(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（ＩＩ）：
0004156667.tif 000012
｛式中、以下の：
0004156667.tif 000013
がコバラミンであり、以下の：
0004156667.tif 000014
がコバラミンアミド基のカルボニル残基であり；
Ｘが、シアノ、ヒドロキシ、メチル又はアデノシルであり；
Ｙが結合基であり；そして
Ｄｅｔがキレート化基及び検出可能な金属を含み；ここで前記カルボニル残基が、コバラミンの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導される。｝で表される化合物又は医薬として許容されるその塩。
【請求項２】
前記カルボニル残基がコバラミンの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導されており、そして構造式（ＩＩ）の化合物であってそのカルボニル基が（ｂ）−プロピオンアミド以外のカルボニルアミドから誘導されているものが実質的に存在しない状態で存在する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式中、Ｙが、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）2-6ＮＨ2の残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式中、Ｙがω−アミノアルカン酸又はアルカンジアミンの残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式中、Ｙが−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）4ＮＨ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記キレート化基が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）；１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（１５Ｎ４）；１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（９Ｎ３）；１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（１２Ｎ３）；２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；６−ブロモアセタミド−ベンジル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＢＡＴ）又は以下の式：
0004156667.tif 000015
｛式中、Ｒ3は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル又はＣＨ2ＣＯ2−でありうる。｝のシクロヘキサンベースの金属キレート化剤（ＤＣＴＡ）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記キレート化基がＤＴＰＡである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記検出可能な金属が放射性核種である、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記検出可能な金属が常磁性金属イオンである、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記検出可能な金属が、アンチモン−１２４、アンチモン−１２５、ヒ素−７４、バリウム−１０３、バリウム−１４０、ベリリウム−７、ビスマス−２０６、ビスマス−２０７、カドミウム−１０９、カドミウム−１１５ｍ、カルシウム−４５、セリウム−１３９、セリウム−１４１、セリウム−１４４、セシウム−１３７、クロミウム−５１、コバルト−５５、コバルト−５６、コバルト−５７、コバルト−５８、コバルト−６０、コバルト−６４、エルビウム−１６９、ユーロピウム−１５２、ガドリニウム−１５３、金−１９５、金−１９９、ハフニウム−１７５、ハフニウム−１７５−１８１、インジウム−１１１、イリジウム−１９２、鉄−５５、鉄−５９、クリプトン−８５、鉛−２１０、マンガン−５４、水銀−１９７、水銀−２０３、モリブデン−９９、ネオジミウム−１４７、ネプツニウム−２３７、ニッケル−６３、ニオブ−９５、オスミウム−１８５＋１９１、パラジウム−１０３、白金−１９５ｍ、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４７、プロタクチニウム−２３３、ラジウム−２２６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、ルビジウム−８６、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０６、スカンジウム−４４、スカンジウム−４６、セレン−７５、銀−１１０ｍ、銀−１１１、ナトリウム−２２、ストロンチウム−８５、ストロンチウム−８９、ストロンチウム−９０、硫黄−３５、タンタル−１８２、テクネチウム−９９ｍ、テルル−１２５、テルル−１３２、タリウム−２０４、トリウム−２２８、トリウム−２３２、タリウム−１７０、錫−１３３、チタン−４４、タングステン−１８５、バナジウム−４８、バナジウム−４９、イッテルビウム−１６９、イットリウム−８８、イットリウム−９０、イットリウム−９１、亜鉛−６５及びジルコニウム−９５の内から選択される放射性核種である、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記検出可能な金属がインジウム−１１１である、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記検出可能な金属がイットリウム−９０である、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
式中、Ｘがアデノシルであり、カルボニル残基がコバミランの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導され、Ｙが−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）4ＮＨ−であり、そしてＤｅｔがインジウム−１１１でキレート化されたＤＴＰＡである、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
式中、Ｘがアデノシルであり、カルボニル残基がコバミランの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導され、Ｙが−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）4ＮＨ−であり、そしてＤｅｔがイットリウム−９０でキレート化されたＤＴＰＡである、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
式中、Ｘがアデノシルであり、カルボニル残基がコバミランの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導され、Ｙが−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）4ＮＨ−であり、そしてＤｅｔがインジウム−１１１でキレート化されたＤＴＰＡであり、そして構造式（ＩＩ）の化合物であってそのカルボニル基が（ｂ）−プロピオンアミド以外のカルボニルアミドから誘導されているものが実質的に存在しない状態で存在する、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
式中、Ｘがアデノシルであり、カルボニル残基がコバミランの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導され、Ｙが−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）4ＮＨ−であり、そしてＤｅｔがイットリウム−９０でキレート化されたＤＴＰＡであり、そして構造式（ＩＩ）の化合物であってそのカルボニル基が（ｂ）−プロピオンアミド以外のカルボニルアミドから誘導されているものが実質的に存在しない状態で存在する、構造式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
非経口投与用に処方された、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
静脈内投与用に処方された、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
腹腔内投与用に処方された、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
経口投与用に処方された、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
哺乳動物における腫瘍のイメージング又は治療用医薬組成物であって、有効量の以下の式（ＩＩ）：
0004156667.tif 000016
｛式中、以下の：
0004156667.tif 000017
がコバラミンであり、以下の：
0004156667.tif 000018
がコバラミンアミド基のカルボニル残基であり；
Ｘが、シアノ、ヒドロキシ、メチル又はアデノシルであり；
Ｙが結合基であり；そして
Ｄｅｔが、放射性核種又は常磁性金属イオンを含む検出可能なキレート化基であり、かつ、前記カルボニル残基が、コバラミンの（ｂ）−プロピオンアミド基から誘導される。｝で表される化合物又は医薬として許容されるその塩を含み、ここで前記式（ＩＩ）の化合物が哺乳動物の腫瘍中に場合により検出される前記医薬組成物。
【請求項２２】
前記放射性核種が金属放射性核種である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記金属放射性核種が、テクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１、又はガドリニウム−１５３である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
式中、以下の：
0004156667.tif 000019
が（ｂ）−モノカルボン酸の残基である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
Ｙが、−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）2-6Ｎ（Ｈ）−の２価のモノマー、ダイマー又はトリマーである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
Ｙが−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ2）4ＮＨ−である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
Ｄｅｔが、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、又はＤＣＴＡである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Ｄｅｔが、ＤＴＰＡを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
医薬として許容される媒体とともに請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の検出可能な量を含み、ここで、当該化合物の存在が、前記哺乳動物の腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、又は腸内で検出される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
非経口で投与される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
静脈内に投与される、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
腹腔内に投与される、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
経口で投与される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
非経口で投与される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
経口で投与される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記媒体が水性媒体である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記腫瘍が、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、又は胃腸の腫瘍である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記金属放射性核種が、アンチモン−１２４、アンチモン−１２５、ヒ素−７４、バリウム−１０３、バリウム−１４０、ベリリウム−７、ビスマス−２０６、ビスマス−２０７、カドミウム−１０９、カドミウム−１１５ｍ、カルシウム−４５、セリウム−１３９、セリウム−１４１、セリウム−１４４、セシウム−１３７、クロミウム−５１、コバルト−５５、コバルト−５６、コバルト−５７、コバルト−５８、コバルト−６０、コバルト−６４、エルビウム−１６９、ユーロピウム−１５２、ガドリニウム−１５３、金−１９５、金−１９９、ハフニウム−１７５、ハフニウム−１７５−１８１、インジウム−１１１、イリジウム−１９２、鉄−５５、鉄−５９、クリプトン−８５、鉛−２１０、マンガン−５４、水銀−１９７、水銀−２０３、モリブデン−９９、ネオジミウム−１４７、ネプツニウム−２３７、ニッケル−６３、ニオブ−９５、オスミウム−１８５＋１９１、パラジウム−１０３、白金−１９５ｍ、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４７、プロタクチニウム−２３３、ラジウム−２２６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、ルビジウム−８６、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０６、スカンジウム−４４、スカンジウム−４６、セレン−７５、銀−１１０ｍ、銀−１１１、ナトリウム−２２、ストロンチウム−８５、ストロンチウム−８９、ストロンチウム−９０、硫黄−３５、タンタル−１８２、テクネチウム−９９ｍ、テルル−１２５、テルル−１３２、タリウム−２０４、トリウム−２２８、トリウム−２３２、タリウム−１７０、錫−１３３、チタン−４４、タングステン−１８５、バナジウム−４８、バナジウム−４９、イッテルビウム−１６９、イットリウム−８８、イットリウム−９０、イットリウム−９１、亜鉛−６５及びジルコニウム−９５から成る群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
Ｄｅｔが、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＤＣＴＡ、１５Ｎ４、１２Ｎ３、２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸、及びＢＡＴから成る群から選ばれるキレート化基を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1948年のシアノコバラミンとしてのビタミンＢ12の単離後数年間、シアノコバラミン及びおそらくその光分解産物であるヒドロキシコバラミンはヒトの中にあると仮定されていた。その後、シアノコバラミンはビタミンＢ12の単離の人工物であること、並びにヒドロキシコバラミン及びその２つの補酵素形態、メチルコバラミン及びアデノシルコバラミンがビタミンの天然の形態であることが認められた。
これらの種々の形態の構造を図１に示す。ここでＸは各々、CN，OH，CH3又はアデノシルである。以後、コバラミンという用語は、Ｘ基を除く分子の全てをいうのに用いられよう。コバルト（Co）又は側鎖のない基本環システムは、コリン（corrin）と呼ばれ、オクタデヒドロコリンはコロール（corrole）と呼ばれる。CN及びヌクレオチドのない全てのアミド基の加水分解から生ずるCo−contgヘプタカルボン酸はコビリニン酸（cobyrinic acid）と呼ばれる。Ｄ−１−アミノ−２−プロパノール側鎖ｆを有する対応するヘキサカルボン酸はコビニン酸（cobinic acid）と呼ばれ、アミノプロパノールの２−位に結合したα−Ｄ−リボフラノース−３−リン酸を有するヘキサカルボン酸はコバミン酸（cobamic acid）と呼ばれる。これにより、コバミド（cobamide）はコバミン酸のヘキサアミドであり、コビリン酸（cobyric acid）はコビリニン酸のヘキサアミドであり、そしてコビナミド（cobinamide）はコビニン酸のヘキサアミドである。図１は、The Merck tndex, Merck & Co.（11th ed. 1989）（ここで、Ｘはコリン環により規定される平面の上であり、そしてヌクレオチドはその環の平面の下である）から適合させたコリン環は、各々ａ〜ｅ及びｇで示され得る２，３，７，８，13、及び18位における結合した６つのアミドアルキル（H2NC（O）Alk）置換基を有する。D.L−Antonら、J. Amer. Chem. Soc., 102, 2215（1980）を参照のこと。図１に示される分子は以下：
0004156667.tif 000002
（式中、例えばＸはCN，OH，CH3、又はアデノシルである）に示すように略記することができる。
メチルコバラミンは、ホモシステインからのメチオニンの形成を触媒する5Ｎ−メチルテトラヒドロ葉酸：ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（メチオニンシンセターゼ、EC 2.1.1.13）のための細胞質補酵素として機能する。アデノシルコバラミンは、メチルコロニルCoA及びスクシニルCoAを転換するメチルマロニルCoAムターゼ（EC 5.4.99.2）のためのミトコンドリア補酵素である。
ビタミンＢ12の全ての形態（アデノシル−、シアノ−、ヒドロキソ−、又はメチルコバラミン）が、生物学的に活性であるために輸送タンパク質、内因性因子及びトランスコバラミンIIにより結合されなければならない。特に、ビタミンＢ12の胃腸吸収は内因性因子−ビタミンＢ12複合体が末端の回腸において内因性因子レセプターにより結合されることに依存する。同様に、体全体を通しての脈管内輸送及び次のビタミンＢ12の細胞の取込みは、各々トランスコバラミンII及び細胞膜トランスコバラミンIIレセプターに依存する。トランスコバラミンII−ビタミンＢ12複合体がインターナライズされた後、その輸送タンパク質はリゾチーム分解を行い、細胞質にビタミンＢ12を遊離する。次にビタミンＢ12の全ての形態は、細胞の要求に応じてアデノシル−、ヒドロキソ−、又はメチルコバラミンに転換される。例えば、A. E. Finklerら、Arch. Biochem. Biophys., 120, 79（1967）；C. Hallら、J. Cell Physiol., 133, 187（1987）；M. E. Rappazzoら、J. Clin. Invest., 51. 1915（1972）及びR. Sodaら、Blood, 65, 795（1985）を参照のこと。
迅速な増殖を行う細胞はチミジン及びメチオニンの取込みが増加していることが示されている（例えばM. E. Van Eijkerenら、Acta Oncologica, 31, 539（1992）；K. Kobotaら、J. Nucl. Med., 32；2188（1991）及びK. Higashiら、J. Nucl. Med., 34, 773（1993）を参照のこと）。メチルコバラミンはメチオニン合成に直接関連し、そしてチミジル酸及びDNAの合成に間接的に関連するので、メチルコバラミン及びコバルト−57−シアノコバラミンが迅速に分割する組織内の取り込みの増加を有することが示されたことは驚くべきことではない（例えばB. A. Cooperら、Nature, 191, 393（1961）；H. Flodh, Acta Radiol. Suppl., 284, 55（1968）；L. Blomquistら、Experjentia, 25, 294（1969））。更に、トランスコバラミンIIレセプターの数の上昇制御が、いくつかの悪性細胞においてそれらの加速されたチミジン組込み及びDNA合成の間において証明されている（J. Lindemansら、Exp. Cell. Res., 184, 449（1989）；T. Amagasakiら、Blood, 26, 138（1990）及びJ. A. Beglyら、J. Cell. Physiol. 156, 43（1993）を参照のこと）。
ビタミンＢ12は、それを潜在的に、魅力のある生体内腫瘍像形成剤によるいくつかの特徴を有する。ビタミンＢ12は水溶性であり、知られている毒性はなく、そして過度に、糸球体ろ過により排泄される。更に、ビタミンＢ12の取込みは、酸化窒素及び他の薬理剤の投与によって潜在的に操作することができている（D. Suansonら、Pharmaceuticals in Medical Tmaging, Mac Millan Pub. Co., NY（1990）、ページ621-628）。
バクテリアは、コバルト−59をビタミンＢ12のコリン環に自然に挿入する。商業的に、これは、Co−56，Co−57，Co−58、及びCo−60放射能標識ビタミンＢ12の発酵による生産によって開発されている。例えば、Chaietら、Science, 111, 601（1950）。不幸なことに、半減期270.9日のコバルト−57は、臨床での腫瘍イメージングに適さないCo−57−シアノコバラミンを作る。他の金属イオン（コバルト、銅及び亜鉛）はクロマチウム（Chromatium）及びストレプトマイセス・オリバセオウス（Streptomyces olivaceous）により生産された天然のデスコバルトコリノイドに化学的に挿入されている。他の金属イオンをこれらのコバルトのないコリノイド環に化学的に挿入する試みは成功していない。金属（コバルト、ニッケル、パラジウム、白金、ロジウム、亜鉛、及びリチウム）の合成コリン環への配置はいずれの大きな困難も供さない。しかしながら、それらの不安定性及び製造するためのコストは生物学的アッセイについてそれらを実施不能にする。Co−59は２+酸化状態において弱い常磁性の四極の核であるが、Co−59は、ビタミンＢ12のコリン環内で３+酸化状態で存在し、反磁性である。それゆえ、コバルト以外の放射能又は常磁性金属イオンのいずれかのコリン環への挿入はこの場合、実行できないようである。
125Ｉ−ビタミンＢ12誘導体を調製するための方法はNiswenderら（米国特許第3,981,863号）に記載される。この方法において、ビタミンＢ12はモノカルボン酸の混合物を形成するためにマイルドな加水分解にかけられ、それはHouts、前掲が大部分（ｅ）−異性体を含むと開示している。次にその混合物は、（遊離カルボン酸基の１つとの反応により）Ｂ12酸にフェノール基を導入するためにｐ（アミノアルキル）フェノールと反応させられる。次にその混合した置換基Ｂ12誘導体はフェノール基置換においてヨウ素化される。この米国特許は、そのように作られた125Ｉ−Ｂ12誘導体混合物が、その混合物に対して生じた抗体を用いるＢ12のラジオイムノアッセイにおいて役立つことを教授する。
T. M. Houts（米国特許第4,465,775号）は、Niswenderらの放射能標識混合物の構成物はIFと等しいアフィニティーで結合しなかったことを報告した。Houtsは、純粋なモノカルボン酸（ｄ）−異性体がIFが用いられるＢ12のアッセイにおいて役立つことを開示した。しかしながら、Houtsは全般的に、モノカルボン酸（ｄ）−異性体はフルオロホア又は酵素で標識することができそして流体中でビタミンＢ12についての競合セフセイに用いることができることを開示するが、腫瘍及び器官イメージング及び療法に適した標識ビタミンＢ12誘導体のための絶え間ない必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、一般式（Ｉ）：
0004156667.tif 000003
（式中、成分
0004156667.tif 000004
はコバラミンであり、ＸはCN，OH、メチル又はアデノシルであり、
0004156667.tif 000005
は、コリンプロピオナミド基由来のコバラシンのモノカルボン酸であり、好ましくは本質的に純粋な（ｂ）−，（ｄ）−、又は（ｅ）−モノカルボン酸であり；Ｙはリンキング基であり、そしてDetは放射性核腫又は常磁性金属イオンのような検出可能な金属を含むキレート基である）の検出可能な化合物を提供する。好ましくは、リンキング基は−N（H）（CH2）2-6NH−である。
例えば、Detがジエチレントリアミンペンタ酢酸基（DTPA）である（ｂ）−モノカルボン酸由来の式（Ｉ）の化合物は、Tc−99ｍ，In-111及びGd-153を含むもので調製された。これらの化合物は哺乳動物腹腔膜及び胃腸管を通って直ちに吸収され、肝臓、腎臓、脾臓、及び膵臓内に局在化する。それゆえ、本化合物は、式（Ｉ）の化合物を哺乳動物に投与し、比較のための通常の対照値を用いて標的器官内のその存在を検出することにより、ヒト及び実験動物のような哺乳動物において肝臓の、脾臓の、腎臓の、膵臓の、及び小腸の機能を評価するのに用いることができる。
特定の腫瘍性組織は、周囲のよりゆっくり分割する組織より大量にビタミンを蓄積するビタミンＢ12のたまり場として機能することが見い出されている。それゆえ、本化合物は、その化合物が腫瘍内に局在化するように腫瘍を患う哺乳動物に式（Ｉ）の化合物を投与し、そして任意的に、腫瘍、特に上述の器官の腫瘍内の化合物の存在を検出することにより、腫瘍イメージング及び／又は標的癌治療に用いることもできる。
式（Ｉ）の化合物の調製に役立つ中間体も本発明の態様であり、Detが有機キレート基であるChel、又は放射性核種又はラジオマイソトープをキレート化することができるキレーターにより置換されている化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＸがCN（シアノ）、OH，CH3又はアデノシルであるビタミンＢ12の構造を示す。
図２は、コバラミン金属イオンDTPA複合体を概略的に示す。
発明の詳細な記載
式Ｉの化合物は、メガシアノ−、メチル、アデノシル等であるＸ−（コバラミン）のモノカルボン酸を製造することによって調製することができる。これらの化合物は、モノ−、ジカルボン酸及び１つのトリカルボン酸の混合物を生成することが示されているシアノコバラミンの弱酸加水分解によって調製することができる。これらのカルボン酸はアセトアミド側鎖ａ，ｃ及びｇ上のアミド基より加水分解により感受性がある先に議論されるようなｂ，ｄ及びｅで示されるプロピオナミド側鎖由来である。（ｂ）−，（ｄ）−、及び（ｅ）−モノカルボン酸は、カラムクロマトグラフィーによって分離することができる。本明細書の図１、及びD. L. Antonら、J. Amer. Chem. Soc., 102, 2215（1980）の図１を参照のこと。J. B. Armitageら、J. Chem. Soc., 3349（1953）；K. Bernhauer, Biochem. Z., 344, 289（1966）；H. P. C. Hogenkampら、Biochemistry, 14, 3707（1975）；及びL. Ellenbogen, in“Cobalamin,”Biochem. and Pathophysiol., B. Babior, ed., Wiley, N. Y.（1975）at chapter 5も参照のこと。
Ｘ−（コバラミン）（CO2H）は、好ましくは二価の又は“二重官能性”の有機リンキング基であるリンキング基により金属キレーターに結合することができる。このようなリンキング基は２つの反応性基、即ち、CO2H基に結合するもの及び金属キレーターに結合する他方のものを含む。当該技術で周知である種々のホモ二重官能性及びヘテロ二重官能性リンキング試薬が本発明に役立つ。好ましいリンカーは、１又は２のアミノ又はヒドロキシ基、例えばω−アミノアルカノール酸、例えばε−アミノカプロン酸（H2N-（CH2）5-COOH）、又は１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン及び１，６−ジアミノヘキサンを含むアルカンジアミン等を含む。アミノアルカノール酸及び類似する化合物の中で特に好ましいのは、水性緩衝液中で可溶性でるあものである。
Detは、金属ラジオアイソトープのような放射性核種を含むキレート基である。これらのキレート化合物“キレーター”又は（chel）中で好ましいのは、EDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸），DTPA，DCTA，DOTA，TETAのようなポリカルボン酸又はそれらのアナログもしくは同族体である。
DTPAは、遊離アミノ基を含むリンカーとのジエチレントリアミンペンタ酢酸二無水物（Aldrich Chem, Co．）の反応によりコバラミンカルボン酸に結合することができる。これは、２−（アミノメチル）−１，１，７，７−ジエチレントリアミンテトラ酢酸であるChel基を生成する。このキレーターは放射性核種と反応して一般式：
0004156667.tif 000006
（式中、Ｍは放射性核種である）のDet成分を生成する。コバラミン金属イオンDTPA複合体（４）への合成経路は図２に概略的に示される。ここでwsc＝水溶性カルボジイミドである。
キレーター（chel）DCTAは一般式：
0004156667.tif 000007
を有する。
DCTAは、Ｒ3が（Ｃ1−Ｃ4）アルキル又はCH2CO2-であり得、位置４もしくは５を通して又は基Ｒ3を通してＹに結合し得、そして１〜４の検出可能な金属もしくは非金属陽イオン（Ｍ）、一価陽イオン、又はアルカリ土類金属を有し得るシクロヘキサンベースの金属キレーターである。これにより、酸化状態＋１の金属では、各々の個々のシクロヘキサンベースの分子は、（両方のＲ3基がCH2COOMである場合の）４までの金属陽イオンであり得る。より適切なのは、より高い酸化状態で、金属の数はシクロヘキサン骨格当り２又は１にさえ少なくなるであろう。この式は、その分子をいずれの特定の立体化学にも限定することを意図しない。特に、両方のアミノ官能基は互いにcis又はtransであり得る。
ビスアミノリンキング基を通してコバラミンカルボン酸に結合することができる他の巨環カルボン酸キレーターは、TETA  １，４，８，11−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸；１，４，７，10−テトラマザシクロデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（DOTA）；１，４，８，12−テトラアザシクロペンタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（15N4）；１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（9N3）；及び１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（12N3）を含む。そのリガンドの産業骨格に結合した活性化されたアームを通してコンジュゲーションが行われる巨環リガンドに基づく二重官能性キレーターは、M. Moiら、J. Amer. Chem., Soc., 49, 2639（1989）（２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）；S. V. Deshpandeら、J. Nucl. Med., 31, 473（1990）；G. Ruserら、Bioconj. Chem., 1, 345（1990）；C. J. Broanら、J. C. S. Chem. Comm., 23, 1739（1990）；及びC. J. Andersonら、J. Nucl. Med., 36, 850（1995）（６−ブロモアセトアミド−ベンジル−１，４，８，11−テトラアザシクロテタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（BAT））に記載される。
生体内又は試験管内の診断手順において検出され得る金属をDet成分におけるＭとして用いることができる。特に、ヒトもしくは動物の体において、又は試験管内診断アッセイにおいて診断結果を作り出すことができるいずれかの放射性金属イオンを本発明の実施に用いることができる。適切なイオンは、次のもの：アンチモン−124、アンチモン−125、ヒ素−74、バリウム−103、バリウム−140、ベリリウム−７、ビスマス−206、ビスマス−207、カドミウム−109、カドミウム−115ｍ、カルシウム−45、セリウム−139、セリウム−141、セリウム−144、セシウム−137、クロム−51、コバルト−56、コバルト−57、コバルト−58、コバルト−60、コバルト−64、エルビウム−169、ユウロピウム−152、ガドリニウム−153、金−195、金−199、ハフニウム−175、ハフニウム−175-181、インジウム−111、イリジウム−192、鉄−55、鉄−59、クリプトン−85、鉛−210、マンガン−54、水銀−197、水銀−203、モリブデン−99、ネオジム−147、ネプツニウム−237、ニッケル−63、ニオブ−95、オスミウム−185＋191、パラジウム−103、白金−195ｍ、プラセオジム−143、プロメチウム−147、プロトアクチニウム−233、ラジウム−226、レニウム−186、ルビジウム−86、ルテニウム−103、ルテニウム−106、スカンジウム−44、スカンジウム−46、セレニウム−75、銀−110ｍ、銀−111、ナトリウム−22、ストロンチウム−85、ストロンチウム−89、ストロンチウム−90、硫黄−35、タンタル−182、テクネチウム−99ｍ、テルル−125、テルル−132、タリウム−204、トリウム−228、トリウム−232、タリウム−170、スズ−113、チタン−44、タングステン−185、バナジウム−48、バナジウム−49、イッテルビウム−169、イットリウム−88、イットリウム−90、イットリウム−91、亜鉛−65、及びジルコニウム−95を含む。
式（Ｉ）の化合物は好ましくは、生理食塩水又は同様の水性ビヒクルのような非毒性液体ビヒクルに、要求される濃度まで溶解させ又は分散させられる。次に、所定の分析、診断又は治療単位投与量が、経口投与もしくは食物摂取により又は静脈内又は腹腔内注入又は注射としての非経口投与により、要求される生体内濃度を得るために、テスト動物又はヒト患者に投与される。ヒト器官又は腫瘍をイメージングし又は治療するのに役立つ投与量は、ヒトの生体内で又は以下に記載されるような動物モデルにおいて器官をイメージし又は治療するのに有効であることが見い出されているものから、又は動物治療もしくはイメージングに以前に用いられる他の標識ビタミンＢ12分子の投与から得ることができる。
本発明は、以下の詳細な例を引用して更に記載されよう。ここでシアノコバラミン及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドはSigma Chem. Co., St. Louis. Moから購入した。アデノシン、１，４−ジアミノブタンジヒドロクロライド、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DPTA）、ヘキサメチルホスホルアミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、イオドメタン及びチオニルクロライドはAldrich Chem. Co., Milwaukee, WIから購入した。薄層クロマトグラフィー（TLC）シリカゲル及びPET−セルロースシートはE. M. Science, Gibbstown, NJから購入した。Tc99m及びIn111はMallihckrodt Medical, Incから得て、そしてGd153はAmershamから得た。他の無機塩及び溶媒は利用できる最も高純度で得た。
UV−可視スペクトルはHeulett-Packardダイオードアレイスベクトロホトメーターで記録した。DTPA二無水物及び５′−クロロ−５′−デオキシアデノシンは各々にC. EckelmanらJ. Pharm. Sci., 64, 704（1975）及びK. Kikuganaら、Tetrahedron Lett., 87（1971）により記載されるように合成した。シアノコバラミンのモノカルボン酸、メチルコバラミン−ｂ−カルボン酸及びアデノシルコバラミン−ｂ−カルボン酸は、H. P. C. Hogenkamp, Biochemistry, 13, 2736（1974）；D. L. Antonら、J. Amer, Chem. Soc., 102, 2215（1980）；R. H. Yamadaら、J. Biol. Chem., 247, 6266（1972）及びD. Dolphini Methods in Erzymolozy, XVille, 34-52（1971）に記載されるように調製し、単離した。メチルコバラミン、アデノシルコバラミン及びそれらの誘導体は特に溶液中で光感受性であり、全ての反応及び操作は暗室内又はかすかな光下で行った。
生体内研究のための全ての像は、テリネチウムの140kevエネルギーピークについて20％窓のLEAPコリメーター、並びにインジウムの174kev及び247kevエネルギーピークについて20％窓の中位エネルギーコリメーターを用いて、GE500マキシカメラで得た。そのデータを分析するために、専用ピニクル（pinnacte）コンピューターシステムでの256×256マトリックスを用いた。
実施例１．シアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド
100mlの水中にシアノコバラミン−ｂ−カルボン酸（1.0ｇ, 0.6mmol）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.81ｇ, ６mmol）及び１，４−ジアミノブタンジヒドロクロライド（4.8ｇ, 30mmol）を含む混合物をpH7.8に調節した。次に１−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1.20ｇ, 6.6mmol）を加え、そのpHを6.4に調節し、そしてその反応を室温で24時間、撹拌した。ｎ−ブタノール−酢酸水（５：２：３）を用いるシリカゲルでのTLCは、その反応が完了したことを示した。シアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミドを92％フェノール水溶液に抽出し、そのフェノール層を等量の水で数回、洗った。そのフェノール抽出液に３容量のジエチルエーテル及び１容量のアセトンを加えた。その有機相から水で数回抽出することにより所望のコバラミンを除去した。その組み合わせた水性層をジエチルエーテルで数回抽出して残存フェノールを除去し、真空で約20mlに濃縮し、アセトン水溶液から結晶化した。収量955mg, 92％。
実施例２．シアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミドDTPA．
シアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド（500ｇ, 0.3mmol）を30mlの飽和重炭酸ナトリウムに溶かし、固体DTPA二無水物（1.2ｇ, 3.4mmol）で処理した。その反応の進行を溶媒としてｎ−ブタノール−酢酸−水（５：２；３）を用いてPEIプレートでのTLCによりモニターした。室温での30分のインキュベーションの後、２回目のその二無水物1.2ｇを加えた。pHを8.2に調製しながら二無水物を２回添加した後、その反応混合物を一晩インキュベートした。次にシアノコバラミン−DPTAアダクトを92％フェノール水溶液に抽出し、上述のように精製した。その調製物を真空下で乾燥するまでエパポレートし、ガラスとして単離した。収率460mg, 77％。そのシアノコバラミン−DTPAアダクトは0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pH7.1中でペーパー電気泳動においてポリアニオンとして挙動した。
実施例３．メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド。
メチルコバラミン−ｂ−カルボン酸（1.0ｇ, 0.6mmol）をシアノ誘導体について上述されるようにジアミノブタンジヒドロクロライドと反応させた。そのコバラミンをフェノールを通しての抽出により精製し（上記参照）。その結果生じた水溶液を真空下で濃縮した。この溶液をアセテート形態におけるAG1-X2 200-400メッシュ（20×2.5cm）でクロマトグラフィーを行い、その通過したものを収集した。その通過物を約20mlに濃縮し、そのアセトン水溶液から所望のコバラミンを結晶化した。収率920mg, 88％。非反応メチルコバラミン−ｂ−カルボン酸を１Ｍ酢酸で溶出し、濃縮してアセトン水溶液から結晶化した。収率60mg, ６％。
実施例４．メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミドDTPA
メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド（500mg, 0.3mmol）を30mlの飽和重炭酸ナトリウムに溶かし、上述のように固体DTPA二無水物と反応させた。そのメチルコバラミン−DTPAアダクトを、フェノールを通しての抽出により精製し、真空下で乾燥するまでエバポレートし、ガラスとして単離した。収率600mg, 96％。
実施例５．アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド。
ｂ−カルボン酸（500mg, 0.3mmol）を上述のようにジアミノブタンジヒドロクロライド（2.4mg, 15mmol）と反応させた。コバラミンをフェノールを通しての抽出により精製した（上記参照）。結果として生ずる水溶液を真空下で濃縮し、水素形態におけるAG-50 X2, 200-400メッシュ（20×25cm）に適用した。そのカラムを水で全体的に洗ってヒドロキシベンゾトリアゾールを除去し、所望のコバラミンを１Ｍ水酸化アンモニウムで溶出した。フェノールでの更なる抽出の後、アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミドをガラスとして単離した。収率366mg, 77％。
実施例６．アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミドDTPA
アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド（366mg, 0.23mmol）を30mlの飽和重炭酸ナトリウムに溶かし、上述のように固体DTPA二無水物（1.0g, 2.8mmol）で処理した。コバラミンをフェノールにより精製した（上記参照）。その結果生じた水溶液を濃縮し、水素形態におけるAG-50 X2, 200-400メッシュ（6.0×2.5cm）に適用し、そのカラムを水で洗い、所望のコバラミンを0.1Ｍ水酸化アンモニウムで溶出した。その溶液を真空下で乾燥するまでエバポレートして、アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミドDTPAをガラスとして単離した。収率400mg, 80％。
実施例７．内因性因子及びトランスコバラミンタンパク質との相互作用
かすかな光下で、1000μｇの非標識メチル−、アデノシル−、及びシアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA、並びに1000μｇのシアノコバラミン及びDTPA（Sigma, St. Louis, MO 63178）を室温で10mlの通常の塩類溶液に別個に溶かした５つの1000μｇ／10mlサンプル各々を光への露出を防ぐために密封したアルミニウムで覆った10mlバイアル内に保存した。その溶液に緩衝液は加えなかった。Beckman 40 pHメーター（Beckman tnstruments, Fullerton, CA）により測定した溶液のpHは、シアノコバラミン＝5.75, DTPA＝3.78であり；シアノ、メチル及びアデノシルコバラミン−DTPAアナログは各々5.75, 6.10及び6.19であった。
内因性因子（IF）及びトランスコバラミン（TC）への試験管内結合を評価するために、Mayo Clinicで悪性貧血と診断された５人の患者から無作為に得た血清で、内因性因子ブロッキング抗体（IFBA）及び不飽和ビタミンＢ12結合能力（UBBC）アッセイを行った。IFBA及びUBBCアッセイは、最初、臨床目的のためにV. F. Fairbanksら、Mayo Clin. Proc., 58, 203（1983）；Intrinsic Factor Blocking Antibody［57Co］Radioassay-Package insert, Diagnostic Products Corp；D. Grossowiczら、Proc. Exp. Biol., 109, 604（1962）及びC. Gottliebら、Blood, 25, 6（1965）に記載されるように行った。
次に、同じ５人の患者からの血清を改良したIFBA及びUBBCアッセイにかけた。特に、５つの先に記載される溶液１μｌを、精製したIF又は血清と共に、別個にインキュベートして全てのIF及びTC結合部位を潜在的に飽和させた。室温で20分、４℃で更に20分のインキュベーションの後、500μｌの保存（1000μｇ／ｌ）コバルト−57−シアノコバラミン（Mallinckrodt Medica）, Inc., St. Louis, MO 63134）溶液を加え、次にその通常にIFBA及びUBBCプロトコルに従った。全ての上清の活性をガンマカウンター（Micromedix 10/20, Huntsville, AL 35805）で４分間、計数した。その結果を表１に示す。
0004156667.tif 000008
0004156667.tif 000009
IFBAアッセイは、DTPAはIFに大きく結合しないが（陰性対照未満の値）、シアノコバラミン及びコバラミン−DTPAアナログは種々の程度に内因性因子への結合からCo-57-シアノコバラミンを競合的に阻害することを証明した。５つの溶液のカウントに分けた臨床的ランのカウントを用いることにより、内因性因子への結合の効能を評価することができる。IFに対する５つの溶液の平均結合割合は、シアノコバラミン＝92.5％；メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）-アミド-DTPA=63.2％；シアノマドラミン−ｂ−（４＿アミノブチル）アミド−DTPA＝52.9％；アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）−アミド−DTPA＝41.0％及びDTPAについて0.8％であった。これは、ビタミンＢ12の（ｂ）−モノカルボン酸及びその放射性ヨウ素化誘導体がIFに対して極めて低い結果を示すというHoutsの開示（米国特許第4,465,775号）と対照的である。
同様に、トランスコバラミンタンパク質への５つの溶液の平均結合割合は、シアノコバラミン＝100％、メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA＝94.0％、アデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA＝90.4％、シアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA＝66.4％及びDTPAについて3.6％であった。
これにより、DTPAのビタミンＢ12への結合は、その担持タンパク質への結合を変える。予想されるように、非標識シアノコバラミンはIF及びトランスコバラミンタンパク質について最も大きなアフィニティーを有した。メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAは次であり、次にアテツシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAであり、そして最後にシアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAであった。DTPAのその担体タンパク質へのいくつかの非特異的結合もあった（0.8％及び3.6％）。
実施例８．放射性核種のキレート化。
わずかな光の下で、1000μｇのメチル−、アデノシル−、及びシアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAを200μｌの通常の塩類溶液に別個に溶かした。次にそのコバラミン−DTPA溶液に500μCiのインジウム−111又は250μCiのガドリニウム−153を加えた。その反応は室温で部屋の大気下で行った。テクネチウムのキレート化のために、その溶かしたコバラミンDTPA複合体を別個に、密閉した２mlにバイアルに入れた。次に、200μｌの塩化スズ溶液（1000μｇ／mlの通常の塩類溶液）を各々のバイアルに加えた。そのバイアルを５分間、窒素ガスで一掃した。この後、そのN2で一掃したバイアルに１〜５μCiのテクネチウム−99ｍを加えた。全てのキレート化反応を５分間、静かに混合した。
1000μｇのシアノコバラミンの対照混合物を200μｌの通常の塩類溶液に溶かした。シアノコバラミンを室温で部屋の大気下で、及び200μｌの記載される塩化スズ溶液内でTc-99ｍと混合した。更に、コバラミン−DTPA複合体を、塩化スズの欠如下で部屋の空気下で開口した容器内でTc-99ｍ標識化した。
窒素で一掃した２mlバイアル内で、メチル及びアデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA（５μｇ／100μｌ通常の塩類溶液）の100μｌアリコートを50μｌの塩化スズ溶液（１μｇ／50μｌ通常の塩類溶液）と混合することにより評価した。そのバイアルに、10，25，50，75及び100μCiに活性を割り当てたテクネチウム−99ｍを加えた。テクネチウムを加えた後そのバイアルを静かに混合して５分間、連続的に窒素で一掃した。
キレート化及び特異活性の効能を薄層クロマトグラフィー（ICC）により評価した。薄層クロマトグラフィーストリップ（Grade 31 ET Chr−厚さ0.50mm、流速（水）225mm／30分、Whatman Lab Sales, Hilsboro, OR97123）を、かすかな光の下でアセトン中で展開した。その乾燥ストリップをオートラジオグラフィー（AR）のためのフィルム（EKtascan-MC1, Eastern Kodak, Rochester, NY 14650）上においた。クロマトグラフィー及びオートラジオグラフィーの結果を目で見て比較した。生体内投与前に、100％の標識化を確認するため、全ての放射能標識コバラミン−DTPA複合体をTLC及びARにかけた。
アセトン展開下において、遊離Tc-99ｍはクロマトグラフィーストリップの頂上に移動したが、In-111及びGd-153はそのストリップの下側３分の２にわたって拡散して広がった。TLC及びＡR分析は、Tc-99ｍ，In-111、及びGd-153との全ての３つのコバラミン−DTPA複合体の100％標識化があることを証明した。特に、全ての放射能は、コバラミンアナログのクロマトグラフィーでの分布を確認した。
メチル及びアデノシルコバラミンは、悪性組織においてより大きな取込みを潜在的に有するので、メチル及びアデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAによるTc-98ｍ，In-111、及びGd-153のキレート化はより精密に行った。クロマトグラフィー及びオートラジオグラフィー像は一貫して一致した。対照的に、非修飾シアノコバラミンは３つの放射性核種に結合することについていずれのアフィニティーも示さなかった。予想されるように、塩化スズの欠如下及び低酵素条件下でTc-99ｍとのコバラミン−DTPA複合体の最小の標識化があった。
５μｇ／100μｌの濃度において、コバラミン−DTPAアナログの赤色が水性状態においてわずかに認められ、TLCでは検出できない。しかしながら、そのAR分布は、より低い特異活性のより高濃度のコバラミンアナログ溶液と比べて同じである。メチル及びアデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAは、100％効能で５μｇ当り50μCiまでのテクネチウム−99ｍをキレート化することができる。これは、コバラミン−DTPAアナログについて10mgCi／μｇの特異活性を生ずる。
実施例９．生体内研究
Ａ．生体分布：100μｌの通常の塩類溶液当り３００μｇの濃度のメチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAを３μCiのインジウム−111で標識化した。その標識したビタミンＢ12アナログを通常の塩類溶液で最終容量1000μｌに希釈した。腹腔内注入（IP）により、５匹の12週を経た雌のBalb-（マウス（Harlan, Sprague, Dauley, Indianapolis, IN 46229）各々に200μｌ（500μCi）のメチルコバラミン−DTPA−111In複合体を与えた。比較のため、同じ濃度及びメチルコバラミン−DTPAアナログの活性を有するインジウム−111−DTPAをIPで３匹のマウスに注入した。全てのマウスをCO2吸入により24時間目に殺した。膵臓、脾臓、腎臓、及び心臓をそれらの全体を切除した。肝臓、肺、左大腱四頭筋、及び側腹部脂肪も収穫した。全ての組織サンプルを湿ったまま重量をはかり、2.0mlの通常の塩類溶液内に細かく切り刻み、ガンマウエルカウンター（Minaxi Autogamma 5000, Packard Instrument, Douners Grove, IL 60515）中で５分間、計数した。
Ｂ．胃腸吸収：メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）−DTPA及びDTPA単独を、３μCiのインジウム／300ng／100μｌ通常の塩類溶液を希釈しなかったことを除いて上述の通り標識した。３匹のマウスの２つのグループは、それらの口腔部に位置した数滴の111In-DTPA又はメルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）−DTPA−In-111のいずれかを有していた。そのマウスを24時間目に殺し、切除して、上述のように研究した。
２匹のマウスで改良したSchillingsテストを行った。特に、各々のマウスに皮下及び腹腔内投与により、1000μｇ充填量の非標識メルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAアナログを受容させた。24時間目に２〜３滴のインジウム標識メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA複合体を供した。経口投与の後、３つのグループのマウスからの尿及び便を収集した。トレーサーの消化後24時間目にそのマウスを殺し、その時点での像及び分布データを得た。
Ｃ．腫瘍イメージング：24時間目に、目で見て及びガンマウエルカウンティングの両方により、移植した肉腫内に大量のアデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA−In-111取込みがあった。
0004156667.tif 000010
0004156667.tif 000011
IP及びIV経路の間の注入の活性の星の差にかかり、腫瘍内の取込みの程度は腎臓の遅れて一貫して二次的であった。腫瘍は、肝臓、脾臓及び膵臓より２〜４倍大きい活性を有し、心臓、肺、脂肪、及び筋肉より４〜12倍大きい活性を有した。予想されるように、対照の左側腹部に局在化する活性は見られなかった。肝臓及び脾臓での通常の取込みが再び見られた。切除した塊の粗大な（gross）病理は脂肪に覆われた腫瘍を示した。微視的には、Ｅ＆Ｓ染色により、腫瘍は肉腫で一貫して青色に染色された細胞の固体の塊であった。壊死の領域は見い出されなかった。
DTPA−111Inは、移植された腫瘍内の取込みを証明したが、その濃度はアデノシルコバラミン−DTPA−111Inのそれの10〜20倍少なかった。
Ｄ．静脈内投与：メチル又はアデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAのいずれか１ミリグラムを上述のように５μCiの99mTcで標識した。いくつかのマウスを尾静脈注入後種々の間隔でCO2吸息により殺した。最初の通過した尿を収集し、TLC及びARにより分析した。
Ｅ．結果
１．生体内研究
（ａ）生体分布
24時間目におけるメチル及びアデノシルコバラミン−DTPAアナログの器官及び組織分布は投与の経験にかかわらず同様であった（表２）。腎臓が最初で、次に肝臓及び脾臓であった。通常、膵臓の後に肺、脂肪、心臓、及び筋肉であった。膵臓、心臓、肺、脂肪、及び筋肉の間の活性の差は、経口、皮下、及び静脈内投与の後あまり大きくなかった。しかしながら、腎臓から肝臓へ、肝臓から脾臓へ、及び脾臓から膵臓への間の取込みの比率は比較的一定であった。投与の経路（IV,IP,PO）は、これらの化合物によるTc-99ｍ又はIn-111のキレート化にいずれの明日を効果も有さなかった。
最も大量のDTPA−111In取込みは腎臓内であった。DTPAの分布は、特に腹腔内注入後に、コバラミンアナログと同様であった。それらの類似性にかかわらず、DTPA−111Inは、メチル及びアデノシルコバラミンアナログと比べた時、器官又は組織サンプル当り５〜12倍少ない活性を有した。
（ｂ）胃腸吸収
メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA−In−111は、経口投与後に胃腸管から吸収された。活性の大部分は延期イメージングにおいて腎臓、肝臓、及び脾臓に局在化した。非標識メチルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPAの経口及び腹腔内投与が“流されて”いないマウスにおいては、ガンマウエルカウンティングによりその尿において認識できる活性は検出されなかった。しかしながら、“改良したSchillingsテスト”を行ったマウスは、１時間目にそれらの尿に検出できる放射能を有した。これらの“流された”の24時間目におけるイメージングは、“流されていない”マウスと比較した時、体全体にかなり少ない活性を示した。糞の放射能は、放射性コバラミンアナログを経口的に受容した両方のグループにおいて２時間目に検出することができた。
DTPA−111Inは、胃腸管からも吸収されたが、より少ない程度であった。心臓、肺、筋肉、又は脂肪組織サンプルにおいては活性は検出されなかった。２時間目に尿及び糞において放射能が検出された。
（ｃ）静脈内投与
各々静脈内及び腹腔内注入の後約15及び45分に、排尿がおこった。静脈内又は腹腔内投与後に最初に通過した尿は常に放射性であった。収集した尿のTLC及びAR分析は、コバラミン−DTPA複合体からのTc-99ｍ又はIn-111の解離の証拠は示さなかった。尾静脈注入後５分及び４時間の像は、延期イメージにおいて肝臓及び脾臓活性により隠されるようになる腎臓内の集中した早期の取り込みを示した。
（ｄ）腫瘍イメージング
24時間目に、目で見て及びガンマウエルカウンティングの両方で、移植した肉腫内に大量のアデノシルコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド−DTPA−In−111取込みがあった（表２）。IP及びIV経路の間の注入した活性の星の差にかかわらず、腫瘍内の取込みの程度は一貫して腎臓の後で２次的であった。その腫瘍は、肝臓、脾臓、及び膵臓より２〜４倍大きい活性を有し、心臓、肺、脂肪、及び筋肉のそれより４〜12倍大きかった。予想されるように、対照マウスの左側腹部に局在化した活性は見られなかった。肝臓及び膵臓における通常の取込みが再び見られた。切除した塊の粗大病理は、脂肪に覆われた腫瘍を示した。微視的には、Ｈ＆Ｅ染色により、腫瘍は肉腫で一貫して青色に染色された細胞の固体の塊であった。壊死の領域はなかった。
DTPA−111Inは移植された腫瘍内の取込みを証明したが、その濃度はアデノシルコバラミン−DTPA−111Inのそれより10〜20倍小さかった。
本発明は、種々の特定の好ましい実施形態及び技術を引用して記載されている。しかしながら、本発明の範囲を維持しながら多くのバリエーション及び改良を行うことができることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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