(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱可逆性ゲルを形成するための作用剤として、水性媒体中において、α-1,4-α-1-グルコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.25）の群または該群に対応する活性をもつ酵素により、アミロース含有デンプンを処理することによって得ることができる、修飾されたデンプンの使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、
使用される酵素は、本質的に、デンプン分子を望ましくなく損傷させることがない、ところの使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、
アミロース含有デンプンは、じゃがいものデンプン、トウモロコシのデンプン、小麦のデンプン、米のデンプンまたはタピオカのデンプンである、ところの使用。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の使用であって、
修飾されたデンプンは、少なくとも３重量％の濃度で存在する、ところの使用。
【請求項５】
ゲル形成物質として請求項１から３に記載の修飾されたデンプンを含有する熱可逆性ゲル。
【請求項６】
請求項５に記載の熱可逆性ゲルであって、
ゲル形成物質は、少なくとも３重量％の濃度で存在する、ところの熱可逆性ゲル。
【請求項７】
請求項５または６に記載の熱可逆性ゲルであって、
食料品、化粧品、薬剤、洗剤、接着剤および掘穿泥水により形成される群に属する、ところの熱可逆性ゲル。
【請求項８】
熱可逆性ゲルを形成するための作用剤としての修飾されたデンプンが、水溶液の形状である、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、熱可逆性ゲルを形成するための作用剤として、特別の方法で修飾されたデンプンの使用に関する。
多くの異なった方法でデンプンを修飾することが知られている。行われる修飾により、異なった用途に適するデンプン生成物が得られる。既知のデンプン修飾物の多くは、比較的粘性があるために、処理が困難な溶液を得るに至る。他の場合において、低い粘性を実際得ることができるが、分子量が実質的に減少し、このため多くの典型的なデンプンの性質が失われてしまう。
糊化したデンプンから得られる生成物のもう１つの問題点は、溶解したアミロース分子が、漸次的に、また不可逆的に難溶性になるという劣化である。アミロースを含まないデンプンを使用することにより、劣化しないデンプンを得ることができる。この目的のために、アミロペクチンおよびアミロースを、あらゆるタイプのデンプンから分離させることができるが、これらの手順は骨が折れる。アミロースを含まないデンプンはまた、アミロースが形成されない特別の穀物から取り出すこともできる。これらの穀物はこの目的のために育成されなくてはならない。劣化のないデンプンを化学的誘導により得ることもできるが、このことは異物の導入を引き起こし、この異物はデンプンの性質に影響を与える。最後に、劣化は、酵素的加水分解によってデンプン溶液のデキストロース等量（DE）を増加させることによっても防ぐことができるが、これはデンプンの高分子特性を変質させるか、またはしばしば完全に失わせる。
特定のデンプン誘導体が、さらに異なった使用の可能性を与えるデンプンゲルを形成することができることがさらに知られているが、Carnohydrate Polymers 231（1993）の243〜248ページからわかるように、デンプンゲルは、少なくとも10％以上という非常に高濃度においてのみ得ることができる。
ここで、特別の方法で修飾されるデンプンが、熱可逆性ゲルを形成するために、特に適していることがわかっている。
さらに、このような修飾デンプンは、低濃度ですでに熱可逆性ゲルを形成できることがわかっている。
本発明に従って使用される修飾デンプンはまた、水溶液中での低い粘性により特徴づけられ、このため生成物は処理および加工が容易であり、このような水溶液は多くの用途に適している。
本発明に従って使用される修飾デンプンが、平均分子量、還元力（DE）および分岐パーセンテージに関して、スタート物質と実質的に同一であることは、非常に注目すべきことである。さらに、酸化感応箇所における増加がなく（DEは事実上変化しない）、こうして高分子特性は保たれる。
上記の目的に従って、本発明は、水性媒体中において、α-1,4-α-1,4-グルコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.25）の群または活性が上記の群からの酵素の活性に対応する酵素（これらの全ての酵素は、今後は短くグルコシルトランスフェラーゼとして述べる）によりアミロース含有デンプンを処理することにより得ることができる修飾デンプンが、熱可逆性ゲルを形成するための作用剤として使用されることにより特徴づけられる。グルコシルトランスフェラーゼの典型的な関連する活性は、新規なα-1,4結合を作るために、２つのグルコースのユニットの間のα-1,4結合をこわすことができる。
本発明はさらに、上記に定義したような修飾デンプンの、先述のような比較的低い粘性を有する水溶液の形状における使用により特徴づけられる。
ここで使用する“デンプン”の語は、天然のデンプンおよび非置換デンプン誘導体の両方を含む。後者は、酸および／または酵素的加水分解を通じて、5を超えないDEを得るように（さもなければデンプンの高分子特性が失われてしまう）、部分的にこわすことにより得られるデンプンを意味する。グルコシルトランスフェラーゼによる転化に使用されるデンプンは、先述のように、好適には少なくとも5重量％の量のアミロースを含まなくてはならない。さらに、スタートデンプンはまた、アミロペクチンを含む必要があるが、これは常に天然にデンプン中に存在する。アミロース-およびアミロペクチン-を含んだ、じゃがいものデンプン、とうもろこしのデンプン、小麦のデンプン、米のデンプンおよびタピオカのデンプンのような天然のデンプン、並びにそれらの非置換誘導体は、このため、スタートデンプンとして使用され得る。
使用されるグルコシルトランスフェラーゼは、異なった生物から得ることができる。文献より、これらの酵素は、真核生物および細菌の発現体（representatives）に現れることが知られている。さらに、グルコシルトランスフェラーゼはまた、古細菌の発現体に存在することも知られている。やや高い温度、例えば約70℃に対して耐性があるグルコシルトランスフェラーゼを使用することが好適である。この例は、Thermus thermophilis、Thermotoga maritimaおよび古細菌の好熱性発現体から得られるグルコシルトランスフェラーゼである。しかし、例えばじゃがいもまたはEscherichia coli（大腸菌）から得られる、それぞれD-酵素およびアミロマルターゼである非耐熱性グルコシルトランスフェラーゼは、本発明の実行に使用することができる。必要ならば、デンプン分子に望ましくない損傷を与えたり、こわしたりし得る酵素の構成要素から、酵素を精製しなければならない。このように、酵素は本質的に、α-アミラーゼ活性のコンタミネーションがない必要がある。当業者は、このような精製の実行方法を知る。
グルコシルトランスフェラーゼによる酵素転化は、糊化デンプンおよび未だに粒状であるが、次に膨潤した状態になるデンプン、または言い換えれば、部分的にのみ糊化した状態であるデンプンの両方に起こり得る。先の場合において、例えば所望の反応温度に冷却された後に、グルコシルトランスフェラーゼはすでに糊化したデンプン溶液に添加され得る。後の場合において、グルコシルトランスフェラーゼは、所望の時にいつでも、デンプン懸濁液に添加することができる。
酵素転化を行うための反応条件は、使用されるグルコシルトランスフェラーゼに依存し、当業者が容易に決定することができる。実施において、通常、酵素が最適な活性を有するpHまたはその付近のpHで行われる。酵素がより多く使用されると、転化はより速く進み、また、温度をより高くすると、意図された酵素転化は強化される。もちろん、温度を選択する場合、使用されるグルコシルトランスフェラーゼの熱安定性を考慮しなくてはならない。やや熱安定性の酵素が使用される場合、酵素転化は、好適には60〜75℃の範囲内の温度において行われる。転化が進行して、粘性の減少が続く。所望の粘性の減少に達した後、転化は弱くなり得る。しかし、好適には、転化は粘性の減少が全く起こらなくなるまで続く。
所望の酵素転化が起こった後、所望するならば、反応混合物を加熱することにより、酵素の活性を失わせることができる。デンプン懸濁液から始まった場合、これは次にまた、溶液に転化することもできる。所望するならば、活性を失わせることができる酵素およびできない酵素はまた、透析のような当業者に既知の技術により、反応混合物から分離することができる。実際、特定の用途のためには、グルコシルトランスフェラーゼの存在は許容されない。所望するならば、得られたデンプン溶液を濃縮したり、乾燥修飾デンプンを粉状として、元の状態に戻すことができる。また、必要に応じて、冷水およびエタノール濃度を漸増していく溶液等により洗浄処理を行うことができ、その後、乾燥を行うことができる。
グルコシルトランスフェラーゼにより修飾されたデンプンの水溶液は、冷却するとゲルを形成し、温度を高めると再び溶液へと進むという特性を有する。これは従って熱可逆性ゲルであり、本発明はまさに、熱可逆性ゲルとして、説明した方法で得ることができる修飾デンプンの使用に関する。この熱可逆性ゲルの作用は、例えば修飾デンプンが3重量％という低濃度においても起こり、このため本発明に従った熱可逆性ゲルの作用が利用されるならば、少量の修飾デンプンで十分なのである。
上記を簡潔にまとめると、グルコシルトランスフェラーゼで修飾したデンプンの水溶液は、低い粘性を有する。実際、約10重量％水溶液は、未修飾デンプンの10重量％溶液よりも粘性が低い。このため、生成物を非常に容易に加工することができる。さらに、平均分子量、還元力（DE）および分岐パーセンテージは、スタート物質と比較して、実質的に変化しないままであった。このことより、活性を小さくする酸化感応箇所または部分を増加させずに、異なった型のデンプン分子間の相互転位が起こることを推論することができる。最後に、ほとんど、または全く劣化が起こらず、そのため問題となっている生成物は、非常に安定していることが明らかである。
説明した方法により、酵素転化により修飾されたデンプンは、食料品、化粧品、薬剤、洗剤、接着剤および掘穿泥水のような、熱可逆性ゲルを形成する性質を利用することができるか、または重要である多くの用途に適する。これらの用途は当業者に知られており、そのため、ここでさらに詳細に説明する必要はない。これらの用途のために、修飾デンプンの安定性および意図された熱可逆性活性を、例えばたった3重量％の低濃度においても得ることができるという事実は、重要な利点である。特定の場合において、どの量が最適な活性を与えるかということは、実験により、当業者が容易に決定することができる。
本発明はさらに、次の例により示される。
例１
（Thermus thermophilusからの熱安定性グルコシルトランスフェラーゼの精製）
グルコシルトランスフェラーゼの活性は、50mMマレアート緩衝液中において、70℃、pH6.5のマルトトリオースから形成されたグルコースの量を決定することにより決められた。活性は、μmol/分/ミリグラム・タンパク質（ユニット/mg）により表された。
-ステップ１  好熱性グラム陰性真性細菌Thermus thermophilus HB8が、35リットルの使用量を有する40リットル発酵槽で培養された。成長培地は（リットル当たり）、50gの酵母抽出液、50gのカスアミノ酸（casamino acid）、10gのスクロース、2.5gの（NH4）2SO4、0.2gのMgCl2、6.2gのK2HPO4、2.2gのNaH2PO4を含むものであった。培養は、70℃の温度で、2MのNaOHによりpHを7.0に保って行われた。泡立ちを減少させるために、消泡剤が添加された。細胞は、発酵法の後、十字流ろ過および遠心分離によって回収された。この細胞は、-20℃で凍結された。精製の前に、40g（湿重量）の細胞が解凍され、1mgのDNaseが添加された。これは、14×20秒間、9mmプローブ、18ワットで超音波処理をされた。サイクル間に、40秒の待機時間があった。細胞の残留物は、遠心分離により除去された（60分、30,000×g）。上澄み液が、注意深く取り出された。粘性のあるペレットは、pH7.5の50mM Tris-HClで再び洗浄され、もう一度遠心分離にかけられた。２つの上澄み液は一緒にされ、細胞の入っていない抽出液（140ml）として使用された。
-ステップ２  細胞の入っていない抽出液は、10本の試験管に分割され、90℃で5分間培養された。沈殿物は、遠心分離（15分、17,000×grpm）により除去された。
-ステップ３  ステップ２で得られた物質は、30％（飽和）（NH4）2SO4（23.0g）に移され、4℃で15分間培養された。沈殿物は、遠心分離（15分、17,000×grpm）により除去され、上澄み液（150ml）は、60％（飽和）（NH4）2SO4（27.2g）に移された。4℃で15分間培養した後、遠心分離（15分、17,000×grpm）により得られたペレットを、pH7.5の20mM Tris-HCl 25mlに溶解させ、1リットルの同じ緩衝液に対して、一晩透析が行われた。
-ステップ４  ステップ３で透析された物質（40ml）は、２つの20ml部分に分割された。それぞれの部分は、MonoQ（HR 10/10）（Pharmacia）アニオン陰イオン交換クロマトグラフィーにより、個々に分離された。非結合タンパク質は、溶離剤のA280が0.05よりも低くなるまで、カラムで洗浄された。結合タンパク質がpH7.5の20mM Tris-HClにより、0〜0.5M NaClの240mlの勾配で溶離された（4ml/分、画分は4ml）。２つの分離ステップの画分のうち、最も高いグルコシルトランスフェラーゼ活性を示したものが一緒にされた。
-ステップ５  ステップ４で得られた物質に、0.25MのNaClでpH6.8にした1mlの20mM Tris-HClに対して、一晩透析が行われた。この物質は、キレートSuperose HR（10/2）（Pharmacia）に結合され、製造業者の規定に従って銅イオンが帯電された。非結合タンパク質は、溶離剤のA280が0.05よりも低くなるまで、カラムで洗浄された。結合タンパク質は、0.25MのNaClでpH6.8に調製された20mM Tris-HClにより、0〜3.0M NaClの30mlの勾配で溶離された（1ml/分、画分は1ml）。２つの分離ステップの画分のうち、最も高いグルコシルトランスフェラーゼ活性を示したものが一緒にされた。
-ステップ６  ステップ５で得られた物質は、Superdex 200 HR（26/60）（Pharmacia）ゲルろ過カラムに移され、0.1MのNaClでpH7.5に調製された20mM Tris-HClで溶離された（1ml/分、画分は1ml）。２つの分離ステップの画分のうち、最も高いグルコシルトランスフェラーゼ活性を示したものが一緒にされた。
-ステップ７  ステップ６で得られた物質は、1.7M（NH4）2SO4およびアルキルSuperose HR（5/5）（Pharmacia）に移された。非結合タンパク質は、A280が0.05よりも低くなるまで、カラムで洗浄された。結合タンパク質は、pH7.5に調製された20mM Tris-HCl中で、1.7〜0M（NH4）2SO4の25mlの勾配で溶離された（1ml/分、画分は1ml）。２つの分離ステップの画分のうち、最も高いグルコシルトランスフェラーゼ活性を示したものが一緒にされ、pH7.5に調製された25mM Tris-HClで一晩透析され、4℃で保存された。
このようにして得られたグルコシルトランスフェラーゼは、75℃、pH6.5において、最も高い活性を有する。分子量は、43〜54kDaの間であり、酵素はモノマーのときに活性がある。第一の35N末端アミノ酸が決定された。シーケンスは、MELPRAFGLL LHPTSLPGPY GVGVLGQEAR DFLRF（1文字コード）と決定された。
例２
（熱安定酵素による糊化デンプンの修飾）
pH6.5の50mMクエン酸ナトリウム中のじゃがいものデンプン（10重量％乾燥物質）の懸濁液（20重量％アミロース、80重量％アミロペクチン。特に示さなければ、これはまた、次の例にも適用される。）は、ジェット調理器において150℃で糊化された。結果としてできた粘性のある懸濁液は、70℃に冷却され、pH6.5に再調整された。次に、例１で得られた、精製されたグルコシルトランスフェラーゼ1mgが、８リットルの懸濁液に添加された。次に、粘性が一定値に達するまで（図１）、溶液は数時間培養された。粘性の変化は、撹拌モータの回転数を一定に保つために必要な電圧の記録を通じてたどられた。
例３
（熱不安定酵素による糊化デンプンの修飾）
じゃがいものデンプンは、5％デンプン懸濁液を、100℃で10分間培養することにより、糊化された。結果としてできた粘性のある懸濁液は、30℃に冷却され、懸濁液5mlに対して40μgのじゃがいもD-酵素が添加された。反応混合物は、30℃で48時間培養された。
例４
（熱安定酵素による膨潤デンプン粒子の修飾）
じゃがいものデンプンの5％懸濁液（5ml）が、例１で得られた2μgのThermophilusのグルコシルトランスフェラーゼと混合され、70℃に加熱され、次に粘性が一定になるまで（約24時間）培養が行われた。70℃において、膨潤されたじゃがいものデンプンの粒子構造は、非常に可視的であった。グルコシルトランスフェラーゼなしでは粒子構造はまだ非常に可視的であるが、グルコシルトランスフェラーゼの作用後は、粒子構造は完全にみられなくなった（図２は、70℃におけるじゃがいものデンプン（A）およびグルコシルトランスフェラーゼで修飾したじゃがいものデンプン（B）の位相写真（×200）である。）。
例５
（グルコシルトランスフェラーゼで修飾されたデンプンの性質）
例２、３および４から得られた修飾されたデンプンに対して、いくつかの解析が行われた。参照として、糊化された（2％、20分、120℃）じゃがいものデンプンが使われた。
例２、３および４で形成された生成物のヨウ素吸収スペクトルは、互いに同一であるが、スタート物質（じゃがいものデンプン）と比較して、吸収の最大値は、620nmから540nmへと移動した（図３）。アミロースの入っていないじゃがいものデンプン（アミロペクチン）のヨウ素吸収スペクトルとも、比較が行われた。
ゲルろ過クロマトグラフィー（Superdex 200）およびにヨウ素吸収スペクトル（図４、パートB）より決定された、例１で得られたThermophilusのグルコシルトランスフェラーゼで修飾された可溶性のじゃがいものデンプンの分子量の分布（Merck）は、スタート物質（図４、パートA）に比較して、変化した。図４のパートBの２つのピークの存在は、修飾された生成物が大きな分子量を保つ一方、転化が起こったことを示す。
分岐パーセンテージ（付加的な還元基が形成されるようにα-1,6の結合を破壊する酵素イソアミラーゼにより決定される、α-1,6の結合数とα-1,4の結合数の間の割合。イソアミラーゼの作用による還元基の数の増加は、α-1,6の結合数または分岐点の数の測度である。）および還元力は、スタート物質に対して、ほんの少し変化しただけである（分岐パーセンテージ：スタート物質2.77％に対して2.86％、還元含量：スタート物質0.00288％に対して0.00293％）。枝切り後に観察されるように（図５および６）、側鎖長の分布は、実際スタート物質に比較して変化した。図５は、枝切りされたじゃがいものデンプン（A）および枝切りグルコシルトランスフェラーゼで修飾されたじゃがいもデンプンの溶離プロフィールを示す。オリゴ糖は、Dionex HPLCで分離され、パルス電流検出器により検出された。ピークの上の数字は、オリゴ糖の長さを示す。図６は、ゲルろ過カラム（Superdex 200）で分離された、枝切りされたじゃがいものデンプンおよび枝切りグルコシルトランスフェラーゼで修飾されたじゃがいもデンプンの溶離パターンを示す。
例６
（ゲルの形成）
例２で得られた溶液は、4℃に冷却され、白いゲルが形成されるまで、さらに培養された。この物質は続いて、水および25％、50％、75％および100％エタノールにより洗浄された。このようにして得られた物質は、空気で乾燥され、約200μmの平均サイズを有する粉末を得るように粉砕された。グルコシルトランスフェラーゼで修飾されたじゃがいもデンプンが、約500g得られた。
例７
（ゲルの熱可逆性および形成）
例６に従って得られた物質で、5％水性懸濁液が調整され、透明な溶液が得られるまで、90℃で加熱された。この溶液は、レオメーターで4℃に冷却され、G’（G”）が時間でたどられた（G’およびG”は、1991年の“Inleiding in de Reologie”、ISBN 90 201 2557 5, pp. 177-189を参照）。G’が一定になった後、温度が70℃に上昇され、次に再び4℃まで冷却が行われた。この工程は、3回繰り返された。コントロールとして、3％じゃがいもデンプン溶液が選択された。図７は、3回の加熱および冷却サイクルの後の、グルコシルトランスフェラーゼで修飾されたじゃがいもデンプン（パートA）およびじゃがいもデンプン（パートB）の粘性（G’）において立証された変化を仮定した表示である。パートAは、熱可逆性ゲルの作用をはっきりと示している。
この例で説明したように、5％水性懸濁液から始めて、ゲルの形成が行われたが、この点に関して、ゲルの形成は、15℃およびもっと低い温度のようなやや低温において起こることが立証された（図８は、グルコシルトランスフェラーゼで修飾されたじゃがいもデンプンの、異なった温度でのゲル形成（G’の上昇）を示す）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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