(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａからなる単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ＤＮＡである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｃＤＮＡである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９０年９月２１日出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．０７／５８６，５３６の一部継続出願を優先権の基礎とする日本出願である。
【０００２】
本発明はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの基金ＮＳ２２２５６によって支援されたものである。アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
【産業上の利用分野】
本発明はグルタミン酸デカルボキシラーゼ65（ＧＡＤ65）ポリペプチドの発現のために、ＧＡＤ65で宿主生物を形質転換する組み換えＤＮＡ手法の使用に関する。また、ＧＡＤ65ポリペプチドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用する方法も包含する。
【０００４】
【従来の技術】
インシュリンー依存性真性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、最も普遍的な代謝性疾患の一つである。アメリカ合衆国では、ＩＤＤＭはおよそ３００から４００人に１人の割合で見られ、疫学的研究によると、この疾患は増加していることを示唆している。この疾患は膵臓のインシュリン生産性β−細胞の自己免疫破壊の結果生じる。更に特定すれば、この疾患の始まる前段階は、リンパ球が膵臓のランゲルハンス島に浸潤し、βー細胞を選択的に破壊する、”インスリティス”という状態を特徴とする。典型的なＩＤＤＭの過血糖症は、インシュリンー生産性βー細胞の少なくとも８０％がうしなわれた後に、初めて現れる。残りのβー細胞は次の数年間に破壊される。
【０００５】
インシュリン治療によって大半のＩＤＤＭ患者は普通の生活を送ることができるが、この補充は不完全なものであって、代謝恒常性を完全に元に戻すものではない。従って、目、腎臓、心臓、及びその他の器官の機能低下に至る深刻な合併症が、インシュリン治療を受けているＩＤＤＭ患者には多い。このために、β−細胞破壊の開始時と、実際にインシュリン補充が必要となる時（即ち、βー細胞の８０％が破壊されたとき）との間の潜伏期間を伸ばすこと（例えば、免疫抑制剤の投与によって）が極めて望ましい。従って、βー細胞破壊の開始を決定する診断テストがあれば、医者が潜伏期間を伸ばすための免疫抑制剤を投与することができ（Silverstein et al., New England Journal of Medicine, 319:599-604, 1988) 、それによってインシュリン補充による副作用の開始を遅らせることができる。
【０００６】
ＩＤＤＭ患者の多くは、６４ｋＤ分子（Baekkeskov et al., J.Clin.Invest. 79:926-934, 1987; Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) 、島細胞細胞質（ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ：ＩＣＡ）分子又は島細胞表面（ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ：ＩＣＳＡ）分子（Bottazzo et al., Lancet, 1:668-672, 1980) 、或いはインシュリン（Palmer et al., Science, 222:1137-1139, 1983; Atkinson et al., Diabetes, 35:894-898, 1986) に対する抗体を含む血清を有している。Ａｔｋｉｎｓｏｎとその共同研究者ら（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) は、ヒト血清中における６４ｋＤ分子に対する抗体の存在が、ＩＤＤＭ症状が実際に起きる始まりについての、最も初期でかつ最も信頼できる指標であることを示した。
【０００７】
最近になって、Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖとその共同研究者らは、６４ｋＤ分子と、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）とは幾つかの共通の抗原エピトープを有しており、従ってこれらは同じものであるか、或いは非常によく似た分子である、ということを確立した。この同定は重要な発見ではあるが、ＧＡＤの分子生物学に関する知識が未知である限りは、この情報をＩＤＤＭ予知の診断法として用いることは極めて厄介であり、かつ限定されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、大量の６４ｋＤ分子、又は６４ｋＤ分子と抗原的に実質的に同一なＧＡＤ分子をクローニングし、次いで生産することができれば、ＩＤＤＭ予知のための診断キットの開発が可能となろう。本発明は、かかる結果を達成するための手段を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、組み換えＤＮＡ手法を用いて真核性ＧＡＤ65ポリペプチドの生産が可能であり、かつＧＡＤ65ポリペプチドを自己免疫疾患の患者の診断及び治療に用い得るという知見に基づいてなされた。特定すれば、クローン化真核性ＧＡＤ65ポリペプチドを、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を有する患者、或いは有する危険性のある患者の診断に用いることに関する。
【００１０】
本発明の主な利点は、天然の真核性ＧＡＤ65ポリペプチドをその他の真核性非−ＧＡＤ65ポリペプチドから分離する際に、その単離に関して生じる問題を回避しつつ、天然源から精製したものに対応する真核性ＧＡＤ65ポリペプチドの容易な生産源を当業界に提供することである。その他の真核性非−ＧＡＤ65ポリペプチドが存在しないということは、ＧＡＤ65ポリペプチドと特異的に反応する抗体のみを検出する試験システムの開発が可能となるので、重要なことである。
【００１１】
宿主細胞中において真核性ＧＡＤ65ポリペプチドを提供する他の利点は、そうすることによって天然源から現在実際に得られているよりも、はるかに大量のポリペプチドを得ることが可能となることである。その結果、本発明のポリペプチドを用いてＩＤＤＭのような自己免疫疾患を有する患者をより正確に分類することが可能となるばかりでなく、診断システムに使用するための商業的に使用可能な量のＧＡＤ65ポリペプチドを提供することも可能となる。
【００１２】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（ＧＡＤ65）に対する自己抗体と結合するための、１又はそれ以上のエピトープ（抗原決定基）の１次構造コンホメーションの一部又は全てを有するポリペプチドの生産を可能にする組み換え手法によって、遺伝的物質を操作することに関する。これらのポリペプチドは、これと反応する自己抗体を免疫学的に検出するのに極めて有用である。なぜなら、このような自己抗体は、インシュリン依存性真性糖尿病や”スティッフマン（ｓｔｉｆｆ  ｍａｎ）”症候群のような自己免疫疾患の指標となるからである。これらのポリペプチドは、ＧＡＤ機能を変えるようなスクリーニング医薬として、また、ＧＡＤ65を診断的に検出するために用いるポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造用としても使用できる。
【００１３】
ＤＮＡベクター中にスプライシングするための真核性ＧＡＤ65ポリペプチドをコードする特異的ＤＮＡ配列の作製は各種の方法を用いて実施できる。例えば、（１）真核生物のゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配列を単離する；（２）興味のあるポリペプチドにとって必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列を化学的に製造する；及び（３）真核生物ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡ配列を合成する、といった方法を含む各種の方法を用いることができる。後者の場合、実際には、ｃＤＮＡと一般に呼ばれる、ｍＲＮＡと相補的な二本鎖ＤＮＡが形成される。
【００１４】
所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が公知の場合には、ＤＮＡ配列の製造方法はしばしば選択の問題である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接製造は不可能で、選択しうる方法はｃＤＮＡ配列の形成である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的方法には、高レベルでの遺伝子発現を有するドナー細胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラスミド運搬性のｃＤＮＡライブラリーを形成することがある。ポリメラーゼ鎖反応法と組み合わせて用いると、まれな発現産物でもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合には、ターゲットのｃＤＮＡ中に存在すると推定される配列と重複するような、ラベルした一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、あらかじめ一本鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー上で行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いることができる（Jay et al., Nucleic Acid Research, 11:2325, 1983) 。
【００１５】
ラベルした混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって（ここで各プローブは、変性化二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル中において、特定のＤＮＡ配列の完全な相補体である可能性がある）、ハイブリダイゼーション法は組み換え体クローンをスクリーニングするのに有用である。このようなスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡか、或いは変性化二本鎖ＤＮＡのいずれかで実施するのが好ましい。このような方法は、興味のあるポリペプチドと関連するｍＲＮＡ配列の量が極めて少ししか存在しない材料に由来するｃＤＮＡクローンを検出する際には特に有用である。言い換えると、非−特異的な結合を避けるための緊縮的(stringent) ハイブリダイゼーション条件を用いることによって、例えば、ターゲットＤＮＡがその完全な相補体である、混合物中の１個のプローブとハイブリダイゼーションすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフで可視化することができるようになる（Wallace et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 1981) 。
【００１６】
更に、各種ｃＤＮＡをオーサイト(oocyte)に注入して、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が起きるのに十分な時間をおき、そして所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を、例えばＧＡＤ65に, 特異的な抗体を用いるか、或いはＧＡＤ65酵素活性の機能的ッセイを用いることによって試験することにより、ＧＡＤ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００１７】
若しくは、ＧＡＤ65に対する抗体を用いて、少なくとも１個のエピトープを有するＧＡＤ65ペプチドに対して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる（Chang and Gottlieb, J.Neurosci., 8:2123, 1988)。このような抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル由来であり、ＧＡＤ65ｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。ＧＡＤ65のＮ−末端部分の最初の１００アミノ酸にみられるエピトープに対する抗体が好ましい。
【００１８】
遺伝子組み換えにおいて使用できる、特定のＤＮＡ配列作製のための上記３つの方法のうちでは、ゲノムＤＮＡ単離を用いる方法が最も一般的でない。これは、哺乳動物ポリペプチドを微生物の発現で得たいという場合には、イントロンの存在のために、特にそうである。
【００１９】
本発明は、ＧＡＤ65に対する抗体への少なくとも１個のエピトープを有する１次構造コンホメーション、即ち、アミノ酸残基の連続的配列、の一部又は全てを有する、ＧＡＤ65の新規ポリペプチドを提供する。
【００２０】
ＧＡＤ65に対する自己抗体を検出するためには、完全なＧＡＤ65よりもむしろ本発明のポリペプチド断片を用いることができる。ＧＡＤ65ポリペプチドに用いる場合の”ポリペプチド”の語は、ＧＡＤ65に対する自己抗体へのエピトープを有するいかなるアミノ酸配列をも示すが、ここで該アミノ酸配列は、本発明のｃＤＮＡ配列の一部又は全てによってコードされる。
【００２１】
本発明のＤＮＡ配列の微生物発現から得られるポリペプチドは、他の真核性ポリペプチド、或いは天然の細胞環境中で、又は血漿(plasma)や尿のような細胞外液体中で、さもなければＧＡＤ65と関連している他の汚染物を含まない、という特徴を更に有している。
【００２２】
本発明者による研究により、ＧＡＤ65とＧＡＤ67とは別々の遺伝子でコードされるものであり、例えば、共通のゲノム性配列が転写後、又は翻訳後に修飾されることによって生産されるのではないことが明白に確立された。ＧＡＤ65とＧＡＤ67とが別々の遺伝子によってコードされることを示す証拠には以下のものが含まれる：（ａ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの間の正確に一致する部分の最大の連続した配列は、たった１７ヌクレオチドの長さである、（ｂ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67からのｃＤＮＡは、低い緊縮調節(stringency conditions) 下で（２．０ｘＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ，２３℃）お互いにクロスハイブリダイゼーションしないし、またお互いのｍＲＮＡともクロスハイブリダイゼーションしない、そして（ｃ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡは、それぞれＧＡＤ67及びＧＡＤ65をコードする単離したゲノム性クローンとクロスハイブリダイゼーションしない。
【００２３】
”宿主”の語は、原核生物のみでなく、酵母菌、糸状菌のような真核生物、また植物及び動物細胞のように、複製可能で、かつ真核性ＧＡＤ65のイントロンを含まないＤＮＡ配列を発現することのできるものを意味する。しかしながら、宿主生物としては原核生物が好ましい。
【００２４】
”原核生物”の語は、ＧＡＤ65の発現のための遺伝子で形質転換又はトランスフェクションされる全てのバクテリアを含む。原核生物宿主は、グラム陰性菌や、例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陽性菌を含む。
【００２５】
ＧＡＤ65ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子によって、当業者に公知の方法を用いて、宿主を形質転換又はトランスフェクションすることができる。特に好ましいのは、ＧＡＤ65コーディング配列を含むプラスミド又はウィルスを、それぞれ原核生物の形質転換又はトランスフェクションのために用いることである。
【００２６】
融合し、作動的に(operably)連結した遺伝子を調製し、またそれらをバクテリア中で発現させる方法は当業者に公知である（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor、  NY, 1989)。ここで記載する遺伝的構築物及び方法は、原核生物宿主中でのＧＡＤ65の発現に用いることができる。
【００２７】
一般に、挿入された真核生物性遺伝子配列の効率よい転写を容易にするプロモーター配列を含む発現ベクターを、宿主との関連で使用する。発現ベクターは典型的には複製起点、プロモーター、及びターミネーター、並びに形質転換細胞の表現型選択を与えることのできる特定遺伝子を含む。形質転換された原核生物宿主は、発酵槽中で成長させて、当業者に公知の方法によって最適成長条件で培養することができる。次いで本発明のポリペプチドを成育培地、細胞分解物、又は細胞膜分画から単離することができる。
【００２８】
微生物で発現された本発明のポリペプチドの単離及び精製は、例えば、プレパラティブクロマトグラフ分離や、モノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を含む免疫的分離のようないかなる慣用的方法によってもよい。
【００２９】
ＧＡＤ65のアミノ酸残基の配列を既に提供したことによって、本発明は、１又はそれ以上のアミノ酸残基の種類又は位置において天然型と異なっており、かつ天然型ポリペプチドの幾つかの又は全てのエピトープを共有する、ＧＡＤ65のポリペプチド類似体又は誘導体の宿主発現をコードするＤＮＡ配列の製造を提供する。
【００３０】
本発明の新規なＤＮＡ配列は、ＧＡＤ65に対する自己抗体と反応することができる１又はそれ以上のエピトープのための１次構造コンホメーションの少なくとも一部を有するポリペプチドを、原核生物又は真核生物宿主細胞中で発現させるのに有用な全ての配列を含み、該ＧＡＤ65は以下のものと理解される：（ａ）図２〜４又は図５〜８に示されるＤＮＡ配列、又はその相補的鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）遺伝暗号の縮重のために、（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。特に（ｂ）で定義したものは、ＧＡＤ65の対立遺伝子変異型をコードするゲノムＤＮＡ配列と理解される。（ｃ）では特に、そのＤＮＡ配列が、無脊椎動物宿主中でのｍＲＮＡの翻訳を容易にするコドンを導入するような、ＧＡＤ65、ＧＡＤ65断片、及びＧＡＤ65類似体をコードするＤＮＡ配列を製造するものと理解される。
【００３１】
本発明のｃＤＮＡ配列は本質的に全てのヒト又はラットＧＡＤ65分子をコードするものであるので、これからｃＤＮＡの小さいポリペプチド断片、又はヒト又はラットＧＡＤ65に対する自己抗体のための少なくとも１個のエピトープをコードする対応するｃＤＮＡ配列を調製し、サブクローニングし、そして発現させることは今や日常的なことである。次いでクローン化ポリペプチド上にこのようなエピトープが存在することを、例えばＧＡＤ65に対する自己抗体を有する患者からの血清を用いて確認できる。このような小さいペプチドの例としては、ＧＡＤ65のＮ−末端からの最初の約１００アミノ酸がある（図５〜８に示す）。このアミノ酸配列には本質的にＧＡＤ67が欠けている。
【００３２】
本発明のＧＡＤ65はイムノアッセイに用いるのに特に適しており、液相又は固相担体に結合して使用できる。更に、これらのアッセイに用いるＧＡＤ65は各種の方法で検出できるように標識することができる。
【００３３】
本発明のＧＡＤ65を用いるイムノアッセイの例としては、直接又は間接法における、競合的又は非競合的イムノアッセイがある。このようなイムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチイムノアッセイ及びウェスタンブロットアッセイがある。本発明のＧＡＤ65と結合する抗体の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、順相、逆相、又は同時モードのいずれかで行うイムノアッセイを用いて実施することができる。用いるＧＡＤ65の濃度は、イムノアッセイのタイプ及び使用する検出可能な標識の性質に依って変化する。しかしながら、どのようなタイプのイムノアッセイを用いるにせよ、使用するＧＡＤ65の濃度は定法を用いて、当業者には容易に決定できる。
【００３４】
本発明のＧＡＤ65は多くの種類の担体と結合させて、このポリペプチドと特異的に反応する抗体の存在を検出することができる。よく知られた担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトがある。担体の性質は本発明の目的のためには可溶性又は不溶性のいずれであってもよい。当業者はＧＡＤ65と結合するためのその他の適当な担体を知ることができるし、また定法によってこれを確認することができる。
【００３５】
多くの異なる標識及び標識法が当業者には公知である。本発明に使用できる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、及び生物的発光化合物がある。
【００３６】
更に、本発明のポリペプチドはＧＡＤ酵素活性を測定することによって、ＧＡＤ65に対する抗体を検出することができる。例えば、ＧＡＤ65と、ＧＡＤ65に対する抗体を有している疑いのある標本とを、一定期間、ＧＡＤ65と抗体との間に結合を起こさせるに十分な条件下にインキュベーションする。反応生成物を沈殿化して、このＧＡＤ酵素活性を試験する。
【００３７】
本発明の目的のためには、本発明のＧＡＤ65と結合する抗体は、各種の生物的液体及び組織中に存在する。検出可能な量のＧＡＤ65に対する抗体を含むいかなるサンプルも用いることができる。普通、サンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体であるか、或いは組織、糞などの固体又は半固体である。
【００３８】
本発明のアッセイに用いる物質は、そのままキットの製造にも適している。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１又はそれ以上の容器手段を密に閉じ込めるために仕切られた担体手段を含み、該容器手段の各々はこの方法で使用する別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは担体と結合したＧＡＤ65を含む。第２の容器は可溶化、検出可能な第２の抗体を凍結乾燥又は溶液の形で含む。
【００３９】
更に、担体手段はまた複数の容器を含み、各容器は異なる、所定量のＧＡＤ65を含む。次いでこの後者の容器を用いて標準曲線を描き、これに未知の量のＧＡＤ65に対する自己抗体を含むサンプルから得られた結果を挿入する。
【００４０】
キットを使用するに当たって使用者がしなければならないことは、測定可能であるが、未知の量のＧＡＤ65に対する自己抗体を含む、あらかじめ測定した量の検出用サンプルと、第１の容器中に存在するあらかじめ測定した量の担体結合したＧＡＤ65と、第２の容器中に存在するあらかじめ測定した量の検出可能な標識化第２抗体とを容器に加えることである。若しくは、検出不能な標識化ＧＡＤ65を容器に付けて提供し、これにサンプルと、検出可能な標識化第２抗体とを加えることもできる。適当な時間インキュベーションした後、免疫複合体が形成され、これを上清液から分離し、免疫複合体又は上清液を、放射能カウントするか、又は酵素基質を加えて発色させるなどによって検出する。
【００４１】
”改良する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）”の語は、患者が受け取る治療において自己免疫応答の有害な効果を減少することを意味する。”治療的に有効な”の語は、使用するＧＡＤ65ポリペプチドの量が自己免疫応答による疾患誘発を改良するのに十分な量であることを意味する。
【００４２】
本発明の組み換えＧＡＤ65ポリペプチドは、ＧＡＤ65に対する自己免疫応答を有する患者の治療に用いることもできる。このような治療は、例えば、組み換えＧＡＤ65ポリペプチドを投与することによって実施できる。このような投与には非標識化又は標識化ＧＡＤ65ポリペプチドを用いることができる。非標識化ＧＡＤ65ポリペプチドを用いるのが有利な場合には、例えば、免疫応答を刺激するには小さすぎるが、自己免疫応答の継続を束縛したりブロックしたりするには十分大きい断片の形でＧＡＤ65ポリペプチドを投与する。例えば、ＧＡＤ65をエピトープーサイズのペプチド（典型的には５−１２アミノ酸の長さ）に酵素的に消化して、自己免疫疾患を有する患者の体液中、又は免疫細胞の表面上に存在するＦａｂ結合部分に結合させる。
【００４３】
或いは、本発明の組み換えＧＡＤ65ポリペプチドは、治療剤で標識して投与することができる。これらの治療剤は本発明のＧＡＤ65ポリペプチドと直接又は間接にカップリングさせることができる。間接的カップリングの一例はスペーサー部分を用いることである。このスペーサー部分は可溶性又は不溶性であることができ(Diener et al., Science, 231:148, 1986) 、ターゲット部分でＧＡＤ65ポリペプチドから医薬の放出をできるように選択される。免疫治療用に本発明のＧＡＤ65ポリペプチドとカップリングすることができる治療剤の例としては、医薬、放射性同位体、レクチン、及び毒素がある。
【００４４】
本発明のＧＡＤ65ポリペプチドと結合することができる医薬には、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、及びビンブラスチンのような古典的に医薬と呼ばれていたものを含む。
【００４５】
免疫治療用に放射性同位体と結合した本発明のＧＡＤ65ポリペプチドを使用する際には、白血球の分布、安定性及び放射のような要因に依って、ある同位体が他の同位体よりも好ましいことがある。自己免疫応答に依って、ある放射体が他のものよりも好ましいことがある。一般に、免疫治療ではα及びβ粒子放射性の放射性同位体が好ましい。 212Ｂｉのような近距離、高エネルギーのα放射体が好ましい。本発明のＧＡＤ65ポリペプチドと結合することができる放射性同位体の例としては、 125Ｉ， 131Ｉ，90Ｙ，67Ｃｕ， 212Ｂｉ， 211Ａｔ， 212Ｐｂ，47Ｓｃ， 109Ｐｄ及び 188Ｒｅがある。
【００４６】
レクチンは通常植物から単離されるタンパク質であって、特定の糖部分と結合する。多くのレクチンが細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができる。しかし、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療に用いられてきた毒性レクチンである。これは、毒性の原因であるリシンのαーペプチド鎖を、抗体分子と結合させて、毒性効果を特異的に配給することによって達成できる。
【００４７】
毒素は植物、動物、又は微生物によって産出される毒性物質であって、十分な投与量でしばしば死に至る。ジフテリア毒素は治療的に用い得るＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａによって産出される物質である。この毒素はα及びβサブユニットからなっており、適当な条件下に分離できる。毒素Ａ部分は、ＧＡＤ65ポリペプチドと結合させて、ＧＡＤ65ポリペプチドに対するリセプターを発現する白血球への部分特異的な配給に用いられる。
【００４８】
本発明のＧＡＤ65ポリペプチドとカップリングすることができるその他の治療剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの治療法共に、公知であり、又は当業者によって容易に確認できる。
【００４９】
本発明はまた、この疾患を有する患者、又は有する危険のある患者における疾患過程を改良するために治療的に投与するすることのできるポリペプチドに関する。各種アミノ酸を表すために用いる便宜的な一字の記号は以下の通りである：
Ｐｈｅ：Ｆ    Ｌｅｕ：Ｌ    Ｉｌｅ：Ｉ    Ｍｅｔ：Ｍ
Ｖａｌ：Ｖ    Ｓｅｒ：Ｓ    Ｐｒｏ：Ｐ    Ｔｈｒ：Ｔ
Ａｌａ：Ａ    Ｔｒｙ：Ｙ    Ｈｉｓ：Ｈ    Ｇｌｎ：Ｑ
Ａｓｎ：Ｎ    Ｌｙｓ：Ｋ    Ａｓｐ：Ｄ    Ｇｌｕ：Ｅ
Ｃｙｓ：Ｃ    Ｔｒｐ：Ｗ    Ａｒｇ：Ｒ    Ｇｌｙ：Ｇ
【００５０】
本発明のポリペプチド配列は、ヒトＧＡＤ65、ヒトＧＡＤ67、及びピコマウィルス、コクサッキーウィルスのＰ２−Ｃタンパク質のアミノ酸配列を比較することによって同定された。Ｐ２−Ｃポリヌクレオチドは複製複合体と結合したウィルス膜中で一定の役割を演じている。これらの分析によって、いずれのＧＡＤ65分子とコクサッキーウィルスとの間にも広範な配列類似性のあることが明らかとなった。ＧＡＤ65とＰ２−Ｃポリペプチドの６個の隣接するアミノ酸残基からなる中心ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が同一である。実際、ポリペプチド中の２４アミノ酸のうち、１９個が同一であるか、又は保存されている(conserved) 。更に、高電荷密度と、この領域に高い抗原性を与えているプロリン残基の存在がある（表１）。
【００５１】
【表１】
0004072922.tif 000002
表１において、実線は同一のアミノ酸を囲み、破線は類似の電荷、極性、又は疎水性を有するアミノ酸残基を囲む。
【００５２】
この共通のポリペプチド領域の発見は、糖尿病の促進における”分子擬態（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｍｉｃｒｙ）”にとっての病原学的役割を裏付ける。かくして、遺伝的にＩＤＤＭの疑いのある患者はコクサッキーウィルスで感染され、コクサッキーウィルスポリペプチドに対する免疫応答は、患者のβー細胞中の類似のＧＡＤ配列に対する交差反応的免疫応答という結果をもたらす。抗原的に類似のＧＡＤポリペプチドによって免疫応答は維持され、その結果βー細胞が実際に破壊されて、次いでＩＤＤＭを呈するようになる。
【００５３】
現在のところ、膵臓β−細胞の消失は細胞の自己免疫応答によって仲介されると信じられている。その結果、本発明のポリペプチドはこのようになされる細胞性の自己免疫応答をブロックする能力を有しているはずである。自己免疫疾患の複雑さのために、本発明のポリペプチドをこのような疾患の改良のために用いることのできる多くの治療様式を企画することが可能である。従って、抗原提供細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）表面上の自己免疫抗原を提供する特定のＴ細胞リセプター（ＴＣＲ）又はＭＨＣリセプターによる認識をブロックするために、本発明のポリペプチドを用いることが可能である。例えば、患者に本発明のポリペプチドを与えて、これがＭＨＣリセプターの抗原の裂け目(cleft) に存在している自己免疫抗原と置き換わることによって、或いはＴ−ヘルパー細胞の表面上の適当なＴＣＲとの直接的相互作用によって、このような認識の阻害が起きるのかも知れない。この後者のＴＣＲとの直接的相互作用による治療の試みは、高濃度の可溶性ポリペプチドを用いることによる大領域寛容(high-zone tolerance) の誘導によって達成することができる。
【００５４】
若しくは、本発明のポリペプチドは、自己認識を修復し、それによって自己免疫疾患を改良するためにＴ−サプレッサー細胞集団を刺激するために用いることができる。Ｔ−サプレッサー細胞集団の刺激は、例えば、ＭＨＣIIリセプターの裂け目にある自己免疫抗原上に存在するエピトープに特異的な１個の可変領域と、ＣＤ８+ リセプター上に存在するエピトープに特異的な第２の可変領域とを有する二特異的（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いることによって達成できる。本発明のポリペプチドに特異的な抗体の生産は当業者には慣用的であり、２又はそれ以上のエピトープに特異性を有する二特異的抗体の生産もまた当業者には慣用的である。
【００５５】
本発明のポリペプチド類似体は抗原提供のレベルでの自己抗原の認識と競合するようにデザインできる。ＭＨＣ分子は１個のペプチド結合部位を含んでいるので、疾患−関連性ＭＨＣ分子とは高い親和性で結合するが、疾患−誘発性Ｔ−ヘルパー細胞を活性化しないポリペプチドをデザインすることが可能である。このようなポリペプチドは自己−抗原認識のための拮抗剤として作用する。このようなアプローチの先例は、それ自体は非−免疫原性であるマウスリゾチームポリペプチドが、ニワトリ卵白リゾチームからの免疫原性ポリペプチドとのＭＨＣの結合と競合することができ、それによってこのポリペプチドによるＴ細胞活性化を減少させることができる、という観察に由来する（Adorini et al., Nature, 334:623-624, 1988)。同様に、有効なポリペプチド類似体をスクリーニングするためのこのような治療的アプローチは、実験的自己免疫脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）のような自己免疫疾患に用いられてきた（Wraith et al., Cell, 59:248, 1989; Urban et al., Cell, 59:257, 1989)。
【００５６】
本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸を表すために用いる一字の記号は当業者に慣用的に用いられているものである。”類似体”の語は、ここで提供されるポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有し、かつその１又はそれ以上のアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されたポリペプチドをいう。例えば、グリシンやセリンのような極性アミノ酸は、他の極性アミノ酸で置換できるし；或いはアスパラギン酸のような酸性アミノ酸は、グルタミン酸のような他の酸性アミノ酸で置換できるし；或いはリシン、アルギニンやヒスチジンのような塩基性アミノ酸は、他の塩基性アミノ酸で置換できるし；或いはまたアラニン、ロイシンやイソロイシンのような非極性アミノ酸は、他の非極性アミノ酸で置換することができる。
【００５７】
”類似体”の語はまた、本発明のポリペプチドから１又はそれ以上のアミノ酸が欠失されたか、或いはこれに付加されてはいるが、このようなペプチドと実質的に相同なアミノ酸配列を保持しているポリペプチドをも意味する。実質的な配列相同とは５０％以上のいかなる相同をもいう。”断片”の語は、少なくとも６アミノ酸残基を有する、ここで同定するポリペプチドのより短い形のものをいい、この断片は小島侵潤性Ｔリンパ球（ｉｓｌｅｔ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＩＩＴＬｓ）の増殖を刺激することができるか、或いは刺激性ポリペプチド断片によるこのような細胞の刺激を阻害することのできる断片である。
【００５８】
”化学的誘導体”の語は、本発明のポリペプチドに由来するいかなるポリペプチドも意味し、ここでポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の側鎖官能基の反応によって、１又はそれ以上のアミノ酸を化学的に誘導体化したものをいう。従って、”化学的誘導体”とは、１又はそれ以上の化学的工程によってここで同定する配列又はポリペプチドから誘導されるポリペプチドである。このような誘導体は、例えば、遊離のアミノ基を誘導体化してアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルフォアミド、ベンゾキシカルボアミド、ｔ−ブチルオキシカルボアミド、チオウレタンー型誘導体、トリフロロアセチルアミド、クロロアセトアミド、又はフォルムアミドを形成するような分子を含む。遊離のカルボキシル基は誘導体化して、塩、メチル又はエチルエステル、又はその他の型のエステル又はヒドラジドを形成する。遊離の水酸基は誘導体化してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成する。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化してＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンとすることができる。２０の標準アミノ酸の天然に起きるアミノ酸誘導体を１又はそれ以上含むポリペプチドも化学的誘導体に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換でき；５−ヒドロキシリシンはリシンと置換でき；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換でき；ホモセリンはセリンと置換でき、そしてオルニチンはリシンと置換できる。
【００５９】
本発明は表１に示される例示的ポリペプチドに限定されるものではなく、むしろ、あるポリペプチドの実質的部分がコクサッキーウィルスＰ２−Ｃのアミノ酸２８とアミノ酸５０との間の領域、ＧＡＤ65のアミノ酸２５０とアミノ酸２７３との間の領域、又はＧＡＤ67のアミノ酸２５８とアミノ酸２８１との間の領域からのアミノ酸配列、又はそのセグメント、又はその組み合わせによって特徴付けられるものである限り、そして該ポリペプチドが自己免疫疾患に対して所望の免疫学的又は生物学的活性を示すものである限り、本発明の範囲に入るポリペプチドは上記の領域を越えて伸びるか、或いはこれよりも少ないものからなることができる。更に、本発明のポリペプチドは、そのようなポリペプチドが表１に示すアミノ酸領域から実質的になっており、かつ免疫学的又は生物学的活性を示すものである限り、表１に示すポリペプチドのアミノ酸配列よりも長いか、或いは短いアミノ酸配列、又はそのセグメント又はその組み合わせからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。更に、本発明のポリペプチドは、表１のＧＡＤ65ポリペプチドのアミノ酸配列よりも長いか、或いは短いアミノ酸配列、又は該ポリペプチドのセグメントからなるアミノ酸配列で特徴付けられるポリペプチドであって、自己免疫疾患に対する免疫学的又は生物学的活性を示すポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは全て、自己免疫疾患を刺激したり、或いは増強するものであってはならない。
【００６０】
従って、本発明のポリペプチドの中からいずれか１個のポリペプチドを特定して選択することは過度の実験を含むものではない。多数のポリペプチドを調製して、自己免疫疾患の改善におけるその免疫学的及び生物学的活性を試験することによって、かかる選択を行うことができる。糖尿病を改善することのできる本発明のポリペプチドをスクリーニングするためには、ＮＯＤマウスが優秀でかつよく特徴付けられたモデルを提供してくれる。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、組み換え法、又は固体支持体上での合成を含む公知のポリペプチド合成法を用いる慣用的合成法によって生産することができる。適当な固相合成法の例は、Merriweather, J.Am.Chem.Soc., 85:2149, 1963 に記載されている。その他のポリペプチド合成法は、例えば、Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d ed., 1976  及び当業者に公知のその他の文献に記載されているポリペプチド合成法の要約は、Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company,Inc., Rockford, III., 1984 に記載されている。例えば、The Proteins, Vol. II, 3d ed., Neurath et al., eds., 105, Academic Press, New York, NY, 1976  に記載されている溶液法によるポリペプチド合成を使用してもよい。このような合成で使用する保護基は、上記の文献に記載されているが、また J.McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY, 1973 にも記載されている。
【００６２】
本発明のポリペプチドは所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した適当な宿主中で生産することもできる。例えば、あらかじめ形質転換されており、かつ該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現する適当な宿主を発酵させることによってポリペプチドを生産できる。若しくは、本発明のポリペプチドのいくつかをコードするＤＮＡ配列を連結し、次いでこれらの配列を用いて自己免疫疾患に関与するポリペプチドを発現できるような適当な宿主を形質転換する。
【００６３】
本発明のＧＡＤ65ポリペプチドの投与量は、自己免疫応答の症状又は細胞破壊が改善されるような所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、好ましくない交差反応や、アナフィラキシー反応（過敏症）などの副作用を引き起こす程大きいものであってはならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、及び患者の病気の重症度によって変化し、当業者によって決定される。万一何か好ましくない症状があった場合には、投与量は個々の医師により調節される。投与量は、１回の投与当たり、約０．１ｍｇ／ｍ2 から約２０００ｍｇ／ｍ2 まで、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ2 から約５００ｍｇ／ｍ2 までで、１日に１回又は数回、１日又は数日間投与する。
【００６４】
本発明のＧＡＤ65ポリペプチドは、注射又は時間をかけた勾配還流によって非経口的に投与される。本発明のＧＡＤ65ポリペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、空洞内、又は経皮的に投与される。
【００６５】
非経口的投与のための製剤は、滅菌水性、又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びエチルオレエートのような注射可能な有機エステルがある。水性担体は、食塩水及び緩衝液を含む、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、又は固定油(fixed oil) を含む。静脈内担体は、液体及び栄養補充物、電解補充物（リンガーのデキストロースに基づくようなもの）などを含む。保存料、及びその他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在する。
【００６６】
本発明はまた、本発明のＧＡＤ65ポリペプチドを含む医薬、又は医薬組成物の製造法にも関し、該医薬はＧＡＤ65に対する自己免疫応答の治療に使用する。
【００６７】
上記の記載は本発明を一般的に述べたものである。以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解が得られるが、ここで述べる実施例は説明のためのみになされるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６８】
【実施例】
実施例１
ＧＡＤ65のクローニング及び発現
Ａ．組み換えＤＮＡ手法
ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に特異的なｃＤＮＡプローブを得るために、Chirgwin et al., Biochemistry, 18:5294, 1979の方法を用いて、成熟ラットの脳から、グアニジンイソチオシアネートーセシウムグラジエントによって、全ＲＮＡを抽出した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ社）による実験計画書を用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース上で精製した。ポリｄ（Ｎ6 ）−ｍｅｒｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をプライマーとして用いた以外は、指示された条件を用いて、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ社製）を用いて一本鎖合成を行った。このｃＤＮＡ−ＲＮＡ混合物を６５℃で１５分間加熱して不活性化して、−２０℃に貯蔵した。ＰＣＲのためには、サンプルの１／５０を反応物１００μｌに加えた。ネコ（ｃＤＮＡから）（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:2768, 1987)  及びラット（ペプチドから）（Chang and Gottlieb, J.Neurosci., 8:2123, 1988)  ＧＡＤ（図１）の下線を施した共通のアミノ酸配列をコードするために変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各変性オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、ＳｓｔI 及びＨｉｎｄIII （５’末端オリゴ）又はＳｓｔI 及びＳｓｔII（３’末端オリゴ）のいずれかによって認識されるＤＮＡ配列の１本鎖を含む。これらのプライマーを用いて、Gould et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86:1934, 1989  に記載されたように、生じたｃＤＮＡ鋳型のポリメラーゼ鎖反応によって選択的増幅を行った。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄIII ／ＳｓｔI で二重消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし、ＤＨ５（ＢＲＬ社製）に形質転換して、標準法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1989) によって接種した。
【００６９】
ネコＧＡＤ67に特異的な５’−32Ｐ末端標識化オリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼーションを行った（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:2768, 1987)。ニトロセルロースフィルターを５０℃で１５分間洗浄した以外は、文献（Wallace et al., in Guide to Molecular Cloning Techniques; Berger et al., Eds.in Methods of Enzymology; Abelson et al., Eds.Academic Press,Inc. San Diego, 432-442, 1987)  記載のようにして、オリゴヌクレオチドの末端標識、ハイブリダイゼーション条件、及び洗浄条件を実施した。ハイブリダイゼーションで陽性及び陰性であったコロニーを個々に取り上げて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ液体培地中で一夜成長させた（Tartof et al., Focus, 9:12, 1987) 。煮沸法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、  Cold Spring Habor Laboratory 、  Cold Spring Habor, NY, 1989) を用いてＤＮＡを単離し、０．２Ｎ  ＮａＯＨで鋳型を変性し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。変性された二本鎖鋳型の配列決定は、Ｔ７−シークエンスキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、鎖−末端法（Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463, 1977) によって行った。
【００７０】
図１に示すように、ＰＣＲで生じたラットＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡをプローブとして用いて、標準的手法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、  Cold Spring Habor Laboratory 、  Cold Spring Habor, NY, 1989) によって、Ｓ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から供与されたラムダＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ラット海馬ライブラリーをスクリーニングした。２４００ヌクレオチドのＧＡＤ65ｃＤＮＡ（最大クローン）を単離して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに記載するように”ザッピング（ｚａｐｐｉｎｇ）”によってサブクローニングした。手元に既にあった３．２ｋｂのラットＧＡＤ67ｃＤＮＡクローンよりも小さいラットＧＡＤ67ｃＤＮＡを得たら、より大きなｃＤＮＡの配列決定を行った。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67について両方の方向にＥｘｏIII 削除（Henikoff, Gene, 28:351, 1984) を行って、鋳型を調製し、上記のようにして配列決定を行った。ライブラリースクリーニングにおいて単離された元のｃＤＮＡクローン中には現れていなかったＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｍＲＮＡの残りの５’末端をクローニングするために、アンカーＰＣＲを行った（Frohman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85:8998, 1988)。これらのクローンの配列決定を行ったところ、ＧＡＤ65又はＧＡＤ67ｍＲＮＡのいずれも、フレーム中に元のｃＤＮＡクローンの開始コドンであると以前に同定されたものと共に、更に別の開始コドン（ＡＵＧ）をなんら含んでいないことが明らかとなった。
【００７１】
実施例２
クローン化ＧＡＤ65の特徴
Ａ．ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ＧＡＤ67及びＧＡＤ65ｃＤＮＡは２個の異なるｍＲＮＡに由来するのかどうかを決定するために、２個のＰＣＲ−由来のｃＤＮＡプローブを、ラットの脳ＲＮＡを含むノーザンブロットにハイブリダイゼーションした。ＲＮＡは実施例１に記載したように抽出した。ホルムアルデヒド中の電気泳動によってポリ（Ａ）ＲＮＡを分離し、Ｂｉｏｔｒａｎｓ（ＩＣＮ）膜上に移して、１００μｌ／ｍｌのポリ（Ａ）を加えた以外は、Well et al., J.Neurosci., 16:311, 1986  に記載の方法によってハイブリダイゼーションを行った。Feinberg and Vogelstein, Anal.Biochem., 132:6, 1983 に記載のオリゴラベリング法によって、プローブを約１０9 ｄｐｍ／μｇまで標識した。次いでＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの全長クローンで同じ結果が得られた。
【００７２】
図１１に示すように、レーン１及び２は、ラット小脳から抽出したポリ（Ａ）選択ＲＮＡ１μｇを含む。レーン１はネコＧＡＤ67（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:2768, 1987)  のラット起源のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせたものであり、レーン２はラットペプチド配列（ＧＡＤ65と対応する）のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせたものである。
【００７３】
ラットペプチド配列のｃＤＮＡプローブは５．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションし、一方ネコｃＤＮＡのラット起源のｃＤＮＡプローブは３．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションした。これは、ＧＡＤ65とＧＡＤ67が同じｍＲＮＡに由来するものではないことを示している。
【００７４】
Ｂ．ＧＡＤ67及びＧＡＤ65のゲノム性ハイブリダイゼーション
ＧＡＤ67及びＧＡＤ65が別々の遺伝子に由来する可能性を調べるために、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の両方のｃＤＮＡを、ゲノム性ＤＮＡを含むＤＮＡブロットとハイブリダイゼーションした。
【００７５】
サザンブロットのために、ＤＮＡはKaiser et al., in DNA Cloning, vol.1, A Practical Approach, D.M.Glover ed., IRL Press, Oxford, 38-40, 1985  の記載に従って、ラット肝臓から抽出した。製造者（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の指示する条件を用いて、ＤＮＡ（１０μｇ／サンプル）をＥｃｏＲI 及びＨｉｎｄIII で完全に消化した。０．８％アガロース中、１．５ｖ／ｃｍで１６時間、電気泳動を行ってＤＮＡ断片を分離した。次いで、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液の代わりにＣａｒｎａｔｉｏｎドライミルク５μｇ／ｍｌを用いた以外は、Gatti et al., Biotechniques, 2:148, 1984  の記載に従って、ＤＮＡをＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して、ハイブリダイゼーションし、洗浄した。サザンブロットのためのプローブは、上記実施例１に記載したように標識した。
【００７６】
図１２に示すように、ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲI で消化したゲノム性ＤＮＡは、それぞれレーン１、３とレーン２、４にある。ＧＡＤ67ｃＤＮＡはレーン１及び２とハイブリダイゼーションさせ、一方ＧＡＤ65ｃＤＮＡはレーン３及び４とハイブリダイゼーションさせた。ゲル横にある数字はキロベースで表したＤＮＡ断片サイズである。
【００７７】
このデータは、２個のｃＤＮＡは、異なるサイズのゲノム断片とハイブリダイズすることを示している。更に、ＧＡＤ65とＧＡＤ67ｃＤＮＡとの同一のヌクレオチド配列のうち最大の連続した配列は、たった１７ヌクレオチド塩基の長さである。従って、ＧＡＤ67とＧＡＤ65とは２個の異なる遺伝子によってコードされている。
【００７８】
Ｃ．ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の酵素的比較
ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の活性におけるＰＬＰの効果を比較する研究を行った。そのために、両方のｃＤＮＡをバクテリア中でその発現ができるようなベクター中にサブクローニングした（Studier et al., J.Mol.Biol., 189:113, 1986) 。ＧＡＤ65ｃＤＮＡをｐＥＴ−８ｃベクターのＮｃｏI 部位にサブクローニングし、かつＧＡＤ67ｃＤＮＡをｐＥＴ−５ｃベクターのＮｈｅI 部位にサブクローニングすることによって、”融合しない（ｆｕｓｉｏｎｌｅｓｓ）”ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の過発現を実施した（Studier et al., J.Mol.Biol., 189:113, 1986) 。
【００７９】
両方のｃＤＮＡを正しいフレーム内でサブクローニングするための両立性の付着末端を得るために、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＵＳＢ）の指示する条件を用いて、混合物中における２００μＭ  ｄＮＴＰと１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 で、ＰＣＲによる選択的増幅を行い、ＡｍｐｌｉＴＡＱ（ＵＳＢ）の不確実さを減少するために５５℃、２０サイクルでアニーリングした。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に特異的なプライマーは、それぞれＮｃｏI 及びＳｐｅI 制限酵素切断部位の１本のＤＮＡ鎖を含んでいた。ＧＡＤ67のコーディング領域にはＮｈｅI 切断部位があるので、ＳｐｅI （ＮｈｅI と両立性）を用いた。
【００８０】
ＰＣＲ産物をそれぞれのｐＥＴベクターにサブクローニングし、ＤＨ５に形質転換して、上記のように接種した（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor、  NY, 1989)。コロニーを取り出して、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で一夜成育させた。正しい方向性を有するサブクローンを過発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier et al., J.Mol.Biol. 189:113, 1986)  に形質転換した。ネガティブコントロールとして、挿入物をもたないｐＥＴ−８ｃベクターを形質転換して、誘導した。１個のコロニーを取り出して、成育し、１ｍＭのイソプロピルーＢ−Ｄ−チオガラクトーピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導して、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,  17.15-17.16, 1989)  記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【００８１】
ＧＡＤ活性を測定するために、ＯＤ600 −０．５のバクテリア培養物１０ｍｌをＩＰＴＧ１ｍＭで誘導した。誘導後２時間で、バクテリアを遠心して、ホモジェナイズ用バッファー（１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、及び６０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．１）１ｍｌ中に再懸濁して、超音波処理した。超音波処理後、細胞カスを遠心で除去し、上清（少量の上清をー７０℃で貯蔵した）中のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal.Biochem., 72:248, 1986)。文献（Legay et al., J.Neurochem., 46:1478 、  1986)  記載のように脳のホモジネートを調製した。Krieger et al., J.Neurochem., 33:299, 1984  の記載に従って、０．２ｍＭ  ＰＬＰの存在下、又は不存在下に、インキュベーション混合物中に脳ホモジェネート又はバクテリア溶菌物２０μｌを入れて、ＧＡＤ活性を測定した。バクテリア溶菌物中の14ＣＯ2 の生産量は、インキュベーション時間及びタンパク質濃度に比例していた。
【００８２】
【表２】
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表２に示すように、ＧＡＤ65又はＧＡＤ67を含むバクテリア溶菌物は［１−14Ｃ］ーグルタミン酸と、ＧＡＢＡ及び14ＣＯ2 との変換を触媒する。
【００８３】
ＰＬＰは、ＧＡＤ67よりもＧＡＤ65の酵素活性を刺激する。このより大きな刺激は多分、Ｍａｒｔｉｎ及びその共同研究者（Martin, Cell.Mol.Neurobiol., 7:237, 1987) が提唱した不活性サイクルを通して、ＧＡＤ65がより速く循環することを示している。このより速い循環は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するａｐｏ−ＧＡＤのプールに、ＧＡＤ65がより貢献していることを示している（Miller et al., Brain Res.Bull., 5(Suppl.2):89, 1980)。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏではＰＬＰは、ＧＡＤ67活性よりもＧＡＤ65活性をより制御していると考えられる。
【００８４】
バクテリア溶菌物中のＧＡＤ65活性は、ラット黒質から調製したシナプトソーム中に見られるＧＡＤ活性の５倍のＰＬＰ刺激にほぼ等しい（Miller et al., J.Neurochem., 33:533, 1979)。いずれのＧＡＤも、粗ラット脳ホモジネート中のＧＡＤ活性よりもバクテリア中に加えたＰＬＰにより依存するので、バクテリア溶菌物の内在ＰＬＰ濃度は、ラット脳ホモジネートよりも少ないかも知れない。
【００８５】
Ｄ．ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の免疫学的同定
上記のようにしてラット脳ホモジェネートとバクテリア溶菌物を抽出した。Harlow et al., Antibodies, A Labratory Manual, Cold Spring Harbor Labratory 、  Cold Spring Harbor, NY, 1988 に記載されたように、各サンプルに等量の電気泳動用バッファーを加えた。ＳＤＳ中の１０％アクリルアミドゲルで電気泳動を行って、タンパク質を分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移した（Harlow et al., Antibodies 、  A Labratory Manual 、  Cold Spring Harbor Labratory 、  Cold Spring Harbor, NY, 1988)。未反応部分を、２％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）、１％ゼラチン、及び１％トリトンーＸ−１００を含むリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）を用いて、４２℃で、１時間ブロックした。洗浄後、ニトロセルロースフィルターを３つの部分に切断し、以下の一次抗体と共にインキュベーションした：レーン１から４は、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の両方を認識するOertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の抗血清の１／２０００希釈と共に；レーン５から８は、ＧＡＤ67のみを認識するＫ−２抗血清の１／２０００希釈と共に；レーン９から１２は、ＧＡＤ65に特異的なＧＡＤ−６モノクローナル抗体（Chang et al., J.Neurosci., 8:2123, 1988)の１／２０００希釈と共にインキュベーションした。全てのフィルターをよく洗浄して、適当な二次抗体をインキュベーションして、洗浄した。結合した抗体は、 125Ｉ−標識タンパク質Ａ及びオートラジオグラフィーにより検出した。各レーンは以下のものを含んでいた：レーン１、５及び９は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ67；レーン２、６及び１０は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ65；レーン３、７及び１１は、ラット脳ホモジネート；そしてレーン４、８及び１２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−８ｃ。
【００８６】
バクテリア産出性のＧＡＤ65及びＧＡＤ67のイムノブロットは、ＧＡＤ65が脳抽出物中の小さいＧＡＤとよく対応し、そしてＧＡＤ67は大きい形とよく対応することを示している（図１３）。これまでの研究は、ＧＡＤ67がネコＧＡＤ67及びマウスＧＡＤ67にとっての大きいＧＡＤと対応することを示している（Katarova et al., Eur.J.Neurosci., 2:190, 1990; 235, 1987) 。バクテリア産出性のＧＡＤ65及びＧＡＤ67の可動性（Oertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の抗血清で検出した場合）は、ラット脳ホモジネートに見られる免疫反応ダブレット(immunoreactive doublet)と同じである。
【００８７】
ラット脳中のＧＡＤの低分子量及び高分子量形は、それぞれＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの産物と、抗原的にまた大きさ的に同じものである。その結果、ラット脳中の２つのＧＡＤは、ＧＡＤ65とＧＡＤ67である。このデータから、既に報告されているタピア（Ｔａｐｉａ）によるＰＬＰ−依存性ＧＡＤと、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ（Bayon et al., J.Neurochem., 29:519, 1977) は、それぞれＧＡＤ65及びＧＡＤ67と分子的に同じものである、と結論付けることができる。Ｍａｒｔｉｎ及びその共同研究者（Spink et al., Brain Res., 421:235, 1987)  は、ラット脳ＧＡＤには４つの運動力学的に異なる形が存在することを報告している。しかしながら、これらの形のイムノブロッティング（ここで用いたような抗血清を用いる）については報告されていない。
【００８８】
Ｅ、脳組織中のＲＮＡにおけるＧＡＤ65及びＧＡＤ67の分布
その場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションを用いて、小脳のＲＮＡにおけるＧＡＤ65及びＧＡＤ67の分布を決定するための実験を行った。
【００８９】
ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡからの、それぞれ３．２ｋｂ及び２．３ｋｂの転写物を、Wuenschell et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 83:6193, 1986 の方法に従って、35Ｓで放射性標識した。２００ｂｐの加水分解断片を、ラット小脳の冠状セクションとハイブリダイズさせた。動物はハロタンで麻酔して断首した。脳をドライアイス中で急速に冷凍して、冠状凍結セクション（１２μｍ）を、新たに調製したリン酸緩衝液（ＰＢＳ；１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中の４％ホルムアルデヒド中で、３０分間固定した。組織を勾配化エタノール溶液中で脱水し、−７０℃で貯蔵した。
【００９０】
組織の透過性を増加するために、セクションを以下の前処理に付した：勾配化エタノール溶液（９５％、８５％、７０％、５０％及び３０％エタノール中に各５分）中での再水和；ＰＢＳ（５分）；０．００２Ｎ  ＨＣｌ（１０分）；ＰＢＳ（５分）；ＰＢＳ中の０．０１％トリトンＮ−１０１（１分）；ＰＢＳ（２ｘ５分）；１μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（７．５分）；及びＰＢＳ中のグリシン（プロテナーゼＫを阻害するため）（３ｘ５分）。プロテナーゼＫは使用前に３７℃で３０分間消化した。次いでセクションを３７℃、５０％ホルムアミド、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２％  ＳＤＳ，０．０２％  ＢＳＡ、０，００２％  フィコル(Ficol) 、０．０２％  ポリビニルピロリドン、２５０μｇ／ｍｌ  イーストｔＲＮＡ、２５０μｇ／ｍｌ  ポリＡ、及び２５ｍＭ  ＰＰＥＳ（ｐＨ６．８）中でインキュベーションした。
【００９１】
ハイブリダイゼーションのためには、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  硫酸デキストラン、及びセンス(sense) 又はアンチセンス(antisense) の35Ｓ−ＲＮＡを、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。プローブ（センス又はアンチセンス）約３ｎｇ（１０6 ｃｐｍ）を含むハイブリダイゼーション溶液の少量（５０μｌ）をスライド上に加えた。各スライドのカバーをして、５０℃で１６時間インキュベーションし、次いでシリコン処理したカバーを４ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で短時間洗浄した。
【００９２】
次いでセクションをリボヌクレアーゼＡ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０中、５０μｇ／ｍｌ）で、３７℃、２０分間処理して、２ｘＳＳＣ中、室温で２時間リンスし、１０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム中、５５℃で３０分間リンスした。セクションをエタノール中で脱水し、キシレン中で脱脂して、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ２エマルジョンでコーティングし、４℃で１０日間露光した。エマルジョンをＫｏｄａｋ  Ｄ１９で現像して、組織をクレシルバイオレットで対比染色した。
【００９３】
反射偏光を用いてオートラジオグラフ粒子を検出し、粒子数、密度、ｎｄ細胞領域をＡｎａｌｙｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓイメジアナライザーシステムで測定した。バックグラウンドレベルが低いために、細胞が”標識された”と定義するための基準を、５以上の集団化した粒子の存在においた。ＧＡＤ標識された細胞が脳中に分散して見受けられ、個々の細胞上の粒子数の測定を可能とした。細胞と、粒子によって覆われた領域との境界によって、１細胞当たりの領域数の計算が可能となった。染色された細胞と、上におかれた粒子とを同時に見ることができるように、反射偏光と透過光との両方を用いて、高倍率（８００ｘ）で分析を行った。数は、”ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【００９４】
【表３】
0004072922.tif 000004
全ての神経性細胞タイプにおいて、ＧＡＤ67ｍＲＮＡレベルの方が大きい。ｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションにおける観察は、小脳中の非依存性ＧＡＤ活性に対するＰＬＰの依存率は、試験した脳領域中で最も低いものの一つである、という従来の知見（Nitsch, J.Neurochem., 34:822, 1980; Denner et al., J.Neurochem., 44:957, 1985; Itoh et al., Neurochem.Res. 6:1283, 1981)と一致している。更に、表３に示すように、ＧＡＤ67ｍＲＮＡに対する量は、プルキニエ＞ゴルジII＞籠＞星細胞の順であり、一方ＧＡＤ65に対する量は、ゴルジII＞プルキニエ＞籠＞星細胞の順である。
【００９５】
このようにＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｍＲＮＡの発現はニューロンのクラスによって異なる。つまり、全ＧＡＤに対するそれぞれの貢献度は、いかにＧＡＢＡ生産が制御されているかに影響している。例えば、黒質は、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ活性に対して、最も高いＰＬＰ−依存率の一つを含む（Nitsch, L.Neurochem., 34:822, 1980) 。ＧＡＢＡ異化作用の阻害剤を局部的に注射することによって、黒質におけるＧＡＢＡ濃度を増加させることは、捕獲感受性（ｓｅｉｚｕｒｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の減少に特に有効である（Gala, Fed.Proc., 44:2414, 1985) 。従って、ＰＬＰ−アンタゴニストによって誘導される捕獲を受ける実験動物は、特に黒質内の神経末端におけるＧＡＤ65の阻害のために、捕獲の伝達を阻害することができない。
【００９６】
Ｆ．ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の無細胞系配置
ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の分布をＳ2 及びシナプトソーム無細胞分画において評価した。Ｓ2 は、脳中の全細胞の細胞質ゾルからなる高速上清であり、一方シナプトソーム分画は、主として神経終末からなる（Gray et al., J.Anat., Lond, 96:79, 1962)。これらの研究のためには、全ラット脳分画を、Booth and Clark, Biochem.J., 176:365, 1978  の記載するように行った。タンパク質濃度をSchaffner and Weissman (Schaffner et al., Anal.Biochem. 56:502, 1973) の方法によって測定した。Kaise et al., DNA Cloning, Vil.1, A Practical Approach, D.M. Glover ed.,IRL Press, Oxford, 1985, pp.38-40 に記載の方法でサンプルを調製し、ＧＡＤ−６モノクローナル抗体及びＫ−２抗血清を用いて上記のようにしてイムノブロッティングを行った。等量のタンパク質（１６μｇ）を各レーンに加えた。オートラジオグラフィーは、１、３、１０、３０、１００μｇのタンパク質濃度で、Ｋ−２抗血清及びＧＡＤ−６モノクローナル抗体の両方と抗体結合した 125Ｉ−タンパク質Ａの量が線状に増加する応答を示している（データ示さず）。
【００９７】
この結果は、どちらの分画にも等量のＧＡＤ67が存在することを示している。Ｓ2 分画は神経膠（及びその他の非ニューロン性）の細胞質ゾルタンパク質と、ニューロン細胞とを含んでいるので、ＧＡＤ67の濃度は、神経末端よりもニューロン細胞体部における方が大きいに違いない。これとは対照的に、ＧＡＤ65の濃度はＳ2 よりもシナプトソームにおける方が大きい。これらの無細胞分画実験は、ＧＡＤ65とは対照的に、神経末端よりもニューロンの細胞体部において、はるかに大きいＧＡＤ67分画が存在することを示唆している。従って、免疫組織化学的研究におけるのと同様に、無細胞分画化は、ＧＡＤ65及びＧＡＤ67が異なる無細胞分布を有していることを示している。
【００９８】
ＧＡＢＡの合成及び分解阻害剤を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ実験において、ニューロン細胞体部におけるＧＡＢＡプールは、神経末端におけるＧＡＢＡプールとは異なることを示唆している（Iadarola et al., Mol.Cell.Biochem., 39:305, 1981) 。ＧＡＤ67によって生産されるＧＡＢＡは細胞代謝において（例えばＧＡＢＡシャント(shunt) において）、そして神経細胞樹状突起シナプスにおいて、より係わっている。僧帽樹状突起と共に神経細胞樹状突起シナプスを形成し（Shepard, Physiol.Rev., 52:864, 1972)、そして多分ＧＡＢＡを放出している（McLennan, Brain Res., 29:177-184, 1971) 嗅神経球にある顆粒細胞の樹状突起は、Ｋ−２抗血清で強く標識する。ここに示してはいないが、嗅神経球においてはＧＡＤ65よりもＧＡＤ67ｍＲＮＡレベルの方が大きい（２−３倍）ことが見いだされている。この分布は、嗅神経球におけるＧＡＤ活性のほとんどがシナプトソームにではなく、Ｓ2 及びＰ1 （粗核ペレット）に存在する、という知見（Quinn et al., Neurochem., 35:583, 1980) と一致している。
【００９９】
ＧＡＤ65とＧＡＤ67の無細胞分布の相違は、細胞体質の係留性（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）又は未知のタンパク質標的機構によるものかも知れない。いくつかの細胞体質タンパク質では、ＧＡＤ65とＧＡＤ67で似た分布を有している。例えば、培養交感神経細胞において、Peng et al., J.Cell.Biol., 102:252, 1986は、タウ(tau) の８４％は軸索に存在するが、一方ＭＡＰ−２の１００％が細胞体及び樹状突起に存在することを示した。更に、細胞体質タンパク質である、４３ｋｄのタンパク質が、アセチルコリンレセプターをその下にある膜細胞体質に係留するためのものである、と考えられている（Flucher et al., Neuron, 3:163, 1989)。
【０１００】
実施例３
臨床標本中のＧＡＤ自己抗体の検出
Ａ．材料及び方法
１．患者標本：  Ａｔｋｉｎｓｏｎ及びその共同研究者（Atkinson et al., Lacet, 335:1357-1360, 1990)  の以前の研究から、４グループの患者の血清を選択した。このグループは以下のものからなる：グループ（１）以前にはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃｓと呼ばれていた権威あるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄａｔａ  Ｇｒｏｕｐ（ＮＤＤＧ）の基準（Gleichman et al., Diabetes, 36:578-584, 1987) に従って診断された、１人の新規発病ＩＤＤ患者；グループ（２）家族に自己免疫疾患の病歴をなんら持たない、５人の無作為に選択された小島細胞細胞質抗体（ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＩＣＡ）陰性の非−糖尿病性コントロール；グループ（３）ＩＤＤの発病が記録される前の３から６６カ月間、血清が収集されてきた１３人；グループ（４）非−糖尿病性コントロール及び親族、及びＩＤＤ発病前に研究された人達；及びグループ（５）ＩＤＤＭの危険があるが、まだ発病には至っていない３人の患者。この後者のグループは、ＩＤＤ発端者(probands)の第１級親族５０００人以上、及び一般人８２００人（このうち４８１３人が学童である）の継続的ＩＣＡスクリーニングによって確認した。
【０１０１】
２．小島細胞自己抗体：  血液型Ｏのクリオカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）膵炎を間接免疫蛍光法でＩＣＡアッセイした（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) 。全ての結果をコードしたサンプルで、各バッチにおける陰性及び陽性コントロール血清と比較しつつ解釈した。ＩＣＡ陽性の程度はＩＣＡ標準化（Gleichman et al., Diabetes, 36:578-584, 1987) のためのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（ＩＤＷ）によって確立されたガイドラインに沿って分析した。全ての陽性な血清を端点希釈によって滴定し、あらかじめ８０ユニットの国際若年層糖尿病協会（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ＤｉａｂｅｔｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ：ＪＤＦ）標準に調整しておいた標準血清との比較によって、ＪＤＦユニットを測定した。ここで報告する研究においては、陽性なＩＣＡ結果とは１０ＪＤＦユニット又はそれ以上の応答力価で定義される。
【０１０２】
３．ＨＬＡ  ＤＲタイピング：  ＤＲトレイ（Ｏｎｅ  Ｌａｍｄａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ社製，ＣＡ）を用いて、Van Rood and Van Leuwen, Nature, 262:795-797, 1976  に記載の方法でＨＬＡ  ＤＲタイピングを実施した。
【０１０３】
４．ヒト小島細胞：  ヒト膵臓小島をカダベリン性（ｃａｄａｖｅｒｉｃ）膵炎から単離し、上記したように（Ricoedi et al., Diabetes, 37:413-420, 1988) ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持した。小島細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで（９５％空気／５％ＣＯ2 ）35Ｓメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で代謝的に標識した。
【０１０４】
５．小島細胞の抽出及び免疫沈降：  Atkinson et al., Lancet, 1357-1360, 1990  に記載の方法で、以下の修飾を用いて小島細胞を抽出した。免疫沈降の研究のためには、小島細胞溶解物を、各１０００小島細胞毎にコントロール、ＩＤＤ血清（１００μｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130, 1988)（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ) （Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) のいずれかと共にインキュベーションする（２時間、４℃）ことによって、２度前処理した。次いで免疫複合体を、過剰のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）に吸着させた。次いで、非結合性（前処理した）溶解物を含む１０００個の小島細胞を含む少量を、ＩＤＤ又はコントロール血清（２５μｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130, 1988)（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ) でインキュベーションした。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂでもう一度インキュベーションした（１時間、４℃）後、複合体を０．１％  ＳＤＳ、１．０％  トリトンＸ−１１４、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、次いで二重蒸留水で１回洗浄した。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂを次いでＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970) 中で煮沸し、そのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ社製）を用いる蛍光ラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ社製，Ｘ−ｏｍａｔ  ＡＲ５）に付した。或いは、オートラジオグラフをＢＥＴＡＧＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ社製，ＭＡ）アナライザーによって分析した。６４ＫＡの陽性又は陰性の血清を各アッセイで用いて、アッセイ内コントロールとした。全ての蛍光ラジオグラフィーを分析して、既知のアッセイ内コントロールと比較して陽性又は陰性と区分けした。陽性な血清サンプルは、もしもサンプルが６４，０００Ｍx バンドの低い強度の免疫沈降であったなら、これを１とし、もしも中程度の強度のバンドが観察されたら２とし、そしてもしも免疫沈降タンパク質の強度が大きいときは、これを３とした。免疫沈降した35Ｓ−ＧＡＤ65及び35Ｓ−ＧＡＤ67に対応するバンドの強度についても同様の区分けを用いた。
【０１０５】
６．免疫沈降：  35Ｓ−ＧＡＤ65又は35Ｓ−ＧＡＤ67、及びヒト脳ホモジネートからのＧＡＤを含むバクテリア溶解物の免疫沈降を、上記のヒト小島細胞抽出物の免疫沈降研究で記載したのと同様に行った。
【０１０６】
７．ＧＡＤアッセイ：  ヒト脳ホモジネートを、上記のヒト小島細胞で記載したように、患者血清と共にインキュベーションした。吸着及び洗浄後、タンパク質Ａアガローススラリーの少量を３回、等量で採取し、ＧＡＤ活性をKrieger et al., Neurochem. 33:299, 1984 に記載のように測定した。簡単に言うと、タンパク質Ａアガロースビーズを（１−14Ｃ）−グルタミン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、指定のインキュベーション混合物（Krieger et al., Neurochem. 33:299, 1984 ）中でインキュベーションし、液体シンチレーションカウンターで14ＣＯ2 の生産を定量した。
【０１０７】
８．35Ｓ−ＧＡＤ65及び35Ｓ−ＧＡＤ67の生産：  ラットＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡを上記したようにバクテリア発現系にサブクローンした。35Ｓ−ＧＡＤの標識は、ＩＰＴＧ誘導化バクテリア（最小培地で成育）をＴＲＡＮ35Ｓ−ラベル（ＩＣＮ）で１５分間パルスすることによって行った。次いで培養物を遠心して、ホモジナイズバッファー［１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ），１ｍＭ  ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド（ＡＥＴ）及び６０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．１］中に再懸濁して、超音波処理した。超音波処理の後、遠心によって細胞カスを除去し、上清（上清はー７０℃で少量貯蔵した）中のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal.Biochem., 72:248, 1986)。
【０１０８】
Ｂ．ＩＤＤＭ標本の免疫反応性
ＩＤＤＭを有する患者からの血清を用いて、ヒト脳ホモジネートからのＧＡＤを沈降させる能力を試験した。
【０１０９】
【表４】
0004072922.tif 000005
表４に示すように、ＩＤＤＭの危険があるか、或いはＩＤＤＭ患者の（５例のうち）４例の血清は、コントロール患者の血清よりも、有意に大量のヒト脳抽出物の酵素的に活性なＧＡＤと結合している。更に、患者のうちの１人からの血清は前−ＩＤＤＭ時期に採取されており、従ってＧＡＤに対する自己抗体はＩＤＤＭ症状の発病前に存在していたことになる（下記のＣ参照）。
【０１１０】
更に別の実験（結果を示さず）では、ＩＤＤＭの危険がある患者２人（ＤＡ，ＤＣ）からの血清は、組み換え法で生産された35Ｓ−ＧＡＤ65を免疫沈降させるが、一方組み換え法で生産された35Ｓ−ＧＡＤ67は、患者ＤＡの血清のみによって認識された（そしてこれは35Ｓ−ＧＡＤ65よりも弱い）ことを示した。またそれ以後の研究で、神経病の合併症を有するＩＤＤＭ患者の血清中には、ＧＡＤ65よりもＧＡＤ67自己抗体の力価が大きいことが見いだされた（ここでは示さず）。
【０１１１】
患者ＤＡの血清を用いる別の研究において、ヒト膵臓小島細胞で生産される特異的ポリペプチドを認識する抗体の存在が示された。結合ポリペプチドの電気泳動分析によって、他の研究者によって以前にヒトＩＤＤＭ（Baekkeskov et al., Nature, 298:167-169, 1982) 及び動物モデル(Baekkeskov et al., Science, 224:1348-1350, 1984; Atkinson et al., Diabetes, 37:1587-1590, 1988)  で示されたような、６４ｋＤの成分に対する自己抗体の存在が明らかとなった。ＧＡＤ65を認識するが、ＧＡＤ67は認識しない、ＧＡＤ−６モノクローナルで、或いはバクテリアで生産されるＧＡＤ65でこれらの血清をあらかじめ吸着させると、６４ｋＤの膵炎ポリペプチドを血清が認識する能力が失われる。従って６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体によって認識されるエピトープがＧＡＤ65中に存在し、このことは該自己抗原がＧＡＤ65であることを示唆している。ＧＡＤ65の予測される価値を研究するために、ＩＤＤＭの臨床的発現の発病前の患者から血清を採取して、このＧＡＤ65に対する自己抗体を調べた。
【０１１２】
【表５】
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表５に示すように、１２標本中の９標本（７５％）は35Ｓ−ＧＡＤ65と免疫反応性であった。更に、２人の患者（ＶＡ及びＶＣ）はこの条件下でＧＡＤ67と免疫反応性であったが、ＧＡＤ65とは免疫反応性でなかった。従って、組み合わせると、これらの患者の血清の１２例中、１１例（９１％）にＧＡＤ65及びＧＡＤ67に対する自己抗体が存在した。このことは、ＧＡＤ65に対する自己抗体はＧＡＤ67に対する自己抗体よりも一般的であるが、アッセイにおいて両方の組み換えＧＡＤ（ＧＡＤ65及びＧＡＤ67）を用いると、ＩＤＤＭをより広く予測できるようになることを示唆している。これらの血清についての以前の試験（Atkinson et al., Langet, 335:1357-1360, 1990) は、１２例のうちの１１例、又は９２％がヒト膵臓小島細胞からの35Ｓ−６４ｋＤ分子と免疫反応性であることを示している。６４ｋＤ分子に対する検出可能な自己抗体を含むが、ＧＡＤ65に対する自己抗体は含んでいない血清は、６４ｋＤ分子にとって最低の力価（又は”１”）を含む血清であった。従って、ここで得られた誤りの陰性はこのアッセイの感度が低いために起きたことである。更に、このアッセイは、６４Ｋに対して陰性な１人の患者（ＢＲ）にＩＤＤＭを予測している。
【０１１３】
これらの結果は、ヒト膵臓のβー細胞中に同定された６４ｋＤは、ラットＧＡＤ65とサイズ及び抗原性が同一であることを示している。更に、ＩＤＤＭ発病前の患者から採取した血清は、ＧＡＤ65に対する自己抗体を含んでいる。結論として、ＧＡＤ65組み換え分子は、ＩＤＤＭ予測の診断手段として非常に有用である。実際に症状がでる前に医師がＩＤＤＭを診断できるということは、疑いもなくインシュリン治療が必要となるまでの時間がおおいに伸びる結果となる。このような免疫アッセイの感度は、膵臓のβー細胞に存在するＧＡＤ形を表すヒト由来の組み換えＧＡＤ65を用いて改良されるであろう。
【０１１４】
実施例４
ポリペプチドへの免疫増殖応答
自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と標準条件とを用いてポリペプチドを合成した。次いでこれらのポリペプチドの、脾臓リンパ球及び小島侵潤性Ｔリンパ球（ＩＩＴＬ）の増殖を刺激する相対的能力を比較するために、これらのポリペプチドを試験した。この研究においては、ＧＡＤ65コア配列に由来するポリペプチドと、ポリオウィルスの相同領域に由来するポリペプチドとを比較した。適当な細胞をそれぞれのポリペプチドと共に５日間、５ｘ１０4 の照射脾臓細胞の存在下に培養した。培養の最後の１６時間に 3Ｈ−チミジンを加えた。
【０１１５】
【表６】
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これらの研究において、脾臓リンパ球の培養物の増殖活性においては、ポリオウィルス又はＧＡＤ65ポリペプチドのいずれと接触させたものにも有意の差は見られなかった。しかしながら、いずれのポリペプチドも、コントロール培地に見られた応答よりも高いＴ細胞応答を刺激した。脾臓細胞集団における差異がないことは、Ｔ細胞に特異的なＧＡＤポリペプチドの頻度が低いことによるものかも知れない。
【０１１６】
同様の方法で評価したときのＩＩＴＬ集団は、細胞増殖において顕著な差異を示した。このシステムにおいては、ＧＡＤ65ポリペプチドに対する応答は、培地又はポリオウィルスポリペプチドのいずれの応答よりも９倍大きかった。このデータはＧＡＤ65がＩＩＴＬ集団におけるＴ細胞応答のための重要な抗原であることを強く示唆している。このデータは糖尿病の病原学において分子擬態(mimicry) が一定の役割を果たしていることを示唆している。
【０１１７】
今や本発明は十分に説明されたので、当業界で通常の知識をもった人には、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更や修飾が可能であることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67特異的ｃＤＮＡプローブを得るためのクローニング計画を示す図である。
【図２】ラットＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。（図３に続く）
【図３】ラットＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。（図４に続く）
【図４】ラットＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。
【図５】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。（図６に続く）
【図６】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。（図７に続く）
【図７】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。（図８に続く）
【図８】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図である。
【図９】ラットＧＡＤ65とヒトＧＡＤ65アミノ酸配列の比較を示す図である。（図１０に続く）
【図１０】ラットＧＡＤ65とヒトＧＡＤ65アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１１】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの異なるサイズのＲＮＡへのハイブリダイズを示す図である。
【図１２】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に特異的なｃＤＮＡプローブでハイブリダイズしたサザンブロットを示す図である。
【図１３】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の免疫学的同定を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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