(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
0004044133.tif 000053
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000054
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示されるベンズイソセレナゾリン誘導体、ベンズイソセレナジン誘導体、または、それらの誘導体の薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩（一般式Ｉで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）。
【請求項２】
抗酸化剤としての、
・細胞または組織における機能的変性を引き起こす細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生の結果としての中毒の症状を呈する患者の治療；
・炎症性疾患の治療、血管性疾患の治療：
・血管性：血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）または新生児呼吸障害症候群（ＩＲＤＳ）の予防的または治療学的処置；
・関節性疾患、慢性関節リウマチの治療；
・急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療、免疫系疾患の治療；
・フリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療、癌の化学療法における防御治療；
・貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することによる移植のための臓器（ここで、臓器は、心臓、肝臓、腎臓および肺臓から選ばれる）の貯蔵
のための、抗酸化活性を有する医薬組成物の製造のための、下記一般式（Ｉ）：
0004044133.tif 000055
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000056
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示されるベンズイソセレナゾリン誘導体、ベンズイソセレナジン誘導体、または、それらの誘導体の薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩（一般式Ｉで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）の使用。
【請求項３】
一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリン誘導体、またはベンズイソセレナジン誘導体が、薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体の任意の存在下、最終組成物の全重量に対して０．１〜５重量％の範囲の量で含まれる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体の任意の存在下、活性成分として一般式（Ｉ）：
0004044133.tif 000057
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000058
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジン化合物（一般式Ｉで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）の少なくとも一つまたはその酸または塩基の薬理学的に許容しうる塩を含有することを特徴とする、抗酸化剤として、
・細胞または組織における機能的変性を引き起こす細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生の結果としての中毒の症状を呈する患者の治療；
・炎症性疾患の治療、血管性疾患の治療：
・血管性：血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）または新生児呼吸障害症候群（ＩＲＤＳ）の予防的または治療学的処置；
・関節性疾患、慢性関節リウマチの治療；
・急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療、免疫系疾患の治療；
・フリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療、癌の化学療法における防御治療；
・貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することによる移植のための臓器（ここで、臓器は、心臓、肝臓、腎臓および肺臓から選ばれる）の貯蔵に用いる、抗酸化活性を有する医薬組成物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリン誘導体、またはベンズイソセレナジン誘導体が、薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体の任意の存在下、
（ａ）最終組成物の全重量に対して０．１〜５重量％の範囲の量で含まれるか、または
（ｂ）該誘導体を１ｍｇ〜５００ｍｇ含有する
単位投与剤型の形態である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞または組織における機能変化を引き起こす細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生の結果としての中毒の症状を呈する患者の治療、フラビンまたはシトクロームＰ−４５０オキシゲナーゼ、またはモノアミンオキシダーゼから選ばれる代謝経路の活性化、内皮細胞のキサンチンオキシダーゼまたは１５−リポキシゲナーゼの活性化、血液の血小板におけるシクロオキシゲナーゼまたは１２−リポキシゲナーゼの活性化、好中球、マクロファージまたはリンパ球におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼまたは５−リポキシゲナーゼの活性化、またはアントラサイクリン類、ニトロイミダゾールまたはジピリジニウムタイプから選ばれるフリーラジカルを産生する生体異物の結果としての中毒の治療のためのものである、請求項４または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
炎症性疾患の血管レベルまたは関節レベルでの治療、急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療、免疫系疾患の治療、癌の化学療法における防御治療、フリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療、貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することによる移植のための臓器（ここで、臓器は、心臓、肝臓、腎臓および肺臓から選ばれる）の貯蔵のためのものである、請求項４〜６のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項８】
下記一般式（II）：
0004044133.tif 000059
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000060
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示される化合物（一般式IIで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）またはその酸または塩基の薬理学的に許容しうる塩の製造方法であって、下記必須工程：
（ａ）２−位でｇｅｍ−ジ置換されたオルトハロゲノフェニルアセトニトリル誘導体を調製または使用し、ついで目的とする系列に従って、
（ｂ１）該ニトリル誘導体をアミド誘導体に加水分解し、
（ｃ１）常法を用いた転移反応により該アミド誘導体をアミン誘導体に変換し、
（ｄ１）該アミン化合物を銅塩の存在下、極性有機溶媒中で求核性のセレン化合物（その場で生成させてよい）と反応させて対応するベンズイソセレナゾリン誘導体を生成させ、
（ｅ１）後者を常法によりＮ−アルキル化またはＮ−アシル化し、
（ｆ１）最後に、必要なら、得られた誘導体をセレン原子において常法を用いて酸化するか、または
（ｂ２）該ニトリル誘導体を、エーテル性溶媒中でボランを用いてアミン誘導体に還元し、
（ｃ２）該アミン化合物を銅塩の存在下、極性有機溶媒中で求核性のセレン化合物（その場で生成させてよい）と反応させて対応するベンズイソセレナジン誘導体を生成させ、
（ｄ２）後者を常法によりＮ−アルキル化またはＮ−アシル化し、
（ｅ２）最後に、必要なら、得られた誘導体をセレン原子において常法を用いて酸化する
からなることを特徴とする方法。
【請求項９】
該求核性のセレン化合物が、好ましくはセレノシアン酸カリウムなどのセレノシアン酸塩であり、該セレノシアン酸塩が、
・セレン金属（Ｓｅ°）およびシアン化カリウムなどのシアン化塩からその場で生成させるか、または
・そのまま反応混合物に加えられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該銅塩がヨウ化銅（Ｉ）などの銅（Ｉ）（ＣｕI）塩である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
該極性有機溶媒が好ましくはジメチルホルムアミドである、請求項８〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
セレンを酸化するのに用いる該酸化剤がメタクロル過安息香酸などの過酸または過酸化水素である、請求項８〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジンまたはその薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩。
【請求項１４】
３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン；２−アセチル−３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン；３，３−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナゾリン；３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン−１−オキシド；３，３’−ジメチル−７−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン；３，３’−ジメチル−５−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン；３，３−ジメチル−７−フルオロ−ベンズイソセレナゾリン；４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジン−１−オキシド；４，４−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナジン；４，４−ジメチル−６−メトキシ−ベンズイソセレナジン；および４，４−ジメチル−６−（２’−（４″−メチルピペラジン−１″−イル）エトキシベンズイソセレナジンよりなる群から選ばれる、ベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジン化合物またはその薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩。
【請求項１５】
薬理学的に許容しうる賦形剤中に、活性成分として４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジンまたは薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩を含有することを特徴とする、抗酸化剤として、
・細胞または組織における機能的変性を引き起こす細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生の結果としての中毒の症状を呈する患者の治療；
・炎症性疾患の治療、血管性疾患の治療：
・血管性：血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）または新生児呼吸障害症候群（ＩＲＤＳ）の予防的または治療学的処置；
・関節性疾患、慢性関節リウマチの治療；
・急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療、免疫系疾患の治療；
・フリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療、癌の化学療法における防御治療；
・貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することによる移植のための臓器（ここで、臓器は、心臓、肝臓、腎臓および肺臓から選ばれる）の貯蔵に用いる、抗酸化活性を有する医薬組成物。
【請求項１６】
薬理学的に許容しうる賦形剤中に、活性成分として３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン；２−アセチル−３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン；３，３−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナゾリン；３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン−１−オキシド；３，３’−ジメチル−７−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン；３，３’−ジメチル−５−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン；３，３−ジメチル−７−フルオロ−ベンズイソセレナゾリン；４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジン−１−オキシド；４，４−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナジン；４，４−ジメチル−６−メトキシ−ベンズイソセレナジン；および４，４−ジメチル−６−（２’−（４″−メチルピペラジン−１″−イル）エトキシベンズイソセレナジンよりなる群から選ばれる少なくとも一つのベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジン化合物またはその薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩を含有することを特徴とする、抗酸化剤として、
・細胞または組織における機能的変性を引き起こす細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生の結果としての中毒の症状を呈する患者の治療；
・炎症性疾患の治療、血管性疾患の治療：
・血管性：血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）または新生児呼吸障害症候群（ＩＲＤＳ）の予防的または治療学的処置；
・関節性疾患、慢性関節リウマチの治療；
・急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療、免疫系疾患の治療；
・フリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療、癌の化学療法における防御治療；
・貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することによる移植のための臓器（ここで、臓器は、心臓、肝臓、腎臓および肺臓から選ばれる）の貯蔵に用いる、抗酸化活性を有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、３位でｇｅｍ−ジ置換されたベンズイソセレナゾリン構造および４位でｇｅｍ−ジ置換されたベンズイソセレナジン構造を有する新規化合物の抗酸化剤としての使用、その調製法およびこれら化合物を含有する医薬組成物に関する。
従来技術
哺乳動物組織および細胞の大部分は、内因性および外因性の細胞毒性ヒドロペルオキシドを分解させるグルタチオンペルオキシダーゼと称する酵素を有する。
これら抗酸化性で細胞保護性の酵素は、「酸化性ストレス」およびその後の経過を防ぐうえで中心的な役割を果たしている。
これら酵素は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）による過酸化水素の還元（反応１）または有機ヒドロペルオキシドの還元（反応２）を触媒する：
Ｈ2Ｏ2  ＋  ２ＧＳＨ      →  ２Ｈ2Ｏ  ＋  ＧＳＳＧ              反応１
ＲＯＯＨ  ＋  ２ＧＳＨ    →  ＲＯＨ  ＋  Ｈ2Ｏ  ＋  ＧＳＳＧ    反応２
グルタチオンペルオキシダーゼはセレン酵素である。３つのサブファミリーが記載されている：
・水溶性で対称的な四量体構造を有する細胞内酵素（フローエ
0004044133.tif 000002
「グルタチオンペルオキシダーゼの構造および触媒機構（Ｓtructures and Ｃatalytic Ｍechanism of Ｇlutathione Ｐeroxidase）」、Ｇlutathione Ｃentennial（１９８９）中；タニグチ（Ｎ.Ｔaniguchi）、ヒガシ（Ｔ.Ｈigashi）、サカモト（Ｙ.Ｓakamoto）およびマイスター（Ａ.Ｍeister）編：アカデミックプレス、１０３〜１１４頁参照）；
・膜に部分結合し一量体構造を有する細胞内酵素（ウルシニ（Ｆ.Ｕrsini）ら、Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta（１９８２）、７１０、１９７〜２１１頁参照）；および最後に
・血漿に特異的でありＮ−末端が特異的にグリコシル化されている四重体酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼ（タカハシ（Ｋ.Ｔakahashi）ら、Ｊ.Ｂiochem.,（１９９０）、１０８、１４５−１４８頁参照）。
これら酵素の活性部位はすべて、ポリペプチド鎖中に導入されたセレノシステイン残基の形態で必須のセレン原子を有する。
活性部位におけるセレンの本質的特性は広範に記載されている（フォーストローム（Ｊ.Ｗ.Ｆorstrom）ら、Ｂiochemistry（１９７８）、１７、２６３９〜２６４４およびウエンデル（Ａ.Ｗendel）ら、Ｈoppe−Ｓeyler's Ｚ.Ｐhysiol.Ｃhem.、（１９７８）、３５９、１０３５〜１０３６頁参照）。
セレンが栄養学的に不足している場合にはグルタチオンペルオキシダーゼの濃度および活性は徐々に低下する（ワング（Ｙ.Ｘ.Ｗang）およびキエム（Ｊ.Ｋiem）、Ｂiological Ｔrace Ｅlements Ｒes.、（１９８８）、１５、８９頁参照）。
さらに制御された突然変異誘発実験によれば、活性部位中のセレン原子を硫黄原子で置換すると触媒活性が大幅に減少することが示されている（ロチャー（Ｃ.Ｒocher）ら、Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.、（１９９２）、２０５、９５５〜９６０頁参照）。
ヒトおよび動物において、亜セレン酸塩およびセレン酸塩およびＬ−セレノメチオニンはセレン供給の３つの天然形態を構成する。
セレンの栄養補給はグルタチオンペルオキシダーゼの生合成の制限因子であるが、そのようなセレン補給によりグルタチオンペルオキシダーゼ活性が増加した後は急速な飽和曲線となる。飽和プラトーを越えると、セレンの栄養補給の増加は著しい毒性をもたらす（レバンダー（Ｏ.Ａ.Ｌevander）、Ａnn.Ｒev.Ｎutr.、（１９８７）、７、２２７〜２５０頁参照）。天然源から必要とされるセレンの量とその毒性限度との差は、かくして小さい。
赤血球酵素の細胞内マイクロインジェクションを含む実験は、酸化性ストレスに暴露された線維芽細胞または内皮細胞の生存能に対して該酵素が非常に著しい防御効果を有することを示している（マイケルズ（Ｃ.Ｍichiels）ら、Ｅxperiment.Ｃell Ｒes.、（１９８８）、１７９、５８１〜５８９頁参照）。
しかしながら、天然由来のグルタチオンペルオキシダーゼの治療目的の使用は以下の理由から困難である：
・精製した酵素の安定性が不充分である。
・細胞内ターゲティングを確実にする有効法が存在しない。
・経口投与することができない。
これら困難性を克服するため、幾つかの低分子量有機セレン化合物が合成されている。
合成され研究された有機セレン化合物の生化学的および薬理学的特性が、最近考察されている（パーナム（Ｍ.Ｊ.Ｐarnham）およびグラフ（Ｅ.Ｇraf）、Ｐrogress in Ｄrug Ｒes.、（１９９１）、３６、９〜４７頁参照）。
グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有する有機セレン化合物は、セレノールおよび／またはジセレニド型の触媒中間体を生成する。
これら化合物のうち、２−フェニル−３−オン−ベンズイソセレナゾリン（２Ｈ）およびその誘導体のいくつかは主要な毒性作用を有するようには思えない（ウエンデルら、Ｂiochem.Ｐarmacol.、（１９８４）、３３、３２４１〜３２４５頁、およびマーキュリオ（Ｓ.Ｄ.Ｍercurio）およびコームズ（Ｇ.Ｆ.Ｃombs）、Ｂiochem.Ｐarmacol.、（１９８６）、３５、４５０５〜４５０９頁参照）。
しかしながら、過剰のグルタチオンＧＳＨの存在下では２−フェニル−３−オン−ベンズイソセレナゾリン（２Ｈ）は水にごくわずかしか溶解しない誘導体を生成し、そのため医薬用途が制限される。
セレノールおよび／またはジセレニド型の有機セレン化合物の毒性は、主としてスーパーオキサイドおよび過酸化水素への酸素の触媒的還元によるものである（ショーディエール
0004044133.tif 000003
ら、Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.、（１９９２）、２９６、３２８〜３３６頁参照）。
本発明の一つの目的は、生理学的濃度のグルタチオンＧＳＨの存在下でグルタチオンペルオキシダーゼ型の触媒活性を有する有機セレン化合物を提供することにある。
これら化合物は標的組織および細胞に導入することができなければならず、活性濃度で水に可溶でなければならず、酸素を毒性の副生物に有効に還元してはならない。
これら目的は、新規ベンズイソセレナゾリンおよびベンズイソセレナジン誘導体（その抗酸化および細胞毒性活性を記載する）およびその製造法を提供する本発明によって達成される。
化学的観点から、幾つかのベンズイソセレナゾロン誘導体が文献に記載されている。一般に、これら誘導体の殆どは、ハロゲン−金属交換かまたは強塩基による脱プロトンのいずれかで生成したリチウム化芳香族誘導体を金属性セレン（Ｓｅ°）と反応させることによって生成される（ランバート（Ｃ.Ｌambert）ら、Ｓynthetic Ｃomm.、（１９９１）、２１、８５〜９８頁参照）。
本発明の記載する目的の一つは、銅（ＣｕI）塩の存在下、セレノシアン酸塩（たとえばセレノシアン酸カリウム）（その場で生成させてよい）などの求核性セレン誘導体と反応させることにより、２位に置換基を有するハロゲン化ベンゼン核中にセレンを導入する新規方法を提供することにある。
発明の記載
本発明の目的は、
（１）良好な抗酸化活性および細胞保護活性を有し、それゆえ医薬組成物中において価値ある活性成分を構成しうる新規ベンズイソセレナゾリンおよびベンズイソセレナジン誘導体を提供することにより、新規な技術的課題を解決すること；
（２）容易に実施することが可能なこれら化合物の製造法を提供することにより、上記新規な技術的課題を解決すること
にある。
上記技術的課題のこれら側面は、容易に実施することが可能で良好な収量を与える製造法による簡単な解決で同時に解決される。
第一の態様において、本発明は、下記一般式（II）：
0004044133.tif 000004
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000005
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示される新規なベンズイソセレナゾリンおよびベンズイソセレナジン誘導体、および薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩（一般式IIで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）を提供する。
明細書および請求の範囲において、
・低級アルキルまたはアルコキシなる語は、１〜６の炭素数の直鎖または分枝鎖基を意味する；
・ヘテロアリールなる語は、単環式または２環式芳香族核を意味し、各環は５または６の頂点を有し、その炭素骨格中に窒素、酸素および硫黄より選ばれた１または２以上の同じまたは異なるヘテロ原子を含み、また置換されていてもよい；
・アリール、アラルキルまたはヘテロアルキル基に対して適用される置換されたなる語は、これら基が芳香族部分において、低級アルキル、トリフルオロメチル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ；ジアルキルアミノ；スルホニル；スルホンアミド；スルホアルキル；カルボキシ；カルブアルコキシまたは１または２以上の水素より選ばれた１または２以上の同じまたは異なる基によって置換されていることを意味する；
・Ｒ1が−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ3Ｈを示す場合は、本発明は薬理学的に許容しうる塩基との付加塩をも包含する；
・Ｒ1が−ＮＲ6Ｒ7を示す場合には、本発明は薬理学的に許容しうる酸との付加塩をも包含する；
・Ｒ1がＯＨを示す場合には、本発明は薬理学的に許容しうる塩基との付加塩をも包含する。
薬理学的に許容しうる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
薬理学的に許容しうる塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルカリまたはアルカリ土類金属炭酸塩、またはトリエチルアミンやアルギニンなどの有機塩基などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
第二の態様において、本発明は、下記一般式（Ｉ）：
0004044133.tif 000006
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000007
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示される新規なベンズイソセレナゾリンおよびベンズイソセレナジン化合物、および薬理学的に許容しうる酸または塩基の塩（一般式Ｉで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）の抗酸化剤としての使用に関する。
本発明はまた、当業者には理解されるであろうように、上記使用に対応する治療方法を包含する。
有利な態様において、本発明は、とりわけ
・細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生が細胞または組織における機能的変性をもたらすような病理学的状態の治療；
・炎症性成員および／または虚血性成員を有する病理学的状態の治療：
・血管性：血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）または新生児呼吸障害症候群（ＩＲＤＳ）の予防的または治療学的処置など；
・関節性：慢性関節リウマチの治療など；
・急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療などの眼の病理学的状態の治療；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療などの免疫系の機能不全の治療；
・とりわけ癌の化学療法においてフリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療；
・心臓、肝臓、腎臓および肺臓などの移植臓器の貯蔵（これら臓器の貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することにより）
のための、抗酸化活性を有する医薬組成物の製造のための上記一般式Ｉで示される化合物の使用に関する。
これら例において、活性成分を経口、直腸経由または局所的に（たとえば、眼に適用するための軟膏として）、または筋肉内または静脈内注射により投与することができる。
他の有利な態様において、上記一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジンは、最終組成物の全重量に対して０．１〜５重量％の範囲、好ましくは０．１〜１重量％の範囲の量で含まれる。
さらに有利な態様において、本発明は、薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体の任意の存在下、１ｍｇ〜５００ｍｇの一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジンを含有する単位投与剤型の形態の組成物の使用に関する。
第三の態様において、本発明は、薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体の任意の存在下、活性成分として一般式（Ｉ）：
0004044133.tif 000008
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-CN;-SO3H;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000009
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジン化合物（一般式Ｉで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）の少なくとも一つおよびその酸または塩基の薬理学的に許容しうる塩を含有することを特徴とする、とりわけ抗酸化活性を有する医薬組成物を提供する。
本発明の組成物の他の特別の態様は、上記記載から明らかになるであろうし、実施例を含む以下の記載から当業者にも明らかになるであろう。
上記のように、上記式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジン化合物は、価値ある抗酸化剤である。かかるものとして、これら化合物は治療目的の価値ある活性成分を構成する。
一般式（Ｉ）で示される化合物の治療応用の可能性としては、一般に、細胞毒性のヒドロペルオキシドの過剰産生が細胞または組織における機能変化を引き起こすような病理学的状態の治療が挙げられる。そのようなヒドロペルオキシドの過剰産生は、フラビンまたはシトクロームＰ−４５０オキシゲナーゼ、またはモノアミンオキシダーゼなどの代謝経路の活性化の結果として生じるものである。それはまた、内皮細胞（キサンチンオキシダーゼ、１５−リポキシゲナーゼ）の活性化、血液の血小板（シクロオキシゲナーゼおよび１２−リポキシゲナーゼ）の活性化および好中球、マクロファージまたはリンパ球などの炎症性細胞（ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよび５−リポキシゲナーゼ）の活性化によっても起こる。それはまた、アントラサイクリン類、ニトロイミダゾールまたはジピリジニウムタイプの誘導体（フリーラジカルを産生する）などの生体異物による中毒によっても起こりうる。
治療の応用としては、とりわけ、
・炎症性成員および／または虚血性成員を有する病理学的状態の治療：
・血管性：血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）または新生児呼吸障害症候群（ＩＲＤＳ）の予防的または治療学的処置など；
・関節性：慢性関節リウマチの治療など；
・急性の眼のアレルギーの治療、黄斑変性を伴う網膜の変化の治療、緑内障の治療などの眼の病理学的状態の治療；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療などの免疫系の機能不全の治療；
・とりわけ癌の化学療法においてフリーラジカルを生成する生体異物による中毒に対する防御治療；
・心臓、肝臓、腎臓および肺臓などの移植臓器の貯蔵（これら臓器の貯蔵媒体に本発明の化合物の１種を添加することにより）
が挙げられる。
さらに有利な態様において、上記一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジンは、最終組成物の全重量に対して０．１〜５重量％の範囲、好ましくは０．１〜１重量％の範囲の量で含まれる。
治療に応用するには、上記一般式（Ｉ）で示される誘導体は、薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体の任意の存在下、１ｍｇ〜５００ｍｇの一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジンを含有する単位投与剤型の形態でパッケージングするのが有利である。
そのような薬理学的に許容しうる賦形剤、ビヒクルまたは支持体は当業者にはよく知られているので、本明細書において詳細に記載することはしない。
これら例において、活性成分を経口、直腸経由または局所的に（たとえば、眼に適用するための軟膏として）、または筋肉内または静脈内注射により投与することができる。
上記一般式（Ｉ）で示される誘導体の抗酸化活性および治療学的または薬理学的活性は、
（ａ）グルタチオンペルオキシダーゼ活性の測定、
（ｂ）単電子移動による還元作用の測定、
（ｃ）第一継代から第二継代の間に使用した臍静脈のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などのヒト内皮細胞またはウイルストランスフェクションにより不死化したＨＵＶＥＣにおける細胞毒性防御効果の測定
を含む信頼性のある試験より示されている。
これら抗酸化活性および治療学的または薬理学的活性により、上記一般式（Ｉ）で示されるベンズイソセレナゾリンまたはベンズイソセレナジン誘導体は上記治療の応用、とりわけ、
・細胞毒性なヒドロペルオキシドの過剰産生が細胞または組織における機能的変性をもたらすような病理学的状態の治療；
・炎症性成員および／または虚血性血管成員を有する病理学的状態の治療、たとえば、血管形成術後の動脈の再発狭窄症の治療、動脈の同種移植後の動脈狭窄症の治療、下肢の閉塞性虚血を有する患者における間欠性跛行の治療、虚血による脳血管障害の治療、緑内障の治療
に用いることができる。
第四の態様において、本発明は、下記一般式（II）：
0004044133.tif 000010
（式中、
Ｒ1＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ2＝水素;低級アルキル;-OR6;-(CH2)mNR6R7;-(CH2)qNH2;-(CH2)mNHSO2(CH2)2NH2;-NO2;-CN;-SO3H;-N+(R5)2O-;F;Cl;Br;I;-(CH2)mR8;-(CH2)mCOR8;-S(O)NR6R7;-SO2NR6R7;-CO(CH2)pCOR8;R9;
Ｒ3＝水素;低級アルキル;アラルキル;置換アラルキル;-(CH2)mCOR8;-(CH2)qR8;-CO(CH2)pCOR8;-(CH2)mSO2R8;-(CH2)mS(O)R8;
Ｒ4＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）pＣＯＲ8；−（ＣＨ2）pＲ8；Ｆ；
Ｒ5＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；
Ｒ6＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；−（ＣＨ2）qＲ8；
Ｒ7＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；−（ＣＨ2）mＣＯＲ8；
Ｒ8＝低級アルキル；アラルキル；置換アラルキル；アリール；置換アリール；ヘテロアリール；置換ヘテロアリール；ヒドロキシ；低級アルコキシ；Ｒ9；
0004044133.tif 000011
Ｒ10＝水素；低級アルキル；アラルキルまたは置換アラルキル；アリール；または置換アリール；
Ｙ-は薬理学的に許容しうる酸のアニオンを示す；
ｎ＝０、１；
ｍ＝０、１、２；
ｐ＝１、２、３；
ｑ＝２、３、４；
ｒ＝０、１）
で示される化合物（一般式IIで示される各分子には１を越えるＲ9置換基は存在しない）およびその酸または塩基の薬理学的に許容しうる塩の製造方法であって、下記必須工程（反応式１参照）：
（ａ）２−位でｇｅｍ−ジ置換されたオルトハロゲノフェニルアセトニトリル誘導体を調製または使用し、ついで目的とする系列に従って、
（ｂ１）該ニトリル誘導体をアミド誘導体に加水分解し、
（ｃ１）常法を用いた転移反応により該アミド誘導体をアミン誘導体に変換し、
（ｄ１）該アミン化合物を銅塩の存在下、極性有機溶媒中で求核性のセレン誘導体（その場で生成させてよい）と反応させて対応するベンズイソセレナゾリン誘導体を生成させ、
（ｅ１）後者を常法によりＮ−アルキル化またはＮ−アシル化し、
（ｆ１）最後に、必要なら、得られた誘導体をセレン原子において常法を用いて酸化するか、または
（ｂ２）該ニトリル誘導体を、テトラヒドロフランなどのエーテル性溶媒中でたとえばボランを用いてアミン誘導体に還元し、
（ｃ２）該アミン化合物を銅塩の存在下、極性有機溶媒中で求核性のセレン誘導体（その場で生成させてよい）と反応させて対応するベンズイソセレナジン誘導体を生成させ、
（ｄ２）後者を常法によりＮ−アルキル化またはＮ−アシル化し、
（ｅ２）最後に、必要なら、得られた誘導体をセレン原子において常法を用いて酸化する
からなることを特徴とする方法を提供する。
本発明の方法のさらなる実施態様では、求核性のセレン化合物としてセレノシアン酸カリウムなどのセレノシアン酸塩を用いるのが好ましく、これらセレノシアン酸塩は、
・セレン金属（Ｓｅ°）およびシアン化カリウムなどのシアン化塩からその場で生成させるか、または
・そのまま反応混合物に加えてよい。
本発明の方法のさらなる実施態様では、銅塩としてはヨウ化銅（Ｉ）などの銅（Ｉ）（ＣｕI）塩を用いる．
本発明の方法のさらなる実施態様では、極性有機溶媒としてジメチルホルムアミドを用いるのが好ましい。
本発明の方法のさらなる実施態様では、セレンを酸化するのに任意に用いる酸化剤としてメタクロル過安息香酸などの過酸、または過酸化水素を使用する。
本発明の他の目的、特徴および利点は、非制限的実施例を含む下記記載から明らかとなるであろう。これら実施例は説明のためにのみ用いたものであって、本発明を限定するものでは決してない。実施例中のパーセントは特に断りのない限り重量パーセントを意味する。
図面の記載
・図１は、リノレン酸ヒドロペルオキシドによって誘発された酸化性ストレスに供された内皮細胞に対して行った生存能試験で得られた結果を対照と対比して示すヒストグラムである。参照は黒の方形で示す。本発明の種々の化合物、すなわちＢＸＴ−５１０５６、ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７を実施例１８に記載した試験に用いた。
・図２もまた、実施例１９に記載するように、ＴＮＦ−αの存在下で多形核好中球によって誘発された内皮細胞変化に対する本発明の化合物、ＢＸＴ−５１０５６、ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７の防御効果に関する研究から得られたヒストグラムを示す。
・図３は、実施例２０に記載するように、ＴＮＦ−αによって誘発された内皮細胞インターロイキン８の産生に対する本発明の化合物ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７の防御効果に関する研究から得られた図２と同様のヒストグラムを示す。
・図４は、実施例２１に記載するように、インターロイキン１の毒性に対する内皮細胞の防御に関する研究において本発明の化合物ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７で得られた図２および３と同様のヒストグラムを示す。
・図５および６は、実施例２４の試験条件下、インビボでラットに繰り返し経口投与した後に対照（図５）および本発明の化合物ＢＸＴ−５１０７２（図６）でそれぞれ得られた耐性結果を示す。
実験の部
特に断らない限り、反応はすべて不活性窒素雰囲気中で行った。
質量スペクトルは、Ｎermag Ｒ１０−１０Ｂ装置で記録した。イオン化は、７０電子ボルトでの電子衝撃（ＥＩ）、アンモニア、ブタンまたはイソブタン中での化学イオン化（ＩＣ）、またはグリセロールマトリックスを用いた高速原子衝撃（ＦＡＢ）のいずれかを用いた。
1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｖarian Ｇemini−２００装置を用いて記録した。化学シフトは、テトラメチルシランに対してｐｐｍで表してある。多重度は以下の通りである：「ｓ」は一重項、「ｓｌ」はブロードな一重項、「ｄ」は二重項、「ｔ」は三重項、「ｑ」は四重項、「ｍ」は多重項。
融点（ＭＰ℃）はＧallenkamp装置を用いて記録し、補正していない。
液体カラムクロマトグラフィーによる精製は、ＭerkRＳi６０Ｆ254シリカを用いて行った。
一般式（Ｉ）を有する化合物の合成の実施例：
ｎ＝０でＲ1＝Ｒ2＝水素の系列の化合物
実施例１：３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０５６の製造
（Ａ）２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピオニトリルの製造：
ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の２−（２’−ブロモフェニル）−アセトニトリル（７．５ｇ、３８ミリモル）およびヨードメタン（１６．２ｇ、１１４ミリモル）の溶液を、不活性雰囲気中で還流しておいたＴＨＦ（１００ｍｌ）中のＮａＨ（４．０ｇ、１００ミリモル）の懸濁液にゆっくりと（６０分間）加えた。反応は発熱反応であった。還流を２．５時間続けた。ついで、反応混合物を室温にて１５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣を１００ｍｌの水に取り、２×１００ｍｌのtert−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機相をコンバインし、３×１００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。減圧下で蒸留した後（Ｔ＊＝１２５−１４０℃；ｐ＝０．１mbar）、所望の生成物が無色油状物として得られた。
収率：７９％
この物質はまた、パーラム（Ｗ.Ｅ.Ｐarham）およびジョーンズ（Ｌ.Ｄ.Ｊones）によって記載された方法（Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.、（１９７６）、４１、１１８７〜１１９１頁参照）を用いても９０％の収率で製造された。
物理特性：
0004044133.tif 000012
（Ｂ）２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピオンアミドの製造：
前記工程の誘導体（６．７ｇ、３０ミリモル）をエタノール（７０ｍｌ）中に溶解した。ついで、この溶液に炭酸カリウムの飽和溶液（７０ｍｌ）を加え、ついで過酸化水素（５０％溶液；２×７０ｍｌ）を１０〜１５℃の温度にて注意深く加えた。反応は発熱反応であった。この反応混合物を室温にて１４時間撹拌した。この反応混合物にジクロロメタン（２００ｍｌ）を加え、ついで後者をデカントにより除いた。水性相を１００ｍｌのジクロロメタンで抽出した。有機相をコンバインし、３×２００ｍｌの水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。所望の生成物が非常に粘稠な無色油状物として得られ、精製することなく次の工程に用いた。
収率：９０％
物理特性：
0004044133.tif 000013
（Ｃ）１−（２’−ブロモフェニル）−１−メチルエチルアミンの製造：
水／アセトニトリル混合物（５０／５０、６０ｍｌ）中に溶解した前記工程の誘導体を、一度にビス（トリフルオロアセトキシ）ヨードソベンゼン（１０．８８ｇ、２５．３ミリモル）に加えた。この反応混合物を室温にて２４時間撹拌した。水（４５０ｍｌ）を加えた後、さらに３０分間撹拌を続けた。tert−ブチルメチルエーテル（１５０ｍｌ）を反応混合物に加え、後者をデカントにより除いた。有機相を１０％塩酸溶液で抽出し、ついで水相を３×１５０ｍｌのtert−ブチルメチルエーテルで洗浄した。水相を１０℃にてアルカリ性（１２＜ｐＨ＜１４）にし、ついで３×１５０ｍｌのジクロロメタンで抽出した。有機相をコンバインし、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。蒸留した後（Ｔ＊＝６０−７０℃；ｐ＝０．１mbar）、所望の生成物が非常に粘稠な無色油状物の形態で得られた。
収率：８３％
物理特性：
0004044133.tif 000014
（Ｄ）３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０６５の製造：
ＤＭＦ（３５ｍｌ）中の前記工程の誘導体（１．６０５ｇ、７．５ミリモル）の溶液に、トリエチルアミン（３．１３ｍｌ、３７．５ミリモル）、ついでセレノシアン酸カリウム（１．１９ｇ、８．２５ミリモル）およびヨウ化銅ＣｕＩ（１．４９ｇ、７．５ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温にて１８時間撹拌し、ついで１５０ｍｌの水中に注いだ。得られた懸濁液を濾過し、１５０ｍｌの酢酸エチルで洗浄した。デカント後、水相を２×１５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相をコンバインし、２×１００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカカラム上の液体クロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン−酢酸エチル、５／１）による精製後、所望の生成物を得た。
収率：６４％
物理特性：
0004044133.tif 000015
実施例２：２−アセチル−３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０５７の製造：
誘導体３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン（１４８ｍｇ、０．７ミリモル）を室温にてエチルエーテル（４ｍｌ）中に溶解した。トリエチルアミン（１０７μｌ、０．７７ミリモル）およびアセチルクロライド（５４μｌ、０．７７ミリモル）を加えた。直ちに白色沈殿が生成した。１時間後、１ｍｌの水を反応混合物に加えた。得られた粗製の生成物を３×２０ｍｌのジクロロエタンで抽出した。有機相をコンバインし、２×２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカカラム上の液体クロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン−酢酸エチル、１／１）による精製後、所望の生成物を得た。
収率：２６％
物理特性
0004044133.tif 000016
実施例３：３，３−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０８８の製造：
上記で得た誘導体３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン（１０７ｍｇ、０．５ミリモル）のブロモエタン（１．５ｍｌ）中の溶液にジアザビシクロウンデセン（３８０ｍｇ、２．５ミリモル）を加えた。この混合物を室温にて１０時間撹拌し、ついで同量のジアザビシクロウンデセンを再び加えた。室温にて１４時間後、ブロモエタンを減圧下で蒸発させた。シリカカラム上の液体クロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン−酢酸エチル、６／１）による精製後、所望の生成物を非常に粘稠な黄色の油状物の形態で得た。
収率：５３％
物理特性：
0004044133.tif 000017
実施例４：３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリン−１−オキシド：ＢＸＴ−５１０８８の製造：
誘導体３，３−ジメチル−ベンズイソセレナゾリンＢＸＴ−５１０５６（２１２ｍｇ、１ミリモル）を撹拌しながら室温にてメタノール（５ｍｌ）中に溶解した。５％過酸化水素（６００μｌ、１．０５ミリモル）を加えた後、撹拌を１５分間続けた。溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣を２５ｍｌのジクロロメタン中に取り、３×３ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、所望の生成物を黄色がかった結晶の形態で得た。
収率：５５％
物理特性：
0004044133.tif 000018
ｎ＝０でＲ1≠水素である系列化合物
実施例５：３，３’−ジメチル−７−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０６２の製造：
（Ａ）（２’−ブロモ−３’−ニトロ）−フェニルアセトニトリルの製造：
この化合物は、２−ブロモ−３−ニトロトルエンからモノハロゲン化して２−ブロモ−３−ニトロブロモベンジルを生成させ（リッチ（Ａ.Ｒicci）ら、Ａnn.Ｃhim.（ローマ）；（１９６３）；５３、１８６０頁参照）、ついでシアン化カリウムを用いて置換を行って（２’−ブロモ−３’−ニトロ）−フェニルアセトニトリルを生成させる（ウエインストック（Ｊ.Ｗeinstock）ら、Ｊ.Ｍed.Ｃhem.、（１９８７）、３０、１１６６頁参照）ことにより、常法に従って製造した。
これら２工程の全収率：４３％
物理特性：
0004044133.tif 000019
（Ｂ）２−（２’−ブロモ−３’−ニトロ）−フェニル−２−メチルプロピオニトリルの製造：
実施例１（Ａ）と同様の手順を用いて所望の誘導体を得た。
収率：７０％
物理特性：
0004044133.tif 000020
（Ｃ）２−（２’−ブロモ−３’−ニトロ）−フェニル−２−メチルプロピオンアミドの製造：
実施例１（Ｂ）と同様の手順を用いて所望の誘導体を得た。
収率：７７％
物理特性：
0004044133.tif 000021
（Ｄ）１−（２’−ブロモ−３’−ニトロ）−フェニル−１−メチルエチルアミンの製造：
実施例１（Ｃ）と同様の手順を用いて所望の誘導体を得た。
収率：５７％
物理特性：
0004044133.tif 000022
（Ｅ）３，３’−ジメチル−７−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０６２の製造：
実施例１（Ｄ）と同様の手順を用いて所望の誘導体を得た。
収率：４５％
物理特性：
0004044133.tif 000023
実施例６：３，３’−ジメチル−５−ニトロ−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０７５の製造：
（Ａ）２−（２’−ブロモ−５’−ニトロ）−フェニル−２−メチルプロピオニトリルの製造：
この化合物は、実施例１（Ａ）と極めて同様の手順を用いて製造し、黄色の固体の形態で得た。
収率：８０％
物理特性：
0004044133.tif 000024
（Ｂ）２−（２’−ブロモ−５’−ニトロ）−フェニル−２−メチルプロピオンアミドの製造：
上記化合物を実施例１（Ｂ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて加水分解して、非常に薄い黄色の粉末の形態で所望の化合物を得た。
収率：５６％
物理特性：
0004044133.tif 000025
（Ｃ）１−（２’−ブロモ−５’−ニトロ）−フェニル−１−メチルエチルアミンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｃ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて製造し、薄黄色の粉末の形態で得た。
収率：８３％
物理特性：
0004044133.tif 000026
（Ｄ）３，３−ジメチル−５−ニトロ−ベンズイソセレナゾリンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｄ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて製造し、黄色の結晶の形態で得た。
収率：６１％
物理特性：
0004044133.tif 000027
実施例７：３，３−ジメチル−７−フルオロ−ベンズイソセレナゾリン：ＢＸＴ−５１０７６の製造：
（Ａ）２−（３’−アミノ−２’−ブロモ）−フェニル−２−メチルプロピオニトリルの製造：
実施例４（Ｂ）で得た化合物を塩化スズ（II）で還元して所望の誘導体を褐色の固体の形態で生成させ、これを精製することなく次の工程に用いた。
収率：９４％
物理特性：
0004044133.tif 000028
（Ｂ）２−ブロモ−３−（２’−メチル−２’−プロピオニトリル）ベンゼンジアゾニウムヘキサフルオロホスフェートの製造：
前工程の誘導体（１．５４ｇ、６．４４ミリモル）を、２０ｍｌの水中に希釈した濃塩酸（２．７ｍｌ）によって構成される溶液中に室温にて溶解した。亜硝酸ナトリウム（５３３ｍｇ、７．７３ミリモル）を撹拌しながら０〜５℃の温度にて加えた。５分後、リチウムヘキサフルオロホスフェート（１．６６ｇ、１０．９５ミリモル）も加えた。直ちに白色沈殿が生成した。３０分後、得られた懸濁液を濾過し、８ｍｌの冷水、ついでtert−ブチルメチルエーテルとメタノールとの混合物（２：１）で洗浄した。所望の化合物を無色粉末の形態で得、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
収率：８６％
物理特性：
0004044133.tif 000029
（Ｃ）２−（２’−ブロモ−３’−フルオロ）−フェニル−２−メチルプロピオニトリルの製造：
この化合物は、溶媒を用いることなく真空下（０．１mbar）でフッ化カリウム（５×３００ｍｇ）と混合した前工程の化合物（５×３００ｍｇ、３．７８ミリモル）の熱分解によりシーマン（Ｓchiemann）法によって製造した。所望の生成物を薄褐色の粉末の形態で得た。
収率：３０％
物理特性：
0004044133.tif 000030
（Ｄ）２−（２’−ブロモ−３’−フルオロ）−フェニル−２−メチルプロピオンアミドの製造：
前工程の化合物を実施例１（Ｂ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて加水分解して、無色結晶の形態で所望の化合物を得た。
収率：７６％
物理特性：
0004044133.tif 000031
（Ｅ）１−（２’−ブロモ−３’−フルオロ）−フェニル−１−メチルエチルアミンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｃ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて製造し、無色油状物の形態で得た。
収率：７２％
物理特性：
0004044133.tif 000032
（Ｆ）３，３−ジメチル−７−フルオロ−ベンズイソセレナゾリンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｄ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて製造し、黄色がかった結晶の形態で得た。
収率：５２％
物理特性：
0004044133.tif 000033
ｎ＝１でＲ1＝Ｒ2＝水素の系列化合物
実施例８：４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジン：ＢＸＴ−５１０７２の製造：
（Ａ）２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピルアミンの製造：
実施例１（Ａ）の誘導体２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピオニトリル（２．２４ｇ、１０ミリモル）をＴＨＦ（２５ｍｌ）中に不活性雰囲気中で溶解した。ＴＨＦ中のボランＢＨ3の溶液（１Ｍ、２５ｍｌ、２５ミリモル）を反応媒体にゆっくりと加えた。得られた新たな溶液を３時間還流した。室温に冷却した後、反応混合物にトリフルオロ酢酸の水溶液（５０ｍｌ、１／１）を滴下した。この混合物を１時間還流し、ついで溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣を６０ｍｌの塩酸ＨＣｌ（１０％）中に取り、３×１００ｍｌの酢酸エチルで洗浄した。水相をアルカリ性にし（１２＜ｐＨ＜１４）、ついで３×５０ｍｌのジクロロメタンで抽出した。有機相をコンバインし、２×１００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の化合物を黄色がかった油状物として得た。
収率：６０％
物理特性：
0004044133.tif 000034
（Ｂ）４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｄ）の誘導体の場合と極めて同様の手順を用いて無色の結晶の形態で得た。
収率：２０％
物理特性：
0004044133.tif 000035
実施例９：４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジン−１−オキシド：ＢＸＴ−５１０８９の製造：
実施例４の手順と同様にして４，４−ジメチル−ベンズイソセレナジン：ＢＸＴ−５１０７２から所望の誘導体を得た。
収率：８４％
物理特性：
0004044133.tif 000036
実施例１０：４，４−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナジン：ＢＸＴ−５１０７８の製造：
（Ａ）Ｎ−［２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピル］−Ｎ−エチルアミンの製造：
実施例７（Ａ）の誘導体２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピルアミン（２２８ｍｇ、１ミリモル）にヨードエタン（１４６ｍｇ、７５μｌ、１ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温にて撹拌した。３０分後、白色沈殿が生成し、６０分後に５００μｌのクロロホルムを加えた。撹拌を１時間続けた。ジクロロメタン（４０ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ3溶液（２０ｍｌ）を反応媒体に加え、ついで後者をデカントにより除いた。有機相を２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の生成物を、１２％の出発物質（II）および１２％のＮ−［２−（２’−ブロモフェニル）−２−メチルプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン（III）との混合物として黄色がかった油状物として得た。この混合物を精製することなく次の工程に用いた。
収率：７６％
物理特性：
0004044133.tif 000037
（Ｂ）４，４−ジメチル−２−エチル−ベンズイソセレナジンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｄ）の誘導体の場合と極めて同様の手順により前工程の誘導体から黄色の油状物の形態で得た。
収率：２０％
物理特性：
0004044133.tif 000038
ｎ＝１でＲ1≠水素である系列化合物
実施例１１：４，４−ジメチル−６−メトキシ−ベンズイソセレナジン：ＢＸＴ−５１０７７の製造：
（Ａ）５−アミノ−２−ブロモ−フェニルアセトニトリルの製造：
ベラミー（Ｆ.Ｂellamy）らによって記載された方法（Ｔetrahedron Ｌet.、（１９８４）、２５、８、８３９〜８４２頁参照）に従い、塩化スズ（II）を用いて２−（２’−ブロモ−５’−ニトロ）フェニルアセトニトリル（１．６５ｇ、６．８５ミリモル）を還元して所望の誘導体を黄色がかった粉末の形態で得た。
収率：６９％
物理特性：
0004044133.tif 000039
（Ｂ）２−ブロモ−５−ヒドロキシ−フェニルアセトニトリルの製造：
前工程の誘導体（１ｇ、４．７４ミリモル）を硫酸（３５％、２０ｍｌ）中に溶解し、水（５ｍｌ）中の亜硝酸ナトリウム（４０９ｍｇ、６ミリモル）の溶液を０℃の温度にて加えた。５分後、水（１００ｍｌ）中の硝酸銅（II）（１７．２ｇ、７１ミリモル）の溶液を加え、ついで固体の酸化銅（Ｉ）（６７８ｍｇ、４．７４ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温にて２時間撹拌し、ついで３×１００ｍｌのtert−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機相をコンバインし、ついで２×１００ｍｌの水酸化ナトリウムＮａＯＨ（１Ｎ）で抽出した。水相をコンバインし、酸性にし（ｐＨ＝２）、ついで３×１００ｍｌのジクロロメタンで抽出した。有機相をコンバインし、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。所望の生成物を褐色の粉末の形態で得、これを精製することなく次の工程に用いた。
収率：６９％
物理特性：
0004044133.tif 000040
（Ｃ）２−（２’−ブロモ−５’−メトキシ）−フェニル−２−メチルプロピオニトリルの製造：
ＤＭＦ（１５ｍｌ）中の前工程の誘導体（６７０ｍｇ、３．１６ミリモル）およびヨードメタン（２．７ｇ、１９ミリモル）の溶液を、ＤＭＦ（１５ｍｌ）中の水素化ナトリウムＮａＨ（６０％、５０６ｍｇ、１２．６４ミリモル）の懸濁液に０℃の温度にてゆっくりと（６分間）加えた。この温度にて撹拌を１０分間続け、ついで室温で２時間続けた。この反応混合物を５０ｍｌの水中に注意深く注ぎ、２×５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相をコンバインし、５０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカカラム上のクロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン−酢酸エチル、４／１）により精製した後、所望の生成物を黄色の結晶の形態で得た。
収率：８３％
物理特性：
0004044133.tif 000041
（Ｄ）２−（２’−ブロモ−５’−メトキシ）−フェニル−２−メチルプロピルアミンの製造：
前工程の誘導体（３８６ｍｇ、１．５ミリモル）を不活性雰囲気下、ＴＨＦ（１５ｍｌ）中に溶解した。ＴＨＦ中のボランの溶液（１Ｍ、３．７５ｍｌ、３．７５ミリモル）をゆっくりと加えた。この反応混合物を３時間還流した。室温に冷却した後、酢酸（９０％溶液、２ｍｌ）を注意深く加えた。この混合物を再び再還流し（この場合は３０分間）、ついで５０ｍｌの塩酸ＨＣｌ溶液（１Ｎ）中に注ぎ、３×５０ｍｌのtert−ブチルメチルエーテルで洗浄した。水相をアルカリ性にし（１２＜ｐＨ＜１４）、ついで２×５０ｍｌのジクロロメタンで抽出した。有機相をコンバインし、５０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の生成物を黄色の油状物として得た。
収率：７８％
物理特性：
0004044133.tif 000042
（Ｅ）４，４−ジメチル−６−メトキシ−ベンズイソセレナジンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｄ）の誘導体の場合と極めて同様の手順により薄黄色の針状晶の形態で得た。
収率：４２％
物理特性：
0004044133.tif 000043
実例例１２：４，４−ジメチル−６−（２’−（４”−メチルピペラジン−１”−イル）エトキシベンズイソセレナジン：ＢＸＴ−５１０８０の製造：
（Ａ）２−（２’−ブロモ−５’−ヒドロキシ）−フェニル−２−メチルプロピルアミンの製造：
実施例１１（Ｄ）の２−（２’−ブロモ−５’−メトキシ）−フェニル−２−メチルプロピルアミン誘導体（３．０ｇ、１１．６ミリモル）を不活性雰囲気中、ジクロロメタン（１１．６ｍｌ）中に溶解した。ジクロロメタン中の三臭化ホウ素の溶液（１Ｍ、２３．２ミリモル）を０℃の温度にて反応媒体にゆっくりと加えた。この温度で撹拌を１５分間続け、ついで室温で４５分間撹拌を続けた。０℃に冷却した後、水（２０ｍｌ）を注意深く加えた。この反応混合物に重炭酸カリウムを加えて中性にした。得られた沈殿を濾過し、水（１０ｍｌ）ついでtert−ブチルメチルエーテル（１０ｍｌ）で洗浄した。乾燥後、所望の生成物を薄褐色−灰色の粉末の形態で得、これを精製することなく次の工程に用いた。
収率：８０％
物理特性：
0004044133.tif 000044
（Ｂ）Ｎ−２−（２’−ブロモ−５’−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピル−Ｎ−（tert−ブチルオキシカルボニル）−アミンの製造：
前工程の誘導体（３４０ｍｇ、１．４ミリモル）を室温にて水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ、７ｍｌ）中に溶解した。ジtert−ブチルジカーボネート（６７０ｍｇ、３ミリモル）を加えた。ついで、この反応混合物を３５℃の温度にて１．５時間激しく撹拌した。メタノール（８ｍｌ）、ついで濃水酸化ナトリウム溶液（１．１２ｍｌ）を加え、この均質溶液を８５℃にて１時間加熱した。メタノールを減圧下で蒸発して除き、ついで水性残渣を中性にした。沈殿を濾過し、水（２０ｍｌ）で洗浄し、ついで乾燥させた。かくして所望の生成物を灰色の粉末として得、精製することなく次の工程に用いた。
収率：５６％
物理特性：
0004044133.tif 000045
（Ｃ）２−（２’−ブロモ−５’−（２”−クロロエトキシ）−フェニル）−２−メチルプロピルアミンの製造：
前工程の誘導体（５６５ｍｇ、１．６４ミリモル）を室温にてＴＨＦ（１０ｍｌ）中に溶解した。トリフェニルホスフィン（６４５ｍｇ、２．４６ミリモル）、クロロエタノール（１９６ｍｇ、１６０μｌ、２ミリモル）および最後にＤＥＡＤ（４２８ｍｇ、３９０μｌ、２．４６ミリモル）を加えた。この反応混合物を２時間還流した。溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣をシリカカラム上のクロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン−酢酸エチル、５／１）により精製した。得られた無色油状物の形態のＮ−２−（２’−ブロモ−５’−（２”−クロロエトキシ）−フェニル）−２−メチルプロピル−Ｎ−（tert−ブチルオキシカルボニル）−アミン（４２８ｍｇ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）中に溶解した。トリフルオロ酢酸（３ｍｌ）を撹拌しながら加え、撹拌を室温にて１時間続けた。この反応混合物を飽和重炭酸カリウム溶液（２×３０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた後、所望の生成物を黄色がかった油状物として得た。
収率：６４％
物理特性：
0004044133.tif 000046
（Ｄ）６−（２’−クロロエトキシ）−４，４’−ジメチルベンズイソセレナジンの製造：
この化合物は、実施例１（Ｄ）の誘導体の場合と極めて同様の手順により、前工程の誘導体から無色結晶の形態で得られた。
収率：４８％
物理特性：
0004044133.tif 000047
（Ｅ）４，４−ジメチル−６−（２’−（４”−メチルピペラジン−１”−イル）エトキシ）ベンズイソセレナジンの製造：
前工程の誘導体（８６ｍｇ、０．２８ミリモル）をＮ−メチルピペラジン（２．８３ｇ、３．１５ｍｌ、２８ミリモル）中に溶解した。この溶液を６０〜７０℃の温度にて２２時間加熱した。ジクロロメタン（５０ｍｌ）を加えた後、この溶液を２５ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム溶液、ついで２５ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ついで濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させた。酸化アルミナカラム上の液体クロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン−酢酸エチル、１／１）により精製した後、所望の生成物を黄色の油状物として得た。
収率：７１％
物理特性：
0004044133.tif 000048
II．応用の実施例
以下に記載する操作手順は、本発明の方法の応用の非制限的実施例である。
実施例１３：一般構造（Ｉ）を有する化合物のグルタチオンペルオキシダーゼ活性の測定
３７℃にて２分間前以て平衡化した、０．２ｍＭのＤＴＰＡ、０．１４４ｍＭのＮＡＤＰＨ、２．２ｍＭの還元型グルタチオンおよび１．１Ｕ／ｍｌのグルタチオンジスルフィドレダクターゼを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）に、試験しようとする化合物のエタノール母液（１００μｌ）または無水エタノール（１００μｌ）（ブランク）を加えた。各化合物を最終濃度２０μＭで試験した。
ついで、下記のもの５０μｌを加えた。
・超純水中のtert−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）、６．６ｍＭ
・または超純水中の過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、１．６ｍＭ
・または水／メタノール混合物（８５／１５（Ｖ／Ｖ））中のダイズリポキシゲナーゼを用いて調製したリノレン酸のヒドロペルオキシド（１８：２−ＯＯＨ）（ファンク（Ｍ.Ｏ.Ｆunk）ら、Ｌipids、（１９７６）、１１、１１３〜１１７頁参照）、３．３ｍＭ。
３４０ｎｍにおける吸光度の減少を３７℃にて５分間測定することによりグルタチオンペルオキシダーゼの活性を測定した。初期の酵素速度または活性は、時間に対する吸光度のプロットの勾配に正比例する。
被験化合物における酸素還元に対する触媒活性は、ヒドロペルオキシド不在下でのＮＡＤＰＨの消費速度に対応した。この速度が対照の速度よりも有意に大きい場合には、溶解酸素の消費の動力学をクラーク電極を用いて測定することにより対応グルタチオンオキシダーゼ活性を直接確認することができた。
得られたグルタチオンペルオキシダーゼ活性の結果を表１に示す。これら結果は、１分間当たりに還元されたヒドロペルオキシドのナノモル数として表してある。
これら結果は、一般式（Ｉ）で示される本発明の化合物がグルタチオンＧＳＨの存在下での過酸化水素または有機ヒドロペルオキシドの還元を触媒することを示している。
実施例１４：単電子移動による還元活性の測定
本発明の一般構造（Ｉ）を有する分子がグルタチオンＧＳＨの存在下で単電子移動による酸化性化学種の還元を触媒する能力を、ｐＨ＝７．３、３７℃でのフェリシトクロムｃのフェロシトクロムｃへの還元を時間の関数として分光光度測定することにより示した。
反応媒体は、７５μＭのフェリシトクロムｃ、２５０μＭのグルタチオンＧＳＨ、０．１ｍＭのＤＴＰＡ、１０μｇ／ｍｌのＳＯＤおよび１１０Ｕ／ｍｌのカタラーゼを含有するリン酸カリウム緩衝液、１００ｍＭ（ｐＨ＝７．３）によって構成されていた。試験しようとする化合物を加えた後（反応媒体中に１０μＭ）、５５０ｎｍにおける吸光度の増加を１５分間測定した。
フェロシトクロムｃの生成速度は、時間に対する吸光度のプロットの勾配に正比例し（Ｖ、１分間当たりの吸光度単位として表してある）、グルタチオンＧＳＨ（２５０μＭ）の存在下、被験化合物の不在下、他の条件はすべて同じにして観察した生成速度（ＶGSH）と比較した。対応する結果を表２に示す。
これら結果は、本発明の一般構造（Ｉ）を有する化合物が分子の単電子還元を触媒すること、およびその場合に酸化力は過剰のグルタチオンＧＳＨの存在下でフェリシトクロムｃの酸化力よりも熱力学的に大きいかまたは等しいことを示している。これら化合物がグルタチオンＧＳＨの存在下で酸素を還元しないのだとすれば、これら化合物は活性形の酸素を同時に産生させることなく酸化性のフリーラジカルの捕捉剤および連鎖反応の開始剤として挙動するものである。
このことは、酸素を細胞毒性のスーパーオキサイドに還元する多数の他の有機セレン分子と異なり、一般構造（Ｉ）を有する有機セレン分子の主要な利点の一つである。
一般構造（Ｉ）を有する抗酸化性化合物は、１５μＭ以下の濃度で内皮細胞に対して何ら毒性を示さなかった。
実施例１５：リノレン酸ヒドロペルオキシドにより誘発された酸化性ストレスに暴露された内皮細胞に対する保護
ヒト内皮細胞を３７℃、レイトン管中、９５％の空気および５％のＣＯ2の気体混合物よりなる飽和湿度の雰囲気中で培養した。培地は、２％のウシ胎仔血清、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト成長因子（ＥＧＦ）、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含有するＥＧＭ（クロネティックス）培地により構成されていた。
細胞がほぼコンフルエントになったら、試験しようとする一般構造（Ｉ）を有する化合物の存在下または不在下（対照）で細胞を１時間インキュベートした（該化合物は１〜１０μＭの濃度で培地に加え、他の条件はすべて同じにした）。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回連続して洗浄した後、細胞を該培地中のリノレン酸ヒドロペルオキシド（５５μＭ）の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、メイ−グルンバルト（Ｍay−Ｇrunwald）／ギムザ法を用いて染色した。この染色法では、核が紫色に染まり、細胞質は薄い青紫色に染まった。
得られたスライドの顕微鏡観察は、形態が内皮細胞の特徴を有する付着性参照細胞を示した。これら細胞に対するリノレン酸ヒドロペルオキシドの効果は、まず第一に、細胞密度の２５％〜３５％の減少であり、第二に残留細胞の約７０％における劇的な形態変化であり、その核は残りの細胞体（濃縮され、濃い青紫色−黒色に発色）ともはや識別不能になっていた。トリパンブルーを用いた別の排除実験（生体染色）は、細胞の３０％以上が死滅していることを示した。これに対して、リノレン酸ヒドロペルオキシドで処理する前に一般式（Ｉ）の化合物とともに細胞をインキュベートした場合には、内皮細胞の少なくとも８０％が形態学的に正常であることが認められた。
これら結果は、本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物が内皮細胞によって捕捉され、該細胞が脂肪酸ヒドロペルオキシドの有害な作用から保護されることを示している。
実施例１６：過酸化水素により誘発された酸化性ストレスに暴露された内皮細胞に対する保護
ヒト内皮細胞を３７℃、６−穴プレートまたはペトリ皿（直径３５ｍｍ）中、９５％の空気および５％のＣＯ2の気体混合物よりなる飽和湿度の雰囲気中で培養した。培地は、２０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＭ１９９培地（ｐＨ＝７．４）により構成されていた。
細胞がほぼコンフルエントになったら、一般構造（Ｉ）を有する化合物の存在下（培地中で１〜１０μＭの濃度）または不在下（対照）で細胞をインキュベートした（他の条件はすべて同じにした）。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回連続して洗浄した後、細胞を反応媒体中の過酸化水素（５００または１００μＭ）の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。ついで、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ついで、メイ−グルンバルト／ギムザ法を用いて細胞を染色した。この染色法では、核が紫色に染まり、細胞質は薄い青紫色に染まった。あるいは、これら細胞を用いて酸化窒素ＮＯ・を産生させる能力を測定した（ＥＤＲＦ）。内皮細胞によるＮＯ・の産生は、ツカハラ（Ｈ.Ｔskahara）らの方法（Ｂiochem.and Ｂiophys.Ｒes.Ｃomm.、（１９９３）、１９３、７２２〜７２９頁）を用い、１００ｎＭのブラジキニンで刺激した後にＮＯ・電極を用いて行った。
染色後に得られたプレートの顕微鏡観察は、形態が内皮細胞の特徴を有する付着性参照細胞を示した。５００μＭ過酸化水素の効果は、細胞密度の７０％〜８０％の減少であった。これに対して、上記実施例７に記載した一般式（Ｉ）の化合物とともに細胞を最初にインキュベートした場合には、細胞密度の５０％以上が保存された。一例として、細胞を前以て化合物ＢＸＴ−５１０５６で処理しておいた場合には、約７０％の細胞密度が保存された。
１００μＭの過酸化水素で処理しても細胞密度に有意の効果はなかった。細胞は顕微鏡下で形態学的に正常であると思われた。しかしながら、この処理によってＮＯ・産生が９０％以上変化した。これに対して、上記一般式（Ｉ）で示される化合物（０．２〜１μＭの濃度）で内皮細胞を前処理するとブラジキニンに対する正常な応答が回復された。その一例として、１μＭの濃度の化合物ＢＸＴ−５１０５６で細胞を前処理するとブラジキニンに対する正常な応答が８０％以上回復された。
これら結果は、本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物が内皮細胞によって捕捉され、過酸化水素の有害な作用から該細胞を保護することを示している。
実施例１７：ＴＮＦ−αの存在下での多形核好中球により誘発された酸化性ストレスに暴露された内皮細胞に対する保護
ヒト内皮細胞を３７℃、２５ｃｍ3容フラスコ中、９５％の空気および５％のＣＯ2の気体混合物よりなる飽和湿度の雰囲気中で培養した。培地は、２％のウシ胎仔血清、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト成長因子ＥＧＦ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含有するＥＧＭ（クロネティックス）培地により構成されていた。
細胞がほぼコンフルエントになったら、試験しようとする一般構造（Ｉ）を有する化合物の存在下または不在下（対照）で細胞を１時間インキュベートした（該化合物は１〜１０μＭの濃度で培地に加え、他の条件はすべて同じにした）。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回連続して洗浄した後、細胞を該培地中のＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍｌ）および多形核好中球（ＰＭＮ）（内皮細胞当たり約１０ＰＭＮの比）（ヘパリン処理したヒト血液から調製（ボユム（Ａ.Ｂoyum）、Ｓcand.Ｊ.Ｃlin.Ｌab.Ｉnvest.、（１９６８）、２１、７７〜８９頁参照））の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、メイ−グルンバルト／ギムザ法を用いて染色した。この染色法では、核が紫色に染まり、細胞質は薄い青紫色に染まった。
得られたフラスコの顕微鏡観察は、形態が内皮細胞の特徴を有する付着性参照細胞を示した。ＴＮＦ−αの存在下でのこれら細胞に対するＰＭＮの効果は、内皮細胞密度の３０％〜４０％の減少、および残留付着細胞の７０％以上における劇的な変化であり、その核は残りの細胞体（濃縮され、濃い青紫色−黒色に発色）ともはや識別不能になっていた。この場合、多数のＰＭＮが支持体、とりわけ内皮細胞の形質膜の外表面に付着しているのが観察された。これに対して、内皮細胞をＰＭＮおよびＴＮＦ−αとともにインキュベートする前に該細胞を一般式（Ｉ）の化合物の存在下でインキュベートした場合には、内皮細胞の大多数が形態学的に正常であり、ＰＭＮが付着していないことが認められた。
これら結果は、本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物が内皮細胞によって捕捉され、該細胞が活性化多形核好中球の有害な作用から保護されることを示している。
実施例１８：リノレン酸ヒドロペルオキシドにより誘発された酸化性ストレスに暴露された内皮細胞に対する生存性試験
ヒト内皮細胞を３７℃、多穴プレートまたはペトリ皿中、９５％の空気および５％のＣＯ2の気体混合物よりなる飽和湿度の雰囲気中で培養した。培地は、２０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、およびヘパリンと細胞成長因子を添加した培地１容量％を含有するＭ１９９培地（ｐＨ＝７．４）により構成されていた。
細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞を以下の化合物の一つの存在下または不在下で１時間インキュベートした：ＢＸＴ−５１０５６、ＢＸＴ−５１０７２、ＢＸＴ−５１０７７またはエブセレン。これら化合物はそれぞれ４μＭにて２％ウシ胎仔血清を含有する培地中に加え、他の条件はすべて同じにした。
細胞をＰＢＳ緩衝液で３回連続して洗浄した後、細胞を上記培地中のリノレン酸ヒドロペルオキシド（１８：２−ＯＯＨ）（５０μＭ）の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。２時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、最初に定義した２０％ウシ胎仔血清中で再びインキュベートした。約２０時間後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＴ）のブロミドを用いた測定により細胞の生存能を決定した。
その結果を対照に対する生存パーセントとして図１に示す（参照を黒い方形で示す）。試験した化合物のうちＢＸＴ−５１０５６、ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７のみが、１８：２−ＯＯＨによって誘発された死滅から細胞を有意に保護することがわかる。
実施例１５と同様、これら結果は、本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物が内皮細胞によって捕捉され、脂肪酸ヒドロペルオキシドの有害な作用から該細胞を保護することを示している。
実施例１９：化合物ＢＸＴ−５１０５６、ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７の保護作用：ＴＮＦ−αの存在下で多形核好中球により誘発された内皮細胞変化の生化学的定量
ヒト内皮細胞を実施例１８と同じ条件下で培養した。
細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞を以下の化合物の存在下または不在下で１時間インキュベートした：ＢＸＴ−５１０７２、ＢＸＴ−５１０７７またはペントキシフィリン。化合物ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７（それぞれ１０μＭ）およびペントキシフィリン（５０μＭ）を、２％ウシ胎仔血清を含有する培地中に加え、他の条件はすべて同じにした。ついで、細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した。被験化合物で前処理しなかった細胞は、２％ウシ胎仔血清を含有する培地中、実施例１５に示すようにＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）および／または多形核好中球（ＰＭＮ）の存在下でインキュベートするかまたはインキュベートしなかった（対照）。前処理した細胞は同じ条件下でインキュベートしたが、培地には上記濃度の被験化合物が含まれていた。まず１時間のインキュベーション、ついで３時間半のインキュベーションの後、培地を回収し、細胞塊をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、付着したＰＭＮを溶解させた。ついで、ＰＭＮに特異的に含まれる酵素であるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を得られた細胞溶解液中で測定し、内皮細胞へのＰＭＮの付着を評価した。内皮細胞によって培地中に放出されたフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）を、該細胞の変化の指標として３時間半のインキュベーションの後に測定した。
内皮細胞をＰＭＮおよびＴＮＦ−αの存在下でインキュベートすると、それぞれの対照（それぞれ、ＰＭＮ単独、および内皮細胞単独）に比べてＭＰＯおよびｖＷＦの量が非常に有意に増加し、活性化したＰＭＮが内皮細胞に付着し後者が変化することを示していた。
上記３つの被験化合物について得られた結果を図２に示す。これら結果は、ＭＰＯおよびｖＷＦの測定値を、内皮細胞をＴＮＦ−αおよびＰＭＮとともにインキュベートした場合に決定したＭＰＯおよびｖＷＦの各濃度と比較することにより抑制％として表してある。
これら結果は、本発明の化合物ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７がＴＮＦ−αによって誘発されたＰＭＮの付着をペントキシフィリンに比べて遥かに有効に抑制することを示している。ペントキシフィリンとは対照的に、これら化合物はまた、活性化ＰＭＮの有害な作用に対しても内皮細胞を保護する。
実施例２０：化合物ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７の保護作用：ＴＮＦ−αにより誘発された内皮細胞によるインターロイキン８の産生の生化学的定量
ヒト内皮細胞を実施例１８と同じ条件下で培養した。
細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞を以下の化合物の存在下または不在下で１時間インキュベートした：ＢＸＴ−５１０７２、ＢＸＴ−５１０７７またはエブセレン。これら化合物をそれぞれ１０μＭにて２％ウシ胎仔血清を含有する培地中に加え、他の条件はすべて同じにした。培地を除いた後、細胞を上記と同じ培地中、ＴＮＦ−α（０．１、１または１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。該培地には被験化合物が１０μＭで含有されているかまたは含有されていなかった。４時間のインキュベーションの後、培地中のインターロイキン８（ＩＬ−８）を測定した。
得られた結果を図３に示す。これら結果は、細胞をＴＮＦ−αの存在下でインキュベートすることによって培地中のＩＬ−８の産生が増加したこと、および細胞を化合物ＢＸＴ−５１０７２およびＢＸＴ−５１０７７で処理すると該効果が少なくとも７０％抑制されたのに対してエブセレンでは抑制効果がなかったことを示している。
これら結果は、これら化合物が内皮細胞によるインターロイキン８の放出という観点においてＴＮＦ−αのアンタゴニストとして作用しうることを示している。
実施例２１：インターロイキン１の毒性に対する内皮細胞の保護
ヒト内皮細胞を実施例１８と同じ条件下で培養した。
細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞を以下の化合物の存在下または不在下で１時間インキュベートした：ＢＸＴ−５１０７２、ＢＸＴ−５１０７７。これら化合物を１０μＭにて２％ウシ胎仔血清を含有する培地中に加え、他の条件はすべて同じにした。ついで、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。化合物で前処理しなかった細胞を、同じ培地中、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。前処理した細胞も同じ条件下でインキュベートしたが、培地には上記濃度の被験化合物が含まれているかまたは含まれていなかった。４時間のインキュベーションの後、培地中のフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）を測定した。
得られた結果を図４に示す。これら結果は、細胞をインターロイキン１とともにインキュベートする間に化合物ＢＸＴ−５１０７２またはＢＸＴ−５１０７７が存在するか否かにかかわらず、細胞をこれら化合物で処理することによって、ＩＬ−１によって誘発されるｖＷＦ放出の増加が７０％以上抑制されることを示している。
これら結果は、これら化合物が内皮細胞によって捕捉され、内皮細胞によるフォンビルブラント因子の放出に関してインターロイキン１のアンタゴニストとして作用しうることを示している。
実施例２２：ＴＮＦ−αによって誘発されたＰ−セレクチンの内皮細胞発現の抑制
ヒト内皮細胞を実施例１８と同じ条件下で培養した。
細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞を２％ウシ胎仔血清を含有する培地中、ＢＸＴ−５１０７２（１０μＭ）の存在下または不在下で１時間インキュベートし、他の条件はすべて同じにした。ついで、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。化合物で前処理しなかった細胞を、同じ培地中、ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下（対照）でインキュベートした。前処理した細胞も同じ条件下でインキュベートしたが、培地には１０μＭのＢＸＴ−５１０７２が含まれていた。３〜４時間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の２％ホルムアルデヒドで固定した。ついで、モノクローナル抗Ｐ−セレクチンマウス抗体およびアルカリホスファターゼで標識したマウス抗−抗体の存在下で細胞を連続的にインキュベートし、パラニトロフェニルホスフェート（加水分解を４０５ｎｍで追跡した）を加えて暴露することにより、細胞からのＰ−セレクチンの発現をＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた結果は、細胞をＴＮＦ−αの存在下でインキュベートすることによってＰ−セレクチンの発現が４の因子で増加されるが、細胞を化合物ＢＸＴ−５１０７２で処理した場合には該増加が９０％以上抑制されたことを示している。
これら結果は、これら化合物がＴＮＦ−αによるＰ−セレクチンなどの細胞接着因子の発現を抑制しうることを示している。
実施例２３：インビトロでの内皮細胞の培養における化合物ＢＸＴ−５１０５６およびＢＸＴ−５１０７２の毒性の不存在
ヒト内皮細胞を実施例１８と同じ条件下、９６−穴プレート中で培養させた。
細胞がほぼコンフルエントになったら、培地中に１０μＭ以下の濃度で培地中に加えたＢＸＴ−５１０５６およびＢＸＴ−５１０７２の存在下、２４時間または４８時間インキュベートするか、またはインキュベートしなかった（対照）。２４時間または４８時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回濯ぎ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＴ）のブロミドを用いて細胞の生存能を測定した。
参照との有意の差異は何ら認められず、化合物ＢＸＴ−５１０５６およびＢＸＴ−５１０７２が１０μＭ以下の濃度で内皮細胞に対して毒性ではないことを示していた。
実施例２４：ラットにインビボで繰り返し経口投与した後の化合物ＢＸＴ−５１０７２の耐性
オス成体スプラーグ−ドーリーラットをランダムに４つのグループに分けた。１０匹のラットからなる１群および１５匹のラットからなる他の群に、１投与量がそれぞれ体重１ｋｇ当たり１０μモルおよび１００μモルのＢＸＴ−５１０７２を毎日、１４日間経口投与した（強制食餌）。これら投与は、１％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウムを含有する水溶液を用いて投与した。同じ手順により、１２匹のラットからなる第三の群にはベクター（１％ＣＭＣ）のみを与え、３匹のラットからなる第四の群には強制食餌を与えなかった。
被験化合物の毒性を評価するため、すべての動物を１４日にわたって規則的に体重測定した。動物の外観および挙動も毎日観察した。
処理から１４日後、いずれの動物も死亡しなかった。最後の投与から１６時間後、ラットをケタミンで麻酔し、心臓内鼓腹切開により血液試料を採取して種々の血液学的および生化学的パラメータを測定した。動物の体重曲線を図５および６に示す。表３には動物の血液に対して行った測定結果および対応偏差をまとめて示す。
高投与量の本発明のＢＸＴ−５１０７２（１００μモル／ｋｇ、図６）では体重増加がわずかに緩やかになったが、毒性の他の兆候は認められなかった（表３）。これら結果は、本発明の化合物ＢＸＴ−５１０７２が繰り返し経口投与の後でもラットによって充分に耐性が得られることを示している。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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