(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリスミ酸を経由して生合成される二次代謝産物を生産する微生物であって、パラ位がアミノ基またはニトロ基により置換されていないベンゼン環骨格を有する二次代謝産物を生産する微生物の形質転換体であって、微生物に４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子、および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からなる生合成遺伝子が導入され、パラ位がアミノ基またはニトロ基により置換されたベンゼン環骨格を有する二次代謝産物を生産するように形質転換されたことを特徴とする、形質転換体。
【請求項２】
コリスミ酸を経由して生合成される二次代謝産物が、フェニルピルビン酸、ｐ-ヒドロキシフェニル乳酸、フェニルアラニン、チロシン、およびフェニル乳酸からなる群から選択される少なくとも一つのビルディングブロックから合成されることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
形質転換される生物が、ペプチドまたはデプシペプチドを二次代謝産物として生産する生物である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項４】
ペプチドまたはデプシペプチドが、フェニルアラニン、チロシン、およびフェニル乳酸からなる群から選択される少なくとも一つのビルディングブロックから合成されることを特徴とする、請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
形質転換される生物が、下記式の化合物：
【化１】
0004156235.tif 000039
を生産する微生物である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項６】
形質転換体から下記式の化合物：
【化２】
0004156235.tif 000040
が生産されることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項７】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子、および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からなる生合成遺伝子のうち少なくとも一つが、ストレプトマイセス属、ノカルジア属、またはコリネバクテリウム属由来の遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項８】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、もしくは付加から選択される１〜数個の改変を有する配列番号２に記載のアミノ配列であって、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１または７に記載の形質転換体。
【請求項９】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１のＤＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１、７、および８のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項１０】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、もしくは付加から選択される１〜数個の改変を有する配列番号４に記載のアミノ配列であって、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１または７に記載の形質転換体。
【請求項１１】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子が、配列番号３のＤＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１、７、および１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号６に記載のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、もしくは付加から選択される１〜数個の改変を有する配列番号６に記載のアミノ配列であって、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１または７に記載の形質転換体。
【請求項１３】
４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号５のＤＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１、７、および１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
生合成遺伝子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、もしくは付加から選択される１〜数個の改変を有する配列番号２に記載のアミノ配列であって、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；配列番号４に記載のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、もしくは付加から選択される１〜数個の改変を有する配列番号４に記載のアミノ配列であって、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および配列番号６に記載のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、もしくは付加から選択される１〜数個の改変を有する配列番号６に記載のアミノ配列であって、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１または７に記載の形質転換体。
【請求項１５】
生合成遺伝子が、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列、および配列番号５のＤＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１、７、および１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
微生物がMycelia steriliaである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項１７】
Mycelia steriliaがＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１の受託番号のもと生命工学工業技術研究所に寄託されたＰＦ１０２２菌株である、請求項１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５５の受託番号のもと生命工学工業技術研究所に寄託された５５−６５株である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、パラ位がアミノ基またはニトロ基により置換されたベンゼン環骨格を有する二次代謝産物を採取することを含んでなる、パラ位がアミノ基またはニトロ基により置換されたベンゼン環骨格を有する二次代謝産物の製造法。
【請求項２０】
請求項５、１６、１７、または１８に記載の形質転換体を培養し、下記式で表されるＰＦ１０２２物質誘導体を採取することを含んでなる、ＰＦ１０２２物質誘導体の製造法。
【化３】
0004156235.tif 000041
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、官能基により修飾された二次代謝産物を生産する形質転換体に関し、更に詳細には、ベンゼン環のパラ位が窒素原子を含む官能基で修飾された二次代謝産物を生産する形質転換体に関する。本発明はまた、コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する新規遺伝子にも関する。
関連技術の説明
生物は生物学的活性を有する多種、多様な二次代謝産物を生産するため、これらを医薬品、動物薬、農薬等へ利用しようとする研究が盛んに行われている。しかし、生物由来の二次代謝産物がそのまま実用化されるということは希であり、その生物学的活性を最適化するために様々な官能基で修飾されるのが一般的である。その中で、窒素原子を含む官能基、例えばニトロ基あるいはアミノ基による修飾は最も重要な修飾の一つである。
ある物質をニトロ基で修飾するには化学的手法が利用可能である。しかし、化学的手法を用いて、ベンゼン環のパラ位特異的にニトロ基を導入することは難しいため、その収率は非常に低い。さらに、ニトロ基で修飾しようとする物質が生物由来の二次代謝産物のように複雑な物質である場合、その中に含まれるベンゼン環のパラ位を特異的にニトロ基で修飾するには一層の困難を伴う。
一方、アミノ基を導入する方法には、大別して酵素法と化学法の２つの方法がある。酵素法では、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１群）と呼ばれる酵素を使用して行う。しかし、アミノトランスフェラーゼの基質となり得る物質が限られており、ベンゼン環に直接アミノ基を転移することができる酵素はこれまでに知られていない。よって、ベンゼン環をアミノ基で修飾しようとする場合には化学法のみが使用可能であった。
しかし、化学法の場合、初めにベンゼン環をニトロ基で修飾し、これを還元してアミノ基とする、という反応が必要である。第一段階のニトロ化の反応は非常に困難なことから、化学法によるベンゼン環へのアミノ基の導入は非常に困難であった。従って、ベンゼン環のパラ位を特異的にニトロ基またはアミノ基で修飾する方法の開発が切望されていたといえる。
発明の概要
本発明は、二次代謝産物のベンゼン環のパラ位が窒素原子を含む官能基により修飾された二次代謝産物を生産できるように改変された形質転換体、および修飾された二次代謝産物を簡便に、かつ安価に製造する方法を提供することをその目的とする。
本発明者らは、ベンゼン環骨格を含むＰＦ１０２２物質を生産する微生物を、コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換し、ベンゼン環のパラ位がアミノ基により修飾されたＰＦ１０２２物質を生産する形質転換体を得ることに成功した。
本発明による形質転換体は、パラ位が窒素原子を含む官能基により置換されていないベンゼン環骨格を有する二次代謝産物を生産する微生物の形質転換体であって、コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子（以下単に「生合成遺伝子」ということがある）を導入することによって、パラ位が窒素原子を含む官能基により置換されたベンゼン環骨格を有する二次代謝産物を生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。
本発明による製造法は、上記形質転換体を培養し、パラ位が窒素原子を含む官能基により置換されたベンゼン環骨格を有する二次代謝産物を採取することを含んでなる、パラ位が窒素原子を含む官能基により置換されたベンゼン環骨格を有する二次代謝産物の製造法である。
本発明はまた、コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する新規遺伝子を提供することもその目的とする。
本発明による新規遺伝子は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有するその改変配列をコードする遺伝子、
配列番号４に記載のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性を有するその改変配列をコードする遺伝子、および
配列番号６に記載のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するその改変配列をコードする遺伝子
である。
発明の具体的説明
微生物の寄託
実施例５に記載されるＰＦ１０２２菌株は、１９８９年１月２４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１である。
マイセリア・ステリリア（Ｍｙｃｅｌｉａ Ｓｔｅｒｉｌｉａ）の形質転換体５５−６５は、１９９９年９月１７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５５である。
プラスミドｐＵＣ１１８−ｐａｐＡで形質転換された大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９）は、１９９９年９月１７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５６である。
プラスミドｐＴｒｃ−ｐａｐＢで形質転換された大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９）は、１９９９年９月１７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５７である。
プラスミドｐＥＴ−ｐａｐＣで形質転換された大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９）は、１９９９年９月１７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５８である。
形質転換される生物
本発明に用いることができる生物としては、ベンゼン環骨格を含む二次代謝産物を生産する生物を用いることができる。好ましい生物としては、コリスミ酸を経由して生合成される二次代謝産物、特に、フェニルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニルアラニン、チロシン、およびフェニル乳酸からなる群から選択される少なくとも一つのビルディングブロックから合成される二次代謝産物、を生産する生物が挙げられる。
好ましい生物としてはまた、ペプチドまたはデプシペプチド、特にフェニルアラニン、チロシン、およびフェニル乳酸からなる群から選択される少なくとも一つのビルディングブロックから合成されるペプチドあるいはデプシペプチド、を二次代謝産物として生産する生物が挙げられる。
このような二次代謝産物およびそれを生産する微生物は下記の通りである。
0004156235.tif 000002
0004156235.tif 000003
0004156235.tif 000004
0004156235.tif 000005
0004156235.tif 000006
これらの物質は、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ  １９９４）に記載されている。
本発明において形質転換される「生物」としては、細菌、酵母、およびカビのような微生物や植物が挙げられる。植物には植物細胞も含まれる。
窒素原子を含む官能基の例としては、アミノ基およびニトロ基が挙げられる。
形質転換される生物が下記式で表されるＰＦ１０２２物質：
0004156235.tif 000007
を生産する微生物である場合、形質転換体から生産される二次代謝産物は下記式で表されるアミノ基で修飾されたＰＦ１０２２物質（以下「ＰＦ１０２２物質誘導体」という）：
0004156235.tif 000008
であることができる。
ＰＦ１０２２物質［シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］は、アゴノマイセタレス（Ａｇｏｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する糸状菌、ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）により生産される環状デプシペプチドであり、動物寄生性の線虫類に対して極めて高い駆虫活性を示す（特開平３−３５７９６号、Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．，４５，６９２，（１９９２））。このため、ＰＦ１０２２物質は動物用の駆虫薬として有用であると共に、アミノ基で修飾されたその誘導体は高活性な本物質の誘導体を合成するための原料として有用である。
ＰＦ１０２２物質は４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、および２分子のＤ−フェニル乳酸からＰＦ１０２２物質合成酵素により合成される。以下の理論に拘束される訳ではないが、（１）コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子をＰＦ１０２２物質生産菌に導入することにより、ｐ−アミノフェニルピルビン酸が形質転換体において生産され、（２）これにＤ−フェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＰＬＤＨ）が作用してｐ−アミノ−Ｄ−フェニル乳酸が形質転換体において生産され、（３）Ｄ−フェニル乳酸の代わりにｐ−アミノ−Ｄ−フェニル乳酸に対してＰＦ１０２２物質合成酵素が作用し、（４）ＰＦ１０２２物質誘導体が生産される、と考えられる。
生合成遺伝子
コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成に関与する酵素としては、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ、および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる（Ｂｌａｎｃ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３，１９１−２０２（１９９７））。コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路を概略すると下記の通りである：コリスミ酸に４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素が作用して４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸が生成し、生成した４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸に４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼが作用して４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸が生成し、生成した４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸に４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼが作用してｐ−アミノフェニルピルビン酸が生成する。
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素はコリスミ酸に作用して、これを４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸に変換する酵素を意味する。
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素は、コリスミ酸からｐ−アミノ安息香酸生合成系の一部として生物界に広く存在している。ｐ−アミノ安息香酸はコリスミ酸から二段階の反応で生成される。この内初めの反応を４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素が触媒し、後の反応を４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼが触媒する（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１２９７１−１２９７５（１９９１））。
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子としては、大腸菌（Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８，４５１−４６８（１９８３）、Ｇｏｎｃｈａｒｏｆｆ，Ｐ．ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，５７−６２（１９８４））、枯草菌（Ｓｌｏｃｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，７２１１−７２２６（１９９０））、クレブシラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３，３２７−３４０（１９８５）、Ｇｏｎｃｈａｒｏｆｆ，Ｐ．ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．５，５３１−５４８（１９８８））、ストレプトマイセス・プリスチナスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）（Ｂｌａｎｃ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３，１９１−２０２（１９９７））、ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２，１３４５−１３５５（１９９６））、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ９，６６９−６７５（１９９３））由来のものが報告されており、これらを使用することが可能である。これら以外の４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子を、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有する生物より常法に従って単離して使用しても良い。
一方、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素は、大腸菌、枯草菌、クレブシラ・ニューモニアエ由来のもののように２つのポリペプチドに分かれているものと、一部の放線菌またはサッカロマイセス・セレビシエ由来のもののように一つのポリペプチドから成るものの二つに大別することができる。本発明では、複数の遺伝子を宿主に導入する必要があることから、一つのポリペプチドから成る４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子を利用することが好ましい。
本発明において、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号２のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有するその改変配列をコードする遺伝子であり、より好ましくは、配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含む遺伝子である。
本発明において「改変配列」とは置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上、例えば１〜数個、の改変を有する配列をいう。
本発明において、改変アミノ酸配列が「４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有する」か否かは、そのアミノ酸配列からなるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出することにより評価することができ、例えば、実施例２に記載の方法に従って評価することができる。
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼは、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸に作用してこれを４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸に変換する酵素を意味する。
４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸に作用してこれをｐ−アミノフェニルピルビン酸に変換する酵素を意味する。
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｐ−アミノフェニルピルビン酸を生合成できる生物から得ることができる。より具体的には、プリスチナマイシンＩ（ｐｒｉｓｔｉｎａｍｙｃｉｎ  Ｉ）を生産するストレプトマイセス・プリスチナスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ベルナマイシンＢ（ｖｅｒｎａｍｙｃｉｎ  Ｂ）を生産するストレプトマイセス・ロイデンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｏｉｄｅｎｓ）、コリネシン（ｃｏｒｙｎｅｓｉｎ）を生産するノカルジア・パラフィニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐａｒａｆｉｎｎｉｃａ）およびコリネバクテリウム・ハイドロカルボクラスタス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｃｌａｓｔｕｓ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を生産するストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）等が挙げられる。この内、ストレプトマイセス・プリスチナスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）からは、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼおよび４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードすると推定されるそれぞれの遺伝子が既に単離され、その塩基配列が明らかにされており（Ｖ．Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３，１９１−２０２（１９９７））、本発明に利用可能である。
コリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードするそれぞれの遺伝子は、細菌、酵母、植物等から既に多数単離されており、これらを元にして蛋白質工学的手法または進化工学的手法を利用し、適切なアミノ酸を置換、欠失あるいは付加することによって４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を持つように改変することは可能であり、改変された遺伝子を本発明に利用することも可能である。
本発明において、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号４のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性を有するその改変配列をコードする遺伝子であり、より好ましくは、配列番号３のＤＮＡ配列を含む遺伝子である。
本発明において、改変アミノ酸配列が「４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性を有する」か否かは、そのアミノ酸配列からなるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出することにより評価することができ、例えば、実施例３に記載の方法に従って評価することができる。
本発明において、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号６のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するその改変配列をコードする遺伝子であり、より好ましくは、配列番号５のＤＮＡ配列を含む遺伝子である。
本発明において、改変アミノ酸配列が「４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」か否かは、そのアミノ酸配列からなるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出することにより評価することができ、例えば、実施例４に記載の方法に従って評価することができる。
本発明において生合成に関与する酵素のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号２、４、および６に記載されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、本発明による生合成遺伝子とは、配列番号１、３、および５に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
形質転換体
本発明の形質転換体は、コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成に関与する遺伝子を含んでなる、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクター、を宿主に導入することにより得ることができる。
本発明においては複数の生合成遺伝子を宿主に導入する場合、各遺伝子は同一または別々のＤＮＡ分子に含まれていても良い。さらに、宿主が細菌である場合には、各遺伝子をポリシストロン性ｍＲＮＡとして発現させるように設計し、一つのＤＮＡ分子とすることも可能である。
本発明において利用される発現ベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ、ｐＵＣ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ、ＹＩｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。
また、使用されるプラスミドベクターの内、少なくとも一つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主が細菌の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等であり、酵母の場合はトリプトファン生合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル生合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン生合成遺伝子（ＬＥＵ２）等であり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子等であり、植物の場合にはカナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等が挙げられる。
さらに発現ベクターにおいては、各遺伝子の発現に必要な制御配列、例えば、プロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号等の転写調節信号、翻訳調節信号等が、生合成遺伝子に作動可能に連結されていてもよい。制御配列の選択および連結は常法に従って行うことができる。
プロモーターとしては、例えば、大腸菌においてはラクトースオペロン、トリプトファンオペロン等のプロモーターを、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、ガラクトース資化性遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子等のプロモーターを、カビではα−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、Ａｂｐ１遺伝子等のプロモーターを、植物ではＣａＭＶ  ３５ＳＲＮＡプロモーター、ＣａＭＶ  １９ＳＲＮＡプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター等を選択できる。
生物の形質転換には、カルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等のような常法を用いることができ、形質転換される生物に応じて選択できる。
本発明においては、形質転換体を培養し、その培養物を得ることにより所望の修飾された二次代謝産物を得ることができる。本発明による形質転換体の培養も常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。
培地としては、本発明の形質転換体が同化し得る炭素源、資化し得る窒素源、無機塩類、各種ビタミン、グルタミン酸またはアスパラギン等の各種アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。また、本発明の形質転換体の発育を助け、目的とする二次代謝産物の生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。さらに、必要に応じてその他の栄養物をほどよく含有する合成培地または天然培地を使用することができる。
培地に使用される炭素源および窒素源としては、本発明の形質転換体の利用可能なものならば何れの種類でも良い。同化し得る炭素源としては例えばショ糖、ブドウ糖、澱粉、グリセリン、グルコース、シュークロース、グリセロール、フラクトース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、リボース、デキストリン、動・植物油等またはその加水分解物等の種々の炭水化物が利用できる。その濃度は通常、培地に対して０．１％〜５％が好ましい。
資化し得る窒素源としては例えばペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、脱脂大豆粉等の動植物体成分または浸出エキス類、コハク酸アンモニウム塩類、酒石酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム類、尿素その他各種無機酸若しくは有機酸の含窒素化合物も使用可能である。
また、無機塩類としては例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる塩類が適宜使用できる。
勿論、その他の成分として例えば酵母等の微生物の菌体または浸出液および浸出エキス等、また植物体の細末を含む培地であっても本発明の形質転換体の生育および目的とする二次代謝産物の生産蓄積を妨げない限り何れをも適宜に使用し得る。また、栄養要求性を示す変異株を培養する場合には、その栄養要求性を満足させ得る物質を培地に加えるが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する場合は、特に添加を必要としない場合がある。
培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができる。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２６℃〜３７℃付近で生育する。目的とする二次代謝産物の生産は、培地および培養条件、または使用した宿主により異なるが、何れの培養法においても通常２日〜２５日間でその蓄積が最高に達する。目的とする二次代謝産物の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量等の培養条件は使用する形質転換体および外部の条件等に応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において、発泡があるときは、シリコン油、植物油、鉱物油、界面活性剤等の消泡剤を適宜使用できる。このようにして得られた培養物に蓄積される目的とする二次代謝産物は、本発明の形質転換体内および培養濾液中に含有されるので、培養物を遠心分離して培養濾液と形質転換体とに分離し、各々から目的とする二次代謝産物を採取することが可能である。
培養濾液から目的とする二次代謝産物を採取するには、常法により、培養物から目的とする二次代謝産物を採取するのに用いられる手段を、単独若しくは任意の順序に組合せまたは反復して用いられる。すなわち、例えば抽出濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する例えば沈澱、結晶化、再結晶、転溶、向流分配法、クロマトグラフィー等の手段が用いられる。
また、本発明の形質転換体内の培養物から、目的とする二次代謝産物を取得することができる。常法により、例えば培養物から抽出（磨砕処理、加圧破砕等）、回収（ろ過、遠心分離等）および精製（塩析法、溶媒沈殿法等）等の手法が用いられる。
得られた粗物質は、常法により、例えばシリカゲル、アルミナ等の担体を用いるカラムクロマトグラフィーまたはＯＤＳ担体を用いる逆相クロマトグラフィーにより精製することができる。以上のような方法により、またはこれらを適宜組合せることにより、本発明の形質転換体の培養物から目的とする純粋な二次代謝産物が得られる。
ＰＦ１０２２物質誘導体を生産する形質転換体
本発明の好ましい態様によれば、コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子（生合成遺伝子）が導入されたＰＦ１０２２物質生産菌の形質転換体が提供される。
この形質転換体はＰＦ１０２２物質誘導体を生産することができる。
形質転換されるＰＦ１０２２物質生産菌はＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、好ましくは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１の受託番号のもと生命工学技術研究所に寄託された菌株であることができる。
生合成遺伝子は、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子、および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からなることができる。４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素活性を有するその改変配列をコードする遺伝子であることができる。４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号４に記載のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼ活性を有するその改変配列をコードする遺伝子であることができる。４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号６に記載のアミノ酸配列または４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するその改変配列をコードする遺伝子であることができる。
形質転換に用いられる発現ベクターとしては、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列（プロモーター、ターミネーター等）に生合成遺伝子を作動可能に連結した発現ベクターが好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）において機能する制御配列を生合成遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターである。
形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５５の受託番号のもと生命工学工業技術研究所に寄託された形質転換体５５−６５株であることができる。
本発明の更なる態様によれば、ＰＦ１０２２物質生産菌の形質転換体を培養し、ＰＦ１０２２物質誘導体を採取することを含んでなる、ＰＦ１０２２物質誘導体の製造法が提供される。
実  施  例
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）からの４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子、および４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の単離
（１）プローブ用ＤＮＡ断片の取得
５０ｍｌ分の液体培地（２％可溶性デンプン、１％ポリペプトン、０．３％肉エキス、０．０５％リン酸二水素カリウム、ｐＨ７．０）を２５０ｍｌ容の三角フラスコに作製した。この培地に、ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＩＳＰ５２３０株および１４０−５株をそれぞれ植菌し、２８℃、２４時間培養した。培養終了後、培養液から遠心により菌体を集め、これらの菌体よりＧｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｄ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１９８５）に記載の方法で染色体ＤＮＡを調製した。
次に、上記ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＩＳＰ５２３０株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７および配列番号８に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲＴＭｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（パーキン・エルマー社製）を用いて行った。反応液は、染色体ＤＮＡを１μｌ（０．６２μｇ相当量）、キットに添付の１０倍濃度反応用緩衝液を５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液を８μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．５μｌずつ、ジメチルスルホキシド（和光純薬社製）を５μｌ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ（２．５Ｕ）を０．５μｌ、滅菌水を２９．５μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、１０分間の前処理後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で３分間のインキュベーションを２５サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約２ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿を滅菌水に再溶解し、６０μｌのスケールで制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約２ｋｂｐのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。
このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ  Ｂ（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドの挿入断片の制限酵素地図はブラウンら（Ｍ．Ｐ．Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４２，１３４５−１３５５（１９９６））によって示されているｐａｂＡＢ遺伝子（Ｕ２１７２８）のものと一致した事から、ｐａｂＡＢ遺伝子がクローニングされたと判断し、このプラスミドをｐＴＨ−ＰＡＢと命名した。後述する染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングには、プラスミドｐＴＨ−ＰＡＢから制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動で分離、回収して得られる挿入断片をプローブとして用いた。
（２）染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングと遺伝子の単離
ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）１４０−５株の染色体ＤＮＡ約１０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、１０ｋｂｐ〜２０ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離、回収した。
こうして回収した１０ｋｂｐ〜２０ｋｂｐのＤＮＡ断片約０．５μｇと、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで二重消化しておいたλＤＡＳＨ  ＩＩ  １μｇをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩパッケージングエキストラクト（ストラタジーン社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージし、染色体ＤＮＡライブラリーを作成した。これを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡに感染させる事によりプラークを形成させた。
（１）で単離した約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用してプラークハイブリダイゼーションを行い、約２４０００個のプラークをスクリーニングした。取得された陽性クローンの内１０個について２次スクリーニングを行い、陽性クローンを純化した後、ファージＤＮＡを調製した。
これらファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、サザン解析を行った結果、プローブは約１．８ｋｂｐおよび約３．４ｋｂｐの２種類のＤＮＡ断片にハイブリダイズする事が明らかとなった。また、ファージＤＮＡの制限酵素地図の解析から、これら２種類のＤＮＡ断片は染色体ＤＮＡ上で隣り合う断片である事が明らかとなった。
そこで、これら２種類のＤＮＡ断片の全塩基配列を蛍光ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキン・エルマー社製）を用いて決定した。そして、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索した結果、図１に示すようにＯＲＦ  Ｉ〜ＩＶのＯＲＦを見出す事ができた。各ＯＲＦから推定されるアミノ酸配列について、データベースを利用して既知のアミノ酸配列との相同性を検索した結果、ＯＲＦ  Ｉはｐ−アミノ安息香酸合成酵素と、ＯＲＦ  ＩＩはプレフェン酸デヒドロゲナーゼと、ＯＲＦ  ＩＩＩはコリスミ酸ムターゼと相同性を示すことが明らかとなった。そこで、ＯＲＦ  Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの遺伝子をそれぞれｐａｐＡ、ｐａｐＣおよびｐａｐＢと命名した。ｐａｐＡがコードするアミノ酸配列および塩基配列をそれぞれ配列番号２および配列番号１に、ｐａｐＢがコードするアミノ酸配列および塩基配列をそれぞれ配列番号４および配列番号３に、ｐａｐＣがコードするアミノ酸配列および塩基配列をそれぞれ配列番号６および配列番号５に示した。
実施例２：大腸菌におけるｐａｐＡ遺伝子の発現
ｐａｐＡ遺伝子の翻訳領域を取得するため、実施例１に示した陽性クローン由来のファージＤＮＡを鋳型とし、配列番号９および配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキン・エルマー社製）を用いて行った。反応液は、ファージＤＮＡを１μｌ（１μｇ相当量）、酵素に添付の１０倍濃度反応用緩衝液を５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各１μｌずつ、ジメチルスルホキシド（和光純薬社製）を５μｌ、ＫＯＤ  Ｄａｓｈを１μｌ、滅菌水を３１μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９４℃で３０秒間、５０℃で２秒間、７２℃で３０秒間のインキュベーションを１５サイクル行った。得られた反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿を滅菌水に再溶解し、ＤＮＡブラティングキット（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ末端を平滑化した。さらに、Ｔ４  ＤＮＡキナーゼ（和光純薬社製）を利用して５’末端をリン酸化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、回収した後、プラスミドｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＵＣ１１８−ｐａｐＡを得た。
ｐＵＣ１１８−ｐａｐＡの挿入断片について、蛍光ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキン・エルマー社製）を用いて塩基配列を決定した結果、配列番号１に記載の塩基配列の２０４３番目のシトシンがアデニンに置換されていることが明らかとなった。これは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅時のエラーと推定されたが、コードされるアミノ酸配列には変化が無いことから、ｐＵＣ１１８−ｐａｐＡの挿入断片を以降の実験に用いることにした。
ｐＵＣ１１８−ｐａｐＡを大腸菌ＪＭ１１０へ導入し、取得された形質転換体より常法によりプラスミドを調製した。これを制限酵素ＢｃｌＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのＢｃｌＩ  ＤＮＡ断片を分離、回収した。
一方、ブラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（和光純薬社製）を用いてＤＮＡ末端を平滑化した。これを更に制限酵素ＳｍａＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＴｒｃ１０１を得た。
ｐＴｒｃ１０１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）処理を施した後、上述の２ｋｂｐのＢｃｌＩ  ＤＮＡ断片と連結した。ｐＴｒｃ１０１に含まれるプロモーターに対し、ｐａｐＡ遺伝子が正方向に挿入されたプラスミドを選択し、ｐＴｒｃ−ｐａｐＡと命名した。これまでのプラスミドの構築工程について図２に示した。
ｐＴｒｃ−ｐａｐＡを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）中、３７℃で一晩培養した。得られた培養液１ｍｌを１００ｍｌの同培地にシードし、３０℃、４時間培養した後、１ｍｌの１００ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で３時間培養した。培養後、培養液から遠心により菌体を集め、４ｍｌの細胞破砕用緩衝液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）に懸濁した後、超音波処理により細胞を破砕した。破砕後、遠心により上清を得、これを細胞抽出液とした。また、プラスミドｐＴｒｃ１０１を保持する大腸菌ＪＭ１０９株についても同様の処理を行い、細胞抽出液を調製した。
この様にして調製した細胞抽出液を用いて酵素活性を測定した。すなわち、細胞抽出液を１００μｌ、蒸留水を４００μｌ、基質溶液（１０ｍＭコリスミ酸バリウム塩（シグマ社製）、１０ｍＭグルタミン（和光純薬社製）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（和光純薬社製）、ｐＨ７．５）を５００μｌ混合し、３０℃、２時間反応させた。反応終了後、反応液の一部を全自動アミノ酸分析機ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）を用いて分析した。
その結果、図３に示すように、ｐＴｒｃ−ｐａｐＡを保持する大腸菌から調製した細胞抽出液を用いた場合には、チア−ユ  ピーテンら（Ｃｈｉａ−Ｙｕ  Ｐ．Ｔｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７，５００８−５００９（１９８５））の方法に従って合成した４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸標品と同一の保持時間の位置にピークが検出された。一方、煮沸処理した細胞抽出液や、ｐＴｒｃ１０１を保持する大腸菌から調製した細胞抽出液を用いた場合にはその位置にピークは検出されなかった。以上の結果からｐａｐＡ遺伝子は４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸合成酵素をコードしていることが示された。
実施例３：大腸菌におけるｐａｐＢ遺伝子の発現
ｐａｐＢ遺伝子の翻訳領域を取得するため、実施例１に示した陽性クローン由来のファージＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１および配列番号１２に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキン・エルマー社製）を用いて行った。反応液は、ファージＤＮＡを１μｌ（１μｇ相当量）、酵素に添付の１０倍濃度反応用緩衝液を５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各１μｌずつ、ジメチルスルホキシド（和光純薬社製）を５μｌ、ＫＯＤ  Ｄａｓｈを１μｌ、滅菌水を３１μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９４℃で３０秒間、５０℃で２秒間、７２℃で３０秒間のインキュベーションを１５サイクル行った。得られた反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿を滅菌水に再溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．３ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。
ｐＴｒｃ１０１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）処理を施した後、上述の０．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。ｐＴｒｃ１０１に含まれるプロモーターに対し、ｐａｐＢ遺伝子が正方向に挿入されたプラスミドを選択し、ｐＴｒｃ−ｐａｐＢと命名した（図４）。ｐＴｒｃ−ｐａｐＢの挿入断片について、蛍光ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキン・エルマー社製）を用いて塩基配列を決定し、配列番号３に記載の塩基配列と一致していることを確認した。
ｐＴｒｃ−ｐａｐＢを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）中、３７℃で一晩培養した。得られた培養液１ｍｌを１００ｍｌの同培地にシードし、３７℃、２時間培養した後、１ｍｌの１００ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃で５時間培養した。培養後、培養液から遠心により菌体を集め、４ｍｌの細胞破砕用緩衝液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）に懸濁した後、超音波処理により細胞を破砕した。破砕後、遠心により上清を得、これを細胞抽出液とした。また、プラスミドｐＴｒｃ１０１を保持する大腸菌ＪＭ１０９株についても同様の処理を行い、細胞抽出液を調製した。
この様にして調製した細胞抽出液を用いて酵素活性を測定した。すなわち、細胞抽出液を５０μｌ、蒸留水を２００μｌ、基質溶液（２ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（和光純薬社製）、ｐＨ７．５）を２５０μｌ混合し、３０℃、１時間反応させた。反応終了後、反応液の一部を全自動アミノ酸分析機ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）を用いて分析した。
その結果、図５に示すように、ｐＴｒｃ−ｐａｐＢを保持する大腸菌から調製した細胞抽出液を用いた場合には、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸のピークが減少し、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸のピークが新たに検出された。また、５分間煮沸処理を施した細胞抽出液を用いた場合でも同様の結果が得られた。
一方、ｐＴｒｃ１０１を保持する大腸菌から調製した細胞抽出液を用いた場合には、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸のピークに変化が無く、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸のピークも検出されなかった。以上の結果からｐａｐＢ遺伝子が４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼをコードしていることおよびｐａｐＢ遺伝子にコードされる４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸ムターゼは５分間の煮沸処理でも失活しないだけの耐熱性を有していることが示された。
実施例４：大腸菌におけるｐａｐＣ遺伝子の発現
ｐａｐＣ遺伝子の翻訳領域を取得するため、実施例１に示した陽性クローン由来のファージＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３および配列番号１４に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキン・エルマー社製）を用いて行った。反応液は、ファージＤＮＡを１μｌ（１μｇ相当量）、酵素に添付の１０倍濃度反応用緩衝液を５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各１μｌずつ、ジメチルスルホキシド（和光純薬社製）を５μｌ、ＫＯＤ  Ｄａｓｈを１μｌ、滅菌水を３１μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９４℃で３０秒間、５０℃で２秒間、７２℃で３０秒間のインキュベーションを１５サイクル行った。得られた反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿を滅菌水に再溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約１ｋｂｐのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。
プラスミドｐＥＴ−１１ｃ（ストラタジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）処理を施した後、上述の１ｋｂｐのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。ｐＥＴ−１１ｃに含まれるプロモーターに対し、ｐａｐＣ遺伝子が正方向に挿入されたプラスミドを選択し、ｐＥＴ−ｐａｐＣと命名した。
ｐＥＴ−ｐａｐＣの挿入断片について、蛍光ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（パーキン・エルマー社製）を用いて塩基配列を決定し、配列番号５に記載の塩基配列と一致していることを確認した。
一方、ｐＥＴ−ｐａｐＣを用いてｐａｐＣ遺伝子を発現させた場合、ベクター由来の１４アミノ酸から成るペプチドがｐａｐＣ遺伝子産物のＮ末端側に付加されるため、ｐａｐＣ遺伝子産物の性質を正確に評価できないことが予想された。そこで、ｐＥＴ−ｐａｐＣを制限酵素ＮｄｅＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＥＴ−ｐａｐＣ１を得た。ｐＥＴ−ｐａｐＣ１を用いることで、融合蛋白質としてではなく、ｐａｐＣ遺伝子産物そのものを大腸菌で生産させることが可能となった。これまでのプラスミドの構築工程について図６に示した。
ｐＥＴ−ｐａｐＣ１を保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）中、３７℃で一晩培養した。得られた培養液１ｍｌを１００ｍｌの同培地にシードし、３７℃、２時間培養した後、１ｍｌの１００ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃で５時間培養した。培養後、遠心により菌体を集め、４ｍｌの細胞破砕用緩衝液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）に懸濁した後、超音波処理により細胞を破砕した。破砕後、遠心により上清を得、これを細胞抽出液とした。また、プラスミドｐＥＴ−１１ｃを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株についても同様の処理を行い、細胞抽出液を調製した。
この様にして調製した細胞抽出液を用いて酵素活性を測定した。すなわち、本細胞抽出液を４０μｌ、実施例３に記載のｐＴｒｃ−ｐａｐＢを保持する大腸菌から調製し且つ煮沸処理を施した細胞抽出液を１０μｌ、蒸留水を１９０μｌ、１０ｍＭ  ＮＡＤ溶液を１０μｌ、基質溶液（２ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（和光純薬）、ｐＨ７．５）を２５０μｌ混合し、３０℃、１時間反応させた。反応終了後、反応液の一部を全自動アミノ酸分析機ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）を用いて分析した。
その結果、図７に示すように、ｐＥＴ−ｐａｐＣ１を保持する大腸菌から調製した細胞抽出液を用いた場合には、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸のピークが減少し、さらにｐａｐＢ遺伝子産物によって生じる４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸のピークも消失していた。ｐ−アミノフェニルピルビン酸は全自動アミノ酸分析機ＪＬＣ−５００／Ｖにおいて検出されないため、その生成を直接確認することはできなかった。
しかし、ｐ−アミノフェニルアラニンのピークが検出され、これはｐａｐＣ遺伝子産物によって生じたｐ−アミノフェニルピルビン酸が大腸菌のアミノトランスフェラーゼによりアミノ化されて生じたものと推定された。一方、煮沸処理を施した細胞抽出液およびｐＥＴ−１１ｃを保持する大腸菌から調製した細胞抽出液を用いた場合には、ｐａｐＢ遺伝子産物によって生じた４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸のピークに変化はなかった。以上の結果からｐａｐＣ遺伝子は４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードしていることが示された。
実施例５：ＰＦ１０２２生産菌導入用プラスミドｐＰＦ２６０−Ａ２およびｐＰＦ２６０−Ａ３の構築
ＰＦ１０２２生産菌内でｐａｐＡ遺伝子を発現させるためのプラスミドｐＰＦ２６０−Ａ２およびｐＰＦ２６０−Ａ３は図８に示すようにして構築した。
ＰＦ１０２２生産菌用発現ベクターｐＡＢＰｄを構築し、次いでこれに実施例２に記載のプラスミドｐＵＣ１１８−ｐａｐＡより得られたＤＮＡ断片を連結して発現ベクターとした。具体的には下記のようにして発現ベクターを構築した。
ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡの単離
ＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）のゲノムＤＮＡの単離は（Ｈ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２７２−２７８，（１９８８））に記載の方法に従った。具体的には、まずＰＦ１０２２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）を種培地（可溶性澱粉  ２．０％、グルコース  １．０％、ポリペプトン  ０．５％、小麦胚芽  ０．６％、酵母エキス  ０．３％、大豆粕  ０．２％および炭酸カルシウム  ０．２％；殺菌前がｐＨ７．０；ＷＯ９７／００９４４号  実施例１参照）で２日間培養し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。次いで、得られた菌体を凍結乾燥後、ＴＥに懸濁し、３％ＳＤＳ溶液中、６０℃、３０分間処理後、ＴＥ飽和フェノール抽出により、菌体残渣を除去した。抽出液はエタノール沈澱化後、リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）およびプロテイナーゼＫ（和光純薬社製）処理し、さらに１２％ポリエチレングリコール６０００により核酸を沈殿化させた。これをＴＥ飽和フェノール抽出、エタノール沈殿化を行い、同沈殿をＴＥに溶解し、これをゲノムＤＮＡとした。
ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムライブラリーの作製
上記のように調製したＰＦ１０２２物質生産菌由来ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクター、λＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームにＴ４リガーゼ（宝酒造社製ライゲーションキットＶｅｒ．２）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥに溶解した。連結混合物の全量をギガパックＩＩＩプラスパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、ファージプラークを形成させた。この方法により得られた１．３×１０４個（２．６×１０４ＰＦＵ／ｍｌ）のファージライブラリーを用いてＡｂｐ１遺伝子のクローニングを行った。
ＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡからのＡｂｐ１遺伝子クローニング
プローブはＡｂｐ１遺伝子の翻訳領域をＰＣＲ法により増幅し、用いた。前記のようにＰＦ１０２２物質生産菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、８−７３Ｕおよび８−７３Ｒなる合成プライマーを用いて、レッツゴーＰＣＲキット（サワディーテクノロジー社製）に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下に８−７３Ｕおよび８−７３ＲのＤＮＡ配列を示す。
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このようにして得られたＰＣＲ産物はＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、標識化した。前記のように作成したファージプラークを、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に転写し、アルカリ変成後、５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍＭ  クエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットに記載の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、１６時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。プローブの洗浄は前述キットに記載の方法に従った。プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、検出溶液に１分間浸したあと、メディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、１個の陽性クローンを得た。本クローンはサザン解析の結果、少なくとも６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片がゲノムＤＮＡの制限酵素断片長と一致していた。このＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を図９に示す。ＨｉｎｄＩＩＩ断片はｐＵＣ１１９にサブクローニングし（ｐＲＱＨｉｎ／１１９）、以降の実験に供した。
発現ベクターの構築
ｐＲＱＨｉｎ／１１９を鋳型にＡｂｐ１遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。プロモーターの増幅はＡＢＰ−ＮｅｃｏおよびＡＢＰ−Ｎｂａｍ、一方、ターミネーターの増幅はＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−Ｃｘｂａなるプライマーを用い、ＰＣＲスーパーミックスハイフィデリティ（ライフテックオリエンタル社製）によりＰＣＲ法を行った。反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下にＡＢＰ−Ｎｅｃｏ、ＡＢＰ−Ｎｂａｍ、ＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−ＣｘｂａのＤＮＡ配列を示す。
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各ＰＣＲ産物はマイクロスピンＳ−４００カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製し、エタノール沈殿化の後、プロモーターはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、ターミネーターはＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋に順次連結した。これをＸｂａＩで消化し、ｐＭＫＤ０１（ＷＯ９８／０３６６７号）由来デストマイシン耐性カセットを挿入しｐＡＢＰｄを構築した（図１０）。ｐＡＢＰｄはＡｂｐ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを有する。
実施例２に記載のプラスミドｐＵＣ１１８−ｐａｐＡより約２ｋｂｐのＢｃｌＩ  ＤＮＡ断片を調製した。これを、ＰＦ１０２２生産菌用発現ベクターｐＡＢＰｄのＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＰＦ２６０−Ａを得た。
次に、ｐＰＦ２６０−Ａを制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｎＨＩで二重消化し、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。これをｐＵＣ１１９のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ１１９−Ａを得た。ｐＵＣ１１９−Ａを鋳型ＤＮＡ、配列番号２１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏミュータジェネシスキット（バイオラッド社製）を用いて部位特異的変異処理を施し、プラスミドｐＵＣ１１９−Ａ１を得た。
次に、ｐＵＣ１１９−Ａ１およびｐＰＦ２６０−Ａを制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｎＨＩで二重消化し、約１．７ｋｂｐおよび約８．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した後、これらを連結してプラスミドｐＰＦ２６０−Ａ２を得た。さらに、ｐＰＦ２６０−Ａ２を制限酵素ＸｂａＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＰＦ２６０−Ａ３を得た。
実施例６：ＰＦ１０２２生産菌導入用プラスミドｐＰＦ２６０−Ｂ３の構築
ＰＦ１０２２生産菌内でｐａｐＢ遺伝子を発現させるためのプラスミドｐＰＦ２６０−Ｂ３は図１１に示すようにして構築した。
実施例３に記載のプラスミドｐＴｒｃ−ｐａｐＢより約０．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を調製した。これを発現ベクターｐＡＢＰｄ（実施例５）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＰＦ２６０−Ｂを得た。ｐＰＦ２６０−Ｂを制限酵素ＸｂａＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＰＦ２６０−Ｂ１を得た。
次に、ｐＰＦ２６０−Ｂ１を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。これをｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ部位に、ｐａｐＢ遺伝子の向きがｌａｃＺ’遺伝子と同じ向きになるようにサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ１１８−Ｂを得た。ｐＵＣ１１８−Ｂを鋳型ＤＮＡ、配列番号２２に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏミュータジェネシスキット（バイオラッド社製）を用いて部位特異的変異処理を施し、プラスミドｐＵＣ１１８−Ｂ１を得た。
次に、ｐＵＣ１１８−Ｂ１およびｐＰＦ２６０−Ｂ１を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、約０．６ｋｂｐおよび約８．０ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ調製した後、これらを連結してプラスミドｐＰＦ２６０−Ｂ３を得た。
実施例７：ＰＦ１０２２生産菌導入用プラスミドｐＰＦ２６０−Ｃ３の構築
ＰＦ１０２２生産菌内でｐａｐＣ遺伝子を発現させるためのプラスミドｐＰＦ２６０−Ｃ３は図１２に示すようにして構築した。
実施例４に記載のプラスミドｐＥＴ−ｐａｐＣより約１ｋｂｐのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を調製した。これを発現ベクターｐＡＢＰｄ（実施例５）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＰＦ２６０−Ｃを得た。ｐＰＦ２６０−Ｃを制限酵素ＸｂａＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＰＦ２６０−Ｃ１を得た。
次に、ｐＰＦ２６０−Ｃ１を制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩで二重消化し、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。これをｐＵＣ１１８のＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ１１８−Ｃを得た。ｐＵＣ１１８−Ｃを鋳型ＤＮＡ、配列番号２３に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏミュータジェネシスキット（バイオラッド社製）を用いて部位特異的変異処理を施し、プラスミドｐＵＣ１１８−Ｃ１を得た。
次に、ｐＵＣ１１８−Ｃ１およびｐＰＦ２６０−Ｃ１を制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩで二重消化し、約１．７ｋｂｐおよび約７．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ調製した後、これらをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結してプラスミドｐＰＦ２６０−Ｃ３を得た。
実施例８：ＰＦ１０２２生産菌の形質転換
ｐＰＦ２６０−Ａ２、ｐＰＦ２６０−Ａ３、ｐＰＦ２６０−Ｂ３およびｐＰＦ２６０−Ｃ３をそれぞれ１μｇ、３μｇ、３μｇおよび３μｇとなるように混合し、エタノールで沈殿させた後、１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再溶解した。このようにして調製したＤＮＡ溶液を用いて、ＷＯ９７／００９４４号の実施例１に記載の方法でＰＦ１０２２生産菌を形質転換した。具体的には、ＰＦ１０２２生産菌を実施例５に記載の種培地で、２６℃、４８時間培養した。その後、３０００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間の遠心分離により、菌糸体を集菌し、０．５Ｍシュークロース溶液で洗浄した。得られた菌糸体を、β−グルクロニダーゼ（シグマ社製）３ｍｇ／ｍｌ、キチナーゼ（シグマ社製）１ｍｇ／ｍｌ及びザイモラーゼ（生化学工業社製）１ｍｇ／ｍｌを含む０．５Ｍシュークロース溶液中で、３０℃、２時間振とうすることによりプロトプラスト化させた。得られた混合物を濾過し、菌体残さを除去した。ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化カルシウム）で２回遠心分離（２５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃）することによりプロトプラストを洗浄し、次いで、ＳＵＴＣ緩衝液で１×１０７個／ｍｌのプロトプラスト懸濁液を調製した。
プロトプラスト懸濁液１００μｌに、先に調製したプラスミドＤＮＡ溶液を加え、得られた混合物を氷冷下に５分間放置した。その後、当該混合物に、４００μｌのポリエチレングリコール溶液（６０％  ポリエチレングリコール４０００（和光純薬）、１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化カルシウム）を加え、得られた混合物を氷冷下に２０分間放置した。
以上のように処理したプロトプラストを、ＳＵＴＣ緩衝液で洗浄した後、同緩衝液に再懸濁した。得られた懸濁液を１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ及び０．５Ｍシュークロースを含むポテトデキストロース寒天培地に、ポテトデキストロース軟寒天培地と共に重層した。２６℃にて５日間培養し、現れたコロニーを形質転換体とした。
得られた形質転換体より染色体ＤＮＡを調製し、これらを鋳型ＤＮＡとし、サイクル数を２５サイクルとした以外は実施例２、３、および４に記載の条件でＰＣＲを行い、ｐａｐＡ、ｐａｐＢおよびｐａｐＣ遺伝子の検出を行った。その結果、３種全ての遺伝子が導入された形質転換体として５５−６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５５）を選抜した。
実施例９：ＰＦ１０２２生産菌形質転換体の培養とＰＦ１０２２誘導体の検出
実施例８において選抜した形質転換体５５−６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２５５）および親株をＷＯ９７／２０９４５号に記載されている条件に従って培養した。即ち、実施例５に記載の種培地で、２６℃、２日間培養した。得られた培養液２ｍｌを５０ｍｌの生産培地（小麦胚芽  ０．６％、ファーマメディア  １．０％、可溶性澱粉  ２．６％、水飴６．０％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２％、ＮａＣｌ  ０．２％）に植菌し、さらに２６℃、６日間培養した。培養終了後、４０ｍｌ分の培養液から遠心により菌体を集め、３０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。抽出液を濃縮乾固した後、２ｍｌのアセトニトリルに再溶解した。このうち１０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。
ＨＰＬＣ分析の条件は、
ＨＰＬＣシステム：株式会社  日立製作所  ６５５Ａ−１１
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２４．６Ｘ２５０ｍｍ
移動相：アセトニトリル：水＝７０：３０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：日本分光工業株式会社  ８７０−ＵＶ
ＵＶ波長：２４５ｎｍ
とした。
図１３に示したように、形質転換体５５−６５株には、ＰＦ１０２２−２６８（ＷＯ９７／１１０６４号実施例１、Ｃｙｃｌｏ［ＭｅＬｅｕ−Ｌａｃ−ＭｅＬｅｕ−（Ｏ２Ｎ）ＰｈＬａｃ−ＭｅＬｅｕ−Ｌａｃ−ＭｅＬｅｕ−ＰｈＬａｃ］）およびＰＦ１０２２−２６９（ＷＯ９７／１１０６４号実施例２、Ｃｙｃｌｏ［ＭｅＬｅｕ−Ｌａｃ−ＭｅＬｅｕ−（Ｈ２Ｎ）ＰｈＬａｃ−ＭｅＬｅｕ−Ｌａｃ−ＭｅＬｅｕ−ＰｈＬａｃ］）と保持時間が一致するピークが検出された。一方、これらのピークは親株には検出されなかった。また、形質転換体由来の抽出液と各標準品を混合した後にＨＰＬＣ分析を行った実験において、これらのピークが標準品のピークと完全に重なることが示された。さらに、これらのピークに含まれる物質ついて、ＬＣ−ＭＳ（四重極型ベンチトップＬＣ／ＭＳシステムＮＡＶＩＧＡＴＯＲ  ｗｉｔｈ  ａＱａＴＭ（サーモクエスト株式会社製）を用いて質量スペクトルを測定した結果、標準品のものと一致した。
以上の結果から、ｐａｐＡ、ｐａｐＢおよびｐａｐＣ遺伝子の３種が全て導入された形質転換体５５−６５株が、ベンゼン環のパラ位がニトロ基若しくはアミノ基で修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体を生産することが明らかとなった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ストレプトミセス・ヴェネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）から単離したＤＮＡ断片の制限酵素地図およびオープンリーディングフレームの位置を示す。
図２は、プラスミドｐＴｒｃ−ｐａｐＡの構築を示す。
図３は、ｐａｐＡ遺伝子産物の酵素活性検出に用いたアミノ酸分析機のクロマトグラムを示す。
図４は、プラスミドｐＴｒｃ−ｐａｐＢの構築を示す。
図５は、ｐａｐＢ遺伝子産物の酵素活性検出に用いたアミノ酸分析機のクロマトグラムを示す。
図６は、プラスミドｐＥＴ−ｐａｐＣ１の構築を示す。
図７は、ｐａｐＣ遺伝子産物の酵素活性検出に用いたアミノ酸分析機のクロマトグラムを示す。
図８は、プラスミドｐＰＦ２６０−Ａ２およびｐＰＦ２６０−Ａ３の構築を示す。
図９はＡｂｐ１遺伝子を含む６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を示す。
図１０はｐＡＢＰｄの構成および制限酵素地図を示す。
図１１は、プラスミドｐＰＦ２６０−Ｂ３の構築を示す。
図１２は、プラスミドｐＰＦ２６０−Ｃ３の構築を示す。
図１３は、ベンゼン環のパラ位がニトロ基若しくはアミノ基で修飾されたＰＦ１０２２誘導体の検出に用いたＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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