【手続補正書】
【提出日】平成20年8月8日(2008.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）によりチャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）を誘起させる方法において、含窒素有機化合物の末端に、次式（Ｉ）：
【化１】
2003055324.tif 000001
で示されるスクアリル酸残基を導入させて行うことを特徴とする方法。
【請求項２】  含窒素有機化合物が、ペプチド類、ペプチドエステル類、ポリアミン類、ポリアミンエーテル類または分子末端にアミノ基を有する鎖状もしくは環状有機化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】  高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）によりチャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）を誘起させるために、含窒素有機化合物の末端に、次式（Ｉ）：
【化２】
2003055324.tif 000002
で示されるスクアリル酸残基を導入させるための試薬。
【請求項４】  請求項３に記載の式（Ｉ）で示されるスクアリル酸残基を導入するための試薬が、次式（ＩＩ）：
【化３】
2003055324.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アルケニル基、アリール基またはアラルキル基を表わす）
で示されるスクアリル酸誘導体からなるものである、請求項３に記載の試薬。
【請求項５】  請求項３に記載の式（Ｉ）で示されるスクアリル酸残基を導入するための試薬が、次式（ＩＩＩ）：
【化４】
2003055324.tif 000004
（式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、アルケニル基、アリール基またはアラルキル基を表わし、Ｒ４はアミノ基の保護基を表わし、ｎは１または２の整数を表わす）
で示されるスクアリルアミノ酸誘導体である、請求項３に記載の試薬。
【請求項６】  含窒素有機化合物の分子末端に、次式（Ｉ）：
【化５】
2003055324.tif 000005
で示されるスクアリル酸残基を導入させ、高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）により、チャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）を誘起させることからなる有機化合物の構造解析方法。
【請求項７】  請求項６に記載の有機化合物の構造解析方法において、含窒素有機化合物の分子末端にスクアリル酸残基を導入させるために、請求項４に記載の式（ＩＩ）で示されるスクアリル酸誘導体を使用する、当該有機化合物の構造解析方法。
【請求項８】  請求項６に記載の有機化合物の構造解析方法において、含窒素有機化合物の分子末端にスクアリル酸残基を導入させるために、請求項５に記載の式（ＩＩＩ）で示されるスクアリルアミノ酸誘導体を使用する、当該有機化合物の構造解析方法。
【請求項９】  含窒素有機化合物が、ペプチド類、ペプチドエステル類、ポリアミン類、ポリアミンエーテル類または分子末端にアミノ基を有する鎖状もしくは環状有機化合物である、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ；Ｈｉｇｈ−ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により、有機化合物の構造解析を行う方法に関し、詳細には、含窒素有機化合物について、チャージリモートフラグメンテーションを生じさせる方法、ならびにそれに使用する試薬に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
化学構造式が未知あるいは推定される有機物質について、その構造解析と同定化を行う手段として、種々の物理化学的方法が採用されている。例えば、最もオーソドックスな手段としては、対象となる有機化合物についての赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）、プロトンあるいは炭素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−あるいは１３Ｃ−ＮＭＲ）、質量分析法（ＭＳ）、Ｘ−線結晶回折等を行い、得られたデータを解析し、その化学構造式の決定、同定等が行われている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
このような構造解析手段は、科学の進歩とともに、著しい発展を遂げてきており、例えば、含窒素有機化合物としてのペプチド類の高度な構造決定法としてＭＳ／ＭＳ法が多用されてきている。このＭＳ／ＭＳ法においては、一般的には、エレクトロスプレー（ＥＳＩ；Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法や、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ；Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）といったイオン化法に、中性分子で分子開裂を生じさせる衝突誘導解離（ＣＩＤ；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）や、ポストソースディケイ（ＰＳＤ；Ｐｏｓｔ−Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ）を組み合わせた方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ＭＳ／ＭＳスペクトルは、高感度であること、混合物でも測定が可能であるという利点を有していることより、ペプチドの一次配列決定法として広く用いられている方法である。しかし、多くの場合、観測されるフラグメントイオン（開裂イオン）は、例えばペプチド類の場合には、アミド結合で開裂したイオンピークが入り混じり、その構造解析を複雑なものとしている。また、ペプチドを構成するアミノ酸残基に対応した分子量差の情報を得ることはできても、例えば異性体の関係にあるロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）の区別をつけることは困難なものとなっている。さらには、分子量が同じグルタミン（Ｇｌｎ）とリジン（Ｌｙｓ）の判別を行うことも困難なものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
最近になって、これらの問題点を解決する解析方法として、高エネルギー衝突誘導解離法（ＣＩＤ；Ｈｉｇｈ−ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により得られる、チャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ；Ｃｈａｒｇｅ−Ｒｅｍｏｔｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を利用するＭＳ／ＭＳ解析が注目されてきている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
すなわちこのＣＲＦは、例えばペプチド類の分子末端、特にＮ−末端にスルホン酸残基を導入するか、あるいはＮ−末端を第４級アンモニウム塩残基として極性官能基を保持させ（チャージさせ）、一段目のＭＳで分子関連イオンを選択し、引き続き、強制的なフラグメンテーション化、すなわち、高エネルギー衝突誘導解離（ＣＩＤ）を行うと、チャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）が二段目のＭＳで観測されることを特徴としている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ここで観測されるＣＲＦは、分子末端に存在するスルホン酸基あるいは第４級アンモニウム塩等の極性官能基の遠方から、極性官能基に向かって開裂が規則的に生じることを特徴としている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
このＣＲＦが観測される基本的な開裂様式を、下記の模式的な化学式で示す。すなわち開裂は、極性官能基の遠方の方からａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆの様式で生じ、それに対応するフラグメントイオンのピークが特徴的に観測されることとなる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【化６】
2003055324.tif 000006
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
この方法は、両側からの断片化がともに観測される前記した低エネルギーでのフラグメンテーションに比較して、精度の高い構造情報が得られるものであり、これまでにポリアミン類あるいはマイトトキシに代表されるポリエーテル有機分子などの長鎖有機化合物の微量構造解析に、絶大な威力を発揮している方法である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題点を鑑み、上記の高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて含窒素有機化合物の構造解析を行う場合に際して、効果的にチャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）を生じさせる方法、それに使用する試薬、ならびにＣＲＦを誘起させることによる有機化合物の解析方法を提供することを課題とする。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するための請求項１に記載の本発明は、高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）によりチャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）を誘起させる方法において、含窒素有機化合物の末端に、次式（Ｉ）：
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
したがって、請求項３に記載の本発明は、また別の態様として、高エネルギー衝突誘導解離法−ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ）によりチャージリモートフラグメンテーション（ＣＲＦ）を誘起させるために、含窒素有機化合物の末端に、次式（Ｉ）：
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
この場合、反応条件を種々制御することにより、アミノ基のみの選択的なスクアリル化が行われることが判明した。例えば、ブラジキニンにあっては、アミノ基はＮ−末端のみならず、Ｃ−末端にもグアニジン基のアミノ基が存在するが、反応ｐＨを適宜調整することにより、Ｃ−末端グアニジン基のアミノ基にはスクアリル酸残基は全く導入されていないものであった。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
なお、前記した如く、ペプチド分子内に側鎖アミノ基を有する化合物であるリジンが存在する場合には、スクアリル化するチャージサイトが複数存在することとなるので、本発明の試薬を反応させる前に、エドマン分解法を組み合わせることによって、リジンの側鎖アミノ基をフェニルチオカルバミン化して保護するとともに、末端アミノ酸を開裂除去させ、２番目のアミノ酸の遊離アミノ基をスクアリル化する手段を採用し、効果的にＣＲＦを生じさせることができる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
ところで古典的なエドマン分解法にあっては、例えばフェニルイソチオシアネートを用いてカップリング反応を行なわれている。したがって、かかる古典的なエドマン分解法を実施した場合には、ペプチド分子内に存在するリジンの側鎖アミノ基は、通常フェニルチオカルバミン化されている。しかしながら、側鎖アミノ基が多い化合物では、フェニルチオカルバミン化すると極性基がブロックされてイオン化率が悪くなり、この状態で末端アミノ基をスクアリル化してＣＲＦを誘起させても、所望の規則的なフラグメンテーションが生じたものの、その誘発はそれほど効果的でないことが判明した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
５０ｎｍｏｌのアンジオテンシン−Ｉ（１）の２００μｌ  ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）に、上記実施例１で得たｔｅｒｔ−ブチル、メチルスクアリン酸エステル（２）５００ｎｍｏｌのジオキサン５０μｌ溶液を加え、室温下に２日間攪拌を行った。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて精製し、Ｎ−末端がスクアリル化されたアンジオテンシン−Ｉ（３）を主生成物として得た。なお副生成物としてｔｅｒｔ−ブチル基が残存し、かつ水和したと考えられる化合物が、ＭＡＬＤＩ・ＭＳスペクトルから確認された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
５０ｎｍｏｌのブラジキニン（４）の２００μｌ  ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）に、上記実施例１で得たｔｅｒｔ−ブチル、メチルスクアリン酸エステル（２）５００ｎｍｏｌのジオキサン５０μｌ溶液を加え、室温下に２日間攪拌を行った。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて精製し、Ｎ−末端がスクアリル化されたブラジキニン（５）を得た。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
次いで上記で得られた、Ｎ−末端にスクアリル基を含有するＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（Ｂｚｌ）３３ｍｇ（０．０３９３ｍｍｏｌ）を３０％臭化水素酸／酢酸の混合液３ｍｌに加え、室温で２時間攪拌した。反応液を減圧留去して、得られた残留物をＣｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）を用いたカラムクロマトグラフィー（水／メタノール＝２：１〜１：１）に付して分離精製し、目的とするＮ−末端にスクアリル基を含有した化合物（８）を、淡黄色油状物質として１３ｍｇ（６０％）得た。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
得られたＮ−末端にスクアリル基を有する化合物（８）をＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ解析に付した。その結果得られたフラグメントイオンピークのチャート図を図３に示した。図中の結果からも明らかなように、フラグメントイオンピークのチャート上に規則的なＣＲＦが生じていることが判明する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
得られた化合物（１５）をＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ解析に付した。その結果得られたフラグメントイオンピークのチャート図を図４に示した。
図中に示したチャート図からも判明するように、規則的なＣＲＦが生じていることが理解される。特に本実施例におけるスペルミンの場合には、ポリアミンメチレン鎖の間隔が、−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ３−であるか、あるいは、−Ｃ４−Ｃ３−Ｃ３−であるかという、配列の区別が問題となるが、この区別を行い得る一次構造情報が得られていることが判明している。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
（ｂ）スクアリル化とＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ解析
上記で得られたエドマン分解生成物に、そのまま０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）４０μｌを加え、上記実施例１で得たｔｅｒｔ−ブチル、メチルスクアリン酸エステル（２）４００ｎｍｏｌのジオキサン４０μｌ溶液を加え、室温下に２日間攪拌を行った。加熱後、トリフルオロ酢酸２０μｌを加えて５０℃にて６分間加熱し、減圧乾燥し、マストパランのＮ−末端のアミノ酸であるイソロイシン（Ｉｌｅ）が開裂除去され、２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）のアミノ基がスクアリル化された生成物（１８）を得た。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
（ｂ）スクアリル化とＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ解析
上記で得られたエドマン分解物に、リン酸緩衝液（ｐＨ＝８）８μｌを加え、上記実施例１で得たｔｅｒｔ−ブチル、メチルスクアリン酸エステル（２）５０μｌのジオキサン２μｌ溶液を加え、室温下に４時間攪拌した。乾燥後ＦＣ−５５のＮ−末端であるイソロイシン（Ｉｌｅ）が開裂除去され、二番目のロイシン（Ｌｅｕ）のアミノ基がスクアリル化された化合物（２１）を得た。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
本発明の方法によれば、超微量のサンプルによる構造解析が可能であり、特にピコモルレベルでのサンプルによる構造解析が可能である。この点は、天然界には極微量の生理活性物質が存在するが、これまでその化学構造の解析は、超微量であることより極めて困難なものであったが、本発明の方法を応用することにより簡単にその構造が解析され得る。したがって本発明は、今後の微量生理活性物質の検索とその構造解析に、多大な光明を与えるものである。