(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SpoIIIE機能が損なわれた場合に前胞子区画内にトラップされるＤＮＡセグメント内に位置する第１リポーター遺伝子および該セグメントの外側に位置する第２リポーター遺伝子を有する染色体を有するバチルス株であるが、但し、各々のリポーターはプロモーターに連結されており且つ胞子形成の間はσFの作用に応答性である、バチルス株。
【請求項２】
各々のリポーター遺伝子が同じプロモーターに連結されている、請求項１記載のバチルス株。
【請求項３】
プロモーターがspoIIIGである、請求項２記載のバチルス株。
【請求項４】
リポーター遺伝子がLacZおよびuidAである、請求項１ないし３のいずれか１項記載のバチルス株。
【請求項５】
バチルスサチルス株である、請求項１ないし４のいずれか１項記載のバチルス株。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項記載のバチルス株を誘導して薬剤の存在下において胞子形成させて、第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察することからなる、バチルス種においてSpoIIIE機能を阻害する薬剤を測定するための方法。
【請求項７】
２つのリポーター遺伝子が酵素として発現されて、それらの活性が蛍光計により観察される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
マイクロタイタープレートのウエル中にて消耗培地（exhaustion medium）中でバチルス株のサンプルを培養して、次に、細胞を溶解して、２つの酵素の蛍光原基質をウエルに加える、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
背景
バチルスサチルスのspoIIIE遺伝子内の複数の変異が、それらの胞子形成に対する作用により最初に同定されたが、それらは完全に壊滅させる（１）。初期の研究は、SpoIIIEが胞子形成の間の遺伝子発現の制御に関与することを示唆してきたが（２）、我々は、最近、spoIIIE変異細胞中の初期の欠損により、前胞子（prespore）染色体から小さな極性前胞子区画への区画化が行えなくなることを見いだした（３）。その変異体においては、前胞子の染色体のほんの小さな部分（約30％）が前胞子に入り、残りは母細胞に残される。胞子形成の間の遺伝子発現に対する古典的なspoIIIE36変異の効果は、該変異が前胞子区画への遺伝子の侵入を阻害すると推測することにより説明されうる。Wuら（３）により示されたSpoIIIE作用のモデルも、遺伝子発現に対するspoIIIE変異の効果に関して以前に記載した、この興味ある染色体位置作用を説明する（４）。該変異体において前胞子区画へ入るＤＮＡの小さな部分は特別のものであり、よって、この領域に位置する遺伝子は正常に発現されるらしい。染色体のどこか別なところに置かれた同じリポーター遺伝子は完全に不活性であるが、なぜならば該遺伝子は前胞子への接近を得ることがないからである。
我々が知る限り、他の如何なる変異もspoIIIE様の表現型を生じない。該蛋白質の機能上の研究から、それは発生期の胞子隔壁中において胞子様チャンネルを形成することにより作用し、それにより前胞子染色体は、配合体（conjugation）様の機構により作動（drive in)する(５）。spoIIIE変異は栄養成長に対する明らかな効果を有さないが、この研究室における最近の研究は、染色体制御の正常な機構が損なわれたならば、該蛋白質は栄養成長の細胞において作用しうることを明らかにした（６）。この機構は、まだ不明確な様式ではあるが、隔壁が形成される前に１ラウンドのＤＮＡ複製の生成物を分離するように働く。しかしながら、例えばナリジキシン酸のような阻害剤により複製が遅延すれば、不完全に複製された核様体（nucleoide）の回りで隔壁は閉じうる。機能的spoIIIE遺伝子の存在下において、そのような細胞はこの状態から回復することができ、そして娘の核様体は分割隔壁のいずれかの側に位置することになる。隔壁によりトラップ（trap）された核様体を有するspoIIIE変異体細胞は回収することができず、そして、核様体は永久にトラップされるように見える（６）。バチルスサチルスの場合、spoIIIE欠損は、ナリジキシン酸およびマイトマイシンＣのような薬剤に対する耐性における約２倍の低下が現れる（６）。
SpoIIIEの生育期の役割の発見は、おそらく、なぜ該遺伝子が真正細菌の別種のメンバー［例えば、コキシエラブルネッティ（Coxiella burnetii）（７）およびカンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）（８）］において広範囲によく保存されているらしいのかを説明する。その役割は、通常は生育期のバチルスサチルスにおける初期区画化機構に対して補助的であるが、他のバクテリアにおいてはより重要性を有するかもしれない。特に、我々は、発生期の核様体が正常な条件において隔壁によりいっそうトラップされるらしい場合に、バクテリア、例えばコクシジアおよび短い杆菌中のこの機能に関してのより重要な役割を予測するかもしれない。エンテロコッカスに関する少なくとも一つの初期の報告は、この考えを支持するらしい。
発明
SpoIIIEが不活性化される場合に現れる唯一の胞子形成表現型は、さまざまな有力な特異的アッセイに関する潜在性を提供する。機能性SpoIIIEの不在下において、染色体は、前胞子区画の、一部には内部、一部には外部でトラップされるが、前胞子特異的転写因子であるσFは正常に活性化される。σFに依存性のリポーター遺伝子は染色体の特定の位置に位置するならば発現され、そして外の場所に位置するならばブロックされる。
本発明の一つの側面において、それぞれ、プロモーターに連結しており、且つ胞子形成の間にσFの作用に応答性である２つのリポーター遺伝子を有する染色体を有するバチルス株を提供するが、第１のリポーター遺伝子は、SpoIIIE機能が損なわれている場合に、前胞子区画においてトラップされるＤＮＡのセグメント中に位置し、そして第２のリポーター遺伝子は上記セグメントの外側に位置する。
他の側面において、本発明は、薬剤がバチルス種のSpoIIIE機能を阻害するか否かを測定する方法を提供するが、該方法は、該薬剤の存在下で胞子形成すると定義されたバチルス株を誘導し、そして第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察することからなる。バチルス種においてSpoIIIE機能を阻害する特性は該薬剤中の活動的または潜在的抗微生物特性の示唆であると考えられる。即ち、この方法は可能性のある抗微生物薬剤をスクリーニングするのに有用であると予測される。
適切な条件下で胞子形成することができて、且つ遺伝子構築物を作成することができる、あらゆるバチルス種を用いてよい。バチルスサチルスは入手に都合よく、よく特徴付けられており、好ましい。
構築されたバチルス株は、それぞれ、プロモーターに連結しており、且つ胞子形成の間にσFの作用に応答性である２つのリポーター遺伝子を有する染色体を有する。リポーター遺伝子は、発現により容易に検出されるかまたは観察される表現型を生じるものである。例えば、発現された蛋白質は、例えば容易に観察される産物を生じる基質に作用する酵素であってよいが、なぜなら、それは発色するかまたは蛍光の化学発光であるからである。バチルス種の中で発現されることが可能なリポーター遺伝子はよく知られており、文献に記載されている。リポーター遺伝子が好ましく選択されることにより、それらの産物は同時に容易にアッセイされうる。lacZは、バチルスサチルス中において10年以上使用されて成功している。βガラクトシダーゼによる加水分解に際して、発色または発光産物を生じる、広範囲の有用な基質がある。エシェリヒアコリのuid遺伝子は同様の目的に最近利用されてきており、該遺伝子産物、β−グルコロニダーゼに利用可能な基質の範囲はβ−ガラクトシダーゼと同様である。
以下の実施例においては、２つの異なる蛍光原基質を用いることにより、単一反応において同時に２つのリポーターの活性をアッセイする。
各々のリポーター遺伝子は、胞子形成の間に前胞子形成特異的転写因子σFの作用に応答性のプロモーターに対して、機能するように連結される。両方の遺伝子に関して同じプロモーターを使用するのも都合よいが、必須ではない。適切なプロモーターは、gprおよびspoIIIG遺伝子のプロモーターを含む。
２つのリポーター遺伝子のうち、第１はSpoIIIE機能が損なわれる場合に前胞子区画にトラップされるＤＮＡのセグメント中に位置し、一方、第２は該セグメントの外側に位置する。10時から２時にわたる陰の部分としてトラップされたセグメントを示す染色体地図を示す、図１に注意を向ける。より完全な議論のためには、Wu et al（３）を参照する。
本発明のアッセイ方法は、仮想抗微生物薬剤の存在下で胞子形成することが記載されたバチルス株を誘導することを含む。大規模に潜在的な阻害剤をスクリーンするために、該バチルス株のサンプルを、マイクロタイタープレートのウエル中の胞子形成を刺激する消耗培地（exhaustion medium）中に入れてよい。その後、第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察する。例えば、２つのリポーター遺伝子の発現産物が異なる酵素である場合、２つの酵素の基質をマイクロタイタープレートのウエルに加えてよく、そして、例えば酵素活性の化学発光または蛍光あるいは発色産物を観察する。
本発明に従うアッセイ法を示すフローチャートである図３を参照する。バチルスサチルス細胞10は、２つのリポーター遺伝子挿入物を有する染色体12の２コピーを含むが、黒丸印14で示したlacZ遺伝子および暗い丸印16で示したuidA遺伝子であり、両者はσFプロモーターに融合している。胞子形成により細胞は２つの区画に分割して、母細胞区画18および前胞子20となり、隔壁22により分離される。胞子形成の過程は、２つのルートＡおよびＢの一方を採る。ルートＡにおいては、機能性spoIIIE遺伝子が完全染色体を前胞子区画に入れる。ルートＢにおいては、spoIIIE遺伝子が欠損しているかまたはその産物が抗微生物薬剤との接触の結果として阻害されており、そして染色体の小さな部分（約30％）のみが前胞子区画に入る。
前胞子形成特異的転写因子σFは、前胞子区画20において遺伝子の発現を引き起こすが、母細胞区画18においては引き起こさない。ルートＡにおいては、これがβ−ガラクトシダーゼ（lacZ遺伝子から）およびβ−グルコロニダーゼ（uidA遺伝子から）の生成をもたらす。ルートＢにおいては、β−ガラクトシダーゼのみが生成されてβ−グルコロニダーゼは生成されない。胞子形成後、細胞を例えばリゾチームにより溶解して酵素を不活性化して、２つの酵素の蛍光原基質を加える。酵素の何れかまたは両方の存在は、酵素活性の蛍光産物に適当な２つの異なる波長を受ける蛍光計セットにより、同時に検出されてよい。
SpoIIIEの不在下では、両リポーター遺伝子が活性化されて両蛍光産物が生産される。非特異的に胞子形成を阻害するかまたはσFが活性になるのを阻害するように作用する阻害剤は、両活性を消去させて何れの蛍光産物も生産されない。SpoIIIEの特異的阻害剤はσFの活性化に効果を示さないが、σFがリポーターの一方の転写を指示することを阻害するはずであり、一方のみの蛍光産物が生産されるはずである。２つの蛍光の比を変える物質（仮想抗微生物薬剤）を、より詳細に再試験することができる。
実施例
バチルスサチルス株1206は、胞子形成の間σFの作用に応答性である２つのリポーター遺伝子を有する（図１）。spoIIIG’-’lacZ融合は選択可能なクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）により標識されてamyE遺伝子座に置かれた。この遺伝子座は、SpoIIIE機能が損なわれた際に前胞子にトラップされるＤＮＡのセグメント中にある（Wu et al，1994）。この融合は、SpoIIIE機能が損なわれた際においてさえ、前胞子形成特異的シグマ因子σFにより指示される転写に利用可能であるべきである。第２のリポーター遺伝子はspoIIIG’-uidA融合であり、エリスロマイシン耐性遺伝子ermを付加する。この融合はspoIIIG遺伝子座に置かれたが、該遺伝子座はspoIIIE変異体の存在下でトラップされるＤＮＡのセグメントの外側に位置する（図１）。その発現は、即ち、SpoIIIE機能が損なわれる場合にブロックされるべきである。
バチルスサチルスのspoIIIE+株（株1206）において、これらの機能は胞子形成の開始後まもなく、共に強く誘導される（図２）。これは、両リポーター遺伝子が利用可能な場合に前胞子中でσFが正常に活性化されるため、予測される。β−ガラクトシダーゼ活性を与えるlacZへの融合は、spoIIIE36変異の存在下にて依然発現され（株1207）、SpoIIIE機能をブロックする。しかしながら、β−グルコロニダーゼの合成は阻害されるが、なぜなら、uidAへの融合物は、σF活性化を生じた前胞子区画へ侵入できないからである。我々は、何故β−ガラクトシダーゼ活性が高く、且つspoIIIE36変異の存在下でまもなく出現するのかを理解できないが、これは２つの株の挙動の差異を強調するためにのみ働く。
これらの結果は、株1206が、SpoIIIE機能を特異的に損なわせる化合物を同定する、感受性アッセイ株を提供する。そのような化合物は、β−グルコロニダーゼの生成をもたらすであろう。これら２つの酵素の比は、上記概要のとおりに単一のアッセイ法において便利に測定することができる。
文  献
１．Piggot，P J and J G Coote，1976．バクテリアのエンドスポア形成の遺伝上の側面（Genetic aspects of bacterial endospore formation．）。Bact Revs．，40：908-962．
２．Foulger，D and J Errington，1989．バチルスサチルス内の前胞子形成特異的遺伝子発現の制御における胞子形成遺伝子spoIIIEの役割（The role of the sporulation gege spoIIIE in the regulation of prespore-specific gene expression in Bacillus subtilis．）。Mol．Microbiology，3：1247-1255．
３．Wu，L J and J Errington，1994．非対称細胞分割の間のＤＮＡ分離に必要なバチルスサチルスSpoIIIE蛋白質（Bacillus subtilis SpoIIIE protein required for DNA segregation during asymmetric cell division．）。Science 264：572-575．
４．Sun，D，P Fajardo-Cavazos，M D Sussman，F Tovar-Rojo，R M Cabrera-Martinez，and P Setlow，1991．バチルスサチルス遺伝子依存性の染色体位置効果およびＥσFによる転写（Effect of chromosome lpcation of Bacillus subtilis gene dependence and transcription by EσF：identification of features of good EσF-dependent promoters．）J．Bacteriol．173：7867-7874．
５．Wu，L J，P J Lewis，R Allmansberger，P Hauser and J Errington，1995．バチルスサチルスにおける胞子形成の間の前胞子染色体区画化のための配合体様機構（A conjugation-like mechanism for prespore chromosome partitioning during sporulation in Bacillus subtilis．）Genes and Development（印刷中）
６．Sharpe，M E and J Errington，1995．バクテリア中の染色体区画化の後区画化機構（Post-septational mechanism of chromosome partitioning in bacteria．PNAS（印刷中）
７．Oswald，W and D Thiele，1993．コキシエラブルネッティ中の胞子形成遺伝子（A sporulation gene in Coxiella burnetii．）J Vet Med，B 40：366-370．
８．Miller，S E C Pesci and C L Pickett，1994．カンピロバクタージェジュニのべん毛遺伝子fihAの上流領域の遺伝子編成（Genetic organisation of the region upstream from the Campylobacter jejuni flagellar gene fihA．）Gene，146：31-38．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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