(57)【要約】  本発明は、サンプル中の疑われる核酸配列を決定（determining）、同定、検出及びアノテーションする方法に関する。特に、本発明の方法はサンプル中に存在する核酸変異をアノテーションすることを可能にする。該方法は、サンプルから得た核酸のハイスループットシークエンシングにおいて得られるデータに基づく。本発明は、本発明の方法を実行することが可能なコンピュータプログラム及びそれぞれのコンピュータソフトウェアを動かすのに好適な装置にも関する。【選択図】図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する疑いがある核酸配列中の変異をアノテーションする方法であって、
a）対象となる少なくとも1つの核酸配列を選択する工程と、
b）単離核酸を用いてシークエンシング用の鋳型を準備する工程と、
c）前記鋳型のハイスループットシークエンシングを行う工程と、
d）潜在的参照配列を含むデータベースを準備する工程と、
e）核酸配列中のヌクレオチド変異をグループ化し、同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程と、
f）工程e）において同定された変異を、配列データベースを用いてアノテーションする工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
d）において言及される前記データベースが対象となる核酸に対応する野生型配列を含み、又は
d）において言及される前記データベースが対象となる核酸に対応する野生型配列を含み、該野生型配列の変異を更に含む、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記データベースがCOSMICデータベースである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ゲノムDNA配列及びコードDNA配列を決定することを更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
1つの工程でゲノムDNA配列及びコードDNA配列を決定することを更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アンプリコン領域の範囲外の変異をフィルタリングにより除外することを更に含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コードされるアミノ酸配列を決定することを更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中に存在する疑いがある核酸配列中の変異を同定する方法であって、
a）対象となる少なくとも1つの核酸配列を選択する工程と、
b）単離核酸を用いてシークエンシング用の鋳型を準備する工程と、
c）前記鋳型のハイスループットシークエンシングを行う工程と、
d）潜在的参照配列を含むデータベースを準備する工程と、
e）核酸配列中のヌクレオチド変異をグループ化し、同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程と、
f）工程e）において同定された変異を、配列データベースを用いてアノテーションする工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
d）において言及される前記データベースが対象となる核酸に対応する野生型配列を含み、又は
d）において言及される前記データベースが対象となる核酸に対応する野生型配列を含み、該野生型配列の変異を更に含む、
請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記データベースがCOSMICデータベースである、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
ゲノムDNA配列及びコードDNA配列を決定することを更に含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
1つの工程でゲノムDNA配列及びコードDNA配列を決定することを更に含む、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アンプリコン領域の範囲外の変異をフィルタリングにより除外することを更に含む、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
コードされるアミノ酸配列を決定することを更に含む、請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
同定される前記変異が一塩基突然変異（SNP）、多塩基突然変異、イントロンに及ぶヌクレオチドコドンによってコードされる突然変異、挿入及び欠失を含む群から選択される、請求項8〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
疾患を診断する工程を更に含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が感染性疾患又は新生物疾患である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
サンプルを分析した対象に対する治療処置を選択することを更に含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療処置を変異標的核酸の存在についての結果に基づいて選択する、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが臨床サンプルである、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中の核酸アイソフォームの有無（頻度）を決定する方法であって、
a）対象となる少なくとも1つの核酸配列を選択する工程と、
b）単離核酸を用いてシークエンシング用の鋳型を準備する工程と、
c）前記鋳型のハイスループットシークエンシングを行う工程と、
d）潜在的参照配列を含むデータベースを準備する工程と、
e）核酸配列中のヌクレオチド変異をグループ化し、同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程と、
f）工程e）において同定された変異を、配列データベースを用いてアノテーションする工程と、
を含む、方法。
【請求項２２】
サンプル中の核酸配列アイソフォームを定量化する方法であって、
a）対象となる少なくとも1つの核酸配列を選択する工程と、
b）単離核酸を用いてシークエンシング用の鋳型を準備する工程と、
c）前記鋳型のハイスループットシークエンシングを行う工程と、
d）潜在的参照配列を含むデータベースを準備する工程と、
e）核酸配列中のヌクレオチド変異をグループ化し、同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程と、
f）工程e）において同定された変異を、配列データベースを用いてアノテーションする工程と、
を含む、方法。
【請求項２３】
サンプル中の核酸配列の変異を検出する方法であって、
a）対象となる少なくとも1つの核酸配列を選択する工程と、
b）単離核酸を用いてシークエンシング用の鋳型を準備する工程と、
c）前記鋳型のハイスループットシークエンシングを行う工程と、
d）潜在的参照配列を含むデータベースを準備する工程と、
e）核酸配列中のヌクレオチド変異をグループ化し、同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程と、
f）工程e）において同定された変異を、配列データベースを用いてアノテーションする工程と、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記変異が参照野生型核酸配列と比較して少なくとも1つの一塩基変動を有する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異が参照野生型核酸配列と比較して少なくとも2つの塩基変動を有する、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異が参照野生型核酸配列と比較して多塩基変動を有する、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記変異が、野生型アミノ酸配列と比較して少なくとも1つの修飾アミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードする、請求項21〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記変異が野生型アミノ酸配列と比較して少なくとも1つの修飾アミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードし、アミノ酸修飾が薬物に対する感受性又は反応性の変更をもたらす、請求項21〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬物が抗癌薬、抗ウイルス薬又は抗菌薬から選択される、請求項21〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法の工程を実施するソフトウェアパスを備えるソフトウェア製品。
【請求項３１】
請求項30に記載のソフトウェアにおいて規定される方法工程を読み込み、実行することの可能な装置。
【請求項３２】
請求項30に記載のソフトウェアにて与えられた方法工程を実行することが可能である、請求項31に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断用途、好ましくはハイスループットシークエンシングを用いた臨床診断の分野における方法及び製品に関する。該方法により野生型核酸配列及びその変異（variants：変異体）の有無の決定、並びに野生型及び／又は変異核酸配列の頻度の定量化が可能となる。本発明は、野生型アミノ酸配列と比較した場合に、変異核酸配列が修飾アミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードすることの発生率及び／又は頻度を検出する、改善された方法を更に可能にする。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断の分野では、所与の標的配列、例えば疾患関連核酸配列（例えば癌遺伝子又は病原体に由来する核酸）の有無を正確に知ることが重要であり得る。さらに、幾つかの標的核酸配列の発生の頻度を知ることが重要である場合もある。
【０００３】
PCRに基づいて対象となる核酸配列を検出する方法が、標的核酸を検出するために近年大いに用いられている。しかしながら、例えば癌の発症に関与する遺伝子、又は野生型配列の変異として存在するウイルス由来の遺伝子等の種々の変異中に存在する核酸を検出すべき場合に、標的核酸の検出においてPCRが十分に正確でないという状況が見られる。KRASは多くの異なるヒト癌の発症に関係する遺伝子の一例である。KRAS遺伝子は、遺伝子の幾つかの異なる位置での核酸突然変異を特徴とする様々なアイソフォームで存在する。これらの核酸突然変異は大半が一塩基突然変異（single nucleotide mutations）（SNP）であり、野生型アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドコドン変化を生じ得る。かかる突然変異は、その活性化状態又は幾つかの薬物によって阻害されるその可能性という点でのタンパク質の表現型の変更と関連する場合がある。
【０００４】
別の例を提示すると、HCV又はHIV等の幾つかのウイルスが多数の遺伝子型で存在することが知られている。これらの遺伝子型は核酸配列レベル及びアミノ酸配列レベルの両方で互いに異なる。幾つかの治療用途については、ウイルスタンパク質中の突然変異が抗ウイルス薬、例えばインターフェロン、又はウイルスプロテアーゼ阻害剤若しくはウイルス逆転写酵素の阻害剤の投与を伴うHIV感染者の高活性抗レトロウイルス療法（Highly ActiveAnti-Retroviral Therapy；HAART）に使用される薬物に対する感受性又は耐性の変更と関連し得るため、ウイルス遺伝子型（複数の場合もあり）を知ることが重要である。
【０００５】
核酸をサンプル、例えば臨床サンプルから単離し、PCRによって分析する場合、方法の感度は異なる核酸配列の検出に十分でない場合もある。特にマルチプレックスPCR法におけるプライマー二量化、プライマー又はプローブの異なる又はこれまで未知のアイソフォームへの不十分な結合、並びに標的配列の既知の全ての核酸アイソフォームを検出するための大量の材料、例えばプライマー及びプローブが診断用途において問題となる。さらに、数多くの異なる核酸配列を同定するために多数のPCR反応を設定及び実施するコスト及び労力により時間がかかり、困難であり、失敗が多い。
【０００６】
これらの欠点は、「次世代シークエンシング」（Next Generation Sequencing；NGS）とも称されるハイスループットシークエンシングを用いることで克服することができる。NGSはシークエンシングプロセスの自動化、シークエンシングすべきサンプルの調製及びデータ分析の進歩のために、ますます信頼性かつ安価なものとなっている。NGSは膨大な量のシークエンシングデータを比較的短時間で提供する。さらに、NGSにより核酸配列の種々のアイソフォームの検出が高精度で可能となる。NGSを用いて核酸を分析することで、多種多様な対象となる標的配列をカバーする複数の予め増幅された標的配列がシークエンシングされる。例えば標的核酸がウイルス遺伝子である場合、サンプルから単離された核酸を、例えばPCRを用いて初めに増幅し、得られる複数のPCR配列をシークエンシングする。
【０００７】
PCRを実施するためのオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列の幾つかのアイソフォームが同時増幅されるように選択する場合、増幅産物も複数の異なるアイソフォームを含有する。PCR産物のシークエンシングは増幅された核酸配列の同一性の決定を可能にするだけでなく、対象となる特定の配列の有無の決定も可能にする。最後に、シークエンシングによりサンプル中の1つ又は複数の異なる核酸アイソフォームの発生の頻度を決定することも可能となる。
【０００８】
例えばサンプルが5 %のアイソフォームA、30 %のアイソフォームB及び65 %の野生型核酸配列（C）を含有する場合、NGSベースの分析により提供される情報はサンプルから得られた核酸配列に関するものだけではない。NGSにより該核酸がサンプル中に存在する頻度（%）の決定も可能となる。かかる情報は、例えば臨床サンプルを得た患者に適切な療法を選ぶうえで重要であり得る。
【０００９】
しかしながら、得られる核酸配列情報の正確な分析には問題がある。先に述べたように、NGSは異なる長さの数千の配列読取り、部分的に非コード核酸配列フラグメントを含有し得る配列及びこれまで知られていない配列、例えば新規の一塩基突然変異又は多塩基突然変異、挿入、欠失を含む配列等を提供する。したがって、得られるデータを正確かつ効率的に分析し、フラグメントをアラインメントし、無関係の情報を除外し、関連する新たな核酸配列アイソフォームを無視せずにアーチファクトとして認識する必要がある。
【００１０】
NGSは以下の4つの工程から本質的になる：
サンプル材料の採取、核酸の単離及び精製；
cDNAを得るための鋳型、例えば二本鎖DNA、逆転写RNAの生成、DNAの断片化、サイズ選択及びオリゴヌクレオチドアダプターライゲーションを含むシークエンシングライブラリーの準備。用いられるNGS技術に応じて、ライブラリーは直接シークエンシングされるか（単一分子鋳型）、又はシークエンシング前にクローン増幅される；
並行シークエンシング反応、例えばパイロシークエンシング、イオン半導体シークエンシング等における先に作製したシークエンシングライブラリーのシークエンシング；
シークエンシング後のデータ分析。
【００１１】
Rizzo and Buck（非特許文献1）によると、NGSの重要な制約の1つは大量のデータを分析する必要があることである。NGS反応によりメガ塩基〜ギガ塩基の範囲の配列データセットが生成するため、分析にはシークエンシング、データ追跡、蓄積及び品質管理の全ての段階で極めて精密な情報技術が必要とされる。Rizzo and Buck（非特許文献1）には、これらの多大なデータ収集能力によりゲノム研究におけるボトルネックがデータ取得からデータ分析及び解釈へと移行すると記載されている。NGS機器はデータを迅速に生成するため、かかるデータセットの分析が可能な分析アプローチが常に必要とされる。概して、初期分析（「ベースコーリング」とも称される）はシークエンシングプラットホーム上で専用のソフトウェアによって実施される。ベースコーリングの後、シークエンシングデータを利用可能な場合に参照ゲノムとアラインメントするか、又はde novoアセンブリを実施する（Rizzo and Buck、非特許文献1）。配列アラインメント及びアセンブリは計算的研究の盛んな分野であり、新たな方法が開発されている（Flicek and Birney、非特許文献2）。配列を参照ゲノムとアラインメントした後、データを分析する必要がある。NGS実験に由来する配列データの品質及び量により、下流の分析をどの程度包括的かつ正確にすることができるかが最終的に決定される。
【００１２】
定性的には、個々のベースコーリング誤差率はNGSプラットホームによって異なる。全てのNGSプラットホームが個々のベースコールの各々について信頼スコアを提供し、研究者はそれらの配列データを検索する場合に異なる品質フィルターを使用することが可能となる。定量的には、配列データの量はシークエンシング「カバレージ（coverage：包括度）」の計量によって評定することができる（Rizzo and Buck、非特許文献1）。本明細書で使用される場合、配列カバレージ（「深度」とも呼ばれる）は、所与の実験において塩基対をシークエンシングする平均回数を指す。定性的には、不均等な配列カバレージは配列変異の分析を妨げる可能性もある。不均一な読取り分布を有する完全にシークエンシングされたサンプルは、依然としてゲノムの相当部分がシークエンシングされていないか又はシークエンシングが不十分であり、これらの領域の分析では一塩基多型（SNP）、点突然変異又は構造変異等の配列変動を同定することはできない。これは、これらの位置がシークエンシングされていないか又はシークエンシング誤差によって混同しているためである（Rizzo and Buck、非特許文献1）。最終的に、カバレージ深度、分布及び配列品質により、どの情報を各々のシークエンシング実験から読み出すことができるかが決定される。
【００１３】
構造変異（例えば挿入、欠失、転座）の発見のためには、現行の（第二世代）プラットホームによる完全なヒトゲノム配列の正確な同定において、不均等な読取り分布及びシークエンシング誤差を克服するのに、およそ20倍〜30倍の配列カバレージが必要とされる（非特許文献3）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Key Principles and Clinical Applications of "NextGeneration" DNA sequencing, Cancer Prev Res (Phila), 2012 Jul;5(7):887-900
【非特許文献２】Sense from sequence reads: methods for alignment and assembly. NatMethods 2009; 6: S6-12
【非特許文献３】Thompson JF, Milos PM, The properties and applications ofsingle-molecule DNA sequencing Genome Biol. 2011;12(2):217. doi:10.1186/gb-2011-12-2-217
【発明の概要】
【００１５】
上記のことから、NGSシークエンシング法によって得られるデータの分析が重要な問題であることが示される。本発明は、特に対象となる核酸、例えば核酸配列の特定のアイソフォームの有無の検出においてかかるデータを分析する方法に関する。したがって、本発明の方法は遺伝子、例えば癌遺伝子の特定のアイソフォームの存在、又は幾つかの疾患の存在及び重症度と関連し得る病原体の遺伝子、例えば幾つかの抗生物質に対する耐性と関連する黄色ブドウ球菌（S. aureus）の遺伝子と関連する幾つかの疾患又は障害の診断において用いられ得る。さらに本発明の方法により、これまで未知の核酸配列アイソフォームの検出が可能となる。本発明の方法により、サンプルが野生型配列と比較して変更されたアミノ酸配列をコードする核酸配列アイソフォームを含有するか否かを高い信頼性及び精度で同定することも可能となる。本発明の方法は、このようにして評価されたデータの治療用途、例えば分析結果の解釈に応じて所与の患者を特定の薬物を用いて治療することができるか否かにも関する。例えば、シークエンシングデータの分析によりアミノ酸残基が突然変異しているという所見が得られる場合、医師はその後の療法をこの所見に基づいて行うことができる、すなわち所与のアミノ酸突然変異の有無により或る特定の薬物による療法が奏功するか否かが示唆され得る（例えばGenentechの特許を参照されたい）。さらに、シークエンシングデータの分析結果としてウイルス遺伝子型（例えばHCV又はHIV）の有無が確認される場合、担当医師は合理的な奏功への期待をもって或る特定のウイルス静止薬物（例えばγインターフェロン、RT阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等）が使用され得るか否かを決定することができる。本発明は上記の課題に対する解決策を提供するものである。本発明の他の態様は発明を実施するための形態において説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、幾つかのゲノム標的配列におけるイントロン及びエクソンの存在のために、2つの塩基がゲノム位置内では近接せず、コード配列位置内で近接する可能性があることを説明する
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（the singular forms of "a" and "an"）は文脈により特に明確に指定のない限り、対応する複数形も包含する。
【００１８】
本発明に関連して「約」という用語は、対象となる特徴の技術的効果が依然保証されると当業者が理解する精度間隔を指す。「通例」という用語は±10%、好ましくは±5 %の指定数値からの偏差を示す。
【００１９】
「含む（comprising）」という用語は限定するものではないことを理解する必要がある。本発明の目的上、「からなる（consisting of）」という用語は「含む」という用語の好ましい実施の形態であるとみなされる。以下で或る群が少なくとも或る特定数の実施の形態を含むと規定されている場合、これは好ましくはこれらの実施の形態のみからなる群も包含することを意味する。
【００２０】
「存在の検出」という用語は、本明細書で使用される場合、「有無の検出」を意味するものとして理解される。本出願において特許請求される方法において述べられているように、分析対象のサンプルは病原体の存在の指標となるコンセンサス核酸配列（標的配列と称されることもある）を含む核酸を含むことが疑われる。
【００２１】
本発明において、「標的配列」という表現は例えば病原体に特異的なゲノム領域を表す。代替的には、標的配列は癌遺伝子であってもよく、又は疾患におけるその役割が知られている遺伝子であってもよい。例えば幾つかの炎症性疾患、自己免疫性疾患、又は代謝性疾患若しくは障害に対する素因に関与する突然変異が存在する。
【００２２】
決定すべき病原体、存在及び標的配列の例としてC型肝炎ウイルスを挙げることができる。本発明の方法ではHCVの2つ以上の核酸配列変異、すなわち該病原体の2つ以上の遺伝子型、亜型又は株が存在することが考慮される。例えば、HCVのNS5Bゲノム領域によって、サンプル中のHCVの存在を特定することが可能となる。しかしながら、このゲノム領域にはいくつかの遺伝子型及び亜型が存在する、すなわちゲノム領域は全てのHCV遺伝子型の指標となるコンセンサス配列を含んでいるが、これらの個々の遺伝子型及び亜型は異なる核酸配列又は該核酸配列の変異を有している。本発明による方法において分析される重要な標的核酸は感染経過、微生物の毒性及び／又は病原性、及び／又は抗ウイルス薬、抗生物質に対する耐性等に影響を与えるウイルス又は微生物、例えば細菌の遺伝子である。
【００２３】
本発明に関連して、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の自然発生的なデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。核酸は特に、二本鎖DNA及び一本鎖RNAとすることができる。
【００２４】
「配列」という用語は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーにおける塩基の連続発生（sequential occurrence）を指し、デオキシリボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、T、G及びCからなる群から選択され、リボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、U、G及びCからなる群から選択される。そのため、デオキシリボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAGCAAGCCTであり得る一方、リボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAUCGAUであり得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、標的配列を含む核酸の存在について試験することができる任意のヒト又は動物（veterinary）対象由来の任意の生物学的サンプルを指す。サンプルとしては、例えば肺組織等の任意の器官から得られる組織、並びに例えば血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、脳脊髄液、羊水、羊膜帯血、涙液、唾液及び鼻咽頭洗浄液等の任意の器官から得られる体液が挙げられ得る。上記で挙げられたように、サンプルは身体の特定の領域、例えば気道由来のものであってもよく、気道由来のサンプルとしては、咽頭ぬぐい液、咽頭洗浄液、鼻腔ぬぐい液及び下気道由来の検体が挙げられる。
【００２６】
サンプルは特に、ヒト又は動物対象由来のものとすることができる。したがって、「患者」はヒト又は動物対象とすることができる。「臨床サンプル」について言及する場合、このことはサンプルが標的配列を含む核酸を有する病原体に感染している疑いのある患者由来のものであることを示している。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「増幅」という用語は核酸標的のコピーを数十億生成することが可能な酵素媒介性の手法を指す。当該技術分野において既知の酵素媒介性の標的増幅手法の例としてはPCRが挙げられる。例えば（RT-）PCRを用いたゲノム領域の増幅、及び増幅産物のシークエンシング、並びに本発明の方法を用いた後続の分析により、既知若しくは未知であり得る特定の遺伝子突然変異、又は標的核酸の野生型が増幅核酸を得たサンプル中に存在するか否かを決定することが可能となる。
【００２８】
「PCR反応」は、米国特許第4,683,195号においてMullis et al.によって、また米国特許第4,683,202号においてMullisによってDNAの増幅に対して初めて記載され、当業者に既知のものである。PCR法では、DNAのサンプルを、DNA二重鎖の各鎖の3'端に相補的に調製された、モル過剰の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー（上記参照、フォワード及びリバースプライマー）と、モル過剰のヌクレオチド塩基（すなわちdNTP）と、オリゴヌクレオチドプライマー及びdNTPからのDNAの形成を触媒する熱安定性DNAポリメラーゼ（好ましくはTaqポリメラーゼ）とが入った溶液中で混合する。プライマーの内、少なくとも1つが変性DNA分析物の1つの鎖（上記定義ではナンセンス鎖）の3'端に5'→3'方向で結合するフォワードプライマーであり、それ以外が変性DNA分析物のもう一方の鎖（上記の定義ではセンス鎖）の5'端に3'→5'方向で結合するリバースプライマーである。この溶液を約94℃〜96℃に加熱することで、二本鎖DNAを一本鎖DNAへと変性させる。溶液を冷却し、いわゆるアニーリング温度に達すると、プライマーは分離した鎖と結合し、DNAポリメラーゼが、dNTPとプライマーとを結び付けることにより分析物の新たな鎖を触媒する。このプロセスを繰り返し、プライマーから合成された伸長産物をその相補配列から分離する。各伸長産物は他のプライマーから合成される相補伸長産物の鋳型として働く。各サイクルの後に配列は二倍に増幅することから、膨大な数のコピーの理論的な増幅を、数時間、このプロセスを繰り返すことで達成することができ、このようにして極めて僅かな量のDNAを、PCRを用いて比較的短期間にて増幅することができる。
【００２９】
PCR反応の出発材料がRNAである場合、逆転写を介してRNAから相補DNA（「cDNA」）を合成する。次いで得られたcDNAを、上記のPCRプロトコルを用いて増幅する。逆転写酵素は鋳型であるmRNA配列からDNAの相補的な一本鎖を合成することができるレトロウイルスにて見られる酵素として当業者に知られている。RNA産物を増幅するのに用いられるPCRは逆転写酵素PCR、すなわち「RT-PCR」と呼ばれる。
【００３０】
本明細書で使用されるハイスループットシークエンシングとの関連で、サンプルから抽出された核酸の増幅は、ハイスループットシークエンシング（又は次世代シークエンシング）の分野で技術者に既知のIon AmpliSeq法（Lifetechnologies, Inc.）を用いて行うことができる。当然ながら、サンプルに由来する核酸の増幅には他の方法を用いることも可能である。得られる配列情報を続いて本明細書で開示される方法及びデバイスを用いて分析する。
【００３１】
「シークエンシング」という用語は、分子生物学において一般的に意味するものとして本明細書にて用いられている。これにより、核酸配列における塩基の正確な連続発生が求められる。
【００３２】
「癌遺伝子」という用語は、本明細書では分子生物学及び腫瘍学のそれぞれにおいて一般的な意味で使用される。このため、例えば「正常又は野生型」遺伝子を催腫瘍性、すなわち発癌性に変える遺伝子において既知の突然変異が存在する。この点での例は、特定のシグナル（例えば成長誘導シグナル）が常に出され、対応するプロセスが開始されるようにキナーゼを構造上活性なものに変える突然変異である。本明細書で使用される「癌遺伝子」は、同様に発癌状況を生じる染色体内又は染色体間転座に関する場合もある。本発明において用いられる方法では、ヒトにおける癌又は新生物の発症を引き起こす又はそれに関与する癌遺伝子を標的化するのが好ましい。より特には、該方法は特定の薬物に対する癌の耐性の発現に関与する核酸変異の検出、決定及びアノテーションに好適である。これにより、本発明の方法は癌遺伝子の配列変異の決定及びアノテーションを可能にする。この情報は、例えばサンプルが分析される、すなわち標的化及び調査される核酸の由来元である患者にとって投与が任意の臨床的利点を有するか否かについての治療医師による治療決定の基礎となり得る。
【００３３】
「病原体」という用語は、本明細書で使用される場合、最も広い意味で用いられる。そのため、病原体は任意のタイプの細菌、古細菌（archaeum）、原生動物（protozoum）、真菌及びウイルスとすることができる。ウイルスは本明細書で使用される「微生物」の定義に含まれることをはっきりと述べる。
【００３４】
ゲノム変異は、シークエンシングされたサンプルと参照ゲノムとの間の任意の差異として規定される。しかしながら、本発明の方法は一塩基多型（SNP）、多塩基多型（MNP）、並びに小さな（約500 bp未満の）挿入及び欠失等の小規模変異の同定、検出に好適である。
【００３５】
個体内に存在する特定のゲノム変異に応じて、（例えば癌に対する）様々な薬物は異なって応答し得る。したがって、任意の治療を行う前に、薬物応答に影響を及ぼし得る特定の突然変異（変異）について試験することが好ましい。
【００３６】
COSMIC（癌における体細胞突然変異カタログ；Catalogue Of SomaticMutations In Cancer）は、癌に特異的な突然変異を含有するこのようなデータベースで最大のものである。しかしながら、薬物応答は通例タンパク質変化と関連するため、COSMIC等のデータベースはゲノム変化ではなく、タンパク質変化及びコード配列によってアノテーションされる。したがって、COSMICデータによるゲノム変異のアノテーションが大きな問題となる。
【００３７】
これは特に、COSMICによりアノテーションされる幾つかのタンパク質変化が、コード配列空間において複数の隣接塩基対又はコドンにわたる可能性があるためである。単一のコドンが2つのエクソンにわたる可能性があることから、コード配列空間内の2つの隣接塩基対は実際にゲノム空間内で数百塩基対離れている可能性がある。さらに、幾つかの突然変異が別の突然変異のサブセット又はスーパーセットである場合もある。
【００３８】
例えば皮膚癌と関連する遺伝子BRAF内の突然変異V600E（タンパク質配列中の600位のアミノ酸「V」がアミノ酸「E」に変化している）では、1799位のコード配列中の参照塩基「T」は塩基「A」へと突然変異する（これはコドン空間ではc.1799T>Aとして表される）。しかしながら、1798位のGがAになり、かつ1799位のTがAになることで生じる別の既知の突然変異V600K（c.1798_1799GT>AA）が存在する。第1の事例は実際に第2の事例のサブセットである。しかしながら、突然変異をアノテーションする場合、突然変異V600Eを有する患者を、V600Kを有する患者の治療に使用されるものとは異なる薬物で治療する必要があり得るため、2つの事例を厳密に分離する必要がある。
【００３９】
2つの突然変異位置が厳密に近接しない幾つかのアノテーションされる突然変異が存在し得ることにも留意されたい。例えば、事例c.1797_1799AGT>CGAが存在し得る。1798位は突然変異しておらず、変異コーラーによって選択されない。別の考え得る複雑な事例は、コード配列1798及び1799中の2つの塩基位置が実際に2つの異なるエクソン中にあるため、ゲノム配列内で数百塩基離れる可能性があることである。
【００４０】
全てのSNPアノテーション法又はコンピュータプログラム、例えば本発明のSNPアノテーション法又はコンピュータプログラムの前に2つの工程が行われる。第一に、BWA又はTMAP等のマッピングプログラムによって、シークエンシングされた読取りを参照ゲノムへとマッピングする。第二に、GATK又はTorrent Variant Caller等の変異コーラープログラムにより、このマッピング情報を用いてサンプル中の変異をコールする。ここでは、変異は参照ゲノムとサンプルゲノムとの間の任意の小規模な差異、例えば一塩基多型（SNP）、多塩基多型（MNP）又は小さな挿入及び欠失であり得る。
【００４１】
変異コーラーの結果は、通常はVCF（変異コーラーフォーマット；Variant Caller Format）ファイルとして表される。これは、変異が観察される参照ゲノム内の全ての位置、及び各々の変異に関する情報の概要（参照配列、変異配列、シークエンシング読取りの数等）を列挙するものである。このVCFファイルは全ての変異アノテーションプログラムの出発点となる。
【００４２】
しかしながら、VCFファイルから開始し（それまでの情報を無視する）ことによって、変異アノテーションプログラムは重大な情報を失う可能性がある。変異コーラープログラムは近接した変異を処理する方法が異なる。それらの大半が各々の位置を個別にコールし、幾つかの変異がともに生じる可能性があることを考慮に入れない。全ての近接した変異を単一のスーパーセットへとグループ化するが、グループ化された突然変異の1つしか生じない幾つかの事例（一部の読取り／ごく一部分のサンプル）が存在し得ることを考慮に入れないプログラムもある。さらに、2つの突然変異が（異なるエクソンの場合、1塩基若しくは2塩基又は数百塩基）離れている場合、変異コーリングプログラムはかかるコールをともにグループ化しない。
【００４３】
複数のSNPコールにおけるかかる同時発生を同定するための信頼性のある唯一の方法は、元の読取り配列に戻って参照することである。本発明の方法及びコンピュータツールでは、全てのSNP及びMNPを再グループ化するためにVCFファイル及び元のマッピングアウトプットの両方を用い、突然変異率（サンプルにおける発生率）の認知に加えて、どの突然変異の組合せがともに生じるかを正確に報告する。最初にゲノム空間内、続いてコード配列空間内という2工程アプローチをとることで、本発明の方法はゲノム空間内では遠く離れているが、コード配列及びタンパク質空間内で近接又は隣接する変異をグループ化することも可能である。
【００４４】
SnpEff又はSNP-nexus（http://www.snp-nexus.org/）等の他の既存のSNPアノテーションプログラムは元のマッピングデータに戻って参照するものではないため、VCFファイルによって提供される情報により制限される。
【００４５】
したがって、本発明は一態様では、
a）対象となる領域（例えばアンプリコンシークエンシングではアンプリコン領域）のゲノム位置を準備する工程と、
b）サンプルについて、配列アラインメントに好適なソフトウェア（例えばTMAP、BWA）を用いたマッピングBAMファイル、及び変異コーリングに好適なソフトウェア（例えばTorrent Variant Caller、GATK）を用いたVCFフォーマットでのゲノム変異のリストを準備する工程と、
c）準備された対象となる領域のゲノム位置内にない準備されたVCF中の変異コールをフィルタリングする工程と、
d）準備されたVCF及びマッピングBAMファイルにおける変異コールのリストから同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程と、
e）コードDNA配列、及びイントロンにわたる突然変異を含む突然変異のアミノ酸変化を決定する工程と、
f）COSMICデータベースを用いて突然変異をアノテーションする工程と、
を含む方法に関する。
【００４６】
したがって、本発明の方法の一目的は、最も実用的な標的がそれらのcosmicアノテーションによって参照されることから、所与の変異／変異セットを考え得るcosmicアノテーションとマッチングすることである。実用的な標的は変更されたアミノ酸配列をコードする標的化核酸配列の変異であり、該変更により対象となる表現型、例えば所与の薬物に対する耐性がより高く又はその影響を受けやすい癌遺伝子によってコードされるポリペプチド中の突然変異がもたらされる。
【００４７】
したがって、本発明の方法は、cosmicアノテーションを所与の変異について見出すことができる可能性を最大化するアプローチをとるものである。この目的で、初めに各々の変異をcosmicエントリーに対してゲノムレベルで比較する。cosmic VCFファイルは、それらの対応するゲノム変異を有する全てのcosmicエントリーを列挙する。サンプル変異のいずれかがcosmic VCFエントリーにマッチする場合には、サンプル変異をそのcosmicエントリーによりアノテーションする。cosmicマッチがゲノムレベルで見られなかった場合、各々の突然変異をコードアミノ酸へと翻訳する。本発明の方法は、遺伝子／コード配列変化レベルでのcosmicマッチのために検索を実施する工程を含む。プロセス全体を下記に説明する。
【００４８】
本発明の方法は特に多くの目的の少なくとも1つを満たすものである。ゲノム変動のリストが存在することを前提として、該方法は、
i.  所与の分析に無関係の変動をフィルタリングにより除外する；
ii.  どの変異が所与の隣接域で同時発生するかを決定する；
iii.  既知の標的配列を含む（例えばCOSMIC）データベースに対して各々の変異をクロスチェックする；
iv.  既知の標的配列を含む上記データベースに見られるそれぞれの情報により配列をアノテーションする、及び／又は新たな変異を同定する；
v.  変異が標的化遺伝子のコード配列に影響を及ぼす場合、コード配列変化及びアミノ酸変化を予測する；
vi.  所定の標的変異のリストに対して各々の変異を比較するとともに、それがリスト中に存在する場合にアノテーションする。
【００４９】
本発明は、サンプルにおける標的核酸配列又は対象となる核酸配列の存在を決定する方法に関する。好ましい態様では、該方法はそれぞれのアルゴリズムを含む分析プログラムである。さらに、本発明は本発明の方法を実行するのに好適なソフトウェアを備えるデバイス（例えば装置）に関する。
【００５０】
別の態様では、サンプルにおける標的核酸配列又は対象となる核酸配列の存在を決定する上記の方法は、核酸配列のシークエンシング後分析を特徴とし、該分析はサンプルから得られる核酸配列中の変異の検出及び／又は定量化を含む。
【００５１】
特に本発明の方法により、サンプルにおける少なくとも1つの野生型核酸配列を参照として含む核酸配列と比較して少なくとも1つの変異ヌクレオチドを含む核酸配列の存在を決定することが可能となる。
【００５２】
さらに、本発明の方法によりサンプルから得られる核酸配列の存在を決定することが可能になり、該配列を少なくとも野生型核酸配列、及び該野生型と比較して少なくとも1つの変異ヌクレオチド残基を含む該野生型配列の変異（例えば癌遺伝子、薬物に対する感受性又は耐性等の幾つかの表現型と関連するウイルス遺伝子等）と比較することができる。
【００５３】
上記の方法の幾つかの態様では、変異核酸は対象となる表現型、例えば幾つかの薬物（例えば抗癌薬、抗菌薬又はウイルス静止（virostatic）薬等）に対する感受性又は耐性の増大又は減少と関連する突然変異ポリペプチドをコードする。かかる薬物は既知の薬物、例えば小分子、抗生物質、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、細胞シグナル伝達分子、例えばインターフェロン、抗体等から選択することができる。
【００５４】
本発明の方法は、ハイスループットシークエンシング（次世代シークエンシングとも称される）に必要とされる工程を用いる又は含む。好ましい実施の形態では、本発明は例えばIon Torrent専用の技術によって提供されるようなイオン半導体シークエンシングを含む。
【００５５】
NGS手順の開始時には対象となる核酸、すなわち標的核酸を含有する疑いがあるサンプルを得る必要がある。核酸は、当該技術分野で既知の方法を用いてサンプルから抽出することができる。核酸の抽出は（半）自動化システムにおいて行うのが好ましい。
【００５６】
さらに、本発明の方法に先行する又はそれを含むNGS手順において、対象となる領域（例えばアンプリコン領域）のゲノム位置が提供される。
【００５７】
本発明の方法の更なる態様では、領域のゲノム位置はプライマー結合部位の位置（すなわち、それらの配位）として知られる。プライマーにより対象となる標的領域が規定される。この情報はプログラムを加速し、それにより対象となる領域内でコールされる変異の分析に特異的に重点を置き得るため、コンピュータプログラムを含む分析方法のインプットとして働く。さらに、本発明の方法では、各々の標的領域（アンプリコン）について、アルゴリズムによりどの塩基が標的遺伝子転写産物に対してエクソン領域、イントロン領域及び遺伝子間領域にあるかが決定される。本発明の方法、コンピュータプログラム、及びかかるプログラムを備える又は本発明の方法を実行する装置は、NGS工程を含むか又は実際のNGS工程を用いるものであり得る。
【００５８】
したがって本発明の方法及びデバイスは、変異コールをVCFフォーマットの形態で提供するソフトウェア（例えばTorrent VariantCaller、GATK）を使用する工程を含む。続いて、本発明の方法（又はコンピュータプログラム）により、これらの変異コールを初期シークエンシングデータ及び外部データベースソースに基づいて分析し、より正確な結果を得る。
【００５９】
本発明の方法は、更なる工程においてマッピングBAMファイルを準備することを含む。このファイルは、配列データを蓄積するバイナリフォーマットを有する。BAMファイル（.bam）はSAMファイルのバイナリバージョンである。SAMファイル（.sam）は、人間が読み取れるフォーマットで配列アラインメントデータを含有するタブ区切りテキストファイルである。どちらの仕様もhttp://samtools.sourceforge.net/SAMv1.pdfに記載されている。
【００６０】
本発明の方法は、対象となるゲノム領域中（又は標的配列中）に位置しないVCFフォーマットで提供される変異コールをフィルタリングにより除外する工程を更に含み得る。
【００６１】
本発明の方法又はコンピュータプログラムは、VCF及び／又はマッピングBAMファイルで提供される変異コールのリストにおいて同時発生的及び相互排他的突然変異を決定する工程を含む。本発明の方法では、同時発生的突然変異は同じ細胞中に生じる多塩基多型（MNP）である。相互排他的突然変異は同じ細胞中には生じない隣接一塩基多型（SNP）である。
【００６２】
例えば、下記の配列を参照配列としてみなす場合、下線を引いたヌクレオチドtgは変異が生じ得るヌクレオチドである。
1）cagtcgatcgatcgactgcgattgtgtgctagcatgcatcgatcgaga
【００６３】
例示を目的として、下記の9つの読取りがNGSランにおいて得られたと仮定し、その変異を太字の大文字で強調する：
1）cagtcgatcgatcgactgcgatACtgtgctagcatgcatcgatcgaga
2）cagtcgatcgatcgactgcgatACtgtgctagcatgcatcgatcgaga
3）cagtcgatcgatcgactgcgatACtgtgctagcatgcatcgatcgaga
4）cagtcgatcgatcgactgcgatAgtgtgctagcatgcatcgatcgaga
5）cagtcgatcgatcgactgcgatAgtgtgctagcatgcatcgatcgaga
6）cagtcgatcgatcgactgcgatAgtgtgctagcatgcatcgatcgaga
7）cagtcgatcgatcgactgcgattCtgtgctagcatgcatcgatcgaga
8）cagtcgatcgatcgactgcgattCtgtgctagcatgcatcgatcgaga
9）cagtcgatcgatcgactgcgattCtgtgctagcatgcatcgatcgaga
【００６４】
最初の3つの読取り1）〜3）により、「AC」がともに生じるMNPであることが示される。次の3つの読取り4）〜6）により、単独で生じる「A」SNPも存在することが示される。最後の3つの読取り7）〜9）により、単独で生じる「C」SNPも存在することが示される。したがって、「A」SNPは「C」SNPに対して相互排他的に生じる。当該技術分野で既知のプログラム、例えばIon TorrentVariant Callerにおいて、この詳細は失われ、9つの読取りにより支持される変異コール結果「AC」の概要が与えられる。本発明の方法では9つ全ての読取り、すなわち「AC」の3つの読取り、「A」の3つの読取り及び「C」の3つの読取りについての詳細が与えられる。
【００６５】
本発明の方法は、核酸配列中の変異に起因するコードDNA配列及びアミノ酸の変化を決定することを更に含み得る。本発明の方法は、異なるエクソン上に存在するヌクレオチド変異によってコードされるアミノ酸配列中の突然変異の決定を可能にする工程を含んでいてもよい。すなわち、変異が異なるエクソン中に見られる場合、これらのエクソン間のイントロンをスプライシングにより切り出すことで、例えば1つのイントロンの最後のヌクレオチド及び別のイントロンの最初のヌクレオチドが突然変異する場合に、コードされるアミノ酸を突然変異させることができる。エクソンをスプライシングにより切り出す場合、2つの変異ヌクレオチドはヌクレオチド配列中で近接し、コードされるポリペプチド中で異なるアミノ酸残基をコードし得る。アミノ酸配列及びコードされるヌクレオチド配列におけるかかる変更は、本発明の方法において決定することができるが、これは出願人に既知の変異を決定する任意の方法に当てはまらない。より詳細には、幾つかのゲノム標的配列におけるイントロン及びエクソンの存在のために、2つの塩基がゲノム位置内では近接せず、コード配列位置内で近接する可能性がある。図1にこれを説明する。図1では、矢印を付けた2つの塩基はゲノム内で遠く離れているが、イントロンで隔てられているためにコード空間内では近接し、同じコドン又は近接したコドンに含まれ得る。したがって、突然変異をともにグループ化する場合、同じ又は近接したコドンが影響され得るために、グループ化は（コード領域内の場合）コード配列位置に対して行うべきである。
【００６６】
したがって、本明細書で提供される方法は、アミノ酸配列中に突然変異を生じる変異をアノテーションすることができない方法と比較して利点を有する。本発明の方法とは異なり、以前の方法は2つの別個の工程を含む。第1の工程は変異コーリングに関し、第2の工程はアノテーション工程である。これらの方法では、アノテーションプログラムは基礎的なシークエンシングデータにアクセスする（又はそれを利用する）ものではない。したがって、かかる方法では2つの変異が（2つの異なるエクソンにおいて互いに隣り合うか否かにかかわらず）同時発生するか否かを決定することができない。以前の方法では、突然変異は変異コーラーによって報告される通りに処理される。変異コーラー方法では通常、近接した変異はともに報告される。しかしながら、変異が遠く隔てられる場合（例えば2つの異なるエクソン中に存在する場合）、従来技術の変異コーラー方法では（遺伝子／エクソンデータを利用しないため）、それらは別個に報告される。
【００６７】
以前の方法の最終結果では、2つの異なるエクソン中の2つの突然変異が別個にアノテーションされることにより、それらの複合効果は無視される。
【００６８】
本発明の方法では、基礎的なシークエンシングデータを検討して2つのエクソンにわたる2つの突然変異が関連するかを決定し、そのような場合にそれらをともにアノテーションすることによって上述の不正確さが阻止される。
【００６９】
本発明の方法ではデータベース、例えばCOSMICにより変異をアノテーションする。本発明の方法は、変異分析において得られる結果の報告の準備も含み得る。COSMIC IDにマッチしない任意の変異は新規の変異とみなされ、（COSMICアノテーションなしに）そのまま報告される。したがって、本発明の方法はサンプルから得られる核酸中の標的配列の配列を決定する方法に関するだけでなく、標的核酸の新規の変異の同定にも関する。どちらの場合も、該方法はサンプルから得られる核酸のアミノ酸配列も提供することができる。標的配列の新規の核酸変異の配列を同定又は決定する方法は、治療医師が治療決定を行うのを補助するうえで有益である。さらに、標的配列の新規の変異の同定及びアノテーションは特定の薬物、例えばコードされる変異ポリペプチドを標的化する抗体の開発の助けとなり得る。例えば、新規の変異核酸配列が突然変異アミノ酸配列をコードする場合、突然変異ポリペプチドに対する特定の抗体、例えば中和抗体、遮断抗体等を生成することができる。さらに、コードされる新たなポリペプチドの知識に基づいて、ポリペプチドにおける構造変化を当該技術分野で既知の方法を用いて決定することができる。ポリペプチド構造の知識は、例えば様々なチロシンキナーゼ中のATP結合部位を選択的に遮断する薬物イマチニブの場合のように、コードされるポリペプチドの機能に影響を及ぼす小分子の設計を補助し得る。
【００７０】
変異を決定及び／又はアノテーションする及び／又は同定する本発明の方法では、データインプットは以下のものからなる：
a）VCFフォーマットでのゲノム変異のリスト；
b）変異コールを作製するために使用された、（選別及び索引付けした）マッピングBAMファイル；
c）実験、例えばNGSランにおいて得られるシークエンシングデータを含有し、各々のアンプリコンのゲノム位置及びその配列に関する情報、標的化遺伝子のリスト、及びそれらのエクソン又はエクソン−イントロン構造に関する情報、及び転写産物配列（ensemblによる／COSMICによって使用される）、実験において標的化される突然変異のリスト（適用可能な場合にcosmic ID、コード配列変化、アミノ酸変化を有する）を含有する「アッセイファイル」；
d）各々のVCFエントリーについての（VCFフォーマットでの）変異エントリーを含有し、コード配列及びアミノ酸変化によってアノテーションされたCOSMIC VCFファイル（COSMICファイルはCOSMIC ftpのサイト（ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/cosmic/）からダウンロードすることができることに留意されたい）。
【００７１】
上記工程c）で言及されるEnsemblは、ヒトゲノム計画の完了を間近に受けて1999年に発足した欧州バイオインフォマティクス研究所（EuropeanBioinformatics Institute）とWellcome Trust SangerInstituteとによる合同科学プロジェクトである。Ensemblは、ゲノム情報の検索のための幾つかの既知のゲノムブラウザの1つである（http://www.ensembl.org/index.html）。
【００７２】
上記の項目b）では、選別コマンドにより、そのアラインメントによって決定される参照におけるその位置に基づいてBAMファイルが選別される。索引付けコマンドは、（選別された）SAM又はBAMファイルにおけるデータの迅速な探索を可能にする新たな索引ファイルを作り出す。BAMファイルは、シークエンシングランにより生成する読取りのアラインメント情報を含有する。アラインメントは読取りの参照ゲノムへのマッピングから得られる。
【００７３】
本発明を下記実施例においてより詳細に説明する。
【実施例】
【００７４】
実施例1
1）変異のフィルタリング
本発明の方法の第1の工程は、アンプリコン領域に含まれない変異を、これらのコールが信頼性に欠くためにフィルタリングにより除外することである。例えばアンプリコン領域内に完全に含まれない全ての変異を任意の後続の分析で考慮に入れない。このため、変異の一部がアンプリコン領域の範囲外にある場合、変異全体をフィルタリングにより除外する。
【００７５】
2）変異のグループ化
グループ化工程を行う根拠は以下の通りである。既知の変異コーリングプログラムの大半は、各々の塩基での変異を別個にコールするものである。例えば変異コーラーは以下のアウトプットを生じ得る：
Pos 1 A to T（50 %）
Pos 2 C to G（50 %）
【００７６】
データをこのようにして表す場合、2つの突然変異が単一の細胞において同時発生するか否かは明らかでない。2つの突然変異が相互排他的であるか、又はサンプルの50 %が野生型であり、残りが突然変異Pos 1-2 AC to TGを含有する可能性がある。この情報はcosmicアノテーションの決定に不可欠であるため、本発明の方法では、COSMICデータベースとマッチングする前に同時発生的変異をともにグループ化する。
【００７７】
SNP及びMNP（多塩基多型）のみをグループ化に考慮する。（ゲノム位置又はコード配列位置で）互いに近接したこのような全ての変異は潜在的グループを形成する。各々の潜在的グループについて、全ての変異位置に及ぶ全ての配列読取りを抽出する。例えば、以下の3つの変異が検出されることが想定される：
X = Pos 1 Ato T（11 %）
Y = Pos 1 Ato C（21 %）
Z = Pos 2 Tto G（41 %）
【００７８】
下記表（表1）は変異の各々の組合せを示す読取りの数に基づいて記入される。読取りを計数する際に、変異位置での最小phredスコアが17の読取りのみが考慮されることに留意されたい。
【００７９】
【表１】
2017512324.tif 000002
表1−変異分布の例（総読取り：1000）
【００８０】
表1から、サンプルの50 %が野生型であり（なし／なし／なし）、他の組合せが様々な頻度で生じることが示される。最小5 %検出閾値を標的化する場合、5 %未満の頻度で生じる任意の組合せをフィルタリングにより除外する。上記の表に基づくと、本発明の方法により変異が以下のグループで生じることが決定される：X、YZ、Z。上記に挙げたように変異を報告する代わりに（X = Pos 1 A to T等）、それらの同時発生を下流の分析において用いるために正確に表現する形で以下のように変異が報告される。1 %の頻度で生じる変異の組合せを無視することに留意されたい。
Pos 1 A to T（10 %）
Pos 1-2 AT toCG（20 %）
Pos 2 T to G（50 %）
【００８１】
Phred品質スコアは本来、ヒトゲノム計画におけるDNAシークエンシングの自動化を助長するためにプログラムPhredによって開発された。Phred品質スコアは、自動化シークエンサートレースにおいて各々のヌクレオチドベースコールに割り当てられる。Phred品質スコアはDNA配列の品質を特性化するために広く受け入れられつつあり、種々のシークエンシング法の有効性の比較に使用することができる。Phred品質スコアQは、ベースコーリングのエラー確率Pと対数的に関連する特性として規定される。
【００８２】
【数１】
2017512324.tif 000003
【００８３】
例えば、Phredにより30の品質スコアが塩基に割り当てられる場合、この塩基が不正確にコールされる可能性は1000分の1である。最も一般的に用いられる方法は、品質スコア20以上の塩基を計数することである。Phred品質スコアは高い精度のために、配列の品質の評定に理想的なツールである。これは表2に示される（Phred品質スコアはエラー確率と対数的に関係する）。
【００８４】
【表２】
2017512324.tif 000004
【００８５】
3）CDS／AA変化の決定
コード領域内のSNP及びMNPについては、コード配列変化及びアミノ酸配列変化が本発明の方法によって推測される。コード配列（CDS）変化は、突然変異が生じた前後のコード配列の単純な比較によって決定される。アミノ酸（AA）変化は、CDS変化を有する領域中のコドン変化を比較することによって決定される。COSMIC表記に可能な限り従うために、AA変化を有するコドンが隣接する場合を除いてアミノ酸変化を有するコドン（非サイレント）のみを列挙する。
【００８６】
4）Cosmic情報のアノテーション
同時発生的変異をグループ化し、生じる変異コールを得た後、各々の変異の塩基対変化をCOSMIC VCFファイル（複数の場合もあり）におけるエントリーに対して比較する。マッチングエントリーをCOSMIC VCFファイルに見ることができる場合（マッチングエントリーは同じゲノム位置、参照塩基及び交互塩基を有するものとして規定される）、変異をマッチングCOSMIC IDによりアノテーションする。COSMICデータベースによる一貫性を保つために、CDS変化及びアミノ酸（AA）変化をゲノム変化から推測するのではなく、COSMICエントリーからコピーする。
【００８７】
さらに、異なるゲノム突然変異から同じ正味効果（ひいては同じアミノ酸変化）を得ることが可能である。
【００８８】
例えば以下の配列：
TTAGTGGAAGCC
において、AGTGGA（TTAGTGGAAGCC）又はTGGAAG（TTAGTGGAAGCC）の欠失は同じ配列（TTAGCC）を生じる。しかしながら、これら2つの欠失をCOSMICにおいて2つの別個の突然変異とみなし、異なるCOSMIC IDによりアノテーションすることができる。しかし、変異コーリング時には上記2つの候補の一方のみに突然変異が報告される。このような場合、同じ「正味の」ゲノム変化を生じ得る他の全てのCOSMIC突然変異を列挙するのが好ましい。これを容易にするために、付加的な工程を組み込んだ。
【００８９】
報告された各々の突然変異について、隣接ゲノム領域における「正味効果」を構築する（例えば、TTAGTGGAAGCCにおけるAGTGGAの欠失はTTAGCCを生じる）。同様に、データベースにおける各々のCOSMIC突然変異の「正味効果」を構築する。問題の突然変異と同じ正味効果を有する任意のCosmic突然変異を、上記突然変異について考え得るCOSMICアノテーションとして報告する。報告される単一突然変異は複数のCOSMICアノテーションを有し得る。
【００９０】
報告された突然変異を、遺伝子名及びCDS変化に基づくCosmicデータベースに対して再度アノテーションする。遺伝子名及びCDS変化が報告された突然変異とマッチする任意のCosmic突然変異を、その突然変異に対してアノテーションする。
【００９１】
5）標的リストによるアノテーション
処理された各々の変異を所定の標的変異リストに対して比較する。変異は、そのCOSMIC IDが標的リスト中に存在するか又は同じ遺伝子名及びCDS変化の標的エントリーをリスト中に見ることができる場合に「標的」とみなされる。
【００９２】
COSMIC IDにマッチしない任意の変異は新規の変異とみなされ、（COSMICアノテーションなしに）そのまま報告される。
【図１】
2017512324.tif 000005
【配列表】
2017512324000001.app
【国際調査報告】
2017512324.tif 000006