(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の哺乳動物の黒色腫の成長を阻害する方法であって、当該方法が、以下の構造式、すなわち；
0004052485.tif 000004
で表されるベツリン酸またはその塩を、ヒト以外の哺乳動物の黒色腫に対して局所的に投与する工程を含む、ことを特徴とする黒色腫の成長を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、国立癌研究所からU01 CA52956として交付された補助金による政府援助の下に完成された。よって、本発明に関して、政府は一定の権限を有する。
発明の分野
本発明は、腫瘍を選択的に阻害する組成物と方法、具体的には、植物由来の化合物を利用した悪性黒色腫の治療に関する。
発明の背景
最近の40年間にて、黒色腫の発生率は、他の癌と比較して、高率で増加し続けている。そして今や、米国の白人の90人に一人が、その生涯において悪性黒色腫に罹患するとの理論付けがされている。外科的処置を施すに十分な初期段階での黒色腫の診断数は増大し、また、処置から10年後の生存率も90％を超えているが、米国では現在でも悪性黒色腫に罹患した7000人程度の患者が死亡しているものと推定されている。
外科的摘出が困難な悪性黒色腫を患った患者の治療方法は限られている。5-（3,3-ジメチル-1-トリアゼニル）-1-H-イミダゾール-4-カルボキシアミド（ダカルバジン、DTIC）は、24％の反応性を呈する、黒色腫に対して最も効果的な単一の化学療法剤である。しかし、DTICへの応答反応時間は、一般に、非常に短い。N,N'-ビス-（2-クロロエチル）-N-ニトロソ尿素（カルムスチン、BCNU）、シスプラチン、タモキシフェン、インターフェロン−α（IFN-α）およびインターロイキン-2（IL-2）などの、他の合成剤および組換剤を用いた複合療法は、ある臨床例においては高い反応性（例えば、30〜50％）が認めれているが、完全反応性は共通しておらず、また毒性も高まってしまう。化学療法の連続適用も考えられるが、明らかに、悪性黒色腫に罹患した患者への現在の治療手段は不十分であると言える。
アドリアマイシン（ドキソルビシン）誘導体、ブレオマイシン、エトポシドおよびビンクリスチン、およびこれらの誘導体を含めた天然物由来の様々な薬剤が、単一の薬剤あるいは複合療法剤として用いられ、黒色腫に対するそれらの効果が試験されている。しかしながら、合成化合物および組換化合物の場合と同様、これら化合物の反応性は小さく、また、一過性の完全反応性しか示さず、そして、高い毒性を発現する。
にもかかわらず、現在使用されている公知の癌の化学療法剤によって実証されているように、植物由来の天然物は、有効な薬剤の供給源である。かような有用な天然物由来の薬剤として、パクリタキセル（タキソール）およびカンプトセシンの二つがある。パクリタキセルは、元来、イチイ属の木であるTaxus brevifolia（Taxaceae）の樹皮から採取されたものであり、現在では、難治性あるいは後遺性の卵巣癌の処置のために使用されている。最近では、転移性黒色腫の治療におけるパクリタキセルの薬効を調査するための臨床試験が実施されている。単一の薬剤としてのタキソールは、シスプラチンおよびI1-2と同等の活性を呈する。タキソールは、独特の作用機構に従って機能し、そして、チューブリンの重合を促進する。すなわち、タキソールを媒介した抗腫瘍反応は、抗有糸分裂活性によるものである。第二の薬剤である、プロミネンスとカンプトセシンは、シナ木のCamptotheca acuminata Decaisne（Nyssaceae）の幹の樹皮から単離されたものである。カンプトセシンも、新規の作用機構、すなわち、トポイソメラーゼＩ型の阻害によって機能する。０％（リンパ腫）〜50％（小肺細胞）の範囲の反応性が認められた様々な腫瘍に対する、水溶性カンプトセシンのプロドラッグ類似体である、イリノチカン（CPT-11）の第２相試験は、すでに日本で実施済である。同じく水溶性カンプトセシン類似体であるトポテカンは、目下のところ、米国にて第２相試験が実施されている。
動物モデルでのベツリン酸を利用した抗腫瘍データは、非常に変化に富んでおり、再現性が欠けている。例えば、ベツリン酸は、Walker 256マウス癌肉腫に対して、300〜500mg/体重kgの用量レベルにて用量依存活性が認められたことが報告されている。これとは対照的に、以後の報告にあっては、この化合物がWalker 256（400mg/kg）とL1210マウスリンパ球性白血病（200mg/kg）のモデルに対して不活性であったことが述べられている。国立癌研究所で実施した試験では、これら不活性データが確認されている。
同様に、P-388マウスリンパ球試験系でのベツリン酸の抗腫瘍活性が示唆されている。しかしながら、国立癌研究所で実施した試験では活性は認められていない。最近になって、マウスの耳において、ベツリン酸が、ホルボールエステルによる炎症と、表皮性のオルニチンデカルボキシラーゼの蓄積を阻害することが知られるようになった。これらの知見と符合するように、二種類のマウスの肌での発癌反応も阻害された。このように、ベツリン酸による若干の抗腫瘍活性は報告されていたものの、本願発明が完成するまでは、ベツリン酸がヒトの黒色腫を選択的に制御もしくは治療する上で有用であることを示唆する報告もデータも出されていない。
発明の要旨
本発明は、腫瘍の成長を阻害するための方法と組成物に関する。活性化合物であるベツリン酸は、対象となるヒトの癌細胞系においてヒト黒色腫に対する選択的細胞毒性を媒介する抽出物をZiziphus mauritianaの幹の樹皮から調製し、モニターとして培養したヒト黒色腫細胞（MEL-2）を用いた生物学的活性に基づく生物学的定量式分別を行い、そしてそこから活性化合物としてのベツリン酸を取得する、工程を含む方法によって単離される。
よって、本発明の重要な態様によれば、腫瘍の成長を阻害するための、特に、天然物由来の化合物を用いた黒色腫の成長を阻害するための方法と組成物が得られる。
本発明の他の態様によれば、ベツリン酸が局所用製剤として適用することで、癌細胞の成長もしくは転移を防ぐための、ベツリン酸を用いた治療方法が得られる。
本発明の別の態様によれば、合成抗癌剤による哺乳類に及ぼされる高い毒性が、天然物由来の化合物、例えば、ベツリン酸を用いることで解消される。
本発明のさらに他の態様によれば、合成抗癌剤の入手困難性が、容易に入手できる天然物由来のベツリン酸を用いることで解消される。
本発明の趣旨あるいは範囲を意図的に減縮するものでなく、単に本発明の好ましい実施態様を例示するに過ぎない以下の開示からして、本発明の前出の態様および他の態様は明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、対照マウスおよび異なる用量のベツリン酸で処置したマウスでの未成熟MEL-2腫瘍に関する、腫瘍の平均体積［立方センチメーター（cm3）］と時間を座標軸としたグラフであり；
図２は、対照マウスおよびDTICあるいはベツリン酸で処置したマウスでの成熟MEL-2腫瘍に関する、腫瘍の平均体積（cm3）と時間を座標軸としたグラフであり；
図３（A）は、２μg/ml（マイクログラム／ミリリットル）のベツリン酸でのMEL-2細胞の処置に関する、DNA総量の％としての50Kbp（キロ塩基対）のバンドと時間を座標軸としたグラフであり；
図３（B）は、ベツリン酸の濃度（μg/ml）とDNA総量の％としての50Kbpのバンドと時間を座標軸としたグラフであり；および
図４および５は、対照マウスおよび異なる用量のベツリン酸で処置したマウスでの成熟および未成熟MEL-1腫瘍に関する、腫瘍の平均体積（cm3）と時間を座標軸としたグラフである。
発明の詳細な説明
表１に示したように、MEL-2細胞のin vitroでの成長は、ベツリン酸、すなわち、約２μg/mlのED50値にて阻害された。しかしながら、試験に用いた他の癌細胞では（ED50値が約20μg/mlを超えており）ベツリン酸による影響は無かった。ベツリン酸による細胞の種類による明確な特異性は、これまでに知られておらず、また予想すらされていなかった。
例えば、表１に例示したように、パクリタキセル、カンプトセシン、エリプティシン、ホモハリントニン、ミスラマイシンＡ、ポドピロトキシン、ヴィンブラスチンおよびヴィンクリスチンのような公知の抗腫瘍剤では、細胞種に関係なく、比較的強い、非選択性の細胞毒性が確認された。さらに、ベツリン酸によって介在される細胞毒性は、MEL-2黒色腫細胞系に対してのみ作用するものでない。MEL-1、MEL-3およびMEL-4と命名した他のヒトの黒色腫細胞系について行った用量−反応性試験では、それぞれ、1.1、3.3および4.8μg/mlのED50値が得られた。
以下の表１では、抽出したベツリン酸と他の精製化合物に関する、A431（扁平上皮細胞）、BC-1（胸部）、COL-2（大腸）、HT-1080（肉腫）、KB、LNCaP（前立腺）、LU-1（肺）、MEL-2（黒色腫）、U373（神経膠腫）およびZR-75-1（胸部）といった、培養したヒトの細胞系に対する細胞毒性について試験結果を表した。
0004052485.tif 000002
ベツリン酸は以下の構造式を有する。
0004052485.tif 000003
ベツリン酸は多種多様の植物において存在しており、また、前述したような生物学的活性を呈する化合物としてよく報告されていた。
ベツリン酸は、Ziziphus mauritianaの幹の樹皮（450g）を風乾および粉砕した試料を、80％の水性メタノールで抽出することによって取得することができる。そして、このメタノール抽出物を、ヘキサンと酢酸エチルを用いて、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物および水性抽出物に分別した。これら抽出物の中で、酢酸エチル抽出物（13.5g）は、培養した黒色腫細胞系（MEL-2）に対して細胞毒性を呈し、そのED50は3.7μg/mlであった。この酢酸エチル抽出物を、ヘキサン−酢酸エチル（4:1〜1:4）を溶出液とした、シリカゲルカラムを装着したカラムクロマトグラフィーに適用して、10個の画分を得た。第３と第４の画分を併用し、そして、薄層クロマトグフフィーで主要な単一スポット［Rf O.67；CHCl3:MeOH（クロロホルム：メタノール）］を示し、また、メタノールからの析出を繰り返すことで72mgの無色針状の生成物を生成する（乾燥した植物原料からの収率：0.016％ W/W）活性画分を得るべくさらに分別を行った。
表１にまとめたデータで確認したように、ベツリン酸は、培養したKB細胞に対して細胞毒性を呈さなかった。粗抽出物と精製化合物の細胞毒性は、いくつかの培養したヒトの癌細胞系において認められた。表１には、試験に用いた様々な種類の癌細胞が列挙されている。これら細胞を、適切な培地にて、標準的な培養条件に従って培養した。対数増殖を維持すべく、毒性分析を実施する24時間前に培地を交換した。分析当日に、トリプシン処理して細胞を回収し、細胞を計数し、培地を希釈し、そして、DMSOに溶解した試験化合物を分注した96−ウェルプレートに注いだ。この際のDMSOの最終濃度は、0.05％であった。
これらプレートを、３日間にわたってインキュベートした。インキュベートに続いて、細胞を固定して、スルホロダミンＢ（SRB）染料で染色した。結合した染料をTris塩基で遊離せしめ、そして、ELISA計測器でOD515を測定した。OD515値によってベツリン酸で処置した細胞の成長度を決定し、そして、その成長度を、DMSO-処置した対照の細胞でのOD515値と比較した。ED50値を求めるために、用量依存性についても調べを行った。
単離した活性化合物、（MEL-2に対するED50が2.0μg/mlである）ベツリン酸は、高分解性質量スペクトル分析によって決定されたC30H48O3の分子式と、292〜293℃の融点（分解点）を有する。ベツリン酸の文献で報告された融点は、290〜293℃である。公知のベツリン酸試料との混合による融点の低下は認められなかった。この化合物の旋光度は、＋7.3°（C=1.2；ピリジン）であった（文献値＋7.5°）。単離した化合物がベツリン酸であることは、文献で報告された公知のベツリン酸の物理的特徴およびスペクトルと、上記した物理的性質ならびに単離した化合物の1H-NMR、13C-NMRおよび質量スペクトルデータとを比較することで確認された。
悪性黒色腫に対する抗腫瘍剤としてのベツリン酸のin vivoでの機能を試験するために、ヒトの黒色腫細胞（MEL-2）が皮下注射された無胸腺（ヌード）マウスを用いて、一連の試験を行った。最初の試験では、未成熟の腫瘍に対するベツリン酸の活性について研究した。ベツリン酸による処置を１日目、すなわち、最初の24時間に行い、次いで、腫瘍細胞を注入した。50、250および500mg/体重kgの用量にて、ベツリン酸による腫瘍の成長阻害の効果が実証され、その際の対照に対する各用量でのp値は0.001であった（図１）。
図１に記載のグラフは、４週齢の無胸腺マウスの右脇腹に3.0×108個のUISO MEL-2細胞を皮下注射して得た試験結果に基づくものである。UISO MEL-2細胞は、ヒトの胸膜液での転移性黒色腫から得た細胞系である。腫瘍細胞を注射したその日から薬剤治療を開始し、４日おきに合計６回の用量投与を継続した。４匹の対照動物にはPVP対照溶液の0.5mlを腹膜（IP）内に投与し、一方で、処置動物（1グループ当たり４匹）には脱イオン水と混合した50、250もしくは500mg/kg/用量のベツリン酸/PVPを腹膜内に投与した。溶解性と生物学的利用性を高めるために、ベツリン酸をPVPで共沈した。マウスの体重を計量し、試験期間にわたって、一日おきにマイクロメーターで腫瘍の大きさを計測した。対照動物の腫瘍の平均体積が約1cm3の大きさとなった33日目に、すべての動物を屠殺して解剖を行った。
最高用量のベツリン酸において、最少用量のベツリン酸による腫瘍の成長阻害の効果より大きな阻害効果が認められた（ｐ＝0.04）。毒性は体重の減少や他の急性毒性の形態となって表れものであり、この観点からして、ベツリン酸処置と毒性との関連は認められなかった。体重の減少は認められなかった。
次に、成熟した黒色腫に対してベツリン酸によるin vivo試験を行った。この試験にあっては、13日目まで試験の実施を見合わせ、この時期に至るまでにすべてのマウスにおいて触診できる腫瘍の塊が形成されていた。図２に示したように、このような試験条件下でも、ベツリン酸は腫瘍の成長を阻止するに至った（ｐ＝0.0001）。さらに、腫瘍の成長は、処置を終えて14日が経過してもなお、対照（未処置）グループでの腫瘍の成長とは同調していなかった。
図２のグラフの試験結果は、４週齢の無胸腺マウスの右脇腹に5.0×108個のMEL-2細胞を皮下注射して得たものである。各々５匹のマウスを抱える４つの処置グループを準備した。あるグループでは、腫瘍細胞を注射したその日から、３日おきに合計６回、250mg/kg/用量のベツリン酸/PVPを腹膜内に投与した。対照グループには、0.5mlの生理食塩水を腹膜内に投与した。DTIC処置グループには、試験の13〜28日目に３日おきに、４mg/kg/用量のDTICを腹膜内に投与した。ベツリン酸処置グループでは、13〜27日目に３日おきに、250mg/kg/用量のベツリン酸/PVPを腹膜内に投与した。腫瘍の大きさを見計らって、36日目に、対照マウスとDTICで処置したマウスを屠殺して解剖を行った。他のマウスは、41日目に、屠殺して解剖した。
図２に示したように、ベツリン酸の効果を、転移性黒色腫の治療のために臨床的に利用されているDTICとも比較した。DTICの用量を、その毒性のために用量制限を受ける中で、ヒトへの投与量と同等になるように選択した。ベツリン酸処置したグループでの腫瘍の成長は、DTICで処置した動物のグループで認められた腫瘍の成長と比較して、非常に小さなものであった（ｐ＝0.0001）。対照と比較して、DTICによる腫瘍の成長抑制は認められたものの、やや大きい程度に過ぎず、その際のｐ値は0.01であった。この試験での第４のグループは、当初の研究予定に沿った方法で処置された。このような試験条件下で、先に実証したように、ベツリン酸は腫瘍の成長を著しく阻害し（ｐ＝0.0001）、また、治療終了後も３週間にわたって腫瘍の成長を持続的に抑制した。
図４と５には、ベツリン酸がMEL-1細胞に対して活性を呈することを示している。図４と５に記載のグラフは、４週齢の無胸腺マウスの右脇腹に5.0×108個のUISO MEL-1細胞を皮下注射して得た試験結果に基づくものである。腫瘍細胞を注射したその日から薬剤治療を開始し、４日おきに合計６回の用量投与を継続した。４匹の対照動物には0.5mlの生理食塩水を腹膜（IP）内に投与し、一方で、処置動物（１グループ当たり４匹）には脱イオン水と混合した５、50もしくは250mg/kg/用量のベツリン酸/PVPを腹膜内に投与した。マウスの体重を計量し、試験期間にわたって、３日おきにマイクロメーターで腫瘍の大きさを計測した。対照マウスの腫瘍の平均体積が約0.5cm3の大きさとなった41日目に、処置動物を屠殺して解剖を行った。対照マウスには、41日目から４日おきに50mg/kgの用量を６回投与し、そして、71日目にこれらマウスを屠殺して解剖を行った。
MEL-1細胞に関する図４と５に記載の結果は、図１と２に記載の結果と同様であった。よって、ベツリン酸は、MEL-1細胞とMEL-2細胞の双方に対して活性があると言える。
抗腫瘍剤の活性を媒介する機構は、理論的にも臨床的にも重要である。よって、黒色腫に特異的に作用するベツリン酸の作用機構が研究されている。ベツリン酸で処理した黒色腫細胞を観察したところ、細胞表面に無数の気泡が認められた。細胞膜の崩壊とは対照的に、この観察結果は、アポトーシスの誘発を示唆するものである。アポトーシスの最も一般的な分子的および細胞構造上のマーカーの一つは、ヌクレオソーム間DNAのエンドヌクレオチドのランダム分解による生成物に対応する「DNAラダー」の形成である。最近の研究によれば、DNAラダーの欠如を必要としないことはアポトーシスが進行していないことを意味するとの報告がなされているが、二本鎖DNAの切断による約50キロ塩基対（Kbp）の断片の生成が、多様な細胞系での様々な処置によるアポトーシスの誘発に深く相関していることが明らかになっている。よって、50Kbp断片の生成は、アポトーシスに関する信頼のおける一般的な指標である。この断片は、DNAラダーの生成プロセスの初期に生成し、この断片が生成することは、アポトーシスへの初期段階にあることを指し示すものである。
よって、本発明の重要な特徴は、ヒトの癌細胞系でのアポトーシスの誘発に関する生物マーカーとしての50Kbp断片の形成を、解析および定量する方法にある。この方法は、培地中で細胞を処置し、次いで、アガロースフィールド反転ゲル電気泳動を用いて細胞の全DNA含量を分析することを含む。このような条件下、50Kbp断片は、拡散したバンドとなって現れる。50Kbp断片によってもたらされた細胞の全DNAの画分は、このバンドの輪郭の濃淡によって決定される。
ベツリン酸によるアポトーシス誘発能力を検定するために、上述した方法にて、MEL-2細胞系を利用した。図3Aに示したように、50KbpのDNA断片の経時的形成が、MEL-2細胞とベツリン酸によって誘発された。56時間の処置期間経過後に、誘発が最大となった。この処置期間経過後に、内部分解によるものと思われる、50Kbp断片の相対量の減少が認められた。また、50Kbp断片の形成過程にて生じる前駆体と考えられる、約146Kbpと約194KbpのDNA断片がアガロースゲル上に出現した。さらに、ベツリン酸によって媒介されるアポトーシス誘発（50Kbp断片）は用量依存的であり（図3B）、アポトーシス反応で観察されるED50値（約1.5μg/ml）は、細胞毒性反応に関して先に決定したED50値に非常に近似していた（表１）。
図3Aに関して、（25cm2のフラスコ当たり106個の細胞を接種して）培養したMEL-2細胞を、２g/mlのベツリン酸（培地で１：100に希釈した200μg/ml DMSO）で、24、32、48、56および72時間にわたって処理した。この処置の後、細胞を採取し、遠心分離で回収し、そして、以後の分析のために液体窒素中にて急速凍結した。循環式水浴によって10℃に維持されたHoefer HE100 SuperSub装置に準備された１％アガロースゲルで、試料を分析した。0.25μg/mlの臭化エチジウムを含む0.5×TBE緩衝液を電極用緩衝液とし、これを電気泳動中に循環せしめた。各ゲルは、0.1〜200Kbp DNAサイズマーカーであるSigma Pulse Markerを20μl含んでいた。試料を置く前に、50μlの２％ SDSを各試料用のウェルに添加した。各試料保存用チューブを迅速に解凍し、そして、ペレット状の細胞の約50μlを即座にSDSを含むウェルに移した。次いで、SuperSub装置へのゲル用トレイの装着までにゲル化するLMPアガロースを溶解した状態で各ウェルに重層した。
パルス勾配を用いた二つの連続フィールド反転プログラムを利用して、172ボルトで、合計18時間にわたって電気泳動を行った。DNA/臭化エチジウム蛍光を紫外線照射で励起し、そして、ポラロイド55P/N型フィルムを用いて撮影した。PDI走査式濃度計とQuantity Oneソフトウェアを用いてネガを解析した。試料用ウェルを含んだ試料用レーンの全光学濃度の百分率（%）として、光学濃度（吸光度×mm2）を計測することによって、50Kbp断片の強度を決定した。内部分解によって生じる50Kbp断片の減少は、この手順の失敗を意味するものでない。
図3Bに関して、培養したMEL-2細胞を以下の濃度のベツリン酸で56時間処理した。０、0.1、1.0、2.0、4.0および8.0μg/ml。これら細胞を回収し、そして、図3Aについて記載したようにアポトーシスについて計測を行った。この実験を繰り返したところ、同様の用量依存的な曲線が得られた（データ示さず）。
これらデータは、因果関係を示唆するものであり、このことは、無胸腺マウスにおいて認められた抗腫瘍効果が、ベツリン酸が関与するアポトーシスに起因すると理論付けするものである。２および20μg/mlの濃度のベツリン酸で同様に処理したヒトのリンパ球を用いた経時的実験では、試験化合物の特異性と安全性を指し示す50Kbp断片の形成は実証されなかった（データ示さず）。
In vitroでの独特の細胞毒性、顕著なin vivo活性および作用機構を考慮すれば、ベツリン酸は、ヒトの黒色腫を治療する上でこの上なく理想的な化合物であるといえる。急激な毒性や体重の減少を招かずに、500mg/kgの用量のベツリン酸を再三投与できたことから、ベツリン酸は実質的に無毒でもある。200および400mg/kgの用量によるヒッポクラテースのスクリーニングにおいて、ベツリン酸が不活化することがすでに知見されている。
ベツリン酸の供給源が枯渇する心配はない。ベツリン酸は植物界の多くの種から入手可能な豊富なトリテルペンである。さらに重要なことに、ベツリン酸の類似体であるベツリンは、白樹皮のシラカンバ種の主要成分であり（最大収率：22％）、容易に酸化してベツリン酸になる。
ベツリン酸の他に、黒色腫を選択的に治療および阻害するための局所用製剤にベツリン酸誘導体を使用することができる。ベツリン酸誘導体としては、ベツリン酸のエステルに限定するものではないが、１〜16個の炭素原子を含むアルコールでエステル化したベツリン酸や、アンモニアあるいは１〜10個の炭素原子を含むアルキル基を有する１級もしくは２級アミンと反応したベツリン酸のようなベツリン酸のアミド類がある。
他のベツリン酸誘導体として、ベツリン酸の塩がある。ベツリン酸の塩としては、限定するものではないが、例示すれば、ナトリウムやカリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウムやマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム、あるいはアルキルアンモニウムカチオンが１〜３個のアルキル基を有し、また該アルキル基がそれぞれ１〜４個の炭素原子を有しているアルキルアンモニウム塩；あるいは、遷移金属塩がある。
他のベツリン酸誘導体も、本発明の組成物や方法に使用することができる。ベツリン酸あるいはベツリンに対応するアルデヒドも、誘導体の一つである。その他の誘導体として、ベツリン酸の水酸基の位置にアセチル基が付いたアセチル化ベツリン酸がある。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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