(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物乳より分離した非ヒト哺乳動物乳腺由来の細胞をＧ０期に同調した後、３０〜１２０分間トリプシン処理を行った核ドナー細胞を用いて、除核した当該非ヒト哺乳動物の未受精卵に細胞融合させることによって核移植することを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0 期に同調した後、３０〜１２０分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。本発明方法は、クローン動物の作出において乳中に含まれる乳腺由来の細胞を用いることから、動物を屠殺あるいは生体を傷つけることが無く乳腺由来の細胞を得ることができ、さらに３０〜１２０分間のトリプシン処理により、除核した未受精卵との細胞融合率を高めることができることから、効率的にクローン動物を作出する優れた方法として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
核移植は、ある１個の細胞の核を他の細胞に移植する操作であり、受精卵（核供与胚）の細胞（核体）１個を他の核を除いた卵子（除核卵子）に細胞融合して核移植胚を作製し、これを体内又は体外培養し、さらに受卵雌の子宮に移植することで産子を得ることができる。この技術を用いることにより、同一遺伝情報を持つ複数の個体（クローン動物）を得ることが可能となる。家畜における核移植（Nuclear transplantation)は、1986年、S.M.Willadsen がヒツジにおいて、8 -16 細胞期の受精卵を核供与胚として、未受精卵より核を除去した細胞質に移植し、電気的な細胞融合法によって初めて成功した(Nature,320,63-65,1986) 。ウシでは、1987年、R.S.Prather らが同様の方法で成功している(Biology of Reproduction 37,859-866,1987) 。以来、核移植については多数の報告がある。しかしながらこの方法では、受精卵を核体に用いることから数に限りがある。そこで、より多くのクローン動物を得るため、一度に大量の核体を供給できる培養細胞を利用する試みがなされてきた。1993年、M.M.Simsらはウシ胚盤胞期受精卵の内部細胞塊を27日間培養後、これを用いて核移植を行い、産子を得ることに成功した（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 90, 6143-6147(1993)）。さらに1996年には、K.H.S.Campbellらはヒツジにおいてembryonic disc由来の培養細胞（継代6-13代）を血清飢餓状態にし、この細胞を核移植することにより、産子の獲得に成功した(Nature,380,64-66,1996) 。又、1997年には、I.Wilmutらがヒツジにおいて、培養した乳腺細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、同様に産子を獲得した(Nature,385,810-813,1997) 。これは、体細胞までに分化した細胞からは、核移植を行っても個体は発生しないという従来の考え方を覆す結果となり、画期的な成果であった。さらに、乳腺細胞を提供する個体と同一の遺伝子を持ったクローン動物を作出する結果となった。しかしながらこの場合、得られた頭数は、乳腺細胞では２７７回試みて１頭（0.4 ％）、胎仔線維芽細胞の場合で１７２回試みて３頭（1.7 ％）と非常に少なく、未だ確立した技術とは言い難い。特に乳腺細胞は、線維芽細胞と比較して効率が悪く、その原因は核移植後の融合率及びその後の発生率が低いためである。しかし、線維芽細胞では、例えばヒト遺伝子を導入し、乳腺で発現させて乳中に目的物質を分泌させるトランスジェニック動物を作出した時に、遺伝子の導入は確認できても、動物の個体に導入しなければ遺伝子の発現レベルを確認することはできない。一方、乳腺細胞では、導入した遺伝子の発現レベルを核移植前に予めin vitroで確認することができるため、効率的に目的物質の生産性が高い動物を作出することが可能である。そのため、乳腺細胞を用いたクローン動物作出法の確立は不可欠であり、その過程において乳腺細胞分離、培養の効率化、移植した細胞の融合率向上、及び発生率の向上が重要である。特に、乳腺細胞を得る段階においては、通常屠殺した動物を利用するか、あるいは生体を傷つけることで分離することになるため、効率や危険性の面で問題があった。又、組織から分離する場合、単一種類の細胞を分離することが極めて難しい。その上、高泌乳牛のように産業上有益な動物を屠殺したり、体を傷つけるのは困難である。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上述の状況に鑑み鋭意研究を重ねた結果、生体を傷つけたり屠殺した動物から分離するなどの煩わしい操作なく、その上ウシの能力、例えば産乳量を確認した上で乳から細胞を分離し、さらに分離した細胞を培養後、除核した体外培養由来の未受精卵に核移植し、体外で培養することにより胚盤胞を得て、これを受卵雌の子宮に移植することで妊娠せしめることに成功し、本発明を完成させた。即ち本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0 期に同調した後、３０〜１２０分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0 期に同調した後、３０〜１２０分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。詳しくは、哺乳動物の乳から分離した細胞を培養後Ｇ0 期に同調した後、さらにその細胞に３０〜１２０分間トリプシン処理を行い、得られた細胞を除核した体外培養由来の未受精卵に核移植し、さらに体外で培養することにより胚盤胞を得て、これを受卵雌の子宮に移植することで妊娠せしめることを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。本発明方法は、クローン動物の作出において乳中に含まれる乳腺由来の細胞を用いることから、動物を屠殺あるいは生体を傷つけること無く乳腺由来の細胞を調製することができ、さらに３０〜１２０分間のトリプシン処理により、除核した未受精卵との細胞融合率を高めることができることから、効率的にクローン動物を作出する優れた方法として有用である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において対象となる細胞は、乳から分離した乳腺由来の細胞であれば特に限定されない。又、動物種、使用する乳についても限定されないが、好ましくは分娩後７日以内、特に好ましくは１日以内に採取したウシの初乳から分離した乳腺上皮細胞が挙げられる。分離した乳腺上皮細胞を、常法に従い培養する。必要に応じて継代を行い、増殖した細胞は通常、一般的に行われる方法により凍結保存することも可能である。細胞の継代数も、特に限定されるものではない。移植に使用する細胞は、コンフルエントに至るまで培養する。次いで５％以下、好ましくは１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地、特にＤＭＥＭ培地を用いて５日間以上、特に好ましくは６日間培養する。このように培養することにより、乳腺上皮細胞の細胞周期はＧ0 期に同調される。次にこのＧ0 期に同調された細胞を好ましくは３０〜１２０分間、特に好ましくは６０分間、０℃〜５０℃の温度でトリプシン処理する。この処理により、細胞は培養器から剥がされ、単離される。又，コラーゲンなどの細胞外マトリックスなども細胞から分離し、細胞表面は滑らかとなり、さらに細胞膜も十分に軟化し、融合しやすくなる。このように処理した細胞を、屠殺された雌ウシ卵巣から採取し、体外にて成熟培養後、１０〜５０時間、好ましくは１９〜２０時間経過した未受精卵から核染色体物質を除去して調製した卵子（除核卵子）の囲卵腔に注入用ピペットにて挿入後、細胞融合液中で、保持用ピペットにて誘導し、微小（１００〜１５０μｍ）な電極を用いて１０〜１００V/mm、１０〜５０マイクロ秒間、１回以上の電気パルス、好ましくは３０V/mm、２０マイクロ秒間、１回の電気パルスにより、挿入した乳腺上皮細胞と除核卵子を融合する。この際、除核卵子を活性化させる必要があるが、活性化を行うのは細胞融合前あるいは融合後のどちらでも良い。さらに、除核卵子と同様の活性化処理を乳腺細胞に施しても良い。融合後、さらに、化学合成培地、好ましくはウシ血清あるいはウシ血清アルブミンを含む修正合成卵管液培地で０〜１５日、好ましくは７日間、体外で培養する。その結果、胚盤胞まで発生が進み、次いで受卵雌ウシの子宮に移植することにより、乳腺由来の細胞を提供した個体と核内の遺伝子情報が同一である動物（個体）を効率良く作出することができる。
【０００６】
【実施例】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【０００７】
【実施例１】
初乳からの乳腺上皮細胞の分離・培養法
分娩後１日以内に採取した初乳５００mlを滅菌したｐＨ７．０のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２倍に希釈後、遠心分離（１０００ｒｐｍ以下、５分間）した。沈殿をＰＢＳで懸濁し再度、同条件で遠心分離した。このＰＢＳによる洗浄操作を３回以上繰り返し、得られた沈殿を１５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と通常の１０倍濃度の抗生物質（ペニシリン（明治製菓社）２５００ｕｎｉｔ／ml、ゲンタマイシン（Sigma 社）５００μg ／ml、ストレプトマイシン（明治製菓社）１０mg／ml、ポリミキシンＢ（Sigma 社）５００ｕｎｉｔ／ml、ファンギゾン（GIBCO BRL 社）２５μg ／ml）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、GIBCO BRL 社）に懸濁した。この懸濁液を初代培養用フラスコ（プライマリア、ファルコン製、２５cm2 ）に入れて２４時間〜４８時間、３７℃、５％ＣＯ2 存在下で培養した。次いで、通常濃度の抗生物質と１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭに交換し、さらに培養を続けた。その結果、７〜１４日で乳腺上皮細胞のコロニーが観察され、以後活発な増殖が認められた。コンフルエントに至るまで培養後、継代培養を繰り返し、核移植に使用するもの以外は、常法に従って液体窒素中で凍結保存した。
【０００８】
【実施例２】
Ｇ0 期に同調された細胞の調製法
コンフルエント状態まで増殖培地（１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）で培養後、培地を捨て、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、増殖培地培養群と血清制限培地培養群に分けて、さらに培養した。血清制限培地には、１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを用いた。１、２、３、４、５、６、８日間培養後にそれぞれの群の細胞よりＲＮＡを抽出し、ウシチミジル酸シンターゼｍＲＮＡのアンチセンスプライマー（配列表配列番号１）を用いてｃＤＮＡを合成し、配列表配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、配列表配列番号１に示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて、ＰＣＲを行った。同様に、ウシ塩基性タイプ２−コンポーネント３型ケラチンｍＲＮＡのアンチセンスプライマー（配列表配列番号３）を用いてｃＤＮＡを合成し、配列表配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、配列表配列番号３に示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動にて分離後、エチジウムブロマイド染色により可視化し、スキャナーでコンピューターへ取り込み、画像解析ソフトにより試料中のウシチミジル酸シンターゼの目的バンド及びケラチンの目的バンドの染色強度を数値化した。この数値を用いて、Ｇo 期に同調されたことを確認するための指標であるケラチンバンド強度に対するチミジル酸シンターゼバンド強度の比を求めた。各試料における比の値をグラフにしたものを図１に示した。この結果より血清制限培地で培養した細胞は、培養５日目以降でチミジル酸シンターゼの発現が減少し、６日目以降にはほとんどプラトーになることが確認された。よって、血清制限培地で６〜８日間培養することにより、ウシ乳腺上皮細胞がＧ0 期に同調されたことが確認された。
【０００９】
【実施例３】
細胞融合条件の検討
ウシ乳腺上皮細胞のトリプシン処理時間による、除核した未受精卵との細胞融合条件の検討を行った。即ち、ウシ屠体卵巣から小卵胞を吸引して、卵子卵丘細胞複合体を採取し、１０％ＦＣＳ、０．０２ＡＵ／ml卵胞刺激ホルモン（デンカ製薬社）、１μg ／mlエストラジオール１７β（Sigma 社）、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社）及び１％抗菌・抗真菌剤（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ）を添加したｍ−１９９中で、３９℃、５％ＣＯ2 、９５％空気及び飽和湿度下で１９〜２０時間成熟培養した。次いで、卵子の卵丘細胞を、１mg／mlヒアルロニダーゼ（Sigma 社）を添加した１０％ＦＣＳを含むリン酸緩衝液（ＦＣＳ−ＰＢＳ）中で、ボルテックスミキサーで５分間攪拌することにより除去した。卵子を５μg ／mlサイトカラシンＢ（Sigma 社）を含むＦＣＳ−ＰＢＳ中で、顕微操作により第１極体とともに周辺の細胞質を一部吸引し、５μg ／mlヘキスト３３３４２（Sigma 社）に３分間浸漬後、蛍光顕微鏡下で数秒間観察し、染色体の見られなかった卵子を除核卵子とした。さらに、除核卵子を５０μＭイオノマイシン（CALBIOECHEM 社）を添加したカルシウム及びマグネシウムイオンを含まないヘペス緩衝タイロード培地（ＴＬ−ＨＥＰＥＳ）に４５秒間浸漬し、２０％ＦＣＳを含むＴＬ−ＨＥＰＥＳ（ＦＣＳ−ＴＬ−ＨＥＰＥＳ）に１５分間浸漬した。さらに、１０μg ／mlシクロヘキシミドを含むＦＣＳ−ＴＬ−ＨＥＰＥＳに５時間浸漬することにより活性化した。次いで、実施例２で得られたＧ0 期に同調された乳腺上皮細胞をＰＢＳで３回洗浄後、ＣａＣｌ2 、ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  不含のハンクス平衡塩類緩衝液に溶解した０．２５％トリプシン（GIBCO BRL 社）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａを用いて、３７℃で５、３０、６０、１２０、２４０分間それぞれ処理し、単離した細胞を、１００μg ／ ml フィトヘマグルチニン（Sigma 社）を添加した０．１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含むｍ１９９中で顕微操作により１個ずつ活性化した除核卵子の囲卵腔に注入し、細胞質に接着して核移植胚を作製した。融合は、顕微操作が可能な微小電極と融合装置を用いて、チンマーマン融合液（Membrane Biol., 67, 165-182 (1988)； Theriogenology, 37, 5-15 (1992)）中で、３０Ｖ／ｍｍの直流電流を２０マイクロ秒間で、１回通電することにより行った。結果を表１に示す。この結果、トリプシン処理を３０〜１２０分間、特に好ましくは６０分間行うことにより、融合率を高めることができることを確認した。
【００１０】
【表１】
0004119513.tif 000002
【００１１】
【実施例４】
培養ウシ乳腺上皮細胞の核移植及び胚の培養
実施例２と同様の方法で得られたＧ0 期に同調した乳腺上皮細胞と、実施例３と同様の方法で得られた除核卵子を細胞融合した。融合は、顕微操作が可能な微小電極と融合装置を用いて、チンマーマン融合液中で、３０Ｖ／ｍｍの直流電流を２０マイクロ秒間で、１回通電することにより行った。結果を表２に示す。この融合した胚を１０％ＦＣＳを含む修正合成卵管液培地（ＦＣＳ−ＳＯＦ）中で、３９℃、５％ＣＯ2 、９０％Ｎ2 及び飽和湿度下で７〜８日間培養した。結果を表３に示す。その結果、胚盤胞まで発生が進み、次いで受卵雌ウシの子宮に移植することにより、妊娠が確認された。
【００１２】
【表２】
0004119513.tif 000003
【００１３】
【表３】
0004119513.tif 000004
【００１４】
【発明の効果】
本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0 期に同調した後、３０〜１２０分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。本発明方法は、クローン動物の作出において乳中に含まれる乳腺由来の細胞を用いることから、動物を屠殺あるいは生体を傷つけることが無く乳腺由来の細胞を得ることができ、さらに３０〜１２０分間のトリプシン処理により、除核した未受精卵との細胞融合率を高めることができることから、効率的にクローン動物を作出する優れた方法として有用である。
【００１５】
【配列表】
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【００１６】
0004119513.tif 000006
【００１７】
0004119513.tif 000007
【００１８】
0004119513.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】  ウシ初乳から分離した乳腺上皮細胞を血清制限培地（１％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）及び増殖培地（１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で培養した場合の、チミジル酸シンターゼ発現量の消長を示す。
【図１】
0004119513.tif 000009