(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆積、重合させた高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤の製造方法。
【化１】
0004106215.tif 000010
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ１，Ｒ２は、−ＣＨ２ＮＨ２基、またはＨを表し、少なくともＲ１，Ｒ２のいずれかは−ＣＨ２ＮＨ２基である。〕
【請求項２】
少なくとも基材上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤。
【化２】
0004106215.tif 000011
【請求項３】
基板上に請求項２の高分子薄膜を結合剤として有するバイオチップ。
【請求項４】
前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ物質が結合している請求項３のバイオチップ。
【請求項５】
前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている請求項３又は４のバイオチップ。
【請求項６】
前記結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている請求項３〜５のいずれかのバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体検査分野、医療分野などに有用な新規な高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤、およびその製造方法と、これを利用した遺伝子の発現、遺伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野等において使用する機器、例えばカテーテル等は、生体内に挿入され使用される。このように、生体内に異物である医療機器を導入することにより、生体免疫機構、生体防御機構などとの適合性が問題となる。
【０００３】
例えば、血栓症は、血液採集および処理システムのような医療機器の開発、使用において、最も障害となる問題の一つである。血液が異質の表面に接触するときに、体液および細胞の変化が起こる。このような材料の生体適合性を改善するために、抗凝固剤の固定化と、重合体表面上に生物学的に活性な抗凝血性物質を固定化することが必要とされている。
【０００４】
一方、細胞や組織における遺伝子発現の様態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロット）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
【０００５】
一方、遺伝子の研究の進展により解析を必要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００６】
このような要望に対して、最近、マイクロアレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまたはバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検出することである。
【０００７】
上記の方法を用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００８】
ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表面に固定する。
【０００９】
図２は、この従来の方法の原理を説明する図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプローブＤＮＡ２１が入っているマイクロプレート２２を用意する。一方、図２（ｂ）に示すように、プレート２３としてガラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレート２３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤２４をコーティングする。この後、マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡ２１をピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）２４がコーティングしてあるガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡ２１を接触させてスポットする。マイクロプレート２２に入っている全てのプローブＤＮＡ２１をスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このように、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮＡチップを製造していた。
【００１０】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００１１】
このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーティングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残る場合もある。
【００１２】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【００１３】
しかし、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないため、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブリダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があった。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
【００１４】
このような問題を解消すべく、結合材として種々の材料が検討されているが、未だ有効な材料が得られていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造方法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチップを提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
すなわち上記目的は、以下の本発明の構成により達成される。
（１）下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆積、重合させた高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤の製造方法。
【００１７】
【化３】
0004106215.tif 000002
【００１８】
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ１，Ｒ２は、−ＣＨ２ＮＨ２基、またはＨを表し、少なくともＲ１，Ｒ２のいずれかは−ＣＨ２ＮＨ２基である。〕
（２）少なくとも基材上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤。
【００１９】
【化４】
0004106215.tif 000003
【００２０】
（３）  基板上に上記（２）の高分子薄膜を結合剤として有するバイオチップ。
（４）  前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ物質が結合している上記（２）または（３）のバイオチップ。
（５）  前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている上記（２）〜（４）のいずれかのバイオチップ。
（６）  前記結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている上記（２）〜（５）のいずれかのバイオチップ。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の高分子薄膜は、下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆積、重合させて製造することができる。
【００２２】
【化５】
0004106215.tif 000004
【００２３】
上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は双方とも−ＣＨ2ＮＨ2 基であってもよい。
【００２４】
このような原料化合物を用い、これを蒸発させ、基板上に堆積、重合させると、下記構造式（II）で示されるような構造単位を有する高分子薄膜が得られる。
【００２５】
【化６】
0004106215.tif 000005
【００２６】
上記式（II）において、ｎ，ｍは整数であり、ｎ＝０であってもよいが、ｍ＝０となることはない。ｍ／ｍ＋ｎは１に近いほどフィルム中の−ＣＨ2ＮＨ2 基が多いこととなり、望ましいといえるが、特に限定されるものではない。
【００２７】
上記高分子薄膜を基材上に形成することにより、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用に機能し、種々の生化学物質、タンパク、プローブ等を良好に固定することができる。このため、医療機器の表面にこの高分子膜を形成し、免疫抑制剤、血液凝固抑制剤等を固定すれば、生体適合性を有する機器が得られる。
【００２８】
さらに、この高分子薄膜を適当な基材、基板上に形成することにより、水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチップを得ることができる。
【００２９】
このようなバイオチップは、基板とプロ−ブ、特にＤＮＡとをより確実に結合させることができ、水洗い工程等でもプローブ、サンプルが基板から流れ落ちることなく、プローブ、サンプルを有効に活用することができる。
【００３０】
構造式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは蒸着法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、これを基板上に重合・堆積させることで、ガラス等の基板と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ基（ＮＨ2 ）がプローブと良好に結合して、プローブを基板上に強固に固定することができる。特に、プローブにＤＮＡを用いた場合、ＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ4 ）と結合して、プローブＤＮＡを基板上に良好に固定することができる。
【００３１】
また、アミノ基がメチレン基（−ＣＨ2 −）を介してキシリレン主鎖に結合しているので、アミノ基が直接結合している場合に比べ塩基性が増し、ＤＮＡ等との静電結合が強まる。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は、以下の方法により製造することができる。
【００３３】
先ず、［２．２〕−パラシクロファンを、塩化メチレン等の溶剤中で、鉄、ヨウ素などの触媒の存在下、臭素を滴下することによって臭素化する。また、必要によって冷却してもよい。反応の進行状況は、ガスクロマトグラフィーで追跡し、所定の組成に達したら反応を終了し、過剰の臭素は亜硫酸ナトリウム水溶液等ので中和する。その後、溶剤を留去し、残った結晶を再結晶により生成し、ブロモ−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３４】
得られたブロモ−［２，２］−パラシクロファンと、当量よりやや過剰のシアン化銅を、Ｎ−メチルピロリドン等の溶媒中、２００〜２５０℃に加熱反応する。その後、アンモニア水を加え、銅化合物を溶解すると共に目的物を沈殿させる。得られた粗結晶を、再結晶あるいは昇華、またはこれらの組み合わせにより精製し、シアノ−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３５】
次いで、シアノ−［２，２］−パラシクロファンを、接触還元、あるいはテトラヒドロフラン等の溶媒中で水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて還元し、アミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３６】
このようにして得られた構造式（Ｉ）のアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンは、以下の化学蒸着法を用いて、基材上に高分子膜として成膜することができる。
【００３７】
先ず、図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意する。なお、図１において、蒸発部１１には蒸発材料を導入する開口部シャッタ１１ａを有し、さらに蒸発部１３にはトラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されている。
【００３８】
図示例の蒸着装置において、先ず蒸発部１１に固体状の蒸発材料モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを導入する。蒸発部１１の温度を、モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンが気化する温度、好ましくは８０〜２００℃、特に１００〜１８０℃に加熱すると、蒸発材料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成する。
【００３９】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガスをその分解温度、好ましくは６００〜７５０℃、特に６５０〜７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとする。
【００４０】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入する。蒸着室１３内は、所定の真空度、好ましくは１０〜５０mTorr、特に２０〜３５mTorrに保持されている。そして、導入された原料ガスが基板に接触すると、その界面で重合し、高分子膜が形成される。
【００４１】
このようにして得られた高分子は、下記構造式（II）で表されるものである。
【００４２】
【化７】
0004106215.tif 000006
【００４３】
上記式（II）において、ｍ、ｎは整数であり、ｎは０であってもよい。
【００４４】
成膜された、高分子膜はその膜厚が１分子分でもよいが、通常０．０５〜１０μm 、好ましくは０．１〜１μm 程度である。なお、この薄膜は、［２，２］−パラシクロファンあるいはクロロ−［２，２］−パラシクロファンからのフィルムに積層することもできる。
【００４５】
また、成膜時に所定パターンのマスクを用い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸着を行うことにより、精度よく結合剤含有層パターンを形成することができ、不必要な部分にプローブや試料、例えばＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎを悪化させることを防止することができる。
【００４６】
本発明の高分子膜は、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用である。また、ＤＮＡ等のプローブを固定したバイオチップの固定化基質として有用である。組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤、プローブとしては具体的にはタンパク、抗原、レセプター、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片等を挙げることができる。なかでも、ＤＮＡ等の遺伝子を固定化すると優れたバイオチップが得られる。
【００４７】
本発明で得られた高分子膜の固定化基質、つまり結着層として有するバイオチップは、プローブとの結合が良好であり、水洗い工程等においてもプローブが剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用することができる。
【００４８】
基材の材質は、透明なガラス、シリコンまたはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による解析の容易さによるものである。シリカ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。なお、本発明の結着層と基材との結合性を考えると、上記ポリマーなどの樹脂材料も好ましく、さらに結合性を改善するために基材との間にカップリング剤を介在させてもよい。
【００４９】
プローブとして用いられるＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００５０】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、プラスチックプレートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
【００５１】
点着されるＤＮＡ断片は、基板表面に対して、１０2 〜１０5 種類／cm2 の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15 モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。
【００５２】
アミノ基に対するＤＮＡの固定化には、静電相互作用を利用する方法、ＵＶクロスリンカーを用いる方法などがあるが、本発明では何れのものを用いてもよい。
【００５３】
点着後は、必要に応じて乾燥し、固定されなかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００５４】
前記記載の基板表面上のドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００５５】
上記のようにして作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸とのハイブリダーゼーションである。
【００５６】
サンプルである標的核酸としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
【００５７】
標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００５８】
標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好ましい。
【００５９】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００６０】
ハイブリダイゼーションは、プラスチックプレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あるいは分散された水性液を、上記で作製したバイオチップ上に点着することが好ましい。点着の量は、１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００６１】
バイオチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないことである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のバイオチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００６２】
【実施例】
〔実施例１〕
＜モノブロモ−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
［２．２〕−バラシクロファン７５g と、塩化メチレン３．７Ｌの溶液に還元鉄３．０g と水０．３g を加え、３０℃以下で、撹拌下、臭素７３．５g を滴下した。反応は、ガスクロマトグラフィーで追跡し、未反応の［２，２］−パラシクロファンが３．０％まで減少した時点で、８０g チオ硫酸ナトリウム／１．５Ｌ水の溶液を加えた。
【００６３】
次に、塩化メチレン層を分取し、水酸化ナトリウム水溶液を加え、塩化メチレンを留去した。析出した沈殿を濾取、洗浄、乾燥し、１０５．５g の粗結晶を得た。これを３２０g のトルエンに加熱溶解、熱時濾過し、不溶物を除去した。さらに、このトルエン溶液を濃縮し、冷却した。析出した沈殿を濾取、乾燥して、８１．０g のモノブロモ−［２，２］−パラシクロファンを得た。
【００６４】
この化合物の、ガスクロマトグラフィー分析による組成は以下の通りであった。
［２，２］−パラシクロファン                      ４．０％
モノブロモ−［２，２］−パラシクロファン        ９４．９％
ジブロモ−［２，２］−パラシクロファン            １．０％
【００６５】
＜モノシアノ−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
上記化合物３５g に、シアン化銅１６．４g 、Ｎ−メチルピロリドン２００mlを加え、１９５〜２０５℃で２０時間撹拌した。その後、１０％アンモニア水１．０Ｌを加え、析出した沈殿を濾取、洗浄、乾燥し、３８．９g の粗結晶を得た。これを、３０g のアセトンに加熱溶解、熱時濾過して不溶物を除去した。溶液は蒸発乾固して、２６．４g の粗結晶を得た。これを昇華精製し、６０g のエタノールで再結晶を行い、２２．３g のモノシアノ−［２，２］−パラシクロファンを主成分とする化合物を得た。
【００６６】
この化合物の、ガスクロマトグラフィー分析による組成は以下の通りであった。
［２，２］−パラシクロファン                      ３．０％
モノシアノ−［２，２］−パラシクロファン        ９４．５％
ジシアノ−［２，２］−パラシクロファン            １．８％
【００６７】
＜モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
氷浴中で冷却した、テトラヒドロフラン５００g 中に水素化リチウムアルミニウム１５ｇを加え、２で得た化合物１５g をテトラヒドロフラン１００g に溶解させた溶液を撹拌しつつ、２０℃以下で滴下した。
【００６８】
その後、ガスクロマトグラフィーによる分析で、未反応のモノシアノ−［２，２］−パラシクロファンが１％以下になるまで、室温で撹拌を継続した。反応終了後、氷浴中で冷却しながら水１００g を加え、析出した不溶分を濾別、除去した。溶液は蒸発乾固した。得られた粗結晶に３００g のメタノールを加え、加熱溶解、室温まで冷却後、不溶物を濾別、除去した。この溶液を蒸発乾固して、１３．８g のモノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを主成分とする化合物を得た。
【００６９】
この化合物の、ガスクロマトグラフィー分析による組成は以下の通りであった。
［２，２］−パラシクロファン                      ３．０％
モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン  ９４．１％
ジアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン      １．１％
【００７０】
＜高分子薄膜の形成＞
図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意した。
【００７１】
図示例の蒸着装置において、蒸発部１１に、式（Ｉ）の構造を有する固体状の蒸着材料モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを導入した。蒸発部１１の温度を、１００〜１５０℃に加熱すると、蒸発材料が気化して下記構造のダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。
【００７２】
【化８】
0004106215.tif 000007
【００７３】
上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は、双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
【００７４】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入した。この分解部１２では、下記式に示すように、導入された原料ガスを、その分解温度７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとした。
【００７５】
【化９】
0004106215.tif 000008
【００７６】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入した。蒸着室１３内は、最大３０．１mmTorrの真空度に保持されている。そして、導入された原料ガスがガラス基板界面で重合し、下記構造の高分子膜が形成された。なお、このとき高分子膜とガラス基板との結合性を改善するために、ガラス基板表面をシランカップリング剤で処理してもよい。
【００７７】
【化１０】
0004106215.tif 000009
【００７８】
次に、プローブＤＮＡとして、５’末端にＣｙ３またはＣｙ５が標識された３０mer の合成ＤＮＡの１００μＭ水溶液を用意した。マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。プローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造した。
【００７９】
アミノ基に対するＤＮＡの固定化は、静電相互作用を利用する方法と、ＵＶクロスリンカーを利用する方法の双方を試みた。静電相互作用を利用する場合、調湿チャンバーにて一晩放置し、その後８０℃で一晩乾燥し、ＵＶクロスリンカーを用いる場合には、２分間ＵＶクロスリンカー内に放置した。さらに、各サンプルを蒸留水にて一晩洗浄した。
【００８０】
得られた各サンプルについて、ＤＮＡ固定化前（スポット時）と、固定化／水洗後の蛍光を観察し、プローブの固定状体を評価した。
【００８１】
本発明サンプルは、スポット後、ＵＶ照射後に均一なスポットが確認できた。また、洗浄後、過剰なＤＮＡがスポット部位以外にも付着する場合があり、この結着層が容易に、しかも極めて強固にＤＮＡと結合することがわかった。このため、背景の雑音を低減するためには、実際の使用にあたって、スポット部位以外にマスクするか、結着層自体をマスク蒸着するか、蛍光観察領域をスポット部位だけに限定することが望ましい。
【００８２】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造方法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチップを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のバイオチップを製造するための装置の概略構成を示したブロック図である。
【図２】バイオチップの製造工程を示した模式図である。
【符号の説明】
１１    蒸発部
１２    分解部
１３    蒸着部
１４    トラップ
１５    真空ポンプ
２１    ＤＮＡ
２２    マイクロプレート
２３    基板
２４    結合剤含有層
【図１】
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【図２】
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