脳症、落葉状天疱瘡、表皮水疱症、疱疹状皮膚炎、シデナム舞踏病、急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、ミラー・フィッシャー症候群、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、眼球クローヌス、炎症性筋疾患、アイザック症候群（自己免疫性神経性筋強直症）、腫瘍随伴症候群並びに辺縁系脳炎から選択される。
【０２８２】
本開示に従った多量体融合タンパク質は治療又は予防において用いることができる。
【０２８３】
本発明は、個体において望ましくない抗体の濃度を減少させる方法であって、個体に治療的有効用量の本明細書に記載される多量体融合タンパク質を投与するステップを含む上記方法も提供する。
【０２８４】
本発明の多量体融合タンパク質は診断、例えば、Ｂ細胞関連リンパ腫などのＦｃ受容体に関連する病状のｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び画像診断においても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】本発明に従った発現構築物及び多量体融合タンパク質の例を示す図である。ＳＰはシグナルペプチドであり、ＣＨ２及びＣＨ３は重鎖定常ドメインであり、ＴＰはテイルピースである。
【図２（ａ）】例となる配列を示す図である。２（ａ）はポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、テイルピース配列は下線が施され、いかなる突然変異もボールド及び下線で示されている。ヒンジはボールドである。ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む構築物では、この領域はイタリック体で示されている。
【図２（ｂ）】例となる配列を示す図である。２（ｂ）はＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体ポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、ＩｇＧ１とＩｇＧ４間の違いの位置はボールドであり、強調されている。
【図２（ｃ）】例となる配列を示す図である。２（ｃ）はＩｇＧ１のある種の選択された特性とＩｇＧ４のある種の選択された特性を組み合わせるように設計されたＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図である。突然変異はボールド及び下線で示されている。
【図２（ｄ）】例となる配列を示す図である。２（ｄ）はドメイン交換により操作されたハイブリッド重鎖Ｆｃ領域を有するＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図である。
【図２（ｅ）】例となる配列を示す図である。２（ｅ）はハイブリッド重鎖Ｆｃ領域及び追加の突然変異を有し、ＩｇＧ１のある種の選択された特性とＩｇＧ４のある種の選択された特性を組み合わせるように操作されたＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図である。
【図２（ｆ）】例となる配列を示す図である。２（ｆ）はＢ７２．３シグナルペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す図である。（ｉ）ＤＮＡ配列、（ｉｉ）アミノ酸配列。
【図２（ｇ）】例となる配列を示す図である。２（ｇ）はＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図である。
【図３（ａ）】Ｆｃ多量体集合におけるＣＨ３ドメインの役割を示す図である。３（ａ）はＦｃ多量体の六量体化に対するＩｇＧ１／ＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン交換の効果を示すサイズ排除クロマトグラフィートレースを示す図である。
【図３（ｂ）】Ｆｃ多量体集合におけるＣＨ３ドメインの役割を示す図である。３（ｂ）はＩｇＧ１  Ｆｃ  ＩｇＭ  ｔｐの六量体化に対するＣＨ３ドメインの点突然変異の効果を示す図である。
【図３（ｃ）】Ｆｃ多量体集合におけるＣＨ３ドメインの役割を示す図である。３（ｃ）はＩｇＧ４  Ｆｃ  ＩｇＭ  ｔｐの高レベルの六量体化が点突然変異Ｑ３５５Ｒにより達成されることを示す図である。
【図３（ｄ）】Ｆｃ多量体集合におけるＣＨ３ドメインの役割を示す図である。３（ｄ）はＩｇＧ１  Ｆｃ  ＩｇＭ  ｔｐにおけるすべての他のアミノ酸へのＲ３５５の突然変異誘発の効果を示す図である。
【図４】表面プラズモン共鳴分析により測定されるＦｃ多量体のＦｃＲｎへの結合を示している。トレースは、多量体濃度範囲、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭ、０．０７８１２５μＭ、０．０３９０６２５μＭについての結合を示す図である。示されているＦｃ多量体はすべて３１０位にヒスチジンを含んでいた。４（ａ）は低密度ＦｃＲｎへのｈＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐ  Ｌ３０９Ｃの結合を示す図である。４（ｂ）は低密度ＦｃＲｎへのｈＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐの結合を示す図である。４（ｃ）は高密度ＦｃＲｎへのｈＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐ  Ｌ３０９Ｃの結合を示す図である。４（ｄ）は高密度ＦｃＲｎへのｈＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐの結合を示す図である。
【図５】マクロファージ食作用のＦｃ多量体阻害を示す図である。データは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来で、ＩｇＭテイルピース単独で又はＩｇＭテイルピースとＬ３０９Ｃで六量体又は十二量体形態に重合されているＦｃ多量体はすべて、ヒトＩＶＩＧよりも有意に良好な効力及び最大レベルの阻害を示すことを明らかにしている。
【図６】マクロファージ食作用のＦｃ多量体阻害を示す図である。データは、ＩｇＧ１とＩｇＧ４  Ｆｃ領域の間の違いの選択された位置に単一交差突然変異を含むＦｃ多量体の阻害効果を示している。
【図７】マクロファージ食作用のＦｃ多量体阻害を示す図である。データは、免疫不全の治療において使用するために設計されたＦｃ多量体の阻害効果を示している。
【図８】Ｆｃ多量体によるサイトカイン放出の刺激を示す図である。データは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は、Ｌ３０９Ｃがあってもなくても、非常に高いレベルのサイトカイン放出を刺激することを実証した。サイトカインの観察されたレベルは陽性対照の抗ＣＤ５２抗体、キャンパスによって生じるレベルよりも高かった。これとは著しく対照的に、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ不活性「ＬＡＬＡ」突然変異を含むＩｇＧ４  Ｆｃ多量体及びＩｇＧ１  Ｆｃ多量体（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）は、実質的ゼロのサイトカイン放出を生じた。
【図９】Ｆｃ多量体によるサイトカイン放出の刺激を示す図である。データは、ＩｇＧ１とＩｇＧ４  Ｆｃ領域の間の違いの選択された位置に単一交差突然変異を含むＦｃ多量体の効果を示している。
【図１０】Ｆｃ多量体によるサイトカイン放出の刺激を示す図である。データは、サイトカイン放出を調節する突然変異で操作されたＦｃ多量体の効果を示している。
【図１１】Ｆｃ多量体によるＦｃＲｎ媒介ＩｇＧリサイクリングの阻害を示す図である。
【図１２】、急性血小板減少症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける血小板損失のＦｃ多量体による予防を示す図である。グラフは、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用する５つの独立した実験の凝集結果を示している。
【図１３】、慢性血小板減少症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける血小板損失のＦｃ多量体による予防を示す図である。（ａ）３日目に投与された単一用量の１０ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ多量体。（ｂ）３、４、５、及び６日目に投与された４連続毎日用量、用量あたり１０ｍｇ／ｋｇ。グラフ上のポイントごとに群サイズはｎ＝６であった。
【図１４】Ｆｃ多量体のＣ１ｑへの結合を示す図である。
【図１５】Ｆｃ多量体による血小板活性化を示す図である。
【実施例】
【０２８６】
（例１）
分子生物学
Ｆｃ多量体ＤＮＡ配列は、ＰＣＲ、制限−ライゲーションクローニング、点突然変異誘発（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）及びサンガー配列決定法を含む標準分子生物学的方法を使用して構築した。発現構築物は、ＣＨＯ細胞において一過性発現と安定的発現の両方に適している発現プラスミド（ｐＮＡＦＬ、ｐＮＡＦＨ）にクローニングした。適切な発現ベクターの他の例にはｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【０２８７】
本発明に従った発現構築物及び多量体融合タンパク質の図は図１に示されている。
【０２８８】
ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図は、図２（ａ）〜（ｅ）に提供されている。それぞれの配列では、テイルピース配列は下線が施され、いかなる突然変異もボールド及び下線で示されている。ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む構築物では、この領域はイタリック体で示されている。
【０２８９】
ＩｇＧ１／ＩｇＧ４交差突然変異
Ｆｃドメイン中のある種の鍵となる重要なアミノ酸残基がＩｇＧ１において見出されるアミノ酸残基にマッチするように設計され、他の鍵となる重要なアミノ酸残基がＩｇＧ４に見出されるアミノ酸残基にマッチするように設計された種々のＦｃ多量体変異体を構築した。表４に要約されているように、ＩｇＧ１とＩｇＧ４はＣＨ２ドメイン中の７つの位置で及びＣＨ３ドメイン中の６つの位置で互いに異なっている。
【表４】
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【０２９０】
ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体ポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図は、図２（ｂ）に提供されている。それぞれの配列では、ＩｇＧ１とＩｇＧ４間の違いの位置はボールドであり強調されている。
【０２９１】
ＩｇＧ１のある種の選択された特性とＩｇＧ４のある種の選択された特性を組み合わせるように設計されたＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図は図２（ｃ）に提供されている。突然変異はボールド及び下線で示されている。
【０２９２】
対象の特定の配列は、出発点としてＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃドメイン配列のどちらかを使用し、関連する突然変異を作製して作り出すことができることは認識されるであろう。例えば、突然変異Ｆ２３４Ｌを有するＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインは、突然変異Ｈ２６８Ｑ、Ｋ２７４Ｑ、Ｙ２９６Ｆ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを有するＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインと同じである。
【０２９３】
Ｆｃ領域ドメイン交換
ＣＨ２ドメインが一特定のＩｇＧサブクラスに由来しＣＨ３ドメインが異なるＩｇＧサブクラスに由来しているハイブリッド重鎖Ｆｃ領域を含むＦｃ多量体変異体も構築した。ハイブリッド重鎖Ｆｃ領域を有するＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図は図２（ｄ）に提供されている。
【０２９４】
ハイブリッド重鎖Ｆｃ領域及び追加の突然変異を有し、ＩｇＧ１のある種の選択された特性とＩｇＧ４のある種の選択された特性を組み合わせるように設計されているＦｃ多量体の例となるアミノ酸配列を示す図は図２（ｅ）に提供されている。
【０２９５】
（例２）
発現
リポフェクタミン又は電気穿孔法を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞の「一過性」発現を使用して小規模発現を実施した。培養物は、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｌｏｎｚａ）又はＰｒｏＣＨＯ５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地において５０〜２０００ｍｌの範囲のスケールで５〜１０日間、振盪フラスコ又は撹拌バッグ中で増殖させた。細胞は遠心分離により除去し、培養液上清は精製するまで４℃で保存した。細胞を除去した後、いくつかの培養物には保存剤を添加した。
【０２９６】
結果によれば、多量体融合タンパク質が十分発現されていることが実証された。
【０２９７】
多量体融合タンパク質を発現するのに使用したシグナルペプチドは、達成される発現レベルに影響を及ぼすことが分かった。抗体Ｂ７２．３由来のシグナルペプチドは先行技術に記載されていたＩＬ−２シグナルペプチド配列よりも高い発現レベルをもたらした。
【０２９８】
Ｂ７２．３シグナルペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列は図２ｆに示されている。
【０２９９】
（例３）
精製及び分析
Ｆｃ多量体は、ｐＨの点検／６．５以上への調整後プロテインＡクロマトグラフィーとともにｐＨ３．４緩衝液を使用する溶出ステップにより培養液上清から精製した。溶出液は１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５を使用して直ちにｐＨ約７．０まで中和し、その後４℃で保存した。分析的サイズ排除クロマトグラフィーを使用し、Ｓ２００カラム及び画分採取を使用して種々の多量体形態のＦｃドメインを分離した。画分は分析し、Ｇ３０００ＨＰＬＣ並びに還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後プールした。エンドトキシンはカブトガニアメボサイトライセート（ＬＡＬ）アッセイを使用して試験し、アッセイで使用した試料は１ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０３００】
多量体融合タンパク質は主に六量体形態で発現され精製され、一部のタンパク質は十二量体及び他の形態であることが分かった。結果によれば、タンパク質は３０９位にシステインがなくても効果的に集合して多量体になることが実証される。
【０３０１】
保存剤の存在下で多量体融合タンパク質を精製すると凝集する傾向が減少し、さらに均一な構造を有する改善された調製物が産生された。効果的であることが明らかにされている保存剤の例には、Ｎエチルマレイミド（ＮＥＭ）及びグルタチオン（ＧＳＨ）などのチオールキャッピング剤；並びにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのジスルフィド阻害剤が含まれる。
【０３０２】
（例４）
Ｆｃ多量体集合におけるＣＨ３ドメインの役割
多量体化の程度は思いがけないことに、Ｆｃ領域が由来する元のＩｇＧサブクラスに応じて変動することが分かった。ＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体は非常に効率的に六量体に集合し、その分子のおおよそ８０％が六量体形態で存在していた。これとは対照的に、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体はもっと低いレベルの六量体を形成した。ＣＨ２ドメインが一特定のＩｇＧサブクラスに由来しておりＣＨ３ドメインが異なるＩｇＧサブクラスに由来しているハイブリッドＦｃ領域を含むＦｃ多量体を調べると、六量体を形成する能力が主にＣＨ３ドメインにコードされていることが明らかになった。ＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインが存在すると六量体化が著しく増加する。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ１に由来しておりＣＨ２ドメインがＩｇＧ４に由来しているハイブリッドＦｃ多量体はＩｇＧ１野生型と同じくらいの効率で六量体化し、その分子のおおよそ８０％が六量体として見出された。したがって、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインをＩｇＧ１のもので置き換えると、野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体と比べて六量体化のレベルを改善する。こうして得られたハイブリッドは、ＩｇＧ４の望ましい特性の多くを保持しつつ高いレベルの六量体形成をするという利点がある。図３（ａ）。
【０３０３】
ＩｇＧ１とＩｇＧ４のＣＨ３ドメインは例１に記載した６つの位置で異なる。ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体から始めて、これらの位置のそれぞれがＩｇＧ１残基からＩｇＧ４残基に次々に突然変異した。結果によれば、３５５位のアミノ酸が六量体化には極めて重要であることが実証された。野生型ＩｇＧ１中の３５５位に見出されるアミノ酸のアルギニンが効率的な六量体化を促進する。野生型ＩｇＧ４に見出されるアミノ酸のグルタミンでは六量体化は低くなる。ＩｇＧ１とＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの間の違いのその他の位置は六量体化に影響を与えなかった。図３（ｂ）。
【０３０４】
ＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含むＦｃ多量体では、３５５位のグルタミン残基をアルギニン残基で置換すると（Ｑ３５５Ｒ）高いレベルの六量体化が生じた。したがって、ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体の比較的低い六量体化という問題は単一アミノ酸置換により解決することが可能である。これは、こうして得られるＦｃ多量体がＩｇＧ４の特徴的な特性を保持したまま高い効率で六量体に集合するという利点を有する。図３（ｃ）。
【０３０５】
ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体では、３５５位のアルギニンをシステインで置換すると（Ｒ３５５Ｃ）六量体形成を野生型ＩｇＧ１以上に増加させた。理論に縛られたくはないが、この結果から、３５５位のシステイン残基はテイルピース中のシステインとジスルフィド結合を形成することができる可能性があることが示唆される。その他のすべてのアミノ酸へのＲ３５５の突然変異誘発では、ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体における六量体形成のさらなる増強は生じなかった。図３（ｄ）。
【０３０６】
（例５）
Ｆｃ多量体とＦｃＲの相互作用についての親和性測定
多量体融合タンパク質とＦｃγＲ及びＦｃＲｎを含むＦｃ受容体（ＦｃＲ）の相互作用についての親和性／結合力測定は、ＦｃＲ担持細胞系での表面プラズモン共鳴、競合ＥＬＩＳＡ及び競合結合研究を含む周知の方法を使用して実施することが可能である。ＦｃＲの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００でのＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上への非特異的固定化又はタグ特異的捕獲による表面プラズモン共鳴実験において使用した。ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインは、ヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメインとβ２マイクログロブリンの間の非共有結合複合体として提供された。多量体融合タンパク質は、相互作用の強さを最もよく決定するために、受容体上、種々の濃度及び流速で滴定した。データはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析した。
【０３０７】
図４は、表面プラズモン共鳴分析により測定した、ＦｃＲｎへの多量体融合タンパク質の結合についてのデータを示している。トレースは、多量体濃度範囲、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭ、０．０７８１２５μＭ、０．０３９０６２５μＭについての結合を示す。示されているＦｃ多量体はすべて３１０位にヒスチジンを含んでいた。
（ａ）は低密度ＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐ  Ｌ３０９Ｃの結合を示している。
（ｂ）は低密度ＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐの結合を示している。
（ｃ）は高密度ＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐ  Ｌ３０９Ｃの結合を示している。
（ｄ）は高密度ＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ＩｇＭ  ｔｐの結合を示している。
【０３０８】
（ａ）及び（ｃ）において使用される構築物は３０９位にロイシンからシステインへの置換を含有する。
【０３０９】
結果によれば、３１０位にヒスチジンを含むＦｃ多量体はヒトＦｃＲｎに結合することが実証された。
【０３１０】
ヒトＦｃＲｎへの結合を増加させると考えられた突然変異を取り込んだいくつかのＦｃ多量体も生成した。
【０３１１】
表５は、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの突然変異単量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片の結合の解離定数を示す。突然変異によりヒトＦｃＲｎへの結合が増加した。しかし、単量体断片の相互作用の強さはそれでも弱く、解離定数はマイクロモル濃度の範囲であった。突然変異Ｆｃドメインの多量体化は、本発明に記載されるように、結合力の利益を与え、したがって相互作用の強さを大いに改善することができる。
【表５】
2017512063.tif 000007
【０３１２】
（例６）
Ｂ細胞標的のマクロファージ食作用
ヒトマクロファージによるＢ細胞の抗体依存性食作用を測定するアッセイを設計した。マクロファージを調製するため、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を先ず密度勾配遠心分離により新鮮血から単離した。次に、単核球は、ＰＢＭＣを６ウェル組織培養被覆プレートにおいて３７℃で１時間インキュベートし、それに続いて非付着性細胞を除去することにより選択した。付着性単核球は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）での５日培養によりマクロファージに分化した。次に、ヒトＢ細胞は、ＰＢＭＣの単離とそれに続くＭＡＣＳを使用する負の選択によりＢ細胞を精製することにより、別々の（同種）ドナーから調製した（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。いくつかのアッセイで、Ｂ細胞はカルボキシフルオセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。分化したマクロファージとＢ細胞は抗ＣＤ２０  ｍＡｂ（リツキシマブ）の存在下、１対５比で共培養し、Ｂ細胞の抗体依存性食作用を誘導した。多量体融合タンパク質又は対照は指示濃度で添加し、細胞は３７℃、５％ＣＯ２で１〜２４時間インキュベートした。それぞれの時点の終了時、細胞は遠心分離し４℃でＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁してそれ以上の食作用を停止し、Ｂ細胞はフローサイトメトリーによる分析前に抗ＣＤ１９アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で表面染色した。マクロファージはその自己蛍光／側方散乱性により、Ｂ細胞はそのＣＦＳＥ／ＣＤ１９標識化により識別した。ＣＤ１９標識化に対して陰性のＣＦＳＥ陽性マクロファージは貪食されたＢ細胞を含有すると仮定した。
【０３１３】
結果によれば、本発明の多量体融合タンパク質はヒトマクロファージによるＢ細胞枯渇を抑制することが実証された（図５）。データによれば、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来で、ＩｇＭテイルピース単独、又はＩｇＭテイルピースとＬ３０９Ｃにより六量体又は十二量体形態に重合されたＦｃ多量体はすべて、効力と最大レベルの抑制をヒトＩＶＩＧと比べて有意に良好に示すことが明らかになっている。
【０３１４】
十二量体形態と六量体形態が等しく強力であるという証拠は、製品製造及び安全性にとり有益である。なぜならば、六量体から微量の十二量体を除去するための追加の精製の必要性がないからである。
【０３１５】
ＣＦＳＥ染色Ｂ細胞を使用するフローサイトメトリー分析により、その作用機序がマクロファージ食作用の阻害であり、Ｂ細胞死滅でも他の手段によるアポトーシスでもないことが確かめられた。
【０３１６】
任意のＦｃ多量体構築物のマクロファージ食作用を阻害する能力を評価するため、その活性を本明細書の上に記載するアッセイにおいて測定し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体の活性と比較した。次に、それぞれの突然変異体の活性を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体について得られたものとその濃度対効果曲線の目視比較に基づいて「ＩｇＧ１様」、「高」、「中程度」、「低」、又は「ＩｇＧ４様」としてまとめた。
【０３１７】
ＩｇＧ１とＩｇＧ４  Ｆｃ領域の差異の８つの位置のそれぞれで単一交差突然変異を含むＦｃ多量体についての結果は図６に示しており、表６にまとめている。
【０３１８】
野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用を強力に阻害する。ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体中の単一突然変異の２つ（Ａ３３０Ｓ、Ｋ４０９Ｒ）は食作用阻害の効力に全く効果を及ぼさない。６つの単一突然変異（Ｌ２３４Ｆ、Ｈ２６８Ｑ、Ｋ２７４Ｑ、Ｙ２９６Ｆ、Ａ３２７Ｇ及びＰ３３１Ｓ）では食作用阻害の効力に中程度の減少が生じる。残基Ｌ２３４Ｆ及びＡ３２７Ｇは、突然変異させると、食作用阻害の比較的高い効力を維持しつつサイトカイン放出が著しく減少するので特に興味深い（例８参照）。特性をこのように組み合わせれば、自己免疫不全の治療に有用になる。
【０３１９】
野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用を阻害するが、ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体ほど強力ではない。ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体中の単一突然変異の２つ（Ｆ２３４Ｌ及びＧ３２７Ａ）は食作用阻害の効力を中程度に増加させる。ＩｇＧ４中の突然変異の６つ（Ｑ２６８Ｈ、Ｑ２７４Ｋ、Ｆ２９６Ｙ、Ｓ３３０Ａ、Ｓ３３１Ｐ、Ｒ４０９Ｋ）は個別に突然変異した場合は食作用阻害に全く効果を及ぼさない。残基Ｆ２３４Ｌ及びＧ３２７Ａは、どちらかを個別に突然変異させると食作用の阻害においてＩｇＧ４  Ｆｃ多量体の効力を増強するが、サイトカイン産生の増加には全く効果を及ぼさないので特に興味深い（例８参照）。特性をこのように組み合わせれば、自己免疫不全の治療に有用になる。
【表６】
2017512063.tif 000008
【０３２０】
免疫不全の治療での使用のために設計された追加のＦｃ多量体構築物の結果は図７に示されており、表７にまとめられている。
【０３２１】
野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用をＩＶＩＧよりも強力に阻害する。
【０３２２】
Ｌ２３４Ｆ（サイトカイン産生を減少させる）又はＬ２３４ＦとＰ３３１Ｓ（サイトカイン産生及びＣ１ｑ結合を減少させる、例８及び１５参照）を含むＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体と比べて食作用阻害の効力を中程度に減少させたが、それでも野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体又はＩＶＩＧと比べて極めて強力である。
【０３２３】
突然変異Ｆ２３４Ｌ；Ｆ２３４ＬとＦ２９６Ｙ；Ｇ３２７ＡとＳ３３１Ｐ；Ｓ３３０ＡとＳ３３１Ｐ；又はＧ３２７ＡとＳ３３０Ａを含むＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体と比べて食作用阻害における効力を増強した。
【表７】
2017512063.tif 000009
【０３２４】
（例７）
ＩｇＧ  ＦＩＴＣビーズのＴＨＰ１細胞食作用
ＴＨＰ１細胞は継代７でプレートアウトし、計数して、５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。２００μｌの細胞を９６ウェル平底プレートのそれぞれのウェルに添加した（ウェル当たり１×１０５細胞）。ウサギＩｇＧで被覆したビーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＣＡＹ５００２９０−１ｅａ）をそれぞれのウェルに直接添加し、混合し（１０希釈度中１、１０μｌ／ウェル）、時点１時間、２時間、４時間、８時間放置した。ゼロ時点は、氷上、氷冷緩衝液中の細胞にビーズを添加することによりもたらされた。それぞれの時点の終了時、細胞は３００ｇで３分間遠心分離した。細胞は、１対２０の希釈度のトリパンブルー原液を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に２分間再懸濁した。細胞は１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁しＦＡＣＳ用に準備された丸底プレートに移した。細胞は、フローサイトメトリーによる分析前に、もう１度遠心分離し２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＴＨＰ１細胞は前方及び側方散乱でゲートをかけ、ビーズの取り込みはＦＩＴＣ蛍光として測定した。
【０３２５】
（例８）
ヒト全血サイトカイン放出アッセイ
新鮮血をリチウムヘパリンバキュテナーにおいてドナーから採取した。対象のＦｃ多量体構築物又は対照は指示濃度まで無菌ＰＢＳ中に連続希釈した。１２．５μｌのＦｃ多量体又は対照をアッセイプレートに添加し、続いて２３７．５μｌの全血を添加した。プレートはＣＯ２補充なしで２４時間、３７℃でインキュベートした。プレートは１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、サイトカイン分析のために血清を除去した。サイトカイン分析はＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙサイトカインマルチプレックスにより、製造業者のプロトコルに従って実施し、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００上で読み取った。
【０３２６】
結果は図８に示している。データによれば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体はＬ３０９Ｃがあってもなくても、非常に高いレベルのサイトカイン放出を刺激することが実証された。観察されたサイトカインのレベルは、陽性対照キャンパスにより産生されるサイトカインのレベルよりも高かった。これとは著しく対照的に、ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体、及びＦｃγＲとＣ１ｑ不活性「ＬＡＬＡ」突然変異（Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃ多量体が生じるサイトカイン放出は実質的にゼロであった。
【０３２７】
サイトカイン放出に対する任意のＦｃ多量体構築物の効果を評価するため、本明細書の上に記載されるアッセイにおいてその活性を測定し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体の活性と比較した。次に、突然変異体の活性を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体について得られたものとその濃度対効果曲線の目視比較に基づいて「ＩｇＧ１様」、「高」、「中程度」、「低」、又は「ＩｇＧ４様」としてまとめた。
【０３２８】
ＩｇＧ１とＩｇＧ４  Ｆｃ領域の差異の選択された位置に単一交差突然変異を含むＦｃ多量体についての結果は図９に示しており、表８にまとめている。
【０３２９】
結果によれば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、極めて著しいレベルのサイトカインの放出を刺激することが立証された。示されている結果はＩＦＮγについてである。ＴＮＦαについては類似する結果が観察された。
【０３３０】
単一突然変異の２つ（Ｌ２３４Ｆ、Ａ３２７Ｇ）はＩｇＧ１  Ｆｃ多量体におけるサイトカイン放出を著しく減少させた。単一突然変異の１つ（Ｙ２９６Ｆ）はサイトカイン放出の中程度の減少を生じた。突然変異の１つ（Ｐ３３１Ｓ）はサイトカイン放出を著しく増加させた。突然変異の３つ（Ｈ２６８Ｑ、Ｋ２７４Ｑ、Ａ３３０Ｓ）はサイトカイン放出に全く効果を及ぼさなかった。
【０３３１】
これとは著しく対照的に、野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、実質的には全くサイトカイン放出を生じなかった。単一交差突然変異はどれもＩｇＧ４  Ｆｃ多量体によるサイトカイン放出にいかなる効果も及ぼさず、ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体におけるサイトカイン放出にとり重要であることが明らかにされた位置の突然変異でさえ効果はなかった。
【表８】
2017512063.tif 000010
【０３３２】
サイトカイン放出を調節するように設計された追加のＦｃ多量体構築物についての結果は図１０に示されており、表９にまとめられている。
【０３３３】
データによれば、ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体によるサイトカイン放出は、Ｌ２３４Ｆを単独で又はＰ３３１Ｓと組み合わせて含むことによりＩＶＩＧにおおよそ相当するレベルにまで減少させることが可能であることが示されている。そのようなＦｃ多量体は免疫不全の治療に有用である可能性がある。他の有用な特性、例えば、食作用における増強された効力（例６）があることが明らかにされている突然変異を含有するすべてのＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は実質的にゼロレベルのサイトカイン放出を保持し、したがって、免疫不全の治療に有用である可能性がある。
【表９】
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【０３３４】
（例９）
培養中の細胞におけるＩｇＧリサイクリングに対する効果
細胞ベースのアッセイを、ヒトＦｃＲｎとヒトβ２Ｍダブル遺伝子ベクターをジェネテシン選択マーカーと一緒に安定的にトランスフェクトされているメイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）ＩＩ細胞を使用して実施した。ヒトＩｇＧをリサイクルし経細胞輸送することができる安定な細胞クローンを選択し、これをその後のすべての研究で使用した。この細胞はＭＤＣＫＩＩクローン１５と呼ばれることになる。カニクイザル（「クローン４０」）又はマウスＦｃＲｎのどちらかをトランスフェクトされた対応するＭＤＣＫ細胞系を、上記のものに等しいアッセイにおいて使用するために、同じように生成した。
【０３３５】
ＦｃＲｎのＩｇＧリサイクリング能力を阻害する本発明の多量体融合タンパク質の能力を調べるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを確立した。手短に言えば、ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞を酸性緩衝液（ｐＨ５．９）中で多量体融合タンパク質の存在下又は非存在下でビオチン化ヒトＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）とインキュベートしてＦｃＲｎに結合させた。６０分のパルス時間後、過剰なタンパク質はすべて除去し、細胞は中性ｐＨ緩衝液（ｐＨ７．２）中でインキュベートし、表面露出結合ＩｇＧを上清中に放出させた。ＭＳＤアッセイを使用してＦｃＲｎの阻害を追跡し、リサイクルされしたがって上清中の放出されるＩｇＧの量を検出した。
【０３３６】
ＭＤＣＫＩＩクローン１５細胞は９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１５０００細胞で蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞はＨＢＳＳ＋（Ｃａ／Ｍｇ）ｐＨ５．９＋１％ＢＳＡ中多量体融合タンパク質の存在下及び非存在下、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）と一緒にインキュベートした。細胞はＨＢＳＳ＋ｐＨ５．９で洗浄し、その後ＨＢＳＳ＋ｐＨ７．２中３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。ライセートと上清は除去し、ＭＳＤアッセイ（抗ヒトＩｇＧ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）及びストレプトアビジン−スルホタグ暴露抗体（ＭＳＤ）を使用する）を使用して全ＩｇＧについて分析した。阻害曲線は非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）により解析してＥＣ５０を決定した。
【０３３７】
結果によれば、本発明の多量体融合タンパク質はＦｃＲｎ媒介ＩｇＧリサイクリングを阻害することが実証された（図１１）。３１０位に天然のヒスチジン残基を保持するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピース多量体は、３０９位にシステインがあってもなくても、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧ経細胞輸送及びリサイクリングを濃度依存的な形態で遮断する。データによれば、Ｌ３０９Ｃを欠く形態はＬ３０９Ｃがある形態よりも強力であることがはっきり示されている。理論に縛られたくはないが、この違いは、ＦｃＲｎ結合に決定的に関与している３１０位のヒスチジン残基に隣接するＬ３０９Ｃジスルフィド結合による立体障害に起因する可能性がある。
【０３３８】
表１０は、Ｆｃ多量体のブロッキング活性に対する突然変異の効果を示している。ＦｃＲｎへの結合を増加させる３つの突然変異、Ｖ３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｐ及びＴ３０７Ａは、ＩｇＧ１  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピース又はＩｇＧ４  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピースを含むＦｃ多量体において試験した。結果によれば、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧ細胞内取り込み及びＩｇＧリサイクリングを遮断するＦｃ多量体の能力の著しい改善が示された。データによれば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域のどちらかを含むＦｃ多量体の効力を改善するためにはこれらの突然変異が有用であることが実証された。
【０３３９】
３１０位のヒスチジンをロイシンで置換すると（Ｈ３１０Ｌ）、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧ細胞内取り込み及びＩｇＧリサイクリングを遮断するＦｃ多量体の能力が破壊されることが明らかにされた。結果によれば、３１０位にヒスチジン残基を保持しているＦｃ多量体のほうがＦｃＲｎへの結合がはるかに良好であり、ＩｇＧ細胞内取り込み及びＩｇＧリサイクリングのより強力なブロッカーであることが示されている。データによれば、本発明のＦｃ多量体は半減期がさらに長く有効性のさらに大きな新しい改善された治療組成物を提供できることが確証されている。
【表１０】
2017512063.tif 000012
【０３４０】
（例１０）
急性ＩＴＰにおけるＦｃ多量体の有効性
Ｆｃ多量体の有効性を、血小板損失を抗ＣＤ４１の投与により誘導しているＩＴＰのマウスモデルにおいて研究した。この抗体は血小板表面上の糖タンパク質ＩＩｂに結合し、その血小板を破壊の標的にする。
ＩＴＰｉｎ  ｖｉｖｏプロトコル
ベースライン血小板数を得るために投与に先立って５μｌの血液試料をマウスの尾から採取した。
マウスには１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのＦｃ多量体を静脈内に投与した。
１時間後１μｇ／マウスのラット抗マウスＣＤ４１  ＩｇＧ１抗体（ＭＷＲｅｇ３０）を腹腔内に投与した。
最終心臓穿刺は、抗ＣＤ４１投与の２４時間後に実施した。
ＦＡＣ染色プロトコル
５μｌの血液を尾静脈から採取した。最終試料では、血液は心臓穿刺によりヘパリンチューブ内に採取し５μｌを染色用に採取した。
１００μｌの抗体カクテルを５μｌの血液試料に添加し、暗所において４℃で２０分間インキュベートした。
５ｍｌのＦＡＣ緩衝液を添加した。
それぞれの試料は１対４で希釈して「Ｖ字形」底プレートで最終体積２００μｌにし、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣｓ  Ｃａｎｔｏ上で取得する準備ができるまで氷上に保った。
【表１１】
2017512063.tif 000013
【０３４１】
ＦＡＣＳ取得
設定体積１５０μｌの試料を流速１．５μｌ／秒で採取した。閾値は２００に設定した。
解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアで実施した。血小板数はＣＤ４５−／ＣＤ４２ｄ＋にゲートをかけた細胞から導き出した。
細胞数は、最初の５μｌの血液試料は１／４０００に希釈されこのうちの１５０μｌはＦＡＣｓ機械に流され、これは分析されている最初の試料の０．１８７５μｌに一致するという事実に基づいて試料希釈について補正した。５／０．１８７５＝血小板／μｌでは増倍係数×２６．７。
試薬
ラット抗マウスＣＤ４１機能的等級精製されている（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＷＲｅｇ３０、ロット番号Ｅ１１９１４−１６３２）
エンドトキシンなしＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）
ＦＡＣ緩衝液：０．１％のＦＣＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ
結果
１ｍｇ／ｋｇ用量でのヒト多量体融合タンパク質（「Ｆｃ多量体」）は十分に許容的であった。しかし、これらのタンパク質はモデルでのこの用量では効果的ではなかった。陽性結果は１０ｍｇ／ｋｇのヒトＦｃ多量体を使用して観察された。ＩｇＭ又はＩｇＡテイルピースのどちらかを有するＦｃ多量体は、１μｇ／マウスの抗ＣＤ４１の注射によって引き起こされる血小板減少を著しく阻害した。
【０３４２】
結果によれば、Ｆｃ多量体は急性免疫性血小板減少症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで血小板損失を防ぐことが実証された。血小板損失の統計的に有意な減少は、１０ｍｇ／ｋｇの用量での、Ｌ３０９Ｃ有りとなしの両方でのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピース多量体及びＬ３０９Ｃ有りのヒトＩｇＧ４  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピース多量体を使用して達成した（図１２）。したがって、テイルピースだけを通じて、又はＬ３０９Ｃジスルフィドとテイルピースを介して六量体化された多量体融合タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで効果的である。ヒトＩＶＩＧはこのモデルでは１０００ｍｇ／ｋｇというはるかに高い用量のみで活性である。１０ｍｇ／ｋｇの当用量では、ＩＶＩＧは血小板損失を防ぐには不活性であることが分かった。
【０３４３】
（例１１）
慢性ＩＴＰにおけるＦｃ多量体の有効性
Ｆｃ多量体の有効性を、ミニポンプを使用して持続時間の間抗ＣＤ４１を投与することにより血小板損失が誘導されている慢性ＩＴＰのマウスモデルにおいて研究した。
ＩＴＰ  ｉｎ  ｖｉｖｏプロトコル
ベースライン血小板数を得るために投与に先立って５μｌの尾出血を行った。
ラット抗マウスＣＤ４１を８２．５μｇ／ｍｌの濃度（５７．７５μｌのラット抗マウスＣＤ４１  Ａｂ＋６４２．２５μｌのＰＢＳ／ＢＳＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ））で含有するアルゼットミニポンプを皮下に植え込んだ。ポンプは流速０．５μｌ／時を有し、１日当たり０．９９μｇの抗ＣＤ４１の相当量を投与する。
血小板数を得るための５μｌの尾出血は毎日行った。
定常状態の血小板数に到達した時点で、マウスに１ｇ／ｋｇのＩＶＩＧ、又はＦｃ多量体を一定範囲の用量で静脈内に投与する。
７日目、最終心臓穿刺を実施した。
ＦＡＣ染色プロトコル
尾部静脈を経て５μｌの血液を採取する。最終試料では、心臓穿刺によりヘパリンチューブ内に血液を採取し、染色のために５μｌ採取する。
１００μｌの抗体カクテルを添加し、暗所で４℃、２０分間インキュベートする。
５ｍｌのＦＡＣ緩衝液を添加する。
それぞれの試料を１対４で希釈して「Ｖ字形」底プレートで最終体積２００μｌにし、ＢＤ  ＦＡＣｓ  Ｃａｎｔｏ上で取得する準備ができるまで氷上に保つ。
【表１２】
2017512063.tif 000014
【０３４４】
ＦＡＣＳ取得
設定体積１５０μｌの試料を流速１．５μｌ／秒で収集する。閾値は２００に設定する。
解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアで実施する。血小板数はＣＤ４５−ＣＤ４２ｄ＋にゲートをかけた細胞から導き出す。
細胞数は、最初の５μｌの血液試料は１／４０００に希釈されこのうちの１５０μｌはＦＡＣｓ機械に流されこれは分析されている最初の試料の０．１８７５μｌに一致することに基づいて試料希釈について補正する。５／０．１８７５＝血小板／μｌでは増倍係数×２６．７。
【０３４５】
試薬
ラット抗マウスＣＤ４１機能的等級精製されている（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＷＲｅｇ３０、ロット番号Ｅ１１９１４−１６３２）
エンドトキシンなしＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）
ＦＡＣ緩衝液：０．１％のＦＣＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ
１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１  ＩｇＭ  ｔｐ、（ＩＤ：ＰＢ００００２３８）、ＥＷＢＥ−０１７５５３、５．６９ｍｇ／ｍｇ、
エンドトキシン（Endototoxin）＜０．３５ＥＵ／ｍｇ
ＩｇＧ１  Ｆｃ  ＩｇＭ  ｔｐ  Ｌ３０９Ｃ、（ＩＤ：ＰＢ００００１９８）、ＥＷＢＥ−０１７４００、６．４９ｍｇ／ｍｌ、エンドトキシン＜０．４６ＥＵ／ｍｇ
ＩＶＩＧ：Ｇａｍｍｕｎｅｘ  ロット番号２６ＮＫ１Ｎ１
【０３４６】
結果によれば、多量体融合タンパク質は慢性血小板減少症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて血小板損失を防ぐことが実証された。図１３は、（ａ）単一用量の１０ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ多量体、３日目に投与、及び（ｂ）４日連続毎日投与、用量当たり１０ｍｇ／ｋｇ、３、４、５及び６日目に投与、を使用して達成された効果を示している。多用量のＦｃ多量体は、血小板損失を防ぐのにその有効性を増加させた。ヒトＩＶＩＧははるかに高用量の１０００ｍｇ／ｋｇでのみ効果があった。
【０３４７】
（例１２）
質量分析による六量体Ｆｃ多量体のジスルフィド結合及びグリカン分析
方法
六量体Ｆｃ多量体の精製された試料（１００μｇ）は、５５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中８Ｍ尿素の存在下で変性し、２２ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）と一緒に３７℃で６０分間インキュベートすることにより遊離のチオールを捕獲した。尿素濃度は限外濾過を使用して６Ｍまで減少させタンパク質はＬｙｓＣ／トリプシン混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃で３時間消化した。試料は５体積の緩衝液でさらに希釈し、消化は３７℃で一晩続けた。ペプチドは収集し、Ｗａｔｅｒ  Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢカートリッジで脱塩し、遠心式エバポレータを使用して乾燥させ、０．２％蟻酸を含有する水（溶媒Ａ）中に再構成した。
【０３４８】
試料（７．５μＬ、約７μｇ）は溶媒Ａで平衡された２．１×１５０ｍｍのＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  １．７μ  ＰＳＴ  ３００Ａ）上に１５０μＬ／分で充填し、４０℃で操作した。ペプチドは、５０％溶媒Ｂ（４対４対１のアセトニトリル：１−プロパノール：水／０．２％蟻酸）までの６０分勾配により、ＭＳＥ＋ｖｅ−ｉｏｎモードで操作するＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ質量分析計中に溶出させた。ＭＳＥデータは、低及び高衝突エネルギーの交互スキャンからなるが、溶出中範囲１００〜１９００ｍ／ｚにわたり収集した。ランニング後、消化物は自動回収装置バイアルに１０ｍＭのトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）溶液を直接添加することにより還元し、室温で１時間超インキュベートした。次に還元された試料はもう１度分析された。
【０３４９】
ＭＳＥデータはＷａｔｅｒｓ  ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ（商標）（ＢＰＬ）を使用して関連Ｆｃ多量体配列に対して検索した。遊離のジスルフィドチオールの割合は、ＴＨＰ還元消化物中のＩＡＭ標識対遊離ペプチドの比から計算した。グリカンプロファイルは、消化物中で検出された種々の糖ペプチドアイソフォームから決定した。
【０３５０】
結果
Ｌ３０９Ｃ有り及びなしでのＦｃ多量体（ＩｇＧ１  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピース）のグリカン分析の結果は表１３に示している。グリカン構造は表８に示している。
【０３５１】
データは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のグリコシル化部位である、Ｎ２９７の高い占有率を示しており、この位置で見出されている遊離のアスパラギン残基は１０％未満である。Ｎ２９７でのグリコシル化は主にフコシル化二分岐複合体、第１にＧ０Ｆであった。ＩｇＭテイルピース部位、Ｎ５６３の占有率は約５０％であり、天然のＩｇＭで見出された約２０％のレベルよりも高かった。Ｎ５６３でのグリコシル化は主に高マンノースであった。
【表１３】
2017512063.tif 000015
【０３５２】
鎖間ジスルフィド結合の分析の結果は表１４に示している。鎖内ジスルフィド結合についても同様の結果が得られた。データによれば、Ｆｃ多量体中のシステイン残基の高い割合がジスルフィド結合されていることが実証された。相当量のスクランブルされたジスルフィド結合がある証拠はなく、予想されたジペプチドはすべてが還元前は高レベルで見出された。
【表１４】
2017512063.tif 000016
【０３５３】
（例１３）
Ｆｃ多量体のＣ１ｑへの結合
Ｆｃ多量体のＣ１ｑへの結合は、Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、カタログ番号ＫＡ１２７４、ロット番号Ｖ１４−１１１７２３５２７のＣ１ｑ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。Ｆｃ多量体構築物は５００μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌまでずっと５倍希釈で滴定した。１００μｌのそれぞれのＦｃ多量体構築物を適切なウェルに添加し、１時間撹拌して結合を可能にする。次に、製造業者のプロトコルに従ってアッセイを実施し、プレートリーダー上、吸光度４５０ｎｍで分析した。
【０３５４】
任意のＦｃ多量体構築物のＣ１ｑへの結合を評価するため、その活性を測定し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体の活性と比較した。次に、突然変異体の活性を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体について得られたものとその濃度対効果曲線の目視比較に基づいて「ＩｇＧ１様」、「高」、「中程度」、「低」、又は「ＩｇＧ４様」としてまとめた。
【０３５５】
結果は図１４に示しており表１５にまとめている。
【０３５６】
結果によれば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、Ｃ１ｑに強力に結合することが実証された。これとは対照的に、野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、Ｃ１ｑへの結合は非常に弱い。Ｆｃ多量体中のＣ１ｑ結合を規定する支配的残基は３３１位のプロリン（Ｐ３３１）であることが分かった。このプロリン残基をセリンで置換すると（Ｐ３３１Ｓ）、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインを有するＦｃ多量体におけるＣ１ｑ結合が効果的に減少した。逆突然変異、Ｓ３３１Ｐ、はＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインを有するＦｃ多量体におけるＣ１ｑ結合を増加させた。
【表１５】
2017512063.tif 000017
【０３５７】
（例１４）
血小板活性化
Ｆｃ多量体による血小板活性化はフローサイトメトリーにより分析した。２倍希釈のＦｃ多量体をＲＭＰＩ培養液中で調製しＦＡＣＳチューブに移した。最終濃度は１００μｇ／ｍｌから下がって３．１２μｇ／ｍｌであった。チューブ当たり５μｌの新鮮な全血（最小限２人のヒトドナーから）を添加した。血小板は抗ＣＤ４２ｂ標識Ｍａｂを使用してゲートをかけ、活性化はマーカーＣＤ６２ｐ、ＣＤ６３及びＰＡＣ−１に対するＭａｂを用いて追跡した。（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ  ＣＤ４２ｂ  ＡＰＣ  カタログ番号５５１０６１、ＢＤ  ＣＤ６２ｐ  ＰＥ  カタログ番号５５０５６１、ＢＤ  ＣＤ６３  ＰＥ−Ｃｙ−７  カタログ番号５６１９８２、ＢＤ  ＰＡＣ−１  ＦＩＴＣ  カタログ番号３４０５０７）。細胞はフローサイトメトリーによる分析前に５００μｌのパラホルムアルデヒド１％の添加により固定化した。
【０３５８】
ＣＤ６２ｐは試験した３つのマーカーのうち最も感受性が高いことが分かった。
【０３５９】
任意のＦｃ多量体構築物による血小板活性化を評価するため、その活性を測定し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体の活性と比較した。次に、突然変異体の活性を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体について得られたものとその濃度対効果曲線の目視比較に基づいて「ＩｇＧ１様」、「高」、「中程度」、「低」、又は「ＩｇＧ４様」としてまとめた。
【０３６０】
ＣＤ６２ｐ発現の誘導についての結果は図１５に示しており表１６にまとめている。
【０３６１】
結果によれば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、著しいレベルの血小板活性化をもたらすことが実証された。
【０３６２】
２つの突然変異、Ｌ２３４Ｆ及びＡ３２７ＧがＩｇＧ１  Ｆｃ多量体からのサイトカイン放出を減少させるのに有用であることを例８で明らかにした。これら２つの突然変異のうち、Ｌ２３４Ｆは、ＩｇＧ１野生型Ｆｃドメインと比べて血小板活性化のレベルを大いに減少させ、Ａ３２７Ｇ突然変異を有するＦｃ多量体は著しいレベルの血小板活性化を保持している。したがって、Ｌ２３４Ｆは極めて有用な突然変異であり、マクロファージ食作用の阻害における効力の消失はわずかなだけでサイトカイン放出及び血小板活性化を減少させる。
【０３６３】
Ｌ２３４ＦにＰ３３１Ｓ（例１３において有用なＣ１ｑ減少突然変異であることが明らかにされている）を追加すると（Ｌ２３４Ｆ  Ｐ３３１Ｓ）、血小板活性化のレベルが低くなる。この二重突然変異体は、低サイトカイン、低血小板活性化及びゼロＣ１ｑ結合を達成する手段である。したがって、この突然変異の組合せは特に有用であり、免疫不全の治療のための新しい療法を提供すると予想される。
【０３６４】
Ｌ２３４ＦはＡ３２７Ｇよりも優位である可能性がある。なぜならば、三重Ｌ２３４Ｆ  Ａ３２７Ｇ  Ｐ３３１Ｓ突然変異体の血小板活性化は低いからである。
【０３６５】
野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、血小板活性化は実質的にゼロである。
【０３６６】
ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１のＣＨ３ドメインと交換してもこれらの減少したレベルの血小板活性化を保持する。
【０３６７】
Ｆ２３４Ｌ突然変異は血小板活性化のレベルは低く（効力を増強させた）が、野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体と比べると血小板活性化を増加させる。
【０３６８】
Ｆ２９６Ｙは、血小板活性化をさらに増加させることなく、Ｆ２３４Ｌと組み合わせることが可能である。この所見は、Ｆ２３４Ｌ  Ｆ２９６ＹがＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体と比べると効力を増加させたので、重要である。したがって、この突然変異の組合せは特に有用であり、免疫不全の治療のための新しい療法を提供すると予想される。
【０３６９】
Ｇ３２７Ａ突然変異は血小板活性化を増加させない。この所見は、高レベルの血小板活性化を保持したＩｇＧ１  Ｆｃ多量体中の逆突然変異Ａ３２７Ｇの結果を考慮すると驚きである。
【０３７０】
ＩｇＧ４  ＷＴよりも効力も増強したある種の二重突然変異体（Ｇ３２７Ａ  Ｓ３３０Ａ、Ｇ３２７Ａ  Ｓ３３１Ｐ及びＳ３３０Ａ  Ｓ３３１Ｐ）は血小板活性化のレベルが非常に低く（ＩｇＧ４様）、免疫不全の治療のための新しい療法を提供すると予想される。
【表１６】
2017512063.tif 000018
【０３７１】
（例１５）
Ｆｃ多量体変異体の操作
以前の例は、免疫不全の治療において使用するのに特に適しているＦｃ多量体が作り出されたことを説明している。以下の特性を有するＦｃ多量体を生成する目的でＦｃ多量体を操作した。
抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用の阻害
Ｆｃ多量体の効力はできる限り高いほうがよい。
サイトカイン放出
Ｆｃ多量体によるサイトカイン放出の刺激はできる限り低いほうがよい。
Ｃ１ｑ結合
Ｆｃ多量体のＣ１ｑへの結合はできる限り低いほうがよい。
血小板活性化
Ｆｃ多量体による血小板活性化はできる限り低いほうがよい。
【０３７２】
しかし、以前の例の研究では、副作用の減少を達成するためには最大効力とわずかに低い効力の間で妥協する必要がありうることが説明された。
【０３７３】
ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、追加の突然変異が全くない野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は免疫不全の治療において使用するには適切さが低い可能性がある。なぜならば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ多量体は食作用阻害の高い効力を示すが、サイトカイン放出、Ｃ１ｑ結合及び血小板活性化によって測定した場合、高いレベルの望ましくない副作用も示すからである。
【０３７４】
ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体が生じる望ましくない副作用のレベルは非常に低いが、その効力はＩｇＧ１の効力に比べて低い。にもかかわらず、図７に示すように、それでも野生型ＩｇＧ４  Ｆｃ多量体の効力はＩＶＩＧの効力に比べて有意に高い。
【０３７５】
ＩｇＧ１とＩｇＧ４野生型Ｆｃ多量体の両方の望ましい特性を組み合わせ、望ましくない特性のないＦｃ多量体を設計した。下の表１７に示すように、これらのＦｃ多量体は望ましくない副作用を許容可能なレベルにまで減少させつつ、効果的レベルの効力を示す。これらのＦｃ多量体は免疫不全の治療において使用するのに特に有用であると予想される。
【表１７】
2017512063.tif 000019
【図１】
2017512063.tif 000020
【図２（ａ）−１】
2017512063.tif 000021
【図２（ａ）−２】
2017512063.tif 000022
【図２（ｂ）】
2017512063.tif 000023
【図２（ｃ）−１】
2017512063.tif 000024
【図２（ｃ）−２】
2017512063.tif 000025
【図２（ｄ）】
2017512063.tif 000026
【図２（ｅ）−１】
2017512063.tif 000027
【図２（ｅ）−２】
2017512063.tif 000028
【図２（ｆ）】
2017512063.tif 000029
【図２（ｇ）−１】
2017512063.tif 000030
【図２（ｇ）−２】
2017512063.tif 000031
【図２（ｇ）−３】
2017512063.tif 000032
【図２（ｇ）−４】
2017512063.tif 000033
【図２（ｇ）−５】
2017512063.tif 000034
【図３（ａ）】
2017512063.tif 000035
【図３（ｂ）】
2017512063.tif 000036
【図３（ｃ）】
2017512063.tif 000037
【図３（ｄ）−１】
2017512063.tif 000038
【図３（ｄ）−２】
2017512063.tif 000039
【図４】
2017512063.tif 000040
【図５】
2017512063.tif 000041
【図６−１】
2017512063.tif 000042
【図６−２】
2017512063.tif 000043
【図６−３】
2017512063.tif 000044
【図６−４】
2017512063.tif 000045
【図６−５】
2017512063.tif 000046
【図６−６】
2017512063.tif 000047
【図６−７】
2017512063.tif 000048
【図６−８】
2017512063.tif 000049
【図７−１】
2017512063.tif 000050
【図７−２】
2017512063.tif 000051
【図７−３】
2017512063.tif 000052
【図７−４】
2017512063.tif 000053
【図７−５】
2017512063.tif 000054
【図８】
2017512063.tif 000055
【図９−１】
2017512063.tif 000056
【図９−２】
2017512063.tif 000057
【図９−３】
2017512063.tif 000058
【図９−４】
2017512063.tif 000059
【図９−５】
2017512063.tif 000060
【図９−６】
2017512063.tif 000061
【図９−７】
2017512063.tif 000062
【図９−８】
2017512063.tif 000063
【図９−９】
2017512063.tif 000064
【図１０−１】
2017512063.tif 000065
【図１０−２】
2017512063.tif 000066
【図１０−３】
2017512063.tif 000067
【図１０−４】
2017512063.tif 000068
【図１１】
2017512063.tif 000069
【図１２】
2017512063.tif 000070
【図１３】
2017512063.tif 000071
【図１４−１】
2017512063.tif 000072
【図１４−２】
2017512063.tif 000073
【図１４−３】
2017512063.tif 000074
【図１４−４】
2017512063.tif 000075
【図１５−１】
2017512063.tif 000076
【図１５−２】
2017512063.tif 000077
【図１５−３】
2017512063.tif 000078
【図１５−４】
2017512063.tif 000079
【図１５−５】
2017512063.tif 000080
【図１５−６】
2017512063.tif 000081
【配列表】
2017512063000001.app
【国際調査報告】
2017512063.tif 000082
2017512063.tif 000083
2017512063.tif 000084
2017512063.tif 000085
2017512063.tif 000086