(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（VI）：
【化１】
0004147768.tif 000010
で表されること、ならびに、ヘキセンウロニダーゼの作用によりヘキセンウロン酸と蛍光物質とに分解されうることを特徴とする、ヘキセンウロン酸誘導体。
【請求項２】
下記の式（V）：
【化２】
0004147768.tif 000011
で表される中間体化合物を脱保護し、生成した上記式（VI）の化合物を単離、精製することを含む、ヘキセンウロン酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のヘキセンウロン酸誘導体を基質として用いてヘキセンウロニダーゼ活性を測定することを含む、ヘキセンウロニダーゼアッセイ方法。
【請求項４】
請求項１に記載のヘキセンウロン酸誘導体又は請求項２に記載の中間体化合物を含む、ヘキセンウロニダーゼアッセイ用試薬又はキット。
【請求項５】
前記中間体化合物はアッセイ前に脱保護して使用するものである、請求項４に記載の試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘキセンウロニダーゼアッセイに使用可能な新規ヘキセンウロン酸誘導体及びその製法に関する。
本発明はまた、該ヘキセンウロン酸誘導体を使用するヘキセンウロニダーゼアッセイ方法、及び、このようなアッセイに使用するための該ヘキセンウロン酸誘導体を含むヘキセンウロニダーゼアッセイ用試薬又はキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
紙の原料であるパルプを作るためには、木材チップを高温、高アルカリ条件下で処理する工程が必要である。パルプを製造する際に起こる問題にはいくつか原因があるが、その一つは、パルプ漂白におけるヘキセンウロン酸の弊害である。
【０００３】
ヘキセンウロン酸は、その分子内に二重結合を保持するため、パルプの漂白工程で使用される酸化系薬品、例えば、オゾン、塩素、二酸化塩素などの漂白試薬と反応する。これらの漂白試薬は本来は着色成分であるリグニン由来の化合物や糖がフランに誘導体化したものと反応すべきであるが、着色成分ではないヘキセンウロン酸が分子内に保有する二重結合と漂白薬品が反応することによって、これらの漂白薬品を無駄に消費し、漂白工程の効率を悪化させる。さらにヘキセンウロン酸は分子内にカルボキシル基を有する酸性糖であり、そのカルボキシル基は負に帯電するため、パルプ中のヘキセンウロン酸の分子に重金属が結合されやすい。このため、上記酸化系の漂白薬品を用いた漂白工程ではこの重金属はイオン化し漂白薬品と反応するため薬品を無駄に消費してしまい、漂白効率を悪化させる。
【０００４】
酸化系漂白薬品で漂白する前にこのヘキセンウロン酸をあらかじめ除去できれば、後段での漂白薬品が削減できることから、当技術分野ではパルプ中よりヘキセンウロン酸を除去する方法が望まれてきた。ヘキセンウロン酸を除去する一般的な方法はパルプを酸で処理する方法であったが、この方法ではパルプ自身も加水分解されてダメージを受け、また酸による加水分解はパルプの収率を低下させるという問題があった。
【０００５】
最近、ヘキセンウロン酸を分解する酵素ヘキセンウロニダーゼの有効性が示された。ヘキセンウロニダーゼは、キシラン主鎖に側鎖としてβ1→2結合しているヘキセンウロン酸を加水分解し5-ホルミル-2-フランカルボン酸、もしくは2-フロイックアシッドを生成する。また、ヘキセンウロニダーゼは、ムコ多糖、ヒアルロン酸、あるいは構成糖としてグルクロン酸を含む酸性多糖（例えばペクチン及びゲラン）、がリアーゼによって分解された際に生成されるヘキセンウロン酸を加水分解し5-ホルミル-2-フランカルボン酸もしくは2-フロイックアシッドを生成する。このヘキセンウロニダーゼの作用を利用し、パルプ中のヘキセンウロン酸を除去する方法が最近本出願人によって開発された。
【０００６】
しかしながらヘキセンウロニダーゼは酵素活性の測定方法が非常に難しいという問題があり、研究が進まなかったという背景がある。例えば、ピーターおよびアルフレッドによる報告（Biochem. J. 165:287-293, 1977）および近年の橋本らの酵素活性測定法（Archives of Biochemistry and Biophysics 368(2): 367-374, 1999）では、酵素活性の定義をヘキセンウロン酸の分解に伴うヘキセンウロン酸の二重結合の吸収（△A232）の単位時間当たりの減少、と定義している。しかしながら、調製された酵素サンプル中には230nm〜250nm付近に吸収をもつ物質がしばしば混在しているため232nm付近の吸収の減少を測定することは難しいと考えられる。
【０００７】
一方、ブヒャートら（PCT国際公開WO 95/33883）のヘキセンウロニダーゼの活性測定法は、ヘキセンウロン酸とグリコシド結合しているアグリコンがヘキセンウロニダーゼにより遊離生成することを利用したものである。具体的には、キシロビオースまたはキシロトリオースの非還元末端側のキシロースにβ結合したヘキセンウロン酸をヘキセンウロニダーゼと反応させることでヘキセンウロン酸とキシロオリゴ糖間の結合が加水分解され、このときキシロビオースもしくはキシロトリオースが生成し、この生成物を測定する。しかしながら、この方法も基質の精製が不十分であれば酵素サンプル中に挟雑するキシラナーゼなどの他の酵素の作用によりキシロオリゴ糖が生成する可能性が否定できないため、酵素活性法としては実用的ではない。それゆえ、従来法に代わるヘキセンウロニダーゼ酵素活性を測定するための方法が望まれてきた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヘキセンウロニダーゼ酵素に対し特異性があり、該酵素の活性測定用基質として利用可能なヘキセンウロン酸誘導体を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記ヘキセンウロン酸誘導体を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、上記ヘキセンウロン酸誘導体を基質として使用するヘキセンウロニダーゼアッセイ方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、上記ヘキセンウロン酸誘導体を含むヘキセンウロニダーゼアッセイ用試薬又はキットを提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、ヘキセンウロニダーゼ用合成基質としてのヘキセンウロン酸誘導体の合成に成功し、これらの誘導体を基質として用いることにより高感度でヘキセンウロニダーゼの酵素活性測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、その第１の態様において、下記の式(I)：
【化５】
0004147768.tif 000002
〔式中、ZはO（酸素）又はS（硫黄）を表し、Xは発蛍光団基、化学発光団基又は発色団基を表す〕
で表されること、ならびに、ヘキセンウロニダーゼの作用によりヘキセンウロン酸と蛍光、化学発光又は発色物質とに分解されうることを特徴とするヘキセンウロン酸誘導体を提供する。
【００１４】
本発明の実施形態において、上記式（I）中Xは発蛍光団基を表すことを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、上記発蛍光団基は、置換された又は未置換のクマリル基、フルオロセイニル基及びナフチル基からなる群から選択されるものであり、特にウンベリフェロン誘導体基であることが好ましい。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態において、上記ヘキセンウロン酸誘導体は、下記の式（VI）:
【化６】
0004147768.tif 000003
で表されることを特徴とする。
【００１６】
本発明はまた、第２の態様において、下記の式（II）：
【化７】
0004147768.tif 000004
〔式中、R1及びR2は水酸基の保護基、R3はカルボキシル基の保護基、ZはO（酸素）又はS（硫黄）を表し、Xは発蛍光団基、化学発光団基又は発色団基を表す〕で表される中間体化合物を脱保護し、生成した上記定義の式（I）の化合物を単離、精製することを含む、ヘキセンウロン酸誘導体の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の実施形態において、上記式（II）中、R1及びR2は独立に、置換されたもしくは未置換のアルカノイル基、トリアルキルシリル基又はアリールアルキル基であり、R3は置換されたもしくは未置換のアルキル又はアリールアルキル基を表す。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、上記中間体化合物は、下記の式（V）：
【化８】
0004147768.tif 000005
で表される化合物である。
【００１９】
本発明は、その第３の態様において、上記定義の式（II）で表される中間体化合物を提供する。
本発明の実施形態において、上記中間体化合物は上記定義の式（V）で表される化合物である。
【００２０】
本発明はさらに、その第４の態様において、上記定義のヘキセンウロン酸誘導体を基質として用いてヘキセンウロニダーゼ活性を測定することを含むヘキセンウロニダーゼアッセイ方法を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、その第５の態様において、上記定義のヘキセンウロン酸誘導体又は上記定義の中間体化合物を含むヘキセンウロニダーゼアッセイ用試薬又はキットを提供する。
本発明の実施形態において、上記中間体化合物はアッセイ前に脱保護して使用する。
本明細書中で使用する「アッセイ」なる用語は、酵素の活性測定を意味する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）ヘキセンウロン酸誘導体
本発明のヘキセンウロン酸誘導体は、ヘキセンウロニダーゼ酵素の合成基質であり、ヘキセンウロン酸の１位の水酸基と、蛍光物質、化学発光物質又は発色物質上の基との間でグリコシド結合を形成することにより得られた上記の式（I）で表される化合物である。該誘導体は、ヘキセンウロニダーゼの作用を受けるとき、このグリコシド結合部分で切断されてヘキセンウロン酸と蛍光、化学発光又は発色物質とに分解される。この酵素作用に伴って遊離する蛍光、化学発光又は発色物質が直接もしくは間接的に発するシグナルを物理化学的方法により検出することによって、ヘキセンウロニダーゼの酵素活性を測定することが可能である。
【００２３】
上記式（I）中のX基は、発蛍光団基、化学発光団基又は発色団基である。発蛍光団基の例は、置換された又は未置換のクマリル基、フルオロセイニル基、ナフチル基（例えばβ-ナフチル基）などを含むが、これらの基に限定されない。該置換基としては、ヘキセンウロン酸の１位の水酸基とグリコシル結合を形成することができる基（好ましくは水酸基、-SH基）、ヘキセンウロニダーゼの酵素作用に実質的に影響を及ぼさない基、などであればいかなる置換基であってもよい。Xがクマリル基、フルオロセイニル基、ナフチル基の場合には、これらの基がもつ水酸基を介してヘキセンウロン酸とのグリコシド結合が形成される。
【００２４】
化学発光団基の例は、ホタル又はウミシイタケ由来のルシフェリンであり、酵素的に遊離したルシフェリンはルシフェラーゼを作用させてオキシルシフェリンに酸化される際に発する光を分光学的に検出することができる。
【００２５】
発色団基の例は、ｐ−ニトロフェノキシ基などであり、例えばｐ−ニトロフェノキシ基の場合、ヘキセンウロニダーゼの作用の結果ｐ−ニトロフェノールが遊離するので、黄色〜黄褐色の着色の程度を分光学的に測定することができる。
【００２６】
本発明においては、上記式（I）中X基として発蛍光団基を含むヘキセンウロン酸誘導体が好ましい。また発蛍光団基としては、置換クマリル基であるウンベリフェロン誘導体基が好ましく、そのような基としては、７−ヒドロキシクマリル基（ウンベリフェリル基ともいう）、４−メチル−７−ヒドロキシクマリル基（４−メチルウンベリフェリル基ともいう）などが挙げられる。したがって、本発明の好ましいヘキセンウロン酸誘導体の例は、上記式（VI）で表されるウンベリフェリル−４−デオキシ−ヘキス−４−エノピラノシドウロン酸である。
【００２７】
（２）ヘキセンウロン酸誘導体の製造
本発明のヘキセンウロン酸誘導体は、以下の工程にしたがって製造又は合成できる。
【００２８】
最初に、出発物質としてβ−ガラクトピラノシドウロン酸を用い、その水酸基を、置換されたもしくは未置換のアルカノイル基〔例えばアセチル基、１〜３個のハロゲン原子で置換されたアセチル基（例えばモノクロロアセチル基、ジクロロアセチル基など）、など〕、トリアルキルシリル基〔例えばトリ低級アルキルシリル基（例えばトリメチルシリル基、トリエチルシリル基など）、など〕、アリールアルキル基（例えば置換もしくは未置換フェニル低級アルキル基、例えば置換もしくは未置換ベンジル基）、又はそれらと同様の保護基で保護し、またカルボキシル基を、置換されたもしくは未置換のアルキルエステル（例えばメチルエステル、エチルエステルなど）、アリールアルキルエステル（例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステルなど）、又はそれらと同様のエステルの形態で保護する。好ましくは、水酸基はアセチル基で、またカルボキシル基はメチルエステルの形態で保護される。本明細書中で使用する低級アルキルとは、C1〜C4アルキルを指し，好ましくはメチル及びエチルである。また、本明細書中で使用するハロゲン原子とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味する。
【００２９】
上記のように保護されたβ−ガラクトピラノシドウロン酸の１位の水酸基を、例えばハロゲン原子（フッ素、塩素又は臭素原子）、-S(=O)R、-O-P(NR2)2、-O-P(=O)(OPh)2、-SR、-S-P(=NPh)(NR2)2（ここで、Rはメチル、エチル、プロピルなどの低級アルキルであり、Phはフェニルなどのアリールを表す。）などによって選択的に置換する。ハロゲン原子が臭素原子の場合、臭素化は例えば臭素酸・酢酸溶液中で行うことができる。次いで、この置換体と、水酸基をもつ蛍光物質、化学発光物質又は発色物質との間でグリコシル化反応を行う（例えばToshima，K.ら, Chem. Rev. 93:1503-1531, 1993；橋本俊一及び中島誠,ファルマシア32:1375-1380, 1996など）。臭素置換体の場合、公知のKoenigs-Knorr法に従って銀塩または水銀塩の存在下でグリコシル化反応を行うことができる。
【００３０】
次に、得られたグリコシル化化合物について、その保護α−ガラクトピラノシドウロン酸部分の４位をデオキシ化して保護へキセンウロン酸部分に変換する。最後に、グリコシル化化合物の保護へキセンウロン酸部分の保護基を脱保護してヘキセンウロン酸部分に変換する。
【００３１】
本発明の好適実施形態において、上記式（V）で表されるウンベリフェリル−４−デオキシ−ヘキス−４−エノピラノシドウロン酸の合成スキームを図１に示す。
【００３２】
（３）ヘキセンウロニダーゼの酵素活性測定
ヘキセンウロニダーゼの酵素活性測定の基本原理は、発蛍光団基、化学発光団基又は発色団基を結合したヘキセンウロン酸誘導体にヘキセンウロニダーゼを作用させ、それによりグリコシド結合が切断されて蛍光、化学発光又は発色物質が生じ、そしてそのシグナルの強度を直接又は間接的に物理化学的方法で測定することによって、該へキセンウロニダーゼの酵素活性を測定することができる。すなわち、上記のように製造又は合成されたヘキセンウロン酸誘導体をヘキセンウロニダーゼ酵素の活性測定用の基質として使用しうる。該基質にヘキセンウロニダーゼを作用させて生じたシグナルが蛍光である場合、遊離した蛍光物質を特定の波長で励起させ、該励起により放出される発光波長によりその蛍光強度を測定する。このとき、反応系内で1分間に1μmolのヘキセンウロン酸を遊離させる酵素量を1ユニットとして定義することができる。
【００３３】
反応は、該基質を反応系内で適切な濃度（例えば約100μM）となるように調製し、各種のサンプル溶液と反応させヘキセンウロニダーゼの活性を測定できるように設定しうる。具体的に説明すると、基質溶液をリン酸バッファー、トリス−HClなどのバッファー(例えばpH約6〜約8)にて調製し、この基質溶液に対して酵素液を例えば酵素対基質比約１：10〜約1：100で添加し、例えば約１分〜30分間、例えば室温〜55℃の温度にてインキュベートする。その後グリシン−NaOHバッファー（pH約10）などのアルカリ域のバッファーを反応系に添加するなどの方法によって酵素反応を停止させる。
【００３４】
このとき生じた蛍光、化学発光又は発色シグナルは、蛍光光度計又は吸光光度計を用いて測定することができる。励起波長や発光波長、あるいは吸光度、はシグナルの特性によって適宜選択される。例えば、酵素反応の結果遊離する蛍光性４−メチル−７−ヒドロキシクマリンの場合、励起波長は約355nm、発光波長は約455nmである。
【００３５】
化学発光団基として例えばホタル又はウミシイタケ由来ルシフェリンを使用する場合には、酵素的に遊離したルシフェリンにルシフェラーゼ酵素をMg2+の存在下で作用させ、オキシルシフェリンに酸化される際に発する光を分光学的に検出することができる。
【００３６】
本発明の方法は、従来法と比べて高感度の酵素活性測定法であり、本発明に係るヘキセンウロン酸誘導体を用いることにより、各種細菌の培養液または多細胞生物の培養細胞などからサンプル溶液を濃縮することなく直接ヘキセンウロニダーゼの酵素活性を測定することができる。
【００３７】
本発明はさらに、上記のヘキセンウロン酸誘導体又は式（II）で表されるその合成中間体（例えば式（V）の化合物）を含むヘキセンウロニダーゼアッセイ用試薬又はキットを提供する。
【００３８】
合成中間体は、ヘキセンウロン酸部分上の水酸基及びカルボキシル基が適切な保護基によって保護された化合物であり、アッセイの前に脱保護し、ｐH調整と濃度調整を行うだけで精製することなしにアッセイに使用することができる。このような中間体は、対応のヘキセンウロン酸誘導体の貯蔵安定性が低い場合に有利である。
【００３９】
本発明のキットは、上記化合物の他に、必要に応じてバッファー溶液(pH約 6〜約8)、反応停止液(例えばpH 約9以上のアルカリ水もしくはバッファー)などを含むことができる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではないと解釈されるべきである。
〔実施例１〕ヘキセンウロン酸誘導体の合成
蛍光物質として４−メチルウンベリフェロンが結合したヘキセンウロン酸誘導体の合成法を図１および以下に説明する。
【００４１】
（１）  (トリ−O−アセチル−α−ガラクトピラノシルブロミド)ウロン酸メチルエステル（III）の合成
【化９】
0004147768.tif 000006
(テトラ−O−アセチル−β−ガラクトピラノシド)ウロン酸メチルエステル3.76g（10mmol）を窒素下0℃で30％臭素酸・酢酸溶液（25mg）に溶解し、1時間攪拌後、さらに室温で1時間攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン（100ml）を加え、氷水および冷重曹水で各5回抽出した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を留去し、表題化合物（I）4.0g（収率100％）を得た。
【００４２】
（２）  (ウンベリフェリルトリ−O−アセチル−ガラクトピラノシド)ウロン酸メチルエステル（IV）の合成
【化１０】
0004147768.tif 000007
【００４３】
上記（１）で得られた(トリ−O−アセチル−α−ガラクトピラノシルブロミド)ウロン酸メチルエステル（III）3.0g（7.5mmol）、４−メチルウンベリフェロン（別称：４−メチル−７−ヒドロキシクマリン）1.32g（7.5mmol）、4オングストロームモレキュラーシーブズ10g、および無水アセトニトリル20mLを窒素下、室温で1時間攪拌した。次に、炭酸銀9.0g（3.2mmol）を加え、一昼夜攪拌した。反応終了後、反応液をセライトで濾過し、ジクロロメタンで溶出した。ジクロロメタン溶出液は飽和重炭酸ナトリウム水溶液で5回抽出し、有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を留去した後、反応生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ジクロロメタン−メタノール（97：3）の画分から表題化合物（IV）2.92g（収率79％）を得た。
【００４４】
（３）  (ウンベリフェリル−ジ−O−アセチル−4−デオキシ−ヘキス−4−エノピラノシド)ウロン酸メチルエステル（V）の合成
【化１１】
0004147768.tif 000008
【００４５】
上記（２）で得られた(ウンベリフェリルトリ−O−アセチル−ガラクトピラノシド)ウロン酸メチルエステル（IV）200mg（0.4mmol）の無水THF5mL中の溶液に窒素下、室温でDBU（1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデス-7-エン）を200μl（4当量）添加し、30分間攪拌した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで希釈し、蒸留水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒留去後、粗生成物153mgをシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ジクロロメタン画分から表題化合物（V）132mg（収率76％）を得た。
【００４６】
（４）  ウンベリフェリル−4−デオキシ−ヘキス−4−エノピラノシドウロン酸（VI）の合成
【化１２】
0004147768.tif 000009
【００４７】
上記（３）で得た(ウンベリフェリル−ジ−O−アセチル−4−デオキシ−へキス−4−エノピラノシド)ウロン酸メチルエステル（V）86mg（0.2mmol）の水−メタノール（１：２）9mlの溶液に窒素下、0℃で2N NaOH 1mlを加え、1時間攪拌した。反応終了後、反応液を陽イオン交換樹脂で濾過し、メタノールで溶出した。その溶出液を濃縮した後、ODS逆相クロマトグラフィーを用いて30％メタノールで溶出し、表題化合物（VI）43mg（収率64％）を得た。
【００４８】
この表題化合物は非常に不安定であり、分解する速度が速いため、その後のアッセイへの使用には表題化合物を精製することなく用いた。基質を保存する場合は、ヘキセンウロン酸部分に存在する水酸基はアセチル化したまま保存しておく。使用時に、表題化合物は反応系で１NのNaOHを用いてアイスバス中にて反応を行うことで脱アセチル化し、その後所定の濃度にバッファーで希釈して使用した。
【００４９】
〔実施例２〕本発明のヘキセンウロン酸誘導体を使用した酵素活性測定
本発明のヘキセンウロン酸誘導体が酵素アッセイ用基質として実際にヘキセンウロニダーゼにより加水分解を受け、それにより発生した蛍光を測定することにより、簡便、容易、更には優れた定量性をもって酵素活性を測定できることを以下に示す。
【００５０】
（１）粗ヘキセンウロニダーゼ酵素液の調製と活性測定
グルコース1.0%、ペプトン0.5％、酵母抽出物0.5％、K2HPO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.02％を含む液体培地10ml（pH7.0）を、内径25mmの試験管に採り、紙栓をした後121℃で15分間蒸気滅菌した。これにパニバチルス・エスピー(Paenibacillus sp)7−5（受託番号FERM  P-18225）を１白金耳植菌し、37℃で往復振盪培養した（振幅25mm、300往復／分）。上記条件にて24時間の培養終了後、遠心分離（10,000rpm×10分）して菌体を分離し、菌体を10mlの50mMリン酸バッファー(pH 7.0)に懸濁した。菌体の懸濁液は氷上で超音波破砕機を用いて出力10kHzにて5分間処理し、ヘキセンウロニダーゼの粗酵素液を得た。
【００５１】
200μMの実施例１で調製したヘキセンウロン酸誘導体（基質）の溶液をリン酸バッファー（pH7.0：100mM）にて調製した。この基質溶液10μlに対し上記粗酵素液10μlを添加して反応を開始し、30分間、37℃にてインキュベートした。その後グリシン−NaOHバッファー(pH10.5：500mM)の100μlを反応系に添加し酵素反応を停止させた。検量線は既知濃度の４−メチルウンベリフェロン（シグマ社製）を用いて作成した。ヘキセンウロニダーゼ活性は、上記の条件で１分間に１μmolのヘキセンウロン酸を生成する酵素量を１ユニット（Unit）とした。その結果、粗酵素液中のヘキセンウロニダーゼ活性は、0.05U/mlであった。
【００５２】
（２）ヘキセンウロニダーゼの精製と活性測定
グルコース1.0％、ペプトン0.5％、酵母抽出物0.5％、K2HPO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.02％、pH7.0の液体培地50mlを500 ml容の坂口フラスコに取り綿栓をした後、121℃で15分間蒸気滅菌した。これに上記（１）で得られた培養液を１ml加え、37℃で1日往復振盪培養（振幅10cm、100往復／分）した。培養終了後、遠心分離（8,000rpm×10分）により培養上清を得た。この培養上清を硫安分画し、20〜60％画分を遠心分離（20,000rpm×10分）により回収した後、0.9M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸バッファー（pH7.0）を外液として透析を行った。得られた粗酵素液について、0.9M硫酸アンモニウムを含む20mＭリン酸バッファー（pH7.0）で平衡化したブチルトヨパール650-M（直径2.5cm×30cm）を用いて疎水クロマトグラフィーを行った。平衡化に用いたバッファーを使って十分にカラムを洗浄したのち、リン酸バッファー中の硫酸アンモニウム濃度を0.9Mから0Mまで落とす濃度勾配で吸着画分を溶出し、3.5mlずつ分画した。その結果、ヘキセンウロニダーゼ活性は１つのピークで溶出した。
【００５３】
次に、活性画分を回収し、リン酸バッファー（pH7.0）を外液として透析し、同バッファーにて平衡化されたDEAEトヨパール650-Mにて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。同バッファーで洗浄後、バッファー中のNaCl濃度を0Mから0.5Mまで上昇させるグラジエントをかけて吸着画分を溶出し、3.0mlずつ分画した。ヘキセンウロニダーゼは一つのピークとして回収された。
【００５４】
回収したヘキセンウロニダーゼ画分をセントリコン（アミコン）にて容量を2.0mlにまで濃縮した。リン酸バッファー（pH7.0）を用いて平衡化されたセファクリルS-200（2.5cm×95cm）のカラムにヘキセンウロニダーゼをアプライしNaCl50mMを含む50mMリン酸バッファー（pH7.0）を用いてゲル濾過を行った。流速は30ml/時とし5mlずつ回収した。ヘキセンウロニダーゼは一本のピークとして回収された。
【００５５】
回収したヘキセンウロニダーゼ画分はセントリコンにて容量を1.0mlにまで濃縮した。次に濃縮された酵素サンプルを脱塩し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動は濃縮ゲル4.5%、泳動ゲル10%にて100mAにて泳動し、泳動の先端がゲル末端から5mmの位置にくるまで泳動した。ヘキセンウロニダーゼ活性は以下のようにして測定した。
【００５６】
泳動したポリアクリルアミドゲルを実施例１で得られた合成基質100μMを含むリン酸バッファー（pH7.0）中に浸し、40℃にて15分間保持し、ゲル中の酵素と該合成基質とを反応させた。UVランプにてバンドを照らすとゲルの中央より少し下側に酵素活性を示す青白い蛍光を発するタンパク質のバンドが確認された。この蛍光を発するタンパク質を含むゲルを切り出し、4℃にて24時間保持し、3mlの50mMリン酸バッファー（pH7.0）にて酵素蛋白を抽出した。酵素を含む抽出液は脱塩後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いタンパク質の純度を検定した。泳動は濃縮ゲルが4.5%、泳動ゲルが10%の濃度で行い、酵素蛋白が均一に精製されていることを確認した。粗酵素液に対する精製ヘキセンウロニダーゼの収率は0.28%であった。また精製ヘキセンウロニダーゼの比活性は3.59U/mgであった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のヘキセンウロン酸誘導体を基質として用いることにより、各種細菌の培養液または多細胞生物の培養細胞などからサンプル溶液を精製、濃縮することなく直接ヘキセンウロニダーゼの酵素活性を高感度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のヘキセンウロン酸誘導体の1つであるウンベリフェリル−4−デオキシ−ヘキス−4−エノピラシドウロン酸の合成経路を示す。
【図１】
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