(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミンおよびシクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種の糖類と、アルブミンとを含有する凍結乾燥製剤の剤形であることを特徴とするヘモグロビン含有組成物。
【請求項２】
ヘモグロビンと、フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミンおよびシクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種の糖類と、アルブミンと共存させることを特徴とする凍結乾燥状態におけるヘモグロミンの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は安定なヘモグロビン含有組成物、より詳細には、臨床検査の分野における、へモグロビン測定用の安定な標準品やコントロール試薬に関する。また、本発明は、凍結乾燥状態におけるヘモグロビンの安定化方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
へモグロビンは、分子量６４，５００を有し、α鎖およびβ鎖サブユニット、各々、２個ずつから構成される四量体タンパク（α2β2）である。臨床検査における血液検査では、ヘモグロビンの測定は赤血球計数やヘマトクリット値などと共に基本的な検査項目の１つであり、種々の貧血症（例えば、鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血など）や赤血球増加症の診断に用いられている。また、近年、便中のへモグロビンの測定は大腸癌などの診断に利用されている。このようなへモグロビンの測定方法として、食品摂取や薬剤投与の制限を必要としない抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる免疫学的測定法、例えば、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、エンザイムイムノアッセイ法などが広く行われている。
上記免疫学的測定法においては、基準となるヘモグロビンの標準品やコントロール試薬が必須である。しかるに、へモグロビンそのものは安定性が低く、標準品やコントロール試薬を安定化剤の添加なしに製造し、製剤として流通させることは非常に困難である。例えば、ヘモグロビン溶液を凍結乾燥すると、へム部分のＦｅ2+がＦｅ3+に酸化されるメト化が生じ、また、保存中にもメト化が進行し、サブユニットの会合が分解して変性し、その抗原性が低下することが知られている。
したがって、標準品やコントロール試薬の保存中にその中に含まれるヘモグロビンが変性するとヘモグロビンの実質的な量と表示値の間に大きな乖離を生じ、その結果、検体のヘモグロビン測定値に大きな誤差を生じる。そこで、保存中にヘモグロビンの変性がない長期安定なヘモグロビンの標準品やコントロール試薬が求められていた。
【０００３】
ヘモグロビンを測定するためのヘモグロビン標準品やコントロール試薬の安定化法として、特開平８−２４５４２１号公報には、ヘモグロビンにアミノ酸およびアルブミンを共存させる方法が提案されている。この方法は、凍結乾燥品での保存安定性の向上を目ざしたものであるが、最も効果的とされた１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋１％リジン添加で、３７℃、２週間保存したときのヘモグロビンの残存率は７６％（同公報の実施例２）、２％ＢＳＡ＋１％リジンでは８３％（同公報の実施例４）であり、ヘモグロビンの安定化は不十分である。
特開平９−６１４３１号公報には、家兎アルブミンあるいはアミノ酸を共存させる方法が提案されている。この方法は、凍結乾燥したヘモグロビンのコントロール試薬に復元液を添加した後、その溶液中でのヘモグロビンの安定化に関するもの（同公報の実施例２）である。
【０００４】
一方、特公平４−６６８４８号公報およびJ．Pharm．Pharmacol.（１９８３），vol．３５  ２３−２７には、代用血液として利用するヘモグロビン凍結乾燥品として、グルコース、マルトースまたはサッカロースによりヘモグロビンのメト化を防止する方法が示されている。上記の特開平８−２４５４２１号公報にはアルブミン単独添加でもヘモグロビン凍結乾燥品を安定化する効果をもつことが示されている。このように、酵素などの蛋白質の安定化剤として一般的に知られている糖類またはアルブミンが、ヘモグロビン凍結乾燥品においても安定化する効果を持つことが知られている。
しかしながら、例えば、Revue Francaise de Transfusion et Immuno-heamatologie（１９８０），vol．２３，No．１，２３−３４のような研究報告には、その要約の中で「グルコースだけを含むヘモグロビン凍結乾燥品がアルブミンおよびグルコースを含むヘモグロビン凍結乾燥品より、安定性が高い」と記載され、糖とアルブミンがヘモグロビンの安定化に対して相加的または相乗的に作用することについて否定的な報告がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、長期保存における改善された安定性を示すヘモグロビン測定用の標準品またはコントロール試薬を得るための新たな技術を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、標準品やコントロール試薬として使用される微量のへモグロビンを含むヘモグロビン製剤の安定化を鋭意研究した結果、ヘモグロビンに特定の糖類と、アルブミンとを共存させることによりヘモグロビンの安定性、特に、凍結乾燥状態での安定性が著しく向上し、へモグロビンの安定化に対して相乗的に作用することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミンおよびシクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種の糖類と、アルブミンとを含有することを特徴とする長期安定なへモグロビン含有組成物、特に、凍結乾燥製剤の剤形であるヘモグロビン含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、ヘモグロビンと、フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミンおよびシクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種の糖類と、アルブミンとを共存させることを特徴とする凍結乾燥状態におけるへモグロビンの安定化方法も提供するものである。
【０００８】
本発明によれば、凍結乾燥状態で長期にわたり安定に保存できるヘモグロビン含有組成物が提供でき、血液検査におけるヘモグロビン測定の精度を向上させることができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明におけるへモグロビンとしては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ウサギ、ニワトリなどの動物由来のへモグロビンが挙げられ、ヒトの血液検査におけるへモグロビン測定の標準品またはコントロール試薬として使用する場合には、ヒト由来のへモグロビンが使用される。
【００１０】
アルブミンとしては種々のアルブミンが使用でき、例えば、血清アルブミン、卵白アルブミン、ラクトアルブミンなどが例示でき、好適には血清アルブミンが使用される。血清アルブミンは、ヒト、ウシ、ウマなどの哺乳動物の血漿から常法に準じて調製されたものを使用でき、市販品を用いてもよい。好適な血清アルブミンとしてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミンが挙げられる。
用いる糖類は、フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミンおよびシクロデキストリン（αまたはβ）から選ばれ、これらは商業的に入手できるものいずれでもよく、単独でも、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
これらの糖類とアルブミンの配合比は特に限定されないが、一般に、重量比でアルブミン１に対して、該糖類を０．５〜１０程度、好ましくは１〜５程度とされる。
なお、ガラクツロン酸は、アルブミンとの共存なしに単独でもヘモグロビンに対して顕著な安定化効果を有する。
【００１１】
本発明を実施するに際して、へモグロビンに対する該糖類およびアルブミンの配合量は、へモグロビン含有組成物の保存中にヘモグロビンを安定化する効果を達成できる量であればよい。
通常、濃度１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ程度のヘモグロビンの水溶液または緩衝溶液に糖類、アルブミンを加えて組成物を得るので、そのような溶液に対して、糖類を０．２５〜５．０％（ｗ／ｖ）、アルブミンを０．２５〜２．０％（ｗ／ｖ）になるように添加する。
【００１２】
本発明のヘモグロビン含有組成物は種々の剤形をとりえるが、凍結乾燥製剤とするのが好ましい。凍結乾燥製剤は、ヘモグロビン水溶液または緩衝溶液に該糖類およびアルブミンを溶解したヘモグロビン含有混合溶液を調製し、これを必要に応じて濾過処理した後、凍結乾燥することにより得ることができる。
上記のへモグロビン水溶液または緩衝溶液およびヘモグロビン含有混合溶液のpＨは、ヘモグロビンの安定化が図れれば特に限定されない。極端な酸やアルカリ条件下ではヘモグロビンの安定性を損なう恐れがあるので、pＨ５〜９、好ましくは６〜８程度のpＨが望ましい。pＨの維持のためには適当な緩衝剤、例えば、リン酸緩衝剤、グッド緩衝剤などが利用できる。
凍結乾燥の方法としては、例えば、上記のへモグロビン含有混合溶液を−７０℃〜−１０℃の範囲で凍結させ、ついで、高真空で乾燥させる等の方法を採用することができる。このときの棚温は−４０℃〜４℃と低い方が望ましいが、この凍結乾燥速度を早めるために室温程度までの温度を採用することができる。
【００１３】
本発明のヘモグロビン含有組成物は、所望により、公知のヘモグロビン安定化技術と組み合わせることも可能である。例えば、本発明のへモグロビン含有組成物は、必要に応じて種々の添加剤を含有していてもよく、かかる添加剤としては、塩化ナトリウムなどの無機塩、ＥＤＴＡなどのキレート剤、アジ化ナトリウムや安息香酸エチル等の抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤等が例示できる。
本発明のへモグロビン含有組成物は、公知の方法に従って、血液検査のへモグロビン測定における標準品やコントロール試薬として好適に使用され、凍結乾燥製剤の場合には、用時に精製水、あるいは緩衝液で溶解して使用される。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．２）を含有する１００ｎｇ／ｍｌのヒトへモグロビン溶液または、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．２）および０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００ｎｇ／ｍｌのヒトへモグロビン溶液に、種々の糖類を１．０％（ｗ／ｖ）（ただし、シクロデキストリンは０．５％（ｗ／ｖ））となるように添加後、常法に準じて凍結乾燥した。その凍結乾燥品を７℃および３７℃で１４日間保存後、ヒトヘモグロビン量を抗ヒトヘモグロビン抗体（ウサギ）を用いる金コロイド凝集法における吸光度変化により求めた。
塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液、ウシ血清アルブミン、種々の糖類を含むヒトヘモグロビン溶液から調製した凍結乾燥品を７℃保存後に測定したヘモグロビン量をそれぞれ１００とし、３７℃保存後の凍結乾燥品が示すへモグロビン量から残存率を求め、ヘモグロビンの安定化効果の指標とした。
その結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
0004156688.tif 000002
【００１６】
表ｌに示されるように、アルブミン非存在下では、ガラクツロン酸のみ安定化効果が観察され、その他の物質に著しい安定化効果は認められなかった。
一方、アルブミン存在下では、グルコース、フルクトース、ソルボース、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ガラクツロン酸、グリシトール、マンニトール、イノシトール、Ｄ−グルコサミン、α−シクロデキストリンおよびβ−シクロデキストリンに安定化効果が認められたが、中でも、フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミン，α−シクロデキストリンおよびβ−シクロデキストリンには著しい安定化効果が認められた。
【００１７】
実施例２
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．２）および０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００ｎｇ／ｍｌのヒトへモグロビン溶液に、サッカロースを０〜５％（ｗ／ｖ）になるように添加した後、凍結乾燥した。塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび種々の濃度のサッカロースを含むヒトヘモグロビン溶液から調製した凍結乾燥品を７℃保存後に測定したヘモグロビン量をそれぞれ１００とした以外は、実施例ｌと同様にして、へモグロビンの残存率を求めた。
その結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
0004156688.tif 000003
【００１９】
表２に示されるように、サッカロースは０．２５〜５．０％で安定化効果が認められ、０．５％以上添加した場合、９０％以上の残存率を示した。
実施例３
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．２）および０．５％サッカロースを含有する１００ｎｇ／ｍｌのヒトへモグロビン溶液に、ＢＳＡを０．２５〜２％（ｗ／ｖ）になるように添加した後、凍結乾燥した。
塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液、種々の濃度のウシ血清アルブミンおよび０．５％（ｗ／ｖ）サッカロースを含むヒトヘモグロビン溶液から調製した凍結乾燥品を７℃保存後に測定したヘモグロビン量をそれぞれ１００とした以外は、実施例ｌと同様にして、へモグロビンの残存率を求めた。
その結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
0004156688.tif 000004
【００２１】
表３に示されるように、ＢＳＡ濃度は０．２５〜２．０％の範囲で安定化効果が認められ、とりわけ０．５〜１．０％が良く、９０％以上の残存率を示した。
実施例４
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．２）および１．０％（ｗ／ｖ）サッカロースを含有する１００ｎｇ／ｍｌのヒトヘモグロビン溶液に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ゼラチンまたはフィブリノゲンを０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加し、凍結乾燥した。
塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液、種々のタンパクおよび０．５％（ｗ／ｖ）サッカロースを含むヒトヘモグロビン溶液から調製した凍結乾燥品を７℃保存後に測定したヘモグロビン量をそれぞれ１００とした以外は、実施例ｌと同様にして、へモグロビンの残存率を求めた。
その結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
0004156688.tif 000005
【００２３】
表４に示されるように、アルブミンとサッカロースを添加したものに著しい安定化効果が認められた。
【００２４】
【発明の効果】
以上記載したごとく、ヘモグロビンと、フルクトース、ソルボース、サッカロース、トレハロース、ガラクツロン酸、マンニトール、Ｄ−グルコサミンおよびシクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種の糖類と、アルブミンとを共存させることによりへモグロビンの著しい安定化が図れる。したがって、本発明によれば、長期間にわたり安定に保存可能なヘモグロビン含有組成物が得られ、血液検査におけるヘモグロビン測定の精度の向上に寄与することができる。