【手続補正書】
【提出日】平成20年3月11日(2008.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の表面に形成されたアミノ基に核酸を吸着させ、該アミノ基に吸着させた核酸をリン酸塩溶液と反応させることにより、該アミノ基に吸着させた核酸を脱離させることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
前記粒子は、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質の粒子から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記リン酸塩溶液の濃度は、１．０ｍＭ〜５００ｍＭであることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本 発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、粒子の表面に形成されたアミノ基に吸着させた多量の核酸にリン酸塩溶液を特定条件下で反応させ ることにより、該アミノ基に吸着させた核酸を極めて効率良く脱離し、抽出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明は以下の事項に関する。すなわち、
（１）粒子の表面に形成されたアミノ基に核酸を吸着させ、該アミノ基に吸着させた核酸をリン酸塩溶液と反応させることにより、該アミノ基に吸着させた核酸を脱離させることを特徴とする核酸抽出方法。
（２）前記粒子は、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質の粒子から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする（１）に記載の核酸抽出方法。
（３）前記リン酸塩溶液の濃度は、１．０ｍＭ〜５００ｍＭであることを特徴とする（１）又は（２）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の核酸の抽出方法は、粒子の表面に形成されたアミノ基に多量の核酸を吸着させ、該アミノ基に吸着させた核酸をリン酸塩溶液と反応させることにより、核酸を脱離し、抽出することを特徴としている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
＜核酸の脱離＞
[リン酸塩溶液について]
本 発明において、粒子表面に形成されたアミノ基と静電相互作用による相補的結合により吸着した多量の核酸を効率よく脱離するためにリン酸塩溶液を使用 する。リン酸塩溶液中の陰イオンがアミノ基と吸着している核酸に置き換わり、これによって吸着していた核酸の脱離が起こる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
リン酸塩としては、アミノ基との静電相互作用が核酸よりも大きいものであれば良く、特に制限されるものではないが、具 体的にはリン酸水素アンモニウム、リン酸水素カリウム等を例示することができ る。これらの中でもリン酸ナトリウム塩緩衝溶液が特に好ましい。なお、上記緩衝溶液には、少量の塩化ナトリウム等の電解質を添加することもでき、溶液のイ オン強度を調整することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
上記リン酸塩溶液の濃度は、１．０ｍＭ〜５００ｍＭであることが必要である。濃度が１．０ｍＭ未満であると、核酸の脱離が不十分となり、一方、濃度が５００ｍＭを超えると、分離、抽出後の核酸に支障をきたし、ＰＣＲ法による核酸増幅に障害が生じる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
多 量の核酸が吸着した粒子上に上記リン酸塩溶液を加え、所定の温度にてインキュベートした後、核酸を脱離する。インキュベートする温度としては、 １０℃〜９０℃、好ましくは２０℃〜８０℃である。インキュベートする温度が１０℃未満であると核酸の脱離が起こりにくく、９０℃以上であると脱離した核 酸に障害を与えることとなり好ましくない。なお、リン酸塩溶液の濃度とインキュベートする温度の最適化、ＰＣＲ法の適用を考えると、核酸の脱離する 割合が同程度ならば、核酸脱離用リン酸塩溶液は低塩下であることが好ましいので、リン酸塩の濃度を低く設定するとよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明において、吸着した核酸をリン酸塩溶液によって脱離した核酸等の定量は、核酸が吸着した微粒子にリン酸塩溶液を加えた後の上澄み溶液に遊離している核酸を測定することにより行う。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
（比較例１）
実施例１で使用したリン酸ナトリウム緩衝溶液に代えて、比較例として塩化ナトリウム溶液を使用した以外は実施例１と同様にしてλＤＮＡの脱離、抽出を行い、同様に抽出したλＤＮＡの割合を測定し、比較例１とした。測定結果を図２に示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
＜リン酸ナトリウム緩衝溶液の濃度について＞
（実施例２〜実施例５）
リン酸塩溶液として、リン酸ナトリウム緩衝溶液を使用し、ＤＮＡ脱離の温度を２５℃とし、その濃度を変化させた以外は、実施例１と同様にしてλＤＮＡの脱離、抽出を行った。λＤＮＡの抽出量の測定結果を図３に示す。
（実施例６〜実施例９）
λＤＮＡ脱離の温度を８０℃とした以外は実施例４と同様にしてλＤＮＡの脱離、抽出を行った。λＤＮＡの抽出量の測定結果を図３に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
図１〜図３からも明らかなように、リン酸塩溶液として、リン酸ナトリウム緩衝溶液を使用し、温度を８０℃に設定することにより、アミノ基修飾磁性細菌粒子に吸着した多量のλＤＮＡをほぼ１００％という極めて高効率で脱離し、抽出することができることが理解される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図１】添加したλＤＮＡの量（ｎｇ）とアミノ基修飾磁性磁気微粒子(ＢＭＰs)によるλＤＮＡの吸着量(ｎｇ／１０μｇ-ＢＭＰs)との関係を示す図である。
【図２】各リン酸塩溶液とλＤＮＡの脱離割合（％）の関係を示す図である。
【図３】リン酸ナトリウム緩衝溶液の濃度（ｍＭ）とλＤＮＡの脱離割合（％）との関係を示す図である（２５℃、８０℃）。
【図４】抽出したλＤＮＡのＰＣＲ反応後における電気泳動写真である。
【図５】ヒト全血から抽出したＤＮＡのＰＣＲ反応後における電気泳動写真である。
【図６】ヒト全血から抽出したＤＮＡのＰＣＲ産物に対するＳＮＰ検出結果を示す図である（アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２遺伝子）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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