(57)【要約】  一態様では、本開示が、Ｆｃ断片の産生のための細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物ならびにその組成物および使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化可能領域（Ｆｃ）断片を産生する方法であって、
乳腺においてＦｃ断片を含む抗体を発現するように修飾されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップ；
前記トランスジェニック哺乳動物の乳腺によって産生される乳から前記Ｆｃ断片を含む抗体を回収するステップ；および
前記抗体からＦｃ断片を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
Ｆｃ断片を産生する方法であって、
Ｆｃ断片を含む抗体を発現するように修飾された乳腺上皮細胞を提供するステップ；
前記乳腺上皮細胞から前記Ｆｃ断片を含む抗体を回収するステップ；および
前記抗体からＦｃ断片を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
Ｆｃ断片を産生する方法であって、
乳腺においてＦｃ断片を発現するように修飾されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップ；
前記トランスジェニック哺乳動物の乳腺によって産生される乳からＦｃ断片を回収するステップ；および
前記Ｆｃ断片を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項４】
Ｆｃ断片を産生する方法であって、
Ｆｃ断片を発現するように修飾された乳腺上皮細胞を提供するステップ；
前記乳腺上皮細胞からＦｃ断片を回収するステップ；および
前記Ｆｃ断片を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項５】
前記Ｆｃ断片を単離するステップが、抗体を
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および
（ｂ）限外ろ過
に連続してかけるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆｃ断片を単離するステップが、Ｆｃ断片を
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および
（ｂ）限外ろ過
に連続してかけるステップを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記限外ろ過が、リン酸、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ８０を含む溶液中で実行され、前記リン酸が１０〜１００ｍＭの間の濃度を有し、前記ＮａＣｌが１００〜５００ｍＭの間の濃度を有し、前記Ｔｗｅｅｎ８０が０〜０．０１％の間の濃度を有し、任意選択で、前記溶液が、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体からＦｃ断片を単離するステップが、
（ａ）Ｆｃ断片および１つ以上のさらなる断片を含む抗体を得るステップ；
（ｂ）Ｆｃ断片および１つ以上のさらなる断片を産生するために（ａ）の抗体を消化するステップ；
（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィーによって前記１つ以上のさらなる断片から前記Ｆｃ断片を分離するステップであって、
疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに（ｂ）の前記Ｆｃ断片および前記１つ以上のさらなる断片を適用すること、および
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから前記Ｆｃ断片を回収すること
を含むステップ；ならびに
（ｄ）限外ろ過によって、前記回収したＦｃ断片をさらに精製するステップ
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上のさらなる断片が、抗原結合領域（Ｆａｂ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｆｃ断片を単離するステップが、
（ａ）Ｆｃ断片を得るステップ；
（ｂ）Ｆｃ断片を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけるステップであって、
疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに（ａ）のＦｃ断片を適用すること、および
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから前記Ｆｃ断片を回収すること
を含むステップ；ならびに
（ｃ）限外ろ過によって、前記回収したＦｃ断片をさらに精製するステップ
を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１１】
前記乳腺上皮細胞が非ヒト哺乳動物である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、水牛、ウマ、ラット、マウスまたはラマである、請求項１、３または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、シアリルトランスフェラーゼの発現に関してもトランスジェニックである、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体を得るステップが、前記抗体を精製することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｆｃ断片を得るステップが、前記Ｆｃ断片を精製することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｆｃ断片が、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗体を
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および
（ｂ）限外ろ過
に連続してかけるステップを含み、
前記限外ろ過が、リン酸、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ８０を含む溶液中で実行され、前記リン酸が１０〜１００ｍＭの間の濃度を有し、前記ＮａＣｌが１００〜５００ｍＭの間の濃度を有し、前記Ｔｗｅｅｎ８０が０〜０．０１％の間の濃度を有し、任意選択で、溶液が、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む、方法。
【請求項２０】
前記抗体が、疎水性相互作用クロマトグラフィーより前に消化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
消化が、酵素によって実施される、請求項８または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素がシステインプロテアーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記システインプロテアーゼがパパインである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パパインが固体支持体上に固定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体のアイソタイプが、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＤである、請求項１、２、５、７〜９、１１〜１４、１６、１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体のアイソタイプがＩｇＧである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がハーセプチンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｆｃ断片を
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および
（ｂ）限外ろ過
に連続してかけるステップを含み、
前記限外ろ過が、リン酸、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ８０を含む溶液中で実施され、
前記リン酸が１０〜１００ｍＭの間の濃度を有し、前記ＮａＣｌが１００〜５００ｍＭの間の濃度を有し、前記Ｔｗｅｅｎ８０が０〜０．０１％の間の濃度を有し、任意選択で、溶液が、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む、方法。
【請求項２９】
単離されたＦｃ断片の純度が、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離されたＦｃ断片の純度が、高速液体クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法、または混入タンパク質ＥＬＩＳＡによって評価される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、有機ポリマー樹脂を含む疎水性クロマトグラフィーカラムを使用して実行される、請求項５、６、８、１０、１９、２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記有機ポリマー樹脂がフェニル有機ポリマー樹脂である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記疎水性相互作用カラムが、塩緩衝液を使用して溶出される、請求項５、６、８、１０、１９、２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記疎水性相互作用カラムの溶出が、塩緩衝液の濃度の勾配の減少を使用して実行される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記限外ろ過が、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して実行される、請求項５、６、８、１０、１９、２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｆｃ断片が抗炎症特性を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｆｃ断片が、自己免疫症状または炎症症状を有する対象を処置するために使用される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法によって産生された精製Ｆｃ断片。
【請求項３９】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生された治療有効量のＦｃ断片をその必要がある対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項４０】
前記対象が、炎症症状または自己免疫症状を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
トランスジェニックＦｃ断片。
【請求項４２】
精製されたものである、請求項４１に記載のトランスジェニックＦｃ断片。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の治療有効量のトランスジェニックＦｃ断片をその必要がある対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項４４】
前記対象が、炎症症状または自己免疫症状を有する、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる２０１４年６月２日に出願された米国仮特許出願第６２／００６，５８４号について米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、少なくとも部分的に、Ｆｃ断片を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用分子の産生は、細胞培養での組換え発現、動物におけるトランスジェニック発現、および天然の供給源からの抽出を含むことができる。対象への投与のためにこれらの分子の安全性を確実にするために、治療用分子は、あらゆる不純物または潜在的に有害な混入物を除去するために精製される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
Ｆｃ断片を産生する新規な方法が本明細書に記載されている。本開示のいくつかの態様では、結晶化可能領域（Ｆｃ）断片を産生する方法であって、乳腺においてＦｃ断片を含む抗体を発現するように修飾されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップ；トランスジェニック哺乳動物の乳腺によって産生される乳からＦｃ断片を含む抗体を回収するステップ；および抗体からＦｃ断片を単離するステップを含む方法が提供される。
【０００５】
別の態様では、Ｆｃ断片を産生する方法であって、Ｆｃ断片を含む抗体を発現するように修飾された乳腺上皮細胞を提供するステップ；乳腺上皮細胞からＦｃ断片を含む抗体を回収するステップ；および抗体からＦｃ断片を単離するステップを含む方法が提供される。
【０００６】
別の態様では、Ｆｃ断片を産生する方法であって、乳腺においてＦｃ断片を発現するように修飾されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップ；トランスジェニック哺乳動物の乳腺によって産生される乳からＦｃ断片を回収するステップ；およびＦｃ断片を単離するステップを含む方法が提供される。
【０００７】
さらに別の態様では、Ｆｃ断片を産生する方法であって、Ｆｃ断片を発現するように修飾された乳腺上皮細胞を提供するステップ；乳腺上皮細胞からＦｃ断片を回収するステップ；およびＦｃ断片を単離するステップを含む方法が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を単離するステップが、抗体を（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および（ｂ）限外ろ過に連続してかけるステップを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を単離するステップが、Ｆｃ断片を（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および（ｂ）限外ろ過に連続してかけるステップを含む。いくつかの実施形態では、限外ろ過が、リン酸、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ８０を含む溶液中で実行され、リン酸が、１０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度を有し、ＮａＣｌが、１００ｍＭ〜５００ｍＭの間の濃度を有し、Ｔｗｅｅｎ８０が、０％〜０．０１％の間の濃度を有し、任意選択で、溶液が、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む。
【０００９】
提供される方法のいずれかの一実施形態では、抗体からＦｃ断片を単離するステップが、（ａ）Ｆｃ断片および１つ以上のさらなる断片を含む抗体を得るステップ、（ｂ）Ｆｃ断片および１つ以上のさらなる断片を産生するために（ａ）の抗体を消化するステップ；（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィーによって１つ以上のさらなる断片からＦｃ断片を分離するステップであって、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに（ｂ）のＦｃ断片および１つ以上のさらなる断片を適用すること、および疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムからＦｃ断片を回収することを含むステップ；ならびに（ｄ）限外ろ過によって、回収したＦｃ断片をさらに精製するステップを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる断片が、抗原結合領域（Ｆａｂ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片を含む。
【００１１】
提供される方法のいずれかの他の実施形態では、Ｆｃ断片を単離するステップが、（ａ）Ｆｃ断片を得るステップ；（ｂ）断片を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけるステップであって、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに（ａ）のＦｃ断片を適用すること、および疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムからＦｃ断片を回収することを含むステップ；ならびに（ｃ）限外ろ過によって、回収したＦｃ断片をさらに精製するステップを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞が、非ヒト哺乳動物のものである。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、水牛、ウマ、ラット、マウス、またはラマである。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、シアリルトランスフェラーゼの発現についてもトランスジェニックである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗体を得るステップが、抗体を精製することを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を得るステップが、Ｆｃ断片を精製することを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【００１４】
別の態様では、方法が、Ｆｃ断片を含む抗体を（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および（ｂ）限外ろ過に連続してかけるステップを含み、限外ろ過が、リン酸、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ８０を含む溶液中で実行され、リン酸が、１０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度を有し、ＮａＣｌが、１００ｍＭ〜５００ｍＭの間の濃度を有し、Ｔｗｅｅｎ８０が、０％〜０．０１％の間の濃度を有し、任意選択で、溶液が、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、疎水性相互作用クロマトグラフィーより前に消化される。
【００１５】
提供される方法のいずれか１つの一実施形態では、抗体のアイソタイプが、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＤである。いくつかの実施形態では、抗体アイソタイプが、ＩｇＧである。いくつかの実施形態では、抗体が、ハーセプチンである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、消化が、酵素によって実行される。いくつかの実施形態では、酵素が、システインプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、システインプロテアーゼが、パパインである。いくつかの実施形態では、パパインが、固体支持体上に固定される。
【００１７】
別の態様では、方法が、Ｆｃ断片を（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー；および（ｂ）限外ろ過に連続してかけるステップを含み、限外ろ過が、リン酸、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ８０を含む溶液中で実行され、リン酸が、１０〜１００ｍＭの間の濃度を有し、ＮａＣｌが、１００〜５００ｍＭの間の濃度を有し、Ｔｗｅｅｎ８０が、０〜０．０１％の間の濃度を有し、任意選択で、溶液が、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、単離されたＦｃ断片の純度が、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％である。いくつかの実施形態では、単離されたＦｃ断片の純度が、高速液体クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法、または混入タンパク質ＥＬＩＳＡによって評価される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーが、有機ポリマー樹脂を含む疎水性クロマトグラフィーカラムを使用して実行される。いくつかの実施形態では、有機ポリマー樹脂が、フェニル有機ポリマー樹脂である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、疎水性相互作用カラムが、塩緩衝液(salt buffer)を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用カラムの溶出が、塩緩衝液の濃度の勾配の減少を使用して実行される。いくつかの実施形態では、限外ろ過が、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して実行される。
【００２１】
提供される方法のいずれか１つの一実施形態では、Ｆｃ断片が、抗炎症特性を有する。提供される方法のいずれか１つの別の実施形態では、Ｆｃ断片が、自己免疫症状(autoimmune condition)または炎症症状(inflammatory condition)を有する対象を処置するために使用される。
【００２２】
別の態様では、精製Ｆｃ断片が、本明細書において提供される方法のいずれか１つの方法によって産生される。
【００２３】
さらに別の態様では、方法が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生された治療有効量のＦｃ断片をその必要がある対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、対象が、炎症症状または自己免疫症状を有する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、トランスジェニックＦｃ断片に関する。いくつかの実施形態では、トランスジェニックＦｃ断片が精製される。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、治療有効量のトランスジェニックＦｃ断片をその必要がある対象に投与するステップを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、トランスジェニックＦｃ断片が精製される。いくつかの実施形態では、対象が、炎症症状または自己免疫症状を有する。
【００２６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、下記の説明に記載される。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態についての詳細な説明から、ならびに添付の請求項からも明らかになるであろう。
【００２７】
添付の図面は、一定の縮尺で描かれるようには意図されていない。図は、単なる例証であり、本開示の実施可能性に必要とされるものではない。明確化のために、すべての構成成分がすべての図面において表示されているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ清澄化後の示されるサンプルによる代表的な染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示す図である。
【図２】図２は、パパイン、ペプシン、フィシン、またはトリプシンによる消化後の、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブによる代表的な染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示す図である。
【図３】図３は、もたらされるＦｃ断片の精製がその後に続く、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブの消化についてのワークフローの非限定的な例を示す図である。
【図４】図４Ａは、パパインにより消化され、次いでＸＫ１６／３０東ソーフェニル６５０Ｃ疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用された、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブの調製物からのトレースの非限定的な例を示す図である。一番下のトレースは、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示し、真中のトレースは、ｐＨを示し、一番上のトレースは、伝導率を示す。フェニルカラムは、１Ｍ硫酸ナトリウムを有する２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０中で平衡化した。図４Ｂは、還元（「Ｒｅｄ」）または非還元（「ＮｏｎＲｅｄ」）条件下での、フロースルー（ＦＴ）ならびにピーク１、２、３、および４（ｐｋ１、２、３、４）を含む、パパイン（Ｐａｐ消化）による消化からのサンプルおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから回収したサンプルによる染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示す図である。
【図５】図５Ａは、パパインにより消化し、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片を分離するために疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用され、次いで、ＸＫ１６／９５  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに適用された、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブの調製物からのトレースの非限定的な例を示す図である。一番下のトレースは、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。真中のトレースは、ｐＨを示し、一番上のトレースは、伝導率を示す。カラムは、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用し、イソクラティック溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ｒｕｎ）により溶出した。図５Ｂは、図５Ａのカラムから回収したサンプルの染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示す図である。
【図６】図６Ａは、パパインにより消化され、次いでＸＫ１６／３０東ソーフェニル６５０Ｃ疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用された、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブの調製物からのトレースの非限定的な例を示す図である。一番下のトレースは、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示し、真中のトレースは、ｐＨを示し、一番上のトレースは、伝導率を示す。フェニルカラムは、１Ｍ硫酸ナトリウムを有する２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０中で平衡化した。図６Ｂは、還元（「Ｒｅｄ」）または非還元（「ＮｏｎＲｅｄ」）条件下での、フロースルー（ＦＴ）、ピーク１、２、および３（ｐｋ１、２、３）を含む、図６Ａのパパイン（Ｐａｐ消化）による消化からのサンプルおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから回収したサンプルを含む染色タンパク質ゲルを示す図である。
【図７】図７は、パパインにより消化され、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用され、次いでＸＫ２６／９５  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに適用された、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブの調製物からのトレースの非限定的な例を示す図である。一番下のトレースは、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示し、真中のトレースは、ｐＨを示し、一番上のトレースは、伝導率を示す。カラムは、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用し、イソクラティック溶離により溶出した。
【図８】図８は、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用され、次いでＸＫ２６／９５  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上でのゲルろ過クロマトグラフィーにかけられた、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブのサンプルによる代表的な染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示す図である。
【図９】図９Ａ〜Ｄは、ハーセプチン／トラスツズマブから単離されたＦｃ断片のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析からの代表なトレースを示す図である。
【図１０】図１０は、ハーセプチン／トラスツズマブから単離されたＦｃ断片のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析からの代表的なトレースを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｆｃ断片を含有する抗体の産生のための方法、細胞、およびトランスジェニック動物ならびにそのような抗体からＦｃ断片を単離および精製するための方法が本明細書に開示される。Ｆｃ断片の産生、単離および精製のための方法、細胞、およびトランスジェニック動物もまた、本明細書に開示される。多くの治療用分子の産生は、細胞もしくは生物体における組換え発現および／または天然の供給源からの抽出に依存する。たとえば、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、抗炎症性ＩｇＧ抗体を含有し、ヒト血清から抽出される。異種ＩＶＩＧの抗炎症特性は、抗体のＦｃ断片に起因する（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ）。Ｆｃ断片の産生のための代替方法が、本明細書に記載される。これらの方法は、驚いたことに、単離されたＦｃ断片の高レベルの純度をもたらし、Ｆｃ断片を単離するための従来の精製方法の難しさを改善する。
【００３０】
本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるまたは図面に示される構成成分の構造および配置の細部に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。さらに、本明細書において使用される用語および術語は、説明のためのものであり、限定と見なされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」、「含有する」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびその変形の使用は、その後に列挙される要素およびその等価物ならびにさらなる要素を包含することを意味する。
【００３１】
Ｆｃ断片
本発明の態様は、結晶化可能領域（Ｆｃ）断片を産生する方法に関する。本明細書において使用されるように、「Ｆｃ断片」は、細胞表面Ｆｃ受容体と相互作用する免疫グロブリンの一部分を指す。Ｆｃ断片は、２つのポリペプチド断片を含み、１つ以上のジスルフィドによって共有結合されてもよい。２つのポリペプチド断片のそれぞれは、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から選択される１つ以上の重鎖定常ドメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、重鎖定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含む。任意のアイソタイプ（たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）の免疫グロブリン由来のＦｃ断片は、本発明の態様と適合してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、ＩｇＧ  Ｆｃ断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、配列番号１によって提供される配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、米国特許第７，８６７，４９１号明細書に開示され、かつ米国特許第７，８６７，４９１号明細書から参照によって組み込まれるものなどのようなハイブリッドＦｃ断片である。
【００３２】
トラスツズマブのＦｃ断片のアミノ酸配列は、配列番号１において提供される：
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００３３】
本発明に関連するＦｃ断片は、Ｆｃ断片の重鎖中のＦｃガンマグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）に１つ以上のＮ−グリカンを含んでいてもよい。様々なグリコシル化パターンが、Ｆｃガンマグリコシル化部位に存在することができる。この部位に見つけられるオリゴ糖は、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡ）、Ｎ−グルコイルノイラミン（ＮＧＮＡ）、およびフコースを含む。Ｆｃガンマグリコシル化部位で見つけられるＮ−グリカンは、抗体のアスパラギンに付加される第１のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、第１のＧｌｃＮａｃに付加される第２のＧｌｃＮＡｃ、および第２のＧｌｃＮａｃに付加される第１のマンノースの非分岐鎖からなる共通のコア構造を一般に有する。さらなる２つのマンノースが、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−マンノース鎖の第１のマンノースに付加され、コア構造を完成し、さらなるグリコシル化のための２つの「アーム」を提供する。そのうえ、フコース残基を、Ｎ結合型の第１のＧｌｃＮＡｃに付加することができる。
【００３４】
本発明の態様は、Ｆｃ断片を含む抗体からのＦｃ断片の単離に関する。Ｆｃ断片を含む任意の抗体は、本発明の態様と適合することができる。いくつかの態様は、抗体に由来しないＦｃ断片の単離に関する。Ｆｃ断片は、天然のＦｃ断片とすることができ、Ｆｃ断片が単離される抗体の領域の天然のまたは自然のアミノ酸配列をＦｃ断片が含むことを意味する。いくつかの実施形態では、天然のＦｃ断片が、Ｆｃ断片が単離される抗体に関して、Ｆｃ断片の単離より前にまたはその後にさらに修飾されない。他の実施形態では、Ｆｃ断片が、変異Ｆｃ断片とすることができる。変異Ｆｃ断片は、Ｆｃ断片が単離される抗体の領域の天然のまたは自然のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有するＦｃ断片を含む。たとえば、アミノ酸配列は、突然変異させることができる（たとえば、アミノ酸残基の１つ以上の置換、挿入、および／または欠失を通して）。変異Ｆｃ断片は、抗体からのＦｃ断片の単離より前にまたはその後に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ断片が、天然のＦｃ断片と比較して、さらなるグリコシル化部分(glycosylation moieties)を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、天然のＦｃ断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの天然のＦｃ断片である。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ変異Ｆｃ断片である。
【００３６】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むポリペプチドを指す。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において区別なく使用され、等価である。抗体のそれぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨと本明細書において省略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、少なくとも３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および任意選択でＣＨ４から構成される。抗体のそれぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬと本明細書において省略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体のＦｃ断片内の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、抗体が、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのものである。さらなる実施形態では、抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択されるまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの免疫グロブリン定常ドメインおよび／もしくは可変ドメインを有する。他の実施形態では、抗体が、二重特異性または多重特異性抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。代替の実施形態によれば、本開示の抗体が、二重特異性抗体または多重特異性抗体の形態となるように修飾することができる。用語「二重特異性抗体」は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合するまたはそれと相互作用する２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を含むことが意図される。用語「多重特異性抗体」は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合するまたはそれと相互作用する、２つを超える異なる結合特異性を有する任意の作用物質、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を含むことが意図される。したがって、本開示は、細胞表面抗原およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体に向けられる二重特異性、三重特異性、四重特異性（ｔｅｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ）、および他の多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
他の実施形態では、抗体が、重鎖抗体である。用語「重鎖抗体」は、２つの重鎖を有し、軽鎖を有していないポリペプチドを指す。重鎖抗体の重鎖のそれぞれは、重鎖定常（ＣＨ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域から構成される。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域が、少なくとも２つのドメインから構成される。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域が、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される。
【００３９】
用語「抗体」はまた、様々なタイプの抗体、たとえば組換え抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体またはこれらの混合物を包含する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、抗体が、組換え抗体である。用語「組換え抗体」は、本明細書において使用されるように、別の種の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックされた動物から単離される抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、または他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製される、発現される、作られる、もしくは単離される抗体などのような、組換え手段によって調製される、発現される、作られる、または単離される抗体を含むことが意図される。
【００４１】
さらに他の実施形態では、抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体とすることができる。本明細書において使用されるように、用語「キメラ抗体」は、ヒト抗体の一部と非ヒト（たとえばマウス、ラット、ウサギ）抗体の一部を組み合わせる抗体を指す。本明細書において使用されるように、用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域と結合した親抗体由来の抗原結合ＣＤＲのみを保持する抗体を指す（Ｗａｌｄｍａｎｎ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５７を参照されたい）。マウス抗体の結合特異性を保持するそのようなキメラ抗体またはヒト化抗体は、本開示に従って診断、予防的、または治療上の適用のためにインビボで投与された場合に、低減された免疫原性を有することが期待される。
【００４２】
ある実施形態では、抗体がヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用されるように、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえばインビトロにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発またはインビボにおける体細胞変異によって導入された突然変異）を含んでいてもよい。ヒト抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を持つトランスジェニックマウスを使用して生成される。完全ヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックされたマウスを免疫化することによって調製することができる。たとえば、内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，６６９号明細書、米国特許第５，５９８，３６９号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、およびそこに引用される参考文献を参照されたい。これらの動物は、内因性の（たとえばマウス）抗体の産生に機能的な欠失があるように遺伝子修飾されている。動物は、これらの動物の免疫が関心のある抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすように、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子遺伝子座のすべてまたは一部を含有するようにさらに修飾される。これらのマウス（たとえばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫の後に、モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製される。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、そのため、ヒトに投与された場合にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を引き起こさないであろう。ヒト抗体は、本明細書において提供される抗体のいずれかのように、モノクローナル抗体とすることができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、抗体が、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、完全長抗体が、重鎖および軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、抗ＨＥＲ２抗体である。いくつかの実施形態では、重鎖が、配列番号２を含み、軽鎖が、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号１を含むＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、トラスツズマブである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号２の重鎖配列および配列番号３の軽鎖配列からなる。ある実施形態では、抗体のＦｃ断片が、配列番号１の配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。任意の抗体が、本発明の態様と適合し得ることが認識されるべきである。
【００４５】
トラスツズマブの重鎖は、配列番号２において提供される：
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００４６】
トラスツズマブの軽鎖は、配列番号３において提供される：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００４７】
トランスジェニック動物からの抗体またはＦｃ断片の精製
一態様では、抗体が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から精製される。いくつかの実施形態では、抗体が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳の中に分泌される。抗体は、抗体が実質的に純粋となるように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳から精製することができる。いくつかの実施形態では、「実質的に純粋な」は、混入物が実質的にないことを含む。そのような精製は、さらに処理される中間産物をもたらすことができる。
【００４８】
一態様では、Ｆｃ断片を含む抗体が、Ｆｃ断片を含む抗体を発現するように修飾された乳腺上皮細胞から精製される。抗体は、抗体が実質的に純粋となるように、乳腺上皮細胞から精製することができる。
【００４９】
一態様では、Ｆｃ断片が、Ｆｃ断片を発現するように修飾された乳腺上皮細胞から精製される。Ｆｃ断片は、Ｆｃ断片が実質的に純粋となるように乳腺上皮細胞から精製することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、「実質的に純粋な」は、混入物が実質的にないことを含む。そのような精製は、さらに処理される中間産物をもたらすことができる。
【００５１】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳または乳腺上皮細胞から回収されるＦｃ断片を含む抗体は、中間産物を生成するために当技術分野において知られている任意の適した手段を使用して精製することができる。同様に、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳または乳腺上皮細胞から回収されるＦｃ断片は、中間産物を生成するために当技術分野において知られている任意の適した手段を使用して精製することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはＦｃ断片が、クリーム分離器を使用して精製される。クリーム分離器およびその使用は、当技術分野においてよく知られている。いくつかの実施形態では、抗体またはＦｃ断片が、カラムクロマトグラフィーを使用して精製される。カラムクロマトグラフィーは、当技術分野においてよく知られている（一般的なクロマトグラフィー法については、たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｕｎｉｔ  ６．２（２００８）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗体またはＦｃ断片が、カラムクロマトグラフィーが後続するクリーム分離器を使用して精製される。いくつかの実施形態では、抗体またはＦｃ断片が、プロテインＧおよび／またはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される（たとえばＣａｒｔｅｒ（２０１１）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１７：１２６１−１２６９を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗体またはＦｃ断片が、免疫沈降によって精製される（たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔ  ７．２（２００１）を参照されたい）。
【００５２】
いくつかの態様では、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体が、精製の間に洗剤にさらされる。ポリペプチド精製法における洗剤の使用は、当技術分野においてよく知られており、細胞膜を溶解する、ポリペプチドを可溶化する、溶液中でポリペプチドを維持する、および／またはポリペプチドを変性させるのを助けてもよい。洗剤の非限定的な例は、限定を伴うことなく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグルコシド、およびオクチルチオグルコシドを含む。
【００５３】
Ｆｃ断片の単離および精製
ｉ．疎水性相互作用クロマトグラフィー
本発明の態様は、抗体を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、その後、限外ろ過等のさらなる精製にかけることによって、抗体からＦｃ断片を単離する方法を提供する。本発明の他の態様は、Ｆｃ断片を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、その後限外ろ過等のさらなる精製にかけることによって、Ｆｃ断片を単離する方法を提供する。本明細書において使用されるように、「疎水性相互作用クロマトグラフィー」（ＨＩＣ）は、混合物中の構成成分（たとえば抗体、Ｆｃ断片）を、その成分とカラム内の固定リガンドとの間の可逆的相互作用に基づいて分離する方法を指し、ポリペプチド内の疎水性アミノ酸残基が、カラム内に含有される疎水性リガンドと相互作用する。構成成分は、塩緩衝液の濃度勾配の減少を適用する等、緩衝液の濃度を変化させることによって、カラムから溶出することができる。混合物内の分子は、様々な疎水性の特徴を有し得、したがって、カラムのリガンドとの相互作用は、緩衝液の様々な濃度で妨害され得る。いくつかの実施形態では、カラムの溶出からのサンプルが、さらなる分析および／または精製のために緩衝液のそれぞれの濃度で収集される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を含むまたは含むと思われる溶出のサンプルのみが、さらなる分析および／または精製のために収集される。
【００５４】
本明細書において使用されるように、「樹脂」は、リガンドに付加されたビーズを含むマトリックスなどのようなマトリックスを指す。適切な樹脂の選択は、当業者によく知られており、樹脂に適用されるであろう混合物の構成成分の特徴に依存する。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムに使用される樹脂が、有機ポリマーリガンドを含む。有機ポリマー樹脂の非限定的な例は、フェニル、エーテル、ブチル、ヘキシル、またはポリプロピレングリコール樹脂を含む。いくつかの実施形態では、有機ポリマー樹脂が、フェニル有機ポリマー樹脂（たとえば東ソーフェニル６５０Ｃ）である。様々な樹脂が本発明の態様と適合することができることが認識されるべきである。たとえば、樹脂は、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡによって製造される樹脂とすることができる。いくつかの実施形態では、樹脂が、東ソーフェニル６５０Ｃ、東ソーフェニル６００Ｍ、東ソーブチル６００Ｍ、または東ソーＰＰＧ  ６００Ｍである。
【００５５】
ｉｉ．抗体消化
本発明のいくつかの実施形態では、抗体が、抗体をＨＩＣにかける前に消化される。抗体は、限定を伴うことなく酵素的、化学的、または機械的な消化法を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって消化することができる。いくつかの実施形態では、抗体の消化が、酵素によって実行される。抗体を消化する際に使用される酵素の非限定的な例は、パパインおよびフィシンなどのようなシステインプロテアーゼ、ペプシンなどのようなアスパラギン酸プロテアーゼ、ならびにトリプシンなどのようなセリンプロテアーゼを含む。好ましい実施形態では、抗体が、Ｆｃ断片および抗体のさらなる断片の間の部位で消化される。好ましい実施形態では、酵素が、Ｆｃ断片を消化しないが、抗体のさらなる断片からＦｃ断片を分離する。いくつかの実施形態では、消化が、Ｆｃ断片およびさらなる断片の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、さらなる断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片である。
【００５６】
消化は、酵素が活性な温度で実行されてもよい。消化の適切な継続期間は、当業者に明らかになるであろう、また、当技術分野において知られているルーチン的な方法を使用して決定することができる。抗体を消化するために使用される酵素は、固体支持体上に固定された形態でまたは遊離形態でまたは本明細書において記載される方法と適合する任意の他の形態で提供することができる。本明細書において使用されるように、「固体支持体上に固定された」は、樹脂、たとえばアガロースビーズに付加されたリガンド（たとえばポリマー、酵素）を指す。
【００５７】
ｉｉｉ．限外ろ過およびゲルろ過
本発明の態様は、Ｆｃ断片を含有する抗体をＨＩＣ、その後、限外ろ過などのようなさらなる精製にかけることに関する。本発明の他の態様は、Ｆｃ断片をＨＩＣ、その後、限外ろ過などのようなさらなる精製にかけることに関する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を含むまたは含むと思われるＨＩＣ溶出サンプルが、限外ろ過にかけられる。本明細書において使用されるように、「限外ろ過」は、構成成分のサイズまたは分子量に基づいて混合物の構成成分を分離する方法を指す。限外ろ過は、いくつかの実施形態において、膜の穴よりも小さな分子は通過させるのに対して、より大きな分子は膜上で遮断され、かつ保持される、透過性の膜フィルターを含むことができる。その代わりに、サイズ排除クロマトグラフィーと呼ばれるゲルろ過クロマトグラフィーが、混合物の構成成分を分離するために使用することができる。本明細書において使用されるように、「ゲルろ過クロマトグラフィー」は、構成成分のサイズまたは分子量に基づいて、また、混合物の構成成分およびカラム内の樹脂の間の相互作用に基づいて、混合物の構成成分を分離する方法を指す。本発明の態様と適合する樹脂の選択は、当業者によく知られているであろう。いくつかの実施形態では、ポリマー樹脂が、ゲルろ過クロマトグラフィーに使用される。いくつかの実施形態では、ポリマー樹脂が、デキストラン樹脂（たとえばＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標））である。
【００５８】
抗体、その断片、またはＦｃ断片は、様々な濃度の緩衝液を適用することによってカラムから溶出することができる。いくつかの実施形態では、溶出からのサンプルが、さらなる分析のために緩衝液のそれぞれの濃度で収集される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を含むまたは含むと思われる溶出のサンプルのみが、さらなる分析のために収集される。
【００５９】
抗体、その断片、またはＦｃ断片を含む溶出サンプルは、限定を伴うことなくウェスタンブロッティング、タンパク質電気泳動法、タンパク質染色、高速液体クロマトグラフィー、または質量分析法を含む当技術分野において知られている任意の方法によって純度についてさらに分析または評価することができる。
【００６０】
ｉｖ．緩衝液条件
緩衝液などのような様々な溶液が本発明の態様と適合することができることが認識されるべきである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片を含む抗体の消化が、トロメタミン（トリス）緩衝液中で行われる。いくつかの実施形態では、緩衝液が、トリスリン酸緩衝液である。他の実施形態では、緩衝液が、リン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液が、１ｍＭ〜１００ｍＭの間の、２ｍＭ〜５０ｍＭの間の、または５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度を有する。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度が、１ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度が、１００ｍＭを超える。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度が、およそ２０ｍＭである。緩衝液の濃度が、使用されている緩衝液の性質に依存性であることが認識されるべきである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨが、ｐＨ６〜ｐＨ９の間またはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の間にある。たとえば、いくつかの実施形態では、ｐＨが、およそ６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨが、およそ７．０である。必要な場合、酸（ＨＣＬなど）または塩基（ＮａＯＨなど）を、所望のｐＨに到達するように緩衝液に追加することができる。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、多価カチオンをキレート化するために緩衝液に追加されてもよい。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ濃度が、１ｍＭ〜１００ｍＭの間に、２ｍＭ〜５０ｍＭの間に、または５ｍＭ〜２０ｍＭの間にある。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ濃度が、およそ１０ｍＭである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムが、塩緩衝液またはその濃度勾配を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、塩緩衝液が、硫酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムを溶出するために使用される塩緩衝液の濃度範囲が、０．１Ｍ〜１Ｍまたは０．３Ｍ〜０．８Ｍの間または０．４Ｍ〜０．６Ｍの間とすることができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ゲルろ過クロマトグラフィーの後にＦｃ断片を溶出するために使用される緩衝液が、トロメタミン（トリス）緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液が、トリスリン酸緩衝液である。他の実施形態では、緩衝液が、リン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液が、１ｍＭ〜１００ｍＭの間の、２ｍＭ〜５０ｍＭの間の、または５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度が、１ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度が、１００ｍＭを超える。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度が、およそ２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液が、およそ２０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨが、ｐＨ６〜ｐＨ９の間またはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の間にある。たとえば、いくつかの実施形態では、ｐＨが、およそ６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨが、およそ７．０である。いくつかの実施形態では、緩衝液が、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどのような塩でさらに補足されてもよい。いくつかの実施形態では、緩衝液中の塩の濃度が、１ｍＭ〜３００ｍＭの間、５０ｍＭ〜２００ｍＭの間、または１００ｍＭ〜２００ｍＭの間にある。いくつかの実施形態では、塩の濃度が、およそ１５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムが、１５０ｍＭの濃度で緩衝液に追加される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、さらなる緩衝液が、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）などのような洗剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液中の洗剤の濃度が、０．００１％〜１％の間または０．０５％〜０．１％の間にある。いくつかの実施形態では、緩衝液中のＴｗｅｅｎ８０などのような洗剤の濃度が、およそ０．０１％である。
【００６５】
抗体を発現するトランスジェニック動物を作るための構築物
本発明のいくつかの態様は、核移植によってトランスジェニックヤギを産生する際に使用するための構築物（たとえば、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体をコードする）を含有する初代細胞株の産生に関する。構築物は、初代ヤギ皮膚上皮細胞の中にトランスフェクトすることができ、これらは、クローン増殖され、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造の完全性、および染色体の統合部位を評価するために完全に特徴付けられる。本明細書において使用されるように、「核移植」は、ドナー細胞由来の核が摘出された卵母細胞の中に移植されるクローニングの方法を指す。
【００６６】
関心のあるタンパク質（たとえばＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体）についてのコード配列は、最適な動物（ウマなど）に由来するゲノム物質または逆翻訳メッセンジャーＲＮＡのライブラリーのスクリーニングによるものを含む任意の適した供給源から得ることができる、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋなどのような配列データベースからまたは抗体もしくはＦｃ断片の配列を得ることによって得ることができるなどである。配列は、適切なプラスミドベクターの中にクローニングされ、大腸菌等の適した宿主生物体において増幅させることができる。ベクターの増幅の後、ＤＮＡ構築物は、切り取られ、残りのベクターから精製され、トランスジェニック動物を産生するために使用することができる発現ベクターの中に導入することができる。トランスジェニック動物は、それらのゲノムの中に統合された所望のトランスジェニックタンパク質を有するであろう。
【００６７】
ベクターの増幅の後、ＤＮＡ構築物は、さらに、適切な５’および３’コントロール配列と共に切り取り、残りのベクターから精製され、トランスジェニック動物のゲノムの中に所望の発現構築物を統合したトランスジェニック動物を産生するために使用される。反対に、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのようないくつかのベクターでは、組み立てられた構築物をベクターから取り出すことは必要ではなく、そのような場合、トランスジェニック動物を作製するために増幅させたベクターが直接使用されてもよい。コード配列は、適切に作用するようにコントロール配列に連結することができ、これにより、コード配列をトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳の中に発現させることができる。
【００６８】
Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体の産生をトランスジェニック動物の乳に向けるのに適したＤＮＡ配列は、天然由来乳タンパク質に由来する５’プロモーター領域を運搬し得る。このプロモーターは、結果的に、ホルモンおよび組織特異的因子にコントロールされ、乳を分泌する乳房組織において最も活性となる。いくつかの実施形態では、プロモーターが、ヤギベータカゼインプロモーターである。プロモーターは、タンパク質リーダー配列の産生を指示するＤＮＡ配列に作動可能に連結することができ、リーダー配列は、乳の中への乳房上皮を介してのトランスジェニックタンパク質の分泌を指示する。いくつかの実施形態では、天然に分泌された乳タンパク質から誘導することができる３’配列を、ｍＲＮＡの安定性を改善するために追加することができる。
【００６９】
本明細書において使用されるように、「リーダー配列」または「シグナル配列」は、タンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動可能に連結された場合、分泌を指示する。リーダー配列は、天然のヒトリーダー配列、人工的に誘導されたリーダーであってもよいまたは導入遺伝子コード配列の転写を指示するために使用されるプロモーターと同じ遺伝子からもしくは哺乳動物乳腺上皮細胞などのような細胞から通常分泌される別のタンパク質から得られてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、プロモーターが、乳特異的プロモーターである。本明細書において使用されるように、「乳特異的プロモーター」は、乳の中にタンパク質を分泌する細胞（たとえば乳腺上皮細胞）において遺伝子の発現を天然に指示するプロモーターであり、たとえばカゼインプロモーター、たとえばα−カゼインプロモーター（たとえばアルファＳ−１カゼインプロモーターおよびアルファＳ２−カゼインプロモーター）、β−カゼインプロモーター（たとえばヤギベータカゼイン遺伝子プロモーター（ＤｉＴｕｌｌｉｏ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １０：７４−７７，１９９２）、γ−カゼインプロモーター、κ−カゼインプロモーター、ホエー酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ５：１１８３−１１８７，１９８７）、β−ラクトグロブリンプロモーター（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ７：４８７−４９２，１９８９）、ならびにα−ラクトアルブミンプロモーター（Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＳ．２９７：１３，１９９２）を含む。たとえばマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのような、乳房組織において特異的に活性化されるプロモーターもまた、この定義に含まれる。
【００７１】
本明細書において使用されるように、コード配列および調節配列は、コード配列の発現または転写を調節配列の影響またはコントロール下に置くようにそれらが共有結合される場合に、「作動可能につながれる(operably joined)」と言われる。コード配列が機能タンパク質に翻訳されるために、コード配列は、調節配列に作動可能につながれる。２つのＤＮＡ配列は、５’調節配列中のプロモーターの誘発が、コード配列の転写をもたらし、２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力に干渉しない、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合、作動可能につながれると言われる。したがって、プロモーター領域は、結果として生じる転写物が所望のポリペプチド（たとえばＦｃ断片または抗体）に翻訳され得るようにプロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼすことができた場合、コード配列に作動可能につながれている。
【００７２】
本明細書において使用されるように、「ベクター」は、異なる遺伝的環境間の輸送のためのまたは宿主細胞における発現のための、所望の配列が制限およびライゲ−ションによって挿入されてもよい多くの核酸のいずれかであってもよい。ＲＮＡベクターもまた利用可能であるが、ベクターは典型的にＤＮＡから構成される。ベクターは、プラスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製することができ、かつベクターが特定できる様式で切られてもよく、かつ新たな組換えベクターが宿主細胞において複製するその能力を保持するように所望のＤＮＡ配列がライゲーションされてもよい１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるベクターである。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドのコピー数が宿主細菌内で増加するとともに何度も行われ得るまたは宿主が有糸分裂によって子孫をつくる時に宿主当たり１回だけである。ファージの場合、複製は、溶菌期の間は積極的にまたは溶原期の間は消極的に行われ得る。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が調節配列に作動可能につながれ、かつＲＮＡ転写物として発現され得るように所望のＤＮＡ配列が制限およびライゲ−ションによって挿入されてもよいベクターである。ベクターは、ベクターにより形質転換されたもしくはトランスフェクトされたまたは形質転換されなかったもしくはトランスフェクトされなかった細胞の同定において使用するのに適した１つ以上のマーカー配列をさらに含有してもよい。マーカーは、たとえば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性を増加させるまたは減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野において知られている標準的なアッセイによって検出可能となる酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見えて影響を与える遺伝子を含む。好ましいベクターは、それらが作動可能につながれたＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の自律複製および発現が可能なベクターである。
【００７３】
Ｆｃ断片の産生のための乳腺上皮細胞およびトランスジェニック動物
一態様では、本開示が、Ｆｃ断片を含む抗体を発現する乳腺上皮細胞を提供する。別の態様では、本開示が、Ｆｃ断片を発現する乳腺上皮細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示が、Ｆｃ断片を含む抗体を発現する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。他の実施形態では、本開示が、Ｆｃ断片を発現する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００７４】
一態様では、本開示が、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体の産生のための方法であって、
（ａ）Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体をコードする導入遺伝子ＤＮＡ構築物により非ヒト哺乳動物細胞をトランスフェクトするステップ；
（ｂ）前記導入遺伝子ＤＮＡ構築物が細胞のゲノムの中に挿入された細胞を選択するステップ；および
（ｃ）Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体についてヘテロ接合性であり、その乳の中にＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体を発現することができる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成するために第１の核移植手順を実行するステップを含む方法を提供する。
【００７５】
一態様では、本開示が、
（ａ）Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供するステップ、
（ｂ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳の中にＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体を発現させるステップ；および
（ｃ）乳の中に産生されたＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体を単離するステップを含む方法を提供する。
【００７６】
トランスジェニック動物はまた、当技術分野において知られている方法に従って生成することもできる（たとえば米国特許第５，９４５，５７７号明細書を参照されたい）。トランスジェニック発現に適した動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、雌ウシ、ウサギ、水牛、ウマ、ラット、マウス、またはラマを含むが、これらに限定されない。適した動物はまた、雌ウシ、ヤギ、およびヒツジの様々な種にそれぞれ関係するウシ、ヤギ、およびヒツジをも含む。適した動物はまた、有蹄動物をも含む。本明細書において使用されるように、「有蹄」は、蹄のある典型的に草食性の四肢哺乳動物について言いまたはそれに関係し、限定を伴うことなく、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマを含む。一実施形態では、動物が、別々の構築物により初代細胞を同時形質移入することによって生成される。次いで、これらの細胞は、核移植に使用される。その代わりに、マイクロインジェクションがトランスジェニック動物を生成するために使用される場合、構築物は、注射されてもよい。
【００７７】
クローニングは、多様なトランスジェニック動物をもたらすであろう−それぞれ、Ｆｃ断片もしくはＦｃ断片を含む抗体または関心のある他の遺伝子構築物を産生することができる。産生方法は、クローン動物およびそれらの動物の子孫の使用を含む。いくつかの実施形態では、クローン動物が、ヤギ、ウシ、またはマウスである。クローニングはまた、胎児の核移植、核移植、組織および器官移植、ならびにキメラ子孫の生成をも包含する。
【００７８】
クローニングプロセスのあるステップは、摘出された卵母細胞の中にＦｃ断片構築物または抗体構築物をコードする導入遺伝子を含有する細胞のゲノムを移入するステップを含む。本明細書において使用されるように、「導入遺伝子」は、細胞またはその祖先の中に巧みに挿入され、その細胞から成長する動物のゲノムの一部分になる核酸分子の任意の部分を指す。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック動物にとって部分的にもしくは全体的に外因性の（つまり外来性の）遺伝子を含んでいてもよいまたは動物の内因性の遺伝子に対して同一性を有する遺伝子に相当してもよい。
【００７９】
卵母細胞に適した哺乳動物種は、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、非ヒト霊長動物などを含む。好ましくは、卵母細胞は、有蹄動物、および最も好ましくはヤギまたはウシから得られる。卵母細胞の単離のための方法は、当技術分野においてよく知られている。本質的に、そのプロセスは、哺乳動物、たとえばヤギの卵巣または生殖器系から卵母細胞を単離することを含む。有蹄卵母細胞の容易に利用可能な種は、ホルモン誘発性の雌動物由来の種である。遺伝子工学、核移植、およびクローニングなどのような技術の使用を成功させるために、卵母細胞は、好ましくは、これらの細胞がレシピエント細胞として核移植に使用され得る前に、かつそれらを精子と受精させて胚に成長させる前にインビボにおいて成熟させてもよい。インビボにおいて成熟させた中期ＩＩ卵母細胞は、核移植技術における使用で成功してきた。基本的に、成熟中期ＩＩ卵母細胞は、発情の開始またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンの注射の数時間後に非過排卵動物または過排卵動物から外科的に収集される。
【００８０】
乳腺において発現された組換えタンパク質の量および質を予測するために使用されるツールの１つは、乳汁分泌の誘発を通してのものである（Ｅｂｅｒｔ  ＫＭ，１９９４）。誘発泌乳は、少なくとも１年後になる妊娠から結果として生じる第１の自然の乳汁分泌からではなく、トランスジェニック産生の初期からタンパク質の発現および分析を可能にする。乳汁分泌の誘発は、ホルモンによってまたは手作業で行うことができる。
【００８１】
一態様では、本開示が、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体を産生する乳腺上皮細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明の態様に従う乳腺上皮細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、抗体をコードする核酸配列を発現する。いくつかの実施形態では、核酸配列が、配列番号１において示されるＦｃ断片をコードする配列を含む。
【００８２】
Ｆｃ断片の産生
本発明の態様は、トランスジェニックＦｃ断片に関する。いくつかの実施形態では、トランスジェニックＦｃ断片が、精製される。
【００８３】
いくつかの態様では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物または乳腺上皮細胞において本明細書に記載されるように産生されたＦｃ断片が、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して特徴が改変されている。たとえば、本明細書において記載されるように産生されたＦｃ断片は、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して、改変されたグリコシル化および／またはシアリル化を示すことができる。本明細書において記載されるように産生されたＦｃ断片は、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して半減期および／または安定性の増加を示すことができる。本明細書において記載されるように産生されたＦｃ断片はまた、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して、対象に投与された場合に、増強された抗炎症特性を示すこともできる。
【００８４】
一態様では、本開示が、組換え抗体または遺伝子導入で産生された抗体を提供し、Ｆｃ断片は、続いて抗体から単離および精製される。別の態様では、本開示が、続いて単離および精製される、遺伝子導入で産生されたＦｃ断片を提供する。組換えＦｃ断片または遺伝子導入で産生されたＦｃ断片を含むそのようなＦｃ断片および組成物は、グリコシル化および／またはシアリル化を示すことができる。たとえば、いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生され、次いで単離および精製されたＦｃ断片は、乳腺上皮細胞で産生されたものではないＦｃ断片と比較した場合、グリコシル化および／またはシアリル化のレベルが増加している。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞において産生されたものではないＦｃ断片は、細胞培養において産生される。本明細書において使用されるように、乳腺上皮細胞において産生されたＦｃ断片と比較される場合、「細胞培養において産生された」Ｆｃ断片は、乳腺上皮細胞を除く標準的な産生細胞株（たとえばＣＨＯ細胞またはバキュロウイルス−Ｓｆ９細胞）において産生されたＦｃ断片を指す。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生され、次いで単離および精製されたＦｃ断片は、ＩＶＩＧから単離されたＦｃ断片と比較した場合、グリコシル化および／またはシアリル化のレベルが増加している。
【００８５】
いくつかの実施形態では、上記の方法が、乳汁分泌を誘発するためのステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法が、さらなる単離および／または精製ステップをさらに含む。さらに他の実施形態では、方法が、細胞培養、たとえば非乳房細胞培養において産生されたＦｃ断片のグリコシル化パターンを比較するためのステップをさらに含む。さらなる実施形態では、方法が、非乳腺上皮細胞によって産生されたＦｃ断片と、得られたＦｃ断片のグリコシル化パターンを比較するためのステップをさらに含む。そのような細胞は、細胞培養物の細胞とすることができる。Ｆｃ断片のグリコシル化パターンを評価するための実験技術は、当業者らに知られている。そのような方法は、たとえば液体クロマトグラフィー質量分析、タンデム質量分析、およびウエスタンブロット分析を含む。
【００８６】
いくつかの態様では、本明細書において開示されるＦｃ断片が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物におけるまたは乳腺上皮細胞におけるＦｃ断片を含む抗体の産生によって生成される。他の態様では、本明細書において開示されるＦｃ断片が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物におけるまたは乳腺上皮細胞におけるＦｃ断片の産生によって生成される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片のシアリル化レベルを増加させることが有利であってもよい。Ｆｃ断片のシアリル化レベルは、たとえばシアリルトランスフェラーゼにＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体をさらすことによって増加させることができる。Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体は、インビトロまたはインビボにおいてシアリルトランスフェラーゼにさらすことができる。Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体は、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体をシアリルトランスフェラーゼおよび適切な糖類ベースの基質にさらすことによってインビトロにおいてシアリル化することができる。Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体は、乳腺または乳腺上皮細胞においてシアリルトランスフェラーゼを産生させることによってインビボにおいてシアリル化することができる。
【００８７】
いくつかの態様では、本開示が、アルファ−２，６−シアリル化のレベルが増加したＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体のトランスジェニック動物の乳腺におけるまたは乳腺上皮細胞における産生のための方法を提供する。シアリル化の増加を示すＦｃ断片は、高められた抗炎症特性を示してもよい。
【００８８】
一態様では、本開示が、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体の乳腺における産生のためにトランスジェニックされ、さらに、シアリルトランスフェラーゼの産生のためにもトランスジェニックされたトランスジェニック動物（および乳腺上皮細胞）を提供する。そのような動物および細胞によって産生されたＦｃ断片は、末端のアルファ−２，６−シアル酸連結のレベルが増加していることが期待される。
【００８９】
一態様では、本開示が、末端のアルファ−２，６−シアル酸連結のレベルが増加しているＦｃ断片を対象に投与するステップを含む、対象を処置する方法を提供する。
【００９０】
Ｆｃ断片は、いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるように産生されたトランスジェニック動物の乳からまたは前記トランスジェニック動物の子孫からＦｃ断片またはＦｃ断片を含む抗体を回収することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片が、産生される乳の１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルで産生される。たとえば、いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法が、Ｆｃ断片の１リットル当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０グラムの産生を可能にする。いくつかの実施形態では、抗体が、産生される乳の１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルで産生される。たとえば、いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法が、抗体の１リットル当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０グラムの産生を可能にする。
【００９１】
いくつかの態様では、本明細書において記載されるように産生されたＦｃ断片が、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して特徴が増強されている。たとえば、いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法によって産生されたＦｃ断片が、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して純度が高い。いくつかの実施形態では、続いて単離および精製された、遺伝子導入で産生されたＦｃ断片が、少なくとも９５〜９９．９９％純粋である。いくつかの実施形態では、続いて単離および精製された、遺伝子導入で産生されたＦｃ断片が、少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、または９９．９９％純粋である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入で産生された抗体から単離および精製されたＦｃ断片が、少なくとも９５〜９９．９９％純粋である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入で産生された抗体から単離および精製されたＦｃ断片が、少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、または９９．９９％純粋である。
【００９２】
本明細書において記載される方法のいずれかによって産生されたＦｃ断片の純度は、限定を伴うことなく、ウェスタンブロッティング、タンパク質電気泳動法、タンパク質染色、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法、混入タンパク質ＥＬＩＳＡなどを含む当業者らに知られている任意の技術によって評価することができる。
【００９３】
本明細書において記載されるように産生されたＦｃ断片はまた、他の方法によって産生されたＦｃ断片と比較して、高められた効率で産生することができる。本明細書において使用されるように、「高められた効率(enhanced efficiency)」は、出発物質と比較したＦｃ断片のより高い収量パーセントを指す。いくつかの実施形態では、遺伝子導入で産生された抗体から単離および精製されたＦｃ断片の収量パーセントが、６０〜８０％である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入で産生された抗体から単離および精製されたＦｃ断片の収量パーセントが、少なくとも６０、６５、７０、７５、または８０％である。
【００９４】
処置の方法
いくつかの態様では、本開示は、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む組成物をその必要がある対象に投与する方法を提供する。対象がＦｃ断片を含む処置を必要としているかどうかを決定する方法は、当技術分野において知られている。たとえば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む組成物を投与することを含む処置を必要とする対象が、自己免疫症状または炎症症状を有する対象である。本明細書において記載される本発明の実施によって処置することができるかもしれない例示的な自己免疫症状および／または炎症症状は、当業者に明らかであろう。非限定的な例は、米国特許第８３４９７９３号明細書および国際公開第２０１３／０３４７３８号から参照によって明確に組み込まれる。
【００９５】
自己免疫症状の非限定的な例は、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病；運動ニューロン疾患でもある）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群（Ａｎｔｉｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性消化器病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性末梢性ニューロパシー、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性じんましん、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病／バロー同心円性硬化症（Ｂａｌｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ベーチェット病、ベルガー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャガス病、慢性炎症脱髄性多発ニューロパシー、慢性再発性多発性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ−ストラウス症候群、良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠乏症（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ２  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、接触皮膚炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、びまん性皮膚全身性硬化症、ドレスラー症候群、薬剤誘発性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎（Ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児性赤芽球症、クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維化肺胞炎（または特発性肺線維症）、胃炎、胃腸類天疱瘡（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名妊娠性天疱瘡（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、汗腺膿瘍、ヒューズ−ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病を参照）、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、ミラー−フィッシャー症候群、混合結合組織病、斑状強皮症、ムッハ−ハーベルマン病、別名急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病でもある）、神経性筋強直症、眼類天疱瘡、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎（Ｏｒｄ’ｓ  ｔｈｙｒ���ｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（溶連菌関連小児自己免疫性精神神経疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルク症候群、パーソネージ−ターナー症候群、毛様体扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性の貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラズムッセン脳炎、レイノー症状、再発性多発軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、ＡＰＳの別の形態、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、ＰＡＮＤＡＳを参照、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデスを参照、高安の動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、血小板減少症、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、じんま疹様血管炎、脈管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症を含む。
【００９６】
炎症症状の非限定的な例は、強直性脊椎炎、（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎中心（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、脈管炎、盲腸炎、滑液包炎、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、感染性髄膜炎、扁桃腺炎、喘息、肺炎、静脈炎、ＲＳＤ／ＣＲＰＳ、鼻炎、腱炎、扁桃腺炎、脈管炎、そう痒症、皮膚炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎および脂漏性皮膚炎、ケラチノパシー（ｋｅｒａｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、変形性関節症、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、炎症性肺損傷、炎症性肝臓損傷、炎症性糸球体損傷、角結膜炎、関節、皮膚、または筋肉の炎症疾患、急性または慢性特発性炎症関節炎、脱髄疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、間質性腎炎、ならびに慢性活動性肝炎を含む。
【００９７】
医薬組成物、投薬量、および投与
本発明の態様は、有効量のＦｃ断片またはＦｃ断片を含む組成物を投与することに関する。いくつかの実施形態では、方法が、治療有効量のトランスジェニックＦｃ断片をその必要がある対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニックＦｃ断片が精製される。いくつかの実施形態では、対象が、炎症症状または自己免疫症状を有する。
【００９８】
本明細書において使用されるように、「治療有効量」または「有効量」は、症状に影響を及ぼすのに有効なＦｃ断片またはＦｃ断片を含む組成物の量を指す。たとえば、いくつかの実施形態では、有効量が、炎症または自己免疫を低下させるのに十分な量とすることができる。有効量の決定は、組成物の毒性および効能のような因子に依存する。これらの因子は、効力、相対的な生物学的利用率、対象の体重、有害な副作用の重さ、および好ましい投与のモードなどのような他の因子に依存して異なるであろう。毒性は、当技術分野においてよく知られている方法を使用して決定されてもよい。効能は、同じ教示を利用して決定されてもよい。効能は、たとえば、いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインの量、炎症細胞の存在、特異的な抗体の量、または発赤もしくは腫脹などのような特徴を定量化することによって測定することができる。有効量は、当業者によって容易に決定することができる。
【００９９】
投薬量は、投与のモードに依存して、局所的なまたは全身性の所望のレベルを実現するために適切に調節されてもよい。対象における応答がそのような用量で不十分である場合、さらに高い用量（または異なる、より局所的な送達ルートによる有効な、より高い用量）が、対象の耐性が許容する程度まで用いられてもよい。いくつかの実施形態では、１日当たり複数の用量が、適切な全身性レベルの産物または組成物を実現するために使用することができる。適切な全身性レベルは、たとえば、Ｆｃ断片の対象のピークまたは持続性の血漿レベルを測定することによって決定することができる。「用量」および「投薬量」は、本明細書において区別なく使用される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、対象に投与されるＦｃ断片またはＦｃ断片を含む医薬組成物の量が、１週間当たり５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、または２００〜３００ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、対象に投与されるＦｃ断片またはＦｃ断片を含む医薬組成物の量が、１週間当たり２５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、４００ｍｇ／ｋｇの初回量が、第１の週に対象に投与され、続く数週間、対象への２５０ｍｇ／ｋｇの投与が後続する。いくつかの実施形態では、投与速度が、１０ｍｇ／分未満である。いくつかの実施形態では、対象へのＦｃ断片またはＦｃ断片を含む医薬組成物の投与が、別の治療剤による処置の少なくとも１時間前に行われる。いくつかの実施形態では、前処置が、Ｆｃ断片またはＦｃ断片を含む医薬組成物の投与より前に投与される。
【０１０１】
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子導入で産生され精製されたＦｃ断片および医薬として許容されるビヒクル、希釈剤、またはキャリヤを含む医薬組成物を包含する、組成物を提供する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、提供される組成物が、インビボにおける適用のために使用される。インビボにおける意図される投与のモードに依存して、使用される組成物は、たとえば錠剤、丸剤、粉剤、カプセル、ゲル、外用薬、液剤、懸濁剤、およびその他同種のものなどのように、固体、半固体、または液体の剤形をしていてもよい。好ましくは、組成物は、正確な施薬量の１回の投与に適した単位剤形で投与される。組成物はまた、所望される製剤に依存して、動物またはヒトの投与のための医薬組成物を製剤するために一般に使用される水性液ベースのビヒクルとして定義される医薬として許容されるキャリヤまたは希釈剤を含んでいてもよい。希釈剤は、Ｆｃ断片の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。同様の希釈剤が、関心のある凍結乾燥組換えタンパク質を還元するために使用されてもよい。そのうえ、医薬組成物はまた、他の薬用の薬剤、医薬品、キャリヤ、補助剤、無毒の、非治療用の、非免疫原性の安定剤などを含んでいてもよい。そのような希釈剤またはキャリヤの有効量は、構成成分の溶解性、生物学的活性などの点から医薬として許容される製剤を得るのに有効な量である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物が、滅菌されている。
【０１０３】
インビボにおける処置の間の投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻内、舌下、気管内、吸入、眼球、膣、および直腸を含む任意の数のルートによるものであってもよい。包内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、静脈内、および腹腔内投与ルートもまた、用いられてもよい。当業者は、投与ルートが、所望の応答に依存して変わることを認識する。たとえば、本明細書におけるＦｃ断片または組成物は、経口、非経口、または局所投与を介して対象に投与されてもよい。一実施形態では、本明細書における組成物が、静脈内注入によって投与される。
【０１０４】
組成物は、それらを全身的に送達することが望ましい場合、注射による、たとえばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤されてもよい。注射用の製剤は、追加される保存剤と共に、単位剤形で、たとえばアンプル中にまたは複数回用量の容器中に提示されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中で懸濁剤、水剤、または乳剤のような形態を取ってもよく、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などのような調合剤を含有してもよい。非経口投与用の医薬製剤は、水溶性の形態をした活性組成物の水性の水剤を含む。そのうえ、活性組成物の懸濁剤は、適切な油性注射懸濁剤として調製されてもよい。適した親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などのような脂肪油またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどのような合成脂肪酸エステルまたはリポソームを含む。水性注射懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどのような懸濁剤の粘性を増加させる物質を含有してもよい。任意選択で、懸濁剤はまた、高濃縮溶液の調製を可能にするために、組成物の溶解性を増加させる、適した安定剤または作用物質をも含有してもよい。その代わりに、活性組成物は、使用の前の適したビヒクル、たとえば滅菌発熱物質不含水との構成のために粉剤形態をしていてもよい。
【０１０５】
経口投与については、医薬組成物は、結合剤（たとえばアルファ化とうもろこしデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（たとえばラクトース、結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、滑石、もしくはシリカ）；崩壊剤（たとえばジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）などのような医薬として許容される賦形剤と共に従来の手段によって調製されるたとえば錠剤またはカプセルの形態を取ってもよい。錠剤は、当技術分野においてよく知られている方法によってコーティングされてもよい。経口投与用の液剤調製物は、たとえば水剤、シロップ、もしくは懸濁剤の形態を取ってもよいまたはそれらは、使用の前に水もしくは他の適したビヒクルとの構成のための乾燥した製品として提供されてもよい。そのような液剤調製物は、懸濁化剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油）；および保存剤（たとえばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）などのような、医薬として許容される添加剤と共に従来の手段によって調製されてもよい。調製物はまた、緩衝液塩、調味料、着色料、および甘味料を必要に応じて含有してもよい。
【０１０６】
構成成分は、経口送達が効果的となるように化学的に修飾されてもよい。一般に、企図される化学修飾は、少なくとも１つの分子の付加であり、ここで前記分子は、（ａ）タンパク質分解の阻害および（ｂ）胃または腸から血液循環への取込みを可能にする。全体的な安定性の増加および身体における循環時間の増加もまた所望される。そのような分子の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ならびにポリプロリンを含む。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８１，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９。使用することができるかもしれない他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−トリオキソカンである。ポリエチレングリコール分子は、上記に示されるように、薬学的用途にとって好ましい。経口組成物については、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）、または大腸であってもよい。当業者は、胃において溶解しないが、十二指腸または他の腸において物質を放出させるであろう入手可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、生物学的活性物質の保護によってまたは腸においてなどのように胃環境を過ぎてからの生物学的活性物質の放出によって、胃環境の悪影響を回避するであろう。頬への投与については、組成物は、従来の方式で製剤された錠剤またはロゼンジの形態を取ってもよい。
【０１０７】
組成物はまた、たとえば、カカオバターまたは他のグリセリドなどのような従来の坐剤基剤を含有する坐剤または保持浣腸剤などのような直腸または膣組成物で製剤されてもよい。
【０１０８】
医薬組成物はまた、適した固相またはゲル相キャリヤまたは賦形剤を含んでいてもよい。そのようなキャリヤまたは賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのようなポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
適した液体または固体医薬調製物の形態は、たとえば、吸入のための水性の水剤または生理食塩水である、マイクロカプセル化される、渦巻形化される（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、顕微鏡的金粒子上にコーティングされる、リポソーム中に含有される、噴霧される、エアロゾルである、皮膚の中への移植のためのペレットである、または乾燥させて鋭い物体にし、引っ掻いて皮膚の中に入れられる。医薬組成物はまた、顆粒剤、粉剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、乳剤、懸濁剤、クリーム、点滴剤、または活性組成物が長期放出される調製物をも含み、この調製物において、崩壊剤、バインダー、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、調味料、甘味剤、または可溶化剤などのような賦形剤ならびに添加剤および／または助剤が上記に記載されるように通常使用される。医薬組成物は、様々な薬剤送達系における使用に適している。薬剤送達のための方法の簡単な概説については、参照によって本明細書において組み込まれるＬａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０を参照されたい。
【０１１０】
治療薬は、それ自体で（純粋）または医薬として許容される塩の形態で投与されてもよい。医薬中で使用される場合、塩は、薬学的に許容できるものであるべきであるが、薬学的に許容できない塩は、その薬学的に許容できる塩を調製するために、好都合に使用されてもよい。そのような塩は、以下の酸から調製されるものを含むが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタリン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのような、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
【０１１１】
適した緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；硼酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を含む。適した保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を含む。
【０１１２】
本開示の医薬組成物は、医薬として許容されるキャリヤ中に含まれる有効量のＦｃ断片および任意選択で治療剤を含有する。医薬として許容されるキャリヤという用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適した、１つ以上の適合する固体または液体増量剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。キャリヤという用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わせられる天然のまたは合成の有機または無機成分を表わす。医薬組成物の構成成分はまた、互いに、所望の薬学的な効率を実質的に害する相互作用がないように、本開示の組成物と混ぜることができる。
【０１１３】
Ｆｃ断片を含む治療剤は、いくつかの実施形態において、粒子で提供されてもよい。本明細書において使用される粒子は、全体的にもしくは部分的に治療剤からなることができるまたは他のさらなる治療剤を含むことができるナノ粒子もしくは微粒子（またはいくつかの場合、より大きい）を意味する。粒子は、治療剤に加えて、侵食可能、非侵食可能、生分解性、もしくは非生物分解性物質またはその組合せを含むが、これらに限定されない、薬学および医学の技術においてごく普通に使用される物質のいずれかを含んでいてもよい。粒子は、溶液中にまたは半固体状態で治療剤を含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、事実上任意の形状をしていてもよい。
【０１１４】
等価物
当業者らは、ルーチン的な実験のみを使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物について認識または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。
【０１１５】
本明細書において他に定義されない限り、本開示に関して使用される科学用語および専門用語は、当業者らによって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語は、多数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。本開示の方法および技術は、当技術分野においてよく知られている従来の方法に従って一般に実行される。全般的に、本明細書において記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、また、一般に使用されるものである。本開示の方法および技術は、別段の指示がない限り、当技術分野においてよく知られており、本明細書の全体にわたって引用され、議論される様々な全般的なおよびより詳細な参考文献において記載される従来の方法に従って、全般的に実行される。
【０１１６】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、これらはさらなる限定として決して解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用される参考文献（文献の参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属特許出願を含む）のすべての全内容は、特に上記に参照される教示について、参照によってこれによって明確に組み込まれる。しかしながら、いかなる参考文献の引用も、参考文献が先行技術となることを許可することを意図するものではない。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：ハーセプチン／トラスツズマブを産生するトランスジェニックヤギの生成
それらのゲノム中にトラスツズマブ抗体をコードする核酸配列を含むトランスジェニックヤギを生成した。トラスツズマブを産生するヤギは、従来のマイクロインジェクション技術を使用して生成した（たとえば米国特許第７，９２８，０６４号明細書を参照）。重鎖および軽鎖（配列番号４および配列番号５）をコードするｃＤＮＡを、ベータカゼイン発現ベクターとライゲーションし、構築物ＢＣ２６０１  ＨＣおよびＢＣ２６０２  ＬＣを得た。これらのプラスミドにおいて、トラスツズマブをコードする核酸配列は、ヤギの乳腺におけるトラスツズマブの発現を容易にするプロモーターのコントロール下にある。原核生物の配列を除去し、ＤＮＡをヤギの着床前の胚の中にマイクロインジェクトした。次いで、これらの胚を偽妊娠している雌に移入した。結果として生じる子孫を導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。両方の鎖を運搬するものをトランスジェニックの初代として同定した。
【０１１８】
トラスツズマブの重鎖をコードする核酸配列は、配列番号４において提供される：
ＡＴＧＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧ。
【０１１９】
トラスツズマブの軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号５において提供される：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡ。
【０１２０】
年齢が適切になったら、初代の動物に子を産ませた。妊娠および出産後にヤギから乳を搾った。たとえば、ヤギＮ０３６６は、２００日間で１日当たり２回の自然の乳汁分泌を通しておよそ１．５〜２Ｌの乳を産生し、６０〜７０ｇ／Ｌのハーセプチン／トラスツズマブがもたらされた。
【０１２１】
実施例２：ハーセプチン／トラスツズマブ清澄化
トランスジェニックヤギから回収した乳を清澄化プロセスにかけた。手短かに言えば、乳の温度を３７℃まで増加させ、次いで、クリームおよびスキムミルクを、クリーム分離器を使用して分離した。クリームの除去後、１％トリトンＸ１００を乳に追加し、混合物を１時間インキュベートした。次いで、乳を適切なｐＨおよび伝導率を実現するように希釈し、スルホプロピル（ＳＰ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗアガロースビーズを含有するカラムに適用した。図１は、２つの乳サンプルについてのＳｅｐｈａｒｏｓｅ清澄化カラムからのフロースルー（ＦＴ）および溶出（ＥＬ）を含有するタンパク質ゲルを示す。大部分のハーセプチン／トラスツズマブは、フロースルーサンプルではなく溶出サンプル中に存在した。最後に、溶液は、０．２μｍフィルターを通過させ、＞５０％の純度の清澄化中間体がもたらされた。
【０１２２】
実施例３：ハーセプチン／トラスツズマブの消化および精製
清澄化中間体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにかけ、四級アンモニウム（Ｑ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗアガロースビーズを含有するカラムに適用した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラムからのフロースルー画分を濃縮し、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む適切な消化緩衝液の中にダイアフィルトレーションした。
【０１２３】
抗体を消化することができる様々な酵素を、本発明におけるそれらの実用性について試験した。消化反応液は、表１に示されるように調製した。パパインによる抗体消化は、Ｆｃ断片および２つのＦａｂ断片をもたらすことが期待された。ペプシンによる消化は、１つのＦ（ａｂ’）２断片および分解されたＦｃ断片をもたらすことが期待された。フィシンによる消化は、２つのＦａｂ断片および分解されたＦｃ断片をもたらすことが期待された。パパインによる消化と同様に、トリプシンによる消化は、Ｆｃ断片および２つのＦａｂ断片をもたらすことが期待された。
【０１２４】
【表１】
2017520531.tif 000002
【０１２５】
示す時間のインキュベーション後に、消化反応液を、図２に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルによって評価した。パパインは、さらなる開発のための消化酵素として選択した。
【０１２６】
図３のワークフローにおいて概説されるように、遺伝子導入で産生されたハーセプチン／トラスツズマブを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって清澄化し、精製し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗアガロースビーズを含有するカラムに適用した。 
【０１２７】
次いで、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを実行し、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡに緩衝液を交換した。抗体を、３７℃で２２時間、システインの存在下で固定パパインにより消化した。消化の終了後、パパインは、消化されたハーセプチン／トラスツズマブから除去した。硫酸ナトリウムを、０．７５Ｍの濃度まで追加し、消化された抗体を、１Ｍ硫酸ナトリウムを有する２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０中で平衡化したＸＫ１６／３０東ソーフェニル６５０Ｃ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに適用した。カラムは、いかなる未消化抗体をも除去するために、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０（０Ｍの硫酸ナトリウム濃度）により洗浄した。カラムを硫酸ナトリウムの濃度の減少を使用して溶出した。Ｆａｂ断片は、およそ０．６Ｍ硫酸ナトリウムでカラムから溶出し、Ｆｃ断片は、およそ０．４Ｍ硫酸ナトリウムでカラムから溶出した。図４Ａおよび図６Ａは、消化されたハーセプチン／トラスツズマブの２つの独立した調製物についてのＨＩＣトレースを示す。図４Ｂおよび図６Ｂは、ＨＩＣトレース（図４Ａおよび図６Ａ）において示されるピークのそれぞれから収集したサンプルを含む、ハーセプチン／トラスツズマブ調製物のそれぞれからのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示す。表２は、示されるＨＩＣピークにおけるＦｃ断片の収率を要約する。ハーセプチン／トラスツズマブ調製物０８１４１３ｐｈｅ１（図４Ａおよび４Ｂに示される）は、１．４の吸光係数でＡ２８０ｎｍによって計算されるように、３７２ｍｇ（９２．１％）の総タンパク質回収率および９９ｍｇ（２６．６％）のＦｃ断片回収率をもたらした。ハーセプチン／トラスツズマブ調製物０８２０１３ｐｈｅ１は、３２９ｍｇ（８１．４％）の総タンパク質回収率および９３ｍｇ（２８．３％）のＦｃ断片回収率をもたらした。ハーセプチン／トラスツズマブ調製物０８２１１３ｐｈｅ１は、３３２ｍｇ（８２．２％）の総タンパク質回収率および９６ｍｇ（２８．９％）のＦｃ断片回収率をもたらした。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
０．４Ｍ硫酸ナトリウムでの溶出物（Ｆｃ断片を含有する）を収集し、濃縮し、次いで、ＸＫ２６／９５  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを使用し、ゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製した（図５Ａおよび図７）。カラムは、２０ｍＭリン酸  ｐＨ７．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用し、イソクラティック溶離により溶出した。ＨＩＣトレースのピークのそれぞれから収集したサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってさらに分析した（図５Ｂおよび８）。表３は、ゲルろ過クロマトグラフィーからの示されるピークにおけるＦｃ断片の収率を要約する。ハーセプチン／トラスツズマブ調製物０８２６１３ｓ２００ａは、１０５ｍｇ（９２．９％）の総タンパク質回収率および８８ｍｇ（８３．８％）のＦｃ断片回収率をもたらした。ハーセプチン／トラスツズマブ調製物０８２７１３ｓ２００ａは、１１１ｍｇ（９８．２％）の総タンパク質回収率および９５ｍｇ（８５．６％）のＦｃ断片回収率をもたらした。ハーセプチン／トラスツズマブ調製物０８２７１３ｓ２００ｂは、１１６ｍｇ（１０２．３％）の総タンパク質回収率および９８ｍｇ（８４．５％）のＦｃ断片回収率をもたらした。
【０１３０】
【表３】
2017520531.tif 000004
【０１３１】
Ｆｃ断片を含有するサンプルをプールし、最終Ｆｃプールを作った（図８、サンプル数５）。サンプルおよび最終プールの純度もまた、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって評価した（図９、図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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