(57)【要約】  本出願は、そのチオール基を介したシステインアミノ酸の対C2架橋によって特徴づけられるペプチドおよびタンパク質の標的複合化のための新規の工程、さらには、このような工程により得ることができるペプチドおよびタンパク質の複合体、ならびに障害の診断および／または治療のためのこのような複合体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（II）
【化１】
2017520617.tif 000027
（式中、S1およびS2は、ジスルフィド架橋内で結合されたこのペプチドまたはタンパク質のシステインの硫黄原子を表す。）のペプチドまたはタンパク質が、還元条件下、式（III）
【化２】
2017520617.tif 000028
のペプチドまたはタンパク質に変換され、これが、次いで、フリーラジカル反応条件下、式（IV）
【化３】
2017520617.tif 000029
（式中、
R1およびR2は、互いに無関係に、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノまたはアルコキシカルボニルアミノを表し、
ここで、その部分のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Aは、結合、あるいは−O−、−S−、−S（＝O）−、−S（＝O）2−、−NH−、−N（CH3）−、−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−、−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−、−C（＝O）−O−、−SO2−NH−、−NH−SO2−、−NH−NH−、−SO2−NH−NH−、−NH−NH−SO2−、−C（＝O）−NH−NH−、−NH−NH−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−NH−、−NH−C（＝O）−O−、ならびにN、O、S、S（＝O）およびS（＝O）2からなる群からの最大4個のヘテロ原子を有する4員〜10員芳香族または非芳香族複素環からなる群から選択される同一または異なる基により1回または1回を超えて中断されてもよいアルキレン基、シクロアルキレン基および／またはアリーレン基からの1〜100個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表し、
または
R2およびAは互いに結合して、介在する炭素原子と共に、3員〜6員シクロアルキル環に縮合されてもよい8員炭素環を形成し、
ここで、前記8員炭素環、および任意選択で縮合シクロアルキル環は、フッ素、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアルコキシからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Lは、結合またはリンカーを表し、
Xは、n回存在してもよく、活性化合物分子、高分子、アルカロイド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ステロイド、テルペン、ポルフィリン、クロリン、コリン、エイコサノイド、フェロモン、ビタミン、ビオチン、色素分子またはクリプタンドを表し、あるいは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、
ここで、その部分のアルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
ここで、その部分のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
nは、1〜10の範囲の整数（1と10を含む。）を表し、
ここで、1つを超える基Xが存在する場合、それらの個々の意味は、同一でも異なっていてもよい。）のアルキン誘導体と反応して、
式（I）
【化４】
2017520617.tif 000030
（式中、R1、R2、A、L、Xおよびnは上述の意味を有する。）の複合体を与えることを特徴とする、システインアミノ酸を介して対C2架橋されたペプチドまたはタンパク質の複合体を調製するための工程。
【請求項２】
一般式（I）
【化５】
2017520617.tif 000031
（式中、
S1およびS2は、ペプチドまたはタンパク質のジスルフィド架橋内であらかじめ結合されたシステインの硫黄原子を表し、
R1およびR2は、互いに無関係に、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノまたはアルコキシカルボニルアミノを表し、
ここで、その部分のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Aは、結合、あるいは−O−、−S−、−S（＝O）−、−S（＝O）2−、−NH−、−N（CH3）−、−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−、−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−、−C（＝O）−O−、−SO2−NH−、−NH−SO2−、−NH−NH−、−SO2−NH−NH−、−NH−NH−SO2−、−C（＝O）−NH−NH−、−NH−NH−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−NH−、−NH−C（＝O）−O−、ならびにN、O、S、S（＝O）およびS（＝O）2からなる群からの最大4個のヘテロ原子を有する4員〜10員芳香族または非芳香族複素環からなる群から選択される同一または異なる基により1回または1回を超えて中断されてもよいアルキレン基、シクロアルキレン基および／またはアリーレン基からの1〜100個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表し、
または
R2およびAは互いに結合して、介在する炭素原子と共に、3員〜6員シクロアルキル環に縮合されてもよい8員炭素環を形成し、
ここで、8員炭素環、および任意選択で縮合シクロアルキル環は、フッ素、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアルコキシからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Lは、結合またはリンカーを表し、
Xは、n回存在してもよく、活性化合物分子、高分子、アルカロイド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ステロイド、テルペン、ポルフィリン、クロリン、コリン、エイコサノイド、フェロモン、ビタミン、ビオチン、色素分子またはクリプタンドを表し、あるいは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、
ここで、その部分のアルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
ここで、その部分のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
nは、1〜10の範囲の整数（1と10を含む。）を表し、
ここで、1つを超える基Xが存在する場合、それらの個々の意味は、同一でも異なっていてもよい。）のペプチドまたはタンパク質の複合体。
【請求項３】
障害の診断および／または治療のための請求項2に記載のペプチドまたはタンパク質の複合体。
【請求項４】
癌障害および腫瘍障害の診断および／または治療のための方法における使用のための請求項2に記載のペプチドまたはタンパク質の複合体。
【請求項５】
1つまたは複数の不活性で非毒性の薬剤的に適した助剤と組み合わせた請求項2に記載のペプチドまたはタンパク質の複合体を含む医薬組成物。
【請求項６】
癌障害および腫瘍障害の診断および／または治療のための請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項2に記載のペプチドまたはタンパク質の複合体あるいは請求項5に記載の医薬組成物を利用した癌障害および腫瘍障害の診断および／または治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、そのチオール基を介したシステインアミノ酸の対C2架橋によって特徴づけられるペプチドおよびタンパク質の標的複合化のための新規の工程、さらには、このような工程により得ることができるペプチドおよびタンパク質の複合体、ならびに障害の診断および／または治療のためのこのような複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ペプチドおよびタンパク質複合化は、治療上重要な活性化合物の提供、疾患過程の診断および生化学的機構の解明において大きな意義を持った［Flygareら、2013；Jonesら、2013］。
【０００３】
実質的に、複合化により、ペプチドおよびタンパク質の特性は変化または調節される。治療上関連のあるペプチドおよびタンパク質は、例えば、血漿循環における当該ペプチドまたはタンパク質の半減期、したがって、その作用期間を延ばしたり、または可能性のある免疫原性を抑えたりする生体適合性高分子と複合化することができる［Veronese and Maro，2008；Robertsら、2002］。さらに、ペプチドおよびタンパク質は、投与後、次いで、ある特定の臓器または細胞領域における結合工程への洞察を与える生化学的マーカー、色素または反応性基と複合化することができる［Miller and Cornish，2005］。
【０００４】
広い研究関心を引く別の分野は、ある特定の細胞領域または臓器領域において標的を定めて、これらの活性化合物を所期の作用部位へ導く、ペプチドおよびタンパク質の活性化合物との複合体である（ドラッグターゲティング）。顕著な例は、標的を定めて、ある特定のドメイン／抗原に結合し、細胞内へのインターナリゼーションおよびその後のプロセシング（例えば、リソソーム内）の後、作用部位の区画内に活性化合物を放出する抗体薬物複合体（ADC）である［Garnett，2001；Wu and Senter，2005；Sapraら、2011；Chariら、2014；Klinguer−Hamourら、2014；Tianら、2014］。
【０００５】
ペプチドまたはタンパク質を複合化するための方法は多数ある。したがって、ペプチドおよびタンパク質は、反応性基との様々な工程によりもたらされ、次いで、その反応性基自体は、活性化合物または診断薬の結合点として役目を果たす［Ramil and Lin，2013］。さらに、ペプチドおよびタンパク質は、それらのアミノ酸の官能基を介して複合化することができる［Widdisonら、2006］。ここで、課題は、他の一般に保護されていない（フリーの）アミノ酸基の存在下で、ペプチドまたはタンパク質内の所望の官能基の選択反応を可能にする方法を提供することである。
【０００６】
別の可能性は、生化学的変換により、その後の複合化に利用できる反応性基を生成するものである。顕著な例は、ペプチドまたはタンパク質内のシステインにより生成される1つまたは複数のジスルフィド結合の還元であり、その目的は、後に、こうして放出されたチオール基を結合させるためである。これは、好ましくはマレインイミドとの単一のチオールの複合化［Ghoshら、1990］により、または前者のジスルフィド結合の2つのチオール基の架橋により影響されることがある。例えば、このようなチオールの架橋のためのダブルマイケル受容体が記述されており、これはC1またはC3架橋が生じ［Liberatoreら、1990；Godwinら、国際公開第2005／007197（A2）号パンフレット、国際公開第2010／100430（A1）号パンフレット］、また、二官能基の求電子性マレインイミドが記述されており、これはC2架橋を与える［Schumacherら、2013］：
スキーム1a：
【化１】
2017520617.tif 000002
スキーム1b：
【化２】
2017520617.tif 000003
スキーム1：ビス反応性複合化試薬：a）ジスルフィドC3架橋のための「平衡移動アルキル化架橋」（ETAC）試薬；b）ジスルフィドC2架橋のための官能性マレインイミド。
【０００７】
スキーム1aおよびスキーム1bで概説した方法は、抗体薬物複合体（ADC）を与えるためにうまく利用された。この場合、当該抗体の鎖間ジスルフィド架橋がフリーのチオール基に還元され、次いで架橋法により複合化される。
【０００８】
本発明の文脈において、我々はここで、C2架橋のペプチドおよびタンパク質の複合体が新規に利用できるようになる方法を見出した。この方法において、2つのチオールは、システインにより生成されるジスルフィド架橋の還元後、いわゆるチオール−イン反応においてアルキンと選択的に反応する：
スキーム2：
【化３】
2017520617.tif 000004
スキーム2：ペプチドおよびタンパク質内の還元されたジスルフィド結合をC2架橋するためのチオール−イン反応。
【０００９】
ペプチドおよびタンパク質におけるチオール−イン反応［チオール−インカップリング（TYC）］は、それ自体既知である。しかし、これまでこの反応はフリーのチオール基を有するシステインに対するC2架橋複合化には適用されておらず、むしろ、各チオール基は、架橋法によらず別々に複合化された［Lo Conteら、2011；Lo Conteら、2010；Massi and Nanni，2012；Minozziら、2011；Krannigら、2013；Aimettiら、2010］。同様に知られているのは、ペプチドに対するチオール−イン反応であり、この反応は、直鎖状の前駆体ペプチドを適した位置でアルキン基で置換し、次いで、同じペプチドのフリーのシステインと環化を伴って反応することにより環状ペプチドを合成する働きをする［Aimettiら、国際公開第2011／156686（A2）号パンフレット］。この反応において生成されるビニルスルフィドは、その後の反応ステップにおいて、別の（異なる）チオールと反応させることもある。しかし、本明細書に記載の本発明による方法とは対照的に、この場合、ペプチドまたはタンパク質の2つのフリーのシステインは互いに架橋されず、それぞれの場合において、ペプチド結合アルキンまたはタンパク質結合アルキンは、このペプチドまたはタンパク質のシステインと反応する。また、文献に記載されているのは、大環状クラウンエーテル構造およびロタキサン構造を合成するための、フリーのチオール基を有する2つの結合したメルカプト酢酸エステルの架橋チオール−イン反応である［Zhouら、2010］。さらに記述されているのは、ヒドロゲルなど、三次元のネットワークを構築する働きをする、ペプチドおよびタンパク質とのチオール−イン反応である［Ansethら、国際公開第2012／103445（A2）号パンフレット；Kazantsevら、米国特許出願公開第2014／0273153（A1）号明細書］。本明細書に記載の本発明による方法とは対照的に、この反応は均一な複合体を与えず、不均一な高分子のネットワークを与える。
【００１０】
上述のシステイン架橋の極めて重要な特徴は、対応するジスルフィド架橋により事前に与えられるペプチドまたはタンパク質の安定性または構造が実質的に保持されることである。さらに、多くの場合、C2架橋は官能基を維持し、すなわち、ペプチドまたはタンパク質の生物学的標的に対する親和性を維持する［Jonesら、2012；Gerona−Navarroら、2011］。
【００１１】
一方、上述のC1架橋またはC3架橋複合体の場合のようなマイケル付加生成物（スキーム1a参照）は、生理的条件下で、例えば、グルタチオンまたは血清アルブミンなどの他のチオール化合物とレトロ反応および交換反応を起こし、したがって、血漿循環においてある程度分解されることが知られている［Baldwin and Kiick，2011；Todaら、2013；Shenら、2012］。この望まれないことが多い性質を抑えるために、その後に化学変換が必要である。マレインイミドによりC2架橋された複合体の場合（スキーム1b参照）、またはスクシンイミドの飽和した場合、チオールに対して安定な複合化を実現するために、マレインイミドの開環が必要である［Castanedaら、2013］。チオール−イン反応による本発明による工程によって得ることができる化合物はマイケル受容体の複合体ではない；したがって、このようなレトロ反応および交換反応は、この場合、予想されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第2005／007197（A2）号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2010／100430（A1）号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2011／156686（A2）号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2012／103445（A2）号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第2014／0273153（A1）号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
示した背景技術に対して、本発明の目的は、そのシステイン基を介してペプチドおよびタンパク質を選択的に安定な形態で複合化することができ、したがって、様々な定義されたペプチドおよびタンパク質の複合体の調製に使用される新規な方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的を実現するために、本発明は、アルキン誘導体との選択的なチオール−イン反応により、ペプチドおよびタンパク質内にフリーのチオール基を有するシステインの複合化C2架橋を可能にする工程を提供する。適切なフリーのチオールは、例えば、ジスルフィド結合の還元により生成することができる。さらに、置換基、官能基および／またはリンカー単位とのアルキン誘導体を適した方法で提供して、標的複合体の分子特性の対応する調節を可能にすることができる。
【００１５】
本発明は、均一なペプチドおよびタンパク質の複合体を調製するための工程を提供し、この工程は、式（II）
【化４】
2017520617.tif 000005
（式中、S1およびS2は、ジスルフィド架橋内で結合されたこのペプチドまたはタンパク質のシステインの硫黄原子を表す。）のペプチドまたはタンパク質が、還元条件下、式（III）
【化５】
2017520617.tif 000006
のペプチドまたはタンパク質に変換され、これが、次いで、フリーラジカル反応条件下、式（IV）
【化６】
2017520617.tif 000007
（式中、
R1およびR2は、互いに無関係に、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノまたはアルコキシカルボニルアミノを表し、
ここで、その部分のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Aは、結合、あるいは−O−、−S−、−S（＝O）−、−S（＝O）2−、−NH−、−N（CH3）−、−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−、−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−、−C（＝O）−O−、−SO2−NH−、−NH−SO2−、−NH−NH−、−SO2−NH−NH−、−NH−NH−SO2−、−C（＝O）−NH−NH−、−NH−NH−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−NH−、−NH−C（＝O）−O−、ならびにN、O、S、S（＝O）およびS（＝O）2からなる群からの最大4個のヘテロ原子を有する4員〜10員芳香族または非芳香族複素環からなる群から選択される同一または異なる基により1回または1回を超えて中断されてもよいアルキレン基、シクロアルキレン基および／またはアリーレン基からの1〜100個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表し、
または
R2およびAは互いに結合して、介在する炭素原子と共に、3員〜6員シクロアルキル環に縮合されてもよい8員炭素環を形成し、
ここで、8員炭素環、および任意選択で縮合シクロアルキル環は、フッ素、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアルコキシからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Lは、結合またはリンカーを表し、
Xは、n回存在してもよく、活性化合物分子、高分子、アルカロイド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ステロイド、テルペン、ポルフィリン、クロリン、コリン、エイコサノイド、フェロモン、ビタミン、ビオチン、色素分子またはクリプタンドを表し、あるいは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、
ここで、その部分のアルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
ここで、その部分のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
nは、1〜10の範囲の整数（1と10を含む。）を表し、
ここで、1つを超える基Xが存在する場合、それらの個々の意味は、同一でも異なっていてもよい。）のアルキン誘導体と反応して、
式（I）
【化７】
2017520617.tif 000008
（式中、R1、R2、A、L、Xおよびnは上述の意味を有する。）のペプチドまたはタンパク質の複合体を与えることを特徴とする。
【００１６】
本発明による工程を以下の反応スキームにまとめる：
スキーム3
【化８】
2017520617.tif 000009
［a）：還元；b）：チオール−イン反応］。
【００１７】
スキーム3に示す反応ステップa）および反応ステップb）は、中間体（III）を途中で単離して別々に実施することも、または同じ反応容器内で連続して実施することもできる。好ましくは、反応は後者の「ワンポット工程」により行われる。ジスルフィド（II）のフリーのジチオール（III）への還元は、好ましくは、トリス（2−カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を用いて行われる。式（I）の複合体を与えるジチオール（III）と式（IV）のアルキン誘導体とのチオール−イン反応は、フリーラジカル機構を経由して進むが、光化学的なフリーラジカル開始剤または酸化的に発生させたラジカル（例えば、トリエチルボランと少量の酸素など。）によって媒介することができる。既知の光化学的なフリーラジカル開始剤、例えば、ビス（2，4，6−トリメチルベンゾイル）フェニルホスフィンオキシド（Irgacure（登録商標）819）またはリチウムフェニル−2，4，6−トリメチルベンゾイルホスフィナート（LAP）［Gongら、2013］などを使用することが好ましい。フリーラジカル開始剤と組み合わせたUV光が光化学的開始反応に適している。350nm〜400nmの波長を有するUV光が好ましい；365nmおよび385nmの波長が特に好ましい。反応ステップa）および反応ステップb）に好ましい不活性溶媒は、水、緩衝水溶液、あるいは水と、メタノールまたはエタノールなどの水溶性有機溶媒との混合物である。反応は一般に、0℃〜40℃の温度範囲で、好ましくは室温で行われる。
【００１８】
本発明にしたがって複合化されるペプチドまたはタンパク質が既にジチオールの形態（III）で存在する場合、上に列挙した還元ステップa）は適用されない；この場合、本発明による工程は、反応ステップb）のための上述の条件下で式（I）の複合体を与えるジチオール（III）とアルキン誘導体（IV）の「直接」反応に関する。
【００１９】
本発明による工程は、式（II）のペプチドまたはタンパク質内に、このような複合化に利用できる複数のジスルフィド架橋が存在する場合、上述の反応順序による、アルキン誘導体（IV）を用いる式（II）のペプチドまたはタンパク質の複数の複合体の調製も含む。
【００２０】
本発明はさらに、一般式（I）
【化９】
2017520617.tif 000010
（式中、
S1およびS2は、ペプチドまたはタンパク質のジスルフィド架橋内であらかじめ結合されたシステインの硫黄原子を表し、
R1およびR2は、互いに無関係に、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノまたはアルコキシカルボニルアミノを表し、
ここで、その部分のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Aは、結合、あるいは−O−、−S−、−S（＝O）−、−S（＝O）2−、−NH−、−N（CH3）−、−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−、−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−、−C（＝O）−O−、−SO2−NH−、−NH−SO2−、−NH−NH−、−SO2−NH−NH−、−NH−NH−SO2−、−C（＝O）−NH−NH−、−NH−NH−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−NH−、−NH−C（＝O）−O−、ならびにN、O、S、S（＝O）およびS（＝O）2からなる群からの最大4個のヘテロ原子を有する4員〜10員芳香族または非芳香族複素環からなる群から選択される同一または異なる基により1回または1回を超えて中断されてもよいアルキレン基、シクロアルキレン基および／またはアリーレン基からの1〜100個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表し、
または
R2およびAは互いに結合して、介在する炭素原子と共に、3員〜6員シクロアルキル環に縮合されてもよい8員炭素環を形成し、
ここで、8員炭素環、および任意選択で縮合シクロアルキル環は、フッ素、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアルコキシからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
Lは、結合またはリンカーを表し、
Xは、n回存在してもよく、活性化合物分子、高分子、アルカロイド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ステロイド、テルペン、ポルフィリン、クロリン、コリン、エイコサノイド、フェロモン、ビタミン、ビオチン、色素分子またはクリプタンドを表し、あるいは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、ここで、その部分のアルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
ここで、その部分のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルアミノおよびアルコキシカルボニルアミノからなる群からの同一または異なる置換基により一置換または多置換されてもよく、
および
nは、1〜10の範囲の整数（1と10を含む。）を表し、
ここで、1つを超える基Xが存在する場合、それらの個々の意味は、同一でも異なっていてもよい。）のペプチドおよびタンパク質の複合体を提供する。
【００２１】
本発明は、本発明による複合化法に利用できる複数のジスルフィド架橋を有するペプチドまたはタンパク質の場合、このようなペプチドまたはタンパク質の対応する複数の複合体、すなわち、式（I）の意味で対C2架橋が当該前駆体ペプチドまたはタンパク質の複数の位置で生じた複合体も包含する。
【００２２】
本発明の文脈において、別段の指定がない限り、置換基および基は以下の通り定義される：
本発明の文脈において、アルキルは、1〜10個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜6個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、1−エチルプロピル、1−メチルブチル、2−メチルブチル、3−メチルブチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、1−メチルペンチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、4−メチルペンチル、3，3−ジメチルブチル、1−エチルブチル、2−エチルブチル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニルおよびn−デシル。
【００２３】
本発明の文脈において、アルキレンは、1〜10個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜6個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の二価のアルキル基（アルカンジイル基）を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：メチレン、エタン−1，1−ジイル、エタン−1，2−ジイル（1，2−エチレン）、プロパン−1，1−ジイル、プロパン−1，2−ジイル、プロパン−2，2−ジイル、プロパン−1，3−ジイル（1，3−プロピレン）、ブタン−1，2−ジイル、ブタン−1，3−ジイル、ブタン−2，3−ジイル、ブタン−1，4−ジイル（1，4−ブチレン）、ペンタン−1，5−ジイル（1，5−ペンチレン）、ヘキサン−1，6−ジイル（1，6−ヘキシレン）、ヘプタン−1，7−ジイル（1，7−ヘプチレン）、オクタン−1，8−ジイル（1，8−オクチレン）、ノナン−1，9−ジイル（1，9−ノニレン）およびデカン−1，10−ジイル（1，10−デシレン）。
【００２４】
本発明の文脈において、ヒドロキシアルキルは、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有し、鎖内または末端位に置換基としてヒドロキシル基を持つ直鎖または分岐鎖アルキル基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1，1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−1−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、5−ヒドロキシペンチルおよび6−ヒドロキシヘキシル。
【００２５】
本発明の文脈において、アルコキシは、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ、n−ペントキシ、イソペントキシ、1−エチルプロポキシ、1−メチルブトキシ、2−メチルブトキシ、3−メチルブトキシおよびn−ヘキソキシ。
【００２６】
本発明の文脈において、アルコキシカルボニルは、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有し、酸素原子に結合したカルボニル基［−C（＝O）−］を介して分子の残りの部分に結合した直鎖または分岐鎖アルコキシ基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、n−プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、n−ブトキシカルボニルおよびtert−ブトキシカルボニル。
【００２７】
本発明の文脈において、アルキルアミノは、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル置換基を有するアミノ基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：メチルアミノ、エチルアミノ、n−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、n−ブチルアミノおよびtert−ブチルアミノ。
【００２８】
本発明の文脈において、ジアルキルアミノは、それぞれの場合において、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有する2つの同一または異なる直鎖または分岐鎖アルキル置換基を有するアミノ基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：N，N−ジメチルアミノ、N，N−ジエチルアミノ、N−エチル−N−メチルアミノ、N−メチル−N−n−プロピルアミノ、N−イソプロピル−N−メチルアミノ、N−イソプロピル−N−n−プロピルアミノ、N，N−ジイソプロピルアミノ、N−n−ブチル−N−メチルアミノおよびN−tert−ブチル−N−メチルアミノ。
【００２９】
本発明の文脈において、アルコキシカルボニルアミノは、アルコキシ基内に1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有し、カルボニル基を介して窒素原子に結合した直鎖または分岐鎖アルコキシカルボニル置換基を持つアミノ基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、n−プロポキシカルボニルアミノ、イソプロポキシカルボニルアミノ、n−ブトキシカルボニルアミノおよびtert−ブトキシカルボニルアミノ。
【００３０】
本発明の文脈において、アルキルカルボニルは、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有し、カルボニル基［−C（＝O）−］を介して分子の残りの部分に結合した直鎖または分岐鎖アルキル基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：アセチル、プロピオニル、n−ブチリル、イソブチリル、n−ペンタノイルおよびピバロイル。
【００３１】
本発明の文脈において、アルキルカルボニルアミノは、アルキル基内に1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有し、カルボニル基を介して窒素原子に結合した直鎖または分岐鎖アルキルカルボニル置換基を持つアミノ基を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：アセチルアミノ、プロピオニルアミノ、n−ブチリルアミノ、イソブチリルアミノ、n−ペンタノイルアミノおよびピバロイルアミノ。
【００３２】
本発明の文脈において、シクロアルキルは、3〜10個、好ましくは3〜8個、特に好ましくは3〜6個の環炭素原子を有する単環式飽和炭素環を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデシル。
【００３３】
本発明の文脈において、シクロアルキレンは、3〜10個、好ましくは3〜8個、特に好ましくは3〜6個の環炭素原子を有する二価の単環式飽和シクロアルキル基（シクロアルカンジイル基）を表す。例として、かつ好ましくは、以下に言及してもよい：シクロプロパン−1，1−ジイル、シクロプロパン−1，2−ジイル、シクロブタン−1，1−ジイル、シクロブタン−1，2−ジイル、シクロブタン−1，3−ジイル、シクロペンタン−1，1−ジイル、シクロペンタン−1，2−ジイル、シクロペンタン−1，3−ジイル、シクロヘキサン−1，1−ジイル、シクロヘキサン−1，2−ジイル、シクロヘキサン−1，3−ジイル、シクロヘキサン−1，4−ジイル、シクロヘプタン−1，1−ジイル、シクロヘプタン−1，2−ジイル、シクロヘプタン−1，4−ジイル、シクロオクタン−1，2−ジイル、シクロオクタン−1，5−ジイル、シクロノナン−1，2−ジイル、シクロノナン−1，5−ジイル、シクロデカン−1，2−ジイルおよびシクロデカン−1，6−ジイル。
【００３４】
本発明の文脈において、ヘテロシクロアルキルは、飽和しているか、二重結合を含み、合計で4〜10個の環原子を有する単環式、または任意選択で二環式の4員〜10員非芳香族複素環を表し、これは、N、O、S、S（＝O）および／またはS（＝O）2からなる群からの最大4個の環ヘテロ原子を含み、環炭素原子、または任意選択で環窒素原子を介して結合している。例として、以下に言及してもよい：アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピラゾリジニル、ジヒドロピラゾリル、テトラヒドロフラニル、チオラニル、1，1−ジオキシドチオラニル、1，3−オキサゾリジニル、1，3−チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピリジル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、1，3−ジオキサニル、1，4−ジオキサニル、モルホリニル、チオモルホリニル、1，1−ジオキシドチオモルホリニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ヘキサヒドロ−1，4−ジアゼピニルヘキサヒドロアゼピニル、オクタヒドロアゾシニル、オクタヒドロピロロ［3，4−b］ピロリル、オクタヒドロイソインドリル、オクタヒドロピロロ［3，4−b］ピリジル、ヘキサヒドロピロロ［3，4−c］ピリジル、オクタヒドロピロロ［1，2−a］ピラジニル、デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロピリド［1，2−a］ピラジニル、7−アザビシクロ［2．2．1］ヘプタニル、3−アザビシクロ［3．2．0］ヘプタニル、3−アザビシクロ［3．2．1］オクタニル、8−アザビシクロ［3．2．1］オクタニルおよび8−オキサ−3−アザビシクロ［3．2．1］オクタニル。合計で4〜6個の環原子を有する4員〜6員単環式飽和複素環が好ましく、これは、N、OおよびSからなる群からの1個または2個の環ヘテロ原子を含み、環炭素原子、または任意選択で環窒素原子を介して結合している。例として、以下に言及してもよい：アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、テトラヒドロフラニル、チオラニル、1，3−オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、1，4−ジオキサニル、モルホリニルおよびチオモルホリニル。
【００３５】
本発明の文脈において、アリールは、フェニルおよびナフチルなど、6個または10個の環炭素原子を有する芳香族炭素環を表す。
【００３６】
本発明の文脈において、アリーレンは、例えば、1，2−フェニレン、1，3−フェニレン、1，4−フェニレン、ナフタレン−2，3−ジイル、ナフタレン−1，4−ジイル、ナフタレン−1，5−ジイル、ナフタレン−2，6−ジイルおよびナフタレン−1，8−ジイルなどの二価のアリール基を表す。
【００３７】
本発明の文脈において、ヘテロアリールは、合計で5〜10個の環原子を有し、N、OおよびSの群からの最大4個の環ヘテロ原子を含み、環炭素原子、または任意選択で環窒素原子を介して結合している単環式、または任意選択で二環式の5員〜10員芳香族複素環（複素環式芳香族）を表す。例として、以下に言及してもよい：フリル、ピロリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、インダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニルおよびピラゾロ［3，4−b］ピリジニル。合計で5個または6個の環原子を有し、N、OおよびSからなる群からの最大3個の環ヘテロ原子を含み、環炭素原子、または任意選択で環窒素原子を介して結合している5員または6員単環式ヘテロアリール基が好ましい。例として、以下に言及してもよい：フリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニルおよびトリアジニル。
【００３８】
本発明の文脈におけるハロゲンには、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。塩素、フッ素または臭素が好ましく、フッ素または塩素が特に好ましい。
【００３９】
本発明の文脈において、1回を超えて発生するすべての基は、互いに無関係に定義される。本発明による化合物内の基が置換されるとき、基は、別段の指定がない限り、一置換または多置換されてもよい。1個の置換基による、あるいは2個または3個の同一または異なる置換基による置換が好ましい。1個の置換基による、あるいは2個の同一または異なる置換基による置換が特に好ましい。1個の置換基による置換が特に非常に好ましい。
【００４０】
本発明において、「リンカー」は、−O−、−S−、−S（＝O）−、−S（＝O）2−、−NH−、−N（CH3）−、−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−、−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−、−C（＝O）−O−、−SO2−NH−、−NH−SO2−、−NH−NH−、−SO2−NH−NH−、−NH−NH−SO2−、−C（＝O）−NH−NH−、−NH−NH−C（＝O）−、−NH−C（＝O）−NH−、−O−C（＝O）−NH−、−NH−C（＝O）−O−、ならびにN、O、S、S（＝O）およびS（＝O）2からなる群からの最大4個のヘテロ原子を有する4員〜10員芳香族または非芳香族複素環からなる群から選択される同一または異なる基により、およびインビボで切断可能な基により、またはインビボで過渡的に安定な基により、1回または1回を超えて中断されてもよいアルキレン基、シクロアルキレン基および／またはアリーレン基からの1〜100個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表す。
【００４１】
用語「インビボで切断可能な基」は、インビボでの化学的手段により（例えば、酸加水分解工程または酸化還元工程により）切断することができる基と、酵素的に、すなわち、内在性酵素のインビボでの作用により切断することができる基とに細分することができる。いずれのタイプの切断可能な基も、初めは循環系内で安定なはずであり、標的細胞において、または標的細胞内で、その場所の異なる化学環境または酵素環境（例えば、さらに低いpH、グルタチオン濃度の上昇、カテプシンまたはプラスミンなどのリソソーム酵素の存在）によってのみ切断されるはずである。この目的に適した化学的にインビボで切断可能な構造断片は特に、ジスルフィド、ヒドラゾン、アセタールおよびアミナールのグルーピングである。酵素的にインビボで切断可能な構成要素は特に、2〜8個のアミノ酸のオリゴペプチド単位であり、この場合、特にジペプチドのグルーピングである。示した多くのこのようなペプチド切断部位が文献に記述されている。顕著な例は、ジペプチド単位バリン−アラニン、バリン−リシン、バリン−シトルリン、アラニン−リシンおよびフェニルアラニン−リシンである［例えば、J．J．Petersen and C．F．Meares，Bioconjugate Chem．9，618−626（1998）；G．M．Dubowchik and R．A．Firestone，Bioorg．Med．Chem．Lett．8，3341−3346（1998）；G．M．Dubowchikら、Bioconjugate Chem．13，855−869（2002）参照］。
【００４２】
上述のリンカーは、インビボで過渡的に安定な基を含んでもよい。このような過渡的に安定な基は、化学環境または酵素環境の作用で、例えば循環系内において、（数時間または数日の）長期間にわたり切断される［例えば、Flammeら、国際公開第2013／064455（A1）号パンフレット参照］。
【００４３】
基Xの上述の定義における適した活性化合物分子は特に、細胞毒素および細胞分裂阻害薬など、癌療法のための医薬品である。詳細には、これらの活性化合物は、癌細胞に障害を与え、アポトーシスを開始し、かつ／または細胞成長および細胞増殖を抑制することができる。このような癌療法のための活性化合物の例として、以下に言及してもよい：メトトレキサート、クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、シタラビン、フルオロウラシル、カペシタビンおよびゲムシタビンなどの代謝拮抗剤、シクロホスファミド、イホスファミド、マイトマイシン、トロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プロカルバジン、ダカルバジンおよび白金化合物シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンなどのアルキル化剤、トポテカン、イリノテカン、エトポシドおよびテニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ソラフェニブ、regorafinib、スニチニブ、アファチニブ、エルロチニブおよびゲフィチニブなどのキナーゼ阻害剤、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの有糸分裂阻害剤、ならびにダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、ミトキサントロンおよびアムサクリンなどの抗生物質。
【００４４】
基Xの範囲に含まれる別の活性化合物は、細胞毒性化合物および毒素であり、抗体薬物複合体（ADC）における「担毒体（toxophore）」として、特に癌療法のために実験的および臨床的に調査されてきたものなどである。本明細書において言及してもよい例は特に、メイタンシンおよびメイタンシノイド（DM−1、DM−4）、ドラスタチン、アウリスタチン（MMAE、MMAF）、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、カンプトテシン（トポテカン、エクサテカン、イリノテカン、SN−38）、ドキソルビシン、アマトキシン（アマニチン）、ピロロベンゾジアゼピン（PBD）およびキネシンスピンドルタンパク質（KSP）阻害剤などの物質である。
【００４５】
本発明によれば、式（II）のペプチドおよびタンパク質は、ジスルフィド結合を形成する、またはジスルフィド結合を形成ことができる少なくとも2つのシステインアミノ酸を含む。このようなペプチドには、例えば、インスリン、ソマトスタチン、オキシトシン、テルリプレシン、アドレノメデュリン、カルシトニンまたはバソプレッシンなどのペプチドホルモンが含まれる。このタイプのタンパク質の言及してもよい例は、抗体、インターロイキンなどのサイトカイン、ならびにアルブミンである。
【００４６】
本発明により、用語「抗体」は、その最も広い意味で理解されるべきであり、免疫グロブリン分子、例えば、無処置または修飾モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体あるいは多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびにこれらの断片を指す。免疫グロブリン分子は、好ましくは、2本の重鎖（H鎖、HC）および2本の軽鎖（L鎖、LC）からなる4本のポリペプチド鎖を有する分子を表し、これらは通常、ジスルフィド架橋（鎖間ジスルフィド架橋）を介して互いに結合している。各重鎖は、可変ドメイン（VHと略記）および定常部ドメイン（CH）を含む。その部分において、重鎖の定常部ドメインは、3つ（CH1、CH2、CH3）または4つのサブドメインを有してもよい。各軽鎖も、可変ドメイン（VL）および定常部ドメイン（CL）を含む。VHドメインおよびVLドメインは、相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる超可変性を有する領域、および、さらに低い配列多様性を有する領域（フレームワーク領域、FR）にさらに細分することができる。各VHおよびVL領域は通常、3つのCDRおよび最大4つのFRから構成され、例えば、アミノ末端からカルボキシル末端まで、配列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で構成される。抗体は、任意の適した種、例えば、サル、ブタ、ウサギ、マウスまたはラットから得られてもよい。特定の実施形態では、抗体は、ヒトまたはマウス由来のものである。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でもよい。
【００４７】
本発明はさらに、障害の診断および／または治療のための、特に癌障害および腫瘍障害の診断および／または治療のための式（I）の複合体の使用を提供する。
【００４８】
さらに本発明は、障害、特に癌障害および腫瘍障害の診断および／または治療のための方法における式（I）の複合体の使用を提供する。
【００４９】
さらに本発明は、式（I）の1つまたは複数の複合体を使用する、障害、特に癌障害および腫瘍障害の診断および／または治療のための方法を提供する。
【００５０】
本発明において、用語「治療」または「を治療する」には、疾患、状態、障害、傷害または健康問題、あるいは、このような状態および／またはこのような状態の症状の発生、経過または進行の阻害、遅延、検査、軽減、減弱、制限、減少、抑制、忌避または治癒が含まれる。本明細書において、用語「治療法」は、用語「治療」と同義であると理解される。
【００５１】
本発明の文脈において、用語「診断」は、（鑑別する）識別、認識、決定、評価、分類および疾患、状態、障害、病徴、傷害または健康問題の命名として通常の意味で理解される。
【００５２】
さらに本発明は、式（I）の複合体のうちの少なくとも1つを、通常、1つまたは複数の不活性で非毒性の薬剤的に適した助剤と共に含む医薬組成物を提供し、上述の目的のためのその使用を提供する。
【００５３】
本発明による式（I）の複合体は、全身的および／または局所的に作用することができる。この目的のために、これらの複合体は適した方法で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、皮膚（dermal）、経皮（transdermal）、結膜または耳の経路により、あるいは植込またはステントとして投与することができる。
【００５４】
本発明による複合体は、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００５５】
経口投与に適した投与形態は、先行技術にしたがって働き、本発明による複合体を迅速に、かつ／または変更された方法で放出し、結晶形態および／またはアモルファス形態および／または溶解した形態で本発明による複合体を含む投与形態であり、例えば、錠剤（例えば、耐胃液性コーティングまたは遅れて溶解するコーティング、あるいは不溶性のコーティングを備え、本発明による複合体の放出を制御する非コーティング錠またはコーティング錠）、口腔内で速やかに分解する錠剤またはフィルム／オブラート、フィルム／凍結乾燥物、カプセル（例えば、ハードまたはソフトゼラチンカプセル）、糖衣錠、顆粒、ペレット、粉末、乳剤、懸濁液、エアロゾルあるいは溶液である。
【００５６】
非経口投与は、吸収ステップ（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内の経路による。）を避けて、または吸収（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮的または腹腔内の経路による。）を含めて実現することができる。非経口投与に適した投与形態には、溶液、懸濁液、乳剤、凍結乾燥物または無菌粉末の形態で注入および輸注するための製剤が含まれる。
【００５７】
他の投与経路に適した例は、吸入薬（粉末吸入器、ネブライザーを含む。）、点鼻液、溶液またはスプレー；舌、舌下または頬側で投与するための錠剤、フィルム／オブラートまたはカプセル、坐剤耳または眼の製剤、膣用カプセル、水性懸濁液（ローション、振盪合剤）、親油性懸濁液、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えば、パッチ）、乳剤、ペースト、泡、散布剤、植込またはステントである。
【００５８】
非経口投与、特に静脈内投与が好ましい。
【００５９】
本発明による複合体は、述べた投与形態に転換することができる。この転換は、それ自体既知の方法で、不活性で非毒性の薬剤的に適した賦形剤と混合することによって実現することができる。これらの賦形剤には、キャリヤー（例えば、微結晶セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば、液体のポリエチレングリコール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレアート）、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、合成および天然の高分子（例えば、アルブミン）、安定剤（例えば、アスコルビン酸などの酸化防止剤）、着色剤（例えば、酸化鉄などの無機顔料）ならびに矯味薬および／または矯臭薬が含まれる。
【００６０】
以下の作業例により本発明を説明する。本発明は、実施例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】異性体の1H NMRスペクトル。
【図２】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図３】生成物分画の13C NMRスペクトル。
【図４】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図５】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図６】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図７】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図８】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図９】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図１０】生成物分画の1H NMRスペクトル。
【図１１】クロマトグラム。
【図１２】計算されたパーセント。
【図１３】スペクトル。
【００６２】
A．実施例
【表１】
2017520617.tif 000011
【００６３】
LC／MS法：
方法1：
測定器：Waters Acquity SQD UPLC System；カラム：Waters Acquity UPLC HSS T3 1．8μm、50×1mm；移動相A：1lの水＋0．25mlの99％強度ギ酸、移動相B：1lのアセトニトリル＋0．25mlの99％強度ギ酸；勾配：0．0min 95％ A→6．0min 5％ A→7．5min 5％ A；オーブン：50℃；流量：0．35ml／min；UV検出：210−400nm。
【００６４】
方法2：
MS測定器タイプ：Waters Synapt G2S；UPLC測定器タイプ：Waters Acquity I−Class；カラム：Waters HSS T3、2．1×50mm、C18 1．8μm；移動相A：1lの水＋0．01％ギ酸、移動相B：1lのアセトニトリル＋0．01％ギ酸；勾配：0．0min 2％ B→2．0min 2％ B→13．0min 90％ B→15．0min 90％ B；オーブン：50℃；流量：1．20ml／min；UV検出：210nm。
【００６５】
方法3：
MS測定器タイプ：Thermo Fisher Scientific LTQ−Orbitrap−XL；HPLC測定器タイプ：Agilent 1200SL；カラム：Agilent Poroshell 120 SB−C18 2．7μm、3×150mm；移動相A：1lの水＋0．1％トリフルオロ酢酸、移動相B：1lのアセトニトリル＋0．1％トリフルオロ酢酸；勾配：0．0min 2％ B→1．5min 2％ B→15．5min 95％ B→18．0min 95％ B；オーブン：40℃；流量：0．75ml／min；UV検出：210nm。
【００６６】
出発化合物：
化合物A
N−（2，5，8，11，14，17，20，23−オクタオキサペンタコサン−25−イル）ヘキサ−5−インアミド
【化１０】
2017520617.tif 000012
アルゴン雰囲気下、27．8μl（0．25mmol）のヘキサ−5−イン酸および48．3mg（0．25mmol）の1，1’−カルボニルジイミダゾールを初めに1mlの無水DMFに入れた。混合物を室温で2時間撹拌した。次いで、0．5mlの無水DMFに溶解した100．0mg（0．25mmol）の2，5，8，11，14，17，20，23−オクタオキサペンタコサン−25−アミンを加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残留物を分取MPLCにより精製した。生成物を含む分画を濃縮し、10mlの水を残留物に加え、混合物をそれぞれの場合において10mlの酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥して減圧下で濃縮し、残留物を高真空下で乾燥した（生成物収量：22mg）。事前に得られた水性相を凍結乾燥し、凍結乾燥物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した（移動相：まずはジクロロメタン／メタノール100：5、次いでジクロロメタン／メタノール9：1）。これにより、37．8mgの透明なオイルを得た。
全収量：59．8mg（理論値の51％）
1H−NMR（400MHz，CDCl3）：［ppm］＝1．87（quin，J＝7．1Hz，2H），1．99（t，J＝2．5Hz，1H），2．26（td，J＝6．9 and 2．7Hz，2H），2．32（t，J＝7．4Hz，2H），3．38（s，3H），3．45（q，J＝5．4Hz，2H），3．55（m，4H），3．60−3．71（m，26H），6．18（br．s，1H）．
13C−NMR（125．78MHz，CDCl3）：δ［ppm］＝172．21，83．61，71．93，70．60，70．56，70．53，70．51，70．25，69．87，69．12，59．03，39．18，35．00，24．18，17．88．
【００６７】
化合物B
4−（ヘキサ−5−イン−1−イル）−4−メチルモルホリン−4−イウムヨージド
【化１１】
2017520617.tif 000013
3．0ml（22．7mmol）の6−ヨードヘキサ−1−インを2．5ml（22．7mmol）の4−メチルモルホリンに滴下した。混合物を室温で5分間撹拌し、次いで54℃で10分間撹拌した。次いで、混合物を室温まで冷却し、さらに16時間撹拌し、次いで、少量の石油エーテル、ジエチルエーテル、最後に酢酸エチルを加えた。沈殿物を濾過して取り出し、濾液を減圧下で濃縮した。生じる沈殿物を濾過して取り出し、酢酸エチルで洗った。白色からベージュ色の粉末を高真空下で乾燥した。収量：593．6mg（理論値の9％）。
1H−NMR（400MHz，D2O）：［ppm］＝1．62（quin，J＝7．3Hz，2H），1．95（m，2H），2．33（td，J＝7 and 2．6Hz，2H），2．41（t，J＝2．6Hz，1H），3．21（s，3H），3．46−3．60（m，6H），4．06（br．s，4H）．
13C−NMR（125．78MHz，D2O）：δ［ppm］＝84．64，70．01，66．59，60．42，59．64，59．58，24．23，20．13，17．11．
MS（ESpos）：m／z＝182．2．
【００６８】
作業例：
実施例1
（5R，12R）−12−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−カルボキシ−8−（8−カルボキシオクチル）−3−オキソ−1−フェニル−2−オキサ−7，10−ジチア−4−アザトリデカン−13−酸
【化１２】
2017520617.tif 000014
二口丸底フラスコ内で、アルゴン雰囲気下、100．00mg（0．19mmol）のN，N’−ビス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−シスチンおよび79．47mg（277．25μmol）のTCEP−HClを初めに1mlの水／メタノール（1：1v／v）に入れた。混合物を室温で2．5時間撹拌した。次いで、33．69mg（0．19mmol）のウンデカ−10−イン酸および3．87mg（9．24μmol）のIrgacure（登録商標）819を加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCureLX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。HPLCによる変換（移動相：勾配アセトニトリル／水＋0．1％TFA；ELSD）は定量的であった。次いで、反応溶液をメタノールで希釈し、分取HPLCにより精製した（移動相：勾配アセトニトリル／水＋0．1％TFA）。これにより、39mg（理論値の27％、LC／MSによる純度88％）の目標化合物を得た。
LC／MS（方法1）：Rt＝3．45min；MS（ESIpos）：m／z＝693［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝1．24−1．50（m，13H），1．55−1．60（m，2H），1．72−1．79（m，1H），2．66−3．18（m，7H），4．34−4．40（m，2H），5．07−5．14（m，4H），7．26−7．38（m，10H）．
【００６９】
実施例2Aおよび2B
2A：5−［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−｛［（2S）−2−（｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝カルバモイル）ピロリジン−1−イル］カルボニル｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−3−イル］ペンタン酸
2B：5−［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−｛［（2S）−2−（｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝カルバモイル）ピロリジン−1−イル］カルボニル｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−2−イル］ペンタン酸
2A：
【化１３】
2017520617.tif 000015
2B：
【化１４】
2017520617.tif 000016
アルゴン雰囲気下、50．17mg（37．23μmol）のテルリプレシン酢酸塩（Bachem（スイス）製；配列：H−Gly−Gly−Gly−Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro−Lys−Gly−NH2、環状Cysジスルフィドとして。）を初めに二口フラスコ内で1．1mlの水に入れ、16．01mg（55．85μmol）のTCEP−HClを加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、100μlのメタノール中の4．70mg（37．23mmol）のヘプタ−6−イン酸の溶液を加えた。次いで、150μlの水中の0．55mg（1．86μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。次いで、さらに0．55mg（1．86μmol）のLAPを加え、反応混合物に365nmのUV光をさらに1時間照射した。次いで、分取HPLCにより異性体生成物を分離して、反応混合物を精製した（カラム：Waters X−Bridge BEH130 Prep C18 10μm OBD、19×250mm；移動相A：0．05％TFA添加水、移動相B：0．05％TFA添加アセトニトリル；勾配：0．0min 5％ B→40min 40％ B）。
異性体1：
LC／MS（方法2）：Rt＝3．53min；MS（ESpos）：m／z＝1355［M＋H］＋．
異性体2：
収量：1．3mg（理論値の2．6％）
LC／MS（方法2）：Rt＝3．57min；MS（ESpos）：m／z＝1355［M＋H］＋
13C−NMR（125．78MHz，D2O，δ（1，4−dioxane）＝67．4ppm）：δ［ppm］＝183．1（S），182．1（S），178．5（S），175．2（3S），174．7（S），174．0（S），173．9（S），172．7（S），172．5（S），171．5（S），170．9，168．7，155．2（S），137．0（S），131．4（S），130．0（S），129．7（S），128．8（S），128．2（S），116．3（S），61．7（D），57．1（D），55．6（D），55．3（D），54．5（D），53．4（D），52．6（D），50．7（D），48．8（T），45．7（D），43．2（T），43．0（T），42．9（T），41．3（T），40．1（T），38．8（T），37．0（T），36．6（T），36．4（2T），34．0（T），33．6（T），31．9（2T），30．9（T），30．1（T），27．0（T），26．9（T），26．8（T），25．6（T），25．5（T），22．9（T）［corresponds to a ring−closed structure since no olefinic carbon atoms can be detected］．
この異性体の1H NMRスペクトルを図1に示す。
【００７０】
実施例3Aおよび3B
3A：（2S）−1−｛［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−3−（27−オキソ−2，5，8，11，14，17，20，23−オクタオキサ−26−アザトリアコンタン−30−イル）−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−6−イル］カルボニル｝−N−｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝ピロリジン−2−カルボキサミド
3B：（2S）−1−｛［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−2−（27−オキソ−2，5，8，11，14，17，20，23−オクタオキサ−26−アザトリアコンタン−30−イル）−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−6−イル］カルボニル｝−N−｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝ピロリジン−2−カルボキサミド
3A：
【化１５】
2017520617.tif 000017
3B：
【化１６】
2017520617.tif 000018
アルゴン雰囲気下、20．64mg（15．32μmol）のテルリプレシン酢酸塩（Bachem（スイス）製；配列：H−Gly−Gly−Gly−Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro−Lys−Gly−NH2、環状Cysジスルフィドとして。）を初めに二口フラスコ内で500μlのDPBS緩衝液に入れ、13．30mg（46．39μmol）のTCEP−HClを加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、150μlのDPBS緩衝液中の7．20mg（15．15μmol）のN−（2，5，8，11，14，17，20，23−オクタオキサペンタコサン−25−イル）ヘキサ−5−インアミドの溶液を加えた。次いで、4．4mg（14．95μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を500μlのDPBS緩衝液に溶解し、次いで、50μlのこのLAP溶液を反応混合物に加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365 nmのUV光を1時間照射した。次いで、50μlのLAP溶液の添加およびその後の365nmのUV光での1時間の照射をさらに2回繰り返した。次いで、反応混合物を分取HPLCで分画した（カラム：Waters X−Bridge BEH130 Prep C18 10μm OBD、19×250mm；移動相A：0．1％TFA添加水、移動相B：0．1％TFA添加アセトニトリル；勾配：0．0min 5％ B→3 min 5％ B→43min 40％ B→44．30min 95％ B→49．30min 95％ B）。
生成物分画1：
収量：6．20mg（理論値の23％）；LC／MSによる純度（方法3）：99％
LC／MS（方法3）：Rt＝7．41min；MS（ESpos）：m／z＝853．9101［M＋2H］2＋
HRMS：C75H121O24N17S2［M＋2H］2＋の計算値：853．9100、測定値：853．9100。
この生成物分画の1Hおよび13C NMRスペクトルを図2および図3に示す。
生成物分画2：
収量：1．70mg（理論値の7％）
LC／MS（方法2）：Rt＝4．09min；MS（ESpos）：m／z＝853．9149［M＋2H］2＋
HRMS：C75H121O24N17S2［M＋2H］2＋の計算値：853．9100、測定値：853．9095。
【００７１】
実施例4Aおよび4B
4A：4−｛4−［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−｛［（2S）−2−（｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝カルバモイル）ピロリジン−1−イル］カルボニル｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−3−イル］ブチル｝−4−メチルモルホリン−4−イウムトリフルオロアセタート
4B：4−｛4−［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−｛［（2S）−2−（｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝カルバモイル）ピロリジン−1−イル］カルボニル｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−2−イル］ブチル｝−4−メチルモルホリン−4−イウムトリフルオロアセタート
4A：
【化１７】
2017520617.tif 000019
4B：
【化１８】
2017520617.tif 000020
アルゴン雰囲気下、21．54mg（15．98μmol）のテルリプレシン酢酸塩（Bachem（スイス）製；配列：H−Gly−Gly−Gly−Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro−Lys−Gly−NH2、環状Cysジスルフィドとして。）を初めに二口フラスコ内で800μlのDPBS緩衝液に入れ、6．50mg（22．68μmol）のTCEP−HClを加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、500μlのDPBS緩衝液中の4．9mg（15．84μmol）の4−（ヘキサ−5−イン−1−イル）−4−メチルモルホリン−4−イウムヨージドの溶液を加えた。次いで、4．70mg（15．98μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を500μlのDPBS緩衝液に溶解し、次いで、50μlのこのLAP溶液を反応混合物に加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。次いで、50μlのLAP溶液の添加およびその後の365nmのUV光での1時間の照射をさらに2回繰り返した。次いで、反応混合物を分取HPLCで分画した（カラム：Phenomenex Kinetex Prep 5μm C18 100Å AXIA Packed LC Column、21．2×100mm；移動相A：0．1％TFA添加水、移動相B：0．08％TFA添加アセトニトリル；勾配：0．0min 5％ B→3 min 5％ B→63min 40％ B→64．30min 95％ B→69．30min 95％ B）。
生成物分画1：
収量：1．5mg（理論値の4％）；LC／MSによる純度（方法3）：65％
LC／MS（方法3）：Rt＝6．49min；MS（ESpos）：m／z＝705．8397［M＋H］2＋
HRMS：C63H97O16N17S2［M＋H］2＋の計算値：705．8365、測定値：705．8361。
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図4に示す。
生成物分画2：
収量：2．2mg（理論値の8％）；LC／MSによる純度（方法3）：87％
LC／MS（方法3）：Rt＝6．48min；MS（ESpos）：m／z＝705．8401［M＋H］2＋
HRMS：C63H97O16N17S2［M＋H］2＋の計算値：705．8365、測定値：705．8377。
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図5に示す。
【００７２】
実施例5Aおよび5B
5A：（2S）−3−［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−｛［（2S）−2−（｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝カルバモイル）ピロリジン−1−イル］カルボニル｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−3−イル］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロパン酸
5B：（2S）−3−［（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−｛［（2S）−2−（｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝カルバモイル）ピロリジン−1−イル］カルボニル｝−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−2−イル］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロパン酸
5A：
【化１９】
2017520617.tif 000021
5B：
【化２０】
2017520617.tif 000022
アルゴン雰囲気下、10．16mg（7．54μmol）のテルリプレシン酢酸塩（Bachem（スイス）製；配列：H−Gly−Gly−Gly−Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro−Lys−Gly−NH2、環状Cysジスルフィドとして。）を初めに二口フラスコ内で300μlのDPBS緩衝液に入れ、3．20mg（11．17μmol）のTCEP−HClを加えた。反応混合物を室温で1．5時間撹拌し、次いで、200μlのDPBS緩衝液および100μlのDPBS緩衝液中の1．6mg（7．54μmol）のN−Boc−l−プロパルギルグリシンの溶液を加えた。次いで、3．20mg（10．87μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を500μlのDPBS緩衝液に溶解し、次いで、50μlのこのLAP溶液を反応混合物に加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。次いで、50μlのLAP溶液の添加およびその後の365nmのUV光での1時間の照射をさらに2回繰り返した。次いで、反応混合物を分取HPLCで分画した（カラム：Phenomenex Kinetex Prep 5μm C18 100Å AXIA Packed LC Column、21．2×100mm；移動相A：0．1％TFA添加水、移動相B：0．08％TFA添加アセトニトリル；勾配：0．0min 5％ B→3min 5％ B→63min 40％ B→65．3min 95％ B→70min 95％ B）。
生成物分画1：
収量：0．4mg（理論値の4％）
LC／MS（方法3）：Rt＝7．11min；MS（ESpos）：m／z＝721．8130［M＋2H］2＋
HRMS：C62H93O19N17S2［M＋2H］2＋の計算値：721．8132、測定値：721．8130。
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図6に示す。
生成物分画2：
収量：1．6mg（理論値の15％）；LC／MSによる純度（方法3）：94％
LC／MS（方法3）：Rt＝7．36min；MS（ESpos）：m／z＝1442．6134［M＋H］＋
HRMS：C62H93O19N17S2［M＋2H］2＋の計算値：721．8132、測定値：721．8132。
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図7に示す。
生成物分画3：
収量：0．3mg（理論値の3％）；LC／MSによる純度（方法3）：89％
LC／MS（方法3）：Rt＝7．34min；MS（ESpos）：m／z＝721．8122［M＋2H］2＋
HRMS：C62H92O19N17S2［M＋H］＋の計算値：1442．6191、測定値：1442．6200。
【００７３】
実施例6Aおよび6B
6A：（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−アミノ−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−3−（4−カルボキシブチル）−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−6−カルボン酸
6B：（6R，9S，12S，15S，18S，21R）−21−アミノ−9−（2−アミノ−2−オキソエチル）−12−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−15−ベンジル−2−（4−カルボキシブチル）−18−（4−ヒドロキシベンジル）−8，11，14，17，20−ペンタオキソ−1，4−ジチア−7，10，13，16，19−ペンタアザシクロドコサン−6−カルボン酸
6A：
【化２１】
2017520617.tif 000023
6B：
【化２２】
2017520617.tif 000024
アルゴン雰囲気下、15．33mg（19．78μmol）のプレッシン酸（Bachem（スイス）製；配列：H−Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−OH、環状Cysジスルフィドとして。）を初めに二口フラスコ内で500μlの0．1％強度酢酸水溶液および500μlのアセトニトリルに入れ、8．70mg（30．35μmol）のTCEP−HClを加えた。反応混合物を室温で2．5時間撹拌し、次いで、200μlの0．1％強度酢酸水溶液、200μlのアセトニトリル、および100μlの0．1％強度酢酸水溶液中の2．5mg（19．82μmol）のヘプタ−6−イン酸の溶液を加えた。次いで、5．8mg（19．72μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を500μlの0．1％強度酢酸水溶液に溶解し、次いで、50μlのこのLAP溶液を反応混合物に加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。次いで、50μlのLAP溶液の添加およびその後の365nmのUV光での1時間の照射をさらに2回繰り返した。次いで、反応混合物を分取HPLCで分画した（カラム：Waters X−Bridge BEH130 Prep C18 10μm OBD、19×250mm；移動相A：0．1％TFA添加水、移動相B：0．08％TFA添加アセトニトリル；勾配：0．0min 5％ B→3min 5％ B→33min 40％ B）。
生成物分画1：
収量：1．4mg（理論値の8％）
LC／MS（方法1）：Rt＝1．25min；MS（ESpos）：m／z＝903．4［M＋H］＋．
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図8に示す。
生成物分画2：
収量：0．6mg（理論値の3％）
LC／MS（方法1）：Rt＝1．25min；MS（ESpos）：m／z＝903．4［M＋H］＋ and Rt＝1．27min；MS（ESpos）：m／z＝903．3［M＋H］＋．
HRMS：C40H55O12N8S2［M＋H］＋の計算値：903．3375測定値：903．3371。
生成物分画3：
収量：0．7mg（理論値の4％）
LC／MS（方法1）：Rt＝1．27min；MS（ESpos）：m／z＝903．3［M＋H］＋．
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図9に示す。
【００７４】
実施例7Aおよび7B
7A：（2S）−1−｛［（3R，6S，9S，12S，15S，18R，22aR，23S，23aS）−18−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−（2−アミノ−2−オキソエチル）−9−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−12−ベンジル−15−（4−ヒドロキシベンジル）−23−（ヒドロキシメチル）−5，8，11，14，17−ペンタオキソヘキサコサヒドロ−20aH−シクロプロパ［5，6］シクロオクタ［1，2−b］［1，4，7，10，13，16，19］ジチアペンタアザシクロドコシン−3−イル］カルボニル｝−N−｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝ピロリジン−2−カルボキサミド
7B：（2S）−1−｛［（3R，6S，9S，12S，15S，18R，22aS，23R，23aR）−18−｛［（｛［（アミノアセチル）アミノ］アセチル｝アミノ）アセチル］アミノ｝−6−（2−アミノ−2−オキソエチル）−9−（3−アミノ−3−オキソプロピル）−12−ベンジル−15−（4−ヒドロキシベンジル）−23−（ヒドロキシメチル）−5，8，11，14，17−ペンタオキソヘキサコサヒドロ−20aH−シクロプロパ［5，6］シクロオクタ［1，2−b］［1，4，7，10，13，16，19］ジチアペンタアザシクロドコシン−3−イル］カルボニル｝−N−｛（2S）−6−アミノ−1−［（2−アミノ−2−オキソエチル）アミノ］−1−オキソヘキサン−2−イル｝ピロリジン−2−カルボキサミド
7A：
【化２３】
2017520617.tif 000025
7B：
【化２４】
2017520617.tif 000026
アルゴン雰囲気下、26．24mg（19．47μmol）のテルリプレシン酢酸塩（Bachem（スイス）製；配列：H−Gly−Gly−Gly−Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro−Lys−Gly−NH2、環状Cysジスルフィドとして。）および8．4mg（29．31μmol）のTCEP−HClを初めに二口フラスコ内で1．5mlのDPBS緩衝液に入れた。反応混合物を室温で2．5時間撹拌し、次いで、200μlのメタノール中の2．9mg（19．32μmol）のrel−（1R，8S，9r）−ビシクロ［6．1．0］ノナ−4−イン−9−イルメタノールの溶液を加えた。次いで、5．70mg（19．38μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を500μlのDPBS緩衝液に溶解し、次いで、50μlのこのLAP溶液を反応混合物に加えた。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。次いで、50μlのLAP溶液の添加およびその後の365nmのUV光での1時間の照射をさらに2回繰り返した。次いで、反応混合物を分取HPLCで分画した（カラム：Phenomenex Kinetex Prep 5μm C18 100Å AXIA Packed LC Column、21．2×100mm；移動相A：0．1％TFA添加水、移動相B：0．08％TFA添加アセトニトリル；勾配：0．0min 5％ B→3min 5％ B→63min 40％ B→64．30min 95％ B→69．30min 95％ B）。
生成物分画1：
収量：3．1mg（理論値の7．5％）；LC／MSによる純度（方法3）：65％
LC／MS（方法3）：Rt＝6．92min；MS（ESpos）：m／z＝903．3［M＋H］＋
HRMS：C62H91O16N16S2［M＋H］＋の計算値：1379．6235、測定値：1379．6244。
この生成物分画の1H NMRスペクトルを図10に示す。
【００７５】
実施例8
抗体FAB断片を用いるC2架橋チオール−イン反応：
アルゴン雰囲気下、108．4μlのFAB断片M14−G07［Dittmerら、米国特許出願公開第2014／0050743（A1）号明細書、13ページ、段落0105、0106および0113ff．に記載。］の溶液を初めに二口フラスコ内でPBS緩衝液（c＝46．1mg／ml、0．107μmol）に入れた。4．60mgのTCEP−HClを400μlのDPBS緩衝液に溶解し、4μlのこの溶液をFAB断片の溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで、398μlのメタノール中の4μlの1．36μl（10．75μmol）のヘプタ−6−イン酸の溶液を加えた。次いで、3．10mg（10．53μmol）のLAP［文献（Gongら、2013）による既知の工程により調製。］を500μlのDPBS緩衝液に溶解し、次いで、1μlのこのLAP溶液を反応混合物に加えた。反応フラスコを氷浴を用いて冷却した（5℃＜T＜10℃）。二口フラスコのすり合わせガラスジョイント経由で、LED−UVヘッド（OmniCure LX400、直径12mm；igb−tech GmbH（ドイツ））を導入（反応混合物までの距離は約40mm）し、反応混合物に365nmのUV光を1時間照射した。連続する3つの間隔で、それぞれの場合においてさらに1μlのLAP溶液を加え、続いて、反応混合物に365nmのUV光をそれぞれの場合において1時間照射した。次いで、反応混合物を2．384mlのDPBS緩衝液で希釈し、それぞれの場合において5mlのDPBS緩衝液で事前に5回コンディショニングしたSephadex（登録商標）G−25M PD−10カラム（GE Healthcare）で分画した。生じる分画を5分間遠心分離した（10℃、4000rpm）。次いで、溶液をピペットで遠心濾過容器（Ultracel（登録商標）30K−Amicon（登録商標）Ultra−4）に入れ、さらに15分間遠心分離した。生じる濃縮物を合計2．5mlのDPBS緩衝液で繰り返し希釈した。
【００７６】
共有結合したFAB断片の確認および定量化：
生じるDPBS緩衝液中のサンプルから、FAB断片の共有結合を以下の通り定量および同定した：
共有結合FAB断片の定量化は、還元および変性させたFAB断片のRPクロマトグラフィーにより行った。グアニジニウム塩酸塩（GuHCl）（28．6mg）およびdl−ジチオトレイトール（DTT）の溶液（500mM、3μl）をサンプル溶液（1mg／ml、50μl）に加えた。混合物を55℃で1時間インキュベートし、次いで、HPLCにより分析した。
【００７７】
HPLC分析は、Agilent 1260 HPLCシステムで220nmで検出して行った。Polymer Laboratories PLRP−Sポリマー逆相カラム（2．1mm×150mm、粒径8μm、1000Å、カタログno．PL1912−3802）を、流量1ml／minで以下の移動相系で使用した：移動相A：水中の0．05％トリフルオロ酢酸、移動相B：アセトニトリル中の0．05％トリフルオロ酢酸；勾配：0min 25％ B、3min 25％ B、28min 50％ B。
【００７８】
検出されたピークは、非複合化FAB断片の軽鎖（L0）および重鎖（VH−CH1＝H0）との保持時間の比較により帰属された。複合化サンプルにおいてのみ検出された信号は、還元できないように共有結合したFABと帰属された。共有結合したFABの割合は、積分により求めた信号面積から計算した。このために、全信号の総面積に対するFAB断片の信号面積の商を求めて100を掛けた。生じるクロマトグラムおよび計算されたパーセントを図11および図12に示す。
【００７９】
共有結合したFAB断片を確認するために、変性および還元させたサンプルを、Grom−Sil 300 Butyl−1Stカラム（粒径5μm、カラム寸法5mm×500μm）でオンライン脱塩した後、HPLC−ESI−TOF（Impact HD、Bruker Daltonik）を用いて質量分析法により分析した。流量は5μl／minで、以下の移動相系を用いた：移動相A：水中の0．1％ギ酸、移動相B：80％イソプロパノール、10％アセトニトリルおよび10％水中の0．1％ギ酸；勾配：0min 22％ B、8min 22％ B、10min 24％ B、12min 80％ B、18min 95％ B、27min 95％ B、30min 22％ B。
【００８０】
TIC（全イオンクロマトグラム）信号の得られたスペクトルを加え、MaxEntデコンボリューションに基づいて様々な種の分子量を計算した。軽鎖および重鎖（VH−CH1）ならびに共有結合したFAB断片の理論質量と得られた質量を比較することにより、FAB断片の所望の共有結合を明瞭に確認することができた。生じるスペクトルを図13に示す。
【００８１】
B．参考文献
AIMETTI，A．A．，FEAVER，K．R．＆ANSETH，K．S．，2010．Synthesis of cyclic，multivalent Arg−Gly−Asp using sequential thiol−ene／thiol−yne photoreactions．Chem Commun（Camb），46，5781−3．
【００８２】
BALDWIN，A．D．＆KIICK，K．L．，2011．Tunable degradation of maleimide−thiol adducts in reducing environments．Bioconjug Chem，22，1946−53．
【００８３】
CASTANEDA，L．，MARUANI，A．，SCHUMACHER，F．F．，MIRANDA，E．，CHUDASAMA，V．，CHESTER，K．A．，BAKER，J．R．，SMITH，M．E．＆CADDICK，S．，2013．Acid−cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibody−drug conjugation．Chem Commun（Camb），49，8187−9．
【００８４】
CHARI，R．V．，MILLER，M．L．＆WIDDISON，W．C．，2014．Antibody−drug conjugates：an emerging concept in cancer therapy．Angew Chem Int Ed Engl，53，3796−827．
【００８５】
FLYGARE，J．A．，PILLOW，T．H．＆ARISTOFF，P．，2013．Antibody−drug conjugates for the treatment of cancer．Chem Biol Drug Des，81，113−21．
【００８６】
GARNETT，M．C．，2001．Targeted drug conjugates：principles and progress．Adv Drug Deliv Rev，53，171−216．
【００８７】
GERONA−NAVARRO，G．，YOEL，R．，MUJTABA，S．，FRASCA，A．，PATEL，J．，ZENG，L．，PLOTNIKOV，A．N．，OSMAN，R．＆ZHOU，M．M．，2011．Rational design of cyclic peptide modulators of the transcriptional coactivator CBP：a new class of p53 inhibitors．J Am Chem Soc，133，2040−3．
【００８８】
GHOSH，S．S．，KAO，P．M．，MCCUE，A．W．＆CHAPPELLE，H．L．，1990．Use of maleimide−thiol coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotide−enzyme conjugate hybridization probes．Bioconjug Chem，1，71−6．
【００８９】
GONG，T．，ADZIMA，B．J．＆BOWMAN，C．N．，2013．A novel copper containing photoinitiator，copper（II）acylphosphinate，and its application in both the photomediated CuAAC reaction and in atom transfer radical polymerization．Chem Commun（Camb），49，7950−2．
【００９０】
JONES，L．H．，MCKNIGHT，A．J．＆EDITORS，2013．Biotherapeutics：Recent Developments Using Chemical and Molecular Biology．［In：RSC Drug Discovery Ser．，2013；36］，RSC．
【００９１】
JONES，M．W．，STRICKLAND，R．A．，SCHUMACHER，F．F．，CADDICK，S．，BAKER，J．R．，GIBSON，M．I．＆HADDLETON，D．M．，2012．Polymeric dibromomaleimides as extremely efficient disulfide bridging bioconjugation and pegylation agents．J Am Chem Soc， 134， 1847−52．
【００９２】
KLINGUER−HAMOUR，C．，STROP，P．，SHAH，D．K．，DUCRY，L．，XU，A．＆BECK，A．，2014．WorldAntibody−DrugConjugateSummit，October 15−16，2013，San Francisco，CA．MAbs，6，18−29．
【００９３】
KRANNIG，K．−S．，HUANG，J．，HEISE，A．＆SCHLAAD，H．，2013．Photochemical thiol−yne functionalization of polypeptide scaffolds．Polymer Chemistry，4，3981−3986．
【００９４】
LIBERATORE，F．A．，COMEAU，R．D．，MCKEARIN，J．M．，PEARSON，D．A．，BELONGA，B．Q．，3RD，BROCCHINI，S．J．，KATH，J．，PHILLIPS，T．，OSWELL，K．＆LAWTON，R．G．，1990．Site−directed chemical modification and cross−linking of a monoclonal antibody using equilibrium transfer alkylating cross−link reagents．Bioconjug Chem，1，36−50．
【００９５】
LO CONTE，M．，PACIFICO，S．，CHAMBERY，A．，MARRA，A．＆DONDONI，A．，2010．Photoinduced addition of glycosyl thiols to alkynyl peptides：use of free−radical thiol−yne coupling for post−translational double−glycosylation of peptides．J Org Chem，75，4644−7．
【００９６】
LO CONTE，M．，STADERINI，S．，MARRA，A．，SANCHEZ−NAVARRO，M．，DAVIS，B．G．＆DONDONI，A．，2011．Multi−molecule reaction of serum albumin can occur through thiol−yne coupling．Chem Commun（Camb），47，11086−8．
【００９７】
MASSI，A．＆NANNI，D．，2012．Thiol−yne coupling：revisiting old concepts as a breakthrough for up−to−date applications．Org Biomol Chem，10，3791−807．
【００９８】
MILLER，L．W．＆CORNISH，V．W．，2005．Selective chemical labeling of proteins in living cells．Current Opinion in Chemical Biology，9，56−61．
【００９９】
MINOZZI，M．，MONESI，A．，NANNI，D．，SPAGNOLO，P．，MARCHETTI，N．＆MASSI，A．，2011．An insight into the radical thiol／yne coupling：the emergence of arylalkyne−tagged sugars for the direct photoinduced glycosylation of cysteine−containing peptides．J Org Chem，76，450−9．
【０１００】
RAMIL，C．P．＆LIN，Q．，2013．Bioorthogonal chemistry：strategies and recent developments．Chemical Communications，49，11007−11022．
【０１０１】
ROBERTS，M．J．，BENTLEY，M．D．＆HARRIS，J．M．，2002．Chemistry for peptide and protein PEGylation．Adv Drug Delivery Rev，54，459−476．
【０１０２】
SAPRA，P．，HOOPER，A．T．，O’DONNELL，C．J．＆GERBER，H．P．，2011．Investigational antibody drug conjugates for solid tumors．Expert Opin Investig Drugs，20，1131−49．
【０１０３】
SCHUMACHER，F．F．，SANCHANIA，V．A．，TOLNER，B．，WRIGHT，Z．V．，RYAN，C．P．，SMITH，M．E．，WARD，J．M．，CADDICK，S．，KAY，C．W．，AEPPLI，G．，CHESTER，K．A．＆BAKER，J．R．，2013．Homogeneous antibody fragment conjugation by disulfide bridging introduces ‘spinostics’．Sci Rep，3，1525．
【０１０４】
SHEN，B．Q．，XU，K．，LIU，L．，RAAB，H．，BHAKTA，S．，KENRICK，M．，PARSONS−REPONTE，K．L．，TIEN，J．，YU，S．F．，MAI，E．，LI，D．，TIBBITTS，J．，BAUDYS，J．，SAAD，O．M．，SCALES，S．J．，MCDONALD，P．J．，HASS，P．E．，EIGENBROT，C．，NGUYEN，T．，SOLIS，W．A．，FUJI，R．N．，FLAGELLA，K．M．，PATEL，D．，SPENCER，S．D．，KHAWLI，L．A．，EBENS，A．，WONG，W．L．，VANDLEN，R．，KAUR，S．，SLIWKOWSKI，M．X．，SCHELLER，R．H．，POLAKIS，P．＆JUNUTULA，J．R．，2012．Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody−drug conjugates．Nat Biotechnol，30，184−9．
【０１０５】
TIAN，F．，LU，Y．，MANIBUSAN，A．，SELLERS，A．，TRAN，H．，SUN，Y．，PHUONG，T．，BARNETT，R．，HEHLI，B．，SONG，F．，DEGUZMAN，M．J．，ENSARI，S．，PINKSTAFF，J．K．，SULLIVAN，L．M．，BIROC，S．L．，CHO，H．，SCHULTZ，P．G．，DIJOSEPH，J．，DOUGHER，M．，MA，D．，DUSHIN，R．，LEAL，M．，TCHISTIAKOVA，L．，FEYFANT，E．，GERBER，H．P．＆SAPRA，P．，2014．A general approach to site−specific antibody drug conjugates．Proc Natl Acad Sci USA，111，1766−71．
【０１０６】
TODA，N．，ASANO，S．＆BARBAS，C．F．，3RD，2013．Rapid，stable，chemoselective labeling of thiols with Julia−Kocienski−like reagents：A serum−stable alternative to maleimide−based protein conjugation．Angew Chem Int Ed Engl，52，12592−6．
【０１０７】
VERONESE，F．M．＆MERO，A．，2008．The impact of PEGylation on biological therapies．BioDrugs，22，315−29．
【０１０８】
WIDDISON，W．C．，WILHELM，S．D．，CAVANAGH，E．E．，WHITEMAN，K．R．，LEECE，B．A．，KOVTUN，Y．，GOLDMACHER，V．S．，XIE，H．，STEEVES，R．M．，LUTZ，R．J．，ZHAO，R．，WANG，L．，BLATTLER，W．A．＆CHARI，R．V．，2006．Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer．J Med Chem，49，4392−408．
【０１０９】
WU，A．M．＆SENTER，P．D．，2005．Arming antibodies：prospects and challenges for immunoconjugates．Nat Biotechnol，23，1137−46．
【０１１０】
ZHOU，W．，ZHENG，H．，LI，Y．＆LIU，H．，2010．Synthesis of sulfuric macrocycles and a rotaxane through thiol−yne click and dithiol coupling reactions．Org Lett，12，4078−81．
【図１】
2017520617.tif 000032
【図２】
2017520617.tif 000033
【図３】
2017520617.tif 000034
【図４】
2017520617.tif 000035
【図５】
2017520617.tif 000036
【図６】
2017520617.tif 000037
【図７】
2017520617.tif 000038
【図８】
2017520617.tif 000039
【図９】
2017520617.tif 000040
【図１０】
2017520617.tif 000041
【図１１】
2017520617.tif 000042
【図１２】
2017520617.tif 000043
【図１３】
2017520617.tif 000044
【国際調査報告】
2017520617.tif 000045
2017520617.tif 000046
2017520617.tif 000047
2017520617.tif 000048
2017520617.tif 000049
2017520617.tif 000050