(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質の分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ蛍光タンパク質の定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質の、
前記蛍光タンパク質で遺伝学的にラベルされた標的レセプターと
−  前記蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる分子か、
−  又は蛍光物質のいずれか
よりなるラベルでラベルされたリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用を検出及び定量するための使用であって、
この検出及び定量が：
●  前記蛍光タンパク質と、前記蛍光タンパク質の発光波長で励起性であるかあるいは前記蛍光タンパク質の励起波長で発光する上述の蛍光物質の間、あるいは
●  前記蛍光タンパク質と、前記蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる上述のラベルとの間
での蛍光エネルギー移動によって実施される、
使用。
【請求項２】
標的レセプターをラベルする蛍光タンパク質が：
−  グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ又はＥＧＦＰ）、
−  シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ又はＥＣＦＰ）、
−  イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ又はＥＹＦＰ）若しくは
−  ＧＦＰＵＶ、
又は、コドンがヒト、細菌もしくは植物細胞での発現に最適化された、前記ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、若しくはＧＦＰＵＶの変異体、
又は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、若しくはＧＦＰＵＶに関連する励起もしくは発光波長より高いかもしくは低い励起もしくは発光波長を有する、前記ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、若しくはＧＦＰＵＶの変異体、
ただし、前記蛍光タンパク質の分子吸光係数は、１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ前記蛍光タンパク質の定量的な蛍光収率は０．３８より大きい、
から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
リガンドのラベルが：
−  前記蛍光タンパク質の分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質、
−  蛍光化学化合物、
−  バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する、非蛍光化学化合物、
から選択される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
リガンドが、
●  蛍光物質、ここでこのラベル化は：
−  化学結合を経由する、このとき、蛍光物質は、蛍光化学化合物であるか
−  又は、遺伝子組換えを経由する、このとき、蛍光物質は、分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光ペプチド又はタンパク質であるか、
で実施される、
●  又は、バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する非蛍光物質
のいずれかでラベルされる、請求項１又は３記載の、蛍光タンパク質の使用。
【請求項５】
標的レセプター及びリガンドが、遺伝学的にラベルされ、蛍光タンパク及び蛍光物質が、それぞれ、以下の化合物のペア：
ＧＦＰＵＶ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＧＦＰＵＶ
ＥＣＦＰ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＥＣＦＰ
ＥＣＦＰ−ＥＧＦＰ
ＥＧＦＰ−ＥＣＦＰ
ＥＧＦＰ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＥＧＦＰ
から選択される、請求項１記載の蛍光タンパク質の使用。
【請求項６】
蛍光タンパク質で遺伝学的にラベルされた標的レセプターと、請求項３に記載の蛍光ラベルでラベルされたリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用の検出及び定量のための、
分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ蛍光タンパク質の定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質の請求項１記載の使用であって、
この検出及び定量が、蛍光タンパク質と、蛍光タンパク質の発光波長で励起性であるかあるいは蛍光タンパク質の励起波長で発光する蛍光ラベルとの間の蛍光エネルギー移動により実施される、使用。
【請求項７】
蛍光タンパク質が、
●  ＥＧＦＰであり、ここで
−  ＥＧＦＰは、蛍光エネルギー供与体であり、ＥＧＦＰにより発光される光を吸収するラベルは蛍光物質又は非蛍光物質であり、ラベルは、その励起スペクトルがＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる物質から選択され、
ａ）ラベルが蛍光物質であるとき、それは４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Bodipy）、エオシン、エリトロシン、テトラメチルローダミン、スルホローダミン１０１（Texas Red）及び、一方において、グラフトさせ、かつ他方において、ＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを有するそれらの誘導体類から選択され、
ｂ）そしてラベルが蛍光物質ではないとき、それは、バイオレット酸の群、The Acid Red群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミンＢ、塩基性フシン、ボルド−Ｒ及びカルミンから選択されるか、
−  又は、ＥＧＦＰは蛍光エネルギー受容体であり、蛍光ラベルが、蛍光エネルギー供与体であり、そしてＥＧＦＰの励起スペクトルに重なる発光スペクトルを有する物質であり、クマリン類、フルオレスカミン、６−（Ｎ−メチルアリニノ）ナフタレン、（マンシル）及び、一方において、グラフトさせ、他方において、ＥＧＦＰの発光スペクトルに重なる励起スペクトルを有するその誘導体類から選択されるか、
●  又は、蛍光タンパク質がＥＣＦＰである、ここで、
−  ＥＣＦＰは蛍光エネルギー供与体であり、そして蛍光物質がエネルギー受容体であり、そしてフルオレセイン及び７−ニトロ−２−ベンゾキサ−１，３−ジアゾールから選択されるか、
−  ＥＣＦＰは、蛍光エネルギー受容体であり、そして蛍光物質がエネルギー供与体であり、ピレン及びクマリン又は、一方において、グラフトさせ、他方において、ＥＣＦＰの発光スペクトルに重なる励起スペクトルを有するそれらの誘導体類から選択される、
請求項１または６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
標的レセプターが、
−  Ｇタンパク質に結合した膜結合レセプター類、
−  増殖因子レセプター類、
−  イオンチャンネルレセプター類、
−  細胞内核レセプター類、
から選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
標的レセプターが、Ｇタンパク質に結合した膜結合レセプター類から選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
標的レセプターと、リガンドの一つとの間の非共有結合相互作用を、検出しかつ定量する方法であって、
−  標的レセプターの遺伝子と融合した蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む細胞又は細胞のフラグメントが調製され、ここで該蛍光タンパク質は、分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ蛍光タンパク質の定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質から選択され、
−  上述の細胞又は細胞フラグメントが、標的レセプターのためのリガンドと接触して配置され、リガンドが、
ａ）蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子、
ｂ）又は、蛍光物質
のいずれかからなるラベルでラベルされ、
そして、蛍光タンパク質が蛍光エネルギー供与体であり、そしてラベルが蛍光エネルギー受容体であるか、又は蛍光タンパク質が蛍光エネルギー受容体であり、そしてラベルが蛍光エネルギー供与体である蛍光物質であるかのいずれかであり、そして
−  照射が、蛍光タンパク質を励起するか、又は蛍光物質を励起するかのいずれかを可能にする波長で実施され、
−  上述の接触に配置する及び照射工程が、同時にか又は順次にかのいずれかで実施されることを可能とされ、あるいは
−  上述の細胞又は上述の細胞のフラグメントが、上述のレセプターのためのリガンドと接触して配置され、ラベルでラベルされ、細胞又はリガンドが、接触して配置される前に照射され、
−  供与体の発光の大きさの減少及び／又は受容体の発光に特有の発光シグナル特性のいずれかが、検出される
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
標的レセプターとリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用を、検出かつ定量する請求項１０記載の方法であって、
−  標的レセプターと融合した蛍光タンパク質が調製され、ここで該蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰＵＶ、又は、
コドンがヒト、細菌もしくは植物細胞での発現に最適化された、前記ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰＵＶの変異体、又は、
ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰＵＶに関連する励起もしくは発光波長より高いかもしくは低い励起もしくは発光波長を有する、前記ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰＵＶの変異体、
ただし、前記蛍光タンパク質の分子吸光係数は、１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ前記蛍光タンパク質の定量的な蛍光収率は０．３８より大きい、
から選択され、
−  標的レセプターで融合された上述の蛍光タンパク質が、該レセプターのためのリガンドと接触して配置され、このリガンドは、
−  分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質、
−  または、蛍光化学化合物、
−  または、バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する、非蛍光化学化合物、
でラベルされ、ここで蛍光タンパク質は蛍光エネルギー供与体であり、そしてラベルは蛍光エネルギー受容体であるか、又は蛍光タンパク質は蛍光エネルギー受容体であり、そしてラベルは蛍光エネルギー供与体である蛍光物質であるかのいずれかであり、そして
−  照射が、蛍光タンパク質を励起するか、又は蛍光ラベルを励起するかのいずれかを可能にする波長で実施され、
−  上述の接触に配置する及び照射工程が同時にか又は順次にかのいずれかで実施されることを可能とされ、又は
−  標的レセプターで融合された蛍光タンパク質が、上述のレセプターのためのリガンドと接触して配置され、このリガンドが、
−  蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる分子、
−  又は蛍光物質、
のいずれかからなるラベルでラベルされ、
標的レセプターで融合された蛍光タンパク質又はリガンドは、接触して配置される前に照射され、
−  供与体の発光の大きさの減少及び／又は受容体の発光の発光シグナル特性のいずれかが検出される
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
更なる工程を、
−  標的レセプターで融合された蛍光タンパク質及び
−  分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質、
−  蛍光化学化合物、
−  バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する、非蛍光化学化合物、
から選択されるラベルでラベルされている該レセプターのリガンドとを接触して配置する工程の前、後又は同時にか、又は、
−  細胞又は細胞フラグメント及び上述のラベルでラベルされているレセプターのリガンドとを接触して配置する工程の前、後又は同時に、導入し、
この更なる工程が、
ａ）標的レセプターで融合されている蛍光タンパク質を、非ラベルリガンドと接触させ、そして上述のラベルされたリガンドと同時接触させて配置するか、
ｂ）又は、上述の細胞又は上述の細胞フラグメントを、非ラベルリガンド及びラベルしたリガンドと同時に接触させて配置する
ことからなり、
次いで、
−  供与体の発光の大きさの減少及び／又は受容体の発光のシグナル特性が、ラベルされたリガンドを用いる場合並びにラベルされたリガンド及び非ラベルリガンドを同時に用いた場合に、それぞれ検出され、
−  そしてそれぞれに得られた供与体の発光の大きさの減少及び／又はそれぞれに得られた受容体の発光シグナルの特性を比較する、
請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
蛍光タンパク質が、ＥＧＦＰであり、そして
ａ）ＥＧＦＰが蛍光エネルギー供与体であり、ラベルが蛍光エナルギー受容体であり、そして励起スペクトルがＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる物質から選択され、そして：
−  ラベルが蛍光物質であるとき、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Bodipy）、エオシン、エリトロシン、テトラメチルローダミン、スルホローダミン１０１（Texas Red）及び、一方において、グラフトさせ、かつ他方において、ＥＧＦＰの放射スペクトルと重なる励起スペクトルを有するそれらの誘導体類から選択され、
−  そして、ラベルが蛍光物質ではないとき、それは、バイオレット酸の群、the Acid Red群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミンＢ、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンから選択されるか、
ｂ）又は、ＥＧＦＰが蛍光受容体であり、蛍光物質が蛍光エネルギー供与体であり、かつその放射スペクトルがＥＧＦＰの励起スペクトルに重なる物質であり、クマリン類、フルオレスカミン、６−（Ｎ−メチルアニリノ）ナフタレン、（マンシル）及び、一方において、グラフトさせ、他方において、ＥＧＦＰの放射スペクトルに重なる励起スペクトルを有するその誘導体類から選択される、
請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
レセプター−リガンド相互作用の測定を所望するレセプターが、
−  Ｇタンパク質に結合した膜結合レセプター類、
−  増殖因子レセプター類、
−  イオンチャンネルレセプター類、
−  細胞内核レセプター類、
から選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
蛍光タンパク質がＥＧＦＰであり、そしてラベルがBodipyであり、そしてＥＧＦＰの発光の大きさの減少又はエネルギー移動からもたらされるBodipyの発光シグナルが検出され、照射波長がＥＧＦＰの励起波長に相当する、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
蛍光タンパク質がＥＧＦＰであり、ラベルがクマリンであり、そしてクマリンの大きさの減少又はエネルギー移動からもたらされるＥＧＦＰの発光シグナルのいずれかが検出され、照射の波長がクマリンの励起波長に相当する、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
蛍光タンパク質が、Ｎ末端側で融合し、そして標的レセプターが、Ｃ末端側で融合する、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
蛍光タンパク質が、Ｃ末端側で融合し、そして標的レセプターが、Ｎ末端側で融合する、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
７回の膜貫通ドメインを有するＧタンパク質へ結合されたレセプターの場合に、蛍光タンパク質が標的レセプターに挿入され、この挿入が該レセプターの第一又は第三の細胞内ループで起る、請求項１０〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
細胞が、
−  哺乳動物の細胞、又は
−  酵母細胞、又は
−  昆虫の細胞、又はfungiである、請求項１０〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
エネルギー移動シグナルが、蛍光分光装置、又は供与体と受容体を混合した後に、蛍光を検出するためのシステムを備えた混合装置中で検出することができる、請求項１０〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
レセプターに関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な、非共有結合相互作用を形成することができる分子を同定するために、Ｇタンパク質に結合した標的レセプターとＧタンパク質との間の非共有結合相互作用を検出及び定量するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質の使用であって、
該レセプターが、遺伝子的に蛍光タンパク質でラベルされ、そしてＧタンパク質が、
−  蛍光タンパク質により発光される光を吸収し得る分子か、
−  又は、
−  分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質、
−  蛍光化学化合物、
−  バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する、非蛍光化学化合物、
から選択される蛍光物質
のいずれかよりなるラベルでラベルされる、使用。
【請求項２３】
蛍光タンパク質が、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰ、又はそれらの突然変異体から選択され、該蛍光タンパク質の分子吸光係数が、１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が、０．３８より大きい、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
レセプターが、
−  Ｇタンパク質に結合したレセプター、
−  これらのレセプターに関連して生物学的に活性な分子が同定されている想定上のＧタンパク質に結合したレセプターをコードする配列、
から選択される、請求項２２又は２３記載の使用。
【請求項２５】
レセプターに関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な、非共有結合相互作用を形成することができる分子を同定するために、Ｇタンパク質に結合された標的レセプターとＧタンパク質との非共有結合相互作用を検出しかつ定量するための方法であって、
−  Ｇタンパク質に結合されたレセプターのための遺伝子と融合された蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現する、細胞又は細胞のフラグメントが調製され、
ここで蛍光タンパク質は、分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ蛍光タンパク質の定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質から選択され、
Ｇタンパク質は、
−  分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質、
−  蛍光化学化合物、
−  バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する、非蛍光化学化合物、
から選択されたラベルでラベルされ、
−  蛍光タンパク質及びラベルは、それらが一つから他へエネルギーを移動し、ここで蛍光タンパク質はエネルギー供与体であることが可能であるか、又はラベルはエネルギー供与体であることができ、
蛍光タンパク質でラベルされたレセプターと上に定義されたラベルでラベルされたＧタンパク質との間の相互作用が、蛍光エネルギー移動により検出される
ことを特徴とする方法。
【請求項２６】
生物学的に活性な、非蛍光分子が、蛍光タンパク質でラベルされたレセプター及びラベルでラベルされたＧタンパク質をコードするＤＮＡを発現する細胞又は細胞のフラグメントに加えられることによる、レセプターと該レセプターに関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な、非共有結合相互作用を形成することができる非蛍光分子との相互作用を検出しかつ定量するための、請求項２５記載の方法であって、
−  アゴニストであり、かつ生物学的に活性な非蛍光分子が、蛍光タンパク質でラベルされたレセプターとラベルでラベルされたＧタンパク質との間のエネルギー移動での変化により検出されるシグナル変換を誘発し、
−  アンタゴニストであり、生物学的に活性な非蛍光分子が、アゴニストによりもたらされ、蛍光タンパク質でラベルされたレセプターとラベルでラベルされたＧタンパク質との間の蛍光エネルギーの移動での変化により検出されるシグナル変換を阻害する
ことを特徴とする方法。
【請求項２７】
分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質から選択された蛍光タンパク質でラベルされた標的レセプターと、
−  分子吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きい、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光タンパク質、
−  蛍光化学化合物、
−  バイオレット酸の群、Acid Redの群、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミン類、塩基性フシン、ボルドーＲ及びカルミンに属する、非蛍光化学化合物、
から選択されたラベルでラベルされているリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用を検出し及び定量するための、キットであって、
該キットは、
−  蛍光タンパク質で融合された標的レセプター又は安定細胞株、ここでそれは、上で定義されている蛍光タンパク質で融合された該標的レセプターをコードする、蛍光タンパク質で融合されているレセプター又は核酸配列を含むプラスミドを発現することができる、
−  上述の選択されたラベルでラベルされたリガンド
を含み、
この検出及び定量が：
●  前記蛍光タンパク質と、前記蛍光タンパク質の発光波長で励起性であるかあるいは前記蛍光タンパク質の励起波長で発光するように選択されたラベルの間、あるいは
●  前記蛍光タンパク質と、前記蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができるラベルとの間
での蛍光エネルギー移動によって実施される、
キット。
【請求項２８】
蛍光タンパク質（No.１）でラベルされた標的レセプターと、蛍光タンパク質（No.２）に相当する蛍光物質でラベルされているそのリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用を検出し及び定量するためのキットであって、
蛍光タンパク質（No.１）が、蛍光タンパク質ＥＹＦＰ若しくはＥＧＦＰから選択され、そしてリガンドが、蛍光タンパク質（No.２）ＥＣＦＰでラベルされているか、又は蛍光タンパク質（No.１）が、ＥＣＦＰであり、そしてリガンドが、蛍光タンパク質（No.２）ＥＹＦＰ若しくはＥＧＦＰでラベルされており、該キットは、
−  蛍光タンパク質（No.１）で融合された標的レセプターをコードする核酸配列を含むプラスミド、及び
●  蛍光タンパク質（No.２）で融合されたリガンドをコードする核酸配列を含むプラスミド、又は
●  遺伝子組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質（No.２）で融合されたリガンド、
−  又は、蛍光タンパク質（No.１）で融合された標的レセプターを発現することができる安定な細胞株、及び
●  蛍光タンパク質（No.２）で融合されたリガンドを発現することができる安定な細胞株、又は
●  遺伝子組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質（No.２）で融合されたリガンド
を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
蛍光タンパク質（No.１）でラベルされたＧタンパク質に結合したレセプターからなる標的レセプターと、蛍光タンパク質（No.２）に相当する蛍光物質でラベルされているＧタンパク質との間の非共有結合相互作用を検出し及び定量するためのキットであって、
蛍光タンパク質（No.１）が、蛍光タンパク質ＥＹＦＰ若しくはＥＧＦＰから選択され、そしてＧタンパク質が、蛍光タンパク質（No.２）ＥＣＦＰでラベルされているか、又は蛍光タンパク質（No.１）が、ＥＣＦＰであり、そしてＧタンパク質が、蛍光タンパク質（No.２）ＥＹＦＰ若しくはＥＧＦＰでラベルされており、該キットは、
−  蛍光タンパク質（No.１）で融合されたレセプターをコードする核酸配列を含むプラスミド、及び
●  蛍光タンパク質（No.２）で融合されたＧタンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミ、又は、
●  遺伝子組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質（No.２）で融合されたＧタンパク質、
−  又は、蛍光タンパク質（No.１）で融合されたレセプターを発現することができる安定な細胞株、及び
●  蛍光タンパク質（No.２）で融合されたＧタンパク質を発現することができる安定な細胞株、又は、
●  遺伝子組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質（No.２）で融合されたＧタンパク質
を含む、請求項２７又は２８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、標的タンパク質とそのリガンドの間の相互作用を検出するための蛍光タンパク質の使用に関する。
数多くの医薬品と天然物質が、生物の多くの生理学的な機能に関わっていて、レセプターとして知られている調節タンパク質と相互作用することによりその作用を発揮し、その機能の障害が多くの病理の原因となる。細胞外部に由来する天然又は合成、内因性又は外因性の薬理学的物質に対してレセプターが近づくことができる能力のため、生物学的に活性な分子、特に潜在的治療能を示す分子の探索においてこれらは好適な標的であると考えられるようになってきている。
新しい薬理学的な道具と医薬品を同定するために、生物学的に活性な分子をスクリーニングするための数々の検査方法が開発されてきた。すなわち、
−ＳＰＡ検査法あるいはシンチレーション近接測定法（Udenfirend et al.,Anal. Biochem.（1987）161: 494-500, 米国特許第4,568,649号；欧州特許0 154 734号及び日本特許出願第84//52452号）では、放射性分子を使用せずに済ますことは不可能であり、したがって、放射性元素の取扱い、使用、貯蔵に関連するすべての不都合さが付随する。
−ユウロピウム−アロフィコシアニン結合を使用している蛍光エネルギー移動による測定検査（Mathis. Clin. Chem.（1993）, 39: 1953-1959）では、精製アロフィコシアニンの使用が必要であり、これもまた精製された標的タンパク質上にそれを移植することが必要である。しかし、特にその標的タンパク質が豊富ではない場合には、これはいつも可能というわけにはいかない。
−冷光タンパク質をコードするリポーター遺伝子の調節を含む機能検査、あるいは比色分析により測定される酵素活性を備えた機能検査は、１つのリガンドとそのレセプター間の相互作用に関する非常に間接的な測定法であり、偽陽性の一因となる可能性があり、レセプターとそのリガンド間の相互作用の定量的な測定に干渉する増幅カスケードを含み、遺伝子の転写と結合した生物学的システムにのみ適用可能である（Broach, J.R & Thorner, J., 1996, Nature 384 supp.14-16）。
−クラゲAequorea victoria（Thastrup et al., WO96/23898）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）上に第２のメッセンジャー結合部位を移植する手法により開発された、細胞内第２のメッセンジャー（サイクリックヌクレオチド、つまりｃＡＭＰ）の結合の検出を可能にする蛍光測定法。生物学的に活性な分子の検出を可能にするこの検査は、細胞内プロセスに影響を及ぼす第２のメッセンジャーの類似体に限定されている。
クラゲAequorea victoria由来の蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質（あるいはＧＦＰ）をコードする遺伝子（Prasher et al. 1992, Gene 111;229-233）は最近解読された。ＧＦＰは単量体タンパク質である。ＧＦＰは、発蛍光団形成の自己触媒メカニズムによってその蛍光特性を獲得している。ＧＦＰの内因性あるいは異種発現には１つの遺伝子のみが必要であり、補助基の付加を必要としていない。ＧＦＰは、細菌、酵母、動物や植物の真核細胞のようにさまざまな細胞と生物に異種的に発現されている。ＧＦＰの構造
0004084425.tif 000002
により、アミノ末端あるいはカルボキシ末端上かのいずれかにおいて、その発現レベル、又は発蛍光団の形成に悪影響を与えずに他のポリペプチド上にＧＦＰを移植することが可能になっている。このように、ＧＦＰを遺伝子融合により可溶性又は膜タンパク質と結合することが可能である。最後に、天然遺伝子に含まれているコドンは、宿主生物の好適なコドン（例えば、動物真核細胞における発現に関しては、ＥＧＦＰ［Cormack et al. 1996, Gene 173:33-38］）と置換され、またさまざまな突然変異がその光の吸収と発光スペクトルを修飾し、単一の発現システムの中での複数の検出を可能にする。
本発明は特に、第一に、標的タンパク質の調製に関し、特に蛍光タンパク質と融合することにより蛍光発光させられるレセプターに関する。本発明は、第二には、それらのラベルされたリガンドに関し、また蛍光レセプターとそのラベルされたリガンド間の相互作用の検出と新規な生物学的に活性な分子同定のための使用に関する。
本発明の他の態様の１つは、標的タンパク質とそのリガンド間の非共有結合相互作用に関して平衡状態並びにリアルタイムでの定量的測定を実施するための、実施しやすく、迅速かつ感受性の高い方法である。
本発明の他の態様の１つは、多くの標的タンパク質とそのリガンドを一般化することができる方法を提案することである。
本発明の他の態様の１つは、標的タンパク質又はリガンドのいずれかの精製を必要としない方法を提案することである。
本発明の態様の１つは、放射能を使用しないので非汚染性であり、入手可能な装置については可視光線（石英ではない）を使用するので、コスト効率がよく、濾過を必要としない方法を提案することである。
他の態様の１つは、オートメーション化した方法を提案することである。
本発明は、以下をコードする配列を含むｃＤＮＡの構築物に関する。すなわち、
１）読み枠を維持し、またハイブリッドポリペプチドを得るために、１つ以上のアミノ酸が、置換、挿入又は欠失されたＧＦＰ、又は読み枠を維持し、またハイブリッドポリペプチドを得るために、１つ以上のアミノ酸が置換、挿入あるいは欠失されているその突然変異体の１つをコードするｃＤＮＡと融合されたタンパク質、特にレセプター。
本発明はまた、読み枠を維持し、また想定されるＤＮＡ配列を発現させることができるように、１つ以上のアミノ酸が、置換、挿入又は欠失されたＧＦＰ、又は読み枠を維持し、想定されるＤＮＡ配列を発現させることができるように、１つ以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されているその突然変異体の１つをコードするｃＤＮＡと融合しているタンパク質、特にレセプターをコードするＤＮＡ配列を含む細胞にも関する。
本発明はまた、化学反応により結合された蛍光化学基（この蛍光基は、ＧＦＰへのエネルギーの供与体又はその突然変異体の１つ、あるいはＧＦＰからのエネルギーの受容体又はその突然変異体の１つのいずれかである）を含む薬理活性リガンドの産生に関する。
本発明はまた、以下を可能にする条件下でタンパク質−ＧＦＰハイブリッドを含む細胞の培養に関する。すなわち、
１）ハイブリッドポリペプチドの発現、
２）細胞の蛍光発光の検出。
本発明はまた、蛍光リガンドと共にタンパク質−ＧＦＰハイブリッドを発現する細胞の培養、供与体の発光もしくは受容体の発光のいずれか又は受容体の励起の蛍光の変化の測定（タンパク質−リガンドの相互作用を示す）、並びに生物学的に活性であると疑われる分子と蛍光リガンドの添加、及び上述の細胞の蛍光リガンドとの培養と比較してのエネルギー移動シグナルの副次的変化の測定にも関する。
本発明はまた、以下をコードする配列を含むｃＤＮＡの構築に関する。すなわち、
１）読み枠を維持し、またハイブリッドポリペプチドを得るために、１つ以上のアミノ酸が、置換、挿入又は欠失されている、ＧＦＰ、特に読み枠を維持し、またハイブリッドポリペプチドを得るために、１つ以上のアミノ酸が、置換、挿入、若しくは欠失されているその突然変異体Ｓ６５Ｔ又はＳ６５ＣをコードするｃＤＮＡを融合しているポリペプチド、特にリガンド。
本発明はまた、読み枠を維持し、想定されるＤＮＡ配列を発現させるために、１つ以上のアミノ酸が、置換、挿入、又は欠失されている、ＧＦＰ、特に読み枠を維持し、想定されるＤＮＡ配列を発現させるために、１つ以上のアミノ酸が、置換、挿入、又は欠失されているその突然変異体Ｓ６５Ｔ又はＳ６５ＣをコードするｃＤＮＡと融合しているポリペプチド、特にリガンドをコードするｃＤＮＡ配列を含む細胞にも関する。
本発明はまた、以下を可能にする条件下でリガンド−ＧＦＰハイブリッドを含む細胞の培養に関する。すなわち、
１）ハイブリッドポリペプチドの発現、
２）細胞の蛍光の検出、
３）リガンド−ＧＦＰハイブリッドの単離。
本発明はまた、タンパク質−ＧＦＰハイブリッド、特に、リガンド−ＧＦＰハイブリッドと共に突然変異体ＢＦＰ（ＧＦＰ  Ｙ１４５Ｆ  Ｙ６６Ｈ）と融合したレセプター（特にＧＦＰの突然変異体Ｓ６５ＴあるいはＳ６５Ｃ）を発現する細胞の培養、及び供与体（タンパク質−ＧＦＰ）の発光もしくは受容体（リガンド−ＧＦＰ）の発光のいずれか、又は受容体の励起の蛍光の変化（タンパク質−リガンドの相互作用を示す）、並びにリガンド−ＧＦＰハイブリッドを有する生物学的に活性であると疑われる分子の添加、及びタンパク質−ＧＦＰハイブリッドとリガンド−ＧＦＰハイブリッドを発現する細胞の培養と比較してのエネルギー移動シグナルの副次的変化の測定に関する。
こうしたさまざまな態様は、特に以下から選択される刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られた、又は誘導された蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質を使用して達成され：
−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は、
−変異体が蛍光特性を保持しているのであれば、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失あるいは置換によってＧＦＰから誘導された変異体、
−あるいは、フラグメントが蛍光特性を保持しているのであれば、ＧＦＰのフラグメント、又は上述の変異体のフラグメント、
上記の態様は、ＧＦＰ又は上記で定義された変異体の１つあるいは上記で定義されたフラグメントの１つで標識化された標的タンパク質と、以下のものからなる標識で標識されたそのリガンドの１つとの間の非共有結合相互作用の検出と定量化のためである：
−蛍光タンパク質によって発光される光を吸収することができる分子、又は
−蛍光物質のいずれか。
その検出と定量化は、以下の間で発生する蛍光エネルギー移動によって行われる。すなわち、
●  ＧＦＰ、又は上記で定義された変異体の１つ、又は上記で定義されたフラグメントの１つと、上記の蛍光物質の間（この蛍光物質は、ＧＦＰ、又は上記の変異体の１つ、又は上記フラグメントの１つの発光波長で励起可能であるか、あるいはＧＦＰ、又は上記の変異体の１つ、又は上記のフラグメントの１つの励起波長で発光する）、あるいは、
●  ＧＦＰ又は上記で定義されたその変異体の１つ、又は上記で定義されたフラグメントの１つと蛍光タンパク質によって発光された光を吸収することができる上記の分子との間。
本発明は、ＧＦＰ又は下記に定義される誘導体の一つ若しくは下記に定義されるフラグメントの一つで遺伝学的ラベルされた標的タンパク質と、
−蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる分子か、
−又は蛍光基質のいずれか
よりなるラベルでラベルされたそのリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用の検出及び定量のための、
刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質の使用であって、
そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約０．３８より大きく、このタンパク質は、特に、
−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は
−１個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によってＧＦＰから誘導される誘導体（但し、これらの誘導体は、蛍光特性を保持する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、若しくは上述の変異体のフラグメント（但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する）から選択され、
この検出及び定量が：
●  ＧＦＰ若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラグメントの一つと、上述の蛍光基質の間（蛍光基質は、それはＧＦＰ若しくは上述の誘導体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起性であるか、あるいはＧＦＰ若しくは上述誘導体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの励起波長で発光する）、あるいは
●  ＧＦＰ若しくは上述のその誘導体、又は上に定義されたフラグメントの一つと、蛍光タンパク質により発光される光を吸収するすることができる上述の分子との間
での蛍光エネルギー移動によって実施される使用に関する。
本発明は以下の長所からなる。すなわち、その蛍光タンパク質との融合によって得られた標的及び／又はリガンドの検出の感受性は、ピコモル単位の濃度が容易に検出可能であるような感受性である。蛍光は、遺伝子操作により標的（またときにはリガンド上でも）上に導入されるという事実のため、操作可能な分量が不足する（単離されないタンパク質、あるいは単離が不可能なタンパク質）という理由から、化学的ラベリングを阻害している自然界に豊富にあるタンパク質を検出することが可能である、蛍光発光させることが望まれているタンパク質を入手する必要はない。
遺伝子ラベリングはまた、２つの付加的な長所、つまり量と均一性を有するあるケースでは部分的かつ不均一に起こるかもしれない化学的ラベリングとは反対に、遺伝子ラベリングは定量的であり、また所定かつ既知の位置で起こる。また結果的には、すべての分子はラベルされ、またすべて同一にラベルされる。
本発明は、蛍光エネルギー移動によりタンパク質とそのリガンドの１つの間の非共有結合相互作用を検出することからなり、また特にレセプターの分野において、生物学的に活性な分子をスクリーニングするためにこの方法を使用することからなる。そのｃＤＮＡとＧＦＰをコードするｃＤＮＡとを融合させることによって、タンパク質を蛍光発光させる。そのリガンドは、蛍光基の化学的移植によるか、又はその遺伝子をＧＦＰの遺伝子と融合させることのいずれかによって蛍光発光させる。タンパク質とそのリガンドの間の相互作用は、リアルタイムあるいは平衡状態で記録できるＧＦＰ及び／又はリガンドの蛍光スペクトルの変化を起こす。
標的タンパク質とそのリガンド間の非共有結合相互作用は、標的タンパク質とリガンド間の複合体の形成に対応し、標的タンパク質とリガンドが互いに相互作用し、また相互作用抑制後はそのまま手付かずの状態で発見される。
その相互作用の特異的そして飽和可能な非共有結合性の測定を可能にする一連の検査が特に以下の記事中に記載されている。すなわち、Levitski, A. 1980,in Cellular receptors for hormones and neurotransmitters, Eds Schulster,D. & Levitsk, A., John Wiley & Sons Ltd.; Horovitz, H. and Levitski, A.1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 6654-6658, Receptor Biochemistry and Methodology, volume 3, Ventre, J.C. & Harrison, L.C. Eds, Alan R. Liss,INC, New York, 1987。
本文の中では、以下の用語が以下のように定義される。すなわち、
−「自動蛍光タンパク質」：補助基の付加を必要とせずにそのタンパク質のアミノ酸間で自己触媒反応により発光団を形成し、その蛍光特性がその単量体に固有のものである、合成又は天然タンパク質。
−「ハイブリッドポリペプチド」：本発明では、２つのタンパク質の少なくとも一部分の融合物であるポリペプチドを指すが、実施例によっては、標的タンパク質の一部、又は標的タンパク質のポリペプチドリガンドの一部分を伴う少なくともＧＦＰの一部分。
−「競合物」：蛍光リガンドと同じ部位で標的タンパク質に結合する何らかの分子。
−「生物学的に活性な物質」：蛍光リガンドとその特異的な蛍光タンパク質との相互作用に干渉し、相互作用の動力学あるいは熱動力学的パラメータを修飾することができる何らかの物質。
「リガンド」という用語は、他の分子と非共有結合的に、かつ可逆的に相互作用する何らかの分子を言う。
「蛍光エネルギー移動」という表現は、物理的、距離依存的なプロセスであって、それによってそのエネルギーが非放射的方法で、二極−二極相互作用によって励起発光団、供与体から他の発光団、受容体に伝達されるプロセスに相応する
0004084425.tif 000003
そのエネルギー移動は、供与体の発光の大きさを減少することによって、又は受容体の励起及び発光の大きさを増大することのいずれかによって、観察することができる。
生物学的試料に対するエネルギー移動の非共有結合相互作用での適用例では、蛍光リガンドと蛍光標的タンパク質間の相互作用を許容するような実験条件でない場合には、転移シグナルは持続できない。同様に、相互作用する２つのパートナーの１つが蛍光ではない場合には、他のパートナーについて観察される可能性のあるさまざまな蛍光発光を、エネルギー移動プロセスに帰することはできない。
エネルギー移動の文において定義される、蛍光における「変化」あるいは「変動」という用語は、１）供与体の蛍光シグナルの大きさ、２）励起スペクトルの大きさ、又は３）供与体の発光シグナルの大きさの何らかの修飾を言う。蛍光の変動あるいは変化は、２つのパートナーのうちの１つが蛍光発光しない場合には、あるいは蛍光パートナー間の相互作用が、例えば、過剰な競合する試料により阻害される場合には、観察されないことになる。
さらに詳細には、蛍光エネルギー移動反応には、２つの蛍光基が必要であり、１つは供与体、もう１つは受容体である。この反応は２つの条件が満たされた場合に起こる。すなわち、
１）受容体の吸収スペクトルと供与体の発光スペクトルは少なくとも部分的に重複しなければならない。その重複は実験データとcm3M-1単位の値を与える式から計算される（Lakey et al. 1991, J. Mol. Biol. 218: 639-653）。
２）供与体と受容体は、エネルギー移動が起こりうるように、空間的に近くなければならない（１０〜１００オングストローム）。
第１の条件から生じる結果は、供与体の励起がその後、供与体の発光の大きさの減少と受容体からの発光シグナルの出現を伴うものとなる。このことは、供与体と受容体間の相互作用を検出し、及び／又はそれらの距離を測定することを可能にする。
「空間的に近い」という表現は、供与体と受容体の間の距離が２  Ｒｏ未満であるか、又は等しいことを意味し、ここでＲｏはフォースタービームを表す（前掲引用書中にある）（Lakey, J.H. et al. 1991, J.Mol.Biol. 218: 639-653）。
受容体が蛍光ではないが、供与体の発光スペクトルと少なくとも部分的に重複する励起スペクトルを有する場合には、エネルギー移動が供与体の発光の大きさの減少の形で検出できる。
本発明は、標的タンパク質と、上述のリガンドの間の非共有結合相互作用の検出及び定量のための、
−蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる分子、
−又は蛍光基質のいずれか
よりなるラベルでラベルされたリガンドの使用であって、
該標的タンパク質が、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質で遺伝学的にラベルされ、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率は約０．３８より大きく、そのタンパク質は、特に、
−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は
−１個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりＧＦＰから誘導される誘導体（但し、これらの誘導体は、蛍光特性を保持する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント（但し、これらのフラグメントは、蛍光特性を保持する）から選択され、
この検出及び定量が：
●  ＧＦＰ若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラグメントの一つと、上述の蛍光物質の間（蛍光物質は、ＧＦＰ若しくは上述の誘導体、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起性であるか、あるいはＧＦＰ若しくは上述誘導体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの励起波長で発光する）、あるいは
●  ＧＦＰ若しくは上に定義されたその誘導体、又は上に定義されたフラグメントと、蛍光タンパク質により発光される光を吸収するすることができる上述の分子との間
での蛍光エネルギー移動により実施される使用。
本発明の１つの好都合な実施様態によると、蛍光タンパク質は以下から選択される：
−  グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ward et al. 1980, Photochem.Photobiol. 31: 611-615; Chalfie 1995, Photochem. Photobiol. 62: 651-656）、又はＥＧＦＰ（Heim & Tsien, Current Biology, 1996, vol. No.6,pp.178-182; Miyawaki et al. Nature 1997, vol. 388, pp. 882-887）
−  シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ又はＥＣＦＰ）（Heim & Tsien, Current Biology, 1996, vol. No.6, pp.178-182; Miyawaki et al. Nature 1997, vol.388, pp. 882-887）
−  黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ又はＥＹＦＰ）（Cormack et al. 1995, Gene 173: 33-38; Heim, Cubitt and Tsien, 1995, Nature; Ehrig et al. 1995,FEBS Lett. 367: 163-166）（Miyawaki et al. Nature 1997, vol. 388, pp.882-887）、
−  ＧＦＰＵＶ（Crameri et al. 1966, Nature Biotechnol. 14: 315-319;Ehrig et al. 1995, FEBS Lett. 367: 163-166）、
あるいは、コドンが、ヒト、細菌、又は植物細胞における発現に関して最適化されているその突然変異体、
あるいは、上記で定義されたタンパク質と関連する波長よりも高い若しくは低い励起又は発光波長を有するその突然変異体（但し、そのモル吸光係数が約１４，０００M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率が約０．３８以上である）。
「最適化されたコドン」という表現は、コードを変えず、したがってそのタンパク質配列を変えることなく、野生型タンパク質のコドンを宿主生物の好適な相同物で置換することを指す。
３９５／４７０〜５０９の励起及び発光波長を有する野生型（ＷＴ）ＧＦＰは次の参考文献に記載されている：Ward et al. 1980, Photochem. Photobiol.31: 611-615, Chalfie 1995, Photochem. Photobiol. 62: 651-656。
ＧＦＰＵＶは以下の突然変異を示した：それぞれ３９５及び５１０の励起及び発光波長をそれぞれ有するＦ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａが、Crameri et al. 1996, Nature Biotechnol. 14: 315-319に記載されており、あるいは突然変異Ｔ２０３１とそれぞれ４００及び５１２の励起及び発光波長に関しては、Ehrig et al. 1995, FEBS Lett.367: 163-166に記載されている。
ＥＧＦＰは以下の突然変異を有する。すなわち、
Ｆ６４Ｌ      Ｓ６５Ｔ      Ｈ２３１Ｌ
ＥＹＦＰは以下の突然変異を有する。すなわち、
Ｓ６５Ｇ      Ｖ６８Ｌ      Ｓ７２Ａ      Ｔ２０３Ｙ
ＥＣＦＰは以下の突然変異を有する。すなわち、
Ｆ６４Ｌ      Ｓ６５Ｔ      Ｙ６６Ｗ      Ｎ１４６Ｉ
Ｍ１５３Ｔ    Ｖ１６３Ａ    Ｎ２１２Ｋ
さまざまなＧＦＰ突然変異体もまた、以下の細胞における発現のために（それぞれの種に特異的なコドンの使用を最適化するサイレント突然変異の導入によって）最適化されうる：
ヒト：参考文献；Haas et al. 1996, Curr. Biol. 6: 315-323; Yan et al.1996, Nucleic Ac. Res. 24: 4592-4593; Zolotukhin et al. 1996, J. Virol.70: 4646-4654。
細菌：Crameri et al. 1996, Nature Biotechnol. 14: 315-319; Cormack et al. 1996, Gene 173: 33-38（Escherichia coliに関する）、
植物：Reichel et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5888-5893。
ＧＦＰ：
ＧＦＰという用語は、図１に示されているヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を指しており、これは、一旦細胞で発現されると、蛍光を発する。その蛍光特性又はＧＦＰの発現の程度のどちらかに影響を及ぼすアミノ酸の置換、付加、あるいは欠失を伴うＧＦＰは、ＧＦＰ突然変異体と呼ばれる。
蛍光タンパク質の主要な特徴は、下に示した本発明の方法の中で好都合に使用されている。
0004084425.tif 000004
自動蛍光タンパク質ＢＦＰは、刺胞動物の自動蛍光タンパク質についての定義、すなわち、モル吸光係数が１４，０００M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収率が０．３８より大きいという定義を満たしていないので、好ましくは除外する。
本発明はまた、リガンドが、
●  蛍光物質でラベル（このラベル化は、
−化学ルートを経由（このとき、蛍光物質は、化学化合物である）するか、
−又は組換えルートを経由（このとき、蛍光物質は、特に刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光ペプチド又はタンパク質（No.2）であり、その分子吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約０．３８より大きく、この蛍光物質は、特に、
−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は
−１個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりＧＦＰから誘導される誘導体（但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント（但し、このフラグメントは、蛍光特性を保持する）から選択される）して実施される）されるか、
●  又はバイオレット酸の群［Acid Violet 5, CAS 10130-48-0; Acid Violet 7, CAS 4321-69-1; Acid Violet 17, CAS 4129-84-4］,the Acid Red group［Acid Red 1. CAS 3734-67-6; Acid Red 8, CAS 4787-93-3;Acid Red 37, CAS 6360-07-2; Acid Red 40, CAS 12167-45-2; Acid Red 106, CAS 6844-74-2; Acid Red 114, CAS 6459-94-5］、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミンＢ［CAS 25360-72-9］、塩基性フシン［Basic Red 9, CAS 569-61-9］、ボルドーＲ［Acid Red 17, CAS 5858-33-3］及びカルミン［CAS 1390-65-4］に属する、非蛍光物質のいずれかでラベルされる、上に定義された蛍光タンパク質（No.1）の使用にも関する。
「ＣＡＳ」はChemical Abstractsという意味である。
●  標識：
標的タンパク質又はリガンドの「ラベリング」とは、
標的タンパク質については、ＧＦＰの、その遺伝子もしくはｃＤＮＡ、又はその遺伝子の一部もしくはｃＤＮＡと、その遺伝子もしくはｃＤＮＡ、又はその遺伝子の一部もしくはｃＤＮＡとの融合を意味し、
リガンドについては、そのリガンドとＧＦＰの蛍光基間の化学的結合であるか、あるいは、その遺伝子もしくはｃＤＮＡ、又はその遺伝子の一部もしくはｃＤＮＡと、ＧＦＰの遺伝子もしくはｃＤＮＡ、又はその遺伝子の一部もしくはｃＤＮＡとの融合を意味する。
本発明は、本発明による標的タンパク質及びリガンドが、遺伝学的にラベルされ、蛍光タンパク及び蛍光物質が、それぞれ、以下の化合物のペア：
ＧＦＰＵＶ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＧＦＰＵＶ
ＥＣＦＰ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＥＣＦＰ
ＥＣＦＰ−ＥＧＦＰ
ＥＧＦＰ−ＥＣＦＰ
ＥＧＦＰ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＥＧＦＰ
から選択され、そして特にここで、標的タンパク質がＥＹＦＰ若しくはＥＧＦＰタンパク質でラベルされ、そしてリガンドがＥＣＦＰタンパク質でラベルされるか、又は標的タンパク質がＥＣＦＰタンパク質でラベルされ、そしてリガンドがＥＹＦＰ若しくはＥＧＦＰタンパク質でラベルされている、本発明の蛍光タンパク質の使用に関する。
本発明はまた、ＧＦＰ若しくは下記に定義される誘導体の一つ又は下記に定義されるフラグメントの一つでラベルされた標的タンパク質と、蛍光物質でラベルされたそのリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用の検出及び定量のための、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質の使用であって、
そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約０．３８より大きく、そのタンパク質は、特に、
−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は
−１個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりＧＦＰから誘導される誘導体（但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント（但し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する）から選択され、
この検出及び定量が：
ＧＦＰ若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラグメントの一つと、上述の蛍光物質の間（蛍光物質は、それはＧＦＰ若しくは上に定義された誘導体、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起性であるか、あるいはＧＦＰ若しくは上述誘導体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの励起波長で発光する）の蛍光エネルギー移動により実施される使用にも関する。
本発明の１つの好都合な実施様態によると、蛍光タンパク質はＥＧＦＰであって、ここで、
−ＥＧＦＰは、蛍光エネルギー供与体であり、ＥＧＦＰにより発光される光を吸収するラベルが蛍光又は非蛍光物質であり、マーカーは、特にラベルが蛍光物質であるとき、その励起スペクトルがＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる物質から選択され、それは４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Bodipy）、エオシン、エリトロシン、テトラメチルローダミン、Texas Redの名前でMolecular Probeにより販売されているスルホローダミン１０１及びそれらの誘導体類（一方において、グラフトさせ、かつ他方において、ＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを有する）から選択され、
そしてラベルが蛍光物質ではないとき、それは、バイオレット酸の群［Acid Violet 5, CAS 10130-48-0; Acid Violet 7, CAS 4321-69-1;Acid Violet 17, CAS 4129-84-4］，the Acid Red群［Acid Red 1. CAS 3734-67-6; Acid Red 8, CAS 4787-93-3; Acid Red 37, CAS 6360-07-2;Acid Red 40, CAS 12167-45-2; Acid Red 106, CAS 6844-74-2; Acid Red 114, CAS 6459-94-5］、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミンＢ［CAS 25360-72-9］、塩基性フシン［Basic Red 9, CAS 569-61-9］、ボルドーＲ［Acid Red 17, CAS 5858-33-3］及びカルミン［CAS 1390-65-4］から選択されるか、
−又はＥＧＦＰは蛍光エネルギー受容体であり、蛍光物質は、蛍光エネルギー供与体であり、そしてその発光スペクトルがＥＧＦＰの励起スペクトルに重なる物質、特にクマリン類、フルオレスカミン、６−（Ｎ−メチルアリニノ）ナフタレン、（マンシル）及びその誘導体類（一方において、グラフトさせ、他方において、ＥＧＦＰの発光スペクトルに重なる励起スペクトルを有する）から選択されるか、
−又は蛍光タンパク質はＥＣＦＰであり、そして蛍光エネルギー供与体であり、そして蛍光物質は、エネルギー受容体であり、そしてフルオレセイン及び７−ニトロ−２−ベンゾキサ−１，３−ジアゾールから選択されるか、
−又は蛍光タンパク質はＥＣＦＰであり、蛍光エネルギー受容体であり、そして蛍光物質はエネルギー供与体であり、ピレン及びクマリン又はその誘導体類（一方において、グラフトさせ、他方において、ＥＣＦＰの発光スペクトルに重なる励起スペクトルを有する）から選択される。
標的タンパク質に関しては、以下から選択される：
−Ｇタンパク質に結合した膜結合レセプター類（特に、Supplement Trend in Pharmacological Sciences, 1997（Receptor and ion Channel Nomenclature）、
−増殖因子レセプター類（特に、構造的にインスリンレセプター（Yarden,Y. and Ullrich, A. 1988, Biochemistry 27: 3113-3119）又はインターフェロンγレセプター（Brisco, J. et al. 1996, Phylos. Trans. R.Soc. Lond.B.Biol. Sci. 351: 167-171; Ihle, J. N. 1995, Nature 377: 591-594）に結合しているそれら）、
−イオンチャンネルレセプター類（特に、Supplement Trend in Pharmacological Sciences, 1997（Receptor and ion Channel Nomenclature））、
−細胞内核レセプター類（特に、構造的にステロイドレセプターに結合しているそれら（Mangelsdorf et al. 1995, Cell, 83: 835-839; Wurtz, J. L. et al. 1996, Nature Struct. Biol. 3: 206））
１つの好都合な実施様態によると、標的タンパク質はＧタンパク質に結合している膜結合レセプターから選択される。
これより上記、またこれより下記の文中において、「レセプター」という用語は、薬理学的物質と非共有結合的に相互作用することができるタンパク質性の何らかの分子を意味する。好適には、本発明では、神経伝達物質、ホルモン、成長因子、その他の、薬理学的なリガンドと相互作用後に、in vivo及び／又はin vitroで測定することができる、シグナル変換反応を産生する能力のあるレセプターである。
「シグナル変換反応」という表現は、レセプターとそれに特異的な薬理学的な物質との相互作用の結果生じ、第２のメッセンジャー、酵素ないしはイオン電流に作用することにより細胞代謝の活性化あるいは阻害に結びつく、in vivo及び／又はin vitroで測定することができる何らかの反応又は反応の阻害を意味する。
Ｇタンパク質に結合したレセプターに対するシグナル変換反応に関しては、通常の試験には、ＧＴＰの結合の測定によりＧタンパク質の活性化を測定することが含まれる（Befort et al. 1996, Neurochem. Res. 11: 1301-1307）。他のさらに特異的な測定には、関連するレセプターの結合の特異的な型によって、例えば、ｃＡＭＰ、イノシトール、リン酸もしくはカルシウムの細胞内濃度の測定、又は遺伝子転写の活性化、又は癌遺伝子活性の測定が含まれる。
イオンチャネル受容体に関しては、もっとも直接的な測定はイオン電流の測定である（Hille, B., 1992年，『励起可能な膜のイオンチャネル（Ion channels of excitable membranes）』、Sinauer Associates刊、マサチューセッツ州サンダーランド）。他の測定には、例えば、遺伝子転写あるいは酵素活性化の測定を含めることができる。
増殖因子に関しては、通常の試験は、細胞増殖、分化、又は生存についての試験であり、また、各レセプターの特定基質のリン酸化試験並びにホスホアミノ酸に特異的な抗体の検出試験も多い（Honneger et al. 1988, EMBO J. 7: 3053-3060）。
核レセプターに関しては、シグナルトランスダクション試験は、「染色体性」リポーター遺伝子が、研究対象のレセプターの形質導入経路に特異的なプロモーターの制御下に置かれている遺伝子転写試験である。
Ｇタンパク質に結合した膜結合レセプターの例としては、オーファンレセプターの他に、プリン、ヌクレオチド、タンパク質とペプチドの生物性アミン、エイコサノイド、脂質及び誘導体、興奮性アミノ酸及びイオン、匂い分子の受容体を挙げることができる（かなり網羅的な一覧表を下記に付した）。
増殖因子レセプターの例としては、サイトカイン、上皮増殖因子、インスリン、血小板に由来する増殖因子、形質転換増殖因子が挙げられる。
イオンチャネル受容体としては、ＡＴＰ、セロトニン、ＧＡＢＡ、グリシン、アセチルコリン、グルタミン酸レセプターが特に挙げられる。
核受容体の例としては、甲状腺ホルモン、エストロゲン、グルココルチコイド、レチノイドレセプターが特に挙げられる。
Ｇタンパク質に結合するレセプターのリガンドとしては、以下に記載するものがある：
●  プリン及びヌクレオチド
・  アデノシン
・  ｃＡＭＰ
・  ＡＴＰ
・  ＵＴＰ
・  ＡＤＰ
●  生物性アミン（及び関連する天然自然リガンド）
・  ５−ヒドロキシトリプタミン
・  アセチルコリン
・  ドーパミン
・  アドレナリン
・  ヒスタミン
・  メラトニン
・  ノルアドレナリン
・  チラミン／オクトパミン
・  その他の関連する化合物
●  ペプチド
・  副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）
・  メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）
・  メラノコルチン（ＮＴ）
・  ノイロテンシン（ＮＴ）
・  ボンベシン及び関連ペプチド
・  エンドセリン
・  コレシストキニン
・  ガストリン
・  ノイロキニンＢ（ＮＫＢ）
・  タキキニンレセプター
・  サブスタンスＫ（ＮＫＡ）
・  サブスタンスＰ（ＳＰ）
・  神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）
・  甲状腺刺激ホルモン放出因子
・  ノシセプチン
・  ブラジキニン
・  アンギオテンシンII
・  βエンドルフィン
・  Ｃ５ａアナファラトキシン
・  カルシトニン
・  ケモカイン（インタークリンとしても知られている）
・  コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）
・  ジノルフィン
・  エンドルフィン
・  ホルミル化ペプチド
・  フォリトロピン（ＦＳＨ）
・  真菌成熟フェロモン
・  ガラニン
・  ガストリックインヒビトリーポリペプチド（ＧＩＰ）のレセプター
・  グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）
・  グルカゴン
・  ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｍＲＨ）
・  成長因子放出ホルモン（ＧＨＲＭ）
・  昆虫利尿ホルモン
・  インターロイキン
・  ロイトロピン（ＬＨ／ＨＣＧ）
・  ＭＥＴ−エンセファリン
・  オピオイドペプチド
・  オキシトシン
・  副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）及び（ＰＴＨｒＰ）
・  ペプチド活性下垂体アデニルシクラーゼ（ＰＡＣＡＰ）
・  セクレチン
・  ソマトスタチン
・  トロンビン
・  甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
・  バソアクティブインテスティナルペプチド（ＶＩＰ）
・  バソプレッシン
・  バソトシン
●  エイコサノイド
・  ＩＰ−プロスタサイクリン
・  ＰＧ−プロスタグランジン
・  ＴＸ−トロンボキサン
●  レチナールに基づく化合物
・  脊椎動物１１−シス−レチナール
・  無脊椎動物１１−シス−レチナール
●  脂質及び脂質に基づく化合物
・  カンナビノイド
・  アナンダミド
・  リゾホスファチジン酸
・  血小板活性因子
・  ロイコトリエン
●  興奮性アミノ酸及びイオン
・  カルシウムイオン
・  グルタミン酸
●  オーファンレセプター
・  嗅覚レセプター
リガンドはアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかでありうる。
「アゴニスト」という用語は、例えば、神経伝達物質、増殖因子、あるいはホルモンなどの天然内在性リガンドの効果を真似る何らの分子を意味する。
「アンタゴニスト」という用語は、アゴニストと同じ標的タンパク質に結合することによってこのアゴニストの効果を阻害する何らかの分子を言う。
本発明は、標的タンパク質、特にレセプターと、そのリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用を、検出しかつ定量する方法であって、
−標的タンパク質の遺伝子と融合した蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を含む細胞又は細胞のフラグメントが、調製され、蛍光タンパク質のための遺伝子と上述の標的タンパク質の遺伝子との間の融合が、標的タンパク質の特性、特にレセプターの特性が、蛍光タンパク質の存在により改質されず、すなわち：
●  標的タンパク質、特にレセプターとリガンドとの間の相互作用が、改質されず、
●  応答変換機能が、改質されず、蛍光タンパク質は、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択され、その分子吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約０．３８より大きく、そのタンパク質は、特に、
−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は
−１個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりＧＦＰから誘導される誘導体（但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント（但し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する）から選択され、
−上述の細胞又は上述の細胞フラグメントは、上述の標的タンパク質、特に上述のレセプターのためのリガンド（これは、
−蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子、
−又は蛍光物質のいずれかからなるラベルでラベルされている）と接触して配置され、
そして蛍光タンパク質が蛍光エネルギー供与体であり、そしてラベルは、蛍光エネルギー受容体であるか、又は蛍光タンパク質が蛍光エネルギー受容体であり、そしてラベルが蛍光エネルギー供与体である蛍光物質であるかのいずれかであり、そして
−照射が、蛍光タンパク質を励起するか、又は蛍光物質を励起するかのいずれかを可能にする波長で実施され、
−接触して配置する上述の工程、及び同時にか又は順次にかのいずれかで実施されるべき照射を可能にするか、あるいは
−上述の細胞又は上述の細胞のフラグメントが、上述のタンパク質、特に上述のレセプターのためのリガンドと接触して配置され、ラベルでラベルされ、細胞又はリガンドが、接触して配置される前に照射され、
−供与体の発光の大きさの減少及び／又は受容体の発光に特有の発光シグナルを検出する方法に関する。
細胞、フラグメント及び精製タンパク質
「細胞」という用語は任意の真核性若しくは原核性の動物又は植物細胞であって、融合タンパク質をコードする遺伝子がレセプター（記載されている）とＧＦＰ又はそのミュータント若しくはフラグメントの間に導入されているものを意味する。
「細胞フラグメント」という表現は任意の（膜結合していてもしていなくてもよい）フラクションであって、細胞から得られ、レセプターＧＦＰ融合タンパク質を含有するものを意味する。
「精製タンパク質という表現は部分的に又は全体的に精製されている融合タンパク質を意味する。
一つの好適な実施態様によると、本方法はグリーン蛍光性タンパク質がレセプターに融合したＥＧＦＰ変異体のｃＤＮＡをそのレセプターに対するリガンドをBodipy530-550でラベルしたものと組み合わせて使用する。好適な表現系は哺乳類又はイースト細胞である。
本発明はまた標的タンパク質、特にレセプターとそのリガンドの一つとの間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量する方法に関するものであって、この方法は、
−標的タンパク質と融合した蛍光性タンパク質であって、タンパク質−リガンド相互作用を決定することが望まれるものを調製し、その際蛍光性タンパク質と上述の標的タンパク質との間の融合はタンパク質、特にレセプターの性質が蛍光性タンパク質の存在により修飾されないように行われる、すなわち、
●  標的タンパク質、特にレセプターとリガンドとの間の相互作用が修飾されず、
●  応答変換機能が修飾されない、
ように行われ、
蛍光性タンパク質は刺胞動物の自動蛍光性タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光性タンパク質から選ばれ、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、及びその定量的な蛍光収率は約０．３８よりも大きく、このタンパク質は特に
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−又はＧＦＰのフラグメント若しくは上述の変異体のフラグメント（但しこれらのフラグメントは蛍光性を保存する）、
−標的タンパク質と融合した上述の蛍光性タンパク質を上述のタンパク質用、特に上述のレセプター用のリガンドと接触させ、このリガンドは、
−蛍光性タンパク質が発する光を吸収することができる分子か、
−又は蛍光性物質からなるラベルでラベルされており、
かつ、蛍光性タンパク質が蛍光エネルギー供与体であり、ラベルが蛍光エネルギー受容体であるか、又は蛍光性タンパク質が蛍光エネルギー受容体であり、ラベルが蛍光性物質（これは蛍光エネルギー供与体である）であるかのいずれかであり、かつ、
−照射は、蛍光性タンパク質を励起するか、又は蛍光性物質を励起するかのいずれかを可能とする波長で行い、
−上述の接触工程と照射工程を同時に又は逐次にのいずれでも行うことが可能であり、又は、
−標的タンパク質と融合した上述の蛍光性タンパク質を上述のタンパク質用、特に上述のレセプター用のリガンドと接触させ、このリガンドは、
−蛍光性タンパク質が発する光を吸収することができる分子か、
−又は蛍光性物質
からなるラベルでラベルされており、
標的タンパク質と融合した蛍光性タンパク質又はリガンドは接触させる前に照射しておき、
−供与体の発光の大きさの減少及び／又は受容体の発光に特徴的な発光信号を検出することを特徴とする。
ＧＦＰの蛍光性を示すことに加えて、標的タンパク質及び特にＧＦＰとの融合により修飾されたレセプターは、それを特徴づける化合物に特異的なレセプターとしての定義に適合する薬理学的性質を保存している必要がある。特に、野生型のレセプターと同じリガンドに結合することが必要である。
本発明の方法において、標的タンパク質と融合した蛍光性タンパク質とリガンドを接触させるか、又は細胞若しくは細胞フラグメント（上述の蛍光性タンパク質が標的タンパク質と融合したものを含有する）とリガンドを接触させると混合物を生じる。
混合は任意の添加順序で行うことができる。好ましい順序は蛍光性リガンドを細胞又はタンパク質の溶液に添加することであるが、これはＧＦＰが供与体の場合であり、ＧＦＰが受容体であるならば逆の順序とする。
混合は急速混合装置と蛍光検知システムを組み合わせた装置で行い、レセプターリガンド相互作用及び生理活性分子によるその減損の実時間測定を行うことができるようにすることができる。
細胞内へのＤＮＡの導入
選択された発現系を構成する動物、植物、昆虫、イースト、細菌又は真菌細胞は実験室マニュアル、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, eds Ausabel et al., John Wiley and sonsに記載されている手順に従って、安定的に又は一過的にトランスフェクション、形質転換、電気穿孔又は感染させてもよい。
本発明はまた追加工程が導入された方法に関する：
−標的タンパク質と融合した蛍光性タンパク質と上述のタンパク質用のリガンドを接触させる工程の前、後又はそれと同時に、このリガンドをラベルでラベルするか、又は
−細胞若しくは細胞フラグメントと上述のタンパク質用のリガンドを接触させる工程の前、後又はそれと同時に、ラベルでラベルし、
この追加工程は次の工程からなる：
−標的タンパク質と融合した上述の蛍光性タンパク質を上述のラベルされていないリガンドと、かつ同時に上述のラベルされたリガンドと接触させるか、
−又は上述の細胞又は上述の細胞フラグメントを同時に上述のラベルされていないリガンド及び上述のラベルされたリガンドと接触させ、
−供与体の発光の大きさの減少及び／又は受容体の発光に特徴的な発光信号を、ラベルされたリガンドを使用した場合と、ラベルされたリガンドとラベルされていないリガンドとを同時に使用した場合とについてそれぞれ検知し、
−かつ、それぞれの場合に得られた供与体の発光の大きさの減少及び／又はそれぞれの場合に得られた、受容体の発光に特徴的な発光信号を比較する。
この場合、ラベルされたリガンドとラベルされていないリガンドの間に標的タンパク質に関して競争が起きる。そのような方法の利点は自動機械に適合させて、標的タンパク質と相互作用することができかつ生物学的応答に関して作動薬又は拮抗薬のいずれかとして振る舞うことができる新しい分子を同定することができることにある。標的タンパク質とその蛍光性リガンドとの間の相互作用の阻害の（ラベルされていない分子の種々の濃度における）解析はラベルされていない分子の標的タンパク質に対する親和性パラメータを決定することを可能にする。
本発明はまた蛍光性タンパク質がＥＧＦＰである方法であって、ここにおいて、
−ＥＧＦＰは蛍光性エネルギー供与体であり、ラベルが蛍光エネルギー受容体であってその励起スペクトルがＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる物質から選ばれ、特にラベルが蛍光性物質であるときは、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Bodipy）、エオシン、エリスロシン、テトラメチルローダミン、スルホローダミン１０１（商品名Texas Red、Molecular Probe社製）及びそれらの誘導体から選ばれ、一方ではグラフトすることが可能であり、他方ではＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを持ち、
かつ、ラベルが蛍光性物質でないときは、Acid Violet群［Acid Violet 5,CAS10130-48-0; Acid Violet 7, CAS4321-69-1; Acid Violet 17, CAS 4129-84-4］、Acid Red群［Acid Red 1, CAS 3734-67-6; Acid Red 8, CAS 4787-93-3;Acid Red 37, CAS 6360-07-2; Acid Red 40, CAS 12167-45-2; Acid Red 106,CAS 6844-74-2; Acid Red 114, CAS 6459-94-5］、アリザリン、アルミノン、アゾカーミンＢ［CAS 25360-72-9］、塩基性フシン［Basic Red 9, CAS 569-61-9］、ボルドーＲ［Acid Red 17, CAS 5858-33-3］及びカーミン［CAS 1390-65-4］、
−又はＥＧＦＰは蛍光エネルギー受容体であり、蛍光性物質は蛍光エネルギー供与体であり、その発光スペクトルがＥＧＦＰの励起スペクトルと重なる物質から、特にクマリン、フルオレスカミン、６−（Ｎ−メチルアニリノ）ナフタレン、（マンシル）及びその誘導体から選ばれ、一方でグラフトすることが可能であり、他方ではＥＧＦＰの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを持つ。
本発明はまたタンパク質−リガンド相互作用を決定することを望むタンパク質を下記から選ぶ方法に関する。
−Ｇタンパク質に結合した膜結合タンパク質、特にSupplement Trends in Pharmacological Sciences, 1997（Receptor and ion Channel Nomenclature）に記載のもの、
−成長因子レセプター、特にインスリンレセプター（Yarden, Y. and Ullrich,A. 1988, Biochemistry 27:3113-3119）に構造的にリンクしているもの、γインタフェロンレセプター（Brisco, J. et al. 1996, Phylos. Trans. R. Soc.Lond. B. Biol. Sci. 351:167-171; Ihle, J.N. 1995, Nature 377:59-594）に構造的にリンクしているもの、
−イオンチャンネルレセプター、特にSupplement Trends in Pharmacological Sciences, 1997（Receptor and ion Channel Nomenclature）に記載のもの、
−細胞内核レセプター、特にステロイドレセプターに構造的にリンクしたもの（Mangelsdorf et al. 1995, Cell, 83:835-839; Wurtz, J. L. et al. 1996,Nature Struct. Biol 3:206）。
本発明はまた蛍光性タンパク質がＥＧＦＰであり、ラベルされた物質がBodipyであり、エネルギー移動の結果生じる、ＥＧＦＰの発光の大きさの減少又はBodipyの発光信号を検知する方法に関するものであり、照射波長はＥＧＦＰの励起波長に相当する。
本発明はまた蛍光性タンパク質がＥＧＦＰであり、ラベルされた物質がクマリンであり、エネルギー移動の結果生じる、クマリンの発光の大きさの減少又はＥＧＦＰの発光信号を検知し、その際照射波長がクマリンの励起波長に相当する方法に関する。
本発明はまた蛍光性タンパク質がＮ末端側に融合し、標的タンパク質、特にレセプターがＣ末端側に融合する方法に関する。
本発明はまた蛍光性タンパク質がＣ末端側に融合し、標的タンパク質、特にレセプターがＮ末端側に融合する方法に関する。
本発明はまた蛍光性タンパク質を標的タンパク質内に、標的タンパク質−リガンド結合部位に相当しない場所で挿入し、特にＧタンパク質に結合したレセプターの場合、この挿入はレセプターの第１又は第３の細胞内ループで起きる（但し、挿入はレセプターの性質又は蛍光性タンパク質の蛍光を破壊しない）方法に関する。
本発明はまた細胞が哺乳動物細胞、特にＨＥＫ２９３細胞（付着性又は懸濁している）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、白血球系統、繊維芽細胞等、又はイースト細胞、特にPichia pastorisのようなPichia、Saccharomyces cerevisia、Saccharomyces kluyveri、のようなSaccharomyces、Hansenula polymorphaのようなHansenula、又はBaculovirusのようなウイルスに感染した昆虫細胞、特にTNI又はsf9細胞、又は真菌類、特にAspergillusの菌株（A. oryzae、A.nidulans、A. niger）、Neurospora、Fusarium又はTrichodermaである方法に関する。
タンパク質発現のためのAspergillusの使用はEP0,272,277又はEP0,230,023又はEP0,184,438に記載されているが、植物由来細胞、特にArabidopsis（A.thaltana）、又は甘夏（Citrus sinensis）由来のプロトプラストがHaseloff,J.and Amos, B., 1995, Trends in Genetics 11;328-329に記載されている。
使用する細胞系統に関しては、これはレセプターによって決まる。詳しくは選択したレセプターを既に天然に発現しているものではない系統を選択するのが望ましい。
本発明はまた従来の蛍光測光装置又は蛍光検出系を備えた高速混合装置内で供与体と受容体を混合した後信号を検出することができ、かつ同じ薬理学的特異性を持つ非蛍光性物質の添加により終了させることができる方法、特に信号／雑音比が約２より大きい方法に関する。
いろいろなアイデアを実現するため、かつ例示のため、信号／雑音比は約１００であり、この場合、Bodipy−ＥＧＦＰカップルを装置上で用い（実施例に記載）、上述の物質のためのレセプター（ＮＫ２Ｒと呼ぶ）はＥＧＦＰでラベルし（ＮＫ２Ｒ−ＥＧＦＰ）、そのリガンド、物質Ｋ（ＮＫＡ）はBodipyでラベルした（ＮＫＡ−ＢＯ）。
信号と信号対雑音比に関して、以下のように定義することができる。
供与体と受容体の混合に伴い供与体又は受容体のいずれかの蛍光が変化するならば、この変化は（同じ薬理学的特異性の）非蛍光性物質により阻害及び回復させられる必要があり、これにより、観察している薬理学的現象の特異性を明確にする。一定の用途（イエス−ノー型の応答）に対しては、低い信号対雑音比で十分である。
標的タンパク質については、細胞全体（標的タンパク質をコードするＤＮＡを含有する）、細胞フラグメント（膜レセプター用膜）又は溶解された（膜レセプター）若しくは精製された（実施例参照）標的タンパク質のサンプルを用いて測定することが可能である。
本発明はまた刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又はこれに由来する蛍光性タンパク質から選ばれた蛍光性タンパク質であって、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きく、このタンパク質は特に
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−ＧＦＰのフラグメント、上述の変異体のフラグメント（但しこれらのフラグメントは蛍光性を保存する）、
から選ばれ、
Ｇタンパク質に結合したレセプターからなる標的タンパク質とＧタンパク質との間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量するために、レセプターに関し生物学的活性があり、かつ、可逆的、非共有結合的相互作用を上述のレセプターと形成することができる分子を同定することができるように、レセプターを蛍光タンパク質で遺伝的にラベルし、Ｇタンパク質を
−蛍光タンパク質の発する光を吸収することができる分子からなるか、
−又は特に刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られる又はこれに由来する蛍光性タンパク質から選ばれた蛍光性物質のいずれかよりなるラベルでラベルされ、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きく、このタンパク質は特に
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、上述の変異体のフラグメント（但し、これらのフラグメントは蛍光性を保存する）
から選ばれ、
●  この検知及び定量は、ＧＦＰでラベルしたレセプター又は上述のその変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つと上述の蛍光性物質との間の蛍光エネルギー移動によって起こり、この蛍光性物質はＧＦＰ、若しくは上述の変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起可能であるか、この蛍光性物質はＧＦＰ、若しくは上述の変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの励起波長で発光するか、あるいは
●  ＧＦＰ、若しくは上述の変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つと上述の分子（蛍光性タンパク質の発する光を吸収することができる）
との間で起きる。
本発明はまたラベルでラベルされたＧタンパク質の使用に関し、このラベルは
−蛍光性タンパク質の発する光を吸収することができる分子からなるか、
−又は刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られる又はこれに由来する蛍光性タンパク質から特に選ばれた蛍光性物質であって、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きい蛍光性物質からなり、このタンパク質は特に
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−ＧＦＰのフラグメント、上述の変異体のフラグメント（但しこれらのフラグメントは蛍光性を保存する）、
から選ばれ、
Ｇタンパク質に結合したレセプターからなる標的タンパク質とＧタンパク質との間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量するために、レセプターに関し生物学的活性があり、かつ、該レセプターと可逆的、非共有結合的相互作用を形成することができる分子を同定することができるように（ここで、上述のレセプターは、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか又はこれに由来する蛍光性タンパク質から選ばれた蛍光性タンパク質であって、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きい蛍光性タンパク質から選ばれた蛍光性タンパク質で遺伝的にラベルされている）、このタンパク質は
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−ＧＦＰのフラグメント、上述の変異体のフラグメント（但しこれらのフラグメントは蛍光性を保存する）、
から選ばれ、
●  この検知及び定量は、ＧＦＰ又は上述のその変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つと上述の蛍光性物質との間の蛍光エネルギー移動によって起こり、この蛍光性物質はＧＦＰ、若しくは上述の変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起可能であるか、この蛍光性物質はＧＦＰ、若しくは上述の変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの励起波長で発光するか、あるいは
●  ＧＦＰ、若しくは上述の変異体の一つ、又は上述のフラグメントの一つと上述の分子（蛍光性タンパク質の発する光を吸収することができる）との間で起こる。
本発明方法の一つの好適な実施態様によると、蛍光性タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰ又はその突然変異体から選ばれ、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きい。
一つの好適な実施態様によると、レセプターは、
−Ｇタンパク質に結合したレセプター、特にSupplement Trends in Pharmacological Sciences, 1997（Receptor and ion Channel Nomenclature）に記載のもの、
−推定Ｇタンパク質に結合したレセプターをコードする配列（ここで、これらのレセプターに関し生物学的に活性である分子を同定するものとし、配列は特にGenbank及びEMBL配列ライブラリ及びその系列ライブラリから入手可能なオーファンレセプター配列から選ばれる）
から選ばれる。
もう一つの好適な実施態様によると、Ｇタンパク質はJournnal of Receptor Research, vol 13, pp. 19-26, 1993又はAngewandte Chemie, ed. Engl. Vol.34, pp. 1406-1419, 1995から選ばれる。
本発明はまたレセプターに関し生物学的活性があり、かつ、可逆的、非共有結合的相互作用を上述のレセプターと形成することができる分子を同定するために、Ｇタンパク質に結合したレセプターからなる標的タンパク質とＧタンパク質との間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量する方法に関し、この方法の特徴とするところは、
−Ｇタンパク質に結合したレセプターをコードする遺伝子と融合した蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を発現する細胞又は細胞フラグメントを調製し、蛍光タンパク質をコードする遺伝子と上述のレセプターをコードする遺伝子との間の融合をレセプターの性質が蛍光タンパク質の存在によって修飾されないようにして行い、すなわち、
●  レセプターとＧタンパク質との間の相互作用が修飾されず、
●  レセプターと生物学的に活性な分子との間の相互作用が修飾されず、
●  応答変換機能が修飾されない、
ように行われ、
蛍光性タンパク質は刺胞動物の自動蛍光性タンパク質から得られるか又は誘導される蛍光性タンパク質から選ばれ、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1より大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きく、このタンパク質は特に
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−又はＧＦＰのフラグメント、上述の変異体のフラグメント（但しこれらのフラグメントは蛍光性を保存する）
から選ばれ、
Ｇタンパク質は
−蛍光性タンパク質が発する光を吸収することができる分子か、
−又は蛍光性物質
からなるラベルでラベルされており、
蛍光タンパク質と上述のラベルは、相互にエネルギーを移動し、蛍光タンパク質がエネルギー供与体となることができ、又は上述のラベルがエネルギー供与体になることができ、
蛍光タンパク質でラベルしたレセプターと上に定義したラベルでラベルしたＧタンパク質との間の相互作用が蛍光エネルギー移動により検知されるように行われることにある。
本発明はまた、上述の方法（ここで、蛍光性タンパク質でラベルしたレセプターとラベルでラベルしたＧタンパク質とをコードするＤＮＡを発現する、細胞又は細胞フラグメントに生物学的に活性な非蛍光性分子を添加をする）を実施することによって、レセプターと、このレセプターに関し生物学的活性があり、かつ、可逆的、非共有結合的相互作用を上述のレセプターと形成することができる非蛍光性分子の間の相互作用を同定し場合によって定量する方法において、
作動薬である生物学的に活性な非蛍光性分子が蛍光性タンパク質でラベルしたレセプターとラベルでラベルしたＧタンパク質との間のエネルギー移動の変化により検知されるシグナル変換をトリガーし；
−拮抗性の、生物学的に活性な非蛍光性分子が、作動薬によりもたらされ、かつ蛍光性タンパク質でラベルされたレセプターとラベルでラベルされたＧタンパク質との間の蛍光エネルギーの移動における変化により検知される信号変換を阻害する
ことを特徴とする方法に関する。
本発明の一つの対象は細胞又は細胞フラグメントであって、それが含有するＤＮＡ配列は標的タンパク質をコードする遺伝子と融合した蛍光性タンパク質をコードする遺伝子を含み、ここで、蛍光性タンパク質は刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られる又はこれに由来する蛍光性タンパク質から選ばれた蛍光性タンパク質であって、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きい蛍光性タンパク質からなり、蛍光タンパク質をコードする遺伝子と上述の標的タンパク質をコードする遺伝子の間の融合は、
●  標的タンパク質の性質が蛍光性タンパク質の存在によって修飾されない、すなわち、
●  標的タンパク質とリガンドとの間の相互作用が修飾されず、
●  応答変換機能が修飾されない、
ように行われるが、
但し、
●  標的タンパク質が、Ｎ末端にヒスチジン６個を含む精製配列と、ヘマトグルチニンエピトープと蛍光タンパク質とを順次融合したラットのグルココルチコイドレセプターであり、細胞系統１４７１．１（Hun et al.1996, PNAS 93: 4845-4850）において発現させたときは、蛍光性タンパク質はＧＦＰ以外であり（768塩基対のプラスミドＴＵ６５をＳ６５Ｔで突然変異させたもの）（Chalfie et al. 1994, Science 263: 802-805,S65Tで突然変異）、
●  標的タンパク質が、ヒトグルココルチコイドレセプターから最初の１３１個のアミノ酸を切り取り、蛍光タンパク質のＣ末端にＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ部位において融合しＣｏｓ−１細胞（Ogawa et al. 1995,PNAS 92: 11899-11993）中で発現させたヒトグルココルチコイドレセプターであり、上述の蛍光タンパク質はＧＦＰ以外（Inouye S. and Tsuji,F.L, 1994, Febs Letters, 341: 277−280）であり、
● 標的タンパク質がＣ末端に蛍光性タンパク質を融合したＨＥＫ２９３細胞（Marshall et al. 1995, Neuron 14: 211-215）中で発現させたラットＮＭＤＡ  Ｒ１サブユニットであり、ここで、蛍光性タンパク質は野生型ＧＦＰ（Chalfie et al. 1994, Science 263: 802-805）のアミノ酸２−２３８からなるものであり、
●  標的タンパク質が細胞内第２メッセンジャー用のレセプター又はレセプターフラグメントであるときは、蛍光性タンパク質はＧＦＰ及びその誘導体（WO96/23898）以外である。
本発明はまた蛍光性タンパク質でラベルした標的タンパク質とラベルでラベルしたそのリガンドの一つとの間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量するためのキット及び装置であって、該ラベルは
−蛍光性タンパク質の発する光を吸収することができる分子からなるか、
−又は蛍光性物質からなり、
この蛍光性タンパク質は刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られる又はこれに由来する蛍光性タンパク質から選ばれた蛍光性タンパク質であって、そのモル吸光係数は約１４，０００M-1cm-1よりも大きく、及びその量子蛍光収率は約０．３８よりも大きく、このタンパク質は特に
−グリーン蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又は
−ＧＦＰから、一個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により誘導される変異体（但しこれらの変異体は蛍光性を保存する）、
−ＧＦＰのフラグメント、上述の変異体のフラグメント（但しこれらのフラグメントは蛍光性を保存し、そのリガンドは蛍光性タンパク質でラベルされている）
から選ばれ、
上述のキットは下記を含む：
−蛍光性タンパク質を融合した標的タンパク質又は安定な細胞系統であって蛍光性タンパク質を融合したタンパク質を発現することができるものか、又はこの蛍光性タンパク質を融合した上述の標的タンパク質をコードする核酸配列を含有するプラスミド、
−上述のラベルでラベルしたリガンド、
−上述のタンパク質と上述のリガンドとの間のエネルギー移動のために必要なバッファー及び媒体。
本発明はまた蛍光性タンパク質（No.１）でラベルした標的タンパク質と蛍光性タンパク質（No.２）に対応する蛍光性物質でラベルしたそのリガンドの一つとの間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量するためのキット及び装置であって、蛍光性タンパク質（No.１）は蛍光性タンパク質ＥＹＦＰ又はＥＧＦＰから選ばれ、リガンドは蛍光性タンパク質（No.２）ＥＣＦＰでラベルされ又は蛍光性タンパク質（No.１）はＥＣＦＰであり、リガンドは蛍光性タンパク質（No.２）ＥＹＦＰ又はＥＧＦＰでラベルし、上述のキットは
−蛍光性タンパク質（No.１）を融合した、標的タンパク質をコードする核酸配列を含有するプラスミド、及び
●  蛍光性タンパク質（No.２）を融合した、リガンドをコードする核酸配列を含有するプラスミド、又は
●  蛍光性タンパク質（No.２）を融合したリガンドであって、組替えルートで得られかつ精製されたもの、
又は標的タンパク質を発現することができる安定な細胞系統を蛍光性タンパク質（No.１）と融合したもの、及び
●  標的タンパク質を発現することができる安定な細胞系統を蛍光性タンパク質（No２）と融合したもの、又は
●  蛍光性タンパク質（No.２）を融合したリガンドであって、組替えルートで得られ、かつ精製したもの、
−上述のタンパク質及び上述のリガンドの間のエネルギー移動に必要なバッファー及び媒体を含む。
本発明はまた蛍光性タンパク質（No.１）でラベルしたＧタンパク質に結合したレセプターからなる標的タンパク質と、蛍光性タンパク質（No.２）に対応する蛍光性物質でラベルしたＧタンパク質との間の非共有結合的相互作用を検知かつ定量するためのキット及び装置であって、蛍光性タンパク質（No.１）は蛍光性タンパク質ＥＹＦＰ又はＥＧＦＰから選ばれ、Ｇタンパク質は蛍光性タンパク質（No.２）ＥＣＦＰでラベルされ又は蛍光性タンパク質（No.１）がＥＣＦＰであり、Ｇタンパク質は蛍光性タンパク質（No.２）ＥＹＦＰ又はＥＧＦＰでラベルし、上述のキットは
−蛍光性タンパク質（No.１）を融合した、レセプターをコードする核酸配列を含有するプラスミド、及び
●  蛍光性タンパク質（No.２）を融合した、Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するプラスミド、又は
●  蛍光性タンパク質（No.２）を融合したＧタンパク質であって、組替えルートで得られ、精製したもの、
又はレセプターを発現することができる安定な細胞系統を蛍光性タンパク質（No.１）と融合したもの、及び
●  Ｇタンパク質を発現することができる安定な細胞系統を蛍光性タンパク質（No２）と融合したもの、又は
●  蛍光性タンパク質（No.２）を融合したＧタンパク質であって、組替えルートで得られ、かつ精製したもの、
−上述のレセプター及び上述のＧタンパク質の間のエネルギー移動に必要なバッファ及び媒体を含む。
発明の詳細な説明
好適な実施態様において、本発明の発展は、クラゲAequoria victoria、好ましくはこの蛍光性タンパク質の変異体ＧＦＰＵＶ、ＲＳＧＦＰ及びＢＦＰ（好適なホスト生物、哺乳動物細胞での発現に対して最適化されている）から得た、グリーン蛍光性タンパク質をコードするｃＤＮＡ（Prasher et al. Gene 1992,111: 229-233; GenBank Association No. M62653）を用いる。
このcＤＮＡは修飾して一個以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されてＮ末端又はＣ末端が標的タンパク質をコードする遺伝子と融合するようにできる。
標的タンパク質（好ましくはレセプター）は下記から選ぶことができる：
１）Ｇタンパク質に結合した神経伝達物質レセプターであってアドレナリン作動性レセプター及びグルタメートの代謝共役型レセプターに構造的にリンクしているもの。これは逐年改訂編集されるリストに下記名称で追補として載っている：“Receptor and Ion Channel Nomenclature”Elsevier Trends journals, in Trends in Pharmacological Sciences．
２）ニコチン性レセプター、グルタメートレセプター、及びＡＴＰレセプターに構造的にリンクしているイオンレセプターチャンネル。これは逐年改訂編集されるリストに下記名称で追補として載っている：“Receptor and Ion Channel Nomenclature”Elsevier Trends journals, in Trends in Pharmacological Sciences．
３）ステロイドレセプターに構造的にリンクしているＤＮＡ塗装後作用するドメインを含む核性レセプター（Mangelsdorf et al. 1995, Cell, 83: 835-839,Wurz,J.L. et al. 1996, Nature truct. Biol. 3: 206）．
４）チロシンカイネース活性を有するプラスミド膜レセプター、これはインスリンレセプターに構造的にリンクしている（Yarden, Y. and Ullrich, A. 1988,Biochemistry 27: 3113-311９）．
５）チロシンカイネースタンパク質（ＳＴＡＴｓ、ＴＹＫ２、Ｊａｋ）に結合した膜結合レセプターで、γインタフェロンレセプター（Brisco, J. et al.1996, Physlos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351: 167-171; Ihle,J.N. 1995, Nature 377: 591-594）に構造的にリンクしているもの。
ＥＧＦＰとＧタンパク質（グループ１）と結合したレセプターとの間で融合が行われると、融合は特に、
１）レセプターのＮ末端側、したがってＥＧＦＰのＣ末端側で、
２）レセプターのＣ末端側で、したがってＥＧＦＰのＮ末端側で、
３）レセプターの配列中、特に第１又は第３の細胞内ループ中で、場合によって１個以上のスペーサー配列のコピー導入により、特に−ＧＧＧＧＳ−で、
行うことができる。
ＥＧＦＰとレセプターチャンネル（グループ２）との間で融合が行われると、融合は特に、
１）Torpedo（残基６７−７６）のニコチン性レセプターのαサブユニットの「主免疫領域」に相同な領域で、場合によってスペーサー配列の１個以上のコピーを導入して、特に−ＧＧＧＧＳ−において
行うことができる。
ＥＧＦＰと核性レセプター（グループ３）の間で融合が行われると、融合は特に
１）レセプターのＮ末端側、したがってＥＧＦＰのＣ末端側で、
２）ＤＮＡ結合ドメインの上流のＮ−末端部分でレセプターのＮ末端側で先端を切りとった、したがってＥＧＦＰのＣ末端側で、
行うことができる。
ＥＧＦＰとチロシンカイネース活性を持つレセプター又はチロシンカイネース（グループ４及び５）にカップルしたレセプターの間で融合が行われるときは、融合は特に
レセプターのＮ末端側、したがってＥＧＦＰのＣ末端側で［脱落］
行うことがきる。
蛍光性タンパク質、特にＧＦＰをコードする任意の遺伝子であってレセプターに結合しＧＦＰ又は同様のタンパク質を発現する生物由来のものは本発明において使用することができる。
ＧＦＰをコードするＤＮＡ配列及び標的タンパク質、特にレセプターはゲノム由来であってもcＤＮＡであってもよく、任意の動物又は植物、真核性又は原核性種から得てもよく、例えばゲノムライブラリー又はcＤＮＡライブラリーを調製し、これらのライブラリーをスクリーニングしてコード配列をオリゴヌクレオチドプローブを用いて標準技法（Current Protocols in Molecular Biology、既出）ハイブリッド化することによって得ることができる。
ＧＦＰ及び標的タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は標準的方法、特にホスホルアミダイト法（Beaucage and Caruthers, Tett. Lett 1981, 22: 1859-1869）により、かつ自動化されたＤＮＡ合成装置を使用する全合成によって得ることもできる。ついで、得られたポリヌクレオチドを精製し、連結し、適当なベクター中でクローン化する。大抵の応用に対しては、ＧＦＰをコードする遺伝子と標的タンパク質はライブラリーをスクリーニングすることにより得るのが好ましいが、変異誘発に必要なスペーサーアームとオリゴヌクレオチドは合成により得るのが好ましい。
ＤＮＡ構築物は混合物、合成物、又は標準の手順（Current Protocols in Molecular Biology、既出）に従い、合成フラグメントをゲノム性ＤＮＡ要素と連結することによるゲノム性のものであってもよい。
ＤＮＡ構築物はまた、特異的プライマー、例えばPCR Protocol 1990,Academic Press, San Diego, California, USA）に記載されているようなものを用いたPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により得ることもできる。
最後に、ＤＮＡ構築物は他の方法、例えば化学反応、ランダム又はサイト部位指向変異誘発、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により修飾することができるが、これらの修飾が他のタンパク質、特にＧＦＰ及び標的タンパク質の性質を悪化させることもあり得る。
ＤＮＡ構築物は組替えベクターに挿入することができる。このベクターは組替えベクターとともに用いる手順に適していればどのようなベクターでもよい。ベクターの選択はしばしば、ＤＮＡ構築物の導入を望むホスト細胞の機能によってなされる。ベクターはしたがって自立的に複製し得るベクターであってもよく、これは染色体外性であり、染色体の複製とは独立性であり、例えばプラスミドである。あるいはまた、ベクターはそれが含有するＤＮＡのすべて又は一部をホスト細胞のゲノム内に取り込み、それが取り込まれた染色体と同時に複製するように開発してもよい。
ベクターは標的タンパク質を融合したＧＦＰ又はリガンドを融合したＧＦＰが転写に必要なＤＮＡの他のセグメントの制御下にある発現ベクターが好ましい。一般に、発現ベクターはウイルス又はプラスミドＤＮＡから導かれるか、又は一方又は他方の要素を含むようにすることもできる。
「制御下」という表現はＤＮＡセグメントがベクター上に配置されて調和して機能し所望の目的に奉仕することを示し、例えば、転写がプロモーターにおいて開始され標的タンパク質ＧＦＰと融合した標的タンパク質又はＧＦＰと融合したリガンドをコードする配列を通って継続される。
プロモーターは選択されたホスト細胞中で転写活性を促進することができるものであれば任意のＤＮＡ配列であってもよい。
ＧＦＰと融合した標的タンパク質又はＧＦＰと融合したリガンドを哺乳動物細胞中で発現するのに適しているプロモーターの例はサルウイルスＳＶ４０プロモーター（Subramani et al. 1981, Mol Cell. Biol. 1: 854-864）、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又はアデノウイルスメージャーレイトプロモーター（adenovirus majorlate promoter（AdMLP）がある。
昆虫細胞用プロモーターの例：
ポリヘドリンプロモーター（US4,745,051; Vasuvedan et al. 1992, FEBS Let.311: 7-11）、プロモーターＰ１０（Vlack et al. 1988, J. Gen. Virol. 69:765-776）、バキュロウイルスの初期遺伝子１用プロモーター（US5,155,037）； US5,162,22）
イースト用プロモーターの例：
解糖遺伝子のプロモーター（Hitzeman et al. J. Biol. Chem. 1980, 255:12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1982, 1: 419-434）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Young et al. in Genetic Engineering of microorganisms for chemicals（Hollanender et al. eds），Plenum Press, NY 1982）。
バクテリア用プロモーターの例
バクテリア中で発現するプロモーターの例はとしては、Ｔ７ポリメラーゼ・プロモーターのような構成プロモーター、又は例えばラムダファージのpLプロモーターのような誘導性プロモーター（Current Protocols in Molecular Biology、既出）を挙げられる。
糸状菌用のプロモーターの例
使用可能なプロモーターは、例えば、ＡＤＨ３プロモーター（McKnight et al.EMBO J. 1985, 4: 2093-2099）又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターはRhizomucor mieheiのアスパルテート・プロテイナーゼ、Aspergillus nigerの中性αアミラーゼ、Aspergillus nidulansのアセタミダーゼ、Aspergillus oryzaeのタカアミラーゼ又はAspergillus awamoriのグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導してもよい。
ベクターはさらに下記のものを含有していてもよい。
−ポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０の配列又はアデノウイルスのＥｌｂ５領域のようなもの）
−転写アクチベーター（エンハンサー）配列（SV40アクチベーター）
−複製配列（例えば、ＳＶ４０の複製配列又は哺乳動物細胞用のEpstein Barrウイルス、又はイースト用のプラスミド２μの複製起点及び複製遺伝子ＲＥＰ１−３、
−選択マーカー、すなわち抗生物質（ネオマイシン、ゼオシン、ヒグロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロランフェニコール等）に耐性を付与する遺伝子又は欠陥の補償を許容する遺伝子（メトトレクセートに対する耐性を許容するジヒドロフォレートレダクターゼをコードする遺伝子）又はS. pombeのＴＰＩ遺伝子（Russell, 1985, Gene, 40: 125-130）
ホスト細胞は適当なベクター内に挿入されたＤＮＡ構築物を発現することができる任意の細胞であってよい。
これらの細胞は特に、バクテリア、イースト、真菌、哺乳動物細胞のような高級真核性細胞であってもよい。
ＤＮＡ構築物を発現することができるバクテリア細胞は、
−グラム陽性菌、例えばB.subtilip,B.licheniformis, B. lentus, B.brevis, B. strearothermophilus, B. thurigiensisのようなBacillus菌株、又はStreptomyces菌株、例えばS. lividans、S. murinus、のような
−グラム陰性菌、Escherichia coliのような
バクテリアの形質転換はプロトプラスト形質転換により又はコンピテント・バクテリアの形質転換により行うことができる（Current Protocols in Molecualar Biology、既出）。
真核細胞の例
細胞系統ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、初代培養、ＣＯＳ細胞（例えば、ATCC CRL 1650）、ＢＨＫ（例えば、ATCC CRL 1632）ＣＨＯ（例えば、ATCC CCL 61）
これらの細胞内にＤＮＡを導入する方法（トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔等がCurrent Protocols in Molecular Biology、既出に記載されている。
イーストの細胞の例
Saccharomyces, S. cerevisiae, S. kluyveri，
Kluiveromyces, K. lactis，
Hansenula, H. polymorpha，
Pichia, P. pastoris，
Current Protocols in Molecular Biology、既出に記載の手順に従って異種ＤＮＡの導入を行うことによって形質転換した。
形質転換された細胞を耐性マーカー、一般に薬剤耐性マーカー、又は特定の栄養の不存在下での増殖能力により決定された表現型により選択する。
糸状菌の例：
Aspergillus菌株（A. oryzae, A. nidulans, A. niger）、Neurospora,Fusarium, Trichoderma。Aspergillusをタンパク質の発現に使用することはEP272277、EP230023又はEP184438に記載されている。
昆虫細胞の例
Lepidoptera系統、例えばSpodoptera frugiperda（Sf9）又はTricholusiani（Tni）について言及する。形質転換方法（特に感染）はCurrent Protocols in Molecualar Biology（既出）に記載されている。
リガンド
標的タンパク質と相互作用するリガンドは任意の起源（天然、合成、半合成又は組替え）及び構造のものであってもよい。これは天然状態で蛍光性（又は発色団を担持する）又は蛍光基（又は蛍光基の前駆体）又は発色団をグラフトさせるには化学反応が必要であることもあるし、あるいはリガンドをＧＦＰと融合してこのようにして蛍光性にされたリガンドの発現を可能にするにはＤＮＡ構築物を必要とすることがある。
化学反応の例
−アミン類やチオール類とアルキルハライド、アリールハライド、アシルハライド、酸ハライド、イソシアネート基、マレイミド基又はエポキシドのような試薬とを有機溶媒中塩基不存在下、又は水性媒体中でカップリング
−酸類とスクシンイミド類のような基で活性化されたアミン類とのカップリング
本発明の方法によれば、形質転換された細胞の蛍光は分光分析器中で測定することができ、それを用いて励起及び発光スペクトルを取得することにより懸濁又は付着細胞の性質を決定することができる。蛍光性リガンドとの相互作用は供与体と受容体の励起及び／又は発光エネルギースペクトルにおける変化により検知され、リガンドは、標的タンパク質との相互作用が非蛍光リガンド（これは標的タンパク質と蛍光性リガンドとの間の相互作用を妨げる）の過剰量を添加することによって阻害されるならば、それらは薬理学的に有意義であると定義される。
【図面の簡単な説明】
図１は、Aequorea victoriaの野生型ＧＦＰ（Prasher et al, 1992, Gene 111: 229-233）をコードするヌクレオチド配列である。
図２は、ｐＭＴ３−ＥＧＦＰ−Ｃ３−ＳＰ構造の発現の間に測定された蛍光を表す。１秒当たりのカウント（cps）で表された蛍光をｙ軸に、発光波長をｘ軸にとっている。示されているプロットは、ＥＧＦＰを発現している培地とＥＧＦＰを発現していない培地についての測定の間の差の発光スペクトルである。
図３は、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１（１３．６７kb）を表し、alpha７ニコチン性レセプター（alpha7 SP）のシグナルペプチド、ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ  Ｃ３−１）、及びタキキニンのＮＫ２Ｒレセプター（ＮＫ２Ｒ  ＡＲＮｍ）をコードする配列を含む。
図４ａは、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ及びｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１を発現する懸濁液中のＨＥＫ２９３細胞の励起スペクトル（５４０nmで発光）と発光スペクトル（４５０nmで励起）を表す。１秒当たりのカウント（cps）で表された蛍光をｙ軸に、発光波長をｘ軸にとっている。
破線の曲線は、ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ（細い線）とｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１（太い線）の励起スペクトル（５４０nmで発光）を表す。
実線は、ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ（細い線）とｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１（太い線）の発光スペクトル（４５０nmで励起）を表す。
図４ｂは、レセプターＮＫ２Ｒ−ＷＴ（曲線No.３）、ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１（曲線No.１）及びＮＫ２Ｒ−ＲＦ２（曲線No.２）を発現する細胞の発光スペクトル（４５０nmで励起）を表す。１秒当たりのカウント（cps）で表された蛍光をｙ軸に、発光波長をｘ軸にとっている。
図５ａは、野生型ＮＫ２Ｒレセプターを発現する細胞へのアンタゴニスト3H SR 48968の結合を表す。結合した3H SR 48968の量（１分当たりの崩壊；dpm）をｙ軸に、サンプルに加えられた3H SR 48968の濃度をｘ軸にとっている。灰色と黒の菱形は、２種類の異なる実験における3H SR 48968の合計の結合を表し、灰色の十字と正方形は過剰なニューロキニンＡ（１０μM）の存在下で求めた非特異的結合を表す。線は、リガンドのレセプターへの結合、すなわち非特異的結合部位への結合に関する理論曲線に対応する。求められたアフィニティー値（ＫＤ）は、２つの実験の各々において１．０５nMと０．７８nMである。最大結合値（Ｂ max）は、両方とも２５，０００個の細胞当たり０．１pMolである。
図５ｂは、蛍光性レセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１を発現する細胞へのアンタゴニスト3H SR 48968の結合を表す。結合した3H SR 48968の量（１分当たりの崩壊；dpm）をｙ軸に、サンプルに加えられた3H SR 48968の濃度をｘ軸にとっている。灰色と黒の菱形は２種類の異なる実験における3H SR 48968の合計の結合を表し、灰色の十字と正方形は過剰なニューロキニンＡ（１０μM）の存在下で求めた非特異的結合を表す。線は、リガンドのレセプターへの結合、すなわち非特異的結合部位への結合に関する理論曲線に対応する。求められたアフィニティー値（ＫＤ）は、２つの実験の各々において０．８nMと０．９２nMである。最大結合値（Ｂ max）は、２５，０００個の細胞当たりそれぞれ０．０７５pMolと０．０８８pMolである。
図６ａは、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ  ＷＴを発現する細胞に関する細胞内カルシウム（ＦＵＲＡ  ２）の放出の応答機能性試験を表す。３４０nmで励起を行った５１０nmにおける蛍光（１秒当たりのカウントで表される）をｙ軸に、時間（秒）をｘ軸にとっている。応答はアゴニストニューロキニンＡ（ＮＫＡ）によって引き出され、アンタゴニスト  シクロ（−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）（環状ペプチド）によって阻害される。実験１においては１０nMのＮＫＡを加える。実験２及び３においては、５μMの環状ペプチド（２）、そして１０nMのＮＫＡ（３）を逐次加える。
図６ｂは、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１を発現する細胞に関する細胞内カルシウム（ＦＵＲＡ２）の解離の応答機能性試験を表す。３４０nmで励起を行った５１０nmにおける蛍光（１秒当たりのカウントで表される）をｙ軸に、時間（秒）をｘ軸にとっている。応答はアゴニストニューロキニンＡ（ＮＫＡ）によって引き出され、アンタゴニスト  シクロ（−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）（シクロペプチド）によって阻害される。実験１においては１０nMのＮＫＡを加えた。実験２及び３においては、５μMの環状ペプチド（２）、その後１０nMのＮＫＡ（３）を逐次加えた。
図７は、逆相ＨＰＬＣによるペプチドＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの精製を表す。時間（分）をｘ軸に、ＯＤ（mV）をｙ軸にとっている。検出は２１９nm（破線）と５３０nm（実線）の２つの波長で行った。
同定されたピーク１、２及び３は、それぞれＮＫＡ、ＮＫＡ−Bodipy誘導体、及びBodipy−ＩＡ試薬のピークである。
図８ａは、3H SR 48968のレセプターＮＫ２Ｒ−ＷＴへの結合のＮＫＡ及びＮＫＡ  ＢＯ  Ｉによる置換を表す。放射能（１分当たりの崩壊、dpmで表される）をｙ軸に、リガンドの濃度（Ｍ）をｘ軸にとっている。
黒丸は、3H SR 48968のＮＫＡ  ＢＯ  Ｉ（ＫＩ＝１６．１５nM）による置換に関する実験を表す。
白抜きの正方形は、3H SR 48968のＮＫＡ（ＫＩ＝３．０３nM）による置換に関する実験を表す。
図８ｂは、3H SR 48968のレセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１への結合のＮＫＡ［黒丸（ＫＩ＝２．１nM）］及びＮＫＡ−ＢＯ  Ｉ［白抜きの正方形（ＫＩ＝１６．０８nM）］による置換を表す。放射能（１分当たりの崩壊、dpmで表される）をｙ軸に、リガンドの濃度をｘ軸にとっている。
図９は、平衡時に求めた蛍光性リガンドＮＫＡ−ＢＯ  Ｉと蛍光性レセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１の間のエネルギー移動に関する実験を表す。
実線の曲線は、蛍光性レセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１（４６０nmで励起）を発現（工程１）する細胞の蛍光発光（４９０nmと６００nmの間）を表す。
長い方の破線の曲線は、１００nMのＮＫＡ  ＢＯ  Ｉを添加（工程２）した後の同じ蛍光発光スペクトルを表す。
短い方の破線の曲線は、工程２で１０μMの非蛍光性ＮＫＡを添加した後の蛍光発光スペクトルを表す。１０μMのシクロ（−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、すなわちＳＲ  ４８９６８を添加した後にも同様の結果が得られる。
工程２で、ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの代わりに非蛍光性ＮＫＡを添加しても、蛍光発光スペクトルには何の影響も与えない。これは実線のスペクトルに重なる。
蛍光（cps）をｙ軸に、波長（nm）をｘ軸にとっている。
図１０は、１００nMのＮＫＡ  ＢＯ  ＩとレセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１との間のエネルギー移動（１）と、過剰な非蛍光性リガンド（２０μMのＮＫＡ又はＭＥＮ  １０．３７６又は環状ペプチド）による阻害（２）の実時間測定を表す。時間（秒）をｘ軸に、４６０nmで励起を行った５１０nmにおける蛍光（１秒当たりのカウント）をｙ軸にとっている。
測定は、１０6個細胞／mlの懸濁液を用いて行っている。
図１１ａは、１００nMのＮＫＡ−ＴＲとレセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１との間のエネルギー移動（１）と、過剰な非蛍光性リガンド（１００μMのＮＫＡ又はＭＥＮ  １０．３７６又は環状ペプチド）による阻害（２）の実時間測定を表す。時間（秒）をｘ軸に、４６０nmで励起を行った５１０nmにおける蛍光（１秒当たりのカウント）をｙ軸にとっている。
図１１ｂは、１００nMのＮＫＡ−ＥｏｓとレセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１との間のエネルギー移動（１）と、過剰な非蛍光性リガンド（２０μMのＮＫＡ又はＭＥＮ  １０．３７６又は環状ペプチド）による阻害（２）の実時間測定を表す。時間（秒）をｘ軸に、４７０nmで励起を行った５１０nmにおける蛍光（１秒当たりのカウント）をｙ軸にとっている。
図１２は、レセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１を発現する細胞の懸濁液（１０6個細胞／ml）に加えられたＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの濃度（０〜２５６nM）、及び過剰な非蛍光性リガンド（１０μMのＮＫＡ又はＭＥＮ  １０．３７６又は環状ペプチド）による阻害（Ａ）に対する蛍光シグナルの増幅を表す。時間（秒）をｘ軸に、４５nmで励起を行った５１０nmにおける蛍光（１秒当たりのカウント）をｙ軸にとっている。
図１３は、図１２から得られたデータの処理を表す。ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの濃度（nM）をｘ軸に、任意の単位（A.U.）で表された蛍光シグナルの増幅をｙ軸にとっている。実線はＮＫＡ−ＢＯ  Ｉのその部位への結合に関する理論曲線を表し、アフィニティー値ＫＤは２４nMである。
図１４は、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）の不存在下及び濃度を増加させながら（グラフ上にnMで示される）ＮＫＡを存在させて、ＨＥＫ２９３細胞（１０6個細胞／mlを含有する懸濁液）の表面で発現されたレセプターＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒへの１０nMのＮＫＡ−ＢＯの結合によって生じる５１０nmにおいて測定された蛍光減衰（４６０nmで励起）を表す。１秒当たりのカウント（cps）で測定された蛍光をｙ軸に、時間（秒）をｘ軸にとっている。
図１５は、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）、すなわちＳＲ４８９６８の存在下に行われた図１４に記載されている実験に対応する。ＮＫＡ、すなわちＳＲ４８９６８の不存在下に測定した蛍光増幅に対して正規化した蛍光増幅を、レセプターＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲにおけるＮＫＡ−ＢＯの結合の、ＮＫＡ、すなわちＳＲ４８９６８に対する競争曲線をプロットするために用いられたＮＫＡ、すなわちＳＲ４８９６８の濃度に対してグラフ上にプロットしている。ＮＫＡ−ＢＯの結合を５０％阻害する値の、非蛍光性リガンドのアフィニティーを求め、これは非蛍光性化合物のＩＣ50値に相当する。
図１６は、融合タンパク質ＥＧＦＰ−Ｈｉｎｄ−ＣＣＲ５を発現する細胞（１０6個細胞／ml）の発光スペクトルを表す。励起は４６０nmで行った。１秒当たりのカウント（cps）で表された蛍光をｙ軸に、発光波長（nm）をｘ軸にとっている。
図１７は、ＤＮＡ構造体ＥＧＦＰ−Ｈｉｎｄ−ＣＣＲ５を発現する細胞に関する細胞内カルシウム（ＩＮＤＯ−１）の解離の応答機能性試験を表す。３３５nmで励起を行い、１秒当たりのカウントで表された４０５nmにおける蛍光をｙ軸に、時間（秒）をｘ軸にとっている。１００nMのＲＡＮＴＥＳケモカインによって引き出された応答が示される。
図１８は、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロッティングによる蛍光性ケモカインＥＧＦＰ−ＲＡＮＴＥＳの発現の顕色を表す。非蛍光性タンパク質（トリプシノゲン）、すなわちＥＧＦＰ−ＲＡＮＴＥＳをコードするＤＮＡ構造体を発現する酵母又はその培養上清液を、１２％ポリアクリルアミド変性ゲルに注入した。電気泳動の後、タンパク質はニトロセルロース膜に電気転移し、抗ウサギＧＦＰ第一抗体、そしてルシフェラーゼに結合した抗ウサギ第二抗体を添加することによって、ＧＦＰを含むタンパク質の存在が明らかにされる。このＧＦＰを含んだタンパク質バンドは、Amersham社から購入できるＥＣＬキットを用いた化学発光によって明らかにされる。
この図から、ＤＮＡ構造体ＥＧＦＰ−ＲＡＮＴＥＳ（４２，０００ダルトンバンド）を発現するレーン３及び６（それぞれ酵母培養上清液と酵母）において、ＥＧＦＰ−ＲＡＮＴＥＳの存在が明らかになる。レーン１及び８は、２０、３０、４０及び５０キロダルトンと注釈をつけられた分子量マーカーの移動に対応する。レーン２はコントロールの酵母上清液（トリプシノゲン）に、レーン４はＥＧＦＰ−ＲＡＮＴＥＳ透析沈殿物、レーン５はコントロールの酵母、そしてレーン７はＥＧＦＰのみを発現する酵母に対応する。
実施例
実施例１：ＥＧＦＰとタキキニンのＮＫ２Ｒレセプターのアミノ末端との融合体を含むＤＮＡ構造体
Ｉ）ＥＧＦＰとシグナル・ペプチドとの融合：
以下のようにして、ＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡ（図１）を、アセチルコリン・ニコチン性レセプターをコードするｈｅｎアルファ７サブユニット（Genbank Accession No: X522995）のシグナル・ペプチドをコードする配列と一段階で融合させた。
Amersham社により供給される突然変異導入キットRPN1526（Sculptor）中に提供されている試薬、オリゴヌクレオチド５’ＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ３’、及びClonTech社により供給されるプラスミドｐＥＧＦＰ  Ｃ３（Genbank Accession No: US57607）から調製された一本鎖ｐＥＧＦＰ  Ｃ３を用いて、ＥＧＦＰのコーディングコドン１から９に、エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩの制限部位を導入した。得られた変異型ｐＥＧＦＰＣ３−１を配列決定し、次に２つの断片、ｐＪＬ２２３の５２２５ntフラグメントＢｓｒＧＩ−Ｘｈｏ（Eisele et al.1993, Nature 366: 479-483）とｐＥＧＦＰ  Ｃ３−１の７２５ntフラグメントＢｓｒＧＩ−ＸｈｏＩとの連結により、アルファ７のシグナル・ペプチドと一段階でクローニングした。プラスミドｐＪＬ２２３は、ベクターｐＭＴ３のＮｏｔＩ部位及びＸｈｏＩ部位の間にタンパク質ａ７−Ｖ２０１−５ＨＴ３の遺伝子を含む（Swick, A. G. et al.1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1812-1816）。ｐＭＴ３−ＥＧＦＰ−Ｃ３−ＳＰと名付けられた、得られた構造体を、構造体が正しいことを確認するため、リン酸カルシウムによるトランスフェクション（Cheng and Okayama 1986）の後、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）で一過的に遅れて発現（transiently late expressed）させた。ｐＭＴ３−ＥＧＦＰ−Ｃ３−ＳＰを発現する細胞又は形質転換された細胞の培養上清（centrikon 10 Amiconでの遠心分離により５倍に濃縮）の蛍光発光スペクトル（４５０nmで励起）を記録した。形質転換された細胞及び形質転換されていない細胞のスペクトルの違いを示している図２には、ＥＧＦＰの発光ピークが明確に見られ、このことは、培養培地に分泌されるＥＧＦＰの発現を構造体が実際にもたらしたことを示している。
II）タキキニンのレセプターＮＫ２Ｒの、突然変異導入ベクターＫＳ及び発現ベクターｐＣＥＰ４へのクローニング：
ラットＮＫ２ＲレセプターをコードするｃＤＮＡ（Genbank Accession No:M31838）を含む、プラスミドｐｒＴＫＲ１−１（Pr. S. Nakanishi, Kyoto university, Japan, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 165: 695-702）由来の２９９７ntフラグメントＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）由来の３５４９ntフラグメントＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩと連結させ、プラスミドｐＫＳ  ＮＫ２Ｒを得た。
プラスミドｐｒＴＫＲ１−１由来の１３６９ntフラグメントＮｏｔＩ−ＢｓｒＧＩをｐＫＳ  ＮＫ２Ｒ由来の１６６３ntフラグメントＢｓｒＧＩ−ＸｈｏＩ及びｐＣＥＰ４由来の１０３７０ntフラグメントＮｏｔＩ−ＸｈｏＩと結合し、プラスミドｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒを得た。
III）アルファ７のシグナル・ペプチドとタキキニンＮＫ２Ｒレセプターのアミノ末端の間へのＥＧＦＰの融合
ｐＭＴ３−ＥＧＦＰ  Ｃ３−ＳＰ由来の８１６ntフラグメントＮｏｔＩ−ＸｈｏＩを、ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ由来の１２８５６ntフラグメントＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ（ＸｈｏＩ部分分解）と結合させ、構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１（図３）を得た。
実施例２：タキキニンＮＫ２Ｒレセプターの細胞内ループＩ１及びＩ３へのＧＦＰの融合体を含むＤＮＡの構築
Ｉ）ＮＫ２Ｒレセプターのループｉ１又はｉ３へのＥＧＦＰクローニング部位の導入
以下のオリゴヌクレオチドを用いて１ａ）と同様にして、ｐＫＳ  ＮＫ２Ｒの一本鎖ＤＮＡに突然変異を導入した。
ｉ１：アミノ酸６５と６６の間へのＥＧＦＰの導入が可能となるよう、クローニング部位ＢｓｒＧＩ及びＸｈｏＩのための突然変異を含む、５’ＣＡＣＧＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣ３’
ｉ３：残基２３３と２３４の間、又は２３３と２３８の間へのＥＧＦＰの導入が可能となるよう、クローニング部位ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｈｄＩＩＩのための突然変異を含む、５’ＧＴＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣ３’
得られたプラスミドｐＫＳ  ＮＫ２Ｒ−ｉ１及びｐＫＳ  ＮＫ２Ｒ−ｉ３をコンピテントＸＬ１ブルー細菌（トランスフォーメーション）に導入し、アンピシリン耐性コロニーから単離したプラスミドＤＮＡ試料を、それぞれオリゴヌクレオチドｉ１及びｉ３による突然変異により導入された部位が存在するものをスクリーニングした。
II）タキキニンＮＫ２Ｒレセプターのループｉ１又はｉ３におけるＥＧＦＰのクローニング
−ループｉ１へのクローニング：ｐＫＳ  ＮＫ２Ｒ−ｉ１のフラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｒＧＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩを、ｐＥＧＦＰ
Ｃ３−１の７２５ntフラグメントＢｓｒＧＩ−ＸｈｏＩと結合した。次に、融合タンパク質をコードする３７４１ntインサートを、酵素ＳｐｅＩ及びＳａｌＩで切断し、酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩにより開裂したベクターｐＣＥＰ４と連結させ、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ２を得た。
−ループｉ３へのクローニング：２つの構造体が得られた：
ｐＥＧＦＰ  Ｃ３の７４４ntフラグメントＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩを、ｐＫＳ−ＮＫ２Ｒ−ｉ３のフラグメントＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩと結合し、次に、得られた３７５０ntインサートＳｐｅＩ−ＳａｌＩを、ベクターｐＣＥＰ４のＮｈｅＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にクローニングし、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ３を得た。
ｐＥＧＦＰ  Ｃ３の７５７ntフラグメントＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを、ｐＫＳ−ＮＫ２Ｒ−ｉ３のフラグメントＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩと結合し、次に、このようにして得られた３７７０ntインサートＳｐｅＩ−ＳａｌＩを、ベクターｐＣＥＰ４のＮｈｅＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にクローニングし、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４ ＮＫ２Ｒ−ＲＦ４を得た。
実施例３：組換えタンパク質の発現及び機能的特徴決定
Ｉ）発現
リン酸カルシウムによる調製法（Cheng & Okayama 1987, Mol. Cell. Biol.7: 2745-2752, Current Protocols in Molecular Biology、前掲）により、ＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１、ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ２、ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ３及びｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ４でＨＥＫ２９３細胞を形質転換し、ハイグロマイシン（１００μg/ml、Clontech）に耐性の、形質転換された細胞を選択することにより安定的な系を樹立した。１０％胎児ウシ血清（Seromed）、ペニシリン（１００ユニット／ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）及びグルタミン（４mM）を追加したＭＥＭ培地（Gibco）中、１００μg/mlハイグロマイシンの存在下で、細胞を培養した（Method in enzymology, Vol LVIII, 1979）。
ＩＩ）組換えレセプターの発現及び結合特性の測定：
ａ）蛍光測定により：
蛍光実験は、４５０Wキセノン・ランプ（Osram）及びSpex 1680 ０．２２mモノクロメーター（励起）及びSpex 1681 ０．２２mモノクロメーター（発光）を装備したFluorolog分光蛍光計（ＳＰＥＸ）内に置かれた、磁気攪拌装置を備えた１mlのタンク内で行った。細胞又は膜断片を生理学的緩衝液：１０mMヘペス、１３７．５mM ＮａＣｌ、１．２５mM ＭｇＣｌ2、１．２５mM ＣａＣｌ2、６mM ＫＣｌ、５．６mMグルコース、０．４mM ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％（w/v）ＢＳＡ、pH７．４に懸濁させた。
Versene（ＰＢＳ、５mM ＥＤＴＡ）による処理の後、全細胞を収集し、１０００ｇで５分間遠心分離し、２５０，０００〜１，０００，０００個／mlの濃度で生理学的緩衝液に再懸濁させた。
図４ａは、構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＷＴ及びｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１で形質転換された細胞で記録された励起スペクトル及び発光スペクトルを示している。スペクトルは、ＥＧＦＰのシグナルを明確に示しており、これらの構造体がＨＥＫ２９３細胞により実際に発現されていることを示している。図４ｂは、野生型レセプター、並びに融合体ＲＦ１及びＲＦ２を発現している細胞の蛍光発光スペクトルを示している。
ｂ）結合実験により：
ＰＢＳ中の０．１nM125Ｉ NKA又は１nM3H SR ４８９６８の、懸濁液中の全細胞（２００〜５００，０００個／ml、２５０μl/l試験）への結合により、細胞表面のニューロキニン結合部位の出現を決定した。室温で３０分間のインキュベーションの後、ＰＢＳ（２．７mM ＫＣｌ、１．４７mM ＫＨ2ＰＯ4、０．１３７mM ＮａＣｌ、８．０６mM Ｎａ2ＨＰＯ4）中の１％粉乳で前処理されたＧＦ／Ｃフィルター（Whatmann）で試料を濾過し、ＰＢＳ（４ml）で２回洗浄し、次にシンチレーションカクテル中で計数した。
3HSR 48 968の結合の飽和曲線を、最終濃度１μMのＮＫＡの存在下又は非存在下で、４℃で１時間３０分間、１０mMヘペス、１３７．５mM ＮａＣｌ、１．２５mM ＭｇＣｌ2、１．２５mM ＣａＣｌ2、６mM ＫＣｌ、５．６mMグルコース、０．４mM ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％（w/v）ＢＳＡ、pH７．４中で行った。各５００μｌの試料は２５，０００個の細胞を含み、結合したリガンドの画分は各チューブに添加された量の１０％未満であった。インキュベーションの最後に、前述のようにして濾過を行った。図５ａ及び５ｂは、それぞれ、野生型レセプター（ＮＫ２Ｒ  ＷＴ）又はＥＧＦＰとのＮ末端融合体（ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１）を発現している細胞において、リガンド3HSR 48968の濃度を増加させるに伴って得られた結合曲線（dpm単位の結合）を示している。リガンドは、２つのレセプターに対して同一の親和性を示し、細胞表面に発現した結合部位の数はほぼ同等であった。
III）機能的試験：
Ｉ）ＦＵＲＡ２を用いたサイトゾル中のカルシウムの測定：
ＤＭＳＯに溶解した蛍光カルシウム・キレート形成剤、ＦＵＲＡ２アセチルメチルエスチル（Molecular Probes）を、１０mMヘペス、１３７．５mM ＮａＣｌ、１．２５mM ＭｇＣｌ2、１．２５mM ＣａＣｌ2、６mM ＫＣｌ、５．６mMグルコース、０．４mM ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％（w/v）ＢＳＡ、pH７．４緩衝液で３μMの濃度に希釈した。細胞培養培地を吸引し、次に７〜１０mlのＦＵＲＡ２  ＡＭ溶液と交換した。細胞を４５分間ＣＯ2インキュベーター内に置いた。次に、培地を吸引し、ＦＵＲＡを含まないヘペス緩衝液と交換し、細胞をさらに１５分間ＣＯ2インキュベーター内に置いた。緩衝液を吸引し、次に、５分間５mM ＥＤＴＡ、ＰＢＳ溶液によって、細胞をディッシュから剥離した後に、細胞を回収した。１０００×ｇで５分間の遠心分離の後、得られた細胞ペレットを１×１０6個／mlの割合でヘペス緩衝液に再懸濁させた。
磁気攪拌棒を含む分光蛍光測定タンク内で、３７℃で、カルシウム放出測定を行った。励起波長は３４０nmに設定し、発光波長は５１０nmに設定した。
図６は、野生型レセプターをコードする構造体で形質転換された細胞（６ａ）及び構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１で形質転換された細胞（６ｂ）の刺激中に得られた結果を示している。ニューロキニンＡで引き起こされた反応は、特異的ＮＫ２ＲアゴニストＳＲ４８９６８（Sanofi recherche）、MEN10,376（Bachem）又はシクロペプチド、シクロ（−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）（Bachem）により阻害された。ニューロキニンＡは、形質転換されていないＨＥＫ２９３細胞においては反応を引き起こさなかった。
膜断片の調製；
膜断片は、プロテアーゼ阻害剤の混合物の存在下、４℃で、組織ホモジナイザー（Potter又はUltra-Turrax）を用いて細胞をホモジナイズすることにより調製した。細胞を、１０００×Ｇで５分間遠心分離し、次にプロテアーゼ阻害剤カクテルComplete（Boehringer）を含む膜調製緩衝液：５０mMトリス塩酸、１mM ＥＤＴＡ−Ｎａ、１０mM ＤＴＴに再懸濁させた。４℃でPotterホモジナイザーを用いて懸濁液をホモジナイズした。３０００×Ｇで１０分間の遠心分離の後、上清を回収し、ペレットを上記緩衝液に溶解させ、再びホモジナイズし、１５０，０００×ｇで３０分間再遠心分離した。得られたペレットを６〜１０mgタンパク質／mlの濃度で膜調製緩衝液に再懸濁させた。
実施例４：蛍光リガンドの調製
Ｉ）蛍光ニューロキニンＡの調製：
ａ）Bodipy 530/560グループ：
凍結乾燥したＮＫＡを最終濃度１０mMでＤＭＦに溶解させた。
この溶液（５０μモル、５０μL）５０μLに、１０μmolのＮＥｔ3（ＣＨ3ＣＮ中２００mM）、すなわち１００μLを添加し、その後、１０μL当たり０．３μモルの割合でＤＭＦに溶解したBODIPY 530/550 IA［Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ’−ヨードアセチル−エチレンジアミン］を添加した。混合物をボルテックスで攪拌し、次に室温で放置した。２４時間後、１ml／分の流速で６０分間で溶媒Ｂを１０〜９５％にする直線勾配（Ａ：Ｈ2Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：ＣＨ3ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ）で展開されたZ5C8 25F逆相カラム（Zorbax）でのＨＰＬＣ（Gilson）により反応生成物を精製した。検出波長は、２１９nm（ペプチド）及び５３０nm（発蛍光団（fluorophore））に設定した。３４分で溶出した生成物（ＮＫＡ ＢＯ Ｉ）（図７）を回収し、減圧により濃縮し、ＤＭＦに再懸濁させた。
ｂ）クマリン類及びエオシン類：
クマリン誘導体（７−ジエチルアミノ−３−（（４’−（ヨードアセチル）アミノ）フェニル）−４−メチルクマリン）及びエオシン誘導体（エオシン−５−ヨードアセトアミド）でニューロキニンＡを標識するために用いられた反応条件は、ａ）と同一である。精製は、１ml／分の流速で６０分間で溶媒Ｂを１０〜９５％にする直線勾配（Ａ：Ｈ2Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：ＣＨ3ＣＮ ０．１％ＴＦＡ）で展開されたZ5C8 25F逆相カラム（Zorbax）で行った。ＮＫＡのクマリン誘導体（ＮＫＡ−Ｃｏｕｍ）は時間２５分に溶出し、ＮＫＡのエオシン誘導体（ＮＫＡ−Ｅｏｓ）は時間２７分に溶出した。
ｃ）スルフォロダミン１０１類：
試薬は、スルフォロダミン１０１塩酸（sulforhodamine 101 acid chloride）（Aldrich又はMolecular Probesより販売されているTexas Red）を用いた。プロトコルは、BODIPY 530/550 IAのグラフト化のプロトコルと同一であった。精製は、１ml／分の流速で６０分間で溶媒Ｂを１０〜９５％にする直線勾配（Ａ：Ｈ2Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：ＣＨ3ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ）で展開されたZ5C8 25F逆相カラム（Zorbax）でのＨＰＬＣ（Gilson）により行った。検出波長は、２１９nm（ペプチド）及び５９０nm（発光蛍光団）に設定した。時間４０〜４１分に溶出した生成物（ＮＫＡ ＴＲ）（図７）を回収し、減圧により濃縮し、ＤＭＦに再懸濁させた。
実施例５：蛍光ＮＫ２Ｒレセプターとその蛍光リガンドの間の相互作用の検出
Ｉ）放射性リガンドの置換（競合実験）により：
非放射性リガンドによる3HSR 48968の結合の置換に関する曲線を、最終濃度１μMのＮＫＡの存在下又は非存在下で、４℃で１時間３０分間、１０mMヘペス、１３７．５mM ＮａＣｌ、１．２５mM ＭｇＣｌ2、１．２５mM ＣａＣｌ2、６mM ＫＣｌ、５．６mMグルコース、０．４mM ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％（w/v）ＢＳＡ、pH７．４緩衝液中で行った。各５００μｌの試料は２５，０００個の細胞、１nMの3HSR 48968及び様々な濃度（１nM〜１０μMまで）の非放射性リガンドを含んでいた。インキュベーションは４℃で１時間行った。インキュベーションの最後に、３ｂ）に記載したとおりに、濾過を行った。
図８は、それぞれ、野生型ＮＫ２Ｒレセプター（構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ、図８Ａ）又はＮＫ２ＲレセプターのＮ末端におけるＥＧＦＰの融合体（構造体ｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１、図８ｂ）を発現するＨＥＫ２９３細胞における、ニューロキニン（ＮＫＡ）及びＮＫＡ  ＢＯ  Ｉによる放射性リガンド3HSR 48968の置換に関する曲線を示している。点は、様々な濃度のＮＫＡ又はＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの存在下における結合放射活性（dpm単位）を表す。これらの曲線から導出された親和性値は、ＮＫＡが（ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉと全く同様に）同一の親和性で野生型レセプター及び蛍光化されたレセプターに結合することを示している。親和性値は、ＮＫＡについては、ＫＩ＝野生型レセプターで３nM、蛍光レセプターで２．１nM、ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉについては、ＫＩ＝野生型レセプターで１６nM、蛍光レセプターで１６nMであった。アンタゴニストMEN10.376を用いて行われた同一の測定は、ＫＩ＝野生型レセプターで５３nM、蛍光レセプターで６１nMという親和性値を与えた。
II）エネルギー移動により：
ａ）平衡時のＮＫＡ  ＢＯ  ＩとＮＫ２Ｒ−ＲＦ１レセプターの間の相互作用：
ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１を発現しているHEK293細胞を、１，０００，０００個／mlの濃度でヘペス生理学的緩衝液（１０mMヘペス、１３７．５mM ＮａＣｌ、１．２５mM ＭｇＣｌ2、１．２５mM ＣａＣｌ2、６mM ＫＣｌ、５．６mMグルコース、０．４mM ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％（w/v）ＢＳＡ、pH７．４）に懸濁させた。次に、１００，０００〜１，０００，０００個／mlの範囲であり得る濃度で、細胞を蛍光タンク内に置いた。これらの細胞の発光スペクトルを４９０nmと６００nmの間で記録し（４６０nmで励起）、次に最終濃度１００nMでＮＫＡ  ＢＯ  Ｉを添加した。溶液の発光スペクトルを再び記録した。次に、ＮＫ２Ｒレセプター（非標識ＮＫＡ）又はＳＲ４８９６８（Sanofi Recherche）又は環状ペプチド、シクロ（−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）に特異的な過剰（１〜１０μM）の非標識リガンドを添加し、溶液の発光スペクトルを再び記録した。図９は、重ね合わされた３つのスペクトルを示しており、ここで、ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの添加中のＥＧＦＰの蛍光（５１０nmでピーク）の消光及びその後の非標識リガンドの添加中の初期蛍光への回復が明確に検出された。蛍光リガンドの添加中の５５０〜５６０nmにおけるピークの出現及び非標識リガンドの添加中のその強度の減少も検出された。これらの結果は、蛍光レセプターとその蛍光リガンドの間のエネルギー移動の発生を示している。リガンドとそのレセプターの間の相互作用を阻害することができる薬理学的試薬の添加によるシグナルは可逆的であった。蛍光レセプターＮＫ２Ｒ−ＲＦ１を発現している細胞への非蛍光ＮＫＡの添加は、蛍光発光スペクトルに影響を与えなかった。
ｂ）ＮＫＡ  ＢＯ  ＩとＮＫ２Ｒ−ＲＦ１の間のリアルタイムの相互作用：
リアルタイムで同一の記録をすることができた。このため、励起波長は４６０nmに設定し、発光波長は５１０nmに設定した。細胞懸濁液へのＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの添加は、５１０nmにおける蛍光強度の減少を伴い、その後の過剰の非標識リガンドの添加はその初期値へ蛍光を回復させた（図１０を参照）。蛍光リガンドの吸光がシグナルに寄与する場合、最終的な蛍光強度の値は、初期値よりも高くなりうる。これは細胞濃度が５×１０5〜１×１０6個／ml程度である場合において、２００nMを超える濃度のＮＫＡ  ＢＯで観察された。最後に、０時点における非蛍光ＮＫＡの添加は、５１０nmで測定されたシグナルの強度に影響を与えなかった。
ｃ）ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１レセプターとリガンドＮＫＡ  ＴＲ及びＮＫＡ  Ｅｏｓの間の相互作用の検出：
ＮＫＡ  ＴＲ（図１１ａ）又はＮＫＡ  Ｅｏｓ（図１１ｂ）を用いた、ａ）に記載された実験の再現は、ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１レセプター−蛍光リガンド相互作用シグナルの検出がＥＧＦＰ−ＢＯＤＩＰＹの組合せに限定されず、ＥＧＦＰ−スルフォロダミン１０１の組合せ又はＥＧＦＰ−エオシンの組合せにも拡張されうることを示した。
ｄ）ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉのそのレセプター部位への結合の飽和の実験：
８ｂの記載に従い記録されたシグナルの増幅（図１２）が、添加されたＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの濃度に比例するのであれば、特異的シグナルの増幅は、添加されたリガンドの濃度の関数として測定されうる。図１２ａは、ヘペス生理学的緩衝液中１０6個／mlの濃度の細胞懸濁液１mlへ１０-5Mストック溶液の一部を連続的に添加することにより、ＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの濃度が０〜２５６nMにわたる場合の、シグナルの増幅の変動を示している。実験データ（図１２ｂ）の処理により、実施例５、Ｉ）に記載の放射性リガンドを置換することにより行われた測定と非常によく一致しているＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの親和性値（ＫＤ＝２０〜３０nM）を導き出すことができた。
ｅ）競合実験：
実施例３の、膜断片の調製に関する部分に記載の方法に従い調製されたＮＫ２Ｒ−ＲＦ１レセプターを含む膜断片を、２０μLの膜／mlの割合で、ヘペス緩衝液（１０mMヘペス、１３７．５mM ＮａＣｌ、１．２５mM ＭｇＣｌ2、１．２５mM ＣａＣｌ2、６mM ＫＣｌ、５．６mMグルコース、０．４mM ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％（w/v）ＢＳＡ、pH７．４）で希釈した。膜の一部を、様々な濃度の、ＮＫＡ、ＭＥＮ１０．３７６、シクロ（−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）又はＳＲ４８９６８の存在下でインキュベートした。３０分間のインキュベーションの後、試料を分光蛍光タンク内に置き、励起波長を４７０nmに設定し、２５nMのＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの添加により生成したシグナルを、５１０nmで１２０秒間記録した。ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１レセプターとそのリガンドＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの間の相互作用により引き起こされるシグナルの増幅は、蛍光リガンドに到達可能な結合部位の数に比例するため、非蛍光リガンドによるＮＫＡ  ＢＯ  Ｉの置換の曲線を確立することができた。
この方法は、ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１レセプター、リガンドＮＫＡ  ＢＯ  Ｉ及び非標識リガンドを含む膜断片の同時混合により、行うことも可能である。次に、励起波長を４７０nmに設定し、混合物を結合平衡に達するのに必要な時間（３０〜６０分間）インキュベートし、５１０nmにおける蛍光を測定する。２５０，０００〜１，０００，０００個／mlの濃度の全細胞で同実験を行うこともできる。
図１４は、５１０nmで測定された蛍光シグナル（４６０nmで励起）の増幅が、試験中に存在する非蛍光分子の濃度が増加するときに減少することを示している。ＮＫＡ  Ｂｏ  Ｉの結合の阻害に関する曲線によって、非蛍光ニューロキニンＡ及びＳＲ４８９６８分子の親和性を推定することができる。
図１５は、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）すなわちＳＲ４８９６８の存在下で行われた、図１４に記載された実験に相当する。
実施例６：ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１  ＣＤＮＡのベクターＰＲＩＣ９へのクローニング及び酵母ＰＩＣＨＩＡ  ＰＡＳＴＯＲＩＳにおける発現
ａ）クローニング：
１）シグナル・ペプチドを除く融合タンパク質ＮＦ２Ｒ−ＥＧＦＰの全部をコードする１８６８ntフラグメントの生成、及び２）遺伝子ＡＯＸ１のプロモーター因子アルファのシグナル・ペプチドをコードする配列との酵母ｐＰＩＣ９の発現ベクター（Invitrogen）への同時期クローニングを可能にする、プライマー５’ＧＧＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ３’及び５’ＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴ３’を用いたＰＣＲ（Current Protocols in Molecular Biology、前掲）により、融合タンパク質をコードするｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１の一部を増幅した。用いられたクローニング部位は、それぞれ、増幅産物の５’末端に対してはＸｈｏＩ及びその３’末端に対してはＮｏｔＩであった。
ｂ）発現：
直鎖化されたｐＰＩＣ９−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１プラスミド（ＳｔｕＩ又はＳａｌＩ）で酵母を形質転換し、ベクターｐＰＩＣ９（inVitrogen）と共に供給されたマニュアルの指示に従って調製されたヒスチジンを含まないＭＤ培養培地で培養した。細胞に導入されたＤＮＡ構造体の発現を、メタノールで誘導した。
そのために、コロニーを液体培地（ＢＭＧＹ）中で２４時間増殖させ、次に、０．５％メタノールを含むＢＭＭＹ培地に移し、ＤＮＡ構造体ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１の発現の誘導を可能にした。これらの培養物の一部を吸引し、ＥＧＦＰの励起スペクトル及び発光スペクトルを測定することにより、蛍光タンパク質を発現しているクローンを同定した。
例７：ＥＧＦＰと融合したムスカリン性アセチルコリンレセプターをコードしているＤＮＡの構築と哺乳類細胞中での発現
Ｉ）クローニング：ヒトムスカリン性Ｍ１レセプター（Genbank Accession No X15263）をコードしているｃＤＮＡフラグメントを、プライマー：
0004084425.tif 000005
を用いてＰＣＲで増幅した。
得られた１３８３ntフラグメントを酵素ＮｏｔＩ（５’末端）及びＸｈｏＩ（３’末端）で処理し、同一の酵素で開裂したＫＳベクターに結合して構造体ＫＳ−ｈＭ１を生じ、又は同一の酵素で開裂したベクターｐＣＥＰ４に結合して構造体ｐＣＥＰ４−ｈＭ１を生じた。
構造体ＫＳ−ｈＭ１は一本鎖ＤＮＡ（Current Protocols in Molecular Biology, op. cit.）の作成及び突然変異体の作成に用いた。
II）ＥＧＦＰのｈＭ１レセプターＮ末端への融合
オリゴヌクレオチド５’ＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＣ３’を、Sculptor mutagenesisキット（Amersham）の試薬類と共に用いて、酵素ＢｇｌＩＩの制限部位を導入することにより、ｈＭ１レセプターをコードしている配列の位置Ｉ３への融合を可能とする突然変異体を作成した。
得られた突然変異体は酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化し、生成した１３５４nｔフラグメントはｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＲＦ１の８１２ntＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント、及び酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで開裂したベクターｐＣＥＰ４と結合してＤＮＡ構造物ｐＣＥＰ４−ｈＭ１−ＲＦ１を得た。
III）融合タンパク質及びｈＭ１−ＲＦ１の発現
プラスミドｐＣＥＰ４−ｈＭ１−ＲＦ１はリン酸カルシウムでのトランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞へ、又は、エレクトロポレーション（Current Protocols in Molecular Biology, op.cit.）によりＣｏｓ１細胞に導入した。
タンパク質の発現は上述したとおりに検出した。
IV）ムスカリン性のリガンドＡＢＴ−Bodipyの合成及び精製
塩基ＡＢＴ（３−［２’−アミノベンズヒドリロキシ］トロパン）をＤＭＦ（１０mM）に溶解した。この溶液２０μl（０．２μMol）をBodipy−ＩＡの１００mM溶液４μlと混合し、室温で２０時間放置した。反応産物は溶媒Ｂの１０〜９５％の線形勾配を６０分以上（Ａ：Ｈ2Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：ＣＨ3ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ）流速１ml/minで展開したZ5C8 25F逆相カラム（Zorbax）でＨＰＬＣ（Gilson）によって精製した。検出波長は２１９nm（ペプチド）及び５３０nm（発蛍光団）にセットした。時間３４分（図７）に溶離した産物（ＡＢＴ  Ｂｏ）を収集し、減圧によって濃縮してＤＭＦに再懸濁した。
Ｖ）ｈＭ１レセプターのＮ末端へのＥＹＦＰの融合及びpirenzepine-bodipy558/568との相互作用の検出。
この構造体はポイントIIに記述した構造体を作成したのと同一の方法で作成した。
融合タンパク質とそのリガンドの相互作用は蛍光基がbodipy 558/568（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）に符合しているpirenzepine-bodipyを用いてもたらされる。
例８：蛍光ニコチン性レセプターをコードしているＤＮＡ構造体
ａ）ａ７−Ｖ２０１−５ＨＴ3レセプターのＭＩＲ部位へのＥＧＦＰの融合をコードしているＤＮＡ構造体
プラスミドｐＪＬ２２３（Eisele et al. 1993, Nature 366: 479-483）は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において発現する際にアセチルコリン及びニコチンにより活性化されるレセプターチャンネルを形成するタンパク質ａ７−Ｖ２０１−５ＨＴ3の遺伝子を含む。コードしているｃＤＮＡはベクターｐＭＴ３のＮｏｔＩ部位とＸｈｏＩ部位の間である（Swick, A.G. et al. 1992, Proc. Natl. Acad.Sci. 89: 1812-1816）
１４２４nt ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩインサートはBluescriptベクターのＮｏｔＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にクローン化され、得られたプラスミド（KS 233）は一本鎖ＤＮＡを生産する基質として役立った。
オリゴヌクレオチド５’ＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧ３’を用い、酵素ＢｓｒｇＩ、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩの制限部位を、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ３によりもたらされるのと同一の部位と同じ状態でＫＳ２２３に導入した。突然変異はＭＩＲ（Major Immunogenic Region, Barkas et al. 1987, Science, 235: 77-80）として知られているレセプター領域のアミノ酸６３と６４の間に導入された。
このＫＳ２２３の突然変異体のフラグメントＮｏｔＩ−ＢｓｒＧＩ（２６７nt）及びＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ（１１４７nt）をｐＥＧＦＰ−Ｃ３のフラグメントＢｓｒＧＩ−ＢｇｌＩＩ（７２１nt）、及び酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで開裂したベクターｐＣＥＰ４と結合してＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−２２３−ＲＦ１を得た。
このＫＳ２２３の突然変異体のフラグメントＮｏｔＩ−ＢｓｒＧＩ（２６７nt）及びＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（１１３８nt）をｐＥＧＦＰ−Ｃ３のフラグメントＢｓｒＧＩ−ＢａｍＨＩ（７７２nt）、及び酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで開裂したベクターｐＣＥＰ４と結合してＤＮＡ構造体ｐＣＥＰ４−２２３−ＲＦ２を得た。
ｂ）レセプターα７−Ｖ２０１−５ＨＴ3の細胞質部位におけるＥＧＦＰの融合をコードしているＤＮＡの構築
タンパク質α７−Ｖ２０１−５ＨＴ3をコードしているｃＤＮＡは細胞質領域に、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ２（ClonTech）のＮｈｅＩ及びＰｓｔＩにより消化される配列とそれぞれ位相が同じで結合力がある、ＡｖｒＩＩ及びＰｓｔＩ部位の配列を含み、タンパク質α７−Ｖ２０１−５ＨＴ3の細胞質領域においてＥＧＦＰの配列を含む融合タンパク質を生産することができる。
この融合タンパク質をコードしているＤＮＡ構造体は、このようにＫＳ２３３のフラグメントＮｏｔＩ−ＡｖｒＩＩ（１０３６nt）及びＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ（２８６nt）をｐＥＧＦＰ−Ｃ２のフラグメントＮｈｅＩ−ＰｓｔＩ（７７４nt）、及び構造体ｐＣＥＰ４−２２３−ＲＦ３を供給するために酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで開裂したベクターｐＣＥＰ４と結合して得た。
構造体ｐＣＥＰ４−２２３−ＲＦ１、−ＲＦ２、及び−ＲＦ３は、上述したとおりＨＥＫ２９３細胞中で発現された。
例９：蛍光ケモカインレセプターをコードしているＤＮＡ構造体
ヒトケモカインレセプターＣＣＲ５（Genbank access No:U54994）をオリゴヌクレオチド
0004084425.tif 000006
を用いて増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＶで開裂したベクターBluescript KSにクローン化した。
ＥＧＦＰ又はＥＣＦＰをコードしているｃＤＮＡと同じ状態でクローン化するため、インサートは酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＢａｍＨＩ（５’）及びＸｈｏＩ（３’）で摘出した（フラグメント１）。
プラスミドｐＪＬ２２３（例１）のシグナルペプチドと一緒のＥＧＦＰ又はＥＣＦＰとレセプターＣＣＲ５をコードする遺伝子の同期融合は以下の方法でなされた。プラスミドｐＪＬ２２３を制限酵素ＡｇｅＩで開裂し、Klenowフラグメント及びヌクレオチドと混合して平滑末端にした。次に、ＸｈｏＩ部位までにわたるフラグメントを排除した（ＸｈｏＩで消化）（フラグメント２）
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ３及びｐＥＣＦＰ−Ｃ３を酵素ＡｇｅＩで開き、平滑末端にした。ＡｇｅＩ平滑−ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｇｅＩ平滑−ＸｈｏＩ（フラグメント３）をフラグメント１及び２と結合して構造体ＫＳ−ＳＰ  ＥＧＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＣＲ５、ＫＳ−ＳＰ  ＥＧＦＰ−ＸｈｏＩ−ＣＣＲ５、ＫＳ−ＳＰ  ＥＣＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＣＲ５及びＫＳ−ＳＰ  ＥＣＦＰ−ＸｈｏＩ−ＣＣＲ５を生じさせた。配列ＳＰ  ＥＧＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＣＲ５、ＳＰ  ＥＧＦＰ−ＸｈｏＩ−ＣＣＲ５、ＳＰ  ＥＣＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＣＲ５及びＳＰ  ＥＣＦＰ−ＸｈｏＩ−ＣＣＲ５に対応するｃＤＮＡをＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで摘出し、同じ酵素で開裂したベクターｐＣＥＰ４にクローン化した。
図１６は、レセプターＥＧＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＣＲ５を発現している、感染したＨＥＫ２９３細胞の発光スペクトルを表し、図１７はＤＮＡ構造体ＥＧＦＰ−ＨｉｎｄＣＣＲ５が発現している細胞における、細胞内カルシウム解離反応を表す。
例１０：蛍光ヒトケモカインＲＡＮＴＥＳをコードしているＤＮＡ構造体
ヒトケモカインＲＡＮＴＥＳ（Genbank access number M21121）をコードしているｃＤＮＡはオリゴヌクレオチド
0004084425.tif 000007
を用いて、Prodromou & Pearl, Protein Engineering Vol 5, pp 827-829, 1992に記載されたプロトコルにしたがって、繰り返しＰＣＲで合成し、ＥｃｏＲＶで開裂したベクターBluescript KSにクローン化した。
ＲＡＮＴＥＳケモカイン（フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ又はＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ）及び黄色蛍光タンパク質（プラスミドｐＥＹＦＰ−Ｃ３のＡｇｅＩ平滑−ＢａｍＨＩ又はＡｇｅＩ平滑−ＨｉｎＤＩＩＩフラグメント）をコードしているＤＮＡは、それぞれベクターｐＰＩＣ９の部位ＳｎａＢＩとＮｏｔＩの間の酵母のα成熟因子のシグナルペプチドと同じ位相にクローン化し、構造体ｐＰＩＣ９−ＥＹＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＡＮＴＥＳ及びｐＰＩＣ９ＥＹＦＰ−ＢａｍＨＩ−ＲＡＮＴＥＳを得た。
図１８はプラスミドｐＰＩＣ９−ＥＹＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＡＮＴＥＳで形質転換し、対ＧＦＰ抗体を用いて検出したpichia pastorisの培養上清における構造体ＥＹＦＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＡＮＴＥＳの発現を明らかにする免疫ブロットを表す。
例１１：孤児レセプターに対する新規なリガンドの同定
１）ＥＧＦＰとタキキニンＮＫ２Ｒレセプターのカルボキシ末端との融合
プラスミドｐＫＳ  ＮＫ２Ｒ（例１）に含まれる、ＮＫ２ＲレセプターをコードするｃＤＮＡを酵素ＡｇｅＩで消化した。得られた、突出している５’末端をヌクレオチド及びKlenowポリメラーゼにより平滑にした。直線化したＤＮＡを酵素ＮｏｔＩで消化し、１０４５ntフラグメントを作成した（フラグメントａ）。
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ３を酵素ＡｇｅＩで開裂し、平滑化した。次にそれを酵素ＸｈｏＩで消化して７３９ntフラグメント、ｂを得た。
フラグメントａ及びｂを酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで開裂したベクターｐＣＥＰ４と結合してプラスミドｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＡｇｅＩ−ＥＧＦＰを得た。
２）蛍光タンパク質ＥＹＦＰと、マウスタンパク質Ｇｑのαサブユニットのアミノ末端との融合
マウスタンパク質Ｇｑ（Genbank Accession No M55412）のαサブユニットをコードしているｃＤＮＡをオリゴヌクレオチド
0004084425.tif 000008
で増幅し、タンパク質Ｇｑのαサブユニットをコードしている遺伝子の５’末端にＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ部位、及び３’末端にＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位を導入した。
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶで開裂したベクターＫＳにクローン化した。
αサブユニットＧｑをコードしているｃＤＮＡは酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで摘出し、酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで開裂したプラスミドｐＹＥＦＰ−Ｃ３に結合し、プラスミドｐＥＹＦＰ−ＢｇｌＩＩ−Ｇｑを得た。
３）レセプターＮＫ２Ｒ−ＡｇｅＩ−ＥＧＦＰとタンパク質ＥＹＦＰ−ＢｇｌＩＩ−Ｇｑの共発現
ＨＥＫ２９３細胞にプラスミドｐＥＹＦＰ−ＢｇｌＩＩ−Ｇｑ又はｐＣＥＰ４−ＮＫ２Ｒ−ＡｇｅＩ−ＥＧＦＰ、及びｐＥＹＦＰ−ＢｇｌＩＩ−Ｇｑを移入した。プラスミドｐＣＥＰ４の遺伝子の産物を発現した細胞は抗生物質ハイグロマイシンＢを用いて選択し、修飾されたプラスミドｐＥＧＦＰの遺伝子産物を発現した細胞はネオマイシンを用いて選択した。
４）蛍光タンパク質Ｇｑの機能性試験
これらはカルシウムの解離の機能性研究によってもたらされた。Ｇタンパク質の過発現はカルシウム応答の大きさの増加を伴う。
５）安定してタンパク質Ｇｑを発現している細胞は孤児レセプターをコードする発現プラスミドを用いて移入した。分子の効果は細胞懸濁液を３５５nmで励起させながら、４０５nmの蛍光で測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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