【手続補正書】
【提出日】平成20年4月23日(2008.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−グルコシダーゼの生産が抑制された株として選択することにより得られる菌株であるセルラーゼ生産菌を培養することを特徴とするセルラーゼの製造方法。
【請求項２】
セルラーゼ生産菌の培養が、培養中のｐＨを３．５未満に制御することを特徴とする請求項１に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
セルラーゼ生産菌がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する菌株であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法で得られたセルラーゼ溶液を使用し、セルロースを酵素分解することを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明者等は、セルラーゼ生産菌をｐＨ制御下で培養することによりグルコシダーゼの副生を削減したセルラーゼの製造方法を見出した。
さらに、セルラーゼ生産菌からβ−グルコシダーゼ活性の低い菌株を選択する方法を見出し、例えば、突然変異を誘発させ、変異体からβ−グルコシダーゼの副生が削減された株を取得することに成功した。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
（１）β−グルコシダーゼの生産が抑制された株として選択することにより得られる菌株であるセルラーゼ生産菌を培養することを特徴とするセルラーゼの製造方法。
（２）セルラーゼ生産菌の培養が、培養液中のｐＨを３．５未満に制御することを特徴とする上記（１）のセルラーゼの製造方法。
（３）セルラーゼ生産菌がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する菌株であることを特徴とする上記（１）又は（２）のセルラーゼの製造方法。
（４）上記（１）〜（３）に記載のセルラーゼの製造方法で得られたセルラーゼ溶液を使用し、セルロースを酵素分解することを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明のセルラーゼとは、セルロースを分解する酵素の総称であり、セルロースの分解活性を有していれば、本発明でいうセルラーゼに含まれる。セルラーゼ生産菌としては、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物である、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に属する微生物を挙げることができる。
本発明で得られるセルラーゼは、β−グルコシダーゼ活性とセルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）が０．３５以下であり、より好ましくは０．３０以下であり、さらに好ましくは０．２５以下である。ここでいう活性比は、セルラーゼの結晶性セルロース分解能と、セロビオースの分解能（β−グルコシダーゼ）の比で表される。該活性比が小さければ小さいほど、オリゴ糖分解能が低く、オリゴ糖の生産性、選択性が向上するため好ましく、その下限は特に制限されないが、容易に達成させる活性比の範囲としては０．０１以上である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また、さらに（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）比を低く抑える培養方法として、例えば、培養中、培養液のｐＨをｐＨ３．５未満、かつセルラーゼ生産菌の生育可能なｐＨ以上に制御する方法が挙げられる。具体的には、上記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９株もしくはその変異株をポテトデキストロース寒天斜面で２５〜３５℃、３〜１０日間培養し、培養懸濁および溶解させ、セルロースを炭素源とする培地を５００ｍｌ容量の三角フラスコに１００ｍｌ分注し、オートクレーブで滅菌した培地に植菌し、２８℃で２〜４日間前培養を行う。さらに同じ組成の培地３ｌを５ｌのジャーファーメンターに仕込みオートクレーブで殺菌した培地に、前培養液を移植し、２８℃で攪拌２００〜４００ｒｐｍ、通気０．３〜１ｖｖｍで培養を行い、培養中ＮａＯＨもしくはアンモニア水でｐＨ２〜３．５、好ましくは２．５〜３．０に制御する。４〜７日間培養を行った後、培養液を遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上清液を得る。この上清液は、このまま粗酵素液として使用することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
以下にセロオリゴ糖の製造方法を説明する。
酵素分解方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明のセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。また、この圧力、温度、ｐＨについても、上記同様、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、上述のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９株またはその変異株をセルラーゼ生産菌とし、得られたセルラーゼを用いる場合には、セルロースの酵素分解は、常圧で、酢酸またはリン酸緩衝液中で、温度５０〜６０℃、ｐＨ３．０〜５．５の範囲で行うことが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明を実施例などに基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例などにより何ら限定されるものではない。
［実施例１］
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で２８℃、７日間培養する。生成した胞子を１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７）２ｍｌに１０6 個／ｍｌになるよう懸濁し、ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｓｌｆｏｎａｔｅ）を２４ｕｌ添加し、２８℃で１６時間振とうし、変異処理を施す。この胞子懸濁液から遠心分離により胞子を集め、１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７）でよく洗浄し、平板あたり１００〜３００胞子になるように希釈し、グルコース１ｇ、酵母エキス１ｇ、（NH4 ）2SO4 ２ｇ、KH2PO4 ４ｇ、Na2HPO4 ２ｇ、
MgSO4・7H2O ２００ｍｇ、 CaCl2・2H2O １ｍｇ、トリトンＸ−100 、トレースエレメント１ｍｌ（硼酸６ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物２６ｍｇ、塩化鉄（３）６水和物１００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン４水和物８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物２００ｍｇを全量１００ｍｌの精製水に溶解させたもの）、寒天２０ｇを１ｌの水に溶解または懸濁させた後、オートクレーブで滅菌し、さらにメンブレンフィルターでろ過滅菌し、２８℃で５日間培養した培養液の、β−グルコシダーゼ活性および結晶セルロース分解活性を測定し、変異株ＧＬ−１（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３）を選択した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
［実施例２］
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９および実施例１で取得した変異株ＧＬ−１株の各菌株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２５℃で７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳をポリペプトン１．０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、KH2PO42.0g 、（NH4 ）2SO4 1.5g 、MgSO4 ・7H2O 0.3g 、CaCl2 ・2H2O 0.3g 、ツイーン８０［半井化学薬品（株）製］ 1.0ml、微量元素液（H3BO4 6mg 、（NH4 ）6Mo7O24 ・4H2O 26mg 、 FeCl3・6H2O 100mg、 CuSO4・5H2O 40mg 、 MnSO4・4H2O 8mg、 ZnSO4・7H2O 200mgを水 100mlに溶解並びに懸濁した液）1.0ml 、酒石酸 7.5g を水１ｌに溶解および懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、５００ｍｌ容量の三角フラスコに１００ｍｌ分注し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）１ｇを添加後、オートクレーブで滅菌した培地に接種して、２８℃で５日間振盪培養した。５日目に培養液を遠心分離し、その上清のセルラーゼ活性およびβ−グルコシダーゼ活性を測定した。その結果を表１に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
［実施例３］
ポテトデキストロース培地（Difco 社製）にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を接種し、３７℃で７日間培養を行う。その培地表面から胞子を１白金耳取り、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、リン酸１カリウム２ｇ、硫酸アンモニウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、塩化カルシウム０．３ｇ、トレースエレメント１ｍｌ（硼酸６ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物２６ｍｇ、塩化鉄（３）６水和物１００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン４水和物８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物２００ｍｇを全量１００ｍｌの精製水に溶解させたもの）、アデカノールＬＧ−１０９  １ｍｌを全量１ｌの精製水に懸濁および溶解させ５００ｍｌ容量の三角フラスコに１００ｍｌ分注し、各フラスコに結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名：ＰＨ−１０１）１ｇ添加後、オートクレーブで滅菌した培地に植菌し、２８℃で３日間前培養を行う。さらに同じ培地３ｌを仕込んだ５ｌジャーファーメンターに前培養液を３０ｍｌ移植し、２８℃、攪拌４００ｒｐｍ、通気０．５ｖｖｍで培養を行い、培養中ＮａＯＨ水溶液でｐＨの下限をｐＨ３．０に制御した。５日間培養を行った培養後の液を遠心分離し、上清を粗酵素として得た。得られた酵素液の結晶性セルラーゼ分解活性およびβ−グルコシダーゼ活性を前述の方法で測定した。培養中のｐＨ経時変化を図１に、活性測定結果を表２に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
［実施例４］
実施例３と同様の方法でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を培養する際、培養中ＮａＯＨでｐＨの下限をｐＨ２．５に制御し、粗酵素液を得た。得られた酵素液の結晶性セルラーゼ分解活性およびβ−グルコシダーゼ活性を前述の方法で測定した。培養中のｐＨ経時変化を図１に、活性測定結果を表２に示す。
［比較例１］
実施例３と同様の方法でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を培養する際、培養中ＮａＯＨでｐＨの下限をｐＨ３．５、もしくはｐＨ４、もしくはｐＨ５に制御し、粗酵素液を得た。得られた酵素液の結晶性セルラーゼ分解活性およびβ−グルコシダーゼ活性を前述の方法で測定した。培養中のｐＨ経時変化を図１に、活性測定結果を表２に示す。