(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１に特異的に結合することができるＲＮＡであって、下記の（ａ）または（ｂ）より選択されるＲＮＡ。
（ａ）配列番号１６〜３３、３８〜４２及び４３の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ。
（ｂ）下記の二次構造（Ａ１）〜（Ａ３）、（Ｂ１）、（Ｃ１）および（Ｄ１）からなる群から選択されるいずれかの構造をとることができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ。
【化１】
0004167403.tif 000042
【化２】
0004167403.tif 000043
【化３】
0004167403.tif 000044
【化４】
0004167403.tif 000045
【請求項２】
請求項１に記載のＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡであって、下記の方法により得られる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１に対する結合活性を有するＲＮＡ。
請求項１に記載のＲＮＡアプタマーに対するテンプレートＤＮＡ配列に対して任意のプライマーを用いて高塩濃度やＭｎＣｌ２の存在下でｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲを行うか、あるいはｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法で変異の入ったテンプレートＤＮＡを作製し、これをＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にクローン化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写、精製する
【請求項３】
請求項１または２に記載のＲＮＡの塩基配列中の少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されているＲＮＡ。
【請求項４】
ＲＮＡが標識化されている請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の少なくとも１つのＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１を検出および／または定量する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む医薬。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む癌に対する予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、翻訳開始因子に特異的に結合する核酸（ＲＮＡアプタマー）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の生合成は大多数の遺伝情報発現の最終段階であり、極めて重要な反応である。遺伝子からタンパク質への翻訳はmRNAの示す情報に従い、その翻訳開始コドンの位置でリボソーム、メチオニン-tRNA複合体(Met-tRNA)を含む開始複合体を作ることにより開始される。この翻訳開始複合体の形成の反応は幾つかのステップにより成り立っており、数々のタンパク質因子が逐次的に関与する複雑な反応である。真核細胞翻訳開始因子（eIF）は現在１２種類知られており、それらを構成するサブユニットや関連因子を含むと30種類以上のタンパク質が同定されている。40SリボソームサブユニットはeIF3とeIF1Aが結合した後、Met-tRNA・eIF2・GTP複合体が結合し43S 複合体を形成する。一方で、mRNA上では幾つかのeIFが翻訳開始の準備を行っている。eIF4FはeIF4E、eIF4A、eIF4Gからなる複合体の総称で、eIF4EはmRNAのcap構造に対し結合能を持ち、複合体をmRNAの5'末端に導く。eIF4GはeIF4E、 eIF4Aをまとめる骨格の役割を持つ。 eIF4AはATPase活性を有するRNA helicase でmRNAの5'末端非翻訳領域（5' UTR）に存在する2次構造をほどくことにより43S複合体が結合する部位を提示する。43S複合体がmRNAと結合し翻訳開始部位に到達すると、eIF5によりeIF2のGTPase活性が促進され、これにより複合体に結合していたeIFが解離し、その後60Sサブユニットが結合し、ポリペプチド伸長反応が始まる。これらのeIFのうち、eIF2α、eIF2B、eIF4E及びこれに結合してeIF4Eの機能を抑制するeIF4E binding protein (4E-BP)は細胞外のシグナルによりリン酸化・脱リン酸化が行われ、その活性が調節されている。しかし、多くのeIFを構成するサブユニットや関連因子の作用機序はよくわかっていない。
【０００３】
近年、癌や遺伝性疾患の中には、タンパク質への翻訳異常によるものが報告されていて、とくに癌化に関する情報が蓄積しつつある。eIF4Eは細胞内でその発現量は少なく、さらに細胞外シグナルによる機能発現調整が行われており、翻訳開始の律速段階といわれている。このeIF4EをNIH3T3やCHOなどの培養細胞中に過剰発現させると細胞の癌化が引き起こされる（L-Karatzas A., et al., Malignant transformation by a eukaryotic initiation factor subunit that binds to mRNA 5' cap, Nature,  345:544-547, 1990、De Benedetti A., et al., CHO cells transformed by the translation factor eIF4E display increased c-myc expression, but require overexpression of Max for tumorigenicity, Mol. Cell Diff., 2:347-371, 1994）。また実際、eIF4Eはヒトの乳癌や扁平上皮癌においてその発現量が上昇していることが報告されている（Kerekatte K. et al., The proto-oncogene/translation factor eIF4E: a survey of its expression in breast carcinomas, Int. J. cancer, 64:27-31, 1995、Nathan C. A. et al., Detection of the protooncogene eIF4E in surgical margins may predict recurrence in head and neck cancer, Oncogene, 15:579-584, 1997）。他のeIF4グループのタンパク質のeIF4Gでも、NIH3T3で過剰発現させることにより細胞の癌化が起ることが知られている（Shimogori T. F., et al., Malignant transformation by overproduction of translation intiation factor eIF4G, Cancer Res., 57:5041-5044, 1997）。さらに、肺癌の細胞中でeIF4G遺伝子の増幅が見られる（Brass N., et al., Translation initiaion factor eIF-4gamma is encoded by an amplified gene and induces an immune response in squamous cell lung carcinoma, Human Mol. Genet., 6:33-39, 1997）。また、 eIF4A1のmRNA量がヒト黒色腫において上昇している（Eberle J., et al., Translation initiation factor eIF-4A1 mRNA is consistently overexpressed in human melanoma cells in vitro, Int. J. Cancer, 71:396-401, 1997）。以上のようにeIF4グループの過剰発現によるeIF4F複合体量の増加と細胞の癌化は密接に関わっていることが報告されてきている。このeIF4F複合体量の増加が癌遺伝子などの病原遺伝子の翻訳量を上昇させ、癌化につながると考えられる。
【０００４】
さらに他のeIFも癌化との関係が示されており、eIF2αのリン酸化されない変異体や、eIF2αキナーゼの変異によって細胞が癌化する（Koromilas A. E., et al., Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase, Science, 257:1685-1689, 1992、Donze O., et al., Abrogation of translation initiation factor eIF-2 phosphorylation causes malignant transformation of NIH 3T3 cells, EMBO J., 14:3828-3834, 1995）。さらにeIF3のサブユニットの１つであるp48をコードする遺伝子はマウス乳腫瘍ウイルスの組込み部位で、仮想的な癌抑制遺伝子として知られていたint6と同一であることが報告され（Asano K., et al., The translation initiation factor eIF3-p48 subunit is encoded by int-6, a site of frequent integration by the mouse mammary tumor virus genome, J. Biol. Chem. 272:23477-23480, 1997）、さらに、最近になりヒトの肺癌と乳癌でのeIF3-p48の染色体部位のヘテロ染色体欠失(LOH)とeIF3-p48サブユニットの発現量の低下に相関関係があることが報告されている(Marchetti A., et al., Reduced expression of INT-6/eIF3-p48 in human tumors, Int. J. Oncol., 18:175-179, 2001)。このように、タンパク質の翻訳と癌化がより密接に関係していることが示されてきているが、そのメカニズムはまだよく分かっていない。現在明らかになっている遺伝子異常による癌患者は全体の数%でしかない。残り9割以上の原因を明らかにするためには、翻訳異常により引き起こされる癌化メカニズムの解明は重要な課題である。翻訳開始因子と特異的に結合する物質、生理活性を阻害する物質が得られれば、上記のような発症メカニズムの解明に役立つばかりでなく、その診断、治療薬として有望であるが、現在、この様なアプローチが行われているという報告はない。
【０００５】
ところで、in vitroにおいてある標的物質と特異的に結合するRNAを選択・濃縮する手法として、SELEX法と呼ばれる新たな手法が開発されている(C. Tuerk & L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249:505-510, 1990)。SELEX法は、PCRプライマー用の配列（一方にはT7ポリメラーゼの配列を含む）を両端に含む適当な長さのランダム配列を持つRNAを合成し、これを標的タンパク質と会合させ固相化する。結合しなかったRNAを洗浄後、結合したRNAを回収し、RT-PCRで増幅後、次のラウンドで用いるRNAのテンプレートとする。これを１０ラウンド前後繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するRNAアプタマーを取得する。この方法では、標的タンパク質と特異的に結合するRNA配列を明らかにできるだけでなく、標的タンパク質の機能を促進あるいは阻害するような生理活性を持つRNAを取得することが可能である。このことは病原タンパク質をターゲットにしてSELEXを行うことにより、得られたアプタマーを医薬品として応用できることを示唆している。従来の創薬に比べこのSELEX法を用いた創薬の優れている点として、（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模の母集団よりスクリーニングをシステマティックに行えること、（２）試験管内で容易に大量合成することができること、（３）免疫排除がないこと、（４）容易に合目的に改良を行えること、（５）保存性が高く抗体を作ることが困難なタンパク質を標的にできることなどがあげられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、翻訳異常により引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、この様な物質の候補として種々のeIFに対してSELEX法によるRNAアプタマーを作成した。すなわち、翻訳開始因子eIF4A1と、eIF4GのeIF4A1結合領域を含むペプチド（アミノ酸番号672-970；以下eIF4G(672-970)と記す）を標的タンパク質としてSELEXを行い、得られたアプタマーの標的タンパク質との結合活性、標的タンパク質の作用に与える影響を調べ、その有用性を示した。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）配列番号１６〜３３、３８〜４３、５７および５８の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ。
（２）下記の塩基配列(I)〜(IV)の少なくとも１つを含み、翻訳開始因子に特異的に結合することができるＲＮＡ。
0004167403.tif 000002
（塩基配列中、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシル、Sはグアニンまたはシトシンである。）
（３）下記の二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含み、翻訳開始因子に特異的に結合することができるＲＮＡ。
【０００８】
【化９】
0004167403.tif 000003
（二次構造中、N１は1個以上の核酸塩基であり、N2aおよびN2bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、N3は４〜１１個の核酸塩基であり、N4はUまたはCであり（但し、N4がCの場合は塩基対を形成しない）、N5aおよびN5bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも２対の核酸塩基であり、N6は４〜１２個の核酸塩基であり、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【０００９】
【化１０】
0004167403.tif 000004
（二次構造中、N11は1個以上の核酸塩基であり、N12aおよびN12bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも4対の核酸塩基であり、N13は４〜１１個の核酸塩基であり、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１０】
【化１１】
0004167403.tif 000005
（二次構造中、N21aおよびN21bは相補的塩基形成が可能な少なくとも5対の核酸塩基対であり、N22は10〜20個の核酸塩基であり、N23およびN25は、それぞれ独立に、1〜5個の核酸塩基であり、N24aおよびN24bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、N26aおよびN26bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、N27は20〜30個の核酸塩基であり、R21、R22およびR23は、それぞれ独立に、1個のプリン塩基であり、Y21およびY22は、それぞれ独立に、1個のピリミジン塩基であり、Cはシトシン、Gはグアニンであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１１】
【化１２】
0004167403.tif 000006
（二次構造中、N31aおよびN31bは相補的塩基形成が可能な少なくとも5対の核酸塩基対であり、N32およびN34は、それぞれ独立に、5〜15個の核酸塩基であり、N33aおよびN33bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、R31、R32およびR33は、それぞれ独立に、1個のプリン塩基であり、Y31およびY32は、それぞれ独立に、1個のピリミジン塩基であり、Cはシトシン、Gはグアニンであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
（４）二次構造(A)が下記の二次構造(A1)、(A2)または(A3)のいずれかであり、二次構造(B)が下記の二次構造(B1)であり、二次構造(C)が下記の二次構造(C1)であり、二次構造(D)が下記の二次構造(D1)である（３）記載のＲＮＡ。
【００１２】
【化１３】
0004167403.tif 000007
【００１３】
【化１４】
0004167403.tif 000008
【００１４】
【化１５】
0004167403.tif 000009
【００１５】
【化１６】
0004167403.tif 000010
【００１６】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡ。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡの塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されているＲＮＡ。
（７）ＲＮＡが標識化されている（１）〜（６）のいずれかに記載のＲＮＡ。
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の少なくとも１つのＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（９）（８）記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、翻訳開始因子を検出および／または定量する方法。
（１１）配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（１２）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（１３）（１１）記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項１２記載のオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマー。
【００１７】
（１）のＲＮＡ（ＲＮＡアプタマー）は、翻訳開始因子（例えば、翻訳開始因子eIF4A1またはeIF4G、特に、ヒト由来のもの）に特異的に結合することができる。本明細書において、「翻訳開始因子に特異的に結合する」とは、セレクションの最初に用いるランダム配列RNAと比較して翻訳開始因子との結合活性が有意に上昇していることをいう。ＲＮＡアプタマーと翻訳開始因子との結合活性は、以下のようにして調べることができる。1nM以下の32P標識したRNAアプタマーを様々な濃度の翻訳開始因子と、20 mM Tris-HCl (pH7.6), 80 mM K-acetate, 2.5 mM Mg-acetate, 1 mM DTT, 100 U/ml RNase Inhibitor, 10 μg/ml tRNA, 5 % glycerolの条件下で25℃で30分間インキュベーションした後、ニトロセルロース膜にRNAアプタマーと翻訳開始因子の複合体を吸着させ、非特異的に結合しているRNAアプタマーを洗浄後、膜に吸着した32Pのカウントを測定し、結合活性を定量する。
（１）のＲＮＡは、後述のSELEX法により取得することができる。
（１）のＲＮＡのうち、配列番号１６〜３３および３８〜４４の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡは、ヒト翻訳開始因子eIF4A1に特異的に結合することができる（eIF4A1に対するRNAアプタマー）。eIF4A1に対するRNAアプタマーはeIF4A1のATPase活性を抑制することで過剰量のeIF4Fの機能を阻害し、腫瘍細胞の増殖を抑えることができると考える。また、（１）のＲＮＡのうち、配列番号５７および５８の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡは、ヒト翻訳開始因子eIF4Gに特異的に結合することができる（eIF4Gに対するRNAアプタマー）。eIF4G(672-970)に対するRNAアプタマーは、eIF複合体の機能解析に有用であり、翻訳異常による疾患に対する診断薬として、また翻訳亢進による疾患に対する治療薬としての機能を持ちうると期待できる。
【００１８】
（２）のＲＮＡは、配列番号１６〜３３および３８〜４４の塩基配列中で保存されている配列（図４のBoxIで囲まれている配列（塩基配列(I))および図４のBoxIIで囲まれている配列（塩基配列(II)）または後述のselection2の方法で得られたRNAアプタマーの二次構造（コンピューターにより予測したもの）中に見出されたstem-loop構造の塩基配列（図８の二次構造において陰影をつけた部分の塩基配列(塩基配列(III)および(IV)）を含み、翻訳開始因子に特異的に結合することができるＲＮＡである。翻訳開始因子は、例えば、翻訳開始因子eIF4A1およびeIF4Gであり、特に、ヒト由来のものであるとよい。
（２）のＲＮＡは既知の化学合成法により取得することができる。また、化学合成を宝酒造などの企業に委託することもできる。
【００１９】
（３）のＲＮＡは、上記の二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
二次構造(A)には、後述のselection 1で取得されたGroup 2 clone no. -1、+42および+11の予測される二次構造（二次構造(A1)、(A2)および(A3)）（図５参照）が含まれる。
【００２１】
二次構造(A)において、N１は1個以上の核酸塩基であり、好ましくは6〜8個の核酸塩基である。N１は全ての核酸塩基を取りうる。N2aおよびN2bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、好ましくは1〜4対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N2aおよびN2bは全ての核酸塩基を取りうる。N3は４〜１１個の核酸塩基であり、好ましくは4〜6個の核酸塩基である。N3は全て核酸塩基を取りうる。N4はUまたはCであるが、N4がCの場合は塩基対を形成しない。N5aおよびN5bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも２対の核酸塩基であり、好ましくは3〜6対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N5aおよびN5bの好ましい核酸塩基対としては、C-Gを挙げることができる。N6は４〜１２個の核酸塩基であり、好ましくは4〜6個の核酸塩基である。N3は全ての塩基配列を取りうる。
【００２２】
二次構造(A)の構造の特徴として２つのstem-loop構造が挙げられる。生物界においてRNAがタンパク質の立体構造をまねて機能を有する「分子擬態」という概念が提出されている（Ito K., et al., A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA, Nature, 403:680-684, 2000、Nakamura Y., et al., Mimicry grasps reality in translation termination, Cell, 101:349-352, 2000）。この概念は、RNAがstem-loop構造、シュードノット構造や分子内四重鎖構造(G-カルテット)などの安定な高次構造を作りタンパク質のような機能を発揮する可能性を示している。実際、このような高次構造を持つRNAの中にはタンパク質の機能ドメインと結合し、生理活性を有するものがある。二次構造(A)の２つのstem-loop構造もこのような安定な高次構造を作り、生理機能を与えていると考えられる。
【００２３】
二次構造(B)には、後述のselection 1で取得されたGroup 3 clone no. -14の予測される二次構造（二次構造(B1)）（図５参照）が含まれる。
【００２４】
二次構造(B)において、N11は1個以上の核酸塩基であり、好ましくは8〜12個の核酸塩基である。N11は全ての核酸塩基を取りうる。N12aおよびN12bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも4対の核酸塩基であり、好ましくは5〜9対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N12aおよびN12bの好ましい核酸塩基対としては、C-Gを挙げることができる。N13は４〜１１個の核酸塩基であり、好ましくは４〜7個の核酸塩基である。N13は全ての塩基配列を取りうる。
【００２５】
二次構造(B)の構造の特徴はstem-loop構造にある。これは二次構造(A)と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２６】
二次構造(C)には、後述のselection 2で取得された40merのclone no. 25の予測される二次構造（二次構造(C1)）（図８参照）が含まれる。
【００２７】
二次構造(C)において、N21aおよびN21bは相補的塩基形成が可能な少なくとも5対の核酸塩基対であり、好ましくは5〜７対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N21aおよびN21bは全ての塩基対合を取りうる。N22は10〜20個の核酸塩基であり、好ましくは12〜14個の核酸塩基である。N22は全ての塩基配列を取りうる。N23およびN25は、それぞれ独立に、1〜5個の核酸塩基であり、好ましくは2または3個の核酸塩基である。N23およびN25の好ましい核酸塩基としては、Aを挙げることができる。N24aおよびN24bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、好ましくは3〜5対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N24aおよびN24bの好ましい核酸塩基対としては、C−Gを挙げることができる。N26aおよびN26bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、好ましくは4〜8対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N26aおよびN26bは全ての塩基対合を取りうる。N27は20〜30個の核酸塩基であり、好ましくは25〜28個の核酸塩基である。N27は全ての核酸塩基を取りうる。R21、R22およびR23は、それぞれ独立に、1個のプリン塩基であり、好ましいプリン塩基としては、R21はA、R22はG、R23はGを挙げることができる。Y21およびY22は、それぞれ独立に、1個のピリミジン塩基であり、好ましいピリミジン塩基としては、どちらもCを挙げることができる。
【００２８】
二次構造(C)の構造の特徴はやはりstem-loop構造にあり、二次構造(A)と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２９】
二次構造(D)には、後述のselection 2で取得された30merのclone no. 2の予測される二次構造（二次構造(D1)）（図８参照）が含まれる。
【００３０】
二次構造(D)において、N31aおよびN31bは相補的塩基形成が可能な少なくとも5対の核酸塩基対であり、好ましくは5〜8対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N31aおよびN31bは全ての塩基配列を取りうる。N32およびN34は、それぞれ独立に、5〜15個の核酸塩基であり、好ましくは5〜７個の核酸塩基である。N32およびN34は全ての核酸塩基を取りうる。N33aおよびN33bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、好ましくは3〜6対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N33aおよびN33bの好ましい核酸塩基対としてはG-Cを挙げることができる。R31、R32およびR33は、それぞれ独立に、1個のプリン塩基であり、好ましいプリン塩基としては、 R31はA、R32およびR33はGを挙げることができる。Y31およびY32は、それぞれ独立に、1個のピリミジン塩基であり、好ましいピリミジン塩基としては、Y31はU、Y32はCを挙げることができる。
【００３１】
二次構造(D)の構造の特徴もstem-loop構造で、二次構造(A)と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００３２】
ヌクレオチド配列の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウェア(GENETYX-MAC: ソフトウェア開発社製、DNASIS: 日立ソフトウェアエンジニアリング社製など)に塩基配列を入力して予測することができ、このような方法で、あるヌクレオチド配列が二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることが予測された場合に、そのヌクレオチド配列は二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることができるものとする。あるいはまた、ヌクレオチド配列の二次構造は、二本鎖RNAを特異的に切断するRNase V1や、一本鎖RNAを特異的に切断するRNase T1やRNase Aなどを用いてmapするような実験的な手法で確認してもよい。
（３）のＲＮＡは既知の化学合成法により取得することができる。また、化学合成を宝酒造などの企業に委託することもできる。
【００３３】
（１）〜（４）のＲＮＡは、30〜120 merの長さであるとよく、好ましくは、60〜90 merの長さである。
【００３４】
（５）の変異を導入したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
（１）〜（４）のいずれかに記載のRNAアプタマーに対するテンプレートDNA配列に対して任意のプライマーを用いて高塩濃度やMnCl2の存在下でmutagenesis PCRを行うか、あるいはsite directed mutagenesis法で変異の入ったテンプレートDNAを作製し、これをRNAポリメラーゼの下流にクローン化し、in vitroで転写、精製することにより得ることができる。
（５）の変異を導入したＲＮＡは、より結合活性が高い、および／または生理活性の阻害効果が強いという利点を有しうる。
【００３５】
（２）〜（５）のＲＮＡは、（１）のＲＮＡと同様に、翻訳開始因子に特異的に結合し、その生理活性を阻害することができる。従って、これらのＲＮＡは、腫瘍細胞の増殖抑制あるいはeIF複合体の機能解析に有用であり、翻訳異常による疾患に対する診断薬として、また翻訳亢進による疾患に対する治療薬としての機能を持ちうる。
【００３６】
（６）のＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
In vitroでRNAアプタマーをテンプレートよりRNAポリメラーゼで転写する時に、ある塩基のヌクレオシド三リン酸の代わりに、その塩基に修飾の入ったヌクレオシド三リン酸を用いて転写を行い、転写産物を精製する。
【００３７】
本明細書において、「修飾塩基」とは、天然の核酸に見られる通常の塩基以外の塩基誘導体をいう。
【００３８】
修飾塩基を導入したＲＮＡアプタマーは、翻訳開始因子の機能解析に用いることができる。例えば、ＲＮＡアプタマーにBr-dUTPなどの修飾塩基を導入し、タンパク質と結合させたのちに紫外線を当ててアプタマーとタンパク質を共有結合させる。アプタマー、タンパク質を加水分解した後、高速液体クロマトグラフィーでアミノ酸分析を行うと、アプタマーとタンパク質の結合していた部分が分かる。
あるいはまた、RNA合成時に2'-fluoro UTP, 2'-fluoro CTP, 2'-amino UTP, 2'-amino CTP, 2'-hydroxy UTP, 2'-hydroxy CTPのうちの1種類または複数種類を導入することにより、RNAアプタマーの安定を高くすることができる。
【００３９】
（７）の標識化したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
RNAアプタマーを5'-Oligolabelling Kit for Fluorescence(アマシャム・ファルマシア社製)により蛍光物質(fluorescein)で標識することができる。またRNAアプタマーのテンプレートを用いてRNA合成時に32Pラベルしたヌクレオチドを取り込ませることにより放射性同位体で標識することが、DIG RNA Labeling Kit(ロッシュ・ダイアグノスティック社製)の使用によりジゴキシゲニンで標識化することができる。
（７）の標識化したＲＮＡは、翻訳開始因子の検出・定量に用いることができる。例えば、蛍光物質で標識化したＲＮＡアプタマーと翻訳開始因子との結合をMulti-well plate reader(ABI社製)により確認することができる。修飾塩基を導入したアプタマーを標識化することにより、さらに感度を上げることができる。
【００４０】
（８）のＤＮＡは、（１）〜（６）のいずれかに記載の一つまたは複数のＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
（８）のＤＮＡは、既知の化学合成法により作製することができる。また、化学合成を宝酒造などの企業に委託することもできる。
【００４１】
（９）のベクターは、以下のようにして作製することができる。
（１）〜（６）のいずれかに記載のRNAに対して配列番号1,2もしくは配列番号4,5をプライマーとしてRT-PCRを行い、これを後述のpUC-tRRなどのベクターにサブクローニングすることにより、作製することができる。また、化学合成により作製したDNA断片をベクターにサブクローニングすることにより作製できる。
【００４２】
（８）のＤＮＡおよび（９）のベクターは、癌などの翻訳異常による疾患の遺伝子治療に用いることができる。
【００４３】
（１）〜（７）のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、翻訳開始因子を検出および／または定量することができる。これにより発症機構の分かっていない疾患が翻訳調節異常を伴うかどうかを明らかにすることができる。具体的な検出および／または定量方法の一例を以下に記載する。翻訳開始因子を含む溶液を96-well multi plate(コーニング社製)に分注、洗浄の後、蛍光物質で標識したRNAアプタマーを結合させる。洗浄の後、プレートリーダー(ABI社製など)で蛍光強度を測定することにより翻訳開始因子を定量することができる。
【００４４】
（１１）および（１２）のオリゴヌクレオチドは既知の化学合成法により製造することができる。また化学合成を宝酒造等の企業に委託することができる。
（１１）および（１２）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてSELEX法を行うことにより、翻訳開始因子に特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる。
【００４５】
【発明の実施の形態】
本発明において用いたSELEX法の概略を図１に示す。
【００４６】
本発明ではランダム配列を含むテンプレートは2種類（ランダム配列が30merのものと40merのもの（図１参照））を用い、標的タンパク質の固相化、洗浄は3種類の方法(図２)でSELEXを行った。すなわち、i)のNi-agaroseによる固相化では、His-tagのついたタンパク質をNi-agaroseに結合させ、会合したRNA分子と伴にイミダゾールで溶出した。ii)のニトロセルロース膜による固相化、強い洗浄では、タンパク質-ＲＮＡ複合体をカートリッジに入ったニトロセルロース膜に吸着させ、注射筒を用いて洗浄したのち、フェノール／尿素溶液で溶出した。iii)のニトロセルロース膜による固相化、弱い洗浄では、タンパク質-ＲＮＡ複合体をニトロセルロース膜に吸着させ、洗浄液を入れたペトリ皿に移して５分２回、洗浄したのち、フェノール／尿素溶液で溶出した。i)は非特異的結合が少なくなる傾向があり、洗浄と抽出条件が緩やかで、ii)は洗浄条件が厳しいため強い結合力を持つものを選択できる可能性があり、iii)は比較的弱い結合力を持つものでも選択できる可能性がある。このうちii)、iii)は非特異的結合が多くなる傾向がある。eIF4A1に対するSELEXは40merの配列を用いた図２ i)の方法(selection 1)、40merの配列を用いた図２ ii)の方法(selection 2/40mer)、30merの配列を用いた図２ ii)の方法(selection 2/30mer) で行い、eIF4G(672-970)に対しては40merの配列(selection 3/40mer)と30merの配列(selection 3/30mer)を用いて、図２ i), ii)及びiii)の方法で行った。
【００４７】
selection 1; このselectionはHis-tagの付いたeIF4A1をNi2+-NTA agaroseに固相化し、40 merのランダム配列を持つRNAプールに対して行った。in vitroの実験よりeIF4A1はATP存在下でmRNAと結合し、ATPaseとhelicase活性を発揮することが知られている（Rogers G., et al., Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A, J. Biol. Chem., 274:12236-12244, 1999）。このselectionでは得られたアプタマーがeIF4A1の natural targetとそうでないものに分別するためにselectionを1 mM ATP 存在と非存在下の２つの異なった条件で行った。9ラウンドまでselectionのサイクルを回した後、濃縮されてきたRNAアプタマープールを32Pでラベルし、eIF4A1に対する結合活性を測定した。その結果、ランダム配列のRNAプールに比べて結合活性の上昇が見られた（図３A）。これをクローン化し、ATP存在下でのselectionより４６クローン、ATP非存在下でのselection より４０クローンの塩基配列を決定した。その結果、いくつかの共通配列及び共通の二次構造が認められ、その共通配列に基づいて３つのグループに分類することができた（図４、５）。得られたRNAアプタマーはATP存在、非存在下での選択による特異的な配列は存在しなかった。それぞれのグループより幾つかのクローンの結合活性を調べた結果、グループ1のクローンno. +22ではランダム配列のRNAと同様で特異的な結合は見られなかったが、グループ２と３のクローンno. -1, no. -14, no. +11, no. +42では、ランダムRNAに比べ結合活性が上昇しており、その解離定数（Kd）は〜5μM程度であると思われた（図３B）。
【００４８】
結合活性が見られたグループ２、３のアプタマーでは共通配列（図４box I and II ; box IIは両グループに共通）が見られるが、これら共通配列はプライマー由来の配列と相補的で、stem構造を取ることが予想された。このことから、この塩基配列自体にはそれ程重要性はなく、stem構造を取ることが重要なのではないかと考えられる。また、それぞれのアプタマーの予想される二次構造でstem部分の配列と長さに多様性が見られ（図５）、これらにより結合能に差が見られることが期待されたが、顕著な差は見られなかった。
【００４９】
selection 2; 次に30 mer、40 merの2種類のランダムRNAプールに対して、30 merは12ラウンド、40 merは14ラウンドまでニトロセルロース膜を用いた固相化の方法でselectionを行った。40 merは15ラウンドのみ、Ni2+-NTA agaroseを用いた方法で行った。15ラウンド目にそれまでとは異なるselection法を採用したことにより、selection後のRNAプールの結合能が飛躍的に上昇した。これは、ニトロセルロース膜や、そのハウジングユニットなどに結合しているRNA分子が異なる系を用いることにより排除されたものと考えられる。それぞれの濃縮されたRNAプールの結合活性を調べたところ、30 mer、40 merともにランダム配列より強い結合が見られた(図６)。これらをクローン化し、それぞれ48クローンの塩基配列を決定した。30 merでは約1/3が、40 merでは約4/5が数カ所の塩基置換が見られるのみであり、相同配列であると考えられる。両者からいくつかのクローンを選び、結合活性を調べた(図７)。その結果、30 merのクローンより40 merのクローンの方が結合活性が高く、no.25が最も高い結合能を示した(Kd=〜3nM)。この結合活性は、平均的な抗原と抗体の結合活性（〜50nM）よりも一桁高いものであった。一方、この方法で得られた2種類のRNAアプタマー(30 mer no. 2、40 mer no.25)の二次構造をコンピューターで予測させたところ、ループ部分が1塩基だけ異なる共通のstem-loop構造が見出された(図８)。これは、この配列がeIF4A1に対する結合に直接関与している可能性を示している。そこで、この配列を持つ14 merと24 merの短いRNAを作成し、eIF4A1との結合能を調べたところ、特異的な結合活性は得られなかった（図９）。一方、30 merアプタマーの結合活性(Kd=〜100nM)は40 merアプタマーに比べると1/30程度であることから、後者の高い結合活性には共通配列以外の部分も重要と考えられる。そこで、得られたRNAアプタマーのeIF4A1との結合領域を調べるために結合活性の高かったRNAアプタマー(40 mer no.2)に対しmutagenesis PCRを行い、数塩基置換した変異アプタマーを作成し、これらのeIF4A1に対する結合活性を調べた。その結果、結合能を失わせる塩基置換の位置は、保存されていた配列だけではなくRNAアプタマー全体に渡ることがわかった（図１０）。以上から、これらのRNAアプタマーはその全領域でeIF4A1と結合していることが示唆された。
【００５０】
次にselection 1及びselection 2で得られたRNAアプタマーがeIF4A1のATPase活性を阻害するかを調べた。その結果、eIF4A1と結合活性があるRNAアプタマーは、ATPase活性を阻害したが、結合活性の見られなかったselection 1 no. +22では阻害効果が見られなかった（図１１）。阻害の強さはselection 2/40 merのアプタマーはselection 1のアプタマーよりも強いという、結合活性を反映する結果になった。selection 2/40 merでは１〜３倍量のRNAアプタマーでATPase活性をほぼ完全に抑えることができた。一方、selection 1のアプタマーでも１０倍量で５０〜８０％の活性阻害が見られた。これは結合活性の強さに比べて非常に高い阻害効果と言える。このことから、これらのRNAアプタマーはeIF4A1の生理機能に対する阻害効果を持つと考えられる。
【００５１】
selection 3；さらにeIF4G(672-970)に対しても、30 merと40 merの2種類のテンプレートを用い図２のi)、ii)の方法でselectionを12ラウンド行ったが、RNAプールの結合能はランダム配列と差が見られなかった。この原因として、固相化および洗浄の条件が厳しすぎた可能性があったのでiii)のより緩やかな条件でselectionを8ラウンド行った。その結果、30 mer、40 mer両方のRNAプールの結合活性が高くなっていた（図１２A）。これらをクローン化し塩基配列を決定した（図１２C）。幾つかのクローンを選び結合活性を測定した結果、40 mer no. 1及び40 mer no.4のクローンでKd=〜30nMという結合能を得た（図１２B）。
【００５２】
以上のように本発明ではeIF4A1及びeIF4Gに対するRNAアプタマーを取得した。本発明において幾つかの固相化・洗浄条件を検討したことにより、他のタンパク質に対してSELEXを行う場合のselection方法、RNAのランダム配列の長さの調節等の技術知識は十分に蓄積されたと考える。これに従えば、他のeIFに対してもRNAアプタマーを取得することできる。今後、より治療薬として適したRNAアプタマーを取得することが可能である。これらアプタマーのうち細胞内での翻訳阻害活性を持つものは、多くの癌遺伝子の発現抑制を行うことが可能である。また、腫瘍細胞に対して特異的に働かせる系を確立すれば、原因遺伝子に関わらず癌細胞の増殖を抑制する万能な治療薬となりうることも考えられる。
【００５３】
これら、eIFに対するRNAアプタマーを利用して以下の（１）〜（３）が可能となる。
（１）翻訳開始因子の機能解析:  あるeIFを構成するタンパク質に対するアプタマーがそのタンパク質の生理機能を阻害したとき、タンパク質のどの部分がその生理機能を担っているかを明らかにすることができる。すなわち、アプタマーにBr-dUTP(Sigma社製)などの修飾塩基を導入し、タンパク質と結合させたのちに紫外線を当ててアプタマーとタンパク質を共有結合させる。アプタマー、タンパク質を加水分解した後、高速液体クロマトグラフィーでアミノ酸分析を行うと、アプタマーとタンパク質の結合していた部分が分かる。また、個々のeIFサブユニットからeIF複合体を再構成することが可能である。この系にタンパク質との結合部位が明らかとなっているRNAアプタマーを加えることにより、複合体形成を形成する際の個々のタンパク質同士の結合部位を明らかにすることができる。In vitro だけではなく、in vivo における機能解析も行うことができる。アプタマーを既知の遺伝子導入方法、Lipofection(GibcoBRL社製)を用いたリポフェクションや、GenePulser(BioRad社製)を用いたエレクトロポーレーションにより培養細胞に導入することができる。また、pUC-tRR(H. Kawasaki, et al. Selection of the best target site for ribozyme-mediated cleavage within a fusion gene for adenovirus E1A-associated 300 kDa protein (p300) and luciferase, Nucl. Acid. Res. 24:3010-3016, 1996)などの発現ベクターにアプタマーを組み込み、同様に培養細胞に導入することにより、アプタマーを細胞内で発現させることができる。これにより、アプタマーに培養細胞の癌化を抑制する作用があるかどうかを確かめることができる。
（２）治療薬としての応用:  in vitro, in vivo で作用のあったアプタマーが治療薬として有効であるかどうかを調べることができる。既知の方法で癌を発症させた実験動物に培養細胞と同様の方法でアプタマーを血中、もしくは直接患部に投与して癌組織に変化が起これば、そのアプタマーは治療薬として有望である。このとき、アプタマーをより安定化させて効果を上げるために、既知の方法で修飾塩基を導入することができる。たとえば、RNA合成時に2'-fluoro UTP, 2'-fluoro CTP, 2'-amino UTP, 2'-amino CTP, 2'-hydroxy UTP, 2'-hydroxy CTP(JBL Scientific 社製など)のうち1種類、または複数種類を導入するとRNAアプタマーの安定を高くすることができる。
（３）診断薬としての応用:  RNAアプタマーは抗体の特徴を有しているが、これはRNAアプタマーを抗体の変わりに「RNA抗体」として用いることができることを意味する。これまで抗体を用いて行われていた免疫染色・ELISAなどでこのRNA抗体を用いた新規の検出系が構築できる。すでにRNAアプタマーの5'末端を市販のキット(Amersham Pharmacia社製)により蛍光ラベルしたものとeIF4A1の結合をMulti-well plate reader(ABI社製)により確認している。修飾塩基を導入したアプタマーをラベルすることにより、さらに感度を上げることができる。すなわち、種々のアプタマーを用いた翻訳開始因子の定量的測定が可能である。これにより発症機構の分かっていない疾患が翻訳調節異常を伴うかどうかを明らかにすることができる。また、前述のように腫瘍細胞では正常細胞に比べeIFの発現量に異常が見られるという報告がある。さらに、ラットにおいて種々の癌細胞でeIF4EのmRNA量が異なっていることが報告されている（Miyagi Y., et al., Elevated levels of eukaryotic translation initiation factor eIF-4E, mRNA in a broad spectrum of transformed cell lines, Cancer Lett., 91:247-252, 1995）。このように腫瘍細胞の良性・悪性、さらには転移性の強さなどでeIFの発現パターンに違いがあることが予想される。アプタマーを用いてeIFの発現量の差を認識できる系をELISAやアプタマーのチップ化により確立することにより、安価で簡便でな癌診断が可能となる。さらに、種々のeIFに対してアプタマーを取得しカタログ化し、eIFの発現パターンを調べることにより、腫瘍の種類を識別できる診断法を開発することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明の実験の手法を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
［実施例１］  タンパク質の精製
ヒトeIF4A1とヒトeIF４G(672-970)のサブクローンはカナダ・マクギル大学のNahum Sonenberg教授より提供された（Pause A. and Sonenberg N., Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase: the mammalian translation initiation factor eIF-4A, EMBO J., 17: 7480-7489, 1998、 MorinoS., et al., Eukaryotic translation nitiation factor 4E (eIF4E) binding site and the middle one-third of the eIF4G constiturte the core domain for cap-dependent translation, and the C-terminal one-third functions as a modulatory region, Mol. Cell. Biol., 20: 468-477, 2000）。ヒトeIF4A1とヒトeIF4G(672-970)をコードするDNAをpET15bベクター(Novagen社製)にサブクローニングし、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen社製)に形質転換した。BL21(DE3)株はT7RNAポリメラーゼをIPTG(Sigma社製など)の培地への添加により発現誘導でき、pET15bのクローニングサイト上流のT7プロモーターを稼働させ、目的遺伝子をヒスチジンのタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させることができる。得られた形質転換体をLB/アンピシリン液体培地中で培養し、増殖速度が最大の時にIPTGを終濃度0.5mMになるように加えてヒトeIFの発現誘導をかけた。大腸菌を遠心回収し、超音波破砕後、ヒスチジンに対して結合能を持つNi2+-NTA agarose（Qiagen社製）を用いて粗精製し、さらに陰イオン交換カラムResuroce Q（Amercham Pharmacia biotech社製）により精製分離した。
【００５６】
［実施例２］  RNAアプタマーの取得
SELEX法を用いたin vitro RNA selectionはEllingtonらの方法（Ellington A.D. and Szostak J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346:818-22, 1990）及びTuerkらの方法（Tuerk C. and Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249:505-510, 1990）を改良して行った。in vitro selectionに用いたRNA poolは化学合成した以下のプライマー及びランダム配列テンプレート(グライナー・ジャパン社に合成依頼)より作成した。PCRで増幅させたランダム配列のDNA断片を転写のテンプレートとし、プライマーP1、P1'に含まれるT7RNAポリメラーゼのプロモーターより、in vitroでT7RNAポリメラーゼにより転写し、フェノール抽出とゲル濾過により精製した。
0004167403.tif 000011
RNAは結合前に95℃で5分間処理した後、30分以上かけゆっくりと室温まで温度を下げ二次構造を取るようにした。RNAとタンパク質との結合はbinding buffer [20 mM Tris-HCl(pH7.6), 80 mM K-acetate, 2.5 mM Mg-acetate, 1 mM DTT, 100U/ml RNase Inhibitor, 5 % glycerol]中で行われた。固相化・洗浄条件は図２に示す。
８〜１５ラウンドselectionを行った後、PCR産物はpGEM-T vector（Promega社製）にサブクローニング後、大腸菌株NovaBlue（Novagen社製）に形質転換し、単一クローンを得た。これらは、plasmidを抽出後DNA sequencer（model 377, ABI社製）で、以下のsequence primerを用いて塩基配列を決定した。
0004167403.tif 000012
得られた塩基配列は遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX-MAC（ソフトウェア開発社製）によりRNAの二次構造予測を行った。
【００５７】
［実施例３］  RNA結合活性の測定
得られたRNAアプタマーの結合活性はニトロセルロース膜を用いて測定した。RNAアプタマーは［α-32P］CTP存在化で転写を行いRIラベルした。ラベルされたRNAアプタマーは種々の濃度のeIF4A1とbinding buffer中で混合し、25℃で30分間インキュベートした後、吸引ろ過装置で10 μg/ml tRNA存在下のbinding bufferで処理されたニトロセルロース膜を透過させ、１mlのbinding bufferで洗浄、乾燥後、膜に吸着した32Pのカウントをシンチレータ（Beckman社製）で測定した。系に加えた総RNAのラベルのカウントに対する、膜に吸着したカウントの相対量を結合効率としてグラフにプロットした。
【００５８】
共通ステム構造部分の短い配列は２つのオリゴヌクレオチド、T7-proとP-14あるいはP-24をアニーリングさせ、これをテンプレートとしてin vitroにおいてT7ポリメラーゼにより転写させ、精製してきた。
0004167403.tif 000013
【００５９】
［実施例４］  ATPase活性の阻害効果の確認
eIF4A1はRNA存在下でATPase活性を示す。RNAアプタマー^によりATPase活性が上昇することが予備実験で示されたので、アッセイ系に過剰量のpoly(A)を加えることで影響が出ないようにして活性測定を行った。1 μM（最終濃度）のeIF4A1と0、0.1、0.3、1、3、10 μM（最終濃度）のRNAアプタマーをbinding buffer中で混合し、室温で15分間インキュベートした後、A260=25（最終濃度）のpoly(A)、0.1mM（最終濃度）のATP、0.125μCi（最終放射線量）の[γ-32P] ATP(6000 Ci/mmol)を加え、37℃で60分インキュベートした。遊離した無機リン酸をGrifoらの方法（Grifo J. A., et al., RNA-stimulated ATPase activity of eukaryotic initiation factors, J. Biol. Chem., 259:8648-8654, 1984）に従い抽出し、32Pカウントをシンチレータで測定した。RNAアプタマーを加えていない反応でのカウントに対する、相対量をグラフにプロットした。
【００６０】
［実施例５］  RNAアプタマー変異体の作成
pGEM-T vectorにクローン化してある40 mer no.2をテンプレートとし、プライマーP1とP2を用いて、PCR反応液中に0.75mMのMnCl2を加えPCR反応を行った。このPCR産物をpGEM-T vectorにクローン化し、塩基配列を確認した。得られたクローンをRNAに転写後、結合活性を測定した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、翻訳開始因子に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが提供された。本発明のＲＮＡアプタマーは、翻訳異常により引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能である。
【００６２】
【配列表】
0004167403.tif 000014
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【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、プライマーP1の塩基配列を示す。
【００６３】
【配列番号２】
配列番号２は、プライマーP2の塩基配列を示す。
【００６４】
【配列番号３】
配列番号３は、40merランダム配列テンプレートの塩基配列を示す。
【００６５】
【配列番号４】
配列番号４は、プライマーP1'の塩基配列を示す。
【００６６】
【配列番号５】
配列番号５は、プライマーP2'の塩基配列を示す。
【００６７】
【配列番号６】
配列番号６は、30merランダム配列テンプレートの塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号７】
配列番号７は、sequence primerの塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号８】
配列番号８は、Group 1 clone no.+13 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７０】
【配列番号９】
配列番号９は、Group 1 clone no.+7 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７１】
【配列番号１０】
配列番号１０は、Group 1 clone no.+1 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７２】
【配列番号１１】
配列番号１１は、Group 1 clone no.+45 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７３】
【配列番号１２】
配列番号１２は、Group 1 clone no.+20 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７４】
【配列番号１３】
配列番号１３は、Group 1 clone no.+2 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７５】
【配列番号１４】
配列番号１４は、Group 1 clone no.+48 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７６】
【配列番号１５】
配列番号１５は、Group 1 clone no.+22 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７７】
【配列番号１６】
配列番号１６は、Group 2 clone no.+27 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７８】
【配列番号１７】
配列番号１７は、Group 2 clone no.+31 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７９】
【配列番号１８】
配列番号１８は、Group 2 clone no.+33 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８０】
【配列番号１９】
配列番号１９は、Group 2 clone no.+41 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８１】
【配列番号２０】
配列番号２０は、Group 2 clone no.+42 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８２】
【配列番号２１】
配列番号２１は、Group 2 clone no.+38 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８３】
【配列番号２２】
配列番号２２は、Group 2 clone no.+47 (selection 1の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８４】
【配列番号２３】
配列番号２３は、Group 2 clone no.+11 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８５】
【配列番号２４】
配列番号２４は、Group 2 clone no.-1 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８６】
【配列番号２５】
配列番号２５は、Group 2 clone no.-2 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８７】
【配列番号２６】
配列番号２６は、Group 3 clone no.+10 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８８】
【配列番号２７】
配列番号２７は、Group 3 clone no.+15 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８９】
【配列番号２８】
配列番号２８は、Group 3 clone no.+6 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９０】
【配列番号２９】
配列番号２９は、Group 3 clone no.+46 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９１】
【配列番号３０】
配列番号３０は、Group 3 clone no.+44 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９２】
【配列番号３１】
配列番号３１は、Group 3 clone no.-13 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９３】
【配列番号３２】
配列番号３２は、Group 3 clone no.-14 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９４】
【配列番号３３】
配列番号３３は、Group 3 clone no.-18 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９５】
【配列番号３４】
配列番号３４は、Group 2 clone no.-1の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９６】
【配列番号３５】
配列番号３５は、Group 2 clone no.+11の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９７】
【配列番号３６】
配列番号３６は、Group 2 clone no.+42の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９８】
【配列番号３７】
配列番号３７は、Group 3 clone no.-14の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９９】
【配列番号３８】
配列番号３８は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１００】
【配列番号３９】
配列番号３９は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 9 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０１】
【配列番号４０】
配列番号４０は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 15 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０２】
【配列番号４１】
配列番号４１は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 25 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０３】
【配列番号４２】
配列番号４２は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（30merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０４】
【配列番号４３】
配列番号４３は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 5 (selection 2)の塩基配列（30merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０５】
【配列番号４４】
配列番号４４は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 25 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０６】
【配列番号４５】
配列番号４５は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と30merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０７】
【配列番号４６】
配列番号４６は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 25 (selection 2)の保存領域の塩基配列を示す。
【０１０８】
【配列番号４７】
配列番号４７は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の保存領域の塩基配列を示す。
【０１０９】
【配列番号４８】
配列番号４８は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１０】
【配列番号４９】
配列番号４９は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１１】
【配列番号５０】
配列番号５０は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１２】
【配列番号５１】
配列番号５１は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１３】
【配列番号５２】
配列番号５２は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１４】
【配列番号５３】
配列番号５３は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１５】
【配列番号５４】
配列番号５４は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１６】
【配列番号５５】
配列番号５５は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１７】
【配列番号５６】
配列番号５６は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１８】
【配列番号５７】
配列番号５７は、eIF4Gをターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたclone no. 1 (selection 3)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１１９】
【配列番号５８】
配列番号５８は、eIF4Gをターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたclone no. 4 (selection 3)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１２０】
【配列番号５９】
配列番号５９は、eIF4Gをターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたclone no. 7 (selection 3)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１２１】
【配列番号６０】
配列番号６０は、塩基配列(IV)の塩基配列を示す。
【０１２２】
【配列番号６１】
配列番号６１は、T7-proの塩基配列を示す。
【０１２３】
【配列番号６２】
配列番号６２は、P-14の塩基配列を示す。
【０１２４】
【配列番号６３】
配列番号６３は、P-24の塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  SELEX法の概略。T7RNAポリメラーゼプロモーター配列とランダム領域を含むDNAを合成し、P1, P2をプライマーとしてPCRを行いテンプレートを得る。これから合成したRNAを標的物質と会合させ、結合したRNAを回収する。回収したRNAからRT-PCRにより次のラウンドへのテンプレートを得る。これを8〜15ラウンドを繰り返す。最終ラウンドでのRTーPCR産物ををクローニング、シークエンスに回す。特に楕円で示した複合体の固相化、洗浄、RNAの抽出の条件設定が重要である。
【図２】固相化、洗浄法。本発明で用いたアプタマーselection時の固相化と洗浄方法を模式的に示す。
【図３】  selection1で得られたRNAアプタマーのeIF4A1との結合活性。(A)ではselection後のRNAプールに対して、(B)ではそれらをクローン化し単一のRNAとして転写したものに対してアッセイを行った。タンパク質と結合し膜にトラップされた32PでラベルされているRNAのカウントを計測し、系に加えた総RNAのカウント数に対する相対比率を結合活性とし縦軸にプロットした。横軸は系に加えたeIF4A1の濃度を示す。
【図４】  selection 1で得られたRNAアプタマーの塩基配列。配列の相同性により便宜上３つのグループに分けられた。Boxで囲ってある配列がそれぞれで保存されていた配列を示す。グループ2と3では共通の配列（boxII）が見られた。矢印はその向きに相補的な配列を示す。
【図５】  selection 1で得られたRNAアプタマーの予想される二次構造。グループ2より-1、+11、+42の、グループ3より-14のアプタマーの二次構造を示す。グループ1ではグループ内で保存されている二次構造は見られなかった。小文字はプライマー由来の配列、大文字がSELEXで得られた配列を示す。グループ２、３で保存されている配列は（box IとII）プライマー由来の配列と相補鎖を形成する。図４で矢印で示した配列はstem構造をとる。しかし、stemの長さやbulgeの有無はクローンにより差があった。
【図６】  selection 2で得られたRNAアプタマーのeIF4A1との結合活性。(A)ではselection後のRNAプールに対して、(B)ではそれらをクローン化し単一のRNAとして転写したものに対しての結合活性を示す。
【図７】  selection 2で得られたRNAアプタマーの塩基配列。
【図８】  selection 2で得られたRNAアプタマーの予想される二次構造。
【図９】  RNAアプタマー保存領域とeIF4A1との結合活性。selection 2/30 merと40 merで見られた保存領域のみのRNAを作成し、eIF4A1との結合活性を測定した。(A)は転写産物の予想される二次構造を示す。（B）はニトロセルロース膜を用いたeIF4A1との結合活性の測定結果を示す。
【図１０】  eIF4A1との結合活性を失った変異の位置。selection 2 no. 2のアプタマーに対して変異を導入した。no. 2 のRNAアプタマーの二次構造に対して、変異の導入された位置と置換された塩基をその外側に記した。変異体は基本的に図に示された位置での一塩基置換であるが、四角で囲まれた塩基はその組み合わせで複数個置換が導入されていることを示す。
【図１１】  SELEXで得られたeIF4A1に対するアプタマーのeIF4A1のATPase活性への影響。(A)ではselection 1のアプタマーを(B)ではselection 2/40 merのアプタマーの結果を示している。縦軸には、RNAアプタマーを加えていない時の遊離リン酸のカウント数を100とした時の相対量をとり、横軸には加えたRNAアプタマーの量を示している。
【図１２】  selection 3で得られたeIF4G(672-970)に対するRNAプールの結合活性(A)、40mer RNAプールより得たクローンの結合活性(B)とその塩基配列(C)。
図１２Ａにおいて、40mer, 8thとは、eIF4G(672-970)をターゲットにして40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNAプールであり、30mer, 8thとは、eIF4G(672-970)をターゲットにして30merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNAプールである。
図１２Bにおいて、40mer, 8th, no.1, 4, 7とは、eIF4G(672-970)をターゲットにして40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNA clone no.1, 4, 7である。
図１２Cにおいて、eIF4G, 40mer, 8th round, no.1, 4, 7とは、eIF4G(672-970)をターゲットにして40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNA clone no.1, 4, 7である。
【図１】
0004167403.tif 000046
【図２】
0004167403.tif 000047
【図３】
0004167403.tif 000048
【図４】
0004167403.tif 000049
【図５】
0004167403.tif 000050
【図６】
0004167403.tif 000051
【図７】
0004167403.tif 000052
【図８】
0004167403.tif 000053
【図９】
0004167403.tif 000054
【図１０】
0004167403.tif 000055
【図１１】
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【図１２】
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