(57)【要約】本発明者らは、レーザアブレーション誘導結合プラズマ質量分析（ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ）を組織サンプル中分解能の一細胞の細胞内レベルの分解能でのイメージングに適したものに改変した。前記レーザのスポットサイズは４μｍ以下であってもよい。飛行時間質量分析計を用いてもよい。前記組織サンプルは４つ以上の希土類金属で標識してもよい。
2017512985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：
（ｉ）組織サンプル中の複数の異なる標的分子を複数の異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；
（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置で細胞内レベルの分解能でのレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および
（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；
を含む、方法。
【請求項２】
複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：
（ｉ）組織サンプル中の複数の異なる標的分子を複数の異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；
（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置でレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および
（ｉｉｉ）プルームに、飛行時間質量分析計を用いて誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；
を含む、方法。
【請求項３】
複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：
（ｉ）組織サンプル中の少なくとも４つの異なる標的分子を異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；
（ｉｉ）標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置でレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および
（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；
を含む、方法。
【請求項４】
複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：
（ｉ）組織サンプル中の複数の異なる標的分子を複数の異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；
（ｉｉ）該標識された組織サンプル中の個別の細胞を区画するステップ；
（ｉｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置でレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および
（ｉｖ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；
を含む、方法。
【請求項５】
複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：
（ｉ）組織サンプル中の１つ以上の標的分子を標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；
（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置で４μｍ以下のレーザスポットサイズを用いてレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および
（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；
を含む、方法。
【請求項６】
複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：
（ｉ）複数の異なる標的分子が複数の異なる標識原子で標識された、標識された組織サンプルをもたらすステップ；
（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置で細胞内レベルの分解能でのレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および
（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；
を含む、方法。
【請求項７】
前記画像が２μｍ未満の分解能を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記画像が細胞内レベルの分解能を有し、前記組織サンプルのレーザアブレーションが少なくとも１０Ｈｚの周波数で行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記レーザアブレーションが０．２〜２μｍの範囲内のレーザスポットサイズを用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レーザアブレーションが１００ｍｓ以下のウォッシュアウト時間を有するアブレーションセルにおいて行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記レーザアブレーションが（ｉ）３０ｍｓ以下のウォッシュアウト時間を有するアブレーションセルにおいて（ｉｉ）少なくとも２０Ｈｚの周波数で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レーザが２〜５Ｊ／ｃｍ２のフルエンスを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レーザがエキシマレーザまたはエキサイプレックスレーザである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
異なる原子質量を有する少なくとも２０個（例えば、少なくとも３０個、または少なくとも５０個）の異なる標識原子が用いられる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識原子が標識前の組織サンプルには実質的に存在しない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識原子がランタニドのような遷移金属である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識原子が８０〜２５０の範囲内の原子質量を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記質量分析のステップが飛行時間検出を用いる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分子が金属コンジュゲート抗体および／または金属コンジュゲート核酸プローブで標識されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの細胞内標的および少なくとも１つの細胞表面標的が標識される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織サンプルが、腫瘍に由来するか、または腫瘍細胞を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組織サンプルが切片である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記レーザアブレーションがラスタ走査により行われる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ラスタ走査が前記レーザスポットサイズと実質的に同じステップサイズを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織サンプル中の個別の細胞が区画されている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的分子が定量化される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織サンプルがレーザアブレーション前に顕微鏡観察により分析される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
組織サンプルを異なる原子質量を有する４つ以上の遷移金属（例えば、希土類金属）での標識する方法。
【請求項２９】
組織サンプル中の複数種の細胞に細胞内レベルの分解能での質量サイトメトリが行われる、組織サンプルのイメージング方法。
【請求項３０】
組織サンプル中の複数種の細胞に細胞内レベルの分解能でのＬＡ−ＩＣＰ−ＴＯＦＭＳが行われる、組織サンプルのイメージング方法。
【請求項３１】
組織サンプルのイメージングの代わりに、接着性細胞の単層をイメージングするため、または固体表面上に固定化した細胞をイメージングするための、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザアブレーション誘導結合プラズマ質量分析（ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ）または質量サイトメトリを用いる、組織サンプルのイメージングに関する。
【背景技術】
【０００２】
一細胞（シングルセル）計測および分子標的の多重化定量検出は、個別の細胞の状態および挙動に対する洞察を提供することができる。一細胞分析に用いられてきた技術としては、（例えば免疫細胞化学を用いる）特定の標識技術と組み合わせた顕微鏡観察、一細胞イメージング質量分析、表面増強ラマン散乱分光分析、およびＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳが挙げられる。
【０００３】
これらの技術のいくつかは、（例えば免疫組織化学を用いる）組織のｉｎ  ｓｉｔｕイメージングまで容易に拡張することができるが、他の技術はできない。例えば、免疫蛍光顕微鏡観察（ＩＦＭ）のようなアプローチはナノメートルレベルの分解能までのイメージングに有用であるが、実際のところ、同時測定は７つ以下の標的に制限される。対照的に、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、一細胞中の抗原発現の高度に多重化された定量分析を提供するが、現時点では組織サンプル内の一細胞のイメージングに必要な分解能が不足している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、組織サンプルのイメージングのさらなる向上した技術を提供することであり、とくにＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳを一細胞イメージング技術としての使用に適合させることである。
【０００５】
ＩＣＰ−ＭＳは、一細胞分析に用いられてきたが、それは懸濁液中の細胞にのみ限られていた［１］。本発明者らは今やレーザアブレーション（ＬＡ）をＩＣＰ−ＭＳに適合させ、この技術を組織サンプル中の一細胞イメージングに好適化した。ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳによる組織イメージングは以前に報告されているが、開示された手順は高い空間分解能を達成しなかった。例えば、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、脳切片［２］や癌組織［３、４］の画像を取得するのに用いられているが、一細胞レベルまたは細胞内レベルの分解能は達成されなかった。すべての場合において、分解能は、アブレーションレーザのスポットサイズにより、および／または連続的なアブレーション中に放出される物質の分析間の重なり合い／混ざり合いにより、制限された。例えば、４０μｍのスポットサイズ［２］では、組織サンプル中の一細胞のイメージングに十分な高い分解能で物質をアブレーションすることができない。同様に、アブレーションされた物質をＩＣＰ−ＭＳまで１００ｍｓ未満で輸送することができない場合、１０Ｈｚの周波数でのアブレーションは重なり合う信号をもたらす；例えば参考文献３において同アブレーション周波数で用いられるアブレーションセルは、１秒を大幅に超えたウォッシュアウト時間を有した（この文献の著者らは、その点に注目しなかった）。
【課題を解決する手段】
【０００６】
ここで本発明者らは、これらの欠点を克服し、細胞内レベルの分解能を達成することができるＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳシステムを提供し、これにより初めてＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ技術を組織の一細胞イメージングに適したものにした。したがって、本発明は、複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：（ｉ）組織サンプル中の複数の異なる標的分子を複数の異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置で細胞内レベルの分解能でのレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；を含む方法を提供する。本発明の１つの一般的な利点は、免疫組織化学（ＩＨＣ）において既に用いられている技術およびプロトコルと互換性があるが、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳにより検出される標識の使用が今やサンプル中でより多くの標的の局在化を可能にすることである。
【０００７】
本発明はまた、複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：（ｉ）組織サンプル中の複数の異なる標的分子を複数の異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置でレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および（ｉｉｉ）プルームに飛行時間質量分析計を用いて誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：（ｉ）組織サンプル中の少なくとも４つの異なる標的分子を異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置でレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：（ｉ）組織サンプル中の複数の異なる標的分子を複数の異なる標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；（ｉｉ）該標識された組織サンプル中の個別の細胞を区画するステップ；（ｉｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置でレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および（ｉｖ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：（ｉ）組織サンプル中の１つ以上の標的分子を標識原子で標識し、標識された組織サンプルをもたらすステップ；（ｉｉ）該標識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置で４μｍ以下のレーザスポットサイズを用いてレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、複数の細胞を含む組織サンプルのイメージング方法であって：（ｉ）複数の異なる標的分子が複数の異なる標識原子で標識された、標識された組織サンプルをもたらすステップ；（ｉｉ）標該識された組織サンプルの複数種の細胞に異なる複数の既知の位置で細胞内レベルの分解能でのレーザアブレーションを行い、複数のプルームを形成するステップ；および（ｉｉｉ）プルームに誘導結合プラズマ質量分析を行い、それによって該プルーム中の標識原子の検出が該組織サンプルの画像の構築を可能にするステップ；を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、４つ以上（例えば、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５以上）の異なる遷移金属原子での組織サンプルの標識方法を提供する。これらの原子は特定の細胞内標的と会合し、これにより、下流のＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳによる検出を可能にする。ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳからのデータは次にサンプルの画像を作成するのに用いることができる。
【００１３】
本発明はまた、組織サンプルの複数の細胞に細胞内レベルの分解能での質量サイトメトリを行う、組織サンプルのイメージング方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、標識された一細胞の内容物の実質的にすべてを１回のレーザショットでアブレーションした後ＩＣＰ−ＭＳを行う、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ方法を提供する。よって一細胞全体の内容物の実質的にすべてを質量サイトメトリにより分析することができる。アブレーションは前記細胞の内容物の実質的にすべてを含むプルームをもたらし、次いで、このプルームをＩＣＰに導入し、ＭＳを行うことができ、これによって、標識された物質を検出し、単一分析における一細胞全体の多重分析を可能にする。
【００１５】
［発明の詳細な説明］
＜ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳおよび質量サイトメトリ＞
本発明は、組織サンプルのイメージング方法において、誘導結合プラズマ質量分析（ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ）と組み合わせたレーザアブレーションを用いる。サンプル中の異なる標的分子が異なる標識原子で標識され、次に標識された組織サンプルの複数種の細胞にＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳが用いられる。検出された信号を、それらの信号を生じさせたレーザアブレーションの既知の位置と関連づけることにより、本方法は、標識された標的分子のサンプル上の特定位置への局所化を可能にし、ひいてはサンプルの画像の構築を可能にする。
【００１６】
ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、組織サンプルへの該組織サンプルからアブレーションされた物質のプルームを生成させるレーザパルスの印加を伴い、これらのプルームは、分析のためエアロゾルとしてＩＣＰ−ＭＳ装置まで輸送される。前記組織サンプル中の標識原子はＭＳにより識別することができ、よってそれらの検出は、プルーム中の異なる複数の標的の存在または不存在を明らかにする。
【００１７】
この方法で生成される信号の空間分解能は、次の２つの主要な因子によって決まる：（ｉ）レーザのスポットサイズ（信号がアブレーションされる総面積にわたって積分されるため）；および（ｉｉ）複数のプルームを生成する速度に対して、１のプルームを分析できる速度（上記のような連続的な複数のプルームからの信号の重なり合いを回避するため）。
【００１８】
よって、個別の細胞を分析するため、本発明は、これらの細胞より大きくないレーザスポットサイズを用い、すなわち、物質を細胞内レベルの分解能でアブレーションすることができるレーザスポットサイズを用いる。このサイズはサンプル中の具体的な細胞によって決まるが、一般的にレーザスポットは、４μｍ未満、例えば、０．２〜４μｍ、０．２５〜３μｍ、または０．４〜２μｍの範囲内の直径を有する。よってレーザスポットは、約３μｍ、２μｍ、１μｍ、または０．５μｍの直径を有することができる。好適な実施形態において、レーザスポット直径は、０．５〜１．５μｍの範囲内、または約１μｍである。小さなスポットサイズは、幅の広いレーザビームの縮小および近視野光学装置を用いて達成することができる。１μｍのレーザスポット直径は１μｍのレーザ焦点に対応するが、前記レーザ焦点はレーザビームをサンプル表面上へ輸送する対物レンズの開口数によって±２０％変動し得る。
【００１９】
組織サンプルの高速分析には、高周波数、例えば１０Ｈｚ以上のアブレーション（すなわち、毎秒１０個のプルームをもたらす毎秒１０回のアブレーション）が必要である。好適な実施形態において、アブレーションの周波数は、１０〜２００Ｈｚの範囲内、１５〜１００Ｈｚの範囲内、または２０〜５０Ｈｚの範囲内である。少なくとも２０Ｈｚのアブレーション周波数は、典型的な組織サンプルのイメージングを妥当な時間で達成することを可能にする。上記のとおり、これらの周波数では、計測手段は、アブレーションされた物質を、連続的な複数回のアブレーション間での実質的な信号の重なり合いを回避するのに十分な程度の高速で分析できなければならない。連続的な複数のプルームから生じる複数の信号間の重なり合いは、強度で、＜１０％、より好適には＜５％、理想的には＜１％であることが好ましい。プルームの分析に必要な時間は、アブレーションセルのウォッシュアウト時間、プルームエアロゾルがＩＣＰに到達して通過するまでの輸送時間、およびイオン化された物質を分析するのにかかる時間によって決まる。
【００２０】
よって短いウォッシュアウト時間（例えば、１００ｍｓ以下）を有するアブレーションセルは、本発明での使用に有利である。長いウォッシュアウト時間を有するセルは、画像を生成することができる速度を制限するか、または連続的な複数のサンプルスポットから生じる複数の信号間の重なり合いを引き起こす（例えば、１０秒超の信号持続時間を有した参考文献５）。したがって、エアロゾルのウォッシュアウト時間は、合計走査時間を増加させることなく高分解能を達成するための主要な制限因子である。１００ｍｓ以下のウォッシュアウト時間を有するアブレーションセルは当技術分野において知られている。例えば、参考文献６は１００ｍｓ未満のウォッシュアウト時間を有するアブレーションセルについて開示する。とくに好適なアブレーションセルは、参考文献７において開示され（参考文献８も参照）、３０ｍｓ以下のウォッシュアウト時間を有し、これにより高いアブレーション周波数（例えば、２０〜４０Ｈｚ）を可能にし、ひいては高速分析を可能にする。本明細書における実施例は、２０Ｈｚの複数回のレーザアブレーションショットにより生成される複数のプルームの複数の信号を、このアブレーションセルにより完全に分離することができ、これにより広い面積を短時間でイメージングすることを可能にすることを示す。したがって、本発明の方法を用いて、最終画像における空間分解能１ピクセル当たり１００ｍｓ未満の時間を達成することが可能である。
【００２１】
プルームエアロゾルがＩＣＰに到達して通過するまでの輸送時間は、単に、アブレーションセルをＩＣＰの近くに配置することにより、およびエアロゾルを適切な速度で直接ＩＣＰまで輸送するのに十分なガス流を確保することにより、容易に制御される。参考文献７に記載されるようなアルゴンおよびヘリウムを用いる輸送は、良好な結果をもたらす。
【００２２】
イオン化された物質を分析するのにかかる時間は、イオンの検出に用いられる質量分析計のタイプによって決まる。例えば、ファラデーカップを用いる装置は、一般的に高速な複数の信号を分析するには遅すぎる。全体として、所望のイメージング速度（よって、アブレーション周波数）、分解能（よって、レーザスポットサイズおよびアブレーションセル）および多重化の度合いが、用いられるべき質量分析計のタイプを決定する（または逆に、質量分析計の選択が、達成することができる速度、分解能および多重化の度合いを決定する）。
【００２３】
例えば点イオン検出器を用い、一度にただ１つの質量電荷比（ｍ／Ｑ、ＭＳでは一般にｍ／ｚと称される）でイオンを検出する質量分析装置は、異なる複数の標識を用いる一細胞イメージングに好ましくない結果をもたらす。第１に、質量電荷比間の切り換えにかかる時間は異なる複数の信号を測定することができる速度を制限し、第２に、イオン含量が低ければ、装置が他の質量電荷比に焦点を合わせる際に複数の信号を見逃し得る。よって、参考文献２および３において用いられる装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４５００）は感度が良いが、異なる質量電荷比のイオンが次々と通過するため異なる複数の標識のデータ取得が遅い設計により、その四重極型検出器は異なる複数の標識でのイメージングには十分に適さない。同様に、参考文献４および７において用いられる装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＥｌｅｍｅｎｔＸＲおよびＥｌｅｍｅｎｔ２）は、一度にただ１つのｍ／Ｑを分析し、静電場ジャンプの範囲を超える範囲にわたって異なる複数のｍ／Ｑ値を測定する場合には、磁気ジャンプのセトリング時間が大きい。
【００２４】
よって、異なるｍ／Ｑ値を有する複数のイオンを実質的に同時に検出することを提供する技術を用いることが好ましい。例えば、点イオン検出器を用いる代わりに、アレイ検出器を用いることが可能である（例えば、参考文献９の第２９章参照）。マルチコレクタ型セクタ場ＩＣＰ−ＭＳ装置（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｅｐｔｕｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ｎｕ  Ｐｌａｓｍａ  ＩＩ、およびＮｕ  Ｐｌａｓｍａ  １７００システム）、とくにマッタウフ−ヘルツォーク幾何学を有するもの（例えば、ＳＰＥＣＴＲＯ  ＭＳ、半導体直接電荷検出器を用いる１回の測定においてリチウムからウラニウムまでのすべての元素を同時に記録することができる）を用いることができる。これらの装置は異なる複数のｍ／Ｑ信号を実質的に同時に測定することができる。それらの感度は、それらの検出器に電子増倍管を含めることにより増加させることができる。しかしながら、アレイセクタ装置は理想的ではない。アレイセクタ装置は、信号の増加の検出には有用であるが、信号レベルが低下している場合あまり有用でなく、よって複数の標識が高度に可変的な濃度で存在する状況には十分に適していないためである。
【００２５】
本発明で用いるのに最も好適なＭＳ方法は、飛行時間（ＴＯＦ）検出に基づき、一のサンプル中の複数の質量を擬似的に同時に登録することができる。理論的には、ＴＯＦ技術はそれらの空間電荷特性のためＩＣＰイオン源に理想的には適していないが、本発明者らは、ＴＯＦ装置がＩＣＰイオンエアロゾルを実用的な一細胞イメージングを可能にするのに十分に高速かつ十分に高感度で分析できることを示した。ＴＯＦ質量分析計は、ＴＯＦ加速器および飛行管における空間電荷の影響に対処するため妥協が必要であるので、原子分析には通常不人気であるが、本発明の組織イメージング方法は、標識原子のみを検出し、他の原子（例えば、１００未満の原子質量を有するもの）を除去できることにより有効であり得る。本発明の組織イメージング方法は、（例えば）１００〜２５０ダルトン領域中の質量を多く含み、より効率的に操作および集束することができる、低密度のイオンビームをもたらし、これによりＴＯＦ検出を促進してＴＯＦの高いスペクトル走査速度を生かすことができる。このようにして、ＴＯＦ検出を、組織サンプル中では稀であって理想的には非標識サンプルにおいて見られる質量を上まわる質量を有する標識原子を選択すること（例えば、より高質量の遷移元素を用いることによって）と組み合わせることにより、高速イメージングを達成することができる。よって、狭い範囲の標識質量を用いることは、ＴＯＦ検出を効率的なイメージングに用いることができることを意味する。
【００２６】
好適なＴＯＦ装置は、Ｔｏｆｗｅｒｋ社、ＧＢＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社（例えば、Ｏｐｔｉｍａｓｓ  ９５００  ＩＣＰ−ＴＯＦＭＳ）、およびＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃａｎａｄａ社（例えば、ＣｙＴＯＦ（商標）装置およびＣｙＴＯＦ（商標）２装置）から入手可能である。これらのＣｙＴＯＦ装置は、Ｔｏｆｗｅｒｋ社およびＧＢＣ社の装置より高い感度を有し、希土類金属の質量範囲内（とくに、１００〜２００のｍ／Ｑ範囲内）のイオンを高速かつ高感度で検出することができるため、質量サイトメトリにおける使用が知られている［１０］。よって、これらは本発明で用いるのに好適な装置であり、当技術分野（例えば、参考文献１１および１２）において既に知られている装置設定でのイメージングに用いることができる。それらの質量分析計は、高周波レーザアブレーションの時間スケールの高質量スペクトル取得周波数で、多数のマーカーを準同時的に、、検出することができる［４］。前記質量分析計は、多数の標識原子を１細胞当たり約１００の検出限界で測定することができ、組織サンプルの高感度な画像構築を可能にする。これらの特徴のため、質量サイトメトリを用い、細胞内レベルの分解能での組織イメージングに対する感度および多重化の必要性を満足することができる。従来、質量サイトメトリは懸濁液中の細胞を分析するためにのみ用いられ、したがって、組織または腫瘍の微小環境内部の細胞間相互作用の情報は失われていた。質量サイトメトリ装置を高分解能レーザアブレーションシステムおよび高速輸送低分散アブレーションチャンバと組み合わせることにより、組織サンプルの画像を実用的な時間スケールで高多重化した構築が可能となった。質量サイトメトリのさらなる詳細については参考文献１および１３を参照することができる。
【００２７】
組織サンプルのアブレーションに用いられるレーザの波長およびパワーの選択は、ＩＣＰ−ＭＳによる細胞分析における通常の使用方法に従うことができる。レーザは、サンプル支持ホルダを実質的にアブレーションすることなく、所望の深さまでのアブレーションをもたらすのに十分なフルエンスを有していなければならない。２０Ｈｚで２〜５Ｊ／ｃｍ２、例えば、３〜４Ｊ／ｃｍ２または約３．５Ｊ／ｃｍ２のレーザフルエンスが、典型的には適切である。理想的には、単一レーザパルスが、分析のため細胞物質をアブレーションするには十分であり、レーザパルス周波数が、アブレーションプルームが生成される周波数と一致する。レーザは通常、エキシマレーザまたはエキサイプレックスレーザである。フッ化アルゴンレーザ（λ＝１９３ｎｍ）を用いて適切な結果を得ることができる。２５μｍの開口を用いると、このレーザは、組織サンプルを２５倍縮小でイメージングし、１μｍの直径を有するスポットサイズをもたらすことができる。これらのレーザでの１０〜１５ｎｓのパルス持続時間は、適切なアブレーションを達成することができる。フェムト秒レーザ（すなわち、パルス持続時間＜１ｐｓ）を用いることもでき、サンプルへの熱伝達が低減されるため有益であるが、フェムト秒レーザは非常に高価であり、良好なイメージング結果はフェムト秒レーザなしで達成することができる。
【００２８】
全体として、レーザパルス周波数および強度は、個別のレーザアブレーションプルームの識別を可能にするように、ＭＳ検出器の応答特性と組み合わせて選択される。小さなレーザスポットおよび短いウォッシュアウト時間を有するアブレーションセルの使用と組み合わせることで、今では、高速かつ高分解能イメージングが実現可能である。
【００２９】
＜画像構築＞
ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、プルーム中の複数種の標識原子の信号を提供することができる。プルーム中の標識の検出は、アブレーション位置での、同種の標識の標的の存在を明らかにする。サンプル表面上の複数の既知の空間位置で一連のプルームを生成することにより、ＭＳ信号はサンプル上の標識の位置を明らかにするので、該信号を用いて該サンプルの画像を構築することができる。識別可能な複数の標識で複数種の標的を標識することにより、標識原子の位置を同種の標的の位置と関連づけることが可能であり、よって本発明は、既存の技術を用いて達成可能なものをはるかに超える多重化レベルに達する、複雑な画像を構築することができる。本発明者らは、本発明の方法により生成される画像がＩＦＭにより測定されるような所定のマーカーを発現する細胞の染色パターンおよび割合を再現できることを示し、これにより本発明がイメージングに好適であることを確認した。
【００３０】
理想的には、画像は、組織サンプル上でレーザのラスタ走査を行うことにより構築される。ラスタ走査（ステップサイズ）における連続的なアブレーションの間隔、およびラスタ走査における隣接するライン間の間隔は、理想的には、対象となる領域を完全にカバーするため、用いられるレーザスポットサイズと同じ（例えば、１μｍのレーザスポットについて１μｍの間隔）である。しかしながら、いくつかの実施形態では、より小さなアブレーション面積をもたらすことによってイメージング分解能を向上させることができるため、レーザスポットサイズより小さな（例えば、少なくとも２倍、４倍、または５倍小さな）ステップサイズを用いることができる。ラスタ走査を達成するため、レーザを移動させることが可能であるが、通常は、アブレーションセル（またはセルの内容物）を移動させるほうが便利である。移動速度はアブレーション周波数およびラスタ間隔によって決まり、例えば、１μｍのラスタ間隔および２０Ｈｚのアブレーションでは、アブレーションセルは２０μｍ／ｓの並進速度を有する。１μｍ以下のステップサイズを達成することができる、例えば、５００ｎｍまたは２００ｎｍの（またはさらに小さい）ステップサイズを有する支持ステージが、利用可能である。
【００３１】
本発明の方法は、一般には、アブレーションされた表面層の内容物に基づき、１サンプルの２次元（２Ｄ）画像を作成するのに用いられる。組織の３Ｄ画像は、ｚ軸において隣接する１サンプルの複数切片二由来する（ｘｙ平面における）２Ｄ画像のスタックを組み立てることにより作成することができる。しかしながら、この方法での２Ｄ画像の組み立ての代替策として、本発明の方法は、直接的な３Ｄイメージングにも用いることができる。これは様々な方法で達成することができる。例えば、アブレーションが実質的に一定の深さでの気化をもたらす場合、一の（ｘ，ｙ）点での反復アブレーションは、ｚ軸方向に徐々に深い情報を明らかにする。アブレーションが実質的に一定の深さを有さない場合、アブレーションされた物質の体積を（例えば、既知の体積の基準に対して）測定することができ、この体積は、容易にｚ軸深さに変換することができる。３Ｄイメージングが行われる場合、（ｘ，ｙ）位置を維持しながら複数回のｚ軸アブレーション（「穴あけ」）を行うこと、またはサンプルを１層ずつアブレーションする（すなわち、あるｘｙ面のアブレーションを行った後、より深いｚ軸層に移動する）ことが可能である。１層ずつのアブレーションが好ましい。３Ｄイメージングの精度は、アブレーションされた物質の再堆積、一定のアブレーション深さを維持する能力、および標識のサンプル中への浸透能力のような因子によって制限されるが、これらの制限内でも依然として有用な結果を達成することができる。
【００３２】
信号の画像への組み立ては、コンピュータを用い、既知の技術およびソフトウェアパッケージを用いて達成することができる。例えば、参考文献３はＫｙｌｅｂａｎｋ  ＳｏｆｔｗａｒｅのＧＲＡＰＨＩＳパッケージを用いたが、ＴＥＲＡＰＬＯＴのような他のパッケージを用いることもできる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳＩのような技術から取得したＭＳデータを用いるイメージングは、当技術分野において知られており、例えば、参考文献１４はＭａｔｌａｂプラットフォーム上でＭＳイメージングファイルを閲覧および分析するための「ＭＳｉＲｅａｄｅｒ」インターフェースについて開示し、参考文献１５はフル空間スペクトル分解能での２Ｄおよび３Ｄ両方のＭＳＩデータセットの高速データ探索および可視化のための２つのソフトウェア装置、例えば、「Ｄａｔａｃｕｂｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」プログラムについて開示する。
【００３３】
本発明の方法を用いて得られる画像は、例えば、ＩＨＣ結果が分析されるのと同じ方法で、さらに分析することができる。例えば、本発明の方法を用いて得られる画像は、サンプル内の細胞部分集団を描画するのに用いることができ、臨床診断に有用な情報を提供することができる。同様に、ＳＰＡＤＥ分析を用い、本発明の方法が提供する高次元サイトメトリデータから細胞階層を抽出することができる［１６］。
【００３４】
＜組織サンプルの標識＞
本発明は、複数の異なる標識原子で標識されたサンプルの画像を提供し、当該標識原子は、ＩＣＰ−ＭＳによりレーザアブレーションされたプルーム中で検出される。複数の異なる原子とは、サンプルを標識するのに２個以上の原子種が用いられることを意味する。これらの原子種はＩＣＰ−ＭＳを用いて識別することができ（例えば、それら原子種は異なるｍ／Ｑ比を有し）、１つのプルーム内の２個の異なる標識原子の存在は２つの異なるＭＳ信号を生じる。
【００３５】
本発明は、２個よりさらに多くの異なる標識原子、例えば、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、３２、４０、５０またはさらには１００個の異なる標識原子の同時検出に適し、多重標識検出を可能にする。標識原子は、組み合わせて用いて、識別可能な標識の数をさらに増加させることもできる。実施例は１つのイメージング方法における３２個の異なる標識原子の使用を示すが、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、本質的には、より多数の異なる原子、例えば１００をも超える異なる原子種の並列検出に適している［１０］。異なる複数の標的を異なる複数の標識原子で標識することにより、単一の画像において複数種の標的の細胞内位置を決定することが可能である。
【００３６】
本発明で用いることができる標識原子は、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳにより検出可能であり、非標識組織サンプルには実質的に存在しない、いずれかの種を含む。よって、例えば、１２Ｃ原子は自然界に豊富に存在するため標識原子としては不適切であり、１１Ｃは自然界に存在しない人工同位体であるため理論的には用いることができる。しかしながら、好適な実施形態において、標識原子は、希土類金属（１５個のランタニド、ならびにスカンジウムおよびイットリウム）のような遷移金属である。これらの１７個の元素は、ＩＣＰ−ＭＳによって容易に識別することができる多くの異なる同位体を提供する。これら多種多様な元素は濃縮同位体の形態で入手可能であり、例えば、サマリウムは６つの安定同位体を有し、ネオジムは７つの安定同位体を有し、これらのすべては濃縮形態で入手可能である。１５個のランタニド元素は、重複しない特有の質量を有する少なくとも３７個の同位体を提供する。標識原子としての使用に適した元素の例としては、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、およびイットリウム（Ｙ）が挙げられる。例えば、本発明は、表１〜５に挙げるようなランタニドの同位体のいずれかを用いることができる。希土類金属に加えて、他の金属原子、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、イリジウム（Ｉｒ）、ロジウム（Ｒｈ）、ビスマス（Ｂｉ）、等は、ＩＣＰ−ＭＳによる検出に適している。放射性同位体の使用は、取り扱いが便利でなく、不安定であるため好ましくなく、例えば、Ｐｍはランタニドの中でも好適な標識原子ではない。
【００３７】
ＴＯＦ分析（上記参照）を促進するため、８０〜２５０の範囲内、例えば、８０〜２１０の範囲内、または１００〜２００の範囲内の原子質量を有する標識原子を用いることが有用である。この範囲はすべてのランタニドを含むが、ＳｃおよびＹを除外する。１００〜２００の範囲は、本発明がＴＯＦ  ＭＳの高いスペクトル走査速度を利用することを可能にしながら、異なる標識原子を用いることにより理論的には１０１重分析を可能にする。上述したとおり、質量が非標識サンプルにおいて見られるものより上の範囲（例えば、１００〜２００の範囲）に含まれる標識原子を選択することにより、ＴＯＦ検出は、生物学的に有意なレベルでの高速イメージングを提供するのに用いることができる。
【００３８】
組織サンプルの標識は、一般的には、標識原子を特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーの１つに付着させることが必要である。この標識されたｓｂｐは、組織サンプルと接触して、当該ｓｂｐの他のメンバー（標的ｓｂｐメンバー）が存在する場合には当該他のメンバーと相互作用することができ、これにより前記標識原子を組織サンプル中の特定位置に局所化させる。本発明の方法は、次に、前記標識原子の存在を当該特定位置で検出し、この情報を、前記標的ｓｂｐメンバーがその特定位置で存在する画像に変換する。希土類金属および他の標識原子は既知の技術によりｓｂｐメンバーにコンジュゲートさせることができ、例えば、参考文献１７はＩＣＰ−ＭＳ検出のためのランタニド原子のオリゴヌクレオチドプローブへの付着について記載し、参考文献１８はオリゴヌクレオチドを標識するためのルテニウムの使用について記載し、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃａｎａｄａは３０超の異なる標識原子を（抗体を含む）タンパク質にコンジュゲートするのに用いることができるＭａｘＰａｒ（商標）金属標識キットを販売している。
【００３９】
様々な数の標識原子を単一のｓｂｐメンバーに付着させることができ、より多くの標識原子をいずれかのｓｂｐメンバーに付着させるる場合、より大きな感度を達成することができる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個より多くの標識原子を１つのｓｂｐメンバーに付着させることができる。例えば、それぞれＤＴＰＡのようなキレート剤を含む、複数のモノマー単位を含む単分散ポリマーを用いてもよい。ＤＴＰＡは、例えば、３＋のランタニドイオンに約１０−６Ｍの解離定数で結合する［１］。これらのポリマーは、ｓｂｐメンバーとの付着に用いることができるチオール反応性基（例えば、マレイミド）で終端することができる。例えば、チオール反応性基は抗体のＦｃ領域に結合し得る。これらのポリマーのコンジュゲーションには、他の官能基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなアミン反応性基、またはカルボキシルに対する反応性基もしくは抗体のグリコシル化に対する反応性基を用いることもできる。いかなる数のポリマーも、各ｓｂｐメンバーに結合し得る。用いられ得るポリマーの具体例としては、直鎖（「Ｘ８」）ポリマーまたは第３世代樹枝状（「ＤＮ３」）ポリマーが挙げられ、ともにＭａｘＰａｒ（商標）試薬として入手可能である。標識中の原子の数を増加させるため、金属ナノ粒子を用いることもできる。
【００４０】
上述したとおり、標識原子をｓｂｐメンバーに付着させ、この標識されたｓｂｐメンバーを（存在する場合には）標的ｓｂｐメンバーを見つけることができる組織サンプルと接触させることによって、標識されたｓｂｐを形成する。前記標識されたｓｂｐメンバーは、標識原子への付着および本発明によるイメージングに適した、いずれかの化学構造を備えることができる。
【００４１】
一般に、本発明の方法は、（例えば、ＩＨＣまたは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨに用いられるような）組織サンプル中の標的分子の位置の決定に用いることが既に知られるいかなるｓｂｐにも基づくことができるが、サンプルと接触させられるｓｂｐメンバーは、ＩＣＰ−ＭＳにより検出可能な標識原子を担持する。よって本発明は、入手可能なＩＨＣおよびＦＩＳＨ試薬を用いることにより、単に、以前から用いられている標識を修飾（例えば、ＦＩＳＨプローブをＩＣＰ−ＭＳにより検出することができる標識を担持するように修飾）することにより、容易に実施することができる。
【００４２】
ｓｂｐは、核酸二本鎖；抗体／抗原複合体；受容体／リガンド対；またはアプタマー／標的対のいずれかを備えてもよい。このように、標識原子は、その後組織サンプルと接触させられる核酸プローブに付着させることができ、当該核酸プローブは当該組織サンプル中で相補的な核酸にハイブリダイズして、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖、またはＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成することができる。同様に、標識原子は、その後組織サンプルと接触させられる抗体に付着させることができ、該抗体の抗原に結合することができる。標識原子は、その後組織サンプルと接触させられるリガンドに付着させることができ、該リガンドの受容体に結合することができる。標識原子は、その後組織サンプルと接触させられるアプタマーリガンドに付着させることができ、該アプタマーリガンドの標的に結合することができる。このようにして、標識されたｓｂｐメンバーを用いて、サンプル中の、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質、糖、脂質、または代謝産物を含む、様々な標的を検出することができる。
【００４３】
本発明の典型的な実施形態において、標識されるｓｂｐメンバーは抗体である。抗体の標識は、例えば、上述したようなＭａｘＰａｒ（商標）コンジュゲーションキットを用い、１つ以上の標識原子を結合している分子を抗体にコンジュゲーションすることによって達成することができる。イメージングに有用な細胞内タンパク質を認識する抗体は、ＩＨＣ用途に既に広く利用可能であり、これらの既知の抗体は、現行の標識技術（例えば、蛍光）の代わりに標識原子を用いることによって、多重化能力を増加させるという利点を有しながら、本発明の方法における使用に容易に適合させることができる。本発明で用いられる抗体は、細胞表面上の標的または細胞内の標的を認識することができる。抗体は、多様な標的を認識することができ、例えば、個別のタンパク質を特異的に認識することができ、共通のエピトープを共有する複数の関連タンパク質を認識することができ、または（例えば、対象となるタンパク質上のチロシンとホスホチロシンとの識別、リジンとアセチルリジンとの識別、ユビキチン化の検出、等のため）タンパク質上の特定の翻訳後修飾を認識することができる。その標的に結合した後、抗体にコンジュゲーションしている標識原子を検出し、サンプル中の当該標的の位置を明らかにすることができる。
【００４４】
標識されたｓｂｐメンバーは通常、サンプル中の標的ｓｂｐメンバーと直接的に相互作用する。しかしながら、いくつかの実施形態において、標識されたｓｂｐメンバーは標的ｓｂｐメンバーと間接的に相互作用することが可能であり、例えば、サンドイッチアッセイの方法で、一次抗体が標的ｓｂｐメンバーに結合してもよく、次いで、標識された二次抗体が一次抗体に結合することができる。しかしながら、通常は、より容易に達成することができ、高次多重化を可能にするため、本発明は直接相互作用に依る。しかしながら、両方の事例において、サンプルを当該サンプル中の標的ｓｂｐメンバーに結合することができるｓｂｐメンバーと接触させて、その後の段階では標的ｓｂｐメンバーに付着した標識が検出される。
【００４５】
本発明の１つの特徴は、サンプル中の複数（例えば、１０個以上、およびさらには最大１００個以上）の異なる標的ｓｂｐメンバーを検出する能力、例えば、複数の異なるタンパク質および／または複数の異なる核酸配列を検出する能力である。これらの標的ｓｂｐメンバーの示差的検出を可能にするため、それら各ｓｂｐメンバーは、それらの信号をＩＣＰ−ＭＳにより識別することができるように、異なる標識原子を担持すべきである。例えば、１０個の異なるタンパク質を検出する場合、それぞれ特有の標識を担持する（それぞれ異なる標的タンパク質に特異的な）１０個の異なる抗体を用いることができ、異なる抗体に由来する信号を識別することができる。いくつかの実施形態では、例えば、同じタンパク質上の異なるエピトープを認識する、単一標的に対して複数の異なる抗体を用いることが望ましい。よって、ある方法は、このタイプの重複性のため標的より多くの抗体を用い得る。しかしながら、一般的に、本発明は、複数の異なる標的を検出するのに複数の異なる標識原子を用いる。
【００４６】
本発明で２つ以上の標識抗体が用いられる場合、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳにより検出される標識原子の量と組織サンプル中の標的抗原の豊富さとの間の関係が（とくに高い走査周波数で）異なるｓｂｐにわたり一定であることを確保するのに役立つため、抗体はそれらの各抗原について類似の親和性を有するべきである。
【００４７】
標的ｓｂｐメンバーが細胞内に位置する場合、サンプルの標識との接触前またはその間に、細胞膜を透過処理することが典型的には必要である。例えば、標的がＤＮＡ配列であるが、標識ｓｂｐメンバーが生細胞の膜を透過することができない場合、組織サンプルの細胞は固定および透過処理することができる。標識ｓｂｐメンバーは次に細胞に侵入し、標的ｓｂｐメンバーとｓｂｐを形成することができる。この点において、ＩＨＣおよびＦＩＳＨで用いられる既知のプロトコルを用いることができる。
【００４８】
通常は、本発明の方法は、少なくとも１つの細胞内標的および少なくとも１つの細胞表面標的を検出する。いくつかの実施形態において、しかしながら、本発明を用い、細胞内標的を無視しながら複数の細胞表面標的を検出することができる。全体として、本発明はサンプル中の選択された標的の位置の画像を提供するので、標的の選択は本方法から望ましい情報により決定される。
【００４９】
＜組織サンプル＞
本発明は、組織サンプルのイメージング方法を提供する。組織サンプルは複数の相互作用する細胞を含み、本方法は、組織サンプル中のこれらの細胞の画像を提供するため、複数のこれらの細胞にレーザアブレーションを行う。一般的には、本発明を用い、ＩＨＣ技術により研究される組織サンプルを、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳによる検出に適した標識を使用して分析することができる。
【００５０】
本明細書に記載される方法にはいずれかの適切な組織サンプルを用いることができる。例えば、組織は、上皮組織、筋肉組織、神経組織、等、およびこれらの組み合わせとすることができる。診断または予後目的のため、組織は腫瘍からのものとすることができる。いくつかの実施形態において、サンプルは既知の組織からのものであってもよいが、サンプルが腫瘍細胞を含むかは不明であり得る。イメージングは腫瘍の存在を示す標的の存在を明らかにすることができ、よって診断を促進する。組織サンプルは乳癌組織、例えば、ヒト乳癌組織またはヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＬＥ）を含み得る。組織サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含み得る。組織はいずれかの生きている多細胞生物から、通常ヒトから入手することができる。
【００５１】
組織サンプルは通常、例えば、４〜６μｍのような２〜１０μｍの範囲内の厚さを有する切片である。こうした切片の作製技術はＩＨＣの分野から周知であり、例えば、ミクロトームを用い、脱水ステップ、包埋、等を含む。このようにして、組織を化学的に固定させることができ、次いで、所望の平面で切片を作製することができる。凍結切片またはレーザ捕捉顕微解剖を組織サンプルの作製に用いることもできる。サンプルは、例えば、試薬の細胞内標的の標識を可能にするため、透過処理してもよい（上記参照）。
【００５２】
分析する組織サンプルのサイズは現行のＩＨＣ方法に類似するが、最大サイズはレーザアブレーション装置により、とくにそのアブレーションセルに入ることができるサンプルのサイズにより、決定される。５ｍｍｘ５ｍｍまでのサイズが典型的であるが、より小さなサンプル（例えば、１ｍｍｘ１ｍｍ）も有用である（これらの寸法は、その厚さではなく、切片のサイズを指す）。
【００５３】
組織サンプルのイメージングに有用であることに加えて、本発明は、代わりに、（従来の免疫細胞化学において見られる）接着性細胞または固体表面上に固定化した細胞の単層のような細胞サンプルのイメージングに用いることができる。これらの実施形態は、細胞懸濁質量サイトメトリのために容易に可溶化することができない接着性細胞の分析にとくに有用である。このように、本発明は、現行の免疫組織化学分析を向上させるのに有用であるとともに、免疫細胞化学を向上させるのに用いることができる。
【００５４】
作製後、サンプルはレーザアブレーションセルに入れ、本発明による分析を行う。
【００５５】
＜一細胞分析＞
本発明の方法はサンプル中の複数の細胞のレーザアブレーションを含み、よって複数の細胞からのプルームが分析され、それらの内容物がサンプル中の特定位置にマッピングされて、画像を提供する。ほとんどの場合において、本方法の使用者は、信号を、サンプル全体ではなく、サンプル中の特定細胞に局在化させることが必要となる。これを達成するため、サンプル中の細胞の境界（例えば形質膜、またはいくつかの場合においては細胞壁）を区画することができる。
【００５６】
細胞境界の区画は、様々な方法で達成することができる。例えば、サンプルは、顕微鏡観察のような、細胞境界を区画することができる従来技術を用いて研究することができる。次に本発明の方法を用いてこのサンプルの画像を作成することができ、この画像を前の結果の上に重ね、これによりＬＣＰ−ＭＳ信号の特定の細胞への局在化を可能にすることができる。
【００５７】
複数の技術を用いる必要性を回避するため、しかしながら、本発明のイメージング方法の一部として細胞境界を区画することが可能である。こうした境界区画戦略はＩＨＣおよび免疫細胞化学でよく知られ、これらのアプローチはＩＣＰ−ＭＳにより検出することができる標識を用いることにより適合させることができる。例えば、本方法は、細胞境界で局在化することが知られる標的分子の標識を含むことができ、これらの標識からの信号を境界区画化に用いることができる。適切な標的分子は、接着複合体のメンバー（例えばβ−カテニンまたはＥ−カドヘリン）のような、細胞境界の豊富なまたは一般的なマーカーを含む。いくつかの実施形態は、区画化を向上させるため、２つ以上の膜タンパク質を標識することができる。
【００５８】
適切な標識を含むことによる細胞境界の区画化に加えて、特定の細胞小器官をこの方法で区画することも可能である。例えば、ヒストン（例えばＨ３）のような抗原を用いて核を識別することができ、ミトコンドリア特異的抗原、細胞骨格特異的抗原、ゴルジ特異的抗原、リボソーム特異的抗原、等を標識することも可能であり、これにより本発明の方法による細胞の超微細構造の分析を可能にする。
【００５９】
細胞（または細胞小器官）の境界を区画する信号は、目視により評価することができ、または画像処理を用いてコンピュータにより分析することができる。こうした技術は他のイメージング技術の分野において知られ、例えば参考文献１９は蛍光画像から細胞境界を決定する空間フィルタリングを用いる分割スキームについて記載し、参考文献２０は明視野顕微鏡画像から境界を決定するアルゴリズムについて開示し、参考文献２１は共焦点顕微鏡画像から細胞幾何を抽出するＣｅｌｌＳｅＴ方法について開示し、参考文献２２は蛍光顕微鏡画像のＣｅｌｌＳｅｇｍ  ＭＡＴＬＡＢツールボックスについて開示する。本発明で有用な方法は、ウォーターシェッド変換およびガウスぼかしを用いる。これらの画像処理技術は単独で使用することができ、またはそれらを使用した後、目視で確認することができる。
【００６０】
細胞境界が区画されると、特定の標的分子からの信号を個別の細胞に割り当てることが可能となる。例えば本方法を定量的基準に対して較正することにより、個別の細胞中の標的分析物の量を測ることも可能となり得る。本発明の方法は高度に定量的である。既知の方法との比較において、本発明の方法は、サンプル自家蛍光の影響を受けず、ＭＡＬＤＩおよびＳＩＭＳイメージングにおいて一般的なものと比較してマトリックス効果は最小限または全くなく、ＩＨＣにおいて適用されることが多い増幅ステップの必要がなく、組織を完全にサンプリングすることができ、本方法は〜１０５の広いダイナミックレンジを有する。
【００６１】
＜他の技術との組み合わせ＞
本発明の方法は他のイメージング技術と組み合わせることができ、異なる技術から得られた画像を組み合わせ、よりリッチな複合画像を得ることができる。例えば、サンプルは、まず蛍光および／または可視標識を用いる顕微鏡観察のような従来技術（例えばＩＨＣ分析）によりイメージングされ得る。こうした技術は、非破壊性であり、それらの標識は一般的には有用なＬＣＰ−ＭＳ信号をもたらす原子を含まない（典型的にはそれらはサンプル自体と同じ原子からなり；それらがＭＳスペクトルにおいて可視的な原子を含む場合、それらの存在はＭＳステップにおいて、例えばこれらを標識原子として用いないことにより、容易に相殺することができる）ため、サンプルは本発明の方法によりイメージングすることができ、顕微鏡観察および質量サイトメトリの結果は組み合わせて用いることができる。
【００６２】
本発明の方法を別の破壊性イメージング技術（例えばＭＡＬＤＩイメージング［２３］）と組み合わせる場合、２つの技術は同じ組織の隣接する切片で用いることが好ましい。
【００６３】
＜全般＞
「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜で構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸ「を含む」組成物は、排他的にＸで構成されてもよく、または例えばＸ＋Ｙのように追加のものを含んでもよい。
【００６４】
数値ｘに関する「約」の語は任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００６５】
「実質的に」の語は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物はＹを完全に含まない場合があり得る。必要に応じて、「実質的に」の語は本発明の定義から省略され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１ａ】非標識（左）および５つのマーカー（上から：Ｈ３；ＨＥＲ２；ＣＫ８／１８；Ｅ−Ｃａｄ；Ｖｉｍ）を認識する金属標識（右）抗体を用いるルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ（症例ｎｏ．３７）の一連の乳癌組織切片のＩＦＭを示す。文字は標識の色を示し、ｃ＝シアン、ｒ＝赤、ｙ＝黄である。
【図１ｂ】図１ａと同じ５つのマーカーを認識する金属標識抗体を用いるルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ（症例ｎｏ．２１０、２３および３７）の乳癌組織切片のＩＦＭ（左）およびＣｙＴＯＦイメージング質量サイトメトリ（右）を示す。
【図２ａ】ルミナルＨＥＲ２＋乳癌組織サンプル、症例ｎｏ．２１０の質量サイトメトリ画像を示す。合計３２個のタンパク質およびリン酸化部位を１μｍ分解能で同時に測定した（表１および２）。サイトケラチン８／１８（赤）、Ｈ３（シアン）およびビメンチン（黄）のオーバーレイ。
【図２ｂ】ルミナルＨＥＲ２＋乳癌組織サンプル、症例ｎｏ．２１０の質量サイトメトリ画像を示す。合計３２個のタンパク質およびリン酸化部位を１μｍ分解能で同時に測定した（表１および２）。サイトケラチン７（赤）、Ｈ３（シアン）およびＣＤ４４（黄）のオーバーレイ。
【図２ｃ】ルミナルＨＥＲ２＋乳癌組織サンプル、症例ｎｏ．２１０の質量サイトメトリ画像を示す。合計３２個のタンパク質およびリン酸化部位を１μｍ分解能で同時に測定した（表１および２）。ｐａｎ−アクチン（赤）、プロゲステロン受容体（青）およびＣＤ６８（黄）のオーバーレイ。
【図２ｄ】ルミナルＨＥＲ２＋乳癌組織サンプル、症例ｎｏ．２３の質量サイトメトリ画像を示す。合計３２個のタンパク質およびリン酸化部位を１μｍ分解能で同時に測定した（表１および２）。ＨＥＲ２（赤）、Ｈ３（シアン）およびビメンチン（黄）のオーバーレイ。
【図２ｅ】ルミナルＨＥＲ２＋乳癌組織サンプル、症例ｎｏ．２３の質量サイトメトリ画像を示す。合計３２個のタンパク質およびリン酸化部位を１μｍ分解能で同時に測定した（表１および２）。Ｅ−カドヘリン（赤）、サイトケラチン７（黄）およびＳ６におけるＳ２３５／Ｓ２３６のリン酸化（青）のオーバーレイ。
【図２ｆ】ルミナルＨＥＲ２＋乳癌組織サンプル、症例ｎｏ．２３の質量サイトメトリ画像を示す。合計３２個のタンパク質およびリン酸化部位を１μｍ分解能で同時に測定した（表１および２）。β−カテニン（赤）、エストロゲン受容体（青）およびＣＤ６８（黄）のオーバーレイ。スケールバー、２５μｍ。
【図３】イメージング質量サイトメトリ（上２行；Ｃ）またはＩＦＭ（下２行；ＩＦＭ）による接着性細胞の分析を示す。顕微鏡写真は、チロシンホスファターゼ阻害剤バナデートでの３０分の処理あり（行１および３；＋）またはなし（行２および４；−）で、一連のリン酸化残渣を認識する金属標識抗体（左から：ＰＬＣγ２、ｐＹ７５９；ＥＲＫ、ｐＴ２０２／ｐＹ２０４；ｐ３８、ｐＴ１８０／ｐＹ１８２；Ｓ６、ｐＳ２３５／ｐＳ２３６）で示されるように、標識およびイメージングされたヒト乳腺上皮細胞を示す。スケールバー、２５μｍ。曝露は各対照−刺激比較について一定に保ったが、異なる抗体間では一定でなかった。
【図４】ａは重なり合う細胞集団を示されるマーカーパターンで識別するＳＰＡＤＥツリーを示す。薄灰色の領域はすべてのチャネルにおいて低いマーカー発現を有する細胞を含む。Ｖｉｍ、ビメンチン；Ｅ−Ｃａｄ、Ｅ−カドヘリン；ＣＫ８／１８、サイトケラチン８／１８；ＣＫ７、サイトケラチン７；β−Ｃａｔ、β−カテニン；ＥＲ、エストロゲン受容体；ＣＡＨ  ＩＸ、炭酸脱水酵素ＩＸ；ＰＲ、プロゲステロン受容体；ｍｅｄ、媒体。ｂは腫瘍症例ｎｏ．２０１のＣＤ２０側集団を示すクラスタツリーを示す。色は示されるマーカーの発現レベルを示し、ノードのサイズは細胞クラスタに該当する所定の患者からの細胞の割合に対応する。ｃ〜ｉは、ＨＥＲ２＋サンプルの細胞部分集団を示すクラスタツリーを示す。症例番号は（ｃ）３５９（ｄ）２５４（ｅ）２１０（ｆ）１９９（ｇ）２０１（ｈ）２９４（ｉ）２７９であり、ルミナルサンプルである。
【図５】２０Ｈｚでのアブレーションチャンバの信号分離を示す。示される信号は対象となるすべての同位体の合計強度である。個数はすべての測定チャネルにわたり合計した。
【図６】ルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ（ＰＲ症例ｎｏ．２１０、ＨＥＲ２およびサイトケラチン８／１８症例ｎｏ．２３）の乳癌組織切片のＩＦＭ（左）およびＣｙＴＯＦイメージング質量サイトメトリ（右）により分析された金属標識抗体の特異性の比較を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８およびＨ３はシアンで、３つの特異的マーカーは赤で示す（上：ＰＲ；中央：Ｈｅｒ２；下：ＣＫ８／１８）。１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは次のとおり調節した：Ｈ３、２００（症例ｎｏ．２１０）および４００（症例ｎｏ．２３）；ＰＲ、１０；ＨＥＲ２、５０；サイトケラチン８／１８、３０。画像中の白のサイズバーは２５μｍを示す。
【図７ａ】β−カテニン（赤）、Ｈ３（シアン）、およびｐＳ６（黄）のオーバーレイを示す組織ｎｏ．２１０の画像を示す。図７ａ〜ｄについて、１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは次のとおり調節した：ｐＳ６、１５（組織ｎｏ．２１０）および２０（組織ｎｏ．２３）；Ｈ３、２００（組織ｎｏ．２１０）および４００（組織ｎｏ．２３）；β−カテニン、２０；ＨＥＲ２、３０；ＣＡＨ  ＩＸ、１５；Ｅ−カドヘリン、２０；ビメンチン、４００；サイトケラチン８／１８、２５。画像中の白色のサイズバーは２５μｍを示す。
【図７ｂ】ＨＥＲ２（赤）、Ｈ３（シアン）、およびＣＡＨ  ＩＸ（黄）のオーバーレイを示す組織ｎｏ．２１０の画像を示す。
【図７ｃ】Ｅ−カドヘリン（赤）、Ｈ３（シアン）、およびビメンチン（黄）のオーバーレイを示す組織ｎｏ．２１０の画像を示す。
【図７ｄ】サイトケラチン８／１８（赤）、Ｈ３（シアン）、およびＳ６のリン酸化（黄）のオーバーレイを示す組織ｎｏ．２３の画像を示す。
【図８】Ａ〜Ｅは、症例ｎｏ．３７の連続切片の金属標識（左上）および非標識（右上）抗体のＩＦＭ画像を示す。事象に対する強度をプロットする、金属標識抗体（左下）および非標識抗体（右下）のＩＦＭ分析の単一細胞強度分布を示す。事象番号は正規化しなかった。平均信号は赤線により表す。中央信号は緑四角により表す。
【図９】ａおよびｂは一重ＩＨＣ（左２パネル）および３２重イメージング質量サイトメトリ（右側パネル）測定の間の比較を示す。ルミナルＨＥＲ２＋腫瘍の切片を使用したが（症例ｎｏ．２１０）、切片は連続ではなかった。１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは次のとおり調節した：ＨＥＲ２、３０；ＰＲ、１０；ＣＫ８／１８、８０；Ｈ３、２００。画像中の白色のサイズバーは２５μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
以下に示す実施例は、ＣｙＴＯＦベースの質量サイトメトリの多重化分析能力を、ＬＡ−ＩＣＰ−ＴＯＦＭＳを用いる空間解像測定まで拡張するイメージング技術を示す。さらなる詳細、ならびに図１〜４および６〜９のカラーコピーを含む、その補助情報は、参考文献２４に開示される（すべて本明細書に参照により組み入れられる）。
【００６８】
［実施例１：質量サイトメトリを用いる組織サンプルのイメージング］
質量サイトメトリ、ＩＣＣおよびＩＨＣ分析を高分解能レーザアブレーションシステムと組み合わせ、１μｍの細胞内レベルの分解能での接着性細胞および組織切片の分析を可能にするワークフローが開発された。
【００６９】
第１ステップにおいて、通常のＩＣＣおよびＩＨＣプロトコル［２５］を用い、抗体標識のための細胞サンプルまたは組織切片を作製した。３２個のタンパク質および乳癌に関連するタンパク質修飾を標的とする抗体を選択した。染色前、抗体は所定の原子質量を有する特有の希土類金属同位体でタグをつけた。
【００７０】
空気乾燥後、サンプルは、高分解能、高スループットおよび高感度分析のためエアロゾル分散を最小化する、参考文献７に記載されるレーザアブレーションチャンバに入れた。組織を次に１スポットずつおよび１ラインずつアブレーションし、アブレーションされた物質を次にアルゴンおよびヘリウムの混合ストリームにより、ＣｙＴＯＦ質量サイトメータまで輸送した。
【００７１】
図５は、すべての測定チャネルにわたり合計された、２０Ｈｚでの個別のレーザショットの信号が完全に分離されたことを示す。検出限界はイオン約６個（分子〜５００個に対応）であり、ポアソン統計を仮定する。
【００７２】
データ処理後、３２個の過渡、単一同位体信号を、各単一レーザショットの座標を用いてプロットし、すべての分析された測定チャネルをオーバーレイすることによりサンプルの高次元画像を生成した。次に、単一細胞機構を、ウォーターシェッドアルゴリズムを用いて計算的に分割し、マーカー発現データを個別の細胞と一致させた。単一細胞データは、すべての下流データ分析に、ならびに合計２０人の乳癌患者からの１セット２１個の腫瘍および正常サンプル内の細胞部分集団を調査するために用いた。
【００７３】
＜患者および試料の特徴＞
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、以前記載されたように［２６］、ＦＦＰＥ乳癌組織の主要サブタイプおよび正常乳房組織を含んだ。イメージング質量サイトメトリにより分析されたすべての腫瘍は、２人の経験豊富な臨床病理医により、代表的な領域を識別するヘマトキシリンおよびエオシン染色により再評価した。腫瘍ステージおよびブルーム−リチャードソン−エルストン（ＢＲＥ）グレードを、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）および世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に従って割り当てた。乳癌サブタイプの分類は、ＥＲ、ＰＲおよびＨＥＲ２のＩＨＣ発現パターンに基づいた。ＨＥＲ２ステータスは、ＨＥＲ２  ＩＨＣおよびＨＥＲ２  ＦＩＳＨ［２７］により評価した。
【００７４】
＜イメージング質量サイトメトリのためのＨＭＬＥ細胞の作製＞
ヒト乳腺上皮（ＨＭＬＥ）細胞［２８］をカバーガラス上で〜８０％コンフルエントまで増殖させ、モック処理、または１２５μＭバナデートで、３０分間３７℃で処理した。標準的なＩＣＣプロトコル［２５］を用い、イメージング質量サイトメトリおよびＩＦＭのため細胞を作製した。
【００７５】
＜抗体＞
抗体は、担体／タンパク質を含まない緩衝液中で入手後、製造業者の指示［２９］に従ってＭａｘＰａｒ（登録商標）抗体複合キットを用いて作製した。２８０ｎｍの吸光度での測定により収率を決定した後、金属標識抗体を４℃での長期保存のため安定化溶液で希釈した。この研究に用いた抗体を表１〜５に挙げる。
【００７６】
＜ＩＨＣ、ＩＦＭおよびイメージング質量サイトメトリのための乳癌組織切片の作製＞
これらの実施例において示されるＴＭＡのすべての古典的ＩＨＣ染色は、Ｖｅｎｔａｎａの予め希釈した抗体、および標準的なプロトコルを用い、Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ上で行った。サンプルはＨＥＲ２、ＰＲ、サイトケラチン８／１８およびＨ３について染色した。各抗体の比較分析のため所定のマーカーの曝露時間を一定に保った。画像はＩｍａｇｅＪソフトウェアにより処理した。
【００７７】
組織ｎｏ．２３およびＦＦＰＥ乳癌ＴＭＡならびに対応する健康な組織を、イメージング質量サイトメトリのため５μｍの厚さの切片にした。切片を一晩キシレン中で脱ろうし、一連の勾配アルコール（絶対エタノール、エタノール：脱イオン水９０：１０、８０：２０、７０：３０、５０：５０、０：１００；各１０分［３０］）中で再水和した。熱誘導性エピトープ賦活化を２０分間、ｐＨ９のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中、８８℃の水浴で行った。すぐに冷却した後、ＴＭＡをＰＢＳ中１％ＢＳＡ／０．１％トリトンＸ−１００で３０分間ブロックした。染色のため、ＴＭＡサンプルを抗体マスターミックス（表１、４および５）と一晩４℃でインキュベートした。サンプルを次にＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００で５回洗浄した。
【００７８】
図１ｂ、２および７に示されるＴＭＡコアｎｏ．２１０について、下記プロトコルを用いた：２０分間、ｐＨ９のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中、９２〜９４℃での熱誘導性エピトープ賦活化。すぐに冷却した後、ＴＭＡ切片をＴＢＳ中３％ＢＳＡ／０．１％トリトンＸ−１００で４５分間ブロックした。ＴＭＡサンプルを、抗ｐＳＨＰ２、抗ＣＤ３１、抗ＴＷＩＳＴ、抗ＣＤ３、抗ＳＬＵＧ、および抗ＥＧＦＲを除くすべての抗体を含む抗体マスターミックス（表２）と一晩４℃でインキュベートした。２×ＴＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００および２×ＴＢＳでの洗浄ステップ後、それらの抗体を添加し、サンプルを室温で２．５ｈ、次に４℃で１ｈインキュベートした。洗浄後、サンプルは室温で乾燥させた後、イメージング質量サイトメトリを行った。
【００７９】
＜高空間分解能レーザアブレーション＞
上述したとおり、組織切片をイメージング質量サイトメトリにより分析した。改良型ＡｒＦエキシマレーザシステムＧｅｏＬａｓＣ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）は、均質化したＵＶレーザビーム（λ＝１９３ｎｍ）を２５μｍの開口に送達し、これを組織サンプル上に２５倍縮小でイメージングした。得られた直径１μｍおよび３．５Ｊ／ｃｍ２レーザフルエンスのレーザビームを用い、２０Ｈｚの周波数で抗体染色組織をアブレーションした。得られた組織のレーザアブレーションクレータは（走査電子顕微鏡観察により決定されるとおり）直径〜１μｍであった。レーザアブレーションチャンバの並進速度は２０μｍ／ｓであった。１μｍ距離での個別のライン走査は、対象となる領域内の組織層を完全に除去するため、ラスタ化した。レーザアブレーションシステムでの高空間分解能、高感度イメージングを可能にするため用いられるレーザアブレーションチャンバは、参考文献７に詳細に記載される。アブレーションされたサンプルエアロゾルは、アルゴンおよびヘリウムガス流によりＣｙＴＯＦ質量サイトメトリまで直接輸送した。ＣｙＴＯＦ装置設定は、ＣｙＴＯＦソフトウェアバージョン５．１．５９８で以前記載した［１１、１２］。
【００８０】
＜一細胞への分割＞
単一細胞タンパク質発現分析の前に、形態学的な一細胞への分割が必要である。画像中の細胞の境界を検出するため、細胞膜タンパク質β−カテニン、ＨＥＲ２およびサイトケラチン８／１８を実験プロトコル中に組み入れ；タンパク質Ｈ３の染色を用い、細胞核を識別した。画像は、よく整列した形態学的な細胞境界および中心を示した。さらなる細胞の分割は、ウォーターシェッド変換［３１、３２］により達成した。まず、膜画像および陰性核画像をオーバーレイし、最大限の細胞境界情報をもたらした。次に、画像にガウスぼかしを行い、イメージングアーチファクトおよびノイズを最小化した。最後に、ウォーターシェッドをＭａｔｌａｂイメージングツールボックス（Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２０１１ｂ）で細胞膜に沿って検索した。最良の分割結果は、従来のガウスぼかし（３〜４．５ピクセルのカーネル幅）およびウォーターシェッドの標準的なパラメータ［３１］で達成された。すべての一細胞の境界を目視評価し、必要に応じて補正した。次に境界マスクの内容物に一細胞分析を行った。最後に、一細胞マーカー発現を、各画像から得られた中央Ｈ３信号に正規化した。
【００８１】
＜一細胞マーカー強度の比較＞
免疫蛍光画像について、一細胞への分割はＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ［３３］分割パイプラインを用いて行った。すべての強度を０から１まで変更し、外れ値（＜０．１％サンプルサイズ）を除去した。イメージング質量サイトメトリデータについて、ウォーターシェッドアルゴリズムから抽出された細胞事象を分析した（上記参照）。正規分布を仮定することができないため、予備処理およびさらなる分析は、Ｍａｔｌａｂ  ２０１３ａにおいてスチューデントのｔ検定の代替としてＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いて行った。陽性および陰性の一細胞は、各方法について世界的に定義される閾値により評価した。各比較について１回の生物学的反復が可能であった。
【００８２】
＜検出限界の計算＞
検出限界（ＬＯＤ）を単一レーザショットの積分時間（５０ｍｓまたは１画像ピクセル）と同じ時間の信号について計算した。ほとんどのチャネルの平均化した背景信号は、１レーザショット当たり１個未満であった。ポアソン統計に基づき、イオン数でのＬＯＤを下記式［３４］：ＬＯＤ＝３．２９×Ｓ＋２．７１に従って割り出し、式中、Ｓはこの時間で積分される背景信号の標準偏差である（Ｓは平均背景の平方根であると仮定され；よって控えめに評価して、Ｓ≒１である）。したがって、画像（平均背景補正）のＬＯＤは、１画像ピクセル当たり６個であると評価された。
【００８３】
＜データ分析および画像可視化＞
すべてのデータ処理はＭａｔｌａｂルーチン（Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２０１２ａ）を用いて行った。過渡信号データを質量サイトメータからテキスト形式でエクスポートした。ファイルはプッシュ数（すなわち、時間）の行および質量チャネルの列からなり、測定値はイオン数として表す。各チャネルで記録された信号を、１０ｍｓ時間窓に等しい（１プッシュ＝１３μｓ）、７６８プッシュで積分した。その後、過渡信号における各レーザ生成パルス（５０ｍｓ時間）を単一レーザショット信号に積分した。最後に、各質量チャネルの画像を、レーザショット信号をそれらが記録されたのと同じ順序で１ライン走査ずつプロットすることにより、再構築した。さらなるデータ分析のため、第１ライン走査を開始する前に得られた各個別チャネルの約１ｓの時間で割り出された平均背景を、各個別画像データセットから差し引いた。
【００８４】
可視化のみの目的で、各個別チャネルの画像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖ．１３において、バイキュービック自動リサンプリングを用いて画像比を維持しながら１，５００ピクセルの幅までアップサンプリングした。画像アーチファクト補正のため、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖ．１３において、これらの設定：強度５、ディテールの保持２％、カラーノイズの除去０％およびディテールのシャープ処理４０％でノイズ除去を実施した。ＰＲ（症例ｎｏ．２３および２１０）および開裂カスパーゼ３（症例ｎｏ．２１０）について、アップサンプリング前に「スペックル除去」およびガウスぼかし（カーネル幅、０．２５ピクセル）を適用した。すべてのデータ分析ステップについて、とくに記述のない限り、生データのみを用いた。図１ｂについて、１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは、イメージング質量サイトメトリのため次のとおり調節した：上から、Ｈ３、２００；ＨＥＲ２、３０およびＨ３、２００；ＣＫ８／１８、８０およびＨ３、２００；Ｅ−カドヘリン、４０およびＨ３、４００；ビメンチン、８０およびＨ３、４００。図２について、１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは次のとおり調節した。組織ｎｏ．２１０：Ｈ３、２００；ＣＫ８／１８、８０；ビメンチン、４００；ＣＫ７、２５；ＣＤ４４、５０；ＰＲ、１０；ｐａｎ−アクチン、４０；ＣＤ６８、２０。組織ｎｏ．２３：ＨＥＲ２、５０；Ｈ３、４００；ビメンチン、１００；Ｅ−カドヘリン、３０；サイトケラチン７、２５；ｐＳ６、２０；β−カテニン、４０；ＥＲ、４０；およびＣＤ６８、１０。図３について、各タンパク質リン酸化部位について示された最大イオン数は処理および対照条件の間で同じであり、１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは次のとおり調節した：ＰＬＣγ２、６００；ＥＲＫ、１００；ｐ３８、６０およびＳ６、６０。
【００８５】
［実施例２：抗体特異性に対する標識原子の効果］
ＦＦＰＥ乳癌サンプルを用いて実験を行い、抗体の標識がそれらの標的特異性を妨げるかを決定した。非標識および標識抗体は、同じタイプの腫瘍からの組織ｎｏ．２１０およびｎｏ．３７の連続切片のＩＦＭ分析を用いて比較した。図１ａは、金属標識による抗体特異性の明らかな変化が観察されなかったことを示す。
【００８６】
図１ａは、非標識および示されるマーカーを認識する金属標識抗体を用いるルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ（症例ｎｏ．３７）の連続乳癌組織切片のＩＦＭを示す。
【００８７】
定量分析は、非標識および金属標識抗体の間の各マーカーの平均単一細胞蛍光強度の差が、有意ではあったが、小さかったことを示した。これらの差は十分に、実験手順において、および類似するが同一ではない連続組織切片の間で典型的に観察される、ばらつきの範囲内であった。非標識および金属標識抗体の間の類似性は、すべての試験された抗体対について分析された強度範囲にわたる単一細胞マーカー蛍光強度分布の一致によりさらに確認された（図８ａ〜ｅ）。
【００８８】
図８ａ〜ｅは、症例ｎｏ．３７の連続切片の、Ｈ３、ＨＥＲ２、サイトケラチン８／１８、Ｅ−カドヘリン、およびビメンチンに対する金属標識および非標識抗体のＩＦＭ画像を示す。これらの画像を用い、単一細胞信号強度を定量的に比較した。金属標識抗体および非標識抗体のＩＦＭ分析の単一細胞強度分布は同程度である。事象数は正規化しなかった。
【００８９】
［実施例３：ＩＦＭとの比較によるイメージング方法の検証］
質量サイトメトリにより生成された画像は、ＩＦＭにより測定されるような所定のマーカーを発現する細胞の同じ染色パターンおよび割合を再現した。同じルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ毎からの腫瘍切片（ｎｏ．２１０およびｎｏ．２３）にＩＦＭおよびイメージング質量サイトメトリを用い；両方の方法は、このサブタイプに予想される抗体染色パターンをもたらした（図１ｂ、図６ならびに表１および２）。マーカーＨ３、ヌクレオソームＤＮＡパッケージングタンパク質は典型的には核において観察される。プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ルミナル乳癌、ＨＥＲ２において活性化される転写因子、上皮成長因子受容体ファミリーメンバー、ならびにサイトケラチン８／１８および上皮細胞間結合成分Ｅ−カドヘリンは、典型的には形質膜において観察される。ビメンチンは間質コンパートメントを示す。これらのパターンは他の抗体検証と一致する。
【００９０】
分析されるマーカーを発現する腫瘍細胞の割合は、連続組織切片のＩＦＭおよびイメージング質量サイトメトリにおいて類似した。図１ｂは、それぞれ、Ｈ３について１００％および１００％；ＨＥＲ２について７５％および７９％；ならびにサイトケラチン８／１８について６３％および６６％を示す。図２および図７はさらなるマーカーの質量サイトメトリ画像を示す。
【００９１】
図１ｂは、示されるマーカーを認識する金属標識抗体を用いるルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ（症例ｎｏ．２１０、２３および３７）の乳癌組織切片のＩＦＭおよびＣｙＴＯＦイメージング質量サイトメトリを示す。Ｅ−カドヘリン（Ｅ−Ｃａｄ）およびビメンチン（Ｖｉｍ）は連続切片では分析されなかった。
【００９２】
図６は、ルミナルＨＥＲ２＋サブタイプ（ＰＲ症例ｎｏ．２１０、ＨＥＲ２およびサイトケラチン８／１８症例ｎｏ．２３）の乳癌組織切片のＩＦＭおよびＣｙＴＯＦイメージング質量サイトメトリにより分析された金属標識抗体の特異性の比較を示す。特異性の明らかな変化は見られなかった。
【００９３】
［実施例４：抗体挙動に対する多重化の効果］
一重ＩＨＣ、二重ＩＦＭおよび３２重イメージング質量サイトメトリ分析は、一致する結果をもたらした。同じルミナルＨＥＲ２＋腫瘍（ｎｏ．２１０）において同一の抗体（サイトケラチン８／１８およびＨ３）を用いる、または異なる抗体クローンを用いるが同じ標的（ＨＥＲ２およびＰＲ）に対する一重ＩＨＣ分析は、類似した染色パターンをもたらした。ＩＨＣおよびイメージング質量サイトメトリの両方について、図９ａおよびｂに示されるように、上皮細胞の＞９０％はこれらのマーカーを発現した。図９ａおよび９ｂに示される質量サイトメトリおよびＩＨＣには同じルミナルＨＥＲ２＋腫瘍の切片を用いた（症例ｎｏ．２１０）が、切片は連続でなかった。染色パターンに明らかな違いは見られなかった。１レーザショット当たりの個数を示す最大スケールは次のとおり調節した：ＨＥＲ２、３０；ＰＲ、１０；ＣＫ８／１８、８０；Ｈ３、２００。図９ａについて、イメージング質量サイトメトリおよびＩＨＣ分析に同じ抗体クローンを用いた。図９ｂについて、イメージング質量サイトメトリおよびＩＨＣ分析に異なる抗体クローンを用いた（イメージング質量サイトメトリ：ＨＥＲ２、ＢＤ（３Ｂ５）；ＰＲ、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（ＥＰ２）およびＩＨＣ：ＨＥＲ２、Ｖｅｎｔａｎａ（４Ｂ５）；ＰＲ、Ｖｅｎｔａｎａ（１Ｅ２））。
【００９４】
ＩＦＭ分析において二重測定された抗体は、所定の分析されたマーカーを発現する腫瘍細胞の空間分布および割合に関して、３２重ＣｙＴＯＦ分析のものと同程度の特性を示した（図１ｂおよび図６）。ともに、これらの結果は、多重化が抗体挙動の観察可能な変化もたらさなかったことを示す。
【００９５】
これらの実施例において提示される結果はしたがって、イメージング質量サイトメトリが細胞内レベルの分解能での同時かつ高度多重化組織イメージングを可能にすることを示す。非標識および標識抗体の間、またはイメージング質量サイトメトリを用いる一重ＩＨＣ、二重ＩＦＭおよび多重分析に用いた抗体の間で特異性および性能に明らかな変化はなかった。
【００９６】
［実施例５：ＩＣＣプロトコルにおける接着性細胞株の評価］
イメージング質量サイトメトリを試験し、ＩＣＣプロトコルにおいて接着性細胞株を評価するのに用いることができるかを決定した。モック処理およびホスホチロシンホスファターゼ阻害剤処理ＨＭＬＥ細胞のイメージング質量サイトメトリによる２８個のマーカーの分析は、予想された信号伝達応答を明らかにした。表３はこの分析に用いたマーカーおよび抗体の詳細を示す。図３に示されるように、ＰＬＣγ２に対してＹ７５９、ＥＲＫ１に対してＴ２０２およびＹ２０４（ＥＲＫ２に対してＴ１８４およびＹ１８６）ならびにｐ３８に対してＴ１８０およびＹ１８２でリン酸化の増加が観察された。
【００９７】
図３は、ＩＦＭおよびイメージング質量サイトメトリによる接着性細胞の分析を示す。図３に示される顕微鏡写真は、チロシンホスファターゼ阻害剤バナデートでの３０分の処理なし（「対照」）およびあり（「刺激」）の、一連のリン酸化残基を認識する抗体で示されるように、標識およびイメージングされたヒト乳腺上皮細胞を示す。曝露は各対照−刺激比較について一定に保ったが、異なる抗体の間では一定でなかった。一次および二次抗体検出をそれぞれイメージング質量サイトメトリおよびＩＦＭに用いたことに留意されたい。
【００９８】
質量サイトメトリについて得られた結果は、同様に処理および作製されたＨＭＬＥ細胞のＩＦＭ分析からのデータと一致する（図３）。Ｓ６上のＳ２３５およびＳ２３６を含む、他の非チロシンリン酸化部位について、誘導は観察されなかった。
【００９９】
したがって、本発明の方法は、接着性細胞単層およびｅｘ  ｖｉｖｏサンプルのイメージングに適している。
【０１００】
［実施例６：乳癌における腫瘍不均一性の分析］
乳癌において、ＨＥＲ２、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびＰＲの発現を用い、ルミナルＨＥＲ２−、ルミナルＨＥＲ２＋、ＨＥＲ２＋およびトリプルネガティブを含む、主要サブタイプを定義する［３５］および［３６］。本発明の方法は、（ｉ）細胞部分集団表現型を、多重化測定を用いて描画する、および（ｉｉ）以前観察された乳癌のそれらのサブタイプ内およびそれらの間での不均一性を、イメージング質量サイトメトリを用いて  検出することができるかを評価する目的で試験した［３７］、［３８］、および［３９］。３２重イメージング質量サイトメトリを用い、２１個のＦＦＰＥサンプルを、病理医により  主要乳癌サブタイプまたは正常と予め分類された組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上で分析した。
【０１０１】
細胞部分集団および細胞転換を、密度正規化事象のスパニングツリー進行分析（ＳＰＡＤＥ）［１６］を用いて識別した。分析された腫瘍のＳＰＡＤＥ分析のため、ウォーターシェッドアルゴリズムから抽出された細胞事象をｈｔｔｐ：／／ｃｙｔｏｂａｎｋ．ｏｒｇ／上で、ソフトウェアツールＳＰＡＤＥ［１６］を用いて分析した。下記はＳＰＡＤＥアルゴリズムをこのイメージングベースの単一細胞分析の文脈内でまとめる。まず、すべての抽出された細胞事象の所定の標的数までの密度依存性ダウンサンプリングを行った。次の設定を実施した：Ａｒｃｓｉｎｈ余因子＝５、クラスタの標的数＝１５０、ダウンサンプリングする事象の標的数＝５。分析はソフトウェアＣｙｔｏｓｃａｐｅ＿ｖ．２．８．３を用いることにより行った。ダウンサンプリングした細胞事象は次に、１９個のマーカー（ＥＲ、ＰＲ、ＣＤ６８、ＣＤ２０、ｃ−ＭＹＣ、ＨＥＲ２、ｐＡＭＰＫ、Ｈ３、ｐＥＲＫ、ｐＢａｄ、ＣＤ４４、β−カテニン、ビメンチン、サイトケラチン７、ＣＡＨ  ＩＸ、Ｅ−カドヘリン、ｐＳ６、カスパーゼ３およびサイトケラチン８／１８）の発現に応じて、  表現型的に類似した細胞凝集塊にクラスタ化した。表現型的に類似した細胞凝集塊は端をつなげ、最小限のスパニングツリーを描画した。次に、アップサンプリングステップを行い、初期データセットからの各細胞事象を最も代表的な凝集塊に割り当てた。最後に、最小限のスパニングツリーを２次元で投影させ、細胞凝集塊を表すツリーの円を所定の測定されたパラメータの中央強度レベルにより色づけし、細胞階層全体にわたるマーカー発現の可視化を可能にした。細胞集団を表すＳＰＡＤＥツリーについて、ノードサイズは合計パーセント（例えば、細胞クラスタに該当する所定の画像からの細胞数）として表した。用いた属性値は：０／５／７／１５／最大、ノードサイズ：６０／１２０／１５０／２００／２００である。図４において、ＨＥＲ２について、カラーバーはステップ４／４．５／５／６／７／８．５／９で範囲４〜９に設定した。ＣＤ２０陽性細胞部分集団を表示し、カラーバーを下記ステップ：１／３／５／６／７／８／９において範囲０〜９に設定した。
【０１０２】
図４は、腫瘍不均一性のイメージング質量サイトメトリ分析を示す。２０人の乳癌患者からの２１個のサンプルを分析した。ＳＰＡＤＥツリーは、重なり合う細胞集団を示されるマーカーパターンで識別する。薄灰色の領域はすべてのチャネルにおいて低いマーカー発現を有する細胞を含む（図４ａ）。図４ｂは、腫瘍症例ｎｏ．２０１のＣＤ２０側集団を示すクラスタツリーを示す。図４ｃ〜ｇは、乳癌サブタイプによるＨＥＲ２＋細胞部分集団を示し、これらの細胞の内在的な不均一性を反映する：症例ｎｏ．３５９（ｃ）、２５４（ｄ）、２１０（ｅ）、１９９（ｆ）および２０１（ｇ）を示す。図４ｈ〜ｉは、ＨＥＲ２＋（症例ｎｏ．２９４；ｈ）およびルミナルＨＥＲ２＋サンプル（症例ｎｏ．２７６；ｉ）の細胞部分集団を示すクラスタツリーを示す。色は示されるマーカーの発現レベルを示し、ノードのサイズは細胞クラスタに該当する所定の患者からの細胞の割合に対応する。
【０１０３】
ＳＰＡＤＥツリーは、ビメンチンを発現する間質細胞部分集団、広範囲のマーカーを発現する上皮性腫瘍細胞部分集団、およびＣＤ２０＋免疫細胞を反映する（図４ａおよびｂ）。ＨＥＲ２（図４ａ、ｃ〜ｉ）、ビメンチン、ＰＲ、ＥＲ、β−カテニン、炭酸脱水酵素（ＣＡＨ）ＩＸ、Ｅ−カドヘリン、ｃ−ＭＹＣ等のレベルはかなり変動した（図４ａ）。発現の明らかな違いは、とくにサイトケラチン８／１８、サイトケラチン７、ＨＥＲ２、Ｅ−カドヘリン染色について同じ腫瘍内でも可視的であった（図２）。分岐は患者分類：例えば、ＨＥＲ２＋およびルミナルＨＥＲ２＋に用いたマーカーにより誘導されたので、識別された細胞部分集団は予測された乳癌サブタイプも部分的に反映した（図４ｅ、ｆ、ｈ、ｉ）。
【０１０４】
ＳＰＡＤＥ分析は、図４からわかるように、腫瘍サブタイプを部分的に反映した。しかしながらこれは、細胞部分集団の手動割り当ておよびしたがって上で示したような乳癌細胞部分集団のマップの描画を可能にする、高次元単一細胞データのＳＰＡＤＥツールの非常に高い可視化能力を減じない。
【０１０５】
７つのサンプルをＨＥＲ２＋またはルミナルＨＥＲ２＋として分類した。これらのサンプルはＳＰＡＤＥツリーにおいてＨＥＲ２陽性分岐を占めたが、サイトケラチン８／１８、Ｅ−カドヘリン、β−カテニンおよびｃ−ＭＹＣ発現が異なる特有の部分集団もあった（図４ａ）。例えば、ルミナルＨＥＲ２＋腫瘍ｎｏ．２１０（図４ｅ）はｃ−ＭＹＣを過剰発現した。同じ乳癌サブタイプ内でのこれらの違いは、患者間腫瘍不均一性を示す（図４ｅ、ｆ、ｈ、ｉ）。
【０１０６】
本発明のこれらの実施形態は、質量サイトメトリが、細胞型マーカー、信号伝達活性および低酸素のような癌の特徴の同時イメージングを可能にすることを示す。つまり、これらの分析は、分析されたＦＦＰＥサンプル中に存在する乳癌細胞部分集団を描画し、それらの空間配置を識別し、同じ患者内および同じ腫瘍分類を有する患者間での違いを明らかにした。
【０１０７】
本発明は上で例としてのみ説明され、本発明の範囲および精神から逸脱することなく改変を行われ得ることが理解されるだろう。
【０１０８】
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【０１０９】
【表１】
2017512985.tif 000003
【０１１０】
【表２】
2017512985.tif 000004
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
【表５】
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【図１】
2017512985.tif 000008
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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