(57)【要約】  気道器官バイオリアクタ装置、およびその使用方法、ならびにそれらの方法を使用して生成されるバイオ人工気道器官、およびバイオ人工気道器官を使用して対象を治療する方法が提供される。
2017512492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの流体を灌流させる器官マトリックス骨格または器官を保持するように構成された器官チャンバと、
前記器官チャンバとリザーバシステムとを接続する進入ラインであって、流体ライン、動脈ライン、静脈ライン、気管ライン、または進入ポンプのいずれかを含む進入ラインと、
前記器官チャンバと前記リザーバシステムとを接続する放出ラインであって、放出ポンプを含む放出ラインと、
前記進入ラインおよび前記放出ラインを通した前記器官チャンバと前記リザーバシステムとの間の流体交換を制御するように構成されたコントローラと、
前記器官チャンバに接続されたチャンバ圧力センサであって、チャンバ圧力を記録し前記コントローラに送信するように構成されたチャンバ圧力センサとを備える、気道器官バイオリアクタ装置。
【請求項２】
前記進入ポンプ、前記放出ポンプ、またはそれら両方が双方向ポンプである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記コントローラは、
前記双方向ポンプの方向を制御すること、または、
前記双方向ポンプのポンプサイクルの持続時間を制御すること
のいずれかによって、前記進入ラインおよび前記放出ラインを通した前記器官チャンバと前記リザーバシステムとの間の流体交換を制御するように構成されている、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記コントローラが、前記チャンバ圧力センサから送信されるデータに応答して、前記進入ラインおよび前記放出ラインを通した前記器官チャンバと前記リザーバシステムとの間の流体交換を制御するように構成されている、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記進入ラインが、前記動脈ライン、前記静脈ライン、および前記気管ラインを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記気管ラインが、前記器官チャンバに接続されるとともに、陽圧マニホルドに接続され、
前記陽圧マニホルドが、
ガス源、
前記ガス源に接続された圧力リザーバ、および、
前記圧力リザーバに接続された圧力解放弁
を含み、
前記陽圧マニホルドが前記コントローラによって制御される、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記陽圧マニホルドが、前記気管ラインに沿って持続陽圧を印加するように構成されている、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記動脈ラインおよび前記静脈ラインの一方もしくは両方が、圧力センサ、流体ポンプ、または圧力センサと流体ポンプの両方を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
前記動脈ラインが、前記コントローラによってそれぞれ制御される第１の圧力センサおよび第１のポンプを含み、
前記静脈ラインが、前記コントローラによってそれぞれ制御される第２の圧力センサおよび第２のポンプを含み、
前記気管ラインが、前記コントローラによってそれぞれ制御される第３の圧力センサおよび第３のポンプを含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記第３のポンプが双方向性である、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記動脈ラインおよび前記静脈ラインが前記リザーバシステムに接続され、前記気管ラインが換気装置に接続される、請求項５に記載の装置。
【請求項１２】
前記器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールをさらに備え、
前記空気圧制御モジュールが、
入口圧力弁、入口圧力リザーバ、および入口圧縮機を含むガス入口ラインと、
出口圧力弁、出口圧力リザーバ、および出口圧縮機を含むガス出口ラインと
を含み、
前記コントローラが、前記入口圧力弁、前記入口圧縮機、前記出口圧力弁、または前記出口圧縮機のいずれかを制御する、請求項１または６に記載の装置。
【請求項１３】
動脈ラインに、静脈ラインに、および気管ラインに接続するように構成された器官チャンバを提供するステップと、
気道および実質的な血管系を含む肺組織マトリックスを提供するステップと、
前記気道を前記気管ラインに接続するステップと、
前記肺組織マトリックスを前記動脈ラインに、および前記静脈ラインに接続するステップと、
前記動脈ライン、前記静脈ライン、または前記気管ラインの少なくとも１つの全体にわたって前記肺組織マトリックスに細胞を播種するステップと、
第１の所望の程度の器官成熟を生じさせて湿潤成熟した器官を生成するのに十分な時間の間、前記肺組織マトリックスに湿潤換気を提供するステップと、
任意選択で、湿潤換気の間、前記器官チャンバ内の実質的に一定の流体レベルを維持するステップとを含む、湿潤成熟した肺器官を提供する方法。
【請求項１４】
前記器官チャンバが、チャンバ圧力センサおよび双方向排液チャンバポンプを含み、前記チャンバ圧力センサおよび双方向排液チャンバポンプが、前記チャンバ圧力センサによって送信されるデータに応答して前記双方向排液ポンプを制御する制御モジュールによってそれぞれ制御される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記静脈ライン内の圧力レベルと前記媒体リザーバ内の圧力レベルとを平衡化することによって、肺内外圧較差を防止するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記器官チャンバが、前記器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールをさらに備え、
前記空気圧制御モジュールが、
吸気相の間は前記器官チャンバ内で陰圧を発生させ、
安定相では前記器官チャンバ圧力を維持し、
呼気相の間は前記器官チャンバ内で陽圧を発生させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
湿潤換気が、
前記コントローラに接続された双方向気管ポンプを含む前記気管ラインを媒体リザーバに接続するステップと、
前記双方向気管ポンプを使用して前記肺組織マトリックスを媒体で膨張させるステップと、
前記双方向気管ポンプを使用して媒体を前記肺組織マトリックスから抜き取って、前記肺組織マトリックスを収縮させるステップと
を含み、
前記媒体が、湿潤換気の間、継続的に入れ替えられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記湿潤換気が、
前記コントローラにそれぞれ接続された第１のポンプおよび第２のポンプを含む前記気管ラインを媒体リザーバに接続するステップと、
前記第１のポンプを使用して前記肺組織マトリックスを媒体で膨張させるステップと、
前記第２のポンプを使用して媒体を前記肺組織マトリックスから抜き取って、前記肺組織マトリックスを収縮させるステップと
を含み、
前記媒体が、湿潤換気の間、継続的に入れ替えられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記コントローラが、前記気管ラインに接続された気管圧センサによって送信されるデータに応答して、前記双方向気管ポンプを制御する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
動脈ラインに、静脈ラインに、および気管ラインに接続するように構成された器官チャンバを提供するステップと、
気道および実質的な血管系を含む、請求項１３に記載の湿潤成熟した肺、または摘出した肺を提供するステップと、
前記気道を前記気管ラインに接続するステップと、
前記湿潤成熟した肺または前記摘出した肺を動脈ラインおよび静脈ラインに接続するステップと、
少なくとも前記動脈ラインまたは前記静脈ラインを通して、前記湿潤成熟した肺または前記摘出した肺の前記血管系全体にわたって媒体を灌流させるステップと、
機能する肺器官を生成または維持するのに十分な時間の間、前記湿潤成熟した肺または前記摘出した肺に乾燥換気を提供するステップと、
気管圧の変動を最小限に抑えるステップとを含む、肺器官を保存、修復、および／または改変する方法。
【請求項２１】
気管圧の変動を最小限に抑える前記ステップが、
コントローラにそれぞれ接続された換気装置および気管圧センサを含む、前記気管ラインを媒体リザーバに接続するステップと、
前記換気装置を使用して前記湿潤成熟した肺または前記摘出した肺をガスで膨張させるステップと、
前記換気装置を使用して前記湿潤成熟した肺または前記摘出した肺を収縮させるステップと
を含み、
前記コントローラによって、前記換気装置が、前記湿潤成熟した肺または前記摘出した肺を膨張もしくは収縮させて、前記気管圧センサによって感知される前記気管圧の変動を最小限に抑える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
気管圧の変動を最小限に抑えるステップが、
前記気管ラインに接続されるとともにコントローラに接続された陽圧マニホルドを提供するステップであって、前記陽圧マニホルドが、圧力リザーバ、前記圧力リザーバに接続されたガス源、および圧力解放弁を含む、ステップと、
前記気管ラインに接続されるとともに前記コントローラに接続された気管圧センサを提供するステップとを含み、
前記コントローラが、前記気管圧センサから送信されるデータに応答して、前記圧縮機または前記圧力解放弁を制御する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記圧力リザーバが、吸気および呼気の間の圧力の変動を最小限に抑えるように、近似的にサイズ決めされた、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記器官チャンバが、前記器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールをさらに備え、
前記空気圧制御モジュールが、
吸気相の間は前記器官チャンバ内で陰圧を発生させ、
安定相では前記器官チャンバ圧力を維持し、
呼気相の間は前記器官チャンバ内で陽圧を発生させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
気管圧の変動を最小限に抑えるステップが、
前記気管ラインに接続されるとともにコントローラに接続された陽圧マニホルドを提供するステップであって、前記陽圧マニホルドが、圧力リザーバ、前記圧力リザーバに接続されたガス源、および圧力解放弁を含む、ステップと、
前記気管ラインに接続されるとともに前記コントローラに接続された気管圧センサを提供するステップと
を含み、
前記コントローラが、前記気管圧センサから送信されるデータに応答して、前記圧縮機または前記圧力解放弁を制御し、
前記器官チャンバが、前記器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールを備え、
前記空気圧制御モジュールが、
吸気相の間は前記器官チャンバ内で陰圧を発生させ、
安定相では前記器官チャンバ圧力を維持し、
呼気相の間は前記器官チャンバ内で陽圧を発生させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１３から２５に記載の方法によって生成された機能する肺。
【請求項２７】
前記器官が完全肺またはその血管新生部分である、請求項２６に記載の機能する肺。
【請求項２８】
肺容量の障害または低下を有する対象を治療する方法であって、請求項２７に記載の前記肺を前記対象に移植するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体を本明細書に組み込む、２０１４年３月１４日付けの米国仮特許出願第６１／９５３，１９１号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、肺バイオリアクタのアセンブリおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺移植は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺がん、および先天性肺疾患などの、肺不全に代表される症状がある多くの患者にとって最後の希望を象徴するものである。肺移植の一般的な待機期間は、２年以上の場合があり、待機リストに載っている者の死亡率は３０％である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの態様では、気道器官バイオリアクタは、流体を灌流させる器官マトリックス骨格または器官を保持するように構成された器官チャンバと、器官チャンバとリザーバシステムとを接続する進入ラインであって、流体ライン、動脈ライン、静脈ライン、気管ライン、または進入ポンプのいずれかを含む進入ラインと、器官チャンバとリザーバシステムとを接続する放出ラインであって、放出ポンプを含む放出ラインと、進入ラインおよび放出ラインを通した器官チャンバとリザーバシステムとの間の流体交換を制御するように構成されたコントローラと、器官チャンバに接続されたチャンバ圧力センサであって、チャンバ圧力を記録しコントローラに送信するように構成されたチャンバ圧力センサとを含む。
【０００５】
別の態様では、湿潤成熟した肺器官を提供する方法は、動脈ラインに、静脈ラインに、および気管ラインに接続するように構成された器官チャンバを提供することと、気道および実質的な血管系を含む肺組織マトリックスを提供することと、気道を気管ラインに接続することと、肺組織マトリックスを動脈ラインに、および静脈ラインに接続することと、動脈ライン、静脈ライン、または気管ラインの少なくとも１つの全体にわたって肺組織マトリックスに細胞を播種することと、第１の所望の程度の器官成熟を生じさせて湿潤成熟した器官を生成するのに十分な時間の間、肺組織マトリックスに湿潤換気を提供することと、任意選択で、湿潤換気の間、器官チャンバ内の実質的に一定の流体レベルを維持することとを含む。
【０００６】
さらなる態様では、肺器官を保存、修復、および／または改変する方法は、動脈ラインに、静脈ラインに、および気管ラインに接続するように構成された器官チャンバを提供することと、気道および実質的な血管系を含む、湿潤成熟した肺または摘出した肺を提供することと、気道を気管ラインに接続することと、湿潤成熟した肺または摘出した肺を動脈ラインおよび静脈ラインに接続することと、少なくとも動脈ラインまたは静脈ラインを通して、湿潤成熟した肺または摘出した肺の血管系全体にわたって媒体を灌流させることと、機能する肺器官を生成または維持するのに十分な時間の間、湿潤成熟した肺または摘出した肺に乾燥換気を提供することと、気管圧の変動を最小限に抑えることとを含む。
【０００７】
実現例は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を含むことができる。
【０００８】
いくつかの実現例では、進入ポンプ、放出ポンプ、またはそれら両方は双方向ポンプである。
【０００９】
特定の実現例では、コントローラは、双方向ポンプの方向を制御すること、または双方向ポンプのポンプサイクルの持続時間を制御することのいずれかによって、進入ラインおよび放出ラインを通した器官チャンバとリザーバシステムとの間の流体交換を制御するように構成される。
【００１０】
いくつかの実現例では、コントローラは、チャンバ圧力センサから送信されるデータに応答して、進入ラインおよび放出ラインを通した器官チャンバとリザーバシステムとの間の流体交換を制御するように構成される。
【００１１】
特定の実現例では、進入ラインは、動脈ライン、静脈ライン、および気管ラインを含む。
【００１２】
いくつかの実現例では、気管ラインは、器官チャンバに接続され、また、ガス源、ガス源に接続された圧力リザーバ、および圧力リザーバに接続された圧力解放弁を含む、陽圧マニホルド（positive pressure manifold）に接続され、陽圧マニホルドはコントローラによって制御される。
【００１３】
特定の実現例では、陽圧マニホルドは、気管ラインに沿って持続陽圧を印加するように構成される。
【００１４】
いくつかの実現例では、動脈ラインおよび静脈ラインの一方もしくは両方は、圧力センサ、流体ポンプ、または圧力センサと流体ポンプの両方を含む。
【００１５】
特定の実現例では、動脈ラインは、コントローラによってそれぞれ制御される第１の圧力センサおよび第１のポンプを含み、静脈ラインは、コントローラによって制御される第２の圧力センサを含み、気管ラインは、コントローラによってそれぞれ制御される第３の圧力センサおよび第３のポンプを含む。
【００１６】
いくつかの実現例では、第３のポンプは双方向性である。
【００１７】
特定の実現例では、動脈ラインおよび静脈ラインはリザーバシステムに接続され、気管ラインは換気装置に接続される。
【００１８】
いくつかの実現例では、空気圧制御モジュールは器官チャンバに接続され、空気圧制御モジュールは、入口圧力弁、入口圧力リザーバ、および入口圧縮機を含むガス入口ラインと、出口圧力弁、出口圧力リザーバ、および出口圧縮機を含むガス出口ラインとを含み、コントローラは、入口圧力弁、入口圧縮機、出口圧力弁、または出口圧縮機のいずれかを制御する。
【００１９】
特定の実現例では、器官チャンバは、チャンバ圧力センサによって送信されるデータに応答して双方向排液ポンプを制御する、制御モジュールによってそれぞれ制御される、チャンバ圧力センサおよび双方向排液チャンバポンプを含む。
【００２０】
いくつかの実現例では、肺内外圧較差を防止することは、静脈ライン内の圧力レベルと媒体リザーバ内の圧力レベルとを平衡化することによって達成される。
【００２１】
特定の実現例では、器官チャンバは、器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールをさらに含み、空気圧制御モジュールは、吸気相の間は器官チャンバ内で陰圧を発生させ、安定相では器官チャンバ圧力を維持し、呼気相の間は器官チャンバ内で陽圧を発生させる。
【００２２】
いくつかの実現例では、湿潤換気は、コントローラに接続された双方向気管ポンプを含む気管ラインを媒体リザーバに接続することと、双方向気管ポンプを使用して肺組織マトリックスを媒体で膨張させることと、双方向気管ポンプを使用して媒体を肺組織マトリックスから抜き取って、肺組織マトリックスを収縮させることとを含む。媒体は、湿潤換気の間、継続的に入れ替えられる。
【００２３】
特定の実現例では、湿潤換気は、コントローラにそれぞれ接続された第１のポンプおよび第２のポンプを含む気管ラインを媒体リザーバに接続することと、第１のポンプを使用して肺組織マトリックスを媒体で膨張させることと、第２のポンプを使用して媒体を肺組織マトリックスから抜き取って、肺組織マトリックスを収縮させることとを含む。媒体は、湿潤換気の間、継続的に入れ替えられる。
【００２４】
いくつかの実現例では、コントローラは、気管ラインに接続された気管圧センサによって送信されるデータに応答して、双方向気管ポンプを制御する。
【００２５】
特定の実現例では、気管圧の変動を最小限に抑えることは、コントローラにそれぞれ接続された換気装置および気管圧センサを含む、気管ラインを媒体リザーバに接続することと、換気装置を使用して湿潤成熟した肺または摘出した肺をガスで膨張させることと、換気装置を使用して湿潤成熟した肺または摘出した肺を収縮させることとを含む。コントローラによって、換気装置が、湿潤成熟した肺または摘出した肺を膨張もしくは収縮させて、気管圧センサによって感知される気管圧の変動を最小限に抑える。
【００２６】
いくつかの実現例では、気管圧の変動を最小限に抑えることは、気管ラインに接続されるとともにコントローラに接続された陽圧マニホルドを提供することと、気管ラインに接続されるとともにコントローラに接続された気管圧センサを提供することとを含む。陽圧マニホルドは、圧力リザーバと、圧力リザーバに接続されたガス源と、圧力解放弁とを含む。コントローラは、気管圧センサから送信されるデータに応答して、圧縮機または圧力解放弁を制御する。
【００２７】
特定の実現例では、圧力リザーバは、吸気および呼気の間の圧力の変動を最小限に抑えるように、適切にサイズ決めされる。
【００２８】
いくつかの実現例では、器官チャンバは、器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールをさらに備える。空気圧制御モジュールは、吸気相の間は器官チャンバ内で陰圧を発生させ、安定相では器官チャンバ圧力を維持し、呼気相の間は器官チャンバ内で陽圧を発生させる。
【００２９】
特定の実現例では、気管圧の変動を最小限に抑えることは、気管ラインに接続されるとともにコントローラに接続された陽圧マニホルドを提供することと、気管ラインに接続されるとともにコントローラに接続された気管圧センサを提供することとを含む。陽圧マニホルドは、圧力リザーバと、圧力リザーバに接続されたガス源と、圧力解放弁とを含む。コントローラは、気管圧センサから送信されるデータに応答して、圧縮機または圧力解放弁を制御し、器官チャンバは、器官チャンバに接続された空気圧制御モジュールを含む。空気圧制御モジュールは、吸気相の間は器官チャンバ内で陰圧を発生させ、安定相では器官チャンバ圧力を維持し、呼気相の間は器官チャンバ内で陽圧を発生させる。
【００３０】
いくつかの実現例では、機能する肺が生成される。
【００３１】
特定の実現例では、器官は、完全肺またはその血管新生部分である。
【００３２】
いくつかの実現例では、肺容量の障害または低下を有する対象は、本明細書に記載する肺を対象に移植することによって治療される。
【００３３】
特定の実現例では、細胞媒体は灌流される。
【００３４】
特定の実現例では、流体（例えば、細胞媒体、液体、または空気）は、細胞マトリックスの上および／または中へと灌流される。
【００３５】
いくつかの実現例では、脱細胞化肺組織マトリックス、肺器官、または摘出した肺は、ヒトの肺（またはそれに由来するもの、もしくはそのサイズのもの）、あるいはブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、または他の大型哺乳類由来の肺である。
【００３６】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価の方法および材料を使用して、本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及するすべての文献、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体を参照により組み込む。矛盾がある場合は、定義を含めて本明細書が優先する。それに加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定的であることを意図しない。
【００３７】
本発明の１つまたはそれ以上の実施形態の詳細を、添付図面および以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、態様、および利点は、明細書および図面から、ならびに特許請求の範囲から明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】例示の灌流肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図２】陰圧湿潤換気に灌流システムを提供するように構成された例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図３】図４に示される例示の陽圧マニホルドを示す概略図である。
【図３Ａ】図４に示される例示の陽圧マニホルドを示す概略図である。
【図４】別個の媒体リザーバを備え、静脈ドレナージが監視される陰圧乾燥換気システムを含む、例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図５】陽圧湿潤換気システムおよび灌流システムを含む例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図６】陽圧乾燥換気システムおよび灌流システムを含む例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図７】器官培養チャンバに接続された空気圧制御モジュールを示す概略図である。
【図８】灌流システムを備えるとともに、図７に示されるような空気圧制御モジュールを備えた、陰圧湿潤換気システムを含む例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図９】図３に示される陽圧モジュールおよび図７に示される空気圧制御モジュールを備えた、陰圧乾燥換気システムを含む例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図１０−１】臨床用の例示の肺バイオリアクタを示す概略図である。
【図１０−２】図１０Ｂ〜１０Ｃは、分離肺培養物からの例示の換気量（上）および圧力（下）のトレースを含む、肺培養物と関連付けられた生理学的データを示すグラフであって、上側のプロットにおける不連続性がＰＥＥＰ弁を出る体積を表し、ＶＴが１回呼吸量を表し、ＲＲが呼吸数を表し、ＰＴが気管圧を表し、ＰＯＣが器官チャンバ圧力を表し、Ｉが吸気時間を表し、Ｅが呼気時間を表す、グラフである。図１０Ｄは、生体内で肺に作用する力を示す概略図である。
【図１１−１】図１１Ａは、ブタ肺の短期間（２４時間）分離肺培養（ＩＬＣ）後の器官重量の変化を表す生理学的データのグラフである。図１１Ｂは、ブタ肺の短期間ＩＬＣ中におけるＰＡからＰＶへの培養媒体の溶解Ｏ２、溶解ＣＯ２、およびグルコースの含量の変化を表す生理学的データのグラフであって、示されるデータが条件毎の３つの独立した短期間ＩＬＣを包含しており、培養されている肺の各組に対して２４時間の期間毎に５〜７回媒体をサンプリングした、グラフである。図１１Ｅは、短期間ＩＬＣ後のブタ肺組織におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化を表す生理学的データのグラフである。
【図１１−２】図１１Ｃは、短期間ＩＬＣ後のブタ肺組織をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した結果を示す画像である（スケールバー２５０μｍ）。図１１Ｄは、短期間ＩＬＣ後のブタ肺組織のＴＵＮＥＬアッセイの結果を示す画像であって、核およびＴＵＮＥＬ陽性細胞がそれぞれ青色および緑色である（スケールバー１５０μｍ）、画像である。
【図１２−１】図１２Ａは、ブタ肺の長期間（７２時間）ＩＬＣ中におけるＰＡからＰＶへの培養媒体の溶解Ｏ２、溶解ＣＯ２、グルコース、および乳酸の含量の変化を表す生理学的データのグラフであって、示されるデータが条件毎の４つの独立した長期間ＩＬＣを包含しており、培養されている肺の各組に対して２４時間の期間毎に３〜５回媒体をサンプリングした、グラフである。図１２Ｂは、長期間ＩＬＣ下のブタ肺の酸素交換機能（左側）、ならびに機能試験後のＰＡ（オレンジ色）およびＰＶ（緑色）のｐＯ２値（右側）を表す生理学的データのグラフである。
【図１２−２】図１２Ｃは、長期間ＩＬＣ下で培養されたブタ肺の灌流力学を表す生理学的データのグラフであって、バイオリアクタシステム内の総媒体量（上）、肺動脈流量（ＱＰＡ、上から２番目）、肺動脈圧力（ＰＰＡ、下から２番目）、肺血管抵抗（ＰＶＲ、下）を表し、黒い線が平均を表し、グレーの線が平均±ＳＥＭを表す、グラフである。
【図１２−３】図１２Ｄは、長期間ＩＬＣ後のブタ肺組織の例示のＴＵＮＥＬ画像（左側）、ならびにＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化（右側）を示す図である。図１２Ｅは、長期間ＩＬＣの前（０時間）および後（７２時間）のブタ肺組織の組織学的分析および免疫蛍光分析を示す画像であって、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ、スケールバー２５０μｍ）、ならびにＶＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１、およびプロＳＰＢ（赤色、核は青色、スケールバー５０μｍ）を示す画像である。
【図１３−１】図１３Ａは、単一のヒト肺の長期間（７２時間）ＩＬＣ中におけるＰＡからＰＶへの培養媒体の溶解Ｏ２、溶解ＣＯ２、グルコース、および乳酸の含量の変化を表す生理学的データのグラフであって、２４時間の期間毎に４回媒体をサンプリングした、グラフである。図１３Ｂは、長期間ＩＬＣ下でのヒト肺の酸素交換機能（左側）、ならびに機能試験後のＰＡ（オレンジ色）およびＰＶ（緑色）のｐＯ２値（右側）を表す生理学的データのグラフである。
【図１３−２】図１３Ｃは、長期間ＩＬＣ下で培養されたヒト肺の灌流力学を表す生理学的データのグラフであって、バイオリアクタシステム内の総媒体量（上）、肺動脈流量（ＱＰＡ、上から２番目）、肺動脈圧力（ＰＰＡ、下から２番目）、肺血管抵抗（ＰＶＲ、下）を表し、黒い線が平均を示し、グレーの線が平均±ＳＥＭを表す、グラフである。
【図１３−３】図１３Ｄは、長期間ＩＬＣ後のヒト肺組織の例示のＴＵＮＥＬ画像（左側）、ならびにＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化（右側）を示す図である。図１３Ｅは、長期間ＩＬＣの前（０時間）および後（７２時間）のブタ肺組織の組織学的分析および免疫蛍光分析を示す画像であって、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ、スケールバー２５０μｍ）、ならびにＶＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１、およびプロＳＰＢ（赤色、核は青色、スケールバー５０μｍ）を示す画像である。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、熱生理学的（physiothermal）条件下で、５％デキストランに加えて０．６ｍｌ／分のＫＨＢを用いて灌流した、ラット肺の保存と関連付けられる生理学的データのグラフであって、図１４Ａは、主要チャンバ圧力が０〜８ｃｍＨ２Ｏに調節され、呼吸数が２０回／分であったことを示す投影図、図１４Ｂは、時間に伴う灌流圧力の維持を実証する、ＰＡ灌流圧力時間経過を示す棒グラフ、図１４Ｃは、動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）がやはり時間に伴って減少したことを示す棒グラフである（この実験において、分離肺は４時間の灌流にわたって浮腫を生じ、Ｃｄｙｎは、１回呼吸量（ｍｌ）をピーク主要チャンバ陰圧値（ｃｍＨ２Ｏ）で割ったものとして定義した）。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、熱生理学的条件下で、０．６ｍｌ／分のＫＨＢを用いて灌流した、ラット肺の保存と関連付けられる生理学的データのグラフであって、図１５Ａは、圧力が徐々に減少したことを実証する、ＰＡ灌流圧力の時間経過を示す棒グラフ、図１５Ｂは、動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）がやはり時間に伴って減少したことを示す棒グラフである（この実験において、分離肺は４時間の灌流によって浮腫状になった）。図１５Ｃは、灌流後の肺試料をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した結果を示す画像であって、左側のパネルは対照を１００倍で示し、右側のパネルは６時間の灌流後のサンプルを１００倍で示し、６時間の灌流後の正常な肺構造および細胞の完全性の維持、ならびにバイオリアクタ内の脳死肺の換気を示す、画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本文書は、気道器官の産生および保存に関与する方法および材料に関する。本発明は、少なくとも部分的には、ヒトおよび他の動物に移植できる状態の、機能する気道器官の成長のためのより現実的な環境を提供するのに使用することができる、機能する肺組織を産生するように構成されたバイオリアクタの発見に基づく。肺組織は、所与のマトリックス、例えば人工または脱細胞化肺組織マトリックスの上で産生される。本発明はさらに、より多くの改善され個別化された移植用グラフトを提供するために、長期間にわたって、ドナー器官の保存、修復、および改変のためにこの現実的な環境を使用することに基づく。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「機能する」肺組織は、正常の健康な肺の機能のほとんどまたはすべてを行い、例えば、酸素を空気中から血流中へと輸送すること、および二酸化炭素を血流から空気中へと放出することを可能にする。それにより、吸入した空気を加湿し、肺胞内の表面張力を減少させる界面活性物質を生成し、かつ／または粘液を生成し輸送して、吸入した粒子状物質を遠位気道から近位気道へと除去することができる。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「脱細胞化」および「無細胞」という用語は、標準的な組織学的染色手順を使用して、組織学的切片中に検出可能な細胞内物質、内皮細胞、上皮細胞、および核が完全にもしくはほぼ完全に不在であることとして使用または定義される。好ましくは、ただし必須ではないが、残余の細胞残屑も脱細胞化器官または組織から除去されている。
【００４２】
脱細胞化組織／器官マトリックス
本発明の方法のいくつかの実施形態では、肺組織は脱細胞化マトリックスの上に産生される。脱細胞化肺組織マトリックスを調製する方法および材料は、以下に考察されるように、当該分野において知られている。任意の適切な材料を使用して、かかるマトリックスを調製することができる。好ましい実施形態では、組織マトリックスは、脱細胞化肺組織から生じた無細胞組織骨格であることができる。例えば、ヒト肺などの組織、例えば１つもしくは一対のヒト肺またはその一部、例えばヒト、ブタ、ウシ、霊長目、またはヒツジの死体肺またはその一部は、形態学的完全性および組織もしくは組織部分の血管系を維持するとともに、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を保存しながら天然細胞を組織から除去する、適切な方法によって脱細胞化することができる。哺乳類肺組織を脱細胞化する方法は、例えば、O'Neill JD et al., Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering, Ann Thorac Surg. 2013 Sep;96(3):1046-55; Nichols JE et al., Production and assessment of dcellularized pig and human lung scaffolds, Tissue Eng Part A. 2013 Sep;19 (17-18):2045-62; Gilpin SE et al., Perfusion Decellularizatoin of human and porcine lungs: Bringing the matrix to clinical scale. Journal of Heart and Lung Transplantation.  In press; Song JJ et al., Bioartificial lung engineering. Am J Transplant. 2012 Feb;12(2):283-8、ならびにOtt HC et al., Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung, Nat Med. 2010 Aug;16(8):927-33に記載されている。例示の脱細胞化方法は、組織（例えば、肺組織）を、例えば液体窒素を使用して、繰返し凍結融解サイクルに晒すことを含むことができる。他の例では、組織は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはトリトンＸなど、アニオン性またはイオン性細胞破壊媒体に晒すことができる。組織はまた、ヌクレアーゼ溶液（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ）で処理し、滅菌リン酸で緩衝した食塩水中で軽く撹拌して洗うことができる。例示の方法は、当該分野において知られている。例えば、 O'Neill JD et al., Decellularization of human and porcin lung tissues for pulmonary tissue engineering.  Ann Thorac Surg. 2013 Sep; 96(3):1046-55を参照のこと。いくつかの例では、脱細胞化は、当該分野で知られている方法および材料を使用して、器官または組織の脈管、管、および／または腔を洗い流すことによって行うことができる。例えば、Maghsoudlou P et al. Preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment. Biomaterials. 2013 Sep; 34(28):6638-48に記載されているようなものである。洗い流すステップに続いて、器官または組織を、上述したような、例えば脱イオン化水中にＳＤＳ１％の細胞破壊媒体を用いて、ラインを介して灌流することができる。組織を通る灌流は順行性または逆行性であることができ、灌流効率を改善するために方向を変更することができる。器官または組織のサイズおよび重量、ならびに特定のアニオン性またはイオン性界面活性物質、および細胞破壊媒体中のアニオン性またはイオン性界面活性物質の濃度に応じて、組織は一般に、組織１グラム当たり約２〜約１２時間、細胞破壊媒体で灌流される。洗浄を含めて、器官は、組織１グラム当たり最大約１２〜約７２時間灌流されて���よい。灌流は、一般に、流量および圧力、例えば５〜１００ｍｍＨｇの圧力、および元の生物もしくは個人の生理学的心拍出量の０．１〜１０倍の流量を含む、生理学的条件に合わせて調節される。
【００４３】
別の例示的方法では、脱細胞化方法は、界面活性物質、例えば（１）ＳＤＳ０．１％、（２）デオキシコール酸ナトリウム２％、または（３）［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）（ｐＨ１２）８ｍｍｏｌ／リットルの界面活性物質を、３０ｃｍＨ２Ｏの一定圧力で肺動脈を通して灌流することを含む。３つの界面活性物質に対するプロトコルは、次のとおりである。
１．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０分間の初期順行性洗浄を行う。
２．不透明な半透明マトリックスの可視化（脱細胞化を含む）に要する時間に加えて初期時間に２０％を追加した時間（例えば、７０分＋１４分）、界面活性物質の灌流を行う。
３．１５分の脱イオン化Ｈ２Ｏ洗浄を行う。
４．追加の抗生物質および抗真菌剤を用いて、さらに１７２時間のＰＢＳ洗浄を行う。この脱細胞化方法は、例えば、脱イオン化したＨ２Ｏに続いて、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを用いてさらに洗浄することを含むことができる。ＳＤＣプロトコルは、ＳＤＣの前に０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで灌流すること、またＳＤＣの後に１ｍｏｌ／リットルのＮａＣｌで洗浄することを含むことができる。
【００４４】
同様に、ブタおよびヒト肺脱細胞化方法は、界面活性物質または他の脱細胞化剤を一定圧力で肺動脈を通して灌流し、それに続いてＨ２Ｏ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの１％溶液、およびＰＢＳを用いて連続的に洗浄することを含むことができる。ラット肺と同様に、脱細胞化は、視認検査および不透明な半透明マトリックスの出現で完了したと見なすことができる。主に摘出中における広範囲な事前洗浄に起因する開始器官の可変性、結果として生じる血塊が、求められる灌流の長さに寄与する場合がある。一般に、脱細胞化灌流の時間は、例えば４〜７日間で変動し得る。
【００４５】
脱細胞化組織は、血管樹のＥＣＭ成分を含む、組織のすべてまたはほとんどの部分の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分から本質的に（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、および９９重量％純粋）成ることができる。ＥＣＭ成分は、基底層などの規定構造として器質化されたままであることができる、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン類のメンバー（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）、グリコサミノグリカン、基質、細網繊維、ならびにスロンボスポンジンのいずれかまたはすべてを含むことができる。好ましい実施形態では、脱細胞化肺組織マトリックスは無処置の血管系を保持する。実質的に無処置の血管系を保存することによって、移植の際に組織マトリックスを対象の血管系に接続することが可能になる。それに加えて、脱細胞化組織マトリックスは、例えば、脱細胞化組織マトリックスの上もしくは中に残るあらゆるタイプの微生物の存在を低減または排除するため、照射（例えば、ＵＶ、ガンマ）によってさらに処理することができる。
【００４６】
物理的、化学的、および酵素的手段を使用して脱細胞化組織マトリックスを得る方法は、当該分野において知られている。例えば、Liao et al, Biomaterials 29(8):1065-74(2008); Gilbert et al. Biomaterials 27(9):3675-83(2006); Teebken et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 19381-86(2000)を参照のこと。また、米国特許出願公開第２００９／０１４２８３６号明細書、第２００５／０２５６５８８号明細書、第２００７／０２４４５６８号明細書、および第２００３／００８７４２８号明細書も参照のこと。
【００４７】
人工器官マトリックス
本発明の方法のいくつかの実施形態では、肺組織は人工器官マトリックスの上に産生される。人工器官マトリックスを調製する方法および材料は、当該分野において知られている。任意の適切な材料を使用して、かかるマトリックスを調製することができる。好ましい実施形態では、人工器官マトリックスは、例えば、ポリグリコール酸、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（ＰＦ−１２７）、Ｇｅｌｆｏａｍスポンジ、コラーゲン−グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、フィブリノゲンーフィブロネクチン−ビトロネクチンヒドロゲル（ＦＦＶＨ）、およびエラスチンなどの多孔質材料から生じた骨格であることができる。例えば、Ingenito et al. J Tissue Eng Regen Med. 2009 Dec 17; Hoganson et al., Pediatric Research, May 2008, 63(5):520-526; Chen et al., Tissue Eng. 2005 Sep-Oct;11(9-10):1436-48を参照のこと。いくつかの例では、人工器官マトリックスは、肺胞単位に類似した多孔質構造を有することができる。Andrade et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007 Feb;292(2):L510-8を参照のこと。いくつかの例では、移植人工器官マトリックスは、器官特異的なマーカー（例えば、クラーラ細胞、肺細胞、および呼吸上皮に対する肺特異的なマーカー）を発現することができる。いくつかの場合では、移植人工器官マトリックスは、特定可能な構造（例えば、人工肺マトリックス内の肺胞および終末細気管支に類似した構造）を組織することができる。例えば、ＦＦＶＨを使用して作られた移植人工肺マトリックスは、周囲組織に対する栄養作用を示して、細胞付着、伝播、ならびに細胞外マトリックスの生体外での発現および生体内での見かけ上の生着を促進することができる。上述のIngenito et al.を参照のこと。また、米国特許第７，６６２，４０９号明細書および第６，０８７，５５２号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００３４７９１号明細書、第２００９／００７５２８２号明細書、第２００９／００３５８５５号明細書、第２００８／０２９２６７７号明細書、第２００８／０１３１４７３号明細書、第２００７／００５９２９３号明細書、第２００５／０１９６４２３号明細書、第２００３／０１６６２７４号明細書、第２００３／０１２９７５１号明細書、第２００２／０１８２２６１号明細書、第２００２／０１８２２４１号明細書、および第２００２／０１７２７０５号明細書を参照のこと。
【００４８】
死体器官
本明細書に記載する方法およびデバイスはまた、移植に使用するために死体肺を維持し調製するのに有用である。
【００４９】
ドナー器官（例えば、肺）をヒトおよび動物のドナーから分離する方法および材料は、当該分野において知られている。例えば、Pasque MK et al. Standardizing thoracic organ procurement for transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010 Jan;139(1):13-7、およびBribriesco AC et al Experimental models of lung transplantation. Front Biosci （Elite Ed）. 2013 Jan 1;5:266-72に記載されている。これらを分離する任意の適切な方法を使用することができる。これらのドナー器官は、本明細書に記載するバイオリアクタを使用して、移植のレシピエントを準備するのに十分な時間、器官をレシピエントのところへ輸送するのに十分な時間、または器官全体もしくはその一部を移植に適切なように修復するのを容易にする条件下で器官を維持するのに十分な時間、維持することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ヒト器官ドナーからのドナー器官は、内皮ライニングを除去するように改変し、それに続いてレシピエント由来の内皮細胞を再播種して、免疫性を最小限に抑えることができる。例えば、これは、脱イオン化水を用いた灌流、ポリドカノール０．０５％などの低い界面活性物質濃度での灌流、またはＤＮアーゼなどの酵素溶液もしくはコラゲナーゼを用いた灌流を介した、浸透圧刺激によって達成することができる。感染、外傷などの物理的損傷、もしくは長期の低灌流による虚血性の損傷が原因で、または脳死などのドナー条件が原因で、即時の移植に適さないことが見出されたドナー器官は、本明細書に記載するデバイスおよび方法（例えば、抗生物質、細胞、成長因子刺激、および抗炎症治療を使用したマウント、灌流、および修復）を使用して修復することができる。動物由来の器官は、遺伝子および細胞の改変によって免疫原性を低くすることができる。
【００５１】
いくつかの場合では、ドナー肺は、Ｘ線撮影または気管支鏡によって感染のエビデンスを示すことがある。潜在的な感染のバイオバーデンおよび他のソースを制御するために、肺を、例えば本明細書に記載のデバイス上に載置し、血管系および気管の両方を通して抗生物質および防腐剤の溶液で洗浄することができる。溶液は、次に、例えば気管支鏡を使用して、ドナー肺から吸引することができる。この洗浄処置は、培養前および培養中の両方で行うことができる。特定の例では、死亡前の肺塞栓症、または心停止後の血液凝固が起こって、血塊形成のリスクがもたらされることがある。分離されたドナー器官を載置し、肺静脈を介して逆行的に洗浄して、血塊を除去することができ、ならびに／あるいは血栓溶解物質を用いて灌流して、血塊の可能性があればそれを溶解することができる。いくつかの例では、ドナー器官は、ドナーの脳死に多くの場合は関連する、ドナー肺中の肺胞マクロファージにおいて、高レベルの炎症性サイトカインおよび／または炎症状態を含むことがある（Venkateswaran RV et al., The proinflammatory environment in potential heart and lung donors: prevalence and impact of donor management and hormonal therapy. Transplantation. 2009 Aug 27;88(4):582-8）。これらの肺は、器官培養前および／または器官培養中に、抗炎症剤を用いて処理（例えば、灌流）することができる。特定の例では、炎症細胞タイプを特異的に標的にする薬物を灌流させてもよい。この炎症状態はまた、例えば、Venkateswaran RV et al., Measurement of extravascular lung water following human brain death: implications for lung donor assessment and transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 2013 Jun;43(6):1227-32に記載されているような、ドナー器官における毛細管の漏れおよび組織液増加に結び付く場合がある。保存期間の間、器官を高浸透圧溶液で灌流して、組織液を血管空間に引き戻し、それによってより健康な流体均衡と、正常な肺コンプライアンスを回復することができる。
【００５２】
いくつかの場合では、保存溶液はまた、グラフト失敗のリスクを低減するため、本明細書に記載のデバイスを介して肺に投与されてもよい。いくつかの例では、保存流体は、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（登録商標）、または表１に示されるような組成など、低カリウム細胞外タイプの溶液を含んでもよい。アミノ酸、抗生物質、または作用薬（例えば、表２に示されるもの）も、保存溶液に添加されてもよい。
【００５３】
【表１】
2017512492.tif 000003
【００５４】
【表２】
2017512492.tif 000004
【００５５】
いくつかの場合では、ドナー肺は、例えば、ドナー肺の質、保存溶液のタイプ、摘出から培養までの時間長など、様々な因子によってもたらされる損傷のエビデンスを示すことがある。損傷の程度を低減および／または排除するために、ドナー肺および／またはその一部を、例えば本明細書に記載するデバイス上に載置し、液体および／または乾燥換気で換気することができる。一例では、気管ライン全体にわたって空気が灌流され、一方で空洞および／または動脈ラインは、生理学的パラメータを模倣した溶液、例えば生理食塩水、溶液を含有する血液、および／または保存溶液で灌流される。ドナー肺は、ドナー肺が移植に必要となるまで、および／または損傷したドナー肺が上皮再生を示し、内皮バリア機能の改善を示すまで、載置されたままであってもよい。これらの灌流方法は、後述するようは、細胞播種方法と組み合わせることができる。
【００５６】
細胞播種
本明細書に記載する方法のいくつかでは、肺組織マトリックス、例えば脱細胞化肺組織マトリックスまたは人工肺マトリックスに、細胞が、例えば分化細胞または再生細胞が播種される。
【００５７】
天然または未分化の細胞タイプなど、任意の適切な再生細胞タイプを使用して、肺組織マトリックスに播種することができる。細胞は、幹細胞段階（例えば、誘導後）、始原細胞段階、血管芽細胞段階、または分化段階（例えば、ＣＤ  ３１＋、ｖＷＦ＋）を含むがそれらに限定されない、様々な段階で播種されてもよい。本明細書で使用するとき、再生細胞は、非限定的に、始原細胞、前駆細胞、ならびに臍帯細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞）および胎児幹細胞を含む「成体」由来の幹細胞を含むことができる。再生細胞はまた、分化または委任細胞タイプを含むことができる。本明細書に提供する方法および材料に適した幹細胞としては、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、未分化、分化内胚葉、前方化（anteriorized）内胚葉、ＴＴＦ−１陽性肺前駆体）、ヒト間葉系幹細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、多能性成体始原細胞（MAPC）、ｉＰＳ由来の間葉細胞、または胚性幹細胞を挙げることができる。いくつかの例では、他の組織由来の再生細胞も使用することができる。例えば、皮膚、骨、筋肉、骨髄、滑膜、または脂肪組織由来の再生細胞を使用して、幹細胞が播種された組織マトリックスを生じさせることができる。
【００５８】
いくつかの場合では、本明細書で提供する肺組織マトリックスは、別の方法として、またはさらに、（好ましくはヒトの）上皮細胞および内皮細胞など、分化細胞タイプを播種することができる。例えば、肺マトリックスに、血管系を介して（例えば、動脈ラインまたは静脈ラインを通して）内皮細胞を播種することができ、また、気道を介して（例えば、気管ラインを通して）上皮細胞を播種することができる。また、肺マトリックスに、１つ以上の細胞タイプ（例えば、１つもしくはそれ以上のタイプの上皮および間葉細胞、成体の末梢血液由来の上皮細胞、臍帯血由来の上皮細胞、ｉＰＳ由来の上皮細胞、始原段階細胞（例えば、平滑筋）、成体肺由来の細胞混合物（例えば、ラット・ヒト）、市販の小気道上皮細胞または肺胞上皮細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞由来の上皮細胞、ならびに／あるいはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種することができる。
【００５９】
任意のタイプの適切な市販の媒体および／または媒体キットを、細胞の播種および培養に使用してもよい。例えば、ＳＡＧＭ媒体が小気道細胞に使用されてもよく（例えば、Ｌｏｎｚａ製のＳＡＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）、またＥＧＭ−２キットが内皮細胞に使用されてもよい（例えば、Ｌｏｎｚａ製のＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）。例えば、 Brudno Y et al. Enhancing microvascular formation and vessel maturation through temporal control over multiple pro-angiogenic and pro-maturation factors. Biomaterials 34(2013) 9201-9209に記載されているように、播種された内皮細胞タイプに合わせて、（例えば、ＶＥＧＦなどの成長因子を増加もしくは減少させることによって）カスタマイズした媒体が使用されてもよい。内皮細胞の場合、細胞の播種、増殖、生着、および成熟の様々な段階を誘導するため、一連の異なる媒体組成が使用されてもよい。例えば、第１の段階では、細胞播種構成物は、内皮細胞の増殖、移動、および代謝を増加させるため、「血管形成媒体」で２〜３０日間灌流されてもよい。この媒体は、高濃度のサイトカイン、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび５〜１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、およびホルボールミリスタートアセテート（ＰＭＡ）の存在、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡによって特徴付けられ、それにより、タンパク質キナーゼＣ、および内皮細胞の出芽を刺激するＡｎｇ−１の活性化を通して、血管形成経路を活性化させる。第２の段階では、細胞播種構成物を、次に、内皮の成熟および密着結合の形成を支援する、「密着媒体（tightening media）」を用いて灌流することができる。密着媒体は、低レベルのサイトカインを有し、基本的組成は血管形成媒体と同じであるが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＭＡのレベルが減少している（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＭＡは０．１〜５ｎｇ／ｍｌ）。密接結合形成を促進し、肺浮腫を低減することが示されているヒドロコルチゾンを、密着媒体にさらに添加して、血管の成熟を促進することができる。脈管形成を向上させるため、ＰＤＧＦおよびＡｎｇ−２などのさらなる成熟促進因子が、密着媒体に添加されてもよい。これらの因子の濃度は、異なる脈管サイズに対応するように滴定されてもよい。急激なサイトカインの変化による悪影響を回避するため、媒体の変更は徐々に行うことができる。内皮細胞支持媒体と同様に、連続的な媒体の変化を使用して上皮細胞の運命をガイドすることができる。初期媒体は、例えば、胚体内胚葉を誘導するため、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、および０．０１〜１μＭのＺＳＴＫ  ４７４などのＰｉ３Ｋ阻害剤を含有してもよく、それに続いて、前方化内胚葉を誘導するため、０．１〜１０μＭのＡ−８３０１などのＴＧＦ−β阻害剤および０．０５〜１μＭのＤＭＨ−１などのＢＭＰ４拮抗薬を含有してもよく、最後に、肺始原細胞の生成を誘導するため、１〜１００μｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１０〜５００ｎＧ／ｍｌのＦＧＦ２、１０〜５００ｎＭのＣＨＩＲ  ９９０２１などのＧＳＫ−３β阻害剤、１〜１００ｎＭのＰＩＫ−７５などのＰＩ３Ｋ阻害剤、および１〜１００ｎＭのメトトレキセートを含有してもよい。
【００６０】
播種のために細胞を分離し収集する任意の適切な方法を使用することができる。例えば、人工多能性幹細胞は、一般に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８などの転写因子の異所的発現によって、多能性状態に「再プログラムされた」体細胞から得ることができる。Takahashi et al., Cell 131:861-72(2007); Park et al., Nature 451:141-146(2008); Yu et al., Science 318:1917-20(2007); Zhu et al., Cell Stem Cell. 7:651-5 2010; and Li et al., Cell Res. 21:196-204 (2001); Malik and Rao, Methods Mol Biol. 2013;997:23-33; Okano et al., Circ Res. 2013 Feb 1;112(3):523-33; Lin and Ying, Methods Mol Biol. 2013;936:295-312を参照のこと。末梢血液由来の単核細胞を、患者の血液サンプルから分離し、人工多能性幹細胞の産生に使用することができる。他の例では、人工多能性幹細胞は、変異成長因子β（ＳＢ４３１５４２）、ＭＥＫ／ＥＲＫ（ＰＤ０３２５９０１）、およびＲｈｏキナーゼ情報伝達（チアゾビビン）などの小分子と併せて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭＹＣの同時発現を高めるために最適化した構成物を用いて再プログラムすることによって得ることができる。Groβ et al., Curr Mol Med. 13:765-76 (2013)およびHou et al., Science 341:651-654(2013)を参照のこと。幹細胞から内皮細胞を産生する方法は、Reed et al., Br J Clin Pharmacol. 2013 Apr;75(4):897-906で検討されている。臍帯血幹細胞は、新鮮なまたは凍結した臍帯血から分離することができる。間葉系幹細胞は、例えば、生の未精製の骨髄またはフィコール精製骨髄から分離することができる。上皮および内皮細胞は、当該分野で知られている方法にしたがって、生体または死体ドナーから、例えば人工肺を受け入れる予定の対象から、分離し収集することができる。例えば、上皮細胞は皮膚組織サンプルから得ることができ（例えば、パンチ生検）、内皮細胞は血管組織サンプルから得ることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質分解酵素は、血管系に入れられたカテーテルを通して、組織サンプル内に灌流される。酵素処理された組織の一部を、さらに酵素的および機械的に破壊することができる。このようにして得られた細胞の混合物を分離して、上皮および内皮細胞を精製することができる。いくつかの例では、フローサイトメトリーに基づく方法（例えば、蛍光励起細胞選別）を使用して、特定の細胞表面マーカーが存在するかしないかに基づいて、細胞を選別することができる。さらに、肺細胞（上皮、間葉系、および内皮）を、経気管支および気管支内生検を介して、または肺組織の外科的生検を介して得ることができる、肺生検から得ることができる。非自家細胞が使用される場合、対象に移植したときに器官または組織が拒絶されないように、免疫型が適合した細胞を選択することを考慮すべきである。
【００６１】
分離された細胞は、緩衝溶液（例えば、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水）中ですすぎ、細胞培養媒体に再懸濁することができる。標準的な細胞培養方法を使用して、細胞を培養し、その個体数を増殖させることができる。一旦得られると、細胞を使用して組織マトリックスに播種することができ、例えば、動脈もしくは静脈ラインを介して（内皮細胞）、または気道（気管）ラインを通して（上皮細胞）、マトリックスに導入することができる。例えば、組織マトリックスに、任意の適切な細胞密度で、生体外で少なくとも１つの細胞タイプを播種することができる。例えば、マトリックスに播種される細胞密度は、マトリックス１グラム当たり少なくとも１×１０３個であることができる。細胞密度は、マトリックス１グラム当たり約１×１０５〜約１×１０１０個（例えば、マトリックス１グラム当たり、少なくとも１００，０００個、１、０００，０００個、１０，００，０００個、１００，０００，０００個、１，０００，０００，０００個、または１０，０００，０００，０００個であることができる。
【００６２】
いくつかの場合では、脱細胞化または人工肺組織マトリックスは、本明細書に提供するように、灌流播種によって、上述した細胞タイプおよび細胞密度で播種することができる。例えば、フロー灌流システムを使用して、（例えば、動脈ラインを通して）組織マトリックス中に保存された血管系を介して、脱細胞化肺組織マトリックスを播種することができる。いくつかの場合では、適切な条件下で、自動フロー灌流システムを使用することができる。かかる灌流播種方法は、播種効率を改善し、組成物全体に細胞のより均一な分布を提供することができる。定量的な生化学的および画像分析技術を使用して、静的または灌流どちらかの播種方法後における、播種された細胞の分布を評価することができる。
【００６３】
いくつかの場合では、組織マトリックスに１つまたはそれ以上の成長因子を含浸させて、播種された再生細胞の分化を刺激することができる。例えば、組織マトリックスには、本明細書に提供する方法および材料に適した成長因子を、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＴＦＧ−β成長因子、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１０、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、または成長分化因子−５（ＧＤＦ−５）を含浸させることができる。例えば、Desai and Cardoso, Respire. Res. 3-2(2002)を参照のこと。これらの成長因子は、時間的放出を制御するように封入することができる。骨格の異なる部分を、異なる成長因子で増進して、正著因子刺激の空間的制御を追加することができる。
【００６４】
播種された組織マトリックスを、播種後にある期間（例えば、数時間〜約１４日以上）にわたってインキュベートして、組織マトリクス内における細胞の固着および浸透を改善することができる。播種された組織マトリックスは、再生細胞の少なくとも一部が無細胞組織マトリックスの中および上で増加および／または分化することができる条件下で、維持することができる。かかる条件としては、非限定的に、適切な温度（３５〜３８℃）および／または圧力（例えば、大気圧）、電気的および／または機械的活性（例えば、呼気終端陽圧１〜２０ｃｍＨ２Ｏ、平均気道圧５〜５０ｃｍＨ２Ｏ、最高吸気圧５〜６５ｃｍＨ２Ｏで、陽圧もしくは陰圧を介した換気）、適切な量の流体、例えばＯ２（１〜１００％ＦｉＯ２）および／またはＣＯ２（０〜１０％ＦｉＣＯ２）、適切な量の湿度（１０〜１００％）、ならびに滅菌もしくは近滅菌条件を挙げることができる。かかる条件としては、湿潤換気、湿潤・乾燥換気、および乾燥換気も挙げることができる。いくつかの例では、栄養補助剤（例えば、栄養素、および／またはグルコースなどの炭素源）、外生ホルモン、または成長因子を、播種された組織マトリックスに添加することができる。組織学および細胞染色を行って、播種された細胞の伝播に関するアッセイを実施することができる。任意の適切な方法は、播種された細胞の分化に関するアッセイを行うことができる。一般に、本明細書に記載する方法は、例えば本明細書に記載するような、気道器官バイオリアクタ装置内で行われる。
【００６５】
したがって、本明細書に記載する方法を使用して、例えばヒト対象への移植のため、移植可能なバイオ人工肺組織を産生することができる。本明細書に記載するように、移植可能組織は、好ましくは、患者の血管系に接続することができる、十分に無傷の血管系を保持する。
【００６６】
本明細書に記載のバイオ人工肺組織は、製品またはキットを生成するため、パッケージ化材料と組み合わせることができる。製品を作成するための構成要素および方法は周知である。バイオ人工組織に加えて、製品またはキットは、例えば、１つもしくはそれ以上の癒着防止剤、滅菌水、製薬担体、緩衝剤、ならびに／あるいは生体外での機能する肺組織の産生および／またはその後の移植を促進する、他の試薬をさらに含むことができる。それに加えて、中に収容された組成物をどのように使用できるかを説明した印刷説明書をかかる製品に含めることができる。製品またはキットの構成要素は、様々な好適な容器にパッケージ化することができる。
【００６７】
バイオ人工肺を使用する方法
本書はまた、バイオ人工肺組織を使用する、またいくつかの場合では肺機能を促進する、方法および材料を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法を使用して、肺容量の障害または低下を伴う疾患を有する患者において一部の肺機能を回復することができる（例えば、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、気腫、肺がん、浮腫、肺高血圧症、肺外傷、または他の遺伝性もしくは先天性の肺異常、例えば、気管支嚢胞、肺の発育不全および形成不全、多肺胞葉、肺胞毛細血管異形成、動静脈奇形（ＡＶＭ）およびシミター症候群を含む隔離、肺リンパ管拡張症、先天性大葉性肺気腫（ＣＬＥ）、ならびに先天性腺種様奇形（ＣＡＭ）、および他の肺嚢胞）。本明細書に提供する方法は、また、例えば、肺機能の向上、または肺容量の増加もしくは改善など、特定の規定された治療が必要な場合などに対象が特定されるものを含む。
【００６８】
バイオ人工肺組織（例えば、器官全体またはその一部）は、本明細書に提供する方法にしたがって産生することができる。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に提供するようなバイオ人工肺組織を、それを必要としている対象（例えば、ヒト患者）に移植することを含む。いくつかの実施形態では、バイオ人工肺組織は病変または損傷した組織の部位に移植される。例えば、バイオ人工肺組織は、機能していないかもしくは十分に機能していない肺の代わりに（またはそれとともに）、対象の胸腔に移植することができ、肺移植を行う方法は当該分野で知られている。例えば、Boasquevisque et al., Surgical Techniques: Lung Transplant and Lung Volume Reduction, Proceedings of the American Thoracic Society 6:66-78 (2009); Camargo et al., Surgical maneuvers for the management of bronchial complications in lung transplantation, Eur J Cardiothorac Surg 2008;34:1206-1209 (2008); Yoshida et al., “Surgical Technique of Experimental Lung Transplantation in Rabbits,” Ann Thorac Cardiovasc Surg. 11(1):7-11 (2005); Venuta et al., Evolving Techniques and Perspectives in Lung Transplantation, Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683 (2005); Yang and Conte, Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522 (2000) Gaissert and Patterson, Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation in The Transplantation and Replacement of Thoracic Organs, 2d ed. Springer Netherlands (1996)を参照のこと。
【００６９】
方法は、対象の肺を部分的もしくは完全に除去する外科的処置の間、および／または肺切除の間に、本明細書に提供されるようなバイオ人工肺またはその一部を移植することを含むことができる。方法はまた、肺またはその一部を、生体ドナーまたは死体から摘出することと、肺を本明細書に記載するバイオリアクタ内で保存または再生することとを含むことができる。いくつかの場合では、本明細書に提供する方法を使用して、対象、例えばヒトまたは動物対象において、肺組織および機能を交換または補足することができる。
【００７０】
任意の適切な方法を行って、移植前または移植後の肺機能のアッセイを実施することができる。例えば、方法を行って、組織治癒の評価、機能性の評価、および細胞内成長の評価を行うことができる。いくつかの例では、組織部分を収集し、例えば中性緩衝ホルマリンなどの固定剤で処理することができる。かかる組織部分は、組織学的分析のため、脱水し、パラフィンに埋め込み、ミクロトームを用いて薄片にすることができる。薄片は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色し、次に、形態学および細胞性の顕微鏡的評価のため、ガラススライド上に載置することができる。例えば、組織学および細胞染色は、播種された細胞の伝播を検出するために行うことができる。アッセイは、移植された組織マトリックスの機能的評価、または撮像技術（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、もしくは磁気共鳴画像診断（例えば、コントラスト強調ＭＲＩ））を含むことができる。アッセイはさらに、安息時および生理学的ストレス下での機能性試験（例えば、体幹プレチスモグラフィ、肺機能試験）を含むことができる。細胞を播種したマトリックスの機能性は、当該分野で知られている方法、例えば、組織学、電子顕微鏡法、および機械的試験（例えば、容積およびコンプライアンスの）を使用してアッセイを行うことができる。ガス交換は、別の機能性アッセイとして測定することができる。細胞増殖のアッセイを行うため、例えばチミジン組込みを検出することによって、チミジンキナーゼ活性を測定することができる。いくつかの場合では、血液検査を行って、血中酸素のレベルに基づいて肺の機能を評定することができる。
【００７１】
培養中の機能性アッセイを容易にするため、本明細書に記載するバイオリアクタ装置の任意のラインは、機能性パラメータ（例えば、ｐＨ、グルコース、乳酸、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｃｌ、重炭酸、Ｏ２、ＣＯ２、血中酸素飽和度）の単一またはリアルタイムの測定を可能にする、サンプリングポートを含んでもよい。代謝物もまた、比色アッセイを使用して細胞の数および生存度を監視するのに使用されてもよく、生化学アッセイは、細胞成熟度を監視する（例えば、界面活性タンパク質などを測定する）のに使用されてもよい。例えば、界面活性物質の濃度増加は、培養肺が乾燥換気に耐えるのに十分な上皮細胞を有していることを示すことができる。いくつかの場合では、内皮バリア機能を、血管成熟度のマーカーとして使用することができる。肺は、異なるサイズの分子（規定のサイズのデキストラン、およびアルブミンなど）、およびマイクロビーズ（径は０．２から５μｍに増加）、ならびに分離された赤血球で灌流することができる。次に、気管支肺胞洗浄流体をサンプリングして、肺胞空間内へのこれらのマーカーの漏れを評価することができる。例えば、５００ｋＤａのデキストランを、気管支肺胞洗浄アッセイと組み合わせて使用して、血管区画内に保持されたデキストランの割合を判断することができる。保持されたデキストランの割合の増加は、バリア機能の改善を示すが、これは、デキストランに対するバリア機能が、生存可能かつ機能的な内皮に依存する一方で、デキストランが、一定の灌流中に時間に伴って、（例えば、無細胞肺内の）裸出した血管基底膜全体に拡散することに依存する。例えば、死体肺は、血管区画内の実質的にすべてのデキストランを保持することがあり、無細胞肺は、少ない割合のデキストラン（例えば、１０．０％±８．０％）を保持することがある。許容最小限よりも多い（例えば、４μｍのマイクロビーズで＞１０％、または０．２μｍのマイクロビーズで２０％超過）、肺胞空間内へのこれらのマーカーの漏れを使用して、肺が乾燥換気に耐えるのに十分に成熟していないことを示すことができる。
【００７２】
いくつかの場合では、ＲＴ−ＰＣＲなどの分子生物学技術を使用して、代謝マーカー（例えば、界面活性タンパク質、ムチン−１）および分化マーカー（例えば、ＴＴＦ−１、ｐ６３、界面活性タンパク質Ｃ）の発現を定量化することができる。任意の適切なＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用することができる。簡潔には、生物学的サンプル（例えば、腱サンプル）を均質化し、クロロホルム抽出を行い、スピンカラム（例えば、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア））または他の核酸結合物質を使用して全ＲＮＡを抽出することによって、全ＲＮＡを収集することができる。他の例では、肺細胞タイプ、およびかかる細胞タイプの分化の異なる段階と関連付けられたマーカーは、抗体および標準的な免疫アッセイを使用して検出することができる。
【００７３】
気道器官バイオリアクタ装置
例示の気道器官バイオリアクタが図１に示される。本明細書全体を通して、肺は気道器官の一例として提示される。他の例は、階層的な血管系構造、例えば葉または節を含む、肺の一部分を含むことができる。生体ドナーまたは死体からの摘出肺に対応する例示のバイオリアクタが、図８および９に示される。本明細書に記載するバイオリアクタのいずれも、仰臥位の肺の培養を可能にするように構成することができる。
【００７４】
図１を参照すると、バイオリアクタ１００の構成要素は、肺チャンバ１０１と、インキュベータチャンバ１０２と、動脈灌流ポンプ１０３と、動脈圧１０４と、動脈ライン１０５と、静脈ライン１０６と、気管ライン１０７と、フィルタ１０８と、酸素付加器１０９と、放出ライン１１２と、制御モジュール１１０と、静脈弁１１１と、動脈流量センサ１１４と、静脈灌流ポンプ１１６と、静脈圧力センサ１１８と、静脈流量センサ１２０と、気管弁１２２とを含む。少なくとも肺チャンバ１０１は、適切な温度および湿度を維持するため、インキュベータチャンバ１０２内に密封される。
【００７５】
バイオリアクタ１００により、肺動脈、肺静脈、または酸素化媒体の別の適切な通過を通して、一定圧力での灌流（酸素化媒体を用いる）が可能になる。肺チャンバ１０１は肺（図示なし）を保持する。肺の肺動脈は肺動脈ライン１０５に接続され、肺の肺静脈は静脈ライン１０６に接続され、肺の気管は気管ライン１０７に接続される。滅菌フィルタ１０８が肺チャンバ１０１内の圧力をインキュベータチャンバ１０２の圧力と平衡化するので、バイオリアクタ１００は中立圧力換気システムであり、一方で、気管弁１２２は通常開いているので、気管ライン１０７もインキュベータの圧力と平衡化される。
【００７６】
肺チャンバ１０１内で、細胞を肺マトリックス内で成長させるのに播種を可能にするために、細胞マトリックスは、細胞および媒体を用いて順行方向で灌流される。灌流は、気管弁１２２が開いたままの状態で、肺動脈までの動脈ライン１０５を通して、また肺静脈までの静脈ラインを通して行われる。この構成により、細胞および媒体が、動脈側および静脈側の両方から毛細管床に達することができ、媒体が無細胞基底膜を通して拡散し、気管を介して、または胸膜を横切ってマトリックスを出ることができる。
【００７７】
動脈流量センサ１１４および静脈流量センサ１２０は、これらのラインの流量を測定することができるセンサ（例えば、遷音速流量プローブ）である。流量センサは、本明細書に記載するバイオリアクタのいずれかの中の任意の流体ライン（例えば、任意の進入もしくは放出ライン、動脈ライン、静脈ライン、気管ライン、または酸素交換ライン）に組み込まれてもよい。特定の実施形態では、流量はまた、管材の直径および関連するポンプの速度に基づいて計算されてもよい。
【００７８】
細胞および／または媒体は、肺血管系を通る動脈ライン１０４および静脈ライン１０７を通って流れる。再循環させるため、媒体は酸素付加器１０９を通過する。酸素化媒体は、次に、バイオリアクタ１００を通して媒体を循環させる、動脈灌流ポンプ１０３または静脈灌流ポンプ１１６を流れる。このポンプは、動脈圧力センサ１０４および静脈圧力センサ１１８それぞれの圧力読取り値に基づいて、灌流ポンプ１０４および静脈ポンプ１１６の速度を制御する、制御モジュール１１０によって制御される。動脈および静脈灌流圧力は、細胞送達を最適化するために、細胞のサイズおよび数に基づいて改変することができる。制御モジュール１１０はまた、データ（例えば、動脈圧力センサ１０４および静脈圧力センサ１１８からの抵抗読取り値）を記録することができる。媒体は、回路を完成して、動脈ライン１０４および／または静脈ライン１０６に戻る。最初の順行性播種の間、媒体は、毛細管床に達する前に、または達すると、肺マトリックスを通って拡散する。骨格を通して媒体を案内するため、気管弁１２２を開放または閉止して肺の中の圧力を改変し、それによって骨格を通して媒体を案内することができる。いくつかの場合では、逆行性の播種を使用することができる。これらの場合では、細胞および／または媒体は静脈ライン１０７を通って流れ、酸素化媒体は静脈灌流ポンプ１１６へと流れ、それによって媒体がバイオリアクタ１００を通って循環する。順行性の播種と同様に、骨格を通して媒体を案内するため、気管弁１２２を開放または閉止して、肺の中の圧力を改変し、それによって骨格を通して媒体を案内することができる。
【００７９】
肺マトリックスの血管系抵抗が生理学的条件（例えば、肺マトリックスの再内皮化による血管抵抗の増加）に十分に耐えた後、バイオリアクタ１００は順行性灌流に切り替わる。血管系抵抗は、時間に伴って動脈圧力センサ１０４によって測定される。血管系が生成されるにつれて、血管膜を横切る拡散が減少して、動脈センサ１０４によって測定される圧力が増加する（即ち、血管抵抗が増加する）。いくつかの実施例では、粒子は、バイオリアクタ１００を通して灌流され、それらの進行は、血管膜を横切る拡散速度を判断するために監視される。
【００８０】
図２を参照すると、バイオリアクタ２００の構成要素は、肺チャンバ２０１と、インキュベータチャンバ２０２と、媒体リザーバ２０３と、動脈灌流ポンプ２０４と、排液ポンプ２０５と、動脈圧力センサ２０６と、チャンバ圧力センサ２０７と、気管圧センサ２０８と、静脈圧力センサ２０９と、動脈ライン２１０と、静脈ライン２１１と、気管ライン２１２と、フィルタ２１３と、酸素付加器２１４と、制御モジュール２１５と、静脈弁２１６と、気管弁２２１と、放出ライン２１７とを含む。肺チャンバ２０１は、適切な温度および湿度を維持するため、インキュベータチャンバ２０２内に密封される。
【００８１】
やはり図２を参照すると、バイオリアクタ２００は、フロー灌流システムと陰圧換気を組み合わせている。肺マトリックスは肺チャンバ２０２に入れられる。フロー灌流システムは、肺の肺動脈に接続された動脈ライン２１０を使用する。媒体は、媒体リザーバ２０３から吸引され、酸素付加器２１４を通過する。酸素付加器２１４は、例えば、入口地点２１８および出口地点２１９からの空気を、インキュベータチャンバ２０２を取り囲む環境と交換する。酸素付加器２１４を通過した後、動脈圧力センサ２０６は動脈圧を記録し、このデータを制御モジュール２１５に送信する。動脈圧読取り値は、次に、媒体をリザーバから肺動脈に給送するローラポンプを調整する。媒体は、次に、循環して放出ライン２１７を通って肺チャンバ２０１ｊから出て、排液ポンプ２０５を使用して媒体リザーバ２０３内へと給送される。排液ポンプ２０５は双方向性であり、媒体リザーバ２０３と肺チャンバ２０１との間で媒体を循環させるのに使用することができる。この再循環は、肺チャンバ２０１内の適正ｐＨを維持する助けにもなる。制御モジュール２１５は、チャンバ圧力センサ２０７によって記録された圧力読取り値に基づいて、排液ポンプ２０５を、例えば速度および／または方向を制御する。肺チャンバ２０１内のチャンバ圧力が変動するにつれて、液体は気管ライン２１２に流入し、またそこから流出する。静脈ライン２１１は媒体リザーバ２０３に対して開いているので、静脈圧力はチャンバ圧力に対して平衡化し、それによって、動脈から組織内への流体の流入を引き起こし得る肺内外圧較差を防ぐ。チャンバ圧力および給送を適宜監視することによって、肺チャンバ２０１の媒体レベルを維持することができる。
【００８２】
陰圧湿潤換気の間、流体が肺マトリックスを出入りして、肺チャンバ２０１内の圧力の変動が引き起こされる。この変動により、肺マトリックスの拡張および収縮ももたらされる。この拡張によって、液体が気管を繰り返し出入りし、流体が肺マトリックスを通って（例えば、肺静脈およびリンパ管を通って）変位して、肺チャンバ２０１に入る。これらの流体変位は、培養期間全体を通して変動する可能性があり、不安定な培養条件、チャンバ圧力の望ましくない増加、媒体のオーバーフロー、陰圧換気の失敗、および肺もしくは肺グラフトの損傷をもたらす可能性がある。チャンバ圧力センサ２０７を使用して肺チャンバ２０１の圧力を監視することによって、制御モジュール２１５が、排液ポンプ２０５の方向および持続時間を適切に調節することによって、これらの流体変位を補正することができる。例えば、肺チャンバ２０１内の媒体体積が増加するにつれて、圧力の増加がチャンバ圧力センサ２０７によって感知される。このデータは制御モジュール２１５に送信され、そこで灌流ポンプ２０５が十分な持続時間の間活性化されて、望ましい圧力が回復されるまで、余分な媒体が肺チャンバ２０１から媒体リザーバ２０３に戻される。
【００８３】
図２に示されるように、バイオリアクタ２００はまた、気管圧センサ２０８と静脈圧力センサ２０９とを含む。気管圧センサ２０８気道（例えば、気管）内の圧力を測定する。気管ライン２１２は、気管弁２２１によって媒体リザーバ２０３に接続され、気管ライン２１２内の圧力は、媒体リザーバ２０３内の圧力と平衡化する。気道圧を生理学的範囲に制限するため、媒体リザーバ２０３の高さを上昇させて、生成された気道陽圧を改変してもよい。チャンバ圧力が減少するにつれて、割合は少ないが気管圧も減少する。
【００８４】
バイオリアクタ２００はまた、静脈圧力センサ２０９を使用して、静脈ライン２１２と媒体リザーバ２０３との間の媒体交換速度を動的に監視することができる。システムに装填した後の静脈は、弁２１６が閉じているときはリザーバのレベルによって、または静脈弁２１６が開位置の場合はそれに取り付けることができる抵抗弁によって制御される。例えば、静脈弁２１６は通常は開位置にある。低圧の読取り値（例えば、＜−５ｍｍＨｇ）によって、静脈弁２１６がトリガされて閉じ（例えば、自動的にもしくはオペレータによって）、その結果、より高い静脈背圧がもたらされて後毛細血管が虚脱するのを防ぐ。圧力読取り値が高い（例えば、＞２０ｍｍＨｇ）場合、静脈弁２１６が開いて、静脈の後負荷を低減し、間質空間および気道内への流体変位を最小限に抑えることができる。
【００８５】
引き続き図２を参照すると、媒体チャンバ２０３内の圧力は、滅菌フィルタ２１３を通して周囲環境（例えば、インキュベータチャンバ）と平衡化される。この交換により、インキュベータチャンバ２０２と媒体リザーバ２０３との間でガス（例えば、二酸化炭素）を交換することも可能になり、このことは、システム内の媒体の適切なｐＨ値を維持する助けとなる。媒体リザーバ２０３の高さは、肺チャンバ２０１の高さに対して調節されてもよい。これにより、湿潤呼吸陽圧（positive wet respiratory pressure）がもたらされ、肺に関連する気管気道圧に影響が及ぼされる。例えば、媒体リザーバ２０３は、媒体に沈められた肺の上方４ｃｍに設定される。これによって、気道陽圧がもたらされる。
【００８６】
一般に、本明細書に記載するセンサのいずれかによって記録される圧力は、培養される器官に応じて、生理学的範囲内にある。例えば、動脈の範囲は平均１０〜３５ｍｍＨｇであってもよく、肺チャンバ２０１は平均−４０〜４０ｍｍＨｇであってもよい。
【００８７】
図３を参照すると、陽圧マニホルド３００は、気管ライン３０４と、圧力リザーバ３０２と、圧力解放弁３０１と、圧縮機３０３（例えば、加圧ガス源）、膨張式通気バッグ３０６と、マニホルド圧力センサ３０８とを含む。気管ライン３０４は、肺（図示なし）の気道に接続される。圧縮機３０３は圧力リザーバ３０３に陽圧を提供し、圧力リザーバ３０２内の圧力レベルは、圧力解放弁３０１によって改変することができる（例えば、圧力を低減することができる）。特定の実施形態では、陽圧マニホルド３００は、（例えば、気管圧センサ４０８によってもしくはマニホルド圧力３０８によって記録されるような）吸気および呼気に関連する気道内の圧力変動に応答して、圧力リザーバ３０２内の圧力を動的に調整するコンピュータ化システムである。膨張式通気バッグ３０６は、チャンバ、気道、および肺の中の圧力を一定に保ちながら、吸気および呼気の間の急激な容積変化に適応するように、圧力リザーバ３０２に取り付けられる。膨張式通気バッグ３０６の容積は、培養されている肺のサイズに応じて変動してもよい。例えば、膨張式バッグ３０６の容積は、２５０ｃｃ〜４０００ｃｃ、少なくとも２５０ｃｃ、４０００ｃｃ未満、３００ｃｃ〜３５００ｃｃ、４００ｃｃ〜３０００ｃｃ、５００ｃｃ〜２５００ｃｃ、６００ｃｃ〜２０００ｃｃ、７００ｃｃ〜１５００ｃｃ、８００ｃｃ〜１０００ｃｃであってもよい。膨張式通気バッグ３０６の材料は、可撓性、空気不透過性、および滅菌適性の材料（例えば、ラテックスまたはゴム）であってもよい。マニホルド圧力センサ３０８によって、終末呼気圧力の監視が容易になるとともに、換気ラインにおけるフローの計算が可能になる。
【００８８】
図３Ａを参照すると、陽圧マニホルド３２０は、上述したように、気管ライン３０４と、圧力リザーバ３０２と、圧力解放弁３０１と、圧縮機３０３（例えば、加圧ガス源）と、膨張式通気バッグ３０６と、マニホルド圧力センサ３０８とを含む。陽圧マニホルド３２０はまた、吸気弁３３０と、呼気弁３３２と、呼気圧力解放弁３３４とを含む。気管ライン３０４は、肺（図示なし）の気道に接続される。図３を参照して記載したように、圧縮機３２６は圧力リザーバ３０２に陽圧を提供し、圧力リザーバ３０２内の圧力レベルは、圧力解放弁３２４によって改変することができる（例えば、圧力を低減することができる）。気管ライン３２８はまた、吸気弁３３０および呼気弁３３２に接続される。吸気弁３３０および呼気弁は、流体、例えば空気が一方向で流れることを可能にし、逆流を防ぐ、一方向弁である。呼気相の間、空気は、気管ラインから、呼気弁３３２および呼気圧力弁３３４を通って呼気ライン（図示なし）に流れる。呼気流体は、吸気弁３３０により、圧力リザーバ３０２には入らない。吸気相の間、空気は、圧力リザーバから吸気弁３３０を通って、気管ライン３０４を介して肺の気道に流れる。呼気圧力解放弁３３４によって、呼気ラインが吸入相の間は陽圧を保持し、それによって吸入相の間、空気が呼気ラインを通って流れるのを防ぐことが担保される。
【００８９】
図４を参照すると、バイオリアクタ４００の構成要素は、肺チャンバ４０１と、インキュベータチャンバ４０２と、媒体リザーバ４０３と、動脈灌流ポンプ４０４と、排液ポンプ４０５と、動脈圧力センサ４０６と、チャンバ圧力センサ４０７と、気管圧センサ４０８と、静脈圧力センサ４０９と、動脈ライン４１０と、静脈ライン４１１と、気管ライン４１２と、滅菌フィルタ４１３と、酸素付加器４１４と、制御モジュール４１５と、静脈弁４１６と、陽圧マニホルド３００とを含む。バイオリアクタ４００は、灌流システムに加えて、例えば空気を使用した陰圧乾燥換気を含み、一般に、陽圧モジュールを除いてバイオリアクタ２００を参照して上述したように配置される。肺チャンバ４０１内の圧力は変動可能であって、肺マトリックスを膨張または収縮させる。
【００９０】
吸気相の間、肺チャンバ４０１内の圧力は気道圧力未満に低下し、それによって気道陰圧が作られる。この陰圧により、血管系から組織内へと流体が変位して、間質浮腫に結び付き、気道内の分泌物が増加する。これらの流体変位は、気管ライン４１２および取り付けられた管材の抵抗によって悪化する。呼気相の間、肺チャンバ４０１内の圧力は増加し、それによって気道陽圧が作られる。気管が大気圧に対して開いている場合、または中立圧力に接続されている場合、近位気道はチャンバ圧力によって圧縮されて虚脱し、それによって遠位気道および肺胞に空気が捕えられ、肺マトリックスが損傷する。陽圧マニホルド３００は、上述したように、適切なサイズ、例えば肺の１回呼吸量の約１０倍のサイズを有することによって、吸気および呼気の間の圧力変動を最小限に抑える。制御モジュール４１５は、上述したように、圧縮機３０３または圧力解放弁３０１を活性化させて、圧力リザーバ２０３内の一定圧力を維持し、それが吸気相および呼気相の間に、気管ライン４１２を通して気管に伝達される。バイオリアクタ２００と同様に、媒体は、肺チャンバ４０１と媒体リザーバ４０３との間で灌流ポンプ４０５によって入れ替えられる。動脈圧力センサ４０６と双方向動脈灌流ポンプ４０５との組み合わせは、（上述したような）肺チャンバ４０１内の適切な圧力および／または媒体流体レベルを維持するのに役立つ。
【００９１】
図５を参照すると、バイオリアクタ５００の構成要素は、肺チャンバ５０１と、インキュベータチャンバ５０２と、媒体リザーバ５０３と、動脈灌流ポンプ５０４と、排液ポンプ５０５と、湿潤換気ポンプ５０６と、動脈圧力センサ５０７と、チャンバ圧力センサ５０８と、気管圧センサ５０９と、静脈圧力センサ５１０と、動脈ライン５１１と、静脈ライン５１２と、気管ライン５１３と、滅菌フィルタ５１４と、酸素付加器５１５と、制御モジュール５１６と、静脈弁５１７とを含む。肺チャンバ５０１は肺マトリックス（図示なし）を保持する。バイオリアクタ１００、２００、および４００と同様に、肺の肺動脈は動脈ライン５１１に接続され、肺の肺静脈は静脈ライン５１２に接続され、肺の気管は気管ライン５１３に接続される。バイオリアクタ２００の特徴に加えて、バイオリアクタ５００は、気管ライン５１３に接続された湿潤換気ポンプ５０６をすでに含む。湿潤換気ポンプ５０６により、陽圧液体換気が可能になる。湿潤換気ポンプ５０６は、新鮮な媒体を媒体リザーバ５０３から引き出し、気管ライン５１３を通して媒体を給送し、それによって肺を液体（例えば、媒体）で膨張させる。湿潤換気ポンプ５０６は双方向性であり、液体を気管ラインから吸引し、それによって肺を収縮させる。湿潤換気ポンプは媒体リザーバ５０３から直接引き出すので、肺マトリックスは新鮮な媒体で継続的に膨張させられる。制御モジュール５１６は、気管圧センサ５０９によって送信された圧力読取り値に基づいて、湿潤換気ポンプ５０６の動作（例えば、持続時間、方向、および速度）を制御する。例えば、吸気中は５〜４５ｃｍＨ２Ｏの吸気陽圧が印加され、呼気中は５〜−１５ｃｍＨ２Ｏの呼気圧力が印加される。
【００９２】
湿潤換気および乾燥換気モードの間、換気は圧力制御（ＰＣ）または容量制御（ＶＣ）することができる。圧力制御モードでは、ポンプは、規定の期間（吸気時間、呼気時間）、陽圧、中立圧力、および陰圧の安定を想定して、規定の速度で、規定の吸気圧力および規定の呼気圧力を提供する。容量制御換気モードでは、ポンプは、特定の容積が吸気されるまで規定の吸気圧力を生成し、次に規定の安定を保持し、次に特定の規定の容量が呼出されるまで、または特定の規定の標的圧力に達するまで呼気圧力を生成し、次にポンプは、中立圧力または規定の呼出プラトー圧力で保持してもよい。容積の移動は、様々な流量計（例えば、熱ベース、差圧ベース、または超音波）によって測定されてもよい。これらの流量計は、最も正確なフロー測定を提供するため、肺チャンバの付近で気管ラインに取り付けなければならない。
【００９３】
バイオリアクタ２００に関して記載したように、肺組織からグラフチャンバ５０１へと変位した任意の流体は、双方向排液ポンプ５０５を使用して排液されて、媒体リザーバ５０３に自動的に戻される。制御モジュール５１６は、チャンバ圧力センサ５０８から収集されたデータに基づいて、排液ポンプ５０５を活性化する。図６を参照すると、バイオリアクタ６００の構成要素は、肺チャンバ６０１と、インキュベータチャンバ６０２と、媒体リザーバ６０３と、動脈灌流ポンプ６０４と、排液ポンプ６０５と、動脈圧力センサ６０６と、チャンバ圧力センサ６０７と、気管圧センサ６０８と、静脈圧力センサ６０９と、動脈ライン６１０と、静脈ライン６１１と、気管ライン６１２と、滅菌フィルタ６１３と、酸素付加器６１４と、制御モジュール６１５と、弁制御静脈ドレナージ６１６と、換気装置６１７とを含む。バイオリアクタでは、肺マトリックスは、バイオリアクタ１００、２００、４００、および５００に関して上述したように、動脈ラインを通して媒体で灌流される。
【００９４】
引き続き図６を参照すると、バイオリアクタ６００は、陽圧乾燥換気を可能にする換気装置６１７を含む。換気装置６１７は双方向性であり、気管ライン６１２を通して肺マトリックスとの間でガス（例えば、空気）を給送する。このガス移動によって、一般的な肺機能に類似した形で、肺マトリックスが膨張および収縮する。バイオリアクタ６００は、器官培養の後段の間、再生肺グラフトおよび肺の機能性試験のために使用されてもよい。例えば、気管ラインは、気管圧センサ６０８と換気装置６１７との間の換気動力を試験する、少なくとも１つのポートを含むことができる。気管ラインはまた、システムの汚染を伴わずに肺グラフトの気管支鏡的評価のため、ユーザがシステムにアクセスするのを可能にする、１つまたはそれ以上のポートを含んでもよい。各進入または放出ラインはまた、血液ガス分析を容易にしてリアルタイムの酸素測定を容易にする、少なくとも１つのポートを含有してもよい。
【００９５】
図７を参照すると、空気圧制御モジュール７００は、入口圧力弁７０３と、入口圧力リザーバ７０５と、入口圧縮機７０１と、入口ライン７０７と、出口圧力弁７０４と、出口圧力リザーバ７０６と、出口圧縮機７０２と、出口ラインと、ＰＰＣコントローラ７０９とを含む。入口ライン７０７および出口ライン７０８は、チャンバ圧力センサ７１０を含む肺チャンバ７１２（上述したような）に接続される。入口および出口圧縮機７０１、７０２は、入口および出口圧力リザーバ７０５、７０６にガス（例えば、空気）を充填する。入口および出口圧力弁７０３、７０４（例えば、ソレノイド弁）ならびに入口および出口圧縮機７０１、７０２は、ＰＰＣコントローラ７０９によって制御される。吸気相の間、出口弁７０４が開き、グラフトチャンバ７１２内への陰圧を生成する。標的陰圧がチャンバ圧力センサ７１０によって記録されると（例えば、−２０ｃｍＨ２Ｏ）、出口弁７０４が閉じる。チャンバ圧力は、呼気および吸気の間、−５０〜＋１００ｃｍＨ２Ｏの範囲であってもよい。肺コンプライアンスが正常な肺のコンプライアンスに近付くと、チャンバ圧力は胸膜内圧力の生理学的範囲（例えば、−１０〜＋２５ｃｍＨ２Ｏ）をより緊密に模倣する。適切な安定相の後、呼気相が始まり、入口圧力弁７０３が開き、肺チャンバ７１２内における陽圧の生成が可能になる。標的陽圧がチャンバ圧力センサ７１０によって記録されると（例えば、２５ｃｍＨ２Ｏ）、入口弁７０３が閉じる。入口および出口圧力リザーバ７０５、７０６は、肺チャンバ７１２内の圧力の迅速な調節が可能になるように、適切にサイズ決めされる。入口および出口圧力リザーバは、入口または出口圧縮機７０１、７０２によって生成される、振動アーチファクトを防止および／または低減する。いくつかの実施形態では、圧力平衡化の傾きは、入口ライン７０７および／または出口ライン７０８内に位置する追加の抵抗弁（図示なし）によって調節することができる。上述したように、換気は圧力制御（ＰＣ）または容量制御（ＶＣ）であることができる。
【００９６】
図８を参照すると、バイオリアクタ８００の構成要素は、肺チャンバ８０１と、インキュベータチャンバ８０２と、媒体リザーバ８０３と、動脈灌流ポンプ８０４と、排液ポンプ８０５と、動脈圧力センサ８０６と、チャンバ圧力センサ８０７と、気管圧センサ８０８と、静脈圧力センサ８０９と、動脈ライン８１０と、静脈ライン８１１と、気管ライン８１２と、フィルタ８１３と、酸素付加器８１４と、制御モジュール８１５と、静脈弁８１６と、ＰＰＣモジュール７００とを含む。
【００９７】
バイオリアクタ８００は、一般に、ＰＰＣモジュール７００を追加したバイオリアクタ２００に関して記載したように配置される。肺チャンバ８０１内の圧力は、ＰＰＣモジュール７００（上述したような）によって調整される。この配置により、肺チャンバ８０１内外への大きな流体変位を伴わずに、陰圧換気が可能になる。排液ポンプはチャンバ８０１内の一定の流体レベルを維持し、吸気中の陰圧および呼気中の陽圧はＰＰＣモジュール７００によって達成される。ＰＰＣモジュール７００を用いた陰圧および陽圧換気源を交換し、媒体を発泡させることによって、培養全体を通した乱流および機器の故障によるグラフの損傷が防止および／または低減される。さらに、ＰＰＣモジュール７００は様々な生理学的呼吸速度を達成することができるので、バイオリアクタ８００は、様々な肺マトリックスサイズ（例えば、ヒト成人の肺、ヒト小児の肺、または任意の動物（例えば、哺乳類の肺）に容易に適合可能である。上述したように、湿潤換気の間、媒体リザーバ８０３の高さを肺チャンバ８０１の高さよりも高くし、それによって、気管ラインを通して静水圧を生じさせることによって、気道陽圧が維持される。
【００９８】
図９を参照すると、バイオリアクタ９００の構成要素は、肺チャンバ９０１と、インキュベータチャンバ９０２と、媒体リザーバ９０３と、動脈灌流ポンプ９０４と、排液ポンプ９０５と、動脈圧力センサ９０６と、チャンバ圧力センサ９０７と、気管圧センサ９０８と、静脈圧力センサ９０９と、動脈ライン９１０と、静脈ライン９１１と、気管ライン９１２と、フィルタ９１３と、酸素付加器９１４と、制御モジュール９１５と、静脈弁９１６と、平衡化ライン９１８と、フィルタオクルダ９１７と、ＰＰＣモジュール７００と、陽圧マニホルド３００とを含む。バイオリアクタ９００の構成要素は、一般に、気管ライン９１１に接続された陽圧マニホルド３００を追加することを除いて、バイオリアクタ８００に関して記載したように配置される。この配置により、バイオリアクタ９００が、バイオリアクタ８００に関して上述したように、吸気、呼気の全体を通じて陰圧換気を生成し、（気管ライン９１１を通して）気道陽圧を生成し維持することができる。バイオリアクタ９００はさらに、大きいマトリックスサイズ（例えば、ヒト成人の肺およびヒト小児の肺）に、また平衡化ライン９１８およびオクルダ９１７の追加による、長期培養に適合するように構成される。
【００９９】
通常の条件下（例えば、室内空気、自発的な換気）におけるヒトの身体では、通常の測定値は、気管／気道からの正味圧力「ｐｔ」≒０ｃｍＨ２Ｏ、胸膜間空間圧力「ｐｐ」≒−５〜８ｃｍＨ２Ｏ、動脈圧「ｐａ」≒１３ｍｍＨｇ、静脈圧「ｐｖ」≒６ｍｍＨｇ（平均ｐｖ９．５ｍｍＨｇ）、および間質圧力ｐｉ≒５ｍｍＨｇである。スターリングの方程式（Granger HJ, Laine GA et al. Dynamics and control of transmicrovascular fluid exchange. In: Staub NC, Taylor AE, editors. Edema. New York: Raven Press; 1984. p. 189-228を参照）を使用すると、計算は、肺が間質およびリンパの陰圧を経験し、それによってリンパドレナージが容易になることを実証することができる。例えば、次式を使用する。
Ｊｖ＝ＬＳ［Ρｍｖ−Ρｐｍｖ）−σ（Πｍｖ−Πｉｓ）］
式中、ＬＳ≒０．２ｍＬ／分／１００ｇ／ｍｍＨｇ（Κｆまたは流体濾過係数、流体に対する透過率の測定値、および血管表面積）、Ρｍｖ≒５〜１０ｍｍＨｇ（微小血管（≒毛細管）静水圧）、Ρｐｍｖ≒−５〜−７ｍｍＨｇ（微小血管周囲または間質静水圧）、σ≒０．５〜０．８（浸透反射係数、正味駆動圧に対する血管系全体の膨張圧較差の相対的寄与を決定、特定の溶質（例えば、アルブミン）に対する特定の膜（例えば、内皮）の透過率の測定値は、膜が全体的に透過性である場合の０から完全に不透過性である場合の１まで変動）、Πｍｖ≒２４ｍｍＨｇ（肺の微小血管系内における血液の膨張圧）、およびΠｐｍｖ≒１４ｍｍＨｇ（微小血管周囲間質における膨張圧）、結果として得られる外向きの圧力≒１．５〜２ｍｍＨｇ、間質空間内への正味の流体フロー約１０〜２０ｃｃ／分である。気管／気道（ｐｔ）および胸膜間空間（ｐｐ）からの正味圧力は−５ｍｍＨｇであり、リンパドレナージを容易にする間質およびリンパの陰圧がもたらされる。
【０１００】
肺実質組織全体の正味陰圧および呼吸中のその変動、ならびに肺組織の伸展を組み合わせて、例えば、Bhattacharya J et al. Lung expansion and the perialveolar interstitial pressure gradient. J Appl Physiol 1989;66:2600-5において考察されているように、間質液を排液するポンプとして機能する。それに対応して、自発的換気の増加は、例えば、Albelda SM et al., Effects of increased ventilation on lung lymph flow in unanesthetized sheep. J Appl Physiol (1985). 1986 Jun;60(6):2063-70において考察されているように、リンパ流の増加に結び付く。
【０１０１】
肺の評価に使用される標準的な体外肺灌流（ＥＶＬＰ）設定では、値は、ｐｔ≒７．５ｃｍＨ２Ｏ、ｐｐ＝０ｍｍＨｇ、ｐａ≒１３ｍｍＨｇ、ｐｖ≒６ｍｍＨｇ（平均ｐｖ０．５ｍｍＨｇ）に設定される。上述したように、方程式を適用して、理想的な状況（灌流液の生理学的膨張圧および浸透反射係数を仮定する）下では、間質空間内への正味流体フローは１分当たり約１０〜２０ｃｃである。この設定では、肺は隔離され、したがって通常は、胸壁、胸膜間圧力および間質圧力の変動、ならびに結果として生じる双方向の肺内外圧較差によって加えられる生理学的な逆圧がない。時間に伴い、これは、静水圧間質性肺浮腫、および最終的には臓器不全を伴う肺胞浮腫に結び付く。このことは、例えば、Erasmus ME et al., Normothermic ex vivo lung perfusion of non-heart-beating donor lungs in pigs: from pretransplant function analysis towards a 6-h machine preservation.  Transpl Int 2006; 19: 589-593において、回路によって誘起される（circuit induced）肺損傷として説明されてきた。
【０１０２】
図９を参照すると、肺チャンバ９０１と媒体リザーバ９０３との間の圧力平衡化ライン９１８、およびフィルタ９１３上のオクルダ９１７は、肺チャンバ９０１と媒体リザーバ９０３との間の圧力を平衡化する。これにより、呼吸サイクルのすべての相において、両方のチャンバ全体の等圧が担保される。この改変は、本明細書で考察するすべてのバイオリアクタ、小型動物および大型動物／ヒトの両方に適用することができ、陽圧および陰圧換気モード、ならびに湿潤および乾燥換気モードの両方で使用することができる。この圧力平衡化ライン９１８を導入することにより、双方向の肺内外圧較差を作り出すことができる。換言すれば、肺を、Ｐｐｍ３００を介して内部から圧縮することができ（それによって気道陽圧が作られる）、またＰＰＣモジュール７００を介して外部から圧縮することができる（それによってチャンバ陽圧が作られる）。
【０１０３】
この双方向の肺内外圧較差の目的は、長期間の隔離された肺培養の間に間質浮腫が形成されるのを防ぐこと、また、間質液を血管系に流し込み、それによって肺機能（例えば、コンプライアンス、拡散、重量、およびサイズ）を改善することによって、（例えば、すでに損傷した肺に）すでに形成されている浮腫を治療することである。この較差は、静脈圧をチャンバ圧力に対して調節できる場合に達成することができる。媒体リザーバ９０３の高さを調節し、またそれによって静脈カニューレ内の水カラムの高さを調節し、肺静脈を排液して媒体チャンバ９０３に戻すことによって、静脈圧９０４をチャンバ圧力よりも高い、またはそれよりも低い一定のレベルで保つことができる。本質的に、２つのチャンバ間の平衡化によって、陰圧換気中の一定の肺静脈ドレナージが可能になる。対照的に、平衡化が維持されず、Ｐｖが一定に保たれた場合、肺チャンバ９０１内の陰圧によって静脈ドレナージが減少するか、または静脈フローが（例えば、部分的もしくは完全に）反転し、肺チャンバ９０１内の陽圧によって肺静脈が虚脱して、流出障害に結び付く。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例で本発明についてさらに記載するが、それらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０５】
無細胞肺骨格およびヒト由来の肺始原細胞に基づく肺再生
背景
肺グラフトは、例えば、Ott HC et al., Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 2010 Aug;16(8):927-33、およびSong JJ et al., Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats. Ann Thorac Surg. 2011 Sep;92(3):998-1005で考察されているように、胎児上皮細胞を使用して産生されてきた。この技術を臨床用途に転用するためには、患者由来の細胞を使用するべきである。これらの細胞は、表現型によってそのように前分化されたＩＰＳ細胞由来であることができる。
【０１０６】
方法
ラット肺を、成体ルイスラットから心臓および気管と一括して摘出した。ドナー器官を、肺動脈を介した０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）灌流およびそれに続く生理食塩水洗浄によって、脱細胞化した。結果として得られた肺骨格を、図２の上述したようなバイオリアクタに入れて、陰圧湿潤換気を可能にした。３０００万個のヒト臍帯内皮細胞と、１億個の前分化ヒトｉＰＳ細胞（皮膚繊維芽細胞の再プログラムによって派生したＢＪＲｉＰＳ細胞）とを、胚体内胚葉段階において、肺動脈および気管それぞれを介して同時に送達した。次に、肺グラフトをバイオリアクタに入れ、静的器官培養下で２時間維持して、細胞生着を可能にした。次に、毎分３ｍＬの速度で媒体灌流を開始した。湿潤換気を、グラフトチャンバ内における−２０〜＋１０ｃｍＨ２Ｏの圧力範囲、および８ｃｍＨ２Ｏの持続湿潤気道陽圧で開始した。これらの条件下での培養を合計１０日間維持した。実験を終了する前に、最高吸気圧３５ｃｍＨ２Ｏ、吸気陽圧５ｃｍＨ２Ｏ、ならびに１００％および２１％のＦｉＯ２で、陽圧換気を使用して肺を換気した。血液ガスサンプルは静脈ラインから抜き出した。次に、肺グラフトをバイオリアクタから摘出した。右肺は、組織学的な生化学および遺伝的組織分析に使用した。左肺は、肺グラフトとして使用し、ラットモデルに同所移植した。
【０１０７】
結果
内皮および前分化ＩＰＳ細胞の細胞生着を観察した。細胞生存度を、ＴＵＮＥＬ染色によって確認し、培養の終了時で７５％超過であることが見出された。ガス交換を、血液ガス分析による実験の終了時に確認した。左肺の成功した外科的移植は、すべての再生グラフトにおいて達成された。
【実施例２】
【０１０８】
灌流および陰圧換気による肺保存：ラット肺モデル
背景
ドナー肺は、現在、低温虚血状態で輸送されている。通常の温熱灌流および換気の間、体外で肺を保存するための努力がなされてきた。現在最新の機器では、６〜４８時間を超えて良好な生存度でドナー器官を維持することができない。組織浮腫および機械的損傷が、この期間の間の組織の損傷およびグラフトの故障に結び付く。すべての現在利用可能なシステムは、陽圧乾燥換気を使用しており、これは保護胸壁がない場合に肺グラフトの機械的損傷に結び付く。陰圧湿潤および乾燥換気バイオリアクタを設計し、長期（＞７日間）にわたって肺組織を生存可能に維持する能力を調査した。
【０１０９】
方法
肺を、イソフルランを用いて麻酔し、３０００単位のヘパリンを全身注射し、その後に、４℃まで冷却した１０ｍｌのＰＢＳを用いて肺動脈を洗浄した後に、月齢３か月のＳＤ４００ラットから心臓および気管と一括して摘出した。気道、肺動脈（ＰＡ）および左房（ＬＡ）を滅菌方式で洗浄した。肺を、５００ｍｌの器官チャンバ（主要チャンバ）に入れ、３７℃のインキュベータ内で培養した。この実験には、図４に示されるようなバイオリアクタを使用した。
【０１１０】
気管ラインは陽圧マニホルドシステムに接続し、それによって、酸素または周囲空気と均衡させた５％ＣＯ２を用いて持続気道陽圧（ＣＰＡＰ）を提供した。ＰＡラインは灌流ラインに接続し、灌流ラインは灌流液を充填したリザーバにも接続した。灌流液は、ＲＰＭＩ  ５００ｍｌ、１６４０グルタマックス、アルブミン  ５００ｍｇ、ウシ胎児血清５０ｍｌ、抗生物質／抗真菌剤溶液５ｍｌ（１ｍＬ当たりペニシリン１０，０００単位、ストレプトマイシン１０ｍｇ、アンフォテリシンＢ  ２５μｇ）で構成した。主要チャンバおよびリザーバは戻りチューブで接続し、またそれによって灌流液を２つのチャンバ間で循環させることができた。灌流液は少なくとも１日おきに交換した。灌流フローおよび戻りフローは両方とも、蠕動ポンプ（Ismatec, Cole-Parmer）によって調整した。灌流ライン圧力をＰＡラインの付近で監視した。主要チャンバおよびリザーバは、換気チューブによって、蠕動ポンプ（Ｐ２３０、Ｈａｒｖｅｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）と接続し、それにより、陰圧肺換気のために空気および流体を出し入れすることによって、主要チャンバ内に陽圧および陰圧を作り出すことができた。
【０１１１】
ＰＥＥＰ／ＣＰＡＰによる６または７日間の肺培養、および陰圧肺換気を用いたもしくは用いない灌流の後、肺を固着し、パラフィンに埋め込み、薄片にした。Ｈ＆Ｅ染色およびＴＵＮＥＬ染色を行った。
【０１１２】
結果
安定分離肺培養は、次のような設定で維持された。５％ＣＯ２および平衡化空気を用いた１５ｃｍＨ２Ｏ  ＰＥＥＰ、灌流速度１〜３ｍｌ／分、＋１０ｍｍＨｇ〜−２０ｍｍＨｇの主要チャンバ圧力での陰圧換気、標的陰圧がどの程度早く達成されるかに応じて、呼吸数２〜４。測定された灌流ライン圧力は、８．４〜３０ｍｍＨｇであった。
【０１１３】
組織学に関して、正常に見える肺組織のいくつかの範囲を、７日間の培養後に見た。ＴＵＮＥＬ染色によって細胞生存度の保存を確認した。
【実施例３】
【０１１４】
ヒト肺骨格の再細胞化および培養
４歳の小児ドナーからの左肺を除去し、右肺を成功裏にカニューレ挿入し、完全に脱細胞化した。脱細胞化に続いて、上下の右葉を分離し、再細胞化および培養に利用した。
【０１１５】
細胞の播種および培養に関して、葉の主要動脈および静脈の両方を分離し、灌流液の受動ドレナージを可能にするように設計された血管カニューレを用いてカニューレ挿入した。主要気道をインキュベートし、バイオリアクタチャンバの蓋を通して接続した。これによってまた、システムが媒体の一定フローまたは圧力制御された灌流が可能になる。
【０１１６】
方法
合計５００×１０６個の肺胞上皮細胞（ＰＡＥｐｉＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を、低速シリンジによって気道に送達し、次いで、３７度で２時間の静的培養を行った。容量１．５Ｌの肺胞細胞成長媒体を用いた灌流を、６０ｍｌ／分の速度で開始して、８〜１０ｍｍＨｇ以内の圧力を生成した。灌流および培養は４日間維持し、その後に組織を分析用に摘出した。培養中の汚染は観察されなかった。
【０１１７】
結果
肺組織全体にわたるいくつかの範囲の組織学的分析により、異質的な細胞保持が実証されたが、ロバストな再細胞化のいくつかの範囲を含んでいた。細胞分布のまだらな性質は、細胞送達におけるばらつきによる可能性が高い。肺の再細胞化範囲によって、高レベルの細胞付着、および肺骨格の天然構造に沿った伸展が示された。ＴＵＮＥＬアッセイによって細胞生存度をさらに分析して、４日間の培養にわたって生じるアポトーシスは非常に低レベルであることが示された。
【実施例４】
【０１１８】
死体ブタ肺
この実施例は、一組のブタ死体をバイオリアクタに接続し、バイオリアクタの機能を試験した、実証実験について記載する。
【０１１９】
方法
一組の死体ブタ肺を試験のために得た。肺動脈および気道にカニューレを挿入し、器官を器官チャンバの内部に置き、カニューレをそれらに対応する入力（それぞれ、灌流ラインおよび換気ライン）に接続した。器官の換気を試みる前に、ヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いた灌流を開始した。灌流の一定フローおよび一定圧力両方のモードを実現した。
【０１２０】
結果
灌流が成功すると、器官チャンバの加圧モードを試験した。両方の加圧モードが器官の換気に成功した。しかしながら、圧力目標による加圧（＋２０ｍｍＨｇ〜−１５０ｍｍＨｇ）により、器官容積の目に見える変化がより大きくなった。換気を１８時間の期間（終夜）にわたって実施して、バイオリアクタ機能の一貫性を確認した。死体肺に対する第１の試験に使用したバイオリアクタパラメータを、表３に概説する。
【０１２１】
この実験は、ＰＰＭマニホルドに接続した換気バッグを含まなかった。このことにより、換気ラインおよび器官内の限定されたガス体積が膨張するので、器官を換気するのに器官チャンバ内で必要とされるゲージ陰圧が大きくなった。十分な大きさの換気バッグを追加することでこの膨張は緩和されるはずであり、膨張および収縮ではなく器官チャンバ圧力の変化に応答して、ガスが自由に肺に流入し、またそこから流出することができる。
【０１２２】
【表３】
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【実施例５】
【０１２３】
ブタ肺の保存（短期２４時間）
この実施例は、隔離されたブタ肺をバイオリアクタに接続して、短期間分離肺培養を介してバイオリアクタの機能を実証した、実証実験について記載する。器官チャンバ圧力（図１０Ａ、ＰＯＣ）、ＰＡ圧力（ＰＰＡ）、ＰＶ圧力（ＰＰＶ）、ＰＥＥＰチャンバ圧力（ＰＰＥＥＰ）、および気管圧（ＰＴ）を、培養全体を通して監視する。灌流パラメータ、換気パラメータ、およびバイオリアクタイベントのログ収集の制御は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの小型データ収集（ｃＤＡＱ）システムを、専用に開発したＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ウーバン）と組み合わせることによって達成される。
【０１２４】
システム内の陰圧換気は、圧力制御され、呼吸数（ＲＲ）、吸気呼気（Ｉ：Ｅ）比、下限器官チャンバ圧力目標（ＰＯＣ−Ｌｏｗｅｒ）、および上限器官チャンバ圧力目標（ＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒ）という４つのパラメータによって管理される。ＲＲは、各呼吸の長さを決定し、Ｉ：Ｅ比は、吸気または呼気状態に入る各呼吸の時分割を定義する。ＰＯＣ−ＬｏｗｅｒおよびＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒは、吸気および呼気それぞれの間において器官チャンバが維持される空気圧を表す。ＰＯＣ−ＬｏｗｅｒとＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒとの差によって、呼吸の大きさ、または肺の外側が晒される圧力範囲が決定する。したがって、ＰＥＥＰチャンバ圧力に対するこれら目標の位置は、換気中のＰＴｒａｎｓｍｕｒａｌに影響する。これらの実験に対して、漸増させた気道が虚脱しないように適切な呼気に対する肺の弾性反跳に依存して、ＰＯＣ−ＵｐｐｅｒはＰＥＥＰチャンバ圧力付近に設定し、ＰＯＣ−Ｌｏｗｅｒはそれよりも１０〜１５ｍｍＨｇ低く設定した。これらのパラメータを、表４にしたがって、膨張を維持し、あらゆる目に見える浮腫の蓄積を低減するように、培養中に調節した。調節は、２４時間の期間に３〜７回、媒体サンプリングとほぼ同頻度で行った。
【０１２５】
【表４】
2017512492.tif 000006
【０１２６】
方法
ドナー肺を、滅菌技術を使用して取り出し、層流フードに入れた。専用のコネクタ（例えば、様々なホース返し取付け具、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、イリノイ州ヴァーノンヒルズ）を使用して、気管（Ｔ）、肺動脈（ＰＡ）、および左房カフ（ＰＶ）にカニューレを挿入した。次に、肺を、培養のために器官チャンバ（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ＴＥＲＭ、マサチューセッツ州ノーウッド）に入れ、ＰＡ、ＰＶ、および気管カニューレをそれらそれぞれの接続部に取り付けた。臨床スケールのバイオリアクタ（図１０Ａ）は、肺グラフトを収容し、流体リザーバとして作用し、生理学的灌流および換気に対する接続を提供する、気密器官チャンバを含む。器官チャンバおよび付属チャンバは、３７℃のインキュベータ内に置かれて、分離肺培養の持続時間の間温度を維持する。この設定の重要な特徴は、長時間（場合によっては数週間）にわたって、完全に密封されたシステム内で無菌器官培養を維持することができ、媒体交換、サンプリング、および器官の介入が可能になることである。
【０１２７】
バイオリアクタ機能の最初の実証を、温虚血時間＞１時間、冷虚血時間＞２４時間で、屠殺場のブタ肺（ｎ＝８）を使用して実施した。試験した肺の各組に対して、ＰＡ、ＰＶ、および気管にカニューレを挿入し、組織生検を対照として行い、器官チャンバ内で接続する前に器官を秤量した。次に、培養媒体の灌流を開始し（灌流ラインを、ＰＡに接続する前に２Ｌの媒体でプライミングした）、肺を漸増させ、ＰＥＥＰを確立し、インキュベータ空気（Ｏ２  ２１％、ＣＯ２  ５％）を用いて陰圧換気を開始した。培養媒体はＤＭＥＭを含有し、１倍のＧｌｕｔａ  ＭＡＸ、１倍のＭＥＭアミノ酸（カタログ番号１２８００−０１７、３５０５０−０６１、および１１１３０−０５１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）、１容量／容量％の抗生物質／抗真菌剤、ならびに１１０ｎＭのヒドロコルチゾン（カタログ番号Ａ５９５５およびＨ６９０９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、コロイドとしてもしくはコロイドを含まない１０質量／容量％のＢＳＡ（カタログ番号Ａ２１５３、Ｓｉｇｍａ）を追加した。培養は２４時間維持し、その間、灌流液をＰＡおよびＰＶで周期的にサンプリングした。培地は、ＰＶから１〜２ＬのＰＶ排液を除去し、器官チャンバに対する新しい媒体の量に等しいまたはそれよりも多量の新しい媒体を排液チャンバに補給することによって、２４時間の期間毎に２回交換した。灌流および換気圧力は、培養全体を通して継続的に監視した。分離肺培養後、肺をチャンバから除去し、秤量し、組織学のために組織サンプルを取った。
【０１２８】
灌流液分析
灌流液（培地）サンプルを、ＰＡの上流およびＰＶの下流から抜き取った。灌流液組成を、ＣＧ８＋カートリッジ（Ａｂｂｏｔｔ）とともに、ｉ−ＳＴＡＴ  １  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州プリンストン）を使用して、培養期間の間に分析して、ｐＨ、ＰＯ２、ＰＣＯ２、およびグルコースを測定した。灌流液の乳酸含量は、短期間ＩＬＣ実験では測定しなかった。媒体成分の変化は、ＰＡおよびＰＶの測定値間の差として表現される。したがって、負の値は減少を指し、正の値は増加を指す。
【０１２９】
組織学および免疫蛍光法
組織サンプルを、真空下で１０％ホルマリン中で一晩固定し、その後、７０％エタノールへと移し、パラフィンに埋め込み、染色のために５μｍの薄片にした。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、全体的な形態学を評価した。末端デオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰのニック末端標識アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＤｅａｄＥｎｄ  Ｃｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、アポトーシスを評価した。組織サンプル１つ当たり６つの無作為範囲について、２０倍範囲（約０．３４１９ｍｍ２）当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を計算することによって、アポトーシスの定量化を実施した。試験した各肺に対して２つ以上の組織サンプルを定量化に使用した。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ［１９，２０］を使用して、画像毎のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を決定した。
【０１３０】
組織切片の一次標識付けは、最初に組織切片の脱パラフィン化および再水和を行い、次に圧力鍋の中でクエン酸溶液中において抗原賦活化を行い（抗原アンマスク溶液、クエン酸系、カタログ番号Ｈ−３３００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バーリンゲーム）、切片をＰＢＳ中で洗い、ＰＢＳ中で３０分間、５％のロバ血清を用いて阻害し（カタログ番号Ｓ−３０−１００ＭＬ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ダルムシュタット）、一次抗体を用いてスライドを終夜（１８時間）インキュベートすることによって行った。一次抗体は、ＶＥ−カドヘリン（カタログ番号ｓｃ−９９８９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）、Ｅ−カドヘリン（カタログ番号６１０１８１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、ＺＯ−１（カタログ番号６１−７３００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、およびプロＳＰＢ（カタログ番号ＡＢ３４３０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）用のものを使用した。一次抗体の二次標識付けは、最初に組織切片をＰＢＳの０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で洗い、次に対応する二次抗体を用いて３０分間インキュベートし、ＰＢＳの０．１％  Ｔｗｅｅｎを用いて再び洗い、ＤＡＰＩ含有封入剤でスライドを封入（ＤＡＰＩ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ、カタログ番号０１００−２０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミングハム）することによって行った。
【０１３１】
物理的パラメータの計算
経壁圧力（ＰＴＭ）を、ＰＴＭ＝ＰＴ−ＰＯＣとして計算し、機械的応力を示す測定値として肺に適用して換気を容易にした。正のＰＴＭは吸気に対応し、負のＰＴＭは呼気に対応する。器官重量の百分率変化を、ΔＷＯｒｇａｎ＝（ＷＦｉｎａｌ−ＷＩｎｉｔｉａｌ）／ＷＩｎｉｔｉａｌ×１００として計算した。グルコースおよび乳酸の質量消費率（ΔグルコースおよびΔ乳酸）を、ＰＡからＰＶへの濃度変化に灌流流量を掛けたものとして計算した。肺血管抵抗（ＰＶＲ）を、ＰＶＲ＝（ＰＰＡ−ＰＰＶ）／Ｑとして計算した（式中、Ｑは灌流流量）。すべてのデータは、平均±標準偏差として、または特段の指示がない限り、ボックスプロットとして提示する。
【０１３２】
結果
短期間（２４時間）ＩＬＣ条件を、ＤＭＥＭ中の１０％  ＢＳＡ（ＢＳＡ、ｎ＝５）およびＤＭＥＭのみ（ＤＭＥＭ、ｎ＝３）の灌流液群について、表５に概説している。両方の群の肺は、培養に先立って＞２４時間の冷虚血時間を有していた。両方の群のＰＡ圧力は、灌流および換気の間、器官チャンバ圧力に対して２０〜４０ｍｍＨｇで維持した。ＰＥＥＰ、呼吸数、経壁圧力、およびＩ：Ｅ比を培養の間に調節して、膨張を維持し、目に見える浮腫の蓄積を低減させたが、群同士では類似していた。
【０１３３】
１０％ＢＳＡ中で２４時間培養した肺は、ＤＭＥＭのみで培養した肺よりも器官重量の変化割合が大きかった（図１１Ａ）。ＢＳＡ群の場合、ＰＡおよびＰＶにおける平均ｐＯ２値はそれぞれ、１３１．７±６．５ｍｍＨｇおよび７９．２±８．１ｍｍＨｇであった。ＤＭＥＭ群の場合、ＰＡおよびＰＶにおける平均ｐＯ２値はそれぞれ、１５６．１±６．８ｍｍＨｇおよび１０１．５±２．５ｍｍＨｇであった。培養期間にわたってＰＡおよびＰＶで同時に灌流液をサンプリングすることによって、媒体が灌流される際の溶解ガスおよびグルコース含量の変化を実現することができた。両方の群からの媒体によって、溶解Ｏ２およびグルコースの消費が、それに対応する溶解ＣＯ２の生成に匹敵することが明らかになった（図１１Ｂ）。これらの観察は、２４時間の培養期間全体にわたって一定である。
【０１３４】
短期間ＩＬＣ後に行った組織サンプルの組織学的分析（図１１Ｃ〜Ｄ）によって、天然肺構造が維持されることが明らかになった（図１１Ｃ）。ＴＵＮＥＬアッセイ（図１１Ｄ〜Ｅ）により、統計的に有意でなかった、アポトーシス細胞の割合のわずかな増加が示された（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．６８５１）。
【０１３５】
【表５】
2017512492.tif 000007
【実施例６】
【０１３６】
ブタ肺の保存（長期７２時間）
この実施例は、隔離されたブタ肺をバイオリアクタに接続して、長期間分離肺培養を介してバイオリアクタの機能を実証した、実証実験について記載する。器官チャンバ圧力（図１０Ａ、ＰＯＣ）、ＰＡ圧力（ＰＰＡ）、ＰＶ圧力（ＰＰＶ）、ＰＥＥＰチャンバ圧力（ＰＰＥＥＰ）、および気管圧（ＰＴ）を、培養全体を通して監視する。灌流パラメータ、換気パラメータ、およびバイオリアクタイベントのログ収集の制御は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの小型データ収集（ｃＤＡＱ）システムを、専用に開発したＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ウーバン）と組み合わせることによって達成される。
【０１３７】
バイオリアクタ内の陰圧換気は、圧力制御され、呼吸数（ＲＲ）、吸気呼気（Ｉ：Ｅ）比、下限器官チャンバ圧力目標（ＰＯＣ−Ｌｏｗｅｒ）、および上限器官チャンバ圧力目標（ＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒ）という４つのパラメータによって管理される。ＲＲは、各呼吸の長さを決定し、Ｉ：Ｅ比は、吸気または呼気状態に入る各呼吸の時分割を定義する。ＰＯＣ−ＬｏｗｅｒおよびＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒは、吸気および呼気それぞれの間において器官チャンバが維持される空気圧を表す。ＰＯＣ−ＬｏｗｅｒとＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒとの差によって、呼吸の大きさ、または肺の外側が晒される圧力範囲が決定する。したがって、ＰＥＥＰチャンバ圧力に対するこれら目標の位置は、換気中のＰＴｒａｎｓｍｕｒａｌに影響する。これらの実験に対して、漸増させた気道が虚脱しないように適切な呼気に対する肺の弾性反跳に依存して、ＰＯＣ−ＵｐｐｅｒはＰＥＥＰチャンバ圧力付近に設定し、ＰＯＣ−Ｌｏｗｅｒはそれよりも１０〜１５ｍｍＨｇ低く設定した。これらのパラメータを、表６にしたがって、膨張を維持し、あらゆる目に見える浮腫の蓄積を低減するように、培養中に調節した。調節は、２４時間の期間に３〜７回、媒体サンプリングとほぼ同頻度で行った。
【０１３８】
【表６】
2017512492.tif 000008
【０１３９】
方法
長期間ＩＬＣを確立するため、冷虚血時間＜１時間で、ブタ肺（ｎ＝４）を使用した。非コロイド培養媒体を使用したこと以外は上述した手順を使用して、器官を培養用に調製し、器官チャンバに入れた。培養は少なくとも７２時間維持し、その間、灌流液をＰＡおよびＰＶで周期的にサンプリングした。培地も、短期間ＩＬＣに関して記載したのと同じ間隔で変更し、器官チャンバリザーバが低量（＜１Ｌ）に見えた場合に追加の媒体を添加した。灌流および換気圧力は、培養全体を通して継続的に監視した。酸素交換の機能性試験を、１００％Ｏ２（ＦｉＯ２＝１．０）を用いて１０分間換気し、ＰＶ出口で測定されるような、灌流液中におけるＯ２の分圧の変化を観察することによって実施した。この場合、ΔＰＶ  ｐＯ２＝ＰＶ  ｐＯ２試験後−ＰＶ  ｐＯ２試験前であった。システムは閉ループで媒体を灌流し、ＰＡの上流では灌流液を脱酸素化しないので、機能性試験のこの方法を、ＰＡ対ＰＶでのｐＯ２の比較に対して選択した。ＦｉＯ２＝０．２１および１．０におけるＰＶ  ｐＯ２の比較によって、バイオリアクタシステムに関して、換気肺が灌流液を酸素化する能力が分かる。機能性試験の間、灌流で残ったインキュベータ空気を中空繊維のガス交換体に供給した。ＩＬＣ後、肺をチャンバから除去し、秤量し、組織学のために組織サンプルを取った。
【０１４０】
灌流液分析
灌流液（培地）サンプルを、ＰＡの上流およびＰＶの下流から抜き取った。灌流液組成を、ＣＧ８＋カートリッジ（Ａｂｂｏｔｔ）とともに、ｉ−ＳＴＡＴ  １  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州プリンストン）を使用して、培養期間の間に分析して、ｐＨ、ＰＯ２、ＰＣＯ２、およびグルコースを測定した。ＣＧ４＋カートリッジを使用して、長期間ＩＬＣ実験における乳酸含量を測定した。媒体成分の変化は、ＰＡおよびＰＶの測定値間の差として表現され、したがって、負の値は減少を指し、正の値は増加を指す。
【０１４１】
組織学および免疫蛍光法
組織サンプルを、真空下で１０％ホルマリン中で一晩固定し、その後、７０％エタノールへと移し、パラフィンに埋め込み、染色のために５μｍの薄片にした。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、全体的な形態学を評価した。末端デオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰのニック末端標識アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、アポトーシスを評価した。組織サンプル１つ当たり６つの無作為範囲について、２０倍範囲（約０．３４１９ｍｍ２）当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を計算することによって、アポトーシスの定量化を実施した。試験した各肺に対して２つ以上の組織サンプルを定量化に使用した。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ［１９，２０］を使用して、画像毎のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を決定した。
【０１４２】
組織切片の一次標識付けは、最初に組織切片の脱パラフィン化および再水和を行い、次に圧力鍋の中でクエン酸溶液中において抗原賦活化を行い（抗原アンマスク溶液、クエン酸系、カタログ番号Ｈ−３３００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バーリンゲーム）、切片をＰＢＳ中で洗い、ＰＢＳ中で３０分間、５％のロバ血清を用いて阻害し（カタログ番号Ｓ−３０−１００ＭＬ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ダルムシュタット）、一次抗体を用いてスライドを終夜（１８時間）インキュベートすることによって行った。一次抗体は、ＶＥ−カドヘリン（カタログ番号ｓｃ−９９８９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）、Ｅ−カドヘリン（カタログ番号６１０１８１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、ＺＯ−１（カタログ番号６１−７３００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、およびプロＳＰＢ（カタログ番号ＡＢ３４３０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）用のものを使用した。一次抗体の二次標識付けは、最初に組織切片をＰＢＳの０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で洗い、次に対応する二次抗体を用いて３０分間インキュベートし、ＰＢＳの０．１％  Ｔｗｅｅｎを用いて再び洗い、ＤＡＰＩ含有封入剤でスライドを封入（ＤＡＰＩ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ、カタログ番号０１００−２０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミングハム）することによって行った。
【０１４３】
物理的パラメータの計算
経壁圧力（ＰＴＭ）を、ＰＴＭ＝ＰＴ−ＰＯＣとして計算し、機械的応力を示す測定値として肺に適用して換気を容易にした。正のＰＴＭは吸気に対応し、負のＰＴＭは呼気に対応する。器官重量の百分率変化を、ΔＷＯｒｇａｎ＝（ＷＦｉｎａｌ−ＷＩｎｉｔｉａｌ）／ＷＩｎｉｔｉａｌ×１００として計算した。グルコースおよび乳酸の質量消費率（ΔグルコースおよびΔ乳酸）を、ＰＡからＰＶへの濃度変化に灌流流量を掛けたものとして計算した。肺血管抵抗（ＰＶＲ）を、ＰＶＲ＝（ＰＰＡ−ＰＰＶ）／Ｑとして計算した（式中、Ｑは灌流流量）。すべてのデータは、平均±標準偏差として、または特段の指示がない限り、ボックスプロットとして提示する。
【０１４４】
結果
長期間（７２時間）ＩＬＣ条件および結果を、表７に概説している。肺は、培養に先立って約１時間の冷虚血時間を有していた。長時間ＩＬＣの間のＰＡ圧力は、灌流および換気の間、器官チャンバ圧力に対して２０ｍｍＨｇ以下で維持した。ＰＥＥＰ、呼吸数、経壁圧力、およびＩ：Ｅ比を培養の間に調節して、膨張を維持し、目に見える浮腫の蓄積を低減させた。
【０１４５】
長期間ＩＬＣ下の肺は、短期間ＩＬＣ下で試験した肺（図１１Ｂ、ｙ軸スケールを参照）よりも程度は低いものの、Ｏ２およびグルコースの消費と、それに対応するＣＯ２の生成を示した（図１２Ａ）。それに対応する乳酸の生成も、長期間ＩＬＣ下の肺において観察された（図１２Ａ）。長期間ＩＬＣ下の肺の機能性試験によって、７２時間（３日間）の培養の持続時間全体で、酸素交換能力が維持されることが明らかになった（図１２Ｂ、左側）。機能性試験後のＰＡおよびＰＶ  ｐＯ２値（図１２Ｂ、右側）は、ＰＡよりもＰＶでｐＯ２が多いこと、また、ＦｉＯ２＝０．２１で平衡化したときと比較して、灌流液のｐＯ２が全体的に増加することを明らかにしている（０．２１のＦｉＯ２に対する平均ＰＡ  ｐＯ２＝１４４．０±９．７８ｍｍＨｇ）。培養時間とともに増加した合計媒体量を新鮮な媒体として、器官チャンバリザーバが低量（＜１Ｌ）に見えた場合に添加した。一貫した平均ＰＡ流量（ＱＰＡ）によって、培養期間の持続時間の間、長期間ＩＬＣ下で肺の安定したＰＰＡおよびＰＶＲが生成された（図１２Ｂ）。
【０１４６】
ＴＵＮＥＬアッセイにより、統計的に有意でなかった、合計７２時間の培養期間後に取った組織サンプルのアポトーシスにおける、対象組織と比較したときのわずかな増加が明らかになった（図１２Ｄ、ｐ＝０．０６９２）。Ｈ＆Ｅ染色（図１２Ｅ）によって、長期間ＩＬＣ後の肺構造が維持されることが明らかになった。長期間ＩＬＣ（図１２Ｅ、７２時間）後に収集した肺組織はまた、培養前に生検した組織（図１２Ｅ、０時間）と比較して、ＶＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１、およびプロＳＰＢの発現および出現を保持した。
【０１４７】
【表７】
2017512492.tif 000009
【実施例７】
【０１４８】
単一のヒト肺の保存（長期７２時間）
この実施例は、隔離されたヒト肺をバイオリアクタに接続して、長期間分離肺培養を介してバイオリアクタの機能を実証した、実証実験について記載する。器官チャンバ圧力（図１０Ａ、ＰＯＣ）、ＰＡ圧力（ＰＰＡ）、ＰＶ圧力（ＰＰＶ）、ＰＥＥＰチャンバ圧力（ＰＰＥＥＰ）、および気管圧（ＰＴ）を、培養全体を通して監視する。灌流パラメータ、換気パラメータ、およびバイオリアクタイベントのログ収集の制御は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの小型データ収集（ｃＤＡＱ）システムを、専用に開発したＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ウーバン）と組み合わせることによって達成される。
【０１４９】
本発明のシステム内の陰圧換気は、圧力制御され、呼吸数（ＲＲ）、吸気呼気（Ｉ：Ｅ）比、下限器官チャンバ圧力目標（ＰＯＣ−Ｌｏｗｅｒ）、および上限器官チャンバ圧力目標（ＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒ）という４つのパラメータによって管理される。ＲＲは、各呼吸の長さを決定し、Ｉ：Ｅ比は、吸気または呼気状態に入る各呼吸の時分割を定義する。ＰＯＣ−ＬｏｗｅｒおよびＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒは、吸気および呼気それぞれの間において器官チャンバが維持される空気圧を表す。ＰＯＣ−ＬｏｗｅｒとＰＯＣ−Ｕｐｐｅｒとの差によって、呼吸の大きさ、または肺の外側が晒される圧力範囲が決定する。したがって、ＰＥＥＰチャンバ圧力に対するこれら目標の位置は、換気中のＰＴｒａｎｓｍｕｒａｌに影響する。これらの実験に対して、漸増させた気道が虚脱しないように適切な呼気に対する肺の弾性反跳に依存して、ＰＯＣ−ＵｐｐｅｒｖはＰＥＥＰチャンバ圧力付近に設定し、ＰＯＣ−Ｌｏｗｅｒはそれよりも１０〜１５ｍｍＨｇ低く設定した。これらのパラメータを、表８にしたがって、膨張を維持し、あらゆる目に見える浮腫の蓄積を低減するように、培養中に調節した。調節は、２４時間の期間に３〜７回、媒体サンプリングとほぼ同頻度で行った。
【０１５０】
【表８】
2017512492.tif 000010
【０１５１】
方法
ニューイングランド臓器バンク（ＮＥＯＢ）と連携して、移植に適さないことが分かっている提供ヒト肺を、標準的な手術方式で、心臓が拍動しているドナーから調達した。提供前の胸部Ｘ線により、少量の肺底部拡張不全（basilar atelectasis）が示され、動脈酸素張力は１００％ＦｉＯ２で１１６ｍｍＨｇであり、ガス交換の損失が示された。肺は、氷に載せて滅菌容器に入れて送達し、到着後すぐにバイオリアクタに載せた。右肺を分離し、ＰＡ、ＰＶ、および気管にカニューレを挿入し、その後、上述したように７２時間の長期間ＩＬＣ向けに設定した。摘出から再灌流までの冷虚血時間は５．５時間であった。
【０１５２】
灌流液分析
灌流液（培地）サンプルを、ＰＡの上流およびＰＶの顆粒から抜き取った。灌流液組成を、ＣＧ８＋カートリッジ（Ａｂｂｏｔｔ）とともに、ｉ−ＳＴＡＴ  １  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州プリンストン）を使用して、培養期間の間に分析して、ｐＨ、ＰＯ２、ＰＣＯ２、およびグルコースを測定した。ＣＧ４＋カートリッジを使用して、長期間ＩＬＣ実験における乳酸含量を測定した。媒体成分の変化は、ＰＡおよびＰＶの測定値間の差として表現される。したがって、負の値は減少を指し、正の値は増加を指す。
【０１５３】
組織学および免疫蛍光法
組織サンプルを、真空下で１０％ホルマリン中で一晩固定し、その後、７０％エタノールへと移し、パラフィンに埋め込み、染色のために５μｍの薄片にした。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、全体的な形態学を評価した。末端デオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰのニック末端標識アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、アポトーシスを評価した。組織サンプル１つ当たり６つの無作為範囲について、２０倍範囲（約０．３４１９ｍｍ２）当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を計算することによって、アポトーシスの定量化を実施した。試験した各肺に対して２つ以上の組織サンプルを定量化に使用した。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して、画像毎のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を決定した。
【０１５４】
組織切片の一次標識付けは、最初に組織切片の脱パラフィン化および再水和を行い、次に圧力鍋の中でクエン酸溶液中において抗原賦活化を行い（抗原アンマスク溶液、クエン酸系、カタログ番号Ｈ−３３００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バーリンゲーム）、切片をＰＢＳ中で洗い、ＰＢＳ中で３０分間、５％のロバ血清を用いて阻害し（カタログ番号Ｓ−３０−１００ＭＬ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ダルムシュタット）、一次抗体を用いてスライドを終夜（１８時間）インキュベートすることによって行った。一次抗体は、ＶＥ−カドヘリン（カタログ番号ｓｃ−９９８９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）、Ｅ−カドヘリン（カタログ番号６１０１８１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、ＺＯ−１（カタログ番号６１−７３００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、およびプロＳＰＢ（カタログ番号ＡＢ３４３０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）用のものを使用した。一次抗体の二次標識付けは、最初に組織切片をＰＢＳの０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で洗い、次に対応する二次抗体を用いて３０分間インキュベートし、ＰＢＳの０．１％  Ｔｗｅｅｎを用いて再び洗い、ＤＡＰＩ含有封入剤でスライドを封入（ＤＡＰＩ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ、カタログ番号０１００−２０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミングハム）することによって行った。
【０１５５】
物理的パラメータの計算
経壁圧力（ＰＴＭ）を、ＰＴＭ＝ＰＴ−ＰＯＣとして計算し、機械的応力を示す測定値として肺に適用して換気を容易にした。正のＰＴＭは吸気に対応し、負のＰＴＭは呼気に対応する。器官重量の百分率変化を、ΔＷＯｒｇａｎ＝（ＷＦｉｎａｌ−ＷＩｎｉｔｉａｌ）／ＷＩｎｉｔｉａｌ×１００として計算した。グルコースおよび乳酸の質量消費率（ΔグルコースおよびΔ乳酸）を、ＰＡからＰＶへの濃度変化に灌流流量を掛けたものとして計算した。肺血管抵抗（ＰＶＲ）を、ＰＶＲ＝（ＰＰＡ−ＰＰＶ）／Ｑとして計算した（式中、Ｑは灌流流量）。すべてのデータは、平均±標準偏差として、または特段の指示がない限り、ボックスプロットとして提示する。
【０１５６】
結果
第１の培養ヒト肺は、以前に試験したブタ肺の組と同様に挙動した。培養の間、平均ＰＡ圧力は１２．１０ｍｍＨｇであり、ＰＥＥＰは８．３８ｍｍＨｇに設定した。呼吸数は毎分５回に保ち、Ｉ：Ｅ＝１．２、ＰＴＭは１２．９１〜−４．４７ｍｍＨｇ（ΔＰＴＭ＝１７．３８ｍｍＨｇ）であった。酸素およびグルコースの消費を、比較のスケール上で乳酸の産生と並べて提示した（図１３Ａ）。ブタ肺とは異なり、媒体からＣＯ２が除去される傾向が観察された（図１３Ａ）。酸素交換機能も培養の持続時間を通して維持された（図１３Ｂ、左側）。機能静試験後のＰＡおよびＰＶ  ｐＯ２値（図１３Ｂ、右側）は、試験したブタ肺と比較して、ＰＡよりもＰＶでｐＯ２が大幅に高いこと、また、ＦｉＯ２＝０．２１で平衡化したときと比較して、灌流液のｐＯ２が全体的に増加することを明らかにしている（０．２１のＦｉＯ２に対する平均ＰＡ  ｐＯ２＝１４５．１ｍｍＨｇ）。リザーバが低量（＜１Ｌ）に見えた場合に新鮮な媒体をバイオリアクタシステムに添加し、その結果、合計媒体量が培養時間とともに増加した（図１３Ｃ、上）。やはり、一貫したＱＰＡによって、培養期間の持続時間の間、長期間ＩＬＣ下で肺の安定したＰＰＡおよびＰＶＲが生成された（図１３Ｃ）。
【０１５７】
小さく統計的に有意でないアポトーシスの増加も観察された（図１３Ｄ、ｐ＝０．１３５２）。組織学的分析によって、天然肺構造が維持されることが明らかになった（図１３Ｅ、Ｈ＆Ｅ）。長時間ＩＬＣ下のヒト肺はまた、ＶＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１、およびプロＳＰＢの発現および出現を保持した（図１３Ｅ）。
【実施例８】
【０１５８】
ラット肺の保存
この実施例は、新しく隔離されたラット肺をバイオリアクタに接続して、バイオリアクタの機能を試験した、実証実験について記載する。
【０１５９】
方法
ラット肺を、陰圧換気を使用して熱生理学的条件下で保存した。図１４Ａに示されるように、主要チャンバ圧力は０〜−８ｃｍＨ２Ｏに調節し、呼吸数は２０回／分であった。
【０１６０】
結果
第１の実験では、５％デキストランを含むＫＢＨ（０．６ｍｌ／分）を灌流液に添加し（図１４Ｂ〜Ｃに示されるように）、その結果、灌流圧力および動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）が４時間以内で減少し、肺は完全に浮腫状になった。Ｃｄｙｎは、肺の質の機能的パラメータである。それに加えて、灌流圧力および動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）は、デキストランを含まないＫＨＢを使用した場合（０．６ｍｌ／分）も、６時間以内に減少した。
【０１６１】
５％デキストランに加えて０．６ｍｌ／分のＫＨＢで灌流した、分離肺に関連する生理学的データ（図１５Ａ〜Ｃに示されるような）を収集した。図１５Ａに示されるように、主要チャンバ圧力は０〜−８ｃｍＨ２Ｏに調節し、呼吸数は２０回／分であった。図１５Ｂを参照すると、ＰＡ灌流圧力の時間経過が示される。圧力は徐々に減少し、図１５Ｂに示されるように、動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）も減少した。この実験では、４時間の灌流後、分離肺は完全に浮腫状であった。Ｃｄｙｎは、１回呼吸量（ｍｌ）を最高主要チャンバ陰圧値（ＣｍＨ２Ｏ）で割ったものとして定義した。図１５Ｃを参照すると、隔離された肺が保存によって破壊または傷害を受けたというエビデンスはない。図１５Ｃは、灌流後の肺試料をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した結果を示す画像である。左側のパネルは、倍率１００倍の対照である。右側のパネルは、倍率１００倍の、６時間の灌流後のサンプルである。この画像は、６時間の灌流後の正常な肺構造および細胞の完全性の維持、ならびにバイオリアクタ内の死体肺の換気を示している。
【実施例９】
【０１６２】
ヒトドナーからの一次肺上皮の分離
この実施例は、一次ヒト肺上皮を分離し増殖させるプロトコルについて記載する。第１の新生仔ラット組織消化プロトコルの適応（プロトコルＡ）、および第２の、文献から適応したプロトコル（Karp, P.H. et al.,、プロトコルＢ）。
【０１６３】
方法
プロトコルＡ−ラット新生仔の肺／腎臓消化に基づく。タイミング＝〜３時間
１．消化媒体を調製する。ディスパーゼ１ｍｇ／ｍｌ（幹細胞技術）にコラゲナーゼ１ｍｇ／ｍｌ。
２．（ａ）周囲肺組織、約１．５インチ（３．８４ｃｍ）の立方体、または（ｂ）主気道（気管支枝）を５０ｍｌファルコンチューブに分布させる。
３．２０ｍｌの消化媒体を各チューブに添加する。
４．小型の鋭いはさみを使用して、肺を迅速に切断して小さい細片にする。
５．細片にした肺を消化緩衝液中で３７℃で９０分間インキュベートする。
６．サンプルを３７℃から除去し、組織を一時的に沈殿させる。
７．サンプルから流体を分取し、１００μｍのフィルタに通す。
８．濾過液を遠心沈殿させる−３００ｘｇ、５分間。
９．赤血球溶解緩衝液中に再懸濁し、ＲＴで５〜１０分間インキュベートする。
１０．等量のαＭＥＭを添加して洗浄する。
１１．遠心沈殿させる−３００ｘｇ、５分間。
１２．細胞を計数し、培養フラスコに直接培養する。
【０１６４】
プロトコルＢ−Mol. Biol. 2002;188:115-37の方法に基づく。タイミング＝〜２４時間
１．解離溶液を調製する。プロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ／Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カタログ番号１６５９２１）およびデオキシリボヌクレアーゼ１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＤＮ−２５）。１００ｍＬに対して、αＭＥＭ  １００ｍＬ中にプロナーゼ１４０ｍｇおよびＤＮアーゼ１０ｍｇを溶解する。
２．（ａ）周囲肺組織、約１．５インチ（３．８４ｃｍ）の立方体、または（ｂ）主気道（気管支枝）を５０ｍｌファルコンチューブに分布させる。
３．２０ｍｌの消化媒体を各チューブに添加する。
４．小型の鋭いはさみを使用して、肺を迅速に切断して小さい細片にする。
５．細片にした肺を消化緩衝液中で４℃で２４時間インキュベートする。解離の間チューブを時々反転させて、細胞凝集塊を撹拌しばらばらにする。気管および気管支組織は、最短で４０時間から最長で９６時間を要する。
６．解離を終了するため、１０％ＦＢＥを含むαＭＥＭを解離溶液に添加する。チューブを数回反転させて、細胞懸濁液を撹拌する。細胞ペレットを特定の気道内で再懸濁させ、未コーティングの組織培養皿上に培養する。懸濁液を最短で１時間またはそれ以上インキュベートして、繊維芽細胞を付着させる。気道上皮細胞は、コラーゲンの前処理をしなければプラスチック面に付着しない。
７．付着しなかった細胞懸濁液をインキュベーション皿から回収し、コーティング済みの皿に移す。
【０１６５】
プロトコルＡおよびプロトコルＢによるヒトドナー肺の消化に続いて、細胞を、（１）０．１％ゼラチンまたは（２）０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶのどちらかで事前コーティングした培養フラスコ上に培養した。次に、細胞を、（１）ＤＭＥＭ、（２）ＳＡＧＭ、（３）ＡＥｐｉＣＭ、または（４）ＢＥＧＭ中で成長させた。
【０１６６】
結果
２４時間の培養における細胞の付着および形態学を評価することによって、プレートのコラーゲンＩＶコーティングと併せたプロトコルＢにより、より上皮様のコロニーがもたらされることが示された。これらの培養を７日間継続することにより、これらそれぞれの培養物の拡張能力が実証された。ＤＭＥＭで培養した細胞を、繊維芽細胞様の個体群によって迅速に過成長させ、これらの培養物を廃棄した。
【０１６７】
この時点で、細胞を継代し再培養して、拡張能力をさらに評価した。各条件から少量の細胞を、ヒト肺マトリックス切片にも播種して、生体適合性を評価した。４日後の細胞マトリックス培養物にカルセインＡＭ染料を添加することにより、培養物中における高レベルの生存度および細胞生存率が示され、細胞とマトリックスとの間で相互作用が観察された。
【０１６８】
培養細胞の表現型も、１回の継代の後、１１日目の培養物を免疫蛍光染色することによって調査した。異質表現型は、Ｉ型肺胞（Ｔ１α）、クラーラ細胞（ＣＣＳＰ）、気道上皮（ＣＫ５）、基底細胞（ｐ６３）、ＩＩ型肺胞（Ｅ−Ｃａｄ）、および間充織細胞（ビメンチン）の部分集合を表す。
【０１６９】
他の実施形態
本発明の多数の実施形態について記載してきた。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされてもよいことが理解されるであろう。
【符号の説明】
【０１７０】
１００ バイオリアクタ、１０１ 肺チャンバ、１０２ インキュベータチャンバ、１０３ 動脈灌流ポンプ、１０４ 動脈圧、１０５ 動脈ライン、１０６ 静脈ライン、１０７ 気管ライン、１０８ フィルタ、１０９ 酸素付加器、１１０ 制御モジュール、１１１ 静脈弁、１１２ 放出ライン、１１４ 動脈流量センサ、１１６ 静脈灌流ポンプ、１１８ 静脈圧力センサ、１２０ 静脈流量センサ、１２２ 気管弁、２００ バイオリアクタ、２０１ 肺チャンバ、２０２ インキュベータチャンバ、２０３ 媒体リザーバ、２０４ 動脈灌流ポンプ、２０５ 排液ポンプ、２０６ 動脈圧力センサ、２０７ チャンバ圧力センサ、２０８ 気管圧センサ、２０９ 静脈圧力センサ、２１０ 動脈ライン、２１１ 静脈ライン、２１２ 気管ライン、２１３ フィルタ、２１４ 酸素付加器、２１５ 制御モジュール、２１６ 静脈弁、２１７ 放出ライン、２１８ 入口地点、２１９ 出口地点、３００ 陽圧マニホルド、３０１ 圧力解放弁、３０２ 圧力リザーバ、３０３ 圧縮機、３０４ 気管ライン、３０６ 膨張式通気バッグ、３０８ マニホルド圧力センサ、３２０ 陽圧マニホルド、３２２ 吸気弁、３２４ 呼気弁、３２６ 圧縮機、３３０ 吸気弁、３３２ 呼気弁、３３４ 呼気圧力解放弁、４００ バイオリアクタ、４０１ 肺チャンバ、４０２ インキュベータチャンバ、４０３ 媒体リザーバ、４０４ 動脈灌流ポンプ、４０５ 排液ポンプ、４０６ 動脈圧力センサ、４０７ チャンバ圧力センサ、４０８ 気管圧センサ、４０９ 静脈圧力センサ、４１０ 動脈ライン、４１１ 静脈ライン、４１２ 気管ライン、４１３ 滅菌フィルタ、４１４ 酸素付加器、４１５ 制御モジュール、４１６ 静脈弁、５００ バイオリアクタ、５０１ 肺チャンバ、５０２ インキュベータチャンバ、５０３ 媒体リザーバ、５０４ 動脈灌流ポンプ、５０５ 排液ポンプ、５０６ 湿潤換気ポンプ、５０７ 動脈圧力センサ、５０８ チャンバ圧力センサ、５０９ 気管圧センサ、５１０ 静脈圧力センサ、５１１ 動脈ライン、５１２ 静脈ライン、５１３ 気管ライン、５１４ 滅菌フィルタ、５１５ 酸素付加器、５１６ 制御モジュール、５１７ 静脈弁、６００ バイオリアクタ、６０１ 肺チャンバ、６０２ インキュベータチャンバ、６０３ 媒体リザーバ、６０４ 動脈灌流ポンプ、６０５ 排液ポンプ、６０６ 動脈圧力センサ、６０７ チャンバ圧力センサ、６０８ 気管圧センサ、６０９ 静脈圧力センサ、６１０ 動脈ライン、６１１ 静脈ライン、６１２ 気管ライン、６１３ 滅菌フィルタ、６１４ 酸素付加器、６１５ 制御モジュール、６１６ 弁制御静脈ドレナージ、６１７ 換気装置、７００ 空気圧制御モジュール、７０１ 入口圧縮機、７０２ 出口圧縮機、７０３ 入口圧力弁、７０４ 出口圧力弁、７０５ 入口圧力リザーバ、７０６ 出口圧力リザーバ、７０７ 入口ライン、７０８ 出口ライン、７０９ ＰＰＣコントローラ、７１０ チャンバ圧力センサ、７１２ 肺チャンバ、８００ バイオリアクタ、８０１ 肺チャンバ、８０２ インキュベータチャンバ、８０３ 媒体リザーバ、８０４ 動脈灌流ポンプ、８０５ 排液ポンプ、８０６ 動脈圧力センサ、８０７ チャンバ圧力センサ、８０８ 気管圧センサ、８０９ 静脈圧力センサ、８１０ 動脈ライン、８１１ 静脈ライン、８１２ 気管ライン、８１３ フィルタ、���１４ 酸素付加器、８１５ 制御モジュール、８１６ 静脈弁、９００ バイオリアクタ、９０１ 肺チャンバ、９０２ インキュベータチャンバ、９０３ 媒体リザーバ、９０４ 動脈灌流ポンプ、９０５ 排液ポンプ、９０６ 動脈圧力センサ、９０７ チャンバ圧力センサ、９０８ 気管圧センサ、９０９ 静脈圧力センサ、９１０ 動脈ライン、９１１ 静脈ライン、９１２ 気管ライン、９１３ フィルタ、９１４ 酸素付加器、９１５ 制御モジュール、９１６ 静脈弁、９１７ フィルタオクルダ、９１８ 平衡化ライン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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2017512492.tif 000034
2017512492.tif 000035