【手続補正書】
【提出日】平成20年2月21日(2008.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め皮膚にダメージを与えた群の動物の皮膚と、皮膚にダメージを与える前及び／又は後に皮膚上に被検試料を投与した群の動物の皮膚とを比較する、被検試料の皮膚への作用の鑑別法であって、動物の真皮内に注射した透過性マーカーの真皮側から角層側への透過・拡散性の比較をすることを特徴とする、被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
【請求項２】
前記ダメージが、紫外線照射による皮膚の障害であることを特徴とする、請求項１に記載の被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
【請求項３】
前記透過・拡散性の比較に於いて、被検試料の投与による透過性マーカーの透過・拡散性の低下度合いが大きい程、被検試料が皮膚に対してより好ましい作用を有するものであると鑑別することを特徴とする、請求項１又は２に記載の被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
【請求項４】
前記被検試料の投与による透過性マーカーの透過・拡散性の低下が、角層細胞に存在するタイトジャンクションタンパクの結合強化によるものであることを特徴とする、請求項３に記載の被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、化粧料原料などの物質の皮膚への作用の鑑別法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
（１）予め皮膚にダメージを与えた群の動物の皮膚と、皮膚にダメージを与える前及び／又は後に皮膚上に被検試料を塗布した投与群の動物の皮膚とを比較する、被検試料の皮膚
への作用の鑑別法であって、動物の真皮内に注射した透過・拡散性の比較をすることを特徴とする、被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
（２）前記ダメージが、紫外線照射による皮膚の障害であることを特徴とする、（１）に記載の被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
（３）前記透過・拡散性の比較に於いて、被検試料の投与による透過性マーカーの透過・拡散性の低下度合いが大きい程、被検試料が皮膚に対してより好ましい作用を有するものであると鑑別することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
（４）前記被検試料の投与による透過性マーカーの透過・拡散性の低下が、角層細胞に存在するタイトジャンクションタンパクの結合強化によるものであることを特徴とする、（３）に記載の被検試料の皮膚への作用の鑑別法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の被検試料の皮膚への作用の鑑別法は、予め皮膚にダメージを与えた群の動物の皮膚と、ダメージを与える前及び／又は後に皮膚上に被検試料を塗布した投与群の動物の皮膚とを比較する、被検試料の皮膚への作用の鑑別法であって、動物の真皮内に注射した透過性マーカーの真皮側から角層側への透過・拡散性の比較を指標とすることを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の被検試料の皮膚への作用の鑑別法において使用される動物は、ヒト以外であって、一般的に使用が容易なものとしてマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サルなどが挙げられる。さらに皮膚に体毛を有していない動物がより好適であり、ヘアレスマウス、ヘアレスラット、ヘアレスモルモットなどが例示されるが、取り扱いの容易さからヘアレスマウスがもっとも好ましい。また、体毛のある動物においても体毛を除去することにより使用可能であることは言うまでもない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の被検試料の皮膚への作用の鑑別法において使用される被検物質としては、特に限定しないが、植物及び／又はその乾燥物の裁断物、破砕物、粉砕物を用いることも可能であるが、植物の溶媒による抽出エキス、種々の医薬品、化粧品原料などが挙げられる。これらの内、皮膚に対する悪影響が少ないものであれば使用可能である。被検物質を含む被検試料としては、皮膚に適用される形態であれば何ら支障がなく使用でき、例えば、クリーム剤、軟膏剤、液剤などに被検物質を添加したのもの、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオールなどのアルコール類及び／又は水との混合溶媒など、ジメチルスルホキシドなどの皮膚への影響の少ない有機溶剤及び／又は水との混合溶媒など、更には閉塞作用のある貼付剤などに被検物質を添加したものなどが挙げられる。試料の調整のし易さから、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオールなどのア
ルコール類及び／又は水との混合溶媒などに被検物質を添加したもの、ジメチルスルホキシド及び／又は水に被検物質を添加したものが好適である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の被検試料の皮膚への作用の鑑別法において用いられる透過性マーカーとしては、生体への影響が少なく、肉眼及び／又は顕微鏡下でその存在が確認できれば良く、例えば、ブリリアントグリーン、メチレンブルー、エバンスブルー、ゲンチアナバイオレットなどの各種染料、又はフルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、ダンシルなどの蛍光物質、さらには、これらの染料、蛍光物質に生体内のタンパク質などと反応しうる酸クロリド、Ｎーヒドロキシサクシイミドなどの反応性の基が結合したアミノ基反応性の染料、蛍光物質などが挙げられる。また、透過性マーカーとして、ビオチンのように他の物質と特異的に結合できる性質を有している物質も使用できる。例えば、ビオチンはアビジンと特異的な結合を形成する性質を有しており、透過性マーカーとしてビオチンを使用し、組織観察時に、蛍光標識化したアビジンを用いることによりビオチンを可視化することができる。このようなアビジン系の物質としては、アビジン、ストレプトアビジンが例示できる。このうち、アミノ基反応性のサクシニルイミド基などの結合したビオチンが、分子量も小さく、細胞間の移動性の良い透過性マーカーとして好適である。この場合は、組織観察時に、蛍光標識化したアビジンなどを用いてビオチンを可視化する必要がある。これらの透過性マーカーは、必要に応じて、水、各種緩衝溶液、生理食塩水、緩衝生理食塩水などに溶解して用いられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
透過性マーカーの注射は、動物の試験対象部位の真皮内への注射によって行われる。この時使用する注射針の太さは、ツベルクリン用のものを使用することができ、２６〜２７Ｇが好適である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の被検試料の皮膚への作用の鑑別法において、透過性マーカーの透過状況の観察としては、そのまま皮膚表面より、またテープストリッピングで角層を除去した後表面から観察することも可能であるが、より厳密に評価するには、動物より皮膚組織を切り出し、皮膚組織切片を作成し、顕微鏡下、皮膚表面から垂直断面方向での透過性マーカーの透過、拡散状況を検出する方が好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の被検試料の皮膚への作用の鑑別法において、真皮内に注射した透過性マーカーの真皮側から角層側への透過・拡散性の比較とは、作成された組織標本において、抗オクルディン抗体によって認識されるタイトジャンクションの位置と透過性マーカーの検出によって認識される細胞間の物質の移動状態を比べ、タイトジャンクションの位置において透過性マーカーが堰きとめられていれば、タイトジャンクション機能が強固で透過性低く、タイトジャンクションの位置を越えて角層側へ透過性マーカーが透過していれば、タイトジャンクション機能が弱体化していると評価できる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
具体的には、皮膚タイトジャンクション機能を強化する被検試料の皮膚への作用の鑑別においては、顕微鏡下で、抗オクルーディン抗体でドット状に認識される皮膚タイトジャンクションを検出し、且つ、その部分での透過・拡散状況を観察し、「紫外線非照射の皮膚タイトジャンクションの状態」、「紫外線照射のみの皮膚タイトジャンクションの状態」を対照として、「紫外線照射且つ被検試料投与の皮膚タイトジャンクションの状態」を比較して、皮膚タイトジャンクションの存在箇所数に対して、どの程度透過性マーカーの透過・拡散箇所数が抑えられたかを評価することによる、被検試料の皮膚への作用の鑑別法に関する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
以下に、本発明に関して見出された、非ダメージ処理皮膚と紫外線照射によるダメージ処理皮膚における皮膚タイトジャンクションの状態、及び、その時の透過性マーカーの透過・拡散状態、さらには本発明の皮膚への作用の鑑別に関して実施例を挙げて詳細に説明する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
１５匹のヘアレスマウスのＴＥＷＬ（Trans Epidermal Water Loss；経表皮水分蒸散量）を測定し、ＴＥＷＬの値から等価な三群に群分けした。この内の一群には０．０１％デキサメタゾンのプロピレングリコール溶液を一日３回塗布し続けた。もう一群は紫外線照射のみの群とし、残り一群は紫外線非照射群とした。群分け２４時間後に、デキサメタゾン塗布群と紫外線照射群の背部皮膚に１６０ｍＪの紫外線（ＵＶ−Ｂ）を照射し、紫外線照射７２時間後に、再びＴＥＷＬ値を測定した。この時、紫外線照射のみの群のＴＥＷＬ値は、紫外線の照射前後で２倍程度に上昇し、紫外線の照射により、皮膚の水分蒸散抑制機能が損傷を受けていることが確認できた（表２）。デキサメタゾン塗布群では、ＴＥＷＬの上昇が抑えられている傾向が認められた。その後、紫外線を照射した部位の皮膚に１００μlの透過性マーカー水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ ＥＺ−ＬＩＮＫTM−スルフォ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（以下ビオチン誘導体という）、ピアス社製；ＰＩＥＲＣＥ）および１ｍＭの塩化カルシウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を皮内注射し、１時間後に皮膚を採取した。採取した皮膚から凍結切片を作成し、ブロッキング操作の後、抗オクルー
ディン一次抗体（ザイメッド社製：ＺＹＭＥＤ）とＦＩＴＣ標識二次抗体処理による蛍光抗体染色によって皮膚タイトジャンクションを染色した。次いで、ストレプトアビジンテキサスレッド（オンコジーン社製：ＯＮＣＯＧＥＮＥ）により透過性マーカーであるビオチン誘導体の蛍光染色をした。これらを、落射蛍光顕微鏡にて観察し、ＦＩＴＣの緑の蛍光で示される皮膚タイトジャンクション部位とテキサスレッドの赤の蛍光で示される透過性マーカーを検出し、画像として撮影した。この画像を重ね合わせることにより、皮膚タイトジャンクションの位置と透過性マーカーの状態を評価した（図１、図２、図３）。同時に、紫外線照射などの処置を何ら施さないヘアレスマウスにおいても透過性マーカーの皮内注射およびその後の皮膚採取を行い、未処置の皮膚でのタイトジャンクション位置及び透過性マーカーの状態を評価した（図４，図５、図６）。オクルーディン抗体によるタイトジャンクション部分の認識と透過性マーカーのよる透過性の評価は、以下のような基準によって行った。それぞれ、一群５匹で評価し、その平均値で判断した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
図１，図２、図３は、紫外線照射のみを行ったヘアレスマウスの皮膚組織切片図である。図１は透過性マーカーの染色像、図２はオクルーディンの蛍光抗体染色像、図３は透過性マーカーとオクルーディン蛍光染色の重ね合わせ像であり、図３より、紫外線照射では、オクルーディン染色で示される皮膚タイトジャンクションの位置（矢印）を超えて角層側（図の上方）に透過性マーカーが透過・拡散していることが判る。 図４、図５、図６は、紫外線非照射のヘアレスマウスの皮膚組織切片図である。図４は透過性マーカーの染色像、図５はオクルーディンの蛍光抗体染色像、図６は透過性マーカーとオクルーディン蛍光染色の重ね合わせ像であり、図６より、紫外線非照射では、オクルーディン染色で示される皮膚タイトジャンクションの位置（矢印）で、透過性マーカーが堰きとめられている。これらのことより、紫外線照射による皮膚ダメージにより、皮膚タイトジャンクション構造が弱体化し、細胞間の結合がゆるみ、皮膚バリア機能が低下したことが判る。０．０１％デキサメタゾンを塗布したヘアレスマウスでのタイトジャンクション部分を通しての透過性マーカーの透過性部分は、紫外線のみの照射皮膚の４割程度で、図３と図６の中間くらいであった。結果を表３に示す。