(57)【要約】  本開示は、前赤内期、血液、および有性寄生生物段階に由来するいくつかの異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原を含む種々の組換えタンパク質、特に、組換え融合タンパク質から構成される新規マラリアワクチンに関する。タンパク質および／または融合タンパク質は、ヒトにおいて防御免疫応答を誘発するために混合物ワクチン製剤中に使用される。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、核酸を含有するベクター、宿主細胞ならびにこのようなタンパク質を調製および生成するための方法、前記マラリアワクチンまたは前記タンパク質および／もしくは融合タンパク質をコードする前記核酸分子の使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄生生物熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適した組換えタンパク質の混合物であって、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原を含み、
ａ）前赤内期抗原が、少なくとも抗原ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰおよびＰｆＴＲＡＰまたはそのドメイン、変異体もしくは断片を含み、
ｂ）血液段階抗原（単数または複数）が、頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の少なくとも１種もしくは複数の変異体またはその断片を含み、
ｃ）有性段階抗原（単数または複数）が、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５および／もしくは生殖体／ガメトサイト表面タンパク質Ｐｆ２３０Ｃ０またはその変異体もしくは断片を含む、混合物。
【請求項２】
前記ＰｆＣＳＰのドメインが、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインである、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記ＰｆＴＲＡＰのドメインが、ＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインである、請求項１または２のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項４】
前記血液段階抗原が、少なくともさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項５】
前記前赤内期（pre-erytrocytic）抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項１から４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項６】
前記組換え融合物が、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片からなる群から選択される、請求項５に記載の混合物。
【請求項７】
前記頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の変異体が、任意の野生型ＰｆＡＭＡ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３および除去されたまたは追加の潜在的なＮ−グリコシル化部位を有するその変異体からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項８】
前記頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の変異体が、野生型ＰｆＡＭＡ１である、請求項１から７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９】
前記頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の変異体が、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０】
前記頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の変異体が、発現宿主特異的Ｎ−グリカンを保持する、請求項１から９のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１１】
前記さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原が、ＰｆＭｓｐ１、ＰｆＲＩＰＲ、ＰｆＲｈ２、ＰｆＭｓｐ４、ＰｆＭｓｐ８、ＰｆＲｈ５およびＰｆＭｓｐ３またはその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項２から１０のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１２】
前記さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原が、ＰｆＭｓｐ１−１９、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８、ＰｆＲｈ２、ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２、ＰｆＲｈ５ａ（ペプチド）、ＰｆＲｈ５ｂ（ペプチド）およびＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片またはその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項２から１１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１３】
前記さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原が、ＰｆＭｓｐ１−１９（配列番号３７）、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８（配列番号３９）およびＰｆＲｈ２（配列番号３８）またはその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項２から１１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１４】
前記さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原が、ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１（配列番号３２）、ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ（配列番号３３）、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１（配列番号３４）、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２（配列番号３５）およびＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片（配列番号３６）またはその変異体もしくは断片を含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１５】
前記さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１６】
前記組換え融合タンパク質が、配列番号３または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片を含む、請求項１５に記載の混合物。
【請求項１７】
前記血液段階抗原が、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３またはその変異体もしくは断片を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１８】
前記血液段階抗原が、好ましくは、組換え融合タンパク質（配列番号１４）として、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１（配列番号１１）およびＰｆＭｓｐ１−１９（配列番号３７）を、またはその変異体もしくは断片を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１９】
前記血液段階抗原が、好ましくは、組換え融合タンパク質（配列番号１５）として、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２（配列番号１２）およびＰｆＲｈ２（配列番号３８）を、またはその変異体もしくは断片を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２０】
前記血液段階抗原が、好ましくは、組換え融合タンパク質（配列番号１６）として、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３（配列番号１３）、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８（配列番号３９）を、またはその変異体もしくは断片を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２１】
前記血液段階抗原が、
ｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１およびＰｆＭｓｐ１−１９、
ｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＲｈ２、ならびに
ｉｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８
を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２２】
前記ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１およびＰｆＭｓｐ１−１９が、第１の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＲｈ２が、第２の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３およびＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８が、第３の組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項２１に記載の混合物。
【請求項２３】
前記第１の組換え融合タンパク質が、配列番号１４または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片を含む、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２４】
前記第２の組換え融合タンパク質が、配列番号１５または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２５】
前記第３の組換え融合タンパク質が、配列番号１６または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２６】
前記有性段階抗原Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０の変異体が、野生型または除去されたもしくは追加の潜在的なＮ−グリコシル化部位を有する変異体または断片である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２７】
前記有性段階抗原が、Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０またはその変異体もしくは断片を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２８】
前記有性段階抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項１から２７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２９】
前記組換え融合タンパク質が、配列番号４、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片からなる群から選択される、請求項２８に記載の混合物。
【請求項３０】
４（４）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメイン、
ｂ）ポリペプチド２：ＰｆｇＡＭＡ１、
ｃ）ポリペプチド３：ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１、ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２およびＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片、
ｄ）ポリペプチド４：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０
を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３１】
ａ）ポリペプチド１：配列番号１、
ｂ）ポリペプチド２：配列番号２、
ｃ）ポリペプチド３：配列番号３、および
ｄ）ポリペプチド４：配列番号４
のアミノ酸配列を有する４（４）種の組換えポリペプチド、
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３２】
５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、
ｂ）ポリペプチド２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、
ｃ）ポリペプチド３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、
ｄ）ポリペプチド４：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメイン、ならびに
ｅ）ポリペプチド５：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０
を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３３】
ａ）ポリペプチド１：配列番号１１、
ｂ）ポリペプチド２：配列番号１２、
ｃ）ポリペプチド３：配列番号１３、
ｄ）ポリペプチド４：配列番号８および
ｅ）ポリペプチド５：配列番号２６
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド、
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項１から３２に記載の混合物。
【請求項３４】
５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、
ｂ）ポリペプチド２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、
ｃ）ポリペプチド３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、
ｄ）ポリペプチド４：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＲｈ５ａ、ならびに
ｅ）ポリペプチド５：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０およびＰｆＲｈ５ｂ
を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３５】
ａ）ポリペプチド１：配列番号１１、
ｂ）ポリペプチド２：配列番号１２、
ｃ）ポリペプチド３：配列番号１３、
ｄ）ポリペプチド４：配列番号９、および
ｅ）ポリペプチド５：配列番号２８
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項１から３４に記載の混合物。
【請求項３６】
５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原：
ｆ）ポリペプチド１：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ１−Ｍｓｐ１＿１９ＦＵＰ、
ｇ）ポリペプチド２：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ２−Ｒｈ２、
ｈ）ポリペプチド３：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ３−ＲＩＰＲ７／８、
ｉ）ポリペプチド４：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＲｈ５ａ、ならびに
ｊ）ポリペプチド５：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０およびＰｆＲｈ５ｂ
を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３７】
ｆ）ポリペプチド１：配列番号１４、
ｇ）ポリペプチド２：配列番号１５、
ｈ）ポリペプチド３：配列番号１６、
ｉ）ポリペプチド４：配列番号９、および
ｊ）ポリペプチド５：配列番号２８
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド、
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項１から３６に記載の混合物。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、等モル比または任意のその他の比で混合物中に含まれる、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３９】
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列を有するポリペプチド、
ｂ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号２６の配列を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号２８の配列を有するポリペプチド、
ｄ）配列番号８、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号２６の配列を有するポリペプチド、
ｅ）配列番号９、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号２８の配列を有するポリペプチド、
ｆ）好ましくは１個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、ａ）〜ｅ）のポリペプチドの修飾された形態；
ｇ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｆ）の核酸分子のいずれかとハイブリダイズ可能である核酸分子
ｈ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｆ）の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズ可能である核酸分子
ｉ）ａ）〜ｈ）の核酸分子のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸分子
ｊ）またはａ）〜ｉ）の核酸分子のいずれかの相補体
をコードする単離された核酸分子または複数の核酸分子。
【請求項４０】
請求項３９に記載のヌクレオチド分子を含むベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４２】
植物細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記植物がベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana tabacum）である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
酵母細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記酵母が、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）である、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
生理学的に許容される媒体中に、有効成分としての請求項１から３８のいずれか一項に記載の混合物および担体を含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対してヒト個体を免疫処置するためのワクチン組成物。
【請求項４７】
アジュバントをさらに含む、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
組換えタンパク質の混合物を生成する方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質を生成するのに適した条件下、適した培養培地中で請求項４１に記載の宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）前記生成された組換えタンパク質を得るステップと、任意選択で、（ｃ）前記組換えタンパク質をプロセシングするステップとを含む、方法。
【請求項４９】
前記宿主細胞が、植物細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記植物が、藻類、コケ、単子葉植物および／または双子葉植物からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記植物が、オランダミツバ属（Apium）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アブラナ属（Brassica）、トウガラシ属（Capsium）、ニンジン属（Daucus）、オオムギ属（Hordeum）、アキノノゲシ属（Lactuca）、トマト属（Lycopersicon）、タバコ属（Nicotiana）、ペチュニア属（Petunia）、シロガラシ属（Sinapis）、ナス属（Solanum）、コムギ属（Triticum）またはトウモロコシ属（Zea）からなる群に由来する属から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記植物がベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana tabacum）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記酵母が、コマガタエラ・パストリス（Komatagaella pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacharomyces pombe）からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
患者において熱帯性マラリアを治療および／または予防するための方法であって、治療有効量の請求項１から３８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の混合物または請求項４６もしくは４７に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５６】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する、種々の単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物。
【請求項５７】
請求項５６に記載の抗体組成物を含む診断アッセイ。
【請求項５８】
請求項５６に記載の抗体組成物または請求項５５に記載の診断アッセイを含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、前赤内期、血液および有性寄生生物段階に由来するいくつかの異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原を含む種々の組換えタンパク質、特に、組換え融合タンパク質から構成される新規マラリアワクチンに関する。タンパク質および／または融合タンパク質は、ヒトにおいて防御免疫応答を誘発するために混合物ワクチン製剤中に使用される。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、核酸を含有するベクター、宿主細胞ならびにこのようなタンパク質を調製および生成するための方法、前記マラリアワクチンまたは前記タンパク質および／もしくは融合タンパク質をコードする前記核酸分子の使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、アピコンプレクサ（Apicomplexa）門原生動物の寄生生物、すなわちプラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物による感染によって引き起こされる疾患であり、全世界で毎年２億人以上の新規感染、および７０万人以上の死亡を引き起こす。マラリアは、アフリカでは特に深刻な問題であり、５人に１人（２０％）の小児の死亡はこの疾患の影響によるものである。アフリカの小児は毎年、平均して１．６から５．４の間のマラリア発熱を発症する。
【０００３】
ヒトでは、マラリア疾患はプラスモジウム属（Plasmodium）寄生生物のうち５種：熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）によって引き起こされ、中でも最も蔓延しているのは熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）である。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によって引き起こされるマラリア（悪性マラリア、熱帯熱マラリアまたは熱帯性マラリアとも呼ばれる）は最も危険な形態のマラリアであり、最高割合の合併症および死亡率を有する。ほとんどすべてのマラリアによる死亡は熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）によって引き起こされる。
【０００４】
手短には、ヒトにおけるマラリア原虫の生活環（図１）は、ハマダラカ属（Anopheles）の蚊に刺されることによる２、３のスポロゾイトの播種で開始する。数分でスポロゾイトは肝細胞に侵入してその発達を開始し、シゾゴニーによって増殖する（肝臓段階または前赤内期段階）。マラリア原虫の種に応じて５〜１４日の期間の後、シゾントは何千ものメロゾイトに発達し、これが血流中に放出され、赤血球（ＲＢＣ）に侵入し、血液段階を開始する。ＲＢＣ内で各メロゾイトが、マラリア原虫の種に応じて、４２〜７２時間以内にトロホゾイトに発達し、これが成熟、分裂し、シゾントが生じ、これが十分に成熟した後、最大３２個のメロゾイトを生じさせる。血流中に放出されたメロゾイトは他のＲＢＣに侵入し、その生活環を維持する。いくつかのメロゾイトはＲＢＣに侵入した後、有性型−雄または雌ガメトサイトに発達し、これも成熟および赤血球破裂後に血流に入る。雌のハマダラカ属（Anopheles）の蚊が吸血し、ガメトサイトを摂取すると、感染することとなり、プラスモジウム属（Plasmodium）生活環の有性段階を開始する。蚊の腸では雄ガメトサイトが雌ガメトサイトと融合し、腸壁と結合し、それを通過するオーキネートを形成し、その外面と結合したままオーシストに変換する。オーシストはスポロゴニーによって分裂し、数千ものスポロゾイトが生じ、それらが蚊の体腔中に放出され、最終的にその唾液腺に移動し、ここでそれらは成熟し、吸血のために宿主を刺すときにヒトにおいて新規感染を開始できるようになる。
【０００５】
既存の抗マラリア薬クロロキンに対する熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の耐性は１９６０年代に出現し、それから蔓延した。さらにマラリア原虫は、過去数十年かけてほとんどのその他の抗マラリア薬に対する耐性を発達させた。これは熱帯諸国における公衆衛生および旅行者を大きく脅かす。抗マラリア薬耐性の蔓延および程度は増大し続けると考える十分な根拠がある。殺虫剤耐性ベクターおよび薬剤耐性寄生生物の数の増大が、有効なマラリアワクチンの需要をさらに増大する。マラリアワクチンは単一の作用様式に限定されず、マラリアによる負担を劇的に軽減する可能性がある。
【０００６】
効率的なマラリアワクチンを開発する困難の一部は、寄生生物の多段階の生活環に起因する。寄生生物発達の各段階は、異なる種類の免疫応答を誘発する異なるセットの表面抗原を特徴とする。提示されるさまざまな表面抗原にもかかわらず、それらに対する免疫応答は有効でないことが多い。理由の１つはマラリア原虫抗原の大規模な配列多形であり、これが種々の分離株の免疫回避を促進する。
【０００７】
前赤内期のワクチンは、蚊によって注入される感染性形態（スポロゾイト）から保護し、それによって肝臓における寄生生物発達を阻害する。これまでに曝露されていない個体では、２、３の寄生生物が前赤内期のワクチンによって誘導された免疫防御を逃れた場合、それらは最終的に血液段階に入り、赤血球内で増殖し、最も悪化した疾患を確立する。
【０００８】
赤血球または血液段階ワクチンは、赤血球における寄生生物の侵襲および増殖を阻害し、したがって血液感染の間の重症疾患症状を防ぐ（または減少させる）。しかし、このアプローチによってプラスモジウム属（Plasmodium）生活環を完全に中断し、寄生生物の伝達を防ぐ可能性は低い。
【０００９】
有性段階ワクチンは、ワクチン接種されているヒトを保護しないが、代わりに、寄生生物が蚊によって取り込まれると、ワクチンに応じて生じた抗体とともに、寄生生物の発達を阻害することによって伝達のサイクルを妨げる。伝達阻止ワクチンは、寄生生物排出に対して、同時に抗前赤内期または赤血球治療に対する寄生生物耐性の防止に対して向けられた多角的戦略の一部として含まれ得る。
【００１０】
マラリア原虫の上記の複雑な複数段階生活環は、相乗的ワクチンアプローチについて独特の課題を示す。マラリア原虫に対する免疫性は段階依存的であり、種依存的である。多数のマラリア研究者および教本の記述は、生活環の１段階のみに対応する単一抗原ワクチンは十分ではなく、有効な免疫性を誘導するには、寄生生物発達の異なる段階、すなわち少なくとも２段階、を標的とする複数抗原、複数段階ワクチンが必要であると考え結論づけている（Mahajan，Berzofsky et al. 2010）。複数抗原ワクチンの構築（異なる寄生生物段階を変換することおよび可能性のある熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）エスケープ突然変異体を包囲しようという、ワクチンによって誘導される免疫応答の幅を増大することを目的とした）は、（フルサイズ）抗原を一緒に遺伝子連結することによって、組換えタンパク質の混合物によって、または異なる寄生生物タンパク質および段階に由来するいくつかのペプチドを含有する、合成ペプチドベースの（１５〜２５マー）化学合成ワクチンによってのいずれかで達成され得る。
【００１１】
いくつかの異なる抗原または単一抗原のいくつかの異なる対立遺伝子からなる単一融合タンパク質アプローチ（寄生生物に対して相乗的活性を有する抗体を誘導するための）は、抗原多様性および免疫回避のための熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の能力によって妨げられる（Richards,Beeson, 2009）。可能性のあるワクチン候補として多数の抗原が評価されたが、ほとんどの臨床治験は臨床マラリアを防ぐことに対して有意な影響を示さなかったものの、それらのうち一部は寄生生物増殖を低減させるとわかった。得られた融合タンパク質／ワクチン候補の大きさは、２、３の選択された抗原の組合せのみを許可する、選択された抗原が自然免疫の標的でないこと、および／または相当な遺伝的多形性を示すことを排除しない別の制限因子である。複対立遺伝子を有する高度に可変性の抗原が、自然なチャレンジ下での免疫応答の明白な標的であり、ＰｆＡＭＡ１およびＰｆＭＳＰ２のワクチン研究は対立遺伝子特異的効果が達成され得ることを示唆する（Schwartz, 2012）。現在組合せワクチンのみ（ＰｆＣＳＰおよびＰｆＡＭＡ１からなる）が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の前赤内期および無性血液段階を標的とする臨床治験を受けている（Schwartz, 2012）。プラスモジウム属（Plasmodium）の３種の生活環段階のすべてを標的とする、融合物でも組合せアプローチでもない複数抗原ワクチン候補（ハマダラカ属（Anopheles）の蚊の有性段階を含み、したがって寄生生物伝達を妨げる）は、いまだ臨床治験で試験されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対する新規および改善された複数成分複数段階ワクチンを利用できることは、高度に有利となる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、好ましくは、必ずしもそうではないが、寄生生物の生活環の異なる段階の間に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の表面に提示される複数のタンパク質またはタンパク質に由来するタンパク質ドメインを含む、マラリアに対するヒトワクチンとして適している、組換えタンパク質の組合せおよび／または組換え融合タンパク質に関する。
【００１４】
第１の態様では、本開示は、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原を含む寄生生物熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適している組換えタンパク質の混合物に関連し、ここで、
ａ）前赤内期抗原は、少なくとも抗原ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰおよびＰｆＴＲＡＰまたはそのドメイン、変異体もしくは断片を含み、
ｂ）血液段階抗原（単数または複数）は、頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の少なくとも１種または複数の変異体またはその断片を含み、
ｃ）有性段階抗原（単数または複数）は、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５および／または生殖体／ガメトサイト表面タンパク質Ｐｆ２３０Ｃ０またはその変異体もしくは断片を含む。
【００１５】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、本開示の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する種々の単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物に関する。
【００１６】
別の態様では、本開示の実施形態は、本開示の組換えタンパク質または抗体の混合物を含む医薬組成物および／または診断用組成物に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、生理学的に許容される培地中に有効成分として本開示の組換えタンパク質の混合物と担体とを含む、マラリアに対して感受性哺乳動物を免疫処置するためのワクチン組成物に関する。
【００１８】
さらに別の態様では、本開示の実施形態は、本開示の混合物中に含まれる前記組換え融合タンパク質をコードする核酸ならびにこのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１９】
その他の態様では、本開示は、熱帯性マラリアの予防および／または治療における本開示の組換えタンパク質の混合物の使用に関する。
【００２０】
さらに、有効量の、本開示の混合物中に含まれる組換えタンパク質、本開示の組換え融合タンパク質の混合物を含む組成物または本開示のワクチン組成物を投与するステップを含む、感染に対して、特に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対してヒトを免疫処置する方法が開示される。
【００２１】
さらに、本開示は、本開示の抗体組成物を含む診断アッセイおよび本開示の抗体組成物または本開示の診断アッセイを含む診断キットに関連する。
【００２２】
本開示が詳細に記載される前に、本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、限定とする意図がないということも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は文脈が明確に他のものを示さない限り、単数および／または複数の言及を含むということに留意されなければならない。数値によって範囲が定められるパラメータ範囲が与えられる場合には、範囲はこれらの限界値を含むと見なされるということがさらに理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の生活環のスキームを示す図である。
【図２】４種の例示的融合タンパク質（Ａ：ＣＣＴ−ＥＲＨ／配列番号１、Ｂ：ｇＡＭＡ１−ＥＲＨ／配列番号２、Ｃ：ＮＭＥ−ＥＲＨ／配列番号３、Ｄ：Ｆ０−ＥＲＨ／配列番号４）を含む本開示の混合物の一実施形態の模式図である。
【図３】４種の（１：ＣＣＴ−ＥＲＨ／配列番号１、２：ｇＡＭＡ１−ＥＲＨ／配列番号２、３：ＮＭＥ−ＥＲＨ／配列番号３、４：Ｆ０−ＥＲＨ／配列番号４）精製された例示的ワクチンタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析を示す図である。
【図４】４種の（ＣＣＴ−ＥＲＨ：配列番号１、ｇＡＭＡ１−ＥＲＨ：配列番号２、ＮＭＥ−ＥＲＨ：配列番号３、Ｆ０−ＥＲＨ：配列番号４）の例示ワクチンタンパク質の混合物を用いる免疫処置に由来する抗体を使用する熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）段階の免疫蛍光染色のイメージを示す図である。
【図５】５種の例示的融合タンパク質を含む本開示の混合物の別の実施形態の模式図である。
【図６】本開示のワクチン混合物Ｍ１およびＭ２を調製するために使用された種々の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適した、組換えタンパク質の組合せ、特に、融合タンパク質に関する。有利な実施形態では、本開示の組換えタンパク質およびワクチン組成物は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質と寄生生物発達の種々の段階に由来するドメインを組み合わせる。
【００２５】
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の複雑な複数段階生活環および遺伝的変動は、マラリアワクチン開発の成功にとって重大な課題に相当する。発達段階に応じて、寄生生物は、肝臓細胞の侵襲を低減または防止する（前赤内期段階）、マラリアの臨床徴候を低減または防止する（血液段階）、および蚊宿主によるマラリアの伝達を低減または防止することを目的として、防御免疫応答によって標的とされる必要がある表面タンパク質の異なるセットを提示する。さらに、多数の重要な表面タンパク質は、二形性またはさらには多形性である。したがって、効率的な複数段階マラリアワクチンは、異なる段階に由来する複数の関連抗原を組み合わせなければならない。これに対処するための１つのアプローチは、いくつかの適したタンパク質および／またはタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の設計である。さらに、単一ポリペプチドから構成されるこのようなワクチン候補の切望は、再現性があり、頑強な費用効率の高い生成に対する、実際の技術的で経済的な需要から主に起こっている。
【００２６】
しかし当業者には、組換え発現される融合タンパク質には大きさの制限があるということも明確である。タンパク質特有の相違も同様に考慮されなければならないが、ポリペプチドの長さが増大するにつれ、発現レベルおよび収率の大きな低下がある。複数の課題が大きさによって比例する以上に増大し、大きなタンパク質の全体的な特性は小さいタンパク質、ドメインまたは断片のものよりも大幅に最適化を受け入れにくい。これらの問題すべては今まで、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対する効率的なワクチンの開発の大きなボトルネックであり、その結果複数の線形エピトープ、１種または２種の生活環段階に由来する１種または２種の抗原のみを含む最適以下の、圧倒的な数のワクチン候補が得られてきた。代替法として、化学的または遺伝的に弱毒化された、または不活性化された生ワクチンが提案されているが（例えば照射されたスポロゾイト）、このようなアプローチは、バッチ間一貫性、スケールアップ生成および最も重要な生成物の安全性に取り組まなければならない。
【００２７】
マラリアの伝播および臨床徴候と関連している寄生生物生活環ならびに免疫学的に関連する熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質の対立遺伝子変動の両方を克服するための組換えタンパク質の混合物の使用は、いくつかの利点を有する。対立遺伝子変異体またはさらには人工的な多様性を網羅するものを、異なる段階に由来する保存された抗原と、遺伝子融合によって、ならびに製剤中でそれらを混合することによって組み合わせることができる。このような複数成分ワクチンにおける適した融合タンパク質の設計において、ポリペプチドの大きさならびにそれぞれの生成システムにおける収率および安定性が考慮され得るので、アプローチは、すべての段階に由来する関連抗原を１種の大きな融合タンパク質に組み合わせることを必要とすることによって妨げられることはない。このような抗原混合物の別の利点は、所与の必要性に従って混合物の成分を適応させることによる、病原体の地理的分布および進化に対応するためのより高い柔軟性、ならびにいくつかの免疫関連抗原（ならびに単一融合タンパク質との関連の中では容易に認識され得ないそのＢおよびＴ細胞エピトープを特徴とするこのような抗原カクテルを用いて誘発され得るより広い複数段階特異的免疫応答である。
【００２８】
本開示において記載される混合物中に含まれる組換えタンパク質および融合タンパク質は、選択された生成宿主ベンサミアナタバコ（N.benthamiana）における最適な収率および安定性のために設計され、最適化される。融合タンパク質は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）生活環のそれぞれの段階に対応し、所望の免疫応答を誘発するのに必要な最も必須の抗原または抗原ドメインを特徴とするよう設計された。融合タンパク質中に抗原を組み合わせることは、ワクチン混合物中に使用されるタンパク質の数を低減し、生成の際の上流、下流および品質管理費用を低減するのに有用であり、段階特異的抗原を融合タンパク質に組み合わせることは、組成物において種々の割合の段階特異的機能性を実行することによって、複数段階、複数成分ワクチン組成物の有効性および特異性を微調整するための好都合な概念である。
【００２９】
さらに、抗原の特定の組合せによって、本開示のワクチン混合物は、十分に発現され得、発現レベルは高く、したがって、実験室規模にとって適しているだけでなく、大規模／工業規模生成にとっても適している。さらに、本開示のワクチン混合物中に含まれる抗原の選択、すべての抗原ドメインに対する力価は高い。誘導された力価によって、あらゆるプラスモジウム属（Plasmodium）の主な段階について、すべての利用可能なアッセイにおける寄生生物阻害が改善される。さらに、自由混和性によって、本開示のワクチン混合物の平衡が保たれた免疫応答および平衡が保たれた阻害活性が可能となる。
【００３０】
重要なことに、本開示の混合物中に含まれる融合タンパク質は、（ｉ）種々の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来するドメインを含み、（ｉｉ）十分に発現し、免疫学的に関連していると実験的に同定され、確認されているビルディングブロック（ドメイン）を使用して設計された。
【００３１】
いくつかの場合には、例えば、ＰｆＣｅｌＴｏｓ、２種のその他の前赤内期抗原との遺伝的融合物は、驚くべきことに、植物におけるその個別の発現と比較して驚くほど高い発現レベルをもたらし、これにより、関連抗原ＰｆＣｅｌＴｏｓが効率的に発現され、複数段階、複数成分ワクチンにおいて抗原として使用されることが可能になる。
【００３２】
本開示の別の極めて重要な態様は、３つの寄生生物段階に由来する異なる成分に対する強力な免疫応答が、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原を含む抗原混合物の注射によって誘発され得るという予想外の知見であり、ここで、
ａ）前赤内期抗原は、少なくとも抗原ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰおよびＰｆＴＲＡＰまたはそのドメイン、変異体または断片を含み、
ｂ）血液段階抗原（単数または複数）は、頂端膜抗原１（ＰｆＡＭＡ１）の少なくとも１種または複数の変異体またはその断片を含み、
ｃ）有性段階抗原（単数または複数）は、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５および／または生殖体／ガメトサイト表面タンパク質Ｐｆ２３０Ｃ０またはその変異体もしくは断片を含む。
【００３３】
有利な実施形態では、ＰｆＣＳＰのドメインは、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインである。別の有利な実施形態では、ＰｆＴＲＡＰのドメインは、ＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインである。
【００３４】
有利な実施形態では、本開示の血液段階抗原の混合物は、少なくともさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原を含む。
【００３５】
手短には、本開示の組換えタンパク質および融合タンパク質の記載された組合せは、十分に発現され、高い免疫学的関連を有し、改善された免疫原性を有し得る。有利な実施形態では、ワクチンとして使用される本開示の組換えタンパク質と融合タンパク質の組合せは、感染を阻止し、ならびに病状を防ぎ、寄生生物の伝達を妨げる感染防御免疫を誘発する能力を有し、異なる寄生生物段階から得られたサブユニットから構成される組合せワクチンである可能性が高い。
【００３６】
全般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において利用される実験室手順として、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual”Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同４，６８３，２０２号明細書；同４，８０１，５３１号明細書；同５，１９２，６５９号明細書および同５，２７２，０５７号明細書に示される方法論; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H. Freeman and Co., New York (1980)を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同３，８３９，１５３号明細書；同３，８５０，７５２号明細書；同３，８５０，５７８号明細書；同３，８５３，９８７号明細書；同３，８６７，５１７号明細書；同３，８７９，２６２号明細書；同３，９０１，６５４号明細書；同３，９３５，０７４号明細書；同３，９８４，５３３号明細書；同３，９９６，３４５号明細書；同４，０３４，０７４号明細書；同４，０９８，８７６号明細書；同４，８７９，２１９号明細書；同５，０１１，７７１号明細書および同５，２８１，５２１号明細書；“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, Calif. (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照のこと；それらのすべては、本明細書において十分に記載されるかのように参照により組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本文書を通じて提供される。本明細書における手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含有されるすべての情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
語句「組換えタンパク質」は、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたタンパク質などの、組換え手段によって、調製され、発現され、作製されるか、または単離されるタンパク質、特に、組換え融合タンパク質を含む。
【００３８】
用語「組換え融合タンパク質」は、異なるタンパク質または異なる生物などの異種供給源に由来するセグメント、すなわちアミノ酸配列を含む組換え技術によって生成されるタンパク質を指す。セグメントは、ペプチド結合によって互いに直接的または間接的のいずれかで接合される。間接的接合とは、ペプチドリンカーなどの介在するアミノ酸配列が、融合タンパク質を形成するセグメント間に並置されることを意味する。組換え融合タンパク質は、１種の遺伝子の異なる領域に由来するヌクレオチド配列を遺伝子的に接合することによって、および／または２種以上の別個の遺伝子に由来するヌクレオチド配列を接合することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされる。これらのヌクレオチド配列は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に由来し得るが、それらはまたその他の生物に、クローニング手順のために使用されるプラスミドに、またはその他のヌクレオチド配列に由来する場合もある。
【００３９】
さらに、コードするヌクレオチド配列は、例えばデジタル遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド合成および得られた断片のその後のアニーリングによって最初の鋳型ＤＮＡサンプルを必要とせずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成され得る。所望のタンパク質配列は、例えば適当なソフトウェアツールを使用して「逆翻訳」され得る。ユニバーサルな遺伝暗号の縮重のために、オープンリーディングフレーム（すなわち組換えタンパク質コーディング領域）内の同義のコドンは、例えばシス作用性不安定性エレメント（例えばＡＵＵＵＡ）を除去し、二次および三次ｍＲＮＡ構造（例えばシュードノット、ステム−ループ、…）を除去、導入または修飾するよう、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＧＴＳ）を引き起こし得る自己相補性領域を避けるよう、全体的なＡＴ：ＧＣ含量を変更するよう、または発現宿主にコドン使用を調整するよう、種々の方法で交換されてもよい。このような変更は手作業で、または適当なソフトウェアツールを使用して、またはその組み合わせによって設計され得る。
【００４０】
プラスモジウム属（Plasmodium）表面タンパク質またはそのドメインを含む組換え融合タンパク質は、当技術分野で公知であるように、組換えＤＮＡ法および適した宿主細胞における発現を使用して調製された組換え生成物であり得る（例えばSambrook et al., (2001) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Yを参照のこと）。特定の単離されたタンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列は、例えば単離に必要なドメインの５’および３’領域に対応する適当なオリゴヌクレオチドプライマー、および鋳型としての単離されるタンパク質ドメイン配列の全長コーディングを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって好都合に調製され得る。全長コーディングタンパク質配列の供給源は、例えば寄生生物細胞またはクローニングされた全長遺伝子を含有するプラスミドベクターから抽出されたＤＮＡであり得る。あるいは、タンパク質コード配列はｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的に、もしくは完全に合成され得るか、種々のアプローチの組合せが使用され得る。本開示の融合タンパク質の特性の限定されない例は、熱安定性およびｐＨ安定性である。
【００４１】
有利な実施形態では、本開示のワクチン組成物または組換えタンパク質の混合物は、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原を含み、ここで、
ａ）前赤内期抗原は、少なくともＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインを含み、
ｂ）血液段階抗原は、頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の１種または複数の変異体を含み、
ｃ）有性段階抗原（単数または複数）は、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５および／または生殖体／ガメトサイト表面タンパク質Ｐｆ２３０Ｃ０またはその変異体を含む。
【００４２】
上記のように、有利な実施形態では、本開示の血液段階抗原の混合物は、少なくともさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原を含む。
【００４３】
本明細書において、前赤内期抗原「ＰｆＣｅｌＴｏｓ」とは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）オーキネートおよびスポロゾイトの細胞通過タンパク質（ＣｅｌＴｏｓ）を指し、前赤内期抗原「ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ」とは、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のサーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）由来のＴＳＲ−ドメインを指し、「ＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ」は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）のトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）由来のＴＳＲ−ドメインを指す。
【００４４】
「ＴＳＲドメイン」は、免疫性、細胞接着、細胞間相互作用および神経細胞発達に関与している、細胞外タンパク質中または膜貫通タンパク質の細胞外部分中に見られる、小さな約６０残基のドメインである（Tucker, 2004）。トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１; Tan et al. 2002）およびＦ−スポンジン（ＰＤＢコード１ＳＺＬおよび１ＶＥＸ）由来のＴＳＲドメインの構造は解明されている。これらは、ＴＳＲドメインが逆平行３本鎖β−シートからなる長い構造を有することを示す。ドメインコアは保存されたトリプトファン、アルギニンおよびシステインの側鎖の積み重ねられたアレイによって形成される。いくつかのタンパク質のＴＳＲは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合を媒介すると報告されている。例えばプラスモジウム属（plasmodium）表面タンパク質プラスモジウム属（plasmodium）ＣＳおよびＴＲＡＰは両方とも、接着性トロンボスポンジン１型ドメイン、ＴＳＲを含有する。
【００４５】
一実施形態では、ＰｆＣｅｌＴＯＳ抗原は、配列番号２９を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインは、配列番号３０を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインは、配列番号３１を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、前赤内期（pre-erytrocytic）抗原は、配列番号２９、配列番号３０および／または配列番号３１を有するポリペプチドを含む。
【００４６】
有利な実施形態では、前赤内期（pre-erytrocytic）抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる。一実施形態では、組換え融合タンパク質は、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００４７】
別の有利な実施形態では、血液段階抗原は、頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の１種または複数の変異体および少なくともさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原を含む。
【００４８】
本明細書において、抗原「ＰｆｇＡＭＡ１」とは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）頂端膜抗原（ＡＭＡ１）細胞外ドメイン１〜３を指す。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）ＡＭＡ−１の全エクトドメイン（ドメインＩ〜ＩＩＩ）に相当する組換えタンパク質は、天然寄生生物を認識する抗体を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで赤血球のメロゾイト侵襲を阻害し得る。ＰｆＡＭＡ１の制限された多形は、天然に存在する対立遺伝子の極めて高い網羅度を有する（平均で＞９７％）３種の人工ＰｆＡＭＡ１配列の合理的な設計を可能にした。この多様性を網羅するアプローチ（ＤｉＣｏ）は、天然に見られる多形を克服し、すべての天然に存在するＡＭＡ１対立遺伝子に対する広い応答を可能にすると予測される。
【００４９】
したがって、頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の変異体は、任意の野生型ＰｆＡＭＡ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２および／またはＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、ならびにまた、除去されたまたは追加の潜在的なＮ−グリコシル化部位を有する、その天然プロペプチド配列を有するかまたは有さないその変異体であり得る。
【００５０】
有利な実施形態では、ワクチン混合物中の頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の変異体は、野生型ＰｆＡＭＡ１である。一実施形態では、ＰｆＡＭＡ１変異体は、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２のアミノ酸配列または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＰｆＡＭＡ１変異体は、例えば、植物において発現される場合に、発現宿主特異的Ｎ−グリカンを保持する。
【００５１】
別の有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物は、ＰｆＡＭＡ１変異体に加えて１種または複数のさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原を含む。１つの有利な実施形態では、このさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原は、ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１（配列番号３７）、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８（配列番号３９）、ＰｆＲｈ２（配列番号３８）、ＰｆＲｈ５（（配列番号４２および４３）、ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ（配列番号３３）、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１（配列番号３４）、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２（配列番号３５）およびＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片（配列番号３６）またはそれらの断片もしくはペプチドからなる群から選択される。
【００５２】
いくつかのメロゾイト表面タンパク質（ＭＳＰ）が同定されているが、それらのほとんどについて、なおもその機能はさらに解明されなければならない。ＭＳＰ−１と名付けられた主なＭＳＰの場合には、ＲＢＣとのメロゾイト結合において、侵入と関連するその後の生化学的機序において役割が仮定されている。このタンパク質は、後期シゾント段階において１８５〜２１０ｋＤａの前駆体として合成され、分子量の変動するいくつかのポリペプチドを生成するようプロセシングされる。４２ｋＤａのポリペプチド（ＭＳＰ１−４２）はメロゾイト膜と結合されて維持され、１９ｋＤａのポリペプチド（ＭＳＰ１−１９）を生成するようさらにプロセシングされ、宿主細胞中に入る。ＭＳＰ−１に加え、少なくとも８種のその他のＭＳＰが熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）において記載されている：ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＭＳＰ−６、ＭＳＰ−７、ＭＳＰ−８およびＭＳＰ−１０。別のメロゾイト表面関連抗原として、酸性塩基性反復抗原（ＡＢＲＡ）がある。ロブトリー関連タンパク質−１（ＲＡＰ−１）およびＲＡＰ−２のように、メロゾイト頂端オルガネラ中に位置するタンパク質も同定されている。
【００５３】
本明細書において、「ＥＧＦ」は、さまざまなタンパク質において見られ得るＥＧＦ様モチーフ、ならびに血液凝固カスケードに関与しているものを含むＥＧＦおよびＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドである「ＥＧＦ様ドメイン」を指す（Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）。例えばこのモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸなどの細胞外タンパク質において（Rees et al., 1988, EMBO J. 7:2053-2061; Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）、その他のショウジョウバエ（Drosophila）遺伝子において（Knust et al., 1987 EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55:1047-1059）、またトロンボモジュリンなどのいくつかの細胞表面受容体タンパク質（Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6:1891-1897）およびＬＤＬ受容体（Sudhof et al., 1985, Science 228:815-822）において見出されている。トロンボモジュリンおよびウロキナーゼにおいて、タンパク質結合部位はＥＧＦ反復ドメインにマッピングされている（Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem 263:5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4437-4440）。
【００５４】
用語「断片」は本明細書において、全長熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質から分離されており、それとの関連にはない、突然変異を有する、または有さない、天然全長タンパク質の連続部分を指す。それは全長または完全タンパク質の構造的／組織分布的または機能的サブユニットであり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原は、ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１（配列番号３７）、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８（配列番号３９）およびＰｆＲｈ２（配列番号３８）からなる群から選択される。有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物は、さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原として、ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１（配列番号３７）、ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ（配列番号３３）、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１（配列番号３４）、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２（配列番号３５）およびＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片（配列番号３６）を含む。
【００５６】
別の実施形態では、さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原は、ＰｆＲｈ５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＢ８７９０８．１：ＡＡ３５３−３６５、配列番号４２およびＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＢ８７９０８．１：ＡＡ１９９−２１３、配列番号４３）からなる群から選択されるペプチドである。
【００５７】
有利な実施形態では、さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原は、組換え融合タンパク質中に、例えば、配列番号３または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質中に含まれる。
【００５８】
さらなる有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物の血液段階抗原は、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１およびＰｆＭｓｐ１−１９を、好ましくは、組換え融合タンパク質として含む。
【００５９】
さらなる有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物の血液段階抗原は、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＲｈ２を、好ましくは、組換え融合タンパク質として含む。
【００６０】
さらなる有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物の血液段階抗原は、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８を、好ましくは、組換え融合タンパク質として含む。
【００６１】
別の有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物の血液段階抗原は、
ｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１およびＰｆＭｓｐ１−１９、
ｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＲｈ２、ならびに
ｉｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８
を含む。
【００６２】
一実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１およびＰｆＭｓｐ１−１９抗原は、第１の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＲｈ２抗原は、第２の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８抗原は、第３の組換え融合タンパク質中に含まれる。
【００６３】
別の実施形態では、上記の第１の組換え融合タンパク質は、配列番号１４もしくは２０または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６４】
別の実施形態では、上記の第２の組換え融合タンパク質は、配列番号１５もしくは２１または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６５】
別の実施形態では、上記の第３の組換え融合タンパク質は、配列番号１６もしくは２２または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６６】
本開示の組換えタンパク質の混合物およびワクチン組成物は、少なくとも有性段階抗原、特に、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５（配列番号４４）および／もしくは生殖体／ガメトサイト表面タンパク質Ｐｆｓ２３０Ｃ０（配列番号４５）またはその変異体を含む。
【００６７】
一実施形態では、有性段階抗原Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０の変異体は、野生型または除去されたもしくは追加の潜在的なＮ−グリカン認識部位を有する変異体である。
【００６８】
有利な実施形態では、組換えタンパク質の混合物およびワクチン組成物は、特に、組換え融合タンパク質中に有性段階抗原Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０を含む。組換え融合タンパク質は、例えば、配列番号４、２６、２７もしくは配列番号２８または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６９】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、４（４）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドは、以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメイン、
ｂ）ポリペプチド２：ＰｆｇＡＭＡ１、
ｃ）ポリペプチド３：ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１、ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１、ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２およびＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片、
ｄ）ポリペプチド４：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０
を含む。
【００７０】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、
ａ）ポリペプチド１：配列番号１、
ｂ）ポリペプチド２：配列番号２、
ｃ）ポリペプチド３：配列番号３、および
ｄ）ポリペプチド４：配列番号４
のアミノ酸配列を有する４（４）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００７１】
ワクチンが、５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが以下の抗原を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の混合物。
【００７２】
別の有利な実施形態では、本開示の混合物は、５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドは、以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１０：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、
ｂ）ポリペプチド１１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、
ｃ）ポリペプチド１２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、
ｄ）ポリペプチド８：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０ならびに
ｅ）ポリペプチド９：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメイン
を含む。
【００７３】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、
ａ）ポリペプチド１０：配列番号１１、
ｂ）ポリペプチド１１：配列番号１２、
ｃ）ポリペプチド１２：配列番号１３、
ｄ）ポリペプチド８：配列番号８、
ｅ）ポリペプチド９：配列番号２６
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００７４】
さらに有利な実施形態では、本開示の混合物は、５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドは、以下の抗原：
ｆ）ポリペプチド１０：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、
ｇ）ポリペプチド１１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、
ｈ）ポリペプチド１２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、
ｉ）ポリペプチド１３：Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２３０Ｃ０およびＰｆＲｈ５ｂならびに
ｊ）ポリペプチド１４：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメイン、ＰｆＲｈ５ａ
を含む。
【００７５】
さらに有利な実施形態では、本開示の混合物は、
ｅ）ポリペプチド１０：配列番号１１、
ｆ）ポリペプチド１１：配列番号１２、
ｇ）ポリペプチド１２：配列番号１３、
ｈ）ポリペプチド１３：配列番号２８、
ｉ）ポリペプチド１４：配列番号９
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００７６】
ワクチンが、５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１およびＰｆＭｓｐ１−１９、
ｂ）ポリペプチド２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＲｈ２、
ｃ）ポリペプチド３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、ＰｆＲＩＰＲ＿ＥＧＦ７／８、
ｄ）ポリペプチド４：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメインならびに
ｅ）ポリペプチド５：Ｐｆｓ２５およびＰｆｓ２３０Ｃ０
を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の混合物。
【００７７】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、
ａ）ポリペプチド１：配列番号１４、
ｂ）ポリペプチド２：配列番号１５、
ｃ）ポリペプチド３：配列番号１６、
ｊ）ポリペプチド４：配列番号８、
ｄ）ポリペプチド５：配列番号２６
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００７８】
さらに有利な実施形態では、本開示の混合物は、５（５）種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドは、以下の抗原：
ａ）ポリペプチド１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、
ｂ）ポリペプチド２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、
ｃ）ポリペプチド３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、
ｄ）ポリペプチド４：Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２３０Ｃ０およびＰｆＲｈ５ペプチドならびに
ｅ）ポリペプチド５：ＰｆＣｅｌＴＯＳ、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインおよびＰｆＴＲＡＰのＴＳＲ−ドメイン、ＰｆＲｈ５ペプチド
を含む。
【００７９】
さらに有利な実施形態では、本開示の混合物は、
ａ）ポリペプチド１：配列番号１１、
ｂ）ポリペプチド２：配列番号１２、
ｃ）ポリペプチド３：配列番号１３、
ｄ）ポリペプチド４：配列番号２８、
ｅ）ポリペプチド５：配列番号９
のアミノ酸配列を有する５（５）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００８０】
例えば、組換えポリペプチドは、等モル比または任意のその他の比で混合物中に含まれる。有利な実施形態では、組換えポリペプチドおよび／または抗原は、等モル比で混合物中に含まれる。
【００８１】
さらに有利な実施形態では、本開示の混合物は、
ａ）群１（前赤内期段階）：配列番号１および５〜１０、
ｂ）群１（前赤内期段階）：配列番号２、３および１１〜２２、
ｃ）群１（前赤内期段階）：配列番号４および２３〜２８
のアミノ酸配列を有する群１、２および３（群２に由来する少なくとも３種のタンパク質）から選択される少なくとも５（５）種の組換えポリペプチド
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００８２】
有利な組換えタンパク質、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適している混合物中に含まれる組換え融合タンパク質は、以下の表１に列挙されている。
【００８３】
【表１−１】
2017512498.tif 000002
【００８４】
【表１−２】
2017512498.tif 000003
【００８５】
【表１−３】
2017512498.tif 000004
【００８６】
【表１−４】
2017512498.tif 000005
【００８７】
【表１−５】
2017512498.tif 000006
【００８８】
【表１−６】
2017512498.tif 000007
【表１−７】
2017512498.tif 000008
【表１−８】
2017512498.tif 000009
【００８９】
さらなる実施形態は、特に無作為法による、または部位指定カップリング法の使用による、組換えタンパク質をそれ自身またはその他の分子、タンパク質または担体とコンジュゲートするための方法に関する。特に部位指定カップリングは、組換えタンパク質内に特異的に保持される、または導入されるＮ−グリコシル化部位に収容され得る。
【００９０】
本開示は、本開示のポリヌクレオチドに由来するすべての分子、および遺伝的にコードされるアミノ酸配列と比較した、翻訳後プロセシングによる本願に記載されるそのすべての変異体を含むということも理解される。これらの翻訳後修飾は、天然宿主または任意の適した発現宿主による生成／発現の際に起こるとき、これらに限らないが、リーダーおよび／またはプロ配列などのＮ末端配列のタンパク質分解による切断、Ｃ末端伸長のタンパク質分解による除去、Ｎ−および／またはＯ−グリコシル化または脱グリコシル化、脂質化、アシル化、脱アミド化、ピログルタミン酸形成、リン酸化および／またはその他、またはそれらの任意の組合せを含む。これらの翻訳後修飾は、本明細書において調査されたようにタンパク質の特性に影響を有する場合も有さない場合もある。
【００９１】
用語「修飾」は本明細書において、例えばアミノ酸配列中の特定の位置でのアミノ酸残基の置換、挿入または欠失、ならびにポリペプチド状の特定の位置のリン酸化、パルミトイル化のようなアセチル化、メチル化、硫酸化、グリコシル化、イソプレニル化のような脂質化、ファルネシル化、脂肪酸部分の結合、グリピエーション（glypiation）および／もしくはユビキチン化、またはそれらの組合せを指す。
【００９２】
用語「修飾すること」は本明細書において、抗体またはその抗原結合部分中の１個または複数のアミノ酸を変更することを含む。変更は、１つまたは複数の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失することによってもたらされ得る。変更は、ＰＣＲ突然変異誘発などの既知技術を使用してもたらされ得る。
【００９３】
用語「相同ポリペプチド」は、本開示によれば、本開示の混合物またはワクチン組成物中の組換えタンパク質に対して少なくとも７０％、または好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％の配列同一性を有する任意の組換えタンパク質を含む。
【００９４】
用語「変異体」とは、元の非変異体ポリペプチドに対する相同ポリペプチドを意味し、元の非変異体ポリペプチドと結合する少なくとも１種の抗体によって認識され得、ここで、変異体は、１つまたは複数の（いくつかの）位置で変更、すなわち、置換、挿入および／または欠失を含む。
【００９５】
相同性は、本開示の融合タンパク質の類似体または変異体として規定される。融合タンパク質は特定のアミノ酸を特徴とし、特定の核酸配列によってコードされる。このような配列は組換えまたは合成法によって生成される類似体および変異体を含み、このようなポリペプチド配列は組換えポリペプチド中の１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって修飾されており、本明細書において記載される生物学的アッセイのいずれかにおいて依然として免疫原性であると理解される。置換は、好ましくは「保存的」である。置換は、好ましくはアミノ酸配列の何らかの変更につながらないが、タンパク質の発現を増強するよう導入され得るコドン使用におけるサイレント置換である。表４によれば、第２列の同一ブロック中の、好ましくは第４列の同一の並び中のアミノ酸は互いに置換され得る。第２および第４列中のアミノ酸は１文字コードで示されている。
【００９６】
別の態様では、本開示は、
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列を有するポリペプチド、
ｂ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号２６の配列を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号２８の配列を有するポリペプチド、
ｄ）配列番号８、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号２６の配列を有するポリペプチド、
ｅ）配列番号９、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号２８の配列を有するポリペプチド、
ｆ）好ましくは、１個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、ａ）〜ｉ）のポリペプチドの修飾された形態；
ｇ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｉ）の核酸分子のいずれかとハイブリダイズ可能である核酸分子
ｈ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｉ）の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズ可能である核酸分子
ｉ）ａ）〜ｉ）の核酸分子のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸分子
ｊ）またはａ）〜ｉ）の核酸分子のいずれかの相補体
をコードする単離された核酸分子または複数の核酸分子に関連する。
【００９７】
用語「核酸分子」または「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはＬＮＡ起源の任意の一本鎖または二本鎖核酸分子を示すよう意図される。
【００９８】
用語「保存的突然変異」または「保存的置換」はそれぞれ、当業者が第１の突然変異に対して保存的と考えるアミノ酸突然変異を指す。この関連で「保存的」は、アミノ酸の特徴の点で同様のアミノ酸を意味する。例えば突然変異が、特定の位置で、非脂肪族アミノ酸残基（例えばＳｅｒ）の脂肪族アミノ酸残基（例えばＬｅｕ）との置換につながる場合、異なる脂肪族アミノ酸（例えばＩｌｅまたはＶａｌ）との同一位置における置換は保存的突然変異と呼ばれる。さらなるアミノ酸の特徴として、残基の大きさ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値およびその他の当技術分野で公知のアミノ酸の特徴が挙げられる。したがって保存的突然変異は、塩基性と塩基性の置換、酸性と酸性の置換、極性と極性の置換などの置換を含み得る。このように導かれたアミノ酸のセットは構造的理由のために保存される可能性が高い。
【００９９】
本開示はまた、本開示のヌクレオチド分子を含むベクターを対象とする。用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を含む。ある種のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製できる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。本明細書において「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最もよく使用される形態であるので同義的に使用され得る。しかし本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など発現ベクターの、このようなその他の形態を含むことを意図する。
【０１００】
有利な実施形態では、組換えタンパク質の核酸配列は、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ断片として植物発現ベクターｐＴＲＡｋｃ中に挿入され得る。ｐＴＲＡｋｃはアグロバクテリア（agrobacteria）中にエレクトロポレーションされ、その後タバコ植物に浸潤され得る植物発現ベクターの一例である（Boes, A. et al. 2011）。その他のタンパク質発現系も当技術分野で公知であり、本明細書において考慮される。
【０１０１】
本開示はまた、本開示の組換え融合タンパク質を含むベクターを有する宿主細胞を対象とする。語句「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を含む。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことを意図することは理解されなければならない。突然変異または環境の影響のいずれかによって、続いて起こる世代において特定の修飾が起こり得るので、このような後代は実際親細胞と同一でない場合もあるが、なおも本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１０２】
宿主細胞は単一の宿主細胞の後代を含み、後代は天然の、偶発的または計画的な突然変異および／または変更により、元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合もある（形態において、または全ＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は本開示の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」とも呼ばれることもある。
【０１０３】
用語「宿主細胞（単数または複数）」は、本開示に従って組換えタンパク質を精製するプロセスにおいて使用され得る細胞（単数または複数）を指す。このような宿主細胞は対象のタンパク質（ＰＯＩ）を保持する。宿主細胞はタンパク質発現細胞とも呼ばれ得る。本発明の宿主細胞は、これらに限らないが、原核細胞、真核細胞、古細菌、細菌細胞、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞および／または植物細胞であり得る。宿主細胞として想定される細菌はグラム陰性またはグラム陽性のいずれか、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、エルウィニア（Erwinia）種、クレブジエラ（Klebsellia）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種または枯草菌（Bacillus subtilis）であり得る。通常の酵母宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）からなる群から選択される。
【０１０４】
有利な実施形態では、宿主細胞はベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物細胞、タバコ（Nicotiana tabacum）植物細胞またはそのＢＹ２細胞であり、哺乳動物の場合には、好ましくはＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯまたは２９３細胞であり、酵母の場合は、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。
【０１０５】
本開示に従って使用するための植物として、被子植物、コケ植物（例えばゼニゴケ類、スギゴケ類など）、シダ植物（Ptepdophytes）（例えばシダ類、ツクシ、ヒゲノカズラ）、裸子植物（例えば針葉樹、サイカセ（cycase）、銀杏、グネツム目（Gnetales））および藻類（例えば緑藻類、褐藻類、紅藻類、藍藻類、黄緑藻類およびユーグレナ藻類）が挙げられる。例示的植物は、マメ科（Leguminosae）（マメ科（Fabaceae）、例えばエンドウマメ、アルファルファ、ダイズ）、イネ科（Gramineae）（イネ科（Poaceae）、例えばトウモロコシ、コムギ、ニー（nee））、ナス科（Solanaceae）、特にトマト属（Lycopersicon）（例えばトマト）、ナス属（Solarium）（例えばジャガイモ、ナス）、トウガラシ属（Capsium）（例えばコショウ）またはタバコ属（Nicotiana）（例えばタバコ）、セリ科（Umbelhferae）、特にニンジン属（Daucus）（例えばニンジン）、オランダミツバ属（Apium）（例えばセロリ）、またはミカン科（Rutaceae）（例えばオレンジ）、キク科（Compositae）、特にアキノノゲシ属（Lactuca）（例えばレタス）のもの、アブラナ科（Brassicaceae）（アブラナ科（Cruciferae））、特にアブラナ属（Brassica）またはシロガラシ属（Sinapis）のメンバーである。特定の態様では、本発明に従う植物はアブラナ属（Brassica）またはシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の種であり得る。いくつかの例示的アブラナ科（Brassicaceae）のメンバーとして、ブラシカ・カンペストンス（Brassica campestns）、Ｂカンナタ（cannata）、Ｂカラシナ（juncea）、Ｂアブラナ（napus）、Ｂクロガラシ（nigra）、Ｂオレラセアエ（oleraceae）、Ｂトウニフォルツ（tournifortu）、シロガラシ（Sinapis alba）およびダイコン（Raphanus sativus）が挙げられる。形質転換を受け入れられ（amendable）発芽実生として食用できるいくつかの適した植物として、アルファルファ、リョクトウ、ラディッシュ、コムギ、マスタード、ホウレンソウ、ニンジン、ビート、タマネギ、ニンニク、セロリ、ダイオウ、キャベツまたはレタスなどの葉物植物、オランダカラシまたはクレス、パセリ、ミントまたはクローバーなどのハーブ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイズ、レンティル、ヒマワリなど食用花などが挙げられる。
【０１０６】
本開示の組換えタンパク質を発現するために、融合タンパク質またはその一部をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列と作動可能に連結されるよう発現ベクター中に挿入され得る。この関連で、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、タンパク質遺伝子の転写および翻訳を調節するその意図される機能を果たすよう、タンパク質遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。単離されたタンパク質ドメイン配列は通常、同一発現ベクター中に挿入される。タンパク質遺伝子は、標準法によって発現ベクター中に挿入される。さらに組換え発現ベクターは、新生ポリペプチド鎖の小胞体（ＥＲ）への同時翻訳的転位置を促進するシグナルペプチドをコードし得る。フォールディングされたポリペプチド（本開示の組換え融合タンパク質）は宿主細胞から分泌され得るか、または宿主細胞内に保持され得る。細胞内保持またはターゲッティングは、ＥＲ検索のためのＣ末端ＫＤＥＬタグなどの適当なターゲッティングペプチドの使用によって達成され得る。
【０１０７】
一般に当業者はベクターを十分に構築し、組換え遺伝子発現のためのプロトコールを設計できる。さらなる詳細については、例えば参照により本明細書において組み込まれるMolecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press（またはこの研究の後の版）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992を参照のこと。
【０１０８】
有利な実施形態では、発現ベクターは既知技術に従って植物に送達され得る。例えば、ベクター自体が植物に直接適用され得る（例えばこすりつけ接種（abrasive inoculations）、機械化された噴霧接種、真空浸潤、微粒子銃またはエレクトロポレーションによって）。あるいは、またはさらに、バイロンは調製され得（例えばすでに感染した植物から）、既知技術によってその他の植物に適用され得る。種々の植物種に感染するさまざまなウイルスが公知であり、本発明によるポリヌクレオチド発現のために使用され得る（例えばThe Classification and Nomenclature of Viruses中、"Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses"(Ed Murphy et al), Springer Verlag New York, 1995, Grierson et al, Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp 126-146, 1984, Gluzman er al, Communications in Molecular Biology Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sppng Harbor, NY, pp 172-189, 1988およびMathew, Plant Viruses Onlineを参照のこと、それらのすべては参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、植物細胞に単一ウイルスベクターを送達することよりも、ウイルスベクター（単数または複数）の複製（任意選択で、細胞から細胞および／または長距離移動）を可能にする複数の異なるベクターが一緒に送達される。タンパク質の一部またはすべては、トランスジェニック植物のゲノムによってコードされ得る。さらに本明細書に詳細に記載される特定の態様では、これらの系は１種または複数のウイルスベクター成分を含む。
【０１０９】
本開示のさらなる態様は、本明細書において記載される核酸分子から本明細書において記載されるように組換えタンパク質を宿主細胞において発現する方法、前記タンパク質を生成するための適当な培養条件において本明細書において記載される融合タンパク質を発現できる宿主細胞、適当な条件下でこのような宿主細胞を培養することを含む組換えタンパク質を生成する方法に関し、この方法は細胞培養から前記タンパク質を単離することをさらに含み得、単離された融合タンパク質を適したさらなる成分（例えば別のタンパク質または賦形剤または担体であり得る）と混合することをさらに含み得る。
【０１１０】
上記で論じたように、本開示に従って、組換えタンパク質は任意の望ましい系において生成され得る。ベクター構築物および発現系は当技術分野で公知であり、本明細書において提供される組換え融合ポリペプチドの使用を組み込むよう適応され得る。例えばトランスジェニック植物生成は公知であり、構築物の作製および植物生成は当技術分野で公知の技術に従って適応され得る。いくつかの実施形態では、植物における一時的な発現系が望ましい（国際特許出願ＷＯ１００３７０６３Ａ２を参照のこと）。
【０１１１】
組換えポリペプチドの生成のために、本開示に従って、植物、植物細胞および／または植物組織（例えばクローン植物、クローン植物細胞、クローン根、クローン根株、スプラウト、発芽実生、植物など）を培養または増殖させるために、概して当技術分野で公知の標準法が使用され得る。毛根細胞、根細胞系統および植物細胞を培養するために、さまざまな培養培地およびバイオリアクターが使用された（例えばRao et al, 2002, Biotechnol Adv, 20 101を参照のこと）。
【０１１２】
特定の実施形態では、本明細書に従う組換えポリペプチドは任意の既知方法によって生成され得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は植物またはその一部において発現される。タンパク質は、当技術分野で公知の従来の条件および技術に従って単離および精製され得る。これらは抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などといった方法を含む。本発明は、当技術分野で公知であり、本明細書において提供されるさまざまな植物発現系のいずれかを使用する、組換えポリペプチド（単数または複数）の生成物の精製および手頃なスケールアップを含む。
【０１１３】
本開示のいくつかの実施形態では、ワクチン生成物のために組換えポリペプチド（単数または複数）を単離することが望ましいであろう。植物組織（単数または複数）またはその一部、例えば、それらを発現する根、根細胞、植物、植物細胞から本開示に従ってタンパク質が生成される場合には、植物材料からの部分または完全単離のいずれかのために、当技術分野で公知の方法が使用され得る。発現産物を発現する植物細胞または組織の一部、またはすべてから発現産物を単離することが望ましい場合には、任意の利用可能な精製技術が使用され得る。当業者は幅広い分画および分離手順に精通している（例えばScopes et al, Protein Purification Principles and Practice, 3 rd Ed, Janson et al, 1993, Protein Purification Principles High Resolution Methods, and Applications, Wiley- VCH, 1998, Springer-Verlag, NY, 1993およびRoe, Protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001を参照のこと、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。当業者ならば、所望の組換え融合ポリペプチド産物（単数または複数）を得る方法が抽出によることを理解するであろう。植物材料（例えば根、葉など）は、残りのバイオマスから目的生成物を回収するために抽出され得、それによって濃度を高め生成物を精製する。植物は緩衝溶液中で抽出され得る。例えば植物材料は、例えばリン酸バッファーで緩衝されている一定量の氷冷水中に、重量で１対１の割合で移され得る。必要に応じて、プロテアーゼ阻害剤が添加され得る。植物材料は、バッファー溶液中に懸濁されながら、勢いよく混ぜるまたはすりつぶすことによって破壊され、抽出され、濾過または遠心分離によってバイオマスが除去され得る。溶液中の得られた生成物は、さらなるステップによってさらに精製されるか、または凍結乾燥または沈殿によって乾燥粉末に変換され得る。抽出物は圧搾することによって得られる。植物または根は、プレス機での圧搾によって、または密接した間隔のローラーを通されるときに潰されることによって抽出され得る。潰された植物または根から得られた流体が集められ、当技術分野で公知の方法に従って処理される。圧搾による抽出によって、より濃縮された形態での生成物の放出が可能となる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、これらに限らないが、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑカラム）または限外濾過を含むクロマトグラフィー法によってさらに精製され得る。Ｈｉｓタグを含有するポリペプチドは、標準法に従うニッケル交換クロマトグラフィーを使用して精製され得る。いくつかの実施形態では、生成されたタンパク質またはポリペプチドは植物組織から単離されず、むしろ生存植物（例えば発芽実生）の関連で提供される。いくつかの実施形態では、植物が食用である場合には、発現されたタンパク質またはポリペプチドを含有する植物組織は消費のために直接的に提供される。したがって本開示は、発現されたタンパク質またはポリペプチドを含有する食用の若い植物バイオマス（例えば食用発芽実生）を提供する。
【０１１４】
したがって、いくつかの有利な実施形態は本開示の組換え融合タンパク質を生成する方法に関連し、方法は、
ａ）融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物を提供するステップと、
ｂ）核酸構築物を宿主細胞中に導入するステップと、
ｃ）融合タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を維持するステップと
を含む。
【０１１５】
さらに、本開示は、生理学的に許容される媒体中に、有効成分としての本開示の混合物および担体を含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対してヒト個体を免疫処置するためのワクチン組成物に関連する。
【０１１６】
「ワクチン」は、対象に投与されると、免疫応答を誘導する製剤を含む物質の組成物である。ワクチンは、ポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、２種以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の融合物などといった各々の誘導体および組合せを含み得る。ワクチンは、当業者によって容易に理解されるであろうが、希釈剤、アジュバント、担体またはそれらの組合せをさらに含み得る。一実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含む。
【０１１７】
本開示の融合タンパク質が動物によって認識される有効なワクチンは、動物モデルにおいて血液および標的臓器中の寄生生物負荷を低減し、生存時間を延長し、および／またはマラリアの寄生生物を用いてチャレンジした後の体重減少を非ワクチン接種動物と比較して縮小することができる。
【０１１８】
上記のように、ワクチン組成物中の組換えタンパク質は、炭水化物または脂質部分、例えば、担体に連結され得る、またはその他の方法で修飾され、例えばアセチル化され得る。適した担体は、プラスチック、例えばポリスチレンなどのポリペプチド（単数または複数）が疎水性非共有結合相互作用によって結合されているポリマーまたは多糖またはポリペプチド、例えばウシ血清アルブミン、オボアルブミンまたはキーホールリンペットヘマトシアニンなどのポリペプチド（単数または複数）が共有結合によって結合されているポリマーからなる群から選択される。適した媒体は、希釈剤および懸濁剤からなる群から選択される。アジュバントは、好ましくはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、Ｑｕｉｌ  Ａ、ポリＩ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイントの不完全アジュバント、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘナートおよびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）からなる群から選択される。
【０１１９】
有効成分としてペプチド配列を含有するワクチンの調製は、参照によってすべて本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６０８，２５１号明細書、同４，６０１，９０３号明細書、同４，５９９，２３１号明細書および同４，５９９，２３０号明細書によって例示されるように、一般に当技術分野で十分に理解されている。
【０１２０】
ワクチンのアジュバント効果を達成するその他の方法として、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）などの薬剤の使用、糖の合成ポリマー（Carbopol）、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集、アルブミンに対するペプシン処理された（Ｆａｂ）抗体を用いる再活性化による凝集、Ｃ．パルバム（parvum）などの細菌細胞またはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖類成分との混合物が挙げられ、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に許容されるオイル媒体中のエマルジョンまたはブロック代用物として使用されるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液を有するエマルジョンも使用され得る。その他の可能性は、上記のアジュバントと組み合わせたサイトカインまたはポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質の使用を含む。
【０１２１】
アジュバント効果を達成するための別の可能性は、Gosselin et al, 1992に記載される技術を使用することである。手短には、本発明の抗原などの関連抗原は、単球／マクロファージ上のＦｃ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体断片）とコンジュゲートされ得る。
【０１２２】
ワクチンは、投与製剤と適合する方法で、治療上有効であり免疫原性であるような量で投与される。投与されるべき量は、例えば免疫応答を開始する個体の免疫系の能力および所望の保護の程度を含み、治療されるべき対象に応じて変わる。適した投与量範囲は約０．１マイクロｇ〜１０００マイクロｇの好ましい範囲、例えば約１マイクロｇ〜３００マイクロｇの範囲の、特に約１０マイクロｇ〜５０マイクロｇの範囲の、ワクチン接種あたりほぼ数百マイクログラム程度の有効成分のものである。最初の投与およびブースターショットのための適したレジメンも可変性であるが、それは最初の投与と、それに続くその後の接種またはその他の投与によって典型的に表される。適用の方法は広く変わり得る。ワクチンの投与のための従来法のいずれかが適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容される基剤での、または生理学的に許容される分散物中での経口投与、注射などによる非経口的投与を含むと考えられている。ワクチンの投与量は投与経路に応じて変わり、ワクチン接種されるべきヒトの年齢、より少ない程度であるがワクチン接種されるヒトの大きさに従って変わる。
【０１２３】
ワクチンは注射、例えば皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって従来的に非経口的に投与される。その他の投与様式に適しているさらなる製剤として、坐剤が挙げられ、いくつかの場合には、経口製剤が挙げられる。坐剤については、従来の結合剤および担体として、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを挙げることができ、このような坐剤は０．５パーセント〜１０パーセント、好ましくは１〜２パーセントの範囲の有効成分を含有する混合物から形成され得る。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形態をとり、有利には１０〜９５パーセントの有効成分、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する。
【０１２４】
多数の例では、ワクチンの複数の投与を有することが必要であろう。特にワクチンはマラリアの感染を防ぐために、および／または確定的なマラリア感染を治療するために投与され得る。感染を防ぐために投与される場合には、ワクチンは感染の決定的な臨床徴候または感染症状が存在する前に予防的に与えられる。
【０１２５】
遺伝的変動のために、異なる個体は同一タンパク質に対して変動する強度の免疫応答を有して反応し得る。したがって、本開示のワクチンは免疫応答を増大するために、本開示のいくつかの異なる融合タンパク質を含み得る。ワクチンは２種以上の融合タンパク質または免疫原性部分を含み得、そこでタンパク質のすべては上記で定義されるとおりであり、またはペプチドのすべてではない一部は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）またはプラスモジウム属（Plasmodium）由来のその他の寄生生物に由来し得、後の実施例では、ポリペプチドについて上記で示される判定基準を必ずしも満たさないポリペプチドは、その自身の免疫原性ゆえ作用し得るか、または単にアジュバントとして作用し得る。ワクチンは、１〜２０種、例えば２〜２０種またはさらに３〜２０種の異なる組換えタンパク質または融合タンパク質、例えば３〜１０種の異なるタンパク質または融合タンパク質を含み得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は前記担体に吸着されるか、または共有結合によって結合される。別の実施形態では、担体は担体タンパク質である。
【０１２７】
本開示はまた、本開示の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物に関連する。本開示によれば、用語「抗体」は、これらに限らないが、組換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディー、ダイアボディー、トリボディーならびにＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および上述の単一ドメイン抗体などの本開示の抗体の抗原結合部分を含む抗体断片を含む。
【０１２８】
本開示のさらなる態様は、治療有効量の本開示の組換えタンパク質の混合物を投与するステップを含む、患者において熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によって引き起こされるマラリア（悪性マラリア、熱帯熱マラリアまたは熱帯性マラリアとも呼ばれる）を治療および／または予防するための方法に関連する。
【０１２９】
対象に投与される本開示の混合物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療されている疾患の種類、これまでのまたは同時発生的治療的介入、患者の特発性および投与経路などに関する物理的および生理学的因子によって決定され得る。投与に責任のある医師がいかなる事象においても、組成物中の有効成分（単数または複数）の濃度および個々の対象に適当な用量を決定する。
【０１３０】
以下の方法および実施例は例示目的で提供され、決して本開示の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１３１】
方法および実施例
以下の実施例では、本開示の材料および方法が提供される。これらの実施例は単に例示目的であって、決して本開示を限定すると解釈されてはならないということが理解されなければならない。本明細書において引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
例として、ＣＣＴ（ＰｆＣｅｌＴｏｓ（配列番号２９）、ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ（配列番号３０）およびＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ（配列番号３１）を特徴とする融合タンパク質）、ｇＡＭＡ１（熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株３Ｄ７に対応するＰｆＡＭＡ１（配列番号２））、ＮＭＥ（ＰｆＭｓｐ１＿１９の第１のＥＧＦ（配列番号３２）、ＰｆＭｓｐ４のＥＧＦ（配列番号３３）、ＰｆＭｓｐ８の第１および第２のＥＧＦ（配列番号３４〜３５）を特徴とする融合タンパク質、ＰｆＭｓｐ３のＮ末端断片（配列番号３６）ならびに２５−２３０Ｃ０（Ｐｆｓ２５（配列番号４４）およびＰｆｓ２３０のＣ０断片（配列番号４５）を特徴とする融合タンパク質）と名付けられた４種の異なる組換えタンパク質を、ベンサミアナタバコ（N.benthamiana）植物において生成した。精製後、タンパク質を混合し、ウサギの免疫処置のために使用した。得られた免疫血清から得た抗体調製物を、免疫原性および種々の段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物に対する阻害効果を実証するための種々の方法によって特徴づけた。
【０１３３】
１．発現構築物のクローニング
表１に列挙される抗原断片配列を、植物発現のために最適化した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。最適化された配列を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ断片として植物発現ベクターｐＴＲＡｋｃ中に挿入した。抗原融合タンパク質の作製のために、抗原を含有する植物発現ベクターを、ＮｏｔＩによって線形化し、５’リン酸基をウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）によって除去し、抗原ドメインをＥａｇＩ断片として挿入した。すべての構築物は、精製のためのＣ末端Ｈｉｓ６−タグおよびＥＲ検索のためのＳＥＫＤＥＬ−タグを保持していた（Pelham, 1990）。ｐＴＲＡｋｃプラスミドの詳細な説明が、Boes et al （Boes et al. 2011）に報告されている。すべての組換え遺伝子構築物を、配列決定することによって検証し、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１中に導入した（ｐＭＰ９０ＲＫ）。組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）をこれまでに記載されたように培養した（Sack et al. 2007; Vaquero et al. 1999）。培養物の光学濃度（ＯＤ）を決定し、発現株をサイレンシングサプレッサーｐ１９を保持するアグロバクテリウム（agrobacterium）株（Plant Bioscience Limited, Norwich, England）と５：１の比で混合し、１の最終ＯＤとした。
【０１３４】
図２は、この実施例において使用される４種ワクチン抗原の模式図を示す。
ＰｆＣｅｌＴｏｓ：熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のオーキネートおよびスポロゾイトの細胞通過タンパク質（ＣｅｌＴｏｓ）；ＣＳＰ＿ＴＳＲ：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のサーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）由来のＴＳＲ−ドメイン；ＴＲＡＰ＿ＴＳＲ：熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）のトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）由来のＴＳＲ−ドメイン；ＰｆｇＡＭＡ１：熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）頂端膜抗原（ＡＭＡ１）細胞外ドメイン１〜３；ＰｆＭｓｐ１−１９＿ＥＧＦ１：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のＭＳＰ１の１９ｋＤａ断片に由来するＥＧＦ１；ＰｆＭｓｐ４＿ＥＧＦ：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のＭＳＰ４に由来するＥＧＦ；ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ１：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のＭＳＰ８に由来するＥＧＦ１；ＰｆＭｓｐ８＿ＥＧＦ２：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のＭＳＰ８に由来するＥＧＦ２；Ｐｆｓ２５：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のオーキネート表面タンパク質２５；Ｐｆｓ２３０Ｃ０：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）の生殖体／ガメトサイト表面タンパク質２３０のＣ０−断片。
【０１３５】
２．一時的な発現
各構築物のために、それぞれの発現カセットを含有する組換え細菌を、ロックウール中で成長した６〜８週齢のベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物中に手作業で別個に注射した。浸潤されたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物を１６時間の光周期を用い、２２℃で５日間インキュベートした。植物葉組織をタンパク質抽出および精製のために回収した。
【０１３６】
３．タンパク質抽出
乳鉢（mortal）および乳棒を使用して液体窒素中で葉組織を破砕し、可溶性タンパク質を１ｇの葉材料あたり２ｍｌの抽出バッファーを用いて抽出した。本発明者らは、２５−２３０Ｃ０のためには、ＰＢＳ  ｐＨ７．４を使用し、その他の３種のタンパク質は１０ｍＭ二硫化ナトリウムを含有するＰＢＳ  ｐＨ  ７．４を使用して抽出した。不溶性材料を遠心分離（１６０００ｘｇ、２０分、４℃）によって除去し、清澄な上清を精製に直接使用した。熱安定性融合タンパク質ＣＣＴおよび２５−２３０Ｃ０には、植物宿主細胞タンパク質を効率的に除去するためにさらなる熱沈殿ステップを実施した（６５℃で５分間の植物抽出物のインキュベーション）。その後、不溶性材料を一連の遠心分離および濾過ステップによって除去した。
【０１３７】
４．タンパク質精製
Ｈｉｓタグをつけた対象の組換えタンパク質を、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。手短には、抽出物のｐＨをｐＨ８．０に調整し、ＮａＣｌを５００ｍＭの最終濃度に添加した。標的タンパク質は、ニッケルを充填したキレーティングセファロース上に捕獲された。ｐＨ８．０に調整したＰＢＳを用いる洗浄ステップ後に、標的タンパク質をｐＨ８．０のＰＢＳに溶解した１５ｍＭ、５０ｍＭおよび２５０ｍＭイミダゾールの段階勾配で溶出した。
【０１３８】
５．ウサギの免疫処置
精製されたタンパク質（配列番号１〜４）を等量で混合して（本明細書において以下、ＰｌａｓｍｏＭｉｘと呼ばれる）、２２０μｇ／ｍｌの各組換えタンパク質（総タンパク質濃度８８０μｇ／ｍｌ）を含有する溶液を調製し、「完全で容易な提案（complete and Easy offer）」およびその対応する免疫処置プロトコールに従うウサギの免疫処置のために、Ｂｉｏｇｅｎｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送った。
【０１３９】
６．ウサギ血清から得られた抗体のプロテインＡ精製
免疫処置後、ウサギ抗血清から得られた抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。手短には、血清サンプルをＰＢＳを用いて１：５希釈し、精製に先立って０．４５μｍフィルターを通して濾過した。抗体をプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に結合させ、結合していない不純物をＰＢＳを用いる洗浄ステップによって除去した。結合している抗体を１００ｍＭグリシンｐＨ３．０を用いて溶出し、１Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０を用いて直接中和した。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、Ｌ−グルタミン（Ｅ１５−０４１、ＰＡＡ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０に対するバッファー交換を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムを使用して実施し、抗体を、遠心性濃縮装置（ＶｉｖａＳｐｉｎ  １５Ｒ  ３０．０００  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｕｉｓ）によって、１２ｍｇ／ｍｌを超える濃度に濃縮し、滅菌濾過した。抗体を４℃で保存した。
【０１４０】
７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット解析
タンパク質を、還元および／または非還元条件下で市販の４〜１２％（ｗ／ｖ）勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、フェアバンクス（Fairbanks）プロトコール（Wong et al. 2000）に従ってクマシーＲ−２５０で染色した。分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロッティングし、ＰＢＳに溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロッキングした。タンパク質を、１：５０００希釈の一次抗体としてウサギ抗Ｈｉｓ６タグを用いてプロービングした。二次抗体は、アルカリホスファターゼ標識されたヤギ抗ウサギＨ＋Ｌとした。バンドをＮＢＴ／ＢＣＩＰ（基質バッファー：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．６中、１ｍｇ・ｍｌ−１）を用いて可視化した。インキュベーションステップの間に、メンブランを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１４１】
図３  本実施例の種々のＮｉ−ＮＴＡ精製組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。タンパク質を還元条件下で分離した。図３Ａはクマシー染色されたゲルを示す；図３Ｂは免疫ブロット解析である。組換えタンパク質を、ウサギ抗Ｈｉｓ抗体とそれに続くヤギ抗ウサギＨ＋Ｌアルカリホスファターゼ標識された抗体を用いて検出した。分子量標準は左側に示されている。
【０１４２】
図３中の略語は以下のとおりである：
１：ＣＣＴ−ＥＲＨ（配列番号１）
２：ｇＡＭＡ１−ＥＲＨ（配列番号２）
３：ＮＭＥ−ＥＲＨ（配列番号３）
４：Ｐｆｓ２５＿２３０Ｃ０−ＥＲＨ（配列番号４）
Ｍ：分子量マーカー
【０１４３】
８．ＥＬＩＳＡ
免疫処置のために使用されたタンパク質に対する血清における特異的抗体（ＩｇＧ）力価、ならびにすべてのサブユニット／ドメインに対する反応性を、室温で１時間インキュベートした後、１μｇ／ｍｌの濃度の組換えタンパク質を用いてコーティングされた高結合性９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＥＬＩＳＡによって測定した。ウェルをＰＢＳ中、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロッキングし、再度室温で１時間インキュベートした。血清ならびに免疫前血清の段階希釈を９６ウェルプレートに適用し、室温で１時間インキュベートした。抗原が結合している抗体をＨＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃを用いてプロービングし、３０分後に４０５ｎｍでＡＢＴＳ基質を用いて検出した。各ステップの間に、プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳを用いて３回洗浄した。特異的ＩｇＧ力価を、免疫前血清の値の２倍のＯＤ４０５ｎｍをもたらす希釈として規定した。
【０１４４】
【表２】
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【０１４５】
９．免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）寄生生物の異なる段階を可視化するために、間接ＩＦＡの大部分をこれまでに記載されるように（Pradel et al, 2004）実施した。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）株ＮＦ５４の無性段階およびガメトサイトの培養を、これまでに記載されるように（Ifediba and Vanderberg, 1981）実施した。寄生生物調製物を８ウェル診断用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で風乾させ、−８０℃のメタノールを用いて１０分間固定化した。非特異的結合をブロックしメンブランを透過処理するために、固定化された細胞を、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０１％サポニン中、室温で３０分間、続いてＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０１％サポニン、１％中性ヤギ血清中、室温で３０分間インキュベートした。サンプルを、ヤギ血清を含まないブロッキング溶液で希釈されたＰｌａｓｍｏＭｉｘに対する精製された抗体とともに、３７℃で１時間インキュベートした。精製された抗体を１５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。異なる熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）生活環段階の対比染色のために、Ｐｆ＿ＣＳＰ＿ＴＳＲ（スポロザイトの対比染色）、ＭＳＰ１−１９（シゾントの対比染色）またはＰｆｓ２５（マクロガメートおよび接合子の対比染色）に由来する単一熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）抗原断片に対するマウス抗血清をフラウンホーファー（Fraunhofer）ＩＭＥによって作製し、１／２００の最終濃度で使用した。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液中１／１０００の希釈の蛍光コンジュゲートＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに細胞をインキュベートすることによって、一次抗体を可視化した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４がカップリングした抗体が生じる寄生生物の標識がない場合には、ＰＢＳ中０．０５％エバンスブルーを用いて細胞を対比染色した。核を強調するために、サンプルをＰＢＳ中０．０１％サポニン中のヘキストとともにインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液ＡＦ２（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ  Ｌｔｄ．）とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。ライカｓｐ５共焦点顕微鏡を使用して標識された細胞の検査およびイメージのスキャニングを実施した。本開示のＰｌａｓｍｏＭｉｘに対して作製され精製されたウサギ抗体を用いる、異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）段階の例示的免疫蛍光アッセイが図４に示されている。図の各部分では、左側にヘキスト核染色、左から２番目に陽性対照染色（マウス対照ｐＡｂ、Ａｌｅｘａ４８８を用いて標識された抗マウスｐＡｂを用いて検出）、左から３番目にＰｌａｓｍｏＭｉｘに対して作製された精製されたウサギｐＡｂを用いる染色（Ａｌｅｘａ５９４を用いて標識された抗ウサギｐＡｂを用いて検出）、左から４番目に中性ウサギｐＡｂ対照、および右側に透過とそれに続いて重ね合わせイメージが示されている。
【０１４６】
１０．スポロザイト結合／侵襲の阻害（ＩＳＩ）
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）抗原に対する抗血清の、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）ＮＦ５４スポロザイトのヒト肝臓細胞への結合および侵襲を阻止する能力を評価するために、Rathore et al. (2003)およびMcCormick et al. (2008)に提示されるプロトコールに従って、スポロザイト結合／侵襲の阻害アッセイを実施した。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地で６００００／ｍｌの濃度に希釈した。この懸濁液の４００μｌを、Ｅ−Ｃ−Ｌ細胞結合マトリックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でコーティングされた８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ  ｐｅｒｍａｎｏｘチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートして、閉じた単層を形成した。ＨｅｐＧ２細胞の播種後２日目に、人工感染性吸血の１９〜２１日後のアノフェレス・ステフェンシ（Anopheles stephensi）蚊から熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）ＮＦ５４スポロザイトを単離し、ＰＢＳ中０．０００１％ＦＢＳ中に集めた。スポロザイトをノイバウエル血球算定器を使用してカウントし、３００μｌのＲＰＭＩ／１０％  ＦＢＳ中２００００個のスポロザイトを、事前にＲＰＭＩを用いて３回洗浄したＨｅｐＧ２細胞の各ウェルに添加した。ＲＰＭＩ中に溶解した、ＰｌａｓｍｏＭｉｘに対するウサギ抗血清から得られた精製されたポリクローナル抗体を６００μｇ／ｍｌの濃度で使用し、細胞をその後３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。細胞外および細胞内スポロザイト間を区別するために、これまでに記載されたプロトコールに従い（Hugel et al. 1996, Pradel and Frevert 2001）いくつかの修飾を用いて二重標識を実施した。細胞外スポロザイトを標識するために、ＨｅｐＧ２細胞をＲＰＭＩ培地を用いて３回洗浄した。ＲＰＭＩで１／２００希釈したウサギ抗ＣＳＰ（ＭＲＡ−２４、ＡＴＣＣ）との、３７℃で１時間のインキュベーションの次に、ＲＰＭＩを用いる３回の洗浄ステップ、およびＲＰＭＩで１／１０００希釈したａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との、３７℃で１時間のインキュベーションを続けた。細胞をＰＢＳを用いて３回洗浄し、風乾し、メタノールを用いて−８０℃で１０分間固定化した。ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０１％サポニンとともにインキュベートすることによるブロッキングおよび細胞膜の透過処理を、４℃で一晩実施した。続いてすべてのスポロザイトを標識するために、ブロッキング溶液で１／２００希釈したウサギ抗ＣＳＰ（ＭＲＡ−２４、ＡＴＣＣ）との、３７℃で１時間のインキュベーションの次に、ブロッキング溶液を用いる３回の洗浄ステップ、およびブロッキング溶液で１／１０００希釈したａｌｅｘａ  ５９４コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との、３７℃で１時間のインキュベーションを続けた。核を強調するために、サンプルをＰＢＳ中ヘキストとともにインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液ＡＦ２（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ  Ｌｔｄ．）とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。細胞外（赤色および緑色蛍光）および細胞内（赤色のみの蛍光）のカウントを、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を使用して実施した。本開示のＰｌａｓｍｏＭｉｘに対して作製された精製されたウサギ抗体のＩＳＩ結果が、以下の表４に列挙されている。
【０１４７】
１１．成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）
プラスモジウム属（Plasmodium）寄生生物に対する成長阻害の可能性を、標準化されたプロトコールを使用して実施した。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）寄生生物株３Ｄ７Ａ（ＭＲ４によって提供された）を、３７℃で５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で、１０％Ａｌｂｕｍａｘ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１００μΜのヒポキサンチンを補給したＲＰＭＩ培地中、４％のヘマトクリットで、５％未満の寄生虫症で培養物中に維持した。培養物を日常的なルーチンで維持し、ギムザ染色によって寄生中症を推定した。アッセイに使用される赤血球は１５人のマラリア無感作血液ドナーから混合し、それらは３週間以内のものだった。赤血球はＳＡＧ−マンニトール中、４℃で保存した。寄生生物を、侵襲後１〜１６時間の時間ウィンドウ内の１０％ソルビトール処理によって同調させた。アッセイには、侵襲後３６〜４０時間の高度に同調した培養物のみを使用した。
【０１４８】
寄生生物および新鮮なＲＢＣおよび抗体を、およそ、０．１％の最終寄生中症および２％の最終ヘマトクリットを有するよう９６ウェルプレート中で混合した。バックグラウンド対照のために、寄生生物を含まないＲＢＣのみを寄生生物と同一条件下で培養物中に維持した。添加を行わずに熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）寄生生物を培養することによって、寄生生物成長をモニタリングするための成長制御を実施した。すべてのサンプルを３連で測定した。陰性対照として、マラリア無感作ウサギおよびヒト血漿を得、精製された抗体を試験した。完全侵襲阻害の陽性対照として、ＥＤＴＡ（４ｍＭ最終濃度）およびＢＧ９８ウサギ抗ＡＭＡ−１ポリクローナル抗体を使用した。プレートは３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で４０〜４４時間インキュベートした。回収時に、冷ＰＢＳを用いて１回ウェルを洗浄し、凍結した。寄生生物成長をＭａｌｓｔａｔ（商標）アッセイ３２によって推定した。吸光度を分光光度計を使用して６５５ｎｍの波長で３０分後に測定した。阻害能は以下の式によって推定した：
阻害％＝１００％−（（Ａ６５５  ＩｇＧサンプル−Ａ６５５  ＲＢＣ対照））／（（Ａ６５５シゾント対照−Ａ６５５  ＲＢＣ対照））＊１００％
【０１４９】
上記のように、成長阻害アッセイは抗体の阻害の可能性を評価するための標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。アッセイは無性段階／血液段階をシミュレートする。ＰｌａｓｍｏＭｉｘに対して作製され精製されたウサギ抗体のＧＩＡ結果は、表４に列挙されている。
【０１５０】
１２．伝達阻止アッセイ（ＴＢＡ）
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）抗原に対する抗血清の、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）ＮＦ５４のヒトから蚊への伝達を阻止する能力を評価するために膜飼育アッセイを実施した（Bishop and Gilchrist, 1946）。手短には、パーコール密度勾配遠心分離によって相当な鞭毛放出を示す成熟段階Vガメトサイトを培養物から精製し（Kariuki et al, 1998）、等量の新鮮なＡ＋−赤血球と混合する。次いで細胞を、試験のためにそれぞれの抗血清を補給した、等量の活性ヒトＡ＋−血清と混合した。未精製の試験血清を１／１０の濃度まで、精製された試験血清を１ｍｇ／ｍｌの濃度まで使用した。サンプルを、３８℃に加熱したガラスフィーダーの底に広げたパラフィルムの薄層を介して、３〜５日齢のＡ．ステフェンシ（Stephensi）蚊に直接与えた。感染に使用した蚊は、これまでは脱脂綿パッドに浸した５％サッカロース、０．０５％パラアミノ安息香酸、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンの溶液で与えられた。ゲンタマイシンは感染率全体を増強するための食事の一部であった（Beier MS et al, 1994）。蚊は、吸血で２０分間摂食することが許可され、その後、８０％湿度で２６℃の安全な昆虫実験室中で維持された。翌日以降、摂食は上記の溶液を使用して行われた。異なる吸血の感染性を測定するために、血液を与えられた蚊の２０個の中腸の各サンプルを感染の９〜１２日後に解剖し、オーシストのカウントを容易にするために、ＰＢＳ中０．２％マーキュロクロムを用いて染色した。オーシストのカウントを、１００倍の倍率を使用して光学顕微鏡で実施した。ＰｌａｓｍｏＭｉｘに対して作製された精製されウサギ抗体のＴＢＡ結果が、表４に列挙されている。
【０１５１】
【表３】
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【０１５２】
結果は、３種のプラスモジウム属（Plasmodium）生活環段階の、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質またはタンパク質ドメインに基づいて、本開示の例示的抗原を生成する実現可能性を実証する。生成は、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物において達成された。精製後、４種の組換えタンパク質の混合物は、動物において平衡が保たれた抗体反応を誘発し、１ｘ１０−４超の力価を有していた。免疫蛍光アッセイによって、誘導された抗体は天然プラスモジウム属（Plasmodium）抗原と特異的に結合すると確認された。さらに機能アッセイによって、対応するプラスモジウム属（Plasmodium）生活環段階すべてにおいて３０〜１００％の範囲の特異的寄生生物阻害が実証された。
【０１５３】
本開示のワクチン混合物のさらなる実施例（Ｍ１およびＭ２）を生成し、試験した。
【０１５４】
１３．発現構築物のクローニング
上記ですでに記載した。
【０１５５】
１４．一時的な発現
上記ですでに記載した。
【０１５６】
１５．タンパク質抽出
乳鉢（mortal）および乳棒を使用して液体窒素中で葉組織を破砕し、可溶性タンパク質を、１ｇの葉材料あたり３〜７ｍｌの抽出バッファー（１０ｍＭ  二硫化ナトリウムおよび５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ）を用いて抽出した。１０％（ｖ／ｖ）の１Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０を添加することによって、タバコ粗抽出物をｐＨ８．０に調整した。ＰｆＣｅｌＴＯＳ−ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＲｈ５ａ（配列番号３３）およびＰｆｓ２５−Ｐｆｓ２３０＿Ｃ０＿ＰｆＲｈ５ｂ（配列番号３６）の場合には、植物宿主細胞タンパク質を除去するために熱沈殿を実施した。抽出物を、抽出物中の温度が６５℃に達するまでサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中でインキュベートした。不溶性材料を遠心分離（１６０００ｘｇ、２０分、４℃）によって除去し、清澄な上清を精製に直接使用した。
【０１５７】
１６．タンパク質精製
ＣＣＴ−９ＡＤ４およびＦ０−Ｑ５Ａは、さらなる精製ステップを行わずに直接使用した。ＡＭＡ１＿ＤｉＣｏ変異体（ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ１−３およびＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ１−Ｍｓｐ１＿１９ＦＵＰ、ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ２−Ｒｈ２およびＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ３−ＲＩＰＲ７／８）は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。したがって、キメラモノクローナル抗体４Ｇ２（ＰｆＡＭＡ１特異的）を、製造業者の説明書に従って、ＮＨＳ活性化セファロース（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合によって連結させた。ＰＢＳを用いて、結合していないタンパク質を洗浄除去し、１００ｍＭ  グリシン  ｐＨ３．０を用いて結合しているタンパク質を溶出し、１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０を用いて直ちに中和した。
【０１５８】
１７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット解析
タンパク質を、非還元条件下で市販の４〜１２％（ｗ／ｖ）勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、フェアバンクス（Ｆａｉｒｂａｎｋｓ）プロトコール（Wong et al. 2000）に従ってクマシーＲ−２５０で染色した。分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロッティングし、ＰＢＳに溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロッキングした。ＰｆＡＭＡ１を含有するタンパク質を、以下の１：５０００の希釈の一次抗体としてキメラモノクローナル抗体４Ｇ２と、続いて、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒト抗血清を用いてプロービングした。タンパク質ＰｆＣｅｌＴＯＳ−ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＲｈ５ａを、ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ特異的モノクローナル抗体と、続いて、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス抗血清を用いてプロービングし、タンパク質Ｐｆｓ２５−Ｐｆｓ２３０＿Ｃ０＿ＰｆＲｈ５ｂを、キメラモノクローナル抗体４Ｂ７（Ｐｆｓ２５−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）と、続いて、ＰｆＡＭＡ１タンパク質の検出のために使用される同一二次抗体を使用してプロービングした。バンドをＮＢＴ／ＢＣＩＰ（基質バッファー中１ｍｇ・ｍｌ−１：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．６）を用いて可視化した。インキュベーションステップの間に、メンブランを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１５９】
図６：本実施例のワクチン混合物Ｍ１およびＭ２を調製するために使用される種々の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。タンパク質を非還元条件下で分離した。図６Ａは、イムノアフィニティークロマトグラフィー精製したＰｆＡＭＡ１含有組換えタンパク質のクマシー染色ゲルおよびＰｆＣｅｌＴＯＳ−ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＲｈ５ａ（中黒矢頭によって示される）またはＰｆｓ２５−Ｐｆｓ２３０＿Ｃ０−ＰｆＲｈ５ｂ（中白矢頭によって示される）のいずれかを含有する熱沈殿したタバコ粗抽出物を示し、図６Ｂは、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＰｆＡＭＡ１含有タンパク質の免疫ブロット解析であり；図６Ｃは、ＰｆＣｅｌＴＯＳ−ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＲｈ５ａを含有する熱沈殿したタバコ粗抽出物の免疫ブロット解析であり；図６Ｄは、Ｐｆｓ２５−Ｐｆｓ２３０＿Ｃ０−ＰｆＲｈ５ｂを含有する熱沈殿したタバコ粗抽出物の免疫ブロット解析である。組換えタンパク質の検出のために使用された抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット解析の節において列挙されている。Ｍ：マーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；１：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ１（配列番号１１）；２：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ２（配列番号１２）；３：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ３（配列番号１３）；４：１〜３の混合物；５：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ１−Ｍｓｐ１＿１９ＦＵＰ（配列番号１４）；６：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ２−Ｒｈ２（配列番号１５）；７：ＰｆＡＭＡ１−ＤｉＣｏ３−ＲＩＰＲ７／８（配列番号１６）；８：５〜７の混合物；９：熱沈殿した野生型タバコ粗抽出物；１０：ＰｆＣｅｌＴＯＳ−ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＰｆＲｈ５ａ（配列番号９）を含有する熱沈殿したタバコ粗抽出物；１１：Ｐｆｓ２５−Ｐｆｓ２３０＿Ｃ０−ＰｆＲｈ５ｂ（配列番号２８）を含有する熱沈殿したタバコ粗抽出物。
【０１６０】
１８．ウサギ免疫処置
ウサギの免疫処置のために、２種のワクチン混合物Ｍ１およびＭ２（ワクチンカクテル）を調製し、混合物は以下に記載されている。
【０１６１】
【表４】
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【０１６２】
タンパク質を等容積で混合し、ウサギ免疫処置のために得られたワクチン混合物Ｍ１およびＭ２を使用した（Ｂｉｏｇｅｎｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１６３】
１９．力価決定
免疫処置のために使用されるワクチン混合物（Ｍ１およびＭ２）に対する血清中の特異的抗体（ＩｇＧ）力価を、それぞれのワクチン混合物（５０ｍＭ炭酸バッファーｐＨ９．５中、１０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた高結合性９６ウェルプレートを使用するＥＬＩＳＡによって測定した。コーティングステップ（室温、一晩）後、ＴＢＳ中、１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を用いて、室温で３０分間ウェルをブロッキングした。血清ならびに免疫前血清の段階希釈を、９６ウェルプレートにアプライし、室温で１時間インキュベートした。抗原が結合している抗体を、ＰＯＤ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ４９１４）を用いて、室温で１時間プロービングし、ＴＭＢ  Ｏｎｅ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いて検出した。１５分後に５００ｍＭ硫酸を添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍで（参照波長６３０ｎｍ）黄色溶液の吸収を測定した。各ステップの間に、プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補給したＴＢＳを用いて３回洗浄した。特異的ＩｇＧ力価は、免疫前血清の値の２倍のＯＤ４５０ｎｍをもたらす希釈として定義した。
【０１６４】
【表５】
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【０１６５】
（参考文献）
本明細書を通じて引用される文献参考文献、発行された特許および公開された特許出願を含むすべての引用された参考文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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