(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成洗剤用界面活性剤化合物と蛋白質との複合体で免疫したマウスの脾細胞またはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られる、該化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗体を産生するマウス−マウスハイブリドーマであって、該界面活性剤化合物が、アルキル硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物およびそれらの塩からなる群から選択される陰イオン界面活性剤化合物、またはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される非イオン界面活性剤化合物であるところのマウス−マウスハイブリドーマ。
【請求項２】
陰イオン界面活性剤化合物が、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸またはその塩である、請求項１記載のハイブリドーマ。
【請求項３】
マウス−マウスハイブリドーマＧＯＴ９３０−９（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０６５）、ＧＯＴ９３５−５４（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０６６）またはＭＯＦ３−１３９（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５９）である、請求項１記載のハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載のマウス−マウスハイブリドーマより産生される、合成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項４記載のモノクローナル抗体を必須の構成成分としてなることを特徴とする洗剤、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析用キット。
【請求項６】
検体と、担体上に保持された請求項４記載のモノクローナル抗体と、標識剤で標識された洗剤、その分解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定することを特徴とする検体中の該洗剤、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤またはその分解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、該抗体を産生するハイブリドーマ、産生されたモノクローナル抗体、それを用いる、洗剤、その分解物またはそれらの混合物を免疫学的に分析するためのキットおよび方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
合成洗剤用界面活性剤化合物のうち陰イオン系界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（以下、ＬＡＳと略記することがある）は、生分解性の悪い分枝状アルキルベンゼンスルホン酸（ＡＢＳ）に代わり、１９６７年から行政指導により販売、使用が実施された。ＬＡＳは、安価かつ毒性の少ない洗浄剤として家庭用合成洗剤の主成分として現在も使用されているが、生活排水の河川への流入に伴い、近年、ＬＡＳおよびＬＡＳの分解物による水質汚染が問題となっており、陰イオン系界面活性剤として水道水質基準（０.２ミリグラム／リットル以下）が設定されている。また、非イオン系界面活性剤も合成洗剤使用量の４０％を占め、水道水質基準の設定が検討中である。
かかる事情から、環境中の合成洗剤やその分解物を測定、分析し、その結果を環境保全に役立たせている。このような測定、分析法として、例えば、上水、河川水、湖沼水または下水中のこれら洗剤および洗剤の分解物を定量測定するための高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィがあるが、これらは機器のコストが高く、前処理が必要で操作に習熟を要することが問題となっている。また、陰イオン系および非イオン系界面活性剤の公定測定法としては、それぞれ、メチレンブルー吸光度法およびカリウムテトラチオシアン酸亜鉛（ＩＩ）法があるが、これらの測定法は、人体に有害な有機溶媒を抽出操作時に使用し、また繁雑な濃縮操作を必要とするなど、定量法の改良が期待されている。
これらの問題から、陰イオンおよび非イオン界面活性剤について、従来の測定感度を維持した上で、迅速かつ簡便で、特異的で、低コストの測定法が望まれている。これらの問題を解決する手段として酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略記することがある）が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＥＬＩＳＡ法による、様々な他の環境汚染物質に対する定量系やキットが構築されており、例えば、ＷＯ９４／１２５３６号には、環境における石油燃料の検出用のＥＬＩＳＡ法や、そのキットが開示されている。酵素と抗体で構成されるこれらのキットは非常に迅速に、通常、数時間で測定が完了する。また、操作は、従来の高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィなどよりも非常に簡便であり、これらの測定操作に必要な煩雑な前処理もほとんどの場合必要でない。さらに、抗体、特に、モノクローナル抗体を使用することにより、非常に特異的な定量が可能になる。高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィなどは非常に高価な機器であり、そのメンテナンスにかかる費用もかなりなものであるが、ＥＬＩＳＡ法にはそのような問題がない。
しかし、ＬＡＳをはじめ、合成洗剤用の界面活性剤や、その分解物の検出、測定に使用できる免疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法は未だ確立されていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＬＡＳおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＡＰＥと略記することがある）や、その分解物の免疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法による検出、測定法を確立すべく、鋭意研究を重ねた。その結果、ＬＡＳの類似化合物であるスルホフェニル吉草酸（以下、ＳＰＣと略記することがある）およびＡＰＥの類似化合物であるノニルフェノールエトキシレートと無水コハク酸とのハーフエステル（以下、ＮＰ７ＥＣと略記することがある）を用い、これらをキャリヤー蛋白質と結合させ、マウスに免疫することにより、その脾臓より抗ＬＡＳまたは抗ＡＰＥモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作成できることを見出した。また、これらのモノクローナル抗体と、ＬＡＳ、ＡＰＥ、それらの類似化合物を標識したものを用いて高感度にＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの分解物を測定できることを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、合成洗剤用界面活性剤化合物と蛋白質との複合体で免疫した動物の脾細胞またはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られる該化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。
また、本発明は、本発明のハイブリドーマより産生される合成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗体を提供するものである。
本発明は、また、本発明のモノクローナル抗体を必須の構成成分としてなることを特徴とする洗剤、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析用キットも提供する。
さらに、本発明は、検体と、担体上に保持された本発明のモノクローナル抗体と、標識剤で標識された洗剤、その分解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定することを特徴とする検体中の該洗剤、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析方法、特に、ＥＬＩＳＡ法を提供するものである。
【０００６】
本発明における、対象となる洗剤は、合成洗剤用の界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤や非イオン界面活性剤を含有する洗剤であり、本発明によれば、これらの洗剤、その生分解物またはそれらの混合物を、免疫学的に、高感度かつ特異的に分析できる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のハイブリドーマは、合成洗剤用界面活性剤化合物と、蛋白質（キャリヤー蛋白質）との複合体を使用し、自体公知の方法に準じて作成できる。
用いる合成洗剤用界面活性剤化合物は、例えば、アルキル硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物およびそれらの塩（例、アルカリ金属塩等）のような陰イオン界面活性剤化合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびそれらの塩（例、リン酸塩、硫酸塩等）のような非イオン界面活性剤化合物が挙げられ、ここに、アルキルとしては、炭素数２〜１８程度のものが包含される。これらは、分析対象とする洗剤や、分解物に応じて適宜選択できるが、環境保全の観点からは、特に、ＬＡＳ、ＡＰＥおよびその塩を選択することが望ましい。
【０００８】
キャリヤー蛋白質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略す）、牛チログロブリン（以下、ＢＴＧと略す）などが挙げられる。
【０００９】
合成洗剤用界面活性剤化合物またはその類縁化合物と蛋白質との複合体の形成は、例えば、式：
Ａ−Ｒ              （Ｉ）
［式中、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＮＨ２またはＳＨを、Ａは、Ｒ基の離脱により、合成洗剤用界面活性剤化合物またはその類縁化合物となる基を示す。］
で表される化合物を、自体公知の方法により蛋白質に結合させることにより行える。
式（Ｉ）で表される化合物も、自体公知の方法で、適宜の原料に、カルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基を形成または導入することにより、化学的に合成できる。
例えば、ＲがＣＯＯＨで、ＡがＬＡＳとなる式（Ｉ）で表される化合物は、フェニルアルキルカルボン酸、例えばフェニル吉草酸をスルホン化することにより製造できる［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７９）］。
ＲがＣＯＯＨで、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルと無水コハク酸を脱水縮合（ハーフエステル）することにより製造できる［キャンサー・バイオケミストリー・バイオフィジックス（Cancer Biochem. Biophys.），７，１７５（１９８４）］。
ＲがＮＨ２で、ＡがＬＡＳとなる式（Ｉ）で表される化合物は、クロロアルキルベンゼン、例えば２−クロロエチルベンゼンをスルホン化した後［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７９）］、アンモニアで処理することにより製造できる［オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパレーションズ（Organic Functional Group Preparations）, 第１巻, ３８２頁］。
ＲがＮＨ２で、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チオニルにより塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），６０，２５４０（１９３８）］、アンモニアで処理することにより製造できる［オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパレーションズ（Organic Functional Group Preparations）, 第１巻, ３８２頁］。
ＲがＳＨで、ＡがＬＡＳとなる式（Ｉ）で表される化合物は、クロロアルキルベンゼン、例えば２−クロロエチルベンゼンをスルホン化した後［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７９）］、水硫化ナトリウムと反応させることにより製造できる［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），７２，１８４３（１９５０）］。
ＲがＳＨで、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チオニルにより塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），６０，２５４０（１９３８）］、水硫化ナトリウムと反応させることにより製造できる［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），７２，１８４３（１９５０）］。
【００１０】
動物を免疫するには、得られた複合体を動物に接種する。接種する動物としては、例えば、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリなどが用いられるが、ＬＡＳまたはＡＰＥに対するモノクローナル抗体（以下、ＭoＡbと略記することがある）が所望の場合には、マウスが特に好ましく用いられる。
接種方法としては、通常実施される方法でよく、例えば、マウスに１回に１〜１００μg、好ましくは５０〜１００μgを等容量（０.１ml）の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバントまたはＲＩＢＩアジュバントシステムで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。
これらの免疫動物、例えば、マウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。
融合操作は既知の方法に従って実施でき、融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）や、センダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓp２／Ｏなどが用いられ、特にＰ３Ｕ１が好ましい。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は１:１〜１０:１で、これに分子量１,０００〜６,０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度で添加され、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜１０分インキュベートするのがよい。
【００１１】
所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、種々の方法が使用できるが、例えば、ＳＰＣまたはＮＰ７ＥＣを結合させたＯＶＡを吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、ついで、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレート固相に結合した抗体を検出するＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。抗体活性陽性のハイブリドーマを直ちにクローニングに供するが、通常これは限界希釈法などで容易に実施される。
クローン化されたハイブリドーマ上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノクローナルなハイブリドーマを取得することができる。
以上のよう方法で作成した抗体産生ハイブリドーマの例として、後の実施例に示すマウスハイブリドーマＧＯＴ９３０−９、ＧＯＴ９３５−５４またはＭＯＦ３−１３９が挙げられる。
【００１２】
これらのハイブリドーマより産生される合成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗体も本発明の範囲のものである。
ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の産生、精製も自体公知の方法で行える。得られたモノクローナル抗体は、該合成洗剤用界面活性剤化合物、その分解物のみならず、式（Ｉ）で表される化合物に対する抗体となる。
【００１３】
得られたモノクローナル抗体は、例えば、「代謝」，Vol.８，６９６（１９７１）に記載されているブロムシアン法、グルタルアルデヒド（以下、ＧＬＡと略す）法などの公知の方法により、固相抗体とすることができる。また、より簡便で好ましい方法として、抗体を、マイクロプレートやチューブ、ポリスチレン粒子上に物理的に吸着させる方法、イムノクロマト法を利用した方法などがある。
これらを、例えば、ＥＬＩＳＡ用の酵素剤や、緩衝剤等と組み合わせて、洗剤、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析用キットとすることができ、かかるキットも本発明範囲のものである。
【００１４】
本発明の免疫化学的分析方法においては、検体（例、洗剤、その分解物またはそれらの混合物を含有する水や土壌試料）と、既知の量の標識された洗剤、その分解物またはそれらの混合物との、本発明のモノクローナル抗体に対する結合の量的な競合反応によって定量するいわゆる競合法が用いられる。競合法においては、未知の抗原を含む検体液を、担体上に保持された一定量の抗体に加え、さらに標識剤で標識した一定量の抗原を加える。担体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定する。検体と標識された抗原の添加はほぼ同時に行うことが望ましい。
この競合法は、一般にサンドウィッチ法などに比べて、操作が簡便で比較的短時間での測定が可能である。
【００１５】
抗原を標識する標識剤としては、放射性同位元素（以下、ＲＩと略す）、酵素、酵素基質、蛍光物質、ビオチンなどが挙げられる。これら抗原と標識剤の結合には、マレイミド法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ.Ｂiochem.），７９，２３３（１９７６）］、活性化ビオチン法［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ.Ａm．Ｃhem．Ｓoc.），１００，３５８５（１９７８）］などが用いられる。
【００１６】
例えば、ＬＡＳの場合、競合法による特異的免疫化学的測定方法を実施するには、未知量のＬＡＳを含有する被検試料に公知の常套手段で物理的または化学的に抗体を結合させた固相を加えて反応させる。また、同時に標識剤で標識した抗原の一定量を加えて反応させる。つぎに、通常、固相をよく洗浄し、固相上に結合している標識剤の活性を測定する。標識剤がＲＩである場合、ウェル・カウンターまたは液体シンチレーション・カウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。
本発明の方法においては、特異性の高いモノクローナル抗体を用いているので、ＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの分解物以外の化合物、例えば、トルエン、フェノール、ベンゼン、アニリンなどベンゼン環をもつような化合物または他の界面活性剤について、交叉反応で誤って測定してしまうことはなく、非常に特異的にＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの分解物を定量することができるという極めて優れた特色を有するものである。
かくして、本発明では洗剤や、その分解物に非常に特異的な抗体を用いることによって、検体中の他の化学物質による影響を排除できるので、高感度に、かつ特異的に、簡便に測定が行え、学術上での分析はもとより、環境保全等における洗剤、その分解物の影響等の調査等に有用である。
【００１７】
【実施例】
以下に、実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するものではない。
なお、以下の実施例は、ＬＡＳ、ＳＰＣ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＡＰＥについてのものであるが、これらは同様に他の合成洗剤用界面活性剤化合物にも適用できる。また、実施例におけるマウス−マウスハイブリドーマＧＯＴ９３０−９およびＧＯＴ９３５−５４は、それぞれ通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にブタペスト条約の下、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０６５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−６０６６として（原寄託日：平成８年９月２５日）、また、ＭＯＦ３−１３９は、平成９年８月１３日よりブタペスト条約の下、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５９として寄託されている。
実施例１
抗ハプテンモノクロナール抗体の取得
（１）免疫原の調製
ハプテンであるＳＰＣおよびＮＰ７ＥＣは公知の方法でフェニル吉草酸およびノニルフェノールエトキシレートから合成した。ハプテン５０mg／ml水溶液をＢＳＡ５０mg／４ml水溶液に加え、水溶性カルボジイミド５０mg／ml水溶液１mlを氷冷下、静かに滴下し、５時間反応させた。蒸留水で５回透析後（３リットル×５）、凍結保存し免疫原として用いた。
（２）免疫
ハプテンとＢＳＡの複合体５００μg／ml生理食塩水に等量のフロイント完全アジュバントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／cマウス（雌、１００μg／０.４ml／マウス）に腹腔および背部皮下投与し、２週間隔で追加免疫を実施した。６回の追加免疫後、２週で最大の血清抗体価を示した個体について、同じ複合体溶液（３０μg／０.１ml生理食塩水／マウス）を静脈投与した。
【００１８】
（３）細胞融合
最後の免疫から３日後、マウス腹腔中から脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を常法により調製した（約１０8個）。ついで、血清無添加培地で３回洗浄したマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０7個を添加し、ＰＥＧ６０００を用いてケーラーとミルスタインの方法［ネーチャー（Ｎature），２５６，４９５（１９７５）］に準じて細胞融合に供した。
融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。１０日間の培養期間中に脾臓由来の細胞は自然に死滅し、ＨＡＴ培地により脾臓細胞と融合しなかったＰ３Ｕ１株も死滅した。培地中に生存した細胞をハイブリドーマとし、以後はＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に代えて培養を続けた。
（４）ハイブリドーマの一次選択およびクローニング
固相にハプテンとＯＶＡの複合体（以下ハプテン−ＯＶＡと略す）を吸着させたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。融合１０日目から２０日後でハイブリドーマの出現を認め、かつハプテン−ＯＶＡに結合する抗体の出現が認められた。特に産生抗体の結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニンングに供した。
【００１９】
（５）ハイブリドーマの二次選択
（５）−１  抗ＬＡＳ抗体、抗ＳＰＣ抗体、抗ＳＤＳ抗体産生ハイブリドーマの選択
（４）の方法で取得したハイブリドーマーについて、ＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳ、ベンゼンスルホン酸、トルエン、ベンゼン、フェノールなどの化合物を、これらの培養上清に添加し、ＳＰＣ−ＯＶＡを吸着したマイクロプレートへの結合能の阻害を見る結合阻害試験を行い、ＬＡＳのみ、またはＬＡＳ、ＳＰＣおよびＳＤＳにより結合が阻害され、他のものについては結合が影響を受けないものを選択した。
これらの結果、ＬＡＳに特異的に結合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＧＯＴ９３５−５４およびＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳと特異的に結合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＧＯＴ９３０−９が得られた。これらの免疫グロブリンクラス、サブクラスはＥＬＩＳＡ法による測定で両方ともＩｇＧ１であった。
（５）−２  抗ＡＰＥ抗体産生ハイブリドーマの選択
（４）の方法で取得したハイブリドーマについて、ＡＰＥ、ＡＰＥ生分解物（ＡＰＥＣと略記することもある）およびＰＥＧ等の化合物をこの培養上清に加えて、ＮＰ７ＥＣ−ＯＶＡを吸着したマイクロプレートへの結合能の阻害を調べる阻害試験を行い、ＡＰＥおよびＡＰＥＣにより結合が阻害され、他のものについては結合が影響を受けないものを選択した。
これらの結果から、ＡＰＥ、ＡＰＥＣに特異的に結合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＭＯＦ３−１３９が得られた。この免疫グロブリンクラス、サブクラスはＥＬＩＳＡ法による測定でＩｇＧ１であった。
測定物質、用いたハプテン、取得したハイブリドーマおよびその受託番号を表１にまとめる。
【００２０】
【表１】
0004044648.tif 000002
【００２１】
（６）モノクローナル抗体の作製
クローン化されたハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清を含むダイゴＴ培地（日本製薬、東京）中、３７℃、５％ＣＯ2濃度のインキュベータを用いて培養し、その上清より抗体を得た。
一方、多量の抗体を得るためには、予め０.５mlの鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０6個のハイブリドーマを腹腔内接種した。細胞を接種したマウスは約１０日後に腹水の貯留が見られた。腹水の貯留したマウスを開腹し、腹腔内より腹水液を採取した。
抗体の精製は常法により、細胞培養上清または腹水上清より４５〜５０％飽和硫酸アンモニウムで分画後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーに供し、実施した。腹水上清液２mlから、細胞株によって２〜２０mgのモノクローナル抗体が得られた。また、これら精製したモノクローナル抗体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、９６％以上の純度を示した。
【００２２】
実施例２
ＬＡＳおよびＬＡＳ分解物の測定
（１）ＨＲＰ標識ＳＰＣの作製
蒸留水に溶解したＨＲＰペルオキシダーゼ４mg／０.２mlとＳＰＣ１０mg／０.２mlを混合し、氷上で１５mg／０.１mlの水溶性カルボジイミド溶液を攪拌しながら滴下した。氷上で約８時間反応後、ＰＢＳ（−）に対して十分透析し、未反応のＳＰＣ、ＷＳＣを除去した。
（２）モノクローナル抗体の固相化
実施例１（５）−１で得られた抗体を２５mＭビス−トリス緩衝液に５μg／mlの濃度に溶解し、９６ウエル・イムノプレート（ヌンク社製、デンマーク）の各ウェルに１００μlずつ分注し、４℃で一晩静置し、抗体を固相化した。抗体の結合しなかった結合基をブロックするために、０.０１％メルチオレートナトリウム（シグマ社製、ＵＳＡ）を含むブロックエース溶液（雪印乳業株式会社製、東京）を１５０μlずつ分注し、使用するまで４℃にて保存した。
（３）ＬＡＳおよびＬＡＳ分解物の測定
蒸留水を用いてＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳ（東京化成株式会社製、東京）を希釈したものと、上記（１）で調製したＨＲＰ標識ＳＰＣ ２μg／ml（０.０２％Ｔween２０−ＰＢＳ）を等量混合し、上記（２）で調製した抗体結合マイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で９０分反応後、ＰＢＳでプレートを洗浄し、酵素基質液（ＴＭＢＺ ０.１mg／ml、ウレアハイドロゲンペルオキサイド０.３５mg／mlを含む４０mＭクエン酸緩衝液、pＨ５.０）１００μlを添加し、１５分間発色反応を行わせた。１Ｎリン酸で反応停止後、４５０nmにおける吸光度を測定した。
ＬＡＳ、ＳＰＣおよびＳＤＳの標準曲線をそれぞれ、図１、図２および図３に示す。この系で約２０〜５００ｐｐｂのＬＡＳが、また、約５０〜５００ｐｐｂのＳＰＣおよびＳＤＳが測定できた。
【００２３】
実施例３
ＡＰＥの測定
（１）ＨＲＰ標識ＮＰ７ＥＣの作製
０.１３Ｍ ＮaＨＣＯ3水溶液に溶解したＨＲＰ３.３mg／２mlと、公知の方法により活性化エステルを形成させたＮＰ７ＥＣ３００μg／５μlＤＭＳＯを混合し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ（−）に対して十分透析し、未反応のＮＰ７ＥＣを除去した。
（２）モノクロナール抗体の固相化
実施例１（５）−２で得られた抗体をＰＢＳ（−）に５μg／mlの濃度に溶解し、実施例２（２）の方法で９６ウエル・イムノプレートに固相化した。
（３）ＡＰＥおよびＡＰＥ生分解物の測定
６０％メタノール水溶液を用いてＡＰＥ（東京化成株式会社）を希釈したものと、上記（１）で調製したＨＲＰ標識ＮＰ７ＥＣ０.３μg／ml（０．１％Ｔween２０−２倍濃縮ＰＢＳ）を当量混合し、上記（２）で調製した抗体結合マイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で９０分反応後、０.０５％Ｔween２０−ＰＢＳでプレートを洗浄し、酵素基質液（ＴＭＢＺ ０.１mg／ml、ウレアハイドロゲンペルオキサイド０.０３５mg／mlを含む４０mＭクエン酸緩衝液、pＨ５.０）１００μlを添加し、１５分間発色反応を行わせた。１Ｎリン酸で反応停止後、４５０nmにおける吸光度を測定した。
ＡＰＥの標準曲線を図４に示す。この系で約５０〜５００ｐｐｂのＡＰＥが測定できた。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、洗剤や、その分解物を高感度で、かつ特異的に、簡便に測定でき、学術的な研究はもとより、環境保全等に役立たせることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＬＡＳ測定用の標準曲線である。
【図２】  ＳＰＣ測定用の標準曲線である。
【図３】  ＳＤＳ測定用の標準曲線である。
【図４】  ＡＰＥ測定用の標準曲線である。
【図１】
0004044648.tif 000003
【図２】
0004044648.tif 000004
【図３】
0004044648.tif 000005
【図４】
0004044648.tif 000006