(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スライドガラスに固定された標本上に採取用キャップを載置し、該採取用キャップにレーザ光を照射することで、前記標本中の目的物を前記採取用キャップに接着させて採取するマイクロダイセクション装置において、
前記スライドガラスを前記レーザ光の照射領域に移動する電動ステージと、
前記レーザ光の照射領域に設置された前記スライドガラス上の標本中で確認された目的物に対して前記レーザ光の照射領域を設定するレーザ照射領域設定手段とを具備し、
前記レーザ照射領域設定手段は、第１のスライドガラスに固定された標本中の目的物に対して設定されたレーザ照射領域に、第２のスライドガラスに固定された標本中の目的物の観察像を重ね合わせて表示し、この結果に応じて該第２のスライドガラス上の目的物のレーザ照射領域を設定することを特徴とするマイクロダイセクション装置。
【請求項２】
前記電動ステージ上に設けられ、前記レーザ光の照射領域での前記スライドガラスの設置位置を調整する設置位置調整手段をさらに備えることを特徴とする請求項１記載のマイクロダイセクション装置。
【請求項３】
設置位置調整手段は、前記電動ステージ上でさらに前記スライドガラスを回転方向に調整する回転調整手段と、前記スライドガラスを直交する２方向に移動調整する移動調整手段の少なくとも一つを有することを特徴とする請求項２記載のマイクロダイセクション装置。
【請求項４】
レーザ照射領域設定手段は、前記目的物の観察像をドラックアンドドロップにより既設定された目的物のレーザ照射領域に重なるように移動させ、該目的物のレーザ照射領域を設定可能にしたことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のマイクロダイセクション装置。
【請求項５】
スライドガラスに固定された標本中の目的物をレーザ光を用いて採取するマイクロダイセクション装置において、
前記スライドガラスを載置し、前記レーザ光の前記標本への照射位置を移動する電動ステージと、
前記スライドガラスに固定された標本中の目的物に対して前記レーザ光の照射位置を設定するレーザ照射位置設定手段とを有し、
前記レーザ照射位置設定手段は、第１のスライドガラスに固定された標本中の目的物に対して設定されたレーザ照射位置に、第２のスライドガラスに固定された標本中の目的物の観察像を重ね合わせて表示し、この結果に応じて該第２のスライドガラス上の目的物のレーザ照射位置を設定することを特徴とするマイクロダイセクション装置。
【請求項６】
前記レーザ照射領域設定手段は、レーザ照射位置として前記目的物の輪郭形状を設定することを特徴とする請求項５記載のマイクロダイセクション装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織標本から単一細胞やＤＮＡを取り出すために用いられるマイクロダイセクション装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、遺伝子などの研究分野では、正常細胞や癌などの発達段階にある異常細胞が混在した組織標本から目的とする細胞を取り出すための技術が極めて重要になっている。
【０００３】
ところが、細胞を取り出すための技術は、単調な作業にかかわらず時間がかかり、しかも熟練を要するものとなっており、このため分子レベルの分析を目的とする細胞を簡単に取り出すためのものとして、特表２００１−５２６７９５号公報に開示されるようなマイクロダイセクション装置が提案されている。
【０００４】
この装置は、レーザ捕捉式のマイクロダイセクション装置であり、倒立型光学顕微鏡をベースにして、組織標本の目的部分を採取する採取用キャップを保持して搬送するキャップ搬送部およびレーザ照射部が設けられている。キャップ搬送部は、倒立型光学顕微鏡のステージ上に回転および上下動可能に設けられたアームを有しており、このアーム先端部に採取用キャップが保持可能となっている。
【０００５】
このようなマイクロダイセクション装置を用いて組織標本の目的とする細胞を採取するには、まず、ステージ中央部に、組織標本が固定されたスライドガラスを載置し、キャップ搬送部を用いて採取用キャップを移動させ、スライドガラスの組織標本上に置く。そして、倒立型光学顕微鏡の観察光学系を通じて組織標本を観察しながら、ステージを手動操作してスライドガラスを水平移動させ、目的とする細胞を組織標本から探し出し、目的とする細胞が観察視野の中心に来るように位置決めする。その後、レーザ照射部からレーザ光を採取用キャップを介して照射し、採取用キャップの熱塑性部分を利用して組織標本の目的とする細胞部分だけを接着させ、この状態から、スライドガラス上から採取用キャップを引き剥がし、採取用キャップとともに、目的とする細胞部分を採取するようになっている。この他に、レーザ光で目的の部分を切り取る方式のマイクロダイセクション装置も知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、このようなマイクロダイセクション装置を用いて組織標本の目的とする細胞を採取する場合、採取する細胞が多いほど、精度の高い分析結果が得られることから、例えば、一つの組織標本上に点在する同種の細胞を極力探し出して採取したり、ほぼ同じ位置に存在するもともと一体だった細胞を採取するなどの作業を行うようにしている。
【０００７】
しかしながら、レーザ捕捉式のマイクロダイセクション装置では、これら多くの細胞を採取するには、同一組織標本上で複数箇所に点在する細胞一つ一つについて、ステージを手操作しながら目的とする細胞が観察視野の中心に来るように位置決めし、レーザ光を照射するという作業を繰り返し行わなければならず、このための作業に多大な手間がかかっていた。
【０００８】
また、手動のステージ操作でレーザ光の照射位置を決定しているため、作業中、常に神経を集中させておかねばならず、僅かな操作ミスで不要な細胞を採取してしまい分析結果に悪影響を与えるなどのおそれもあった。また、ステージ操作を誤ると、既に観察が済んだ細胞を重複して観察してしまうような無駄な作業を行うこともあった。
【０００９】
さらに、スライドガラスを交換したり、スライドガラス上の採取用キャップの載置位置を変えるような場合は、採取用キャップをアームで持ち上げた状態でスライドガラスに物理的に直接接触し、任意の方向に外力を加えてステージ上での位置を調整するようになるため、精度の良い位置決めができないと同時に、カバーガラスが付いていない組織標本上に異物が落下し、コンタミネーションの問題が生じるおそれもある。
【００１０】
次に、レーザ捕捉式に限らずマイクロダイセクション装置全般の課題としては、図１３に示すように１個の組織標本４００を複数にスライスして、これら連続したスライス切片４０１、４０２、４０３…４０ｎについてそれぞれ細胞を採取することがあるが、これらスライス切片４０１、４０２、４０３…４０ｎは、もともと一体だった細胞で酷似した断面形状を有するものであるにもかかわらず、仮に、１枚目のスライス切片４０１より細胞を採取し、続けて２枚目以降のスライス切片より細胞を採取するような場合は、スライス切片４０２以降についても全く同じ作業を繰り返して行わなければならず、極めて作業効率が悪いという問題があった。
【００１１】
さらに、これらスライス切片４０１、４０２、４０３…４０ｎをそれぞれ組織標本として固定したスライドガラス上では、スライス切片４０１、４０２、４０３…４０ｎの位置が必ずしも同じではなく、多くの場合相対的にずれている。このため、ステージ上に、例えば位置決め用の突き当て部材を設けて、スライドガラス自体の設置位置の精度を確保しても、組織標本自体の位置ずれは残り、これらの位置ずれを補正するのに、さらに面倒な作業が必要となる。
【００１２】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、組織標本より目的物を効率よく採取することができるマイクロダイセクション装置を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、スライドガラスに固定された標本上に採取用キャップを載置し、該採取用キャップにレーザ光を照射することで、前記標本中の目的物を前記採取用キャップに接着させて採取するマイクロダイセクション装置において、前記スライドガラスを前記レーザ光の照射領域に移動する電動ステージと、前記レーザ光の照射領域に設置された前記スライドガラス上の標本中で確認された目的物に対して前記レーザ光の照射領域を設定するレーザ照射領域設定手段とを具備し、前記レーザ照射領域設定手段は、第１のスライドガラスに固定された標本中の目的物に対して設定されたレーザ照射領域に、第２のスライドガラスに固定された標本中の目的物の観察像を重ね合わせて表示し、この結果に応じて該第２のスライドガラス上の目的物のレーザ照射領域を設定することを特徴としている。
【００１４】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記電動ステージ上に設けられ、前記レーザ光の照射領域での前記スライドガラスの設置位置を調整する設置位置調整手段をさらに備えることを特徴としている。
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、設置位置調整手段は、前記電動ステージ上でさらに前記スライドガラスを回転方向に調整する回転調整手段と、前記スライドガラスを直交する２方向に移動調整する移動調整手段の少なくとも一つを有することを特徴としている。
【００１６】
請求項４記載の発明は、請求項１から３のいずれかに記載の発明において、レーザ照射領域設定手段は、前記目的物の観察像をドラックアンドドロップにより既設定された目的物のレーザ照射領域に重なるように移動させ、該目的物のレーザ照射領域を設定可能にしたことを特徴としている。
【００１７】
請求項５記載の発明は、スライドガラスに固定された標本中の目的物をレーザ光を用いて採取するマイクロダイセクション装置において、前記スライドガラスを載置し、前記レーザ光の前記標本への照射位置を移動する電動ステージと、前記スライドガラスに固定された標本中の目的物に対して前記レーザ光の照射位置を設定するレーザ照射位置設定手段とを有し、前記レーザ照射位置設定手段は、第１のスライドガラスに固定された標本中の目的物に対して設定されたレーザ照射位置に、第２のスライドガラスに固定された標本中の目的物の観察像を重ね合わせて表示し、この結果に応じて該第２のスライドガラス上の目的物のレーザ照射位置を設定することを特徴としている。
請求項６記載の発明は、請求項５記載の発明において、前記レーザ照射領域設定手段は、レーザ照射位置として前記目的物の輪郭形状を設定することを特徴としている。
【００１８】
この結果、本発明によれば、スライドガラスを直接指先で摘まんだり外力を加えて位置決めするような作業がなくなり、顕微鏡観察下で微調整が必要なスライドガラスの位置決め作業を飛躍的に簡単にできる。
【００１９】
また、最初に設定された目的とする細胞のレーザ照射領域をそのまま流用して、以後の組織標本に対するレーザ照射領域を設定することができるので、レーザ照射領域を改めて設定するなどの作業を省くことができる。
【００２０】
ドラックアンドドロップにより目的物の観察像を移動させるのみでレーザ照射領域を設定できるので、位置ずれの補正を簡単に行うことができる。
なお、前記レーザ照射位置設定手段は、レーザ照射位置として前記目的物の輪郭形状を設定するようにしてもよい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２２】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用されるマイクロダイセクション装置の概略構成、図２は、同マイクロダイセクション装置の観察光学系およびコントロール部を示している。
【００２３】
図１において、１は、本装置のベースとなる倒立型光学顕微鏡で、この倒立型光学顕微鏡１には、組織標本２の採取したい細胞部分を接着する採取用キャップ３を保持して搬送するキャップ搬送部４およびレーザ照射部５が設けられている。キャップ搬送部４は、倒立型光学顕微鏡１の電動ステージ６上にアーム支柱７が直立して設けられており、このアーム支柱７にアーム８が回転および上下動可能に設けられている。アーム８の先端には、一対のキャップ保持部９ａ、９ｂが水平方向に突出して設けられている。そして、これらキャップ保持部９ａ、９ｂにより、採取用キャップ３が保持されている。この場合、採取用キャップ３は、後述するスライドガラス２９に載置される側端面に光透過性の熱塑性フィルム３ａが設けられている。
【００２４】
倒立型光学顕微鏡１の電動ステージ６の上方には、照明部１０が設けられている。この照明部１０の内部には、レーザ照射部５の他に、照明光源１１、光学レンズ１２、ダイクロイックミラー１３、集光レンズ１４が設けられ、照明光源１１より放射される照明光が光学レンズ１２、ダイクロイックミラー１３、集光レンズ１４を通して電動ステージ６上方から組織標本２に照射されるようになっている。この場合、組織標本２は、スライドガラス２９の中央に、カバーガラスで覆われることなく固定されている。
【００２５】
また、レーザ照射部５は、赤外線波長領域のレーザ光を出力する半導体レーザ１５と、この半導体レーザ１５から出力されるレーザ光の光軸上に配置されるコリメータレンズ１６が構成され、半導体レーザ１５から出力されるレーザ光は、コリメータレンズ１６を通ってダイクロイックミラー１３で反射して照明光の光軸と同軸上を進んで観察視野中心にある組織標本２上の採取用キャップ３に照射されるようになっている。
【００２６】
倒立型光学顕微鏡１の電動ステージ６の下方には、対物レンズ１７、ハーフミラー１８、ミラー１９および接眼レンズ２０からなる観察光学系２１とＣＣＤカメラ２２が配置されている。観察光学系２１は、照明光源１１からの照明光が照射され組織標本２を透過した観察光を対物レンズ１７、ハーフミラー１８を通してミラー１９で反射し、接眼レンズ２０で目視観察可能にしている。また、ＣＣＤカメラ２２は、ハーフミラー１８の分光光軸上の観察光の結像位置に撮像面が位置するように配置され、接眼レンズ２０で目視観察されるのと同じ観察像が撮像できるようになっている。
【００２７】
レーザ照射部５には、レーザコントローラ２３が接続され、このレーザコントローラ２３には、制御用コンピュータ２４が接続されている。また、制御用コンピュータ２４には、モニタ２５、例えばマウスからなるポインティングデバイス２６が接続されるとともに、ＣＣＤカメラ２２および電動ステージコントロールボックス２７が接続されている。
【００２８】
制御用コンピュータ２４は、本マイクロダイセクション装置専用のソフトウェアを組み込んだパーソナルコンピュータからなるもので、この制御用コンピュータ２４の命令に基づいてレーザコントローラ２３により半導体レーザ１５の出力状態が制御されるとともに、電動ステージコントロールボックス２７により電動ステージ６に対する電源供給とパルス信号が制御されるようになっている。
【００２９】
電動ステージコントロールボックス２７には、ジョイスティックコントローラ２８が接続されている。このジョイスティックコントローラ２８には、図示しないジョイスティックが組み込まれ、このジョイスティックの操作に応じたパルス信号を電動ステージ６に与えるようにしている。ここでは、例えば、ジョイスティックの傾き方向で電動ステージ６側のパルス信号を送るモータの選択と、モ一夕の回転方向が決まり、傾き角度に応じた周波数でパルス信号が発振されてモータが回転し、電動ステージ６が移動するようにしている。
【００３０】
また、制御用コンピュータ２４は、ＣＣＤカメラ２２から出力された映像信号を取り込んで記録保存するとともに、モニタ２５に撮影した映像を表示するようにしている。
【００３１】
図３は、電動ステージ６の概略構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付している。この場合、倒立型光学顕微鏡１は、凹型の形状の基体１００を有し、この基体１００の前後に立ち上がった一対の支持部１０１、１０２に、それぞれ受け部１０１ａ、１０２ａが設けられている。これら受け部１０１ａ、１０２ａ上には、中心部に孔部６０１ａが形成されたベース板６０１が固定されている。
【００３２】
ベース板６０１上には、紙面と垂直方向に沿って平行に２本の直動ガイド６０２が配置され、これら直動ガイド６０２に沿って中板６０３が移動可能に設けられている。この場合、中板６０３は、ベース板６０１と平行な平面上で、且つ、対物レンズ１７の光軸１７ａと直交する方向(紙面に対して垂直な方向)に移動されるようになっている。
【００３３】
中板６０３上には、紙面の左右方向に沿って平行に直動ガイド６０４が配置され、これら直動ガイド６０４に沿って上板６０５が移動可能に設けられている。この場合、上板６０５は、中板６０３と平行な平面上で、且つ、中板６０３の移動方向に直交する方向（紙面の左右方向）に移動されるようになっている。
【００３４】
こうすることで、中板６０３の移動に際して支持部１０１、１０２および照明部１０を支持している支柱１０００が邪魔になることがなく、また、上板６０５は、支持部１０１、１０２から離れた位置にあるのでストロークの制限を受けずに、大きなストロークを確保することが可能になる。
【００３５】
一方、ベース板６０１の中板６０３と反対側の面(支持部１０１、１０２の受け部１０１ａ、１０２ａ側の面)には、中板６０３の駆動用のパルスモータ６０６と、このパルスモータ６０６の回転軸に直結されたボールネジ６０７からなる駆動系が設けられている。ボールネジ６０７には、ナット６０８が螺合されている。このナット６０８には、ベース板６０１の孔部６０１ａを通して中板６０３に連結した連結部材６０９が設けられ、ボールネジ６０７の回転により、同ボールネジ６０７の軸方向に移動されるナット６０８とともに、中板６０３を移動させるようになっている。また、中板６０３には、上板６０５の駆動用のパルスモータ６１０と、このパルスモータ６１０の回転軸に直結されたボールネジ６１１からなる駆動系が設けられている。
【００３６】
また、ボールネジ６１１にも、図４に示すようにナット６１２が螺合されている。このナット６１２には、上板６０５に連結した連結部材６１３が設けられ、ボールネジ６１１の回転により、同ボールネジ６１１の軸方向に移動されるナット６１２とともに、上板６０５を移動させるようになっている。
【００３７】
この場合、ボールネジ６１１の軸端は、継手６１４を介してパルスモータ６１０の回転軸に固定されている。このパルスモータ６１０の回転軸の継手６１４を接続した軸端と反対側の軸端には、パルス発振に起因する振動を抑えるためのダンパ６１５が設けられている。このダンパ６１５は、電源オフの時にモータ軸を回すツマミも兼ねている。また、この場合のボールネジ６１１のねじピッチとパルスモータ６１０の分解能と送りパルスは、上板６０５の最小移動量が１パルス当り１μｍ以下となるように設定されている。
【００３８】
なお、上述した中板６０３を駆動するパルスモータ６０６についても、図４に示すように、回転軸の軸端には、パルス発振に起因する振動を抑えるとともに、電源オフの時にモータ軸を回すためのツマミを兼ねたダンパ６１６が設けられ、また、ボールネジ６０７のねじピッチとパルスモータ６０６の分解能と送りパルスは、中板６０３の最小移動量が１パルス当り１μｍ以下となるように設定されている。
【００３９】
こうすることで、上板６０５や中板６０３の移動ストロークに制限を生じさせることなく、中板６０３および上板６０５の駆動系を省スペースで配置することができる。
【００４０】
また、図４は、電動ステージ６の上板６０５の概略構成を示している。この場合、上板６０５には、設置位置調整手段を構成する、組織標本２を固定したスライドガラス２９が載置される中座３０（回転調整手段）が設けられている。この中座３０は、上板６０５と面一の面上で回転できるようになっている。この場合、中座３０の周縁部には、突出部３０ａが設けられ、この突出部３０ａは、上板６０５側の切欠け部６０５ａ内に挿入されおり、中座３０の回転により突出部３０ａが切欠け部６０５ａ端部に当接することで、中座３０の回動範囲を規制できるようになっている。また、中座３０の下面には、レバー３１が固定されている。このレバー３１は、中座３０の半径方向に沿って配置されるもので、先端部が中座３０側に連結され、また、基端部が上板６０５に形成された長穴６０５ｂを介して上板６０５上面に突出され、この突出部にツマミ３２が螺装されている。そして、ツマミ３２を持ってレバー３１を長穴６０５ｂに沿って移動させることで、レバー３１を介して中座３０が回転され、ツマミ３２を締め付けることで、上板６０５に対しレバー３１が固定状態となり、中座３０の上板６０５に対する回転位置を固定できるようになっている。
【００４１】
なお、中座３０の回転機構については、ラックとピニオンまたは歯車を組み合わせたものなど、種々の構成のものを用いることができる。
【００４２】
このようにして、上板６０５上において、中座３０を微調整可能に回転できるようにすることで、組織標本２面の光軸方向の高さを変えることなく、スライドガラス２９の傾きを簡単に調整できるようになる。
【００４３】
なお、中座３０には、回転中心付近に透孔３０ｂが形成されている。この透孔３０ｂは、スライドガラス２９越しに対物レンズ１７を介して組織標本２を観察可能にするためのものである。
【００４４】
中座３０には、この中座３０とともに設置位置調整手段を構成する、図５（ａ）（ｂ）に示すような直交２軸のサブステージ３３（移動調整手段）が固定されている。この場合、中座３０の突出部３０ａには、サブステージ３３の固定位置に位置決め用の２個所の嵌合穴３０ｃ、３０ｄが設けられ、一方、サブステージ３３のベース３３ａには、嵌合穴３０ｃ、３０ｄと相対する位置に２本のピン（図示せず）が設けられており、これらピンを嵌合穴３０ｃ、３０ｄに嵌合することにより、中座３０に対してサブステージ３３が位置決め固定できるようになっている。
【００４５】
サブステージ３３のベース３３ａには、Ｌ字形の移動部品３４がスライドガラス２９の長辺方向に沿って往復移動可能に設けられ、また、この移動部品３４には、スライドガラス受け３５がスライドガラス２９の短辺方向に沿って往復移動可能に設けられている。この場合、スライドガラス受け３５は、バネ力が働いた押付部材３５ａを有しており、この押付部材３５ａによりスライドガラス２９を当り面３５ｂ側に押し付けることで保持するようになっている。
【００４６】
また、サブステージ３３は、ベース３３ａにツマミ３６が設けられ、このツマミ３６を回すことで、移動部品３４がスライドガラス２９の長辺方向に微調整可能に移動され、また、移動部品３４にもツマミ３７が設けられ、このツマミ３７を回すことで、スライドガラス受け３５がスライドガラス２９の短辺方向に微調整可能に移動されるようになっており、これらツマミ３６、３７をそれぞれ独立して回すことで、スライドガラス２９の長辺方向と短辺方向ヘの移動量を微調整できるようになっている。
【００４７】
このようなサブステージ３３を設けることにより、中座３０上でスライドガラス２９を直接指先で摘まんで位置決めするような作業がなくなり、顕微鏡観察下で微調整が必要なスライドガラス２９の位置決め作業を飛躍的に簡単にできる。また、スライドガラス２９の微妙な位置変更の際に、直接スライドガラス２９を触らずに済むことから、採取する組織標本２のコンタミの増加を抑える効果もある。
【００４８】
図４に戻って、電動ステージ６の上板６０５の側面に対向する位置には、上板６０５の移動方向に沿って原点検出器３８、レーザ照射域検出器３９およびオーバーラン防止検出器４０が並べて設けられている。この場合、原点検出器３８、レーザ照射域検出器３９およびオーバーラン防止検出器４０には、例えば、光透過形のフォトセンサが用いられ、上板６０５側に設けられる光遮蔽部６０５ｃがそれぞれのセンサに対する光の透過を遮断することで、それぞれの状態を検出するようになっている。
【００４９】
ここで、原点検出器３８は、電動ステージ６の機械的原点位置を検出するもので、オーバーラン防止検出器の機能も兼ね備えている。また、レーザ照射域検出器３９は、レーザ照射領域を検出するもので、半導体レーザ１５からのレーザ光の光軸に対して採取用キャップ３の中心位置が一致した状態にあるときにレーザ照射領域の中心を検出するように設定されている。また、レーザ照射域検出器３９は、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａの大きさよりも若干広い領域をレーザ照射領域として検出できるように構成されており、採取用キャップ３の組織標本２上で設置位置ずれが生じてもレーザ照射領域を外れることがないようにしている。さらに、オーバーラン防止検出器４０は、パルスモータ脱調時のオーバーランを防止するためのものである。
【００５０】
なお、図４では、上板６０５の移動方向に沿って原点検出器３８、レーザ照射域検出器３９およびオーバーラン防止検出器４０が並べて設けられる構成についてのみ示しているが、中板６０３についても図示していないが、上述と同様にして移動方向に沿って原点検出器３８、レーザ照射域検出器３９およびオーバーラン防止検出器４０が並べて設けられ、上述したと同様な動作を得られるようになっている。
【００５１】
次に、このように構成されたマイクロダイセクション装置により採取用キャップ３を用いて組織標本２の目的とする細胞を採取するまでの手順と制御用コンピュータ２４に組み込まれた専用ソフトウェアによる動作について説明する。
【００５２】
なお、ここでは、組織標本２を複数にスライスして、これら連続したスライス切片の組織標本２について、それぞれ目的とする細胞を採取するような場合を説明する。
【００５３】
まず、マイクロダイセクション装置の電源を投入して制御用コンピュータ２４の専用ソフトウェアを起動する。すると、自動的に実行される初期化動作に従って、電動ステージ６は、原点検出器３８により原点位置検出を行って、原点から所定の距離だけ離れたレーザ照射領域へ移動して待機する。
【００５４】
この時のステージ位置は、キャップ搬送部４のアーム８により採取用キャップ３を組織標本２上に載置したときに、レーザ光軸（照明光の光軸）とキャップ中心軸とが一致する位置である。
【００５５】
この状態で、サブステージ３３のスライドガラス受け３５に設けられた押付部材３５ａをバネ力に抗して手で広げ、スライドガラス２９を当り面３５ｂに当て付けるようにして設置し、その後、押付部材３５ａから手を放し、バネ力が作用された押付部材３５ａでスライドガラス２９を当り面３５ｂに押し付けて保持させる。
【００５６】
次に、倒立型光学顕微鏡１の照明光源１１から照明光を光学レンズ１２、ダイクロイックミラー１３、集光レンズ１４を通して電動ステージ６上方からスライドガラス２９上の組織標本２に照射し、組織標本２を透過した観察光を対物レンズ１７、ハーフミラー１８、ミラー１９を通し接眼レンズ２０で目視観察する。
【００５７】
接眼レンズ２０での目視観察により組織標本２の目的とする細胞群を探し出し、サブステージ３３のツマミ３６、３７を操作してスライドガラス２９の電動ステージ６上での位置を微調整しながら、組織標本２の採取したい細胞群をＣＣＤカメラ２２で撮像し、制御用コンピュータ２４のモニタ２５上に映し出す。
【００５８】
次に、キャップ搬送部４のアーム８を降下させ、採取用キャップ３をスライドガラス２９の組織標本２上へ載置する。この状態で電動ステージ６を駆動してＣＣＤカメラ２２で顕微鏡像を撮像し、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａ面に密着された領域全体の組織標本２の観察像(マクロ画像)を顕微鏡像の貼り合わせによって構築する。（この考えは、特開平９−２８１４０５に開示されている。）
この場合、予め、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａの寸法と対物レンズ１７の倍率毎の撮影範囲が分っていれば、対物レンズ１７の倍率に応じた電動ステージ６の移動量と移動範囲が必然的に決まることから、専用ソフトウェアによりマクロ画像取込み開始を指示することで、電動ステージ６による所定位置へのスライドガラス２９の移動、顕微鏡像の撮影、撮影した像の保存などを一連の動作として行うことができる。ただし、作業時間の短縮、保存データ容量の節約の観点から、通常、このマクロ画像の構築には低倍の対物レンズが使用されるのが一般的である。また、連続切片からの細胞採取を目的としない場合は、マクロ画像の構築は必ずしも必要ではなく、一連の手順から省略することができる。
【００５９】
また、モニタ２５は、図６に示すようにＣＣＤカメラ２２で現在撮影している１視野の顕微鏡観察像Ａと、上述したマクロ画像を縮小して熱塑性フィルム３ａ面領域全体の組織標本２の像と確認できるようにしたマップ画像Ｂとが常に表示される画面を構成している。この場合、マップ画像Ｂ上には、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａの外周形状を示す円形部３０１と現在撮影している顕微鏡観察像の視野領域を示す指標３０２とが重ね合せて表示され、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａ面内における現在撮影している１視野の位置を確認することができる。
【００６０】
次に、採取したい細胞を、熱塑性フィルム３ａと密接した部分の組織標本２の領域全体から顕微鏡像を観察しながら探し出していく。この場合、図７に示すようにスライドガラス２９の組織標本２内で適当な領域を２０ａを特定し、採取したい細胞２０１の大きさごとに対物レンズ１７の倍率を切換えて、最終的に組織標本２内の採取したい細胞２０１が観察視野内一杯に収まるまで拡大して顕微鏡観察を行う。この場合、対物レンズ１７を切換える図示しないレボルバーには、レンズ倍率識別器が組み込まれており、レンズ倍率の切換えに応じてレンズ倍率情報が制御用コンピュータ２４に取り込まれ、電動ステージ６の移動量や速度が自動的に制御される。
【００６１】
その後、採取したい細胞を確認したところで、レーザ照射領域設定手段により採取用キャップ３を通して組織標本２上にレーザ光を照射する領域を設定する。このレーザ光照射領域の設定は、組織標本２中の採取したい細胞２０１の輪郭に応じて設定し易い設定モードを選択して、ポインティングデバイス２６を用いて行う。この場合の設定モードとしては、中心点と円周上の一点を指示する円領域設定モード、対向する２角を指示する矩形領域設定モードあるいは採取したい細胞の輪郭をポインティングデバイス２６でなぞり、なぞった通りに領域を指定する任意曲線領域設定モードなどがあり、細胞の輪郭に応じて領域設定を効率的に行えるような配慮がなされている。
【００６２】
図８は、任意曲線領域設定モードにより領域を設定する例を示しており、細胞２０１の輪郭に沿ってポインティングデバイス２６でなぞり（図示太線で示している）、このなぞった曲線が最外周となるようなレーザ照射領域を設定する。そして、レーザ光を照射時には、設定された領域の内側全域（図示ハッチンク部分）にレーザ光が照射されるように電動ステージ６が自動的に移動される。
【００６３】
このようにして、レーザ照射領域設定時は、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａ面内全域が対物レンズ倍率固有の視野に分けて、それぞれの視野から視野へ電動ステージ６をステップ移動させながら、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａ面内全域にわたって採取したい細胞を探し出し、レーザ照射領域を設定するようになる。この場合、視野周辺に存在する細胞の見落としを防ぐために、視野周辺を僅かにオーバーラップさせるような移動量で電動ステージ６をステップ移動させるのが望ましい。
【００６４】
次に、組織標本２上の任意の位置を基準位置として設定し、そのステージ座標（基準位置座標）を登録すると同時に、顕微鏡観察像（基準位置顕微鏡像）を登録する。モニタ２５上で登録した顕微鏡像と比較して、隣接していた切片サンプルと同じ位置と認識できるような特徴的な形状をした位置を電動ステージ駆動しながら探し出し、基準位置座標として保存する。
【００６５】
通常、組織標本２の最外周部分は、認識し易く、その一部を基準位置として指定することが多い。この基準位置は、熱塑性フィルム３ａの内側でも外側でも良く、採取する細胞であってもそうでなくても構わない。また、連続切片サンプル以外のサンプルの場合、この基準位置設定は省略できる。
【００６６】
設定した各レーザ照射領域の重心座標と、その領域をモニタ上に表示する輪郭線のデータと、基準位置座標とを、顕微鏡像と別ファイルで保存し、任意の顕微鏡像と基準位置座標を合せた状態で重ね合せ表示することができる。また、マップ画像上には、各レーザ照射領域の重心位置を示す指標を表示し、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａ面内におけるレーザ照射領域の分布状態を把握できるようにしている。さらに、半導体レーザの出力状態に応じて電動ステージ６の移動量と移動速度を設定することもできる。
【００６７】
このようにして設定した複数のレーザ照射領域の重心座標から重心座標へ電動ステージ６を自動移動しながら、照射領域内全体についてレーザ光を自動的に照射していく。この場合、図２に示すように、半導体レーザ１５から出力されるレーザ光は、コリメータレンズ１６を通ってダイクロイックミラー１３で反射して照明光の光軸と同軸上を進んで採取用キャップ３に照射される。これにより熱塑性フィルム３ａは徐々に熱せられ、接触している組織標本２の採取したい細胞が接着される。
【００６８】
そして、これら設定されたレーザ照射領域へのレーザ照射が完了したら、アーム８を持ち上げて採取用キャップ３をスライドガラス２９から剥がして、採取用キャップ３に貼り付いている目的とする細胞のみを採取する。
【００６９】
そして、目的とする細胞を採取した採取用キャップ３は、そのまま図示しない分析用マイクロチューブの蓋として使用されるとともに、採取された細胞群の培養が分析用マイクロチューブ内で行われる。
【００７０】
次に、スライドガラス２９上の採取用キャップ３を載せた部分以外の箇所で細胞を採取するには、まず、サブステージ３３を操作してスライドガラス２９を目的の箇所まで移動し、アーム８を下げて採取用キャップ３を再びスライドガラス２９上へ載置する。その後の細胞の採取までの手順は、上述したと同様であり、ここでの説明は省略する。
【００７１】
次に、１枚目のスライドガラスについて細胞の採取が完了したら、サブステージ３３の押付部材３５ａをバネ力に抗し手で開いてスライドガラス２９を外し、隣接していた組織標本２を載せた２枚目のスライドガラス２９をサブステージ３３にセットする。
【００７２】
この場合、１枚目のスライドガラス２９とその組織標本２に隣接していた組織標本２を載せた２枚目のスライドガラスの断面形状とは十分酷似していることが予測できる。従って、電動ステージ６に対して同じ位置に２枚目のスライドガラス２９上の組織標本２が設置できれば１枚目のスライドガラス２９で登録したレーザ照射領域を殆ど変更すること無く使用でき、レーザ照射領域の設定作業を大幅に簡単化することができる。
【００７３】
以下、２枚目以降のスライドガラス２９の位置合せ手順について記述する。
【００７４】
この場合、基準位置呼出し機能を使って、保存していた１枚目のスライドガラス２９の基準位置を呼出す操作を行う。
【００７５】
すると、制御用コンピュータ２４の指示に従い、電動ステージ６が基準位置座標に移動すると同時に、基準位置顕微鏡像がモニタ２５上に表示され、更にオーバーラップ機能が働く。ここで、オーバーラップ機能とは、登録・保存していた顕微鏡像と電動ステージ６上にあるスライドガラス２９のライブ像を重ね合せて表示する機能である。つまり、図９に示すように２枚目のスライドガラス２９の顕微鏡像をライブ像Ａとして１枚目のスライドガラス２９の基準位置顕微鏡像Ｂと重ね合せて、オーバーラップ画像Ｃを得るための機能である。
【００７６】
この場合、電動ステージ６が基準位置座標に停止した状態でサブステージ３３を操作して２枚目のスライドガラス２９のライブ像Ａのうち、１枚目のスライドガラス２９基準位置顕微鏡像Ｂの特徴的な形状部分と同様な部分を、オーバーラップ画像Ｃとしてモニタ２５上に表示させる。
【００７７】
ところで、組織標本２の位置や傾きは、通常、スライドガラス２９ごとに異なっているので、図９のオーバーラップ画像Ｃに示すように１枚目と２枚目のスライドガラス２９のそれぞれの組織標本２にずれを生じる。（なお、これら１枚目と２枚目を区別するため、１枚目のスライドガラス２９の組織標本２には（＃１）、２枚目のスライドガラス２９の組織標本２には（＃２）が付記されている。以下、同様である。）
このような場合は、図１０に示すように、２枚目のスライドガラス２９の組織標本２（＃２）について中座３０を図示矢印Ｄ方向に回転させて傾きを調整し、サブステージ３３のＸＹ操作により位置を図示矢印Ｅ方向に移動させて、１枚目のスライドガラス２９の組織標本２（＃１）と、２枚目のスライドガラス２９の組織標本２（＃２）の位置を一致させる。
【００７８】
次に、基準位置への位置合せが完了したところで、アーム８を降下させて採取用キャップ３をスライドガラス２９上へ載置する。そして、１枚目のスライドガラス２９で設定したレーザ照射領域の２枚目のスライドガラス２９ヘの有効性を確認する。この場合、２枚目のスライドガラス２９の顕微鏡ライブ像に１枚目のスライドガラス２９のレーザ照射領域をオーバーレイ表示させる同時に、電動ステージ６を最初のレーザ照射領域の重心座標が像中心にくるように移動する。ここで、図１１（ａ）に示すように２枚目のスライドガラス２９の顕微鏡ライブ像内の採取したい細胞２０１と１枚目のスライドガラス２９で設定したレーザ照射領域２０２とが確実に重なり合っていれば、レーザ照射領域を改めて設定する必要はないが、同図（ｂ）に示すように、ずれが生じていて不要な箇所にもレーザ光を照射する状態になっていればレーザ照射領域を再設定しなければならない。しかし、ここでの細胞は、同一の組織標本をスライスしたものであるから、ずれの殆どが形状や大きさに関わるものでなく位置のずれにとどまる。この位置ずれは、ソフトウェア上でレーザ照射領域を任意の距離だけオフセット移動できる機能を使い、モニタ２５上でポインティングデバイス２６を用いて採取したい細胞２０１の観察像をドラックアンドドロップにより１枚目のスライドガラス２９のレーザ照射領域２０２に重なるように移動させることで、その移動量だけ電動ステージ６が移動され位置ずれが補正される。
【００７９】
一方、位置ずれに加えて細胞の形状や大きさがずれている場合は、設定されていたその位置のレーザ照射領域を一度削除して、再度最適なレーザ照射領域を設定する。このレーザ照射領域の有効性の確認と再設定は、採取用キャップ３の熱塑性フィルム３ａ面内全域で行う。この場合、既にレーザ照射領域は、１枚目のスライドガラス２９で設定されているため、２枚目以降のスライドガラス２９では採取したい細胞の位置が分かっており、探す手間が省かれ、更にレーザ照射領域の設定作業を大幅に削減することができる。レーザ照射領域の設定が完了したら１枚目のスライドガラス２９と同様にレーザ光を照射する。以下、３枚目以降についても上述したと同様にしてスライドガラス２９の位置合せが行われる。
【００８０】
従って、このようにすれば、電動ステージ６によりスライドガラス２９をレーザ光の照射領域まで移動した状態から、さらに中座３０を微調整可能に回転することにより、組織標本２面の光軸方向の高さを変えることなく、スライドガラス２９の傾きを簡単に調整することができ、同時に、サブステージ３３のツマミ３６、３７をそれぞれ回すことで、ＸＹ軸方向、つまりスライドガラス２９の長辺方向と短辺方向ヘの移動量も微調整できるので、スライドガラス２９を直接指先で摘まんで位置決めするような作業がなくなり、顕微鏡観察下で微調整が必要なスライドガラス２９の位置決め作業を飛躍的に簡単にできる。また、スライドガラス２９の微妙な位置変更の際に、直接スライドガラス２９を触らずに済むことから、採取する組織標本２のコンタミの増加を抑える効果もある。
【００８１】
また、組織標本２を複数にスライスして、これら連続したスライス切片の組織標本２について、それぞれ目的とする細胞を採取するような場合、各スライドガラス２９上で固定位置が微妙にずれている組織標本２についても、最初に設定された目的とする細胞のレーザ照射領域をそのまま流用して、以後の組織標本２に対するレーザ照射領域を設定することができるので、レーザ照射領域を改めて設定するなどの作業を省くことができる。
【００８２】
さらに、最初に設定されたレーザ照射領域に対し、以後の組織標本２中の目的とする細胞の観察像をドラックアンドドロップにより重ねるように移動させるのみでレーザ照射領域を設定することもできるので、位置ずれの補正を簡単に行うことができる。
【００８３】
（第２の実施の形態）
ところで、１枚目のスライドガラス２９の組織標本２を染色し、この組織標本２内の採取細胞位置を同定し、２枚目以降について無染色の組織標本２について細胞を採取するようにすれば、細胞に与えるダメージを少なくでき、より精度の高い分析が可能となる。
【００８４】
そこで、この第２の実施の形態では、２枚目以降について無染色の組織標本２について細胞を採取できるようにしたものである。
【００８５】
図１２は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付している。
【００８６】
この場合、倒立型光学顕微鏡１は、観察光学系２１の対物レンズ１７とハーフミラー１８との間の光路に、無染色の組織標本２を顕微鏡観察するために微分干渉検鏡用のアナライザ４１とＤＩＣプリズム４２が出し入れ可能に配置され、また、ダイクロイックミラー１３と集光レンズ１４との間の光路に、ポラライザ４３とＤＩＣプリズム４４が出し入れ可能に配置されている。
【００８７】
そして、１枚目のスライドガラス２９の染色した組織標本２の採取細胞位置を同定したのち、２枚目以降について無染色の組織標本２について細胞を採取する際に、アナライザ４１とＤＩＣプリズム４２を対物レンズ１７とハーフミラー１８との間の光路に、ポラライザ４３とＤＩＣプリズム４４をダイクロイックミラー１３と集光レンズ１４との間の光路上にそれぞれ挿入し、この状態で、微分干渉観察を行うことにより、無染色の組織標本２上の採取する細胞の位置を同定することが可能となり、染色した組織標本２の場合と同様にして細胞を採取することができる。なお、レーザ照射時は、損傷を防ぐため、これらアナライザ４１とＤＩＣプリズム４２、ポラライザ４３とＤＩＣプリズム４４は、予め光路上から外しておき、微分干渉観察時に再び光路上に挿入する。
【００８８】
従って、このようにすれば、２枚目以降について無染色の組織標本２について細胞を採取できるので、細胞に与えるダメージを少なくでき、より精度の高い分析が可能となる。
【００８９】
なお、例えば、第１および第２の実施の形態において、連続切片サンプルの２枚目以降に対する採取動作については、レーザ捕捉式でないタイプのマイクロダイセクション装置にも適用できる。すなわち、１枚目の標本に対して基準位置を設定し、２枚目以降の標本に対して基準位置呼び出し機能、オーバラップ機能、レーザ照射領域（標本を切り取るためのレーザ照射位置）のオフセット機能を用いることにより、最初に設定されたレーザ照射領域（レーザ照射位置）の流用や位置ずれ補正を簡単に行うことができるようになる。
【００９０】
なお、レーザ捕捉式でないタイプのマイクロダイセクション装置では、例えば目的物の輪郭を切り取るようにレーザを照射するので、この場合には、レーザ照射領域の代わりにレーザ照射位置（例えば目的物の輪郭形状）を設定するようにする。具体的には、第１の実施の形態のレーザ照射領域設定と同じようにポインティングディバイスを用いて目的物の輪郭形状を設定し、レーザ光の照射時に、設定した輪郭上だけにレーザ光を照射するように電動ステージを制御する。
【００９１】
さらに、レーザ照射領域設定手段または照射位置設定手段に、ソフトウエア上で照射領域（照射位置）のオフセット機能に加えて回転機能を持たせてもよい。モニタ上で照射領域（照射位置）を回転できれば、連続切片サンプルの場合に位置とともに向きがずれていても容易に修正できる。
【００９２】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００９３】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００９４】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、組織標本より目的物を効率よく採取することができるマイクロダイセクション装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態が適用されるマイクロダイセクション装置の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態が適用されるマイクロダイセクション装置の観察光学系およびコントロール部を示す図。
【図３】第１の実施の形態に用いられる電動ステージの概略構成を示す図。
【図４】第１の実施の形態に用いられる電動ステージを上板側から見た概略構成を示す図。
【図５】第１の実施の形態に用いられる電動ステージのサブステージの概略構成を示す図。
【図６】第１の実施の形態のモニタにおける顕微鏡観察像とマップ画像の表示例を示す図。
【図７】第１の実施の形態の組織標本の領域から採取したい細胞を探し出すための手段を説明する図。
【図８】第１の実施の形態のレーザ光照射領域を設定する方法を説明する図。
【図９】第１の実施の形態の１枚目のスライドガラスの基準位置顕微鏡像に２枚目のスライドガラスの顕微鏡像を重ねオーバーラップ画像を得るための機能を説明する図。
【図１０】第１の実施の形態の１枚目のスライドガラスに対する２枚目のスライドガラスのずれの補正を説明する図。
【図１１】第１の実施の形態の採取したい細胞のずれの補正を説明する図。
【図１２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１３】従来の組織標本を複数にスライスして連続したスライス切片を生成する例を説明する図。
【符号の説明】
１…倒立型光学顕微鏡
２…組織標本
３…採取用キャップ
３ａ…熱塑性フィルム
４…キャップ搬送部
５…レーザ照射部
６…電動ステージ
７…アーム支柱
８…アーム
９ａ．９ｂ…キャップ保持部
１０…照明部
１１…照明光源
１２…光学レンズ
１３…ダイクロイックミラー
１４…集光レンズ
１５…半導体レーザ
１６…コリメータレンズ
１７…対物レンズ
１７ａ…光軸
１８…ハーフミラー
１９…ミラー
２０…接眼レンズ
２１…観察光学系
２２…ＣＣＤカメラ
２３…レーザコントローラ
２４…制御用コンピュータ
２５…モニタ
２６…ポインティングデバイス
２７…電動ステージコントロールボックス
２８…ジョイスティックコントローラ
２９…スライドガラス
３０…中座
３０ａ…突出部
３０ｂ…透孔
３０ｃ．３０ｄ…嵌合穴
３１…レバー
３２…ツマミ
３３…サブステージ
３３ａ…ベース
３４…移動部品
３５ａ…押付部材
３５ｂ…当り面
３６．３７…ツマミ
３８…原点検出器
３９…レーザ照射域検出器
４０…オーバーラン防止検出器
１００…基体
１０１．１０２…支持部
６０１…ベース板
６０１ａ…孔部
６０２…直動ガイド
６０３…中板
６０４…直動ガイド
６０５…上板
６０５ａ…切欠け部
６０５ｂ…長穴
６０５ｃ…光遮蔽部
６０６、６１０…パルスモータ
６０７、６１１…ボールネジ
６０８、６１２…ナット
６０９、６１３…連結部材
６１４…継手
６１５、６１６…ダンパ
２０１…細胞
２０２…レーザ照射領域
３０１…円形部
３０２…指標
４１…アナライザ
４２…ＤＩＣプリズム
４３…ポラライザ
４４…ＤＩＣプリズム
【図１】
0004156851.tif 000002
【図２】
0004156851.tif 000003
【図３】
0004156851.tif 000004
【図４】
0004156851.tif 000005
【図５】
0004156851.tif 000006
【図６】
0004156851.tif 000007
【図７】
0004156851.tif 000008
【図８】
0004156851.tif 000009
【図９】
0004156851.tif 000010
【図１０】
0004156851.tif 000011
【図１１】
0004156851.tif 000012
【図１２】
0004156851.tif 000013
【図１３】
0004156851.tif 000014