(57)【要約】（ａ）対象の加齢を治療する、抑制する、もしくは低減する、（ｂ）対象の加齢関連症状もしくは加齢関連疾患を治療する、抑制する、もしくは低減する、ならびに／または（ｃ）対象に１つ以上ケト酪酸化合物及びその組成物を投与することを含む、対象の寿命を延ばすための方法を本明細書にて開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制する化合物の治療に有効な量を対象に投与することを含む、加齢、対象の加齢関連症状及び／または加齢関連疾患を治療する、抑制する、または低減する方法。
【請求項２】
前記化合物がケト酪酸化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がα−ケト酪酸塩またはαケト酪酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療に有効な量が同じ観察可能な変化を生じるのに必要なα−ケトグルタン酸塩の量未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記治療に有効な量が同じ観察可能な変化を生じるのに必要なα−ケトグルタン酸塩の量の半分未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記治療に有効な量が同じ観察可能な変化を生じるのに必要なα−ケトグルタン酸塩の量の約１／１６である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記治療に有効な量が所定の期間にわたって数回の投与、例えば１週間以上１日量の投与として投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ケト酪酸化合物が１日当たり体重１ｋｇにつき１日量約０．０１〜１．０、好ましくは約０．０１〜０．５、より好ましくは約０．１〜０．２ｇとして投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０５〜約２ｇが少なくとも１週間毎日対象に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象のα−ケト酪酸塩濃度が約３０〜６０％、約４５〜５５％または約５０％だけ上昇することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記加齢関連症状が脱毛、毛髪が薄くなること、毛髪が白髪になること、可動性の喪失、スタミナの減退、疲労、感染症にかかりやすくなること、代謝変化、または生化学的変化である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記加齢関連疾患が、心臓肥大症、心不全、心筋梗塞、虚血再灌流障害、またはアルツハイマー病である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象の寿命が、未治療の対照群と比べて最大約１０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％だけ延びる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象の加齢を治療する、抑制する、もしくは低減する；
対象の加齢関連症状を治療する、抑制する、もしくは低減する；
対象の加齢関連疾患を治療する、抑制する、もしくは低減する；
対象の寿命を延ばす；または
対象の心臓肥大症及び／もしくは心筋梗塞を治療する、抑制する、もしくは低減するのに使用するケト酪酸化合物。
【請求項１５】
１つ以上のケト酪酸化合物の精製された量、及び、天然の１つ以上のケト酪酸化合物と関連していることが見いだせない薬学的に許容される担体または食品を含む組成物。
【請求項１６】
天然では見いだせない量の１つ以上のケト酪酸化合物及びα−ケトグルタル酸化合物を含む組成物。
【請求項１７】
天然のα−ケト酪酸化合物と関連していることが見いだせない薬学的に許容される担体または食品を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記対象が哺乳類、好ましくはヒトである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法、請求項１４に記載のケト酪酸化合物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連技術の相互参照）
本出願は、２０１４年６月３０日に出願された米国特許出願第６２／０１９，０５５号の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、加齢及び加齢関連症状及び疾患を治療する、抑制する、または低減することに関する。
【０００３】
代謝及び加齢は密接に関連している。無規則摂食と比較して、食事の制限（ＤＲ）またはカロリー制限（ＣＲ）は進化的に多種多様な生物の寿命を堅実に延長して、加齢関連疾患を遅延させる。栄養素の制限、及び栄養素もしくはエネルギー代謝の遺伝学的または薬学的混乱の同様の条件も、長命の利点を有する。大部分は未定義の分子的メカニズムを有する加齢を調整するいくつかの化合物が、確認されている。
【０００４】
しかし、加齢関連症状ならびに癌、糖尿病及び心臓血管疾患を含む加齢関連疾患の治療、ならびに対象の寿命を延ばすことの必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態で本発明は、対象にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制する化合物の治療に有効な量を投与することを含む、対象の加齢、加齢関連症状及び／もしくは加齢関連疾患を治療する、抑制する、または低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物はケト酪酸化合物である。いくつかの実施形態では、化合物はα−ケト酪酸塩またはα−ケト酪酸である。いくつかの実施形態では、治療に有効な量のケト酪酸化合物は、同じ観察可能な変化を生じるために必要なα−ケトグルタル酸塩の量未満である。Ｃｈｉｎら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５１０：３９７−４０１及びそれに関する拡張データ図を参照のこと。それはその全体が参照として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、治療に有効な量のケト酪酸化合物は、同じ観察可能な変化を生じるために必要なα−ケトグルタル酸塩の量の半分未満である。いくつかの実施形態では、治療に有効な量のケト酪酸化合物は、同じ観察可能な変化を生じるために必要なα−ケトグルタル酸塩の量の約１／１６である。いくつかの実施形態では、ケト酪酸化合物の治療に有効な量は、所定の期間にわたって数回の投与、例えば１週間以上１日量の投与として投与される。いくつかの実施形態では、ケト酪酸化合物は１日当たり体重１ｋｇにつき１日量約０．０１〜１．０、好ましくは約０．０１〜０．５、より好ましくは約０．１〜０．２ｇとして投与される。いくつかの実施形態では、対象の体重１ｋｇ当たり約０．０５〜約２ｇのケト酪酸化合物は少なくとも１週間毎日対象に投与される。いくつかの実施形態では、前記方法は、対象のα−ケト酪酸塩濃度が約３０〜６０％、約４５〜５５％または約５０％だけ上昇することを含む。いくつかの実施形態では、加齢関連性症状は、コレステロールの増加、動脈壁の硬化、血圧の増加、免疫老化、筋力の低下、骨喪失、関節炎、骨粗鬆症、物忘れ、聴力の低下、視力の低下、しわの増加、脱毛、毛髪が薄くなること、毛髪が白髪になること、ストレス抵抗性の低下、認知症、聴力の喪失、視力の喪失、可動性の喪失、筋力の喪失、スタミナの喪失、虚弱、疲労、感染症にかかりやすくなること、乾燥肌、しわのある皮膚、睡眠パターンの変化、２４時間周期サイクルの変化、代謝変化、生化学的変化などである。いくつかの実施形態では、加齢関連症状は脱毛、毛髪が薄くなること、毛髪が白髪になること、可動性の喪失、スタミナの減退、疲労、感染症にかかりやすくなること、代謝変化、または生化学的変化である。いくつかの実施形態では、加齢関連性疾患は、癌（例えば神経膠腫、白血病、リンパ腫、乳癌、前立腺癌、肺癌など）、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症など）、サルコペニア、骨減少症、骨粗鬆症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、高血圧、白内障、老眼、緑内障、２型糖尿病、メタボリック症候群、脱毛症、慢性炎症、免疫老化など、または心臓肥大、心筋症、心不全もしくは心臓血管疾患などの加齢関連症状である。いくつかの実施形態では、加齢関連疾患は心臓肥大症、心不全、心筋梗塞、虚血再灌流障害、またはアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、対象の寿命は未治療の対照群と比べて最大約１０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％だけ延びる。
【０００６】
いくつかの実施形態で本発明は、対象の加齢を治療する、抑制する、もしくは低減する；対象の加齢関連症状を治療する、抑制する、もしくは低減する；対象の加齢関連疾患を治療する、抑制する、もしくは低減する；対象の寿命を延ばす；または対象の心臓肥大症及び／もしくは心筋梗塞を治療する、抑制する、もしくは低減するのに使用するケト酪酸化合物を提供する。いくつかの実施形態では、ケト酪酸化合物はα−ケト酪酸塩またはα−ケト酪酸である。いくつかの実施形態では、加齢関連性症状は、コレステロールの増加、動脈壁の硬化、血圧の増加、免疫老化、筋力の低下、骨喪失、関節炎、骨粗鬆症、物忘れ、聴力の低下、視力の低下、しわの増加、脱毛、毛髪が薄くなること、毛髪が白髪になること、ストレス抵抗性の低下、認知症、聴力の喪失、視力の喪失、可動性の喪失、筋力の喪失、スタミナの喪失、虚弱、疲労、感染症にかかりやすくなること、乾燥肌、しわのある皮膚、睡眠パターンの変化、２４時間周期サイクルの変化、代謝変化、生化学的変化などである。いくつかの実施形態では、加齢関連症状は脱毛、毛髪が薄くなること、毛髪が白髪になること、可動性の喪失、スタミナの減退、疲労、感染症にかかりやすくなること、代謝変化、または生化学的変化である。いくつかの実施形態では、加齢関連性疾患は、癌（例えば神経膠腫、白血病、リンパ腫、乳癌、前立腺癌、肺癌など）、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症など）、サルコペニア、骨減少症、骨粗鬆症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、高血圧、白内障、老眼、緑内障、２型糖尿病、メタボリック症候群、脱毛症、慢性炎症、免疫老化など、または心臓肥大、心筋症、心不全もしくは心臓血管疾患などの加齢関連症状である。いくつかの実施形態では、加齢関連疾患は心臓肥大症、心不全、心筋梗塞、虚血再灌流障害、またはアルツハイマー病である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のケト酪酸化合物の精製された及び／または濃縮された量、ならびに薬学的に許容される担体または食品を提供する。いくつかの実施形態では、組成物の精製または濃縮のレベルは当然天然で見いだされるものでない。いくつかの実施形態では、担体または食品は天然の１つ以上のケト酪酸化合物と関連していることが見いだせない。例えばいくつかの実施形態では、本発明は、それに添加した１つ以上のケト酪酸化合物を有する、牛乳またはオレンジジュースなどの食品を提供する。いくつかの実施形態で組成物は、α−ケトグルタル酸塩（α−ケトグルタル酸塩）、α−ケトグルタル酸塩の誘導体（例えばＭａｃＫｅｎｚｉｅら（２００７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７（９）：３２８２−３２８９に記載されているα−ケトグルタル酸塩の誘導体）、α−ケトグルタル酸塩の類似体（例えばホスホン酸塩の類似体（例えばＢｕｎｉｋら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４（３１）：１０５５２−６１に記載されているもの））、α−ケトグルタル酸塩のエステル（例えばジメチルα−ケトグルタル酸塩及びオクチルα−ケトグルタル酸塩）、及び多様な種の特定の類似体、例えばヒトα−ケトグルタル酸塩、ブタα−ケトグルタル酸塩、マウスα−ケトグルタル酸塩、ウシα−ケトグルタル酸塩などの少なくとも１つのケトグルタル酸化合物を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のケト酪酸化合物及びケトグルタル酸化合物の量は天然では見られない量で存在する。
【０００８】
いくつかの実施形態で本発明は、対象の加齢、加齢関連性症状及び／もしくは加齢関連性疾患を治療する、抑制する、もしくは低減する、または対象の寿命を延ばすための薬剤ならびに薬剤を作製する方法を提供し、前記薬剤は治療に有効な量のケト酪酸化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物はα−ケト酪酸塩またはα−ケト酪酸である。
【０００９】
いくつかの実施形態で本発明は、対象の加齢関連症状及び／もしくは加齢関連疾患を治療する、抑制する、もしくは低減する、または対象の寿命を延ばすための薬剤の製造において１つ以上のケト酪酸化合物の使用を提供する。いくつかの実施形態で薬剤は、治療に有効な量のケト酪酸化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物はα−ケト酪酸塩またはα−ケト酪酸である。
【００１０】
上述の一般的な説明と以下に述べる詳細な説明の両方は例示であって、例示だけを目的としており、特許請求されている本発明の範囲の限定を意図するものではない。添付図面は本発明の更なる理解を提供するために含まれ、かつ組み入れられ、本明細書の一部を構成し、本発明の実施形態を図示し、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明は、図面を参照して更に理解される。
【００１２】
【図１】α−ＫＢが未治療の対照群の平均寿命と比較して対象の寿命を延ばすことを示す。
【図２】ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉ）に起因する結合アッセイ（リンゴ酸塩及びピルビン酸塩を補充）の結果を示す。グラフのＡＤＰとオリゴの位置の間及びグラフのＦＣＣＰとＡＡの位置の間の、上部から下部までのデータポイントは、ＤＭＳＯ、５０μＭのα−ＫＢ、１００μＭのα−ＫＢ及び２００μＭのα−ＫＢである。
【図３Ａ】複合体ＩＩのα−ＫＢに起因する結合アッセイ（コハク酸塩及びロテノンを補充）の結果を示す。グラフのＡＤＰとオリゴの位置の間の上部データポイントはＤＭＳＯであり、下部データポイントは０．５ｍＭのα−ＫＢである。
【図３Ｂ】複合体ＩＩのオクチルα−ＫＢ（オクチルα−ケトグルタル酸塩）及び３−ＨＢに起因する結合アッセイ（コハク酸塩及びロテノンを補充）の結果を示す。グラフのＡＤＰとオリゴの位置の間の下部データポイントは、０．６ｍＭオクチルα−ＫＧであり、上部データポイントはＤＭＳＯ及び０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭの３−ＨＢである。
【図４Ａ】電子流アッセイのα−ＫＢの結果を示す。グラフのＲｏｔｅの位置の前の上部データポイントはビヒクルであり、中間データポイントは１００μＭのα−ＫＢであり、最下部データポイントは５００μＭのα−ＫＢ及び２５０μＭのα−ＫＢである。グラフのＳｕｃｃとＡＡ位置の間の上部データポイントはビヒクルであり、最下部データポイントは２５０μＭのα−ＫＢである。
【図４Ｂ】ビヒクル及び電子流アッセイの１０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭ３−ＨＢの結果を示す。
【図５Ａ】基礎呼吸のα−ＫＢの効果を示す。
【図５Ｂ】基礎呼吸の３−ＨＢの効果を示す。
【図６Ａ】最大呼吸のα−ＫＢの効果を示す（ＦＣＣＰ処理のミトコンドリア呼吸）。
【図６Ｂ】最大呼吸の３−ＨＢの効果を示す（ＦＣＣＰ処理のミトコンドリア呼吸）。
【図７】α−ＫＢが用量依存的に細胞ＲＯＳを増加させることを示す。
【図８】パネルＡ〜Ｃはα−ＫＢで治療された加齢マウスの加齢関連症状の不存在を示す。パネルＡは、α−ＫＢで処理した加齢マウスが無処理対照マウスと比較して毛髪の密度（または脱毛の減少）を改善したことを示す。パネルＢは、α−ＫＢで処理したマウスが白内障にかかっておらず、無処理対照マウスと比較して白髪になった毛髪の減少を示す。パネルＣは、α−ＫＢで処理したマウスが無処理対照と比較して健康な肝臓（色、サイズ、脂肪含有量）を有することを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃはα−ＫＢの虚血後投与が心筋梗塞サイズを低減することを示す。＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝グループ当たり約５〜６つのマウス。  図９Ａは実験の概要を示す。雄マウスのＬＡＤを３０分間閉塞して、その後２４時間の再灌流が続く。再灌流の開始時にα−ＫＢまたはＰＢＳの１回投与分が尾静脈を介して投与された。
【図９Ｂ】虚血域（ＡＡＲ）／ＬＶのパーセンテージを示す。
【図９Ｃ】梗塞サイズ（ＩＳ）／ＡＡＲを示す。
【図１０】図１０左は２−ＫＢの虚血後投与が虚血後に心機能を回復することを示す。単離された心臓は３０分の虚血に実施されて、その後、対照緩衝液、２−ＫＢ、（Ｒ）−２−ヒドロキシ酪酸塩、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩（別名ケトン体）、α−ＫＧ、及び複合体Ｉ抑制剤ロテノンによる再灌流が６０分間続いた。ＬＶＤＰは時間の関数として示される。  図１０右は再灌流前に示された化合物による処理に起因する梗塞サイズを示す。画像は、より良好な再現性のため逆の色画像である。
【図１１】α−ＫＢが、ビヒクル処置した線虫と比較して線虫の麻痺を遅らせたことを示す。
【図１２Ａ】α−ＫＢが、用量依存的にＨＣＶ感染を抑制する、または減退させることを示す。Ｂｕｔｌｅｒ、α−ＫＢ。
【図１２Ｂ】α−ＫＢによるＨＣＶ感染の抑制が細胞毒性の結果ではないことを示す。Ｂｕｔｌｅｒ、α−ＫＢ。
【図１３】α−ＫＢがピルビン酸デヒドロゲナーゼを抑制し、及びそれによりＥＴＣ複合体Ｉ活性を減退させることを示す。グラフで、ビヒクルの後の第１のバーは５０μＭ、２００μＭ及び８００μＭである。
【図１４】α−ＫＢが直接、ＥＴＣ複合体Ｉジアホラーゼ（ＮＡＤＨ：アクセプタ酸化還元酵素）を抑制することを示す。グラフで、ビヒクルの後の第１のバーは２００μｍ、及び第２のバーは８００μｍである。
【図１５Ａ】α−ＫＢが長寿命のｎｕｏ−６（ｑｍ２００）変異体線虫株の寿命を更に延ばさないことを示す。
【図１５Ｂ】α−ＫＢがより長寿命のｄａｆ−２（ｅ１３７０）変異体線虫株の寿命を延ばすことを示す。
【図１５Ｃ】α−ＫＢが長寿命ｅａｔ−２（ａｄ１１１６）変異体線虫株の寿命を延ばすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
いくつかの小分子は、加齢の線虫の長命を促進して、加齢及び加齢関連疾患に対処する化合物を識別するために、モデル生物を使用してスクリーニングされた。本明細書にて開示するように、１つの分子、α−ケト酪酸塩（α−ＫＢ）は、α−ケトグルタル酸塩（α−ＫＧ）と比較して著しく少ない量で、線虫の平均寿命を予想外に延ばした。
【００１４】
α−ＫＢは、アミノ酸異化及びスクシニルＣｏＡ合成に含有されるケト酸である。単離されたミトコンドリア結合及び電子流アッセイを用いて、α−ＫＢは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（電子輸送連鎖の複合体Ｉ）を抑制することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ異なる分子標的を係合する。α−ＫＧとは異なり、α−ＫＢはＡＴＰシンターゼまたはＴＯＲ（ラパマイシンの標的）を抑制しない。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子変異（例えばノックダウン）及び薬理学的混乱が線虫の寿命を延ばすことも見いだされた。そのうえα−ＫＢは細胞呼吸を抑制して、活性酸素種（ＲＯＳ）を誘発することが見いだされた。
【００１５】
したがって、いくつかの実施形態で本発明は、対象に少なくとも１つのケト酪酸化合物を投与することを含む、対象の加齢関連症状及び／または加齢関連疾患を治療する、抑制する、または低減する方法を目的とする。いくつかの実施形態で本発明は、対象に少なくとも１つのケト酪酸化合物を投与することを含む、対象の寿命を延ばす方法を目的とする。いくつかの実施形態で本発明は、対象の加齢関連症状及び／または加齢関連疾患を治療する、抑制する、または低減するための組成物を目的としており、前記組成物は少なくとも１つのケト酪酸化合物を含む。いくつかの実施形態で本発明は、対象の寿命を延ばすための組成物を目的としており、前記組成物は少なくとも１つのケト酪酸化合物を含む。いくつかの実施形態で対象は動物であり、それは加齢、加齢関連症状及び／または加齢関連疾患の動物モデルであっても、またはそうでなくてもよい。いくつかの実施形態で対象は、線虫、げっ歯動物または非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態で対象は、ヒトである。
【００１６】
本明細書で使用する場合「加齢関連症状」とは、加齢から生じる生物学的及び／または身体的症状を意味しており、コレステロールの増加、動脈壁の硬化、血圧の増加、免疫老化、筋力の低下、骨喪失、関節炎、骨粗鬆症、物忘れ、聴力の低下、視力の低下、しわの増加、脱毛、毛髪が薄くなること、毛髪が白髪になること、ストレス抵抗性の低下、認知症、聴力の喪失、視力の喪失、可動性の喪失、筋力の喪失、スタミナの喪失、虚弱、疲労、感染症にかかりやすくなること、乾燥肌、しわのある皮膚、睡眠パターンの変化、２４時間周期サイクルの変化、代謝変化、生化学的変化などを含む。代謝及び／または生化学的変化は、当該技術分野において既知の種々のバイオマーカにより明示され得る。いくつかの実施形態で加齢関連症状は、高齢の未治療の対照群を示すバイオマーカの増加を指す。いくつかの実施形態で加齢関連症状は、老齢の未治療の対照群を示すバイオマーカの増加を指す。いくつかの実施形態で加齢関連症状は、高齢の未治療の対照群を示すバイオマーカのプロファイルを指す。いくつかの実施形態で加齢関連症状は、老齢の未治療の対照群を示すバイオマーカのプロファイルを指す。高齢の及び／または老齢の対象である対象を示すバイオマーカならびにバイオマーカプロファイルは心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及び、米国特許第２００８０１２４７５２号に記述されているものを含み、それはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書で使用する場合「高齢」の対象とは、未治療の対照群が身体的、精神的及び／または生物学的に劣化しはじめているときの年齢期の対象を指す。いくつかの実施形態で高齢の対象は、実際の年齢が未治療の対照群の平均寿命の少なくとも中央にあるものである。
【００１８】
本明細書で使用する場合「老齢」の対象は、実際の年齢が未治療の対照群の平均寿命の少なくとも２／３にあるものである。例えば、実験室マウスの所定の株の平均期待寿命が２年である場合、その株の老齢マウスは少なくとも１６か月であり、実験室マウスの別の株の平均気体寿命が３年である場合、その株の老齢マウスは２４か月である。ヒトについて、ヒトの平均期待寿命が約８０年である場合、老齢のヒトは約５３歳である。高齢の対象は老齢の対象であっても、またはそうでなくともよいことに留意するべきである。
【００１９】
本明細書で使用する場合「加齢関連疾患」とは多くの場合加齢に不随する疾患及び障害を意味し、癌（例えば神経膠腫、白血病、リンパ腫、乳癌、前立腺癌、肺癌など）、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症など）、サルコペニア、骨減少症、骨粗鬆症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、高血圧、白内障、老眼、緑内障、２型糖尿病、メタボリック症候群、脱毛症、慢性炎症、免疫老化などを含む。本明細書で使用する場合「加齢関連心臓病」とは、心臓肥大、心筋症、心不全及び心血管疾患を意味する。
【００２０】
いくつかの実施形態で対象の「加齢」を治療する、抑制する、または低減する本発明の方法及び組成物は、未治療の対照群と比較して、加齢関連症状を治療する、抑制する、または低減するものである。いくつかの実施形態で対象の「加齢」を治療する、抑制する、または低減する本発明の方法及び組成物は、未治療の対照群と比較して及び／または治療前の対象のベースラインと比較して、対象の加齢関連疾患の臨床症状の臨床効果をもたらすものである。いくつかの実施形態で対象の「加齢」を治療する、抑制する、または低減する方法及び組成物は、治療した対象より実年齢が若い未治療の対照群に特有の生物学的年齢及び／または代謝年齢を有する対象をもたらすものである。いくつかの実施形態では対象の「加齢」を治療する、抑制する、または低減する方法及び組成物は、治療前の対象の生物学的年齢及び／または代謝年齢と比較して、対象の生物学的年齢及び／または代謝年齢の減少をもたらすものである。対象の生物学的年齢及び／または代謝年齢を測定して、その実年齢と比較する方法は、当技術分野において既知である。例えば米国特許第７，２７３，４５３号及び米国特許第２００８０１２４７５２号を参照し、これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態で対象の「寿命」を延ばす方法及び組成物は、未治療の対照群の平均寿命を超える寿命を有する対象をもたらすものである。
【００２１】
本明細書において「ケト酪酸化合物」とは、α−ケト酪酸塩、α−ケト酪酸、及び以下の構造式Ｉを有する化合物であって、
【化１】
2017520553.tif 000002
（Ｉ）
式中、
Ｒａは、負電荷、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルケニル、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルケニルであり、
Ｒｂは、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルケニル、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルケニルであり、
Ｒｃは所望により存在し、存在する場合、Ｒｃは、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルケニル、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルケニルであり、存在しない場合、Ｚは二重結合である、化合物、
ならびに、その薬学的に許容される溶媒和物、塩、プロドラッグ及び代謝物質である。
【００２２】
いくつかの実施形態でＲａは、負電荷、Ｈまたは−ＣＨ３である。いくつかの実施形態でＲｂは、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｚは二重結合である。いくつかの実施形態では、Ｒａは負電荷、Ｈまたは−ＣＨ３であり、ＲｂはＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルケニル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ５アルケニル、または直鎖もしくは分枝鎖１−Ｃ１０アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒａは負電荷、Ｈまたは−ＣＨ３であり、ＲｂはＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒａは負電荷、Ｈまたは−ＣＨ３であり、ＲｂはＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＣＨ２＝ＣＨ３、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルケニルであり、及びＺは二重結合である。
【００２３】
本明細書で使用する場合「Ｃ１−Ｃｎアルキル」とは１−ｎつの炭素原子を有するアルキルを意味し、「ｎ」は正の整数である。同様に「Ｃ１−Ｃｎアルケニル」とは１−ｎつの炭素原子を有するアルケニルを意味し、「ｎ」は正の整数である。式Ｉに記載されるアルキル及びアルケニルは、１つ以上の好適な官能基で置換または未置換でもよく、該官能基は活性ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制する、または低減するために化合物の能力を増加させる、または減少させるがその能力を完全には阻害しない。
【００２４】
本明細書で使用する場合、省略形「ＫＢ」は用語「ケト酪酸塩」を意味するために用いることができ、例えばα−ケト酸塩はα−ＫＢとして略記される。ケト酪酸化合物は、種々の種の特定の類似体も含む。例えば、特定の種であるとして明確に指定されない限り、「α−ＫＢ」はヒトα−ケト酪酸塩、ブタα−ケト酪酸塩、マウスα−ケト酪酸塩、ウシα−ケト酪酸塩などを含む。
【００２５】
「薬学的に許容される溶媒和物」とは、前記化合物の生物学的効果を保持する特定の化合物の溶媒和物形態を意味する。溶媒和物の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸、エタノールアミンまたはアセトンと組み合わせた本発明の化合物を含む。多くの有機化合物はそれらが反応する、またはそれらが沈殿するもしくは結晶化する溶媒と複合体を形成できることを有機化学の当業者は理解するであろう。これらの複合体は「溶媒和物」として公知である。例えば水との複合体は「水和物」として公知である。式Ｉの化合物の溶媒和物は本発明の範囲内である。有機化学の当業者は、多くの有機化合物が１つ以上の結晶形に存在できることも理解するであろう。例えば結晶形は、溶媒和物から溶媒和物へ変化できる。したがって式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される溶媒和物のすべての結晶形は、本発明の範囲内である。
【００２６】
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物で治療される対象にとって、薬学的に許容されかつ実質的に無毒である塩形態を意味する。薬学的に許容される塩は、好適な非毒性の有機もしくは無機酸もしくは無機塩基から形成される、従来の酸付加塩または塩基付加塩を含む。例示の酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸など無機酸に由来するもの、ならびに、ｐ−トルエンスルホン酸、メタン硫酸酸、エタン−ジスルホン酸、イセチオン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、酢酸、フェニル酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸酸、グルタミン酸、サリチル酸、スルファニル酸及びフマル酸などの有機酸に由来するものを含む。例示の塩基付加塩は、水酸化アンモニウム（例えば、水酸化四メチルアンモニウムなどの水酸化四級アンモニウム）に由来するもの、アルカリまたはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムもしくはマグネシウム）水酸化物など無機塩基に由来するもの、及び塩基性アミノ酸など非毒性の有機塩基に由来するものを含む。
【００２７】
「薬学的に許容されるプロドラッグ」とは、生理的条件下で、または、特定の化合物への、またはかかる化合物の薬学的に許容される塩への加溶媒分解によって変化し得る化合物である。「薬学的に活性な代謝物」とは、特定の化合物またはその塩の体内の代謝によって生じる薬学的に活性な生成物を意味する。化合物のプロドラッグ及び活性代謝物は、当該技術分野で公知の日常的な技術を用いて確認可能である。例えばＢｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｇら（１９９７）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２０１１−２０１６；Ｓｈａｎ．Ｄら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（７）：７６５−７６７；Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．（１９９５）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．３４：２２０−２３０；Ｂｏｄｏｒ，Ｎ．（１９８４）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１３：２２４−３３１；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５）；及びＬａｒｓｅｎ，Ｉ．Ｋ．、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎら編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９１）を参照のこと。
【００２８】
いくつかの実施形態では、対象に投与されるケト酪酸化合物の量は、治療有効量である。「治療有効量」とは、対象に投与されるとき、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を治療する、もしくは抑制する、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害の１つ以上の症状を減弱する、改善する、もしくは除去する、及び／または（ｉｉｉ）対照と比較して、特定の疾患、状態もしくは障害の１つ以上の症状の発症を抑制する、もしくは遅延させる、本発明の１つ以上の化合物の量を指す。本発明の１つ以上の化合物の治療有効量は、所定の化合物（複数可）、医薬製剤、投与経路、疾患または障害の種類、疾患または障害の程度、及び治療される対象の個性などの要因に応じて変化するが、それにもかかわらず当業者で直ちに決定され得る。例えばいくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物の「治療有効量」は、対象の加齢を治療する、抑制する、または減退する量である。いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物の「治療有効量」は、対象の１つ以上の加齢関連症状を治療する、抑制する、または減退する量である。いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物の「治療有効量」は、対象の１つ以上の加齢関連疾患を治療する、抑制する、または減退する量である。いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物の「治療有効量」は、対象の寿命を延ばす量である。
【００２９】
いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物の治療有効量は、対象の体重１ｋｇ当たり１日につき約０．０１〜２ｇ、約０．２５〜２ｇ、約０．５〜２ｇ、約１〜２ｇまたは約２ｇの１日量として投与される。本明細書にて開示するようにα−ＫＢは、加齢及び加齢関連症状を治療する、抑制する、または減退する際に、α−ＫＧより約１倍強力である。したがって、いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物の治療有効量は、対象の体重１ｋｇ当たり１日につき約０．０１〜１ｇ、約０．２５〜１ｇ、約０．５〜１ｇ、または約１ｇの１日量として投与される。いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物は、対象の体重１ｋｇ当たり１日につき約０．０１〜１．０ｇ、約０．０１〜０．５ｇ、または約０．１〜０．２ｇの１日量として投与される。疾患または障害の重篤性、以前の治療、対象の健康状態及び／または年齢、ならびに他の疾患の存在を含む、特定の要因が対象を効果的に治療するのに必要な投与量に影響し得ることを当業者は理解するであろうが、これらに限定されない。いくつかの実施形態で対象に投与される１つ以上のケト酪酸化合物の量は、対象のα−ＫＢ濃度を約１０〜５０％、約２０〜５０％、約３０〜５０％または約４０〜５０％増加させる結果になるものである。いくつかの実施形態で対象に投与される１つ以上のケト酪酸化合物の量は、対象のα−ＫＢ濃度を約２５％増加させる結果になるものである。いくつかの実施形態で対象に投与される１つ以上のケト酪酸化合物の量は、対象のα−ＫＢ濃度を約５０％増加させる結果になるものである。
【００３０】
治療有効量は、単回投与として、またはある期間にわたる複数回投与として投与され得る。例えば対象は、少なくとも１回、１つ以上のケト酪酸化合物で治療され得る。しかし対象は、１週間につき約１回から所定の治療期間の間の毎日約１回まで１つ以上のケト酪酸化合物で治療され得る。治療期間の長さは、疾患もしくは障害の重篤性、本発明の１つ以上の化合物の濃度及び活性、またはこれらの組み合わせなど様々な要因に依存する。治療に使用される１つ以上の化合物の有効な投与量は特定の治療中に増減できることも理解されるだろう。
【００３１】
対象に投与される１つ以上のケト酪酸化合物は、医薬製剤として提供されてもよい。医薬製剤は、所望の投与方法に適した単位投与剤形で調製されることができる。本発明の医薬製剤は、経口、直腸、鼻、局所（口腔内及び舌下を含む）、膣ならびに非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）を含む、任意の好適な経路で投与されることができる。投与経路は、レシピエントの状態及び年齢、治療される状態の性質、ならびに本発明の所定の化合物（複数可）によって異なり得ることは理解されるであろう。いくつかの実施形態で投与経路は経口である。いくつかの実施形態で１つ以上のケト酪酸化合物は食品の形で提供される。
【００３２】
医薬製剤で使用するケト酪酸化合物の実際の投与量は、使用される特定の化合物（複数可）、配合される特定の組成物、投与方法、ならびに治療される特定の部位、対象及び疾患によって変化することは理解されるであろう。条件の所定のセットの最適投与量は、所定の化合物の実験データに対する投与量の決定試験を使用する当業者によって確認され得る。プロドラッグの投与は、十分に活性な形態の重量濃度に化学的に等しい重量濃度で投与され得る。
【００３３】
本発明の医薬製剤は、本発明の１つ以上の化合物の治療有効量、及び不活性な薬学的に許容される担体または希釈剤を有する。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、薬剤の投与と適合する、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤などを包含することを目的としている。使用される薬剤担体は、固体または液体であり得る。例示の固体担体は、ラクトース、スクロース、タルク、ゼラチン、アガー、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。例示の液体担体は、シロップ、落花生油、オリーブ油、水などである。同様に担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリルなどの当該技術分野において既知の時間遅延もしくは時間放出物質を単独で、またはワックス、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸メチルなどと共に包含してもよい。薬学的活性物質に対するかかる媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において既知である。
【００３４】
ケト酪酸化合物の毒性及び治療有効性は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％にとって致死量）及びＥＤ５０（母集団の５０％で治療上有効な量）を測定するために、細胞培養または実験動物の標準薬学的手順で測定されることができる。毒性と治療有効の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよい一方で、感染してない細胞への潜在的な損傷を最小化して、それにより副作用を減らすために、かかる化合物を罹患した組織の部位に標的として設定するデリバリーシステムを設計するために注意する必要がある。
【００３５】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒト用の投与量の範囲を組み立てるのに使用可能である。かかる化合物の投与量は好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性のないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用する任意の化合物について、治療有効量は細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。投与量は動物モデルで配合されて、細胞培養で測定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血しょう濃度範囲を得ることができる。かかる情報は、ヒトに有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血しょうの濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定されることができる。
【００３６】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、本発明を限定するためのものではない。
実施例
【００３７】
α−ＫＢは成体線虫の平均及び最大寿命の両方を延ばす。
【００３８】
α−ＫＢが寿命を延長することを示すために、以下の実験を実行した。時限産卵または卵調製（７０μｌ  Ｍ９緩衝液、２５μｌ漂白剤及び５μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ中に産卵期の虫＜１００を混合）を実行することによって、線虫を同期化した。一旦線虫が成虫期に達すると、１．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｄ８４１８）、４９．５μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ、Ｓｉｇｍａ  Ｆ０５０３）、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、及びα−ＫＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｋ４０１）を含むＮＧＭ処理プレート上に、それらを取った。α−ＫＢを含有するプレートを、ＮａＯＨの添加によりｐＨ６．０（すなわち対照プレートと同じｐＨ）に調整した。処理プレートに線虫の食物源としてＯＰ５０大腸菌を播種した。線虫の生存を評価するために、動物は白金ワイヤで２〜３日毎で刺されて、反応しないものは死亡と記録された。線虫は新しいプレートへ４日毎に移動した。すべての寿命実験を２０℃で実施した。
【００３９】
図１は、α−ＫＢが未治療の対照群の平均寿命と比較して対象の寿命を延ばすことを示す。
【００４０】
α−ＫＢは特にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制する。
【００４１】
α−ＫＢがＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制することを示すために、以下の実験を実行した。動物実験は、承認されたＵＣＬＡ動物実験プロトコル下で実施した。月齢３か月のＣ５７ＢＬ／６マウスからのミトコンドリアを単離した。簡単に説明すると、肝臓を抽出して、ＭＳＨＥ＋ＢＳＡ（７０ｍＭのスクロース、２１０ｍＭのマンニトール、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び０．５％の脂肪酸を含まないＢＳＡ、ｐＨ７．２）中で４℃で刻み、血液を除去するために数回すすいだ。すべての次の工程は、氷上で、または４℃で実施された。組織をＭＳＨＥ＋ＢＳＡの１０倍量でガラスＤｏｕｎｃｅホモジナイザ（５〜６ストローク）を用いて破壊し、ホモジネートを１０分間８００×ｇで遠心分離されて組織片及び核を除去した。上澄みを細胞濾過器を通してデカントして、１０分間８，０００×ｇで遠心分離した。濃いミトコンドリアペレットをＭＳＨＥ＋ＢＳＡに再懸濁し、１０分間８，０００×ｇで再度遠心分離した。最終的なミトコンドリアペレットをＭＡＳ緩衝液３０μｌ（７０ｍＭのスクロース、２２０ｍＭのマンニトール、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び０．２％の脂肪酸のないＢＳＡ，ｐＨ７．２）に再懸濁した。単離されたミトコンドリア呼吸は、記載されているように結合及び電子流アッセイを実施することにより測定された。
【００４２】
結合アッセイにおいて、完全なＭＡＳ緩衝液（１０ｍＭのコハク酸塩及び２μＭのロテノンを補充した、または１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び２ｍＭのリンゴ酸塩を補充したＭＡＳ緩衝液）中の１７μｇのミトコンドリアを、４℃で２０分間の２，０００ｇで遠心分離することによりＸＦ２４Ｓｅａｈｏｒｓｅプレート内に播種した。アッセイ直前にミトコンドリアに完全ＭＡＳ緩衝液を補充して合計５００μｌ（１％ＤＭＳＯまたはα−ＫＢを有する）にし、ＯＣＲ測定を始める前に３０分間３７℃で暖めた。ミトコンドリア呼吸は共役状態２に開始し、状態３は２ｍＭのＡＤＰにより開始されて、状態４ｏ（オリゴマイシン非感受性、すなわち複合体Ｖ非依存性）は２．５μＭオリゴマイシンにより誘発されて、状態３ｕ（ＦＣＣＰ脱共役した最大呼吸容量）は４μＭのＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、ａｂ１２００８１、Ａｂｃａｍ）による。最後に１．５μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡをアッセイの最後に注入した。
【００４３】
電子流アッセイにおいて、ＭＡＳ緩衝液に１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（複合体Ｉ基質）、２ｍＭのリンゴ酸塩（複合体ＩＩ抑制物質）及び４μＭのＦＣＣＰを補充して、及びミトコンドリアを結合アッセイのために記載されている同一方法で播種した。基礎読み取り後、経時的な注入は以下の２μＭのロテノン（複合体Ｉ抑制物質）、１０ｍＭのコハク酸塩（複合体ＩＩ基質）、４μＭのアンチマイシンＡ（複合体ＩＩＩ抑制物質）及び１０ｍＭ／１００μＭのアスコルビン酸塩／テトラメチルフェニレンジアミン（複合体ＩＶ基質）であった。
【００４４】
結果は、呼吸がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ基質（ピルビン酸塩及びリンゴ酸塩）によって引き起こされるとき、α−ＫＢのみが状態３及び状態３ｕの呼吸を抑制することを示す。一貫して、α−ＫＢのみが電子流アッセイのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を抑制する。
【００４５】
ミトコンドリア呼吸でのα−ＫＢの効果の実験に対して、結合及び電子流アッセイは単離されたミトコンドリアを使用して実施された。ミトコンドリアは、上述のとおりマウス肝臓から単離された。最終的なミトコンドリアペレットをＭＡＳ緩衝液３０μｌ（７０ｍＭのスクロース、２２０ｍＭのマンニトール、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び０．２％の脂肪酸のないＢＳＡ，ｐＨ７．２）に再懸濁した。
【００４６】
ミトコンドリア呼吸は、結合及び電子流アッセイを実施することにより測定された。結合アッセイにおいて、完全なＭＡＳ緩衝液（１０ｍＭのコハク酸塩及び２μＭのロテノン、または１０ｍＭのピルビン酸塩及び２ｍＭのリンゴ酸塩を補充したＭＡＳ緩衝液）中の２０μｇのミトコンドリアを、４℃で２０分間の２，０００ｇで遠心分離することによりＸＦ２４Ｓｅａｈｏｒｓｅプレート内に播種した。アッセイ直前にミトコンドリアに完全ＭＡＳ緩衝液を補充して合計５００μｌ（１％ＤＭＳＯまたはα−ＫＢを有する）にし、ＯＣＲ測定を始める前に３０分間３７℃で暖めた。ミトコンドリア呼吸は共役状態２に開始し、状態３は２ｍＭのＡＤＰにより開始されて、状態４（オリゴマイシン非感受性、すなわち複合体Ｖ非依存性）は２．５μＭオリゴマイシンにより誘発されて、状態３ｕ（ＦＣＣＰ脱共役した最大呼吸容量）は４μＭのＦＣＣＰによる。最後に１．５μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡをアッセイの最後に注入した。
【００４７】
電子流アッセイにおいて、ＭＡＳ緩衝液に１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（複合体Ｉ基質）、２ｍＭのリンゴ酸塩（複合体ＩＩ抑制物質）及び４μＭのＦＣＣＰを補充して、及びミトコンドリアを結合アッセイのために記載されている同一方法で播種した。基礎読み取り後、経時的な注入は以下の２μＭのロテノン（複合体Ｉ抑制物質）、１０ｍＭのコハク酸塩（複合体ＩＩ基質）、４μＭのアンチマイシンＡ（複合体ＩＩＩ抑制物質）及び１０ｍＭ／１００μＭのアスコルビン酸塩／テトラメチルフェニレンジアミン（複合体ＩＶ基質）であった。
結論
【００４８】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ基質、ピルビン酸塩及びリンゴ酸塩で補充）によって呼吸が引き起こされるとき、α−ＫＢ治療におけるＡＤＰ誘発及びＦＣＣＰ誘発呼吸の著しい減少があり、複合体ＩＩ基質（コハク酸塩）が補充されるときに、ミトコンドリア呼吸におけるα−ＫＢ効果はない。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼがα−ＫＢによって特に抑制されることを、これらの結果は強く示す。この仮説は電子流アッセイによって更に確認されて、呼吸に関連するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼだけがα−ＫＢ治療によって抑制される。類似の内因性代謝物、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩（３−ＨＢ）は、複合体ＩＩに起因する結合または電子流の任意の工程に影響を及ぼさず、更にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制するα−ＫＢの特異性を示す。
【００４９】
図２は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉ）に起因する結合アッセイ（リンゴ酸塩及びピルビン酸塩を補充）の結果を示す。複合体ＩＩに起因する結合アッセイ（コハク酸塩及びロテノンを補充）の結果を、図３Ａ（α−ＫＢ）及び図３Ｂ（３−ＨＢ）に示す。電子流アッセイの結果を、図４Ａ（α−ＫＢ）及び図４Ｂ（３−ＨＢ）に示す。
【００５０】
α−ＫＢはヒト細胞のミトコンドリア生体エネルギー論に影響を及ぼす。
【００５１】
単離されたミトコンドリアモデルにおいてだけでなく、細胞モデルにおいても、α−ＫＢはミトコンドリア生体エネルギー論に影響を及ぼす。α−ＫＢは細胞呼吸を抑制することが見いだされた。そのうえ、α−ＫＢは細胞ＲＯＳ濃度を増大させる。これらの表現型はロテノンの効果に似ており、それはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの周知の抑制物質である。合わせてこれらの結果は、α−ＫＢがミトコンドリアに、好ましくはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの抑制により響を及ぼすことを示す。
【００５２】
酸素の消費率（ＯＣＲ）の測定ＯＣＲ測定は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ−２４アナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施された。Ｃ２Ｃ１２細胞は、１０％のＦＢＳ及び１０ｍＭのグルコースを補充したＤＭＥＭメディア中の１ウェル当たり３０，０００細胞でＳｅａｈｏｒｓｅＸＦ−２４細胞培養マイクロプレートに播種されて、一晩３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートされた。α−ＫＢまたはＤＭＳＯ（ビヒクル対照）の処理は１時間あった。細胞は測定直前に非緩衝ＤＭＥＭ媒体（ｐＨ７．４、１０ｍＭのブドウ糖）で洗浄されて、α−ＫＢの指示された濃度の本緩衝液内で維持された。ＯＣＲを基本条件下で３回測定し、ウェル当たりタンパク質濃度に正規化された。
【００５３】
α−ＫＢ処理において、基礎呼吸（図５Ａ）及び最大呼吸（ＦＣＣＰ処理のミトコンドリア呼吸）（図６Ａ）は両方とも、ロテノン処理と同様に抑制された。図５Ｂ及び図６Ｂに示すように、３−ＨＢは更にこのアッセイにいかなる効果も有しない。
【００５４】
ＲＯＳの測定Ｃ２Ｃ１２細胞を、密度２５０，０００細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに播種した。反応酸素種（ＲＯＳ）濃度は、３時間の薬剤処理の後、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ）を使用して測定された。
【００５５】
図７に示すように、α−ＫＢはロテノン処理と同様に細胞ＲＯＳを増大させる。これは更に、α−ＫＢがＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを抑制するという仮説を支持する。
【００５６】
α−ＫＢはマウスモデルの心臓肥大及び心不全を救う。
【００５７】
ＵＣＬＡのＪａｋｅ  Ｌｕｓｉｓ、Ｍｅｉｓｈｅｎｇ  Ｊｉａｎｇ及びＹｉｂｉｎ  Ｗａｎｇと共同で細胞及び動物モデルを使用することにより、α−ＫＢがイソプロテレノールにより、及び横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）により誘発される心臓肥大に対する有望な活性を示すことが見いだされた。例えばα−ＫＢのＣ５７ＢＬ／６マウスへの投与は、ＴＡＣ誘発の心臓肥大心不全を救う。外科的手順は、ビヒクルまたはα−ＫＢによる処理の１日前に実施された。心拍出量は、エコーによる心臓駆出率（ＥＦ）を測定することにより、処理後３週間評価された。ＥＦは、α−ＫＢ処理マウス（０．１６８±０．０２３）対ビヒクル処理マウス（０．２１８±０．０１４）で減少した、Ｐ＜０．０５。
【００５８】
追加の実験において、新生仔ラットの心筋細胞をコラゲナーゼ消化により単離して、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで一晩培養し、次に培養基は、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウム）を補充した、無血清の高グルコースＤＭＥＭに変えられた。
カテコールアミンにより誘発された心臓肥大心筋細胞の肥大は、細胞を１ｍＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）またはフェニレフリン（ＰＥ）で４８時間処理することによって誘発された。α−ＫＢ（１ｍＭ）は完全にＩＳＯ及びＰＥにより誘発された肥大を消失させて、同様に、肥大関連のマーカであるＡＮＦ及びＢＮＰの誘発された過剰発現も抑制した。
【００５９】
マウスの横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）を使用して、圧過負荷により誘発された心不全及び心臓肥大を誘発した。ＴＡＣ外科的手順は、ビヒクルまたはα−ＫＢによる処理の１日前に実施された。Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、飲料水中１日当たり３０ｍｇ／体重ｋｇでα−ＫＢで処理した。心拍出量は、エコーによる測定された心臓駆出率（ＥＦ）を測定することにより、処理後３週間評価された。
【００６０】
ＴＡＣ手順後３週間の対照マウスに関するＥＦは、０．２１８±０．０１４（ｎ＝８、以前の実験で試験された５を含む）、及びα−ＫＢ処理された動物に関して、０．２６８±０．０２３（ｎ＝７）（平均値、ＳＥＭ）であった、Ｐ＜０．０５。実験の終了時に（５週間）、心臓（ｍｇ）／身体（ｇ）比率は対照群について１３．２３±１．０（ｎ＝２）であり、α−ＫＢ処置群は１０．７２±１．９８（ｎ＝６）（平均値、ＳＴＥＤＶ）であった、Ｐ＝０．１４７。したがってα−ＫＢはＴＡＣにより誘発された心不全マウスモデルの心拍出量を著しく高めて、更にこれらのマウスの死亡率を低下させるように見える。
【００６１】
α−ＫＢは老齢マウスの加齢関連症状を逆転させる。
【００６２】
雄及び雌両方を含む老齢マウス（２２〜２３か月のＣ５７ＢＬ／６Ｊ）は水またはα−ＫＢ（飲料水中８ｍＭまたは９０ｍｇ／体重ｋｇ）の両方を７か月間与えた。実験期間中、α−ＫＢの副作用は処理動物で観察されなかった。α−ＫＢ処理マウスは、非処理対照動物と比較して試験期間中正常挙動及び身体活動を示した。マウスは少なくとも週２回不健康の徴候がないか調べられて、重篤な病気または動けなくなったマウスは終了とされた。α−ＫＢ処理した雄群の寿命は延びた。未処理の対照群のすべての雄（５のうちの５）は７か月の試験完了前に死亡または重大な疾患により終了とされた。意外なことにα−ＫＢ処置群の大部分の雄（５のうちの４）は健康に生存し、７か月の実験期間の終了時に依然として健康であった。
【００６３】
処理群及び未処置群の雌の寿命は差がなかったが、α−ＫＢで処理された雌マウスは、動物がα−ＫＢ処理を受けた約２〜約３か月始まる毛髪及び毛皮外観の改善を示した（図８のパネルＡは処理後７か月のそれらを示す）。処理した雌群の毛髪密度は無処理の対照群より高かった（図８のパネルＡ）。α−ＫＢ処置群の白髪は無処理群と比べて減っていた（図８のパネルＢ）。処理した雄群ついて、白髪及び毛髪密度への影響は最小限であるように見えた。α−ＫＢ処理は肝臓外観も大いに改善した。老齢の未処理動物について、肝臓はその特徴的な赤みがかった色を失って、黄色がかった色合いを帯びる。雄及び雌両方の処理動物の肝臓は、いかなる黄色がかった色合いもない赤みがかった色健康的な外観を示す（図８のパネルＣ）。総合すればこれらの結果は、α−ＫＢが哺乳類の老化作用を遅らせる、または逆転させる抗老化特性を有することを示唆する。
【００６４】
虚血再灌流障害及び心筋梗塞を減らすためのα−ＫＢ。
【００６５】
α−ＫＢの心保護的役割を実験するために、虚血再灌流障害のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用した。雄マウスの左冠状動脈を３０分間閉塞して、その後２４時間の再灌流が続いた。ＰＢＳ（ビヒクル対照）またはα−ＫＢ（８００μＭ）の１回投与分を、再灌流の開始時に尾静脈より投与した（図９Ａ）。虚血域（ＡＡＲ）対左心室の比は両方の群で類似しており、α−ＫＢで６４．１±２．３（ｎ＝６）対対照処理で５６．８±３．３（ｎ＝５）、それは２つの群が同等程度の虚血性リスクにあったことを示す（図９Ｂ）。しかし梗塞サイズは対照群と比べてα−ＫＢ群は著しく小さくなり、梗塞サイズ対ＡＡＲの比はα−ＫＢで３１．２±３．６（ｎ＝６）対対照群で４４．５±３．０（ｎ＝５）であった、Ｐ＝０．０２（図９Ｃ）。図１０は再灌流前の治療に起因する梗塞サイズを示す。
【００６６】
α−ＫＢは線虫アルツハイマー病モデルの麻痺を遅らせる。
【００６７】
α−ＫＢが線虫のアルツハイマー病における麻痺を遅延させることを示すために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ（豪州）のＧａｗａｉｎ  ＭｃＣｏｌｌによって開発されたＧＭＣ１０１線虫株が使用され、それは、完全浸透性加齢進行性麻痺につながる、体壁筋細胞に全長ヒトアミロイド−β１−４２タンパク質を発現する。虫は約１００つの産卵期の成虫による３時間の時限産卵を実施することによって加齢同期化されて、卵は２０℃のインキュベーターに置かれた。一旦卵が産卵後４２時間でＬ４ステージに発現すると、それは、子孫産生を阻止するための４９．５μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ、Ｓｉｇｍａ  Ｆ０５０３）、及び４ｍＭのα−ＫＢまたはビヒクル（水）対照を含有するＮＧＭ治療プレート上に移された。次に虫は、アミロイド−β凝集及び麻痺を誘発するために３０℃に移された。虫は、処理の２日目に開始する毎日の麻痺の評価が行われ、白金ワイヤによって穏やかにつつくと全身を屈曲して前後に激しく移動することの不履行によって評価された。大部分の麻痺した虫は依然としてその頭部及び体の一部を動かすことができた。すべての虫は、４日目に新しい処理プレートに移された。図１１に示すように、４ｍＭのα−ＫＢはビヒクル処理した虫と比較して最大３７％まで麻痺を遅延した。
【００６８】
α−ＫＢはＨＣＶ感染を減らすのに役立つ。
【００６９】
対象が加齢するにつれて、感染への感染しやすさは増加する。したがって、α−ＫＢが加齢関連感染への感染しやすさを減らすのかを測定するために、Ｈｕｈ７．５細胞を５時間のＲｅｎｉｌｌａレポータＨＣＶに感染させて、その後α−ＫＢ１ｍＭ及び１μＭで処理した。処理後７２時間で細胞は溶解して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルスアセンブリの抑制剤であるＪＧ−９８が陽性対照として使用されて、水が陰性対照として使用された。図１２Ａに示すように、α−ＫＢはウイルス感染を抑制する、または減少させる。α−ＫＢの抗ウイルス活性が細胞毒性の結果でないことを確実にするために、Ｈｕｈ７．５細胞は、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ及び１００ｎＭのα−ＫＢで処理された。ＭＴＴアッセイを処理後２４時間毎最大７２時間まで実施した。細胞毒性である抗癌化合物ルテオリンが陽性対照として使用されて、水が陰性対照として使用された。図１２Ｂに示すように、α−ＫＢは細胞毒性ではない。
【００７０】
α−ＫＢはピルビン酸デヒドロゲナーゼを抑制し、それによりＥＴＣ複合体Ｉ活性を減退させる。
【００７１】
ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼへのα−ＫＢの効果を実験するために、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）酵素活性マイクロプレートアッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０９９０２）を使用した。アッセイは提供されたプロトコルに従って実行された。洗剤剤をウシ心臓ミトコンドリア溶解物（Ａｂｃａｍ、ａｂｌ  １０３３８）に添加して、その後２０分間の４℃でインキュベートして、ＰＤＨを放出した。試料を次に１４，００００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みをインキュベーション緩衝液で希釈して、ＰＤＨ抗体でコーティングした９６ウェルプレートに加えた。３時間のインキュベート後、安定剤緩衝液で２度洗浄し、ウェルに、１０、２０、５０、２００及び８００μＭのα−ＫＢまたはビヒクル対照（蒸留水）を含有する反応混合物２００μＬを加えた。各状態を３回実施した。４５０ｎｍで１分間隔の吸光度の動力学的測定が行われて、ＰＤＨ活性は吸収度対時間の勾配で計算された。読み取り値はビヒクル平均（１００％として）に正規化された。図１３に示すように、２００及び８００μＭのα−ＫＢで処理されたウェルのおける正規化された活性（％）は、対照より著しく低かった：ビヒクル（水）１００±１４．９、２００μＭのα−ＫＢ６８．０±１１．８、Ｐ＝０．０４０８、８００μＭのα−ＫＢ４１．６±７．８９、Ｐ＝０．００４。
【００７２】
α−ＫＢは直接、ＥＴＣ複合体Ｉジアホラーゼ（ＮＡＤＨ：アクセプタ酸化還元酵素）を抑制する。
【００７３】
α−ＫＢが複合体Ｉのジアホラーゼ（ＮＡＤＨ：アクセプタ酸化還元酵素）活性に影響を及ぼすことができるか評価するために、複合体Ｉ酵素活性マイクロプレートアッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０９７２１）を使用した。アッセイは提供されたプロトコルに従って実行された。ウシ心臓ミトコンドリア溶解物（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１０３３８）に洗剤剤を加えて、その後３０分間の氷上でインキュベートし、複合体Ｉを放出して、次に１２，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。上澄みを収集して、提供された緩衝液で希釈し、複合体Ｉ抗体でコーティングした９６ウェルプレートに加えた。３時間のインキュベート後、安定剤緩衝液で２度洗浄し、ウェルに、５０、２００もしくは８００μＭのα−ＫＢまたはビヒクル対照（蒸留水）を含有する反応混合物２００μＬを加えた。各状態を３回実施した。４５０ｎｍで１分間隔の吸光度の動力学的測定が行われて、複合体Ｉジアホラーゼ活性は吸収度対時間の勾配で計算された。読み取り値はビヒクル平均（１００％として）に正規化された。
【００７４】
α−ＫＢは長寿命の複合体Ｉ変異体線虫株の寿命を延ばさない。
【００７５】
ｎｕｏ−６遺伝子は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体として知られている、ミトコンドリア電子輸送連鎖の複合体ＩのＮＤＵＦＢ４／Ｂ１５サブユニットの線虫オルソログをコード化する。図１５Ａに示すように、ｎｕｏ−６（ｑｍ２００）変異体株は複合体Ｉの機能を減らして、それは野生型Ｎ２線虫と比べて長寿命である。ｎｕｏ−６（ｑｍ２００）株の寿命の延長をα−ＫＢができないことは、複合体Ｉを介して媒介されるα−ＫＢの老化防止メカニズムと適合する。他方では図１５Ｂに示すように、α−ＫＢはすでに長寿命のｄａｆ−２（ｅ１３７０）株、または図１５Ｃに示すｅａｔ−２（ａｄ１１１６）株の寿命を延ばす。これらはα−ＫＢの老化防止効果が２つの主要な老化経路、インスリン／ＩＧＦ−１シグナル経路（ｄａｆ−２）及び食事制限経路（ｅａｔ−２）に依存していないことを実証するので、これらの結果は重要である。これは、ミトコンドリアＥＴＣ抑制による寿命の延長の特異性を実証するだけでなく、α−ＫＢがインスリン／ＩＧＦ−１経路及び食事制限経路の両方により寿命を延長する分子に共に相乗的で作用し得ることも示唆する。
【００７６】
本出願で使用されるすべての科学用語及び専門用語は、特に指示がない限り、当該技術分野において一般的に用いられる意味を有する。
【００７７】
本明細書で使用する場合「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語はすべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、鶏及びその他獣医学的対象及び実験動物など哺乳動物及び非哺乳動物を含む。
【００７８】
特に記述されない限り、単数の使用は複数を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことができる。「または」の使用は、特に明記しない限り「及び／または」を意味する。本明細書で使用する場合「及び／または」は「及び」または「または」を意味する。例えば「Ａ及び／またはＢ」は「Ａ、ＢまたはＡ及びＢの両方」、ならびに「Ａ、Ｂ、Ｃ及び／またはＤ」は「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはこれらの組み合わせ」を意味し、ならびに前記「これらの組み合わせ」とは、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの任意のサブセット、例えば、１つの要素のサブセット（例えばＡまたはＢまたはＣまたはＤ）、２つの要素のサブセット（例えばＡ及びＢ、Ａ及びＣなど）、または３つの要素のサブセット（例えば、Ａ、Ｂ及びＣ、またはＡ、Ｂ及びＤなど）、または４つすべての要素（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）の任意のサブセットを意味する。
【００７９】
本発明の開示を理解する、または完成するのに必要な範囲で、本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許出願は、各々が個々に組み込まれたかのように同じ範囲で参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８０】
本発明の例示の実施形態に記載のとおり、開示内における単なる例示であって、種々の他の修正、改良及び変更は本発明の範囲内であり得ることを当業者は留意すべきである。したがって本発明は、本明細書に示されている特定の実施形態に限定されず、以下の請求項により制限されるだけである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【国際調査報告】
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