(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的高分子物質のＮＭＲ測定法であって、一般式(Ｉ)：
Ｌ−Ｐ
[式中、Ｌは有機性官能基、アミノ酸、核酸塩基および糖のいずれか１つから選択されるかまたはそれらのうちのいずれか２つ以上を組合せて選択される連結鎖単位が３０以上６００以下連結した連結鎖であり、ＰはＮＭＲ測定の標的高分子物質であり、−は化学結合を示し、Ｌの左端において固相に固定化されており、前記標的高分子物質は４０以上１０００以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドである]
で表される構造体を用い、測定サンプルと同量のＤ２Ｏを含む純水もしくは測定サンプルと同組成の溶媒を用いて測定サンプルが受ける磁場が均一となるように調整する操作の後に、水溶液中でＮＭＲ測定を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
連結鎖（Ｌ）が、一般式(II)：
Ｌ１−Ｔ−Ｌ２
[式中、Ｌ１は第一連結鎖であり、Ｔはタグ複合体であり、Ｌ２は第二連結鎖であり、また−は化学結合を示す]
であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タグ複合体（Ｔ）が、(i)金属イオン、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸または糖および(ii)それらのいずれかと特異的に結合する物質からなることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一連結鎖（Ｌ１）が１０炭素原子を含む１２原子からなる連結鎖であり、タグ複合体（Ｔ）がグルタチオンとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの複合体であり、かつ第二連結鎖（Ｌ２）が１０以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
４０以上１０００以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドと相互作用する被検物質の同定方法であって、
（ｉ）請求項１〜４のいずれかの方法において用いられる固相化された構造体を用い、水溶液中で上記ポリペプチドのＮＭＲ測定を行い、
（ｉｉ）同溶液中で上記ポリペプチドに被検物質を接触させた後に上記ポリペプチドのＮＭＲ測定を行い、
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で得られたスペクトルを比較する
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、連結鎖を介して固相に固定化された標的高分子物質を水溶液中でＮＭＲ測定する方法および該方法に用いられる固相化された構造体、並びに標的高分子物質と相互作用する物質の同定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ポストゲノム解析として、タンパク質の構造・機能解析やタンパク質間ネットワークの解析を網羅的・体系的に行う、プロテオミクス研究が大きな課題となっている。
このようなプロテオミクス研究は、細胞内における生体物質の相互作用、ひいては生命現象の解明という点においてゲノム解析よりもさらに一歩踏み込んだものであり、また創薬等の一般社会への還元性という点においても同様である。
このような状況下において、プロテオミクス研究に必要とされる、▲１▼網羅的発現系の効率的な構築、▲２▼高効率または迅速な構造決定・相互作用解析および▲３▼解析によって得られたデータベースの構築といった技術の構築・改良が、ますます重要視されている。
タンパク質の構造決定・相互作用解析という分野において主に用いられている方法の１つに核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance：ＮＭＲ）技術（例えば、非特許文献１および２等参照のこと）がある。
このＮＭＲ技術によれば、タンパク質等の高分子物質を結晶化することなく溶液中での立体構造の決定を行うことができる。ところが、ＮＭＲ測定においては多量のサンプルを必要とすることから、サンプルの再利用およびサンプルが難溶性・会合性のタンパク質およびペプチド等の場合、これらを解消すること等を目的としてサンプルを固相化してＮＭＲ測定を行う方法が開発された。
一方、タンパク質等の生体内高分子物質のＮＭＲ測定を行う場合、溶媒として有機溶媒を用いると、該分子の立体構造が変化してしまうため、水溶液を溶媒として行うことが知られていた。
しかし、固相化された生体内高分子サンプルについてＮＭＲ測定する場合には有機溶媒を用いた場合にしかスペクトルが得られず、水溶液中で行う場合には、high-resolution magic angle spinning NMR(ＨＲＭＡＳ ＮＭＲ)という特殊な装置が用いられていた（非特許文献３参照のこと）。しかし、ＨＲＭＡＳ ＮＭＲは通常の溶液ＮＭＲに比べて感度が非常に低いこと、また該装置を用いて行える測定法には限りがあり汎用性に欠けること等から、通常の溶液ＮＭＲを用いて行う方法の開発が望まれていた。
【０００３】
【非特許文献１】
Jeremy N. S. Evans, Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press (1995)
【非特許文献２】
J. Cavanagh, et al., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, Academic Press，(1996)
【非特許文献３】
Furrer, J., et al., J. Am. Chem. Soc., 123, 4130-4138 (2001)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、従来のＮＭＲ技術では困難であった、高分子物質を水溶液中でＮＭＲ測定する方法の提供、および該方法を用いた高効率または迅速な標的高分子物質の相互作用解析手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、標的高分子物質のNMRを測定するにあたり、当該標的高分子物質を連結鎖を介して固相に連結させた状態で、水溶液中で測定を行うことにより、上記課題を解決したものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、標的高分子物質のＮＭＲ測定方法であって、一般式(Ｉ)：
Ｌ−Ｐ
[式中、Ｌは連結鎖であり、Ｐは標的高分子物質であり、Ｌの左端において固相に固定化されている。]
で表わされるように連結鎖を介して固相に連結した状態で水溶液中で測定を行なうことを特徴とする、測定方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、標的高分子物質のNMRを測定するにあたり、標的高分子物質を連結鎖を介して固相に連結させた状態で、水溶液中で測定を行うことを特徴とする測定方法であって、この場合、当該連結鎖がタグ複合体を含むものである、当該測定方法を提供する。
【０００８】
すなわち、本発明は、上記ＮＭＲ測定方法において、連結鎖Ｌが、一般式(II)：
Ｌ１−Ｔ−Ｌ２
[式中、Ｌ１は第一連結鎖であり、Ｔはタグ複合体であり、Ｌ２は第二連結鎖である。]
であることを特徴とする当該方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、上記２つのＮＭＲ測定法において用いられる固相化された構造体を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、標的高分子物質と相互作用する物質の同定方法であって、（ｉ）上記の態様により提供された構造体を用い、水溶液中で標的高分子化合物のＮＭＲ測定を行い、（ｉｉ）同溶液中で標的高分子物質に被検物質を接触させた後に標的高分子物質のＮＭＲ測定を行い、（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で得られたスペクトルを比較することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）標的高分子物質のＮＭＲ測定方法
本発明は、固相に固定化されたＮＭＲ測定の標的高分子物質の水溶液中でのＮＭＲ測定方法である。
【００１２】
本発明におけるＮＭＲ測定には、ＨＲＭＡＳを用いる方法を除く通常の溶液ＮＭＲに用いられ得る方法であれば如何なる方法も用いることができる。通常は、サンプルに対して回転させない状態で測定することが多い。具体的には、同種核多次元ＮＭＲ測定法または異種核多次元ＮＭＲ測定法のいずれでもよく、同種核多次元ＮＭＲ測定法としては、COSY、TOCSY、NOESY、ROESY[Cavanagh, W.J. et al., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, Academic Press (1996)]等が挙げられ、異種核多次元ＮＭＲ測定法としては、HSQC、HMQC、CH-COSY、CBCANH、CBCA(CO)NH、HNCO、HN(CA)CO、HNHA、H(CACO)NH、HCACO、15N-edited NOESY-HSQC、13C-edited NOESY-HSQC、13C/1５N-edited HMQC-NOESY-HMQC、13C /13C-edited HMQC-NOESY-HMQC、15N/15N-edited HSQC-NOESY-HSQC [Cavanagh, W.J., et al., Protein NMR Spectroscopy.  Principles and Practice, Academic Press(1996)]、HN(CO)CACB、HN(CA)CB、HN(COCA)CB [Yamazaki, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) 11655-11666]、H(CCO)NH、C(CO)NH [Grzesiek, S., et al., J. Magn. Reson., B 101 (1993) 114-119]、CRIPT、CRINEPT [Riek, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96 (1999) 4918-4923]、HMBC、HBHA(CBCACO)NH [Evans J. N. S., Biomolecular NMR Spectroscopy. Oxford University Press (1995) 71]、INEPT [Morris, G. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 101 (1979) 760-762]、HNCACB [Wittekind, M., et al., J. Magn. Reson. B 101 (1993) 201]、HN(CO)HB [Grzesiek, S., et al., J. Magn. Reson. 96 (1992) 215-222.]、HNHB [Archer, S. J., et al., J. Magn. Reson., 95 (1991) 636-641]、HBHA(CBCA)NH [Wang, A.C., et al., J. Magn. Reson., B 105 (1994) 196-198.]、HN(CA)HA [Kay, L.E., et al., J. Magn. Reson., 98 (1992) 443-450]、HCCH-TOCSY [Bax, A., et al., J. Magn. Reson., 88 (1990) 425-431]、TROSY [Pervushin, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94 (1997) 12366-12371]、13C /15N-edited HMQC-NOESY-HSQC [Jerala R, et al., J. Magn. Reson., 108 (1995) 294-298]、HN(CA)NH [Ikegami, T., et al., J. Magn. Reson., 124 (1997) 214217]、およびHN(COCA)NH [Grzesiek, S., et al., J. Biomol. NMR, 3 (1993) 627-638.]等の測定法が含まれるが、これらに限らない。
【００１３】
これらのうち後述する標的高分子物質がタンパク質等の場合には、ＨＳＱＣおよびＨＭＱＣ法が好ましくは用いられる。
【００１４】
標的高分子物質とは、本発明により開示するＮＭＲ測定に用いる構造体の一部を構成する部分であって、ＮＭＲ測定を行うため連結鎖を介して固相に固定化する任意のサンプル物質をいう。具体的には、ポリペプチド、核酸、糖、糖タンパク質、糖脂質、脂肪酸、これらの誘導体、共有結合体および複合体等が挙げられる。ポリペプチドは４０以上１０００以下のアミノ酸残基からなるものが好ましく用いられる。また、核酸、糖、糖タンパク質、糖脂質、脂肪酸としては分子量が１０００以上１０万以下のものが好ましい。具体的には、天然に存在するタンパク質、またはその一部、さらに人工的に産生されたポリペプチド、および天然に存在するタンパク質のＮ末端またはＣ末端に１以上のアミノ酸残基が付加されているタンパク質などが含まれるが、これらに限らず、この場合、これらのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
【００１５】
本発明の標的高分子物質は、連結鎖を介して固相に固定化されてＮＭＲ測定に供される。ここで連結鎖とは、本発明により開示するＮＭＲ測定に用いる構造体の一部を構成するものであって、当該構造体全体を固相に固定化する役割および標的高分子物質に非常に高い自由度を供する役割等を担うものをいう。すなわち、本発明のＮＭＲ測定に用いる構造体は、当該連結鎖を介して固相に固定化され、高い自由度を有する。ここで、当該連結鎖は連結鎖単位により構成され、そして当該連結鎖は、各連結鎖単位が互いに化学結合により直鎖状または分枝状に連結することにより構成される。かかる連結鎖単位は、メチレン基、カルボニル基、アミノ基、アミド基、ケト基、ヒドロキシルメチン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基などの有機性官能基、アミノ酸、核酸塩基および糖のいずれか1つから選択され得るか、またはそれらのうちのいずれか２つ以上を組合せて選択され得る。また、当該連結鎖単位が有機性官能基である場合、当該連結鎖単位は、カルボニル基、アミノ基、アミド基、ケト基、ヒドロキシルメチン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基のいずれか1つの基とメチレン基との組合せでもよく、また、それら基のうちのいずれか２つ以上の基とメチレン基との組合せでもよい。
【００１６】
連結鎖単位の数は、通常、３０個以上かつ６００個以下であり、好ましくは３０個以上かつ４５０個以下であり、より好ましくは３０個以上かつ３００個以下である。
【００１７】
本発明の連結鎖は、連結鎖単位からなるタグ複合体および当該タグ複合体をはさむ２つの連結鎖からなるものも含む。タグ複合体とは、タンパク質と該タンパク質と特異的に結合する物質からなり、具体的には、下述のもの等が挙げられる。下述の例示のうち製品名を挙げたものは、該タグ複合体のうちタンパク質または該タンパク質と特異的に結合する物質のいずれかが適当な固相に固定化されているものが含まれる。
【００１８】
金属イオンとポリヒスチジンとの複合体[Smith, M.C., et al., J. Biol. Chem. 263, (1998) 7211-7215; Chelating FF(Amersham社)等]、グルタチオンとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との複合体[Smith, D.B., et al., Gene, 67, (1988) 31-40; Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF(Amersham社); GST・bind resin(Novagen社)等]、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)とプロテインＧまたはプロテインＡとの複合体、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)とＦＬＡＧタグとの複合体、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)とヒスチジンとの複合体、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)とｃ−ｍｙｃタグとの複合体[Livingstone, D.M., Methords Enzymol. 34, (1974) 723-731; Protein G Plus/Protein A-Agarose(Novagen社); BPV-1(AU1)Affinity Matrix、HA.11 Affinity Matrix、FLAG Affinity Matrix、6-His Affinitu Matrix、c-myc Affinity Matrix、Polyoma Virus Medium T Antigen Affinity Matrix (COVANCE社); ANTI-FLAG M1 or M2 Affinity gel (Sigma-Aldrich社)等]、マルトースとマルトース結合タンパク（ＭＢＰ）との複合体[Moks, T., et al., Biochemistry 26, (1987) 5239-5244]、ストレプトアビジンとＳＴＲＥＰタグとの複合体、ストレプトアクチンとＳＴＲＥＰタグとの複合体[Schmidt, T.G.M. et al., Prot. Engineering 6, (1993) 109-122; StrepTactin Sepharose、StrepTactin POROS(Sigma-Genosys社)等]、ストレプトアビジンとビオチンとの複合体[Hsu, S.R., et al., J. Histochem. Cytochem. 29, (1981) 577; Streptavidin-CPG(CPG社); Streptavidin Sepharose High Performance(Amersham社); SoftLink resin、TetraLink resin(Promega社)等]、カルモジュリンとカルモジュリン結合タンパク（ＣＢＰ）との複合体[Stofko-Hahn, R.E. et al., FEBS Lett. 302, (1992) 274-278; Calmodulin-affinity resin(Stratagene社)等]、キチンとキチン結合タンパクとの複合体[Watanabe, T. et al., J. Bacteriol. 176, (1994) 4465-4472; Chitin resin(New England Biolabs社)等] 、レクチンと糖との複合体[Hayman, M.J. et al., FEBS Lett. 29, (1973) 185; Lentil Lectin Sepharose 4B(Amersham社)等]、コンカナバリンＡと糖との複合体[Kennedy, J.F. et al., J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 19, (1973) 2041; ConA Sepharose 4B (Amersham社)等]、Ｓ-タンパクとＳ-タグとの複合体[Ho, I.C., et al., Cell, 85,  (1996) 973-983; S-protein agarose(Novagen社)等]、および核酸中のアデニンとチミンとの複合体、アデニンとウラシルとの複合体、シトシンとグアニンとの複合体[Saenger, W., Principles of Nucleic Acid Structure, Springer  Verlag (1984); Poly(A) Sepharose 4B、Poly(U) Sepharose 4B、Poly(C) Type6 (Amersham社)等]、ホルモンレセプターとホルモンの複合体等があるが、これらに限らない。
【００１９】
これらの複合体を固相に固定化する第一連結鎖（一般式(II)のＬ１）は、構造体全体を固相に固定化する役割および標的高分子物質に非常に高い自由度を供する役割等を担うものをいい、固相に固定化し得るものであれば如何なるものであってもよい。すなわち、本発明のＮＭＲ測定に用いる構造体は、当該第一連結鎖を介して固相に固定化され、高い自由度を有する。ここで、当該第一連結鎖は第一連結鎖単位により構成され、そして当該第一連結鎖は、各第一連結鎖単位が互いに化学結合により直鎖状または分枝状に連結することにより構成される。かかる第一連結鎖単位は、メチレン基、カルボニル基、アミノ基、アミド基、ケト基、ヒドロキシルメチン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基などの有機性官能基、アミノ酸、核酸塩基および糖のいずれか1つから選択され得るか、またはそれらのうちのいずれか２つ以上を組合せて選択され得る。また、当該第一連結鎖単位が有機性官能基である場合、当該第一連結鎖単位は、カルボニル基、アミノ基、アミド基、ケト基、ヒドロキシルメチン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基のいずれか1つの基とメチレン基との組合せでもよく、また、それら基のうちのいずれか２つ以上の基とメチレン基との組合せでもよい。
【００２０】
また、第一連結鎖は上記タグ複合体のうちタンパク質または該タンパク質と特異的に結合する物質のどちらと結合していてもよいが、１つの構造体中の第一連結鎖と結合している物質と後述の第二連結鎖と結合している物質がタグ複合体を形成する。
【００２１】
第一連結鎖とともにタグ複合体に結合している第二連結鎖（一般式(II)のＬ２）は、上記のタグ複合体と標的高分子物質とを連結する役割および当該標的高分子物質に非常に高い自由度を供する役割等を担うものをいう。ここで、当該第二連結鎖は第二連結鎖単位により構成され、そして当該第二連結鎖は、各第二連結鎖単位が互いに化学結合により直鎖状または分枝状に連結することにより構成される。かかる第二連結鎖単位は、メチレン基、カルボニル基、アミノ基、アミド基、ケト基、ヒドロキシルメチン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基などの有機性官能基、アミノ酸、核酸塩基および糖のいずれか1つから選択され得るか、またはそれらのうちのいずれか２つ以上を組合せて選択され得る。また、当該第二連結鎖単位が有機性官能基である場合、当該第二連結鎖単位は、カルボニル基、アミノ基、アミド基、ケト基、ヒドロキシルメチン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基のいずれか１つの基とメチレン基との組合せでもよく、また、それら基のうちのいずれか２つ以上の基とメチレン基との組合せでもよい。
【００２２】
また、第二連結鎖は、上記タグ複合体のうちタンパク質または該タンパク質と特異的に結合する物質のどちらと結合していてもよいが、１つの構造体中の第一連結鎖と結合している物質と第二連結鎖と結合している物質がタグ複合体を形成する。さらに第二連結鎖は必要に応じて適宜結合すればよい。
【００２３】
本明細書において、標的高分子物質の自由度が非常に高いとは、該構造体が固定されている固相上の点から最も離れた当該構造体表面上の点を半径として形成される半球内の範囲において、標的高分子物質が自由に動くことが可能であることをいう。また、固相表面が、平面以外の表面、例えば球面であれば、標的高分子物質は、該半球内の範囲を超えて動くことも可能である。
【００２４】
本発明の連結鎖として、特に好ましくは、第一連結鎖が１０炭素原子を含む１２原子からなる連結鎖で、タグ複合体がグルタチオンと、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼであり、第二連結鎖が１０以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドであるものが挙げられる。
【００２５】
本発明の構造体は、上記連結鎖または第一連結鎖により固相に固定化された状態でＮＭＲ測定に供されるものである。すなわち、一般式(Ｉ)の場合には、標的高分子物質に連結する連結鎖の一端以外の他の一端により固相に固定化されている。また、連結鎖(Ｌ)が一般式(II)である場合には、タグ複合体(Ｔ)に連結する第一連結鎖の一端以外の他の一端により固相に固定化されている。このような固相としては、溶液ＮＭＲ測定に用いられ得るものであれば、特に制限はないが、例えば、樹脂、ならびにガラス、セラミックス、ラテックスおよび金属などの無機化合物(ただし非磁性化合物に限る)等が挙げられる。
【００２６】
また、固相の形状はこれを溶液ＮＭＲに用いることができれば如何なるものでもよいが、ビーズ等の粒子状のものや、あるいはＮＭＲ装置の分析用チューブの内壁等であってもよい。樹脂の具体例を以下に示すが、これらの中には樹脂にすでにタグ複合体の一部が結合しているものも含まれる。樹脂としては、例えば、コンビナトリアルケミストリーに利用される樹脂[TentaGel，Polystyrene Resin，ArgoGel，2-Chlorotrityl Resin，Kaiser Oxime Resin，Phosphine Resin，Rink-amide Resin，Thiomethyl Resin，Merrifield Resin，Wang Resin等(SIGMA、Aldrich社等)]、亜鉛イオンキレート樹脂[Chelating FF(Amersham社)等]、Glutathione固定化樹脂[Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF(Amersham社)、GST・bind resin(Novagen社)等]、ＩｇＧ抗体固定化セファロース樹脂[Protein G Plus/Protein A-Agarose(Novagen社)、BPV-1(AU1)Affinity Matrix, HA.11 Affinity Matrix, FLAG Affinity Matrix, 6-His Affinity Matrix, c-myc Affinity Matrix, Polyoma Virus Medium T Antigen Affinity Matrix (COVANCE社), ANTI-FLAG M1 or M2 Affinity gel (Sigma-Aldrich社)、アミロース樹脂[Amylose resin(Novagen社)等]、ストレプトアクチン結合樹脂[StrepTactin Sepharose、StrepTactin POROS(Sigma-Genosys社)等]、ストレプトアビジン結合樹脂[Streptavidin-CPG(CPG社)、Streptavidin Sepharose High Performance(Amersham社)、SoftLink resin、TetraLink resin(Promega社)等]、カルモジュリン固定化樹脂[Calmodulin-affinity resin(Stratagene社)等]、キチン樹脂[Chitin resin(New England Biolabs社)等]、レクチン結合樹脂[Lentil Lectin Sepharose 4B(Amersham社)等]、コンカナバリンＡ結合樹脂[ConA Sepharose 4B (Amersham社)等]、Ｓ-タンパク固定化樹脂[S-protein agarose(Novagen社)等]、核酸固定化樹脂[Poly(A) Sepharose 4B, Poly(U) Sepharose 4B, Poly(C) Type6 (Amersham社)等]が挙げられるが、これらに限らない。
【００２７】
本発明の固相に固定化された構造体として特に好ましくはセファロース（固相）に１０炭素原子を含む１２原子からなる連結鎖（第一連結鎖）を介してグルタチオン（タグ複合体の一部）が結合したグルタチオンセファロース（Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF(Amersham社））と、グルタチオンと特異的に結合するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（タグ複合体の一部）と１０〜５０のアミノ酸残基からなるポリペプチド（第二連結鎖）、および適当なポリペプチド（標的高分子物質）との融合タンパク質がグルタチオンとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼにより結合しているもの等が挙げられる。
【００２８】
上記構造体は、これを構成する固相、連結鎖(または第一連結鎖)およびタグ複合体の一部を任意の順序で結合させて作製することができる。固相と連結鎖(または第一連結鎖)との間の結合および連結鎖(または第一連結鎖)とタグ複合体の一部との間の結合は、それぞれ既知の通常用いられる方法により行うことができる。かかる方法により、NMR測定用試薬を調製することができる。例えば、連結鎖が１０炭素原子を含む１２原子からなり、タグ複合体の部分がグルタチオンである当該NMR測定用試薬を調製することができる。ここで、固相に結合されるタグ複合体の一部が、タンパク質（ポリペプチド）である場合には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基または水酸基等を利用する方法を用いることができる。また、既にこれらが結合した市販品を用いることもできる。市販品の具体例としては、Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF(Amersham社)、GST bind resin(Novagen社)、Chelating FF(Amersham社)、Protein G Plus、Protein A-Agarose(Novagen社)、BPV-1(AU1)Affinity Matrix、HA.11 Affinity Matrix、FLAG Affinity Matrix、6-His Affinity Matrix、c-myc Affinity Matrix、Polyoma Virus Medium T Antigen Affinity Matrix (COVANCE社)、ANTI-FLAG M1 or M2 Affinity gel (Sigma-Aldrich社)、アミロース樹脂[Amylose resin(Novagen社)等]、ストレプトアクチン結合樹脂[StrepTactin Sepharose、StrepTactin POROS(Sigma-Genosys社)等]、ストレプトアビジン結合樹脂[Streptavidin-CPG(CPG社)、Streptavidin Sepharose High Performance(Amersham社)、SoftLink resin、TetraLink resin(Promega社)等]、カルモジュリン固定化樹脂[Calmodulin-affinity resin(Stratagene社)等]、キチン樹脂[Chitin resin(New England Biolabs社)等]、レクチン結合樹脂[Lentil Lectin Sepharose 4B(Amersham社)等]、コンカナバリンＡ結合樹脂[ConA Sepharose 4B (Amersham社)等]、Ｓ-タンパク固定化樹脂[S-protein agarose(Novagen社)等]、核酸固定化樹脂[Poly(A) Sepharose 4B、Poly(U) Sepharose 4B、Poly(C) Type6 (Amersham社)等]が挙げられるが、これらに限らない。
【００２９】
標的高分子物質と第二連結鎖、およびタグ複合体の一部との結合は、それ自体既知の通常用いられる方法により行うことができる。標的高分子およびタグ複合体の一部がともにポリペプチドである場合には、第二連結鎖もポリペプチドとしてすべてを融合タンパク質として合成することにより結合させることもできる。
【００３０】
具体的には、タグ複合体の一部としてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いる場合、市販のＧＳＴ融合タンパク質用発現ベクター（pGEX VectorおよびGSTrap FF（Amersham Pharmacia社））に、標的高分子物質であるポリペプチドをコードするＤＮＡをＧＳＴ等とフレームが合うように挿入し、これを適当な方法により転写・翻訳することにより作製することができる。ここで、上記市販ベクターを用いることによりＧＳＴと標的高分子物質であるポリペプチドとの間に数個のアミノ酸残基が挿入されるので、これらが第二連結鎖となる。
【００３１】
かくして作製された固相に連結鎖を介して固定化された構造体は、水溶液中で上述の方法によりＮＭＲ測定を行う。水溶液とは、溶液ＮＭＲに用いられ、かつ標的高分子物質がタンパク質の場合、その立体構造を保持するものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、純水、古典的緩衝液（グリシン、酢酸、リン酸、カコジル酸、イミダゾール等）、Ｇｏｏｄ緩衝液（Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｍｅｓ、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ等）、およびプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ロイペプチン、ＥＤＴＡ、ペプスタチンＡ等）、多水酸基性化合物（ショ糖、グリセロール、ポリエチレングリコール等）、ＳＨ基保護剤、酸化防止剤（2-mercaptoethanol、dithiothreitol等）、界面活性剤（オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド、ＣＨＡＰＳ、TritonX-100等）、脂質（ＤＰＣ、ＤＨＰＣ等）、有機溶媒（グリセロール、プロパノール、ＴＦＥ、ＤＭＳＯ等）等を含む上記水溶液、およびこれらを安定同位体標識したものも含む水溶液等が挙げられる。
【００３２】
ＮＭＲ測定法としては、標的高分子物質がタンパク質（ポリペプチド）である場合には、同種核多次元ＮＭＲ測定もしくは異種核多次元ＮＭＲ測定等が好ましく用いられる。例えば、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣと呼ばれるＮＭＲ測定法により行い得、かかる測定は当業者に既知の技術である[Cavanagh, W.J., et al., Protein NMR Spectroscopy.  Principles and Practice, Academic Press(1996)]。簡単にいうと、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣは、タンパク質中のペプチド結合における水素原子と窒素原子との相関スペクトル、すなわち１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトルであり、主鎖由来の１Ｈ−１５Ｎシグナルから個々の残基の情報を得ることができる。かかる新規なＮＭＲ測定方法により、タンパク質等の標的高分子物質の立体構造解析が可能となり、また後述するようにタンパク質の相互作用解析が可能となる。本発明におけるＮＭＲ測定とは、標的高分子物質がポリペプチドの場合には４０アミノ酸以上に対応する信号の同定が可能なスペクトルを取得することをいい、核酸、糖、糖タンパク質、糖脂質等の場合には、分子量として２０００以上に対応する信号の同定が可能なスペクトルを取得することをいう。
【００３３】
上記定義の構造体を用いてＨＳＱＣの測定を行う場合、均一な磁場を得るために事前にロック溶媒を含む測定サンプルと同量の水(Ｄ２Ｏ)もしくは測定サンプルと同組成の溶媒でシムを合わせる操作が必要となる。これは、上記定義の構造体を用いたサンプルのように、液体と固体という混合状態では均一な磁場を得るための操作を行う事ができず、ＮＭＲ測定が事実上不可能であるためである。
【００３４】
（２）標的高分子物質と相互作用する物質の同定方法
本発明の固相に固定化された標的高分子物質の水溶液中でのＮＭＲ測定方法によれば、標的高分子物質と相互作用する物質を同定することもできる。相互作用とは、通常は標的高分子物質と特定物質間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、如何なる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含む。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
【００３５】
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプターとリガンド間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質あるいは糖の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合および解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、あるいは糖とタンパク質間の結合および解離等が挙げられる。
【００３６】
標的高分子物質と相互作用する可能性のある物質（本明細書中では、これを「被検物質」と称することがある）としては、タンパク質、核酸、糖、脂質、および低分子化合物等が挙げられる。
【００３７】
相互作用する物質の同定は、（ｉ）上記（１）で作成した固相に固定化された標的高分子物質について、上記（１）に記載の方法により水溶液中でＮＭＲ測定を行い、（ｉｉ）同溶液中で標的高分子物質に上記被検物質を接触させた後に、同様にＮＭＲ測定を行い、（ｉｉｉ）被検物質を接触させる前と後のＮＭＲスペクトルを比較することにより行うことができる。被検物質を接触させた後のスペクトルが、接触させる前のスペクトルと異なる場合には、該被検物質が標的高分子物質と何らかの相互作用をすると判断し、標的高分子物質と相互作用する物質を同定することができる。ここで、上記２つのスペクトルのうち、変化したシグナルがどのアミノ酸残基であるかを特定することによれば、相互作用により被検物質が結合しているアミノ酸残基を特定することもできる。ＮＭＲスペクトルのシグナルの特定方法は、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられる。被検物質を標的高分子物質へ接触させる方法としては、固相に固定化された標的高分子物質についてＮＭＲ測定を行った溶液中に被検物質を投入する方法等が挙げられる。
【００３８】
また、接触させる被検物質の量を変化させてＮＭＲ測定を行うことによれば、相互作用の詳細な解析を行うこともできる。さらに、固相化された標的高分子物質がＮＭＲチューブ内に保持された条件下で上記の方法でＮＭＲ測定を行った後に、被検物質と標的高分子物質の結合のみが解離するような条件で、被検物質を標的高分子物質から解離させ、さらに別の被検物質を接触させ、ＮＭＲ測定を行うことによれば、標的高分子物質の再利用が可能である。
【００３９】
従って、一般式(Ｉ)および(II)により表される当該構造体を用いれば、固相に固定化された状態で水溶液中でサンプルである標的高分子物質のＮＭＲ測定が可能となる。また、当該標的高分子物質が固定されているため、必要とされるサンプルの消費量が低減され、結果としてハイスループットなタンパク質の相互作用解析、特に水溶液中での相互作用解析が可能となるという効果が得られる。さらにまた、難溶性・会合性のタンパク質やペプチドなどのＮＭＲ測定が可能となり、当該タンパク質などの立体構造解析が可能となるといった効果が得られる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４１】
以下の実施例において一般式(I)におけるＰ（標的高分子物質）としてヒト由来のユビキチンを、Ｌ（連結鎖単位）として３０残基のアミノ酸を、また構造体を固定する樹脂として１０炭素原子を含む１２原子を介してグルタチオンを結合した４％アガロース樹脂[Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF(Amersham社)]を用いた。
【００４２】
ユビキチンと、その特異的相互作用を有するイーストユビキチンヒドロラーゼとの相互作用解析はＮＭＲによる１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定によって行った。各ＮＭＲ測定には例えばＢｒｕｋｅｒ社製ＤＲＸ−８００スペクトロメーターを用い、測定試料には磁場の安定性を保つためのＮＭＲロック用に１０％のＤ２Ｏを添加した。溶媒には１０ｍＭリン酸カリウム(ｐＨ６.５)、５０ｍＭ塩化カリウムを用い、測定温度は４０℃とした。
【００４３】
実施例１  構造体の作成及び１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣの測定
構造体の作成例
全体を１５Ｎ標識したＧＳＴ−(ＧＧＧＧＳ)４−ユビキチン（Ｇはアミノ酸のグリシン、Ｓはアミノ酸のセリンを表す）0.7ｍＭをGlutathione Sepharose 4FF  0.5mlに混合し、３０分間、４℃の条件で固定化した。その後、未固定のＧＳＴ−(ＧＧＧＧＳ)４−ユビキチンを除くために１ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム(ｐＨ６.５)、５０ｍＭ塩化カリウム溶液で５回洗浄した。
【００４４】
樹脂を含む水溶液中でＮＭＲの測定を行うための工夫
ＮＭＲ測定において、シグナルの線幅の増大を抑えるためにサンプル中の分子が受ける磁場が均一となるよう分解能調整を行うことが必要である。しかし、今回用いる構造体を含む水溶液中では、測定環境が固体/溶液の混合状態であるために直接分解能の調整を行う事ができない。
【００４５】
今回その問題を解決するために、サンプルと同量の１０％Ｄ２Ｏを含む純水を充填したサンプルチューブを用意し、これを用いてサンプルが受ける磁場が均一になるように調整した。その後、上記の方法により作成した構造体を１０％のＤ２Ｏと共に充填したサンプルチューブに交換し、サンプルの位置を純水サンプルチューブと同一になるよう高さを調節した(図１)。
【００４６】
測定方法及び結果
上記の方法で分解能を調節した後、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの測定を行った。図２に樹脂に固定していない状態のスペクトルと、樹脂に固定した状態のスペクトルとの比較を示す。比較から、線幅の増大は認められるものの、樹脂に固定していない状態での全てのシグナルを、樹脂に固定した状態で認めることができる。
【００４７】
実施例２ 構造体による１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣを利用した相互作用解析
溶液状態、及び樹脂に固定した状態のＧＳＴ−(ＧＧＧＧＳ)４−ユビキチン分子に関して、その絶対数（29nmol）に対して1/10量(2.9nmol)のイーストユビキチンヒドロラーゼを加え、混合した後、ただちに１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定を行った。図３にイーストユビキチンヒドロラーゼの添加の有無について、溶液状態及び樹脂に固定化した状態での比較を示す。溶液状態でのシグナルの変化のパターンが樹脂への固定化状態でも再現されており、樹脂に固定化した状態での相互作用解析をＮＭＲで追跡できることが示された。
【発明の効果】
本発明によれば、連結鎖を介して固相に固定化された標的高分子物質を水溶液中でＮＭＲ測定する方法が提供される。該方法によれば、例えば、水溶液中で難溶性あるいは会合性を示すタンパク質（ポリペプチド）等をＮＭＲ測定する場合、固相に固定化されていることで会合が防がれスペクトルを取得することができる。また、該方法を用いて標的高分子物質と相互作用する物質を同定する場合には、固相に固定化することにより標的高分子物質を再利用することができるため、ハイスループットな相互作用解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  サンプルと同量の１０％Ｄ２Ｏを含む純水を充填したサンプルチューブによる分解能調節の方法を示したものである。
【図２】  溶液条件および樹脂に固定化した条件でのＧＳＴ−（ＧＧＧＧＳ）4−ユビキチンの１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを比較したものである。
(A)は溶液条件における１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
(B)は樹脂に固定化した条件における１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図３】  溶液条件および樹脂に固定化した条件で、イーストユビキチンヒドロラーゼの添加の有無を１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルによって比較したものである。
(A)と(B)は溶液条件でイーストユビキチンヒドロラーゼの添加の有無を比較したＧＳＴ−（ＧＧＧＧＳ）4−ユビキチンの１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
(C)と(D)は樹脂に固定化した条件でイーストユビキチンヒドロラーゼの添加の有無を比較したＧＳＴ−（ＧＧＧＧＳ）4−ユビキチンの１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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