【手続補正書】
【提出日】平成20年10月27日(2008.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
得られた高度不飽和脂肪酸組成物中のジホモ−γ−リノレン酸の比率が89％以上である、請求項17に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
EPAやDHAには、魚油という豊富な供給源が存在するが、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA）、アラキドン酸（ARA）及び5,8,11−エイコサペンタエン酸（20:3 ｎ-9）は、従来の油脂供給源から殆ど得ることができず、現在では微生物を発酵して得た高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂（トリグリセリド）が一般に使用されている。例えば、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂（トリグリセリド）を産生することのできる種々の微生物を培養して、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂（トリグリセリド）を得る方法が提案されている。この中でも、特にモルティエレラ属の微生物を用いることによって、アラキドン酸高含有油脂（トリグリセリド）が得られることが知られている（特開昭63-44891、特開昭63-12290）。さらに同じモルティエレラ属の微生物の変異株を用いてジホモ-γ-リノレン酸、5,8,11−エイコサペンタエン酸（20:3 ｎ-9）を生産する技術が開示されている（特開平5-91887、特開平5-91888）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
更に他の例では、前記特定の高度不飽和脂肪酸が、ミード酸であり、この場合、前記工程（１）で使用する特異的リパーゼは、ブルクホルデリア・セパシア（旧分類ではシュードモナス・スペーシス）由来のリパーゼである。得られた高度不飽和脂肪酸組成物中のミード酸の比率は50％以上であり、好ましくは80％以上であり、更に好ましくは90％以上である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
そして、炭素数が20以上で二重結合は２以上のｎ-6系、ｎ-9系またはｎ-3系の高度不飽和脂肪酸としては、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA；8,11,14-エイコサトリエン酸）、アラキドン酸（ARA；5,8,11,14-エイコサテトラエン酸）、7,10,13,16-ドコサテトラエン酸（22:4ｎ-6）、DPAω6（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）、8,11-エイコサジエン酸、ミード酸（MA；5,8,11-エイコサトリエン酸）、8,11,14,17-エイコサテトラエン酸（20:4 ｎ-3）、EPA（5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸）、DPAｎ-3（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）、及びDHA（4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸）を挙げることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
なお、不飽和脂肪酸の収率を増加せしめるために、不飽和脂肪酸の前駆体として、例えば、ヘキサデカン若しくはオクタデカンのごとき炭化水素；オレイン酸若しくはリノール酸のごとき脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸エステル、例えばエチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル；又はオリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油若しくはヤシ油のごとき油脂類を単独で、又は組み合わせて使用できる。基質の添加量は培地に対して0.001〜10%、好ましくは0.5〜10%である。またこれらの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
（１）アルカリゲネス・スペーシス（Alcaligenes sp.）由来のリパーゼ（QLM）（名糖産業社製）
（２）ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）〔旧名称：シュードモナス・スペーシス（Pseudomonas sp.）〕由来のリパーゼ（PS）（アマノエンザイム社製）
（３）シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginisa）由来リパーゼ（LPL）（TOYOBO社製）
（４）シュードモナス・スツチェリ（Pseudomonas stutzeri）由来のリパーゼ（TL）（名糖産業社製）
（５）バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）由来のリパーゼ（SL）（名糖産業社製）
（６）リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）由来のリパーゼ（タリパーゼ）（アマノエンザイム社製）
（７）カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）由来のリパーゼ（OF）（名糖産業社製）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
一方、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）〔旧名称：シュードモナス・スペーシス（Pseudomonas sp.）〕由来のリパーゼの反応性は、アラキドン酸とDGLA及びGLAとの間で大きく異なり、アラキドン酸に対する反応性はほぼ1/10である。この差を利用することで選択性が生まれ、高純度のアラキドン酸が得られることになる。従って、アラキドン酸の濃縮のためには、ブルクホルデリア（Burkholderia）属に由来し、アラキドン酸に対してよりもDGLA及びGLAに対して高い特異性を示すリパーゼが好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
エステル化された脂肪酸の除去
エステル化された脂肪酸は、当該エステル化された脂肪酸と目的とする特定の高度不飽和脂肪酸との理化学的性質の相違を利用して、エステルと遊離脂肪酸との間の分離に用いる常法を用いることができる。具体的には蒸留、溶剤抽出などを用いることができる。
例えば、蒸留によりエステル化された脂肪酸を蒸発除去することができる。また、ヘキサンなどの抽出溶剤を用いて、エステル化反応生成物から選択的にエステルを抽出除去すすることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
次に、例により、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、例に限定されない。
実施例１. アラキドン酸濃縮物の調製
（１）リパーゼによる分解
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）から得られたアラキドン酸含有油(SUNTGA40S, トリアシルグリセロール)100ｇに200 gの水を加え、反応系１ｇ当り1800Uのリパーゼ（QLM:名糖産業）で40℃、72時間加水分解した。加水分解後、ヘキサンで遊離の脂肪酸を抽出し、ヘキサンをエバポレーターで除去した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（２）尿素包括法による飽和脂肪酸の除去
前記（１）で調製した遊離脂肪酸組成物中に含まれる長鎖の飽和脂肪酸を尿素包括法により除去した。尿素包括に用いたアルコールを除去後、次のステップの選択的エステル化反応に供した。
（３）選択的エステル化（一回目）
選択的エステル化は同じリパーゼを用い、酵素力価を変えて２段階反応で行った。１回目の選択的酵素反応は、先の尿素包括で得た遊離脂肪酸に、その２倍量（モル比）のラウリルアルコールを加え、原料の油脂とアルコールの総和に対して20％になるように水を加えた後、反応系１ｇ当り20U の選択的リパーゼ（Lipase PS）を添加して、30℃、16時間反応を行い、不要な脂肪酸をエステル化した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
（５）選択的エステル化（２回目）
上記（４）で得た高純度のアラキドン酸を含む脂肪酸に１回目と同様の２倍量（モル比）のラウリルアルコールを加え、原料の油脂とアルコールの総和に対して20％になるように水を加えた後、今回は高力価１回目より高力価である反応系１ｇ当り60U の選択的リパーゼ（Lipase PS）を添加して、30℃にて、16時間反応した。先の反応と同様にエステル化された脂肪酸をヘキサン抽出で除去して、残った水層から酸性条件下のヘキサン抽出で精製アラキドン酸を得た。48.9％の回収率で、96.6％の高純度の遊離型アラキドン酸を得た。実施例１で精製したアラキドン酸含有油脂の脂肪酸組成は表２に示す。
【表２】
2007089522.tif 000001
実施例２. DGLA濃縮物の調製
（１）DGLA含有脂肪酸組成物原料の調製
モルティエレラ（Mortierella）の変異株から得られたDGLA含有油(SUNTGD, トリアシルグリセロール)100ｇを、40 gの水酸化ナトリウム、80 gの水、および800 mlのエタノール混液を60℃まで加温した後に加え、窒素気流下で、時々攪拌しながら60℃で20分間保温した。800 mlの水を添加した後、pHが２以下になるまで濃塩酸を加え、室温まで冷却した。ここに存在する遊離脂肪酸を3000 mlのヘキサンで抽出した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターで脱溶媒した結果、92.1 gの遊離脂肪酸が得られた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
実施例３. ミード酸（MA）濃縮物の調製
（１）MA含有脂肪酸組成物原料の調製
モルティエレラ（Mortierella）の変異株から得られたMA含有油(SUNTGM33, トリアシルグリセロール)100ｇを、40 gの水酸化ナトリウム、80 gの水、および800 mlのエタノール混液を60℃まで加温した後に添加し、窒素気流下で、時々攪拌しながら60℃で20分間保温した。800 mlの水を添加した後、pHが２以下になるまで濃塩酸を加え、室温まで冷却した。ここに存在する遊離脂肪酸を3000 mlのヘキサンで抽出した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターで脱溶媒した結果、93.0 gの遊離脂肪酸が得られた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
【表６】
2007089522.tif 000002
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
（３）リパーPSによる選択的エステル化（１回目）
0.71 gのFFA-MA41、0.89 gのLauOH(脂肪酸に対して２倍モル)、0.4 gの水、および400 Uのブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）由来リパーゼ(アマノエンザイム製、リパーゼPS)からなる混液を、30℃で攪拌しながら反応させた。同じ反応液を７本作った。0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8時間後、反応液の遠心分離により油層を回収した。この油層中の酸価の減少量からエステル化率を算出した。またヘキサン抽出により油層から未反応の遊離脂肪酸を回収し、その脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで分析した。結果を表７に記載する。