(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーティングがポリマーの二重結合を介してポリマー表面に共有結合で結合したコートポリマー物品であって、次式で表されるコートポリマー物品。
0004156675.tif 000028
式中、
ａ）Ｐは、ビニル基を含む芳香族化合物由来の基本ポリマー構造と、さらに次式の基とを含むものであり、
−Ｌ−ＣＨ（−Ｘ（Ｒ1）p）−ＣＨ2（−Ｙ（Ｒ2）p）
ｂ）Ｌはベンゼン環であり、
ｃ）ＸおよびＹは独立してハロゲン、Ｎ、ＳおよびＯから選択されるものであり、
ｄ）Ｒ1は水素、または直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキルまたはアシル基であるか、或いはＸがＮ、ＯまたはＳのときはＲ2であり、
ｅ）Ｒ2は水素、または直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル、−Ｒ3（−ＮＨ2）q、アルキルアリールもしくはアリールアルキルであってアルキル部分が１−１８個の炭素原子を含むもの、−Ｒ3（−ＮＨ−ＣＲ4＝Ｏ）q、−ＣＲ4＝Ｏ、または末端でアシル化もしくはアルキル化されていてもよいポリ低級アルキルオキシ基であり、
ｆ）ｐは０−３の整数であるが、但しＸがハロゲンのときはｐ＝０であり、ＸがＯのときはｐ＝１であり、ＸがＳのときはｐ＝１または２であり、Ｘ＝Ｎのときはｐ＝１、２または３であり、更にｐ＝２または３のとき、Ｒ2の二個または三個の基は同一または異なるものでよく、
ｇ）Ｒ3は、アルキル部分が１８個までの炭素原子を有する直鎖、環状または分枝鎖アルキル、−Ｏ−アルキル、ヒドロキシアルキル、フェニルアルキルであり、Ｒ4は直鎖、分枝鎖または環状アルキル基であり、
ｈ）ｑは＞０の整数であり、Ｒ3の１個またはそれ以上の水素が各々１級アミノ基（−ＮＨ2）または−ＮＨ−ＣＲ4＝Ｏ基で置換されていることを示す。
【請求項２】
前記基本ポリマー構造が架橋ポリスチレン−ジビニルベンゼンである、請求項１記載のコートポリマー物品。
【請求項３】
前記ハロゲンがＢｒである、請求項１または２に記載のコートポリマー物品。
【請求項４】
Ｒ1の直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキルまたはアシル基がＣ1−Ｃ10アルキルまたはＣ1−Ｃ18アシルであり、Ｒ2の直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル基がＣ1−Ｃ10アルキルである、請求項１〜３のいずれかに記載のコートポリマー物品。
【請求項５】
物品が直径３〜１００μｍの粒子の形であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のコートポリマー物品。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のコートポリマー物品の、クロマトグラフィー分離型媒体としての使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のコートポリマー物品であって１級または２級アミノを示すコートポリマー物品の、固相オリゴヌクレオチド合成の支持体としての使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のコートポリマー物品の、逆相クロマトグラフィー媒体としての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野および背景
本発明は、コートされたポリマー物品およびその製造法およびクロマトグラフィー媒体としてのその物品の使用法に関する。具体的に、本発明は、ポリマー表面のペンディング二重結合を介して共有結合的にポリマー表面に結合したコーティングを有するコートされた物品に関する。ペンディング基の例は、ジビニルベンゼンモノマーのようなビニルモノマーの重合化の後に残る残基ビニル基である。
本発明の内容において、“コート”／“コーティング”なる用語は、表面上のペンディングアルケン基が誘導体化され、物品の二つの具体的使用（クロマトグラフィー支持体ならびにオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成の支持体）に適合し得る新規官能性が挿入されたことを意味する。“コート”は、従って、層内へのおよび／または本来の表面への吸着層（コート）の架橋による物理的吸着および安定化という概念におけるコーティングと比べて幾分異なる意味を有する。
液体クロマトグラフィーの固定相（支持体、マトリックス）は、多孔性マトリックスから成り、最も一般的にはビーズ形である。無機および有機物質の両方の、広範囲の物質がクロマトグラフィーマトリックスに使用される。マトリックスへの要求は多い。化学的および物理的に安定でなければならず、極端なpH条件に耐えることができなければならない。マトリックスは小さい直径の粒子を充填したカラムの高流速を可能にするために硬くなければならない。広範囲の多孔性の粒子の製造も可能でなければならない。
マトリックスの表面特性は重要である。新しい化学構造をマトリックスの表面に挿入することにより、特性が多かれ少なかれ、特定の分子と相互作用する固定相を設計することが可能である。水性溶液中のタンパク質のクロマトグラフィー分離において、マトリックスは通常親水性である。ペプチドまたはタンパク質分離のための逆相クロマトグラフィー（RPC）において、シリカゲルがクロマトグラフィー媒体として使用されている。シリカゲルは高流速に耐えるのに十分硬く、異なる疎水性が可能である（Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８）。しかし、シリカゲルはpH８．０より上では安定ではなく、従って、アルカリを使用して無傷ではない。代わりに、有機ポリマー、例えば、ポリメタクリレートまたはポリスチレン／ポリスチレン−ジビニルベンゼンの硬いマトリックスの使用が一般的である。ポリスチレン−ジビニルベンゼン粒子は、水性溶液中で疎水性であり、大量の有機溶媒を吸着分子の溶出に使用しなければならない。選択性もまた限定される。これらの粒子は疎水性の変動幅が小さいという事実のため、それらの使用は限定されている。これに対して、シリカ粒子の疎水性／親水性の割合は化学反応により変えることができる。親水性シリカ表面の修飾に利用可能な化学には大きな多様性がある。ポリスチレン−ジビニルベンゼンおよび他の疎水性ポリマーの使用の可能性を増加させるために、粒子の表面を、それらをクロマトグラフィー分離媒体として使用する前により親水性にする修飾をしなければならないという認識がある。異なる方法が、疎水性ポリマーを基本にした粒子の表面の親水性化のために示唆されている：
WO91/11241は、疎水性および親水性ドメインを含む化合物が、表面に吸着される、疎水性表面上の親水性コーティングの製造法に関する。この方法の欠点はいくつかある。吸着すべきポリマーが高分子量であり、従ってポリマーがすべての孔に均質に広がらない。孔サイズ分布のコントロールがそのため失われ、ある孔は全くコートすらされない。ポリマーコーティングが吸着のみであるため、それは非極性溶媒との接触により表面から失われ得る。従って、コーティングは架橋していなければならない。
WO95/23022は、疎水性表面への親水性コーティングの共有結合的結合の方法を記載する。不飽和ポリマーコーティングが、表面の不飽和基を介して表面に継がれる。この方法はまたマトリックスの多孔性表面への均質に分散したコーティングを得ることに問題がある。
ビニルベンゼンポリマー上にのペンディングのビニル基の種々の使用が、Hubbard et al.（Reactive Functional Polymer 36（1998）1-16および17-30）により、優先権主張年中にレビューされている。マクロポーラスポリスチレン樹脂上の触媒を固定化するためのペンディングビニル基の使用がFaber et al（Reactive Polymers 11（1989）117-126）に記載されている。残基ビニル以外の経路によるクロマトグラフィービニルベンゼンベースの支持体の修飾が、Sun et al.（J, Chromatog, 522（1990）95-105）に記載されている。更に他の経路がMoberg et al（Reactive Polymers 15（1991）25-35）に記載されている。
本発明の目的
本発明の目的は、改善されたコートされたポリマー物品および既知の方法の欠点無く物品の表面特性を変えるためのポリマー物品のコーティング法を得ることである。
本発明の更なる目的は、クロマトグラフィー使用に適当な表面特性を有するポリマー粒子の製造である。
異なるタイプのクロマトグラフィーに使用するための広範囲の異なる官能基を製造するために誘導体化し得るコーティングの提供が本発明の更なる目的である。意図は、疎水性／親水性および選択性の両方の大きな変化の達成および溶出に使用する溶媒の量の減少を可能にすることである。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの合成に使用する支持体の疎水性と親水性のバランスに関する要求は、クロマトグラフィーマトリックスよりも小さいが、一定の多孔性支持体の高いキャパシティーを維持するためには維持された開放孔が重要であることは残っている。本発明のこの態様に関する主な目的は、疎水性ポリマーを基本にしたポリマー支持体への１級または２級アミノ基の形の形のハンドルの挿入の単純で十分定義された方法の提供である。
本発明
本発明の目的は、請求の範囲に定義のポリマー物品および方法により達成される。本発明に従い、コートされたポリマー物品が得られ、この物品はコーティングがポリマーの二重結合を介してポリマー表面に共有結合的に結合していることを特徴とする。物品は構造：
0004156675.tif 000002
〔式中、
Ｐはコーティング前の物品の基本ポリマー構造および更なる基
−Ｌ−ＣＨ（−Ｘ（Ｒ1）p）−ＣＨ2（−Ｙ（Ｒ2）p）
を含む；
Ｌは基本ポリマーから突出したペンディング基の一部であり、−Ｘ（Ｒ1）pおよび−Ｙ（Ｒ2）pの挿入に利用する二重結合を含む。基本ポリマーまたはベンゼン環への一つの共有結合でもあり得る。
ＸおよびＹは独立してハロゲン、特にＢｒおよびＮ、ＳおよびＯから選択される。Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ1−Ｃ18アシルのような直鎖、分枝鎖または環状アルキルまたはアシル基、またはＸがＮ、ＯまたはＳの時、Ｒ2であり、Ｘ＝Ｙ＝Ｏを強調する。
Ｒ2は水素、Ｃ1−Ｃ18アルキルのような直鎖、分枝鎖または環状アルキル、−Ｒ3（−ＮＨ2）q、アルキルアリールまたはアリールアルキル（アルキル部分は１−１８個の炭素原子を含み得る）、−Ｒ3（−ＮＨ−ＣＲ4＝Ｏ）q、−ＣＲ4＝Ｏ、または末端でアシル化またはアルキル化されていてもよいポリ低級アルキルオキシ基（例えば、−（（ＣＨ2）n−Ｏ）n’ＯＲ’（ここで、ｎは２、３または４の整数であり、ｎ’は２−１００の整数およびＣＨ2のＨはメチルで置き換え得、Ｒ’はＲ1基に関して記載の一つであり得る）。
Ｙ＝Ｂｒである時、ｐ＝０。Ｙ＝ＯまたはＳの時、ｐは１であり得る。Ｙ＝ＮまたはＳの時、ｐは２であり得る。Ｙ＝Ｎの時、ｐは３であり得る。一つ以上のＲ2がある場合、それらは同一または異なり得る。
Ｒ3は、アルキル部分に１８個までの炭素原子を有する直鎖、環状または分枝鎖アルキル、−Ｏ−アルキル、ヒドロキシアルキル、フェニルアルキル。
Ｒ4はＣ1−Ｃ18アルキルのような直鎖、分枝鎖または環状アルキル基。
ｑは基本アルキル基Ｒ3に１個またはそれ以上（１、２、３、４など、即ち１−ポリ）の水素が各々１級アミノ基（−ＮＨ2）または−ＮＨ−ＣＲ4＝Ｏ基で置換されていることを示す。〕
を有する。
上記のアルキルおよびアシル基において、１個またはそれ以上の水素が所望によりアミノまたはヒドロキシまたはアルコキシ基で置換されていてもよく、炭素鎖は所望により１個またはそれ以上の場所で、酸素またはアミノ窒素で中断されていてもよいが、但し、酸素および窒素から選択した最大１個の原子が、一つのそして同じｓｐ3−ハイブリダイズ炭素原子に結合している。特に興味深い中断された炭化水素基を有するアルキル基は、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−等の反復アルキレンオキサイド単位を含むものを特記し得る。
本発明の更なる態様に従って、物品の基本ポリマー構造（Ｐ）に、基Ｌを介して結合した二重結合を誘導体化することを特徴とする、コートされたポリマー物品の製造法が提供される。
本発明の更に別の態様に従って、本発明のコートされたポリマー物品をクロマトグラフィー媒体もしくはオリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドの固相合成の支持体として使用する。
本発明により、表面に二重結合を有するポリマー物品にコーティングをする、従って、予め決定した方法で表面を修飾することが可能になる。好ましくは、本方法はクロマトグラフィー媒体の製造に使用する。広範囲のクロマトグラフィー媒体が、多孔性ポリマー表面に異なる化学構造を挿入することにより合成できることが明らかとなった。所望の基および／または電荷の制御された量を表面に挿入できる。本発明に従って、所望の基および／または電荷を含むコーティングが、表面にわたり、また孔の中に均質に広がり、それにより孔サイズ分布はそのままである。その他に、孔サイズ分布は、表面に挿入する基の長さの変化により変えることができる。本方法は、シリカ媒体と同じ性能であるが、シリカの欠点がない逆相クロマトグラフィー（RPC）媒体の製造に適している。新規RPC媒体は、長アルキルまたはアミド基を含む極性基の表面近くへの挿入により製造する。アルキルおよびアミド鎖の長さを変えることにより、種々の疎水性および孔サイズ分布の異なるマトリックスが製造できる。またオリゴヌクレオチドの合成の支持体への使用に必須である１級および２級アミノ基も挿入できる。
本発明に従い、ペンディング基の二重結合を、ハロヒドリンまたはビシナルハライド、即ち、−ＣＨＸ1−ＣＨＹ1−（ここで、Ｘ1およびＹ1の少なくとも一つはハロゲン、特に臭素から選択される置換基であり、Ｘ1およびＹ1の残りの基はヒドロキシまたはアルキル）に、またはエポキシドにまたは対応する窒素または硫黄アナログに変換できる。
ハロゲンは、ポリマー表面に存在する二重結合へのあるハロゲン含有化合物（好ましくはハロゲンは臭素である）の添加により挿入し得る。臭素は適当な溶媒中でのＢｒ2、または適当な溶媒中のＮ−Ｂｒ−スクシンイミドとの反応のような既知の方法により挿入できる。合成は、臭素との反応の記載によりここでは説明する。これは、しばしば類似の反応に付される塩素またはヨウ素のような他のハロゲンの使用を除外するものではない。
好ましくは、方法の第１段階で、ポリマー化合物の、ポリマーの１個またはそれ以上の二重結合（Ｐ−Ｌ−ＣＨ＝ＣＨ2、ＰおよびＬは上記の意味を有する）をＲ1ＯＨまたはＨ2ＯとＨ2Ｏに可溶性の有機溶媒の混合物の溶液中でＢｒ2と反応させ、それにより構造
0004156675.tif 000003
または構造の混合物：（１）および
0004156675.tif 000004
を得、式中、
Ｒ1は、上記で定義のような水素または酸素原子を含む直鎖、分枝鎖または環状アルキル基である。特にＲ1は水素またはＣ1−Ｃ10アルキルであり得る。
上記のように、本発明の方法は、表面に遊離二重結合を有するポリマー表面に使用できる。ポリマーは、それ自体、ビニル基を含む芳香族化合物由来のポリマーと特記できる。芳香族化合物は、一官能性、二または多官能性であり得る。ポリマーは、架橋構造をもたらすために十分な量のジまたはポリビニル基を有さなければならない。適当な芳香族化合物は、例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、ビニルベンゼン、ビニルベンジルクロライド、エチルビニルベンゼン、アセトキシビニルベンゼンまたは他のビニルベンゼン誘導体を記載できる。好ましい態様において、基本ポリマー構造はスチレン、ジビニルベンゼンおよびエチルビニルベンゼンの架橋ポリマーまたはジビニルベンゼンおよびエチルビニルベンゼンのポリマーである。ペンディング基は、即ち、架橋していないビニル基のベンゼン基由来である。構造は下記であり得る：
0004156675.tif 000005
ポリマーの表面上のビニル基由来の遊離二重結合が臭素との反応に使用される。
本発明の好ましい態様において、コートされた物品は粒子である。好ましくは、コートされた粒子は、１−２００μm、好ましくは３−５０μmの直径の非コート粒子から製造する。非コート粒子の表面領域は、１−１０００ｍ2／ｇ、好ましくは１００−８００ｍ2／ｇの範囲内であり、適当な細孔容積は０．１−０．３ml／ｇである。ビーズ内の残基ビニル基の含量は、通常０．３−７．７mmol／ｇであり、好ましくは０．３−３mmole／ｇ、最も好ましくは１−２mmole／ｇである。
本発明の第１段階において、非コートポリマー物品を同じ溶媒に溶解した臭素と接触させる。しばしば、ポリマー物品は、コーティング目的で臭素と同じ溶媒に懸濁させた粒子の形態とする。臭素との反応において、選択した溶媒は反応の結果に関して重要である。臭素との反応は、上記のようにモノブロミドまたはジブロミドまたはそれらの混合物をもたらし得る。通常、モノおよびジブロミドの種々の含量で混合物が得られる。この含量はこの目的で使用する溶媒に依存する。テトラクロロメタンのような非極性溶媒中での臭素化はジブロミドの高い含量をもたらすことが知られている。低級アルコール、即ち、直鎖または分枝鎖Ｃ1−Ｃ10アルコールのような極性溶媒中では、モノブロミドの高い含量が得られる。しかし、水中では、臭素が水に部分溶解性であるため、ジブロミド達成の量が高い。水を、水に可溶性の有機溶媒と混ぜ、その中に臭素を溶解した場合、モノブロミドが高い程度で得られる。アルキル基が長いほど、アルコールがより非極性となり、ジブロミドの量が増加する。一般に、誘電率εで表される極性が溶媒または溶媒混合物に関して低い場合、高い割合のジブロミドが得られる。εが高い場合、モノブロミドの製造が有利である。本発明において、高い量のモノブロミドが好ましい。即ち、６から約７８までのεが好ましい。本発明に適当な溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ヘキサノールのようなＣ1−Ｃ10アルコールである。水と有機溶媒の混合物を使用する場合、テトラヒドロフラン、低級のような溶媒が示唆される。後者の場合、上記の式中のＲ1はＨである。ビニル基の臭素化に関する多くの報告がある。以下の参考文献を特記し得る；Yates, K, McDonald, R. S. and Shapiro., S. A.,（1973）: J. Org. Chem. 38, 2465; J. H. Rolston and K. Yates,（1969）: J. Am. Chem. Soc. 91 1469; R. C. Fahey,（1989）: Topics in stereochemistry, Wiley, New York, p280-286。
臭素との反応は、このましくは−２０−５０℃、好ましくは０−２０℃の温度で行う。使用する臭素の量は、適当には０．１−１０moles臭素／moleビニル、好ましくは０．５−２moles臭素／moleビニルである。得られるモノブロミドの量はまた臭素濃度に依存する。０．０５−０．５moles／ｌ溶媒、好ましくは０．１−０．２moles／ｌの濃度を使用できる。
本発明の次ぎの段階において、本発明の臭素化物品を化合物Ｙ（Ｒ2）pと反応させ、構造
0004156675.tif 000006
または構造混合物（３）と
0004156675.tif 000007
を有するコートされたポリマー物品が得られ、式中、
Ｙ＝Ｎ、Ｓ、ＯおよびＲ2およびＲ3およびｐは上記の意味である。
化合物Ｙ（Ｒ2）pは基：アンモニア、モノ−ジ−またはポリ−アルキルアミン、モノ−ジ−またはポリ−アルキルアルコール、モノ−ジ−またはポリ−アルキルチオールから選択できるが、アミン−、アルコール−またはチオール基は各々１級基である。アルキル基は直鎖または分枝鎖であり得、アルキル基の長さは好ましい溶媒への溶解性の要求を満たすために、好ましくはＣ18を超えない。アルキル基が長いほど、クロマトグラフィー媒体がより疎水性となる。長いアルキル基はまたポリマー物品の小さいサイズの孔（直径＜５０Å）への減少をもたらす。
第２段階において、臭素化物品の水性懸濁液を、例えば、アミンと混合する。水とメタノールまたはエタノールのような低級アルコールとの混合物も懸濁媒体として使用することが可能である。反応温度は適当には５０−１００℃であり、反応時間は約２４時間である。
臭素化物品をアンモニアまたは１級アミン（モノ、ジまたはポリ）と反応させる場合、構造
0004156675.tif 000008
または構造の混合物：（５）または構造の混合物：（５）または
0004156675.tif 000009
または構造：
0004156675.tif 000010
または構造の混合物：（１６）および
0004156675.tif 000011
を有するコートされたポリマー物品が得られ、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびｑは上記と同じ意味である。これらの化合物は、更に酸クロライド、酸無水物またはイソシアネート：
0004156675.tif 000012
と反応でき、または構造：
0004156675.tif 000013
または構造の混合物：（９）および
0004156675.tif 000014
または構造：
0004156675.tif 000015
または構造の混合物：（１１）および
0004156675.tif 000016
を有するコートされたポリマーまたは構造：
0004156675.tif 000017
構造の混合物：（１８）および
0004156675.tif 000018
または構造：
0004156675.tif 000019
または構造の混合物：（２０）および
0004156675.tif 000020
を有するコートされたポリマー物品が得られ、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4およびｑは上記と同じ意味を有し、Ｚは塩素のようなハロゲンである。
アミン置換基と酸クロライド、酸無水物またはイソシアネートの反応は、アセトン、または他の適当な産業的ケトンのような無水有機溶媒中で行う。溶媒は酸クロライド／無水物またはイソシアネートと反応できる基を含んではならない。
温度を１５℃以下に保つ場合、水を使用することが可能である。この反応中、酸クロライドを使用した場合、ＨＣｌが産生される。ＨＣｌはジ−イソプロピル−エチルアミンのような３級アミンで中和できる。反応は２０−５０℃の温度で、反応時間は適当には１−３時間で行う。
この最後の反応段階の別法として、そして置換基Ｒ1がＨである場合、式５、６、１６および１７の両方のアミン置換基およびヒドロキシル基が酸クロライド、無水物またはイソシアネートと反応し得、それにより構造
0004156675.tif 000021
または構造の混合物：（１４）および（１０）を有するまたは構造
0004156675.tif 000022
または構造の混合物：（１５）および（１２）を有するまたは構造：
0004156675.tif 000023
または構造の混合物：（２３）および（１９）を有するまたは構造：
0004156675.tif 000024
または構造の混合物：（２４）および（２１）を有するコートされたポリマー物品が得られる。
ペンディング基の二重結合はまたエポキシド基または対応する硫黄またはアミノアナログに当分野で既知の方法で変換し得る。ハロヒドリンまたはビシナルジハライドに関して、ｐＨの適当な調節がエポキシドをもたらし得、これを適当な硫黄またはアミノ化合物の存在下で行うことにより、各々硫黄または窒素アナログが形成される。これらの３員環は、次いで、ハロヒドリンおよびビシナルジハライドに関して概略のように、同じ化合物による求核攻撃を受けやすい傾向がある。得られる生産物を、次いで、また上記に概略のように誘導体化し得る。エポキシドを得る別法は、二重結合のペルオキシ化合物との反応である。
更に挿入された基（コート）を、例えば、−ＳＯ3-（スルホネート）、−ＰＯ32-（ホスホネート）、−Ｏ−ＰＯ32-（ホスフェート）、荷電アンモニウム基（１級、２級、３級および４級アンモニウム基）のような荷電基を挿入するために、更に誘導体化し得る（飽和または不飽和炭素に結合する遊離原子価）。
コートされたポリマー物品は、異なるタイプのクロマトグラフィー媒体として使用できる。ハロゲン化、例えば臭素化の程度、アミンのタイプおよび量および酸クロライドのような酸ハライドまたはイソシアネートののタイプおよび量を変えることにより、表面特性が大きな多様性を有する粒子を製造することが可能である。従って、本発明により、クロマトグラフィーで分離すべき異なる分子に関して表面特性を調整することが可能である。本発明の好ましい態様に従って、コートされた物品をRPC媒体として使用する。
１級または２級アミノ基の挿入は、本発明の粒子のオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドの固相合成への使用を可能にする。
本発明を、ここで以下の実施例により説明するが、これらは本発明を限定する意図はない。部およびパーセントは、特記しない限り重量部および重量パーセントを意味する。
反応において、ジビニルベンゼン粒子を使用する。粒子は下記の特性を有する：粒子サイズ：１５μm；表面領域：７１４ｍ2／ｇ；孔サイズ：２．２ml／ｇ；１．５mmolビニル基／ｇ。これらの粒子から出発して、PRCのための１１個の異なるコートされた粒子を、アルキルおよびアミド鎖の長さを変えることにより合成した。得られたコートされた粒子を、ペプチドの分離により試験し、非コート粒子および慣用のシリカ粒子であるKromasilTMC18（Eka Nobel ABから）と比較した。
実験部分
実施例１：エタノール中の１００ｇのジビニルベンゼン（乾燥物質の量１０．６％）をエタノールで洗浄し、反応器に入れ、１５℃に冷却した。２５．５０ｇの臭素（１．６０mmol／ｇ粒子）を４００ｇエタノールに溶解し、数回にわたり１５分にわたって添加した。粒子を２時間後エタノールで洗浄した。
実施例２：３１．１８ｇヘキシルアミンを、実施例１の臭素化粒子の１９９．９０ｇ水性懸濁液（乾燥含量：２０．０ｇ）に添加した。９０℃までの加熱を同時に開始した。２４時間後、３００mlエタノールｍ／１０％イソプロパノールを１０分にわたり添加した。懸濁液を２５分撹拌し、次いで濾過して０．８ｌ水、１．６ｌ ０．１Ｍ ＮａＯＨおよび２．０ｌ水で洗浄した。
実施例３：４３．５１ｇヘキサデシルアミンを、実施例１の臭素化粒子の１２０．０ｇ水性懸濁液（乾燥含量：１２．０ｇ）に添加した。９０℃までの加熱を同時に開始した。２４時間後、１８０mlエタノールｍ／１０％イソプロパノールを１０分にわたり添加した。懸濁液を２５分撹拌し、次いで濾過して０．４ｌエタノールｍ／１０％イソプロパノール、０．４８ｌ水、１．０ｌ ０．１Ｍ ＮａＯＨおよび１．２ｌ水で洗浄した。
実施例４：７．５mlラウロイルクロライドおよび０．９５mlジイソプロピルエチルアミンを、乾燥アセトン中の実施例２の粒子の９０．１３懸濁液（乾燥含量：９．０ｇ）に環境温度で添加した。２時間後、懸濁液を濾過し、３６０mlアセトンおよび３６０mlエタノールで洗浄した。
実施例５：４．３５mlカプリロイルクロライドおよび０．９５mlジイソプロピルエチルアミンを、乾燥アセトン中の実施例２の粒子の９０．０ｇ懸濁液（乾燥含量：９．０ｇ）に環境温度で添加した。２時間後、懸濁液を濾過し、３６０mlアセトンおよび３６０mlエタノールで洗浄した。
実施例６：４．２５mlラウロイルクロライドおよび０．５５mlジイソプロピルエチルアミンを、乾燥アセトン中の実施例３の粒子の５１．０ｇ懸濁液（乾燥含量：５．１０ｇ）に環境温度で添加した。２時間後、懸濁液を濾過し、２００mlアセトンおよび２００mlエタノールで洗浄した。
実施例７：２．４５mlカプリロイルクロライドおよび０．５５mlジイソプロピルエチルアミンを、乾燥アセトン中の実施例３の粒子の５０．９６ｇ懸濁液（乾燥含量：５．１０ｇ）に環境温度で添加した。２時間後、懸濁液を濾過し、２００mlアセトンおよび２００mlエタノールで洗浄した。
実施例８：１６．６５ｇの１，３−ジアミノプロパン（１５mmol／ｇ粒子）を、水中の実施例１の１５ｇの粒子（１４９．５ｇ懸濁液）に添加した。混合物を９０℃に２５時間４０分暖め、次いで水、ＮａＯＨ（０．５Ｍ）、水、２０％エタノールおよびアセトンで洗浄した。
実施例９：６．００ｇの実施例８のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。カプリロイルクロライド（９．１８ｇ、９．４mmol／ｇ粒子）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（１．１０ｇ、１．４mmol／ｇ粒子）を６０ｇのアセトン懸濁液に添加した。２時間、室温の後、粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
実施例１０：３３．３７ｇの２，２−エチレンジオキシジエチルアミン（１５mmol／ｇ粒子）を、水中の実施例１の粒子１５ｇ（１５０．２０懸濁液）に添加した。混合物を９０℃に加熱した。２４時間後、粒子を水、ＮａＯＨ（０．５Ｍ）、水およびアセトンで洗浄した。
実施例１１：２６．３８ｇのヘキサンジアミン（１５mmol／ｇ粒子）を、水中の実施例１の粒子１５ｇ（１４９．９７ｇ懸濁液）に添加した。混合物を９０℃に加熱した。２４時間後、粒子を水、ＮａＯＨ（０．５Ｍ）、水およびアセトンで洗浄した。
実施例１２：６．００ｇの実施例８のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。ラウロイルクロライド９．５５ｇ（７．３mmol／ｇ粒子）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン１．１１ｇ（１．４mmol／ｇ粒子）を６０ｇのアセトン懸濁液に添加した。２時間、室温の後、粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
実施例１３：６．００ｇの実施例１０のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。ラウロイルクロライド９．２１ｇ（７．０mmol／ｇ粒子）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン１．１１ｇ（１．４mmol／ｇ粒子）を６０ｇのアセトン懸濁液に添加した。２時間、室温の後、粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
実施例１４：６．００ｇの実施例１０のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。カプリロイルクロライド５．６８ｇ（５．８mmol／ｇ粒子）およびＮ−エチルイソプロピルアミン１．１０ｇ（１．４mmol／ｇ粒子）を６０ｇのアセトン懸濁液に添加した。２時間、室温の後、粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
実施例１５：６．００ｇの実施例１１のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。ラウロイルクロライド９．２０ｇ（７．０mmol／ｇ粒子）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン１．１０ｇ（１．４mmol／ｇ粒子）を６０ｇのアセトン懸濁液に添加した。２時間、室温の後、粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
実施例１６：６．００ｇの実施例１１のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。カプリロイルクロライド５．６５ｇ（５．８mmol／ｇ粒子）およびＮ−エチルイソプロピルアミン１．１０ｇ（１．４mmol／ｇ粒子）を６０ｇのアセトン懸濁液に添加した。２時間、室温の後、粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
実施例１７：１０ｇのメタノール中の多孔性粒子（乾燥含量１２．４％）を反応器に入れ、１５℃に冷却した。２．５３ｇの臭素（１．５８mmol／ｇ粒子）を１５分にわたって数回にわたりガラスシリンジで添加した。粒子をエタノールで洗浄した。
実施例１８：１５．９３ｇヘキシルアミン（１７mmol／ｇ粒子）を、水中の９．１４ｇの実施例１７の粒子（９１．０ｇ懸濁液）に添加した。混合物を９０℃で２４時間加熱し、次いで水、水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）、水、メタノールおよびアセトンで洗浄した。
実施例１９：７．００ｇの実施例１８のアミノ化粒子を乾燥アセトンで洗浄した。ドデシルイソシアネート５．１８ｇ（３．５mmol／ｇ粒子）を６２ｇのアセトン懸濁液に添加し、最初の１時間３５分は３５℃で、次いで５０℃で１時間加熱した。粒子をアセトンおよびエタノールで洗浄した。
得られた最終粒子を、以下に従ってペプチドの分離によるクロマトグラフィーの試験に使用した：
実施例２０：ペプチドの分離Ｉ
（Ile7）−アンギオテンシンIII、（Val4）−アンギオテンシンII、アンギオテンシンIIIおよびアンギオテンシンＩからなるペプチド混合物。
サンプル：０．１２５mg／ml（Ile7）−アンギオテンシンIII
０．１２５mg／ml（Val4）−アンギオテンシンII
０．１２５mg／mlアンギオテンシンIII
０．１２５mg／mlアンギオテンシンＩ
ペプチドは溶液Ａに溶解。
溶液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液。１ml TFAが１０００ml脱イオン水に溶解。
溶液Ｂ：６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）。６００mlアセトニトリルを４００ml脱イオン水および１ml TFAに溶解した。
勾配：    ０−２col．vol．１５％Ｂ
２−２２col．vol．１５−６５％Ｂ
２２−２５col．vol．６５％Ｂ
２５−２７％col．vol．１５％Ｂ
注入量：  ２５μL
直線速度：３００cm／ｈ
検出器：  UV ２１４nm、０．２AU
0004156675.tif 000025
ペプチド分離II
アンギオテンシンは全てこのｐＨで陽性に荷電しており、混合物として適用した。保持時間（ｔR）、キャパシティー係数（ｋ）および選択性（分離係数α）を測定した。
カラム：  ガラスカラムPharmacia HR 5/5（vol．：１ml）
移動相Ａ：０．１％TFA
移動相Ｂ：０．１％TFA／６０％アセトニトリル
勾配：    ２０分で９−３９％アセトニトリル
注入：    ０．５mg／mlアンギオテンシン混合物２５μｌ
流速：    ５cm／分（１ml／分）
検出器：  UV  ２１４nm、０．２AU
システム：FPLC▲Ｒ▼（Pharmacia Biotechのクロマトグラフィーシステム）
サンプルを適用する前に、勾配を全カラムで流し、カラムを１０カラム容量の１５％移動相Ｂ（９％アセトニトリル）で平衡化した。
ペプチドの分離III
アンギオテンシンを、アセトニトリルの上昇させた勾配での疎水性の差異により分離した。
結果を下記の表およびクロマトグラムに示す。
保持時間ｔRは溶出の開始と最大ピークの発現の間の時間である。保持時間を表１に示す。保持容量ＶRは溶出の開始とピークの発現の間の移動相の対応する容量である。
分離係数αは、二つのピークがどれだけ十分分離できたかの測定である。これは、二つのピークのキャパシティー係数の比（ｋ2／ｋ1）により示される。分離係数は表２に示す。
0004156675.tif 000026
0004156675.tif 000027
修飾媒体は、全て非修飾媒体よりも親水性であり、また比較に使用したシリカよりも親水性である。保持時間は合成媒体の多孔性に関連する。保持時間が短いほど、固定相中のサンプルの濃度が低く、表面がより極性である。ラウロイルクロライドを使用して合成した媒体は、カプリロイルクロライドを使用したものよりも高い保持時間を有した。最も極性の媒体は、実施例９および１４に従ってジアミンおよびカプリロイルクロライドで製造した媒体であった。これは、ｔR値が実施例９および１４で最低である表１から明らかである。これに従って、クロマトグラムでのピークは最初に実施例９および１４で出現する。クロマトグラムから見られるように、本発明の実施例由来の全てのピークは、非修飾媒体およびシリカ媒体のピークの前に出現し、本発明の粒子がより親水性であることを示す。従って、本発明の表面修飾は、溶出に使用するアセトニトリルの濃度に明白な硬化を有する。溶出に使用するアセトニトリルの容量の低減は、有機溶媒の費の非常な節約を導く。
選択係数の差は、ペプチド間の分離が、表面修飾により容易に変化でき、分離問題が製造法の小さい変化により最適化できることを示す。
モノ置換アミンから合成した媒体は、ジ置換アミンから合成したものより低い分離係数を有する。ジアミノ媒体は（Ile7）アンギオテンシンIIIおよび（Val4）アンギオテンシンIIIを、モノアミンをベースにした媒体よりも良好に分離し、分離で大きな変化を付与する。
実施例９および１４の媒体はまた（Ile7）アンギオテンシンIIIおよび（Val4）アンギオテンシンIIIに関して最大の分離係数を有し、これは表２およびクロマトグラムのピーク分離から明らかである。一般に、クロマトグラムから、本発明の媒体での分離が、非修飾媒体またはシリカ媒体でよりも良好であることを見ることができる。Kromasilは、ピークが分離しないため、ペプチドを全く分離しない。
優先権主張年の間、我々は、Ｒ1および／またはＲ2が各々−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、ＣＨ2ＣＨ2（ＣＨ3）−Ｏ−のような低級アルケニルオキシ基の反復単位であり、少なくとも５０００ダルトンまでの分子量を有するコーティングが、クロマトグラフィー適用で機能することを示した。
優先権主張年の間、我々はまた固相オリゴヌクレオチド合成に適したビーズの製造のためにアミノ基を挿入した。
臭素の添加：１０ｇの氷を３００ml  ０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５で洗浄した。酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中の６２ｇのポリ（ジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼン）粒子を１００ml反応器に移した。温度を１５℃に調整した。次いで、２．４０ｇ臭素（１：１Mmol臭素／mmolビニル）を６５ｇ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５に添加し、反応器に添加した。５分後、粒子を５００ml水で洗浄した。
アンモニアとの反応：１０ｇ粒子を、５４．４ｇ  ２５％アンモニア溶液を含む１００ml反応器に移した。温度を６０℃に上昇させ、懸濁液を機械的に３００rpmで撹拌した。１６時間後、混合物を７００mlの水および３００mlの２０％エタノールで洗浄した。
アミン：０．３０mmolアミン／ｇ粒子。
アミン含量は０．３０mmol／ｇ粒子であることが、アミン塩酸塩の硝酸銀による滴定で判明した。
このようにして得たアミン化粒子は、慣用による固相オリゴヌクレオチド合成に十分使用されている。