(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機高分子を主成分とする粒子の表面に、特定の制限酵素の認識部位および相補鎖部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された核酸結合用粒子担体であって、
（１）該粒子は、表面にカルボキシル基を有しており、かつ平均粒子径が０．３〜５μｍであり、
（２）該二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全塩基数が５〜８０であり、該二本鎖オリゴヌクレオチドの片方の末端の二本鎖部位は、互いに相補性がない塩基数１〜３０の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２から構成され、該二本鎖オリゴヌクレオチドの他方の末端の二本鎖部位は、少なくとも末端に特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢから構成されており、
（３）該二本鎖オリゴヌクレオチドと該粒子とは、該二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の塩基にそれぞれ少なくとも１つ存在するアミノ基と該粒子表面に存在するカルボキシル基とのアミド結合により固定化されている、
ことを特徴とする核酸結合用粒子担体。
【請求項２】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２を構成する塩基は、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸、またはデオキシグアニル酸から選ばれる１種類の塩基であることを特徴とする請求項１記載の核酸結合用粒子担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸結合用粒子担体に関し、さらに詳しくは遺伝子工学、クローニング、ゲノム核酸解析等の分野における特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の結合、回収あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出、特に生植物のゲノム核酸の解読に行われる制限酵素ランドマークの一次スクリーニングに有効な粒子担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一本鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして固定化された水不溶性固相担体と、プローブと相補的な塩基配列とを相補的な結合で結合させることによって形成される特定の制限酵素の認識部位を有する担体を用いて、標的核酸（またはその断片）を結合させ、特定の塩基配列を抽出、分離する試みは以前から行われてきた。
従来の水不溶性固相担体にオリゴヌクレオチドを固定化する技術としては、例えばオリゴヌクレオチドの末端部位にアーム、スペーサー等の物質を介して水不溶性固相担体の表面に存在する所望の官能基に結合する方法、スペーサー等を介することなく、オリゴヌクレオチドの末端塩基を化学的に修飾することによって水不溶性固相担体の表面の官能基に結合する方法、オリゴヌクレオチドの末端塩基をそのまま水不溶性固相担体の表面の官能基に結合する方法等を挙げることができる（特開昭６１−１３０３０５号、特開昭６１−２４６２０１号、特開昭６３−２７０００号、特開平１−１７１４９９号、特開平３−１４７８００号、Ｃｅｌｌ  ５，３０１（１９７５）等）。しかしながら、いずれの場合においても一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を選択的に固相担体表面に固定化する技術であり、二本鎖オリゴヌクレオチドの固定化には利用できない。
また、一般に知られている化学反応あるいはビオチン／アビジン反応のような生化学的な反応も一本鎖オリゴヌクレオチドの固相表面への固定化には利用することができるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの固定化には利用できない。従って、それらの反応により一本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された担体は、ハイブリタイゼーション法を用いた特定の核酸、プローブ核酸またはターゲット核酸の捕捉、検出等への利用に限られていた。
【０００３】
一方、一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化した固相担体を、特定の制限酵素によって処理した核酸断片の回収、接続あるいはＤＮＡ結合蛋白質との結合に用いる場合には、一本鎖オリゴヌクレオチドに相補鎖をアニールし、前記特定の制限酵素の認識部位を形成させることが必要である。
そこで、例えば固定化された一本鎖オリゴヌクレオチドを一旦、相補鎖過剰の条件でアニーリングさせて固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し、さらにその末端に特定の制限酵素認識部位を形成させた後、余分な相補鎖を除去することによって調製される特定の制限酵素認識部位を末端にもつ二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された担体を、前記制限酵素で切断されたＤＮＡ断片の分離、抽出に使用する方法が挙げられる（特開平３−１４７８００号）。
しかし上記方法において固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させるには過剰な相補鎖と長時間とを必要とし、また固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドの結合が数十ベース長の塩基による水素結合のみであるために、アニーリングの効率の悪さによって満足に制限酵素認識部位を末端に形成させられないという欠点がある。さらに、得られる固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドは、保存安定性が悪く、二本鎖形成時の条件で保存しなければならず、使用上および保存上、効率的であるとはいえない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度よく行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、有機高分子を主成分とする粒子の表面に、特定の制限酵素の認識部位および相補鎖部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された核酸結合用粒子担体であって、（１）該粒子は、表面にカルボキシル基を有しており、かつ平均粒子径が０．１〜１５μｍであり、（２）該二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全塩基数が５〜８０であり、該二本鎖オリゴヌクレオチドの片方の末端の二本鎖部位は、互いに相補性がない塩基数１〜３０の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２から構成され、該二本鎖オリゴヌクレオチドの他方の末端の二本鎖部位は、少なくとも末端に特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢから構成されており、（３）該二本鎖オリゴヌクレオチドと該粒子とは、該二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の塩基にそれぞれ少なくとも１つ存在するアミノ基と該粒子表面に存在するカルボキシル基とのアミド結合により固定化されている、
ことを特徴とする核酸結合用粒子担体、によって達成される。
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。これにより、本発明の目的、構成および効果がより明確になるであろう。
本発明に用いる粒子は、有機高分子を主成分とする水不溶性の粒子である。ここで主成分となる有機高分子としては、例えばスチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロモプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビニル系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の有機高分子を挙げることができる。さらに他の有機高分子としては、アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体を挙げることができる。
【０００７】
これらの粒子は、乳化重合、懸濁重合、溶液沈澱重合等によって製造することができる。また、有機高分子を非溶媒中に分散し架橋したり、または溶媒を揮散させることなどによって該粒子を得ることができるが、粒子の製造方法はこれらに限定されるものではない。
【０００８】
なお、これらの粒子には必要に応じて粒子の内部、または表面に有機染料、顔料、蛍光色素を含有または被覆させてもよいし、無機物質からなる充填剤、例えばマグネタイト、ヘマタイト、ニッケル等の金属あるいは金属化合物のような磁性もしくは超常磁性を有する物質を含浸させ、粒子を複合化させてもよい。
【０００９】
以上のようにして得られる粒子の表面は、非多孔質であることが望ましい。ここで、粒子の表面が「非多孔質」であるとは、長径が０．０１μｍ以上である孔を粒子の表面に有しないことを意味する。粒子の表面が非多孔質でないと、すなわち、長径で０．０１μｍ以上である孔が粒子の表面に存在すると、核酸の検出法等で用いられる制限酵素切断末端をもつ核酸断片が粒子の内部に捕捉される等の原因により感度や精度の問題を生ずる場合がある。なお、このように、粒子の表面は非多孔質であることが望ましいが、粒子の内部には独立気泡等が存在してもよい。
【００１０】
粒子の平均粒子径は、０．１〜１５μｍであり、好ましくは０．３〜５μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満であると遠心分離等の簡便な操作で粒子を回収しにくくなる。一方１５μｍを超えると粒子の単位体積当たりの表面積が小さくなり、かつ核酸断片の分離、抽出等において粒子が均一に分散しなくなるために、高い分離率、抽出率等を達成できない恐れがある。
【００１１】
さらに、本発明において使用する粒子は、後述するように一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２中の塩基のアミノ基とのアミド結合を形成させるために、その表面にアミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する必要がある。従って、粒子がその表面にカルボキシル基を有しない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入する必要がある。カルボキシル基は粒子表面積１ｎｍ2当たり少なくとも平均１個存在することが好ましく、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは５個以上である。
このようなカルボキシル基を表面に有する前記有機高分子からなる粒子としては、例えばイムテックスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０２、Ｇ０３０１、Ｇ０２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１、Ｌ０１０２、ＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３等の商品名（日本合成ゴム（株））で市販しているものが挙げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する粒子は、酵素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの耐熱性を有するものである。また、カルボキシル基を有しない粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、従来より知られている種々の方法を利用することができる。
【００１２】
次に本発明に用いる二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「特定二本鎖オリゴヌクレオチド」という。）について説明する。
特定二本鎖オリゴヌクレオチドは、片方の末端が互いに相補性がない塩基数１〜３０の一本鎖オリゴヌクレチドＡ１およびＡ２から構成され、さらに他方の末端が少なくとも末端に特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢから構成されており、その全塩基数は５〜８０塩基（一本鎖当たり）であり、好ましくは１０〜５０塩基（一本鎖当たり）である。ここで、全塩基数が５塩基未満であると制限酵素の認識部位を形成することが困難となったり、あるいは酵素反応が非効率的となり、８０塩基を超えると特定二本鎖オリゴヌクレオチドの合成効率が低下し、かつ特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離が非効率的となる。
【００１３】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドＢは、その末端および必要に応じてその相補鎖中に同一もしくは異なる種類の特定の制限酵素（例えばEcoR I、Not I、ScaI等）の認識部位を一つ以上有し、該認識部位は特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片とリガーゼ等の作用により結合する働きか、特定の制限酵素により切断される働きをもつものである。ここで二本鎖オリゴヌクレオチドＢの末端の制限酵素の認識部位は、塩基数の異なる接着末端型であっても良いし、塩基数の揃った平滑末端型であってもよい。
なお、二本鎖オリゴヌクレオチドＢが特定の制限酵素の認識部位を二つ以上有する場合、二本鎖オリゴヌクレオチドＢが特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片と結合した後、該結合部位とは別の部位の特定の制限酵素で切り出し、クローニング等に直接用いることが可能となる。
【００１４】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２は、その塩基数が１〜３０塩基であり、好ましくは５〜１５塩基である。ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の塩基数は、後述する粒子との固定化反応の効率およびオリゴヌクレオチドの対象性を考慮すると、塩基数が近いことが好ましいが、必ずしも同じ塩基数である必要はない。また、前記一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２は、互いに相補性がなく、アニール後も常に一本鎖状態を維持する。そこで前記一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２は、互いの相補性を回避するために一種類単独の塩基、例えばデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）またはデオキシグアニル酸（ｄＧ）のいずれかから構成されることが好ましい。
【００１５】
本発明に用いられる特定二本鎖オリゴヌクレオチドは、塩基数１〜３０塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２となり得る塩基配列と、アニール後に特定の制限酵素の認識部位を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドＢとなり得る塩基配列とを有する全塩基数５〜８０の一本鎖オリゴヌクレオチドを、通常のアニーリング条件でアニールさせることにより容易に形成することができる。
アニール後の特定二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドＢの塩基配列中に存在するアミノ基がアニーリングにより水素結合で束縛され、一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の塩基中にあるアミノ基のみがフリーな状態となるため、一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２が特異的に粒子表面に固定化される。従って、前記特定二本鎖オリゴヌクレオチドを用いれば一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の特定部位を特別な化学的修飾をすることなく、特異的に、かつ高い効率で粒子表面に固定化することができる。
なお、上記アニーリングにより得られた特定二本鎖オリゴヌクレオチドは、市販されているハイドロキシアパタイトカラムを通し、未反応の特定一本鎖オリゴヌクレオチドを除去することにより精製することができる。
【００１６】
特定二本鎖オリゴヌクレオチドを粒子に固定化させるためには、操作の簡便さ、固定化効率の高さおよび精度を考慮すると、粒子表面のカルボキシル基と一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２中の塩基のアミノ基とをアミド結合によって固定化させることが必要である。
【００１７】
上記固定化のための反応は、例えば適当な大きさの反応容器に、表面にカルボキシル基を有する粒子と前記特定二本鎖オリゴヌクレオチドとを仕込んだ後、脱水縮合剤を添加することにより行う。ここで脱水縮合剤としては、例えば１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン等の水溶性の脱水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、油溶性の脱水縮合剤も使用することができる。これらの脱水縮合剤は、使用する粒子が表面に有するカルボキシル基１グラム当量に対して、通常、１〜２０モル、好ましくは２〜１０モル使用する。
粒子の使用量は、特定二本鎖オリゴヌクレオチド１ミリモル当たり、通常、０．５〜５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇである。上記反応は、通常、ｐＨ３〜１１程度の水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃において、５分ないし一夜行えばよい。
上述のようにして得られる本発明の担体を用いて目的の特定の制限酵素の認識部位をもつ核酸断片と結合反応するとき、粒子担体は通常、水溶性媒体に分散させた状態で用いられる。この際の分散液の濃度は、通常、０．０５〜２５重量％であり、より好ましくは０．１〜１５重量％である。粒子濃度が０．０５重量％未満であると、特定の制限酵素の認識部位をもつ核酸断片と効率的に結合することができず、２５重量％を超えると制限酵素が粒子表面に付着して有効に働かない。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例
（１）一本鎖オリゴヌクレオチドの合成および精製
ＤＮＡ合成装置（アプライド  バイオシステム社モデルＡＢＩ３８１Ａ型）を用いてβ−シアノエチルホスホアミド法で、下記に示す塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）を合成した。なお、下記塩基配列はアニールさせて得られる特定二本鎖オリゴヌクレオチドが、片方の末端がその末端にＮｏｔＩの認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢと塩基数が１０塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２とから構成されるように設計した。
配列Ｘ（＋）；5'GGC CGC CTT TAG TGA GGG TTA ATG TCG ACA CCC CCC CCCC 3'
配列Ｘ（−）；3'     CG GAA ATC ACT CCC AAT TAC AGC TGT CCC CCC CCCC 5'
ここで、（＋）および（−）はそれぞれＤＮＡの＋鎖および−鎖を、５’および３’は５’末端および３’末端を表す。
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）をそれぞれ濃水酸化アンモニウム１０ｍｌで前記装置のカラムから切り出し、５５℃で一夜放置した後、真空乾燥した。次いで高速液体クロマトグラフィーで溶出液として１５重量％アセトニトリル溶液を用い、Ｃ１８逆相カラムにより精製した。精製した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）を１８重量％ポリアクリルアミドゲル中に電気泳動させ、該一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）が精製されていることを確認した。
得られた一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）の溶出液から、エタノールで沈澱させることにより一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）をさらにを濃縮・精製した。次に、濃縮・精製した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）をそれぞれ５００μｌの滅菌水に溶解した後、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量したところ、約５ｍｇの一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）が得られた。
【００１９】
（２）一本鎖オリゴヌクレオチドの末端リン酸化処理
（１）で合成した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）を８８μｌ（３ｍｇ）また、一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（−）を９１μｌ（３ｍｇ）取り、それぞれにポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）５００ユニットおよびアデノシン−５’三リン酸２ｎｍｏｌを混合し、１０倍プロトレーディンエンドキナーゼ緩衝液（東洋紡社製）５０μｌを加えてから滅菌蒸留水で５００μｌに調整した。
これらを３７℃のウォーターバス中で２時間反応させた後、９５℃で３分間放置し、エタノールを用いて沈澱、精製した。続いて、精製した末端リン酸化処理された一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）各１ｍｇをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）および１ｍＭエチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）５００μｌに溶解した。
【００２０】
（３）特定二本鎖オリゴヌクレオチドの形成
（２）で得られた末端リン酸化処理した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）をそれぞれ６ｎｍｏｌ採取し、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、１０倍アニーリング溶液（１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）、６０ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液）を１０μｌ加え、滅菌蒸留水で１００ｍｌに調整した。
これを８０℃のウォーターバスにて１０分間加温し、その後室温になるまで静置した（所要時間４時間）。この反応により、片方の末端が塩基数がそれぞれ１０塩基である二本の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２と、他方の末端がその末端に制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢとから構成される特定二本鎖オリゴヌクレオチドが得られた。得られた特定二本鎖オリゴヌクレオチドをハイドロキシアパタイトカラム（バイオゲルＨＰＨＴカラム、バイオラッド社製）を用いて０．６モルリン酸緩衝液を溶出液として精製を行った。精製後の特定二本鎖オリゴヌクレオチドを回収し、ブタノールで濃縮し、脱塩したところ、その収量は精製前の９１％であった。
【００２１】
（４）特定二本鎖オリゴヌクレオチドの粒子への固定化
平均粒子径が１．０μｍ、平均粒子径の標準偏差が５％、かつ粒子表面積１ｎｍ2当たり平均５個のカルボキシル基を有するポリスチレン粒子イムノテックスＬ０１０１（日本合成ゴム（株）製）の１０（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸懸濁液を１０００μｌ、（３）で得られた特定二本鎖オリゴヌクレオチド４ｎｍｏｌおよび１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０．５（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸溶液５００μｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより特定二本鎖オリゴヌクレオチド中の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２のｄｃの塩基配列中のアミノ基と粒子表面のカルボキシル基とをアミド結合させた。
その後、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して特定二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子を沈澱として回収した。次に結合用緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１（Ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）をオリゴヌクレオチド固定化粒子に１ｍｌ添加し再分散させた後、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、特定二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子を回収した。この操作を３回繰り返して最終的に特定二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子をＴＥ緩衝液１ｍｌ（固形分１０（Ｗ／Ｖ）％）に分散した（以下、「分散液ａ」という。）。
【００２２】
（５）ＮｏｔＩ末端をもつ核酸断片の調整
プラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）（ｐＢＳII  東洋紡社製）７５μｇ（約３８ｐＭ）、ＮｏｔＩ（１０ユニット／μｌ）２００ユニット、１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌ（いずれもタカラ社製）および滅菌蒸留水２９４μｌを混合し、３７℃にて３時間反応させた。反応終了後、反応混合液と等量のＰ．Ｃ．Ｉ（フェノール：クロロホルム：イソアミノアルコール＝２５：２４：１（容量比））溶液を加えて充分に混和し、１５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上部の水層を回収した。回収した水層に８Ｍアンモニウムアセテート１００μｌを加えて充分に混合をし、次いで１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、得られたＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）をＴＥ緩衝液２０μｌに分散させた。
【００２３】
（６）32Ｐによる標識
（５）で調整したＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）のＴＥ緩衝液にアルカリフォスフォターゼ（タカラ社製）約２μｌ（酵素活性にして４０ユニット）、１０倍アルカリフォスフォターゼ用緩衝液２μｌおよび滅菌蒸留水１６μｌを加えて３７℃で２時間反応させた後、６５℃で３０分間加熱した。この溶液にエタノール５０μｌを加え、−８０℃にて１０分間静置した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた沈澱をＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。この溶液にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーハイム社製）１μｌ（酵素活性にして８ユニット）、γ−32Ｐアデノシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣｉ）、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液５μｌおよび滅菌水１９μｌを加えて混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
次に反応液からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（”Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratories,1982,458）によって除去した後、反応液をＴＥ緩衝液で膨潤させたセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。
0004134351.tif 000002
ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各画分の放射線量をチェレンコフカウント法によって測定して素通り画分を判別し集めた。
この結果、32Ｐによって標識したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）のＮｏｔＩ消化物のＴＥ緩衝液（以下、「ＴＥ緩衝液Ｉ」という。）２０μｌが得られた。
【００２４】
（７）ＳｃａＩによる消化
（６）で得られたＴＥ緩衝液ＩにＳｃａＩ（１００／μｌ、タカラ社製）および１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌを加え、滅菌水で４００μｌに調製してから３７℃で３時間反応させた。反応終了後、等量のＰ．Ｃ．Ｉ溶液を加えて充分に混合し、次いで１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上部の水層を回収した。
回収した水層に８Ｍアンモニアアセテート１００μｌおよびエタノール８００μｌを加えて充分に混合してから１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＳｃａＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片を１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。
（６）と同様にしてチェレンコフ−カウント法によって放射線量を測定したところ、１μｌ当たり４０，０００ｒｐｍのカウントの放射線量を有する溶液であった。また、プラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片の濃度は０．３０ｐｍｏｌ／μｌ、ＮｏｔＩ末端サイトは０．６ｐｍｏｌｅ／μｌであった。
【００２５】
（８）ＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片の捕獲および分離の評価
（４）で得られた分散液ａを１０μｌずつＡ−１〜Ａ−４までの４本の遠心管に入れた。次いで（７）で調製したＮｏｔＩおよびＳｃａＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片をそれぞれ１、２、４、６ｐｍｏｌとなるようにＡ−１〜Ａ−４まで４本の遠心管に加えた。これら４本の遠心管にそれぞれ１０倍のライゲーション緩衝液（６６０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、６６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液）５μｌ、５０ｍＭ  ５’−アデノシン三リン酸５μｌ、５０％ポリエチレングリコール５μｌおよび３Ｍ塩化ナトリウム５μｌを加えた。そして、各遠心管にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラ社製、３５０ユニット／μｌ）５μｌを加えた後、滅菌蒸留水を加えて５０μｌに調製し、１７℃にて１２時間反応させた。反応終了後、４本の遠心管のチェレンコフカウントを測定し、それぞれを各遠心管のトータルカウントとした。
また、上記反応終了後、４本の遠心管にＭＢ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液）１０００μｌずつを加え、反応を停止させた。次いで４本の遠心管を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、ＴＥ緩衝液５０μｌに分散してチェレンコフカウントを測定し、それぞれを各遠心管のカウント２とした。
次いで、４本の遠心管にＮｏｔＩ（１００ユニット／μｌ）４０ユニットおよび１０倍ＨＢ緩衝液（タカラ社製）１０μｌを加え、滅菌蒸留水で１００μｌに調製し、３７℃で３時間反応させた。続いて１０，０００ｒｐｍで５分間遠心洗浄し、沈澱物をＴＥ緩衝液／０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回遠心洗浄した後、ＴＥ緩衝液で５０μｌに再分散したもののチェレンコフカウントを測定し、これらをカウント３とした。
ＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の捕獲率および回収率を次式により算出し、表１に示した。
【００２６】
【数１】
0004134351.tif 000003
【００２７】
【数２】
0004134351.tif 000004
【００２８】
【表１】
0004134351.tif 000005
【００２９】
【本発明の効果】
本発明によれば特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の結合、回収あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度良く行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体が得られる。