(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性不死化遺伝子が導入されていないが、不死化しており、半永久的に継代培養可能なヒト水晶体上皮細胞株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８１１）。
【請求項２】
請求項１記載のヒト水晶体上皮細胞株を用いた医薬品のスクリーニング方法。
【請求項３】
スクリーニング対象医薬品が、水晶体上皮細胞疾患治療薬である請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
水晶体上皮細胞疾患治療薬が、白内障治療薬および後発白内障治療薬の少なくとも一方である請求項３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自然発生的に樹立された半永久的に継代培養可能なヒト水晶体上皮細胞およびそれを用いた医薬品のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白内障等の水晶体疾患のメカニズム解析や治療薬の開発には、水晶体上皮細胞が必要である。しかし、ヒト水晶体上皮細胞（ＨＥＬＣ）の初代培養細胞は不安定であるから、ヒト水晶体上皮細胞の継代培養は困難である。他方、水晶体上皮細胞の生理学的研究および水晶体疾患の治療薬の開発のために、ニワトリ、ラット、ウサギおよびブタの細胞が使用されている。しかし、実験動物は、ヒトと代謝機構が異なるから、これら実験動物の細胞を用いた実験のみでは、確実な情報を得ることができない。このため、最近では、半永久的に培養可能なヒト水晶体上皮細胞株の樹立が試みられている。
【０００３】
Andley等は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の不死遺伝子を持つアデノウイルス１２をヒト水晶体上皮細胞に感染させることにより、半永久的に培養可能なセルラインを樹立した（Andley, UP, Rhim, JS, Chylack, LT, Fleming, TP: Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994 Jun; 35(7): 3094-102）。茨木等は、アデノウイルスのヒトへの感染を回避するために、ＳＶ４０の大型Ｔ抗原をコードするプラスミドベクターを用いることにより、半永久的に培養可能なヒト水晶体上皮細胞のセルラインを樹立し、いくつかのクローンのセルラインを得ている（特開平１０−５２２７２号公報等）。アデノウイルスやプラスミドにより不死化されたこれらの細胞は、クリスタリン、染色体数、アイソザイム表現型等のヒト水晶体上皮細胞本来の特徴を保存している。しかし、これらの遺伝子組換えで得られたセルラインは、水晶体疾患の治療薬の開発やその生理学的研究において、計り知れない価値を有しているものの、ウイルス遺伝子が入り込んでいるため、自然な状態のヒト水晶体細胞とは言えない。したがって、これらの遺伝子組換えセルラインを用いた実験結果も、有用な情報であるが、自然な状態のヒト水晶体上皮細胞と異なる恐れもある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、自然発生的に樹立された半永久的に継代培養可能なヒト水晶体上皮細胞およびそれを用いた医薬品のスクリーニング方法の提供を、その目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明者等は、白内障患者から外科的手術により得られたヒト水晶体上皮細胞を培養したところ、このなかから自然発生的に、不死化した細胞株を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明のヒト水晶体上皮細胞は、外因性不死化遺伝子が導入されていないが、不死化しており、半永久的に継代培養可能なヒト水晶体上皮細胞株である。この細胞株は、ウイルス由来の不死化遺伝子や、ベクター（アデノウイルス、プラスミド等）由来の外来遺伝子を導入していないため、従来の細胞株より、自然に近いヒト水晶体上皮細胞株である。本発明の細胞株は、医薬品のスクリーニングに使用でき、上述のように、自然発生的に得られたもので外来遺伝子を導入しておらず、白内障関連のタンパク質の発現が抑制されているが、ＴＧＦ等の刺激で前記タンパク質の発現が促進されるから、水晶体上皮細胞疾患治療薬、特に白内障治療薬や後発白内障治療薬のスクリーニングに最適である。この他に、本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、ヒト水晶体上皮細胞の代謝や生理学的機構の解明に有用である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞株は、例えば、染色体数が４５であり、性染色体の一つが欠落しており、残存している性染色体はＸである。この細胞株は、ヒト水晶体上皮細胞と同様の特性を持ち、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の双方若しくはいずれかの刺激により、クリスタリン、α平滑筋アクチン、コラーゲン等のタンパク質の産生量が増加する。また、この細胞株では、ketotifen fumarateおよびdiclofenacの少なくとも一方の後発白内障治療薬候補物質により、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のいずれか一方の刺激により増加したαＳＭＡが減少する。本発明の細胞株は、そのミオグロビン遺伝子の配列が、ヒトのミオグロビン遺伝子の配列と同一である。本発明の細胞株としては、ＨＬＥＣ−１株があり、これは特許生物寄託センターに、平成１４年４月９日付けで寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８１１）。
【０００７】
本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、例えば、空気に５％のＣＯ2を加えた雰囲気で３７℃で培養できる。培地は、後述のEagleのＭＥＭ培地に、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％含有させたものを使用でき、培地のｐＨはｐＨ７．１である。培養には、例えば、小型フラスコを使用することができる。なお、本発明のヒト水晶体上皮細胞は、この他の条件で培養してもよい。
【０００８】
本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、−８０℃付近で凍結保存可能である。凍結する場合は、例えば、上記ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地：血清（ＦＢＳ）：ジメチルサルフォキシド（ＤＭＳＯ）＝７：２：１の重量割合で混合したものに、細胞を入れる。また、解凍する場合は、例えば、凍結したチューブを３７℃の水浴で溶かし、上記培地を６ｍｌ加えてから遠心分離し（１０００回転、５分）、上清を捨てて、１０％血清（ＦＢＳ）入りの上記培地５ｍｌにまき、小型フラスコで培養する。解凍直後は、１週間程静置することが好ましい。
【０００９】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００１０】
（ヒト水晶体上皮細胞株の調製）
ヒト水晶体上皮細胞は、複数の白内障患者（匿名）から外科的手術により得られたものを準備した。一方、下記の組成のＥａｇｌｅのＭＥＭ培地粉末を蒸留水１Ｌに溶解し、オートクレーブで高圧蒸気滅菌（圧力０．１８ＭＰａ、温度１２１℃）した。これに、Ｌ−グルタミン０．２９２ｇおよび７％メイロン１２ｍｌ入れて、培地（ｐＨ７．１）を調製し，これに１０％の割合で血清（ＦＢＳ）を入れた。この培地を用い、切除後２時間以内に、前記ヒト水晶体上皮細胞の培養を開始した。最初の培養は、前記培地（１０％ＦＢＳ含有）０．５ｍｌが入った４８ウエルのプラスチックプレート（マルチウエル組織培養プレート、平坦底面、ｆａｌｃｏｎ社製）に、前記細胞を直接入れて、温度３７℃で５％ＣＯ2含有空気雰囲気下で行った。一週間の培養後、２５ｃｍ2のプラスチックフラスコに移し変え、上記と同様の条件で、培地の交換なしで１ヶ月間培養した。顕微鏡観察で増殖を確認した後、二次培養を行った。その結果、樹立されたヒト水晶体上皮細胞株をＨＬＥＣ−１と名づけた。細胞増殖の分析は、水溶性ホルマザンアッセイの変法である市販のＷＳＴ−８キット（同仁化学社製）を用いて行った。このＨＬＥＣ−１株は、２００２年４月の時点で、２年間以上も試験管内で増殖を続けている。
【００１１】
（培地組成：１Ｌ中）
塩化ナトリウム  ６８００ｍｇ
塩化カリウム  ４００ｍｇ
リン酸無水素ナトリウム（無水）  １１５ｍｇ
硫酸マグネシウム（無水）  ９３．５ｍｇ
塩化カルシウム  ２００ｍｇ
ブドウ糖  １０００ｍｇ
Ｌ−アルギニン塩酸塩  １２６ｍｇ
Ｌ−システイン塩酸塩（一水塩）  ３１．４ｍｇ
Ｌ−チロシン  ３６ｍｇ
Ｌ−ヒスチジジン塩酸塩（一水塩）  ４２ｍｇ
Ｌ−イソロイシン  ５２ｍｇ
Ｌ−ロイシン  ５２ｍｇ
Ｌ−リジン塩酸塩  ７３ｍｇ
Ｌ−メチオニン  １５ｍｇ
Ｌ−フェニルアラニン  ３２ｍｇ
Ｌ−スレオニン  ４８ｍｇ
Ｌ−トリプトファン  １０ｍｇ
Ｌ−バリン  ４６ｍｇ
コハク酸  ７５ｍｇ
コハク酸ナトリウム（六水塩）  １００ｍｇ
重酒石酸コリン  １．８ｍｇ
葉酸  １ｍｇ
ｉ−イノシトール  ２ｍｇ
ニコチン酸アミド  １ｍｇ
パントテン酸カルシウム  １ｍｇ
塩酸ピリドキサール  １ｍｇ
リボフラビン  ０．１ｍｇ
塩酸チアミン  １ｍｇ
ビオチン  ０．０２ｍｇ
カナマイシン  ６０ｍｇ（力価）
フェノールレッド  ６ｍｇ
【００１２】
（倒立顕微鏡観察）
ＨＬＥＣ−１細胞株の形態を倒立顕微鏡（ＩＭＴ−２，オリンパス社製）で観察した。その結果を、図１に示す。ＨＬＥＣ−１の形状は、図１（ａ）の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示すように、コンフルーエントな状態では、紡錘状であり、また同図（ｂ）の顕微鏡写真（倍率２００倍）に示すように、対数増殖期では樹枝状である。
【００１３】
（透過型電子顕微鏡観察）
培養ＨＬＥＣ−１細胞株を２％グルタルアルデヒド含有の０．０５Ｍカコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．２）を用いて培養フラスコ中で５分間固定し、ゴムへらでかき集めた。これをコニカルチューブに入れ、遠心分離して細胞株のペレットを得た。このペレットを、前記のカコジル酸塩バッファーを用い、温度４℃、固定時間６０分間の条件で固定し、０．０５Ｍカコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．２）で５回洗浄した。このペレットを、１％四酸化オスミウム含有の０．０５Ｍカコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．２）を用い、温度４℃、固定時間６０分間の条件で再度固定し、０．０５Ｍカコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄し、エタノールを用いて脱水した後、エポキシ樹脂で包埋した。ついで、Porter-Blumウルトラミクロトームで極薄切片を調製し、これを、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二回染色し、透過型電子顕微鏡（商品番号：Ｈ−７１００，日立製作所社製）で観察した。このＨＬＥＣ−１の電子顕微鏡写真（倍率１１２００倍）を図２（ａ）に示す。図２（ｂ）は、比較のために上記と同様の手法で調製したヒト繊維芽細胞のセルライン（ＷＩ−３８）の電子顕微鏡写真である。図示のように、ＨＬＥＣ−１は、前記ヒト繊維芽細胞セルラインと比較して、ミトコンドリアリッチであり、粗面小胞体の数が少なく、核は内部に陥没した形状である。
【００１４】
（核型分析）
トリプシン−ギムザ法（Gilbert, F, Feder, M, Balaban, G, Brangman, D, Lurie, DK, Podolsky, R, Rinaldt, V, Vinikoor, N, Weisband, J: Human neuroblastomas and abnormalities of chromosomes 1 and 17. Cancer. Res. 1984 Nov; 44(11): 5444-9）により、ＨＬＥＣ−１から染色体標本を調製し、２０個の細胞について核型分析を行った。図３の顕微鏡写真に示すように、ＨＬＥＣ−１は、４５の染色体を有し、性染色体が一つ欠落しており、残存の性染色体はＸである。
【００１５】
（遺伝子分析）
ＨＬＥＣ−１がヒト由来の細胞であることを確かめるために、ミオグロビンの塩基配列を調べた。この分析は、ｍｉｏｇ．Ｅｘｏｎ３−Ｆおよびｍｉｏｇ．Ｅｘｏｎ３−Ｒの一対のプライマーを用いたＰＣＲにより、ミオグロビンの保存領域を増幅させ、ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で配列を読むことにより、行った。その結果、ＨＬＥＣ−１のミオグロビン遺伝子配列は、ヒトと完全に一致した。
【００１６】
（微生物の感染）
マイコプラズマ感染は、マイコプラズマ非感染のベロ細胞を、ＨＬＥＣ−１細胞株培養液の上清に入れて培養後、商品名Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ヘキスト社製）を用いて染色し、蛍光顕微鏡で核外蛍光を観察することにより判断した。その結果を、図４の蛍光顕微鏡写真に示す。図４ａは１次培養したベロ細胞であり、図４ｂは２次培養したベロ細胞であり、図４ｃは陰性コントロールであり、図４ｄは陽性コントロールである。これらの蛍光顕微鏡写真で示すように、核外蛍光は観察できず、ＨＬＥＣ−１細胞株は、マイコプラズマ非感染と言える。他方、チオグリコレート培地１およびグルコースペプトン培地を用いた実験では、ＨＬＥＣ−１細胞株から細菌および真菌は検出されなかった。
【００１７】
（細胞増殖速度）
マイクロプレートウエルに、５×１０3濃度のＨＰＬＣ−１細胞株液１００μｌを入れて、前述の培養条件で培養し、分光光度計で光学密度を測定することにより（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍ）、細胞増殖速度を評価した。その結果を、図５の増殖曲線のグラフに示す。図示のように、培養開始から３日目でコンフルーエントな状態にまで増殖した。
【００１８】
（マトリックスタンパク質の発現：免疫組織化学的評価）
ＨＬＥＣ−１細胞株を、８ウエルのスライドグラス中で、前述の培養培地で培養し、１％アセトンを用い、室温で３分間固定した。この固定細胞株を、免疫組織化学的手法で染色した。すなわち、抗クリスタリン（αＡ、αＢ）モノクローナル抗体、抗コラーゲン（１型および４型）モノクローナル抗体および抗α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）モノクローナル抗体を、前記固定細胞株に対し、３７℃で３０分間反応させ、ＰＢＳバッファーを用い、室温で３０分間穏やかな条件ですすいだ。ついで、この固体細胞株に対し、西洋わさびペルオキシダーゼでラベルした抗マウスＩｇＧヤギ抗体を、３７℃で３０分間反応させ、ＰＢＳバッファーを用い、室温で３０分間穏やかな条件で洗浄した。洗浄後、diamino benzidineを用いて発色させ、前記固定細胞株を顕微鏡で観察した。クリスタリン発現結果を図６に示す。なお、比較のために、初代培養のヒト水晶体上皮細胞（図６ａ，ｄ）とＨｅｌａセルラインとについて、前記と同様の手法で免疫組織化学的染色を行い、顕微鏡観察した。図６ａは、初代培養ヒト水晶体上皮細胞のαＡクリスタリンの発現を示し、図６ｂはＨＬＥＣ−１細胞株のαＡクリスタリンの発現を示し、図６ｃはＨｅｌａセルラインのαＡクリスタリンの発現を示し、図６ｄは初代培養ヒト水晶体上皮細胞のαＢクリスタリンの発現を示し、図６ｅはＨＬＥＣ−１細胞株のαＢクリスタリンの発現を示し、図６ｆはＨｅｌａセルラインのαＢクリスタリンの発現を示す。図６に示すように、初代培養ヒト水晶体上皮細胞では、細胞質と細胞外にクリスタリンが発現していたが、ＨＬＥＣ−１細胞株では、細胞質のみにクリスタリンが発現し、その量は前記初代培養ヒト水晶体上皮細胞より少なかった。
【００１９】
（マトリックスタンパク質の発現：ＴＧＦβの影響）
９６ウエルマイクロプレートに、細胞濃度５×１０3のＨＬＥＣ−１細胞株の上清を入れ、種々濃度のＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の存在下で７日間培養した。そして、αＢクリスタリン、コラーゲンおよびαＳＭＡの濃度を、小林等の方法（Kobayashi, M, Sano, K, Katsumura, K, Tanaka, K, Sugiyama, T, Doi, M, Abe, M, Ikeda, T: Determination of optimal conditions for the immobilization of cells in a cell capture enzyme immunoassay (CC-EIA) by a simple Geimsa assay. J. Immunoassay. 2000 Nov; 21(4): 297-314.）および田中等の方法（Tanaka, K, Sano, K, Tanaka, K, Kobayashi, M, Katsumura, K, Ikeda, T, Abe, M: Demonstration of downregulation of alpha-smooth muscle actin in interferon-gamma-treated myofibroblast by a novel cell-capture enzyme immunoassay. Int. Immunopharmacol. 2001 Apr; 1(4): 769-75）により、測定した。すなわち、培養細胞を、５％ホルマリンを用い、１５分間、室温で固定し、１０％ウシ血清アルブミン２００μｌ含有のＰＢＳバッファーで処理（６０分間）することにより、非特異的に結合した抗体をブロックした。そして、前記固定細胞を、抗αＢクリスタリンモノクローナル抗体、抗コラーゲン（１型および４型）モノクローナル抗体および抗αＳＭＡモノクローナル抗体と反応させ（３７℃、３０分間）、０．１５ＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）ですすいだ。さらに、この固定細胞を、アルカリホスホターゼ（ＡＬＰ）でラベルした抗マウスＩｇＧヤギ抗体と反応させ（３７℃、３０分間）、前記ＰＢＳバッファーで洗浄した。ついで、前記固定細胞を、パラニトロフォスフェートのキット（商品名：ＭｏｎｏｔｅｓｔＡＬＰｏｐｔ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で処理し（３７℃、３０分間、室温）、マイクロプレートリーダー（製品番号：ＮＪ−２００、Ｎｕｎｃ Ｊａｐａｎ社製）を用い、光学密度（ＯＤ）を測定した（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍ）。その結果を、図７のグラフ（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）に示す。
【００２０】
図７の全グラフにおいて、黒い丸印はＴＧＦβ１を示し、白抜きの丸印はＴＧＦβ２を示し、横軸はＴＧＦβの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は光学密度（ＯＤ）を示す。まず、通常の状態において、ＨＬＥＣ−１細胞株は、クリスタリンの発現量が少なかったが、図７ａに示すように、ＴＧＦβで刺激すると、その濃度に応じてαＢクリスタリンの産生量が増え、わずかではあるが、ＴＧＦβ２の方がβ１より効果があった。また、図７ｂにαＳＭＡの産生量を、図７ｃに１型コラーゲンの産生量を、図７ｄに４型コラーゲンの産生量を、それぞれ示すが、図示のように、ＴＧＦβの量の増加に応じ、前記各タンパク質の産生量も増加した。
【００２１】
（後発白内障治療薬候補物質の影響）
後発白内障治療薬候補物質であるketotifen fumarateおよびdiclofenacをマイクロプレートに入れ、前述と同様にして、ＨＬＥＣ−１細胞株を培養し、αＳＭＡの量を測定した。その結果を、図８グラフ（ａ，ｂ）に示す。図８全グラフにおいて、黒い丸印はＴＧＦβ１を示し、白抜きの丸印はＴＧＦβ２を示し、横軸はＴＧＦβの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は光学密度（ＯＤ）を示す。また、図８はketotifen fumarateを添加した場合を、図８はdiclofenacを添加した場合を示す。図示のように、前記両治療薬を添加すると、αＳＭＡの産生量が低下した。ただし、ＴＧＦβ１で刺激した場合の方が、ＴＧＦβ２で刺激した場合より、わずかに低下の程度が大きかった。
【００２２】
【発明の効果】
以上のように、本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、自然発生的に得られたものであり、外来遺伝子を導入されてなく、従来の細胞株より自然に近いものである。したがって、本発明の細胞株は、医薬品のスクリーニングに使用でき、水晶体上皮細胞疾患治療薬に有用であり、特に白内障治療薬や後発白内障治療薬のスクリーニングに最適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＨＬＥＣ−１細胞株の形態を表す顕微鏡写真であり、図１ａはコンフルーエントな状態であり、図１ｂは対数増殖期の状態である。
【図２】図２ａは、本発明のＨＬＥＣ−１細胞株の形態を表す電子顕微鏡写真であり、図２ｂは、ヒト繊維芽細胞株の電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明のＨＬＥＣ−１細胞株の核型を示す顕微鏡写真である。
【図４】図４は、本発明のＨＬＥＣ−１細胞株のマイコプラズマ感染検査結果を示す蛍光顕微鏡写真であり、図４ａおよび図４ｂは、ＨＬＥＣ−１細胞株培養液上清にマイコプラズマ非感染ベロ細胞を入れて培養した後のベロ細胞であり、図４ｃはマイコプラズマ非感染ベロ細胞であり、図４ｄはマイコプラズマ感染ベロ細胞である。
【図５】図５は、本発明のＨＬＥＣ−１の増殖速度を示すグラフである。
【図６】図６は、クリスタリンの発現を調べた顕微鏡写真であり、図６ａは、初代培養ヒト水晶体上皮細胞のαＡクリスタリンの発現を示し、図６ｂはＨＬＥＣ−１細胞株のαＡクリスタリンの発現を示し、図６ｃはＨｅｌａセルラインのαＡクリスタリンの発現を示し、図６ｄは初代培養ヒト水晶体上皮細胞のαＢクリスタリンの発現を示し、図６ｅはＨＬＥＣ−１細胞株のαＢクリスタリンの発現を示し、図６ｆはＨｅｌａセルラインのαＢクリスタリンの発現を示す。
【図７】図７は、ＴＧＦβ刺激によるＨＬＥＣ−１細胞株のタンパク質産生量を示すグラフであり、図７ａはαＢクリスタリンの産生量を示し、図８ｂはαＳＭＡの産生量を示し、図７ｃは１型コラーゲンの産生量を示し、図７ｄは４型コラーゲンの産生量を示す。
【図８】図８は、後発白内障治療薬候補物質によるαＳＭＡの産生量の低下を示すグラフであり、図８ａは、ketotifen fumarateの場合であり、図８ｂはdiclofenacの場合である。
【図１】
0004052379.tif 000002
【図２】
0004052379.tif 000003
【図３】
0004052379.tif 000004
【図４】
0004052379.tif 000005
【図５】
0004052379.tif 000006
【図６】
0004052379.tif 000007
【図７】
0004052379.tif 000008
【図８】
0004052379.tif 000009