(57)【要約】本発明は、抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体を含む組成物及びそれらの使用方法を提供する。【選択図】図１Ａ−１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）、ならびに３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、及び
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、
Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と特異的に結合する、単離抗赤血球凝集素モノクローナル抗体。
【請求項２】
抗体が、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項３】
抗体が、配列番号９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項４】
抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が、配列番号９１のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が、配列番号９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項５】
抗体が、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項６】
抗体が、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項７】
抗体が、軽鎖及び重鎖を含み、該軽鎖が、配列番号９３のアミノ酸配列を含み、該重鎖が、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項８】
３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）、ならびに３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号６４及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号７５のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、及び
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、
Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と特異的に結合する、単離抗赤血球凝集素モノクローナル抗体。
【請求項９】
抗体が、配列番号７８、８２及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１０】
抗体が、配列番号７９及び８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１１】
抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が、配列番号７８、８２及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が、配列番号７９及び８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１２】
抗体が、配列番号８０、８４及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項８に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１３】
抗体が、配列番号８１、８５及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項８に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１４】
抗体が、軽鎖及び重鎖を含み、該軽鎖が、配列番号８０、８４及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該重鎖が、配列番号８１、８５及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１５】
３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）、ならびに３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、及び
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、
Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と特異的に結合する、単離抗赤血球凝集素モノクローナル抗体。
【請求項１６】
抗体が、配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１７】
抗体が、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１８】
抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８９のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項１９】
抗体が、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１５に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項２０】
抗体が、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１５に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項２１】
抗体が、軽鎖及び重鎖を含み、該軽鎖が、配列番号８０のアミノ酸配列を含み、該重鎖が、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の単離抗赤血球凝集素抗体。
【請求項２２】
Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療、阻害または予防する必要性のある個体においてそれを治療、阻害または予防する方法であって、請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物の有効量を該個体に投与し、それによってＢ型インフルエンザウイルス感染を治療、阻害または予防することを含む、方法。
【請求項２３】
方法が、追加の治療剤を個体に投与することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
追加の治療剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤、抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項２６】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
抗体の産生方法であって、該抗体が産生されるように、請求項２８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項３０】
医薬の製造における、請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項３１】
医薬が、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療、阻害または予防のためのものである、請求項３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／９７１，１２３号の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提供され、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１４年３月１８日に作成され、Ｐ０５７９４Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと呼ばれ、９６，６１２バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体を含む組成物及びそれらの使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルス感染は、世界中で毎年３〜５百万件の重篤な疾病及び２５０，０００〜５００，０００人の死亡を引き起こしている。米国単独でも、人口の５％〜２０％が毎年インフルエンザウイルスに感染しており、これらの感染の大部分は、Ａ型インフルエンザウイルスにより引き起こされている。（例えば、Ｄｕｓｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １６３：１８１−１８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＪＡＭＡ  ２９２：１３３３−１３４０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＪＡＭＡ  ２８９：１７９−１８６を参照すること。）しかし、Ｂ型インフルエンザウイルス感染は、米国単独でも毎年およそ１０，０００〜１００，０００件のインフルエンザの入院症例を占め、毎年高い変動を示している（インフルエンザウイルスの全ての入院症例の１％〜４０％は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染であり、平均１７％である）。（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ  ５４：１４２７−１４３６を参照すること。）インフルエンザウイルス感染に関連する医療費用への負担及び生産性の損失は、膨大である。入院及び死亡は、高齢者、小児及び慢性疾病などの主に高危険度群において生じる。
【０００５】
ノイラミニダーゼ阻害剤は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス感染の外来患者の治療及び予防に承認されている。オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））は、広く使用されている予防薬であり、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス感染の早期治療処置の選択肢である。（例えば、Ｋａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ（２００１）ＢｉｏＤｒｕｇｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５：３０３−３２３；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：１８４５−１８５０；Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）ＪＡＭＡ  ２８３：１０１６−１０２４；及びＷｅｌｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＪＡＭＡ  ２８５：７４８−７５４を参照すること。）しかし、オセルタミビル治療は、有意な臨床利益を提供するために、症状の発症から４８時間以内に開始しなければならない。（例えば、Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５１：１２３−１２９を参照すること。）この負担は、治療を求めている時点で最適な４８時間治療範囲を概して超えている、重篤の疾病患者を治療するオセルタミビルの能力を損なう。加えてオセルタミビルは、恐らく、Ａ型インフルエンザノイラミニダーゼと比較してＢ型インフルエンザノイラミニダーゼに対して１０倍高いＩＣ５０値があることに部分的に起因して、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療と比較してＢ型インフルエンザウイルス感染の治療に有効性が低い。したがって最近では、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の入院患者を治療するＢ型インフルエンザウイルス治療薬を特定することに、相当な注目が集まっている。
【０００６】
１９８８年から１９８９年にかけて、Ｂ型インフルエンザウイルスの２つの極めて特有の抗原変種が、祖先Ｂ型インフルエンザウイルス系列から出現した。これらのウイルスは、Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ビクトリア／２／８７またはＢ／ヤマガタ／１６／８８のいずれかと抗原的に関連した。（例えば、Ｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７５：５９−６８を参照すること。）したがって、祖先、ビクトリア及びヤマガタ系列のＢ型インフルエンザウイルスに対して有効である、Ｂ型インフルエンザウイルス感染療法を開発することが望ましい。
【０００７】
最近の報告は、赤血球凝集素と結合し、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を記載している。（例えば、Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３８７：１８０−１８５；Ｙａｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９：ｅ１００３１５０，１−１２；Ｄｒｅｙｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３３７：１３４３−１３４８；国際出願公開第２０１３／００７７７０号、同第２０１３／１３２００７号、同第２０１３／１１４８８５号、同第２０１０／０７３６４７号、ならびに米国特許出願公開第２００９／００９２６２０号、同第２０１１／０３１９６００号及び同第２０１１／０３１９６６０号を参照すること。）
【０００８】
これらの報告にもかかわらず、祖先、ヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルス感染の治療または予防に有効なＢ型インフルエンザウイルス療法を含む、広範囲のＢ型インフルエンザウイルス株に対して有効な新規のＢ型インフルエンザウイルス療法の必要性が、当該技術において依然として存在する。本発明は、この必要性を満たし、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療及び予防に他の利益を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体（すなわち、抗赤血球凝集素抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体）、抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体を含む組成物及びそれらの使用方法を提供する。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）、ならびに３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６４及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５及び／または６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６４及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態において、本発明は、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態において、本発明は、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６４及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、少なくとも１、２及び／または３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２及び／または３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６４及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号７９及び８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号７８、８２及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号７８、８２及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号７９及び８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１９】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号８１、８５及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号８０、８４及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号８０、８４及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号８１、８５及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）、ならびに３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２、３、４、５及び／または６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態において、本発明は、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
幾つかの実施形態において、本発明は、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２及び／または３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２及び／または３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号８９のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３０】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００３１】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００３４】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）、ならびに３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２、３、４、５及び／または６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本発明は、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本発明は、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２及び／または３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１、２及び／または３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離抗赤血球凝集素抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４２】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４５】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、本発明の単離抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素と特異的に結合する。幾つかの実施形態において、単離抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素と特異的に結合する単離抗赤血球凝集素モノクローナル抗体である。
【００４７】
本発明は、本発明の抗赤血球凝集素抗体をコードする単離核酸も提供する。本発明は、本発明の抗赤血球凝集素抗体をコードする核酸を含むベクターも提供する。本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。ベクターは、任意の種類、例えば、発現ベクターなどの組み換えベクターでありうる。様々な宿主細胞のいずれかを使用することができる。１つの実施形態において、宿主細胞は原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉである。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞である。
【００４８】
本発明は、本発明の抗赤血球凝集素抗体を産生する方法を更に提供する。例えば、本発明は、抗赤血球凝集素抗体（本明細書において定義されるように、完全長抗体及びそのフラグメントを含む）を作製する方法であって、適した宿主細胞において、抗赤血球凝集素抗体またはそのフラグメントをコードする本発明の組み換えベクターを、抗体またはそのフラグメントが産生されるように発現させることを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、方法は、本発明の抗赤血球凝集素抗体（またはそのフラグメント）をコードする核酸を含む宿主細胞を、核酸が発現するように培養することを含む。方法は、宿主細胞培養物または宿主細胞培養培地から、抗赤血球凝集素抗体またはそのフラグメントを回収することを更に含んでも良い。
【００４９】
本発明は、本発明の抗赤血球凝集素抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤も提供する。薬学的製剤は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５０】
本発明は、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む組成物も提供する。組成物は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５１】
本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の予防に使用される、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む組成物も提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の予防に使用される、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療に使用される、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む組成物を更に提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療に使用される、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害に使用される、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む組成物を更に提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害に使用される、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【００５２】
また本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む組成物を、医薬の製造に使用しても良い。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５３】
本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を阻害する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む有効量の組成物を投与し、それによって、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を阻害することを含む方法も提供する。本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む有効量の組成物を投与し、それによって、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療することを含む方法も提供する。本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を予防する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む有効量の組成物を投与し、それによって、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を予防することを含む方法も提供する。
【００５４】
本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を阻害、治療または予防する方法であって、その必要性のある患者に、本発明の抗赤血球凝集素抗体を含む有効量の組成物を投与し、患者に有効量の追加の治療剤を投与し、それによって、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を阻害、治療または予防することを含む方法も提供する。幾つかの実施形態において、追加の治療剤は、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤である。他の実施形態において、追加の治療剤は別の抗赤血球凝集素抗体である。なお他の実施形態において、追加の治療剤は抗Ｍ２抗体である。そのような併用治療の様々な態様において、治療剤は、ほぼ同じ時に投与される、一緒に投与される、または順次的若しくは連続的に投与される。特定の実施形態において、抗ノイラミニダーゼ阻害剤は、本発明の抗赤血球凝集素抗体の投与の前に投与される。幾つかの実施形態において、本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体は、祖先、ヤマガタ及びビクトリア系列を含む異なる系列のＢ型インフルエンザウイルス株によるＢ型インフルエンザウイルス感染を中和する、阻害する、治療する、または予防するのに有効である。
【００５５】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の抗赤血球凝集素抗体の使用を提供する。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５６】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５７】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５８】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００５９】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の製品の使用を提供する。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００６０】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の阻害、治療または予防に使用しても良い。ある特定の実施形態において、医薬は、追加の治療剤（例えば、オセルタミビルまたはザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤、別の抗赤血球凝集素抗体または抗Ｍ２抗体などの別の抗体等）を更に含んでも良い。
【００６１】
様々な態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と結合する。他の態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、赤血球凝集素と結合し、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和する。幾つかの実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスをインビトロ、インビボ、またはインビトロ及びインビボにおいて中和する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】モノクローナル抗体３４Ｂ５Ａ及びモノクローナル抗体３３Ｆ８それぞれによる、様々なＢ型インフルエンザウイルス単離菌のインビトロ中和を示すデータを記載する。
【図１Ｂ】モノクローナル抗体３４Ｂ５Ａ及びモノクローナル抗体３３Ｆ８それぞれによる、様々なＢ型インフルエンザウイルス単離菌のインビトロ中和を示すデータを記載する。
【図２】モノクローナル抗体４６Ｂ８Ａによる、様々なＢ型インフルエンザウイルス単離菌のインビトロ中和を示すデータを記載する。
【図３】赤血球凝集阻害に対するモノクローナル抗体３４Ｂ５Ｃ及びモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃの効果を示すデータを記載する。
【図４】インビトロプラーク阻害アッセイによるモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃによる様々なＢ型インフルエンザウイルス単離菌の中和を示すデータを記載する。
【図５】赤血球凝集素媒介細胞間融合に対するモノクローナル抗体３４Ｂ５Ｃ及びモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃの効果を示すデータを記載する。
【図６Ａ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ビクトリア／２０００に感染し、様々な量のモノクローナル抗体３４Ｂ５Ａが投与されたマウスの生存率（％）（図６Ａ）と、オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）が投与されたマウスの生存率（％）（図６Ｂ）との比較を示すデータを記載する。
【図６Ｂ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ビクトリア／２０００に感染し、様々な量のモノクローナル抗体３４Ｂ５Ａが投与されたマウスの生存率（％）（図６Ａ）と、オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）が投与されたマウスの生存率（％）（図６Ｂ）との比較を示すデータを記載する。
【図７Ａ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０００に感染し、様々な量のモノクローナル抗体３４Ｂ５Ｃが、感染の４８時間後または感染の７２時間後にそれぞれ投与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図７Ｂ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０００に感染し、様々な量のモノクローナル抗体３４Ｂ５Ｃが、感染の４８時間後または感染の７２時間後にそれぞれ投与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図８Ａ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０１０、Ｂ／ビクトリア／２０００、Ｂ／ロシア／１９６９及びＢ／マサチューセッツ／１９６６のそれぞれに感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが感染の２４、４８または７２時間後に投与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図８Ｂ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０１０、Ｂ／ビクトリア／２０００、Ｂ／ロシア／１９６９及びＢ／マサチューセッツ／１９６６のそれぞれに感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが感染の２４、４８または７２時間後に投与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図８Ｃ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０１０、Ｂ／ビクトリア／２０００、Ｂ／ロシア／１９６９及びＢ／マサチューセッツ／１９６６のそれぞれに感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが感染の２４、４８または７２時間後に投与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図８Ｄ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０１０、Ｂ／ビクトリア／２０００、Ｂ／ロシア／１９６９及びＢ／マサチューセッツ／１９６６のそれぞれに感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが感染の２４、４８または７２時間後に投与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図９Ａ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０１０及びＢ／ビクトリア／２０００のそれぞれに感染し、様々な量のモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが感染の７２時間後に与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図９Ｂ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ウイスコンシン／２０１０及びＢ／ビクトリア／２０００のそれぞれに感染し、様々な量のモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが感染の７２時間後に与されたマウスの生存率（％）を示すデータを記載する。
【図１０Ａ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ビクトリア／２０００に感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃまたはオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）のいずれかが投与されたマウスの生存率（％）及び体重（ＢＷ）変化（％）をそれぞれ示すデータを記載する。
【図１０Ｂ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ビクトリア／２０００に感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃまたはオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）のいずれかが投与されたマウスの生存率（％）及び体重（ＢＷ）変化（％）をそれぞれ示すデータを記載する。
【図１１Ａ】マウスにおける生存率（％）及び肺ウイルス力価それぞれに対するモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃ及びオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）の単独での、または組み合わせでの投与の効果を示すデータを記載する。
【図１１Ｂ】マウスにおける生存率（％）及び肺ウイルス力価それぞれに対するモノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃ及びオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）の単独での、または組み合わせでの投与の効果を示すデータを記載する。
【図１２Ａ】モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃ及びオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）の共投与の効果を示すデータを記載する。
【図１２Ｂ】モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃ及びオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ）の共投与の効果を示すデータを記載する。
【図１３】本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の軽鎖及び重鎖超可変領域のアミノ酸配列を記載する。
【図１４】ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図１５】ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｂの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図１６】ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図１７】ｍＡｂ  ３３Ｆ８の軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図１８】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ａの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図１９】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｂの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２０】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２１】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｄの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２２】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｅの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２３】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｆの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２４】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｇの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２５】ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｈの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を記載する。
【図２６Ａ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ブリスベン／２００８に感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが投与されたマウスの生存率（％）及び体重（ＢＷ）変化（％）をそれぞれ示すデータを記載する。
【図２６Ｂ】Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ブリスベン／２００８に感染し、モノクローナル抗体４６Ｂ８Ｃが投与されたマウスの生存率（％）及び体重（ＢＷ）変化（％）をそれぞれ示すデータを記載する。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
Ｉ．定義
本明細書の目的において「ヒト受容体フレームワーク」は、下記に定義されているヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークから誘導される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークから「誘導される」ヒト受容体フレームワークは、同じアミノ酸配列を含んでも良い、またはアミノ酸配列の変化を含有しても良い。幾つかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下または２個以下である。幾つかの実施形態において、ＶＬヒト受容体フレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００６４】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用の合計の強度を指す。特に示されない限り、本明細書に使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の１：１の相互作用を反映する固有結合親和性を指す。分子ＸとそのパートナーＹとの親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当該技術に既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定する特定の実例的及び例示的な実施形態を、以下に記載する。
【００６５】
「親和性成熟」抗体は、変更を有さない親抗体と比較して、１個以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１個以上の変更を有する抗体を指し、そのような変更は、抗原への抗体の親和性の改善をもたらす。
【００６６】
「抗赤血球凝集素抗体」及び「赤血球凝集素に結合する抗体」という用語は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を標的にすることを含む、赤血球凝集素を標的にすることにおいて診断及び／または治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性を持って赤血球凝集素と結合する抗体を指す。１つの実施形態において、無関係の非赤血球凝集素タンパク質への抗赤血球凝集素抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定して、赤血球凝集素への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、赤血球凝集素に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗赤血球凝集素抗体は、祖先、ビクトリアまたはヤマガタ系列のＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素のエピトープなどの、Ｂ型インフルエンザウイルスの異なる菌株、サブタイプ及び単離菌の赤血球凝集素に保存されている、Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素のエピトープに結合する。
【００６７】
「抗体」という用語は、本明細書において、最も広義の意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントが望ましい抗原結合活性を示す限り含まれるが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【００６８】
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体が結合する抗原と結合する無傷の抗体の一部分を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントは、赤血球凝集素と結合し、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する無傷の抗体の一部分を含む、無傷の抗体以外の分子も指す。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、直線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
基準抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて基準抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、基準抗体は、競合アッセイにおいて抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する。例示的な競合アッセイは、本明細書に提供されている。
【００７０】
「キメラ」抗体という用語は、重及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種から誘導され、重及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種から誘導される抗体を指す。
【００７１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５つの主な抗体のクラスがあり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、これらのうちの幾つかを、サブクラス（アイソタイプ）に更に分けることができ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ及びμとそれぞれ呼ばれる。
【００７２】
「細胞傷害剤」という用語は、本明細書に使用されるとき、細胞機能を阻害若しくは防止する、及び／または細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びLｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物または動物由来の、小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（そのフラグメント及び／または変種を含む）；ならびに以下に開示されている様々な抗腫瘍または抗癌剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；ならびにＢ細胞活性化が含まれる。
【００７４】
作用物質、例えば薬学的製剤の「有効量」は、望ましい治療または予防の結果を、必要な投与量及び期間で達成するのに有効な量を指す。
【００７５】
「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。用語には、未変性配列Ｆｃ領域及び変種Ｆｃ領域が含まれる。１つの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸びている。しかしＦｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していても、いなくても良い。本明細書において特定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているように、ＥＵ指標とも呼ばれるＥＵ番号付け系に従っている。
【００７６】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＦ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（またはＶＬ）に以下の順序：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で表れる。
【００７７】
「完全長抗体」、「無傷の抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、未変性抗体構造と実質的に類似した構造を有する、または本明細書に定義されているＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００７８】
「宿主細胞」、「宿主細胞系」及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の後代も含まれる。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、一次形質転換細胞及び継代数に関わりなくそれから誘導される後代が含まれる。後代は、親細胞と核酸含有量が完全に同一ではない場合もあるが、突然変異を含有する場合もある。元の形質転換細胞で選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異後代が、本明細書において含まれる。
【００７９】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
【００８０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表す、フレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の部分群からである。一般に、配列の部分群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような部分群である。１つの実施形態において、ＶＬでは、部分群は上記のＫａｂａｔらにあるようにカッパＩである。１つの実施形態において、ＶＨでは、部分群は上記のＫａｂａｔらにあるように部分群ＩＩＩである。
【００８１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、全て、または実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のものに対応し、全て、または実質的に全てのＦＲは、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体から誘導される抗体定常領域の少なくとも一部分を場合により含んでも良い。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けている抗体を指す。
【００８２】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書に記載されるとき、順序が超可変性（「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」）である、及び／または構造的に確定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含有する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。本明細書において例示的なＨＶＲには、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）及び９３〜１０１（Ｈ３）に生じるアミノ酸接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）の組み合わせ
が含まれる。
【００８３】
特に示されない限り、可変ドメインのＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００８４】
「免疫複合体」は、細胞傷害剤が含まれるが、これに限定されない１つ以上の異種分子に複合した抗体である。
【００８５】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が、限定されることなく含まれる。ある特定の実施形態において、個体または対象はヒトである。
【００８６】
「単離」抗体は、その天然環境の構成成分から分離されたものである。幾つかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、細管電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％または９９％を超えた純度に精製される。抗体純度の評価方法についての総説には、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照すること。
【００８７】
「単離」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、核酸分子を通常含有するが、核酸分子が染色体外に存在する、または天然の染色体の位置と異なる染色体の位置に存在する細胞に含有されている、核酸分子が含まれる。
【００８８】
「抗赤血球凝集素抗体をコードする単離核酸」は、抗体重及び軽鎖（またはそのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一ベクターまたは別個のベクターにおけるそのような核酸分子（複数可）及び宿主細胞の１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子（複数可）が含まれる。
【００８９】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書に使用されるとき、実質的に同種の抗体の個体群から得られる抗体を指し、すなわち、個体群に含まれる個別の抗体は、例えば、天然に生じる突然変異を含有する、またはモノクローナル抗体調合剤の産生の際に生じる変種抗体の可能性を除いて、同一である及び／または同じエピトープと結合する。そのような変種は、一般に少量で存在する。異なる決定因子（エピトープ）に向けられている異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調合剤と対照的に、モノクローナル抗体調合剤の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定因子に向けられている。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の性質が抗体の実質的に同種の個体群から得たものであることを示しており、任意の特定の方法により抗体を産生することを必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージ提示法及びヒト免疫グロブリン座の全て、または一部を含有する遺伝子導入動物を利用する方法が含まれるが、これらに限定されない様々な技術により作製されても良く、そのような方法及びモノクローナル抗体を作製する他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００９０】
「裸抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識と複合していない抗体を指す。裸抗体は、薬学的製剤に存在しても良い。
【００９１】
「未変性抗体」は、様々な構造の天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、未変性ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。ＮからＣ末端において、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、ＮからＣ末端において、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に１つの定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに指定しても良い
【００９２】
「添付文書」という用語は、市販の治療製品の包装に慣用的に含まれる使用説明書を指すために使用され、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌についての情報及び／またはそのような治療製品の使用に関する警告を含む。
【００９３】
基準ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の率（％）」は、配列を整列し、必要であれば配列同一性の最大率を達成するため、ギャップを導入した後の、基準ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率と定義され、保存的置換を配列同一性の一部として全く考慮しない。アミノ酸配列同一性の率を決定する目的の整列は、当該技術の技能の範囲内の様々な方法により、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大限の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するのに適切なパラメーターを決定することができる。しかし本明細書の目的において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは米国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザーマニュアルと共に出願されており、米国著作権登録番号（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．）ＴＸＵ５１００８７により登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより公開されている、またはソースコードからコンパイルしても良い。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペーレーティングシステムにおける使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変更はない。
【００９４】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる場合、所定のアミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂとのアミノ酸配列同一性％（これを、所定のアミノ酸配列Ｂとある特定の％のアミノ酸配列同一性を有する、または含む所定のアミノ酸配列Ａ、と言い換えることができる）は、以下のように計算される。
１００×Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２により、Ａ及びＢのプログラム整列において完全一致したとスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミン酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへのアミノ酸配列同一性の％は、ＢのＡへのアミノ酸配列同一性の％と等しくないことが理解される。特定的に記述されない限り、本明細書に使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、直前の段落に記載されたように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して得られる。
【００９５】
「薬学的製剤」という用語は、含有された活性成分の生物学的活性が有効であることを許容するような形態である及び製剤が投与される対象に許容されない毒性がある追加の構成成分を含有しない、調合剤を指す。
【００９６】
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、薬学的製剤における活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
「赤血球凝集素」という用語は、本明細書に使用されるとき、特に示されない限り、任意のインフルエンザウイルス源からの任意の未変性赤血球凝集素を指す。この用語は、「完全長」の未処理赤血球凝集素、ならびにインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス感染細胞における処理によってもたらされる任意の形態の赤血球凝集素を包含する。この用語は、赤血球凝集素の天然に生じる変種、例えばスプライス変種または対立遺伝子変種も包含する。様々なＢ型インフルエンザウイルス株または系列からの例示的な赤血球凝集素タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術において容易に入手可能である。
【００９８】
本明細書に使用されるとき、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などの文法的変形）は、治療される個体の自然の経過の変更を試みる臨床介入を指し、予防的に、または臨床病理の過程において、実施することができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防（例えば、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の発生または再発の予防）、症状の低減（例えば、減力）または軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解または緩和、及び寛解または改善された予後が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発生を遅延するため、または疾患の進行を緩徐するために使用される。
【００９９】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合させることに関与する抗体重または軽鎖のドメインを指す。未変性抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似した構造を有し、各ドメインは、４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照すること。）単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。更に特定の抗原と結合する抗体を、抗原と結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、相補的なＶＬまたはＶＨドメインそれぞれのライブラリーを選別することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照すること。
【０１００】
「ベクター」という用語は、本明細書に使用されるとき、それが連結される別の核酸を伝播することが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造のベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、作動可能に連結される核酸の発現を方向付けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【０１０１】
ＩＩ．組成物及び方法
１つの態様において、本発明は、抗赤血球凝集素抗体及びその使用に、部分的に基づいている。ある特定の実施形態において、赤血球凝集素に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断、治療または予防に有用である。
【０１０２】
Ａ．例示的な抗赤血球凝集素抗体
１つの態様において、本発明は、赤血球凝集素に結合する単離抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、赤血球凝集素と結合する、Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と結合する、ヤマガタ系列のＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と結合する、ビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と結合する、祖先系列のＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と結合する、またはヤマガタ系列、ビクトリア系列及び祖先系列のＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と結合する。他の実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスをインビトロにおいて中和する。他の実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスをインビボにおいて中和する。なお他の実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を低減する、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を予防する、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を阻害する、またはＢ型インフルエンザウイルス感染を治療する。幾つかの実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、インフルエンザウイルス膜と感染細胞エンドソーム膜との赤血球凝集素媒介融合を予防、阻害または低減する（したがって、感染細胞の細胞質へのウイルスＲＮＡ侵入を予防、阻害または低減し、したがって、インフルエンザウイルス感染の更なる伝播を予防、阻害または低減する）。
【０１０３】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１０４】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１０５】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１０６】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号５９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号５９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、配列番号７９及び８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、配列番号７８、８２及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、配列番号７９及び８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７８、８２及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１１３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１１４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１１５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１１６】
別の態様において、本発明は、配列番号８１、８５及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、配列番号８０、８４及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、配列番号８１、８５及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８０、８４及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１１９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１２０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１２１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８７のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１２２】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１２３】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１２４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号５９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１２６】
別の態様において、本発明は、配列番号８９の酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【０１２７】
別の態様において、本発明は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【０１２８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１２９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１３０】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３１】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３２】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３３】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３４】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３５】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３６】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３７】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３８】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含む抗赤血球凝集素抗体を提供する。
【０１３９】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４０】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４１】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４２】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４３】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４４】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４５】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４６】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４７】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０１４８】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１４９】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５１】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５２】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５５】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む抗体を提供する。
【０１５６】
別の態様において、本発明は、配列番号９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【０１５７】
別の態様において、本発明は、配列番号９１の酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【０１５８】
別の態様において、本発明は、配列番号９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１５９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６６】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体を提供する。
【０１６７】
別の態様において、本発明は、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。
【０１６８】
別の態様において、本発明は、配列番号９３の酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。
【０１６９】
別の態様において、本発明は、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７６】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７７】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体を提供する。
【０１７８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、本発明の抗赤血球凝集素抗体はヒト化される。１つの実施形態において、抗赤血球凝集素抗体は、上記の実施形態のいずれかのようにＨＶＲを含み、ヒト受容体フレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。
【０１７９】
別の態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、配列番号７９、８３、８９、９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、その配列を含む抗赤血球凝集素抗体は、赤血球凝集素に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、合計で１〜１０個のアミノ酸が、配列番号７９、８３、８９、９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５または１０７において置換、挿入及び／または欠失されている。ある特定の実施形態において、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲの外側（すなわち、ＦＲ内）の領域で生じる。場合により、抗赤血球凝集素抗体は、配列番号７９、８３、８９、９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５または１０７にＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含まれる。
【０１８０】
別の態様において、抗赤血球凝集素抗体が提供され、ここで抗体は、配列番号７８、８２、８６及び９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、その配列を含む抗赤血球凝集素抗体は、赤血球凝集素に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、合計で１〜１０個のアミノ酸が、配列番号７８、８２、８６または９１において置換、挿入及び／または欠失されている。ある特定の実施形態において、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲの外側（すなわち、ＦＲ内）の領域で生じる。場合により、抗赤血球凝集素抗体は、配列番号７８、８２、８６または９１にＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含まれる。
【０１８１】
別の態様において、抗赤血球凝集素抗体が提供され、ここで抗体は、上記に提供された実施形態のいずれかのようなＶＨ及び上記に提供された実施形態のいずれかのようなＶＬを含む。１つの実施形態において、抗体は、配列番号７９、８３、８９、９２、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５または１０７及び配列番号７８、８２、８６または９１それぞれにＶＨ及びＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾も含まれる。
【０１８２】
更なる態様において、本発明は、本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある特定の実施形態において、配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号７８のＶＬ配列；配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列；配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列；配列番号８９のＶＨ配列及び配列番頭７８のＶＬ配列；配列番号９２のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号９５のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号９７のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号９９のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０１のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０３のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０５のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０７のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列を含む抗赤血球凝集素抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
【０１８３】
本発明の更なる態様において、上記の実施形態のいずれかの抗赤血球凝集素抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、抗赤血球凝集素抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二特異性抗体またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。別の実施形態において、抗体は、完全長抗体、例えば無傷の、例えばＩｇＧ１抗体、または本明細書に定義されている他のクラス若しくはアイソタイプの抗体である。
【０１８４】
更なる態様において、上記の実施形態のいずれかにおける抗赤血球凝集素抗体は、下記のセクション１〜７に記載されている特徴のいずれかを単独で、または組み合わせて組み込むことができる。
【０１８５】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１８６】
１つの実施形態において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。１つの実施形態において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて実施される。例えば、抗原へのＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と、非標識抗原の一連の滴定の存在下で平衡化し、次に抗Ｆａｂ抗体被覆プレートにより、結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照すること）。アッセイの条件を確立するため、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム中の捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）（ｐＨ９．６）の５μｇ／ｍｌにより一晩被覆し、続いてＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより室温（およそ２３℃）で２〜５時間にわたって遮断する。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致している）。次に目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは、より長時間（例えば、約６５時間）にわたって続けて、平衡が達成されることを確実にしても良い。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移す。次に溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）により１０分間数える。２０％以下の最大結合を与える濃度のＦａｂが、それぞれ、競合結合アッセイにおける使用のために選択される。
【０１８７】
別の実施形態によると、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用するアッセイは、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップにより２５℃で実施される。１つの実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により、供給会社の使用説明書に従って活性化される。抗原は、５μｌ／分の流速で注入される前に、共役タンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成するため、１０ｍＭの酢酸エチル、ｐＨ４．８により５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈される。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動態測定のため、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳに、およそ２５μｌ／分の流速により２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、簡単な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時に当てはめることにより計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、Ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照すること。上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより、ｏｎの速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、ｏｎの速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定して、増加濃度の抗原の存在下でＰＢＳ、ｐＨ７．２中における２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、帯域１６ｎＭ）の増加または減少を測定する、蛍光消光技術を使用して決定することができる。
【０１８８】
２．抗体フラグメント
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメント、ならびに下記に記載されている他のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体フラグメントについての総説は、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照すること。ｓｃＦｖフラグメントについての総説は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照すること。また、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照すること。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察は、米国特許第５，８６９，０４６号を参照すること。
【０１８９】
二特異性抗体は、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照すること。三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）及び四特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）も、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１９０】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部分または軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部分を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照すること）。
【０１９１】
抗体フラグメントは、本明細書に記載されているように、無傷の抗体のタンパク質分解性消化、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生が含まれるが、これらに限定されない様々な技術により作製することができる。
【０１９２】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。１つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類から誘導される可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスと変わっている「クラス切り替え」抗体である。キメラ抗体には、その抗体結合フラグメントが含まれる。
【０１９３】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体はヒト化されて、ヒトに対する免疫原性が低下するが、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持している。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（または、その一部分）が、非ヒト抗体から誘導され、ＦＲ（または、その一部分）がヒト抗体配列から誘導される、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するため、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が誘導される抗体）の対応する残基で置換される。
【０１９４】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植について記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」）について記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」について記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」について記載している）に更に記載されている。
【０１９５】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「最良適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法を使用して選択されるフレームワーク（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照すること）；ヒト抗体の特定の部分群の軽または重鎖可変領域のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照すること）；ヒト成熟（体細胞性突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照すること）；ならびにＦＲライブラリーを選別することにより誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照すること）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術に既知の様々な技術を使用して、または本明細書に記載されている技術を使用して、産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１９７】
ヒト抗体は、免疫原を、抗原投与に応答して無傷のヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷の抗体を産生するように修飾された遺伝子導入動物に投与することによって、調製され得る。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン座の全て、または一部分を含有し、ヒト免疫グロブリン座は内在性免疫グロブリン座を交換する、または染色体外に存在する若しくは動物の染色体に無作為に組み込まれる。そのような遺伝子導入マウスにおいて、内在性免疫グロブリン座は、一般に不活性化されている。遺伝子導入動物からヒト抗体を得る方法についての総説は、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照すること。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照すること。そのような動物により生成された無傷の抗体のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に修飾され得る。
【０１９８】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞系が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照すること。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体も、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。追加的な方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載している）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載している）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術）も、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１９９】
ヒト抗体は、ヒト誘導ファージ提示ライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次にそのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせても良い。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術は、下記に記載される。
【０２００】
５．ライブラリー誘導抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーを選別することによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリーを生成する及びそのようなライブラリーを、所望の結合性を有する抗体について選別する様々な方法が、当該技術において知られている。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍらにより、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）において総説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）において更に記載されている。
【０２０１】
ある特定のファージ提示方法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローンし、ファージライブラリーにおいて無作為に組み合わせ、次にこれらを、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように、抗原結合ファージについて選別することができる。ファージは、典型的には抗体フラグメントを、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されているように、未変性のレパートリーをクローンして（例えば、ヒトから）、任意の免疫化を行うことなく、広範囲の非自己、また自己抗原に対して抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されているように、幹細胞の非再編成Ｖ遺伝子セグメントをクローンし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再編成を達成することによって、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０２０２】
ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体または抗体フラグメントは、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと考慮される。
【０２０３】
６．多特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、赤血球凝集素に対してであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、赤血球凝集素の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、また、赤血球凝集素を発現する細胞に細胞傷害剤を局在させるために使用しても良い。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
【０２０４】
多特異性抗体を作製する技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照すること）、ならびに「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」技術（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照すること）が含まれるが、これらに限定されない。多特異性抗体は、静電的操縦効果を操作して抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製する（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体またはフラグメントを架橋する（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照すること）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生する（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照すること）、「二特異性抗体」技術を使用して二重特異性抗体フラグメントを作製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照すること）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用する（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照すること）、ならびに例えばＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように三重特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を調製することによっても作製され得る。
【０２０５】
「タコ型抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する改変抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照すること）。
【０２０６】
本明細書の抗体またはフラグメントには、赤血球凝集素のみならず、別の異なる抗原にも結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照すること）。
【０２０７】
７．抗体変種
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変種が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、適切な修飾を、抗体をコードするヌクレオチド配列に導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内からの欠失、及び／またはアミノ酸配列内への挿入、及び／またはアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを実施して、最終構築物を得ることができるが、但し、最終構築物が所望の特徴、例えば抗原結合を有することが条件である。
【０２０８】
ａ）置換、挿入及び欠失変種
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変種が提供される。置換突然変異誘発の目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換が、「好ましい置換」の見出しで表１に示されている。より実質的な変化が、「例示的置換」の見出しで表１に提示されており、アミノ酸側鎖クラスを参照しながら下記に更に記載される。アミノ酸置換が、目的の抗体に導入され、生成物が、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善について選別され得る。
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【０２０９】
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必然的に伴う。
【０２１０】
１つの種類の置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、更なる研究のための選択によって得られた変種（複数可）は、親抗体と比べて特定の生物学的特性に修飾（例えば改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）を有する、及び／または親抗体のある特定の生物学的特性を保持する。例示的な置換変種は親和性成熟抗体であり、これは、例えば本明細書に記載されているものなどのファージ提示に基づいた親和性成熟技術を使用して、都合良く生成され得る。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が突然変異され、変種抗体がファージに提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）について選別される。
【０２１１】
変更（例えば、置換）を、例えば、抗体親和性を改善するためにＨＶＲに行っても良い。そのような変更を、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程において高い頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照すること）及び／または抗原に接触する残基において行っても良く、得られる変種ＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築及び再選択される親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００１））に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施形態において、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟について選択された様々な遺伝子に導入される。次に二次ライブラリーが作り出される。次にライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体変種を特定するために選別される。多様性を導入する別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）が無作為化されるＨＶＲ指定手法を伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング（ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に特定しても良い。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は、多くの場合に標的になる。
【０２１２】
ある特定の実施形態において、置換、挿入または欠失は、そのような変更が、抗原と結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＨＶＲ内に生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書に提供されている保存的置換）を、ＨＶＲに行っても良い。そのような変更は、例えば、ＨＶＲの残基と接触している抗原の外側であっても良い。上記に提供された変種ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、変更されていない、または１、２若しくは３個以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２１３】
突然変異誘発の標的になり得る抗体の残基または領域を特定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または一群の標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）を特定し、中性または陰性荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に代えて、抗体と抗原の相互作用に影響を与えるかを決定する。最初の置換に機能的な感受性を示すアミノ酸位置に、更なる置換を導入しても良い。代替的または追加的には、抗体と抗原の接触点を特定する、抗原抗体複合物の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基を、置換の候補として標的にしても、または排除しても良い。変種を選別して、所望の特性を含有しているかを決定しても良い。
【０２１４】
アミノ酸配列挿入物には、１個の残基の長さから百個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ及び／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変種には、抗体のＮ若しくはＣ末端を酵素に融合したもの（例えば、ＡＤＥＰＴ）、または抗体の血清半減期を増加するポリペプチドが含まれる。
【０２１５】
ｂ）グリコシル化変種
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように変更される。抗体のグリコシル化部位の付加または欠失は、アミノ酸配列を、１個以上のグルコシル化部位が作り出される、または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって都合良く達成され得る。
【０２１６】
抗体がＦｃ領域を含む場合、結合している炭水化物が変更され得る。哺乳類細胞により産生される未変性抗体は、一般にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ連結により結合している、典型的には、分岐した二分岐鎖オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照すること。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、ならびに二分岐鎖オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースが含まれ得る。幾つかの実施形態において、本発明の抗体のオリゴ糖における修飾は、ある特定の改善された特性を有する抗体変種を作り出すために行う場合がある。
【０２１７】
１つの実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠いている炭水化物構造を有する抗体変種が、提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えばＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定して、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（例えば、複合物、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、２９７位から上流または下流に約±３個のアミノ酸、すなわち抗体における僅かな配列差異に起因して２９４〜３００位の間に位置する場合もある。そのようなフコシル化変種は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する場合がある。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を参照すること。「脱フコシル化」または「フコース欠乏」抗体変種に関する公報の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ  ２０００／６１７３９；ＷＯ  ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞系の例には、タンパク質フコシル化が欠けているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら、とりわけ実施例１１）、ならびにアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞系（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照すること）が含まれる。
【０２１８】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐鎖オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変種が更に提供される。そのような抗体変種は、低減したフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変種の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体変種も、提供される。そのような抗体変種は、改善されたＣＤＣ機能を有する場合がある。そのような抗体変種は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２１９】
ｃ）Ｆｃ領域変種
ある特定の実施形態において、１個以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦＣ領域変種を生成し得る。Ｆｃ領域変種は、１個以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２２０】
ある特定の実施形態において、本発明は、エフェクター機能の、全てではないが幾つかを有する抗体変種を企図し、これは、抗体のインビボでの半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）が不必要である、または有害である用途に、抗体変種を望ましい候補にする。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体はＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、恐らくＡＤＣＣ活性を欠いている）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞のＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照すること）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照すること）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いても良い（例えば、フローサイトメトリーのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ．）及びＣｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｓｏｎ、ＷＩ）を参照すること）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価しても良い。またＣ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑと結合できないこと、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認しても良い。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照すること。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを実施しても良い（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照すること）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定も、当該技術に既知の方法を使用して決定することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照すること）。
【０２２１】
低減されたエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１個以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２個以上に置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる。
【０２２２】
ＦｃＲへの改善または縮小された結合を有する、ある特定の抗体変種が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照すること。）
【０２２３】
ある特定の実施形態において、抗体変種は、ＡＤＣＣを改善する１個以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３及び／または３３４（残基のＥＵ番号付け）に置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２２４】
幾つかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、変更された（すなわち、改善若しくは縮小された）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変更が、Ｆｃ領域において行われる。
【０２２５】
増加した半減期及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体は、母系ｌｇＧの胎児への移行に関与し（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１個以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変種には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の１個以上に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するもの（米国特許第７，３７１，８２６号）が含まれる。
【０２２６】
Ｆｃ領域変種の他の例については、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照すること。
【０２２７】
ｄ）システイン改変抗体変種
ある特定の実施形態において、抗体の１個以上の残基がシステイン残基に置換されているシステイン改変抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作り出すことが、望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、抗体の利用可能な部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体の利用可能な部位に位置付けられ、抗体を薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分に複合して、本明細書に更に記載されている免疫複合体を作り出すために使用され得る。ある特定の実施形態において、以下の１個以上の残基をシステインにより置換しても良い。Ｆｃ領域の軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）及び重鎖のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成しても良い。
【０２２８】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体を、当該技術において既知であり、容易に利用可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾しても良い。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性のため製造に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であっても良く、分岐鎖または非分岐鎖であっても良い。抗体に結合しているポリマーの数は変わっても良く、１つを超えるポリマーが結合している場合、これらは同一または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、抗体誘導体が、確定された条件下で治療に使用される等に関わらず、改善される抗体の特定の特性または機能が含まれるが、これらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
【０２２９】
別の実施形態において、抗体と、放射線への曝露により選択的に加熱され得る非タンパク質性部分との複合体が、提供される。１つの実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であっても良く、通常の細胞は傷つけないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分の近位の細胞を死滅させる温度まで加熱する波長が含まれるが、これに限定されない。
【０２３０】
Ｂ．組み換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組み換え方法及び組成物を使用して産生され得る。１つの実施形態において、本明細書に記載されている抗赤血球凝集素抗体をコードする単離核酸が、提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽及び／または重鎖）をコードし得る。更なる実施形態において、そのような核酸を含む１個以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、を含む（例えば、によって形質転換されている）。１つの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。１つの実施形態において、抗赤血球凝集素抗体を作製する方法であって、上記に提供された、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養し、場合により、抗体を宿主細胞（または、宿主細胞培養培地）から回収することを含む方法が、提供される。
【０２３１】
抗赤血球凝集素抗体の組み換え産生では、例えば上記に記載された、抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／または発現のために、１個以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離及び配列決定され得る。
【０２３２】
抗体コードベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載されている原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌において産生され得る。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現は、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号及び同第５，８４０，５２３号を参照すること。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体フラグメントの発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．  ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照すること。）発現した後、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離しても良く、更に精製することができる。
【０２３３】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物が、抗体コードベクターのクローニングまたは発現宿主に適しており、グリコシル化経路が「ヒト化」されて、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母菌株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照すること。
【０２３４】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫の細胞が含まれる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入のため、昆虫細胞と一緒に使用され得る多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０２３５】
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号及び同第６，４１７，４２９号（遺伝子導入植物における抗体産生のＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照すること。
【０２３６】
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中に増殖するように適合された哺乳類細胞系は、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞系の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系；ヒト胎児肝臓系（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されている２９３または２９３細胞）；子ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；バッファロー（ｂｕｆｆａｌｏ）ラット腎細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト腎細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類細胞系には、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系が含まれる。抗体産生に適した、ある特定の哺乳類宿主細胞系の総説には、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照すること。
【０２３７】
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体は、当該技術に既知の様々なアッセイにより物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について特定、選別または特徴決定され得る。
【０２３８】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
１つの態様において、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等などの既知の方法により、抗原結合活性について試験される。
【０２３９】
別の態様において、競合アッセイを使用して、赤血球凝集素の結合について本明細書に記載されている任意の抗赤血球凝集素抗体と競合する抗体を特定しても良い。ある特定の実施形態において、そのような競合抗体は、本明細書に記載されている抗赤血球凝集素抗体（例えば、配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号７８のＶＬ配列；配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列；配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列；配列番号８９のＶＨ配列及び配列番頭７８のＶＬ配列；配列番号９２のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号９５のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号９７のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号９９のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０１のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０３のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０５のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列；配列番号１０７のＶＨ配列及び配列番号９１のＶＬ配列を含む抗赤血球凝集素抗体）が結合している同じエピトープ（例えば、直線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする例示的な詳細な方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
【０２４０】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化赤血球凝集素は、赤血球凝集素に結合する第１の標識抗体及び赤血球凝集素への結合を第１の抗体と競合する能力が試験される第２の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上澄みに中に存在しても良い。対照として、固定化赤血球凝集素は、第１の抗体を含むが、第２の抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。赤血球凝集素への第１の抗体の結合に許容的な条件下でインキュベートした後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化赤血球凝集素と会合した標識の量を測定する。固定化赤血球凝集素と会合した標識の量が、対照試料と比べて試験試料において実質的に低減している場合、このことは、第２の抗体が赤血球凝集素への結合を第１の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照すること。
【０２４１】
２．活性アッセイ
１つの態様において、生物学的活性を有する抗赤血球凝集素抗体及びそのフラグメントを特定するアッセイが、提供される。生物学的活性には、例えば、Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素への特異的結合、Ｂ型インフルエンザウイルスの中和等が含まれ得る。抗体、ならびにそのような生物学的活性をインビボ及び／若しくはインビトロで有する抗体またはそのフラグメントを含む組成物も、提供される。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。そのようなアッセイの例示的な記載について、実施例３〜１６を参照すること。
【０２４３】
Ｄ．免疫複合体
本発明は、化学療法剤若しくは薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、またはこれらのフラグメント）、あるいは放射性同位体などの、１つ以上の細胞傷害剤と複合している、本明細書の抗赤血球凝集素抗体を含む免疫複合体も、提供する。
【０２４４】
１つの実施形態において、免疫複合体は、抗体が、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照すること）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号を参照すること）；ドラスタチン；カリチアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；及びＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照すること）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照すること）；メトトレキセート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（ｌａｒｏｔａｘｅｌ）、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）及びオルタタキセル（ｏｒｔａｔａｘｅｌ）などのタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されない１つ以上の薬物と複合している、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【０２４５】
別の実施形態において、免疫複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、菌体外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン、ならびにトリコテシンが含まれるが、これらに限定されない酵素活性毒素またはそのフラグメントに複合した、本明細書に記載されている抗体を含む。
【０２４６】
別の実施形態において、免疫複合体は、放射性原子に複合して放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成する、本明細書に記載されている抗体を含む。様々な放射性同位体が、放射性複合体の産生に利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性複合体が検出に使用されるとき、シンチグラフ検査に放射性原子、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ＭＲＩとしても知られている）にｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、または、ここでもヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン若しくは鉄などのスピン標識を含む場合がある。
【０２４７】
抗体と細胞傷害剤との複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して、作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の複合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照すること。リンカーは、細胞中の細胞傷害薬の放出を推進する「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用しても良い。
【０２４８】
本明細書の免疫複合体またはＡＤＣは、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ,ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が含まれるが、これらに限定されない架橋試薬により調製される複合体を明確に企図するが、そのような複合体に限定されない。
【０２４９】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される任意の抗赤血球凝集素抗体は、生物学的試料中の赤血球凝集素またはＢ型インフルエンザウイルスの存在を検出するのに有用である。「検出すること」という用語は、本明細書に使用されるとき、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態において、生物学的試料は、例えば、肺、上気道、鼻管、血液、痰などの細胞若しくは組織を含む、または鼻若しくは咽頭の拭き取りにより得られた生物学的試料を含む。
【０２５０】
１つの実施形態において、診断または検出の方法に使用される抗赤血球凝集素抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中の赤血球凝集素またはＢ型インフルエンザウイルスの存在を検出する方法が、提供される。ある特定の実施形態において、方法は、生物学的試料を、本明細書に記載されている抗赤血球凝集素抗体と、赤血球凝集素への抗赤血球凝集素抗体の結合を許容する条件下で接触させること、ならびに複合物が抗赤血球凝集素抗体及び赤血球凝集素により形成されるかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ、またはインビボ方法であり得る。１つの実施形態において、抗赤血球凝集素抗体は、例えば、赤血球凝集素が患者の選択バイオマーカーである、抗赤血球凝集素抗体による療法に適格な患者を選択するために使用される。
【０２５１】
本発明の抗体を使用して診断され得る障害の例には、小児、幼児、成人及び高齢者におけるＢ型インフルエンザウイルス感染を含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染が含まれる。
【０２５２】
ある特定の実施形態において、標識された抗赤血球凝集素抗体が提供される。標識には、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光及び放射性標識）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して検出される、酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性アイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどの蛍光団、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラー及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラデッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などの色素前駆体を酸化する過酸化水素を用いる酵素と共役したもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５３】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載されている抗赤血球凝集素抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのような抗体を、任意の１つ以上の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合して、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態に調製される。薬学的に許容される担体は、用いられる投与量及び濃度で受容者に対して一般に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；ヘキサメトニウム塩化物；ベンザルコニウム塩化物；ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個未満の残基）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖及びグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合物（例えば、Ｚｎタンパク質複合物）；ならびに／あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの間質薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が、更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０２５４】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン酢酸塩緩衝液を含む。
【０２５５】
本明細書の製剤は、また、治療される特定の適応症のために必要であれば１つを超える活性成分を、好ましくは互いに有害な影響を与えない相補的活性を有するものを、含有しても良い。例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤、抗赤血球凝集素抗体、抗Ｍ２抗体等を更に提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わされて、適切に存在する。
【０２５６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されたマイクロカプセルに、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにそれぞれ閉じ込められていても良い。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２５７】
持続放出調合剤が調製され得る。持続放出調合剤の適切な例には、抗体を含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは造形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
【０２５８】
インビボ投与に使用される製剤は、一般に滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって、容易に達成され得る。
【０２５９】
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書に提供される任意の抗赤血球凝集素抗体は、治療方法に使用され得る。
【０２６０】
１つの態様において、医薬として使用される抗赤血球凝集素抗体が提供される。更なる態様において、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療、予防または阻害に使用される抗赤血球凝集素抗体が提供される。ある特定の実施形態において、治療の方法に使用される抗赤血球凝集素抗体が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、有効量の抗赤血球凝集素抗体を個体に投与することを含む、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を有する個体を治療する方法に使用される抗赤血球凝集素抗体を提供する。１つのそのような実施形態において、方法は、例えば下記に記載される、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を、個体に投与することを更に含む。更なる実施形態において、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス膜と感染細胞エンドソーム膜との赤血球凝集素媒介融合を予防、阻害または低減し、したがって、感染細胞細胞質へのウイルスＲＮＡの侵入を予防し、感染の更なる伝播を予防するための、抗赤血球凝集素抗体の使用を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を予防、阻害または治療する有効量の抗赤血球凝集素抗体を個体に投与することを含む、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を個体において予防、阻害または治療する方法に使用される抗赤血球凝集素抗体を提供する。上記のいずれかの実施形態における「個体」は、好ましくは、ヒトである。
【０２６１】
更なる態様において、本発明は、医薬の製造または調製における抗赤血球凝集素抗体の使用を提供する。１つの実施形態において、医薬はＢ型インフルエンザウイルス感染の治療用である。更なる実施形態において、医薬は、有効量の医薬を、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を有する個体に投与することを含む、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療する方法に使用される。１つのそのような実施形態において、方法は、例えば下記に記載される、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を、個体に投与することを更に含む。更なる実施形態において、医薬は、Ｂ型インフルエンザウイルス膜と感染細胞エンドソーム膜との赤血球凝集素媒介融合を予防、阻害または低減し、したがって、感染細胞細胞質へのウイルスＲＮＡの侵入を予防し、感染の更なる伝播を予防する。更なる実施形態において、医薬は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を予防、阻害または低減する有効量の医薬を個体に投与することを含む、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を個体において予防、阻害または治療する方法に使用される。上記のいずれかの実施形態における「個体」は、ヒトであり得る。
【０２６２】
更なる態様において、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、そのようなＢ型インフルエンザウイルス感染を有する個体に、有効量の抗赤血球凝集素抗体を投与することを含む。１つのそのような実施形態において、方法は、本明細書に記載される、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を、個体に投与することを更に含む。上記のいずれかの実施形態における「個体」は、ヒトであり得る。
【０２６３】
本発明は、個体（例えば、対象または患者）においてＢ型インフルエンザウイルス感染を阻害、予防または治療するのに有効な抗赤血球凝集素抗体を提供する。幾つかの態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、個体のＢ型インフルエンザウイルス感染を予防するため、個体を予防的に治療することに有効である。
【０２６４】
幾つかの態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による治療に適した個体は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を有する、または有すると疑われた個体である。幾つかの実施形態において、そのような個体には、幼児、小児、成人及び高齢者が含まれる。幾つかの実施形態において、個体はＢ型インフルエンザウイルス感染により入院している。他の実施形態において、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を有する個体は、例えば、免疫不全、妊娠、肺疾患、心臓疾患、腎臓疾患または同時感染（例えば、細菌性若しくはウイルス性肺炎などの細菌感染若しくはウイルス感染）などの１つ以上の共存症を有する。
【０２６５】
幾つかの態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による個体の治療は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の重篤度を低減する、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の長さを低減する、またはＢ型インフルエンザウイルスの感染力を低減する。他の態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体によるＢ型インフルエンザウイルス感染の治療は、入院期間の低減、集中治療室（ＩＣＵ）を使用する必要性の低減または予防、補助または機械換気の必要性の低減または予防、酸素補給を使用する必要性の低減または予防、及び死亡率の低減を含む、追加的な利益を提供する。幾つかの実施形態において、入院期間の低減は、１日、２日、３日、４日、５日または５日以上である。幾つかの実施形態において、集中治療室を使用する必要性の低減は、１日、２日、３日、４日、５日または５日以上である。幾つかの実施形態において、補助または機械換気の必要性の低減は、１日、２日、３日、４日、５日または５日以上である。幾つかの実施形態において、酸素補給の必要性の低減は、１日、２日、３日、４日、５日または５日以上である。幾つかの態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による個体の治療は、例えば、発熱、鼻感冒、悪寒、咽頭炎、筋肉痛、身体痛、頭痛、咳、鼻閉、脱力感または疲労感、眼刺激または涙目及び全身の不快感などの、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の疾患症状を低減する。
【０２６６】
幾つかの実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による個体の治療は、呼吸数が正常化するまでの時間の低減または酸素飽和度が正常化するまでの時間の低減などの、呼吸機能が正常化するまでの時間を低減する。幾つかの態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による個体の治療は、正常な酸素飽和度に、例えば、酸素補給投与を行うことなく２４時間にわたって測定して、約９２％以上の酸素飽和度に戻るまでの時間を低減する。他の態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による個体の治療は、心拍数、血圧、呼吸数及び体温などの生命徴候が正常化するまでの時間を低減する。
【０２６７】
幾つかの態様において、本発明の抗赤血球凝集素抗体による個体の治療は、例えばインフルエンザウイルス力価などのウイルス学的終点を改善する。ウイルス力価は、例えばｑＰＣＲまたは組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）で測定した、例えばウイルス曲線下面積（ＡＵＣ）などの、当業者に既知の様々な方法によって測定することができる。幾つかの態様において、治療は、ｑＰＣＲまたはＴＣＩＤ５０により測定して、ウイルスＡＵＣに５０％以上の低減をもたらす。
【０２６８】
本発明の様々な態様において、本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体は、症状の発症（例えば、疾病の発症）の約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間及び約９６時間後に投与されたとき、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効である。他の態様において、本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体は、症状の発症後の約２４時間〜４８時間に投与されたとき（例えば、個体が２４〜４８時間にわたって症状を示しているとき）、症状の発症後の約４８時間〜７２時間に投与されたとき、または症状の発症後の約７２時間〜９６時間に投与されたとき、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効である。本発明のある特定の実施形態において、本発明の抗赤血球凝集素抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療または低減に有効であり、現在の標準治療（例えば、オセルタミビル）の治療範囲を、症状の発症後の４８時間を超えて延長する。
【０２６９】
更なる態様において、本発明は、本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体のいずれかを含む薬学的製剤を、例えば、上記の治療方法のいずれかに使用するために提供する。１つの実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗赤血球凝集素抗体のいずれか及び少なくとも１つの追加の治療剤、例えば下記に記載されるものを含む。
【０２７０】
本発明の抗体を、療法において単独で、または他の作用物質と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体を、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与しても良い。ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル、オセルタミビルリン酸塩、アマンタジン、リマンタジン）、抗Ｍ２抗体、抗赤血球凝集素抗体等である。幾つかの態様において、ノイラミニダーゼ阻害剤と共投与される本発明の抗赤血球凝集素抗体による、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を有する患者の治療は、いずれかの作用物質単独による治療と比較して、相乗的治療効果を提供する。
【０２７１】
上記に示されたそのような併用療法は、組み合わせ投与（２つ以上の治療剤が同じ、または別々の製剤に含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合には、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤の投与の前、投与と同時、及び／または投与の後に発生することができる。１つの実施形態において、抗赤血球凝集素抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内、または約１、２若しくは３週間以内、約１、２、３、４、５若しくは６日以内、または約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１６、２０若しくは２４時間以内に発生する。
【０２７２】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）を、非経口、肺内及び鼻腔内、局所治療が望ましい場合には病巣内投与を含む、任意の適切な方法によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。投与は、部分的には投与が短時間または慢性的であるかに応じて任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によって行うことができる。様々な時点における単回または多回投与、ボーラス投与及びパルス注入が含まれるが、これらに限定されない様々な投与スケジュールが、本明細書において企図される。
【０２７３】
本発明の抗体は、良好な医療行為と一致する様式で処方、服用及び投与される。この文脈において考慮される要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師に既知の他の要因が含まれる。抗体は、必ずしも必要ではないが、場合により、当該の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の作用物質と共に処方される。そのような他の作用物質の有効量は、製剤に存在する抗体の量、障害または治療の種類及び上記に考察された他の要因によって左右される。これらは、一般に、本明細書に記載されているものと同じ投与量及び投与経路により、または本明細書に記載されている投与量の約１〜９９％により、または適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投与量及び任意の経路により使用される。
【０２７４】
疾患の予防または治療では、本発明の抗体（単独で使用したとき、または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせたとき）の適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防または治療の目的で投与されたか、以前の療法、患者の臨床病歴及び抗体への応答、ならびに担当医の判断によって左右される。抗体は、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるもの、または連続注入によるものであるかに関わらず、患者への投与の初回投与量候補であり得る。１つの典型手な１日投与量は、上記に記述された要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与では、状態に応じて、治療は、一般に疾患症状の望ましい抑制が生じるまで持続される。抗体の例示的な投与量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約１．０ｍｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ若しくは４５ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量を、患者に投与しても良い。そのような用量を断続的に、例えば、毎日、２日に１回、３日に１回等で投与しても良い。高い初回負荷用量の後に、１つ以上の低い用量を投与しても良い。投与は、また、例えば、２００ｍｇ、４００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、１０００ｍｇ、１２００ｍｇ、１４００ｍｇ、１５００ｍｇ、１６００ｍｇ、１８００ｍｇ、２０００ｍｇ、２２００ｍｇ、２４００ｍｇ、２５００ｍｇ、２６００ｍｇ、２８００ｍｇ、３０００ｍｇ、３２００ｍｇ、３４００ｍｇ、３６００ｍｇ等などの固定用量であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２７５】
上記の製剤または治療方法のいずれかを、抗赤血球凝集素抗体の代わりに、または抗赤血球凝集素抗体に加えて、本発明の免疫複合体を使用して実施しても良いことが、理解される。
【０２７６】
Ｈ．製品
本発明の別の態様において、上記に記載された障害の治療、予防及び／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器及び容器上の、または容器に付随したラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を、それ自体で、または状態を治療、予防及び／または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌利用口を有しても良い（例えば、容器の例は、静脈注射用溶液バッグ、または皮下注射用針が突き刺し可能な共栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態の治療のために使用されることを示す。更に、製品は、（ａ）含有された組成物が本発明の抗体を含む第１の容器と、（ｂ）含有された組成物が更なる細胞傷害剤、そうでなければ治療剤を含む第２の容器とを含んでも良い。本発明のこの実施形態の製品は、組成物を特定の状態の治療のために使用できることを示す添付文書を更に含んでも良い。代替的または追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器を更に含んでも良い。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的な、または使用者の観点から望ましい他の材料を、更に含んでも良い。
【０２７７】
上記の製品のいずれかは、抗赤血球凝集素抗体の代わりに、または抗赤血球凝集素抗体に加えて、本発明の免疫複合体を含み得ることが理解される。
【実施例】
【０２７８】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記に提供された一般的な記載を考慮すると、様々な他の態様を実施しても良いことが理解される。
【０２７９】
実施例１：形質芽球の濃縮及び増殖
Ｂ型インフルエンザ赤血球凝集素に対する希な抗体を発見及び特定するため、以下の形質芽球濃縮及び増殖技術を開発した。（両方とも２０１３年１１月１２日に出願された、同時係属特許出願の米国特許出願第１４／０７７，４１４号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／６９５６７号、ならびにＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ，１４：９３−１０３を参照すること。これらは、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。）
【０２８０】
季節性インフルエンザＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）ワクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｌｏｔ  ＃１１１７９６Ｐ１）を献血の７日前に受けた正常なヒトドナーからのロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃ）は、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得た。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、標準的な方法論を使用してロイコパックから単離した。６〜８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）から購入し、米国実験動物協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）指針に従って、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて収容及び維持した。全ての実験研究は、実験動物のケア及び使用のガイド（Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、ならびに適用法令に従い、ＡＡＡＬＡＣｉ公認施設において、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの実験動物委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認の下で実施した。健康なヒトドナーからのロイコパックまたは血液は、書面によるインフォームドコンセントが承認され、倫理審査による承認が西部治験審査委員会（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）から与えられた後に、得た。
【０２８１】
インビボ抗原誘導形質芽球濃縮及び増殖は、以下のように、ＰＢＭＣの脾臓内移植を使用して実施した。単離ＰＢＭＣを、赤血球凝集素抗原（下記を参照すること）（Ｂ細胞百万個毎に０．１〜２μｇの抗原）に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした（ＰＢＭＣ／抗原プレミックス）。このインキュベーションの後、ＰＢＭＣを洗浄して、非結合抗原を除去した。Ｂ型インフルエンザウイルスに特異的な交差反応性赤血球凝集素抗体を産生する形質芽球を濃縮するため、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス及び単一細胞選別に使用した赤血球凝集素抗原変種を、特定的に選択して、インフルエンザＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）ワクチン内に含有された赤血球凝集素抗原変種と区別した。したがって、この研究に使用した赤血球凝集素抗原は、Ｂ型インフルエンザウイルス単離菌：Ｂ／ホンコン／１９７３（抗原プレミックス及びＦＡＣＳに使用）、Ｂ／メリーランド／１／１９５９及びＢ／ウイスコンシン／２０１０（ＥＬＩＳＡ選別に使用）、ならびにＢ／ブリスベン／２００８（ワクチン中にあり、ＥＬＩＳＡ選別に使用）からの赤血球凝集素を含んだ。赤血球凝集素抗原は、標準的な分子生物学の技術を使用してＧｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて産生した。
【０２８２】
６〜８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を、セシウム−１３７源を使用して３５０ラドで亜致死的に照射した。ポリミキシンＢ（１１０ｍｇ／Ｌ）及びネオマイシン（１．１ｇ／Ｌ）を、照射後の７日間にわたって飲料水に加えた。照射の４時間後、各マウスの左側腹部を剃り、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｐｈａｒｍａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）及び７０％アルコールで準備処置を施した。外科的処置は、無菌の外科的処置を使用して麻酔下で実施した。１ｃｍの皮膚切開を、各マウスの肋骨辺縁の真下に行い、続いて腹壁及び腹膜を切開した。各マウスの脾臓を注意深く露出させ、３０μＬのＰＢＳに再懸濁した５０×１０６個のヒトＰＢＭＣを注射した。切開を筋肉層により、ならびに５−Ｏ  Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）及び外科用ステープルをそれぞれ使用して皮膚により閉鎖した。抗原特異的細胞選別実験では、マウスを移植の８日後に殺処分し、脾臓を採取した。
【０２８３】
マウスから得た脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、ヒトＩｇＧ＋形質芽球をＣＤ３８ｈｉｇｈ／ＩｇＧ＋発現として確定する、抗ヒトモノクローナル抗体ＣＤ３８  ＰＥＣｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及びＩｇＧ  Ｄｙｌｉｇｈｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のカクテルで染色した。単離脾臓細胞の懸濁液中においてＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素交差反応性形質芽球を特定するため、細胞を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）標識キット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して、ＦＩＴＣまたはＰＥのそれぞれと予め複合させたＢ型インフルエンザウイルス株Ｂ／ホンコン／１９７３の赤血球凝集素で染色した。
【０２８４】
上記に記載された方法を使用して特定された、およそ２，０１８個の抗原特異性形質芽球のうち、７個のｍＡｂは、少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株に対してウイルス中和を示し、３つのｍＡｂは、祖先、ヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルスを含む、試験した全てのＢ型インフルエンザウイルス株に対して、ウイルス中和を示した。
【０２８５】
実施例２．単一形質芽球からのＩｇＧクローニング
Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素交差反応性ヒト形質芽球（上記に記載された）を、単一細胞選別し、およそ２，０１８個の抗原特異性形質芽球をもたらした。単一形質芽球を、５％低ＩｇＧウシ胎児血清を含有する５０μｌのＲＰＭＩを含有するＵ底９６ウェルマイクロウェルプレートから、直接選別した。プレートを６００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）により５分間遠心分離し、培地を吸引により注意深く除去した。細胞を再懸濁し、９０μｌのＰＢＳにより同じ手順に従って２回洗浄した。
【０２８６】
可変重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡを生成するため、各細胞を、２単位のＲＮａｓｅｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、０．５ｍＭの４ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、３７．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、０．２５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ、ＭＡ）、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３、０．２５ｐｍｏｌのＩｇＧ１−４定常、カッパ鎖定常及びラムダ鎖定常領域特異的オリゴヌクレオチド（以下に示す）、ならびに４０ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する６μｌの逆転写酵素（ＲＴ）反応混合物に再懸濁した。
ＩｇＧ１−４定常部：ＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）
カッパ定常部：ＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＹＴＧＣＴＧＡＧ（配列番号２）
ラムダ定常部：ＧＧＧＴＫＴＧＧＴＳＧＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号３）
【０２８７】
反応を３×３０分の間隔を置いて、それぞれ４５℃、５０℃及び５５℃でインキュベートした。インキュベートした後、反応混合物を、ＴＥ緩衝液（１０ｍｍのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）により１５μｌに希釈した。初回ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、２μｌの希釈した上記のＲＴカクテル及びＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）の使用により、製造会社により提供されたプロトコールに従って実施して、ＩｇＧ重鎖、カッパ鎖及びラムダ鎖を増幅した。ＰＣＲ増幅は、下記に示されている可変重鎖及び軽鎖生殖系及び定常領域配列に基づいた変性オリゴヌクレオチドを使用して、実施した。
ＩＧＶＨ１ａ  ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号４）
ＩＧＶＨ１ｂ  ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号５）
ＩＧＶＨ２  ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣ（配列番号６）
ＩＧＶＨ３  ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧ（配列番号７）
ＩＧＶＨ４  ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣ（配列番号８）
ＩＧＶＨ５  ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ（配列番号９）
ＩＧＶＨ６  ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣ（配列番号１０）
ＩＧＶＨ７  ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧ（配列番号１１）
ＩＧＫＶ１  ＧＨＣＡＴＣＣＲＧＷＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１２）
ＩＧＫＶ２  ＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧＷＣＴＣ（配列番号１３）
ＩＧＫＶ３  ＧＡＡＡＴＷＧＴＲＷＴＧＡＣＲＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１４）
ＩＧＫＶ４  ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号１５）
ＩＧＫＶ５  ＧＡＡＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１６）
ＩＧＫＶ６  ＧＡＷＲＴＴＧＴＧＭＴＧＡＣＷＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１７）
ＩＧＬＶ１  ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＹＴＧＡＣＫＣＡＧＣＣＲＣＣＣＴＣ（配列番号１８）
ＩＧＬＶ２  ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴ（配列番号１９）
ＩＧＬＶ３  ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＷＣＡＧＳＨＶＣＣＣＫＣ（配列番号２０）
ＩＧＬＶ４  ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＲＴＣＶＣＣＣＴＣ（配列番号２１）
ＩＧＬＶ５  ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣ（配列番号２２）
ＩＧＬＶ６  ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣ（配列番号２３）
ＩＧＬＶ７  ＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣ（配列番号２４）
ＩＧＬＶ８  ＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣ（配列番号２５）
ＩＧＬＶ９  ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号２６）
ＨＣ３０１．５定常部  ＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＣＳＧＣＴＧＴＧＣ（配列番号２７）
カッパ１０２定常部  ＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧ（配列番号２８）
ラムダ２０２定常部  ＣＴＴＧＲＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号２９）
【０２８８】
重鎖及び軽鎖のＰＣＲ増幅反応を、以下のようにそれぞれ２つの反応に分けた。重鎖ファミリーＶＨ．１、２、３（プライマーＩＧＶＨ１ａ、ＩＧＶＨ１ｂ、ＩＧＶＨ２、ＩＧＶＨ３）及びＶＨ．４、５、６、７（プライマーＩＧＶＨ４、ＩＧＶＨ５、ＩＧＶＨ６、及びＩＧＶＨ７）；カッパ鎖ファミリーＶＫ．１、２、３（プライマーＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、及びＩＧＫＶ３）及びＶＫ．４、５、６（プライマーＩＧＶＫ４、ＩＧＶＫ５、及びＩＧＶＫ６）；ならびにラムダ鎖ファミリーＶＬ．１、２、３、４、５（ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、及びＩＧＬＶ５）及びＶＬ．６、７、８、９（プライマーＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、及びＩＧＬＶ９）。タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ増幅プロトコールを温度サイクルに使用した。
【０２８９】
反応の後、ＰＣＲ増幅産物をエキソヌクレアーゼ１（Ｅｘｏ）及びエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理して、それぞれのＰＣＲ増幅反応において過剰量のヌクレオチド及びプライマーを除去した（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ、ＭＡ）。初回ＰＣＲ増幅産物を、サンガー配列決定の使用により直接配列決定して、重鎖及び軽鎖の両方の可変配列を決定した。第２のネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ増幅を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーの使用により哺乳類シグナル及び定常領域クローニング配列を挿入するため、生殖系適合重鎖及び軽鎖可変オリゴヌクレオチドを使用して実施した。
ｓＶＨ１ａ：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧ（配列番号３０）
ｓＶＨ２：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＴＧ（配列番号３１）
ｓＶＨ３ｖｖ：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣ（配列番号３２）
ｓＶＨ３ｇｌ：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧ（配列番号３３）
ｓＶＨ４：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧ（配列番号３４）
ｓＶＨ５：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号３５）
ｓＶＨ６：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴ（配列番号３６）
ｓＶＨ７：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧ（配列番号３７）
ｓＶＫ１：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧ（配列番号３８）
ｓＶＫ２：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣ（配列番号３９）
ｓＶＫ３：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４０）
ｓＶＫ４：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧ（配列番号４１）
ｓＶＫ５：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号４２）
ｓＶＫ６：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＣＧ（配列番号４３）
ｓＶＬ１：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＴＧＹＴＧＡＣＫＣＡＧＣＣＲＣＣＣＴＣ（配列番号４４）
ｓＶＬ２：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴ（配列番号４５）
ｓＶＬ３：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＷＣＡＧＳＨＶＣＣＣＫＣ（配列番号４６）
ｓＶＬ４：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＲＴＣＶＣＣＣＴＣ（配列番号４７）
ｓＶＬ５：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣ（配列番号４８）
ｓＶＬ６：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣ（配列番号４９）
ｓＶＬ７：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣ（配列番号５０）
ｓＶＬ８：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣ（配列番号５１）
ｗＶＬ９：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号５２）
重定常部：ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧ（配列番号５３）
カッパ定常部：
ＣＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣ（配列番号５４）
ラムダ定常部：ＣＴＴＧＲＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号２９）
【０２９０】
ＰＣＲ増幅反応は、ＧＣを有するＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を製造会社の推奨に従って使用して設定した。ＰＣＲ増幅反応の後、増幅産物を、Ｅｘｏ／ＳＡＰにより上記に記載されたように処理した。ＰＣＲ増幅産物をコードする重可変鎖及び軽可変鎖を、制限エンドヌクレアーゼ無含有手順の使用により、哺乳類発現ベクターに挿入した。２０μｌのＰＣＲ増幅産物を、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発プロトコールの使用により、ＩｇＧ１、カッパ及びラムダ鎖の単鎖ＤＮＡヒトテンプレートにアニールした。（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）ＰＮＡＳ  ８２：４８８−４９２を参照すること。）正確に挿入された構築物を、ＤＮＡ配列決定により確認した。重鎖及び軽鎖をコードするプラスミド含有核酸を、一時的発現のためにＦｕｇｅｎｅ形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、２９３Ｔヒト胎児腎細胞に同時形質移入し、発現及び結合について下記に記載されるように分析した。
【０２９１】
実施例３．赤血球凝集素のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ
異なるＢ型インフルエンザウイルス単離菌の様々な赤血球凝集素サブタイプと結合する、上記に記載されたようにして得られるモノクローナル抗赤血球凝集素抗体（すなわち、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体）のそれぞれの能力を、ＥＬＩＳＡにより以下のように検査した。様々な赤血球凝集素発現プラスミドを２９３Ｔ細胞に形質移入し、これらは、Ｂ型インフルエンザウイルス株のＢ／メリーランド／１／１９５９、Ｂ／ビクトリア／２０００及びＢ／ブリスベン／２００８の赤血球凝集素を含んだ。２日後、細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）に溶解した。核を遠心分離により取り除き、得られた溶解産物を−８０℃で貯蔵した。
【０２９２】
ＥＬＩＳＡスクリーニングのために、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、５μｇ／ｍｌの、ＰＢＳ中のＧａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。プレートを洗浄し、次に、様々に発現した赤血球凝集素を含有する細胞溶解産物の希釈液で被覆した。プレートを洗浄し、抗赤血球凝集素抗体の様々な希釈液と共に、続いてヤギ抗ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共にインキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質検出のために処理した。
【０２９３】
およそ２，０１８個の形質芽球を、上記の実施例２に記載された単一細胞選別から得た。これらのうち、２９３Ｔ細胞に一時的に発現し、ＥＬＩＳＡにより選別された９８個のモノクローナル抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルス株のＢ／メリーランド／１／１９５９、Ｂ／ビクトリア／２０００及びＢ／ブリスベン／２００８の赤血球凝集素への結合を示した。
【０２９４】
実施例４．インビトロにおけるＢ型インフルエンザウイルスの中和
本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体のＢ型インフルエンザウイルス単離菌のパネルのインビトロにおける広範囲の赤血球凝集素サブタイプ結合及び中和を誘発する能力を、以下のように検査した。ＭＤＣＫ細胞を、９６ウェル黒壁透明底画像化プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９０４）において、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地に２５％集密単層として増殖させた。各Ｂ型インフルエンザウイルスサブタイプを、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２６０の０．２％ＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０３７８のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ１４２６の２ｕｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン）において１のＭＯＩに希釈し、０．０２〜１，６００ｎＭの範囲の様々な濃度のｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａ及びｍＡｂ  ３３Ｆ８と共に３７℃で１時間インキュベートした。次にそれぞれの抗体／インフルエンザウイルのスカクテルを、ＭＤＣＫ細胞に、細胞を冷１００％エタノールで固定する前に、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１６時間感染させた。次に固定細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｈ３５７０）で染色して、細胞核を可視化し、総細胞数を決定した。また細胞を、Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）に特異的な広域反応性のモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＭＡＢ８２５８）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８複合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１０２９）により順次染色して、感染細胞の数を決定した。細胞を、Ｉｍａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の使用により画像化し、画像データをＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ３．１ソフトウェアの使用により分析した。
【０２９５】
感染細胞の百分率を決定し、Ｘ軸の抗体濃度（対数１０）に対してＹ軸にプロットした。全ての中和アッセイを、三重に完了し、データを９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のＩＣ５０値（ｎＭ）として報告する。データを、非線形回帰用量応答曲線に当てはめて、ＩＣ５０及び９５％ＣＩを生成した。
【０２９６】
インビトロ中和用量応答曲線は、広範囲のＢ型インフルエンザウイルス株のパネルに対して、様々な濃度の本明細書に記載されているモノクローナル抗体を使用して生成した。図１Ａ及び１Ｂは、Ｂ型インフルエンザウイルス株のパネルに対するｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａ及びｍＡｂ  ３３Ｆ８それぞれの中和曲線を示す。図１Ａ及び１Ｂに示されているように、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａ及びｍＡｂ  ３３Ｆ８は、祖先Ｂ型インフルエンザウイルス系列、ならびにヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルスに対するインビトロ中和活性を含む、広範囲のＢ型インフルエンザウイルス株のパネルのインビトロ中和に有効である。
【０２９７】
下記の表２は、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａについて上記に記載された実験のインビトロ中和活性の計算を示す。
2017512471.tif 000004
【０２９８】
図２は、Ｂ型インフルエンザウイルス株パネルに対するｍＡｂ  ４６Ｂ８Ａのインビトロ中和曲線を示す。加えて、図２に示されているように、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ａは、祖先Ｂ型インフルエンザウイルス系列、ならびにヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルスに対するインビトロ中和活性を含む、広範囲のＢ型インフルエンザウイルス株のパネルのインビトロ中和に有効である。
【０２９９】
これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が、様々なＢ型インフルエンザウイルス単離菌／株をインビトロで用量依存的に中和できたことを示した。加えて、これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が、祖先Ｂ型インフルエンザウイルス単離菌、ならびに、Ｂ型インフルエンザウイルス株のウイスコンシン／２０１０、ブリスベン／２００８、バングラデシュ／２００７、マレーシア／２００４、ビクトリア／２０００、ロシア／１９６９、マサチューセッツ／１９６６、メリーランド／１９５９及びリー／１９４０の中和を含む、ヤマガタ及びビクトリア系列の分岐後のＢ型インフルエンザウイルス単離菌を中和できたことを示した。
【０３００】
これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が、Ｂ型インフルエンザウイルス感染、ならびに祖先、ヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルス株の治療及び予防に有効であることを示した。
【０３０１】
実施例５．Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集阻害アッセイ
ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ及びｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃによる中和機構を検査するため、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイを、２つのＢ型インフルエンザウイルスのＢ／ビクトリア／５０４／２０００及びＢ／ウイスコンシン／１／２０１０の使用により実施した。それぞれのＢ型インフルエンザウイルスでは、５倍工程の８つの段階希釈液を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）により、１：５から出発して二重に作製した。５０μｌの各希釈液をＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３８９４）に移した。シチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ、Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号７２４９４０８）を、ＰＢＳで０．５％に希釈し、５０μｌを、ウイルスを含有する各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＴＲＢＣ凝集を防止した最後のウイルス希釈液（最低ウイルス濃度に相当する）を、直接的な可視化により決定し、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイに使用した。
【０３０２】
ＨＩアッセイを、広範囲のＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素サブタイプ結合を有する２つのヒトモノクローナル抗体（ｈｕＭａｂ）であるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ及びｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃ、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質Ｄに特異的な対照のｈｕＭａｂ  ｇＤ５２３７により実施しした。０．００３２〜２５０μｇ／ｍｌの範囲の５倍工程での各抗体の８つの段階希釈液（三重）を、ＰＢＳ中の予め決定された量のＢ／ビクトリア／５０４／２０００またはＢ／ウイスコンシン／１／２０１０ウイルスと混合し、上記に記載されたように３７℃で１時間インキュベートした。５０μｌのウイルス抗体混合物を、Ｖ底９６ウェルプレートに移した。ＴＲＢＣを、ＰＢＳで０．５％に希釈し、５０μｌを、５０μｌのウイルス抗体混合物を含有する各ウェルに加えた。各プレートを、室温で１時間インキュベ−トし、ＨＩ力価（すなわち、赤血球凝集の阻害に有効な最低抗体濃度）を、直接的な可視化によりそれぞれの抗体において決定した。
【０３０３】
図３に示されているように、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃは、Ｂ／ビクトリア／５０４／２０００及びＢ／ウイスコンシン／１／２０００のＢ型インフルエンザウイルスの両方によるシチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）の赤血球凝集の阻害に有効であった。対照的に、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃまたは対照のｇＤ５２３７抗体は、いずれも、試験した最高抗体濃度であっても、どちらのＢ型インフルエンザウイルスによる赤血球凝集に対しても阻害を示さなかった。これらの結果は、ｍＡｂ  ３４Ｂ５ＣがＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素の頭部基の受容体結合ドメインに結合し、したがってＴＲＢＣのシアル酸受容体へのウイルスの結合を防止することを示唆した。これらの結果は、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃが、受容体結合ドメインの外側（例えば、柄（または、幹）領域）にあるＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素の区域に結合することも示唆した。
【０３０４】
実施例６．プラーク阻害アッセイによるインビトロにおけるＢ型インフルエンザウイルスの中和
本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体の様々なＢ型インフルエンザウイルス単離菌を中和する能力を、以下のように更に分析した。Ｂ型インフルエンザウイルス力価は、プラークアッセイによって、以下のように決定した。ＭＤＣＫ細胞を、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５１６）において、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地に集密単層として増殖させた。これらの研究に使用した全てのＢ型インフルエンザウイルス株は、ＶｉｒａＰｕｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ウイルス力価の決定では、各貯蔵ウイルスを、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２６０の０．２％ＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０３７８のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ１４２６の２ｕｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン）において希釈した。１：１０２〜１：１０７の１０倍工程の６つの段階希釈液を、各ウイルスにおいて作製し、それぞれ１ｍｌを使用して、６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞を感染させた。感染の２時間後、ウイルスを除去し、細胞を、２ｍｌの２×インフルエンザ培地：２％アガロースの１：１混合物で覆った。プレートを室温で３０分間保持し、次に５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃でインキュベートした。３日後、プラークを不透明光下で直接的な可視化により数え、各ウイルスの力価をプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで決定した。
【０３０５】
プラーク阻害アッセイによるＢ型インフルエンザウイルス中和に対する本発明のモノクローナル抗体の効果を、次に以下のように検査した。ＭＤＣＫ細胞を、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５１６）において、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地に集密単層として増殖させた。それぞれのＢ型インフルエンザウイルスにおいて、６ウェルプレートのウェル１つあたり２０〜２００個のプラークをもたらすウイルスの量（上記に記載されたよう決定した）を、プラーク阻害アッセイに使用した。０．１６〜３８．４ｎＭの範囲の３倍工程によるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの６つの段階希釈液を、インフルエンザ培地中の各ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１ｍｌのウイルス抗体混合物を使用して、６ウェルプレートのＭＤＣＫ細胞を感染させ、それぞれの感染は、プレートに３重に行った。ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの同じ段階希釈液を２×インフルエンザ培地において作製し、２％アガロースと１：１で混合した。感染の２時間後、ウイルス抗体混合物を除去し、細胞を、２ｍｌの抗体アガロース混合物で覆った。プレートを室温で３０分間保持し、次に５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃でインキュベートした。５〜６日後、プラークを不透明光下での直接的な観察により数えた。感染の百分率は、最高プラーク数（最低抗体濃度における）に正規化し、Ｘ軸の対数１０抗体濃度に対してＹ軸にプロットすることによって決定した。データを、非線形回帰用量応答曲線に当てはめて、ＩＣ５０（５０％の阻害を与える濃度）値及び９５％信
頼区間（９５％ＣＩ）を生成した。
【０３０６】
図４に示されているように、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、試験した全てのＢ型インフルエンザウイルス株に対して、インビトロプラーク形成を用量依存的に遮断した。上記に記載されたｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃによるプラーク形成アッセイにおいて生成されたデータから計算されたＩＣ５０値を、下記の表３に示す。表３から分かるように、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、１ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す非常に低い濃度でプラーク形成を遮断した。
【０３０７】
2017512471.tif 000005
まとめると、これらのデータは、プラーク中和アッセイを使用して、本発明のモノクローナル抗体が、祖先、ヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルス単離菌を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスのインビトロプラーク形成の阻害及び中和に有効であることを示した。加えて、これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が、Ｂ型インフルエンザウイルスのインビトロプラーク形成を１ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害することを示した。
【０３０８】
実施例７．Ｂ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素融合阻害アッセイ
ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ及びｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃによる中和機構を更に探索するため、ウイルス侵入の際の初期受容体結合段階を迂回する赤血球凝集素媒介細胞間融合アッセイにおける、これらの抗体の阻害効果を、以下のように検査した。ＨｅＬａ細胞を、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５１６）において、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに約４０％の集密として増殖させた。各ウェルの細胞に、１０ｍｇの、Ｂ／ウイスコンシン／１／２０１０赤血球凝集素を発現するプラスミドで形質移入した。１７時間後、形質移入ミックスを細胞から除去し、１０ｍＭの酪酸ナトリウムを含有する新たな培地を細胞に加えた。培地を６時間後に再び取り換え、細胞を、一晩かけて約８０％の集密に増殖させ、その後、融合阻害アッセイを実施した。
【０３０９】
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌのＴＰＣＫトリプシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ１４２６）により３７℃で７分間処理した。トリプシンを除去し、５０ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍカタログ番号６５０３５）を含有する培養培地を加え、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。次に細胞を、２０ｍｇ／ｍｌまたは２００ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃ、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質Ｄに特異的な対照のヒトｍＡｂ  ｇＤ５２３７を含有する培養培地において、３７℃でインキュベートした。１時間後、抗体を除去し、細胞をインフルエンザ培地（ｐＨ４．８５）において３７℃で５分間インキュベートした。低ｐＨ培地を除去し、細胞を増殖培地において３７℃で一晩インキュベートして、合胞体の完全な形成をもたらした。細胞の位相画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｅ顕微鏡及びＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ３．２ソフトウェアにより１０×対物レンズ下で取得した。
【０３１０】
ＨｅＬａ細胞発現Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ウイスコンシン／１／２０１０の赤血球凝集素を、低ｐＨＣ培地に曝露する前に、２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃまたは対照のｍＡｂ  ｇＤ５２３７と共にインキュベートした。ｐＨが低下した数時間以内に合胞体が現れ、一晩の培養によって完全に発育した。ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、２０μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌの両方において合胞体の形成を阻害したが、対照的にｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃまたは対照のｍＡｂ  ｇＤ５２３７は、いずれも、検査したいずれの濃度でも細胞間融合を遮断しなかった。（図５を参照すること。）
【０３１１】
上記の実施例５に記載された赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイにおいて得られた結果と一致して、これらの結果は、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃが、赤血球凝集素の柄結合抗体であり、したがって、Ｂ型インフルエンザウイルス膜融合に必要な赤血球凝集素柄におけるｐＨ誘発性立体構造変化を遮断できることを示唆した。これらの結果は、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃが赤血球凝集素の頭部基に結合し、本明細書に記載されている細胞間融合アッセイにおいて迂回される工程である、初期受容体結合段階を遮断することによってＢ型インフルエンザウイルスを中和する可能性も示唆した。
【０３１２】
実施例８．様々なＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素に対するｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの親和性
様々なＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素に対するｍＡｂ  ４６Ｂ８の親和性を、以下のように実証した。
結合緩衝液（２％のＦＢＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２及び０．１％のアジ化ナトリウムを有するＤＭＥＭ）中に固定濃度のヨウ素化抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体（ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ）及び段階希釈濃度の非標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体（ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ）を含有する５０μＬの競合反応混合物を、９６ウェルプレートに入れた。様々な菌株のＢ型インフルエンザウイルスを一時的に発現する２９３個の細胞を、競合反応混合物に、結合緩衝液中０．２ｍｌあたり５０，０００個の細胞の密度で加えた。細胞を伴う競合反応液を室温で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーションの後、競合反応液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移し、結合緩衝液で４回洗浄して、結合ヨウ素化抗体から遊離物を分離した。フィルターをＷａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマ計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）により数えた。結合データを、Ｎｅｗ  Ｌｉｇａｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用して評価したが、これは結合親和性を決定するためにＭｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄの当てはめアルゴリズムを使用する（Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｄｂａｒｄ（１９８０）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７：２２３９）。
【０３１３】
下記の表Ｘは、２９３Ｔ細胞の表面に組み換え的に発現された様々なＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素三量体に対するｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃのスキャッチャード結合分析を示す。下記の表４に示されているように、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、様々なＢ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対して低ｎＭ親和性を示した
2017512471.tif 000006
【０３１４】
実施例９．Ｂ／ビクトリア／２０００及びＢ／ウイスコンシン／２０１０に対する、マウスにおけるｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａのインビボ効力
マウスにおけるＢ型インフルエンザウイルス感染に対するｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａのインビボ効力を、以下のように実施した。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％のＢＳＡ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン）において最小ＬＤ１００用量（１×１０４個のウイルス／マウス）で希釈したＢ型インフルエンザウイルス株のＢ／ビクトリア／２０００の５０μｌにより、鼻腔内に感染させた。インフルエンザウイルス感染を、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａの静脈内投与の前に、７２時間進行させた（Ｂ／ビクトリア／２０００の感染のため）。
【０３１５】
Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ビクトリア／２０００の感染の７２時間後、様々な量のｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａを、２００μｌのＰＢＳ中の１５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ及び０．１２ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内投与した。対照処理動物には、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａの最高試験用量に等しい用量（すなわち、およそ１５ｍｇ／ｋｇ）でｍＡｂ  ｇＤ５２３７を投与した。マウスを、身体状態及び生存について毎日モニターし、また、感染後の２１日目まで毎日計量した。
【０３１６】
図６Ａは、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ビクトリア／２０００による感染の７２時間後に、様々な量のｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａが投与されたマウスの生存率（％）（経時的、日数）を示す。図６Ａに示されているように、１００％の死亡率が、対照抗体が投与された感染マウスでは１０日目までに観察された。しかし本発明のモノクローナル抗体が投与された感染マウスは、生存の増加を示した。特に、１００％の生存率が、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ビクトリア／２０００により感染したマウスでは、１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ３４Ｂ５Ａの治療用量で観察された。
【０３１７】
並列実験を実施して、ｍＡｂ  ３４Ｂ５ＡとＴａｍｉｆｌｕ（オセルタミビル）の効力を比較した。Ｔａｍｉｆｌｕを、ウイルス感染後の７２時間から開始して、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの１日２回で投与した。Ｔａｍｉｆｌｕは、ビヒクル対照治療動物と比較して、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ビクトリア／２０００により感染したマウスにいくらかの保護を提供したが、１００％の死亡率が、最高投与用量であっても、１１日目までに観察された。（図６Ｂを参照すること。）
【０３１８】
これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体がＢ型インフルエンザウイルス感染をインビボで治療するのに有効であることを示した。加えて、これらのデータは、本発明のモノクローナル抗体がＢ型インフルエンザウイルス感染の少なくとも７２時間後までに投与されたとき、Ｂ型インフルエンザウイルス感染をインビボで治療するのに有効であったことを示した。まとめると、これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体がウイルス感染の７２時間後に投与されたとき、Ｔａｍｉｆｌｕのインビボ効力と比較してマウスにおいてより良好なインビボ効力を示したことを更に示した。
【０３１９】
実施例１０．Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ウイスコンシン／２０１０に対する、マウスにおけるｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃのインビボ効力
マウスにおけるＢ型インフルエンザウイルス感染に対するｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃのインビボ効力を、以下のように実施した。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％のＢＳＡ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン）において最小ＬＤ１００用量（１×１０6個のウイルス／マウス）で希釈したＢ型インフルエンザウイルス株のＢ／ウイスコンシン／２０１０の５０μｌにより、鼻腔内に感染させた。インフルエンザウイルス感染を、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃの静脈内投与の前に、４８時間または７８時間進行させた。
【０３２０】
Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ウイスコンシン／２０１０の感染の４８時間または７２時間後、様々な量のｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃを、２００μｌのＰＢＳ中の１５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１．７ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内投与した。対照処理動物には、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃの最高試験用量に等しい用量（すなわち、およそ１５ｍｇ／ｋｇ）でｍＡｂ  ｇＤ５２３７を投与した。マウスを、身体状態及び生存について毎日モニターし、また、感染後の２１日目まで毎日計量した。
【０３２１】
図７Ａ及び７Ｂは、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ウイスコンシン／２０１０による感染の４８または７２時間後に、様々な量のｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃが投与されたマウスの生存率（％）（経時的、日数）をそれぞれ示す。図７Ａ及び７Ｂに示されているように、１００％の死亡率が、対照抗体が投与された感染マウスでは９日目または１０日目までに観察された。しかし、ｍＡｂ  ３４Ｂ５Ｃが投与された感染マウスでは、生存の増加を示した。（図７Ａ及び７Ｂを参照すること。）
【０３２２】
これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が様々なＢ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効であることを示した。加えて、これらのデータは、本発明のモノクローナル抗体がＢ型インフルエンザウイルス感染の少なくとも７２時間後までに投与されたとき、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効であることを示した。
【０３２３】
実施例１１．Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ウイスコンシン／２０１０に対する、マウスにおけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃのインビボ効力
マウスにおけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃのインビボ効力を試験するため、４つの異なるＢ型インフルエンザウイルス株（Ｂ／ウイスコンシン／２０１０、Ｂ／ビクトリア／２０００、Ｂ／ロシア／１９６９及びＢ／マサチューセッツ／１９６６）により感染したマウスに、抗体を静脈内投与した。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％のＢＳＡ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン）に１×ＬＤ１００用量で希釈した異なるＢ型インフルエンザウイルス株の５０μｌにより、鼻腔内に感染させた。
【０３２４】
一組の実験において、以下のＢ型インフルエンザウイルス単離菌を使用した。Ｂ／ウイスコンシン／２０１０、Ｂ／ビクトリア／２０００、Ｂ／ロシア／１９６９及びＢ／マサチューセッツ／１９６６。感染の２４、４８または７２時間後、抗赤血球凝集素ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃを、２００μｌのＰＢＳ中のおよそ１５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。対照治療動物には、ｍＡｂ  ｇＤ５２３７（１５ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスを、身体状態及び生存についてモニターし、感染後の２１日目まで計量した。
【０３２５】
図８Ａ及び８Ｂに示されているように、１００％の死亡率が、Ｂ型インフルエンザウイルス株のＢ／ウイスコンシン／２０１０及びＢ／ビクトリア／２０００がそれぞれ投与されたマウスでは、１０日目及び９日目までに対照治療群において観察された。Ｂ／ビクトリア／２０００またはＢ／マサチューセッツ／１９６６のいずれかによる感染の２４、４８または７２時間後に１５ｍｇ／ｋｇで投与された単回用量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、マウスの１００％の生存率をもたらした。（図８Ｂ及び８Ｄを参照すること。）Ｂ／ウイスコンシン／２０１０またはＢ／ロシア／１９６９のいずれか（ならびに、Ｂ／ビクトリア／２０００またはＢ／マサチューセッツ／１９６６のいずれか）による感染の２４または４８時間後に１５ｍｇ／ｋｇで投与された単回用量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、マウスの１００％の生存率をもたらした。（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄを参照すること。）
【０３２６】
これらの結果は、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃが、Ｂ型インフルエンザウイルスの様々な菌株の感染のインビボにおける治療に有効であったことを示した。特に、これらの結果は、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃが感染の２４、４８または７２時間後に投与されたとき、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の治療及び生存の改善に有効であったことを示した。まとめると、これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が感染の少なくとも７２時間後までに投与されたとき、祖先、ヤマガタ及びビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルス単離菌の治療に有効であったことを示した。
【０３２７】
実施例１２．Ｂ型インフルエンザウイルス感染の７２時間後に投与されたときの、マウスにおけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃのインビボ効力
マウスにおけるＢ型インフルエンザウイルス感染に対するｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの様々な用量のインビボ効力を、以下のように実施した。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％のＢＳＡ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン）において最小ＬＤ１００用量で希釈したＢ型インフルエンザウイルス株のＢ／ウイスコンシン／２０１０またはＢ／ビクトリア／２０００の５０μｌにより、鼻腔内に感染させた。インフルエンザウイルス感染を、様々な用量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの静脈内投与の前に、７２時間進行させた。
【０３２８】
Ｂ型インフルエンザウイルス感染の７２時間後、様々な量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃを、２００μｌのＰＢＳ中の４５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇｍまたは５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内投与した。対照処理動物には、最高試験用量に等しい用量のおよそ４５ｍｇ／ｋｇでｍＡｂ  ｇＤ５２３７を投与した。マウスを、身体状態及び生存について毎日モニターし、また、感染後の２１日目まで毎日計量した。
【０３２９】
図９Ａ及び９Ｂに示されているように、Ｂ型インフルエンザウイルス感染の７２時間後の４５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのいずれかによるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの投与は、Ｂ／ウイスコンシン２０１０またはＢ／ビクトリア／２０００のいずれかに感染したマウスの１００％の生存率をそれぞれもたらした。５ｍｇ／ｋｇの用量であっても、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの投与は、マウスの生存率（％）により測定すると、対照治療動物と比較して、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ウイスコンシン／２０１０及びＢ／ビクトリア／２０００に対して治療処置効力を示した。このデータは、ｍＡｂ  ４６Ｂ８ＣがＢ型インフルエンザウイルス感染の少なくとも７２時間後までに投与されたとき、Ｂ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効であることを示した。
【０３３０】
実施例１３．マウスの重篤なＢ型インフルエンザウイルス感染におけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃとオセルタミビルのインビボ効力の比較
マウスにおいて本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体とオセルタミビルリン酸塩（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））の効力を比較するため、以下の研究を実施した。６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）に、５０μｌのＢ型インフルエンザウイルス株のＢ／ビクトリア／２０００を４×ＬＤ１００で鼻腔内に感染させた。感染の４８時間後、抗赤血球凝集素抗体ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃを２００μｌのＰＢＳ中の単回用量の４５ｍｇ／ｋｇにより、または対照ＩｇＧを静脈内投与した。これらの実験において、５日間の１日２回（ＢＩＤ）の２ｍｇの投与からなるオセルタミビル投与レジメンを、単回静脈内用量の約１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃと比較した。（本明細書に記載されている実施例のいずれかに使用されているオセルタミビル（すなわち、Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））は、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号０７０１０００から得た。）
【０３３１】
図１０Ａに示されているように、１００％の死亡率が、対照ＩｇＧ（ｍＡｂ  ｇＤ５２３７）治療動物では９日目までに観察され、１００％の死亡率が、Ｔａｍｉｆｌｕ治療動物では１１日目までに観察された。しかし、単回１５ｍｇ／ｋｇ用量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、およそ７５％の感染動物を致死的なＢ型インフルエンザウイルス負荷から保護した。加えて、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃにより治療された動物は、体重変化率（％）に回復を示した。（図１０Ｂを参照すること。）
【０３３２】
実施例１４．ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、Ｔａｍｉｆｌｕとの組み合わせにおいて安全であり、肺力価を低減する
マウスにおいて本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体の使用及び効力とオセルタミビルリン酸塩（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））の使用及び効力を更に検査するため、以下の研究を実施した。６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に、５０μｌのＢ型インフルエンザウイルス株のＢ／ビクトリア／２０００を１×ＬＤ１００で鼻腔内に感染させた。感染の４８時間後、抗赤血球凝集素抗体ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃを２００μｌのＰＢＳ中の単回用量の１５ｍｇ／ｋｇにより、または対照ＩｇＧを静脈内投与した。これらの実験において、５日間の１日２回（ＢＩＤ）の２ｍｇの投与（１００ｍｇ／ｋｇ）からなるオセルタミビル投与レジメンを、単回静脈内用量の約１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃと比較した。併用治療も実施した。
【０３３３】
図１１Ａに示されているように、１００％の死亡率が、対照ＩｇＧ（ｍＡｂ  ｇＤ５２３７）治療動物では１１日目までに観察された。しかし、単回１５ｍｇ／ｋｇ用量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、単独で、またはＴａｍｉｆｌｕと組み合わせて投与されたとき、マウスの１００％の生存率をもたらした。加えて、ｍＡｂ  ４６Ｂ８ＣとＴａｍｉｆｌｕとの組み合わせによる動物の治療は、このインビボＢ型インフルエンザウイルス感染モデルにおいて安全でもあり、有効でもあった。
【０３３４】
図１１Ｂに示されているように、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃの単独での、またはＴａｍｉｆｌｕと組み合わせた投与は、対照治療動物またはＴａｍｉｆｌｕ単独で治療された動物に観察されたものと比較して、Ｂ型インフルエンザウイルスの肺力価の低減を示した。
【０３３５】
これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体がノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビル）と組み合わせて使用されるとき、安全及び有効であることを示した。
【０３３６】
実施例１５．マウスの重篤なＢ型インフルエンザウイルス感染モデルにおけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃとオセルタミビルの相乗作用
マウスにおいて本発明の抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗体とオセルタミビルリン酸塩（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））の共投与の効力を更に検査するため、以下の研究を実施した。６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）に、５０μｌのＢ型インフルエンザウイルス株のＢ／ビクトリア／２０００を４×ＬＤ１００で鼻腔内に感染させた。感染の４８時間後、抗赤血球凝集素抗体ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃを２００μｌのＰＢＳ中の単回用量の１５ｍｇ／ｋｇ若しくは５ｍｇ／ｋｇにより、または対照ＩｇＧを静脈内投与した。これらの実験において、５日間の１日２回（ＢＩＤ）の２ｍｇの投与からなるオセルタミビル投与レジメンを、単回静脈内用量の約１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃと比較した。これらの実験において、５日間の１日２回（ＢＩＤ）の２ｍｇの投与（１００ｍｇ／ｋｇ）からなるオセルタミビル投与レジメン。動物を、対照抗体、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃ単独、オセルタミビル単独、またはｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃとオセルタミビルの組み合わせにより治療した。
【０３３７】
図１２Ａ及び１２Ｂに示されているように、対照抗体またはＴａｍｉｆｌｕのいずれかの単独が投与された動物は、９または１０日目までに１００％の死亡率を示した。加えて、５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃが投与された動物は、この重篤なＢ型インフルエンザウイルス感染モデルにおいて、９日目までに１００％の死亡率を示した。しかし、ｍＡｂ  ４６Ｂ８ＣとＴａｍｉｆｌｕの併用治療は、５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのいずれの用量においても生存の増加をもたらした。
【０３３８】
これらの結果は、本発明の抗体をオセルタミビルと一緒に使用した併用治療が、いずれかの治療の単独と比較して、治療成果にある程度の相乗作用を提供することを示した。
【０３３９】
実施例１６．競合的ＥＬＩＳＡ
競合的ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｂ型インフルエンザウイルス（例えば、／ビクトリア／２０００、Ｂ／ウイスコンシン／２０１０等）の赤血球凝集素を使用して開発される。赤血球凝集素被覆ＥＬＩＳＡプレートには、飽和濃度の本発明のビオチン標識モノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ  ４８Ｂ８Ｃ等）の添加の前に、様々な濃度（Ｘ軸）の試験抗体を結合させる。試験抗体が、本発明のモノクローナル抗体のＢ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素エピトープと競合する場合、ビオチンＥＬＩＳＡシグナル（Ｙ軸）は、増加する試験抗体濃度の関数として、減少する。結合データを非線形用量応答曲線に当てはめて、ＥＣ５０値をｎＭで決定する。
【０３４０】
本発明のモノクローナル抗体は、製造会社の推奨プロトコール（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従ってアミンカップリングを介してビオチン化される。ビオチン化ｍＡｂの最終貯蔵濃度は、例えば、１３．２ｍＭである。使用の最適濃度を決定するため、ビオチン化ｍＡｂを、Ｂ型インフルエンザウイルスの固定化した赤血球凝集素に対して段階的に滴定する。組み換え赤血球凝集素タンパク質を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２μｌ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に分配する（１００μｌ）。プレートを一晩かけて４℃で被覆し、ＰＢＳですすぎ、次に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳにより室温で１時間にわたって遮断する。
【０３４１】
次に各プレートは、１．０％のＢＳＡ及び０．０５％のポリソルベート２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳによる１／３希釈液の８８ｎＭの初期濃度から出発する、１００μｌの段階希釈ビオチン化ｍＡｂを受ける。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次に１００μｌの１：５０００希釈のストレプトアビジン複合ホースラデッシュペルオキシダーゼ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に、室温で３０分間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）と共に現像した。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレート読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ．）によりＯ．Ｄ．４５０ｎＭで読み取る。ビオチン化ｍＡｂの最適濃度を、例えば、１ｍＭと決定する。
【０３４２】
実施例１７．Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ブリスベン／２００８に対する、マウスにおけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃのインビボ効力
ビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルスである、Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／ブリスベン／２００８（Ｖｉａｐｕｒ，ＬＬＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対する、マウスにおけるｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃのインビボ効力を試験するため、以下の研究を実施した。ＤＢＡ／２Ｊマウスに、最小限の１×ＬＤ１００用量（１×１０４ＰＦＵ／マウス）のＢ型インフルエンザウイルスのＢ／ブリスベン／２００８を、鼻腔内に感染させた。感染の２４、４８及び７２時間後に、８匹の雌マウス／群に、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃを０．１ｍＬのＰＢＳ中の１５ｍｇ／ｋｇにより静脈内投与した。マウスを、生存についてモニターし、感染後の２１日目まで計量した。対照として、一群の感染マウスを、ヒトＩｇＧ１抗体の抗ｇＤ（マウスにおいて既知の標的なし）の１５ｍｇ／ｋｇにより、感染の７２時間後に治療した。
【０３４３】
図２６Ａに示されているように、１００％の死亡率が、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ブリスベン／２００８が投与されたマウスでは、対照治療群において１１日目までに観察された。Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／ブリスベン／２００８による感染の２４、４８または７２時間後に１５ｍｇ／ｋｇで投与された単回用量のｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃは、マウスの１００％の生存率をもたらした。（図２６Ａを参照すること。）図２６Ｂは、上記に記載された様々な条件及び治療下でのマウスの体重の変化を示す。
【０３４４】
これらの結果は、ｍＡｂ  ４６Ｂ８Ｃがビクトリア系列のＢ型インフルエンザウイルスのＢ／ブリスベン／２００８の感染治療に有効であったことを示した。
【０３４５】
統計分析
統計は、ＪＭＰバージョン９．０．２ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して計算した。生存率実験は、ログランク検定（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を使用して比較した。ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。ＩＣ５０曲線及び値をプロットし、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェアを使用して計算した。
【０３４６】
前述の発明は、理解の明確化の目的のために説明及び例により幾らか詳細に記載されてきたが、記載及び例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されている全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照として明確に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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