(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸の活性を有する、１もしくは数個の核酸の置換、付加または欠失によって請求項１に記載の核酸から得られる核酸であって、ここで該活性は、細胞におけるウイルスの再生に必要であるが、細胞生存に必須でないことである、核酸。
【請求項３】
配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされたタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１、２または３に記載の核酸と高ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし、かつ請求項１、２または３に記載の核酸の活性を有し、ここで該活性は、細胞におけるウイルスの再生に必要であるが、細胞生存に必須でないことである、核酸。
【請求項６】
請求項１、２、３、または５に記載の核酸によりコードされたタンパク質。
【請求項７】
配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む、遺伝子の調節領域を含む核酸。
【請求項８】
前記調節領域がレポーター遺伝子に機能的に連結されている、請求項７に記載の核酸を含む構築物。
【請求項９】
細胞におけるウイルス増殖に必要であるが、細胞生存に必須でない細胞性遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）血清含有培地中で増殖する細胞培養物に、機能的プロモーターを欠失する選択マーカー遺伝子をコードするベクターを移入させる工程、
（ｂ）該マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）該細胞培養物から血清を除去する工程、
（ｄ）該細胞培養物に該ウイルスを感染させる工程、および
（ｅ）生存細胞から、該マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を単離する工程を包含し、それにより細胞におけるウイルス増殖に必要であるが、細胞生存に必須でない遺伝子を同定する、方法。
【請求項１０】
ウイルス感染を処置するのに有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を、細胞におけるウイルスの再生に必要であるが、細胞の生存に必要でない遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含む細胞に投与する工程、および産生された遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、ここで該細胞性遺伝子が、請求項１〜３および５のいずれかに記載される核酸であり、該遺伝子産物の減少または除去が、該ウイルス感染を処置するのに有効である化合物を示す、方法。
【請求項１１】
ウイルス感染を減少または阻害するための化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を、請求項８に記載の構築物を含む細胞に投与する工程、および産生されたレポーター遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、該レポーター遺伝子産物の減少または除去が、該ウイルス感染を減少または阻害するための化合物を示す、方法。
【請求項１２】
細胞におけるウイルス増殖に必要であるが、細胞生存に必要でない細胞性遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）細胞培養物に、機能的プロモーターを欠失する選択マーカー遺伝子をコードするベクターを移入させる工程；
（ｂ）該マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）該細胞培養物に該ウイルスを感染させる工程、および
（ｄ）該生存細胞から、該マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を単離する工程を包含し、それにより細胞におけるウイルス増殖に必要であるが、細胞生存に必須でない遺伝子を同定する、方法。
【発明の詳細な説明】
背景
発明の分野
本発明は、ウイルス増殖または腫瘍の進行に使用される細胞性遺伝子を同定する方法を提供する。従って、本発明は、ウイルス感染を低減するかまたは予防し、そして腫瘍の進行を抑制するための核酸および方法に関する。本発明はまた、さらなるこのような遺伝子についてスクリーニングするための方法に関する。
技術背景
種々のプロジェクトが、種々の動物（特にヒト）のゲノムを単離しそして配列決定することを指向してきた。しかし、ほとんどの方法論は、その機能が関連も示唆さえもしないヌクレオチド配列を提供し、従ってこのようなデータの即時有用性を限定する。
本発明は、対照的に、特定のプロセス（すなわち、ウイルス感染または腫瘍の進行）に関与する核酸についてのみ、およびさらに、これらのプロセスのための処置に有用な核酸についてのスクリーニングの方法を提供する。なぜなら、この方法によって、細胞に不要な核酸のみが単離されるからである。このような方法は、非常に有用である。なぜなら、その方法は、機能を、各単離された遺伝子に帰因させ、従って単離された核酸は、種々の特異的な方法および手順に即時に有用であり得るからである。
例えば、本発明は、ウイルス感染に使用されるが細胞には不要である遺伝子産物をコードする核酸を単離する方法を提供する。腸および肝臓のウイルス感染は、ヒトの罹患率および死亡率の有意な原因である。このような感染の分子機構を理解することは、これらの処置および制御における新たなアプローチを導く。
ウイルスは、種々のタイプの感染を確立し得る。これらの感染は、一般的に、溶解性または持続性として分類され得るが、いくつかの溶解性感染のみが、持続性を考えられている。一般的には、持続性感染は、２つのカテゴリーに分類される：（１）慢性（生産的な）感染（すなわち、感染性ウイルスが存在し、そしてそれが伝統的な生物学的方法によって回収され得る感染）および（２）潜在性感染（すなわち、ウイルスゲノムは細胞中に存在するが、感染性ウイルスは再活性化の断続的な発症の間を除いては一般的に産生されない感染）。持続性は一般的に、生産的感染と慢性の感染の両方の状態を含む。
溶解性感染はまた、全細胞の小さな部分のみが感染される（煙（smolder）（循環）感染）条件下で持続し得る。わずかな感染細胞はウイルスを放出し、そして殺傷されるが、子孫ウイルスは、再度、全細胞の少数のみを感染する。このような煙感染の例としては、マウスにおける乳酸脱水素酵素ウイルスの持続性（Mahy,B.W.J., Br.Med.Bull. 41:50-55（1985））およびヒトにおけるアデノウイルス感染（Porter,D.D. 784-790頁、Baron,S編、Medical Microbiology第２版（Addison-Wesley, Menlo Park, CA 1985））が挙げられる。
さらに、ウイルスは、いくつかの細胞型については溶解性であり得るが他の細胞型については溶解性であり得ない。例えば、証拠は、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）が、単球／マクロファージよりもＴ細胞に対してより溶解性であり、それゆえ、細胞死を生じ得るＴ細胞の生産的な感染を生じ得るが、一方、HIV感染単核食細胞は、相当な期間細胞溶解せずにウイルスを産生し得ることを示唆する。（Klatzmannら、Science 225:59-62（1984）；Koyanagiら、Science 241:1673-1675（1988）；Sattentauら、Cell 52:631-633（1988））。
伝統的なウイルス感染の処置は、HIVプロテアーゼまたは逆転写酵素のような特定のウイルス由来タンパク質、またはインターフェロンのような組換え（クローン化）免疫モジュレーター（宿主由来）を目的とする医薬品を含む。しかし、現在の方法は、抗ウイルス製剤を無効にさせる高い割合のウイルス変異を含むいくつかの制限および欠点を有する。免疫モジュレーターについて、制限された有効性、副作用を限定すること、特異性の欠失は、これらの薬剤の一般的な適用性を全て制限する。また、現在の抗ウイルスおよび免疫モジュレーターでの成功の割合は、期待はずれである。
本発明は、１つまたは両方の対立遺伝子において破壊される場合、細胞生存に必要ではないが、ウイルス複製に必須とされる遺伝子を単離することに焦点を合わせる。このことは、用量効果とともに生じ得、これにおいて１つの対立遺伝子ノックアウトは、ウイルス耐性の表現型を細胞に付与し得る。治療介入のための標的のように、これらの細胞性遺伝子産物（タンパク質、タンパク質の一部（糖化、脂質修飾（ミリオレート（myriolate）など）を含むがこれに制限されない改変酵素）、脂質、転写エレメント、およびRNA調節分子を含む）の阻害は、強い毒性の副作用をほとんど有さないようであり、そしてウイルス変異は、首尾よい複製に対する「ブロック」をほとんど克服しないようである。
本発明は、増殖するためにウイルスに必要とされる細胞性遺伝子に対処する（address）ことにより、ウイルス感染に対して試みられる治療的介入の以前の方法の有意な改善を提供する。従って、本発明はまた、ウイルス感染に必要な細胞性遺伝子を阻害することによりウイルスを処置する方法を提供することによって、ウイルス感染に介入するための画期的な治療的アプローチを提供する。これらの遺伝子は、本来検出された手段の長所によって細胞の生存に不要であるため、これらの処置方法は、以前の方法に見出されるような、被験体に深刻な有害な効果を与えずに、被験体に使用され得る。本発明はまた、ウイルス性感染細胞は、生存するために血清中の因子に依存するという驚くべき発見を提供する。従って、本発明はまた、この血清生存因子を阻害することによってウイルス感染を処置するための方法を提供する。最後に、これらの発見はまた、培養物中のこの血清生存因子を除去し、阻害し、または破壊することによって、ウイルス性感染細胞を細胞培養物から除去し、その結果、非感染細胞を選択的に生存させる方法を提供する。
腫瘍抑制遺伝子（単数または複数）の選択は、ガンの治療的介入のための新たな標的の発現における重要な領域になっている。「形質転換された」表現型の抑制が可能な特定の遺伝子によって、細胞が細胞周期への無差別な参入から制限されるという発見以来、これらの遺伝子の発見に相当な時間が費やされている。これらの遺伝子のいくつかは、横紋筋肉腫（Rb）およびp53（アポトーシス関連）コード遺伝子に関連する遺伝子を含む。本発明は、遺伝子トラップを使用して、形質転換されていない細胞から形質転換された表現型を有する細胞株を選択し、そしてこれらの細胞から悪性の表現型を抑制し得る遺伝子を単離する方法を提供する。従って、単離プロセスの特性によって、単離された遺伝子に機能が関連される。腫瘍抑制遺伝子を迅速に選択する能力は、ガンを処置するか予防し、さらに診断試験するプロセスにおけるユニークな標的を提供し得る。
発明の詳細な説明
本発明は、特定の機能に関連した遺伝子由来の核酸を同定および単離するための選択プロセスとともに「遺伝子トラップ」法を利用する。詳細には、ウイルス感染に必要であるが、細胞の生存には必須でない細胞性遺伝子を単離する手段を提供し、そして腫瘍の進行を抑制する細胞性遺伝子を単離する手段を提供する。
本発明はまた、ウイルス性感染細胞は、生存のために血清に存在する少なくとも１つの因子に依存性になるが、非感染細胞はこの依存性を示さないという核心の発見を提供する。この核心の発見は、本発明のいくつかの方法において利用されている。最初に、「血清生存因子」の阻害は、非感染細胞の集団由来の持続性のウイルス性感染細胞を全滅させるのに利用され得る。この因子の阻害はまた、本明細書中にさらに記載されるように、被験体におけるウイルス感染を処置するために使用され得る。さらに、組織培養物中における血清生存因子の阻害または回収は、ウイルス複製に必要とされるが、未感染細胞の生存に必須でない細胞性遺伝子の検出を可能にする。本発明はさらに、いくつかのこのような細胞性遺伝子、ならびにこのような遺伝子の機能を阻害することによってウイルス感染を処置する方法を提供する。
さらに、本発明は、腫瘍の進行に利用される細胞性遺伝子の単離のための方法を提供する。
本方法は、細胞におけるウイルス増殖に必要であるが、細胞の生存に必須ではないいくつかの細胞性遺伝子を提供する。これらの遺伝子は、ウイルスによる溶解性および持続性感染に重要である。これらの遺伝子は、レトロウイルス遺伝子トラップベクターでの感染細胞により遺伝子トラップライブラリーを作製し、遺伝子トラップ事象を生じる（すなわち、ベクターが挿入され、その結果無プロモーターマーカー遺伝子が挿入され、その結果細胞性プロモーターがマーカー遺伝子の転写を促進する（すなわち、機能する遺伝子に挿入される））細胞を選択し、細胞を血清飢餓させ、連続的血清飢餓の間選択された細胞を選択ウイルスで感染させ、そして限定希釈によってクローン化される可視コロニーの発現を可能にするために血清を添加することにより、単離された。次いで、レトロウイルストラップベクターに挿入された遺伝子は、レトロウイルス遺伝子トラップベクターに特異的なプローブを用いて、コロニーから単離された。従って、この方法によって単離された核酸は、単離された遺伝子の一部である。
従って、本発明は、細胞におけるウイルス増殖に必要であり、そして細胞の生存に必須ではない細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（a）血清含有培地において増殖する細胞培養物に、機能的プロモーターを欠失する選択的マーカー遺伝子をコードするベクターを形質転換する工程、（b）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、（c）培養培地から血清を除去する工程、（d）細胞培養物をウイルスに感染させる工程、および（e）生存する細胞から、マーカー遺伝子が挿入される範囲内の細胞性遺伝子を単離し、それによって細胞におけるウイルス増殖に必要であり、そして細胞の生存に必須ではない遺伝子を同定する工程を含む。本発明はまた、細胞におけるウイルス増殖に使用され、そして細胞生存に必須ではない細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（a）血清含有培地において増殖する細胞培養物に、機能的プロモーターを欠失する選択的マーカー遺伝子を形質転換する工程、（b）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、（c）培養培地から血清を除去する工程、（d）細胞培養物をウイルスで感染させる工程、および（e）生存する細胞から、マーカー遺伝子が挿入される範囲内の細胞性遺伝子を単離し、それによって細胞におけるウイルス増殖に必要であり、そして細胞の生存に必須ではない遺伝子を同定する工程を含む。任意の選択される細胞型（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において、血清飢餓が選択に必要であるかどうかを、容易に決定し得る。そうでなければ、血清飢餓はこの工程から除外され得る。
あるいは、培養培地から血清を除去するかわりに、ウイルスの増殖に必要な血清因子は、例えば、この因子に特異的に結合する抗体の投与によって阻害され得る。さらに、培養物中に持続的に感染した細胞が存在しないと考えられる場合、血清飢餓工程は除外され得、そして細胞は細胞型のための通常の培地において増殖され得る。血清飢餓が使用される場合、培養物がウイルスに感染した後に、一定期間続けられ得る。次いで、血清は培養物に添加され得る。いくつかの他の方法が因子を不活化するために使用される場合、培養物に新たな血清を添加する前に、中止されるか、不活化されるか、または除去（例えば、この抗因子抗体を除去する（例えば、この抗体に対して指向される結合抗体を用いる））され得る。生存する細胞は、ウイルスの増殖に必要な遺伝子における挿入物の不活化を有する変異体である。次いで、挿入物を有する遺伝子は、マーカー遺伝子配列を有する配列を単離することによって単離され得る。この変異のプロセスは、野生型機能を妨げる。変異体遺伝子は、低レベルで通常の産物を産生し得るか、正常産物であるが通常はこれらの細胞では見出されないものを産生し得るか、正常産物を過剰生産し得るか、いくつかの機能を有するが他のものは有さない改変産物を産生し得るか、または遺伝子機能を完全に破壊し得る。さらに、変異は、機能を有するが、決してタンパク質に転写されないRNAを破壊し得る。例えば、αトロポミオシン遺伝子は、細胞調節に非常に重要であるが決してタンパク質に転写されない3’RNAを有する。（Cell 75 1107-1117頁、1993年12月17日）。
本明細書中に使用されるように、「細胞の生存に必須ではない」細胞性遺伝子は、１つまたは両方に対立遺伝子が、少なくとも一定期間生存可能な細胞を生じ、これが、予防または治療的使用または研究における使用のために、ウイルス複製を阻害することを可能にする遺伝子を意味する。「細胞増殖に必要な」遺伝子は、タンパク質またはRNAのいずれかの遺伝子産物であり、分泌されるかまたはされず、ウイルスが増殖するためのいくつかの方法において、直接的または間接的のいずれかで必要であり、それゆえ、その遺伝子産物（すなわち、機能的に利用可能な遺伝子産物）の非存在下で、ウイルスを含む少なくともいくつかの細胞が死滅する遺伝子産物を意味する。例えば、このような遺伝子は、細胞周期調節タンパク質、液胞の水素ポンプに作用するタンパク質、またはタンパク質フォールディングおよびタンパク質修飾（これは、以下を含むが限定されない：リン酸化、メチル化、糖化、ミリストイル化もしくは他の脂質成分、または酵素的処理を介するタンパク質処理）に関与するタンパク質をコードし得る。このような遺伝子のいくつかの例は、本明細書中に例示され、ここで、単離された核酸のいくつかは、液胞のH+ATPase、αトロポミオシン、gas5遺伝子、ras複合体、N-アセチル-グルコサミニルトランスフェラーゼI mRNA、およびカルサイクリンのような遺伝子に対応する。
細胞を感染し得る任意のウイルスは、この方法に使用され得る。ウイルスは、研究が所望される特定の感染に基づいて選択され得る。しかし、多くのウイルスは、生存する同じ細胞性遺伝子に依存することが、本発明によって意図される；従って、あるウイルスを用いて単離された細胞性遺伝子もまた、他のウイルスの治療のための標的として使用され得る。任意の細胞性遺伝子は、本明細書中に記載の方法を用いて（すなわち、一般的には、細胞中の遺伝子またはその遺伝子産物を阻害し、そして所望のウイルスがその細胞において増殖し得るかどうかを決定することによって）、任意の所望のウイルスに対する関連性について試験され得る。ウイルスのいくつかの例としては、HIV（HIV-1およびHIV-2を含む）；パルボウイルス；パピローマウイルス；ハンタウイルス；インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザA、B、およびCウイルス）；A〜G型肝炎ウイルス；カリシウイルス；アストロウイルス；ロタウイルス；コロナウイルス（例えば、ヒト呼吸器コロナウイルス）；ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）；エボラウイルス；ヒトヘルペスウイルス（例えば、HSV-1-9）；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトアデノウイルス；エプスタイン-バーウイルス；ハンタウイルス；動物については、上記の任意のヒトウイルスの動物対応物、動物レトロウイルス（例えば、シミアン免疫欠損ウイルス）、トリ免疫不全症ウイルス、ウシ免疫不全症ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、またはビスナウイルスが挙げられる。
本発明の細胞性遺伝子を含む核酸は、上記の方法および実施例に記載のように単離された。本発明は、以下に記載のヌクレオチド配列を含む核酸を含む：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、または配列番号75（この一覧は、ときどき、本明細書中で簡潔に「配列番号５から配列番号75」といわれる）。従って、これらの核酸は、配列表における各配列番号に記載のヌクレオチドに加えて、分子のいずれかの末端にさらなるヌクレオチドを含み得る。このようなさらなるヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、組換え法および合成法）によって付加され得る。本発明によって意図される配列表の任意の項目に記載のヌクレオチド配列を含むこのような核酸の例としては、例えば、ベクター中に配置される核酸；ベクターに特に、機能的な様式で（すなわち、mRNAまたはタンパク質が産生され得る）連結された１つ以上の調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位）を有する核酸；この遺伝子のさらなる核酸を含む核酸（例えば、この遺伝子のより大きいかまたは全長ゲノムフラグメント、部分的または全長cDNA、部分的または全長RNA）が挙げられるが、これに限定されない。このようなより大きな核酸を作製および／または単離することは、以下にさらに記載され、そして当該分野で周知かつ標準的である。
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、または配列番号75に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子、ならびにこのような各遺伝子の対立遺伝子変異体および相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸を提供する。遺伝子は、下記のように、そして当該分野で公知でかつ標準である、標準的な方法を使用して、容易に得られる。本発明はまた、これらの遺伝子または配列番号５〜75のいずれかに示される核酸の独特な任意のフラグメントを企図する。本発明の遺伝子の発明のフラグメントの例は、配列が配列番号５〜75のいずれかに示される核酸である。独特であるためには、フラグメントは、他の公知の配列から識別するのに充分なサイズでなけれならず、任意の核酸フラグメントをGenBankのようなコンピュータデータベース中の核酸のヌクレオチド配列と比較することによって最も容易に決定される。このような比較検索は、当該分野で標準的である。代表的には、プライマーまたはプローブとして有用な独特なフラグメントは、少なくとも長さが約20〜約25ヌクレオチドであり、これは、配列の特異的なヌクレオチド含量に依存する。さらに、例えば、フラグメントは、長さが少なくとも約30、40、50、75、100、200、または500のヌクレオチドであり得る。核酸は、意図する目的によって、一本鎖または二本鎖であり得る。
本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49。配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の調節領域を含む核酸を、さらに提供する。機能的にレポーター遺伝子に連結されるこのような調節領域を含む構築物も、さらに提供される。このようなレポーター遺伝子構築物は、配列番号５〜75のいずれかに示される配列である核酸を含む遺伝子の発現に影響する化合物および組成物についてスクリーニングするために使用され得る。
配列表に示される核酸は、遺伝子フラグメントである；各フラグメントを含む全コード配列および全遺伝子の両方が本明細書中において企図され、そして配列表において示されるヌクレオチド配列を考えると標準的な方法により容易に入手される（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; DNA Cloning: A Practical Approach, 第１巻および第２巻、Glover, D.M.編、IRL Press Limited, Oxford, 1985を参照のこと）。全ゲノム遺伝子を得るためには、簡潔には、配列が配列番号１〜83のいずれかで示される核酸、または好ましくは配列番号５〜83のいずれかにおいて示される核酸もしくはそれらの小フラグメントを、高いストリンジェンシーの条件下で、ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして利用し、そして単離されたクローンが配列決定される。一旦新しいクローンの配列が決定されると、プローブは、新しいクローンの前のフラグメントに存在しない部分から考案され得、そしてライブラリーとハイブリダイズして、遺伝子のフラグメントを含有しているより多くのクローンを単離し得る。このように、体系づけられた様式でこのプロセスを繰り返すことによって、染色体に沿って「歩き」得、そして最終的に全遺伝子のヌクレオチド配列を得ることができる。同様に、オープンリーディングフレームを含む本発明のフラグメントの部分またはゲノムライブラリーから得られるさらなるフラグメントを使用して、cDNAライブラリーをスクリーニングして、本遺伝子の全体コード配列を有するcDNAを得ることができる。反復されたスクリーニングは、必要に応じていくつかのクローンから完全な配列を得るために上記のように利用され得る。次いで、単離物は、ジデオキシヌクレオチド配列決定方法のような標準的な手段によって配列決定して、ヌクレオチド配列を決定するために配列決定され得る（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照のこと）。
本遺伝子は、ラットから単離された。しかし、任意の所望の種（好ましくは哺乳動物、例えばヒト）における相同体は、本明細書中の配列表において示した核酸の配列またはそのフラグメントを含むプローブを用いてヒトライブラリー（ゲノムまたはcDNA）をスクリーニングし、そして好ましくは比較的高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子を単離することにより容易に得ることができる。例えば、高塩条件（例えば、６×SSCまたは６×SSPE中）および／または高温ハイブリダイゼーションが使用され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは代表的には、所定の鎖の長さについてのTm（半分の分子がその対から解離する融点）から約５℃〜約20℃下である。当該分野で公知なように、ハイブリダイズする領域のヌクレオチド組成が、ハイブリッドの融点を決定する際の因子である。例えば、20マープローブについて推薦されるハイブリダイゼーション温度は、代表的には約55〜58℃である。さらに、ラットの配列は、ラットのタンパク質の部分についてのアミノ酸配列を決定して、そして特定の動物における相同体のアミノ酸配列をコードするコドン利用を最適化したプローブを選択することにより、任意の特定の動物における相同体のためのプローブを考案するために利用され得る。任意の単離遺伝子は、遺伝子を配列決定することにより標的遺伝子であると確認され、遺伝子が本明細書中に収載されたヌクレオチド配列を含むことを本遺伝子を含むこととして決定され得る。任意の相同体は、相同体としてその機能性により確認され得る。
さらに、本発明によって、相同領域において、配列表の配列番号５〜75のいずれかにより示されるヌクレオチド配列またはその相同体を含む遺伝子によりコードされるタンパク質をコードする核酸のエキソンにおける領域と98％、95％、90％、85％、80％、70％、60％または50％以上の相同性を有する、任意の所望の種、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒト由来の核酸が、さらに企図される。本発明はまた、配列表の配列番号５〜75のいずれかで示されるヌクレオチド配列またはその相同体を含む核酸のエキソンにおける領域と、相同領域において、98％、95％、90％、85％、80％、70％、60％または50％以上の相同性を有する、任意の所望の種、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト由来の核酸もまた、企図する。これらの遺伝子は、所望であれば、所望の相同性が低減するのに従って低減させ、そしてさらに可変性が検索される任意の領域のGCまたはAT豊度（richness）に依存する、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーで相同体を単離するために使用した同じ方法により、合成され得るかまたは得られ得る。任意の本遺伝子またはその相同体の対立遺伝子変異体は容易に単離され得、そして上記のプロトコル従ってさらなるライブラリーをスクリーニングすることにより配列決定され得る。合成遺伝子を作製する方法は、米国特許第5,503,995号、およびそこで引用される参考文献に記載される。
本発明の任意の選択されたタンパク質をコードする核酸は、そのタンパク質を機能的にコードする任意の核酸でもあり得る。例えば、機能的にコードする（すなわち、核酸の発現を可能にする）ためには、核酸は、外因性または内因性の発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー）、および必要な情報処理部位（例えば、リボソーム結合部、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列）を含み得る。好ましい発現制御配列は、メタロチオネイン遺伝子、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、CMV、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウィルスなどから誘導されるプロモーターであり得る。発現制御配列は、核酸が配置される細胞における機能について選択され得る。選択されたタンパク質をコードする核酸は、選択されたタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、容易に決定され得、そして、明らかに、多くの核酸は、任意の選択されたタンパク質をコードする。
本発明は、本明細書中で収載された任意の配列（すなわち、配列番号５〜75のいずれか）に示されたヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下で、選択的にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。このハイブリダイゼーションは、特異的であり得る。
ハイブリダイズする核酸と核酸がハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、無関係なタンパク質をコードする核酸とのハイブリダイゼーションを排除するのに少なくとも十分であるべきである。従って、本タンパク質コード配列の核酸と選択的にハイブリダイズする核酸は、ストリンジェント条件下では、異なる無関係のタンパク質についての核酸とは選択的にハイブリダイズしないし、また逆もそうである。代表的には、選択的なハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、Tm（半分の分子がその対から解離する融解温度）より約12〜25℃低い温度での高イオン強度溶液（６×SSCまたは６×SSPE）でのハイブリダイゼーションに続く洗浄温度がハイブリッド分子のTmから約５℃〜20℃低くなるように選択された温度および塩濃度の組合せでの洗浄を含む。温度および塩条件は、フィルターに固定化した参照DNAの試料を標識した目的の核酸にハイブリダイズさせ、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において、経験的に容易に決定され得る。ハイブリダイゼーション温度は、代表的には、DNA−RNAおよびRNA−RNAハイブリダイゼーションについて、より高い。洗浄温度は、当該分野で公知なように、選択的なストリンジェンシーを達成するために上記のように使用され得る。（Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989；Kunkelら、Methods Enzymol.1987:154: 367,1987）。任意の所定の核酸に選択的にハイブリダイズする核酸フラグメントは、例えば、さらなるハイブリダイゼーションまたは増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR））についてのプライマーおよび／またはプローブとして使用され得る。DNA：DNAハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×SSCまたは６×SSPE中において約68℃（水溶液中）、続いて68℃における洗浄であり得る。
本発明は、本明細書中において示されるヌクレオチド配列のいずれか（すなわち、配列番号５〜75のいずれか）を含む遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸によって、コードされるタンパク質を、さらに提供する。本タンパク質は、いくつかの手段のいずれかによって、容易に得られ得る。例えば、遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列は翻訳され得、次いで対応するポリペプチドは、機械的に標準的な方法により合成され得る。さらに、遺伝子のコード領域は、発現され得るか、または合成され得、得られたポリペプチドについての特異的な抗体は、標準方法により、惹起され得る（例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, 1988を参照のこと）、そして、タンパク質は、他の細胞性タンパク質から抗体との選択的なハイブリダイゼーションにより単離され得る。このタンパク質は、所望の程度にまでタンパク質精製の標準的な方法により精製され得る（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, 1989を参照のこと）。本発明の任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列は、核酸配列から推論され得、または、単離されたかまたは組換え的に産生されたタンパク質の配列決定によって、決定し得る。
用語「ペプチド」「ポリペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に本明細書中で使用され、そしてアミノ酸のポリマーをいい、そして全長タンパク質およびそのフラグメントを含む。本明細書および請求の範囲において用いられているように「a」は、使用される状況によって、一つ以上を意味し得る。アミノ酸残基は、ペプチド結合においてポリペプチドの化学的消化（加水分解）により形成されるアミノ酸である。本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体の形態である。しかし、所望の機能的な性状がポリペプチドにより保持される限り、「Ｄ」異性体形態の残基は、任意のＬアミノ酸残基に置換され得る。本明細書中では、標準的なポリペプチド命名法（J. Biol. Chem., 243:3552-59（1969）に記載され、そして米国特許施行規則1,822（b）章で採用されている）を使用する。
当業者により理解されるように、本発明はまた、アミノ酸配列または他の性状において軽微な変異を有するそれらのポリペプチドを含む。アミノ酸置換は、中性である公知のパラメーターにより選択され得る（例えば、Robinson WE Jr,およびMitchell WM, AIDS 4：S151-S162（1990））。このような変異は、対立遺伝子の変異（例えば、遺伝的多型のため）として天然に生じ得るか、またはヒトによる介入（例えば、クローン化されたDNA配列の変異誘発（例えば、それは誘導された点変異、欠損、挿入および置換変異）によって）により産生され得る。アミノ酸配列における小さな変化が、通常好ましい（例えば、保存的アミノ酸置換、小さな内部欠失、または挿入、および分子の末端における付加または欠失）。置換は、例えば、Dayhoffらのモデルに基づいて設計され得る（Atlas of Protein Sequence and Structure 1978, Nat’l Biomed Res. Found., Washington, D.C.）。これらの改変は、アミノ酸配列における変化を生じるか、サイレント突然変異を提供するか、制限部位を改変するか、または他の特異的な変異を提供し得る。同様に、このようなアミノ酸変化は、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする異なる核酸を生じる。従って、代替の核酸もまた、このような改変によって企図される。
本発明はまた、本発明の核酸を含有している細胞を提供する。タンパク質をコードする核酸を含有している細胞は、代表的にはDNAを複製し得、さらに、代表的にはコードするタンパク質を発現し得る。細胞は、原核生物細胞（特に核酸を多量に産生する目的のために）、または真核生物細胞（特に哺乳動物細胞）であり得る。生じる産生タンパク質が哺乳類のタンパク質プロセシング改変を有するようなコードされたタンパク質を発現する目的のためには、細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。
本発明の核酸は、任意の選択された手段によって、特に、化合物および標的細胞の送達の目的によって、細胞に送達され得る。多くの送達手段は、当該分野において、周知である。例えば、核への送達のための核局在化シグナルペプチドと組み合わせたエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオンまたはアニオンリポソームおよびリポソームが利用され得る。そして、このことは公知である。
本発明はまた、ウイルス性増殖に必要な変異された細胞性の遺伝子（本方法により産生される）ならびにこれらの変異体を含有している細胞もまた有用であり得ることを企図する。それらを含有するこれらの変異遺伝子および細胞は、単離され得、そして／または本明細書中で記載される方法に従って標準的な方法を使用して産生され得る。
本明細書中で示された配列が微小な配列誤差を含み得ることは理解されるべきである。このような誤差は、例えば、コード配列は、再単離され得、そして再配列決定され得るように、記載された配列由来の種々のプローブを用いる上記のハイブリダイゼーション手順を使用することによって修正され得る。
実施例において記載されるように、本発明は、持続性ウイルス感染細胞の生存のために必要である、血清中に存在する「血清生存因子」の知見を提供する。この因子の単離および特徴付けは、この因子がタンパク質であり、約50kDと100kDとの間の分子量を有し、低いpH（例えば、pH２）およびクロロホルム抽出における不活化に耐性であり、約５分間の煮沸および低イオン強度溶液（例えば、約10mM〜約50mM）によって不活化されることを示した。従って、本発明は、約50kDと100kDとの間の分子量を有する精製哺乳動物血清タンパク質を提供する。このタンパク質は、低いpHにおける不活化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出による不活化に耐性であり、煮沸された場合不活化し、低イオン強度溶液において不活化し、そしてレオウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養から除去された場合、レオウイルスに持続感染した細胞の生存を選択的に実質的に阻害する。上記の物理学的特徴に一致する因子は、この因子を無血清培地（以前は持続性ウイルス感染細胞の生存を維持し得なかった）に添加し、そして添加された推定上の因子を有するこの培地が今や持続性ウイルス感染細胞（特に、レオウイルスに持続感染した細胞）を維持し得るかどうかを決定することにより、容易に実証され得る。本明細書中に使用される場合、「精製」タンパク質は、そのタンパク質が少なくとも、およその分子量が決定され得るほど十分な純度であることを意味する。
タンパク質のアミノ酸配列は、標準的な方法により推定され得る。例えば、タンパク質に対する抗体が惹起され、そして発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されて、タンパク質をコードする核酸配列が得られ得る。次いで、この核酸配列は、対応するアミノ酸配列へ単純に翻訳される。あるいは、タンパク質の一部が標準的なアミノ酸配列決定方法（アミノ末端配列決定）により直接的に配列決定され得る。次いで、このアミノ酸配列は、アミノ酸配列の一部に対する全ての可能なコード配列を含む一連の核酸プローブを生成するために使用され得る。一連のプローブはcDNAライブラリーのスクリーニングをするために使用され、コード配列の残り、および従って最終的には対応するアミノ酸配列が得られる。
本発明はまた、さらなる血清生存因子の検出および単離方法を提供する。例えば、任意の公知の血清成分がウイルス増殖に必要かどうかを決定するために、その公知の成分は培養培地において阻害されるか、または培養培地から除去され得、そして持続性感染細胞が生存しないかどうかを決定することにより、ウイルス増殖が阻害されるかどうかが観察され得る。因子を戻し（または阻害を除去し）、そして因子がウイルスを増殖させるかどうかを決定し得る。
さらに、他の、未知の血清成分もまたウイルス増殖に必須であることが見出され得る。血清は種々の標準的手法により分画され、そして画分は無血清培地に添加されて、以前は血清の欠失により阻害された反応においてウイルスを増殖させる因子が存在するかどうかが決定され得る。次いで、この活性を有する画分は、因子が他の成分を比較的に有さなくなるまで、さらに分画され得る。次いで、因子は標準的な方法（例えば、サイズ分画、種々の手段による変性および／または不活化など）により特徴付けられ得る。好ましくは、一旦因子が所望のレベルの純度まで精製されれば、それは無血清培地中の細胞に添加され、無血清培地単独の場合には増殖しなかったウイルスに増殖させる機能を付与することが確認される。この方法は、任意の所望のウイルスについての特定の因子の要求性を確認するために繰り返され得る。なぜなら、任意の１つのウイルスに必要であると見出された各血清因子が、他の多数のウイルスに必要とされ得るからである。一般に、ウイルスが密接に関連するほど、そしてウイルスの感染様式が類似するほど、１つのウイルスに必要とされる因子が他のウイルスに必要とされるようである。
本発明はまた、本発明者らの知見を利用してウイルス感染を処置する方法を提供する。本明細書中に記載された任意の方法の被験体は、ウイルスに依存して、任意の動物、好ましくはヒトのような哺乳動物、家畜動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ）、または研究動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）であり得る。
本発明は、被験体におけるウイルス感染を減少または阻害し、そしてそれにより処置する方法を提供する。この方法は、被験体に本明細書中に記載された血清タンパク質（すなわち、低いpHにおける不活性化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出による不活化に耐性であり、煮沸された場合に不活化され、低イオン強度溶液において不活化され、そしてウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養物から除去された場合にレオウイルスに持続感染した細胞の少なくともいくつかの生存を妨げる、約50kDと100kDとの間の分子量を有する血清タンパク質）の機能を阻害する組成物の阻害量を投与する工程を含み、それによりウイルス感染を処置する。組成物は、例えば、血清タンパク質に特異的に結合する抗体、または血清タンパク質を機能的にコードする遺伝子によりコードされたRNAに結合するアンチセンスRNAを含み得る。
処置されるべき選択された被験体に感染し得る任意のウイルスが、本方法により処置され得る。上記のように、任意の１つのウイルスの増殖に必要であることが本方法により見出された任意の血清タンパク質または生存因子は、他の多くのウイルスの増殖に必要であることが見出され得る。任意の所定のウイルスについて、血清タンパク質または因子は、本発明に記載の方法によって、増殖に必要であることが確認され得る。レオウイルス、哺乳動物病原体、およびラット細胞系を用いる実施例によって同定された細胞性遺伝子は、公知の全てならびに未だに発見されていないヒト病原体を含む他のウイルス感染への一般的な適用性を有する。これは以下を含むが、それらに限定されない：ヒト免疫不全症ウイルス（例えば、HIV-1、HIV-2）；パルボウイルス；乳頭種ウイルス；ハンタウイルス；インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣウイルス）；肝炎ウイルスＡ〜Ｇ；カリチウイルス；アストロウイルス；ロタウイルス；ヒト呼吸器コロナウイルスのようなコロナウイルス；ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）；エボラウイルス；ヒトヘルペスウイルス（例えば、HSV-1〜9）；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトアデノウイルス；エプスタイン-バーウイルス；ハンタウイルス；動物については、上で列記したヒトウイルスのいずれかの動物対応物、動物レトロウイルス（例えば、サル免疫不全症ウイルス、トリ免疫不全症ウイルス、ウシ免疫不全症ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節脳炎ウイルスまたはビスナウイルス）。
組成物のタンパク質阻害量は、例えば、種々の用量を細胞または被験体に投与し、次いで血液の量または被験体の体重に従って、タンパク質を阻害するための有効量を調整することにより、容易に決定され得る。タンパク質に結合する組成物は、タンパク質ゲル上で推定上の結合タンパク質を泳動すること、およびゲルでのタンパク質の移動の変化を観察することにより、容易に決定され得る。タンパク質の阻害は、任意の所望の手段（例えば、持続感染した細胞を維持するために使用される完全培地にインヒビターを添加し、そして細胞の生存度を観察すること）により決定され得る。組成物は、例えば、血清タンパク質に特異的に結合する抗体を含み得る。抗体による特異的結合は、因子を血清から選択的に除去するため、または因子の生物学的活性を阻害するためにこの抗体が使用され得、そして放射性免疫アッセイ（RIA）、バイオアッセイ、または酵素結合免疫吸着（ELISA）技術によって容易に決定され得ることを意味する。組成物は、例えば、血清タンパク質をコードする遺伝子によってコードされるRNAに特異的に結合するアンチセンスRNAを含み得る。アンチセンスRNAは、標準的な方法により合成および使用され得る（例えば、Antisense RNA and DNA, D. A. Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1988））。
本発明の方法は、ウイルス感染を処置するための化合物をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、細胞におけるウイルスの複製には必要であるが、細胞の生存には必須ではない遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含む細胞に、化合物を投与する工程、産生された遺伝子産物のレベルを検出する工程を含み、遺伝子産物の減少または除去は、ウイルス感染を処置するための化合物を示す。本発明の方法はまた、ウイルス感染の処置に効果的である化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、細胞におけるウイルスの複製には必要であるが、細胞の生存には必須ではない遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含む細胞に化合物を投与する工程、そして産生された遺伝子産物のレベルを検出する工程を含み、遺伝子産物の減少または除去は、ウイルス感染を処置するために効果的な化合物を示す。細胞性遺伝子は、例えば、本明細書中に提供される任意の遺伝子（すなわち、配列番号１から配列番号75のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む任意の遺伝子）、またはそのような遺伝子を得るための本明細書中に提供される方法を用いて得られる任意の他の遺伝子であり得る。遺伝子産物のレベルは、任意の標準的な手段（例えば、タンパク質に対して特異的な抗体での検出による）によって測定され得る。遺伝子産物のレベルは、化合物に接触していないコントロール細胞における遺伝子産物のレベルと比較され得る。遺伝子産物のレベルは、化合物の添加の前の同じ細胞における遺伝子産物のレベルと比較され得る。同様に、遺伝子の調節領域は、レポーター遺伝子に機能的に連結され、そして化合物はレポーター遺伝子の阻害についてスクリーニングされ得る。このようなレポーター構築物は、本明細書中に記載される。
本発明は、血清の非存在下で第１の期間生存し得る動物細胞培養物から、ウイルスに持続感染した細胞を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、血清の非存在下では持続感染細胞が生存し得ない第２の期間細胞培養物を血清の非存在下で増殖させる工程、それにより細胞培養物からウイルスに持続感染した細胞を選択的に除去する工程、を含む。第２の期間は、第１の期間よりも短くあるべきである。従って、標準的な培養培地組成物から一定の期間血清を除去し（例えば、培養容器から血清含有培地を単純に除去し、細胞を洗浄し、そして無血清培地を容器に戻すことによる）、次いで、血清飢餓の時間の後に、培養培地に血清を戻し得る。あるいは、血清飢餓の工程の代わりに培養物からの血清生存因子を阻害し得る。さらに、その代わりに、ウイルス-因子相互作用を妨害し得る。このようなウイルス除去方法は、培養細胞についてそれらがウイルスを有さないままであることを確認するために、定期的に行われ得る。血清除去の期間は、非常に多様であり得、代表的な範囲は約１日〜約30日である；好ましい期間は約３日〜約10日であり得、そしてより好ましい期間は、約５日〜約７日であり得る。この期間は、血清の非存在下で生存する特定の細胞の能力ならびにウイルスの生活環（例えば、レオウイルスについては約24時間の生活環を有し、細胞の３日間の飢餓が劇的な結果を提供する）に基づいて選択され得る。
さらに、期間はまた、細胞を飢餓の間に継代することにより、短縮され得る；一般に、継代の数の増加は、培養からのウイルスの完全な除去を得るために必要な血清飢餓（または血清因子阻害）の時間を減少し得る。継代の間に、細胞は、代表的には血清に短時間曝露される（代表的には約３〜約24時間）。この曝露は、細胞を移動させるために使用されたトリプシンの作用を停止させて、そして細胞を別の増殖サイクルへ刺激し、従ってこの選択プロセスを補助する。従って、飢餓／血清サイクルは、選択効果を最適にするために繰り返され得る。他の標準的な培養パラメータ（例えば、培養物のコンフルエンス、pH、温度など）は、血清飢餓（または血清生存因子阻害）に必要な期間を変更するために多様であり得る。この期間は、任意の所定のウイルス感染について、単純に血清を種々の期間除去し、次いで各試験期間で培養物を感染細胞の存在について試験し（例えば、血清の非存在下で生存する能力により、そして標準的なウイルス力価測定および免疫組織学的技術により、細胞におけるウイルスを定量することにより確認される）、次いで血清欠乏のどの期間でウイルス感染細胞が除去されたかを検出することにより、容易に決定され得る。依然として持続性感染細胞の除去を提供するより短い血清欠乏期間が使用されることが好ましい。さらに、飢餓、次いで血清の再度の添加、および培養において残っているウイルスの量の決定のサイクルは、ウイルス感染細胞が培養において存在しなくなるまで繰り返され得る。
従って、本方法は、さらに細胞の継代（すなわち、細胞培養を第１の容器から第２の容器へ移すこと）を含む。このような移動は、ウイルス感染細胞の生存の選択的な欠失を促進し得る。移動は数回繰り返され得る。移動は、組織培養の標準的な方法により達成される（例えば、Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 第２版、Alan R. Liss, Inc., New York, 1987を参照のこと）。
本方法はさらに、細胞培養物からウイルスで持続感染した細胞を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、低いpHにおける不活化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出に耐性であり、煮沸された場合に不活化され、低イオン強度溶液において不活化され、そしてレオウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養から除去された場合にはレオウイルスに持続感染した細胞の生存を実質的に妨げる、約50kDと100kDの間との分子量を有する血清タンパク質の機能的形態の非存在下で細胞培養物を増殖させる工程を含む。機能的形態の非存在は、いくつかの標準的な手段のいずれか（例えば、タンパク質を、そのタンパク質に対して選択的な抗体に結合させること（血清が細胞に添加される前または後のいずれかにおける血清中の抗体に結合させること；前である場合、血清タンパク質は、例えば、抗体をカラムに結合させ、そして血清にカラムを通過させ、次いで生存タンパク質を有さない血清を細胞に投与することにより血清から除去され得る）、タンパク質を不活化する化合物を投与すること、またはウイルスとタンパク質との間の相互作用を妨害する化合物を投与すること）により達成され得る。
従って、本発明は、血清含有培地において増殖した細胞培養物から、ウイルスに持続感染した細胞を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、低いpHにおける不活化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出に耐性であり、煮沸された場合に不活化され、低イオン強度溶液において不活化され、そしてレオウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養から取り出された場合にレオウイルスに持続感染した細胞の生存を実質的に阻害する、約50kDと100kDとの間の分子量を有するタンパク質を、血清中で阻害する工程を含む。あるいは、ウイルスと血清タンパク質との間の相互作用は破壊され、ウイルスに持続感染した細胞が選択的に除去され得る。
いくつかの形態の持続感染が可能な任意のウイルスが、本発明の除去方法を利用して、細胞培養物から除去され得る。この方法は、血清タンパク質の除去、阻害またはそうでなければ妨害（例えば、本明細書中に例示されたように）を含み、そしてまたウイルス増殖には必要であるが細胞には必須でない、本発明の方法によって見出された任意の細胞性遺伝子からの遺伝子産物の除去、阻害またはそうでなければ妨害を含む。例えば、DNAウイルスまたはRNAウイルスが標的とされ得る。選択されたウイルスに感染した細胞が血清の除去により培養物から選択的に除去されるかどうかは、血清のウイルスに許容的な細胞を飢餓（または血清生存因子を阻害する）させ、選択されたウイルスを細胞に添加し、培養物に血清を添加し、そして感染細胞が死滅するかどうかを観察することにより（すなわち、ウイルスに対して特異的な抗体で生存細胞におけるウイルスのレベルを力価測定することにより）、容易に決定され得る。
血清の非存在下である期間維持され得る任意の動物細胞の培養物（すなわち、代表的には血清における培養において増殖および維持される任意の細胞）は、本発明の方法を利用してウイルス感染から精製され得る。例えば、初代培養物ならびに樹立された培養物および細胞株が使用され得る。さらに、培養され得、そして血清の非存在下である期間維持され得る、任意の動物由来およびその動物中の任意の組織または細胞型由来の細胞の培養物が使用され得る。例えば、代表的には、感染性ウイルスに感染した、そして特に持続感染した組織由来の細胞の培養物が使用され得る。
本願の請求の範囲で使用される場合、「血清の非存在下」とは、持続的にウイルス感染した細胞が生存しないレベルを意味する。代表的には、閾値レベルは培地中で約１％の血清である。従って、約１％以下の血清が使用され得、例えば、約１％、0.75％、0.50％、0.25％、0.1％の血清、または無血清が使用され得る。
本明細書中で使用される場合、ウイルスに持続的に感染した細胞を「選択的に排除する」とは、ウイルスに持続的に感染した実質的に全ての細胞が死滅し、その結果、排除手順が実施された直後の培養物中にウイルス感染細胞の存在が検出され得ないことを意味する。さらに、「選択的に排除する」は、ウイルスに感染していない細胞が、この方法によって一般的には死滅しないことを包含する。いくつかの生存細胞は、低レベルではあるがウイルスをなお産生し得、そしていくつかはウイルスにより死滅へと導かれる経路が不完全であり得る。代表的には、ウイルスに持続的に感染した細胞が実質的に全て死滅するには、培地中の約90％を上回る細胞、そしてより好ましくは約95％、98％、99％、または99.99％を下回るウイルス含有細胞が死滅する。
本方法はまた、任意の遺伝子の調節領域を含む核酸を提供する。そのような調節領域は、上記のように単離および配列決定されたゲノム配列から単離され得、そしてその種の調節領域に特徴的な任意の観察される特徴によって、およびその遺伝子のコード領域の開始コドンとそれらとの関係によって同定され得る。本発明はまた、レポーター遺伝子に機能的に連結した調節領域を含む構築物を提供する。そのような構築物は日常的なサブクローン化方法によって作製され得、そして多くのベクターが入手可能であり、その中で調節領域がマーカー遺伝子の上流にサブクローン化され得る。マーカー遺伝子は、マーカー遺伝子産物の検出を容易にするように選択され得る。
従って、本方法はまた、ウイルス感染を処置するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、任意の上記構築物（レポーター遺伝子に機能的に連結した、配列番号１〜配列番号75のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の１つの調節領域を含む）を含有する細胞に化合物を投与する工程、および産生されるレポーター遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、レポーター遺伝子産物の減少または排除は、ウイルス感染を処置するための化合物を示す。この方法によって検出された化合物は、遺伝子（そこから調節領域が単離された）の転写を阻害し、従って、被検体の処置において、この遺伝子によって産生される遺伝子産物の産生を阻害し、従ってウイルス感染を処置する。
本発明はさらに、被検体におけるウイルス感染を減少または阻害する方法を提供し、この方法は、配列番号１〜配列番号75のいずれかに示される核酸を含む遺伝子またはそのホモログによってコードされる遺伝子産物の発現または機能化を阻害する量の組成物を被検体に投与する工程を包含し、それによってウイルス感染を処置する。組成物は、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質を結合する抗体を含み得る。組成物はまた、遺伝子によってコードされるタンパク質のレセプターを結合する抗体を含み得る。そのような抗体は、標準的な方法によって選択したタンパク質に対して惹起され得、そしてポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得るが、モノクローナルが好ましい。あるいは、組成物は、遺伝子によってコードされるRNAを結合するアンチセンスRNAを含み得る。さらに、組成物は、遺伝子によってコードされるRNAを結合するアンチセンスRNAを機能的にコードする核酸を含み得る。他の有用な組成物は、当業者には容易に明らかである。
本発明はさらに、被検体においてウイルス感染を減少または阻害する方法を提供し、この方法は、被検体からの選択した細胞中で、配列番号１〜配列番号75のいずれかに示される核酸を含む内因性遺伝子またはそのホモログを、遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない遺伝子形態、または遺伝子の機能的遺伝子産物の減少した量を産生する遺伝子形態へとエクスビボで変異させる工程、およびその細胞を被検体の中に戻す工程を包含し、それによって被検体における細胞のウイルス感染を減少させる。特定のウイルス（その感染が減少、防止、または阻害される）の代表的な標的細胞に従って、細胞は選択され得る。いくつかのウイルスに好ましい細胞は造血細胞である。選択した細胞が造血細胞である場合、感染が減少または阻害され得るウイルスには、例えば、HIV（HIV-1およびHIV-2を含む）が挙げられ得る。
本発明はまた、被検体においてウイルス感染を減少または阻害する方法を提供し、この方法は、被検体からの選択した細胞中で、（a）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、血清含有培地中で増殖する細胞培養物中に移入すること、（b）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること、（c）培養培地から血清を除去すること、（d）細胞培養物をウイルスに感染させること、および（e）マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を生存細胞から単離すること、を包含する方法によって単離された核酸を含む内因性遺伝子を、遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない変異した遺伝子形態、または遺伝子の機能的遺伝子産物の減少した量を産生する変異した遺伝子形態へとエクスビボで変異させる工程、およびその細胞を被検体の中に戻す工程を包含し、それによって被検体における細胞のウイルス感染を減少させる。従って、変異した遺伝子形態は、例えば、機能的タンパク質もしくはmRNAの有効量を産生し得ない遺伝子形態であり得るか、または機能的タンパク質もしくはmRNAを産生し得ない遺伝子形態であり得る。この方法は実施され得、ここでウイルスはHIVである。この方法は、任意の選択した細胞（ウイルスが有害な結果を伴って感染し得る）において実施され得る。例えば、細胞は、造血細胞であり得る。しかし、多くの他のウイルスと細胞との組合せが、当業者には明らかである。
本発明はさらに、被検体においてウイルス感染耐性を増加させる方法を提供し、この方法は、被検体からの選択した細胞中で、（a）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、血清含有培地中で増殖する細胞培養物中に移入すること、（b）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること、（c）培養培地から血清を除去すること、（d）細胞培養物をウイルスに感染させること、および（e）マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を生存細胞から単離すること、を包含する方法によって単離された核酸を含む内因性遺伝子を、遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない変異した遺伝子形態、または遺伝子の機能的遺伝子産物の減少した量を産生する遺伝子形態へとエクスビボで変異させる工程、およびその細胞を被検体の中に戻す工程を包含し、それによって被検体における細胞のウイルス感染を減少させる。ウイルスは、特に細胞が造血細胞である場合、HIVであり得る。しかし、多くの他のウイルスと細胞との組合せが当業者には明らかである。
本発明は、細胞における悪性表現型を抑制し得る細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（a）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、軟寒天またはMatrigel中で良好に増殖し得ない細胞培養物中に移入する工程、（b）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、および（c）マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を、軟寒天またはMatrigel中で増殖し得る選択した細胞から単離する工程を包含し、それによって細胞における悪性表現型を抑制し得る遺伝子を同定する。この方法は、任意の選択した非形質転換細胞株を使用して実施され得、その多くは当業者に公知である。
本発明はさらに、細胞における悪性表現型を抑制し得る細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（a）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、非形質転換細胞の細胞培養物中に移入する工程、（b）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、および（c）マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を、選択および形質転換した細胞から単離する工程を包含し、それによって細胞における悪性表現型を抑制し得る遺伝子を同定する。非形質転換表現型は、当該分野における任意のいくつかの標準的方法によって決定され得、例えば、軟寒天中で増殖し得ないこと、またはMatrigel中で増殖し得ないことで例示される。
本発明はさらに、細胞における悪性表現型を抑制するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、細胞における悪性表現型の確立に関与する遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含有する細胞に化合物を投与する工程、および産生される遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、遺伝子産物の減少または排除は、悪性表現型の抑制のために有効な化合物を示す。産生される遺伝子産物のレベルまたは量の検出は、タンパク質のレベルまたは量をアッセイするための、そして特定の遺伝子産物に基づいて選択される、当該分野において標準的な任意のいくつかの方法（例えば、タンパク質ゲル、抗体に基づくアッセイ、標識RNAの検出）によって、直接的または間接的に測定され得る。
本発明はさらに、被検体における細胞の悪性表現型を抑制する方法を提供し、この方法は、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、もしくは配列番号83に示される核酸を含む遺伝子またはそのホモログによってコードされる遺伝子産物の発現または機能化を阻害する量の組成物を被検体に投与する工程を包含し、それによって悪性表現型を抑制する。組成物は、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質を結合する抗体を含み得る。別の例として、組成物は、遺伝子によってコードされるタンパク質のレセプターを結合する抗体を含み得る。組成物は、遺伝子によってコードされるRNAを結合するアンチセンスRNAを含み得る。さらに、組成物は、遺伝子によってコードされるRNAを結合するアンチセンスRNAを機能的にコードする核酸を含み得る。
本発明の診断剤または治療剤は、治療剤または診断剤をその選択部位に投与するための多くの任意の標準的手段、またはその型の機能性物質（functional entity）を投与するための標準法によって、被検体または動物モデルに投与され得る。例えば、薬剤は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、局所的、経皮的などで投与され得る。薬剤は、例えば、カチオン性リポソームとの複合体として、またはアニオン性リポソーム中にカプセル化されて投与され得る。組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた種々の量の選択した薬剤を含み得、そしてさらに、所望であれば、他の医薬品、薬剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。非経口投与（使用される場合）は、一般的に注射によって特徴付けられる。注射可能物質は、液体の溶液もしくは懸濁液として、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するに適した固体形態として、またはエマルジョンとしてのいずれかの、従来の形態で調製され得る。投与の様式に依存して、薬剤は、被検体の中での分解を避けるために、例えば、カプセル化などによって最適化される。
投薬は、投与の様式、処置される疾患または状態、および個々の被検体の状態に依存するが、抗ウイルス剤または抗ガン剤の投与について代表的であり、かつ投与において使用される投薬である。投薬はまた、投与される組成物（例えば、タンパク質または核酸）に依存する。そのような投薬は当該分野で公知である。さらに、投薬は、処置される特定の疾患または状態について代表的な投薬に従って調整され得る。さらに、標的細胞型の培養細胞中のウイルス力価が、インビボでの標的細胞についての投薬を最適化するために使用され得、そして標的細胞型と同じ型の培養細胞中で達成される変化する投薬からの形質転換はモニターされ得る。しばしば、単一投薬が充分であり得る；しかし、所望であれば投薬は反復され得る。投薬は、有害な副作用を引き起こす程に大きくあるべきではない。一般的に、投薬は、年齢、状態、性別、および被検体における疾患の程度によって変化し、そして当業者によって決定され得る。投薬はまた、任意の合併症の場合には個々の医師によって調整され得る。
被検体の中の細胞への投与については、組成物は、一旦被検体の中に入れば、当然ながら被検体の体温に順応する。エクスビボ投与については、組成物は、細胞の生存性を維持する任意の標準的な方法によって（例えば、組成物を（標的細胞に適切な）細胞培地に添加し、そしてこの培地を細胞に直接的に添加することによって）投与され得る。当該分野で公知であるように、この方法で使用される任意の培地は、細胞を非生存性にしないために水性かつ非毒性であり得る。さらに、培地は、所望であれば、細胞の生存性を維持するための標準的な栄養素を含有し得る。インビボ投与については、複合体は、例えば、患者由来の血液サンプルもしくは組織サンプルに、または薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水および緩衝化生理食塩水）に添加され得、そして当該分野で公知の任意のいくつかの手段によって投与され得る。投与の例には、非経口投与（例えば、標的細胞を有する組織もしくは器官に送血する血管を介する局部灌流を含む静脈内注射、またはエアロゾル吸入、皮下注射または筋肉内注射）、局所的投与（例えば、皮膚の創傷または損傷への）、例えば、移植のために調製された骨髄細胞への直接トランスフェクションおよびそれに続く被検体への移植、ならびに器官（続いて被検体に移植される）への直接トランスフェクションが挙げられる。さらなる投与方法には、経口投与（特に、組成物がカプセル化される場合）、または直腸投与（特に、組成物が坐剤形態である場合）が挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアには、生物学的もしくは他の点で望ましくないことのない任意の物質が挙げられ、すなわち、この物質は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすか、または薬学的組成物（その中にこの物質が含有される）の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することなく、選択した複合体と共に個体に投与され得る。
特に、インビボで特定の細胞型が、例えば、器官または腫瘍の局部灌流によって標的化される場合、標的組織由来の細胞が生検され得、そしてその組織への複合体の移入のための最適の投薬が、本明細書中に記載されかつ当該分野で公知なようにインビトロで決定され得、インビボ投薬（濃度および時間の長さを含む）を最適化し得る。あるいは、同じ細胞型の培養細胞はまた、インビボでの標的細胞についての投薬を最適化するために使用され得る。
エクスビボ使用またはインビボ使用のいずれかについては、複合体は、任意の有効濃度で投与され得る。有効濃度は、ウイルス感染の減少、阻害、もしくは防止を生じるか、または細胞の形質転換された表現型の減少もしくは阻害を生じる量である。
核酸は、任意のいくつかの手段で投与され得、これは、利用されるベクター、（もしあれば）標的化される器官または組織、および被検体の特徴に従って選択され得る。核酸は、生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリア中で所望される場合、静脈内、動脈内、経口、非経口、皮下のように、全身的に投与され得る。核酸はまた、器官への直接注射によって、または標的組織に送血する血管への注射によって投与され得る。肺または気管の細胞の感染については、それは気管内投与され得る。核酸はさらに、局所的、経皮的などで投与され得る。
核酸またはタンパク質は、組成物中で投与され得る。例えば、組成物は、他の医薬品、薬剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。さらに、組成物は、ベクターに加えて、リポソームのような脂質（例えば、カチオン性リポソーム（例えば、DOTMA、DOPE、DC-コレステロール）またはアニオン性リポソーム）を含み得る。リポソームはさらに、所望される場合、特定の細胞の標的化を促進するためのタンパク質を含み得る。ベクターおよびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に輸入される血液に投与され得るか、または気道の細胞を標的化するために気道内に吸入され得る。リポソームに関しては、例えば、Brighamら、Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100（1989）；Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417（1987）；米国特許第4,897,355号を参照のこと。
核酸を含むウイルスベクターについては、組成物は、リン酸緩衝化生理食塩水または生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。ウイルスベクターは、当該分野で公知であるように、標的細胞に従って選択され得る。例えば、アデノウイルスベクター、特に複製欠陥アデノウイルスベクターが、その広い宿主域の理由で、任意の多数の細胞を標的化するために利用され得る。多くの他のウイルスベクターが利用可能であり、そしてそれらの標的細胞が公知である。
実施例
細胞培養物からのウイルス感染細胞の選択的排除
ラット腸管細胞株-1細胞（RIE-1細胞）を、10％ウシ胎児血清が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）中で標準的に増殖させた。実験を開始するために、レオウイルスで持続的に感染させた細胞をコンフルエンス付近まで増殖させ、次いで培地を除去し、PBS中で細胞を洗浄し、そして血清を添加していないフラスコ培地へ戻すことにより、血清を、増殖培地から除去した。代表的には、血清含量を１％以下まで減少させた。細胞を、数日間または約１ヶ月程の期間、血清について飢餓状態にして、それらを静止状態または増殖停止にする。次いで、10％血清を含む培地を静止状態の細胞に添加して、細胞の増殖を刺激する。生存している細胞が、細胞が任意の感染性ウイルスを含むか否か確証するために使用される免疫組織化学的技術（ホモジナイズされた細胞の１mlあたり１感染性ウイルスの感度）により、持続的に感染した細胞ではないことが見出される。
細胞ゲノムDNA単離
遺伝子トラップライブラリー：RIE-1細胞を、10細胞あたり１未満のレトロウイルスの比で、レトロウイルスベクター（U3遺伝子-トラップ）を用いて感染させることによりライブラリーを生成する。U3遺伝子トラップレトロウイルスが活性に転写される遺伝子内に組み込まれた場合、U3遺伝子トラップレトロウイルスがコードするネオマイシン耐性遺伝子もまた転写され、これは細胞に抗生物質ネオマイシンに対する耐性を与える。遺伝子トラップ事象を伴う細胞は、ネオマイシンへの曝露に対して生存し得るが、遺伝子トラップ事象を伴わない細胞は死滅する。次いで、ネオマイシン選択から生存する種々の細胞を、遺伝子トラップ事象のライブラリーとして増殖する。このようなライブラリーを、後の同定のために遺伝子をタグする、転写的に活性な細胞プロモーター由来のレポーター遺伝子を発現する特性を有する任意のレトロウイルスベクターを用いて生成し得る。
レトロウイルス選択：レトロウイルス感染は、代表的には、RIE-1細胞に対して致死性であるが、持続的に感染した細胞の発生を生じ得る。これらの細胞は、増殖を続ける一方、感染性レオウイルス粒子を産生する。レオウイルス耐性を細胞に与える遺伝子トラップ事象の同定のために、持続的に感染した細胞を排除しなければならないか、またはそれらを偽ポジティブとして記録する。本発明者らは、レオウイルスに持続的に感染したRIE-1細胞が血清の飢餓、継代、低密度でのプレーティングに対して非常に耐性に乏しいことを見出した。従って、本発明者らは、レオウイルス感受性細胞およびレオウイルスで持続的に感染した細胞の両方を選択するRIE-1遺伝子トラップライブラリーをスクリーニングするためのプロトコルを開発した。
１．RIE-1ライブラリー細胞をコンフルエンス付近まで増殖させ、次いで、血清を培地から除去する。細胞を、数日間血清について飢餓状態にして、それらを静止状態または増殖停止にする。
２．ライブラリー細胞を１細胞あたり10より大きいレオウイルスの力価でレオウイルスに感染させ、そして血清飢餓をさらに数日間続ける。
３．感染した細胞を継代し（それらが３〜６時間血清に曝されるプロセス）、次いでさらに数日間血清について飢餓状態にする。
４．次いで、生存している細胞を、血清の存在下、それらを限界希釈によりクローン化する点において目に見えるコロニーが発達するまで増殖させる。
培地：ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（DME/高）Hyclone Laboratoriesカタログ番号SH30003.02.
ネオマイシン：U3遺伝子トラップレトロウイルスを有しない細胞を選択するために使用される抗生物質。本発明者らは、ゲンタマイシン（Sigma. カタログ番号G9516より）を使用した。
ラット腸管細胞株-1細胞（RIE-1細胞）：これらの細胞は、Ray Dubois博士（VAMC）の研究室由来である。それらを、代表的には、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養する。
レオウイルス：セロタイプ１またはセロタイプ３のいずれかの研究室の株を使用する。これらは、本来Bernard N.Fields（故人）の研究室から得た。これらのウイルスは詳細に記載されている。
レトロウイルス：本明細書中で使用されるU3遺伝子トラップレトロウイルスは、Earl Ruley博士（VAMC）により開発され、そしてライブラリーを彼により示唆された一般的なプロトコルを使用して生成した。
血清：ウシ胎児血清Hyclone laboratoriesカタログ番号A-1115-L。
ウイルス感染のために必要な遺伝子
いくつかの単離した配列の特徴は、以下を含む：
配列番号１：液胞H+ATPaseのラットゲノム配列（遺伝子産物の活性を化学的に阻害することは、インフルエンザウイルスおよびレオウイルスに対する耐性を生じる）
配列番号２：ラットαトロポミオシンゲノム配列
配列番号３：マウスおよびラットのgas5遺伝子のラットゲノム配列（細胞周期調節遺伝子）
配列番号４：ras複合体のp162のラットゲノム配列、マウス、ヒト（細胞周期調節遺伝子）
配列番号５：N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ mRNAに類似、マウス、ヒト（細胞内のゴルジ領域に位置する酵素；DNA含有ウイルスの一部として見出されている）
配列番号６：カルサイクリンに類似、マウス、ヒト、逆相補物（reverse complement）（細胞周期調節遺伝子）
配列番号７：以下に類似する配列を含む：遺伝子座AA254809 364bp mRNA EST DEFINITION mz75a10.r1 Soaresマウスリンパ節NbMLN Mus musculus cDNAクローン719226 5’
配列番号８：番号SW：RSP1_MOUSE Q01730 RSP-1タンパク質に類似する配列を含む
配列番号９：gb|U25435|HSU25435ヒト転写リプレッサー（CTCF）mRNAの5’UTRを含む、完全cds、長さ＝3780
配列番号38：レトロウイルス起源のcDNAに類似
配列番号50：トラップされたAYU-6遺伝エレメント
悪性表現型を抑制する細胞遺伝子の単離
本発明者らは、形質転換していない細胞（RIE-1の親）の集団から形質転換した表現型を有する細胞株（潜在的に腫瘍細胞である）を選択する、遺伝子トラップ方法を利用している。親細胞株であるRIE-1は、軟寒天において増殖するかまたはマウスにおいて腫瘍を生成する能力を有しない。遺伝子トラッピングに続いて、細胞を、軟寒天において増殖するそれらの能力についてスクリーニングした。これらの細胞をクローン化し、そしてゲノム配列は得られた5’または3’のレトロウイルスベクターであった（配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83）。全ての細胞株は、マウス中で腫瘍を誘導するので、腫瘍細胞株であるかのように振る舞う。
細胞株中、２株がプロスタグランジン合成遺伝子IIまたはCOX2の増幅された発現と関連する。COX2遺伝子は、ヒトにおける前ガン状態のアデノーマにおいて上昇し、そしてヒト大腸癌において過剰発現されることが見出されている。COX2発現のインヒビターはまた、腫瘍の増殖を阻止する。細胞株の１つであるx18（配列番号76）は、EST（dbest）データベースに現在表される破壊された遺伝子を有するが、この遺伝子は公知でない（GenBankに存在しない）。
（配列番号76）：>02-X18H-t7..、以下と1.0e-114で同一：gb|W55397|W55397 mb13h04.r1 Life Techマウス脳Mus。X18はまた、見出されている同一のESTを有するベクターから配列決定されている。（配列番号77）：>x8_b4_2..（配列番号78）：>x7_b4..（配列番号79）：>x4-b4..（配列番号80）：>x2-b4...（配列番号81）：>x15-b4..（配列番号82）：>x13-re..、逆相補物。（配列番号83）：>x12_b4..
提供されたヌクレオチド配列が単離される各々の遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子を表す。配列番号76に記載される配列である核酸を含む遺伝子以外の破壊された遺伝子が形質転換された表現型を抑制し得る機構は、現在は未知である。しかし、各々の遺伝子は、公知の遺伝子に対応するゲノム配列が存在しないので、潜在的に独特である腫瘍サプレッサー遺伝子を表す。腫瘍サプレッサー遺伝子を迅速に選択する能力は、ガンを処置するかまたは予防するプロセス（診断的試験について可能性がある）における独特の標的を提供し得る。
ゲノム遺伝子全体の単離
本発明の単離された核酸（その配列は、配列番号１〜配列番号83のいずれかに記載される）、またはより小さいそのフラグメントを、検出可能な標識により標識化し、そしてプローブとして使用して高ストリンジェンシーな（即ち、ハイブリダイゼーションを生成するための高塩濃度および高温ならびに洗浄温度５〜20℃）条件下でラットゲノムライブラリー（λファージまたは酵母人口染色体ベクターライブラリー）をスクリーニングする。クローンを単離し、標準的なSangerジデオキシヌクレオチド配列決定法をにより配列決定した。一旦、新規なクローンの配列全体を決定し、これをプローブ配列と整列させ、そしてプローブ配列に対するその配向性を決定した。第二および第三のプローブを、組み合わせたゲノム配列のいずれかの末端由来の配列を使用して、それぞれ設計した。これらのプローブを使用して、ライブラリーをスクリーニングし、新規なクローンを単離し、このクローンを配列決定した。これらの配列を、以前に得られた配列およびいずれかの末端の配列に対応して設計された新規なプローブと整列させ、そしてプロセス全体を、遺伝子全体が単離されてマップされるまで繰り返した。配列の一端が全く新規なクローンを単離し得ない場合、新規なライブラリーがスクリーニングされ得る。完全な配列は、5’末端に調節領域および3’末端にポリアデニル化シグナルを含む。
cDNAの単離
オープンリーディングフレームを含む、単離された核酸（その配列は、配列番号１〜配列番号83のいずれかに記載され、そして好ましくは、配列番号５〜配列番号83のいずれかに記載される）、またはより小さなそのフラグメント、あるいはゲノムライブラリーから得られたさらなるフラグメントを、検出可能な標識により標識化し、そしてプローブとして使用して本発明のフラグメントの一部をスクリーニングし、cDNAライブラリーをスクリーニングする。ラットcDNAライブラリーはラットcDNAを得て；ヒトcDNAライブラリーはヒトcDNAを得る。上記のように、繰り返されるスクリーニングを使用して、必要であればいくつかのクローン由来の遺伝子の完全なコード配列を獲得し得る。次いで、単離物を配列決定して、標準的な手段（例えば、ジデオキシヌクレオチド配列決定法）によりヌクレオチド配列を決定し得る。
血清生存因子の単離および特徴付け
血清飢餓に対する耐性の欠如は、血清中に存在する血清因子（生存因子）についての持続的に感染した細胞の後天的な依存に起因する。持続的に感染した細胞のための血清生存因子は、50と100kDの間の分子量を有し、そして低いpH（pH２）およびクロロホルム抽出における不活性化に抵抗する。これは、５分間煮沸し［一旦、全血清から分画される（50〜100kD画分）］、そして低イオン強度の溶液［10〜50mM］中に入れることにより不活性化される。
因子を、30〜100kdの排除サイズを有するcentriprep分子カットオフフィルター（MilliporeおよびAmnicon）を使用するサイズ分画、および50kdの分子排除を有する透析チューブ（dialysis tubing）により、血清から単離した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色を使用して、全ての得られた物質が50と100kdの間であることを決定した。このことは、最初の単離の妥当性を確証する。さらなる精製を、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリン硫酸吸着カラム、続いてHPLCを使用して実施した。血清画分（30〜100kd画分）のpHを異なるpH条件にHClを使用して調製し、生物学的活性の評価の前にpHをpH7.4に再調整した後に、活性を決定した。活性を含む画分を低イオン強度溶液に種々の長さの時間で透析し、そして画分を培地に対して透析することにより生物学的活性を決定する前にイオン強度を生理学的条件に再調整することにより、低イオン強度の感度を決定した。生物学的活性はクロロホルム抽出後の水溶液中で維持され、このことは、因子が脂質でないことを示す。生物学的活性は、30〜100kd画分を100℃の水浴に５分間置いた後に失われた。
単離された核酸分子
単離されたタグ化ゲノムDIASを、Sangerジデオキシヌクレオチド配列決定法を使用する標準的な方法により配列決定した。これらの核酸のヌクレオチド配列を、本明細書中で、配列番号１〜配列番号75（ウイルス感染遺伝子）および配列番号76〜配列番号83（腫瘍サプレッサー遺伝子）として記載する。配列を、相同性検索におけるコンピューターデータバンクにかけた。いくつかの「6b」配列［ゲノムライブラリー６から得られる、フラスコb］（即ち、配列番号37、38、39、42、61、65、66、69）についての配列は、既知の遺伝子であるαトロポミオシンに対応し、そして他のいくつかは、液胞H+-ATPaseに対応する。これらの配列は、急性および持続性ウイルス感染の両方に関連し、そしてこれら（即ち、αトロポミオシンおよび液胞H+-ATPase）を含む細胞遺伝子は、上記の方法を使用するウイルス感染のための薬物処置の標的であり得る。特に、１つまたは両方の対立遺伝子の破壊が生存可能な細胞を生じるので、これらの遺伝子は治療標的であり得る。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：バンダービルト  ユニバーシティ
カークランド  ホール  305
ナッシュビル，テネシー州  37240
(ii)発明の名称：ウイルス感染に関する遺伝子
(iii)配列数：83
(iv)連絡住所：
(A)名称：ニードル  アンド  ローゼンバーグ，P. C.
(B)番地：ピーチツリー  ストリート  127，スイート  1200
(C)市：アトランタ
(D)州：ジョージア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：30303-1811
(ｖ)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピー ディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0，バージョン #1.30
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：セルビー，エリザベス
(B)登録番号：38,298
(C)照会／記録番号：22000.0061/P
(ix)電話回線情報：
(A)電話：404 688 0770
(B)テレファックス：404 688 9880
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：828塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号１：
0004106090.tif 000002
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：845塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号２：
0004106090.tif 000003
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：818塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号３：
0004106090.tif 000004
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：857塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号４：
0004106090.tif 000005
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：896塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号５：
0004106090.tif 000006
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：937塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号６：
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(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：888塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号７：
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(2)配列番号８の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：980塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号８：
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(2)配列番号９の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：845塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号９：
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(2)配列番号10の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：528塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号10：
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(2)配列番号11の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：927塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号11：
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(2)配列番号12の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：911塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
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(2)配列番号13の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：880塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号13：
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(2)配列番号14の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：923塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号14：
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(2)配列番号15の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：880塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号15：
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(2)配列番号16の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：166塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号16：
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(2)配列番号17の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：162塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号17：
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(2)配列番号18の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：871塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号18：
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(2)配列番号19の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：936塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号19：
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(2)配列番号20の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：888塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号20：
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(2)配列番号21の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：903塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号21：
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(2)配列番号22の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：918塩基対
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(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号22：
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(2)配列番号23の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：309塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号23：
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(2)配列番号24の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：904塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号24：
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(2)配列番号25の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：883塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号25
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(2)配列番号26の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：924塩基対
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(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号26：
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(2)配列番号27の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：482塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号27：
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(2)配列番号28の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：460塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号28：
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(2)配列番号29の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：465塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号29：
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(2)配列番号30の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：568塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号30：
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(2)配列番号31の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：920塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号31：
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(2)配列番号32の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：176塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号32：
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(2)配列番号33の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：336塩基対
(B)型：核酸
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(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号33：
0004106090.tif 000034
(2)配列番号34の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：92塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号34：
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(2)配列番号35の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：838塩基対
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(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号35：
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(2)配列番号36の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：314塩基対
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(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号36：
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(2)配列番号37の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：226塩基対
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(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号37：
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(2)配列番号38の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：843塩基対
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(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号38：
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(2)配列番号39の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：943塩基対
(B)型：核酸
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(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号39：
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(2)配列番号40の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：904塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号40：
0004106090.tif 000041
(2)配列番号41の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：917塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号41：
0004106090.tif 000042
(2)配列番号42の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：835塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号42：
0004106090.tif 000043
(2)配列番号43の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：924塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号43：
0004106090.tif 000044
(2)配列番号44の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：435塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号44：
0004106090.tif 000045
(2)配列番号45の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：919塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号45：
0004106090.tif 000046
(2)配列番号46の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：915塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号46：
0004106090.tif 000047
(2)配列番号47の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：849塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号47：
0004106090.tif 000048
(2)配列番号48の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：925塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号48：
0004106090.tif 000049
(2)配列番号49の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：827塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号49：
0004106090.tif 000050
(2)配列番号50の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：899塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号50：
0004106090.tif 000051
(2)配列番号51の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：852塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号51：
0004106090.tif 000052
(2)配列番号52の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：967塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号52：
0004106090.tif 000053
(2)配列番号53の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：700塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号53：
0004106090.tif 000054
(2)配列番号54の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：229塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号54：
0004106090.tif 000055
(2)配列番号55の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：465塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号55：
0004106090.tif 000056
(2)配列番号56の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：564塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号56：
0004106090.tif 000057
(2)配列番号57の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：822塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号57：
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(2)配列番号58の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：553塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号58：
0004106090.tif 000059
(2)配列番号59の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：904塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号59：
0004106090.tif 000060
(2)配列番号60の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：698塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号60：
0004106090.tif 000061
(2)配列番号61の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：851塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号61：
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(2)配列番号62の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：936塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号62：
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(2)配列番号63の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：911塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号63：
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(2)配列番号64の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：781塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号64：
0004106090.tif 000065
(2)配列番号65の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：389塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号65：
0004106090.tif 000066
(2)配列番号66の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：340塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号66：
0004106090.tif 000067
(2)配列番号67の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：557塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号67：
0004106090.tif 000068
(2)配列番号68の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：302塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号68：
0004106090.tif 000069
(2)配列番号69の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：820塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号69：
0004106090.tif 000070
(2)配列番号70の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：955塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号70：
0004106090.tif 000071
(2)配列番号71の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：886塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号71：
0004106090.tif 000072
(2)配列番号72の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：900塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号72：
0004106090.tif 000073
(2)配列番号73の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1033塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号73：
0004106090.tif 000074
(2)配列番号74の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：883塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号74：
0004106090.tif 000075
(2)配列番号75の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：892塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号75：
0004106090.tif 000076
(2)配列番号76の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：884塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号76：
0004106090.tif 000077
(2)配列番号77の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：326塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号77：
0004106090.tif 000078
(2)配列番号78の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：557塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号78：
0004106090.tif 000079
(2)配列番号79の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：376塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号79：
0004106090.tif 000080
(2)配列番号80の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：533塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号80：
0004106090.tif 000081
(2)配列番号81の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：346塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号81：
0004106090.tif 000082
(2)配列番号82の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：461塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号82：
0004106090.tif 000083
(2)配列番号83の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：367塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：genomic DNA
(xi)配列：配列番号83：
0004106090.tif 000084