(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物心筋の粗抽出物のホモジネートを含むことを特徴とする、心筋損傷の指標を検出するイムノアッセイに用いるための安定な較正／対照用配合物。
【請求項２】
ウシ心筋がその調製に用いられている、請求項１記載の較正／対照用配合物。
【請求項３】
心トロポニンの検出に適した、請求項１記載の較正／対照用配合物。
【請求項４】
心トロポニンＩの検出に適した、請求項１記載の較正／対照用配合物。
【請求項５】
心筋ホモジネートが架橋剤で架橋されたものである、請求項１記載の較正／対照用配合物。
【請求項６】
ヒト血清中のトロポニンを検出するイムノアッセイにおいて、較正又は対照用として用いるのに適した配合物を調製する方法において、
ｉ）新鮮な哺乳動物心筋組織を生理的塩／緩衝溶液とともに均質に粉砕して筋組織のホモジネートを得る工程と、
ii）ホモジネートを希釈して、較正用配合物としての希釈マトリックスを得る工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
哺乳動物心筋組織がウシ又はヒトの組織である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
生理溶液が約５．５〜８．５のpHを有し、塩濃度が生理的範囲にある、請求項６記載の方法。
【請求項９】
生理溶液の中に洗浄剤、プロテアーゼインヒビタ及び酸化防止剤が含まれる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
希釈マトリックスが、ヒト血清中のタンパク質濃度を近似するのに十分な量のタンパク質を、血清のイオン強度を近似する緩衝剤及び塩とともに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
トロポニンがトロポニンＩである、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか１項記載の方法によって調製される、ヒト血清中のトロポニンを検出するイムノアッセイにおいて較正用又は対照用として用いるのに適した配合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
イムノアッセイは、その特に高い特異性及び感度のおかげで、医療診断目的で血清又は尿試料中のタンパク質を検出するのにしばしば使用される。そのようなイムノアッセイには、１種又は２種の特異性抗体が必要であるだけでなく、患者試料を定量化するための参照標準として使用される較正物質が必要である。大きな分析研究室での自動化検定の場合には、ときには較正物質を数か月から２年間４℃で貯蔵する必要がある。分析対象物に依存して、較正物質配合物の安定性に対するこれらの要求は、たとえば生理的塩及びpHの条件下での較正物質配合物の溶解性が保証されないならば、問題となるおそれがある。これに関して挙げることができる例は、変性溶液（６M 尿素、０．０１M ジチオトレイトール）中でのみ十分な安定性及び可溶性を有するトロポニンＩ及びトロポニンＴである。しかし、この変性剤を使用してイムノアッセイを実施することはできない。理由は、変性条件が、抗体の二次構造を変化させることによって抗体に影響して、抗体がトロポニン分析対象物に結合することができないようにするからである。トロポニンの場合の他の要因は、ガラスのような表面に付着するその傾向及び安定な較正物質の調製を困難にする化学的不安定性であるかもしれない。
【０００２】
タンパク質は溶液中で比較的不安定であり、タンパク質を含む試薬はしばしば、使用者による適用に先立ちそのような試薬を溶解させるのに適した組成物の溶剤とともに、凍結乾燥形態で販売されることが既知である。この方法で得られる溶液を４℃で貯蔵するならば、そのような溶液は、毎日の検出過程で試薬濃度にある程度の変化が見られるとしても、数日間は使用することができる。したがって、凍結乾燥物質から得られる基準溶液をより長期間貯蔵しなければならないならば、それらは一般に、トロポニンＩ及びトロポニンＴの場合に推奨されるように、標準的剤形で凍結される。
【０００３】
【発明の概要】
本発明は、イムノアッセイに使用するための、４℃以上の温度で非常に高い安定性を有する較正物質に関する。較正物質は、トロポニンがその天然形態で保持される心筋の入念に製造された調製物を含む。
【０００４】
心筋調製物はまた、研究室の品質管理体制に統合することができる対照として使用することができる。対照は、それらの安定性要件がそれほど厳格ではないという考えられる例外をもって製造される方法において較正物質とは異ならない。しかし、較正物質は検定を準備するのに使用されるが、対照は、検定が十分な性能を発揮し続けることを保証するために毎日のベースで使用されるため、それらが使用される方法に違いがある。以下の説明は、較正物質としての心筋ホモジネートの使用を強調するが、この説明はまた、対照として使用される心筋ホモジネートの調製にも当てはまることを理解すべきである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
トロポニンを分離し、精製する標準的な方法は、有機溶剤及び／又は高い塩濃度を使用する。本明細書に記載する実施例はトロポニンＩに関するが、開示する手法は、トロポニンＣ及びＴだけでなく、心組織中に存在する、心筋損傷の指標である他いくつかの分子にも同等に応用することができる。
【０００６】
この新規な方法は、新鮮な哺乳動物の心筋を均質に粉砕することからなり、粉砕した心筋は、生理緩衝液を用いて凍結状態で貯蔵することができる。ヒト又はウシの心組織が好ましい。ヒト及びウシの物質中に存在するアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を含むものであるならば、他の哺乳動物の心組織を使用することもできる。好適な均質化媒体は、分子を天然の形状に維持するためにイオン強度を生理的範囲に維持する塩を含む、中性、弱酸性又は弱アルカリ性範囲のpH値、好ましくは約５．５〜８．５のpH値を有する緩衝液、たとえばＰＢＳ（リン酸水素二カリウム／リン酸二水素ナトリウム）、ＴＲＩＳ（トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）、イミダゾール、ＭＥＳ（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）及びＨＥＰＥＳ（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕−ピペラジン−Ｎ′−〔２−エタンスルホン酸〕）である。塩濃度は生理的濃度範囲であり、たとえば１０〜８８０mM  ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ又はＣａＣｌ2 である。好ましくは、洗浄剤、たとえばTriton X 100又はTween 20、プロテアーゼインヒビタ、たとえばトリプシンインヒビタ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＢＳＦ）、ロイペプチン及び／又はペプスタチンならびに酸化防止剤、たとえばＤＴＩ又はβ−メルカプトエタノールが添加物として使用される。洗浄剤は一般に、較正物質がガラス及びプラスチックの面に付着することを防ぎ、酸化防止剤は、ジスルフィド架橋の形成を阻害することにより、分析対象物をモノマー状態に維持するのに役立つ。プロテアーゼインヒビタ（タンパク質分解酵素阻害剤）は、組織抽出物中に存在する非特異性プロテアーゼによるトロポニン分子の分解を防ぐ。
【０００７】
ホモジネートは、遠心分離に付し、低温が貯蔵時のタンパク質溶液を安定化させるため、好ましくは−２０℃〜−８０℃の温度で貯蔵する。この調製物の希釈物は、心トロポニン、特にトロポニンＩに特異的である、イムノアッセイに使用される抗体との反応性を示す。較正物質を調製する際、通常はウシ心組織である心臓ホモジネートを希釈マトリックスに希釈する。上述の心筋調製物中のトロポニンＩ活性は、同様に処理した骨格筋調製物中には存在しないことがわかった。また、心筋調製物中でのみ、前述の抗体が、分離した心筋トロポニンＩと同じ泳動特性を変性ゲル電気泳動で示すタンパク質を認識するということが見いだされた。
【０００８】
上述の調製物はまた、種々の生理緩衝液中２０℃及び４℃で数日間は安定である。好適な希釈マトリックスは、処理済み又は未処理のヒト又は動物の血清又は血漿であるか、分離媒体として述べた緩衝液である。加えて、防腐剤、たとえばアジ化ナトリウム及びProclin 150 ならびに安定化タンパク質、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はγ−グロブリンが使用される。心臓ホモジネートを上述の種々の添加物とともに６％ＢＳＡ水溶液に希釈する方法が、較正物質マトリックスを調製するのに好ましい方法である。通常、イムノアッセイに用いるための較正物質は、測定される分析対象物を正常なヒト血清に溶解することによって調製する。これは、較正物質が臨床血清試料にできるだけ近く一致することを保証するために実施される。しかし、本発明の心臓ホモジネートは、正常なヒト血清中に組み込まれているときには、あまり安定ではない。したがって、正常なヒト血清の人工マトリックスは、ヒト血清の平均タンパク質濃度を近似するのに十分な量のＢＳＡ又は他のタンパク質、たとえばヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清、ウシγ−グロブリンもしくはオボアルブミン（ＢＳＡの場合で６％）を、安定化剤ならびに血清のイオン強度を近似するための緩衝剤及び塩と組み合わせて使用することによって調製する。再現性を改善するため、上述の調製は以下の工程、すなわち、通例の方法、たとえば不溶性成分のゲルろ過、遠心高速除去及び／又は無菌フィルタに通すろ過によって分別する工程を含むことができる。この方法で、心筋梗塞の診断のための上述のイムノアッセイに用いる安定な較正液を非常に簡単かつ低廉な方法で調製することが可能である。さらには、トロポニン配合物は、患者試料中で優勢に見られる形態で検出される分子を含む。健康な心筋中のトロポニンは、トロポニンＩ、Ｔ及びＣの複合体として存在し、本発明の心臓ホモジネートの中ではトロポニンは天然のＩＴＣ複合形態で存在すると考えられる。したがって、本発明の方法を使用して、トロポニンのＴ及びＣ形態の較正物質だけでなくＩ形態の較正物質をも調製することができる。したがって、これは、診断試験に関して、分離されたトロポニンＩ、Ｔ又はＣを含む配合物よりも忠実な制御を提供する。トロポニンはその天然形態では複合体として存在し、この複合体はより安定な形態を表すため、上述のウシ心筋ホモジネートを架橋剤で処理して、複合体の３成分の間に共有結合を得ることができる。架橋剤によって導入される複合体の部分の間の共有結合が複合体の分裂を防ぐため、この結合は、トロポニン複合体の中で自然に起こる分子の相互作用よりも安定である。好適な架橋剤は、ホモ二官能分子、たとえば１−エチル−３−３〔ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、（ビス〔スルホスクシンイミジル〕−スベレート）（ＢＳ3)又はスルホジスクシンイミジルタルトレート（スルホ−ＤＳＴ）である。較正物質の安定性の増大が望まれるときには、トロポニン架橋剤複合体の形成が望ましい。非架橋物質は非常に良好な安定性を示すが、いくつかの市販の検定は１年以上の安定性を要し、その場合には架橋が有利であろう。以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
【０００９】
【実施例】
実施例１
衝撃凍結したウシ心筋３１ｇを、冷却した均質化緩衝液（１．３９g/l   Ｋ2 ＨＰＯ4 、pH７．３、８．７７g/l   ＮａＣｌ、０．３１２g/l   Ｎａ（ＨＰＯ4)2 ・２Ｈ2 Ｏ、０．１％Tween 20、０．１mMジチオトレイトール）３０mlで均質化した。このホモジネートを１，０００G で２０分間遠心分離し、等分し、凍結した。通常、イムノアッセイの較正物質は、測定する分析対象物を正常なヒト血清に溶解することによって調製する。これは、較正物質が臨床血清試料にできるだけ一致することを保証するために実施される。しかし、本発明の心臓ホモジネートは、正常なヒト血清中に組み込まれているときには、あまり安定ではない。種々のマトリックスで、このホモジネートの希釈物が以下の安定性値を示した（表１）。
【００１０】
【表１】
0004106111.tif 000002
【００１１】
安定性は、希釈したホモジネートを、業者から購入した純粋なトロポニンＩＴＣ複合体の同様に調製した希釈物（有効トロポニンＩ含量は標準的方法によって測定剤）と比較することによって測定した。純粋なＩＴＣ複合体を使用して、較正物質の研究ロットを重量法によって調製した。この較正物質の基準ロット（−８０℃で貯蔵）を、実験用トロポニンＩ（ウシ心臓ホモジネートから得たもの）検定試薬とともに使用して、トロポニンＩ濃度を測定するための標準曲線を構成した。ウシ心臓ホモジネートに基づく較正物質を種々の条件下でストレスに付し、基準ロット較正物質に対する未知試料として測定して、活性の減衰を検出した。この調製物をBayer Immuno 1（商標）分析装置（Bayer Diagnostics)で分析した。検定形式は、以下の抗体を使用するサンドイッチ方式であった。１）ヒト心臓トロポニンＩの配列から得たペプチドを使用してアフィニティー精製しておいた多クローン性ヤギ抗体。２）ヒト心臓トロポニンＩに対する単クローン性抗体。サンドイッチの第一の抗体をＦＩＴＣで標識し、抗ＦＩＴＣによって磁気粒子上で固定化した。サンドイッチの第二の抗体は、アルカリホスファターゼを含み、色形成反応を触媒し、この反応によって抗原の量が測定される。この分析装置は、実験結果を臨床単位に変換する前に、実験結果をＡＵ、すなわち吸光度単位／分に換算して報告する。ヒト心臓トロポニンＩのアミノ酸配列とウシ心臓トロポニンＩのアミノ酸配列とは非常に類似しており、これが、抗体交差反応性を説明する。したがって、ウシ心筋は、較正物質調製に使用することができる。原則的に、ヒト及び他の哺乳動物の組織をも調製に用いることができる。表１を参照すると、「較正物質緩衝液」とは、ウシ心筋を下記に加えた調製物をいう。
【００１２】
６．８１g/l   イミダゾール
５．８４g/l   塩化ナトリウム
０．９g/l   アジ化ナトリウム
２．０g/l   Triton X 100
１ml/l  Proclin 150
６０g/l   ＢＳＡ
【００１３】
「未処理の血清」とは、脂質化されていない、又は有機溶剤で処理されていない血清をいう。
【００１４】
表１に提示したデータを参照すると、ホモジネートの安定性データは、緩衝液中と血清中とで有意な差はない。実際に、より長期の実験では、緩衝液が血清マトリックスよりも全体に優れていることが証明された。表に提示したデータには、数週間にわたって実施される実験に予想することができる一定のばらつきがある。
【００１５】
実施例２
実施例１に記載のようにして心筋ホモジネートを調製した。全タンパク質濃度を２mg／mlに調節し、見かけトロポニンＩ濃度に対して２．５〜２５０倍過剰モルの量で以下の架橋剤を加えた。１−エチル−３−３〔ジ−メチルアミノプロピル〕カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、（ビス〔スルホスクシンイミジル〕）スベレート（ＢＳ3)又はスルホジスクシンイミジルタルトレート（スルホ−ＤＳＴ）。室温での反応時間は３時間であった。それから、調製物をさらに希釈し、実施例１に記載のようにして分析した。