(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胞子形成能を有する納豆菌由来の、胞子形成能が欠損或いは低下したビタミンＫ高生産性納豆菌変異株。
【請求項２】
胞子形成能欠損ビタミンＫ高生産性納豆菌変異株ｓｐ−２（Baci11us sp. sp-2 ）ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５７７。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の納豆菌変異株を培養することを特徴とするビタミンＫの生産方法。
【請求項４】
大豆或いは大豆由来の成分を添加した培地で培養する、請求項３に記載のビタミンＫの生産方法。
【請求項５】
大豆或いは大豆由来の成分が全粒大豆粉末、分離大豆蛋白質粉末、豆乳、大豆成分抽出液（大豆煮汁）、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項４に記載のビタミンＫの生産方法。
【請求項６】
大豆或いは大豆由来の成分を、培地の最終成分配合割合で０．２〜１．０％添加する、請求項４又は５に記載のビタミンＫの生産方法。
【請求項７】
大豆由来の成分が大豆煮汁である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のビタミンＫの生産方法。
【請求項８】
更にグリセリンを培地に添加する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のビタミンＫの生産方法。
【請求項９】
グリセリンを、培地の最終成分配合割合で３〜１０％添加する、請求項８に記載のビタミンＫの生産方法。
【請求項１０】
ジャーファーメンター内で培養する、請求項３〜９のいずれか一項に記載のビタミンＫの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、最近骨粗鬆症の予防効果が期待できることで注目されているビタミンＫを大量に生産することが可能なビタミンＫ高生産性菌株、及び該菌株を利用したビタミンＫの生産方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＫは、従来より血液凝固に必要な因子の一つとして知られている。最近の研究により、ビタミンＫには骨形成促進作用や骨吸収抑制作用もあり、ビタミンＫの投与により骨密度が増加されるということが明らかにされた。現在、骨粗鬆症の治療薬として認可されている合成ビタミンＫもある。骨粗鬆症は発症してからの治療は大変難しく、予防することが重要である。そのためには、食品から日常的にカルシウムやビタミンＤとともに、ビタミンＫを摂取することが必要であろう。緑黄色野菜や海草類にはビタミンＫ１（フィロキノン）が含まれており、また、納豆などの醗酵食品にはビタミンＫ２（メナキノン）が含まれていることはよく知られている。しかし最も含有量が多いとされている納豆でも１００ｇ中僅か１ｍｇ程度であり、既存の食品から骨粗鬆症の予防のために必要な量のビタミンＫを摂取することは大変難しい。そこで、食品にビタミンＫを添加することが有効であろうと考えられるが、骨粗鬆症の治療薬として認可されている合成ビタミンＫは食品添加物としては認められておらず、食品に添加することはできない。一方、天然のビタミンＫは食品に添加し得ることから、野菜や納豆などからビタミンＫを分離濃縮して得ることが試みられているが、原料中のビタミンＫの含量が少ないために僅かしか得られておらず、結果的に大変高価なものとなっている。
【０００３】
ビタミンＫを大量に生産する方法として、細菌を利用したビタミンＫの醗酵生産が検討されている。醗酵によるビタミンＫの製造法としては、フラボバクテリウム属に属する細菌を利用する方法（特公平７−２８７４８、特公平７−５１０７０など）、ロドシュードモナス属に属する細菌を利用する方法（特開昭５７−２０２２９５など）、コリネバクテリウム或いはブレビバクテリウムに属する細菌を利用する方法（特公平３−６７６７４、特公平４−８０３９など）などが知られている。これらの方法で得られるビタミンＫを食品に添加使用することは、上記したような細菌を利用しているために安全性の観点から、或いは消費者に与えるイメージの観点から、あまり好ましいとはいえない。
【０００４】
各種食品のうち納豆にはビタミンＫが最も多く含まれているということから、納豆菌を利用したビタミンＫの生産方法も知られている（特開平８−１７３０７８、特開平８−９９１６など）。食品に添加するという観点からは納豆菌を利用することは好ましいといえるが、通常の市販の納豆菌を利用してビタミンＫを醗酵生産してみても、採取して得られるビタミンＫは期待ほど多くはない。よって、ビタミンＫ高生産性菌株の取得、並びにビタミンＫの高生産が期待できる該菌株の培養方法の確立などが要望されているのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、骨粗鬆症の予防効果が期待されるビタミンＫを、その効果が期待できるように摂取するには、納豆菌を利用してビタミンＫを発酵生産し、採取して得られるビタミンＫを日常摂取する食品に添加することが有効であろうと考えられる。そのためには納豆菌を利用してビタミンＫを安価に且つ大量に生産し得る方法を確立することが必要である。よって、ビタミンＫ高生産性菌株を取得し、該菌株を利用してビタミンＫを大量に生産し得る方法が確立したのならば産業上益することは多大であるといえる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決することを目的として本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、納豆菌によるビタミンＫの発酵生産は納豆菌が胞子を形成し始める前の段階で高まり、胞子の形成が進むにつれて低くなり、また、胞子の形成が遅れるような培養条件下においては培養液中のビタミンＫの含量が高まるようになることなどを見出した。このような知見に基づき、本発明者らは、後述の「突然変異作出手段」の項で説明するような方法により、ビタミンＫ高生産性菌株を得ることに成功したのである。
【０００７】
本発明者らは、こうして得られた高生産性変異株を用いてジャーファーメンターにおけるビタミンＫの醗酵生産について各種の培地を用いて調べてみたところ、微生物の培養に一般的に用いられている培地では、培養の後段で溶菌が起こり、期待した程のビタミンＫの収量は得られないことがわかった。このような溶菌を防止する方法を更に研究したところ、培地に全粒大豆粉末、分離大豆蛋白質粉末、豆乳、大豆成分抽出液（大豆煮汁）等の大豆又は大豆由来の成分を添加するならば溶菌が防ぎ得、大量のビタミンＫの生産が可能であることがわかった。また、その際更にグリセリンを添加するならば、培養液中のビタミンＫの濃度を更に高めうることを突き止め、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、胞子形成能を有する納豆菌由来の、胞子形成能が欠損或いは低下したビタミンＫ高生産性納豆菌変異株を提供するものである。
また、本発明は、上記変異株の代表的なものとして、胞子形成能欠損ビタミンＫ高生産性納豆菌変異株ｓｐ−２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ｓｐ−２）ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５７７を提供するものである。
更にまた、本発明は、これらの菌株を利用したビタミンＫの発酵生産方法を提供するものである。
また更に、本発明は、上記のビタミンＫの発酵生産方法において、大豆或いは大豆由来の成分を添加した培地で当該菌株を培養することを特徴とするビタミンＫの生産方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
Ｉ．突然変異作出手段
胞子形成能を有する納豆菌を前培養し、さらに新しい培地に接種して対数増殖期の中期まで培養したものに変異処理を行ない、単一コロニーを形成するように適宜稀釈した後、胞子形成寒天平板で培養する。生じたコロニーの中から胞子形成能が欠損あるいは低下した株を取得する。
変異処理の方法としては、紫外線、Ｘ線等で照射するか、又はＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチルメタンサルファネート）等の変異誘起剤で処理するのが好ましいが、特に限定されるものではない。
また、変異処理後の胞子形成寒天平板での培養により生じたコロニーからの胞子形成能の欠損した或いは低下した無胞子変異株の選択方法も特に限定されるものではないが、一般的には、胞子形成培地上でのコロニーの色調や形態などから不定形のコロニーや透明なコロニーを形成するものを変異株として分離し、更に顕微鏡により胞子形成の有無を確認することにより胞子形成能が欠損或いは低下した変異株であると判断する。
【００１０】
II．変異体の同定
後述の実施例で示すように、上記の方法に従って胞子を形成せず、ビタミンＫを大量に生産する変異株、ｓｐ−２が得られた。この菌株は、納豆菌の培養において用いられる、通常の標準的な寒天培地でも、また、胞子形成用の寒天培地においても胞子の形成が認められず、よって、変異株ｓｐ−２はいわゆる胞子形成能欠損変異株であることがわかった。また、この菌株は、胞子形成能の欠損とそれに関連するコロニーの形態以外の菌学的性質に関しては、市販の納豆菌のもの〔食総研報（Ｒｅｐ．Ｎａｔｌ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．）Ｎｏ．５０，１８〜２１（１９８７）及び大豆月報、１２月号、２１〜２９（１９８５）参照〕と変わらなかった。即ち、この変異株ｓｐ−２は、好気性、グラム染色陽性の桿菌であり、菌（栄養細胞）の大きさ（１×２〜３μｍ）、生育適温（３５〜４５℃）、各種の糖の発酵性、ＤＮＡのＧＣ含量等の性質がＢｅｒｇｅｙ′ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ８版の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の性質と一致しており、かつ粘質物を生成し、ビオチン要求性であること、及び納豆菌のファージに対して感受性であることから、いわゆる納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）に属しているものである。この変異株ｓｐ−２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｓｐ−２）は、平成１０年１月１２日、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５７７号として寄託されている。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明を実施例でもって更に詳しく説明する。本発明において％はすべて重量％である。
【００１２】
なお、ビタミンＫの抽出・測定方法に関しては、従来より様々な方法が知られているが、下記の実施例においては、以下で述べる方法で行なった。
ビタミンＫの抽出
培養液３．０ｍｌを５０ｍｌ容量の褐色ガラス遠沈管にとり、イソプロピルアルコール４．０ｍｌを加え、ボルテックスミキサーにて３０秒間×５回の攪拌・混合を行なう。後述の高速液体クロマグラフィー（ＨＰＬＣ）における内部標準用として、１００μｇ／ｍｌのメナキノン−４のｎ−ヘキサン溶液を１．０ｍｌ加え、更にｎ−へキサンを７．０ｍｌ加え、ボルテックスミキサーにて３０秒間×５回の攪拌・混合を行なう。次いで、遠心分離機により、３５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清のへキサン層を別の褐色ガラス遠沈管に採取する。この遠沈管を４５℃のウォーターバスで暖め、アスピレーターで吸引して乾燥させたのち、残存したビタミンＫをｎ−へキサン４．０ｍｌを加えて再度溶解する。このへキサン溶液を、予めｎ−へキサンとエチルエーテルとの容量比９６：４の混合液を通した後にｎ−へキサン７．０ｍｌを通して洗浄しておいた、セップパックシリカカートリッジ（ウォーターズ製）にゆっくり通し、ビタミンＫを吸着させる。次いで、ｎ−へキサンとエチルエーテルとの容量比９６：４の混合液５．０ｍｌをゆっくり通して、カートリッジ内よりビタミンＫを溶出させる。溶出させたビタミンＫは、別の褐色ガラス遠沈管に採取し、４５℃のウォーターバスで暖め、アスピレーターで吸引して乾燥させたのち、残存したビタミンＫをｎ−へキサン１．０ｍｌを加えて再度溶解し、測定試料とする。
【００１３】
ビタミンＫの測定方法
ＨＰＬＣは、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ（５μｍ）を充填した直径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのカラムを用い、移動相はメタノール‐ジクロロメタン（４：１ｖ／ｖ）を毎分１ｍｌの速度で流し、２４８ｎｍでの吸光度をモニターすることにより実施し、ピークを検出した。
納豆菌由来のビタミンＫ（メナキノン−７：ＭＫ−７と略称）のピークは７分前後に、内部標準由来のメナキノン−４のピークは３．７分前後に溶出するので、培養液中の実際のＭＫ−７の含量（ｍｇ／ｌ）は、これらのピークエリアの比、ヘキサンにおけるモル吸光度、及び内部標準の力価に基づいて算出することができる。
【００１４】
実施例
市販の納豆種菌（宮城野納豆製造所製の三浦菌）を親株とした。この親株をＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩５ｇ及び純水１０００ｍ１：ｐＨ６．８）で前培養し、５ｍｌのＬＢ培地を入れた試験管にこの前培養液５０μｌを接種し、３７℃、１２０ｒｐｍで２時間振とう培養した。次いで、遠心分離機で集菌した菌体を生理食塩水で洗浄後、１０ｍ１の生理食塩水に懸濁し、このものに、１５Ｗの紫外線殺菌灯で３０ｃｍ上空の距離から紫外線を３０秒間照射した。その後、胞子形成培地（ニュートリエントブロス８ｇ、塩化カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．１２ｇ、硝酸カルシウム４水和物２３６ｍｇ、塩化マンガン４水和物１９８ｍｇ、硫酸鉄７水和物２７８μｇ及び純水１０００ｍ１：ｐＨ７．０）に再懸濁し、一晩振とう培養した。培養液を、単一コロニーを作るように適宜稀釈したのち、胞子形成寒天平板（寒天を１．５％上記胞子形成培地に添加したもの）に塗抹した。３７℃で三日間培養した後、コロニーが透明なもの、或いはウェット状でクリーム色をしたコロニーを取得し、顕微鏡で胞子形成が認められないことを確かめたのち、無胞子変異株として取得した。
【００１５】
上記の方法に従って得られた数種の変異株を、大豆煮汁培地（Ｂｒｉｘ１０％の大豆煮汁、グリセリン５％：ｐＨ７．３）を２０ｍ１仕込んだ５００ｍ１容量の坂口フラスコに接種し、３７℃、１２０ｒｐｍの条件下で４日間培養し、得られた培養液中のビタミンＫの含量をそれぞれ高速液体クロマトグラフィーの結果に基づいて算出し、それらのビタミンＫ生産能を比較したところ、下記の表１に示したような幾つかのビタミンＫ高生産性菌株が得られた。その中で最もビタミンＫの生産能力の高い変異株（ｓｐ−２株）を選び、このものを平成１０年１月１２日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。該菌株に対して受託番号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５７７）が付与された。
【００１６】
【表１】
0004104741.tif 000002
【００１７】
ｓｐ−２株のビタミンＫの生産性について、工業規模での大量生産のためにジャーファーメンターによる培養について検討を行なったところ、微生物の培養に一般的に用いられている培地では培養の後段で溶菌が起こり、その結果、ビタミンＫの収量は期待した程得られなかった。
【００１８】
よって、培養中の溶菌を防いで、ビタミンＫの生産量を増加させるのに有効な培養方法について種々検討したところ、培地中に全粒大豆粉末、豆乳、脱脂大豆蛋白質粉末（分離大豆蛋白質粉末）、大豆成分抽出液（大豆煮汁）などの大豆又は大豆由来の成分を添加するならば溶菌が抑えられることを確認した。また、更にグリセリンを添加して培養を行なってみたところ、ビタミンＫの生産量が飛躍的に増大することを確認した。
【００１９】
上記の培養並びにその検討は以下の通りに行なった。
様々な大豆由来の成分を添加した培地を２０００ｍｌ容量の小型ジャーファーメンターにそれぞれ６００ｍｌ仕込み、ｓｐ−２株を接種して３７℃、５００ｒｐｍ、通気量１．０ｖｖｍの条件下で三日間培養し、次いでそれぞれ高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた結果に基づいてそれぞれのビタミンＫの生産量を算定し、その結果を下記の表２に示した。
【００２０】
【表２】
0004104741.tif 000003
【００２１】
これらの結果から、当該変異株によるビタミンＫのジャーファーメンターでの生産には、大豆あるいは大豆由来の成分の存在が好ましいことがわかる。大豆由来の成分において何がそのような効果をもたらすのか不明であるが、大豆煮汁、豆乳の他、分離大豆蛋白質粉末の微量添加においてもビタミンＫの収率が増えていることから、その原因物質は多分大豆蛋白質であろう、と推察できる。
また、表２の結果から明らかなように、これらの大豆由来の成分は必ずしも多量に添加する必要はなく、その添加量は、限定されるものではないが、最終成分配合割合で（大豆煮汁の場合は、それに由来するＢｒｉｘ値で）、０．２〜１．０％程度でよく、このような配合割合で充分なビタミンＫの増産効果が得られる。また、グリセリンの添加量は、最終成分配合割合で３〜１０％程度が好ましい。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、発酵生産によるビタミンＫの生産の向上化が達成し得、即ち、ビタミンＫの含量率の著しく高い培養物を生産し得、しかも従来の生産法に比べてより安価に実施することができることから、食品に添加しうるビタミンＫを安価に、かつ大量に生産できる方法を確立し得たといえる。