(57)【要約】  ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのリボヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は、哺乳類対象の、ボルティモアグループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶに分類されるウイルスによって引き起こされるウイルス感染の治療または予防に幅広く有用である。
2017512837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、前記ウイルスがボルティモア分類グループＶに分類される、前記ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項２】
前記ウイルスがオルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）、およびフィロウイルス科（filoviridae）からなる群から選択される科に由来する、請求項１に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項３】
前記ウイルスがインフルエンザＡウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、はしかウイルス、およびエボラウイルスからなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項４】
哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、前記ウイルスがボルティモア分類グループＩＶに分類され、デングウイルス、黄熱ウイルスおよび重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス以外である、前記ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項５】
前記ウイルスがピコルナウイルス科（picornaviridae）、トガウイルス科（togaviridae）、およびコロナウイルス科（oronaviridae）からなる群から選択される科に由来する、請求項４に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項６】
前記ウイルスがライノウイルス１４、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、チクングンヤ熱ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスからなる群から選択される、請求項４または５に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項７】
哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、前記ウイルスがアデノウイルス科（adenoviridae）およびポックスウイルス科（poxviridae）からなる群から選択される科に由来する、前記ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項８】
前記ウイルスがワクシニアウイルスおよびアデノウイルス２からなる群から選択される、請求項７に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項９】
哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、前記ウイルスがボルティモア分類グループＩＩに分類される、前記ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項１０】
前記ウイルスがパルボウイルス科（parvoviridae）に由来する、請求項９に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項１１】
前記ウイルスがイヌパルボウイルスである、請求項９または１０に記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項１２】
前記ＲＮアーゼが配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項１３】
前記哺乳類対象がヒトである、請求項１から１２のいずれかに記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項１４】
前記ＲＮアーゼが全身投与される、請求項１から１３のいずれかに記載の使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体。
【請求項１５】
哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼであって、前記ウイルスが狂犬病ウイルス、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、チクングンヤ熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、イヌパルボウイルス、アデノウイルス２、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス１４およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、前記ランピルナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼの使用に関し、特に、哺乳類対象の、ボルティモア分類グループ（Baltimore Classification Group）Ｖ、ＩＶ、ＩＩおよびＩに分類されるウイルスによるウイルス感染の治療または予防のためのランピルナーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は肺および消化管などの異なる臓器に影響を与える場合があり、重篤な疾患または感染対象の死さえ引き起こす。
【０００３】
例えば、西アフリカで進行しているエボラ流行はこれまでのところ約１０，０００人の死を引き起こした。いくつかの実験的薬物が試験されているが、これまでのところ、エボラウイルスの感染に対する認可された治療はない。
【０００４】
別の例として、インフルエンザウイルスは毎年何百万の感染を引き起こし、１年につき世界で数千人が亡くなっている。インフルエンザ感染に対する有効な治療は得られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ウイルス疾患を効果的に治療または予防するために使用することができる物質を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
最近の実験で、ランピルナーゼは、治療に対して強い抵抗性を示すウイルス（例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶおよびＥＢＯＶ）を含む驚くほど多くの異なるウイルスに対して、驚くほど強い抗ウイルス効果を示すことが示された。
【０００７】
したがって、本発明は、哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、ウイルスがボルティモア分類グループＶに分類される、使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体に関する。
【０００８】
ボルティモア分類グループＶに分類されるウイルスは、好ましくは、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、オルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）およびフィロウイルス科（filoviridae）からなる群から選択される科に由来し、さらに好ましくは、ウイルスは狂犬病ウイルス、インフルエンザＡウイルス、はしかウイルス、エボラウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、ウイルスがボルティモア分類グループＩＶに分類され、デングウイルス、黄熱ウイルスおよび重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス以外である、使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体に関する。
【００１０】
ボルティモア分類グループＩＶに分類されるウイルスは、好ましくは、トガウイルス科（togaviridae）、コロナウイルス科（coronaviridae）およびピコルナウイルス科（picornaviridae）からなる群から選択される科に由来し、さらに好ましくは、ウイルスはＭＥＲＳ−ＣｏＶ、チクングンヤ熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよびライノウイルス１４からなる群から選択される。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、ウイルスがアデノウイルス科（adenoviridae）およびポックスウイルス科（poxviridae）からなる群から選択される科に由来する、使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体に関する。
【００１２】
好ましくは、ウイルスはワクシニアウイルスおよびアデノウイルス２からなる群から選択される。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体であって、ウイルスがボルティモア分類グループＩＩに分類される、使用のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼまたはその機能的誘導体に関する。
【００１４】
ボルティモア分類グループＩＩに分類されるウイルスは、好ましくは、パルボウイルス科（parvoviridae）に由来し、より好ましくは、ウイルスはイヌパルボウイルスである。
【００１５】
好ましくは、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼは、配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、ランピルナーゼのアミノ酸配列である配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、哺乳類対象はヒトである。
【００１７】
また好ましくは、ＲＮアーゼは全身投与され、さらに好ましくは、ＲＮアーゼは静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、直腸投与または経鼻投与によって投与される。
【００１８】
特に、本発明は哺乳類対象のウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼであって、ウイルスが狂犬病ウイルス、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、チクングンヤ熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、イヌパルボウイルス、アデノウイルス２、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス１４およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、使用のためのランピルナーゼに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】マウス神経芽腫細胞（「ＭＮＡ」）、コウモリ初代上皮細胞（「ＥＦ」）およびクローンベビーハムスター腎細胞（「ＢＳＲ」）内の狂犬病ウイルスに対するランピルナーゼの抗ウイルス活性試験結果を示す。＊：狂犬病ウイルスによる感染前であり、ランピルナーゼとインキュベーション後；＊＊：狂犬病ウイルスによる感染から２４時間後；＊＊＊：狂犬病ウイルスによる感染から４８時間後
【図２】図示される様々な濃度のＳＡＲＳプロテアーゼ阻害剤およびインファージェン（Infergen）の抗ウイルス活性と比較した、正常ヒト気管支上皮（「ＮＨＢＥ」）細胞内のＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスに対する、図示される様々な濃度のランピルナーゼの抗ウイルス活性試験結果を示す。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１
【図３】図示される様々な濃度のリバビリン（「Ｒｉｂａ」）およびオセルタミビルカルボン酸塩（「Ｏｓｅｌ」）の抗ウイルス活性と比較した、ＮＨＢＥ細胞内のインフルエンザ株に対する、図示される様々な濃度のランピルナーゼ（「Ｒａｎｐ」）の抗ウイルス活性試験結果を示す。＊：ｐ＜０．０１；＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊：ｐ＜０．０００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．００００１
【図４】ａ）３０００細胞／ウェルで培養した（「３ｋ」と示される）アストロサイトのＶＥＥＶ感染に対するランピルナーゼ（「ＲＡＮ」と示される）の効果を示す。；ｂ）４０００細胞／ウェルで培養した（「４ｋ」と示される）アストロサイトのＶＥＥＶ感染に対するランピルナーゼ（「ＲＡＮ」と示される）の効果を示す。；ｃ）３０００細胞／ウェルで培養した（「３ｋ」と示される）アストロサイトのＶＥＥＶ感染に対するランピルナーゼ凍結乾燥粉末（「ＲＡＮ＿２」と示される）の効果を示す。
【図５】ＨｅＬａ細胞のＶＥＥＶ感染に対するランピルナーゼの効果を示す。
【図６】Ｕ２ＯＳ細胞のＣＨＩＶ感染に対するランピルナーゼの効果を示す。
【図７】ＨｅＬａ細胞のＥＢＯＶ感染に対するランピルナーゼの効果を示す。
【図８】ＶｅｒｏＥ６細胞のＥＢＯＶ感染に対するランピルナーゼの効果を示す。
【図９】ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶのランピルナーゼ阻害に対するＡＣ５０毒性値を示す。
【図１０】ＥＢＯＶに感染したマウスについて、ランピルナーゼの用量反応の検討で使用された量を示す。
【図１１】図１０の検討におけるマウスの生存数を示す。
【図１２】図１１のデータをパーセンテージで表してグラフ表示したものである。
【図１３】図１０の検討におけるマウスの体重減少を示す。
【図１４】図１０の検討におけるマウスの体重減少をパーセンテージで示す。
【図１５】図１４のデータをグラフ表示したものである。
【図１６】ＮＨＢＥ細胞内のＡＶのランピルナーゼ阻害の検討で使用されたランピルナーゼの用量を示す。
【図１７】図１６の検討結果を示す。
【図１８】Ａ−７２細胞内のイヌパルボウイルスのランピルナーゼ阻害の検討結果を示す。
【図１９】ＮＨＢＥ細胞内のＲＳＶのランピルナーゼ阻害の検討で使用されたランピルナーゼの用量を示す。
【図２０】図１９の検討結果を示す。
【図２１】ＮＨＢＥ細胞内のＲＶ−１４のランピルナーゼ阻害の検討で使用されたランピルナーゼの用量を示す。
【図２２】図２１の検討結果を示す。
【図２３】Ｖｅｒｏ７６細胞内のワクシニアウイルスのランピルナーゼ阻害の検討で使用されたランピルナーゼの用量を示す。
【図２４】図２３の検討結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
最近の実験で、ランピルナーゼは、治療に対して強い抵抗性を示すウイルス（例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶおよびＥＢＯＶ）を含む驚くほど多くの異なるウイルスに対して、驚くほど強い抗ウイルス効果を示すことが示された。
【００２１】
本発明の驚くほど広範囲の活性スペクトルは、ランピルナーゼが様々な型のＲＮＡを分解することによってもたらされると考えられる。
【００２２】
これまでに、３つのＲＮＡ分解機構が、ランピルナーゼを用いた抗ウイルス療法と関係があると考えられている。
【００２３】
これらの機構の１つ目は、ｔＲＮＡの分解である。哺乳類細胞内でのｔＲＮＡの分解によって、細胞はいくつかのウイルス感染に対して抵抗性を持つ。これは、リボソームを用いたタンパク質合成によっていくつかのウイルスは複製し、タンパク質の合成に必要とされるアミノ酸を送るために転移ＲＮＡがリボソーム内に入らない限り、タンパク質合成ができないからである。よって、ｔＲＮＡを分解する薬剤の全身投与は、いくつかのウイルスが非感染細胞に拡散することを阻止または少なくとも実質的に妨げる。哺乳類の宿主を危険にさらすのに十分なほどウイルスが広く拡散する前にこの投与を行う場合、ウイルスは最終的に死滅する。
【００２４】
２つ目の機構はウイルス二本鎖ＲＮＡの分解である。いくつかのウイルスは哺乳類細胞内で増殖プロセスの一部として二本鎖ＲＮＡを産生し、二本鎖ＲＮＡの破壊によってそのようなウイルスの複製を阻止または少なくとも実質的に妨げることができる。
【００２５】
３つ目の機構はマイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの分解である。二本鎖ＲＮＡを用いて増殖するいくつかのウイルスにおいて、二本鎖ＲＮＡはマイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが一本鎖ＲＮＡと相互作用することによって産生される。マイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの破壊によって、ウイルスが複製するウイルス二本鎖ＲＮＡの形成を阻止できる。
【００２６】
ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼは、いくつかの哺乳類およびいくつかの爬虫類の膵臓で多量に見つかった、ピリミジン特異的エンドヌクレアーゼである。これらは、２’，３’−環状リン酸エステル中間体を介して、３’−ホスホモノヌクレオチドおよびＣ−ＰまたはＵ−Ｐで終わる３’−ホスホオリゴヌクレオチドのヌクレオチド鎖切断開裂に関与する。このスーパーファミリーのメンバーには、ランピルナーゼおよびそのバリアント、アムヒナーゼ（amphinase）、ｒアムヒナーゼ２、ウシ精嚢および脳リボヌクレアーゼ；腎臓非分泌性リボヌクレアーゼ；肝臓型リボヌクレアーゼであるアンギオゲニン；好酸球陽イオンタンパク質、ならびにヒトおよびウシ膵臓リボヌクレアーゼを含む異なる種由来の膵臓リボヌクレアーゼが含まれる。
【００２７】
ランピルナーゼは米国特許第５，５５９，２１２号明細書に開示されている、ヒョウガエル（Rana pipiens）の卵母細胞から単離されたＲＮアーゼであり、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（登録商標）としても知られている。ランピルナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ランピルナーゼはＲＮＡに対するその酵素活性によって、がん細胞に対して細胞毒性を有することが試験によりわかっている。
【００２８】
ランピルナーゼのバリアント（以下、「‘８０５バリアント」）が米国特許第５，７２８，８０５号明細書に開示されている。‘８０５バリアントもＲＮアーゼであり、同様にいくつかのがん細胞に対して細胞毒性を有することがわかっている。‘８０５バリアントはランピルナーゼの近縁のバリアントであり；そのアミノ酸配列は、ランピルナーゼのアミノ酸配列の、１１番目がイソロイシンの代わりにバリン、２０番目がアスパラギン酸の代わりにアスパラギン、および１０３番目がセリンの代わりにアルギニンである以外は、ランピルナーゼのアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、‘８０５バリアントは「Ｖａｌ１１、Ａｓｎ２０、Ａｒｇ１０３−ランピルナーゼ」と示される。‘８０５バリアントのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２９】
アムヒナーゼ２もまたＲＮアーゼである。米国特許第６，２３９，２５７号明細書に２３２５ｐ４として同定されたタンパク質であり、がん細胞に対して細胞毒性を有することもわかっている。アムヒナーゼ２のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００３０】
組み換えアムヒナーゼ２（「ｒアムヒナーゼ２」）はアムヒナーゼ２に類似するが、１番目にＭｅｔ残基を有し、アムヒナーゼ２の２７番目および９１番目の糖鎖が欠損している。ｒアムヒナーゼ２については米国特許第７，２２９，８２４号明細書に記載されている。ｒアムヒナーゼ２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００３１】
用語「その機能的に同等」は、天然由来のＲＮアーゼと１つまたは複数のアミノ酸が異なるが、ＲＮアーゼ活性を保持するタンパク質を含むことを示す。例えば、上記で説明した‘８０５バリアントはランピルナーゼの機能的誘導体と考えられ得る。
【００３２】
米国特許第５，５５９，２１２号明細書、第５，７２８，８０５号明細書、第６，２３９，２５７号明細書、第７，２２９，８２４号明細書、第８，５１８，３９９号明細書、第８，６６３，９６４号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１２−０００３２６６号明細書および第２０１４−００３７６１０号明細書の全体が、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
【００３３】
ランピルナーゼはとても効果的にｔＲＮＡを分解することが知られている（Lin et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 201 (1), 156 - 162 (1994)を参照されたい）。正常哺乳類細胞は自然過程として約８０％のｔＲＮＡを分解するので、細胞自体に何らかの害があるとしても、この分解はほとんど起こらない。結果として、ウイルス感染がかなり拡散して効果的に制御することができない場合を除いて、特に、ウイルス感染がかなり拡散する前のランピルナーゼの全身投与によって、ウイルスが感染する正常細胞を殺さずにウイルスを死滅させる。
【００３４】
本発明者らによって、ボルティモア分類グループＶ、ＩＶ、ＩおよびＩＩに分類されるウイルスを含むいくつかのウイルスの増殖に対して、ランピルナーゼは効果があることがわかった。
【００３５】
ウイルスのボルティモア分類は、ウイルスの遺伝子複製および発現の様式を基に、デービット・ボルティモアによって提案された（Baltimore (1971) Bacteriological Reviews 35: 235-241）。この分類によると、ウイルスを７つの異なるグループに分けることができる。
グループＩ：二本鎖ＤＮＡウイルス
グループＩＩ：一本鎖ＤＮＡウイルス
グループＩＩＩ：二本鎖ＲＮＡウイルス
グループＩＶ：プラス鎖ＲＮＡを有する一本鎖ＲＮＡウイルス
グループＶ：マイナス鎖ＲＮＡを有する一本鎖ＲＮＡウイルス
グループＶＩ：ＤＮＡ中間体を介して複製するプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス
グループＶＩＩ：一本鎖ＲＮＡ中間体を介して複製する二本鎖ＤＮＡウイルス
【００３６】
本出願には、ボルティモアグループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶに分類されるウイルス、特にボルティモアグループＩＶおよびＶに分類されるウイルスによるウイルス感染の治療に対して、ランピルナーゼが広く適用できることを示しているデータを示す。
【００３７】
ボルティモア分類グループＶには、マイナス鎖ＲＮＡを有する一本鎖ＲＮＡウイルスが分類される。これらのウイルスのＲＮＡは宿主細胞の翻訳機構で直接使用することはできないが、ウイルスポリメラーゼの作用によってまずプラス鎖ＲＮＡに変換されなければならない。このグループのウイルス科には、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、オルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）、フィロウイルス科（filoviridae）、ブニヤウイルス科（bunyaviridae）およびアレナウイルス科（arenaviridae）が含まれる。本発明の範囲内で、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、オルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）またはフィロウイルス科（filoviridae）に由来するウイルスによるウイルス感染を治療または予防することが好ましい。
【００３８】
ラブドウイルス科（rhabdoviridae）には、リッサウイルス（Lyssavirus）属、エフェメロウイルス（Ephemerovirus）属、ノブラブドウイルス（Novirhabdovirus）属およびベシクロウイルス（Vesiculovirus）属が含まれる。狂犬病ウイルスはリッサウイルス（Lyssavirus）属に属する。したがって、本発明は、リッサウイルス（Lyssavirus）属のウイルス、特に狂犬病ウイルスによるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００３９】
フィロウイルス科（filoviridae）には、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マールブルグウイルス属（Marburgvirus）、およびクウェバウイルス属（Cuevavirus）が含まれる。本明細書において、用語「エボラ（Ebola）」、「エボラウイルス（Ebola virus）」、および「エボラウイルス（Ebola viruses）」は、限定されないが、ブンディブギョウイルス（ＢＤＢＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、タイ森林ウイルス（ＴＡＦＶ、Tai Forest virus、コートジボワールエボラウイルスとしても知られている）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ、以前はザイールエボラウイルスとして知られていた）、およびレストンウイルス（ＲＥＳＴＶ）を含むエボラウイルス属のメンバー全てを示す。マールブルグウイルス属（Marburgvirus）には、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）が含まれ；およびクウェバウイルス属（Cuevavirus）にはルオヴュウイルス（ＬＬＯＶ、Lloviu virus）が含まれる。したがって、本発明は、エボラウイルス属（Ebolavirus）のウイルス、特にエボラウイルスによるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４０】
パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）には、パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）、モルビリウイルス属（Morbillivirus）、およびニューモウイルス属（Pneumovirus）が含まれる。はしかウイルスはモルビリウイルス属（Morbillivirus）に属し、呼吸器合胞体ウイルスはニューモウイルス属（Pneumovirus）に属する。したがって、本発明はまた、モルビリウイルス属（Morbillivirus）またはニューモウイルス属（Pneumovirus）のウイルス、特にはしかウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）によるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４１】
オルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）にはインフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルス属が含まれる。本発明は、インフルエンザＡウイルスによるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４２】
ボルティモア分類グループＩＶには、プラス鎖ＲＮＡを有する一本鎖ＲＮＡウイルスが分類される。これらのウイルスのＲＮＡは宿主細胞の翻訳機構で直接使用することができる。このグループのウイルス科には、トガウイルス科（togaviridae）、コロナウイルス科（coronaviridae）、ピコルナウイルス科（picornaviridae）、フラビウイルス科（flaviviridae）およびカリシウイルス科（calicivirus）が含まれる。本発明の範囲内で、トガウイルス科（togaviridae）、コロナウイルス科（coronaviridae）またはピコルナウイルス科（picornaviridae）に由来するウイルスによるウイルス感染を治療または予防することが好ましい。
【００４３】
トガウイルス科（togaviridae）には、アルファウイルス属（Alphavirus）およびルビウイルス属（Rubivirus）が含まれる。アルファウイルス属（Alphavirus）には、限定されないが、チクングンヤ熱ウイルス（ＣＨＩＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、シンドビスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、エバーグレードウイルス（Everglades virus）、ムカンボウイルス（Mucambo virus）、ピクスナウイルス（Pixuna virus）、ミデルブルグウイルス（Middleburg virus）、アウラウイルス（Aura virus）、ワタロアウイルス（Whataroa virus）、ババンキウイルス（Babanki virus）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus）、ハイランドＪウイルス（Highlands J virus）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus）、ヌドゥムウイルス（Ndumu virus）、バギークリークウイルス（Buggy Creek virus）、バーマ森林ウイルス、ベバルウイルス（Bebaru virus）、カバソウウイルス（Cabassou virus）、ゲタウイルス、マヤロウイルス、メトリウイルス（Me Tri virus）、リオネグロウイルス（Rio Negro virus）、トナテウイルス（Tonate virus）、トロカラウイルス（Trocara virus）、ウナウイルス（Una virus）、オニオニオンウイルス（O’nyong’nyong virus）およびセムリキ森林ウイルスを含むいくつかの種が含まれる。ルビウイルス属（Rubivirus）には、風疹ウイルス種が含まれる。したがって、本発明は、アルファウイルス属（Alphavirus）のウイルス、特に、チクングンヤ熱ウイルス（ＣＨＩＶ）またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）によるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４４】
コロナウイルス科（coronaviridae）には、コロナウイルス属（Coronavirus）、ベータコロナウイルス属（Betacoronavirus）およびトロウイルス属（Torovirus）が含まれる。中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）はベータコロナウイルス属（Betacoronavirus）に属する。したがって、本発明は、ベータコロナウイルス属（Betacoronavirus）のウイルス、特にＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスによるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４５】
ピコルナウイルス科（picornaviridae）には、エンテロウイルス属（Enterovirus）、ライノウイルス属（Rhinovirus）、アフトウイルス属（Aphthovirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、およびＡ型肝炎ウイルス属（Hepatitis A）が含まれる。ライノウイルス１４はライノウイルス属（Rhinovirus）に属する。したがって、本発明は、ライノウイルス属（Rhinovirus）のウイルス、特にライノウイルス１４によるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４６】
ボルティモア分類グループＩには、二本鎖ＤＮＡウイルスが分類される。ｍＲＮＡは、宿主細胞の翻訳機構を用いて、二本鎖ＤＮＡから通常の方法で転写される。このグループのウイルス科には、アデノウイルス科（Adenoviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、イリドウイルス科（Iridoviridae）、アフリカ豚コレラウイルス、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）およびヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）が含まれる。本発明の範囲内で、アデノウイルス科（Adenoviridae）またはポックスウイルス科（Poxviridae）に由来するウイルスによるウイルス感染を治療または予防することが好ましい。
【００４７】
アデノウイルス科（adenoviridae）には、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）およびアビアデノウイルス属（Aviadenovirus）が含まれる。アデノウイルス２はマストアデノウイルス属（Mastadenovirus）に属する。したがって、本発明は、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）のウイルス、特にアデノウイルス２によるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４８】
ポックスウイルス科（poxviridae）には、オルトポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、アビポックスウイルス属（Avipoxvirus）、カプリポックスウイルス属（Capripoxvirus）、レポリポックスウイルス属（Leporipoxvirus）およびパラポックスウイルス属（Parapoxvirus）が含まれる。ワクシニアウイルスはオルトポックスウイルス属（Orthopoxvirus）に属する。したがって、本発明は、オルトポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、特にワクシニアウイルスによるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００４９】
ボルティモア分類グループＩには、一本鎖ＤＮＡウイルスが分類される。このグループのウイルス科には、パルボウイルス科（Parvoviridae）、アネロウイルス科（Anelloviridae）およびサーコウイルス科（Circoviridae）が含まれる。本発明の範囲内で、パルボウイルス科（Parvoviridae）に由来するウイルスによるウイルス感染を治療または予防することが好ましい。
【００５０】
パルボウイルス科（Parvoviridae）には、パルボウイルス属（Parvovirus）およびディペンドウイルス属（Dependovirus）が含まれる。イヌパルボウイルスはパルボウイルス属（Parvovirus）に属する。したがって、本発明は、パルボウイルス属（Parvovirus）のウイルス、特にイヌパルボウイルスによるウイルス感染の治療または予防における使用のためのランピルナーゼにも関する。
【００５１】
１つの態様において、本発明は、ウイルスの増殖もしくは複製の阻害における使用、または細胞に感染するウイルスの能力の低減のためのＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼであって、前記ＲＮアーゼを細胞または組織と接触させる工程を含む、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼに関する。
【００５２】
各試験化合物の抗ウイルス効果は５０％有効濃度（ＥＣ５０）値で評価してもよく、ＥＣ５０はウイルスのみに感染させ、ＲＮアーゼ処理していない培養と比較して、ウイルス転写量が５０％に低下する濃度である。本明細書において、用語ＥＣ５０は、ＡＣ５０（５０％活性濃度）と区別しないで用いられる。
【００５３】
各試験化合物の細胞毒性効果は５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）で評価され、ＣＣ５０は５０％の宿主細胞の死が生じる濃度であり、例えば、トリパンブルー色素排除またはミトコンドリア機能（例えば、ＭＴＴ）アッセイなどの標準細胞毒性アッセイで測定する。
【００５４】
国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）（国立衛生研究所の構成要素）は、選択指数（ＳＩ）の割合を共通の指標として用いて、試験化合物の効力を評価する。ＣＣ５０／ＥＣ５０（またはＣＣ５０／ＡＣ５０）と等しいＳＩは、感染細胞を殺さずに、ウイルス感染の複製を阻害する試験用のＲＮアーゼの能力を測定する。ＳＩが１を超える場合、試験用のＲＮアーゼが示されるウイルスに対して活性を有し、ＳＩ値が上がると活性が上がることを示す。ＳＩは感染細胞自体を殺さずに、特定のウイルスの複製を阻害する試験物質の能力を測定するので、ウイルスに感染する生体を治療する物質の有用性とかなり相関がある。したがって、ＳＩ＞１である試験結果は、試験したウイルスに感染した生体は、適切な用量の対応するＲＮアーゼを投与することによって治療することができることを示している。
【００５５】
いくつかの態様において、ランピルナーゼのＳＩの下限範囲は、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４５０、約５００、約５５０または約６００である。
【００５６】
いくつかの態様において、ランピルナーゼのＳＩの上限範囲は、約２．０、約２．５、約３．０、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４５０、約５００、約５５０または約６００である。
【００５７】
特定の態様において、ランピルナーゼのＳＩは、約１．０から約６００、約２．０から約４５０、約３．０から約４００、約４．０から約３００、約５．０から約２５０、約１０から約１００、約３０から約１００、約３０から約５０、または約４０から約８０である。
【００５８】
本明細書において、用語「約」は、示された量または数に当業者が近いと理解する量または数を示す。例えば、本明細書において用語「約」は、示された量または数のプラスマイナス１０％以内の量を示す。
【００５９】
本明細書において、用語「治療する（treating）」および「治療（treatment）」は、ウイルスに感染した対象に、治療有効量のＲＮアーゼ、例えば、ランピルナーゼや、‘８０５バリアント、アムヒナーゼ２、またはｒアムヒナーゼ２などのランピルナーゼバリアントを投与することを示す。本明細書において、用語「治療する（treating）」は、望ましい薬理および／または生理効果を招くいずれかのウイルス疾患の治療を包含し、疾患の進行を止めること、疾患の退行を招くこと、個体内での１つの細胞から別の細胞へのウイルスの拡散を制限すること、個体内でのウイルスの複製を制限すること、個体の細胞へのウイルスの侵入を制限すること、および個体またはその個体の組織内でのウイルスの数を低下させることを含む。
【００６０】
本明細書において、用語「予防（prevention）」および「予防する（preventing）」は、疾患またはその症状が、疾患または症状が進行するおそれがある対象で起こることを予防することを示すが、まだ疾患または症状があるとは診断されていない。
【００６１】
本明細書において、用語「治療有効量（therapeutically effective amount）」は、用語「治療有効用量（therapeutically effective dose）」と区別しないで用いられ、疾患の症状または治療されるべき状態の改善（improvement）または改善（remediation）を招くＲＮアーゼの量を示す。１つの実施形態において、ランピルナーゼ、‘８０５バリアント、アムヒナーゼ２またはｒアムヒナーゼ２などのＲＮアーゼの治療有効量は、対象のウイルス感染開始を遅らせるもしくは最小限に抑え、または対象のウイルス感染からの回復を早めまたは促進させる。別の実施形態において、ランピルナーゼ、‘８０５バリアント、アムヒナーゼ２またはｒアムヒナーゼ２などのＲＮアーゼは、ウイルス感染の媒介による疾患全体の死亡率を低下させる。１つの実施形態において、ＲＮアーゼは感染対象のウイルス力価を低下させる。別の実施形態において、ＲＮアーゼは感染対象のウイルス力価が上昇することを防止する。１つの実施形態において、治療有効量のＲＮアーゼは、ウイルス感染またはウイルス媒介疾患での治療または管理において治療への利点を提供する。１つの実施形態において、治療有効量のＲＮアーゼは１つの細胞から別の細胞へのウイルスの拡散を低下させる。１つの実施形態において、治療有効量のＲＮアーゼは罹患率または死亡率を低下させる。治療有効量はまた、疾患を予防および／または症状の重症度を低下させ得る。
【００６２】
治療有効量は、日常の実験として当業者によって決定され得る。医薬組成物の治療有効投与量は当業者によって、例えば動物での検討から容易に決定され得る。さらに、ヒトの臨床研究によって、当業者がヒトにとって好ましい有効用量を決定し得る。そのような臨床研究は当技術分野では日常的であり、よく知られている。採用される正確な用量はまた、投与経路に依存する。有効用量は、インビトロまたは動物試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。ＲＮアーゼは単回投与または複数回投与で、投与の必要がある対象に投与され得る。１つの実施形態において、ＲＮアーゼは投与の必要がある対象に１日１回、または１日に複数回投与される。１つの実施形態において、症状が解決するおよび／または対象がウイルス感染する危険性がなくなるまで、ＲＮアーゼを対象に投与する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、治療有効量のＲＮアーゼ、特にランピルナーゼの投与は、ＲＮアーゼで治療していないウイルスに感染した対照と比較して、ウイルス力価を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも２５％低下させる。ウイルス力価の測定については、Reischl, Front Biosci. 1996 Aug 1, 1:e 72-7, Application of molecular biology-based methods to the diagnosis of infectious diseasesで説明されている。
【００６４】
いくつかの実施形態において、治療有効量のＲＮアーゼ、特にランピルナーゼの投与は、検出レベル未満にウイルス力価を低下させる。
【００６５】
１つの実施形態において、治療有効用量は治療を必要とする対象の体重に基づいていてもよい。１つの実施形態において、治療有効用量は約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．００４から約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０２から約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。１つの実施形態において、治療有効用量は約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇであってもよい。しかしながら、投与量は化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療対象の年齢および体重によって変化し得ることは明らかである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＲＮアーゼ、特にランピルナーゼは、ウイルス暴露後４８時間以内に投与してもよい。他の実施形態において、ＲＮアーゼは、ウイルス暴露後７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１４日間、３週間、４週間または２カ月以内に投与してもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＲＮアーゼ、特にランピルナーゼを複数回投与する。これらの複数回投与の頻度は、症状の重症度などの要因によって変化させてもよい。例えば、ＲＮアーゼを月１回、月２回、隔週、週１回、週２回、週３回、週４回、隔日、１日１回、１日２回または１日３回投与してもよい。
【００６８】
ＲＮアーゼ、特にランピルナーゼの投与持続期間、すなわちＲＮアーゼを投与する期間は、症状の重症度、患者の反応などの要因によって変化させることができる。例えば、ＲＮアーゼを１日間、３日間、７日間、２週間、４週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月またはそれ以上の期間にわたって投与することができる。
【００６９】
本明細書において、用語「対象」または「患者」はいずれかの哺乳類を示し、限定されないが、ヒト、ならびにチンパンジー、他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類を含めた、他の霊長類を含む。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラット（コットンラットを含む）およびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物；ならびにニワトリ、七面鳥、他の家禽の鳥、アヒル、ガチョウなどの家庭用、野生および狩猟用のトリを含めたトリも限定されない例である。成人および新生児個人も包含されることが意図される。
【００７０】
特に、本発明はヒト対象のウイルス感染の治療または予防に関する。治療対象のウイルス感染がイヌパルボウイルスによる感染の場合、対象は、好ましくはイヌである。治療対象のウイルス感染がベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）による感染の場合、対象は、好ましくはウマ、ロバまたはシマウマである。
【００７１】
用語「全身投与」は、医薬品、栄養物または他の物質のいずれかの投与経路を含むことが意図され、循環系に入れることによって全身が投与によって影響を受ける。対照的に、局所投与は投与部位のみで局所的に作用する。
【００７２】
一般に、当業者は、ＲＮアーゼ、特にランピルナーゼが全身投与されるいずれの経路もウイルス感染の治療に適していると結論付ける（任意の特定の場合においては、１つの経路が別の経路に比べてより効果的であり得るが）。よって、腸内投与（限定されないが、経口投与および直腸投与を含む）および非経口投与（限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与およびエアロゾル送達を含む）がＲＮアーゼ、特にランピルナーゼの投与に適した方法である。
【００７３】
ランピルナーゼの投与に関する追加の適切な例示方法には、経鼻投与、口腔投与、膣内投与、眼内投与、皮下投与、腹腔内投与、動脈内投与、脊髄投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、舌下投与、口腔粘膜投与、気管支投与、リンパ管投与、子宮内投与、縫合などの埋め込み型装置もしくは埋め込み可能なポリマーなどの埋め込み型装置に統合された投与、硬膜内投与、皮質内投与、または経皮投与が含まれる。通常、そのような組成物は本明細書に記載される薬学的に許容できる組成物として投与される。
【００７４】
本明細書において、用語「医薬組成物」には哺乳類、特にヒトなどの対象への投与に適する組成物が包含される。一般に、「医薬組成物」は滅菌されており、対象内での望ましくない反応を誘発することができる汚染物質が存在しない。
【００７５】
本明細書において、用語「薬学的に許容できる担体」にはありとあらゆる溶媒、分散媒、被膜剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性のある物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は本技術分野でよく知られている。これらの薬剤は一般に、安全であり、毒性を示さず、生物学的および他の観点からも望ましいものである。従来の媒体または薬剤が本発明のベクターまたは細胞に不適合である場合を除いて、治療効果のある組成物への使用が予想される。追加の活性成分を組成物に組み込むこともできる。本明細書に示されるＲＮアーゼ、特にランピルナーゼおよびランピルナーゼバリアントは、他の生物学的に活性がある薬剤とともに投与してもよい。
【００７６】
多種多様の薬学的に許容できる賦形剤が本技術分野で知られているので、本明細書では詳細に説明しない。薬学的に許容できる賦形剤は、例えば、A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.を含む様々な刊行物に詳細に記載されている。
【００７７】
ＲＮアーゼ、特にランピルナーゼは任意の適切な手段を用いて対象に投与してもよく、ウイルス力価、ウイルス感染の症状などの望ましい低下をもたらすことができる。よって、ＲＮアーゼは、治療のための投与に対する様々な製剤に組み込むことができる。より詳細には、ＲＮアーゼは、適切な薬学的に許容できる担体または希釈剤と組み合わせることによって、医薬組成物に処方することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、粒剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体形態の製剤に処方してもよい。
【００７８】
限定として解釈してはならない以下の実施例により、本発明の態様をさらに説明する。本願全体を通して引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図および配列表は、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
（実施例）
【実施例１】
【００７９】
ＭＥＭ、ＥＦ、および、ＢＳＲ細胞内の狂犬病ウイルス
図１に記載される実験において、各試験細胞株の密度を、最小必須培地（ＭＥＭ）を用いて５０，０００細胞／ｍｌに調整した。細胞をウェルに配置し、３７℃および０．５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ランピルナーゼを１０μＭ、３μＭ、９００ｎＭ、２７０ｎＭ、８１ｎＭ、および２４ｎＭの濃度に希釈してウェルに加え、細胞とともに３７℃および０．５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【００８０】
そして、感染多重度（「ＭＯＩ」）が０．１である狂犬病ウイルスを各ウェルに加え、ランピルナーゼおよび狂犬病ウイルスを含むウェルを３７℃および０．５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
【００８１】
各ウェルのウイルスを、マウス神経芽腫細胞を用いて狂犬病ウイルスを導入してから２４および４８時間後に滴定し、その結果を図１に示す。
【００８２】
図１からわかるように、ランピルナーゼで処理した細胞にウイルスを導入してから２４時間後に、示される哺乳類細胞株内の狂犬病ウイルスに対して、ランピルナーゼは並外れた活性を有する。
【００８３】
ＳＩは感染細胞自体を殺さずに、特定のウイルスの複製を阻害する試験物質の能力を測定するので、ウイルスに感染した哺乳類対象を治療する物質の有用性とかなり相関がある。したがって、ＳＩ＞１である試験結果は、狂犬病ウイルスに感染した哺乳類対象は、適切な用量のランピルナーゼを全身投与することによって治療することができることを示している。さらに、他の下記で開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶの実験結果は、狂犬病感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【実施例２】
【００８４】
ＮＨＢＥ細胞内のＭＥＲＳ−ＣｏＶ
図２に示される実験において、ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスに対するランピルナーゼの抗ウイルス活性を、２つの知られている抗ウイルス剤：ＳＡＲＳプロテアーゼ阻害剤およびインファージェンの活性と比較した。実験は正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞を用いて、各薬剤の４つの異なる濃度で行った。
【００８５】
より詳細には、ＮＨＢＥ細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中、３７℃で７日間増殖させた。１日１回細胞を洗浄し、リフレッシュした（refresh）。以下の２つの対照を用いた：ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスが含まれる対照、および試験薬剤で処理した非感染ＮＨＢＥ細胞が含まれる対照。
【００８６】
８日目に、試験濃度の３つの試験薬剤を細胞および緩衝液に導入し、感染多重度（「ＭＯＩ」）が０．０１であるウイルスを導入した。次いで、ウイルスおよび薬剤を含む試料を３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、培地は１日１回補充した。次いで、７２時間後、試料を滴定し、ウイルス含有量を測定した。
【００８７】
様々な試験薬剤の抗ウイルス活性は、ＮＨＢＥ細胞でのウイルス産生に対する様々な試験薬剤で処理したＮＨＢＥ細胞のウイルス産生（Ｖｅｒｏ７６細胞のウイルス力価）を対照として用いて比較することによって測定した。
【００８８】
図２からわかるように、ランピルナーゼは、いずれの他の薬剤よりもＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスに対してさらにより活性が強かった。さらに、最小濃度のランピルナーゼの用量を除いて、Ｐ値が０．０００１未満だったので、ランピルナーゼの活性は明らかに統計的に有意だった。
【００８９】
ランピルナーゼは、宿主細胞を殺さないで、ＮＨＢＥ細胞内のＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスの複製をとても効果的に阻害したので、本実験によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性が証明されている。さらに、他の下記で開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶの実験結果は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【実施例３】
【００９０】
ＮＨＢＥ細胞内のインフルエンザウイルス
図３に示される実験において、インフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスに対する、様々な濃度のランピルナーゼ（５μｇ／ｍｌ「Ｒａｎｐ−５」、１μｇ／ｍｌ「Ｒａｎｐ−１」、０．５μｇ／ｍｌ「Ｒａｎｐ−０．５」、および０．１μｇ／ｍｌ「Ｒａｎｐ−０．５」）の抗ウイルス活性を、ＮＨＢＥ細胞を用いて、様々な濃度の２つの知られている抗ウイルス剤（リバビリン（３２０μｇ／ｍｌ「Ｒｉｂａ−３２０」、１００μｇ／ｍｌ「Ｒｉｂａ−１００」および１０μｇ／ｍｌ「Ｒｉｂａ−２０」）、オセルタミビルカルボン酸塩（２５μＭ「Ｏｓｅｌ−２５」、１０μＭ「Ｏｓｅｌ−１０」および１μＭ「Ｏｓｅｌ−１」））の活性と比較した。３つの対照を用いた。１つ目の対照は、ウイルスに感染し、プラセボで処理したＮＨＢＥ細胞であった（この対照を図３に示す）。２つ目の対照は、プラセボに「感染し」、試験薬剤で処理したＮＨＢＥ細胞であった。３つ目の対照は、プラセボに「感染し」、プラセボで処理したＮＨＢＥ細胞であった。
【００９１】
ＮＨＢＥ細胞に、業者が所有する培養培地を供給し、３７℃および５％ＣＯ２で少なくとも１６時間平衡化した。平衡後、細胞を洗浄し、リフレッシュした。
【００９２】
そして、ＮＨＢＥ細胞に感染多重度のレベルが０．０１であるインフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを感染させた。１時間の吸着期間後、ウイルス接種物を除去し、処理液を加えた。感染してから２４時間後、処理液を補充した。感染してから４８時間後、上清を回収した。そして、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞のウイルス力価を測定し、一元配置分散分析を用いて統計的有意性を解析した。
【００９３】
図３からわかるように、最小濃度の用量を除き、インフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスに対するランピルナーゼの活性は統計的に有意であり、用量依存的であった。さらに、これらの実験によって、図２に示される実験結果が裏付けられ、いずれかの試験濃度のランピルナーゼでも、ＮＨＢＥ細胞の生存率は減少しなかった。
【００９４】
ランピルナーゼは、細胞自体を殺さないで、ＮＨＢＥ細胞内の試験インフルエンザウイルスの複製を阻害したので、本実験によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にインフルエンザウイルスに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性がさらに証明されている。さらに、他の下記で開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶの実験結果は、インフルエンザ感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【実施例４】
【００９５】
ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶ（全てインビトロ）
方法
ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶによる細胞感染を阻害するランピルナーゼの能力を評価するためにいくつかの検討を行った。ランピルナーゼ溶液（ＲＡＮ）および粉末由来ランピルナーゼ（ＲＡＮ−２）について試験した。粉末由来ランピルナーゼは、Ｔａｍｉｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．が提供する凍結乾燥されたランピルナーゼであった。アッセイの品質管理は、陽性（中性）対照（ｎ＝１６）または感染細胞＋培地、非感染細胞（陰性対照）（ｎ＝１６）、および対照阻害剤に対する用量反応（ｎ＝２または４）を用いて行った。中性対照および非感染細胞のＺ’を計算した。データはプレートベースで正規化した。データ解析はＧｅｎｅＤａｔａソフトウェアを用いて行い、ランピルナーゼのＥＤ５０を測定するための用量反応曲線の解析は曲線適合法によるレーベンバーグ・マルカートアルゴリズム（ＬＭＡ）を適用したＧｅｎｅＤａｔａＣｏｎｄｏｓｅｏソフトウェアを用いて行った。
【００９６】
アストロサイト内のＶＥＥＶ
アストロサイトのＶＥＥＶ感染におけるランピルナーゼの効果を試験するため、ランピルナーゼ溶液（「ＲＡＮ」）を１０点用量反応で２回反復試験し、粉末由来ランピルナーゼ（図４における「ＲＡＮ＿２」、図５における「ＲＡＮ−２」）は、３．５ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、単回用量反応についてのみ試験した。ＲＡＮおよびＲＡＮ−２は２つの独立した実験で試験した。これらの実験において、アストロサイトを４，０００および３，０００ 細胞／ウェルでプレートし、一晩インキュベートし、感染前に２時間ランピルナーゼで前処理した。感染多重度（「ＭＯＩ」）が０．０５で細胞を２０時間感染させた。検討結果を図４に示す。
【００９７】
ＨｅＬａ細胞のＶＥＥＶ感染におけるランピルナーゼの効果を試験するため、ＲＡＮを１０点用量反応で４回反復試験し（ｎ＝４）、２つの独立した実験（ｒｅｐ１およびｒｅｐ２）を繰り返した。ＲＡＮ−２はプレートでｎ＝２用量反応で試験し、２つの独立した実験を繰り返した。ＨｅＬａ細胞は４，０００細胞／ウェルでプレートし、一晩インキュベートし、感染前に２時間ランピルナーゼで前処理した。ＭＯＩが０．０５で細胞を２０時間感染させた。検討結果を図５に示す。図５に示されるように、ＲＡＮについてはＳＩ値が１０を超え、ＲＡＮ−２についてはＳＩ値が７．７５を超えた。
【００９８】
Ｕ２ＯＳ細胞内のＣＨＩＶ
Ｕ２ＯＳ細胞のＣＨＩＶ感染におけるランピルナーゼの効果を試験するため、ランピルナーゼ溶液を１０点用量反応で４回反復試験し（ｎ＝４）、２つの独立した実験（ｒｅｐ１およびｒｅｐ２）を繰り返した。ＲＡＮ−２ストックはプレートでｎ＝２用量反応で試験し、２つの独立した実験を繰り返した。Ｕ２ＯＳ細胞は３，０００細胞／ウェルでプレートし、一晩インキュベートし、感染前に２時間ランピルナーゼで前処理した。ＭＯＩが０．４で細胞を２４時間感染させた。検討結果を図６に示す。図６に示されるように、ＳＩ値が１８を超えた。
【００９９】
ＨｅＬａおよびＶｅｒｏＥ６細胞のＥＢＯＶ
ＨｅＬａおよびＶｅｒｏＥ６細胞のＥＢＯＶ感染におけるランピルナーゼの効果を試験するため、ランピルナーゼ溶液を１０点用量反応で４回反復試験し（ｎ＝４）、２つの独立した実験（ｒｅｐ１およびｒｅｐ２）を繰り返した。ＲＡＮ−２ストックはプレートでｎ＝２用量反応で試験し、２つの独立した実験を繰り返した。ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏＥ６細胞をそれぞれ４，０００細胞／ウェルでプレートし、一晩インキュベートし、感染前に２時間ランピルナーゼで前処理した。ＭＯＩが０．５（ＨｅＬａ細胞）、０．５および０．７５（ＶｅｒｏＥ６細胞）で細胞を４８時間感染させた。ＨｅＬａ細胞についての検討結果を図７、ＶｅｒｏＥ６細胞についての検討結果を図８に示す。ＳＩ値は予想外に高く、ＶｅｒｏＥ６細胞は４０を超え、７７も超えていた（図８）。
【０１００】
ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶのインビトロでの実験の要約
検討結果は、驚くほど低いＡＣ５０値および驚くほど高いＳＩ値で、ランピルナーゼがＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶを強く阻害したことを示した。図９はＡＣ５０の検討結果の全体の要約を示す。
【０１０１】
これらの実験は、細胞自体を殺さずに、様々な哺乳類細胞（アストロサイト、ＨｅＬａ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＶｅｒｏＥ６細胞）内の試験用ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶの複製をランピルナーゼが阻害したことを証明する。これらの実験によってさらに、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にＶＥＥＶ、ＣＨＩＶおよびＥＢＯＶに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性が証明されている。さらに、ランピルナーゼで既に処理された細胞にウイルスを導入したこれらの実験で、ランピルナーゼが予防的に用いられていたことに注目すべきである。したがって、これらの実験は、ランピルナーゼの抗ウイルス特性は予防的におよび治療に用いることができることを証明している。
【実施例５】
【０１０２】
マウス内のＥＢＯＶ
ＥＢＯＶ感染マウスでのランピルナーゼの用量の範囲の効果を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８から１２週齢）に１０００ＰＦＵのマウス適応ザイールＥＢＯＶを感染させた。感染は腹腔内注射（尾静脈注入）により行った。感染１時間前に、各マウスに０．９％生理食塩水（対照群；グループ１）、０．１ｍｇ／ｋｇランピルナーゼ（グループ２）、０．０２ｍｇ／ｋｇランピルナーゼ（グループ３）、または０．００４ｍｇ／ｋｇランピルナーゼ（グループ４）を投与した。検討群を図１０に示す。
【０１０３】
マウスの生存をモニターし、各マウスの体重を感染させた日および感染後１４日間毎日測定した。（図１１および１２は感染後１２日間のデータを示すが、マウスのモニターはさらに２日間続けた。）各グループの生存数（グループ当たり１０匹のマウス中）および各グループにおける生存率をそれぞれ図１１および図１２に示す。各グループのマウスの体重および出発体重からの変化率をそれぞれ以下の図１３および１４に示す。図１５は図１４のデータをグラフ表示したものである。
【０１０４】
検討により、ランピルナーゼによってマウスにおいて致命的なエボラウイルス感染が防がれることが示された。特に、０．１ｍｇ／ｋｇのランピルナーゼの用量で、感染後少なくとも１４日間、７０％のマウスが生存した。比較して、ランピルナーゼを投与しなかった対照マウスは、エボラウイルス感染で感染後７日目までに１００％死んだ。さらに、０．１ｍｇ／ｋｇのランピルナーゼを投与したグループで生存しているマウスは、感染後１２日目で出発体重の９２％以内の体重を維持していた。したがって、検討により、ランピルナーゼによってエボラウイルス感染マウスの生存を効果的に促進することが示された。さらに、本検討によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にエボラウイルスに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性が証明されている。さらに、上記の、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶの実験結果は、ＥＢＯＶ感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【実施例６】
【０１０５】
ＮＨＢＥ細胞内のＡＶ
ＮＨＢＥ細胞でのランピルナーゼの抗アデノウイルス（ＡＶ）活性を評価するために検討を行った。
【０１０６】
ランピルナーゼストック溶液を２００μＭに調製し、アリコートで−８０℃にて保存した。実験１日目に、１つのアリコートを解凍し、使用液はストック濃度を細胞培養培地で適切に希釈することによって調製した。使用液は使用前に、３７℃に設定した水浴で１５〜３０分間予め温めた。
【０１０７】
分化ＮＨＢＥ細胞（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）を本検討で用いた。細胞は各１２または２４の組織インサート（tissue insert）で、キットで提供された。本検討で用いたキット（ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）、それぞれＡＩＲ−１１０およびＡＩＲ−１００）は、独身ヒトドナー、＃９８３１、２３歳、健康、非喫煙、白人男性に由来するものだった。到着してすぐに、組織インサートを製造業者の指示書に従って、６ウェルプレートの個別のウェルに移した。１ｍｌのＭａｔＴｅｋ培養培地（ＡＩＲ−１００−ＭＭ／維持培地）を組織の基底外側に供給し、一方で頂端側は９５％加湿空気／５％ＣＯ２の環境にさらした。細胞は実験開始前に少なくとも１６時間、３７℃で平衡化した。平衡期間後、細胞の頂端側から分泌されるムチン層を、５００μｌの予め温めた３０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−５０２４／ロット００００３５４１６５）で慎重に繰り返し（３回）洗浄することによって除去し、培養培地を補充した。
【０１０８】
ウイルス（アデノウイルス２、ＡＴＣＣからのミラー株（strain Miller）；力価６．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌ）は使用前に−８０℃で保存した。アデノウイルスの用量レベルは０．１のＭＯＩに相当した。
【０１０９】
分化ＮＨＢＥ細胞を実験的にウイルスに感染させた。１時間の吸着期間後、ウイルス接種物を除去し、図１６に示されるように処理液を加えた。感染してから２４時間後、処理液を組織インサートの基底区画に補充した。感染してから５日後、上清を回収し、Ａ−５４９細胞（ＡＴＣＣからのヒト肺がん細胞）のウイルス力価を測定するまで−８０℃で保存した。対照は以下の４つのグループからなる。
グループ１−感染およびプラセボ処理細胞（ウイルス対照）
グループ２−偽感染および処理細胞（毒性対照）
グループ３−偽感染およびプラセボ処理細胞（細胞対照）
グループ４−陽性対照薬物としての２’，３’−ジデオキシシチジン
毒性対照は実験の最後に、組織および／または細胞の形態が変化する可能性について、顕微鏡で観察した。
【０１１０】
ＮＨＢＥ細胞は図１６に示されるように、ＡＶまたは細胞培地（偽）を頂端側にさらして接種させた。３７℃および５％ＣＯ２で１時間±１０分のインキュベーション後、ウイルス接種物または細胞培養培地を細胞から除去した。細胞の頂端側を５００μｌの予め温めたＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で１回洗浄した。
【０１１１】
接種後、ランピルナーゼ、２’，３’−ジデオキシシチジンまたは細胞培養培地（プラセボ／細胞対照）を、細胞の頂端側および基底側の培地区画（basal medium compartment）に加え、細胞とともに１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、薬物を含む培地を頂端および基底チャンバーから除去した。培養培地のみ（プラセボ／細胞対照）または薬物を含む培養培地（試験条件）を底部チャンバーに加え、細胞を４日間インキュベートした。感染してから２４時間後、薬物を含むまたは含まない細胞培養培地を基底区画に補充した。
【０１１２】
感染および処理に続いて、細胞を気液界面で維持し、細胞培養物の上清を感染してから４８時間後に回収した。３７℃および５％ＣＯ２で３０分間平衡化した、５００μｌの培養培地を加え収集することによって、ＮＨＢＥ細胞の頂端区画に放出されたウイルスを回収した。頂端区画からの培地を２つのアリコートに分け、後のウイルス力価の分析まで−８０℃で保存した。
【０１１３】
５０％の細胞培養物を感染させることができるウイルス用量（ＣＣＩＤ５０）を評価するために、Ａ−５４９細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達するまで一晩増殖させ、次いで１００μｌの感染培地（５０μｌ／ｍｌのゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ／ＥＢＳＳ）で２回洗浄した。ウェルを１００μｌの感染培地で満たした。ＮＨＢＥ細胞培養物からの頂端の洗浄液を感染培地で１０倍に希釈し、１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。ＮＨＢＥ細胞からの各濃度のランピルナーゼ（６ＮＨＢＥ細胞ウェル／用量）を滴定して、１つの濃度につき６つの力価を求め（反復試験としての各処理ＮＨＢＥウェル）、感染および感染／処理細胞からのウイルス収率を評価した。したがって、各濃度のランピルナーゼを合計６回滴定した。陽性対照である２’，３’−ジデオキシシチジンは、１つのウェルのＮＨＢＥ細胞のみを各濃度に割り当てた。よって、各濃度は１回のみ滴定した。３つのウェルは未処理／感染対照に割り当てた。これらは１回滴定し、未処理／感染対照の力価を３回反復試験した。３７℃および５％ＣＯ２で６日間のインキュベーション後、細胞を顕微鏡で観察し、ウイルス誘導細胞変性効果（「ＣＰＥ」）を判定した。非感染対照と比較していずれかのＣＰＥ（一般的に細胞の細胞円形化または溶解）の跡が観察された場合、ウェルは陽性と判定した。ＣＣＩＤ５０はリード・ミュンヒ法（Reed-Muench method）で計算した。
【０１１４】
検討結果を図１７に示す。最小用量を除いて、全てのランピルナーゼ処理によって、検出不可能なレベルまでウイルス力価が減少した。この低下は５０μＭのランピルナーゼ処理でのウイルス力価のおよそ３の対数降下を示した（４つのアスタリスクは、プラセボと比較してｐ＜０．０００１であることを示す）。５および１０μＭランピルナーゼ処理では、未処理／感染対照ウェルから検出されるウイルス力価と比較して、検出されたウイルス力価は約１の対数低下であった（１つのアスタリスクはプラセボと比較してｐ＜０．０５であることを示す）。２’，３’−ジデオキシシチジンは予想通りにウイルス複製を阻害した。
【０１１５】
非感染／ランピルナーゼ処理細胞、または２’，３’−ジデオキシシチジン処理細胞では、ウイルスの細胞変性効果は検出されなかった。ランピルナーゼ処理または２’，３’−ジデオキシシチジン処理したＮＨＢＥ細胞を顕微鏡により評価した結果、毒性学的現象は起こっていなかった。
【０１１６】
したがって、検討結果は全ての多用量のランピルナーゼ処理は統計的に有意にＡＶの力価を低下させたことを示した。ランピルナーゼは、宿主細胞を殺さないで、ＮＨＢＥ細胞内のＡＶウイルスの複製を効果的に阻害したので、本実験によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にＡＶウイルスに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性がさらに証明されている。さらに、上記に開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶの実験結果は、ＡＶ感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【０１１７】
上記データは、アデノウイルス科（adenoviridae）のウイルスのメンバーであるアデノウイルス２を用いて得られた。この科のウイルスはとても近縁であり、アデノウイルス科（adenoviridae）のいずれか１つのウイルスに対するランピルナーゼの抗ウイルス活性が証明されたことによって、ランピルナーゼがアデノウイルス科（adenoviridae）の全てのウイルスに対して同じ抗複製活性を有することは強く証明されている。
【実施例７】
【０１１８】
Ａ−７２細胞内のイヌパルボウイルス
イヌパルボウイルス２ｃ型をＡ−７２細胞培養物中で増殖させ、細胞培養培地（ダルベッコ最小必須培地；「ＤＭＥＭ」）に含まれるウイルスを使用するまで−８０℃で冷凍保存した。ウイルスストックの力価は約１０５細胞培養感染用量ユニット／ｍｌであり、血球凝集（ＨＡ）の力価は１，０２４から２，０４８であった。
【０１１９】
イヌの腫瘍由来の線維芽細胞株であるＡ−７２連続細胞株を９６ウェルプレート中のＤＭＥＭで増殖させ、様々な試験条件で用いられた。
【０１２０】
Ａ−７２細胞におけるランピルナーゼの細胞毒性を評価するために、１ｍｌのＤＭＥＭ量で、Ａ−７２細胞を１２５，０００細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに播種した。各ウェルの培地に２５μｌのランピルナーゼを５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。各濃度を４回の反復試験で行った。３５．５℃で４日間インキュベーション後、目に見える何らかの形態変化について倒立顕微鏡で細胞を観察した。
【０１２１】
次に、ランピルナーゼの有効性について評価した。ランピルナーゼは２倍希釈により、１０μｇ／ｍｌから０．１５６２５μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で試験した。ストックウイルスは非希釈から１／１０，０００希釈で試験した。Ａ−７２細胞は標準手順に従ってトリプシン処理し、９６ウェル細胞培養プレートに、１８，７５０細胞／ウェルの濃度で１５０μｌの量で播種した。そして各ウェルにランピルナーゼを加え、最終の所定濃度にした。３５．５℃で２時間インキュベーション後、２５μｌの様々な希釈でのウイルスを加えた。対照にはランピルナーゼ処理／非感染細胞、および未処理／非感染細胞の細胞培養物でのイヌパルボウイルス複製のランピルナーゼによる阻害が含まれる。全ての変数について２回反復試験を行った。３５．５℃で４日間インキュベーションの最後に、上清流体を回収し、ＨＡ試験（ウイルスが０．５％ブタ赤血球懸濁液を凝集させる能力について試験する）を用いてウイルスが複製されたかを試験した。ＨＡ力価は９６ウェルプレートでの目に見える赤血球凝集を引き起こす上清流体の最高希釈の逆数で示した。
【０１２２】
ランピルナーゼ処理（様々な濃度）および未処理細胞を顕微鏡によって観察したとき、ランピルナーゼ濃度にかかわらず、２つのグループ間で目に見える形態の違いがなかった。よって、いずれの試験濃度でもランピルナーゼの明らかな細胞毒性効果はなかった。
【０１２３】
検討結果を図１８に示す。ウイルスを最高で１／１００希釈した未処理細胞培養物で、ウイルス増殖が検出された。ウイルス増殖は、非希釈ウイルスストックで０．１５６２５μｇ／ｍｌランピルナーゼ処理した細胞培養物を感染させたときにも検出された。０．３１２５μｇ／ｍｌ以上のランピルナーゼ濃度で処理した培養物ではウイルス増殖がなかった。ランピルナーゼは、宿主細胞を殺さないで、イヌパルボウイルスのウイルス増殖をとても効果的に阻害したので、本実験によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にイヌパルボウイルスに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性がさらに証明されている。さらに、上記に開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶの実験結果は、イヌパルボウイルス感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【実施例８】
【０１２４】
ＮＨＢＥ細胞内のＲＳＶ
ランピルナーゼストック溶液を調製、保存、解凍し、実施例６に記載のように使用液を調製するために用いた。
【０１２５】
ＮＨＢＥ細胞（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を本検討で用いた。これらの細胞は実施例６で用いた細胞株と同じであり、同じキットから提供されたものである。実施例６のように、組織インサートを製造業者の指示書に従って、６ウェルプレートの個別のウェルにすぐに移した。実施例６で使用した同じ培養培地１ｍｌを組織の基底外側に供給し、頂端側は９５％加湿空気／５％ＣＯ２の環境にさらした。細胞は実施例６のように平衡化し、この平衡期間後、ムチン層を実施例６のように除去し、培養培地を補充した。
【０１２６】
ウイルス（ＡＴＣＣからのＲＳＶ  Ａ２；力価４．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌ）は使用前に−８０℃で保存した。攻撃ウイルスの用量レベルは０．１のＭＯＩに相当する。
【０１２７】
分化ＮＨＢＥ細胞を実験的にＲＳＶウイルスに感染させた。１時間の吸着期間後、ウイルス接種物を除去し、図１９に示されるように処理液を加えた。感染してから２４時間後、処理液を組織インサートの基底区画に補充した。感染してから４８時間後、上清を回収し、ＭＡ−１０４細胞（ＡＴＣＣからの胎児アフリカミドリザル腎臓細胞）のウイルス力価を測定するまで−８０℃で保存した。対照はＡＶ実験で使用した４つのグループの中、以下の３つのグループからなる。
グループ１−感染およびプラセボ処理細胞（ウイルス対照）
グループ２−偽感染および処理細胞（毒性対照）
グループ３−偽感染およびプラセボ処理細胞（細胞対照）
毒性対照は実験の最後に、組織および／または細胞の形態が変化する可能性について、顕微鏡で観察した。
【０１２８】
ＮＨＢＥ細胞は図１９に示されるように、ＲＳＶまたは細胞培養培地（偽）を頂端側にさらして接種させた。３７℃および５％ＣＯ２で１時間±１０分のインキュベーション後、ウイルス接種物または細胞培養培地を細胞から除去した。細胞の頂端側を５００μｌの予め温めたＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で１回洗浄した。
【０１２９】
接種後、ランピルナーゼまたは細胞培養培地（プラセボ／細胞対照）を、細胞の頂端側および基底側の培地区画に加え、細胞とともに１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、薬物を含む培地を頂端および基底チャンバーから除去した。培養培地のみ（プラセボ／細胞対照）または薬物を含む培養培地（試験条件）を底部チャンバーに加え、細胞をさらに２３時間インキュベートした（感染後合計２４時間インキュベーションした）。感染してから２４時間後、薬物を含むまたは含まない細胞培養培地を基底区画に補充した。
【０１３０】
感染および処理に続いて、細胞を気液界面で維持し、細胞培養物の上清を感染してから４８時間±３０分後に回収した。３７℃および５％ＣＯ２で３０分間平衡化した、５００μｌの培養培地を加え収集することによって、ＮＨＢＥ細胞の頂端区画に放出されたウイルスを回収した。頂端区画からの培地を２つのアリコートに分け、後のウイルス力価の分析のため−８０℃で保存した。回収前に、１回の処理につき１回の反復試験で用いる組織インサートの画像を倒立顕微鏡で４０倍および１００倍でそれぞれ得た。
【０１３１】
ＣＣＩＤ５０を評価するために、ＭＡ−１０４細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達するまで一晩増殖させ、１００μｌの感染培地（５０μｌ／ｍｌのゲンタマイシンを加えたＭＥＭ／ＥＢＳＳ）で２回洗浄した。ウェルを１００μｌの感染培地で満たした。頂端の洗浄液を感染培地で１０倍に希釈し、１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。各試料を３回反復試験で滴定して（継代１）、感染および感染／処理細胞からのウイルス収率を評価した。３７℃および５％ＣＯ２で６日間のインキュベーション後、細胞を顕微鏡で観察し、ウイルス誘導細胞変性効果（ＣＰＥ）を判定した。非感染対照と比較していずれかの細胞変性効果（一般的に細胞の細胞円形化または合胞体）の跡が観察された場合、ウェルは陽性と判定した。ＣＣＩＤ５０はリード・ミュンヒ法で計算した。
【０１３２】
検討結果を図２０に示す。結果の統計的有意性は一元ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン６ｃ）によって解析した。全てのランピルナーゼ処理によって、検出不可能なレベルまでウイルス力価が減少した（図２０）。この低下は、未処理／感染対照のウイルス力価と比較して、２．３の対数低下を示した（図２０に示される４つのアスタリスクはｐ＜０．０００１であることを示す）。
【０１３３】
ランピルナーゼ処理／偽感染細胞、または非感染対照細胞では、ウイルスの細胞変性効果は検出されなかった。偽感染／ランピルナーゼ処理または２’，３’−ジデオキシシチジン処理したＮＨＢＥ細胞を顕微鏡により評価した結果、毒性学的現象は起こっていなかった。
【０１３４】
したがって、検討結果は全ての試験用量（５μＭ、０．５μＭおよび０．１μＭ）のランピルナーゼ処理で、統計的に有意にＲＳＶの力価を低下させ、ランピルナーゼのみではＮＨＢＥ細胞の細胞変性効果を引き起こさないことを示した。ランピルナーゼは、宿主細胞を殺さないで、ＲＳＶをとても効果的に阻害したので、本実験によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にＲＳＶに感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性がさらに証明されている。さらに、上記に開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶの実験結果は、ＲＳＶ感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【実施例９】
【０１３５】
ＮＨＢＥ細胞内のライノウイルス１４
ランピルナーゼストック溶液を調製、保存、解凍し、実施例６および８に記載のように使用液を調製するために用いた。ＮＨＢＥ細胞（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を本検討で用いた。これらの細胞は実施例６および８で用いた細胞株と同じであり、同じキットから提供されたものである。実施例６および８のように、組織インサートを製造業者の指示書に従って、６ウェルプレートの個別のウェルにすぐに移した。実施例６および８で使用した同じ培養培地１ｍｌを組織の基底外側に補充し、頂端側は９５％加湿空気／５％ＣＯ２の環境にさらした。細胞は実施例６のように平衡化し、この平衡期間後、ムチン層を実施例６および８のように除去し、培養培地を補充した。
【０１３６】
ＲＶ−１４（ＡＴＣＣからの１０５９株）は使用前に−８０℃で保存した。ストックウイルスの力価は力価３．６ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌに相当した。攻撃ウイルスの用量レベルは前の実験のデータを基にし、０．００４１の感染多重度（ＭＯＩ）に相当した。
【０１３７】
分化ＮＨＢＥ細胞を実験的にＲＶ−１４ウイルスに感染させた。１時間の吸着期間後、ウイルス接種物を除去して処理液を加えた（図２１）。感染してから２４時間後、処理液を組織インサートの基底区画に補充した。感染してから４日後、上清を回収し、ＨｅＬａ−Ｏｈｉｏ−１細胞（ＡＴＣＣからのヒト子宮頸がん細胞）のウイルス力価を測定するまで−８０℃で保存した。対照は以下の４つのグループからなる。
グループ１−感染およびプラセボ処理細胞（ウイルス対照）
グループ２−偽感染および処理細胞（毒性対照）
グループ３−偽感染およびプラセボ処理細胞（細胞対照）
グループ４−陽性対照薬物としてのピロダビル
【０１３８】
毒性対照は実験の最後に、組織および／または細胞の形態が変化する可能性について、顕微鏡で観察した。
【０１３９】
ＮＨＢＥ細胞は図２１に示されるように、ＲＶ−１４または細胞培養培地（偽感染）を頂端側にさらして接種させた。３７℃および５％ＣＯ２で１時間±１０分のインキュベーション後、ウイルス接種物または細胞培養培地を細胞から除去した。細胞の頂端側を５００μｌの予め温めたＨＥＰＥＳ 緩衝食塩水で１回洗浄した。
【０１４０】
ウイルス接種後、ランピルナーゼ、ピロダビルまたは細胞培養培地（プラセボ／細胞対照）を、細胞の頂端側および基底側の培地区画に加え、細胞とともに１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、薬物を含む培地を頂端および基底チャンバーから除去した。培養培地のみ（プラセボ／細胞対照）または薬物を含む培地（試験条件）を底部チャンバーに加え、細胞を４日間インキュベートした。感染してから２４時間後、薬物を含むまたは含まない細胞培養培地を基底区画に補充した。
【０１４１】
感染および処理に続いて、細胞を気液界面で維持し、細胞培養物の上清をウイルス暴露から４日後に回収した。３７℃および５％ＣＯ２で３０分間平衡化した、５００μｌの培養培地を加え収集することによって、ＮＨＢＥ細胞の頂端区画に放出されたウイルスを回収した。頂端区画からの培地を２つのアリコートに分け、後のウイルス力価の分析まで−８０℃で保存した。
【０１４２】
ＨｅＬａＯｈｉｏ−１細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達するまで一晩増殖させ、１００μｌの感染培地（５０μｌ／ｍｌのゲンタマイシンを加えたＭＥＭ／ＥＢＳＳ）で２回洗浄した。ウェルを１００μｌの感染培地で満たした。ＮＨＢＥ細胞培養物からの頂端の洗浄液を感染培地で１０倍に希釈し、１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。ＮＨＢＥ細胞からの各濃度のランピルナーゼ（６ＮＨＢＥ細胞ウェル／用量）を滴定して、１つの濃度につき６つの力価を求め（反復試験としての各処理ＮＨＢＥウェル）、感染および感染／処理細胞からのウイルス収率を評価した。したがって、各濃度のランピルナーゼを合計６回滴定した。陽性対照であるピロダビルは、１つのウェルのＮＨＢＥ細胞のみを各濃度に割り当てた。よって、各濃度は１回のみ滴定した。３つのウェルは未処理／感染対照に割り当てた。これらは１回滴定し、未処理／感染対照の力価を３回反復試験した。３７℃および５％ＣＯ２で７日間のインキュベーション後、細胞を顕微鏡で観察し、ウイルス誘導ＣＰＥを判定した。非感染対照と比較していずれかのＣＰＥ（細胞溶解）の跡が観察された場合、ウェルは陽性と判定した。ＣＣＩＤ５０はリード・ミュンヒ法で計算し、希釈液の逆数をウイルス力価として示した。
【０１４３】
最小用量以外の全てのランピルナーゼ処理によって、未処理／感染対照の力価に対して、ウイルス力価が減少した（図２２）。５０、１０、５μＭランピルナーゼ処理によるウイルス力価は、約１．６７ｌｏｇ１０降下していた（Ｐ＜０．０００１）。１μＭランピルナーゼ処理では、未処理／感染対照ウェルで検出されたウイルス力価と比較して、検出されたウイルス力価は約１の対数低下であった（Ｐ＜０．０００１）。１０および３．２μｇ／ｍｌのピロダビルは、予想通りにウイルス複製を阻害し、それに続くより低い薬物希釈ではウイルス収率がいくらか用量反応的に減少していた。一般的には、０．００３２μｇ／ｍｌのピロダビルはまた、本実験のＮＨＢＥ細胞で見られたように、ＨｅＬａＯｈｉｏ−１細胞培養抗ウイルス系のＲＶ−１４に対して活性を示さない。
【０１４４】
非感染／ランピルナーゼ処理細胞、またはピロダビル処理細胞では、ウイルスの細胞変性効果は検出されなかった。ランピルナーゼ処理またはピロダビル処理したＮＨＢＥ細胞を顕微鏡により評価した結果、毒性学的現象は起こっていなかった。
【０１４５】
したがって、検討結果は全ての試験用量（５０μＭ、１．０μＭ、５μＭおよび１μＭ）のランピルナーゼで、統計的に有意にＲＶ−１４の力価を低下させ、ランピルナーゼのみではＮＨＢＥ細胞の細胞変性効果を引き起こさないことを示した。ランピルナーゼは、宿主細胞を殺さないで、ＲＶ−１４をとても効果的に阻害したので、本実験によって、ウイルスに感染した哺乳類対象、特にＲＶ−１４に感染した哺乳類対象の治療に全身投与されたランピルナーゼが有用である可能性がさらに証明されている。さらに、上記に開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶの実験結果は、ＲＶ−１４感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【０１４６】
これらのデータは、ライノウイルス科（rhinovirus）の重要なウイルスのメンバーであるライノウイルス１４を用いて得られた。この科のウイルスはとても近縁であり、ライノウイルス科（rhinovirus）のいずれか１つのウイルスに対するランピルナーゼの抗ウイルス活性が証明されたことによって、ランピルナーゼがライノウイルス科（rhinovirus）の全てのウイルスに対して同じ抗複製活性を有することは強く証明されている。
【実施例１０】
【０１４７】
Ｖｅｒｏ７６細胞内のワクシニアウイルス
実施例６、８および９に記載されるように、ランピルナーゼストック溶液を調製、保存、解凍し、および使用液を調製するために用いた。
【０１４８】
ウイルス（ワクシニアウイルス、ＡＴＣＣからのＷＲ株）は使用前に−８０℃で保存した。ストックウイルスの力価は力価７．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌに相当した。攻撃ウイルスの用量レベルは他の実験のデータを基にし、５０〜１００ウイルスプラーク／ウェルに相当する。
【０１４９】
ワクシニアウイルスに対するランピルナーゼの抗ウイルス効果を測定するために、２４ウェルプレートのＶｅｒｏ７６細胞を、図２３に示すフォーマットのようにウイルスに実験的に感染させた。対照は以下の４つのグループからなる。
グループ１−感染およびプラセボ処理細胞（ウイルス対照）
グループ２−偽感染および処理細胞（毒性対照）
グループ３−偽感染およびプラセボ処理細胞（細胞対照）
グループ４−陽性対照薬物としてシドフォビル
【０１５０】
毒性対照は実験の最後に、組織および／または細胞の形態が変化する可能性およびクリスタルバイオレットによる染色強度を顕微鏡で観察した。
【０１５１】
上記図２３に記載のように、２４ウェルプレートのＶｅｒｏ７６細胞を用いてアッセイを行った。５０〜１００ウイルスプラークを産生するためにウイルスを４８時間前滴定し、３７℃で１時間細胞に吸収させた。そしてウイルス接種物を除去し、アガロース中の試験化合物（以下に記載される）を必要に応じてウェルに加えた。
【０１５２】
ランピルナーゼおよびシドフォビル（陽性対照）の希釈液を半ｌｏｇ１０希釈系列を用いて作製した（図２３）。１つの希釈液につき２つのマイクロウェルを用いた。本アッセイの培地は、２％ＦＢＳが入ったＭＥＭ中、最終濃度１％のアガロース（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．のＳｅａ  Ｐｌａｑｕｅアガロース）を含んだ。試験化合物、陽性対照化合物、または化合物なし（ウイルス対照）を含む寒天重層を、３７℃でインキュベーションする前に５〜１０分冷蔵庫で硬化させた。ウイルス暴露後２日目に、各プレートのウェルを１ｍｌの１０％緩衝ホルマリンに重ね、細胞をウェルに固定した。そして寒天重層を除去した。ウェルを０．１％クリスタルバイオレットで染色し、プラークビューアを用いて１３倍の倍率でプラークを数えた。５０％のプラーク数を低下させる阻害剤の濃度（ＥＣ５０値）は、プラークのパーセンテージに対する阻害剤の濃度でプロットすることにより測定した。毒性評価に設定した単層の染色密度を観察することにより毒性測定を行った。偽／未処理細胞と比較して染色強度が弱い程、毒性が強い。本手順で毒性は検出されず、よってＣＣ５０値の計算は必要なかった。
【０１５３】
Ｖｅｒｏ７６細胞でのワクシニア感染に対するランピルナーゼの抗ウイルス効果を評価した。本アッセイで使用したランピルナーゼおよびシドフォビルいずれの希釈液も毒性を示さず（図２４）、両薬物の毒性をニュートラルレッド取り込みアッセイによって定量した他の以前の検討と一致していた。
【０１５４】
ランピルナーゼは、天然痘が発生した場合に使用するために国防省に備蓄されている薬物であるシドフォビル（ＥＣ５０＝１０μＭ）と引けを取らず、効力のある用量である３．８μＭでワクシニアウイルスの複製を強く阻害した。ランピルナーゼは１００μＭでは毒性がなかったので、そのウイルスの阻害にとても選択的だった（ＳＩ＞２６）。
【０１５５】
ワクシニアウイルスはポックスウイルス科（poxvirus）のウイルスのメンバーである。ポックスウイルス科（poxvirus）のウイルスはとても近縁であり、ポックスウイルス科（poxvirus）のいずれか１つのウイルスに対するランピルナーゼの抗ウイルス活性が証明されたことによって、ランピルナーゼがポックスウイルス科（poxvirus）に分類される全てのウイルス（特に、実験室では慎重に試験することができない重大なバイオハザードである天然痘を含む）に対して同じ抗ウイルス活性を有することは強く証明されている。
【０１５６】
さらに、他の上記に開示した、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＥＢＯＶの実験結果は、ワクシニア感染を予防するための予防薬としてランピルナーゼを使用できるはずであることを示している。
【０１５７】
ＶＥＥＶおよびイヌパルボウイルスに関するデータを除いて、上記データは全て、ヒトのウイルス感染に対する活性とかなり相関がある。これらのデータは、ランピルナーゼがヒト内のウイルスに対して活性があることを強く証明している。ＶＥＥＶに関するデータはウマ科のＶＥＥＶ感染に対する活性とかなり相関があり、イヌパルボウイルスに関するデータはイヌおよび他の哺乳類のイヌパルボウイルス感染に対する活性とかなり相関がある。
【０１５８】
一般に、ランピルナーゼを用いた処理に反応する異なるウイルスの点で、当業者は、ランピルナーゼが全身投与されるいずれの経路も任意の特定のウイルスの治療に適していると結論付ける（任意の特定の場合においては、１つの経路が別の経路に比べてより効果的であり得るが）。よって、腸内投与（限定されないが、経口投与および直腸投与を含む）および非経口投与（限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与およびエアロゾル送達を含む）がランピルナーゼの投与方法に適している。
【０１５９】
上記に列挙された実験結果はランピルナーゼを用いて実施された。しかしながら、ランピルナーゼと高い相同性を有する他のリボヌクレアーゼはヘルペスウイルスおよびヒトパピローマウイルスなどの他のウイルスに対して極めて類似の活性を示している。これらの他のリボヌクレアーゼには、配列番号２、３および４で同定されるＲＮアーゼを含む。当業者にとって、これら３つの他のリボヌクレアーゼの相同性および活性の類似性は、これら３つの他のリボヌクレアーゼが、ランピルナーゼが有する活性と同じ活性を有することを強く証明している。したがって、上記で開示された実験では、‘８０５バリアント、アムヒナーゼ２、またはｒアムヒナーゼ２を用いて繰り返していないが、上記データがこれら３つのリボヌクレアーゼに十分に適用でき、これら３つのリボヌクレアーゼがヒト内の狂犬病ウイルス、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、インフルエンザウイルス、ＣＨＩＶ、ＥＢＯＶ、ＡＶ、ＲＳＶ、ＲＶ、およびポックスウイルス、ウマ科内のＶＥＥＶ、ならびにイヌおよび他の哺乳類内のイヌパルボウイルスに対して活性を持つことが考えられる。
【０１６０】
上記で証明したように、ランピルナーゼは様々な細胞型でのＭＥＲＳ−ＣｏＶ、ＶＥＥＶ、ＣＨＩＶ、およびＲＶ−１４の増殖を阻害する。これら３つのウイルス全てボルティモア分類グループＩＶに分類される。これにより、全身投与されたランピルナーゼが、ボルティモア分類グループＩＶに分類されるウイルスに対して効果的であることは実質的に証明されている。さらに、‘８０５バリアント、アムヒナーゼ２、およびｒアムヒナーゼ２の相同性および活性の、ランピルナーゼの相同性および活性に対する類似性を基に、これら３つの他のリボヌクレアーゼが、ボルティモア分類グループＩＶに分類されるウイルスに対するランピルナーゼと同じ活性を有することが予想される。
【０１６１】
上記で証明したように、ランピルナーゼは様々な細胞型でのインフルエンザウイルス、エボラウイルス、はしかウイルス、ＲＳＶ、および狂犬病ウイルスの増殖を阻害する。これらの５つのウイルスは全てボルティモア分類グループＶに分類される。これにより、全身投与されたランピルナーゼが、ボルティモア分類グループＶに分類されるウイルスに対して効果的であることは実質的に証明されている。さらに、‘８０５バリアント、アムヒナーゼ２、およびｒアムヒナーゼ２の相同性および活性の、ランピルナーゼの相同性および活性に対する類似性を基に、これら３つの他のリボヌクレアーゼが、ボルティモア分類グループＶに分類されるウイルスに対するランピルナーゼと同じ活性を有することが予想される。
【０１６２】
本発明の少なくとも１つの好ましい実施形態は上記に記載されているが、この記載に限定されず、単なる例示に過ぎない。本発明の範囲は以下の請求項によってのみ定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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