(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉに示した配列を持つインスリン誘導体：
0004044140.tif 000006
ここで、位置A21及びB3のＸaaは、独立して、遺伝子暗号によりコードされ得る、Lys、Arg及びCys以外の何れかのアミノ酸であり；
位置B1のXaaは、（a）アミノ基において式-CO-W-COOHの置換基［ここで、Wは12から22の炭素原子を持つ２価の長鎖炭化水素基］で、任意に置換されたPheであるか；又は（b）削除される（この場合、位置B2のVa1のアミノ基はフリーであるか、若しくは上記で定義した式-CO-W-COOHの置換基を有する）；
位置B28のXaaは（a）Proであるか（この場合、位置B29のXaaは、そのε-アミノ基において上記で定義した式-CO-W-COOHの置換基を有するLysである）；又は（b）Asp又はSerである（この場合、位置B29のXaaは、そのε-アミノ基において上記で定義した式-CO-W-COOHの置換基を有するLysである）；
位置B30のXaaは、（a）Thrであるか；（b）Alaであるか：又は（c）削除されており；及びその何れかの亜鉛複合物である。
【請求項２】
請求項１に記載のインスリン誘導体であって、位置A21のXaaは、Ala、Gln、Gly、Ser及びAsnよりなる群から選択されたアミノ酸残基であるインスリン誘導体。
【請求項３】
請求項２に記載のインスリン誘導体であって、位置A21のXaaは、Asnであるインスリン誘導体。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B3のXaaは、Asp、Gln、Thr及びAsnよりなる群から選択されたアミノ酸残基であるインスリン誘導体。
【請求項５】
請求項４に記載のインスリン誘導体であって、位置B3のXaaはAsnであるインスリン誘導体。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B1のXaaはPheであるインスリン誘導体。
【請求項７】
請求項１から５の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B1のアミノ酸は削除されているインスリン誘導体。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B28のXaaはProであり、同時に位置B29のXaaはLysであるインスリン誘導体。
【請求項９】
請求項１から７の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B28のXaaはSerであり、同時に位置B29のXaaはLysであるインスリン誘導体。
【請求項１０】
請求項１から9の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B30のXaaはThrであるインスリン誘導体。
【請求項１１】
請求項１から9の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B30のXaaはAlaであるインスリン誘導体。
【請求項１２】
請求項１から9の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B30のXaaは削除されているインスリン誘導体。
【請求項１３】
請求項１から６及び8から12の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B1のXaaは、該アミノ基において請求項１で限定された一般式-CO-W-COOHの置換基を持つPheであり、且つ位置B29のXaaは、該ε-アミノ基において請求項１に限定された一般式-CO-W-COOHの置換基を持つLysであるインスリン誘導体。
【請求項１４】
請求項１から５及び７から12の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、位置B1のアミノ酸は削除され、位置B2のValは、該アミノ基において請求項１に限定された一般式-CO-W-COOHの置換基を持ち、且つB29のXaaは、ε-アミノ基において、請求項１に限定された一般式-CO-W-COOHの置換基を持つLysであるインスリン誘導体。
【請求項１５】
請求項１から14の何れか１項に記載のインスリン誘導体であって、請求項１に限定されたようにWは、-（CH2）12-、-（CH2）14-、-（CH2）16-、-（CH2）18-、-（CH2）20-及び-（CH2）22-よりなる群から選択されるインスリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、天然に存在するインスリンおよびその類縁体の、溶解性で且つ遅効型活性を有する新規誘導体類、その様な誘導体を製造する方法、それらを含有する薬学的組成物、および糖尿病治療におけるその様な誘導体の使用に関する。
発明の背景
遅効型インスリンの１日当たり１回または２回の注射により基礎的要求に対応すると共に、薬物適用量１回分の即効型インスリンの注射を補充して食事に関連した要求に対応することを含む薬剤投与計画において、多くの糖尿病患者は１日当たり複数回のインスリン注射を処置される。
遅効型インスリン組成物は、当該技術分野において周知である。例えば、１つの主要なタイプの遅延型インスリン組成物は、インスリン結晶または非晶質インスリンの注射用懸濁液からなる。これらの組成物において、利用されるインスリン化合物は、一般的には、プロタミンインスリン、亜鉛インスリンまたはプロタミン亜鉛インスリンである。
ある種の欠点は、インスリン懸濁液の使用に関連している。即ち、厳密な用量を確保するためには、定められた懸濁液の容量をバイアルから引き抜くまたはカートリッジから噴出する前に、緩やかに振盪することによって、インスリン粒子を均一に懸濁しなければならない。また、塊形成や凝集を防止するために、インスリン懸濁液の貯蔵についても、インスリン溶液よりも更に緻密な範囲内で温度を維持しなければならない。
当初、プロタミンは非免疫原性であると考えられていたにも関わらず、現在では、プロタミンはヒトにおいて免疫原となり得ること、更にそれらを医療目的で使用することが抗体の形成を導く可能性を示すことが判明した（Samuel et al.,ヒトおよび実験動物における、マイクロ補体凝集試験の結果によるプロタミンの免疫原性についての研究、Clin.Exp.Immunol,33,pp.252-260（1978））。また、プロタミンインスリン複合体は、それ自身、免疫原性であるという証拠も分かってきている（Kurtz et al.,プロタミンインスリンで治療した患者におけるプロタミンに対する循環IgG抗体、Diabetologica  25,pp.322-324（1983））。それ故に、ある患者にとっては、プロタミンを含む遅効型インスリン組成物の使用は禁忌である。
もう一つのタイプの遅効型インスリン組成物は、インスリンが沈澱するであろう生理的なｐH値よりも低いpH値を有する溶液であり、これは該溶液を注射したときに、ｐH値が上昇するためである。欠点は、インスリンの固体粒子が、注射部位で組織の炎症を誘発する部分的刺激原として作用することである。
WO91/12817（Novo  Nordisk  A/S）は、コバルト（III）のインスリン複合体を含有する遅効型の溶解性インスリン組成物類を開示している。これら複合体の遅効性は中間型でしかなく、更に生物学的利用能は低減されている。
ヒトインスリンは３つの１級アミノ基を持つ：即ち、Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端基とLysB29のε−アミノ基である。これらの官能基を１以上置換した幾つかのインスリン誘導体が従来技術では公知である。例えば、米国特許第3,528,960号（Eli Lilly）は、Ｎ−カルボキシアロイルインスリンに関連するものであり、インスリン分子の１、２または３の１級アミノ基がカルボキシアロイル基を有している。ＮεB29置換インスリンについての特別な開示はない。
英国特許第1.492.997号（Nat.Res.DeV.Corp.）によれば、ＮεB29でのカルバミル置換を伴なうインスリンは低血糖効果について改善された側面を持つ。
日本出願公開番号第1-254699（Kodama Co.,Ltd）は、アルカノイル基が、PheB1のアミノ基若しくはLysB29のε-アミノ基、またはこれらの両方に結合しているインスリンを開示している。提示された該誘導体の目的は、薬学的に許容される安定したインスリン製剤を得ることである。
B30位に、少なくとも５炭素原子を有するアミノ酸［これが必ずしもヌクレオチドトリプレット（コドン）によりコードされる必要はない］を持つインスリン類縁体が、日本出願公開番号第57-067548号（Shionogi）で開示されている。このインスリン類縁体は、真性糖尿病、特にウシインスリンまたはブタインスリンに対する抗体産生に起因したインスリン抵抗性を持つ患者の治療において有用であることか特許請求されている。
米国特許第5,359,030号（Ekwuribe, Protein Delivery, Inc.）は、直線状のポリアルキレン部分が親油性部分を含むポリマーと共有結合したポリペプチドを具備する、経口投与または非経口投与のための配合安定化したポリペプチド組成物であって、該ポリペプチドが酵素分解に対する増強化されたインビボでの抵抗性を持つように、前記部分が互いに深く関与して配置されるているポリペプチド組成物が記載されている。
欧州特許511600 A2号は、特に、式［タンパク］［Z］nのタンパク誘導体に関しており、ここで［タンパク］は、アミノ基の代わりに、その水素原子の１つを取り除くことにより、アミノ基から夫々由来するｎアミノ残基を有するタンパクを表し、［Z］は、式-CO-W-COOHにより表される残基であり、ここでWは、２価の長鎖の炭化水素基であり、また、一定のヘテロ原子をも含んでいてよく、ｎは、［Z］と［タンパク］の間のアミド結合の数の平均値を表す。該発明のタンパク誘導体類は、それらが由来するタンパクと比較して、血清中の半減期が極めて延長されていること、さらにそれらが抗原性を持たないことが記載される。また、インスリンは、該発明による誘導体から製造することが可能なタンパクの１つであるが、特定のインスリン誘導体が欧州特許511600号においては記載されておらず、また、有益なインスリン誘導体を得るために導入すべき好ましい［Z］またはその好ましい導入位置（単数または複数）について、如何なる示唆もされていない。
国際公開番号WO95/０7931号（Novo Nordisk A/S）は、インスリン誘導体を開示しており、ここで、30位のアミノ酸は、（a）コードされない10から24の炭素原子を持つ親油性アミノ酸であるか（この場合、LysB29のε-アミノ基は低級アシル置換基を持つ）または（b）何れかのコードされるアミノ酸であるか（この場合、LysB29のε-アミノ基が親油性置換基を持つ）、または（c）削除される（この場合、LysB29のε-アミノ基は親油性置換基を持つ）。該インスリン誘導体は、生理的ｐＨ値で溶解性を有し、遅効型活性プロファイルを有する。
ここで用いる「インスリン」は、CysA7とCysB7の間、及びCysA20とCysB19の間のジスルフィド結合による架橋、およびCysA6とCysA11の間の内部のジスルフィド結合による架橋を含むヒトインスリンの分子構造と等しい分子構造を持ち、且つインスリン活性を有するペプチドを意味する。B1位でのアミノ酸が、削除されているとき、B鎖の残るアミノ酸の位置の番号を付け替えることはしない。
既に多くの改良が本分野において行われているにも関わらず、未だに、溶液であり、注射後も溶液中で安定であり、炎症性と免疫原性が最小限であるインスリンを含有する新規遅効性注射用インスリン組成物が必要とされている。
本発明の一つの目的は生理的ｐＨ値で溶解性を有し、且つ遅効型活性プロファイルを有するインスリン誘導体を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、皮下注射後の注射部位からの長い消失半減期を持つインスリン誘導体を提供することである。
本発明の更なる目的は、本発明によるインスリン誘導体を具備する薬学的組成物を提供することである。
更に、本発明の更なる目的は、非免疫原性インスリン誘導体を供給することである。
更に、本発明の更なる目的は、本発明のインスリン誘導体を製造する方法を提供することである。
更に、本発明の更なる目的は、糖尿病治療の方法を提供することである。
発明の概要
驚くべきことに、本来存在するインスリンおよびインスリン類縁体のある種の誘導体［ここで、Ｂ鎖のN-末端アミノ酸のアミノ基および／またはLysB29のε-アミノ基は以下に定義する式-CO-W-COOHである親油性置換基を有する］は、遅効型活性プロファイルを持ち、生理的ｐＨ値で溶解性を有することが明らかになった。
よって、最も広い側面において、本発明は式Ｉに示すインスリン誘導体に関する：
0004044140.tif 000002
ここで、位置A21およびB3のXaaは、独立して、遺伝子暗号によりコードされ得る、Lys、ArgおよびCys以外の何れかのアミノ酸残基であり；
位置B1のXaaは、（a）アミノ基において式-CO-W-COOHの置換基［ここで、Wは12から22の炭素原子を持つ２価の長鎖炭化水素基である］で任意に置換されたPheであるか；または、（b）削除される（この場合、位置B2のValのアミノ基はフリーであるか、若しくは上記で限定された式-CO-W-COOHの置換基を有する）；
位置B28のXaaは、（a）Proであるか（この場合、位置B29のXaaは、任意に、そのε-アミノ基において上記で限定する式-CO-W-COOHの置換基を有するLysである）；または、（b）Serであるか（この場合、位置B29でのXaaは、任意に、そのε-アミノ基において上記で限定する式-CO-W-COOHの置換基を有するLysである）；または（c）任意に、ε-アミノ基において、上記に限定する式-CO-W-COOHの置換基を有するLysである（この場合、Lysのε-アミノ基が任意に置換基を有するか否かに関わらず、位置B29のXaaはProである）；
位置B30のXaaは、（a）Thrであるか、（b）Alaであるか;または（c）削除されて；その何れかの亜鉛複合体である。但し、式Ｉのインスリン誘導体は上記で定義した式-CO-W-COOHの少なくとも１つの親油性置換基を持つという条件を伴なう。
もう一つの側面において、本発明は、上記一般式Ｉのインスリン誘導体［ここで、位置A21、B1、およびB3におけるXaaは上記で定義した通りであり、一方、位置B28でのXaaはAspであり、B29でのXaaは、そのε-アミノ基において、上記限定で定義した式-CO-W-COOHの置換基を持つLysであり、位置B30でのXaaはThrである］に関する。
もう一つの側面において、本発明は上記一般式Ｉのインスリン誘導体［ここで位置A21、B１およびB3でのXaaは上記限定の通りであり、一方、位置B28でのXaaはProであり、位置B29でのXaaはThrであり、位置B30でのXaaは、そのε-アミノ基において、上記で定義した式-CO-W-COOHの置換基を有する］に関する。
本発明の一つの好ましい態様において、2価の長鎖炭化水素基である、Wは-（CH2）12-である。
本発明の一つの好ましい態様において、2価の長鎖炭化水素基である、Wは-（CH2）13-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）14-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）15-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、2価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）16-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）17-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）18-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）19-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）20-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）21-である。
本発明のもう一つの好ましい態様において、２価の長鎖炭化水素基である、Wは、-（CH2）22-である。
更に本発明の好ましい特徴は、添付の請求の範囲から明らかであろう。
本発明の好ましいインスリン誘導体の例は、以下の通りである：
NεB29-（CO-（CH2）14-COOH）ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）16-COOH）ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）18-COOH）ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）20-COOH）ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）22-COOH）ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）14-COOH）AspB28-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）16-COOH）AspB28-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）18-COOH）AspB28-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）20-COOH）AspB28-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）22-COOH）AspB28-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB30-（CO-（CH2）14-COOH）ThrB29LysB30-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB30-（CO-（CH2）16-COOH）ThrB29LysB30-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB30-（CO-（CH2）18-COOH）ThrB29LysB30-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB30-（CO-（CH2）20-COOH）ThrB29LysB30-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB30-（CO-（CH2）22-COOH）ThrB29LysB30-ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB28-（CO-（CH2）14-COOH）LysB28ProB29ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB28-（CO-（CH2）16-COOH）LysB28ProB29ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB28-（CO-（CH2）18-COOH）LysB28ProB29ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB28-（CO-（CH2）20-COOH）LysB28ProB29ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB28-（CO-（CH2）22-COOH）LysB28ProB29ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）14-COOH）desB30ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）16-COOH）desB30ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）18-COOH）desB30ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体：
NεB29-（CO-（CH2）20-COOH）desB30ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体；
NεB29-（CO-（CH2）22-COOH）desB30ヒトインスリンおよびその何れかの亜鉛複合体。
発明の詳細な説明
用語
ここで使用するアミノ酸残基を示す3文字コードはJ.Biol.Chem.243,P.3558（1968）において示されたものである。
「コードされるアミノ酸」の表現は、遺伝子暗号、即ちヌクレオチドトリプレット（「コドン」）によりコードされ得るアミノ酸を示すことを意図する。
発明の化合物の製造方法
本発明の化合物は、それ自体公知の方法により製造することが可能である。従って、式Ｉの-CO-W-COOH基は、活性化エステルまたは活性化アミド、例えば、二酸であるHOOC-W-COOHのアゾリド、を介してインスリン部分に導入することが可能である。活性化エステルの製造方法は、特に、欧州特許第0 511600 A2号（Kuraray Co.,Ltd.）およびWO95/07931号（Novo Nordisk A/S）に開示されている。
アゾリド類の製造方法は、フォーストによる記載（W. Foerst, ed. Neure Methoden Der Praparativen Organischen Chemie, Band V,p53-93（Verlag Chemie,Weinheim（1967）））に開示される。
-CO-W-COOH基は、保護されるA鎖およびB鎖のN末端アミノ基のアミノ基においてインスリン部分に導入することが可能である。これは国際公開番号第WO95/07931号に記載される方法と類似する。この場合、脱保護のステップが、追付される例１および例２で説明するように、-CO-W-COOH基の導入に続いて行われる。
その代わりとして、例えば欧州特許第0 712 862 A2号に記述される選択した適切な反応条件により、A鎖およびB鎖のN末端アミノ基に頼らずに、Lys残基のε-アミノ基に選択的に-CO-W-COOH基の導入を行うことが可能である。これは、以下の例３および４に説明している。
本発明の化合物により得られた実験結果
本発明の化合物についての必然的な実験データを表1に示した。
親油度
ヒトインスリンに関連するインスリン誘導体の親油度、k’relは、LiChrosorb RP18（5μm、250×4mm）HPLCカラム上でのアイソクラチック溶出によって、40℃で、溶出液としてA）0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.3、10％アセトニトリル含有と、B）水中の50%アセトニトリルとの混合物を使用して測定した。溶出は、214nmでの溶出液のUV吸収を追跡することによりモニターした。無負荷時間（Void time）、T0は、0.1mMの硝酸ナトリウムの適用により測定した。ヒトインスリンの保持時間、Thumanは、AおよびB溶液の間の割合を変更することにより、少なくとも2t0に調節した。K'rel=（t誘導体-t0）/（tヒト-t0）。
ブタにおけるインスリン誘導体の皮下注射後の注射部位からの消失半減期、T50%の決定
T50%は、外部からγカウンターにより測定されるA14Tyr（125I）標識類縁体の50％が注射部位から消失する時間である（Ribel,U et al.,人における皮下吸収のためのモデルとしてのブタ：M.Serrano-Rios and P.J.Lefeber（Eds）:Diabetes 1985;Proceedings of the 12th Congress of the International Diabetes Federation, Madrid, Spain,1985（Excerpta Medica,Amsterdam,（1986）891-96）。
上記のT50%の決定において使用するために、試験するべき生成物の試料を標準ラクトペルオキシダーゼ法を用いて125Iで沃素化し、TyrA14標識化生成物をエタノール／トリスでのアイソクラチックHPLCにより単離した。
ブタアルブミンへの結合
ブタアルブミンへの結合は、インビトロアッセイにより決定した。「アルブミン結合」の項目下の表1に示した数値は、対照化合物ＥＸＡと比較している。
0004044140.tif 000003
薬学的組成物
本発明のインスリン誘導体を含有する薬学的組成物は、それによる治療が必要な患者に対して非経口投与することができる。非経口投与は、注射器、任意にペン型注射器のような手段による皮下、筋肉内、又は静脈内注射により行ってよい。或いは、非経口投与は、点滴ポンプのような手段により行うことも可能である。更なる選択肢は、鼻用スプレーの形態でのインスリン誘導体投与を行うための粉末又は液体でもよい組成物である。また、更なる選択肢として、インスリン誘導体を経皮的に投与することも可能である。
本発明のインスリン誘導体を含有した薬学的組成物は、従来の技術、例えば、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Sciences,1985）に記述された技術により製造することができる。
例えば、本発明のインスリン誘導体の注射用組成物は、所望の最終生成物を適切に得るための成分を溶解、混合することを含む製薬工業の従来技術を用いることにより製造することが可能である。
例えば、ある方法によれば、該インスリン誘導体は、調製する組成物の最終容量よりもやや少ない量の水に溶解される。等張剤、防腐剤及び緩衝剤を必要に応じて加え、（もし、必要であるならば）溶液のｐＨ値を、酸、例えば塩酸等、又は塩基、例えば水酸化ナトリウム等を必要に応じて用いて調整する。最後に、該溶液の容量を水で調整し、所望に応じた成分濃度を得る。
等張剤の例は、塩化ナトリウム、マンニトール及びグリセロールである。
保存剤の例は、フェノール、ｍ−クレゾール、p−ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切な緩衝剤の例は、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムである。
本発明のインスリン誘導体類の好ましい薬学的組成物は、ヘキサマー複合体の溶液である。典型的には、このヘキサマー複合体は、ヘキサマー当たり2以上の亜鉛イオン、及び3分子以上のフェノール化合物（例えばフェノール若しくはメタクレゾール、又はその混合物）により安定化される。
特定の態様においては、可溶性のヘキサマー複合体の形態で、２つの異なるインスリンを含有する組成物が提供される。１つは遅効型の活性を持ち、１つは即効型の活性を持つ。典型的には、このヘキサマー複合体は、２以上の亜鉛イオン及び３分子以上のフェノール化合物、例えばフェノール若しくはメタ-クレゾール、又はその混合物により安定化される。該複合体は、これら特定のインスリンのヘキサマーの混合物であり、２つの異なるインスリンの比率が１：５から５：１の間である混合ヘキサマーである。
インスリン誘導体の鼻科用投与のための組成物は、例えば、欧州特許第272097号（Novo Nordisk A/S）に記載される通りに製造できる。
本発明のインスリン誘導体は、糖尿病の治療において使用することが可能である。使用する特定のインスリン誘導体及び何れかの患者に対する最適用量レベルは、使用される具体的なインスリン誘導体の効果、年齢、体重、物理的活性、及び患者の食餌療法を含む多様な因子、可能な他剤との組み合わせ、並びにその症例の重度に依存するであろう。本発明のインスリン誘導体の用量は、公知のインスリンと同様に、当業者により夫々個々の患者に対して決定することを薦める。
本発明を、更に以下の例により詳細に説明するが、これは保護の範囲を制限するものと解されるべきものではない。上記において開示した特徴および以下の例は両者とも、独立して、またその何れかの組み合わせによって、その種々の形態での本発明を理解するための資料とすることができる。
例
以下の化学薬品の頭字語を使用する：
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DIC：N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド
HOBT：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
TFA：トリフルオロ酢酸
分析
製造された生成物の分子量は、プラズマ脱着マススペクトロメトリー（PDMS）によりBio-lon 20機器（Bio-lon Nordic AB,Uppsala,Sweden）を用いて得た。
例１
NεB29-（CO-（CH2）12-COOH）des（B30）ヒトインスリンの合成
テトラデカン二酸（tetradecanedioic acid;Sigma,10mg）、HOBT（10mg）及びエチルジイソプロピルアミン（10μl）をDMF（400μl）に溶解し、DIC（6μl）を添加した。その混合物を25℃で１時間放置し、次にDMF（600μl）及びA1,B1-（Boc）2-des（B30）ヒトインスリンを添加した。25℃で１時間の後、水（200μl）を添加し、更に15分後、エタノール（1ml）とエーテル（5ml）の添加により、中間体の沈殿を達成した。その沈殿物を遠心により単離し、エーテルで洗浄（2回）し、乾燥した。乾燥した中間体をTFA（1ml）に溶解し、25℃での15分の後、エーテル（5ml）を添加することにより生成物を沈殿させた。その沈殿物を遠心により単離し、エーテルで洗浄（3回）し、乾燥した。
精製を、C18逆相HPLCカラム上での２ステップ逆相HPLC法で行った。第１ステップは、エタノール／トリス緩衝液（40％エタノール）でアイソクラチック溶出した。クロマトグラフィにおいて最大のピークを構成する所望する物質を回収し、Sep−PakRカラム上で脱塩し、アセトニトリル／TFA勾配溶液（20-60%アセトニトリル）で再クロマトグラフィを行い、45.8%アセトニトリルで該生成物を溶出した。純度は>95%であると評価された。
該生成物の同定は、PDMS（天然物、還元物およびV8-プロテアーゼによる消化物）により確認し、それぞれ天然の類縁体、Ｂ鎖及びＢ鎖のＣ末端断片に対応して、それぞれ5947、3571及び1255のMWを得た。
例２
N-εB29-（CO-（CH2）14-COOH）des（B30）ヒトインスリンの合成
表題化合物を、テトラデカン二酸の代わりにヘキサデカン二酸（hexadecanedioic acid）を使用したことを除いて、例1に記載の方法により合成した。
精製は、本質的に例1に記載した通りに行った。アイソクラチック溶出において、42.4%エタノールを含有したエタノール／トリス緩衝液を用いた。クロマトグラフィにおいて最大ピークを構成する所望する物質を回収しSep-PakRカラム上で脱塩し、アセトニトリル／TFA勾配溶液（20−60%アセトニトリル）での再クロマトグラフィを行い、48.2%アセトニトリルで該生成物を溶出した。純度は、＞95％であると評価された。
該生成物の同定は、PDMS（天然物、還元物およびV8-プロテアーゼによる消化物）により確認し、天然の類縁体、Ｂ鎖及びＢ鎖のＣ末端断片に対応して、それぞれ5976、3601及び1285のMWを得た。
例３
NεB29-（CO-（CH2）18-COOH）des（B30）ヒトインスリンの合成
10mgのエイコサン二酸（eicosadioic acid）、10mgのヒドロキシベンゾトリアゾール及び2.5μlのジイソプロピルカルボジイミドを300μlのN-メチルピロリジンに溶解し、25℃で１時間放置した。次に、2mlの水、2.6mlのN-メチルピロリドン及び200μlのジイソプロピルエチルアミンの混合物中の150mgのdes（B30）ヒトインスリンの溶液を添加し、その反応混合物を室温で１時間放置した。次に、その混合物を水で希釈し、C18逆相HPLCカラムに適用し、48%のエタノールを含有するトリス緩衝液で溶出した。更なる精製は、同じカラム上での逆相HPLCで、アセトニトリル／TFA勾配溶液を用いて溶出することにより行い、55%のアセトニトリルで表題化合物を溶出した。
例４
NεB29-（CO-（CH2）16-COOH）des（B30）ヒトインスリンの合成
Des（B30）ヒトインスリン（99mg〜17.34μmol）を6mlのN-メチルピロリドン／水（30/70 v/v）と84μlジイソプロピルエチルアミン中に溶解した。360μlのN-メチルピロリドン中に溶解した28.5mg〜69.4μmolのN-（17-カルボキシヘプタデカノイルオキシ）サクシンイミド（Mw 411）を添加した。室温で１時間後、該反応混合物を6.5mlのエタノールで希釈し、pHを11.4から7.3に1NのHClを用いることにより調整し、該希釈液を、1×25cmカラムに充填したSourceTMQ15（ファルマシア・バイオテック）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィに供した。該カラムを、40ml/hの割合のKClの直線勾配を使用し、即ち50％エタノール中の30mMトリスpH7.3緩衝液から200mM KCl含有50％エタノール中の30mMトリスpH7.3緩衝液まで使用し、300mlの各溶媒を用いて溶出した。約200mlの溶出の後、表題化合物がカラムから排出され、それを15mlの量で回収した。プールしたものを、22.5mlの水で希釈し、1NのHClを使用してpHを6.0に調整した。4℃で一晩沈殿させた後、その生成物を遠心によって単離した。
該沈殿物を、3.3mlの水中の20%のアセトニトリル（v/v）に溶解し、標識化合物を、ジメチルブチルジメチルで置換した、100オングストロームのポアサイズを持つ5μシリカ球体の1×25cmのカラム上で2回、通すことより精製した。溶出は、5ml/minの割合で40分に亘り、溶媒A［20%のアセトニトリル中の18.75mM（NH4）2SO4、12.5mMトリスpH7.0］と溶媒B［80%のアセトニトリル］との89/2（v/v）から、同じ溶媒の40/60（v/v）の割合までの直線勾配を用いて行った。表題化合物は21-24min後、該カラムから外へ排出した。アセトニトリルを真空下で蒸発することにより除去し、該生成物を、PD-10 SephadexR G-25Mを用いた10mMの炭酸水素アンモニウム／アンモニア緩衝液pH8.8でのゲルろ過により脱塩した。最終的に、該生成物を凍結乾燥による乾燥状態で単離した。収量43mg。純度99%。
表題化合物の分子量のMSによる実測値：6000±6；理論値：6003.
例５
亜鉛存在下でのNεB29-（CO-（CH2）16-COOH）des（B30）インスリンの結晶化
亜鉛を含有した表題化合物の結晶は、様々な条件を用いて、トリス／クエン酸塩緩衝液中で得た：
インスリン類縁体：7.5mg/ml、2.5から20mg/mlの範囲。
酢酸亜鉛：1mM。
トリス：0.5M
クエン酸三ナトリウム：0.1-0.4M。
フェノール又はm-クレソール：0.05%（w/v）、0.02-0.15%の範囲。
pH：8.2
該結晶の外見は、複屈折で、細長い菱面体晶系である。
例６
亜鉛不存在下でのNεB29-（CO-（CH2）16-COOH）des（B30）インスリンの結晶化
亜鉛を含有しない表題化合物の結晶は、様々な条件を用いて、酢酸ナトリウム中で得た：
インスリン類縁体：20mg/ml、10から40mg/mlの範囲。
酢酸ナトリウム：0.35-0.5M。
エタノール：18%、15-25%の範囲。
緩衝剤：酢酸アンモニウム／アンモニア、0.02M、pH9.0。
フェノール：任意に、0−0.05%の範囲。
pH：9.0
該結晶の外見は、複屈折ではない、立方体又は斜方１２面体である。
例７
薬学的製剤
s.c.又はi.m.注射治療に適した薬学的溶液は、例えば、以下のようにして構成される：
600nmol/ml（〜600μM）のインスリン類縁体、例えば、NεB29-（CO-（CH2）16-COOH）des（B30）ヒトインスリン。
5mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5
10mM塩化ナトリウム
16mMフェノール
16mM m-クレソール
200-300μM亜鉛
1.6%（w/v）グリセロール
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：
（Ａ）名称：ノボ・ノルディスク  Ａ／Ｓ
（Ｂ）通り：ノボ・アレ
（Ｃ）市：ＤＫ−２８８０  バグスバエルト
（Ｅ）国：デンマーク
（Ｇ）電話：＋４５  ４４４４８８８８
（Ｈ）テレファックス：＋４５  ４４４９０５５５
（Ｅ）テレックス：３７１７３
（ii）発明の名称：ペプチド誘導体
（iii）配列の数：２
（iv）通信宛先：
（Ａ）名宛人：ノボ・ノルディスク  Ａ／Ｓ  コーポレート・パテンツ
（Ｂ）通り：ノボ・アレ
（Ｃ）市：ＤＫ−２８８０  バグスバエルト
（Ｅ）国：デンマーク
（iv）コンピュータ読取り可能な形態：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：マイクロソフト・ワード
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先行の出願データ：
（Ａ）出願番号：ＤＫ  ０１８８／９６
（Ｂ）出願日：１９９６年２月２１日
（viii）アトニー／エージェント情報
（Ａ）氏名：ヨルゲンセン，ダン  他
（Ｃ）参照／ドケット番号：４６６２−ＷＯ，ＤＪ
（ix）電信情報：
（Ａ）電話：＋４５  ４４４４８８８８
（Ｂ）テレファックス：＋４５  ４４４９３２５６
（２）配列認識番号：１のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：不定部位
（Ｂ）存在位置：２１
（Ｄ）他の情報：配列番号１の位置２１のXaaは、遺伝子暗号によりコードされ得る、Lys、Arg及びCys以外の何れかのアミノ酸残基である。
（xi）配列の記載：配列認識番号：１：
0004044140.tif 000004
（２）配列認識番号：２のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：不定部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：配列番号２の位置１のXaaは、Pheであるか；又はアミノ基において式-CO-W-COOHの置換基で置換されたPhe［ここで、Wは、12から22の炭素原子を持つ2価の長鎖炭化水素］であるか；又は削除されている（この場合、位置B2のValのアミノ基は置換されていないか、上述の式-CO-W-COOHの置換基を持つかの何れかである）。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：不定部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：配列番号２の位置３のXaaは遺伝子暗号によりコードされ得る、Lys、Arg及びCys以外の何れかのアミノ酸である。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：不定部位
（Ｂ）存在位置：２８
（Ｄ）他の情報：配列番号２の位置２８のXaaは、Pro、Asp又はSerあるか（この場合、位置29のXaaは、任意にε-アミノ基を式-CO-W-COOHの置換基で置換されたLys［ここで、Wは、12から22の炭素原子を持つ２価の長鎖炭化水素基］であり、また、位置30のXaaはThrである）；又は、位置28のXaaがProである場合、位置29のXaaはThrであることができ、位置30のXaaは、任意にε-アミノ基を式-CO-W-COOHの置換基で置換されたLysであり得る［ここで、Wは、12から22の炭素原子を持つ２価の長鎖炭化水素基］。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：不定部位
（Ｂ）存在位置：２９
（Ｄ）他の情報：配列番号２の位置29のXaaは、任意にε-アミノ基を式-CO-W-COOHの置換基で置換したLysであるか［ここで、Wは12から22炭素原子を持つ２価の長鎖炭化水素基］；又はProであるか；又はThrである。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：不定部位
（Ｂ）存在位置：３０
（Ｄ）他の情報：配列番号２の位置30のXaaは、Thr；又は任意にε-アミノ基を式-CO-W-COOHの置換基で置換したLys［ここで、Wは12から22炭素原子を持つ２価の長鎖炭化水素基］である。
（xi）配列の記載：配列認識番号：２：
0004044140.tif 000005