(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ及び７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰの存在下にＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって作製されたｃＤＮＡを鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅する方法であって、７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、ホルムアミド及びジメチルスルホキシドの存在下でポリメラーゼ・チェーン・リアクション法により行うことを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
【請求項２】
ｄＩＴＰ及びｄＧＴＰの存在下にＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって作製されたｃＤＮＡを鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅する方法であって、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ、ホルムアミド及びジメチルスルホキシドの存在下でポリメラーゼ・チェーン・リアクション法により行うことを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
【請求項３】
７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ及び７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ及び７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰの存在下にＤＮＡをポリメラーゼ・チェーン・リアクション法により増幅するためのキットであって、７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成するための試薬を含有することを特徴とするキット。
【請求項４】
ｄＩＴＰ及びｄＧＴＰを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、ｄＩＴＰ及びｄＧＴＰの存在下にＤＮＡをポリメラーゼ・チェーン・リアクション法により増幅するためのキットであって、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成するための試薬を含有することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＮＡ増幅法、特にＤＮＡの混在下においてもＲＮＡに対応する塩基配列のみを選択的に増幅することが可能なＲＴ−ＰＣＲ法、並びに該ＤＮＡ増幅方法に使用されるキットに関する。
背景技術
ＤＮＡ増幅法、特にポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法は試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、現在では遺伝子に関する研究のみならず生物学、医学、農業等幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。ＰＣＲ法は本来ＤＮＡを増幅する技術であるが、ＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲ法が開発されており、ＲＴ−ＰＣＲ法と呼ばれている。該方法は、ＤＮＡポリメラーゼの一種であり、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、すなわち逆転写活性を有する逆転写酵素、あるいは逆転写活性を合せ持つＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに相補的なＤＮＡ転写物（ｃＤＮＡ）を合成し、続いてこれを鋳型としてＰＣＲを行うことによりＲＮＡ由来ｃＤＮＡを特異的に増幅する方法である。ＲＴ−ＰＣＲ法はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡのクローニングやｃＤＮＡライブラリーの作製に利用されるほか、特定のｍＲＮＡの発現状態を調べる方法としても有用である。
しかしＲＴ−ＰＣＲに使用されるＲＮＡ試料中にＤＮＡが混在している場合には、ＲＮＡをコードしているＤＮＡ上の領域や偽遺伝子がＰＣＲの鋳型となった産物が同時に増幅されてくるため、ＲＮＡを鋳型とした増幅産物のみを選択的に取得することは困難である。このようなＲＮＡ試料中に混在したＤＮＡ由来の増幅産物の生成を防ぐために、精製されたＲＮＡを試料として用いるか、あるいはＤＮＡ分解酵素処理等によって混在ＤＮＡを除去した試料を用いる必要があり、操作が煩雑になる。
この問題を解決する方法として、ヌクレオチドアナログであるｄＩＴＰ存在下の逆転写反応によってＴｍ値、すなわち融解温度の低いＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸を合成し、更に同じヌクレオチドアナログの存在下、低温の変性温度でＰＣＲ反応を行い、試料中に混在するＤＮＡに起因する産物の増幅を抑制し、ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を選択的に増幅させる方法が提案されている［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）第２４巻、第５０２１〜５０２５頁（１９９６）］。しかし、該方法は増幅させる塩基配列のＧＣ含量に応じてｄＩＴＰの添加量や反応温度を変化させる必要があり、至適条件を探すのは困難である。更に、反応性においても満足できるものではなく、標的となる塩基配列によっては選択的な増幅が起こらない場合もある。
発明の開示
本発明の目的は、従来技術の方法の欠点を克服し、ＤＮＡの混在下においても、ＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡ断片のみを選択的に得ることが可能であり、かつ汎用性、再現性、検出感度に優れたＤＮＡ増幅方法を提供することにある。
本発明者らは、上記のヌクレオチドアナログを使用する方法の問題点の１つが、通常の二本鎖ＤＮＡは変性せず、かつヌクレオチドアナログが取込まれたｃＤＮＡと鋳型ＲＮＡからなるＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸は変性するような温度条件を設定することが困難な点にあることを明らかにした。そしてこの問題がＤＮＡ増幅反応時にＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物、例えばホルムアミド等を添加することにより解決されることを見出した。
更に、本発明者らは、上記方法において合成されるＤＮＡ鎖へのヌクレオチドアナログの取込みが標的ＲＮＡの塩基配列、特にＧＣ含量に左右されることが上記方法のもう一つの問題点であると考えた。本発明者らは一定の頻度でＤＮＡに取込まれるような２種類以上のヌクレオチドアナログを反応液に添加することにより、標的ＲＮＡのＧＣ含量にかかわらず、再現性よくＤＮＡの増幅が起こることを見出して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  ヌクレオチドアナログを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅する方法において、２種以上のヌクレオチドアナログの存在下又は二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で行うことを特徴とするＤＮＡ増幅方法、
〔２〕  ヌクレオチドアナログを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅する方法において、１種又は２種以上のヌクレオチドアナログ及び二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で行うことを特徴とするＤＮＡ増幅方法、
〔３〕  ヌクレオチドアナログを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅するためのキットであって、２種以上のヌクレオチドアナログ又は二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を含有することを特徴とするキット、ならびに
〔４〕  ヌクレオチドアナログを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅するためのキットであって、１種又は２種以上のヌクレオチドアナログ及び二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を含有することを特徴とするキット、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＤＮＡ増幅方法は、ヌクレオチドアナログを含有するＤＮＡ断片を鋳型とし、ヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡを増幅する方法において、２種以上のヌクレオチドアナログの存在下及び／又は二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で行うことを１つの大きな特徴とする。
本発明の方法において、増幅反応の鋳型となるＤＮＡ断片は、１種又は２種以上のヌクレオチドアナログの存在下にＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって作製されたｃＤＮＡが用いられる。逆転写反応はさらに二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で行っても良い。
本発明の方法を適用することができるＲＮＡを含む試料には特に限定はないが、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であってもよい。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えばｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。なお、これらの試料はＤＮＡを含有するものであっても共存するＤＮＡの影響を受けることはなく、ＲＮＡに対応するＤＮＡが選択的に増幅される。また、公知の方法によってＤＮＡが除去された試料を用いてもよい。
本発明の方法により増幅されるＲＮＡとしては、特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子が挙げられ、逆転写及び増幅反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。例えば、該標的ＲＮＡの有無やその量の増減が特定の疾患を指示するものであれば本発明の方法により該疾患の診断を行うことが可能であり、また、微生物に特異的なＲＮＡを標的とすることにより、試料中の該微生物の存在を検出することができる。前記増幅対象のＲＮＡの１回の逆転写反応における使用量は、逆転写反応を行なうに十分な量であればよく、例えば、感度の観点から、好ましくは０．１μｇ以上であり、さらに好ましくは０．５μｇ以上であり、反応阻害の観点から、好ましくは２μｇ以下であり、さらに好ましくは１μｇ以下である。
本発明において標的ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーは、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において標的ＲＮＡに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、オリゴ（ｄＴ）等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）であってもよい。
前記プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行なう観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、さらに好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等いかなる方法で合成されたものでもよい。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであってもよく、例えば該試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製してもよい。逆転写反応液中の前記プライマーの使用量は、標的ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を行なうために十分な量であればよく、合成効率の観点から、好ましくは０．１μＭ以上であり、さらに好ましくは０．５μＭ以上であり、反応阻害の観点から、好ましくは１０μＭ以下であり、さらに好ましくは５μＭ以下である。
また、ＤＮＡの増幅反応（ＰＣＲ）に使用されるプライマーも、標的ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡの増幅に使用可能であれば特に限定はなく、上記同様の種々のオリゴヌクレオチドを使用することができる。上記の標的ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーをＤＮＡの増幅反応に使用してもよい。ＰＣＲ反応液中の前記プライマーの使用量は、標的ＲＮＡを鋳型として得られたｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ＤＮＡ合成を行なうために十分な量であればよく、合成効率の観点から、好ましくは０．０５μＭ以上であり、さらに好ましくは０．１μＭ以上であり、反応特異性の観点から、好ましくは２μＭ以下であり、さらに好ましくは１μＭ以下である。
本発明で用いられる逆転写活性を有する酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２由来逆転写酵素（ＲＡＶ−２−ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもでき、例えば、サーマス・サーモフィラス由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）、バチルス・カルドテナックス由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ）等を使用してもよい。ＡＭＶ−ＲＴａｓｅ又はＲＡＶ−２−ＲＴａｓｅが好ましい。これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組換え蛋白質のいずれであってもよい。前記逆転写活性を有する酵素の使用量は、逆転写反応を行なうに十分な量であればよい。
本発明のＤＮＡの増幅方法は、上記逆転写反応により生成したｃＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ増幅反応を行なって該ＤＮＡを増幅することを１つの大きな特徴とする。ＤＮＡ増幅反応としてはＰＣＲ法（特公平４−６７９５７号公報、特公平４−６７９６０号公報）が好適である。
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、種々の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス・サーモフィラス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）、サーマス・アクアティカス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用でき、これらの酵素は単独で又は混合して使用してもよい。これらの酵素はその本来の起源より精製して取得された蛋白質、あるいは遺伝子工学的に生産された組換え蛋白質のいずれであってもよい。
また、逆転写酵素として、前記した逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＰＣＲ反応においても再度同じＤＮＡポリメラーゼを使用することができるため、逆転写反応及びＰＣＲ反応を１つの反応チューブを用いて行なうことができる。
前記ＤＮＡポリメラーゼの量は、通常ポリメラーゼ反応を行なう際に用いられる量であればよい。
本明細書に記載のヌクレオチドアナログとは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ以外の物質であって、ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成反応、並びに該ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅反応において新規に合成されるｃＤＮＡ中に取込まれ、かつ該反応を停止させないものである。特に、これらが取込まれることによってＤＮＡのＴｍ値を低下させる性質を有するものが本発明に使用される。本発明に使用されるヌクレオチドアナログとしては、特に限定するものではないが、７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、ｄＩＴＰ、ヒドロキシメチルｄＵＴＰ等が使用できる。
１種のヌクレオチドアナログを使用するｃＤＮＡ合成、並びにＤＮＡ増幅では標的となるＲＮＡのＧＣ含量によってヌクレオチドアナログの取込み頻度が左右される場合がある。例えば、ｄＩＴＰはｄＧＴＰに代ってＤＮＡ鎖に取込まれるが、同一反応条件下では標的ＲＮＡのＧＣ含量が高いほどその取込み頻度は高くなる場合がある。本発明では、適当な２種以上のヌクレオチドアナログを組合せて使用し、これらのヌクレオチドアナログを合わせた取込み頻度が標的ＲＮＡのＧＣ含量の影響を受けないようにすることにより、上記ＲＮＡに対応する産物の選択的増幅が起こる条件を容易に設定できるようになる。
このようなヌクレオチドアナログの組合せには特に限定はなく、均一な取込みが起こるような２種以上のヌクレオチドアナログを適宜組合せて使用することができる。例えばｄＡＴＰあるいはｄＴＴＰに代ってＤＮＡ鎖に取込まれるヌクレオチドアナログとｄＣＴＰあるいはｄＧＴＰに代ってＤＮＡ鎖に取込まれるヌクレオチドアナログとの組合せを本発明に使用することができ、特に好ましくは７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰと７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰとの組合せを使用することができる。
逆転写反応液中のヌクレオチドアナログの含有量は、Ｔｍ値を低下させる効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは５０μＭ以上であり、さらに好ましくは５５μＭ以上であり、反応効率の観点から、好ましくは１．５ｍＭ以下であり、さらに好ましくは２００μＭ以下である。このとき、ｄＮＴＰの含有量は、各２００μＭ以上、１ｍＭ以下であることが望ましい。
ＰＣＲ反応液中のヌクレオチドアナログの含有量は、Ｔｍ値を低下させる効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは１０μＭ以上であり、さらに好ましくは１１μＭ以上であり、反応効率の観点から、好ましくは１．５ｍＭ以下であり、さらに好ましくは２００μＭ以下である。このとき、ｄＮＴＰの含有量は各２００μＭ以上、１ｍＭ以下であることが望ましい。
本明細書において、「二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物」とは、ｃＤＮＡ合成、並びにＤＮＡ増幅反応時に基質として核酸中に取込まれる物質以外のものであって、その存在下において二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡから形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖核酸等が一本鎖に変性する解離温度（Ｔｍ値）を低下させる作用を有するものを意味する。このような化合物としては、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶剤、トリメチルグリシンに代表される両電解物質（ベタイン類）を使用することができる。特にホルムアミドはＤＮＡポリメラーゼの伸長活性に悪影響を与えないと言われており、本発明に好適である。また、これらの２種以上を混合して使用してもよく、例えばホルムアミドとジメチルスルホキシドとを組合せて使用することにより、良好な結果を得ることができる。
また、該ヌクレオチドアナログが１種であっても鋳型として用いるＲＮＡの種類によっては、ＧＣ含量の影響を受けない場合もある。かかる場合においては、さらに二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を使用することにより、より良好な結果を得ることができ、このような態様も本発明の範囲内である。
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の逆転写反応液中の含有量は、反応阻害の観点から、好ましくは２０重量％以下であり、さらに好ましくは１０重量％以下である。また、ＰＣＲ反応時においては、前記化合物のＰＣＲ反応液中の含有量は、Ｔｍ値低下の観点から、好ましくは０．５重量％以上であり、さらに好ましくは１重量％以上であり、反応阻害の観点から、好ましくは、２０重量％以下であり、さらに好ましくは１５重量％以下である。
具体的には、ホルムアミドを使用する場合には、逆転写反応液中の含有量は、反応阻害の観点から、好ましくは２０重量％以下であり、さらに好ましくは１０重量％以下である。また、ホルムアミドのＰＣＲ反応液中の含有量は、Ｔｍ値低下の観点から、好ましくは１重量％以上であり、さらに好ましくは１．５重量％以上であり、反応阻害の観点から、好ましくは２０重量％以下であり、さらに好ましくは１５重量％以下である。
ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写は、標的ＲＮＡを含む試料、該標的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート、逆転写活性を有する酵素及び少なくとも１種のヌクレオチドアナログを含む反応液中で行われる。この反応により、ヌクレオチドアナログを含有し、前記標的ＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することができる。また、得られたｃＤＮＡと標的ＲＮＡから形成される鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸は、ヌクレオチドアナログを含有しない二本鎖核酸に比べてＴｍ値が低下しており、例えばヌクレオチドアナログを含有しない通常の二本鎖ＤＮＡに比べて低い温度で一本鎖に解離するという優れた性質を発現する。
次に、上記のｃＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ増幅反応、例えばＰＣＲを実施し、該ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅することができる。この際、上記の鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸は変性し、かつ反応液中に混在するヌクレオチドアナログを含まない二本鎖ＤＮＡは変性しないような条件、例えばＰＣＲにおいては変性工程の温度を設定し、上記のヌクレオチドアナログの存在下にＤＮＡ増幅反応を行うことにより、ｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片、すなわち標的ＲＮＡに対応するＤＮＡ断片を選択的に増幅させることが可能である。ただし、塩基配列や鎖長の異なる種々のＲＮＡを標的とする場合には、逆転写反応時のヌクレオチドアナログ取込み頻度が標的ＲＮＡごとに変動するため、普遍性のある条件設定は難しい場合がある。このような場合には、ＤＮＡ増幅反応液に上記のような二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物、例えばホルムアミドをさらに添加することにより、上記の選択的な増幅が起こる条件を容易に設定することが可能となる。例えば、終濃度１重量％〜２０重量％のホルムアミドを添加してＰＣＲを行う際には、変性温度を８０℃〜８５℃に設定することによりＲＮＡに対応する増幅産物のみを得ることができる。すなわち本発明のＤＮＡ増幅方法の態様として、ＤＮＡ増幅反応液に２種以上のヌクレオチドアナログを存在させて、あるいは二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を存在させて行なうが、特に好ましくはヌクレオチドアナログとＴｍ値を低下させる化合物とを共に存在させる態様である。この場合存在させるヌクレオチドアナログは１種でも２種以上でもよい。ヌクレオチドアナログはＰＣＲ反応液を調製する際に上記濃度となるように添加する。逆転写反応後に得られた溶液の一部をとってＰＣＲ反応液を調製する場合、必要量のヌクレオチドアナログが逆転写反応液中に含まれていれば、それ以外の成分のみを添加してＰＣＲ反応液としてもよい。
本発明の方法においては、上記のＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡの合成反応、並びに該ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅反応とを連続して、同一の反応液を用いて実施することもできる。この場合には逆転写活性を有する酵素とＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼが共に含まれている反応液を使用する。このような反応液は公知方法によって作製し、使用することができる［バイオ  テクニクス（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１８巻、第６７８〜６８７頁（１９９５）］。更に、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、ｃＤＮＡ合成反応、ＤＮＡ増幅反応を、逆転写反応に用いた酵素と同一の酵素で行うことも可能である。
本発明のキットは、上記の方法に用いられるキットであり、ＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡを選択的に増幅するキットである。このようなキットとしては、上記の１種又は２種以上のヌクレオチドアナログと二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物とを含有するもの、あるいは２種以上のヌクレオチドアナログ又は二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を含有するもの等が挙げられる。なかでも、２種以上のヌクレオチドアナログと二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を含有するキットは特に好適である。該キットは、逆転写酵素活性を有する酵素、該酵素の反応に使用する反応緩衝液、ＤＮＡ増幅反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼやその他の試薬を含有するものであってもよい。また、上記のヌクレオチドアナログや二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物は使用時に適当な濃度となるよう、反応用緩衝液等に添加された状態であってもよい。このようなキットを使用することにより、ＤＮＡの混在するＲＮＡ試料からＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡ断片のみを選択的に増幅することが容易に行えるようになる。
実施例
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１  ＲＮＡ、及びＤＮＡの調製
以下の実験に使用するＲＮＡ、並びにＤＮＡはヒト培養細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）、あるいはヒト培養細胞ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）からトライゾール試薬（ライフテック社製）を使用し、該試薬添付の説明書記載の操作により、それぞれ調製した。ヒト培養細胞ＨＬ−６０由来のＲＮＡの純度はＯＤ２６０／ＯＤ２８０が１．８以上、ＤＮＡの純度はＯＤ２６０／ＯＤ２８０が１．７以上であった。また、ヒト培養細胞ＨＴ−２９由来のＲＮＡの純度はＯＤ２６０／ＯＤ２８０が１．８以上、ＤＮＡの純度はＯＤ２６０／ＯＤ２８０が１．７以上であった。
実施例２  種々のＲＮＡを標的としたＲＴ−ＰＣＲ
鎖長やＧＣ含量の異なるｍＲＮＡを標的とした選択的な増幅を試みた。標的にはトランスフェリンレセプターｍＲＮＡ中の６２１ｂａｓｅの領域（ＧＣ含量３８％）、サイトケラチンｍＲＮＡ中の２５２ｂａｓｅの領域（ＧＣ含量４５％）、及びβ−アクチンｍＲＮＡ中の２７５ｂａｓｅの領域（ＧＣ含量５８％）を選んだ。トランスフェリンレセプターｍＲＮＡとβ−アクチンｍＲＮＡの増幅にはヒト培養細胞ＨＬ−６０由来のＲＮＡ、サイトケラチンｍＲＮＡの増幅にはヒト培養細胞ＨＴ−２９由来のＲＮＡをそれぞれ鋳型として使用した。
上記の標的を増幅するためのプライマーとして、トランスフェリンレセプターについてプライマーＰ５及びプライマーＰ６（配列表の配列番号：１及び２にそれぞれプライマーＰ５及びプライマーＰ６の塩基配列を示す）、サイトケラチンについてプライマーＰ１及びプライマーＰ２（配列表の配列番号：３及び４にそれぞれプライマーＰ１及びプライマーＰ２の塩基配列を示す）、β−アクチンについてプライマーＰ７及びプライマーＰ８（配列表の配列番号：５及び６にそれぞれプライマーＰ７及びプライマーＰ８の塩基配列を示す）をそれぞれ合成した。
ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を使用し、５０ｎｇのＲＮＡ、あるいは５０ｎｇのＤＮＡと、上記のキットに添付のオリゴｄＴアダプタープライマーを含む２０μｌの逆転写反応液を調製した。基質ヌクレオチドは、上記のキット説明書どおりのもの（反応液１）、ｄＧＴＰを表１の組成のｄＧＴＰとｄＩＴＰ（ベーリンガー・マンハイム社製）の混合物に置き換えたもの（反応液２〜６、下記表１）及び反応液１に６２．５μＭずつの７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰと７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（共にベーリンガー・マンハイム社製）を添加したもの（反応液７）の７通りの組成とした。これらの反応液をＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナル（宝酒造社製）にセットし、５０℃、２０分〜５℃、５分の逆転写反応を行なった。
0004104285.tif 000002
次に上記のキットを使用し、各標的ｍＲＮＡに対応するプライマー対を含むＰＣＲ反応液を調製した。更に、各ＰＣＲ反応液についてホルムアミドを添加したものも準備した（各ＰＣＲ反応液中のホルムアミドの濃度はトランスフェリンレセプターについては６．２５重量％、サイトケラチンについては７．５重量％、β−アクチンについては１３．７５重量％とじた）。これらの８０μｌを上記の逆転写反応後に得られた溶液に添加して総量１００μｌの反応液とし、これをＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットして８２℃、１分間〜４５℃、１分間〜７２℃、１分間を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを実施した。
こうして得られた反応液の８μｌをヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）３：１アガロース（ＦＭＣ社製）を使用した３％アガロースゲル電気泳動に供した。反応終了後の各反応液中の産物の量は、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射することにより発した蛍光の強度を比較することにより評価した。得られた結果のうち、逆転写反応液に鋳型としてＲＮＡを加えたものについての結果を表２に示す。
0004104285.tif 000003
ホルムアミドを添加しない反応系でＰＣＲを行なった場合には、ごく限られた反応液でのみ若干の増幅産物が得られたのに対し、ホルムアミドを添加した反応系では、逆転写反応に反応液４を用いることによりどの標的ＲＮＡについても増幅産物を得ることができた。更に、ホルムアミドを添加した反応系では、２種のヌクレオチドアナログを含む反応液７を用いることによりすべての標的ＲＮＡについて増幅産物を得ることができた。また、標的がサイトケラチンの場合、ヌクレオチドアナログを使用せずにＰＣＲ時にホルムアミドを添加したときには目的の増幅産物を得ることができなかった。なお、逆転写反応液に鋳型としてＤＮＡを加えたものでは、反応液の組成にかかわらず増幅産物は得られなかった。
これらのことから、ＰＣＲ時にホルムアミドを添加し、ヌクレオチドアナログとして、ある一定量のｄＩＴＰ又は７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰと７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰとの組合せを用いることにより、種々のＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を一定の温度条件でかつ効率よく増幅可能であることが示された。また、この条件ではＤＮＡを鋳型とした増幅は起こらないことから、ＲＮＡを鋳型とするＤＮＡ断片が選択的に増幅されることも明らかになった。
実施例３  ヌクレオチドアナログの組合せの比較
ヒトトランスフェリンレセプターｍＲＮＡ中の約２ｋｂの領域を標的として以下の実験を行なった。
ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を使用し、ヒトＨＬ−６０細胞由来の５０ｎｇのＲＮＡ、あるいは５０ｎｇのＤＮＡと上記のプライマーＰ４（配列表の配列番号：７にプライマーＰ４の塩基配列を示す）、及び下記に記載のヌクレオチドアナログをそれぞれ６２．５μＭの濃度で含む２０μｌの逆転写反応液を調製した。
反応液１：７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ
反応液２：７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ
反応液３：ｄＩＴＰ
反応液４：ｄＩＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ
反応液５：７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ
これらの反応液をＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットし、５０℃、２０分〜５℃、５分の逆転写反応を行なった。
次に上記のＲＮＡ  ＰＣＲキットを使用し、プライマーＰ４、プライマーＰ９（配列表の配列番号：８にプライマーＰ９の塩基配列を示す）を含むＰＣＲ反応液を調製した。これらの８０μｌを上記で得られた逆転写反応後の溶液に添加して総量１００μｌの反応液とし、これをＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットして、８４℃、１分間〜６０℃、３０秒間〜７２℃、２分間を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを実施した。
得られた反応液の８μｌをアガロース  Ｌ０３（宝酒造社製）を使用した１％アガロースゲル電気泳動に供し、実施例２と同様にして評価した。その結果、すべての反応条件においてＲＮＡを鋳型とする増幅断片のみが認められ、ヌクレオチドアナログを１種のみ添加した反応系の中では反応液２を使用した時に最も高い増幅効率が得られた。これにより、使用するヌクレオチドアナログの種類によって増幅効率の異なることが示された。また、２種のヌクレオチドアナログを使用した反応液４及び５は、共に１種のヌクレオチドアナログを添加したどの反応系よりも高い増幅効率を示した。また、鋳型としてＤＮＡが添加された反応液では、その組成にかかわらず増幅産物は見られなかった。
実施例４  種々の酵素を逆転写反応に使用したＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＡＭＶ−ＲＴａｓｅ）、ＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ〔バチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＢＥＳＴ）宝酒造社製〕、ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ（ライフテック社製）を用いて、各々の酵素の説明書に準じて、ヒトＨＬ−６０細胞より調製したＲＮＡ５００ｎｇ又はＤＮＡ２５０ｎｇとプライマーＰ４を含み、終濃度６２．５μＭの７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰを添加した２０μｌの逆転写反応液を調製した。これらの反応液をＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットし、下記のプログラムで逆転写反応を行なった。
0004104285.tif 000004
次に、得られた逆転写反応後の溶液を用い、ＰＣＲ反応液を調製した。ＢｃａＢＥＳＴを使用して逆転写反応を行なった場合はＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを、それ以外の逆転写酵素を使用した場合はＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を用い、各キットの説明書を参考に、プライマーＰ４とＰ３（配列表の配列番号：７及び９にそれぞれプライマーＰ４及びプライマーＰ３の塩基配列を示す）を含み、更にホルムアミドを添加したＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液中のホルムアミド濃度は、ＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットを使用した場合は２．５重量％、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を使用した場合は６．２５重量％とした。これらのＰＣＲ反応液８０μｌを上記の逆転写反応後の溶液に添加して総量１００μｌの反応液とし、これをＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットして８２℃、３０秒〜６０℃、３０秒〜７２℃、１分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを実施した。
反応終了後、反応液より８μｌをとってアガロースＬ０３（宝酒造社製）を用いた１％アガロースゲル電気泳動に供し、実施例２と同様にして評価した。その結果、使用した酵素にかかわらず、鋳型としてＤＮＡが添加された反応液では増幅断片は見られず、またＲＮＡが添加された反応液ではそのすべてで同じサイズ（９６４ｂｐ）の増幅断片が認められた。
実施例５  １反応液によるＲＴ−ＰＣＲへの応用
ヒトサイトケラチンｍＲＮＡ中の２５２ｂａｓｅの領域を標的とし、逆転写反応とＰＣＲとを１反応液中で行うＲＴ−ＰＣＲを行なった。
ジーンアンプＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を使用し、（１）該キット説明書記載の組成、（２）終濃度３００μＭのｄＩＴＰ添加、（３）終濃度各１５０μＭの７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ及び７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、終濃度２重量％ホルムアミドを添加、の３通りの反応液を調製した。各反応液には上記のプライマーＰ１とプライマーＰ２、ヒトＨＴ−２９細胞由来のＲＮＡ１μｇ、及び該細胞由来のＤＮＡ０、５０、１００、２００ｎｇを添加した。これらの反応液のそれぞれについて、ＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルを用いて以下の２通りの条件でＲＴ−ＰＣＲを実施した。
0004104285.tif 000005
こうして得られたＰＣＲ反応液の８μｌをヌシーブ３：１アガロースを使用した３％アガロースゲル電気泳動に供し、生成した増幅産物を分析した。その結果、条件１では反応液の組成にかかわらず、ＲＮＡ由来の増幅産物（２５１ｂｐ）と共にＤＮＡ由来の増幅産物（６０４ｂｐ）が出現し、その増幅量は添加されたＤＮＡの濃度に依存していた。条件２では（１）の反応液ではいずれの増幅産物も得られなかったが、（２）及び（３）の反応液ではＲＮＡを鋳型とする増幅産物のみが得られた。この場合、（２）の反応液に比べて（３）の反応液の方が高い増幅効率を示した。
実施例６  ホルムアミドとジメチルスルホキシドとを併用したＲＴ−ＰＣＲ
反応液にホルムアミドのみを加えた場合とホルムアミドとジメチルスルホキシドとを併用した場合のＲＴ−ＰＣＲへの効果を比較した。
標的としたｍＲＮＡ、及びその増幅に使用したプライマーは以下のとおりである。β−アクチンｍＲＮＡ中の２７５ｂａｓｅの領域（ＧＣ含量５８％）：プライマーＰ７及びプライマーＰ８。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ｍＲＮＡ中の３２５ｂａｓｅの領域（ＧＣ含量６１％）：プライマーＰ１０及びプライマーＰ１１（配列表の配列番号：１０及び１１にそれぞれプライマーＰ１０及びプライマーＰ１１の塩基配列を示す）。アポトーシス関連サイトカインであるＭｃ  １ｍＲＮＡ中の４４８ｂａｓｅの領域（ＧＣ含量５１％）：プライマーＰ１２及びプライマーＰ１３（配列表の配列番号：１２及び１３にそれぞれプライマーＰ１２及びプライマーＰ１３の塩基配列を示す）。
Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を使用し、該キットの説明書に従ってヒト培養細胞ＨＬ−６０由来のＲＮＡ１μｇと上記の各標的に対応するプライマーを含み、各１００μＭの７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ及び７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰが添加された反応液を作製した。更に、この反応液のほか、各反応液に、それぞれ終濃度２、４、６、８、１０重量％となるようにホルムアミドを添加したもの、並びにホルムアミドを終濃度２重量％及びジメチルスルホキシドを終濃度３重量％になるように添加したものの計７通りの反応液を各標的のそれぞれに対して準備した。これらの反応液をＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルにセットし、以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを実施した。
0004104285.tif 000006
こうして得られた反応液の８μｌをヌシーブ３：１アガロースを使用した３％アガロースゲル電気泳動に供し、実施例２と同様にして、生成した増幅産物を分析した。その結果を表３に示す。
0004104285.tif 000007
表３に示されるように、ホルムアミドのみを使用して良好な増幅効率を得るためにはその濃度を標的ＲＮＡごとに調節する必要があるのに対し、ホルムアミドとジメチルスルホキシドを併用した場合には１種類の反応液でどの標的も効率よく増幅されることが示された。
実施例７  キット
本発明のＤＮＡ増幅方法に使用されるキットとして、以下のような２０反応分のキットを作製した。
１０×逆転写反応バッファー                            ４０μｌ
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５００ｍＭ  ＫＣｌ
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＤＴＴ
５００μＭ  ７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ
５００μＭ  ７−ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ
１０ｍＭ    ｄＮＴＰ
ＡＭＶ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）                      ２０μｌ
２×ＰＣＲ反応バッファー                            ８００μｌ
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５重量％  ホルムアミド
５重量％  ジメチルスルホキシド
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）            ２０μｌ
産業上の利用可能性
本発明は、ＲＮＡ由来の塩基配列を有するＤＮＡの選択的な増幅を可能にするものである。本発明の方法を用いることにより、あらかじめ試料中ＲＮＡを精製することなく、ＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅することができ、実験操作の簡略化、並びに再現性の向上がもたらされる。
【配列表】
0004104285.tif 000008
0004104285.tif 000009
0004104285.tif 000010
0004104285.tif 000011
0004104285.tif 000012