(57)【要約】  本発明は、発現を抑制するだけでなく、１または複数の標的遺伝子の発現の抑制を調節する能力を与える、標的化遺伝子サイレンシングのための方法および組成物に関する。
2017512481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え核酸分子であって、
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチドのサブセットまたはその機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、
組み換え核酸分子。
【請求項２】
請求項１の組み換え核酸であって、
前記ヌクレオチド配列は、３またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド、またはＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドと実質的な同一性を有するその機能性フラグメントをコードする、
組み換え核酸。
【請求項３】
請求項１または２の組み換え核酸であって、
２またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド、またはその機能性フラグメントは、融合されて単一のポリペプチドを形成する、
組み換え核酸。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項の組み換え核酸分子であって、
（ａ）Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｂ型）；
（ｂ）Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｃ型）；
（ｃ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｅ型）；
（ｄ）Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ６ｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｆ型）；
（ｅ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、ヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ａ型）；および／または
（ｆ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド、Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｄ型）
と、実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
組み換え核酸分子。
【請求項５】
請求項１または２の組み換え核酸分子であって、
前記組み換え核酸分子は、プロモーターに動作可能に連結される、
組み換え核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかの組み換え核酸分子であって、
前記組み換え核酸分子は、ターミネーターに動作可能に連結される、
組み換え核酸分子。
【請求項７】
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
２またはそれより多くのリピートヌクレオチド配列および１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）を含み、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲアレイ内の各スペーサーヌクレオチド配列は、リピートヌクレオチド配列に、その５’末端およびその３’末端で連結される、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項８】
請求項７の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
プロモーターが、前記ＣＲＩＳＰＲアレイに動作可能に連結される、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項９】
請求項７または８の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
ターミネーターが、前記組み換えＣＲＩＳＰＲアレイに動作可能に連結される、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記の１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）の少なくとも２つは、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列をそれぞれ含む、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記の１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）の少なくとも２つは、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列をそれぞれ含む、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１２】
請求項７から１１のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記の１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）は、標的ヌクレオチド配列またはその相補に対して、少なくとも約５０％の同一性を有する、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ヌクレオチド配列のコード鎖または＋鎖上に位置する、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１４】
請求項９から１２のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ヌクレオチド配列の非コード鎖または−鎖上に位置する、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記標的生物は、真核生物、原核生物またはウイルスである、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記標的ヌクレオチド配列は、プロモーターをコードするヌクレオチド配列の全部または一部、またはその相補を含む、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１７】
請求項１０から１４のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイであって、
前記標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置する、
組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ。
【請求項１８】
請求項１から６のいずれか一項の組み換え核酸分子、および／または、請求項７から１７のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む、
発現カセットまたはベクター。
【請求項１９】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
生物の細胞内に、請求項１から６のいずれか一項の組み換え核酸分子および請求項７から１７のいずれか一項の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを導入し、それにより、前記生物での前記標的遺伝子の発現を抑制する（転写を減少させる）ステップを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、
前記標的遺伝子の抑制を調節するステップをさらに含み、
ここで、前記生物内に導入される少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記標的遺伝子の抑制を調節する、方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、
標的遺伝子の抑制を調節するステップは、前記の少なくとも２つのスペーサーのヌクレオチド配列の少なくとも１つの長さを１〜約１００ヌクレオチド増大させることにより抑制を増大させ、それにより、長さが同様に増大されていない同一のスペーサーと比較して、前記標的遺伝子の抑制を増大させるステップを含む、または、
標的遺伝子の抑制を調節するステップは、前記の少なくとも２つのスペーサーのヌクレオチド配列の少なくとも１つの長さを１〜約１００ヌクレオチド低減させることにより抑制を低減させ、それにより、長さが同様に低減されていない同一のスペーサーと比較して、前記標的遺伝子の抑制を低減させるステップを含む、
方法。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれか一項の方法であって、
生物における少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制するステップをさらに含み、
ここで、少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記生物における少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制する、
方法。
【請求項２３】
請求項１９から２２のいずれか一項の方法であって、
前記組み換え核酸分子および前記組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、同一または異なる発現カセットまたはベクター上に導入される、
方法。
【請求項２４】
請求項１９から２３のいずれか一項の方法であって、
前記生物は、真核生物、原核生物またはウイルスである、
方法。
【請求項２５】
細菌または古細菌の標的遺伝子の発現を抑制する（転写を減少させる）方法であって、
細菌または古細菌において内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を破壊するステップ、ここで、破壊された内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列は存在しない、または存在するが発現しない、および／または、発現するが非機能性である（非機能性は、ヌクレアーゼ活性無しまたは減少として定義される）；および
前記細菌または古細菌内に、請求項７から１７のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む請求項１８の少なくとも１つの発現カセットを導入し、それにより、前記細菌または古細菌の標的遺伝子の発現を抑制するステップ、
を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法であって、
前記標的遺伝子の抑制を調節するステップをさらに含み、
前記の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記細菌または古細菌の標的遺伝子の抑制を調節する、
方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、
標的遺伝子の抑制を調節するステップは、前記の少なくとも２つのスペーサーのヌクレオチド配列の少なくとも１つの長さを１〜約１００ヌクレオチド増大させることにより抑制を増大させ、それにより、長さが同様に増大されていない同一のスペーサーと比較して、前記標的遺伝子の抑制を増大させるステップを含む、または、
標的遺伝子の抑制を調節するステップは、前記の少なくとも２つのスペーサーのヌクレオチド配列の少なくとも１つの長さを１〜約１００ヌクレオチド低減させることにより抑制を低減させ、それにより、長さが同様に低減されていない同一のスペーサーと比較して、前記標的遺伝子の抑制を低減させるステップを含む、
方法。
【請求項２８】
請求項２５から２７のいずれか一項の方法であって、
細菌または古細菌における少なくとも２つの標的遺伝子の発現を抑制するステップをさらに含み、
前記の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記細菌または古細菌の少なくとも２つの標的遺伝子の発現を抑制する、
方法。
【請求項２９】
請求項２５から２８のいずれか一項の方法であって、
前記ＣＲＩＳＰＲアレイを含む前記発現カセットまたはベクターは、前記内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を破壊するのと同時または破壊後のいずれかに、前記細菌または古細菌内に導入される、
方法。
【請求項３０】
請求項２５から２９のいずれか一項の方法であって、
前記細菌または古細菌は、抗ウイルス防御のための内因性ＣＲＩＳＰＲ関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）を含む、
方法。
【請求項３１】
請求項２５から３０のいずれか一項の方法であって、
異種プロモーターが、前記細菌または古細菌内に導入され、前記内因性Ｃａｓｃａｄｅに動作可能に連結される、
方法。
【請求項３２】
請求項３１のいずれか１つの方法であって、
前記の内因性ｃａｓ３の破壊は、相同組み換えを介して前記異種プロモーターの導入と同時に行なわれる、
方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの標的ヌクレオチド配列の発現を抑制するためのキットであって、
請求項１から６のいずれか一項の組み換え核酸分子、請求項７から１７のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または、請求項１８の発現カセットまたはベクターを含む、
キット。
【請求項３４】
標的遺伝子の抑制を調節するためのキットであって、
請求項１から６のいずれか一項の組み換え核酸分子および請求項８の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または、請求項７から９または請求項１１から１７のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む、
キット。
【請求項３５】
生物での少なくとも２つの標的遺伝子の発現を抑制するためのキットであって、
請求項１から６のいずれか一項の組み換え核酸分子および請求項１１の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または、請求項７から１０または請求項１２から１７のいずれか一項の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む、
キット。
【請求項３６】
請求項３３から３５のいずれか一項のキットであって、
前記キットが前記組み換え核酸分子および前記組み換えＣＲＩＳＰＲアレイの両方を含む場合、前記組み換え核酸分子および前記組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、単一のベクターまたは発現カセット上、または、別個のベクターまたは発現カセット上に含まれる、
キット。
【請求項３７】
請求項３３から３６のいずれか一項のキットであって、
取扱説明書をさらに含む、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、および、遺伝子発現の抑制および調節のためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）は、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（ｃａｓ）と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを構成し、多くの細菌および大部分の古細菌において適応免疫を与える。ＣＲＩＳＰＲが仲介する免疫付与は、同一の配列を含むインベーダーによる将来的な感染を妨害するために用いることのできる、ファージおよびプラスミドなどの侵襲性遺伝因子由来のＤＮＡの統合を介して生じる。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、超可変「スペーサー」配列により隔てられた短いＤＮＡ「リピート」のＣＲＩＳＰＲアレイおよび一組の隣接するｃａｓ遺伝子からなる。当該システムは、外来核酸の干渉および配列特異的ターゲッティングを介して、ファージおよびプラスミドなどの侵襲性遺伝因子に対する適応免疫を提供することにより作用する（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９−１７１２；Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−４；Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２７：１６７−７０；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２：１８４３−１８４５；Ｂｈａｙａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３−２９７；Ｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｎｓ．２０１１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３２１−３２７；Ｗｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４６：３１１−３３９；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  Ｒ．２０１３．ＲＮＡ．４：２６７−２７８）。典型的に、侵襲性ＤＮＡ配列は、新規の「スペーサー」として獲得され（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９−１７１２）、それぞれがＣＲＩＳＰＲリピートと対になり、新規のリピート−スペーサーユニットとしてＣＲＩＳＰＲ座に挿入される。「スペーサー」は、全てのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに普遍的なＣａｓ１およびＣａｓ２タンパク質により獲得され（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７−４７７；Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：５５６９−５５７６）、一部のシステムではＣａｓ４タンパク質による関与を伴う（Ｐｌａｇｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１９４：２４９１−２５００；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４７２３２）。生じるリピート−スペーサーアレイは長いｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）として転写され（Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−４）、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列特異的認識を駆動するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へ処理される。具体的には、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより仲介される配列特異的な核酸切断のために、ヌクレアーゼを相補標的に向かってガイドする（Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６８：６７−７１；Ｈａｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１３５５−１３５８；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３９：９２７５−９２８２；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−８２１；Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６；Ｍａｇａｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７：ｅ４０９１３；Ｋａｒｖｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１��．ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．１０：８４１−８５１）。
【０００４】
これらの広範なシステムは、細菌のほぼ半数（約４６％）および大多数の古細菌（約９０％）で生じる。それらは、ｃａｓ遺伝子含有量、ｃｒＲＮＡ生合成を駆動する生化学的プロセスにおける組織化および多様性、および、標的の認識および切断を仲介するＣａｓタンパク質複合体に基づいて、３つの主なタイプに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７−４７７；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４１：４３６０−４３７７）。Ｉ型システムは、細菌および古細菌において、最も普及していて（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７−４７７）ＤＮＡを標的化する（Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−４）。抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体と呼ばれる３〜８個のＣａｓタンパク質の複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理し（Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−４）、ｃｒＲＮＡのスペーサー部分に相補である「プロトスペーサー」と呼ばれるＤＮＡ配列を認識するようにｃｒＲＮＡを保持する。ｃｒＲＮＡスペーサーとプロトスペーサーとの間の相補性は別として、標的化は、プロトスペーサーの５’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５５：７３３−７４０；Ｓｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２：２３７−２６６）。Ｉ型システムに関しては、ＰＡＭは、Ｃａｓｃａｄｅにより直接認識される（Ｓａｓｈｉｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４６：６０６−６１５；Ｗｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４６：５９５−６０５）。必要とされる正確なＰＡＭ配列は異なるＩ型システム間で相違し得て、確立されたバイオインフォマティクスおよび実験手順を介して同定することができる（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：１１１６−１１１２１；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３−２３９；Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５５：７３３−７４０）。プロトスペーサーが認識された時点で、Ｃａｓｃａｄｅは一般に、エンドヌクレアーゼＣａｓ３を動員し、それは標的ＤＮＡを切断および分解する（Ｓｉｎｋｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．ＥＭＢＯ  Ｊ．３０：１３３５−１３４２；Ｓｉｎｋｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．ＥＭＢＯ  Ｊ．３２：３８５−３９４）。
【０００５】
干渉は、複合体を含むＣａｓタンパク質の全て、Ｃａｓ３タンパク質、およびＣＲＩＳＰＲアレイが発現されることを要する。ほとんどの生物において、これらのタンパク質は構成的に発現されると考えられるが、いくつかの例では、これらのタンパク質の一部は誘導的に発現される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでは、複合体をコードする遺伝子は、正常な増殖条件下で抑制される単一オペロン内にコードされる。しかしながら、オペロンの抑制は、リプレッサーＨ−ＮＳの欠失を介して排除することができる（Ｐｕｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：１４９５−１５１２；Ｗｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：１３８０−１３９３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、発現を抑制するだけでなく、１または複数の標的遺伝子の発現の抑制を調節する能力を提供する、標的化遺伝子サイレンシングのための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチドのサブセットまたはその機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え核酸分子が提供される。一部の態様では、本発明の組み換え核酸は、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドに対して実質的な同一性を有する３またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。さらに他の態様では、前記の３またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド、またはその機能性フラグメントは、融合されて単一のポリペプチドを形成することができる。
【０００８】
別の態様では：（ａ）Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｂ型）；（ｂ）Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｃ型）；（ｃ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｅ型）；（ｄ）Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ６ｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｆ型）；（ｅ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、ヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ａ型）；および／または、（ｆ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド、Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｄ型）、に対して実質的な類似性を有するヌクレオチド配列を含む組み換え核酸分子が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、その３’末端でリピートヌクレオチド配列に連結した少なくとも１つのスペーサーヌクレオチド配列を含む、組み換えＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡを提供し、ここで、前記の少なくとも１つのスペーサーヌクレオチド配列は、場合により、その５’末端に、少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを含む。
【００１０】
本発明の追加の態様は、２またはそれより多くのリピートヌクレオチド配列および１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを提供し、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲアレイ内の各スペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端およびその３’末端で、リピートヌクレオチド配列に連結される。
【００１１】
本発明の別の態様は、標的ヌクレオチド配列の発現を抑制する（例えば、転写を減少させる）ための方法を提供し、それは、本発明の組み換え核酸分子および本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを生物内に導入し、それにより、前記生物における前記標的ヌクレオチド配列の発現を抑制するステップを含む。さらなる態様は、標的遺伝子の抑制を調節する（増大させる／低減させる）ための方法を提供し、ここで、生物内に導入される前記の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記標的遺伝子の抑制を調節する。また、さらなる態様は、生物において少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制するための方法を提供し、ここで、前記の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記生物における少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、細菌または古細菌の標的ヌクレオチド配列の発現を抑制する（転写を減少させる）方法を含み、その方法は：細菌または古細菌において内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を破壊するステップ、ここで、破壊された内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列は存在しない、または存在するが発現しない、および／または、発現するが非機能性である；および、前記細菌または古細菌内に、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む少なくとも１つの発現カセットを導入し、それにより、前記細菌または標的ヌクレオチド配列の発現を抑制するステップ、を含む。一部の実施態様では、その方法は、標的遺伝子の抑制（例えば、転写の減少）を調節するステップ（増大させる／低減させるステップ）をさらに含み、ここで、少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記細菌または古細菌の標的遺伝子の抑制を調節する。また、さらなる態様は、細菌または古細菌において少なくとも２つの標的遺伝子の発現を抑制するステップを含み、ここで、少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、そして、細菌または古細菌は、破壊された内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を含み、それにより、前記細菌または古細菌の少なくとも２つの標的遺伝子の発現を抑制する。
【００１３】
本発明の組み換え核酸分子、ＣＲＩＳＰＲアレイ、および／またはヌクレオチド配列を含む、発現カセット、細胞、およびキットが、本明細書においてさらに提供される。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明において、より詳細に示される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＬａｃＺプロモーターの制御下で蛍光ＧＦＰポリペプチドをコードする、プラスミドｐＵＡ６６ｌａｃＺ内の関心領域を示す。長い矢印は、ｇｆｐのコード領域を示す。細い黒の矢印は、黒で概説されたプロモーターの−３５および−１０エレメントを有する転写の開始を示す。上の各スペーサーは、上鎖またはコード鎖とマッチする（したがって、下鎖または非コード鎖と結合する）。同様に、下の各スペーサーは、下鎖または非コード鎖とマッチする（したがって、上鎖と結合する）。確立されたＰＡＭ  ＡＡＧまたはＡＧＧが、各プロトスペーサーの５’末端に位置する。
【図２】本明細書に記載の本発明の方法を用いた、プラスミドｐＵＡ６６ｌａｃＺを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５における蛍光ＧＦＰタンパク質の転写抑制を示すグラフを提供する。示されたスペーサーを有するｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを保有する細胞を、０．４％グリセロールおよび０．２％カザミノ酸で補充されたＭ９最小限培地内で増殖させ、同じ培地にバック希釈して（ｂａｃｋ−ｄｉｌｕｔｅｄ）、そして、対数期中間まで６時間増殖させた。それから、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター上で蛍光を測定した。Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ  ｗ．ｒ．ｔ．  ｐＣＲＩＳＰＲは、ｐＣＲＩＳＰＲに対するｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅを意味する。ｐＣＲＩＳＰＲは同一のプラスミドであるが、ＧＦＰ遺伝子を標的化するスペーサーをコードしない。
【図３】異なる内因性糖利用オペロンを標的化するスペーサーを有するプラスミドを保有する、形質導入されたＭＧ１６５５細胞の培養物の光学濃度（ＡＢＳ６００）の棒グラフを提供し、示された糖での培養物の増殖に対して生じる影響を示す。ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ）、または、関連する糖の利用遺伝子のプロモーターに対するスペーサーを保有する同一プラスミドを用いて、細胞を形質転換した（ＰａｒａＢ，Ｌ−アラビノースに関するａｒａＢプロモーター；ＰｌａｃＺ，ラクトースに関するｌａｃＺプロモーター；および、ＰｘｙｌＡ，Ｄ−キシロースに関するｘｙｌＡプロモーター）。細胞を、グリセロールで補充されたＭ９培地中で２４時間培養し、示された炭素源で補充されたＭ９培地中に０．００１のＡＢＳ６００までバック希釈し、そして、２２時間培養した。棒グラフは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ分光光度計を用いて測定した最終ＡＢＳ６００値を報告する。
【図４Ａ−４Ｂ】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２におけるＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを示す。図４Ａは、Ｉ−Ｅ型システムの遺伝子座を提供する。ｃａｓ３遺伝子は、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質複合体をコードするｃａｓＡＢＣＤＥオペロンの上流に位置する。２つの下流遺伝子ｃａｓ１およびｃａｓ２は、スペーサーの獲得に関与する。ネイティブのスペーサーアレイは、同一のリピート（白の楕円）および間にあるスペーサー（灰色の丸）からなる。図４Ｂは、先行研究に基づくＤＮＡ破壊のメカニズムを示す（Ｓｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８２，２３７−２６６；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５，１７０９−１７１２２）。転写されたアレイは、Ｃａｓｃａｄｅによって個々のｃｒＲＮＡに処理される。それから、アレイのスペーサー部分を用いて、ＰＡＭ（黒の丸）が隣接する相補ＤＮＡ配列を同定する。ＤＮＡ結合は、Ｃａｓ３の動員をもたらし、標的ＤＮＡを切断および分解する。
【図５Ａ−５Ｂ】プログラム化可能な遺伝子抑制のための、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２におけるＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの再目的化（ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ）を示す。図５Ａは、プログラム化可能なリプレッサーへの、Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転換を示す。Ｃａｓｃａｄｅオペロン上流の構成的プロモーターの挿入およびｃａｓ３の欠失は、切断を伴わずにｃｒＲＮＡ依存性ＤＮＡ結合を可能にする。図５Ｂは、ｃｒＲＮＡ依存性遺伝子抑制の推定のメカニズムを示す。Ｃａｓｃａｄｅは、転写されたＣＲＩＳＰＲアレイを、個々のｃｒＲＮＡに処理する。それから、Ｃａｓｃａｄｅ−ｃｒＲＮＡ複合体は、ＰＡＭ（黒の丸）が隣接する標的ＤＮＡ配列（灰色の線）に結合し、転写抑制をもたらす。
【図６】合成Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲアレイに関するクローニングスキームを提供する。標的配列内のＰＡＭの同定に続いて、下流の３２塩基対がプロトスペーサーとしての役割を果たす。最後の２つの塩基対以外は全て、２つのアニールしたオリゴヌクレオチドにコピーされ、それは、アニールすると、リピート−スペーサーペアを形成する。スペーサー−リピートペアは、内部のＸｈｏＩ制限部位とともに、切断されたＸｈｏＩ制限部位（右）および切断されたＫｐｎＩ制限部位（左）のためのオーバーハングを含む。プロトスペーサーの３０番目の塩基がＣでない限り、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化されたプラスミドのいずれかへのアニールしたオリゴヌクレオチドのライゲーションは、オリジナルのＸｈｏＩ制限部位を破壊する。その結果として、さらなるリピート−スペーサーペアを、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ制限部位へ連続して挿入することができる。
【図７Ａ−７Ｃ】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２における、再目的化Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いた、ＲＮＡが仲介する転写抑制を示す。図７Ａは、プラスミドに基づくＧＦＰ発現の標的化されたサイレンシングを示す。ｇｆｐ遺伝子は、低コピープラスミドｐＵＡ６６−ｌａｃＺにおいて、ｌａｃＺプロモーターの制御下にある。各スペーサー配列（中間の灰色の線）およびＰＡＭ（黒の丸）は、プロトスペーサーの最も近い鎖とマッチする。ＲＢＳ，リボソーム−結合部位。図７Ｂは、位置依存性および鎖依存性のＧＦＰ発現抑制を示す。中コピーｐＵＡ６６−ｌａｃＺを保有するＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔおよび示された単一スペーサープラスミドを、ＩＰＴＧおよびＬ−アラビノースでの誘導の後に、フローサイトメトリー分析に供した。非標的化ｍｖｉＭスペーサーは、ネガティブコントロールとしての役割を果たす。抑制は、誘導性のスペーサー無しプラスミド（ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄ）およびそれぞれの単一スペーサープラスミドに関して、自己蛍光を引いた蛍光の比として計算される。図７Ｃは、遺伝子サイレンシングの可逆性を示す。ｐＵＡ６６−ｌａｃＺおよびスペーサー無しプラスミド（ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄ、白の丸）またはＴ２単一スペーサープラスミド（Ｔ２、灰色の丸）のいずれかを保有するＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔ細胞を、ＩＰＴＧのみで事前誘導してＩＰＴＧおよびＬ−アラビノースの両方に切り替え（左）、または、ＩＰＴＧおよびＬ−アラビノースの両方で事前誘導してＩＰＴＧのみに切り替えた（右）。ｔ＝０での誘導物質の切り替え後に、個々の細胞に関する自己蛍光を引いた蛍光、および、培養物の濁度を経時的に追った。ＧＦＰ蛍光は、スペーサー無しプラスミドに対して標的化プラスミドを有する細胞が約１０倍より低く、それは、これらの増殖条件下でのＰａｒａＢプロモーターからの漏れやすい（ｌｅａｋｙ）発現に起因した（Ａｆｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  ＴＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，１０．１０２１／ｓｂ４００１６２ｚ）。値は、３つの別個のコロニーで始めた非依存性実験からの幾何平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表わす。Ｃにおけるエラーバーは、シンボルよりも小さい。
【図８Ａ−８Ｃ】親株ＢＷ２５１１３およびＮＭ５００の変異体におけるＧＦＰ発現およびＤＮＡ形質転換を示す。図８Ａは、ｐＵＡ６６−ｌａｃＺおよび示されたプラスミドを保有する、ＢＷ２５１１３（上）またはＢＷ２５１１３ΔＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（下）のＧＦＰ蛍光を示す。フローサイトメトリー分析の前に、細胞を、０．２％カザミノ酸、０．４％グリセロール、０．２％Ｌ−アラビノース、および０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＭ９最小限培地で約３〜４時間、ＡＢＳ６００約０．２まで増殖させた。報告される値は、ＧＦＰを欠く細胞からの自己蛍光を引いた絶対的蛍光である。図８Ｂは、ｃａｓ３の存在下または不存在下での形質転換効率を示す。ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔまたはｐＵＡ６６−ｌａｃＺを保有するＮＭ５００  ｃａｓ３＋細胞を、示されたプラスミド５０ｎｇで形質転換し、アンピシリン、カナマイシン、ＩＰＴＧ、およびＬ−アラビノースを有するＬＢ寒天上にプレーティングして、コロニーの数を数えた。株間の形質転換効率の違いは、スイッチングキュベット（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｃｕｖｅｔｔｅ）製造業者に起因した。図８Ｃは、抵抗性カセットの切除後またはｃａｓ３存在下の、ＧＦＰ抑制を示す。ｐＵＡ６６−ｌａｃＺおよびｐＣＲＩＳＰＲ．ｉｎｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ．ｉｎｄ−Ｔ２（Ｔ２）、ｐＣＲＩＳＰＲ．ｉｎｄ−ＮＴ２（ＮＴ２）、またはｐＣＲＩＳＰＲ．ｉｎｄ−ｍｖｉＭ（ｍｖｉＭ）を保有する、ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３またはＮＭ５００  ｃａｓ３＋細胞を、図８Ａに関して示されるように増殖させた。抑制は、ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄおよびそれぞれの単一スペーサープラスミドに関する、自己蛍光を引いた蛍光の比として計算される。さらなる情報については図７Ａ−７Ｃを参照。値は、３つのコロニーでの非依存性実験からの幾何平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表わす。
【図９】アレイ長およびスペーサー位置の、サイレンシング効率に対する影響を示す。ｐＵＡ６６−ｌａｃＺおよび示された誘導性ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドを保有するＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔ細胞を、ＩＰＴＧおよびＬ−アラビノースでの誘導の後に、フローサイトメトリー分析に供した。抑制は、誘導性スペーサー無しプラスミド（ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄ）およびそれぞれのマルチスペーサープラスミドに関して、自己蛍光を引いた蛍光の比として計算される。リピート，白の楕円；Ｔ２スペーサー，濃い灰色の円；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｍｖｉＭ遺伝子にマッチする非標的化スペーサー，薄い灰色の円。値は、３つの別個のコロニーでスタートした（ｓｔａｒｉｎｇ）非依存性実験からの幾何平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表わす。
【図１０Ａ−１０Ｄ】パスウェイおよび内因性遺伝子の標的化抑制を示す。図１０Ａは、糖の異化作用の要因である標的化オペロンを示す。スペーサーは、その同族の糖での増殖に必要なそれぞれの異化作用オペロンのプロモーターを標的にするように設計した。図１０Ｂはプロモーター活性の抑制を示す。抑制は、構成的なスペーサー無しプラスミド（ｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎ）およびそれぞれの単一スペーサーまたはマルチスペーサープラスミドに関して、自己蛍光を引いた蛍光の比として計算される。値は、３つのコロニーでの非依存性実験からの幾何平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表わす。図１０Ｃは、内因性遺伝子の抑制を示す。示された単一スペーサープラスミドを保有するＭＧ１６５５  Δｃａｓ３：：ｃａｔ細胞を、同族の糖での誘導の後に全ＲＮＡについて採取して、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。抑制は、スペーサー無しプラスミド（ｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎ）および示された単一スペーサープラスミドから、相対的ｍＲＮＡレベルの比として計算される。値は、４重の技術再現に関する幾何平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表わす。図１０Ｄは、増殖の標的化された抑制を示す。示された単一スペーサーまたはマルチスペーサープラスミドを保有するＭＧ１６５５  Δｃａｓ３：：ｃａｔ細胞を、それぞれの糖を唯一の炭素源として増殖させて、増殖の２４時間後に濁度を測定した。値は、３つの別個のコロニーでスタートした非依存性実験からの、測定されたＡＢＳ６００値の幾何平均を表わす。
【図１１Ａ−１１Ｂ】増殖アッセイに関する拡張した情報を示す。図１１Ａは、増殖アッセイに関する個々のＡＢＳ６００値を示す。データは、４つの糖を含む培地での増殖を示す最後のカラムを例外として、図１０Ｄに示されるものを表わす。ドットは、非依存性の培養物からの個々の測定を表わす。図１１Ｂは、唯一の炭素源として示された糖を有する最小限培地において増殖した、構成的なｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎプラスミドを保有するＭＧ１６５５  Δｃａｓ３細胞の倍加時間を提供する。値は、３つのコロニーでの非依存性実験からの幾何平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を表わす。
【図１２Ａ−１２Ｂ】本発明の組み換え構築物におけるスペーサー長を変更することの、抑制に対する影響を示す。図１２Ａは、構築物およびプロトスペーサーの位置を示す。さらなる情報については図７Ａを参照。図１２Ｂは、抑制が、スペーサー長を増大することにより増大し、スペーサー長を低減させることにより低減することを示す。
【図１３】スペーサー長の変異型に関して標的化される異なる位置の概要を示す。Ｔ２は、プロモーター領域内のテンプレート鎖を標的化し、Ｔ４は、コード領域内のテンプレート鎖を標的化し、ＮＴ３は、非翻訳領域内の非テンプレート鎖を標的化する。
【図１４】ＮＴ３の増大するスペーサー長の変異型の平均抑制比（ｆｏｌｄ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。指定された長さが標準的な３０ヌクレオチドに付加される。例えば、ＮＴ３＋１２は、４２ヌクレオチドのスペーサーをコードする。
【図１５】Ｔ２スペーサー長の変異型の平均抑制比を示す。スペーサー長に関するさらなる情報については図１４を参照。
【図１６】Ｔ４スペーサー長の変異型の平均抑制比を示す。スペーサー長に関するさらなる情報については図１４を参照。
【図１７】より長いスペーサーと標的との間の塩基対合相互作用の破壊の概要を示す。下のイメージは、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに遠位の余分の１２ヌクレオチドが、標的と塩基対合しないように設計された、Ｔ２＋１２突然変異体を示す。塩基対合は、標的に対するスペーサーの最初の３０ヌクレオチドの間で維持される。
【図１８】Ｔ２突然変異体スペーサーの平均抑制比を示す。
【図１９】ＮＴ３突然変異体スペーサーの平均抑制比を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｉ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣａｓｃａｄｅでの標的化された遺伝子抑制を示す。図２０Ａは、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｉ−Ｃ型Ｃａｓｃａｄｅオペロン（上）、および、ｌａｃプロモーターを標的化することにより、Ｃａｓｃａｄｅ複合体をガイドしてＧＦＰ発現をサイレンスにするＣＲＩＳＰＲを示す（下）；図２０Ｂは、フローサイトメトリー分析による培養物の蛍光測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ここで、本発明の実施態様が示される添付の図面および実施例を参照して、以下に本発明を説明する。当該説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の、詳細一覧であることを目的としない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴を他の実施態様に援用し得て、特定の実施態様に関して説明される特徴をその実施態様から欠落し得る。したがって、本発明は、本発明の一部の実施態様において、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略することができることを期待する。加えて、本明細書に示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変更および追加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを目的とし、その全ての並べ替え、組み合わせおよび変更を徹底的に特定することは目的としない。
【００１７】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において本発明の説明で用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のみであり、本発明の限定を意図しない。
【００１８】
本明細書において挙げられる刊行物、特許出願、特許文献および他の引用文献は全て、引用文献が示されている文および／または段落と関連のある教示に関して、それらの全体で参照により援用される。
【００１９】
文脈が別段の提示をしない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで用いることができることが、明確に意図される。さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様において、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることも期待する。説明するために、明細書が、組成物は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと記述する場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせは、単独または任意の組み合わせで省略および放棄することができることが、明確に意図される。
【００２０】
本発明の説明および添付の請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形も同様に含むことを意図する。
【００２１】
また、本明細書において用いられる「および／または」は、１つまたは複数の関連する挙げられた事項の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的（「または」）に解釈する場合は、組み合わせの欠如を言及および包含する。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「約」は、用量または期間などの測定可能な値を言及する場合、規定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を言及する。
【００２３】
本明細書において用いられる「ＸおよびＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」および「約ＸおよびＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈すべきである。本明細書において用いられる「約ＸおよびＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」などの語句は「約Ｘおよび約Ｙの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  ａｂｏｕｔ  Ｙ）」を意味し、「約ＸからＹまで（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  Ｙ）」などの語句は「約Ｘから約Ｙまで（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  ａｂｏｕｔ  Ｙ）」を意味する。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述された特徴、整数、ステップ、操作、因子、および／または構成要素の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、因子、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を妨げない。
【００２５】
本明細書において用いられる暫定の語句「から本質的になる」は、請求項の範囲が、請求項に挙げられた特定の物質またはステップおよび特許請求の範囲に記載された発明の基本的かつ新規の特徴（単数または複数）を実質的に影響しないものを包含すると解釈されることを意味する。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項において用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００２６】
本明細書において用いられる「キメラ」は、少なくとも２つの構成要素が異なる起源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）から得られた核酸分子またはポリペプチドを指す。
【００２７】
本明細書において用いられる「相補」は、コンパレーターヌクレオチド配列と１００％の相補性または同一性を意味することができ、または、１００％未満の相補性（例えば、約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味することができる。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「相補」または「相補性」は、塩基対合による、許容される塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、相補配列「５’−Ｔ−Ｃ−Ａ−３’」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する場合は「部分的」であり得て、または、一本鎖分子間に全体的相補性が存在する場合は完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重大な効果を有する。
【００２９】
本明細書において用いられる「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔ）」、「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」、「接触した（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」およびそれらの文法的変更は、所望の反応（例えば、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティング、組込み、形質転換、部位特異的切断（ニック、開裂）、増幅など）を行なうのに適切な条件下で、所望の反応の構成要素を一緒に配置することを指す。そのような反応を行なうための方法および条件は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。
【００３０】
本明細書において用いられる、抗ウイルス防御のための、Ｉ型Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおける、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの処理およびその後の標的ＤＮＡへの結合に関与するポリペプチドの複合体を指す。これらのポリペプチドは、限定されないが、Ｉ型サブタイプＩ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−Ｄ、Ｉ−ＥおよびＩ−ＦのＣａｓｃａｄｅポリペプチドを含む。Ｉ−Ａ型ポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）、Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）、Ｃａｓ５、Ｃｓａ５、Ｃａｓ６ａ、Ｃａｓ３’および／またはＣａｓ３’’を含む。Ｉ−Ｂ型ポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ６ｂ、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）および／またはＣａｓ５を含む。ＩＣ型ポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）、および／またはＣａｓ７（Ｃｓｄ２）を含む。ＩＤ型ポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃ１、および／またはＣａｓ６ｄを含む。Ｉ−Ｅ型ポリペプチドの非限定の例は、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）および／またはＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）を含む。Ｉ−Ｆ型ポリペプチドの非限定の例は、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）および／またはＣａｓ６ｆ（Ｃｓｙ４）を含む。したがって、本発明の一部の実施態様では、組み換え核酸は、ＣＲＩＳＰＲアレイを処理して、その後に、処理されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡのスペーサーをガイドとして用いて標的ＤＮＡに結合するように機能する、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドのサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、からなる。
【００３１】
ヌクレオチド配列の「フラグメント」または「一部」は、参照核酸またはヌクレオチド配列に対して、長さが減少した（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのヌクレオチド減少した）ヌクレオチド配列を意味すると理解され、および、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一のまたはほぼ同一の（例えば、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の）連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、から本質的になり、および／または、からなる。本発明に係るそのような核酸フラグメントまたは一部は、適切な場合は、それがその構成要素となる、より大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドのフラグメントは、その機能を保持する（例えば、野生型ポリペプチドと比べて長さが減少された１型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドのフラグメントをコードするが、１型Ｃａｓｃａｄｅタンパク質の少なくとも１つの機能を保持する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを処理する、ＤＮＡと結合する、および／または、複合体を形成する）、ポリペプチドをコードするフラグメントであってよい。
【００３２】
本明細書において用いられる用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗−ミクロＲＮＡ、調節ＲＮＡなどを生産するのに用いることが可能な核酸分子を指す。遺伝子は、機能性タンパク質または遺伝子産物を生産するのに用いることが可能であってよく、または不可能であってよい。遺伝子は、コード領域および非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終止配列および／または５’および３’非翻訳領域）の両方を含んでよい。遺伝子は、「単離」され得て、それにより、その天然の状態では核酸と結合して通常は見られる構成要素から、実質的にまたは本質的にフリーである核酸が意味される。そのような構成要素は、他の細胞物質、組み換え生産による培養培地、および／または核酸の化学合成で用いられる様々な化学物質を含む。
【００３３】
本明細書において用いられる「ヘアピン配列」は、ヘアピンを含むヌクレオチド配列である。ヘアピン（例えば、ステム−ループ、フィード−バック）は、いずれか側に二本鎖領域がさらに隣接する一本鎖を形成するヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する、核酸分子を指す。そのような構造は当該分野でよく知られている。当該分野で知られているように、二本鎖領域は、塩基対合内にいくつかのミスマッチを含んでよく、または完全に相補であってよい。一部の実施態様では、リピートヌクレオチド配列は、前記リピートヌクレオチド配列内に位置するヘアピン配列を含む、から本質的になる、からなる（すなわち、リピートヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）が、前記リピートヌクレオチド配列内にあるヘアピンのいずれか側に存在する）。
【００３４】
「異種」または「組み換え」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞と天然には関係しないヌクレオチド配列であり、天然起源ヌクレオチド配列の非天然起源多重コピーを含む。
【００３５】
相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書において「ホモログ」と呼ぶ。ホモログという用語は、同一および他の種由来の相同配列および同一および他の種由来のオルソロガス配列を含む。「相同性」は、位置同一性（すなわち配列類似性または同一性）のパーセントの観点からの、２以上の核酸および／またはアミノ酸配列の間の類似性のレベルを指す。また、相同性は、異なる核酸またはタンパク質間の類似の機能特性の概念を指す。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対するホモログをさらに含む。本明細書において用いられる「オルソロガス」は、種分化の間に共通の祖先遺伝子から生じる異なる種における相同ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列のホモログは、本発明の前記ヌクレオチド配列と実質的な配列同一性（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％）を有する。
【００３６】
本明細書において用いられる、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）、およびそれらの文法的変更は、２つの相補のヌクレオチド配列またはいくつかのミスマッチの塩基対が存在する実質的に相補の配列の結合を指す。ハイブリダイゼーションの条件は当該分野でよく知られていて、ヌクレオチド配列の長さおよびヌクレオチド配列間の相補性の程度に基づき変化する。一部の実施態様では、ハイブリダイゼーションの条件は、高ストリンジェンシーであってよく、または、それらは、ハイブリダイズされる配列の長さおよび相補性の量に応じて、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーであってよい。ヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの目的に関して低、中および高ストリンジェンシーを構成する条件は、当該分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」および「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（およびそれらの文法的変更）は、コントロールと比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％、２５００％、５０００％、１０，０００％、２０，０００％またはそれよりも多い上昇を表す（例えば、特定の遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイは、例えば、その遺伝子の異なる領域を標的とするより多くのスペーサーヌクレオチド配列を有し、したがって、同一の遺伝子だが、例えば、その遺伝子の異なる領域を標的とする、より少ないスペーサーヌクレオチド配列を有するものを標的とするＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、その遺伝子の抑制が増大する）。
【００３８】
「天然」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然起源または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物において天然起源または内因性であるｍＲＮＡである。「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連するヌクレオチド配列である。
【００３９】
また、本明細書において用いられる用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸構築物」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖または分岐の一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡ、またはそれらのハイブリッドを指す。また、用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ｄｓＲＮＡが合成的に生産される場合は、一般的でない塩基、例えば、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対合に用いることができる。例えば、シチジンおよびウリジンのＣ−５プロピンアナログを含むポリヌクレオチドは、高アフィニティでＲＮＡと結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤となることが示されている。他の修飾、例えば、ホスホジエステル主鎖、またはＲＮＡのリボース糖基内の２’−ヒドロキシに対する修飾もすることができる。本開示の核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、好ましくはＤＮＡである。したがって、本発明の核酸構築物は、ＤＮＡの形態で記載され用いられ得るが、使用目的に応じて、ＲＮＡの形態で記載され用いられてもよい。
【００４０】
本明細書において用いられる「合成」核酸またはヌクレオチド配列は、天然に見いだされないが人の手により構築される（結果として天然の産物でない）核酸またはヌクレオチド配列を指す。
【００４１】
本明細書において用いられる用語「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたは核酸分子の５’から３’末端のこれらのヌクレオチドの配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、ｃＤＮＡ、ＤＮＡフラグメントまたは部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含み、そのいずれかは一本鎖または二本鎖であってよい。用語「ヌクレオチド配列」「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に用いられて、ヌクレオチドのヘテロポリマーも指す。別段の指示がされる場合を除き、本明細書において提供される核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、本明細書において、５’から３’の方向で左から右に示され、米国の配列規則（連邦規則法典第３７巻セクション１．８２１〜１．８２５）および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に示されるヌクレオチドの特徴を表すための標準的なコードを用いて表される。本明細書において用いられる「５’領域」は、５’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を意味し得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの５’領域内の因子は、ポリヌクレオチドの５’末端に位置する最初のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの半ばに位置するヌクレオチドまでのどこかに位置し得る。本明細書において用いられる「３’領域」は、３’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を意味し得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの３’領域内の因子は、ポリヌクレオチドの３’末端に位置する最初のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの半ばに位置するヌクレオチドまでのどこかに位置し得る。
【００４２】
本明細書において用いられる用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」は、２つの配列が最適に並べられた場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド配列内の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施態様では、「パーセント同一性」は、アミノ酸配列内の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。
【００４３】
「標的ヌクレオチド配列」は、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に相補である標的遺伝子の部分を指す。
【００４４】
本明細書において用いられる用語「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」「減少する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」「縮小する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」および「低減する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」（およびそれらの文法的変更）は、例えば、コントロールと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低減を示す。特定の実施態様では、減少は、検出可能な活性または量を生じず、または本質的に生じない（すなわち、些細な量、例えば、約１０％未満または実に約５％未満）。したがって、一部の実施態様では、Ｃａｓ３ヌクレアーゼの突然変異体は、Ｃａｓ３のヌクレアーゼ活性を、コントロール（例えば野生型Ｃａｓ３）と比較して、少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少させ得る。
【００４５】
他の実施態様では、本明細書において用いられる、抑制を調節するステップは、コントロールと比較して抑制の低減をもたらすことができる（例えば、特定の遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイであって、例えば、その遺伝子の異なる領域を標的とするより少ないスペーサーヌクレオチド配列を有し、それにより、同一の遺伝子を標的とするが、例えばその遺伝子の異なる領域を標的とするより多くのスペーサーヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、その遺伝子の抑制を低減させる；または、特定の遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイであって、例えば、標的配列に関してより低い相補性を有するスペーサーヌクレオチド配列を有し、例えば、標的配列に関してより高い相補性を有する同一の配列を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、その遺伝子の抑制を低減させる。さらなる実施態様では、コントロールは、いかなる遺伝子も標的としないＣＲＩＳＰＲアレイ、全く関係のない遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含むことができ、または、ＣＲＩＳＰＲアレイを全く含まないこともできる。したがって、一部の実施態様では、コントロールと比較して減少した抑制は、約５％〜約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％、またはその中の任意の範囲または値）、減少され得る。他の実施態様では、コントロールと比較して減少した抑制は、約１．１倍〜約１０、０００倍（例えば、約１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００倍など、およびその中の任意の範囲または値）、減少され得る。したがって、一部の実施態様では、コントロールと比較して減少した抑制は、１倍よりも大きくなり得る。他の実施態様では、コントロールと比較して減少した抑制は、約２倍〜約１００倍、約１０倍〜約１００倍、約２０倍〜約１００倍、約２０倍〜約１０００倍、約５０倍〜約１０００倍、約１００倍〜約１０００倍、約５００倍〜約２０００倍、約５００倍〜約５０００倍、約２５００倍〜約７５００倍、約５０００倍〜約１０，０００倍、など、またはその中の任意の値または範囲であり得る。
【００４６】
本明細書において用いられる「リピートヌクレオチド配列」は、任意の野生型ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型遺伝子座の任意の公知のリピート配列を指し、または、当該分野で知られているものとは異なるヌクレオチド配列を有するが、ループ領域を有するヘアピン構造の野生型リピートヌクレオチド配列のものと似た構造を共有する、合成のリピート配列であり得る。したがって、一部の実施態様では、リピートヌクレオチド配列は、野生型ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型遺伝子座由来のリピート配列と同一または実質的に同一であり得る。一部の実施態様では、リピートヌクレオチド配列は、野生型リピートヌクレオチド配列の部分（例えば、野生型リピートヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くの連続したヌクレオチド）を含み得る。一部の実施態様では、リピート配列は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれより多くのヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）を含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施態様では、リピート配列は、少なくとも約１〜約１５０ヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。さらに他の実施態様では、リピート配列は、少なくとも約１ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値を含む、から本質的になる、またはからなる。さらなる実施態様では、リピート配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチド、約３０〜約４０ヌクレオチド、約２５〜約４０ヌクレオチド、約２５〜約４５ヌクレオチド、および／または約２５〜約５０ヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。代表的な実施態様では、リピート配列は、約２５ヌクレオチド〜約３８ヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。またさらなる実施態様では、リピート配列は、約２９ヌクレオチドを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。またさらなる実施態様では、リピート配列は、少なくとも約２０〜３０ヌクレオチドの長さのみ有するヘアピンを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。さらなる他の実施態様では、リピート配列は、少なくとも約少なくとも３個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。１個よりも多いスペーサーヌクレオチド配列がＣＲＩＳＰＲアレイ内に存在する場合は、各スペーサーヌクレオチド配列は、「リピートヌクレオチド配列」によって互いから離れている。したがって、一部の代表的な実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列の５’末端に連結��れたリピートヌクレオチド配列は、約３個のヌクレオチドの長さ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドまたはそれより多い）であり得て、野生型リピートヌクレオチド配列の同一領域（例えば、５’末端）に対して、少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い）を有し得る。他の実施態様では、スペーサー配列の３’末端に連結されたリピート配列の部分は、野生型リピートヌクレオチド配列に対して少なくとも約５０％またはそれよりも高い同一性を有する３またはそれより多くのヌクレオチドを有し得る。またさらなる実施態様では、リピート配列は、少なくとも約２０〜３０ヌクレオチドの長さのみ有するヘアピンを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
【００４７】
本明細書において用いられる「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、少なくとも２つのリピートヌクレオチド配列、またはそれらの部分、および少なくとも１つのスペーサー配列を含む、核酸分子を意味し、ここで、２つのリピートヌクレオチド配列の１つまたはその部分は、スペーサーヌクレオチド配列の５’末端に連結され、２つのリピートヌクレオチド配列のもう片方またはその部分は、スペーサーヌクレオチド配列の３’末端に連結される。組み換えＣＲＩＳＰＲアレイでは、リピートヌクレオチド配列およびスペーサーヌクレオチド配列の組み合わせは、合成であり、人により作られ、および、天然に見られない。
【００４８】
本明細書において用いられる「配列同一性」は、２つの最適に並べられたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、構成要素（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）のアライメントのウインドウ全体で不変である程度を指す。「同一性」は、制限されないが：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載のものを含む公知の方法により、容易に計算することができる。
【００４９】
本明細書において用いられる「スペーサーヌクレオチド配列」は、標的遺伝子上の標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列である。一部の実施態様では、本発明のスペーサーヌクレオチド配列は、約１５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチドの長さであり得る。他の実施態様では、本発明のスペーサーヌクレオチド配列は、約１５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さ（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ヌクレオチドまたはそれよりも多い）であり得る。一部の特定の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、約８〜約１５０ヌクレオチド、約８〜約１００ヌクレオチド、約８〜約５０ヌクレオチド、約８〜約４０ヌクレオチド、約８〜約３０ヌクレオチド、約８〜約２５ヌクレオチド、約８〜約２０ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１０〜約２０、約１５〜約５０、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０のヌクレオチドの長さ、またはそれよりも多く、およびその中の任意の値または範囲の長さであり得る。
【００５０】
さらなる実施態様では、スペーサー配列は標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して、同一（完全に（１００％）相補）または実質的に同一（実質的に相補）（例えば、少なくとも５０％同一（例えば、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））であり得る。したがって、一部の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、連続または不連続であり得る１、２、３、４、または５個のミスマッチを有し得る。代表的な実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して５０％の同一性を有し得る。さらなる実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して７０％の同一性を有し得る。またさらなる実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して８０％の同一性を有し得る。他の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性などを有し得る。特定の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して１００％同一であり得る。特定の実施態様では、スペーサー配列は、少なくとも約８個のヌクレオチド〜約１５０個のヌクレオチドの長さである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって完全な同一性または実質的な同一性を有する。一部の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列の５’領域は、標的ヌクレオチド配列と同一であり得て、一方で、前記スペーサーの３’領域は、前記標的ヌクレオチド配列と実質的に同一であり得る。したがって、一部の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列の５’領域（例えば、５’末端の最初の８個のヌクレオチド、５’末端の最初の１０ヌクレオチド、５’末端の最初の１５ヌクレオチド、５’末端の最初の２０ヌクレオチド）は、標的ヌクレオチド配列に対して約７５％の同一性またはそれよりも高い（７５％〜約１００％の同一性）を有し、一方で、スペーサーヌクレオチド配列の残部は、標的ヌクレオチド配列に対して約５０％またはそれより高い同一性を有し得る。したがって、例えば、スペーサーヌクレオチド配列の５’末端の最初の８個のヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列と１００％同一であり得て、または、１または２の突然変異を有し得て、したがって、標的ヌクレオチド配列に対してそれぞれ約８８％同一または約７５％同一であり得て、一方で、スペーサーヌクレオチド配列の残部は、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも約５０％またはそれより高く同一であり得る。
【００５１】
本明細書において用いられる、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の関連における語句「実質的に同一」または「実質的な同一性」は、最大一致に関して比較およびアライメントした場合、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いた測定または目視検査により、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指す。特定の実施態様では、実質的な同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、９６、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する、２またはそれより多くの配列またはサブシーケンスを指し得る。
【００５２】
配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割がある。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および比較配列がコンピューターに入力され、必要な場合はサブシーケンス座標が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。それから、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列（単数または複数）のパーセント配列同一性を計算する。
【００５３】
比較ウインドウを並べるための最適な配列アライメントは当業者に広く知られ、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの類似性検索方法などのツールにより、および場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および、ＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムのコンピューター実施により、行ない得る。試験配列および参照配列のアライメントされた区分の「同一性分数」は、２つの並べられた配列が共有する同一の構成要素の数を、参照配列セグメント（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定部分）内の構成要素の全数で割った数である。パーセント配列同一性は、同一性分数に１００をかけて表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列またはその一部に対して、または、より長いポリヌクレオチド配列に対して、され得る。本発明の目的に関し、「パーセント同一性」は、翻訳ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＸ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０およびポリヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０を用いて決定されてもよい。
【００５４】
ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通じて一般に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと並べた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴと一致する、または満たす、クエリー配列内の長さＷのショートワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定するステップを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるためのサーチを始める種として作用する。それから、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアに関する恩恵スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合は停止し、１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積、またはいずれかの配列が終わりに到達したことに起因して、累積スコアは０以下になる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【００５５】
パーセント配列同一性の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３  ５７８７  （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの評価基準は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で一致が偶然に生じる確率の示度を提供する。例えば、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率が約０．１未満〜約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列と類似すると考えられる。したがって、本発明の一部の実施態様では、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率は、約０．００１未満である。
【００５６】
また、２つのヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に同一であると考えることができる。一部の代表的な実施態様では、実質的に同一であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズする。
【００５７】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の関連における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列に関する融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。
【００５８】
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする、（規定のイオン強度およびｐＨでの）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特異的なプローブに関するＴｍと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットでのフィルターにおける、１００よりも多い相補残基を有する相補ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミド（４２℃）であり、ハイブリダイゼーションは一晩行われる。高ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１  ５Ｍ  ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分である（ＳＳＣバッファーの説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（以下）を参照）。バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシーな洗浄の前に低ストリンジェンシーな洗浄を行うことが多い。例えば、１００個を超えるヌクレオチドのデュプレックスに関する、中ストリンジェンシーな洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃、１５分である。例えば、１００個を超えるヌクレオチドのデュプレックスに関する、低ストリンジェンシーな洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣ、４０℃、１５分である。短いプローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）に関しては、ストリンジェントな条件は典型的に、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的に、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０〜８．３）を含み、温度は典型的に、少なくとも約３０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、関係のないプローブについて見られるものより２倍の（またはそれより高い）シグナル・ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードにより許容される最大コドン縮退を用いてヌクレオチド配列のコピーが作られる場合に生じ得る。
【００５９】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために用いられ得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（５０℃）中、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。別の実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（５０℃）中、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、または、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。また、さらなる実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、または７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（６５℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【００６０】
一部の態様では、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に近接または隣接して位置する。ＰＡＭは、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに特異的であることが多いが、ＰＡＭ配列は、確立された実験的および計算的なアプローチを通して当業者により決定され得る。したがって、例えば、実験的なアプローチは、標的ＤＮＡのインビトロ切断（Ｐａｔａｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３９−８４３）または標的プラスミドＤＮＡの形質転換（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：１１１６−１１２１；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３−２３９）などを介して、全てのあり得るヌクレオチド配列が隣接する配列を標的化するステップ、および、標的化を受けない配列メンバーを同定するステップを含む。一部の態様では、計算的なアプローチは、天然のスペーサーのＢＬＡＳＴサーチを行なってバクテリオファージまたはプラスミド内のオリジナルの標的ＤＮＡ配列を同定するステップ、および、これらの配列を並べて標的配列に近接する保存配列を決定するステップを含み得る（Ｂｒｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１４．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０：９９４−１００１；Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５５：７３３−７４０）。
【００６１】
本発明の任意のヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子は、任意の目的の種での発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は当技術分野で広く知られていて、種特異的なコドン使用頻度を用いたコドン使用バイアスに関するヌクレオチド配列の改変を含む。コドン使用頻度は、目的の種に関して最も高く発現される遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列が核内で発現される場合、コドン使用頻度は、目的の種に関して高発現の核遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列の改変は、種特有のコドン使用頻度を、天然のポリヌクレオチド配列に存在するコドンと比較することにより決定される。当該分野において理解されるように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然のヌクレオチド配列と１００％未満の同一性（例えば、５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）を有するが、依然としてオリジナルのヌクレオチド配列によりコードされるものと同一の機能を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を生じさせる。したがって、本発明の代表的な実施態様では、本発明のヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子は、特定の目的の生物／種での発現のためにコドン最適化され得る。
【００６２】
一部の実施態様では、本発明の組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびポリペプチドは、「単離される」。「単離された」核酸分子、「単離された」ヌクレオチド配列または「単離された」ポリペプチドは、人の手によりその天然環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造上の構成要素または他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと関連して一般に見いだされる核酸から、少なくとも部分的に切り離された、精製された形態で存在し得る。代表的な実施態様では、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれよりも高い純度である。
【００６３】
他の実施態様では、単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、非天然の環境（例えば組み換え宿主細胞）内に存在し得る。したがって、例えばヌクレオチド配列に関しては、用語「単離された」は、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離されることを意味する。また、ポリヌクレオチドは、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離され、それから、それが天然に生じない遺伝的状況、染色体および／または細胞（例えば、異なる宿主細胞、異なる制御配列、および／または天然に見られるのと異なるゲノム内の位置）に挿入される場合もまた、単離される。したがって、組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびそれらのコードされるポリペプチドは、人の手により、それらの天然環境から離れて存在し、したがって、天然の産物ではない点で「単離される」が、一部の実施態様では、組み換え宿主細胞内に導入され存在することができる。
【００６４】
本明細書に記載のいずれかの実施態様では、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、ヌクレオチド配列、および／または核酸分子は、様々なプロモーター、ターミネーター、および、様々な生物または細胞における発現のための他の調節エレメントと、作動可能に関連することができる。したがって、代表的な実施態様では、少なくとも１つのプロモーターおよび／またはターミネーターは、本発明の組み換え核酸分子および／または組み換えＣＲＩＳＰＲアレイに動作可能に連結することができる。本発明で有用な任意のプロモーターを用いることができ、そして、例えば、目的の生物で機能性のプロモーター、ならびに、本明細書に記載の、構成的な、誘導性の、発生学的に調節されている、組織−特異的／好適−プロモーターなどを含む。本明細書において用いられる調節エレメントは、内因性または異種であり得る。一部の実施態様では、対象生物から得られる内因性調節エレメントは、それが天然には生じない遺伝学的コンテキストの中に挿入することができ（例えば、天然に見られるのとは異なるゲノム内の位置）、それにより、組み換えまたは非−ネイティブ核酸を生産する。
【００６５】
本明細書において用いられる「動作可能に連結」または「動作可能に関連」は、示された因子が互いに機能的に関連し、また一般に、物理的にも関連することを意味する。したがって、本明細書において用いられる用語「動作可能に連結」または「動作可能に関連」は、機能的に関係がある単一核酸分子上のヌクレオチド配列を指す。したがって、第二のヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列が、第二のヌクレオチド配列と機能的関係で配置される状況を意味する。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写または発現を果たす場合に、プロモーターは前記ヌクレオチド配列と動作可能に関連する。当業者は、コントロール配列がその発現を方向付けるように機能する限り、コントロール配列（例えばプロモーター）は、それが動作可能に関連するヌクレオチド配列と隣接している必要はないことを理解するだろう。したがって、例えば、介在する非翻訳でなお転写される配列が、プロモーターとヌクレオチド配列との間に存在してよく、プロモーターは依然としてヌクレオチド配列に「動作可能に連結」していると考えることができる。
【００６６】
「プロモーター」は、プロモーターと動作可能に関連するヌクレオチド配列の転写を制御または調節するヌクレオチド配列（すなわち、コード配列）である。コード配列は、ポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードし得る。典型的に、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに関する結合部位を含むヌクレオチド配列を指し、転写の開始を管理する。一般に、プロモーターは、５’または対応するコード配列のコード領域のスタートに対して上流に見られる。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他のエレメントを含んでよい。これらは、限定されないが、−３５エレメントコンセンサス配列および−１０コンセンサス配列を含む（Ｓｉｍｐｓｏｎ．１９７９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：３２３３−３２３７）。哺乳類細胞では、これはＴＡＴＡボックスコンセンサス配列を含み、そして、ＣＡＡＴボックスコンセンサス配列を含むことが多い（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ．１９８１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９）。植物では、ＣＡＡＴボックスはＡＧＧＡボックスで置き換えられ得る（Ｍｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８３．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ａｎｄ  Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２１１−２２７）。
【００６７】
プロモーターは、組み換え核酸分子（すなわち、「キメラ遺伝子」または「キメラポリヌクレオチド」）の調製で用いるための、例えば、構成的、誘導性、時間的に調節された、発生学的に調節された、化学的に調節された、組織−好適および／または組織−特異的なプロモーターを含んでよい。これらの様々なタイプのプロモーターは、当該分野で知られている。
【００６８】
したがって、一部の実施態様では、抑制は、目的の生物で機能性の適切なプロモーターに作動可能に結合している本発明の組み換え核酸構築物を用いて、構成的な、誘導性の、時間的に調節された、発生学的に調節された、化学的に調節された、組織−好適および／または組織−特異的なプロモーターによりなされ得る。代表的な実施態様では、抑制は、例えば目的の生物で機能性の誘導性プロモーターに作動可能に結合している本発明の組み換え核酸構築物を用いて、可逆的になされ得る。
【００６９】
プロモーターの選択は、発現のための定量的、時間的および空間的要求に応じて変化し、および、形質転換される宿主細胞にも応じて変化する。多くの異なる生物のためのプロモーターは、当該分野でよく知られている。当該分野に存在する広範囲の知識に基づき、適切なプロモーターを、特定の目的宿主生物のために選択することができる。したがって、例えば、モデル生物において、高度に構成的に発現された遺伝子の上流のプロモーターについて多くが知られ、そのような知識は、必要に応じて、他のシステムで容易に利用および実施することができる。
【００７０】
例示的なプロモーターは、限定されないが、真核生物および原核生物（制限されないが、植物、細菌、菌類、古細菌、動物、および哺乳類を含む）で機能性のプロモーターを含む。例えば、古細菌で有用なプロモーターは、限定されないが、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉのｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）プロモーター（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５．１７７（７）：１８４４−１８４９）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのｇｄｈプロモーター（Ｗａｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６：３３０８−３３１３）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓの１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡ遺伝子コアプロモーター（ＤｅＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３２１：９２−９９）を含む。
【００７１】
酵母で有用な例示的なプロモーターは、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ガラクトース−レギュロン（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２）、ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、銅活性化メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、ＭＦα１、ＰＧＫ／α２オペレーター、ＴＰＩ／α２オペレーター、ＧＡＰ／ＧＡＬ、ＰＧＫ／ＧＡＬ、ＧＡＰ／ＡＤＨ２、ＧＡＰ／ＰＨＯ５、イソ−１−シトクロムｃ／グルココルチコイド応答エレメント（ＣＹＣ／ＧＲＥ）、ホスホグリセレートキナーゼ／アングロゲン（ａｎｇｒｏｇｅｎ）応答エレメント（ＰＧＫ／ＡＲＥ）、転写伸長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ１）、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）、ホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ１）、ピルビン酸キナーゼ１（ＰＹＫ１）、および／またはヘキソース輸送体（ＨＸＴ７）由来の、プロモーターを含み得る（Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８（１９９２）；および、Ｐａｒｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｙｅａｓｔ  ２７：９５５−９６４（２０１０）を参照）。
【００７２】
さらなる実施態様では、細菌で有用なプロモーターは、制限されないが、Ｌ−アラビノース誘導性（ａｒａＢＡＤ、ＰＢＡＤ）プロモーター、任意のｌａｃプロモーター、Ｌ−ラムノース誘導性（ｒｈａＰＢＡＤ）プロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージプロモーター（ｐＬ，ｐＬ−９Ｇ−５０）、アンヒドロテトラサイクリン−誘導性（ｔｅｔＡ）プロモーター、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｃｓｐＡ、Ｔ７−ｌａｃオペレーター、Ｔ３−ｌａｃオペレーター、Ｔ４遺伝子３２、Ｔ５−ｌａｃオペレーター、ｎｐｒＭ−ｌａｃオペレーター、Ｖｈｂ、プロテインＡ、コリネバクテリア−Ｅ．ｃｏｌｉ様のプロモーター、ｔｈｒ、ｈｏｍ、ジフテリア毒素プロモーター、ｓｉｇＡ、ｓｉｇＢ、ｎｕｓＧ、ＳｏｘＳ、ｋａｔｂ、α−アミラーゼ（Ｐａｍｙ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３（２つのオーバーラップするＲＮＡポリメラーゼσ因子認識部位、σＡ、σＢからなる）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３、ｒｐｌＫ−ｒｐｌＡ、フェレドキシンプロモーター、および／またはキシロースプロモーターを含み得る（Ｋ．Ｔｅｒｐｅ  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：２１１−２２２（２００６）；Ｈａｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５４−６０（１９９８）；および、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４０：２２１−２２９  （２００５）を参照）。
【００７３】
植物で機能性のプロモーターの非限定の例は、ＲｕｂｉｓＣｏ小サブユニット遺伝子１のプロモーター（ＰｒｂｃＳ１）、アクチン遺伝子のプロモーター（Ｐａｃｔｉｎ）、硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｒ）および、デュプリケートの炭酸脱水酵素遺伝子１のプロモーター（Ｐｄｃａ１）を含む（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２３：７２７−７３５（２００５）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ４０３：１３２−１４２（２００７）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３７：１１４３−１１５４（２０１０）を参照）。ＰｒｂｃＳ１およびＰａｃｔｉｎは、構成的プロモーターであり、ＰｎｒおよびＰｄｃａ１は、誘導性プロモーターである。Ｐｎｒは、硝酸により誘導され、アンモニウムにより抑制され（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ４０３：１３２−１４２（２００７））、Ｐｄｃａ１は、塩により誘導される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｒｅｐ．３７：１１４３−１１５４（２０１０））。
【００７４】
植物に有用な構成的プロモーターの例は、限定されないが、キチョウジのウイルスプロモーター（ｃｍｐ）（米国特許第７，１６６，７７０号）、米のアクチン１プロモーター（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３３９９−３４０６；および米国特許第５，６４１，８７６号）、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ＣａＭＶの１９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３１５−３２４）、ｎｏｓプロモーター（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８４：５７４５−５７４９）、Ａｄｈプロモーター（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６６２４−６６２９）、スクロースシンターゼプロモーター（Ｙａｎｇ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４１４４−４１４８）、およびユビキチンプロモーターを含む。ユビキチン由来の構成的プロモーターは、多くの細胞型において蓄積する。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物での使用のために、いくつかの植物種、例えば、ヒマワリ（Ｂｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７９：８７−９４）、トウモロコシ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２）、およびシロイヌナズナ（Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：８９５−９０６）からクローン化されている。トウモロコシのユビキチンプロモーター（ＵｂｉＰ）は、トランスジェニック単子葉植物系で発達していて、その配列および単子葉植物の形質転換のために構築されたベクターは、特許公開ＥＰ  ０  ３４２  ９２６に開示される。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物、具体的には単子葉植物での、本発明のヌクレオチド配列の発現に適切である。さらに、ＭｃＥｌｒｏｙら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：１５０−１６０（１９９１））により記載されるプロモーター発現カセットは、本発明のヌクレオチド配列の発現のために容易に改変することができ、単子葉宿主での使用に特に適切である。
【００７５】
一部の実施態様では、組織特異的／組織好適なプロモーターは、植物細胞での異種ポリヌクレオチドの発現のために用いることができる。組織特異的なプロモーターの非限定の例は、種子貯蔵タンパク質（例えば、β−コングリシニン、クルシフェリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）およびファゼオリン）、ゼインまたは油体タンパク質（例えばオレオシン）、または、脂肪酸生合成に関与するタンパク質（アシル担体タンパク質、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ（ｆａｄ２−１）を含む）をコードする遺伝子と関連するもの、および、胚の発達中に発現される他の核酸（例えば、Ｂｃｅ４、例えば、Ｋｒｉｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２０９−２１９；ならびに欧州特許第２５５３７８号を参照）を含む。植物組織特異的／組織好適なプロモーターのさらなる例は、限定されないが、根毛特異的シスエレメント（ＲＨＥ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：２９５８−２９７０（２００６））、根特異的プロモーターＲＣｃ３（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５３：１８５−１９７（２０１０））およびＲＢ７（米国特許第５４５９２５２号）、レクチンプロモーター（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｄｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．１１：１６０−１６７；および、Ｖｏｄｋｉｎ（１９８３）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１３８：８７−９８）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１プロモーター（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００）、および／またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンシンセターゼ（ＳＡＭＳ）（Ｖａｎｄｅｒ  Ｍｉｊｎｓｂｒｕｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３７（８）：１１０８−１１１５）を含む。
【００７６】
さらに、葉緑体で機能性のプロモーターをも使うことができる。そのようなプロモーターの非限定の例は、バクテリオファージＴ３遺伝子９  ５’ＵＴＲおよび米国特許第７，５７９，５１６に開示される他のプロモーターを含む。本発明で有用な他のプロモーターは、限定されないが、Ｓ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーターおよびＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター遺伝子プロモーター（Ｋｔｉ３）を含む。
【００７７】
本発明の一部の実施態様では、誘導性プロモーターを用いることができる。したがって、例えば、化学的に調節されるプロモーターを用いて、外因性の化学的レギュレーターの適用を介して生物での遺伝子発現を調節することができる。化学的に調節されるプロモーターを介した、本発明のヌクレオチド配列の発現の調節は、本発明のＲＮＡおよび／またはポリペプチドが、例えば、植物作物が誘導性化学物質で処理された場合にのみ合成されるのを可能にする。目的に応じて、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子の発現を誘導する場合は化学物質−誘導性プロモーターであってよく、または、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合は、化学物質−抑制性プロモーターであってよい。一部の態様では、プロモーターは、光の特定の波長の適用が遺伝子発現を誘導する場合は、光−誘導性プロモーターを含んでもよい（Ｌｅｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：４４１−４４２）。他の態様では、プロモーターは、光の特定の波長の適用が遺伝子発現を抑制する場合は、光−抑制性プロモーターを含んでよい（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３２：１５６５−１５６８）。
【００７８】
植物で有用な化学的な誘導性プロモーターは、当該分野で知られていて、限定されないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤により活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、発芽前除草剤として用いられる疎水性求電子化合物により活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、および、サリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーター（例えば、ＰＲ１ａシステム）、ステロイド応答性プロモーター（例えば、グルココルチコイド−誘導性プロモーターはＳｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，１０４２１−１０４２５、および、ＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４，２４７−２５７を参照）、および、テトラサイクリン−誘導性およびテトラサイクリン−抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７，２２９−２３７、および、米国特許第５，８１４，６１８号および第５，７８９，１５６号を参照、Ｌａｃリプレッサーシステムプロモーター、銅誘導性システムプロモーター、サリチレート誘導性システムプロモーター（例えば、ＰＲ１ａシステム）、グルココルチコイド−誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：６０５−６１２）、および、エクジソン−誘導性システムプロモーターを含む。
【００７９】
一部の特定の実施態様では、藻類で有用なプロモーターは、限定されないが、ＲｕｂｉｓＣｏ小サブユニット遺伝子１のプロモーター（ＰｒｂｃＳ１）、アクチン遺伝子のプロモーター（Ｐａｃｔｉｎ）、硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｒ）、および、デュプリケートの炭酸脱水酵素遺伝子１のプロモーター（Ｐｄｃａ１）（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２３：７２７−７３５（２００５）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ４０３：１３２−１４２（２００７）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３７：１１４３−１１５４（２０１０）を参照）、σ７０型プラスチドｒＲＮＡ遺伝子のプロモーター（Ｐｒｒｎ）、ｐｓｂＡ遺伝子（光化学系−ＩＩ反応中心タンパク質Ｄ１をコードする）のプロモーター（ＰｐｓｂＡ）、ｐｓｂＤ遺伝子（光化学系−ＩＩ反応中心タンパク質Ｄ２をコードする）のプロモーター（ＰｐｓｂＤ）、ｐｓａＡ遺伝子（光化学系Ｉのアポタンパク質をコードする）のプロモーター（ＰｐｓａＡ）、ＡＴＰａｓｅ  αサブユニット遺伝子のプロモーター（ＰａｔｐＡ）、およびＲｕＢｉｓＣｏ大サブユニット遺伝子のプロモーター（ＰｒｂｃＬ）、および、それらの任意の組み合わせを含む（例えば、Ｄｅ  Ｃｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７１−７４（２００１）；Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３３（２００９）；Ｍｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２６（２００９）；Ｓｕｒｚｙｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ３７：１３３−１３８（２００９）を参照）。
【００８０】
さらなる実施態様では、本発明で有用なプロモーターは、制限されないが、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えばヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）およびヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（Ｍａｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（４）：４３３−４１（２００６））、および、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター（Ｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２９：２８３−２９４（２００６））、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）−由来のイニシャルプロモーター、ＥＦ−１α（伸長因子−１α）プロモーター、Ｕｂｃ（ヒトユビキチンＣ）プロモーター、ＰＧＫ（ミューリンホスホグリセレートキナーゼ−１）プロモーター、および／または、構成的なタンパク質遺伝子プロモーター、例えば、β−アクチン遺伝子プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなどを含み得る。
【００８１】
さらに、組織−特異的な調節された核酸および／またはプロモーター、ならびに、腫瘍−特異的な調節された核酸および／またはプロモーターが報告されている。したがって、一部の実施態様では、組織−特異的または腫瘍−特異的プロモーターを用いることができる。一部の報告された組織−特異的な核酸は、制限されずに、Ｂ２９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単核球細胞）、ＣＤ４３（白血球および血小板）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、デスミン（筋肉）、エラスターゼ−１（膵腺房細胞）、エンドグリン（内皮細胞）、フィブロネクチン（分化細胞および治癒組織）、ＦＬＴ−１（内皮細胞）、ＧＦＡＰ（星状細胞）、ＧＰＩＩｂ（巨核球）、ＩＣＡＭ−２（内皮細胞）、ＩＮＦ−β（造血細胞）、Ｍｂ（筋肉）、ＮＰＨＳＩ（有足細胞）、ＯＧ−２（骨芽細胞、ＳＰ−Ｂ（肺）、ＳＹＮ１（ニューロン）、およびＷＡＳＰ（造血細胞）を含む。一部の報告された腫瘍−特異的な核酸およびプロモーターは、制限されずに、ＡＦＰ（肝細胞癌腫）、ＣＣＫＡＲ（膵癌）、ＣＥＡ（上皮癌）、ｃ−ｅｒｂＢ２（胸癌および膵癌）、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ４、Ｅ２Ｆ−１、ＨＥ４、ＬＰ、ＭＵＣ１（癌腫）、ＰＲＣ１（乳癌）、ＰＳＡ（前立腺癌）、ＲＲＭ２（乳癌）、サバイビン、ＴＲＰ１（メラノーマ）、およびＴＹＲ（メラノーマ）を含む。
【００８２】
一部の実施態様では、誘導性プロモーターは、哺乳類の細胞で用いることができる。誘導性プロモーターの例は、限定されないが、テトラサイクリンリプレッサーシステムプロモーター、Ｌａｃリプレッサーシステムプロモーター、銅−誘導性システムプロモーター、サリチレート−誘導性システムプロモーター（例えば、ＰＲ１ａシステム）、グルココルチコイド−誘導性プロモーター、およびエクジソン−誘導性システムプロモーターを含む。
【００８３】
一部の実施態様では、本発明の核酸構築物は、「発現カセット」であり得て、または、発現カセット内に含まれ得る。本明細書において用いられる「発現カセット」は、目的のヌクレオチド配列（例えば、本発明の組み換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイ）を含む組み換え核酸分子を意味し、ここで、前記ヌクレオチド配列は、少なくともコントロール配列（例えば、プロモーター）と動作可能に関連する。したがって、本発明の一部の態様は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、組み換え核酸分子および／または組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ）を発現するように設計された発現カセットを提供する。
【００８４】
目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよく、それの構成要素の少なくとも１つが、それの他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。また、発現カセットは、天然起源であるが異種発現に有用である組み換え型で得られたものであってもよい。
【００８５】
また、発現カセットは、場合により、選択された宿主細胞内で機能性の転写および／または翻訳終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。様々な転写終結因子が発現カセットでの使用に利用可能であり、目的の異種ヌクレオチド配列を超えて転写の終結に関与し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を修正する。終結領域は、転写開始領域に対して天然であり得て、動作可能に連結された目的のヌクレオチド配列に対して天然であり得て、宿主細胞に対して天然であり得て、または、別の起源（すなわち、プロモーターに対して、目的のヌクレオチド配列に対して、宿主に対して外因または異種、またはそれらの任意の組み合わせ）に由来し得る。本発明の一部の実施態様では、ターミネーターは、本発明の組み換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイに動作可能に連結することができる。
【００８６】
また、発現カセットは、形質転換された宿主細胞を選択するために用いることのできる選択可能なマーカーに関するヌクレオチド配列を含むこともできる。本明細書において用いられる「選択可能なマーカー」は、発現した場合に、マーカーを発現している宿主細胞に、区別できる表現型を与え、したがって、そのマーカーを有さないものからそのような形質転換された細胞が区別されるのを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、化学的手段により、例えば選択剤（例えば抗生物質など）を用いることにより、選択することのできる形質を与えるかどうか、または、マーカーが単に、例えばスクリーニング（例えば蛍光）による、観察または試験を介して同定され得る形質であるかどうかに応じて、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得る。もちろん、適切な選択可能なマーカーの多くの例が当該分野で知られていて、本明細書に記載の発現カセットにおいて用いることができる。
【００８７】
発現カセットに加えて、本明細書に記載の核酸分子およびヌクレオチド配列は、ベクターとの関連で用いることができる。用語「ベクター」は、核酸（単数）（または核酸（複数））を細胞に移行、送達または導入するための組成物を指す。ベクターは、移行、送達または導入されるヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸分子を含む。宿主生物の形質転換での使用のためのベクターは、当該分野でよく知られている。ベクターの全般的なクラスの非限定的な例は、限定されないが、二本鎖または一本鎖の直鎖または環状型の、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーベクターを含み、自己で伝染または動員が可能であってよく、または不可能であってよい。本明細書に定義されるベクターは、細胞ゲノムへの組込みにより原核生物または真核生物宿主を形質転換することができ、または、染色体外に存在することができる（例えば複製起点を有する自己複製プラスミド）。天然にまたは設計により、放線菌および関連種、細菌および真核生物（例えば、より高度の植物、哺乳類、酵母または真菌細胞）から選択され得る２つの異なる宿主生物での複製が可能であるＤＮＡビヒクルを意味する、シャトルベクターがさらに含まれる。一部の代表的な実施態様では、ベクター内の核酸は、宿主細胞での転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり、作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主内で機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合は、これは、それ自身のプロモーターまたは他の調節エレメントを含み得て、ｃＤＮＡの場合は、これは、宿主細胞での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり得る。したがって、本発明の核酸分子（例えば、組み換え核酸分子および／または組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ）、および／または、本発明の核酸分子を含む発現カセットは、本明細書に記載され、当該分野で知られているように、ベクター内に含まれ得る。
【００８８】
本明細書において用いられる用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」および「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、細胞または対象での１または複数の標的遺伝子の発現を抑制する、または発現の抑制を改変するために、それにより本発明の組み換え核酸分子および／または組み換えＣＲＩＳＰＲアレイが細胞または対象に送達されるプロセスを指す。組み換え核酸分子および／または組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、制限されないが、細胞への（すなわち、細胞内）直接導入、および／または、空洞、間質空間、特定の臓器または組織をフィードする局所循環へ、または、組織または構造（例えば、腫瘍）への細胞外導入を含む、多くの方法で投与され得る。
【００８９】
目的のポリヌクレオチドの関連における「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）」、「導入された（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」（およびそれらの文法的変更）は、目的のヌクレオチド配列を、宿主生物または前記生物の細胞（例えば、宿主細胞）に、ヌクレオチド配列が細胞の内部に接近するような方法で提示することを意味し、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」および／または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」のような用語を含む。１個よりも多いヌクレオチド配列が導入される場合は、これらのヌクレオチド配列は、単一のポリヌクレオチドまたは核酸構築物の一部として、または別個のポリヌクレオチドまたは核酸構築物として、集まることができ、同一または異なる発現構築物または形質転換ベクター上に位置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントで、別個の形質転換イベントで、細胞に導入され得て、または、例えば、それらは従来の繁殖プロトコルにより生物に取り込まれ得る。したがって、本発明の一部の態様では、本発明の１つまたは複数の核酸構築物（例えば、組み換え核酸分子、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイなど）を、宿主生物または前記宿主生物の細胞に導入することができる。
【００９０】
本明細書において用いられる用語「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」は、細胞への異種核酸の導入を指す。細胞へのそのような導入は、安定または一過的であり得る。したがって、一部の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の核酸分子により安定的に形質転換される。他の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の組み換え核酸分子により一過的に形質転換される。
【００９１】
ポリヌクレオチドの関連における「一過的に形質転換される」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入されて、細胞のゲノム内に組み込まれないことを意味する。
【００９２】
細胞内に導入されたポリヌクレオチドの関連における「安定に導入される（ｓｔａｂｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「安定に導入された（ｓｔａｂｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノム内に安定的に取り込まれ、したがって細胞がポリヌクレオチドで安定的に形質転換されることを意図する。
【００９３】
本明細書において用いられる「安定した形質転換」または「安定的に形質転換された」は、核酸分子が細胞内に導入されて、細胞のゲノム内に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その子孫により、より具体的には、複数の後に続く世代の子孫により、受け継がれることが可能である。また、本明細書において用いられる「ゲノム」は、核、プラスミドおよびプラスチドゲノムも含み、したがって、例えば葉緑体またはミトコンドリアゲノムへの核酸構築物の組込みを含む。また、本明細書において用いられる安定した形質転換は、染色体外に例えばミニ染色体またはプラスミドとして維持される導入遺伝子も指し得る。
【００９４】
一過的な形質転換は、生物内に導入された１つまたは複数の導入遺伝子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することのできる、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロットなどにより、検出され得る。細胞の安定した形質転換は、生物（例えば、植物、哺乳類、昆虫、古細菌、細菌など）に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイなどにより、検出することができる。細胞の安定した形質転換は、植物または他の生物に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイなどにより、検出することができる。また、細胞の安定した形質転換は、例えば、導入遺伝子の標的配列（単数または複数）とハイブリダイズする特異的なプライマー配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野でよく知られている他の増幅反応により検出することもでき、導入遺伝子配列の増幅をもたらし、標準的な方法に従って検出することができる。また、形質転換は、当技術分野でよく知られているダイレクトシーケンスおよび／またはハイブリダイゼーションのプロトコルにより検出することもできる。
【００９５】
したがって、一部の実施態様では、ヌクレオチド配列、構築物、発現カセットは、一過的に発現することができ、および／または、それらは宿主生物のゲノム内に安定的に取り込まれ得る。
【００９６】
本発明の組み換え核酸分子および／またはＣＲＩＳＰＲアレイは、当業者に公知の任意の方法により細胞内へ導入することができる。形質転換またはトランスフェクションの例示的な方法は、ウイルスおよび細菌（例えば、アグロバクテリウム）を用いた生物学的方法、理化学的方法、例えばエレクトロポレーション、ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法、粒子または衝撃照射（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、マイクロインジェクション、ウィスカ技術、花粉管形質転換、リン酸カルシウム介在の形質転換、ナノ粒子介在の形質転換、シクロデキストリン介在およびポリエチレングリコール介在の形質転換を含むポリマー介在の形質転換、超音波処理、浸潤、ならびに、細胞内への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的メカニズムを含み、それらの任意の組み合わせを含む。
【００９７】
本発明の一部の実施態様では、細胞の形質転換は、核の形質転換を含む。他の実施態様では、細胞の形質転換は、プラスチド形質転換（例えば、葉緑体形質転換）を含む。またさらなる実施態様では、本発明の組み換え核酸分子またはＣＲＩＳＰＲアレイは、従来の繁殖技術を介して細胞内に導入することができる。
【００９８】
真核生物および原核生物は両方とも、形質転換の手順は広く知られていて当該分野においてルーチンであり、文献全体を通して記載される（例えば、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３−２３９；Ｒａｎｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：２２８１−２３０８（２０１３）を参照）。
【００９９】
したがって、ヌクレオチド配列は、当該分野でよく知られている任意の数の方法で、宿主生物またはその細胞に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のヌクレオチド配列が生物内に導入されるためには、それらが生物の少なくとも１つの細胞の内部に接近しさえすれば、特定の方法に依存しない。１個よりも多いヌクレオチド配列が導入される場合は、それらは、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として、集まることができ、同一または異なる核酸構築物上に位置することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換イベントで、または別個の形質転換イベントで、目的の細胞内に導入することができ、あるいは、関連する場合は、ヌクレオチド配列は、繁殖プロトコルの一部として植物内に取り込むことができる。
【０１００】
本発明は、標的化遺伝子サイレンシングのための、またはより具体的には、目的の生物またはその細胞、または無細胞系における、発現抑制および／または発現抑制の調節のための、組成物および方法に関する。
【０１０１】
したがって、本発明の一態様では、抗ウイルス防御プロセスのためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）に関与するＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチドのサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え核酸分子が提供される。本発明で有用なＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲアレイを処理して、処理されたＲＮＡを生産し、それからそれを用いて、処理されたＲＮＡ内のスペーサーに相補であるＤＮＡに複合体を結合させる。一部の実施態様では、獲得に関与するＣａｓｃａｄｅポリペプチドは、本発明の核酸分子内に含まれない（例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２）。当該分野で知られているＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣａｓｃａｄｅポリペプチドの任意のそのようなサブセットまたは後に発見されたものは、本発明の組み換え核酸分子内に含まれ得る。そのようなポリペプチドは、例えば、ＢＬＡＳＴサーチを介して同定することができる。
【０１０２】
したがって、本発明の一部の態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチドのサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる、組み換え核酸分子が提供される。特定の実施態様では、本発明の組み換え核酸は、野生型Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドに対して実質的な同一性（例えば、少なくとも８０％；約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、およびその中の任意の範囲または値）を有する、３またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、からなる。一部の実施態様では、本発明の組み換え核酸は、前記の３またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。本明細書において用いられるＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの機能性フラグメントは、野生型ポリペプチドと比較して長さが減少されたがＩ型Ｃａｓｃａｄｅタンパク質としてまだ機能する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを処理する、ＤＮＡと結合する、および／または複合体を形成する）ことができるポリペプチドを意味する。さらなる実施態様では、本発明の組み換え核酸は、２またはそれより多くのＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの融合、またはその機能性フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせをコードする、ヌクレオチド配列を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
【０１０３】
代表的な実施態様では、以下に対して実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる、組み換え核酸分子が提供される：（ａ）Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｂ型）；（ｂ）Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｃ型）；（ｃ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｅ型）；（ｄ）Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、Ｃａｓ６ｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｆ型）；（ｅ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、ヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ａ型）；および／または（ｆ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド、Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ−Ｄ型）。
【０１０４】
本発明の代表的な実施態様では、Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号１８、配列番号１９および／または配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号２１および／または配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号２３および／または配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号２５および／または配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号２７および／または配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号２９および／または配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号３１および／または配列番号３２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号４１および／または配列番号４２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号４３および／または配列番号４４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）をコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号４５および／または配列番号４６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号４７および／または配列番号４８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号４９および／または配列番号５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号５１および／または配列番号５２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は。制限されないが、配列番号５３および／または配列番号５４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号５５および／または配列番号５６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ６ｆポリペプチドをコードするヌクレオチドは、制限されないが、配列番号５７および／または配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号５、および／または配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号７、配列番号８および／または配列番号９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ６ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号１０および／または配列番号１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号１２、配列番号１３および／または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ３’’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号１５、配列番号１６および／または配列番号１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、制限されないが、配列番号３３および／または配列番号３４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号３５および／または配列番号３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；Ｃｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号３７および／または配列番号３８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；および／または、Ｃａｓ６ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制限されないが、配列番号３９および／または配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０５】
Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードするさらなるアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ホモログを同定するための当該分野においてルーチンの方法を用いて、例えば、公知のＣａｓｃａｄｅポリペプチドのタンパク質ファミリー、遺伝子名、またはアミノ酸配列を用いてＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースをスクリーニングして、当業者により同定され得る。したがって、Ｉ型ポリペプチドのさらなる非限定の例は、それらのＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーにより特定される以下を含む。
【０１０６】
したがって、例えば、Ｉ−Ａ型ｃａｓ７／ｃｓａ２ポリペプチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＣＰ３４７９６．１、ＡＣＶ２５２４０．１、ＡＤＣ６９８５１．１、ＡＤＸ８１７７４．１、ＡＤＸ８４８４８．１、ＢＡＢ６４９８０．２、Ｑ９７Ｙ９１．１、ＹＰ＿００２８３１４４１．１、ＹＰ＿００３１２８７４０．１、ＹＰ＿００３４５８５８７．１、ＹＰ＿００５６４４９８８．１、および／またはＹＰ＿００５６４８０６２を含む。
【０１０７】
他の実施態様では、Ｉ−Ａ型ｃａｓ８ａ１／ｃｓｘ１３ポリペプチドは、限定されないが、表６に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１０８】
表６．Ｉ−Ａ型ｃａｓ８ａ１／ｃｓｘ１３ポリペプチドアクセッションナンバー
AAL95378.1, AAZ69290.1, ABG85850.1, ABP67977.1, ABQ90254.1, ABR48349.1, ABS22299.1, ABU59349.1, ABX07704.1, ABY36145.1, ACD66304.1, ACD89534.1, ACI19672.1, ACI21434.1, ACK40458.1, ACL23511.1, ACM54569.1, ACM59280.1, ACN98336.1, ACO02971.1, ACS24737.1, ACV38707.1, ACV61808.1, ADC88653.1, ADG13584.1, ADG71319.1, ADH59814.1, ADI02112.1, ADI26429.1, ADL41486.1, ADP74262.1, ADQ08188.1, ADQ41858.1, ADU97573.1, ADY55689.1, AEA46792.1, AEE48384.1, AEF19060.1, AEF93612.1, AEH24640.1, AEH47542.1, AEH91548.1, AEN78299.1, AEO02602.1, AEO38050.1, AEV69187.1, AFA49668.1, AFL94587.1, AFS77693.1, AGF58568.1, AGG14993.1, AGG15485.1, AGI39652.1, AGI39866.1, AGR03384.1, AGR15961.1, AGR27586.1, CBL20527.1, CBY03036.1, CBY48110.1, CCY59072.1, CDB20969.1, CDC03261.1, CDC19289.1, CDC79971.1, CDC92385.1, CDC93207.1, CDE55652.1, CDI49498.1, CDI64710.1, EAY25594.1, EDK88416.1, EDO58922.1, EDR97019.1, EDS77895.1, EDT23081.1, EDU38639.1, EEG35956.1, EEG37130.1, EEO38468.1, EEP60017.1, EES51331.1, EEW20706.1, EEW67155.1, EEX23204.1, EFD25239.1, EFE87452.1, EFG27734.1, EFG95262.1, EFH05799.1, EFH17183.1, EFH93278.1, EFI68562.1, EFK93763.1, EFL54064.1, EFM38861.1, EFR88687.1, EFR88692.1, EFS01187.1, EFS20741.1, EFS21645.1, EFS24401.1, EFS28319.1, EFV16756.1, EGG91964.1, EGL83969.1, EGY80091.1, EHJ36418.1, EHL19483.1, EHN61774.1, EHR79718.1, EIJ72305.1, EJP23274.1, EJU08078.1, EJU19990.1, EKA92426.1, EKU43637.1, EMS70152.1, ERI07860.1, ERI93854.1, ERM91451.1, ERT47389.1, EUJ23986.1, EUJ39372.1, EUJ57885.1, NP_604079.1, WP_002187923.1, WP_002702613.1, WP_002835744.1, WP_002838037.1, WP_002840042.1, WP_003019330.1, WP_003364961.1, WP_003374705.1, WP_003488957.1, WP_003693852.1, WP_003721305.1, WP_003731260.1, WP_003733577.1, WP_003745650.1, WP_003770616.1, WP_004066403.1, WP_004228702.1, WP_004456286.1, WP_004628964.1, WP_004820498.1, WP_005345375.1, WP_005366755.1, WP_005896414.1, WP_005903146.1, WP_005917190.1, WP_005957249.1, WP_005969637.1, WP_005971576.1, WP_006806657.1, WP_007502704.1, WP_007547872.1, WP_008118711.1, WP_008401177.1, WP_008794388.1, WP_008800820.1, WP_008801714.1, WP_008821022.1, WP_009005906.1, WP_009081463.1, WP_009200361.1, WP_009220010.1, WP_009264828.1, WP_009371070.1, WP_009423366.1, WP_009528186.1, WP_009528502.1, WP_009531670.1, WP_009643660.1, WP_009926150.1, WP_009926261.1, WP_010248767.1, WP_010479701.1, WP_010528951.1, WP_010680292.1, WP_010885339.1, WP_011012263.1, WP_011016968.1, WP_011249418.1, WP_011591962.1, WP_011917899.1, WP_011956601.1, WP_012063325.1, WP_012094492.1, WP_012121773.1, WP_012192593.1, WP_012258798.1, WP_012459381.1, WP_012465415.1, WP_012546150.1, WP_012548304.1, WP_012574443.1, WP_012581885.1, WP_012615877.1, WP_012673661.1, WP_012675210.1, WP_012984910.1, WP_012991060.1, WP_013100330.1, WP_013144989.1, WP_013149500.1, WP_013175514.1, WP_013289493.1, WP_013400575.1, WP_013404326.1, WP_013433573.1, WP_013538358.1, WP_013624559.1, WP_013683464.1, WP_013749292.1, WP_013876765.1, WP_013905697.1, WP_014073500.1, WP_014091943.1, WP_014255749.1, WP_014357265.1, WP_014601720.1, WP_014788228.1, WP_014835335.1, WP_014966830.1, WP_015394877.1, WP_015526375.1, WP_015756524.1, WP_015769055.1, WP_015864171.1, WP_015906759.1, WP_019416834.1, WP_021623245.1, WP_021654356.1, WP_022172991.1, WP_022302635.1, WP_022304353.1, WP_022588389.1, WP_023438295.1, YP_001181168.1, YP_001276204.1, YP_001320008.1, YP_001375294.1, YP_001433367.1, YP_001547832.1, YP_001636534.1, YP_001930858.1, YP_001942513.1, YP_002249829.1, YP_002249954.1, YP_002351072.1, YP_002461947.1, YP_002570895.1, YP_002572053.1, YP_002728803.1, YP_002731103.1, YP_002950003.1, YP_003163698.1, YP_003190431.1, YP_003472780.1, YP_003616548.1, YP_003633518.1, YP_003671006.1, YP_003675825.1, YP_003702677.1, YP_003839472.1, YP_003988873.1, YP_003993557.1, YP_004027471.1, YP_004152214.1, YP_004265690.1, YP_004341507.1, YP_004445257.1, YP_004496524.1, YP_004587623.1, YP_004603183.1, YP_004623912.1, YP_004832235.1, YP_005047111.1, YP_005270557.1, YP_005946606.1, YP_005964502.1, YP_005970332.1, YP_006424381.1, YP_006680968.1, YP_006692468.1, YP_006787540.1, YP_007457822.1, YP_007500036.1, YP_007500528.1, YP_007679670.1, YP_007679884.1, YP_007784190.1, YP_008273810.1, YP_008282081.1, YP_008299753.1, YP_008428017.1, YP_008773535.1, YP_303870.1, および/または YP_698243.1
【０１０９】
一部の実施態様では、Ｉ−Ａ型ｃａｓ８ａ２／ｃｓｘ９ポリペプチドは、限定されないが、表７に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１１０】
表７．Ｉ−Ａ型ｃａｓ８ａ２／ｃｓｘ１３ポリペプチドアクセッションナンバー
ACS33798.1, ACV25238.1, ADC69853.1, ADV65298.1, AEH24649.1, AFK22399.1, AFL66344.1, EHR79726.1, Q57830.1, WP_004066420.1, WP_010479713.1, WP_010868141.1, WP_010885009.1, WP_011249406.1, WP_012980762.1, WP_013905706.1, WP_014733925.1, WP_015791971.1, YP_002959662.1, YP_003128738.1, YP_003458589.1, YP_004176780.1, YP_004623921.1, YP_006354474.1, YP_006401919.1, および/または YP_008428007.1
【０１１１】
一部の実施態様では、Ｉ−Ａ型ｃａｓ５ポリペプチドは、限定されないが、表８に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１１２】
表８．Ｉ−Ａ型ｃａｓ５ポリペプチドアクセッションナンバー
AAB89384.1, AAB98378.1, AAK41635.1, AAK41674.1, AAK42188.1, AAL62628.1, AAL80765.1, ABG65171.1, ABM80500.1, ABN69435.1, ABP50706.1, ABP95303.1, ABU82316.1, ACB07186.1, ACH62180.1, ACL11102.1, ACP34797.1, ACP37659.1, ACP37697.1, ACP45051.1, ACP49135.1, ACP54855.1, ACP54893.1, ACR41523.1, ACS33795.1, ACV25239.1, ACX92458.1, ADB86650.1, ADC66006.1, ADC69852.1, ADG91075.1, ADM27731.1, ADN51066.1, ADT83453.1, ADX81773.1, ADX84849.1, ADY01599.1, AEB95257.1, AEC52734.1, AEE94621.1, AEM38302.1, AET32402.1, AFA39173.1, AFH42056.1, AFK51440.1, AFL66341.1, AFL66901.1, AFN03430.1, AFU57333.1, AFU57334.1, AGJ61863.1, AHC52233.1, BAA30015.1, BAA80223.2, BAB64981.1, BAB67760.1, BAD84641.1, BAJ48045.1, BAJ48055.1, BAJ50845.1, BAN89822.1, CAB49935.1, CAT72675.1, CCC81887.1, CCE70433.1, EDX76563.1, EFL34103.1, EGK04694.1, EHP69910.1, EWG06386.1, G4RJZ2.1, NP_070697.1, NP_126704.1, NP_142843.2, NP_147810.2, NP_247356.1, NP_342845.1, NP_342884.1, NP_343398.1, NP_375872.1, NP_378651.1, NP_558446.1, NP_578370.1, Q57827.1, Q97WW2.1, Q97Y92.1, Q97YC6.1, WP_002364198.1, WP_003992208.1, WP_006100291.1, WP_006844672.1, WP_009070154.1, WP_009988394.1, WP_009991627.1, WP_010479711.1, WP_010729831.1, WP_010866247.1, WP_010868142.1, WP_010869881.1, WP_010879365.1, WP_010885010.1, WP_010923406.1, WP_010977963.1, WP_010980734.1, WP_011007100.1, WP_011011761.1, WP_011249407.1, WP_011583112.1, WP_011821818.1, WP_011838626.1, WP_011900613.1, WP_012021090.1, WP_012123280.1, WP_012309083.1, WP_012608443.1, WP_012710927.1, WP_012710964.1, WP_012717742.1, WP_012718680.1, WP_012966345.1, WP_012980761.1, WP_013129668.1, WP_013303381.1, WP_013336791.1, WP_013466751.1, WP_013604761.1, WP_013737755.1, WP_013749284.1, WP_013776536.1, WP_014025979.1, WP_014127142.1, WP_014288230.1, WP_014346690.1, WP_014511987.1, WP_014513745.1, WP_014557205.1, WP_014737690.1, WP_014767242.1, WP_014767797.1, WP_015580743.1, WP_015791972.1, WP_015858907.1, WP_016730681.1, WP_016731906.1, WP_016732169.1, WP_016732175.1, WP_018033623.1, WP_018192944.1, WP_018193690.1, WP_020265384.1, WP_020511164.1, WP_020864070.1, WP_021968299.1, WP_022071463.1, WP_022541099.1, WP_024084610.1, WP_024265300.1, YP_001012845.1, YP_001040343.1, YP_001153358.1, YP_001191227.1, YP_001435723.1, YP_001736869.1, YP_002225090.1, YP_002428469.1, YP_002828957.1, YP_002828995.1, YP_002831442.1, YP_002836973.1, YP_002841057.1, YP_002842900.1, YP_002842938.1, YP_002914191.1, YP_002959659.1, YP_003128739.1, YP_003419020.1, YP_003436281.1, YP_003458588.1, YP_003650027.1, YP_003859611.1, YP_003902117.1, YP_004070676.1, YP_004245101.1, YP_004409741.1, YP_004424738.1, YP_004458919.1, YP_004780554.1, YP_004892965.1, YP_005084654.1, YP_005259780.1, YP_005644059.1, YP_005644987.1, YP_005648063.1, YP_005841508.1, YP_006363578.1, YP_006401916.1, YP_006402476.1, YP_006491722.1, YP_006860990.1, YP_006860991.1, YP_007864863.1, YP_008603756.1, YP_008797475.1, YP_008948135.1, および/または YP_182865.1
【０１１３】
さらに他の実施態様では、Ｉ−Ａ型ｃｓａ５ポリペプチドは、限定されないが、表９に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１１４】
表９．Ｉ−Ａ型ｃｓａ５ポリペプチドアクセッションナンバー
AAB89385.1, AAK41676.1, AAK42186.1, ABB24054.1, ABK78026.1, ABM80502.1, ABN69433.1, ABP95305.1, ABR33799.1, ABU82318.1, ACB07184.1, ACI21287.1, ACL11104.1, ACP34795.1, ACP37695.1, ACP45049.1, ACP49137.1, ACP54891.1, ACR41521.1, ACV25241.1, ADB86648.1, ADC69850.1, ADX81775.1, ADX84847.1, AEB07988.1, AEB95255.1, AEE94623.1, AEE95241.1, AEH24646.1, AEM38381.1, AFK22402.1, AGI51452.1, AGJ61865.1, AHC52235.1, BAA30017.1, BAB67758.1, BAD84643.1, BAE63890.1, BAJ48057.1, BAJ50847.1, CAB49937.1, CAQ41128.1, CAT72674.1, CBX31380.1, CCE70435.1, EEK52966.1, EEQ91179.1, EGE82524.1, EGL20033.1, EHN78776.1, EHP69908.1, EHR79724.1, ELS34753.1, ENU25210.1, ENV11469.1, ENX58900.1, ENX61893.1, EOR09267.1, EPD82015.1, ESU14071.1, EWG06384.1, G4RJZ0.1, NP_070695.1, NP_126706.1, NP_142845.1, NP_342886.1, NP_343396.1, NP_378649.1, O28409.1, Q97Y90.1, WP_000270013.1, WP_002746890.1, WP_002764565.1, WP_004066416.1, WP_004652132.1, WP_004801272.1, WP_005202326.1, WP_005323045.1, WP_007388860.1, WP_008426480.1, WP_009070150.1, WP_009625124.1, WP_009671504.1, WP_009990722.1, WP_009991624.1, WP_010479707.1, WP_010868144.1, WP_010879363.1, WP_010885012.1, WP_010923408.1, WP_010923715.1, WP_010980732.1, WP_011249409.1, WP_011357926.1, WP_011821820.1, WP_011838624.1, WP_011968951.1, WP_012021092.1, WP_012123282.1, WP_012309081.1, WP_012546006.1, WP_012608445.1, WP_012710962.1, WP_012713193.1, WP_012715848.1, WP_012717744.1, WP_012718679.1, WP_012980759.1, WP_013482651.1, WP_013705101.1, WP_013737753.1, WP_013776538.1, WP_013779675.1, WP_013905703.1, WP_014026058.1, WP_014511989.1, WP_014513743.1, WP_014733928.1, WP_015791974.1, WP_016162949.1, WP_016729979.1, WP_016731904.1, WP_018033625.1, WP_018192942.1, WP_018193688.1, WP_018541940.1, WP_019324664.1, WP_020265382.1, WP_020265487.1, WP_020268818.1, WP_020269141.1, WP_020864072.1, WP_021052469.1, WP_024084612.1, XP_001825023.2, XP_002259861.1, XP_790100.2, YP_001012847.1, YP_001040341.1, YP_001191229.1, YP_001308755.1, YP_001435725.1, YP_001736867.1, YP_002248920.1, YP_002428471.1, YP_002828993.1, YP_002831440.1, YP_002836971.1, YP_002841059.1, YP_002842936.1, YP_002914189.1, YP_003128741.1, YP_003419018.1, YP_003458586.1, YP_004369169.1, YP_004409739.1, YP_004458921.1, YP_004462063.1, YP_004623918.1, YP_004780633.1, YP_005644989.1, YP_005648061.1, YP_006354477.1, YP_007864865.1, YP_008428011.1, YP_008474533.1, YP_008797477.1, YP_008948137.1, YP_182867.1, YP_375097.1, および/または YP_876330.1
【０１１５】
一部の実施態様では、Ｉ−Ａ型ｃａｓ６ａポリペプチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＣＣＣ３９３２６．１、Ｑ５７８２０．１、Ｑ９７Ｙ９６．１、および／またはＹＰ＿００５８３９１０１．１を含む。
【０１１６】
さらなる実施態様では、Ｉ−Ａ型ｃａｓ３’ポリペプチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＰ＿１４７８０８．１、ＮＰ＿３４３３９９．１、および／またはＣＣＣ８１８８８．１を含む。
【０１１７】
またさらなる実施態様では、Ｉ−Ａ型Ｃａｓ３’’ポリペプチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＰ＿１４７８０７．１、ＮＰ＿３４３４００．１、および／またはＣＣＣ８１８８９．１を含む。
【０１１８】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｂ型ｃａｓ６ｂポリペプチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＱ８Ｕ３Ｒ３．１、Ｑ９７ＷＶ８．１、Ｑ５８６３１．１、ＹＰ＿００３５３３６６３．１、ＹＰ＿００２５３４２４２．１、および／またはＹＰ＿００２５３４２４９．１を含む。
【０１１９】
他の実施態様では、Ｉ−Ｂ型ｃａｓ８ｂ／ｃｓｈ１ポリペプチドは、限定されないが、表１０に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１２０】
表１０．Ｉ−Ａ型ｃａｓ８ｂ／ｃｓｈ１ポリペプチドアクセッションナンバー
ACB09368.1, ACV11630.1, ACV48938.1, AEM58842.1, AFK21437.1, AFO56172.1, AFZ74575.1, AGB03160.1, AGF96002.1, AGF96003.1, AGO61197.1, AGX43472.1, AHB67946.1, AHG05445.1, BAL52721.1, CCK87449.1, CCK90903.1, CCK96290.1, CCK98531.1, CCQ33713.1, EAY30146.1, EDR99204.1, EEP56084.1, EES90449.1, EFH07552.1, EFH15423.1, EHP85065.1, EID43009.1, ELY41482.1, ELY72601.1, ELY83890.1, ELY91754.1, ELY96632.1, ELZ04987.1, ELZ16933.1, ELZ40751.1, ELZ42764.1, ELZ59537.1, ELZ60426.1, ELZ68872.1, ELZ72052.1, ELZ72263.1, ELZ84579.1, ELZ88967.1, ELZ93658.1, ELZ97246.1, ELZ99739.1, EMA18803.1, EMA25147.1, EMA34109.1, EMA56841.1, EMA69343.1, EMT39606.1, ERJ06790.1, ESP86779.1, ETA67346.1, ETI90104.1, GAC90881.1, WP_003377299.1, WP_003380931.1, WP_003413122.1, WP_004046328.1, WP_004060812.1, WP_004064662.1, WP_004971283.1, WP_005533726.1, WP_005576677.1, WP_006165794.1, WP_006168574.1, WP_006601038.1, WP_006648207.1, WP_006653096.1, WP_006673617.1, WP_007188933.1, WP_007736473.1, WP_007982327.1, WP_008094396.1, WP_008164964.1, WP_008320680.1, WP_008324580.1, WP_008444873.1, WP_008452268.1, WP_008524855.1, WP_008572456.1, WP_008847067.1, WP_009887249.1, WP_011099685.1, WP_011222266.1, WP_011722697.1, WP_012310881.1, WP_012660067.1, WP_014030718.1, WP_014555903.1, WP_014863256.1, WP_015763780.1, WP_015789204.1, WP_018129134.1, WP_018258161.1, WP_021373546.1, WP_021403257.1, WP_021412247.1, WP_022615726.1, WP_022746620.1, WP_023396040.1, YP_001739051.1, YP_003130363.1, YP_003178645.1, YP_004785826.1, YP_006351424.1, YP_006540248.1, YP_007179024.1, YP_007249667.1, YP_008142098.1, YP_008377024.1, YP_008675509.1, および/または YP_008874106.1
【０１２１】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｂ型ｃａｓ７／ｃｓｈ２ポリペプチドは、限定されないが、表１１に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１２２】
表１１．Ｉ−Ａ型ｃａｓ７／ｃｓｈ２ポリペプチドアクセッションナンバー
ABR54140.1, ACB09369.1, ACN13664.1, ACV11629.1, ACV48939.1, AEK19972.1, AEM58841.1, AFK21438.1, AHB67947.1, AHD18305.1, CCQ33714.1, ERJ06791.1, WP_004046327.1, WP_004060811.1, WP_004082348.1, WP_004966754.1, WP_004971285.1, WP_005533725.1, WP_006168573.1, WP_007188932.1, WP_007982329.1, WP_008164963.1, WP_008320681.1, WP_008324577.1, WP_008524853.1, WP_008572454.1, WP_011032514.1, WP_011222267.1, WP_011972043.1, WP_012310882.1, WP_012660066.1, WP_012662913.1, WP_013999402.1, WP_014030717.1, WP_015763781.1, WP_015789203.1, WP_018258160.1, WP_020220934.1, YP_001322752.1, YP_001739052.1, YP_002534251.1, YP_002601828.1, YP_003130362.1, YP_003178646.1, YP_003533665.1, YP_004742715.1, YP_004785825.1, YP_006351425.1, YP_008377025.1, YP_008874107.1, および/または YP_008991099.1
【０１２３】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｂ型ｃａｓ５ポリペプチドは、限定されないが、表１２に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１２４】
表１２．Ｉ−Ｂ型ｃａｓ５ポリペプチドアクセッションナンバー
AAB85576.1, AAC06653.1, AAD36863.1, AAM30258.1, AAO36023.1, AAR38875.1, AAV44423.1, ABB15084.1, ABE52050.1, ABG03245.1, ABI69104.1, ABI69807.1, ABJ60926.1, ABK14430.1, ABN54398.1, ABO35079.1, ABP65713.1, ABP65962.1, ABR30222.1, ABR54141.1, ABR56648.1, ABS22297.1, ABS51485.1, ABV32774.1, ABX32567.1, ABY93797.1, ACB09370.1, ACI18906.1, ACJ33146.1, ACJ75703.1, ACJ76380.1, ACK41910.1, ACL21951.1, ACL70272.1, ACM22886.1, ACM61724.1, ACN13665.1, ACN98723.1, ACO03885.1, ACR79388.1, ACS23234.1, ACS24735.1, ACS90540.1, ACV11628.1, ACV25245.1, ACV38705.1, ACV48940.1, ACV61810.1, ACV63756.1, ACV64956.1, ACX52109.1, ACX77838.1, ACZ43322.1, ADB39857.1, ADC46646.1, ADC69846.1, ADD03494.1, ADE01943.1, ADF51863.1, ADG07364.1, ADG07375.1, ADG13848.1, ADG83329.1, ADH59812.1, ADH61863.1, ADI26431.1, ADI36186.1, ADI61856.1, ADL06864.1, ADL41488.1, ADL43515.1, ADL70072.1, ADO35161.1, ADO45628.1, ADP74264.1, ADP76109.1, ADQ08186.1, ADQ08235.1, ADQ14922.1, ADQ41856.1, ADQ41963.1, ADQ42006.1, ADQ47253.1, ADQ47299.1, ADR19819.1, ADU51672.1, ADU92812.1, ADU97575.1, ADV78761.1, ADY32338.1, ADY55691.1, AEB69537.1, AEB77226.1, AEE14450.1, AEE90320.1, AEE97376.1, AEF18280.1, AEF19062.1, AEG14078.1, AEG14216.1, AEG46351.1, AEG61211.1, AEH25122.1, AEH47544.1, AEH49390.1, AEH51742.1, AEH54512.1, AEI14613.1, AEJ40709.1, AEK19971.1, AEK72019.1, AEM58840.1, AEM74922.1, AEM74971.1, AEN78297.1, AEP01119.1, AER66005.1, AEV68770.1, AEV69185.1, AEW01076.1, AEW06746.1, AFK07935.1, AFK21439.1, AFK21704.1, AFK85421.1, AFL96011.1, AFM22198.1, AFO56174.1, AFU57333.1, AFV12619.1, AFZ74577.1, AGA59189.1, AGB20226.1, AGC68638.1, AGC68870.1, AGF58566.1, AGG14995.1, AGH93292.1, AGI39650.1, AGI39868.1, AGL00110.1, AGL00360.1, AGL50734.1, AGR27754.1, AGT06852.1, AGY75623.1, AHB67948.1, AHD18306.1, AHF79950.1, AHG05447.1, AHJ12409.1, BAA29240.1, BAI69702.1, BAI70178.1, BAI80034.1, BAI81693.1, CAB05527.1, CAJ69873.1, CBA65392.1, CBE06412.1, CBH26573.1, CBL06453.1, CBL20525.1, CBL28677.1, CBV37093.1, CBV37147.1, 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WP_022172989.1, WP_022213074.1, WP_022228560.1, WP_022234505.1, WP_022298983.1, WP_022302637.1, WP_022343367.1, WP_022431365.1, WP_022477154.1, WP_022588387.1, WP_022670961.1, WP_022711582.1, WP_022745992.1, WP_022746618.1, WP_022748671.1, WP_022819291.1, WP_022846698.1, WP_022854086.1, WP_022855920.1, WP_022856208.1, WP_023037412.1, WP_023039491.1, WP_023039733.1, WP_023438404.1, WP_023484747.1, WP_023844484.1, WP_023991513.1, XP_003208052.1, XP_004141494.1, YP_001039591.1, YP_001089497.1, YP_001097294.1, YP_001111907.1, YP_001178904.1, YP_001179153.1, YP_001305607.1, YP_001322753.1, YP_001325260.1, YP_001375292.1, YP_001405996.1, YP_001408163.1, YP_001469838.1, YP_001568890.1, YP_001664133.1, YP_001739053.1, YP_002250044.1, YP_002315131.1, YP_002335044.1, YP_002335721.1, YP_002352524.1, YP_002460387.1, YP_002509267.1, YP_002534252.1, YP_002574497.1, YP_002581621.1, YP_002601829.1, YP_002728848.1, YP_002731106.1, YP_002940392.1, YP_002948500.1, YP_002950001.1, YP_002994889.1, YP_003128745.1, YP_003130361.1, YP_003163696.1, YP_003178647.1, YP_003190433.1, YP_003192379.1, YP_003193579.1, YP_003215318.1, YP_003215785.1, YP_003219292.1, YP_003238959.1, YP_003252320.1, YP_003324144.1, YP_003388656.1, YP_003423538.1, YP_003432903.1, YP_003433379.1, YP_003458582.1, YP_003463661.1, YP_003478056.1, YP_003495790.1, YP_003497449.1, YP_003533666.1, YP_003584059.1, YP_003590508.1, YP_003590519.1, YP_003616812.1, YP_003641230.1, YP_003671008.1, YP_003675823.1, YP_003677874.1, YP_003707159.1, YP_003728008.1, YP_003824487.1, YP_003839474.1, YP_003841501.1, YP_003853156.1, YP_003877866.1, YP_003958124.1, YP_003988875.1, YP_003990720.1, YP_003993555.1, YP_003993604.1, YP_003995276.1, YP_004025072.1, YP_004025118.1, YP_004027469.1, YP_004027576.1, YP_004027619.1, YP_004051982.1, YP_004102399.1, YP_004130955.1, YP_004152216.1, YP_004185144.1, YP_004252518.1, YP_004265692.1, YP_004385355.1, YP_004385601.1, YP_004437581.1, YP_004459627.1, YP_004464198.1, YP_004471952.1, YP_004515879.1, YP_004516017.1, YP_004546497.1, YP_004569898.1, YP_004587625.1, YP_004589471.1, YP_004603181.1, YP_004624394.1, YP_004660838.1, YP_004720452.1, YP_004742714.1, YP_004761696.1, YP_004785824.1, YP_004799899.1, YP_004799948.1, YP_004832233.1, YP_004859899.1, YP_004932102.1, YP_005010479.1, YP_005046694.1, YP_005047109.1, YP_005258418.1, YP_005270555.1, YP_005511921.1, YP_005839932.1, YP_006199528.1, YP_006199999.1, YP_006347178.1, YP_006351426.1, YP_006353779.1, YP_006391020.1, YP_006425805.1, YP_006444523.1, YP_006540250.1, YP_006761819.1, YP_006860990.1, YP_006921118.1, YP_006932081.1, YP_006950412.1, YP_007179026.1, YP_007214187.1, YP_007270779.1, YP_007299923.1, YP_007373248.1, YP_007373480.1, YP_007457820.1, YP_007489272.1, YP_007500038.1, YP_007647092.1, YP_007679668.1, YP_007679886.1, YP_007784188.1, YP_007827923.1, YP_007835090.1, YP_007943786.1, YP_007944036.1, YP_007978159.1, YP_008285600.1, YP_008377026.1, YP_008406928.1, YP_008698879.1, YP_008773654.1, YP_008874108.1, YP_008915223.1, YP_008991100.1, YP_134129.1, YP_360969.1, YP_398447.1, YP_519003.1, YP_519038.1, YP_565800.1, YP_643057.1, YP_754475.1, YP_755178.1, YP_815364.1, および/または YP_878707.1
【０１２５】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｃ型ｃａｓ５ｄポリペプチドは、限定されないが、表１３に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１２６】
表１３．Ｉ−Ｃ型ｃａｓ５ｄポリペプチドアクセッションナンバー
AAN47887.1, AAS71465.1, AAU93027.1, AAW74125.1, ABA05200.1, ABB24156.1, ABB28271.1, ABB31305.1, ABC21630.1, ABD12699.1, ABE48872.1, ABF32471.1, ABF34436.1, ABF36361.1, ABF38347.1, ABF88231.1, ABM29988.1, ABN07020.1, ABO49538.1, ABP81369.1, ABQ92672.1, ABR47840.1, ABR74645.1, ACA16216.1, ACD60966.1, ACL75831.1, ACM21758.1, ACO79325.1, ACR11997.1, ADD28250.1, ADK85026.1, ADP88372.1, ADX47760.1, ADY55247.1, ADY61451.1, ADY61692.1, ADZ26350.1, AEB11036.1, AEC00930.1, AEE12857.1, AEE17592.1, AEF93427.1, AEG01411.1, AEG34528.1, AEH55427.1, AEI38602.1, AEO47325.1, AER01367.1, AER57692.1, AEY65499.1, AFM23519.1, AFM40489.1, AFY70023.1, AGB03721.1, AGC48888.1, AGF80046.1, AGH38686.1, AGK13303.1, AGK17629.1, AHC14003.1, AHC19699.1, AHG83784.1, AHG86670.1, BAE67552.1, BAF39966.1, BAF60174.1, BAG13699.1, BAL68714.1, BAM02852.1, CAI07977.1, CAP54006.1, CBA17364.1, CCF16785.1, CCF67638.1, CCG39875.1, CCI63164.1, CCK83453.1, CCO74227.1, CCP41950.1, CCU72640.1, CCU78371.1, CCW39407.1, CCX48117.1, CCX73938.1, CCY00154.1, CCY02819.1, CCY33507.1, CCZ32691.1, CCZ61766.1, CCZ62159.1, CCZ84350.1, CDA15005.1, CDA52082.1, CDA89887.1, CDB26704.1, CDB62743, CDC12997.1, CDC50441.1, CDC62359.1, CDD04553.1, CDD57368.1, CDD59788.1, CDD98974.1, CDE11994.1, CDE46264.1, CDE57765.1, CDF15831.1, CDI43446.1, EAQ36306.1, EAT02164.1, EAW36788.1, EBA01539.1, EDN01971.1, EDN73323.1, EDN76105.1, EDN84715.1, EDP14354.1, EDP25154.1, EDS00205.1, EDS06800.1, EDT45690.1, EDY32905.1, EDY96625.1, EEA82743.1, EEF65984.1, EEF76899.1, EEG30526.1, EEG33494.1, EEG56415.1, EEG71148.1, EEG75123.1, EEG96116.1, EEK17367.1, EEN82611.1, EEO46556.1, EEO62000.1, EEP28832.1, EEP68243.1, EEQ48800.1, EEQ57500.1, EER56004.1, EES74000.1, EET16694.2, EET44432.1, EET62042.1, EEV89051.1, EEX49287.1, EEX75937.1, EEY11080.1, EEZ20539.1, EEZ74756.1, EEZ75907.1, EFA89364.1, EFB90880.1, EFC51247.1, EFC87155.1, EFE11615.1, EFE27918.2, EFF66131.1, EFH21870.1, EFP59912.1, EFR33752.1, EFR34549.1, EFR37025.1, EFR40957.1, EFR44859.1, EFT83495.1, EFV01200.1, EFW29035.1, EGB18208.1, EGC03292.1, EGC18025.1, EGC88888.1, EGN35867.1, EGN46214.1, EGV28562.1, EGZ49812.1, EHJ47330.1, EHQ07660.1, EHQ62726.1, EHQ90704.1, EIA28593.1, EIA30742.1, EIC02345.1, EIG30391.1, EIG54632.1, EIJ33768.1, EIJ71548.1, EIJ72649.1, EIJ78013.1, EIK41596.1, EIQ00066.1, EIQ82361.1, EIT84251.1, EIT88137.1, EIW20398.1, EIW25543.1, EIW30558.1, EIW33390.1, EIW37237.1, EIY19180.1, EJF40816.1, EJG08368.1, EJL40220.1, EJN54261.1, EJO19217.1, EJO71191.1, EJO77909.1, EJP02512.1, EJP15600.1, EJP31579.1, EJP85726.1, EJR26612.1, EJR51643.1, EJR72343.1, EJR80197.1, EJS99959.1, EJU16729.1, EJU25585.1, EJV73300.1, EJW17219.1, EKD25943.1, EKE30555.1, EKE43331.1, EKF36597.1, EKM99102.1, EKN16809.1, EKN28426.1, EKN66244.1, EKN88372.1, EKN97010.1, EKO05463.1, EKO14413.1, EKO24496.1, EKO52394.1, EKO59410.1, EKO69592.1, EKO85513.1, EKO94714.1, EKP04538.1, EKP23618.1, EKP78025.1, EKP85221.1, EKP95534.1, EKQ39148.1, EKQ47929.1, EKQ85360.1, EKR06490.1, EKR19532.1, 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EMP06745.1, EMP59158.1, EMP62865.1, EMS72177.1, EMS78533.1, EMS83941.1, EMS85265.1, EMY05817.1, EMY23092.1, EMY55686.1, EMZ33824.1, ENO72457.1, ENO77317.1, ENO81519.1, ENO88271.1, ENZ10232.1, ENZ16947.1, ENZ39043.1, ENZ43232.1, ENZ45620.1, ENZ47416.1, ENZ54159.1, ENZ69350.1, EOA56068.1, EOH98199.1, EOO33053.1, EOP18423.1, EOP32138.1, EOP44811.1, EOP55656.1, EOP60321.1, EOP87876.1, EOQ36053.1, EOS00147.1, EOS28523.1, EOS50042.1, EOS54453.1, EOS63279.1, EOS64688.1, EOS73779.1, EOS81387.1, EOT59712.1, EPD37767.1, EPD56031.1, EPD62541.1, EPD77060.1, EPE60577.1, EPE83066.1, EPF25861.1, EPG50259.1, EPL64359.1, EPP16776.1, EPP17871.1, EPT71507.1, EPT84064.1, EPU02094.1, EPU03828.1, EPU52082.1, EPU54910.1, EPU81442.1, EPU87008.1, EPU94208.1, EPU97405.1, EPV01336.1, EPV02195.1, EPV09631.1, EPV18668.1, EPV22733.1, EPV25619.1, EPV40784.1, EPV50545.1, EPV51910.1, EPV55807.1, EPV62103.1, EPV65175.1, EPV98861.1, EPW00870.1, EPW07126.1, EPW16761.1, EPW44453.1, EPW59772.1, EPW65049.1, EPW65528.1, EPW80674.1, EPW81318.1, EPW82924.1, EPW86859.1, EPX25333.1, EPX29203.1, EPY00286.1, EPZ01875.1, EPZ27872.1, EPZ29478.1, EPZ29867.1, EPZ46610.1, EQA71137.1, EQA92571.1, ERF77711.1, ERH28583.1, ERH28850.1, ERH97080.1, ERI04267.1, ERI61373.1, ERI68386.1, ERJ00271.1, ERJ69593.1, ERJ89572.1, ERJ93149.1, ERK03389.1, ERK56583.1, ERK64508.1, ERK89621.1, ERL04025.1, ERL17229.1, ERP31666.1, ERP96324.1, ERS87977.1, ERV42109.1, ERV60145.1, ERY77980.1, ESA51291.1, ESQ15434.1, EST51947.1, ESU95723.1, ETA80090.1, ETD20913.1, ETE90141.1, ETI70720.1, GAB60573.1, GAC40772.1, GAD39350.1, GAE10003.1, NP_710869.1, WP_000448696.1, WP_002270820.1, WP_002284930.1, WP_003680283.1, WP_004260232.1, WP_004448864.1, WP_004757770.1, WP_005487698.1, WP_006966953.1, WP_007465278.1, WP_008224256.1, WP_009605936.1, WP_009729418.1, WP_009784757.1, WP_010259997.1, WP_010543173.1, WP_011257746.1, WP_011315193.1, WP_011388584.1, WP_011556938.1, WP_011743510.1, WP_011745279.1, WP_011787403.1, WP_011914754.1, WP_011959009.1, WP_012033149.1, WP_012062878.1, WP_012073022.1, WP_012222310.1, WP_012331626.1, WP_014436072.1, WP_015164989.1, WP_015286683.1, WP_015405728.1, WP_015432824.1, WP_015487358.1, WP_015924973.1, WP_016217545.1, WP_016229737.1, WP_016271358.1, WP_016293318.1, WP_016309858.1, WP_016313870.1, WP_016314947.1, WP_016323949.1, WP_016439663.1, WP_016441069.1, WP_016453851.1, WP_016478058.1, WP_016480397.1, WP_017690352.1, WP_018887427.1, WP_018916770.1, WP_019604447.1, WP_021495565.1, WP_021615274.1, WP_021615581.1, WP_021625750.1, WP_021631528.1, WP_021636852.1, WP_021659784.1, WP_021666376.1, WP_021685844.1, WP_021687360.1, WP_021774882.1, WP_021932607.1, WP_022180174.1, WP_023389231.1, WP_023411381.1, WP_023967437.1, WP_023988272.1, YP_001030287.1, YP_001174211.1, YP_001212543.1, YP_001278622.1, YP_001319499.1, YP_001344580.1, YP_001600359.1, YP_001768650.1, YP_001915498.1, YP_002018512.1, YP_002505811.1, YP_002538859.1, YP_002800300.1, YP_002828.1, YP_003074489.1, YP_003377358.1, YP_003507270.1, YP_003807620.1, YP_004236327.1, YP_004265248.1, YP_004271473.1, YP_004271714.1, YP_004294512.1, YP_004367146.1, YP_004414389.1, YP_004440723.1, YP_004442025.1, YP_004496339.1, YP_004513910.1, YP_004673775.1, YP_004931733.1, YP_005147304.1, YP_005444749.1, YP_005641655.1, YP_005704010.1, YP_005987350.1, YP_006047122.1, YP_006250657.1, YP_006720033.1, YP_007102451.1, YP_007250228.1, YP_007364572.1, YP_007469699.1, YP_007548477.1, YP_007682877.1, YP_007894110.1, YP_007899159.1, YP_008086287.1, YP_008911632.1, YP_088180.1, YP_113169.1, YP_199510.1, YP_318552.1, YP_375199.1, YP_379314.1, YP_425917.1, YP_434017.1, YP_449826.1, YP_482428.1, YP_525132.1, YP_544713.1, YP_635132.1, YP_910048.1, YP_911887.1, および/または YP_961176.1
【０１２７】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｃ型ｃａｓ８ｃ／ｃｓｄ１ポリペプチドは、限定されないが、表１４に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１２８】
表１４．Ｉ−Ｃ型ｃａｓ８ｃ／ｃｓｄ１ポリペプチドアクセッションナンバー
ABA05199.1, ABB24157.1, ABB28270.1, ABB31306.1, ABC18826.1, ABC21631.1, ABD12700.1, ABD71602.1, ABE48873.1, ABF44540.1, ABF90712.1, ABI59275.1, ABI67812.1, ABK46006.1, ABL65462.1, ABM29987.1, ABN07019.1, ABO49539.1, ABP37314.1, ABQ92671.1, ABR47841.1, ABR74646.1, ACA16217.1, ACB33428.1, ACB59636.1, ACD60967.1, ACE84720.1, ACF43896.1, ACG61922.1, ACI51408.1, ACL08916.1, ACM01819.1, ACM21757.1, ACO32176.1, ACO79324.1, ACR12476.1, ACS96760.1, ACV55941.1, ACV64359.1, ACV76426.1, ACX95670.1, ADB10233.1, ADB47146.1, ADD28249.1, ADD43241.1, ADE15051.1, ADE85054.1, ADG82737.1, ADH65195.1, ADI02309.1, ADI14779.1, ADK80204.1, ADK85027.1, ADO43028.1, ADP70486.1, ADP88373.1, ADU21656.1, ADU26220.1, ADU44692.1, ADV45013.1, ADW17643.1, ADX47761.1, ADY55248.1, ADY61450.1, ADY61691.1, ADZ26349.1, AEB11037.1, AEC00929.1, AEE12858.1, AEE17591.1, AEF28113.1, AEF93428.1, AEG01412.1, AEG34529.1, AEG59677.1, AEH52451.1, AEH55428.1, AEI38601.1, AEI64170.1, AEJ20057.1, AEM41208.1, AEN97652.1, AEO47326.1, 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517.1, YP_001112364.1, YP_001130816.1, YP_001174212.1, YP_001278621.1, YP_001319500.1, YP_001344581.1, YP_001768651.1, YP_001790193.1, YP_001812653.1, YP_001915499.1, YP_001956161.1, YP_001982916.1, YP_002018513.1, YP_002122935.1, YP_002276023.1, YP_002436384.1, YP_002526320.1, YP_002538858.1, YP_002753896.1, YP_002800299.1, YP_003006847.1, YP_003074488.1, YP_003182330.1, YP_003192982.1, YP_003227010.1, YP_003262717.1, YP_003361057.1, YP_003398461.1, YP_003507269.1, YP_003512334.1, YP_003527438.1, YP_003577461.1, YP_003640638.1, YP_003686703.1, YP_003702874.1, YP_003705322.1, YP_003802798.1, YP_003807621.1, YP_003964328.1, YP_004011585.1, YP_004090951.1, YP_004104290.1, YP_004109425.1, YP_004162599.1, YP_004194934.1, YP_004236328.1, YP_004265249.1, YP_004271472.1, YP_004271713.1, YP_004294511.1, YP_004367147.1, YP_004414388.1, YP_004440722.1, YP_004442026.1, YP_004496340.1, YP_004513911.1, YP_004544963.1, YP_004567837.1, YP_004665248.1, YP_004673774.1, YP_004698565.1, YP_004771205.1, YP_004834872.1, YP_004839584.1, YP_004857065.1, YP_004858802.1, YP_004917438.1, YP_004931734.1, YP_004969957.1, YP_005053777.1, YP_005063975.1, YP_005147305.1, YP_005169126.1, YP_005641656.1, YP_005668368.1, YP_005704011.1, YP_005795204.1, YP_006047123.1, YP_006250658.1, YP_006285892.1, YP_006287670.1, YP_006373979.1, YP_006445784.1, YP_006465822.1, YP_006720034.1, YP_006815949.1, YP_006905221.1, YP_007096664.1, YP_007102452.1, YP_007214290.1, YP_007250227.1, YP_007296337.1, YP_007318535.1, YP_007364571.1, YP_007469698.1, YP_007483072.1, YP_007548478.1, YP_007593345.1, YP_007666157.1, YP_007669039.1, YP_007773723.1, YP_007829835.1, YP_007837793.1, YP_007840045.1, YP_007841640.1, YP_007848218.1, YP_007881808.1, YP_007894109.1, YP_007899158.1, YP_007947097.1, YP_008086288.1, YP_008145544.1, YP_008219474.1, YP_008221969.1, YP_008233396.1, YP_008338545.1, YP_008866150.1, YP_009171.1, YP_113168.1, YP_318551.1, YP_375200.1, YP_379313.1, YP_425918.1, YP_429369.1, YP_525133.1, YP_544714.1, YP_603709.1, YP_635131.1, YP_747240.1, YP_867412.1, YP_910046.1, YP_910047.1, YP_911886.1, および/または YP_961175.1
【０１２９】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｃ型ｃａｓ７／ｃｓｄ２ポリペプチドは、限定されないが、表１５に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１３０】
表１５．Ｉ−Ｃ型ｃａｓ７／ｃｓｄ２ポリペプチドアクセッションナンバー
ABA05198.1, ABB24158.1, ABB28269.1, ABB31307.1, ABC18825.1, ABC21632.1, ABD12701.1, ABD71603.1, ABF44539.1, ABI59274.1, ABI67813.1, ABK46007.1, ABM29986.1, ABN07018.1, ABO49540.1, ABP37315.1, ABQ92670.1, ABR47842.1, ABR74647.1, ACB33427.1, ACB59637.1, ACD60968.1, ACE85492.1, ACG61923.1, ACI51409.1, ACL08917.1, ACL20219.1, ACM21756.1, ACO79323.1, ACR11071.1, ACS96761.1, ACV55940.1, ACV64358.1, ACV76427.1, ACX95669.1, ADB47147.1, ADD28248.1, ADD43240.1, ADE15052.1, ADG82736.1, ADH65194.1, ADI02308.1, ADI14780.1, ADK80205.1, ADK85028.1, ADN01352.1, ADO43029.1, ADP88374.1, ADU21657.1, ADU26219.1, ADU44693.1, ADV45012.1, ADW17644.1, ADX47762.1, ADY55249.1, ADY61449.1, ADY61690.1, ADZ26348.1, AEA19527.1, AEA19528.1, AEA19529.1, AEA19530.1, AEA19531.1, AEA19532.1, AEC00928.1, AEE12859.1, AEE17590.1, AEF93429.1, AEG01413.1, AEG59678.1, AEH55429.1, AEI38600.1, AEJ20056.1, AEM41209.1, AEN97651.1, AEO47327.1, AEP00021.1, AER57694.1, AET67443.1, AEV30966.1, AEW77431.1, AEY65501.1, AFI86059.1, AFI87839.1, AFM23521.1, AFM40491.1, AFU17709.1, AFV38402.1, AFV71911.1, AFY70025.1, AFY93136.1, AGA59293.1, AGB03719.1, AGB28832.1, AGF80044.1, AGH38688.1, AGK06312.1, AGK13352.1, AGK17702.1, AGK70468.1, AGL03420.1, AGS46824.1, AHB48173.1, AHG79313.1, AHG81511.1, AHG83782.1, AHG86672.1, BAG13701.1, BAK19891.1, BAK56464.1, BAK66416.1, BAL68716.1, BAN13314.1, CBA17366.1, CBK76221.1, CBK91610.1, CBK92829.1, CBK99510.1, CBL17828.1, CBL19923.1, CBL34517.1, CCE23038.1, CCE23845.1, CCG39877.1, CCH29339.1, CCH68439.1, CCI63162.1, CCQ74035.1, CCQ75831.1, CCQ78091.1, CCQ93018.1, CCU72638.1, CCU78374.1, CCW39409.1, CCW41577.1, CCX50886.1, CCY14614.1, CCY42897.1, CCZ62161.1, CDA15003.1, CDA52084.1, CDA72501.1, CDB26702.1, CDB29308.1, CDB98427.1, CDC38734.1, CDC50443.1, CDC67800.1, CDD54041.1, CDD59790.1, CDD98976.1, CDE06407.1, CDE11996.1, CDE34087.1, CDE80446.1, CDF15829.1, CDF27765.1, EDY82084.1, EEG33491.1, EEL61422.1, EEL61569.1, EEL61570.1, EEL61625.1, EEM13962.1, EEM56162.1, EEV24884.1, EEV89053.1, EFB90882.1, EFC91099.1, EFI35153.1, EFV34597.1, EGA91855.1, EGA93920.1, EGB16324.1, EGB94720.1, EGC76281.1, EGD26423.1, EGD49243.1, EGE48067.1, EGJ10200.1, EGJ38118.1, EGK58601.1, EGN35864.1, EGT75762.1, EGT79804.1, EGT80243.1, EGV28564.1, EGV37198.1, EGW49963.1, EGW53124.1, EGX28855.1, EGX72599.1, EGY31355.1, EGY32746.1, EGY34247.1, EGY35534.1, EGY38197.1, EGY39516.1, EGY39870.1, EGY41444.1, EGY43831.1, EGY43832.1, EGY46703.1, EGY61572.1, EGY70645.1, EGY70862.1, EGZ49814.1, EHB62324.1, EHF02461.1, EHG19005.1, EHG23345.1, EHK89720.1, EHK89932.1, EHM10678.1, EHM13738.1, EHO85751.1, EHP86557.1, EHQ07662.1, EHQ90702.1, EIA23997.1, EIA26370.1, EIA26757.1, EIA28591.1, EIA30744.1, EIC02343.1, EIC21112.1, EIG54630.1, EIJ33766.1, EIL98037.1, EIM57403.1, EIQ00068.1, EIT84253.1, EIW20396.1, EIW25545.1, EIW30556.1, EIW33392.1, EIW37239.1, EJG08366.1, EJL40222.1, EJS99961.1, EJW17221.1, EKD37966.1, EKE30553.1, EKF36599.1, EKM99104.1, EKP95536.1, EKT63592.1, ELK39521.1, ELQ17185.1, ELR65962.1, ELT58108.1, ELT59490.1, EMB14047.1, EME03981.1, EMI28183.1, EMI57443.1, EMS72154.1, ENO77319.1, EPE60578.1, EPR34124.1, EPR43458.1, EPY00288.1, ERK89619.1, ETD02080.1, ETD77754.1, ETD86665.1, ETE54112.1, ETE90143.1, ETE90144.1, GAE10005.1, GAF06946.1, WP_000462625.1, WP_000467673.1, WP_001167480.1, WP_002063064.1, WP_002063097.1, WP_002063098.1, WP_002166872.1, WP_002182191.1, WP_002183179.1, WP_002725662.1, WP_003345765.1, WP_003465419.1, WP_003504657.1, WP_004260238.1, WP_004625408.1, WP_005487700.1, WP_005540837.1, WP_005563374.1, WP_005565165.1, WP_005567428.1, WP_005582660.1, WP_005635207.1, WP_005660281.1, WP_005758893.1, WP_005876727.1, WP_005966189.1, WP_006116164.1, WP_006475674.1, WP_006903557.1, WP_007042345.1, WP_007294885.1, WP_007427673.1, WP_007439946.1, WP_007465282.1, WP_007524600.1, WP_007931217.1, WP_008224253.1, WP_008387837.1, WP_008494663.1, WP_008664697.1, WP_008675255.1, WP_008709260.1, WP_008910923.1, WP_009151515.1, WP_009796706.1, WP_010357662.1, WP_010543171.1, WP_010621279.1, WP_011194447.1, WP_011237670.1, WP_011315191.1, WP_011362034.1, WP_011388586.1, WP_011418637.1, WP_011466166.1, WP_011529385.1, WP_011715063.1, WP_011959007.1, WP_012033147.1, WP_012073024.1, WP_012222308.1, WP_012488051.1, WP_012553888.1, WP_012648484.1, WP_012817719.1, WP_013013750.1, WP_013067034.1, WP_013071005.1, WP_013159708.1, WP_013175710.1, WP_013384680.1, WP_013502810.1, WP_013624120.1, WP_013759292.1, WP_013945608.1, WP_013987428.1, WP_014076067.1, WP_014147834.1, WP_014148633.1, WP_014167735.1, WP_014481879.1, WP_014481880.1, WP_014481881.1, WP_014808677.1, WP_014840104.1, WP_015099452.1, WP_015164991.1, WP_015405726.1, WP_015423229.1, WP_015432826.1, WP_015487356.1, WP_015517330.1, WP_015525790.1, WP_015558734.1, WP_015565152.1, WP_015567096.1, WP_015572966.1, WP_015604457.1, WP_015817183.1, WP_016480399.1, WP_016502589.1, WP_016566412.1, WP_018276375.1, WP_018289542.1, WP_018465585.1, WP_019271084.1, WP_019403925.1, WP_019604445.1, WP_020880189.1, WP_020886852.1, WP_021133648.1, WP_021906522.1, WP_021932605.1, WP_022033513.1, WP_022074734.1, WP_022108015.1, WP_022127778.1, WP_022177037.1, WP_022180176.1, WP_022228954.1, WP_022264215.1, WP_022272156.1, WP_022287597.1, WP_022356884.1, WP_022363357.1, WP_022400170.1, WP_022402826.1, WP_022410983.1, WP_022427820.1, WP_022475428.1, WP_022506622.1, WP_022513469.1, WP_022659417.1, WP_022681040.1, WP_023514068.1, WP_023786785.1, WP_023921138.1, WP_023967440.1, YP_001112365.1, YP_001130817.1, YP_001278620.1, YP_001319501.1, YP_001344582.1, YP_001790192.1, YP_001812654.1, YP_001915500.1, YP_001956162.1, YP_001982915.1, YP_002122936.1, YP_002276024.1, YP_002436385.1, YP_002458655.1, YP_002538857.1, YP_002800298.1, YP_003006848.1, YP_003074487.1, YP_003182329.1, YP_003192981.1, YP_003227011.1, YP_003262716.1, YP_003377360.1, YP_003398462.1, YP_003507268.1, YP_003512333.1, YP_003527439.1, YP_003640637.1, YP_003686702.1, YP_003702873.1, YP_003705323.1, YP_003802799.1, YP_003807622.1, YP_003873625.1, YP_003964329.1, YP_004090950.1, YP_004104291.1, YP_004109426.1, YP_004162598.1, YP_004194935.1, YP_004236329.1, YP_004265250.1, YP_004271471.1, YP_004271712.1, YP_004294510.1, YP_004414387.1, YP_004440721.1, YP_004442027.1, YP_004496341.1, YP_004513912.1, YP_004544964.1, YP_004621357.1, YP_004673773.1, YP_004698564.1, YP_004771206.1, YP_004834873.1, YP_004839583.1, YP_004858801.1, YP_004916632.1, YP_004917437.1, YP_004931735.1, YP_004949175.1, YP_004969958.1, YP_005053778.1, YP_005063976.1, YP_005147306.1, YP_005169127.1, YP_005569631.1, YP_005569632.1, YP_005569633.1, YP_005569634.1, YP_005569635.1, YP_005569636.1, YP_005704012.1, YP_005795205.1, YP_006047124.1, YP_006250659.1, YP_006285891.1, YP_006287671.1, YP_006445785.1, YP_006465823.1, YP_006720035.1, YP_006815948.1, YP_006905220.1, YP_006933355.1, YP_006950855.1, YP_007036212.1, YP_007096663.1, YP_007102453.1, YP_007214291.1, YP_007250226.1, YP_007296338.1, YP_007469697.1, YP_007548479.1, YP_007682875.1, YP_007773724.1, YP_007783586.1, YP_007829836.1, YP_007837794.1, YP_007840046.1, YP_007841639.1, YP_007848219.1, YP_007881809.1, YP_007894108.1, YP_007899157.1, YP_007922620.1, YP_007947096.1, YP_008086289.1, YP_008117179.1, YP_008866149.1, YP_425919.1, YP_603708.1, YP_747239.1, YP_867413.1, および/または YP_961174.1
【０１３１】
他の実施態様では、Ｉ−Ｄ型ｃａｓ１０ｄ／ｃｓｃ３ポリペプチドは、限定されないが、表１６に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１３２】
表１６．Ｉ−Ｄ型ｃａｓ１０ｄ／ｃｓｃ３ポリペプチドアクセッションナンバー
AAT42592.1, AAY81179.1, ABA23770.1, ABD41580.1, ABK15325.1, ABL78722.1, ABX04869.1, ACB00885.1, ACC81235.1, ACK64599.1, ACK70149.1, ACK85929.1, ACL15520.1, ACL44816.1, ACM59081.1, ACR73139.1, ACS42755.1, ACU99472.1, ACX52862.1, ACX71879.1, ADB86684.1, ADE15986.1, ADL12353.1, ADN17498.1, ADX82113.1, AEF95767.1, AEH06114.1, AEJ60972.1, AEM74230.1, AEN04685.1, AFV12097.1, AFW97300.1, AFY31720.1, AFY33388.1, AFY42101.1, AFY46832.1, AFY52834.1, AFY78761.1, AFY84408.1, AFY85315.1, AFZ00744.1, AFZ09738.1, AFZ11796.1, AFZ33068.1, AFZ37989.1, AFZ42915.1, AFZ57017.1, AGE71797.1, AGE74069.1, AGF53569.1, AGJ62073.1, AGY58207.1, AHE60848.1, AHE97755.1, AHF03469.1, BAB77928.1, BAD01914.1, BAG02893.1, BAM01333.1, CAI49724.1, CAO91121.1, CBK91863.1, CBN54050.1, CCC39328.1, CCH94174.1, CCH99027.1, CCI01087.1, CCI08755.1, CCI14109.1, CCI18602.1, CCI20994.1, CCI26602.1, CCI35031.1, CDF59229.1, CDL45977.1, EAW34720.1, EDX77067.1, EFA70017.1, EFA71317.1, EFA72475.1, EFH90018.1, EFK07866.1, EFO81885.1, EGZ43965.1, EHC10665.1, EIJ32870.1, EKV02087.1, ELR97242.1, ELS48634.1, ELW63880.1, ELY96080.1, ELY97118.1, ELZ94462.1, ELZ96024.1, EMA56573.1, EPF21994.1, EPZ17369.1, ERT08778.1, ERT67946.1, ESA33790.1, GAD53621.1, GAF34918.1, NP_485602.1, NP_942300.1, WP_000498810.1, WP_000498811.1, WP_000498823.1, WP_000498826.1, WP_000498833.1, WP_001313298.1, WP_001343599.1, WP_001351044.1, WP_001369667.1, WP_001372648.1, WP_001379189.1, WP_001380057.1, WP_001382434.1, WP_001409955.1, WP_001410894.1, WP_001413967.1, WP_001419560.1, WP_001424845.1, WP_001433649.1, WP_001544092.1, WP_002706834.1, WP_002742885.1, WP_002755924.1, WP_002762263.1, WP_002766201.1, WP_002778662.1, WP_002784663.1, WP_002788625.1, WP_002791884.1, WP_002797933.1, WP_002800251.1, WP_005371068.1, WP_006099180.1, WP_006111345.1, WP_006275556.1, WP_006277053.1, WP_006423429.1, WP_006516472.1, WP_006529931.1, WP_006560838.1, WP_006600197.1, WP_006647394.1, WP_006651365.1, WP_006788289.1, WP_007274330.1, WP_007353277.1, WP_007736985.1, WP_007907034.1, WP_009343568.1, WP_009458810.1, WP_009555193.1, WP_009786737.1, WP_010995731.1, WP_011153681.1, WP_011176808.1, WP_011278681.1, WP_011320852.1, WP_011323345.1, WP_011448844.1, WP_011696704.1, WP_011752987.1, WP_012189772.1, WP_012266046.1, WP_012308500.1, WP_012409229.1, WP_012593876.1, WP_012599092.1, WP_012616839.1, WP_012627889.1, WP_012660273.1, WP_012744509.1, WP_012819425.1, WP_012952622.1, WP_013033838.1, WP_013277799.1, WP_013334248.1, WP_013798376.1, WP_013866300.1, WP_014042852.1, WP_014050466.1, WP_014101101.1, WP_014434559.1, WP_014512278.1, WP_014555212.1, WP_014624350.1, WP_015050974.1, WP_015081721.1, WP_015112327.1, WP_015116412.1, WP_015127542.1, WP_015129198.1, WP_015137288.1, WP_015145060.1, WP_015151025.1, WP_015151920.1, WP_015178944.1, WP_015190935.1, WP_015197391.1, WP_015201918.1, WP_015211902.1, WP_015213666.1, WP_015224793.1, WP_015580875.1, WP_015739739.1, WP_015783165.1, WP_015857614.1, WP_015952816.1, WP_016515572.1, WP_016863180.1, WP_016865349.1, WP_016949545.1, WP_017306101.1, WP_017311493.1, WP_017323373.1, WP_017326894.1, WP_017652462.1, WP_017659640.1, WP_017662195.1, WP_017662202.1, WP_017714173.1, WP_017720463.1, WP_017740219.1, WP_017750003.1, WP_018034883.1, WP_018084460.1, WP_018398405.1, WP_018399542.1, WP_018632664.1, WP_018666493.1, WP_019490247.1, WP_019503800.1, WP_020200336.1, WP_020221133.1, WP_020505200.1, WP_020560715.1, WP_021247655.1, WP_021547740.1, WP_021572945.1, WP_022738936.1, WP_023051696.1, WP_023065124.1, WP_023075355.1, WP_023173331.1, WP_024191264.1, WP_024261066.1, YP_001544997.1, YP_001658085.1, YP_001736140.1, YP_001866178.1, YP_002370755.1, YP_002377017.1, YP_002423857.1, YP_002465243.1, YP_002483177.1, YP_002567678.1, YP_002939660.1, YP_002966032.1, YP_003136308.1, YP_003239712.1, YP_003246361.1, YP_003419054.1, YP_003528373.1, YP_003827418.1, YP_003899564.1, YP_004483832.1, YP_004575892.1, YP_004799207.1, YP_004807058.1, YP_004863880.1, YP_005443230.1, YP_005645327.1, YP_005839103.1, YP_006044689.1, YP_006920596.1, YP_006998407.1, YP_007049251.1, YP_007053381.1, YP_007064554.1, YP_007066222.1, YP_007074429.1, YP_007082318.1, YP_007088328.1, YP_007089235.1, YP_007118154.1, YP_007130228.1, YP_007136716.1, YP_007141306.1, YP_007151360.1, YP_007155927.1, YP_007167129.1, YP_007434945.1, YP_007437217.1, YP_007452953.1, YP_007773977.1, YP_007865076.1, YP_008711914.1, YP_022785.1, YP_256472.1, YP_324665.1, YP_327280.1, YP_503299.1, YP_843965.1, および/または YP_920725.1
【０１３３】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｄ型ｃｓｃ２ポリペプチドは、限定されないが、表１７に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１３４】
表１７．Ｉ−Ｄ型ｃｓｃ２ポリペプチドアクセッションナンバー
AAT42592.1, AAY81179.1, ABA23770.1, ABD41580.1, ABK15325.1, ABL78722.1, ABX04869.1, ACB00885.1, ACC81235.1, ACK64599.1, ACK70149.1, ACK85929.1, ACL15520.1, ACL44816.1, ACM59081.1, ACR73139.1, ACS42755.1, ACU99472.1, ACX52862.1, ACX71879.1, ADB86684.1, ADE15986.1, ADL12353.1, ADN17498.1, ADX82113.1, AEF95767.1, AEH06114.1, AEJ60972.1, AEM74230.1, AEN04685.1, AFV12097.1, AFW97300.1, AFY31720.1, AFY33388.1, AFY42101.1, AFY46832.1, AFY52834.1, AFY78761.1, AFY84408.1, AFY85315.1, AFZ00744.1, AFZ09738.1, AFZ11796.1, AFZ33068.1, AFZ37989.1, AFZ42915.1, AFZ57017.1, AGE71797.1, AGE74069.1, AGF53569.1, AGJ62073.1, AGY58207.1, AHE60848.1, AHE97755.1, AHF03469.1, BAB77928.1, BAD01914.1, BAG02893.1, BAM01333.1, CAI49724.1, CAO91121.1, CBK91863.1, CBN54050.1, CCC39328.1, CCH94174.1, CCH99027.1, CCI01087.1, CCI08755.1, CCI14109.1, CCI18602.1, CCI20994.1, CCI26602.1, CCI35031.1, CDF59229.1, CDL45977.1, EAW34720.1, EDX77067.1, EFA70017.1, EFA71317.1, EFA72475.1, EFH90018.1, EFK07866.1, EFO81885.1, EGZ43965.1, EHC10665.1, EIJ32870.1, EKV02087.1, ELR97242.1, ELS48634.1, ELW63880.1, ELY96080.1, ELY97118.1, ELZ94462.1, ELZ96024.1, EMA56573.1, EPF21994.1, EPZ17369.1, ERT08778.1, ERT67946.1, ESA33790.1, GAD53621.1, GAF34918.1, NP_485602.1, NP_942300.1 WP_000498810.1, WP_000498811.1, WP_000498823.1, WP_000498826.1, WP_000498833.1, WP_001313298.1, WP_001343599.1, WP_001351044.1, WP_001369667.1, WP_001372648.1, WP_001379189.1, WP_001380057.1, WP_001382434.1, WP_001409955.1, WP_001410894.1, WP_001413967.1, WP_001419560.1, WP_001424845.1, WP_001433649.1, WP_001544092.1, WP_002706834.1, WP_002742885.1, WP_002755924.1, WP_002762263.1, WP_002766201.1, WP_002778662.1, WP_002784663.1, WP_002788625.1, WP_002791884.1, WP_002797933.1, WP_002800251.1, WP_005371068.1, WP_006099180.1, WP_006111345.1, WP_006275556.1, WP_006277053.1, WP_006423429.1, WP_006516472.1, WP_006529931.1, WP_006560838.1, WP_006600197.1, WP_006647394.1, WP_006651365.1, WP_006788289.1, WP_007274330.1, WP_007353277.1, WP_007736985.1, WP_007907034.1, WP_009343568.1, WP_009458810.1, WP_009555193.1, WP_009786737.1, WP_010995731.1, WP_011153681.1, WP_011176808.1, WP_011278681.1, WP_011320852.1, WP_011323345.1, WP_011448844.1, WP_011696704.1, WP_011752987.1, WP_012189772.1, WP_012266046.1, WP_012308500.1, WP_012409229.1, WP_012593876.1, WP_012599092.1, WP_012616839.1, WP_012627889.1, WP_012660273.1, WP_012744509.1, WP_012819425.1, WP_012952622.1, WP_013033838.1, WP_013277799.1, WP_013334248.1, WP_013798376.1, WP_013866300.1, WP_014042852.1, WP_014050466.1, WP_014101101.1, WP_014434559.1, WP_014512278.1, WP_014555212.1, WP_014624350.1, WP_015050974.1, WP_015081721.1, WP_015112327.1, WP_015116412.1, WP_015127542.1, WP_015129198.1, WP_015137288.1, WP_015145060.1, WP_015151025.1, WP_015151920.1, WP_015178944.1, WP_015190935.1, WP_015197391.1, WP_015201918.1, WP_015211902.1, WP_015213666.1, WP_015224793.1, WP_015580875.1, WP_015739739.1, WP_015783165.1, WP_015857614.1, WP_015952816.1, WP_016515572.1, WP_016863180.1, WP_016865349.1, WP_016949545.1, WP_017306101.1, WP_017311493.1, WP_017323373.1, WP_017326894.1, WP_017652462.1, WP_017659640.1, WP_017662195.1, WP_017662202.1, WP_017714173.1, WP_017720463.1, WP_017740219.1, WP_017750003.1, WP_018034883.1, WP_018084460.1, WP_018398405.1, WP_018399542.1, WP_018632664.1, WP_018666493.1, WP_019490247.1, WP_019503800.1, WP_020200336.1, WP_020221133.1, WP_020505200.1, WP_020560715.1, WP_021247655.1, WP_021547740.1, WP_021572945.1, WP_022738936.1, WP_023051696.1, WP_023065124.1, WP_023075355.1, WP_023173331.1, WP_024191264.1, WP_024261066.1, YP_001544997.1, YP_001658085.1, YP_001736140.1, YP_001866178.1, YP_002370755.1, YP_002377017.1, YP_002423857.1, YP_002465243.1, YP_002483177.1, YP_002567678.1, YP_002939660.1,  YP_002966032.1, YP_003136308.1, YP_003239712.1, YP_003246361.1, YP_003419054.1, YP_003528373.1, YP_003827418.1, YP_003899564.1, YP_004483832.1, YP_004575892.1, YP_004799207.1, YP_004807058.1, YP_004863880.1, YP_005443230.1, YP_005645327.1, YP_005839103.1, YP_006044689.1, YP_006920596.1, YP_006998407.1, YP_007049251.1, YP_007053381.1, YP_007064554.1, YP_007066222.1, YP_007074429.1, YP_007082318.1, YP_007088328.1, YP_007089235.1, YP_007118154.1, YP_007130228.1, YP_007136716.1, YP_007141306.1, YP_007151360.1, YP_007155927.1, YP_007167129.1, YP_007434945.1, YP_007437217.1, YP_007452953.1 YP_007773977.1, YP_007865076.1, YP_008711914.1, YP_022785.1, YP_256472.1, YP_324665.1, YP_327280.1, YP_503299.1, YP_843965.1, および/または YP_920725.1
【０１３５】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｄ型ｃｓｃ１ポリペプチドは、限定されないが、表１８に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１３６】
表１８．Ｉ−Ｄ型ｃｓｃ１ポリペプチドアクセッションナンバー
AAT42591.1, AAY81178.1, ABA23771.1, ABD41579.1, ABK15326.1, ABL78721.1, ABX04870.1, ACB00884.1, ACC81234.1, ACK64598.1, ACK70150.1, ACL15521.1, ACL44817.1, ACM59082.1, ACU99471.1, ACX71878.1, ADB86683.1, ADL12354.1, ADN17497.1, ADX82112.1, AEF95768.1, AEH06113.1, AEM74229.1, AEN04684.1, AFW97299.1, AFY31719.1, AFY33387.1, AFY42100.1, AFY46831.1, AFY52835.1, AFY78762.1, AFY84407.1, AFY85316.1, AFZ00745.1, AFZ09739.1, AFZ11797.1, AFZ19098.1, AFZ27301.1, AFZ33069.1, AFZ37988.1, AFZ42914.1, AFZ57016.1, AGD98072.1, AGE71796.1, AGE74068.1, AGF53570.1, AGJ62072.1, AGY58208.1, BAB77929.1, BAD01915.1, BAG02894.1, CAI49725.1, CAO91122.1, CBN54051.1, CCC39329.1, CCH94173.1, CCH99028.1, CCI01088.1, CCI08756.1, CCI14108.1, CCI18601.1, CCI20996.1, CCI26604.1, CCI35030.1, CDF59228.1, EAW34719.1, EDX73941.1, EDX77236.1, EFA70018.1, EFA71316.1, EFA72474.1, EFH90017.1, EFO81886.1, EGG83583.1, EHC10666.1, EKQ70618.1, EKV02088.1, ELR97241.1, ELS48633.1, ELY96081.1, ELY97117.1, ELZ94461.1, ELZ96025.1, EMA56572.1, EPF21993.1, ERT08676.1, ESA33791.1, GAD53620.1, NP_485603.1, NP_942301.1, WP_002742884.1, WP_002755922.1, WP_002762264.1, WP_002766203.1, WP_002784661.1, WP_002788624.1, WP_002791885.1, WP_003447113.1, WP_006099350.1, WP_006102703.1, WP_006111344.1, WP_006275555.1, WP_006277054.1, WP_006516473.1, WP_006529930.1, WP_006560839.1, WP_006600196.1, WP_006651366.1, WP_007274331.1, WP_007353278.1, WP_007736984.1, WP_007907033.1, WP_009343567.1, WP_009458811.1, WP_009555192.1, WP_009757367.1, WP_009786736.1, WP_010219108.1, WP_010656181.1, WP_010995732.1, WP_011153682.1, WP_011176807.1, WP_011278680.1, WP_011320853.1, WP_011323346.1, WP_011448843.1, WP_011696705.1, WP_011752986.1, WP_012189773.1, WP_012266047.1, WP_012308499.1, WP_012409228.1, WP_012593875.1, WP_012599093.1, WP_012616840.1, WP_012627890.1, WP_012660274.1, WP_012819424.1, WP_012952621.1, WP_013277800.1, WP_013334247.1, WP_013798377.1, WP_013866299.1, WP_014042851.1, WP_014050465.1, WP_014512277.1, WP_014555213.1, WP_015081720.1, WP_015112326.1, WP_015116413.1, WP_015127541.1, WP_015129197.1, WP_015137287.1, WP_015145061.1, WP_015151024.1, WP_015151921.1, WP_015178945.1, WP_015183241.1, WP_015190936.1, WP_015197392.1, WP_015201919.1, WP_015210536.1, WP_015211901.1, WP_015213665.1, WP_015224792.1, WP_015370562.1, WP_015580874.1, WP_015783164.1, WP_016515571.1, WP_016863181.1, WP_016865350.1, WP_016872951.1, WP_016949544.1, WP_017306100.1, WP_017311494.1, WP_017323374.1, WP_017326893.1, WP_017652461.1, WP_017659641.1, WP_017662197.1, WP_017662203.1, WP_017714174.1, WP_017720462.1, WP_017740218.1, WP_017750004.1, WP_018034884.1, WP_018084461.1, WP_018398406.1, WP_018399543.1, WP_018666491.1, WP_019490248.1, WP_019503801.1, WP_020200335.1, WP_020221134.1, WP_022738938.1, WP_023065022.1, WP_023075356.1, WP_023173332.1, YP_001544998.1, YP_001658086.1, YP_001736139.1, YP_001866177.1, YP_002370754.1, YP_002377018.1, YP_002465244.1, YP_002483178.1, YP_002567679.1, YP_003136307.1, YP_003246360.1, YP_003419053.1, YP_003827419.1, YP_003899563.1, YP_004483833.1, YP_004575891.1, YP_004799206.1, YP_004807057.1, YP_005645326.1, YP_005839104.1, YP_006998406.1, YP_007049250.1, YP_007053382.1, YP_007064553.1, YP_007066221.1, YP_007074428.1, YP_007082319.1, YP_007088327.1, YP_007089236.1, YP_007118155.1, YP_007122504.1, YP_007130229.1, YP_007136717.1, YP_007141307.1, YP_007149981.1, YP_007151359.1, YP_007155926.1, YP_007167128.1, YP_007391825.1, YP_007434944.1, YP_007437216.1, YP_007452954.1, YP_007865075.1, YP_008711915.1, YP_022784.1, YP_256471.1, YP_324666.1, YP_327281.1, YP_503298.1, YP_843966.1, YP_920724.1
【０１３７】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｄ型ｃａｓ６ｄポリペプチドは、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＹＰ＿５０３３０１．１、および／またはＹＰ＿３２７２７８．１を含む。
【０１３８】
他の実施態様では、Ｉ−Ｅ型ｃｓｅ１／ｃａｓＡポリペプチドは、限定されないが、表１９に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１３９】
表１９．Ｉ−Ｅ型ｃｓｅ１／ｃａｓＡポリペプチドアクセッションナンバー
AAC75802.1, AAR34761.1, ABA88210.1, ACL06607.1, ADB13717.1, ADI84212.1, ADP38753.1, ADR37700.1, ADY27677.1, AEB06539.1, AEB11721.1, AEB71776.1, AEC02347.1, AEJ53445.1, AFH39942.1, AFL72519.1, AFM27182.1, AFR99214.1, AFV75987.1, AGB27118.1, AGQ58154.1, AGQ66822.1, AGQ74241.1, AGQ78969.1, AGQ87241.1, AGS64000.1, AGW09894.1, AGX11571.1, AGX34769.1, AHB45480.1, AHB94781.1, CCK86079.1, CCX87057.1, EDN80091.1, EDP20981.1, EEB22224.1, EEB34860.1, EEH65617.1, EEI14200.1, EEI27966.1, EEI78888.1, EEI86603.1, EEP20787.1, EET77376.1, EEW16905.1, EEW42244.1, EEW53942.1, EEX47611.1, EEZ61815.1, EFA23032.1, EFB87472.1, EFB90862.1, EFD84089.1, EFD93805.1, EFE06764.1, EFF79646.1, EFH10702.1, EFI89986.1, EFJ64185.1, EFJ75314.1, EFJ78692.1, EFJ85026.1, EFJ97185.1, EFK01968.1, EFK08613.1, EFK13801.1, EFK21927.1, EFK32764.1, EFK39592.1, EFK47880.1, EFK52819.1, EFK65277.1, EFK74802.1, EFL93068.1, EFM24727.1, EFM43106.1, EFO58465.1, EFO71177.1, EFQ06779.1, EFQ22973.1, EFQ47738.1, EFQ49137.1, EFQ52099.1, 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WP_001084101.1, WP_001084102.1, WP_001084104.1, WP_001084105.1, WP_001084106.1, WP_001084109.1, WP_001084110.1, WP_001084111.1, WP_001084112.1, WP_001084113.1, WP_001084115.1, WP_001084116.1, WP_001084117.1, WP_001242694.1, WP_001304057.1, WP_001307969.1, WP_001313216.1, WP_001315810.1, WP_001317281.1, WP_001325175.1, WP_001326095.1, WP_001331425.1, WP_001343650.1, WP_001347282.1, WP_001347764.1, WP_001348410.1, WP_001380031.1, WP_001382398.1, WP_001383465.1, WP_001387009.1, WP_001395991.1, WP_001416300.1, WP_001437794.1, WP_001522848.1, WP_001564555.1, WP_002431961.1, WP_002514606.1, WP_002520770.1, WP_002546992.1, WP_002549141.1, WP_003088905.1, WP_004074401.1, WP_004106702.1, WP_004109011.1, WP_004112666.1, WP_004115350.1, WP_004118009.1, WP_004125152.1, WP_004127864.1, WP_004132146.1, WP_004136185.1, WP_004138497.1, WP_004142783.1, WP_004574565.1, WP_004809665.1, WP_004826834.1, WP_004835170.1, WP_005000855.1, WP_005154891.1, WP_006302702.1, WP_006687055.1, WP_006733195.1, WP_006734900.1, WP_006735514.1, WP_006736346.1, WP_008087876.1, WP_008534586.1, WP_008806236.1, WP_008864956.1, WP_009308515.1, WP_009310573.1, WP_009344934.1, WP_009369774.1, WP_009428278.1, WP_009486039.1, WP_009535625.1, WP_009994024.1, WP_012311912.1, WP_012602053.1, WP_01260
2845.1, WP_012907164.1, WP_012914171.1, WP_012997655.1, WP_013990632.1, WP_014633160.1, WP_014839378.1, WP_016637266.1, WP_016838859.1, WP_019077566.1, WP_019842415.1, WP_020759633.1, WP_020761306.1, WP_020839112.1, WP_020899160.1, WP_020973664.1, WP_021600846.1, WP_021604023.1, WP_021604906.1, WP_021610204.1, WP_021610630.1, WP_021613844.1, WP_021673649.1, WP_021676129.1, WP_021682641.1, WP_021868373.1, WP_022630987.1, WP_023141767.1, WP_023147142.1, WP_023147143.1, WP_023154950.1, WP_023156410.1, WP_023890965.1, WP_024143394.1, WP_024154924.1, WP_024156644.1, WP_024218900.1, WP_024226281.1, WP_024229045.1, WP_024229851.1, WP_024255404.1, WP_024258205.1, YP_003373984.1, YP_004049620.1, YP_004264312.1, YP_004367831.1, YP_004372354.1, YP_004411729.1, YP_006059728.1, YP_006068308.1, YP_006412644.1, YP_006449446.1, YP_006716675.1, YP_006724797.1, YP_006890377.1, YP_006972084.1, YP_007277148.1, YP_008252271.1, YP_008253880.1, YP_008262077.1, YP_008267148.1, YP_008307439.1, YP_008382200.1, YP_008565875.1, YP_008614581.1, および/または YP_008862373.1.
【０１４０】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｅ型ｃｓｅ２／ｃａｓＢポリペプチドは、限定されないが、表２０に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１４１】
表２０．Ｉ−Ｅ型ｃｓｅ２／ｃａｓＢポリペプチドアクセッションナンバー
AAC75801.1, AAR34762.1, ABA88211.1, ACL06608.1, ADB14225.1, ADI84213.1, ADP38754.1, ADR37699.1, ADY27680.1, AEB06540.1, AEB11722.1, AEB71777.1, AEC02348.1, AFH39943.1, AFL72520.1, AFM27183.1, AFR99215.1, AFV75988.1, AGB27117.1, AGX34768.1, CCI86099.1, CCK86080.1, CCX87058.1, EDN80089.1, EDP20980.1, EEB22225.1, EEH65616.1, EEI14201.1, EEI27967.1, EEI78889.1, EEI86602.1, EEJ54448.1, EEP20786.1, EET77375.1, EEW16906.1, EEW42243.1, EEW53943.1, EEX47612.1, EFA23033.1, EFB87473.1, EFB90861.1, EFD84088.1, EFD93804.1, EFE06765.1, EFF79645.1, EFH10701.1, EFI89987.1, EFJ64186.1, EFJ75315.1, EFJ78691.1, EFJ85027.1, EFJ97184.1, EFK01967.1, EFK08585.1, EFK13800.1, EFK21928.1, EFK32765.1, EFK39599.1, EFK47879.1, EFK52820.1, EFK65276.1, EFK74803.1, EFL93067.1, EFM24726.1, EFM43105.1, EFM50100.1, EFO58464.1, EFO71164.1, EFQ06780.1, EFQ22974.1, EFQ47715.1, EFQ49115.1, EFQ52080.1, EFQ53859.1, EFS88257.1, EFT11291.1, EFT25767.1, EFT64289.1, EFT66653.1, EFU34516.1, EFU63289.1, EFU77567.1, EFV94306.1, EFX55035.1, EGB85503.1, EGC81860.1, EGE70489.1, EGF23575.1, EGF57390.1, EGF60538.1, EGG33809.1, EGG50905.1, EGJ06275.1, EGL13349.1, EGL37879.1, EGR97358.1, EGS35782.1, EHI70394.1, EHI77349.1, EHM12585.1, EHO49964.1, EHQ05137.1, EIC19434.1, EIC29372.1, EIC80106.1, EIC97113.1, EIE98891.1, EIG78925.1, EIG93140.1, EIH01730.1, EIH21868.1, EIH32984.1, EIH43940.1, EIH56207.1, EIH65347.1, EIH76747.1, EIH89338.1, EIH99538.1, EII13012.1, EII24837.1, EII35012.1, EII46332.1, EII56124.1, EIJ03341.1, EIJ15160.1, EIM64764.1, EIN19762.1, EIN21472.1, EIN21899.1, EIN36943.1, EIN38052.1, EIN40215.1, EIN52180.1, EIN55482.1, EIN58776.1, EIN69732.1, EIN73810.1, EIN74348.1, EIN86302.1, EIN93752.1, EIN95379.1, EIN98707.1, EIO11869.1, EIO12466.1, EIO15243.1, EIO26601.1, EIO35234.1, EIO35906.1, EIO36689.1, EIO56007.1, EIO56621.1, EIO62658.1, EIO70785.1, EIO73007.1, EIO81613.1, EIO90645.1, EIO93917.1, EIO95544.1, EIP08614.1, EIP08988.1, EIP12992.1, EIP22621.1, EIP26481.1, EIP31382.1, EIP38348.1, EIP43352.1, EIP51902.1, EIP54292.1, EIP58366.1, EIP65857.1, EIP76256.1, EIP77688.1, EIV92933.1, EJF13177.1, EJP19891.1, EKG98244.1, EKH00136.1, EKH03276.1, EKH12297.1, EKH15515.1, EKH23466.1, EKH29554.1, EKH35393.1, EKH39835.1, EKH45718.1, EKH51233.1, EKH56805.1, EKH66296.1, EKH68787.1, EKH74465.1, EKH82250.1, EKH86928.1, EKH99478.1, EKI05872.1, EKI36918.1, EKI40771.1, EKI49527.1, EKI60205.1, EKI64088.1, EKI68327.1, EKI75985.1, EKI79309.1, EKI85619.1, EKI93320.1, EKI96029.1, EKJ04228.1, EKJ08782.1, EKJ13732.1, EKJ23836.1, EKJ24258.1, EKJ33911.1, EKJ39700.1, EKJ41366.1, EKJ50582.1, EKJ56866.1, EKJ59592.1, EKK25397.1, EKK25898.1, EKK26847.1, EKK43172.1, EKK53358.1, EKK55961.1, EKK65124.1, EKK69920.1, EKK73970.1, EKK84921.1, EKO32514.1, EKO79167.1, EKP14479.1, EKQ92379.1, EKQ99402.1, EKR90051.1, EKS02270.1, EKS09451.1, EKV73579.1, EKV75705.1, EKV77179.1, EKV89036.1, EKV91970.1, EKV95739.1, EKW07859.1, EKW08359.1, EKW11944.1, EKW25814.1, EKW26224.1, EKW29159.1, EKW40128.1, EKW42671.1, EKW46450.1, 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ERE02667.1, ERE13279.1, ERE16915.1, ERE25906.1, ERE27663.1, ERE32313.1, ERE40208.1, ERH14164.1, ERH14496.1, ERH20458.1, ERH21169.1, ERH32725.1, ERJ75892.1, ERJ83445.1, ERJ96447.1, ERT63128.1, ESA60138.1, ESA65715.1, ESA72995.1, ESA77457.1, ESA86350.1, ESA88076.1, ESD00139.1, ESD09711.1, ESD21950.1, ESD26437.1, ESD31841.1, ESD51510.1, ESD61896.1, ESD64309.1, ESD71330.1, ESD80443.1, ESD81867.1, ESD83159.1, ESE11367.1, ESK58509.1, ESS00990.1, ETA02742.1, ETA89352.1, ETJ98129.1, EWM59167.1, GAD17057.1, NP_417239.1, NP_952439.1, P76632.1, WP_000893379.1, WP_000893380.1, WP_000893381.1, WP_002514607.1, WP_002549205.1, WP_002887565.1, WP_003088903.1, WP_003611352.1, WP_003619871.1, WP_003711530.1, WP_004074400.1, WP_004106700.1, WP_004109007.1, WP_004112668.1, WP_004125154.1, WP_004127867.1, WP_004132148.1, WP_004136186.1, WP_004138509.1, WP_004167284.1, WP_004809666.1, WP_004826833.1, WP_004835154.1, WP_005371168.1, WP_005524431.1, WP_006002099.1, WP_006302703.1, WP_006733185.1, 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【０１４２】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｅ型ｃａｓ７／ｃａｓＣポリペプチドは、限定されないが、表２１に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１４３】
表２１．Ｉ−Ｅ型ｃａｓ７／ｃａｓＣポリペプチドアクセッションナンバー
AAC75800.1, ACL06610.1, ADB14459.1, ADP38755.1, ADR37698.1, AEB06541.1, AEC02350.1, AEJ53443.1, AFL73107.1, AFR99216.1, AGB27116.1, AGX34767.1, CCK86081.1, EDP20979.1, EEB22226.1, EEB34863.1, EEI14202.1, EEI27968.1, EEI64035.1, EEI78890.1, EEI86601.1, EEJ54447.1, EEP20785.1, EEW53944.1, EEW67653.1, EEX47613.1, EEZ61813.1, EFA23034.1, EFB87474.1, EFB90860.1, EFD93803.1, EFJ75316.1, EFJ78690.1, EFJ85028.1, EFJ97183.1, EFK01966.1, EFK08565.1, EFK21929.1, EFK32762.1, EFK39561.1, EFK47877.1, EFK52821.1, EFK65275.1, EFK66367.1, EFK74804.1, EFM24725.1, EFM43104.1, EFM49873.1, EFO58462.1, EFQ06781.1, EFQ52086.1, EFQ53854.1, EFS88258.1, EFT11290.1, EFT25768.1, EFT64290.1, EFT66654.1, EFU34515.1, EFU63290.1, EFU77568.1, EFX55036.1, EFY49863.1, EGB85504.1, EGC81779.1, EGE70490.1, EGF23576.1, EGJ06276.1, EGL13344.1, EGL37416.1, EGS35793.1, EHE85276.1, EHI77350.1, EHM12586.1, EHO49965.1, EIE98890.1, EIM64762.1, EIV92932.1, EKX65601.1, EKX91277.1, EMH94975.1, EMR53800.1, EPI42422.1, EPI44035.1, EPI53339.1, EPI53370.1, EPI56334.1, EPI57190.1, EPI61101.1, EPI61156.1, EPI62384.1, EPI66849.1, ERH20069.1, ERH32726.1, ERJ75891.1, ERJ83446.1, ERJ96448.1, ESA60139.1, ESA65716.1, ESA72994.1, ESA77458.1, ESA86351.1, ESA88075.1, ESD00138.1, ESD09710.1, ESD21949.1, ESD26438.1, ESD31840.1, ESD51511.1, ESD61897.1, ESD64310.1, ESD64368.1, ESD71329.1, ESD80444.1, ESD81868.1, ESD83160.1, ESE11366.1, ESK58510.1, ETA89351.1, ETE08829.1, ETE36803.1, ETS24673.1, EWM59166.1, GAD17058.1, GAD17059.1, NP_417238.1, Q46899.1, WP_000064439.1, WP_000064440.1, WP_000064441.1, WP_000064442.1, WP_000064443.1, WP_000064444.1, WP_000064446.1, WP_000064447.1, WP_000064448.1, WP_000064450.1, WP_000064451.1, WP_000210566.1, WP_000210567.1, WP_000210568.1, WP_002268123.1, WP_002438041.1, WP_002514608.1, WP_002546993.1, WP_003088900.1, WP_004106698.1, WP_004109003.1, WP_004112670.1, WP_004125156.1, WP_004127870.1, WP_004132150.1, WP_004136188.1, WP_004138505.1, WP_004159615.1, WP_004167285.1, WP_004809667.1, WP_004826832.1, WP_004835077.1, WP_005004478.1, WP_005920816.1, WP_005942576.1, WP_006002098.1, WP_006302704.1, WP_006422698.1, WP_006591781.1, WP_006736340.1, WP_007594588.1, WP_008087838.1, WP_008534589.1, WP_008750295.1, WP_008902366.1, WP_009314426.1, WP_009344897.1, WP_009369771.1, WP_009429036.1, WP_009533382.1, WP_009535623.1, WP_009663589.1, WP_009755578.1, WP_012289871.1, WP_012667164.1, WP_012914173.1, WP_012997657.1, WP_013977922.1, WP_013990630.1, WP_014542122.1, WP_014633159.1, WP_016637268.1, WP_016838863.1, WP_020281498.1, WP_020281499.1, WP_020759631.1, WP_020761304.1, WP_020973662.1, WP_021600848.1, WP_021613846.1, WP_021673647.1, WP_021676131.1, WP_021682643.1, WP_023888110.1, WP_024166819.1, YP_003373986.1, YP_004049618.1, YP_004372356.1, YP_004411732.1, YP_006068306.1, YP_006413232.1, YP_006724799.1, および/または YP_007277146.1
【０１４４】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｅ型ｃａｓ５／ｃａｓＤポリペプチドは、限定されないが、表２２に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１４５】
表２２．Ｉ−Ｅ型ｃａｓ５／ｃａｓＤポリペプチドアクセッションナンバー
AAC75799.2, AAR34764.1, ABA88213.1, ACP32499.1, ADB14481.1, ADI66577.1, ADI84215.1, ADP38756.1, ADR37697.1, ADY27682.1, AEB06542.1, AEB11724.1, AEB71779.1, AEC02351.1, AFH39945.1, AFL72522.1, AFL73106.1, AFM27185.1, AFR99217.1, AFV75990.1, AGB27115.1, AGE37472.1, AGX34766.1, CAQ05926.1, CCI86097.1, CCK86082.1, CDI66081.1, EDN80087.1, EDP20978.1, EEB34864.1, EEH65614.1, EEI27969.1, EEI64036.1, EEI78891.1, EEI86600.1, EEJ54446.1, EEP20784.1, EET77373.1, EEW16908.1, EEW42241.1, EEW53945.1, EEW67652.1, EEX47614.1, EEZ61812.1, EFA23035.1, EFB87475.1, EFB90859.1, EFD84086.1, EFD93802.1, EFE06767.1, EFF79643.1, EFH10699.1, EFI90756.1, EFJ64188.1, EFJ75317.1, EFJ78689.1, EFJ85029.1, EFJ97182.1, EFK01965.1, EFK08634.1, EFK13798.1, EFK21930.1, EFK32759.1, EFK39564.1, EFK47876.1, EFK52822.1, EFK66366.1, EFK74805.1, EFL93065.1, EFM24724.1, EFM49979.1, EFO58461.1, EFQ06782.1, EFQ22977.1, EFQ47702.1, EFQ49119.1, EFQ52096.1, EFS88259.1, EFT11289.1, EFT25769.1, EFT64291.1, EFT66655.1, EFU34514.1, EFU63291.1, EFU77569.1, EFV94308.1, EFX55037.1, EGB85505.1, EGC81843.1, EGE70491.1, EGF23577.1, EGF57388.1, EGF60540.1, EGG33807.1, EGG50907.1, EGJ06277.1, EGL13343.1, EGL38219.1, EGS35926.1, EHI77351.1, EHM12587.1, EHO49966.1, EHQ05135.1, EIC19432.1, EIC29370.1, EIE98889.1, EIM64761.1, EIV92931.1, EKW99768.1, EMH94966.1, EMR53799.1, EPI42423.1, EPI44034.1, EPI53340.1, EPI53369.1, EPI56333.1, EPI57189.1, EPI61102.1, EPI61155.1, EPI62383.1, EPI66848.1, EPI68831.1, EPI71020.1, EPI82118.1, EPI84752.1, EPI87539.1, EPI96742.1, EPJ01392.1, EPJ03481.1, EPJ11329.1, ERH14162.1, ERH14498.1, ERH20070.1, ERH20456.1, ERH21171.1, ERH32727.1, ERJ75890.1, ERJ83447.1, ERJ96449.1, ESA60140.1, ESA65717.1, ESA72993.1, ESA77459.1, ESA86352.1, ESA88074.1, ESD00137.1, ESD09709.1, ESD21948.1, ESD26439.1, ESD31839.1, ESD51512.1, ESD61898.1, ESD64311.1, ESD64369.1, ESD71328.1, ESD80445.1, ESD81869.1, ESD83161.1, ESE11365.1, ESK58511.1, ETA02744.1, ETA89350.1, ETX32969.1, GAD17060.1, NP_417237.2, NP_952441.1, Q46898.2, WP_004106696.1, WP_004109000.1, WP_004112672.1, WP_004115346.1, WP_004125159.1, WP_004127874.1, WP_004136190.1, WP_004138504.1, WP_005524251.1, WP_006302705.1, WP_008864959.1, WP_009429844.1, WP_009550706.1, WP_009994022.1, WP_012914174.1, WP_016637269.1, WP_016838864.1, WP_018637825.1, WP_020281500.1, WP_020759630.1, WP_020761303.1, WP_020973661.1, WP_021600849.1, WP_021604020.1, WP_021604909.1, WP_021610202.1, WP_021610633.1, WP_021613847.1, WP_021673646.1, WP_021676132.1, WP_021682644.1, WP_023140380.1, WP_023156409.1, YP_001801360.1, YP_002834437.1, YP_003373987.1, YP_003718071.1, YP_004049617.1, YP_004264317.1, YP_004367834.1, YP_004372357.1, YP_004411733.1, YP_006059731.1, YP_006412647.1, YP_006413231.1, YP_006449449.1, YP_006716678.1, YP_006724800.1, YP_006890380.1, YP_006972087.1, YP_007277145.1, および/または YP_007417723.1
【０１４６】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｅ型ｃａｓ６ｅ／ｃａｓｅポリペプチドは、限定されないが、表２３に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１４７】
表２３．Ｉ−Ｅ型ｃａｓ６ｅ／ｃａｓｅポリペプチドアクセッションナンバー
AAC75798.1, AAR34765.1, ACL06609.1, ADB14325.1, ADI66576.1, ADI84216.1, ADP38757.1, ADR37696.1, ADY27683.1, AEB06543.1, AEB11725.1, AEB71780.1, AEC02349.1, AFH39946.1, AFL72523.1, AFL73105.1, AFM27186.1, AFR99218.1, AFV75991.1, AGB27114.1, AGX34765.1, CCI86096.1, CCK86083.1, CDC58447.1, CDI66082.1, EDN80086.1, EDP20977.1, EEB22228.1, EEB34862.1, EEI14204.1, EEI27970.1, EEI64037.1, EEI77643.1, EEI78892.1, EEI86599.1, EEJ54450.1, EEP20783.1, EET77372.1, EEW16909.1, EEW42240.1, EEW53946.1, EEW67651.1, EEZ61811.1, EFA23036.1, EFB87476.1, EFD84085.1, EFD93801.1, EFE06768.1, EFF79642.1, EFH10698.1, EFI90757.1, EFJ64189.1, EFJ75318.1, EFJ78688.1, EFJ85030.1, EFJ97190.1, EFK01964.1, EFK08549.1, EFK13797.1, EFK21931.1, EFK32766.1, EFK39594.1, EFK47875.1, EFK52823.1, EFK66365.1, EFK74806.1, EFL93064.1, EFM24723.1, EFM43102.1, EFM50285.1, EFO58460.1, EFO71176.1, EFQ06783.1, EFQ22978.1, EFQ47730.1, EFQ49157.1, EFQ52112.1, EFQ53869.1, EFS88260.1, EFT11288.1, EFT25770.1, EFT64292.1, EFT66656.1, EFU34513.1, EFU63292.1, EFU77570.1, EFV94309.1, EFX55038.1, EGB85506.1, EGC81772.1, EGE70492.1, EGF23578.1, EGF57387.1, EGF60541.1, EGG33808.1, EGG50908.1, EGJ06278.1, EGL13350.1, EGL36080.1, EGS35882.1, EHE85271.1, EHI77352.1, EHQ05134.1, EIC19431.1, EIC29369.1, EIE98888.1, EIM64763.1, EIV92930.1, EKX91280.1, EMH94952.1, EMR53798.1, EPI42424.1, EPI44033.1, EPI52307.1, EPI53368.1, EPI56332.1, EPI57188.1, EPI61103.1, EPI61154.1, EPI62382.1, EPI66847.1, EPI68830.1, EPI71019.1, EPI82117.1, EPI84751.1, EPI87538.1, EPI96741.1, EPJ01391.1, EPJ03480.1, EPJ11328.1, EQC59007.1, EQM55565.1, ERC93626.1, ERH14161.1, ERH14499.1, ERH20071.1, ERH20455.1, ERH21172.1, ERH32728.1, ERJ75889.1, ERJ83448.1, ERJ96450.1, ESA60141.1, ESA65718.1, ESA72992.1, ESA77460.1, ESA86353.1, ESA88073.1, ESD00136.1, ESD09708.1, ESD21947.1, ESD26440.1, ESD31838.1, ESD51513.1, ESD61899.1, ESD64312.1, ESD64370.1, ESD71327.1, ESD80446.1, ESD81870.1, ESD83162.1, ESE11364.1, ESK58512.1, ESS00993.1, ETA02745.1, ETA89349.1, ETX32968.1, EWM59164.1, NP_417236.1, NP_952442.1, Q46897.1, WP_000275968.1, WP_000275969.1, WP_000275970.1, WP_002514610.1, WP_002887563.1, WP_003088897.1, WP_003611355.1, WP_003619878.1, WP_003627701.1, WP_003638535.1, WP_003680452.1, WP_003711544.1, WP_004106694.1, WP_004108997.1, WP_004112674.1, WP_004125169.1, WP_004127877.1, WP_004132153.1, WP_004136192.1, WP_004167288.1, WP_004271052.1, WP_004574564.1, WP_004809669.1, WP_004826830.1, WP_004835071.1, WP_005524691.1, WP_006302706.1, WP_006499676.1, WP_006733194.1, WP_006734894.1, WP_006735522.1, WP_006736351.1, WP_007124219.1, WP_007594585.1, WP_008087967.1, WP_008462592.1, WP_008750297.1, WP_008753314.1, WP_008864960.1, WP_008902364.1, WP_009344936.1, WP_009369769.1, WP_009427694.1, WP_009431210.1, WP_009535621.1, WP_009560664.1, WP_009663637.1, WP_010241933.1, WP_010495835.1, WP_011674074.1, WP_012391079.1, WP_012914175.1, WP_012997658.1, WP_013086434.1, WP_013439422.1, WP_013977924.1, WP_013990628.1, WP_014082580.1, WP_014565815.1, WP_014604239.1, WP_014633158.1, WP_014835008.1, WP_014939123.1, WP_016637270.1, WP_016838866.1, WP_019776152.1, WP_019787555.1, WP_020758452.1, WP_020759629.1, WP_020761302.1, WP_020973660.1, WP_021600850.1, WP_021604019.1, WP_021604910.1, WP_021610201.1, WP_021610634.1, WP_021613848.1, WP_021673645.1, WP_021676133.1, WP_021682645.1, WP_021816697.1, WP_022280995.1, WP_023140379.1, WP_023466234.1, YP_003373988.1, YP_004049616.1, YP_004264318.1, YP_004367835.1, YP_004372358.1, YP_004411731.1, YP_006059732.1, YP_006412648.1, YP_006413230.1, YP_006449450.1, YP_006724801.1, YP_006890381.1, YP_006972088.1, および/または YP_007277144.1
【０１４８】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｆ型ｃｙｓ１ポリペプチドは、限定されないが、表２４に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１４９】
表２４．Ｉ−Ｆ型ｃｙｓ１ポリペプチドアクセッションナンバー
AAK02389.1, AAM85292.1, AAO90474.1, AAQ59428.1, AAS62490.1, AAT03785.1, AAV89306.1, ABA59201.1, ABE06378.1, ABG13929.1, ABG18390.1, ABJ00263.1, ABJ11602.1, ABM03215.1, ABM25017.1, ABM40738.1, ABM57218.1, ABN73326.1, ABP40265.1, ABP60084.1, ABQ13774.1, ABS09366.1, ABS47563.1, ABS76912.2, ABS77281.1, ABX33857.1, ABX50537.1, ABX78740.1, ABX85411.1, ABY68823.1, ACA67939.1, ACC89562.1, ACD38774.1, ACE60872.1, ACJ18399.1, ACJ21001.1, ACJ42249.1, ACJ57095.1, ACO74062.1, ACQ92975.1, ACS84543.1, ACT05579.1, ACV75133.1, ACX89392.1, ACY59063.1, ACY62906.1, ACZ78275.1, ADC72939.1, ADE14358.1, ADE65025.1, ADE89458.1, ADG60301.1, ADH86222.1, ADJ29627.1, ADM99944.1, ADN71993.1, ADR26230.1, ADT95524.1, ADU65668.1, ADV98275.1, ADX89043.1, ADX89502.1, ADZ83760.1, ADZ92541.1, AEC02369.1, AEC18351.1, AEF92273.1, AEF99820.1, AEH62443.1, AEL09136.1, AEL73392.1, AEO75099.1, AET15298.1, AEX04893.1, AEX51728.1, AFF23582.1, AFG36510.1, AFH79569.1, AFH95464.1, AFI46138.1, AFI86378.1, AFI91858.1, AFJ02202.1, 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0957911.1, WP_011095181.1, WP_011135306.1, WP_011146070.1, WP_011192626.1, WP_011212640.1, WP_011216754.1, WP_011240574.1, WP_011769775.1, WP_011789484.1, WP_011803947.1, WP_011809225.1, WP_011927917.1, WP_011996910.1, WP_011997338.1, WP_012016803.1, WP_012089885.1, WP_012104945.1, WP_012197494.1, WP_012203143.1, WP_012220397.1, WP_012229482.1, WP_012303963.1, WP_012440590.1, WP_012570060.1, WP_012570903.1, WP_012667183.1, WP_012696552.1, WP_012729574.1, WP_012764362.1, WP_012768459.1, WP_012817199.1, WP_012886077.1, WP_012917520.1, WP_012983811.1, WP_013032249.1, WP_013107620.1, WP_013163749.1, WP_013221692.1, WP_013319367.1, WP_013330863.1, WP_013505553.1, WP_013657054.1, WP_013662443.1, WP_013739764.1, WP_013747107.1, WP_013804306.1, WP_013818080.1, WP_014016721.1, WP_014228623.1, WP_014325844.1, WP_014390883.1, WP_014424085.1, WP_014454507.1, WP_014500608.1, WP_014509415.1, WP_014602882.1, WP_014658069.1, WP_014673057.1, WP_014701307.1, WP_014703622.1, WP_014833996.1, WP_014848626.1, WP_014872888.1, WP_014916577.1, WP_014995870.1, WP_015259208.1, WP_015337045.1, WP_015551640.1, WP_015555715.1, WP_015670635.1, WP_015696920.1, WP_015731171.1, WP_015834854.1, WP_015834867.1, WP_015862798.1, WP_016158984.1, WP_016232820.1, WP_016248534.1, WP_016261857.1, WP_016418866.1, WP_016451883.1, WP_016504385.1, WP_016534110.1, WP_016534296.1, WP_016534561.1, WP_016836896.1, WP_017004729.1, WP_017253215.1, WP_017350190.1, WP_017395753.1, WP_017448229.1, WP_017466362.1, WP_017788587.1, WP_018025761.1, WP_018076940.1, WP_018122277.1, WP_018125463.1, WP_018176610.1, WP_018285446.1, WP_018298695.1, WP_018347332.1, WP_018414916.1, WP_018559989.1, WP_018676856.1, WP_018719049.1, WP_019001601.1, WP_019022908.1, WP_019520403.1, WP_019543109.1, WP_019671932.1, WP_019843462.1, WP_019935460.1, WP_019951122.1, WP_019959484.1, WP_020161983.1, WP_020328487.1, WP_020355837.1, WP_020393891.1, WP_020443856.1, WP_020566224.1, WP_020680648.1, WP_020870181.1, WP_021017051.1, WP_021205340.1, WP_021325938.1, WP_021461779.1, WP_021496695.1, WP_021511678.1, WP_021519928.1, WP_021531159.1, WP_021760540.1, WP_021986552.1, WP_022027307.1, WP_022381641.1, WP_022498163.1, WP_022642198.1, WP_022642199.1, WP_022642200.1, WP_022654589.1, WP_022775606.1, WP_022850861.1, WP_022852963.1, WP_023053042.1, WP_023087478.1, WP_023091296.1, WP_023100320.1, WP_023103132.1, WP_023122499.1, WP_023271486.1, WP_023320639.1, WP_023327012.1, WP_023337012.1, WP_023338204.1, WP_023346464.1, WP_023593282.1, WP_023640697.1, WP_023655989.1, WP_024107197.1, XP_001401634.1, XP_001584082.1, XP_003494537.1, XP_003665759.1, XP_004528093.1, YP_001052931.1, YP_001163238.1, YP_001176135.1, YP_001209096.1, YP_001367429.1, YP_001400515.1, YP_001424468.1, YP_001425255.2, YP_001555797.1, YP_001562242.1, YP_001596760.1, YP_001606220.1, YP_001651267.1, YP_001712944.1, YP_001720392.1, YP_001873019.1, YP_001906786.1, YP_001968014.1, YP_002303544.1, YP_002306146.1, YP_002320238.1, YP_002324895.1, YP_002347429.1, YP_002390702.1, YP_002396879.1, YP_002555748.1, YP_002647858.1, YP_002757711.1, YP_002795071.1, YP_002892561.1, YP_002955559.1, YP_002986365.1, YP_003003058.1, YP_003041554.1, YP_003041567.1, YP_003225717.1, YP_003260999.1, YP_003334981.1, YP_003377521.1, YP_003461675.1, YP_003526745.1, YP_003568287.1, YP_003626194.1, YP_003690841.1, YP_003761948.1, YP_003884501.1, YP_003896173.1, YP_004112224.1, YP_004308958.1, YP_004314377.1, YP_004411751.1, YP_004421248.1, YP_004490628.1, YP_004512320.1, YP_004766821.1, YP_005019132.1, YP_005176267.1, YP_005199868.1, YP_005274576.1, YP_005362753.1, YP_005432671.1, YP_005474217.1, YP_005505366.1, YP_005509299.1, YP_005522412.1, YP_005620894.1, YP_005623562.1, YP_005639254.1, YP_005801628.1, YP_005975201.1, YP_006100124.1, YP_006111505.1, YP_006119164.1, YP_006205237.1, YP_006218155.1, YP_006239897.1, YP_006245601.1, YP_006284730.1, YP_006286210.1, YP_006292889.1, YP_006482609.1, YP_006518017.1, YP_006559964.1, YP_006648157.1, YP_006672809.1, YP_006675673.1, YP_006678529.1, YP_006681438.1, YP_006692986.1, YP_006754116.1, YP_006822152.1, YP_007014582.1, YP_007217573.1, YP_007326546.1, YP_007342965.1, YP_007506217.1, YP_007693219.1, YP_007821732.1, YP_007826786.1, YP_008163693.1, YP_008275318.1, YP_008278180.1, YP_008282548.1, YP_008284800.1, YP_008285745.1, YP_008289189.1, YP_008299286.1, YP_008301323.1, YP_008304316.1, YP_008570807.1, YP_008590827.1, YP_008682386.1, YP_008685345.1, YP_008791660.1, YP_008981899.1, YP_013608.1, YP_051769.1, YP_071020.1, YP_122343.1, YP_128164.1, YP_162417.1, YP_344731.1, YP_539909.1, YP_647990.1, YP_651874.1, YP_790817.1, YP_851977.1, YP_942814.1, YP_963571.1, YP_984814.1, および/または YP_996236.1
【０１５０】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｆ型ｃｙｓ２ポリペプチドは、限定されないが、表２５に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１５１】
表２５．Ｉ−Ｆ型ｃｙｓ２ポリペプチドアクセッションナンバー
AAC65118.1, AAK02390.1, AAM85293.1, AAQ59427.1, AAS62489.1, AAV89307.2, ABA59202.1, ABE06379.1, ABE06380.1, ABG13928.1, ABG18389.1, ABJ00264.1, ABJ11603.1, ABK50072.1, ABM03216.1, ABM25016.1, ABM40737.1, ABM57217.1, ABN73325.1, ABO37086.1, ABP40264.1, ABP60085.1, ABQ13203.1, ABS09365.1, ABS46484.1, ABS77509.1, ABS77769.2, ABU74104.1, ABX33858.1, ABX50536.1, ABX84883.1, ABY68822.1, ACA67940.1, ACC89561.1, ACD38773.1, ACD70553.1, ACE60871.1, ACH65834.1, ACJ19105.1, ACJ21002.1, ACJ27815.1, ACJ56177.1, ACK48653.1, ACO74063.1, ACQ92976.1, ACS84542.1, ACT05580.1, ACV75132.1, ACX89391.1, ACY59062.1, ACY62907.1, ACZ78274.1, ADC72940.1, ADE14359.1, ADE54031.1, ADE65024.1, ADG60302.1, ADH86221.1, ADJ29628.1, ADM99943.1, ADR02760.1, ADR26231.1, ADR64330.1, ADR64349.1, ADR64397.1, ADR64416.1, ADR64435.1, ADT68979.1, ADT95523.1, ADU65665.1, ADV98276.1, ADX55812.1, ADX89042.1, ADX89501.1, ADZ92540.1, AEC02368.1, AEF92272.1, AEF99821.1, AEH40082.1, AEH62442.1, AEL09137.1, AEL73393.1, AEO75098.1, 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, WP_004863335.1, WP_004877063.1, WP_004895762.1, WP_004907047.1, WP_004918642.1, WP_004928487.1, WP_004948466.1, WP_004963260.1, WP_004998564.1, WP_005003490.1, WP_005024345.1, WP_005026491.1, WP_005048554.1, WP_005081860.1, WP_005163437.1, WP_005217652.1, WP_005370438.1, WP_005371074.1, WP_005378542.1, WP_005463135.1, WP_005472986.1, WP_005478157.1, WP_005497851.1, WP_005499642.1, WP_005535624.1, WP_005540023.1, WP_005562567.1, WP_005596015.1, WP_005600276.1, WP_005603467.1, WP_005606941.1, WP_005611344.1, WP_005614487.1, WP_005616689.1, WP_005623503.1, WP_005623506.1, WP_005721279.1, WP_005725549.1, WP_005725807.1, WP_005751236.1, WP_005753652.1, WP_005756148.1, WP_005764760.1, WP_005769535.1, WP_005842409.1, WP_005879780.1, WP_005974983.1, WP_006033286.1, WP_006052519.1, WP_006174405.1, WP_006365990.1, WP_006790331.1, WP_006790332.1, WP_007011900.1, WP_007069541.1, WP_007106207.1, WP_007111958.1, WP_007117096.1, WP_007181148.1, WP_007293314.1, WP_007460967.1, WP_007607346.1, 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WP_011997339.1, WP_012016804.1, WP_012089884.1, WP_012104946.1, WP_012129694.1, WP_012197493.1, WP_012203144.1, WP_012262739.1, WP_012303964.1, WP_012440591.1, WP_012533314.1, WP_012570449.1, WP_012588885.1, WP_012667184.1, WP_012696553.1, WP_012729575.1, WP_012764361.1, WP_012768460.1, WP_012817198.1, WP_012886076.1, WP_012917521.1, WP_012983812.1, WP_013032250.1, WP_013042753.1, WP_013163748.1, WP_013221693.1, WP_013319366.1, WP_013330864.1, WP_013465401.1, WP_013505551.1, WP_013589020.1, WP_013662442.1, WP_013739763.1, WP_013804305.1, WP_013818081.1, WP_013944828.1, WP_014016720.1, WP_014228624.1, WP_014234833.1, WP_014251761.1, WP_014325845.1, WP_014342279.1, WP_014342713.1, WP_014390884.1, WP_014424086.1, WP_014454508.1, WP_014500607.1, WP_014509416.1, WP_014658070.1, WP_014701306.1, WP_014703621.1, WP_014848625.1, WP_014916578.1, WP_014995869.1, WP_015259207.1, WP_015337044.1, WP_015551639.1, WP_015555714.1, WP_015670636.1, WP_015683962.1, WP_015696921.1, WP_015731170.1, WP_015834853.1, WP_015862797.1, WP_016164443.1, WP_016232821.1, WP_016248535.1, WP_016261858.1, WP_016360503.1, WP_016418865.1, WP_016451882.1, WP_016504384.1, WP_016532754.1, WP_016785737.1, WP_016795643.1, WP_017004728.1, WP_017019123.1, WP_017026497.1, WP_017031015.1, WP_017045320.1, WP_017049067.1, WP_017064054.1, WP_017066106.1, WP_017089408.1, WP_017098522.1, WP_017101566.1, WP_017108317.1, WP_017198528.1, WP_017216065.1, WP_017233561.1, WP_017253164.1, WP_017395754.1, WP_017420289.1, WP_017448230.1, WP_017631032.1, WP_017631279.1, WP_017788586.1, WP_017925083.1, WP_018025760.1, WP_018114351.1, WP_018122276.1, WP_018125462.1, WP_018176611.1, WP_018285447.1, WP_018298696.1, WP_018414917.1, WP_018676855.1, WP_018719048.1, WP_018838292.1, WP_018844146.1, WP_018871531.1, WP_019001600.1, WP_019018098.1, WP_019022907.1, WP_019283232.1, WP_019520402.1, WP_019543110.1, WP_019820373.1, WP_019843463.1, WP_019895601.1, WP_019935461.1, WP_019951123.1, WP_019951124.1, WP_019959485.1, WP_020065396.1, WP_020161984.1, WP_020328488.1, WP_020332815.1, WP_020393890.1, WP_020443857.1, WP_020680649.1, WP_020841380.1, WP_020911193.1, WP_021017052.1, WP_021325939.1, WP_021511407.1, WP_021515757.1, WP_021710780.1, WP_021760541.1, WP_022027306.1, WP_022381642.1, WP_022498162.1, WP_022642201.1, WP_022654590.1, WP_022775602.1, WP_022850860.1, WP_022940476.1, WP_023045107.1, WP_023052957.1, WP_023087477.1, WP_023103131.1, WP_023116495.1, WP_023271487.1, WP_023320640.1, WP_023327013.1, WP_023337013.1, WP_023404025.1, WP_023593281.1, WP_023640696.1, WP_023655988.1, WP_023981414.1, WP_023982290.1, WP_023982478.1, WP_024033837.1, WP_024107196.1, XP_001648478.1, XP_002895673.1, XP_003055745.1, XP_003239553.1, XP_003722415.1, XP_004144180.1, XP_004528092.1, XP_004832109.1, XP_006459595.1, YP_001052930.1, YP_001163237.1, YP_001176136.1, YP_001209097.1, YP_001367428.1, YP_001400516.1, YP_001424469.2, YP_001425256.1, YP_001448331.1, YP_001555796.1, YP_001562243.1, YP_001606219.1, YP_001651266.1, YP_001712945.1, YP_001720393.1, YP_001873018.1, YP_001906787.1, YP_001933132.1, YP_001968013.1, YP_002155777.1, YP_002304250.1, YP_002306147.1, YP_002310402.1, YP_002324896.1, YP_002347428.1, YP_002360076.1, YP_002396880.1, YP_002647859.1, YP_002795072.1, YP_002892562.1, YP_002955558.1, YP_002986364.1, YP_003003059.1, YP_003041553.1, YP_003225716.1, YP_003260998.1, YP_003334980.1, YP_003377522.1, YP_003461676.1, YP_003526746.1, YP_003548201.1, YP_003568286.1, YP_003626195.1, YP_003690840.1, YP_003761949.1, YP_003884500.1, YP_003896174.1, YP_004069130.1, YP_004112221.1, YP_004228872.1, YP_004314376.1, YP_004411750.1, YP_004490627.1, YP_004512321.1, YP_004672873.1, YP_004766820.1, YP_005019133.1, YP_005025972.1, YP_005043015.1, YP_005176268.1, YP_005199869.1, YP_005222302.1, YP_005223367.1, YP_005229910.1, YP_005274575.1, YP_005362754.1, YP_005432672.1, YP_005474218.1, YP_005505365.1, YP_005509300.1, YP_005522413.1, YP_005620893.1, YP_005623563.1, YP_005639255.1, YP_005801629.1, YP_005975200.1, YP_006119165.1, YP_006218156.1, YP_006239896.1, YP_006284729.1, YP_006286211.1, YP_006292888.1, YP_006482608.1, YP_006518016.1, YP_006648158.1, YP_006822151.1, YP_006869473.1, YP_007217572.1, YP_007301291.1, YP_007326545.1, YP_007342966.1, YP_007821731.1, YP_007826785.1, YP_007935926.1, YP_008091000.1, YP_008118899.1, YP_008267627.1, YP_008528750.1, YP_008570808.1, YP_008570809.1, YP_008590828.1, YP_008682385.1, YP_008685344.1, YP_008981898.1, YP_047071.1, YP_051770.1, YP_071019.1, YP_122342.1, YP_128165.1, YP_162418.2, YP_344732.1, YP_539910.1, YP_539911.1, YP_647989.1, YP_651873.1, YP_790816.1, YP_851978.1, YP_871478.1, YP_942815.1, YP_963570.1, YP_984813.1, および/または YP_996235.1
【０１５２】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｆ型ｃａｓ７／ｃｙｓ３ポリペプチドは、限定されないが、表２６に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１５３】
表２６．Ｉ−Ｆ型ｃａｓ７／ｃｙｓ３ポリペプチドアクセッションナンバー
AAK02391.1, AAM85294.1, AAO89723.2, AAQ59426.1, AAS62488.1, AAV89308.1, ABA59203.1, ABE06381.1, ABG13927.1, ABG18388.1, ABJ00265.1, ABJ11604.1, ABK50071.1, ABM03217.1, ABM25015.1, ABM40736.1, ABM57216.1, ABN73324.1, ABP40263.1, ABP57350.1, ABP60086.1, ABQ14256.1, ABS09364.1, ABS46029.1, ABS77636.2, ABS78227.1, ABU74105.1, ABX33859.1, ABX50535.1, ABX78894.1, ABX85185.1, ABY68821.1, ACA67941.1, ACC89560.1, ACD38772.1, ACE60870.1, ACH66461.1, ACJ19106.1, ACJ21003.1, ACJ27816.1, ACJ42247.1, ACJ57414.1, ACK48652.1, ACO74064.1, ACQ92977.1, ACS84541.1, ACT05581.1, ACV75131.1, ACX89390.1, ACY59061.1, ACY62908.1, ACZ78273.1, ADC72941.1, ADE14360.1, ADE65023.1, ADE89794.1, ADG60303.1, ADH86220.1, ADJ29629.1, ADL13485.1, ADM99942.1, ADN71992.1, ADR26232.1, ADT68978.1, ADT95522.1, ADU65664.1, ADV98277.1, ADX89041.1, ADX89500.1, ADZ92539.1, AEC02367.1, AEC18349.1, AEF92271.1, AEF99822.1, AEH62441.1, AEL09138.1, AEL73394.1, AEO64331.1, AEO75097.1, AET15300.1, AEX04895.1, AEX24996.1, AEX51730.1, 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WP_019018099.1, WP_019022906.1, WP_019251101.1, WP_019283233.1, WP_019520401.1, WP_019543111.1, WP_019671930.1, WP_019820371.1, WP_019843464.1, WP_019895600.1, WP_019935462.1, WP_019951125.1, WP_019959486.1, WP_020161985.1, WP_020328489.1, WP_020332816.1, WP_020389180.1, WP_020393889.1, WP_020443858.1, WP_020527196.1, WP_020680650.1, WP_020841381.1, WP_020911194.1, WP_021017053.1, WP_021325940.1, WP_021461781.1, WP_021511406.1, WP_021525891.1, WP_021525892.1, WP_021531160.1, WP_021575785.1, WP_021710781.1, WP_021760542.1, WP_022027305.1, WP_022381643.1, WP_022498161.1, WP_022642203.1, WP_022654591.1, WP_022761971.1, WP_022775599.1, WP_022850859.1, WP_022940477.1, WP_023000930.1, WP_023045108.1, WP_023053015.1, WP_023116494.1, WP_023122498.1, WP_023131487.1, WP_023271488.1, WP_023320641.1, WP_023327014.1, WP_023337014.1, WP_023593280.1, WP_023640695.1, WP_023655987.1, WP_023982477.1, WP_024033838.1, WP_024107195.1, XP_001007303.1, XP_002402345.1, XP_003087158.1, XP_003303032.1, XP_003494537.1, XP_003650667.1, XP_004404055.1, XP_004528091.1, XP_005602236.1, XP_005602237.1, XP_005637873.1, XP_720614.1, XP_720742.1, YP_001052929.1, YP_001163236.1, YP_001176137.1, YP_001209098.1, YP_001367427.1, YP_001400517.1, YP_001424470.1, YP_001425257.2, YP_001448332.1, YP_001555795.1, YP_001562244.1, YP_001596128.1, YP_001606218.1, YP_001651265.1, YP_001712946.1, YP_001720394.1, YP_001873017.1, YP_001906788.1, YP_001968012.1, YP_002155776.1, YP_002304251.1, YP_002306148.1, YP_002310403.1, YP_002320236.1, YP_002324897.1, YP_002347427.1, YP_002360075.1, YP_002390703.1, YP_002396881.1, YP_002555750.1, YP_002647860.1, YP_002795073.1, YP_002892563.1, YP_002955557.1, YP_002986363.1, YP_003003060.1, YP_003041552.1, YP_003225715.1, YP_003260997.1, YP_003334979.1, YP_003377523.1, YP_003461677.1, YP_003526747.1, YP_003568285.1, YP_003626196.1, YP_003690839.1, YP_003761950.1, YP_003828550.1, YP_003884499.1, YP_003896175.1, YP_004069129.1, YP_004112220.1, YP_004314375.1, YP_004411749.1, YP_004421246.1, YP_004490626.1, YP_004512322.1, YP_004766819.1, YP_005019134.1, YP_005025971.1, YP_005176269.1, YP_005199870.1, YP_005274574.1, YP_005362755.1, YP_005432673.1, YP_005474219.1, YP_005505364.1, YP_005509301.1, YP_005522414.1, YP_005620892.1, YP_005623564.1, YP_005639256.1, YP_005801630.1, YP_005975199.1, YP_006100125.1, YP_006111504.1, YP_006119166.1, YP_006218157.1, YP_006239895.1, YP_006284728.1, YP_006286212.1, YP_006292887.1, YP_006482607.1, YP_006518015.1, YP_006648159.1, YP_006822150.1, YP_007217571.1, YP_007301292.1, YP_007326544.1, YP_007342967.1, YP_007506214.1, YP_007821730.1, YP_007826784.1, YP_008163695.1, YP_008267628.1, YP_008528749.1, YP_008570810.1, YP_008590829.1, YP_008682384.1, YP_008685343.1, YP_008981897.1, YP_047072.1, YP_051771.1, YP_071018.1, YP_122341.1, YP_128166.1, YP_162419.1, YP_344733.1, YP_539912.1, YP_647988.1, YP_651872.1, YP_790815.1, YP_851979.1, YP_871477.1, YP_942816.1, YP_963569.1, YP_984812.1, および/または YP_996234.1
【０１５４】
一部の実施態様では、Ｉ−Ｆ型ｃａｓ６ｆ／ｃｙｓ４ポリペプチドは、限定されないが、表２７に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１５５】
表２７．Ｉ−Ｆ型ｃａｓ６ｆ／ｃｙｓ４ポリペプチドアクセッションナンバー
AAV89309.2, ABA59204.1, ABG13926.1, ABG18387.1, ABK50070.1, ABM03218.1, ABM25014.1, ABM40735.1, ABM57215.1, ABP40262.1, ABP60087.1, ABP75546.1, ABQ13095.1, ABR71599.1, ABS09363.1, ABS47360.1, ABX33860.1, ABX50534.1, ABX78249.1, ABX85582.1, ACA67942.1, ACC89559.1, ACH66931.1, ACJ42246.1, ACJ58934.1, ACO74066.1, ACQ92978.1, ACS84540.1, ACT05582.1, ACV75130.1, ACX89389.1, ACZ78272.1, ADC72942.1, ADE14361.1, ADE90298.1, ADG60304.1, ADH86219.1, ADJ29630.1, ADT95521.1, ADU65663.1, ADV54188.1, ADV54624.1, ADZ92538.1, AEC02366.1, AEF92270.1, AEF99823.1, AEL09139.1, AET15301.1, AEX51731.1, AFF23585.1, AFG36513.1, AFH95467.1, AFI85399.1, AFI86381.1, AFI91855.1, AFJ02199.1, AFN56492.1, AGA34089.1, AGB80783.1, AGG09388.1, AGG09394.1, AGG31840.1, AGQ92517.1, AGW13660.1, AGX88280.1, AHB09918.1, AHC77002.1, AHE63726.1, AHE99151.1, AHF01504.1, BAL82651.1, CAX54611.1, CAY73260.1, CBA17530.1, CCG88214.1, CCZ55217.1, CDD80274.1, CDF05509.1, CDK64174.1, EAX33519.1, EDR31157.1, EDR35337.1, EDR37855.1, EDR44978.1, EDR48741.1, EDR55755.1, EDR59630.1, EDR63807.1, EDU58859.1, EDV62090.1, EDZ65577.1, EED26517.1, EEH84598.1, EEO29370.1, EEO29468.1, EEP92234.1, EEQ03935.1, EEQ19215.1, EEV21944.1, EEW05504.1, EEW96606.1, EEX04034.1, EEX50301.1, EEX68262.1, EEY90278.1, EFA49553.1, EFC58010.1, EFI23595.1, EFI34394.1, EFM86278.1, EFM88411.1, EFM90569.1, EFM92756.1, EFM95002.1, EFM97156.1, EFM99345.1, EFN01381.1, EFN03539.1, EFO35488.1, EFO42030.1, EFO49970.1, EFO58225.1, EFU46687.1, EGB79044.1, EGE11097.1, EGE12104.1, EGE12617.1, EGE14944.1, EGE19075.1, EGE19367.1, EGE21987.1, EGE24484.1, EGE25419.1, EGE27754.1, EGJ07914.1, EGJ59629.1, EGJ63890.1, EGM77971.1, EGS63960.1, EGY35787.1, EGY38132.1, EGY39144.1, EGY41119.1, EGY70944.1, EHC04317.1, EHK62472.1, EHM40145.1, EHM48026.1, EHN98432.1, EIC20987.1, EIC29314.1, EIF44412.1, EIK45280.1, EIL89116.1, EJS92990.1, EKD42112.1, EKE17714.1, EKF84297.1, EKG52543.1, EKG57738.1, EKG62914.1, EKG63404.1, EKG72469.1, EKG93026.1, EKT62224.1, EKX95267.1, ELT18758.1, ELY20635.1, ELY22223.1, EMP51884.1, ENO94847.1, ENZ96949.1, EPC10332.1, EPE63815.1, EPE65659.1, EPE67792.1, EPE71679.1, EPP24160.1, EPR80940.1, EPR81194.1, EPR88384.1, EQM86550.1, ERG09342.1, ERG16856.1, ERG53584.1, ERG59562.1, ERH66544.1, ERP69294.1, ERP72007.1, ERP72729.1, ERP73548.1, ERP82383.1, ESD40180.1, ESE13074.1, ESN61387.1, ESQ71759.1, EST01749.1, ETJ46809.1, EVT85800.1, GAA75158.1, GAA77964.1, GAB76059.1, GAC09611.1, GAC15829.1, GAC19764.1, GAC34444.1, NP_819208.1, Q02MM2.2, Q1RE32.1, WP_000083148.1, WP_000083149.1, WP_000339854.1, WP_000340321.1, WP_000340322.1, WP_000350178.1, WP_000350179.1, WP_000350182.1, WP_000350183.1, WP_000350184.1, WP_000378966.1, WP_001104789.1, WP_001104791.1, WP_001110391.1, WP_001909069.1, WP_001982952.1, WP_001986296.1, WP_002211866.1, WP_002802602.1, WP_002812325.1, WP_002923958.1, WP_003116908.1, WP_003139220.1, WP_003143948.1, WP_003162920.1, WP_003464685.1, WP_003662182.1, WP_003664177.1, WP_003666007.1, WP_003667345.1, WP_003670070.1, WP_003670773.1, WP_003672250.1, WP_004089527.1, WP_004240702.1, WP_004279689.1, WP_004343806.1, WP_004349921.1, WP_004389638.1, WP_004395176.1, WP_004681361.1, WP_004713760.1, WP_004904259.1, WP_004918644.1, WP_004928490.1, WP_005026497.1, WP_005186672.1, WP_005378540.1, WP_005473100.1, WP_005478386.1, WP_005497846.1, WP_005499652.1, WP_005511272.1, WP_005540019.1, WP_005562562.1, WP_005565379.1, WP_005596012.1, WP_005600275.1, WP_005606939.1, WP_005611343.1, WP_005614481.1, WP_005616685.1, WP_005725810.1, WP_005728799.1, WP_005753657.1, WP_005764757.1, WP_005769530.1, WP_005842411.1, WP_005974979.1, WP_006087140.1, WP_006174409.1, WP_006790334.1, WP_007069539.1, WP_007106209.1, WP_007117098.1, WP_007293316.1, WP_007620981.1, WP_007641668.1, WP_007986852.1, WP_008129244.1, WP_008133922.1, WP_008135468.1, WP_008169475.1, WP_008215113.1, WP_008247108.1, WP_008608778.1, WP_008845634.1, WP_008869720.1, WP_008898786.1, WP_008911670.1, WP_009095262.1, WP_009174235.1, WP_009286533.1, WP_009288124.1, WP_009355633.1, WP_009832548.1, WP_009838678.1, WP_009875013.1, WP_009876500.1, WP_010106216.1, WP_010279279.1, WP_010295117.1, WP_010318156.1, WP_010364306.1, WP_010554110.1, WP_010559725.1, WP_010588736.1, WP_010606802.1, WP_010906580.1, WP_011095184.1, WP_011146073.1, WP_011212637.1, WP_011216757.1, WP_011221971.1, WP_011240577.1, WP_011703507.1, WP_011718586.1, WP_011769778.1, WP_011789481.1, WP_011803944.1, WP_011809222.1, WP_011919227.1, WP_011997341.1, WP_012016806.1, WP_012070375.1, WP_012089882.1, WP_012197491.1, WP_012203146.1, WP_012220113.1, WP_012262737.1, WP_012440593.1, WP_012534077.1, WP_012570451.1, WP_012601378.1, WP_012667186.1, WP_012696556.1, WP_012729577.1, WP_012764359.1, WP_012768462.1, WP_012817197.1, WP_012886074.1, WP_012917523.1, WP_012983814.1, WP_013032252.1, WP_013101298.1, WP_013107622.1, WP_013163746.1, WP_013221695.1, WP_013319364.1, WP_013505549.1, WP_013662440.1, WP_013739761.1, WP_013804303.1, WP_013818083.1, WP_014228626.1, WP_014325847.1, WP_014390886.1, WP_014424088.1, WP_014509418.1, WP_014610405.1, WP_014701304.1, WP_014703619.1, WP_014707760.1, WP_014848623.1, WP_014916580.1, WP_014995867.1, WP_015259205.1, WP_015670638.1, WP_015696923.1, WP_015834851.1, WP_016504383.1, WP_016785735.1, WP_017045322.1, WP_017066108.1, WP_017098524.1, WP_017108319.1, WP_017216063.1, WP_017395756.1, WP_017448232.1, WP_017631031.1, WP_017791147.1, WP_017926913.1, WP_019820369.1, WP_019843465.1, WP_020328490.1, WP_020841382.1, WP_021017054.1, WP_021760543.1, WP_022027304.1, WP_022381644.1, WP_022498160.1, WP_022654592.1, WP_022775596.1, WP_022940478.1, WP_022943263.1, WP_023593279.1, WP_023640694.1, WP_023655986.1, WP_024107194.1, YP_001176138.1, YP_001183345.1, YP_001209099.1, YP_001341534.1, YP_001367426.1, YP_001400518.1, YP_001555794.1, YP_001562245.1, YP_001596127.1, YP_001720395.1, YP_001873016.1, YP_002155775.1, YP_002320235.1, YP_002324898.1, YP_002647861.1, YP_002795075.1, YP_002892564.1, YP_002986362.1, YP_003003061.1, YP_003225714.1, YP_003260996.1, YP_003334978.1, YP_003377524.1, YP_003461678.1, YP_003526748.1, YP_003626197.1, YP_003690838.1, YP_003761951.1, YP_004112219.1, YP_004314374.1, YP_004411748.1, YP_004490625.1, YP_004512323.1, YP_005176270.1, YP_005199871.1, YP_005274573.1, YP_005362756.1, YP_005432674.1, YP_005474220.1, YP_005639257.1, YP_005801631.1, YP_006009654.1, YP_006010090.1, YP_006100126.1, YP_006218158.1, YP_006284727.1, YP_006286213.1, YP_006292886.1, YP_006297044.1, YP_006518014.1, YP_007217570.1, YP_007342968.1, YP_007506213.1, YP_008267629.1, YP_008590830.1, YP_008682383.1, YP_008981896.1, YP_162420.2, YP_871476.1, YP_942817.1, YP_963568.1, YP_984811.1, および/または YP_996233.1
【０１５６】
一部の実施態様では、Ｃａｓ３ポリペプチドは、限定されないが、表２８に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを含む。
【０１５７】
表２８．Ｃａｓ３ポリペプチドアクセッションナンバー
A82872, AAB89382.1, AAB91160.1, AAB98365.1, AAB98371.1, AAF30996.1, AAK41637.1, AAK41673.1, AAK42189.1, AAL62539.1, AAL62627.1, AAL80764.1, AAM25779.1, AAM38679.1, AAM72368.1, AAM73189.1, AAN50388.1, AAO35720.1, AAO36022.1, AAQ58899.1, AAQ66983.1, AAR38876.1, AAS69549.1, AAS82462.1, AAS94335.1, AAU37598.1, AAU92783.1, AAV44424.1, AAW74126.1, AAZ55629.1, AAZ72010.1, ABB14293.1, ABB24155.1, ABB31304.1, ABC18828.1, ABC21145.1, ABC21629.1, ABC29591.1, ABC56823.1, ABC57331.1, ABD09411.1, ABD12698.1, ABE48871.1, ABE96084.1, ABF44063.1, ABF44542.1, ABF89301.1, ABF91789.1, ABI67810.1, ABI69806.1, ABJ76899.1, ABJ78235.1, ABK14431.1, ABK62334.1, ABL65464.1, ABL78751.1, ABM29989.1, ABM34513.1, ABM80911.1, ABN07021.1, ABN53501.1, ABN54399.1, ABN69437.1, ABO35078.1, ABO49083.1, ABO49537.1, ABP50708.1, ABP65963.1, ABP67974.2, ABP81368.1, ABP86511.1, ABP95302.1, ABQ31016.1, ABQ47098.1, ABQ89071.1, ABQ90257.1, ABQ92673.1, ABR47839.1, ABR48352.1, ABR54142.1, ABR56647.1, ABR74644.1, ABS22296.1, 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ACU96431.1, ACV03335.1, ACV25237.1, ACV25244.1, ACV35540.1, ACV36635.1, ACV38704.1, ACV48941.1, ACV50950.1, ACV55943.1, ACV64361.1, ACV64476.1, ACV64955.1, ACV76424.1, ACX52110.1, ACX82534.1, ACX92460.1, ACX95672.1, ACY48525.1, ACY96527.1, ACY97073.1, ACY98231.1, ACZ11932.1, ACZ43323.1, ADB10235.1, ADB41980.1, ADB47144.1, ADB86651.1, ADC46647.1, ADC66005.1, ADC69847.1, ADC69854.1, ADC74615.1, ADC88654.1, ADE02249.1, ADE15049.1, ADE56275.1, ADE85052.1, ADG07363.1, ADG07374.1, ADG13847.1, ADG24312.1, ADG71322.1, ADG82739.1, ADG83328.1, ADG88252.1, ADG91073.1, ADG94443.1, ADH59811.1, ADH61862.1, ADH65197.1, ADH65311.1, ADH89239.1, ADH93443.1, ADI02109.1, ADI02311.1, ADI14777.1, ADI26432.1, ADI36187.1, ADJ47561.1, ADJ54311.1, ADK80202.1, ADL06865.1, ADL41489.1, ADL43516.1, ADL50598.1, ADL52044.1, ADL70071.1, ADL70152.1, ADM08199.1, ADM09596.1, ADM11310.1, ADN01349.1, ADN51064.1, ADN55919.1, ADO45627.1, ADP38751.1, ADP70484.1, ADP74265.1, ADP76108.1, ADP88371.1, ADQ02874.1, ADQ03682.1, 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【０１５８】
したがって、一部の実施態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチドのサブセットまたはその機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明の組み換え核酸分子は、上記に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーを有する３またはそれより多くのポリペプチドまたは任意の他のＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、２またはそれより多くのリピートヌクレオチド配列、またはその部分、および、１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）を含む、から本質的になる、またからなる、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを提供し、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲアレイ内の各スペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端およびその３’末端で、リピートヌクレオチド配列に連結される。したがって、ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーヌクレオチド配列およびリピートヌクレオチド配列は、例えば、５’から３’へ、リピート、スペーサー、リピートのように、互いに交互である。
【０１６０】
本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、任意の長さであり得て、１または複数の標的遺伝子の発現の抑制（例えば、転写の抑制）の所望のレベルを達成するために必要な、上述のようにリピートヌクレオチド配列と交互に任意の数のスペーサーヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１〜約１００スペーサーヌクレオチド配列を含み得て、から本質的になり得て、またはからなり得て、それぞれ、その５’末端およびその３’末端でリピートヌクレオチド配列に連結される。したがって、一部の実施態様では、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれより多くの、スペーサーヌクレオチド配列を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
【０１６１】
本発明のＣＲＩＳＰＲアレイのリピートヌクレオチド配列は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ  ｃａｓシステムの任意の公知のリピートヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。本明細書に記載されるように、リピートヌクレオチド配列は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ  ｃａｓシステム由来のネイティブのリピート（例えば、内部ヘアピン）の二次構造を含む、合成デザインであってもよい。一部の実施態様では、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイのリピートヌクレオチド配列は、配列番号５９〜２４９のヌクレオチド配列を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
【０１６２】
一部の実施態様では、少なくとも１つのスペーサーヌクレオチド配列は、その３’末端でリピート配列に連結され得て、そして、その５’末端で、リピートヌクレオチド配列の３’末端から約１〜約８、約１〜約１０、約１〜約１５個のヌクレオチド（例えば、リピートヌクレオチド配列の部分）に連結され得る。他の実施態様では、少なくとも１つのスペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端で、リピートヌクレオチド配列の３’末端から約２〜約６、または約２〜約４個のヌクレオチドに連結され得る。
【０１６３】
代表的な実施態様では、組み換えＣＲＩＳＰＥＲアレイは、２またはそれより多くの（例えば、本明細書に記載のように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い）スペーサーヌクレオチド配列を含み、各スペーサーヌクレオチド配列は、その３’およびその５’末端でリピートヌクレオチド配列が隣接し、前記組み換えＣＲＩＳＰＲアレイの２またはそれより多くのスペーサーヌクレオチド配列の少なくとも２つは、それぞれ、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列（例えば、同一の標的遺伝子の異なる領域）に相補であるヌクレオチド配列を含み得る。単一の標的遺伝子の少なくとも２つの異なる領域を標的化することにより、ＣＲＩＳＰＲアレイを用いて前記標的遺伝子の発現の抑制を改変する（例えば、抑制レベルを増大または低減する）ことができる。より具体的には、多数のスペーサーヌクレオチド配列を有してそのそれぞれが単一の遺伝子由来の異なる非オーバーラップの標的ヌクレオチド配列に相補であるＣＲＩＳＰＲアレイは、比較的より少ないスペーサーヌクレオチド配列を有してそのそれぞれが単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるＣＲＩＳＰＲアレイと比較すると、その標的遺伝子の発現の、より強い／増大した抑制を提供することができる。転写抑制のレベルは、同一の標的遺伝子内のオーバーラップ標的ヌクレオチド配列に相補のスペーサーヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲアレイをデザインすることにより、さらに改変することができる。同一の標的遺伝子内のオーバーラップ標的ヌクレオチド配列に相補であるオーバーラップスペーサーヌクレオチド配列は、スペーサーヌクレオチド配列は同一の標的遺伝子内の異なる標的ヌクレオチド配列と相補であるが、前記標的ヌクレオチド配列がオーバーラップしないＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、その標的遺伝子の発現抑制を減少させることができる。すなわち、そのようなオーバーラップスペーサー配列は、オーバーラップしないスペーサー配列よりも、発現抑制に対して減少した効果を有する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、オーバーラップ配列は互いに競合し、それにより、非オーバーラップ配列と比較して抑制レベルを減少させると考えられる。
【０１６４】
単一の遺伝子上の異なる位置／領域を標的化してその遺伝子の抑制を調節するのに加えて、スペーサーの長さまたは標的ヌクレオチド配列に対するその相補性を変更して、抑制を調節することができる。したがって、例えば、より短いスペーサー、または標的ヌクレオチド配列に対してより低い相補性を有するスペーサーは、典型的に、それぞれ、より長いスペーサーおよび／または標的ヌクレオチド配列に対してより高い相補性を有するスペーサーと比較して、抑制の減少をもたらす。
【０１６５】
したがって、一部の実施態様では、スペーサーによる抑制は、前記スペーサーの長さに１または複数のヌクレオチドを追加することにより増大され得て、前記スペーサーは、本発明の組み換え核酸とともに用いた場合に、同一のスペーサーであるが追加のヌクレオチドがないものと比較して、抑制の増大をもたらす。一部の実施態様では、スペーサーの長さは、１〜約１００個のヌクレオチド、および／またはその中の任意の範囲または値（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれより多い）、増大され得る。代表的な実施態様では、スペーサーの長さは、約１〜約４０、約５〜約３０、１０〜約３０、約２０〜約３０個のヌクレオチド、増大され得る。他の実施態様では、スペーサーの長さは、約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２４ヌクレオチドなど、増大され得る。
【０１６６】
さらなる実施態様では、スペーサーによる抑制は、前記スペーサーの長さを、１または複数のヌクレオチド減少させることにより低減され得て、前記スペーサーは、本発明の組み換え核酸とともに用いた場合、同一のスペーサーであるがヌクレオチドの数が減少されていないものと比較して、抑制の低減をもたらす。したがって、一部の実施態様では、スペーサーによる抑制は、スペーサーの長さを、１〜約１００ヌクレオチド、およびその中の任意の範囲または値、低減させることにより低減され得る。代表的な実施態様では、スペーサーの長さは、約１〜約４０、約５〜約３０、１０〜約３０、約２０〜約３０個のヌクレオチド、低減され得る。他の実施態様では、スペーサーの長さは、約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２４ヌクレオチドなど、低減され得る。
【０１６７】
さらなる態様では、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列は、二本鎖標的遺伝子のコード鎖または＋（上）鎖および／または非コード鎖または−（下）鎖由来の標的ヌクレオチド配列と相補であり得る。本明細書において示されるように、非コード／−鎖よりむしろコード／＋鎖を標的とするスペーサーを含むように組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを設計することは、抑制のさらなる調節をコード／＋鎖の標的化に提供し、同一の標的遺伝子の非コード／−鎖の標的化と比較して増大した、またはより高い抑制を提供する（逆も同様）。
【０１６８】
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイ構築物のスペーサーヌクレオチド配列のこれらのバリエーションおよび他のバリエーションが可能であり、標的遺伝子の発現の抑制または抑制変更のために用いることができる。本明細書に記載のスペーサーの型の任意の組み合わせ、ならびに、スペーサーの他の型は、標的遺伝子の発現を抑制するために、または発現の抑制を調節するために、単独または任意の組み合わせで使用することができる。
【０１６９】
したがって、明らかであるように、ＣＲＩＳＰＲアレイのデザインにおける上述および他のバリエーションを用いて、標的遺伝子の発現の抑制の所望のレベルを達成することができる。
【０１７０】
他の実施態様では、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、からなるように、設計することができ、そのそれぞれは、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、単一のＣＲＩＳＰＲアレイを用いて異なる標的遺伝子の発現の抑制を達成する。あるいは、２またはそれより多くの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを用いて、発現の抑制のために、異なる遺伝子が標的化され得る。
【０１７１】
容易に理解されるように、前記細胞または生物における１または複数の標的遺伝子の発現の抑制および／または調節での使用のために、様々な組み換えＣＲＩＳＰＲアレイのデザインを、単一または多数の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ構築物で構築および細胞または生物内に導入することができる。したがって、例えば、本明細書に記載のスペーサーヌクレオチド配列の異なる型の様々な組み合わせを、単一の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ上に、１または複数の標的遺伝子の発現が抑制および／または調節され得るように導入することができる。あるいは、他の実施態様では、１または複数の標的遺伝子の発現を抑制または調節するために、様々なスペーサーヌクレオチド配列を、２またはそれより多くの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ上に導入することができる。
【０１７２】
一部の実施態様では、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列、またはその相補と完全に同一または実質的に同一であり得る。特定の実施態様では、１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）は、標的ヌクレオチド配列、またはその相補に対して、少なくとも約５０％の同一性を有し得る。他の実施態様では、１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）は、標的ヌクレオチド配列、またはその相補に対して、少なくとも約７０％の同一性を有し得る。さらなる実施態様では、１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）は、標的ヌクレオチド配列、またはその相補に対して、少なくとも約８０％の同一性を有し得る。またさらなる実施態様では、１または複数のスペーサーヌクレオチド配列（単数または複数）は、標的ヌクレオチド配列、またはその相補に対して、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有し得る。
【０１７３】
本発明の他の態様では、標的ヌクレオチド配列および／または標的遺伝子は、標的生物のゲノム、プラスミド、またはプラスチド由来である。
【０１７４】
一部の実施態様では、標的生物は、真核生物、原核生物またはウイルスであり得る。他の実施態様では、原核生物は、制限されないが、細菌または古細菌を含む。さらに他の実施態様では、真核生物は、制限されないが、動物、哺乳類、昆虫、植物、菌類、昆虫、鳥類、魚類、両生類、爬虫類、または刺胞動物を含む。追加の実施態様では、哺乳類は、制限されないが、齧歯類、ウマ、イヌ、ネコ、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、ヤギ、ブタ、ウシ（例えば畜牛）、ヒツジ、実験動物（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスターなど）などを含み得る。本発明で有用な鳥類の非限定の例は、ニワトリ、アヒル、ターキー、ガン、ウズラおよびペットとして飼われている鳥（例えば、インコ、オウム、コンゴウインコなど）を含む。追加の実施態様は、例えば、哺乳類および昆虫の細胞株を含み得る。哺乳類および昆虫の細胞株の非限定の例は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＥＦ細胞、３Ｔ３細胞、Ｈｉ−５細胞、およびＳｆ２１細胞を含む。
【０１７５】
適切な標的生物は、雄および雌の両方および胎児（例えば、子宮内または卵内）、幼児、児童、青年、成人および高齢の対象を含む、全ての年齢の対象を含み得る。本発明の実施態様では、標的生物は、ヒト胎児対象ではない。
【０１７６】
したがって、例えば、任意の細菌、古細菌、植物、または菌類を、本発明の実施において用いることができる。代表的な実施態様では、本発明で有用な細菌の非限定の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、またはシアノバクテリアを含む。さらなる実施態様では、本発明で有用な細菌の非限定の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはシアノバクテリアを含む。本発明で有用な細菌のさらなる非限定の例は、制限されないがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を含む乳酸菌；制限されないがＧｅｏｂａｃｔｅｒ種、クロストリジウム種、またはラルストニア・ユートロファを含むエレクトロフューエル細菌（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｅｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ）株；または、例えば植物および哺乳類に病原性の細菌を含む。特定の実施態様では、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり得る。
【０１７７】
そのような古細菌の非限定の例は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、または、制限されないがＨａｌａｄａｐｔａｔｕｓ（例えば、Ｈａｌａｄａｐｔａｔｕｓ  ｐａｕｃｉｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｈａｌａｌｋａｌｉｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｈａｌａｌｋａｌｉｃｏｃｃｕｓ  ｔｉｂｅｔｅｎｓｉｓ）、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ（例えば、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ  ｇｏｍｏｒｒｅｎｓｅ）、Ｈａｌｏｂｅｌｌｕｓ（例えば、Ｈａｌｏｂｅｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ（例えば、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｕｋｏｈａｔａｅｉ）、Ｎａｔｒｉａｌｂａ（例えば、Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ａｓｉａｔｉｃａ）、Ｎａｔｒｉｎｅｍａ（例えば、Ｎａｔｒｉｎｅｍａ  ｐｅｌｌｉｒｕｂｒｕｍ）、Ｎａｔｒｏｎｏｒｕｂｒｕｍ（例えば、Ｎａｔｒｏｎｏｒｕ  ｂｒｕｍｂａｎｇｅｎｓｅ）、Ｓａｌａｒｃｈａｅｕｍ（例えば、Ｓａｌａｒｃｈａｅｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を含む高度好塩菌を含む。
【０１７８】
本発明の一部の実施態様では、本発明で有用な植物および／または植物細胞は、制限されないが、アマナズナ属、ダイズ属、モロコシ属、アブラナ属、アリウム属、セイヨウワサビ属、イチゴツナギ属、ヌカボ属、ドクムギ属、ウシノケグサ属、ノガリヤス属、コメススキ属、ホウレンソウ属、トウジサ属、エンドウ属、アカザ属、ヒマワリ属、アメリカボウフウ属、ニンジン属、パセリ属、ポプラ属、サクラ属、クリ属、ユーカリ属、カエデ属、カシ属、ヤナギ属、クルミ属、トウヒ属、マツ属、モミ属、アオウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウキクサ属（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ）、イネ属、トウモロコシ属またはワタ属を含み得る。他の実施態様では、植物および／または植物細胞は、制限されないが、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ａｌｙｓｓｕｍ（Ｍｉｌｌ．）Ｔｈｅｌｌ．，Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ａｎｄｒｚ．ｅｘ  ＤＣ．，Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｒｕｍｅｌｉｃａ  Ｖｅｌｅｎ．，Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（Ｌ．）Ｃｒａｎｔｚ，Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  Ｌ．Ｍｏｅｎｃｈ），Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ，Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ，Ｚｅａ  ｍａｙｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ，Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ，Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ，Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ，Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｅ，Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｇｒａｎｄｉｄｅｎｔａｔａ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ，Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ，Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ，Ｃａｓｔａｎｅａ  ｄｅｎｔａｔｅ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｓ，Ａｃｅｒ  Ｓａｃｃｈａｒｕｍ，Ａｃｅｒ  ｎｉｇｒｕｍ，Ａｃｅｒ  ｎｅｇｕｎｄｏ，Ａｃｅｒ  ｒｕｂｒｕｍ，Ａｃｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉｎｕｍ，Ａｃｅｒ  ｐｓｅｕｄｏｐｌａｔａｎｕｓ、または、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａを含み得る。追加の実施態様では、植物および／または植物細胞は、制限されないが、小麦、大麦、オート麦、芝草（ブルーグラス、ベントグラス、ライグラス、フェスキュ）、フェザーリードグラス、ヒロハノコメススキ、ホウレンソウ、ビーツ、チャード、キノア、サトウダイコン、レタス、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、アメリカボウフウ（Ｐａｓｔｉｎａｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ウキクサ、マツ、トウヒ、モミ、ユーカリ、オーク、クルミ、またはヤナギであり得る。特定の実施態様では、植物および／または植物細胞は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａであり得る。一部の代表的な実施態様では、植物および／または植物細胞は、カメリナ、小麦、米、トウモロコシ、セイヨウアブラナ、キャノーラ、ダイズ、モロコシ、トマト、竹、または綿であり得る。
【０１７９】
さらなる実施態様では、植物および／または植物細胞は、制限されないが、珪藻類（珪藻）、ハプト藻類、褐藻類（褐色の藻類）、紅藻類（紅色の藻類）または灰色藻類（紅色の藻類）を含む、藻類または藻類細胞であり得る。さらに他の実施態様では、藻類または藻類細胞の非限定の例は、Ａｃｈｎａｎｔｈｉｄｉｕｍ属、Ａｃｔｉｎｅｌｌａ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｎｕｐｅｌａ属、Ｇｅｉｓｓｌｅｒｉａ属、Ｇｏｍｐｈｏｎｅｍａ属、Ｐｌａｎｏｔｈｉｄｉｕｍ属、Ｈａｌａｍｐｈｏｒａ属、Ｐｓａｍｍｏｔｈｉｄｉｕｍ属、Ｎａｖｉｃｕｌａ属、Ｅｕｎｏｔｉａ属、Ｓｔａｕｒｏｎｅｉｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ属、Ａｍｐｈｏｒａ属、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ属、Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ属、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｇｌａｕｃｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ属、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ属、またはチノリモ属であり得る。
【０１８０】
本発明で有用な菌類の非限定の例は、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｔｉｎｅａ種、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種またはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ種を含む。代表的な実施態様では、菌類は、制限されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．  ｕｖａｒｕｍ（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔａ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｕｎｇｕｉｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、または、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｄｕｂｏｉｓｉｉを含み得る。
【０１８１】
標的遺伝子は、発現抑制または発現抑制の調節の要望がある任意の目的遺伝子であり得る。したがって、一部の実施態様では、標的遺伝子の非限定の例は、転写レギュレーター、翻訳レギュレーター、ポリメラーゼ遺伝子、代謝酵素、トランスポーター、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、ＤＮＡ複製酵素、ＤＮＡ改変または分解酵素、調節ＲＮＡ、転移ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含み得る。標的遺伝子は、例えば、細胞分裂、細胞構造、代謝、運動性、病原性または病毒性に関与する遺伝子であってもよい。他の実施態様では、本発明で有用な標的遺伝子は、機能がまだ特徴付けられていない仮説遺伝子を含んでもよい（例えば、Ｋｏｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（８）：２３５３−２３６３（２００４）を参照）。
【０１８２】
代表的な実施態様では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーターをコードするヌクレオチド配列の全部または一部、またはその相補を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。本発明者らは、標的遺伝子のプロモーターまたはその一部に相補であるスペーサーヌクレオチド配列が、本明細書に開示されるように用いた場合に、実質的な遺伝子抑制を達成することを見いだした。具体的には、どちらの鎖が標的化されたかに関わらず、実質的な遺伝子抑制が、そのようなスペーサーにより達成され得ることが見いだされた。
【０１８３】
さらなる態様では、本発明の組み換え核酸分子、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／またはヌクレオチド配列を、宿主生物の細胞内に導入することができる。本発明が有用である任意の細胞／宿主生物を用いることができる。例示的な宿主生物は、限定されないが、植物、細菌、古細菌、菌類、動物、哺乳類、昆虫、鳥類、魚類、両生類、刺胞動物、ヒト、または非ヒト霊長類を含む。さらなる実施態様では、本発明で有用な細胞は、制限されないが、幹細胞、体細胞、生殖細胞、植物細胞、動物細胞、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、刺胞動物細胞、ヒト細胞、または非ヒト霊長類細胞であり得る。したがって、一部の実施態様では、本発明の組み換え核酸分子、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、またはヌクレオチド配列を、前記細胞／生物内の標的遺伝子にとって発現抑制または発現抑制の調節が望ましい生物の細胞内に導入することができる。
【０１８４】
したがって、本開示の組み換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイを用いるための方法がさらに提供される。したがって、一部の実施態様では、標的遺伝子の発現を抑制する（転写を減少させる）ための方法が提供され、当該方法は、生物（例えば、細胞）に、本発明の組み換え核酸分子および本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを導入し、それにより、前記標的遺伝子の発現を抑制する（転写を減少させる）ステップを含む。変化するレベルの抑制が、本発明の方法によって達成され得る。したがって、任意の所定の標的遺伝子に関する抑制（例えば、サイレンシング）の程度は、目的遺伝子（例えば、標的遺伝子）を標的とするスペーサーの設計に依存し、制限されないが、目的遺伝子を標的化するために用いられるスペーサーの数（多数）、スペーサーが相補性を有する標的遺伝子上の標的ヌクレオチド配列の位置（非オーバーラップに対するオーバーラップの標的ヌクレオチド配列の数を含む）、スペーサーの長さおよび／または標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対する各スペーサーの相補性を含む。
【０１８５】
他の実施態様では、標的遺伝子の発現を抑制する（転写を減少させる）ための方法が提供され、当該方法は、生物（例えば、前記生物の細胞）に、本発明の組み換え核酸分子および本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを導入するステップを含み、ここで、生物内に導入される少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれ、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記標的遺伝子に向けられるスペーサーを有さない組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、または、そのようなスペーサーヌクレオチド配列をより多くまたはより少なく有して、それぞれが単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、前記標的遺伝子の抑制を調節する。
【０１８６】
他の実施態様では、単一の標的遺伝子に由来する異なる標的ヌクレオチド配列と相補であるスペーサーヌクレオチド配列がより少ないＣＲＩＳＰＲアレイは、生物または細胞内に導入された場合、同一の標的遺伝子に由来する異なる標的ヌクレオチド配列と相補であるスペーサーヌクレオチド配列がより多いＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、減少または低減された抑制をもたらし得る。
【０１８７】
さらなる実施態様では、単一の標的遺伝子に由来する標的ヌクレオチド配列に対してより相補でないスペーサーヌクレオチド配列は、生物または細胞内に導入された場合、同一の標的遺伝子に由来する同一の標的ヌクレオチド配列に対してより高い度合の相補性を有するスペーサーヌクレオチド配列と比較して、減少または低減された抑制をもたらし得る。またさらなる実施態様では、単一の標的遺伝子に由来する標的ヌクレオチド配列と相補である、より長いスペーサーヌクレオチド配列は、生物または細胞内に導入された場合、同一の標的遺伝子に由来する同一の標的ヌクレオチド配列と相補である、より短いスペーサーヌクレオチド配列と比較して、増大された抑制をもたらし得る。
【０１８８】
当業者が容易に理解するように、様々なスペーサーヌクレオチド配列およびＣＲＩＰＳＲアレイのデザインを、単独または互いに組み合わせて、および、単一または多数のＣＲＩＳＰＲアレイにおいて用いて、単一または多数の標的遺伝子において達成される抑制の量またはレベルの有意な柔軟性を提供することができる。したがって、例えば、スペーサーの総数、ならびに、各スペーサーの長さ、標的遺伝子内の位置、および／または、相補性の程度を、単独または組み合わせで、任意の他のスペーサー／ＣＲＩＳＰＲアレイのデザインとともに用いて、標的遺伝子の抑制の所望のレベルを提供することができる。
【０１８９】
さらに他の実施態様では、生物において少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制する（転写を減少させる）ための方法が提供され、当該方法は、本発明の組み換え核酸分子および本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを生物内に導入するステップを含み、ここで、少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれが、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記生物において少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制する。当業者に容易に理解されるように、本明細書に記載のスペーサーおよびＣＲＩＳＰＲアレイのデザインの任意の組み合わせおよびそれらのバリエーションを用いて、前記２つの遺伝子の発現を抑制することができ、および／または、発現の抑制を調節することができる。
【０１９０】
一部の実施態様では、ゲノム配列を標的化するためのスペーサーヌクレオチド配列をデザインするために、まずは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる一組のヌクレオチド配列に隣接する目的遺伝子の領域（例えば、標的ヌクレオチド配列）を同定する。このモチーフは、したがって、その領域に相補である結果としてスペーサー配列が結合する領域の隣の標的遺伝子内に見られ、そして、スペーサーヌクレオチド配列との塩基対合が始まるポイントを同定する。Ｉ型システムについては、ＰＡＭは、スペーサーにマッチする配列に対してすぐ５’に位置し、したがって、スペーサーヌクレオチド配列と塩基対合する配列に対して３’である。ＰＡＭの非限定の例は、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＣＡ、ＴＴＣ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ、および／またはＣＣを含む。
【０１９１】
一部の実施態様では、本明細書に開示される組み換え核酸分子によりコードされるポリペプチドは、タンパク質複合体として導入され得る。したがって、一部の実施態様では、タンパク質複合体は、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅ由来のポリペプチドの群の任意のサブセットを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。他の実施態様では、タンパク質複合体は、（ａ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチド、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチド、および、Ｃａｓ５ｄポリペプチド（Ｉ−Ｂ型）；（ｂ）Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチド、および、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチド（Ｉ−Ｃ型）；（ｃ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチド、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチド、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチド、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチド、および、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチド（Ｉ−Ｅ型）；（ｄ）Ｃｙｓ１ポリペプチド、Ｃｙｓ２ポリペプチド、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチド、および、Ｃａｓ６ｆポリペプチド（Ｉ−Ｆ型）；（ｅ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはａＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、および、ヌクレアーゼ活性がないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ−Ａ型）；または（ｆ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、および、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ−Ｄ型）を、含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。したがって、一部の実施態様では、タンパク質複合体およびＣＲＩＳＰＲアレイは、無細胞系、細胞および／または生物内に導入される。一部の実施態様では、前記タンパク質複合体およびＣＲＩＳＰＲアレイは、別個に、またはリボ核タンパク質として一緒に導入される。
【０１９２】
したがって、さらなる実施態様では、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイおよびタンパク質複合体を含む、から本質的になる、またはからなる、リボ核タンパク質複合体は、無細胞系、細胞および／または生物内に導入することができる。一部の実施態様では、タンパク質複合体／リボ核タンパク質複合体は、遺伝子を一時的に抑制するために送達され得て、それにより、標的遺伝子の抑制の所望のレベルを達成するためのさらに有利な方法を提供する。
【０１９３】
したがって、またさらなる実施態様では、組み換え核酸分子によりコードされるポリペプチドは、タンパク質複合体、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはリボ核タンパク質複合体として送達され得る。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＤＮＡまたはＲＮＡとして送達され得る。
【０１９４】
さらなる態様では、本発明は、細菌または古細菌の標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供し、以下を含む：細菌または古細菌において内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を破壊するステップ、ここで、破壊された内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列は存在しない、または存在するが発現しない、および／または、発現するが非機能性である；および、前記細菌または古細菌内に、本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイまたは本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターを導入して、それにより、前記細菌または標的遺伝子の発現を抑制するステップ。
【０１９５】
またさらなる態様では、本発明は、細菌または古細菌の標的遺伝子の発現の抑制を調節する方法を提供し、以下を含む：細菌または古細菌において内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を破壊するステップ、ここで、破壊された内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列は存在しない、または存在するが発現しない、および／または、発現するが非機能性である；および、前記細菌または古細菌内に、本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイまたは本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターを導入するステップ、ここで、前記の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれが、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記標的遺伝子に向けられるスペーサーを有さないＣＲＩＳＰＲアレイ、または、より多くまたはより少ないそのようなスペーサーヌクレオチド配列を有しそれぞれが単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む、細菌または古細菌内の同一の標的遺伝子と比較して、前記細菌または古細菌の標的遺伝子の抑制を調節する。
【０１９６】
さらなる実施態様では、本発明は、細菌または古細菌の標的遺伝子の少なくとも２つの遺伝子の発現を抑制する方法を提供し、以下を含む：細菌または古細菌において内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列を破壊するステップ、ここで、破壊された内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列は存在しない、または存在するが発現しない、および／または、発現するが非機能性である；および、前記細菌または古細菌内に、本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイまたは本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターを導入するステップ、ここで、前記の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、それぞれが、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含み、それにより、前記細菌または古細菌の少なくとも２つの標的遺伝子の発現を抑制する。
【０１９７】
一部の実施態様では、本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイまたは本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターは、前記細菌または古細菌内に、前記内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列の破壊と同時に導入され得る。他の実施態様では、本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイまたは本発明の少なくとも１つの組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターは、前記細菌または古細菌内に、内因性ｃａｓ３ヌクレオチド配列の破壊後に導入され得る。一部の実施態様では、前記細菌または古細菌は、内因性Ｃａｓｃａｄｅを含む。さらなる実施態様では、少なくとも１つの異種プロモーターは、細菌または古細菌内に導入されて、前記内因性Ｃａｓｃａｄｅに動作可能に連結される。代表的な実施態様では、前記異種プロモーター（単数または複数）は、例えば、相同組み換えを介して、内因性ｃａｓ３の破壊と同時に導入される。
【０１９８】
本明細書において用いられる「破壊する（ｄｉｓｒｕｐｔ）」、「破壊された（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）」または「破壊する（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）」および／または他の文法的変更は、ｃａｓ３ヌクレオチド配列が突然変異され、または、Ｃａｓ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列が存在しないか、または、Ｃａｓ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は存在するが、Ｃａｓ３タンパク質が生産されない、または生産されて非機能性であるかの、いずれかであるように、それ以外の方法で変更されることを意味する。
【０１９９】
ｃａｓ３ヌクレオチド配列の破壊は、ヌクレオチド配列を変更または突然変異させるための、当業者に公知の任意の方法により達成され得る。そのような方法は、限定されないが、点突然変異の作製（例えば、ミスセンス、またはナンセンス、または、フレームシフトをもたらす単一塩基対の挿入または欠失）、挿入、欠失、および／またはトランケートを含む。
【０２００】
一部の実施態様では、破壊は、ｃａｓ３ヌクレオチド配列全体、またはその一部（例えば、１％〜９９％、またはその中の任意の値または範囲）の除去または欠失をもたらす。代表的な実施態様では、ｃａｓ３遺伝子をコードするヌクレオチド配列全体は、例えば、相同組み換えにより欠落される。特定の実施態様では、破壊は、未熟な翻訳終了、未熟な転写終了、エンドヌクレアーゼ触媒部位の破壊、または、タンパク質の正しいフォールディングを不安定化または妨げる突然変異をもたらし得て、ここで、ｃａｓ３ポリペプチドは生産されず、または、非機能性ｃａｓ３ポリペプチドが生産される。内因性遺伝子を突然変異または他の方法で変更するための方法は、当該分野でよく知られていて、本発明の方法と容易に用いて、内因性ｃａｓ３ポリペプチドを有さない、または非機能性ｃａｓ３ポリペプチドを有する、細菌または古細菌を生産することができる。
【０２０１】
本明細書において用いられる「非機能性Ｃａｓ３ポリペプチド」は、ヌクレアーゼ活性が低い、または無い、Ｃａｓ３ポリペプチドである。「ヌクレアーゼ活性が低い、または無い」とは、破壊されたｃａｓ３ポリペプチドが、野生型／非破壊のＣａｓ３ポリペプチドと比較して、約１０％またはそれ未満の活性（例えば、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％、またはその中の任意の値または範囲）を示すことを意味する。さらに、本明細書において用いられる、非機能性Ｃａｓ３ポリペプチドは、約１０℃〜約１２５℃、またはその中の任意の値または範囲を含む幅広い範囲の温度にわたって、ヌクレアーゼ活性が低い、または無い。したがって、本明細書において定義される非機能性Ｃａｓ３ポリペプチドは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、および／または１２５℃の温度で活性が低い〜無いＣａｓ３ポリペプチドである。したがって、一例として、本発明の破壊されたＣａｓ３ポリペプチドは、３０℃で活性だが４２℃で不活性であるｃａｓ３ポリペプチドを含む。
【０２０２】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法での使用のためのキットに関する。キットは、本発明の組み換え核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ヌクレオチド配列および／またはベクター／発現カセットを、細胞内への導入および／または対象への投与に適切な形態で含み得る。キットは、他の治療剤、担体、バッファー、容器、投与のためのデバイスなどをさらに含み得る。キットは、標的遺伝子の発現抑制および／または標的遺伝子の発現抑制の調節のためのラベルおよび／または説明書をさらに含み得る。そのようなラベルおよび／または説明書は、例えば、組み換え核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ヌクレオチド配列および／またはベクター／発現カセットの導入および／または投与の量、頻度および方法に関する情報を含み得る。
【０２０３】
したがって、一態様では、少なくとも１つの標的ヌクレオチド配列の発現を抑制するためのキットが提供され、前記キットは、本発明の組み換え核酸分子、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または、前記の本発明の組み換え核酸分子および／または本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターを含む、から本質的になる、からなる。
【０２０４】
一部の実施態様では、少なくとも１つの標的遺伝子の抑制を調節するためのキットが提供され、キットは、本発明の組み換え核酸分子、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または、前記の本発明の組み換え核酸分子および／または本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクター含み、から本質的になり、からなり、ここで、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、から本質的になり、からなり、それぞれが、単一の標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０５】
追加の実施態様では、キットは、少なくとも２つの標的遺伝子の抑制を調節するために提供され、キットは、本発明の組み換え核酸分子、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または、前記の本発明の組み換え核酸分子および／または本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイを含む発現カセットまたはベクターを含み、から本質的になり、からなり、ここで、組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも２つのスペーサーヌクレオチド配列を含み、から本質的になり、からなり、それぞれ、異なる標的遺伝子由来の異なる標的ヌクレオチド配列に相補であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０６】
一部の実施態様では、前記キットの組み換え核酸分子および組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、単一のベクターまたは発現カセット上に、または、別個のベクターまたは発現カセット上に、含まれる。さらなる実施態様では、キットは取扱説明書を含む。
【０２０７】
ここで本発明は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は本発明に対する請求項の範囲を限定することを意図しないが、特定の実施態様の例示であることが意図されることが、理解されるべきである。当業者が想到する例示された方法における任意の変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
【実施例】
【０２０８】
実施例１．方法
相同組み換えおよびＰ１形質導入を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３のゲノムならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５のゲノムのｃａｓ３遺伝子をノックアウトし、構成的プロモーターをｃａｓＡＢＣＤＥオペロンの上流に配置した。このことは、Ｃａｓ３タンパク質が完全に存在しない一方で、Ｃａｓｃａｄｅ複合体（５つのＣａｓタンパク質ＣａｓＡ、ＣａｓＢ、ＣａｓＣ、ＣａｓＤ、およびＣａｓＥからなる）は構成的に発現されることを確認した。
【０２０９】
蛍光レポータープラスミド、ｐＵＡ６６ｌａｃＺを標的とするようにスペーサーを設計した。このプラスミドは、ｌａｃＺプロモーターの制御下で蛍光ＧＦＰタンパク質を発現する。スペーサーを、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列−−ＡＧＧまたはＡＡＧのいずれか−−を配置して、３’末端の隣接３０ヌクレオチドを選択することにより設計した。スペーサーは、プロモーター、非翻訳領域、およびコード領域を含む異なる目的位置をカバーするように選択した。ＤＮＡのコード鎖および非コード鎖の両方をターゲットとした。
【０２１０】
各スペーサーを、発現ベクターｐＣＲＩＳＰＲ内にクローン化した。このベクターは、最小のＣＲＩＳＰＲアレイ：プロモーター、単一リピート、およびターミネーターを含む。ベクターは、多数のスペーサーが単一のＣＲＩＳＰＲアレイから発現され得るように、スペーサーの連続的な導入を可能にする。作動するスペーサーを用いて、Ｃａｓｃａｄｅ（例えば、組み換え核酸分子）を、ｐＵＡ６６ｌａｃＺのＤＮＡに結合してＧＦＰの発現レベルを減少させる、したがって蛍光を減少させるように方向付けた。プラスミドｐＵＡ６６ｌａｃＺおよびｐＣＲＩＳＰＲを、ＢＷ２５１１３Δｃａｓ３内に共形質転換した。示されたスペーサーを有するｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを保有する細胞を、０．４％グリセロールおよび０．２％カザミノ酸で補充されたＭ９最小限培地中で増殖させて、同一の培地中にバック希釈し、そして、対数期中間まで６時間増殖させた。それから、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター上で蛍光を測定した。
【０２１１】
フローサイトメトリーを用いて、転写抑制のレベルを、蛍光の減少を測定することにより定量化した。いかなる抑制も存在しない場合、ｐＵＡ６６ｌａｃＺは強い蛍光を生じる。
【０２１２】
Ｌ−アラビノース（ａｒａＢＡＤ）、Ｄ−キシロース（ｘｙｌＡＢ）、およびラクトース（ｌａｃＺＹＡ）の異化作用を担う３つの内因性オペロンのプロモーターを標的にするように、スペーサーをさらに設計した。ｐＣＲＩＳＰＲまたはスペーサーをコードするプラスミドを保有する形質導入ＭＧ１６５５細胞を、グリセロールで補充されたＭ９培地中で２４時間増殖させ、示された炭素源で補充されたＭ９培地中に、０．００１のＡＢＳ６００までバック希釈し、そして、３７℃で２２時間培養した。それから、各培養の最終的なＡＢＳ６００値を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ分光光度計を用いて測定した。
【０２１３】
実施例２．データ
図１に示されるのは、ｌａｃＺプロモーターの制御下で蛍光ＧＦＰポリペプチドをコードするプラスミドｐＵＡ６６ｌａｃＺ内の関心領域である。長い緑の矢印は、ｇｆｐのコード領域を示す。細い黒の矢印は、黒で概説されたプロモーターの−３５および−１０エレメントを有する転写の開始を示す。上の各スペーサーは、上鎖またはコード鎖とマッチする（したがって、下鎖または非コード鎖と結合する）。同様に、下のスペーサーは、下鎖または非コード鎖とマッチする（したがって、上鎖と結合する）。確立されたＰＡＭ  ＡＡＧまたはＡＧＧは各プロトスペーサーの５’末端に位置する。
【０２１４】
図２は、プラスミドｐＵＡ６６ｌａｃＺを保有する形質導入ＭＧ１６５５細胞での、蛍光ＧＦＰタンパク質の転写抑制を示すグラフを提供する。Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ  ｗ．ｒ．ｔ．  ｐＣＲＩＳＰＲは、いずれのスペーサーも欠くｐＣＲＩＳＰＲに対するｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅを意味する。フローサイトメトリー実験をトリプリケートで行なった。抑制比（ｆｏｌｄ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を計算するために、各スペーサーに関する蛍光の中央値を平均して、バックグラウンドの自己蛍光を除去した。次に、蛍光を、いかなるスペーサーもコードしないオリジナルのｐＣＲＩＳＰＲに対して比較した。例えば、ｐＣＲＩＳＰＲコントロールは７３３２  ＡＵを記録し、ｌａｃ１は５６  ＡＵを記録した；これは、１３１−ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅに相当する。
【０２１５】
図３は、異なる内因性糖利用オペロンを標的化するスペーサーを有するプラスミドを保有する形質導入ＭＧ１６５５細胞の培養物の光学濃度、および、示された糖での培養物の増殖に対して生じる影響の、棒グラフを提供する。グリセロールを、異化作用がいかなるスペーサーによっても影響されないネガティブコントロールとして用いた。単一の実験を、増殖アッセイに関して行なった。測定したＡＢＳ６００値をレポートする。
【０２１６】
実施例３．結果および結論
データは、本発明が期待した通りに働くことを確証する；Ｃａｓ３の不存在下で、ＣａｓｃａｄｅはＤＮＡに結合して、可変レベルの転写抑制を誘発する。概念の原理証明に加えて、我々は（１）−３５／−１０領域（ｌａｃ１／ｌａｃ２）内のプロモーターの標的化は、最も強い抑制を誘発すること、および（２）転写領域内で、コードＤＮＡ鎖に結合するスペーサーは、非コードＤＮＡ鎖に結合するスペーサーよりも強いサイレンシングを示すことも見いだした。内因性糖利用遺伝子の標的化は、関係がある糖での無視できる増殖を導くことがさらに見いだされた。これらのデータは、本発明が内因性遺伝子の発現を抑制することもできて、期待される表現型を導くことを示す。
【０２１７】
実施例４．スペーサー長を介した抑制の調節。
Ｅ．ｃｏｌｉスペーサーの長さを変更して、抑制の程度に対する長さの変化の影響を測定した。オリジナルのスペーサーは、３２ヌクレオチドの長さを有した。この研究では、スペーサー長を、６、８、１０または１２ヌクレオチド増大させ、または６ヌクレオチド低減させた。構築物を図１２Ａに示す。結果を図１２Ｂに示す。ここで、増大した長さは抑制の増大をもたらし、一方で、低減した長さは、抑制を廃止した。
【０２１８】
実施例５．スペーサー長および相補性の程度の変更による、遺伝子サイレンシングの調節。
ｐＵＡ６６ｌａｃＺのプロモーターを標的とする２つの報告されたスペーサーを用いて、我々は、１５ｎｔおよび４０ｎｔの間でスペーサーの長さを変更する。また、我々は、これらのスペーサーに関する相補性の程度を、３２−ｎｔのスペーサー全体にわたって、ならびに最初の８ｎｔ（５’末端で始まる）内で、５０％および１００％の間で変更する。各スペーサーは、ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド内で、同一のリピート配列（ＧＡＧＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＣＧ、配列番号７３）が両側に隣接する。長さおよび相補性の程度の減少は、ＧＦＰ発現の程度を減少させることが示される。
【０２１９】
実施例６．異種発現を介した遺伝子サイレンシング
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５由来のｃａｓＡＢＣＤＥオペロンは、ネイティブのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム全体が相同組み換えにより欠落されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株では、ｐＣＤＦ−１ｂプラスミドから発現される（ｗｉｌｌ  ｂｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｆｆ  ｏｆ）。また、その株は、スペーサーがないか、またはｌａｃＺ−標的化スペーサーを有するかのいずれかの、ｐＵＡ６６ｌａｃＺプラスミドおよびｐＣＲＩＳＰＲプラスミドも保有する。我々はそれから、それぞれの株においてＧＦＰ発現を測定し、ここで我々は、ｃａｓＡＢＣＤＥオペロンおよびｌａｃＺ−標的化スペーサーを発現する株は、オペロンまたはｌａｃＺ−標的化スペーサーを発現しない株と比較して、減少した発現を示すことを期待する。これは、Ｉ−Ｅ型システム由来の遺伝子の異種発現を介した遺伝子サイレンシングを示す。
【０２２０】
実施例７．同一または異なる遺伝子の多重標的化
ｐＵＡ６６ｌａｃＺ由来の発現を減少することが既に示された２〜４個のスペーサーを、ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド内の単一のアレイ内に組み合わせる（例えば、３個のスペーサーについてはリピート−スペーサー１−リピート−スペーサー２−リピート−スペーサー３−リピート）。加えて、我々は、他のスペーサーの１つとオーバーラップする標的を有するスペーサーを統合して試験する。我々はそれから、それぞれの株についてＧＦＰ発現を測定する。我々は、ＧＦＰ発現が、非オーバーラップスペーサーの添加により低減し、オーバーラップスペーサーの添加により増大することを期待する。加えて、我々は、糖利用オペロン（ａｒａＢＡＤ、ｌａｃＺＹＡ、ｘｙｌＡＢ）を標的化する３個のスペーサーを、ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド内の単一アレイ中に組み合わせる。このプラスミドまたはオリジナルのｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを保有する形質導入Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株を、それぞれ関係がある糖（Ｌ−アラビノース、ラクトース、Ｄ−キシロース）またはグルコースで、Ｍ９最小限培地中で増殖させる。我々の期待は、３個のスペーサーを有するｐＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ｌ−アラビノース、ラクトース、およびＤ−キシロースでの増殖が減少するが、グルコースでは減少しないことである。サイレンシングは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより確認される。これらの実験は、調節されたサイレンシングまたは多数遺伝子のサイレンシングのための、単一アレイ中の多数のスペーサーの使用を示す。
【０２２１】
実施例８．触媒的に死活したＣａｓ３
Ｃａｓ３触媒活性を不活化する、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５のｃａｓ３遺伝子内の点突然変異を導入する。これらの点突然変異、Ｄ７５ＡおよびＤ２２９Ａは、Ｃａｓ３の活性部位に位置する。生じる遺伝子は、ｐＣＤＦ−１ｂプラスミド上にコードされる。ネイティブのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが欠落されて、ｐＵＡ６６ｌａｃＺおよび確証されたｌａｃＺ−標的化スペーサーのうちの１つをコードするｐＣＲＩＳＰＲプラスミドとともにこのプラスミドを保有する、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株。我々はそれから、オリジナルのｐＣＤＦ１−ｂプラスミドを有する株とともに、この株について、フローサイトメトリー分析によりＧＦＰ発現を測定する。我々の期待は、不活性Ｃａｓ３を有する株またはＣａｓ３を有さない株が、同様レベルのＧＦＰを産生することである。
【０２２２】
実施例９．ＣＲＩＳＰＲアレイ内のスペーサー位置
アレイ内のスペーサーの位置がその抑制効率に影響を与えるかどうか試験するために、我々は、ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド内に３個の非標的化スペーサーおよび１つの確証されたｌａｃＺ−標的化スペーサーを有する４−スペーサーアレイをコードさせる。各アレイは、アレイ内の異なる位置にｌａｃＺ−標的化スペーサーを含む。ｐＵＡ６６ｌａｃＺおよび各ｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを保有する形質導入Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を定量することにより試験する。抑制レベルを比較することにより、我々は、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のどの位置が最も強い抑制を誘発するか、または、その位置が無関係であるかどうか、比較することができる。
【０２２３】
実施例１０．他のＩ型システム
Ｅ．ｃｏｌｉでのＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いたこのアプローチは、他のＩ型システムに一般化される。根拠は、ｃａｓ３は、Ｃａｓｃａｄｅにより結合されたＤＮＡを切断および分解する保存された機能を有する全てのＩ型システム（Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−Ｄ、Ｉ−Ｅ、Ｉ−Ｆ）と関連するシグネチャ遺伝子であるということである。他のＩ型システムが転写抑制を達成する傾向をさらに探るために、我々は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓにおけるＩ−Ｃ型システム、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍにおけるＩ−Ｆ型システム、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘにおけるＩ−Ｂ型システム、および、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉにおけるＩ−Ｄ型システムを調べる。我々は、ｐＣＤＦ−１ｂおよびｐＲＳＦ−１ｂ発現ベクター内にオペロンとして各システム由来のＣａｓｃａｄｅを含む遺伝子をコードさせる。それから、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、各システムをコードするプラスミドおよびオリジナルのｐＣＲＩＳＰＲプラスミドまたはネイティブのシステム由来のリピートが隣接するスペーサーをコードするｐＣＲＩＳＰＲプラスミドで形質転換する。スペーサーは、ネイティブのシステムに由来するＰＡＭを用いて、ｘｙｌＡプロモーターを標的にするように設計される。我々はそれから、増殖およびｘｙｌＡＢ発現（ｑＲＴ−ＰＣＲにより）を評価する。我々は、各システムをコードしてｘｙｌＡプロモーターを標的とする細胞が、キシロースで増殖が不十分であることを期待する。そして、減少したｘｙｌＡＢ発現の減少を示した。
【０２２４】
実施例１１．古細菌
また、古細菌でのＩ型システムを用いた転写サイレンシングが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＣＯＭ１を用いて研究される。はじめに、我々は、Ｉ−Ｂ型システムと関連するネイティブのｃａｓ３遺伝子（ＰＦＣ＿０４８２０）を、Ｐｇｄｈ−ｐｙｒＦ遺伝子の相同組み換えおよびウラシルを含む規定培地上での選択とその後の５’ＦＯＡでの増殖によるｐｙｒＦ遺伝子の除去により、欠落させる。Ｉ−Ａ型システムと関連するｃａｓ３’（ＰＦＣ＿０２３３０）およびＣａｓ３’’（ＰＦＣ＿０２３３５）遺伝子もまた、同一のアプローチを用いて欠落される。我々はそれから、ｇｄｈ遺伝子（ＰＦＣ＿００６７０）または２−水素酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＰＦＣ＿００９１５）のプロモーターを標的とする、ネイティブのリピート配列（ＧＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＡＣＴＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧ、配列番号７４）が両側に隣接する３０−ｎｔスペーサーをコードさせる。５’ＣＣＮ  ＰＡＭを有するプロトスペーサーで、スペーサーを試験する。各構築物は、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質（ｓｌｐ）プロモーターにより駆動され、ｐｙｒＦとともにゲノム内に組み込まれる。我々はそれから、標的化スペーサーおよび非標的化スペーサーについて、ｑＲＴ−ＰＣＲによって各標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する。我々は、ｃａｓ３を欠くＣＯＭ１株ならびにｃａｓ３、ｃａｓ３’、およびｃａｓ３’’を欠く株において、いずれかの遺伝子のｍＲＮＡレベルを実質的に減少させることを期待した。
【０２２５】
実施例１２．真核生物
真核生物における転写サイレンシングは、Ｂａｋｅｒ’の酵母およびＨｅｌａ細胞を例示的な宿主として用いて試験される。合成のＣＲＩＳＰＲアレイおよびＥ．ｃｏｌｉにおけるＩ−Ｅ型システム由来のＣａｓｃａｄｅ遺伝子（ｃａｓＡ、ｃａｓＢ、ｃａｓＣ、ｃａｓＤ、ｃａｓＥ）を、各宿主について標準的な発現ベクター内にコードし、各遺伝子は、別個のプロモーターおよびターミネーター（例えば、各遺伝子についてＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡテール）から個々に発現される。また、我々は、発現構築物を単純化するために、２つの転写産物内の多数の遺伝子を、間にあるＩＲＥＳ配列および自己切断ペプチド配列を用いてコードさせる。構築物を、ＧＦＰを安定して発現する細胞株へ形質転換する。アレイは、異種ＧＦＰプロモーターを標的化するように設計された１、２、または３個の３２−ｎｔスペーサー、ならびに、コード領域をコードする。フローサイトメトリー分析を用いて抑制の程度を測定する。ＣＲＩＳＰＲアレイおよびＣａｓｃａｄｅ遺伝子を発現する細胞株において、ＧＦＰ蛍光が低減することが期待される。
【０２２６】
実施例１３．株およびプラスミド構築
以下の表１は、用いたＥ．ｃｏｌｉ株のリストを提供する。
【表１】
2017512481.tif 000003
【０２２７】
ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔおよびＭＧ１６５５  Δｃａｓ３：：ｃａｔを作製するために、合成の構成的プロモーターＪ２３１１９（ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒｔｓ，ｗｗｗ．ｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇにおけるＢＢａ＿Ｊ２３１１９）を付加するオリゴヌクレオチドを用いて、ｃａｔ抵抗性カセットを、ｐＫＤ３プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，６６４０−６６４５）からＰＣＲ増幅した（Ｊ２３１１９−ｐＫＤ３．ｆｏｒ，Ｊ２３１１９−ｐＫＤ３．ｒｅｖ）。ホモロジーアームを導入するための第二のＰＣＲ増幅（ＨＲ−ｃａｓ３．ｆｏｒ，ＨＲ−ｃａｓ３．ｒｅｖ）の後に、生じたＰＣＲ産物を、ミニ−λ−介在の組み換え（Ｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ，３１５，６３−６９）によってＮＭ５００に組み換えた。挿入は、Ｃａｓｃａｄｅオペロンに関するネイティブのｃａｓ３遺伝子およびネイティブのプロモーターを、ｃａｔカセットおよびＪ２３１１９プロモーターと置き換えた。成功的な組み換えをシーケンシングにより確認した。それから、Ｐ１形質導入を用いて、ｃａｔカセットおよび合成のプロモーターを、ＢＷ２５１１３およびＭＧ１６５５へ移行させた。成功的な形質導入をＰＣＲにより確認した。ＢＷ２５１１３Δｃａｓ３を作製するために、ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔ由来のｃａｔカセットを、以前に記載のｐＣＰ２０プラスミド（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ，１５８，９−１４）を用いて切除した。ＮＭ５００  ｃａｓ３＋を作製するために、構成的プロモーターＪ２３１１９を付加するオリゴヌクレオチドを用いて、ｃａｔ抵抗性カセットを、ｐＫＤ３プラスミドからＰＣＲ増幅した（Ｊ２３１１９−ｐＫＤ３．ｆｏｒ，ＨＲ−ｃａｓＡ．ｒｅｖ）。ホモロジーアームを導入するための第二のＰＣＲ増幅（ＨＲ−ｃａｓ３．ｆｏｒ，ＨＲ−ｃａｓＡ．ｒｅｖ）の後に、生じたＰＣＲ産物をＮＭ５００へ組み換えた。このＮＭ５００  ｃａｓ３＋株は、ネイティブのｃａｓ３遺伝子を保持しながら、Ｃａｓｃａｄｅオペロンに関するネイティブのプロモーターを構成的プロモーターと置き換える。ＢＷ２５１１３  ΔＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ：：ｃａｔを作製するために、ｃａｔ抵抗性カセットをｐＫＤ３プラスミドからＰＣＲ増幅して（ＨＲ−ＣＲＩＳＰＲ．ｆｏｒ，ＨＲ−ｃａｓ３．ｒｅｖ）、ＮＭ５００へ組み換え、その後にＢＷ２５１１３へＰ１形質導入した。このＢＷ２５１１３  ΔＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座全体、ならびに、ｃａｓ３、Ｃａｓｃａｄｅオペロン、およびＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座を除去する。
【０２２８】
本研究で用いた全てのプラスミドのリストについては、以下の表２参照。
【表２−Ａ】
2017512481.tif 000004
【表２−Ｂ】
2017512481.tif 000005
【０２２９】
ＧＦＰレポータープラスミドは、ｐＵＡ６６プラスミドに基づいていて（低コピーｓｃ１０１複製起点）（Ｚａｓｌａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，６２３−６２８）、先行研究で報告された（Ａｆｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．（印刷中）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｇａｒ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｇｉｖｅｓ  ｒｉｓｅ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）。アラビノース−誘導性ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄプラスミド（中コピーｐＢＲ３２２複製起点）を構築するために、オリゴヌクレオチドを、単一リピートおよび合成ｒｈｏ−非依存性ターミネーターをコードするように設計した（ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒｔｓにおけるＢＢａ＿Ｂ１００６）（ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄ．ｆｏｒ，ｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄ．ｒｅｖ）。これらのオリゴヌクレオチドをアニールして、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて５’リン酸化して、ＫｐｎＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦで消化したｐＢＡＤ１８プラスミドにライゲーションした。構成的に発現されるｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎプラスミドを構築するために、合成の構成的プロモーターＪ２３１１９をコードするオリゴヌクレオチド（ｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎ．ｆｏｒ，ｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎ．ｒｅｖ）をアニールして、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて５’リン酸化して、ＮｓｉＩおよびＮｈｅＩで消化したｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄプラスミドにライゲーションした。挿入は、ａｒａＣ遺伝子およびＰａｒａＢプロモーターを、合成の構成的プロモーターで置き換えた。新しいリピート−スペーサーペアをｐｃｒＲＮＡ．ｃｏｎまたはｐｃｒＲＮＡ．ｉｎｄに挿入するために、回文のリピートおよびｃｒＲＮＡスペーサーをコードするオリゴヌクレオチドをアニールして、ＰＮＫを用いて５’リン酸化して、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化したいずれかのプラスミドにライゲーションした。クローニングスキームの説明については図６を参照。
【０２３０】
全てのプラスミドクローニングを、シーケンシングにより確認した。本研究で用いたオリゴヌクレオチドのリストについては以下の表３を参照。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴにより化学的に合成された。全ての酵素はＮＥＢから購入した。
【０２３１】
【表３−Ａ】
2017512481.tif 000006
【表３−Ｂ】
2017512481.tif 000007
【表３−Ｃ】
2017512481.tif 000008
【０２３２】
増殖条件
全ての株を、５ｍｌまでのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）または０．４％グリセロール、０．２％の示された糖、および０．２％カザミノ酸のいくつかの組み合わせを含むＭ９最小限培地（１×Ｍ９塩類、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０μｇ／ｍｌチアミン）中、３７℃および２５０ＲＰＭで、１４ｍｌ丸底ポリプロピレンチューブ内で培養した。全ての株を、１００×１５ｍｍポリスチレンペトリ皿に、ＬＢ寒天（１．２％寒天を含むＬＢ培地）上にプレーティングした。任意のプラスミドを維持するために、適切な抗生物質を以下の濃度で含む液体培地中または寒天プレート上で細胞を培養した：５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン。
【０２３３】
スペーサー設計
本研究で標的化したプロトスペーサーのリストについては、以下の表４を参照。
【表４】
2017512481.tif 000009
【０２３４】
プロトスペーサーは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩ−Ｅ型システム（Ｗｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、４６，５９５−６０５）に関するＰＡＭ（標的配列の３’末端に位置するＣＴＴ、ＣＣＴ、ＣＡＴ、ＣＴＣ）を同定することにより選択した。ＣＴＴおよびＣＣＴのみが、これらのＰＡＭ配列での我々の以前の経験に基づいて（Ｇｏｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ｍＢｉｏ，５，ｅ００９２８−００９１３）、本研究において用いられたことは、注目に値する。それから、ＰＡＭのすぐ下流の３２個のヌクレオチドを、スペーサーとして用いた。クローニングスキームは、ｃｒＲＮＡ活性に影響を与えないと思われる（Ｓｅｍｅｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８，１００９８−１０１０３）、スペーサーの最後の２個のヌクレオチドをＴＣに変更することを要した（図６）。
【０２３５】
形質転換アッセイ
形質転換アッセイは、先行研究（Ｇｏｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ｍＢｉｏ，５，ｅ００９２８−００９１３）と同様に行なった。手短には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔまたはＮＭ５００  ｃａｓ３＋細胞を、ＬＢ培地中で一晩培養した。培養物を、１２５ｍｌ三角フラスコ内の２５ｍｌのＬＢ培地中に１：２５でバック希釈して、０．６〜０．８のＡＢＳ６００まで培養し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化した。それから細胞を氷冷１０％グリセロール中で洗浄し、１００倍に濃縮した。合計５０μｌの濃縮細胞を、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０ｎｇのプラスミドＤＮＡで形質転換した。形質転換された細胞を、５００μｌのＳＯＣ培地中、３７℃で１時間回復させた。回復期間後、細胞を、１０４〜１０６倍に希釈して、２５０μｌの希釈物を、適切な抗生物質および誘導物質を含むＬＢ寒天上にプレーティングした。
【０２３６】
フローサイトメトリー分析
０．２％カザミノ酸および０．４％グリセロールを含むＭ９最小限培地で一晩増殖した細胞を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．２％の示された誘導糖の特定の組み合わせを含むＭ９最小限培地へ、０．０１のＡＢＳ６００までバック希釈した。約３〜４時間の増殖後、約０．２のＡＢＳ６００に到達時に、培養物を１×ＰＢＳ中に１：１００希釈して、ＣＦｌｏｗプレートサンプラー、４８８ｎｍレーザー、および、５３０±１５ｎｍバンドパスフィルターを具備するＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を実行した。細胞を反映するイベントを、それぞれ、より低い１１，５００および６００のカットオフでの前方散乱（ＦＳＣ−Ｈ）および側方散乱（ＳＳＣ−Ｈ）に基づいてゲートして、微粒子の測定を減少させた。ゲートは、ＤＲＡＱ５色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色したＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いてセットした。それから、ゲートされた細胞の蛍光を、ＦＬ１−Ｈにおいて測定した。少なくとも３０，０００イベントを、各サンプルについて分析した。
【０２３７】
可逆性実験のために、細胞を、０．２％カザミノ酸、０．４％グリセロール、および０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＭ９最小限培地中で、０．２％Ｌ−アラビノースを用いて、または用いずに、一晩増殖させた。一晩の培養物をペレットにして、０．２％カザミノ酸、０．４％グリセロール、および０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＭ９最小培地中に２回再懸濁して、残りのＬ−アラビノースを除去した。それから、洗浄した培養物を、それぞれ、０．２％Ｌ−アラビノースを含まないまたは含む３０ｍｌの同一培地中に、約０．００１のＡＢＳ６００までバック希釈した。一時間ごとに、８００μｌの培養物を、フローサイトメトリー分析およびＡＢＳ６００の測定のために取り出した。
【０２３８】
倍加時間測定
０．４％グリセロールを含むＭ９最小限培地中で細胞を一晩増殖させた。一晩の培養物をペレットにして、炭素源を含まないＭ９最小限培地中で２回再懸濁した。それから、洗浄した培養物を、１２５ｍｌ三角フラスコ内で、０．２％の示された糖を含む２５ｍｌのＭ９最小限培地中に、約０．００１のＡＢＳ６００までバック希釈した。３０分ごとに、８００μｌの培養物をＡＢＳ６００の測定のために取り出した。
【０２３９】
定量リアルタイムＰＣＲ
細胞を、０．２％カザミノ酸および０．４％グリセロールを含むＭ９最小限培地中で一晩増殖させた。一晩培養物を、０．２％カザミノ酸、０．４％グリセロール、および０．２％の示された糖を含むＭ９最小限培地中に、１：２５０でバック希釈した。培養物が約０．４のＡＢＳ６００に到達した時点で、以前に報告されたとおりに全ＲＮＡを単離し（Ｓｔｅａｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４０，ｅ１５６）、その後にＤＮａｓｅＩで処理した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、生じたＲＮＡ２μｇからｃＤＮＡを生成し、その後にＲＮａｓｅＨで処理した。表３に提供される遺伝子特異的プライマー（Ｘ−ｑＰＣＲ．ｆｗｄ／ｒｅｖ、ここでＸは標的遺伝子である）およびＳＹＢＲグリーン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ｃＤＮＡサンプルに対して定量ＰＣＲを行なった。ｃＤＮＡを、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ２リアルタイムＰＣＲシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で、製造業者の説明書に従って実行した。ＰＣＲのランに関しては、各ｃＤＮＡを２分間９５℃まで加熱し、その後に、５０サイクルの９５℃での１５秒の変性ステップ、５５℃での１５秒のアニーリングステップ、および、７２℃での３０秒の伸長ステップを続けた。ランの終わりに、融解曲線を作成して非特異的産物の不存在を確認した。遺伝子発現の相対的定量を、２−ΔＣｔ方法を用いて計算した。
【０２４０】
増殖アッセイ
細胞を、０．４％グリセロールを含むＭ９最小限培地中に植菌して一晩増殖させた。２４時間後、細胞をペレットにして、炭素源を含まない２ｍｌのＭ９最小限培地中に２回再懸濁して、可能性のある増殖源としてのグリセロールを除去した。それから、洗浄した培養物を、０．２％の示された糖（単数または複数）を含む２ｍｌのＭ９最小限培地中に、０．００１のＡＢＳ６００までバック希釈した。最後に、培養物を、ＡＢＳ６００が測定されるまで２４時間増殖させた。
【０２４１】
実施例１４．結果
ｃａｓ３の欠失に続く、標的化した遺伝子抑制
遺伝子制御に関するＩ型システムの能力を探るために、我々は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２でＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いた（図４）。ＣａｓｃａｄｅをコードするｃａｓＡＢＣＤＥオペロン（ｃｓｅ１−ｃｓｅ２−ｃａｓ７−ｃａｓ５−ｃａｓ６ｅ）は、正常な増殖条件下で強力に抑制されるので（Ｐｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７５，１４９５−１５１２；Ｗｅｓｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７，１３８０−１３９３）、我々は、ｃａｓ３およびネイティブのｃｓｅ１プロモーターを、１回の相同組み換えで構成的プロモーターと置き換えた（図５）。生じた株（ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔ）を、Ｌ−アラビノース−誘導性の単一−スペーサーアレイをコードする中コピープラスミド（図６）、および、ｌａｃＺプロモーターの下流にグリーン蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子をコードする低コピーレポータープラスミド（ｐＵＡ６６−ｌａｃＺ、表５）を用いて形質転換した。ｇｆｐコード領域およびプロモーター内の１０個の位置、ならびに、プロモーターの遥か上流の２個の位置を標的化するように、スペーサーを設計した（図７Ａ、表４）。それから、ＧＦＰおよびｃｒＲＮＡ発現の誘導の後に、フローサイトメトリー分析を用いて、個々の細胞の蛍光を測定した。
【０２４２】
【表５】
2017512481.tif 000010
【０２４３】
スペーサーが無いプラスミドと比較して（ｐＣＲＩＳＰＲ．ｉｎｄ、図６）、我々は、ｐＵＡ６６−ｌａｃＺのどの領域が標的化されたのかに依存する、抑制の変動する程度を観察した（図７Ｂ）。プロモーター領域のいずれかの鎖の標的化は、ＧＦＰ蛍光を強く減少させた（約２００倍）。転写領域の標的化は、ＧＦＰ蛍光を適度に減少させたが、非テンプレート鎖に沿ったどこか、またはテンプレート鎖上のＲＮＡポリメラーゼフットプリントの近辺を標的化した場合だけであった（Ｋｏｖａｃｉｃ，Ｒ．Ｔ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１３６５４−１３６６１）。興味深いことに、非テンプレート鎖に対して標的化テンプレートを標的とした場合に見られる鎖のバイアスは、細菌でのｄＣａｓ９に関して見られたものに酷似する（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５２，１１７３−１１８３；Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓ  Ｒｅｓ．，４１，７４２９−３７）。期待されるとおり、プロモーター領域の上流の標的化は、無視できる程度に蛍光を減少させた。全ての場合において、遺伝子サイレンシングの程度は、細菌集団全体にわたって均一であった。重要なことに、ＧＦＰレベルは、スペーサー無しプラスミドおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａのｍｖｉＭ遺伝子を標的化するスペーサーをコードするプラスミドに関して同様であり（図７Ｂ）、Ｃａｓｃａｄｅの集合に起因する潜在的な違いを排除した。また、我々は、Ｌ−アラビノースの追加または除去の後の蛍光の変化に基づき、ＧＦＰサイレンシングは可逆的であることも見いだした（図７Ｃ）。関係がある動態は、先行研究と同様に（Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｆ１０００ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐ．，５，４７）、ＧＦＰの安定化に起因し得る。
【０２４４】
我々は次に、一連のコントロール実験を行って、構成的に発現するＣａｓｃａｄｅオペロンおよびｃａｓ３の欠落の影響を評価した。我々はまず、Ｃａｓｃａｄｅオペロンが確実に抑制されてｃａｓ３がまだ存在するオリジナルの野生基準株（ＢＷ２５１１３）、および、ｃａｓ３およびＣａｓｃａｄｅオペロンが両方とも欠落された株（ＢＷ２５１１３  ΔＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ：：ｃａｔ）において、ＧＦＰ蛍光を測定した。蛍光レベルは、標的化スペーサーを用いたかどうかにかかわらず同様であり（図８Ａ）、遺伝子サイレンシングのためにはＣａｓｃａｄｅは存在しなければならずＣａｓ３は不存在でなければならないことが示された。次に、ＤＮＡの完全性に対する影響を評価するために、我々は、構成的に発現されるＣａｓｃａｄｅを有し、ｃａｓ３が存在する株（ＮＭ５００  ｃａｓ３＋）または存在しない株（ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔ）において、標的化および非標的化プラスミドに関する形質転換効率を測定した。驚くべきことに、我々は、ｃａｓ３が存在する場合でさえ、標的化および非標的化プラスミドに関して同様の形質転換効率を観察し（図８Ｂ）、Ｃａｓ３が、この株において発現が不十分または不活性であることが示された。さらなる支持として、ｃａｓ３が存在する株は、ＧＦＰをなお強くサイレンスにすることができた（図８Ｃ）。最後に、抵抗性カセットの影響を判断するために、我々は、ｃａｓ３を欠落させるために用いたカセットを切除してＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３−ｃａｔ株を作製し、遺伝子サイレンシングを測定した。生じた株（ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３）および原株（ＢＷ２５１１３  Δｃａｓ３：：ｃａｔ）は、同様のサイレンシング効率を示し（補足図  Ｓ４Ｃ）、抵抗性カセットの無視できる影響が示された。
【０２４５】
アレイの長さおよびスペーサー位置の影響
Ｃａｓｃａｄｅの１つの有益な特性は、単一のスペーサーアレイ由来の多数のｃｒＲＮＡを処理できることである。しかしながら、天然または合成のマルチ−スペーサーアレイの構成が、どのようにして定量的に個々の標的に影響を与えるかについては、ほとんど知られていない。アレイの長さの影響を評価するために、我々は、１個のプロモーター−標的化スペーサー（Ｔ２）の後に０〜３個の非標的化スペーサーが続くアレイを作製した（ｍｖｉＭ）（図９）。フローサイトメトリー分析は、それぞれの追加のスペーサーでサイレンシング効率が徐々に低減することを明らかにした。我々は、他のＲＮＡ系システムで見られるように（Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｈ．Ｎ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８，１１１０−１１１５）、この低減は、ｃｒＲＮＡを標的化するための利用可能なＣａｓｃａｄｅ複合体を希釈する非標的化スペーサーに起因し得ると考える。この主張の支持において、単一のスペーサーアレイおよび４個の標的化スペーサーのアレイは、統計的に区別できない程度のサイレンシングを示した（両側ｔ検定、ｔ（４）＝１．０５、ｐ＝０．３５）（図９）。スペーサー位置の影響を評価するために、我々は、１個の標的化および３個の非標的化スペーサーの、異なる並べ替えを有するアレイを作製した（図９）。４個のスペーサーアレイの最初の位置の標的化スペーサーを例外として、ｇｆｐサイレンシングの程度は、スペーサー位置にかかわらず同様であった（一元配置分散分析、Ｆ（２，６）＝０．１５、ｐ＝０．８６）。これらの結果は、より長いアレイは、個々のスペーサーの能力を減少することができ、一方で、アレイ内のスペーサーの正確な位置は、サイレンシングの能力に対して、より低い寄与であることを示唆する。
【０２４６】
内因性遺伝子の多重の抑制
ｇｆｐのような異種遺伝子の標的化に対する補足として、我々は、スペーサーが内因性標的を調節する能力を探った。我々は、糖類：Ｌ−アラビノース（ａｒａＢＡＤ）、Ｌ−ラムノース（ｒｈａＢＡＤ）、Ｄ−キシロース（ｘｙｌＡＢ）、およびＤ−ラクトース（ｌａｃＺＹＡ）の異化作用に関与するオペロンに焦点を当てた（図１０Ａ）。これらのオペロンはよく特徴付けられていて、それらの同族の糖での増殖に必要であるからである（Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｅｎｇｌｅｓｂｅｒｇ，Ｅ．（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９，３１４−３３１；Ｐｏｗｅｒ，Ｊ．（１９６７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５５７−５６８；Ｌａｗｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７，１５−２１；Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．Ｒ．（１９６７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５６，５９７−６０４）。ａｒａＢＡＤ、ｒｈａＢＡＤ、およびｌａｃＺＹＡオペロンは、ＢＷ２５１１３において破壊されているため、我々は、ｃａｓ３欠失および合成プロモーターをＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の別株に取り込んだ（ＭＧ１６５５  Δｃａｓ３：：ｃａｔ）。また、我々は、それぞれの単一スペーサーアレイを強力な構成的プロモーターの制御下に置き、誘導物質としてのＬ−アラビノースの必要性を回避した（図６）。
【０２４７】
プロモーター活性のサイレンシングを評価するために、我々は、ｐＵＡ６６プラスミドにおいて、ｇｆｐの上流に各オペロンのプロモーターをクローン化した（以下の表５）。生じたプラスミドを、対応する単一スペーサープラスミド（上）またはマルチスペーサープラスミド（下）を保有するＭＧ１６５５  Δｃａｓ３細胞内に配置して、それから、同族の糖でのプロモーター誘導の後に、それらのそれぞれの標的プロモーターを抑制する能力について、フローサイトメトリー分析により試験した（図１０Ｂ）。スペーサーが無いプラスミドと比較して（ｐＣＲＩＳＰＲｃｏｎ、図６）、各標的化プラスミドは蛍光が非常に減少した（約８０倍〜約９００倍）。予期したとおり、１個のアレイにスペーサーを組み合わせることは、個々に試験した場合、全ての４個のプロモーターに関して蛍光を強く減少させたが（図１０Ｂ）、サイレンシングの程度は、一般に、個々のスペーサーに関して見られるものよりも低かった（図９）。
【０２４８】
内因性遺伝子のサイレンシングを評価するために、我々は、それぞれの単一スペーサープラスミドを有する細胞について、各オペロンのｍＲＮＡレベルを測定した。スペーサー無しプラスミドと比較して、単一スペーサープラスミドは、標的オペロンのｍＲＮＡレベルを非常に減少させ（約１１倍〜約２，２００倍）（図１０Ｃ）、ＧＦＰレポーターに関して見られたものと同等であった（図１０Ｂ）。抑制におけるこの広い範囲は、ｄＣａｓ９で見られた遺伝子サイレンシングでの可変性にマッチする（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５２，１１７３−１１８３；Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４１，７４２９−３７）。
【０２４９】
最後に、我々は、標的化内因性遺伝子が、所定の表現型を生じさせることができるかどうか探った。各オペロンは、その同族の糖の異化作用に必要であるので、我々は、各糖ならびに２個の非標的化糖：Ｄ−グルコースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）での増殖を測定した。我々は、唯一の炭素源として異なる糖類を用いて、４個のスペーサーアレイまたは単一スペーサーを発現するＭＧ１６５５  Δｃａｓ３：：ｃａｔを培養して、培養物の濁度を、増殖の２４時間後に測定した（図１０Ｄ；図１１Ａ）。我々は、各オペロンの標的化は、単一のスペーサーアレイまたは４個のスペーサーアレイを用いようとなかろうと、同族の糖での増殖を制限することを見いだした。４個のスペーサーアレイは、このアレイは、全ての４個の標的の糖類を含む培地での増殖を制限するので、個々の細胞において全ての標的オペロンをサイレンシングした（図１１Ａ）。増殖は、全ての非標的化糖類について妨げられず、標的化の特異性を支持した。最終的な濁度は、一般に、Ｌ−ラムノースで増殖した全ての培養物に関してより低く（図１０Ｄ、図１１Ａ）、我々は、Ｌ−ラムノースが不十分な炭素源であることに起因すると考えた（図１１Ｂ）。したがって、我々は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＣａｓ３が奪われたＩ−Ｅ型システムは、多数の内因性遺伝子をサイレンシングして複合の表現型を生じるようにプログラムすることができると結論付ける。
【０２５０】
実施例１５．考察
本明細書に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓｃａｄｅオペロンの構成的な発現およびｃａｓ３の欠失を通して、プログラム化可能な遺伝子抑制に再目的化することができる。構造的および系統学的データは、この同一現象は、Ｃａｓ３の不存在下でのＣａｓｃａｄｅの安定性、および、転写されたＣＲＩＳＰＲアレイを処理するこの複合体の能力に基づき、Ｉ−Ｂ型、Ｉ−Ｃ型、およびＩ−Ｆ型システムに容易に適応することを示唆する（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）９，４６７−４７７；Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｔｒｕｃｔ．Ｌｏｎｄ．Ｅｎｇｌ．１９９３，２０，１５７４−１５８４；Ｂｒｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９，７１６４−７１７７；Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８，１００９２−１００９７）。２つのまったく別のＣａｓ３タンパク質（Ｃａｓ３’およびＣａｓ３’’）がＩ−Ａ型Ｃａｓｃａｄｅの安定化に必要であり、特徴付けられていないＩ−Ｂ型ＣａｓｃａｄｅがＩ−Ａ型システムに最も密接に関連するので（Ｓｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８２，２３７−２６６；Ｐｌａｇｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２，５１２５−５１３８）、Ｉ−Ａ型およびＩ−Ｂ型システムは、例外であると思われる。しかしながら、これらのｃａｓ３遺伝子は、初歩的な遺伝子ツールを用いて導入することがより困難な点突然変異を有するにもかかわらず、Ｃａｓ９で行なわれるように（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１）、触媒的に不活化され得る（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１１，６６１８−６６２３）。
【０２５１】
この説明で、別の疑問は、Ｉ型システムまたはＩＩ型システムを、転写調節のために用いるべきかどうかということである。ｄＣａｓ９の形でのＩＩ型システムは、さまざまな生物内に取り込むことのできるコンパクトな異種システムを提供するので、非常に魅力的である。しかしながら、内因性Ｉ型システムの活用は、いくつかの潜在的な利点を提供する。例えば、ｃａｓ３が欠落された時点で、合計せいぜい数百塩基のＣＲＩＳＰＲアレイのみを導入しなければならない。別の潜在的利点は、ネイティブのＩ型システムは、一般的なＣａｓ９タンパク質の正しいフォールディングを妨げる環境条件下で繁殖する好熱性および超好熱性微生物に良好に適するという点である。また、Ｉ型システムは、異なる順応およびＴ／Ｃリッチ配列へのバイアスを含む、公知のＩＩ型システムと関連するものとは異なるＰＡＭも提供する（Ｓｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８２，２３７−２６６；Ｗｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４６，５９５−６０５；Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，１１１６−２１）。最後に、Ｉ型システムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む、さまざまな産業的および医学的関連の株で天然に見られる（Ｇｒｉｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，８，１７２）。このストラテジーに対する可能性のある欠点は、それらの株は、一部の浸潤病原体に対する免疫性を失い得ることである。また、Ｃａｓ３の不存在下でのＣａｓｃａｄｅの過剰発現は、転写の展望に不用意に衝撃を与え得るが、このことは、ｄＣａｓ９に関してなおさらに探索されるべきである。
【０２５２】
Ｉ型およびＩＩ型システムでの転写調節に関して、興味深く並行して見られるものは、転写領域を標的とした場合の鎖のバイアスである（図７Ｂ）（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５２，１１７３−１１８３；Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４１，７４２９−３７）。ｄＣａｓ９での先行研究は、テンプレート鎖ではなく非テンプレート鎖を標的化することが、ＲＮＡポリメラーゼ伸長を強く干渉することを示した。我々は、ｄＣａｓ９と比較して反対のＰＡＭ位置および構造的な違いにもかかわらず（Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８，５２９−５３６．；Ｗｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４６，５９５−６０５；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＲＮａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，２３３−２３９．；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ，１５６，９３５−９４９）、Ｉ−Ｅ型Ｃａｓｃａｄｅで同一の傾向を観察した（図７Ｂ）。
【０２５３】
要約すると、本発明は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを転写調節に活用する新規のストラテジーを提供する。さらに、我々の知見は、遺伝子発現を天然に調節する天然のＩ型システムを同定するフレームワークを提供し、細胞プロセスを調整する公知のシステムのリストを潜在的に拡大する（Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１１，１１１６３−８；Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ，４９７，２５４−２５７）。
【０２５４】
実施例１６．スペーサー長
１型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのスペーサー長および他の特徴の効果を研究した。スペーサーを、その３’末端から延長させた（ＰＡＭの位置を保存する）。図１３は、標的化された異なる位置の概略を示す。図１４は、ＮＴ３スペーサーに対して＋２４ヌクレオチドまで行ない、スペーサー長の増大はサイレンシング効率を改善するが、傾向は非単調であることを示す。図１５は、「正常の」スペーサー長が既に蛍光をバックグラウンド付近のレベルまで減少させているので、スペーサー長の増大は、Ｔ２スペーサーでのサイレンシング効率を改善するようには思えないことを示し、サイレンシングの改善の可能性の余地がほとんどない。図１６は、スペーサー長の増大は、Ｔ４スペーサーでのサイレンシング効率を改善するようには思えないことを示す。
【０２５５】
図１７、１８、および１９は、相補性の量が、より長いスペーサーでのサイレンシングの効果にどのように影響を与えるかを示す。図１７は、より長いスペーサーと標的との間の塩基対合相互作用の破壊の概要を示す。図１８および図１９は、余分のヌクレオチドでの塩基対合の破壊が、サイレンシング効率を約１０倍減少させたことを示す。概して、データは、サイレンシング効率は、スペーサーの長さを変化させることにより変更することができ、延長された塩基対合は、サイレンシング活性を保つために維持されなければならないことを示す。
【０２５６】
実施例１７．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｉ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム由来のＣａｓｃａｄｅを用いた、標的化遺伝子抑制
Ｉ−Ｃ  Ｃａｓｃａｄｅ複合体と関連する３つの遺伝子（ｃａｓ５ｃ、ｃａｓ８ｃ、およびｃａｓ７）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて構成的プラスミドから発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｌａｃプロモーターにより制御されるグリーン蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子をコードするプラスミドおよびＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓリピート（スペーサー−）またはリピート−スペーサー−リピート（スペーサー＋）をコードする別のプラスミドも保有した。組み込まれたスペーサーは、隣接するＣＴＣまたはＴＴＣ  ＰＡＭを有するｌａｃプロモーター内の配列を標的化するように設計された。ＰＡＭの両方とも、Ｉ−Ｃ型システムが予測された。３つのプラスミドを保有する細胞を、適切な抗生物質を含むＬＢで一晩増殖させ、同一の培地にバック希釈して、対数期中間に到達するまで培養した。それから、培養物を、フローサイトメトリー分析により分析した。報告される値は、単峰型ヒストグラムからＧＦＰ陰性細胞の蛍光を引いた平均蛍光である。
【０２５７】
図２０Ａは、構成的プロモーターの制御下のＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｉ−Ｃ型Ｃａｓｃａｄｅオペロンを示す。以下に示されるように、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、Ｃａｓｃａｄｅを、ＧＦＰ発現をコントロールするｌａｃプロモーターに結合するようにガイドする；図２０Ｂは、フローサイトメトリー分析による培養物の分析を示す。データは、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ由来のＩ−Ｃ  Ｃａｓｃａｄｅによる抑制を示し、ここで、抑制の程度は２つの異なるＰＡＭの間で異なる。これらのデータは、異種性に発現されるＣａｓｃａｄｅを用いて標的化遺伝子サイレンシングを実行する我々の能力、および、Ｉ−Ｅ型システムを超える我々の全般的アプローチの適用性を示す。
【０２５８】
前述したものは本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって、その中に含まれるべき特許請求の範囲の同等物とともに、定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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