【手続補正書】
【提出日】平成20年7月18日(2008.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然開始単位を組込んだFKBP-リガンド類似体の製造方法であって、
（ａ）少なくともrapK相同体が除去又は不活性化された組換え型菌株を製造する工程；及び
（ｂ）前記菌株に、非天然開始単位を供給する工程、
を含む前記方法。
【請求項２】
さらに、一以上のさらなる補助遺伝子を除去する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、相補性により、一以上の該除去された遺伝子を復元する工程を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
さらに、製造した該FKBPリガンド類似体を単離し、かつ精製する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記非天然開始単位が、下記化合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法：
2-ノルボルナンカルボン酸；
2-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
3-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
2-（cis/trans）-メチルシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-メチルシクロヘキサンカルボン酸；
3-（cis/trans）-メトキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-メトキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-オキソシクロヘキサンカルボン酸；
2-オキソシクロヘキサンカルボン酸；
4-trans-n-ペンチルシクロヘキサンカルボン酸；
2-trans-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
4-cis-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸；
シクロペンタンカルボン酸；
シクロブタンカルボン酸；
1-メチルシクロヘキサンカルボン酸；
3-trans-ヒドロキシ-4-cis-フルオロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-trans-ヒドロキシ-3-cis-フルオロシクロヘキサンカルボン酸；
3-cis-ヒドロキシ-4-trans-フルオロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-cis-ヒドロキシ-3-trans-フルオロシクロヘキサンカルボン酸；
3-cis-ヒドロキシ-4-trans-クロロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-cis-ヒドロキシ-3-trans-クロロシクロヘキサンカルボン酸;
3-trans-ヒドロキシ-4-cis-クロロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-trans-ヒドロキシ-3-cis-クロロシクロヘキサンカルボン酸；
3-trans-シクロヘキセンオキシドカルボン酸；
3-cis-シクロヘキセンオキシドカルボン酸；
3,4-cis-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、及び3,4-trans-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；シクロヘキサン酢酸；
シクロヘキサンプロピオン酸、及び4-cis/trans-tert-ブチルシクロヘキサンカルボン酸、又はこれらの単純エステル、又はこれらの塩。
【請求項６】
前記非天然開始単位が、下記化合物からなる群から選択される、請求項５記載の方法：
3-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
3-（cis/trans）-メトキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-メトキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-オキソシクロヘキサンカルボン酸；
シクロブタンカルボン酸；
3-trans-ヒドロキシ-4-cis-フルオロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-trans-ヒドロキシ-3-cis-フルオロシクロヘキサンカルボン酸；
3-cis-ヒドロキシ-4-trans-フルオロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-cis-ヒドロキシ-3-trans-フルオロシクロヘキサンカルボン酸；
3-cis-ヒドロキシ-4-trans-クロロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-cis-ヒドロキシ-3-trans-クロロシクロヘキサンカルボン酸；
3-trans-ヒドロキシ-4-cis-クロロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-trans-ヒドロキシ-3-cis-クロロシクロヘキサンカルボン酸；
3-trans-シクロヘキセンオキシドカルボン酸；
3-cis-シクロヘキセンオキシドカルボン酸；
3,4-cis-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、及び3,4-trans-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
シクロヘキサンプロピオン酸；
4-cis/trans-tert-ブチルシクロヘキサンカルボン酸、又はこれらの単純エステル、又はこれらの塩。
【請求項７】
前記組換え型菌株に与えられる該非天然開始単位が：
シクロヘキサンカルボン酸、
3-cis,4-trans-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、
1-シクロヘキセンカルボン酸、
3-シクロヘキセンカルボン酸、
シクロヘプタンカルボン酸、
3-（cis/trans）-メチルシクロヘキサンカルボン酸、
4-（cis/trans）-メチルシクロヘキサンカルボン酸、
1-シクロヘプテンカルボン酸、又は5-cis-ヒドロキシル-3-シクロヘキセンカルボン酸ではないものとする、請求項５記載の方法。
【請求項８】
部分(a)の宿主株が、下記工程により製造される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法：
（ａ）dam-、dcm-、又はdam-及びdcm-であるE.コリ株中に、接合性欠失プラスミドを構築する工程；
（ｂ）接合に適した前記宿主株から胞子を生成する工程、ここで、前記菌株を、湿度10％〜40％で成長させ、かつ該胞子を、5〜30日で収集し；
（ｃ）１リットルにつき：
i）  コーン浸透粉0.5 g〜5 g；
ii）  酵母エキス0.1 g〜5 g；
iii）  炭酸カルシウム0.1 g〜10 g；及び
iv）  硫酸鉄0.01 g〜0.5 g；
を含む培地上で、工程（ａ）のE.コリ株と工程（ｂ）から得られた胞子とを接合させる工程であって、前記培地は、さらに、BACTO-寒天、及びデンプンを含み、かつ1〜20重量％減少するように乾燥させており；かつ
（ｄ）ポリケチド産生に適した条件下で、前記組換え型菌株を、任意に培養する工程。
【請求項９】
該菌株が、下記菌株からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法：ストレプトマイセス ハイグロスコピカスsubsp.ハイグロスコピカスNRRL 5491、アクチノプラネスsp. N902-109 FERM BP-3832、ストレプトマイセスsp. AA6554、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスMA 6475 ATCC 14891、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスMA 6678 ATCC 55087、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスMA 6674、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスATCC 55276、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスsubsp.アスコマイセティカスATCC 14891、ストレプトマイセス ツクバエンシスNo.9993 FERM BP-927、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスsubsp.ヤクシマエンシス、ストレプトマイセスsp. DSM 4137、ストレプトマイセスsp. DSM 7348、ミクロモノスポラn. sp. A92-306401 DSM 8429、及びストレプトマイセスsp. MA 6858 ATCC 55098。
【請求項１０】
該菌株が、S.ハイグロスコピカスsubsp.ハイグロスコピカスNRRL 5491、及びS.ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスATCC 14891からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該菌株が、ラパマイシン産生株S.ハイグロスコピカスsubsp.ハイグロスコピカスNRRL 5491である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該除去された遺伝子の復元工程が：
（ａ）一以上の該除去された遺伝子を含む遺伝子カセットを構築すること、及び
（ｂ）FKBP-リガンドをコードする生合成クラスターを含む前記組換え型菌株を、前記遺伝子カセットを用いて形質転換することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子カセットが、直接、発現ベクター内で組み立てられる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該相補性が、相同的である、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
該相補性が、非相同的である、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１６】
前記一以上の除去又は不活性化された補助遺伝子が、開始単位供給遺伝子、アミノ酸前駆体供給遺伝子、シトクロムP-450モノオキシゲナーゼ、フェレドキシン、及びSAM-依存性O-メチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項２〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
該除去又は不活性化された遺伝子が、rapL、rapN、rapO、rapM、rapQ、rapI、及びrapJからなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくともrapK相同体が除去又は不活性化されている、FKBP-リガンドをコードする生合成クラスターを含む組換え型菌株。
【請求項１９】
該菌株が下記菌株からなる群から選択される、請求項１８記載の組換え型菌株：ストレプトマイセス ハイグロスコピカスsubsp.ハイグロスコピカスNRRL 5491、アクチノプラネスsp. N902-109 FERM BP-3832、ストレプトマイセスsp. AA6554、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスMA 6475 ATCC 14891、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスMA 6678 ATCC 55087、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスMA 6674、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスATCC 55276、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスsubsp.アスコマイセティカスATCC 14891、ストレプトマイセス ツクバエンシスNo.9993 FERM BP-927、ストレプトマイセス ハイグロスコピカスsubsp.ヤクシマエンシス、ストレプトマイセスsp. DSM 4137、ストレプトマイセスsp. DSM 7348、ミクロモノスポラn. sp. A92-306401 DSM 8429、及びストレプトマイセスsp. MA 6858 ATCC 55098。
【請求項２０】
該菌株が、S.ハイグロスコピカスsubsp.ハイグロスコピカスNRRL 5491、及びS.ハイグロスコピカスvar.アスコマイセティカスATCC 14891からなる群から選択される、請求項１９記載の組換え型菌株。
【請求項２１】
該菌株が、ラパマイシン産生株S.ハイグロスコピカスsubsp.ハイグロスコピカスNRRL 5491である、請求項２０記載の組換え型菌株。
【請求項２２】
該除去又は不活性化された補助遺伝子が、欠失したrapL、rapN/O、rapQ、rapM、rapI、及びrapJからなる群から選択され、ここで前記欠失が、rapQrapN/OrapMrapLではない、請求項１８〜２１のいずれか１項記載の組換え型菌株。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造される化合物、ただし、前記組換え型菌株に与えられる該非天然開始剤は：
シクロヘキサンカルボン酸、
3-cis,4-trans-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、
1-シクロヘキセンカルボン酸、
3-シクロヘキセンカルボン酸、
シクロヘプタンカルボン酸、
3-（cis/trans）-メチルシクロヘキサンカルボン酸、
4-（cis/trans）-メチルシクロヘキサンカルボン酸、
1-シクロヘプテンカルボン酸、又は5-cis-ヒドロキシル-3-シクロヘキセンカルボン酸ではないものとする。
【請求項２４】
前記組換え型菌株に与えられる該非天然開始が、下記化合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造される化合物：
3-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；
3-（cis/trans）-メトキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-（cis/trans）-メトキシシクロヘキサンカルボン酸；
4-オキソシクロヘキサンカルボン酸；
シクロブタンカルボン酸；
3-trans-ヒドロキシ-4-cis-フルオロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-trans-ヒドロキシ-3-cis-フルオロシクロヘキサンカルボン酸；
3-cis-ヒドロキシ-4-trans-フルオロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-cis-ヒドロキシ-3-trans-フルオロシクロヘキサンカルボン酸；
3-cis-ヒドロキシ-4-trans-クロロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-cis-ヒドロキシ-3-trans-クロロシクロヘキサンカルボン酸；
3-trans-ヒドロキシ-4-cis-クロロシクロヘキサンカルボン酸、及び4-trans-ヒドロキシ-3-cis-クロロシクロヘキサンカルボン酸；
3-trans-シクロヘキセンオキシドカルボン酸；
3-cis-シクロヘキセンオキシドカルボン酸；
3,4-cis-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、及び3,4-trans-ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸；シクロヘキサンプロピオン酸；
4-cis/trans-tert-ブチルシクロヘキサンカルボン酸。