(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターを含有する酵素電極を有し、かつ反応槽に過酸化水素を分解する酵素および過酸化水素を含むことを特徴とするポリフェノールセンサー。
【請求項２】
過酸化水素を分解する酵素がペルオキシダーゼである請求項１記載のポリフェノールセンサー。
【請求項３】
電子メディエーターがフェロセンである請求項１または２に記載のポリフェノールセンサー。
【請求項４】
酵素電極が過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターがカーボンペーストに練り込まれてなる請求項１〜３のいずれかに記載のポリフェノールセンサー。
【請求項５】
酵素電極が透析膜で被覆されてなる請求項１〜４のいずれかに記載のポリフェノールセンサー。
【請求項６】
過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターを含有する酵素電極を用い、一定濃度の過酸化水素を含む反応槽に過酸化水素を分解する酵素および試料液を添加し、一定時間経過後の過酸化水素濃度の減少を電気化学的に測定することにより試料液中におけるポリフェノール濃度を定量することを特徴とするポリフェノールの測定方法。
【請求項７】
過酸化水素を分解する酵素がペルオキシダーゼである請求項６記載の方法。
【請求項８】
電子メディエーターがフェロセンである請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
酵素電極が過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターがカーボンペーストに練り込まれてなる請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
酵素電極が透析膜で被覆されてなる請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料液中のポリフェノールを電気化学的に定量するためのポリフェノールセンサーに関する。また、本発明は、ポリフェノールの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリフェノールは、ベンゼン環に複数の水酸基をもつ化合物の総称であり、これに該当するものは、タンニン類、フラボノイド類、リグナン、リグリン、クマリンなど広範囲にわたっている。近年、ポリフェノールは、動脈硬化促進作用のある低比重リポタンパク質の酸化を防止する等、ラジカル消去作用による抗酸化作用がα−トコフェロールやアスコルビン酸よりも優れていることが明らかにされている。ポリフェノールは多くの食用植物や薬用植物に含まれ、健康志向の高まりと共に、ポリフェノールを豊富に含む赤ワインやお茶の効用が注目されている。
【０００３】
従来、これらのポリフェノールの測定方法として、フォーリン・チオカルト（Folin Ciocalteau）法（J.Biol.Chem.,73,627(1927)）を用いて、試料溶液のポリフェノール含量を没食子酸量で表す分光学的測定法が主として用いられている。しかしながら、この方法では、試料液の濁度や着色の影響が問題となることがあり、反応時間に２〜３時間を要するという欠点を有する。
【０００４】
個々のポリフェノールを分別定量する方法として、ＵＶ（紫外線）吸収等で検出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられている（Chromatorgaphia,34,146(1992)、J.Chromatogr.,642,175(1993)、特開平１０−２８７６０５号公報）。しかしながら、ＨＰＬＣの測定装置は高価であり、特定の設備および場所を必要とする。また、この方法では、対象のフェノール類によって適する溶媒が異なり、１時間以上の測定時間を要する。
【０００５】
一方、より簡単かつ短時間で測定できる方法として、電極を用いた電気化学的測定法が提案されている。上述のフォーリン−チオカルト法やＨＰＬＣ法では、試料溶液の濁度や着色の影響が問題となるが、電気化学的測定法ではこれらの影響は問題にならない。電気化学的測定法は、機器類がコンパクトであり、持ち運びが容易であることから、測定場所を選ばずに行える利点を有する。また、測定機器類は上記の測定方法で用いられる機器類に比較して、安価であるという利点も併せ持つ。さらに試料溶液の測定時間を数分ないしは数十分以内に短縮することが可能である。すなわち、電気化学的測定法は簡単かつ迅速で高感度という長所を有する。
【０００６】
電気化学的測定法として、フェノールあるいはポリフェノールの測定が試みられている（Anal.Chem.,53,1695(1981)，J.Chromatogr.,360,271(1986)）。しかしながら、フェノールの酸化を直接測定するために６５０〜１１００ｍＶ vs.Ａｇ／ＡｇＣｌという正の電位を印加する必要があり、この電位では測定溶液に含まれているフェノール以外の物質も酸化される可能性があり、フェノール類の濃度を正確に求めることができなかった。
【０００７】
そこで、特定のフェノールのみを酸化させ得る一つもしくは二つの酵素を電極に固定化したフェノールセンサーを用いて、酵素反応によって生成したフェノールの酸化体を電気化学的に再還元させる時に流れる電流を測定する方法が近年用いられている（Anal.Chim.Acta.,311,245(1995)，Anal.Chim.Acta.,347,51(1997)）。しかしながら、酵素反応により生成したフェノールの酸化体は容易に重合するため、再還元されずに電気化学的に不活性な重合体になり、この結果得られた電流値はフェノールの量を正しく反映しないという問題があった。
【０００８】
他の電気化学的測定法として、植物組織のポリフェノールオキシダーゼ活性を利用したバイオセンサーも報告されているが（特公平７−１１１４１５号公報）、この場合、数週間の長期間にわたる安定性や再現性に問題があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑み、ポリフェノールをより簡単かつ迅速に測定でき、しかも高感度の測定が可能なポリフェノールセンサーを提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ポリフェノールの測定方法において、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤとも示す）のような過酸化水素を分解する酵素および酵素と電極間の電子移動を促進するフェロセン（以下、Ｆｃとも示す）のような電子メディエーターを含有する酵素電極を用いて、一定の過酸化水素の存在下、過酸化水素を分解する酵素およびポリフェノールを反応槽に添加して一定時間経過後の過酸化水素濃度の減少を電気化学的に測定することにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のような構成から成る。
（１）過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターを含有する酵素電極を有し、かつ反応槽に過酸化水素を分解する酵素および過酸化水素を含むことを特徴とするポリフェノールセンサー。
（２）過酸化水素を分解する酵素がペルオキシダーゼである（１）のポリフェノールセンサー。
（３）電子メディエーターがフェロセンである（１）または（２）のポリフェノールセンサー。
（４）酵素電極が過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターがカーボンペーストに練り込まれてなる（１）〜（３）のいずれかのポリフェノールセンサー。
（５）酵素電極が透析膜で被覆されてなる（１）〜（４）のいずれかのポリフェノールセンサー。
（６）過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターを含有する酵素電極を用い、一定濃度の過酸化水素を含む反応槽に過酸化水素を分解する酵素および試料液を添加し、一定時間経過後の過酸化水素濃度の減少を電気化学的に測定することにより試料液中におけるポリフェノールを検出するポリフェノールセンサー。
（７）過酸化水素を分解する酵素がペルオキシダーゼである（６）のポリフェノールセンサー。
（８）電子メディエーターがフェロセンである（６）または（７）のポリフェノールセンサー。
（９）酵素電極が過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターがカーボンペーストに練り込まれてなる（６）〜（８）のいずれかのポリフェノールセンサー。
（１０）酵素電極が透析膜で被覆されてなる（６）〜（９）のいずれかのポリフェノールセンサー。
（１１）過酸化水素を分解する酵素および電子メディエーターを含有する酵素電極を用い、一定濃度の過酸化水素を含む反応槽に過酸化水素を分解する酵素および試料液を添加し、一定時間経過後の過酸化水素濃度の減少を電気化学的に測定することにより試料液中におけるポリフェノール濃度を定量することを特徴とするポリフェノールの測定方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明のポリフェノールセンサーに用いられる酵素電極について説明し、次いで本発明のポリフェノールセンサーについて説明する。
【００１３】
（１）酵素電極
本発明のポリフェノールセンサーに用いられる酵素電極は、過酸化水素を分解する酵素（以下、酵素と表記する）および電子メディエーターを同時に含有することを特徴とする。前記酵素としては、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等が挙げられる。また、電子メディエーターとは、酵素と電極の間の電子移動を促進する、電極と反応性の高い物質をいうものであり、フェロセン、フェロセン誘導体等のメタロセン類が挙げられる。
【００１４】
前記酵素電極は、酵素および電子メディエーターを電極表面に存在させるためのものであり、形態は特に限定されない。例えば、酵素を含む溶液を電極に載せ、乾燥させ、透析膜で被覆したものでもよい。該透析膜の分画分子量としては、特に限定されないが、１００程度のものが好ましい。
【００１５】
上記のようにして得られる酵素電極を用いた本発明のポリフェノールセンサーについて説明する。
（２）ポリフェノールセンサー
本発明におけるポリフェノールセンサーは、作用電極として働く上記酵素電極の他に参照および対電極を有する。本発明の酵素電極を用いて試料溶液中のポリフェノールの濃度を測定するには、まず、試料を含有しない緩衝液に上記酵素電極を浸漬し、一定量の過酸化水素を加える。続いて、ポリフェノールを含有する測定試料液あるいは緩衝液で希釈した測定試料液を添加し、一定時間経過後の定常電流を測定することにより試料溶液中のポリフェノールの濃度を測定することができる。
【００１６】
すなわち、上記のように作製した酵素電極の外側の反応槽に過酸化水素を添加すると過酸化水素は透析膜を透過して酵素電極の酵素に接触する。透析膜内側の過酸化水素は酵素によって還元され、その結果生じた酵素酸化体がフェロセンと反応して、フェロセニウムイオンが生成する。電極にフェロセニウムイオンをフェロセンに還元できる電位を印加しておくとフェロセニウムイオンが電極表面でフェロセンに再還元され、還元電流が観察される。この時の定常状態の電流値は反応槽の過酸化水素の濃度に比例する。
【００１７】
さらに、ポリフェノールを含有する測定試料液を一定量の酵素と共に反応槽に加えると、ポリフェノールが電子供与体として働くならば、過酸化水素との反応で生成した酵素酸化体が直ちに還元され、さらに過酸化水素との反応が起こる。これによって、ポリフェノール量に比例して反応槽の過酸化水素濃度が減少し、透析膜を透過する過酸化水素濃度も減少する。その結果、フェロセニウムイオンの還元電流値が減少し、この減少量は反応槽のポリフェノールの濃度を反映する。この方法によって、試料に含まれているポリフェノールの量を間接的に測定できる。
【００１８】
本発明におけるポリフェノールセンサーは、酵素反応によって生成されたポリフェノールの酸化体を直接測定しないので、ポリフェノール酸化体の重合化の影響を受けることがない。また、透析膜で試料成分が電極と分離されているので、試料液の濁りや着色に影響されない。また、試料液に含まれているポリフェノールを４〜７分程度の時間で測定できるので、従来のフォーリン−チオカルト法や液体クロマトグラフィー法よりも簡単かつ迅速な測定が可能である。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を用いて具体的に説明する。ポリフェノールセンサーに用いる酵素電極の一例、およびこの酵素電極を有するポリフェノールの測定構成の一例を、図面に基づいて説明する。
【００２０】
（１）ペルオキシダーゼ−フェロセン（ＰＯＤ−Ｆｃ）酵素電極の作製
フェロセン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、液体パラフィン及びグラファイト粉末を４：４：２０：４０の重量比で混合して十分に練った後、市販のカーボンペースト電極（１）（ＢＡＳ製）の凹部（内径３ｍｍ）に詰め、表面をパラフィン紙にこすりつけて滑らかにし、さらにその表面に直径６ｍｍの分画分子量１００の円形透析膜（３）（Spectrum製）を被覆し、さらにナイロンネット（４）で被覆し、これをＯ−リング（５）で止めたＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極を作製した（図１）。
【００２１】
（２）ポリフェノールの測定セル
上記のように作製されたＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極（６）、参照電極（７）および対極（８）のそれぞれをポテンショスタット（９）に接続し、緩衝液を入れた反応槽に浸漬して、測定セルとした（図２）。電流値の変化を記録するために、ポテンショスタットにレコーダ（１０）を接続した。反応槽をマグネチックスターラー上（１１）に設置し、反応槽の緩衝液中にスターラーバー（１２）を入れ、ポリフェーノルの測定中、試料液を攪拌した。
【００２２】
また、以下に示す全ての実施例において、次の測定条件を用いた。測定時以外は、ＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極は４℃で保存した。
印加電位：０．１Ｖ  vs. Ａｇ／ＡｇＣｌ
緩衝液  ：０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．９）
攪拌速度：８８７ｒｐｍ
測定温度：室温
【００２３】
（実施例１）
上記のようにして作製したＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極（図１）と上記のように構成された測定セル（図２）に上記の測定条件下で、まず試料を含有しない緩衝液に上記ＰＯＤ−Ｆｃ電極を浸漬し、０．１Ｖの電位を印加した。バックグラウンド電流は１分以内に安定になり、その後、反応槽に一定の過酸化水素を加えた。加える過酸化水素の濃度は２０μＭ以下が望ましい。電流の変化が安定になった後に反応槽に（＋）−カテキンを含有する試料溶液を添加した。
【００２４】
図３は、緩衝液中に一定量の過酸化水素を添加した後、異なる濃度の（＋）−カテキンを添加して得られた電流・時間曲線を示す。（＋）−カテキンを含有する試料液を添加すると、還元電流の減少が観察された（正の方向に増加した）。
【００２５】
過酸化水素が無い状態で、（＋）−カテキンを含有する試料溶液を加えても電流変化が見られないことから、この電流の減少は（＋）−カテキン自身の電気化学的な反応によるものではなく、（＋）−カテキン添加によって電極上の透析膜内にある過酸化水素の濃度が減少した結果である。
本発明の方法では酸化されたポリフェノールを直接測定しないので、ポリフェノール酸化体の重合化の影響を受けることがない。また、本発明のポリフェノールの測定方法はポリフェノールをより簡単かつ迅速に測定できる。
【００２６】
（実施例２）
（＋）−カテキンの濃度を定量するために、異なる量の（＋）−カテキンを含有する試料溶液を用いて検量線を作成した。上記実施例１と全く同様の測定方法で行った。図４に定常電流値と（＋）−カテキン濃度の関係を示す。図４には２０μＭ以下の検量線を拡大したものを併せて示している。実験値は３回の平均値とその標準偏差をエラーバーで示している。図４に示した検量線から（＋）−カテキンが２０μＭまでの濃度範囲で直線的に増加し、検出限界は０．３μＭであることが示された。定常電流の９０％に達するのに要する時間（以下、反応時間とする）は（＋）−カテキン濃度１０μＭでは１６０秒、２０μＭでは１３７秒、５０μＭでは９４秒であった。
【００２７】
（実施例３）
ワインやお茶の中に含まれている（＋）−カテキン以外の７種類のポリフェノールあるいはフェノール化合物に対するＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極の検出特性を調べた。上記実施例１と全く同様の測定方法で行った。その結果、このＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極は（−）−エピカテキンとカフェー酸に対して（＋）−カテキンと同程度の感度が得られた。一方、タンニン酸、没食子酸に対しては上記３つの化合物に比べると低い検出感度が得られた。またバニリン酸、シリンジク酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸に対してはほとんど検出されなかった。またこれらの反応時間は５分以下であった。
【００２８】
（実施例４）
市販の１種類の白ワインと３種類の赤ワインに含まれているポリフェノールの濃度を測定した。測定は上記の実施例１と同様に行った。白ワインの場合は２分の１、赤ワインは１０分の１に希釈して添加した。これらの反応時間は５分以下であった。得られた定常電流値から見掛けのポリフェノールの濃度を換算するのに上記実施例２の（＋）−カテキンの電流・濃度の検量線を用いた。表１に得られたワインの全ポリフェノールの濃度を示す。
【００２９】
【表１】
0004168217.tif 000002
【００３０】
（実施例５）
市販のお茶飲料におけるポリフェノール濃度の測定を行った。測定は上記の実施例１と同様に行った。市販の９種類の異なるお茶飲料、詳しくは、４種類の緑茶、１種類のウーロン茶、４種類の混合茶を測定試料液として用いた。緑茶またはウーロン茶の場合は５分の１に希釈して添加し、混合茶は原液を希釈せずに添加した。これらの反応時間は５分以下であった。それぞれのお茶飲料の測定から求めた全ポリフェノール濃度の値を表１に示した。
【００３１】
（実施例６）
酵素電極の安定性を検討するために、ＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極を上記の方法で作製し、４℃で保存した。電極作製後２週間、（＋）−カテキンの応答性を測定したところ、測定期間内では測定電流値の変化は見られず、良好な再現性が得られた。
【００３２】
（比較例）
本発明のＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極を用いる電気化学的測定法により得られたポリフェノール濃度の測定結果をフェノール試薬を用いた分光学的測定法から決定した結果と比較した。分光学的測定法によるポリフェノール濃度の評価はフォーリン・チオカルト法に従った。得られた吸光度から見掛けのポリフェノールの濃度を換算するのに（＋）−カテキンの吸光度・濃度検量線を用いた。
【００３３】
表１に、実施例４及び実施例５で用いたワイン及びお茶飲料を測定試料として、分光学的方法で求めた全ポリフェノール濃度の値を併せて示した。表１の比較から明らかなように、本発明のＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極を用いた電気化学的測定法から求めたポリフェノール濃度の値と分光学的測定法で求めた値はほぼ一致していた。このことから、本発明の酵素電極を用いた電気化学的測定法は測定試料液のポリフェノール濃度の測定法として適用できることを示している。
【００３４】
【発明の効果】
上述したように、本発明は、測定試料液に含まれるポリフェノールを簡単かつ迅速で高感度に測定しうるポリフェノールセンサーを提供するものである。また、本発明のポリフェノールの測定方法はポリフェノール酸化体の容易な重合化に影響されることなく正確な測定を可能にする優れた測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリフェノールセンサーに用いたＰＯＤ−Ｆｃ酵素電極の一例を示す図である。
【図２】本発明のポリフェノールセンサーの実施例を示す図である。
【図３】本発明のポリフェノールセンサーによる（＋）−カテキン測定の結果を示す図である。
【図４】本発明のポリフェノールセンサーによる（＋）−カテキン濃度と定常電流との検量線を示す図である。
【符号の説明】
１．カーボンペースト電極
２．フェロセン、ペルオキシダーゼ、液体パラフィン及びグラファイト
３．透析膜
４．ナイロンネット
５．Ｏ−リング
６．酵素電極
７．参照電極
８．対極
９．ポテンショスタット
１０．レコーダ
１１．マクネチックスターラー
１２．スターラーバー
【図１】
0004168217.tif 000003
【図２】
0004168217.tif 000004
【図３】
0004168217.tif 000005
【図４】
0004168217.tif 000006