【手続補正書】
【提出日】平成19年11月30日(2007.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
しかしながら、上記ＨＰＬＣで測定する方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。フィプロニルの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。特に、シロアリ駆除剤としての薬効の維持および保守においては個別の建物の基盤の土壌を測定することが必要となることから、測定方法の簡便さとともに、簡易な測定キットの要請が強まっている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明の化合物は、フィプロニルのハプテンとして好適に用いられるものである。当該ハプテン化合物と高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、動物においてフィプロニルに対する免疫応答を良好に惹起することができ、特異的かつ高感度な抗フィプロニル抗体を得ることができる。前記式（１）で表される化合物において、Ｌはカルボキシル基、ｎは２の場合、フィプロニルのハプテンとして特に優れた効果を奏する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
具体的には、前記反応式において、
（１）工程１
出発原料として５−アミノ−４−トリフルオロメチルスルフィニル−１−（２，６−ジクロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ピラゾール−３−カルボニトリル（１）を用い、酸化剤と反応させて５−アミノ−４−トリフルオロメチルスルホニル−１−（２，６−ジクロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ピラゾール−３−カルボニトリル（２）を得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
この反応で酸化剤としては特に限定されないが、例えば過酸化水素、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸などの過酸類、オゾン、過マンガン酸カリウム、クロム酸などを使用することができる。また触媒としてタングステンやバナジウムを用いることも出来る。溶媒としては、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、酢酸などの酸、水およびそれらの混合溶媒などを挙げることができる。反応温度は通常室温から溶媒の沸点の温度で、３０分から１０時間程度行う。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
（２）工程２
得られた化合物を塩基の存在下、ω-メルカプトアルキルカルボン酸と反応させてω−［５−アミノ−３−シアノ−１−（２，６−ジクロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ピラゾール−４−イルチオ］アルキルカルボン酸（３）を得る。
本反応で用いられる塩基、溶媒については工程１と同様のものを用いることができる。反応温度は通常０℃から溶媒の沸点の温度で、反応時間は３０分から１０時間程度行う。
上記各工程における詳細な合成方法は、実施例に記載する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
抗体には、一般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマの分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナル抗体がある。本発明においては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含される。モノクローナル抗体が有する高感度性および高選択性、さらには、複数のモノクローナル抗体の組み合わせによる複数成分との分離可能な反応性など適用の汎用性の広さから、特にモノクローナル抗体が好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
前記モノクローナル抗体は、フィプロニルに対する特異性と他の物質に対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ５０値を有することが好ましい。ここでＩＣ５０値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
すなわち、本抗体は、フィプロニルを測定対象とする場合は、直接競合ＥＬＩＳＡによるフィプロニルに対するＩＣ５０が５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
前記のように調製した抗原を２ｍｇ／ｍＬ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾細胞を完全に培地中に浮遊させる。遠心、上清除去を数回繰り返し、細胞を洗った後、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と細胞数の比５：１〜１０：１（脾細胞：ミエローマ）で混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）をゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０５個／ｍＬになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μＬ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗フィプロニル抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
また、本発明においては、フィプロニルに特異的に結合する抗体を用いることにより、フィプロニルを簡便に測定することができ、測定手段としての測定キットおよび後述するフィプロニルの測定方法に好適に使用することができる。前記キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたフィプロニルのハプテン化合物、緩衝液、検出試薬および／またはフィプロニルの標準溶液等を含む。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものであり、下記直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、固相化されたフィプロニルに対する抗体、固相化抗体を保持する担体、酵素標識された抗原および検出試薬などを含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
フィプロニルを添加しない反応溶液の吸光度に対して、フィプロニルを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のフィプロニルを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のフィプロニルの濃度を算出することができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
＜実施例４＞（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫源を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢａｌｂ／Ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／ｍＬの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価を間接競合法で確認した。十分に力価が高くなったことを確認し、１週間後に最終免疫として免疫原１０μｇ／１００μＬ・ＰＢＳを尾静脈から投与した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
＜実施例５＞（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０６個の細胞をＢａｌｂ／ｃ  メスＲｅｔｉｒｅ  マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧ  カラムによりＩｇＧ精製を行った。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
【図１】抗体[ＦＰＮ−１Ｅ９−２５]を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法におけるフィプロニルに対する阻害曲線を示す。
【図２】抗体[ＦＰＮ−１Ｅ９−２５]を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法におけるメタノール濃度に対するＩＣ５０値の変動を示す。