【手続補正書】
【提出日】平成20年5月16日(2008.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の精製された、単離された、合成のまたは組換えのポリペプチド：
(a)  配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して99％以上の配列同一性を有するポリペプチド；
(b)  (a)に示したアミノ酸配列において、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのもしくは全てのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(c)  (b)に示したアミノ酸配列において、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、およびY277Dのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(d)  (a)〜（c）のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸をコードする１つ、２つ、または３つのヌクレオチドが発現に最適化されたコドンをコードするように改変されているポリペプチド；
(e)  (a)〜（d）のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ保存的なアミノ酸置換を有するポリペプチド；
(f)  (a)〜(e)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ同種の分泌シグナルペプチドを欠損しているポリペプチド；
(g)  (a)〜(f)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ植物種由来の異種の分泌シグナルペプチドまたは異種の分泌シグナル配列、または細菌もしくは真菌由来の異種の分泌シグナル配列を有しているポリペプチド；
(h)  (a)〜(g)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつターゲティング配列、N-末端認識ペプチド、トランジッドペプチド、または所望の特性を付与する配列を有するポリペプチド；
(i)  (a)〜(h)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ異種配列を含むか、融合酵素となった異種配列を含むポリペプチド；
(j)  （A) (a)〜（i)のいずれか１つのアミノ酸配列に対して同一である10個以上の連続するアミノ酸の隣接アミノ配列；または（B) (a)〜（i)のいずれか１つの酵素学的に活性な断片を有するアミノ酸配列を有し、かつ（A)の隣接アミノ配列または（B)の酵素学的に活性な断片が、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277Dから選択される少なくとも１つのアミノ酸変化、またはこれらの等価物、またはこれらの任意の組合せを有するポリペプチド；
(k)  60℃以上または70℃以上または80℃以上の温度に対して耐性である活性を有する、(a)〜(j)のいずれか一つのポリペプチド；または
(l)  対応する野生型ポリペプチドより２倍以上長い胃液中での半減期を有する、(a)〜(k)のいずれか一つのポリペプチド。
【請求項２】
下記の単離された、合成のまたは組換えのポリヌクレオチド：
(a)  請求項１に記載のフィターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b)  フィターゼポリペプチドをコードし、かつ配列番号９に示した核酸配列に対して99％以上の配列同一性を有する核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(c)  フィターゼポリペプチドをコードし、かつ(a)または(b)に示した核酸配列において、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; 1016がG、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのもしくは全てのヌクレオチド変化を有する核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(d)  (c)に示した核酸配列において、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; および1016がGであるヌクレオチド変化を有する核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(e)  (b)〜（d）のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ１つ、２つ、または３つのヌクレオチドが発現に最適化されたコドンをコードするように改変されているポリヌクレオチド； 
(f)  (b)〜（e）のいずれか一つの核酸配列を有し、当該核酸が保存的アミノ酸置換をコードし、かつ１つ、２つ、または３つのヌクレオチドが発現に最適化されたコドンをコードするように改変されているポリヌクレオチド；
(g)  (b)〜(f)のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ同種の分泌シグナルペプチド配列を欠損しているポリペプチドをコードしている、ポリヌクレオチド；
(h)  (b)〜(g) のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ当該核酸が異種の分泌シグナル配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(i)  (a)〜(h)のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ当該核酸がターゲティング配列、N-末端認識ペプチド、トランジッドペプチド、または所望の特性を付与する配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(j)  (a)〜(i)のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ当該核酸が異種配列を有するポリペプチドをコードしているか、融合酵素となっている異種配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(k)  (b)〜（j)のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して同一である10個以上の連続するヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を有し、当該隣接ヌクレオチド配列が、389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; または1016がG；またはこれらの任意の組合せから選択されるヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチド；または
(l)  (a)〜(k)のいずれか一つの核酸配列に完全に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に示す核酸配列を含むベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体。
【請求項４】
以下の発現系：
(a) 請求項２に示す核酸配列を含む発現系；
(b) 請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を含む発現系；または
(c) 発現系内で作動しうる転写制御配列、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、分泌シグナルペプチドをコードする核酸またはこれらの任意の組合せを含む、(a)または(b)の発現系。
【請求項５】
以下の宿主細胞：
(a) 請求項２に示す核酸配列を含む宿主細胞；
(b) 請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を含む宿主細胞；または
(c) (a)または（b）の宿主細胞であって、当該細胞が、(i) 原核細胞、真核細胞、もしくは植物細胞、または改変された原核、真核もしくは植物細胞；または（ii) (A)サッカロミセス属もしくはピキア属に由来する酵母細胞；(B)バチルス属に由来する細菌細胞；または(C)大腸菌(E. coli)、P. パストリス(P. pastoris)、もしくはS. ポンベ(S. pombe)の細胞である、前記宿主細胞。
【請求項６】
変異フィターゼの生成方法であって、
(a) 請求項２に記載の核酸を取得すること；および
(b) (i) 前記核酸中のヌクレオチドを別のヌクレオチドに変更させ、前記核酸中のヌクレオチドを欠失させ、または前記核酸にヌクレオチドを付加させることによって、当該変化が変異体をもたらすこと；(ii) (i)における変化を、提供された前記核酸のコドン用法から変更されたコドン用法を有するフィターゼコード配列が製造されるまで反復して繰り返すこと；または、(iii) (i)または（ii)における変化が、誤りがちのPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アセンブリPCR、有性PCR突然変異誘発、in vivo突然変異誘発、カセット突然変異誘発、回帰的集合突然変異誘発、指数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、連結リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、またはこれらの任意の組合せにより導入されること；
含む、前記方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって生成された機能的変異フィターゼであって、当該機能的変異フィターゼが請求項１のフィターゼの生物学的活性を保持している、前記機能的変異フィターゼ。
【請求項８】
請求項１に記載の組換えのまたは合成のフィターゼ；
請求項７に記載の機能的変異フィターゼ；
請求項２に示す配列を有するフィターゼをコードする核酸を含む組換え発現系；
請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体；または
請求項４に記載の発現系；
を含むように改変された植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子、または植物。
【請求項９】
請求項８に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子、または植物を動物飼料または食品組成物に適する組成物に変換する工程を含む、フィターゼを含む動物飼料または食品組成物を製造する方法。
【請求項１０】
フィターゼの作製方法であって、
(a) (i) 請求項２に記載のフィターゼをコードする核酸、またはフィターゼをコードする核酸を含む請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を準備すること；および(ii) 当該フィターゼをコードする核酸をフィターゼが発現する条件で発現させること；または
(b) 工程（a)で、発現されたフィターゼを単離すること；または
(c) 請求項５に記載の宿主細胞を、フィターゼをコードする核酸を発現させる条件下で生育させ、そして当該核酸によってコードされるフィターゼを単離すること；
を含む前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって作製した組換えにより生成されたフィターゼ。
【請求項１２】
フィターゼをグリコシル化する方法であって、
(i) 請求項２に記載のフィターゼをコードする核酸、(ii)フィターゼをコードする核酸を含む請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を、フィターゼをグリコシル化できる細胞内で発現させることを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって得られたグリコシル化フィターゼ。
【請求項１４】
(a) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(b) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(c) 請求項７に記載の機能的変異フィターゼ、
(d) 請求項８に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物
(e) 請求項１１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(f) 請求項１３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(g) 請求項１０または１２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、または
(h）(a)〜(g)の任意の組合せ、
を含む、食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤。