(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分取の対象とする神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む組織をトリプシン処理して調製した、前記の神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む複数種の細胞が混合してなる混合細胞懸濁液を用いて、フローサイトメトリーにより細胞にレーザ光を照射し、蛍光標識を用いることなく、その照射光の前方散乱光及び側方散乱光を測定し、その測定値を２次画面上に位置情報として識別表示して、これにより、前記組織から前記神経幹細胞及び神経前駆細胞を分離・分取する神経幹細胞の分取方法であって、
前記フローサイトメトリーによる細胞の流れであるサンプル・コアの流れが、シース圧とサンプル圧の差０．５〜０．７５且つサンプル圧６．７５ｐｓｉ〜７．０ｐｓｉで制御され、
前記前方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧２２０ボルト〜３３０ボルトで検出され、かつ前記側方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧４００ボルト〜５２０ボルトで検出されることを特徴とする神経幹細胞の分取方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種の細胞混合物の中から何ら修飾処理しないで生きた目的の細胞を迅速に分取する方法に関する。とりわけ、脳疾患に対して期待される再生医療の基礎的研究及びその応用として移植等の治療に利用できる、高純度の神経幹細胞及び神経前駆細胞を迅速に分取する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、脳疾患の治療のための新しい方法として再生医療が注目されている。再生医療は生体にある神経幹細胞のもつ再生能力を治療に用いることで、今まで、再生できないと言われていた神経細胞を新生させることで治療をするものである。
神経幹細胞及び神経前駆細胞（以下、神経幹細胞系とする）は、至適条件でニューロン及びグリアなどの細胞に分化することが証明されていて、上記のような再生医療の観点から、アルツハイマー病、パキンソン氏病などの脳疾患の治療に有用となることが期待される。
【０００３】
そのような実情を受け、神経幹細胞系の精製分離が試みられ、とりわけ、迅速に高純度な神経幹細胞系を単離することが期待されてきた。そのような試みの例として以下の方法を挙げることができる。
【０００４】
まず、細胞培養による方法（Isolation and characterization of mouse neural precurser cells in primary culture, in vitro cell. Dev. Bio1. 27A, 615-624(1991), HIROSHI KITANI et al.）の報告がある。この方法では、高純度の神経幹細胞系の取得が難しく、さらに目的の細胞を分離する前に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）にて培養する必要があり、この培養期間に神経幹細胞系の分化等による性質の変化が生じてしまうという欠点があった。
また、比重遠心法による方法（Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem ce11s from diverse regions of the adult CNS.  J Neurosci 19(19):8487-97(1999), Palmer TD, et a1.）では、分離操作の時に化学物質の影響が考えられ、さらに遠心操作では大量の細胞を確保し難いという欠点があった。
【０００５】
ところで、フローサイトメトリーを用いる血液細胞の分取の報告がある。血液は複数種の細胞からなるが、各々の血液細胞は構造や性質からはっきり区別できるため、各々の血液細胞の単離は比較的容易に達成できる。
最近、フローサイトメトリーの細胞解析能を利用したセルソーター（細胞分取装置）を用い、構造的にも性質的にも未知の成分を多く含む脳組織抽出混合物中から神経幹細胞系を精製分離しようとする試みがなされている。そのような例として、蛍光標識した神経細胞に対してフローサイトメトリーを用いる方法（Direct isolation of human central nervous system stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 19; 97(26):14720-5(2000) Uchida N, et a1.）が報告されている。
神経幹細胞系では、細胞自体の性質を維持して入手することが必須である。しかし、蛍光強度と前方散乱光の組み合わせによる上記の方法では抗体で予め標識する必要があり、神経幹細胞系の性質に好ましくない影響を与える。
即ち、細胞分取操作の前に、目的の細胞の細胞表面分子に対して、蛍光色素を結合させ、その分子に特異的な抗体を標識する必要があり、神経幹細胞系の性質を維持して入手することが難しい。
【０００６】
また、遺伝子導入した動物から神経幹細胞系をフローサイトメトリーで分離する方法（Direct isolation of committed neuronal progenitor cells from transgenic mice coexpressing spectrally distinct fluorescent proteins regulated by stage-specific neural promoters., J Neurosci Res, 65, 220-227(2001) Sawamoto K, et al.）が報告されている。
しかし、この方法は、予め受精卵を標識した動物、すなわち組換え動物に適用される技術であって、組換えを受けていない自然のままの生きた神経幹細胞系を分取することはできない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、複数種の細胞混合物の中から何ら修飾処理しないで生きた目的の細胞を迅速に分取する方法を提供することを目的とし、とりわけ、脳疾患に対して期待される再生医療の基礎的研究及びその応用として移植等の治療に利用できる、高純度の神経幹細胞系を迅速に分取する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的に対し鋭意検討した結果、蛍光を用いることなく、フローサイトメトリーのセルソーターを用い、レーザを照射したときの神経幹細胞系自体からの２つの散乱光を適正な条件に設定し、他の細胞との差別化を行い、２次元での位置情報として可視化することにより、何ら修飾処理しないで生きた初期発生における神経幹細胞系を迅速に且つ高純度で分取できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）  分取の対象とする神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む組織をトリプシン処理して調製した、前記の神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む複数種の細胞が混合してなる混合細胞懸濁液を用いて、フローサイトメトリーにより細胞にレーザ光を照射し、蛍光標識を用いることなく、その照射光の前方散乱光及び側方散乱光を測定し、その測定値を２次画面上に位置情報として識別表示して、これにより、前記組織から前記神経幹細胞及び神経前駆細胞を分離・分取する神経幹細胞の分取方法であって、
前記フローサイトメトリーによる細胞の流れであるサンプル・コアの流れが、シース圧とサンプル圧の差０．５〜０．７５且つサンプル圧６．７５ｐｓｉ〜７．０ｐｓｉで制御され、
前記前方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧２２０ボルト〜３３０ボルトで検出され、かつ前記側方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧４００ボルト〜５２０ボルトで検出されることを特徴とする神経幹細胞の分取方法
を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】
フローサイトメトリーは、蛍光を用いることなく、レーザを個々の細胞に照射したときの細胞自体から発する散乱光のみを検出パラメーターとして細胞分取に用いることができる。
【００１２】
本発明で用いるフローサイトメーターのシステムの好ましい１例の概要を図１０に示す。図１０を参照しながらフローサイトメトリーの手順を説明する。
まず、空気圧をかけシース圧調節器１及びサンプル圧調節器４を調節しながらシース液容器２及びサンプル液容器１４からそれぞれシース液及びサンプル液をフローセル７に導入する。ここで、フローセル７中においてシース液とサンプル液とが混じりあうことはない。なお、フローセル７中を流れていくときサンプルコアはシース液流によって囲まれている。
その導入したシース液流で囲まれたサンプルコア流にレーザー光８を照射して、生じた散乱光９を検出する。この散乱光９によりサンプルコア中の細胞を観察する。
【００１３】
次に、レーザー光８の照射により散乱光９で観察した細胞をソーティングする。そのために、水流が水滴に分かれる寸前に水流全体にプラスまたはマイナスの電荷を加え、設定領域内の目的の細胞を含む水滴をプラスまたはマイナスに帯電させる。帯電させたサンプルコアを正電圧板１０及び負電圧板１１でソートし、それぞれ右ソート１２及び左ソート１３に分ける。帯電していないものは垂直に落下して廃液となる。
【００１４】
本発明で用いる検出パラメーターは前方散乱光（ＦＬＳ；１．５°〜１９°）及び側方散乱光（ＰＬＳ；９０°）である。
前方散乱は細胞の大きさ（細胞表面積）に相関があり、側方散乱は細胞内微細構造に相関があることが知られていて、その細胞の特質を表わしている。
この２つのパラメーターで表される２次元座標の１つのドットは個々の細胞を表し、その濃淡は細胞密度を表している。また、その分布は細胞の大きさと細胞内構造の違いを反映する。
【００１５】
図１は標準感度でのフローサイトメトリーによる分取の結果であり、それで得られたゲートIIIのネスチン陽性細胞集団をさらに高感度で分取した結果が図２である。
図１ａは細胞クラスターを差別化した２次元画面であり、図１ｂはａで差別化した細胞クラスターに対するソーティングゲートを作成した２次元画面である。
図２ａはゲートIIIについて標準感度による２次元画面であり、図２ｂはゲートIIIについて高感度による２次元画面であり、図２ｃはゲートIII、IIIA及びIIIBを１つの画面に表示した２次元画面である。
【００１６】
図１及び図２に示したように、Ｉ’：細胞破片、ＩＩ’：死細胞、ＩＩＩＡ：神経幹細胞系、ＩＩＩＢ：ネスチン弱陽性細胞、ＩＶ’：ネスチン弱陽性細胞とフィブロブラスト様細胞の混合細胞を含む支持細胞、Ｖ’：フィブロブラスト様細胞、ＶＩ’：ダブレット（２細胞が連結したもの）のクラスターが存在する２次元画面が得られ、この２つのパラメーターで表示された細胞クラスターにゲート（Ｉ〜ＶＩ、ＩＩＩＡ、及びＩＩＩＢ）を設定することで個々の細胞集団を分取できる。
【００１７】
本発明の方法により分取の対象とする細胞は、神経幹細胞系である。
本発明の方法により分取の対象とする細胞の供給源は、初期胚、初期胚の内部細胞塊、胎仔組織、成人組織等の細胞混合物であってもよい。
本発明の方法により神経幹細胞系を分取する場合、神経幹細胞系の供給源は、胎仔脳、成人脳組織など神経幹細胞系を含む限りいかなる細胞混合物であってもよい。
また、該混合細胞懸濁液の調製は、トリプシンによる酵素法により行われる。上記トリプシンによる酵素法において、溶液中にヒアルロン酸及びキヌレン酸を同時に含んでもよい。また、上記トリプシンによる酵素法において、溶液中にタイプ３コラゲナーゼを含んでもよい。
【００１８】
トリプシンのみによる酵素法の場合、溶媒は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー液を用いてよい。該溶媒は組合わせて用いてよい。このとき、トリプシンの濃度は０．０２５〜０．１(v/v)％が好ましい。
【００１９】
上記細胞懸濁液は単一（非集合）の細胞懸濁液として調製し、細胞１個ずつレーザを通過させるのが好ましい。そのために、単一の細胞が連続して流れるサンプル液流とそれを包むシース液からなるサンプル・コアを形成し、該サンプル・コア中の１個の細胞がレーザ・ビーム中央を通過するように流れを調節し、且つ一度に複数の細胞が照射されないようにレーザ・ビームを集束させて強度を高めることが好ましい。
本発明で扱われる細胞の大きさは、７〜１８μｍである。
レーザ光の強度は、ビーム中心部より縁部のほうが低いので感度及び分解能を高めるために全ての細胞が同じ経路でレーザ・ビーム中心部を通るのが好ましい。
そのため、該サンプル・コアの直径は小さいほど好ましく、具体的には、該サンプル・コアの直径は２５〜５０μｍが好ましく、特に２８〜３８μｍが好ましい。
【００２０】
前述の理由により上記サンプル・コアの流れは低速であるほど好ましい。具体的には、サンプルフローは２５〜４０が好ましく、特に２８〜３８であることが好ましい。
フローサイトメータとしてＥＰＩＣＳ（登録商標、COULTER社製）を用いた場合、上記サンプルフローの値は、シース圧（上記シース液の入った容器に対する圧力）７．５ｐｓｉ＝１００（サンプル圧（上記細胞懸濁液の入った容器に対する圧力）：７．５ｐｓｉ）として、７．５ｐｓｉ−１ｐｓｉ＝０（サンプル圧：６．５ｐｓｉ）として差の１ｐｓｉを１００等分した値に相関する。
測定時のフロー速度は、１００〜９００細胞／秒が好ましく、特に４００〜７００細胞／秒であることが好ましい。
【００２１】
上記サンプル・コアの流れはシース圧により制御され、上記サンプル・コアの直径はシース圧とサンプル圧の差によって制御される。
例えば、サンプル圧を一定に維持したまま、シース圧を高くすることによって上記サンプル・コアの流れを速め、サンプル・コア直径が小さくなる。
【００２２】
具体的には、シース圧とサンプル圧の差が０．５〜０．７５且つサンプル圧が６．７５ｐｓｉ〜７．０ｐｓｉである。シース圧とサンプル圧の差が０．６２〜０．７２且つサンプル圧が６．７８ｐｓｉ〜６．８８ｐｓｉであることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明の光源として用いるレーザは、神経幹細胞系を変質させず、且つ細胞から散乱光が発生する限り、アルゴンレーザ等公知のいかなるレーザを用いることもできるが、アルゴンレーザが好ましい。
波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた場合、照射光１０〜２５ｍＷが好ましく、照射光１５ｍＷがさらに好ましい。
上記アルゴンレーザは、ビーム整形レンズを用いて集束させてよい。
上記サンプルコアに照射される上記アルゴンレーザの断面は、扱われる細胞断面の大きさに近いことが好ましく、特に長軸５７μｍ、短軸１５μｍの楕円形をしていることが好ましい。
【００２４】
波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた場合、検出する前方散乱光の波長は、４８８ｎｍが好ましい。該前方散乱光は輝度が非常に高いため、光の強度を低減するフィルターを通して検出されてよい。
散乱光の検出器は光電子倍増管又はシリコンフォトダイオードであってよい。
上記光電子倍増管及び上記シリコンフォトダイオード管各々は、それ自体に印加される電圧により感度が変動してよい。
前方散乱光の検出器はシリコンフォトダイオードであることが好ましい。
側方散乱光の検出器は光電子倍増管であることが好ましい。
【００２５】
該前方散乱光の検出器がシリコンフォトダイオードである場合、標準感度による分取の際には、該前方散乱光は、該フィルターを通して該検出器に印加する電圧が１３０ボルト〜１７０ボルトで検出されることが好ましく、特に１４５ボルト〜１５５ボルトで検出されることが好ましい。
該前方散乱光の検出器がシリコンフォトダイオードである場合、高感度による分取の際には、該前方散乱光は、該フィルターを通して該検出器に印加する電圧が２２０ボルト〜３３０ボルトで検出され、特に２４５ボルト〜２５５ボルトで検出されることが好ましい。
【００２６】
波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた場合、検出する側方散乱の波長は、４８８ｎｍが好ましい。
該側方散乱光の検出器が光電子倍増管である場合、標準感度による分取の際には、該側方散乱光は、該検出器に印加する電圧が３５０ボルト〜４１０ボルトで検出されることが好ましく、特に３９５ボルト〜４０５ボルトで検出されることが好ましい。
該側方散乱光の検出器が光電子倍増管である場合、高感度による分取の際には、該側方散乱光は、該検出器に印加する電圧が４００ボルト〜５２０ボルトで検出され、特に４３０ボルト〜４５０ボルトで検出されることが好ましい。
上記検出器から発生した電流は、信号としての電圧パルスに変換されてよい。
信号としての該電圧パルスは増幅（増幅比率：ゲイン）、アナログ−デジタル変換等の処理を受けてもよい。
【００２７】
上記２つのパラメーター（前方散乱光及び側方散乱光）について表示された２次元画面上の細胞クラスターにゲートを設定することで個々の細胞集団を分取する際には、そのゲート設定した領域に相当するサンプル・コアに由来する液滴に荷電することにより分取してもよい。
【００２８】
本発明の前方散乱及び側方散乱のフローサイトメトリーを用いる方法において、感度と分解能の至適条件の設定は蛍光標識のビーズであるマイクロスフェア（フローチェック、商品名、COULTER社製）、又は予め４％(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、トリプシン法により作製したＥ１２前脳由来の単一（非集合）細胞などを用いることができる。
【００２９】
本発明において神経幹細胞系を検出するために用いられる抗体としては、１次抗体としては、抗ネスチン抗体、抗ムサシ１抗体などの神経幹細胞系に特異的であれば既知のいかなる抗体でもよく、抗ネスチン抗体を用いることが好ましい。
【００３０】
上記抗ムサシ１抗体は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、神経幹細胞系に対する抗体である（(1) Mouse-Musashi-1, a neural RNA-binding protein highly enriched in the mammalian CNS stem cell., Developmental Biology., 176(2), 230-242(1996) Sakakibara S, et al.; (2) Musashi1: an evolutionally conserved marker for CNS progenitor cells including neural stem cells., Dev. Neuroscience, 22, 138-152(2000） Kaneko Y, et al.)。
２次抗体としては、上記１次抗体に親和性のあるものであればよく、既知のいかなる抗体でもよく、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ’）２抗体が好ましい。
【００３１】
【実施例】
次に実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
参考例１
１）細胞懸濁液の調製：ラット胎仔１２日目（Ｅ１２）からの胎仔脳（前脳及び中脳を含む）の分離はガーゼを敷いた１０ｃｍペトリディッシュ（SH90-15、商品番号、コーニング社製）及び６ｃｍディッシュ（15020、商品番号、コーニング社製）を用いて実体顕微鏡下でおこなった。
その後、１５ｍｌのコニカルチューブ（2095、商品番号、ファルコン社製）へ移し０．１％トリプシン／ＰＢＳと共に３０分間インキュベートし、０．０４％ＤＮアーゼ（DN‐25、商品番号、シグマ社製）及び１０％ウシ胎児血清を加えて５分間静置した。次いでＤＦ（ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２＝１：１）培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＦ培地中で２００μｌ用のチップを装着した１ｍｌピペット（7503、商品番号、ファルコン社製）にてピペッティング後に細胞懸濁液とした。
【００３３】
２）フローサイトメトリーによる無菌ソーティング：フローサイトメトリーはアルゴンレーザを光源とし（４８８ｎｍ、１５ｍＷ出力）、径口１００μｍのチップをフローセルに装着している。
フローサイトメトリーの感度と分解能の至適条件の設定は蛍光標識のビーズであるマイクロスフェアを用いた。
フローサイトメーターの液送ラインは予め７０％(v/v)エタノールで滅菌した。また、シース液はオートクレーブにて滅菌し、ろ過したＰＢＳを用いた。
【００３４】
細胞懸濁液中の細胞の解析は個々の細胞がレーザに照射された時に生ずる散乱光（４８８ｎｍ）の強度をパラメーターとする散乱光分析によった。
この分析法はレーザに照射された細胞の前方散乱と９０°の側方散乱を用いるもので、測定結果はワークステーションのモニターにＦＬＳとＰＬＳの２パラメーターとして細胞の分布と密度からなる、６４チャンネルに分けた２次元の画面にドットで表示したサイトグラムで表示される。
【００３５】
前述のHIROSHI KITANIらの細胞培養による方法で行った予備実験での検討から目的の細胞がサイトグラムから確定できるので画面上の領域を指定して分取した。
図３に示すように指定したソート領域はＥとＦとし、Ｅは右側のチューブに、Ｆは左側のチューブに分取した。
図３ａは、胎仔脳を酵素処理し調製した細胞懸濁液をフローサイトメーターに適応した結果を示している。図３ｂは、ソート範囲Ｅの分取後のサイトグラムを示している。
【００３６】
尚、データの再現性を得るために次のように条件設定をした。
ＦＬＳ：１５０ボルト（ゲイン５）、ＰＬＳ：４０５ボルト（ゲイン１０）、シース圧とサンプル圧の差：０．６０〜０．６４（サンプル圧／シース圧＝６．８８／７．５）、サンプルフロー：３４〜３７、フロー速度：８００〜１０００細胞／秒。
【００３７】
ソーティングに際して、細胞懸濁液は予め５０μｍのナイロンメッシュ（共進理工、５０Ｎ）でろ過して凝集した細胞を除いた。
ろ過した単一（非集合）の細胞懸濁液はサンプルチューブ（2063、商品番号、ファルコン社製）に分けて４℃に保存し、順次ソーティングに供した。
分取した細胞は１０％ウシ胎児血清／ＤＦを含む４．５ｍｌのチューブに順次、無菌的に回収し、遠心後６ｃｍディッシュに集めた。
【００３８】
３）細胞培養：無菌的に分取した細胞は遠心後、洗浄し血清を含む培地及び無血清培地にて培養した。培養２４孔マイクロプレート（25820MP、商品番号、コーニング社製）及びチェンバースライド（Ｌａｂ‐Ｔｅｋ、商品名、ヌンク社製）の表面は予めポリエチレンイミン（ＰＥＩ、P-3143、商品番号、シグマ社製）でコーティングしたもの（ＰＥＩ処理ディッシュ）、あるいは未処理（未処理ディッシュ）の２種類を用いた。
培養液はＤＦ（ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２＝１：１）培地を用い、無血清培地の検討では亜セレン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を含みアポ−トランスフェリン（T-1147、商品番号、シグマ社製）、インスリン（ＣＢＰ社製）、ヘパリン（H-3149、商品番号、シグマ社製）のそれぞれを組み合わせて添加し、２４孔プレートあるいはチェンバースライドにて３７℃、５％ＣＯ２で培養し生存、増殖分化を免疫蛍光法による特異抗原の検出で調べた。培地交換は３日ごとに行った。
【００３９】
また、既知の栄養因子としてａＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）（ＧＦ−０１−０１０、商品名、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）、ｂＦＧＦ（２３３‐ＦＢ、商品名、Ｒ＆Ｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴＧＦ‐α（３２４７ＳＡ、商品番号、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）、ＥＧＦ（３２４７ＳＡ、商品番号、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）、ＩＧＦ‐Ｉ（１３２４５−０１４、商品番号、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＩＧＦ−II（３２５５ＳＡ、商品番号、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）、ＮＧＦ（ＮＣ０１１、商品名、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）及びＬＩＦ（２５０‐Ｌ、商品名、Ｒ＆Ｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、また、神経腫瘍細胞、神経膠腫及び神経芽腫の培養上清を用いて神経幹細胞系の培養系にそれぞれ添加し増殖分化能について検討をした（Bottenstein, J.E., and Sato, G.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517(1979)）。尚、５種類の細胞株は(財)がん研究振興財団細胞バンク（ＪＣＲＢ）から供与された。
【００４０】
細胞懸濁液中の細胞集団の解析
神経上皮細胞層から神経幹細胞系を得るために酵素法にて細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を顕微鏡で観察すると神経幹細胞系を比較的多くを含み、形態が異なる複数の性質をもつ細胞集団が認められ主に、フィブロブラスト、マトリックス細胞、血球系細胞、死細胞それに細胞破片などであった。
次に、これら形態の異なるそれぞれの細胞集団がワークステーションのモニター上でのディスプレイでどの位置を占めるのか特定するため、特にこの中のどこに神経幹細胞系が分布しているのかを調べた。
細胞懸濁液の分布のモニターではほぼ５つの細胞集団がみとめられた。
【００４１】
まず血球細胞系を用いての予備実験を行った。
血球系細胞は胎仔を摘出する際に腹大動脈からヘパリンを含むシリンジにて採血し、等量のＰＢＳで希釈した後、リンパ球比重分離液（日本抗体研究所社製）にて分離した。
分離した血球系細胞のフローサイトメトリーによる解析では、リンバ球は神経幹細胞系集団のほぼ左下方に、顆粒球、マクロファージ様細胞は上方の左右に分散しており、神経幹細胞系集団から離れた位置に認められることが判った。
【００４２】
また、細胞の接着性の違いによる培養法にて細胞懸濁液を個別に分離した神経幹細胞系、フィブロブラスト、マトリックス細胞についてフローサイトメトリーによる解析を行い、それぞれの細胞の位置を同定した（山之端万里、塚田裕三、神経化学４４６〜４４７（１９９４））。
【００４３】
この結果からフィブロブラスト様細胞は図３のＥ領域の神経幹細胞系集団の上方の右側に、すなわちＦ領域に、またマトリックス細胞は下方やや右にそれぞれ位置しておりいずれも神経幹細胞系から離れていた。
死細胞は左下から右上がりの帯上に分散し神経幹細胞系集団から完全に分離できた。細胞破片は左下に認められた。
【００４４】
ソーティングの結果
胎仔脳を酵素処理し調製した細胞懸濁液（１．７×１０７cells/ml）は直ちにフローサイトメーターに適応し、その結果を図３ａに示した。
神経幹細胞系の位置は培養法による予備実験での結果から判断しソート範囲を図３に示したＥとした。
また、Ｆについてもソーティングを試みた。Ｅ及びＦで設定した細胞はそれぞれ右と左のチューブに分取した。
細胞集団のディスプレイ上での解析ではＥの全体の細胞（図３のＡの範囲）に対する占有率は３７％であり、Ｆは２３％であった。
ソートした細胞の回収率を調べるために、再度サイトメトリーで解析した。その結果を図３ｂ及び表１に示した。
図３ｂはソート範囲Ｅの分取後のサイトグラムを示しており、ソート範囲Ｆとの分離が可能であった。
またＥの分取後の細胞の回収率は７７．５％であった。
【００４５】
【表１】
0004134330.tif 000002
【００４６】
分取した細胞の培養結果
分取した図３の細胞集団の培養の結果は、Ｅではブルーの円形の細胞が多く、Ｆでは黄色で変形の細胞およびＥでみられたブルーの円形の細胞でやや大きめの細胞が多くみとめられた。
この細胞集団をＰＥＩ処理ディッシュと未処理ディッシュでそれぞれ培養した。
未処理のディッシュでは、Ｅの細胞は集束しながら増殖するが、ＰＥＩ処理ディッシュではＥの細胞は著明に伸展しさらに培養を継続すると伸展した細胞間で集束を惹起しながらコロニーをつくり増殖をすることが判った。
この増殖している細胞は二次培養でも増殖能が維持された。
尚、Ｆではフィブロブラスト様の接着しながら増殖する細胞が認められた。
このフィブロブラスト接着細胞は弱くピペッティングすることで分離できるが、新たな未処理のディッシュヘ移し二次培養すると集束しながら増殖する。
【００４７】
そこで、Ｅの細胞集団を神経幹細胞系を含む細胞集団として以下の培養・増殖能の検討に用いた。
【００４８】
細胞培養の検討
上記神経幹細胞系を含む細胞集団の無血清培養の検討を行った結果を表２に示した。この中でトランスフェリン、インスリン、ヘパリンを含むＤＦ培地では神経幹細胞系の生存が認められた。
これにｂＦＧＦを添加することで生存から増殖へ移行した。
また、へパリンの添加は相乗作用を示し神経幹細胞系の生存に重要な働きをしていることが判った。
【００４９】
【表２】
0004134330.tif 000003
【００５０】
神経栄養因子の細胞増殖能
図４は、２４孔プレート１×１０４細胞／ｃｍ２の培養密度のＤＦ培地に対する、ａＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ‐Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＧＦ−II（１００ｎｇ／ｍｌ）添加について検討した結果を示す。
ａＦＧＦ及びｂＦＧＦが神経幹細胞系の強い増殖能を示した。特に、ｂＦＧＦが強い増殖能を示した。
なお、評価はアラマールブルー・アッセイ（アラマールバイオサイエンスズ社製）により６日培養後の波長５７０及び６００ｎｍの吸収をモニターした。
【００５１】
神経膠腫及び神経芽腫の培養上清の影響
表３に示すように神経膠腫の培養上清はほとんど影響はないが、神経芽腫の３種では程度の差は認められたがいずれも増殖を促進した。これらは、無血清培地で培養した。
【００５２】
【表３】
0004134330.tif 000004
【００５３】
実施例１
参考例１で得られたソーティング結果、培養条件検討の結果等の知見をもとに、まず標準感度による分取を試みた。
１−１）細胞懸濁液の調製
０．１％(v/v)トリプシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）による調製：胎仔脳は前脳を含む胎生１２日（Ｅ１２）のＳＤラット脳を用いた。摘出した胎仔脳は０．１％トリプシン／ＰＢＳにて３７℃で３０分間インキュベートした。
その後、０．０４％(v/v)ＤＮアーゼ（シグマ社製）及び０．０７％(v/v)オボムコイド（Worthington社製）を添加して５分間静置しＤＦ培地で洗浄した。
【００５４】
遠心して上清を除去し、沈下した脳組織は１００μg／ｍｌトランスフェリン（シグマ社製）、２５μｇ／ｍｌインスリン（コラボレイティブ バイオケミカル プロダクツ社製）、２５μｇ／ｍｌヘパリン（シグマ社製）、３０ｎＭセレン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、５０ユニット／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＦ培地（ＴＩＨ−ＤＦ）中で、２００μｌのイエローチップを装着した１ｍｌのピペットにて２０回上下を繰り返してピペッティングして細胞懸濁液とした。
【００５５】
機械的粉砕による調製：摘出した胎仔脳の一部はトリプシンを含まないが０．０４％(v/v)ＤＮアーゼ／ＤＦを含む１ｍｌのＰＢＳ中で２００μｌのイエローチップを装着した１ｍｌのピペットにて２０回上下を繰り返してピペッティングして静置し、数分のちに沈下した組織断片のみを再度ピペッティングした。
この操作を合計３回繰り返して、それぞれの細胞懸濁液を集めて、ＤＦ培地で洗浄後にＴＩＨ−ＤＦにて保存した。これら２つの方法で調製したそれぞれの細胞懸濁液は順次フローサイトメーターに適応した。また、いずれの操作も無血清培地で行った。
【００５６】
１−２）細胞培養
培養はＴＩＨ−ＤＦ培地に５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を添加して４×１０３／ｃｍ２の細胞密度で３．５ｃｍディッシュ（ファルコン社製）を用いて３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて行った。
培養した培地は３〜４日間隔で新しい培地あるいは、別に調製した培地をいずれも半量ずつ交換した。決められた培養日までに形成した神経細胞塊（ｓｐｈｅｒｅｓ）の数量は３．５ｃｍディッシュにて倒立顕微鏡下で行った。
【００５７】
２次神経細胞塊の培養は初代培養で形成した浮遊している神経細胞塊をトランスファーピペットにてチューブへ移し、先に述べた機械的粉砕にて単一（非集合）細胞の懸濁液として４×１０３細胞／ｃｍ２の培養密度で再び培養した。
培養した細胞の分化の程度は、決められた培養日までに形成した神経細胞塊を２００μｌイエローチップにてピックアップして８−ウェルチェンバースライド（ヌンク社製）へ移し、分化培地にて一週間培養した後の分化抗原の発現の程度から判定した。
分化培地は１ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、１％ウシ胎児血清及び１μＭレチノイン酸を含むＴＩＨ−ＤＦ培地を用いた。
【００５８】
１−３）ネスチンペプチド抗体の作成
ネスチン分子の一次構造から抗原として適している領域を選択するため、Hyphil値、SurfPr値、Al-Ind値を用いて、それらの設定基準を満たしている領域を選定した（東大・医科学研究所ゲノム解析センターのコンピュターを用いた）。
この選定した領域につきＢＬＡＳＴを用いてホモロジー検索を実施した。最終的にネスチン分子のアミノ酸配列のＮ末端側の５１５−５３３（ＥＳＧＬＤＴＥＥＴＱＤＳＱＧＰＬＱＫＥ（配列番号１））及びＣ末端側の１７２３−１７３７（ＤＩＧＧＱＳＰＮＬＤＳＥＱＶＮ（配列番号２））の２箇所を選択した。
２種類のペプチドを合成するにあたり、前者（Ｎ２０）はＣ末端側にまた後者（Ｃ１６）はＮ末端側にシステイン残基をそれぞれ一個付加した。キャリアタンパク質としてヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、それぞれの合成ペプチドと結合させて抗原とした。ウサギヘの免疫は皮下の複数の箇所へ行った。
【００５９】
初回免疫はフロイントの完全アジュバンド（ＦＣＡ）で行い、３週間のちに不完全アジュバンド（ＦＩＡ）にて一週間置きに追加免疫を行い、適宜採血して抗体価をチェックした。抗血清は２つのペプチドを担体（ＦＭＰ活性化セルロファイン、生化学工業社製）にそれぞれ結合させて作成したアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。
精製した２種類の抗体（ＩｇＧ）はいずれも初代培養の細胞に陽性であったがＣ１６の抗体を用いることにした。抗体は使用するまで−３０℃にて保存した。また、Ｃ１６の抗ネスチン抗体としての特異性は東大、中福雅人博士から供与された抗ネスチン抗体（Cattaneo, E. and McKay, R., Nature 347, 762-765(1990)）による初代培養系の細胞の特異性と比較した。
【００６０】
１−４）標準感度によるフローサイトメトリー
参考例１と同様にＦＬＳ及びＰＬＳによる６４チャンネルに分けた２次元の画面のサイトグラムから解析を行った。
フローサイトメーターは４８８ｎｍで１５ｍＷ出力のアルゴンレーザと１００μｍの径口を有するチップをフローセルに装着したＥＰＩＣＳ（登録商標、COULTER社製）を用いた。送液ラインは７０％エタノールにて予め滅菌し、シース液は滅菌・ろ過したＰＢＳを用いた。
尚、データの再現性を得るために次のように条件設定をした。
ＦＬＳ：１５０ボルト（ゲイン５）、ＰＬＳ：４０５ボルト（ゲイン１０）、シース圧とサンプル圧の差：０．６０〜０．６４（サンプル圧／シース圧＝６．８８／７．５）、サンプルフロー：３４〜３７、フロー速度：８００〜１０００細胞／秒。
【００６１】
１−５）フローサイトメトリーによる細胞懸濁液中のネスチン陽性細胞の同定
トリプシンにより調製した細胞懸濁液はナイロンフイルター（ポアサイズ：５０μｍ）にてろ過した後に、その懸濁液の一部はフローサイトメーターへ適応してＦＬＳ及びＰＬＳにて解析した。
図１ａに示したように細胞は散乱光の性質に基づいて６つの細胞クラスター（Ｉ'〜ＶＩ’）に差別化できた。
これらのそれぞれの細胞クラスターに含まれる細胞を同定するために、解析用のソーティングゲートを図１ｂの（Ｉ〜ＶＩ）に示したようにクラスターを囲むように作成した。
【００６２】
ソーティングゲートごとにソーティングした細胞はチューブ（２０６３、商品番号、ファルコン社製）に集めた。チューブには予め０．５ｍｌのＴＩＨ−ＤＦ培地を加えておき、ソートした細胞は４ｍｌになった時に新しいチューブに交換した。このチューブを遠心して細胞を回収し、細胞を固定した後に、抗ネスチン抗体にて染色した。それぞれの結果を図５に示す。
図５は、ゲートごとに抗ネスチン抗体にて染色し、その蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムである。
図５に示したように、ネスチン陽性細胞は再びフローサイトメトリーを用いて、今度はその蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムによって解析して表示した。
この結果はネスチン陽性細胞はゲートIII及びIVであり、主にゲートIIIに収束した。ゲートIIIは、サイトグラムから分かるように参考例１のＥの神経幹細胞系を含む細胞集団に相当する。
【００６３】
１−６）ネスチン陽性細胞と他の細胞との分離
各ゲートからソーティングした細胞は遠心して集め、直ちにｂＦＧＦを添加したＤＦ−ＴＩＨ培地にて培養した。培養した細胞の位相差顕微鏡による観察結果を図６（スケールバー：２５μｍ）に示す。
図６ａはゲートIIIから得た細胞について、図６ｂはゲートVIから得た細胞について、図６ｃはゲートVから得た細胞について、図６ｄはゲートIVから得た細胞についてのそれぞれの位相差顕微鏡による観察結果を示す。
【００６４】
図６ａに示したようにゲートIIIから得たネスチン陽性細胞は神経細胞塊を形成し、これに対して図６ｄに示したゲートIVでは若干の神経細胞塊と共に培養ディッシュ表面へ接着する支持細胞が、また図６ｃに示したゲートVではIVと形態が異なり培養ディッシュ表面に広く接着するフィブロブラスト様の細胞が認められた。
また、細胞破片はゲートＩに、死細胞はゲートII、そして図６ｂのダブレットや組織球などの支持細胞はゲートVIに認められた。
【００６５】
１−７）ゲートIIIより分取した細胞の２次培養
ゲートIIIから分取した細胞の形態を図７に示す。前述のようにクラスターが認められ、これを分取したゲートIIIについて、ｂＦＧＦを含む無血清培地（ＴＩＨ−ＤＦ）にて６日間培養したところ、図７ａに示した神経細胞塊の形成が認められた。
また、この神経細胞塊から酵素法にて単一（非集合）細胞懸濁液を作成して２次の神経細胞塊の形成を期待したが、図７ｂに示したように予想に反してディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞が多く認められた。なお、図７中のスケールバーは２５μｍを示す。
また、ディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞は抗ネスチン抗体／ＦＩＴＣにて染色したところ、弱陽性であった。
【００６６】
１−８）免疫染色
細胞は４％(w/v)パラホルムアルデヒド−０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．３）にて室温で２０分間固定した後に、免疫染色は以下に述べるそれぞれの抗体を用いて一重あるいは二重染色を行い、陽性細胞は蛍光顕微鏡にて同定し、また陽性率を算出した。
【００６７】
使用した抗体は抗ネスチン抗体（２次抗体：ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ’）２抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製））、抗β−チューブリンアイソタイプIII抗体（シグマ−アルドリッチ社製）、抗ＭＡＰ−２抗体（ケミコン社製）及び抗ＧＦＡＰ抗体（ケミコン社製）（各々の２次抗体：ＴＲＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）、抗Ｏ４抗体（ケミコン社製）（２次抗体：ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＭ抗体）である。
これらのコントロールとしては１次抗体にそれぞれ抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ社製）、抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）及び抗マウスＩｇＭ抗体（シグマ社製）を用いた。
なお、上記抗Ｏ４抗体はオリゴデンドロサイトに対する抗体である。
【００６８】
２−１）高感度によるソーティング
１−７）の結果から、神経幹細胞系と上記ディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞とを分離するため、標準感度によるフローサイトメトリーで用いたＦＬＳ及びＰＬＳの感度を変えて、表４に示したようにそれぞれ平均４５％（ＦＬＳ）及び１０％（ＰＬＳ）強くして設定した。
尚、データの再現性を得るために次のように条件設定をした。
ＦＬＳ：２５０ボルト（ゲイン５）、ＰＬＳ：４４０ボルト（ゲイン１０）、シース圧とサンプル圧の差：０．６２〜０．７２（サンプル圧／シース圧＝６．７８／６．８８）、サンプルフロー：２８〜３８、フロー速度：４００〜７００細胞／秒。
【００６９】
【表４】
0004134330.tif 000005
２−２）高感度によるソーティングの結果
この高感度による方法を用いて、同様に作成した細胞懸濁液を解析したところ、図２ｂのサイトグラムに示すようにクラスターIIIの細胞集団が２つに分離した。すなわち、ネスチン陽性細胞は２つの異なる形態の細胞に分画された。
これらのクラスターを新たにクラスターIIIA及びIIIBと称した。
【００７０】
次いで、クラスターIIIA及びIIIBの細胞をソーティングし、ｂＦＧＦを含む無血清培地（ＴＩＨ−ＤＦ）にて６日間培養した結果を図８（スケールバー：２５μｍ）に示す。
図８で示されたようにクラスターIIIA及びIIIBの領域における細胞の形態は、前者は神経細胞塊を形成し、後者ではディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞が認められた。
フィブロブラスト様の細胞の領域はIIIBよりさらに右側にシフトしており、IIIBの領域とは異なっていた。
【００７１】
ＦＬＳ及びＰＬＳそれぞれについて３０チャンネルを位置マーカーとしてゲートIII、IIIA及びIIIBを１つの画面に表した図２ｃから分かるように、このIIIA領域に認められる細胞群はIII領域の神経幹細胞系が上位にシフトしたものであると考えられる。
そして、クラスターIIIに混入していた細胞が新たにクラスターIIIBとして認められたことから、クラスターIIIAから高純度の生細胞の神経幹細胞系を分取することができた。
したがって、本発明の方法により高純度の生細胞の神経幹細胞系を分取することができた。
【００７２】
別に、前脳を機械的粉砕にて処理して作成した細胞懸濁液はフローサイトメトリーによって同様に解析したところ、酵素法と同じようにクラスターIIIはクラスターIIIA及びIIIBの２つの領域に認められた。
【００７３】
２−３）ソーティングによる細胞回収率及び純度
ソーティングはゲートIIIAから独立に５回を試みた。表５に示したように酵素処理した細胞懸濁液の細胞を直接、抗ネスチン抗体で染色したところ陽性細胞は全体の細胞に対して５２．５％であった。
また、細胞懸濁液をフローサイトメトリーに適応してゲートIIIAの細胞をソーティングして抗ネスチン抗体にて染色したところ、全細胞に対して３８．６％であった。
この方法で得られる抗ネスチン抗体陽性細胞数は１胎仔当たり３〜５×１０４細胞であった。また、表６に示したように機械的粉砕にて処理した胎仔脳の細胞懸濁液も同様に算出した。
【００７４】
【表５】
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【００７５】
【表６】
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【００７６】
２−４）高純度で分取された神経幹細胞系の生存性の検討
ゲートIIIAからソーティングした神経幹細胞系は５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＤＦ−ＴＩＨで５×１０３細胞／ｃｍ２にて培養した。
培養した細胞は培養８日目までは増殖し神経細胞塊を形成しながらそのサイズの増大が認められたが、培養９〜１０日日になると全て死滅した。
このため培養１０日目以降の生存の条件について、図９に示したように検討を行なった。
【００７７】
図９において、Ａ＋／Ｂ−はゲートIIIAの細胞を含むがゲートIIIBの細胞は含まないことを示し、Ａ＋／Ｂ＋はゲートIIIAとゲートIIIBの細胞を含むことを示している。細胞塊の数の算出は倒立顕微鏡にて行った。
ｂＦＧＦの添加の濃度の影響を調べるために、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを用いたが１０日目以降の生存は認められなかった。
次に、ゲートIIIBからディッシュ表面接着性のフラットタイプの細胞をソーティングし、そこヘゲートIIIAからソートした神経幹細胞系を加えて培養すると１０日目以降の生存が確認できた。
神経幹細胞系を加える日数は培養する１日目から８日目までのそれぞれの培養日に加えても生存が認められた。
しかし、図９に示すように対照条件として接着性の細胞を含むがｂＦＧＦを含まないＤＦ−ＴＩＨの培地にすると神経幹細胞系の生存は認められなかった。
【００７８】
２−５）神経幹細胞系の長期増殖
上述の生存性の検討から、本発明の方法により得られた高純度の神経幹細胞系は、ｂＦＧＦのみでは培養１０日目に死滅し、長期培養の条件としてIIIBの接着性細胞を若しくは接着性細胞の培養上清を加えることが必須であると判った。
【００７９】
また、共培養によって１０日目以降に増殖する神経細胞塊は、ピペットにて５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＴＩＨ−ＤＦ培地へ移すと生存及び増殖が認められた。培養２０日の神経細胞塊を酵素処理法にて単一な細胞とし、ｂＦＧＦを含むＴＩＨ−ＤＦ培地で培養すると２次神経細胞塊のみを形成した。
【００８０】
２−６）神経幹細胞系の分化程度の解析
分化抗原の発現から、本発明により得られた神経幹細胞系の分化程度の解析を行った。
１−２）の培養条件に従い、ｂＦＧＦを含むＤＦ−ＴＩＨで６日間培養した後４％(w/v)パラホルムアルデヒドにて固定し染色したとき、その構成細胞はネスチン陽性であったが、得られた神経細胞塊は、神経前駆細胞に特異的な抗βチューブリンIII抗体にも陽性の細胞が認められた。
これらの神経細胞塊を培養６日目に分化培地に切り替えて７日間培養した後は神経細胞のマーカーであるＭＡＰ−２にも陽性であった。
そのとき、アストロサイトのＧＦＡＰに陽性の細胞、及びオリゴデンドロサイトのＯ４に陽性の細胞は認められなかったが、切り替えて１５日以降まで培養した神経細胞塊ではＧＦＡＰ陽性細胞、さらにＯ４陽性細胞が認められた。
【００８１】
上記神経幹細胞系の分化程度の解析から、本発明の方法により得られた神経幹細胞系が初期発生における生きた神経幹細胞系であることが判った。
【００８２】
したがって、本発明のフローサイトメトリーを用いた方法に従って、２次画面上に位置情報として識別表示することにより、細胞に何ら異物を付加することなく、初期発生における生きた神経幹細胞系を高純度で分取することが可能になった。
【００８３】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、胎仔組織、成人組織等の細胞混合物の中から何ら修飾処理しないで生きた目的の神経幹細胞系を迅速に分取することを可能にし、とりわけ、再生医療の基礎的研究及びその応用として移植等の治療に利用できる、初期発生における生きた神経幹細胞系を迅速に分取することを可能にするものである。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、標準感度におけるサイトグラムを示す図である。ａ：細胞クラスターを差別化した２次元画面。ｂ：ａで差別化した細胞クラスターに対するソーティングゲートを作成した２次元画面。
【図２】図２は、図１におけるゲートIIIについての標準感度と高感度におけるサイトグラムを示す図である。ａ：ゲートIIIについて標準感度による２次元画面。ｂ：ゲートIIIについて高感度による２次元画面。ｃ：ゲートIII、IIIA及びIIIBを１つの画面に表示した２次元画面。
【図３】図３ａは、胎仔脳を酵素処理し調製した細胞懸濁液をフローサイトメーターに適応した結果を示す図である。図３ｂは、ソート範囲Ｅの分取後のサイトグラムを示す図である。
【図４】図４は、神経栄養因子の影響を示したグラフである。
【図５】図５は、ゲートごとに抗ネスチン抗体にて染色し、その蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムを示す図である。
【図６】図６は、標準感度によるゲートIII〜VIより分取した細胞の培養及びその細胞形態の差異を示す図である。
【図７】図７は、ゲートIIIから分取した細胞の形態を示す図である。ａ：分取後ｂＦＧＦを含む無血清培地（ＴＩＨ−ＤＦ）にて６日間培養後を示す。ｂ：ａから単一細胞懸濁液を作成した後の２次培養を示す。
【図８】図８は、ゲートIIIA及びIIIBから分取した細胞の形態の差異を示す図である。
【図９】図９は、ゲートIIIBより分取した接着性細胞における神経幹細胞系の生存に及ぼす影響を示したグラフである。
【図１０】図１０は、本発明で用いることができるフローサイトメーターのシステムの概要図である。
【符号の説明】
１  シース圧調節器
２  シース液容器
３  シースライン
４  サンプル圧調節器
５  ピンチバルブ
６  トランスデューサー
７  フローセル
８  レーザ光
９  散乱光
１０  正電圧板
１１  負電圧板
１２  右ソート
１３  左ソート
１４  サンプル液容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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