(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の第１番目〜第１２番目で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１の第１番目〜第１３番目で表されるポリペプチドであって第１３番目のアミノ酸がCys-NH2に置換されているポリペプチドを特異的に認識する抗体を有効成分とする妊娠診断薬。
【請求項２】
前記抗体が配列番号：１の第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番目、第４７番目〜第５４番目、第４８番目〜第５４番目、第４９番目〜第５４番目または第５０番目〜第５４番目で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１のアミノ酸配列の第３８番目〜第５４番目のアミノ酸配列であって第３８番目のアミノ酸がCysに置換されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識しない、請求項１記載の妊娠診断薬。
【請求項３】
前記抗体が標識化された請求項１記載の妊娠診断薬。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１記載の妊娠診断薬。
【請求項５】
ＫＩＳ−１Ｎ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２９）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＫＩＳ−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号：１の第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番目、第４７番目〜第５４番目または第４８番目〜第５４番目で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１のアミノ酸配列の第３８番目〜第５４番目のアミノ酸配列であって第３８番目のアミノ酸がCysに置換されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体を有効成分とする妊娠診断薬。
【請求項７】
前記抗体が配列番号：１の第１番目〜第３番目、第１番目〜第４番目、第１番目〜第５番目、第１番目〜第６番目、第１番目〜第７番目、第１番目〜第８番目または第１番目〜第１２番目で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号：１の第１番目〜第１３番目で表されるポリペプチドであって第１３番目のアミノ酸がCys-NH2に置換されているポリペプチドを認識しない請求項６記載の妊娠診断薬。
【請求項８】
前記抗体が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対して中和活性を有する請求項６記載の妊娠診断薬。
【請求項９】
前記抗体が標識化された請求項８記載の妊娠診断薬。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６記載の妊娠診断薬。
【請求項１１】
ＫＩＳ−１Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３０）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＫＩＳ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１１記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項１３】
請求項５または／および請求項１１記載の抗体を含有してなる妊娠診断薬。
【請求項１４】
請求項５記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの定量法。
【請求項１５】
さらに請求項１１記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１４記載の定量法。
【請求項１６】
請求項５記載の抗体を用いて、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの血中における濃度を生体外で測定する工程を包含する、妊娠の検査方法。
【請求項１７】
さらに請求項１１記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１６記載の検査方法。
【請求項１８】
請求項１１記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの定量法。
【請求項１９】
請求項１１記載の抗体を用いて、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの血中における濃度を生体外で測定する工程を包含する、妊娠の検査方法。
【請求項２０】
請求項５または請求項１１記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドの割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの定量法。
【請求項２１】
（１）担体上に不溶化した請求項５記載の抗体、標識化された請求項１１記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定する、または、（２）担体上に不溶化した請求項１１記載の抗体、標識化された請求項５記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの定量法。
【請求項２２】
ＫＩＳ−１Ｎ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２９）で標示されるハイブリドーマ細胞。
【請求項２３】
ＫＩＳ−１Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３０）で標示されるハイブリドーマ細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体に結合特異性を有する新規な抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づく該ポリペプチドまたはその誘導体の定量法、中和活性を利用する該ポリペプチドまたはその誘導体が関与する疾患（癌等）の診断および予防・治療剤の開発に有用な抗体などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ヒトMetastinと称することもある）は、オーファンＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（hOT7T175）に対するリガンドとして、ヒト胎盤より見出された新規ペプチドである。ヒトMetastinは、癌転移抑制遺伝子ＫｉＳＳ−１にコードされていることより癌転移抑制活性を有するとされている（非特許文献１  Nature, 411, 613-617 (2001)；特許文献１  ＷＯ ００／２４８９０；特開２０００−３１２５９０）。hOT7T175を強制発現させたB16メラノーマ（B16 melanoma）を用いたマウスでの自然転移モデル系において、ヒトMetastinを投与することにより、転移数の有意な減少がみられ、ヒトMetastinが生体内においても転移抑制活性を示すことが明らかとなった。また、ヒトMetastin誘導体のhOT7T175発現チャイニーズハムスターオバリー（以下「ＣＨＯ」とも記載する。）細胞に対する[Ca2+]濃度の上昇を指標とした系から、ヒトMetastinは、アミノ酸配列の第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するペプチドと同等の活性を示し、Ｃ末端部のアミド構造がその活性に重要であると考えられている。また、ヒトMetastinは、動物実験においては癌転移抑制作用を示したが、ヒトでの臨床癌に対する作用およびその生理的意義についてはさらに詳細な研究が必要である。
【０００３】
【非特許文献１】
Nature, 411巻, 613-617頁, 2001年
【特許文献１】
ＷＯ ００／２４８９０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトMetastinを効果的に定量する方法は確立されておらず、従って、ヒトMetastinの生理作用を解明するために、ヒトMetastinを簡便かつ高感度に検出・定量する測定系が切望されていた。
本発明は、ヒトMetastinまたはその誘導体を感度よく特異的に定量することができる抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、および該抗体を用いるヒトMetastinまたはその誘導体の検出・定量法、およびこれらを用いた診断薬（例えば、妊娠診断薬）を提供することを主な目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側およびＣ端側を特異的に認識する複数のモノクローナル抗体を作製し、これら抗体を用いることによりヒトMetastinまたはその誘導体を高感度に検出・定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドーマ細胞の製造法、該抗体を用いた競合法あるいはサンドイッチ法によるヒトMetastinおよびその誘導体の免疫測定法に関する。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（２）Ｎ端側の部分ペプチドが配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目〜第１２番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）記載の抗体、
（３）Ｎ端側の部分ペプチドが配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目〜第３番目、第１番目〜第４番目、第１番目〜第５番目、第１番目〜第６番目、第１番目〜第７番目、第１番目〜第８番目または第１番目〜第１２番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）記載の抗体、
（４）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドを認識しない上記（１）記載の抗体、
（５）標識化された上記（１）記載の抗体、
（６）モノクローナル抗体である上記（１）記載の抗体、
（７）ＫＩＳ−１Ｎ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２９）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＫＩＳ−１Ｎａで標示される上記（６）記載のモノクローナル抗体、
（８）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（９）Ｃ端側の部分ペプチドが配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（８）記載の抗体、
（１０）Ｃ端側の部分ペプチドが配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番目、第４７番目〜第５４番目、第４８番目〜第５４番目、第４９番目〜第５４番目または第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（８）記載の抗体、
（１１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識しない上記（８）記載の抗体、
（１２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対して中和活性を有する上記（８）記載の抗体、
（１３）標識化された上記（８）記載の抗体、
（１４）モノクローナル抗体である上記（８）記載の抗体、
（１５）ＫＩＳ−１Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３０）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＫＩＳ−１Ｃａで標示される上記（１４）記載のモノクローナル抗体、
（１６）上記（１）または上記（８）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１７）上記（１）または／および上記（８）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１８）上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
（１９）さらに上記（８）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１８）記載の定量法、
（２０）上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体が関与する疾患の診断法、
（２１）上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする妊娠の診断法、
（２２）さらに上記（８）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（２０）または（２１）記載の診断法、
（２３）上記（８）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
（２４）上記（８）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体が関与する疾患の診断法、
（２５）上記（８）記載の抗体を用いることを特徴とする妊娠の診断法、
（２６）上記（１）または上記（８）記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
（２７）（１）担体上に不溶化した上記（１）記載の抗体、標識化された上記（８）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定する、または（２）担体上に不溶化した上記（８）記載の抗体、標識化された上記（１）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
（２８）上記（６）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（２９）ＫＩＳ−１Ｎ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２９）で標示される上記（２８）記載のハイブリドーマ細胞、
（３０）上記（２８）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（６）記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記（６）記載のモノクローナル抗体の製造法、
（３１）上記（１４）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（３２）ＫＩＳ−１Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３０）で標示される上記（３１）記載のハイブリドーマ細胞、
（３３）上記（３１）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（１４）記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記（１４）記載のモノクローナル抗体の製造法等に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、
（i）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（ii）ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドを認識しない上記（１）記載の抗体、
（iii）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に反応する上記（８）記載の抗体、
（iv）ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識しない上記（８）記載の抗体、
（v）上記（１）または上記（８）記載の抗体と、被検液および標識化されたヒトMetastinまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたヒトMetastinまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする、被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体の定量法、
（vi）担体上に不溶化した上記（１）記載の抗体、標識化された上記（８）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体の定量法、
（vii）担体上に不溶化した上記（８）記載の抗体、標識化された上記（１）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体の定量法なども提供する。
【０００８】
本明細書におけるタンパク質（ポリペプチド）は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。
本発明で用いられるヒトMetastinの誘導体としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が置換可能な基によって置換されたものなどが挙げられる。
本発明で用いられるヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドまたはＣ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、その一部のアミノ酸残基が欠失したもの、その一部のアミノ酸残基が欠失し、かつ一部のアミノ酸残基が置換可能な基（例、Ｃｙｓ、水酸基など）によって置換されたものなどが挙げられ、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側のアミノ酸が約４０〜５０残基欠失したもの、ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側のアミノ酸が約４５〜５１残基欠失したものなどが用いられる。
【０００９】
具体的には、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドとして、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
（i）第１番目〜第３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第１番目〜第５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第１番目〜第６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１番目〜第７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第１番目〜第１２番目のアミノ酸配列を有するペプチドおよび
（viii）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものなどが、
ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドとして、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
（i）第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第４６番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第４７番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第４９番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、および
（vii）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものなどがそれぞれ挙げられる。
【００１０】
本発明のヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、例えばヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目〜第１３番目までのアミノ酸配列であり、かつこのアミノ酸配列の第１３番目を、Ｃｙｓ−ＮＨ2に置き換えたアミノ酸配列を有するポリペプチド［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）（配列番号：２）に特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。このうち好ましくは、ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドを認識しないものである。
好ましい具体例としては、ＫＩＳ−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体が挙げられる。
さらに、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトMetastinの（i）第１番目〜第３番目のアミノ酸配列、（ii）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列、（iii）第１番目〜第５番目のアミノ酸配列、（iv）第１番目〜第６番目のアミノ酸配列、（v）第１番目〜第７番目のアミノ酸配列、（vi）第１番目〜第８番目のアミノ酸配列または（vii）第１番目〜第１２番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
【００１１】
本発明のヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、例えばヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第３８番目〜第５４番目までのアミノ酸配列であり、かつこのアミノ酸配列の第３８番目をＣｙｓに置き換えたアミノ酸配列を有するポリペプチド［Cys38］ヒトMetastin（38-54）（配列番号：３）に特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。このうち好ましくは、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識しないものである。さらに好ましくは、ヒトMetastinの活性を中和する抗体である。例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対して中和活性を有する抗体が挙げられる。
好ましい具体例としては、ＫＩＳ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体が挙げられる。
さらに、ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトMetastinの（i）第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列、（ii）第４６番目〜第５４番目のアミノ酸配列、（iii）第４７番目〜第５４番目のアミノ酸配列、（iv）第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配列、（v）第４９番目〜第５４番目のアミノ酸配列または（vi）第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
【００１２】
以下に、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体またはヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（以下、両者をあわせて本発明の抗体と称することもある）の抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えばヒトMetastinまたはその誘導体と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する合成ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単にMetastin抗原と称することもある）。
ヒトMetastinまたはその誘導体は、（ａ）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）ヒトMetastinまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造される。
（ａ）該哺乳動物の組織または細胞からMetastin抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
（ｂ）化学的にMetastin抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述した天然より精製したMetastin抗原と同一の構造を有するもの、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いてヒトMetastinまたはその誘導体を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning（2nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作成することができる。該クローニング方法とは、（１）ヒトMetastinまたはその誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法によりヒトMetastinまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または（２）ヒトMetastinまたはその誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法によりヒトMetastinまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
【００１３】
Metastin抗原としてのペプチドは、（１）公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の▲１▼〜▲２▼に記載された方法等が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１４】
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
【００１５】
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００１６】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００１７】
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
Metastin抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、Metastin抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）とMetastin抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させたMetastin抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【００１９】
（２）モノクローナル抗体の作製
Metastin抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、Metastin抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗Metastinモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗Metastin抗体価の測定は、例えば後記の標識化Metastinと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256巻、495頁（1975年）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００２０】
抗ヒトMetastin抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばヒトMetastinまたはその誘導体あるいはそれらの部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ヒトMetastinモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したヒトMetastinを加え、固相に結合したヒトMetastinモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。抗ヒトMetastinモノクローナル抗体のスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ヒトMetastin抗体価の測定と同様にして測定できる。
抗ヒトMetastinモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
【００２１】
なお、ヒトMetastinの一部領域と反応する抗ヒトMetastin抗体を産生するハイブリドーマおよび、ヒトMetastinとは反応するがその一部領域とは反応しない抗ヒトMetastinモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、たとえばその一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。
【００２２】
以下に本発明のヒトMetastinまたはその誘導体の定量法（免疫測定法）について、より詳細に説明する。
本発明の抗体を用いることにより、ヒトMetastinの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ヒトMetastin量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法が、特にサンドイッチ法が好ましい。
【００２３】
（１）サンドイッチ法
担体上に不溶化した本発明の抗体、標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することにより被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体を定量する。
好ましくは、
（i）担体上に不溶化したヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体の定量法、
（ii）担体上に不溶化したヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体の定量法などが挙げられる。
さらに好ましくは、ヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、ＫＩＳ−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体で、ヒトMetastinまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、ＫＩＳ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体である定量法である。
【００２４】
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検液を反応（１次反応）させ、さらに標識化された本発明の抗体を反応（２次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のヒトMetastin量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法によるヒトMetastinの測定法においては、例えば、１次反応で用いられる抗体がヒトMetastinまたたその誘導体のＣ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体はＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｎ端側）を認識する抗体が好ましく、１次反応で用いられる抗体がヒトMetastinまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体は、Ｎ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｃ端側）を認識する抗体が好ましく用いられる。
具体例としては、［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）を免疫原として作製したモノクローナル抗体と、［Cys38］ヒトMetastin（38-54）を免疫原として作製したモノクローナル抗体とが用いられる。これらの抗体は、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ（horseradish peroxidase；HRP）で標識化されて用いられる。
【００２５】
（２）競合法
本発明の抗体、被検液および標識化されたヒトMetastinまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたヒトMetastinまたはその誘導体の割合を測定することにより、被検液中のヒトMetastinまたはその誘導体を定量する。
本反応法は、例えば、固相化法を用いて行う。
具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレートに、i)本発明の抗体（例、ＫＩＳ−１ＮａまたはＫＩＳ−１Ｃａ）、ii）horseradish peroxidase（HRP）で標識化された配列番号：２または配列番号：３で表わされるペプチド、およびiii）被検液を添加し、反応後、固相に吸着したＨＲＰ活性を測定し、ヒトMetastinを定量する。
（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００２６】
上記（１）〜（４）において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば 125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えばフルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
【００２７】
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてMetastinの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる［例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法によりMetastinの測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、本発明の抗体は、ヒトMetastinまたはその誘導体を感度良く定量することができるので、ヒトMetastinの生理機能の解明およびヒトMetastinの関与する疾患の診断に有用である。具体的には、本発明の抗体を用いて、体液中（血液、血漿、血清、尿など）に含まれるヒトMetastinまたはその誘導体の量を測定することにより、ヒトMetastinまたはその誘導体が関与する疾患〔例、癌（例、皮膚癌、乳癌、大腸癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、子宮頚部癌など）、妊娠中毒症、胎盤発育不全、切迫流産、子宮内膜症、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群など〕または妊娠などを診断することができる。例えば、妊娠の診断においては、体液中のヒトMetastinを定量し、ヒトMetastinの量が非妊娠時より多い場合、例えば、血中濃度として約１５ｆｍｏｌ／ｍｌ以上、好ましくは約２０ｆｍｏｌ／ｍｌ以上の場合、妊娠と診断する。
【００２８】
また、本発明の抗体は、ヒトMetastinまたはその誘導体が関与する疾患〔例、癌（例、皮膚癌、乳癌、大腸癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、子宮頚部癌など）、妊娠中毒症、胎盤発育不全、切迫流産、子宮内膜症、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群など〕の予防・治療剤として使用することができる。さらに、早産防止、陣痛緩和にも有用である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、経口投与するのが好都合である。非経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００２９】
本発明の明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＰＡＭ      ：フェニルアセタミドメチル
Ｂｏｃ      ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ    ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ    ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
Ｂг−Ｚ    ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル
Ｂｚｌ      ：ベンジル
Ｃｌ−Ｂｚｌ：２−クロロ−ベンジル
ＯｃＨｅｘ  ：シクロヘキシルエステル
ＯＢｚｌ    ：ベンジルエステル
Ｔｏｓ      ：ｐ−トルエンスルホニル
ＨＯＮＢ    ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド
ＨＯＢｔ    ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＯＢｔ  ：３−ヒドロキシ−３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＭｅＢｚｌ  ：４−メチルベンジル
Ｂｏｍ      ：ベンジルオキシメチル
Ｂｕｍ      ：ｔ−ブトキシメチル
Ｔｒｔ      ：トリチル
ＤＮＰ      ：ジニトロフェニル
ＴＦＡ      ：トリフルオロ酢酸
ＤＭＦ      ：Ｎ,Ｎ−ジメチルフォルムアミド
ＤＣＭ      ：ジクロロメタン
ＤＣＣ      ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＢＨＡ      ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ  ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
ＣＨＯ      ：ホルミル
Ｇｌｙ      ：グリシン
Ａｌａ      ：アラニン
Ｖａｌ      ：バリン
Ｌｅｕ      ：ロイシン
Ｉｌｅ      ：イソロイシン
Ｓｅｒ      ：セリン
Ｔｈｒ      ：スレオニン
Ｃｙｓ      ：システイン
Ｍｅｔ      ：メチオニン
Ｇｌｕ      ：グルタミン酸
Ａｓｐ      ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ      ：リジン
Ａｒｇ      ：アルギニン
Ｈｉｓ      ：ヒスチジン
Ｐｈｅ      ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ      ：チロシン
Ｔｒｐ      ：トリプトファン
Ｐｒｏ      ：プロリン
Ａｓｎ      ：アスパラギン
Ｇｌｎ      ：グルタミン
PyBOP      ：ベンゾトリアゾリールオキシ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト
PyBrop     ：ブロモトリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト
HOAｔ      ：１−ヒドロキシ−７−アゾベンゾトリアゾール
DIEA       ：ジイソプロピルエチルアミン
But         ：ｔ−ブチル
PhSMe      ：チオアニソール
TIS        ：トリイソプロピルシラン
EDT        ：エタンジチオール
【００３０】
本明細書において用いられる配列番号は、以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１〕
ヒトMetastinのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：２〕
実験例２で製造された［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）のアミノ酸配列を表す。（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目〜第１３番目までのアミノ酸配列であり、かつこのアミノ酸配列の第１３番目を、Ｃｙｓ−ＮＨ2に置き換えたものである。）
〔配列番号：３〕
実験例３で製造された［Cys38］ヒトMetastin（38-54）のアミノ酸配列を表す。（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第３８番目〜第５４番目までのアミノ酸配列であり、かつこのアミノ酸配列の第３８番目をＣｙｓに置き換えたものである。）
〔配列番号：４〕
実験例４で製造されたヒトMetastin（1-54)-OHのアミノ酸配列を表す。（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第５４番目の置換基であるアミノ基を水酸基に置き換えたものである。）
〔配列番号：５〕
実験例５で製造されたヒトMetastin（40-54）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：６〕
実験例６で製造されたヒトMetastin（45-54）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：７〕
実験例７で製造されたヒトMetastin（46-54）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：８〕
実験例８で製造されたヒトMetastin（47-54）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：９〕
実験例９で製造されたヒトMetastin（48-54）のアミノ酸配列を表す。
【００３１】
後述の実施例で得られたハイブリドーマ細胞ＫＩＳ−１Ｎは、平成１３（２００１）年１月１２日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧：経済産業省技術総合研究所生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２９として寄託されている。
後述の実施例で得られたハイブリドーマ細胞ＫＩＳ−１Ｃは、平成１３（２００１）年１月１２日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧：経済産業省技術総合研究所生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３０として寄託されている。
なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に「ａ」を付けた形で表す。
【００３２】
【実施例】
以下に、実験例および実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実験例１
ヒトMetastin（配列番号：１）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Glu(OcHex), Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Gln, Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Ile, Boc-Gln, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-His(Bom), Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Gln, Boc-Gln, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Ser(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Glu(OcHex), Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Glyを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.1ｇをp-クレゾール1 ml、1,4-ブタンジチオール1 mlと共に無水フッ化水素10 ml中、０℃にて６０分撹袢した後、フッ化水素を減圧留去した後、残留物へジエチルエーテルを加え、沈殿を濾過した。この沈殿に５０％酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、５０％酢酸水で充填したセファデックス（商標）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末33ｍｇを得た。半量をＣＭセルロファイン（登録商標）を充填したカラム（1ｘ1cm）につけCH3CONH4濃度勾配で溶出し主要画分をあつめ、Li Chroprep（商標）RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm）に付け0.1%TFA水  200mlで洗浄し、0.1%TFA水  300mlと0.1%TFA含有33%アセトニトリル水  300mlを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド2.2 mgを得た。得られたペプチドを質量分析により分析した。質量分析による(M+H)+は、5858.5ダルトンであった。(計算値 5858.5ダルトン)
精製条件：
HPLC溶出時間  9.7分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００３３】
実験例２
［Cys13-NH2］ヒトMetastin (1-13)（配列番号：２）の製造
サイバーアミドレジン（Sieber amide resin（登録商標））403 mg に 5% ピペリジン（piperidine）/ DCM / DMF (1 / 1) 10 mL を加え、１０分間振盪後、20% piperidine / DMF 10 mL に換え、さらに20分間振盪した。Fmoc-Cys(Trt) 439 mg、PyBOP 390 mg、HOBt 101 mg、DIEA 393 mL、DMF 5 mL を加え、１時間振盪した。樹脂を洗浄後 Fmoc-Cys(Trt) 439 mg、PyBrop 350 mg、HOAt 102 mg、DIEA 393 mL 、DMF 5 mLを加え、１時間振盪した。樹脂を洗浄後、Ac2O 118 mL、DIEA 87 mL、DCM 5 mLを加え、１時間振盪後樹脂を洗浄してFmoc-Cys(Trt)-Sieber amide resin を得た。この樹脂へのFmoc-Cys(Trt)導入量は 0.43 mmol / gであった。
この樹脂を出発物質とし、目的ペプチドのアミノ酸配列順にFmoc保護アミノ酸誘導体をABI 433Aペプチド合成機を用いて縮合してペプチド鎖の伸長を行い、Fmoc-GlyThr(But)Ser(But)LeuSer(But)LeuSer(But)ProProProGlu(OBut)Ser(But)Ser(But)GlyCys(Trt)-Sieber amide resin樹脂 726 mgを得た。次いでこの樹脂 218 mgに、20% piperidine / DMF 5 mLを加え、３０分振盪した。樹脂を洗浄後、TFA / PhSMe / m-cresol / TIS / EDT (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5) 2 mLを加え、２時間振盪した。樹脂を濾過し除去後、エーテルで洗浄し沈殿を得（71.2 mg）、そのうち 25 mgをＨＰＬＣにより精製を行い、目的物 13.4 mgを得た。得られたペプチドの質量分析を行った。質量分析による(M+H)+は、1217.3ダルトンであった。（計算値 1217.5ダルトン）
精製条件：
HPLC溶出時間：12.7分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18 HG   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 100/0〜30/70へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：1.0 ml / 分
【００３４】
実験例３
［Cys38］ヒトMetastin（38-54）（配列番号：３）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex), Boc-Lys(Cl-Z)，Boc-Glu(OcHex),  Boc-Cys(4MeBzl)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.23ｇをp-クレゾール1 ml、1,4-ブタンジチオール1.2 mlと共に無水フッ化水素10 ml中、０℃、６０分撹袢した後、フッ化水素を減圧留去した後、残留物へジエチルエーテルを加え沈殿を濾過した。この沈殿に５０％酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、５０％酢酸水で充填したセファデックス（商標）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末98ｍｇを得た。20ｍｇをLi Chroprep（商標）RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm）に付け0.1%TFA水200mlで洗浄、0.1%TFA水300mlと0.1%TFA含有40%アセトニトリル水300mlを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド7mgを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+ は、2102.1ダルトンであった(計算値 2101.99ダルトン)。
精製条件：
HPLC溶出時間：10.3分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 80/20〜60/40へ直線型濃度勾配溶出（１０分）
流速：1.0 ml / 分
【００３５】
実験例４
ヒトMetastin（1-54）OH（配列番号：４）の製造
市販Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Glu(OcHex), Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Gln, Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Ile, Boc-Gln, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-His(Bom), Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Gln, Boc-Gln, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Ser(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Glu(OcHex), Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Glyを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。これを配列番号1のペプチド製造と同様に処理し目的のペプチドを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+は、5859.3ダルトンであった(計算値 5859.6ダルトン)。
精製条件：
HPLC溶出時間：10.0分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００３６】
実験例５
ヒトMetastin（40-54）（配列番号：５）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex), Boc-Lys(Cl-Z)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.12ｇをp-クレゾール1 ml、1,4-ブタンジチオール1.2 mlと共に無水フッ化水素10 ml中、０℃、６０分撹袢した後、フッ化水素を減圧留去した後、残留物へジエチルエーテルを加え沈殿を濾過した。この沈殿に５０％酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、５０％酢酸水で充填したセファデックス（商標）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末４０ｍｇを得た。半量をLi Chroprep（商標）RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm）に付け0.1%TFA水  200mlで洗浄、0.1%TFA水  300mlと0.1%TFA含有33%アセトニトリル水  300mlを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド4.1 mgを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+は、1869.9ダルトンであった。(計算値 1969.9ダルトン)
精製条件：
HPLC溶出時間：18.6分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００３７】
実験例６
ヒトMetastin（45-54）（配列番号：６）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.11ｇを実験例１と同様に脱保護精製し目的とするペプチド2.2 mgを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+は、1302.5ダルトンであった。(計算値 1302.6ダルトン)
精製条件：
HPLC溶出時間：18.7分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００３８】
実験例７
ヒトMetastin（46-54）（配列番号：７）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.11ｇを実験例１と同様に脱保護精製し目的とするペプチド3.4 mgを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+ は、1139.6ダルトンであった。(計算値 1139.6ダルトン)
精製条件：
HPLC溶出時間：18.1分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用い  A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００３９】
実験例８
ヒトMetastin（47-54）（配列番号：８）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO) を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.12ｇを例１と同様に脱保護精製し目的とするペプチド13.0 mgを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+ は、1025.5ダルトンであった。(計算値 1025.5)精製条件：
HPLC溶出時間：17.6分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用いA/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００４０】
実験例９
ヒトMetastin（48-54）（配列番号：９）の製造
市販のｐ-メチルＢＨＡ樹脂（0.77 m mole/g resin）をペプチド合成機ABI 430Aの反応槽に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)  ペプチド合成方法でBoc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.16ｇをp-クレゾール1 mlと共に無水フッ化水素10 ml中、０℃で６０分撹袢した後、実験例１と同様に処理、精製し目的とするペプチド29.0 mgを得た。得られたペプチドを質量分析した。質量分析による(M+H)+ は、839.5ダルトンであった。(計算値 839.5ダルトン)
精製条件：
HPLC溶出時間：15.6分
カラム条件
カラム：Wakosil 5C18T   4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1% TFA水、Ｂ液−0.1%TFA含有アセトニトリルを用いA/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【００４１】
実験例１０
免疫原の作製
（１）［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）を含む免疫原の作製
実験例２で得られた［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）とKeyhole Limpet Hemocianin（ＫＬＨ）との複合体を作製し、免疫原とした。
すなわち、ＫＬＨ ２０ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．４ｍｌに溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニミド(ＧＭＢＳ)２．２ｍｇ（８μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４０分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたＫＬＨ １５ｍｇと［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）３．７５ｍｇとを混合し、４℃で２日間反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。
（２）［Cys38］ヒトMetastin（38-54）を含む免疫原の作製
実験例３で得られた［Cys38］ヒトMetastin（38-54）とＫＬＨとの複合体を作製し、免疫原とした。
すなわち、ＫＬＨ ２１ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．４ｍｌに溶解させ、ＧＭＢＳ ２．３５ｍｇ（８．４μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４０分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたＢＴＧ １５ｍｇと［Cys38］ヒトMetastin（38-54）３．０ｍｇとを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後、生理食塩水に対し４℃で３日間透析した。
【００４２】
実験例１１
免疫
６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに、実験例１０で得られた免疫［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨ複合体および［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨ複合体を、それぞれ約５０μｇ／匹となるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後３週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに２〜３回追加免疫した。
【００４３】
実験例１２
酵素標識化抗原の作製
（１）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）の作製
実験例２で得られた［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）とＨＲＰ（酵素免疫測定法用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識体とした。すなわち、ＨＲＰ ６ｍｇ（１５０ｎｍｏｌ）を０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させ、ＧＭＢＳ ０．４２ｍｇ（１．５μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合し、室温で３０分間反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マレイミド基の導入されたＨＲＰ ４．２ｍｇ（１０６ｎｍｏｌ）と実験例２で得られた［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）０．９８ｍｇ（３１９ｎｍｏｌ）とを混合し、４℃で１日反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラムで分画し、ＨＲＰ標識化［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）を得た。
【００４４】
（２）ＨＲＰ標識化［Cys38］ヒトMetastin（38-54）の作製
実験例３で得られた［Cys38］ヒトMetastin（38-54）とＨＲＰとを架橋し、ＥＩＡの標識体とした。すなわち、ＨＲＰ ８ｍｇ（２０３ｎｍｏｌ）を１．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させ、ＧＭＢＳ ０．５６ｍｇ（２．０２μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で３０分間反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画した。かくして得られた、マレイミド基の導入されたＨＲＰ ６．０ｍｇ（１４２ｎｍｏｌ）と実験例３で得られた［Cys38］ヒトMetastin（38-54）０．８９ｍｇ（４２５ｎｍｏｌ）とを混合し、４℃で１日反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画し、ＨＲＰ標識［Cys38］ヒトMetastin（38-54）を得た。
【００４５】
実験例１３
抗体価の測定
（１）［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨ複合体を３週間間隔で２回免疫を行い、その１週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を、４℃で１２，０００ｒｐｍで１５分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず、抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。
得られた抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＣ〔１％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ・Ｎａ〔エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸ニナトリウム塩ニ水和物（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate）, ＤＯＪＩＮＤＯ社〕を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.0〕５０μｌ、およびバッファーＣで希釈した複合体に対する抗血清１００μｌを加え、４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、実験例１２（１）で作製したＨＲＰ標識化［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）（バッファーＣで３００倍希釈）１００μｌを加え、室温で１日反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD & PERRY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測定した。
結果を図１に示す。免疫した８匹のマウス全ての複合体に対する抗血清中に［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）に対する抗体価の上昇が認められた。
【００４６】
（２）［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨ複合体を３回免疫を行いその１週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を、４℃で１２，０００ｒｐｍで１５分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。
上記（１）で作製した抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＣ５０μｌ、およびバッファーＣで希釈した抗血清１００μｌを加え、４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、実験例１２（２）で作製したＨＲＰ標識化［Cys38］ヒトMetastin（38-54）（バッファーＣで５００倍希釈）１００μｌを加え室温で１日反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD & PERRY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測定した。
結果を図２に示す。免疫した８匹のマウス全てに［Cys38］ヒトMetastin（38-54）に対する抗体価の上昇が認められた。
【００４７】
実施例１
モノクローナル抗ヒトMetastin抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して２００〜３００μｇの免疫原を生理食塩水０．２５〜０．３ｍｌに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫３〜４日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔Current Topics in Microbiology and Imnology、81巻、１頁、1978年〕。
細胞融合は、原法〔Nature、256巻、495頁、1975年〕に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ、血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を１０：１になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行ない細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（コッホライト社製）を０．３ｍｌ加え、３７℃の温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１５ｍｌのＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＧＩＴメデイウム（和光純薬）(ＧＩＴ−１０％ ＦＣＳ)に、Ｐ３Ｕ１が１ｍｌ当り２×１０5個になるように浮遊し、２４穴マルチディッシュ（リンブロ社製）に１ウェル１ｍｌずつ１９２ウェルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時間後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン １×１０−４Ｍ、アミノプテリン ４×１０−７Ｍ、チミジン １．６×１０−３Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３、６および９日後に旧液を１ｍｌ捨てた後、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（約１×１０6セル／ｍｌ)、上清を採取し、実験例１３に記載の方法に従って抗体価を測定した。
［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨを免疫したマウス由来のハイブリドーマの抗体産生細胞株を選択した例として、マウスＮｏ.３とＮｏ.４（図１参照）を用いて細胞融合を行い得られたハイブリドーマの抗体産生状態を図３に示した。得られた抗体産生ハイブリドーマの中から下記の計５種類のハイブリドーマを選択した（表１）。
【００４８】
【表１】
0004199502.tif 000002
【００４９】
［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨを免疫したマウス由来のハイブリドーマの抗体産生細胞株の選択の例として、マウスＮｏ.２とＮｏ．８（図２参照）を用いて細胞融合を行い得られたハイブリドーマの抗体産生状態の結果を図４に示した。得られた抗体産生ハイブリドーマの中から下記の３種類のハイブリドーマを選択した（表２）。
【００５０】
【表２】
0004199502.tif 000003
【００５１】
次に、これらのハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。クローニングに際しては、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５×１０5個になるように加えた。クローニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）に１〜３×１０6セル／匹を腹腔内投与したのち、６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。
モノクローナル抗体は、得られた腹水よりプロテインＡカラムにより精製した。即ち、腹水６〜２０ｍｌを等量の結合緩衝液〔３．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ3を含む１．５Ｍグリシン（ｐＨ９．０）〕で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテインＡ−アガロース（Repligen社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液〔（０．０５％ＮａＮ3を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出した。溶出液をＰＢＳに対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し、４℃あるいは−８０℃で保存した。
モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定に際しては、精製モノクローナル抗体結合固相を用いるエンザイム−リンクトイムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を行った。すなわち、抗体２μｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。実施例１に記載の方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mouse-TyperTM Sub-Isotyping Kit バイオラッド社製）を用いるＥＬＩＳＡによって固相化抗体のクラス、サブクラスを調べた。
【００５２】
実験例１４
競合法酵素免疫測定法
（１）競合法−ＥＩＡ（［Cys- NH213］ヒトMetastin（1-13）モノクローナル抗体）
［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨを免疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法により調べた。
まず、各モノクローナル抗体ＫＩＳ−１ＮａおよびＫＩＳ−２Ｎａ溶液の抗体価を実験例１３記載の方法により調べ、競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約５０％となる抗体濃度（約３０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を決定した。次に、実験例１３記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、(i)ＫＩＳ−１Ｎａを５０ｎｇ／ｍｌとなるようバッファーＣで希釈された抗Metastin（1-12）抗体溶液５０μｌ、(ii)バッファーＣで希釈されたヒトMetastin（1-54）溶液５０μｌ、(iii)および上記実験例１２（１）で得られたＨＲＰ標識化［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）（バッファーＣで４００倍希釈）５０μｌを抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに加え、４℃で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート上の酵素活性を、実験例１３（１）記載の方法により測定した。
結果を表１に示す。これより、いずれの抗体も、ＨＲＰ標識化［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）と反応し、さらに、ヒトMetastinに対しても反応性を有していたことがわかる。
例として、これらの中でヒトMetastinに対して最も高い反応性を示したモノクローナル抗体ＫＩＳ−１Ｃａ（ＩｇＧ１，κ）の競合法−ＥＩＡの結果を図５に示す。
ＫＩＳ−１ＮａのヒトMetastinの標準曲線から、（Ｂ／Ｂ0）＝０．５を与えるヒトMetastin濃度は、０．１ｎＭ、０．０５８ｎｇ／ｗｅｌｌであることが分かった（図５）。これらの結果から、ＫＩＳ−１Ｎａは、［Cys13-NH2］ヒトMetastin（1-13）を強く認識し、かつヒトMetastinに対して高い反応性を示しているものと考えられる。
【００５３】
（２）競合法−ＥＩＡ（［Cys38］ヒトMetastin（38-54）モノクローナル抗体）［Cys38］ヒトMetastin（38-54）モノクローナル抗体の反応特異性を同様の方法により調べた。
まず、各モノクローナル抗体溶液の抗体価を実験例１３（２）記載の方法により調べ、競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約５０％となる抗体濃度（約３０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を決定した。次に、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、(i)５０ｎｇ／ｍｌにバッファーＣで希釈された抗ヒトMetastin（39-54）抗体  ＫＩＳ−１Ｃａ溶液５０μｌ、(ii)実験例１２（２）記載ＨＲＰ標識化［Cys38］ヒトMetastin（38-54）をバッファーＣで５００倍希釈した溶液５０μｌを加えたウェルに、（iii）バッファーＣで希釈した10-6M〜１０-9MのヒトMetastin、あるいはヒトMetastin部分ペプチド〔ヒトMetastin（1-54）-COOH（Ｃ端がカルボキシル基のもの）、配列番号：５で表されるヒトMetastin（40-54）、配列番号：６で表されるヒトMetastin（45-54）、配列番号：７で表されるヒトMetastin（46-54）、配列番号：８で表されるヒトMetastin（47-54）、配列番号：９で表されるヒトMetastin（48-54）〕のバッファーＣ溶液５０μｌを５０μｌ加え、４℃で１６時間反応させた。
すなわち、（i）と（ii）が入っているところへ(iii)に記載したペプチドが１種類ずつ入れて反応を行った。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素活性を、実験例１３（１）記載の方法により測定した。
結果を表２に示す。これより、いずれの抗体もＨＲＰ標識化［Cys38］ヒトMetastin（38-54）と反応し、さらに、ヒトMetastinに対しても反応性を有していたことがわかる。
例として、ヒトMetastinに対して最も高い反応性を示したモノクローナル抗体、ＫＩＳ−１Ｃａ（ＩｇＧ１，κ）の競合法−ＥＩＡの結果を図７に示す。
ＫＩＳ−１ＣａのヒトMetastinの標準曲線から、（Ｂ／Ｂ0）＝０．５を与えるヒトMetastin濃度は、１ｎＭ、０．５８ｎｇ／ｗｅｌｌであることが分かった（図６）。また、この抗体はＫＩＳ−１Ｃａは、ヒトMetastin（49-54）との反応性は弱いながらも示すもの、Metastin（1-54）-COOHに対しては交差反応性を示さないことから、 ヒトMetastinのＣ端部分のＣ末端のアミドを強く認識することが分かった（図７）。
【００５４】
実施例２
ＨＲＰ標識化抗Metastinモノクローナル抗体（ＫＩＳ−１Ｃａ−ＨＲＰ）の作製
ＫＩＳ−１Ｃａ精製画分９．５６ｍｇ（６３．７ｎｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に、ＧＭＢＳ ０．７７μｍｏｌを含むＤＭＦ５０μｌを加え、室温で４０分反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．７）で分離し、マレイミド基の導入された抗体画分７．１７ｍｇを得た。次に、ＨＲＰ １７．８ｍｇ（４４５ｎｍｏｌ）を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌも含む）（ｐＨ６．８） １．４ｍｌに、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピオネート(ＳＰＤＰ)６．６７μｍｏｌを含むＤＭＦ６０μｌを加え、室温で４０分反応させた。次に、６６μｍｏｌのジチオスレイトールを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．４ｍｌを加え、室温で２０分反応させた後、セファデックスＧ−２５カラム（溶離液、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）で分離し、ＳＨ基の導入されたＨＲＰ ９．８ｍｇを得た。次に、ＳＨ基の導入されたＨＲＰ ８ｍｇとマレイミド基の導入された抗体画分３ｍｇとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリウス社製）で約０．５ｍｌにまで濃縮したのち、４℃で１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５を用いるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ-３００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供し、ＫＩＳ−１Ｃａ−ＨＲＰ複合体画分を精製した。
【００５５】
実験例１５
サンドイッチ法−ＥＩＡ（サンドイッチ法−ＥＩＡの特異性と感度）
実施例１で得られた精製したモノクローナル抗体ＫＩＳ−１Ｎａを１５μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６溶液）を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエース４００μｌを加え不活化した。
上記調製済みプレートに、バッファーＣを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で希釈したヒトMetastin標準液またはMetastinと同様にＣ末端がＦ−ＮＨ2構造をもつペプチド〔Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP)、Cholecystokinin-4 (CCK-4)、Prolactin-releasing Peptide31 (PrRP31) (いずれもペプチド研究所より購入)〕を１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、実施例２で作製したＫＩＳ−１Ｃａ−ＨＲＰ（バッファーＣで２０，０００倍希釈）１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させたが、標識体濃度としては３０，０００倍希釈のものを用いた。ＰＢＳで洗浄したのち、実験例１３記載の方法によりＴＭＢを用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応２０分）。
結果を図８に示す。これより、極めて高感度にヒトMetastinを検出することがわかった。
すなわち、このサンドイッチ法−ＥＩＡは、ヒトMetastinを０.３ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌで検出することが可能であり、他のＣ末端がＲＦ−ＮＨ2構造をもつペプチドＰｒＲＰ３１、ＮＰＦＦ、ＡＦ−２は全く検出しなかった（図８）。したがって、固相抗体としてＫＩＳ−１Ｎａを用い、標識体としてＫＩＳ−１Ｃａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡは、ヒトMetastinを極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが可能であるとわかった。
【００５６】
実験例１６
ＫＩＳ−１ＣａによるヒトMetastinの生物活性の中和作用
ＫＩＳ−１ＣａによるヒトMetastinに対する中和活性を、特開２０００−３１２５９０号公報記載のhOT7T175発現CHO細胞を用いた細胞内Caイオン濃度上昇活性を指標にＦＬＩＰＲ（Molecular Devices社）を用いて測定を行った。
hOT7T175発現CHO細胞を、１．２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地（１０％ｄＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Black plate clear bottom、Coster社）に分注器を用いて各ウェルに２００μｌずつ植え込み（４×１０4ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ウェル）、５％ ＣＯ2インキュベーター中にて３７℃で一晩培養した後用いた（以後、細胞プレートとする）。ＦＬＩＰＲアッセイバッファー〔ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社）９．８ｇ、炭酸水素ナトリウム ０．３５ｇ、ＨＥＰＥＳ ４．７７ｇ、６Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．４に合わせた後、１Ｌにフィルアップし、フィルター滅菌処理したもの〕２０ｍｌ、２５０ｍＭ Probenecid ２００μｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２１０μｌを混合した。また、Fluo 3-AM（同人化学研究所） ２バイアル（５０μｇ）を、ジメチルスルフォキサイド ４０μｌ、２０％ Pluronic acid（Molecular Probes社）４０μｌに溶解し、これを上記Hanks'/HBSS−Probenecid−FBS に加え、混和後、８連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに、各ウェル１００μｌずつ分注し、５％ ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、１時間インキュベートした（色素ローディング）。ＫＩＳ−１Ｃａおよびコントロール抗体としてＫＩＳ−１Ｃａと同じＩｇＧサブクラス構造（ＩｇＧ１、κ）である抗ＰｒＲＰモノクローナル抗体（Ｐ２Ｌ−１Ｔa）（H. Matsumoto et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun., 257巻, 264-268頁 (1998年)）を、２．５ｍＭ プロベネシド（Probenecid）と ０．２％ ＢＳＡを含むHanks'/HBSS １２０μｌにて希釈し、ヒトMetastin（１ｘ１０-8Ｍ）と３７℃で１時間インキュベーション後、各フラクション５μｌを、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（V-Bottomプレート、Coster社）へ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Hanks'/HBSSに２．５ｍＭ Probenecidを加えた洗浄バッファーで、プレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットし、測定を行った（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０μｌのサンプルが細胞プレートへと移される）。
結果を図９に示す。これより、ＫＩＳ−１Ｃａは、ヒトMetastinの活性を２ｘ１０-8Ｍで７０％、２ｘ１０-7Ｍで１００％抑制したことがわかる。一方、Ｐ２Ｌ−１Ｔａは、ヒトMetastinの活性を２ｘ１０-6Ｍで１４％程度の抑制がみられたのみであった。以上のことから、ＫＩＳ−１Ｃａは、ヒトMetastinの細胞内［Ca2+］上昇活性を中和することが明らかとなった。
【００５７】
実施例３
血漿中のヒトMetastinの定量
ヒト血漿を、同量のバッファーＣで２倍希釈し、上記実験例１５のサンドイッチ−ＥＩＡによりヒトMetastinを定量した。
結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
0004199502.tif 000004
【００５９】
実施例４
ヒト血漿中のヒトMetastinの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による検出
実施例３に記載の、ヒト血漿中に含まれるヒトMetastin免疫活性を同定するため、ヒト血漿５ｍｌにアセトニトリルを１５ｍｌ添加して混和後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分）を行い、タンパク質の除去を行った。上清を凍結乾燥後、この画分を濃縮後ＯＤＳ−８０TMを用いる逆相ＨＰＬＣによって分画した。カラム条件：
カラム：ＯＤＳ−８０TM  (4.6 x 250 mm)
溶離液：Ａ液（０．０５％トリフルオロ酢酸含有 ５％アセトニトリル）
Ｂ液（０．０５％トリフルオロ酢酸含有 ６０％アセトニトリル）
溶出方法：アセトニトリル濃度を最初の５分間に５％から３０％まで上昇させ、次に３０分間かけて３０−４０％に直線的に上昇させた。
流速：１．０ ｍｌ／分
分画：０．５ｍｌ／ｔｕｂｅ
溶出画分を凍結乾燥したのち、２５０μｌのバッファーＣに溶解させ、実験例１５記載のサンドイッチ法−ＥＩＡに供した。
結果を図１０に示す。血漿中のヒトMetastinの免疫活性はほとんどヒトMetastinの溶出位置に検出された（回収率１０２％）ことから、該サンドイッチ法−ＥＩＡが、ヒトMetastinを検出していることが確認された。
これより、この測定系は、血漿中のヒトMetastinの変動を研究する際の重要な手段となりうることがわかる。
【００６０】
実施例５
妊婦血漿中のヒトMetastinの定量
各週産期毎に得られた妊婦血漿を、同量のバッファーＣで２倍希釈し、上記実験例１５のサンドイッチ−ＥＩＡによりヒトMetastinを定量した。妊婦血漿は、ＤＣＰ社より購入したものであり、インフォームドコンセントの取られたものである。
結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
0004199502.tif 000005
【００６２】
表４から、血中ヒトMetastin濃度は、妊娠とともに上昇し、出産後正常レベルに戻ると考えられる。女性非妊時(６．００±２．７７ ｆｍｏｌ／ｍｌ)と比較すると、妊娠初期（４−１０週）で約２０倍に上昇し、２１から３０週で約2000倍上昇した。これらの結果から、ヒトMetastinは、胎盤で産生され、血中ヒトMetastin濃度は妊娠の指標として応用でき、本発明のモノクローナル抗体は、臨床診断薬として有用である。
【００６３】
実施例６
臍帯動脈および臍帯静脈血漿中のヒトMetastinの定量
出産時に得られた臍帯動脈および臍帯静脈血漿を、同量のバッファーＣで２倍希釈し、上記実験例１５のサンドイッチ−ＥＩＡによりヒトMetastinを定量した。妊婦血漿は、ＤＣＰ社より購入したものであり、インフォームドコンセントの取られたものである。
結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
0004199502.tif 000006
これより、臍帯血のような特殊な血液中のMetastin濃度の測定も可能であり臍帯血中にもMetastinが存在していることが明らかとなった。従って、本発明の抗体は、胎児または新生児の異常の診断にも使用できると考えられる。
表５より、臍帯動脈と臍帯静脈間で血中Metastin濃度の差は認められず、胎児がMetastinを産生している可能性は低いと考えられる。
【００６５】
実施例７
ＫＩＳ−１Ｃaを用いたヒト胎盤のMetastin免疫組織染色
ヒト胎盤スライド（DAKO社より購入）のパラフィン切片を脱パラフィン操作を行った。具体的には、スライドを、キシレン中に5分間、2回浸した後、100％エタノール中に5分間、2回浸した。その後、90％エタノール、80％エタノールおよび70％エタノールの順に5分間ずつ浸した後、PBS中に5分間、2回浸した。その後スライドを1 mM  EDTA緩衝液(pH8.0)中で９５℃、３０分間オートクレーブにて熱処理を行い、0.3％  TritonX100を含むＰＢＳ（ＰＢＴ）にて５分間２回洗浄し、1.5％ウマ血清を含むＰＢＴ（1％正常ウマ血清および0.4％ Triton X-100 を含むPBS）にて６０μｇ／ｍｌに希釈したKIS-1Caをスライドに添加した。４℃で１６時間以上反応させた後、ＰＢＴにて３回スライドを洗浄した。スライドにビオチン標識化抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、室温で３０分間反応後、ＰＢＴにて２回洗浄後、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ溶液を添加し、室温で３０分間反応させた（ベクタステイン(mouse IgG)ABC kit,フナコシ）。ＰＢＴにて４回スライドを洗浄後、ジアミノベンチジン (3,3-diaminobenzidine-tetrachloride)基質キット（フナコシ）でペルオキシダーゼを発色させ、２−１０分後に反応を停止した。胎盤の合胞体性栄養膜細胞に免疫陽性反応が検出され、KIS-1Caが、Metastinの免疫組織染色に使用可能であることが明らかとなった。
【００６６】
【発明の効果】
ヒトMetastinは、オーファンレセプターhOT7T175の内因性のリガンドとして胎盤より単離されたペプチドであり、遊走阻害活性や癌転移抑制活性を示す。その生理機能についてはさらなる研究が必要である。本発明の抗体は、極めて高いヒトMetastinまたはその誘導体への結合能を有し、かつヒトMetastinまたはその誘導体の細胞内[Ca2+]上昇活性を中和することができ、ヒトMetastinまたはその誘導体の作用を抑制することにより制癌作用などが期待できる。また、ヒトMetastinまたはその誘導体を発現している癌を見出し、本発明の抗体を用いたミサイル療法による抗癌治療も可能である。ヒトMetastinのＣ端部を認識するモノクローナル抗体とヒトMetastinのＮ端部を認識するモノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫学的測定法により、ヒトMetastinまたはその誘導体を感度よく特異的に定量することができるため、ヒトMetastinまたはその誘導体の生理機能および病態との解明に有用である。さらに、血液中のヒトMetastinまたはその誘導体の濃度を測定することにより、例えば、癌（例、皮膚癌、乳癌、大腸癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、子宮頚部癌など）、妊娠中毒症、胎盤発育不全、切迫流産、子宮内膜症、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群など、または妊娠などの診断に応用も可能である。また、本発明の抗体は、ヒトMetastinまたはその誘導体が関与する疾患〔例、癌（例、皮膚癌、乳癌、大腸癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、子宮頚部癌など）、妊娠中毒症、胎盤発育不全、切迫流産、子宮内膜症、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群など〕の予防・治療剤として有用であり、さらに早産防止、陣痛緩和にも有用である。また、本発明の抗体は、Metastinの免疫組織染色にも使用可能である。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、［Cys- NH213］ヒトMetastin（1-13）―ＫＬＨを免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標識化［Cys- NH213］ヒトMetastin（1-13）を用いて調べた結果を示す。図中、（-◇-）は、マウスＮｏ．１（１ａ）、（−□−）は、マウスＮｏ．２（２ａ）、（−△−）は、マウスＮｏ．３（３ａ）、（−○−）は、マウスＮｏ．４（４ａ）、（−◆−）は、マウスＮｏ．５（５ａ）、（−■−）は、マウスＮｏ．６（６ａ）、（−▲−）は、マウスＮｏ．７（７ａ）、（−●−）は、マウスＮｏ．８（８ａ）を表す。
【図２】図２は、［Cys38］ヒトMetastin（38-54）―ＫＬＨを免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標識化 ［Cys38］ヒトMetastin（38-54）を用いて調べた結果を示す。図中、（-◇-）は、マウスＮｏ．１（１ａ）、（−□−）は、マウスＮｏ．２（２ａ）、（−△−）は、マウスＮｏ．３（３ａ）、（−○−）は、マウスＮｏ．４（４ａ）、（−◆−）は、マウスＮｏ．５（５ａ）、（−■−）は、マウスＮｏ．６（６ａ）、（−▲−）は、マウスＮｏ．７（７ａ）、（−●−）は、マウスＮｏ．８（８ａ）を表す。
【図３】図３は、［Cys- NH213］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨを免疫したマウスを用いた場合の細胞融合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示す。
【図４】図４は、［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨを免疫したマウスを用いた場合の細胞融合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示す。
【図５】図５は、［Cys- NH213］ヒトMetastin（1-13）−ＫＬＨを免疫原として作製したモノクローナル抗体ＫＩＳ−１Ｎａ（−●−）およびＫＩＳ−２Ｎａ（−▲−）のヒトMetastinに対する反応性をＨＲＰ標識化［Cys- NH213］ヒトMetastin（1-13）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図６】図６は、［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨを免疫原として作製したモノクローナル抗体ＫＩＳ−１ＣａのヒトMetastinに対する反応性をＨＲＰ標識化［Cys38］ヒトMetastin（38-54）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図７】図７は、［Cys38］ヒトMetastin（38-54）−ＫＬＨを免疫原として作製したモノクローナル抗体ＫＩＳ−１ＣａのヒトMetastin（−●−）、ヒトMetastin（1-54）COOH（−○−）、ヒトMetastin（40-54）（−▲−）、ヒトMetastin（45-54）（−◆−）、ヒトMetastin（46-54）（−■−）、ヒトMetastin（47-54）（−□−）、およびヒトMetastin（48-54）（−△−）に対する反応性をＨＲＰ標識化［Cys38］ヒトMetastin（38-54）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図８】図８は、酵素標識抗体としてＫＩＳ−１Ｃa−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＫＩＳ−１Ｎａを用いたサンドイッチ法−ＥＩＡのヒトMetastin（−●−）の標準曲線を示す。また、他のペプチドＣＧＲＰ（−■−）、ＣＣＫ−４（−▲−）、ＮＰＦＦ（−◆−）、ＰｒＲＰ３１（−○−）、およびＡＦ−２（−□−）との反応性を示す。
【図９】図９は、[Cys39]ヒトMetastin（３９-５４）−ＫＬＨを免疫原として作製したモノクローナル抗体ＫＩＳ−１ＣａのhOT7T175発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内Caイオン濃度上昇活性をに対する中和作用を示す。a）は、ＫＩＳ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−１ＴをヒトMetastin（20 nM）と１：１、b）は、ＫＩＳ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−１ＴをヒトMetastinと１：１０、c）は、ＫＩＳ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−１ＴをヒトMetastinと１：１００、でそれぞれ反応後の細胞内Caイオン濃度上昇活性を示す。図中、（−◇−）は、Ｐ２Ｌ−１Ｔ（１）、（−□−）は、Ｐ２Ｌ−１Ｔ（２）、（−○−）は、Ｐ２Ｌ−１Ｔ（３）、（−◆−）は、ＫＩＳ−１Ｃ（１）、（−■−）は、ＫＩＳ−１Ｃ（２）、（−●−）は、ＫＩＳ−１Ｃ（３）を表す。
【図１０】図１０は、ヒト血漿中のヒトMetastin免疫活性の逆相−ＨＰＬＣによる溶出画分の免疫活性を、酵素標識抗体としてＫＩＳ−１Ｃa−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＫＩＳ−１Ｎａを用いたサンドイッチ法−ＥＩＡによって定量した結果を示す。破線（----）は、アセトニトリルの濃度勾配を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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