(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を有効成分とする脱水剤。
【請求項２】
サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質が、無水結晶、１含水結晶及び無水非晶質から選ばれる脱水能を有する糖質であることを特徴とする請求項１記載の脱水剤。
【請求項３】
サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する無水結晶が、水分１５ｗ／ｗ％未満のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質のシラップを種晶共存下で５０℃乃至１８０℃の温度範囲に維持しつつ当該無水結晶を晶出させ、これを採取したものであることを特徴とする請求項２記載の脱水剤。
【請求項４】
１含水結晶が、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質のシラップ又は５乃至６含水結晶を乾燥して採取したものであることを特徴とする請求項２記載の脱水剤。
【請求項５】
サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質が、澱粉質由来の糖質であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の脱水剤。
【請求項６】
含水物に、請求項１乃至５のいずれかに記載の脱水剤を含有、接触又は共存させることを特徴とする含水物の脱水方法。
【請求項７】
含水物を脱水することにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質の５乃至６含水結晶を生成することを特徴とする請求項６記載の脱水方法。
【請求項８】
含水物１重量部に対して、請求項１乃至５のいずれかに記載の脱水剤を０．００１乃至２００重量部の範囲で含有、接触又は共存させることを特徴とする請求項６又は７記載の含水物の脱水方法。
【請求項９】
含水物が、糊化澱粉、アルコール、油溶性物質又は生理活性物質を含有していることを特徴とする請求項６、７又は８記載の含水物の脱水方法。
【請求項１０】
含水物に、請求項１乃至５のいずれかに記載の脱水剤を含有、接触又は共存させて得られる脱水物品。
【請求項１１】
脱水物品が、食品、医薬品、化粧品、これら原材料又は加工中間物であることを特徴とする請求項１０記載の脱水物品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質（当該糖質を、その構造にちなんで、本明細書では、以下、「環状四糖」と称する。）を有効成分とする脱水剤及びそれを用いる含水物の脱水方法並びにその方法で得られる脱水物品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖質を用いる脱水方法は、先に、本発明者等が、特開昭６２−１３６２４０号公報、特開昭６２−１５２５３６号公報、特開昭６２−１５２５３７号公報、特開平６−１７０２２１号公報などで開示したように、無水糖質が、水分を捕捉して含水結晶に変換される途上に脱水力を発揮させる方法である。この方法は、加熱乾燥などとは違って、苛酷な条件を必要としないので、含水物を変質、劣化させること無く、脱水物品に変換する特微を有している。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら方法のうち、特開昭６２−１５２５３６号公報で開示した、無水グルコース、無水ガラクトースなどの無水アルドヘキソースを用いる場合には、脱水量が比較的大きいものの還元性糖質であることから反応性に富み、アミノ酸、ペプチドなどと褐変反応を起こし易く、脱水物品の保存安定性に不安のあることが判明した。また、無水アルドヘキソースは、比較的高湿度においても含水結晶に変換せず、脱水力の乏しいことが判明した。また特開昭６２−１３６２４０号公報で開示した無水マルトースを用いる場合や、特開昭６２−１５２５３７号公報で開示した無水パラチノースを用いる場合には、その還元力が弱いものの基本的には還元性糖質であり、脱水物品の長期安定性に、なお不安が残ることが判明した。その上、捕捉できる水分量がどちらの場合も糖質の約５ｗ／ｗ％と比較的少ないことから、脱水剤として多量の無水マルトースあるいは無水パラチノースを必要とする欠点のあることも判明した。
【０００４】
一方、特開昭６２−１５２５３７号公報で開示した無水ラフィノース、無水エルロース、無水メレチトースなどの非還元性無水グリコシルフルクトシドは還元力を持たないためアミノ酸、ペプチドなどとの褐変反応もなく、長期保存安定性において優れていると考えられる。しかしながら、その分子内に耐酸性の小さいフルクトシド結合を持っていることから、酸性含水物の脱水剤としては、必ずしも適していないことが想定され、得られる脱水物品の安定性にも不安が残る。また、特開平６−１７０２２１号公報で開示した無水α，α−トレハロースは還元力を持たないので長期保存安定性に優れており、さらに捕捉できる水分量は糖質の約１０ｗ／ｗ％と比較的多いことから脱水剤として上記の糖質よりも適しているといえる。しかしながら、依然として多量の無水α，α−トレハロースを必要としているため、さらに脱水及び／又は乾燥効率の高い脱水剤が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、糖質を用いる脱水方法における欠点を解消することを目的として、天然型の非還元性糖質の無水物を検索し、更に優れた脱水剤の確立とその利用について鋭意検討を続けてきた。
【０００６】
一方、本発明者等は、先に実験室レベルでの製造方法が知られていた環状四糖を工業レベルで澱粉質を原料として比較的安価に大量生産する方法を確立した。併せて、環状四糖には少なくとも含水形態としての５乃至６含水結晶及び１含水結晶、及び無水形態としての無水結晶及び無水非晶質の形態が存在することを明らかにし、その後の研究により、無水結晶、１含水結晶及び無水非晶質の環状四糖は水分を吸収し、含水形態である５乃至６含水結晶に容易に変換し得ることを発見した。
【０００７】
この特徴を脱水剤に利用すべくさらに研究を重ねたところ、上記した無水結晶、１含水結晶及び無水非晶質から選ばれる環状四糖は、優れた脱水能を有しており、加えて、得られる脱水物品が極めて安定であることから広範囲に適用でき、従来知られていた糖質よりも脱水剤として好適であることを見出した。即ち、脱水能を有する環状四糖、つまり無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖から選ばれる糖質を含水食品、含水医薬品などの含水物に含有、接触又は共存させて５乃至６含水結晶環状四糖に変換させることにより、環状四糖の結晶水として多量の水分を捕捉し、かつきわめて強力な脱水剤として作用すること、及び安定性に優れるため酸性含水物を含めて広範囲の含水物に適用できることを見出し、風味良好な高品質の脱水食品や、高活性で安定な脱水医薬品などの脱水物品を容易に製造し得ることを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明は、従来、脱水剤として全く注目されなかった環状四糖を選択したものであり、とりわけ脱水能を有する環状四糖を脱水剤として含有、接触又は共存させ、含水物を脱水する方法は、本発明をもって嚆矢とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明における含水物の脱水方法は、水分を含有しているもの、とりわけ、結晶水のような結合水分とは違った遊離水分を含有しているものの脱水方法として好ましく、例えば、本発明の脱水剤を乾燥食品などを封入した防湿容器内に共存させることで、雰囲気に含まれる水分を低減する場合、更には、例えば、食品、医薬品、化粧品、工業化学品、これらの原材料又は加工中間物など各種含水物に含有若しくは接触させることで、含水物の遊離水分を低減させる場合などに有利に適用できる。
【００１０】
これら含水物に脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させると、脱水能を有する環状四糖は、その重量の約１１乃至１５ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、「ｗ／ｗ％」を単に「％」と略記する。）もの水分を５乃至６含水結晶環状四糖の結晶水として含水物から強力に取り込み（この値は無水マルトースの場合の２．２乃至３倍量、若しくは無水α，α−トレハロースの場合の１．１乃至１．５倍量に相当する。）、含水物の水分を実質的に低減し、脱水及び／又は乾燥できる。
【００１１】
例えば、味付け海苔、クッキーなどの乾燥食品を封入した防湿容器内に、紙製などの透湿小袋に充填した脱水能を有する環状四糖を共存させておくことにより、容器内の相対湿度を極度に低減させ、乾燥食品、粉末状物などを高品質かつ安定に長期間維持し得ることが判明した。この際、脱水能を有する環状四糖は、水分を補捉して５乃至６含水結晶環状四糖に変換される途上及び変換された後においても、べとついたり、流れたりすることがなく、乾燥食品や防湿容器を汚染する心配はない。
【００１２】
さらに、例えば、ブランディー、食酢、ローヤルゼリー、生クリーム、マヨネーズなどの液状、ペースト状などの高水分食品の場合には、脱水能を有する環状四糖を含有させて、５乃至６含水結晶環状四糖に変換させることにより、実質的に水分の低減された高品質の脱水食品、例えば、マスキット状、粉末状などの食品をきわめて容易に製造することができる。
【００１３】
この場合、脱水能を有する環状四糖が食品原材料などに含まれる水分を充分に脱水可能な量以上加えられると、脱水能を有する環状四糖の一部が５乃至６含水結晶環状四糖に変換される。この結果、本発明により得られた脱水食品は、遊離水分が減少しているので、微生物汚染、加水分解、酸敗、褐変などによる変質、劣化を防止し、風味良好で高品質な商品を長期に安定に維持し得る。
【００１４】
本発明の脱水方法は、環状四糖が非還元性糖質で安定であり、かつ、加熱乾燥などの苛酷な条件を必要としないので、液状又はペースト状の高水分食品を変質、劣化させることなく、風味良好で、水分の低減された脱水食品に容易に変換し得る特徴を有している。また、環状四糖自体は、蔗糖の約２０％の甘味度を持つ、無毒、無害の甘味料であり、なんら危険性はない。
【００１５】
また、リンホカイン、抗生物質などの水溶液、薬用人参エキス、スッポンエキスなどのペースト状医薬品の場合にも、これらに脱水能を有する環状四糖を含有させて、５乃至６含水結晶環状四糖に変換させることにより、実質的に水分の低減された高品質の脱水医薬品、例えば、マスキット状、粉末状などの医薬品をきわめて容易に製造することができる。この方法は、加熱乾燥などの苛酷な条件を必要とせず、また、脱水能を有する環状四糖が脱水剤としてのみならず、医薬品の有効成分の安定剤としても作用するので、高品質で安定な脱水医薬品を製造することができる。
【００１６】
例えば、バイアル瓶に、充分量の脱水能を有する環状四糖を採り、これに、例えば、リンホカイン、ホルモンなどの生理活性物質を含有する水溶液を加え、密栓して固形製剤などを製造することも有利に実施できる。この場合には、脱水能を有する環状四糖が、生理活性物質を含有する水溶液を脱水することは勿論のこと、バイアル瓶内の雰囲気を防湿乾燥し得る。このようにして得られる脱水固形医薬品は、その製造工程が容易であるだけでなく、その高品質を長期に安定に維持し得ること、更には、使用時に水に速やかに溶解するなどの特徴を有している。
【００１７】
また、充分量の脱水能を有する環状四糖を撹拌しながら、これに生理活性物質を含有する水溶液の所定量を混合し、得られる粉末をそのまま容器に封入して、高品質で安定な固体製剤にすることも、更に、この粉末を、常法にしたがって顆粒、錠剤などに成形して利用することも有利に実施できる。
【００１８】
本発明の脱水能を有する環状四糖を用いる脱水剤は、従来知られているシリカゲル、酸化カルシウムなどの脱水剤とは違って、可食性であり、経口摂取されて難消化性で無カロリー乃至低カロリーの糖質脱水剤であるのみならず、各種生理活性物質などの安定剤としても有利に利用できる。
【００１９】
本発明で用いる環状四糖及び脱水能を有する環状四糖は、その由来、製法については問わない。また、脱水能を有する環状四糖としては、後述のように、環状四糖の無水物である無水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖が水分を取り込み５乃至６含水結晶環状四糖に変換されることから好適である。同様に１含水結晶環状四糖もまた水分を取りこみ５乃至６含水結晶環状四糖に変換され、含水物の脱水作用を発揮する。よって、本発明で用いる脱水能を有する環状四糖はその完全な無水物に限らず、例えば、含水結晶物であっても脱水能を有するものであれば有利に用いることができる。したがって、本発明の脱水能を有する環状四糖を定義するには、それに含まれる水分量で判断することができ、その水分量はカール・フィッシャー法などの公知技術によって測定できる。本発明の脱水剤の有効成分である環状四糖に含まれる水分量は、当然、少ないほどよく、好ましくは４％未満、さらに好ましくは３％未満である。４％以上１０％未満の水分を含有している場合は脱水能を有しているものの脱水剤としての機能及び効率が低下する。
【００２０】
本発明者等は、本発明に先立って脱水能を有する環状四糖、とりわけ、無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖、及び無水非晶質環状四糖の製造方法について研究した。
【００２１】
まず、環状四糖の製造方法としては、例えば、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４年）で開示されたアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させる製造方法の他に、本発明者等が、先に特願２０００−２２９５５７号明細書及び特願２０００−２３４９３７号明細書に開示した、澱粉を用いて製造したパノースをα−イソマルトシル転移酵素によって環状四糖に変換して製造する方法、及び澱粉をα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて環状四糖を製造する方法などの澱粉質を原料とした酵素法による製造方法がある。さらに、これら先願明細書に記載したように、本発明者等は、環状四糖の製造方法として、アルテルナンよりも豊富で安価である澱粉質を原料とした酵素法による方法が、高効率かつ安価に製造できることから、工業的に有利に実施できることを明らかにし、更に、環状四糖の形態として５乃至６含水結晶、無水結晶、１含水結晶、無水非晶質などが存在することも初めて明らかにした。
【００２２】
なお、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を産生する微生物として、平成１２年４月２５日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３として寄託されているバチルス  グロビスポルスＣ９株、及び、平成１２年４月２５日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４として寄託されているバチルス  グロビスポルスＣ１１株が挙げられる。
【００２３】
次に、本発明者等は、無水結晶環状四糖粉末の製造方法について検討し、その方法を確立した。即ち、その方法は、例えば、前述の方法で澱粉質から酵素法により得た環状四糖水溶液を、水分約１５％未満、望ましくは、２．０％以上１２％未満の高濃度シラップとし、このシラップを無水結晶環状四糖の種晶共存下で５０乃至１８０℃の温度範囲に維持しつつ、無水結晶環状四糖を晶出させ粉末化して製造する。
【００２４】
また、１含水結晶環状四糖粉末を製造するには、例えば、５乃至６含水結晶環状四糖粉末をさらに約１００乃至１８０℃の温度で適度に乾燥して製造する。
【００２５】
さらに、無水非晶質環状四糖粉末を製造するには、例えば、前述の方法で得た環状四糖水溶液を、例えば、凍結乾燥及び約１００乃至１８０℃の温度で常圧乾燥又は真空乾燥した後、粉砕して製造する。また、当該環状四糖水溶液を濃度約４０乃至８５％のシラップとして、凍結乾燥及び真空乾燥した後、粉砕して製造するか、又は、高圧ノズル法又は回転円盤法などの噴霧乾燥法により粉末を直接製造することもできる。
【００２６】
粉末化の方法としては、上記の噴霧乾燥法以外にも、例えば、ブロック粉砕方法、押出造粒方法、流動造粒方法などの公知の方法を適宜採用すればよい。
【００２７】
このようにして製造される本発明の脱水能を有する環状四糖粉末は、上品な低甘味を有する非還元性の流動性を有する白色粉末で、その水分含量は低く実質的に無水で、カール・フィッシャー法により、通常、４％未満、好ましくは３％未満である。さらにその形態は無水結晶粉末、１含水結晶粉末又は無水非晶質粉末とすることも可能である。
【００２８】
本発明の脱水能を有する環状四糖粉末は、用途に応じて粒径をサイズ分けして利用することも有利に実施できる。例えば、医薬品のような少量の分封若しくは錠剤などを製造する場合では、粒径が小さいほど有効成分が均一に分散されるため、好都合である。本発明の脱水剤の粉末の粒径はメッシュなどを用いた通常行われている分級手段によって、適宜選択でき、通常、２０μｍ乃至５００μｍ、好ましくは５０μｍ乃至２００μｍも有利に調製できる。
【００２９】
更に、本発明でいう脱水能を有する環状四糖粉末は、５乃至６含水結晶環状四糖に変換され強力な脱水作用を発揮する実質的な無水物であればよく、例えば、脱水能を有する環状四糖の５乃至６含水結晶環状四糖への変換を促進し脱水剤としての効果を高めるため、種晶としてできるだけ少量、通常５％未満、望ましくは、１％未満の５乃至６含水結晶環状四糖を脱水剤に混合させた粉末を利用することも有利に実施できる。
【００３０】
このようにして得られる脱水能を有する環状四糖粉末は、これを、例えば、食品、医薬品、化粧品、工業化学品などの含水物に含有させると、それに含まれる遊離水分を５乃至６含水結晶環状四糖の結晶水として捕捉し、固定し、含水物に対して強力な脱水剤として作用する。
【００３１】
本発明の脱水剤が有利に適用できる場合として、防湿容器内に共存させて、防湿容器内の雰囲気を除湿、乾燥する場合、または、加熱乾燥、真空乾燥などの工程で変質、劣化を伴い易い含水物又は乾燥困難な含水物に含有若しくは接触させることで、高品質のマスキット状、粉末状、固体状などの脱水物品を製造する場合などがある。
【００３２】
本発明の脱水剤を除湿、乾燥する場合に適用する場合としては、例えば、味付け海苔、クッキーなどの吸湿防止に利用できる。更には、吸湿して固結し易い粉末状物、例えば、米粉、小麦粉，大豆粉などの穀粉、はったい粉、きな粉、すりゴマなどの加工穀粉、プリンミックス粉、ホットケーキミックス粉などのプレミックス粉、食塩、砂糖などの微細結晶調味料、粉末醤油、粉末味噌、粉末寿司酢、粉末ダシの素、粉末複合調味料などの粉末調味料、粉末パプリカ、粉末にんにく、粉末シナモン、粉末ナツメグ、粉末ペパー、粉末セージなどの粉末香辛料、粉末酵母エキス、粉末ミルク、粉末ヨーグルト、粉末チーズ、粉末ジュース、粉末ハーブ、粉末ビタミン、顆粒スープ、顆粒ブイヨン、魚粉、血粉、骨粉、粉末乳酸菌剤、粉末酵素剤、顆粒消化剤などの粉末状物品に脱水能を有する環状四糖を配合して包装封入することにより、包装容器内の相対湿度を低減させ、粉末状物品の付着、固結を防止できるので、製造直後の流動性良好な高品質を長期間維持するなどの目的にも利用することができる。
【００３３】
また、本発明の脱水剤を含水物を脱水する場合に適用させる場合としては、例えば、動物、植物、微生物由来の器官、組織、細胞、摩砕物、抽出物、成分、又はこれらからの調製物など各種含水物を脱水する場合に有利に利用できる。
【００３４】
例えば、食品、その原材料又は加工中間物の場合には、生果、ジュース、野菜エキス、豆乳、ゴマぺースト、ナッツペースト、生あん、糊化澱粉ペースト、小麦粉などの農産品、ウニペースト、カキエキス、イワシペーストなどの水産品、生卵、レシチン、牛乳、乳清、生クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、などの畜産品、メープルシラップ、蜂蜜、味噌、醤油、マヨネーズ、ドレッシング、カツオエキス、ミートエキス、昆布エキス、チキンエキス、ビーフエキス、酵母エキス、きのこエキス、甘草エキス、ステビアエキス、これらの酵素処理物、漬物用調味液などの含水調味料、日本酒、ワイン、ブランディー、ウイスキー、薬用酒などの酒類、緑茶、紅茶、コーヒーなどの嗜好飲料、ハッカ、ワサビ、ニンニク、カラシ、サンショウ、シナモン、セージ、ローレル、ペパー、柑橘類などから抽出される含水香辛料、セイヨウアカネ、ベニノキ、ウコン、パプリカ、レッドビート、ベニバナ、クチナシ、サフラン、紅麹菌などから抽出される含水着色料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル及びソルビタン脂肪酸エステルなどから調製される含水乳化剤、燻液、醗酵液などの保存料などの液状乃至ペースト状物から安定で風味良好な脱水食品を容易に製造することができる。
【００３５】
このようにして得られた脱水食品、例えば、粉末農水畜産品、粉末油脂、粉末香料、粉末着色料、粉末乳化剤、粉末保存料などは、風味良好な天然型バルクフレーバーなどとして、マヨネーズ、スープの素などの調味料、ハードキャンディー、ケーキ、などの菓子類、ホットケーキミックス、即席ジュースなどのプレミックスなども各種飲食物の加工材料として有利に使用することができる。
【００３６】
また、本発明の脱水剤を医薬品、その原料又は加工中間物の場合に適用させる場合としては、インターフェロン−α，インターフェロン−β，インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α，ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの液状乃至ペースト状物も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の脱水医薬品、脱水健康食品などを容易に製造できる。
【００３７】
また、本発明の脱水剤を化粧品、その原料又は加工中間物の場合に適用させる場合には、前記食品、医薬品の場合と同様に、生卵、レシチン、生クリーム、ハチミツ、甘草エキス、香料、着色料、酵素などを脱水すれば、高品質の脱水化粧品が容易に得られる。本化粧品は、美肌剤、美毛剤、育毛剤などとして有利に利用できる。
【００３８】
また、本発明の脱水剤を脱水物品として酵素の場合に適用させる場合には、食品、医薬品、工業原料などの加工用触媒として、また、治療剤、消化剤などとして、更には酵素洗剤などとしても有利に利用できる。
【００３９】
含水物に脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させる方法としては、目的の脱水物品が完成されるまでに、例えば、混和、混捏、溶解、浸透、散布、塗布、噴霧、注入などの公知の方法が、適宜に選ばれる。
【００４０】
含水物に対する脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させる量は、含水物に含まれる水分量と、目的とする脱水物品の性状によっても変わり、必要ならば、含水物を他の公知の方法で部分的に脱水又は濃縮した後に、脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させてもよく、通常、含水物１重量部に対して、０．００１乃至２００重量部、望ましくは０．０１乃至５０重量部である。
【００４１】
本発明で得られる脱水物品、例えば、食品、医薬品、化粧品などは品質を更に向上させるために、適宜な着香料、着色料、呈味料、安定剤、増量剤などを併用することも有利に実施できる。とりわけ、安定剤について、本発明が脱水能を有する環状四糖による強力な脱水方法であることから、抗酸化剤などの低分子化合物に限る必要はなく、従来、乾燥が困難とされていた水溶性高分子化合物、例えば、可溶性澱粉、デキストリン、プルラン、エルシナン、デキストラン、ザンタンガム、アラビアガム、ローカストビーンガム、グアガム、トラガントガム、タマリンドガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ペクチン、寒天、ゼラチン、アルブミン、カゼインなどの物質も安定剤として有利に利用できる。
【００４２】
これら水溶性高分子化合物を用いる場合には、例えば、液状乃至ペースト状含水物に、予め水溶性高分子化合物を均一に溶解させ、ついで、これに脱水能を有する環状四糖を混和、混捏などの方法で均一に含有させることにより、微細な５乃至６含水結晶環状四糖を析出させた脱水物品が得られる。
【００４３】
本品は含水物由来の香気成分、有効成分などが高分子化合物の皮膜で被膜されているか、又は、該皮膜で囲まれたマイクロカプセル中に微細な５乃至６含水結晶環状四糖とともに内包されるか、更には、香気成分、有効成分などが環状四糖と包接化合物を形成して安定化されており、その揮散、品質劣化が防止されることから、含水物由来の香気成分、有効成分の安定保持に極めて優れている。この際、必要ならば水溶性高分子として、香気成分などと包接化合物を形成するα−、β−又はγ−シクロデキストリンを併用することも有利に実施できる。
【００４４】
シクロデキストリンとしては、高純度の物に限る必要はなく、乾燥しにくく粉末化の困難な低純度のシクロデキストリン、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種シクロデキストリンを含有した水飴状の澱粉部分加水分解物、更にはシクロデキストリンのグルコース誘導体なども有利に利用できる。
【００４５】
本発明の脱水物品、とりわけ、粉末状物品を製造する方法は、種々の方法が採用できる。例えば、食品、医薬品、化粧品、それらの原材料又は加工中間物などの比較的高水分の含水物に、脱水能を有する環状四糖を脱水物品の総重量当り水分約５０％以下、望ましくは１０乃至４０％になるように均一に含有させた後、バットなどに約０．１乃至５日間、約１０乃至５０℃、例えば、室温に放置し、５乃至６含水結晶環状四糖に変換させて、例えばブロック状に固化し、これを切削、粉砕などの方法により製造すればよい。必要ならば、切削、粉砕などの粉末化工程の後に乾燥工程、分級工程などを加えることもできる。
【００４６】
また、噴霧する方法などにより、直接、粉末品を製造することができる。例えば、脱水能を有する環状四糖粉末を流動させながら、これに液状乃至ペースト状の含水物を所定量噴霧して、接触させて造粒し、ついで、必要に応じて約３０乃至６０℃で約０．１乃至１０時間熟成して、５乃至６含水結晶環状四糖に変換させるか、又は、脱水能を有する環状四糖を液状乃至ペースト状含水物に混和、混捏などした後、これを、直ちに、若しくは、５乃至６含水結晶環状四糖への変換を開始させて、噴霧して得られる粉末品を、必要に応じて同様に熟成し、５乃至６含水結晶環状四糖に変換させる方法は、粉末状脱水物品を大量生産する方法として好適である。
【００４７】
このようにして得られた粉末状脱水物品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤、安定剤などを併用して、更には、顆粒、錠剤、カプセル剤、棒状、板状、立方体形など適宜な形状に成型して利用することも自由にできる。
【００４８】
また、一般に、澱粉は、その膨潤、糊化のために、多量の水分を必要としている。したがって、糊化澱粉は極めて微生物汚染を受けやすい。脱水能を有する環状四糖は、このような糊化澱粉の脱水剤としても有効に利用できる。例えば、求肥などの糊化澱粉は、これに脱水能を有する環状四糖を含有させ５乃至６含水結晶環状四糖に変換させることにより、実質的に水分が低減され、微生物汚染を防止することができる。
【００４９】
さらに、脱水能を有する環状四糖は、糊化澱粉に対して容易に均一に混和し、後述するように老化防止剤としても作用することから、糊化澱粉を含有する各種加工食品の商品寿命を大幅に延長することができる。
【００５０】
また、脱水能を有する環状四糖は、例えば、皮むきバナナ、オレンジ、スライスした蒸し芋、開いた鯵、秋刀魚、生麺、ゆで麺、餅菓子などの表面に微生物汚染を受けやすい高水分含有食品に用いられる場合には、その表面に、例えば、脱水能を有する環状四糖粉末をまぶして接触させ、５乃至６含水結晶環状四糖に変換させ、その表面の水分を実質的に低減し、これら食品の日持ちを向上し、品質を改良することから食品の防腐剤、安定剤、品質改良剤などとして有利に利用できる。この際、必要ならば、例えば、乳酸、クエン酸、エタノールなどを併用して、また、真空包装、ガス充填包装、冷蔵などして、その商品寿命を更に延長させることも自由である。
【００５１】
また、脱水能を有する環状四糖は、アルコールに対し高い親和力を示す。この性質から、メタノール、エタノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコールなどのアルコール又はアルコール可溶物などに含まれる水分の脱水剤としても有利に利用できる。
【００５２】
例えば、清酒、焼酎、ワイン、ブランディー、ウイスキー、ウオッカなどの酒類を脱水能を有する環状四糖で脱水し、生成した５乃至６含水結晶環状四糖にその有効成分、香気などを保持したマスキット状、粉末状などとして有利に製造することができる。このようにして製造した粉末酒類は菓子、プレミックスなどに利用でき、水で復元して飲用に供することもできる。
【００５３】
本発明の脱水能を有する環状四糖は、脱水剤、安定剤としてだけでなく、脱水物品中に含有させることで、上品な甘味質、ボディー、適度な粘度付与剤などとしての効果をも発揮することができる。
【００５４】
また、ヨウ素などのアルコール溶液を脱水能を有する環状四糖と混合し、これに水溶性高分子などを含有する水溶液に加えて５乃至６含水結晶環状四糖に変換させることにより、ヨウ素などの有効成分を揮発、変質させることなく安定に保持し、かつ、適度の粘度、延び、付着性を有するマスキット状の膏薬などを製造することも有利に実施できる。
【００５５】
また脱水能を有する環状四糖に含水油溶性物質、乳化物、ラテックスなどを含浸、混合などして脱水能を有する環状四糖を５乃至６含水結晶環状四糖に変換させ、粉末状の油脂、香辛料、香料、着色料などの食品、化粧品、粉末状のビタミン、ホルモンなどの医薬品などを製造することも有利に実施できる。
【００５６】
この場合には、脱水能を有する環状四糖は脱水剤としてのみならず、５乃至６含水結晶環状四糖に変換した後においても、安定剤、保持剤、賦形剤、担体などとしても作用する。
【００５７】
また、チョコレート、クリームなどの水分を嫌う油溶性物質含有食品の場合にも、脱水能を有する環状四糖は有利に利用される。この場合には、脱水剤としてのみならず、加工適性、口溶け、風味などが良好になることに利用される。更に、得られた製品は、その高品質を長期にわたって安定に維持し得る特徴を有している。
【００５８】
以上述べたように、本発明の非還元性糖質である脱水能を有する環状四糖が各種含水物の水分を強力に脱水する、加えて、得られる脱水物品が極めて安定であることを見いだしたことによって達成されたものであり、その脱水能を有する環状四糖を脱水剤として利用することにより、液状乃至ペースト状などの含水物から、環状四糖の特徴である包接作用によって、その風味、香気を劣化、揮散させることなく、水分の低減された高品質の食品、化粧品や、また、その有効成分、活性を分解低下させることなく、水分の低減された高品質の医薬品、化粧品などを有利に製造することができる。
【００５９】
次に本発明の脱水剤の使用例について述べる。
【００６０】
脱水能を有する環状四糖は低甘味であって、虫歯誘発、血中コレステロール及び／又は血糖値の上昇などの懸念がない調味料としても使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ぶどう糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、α，α−トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、アセスルファムＫ、スクラロース、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００６１】
脱水能を有する環状四糖は、非還元性糖質であって環状四糖本来の上品な低甘味を有し、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般食品への脱水剤としてのみならず、甘味付に、また呈味改良、品質改良、風味改善などに利用することも有利に実施できる。
【００６２】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料への脱水剤として、更には、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、風味改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、果実酒、酒などの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席飲料などの各種食品への脱水剤として、更には甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、風味改善などとして利用することも有利に実施できる。
【００６３】
以下、本発明で用いられる環状四糖の製造方法及び性質について述べる。
【００６４】
【実験１】
〈培養物からの環状四糖の調製〉
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製造）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム１２含水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７含水塩０．０５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。
【００６５】
得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸−メタノール法で発色し、また、還元糖質をジフェニルアミン−アニリン法で発色して調べたところ、Ｒｆ値が約０．３１の位置に硫酸−メタノール法で陽性、かつ、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。
【００６６】
先に得た上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、アマノ製薬株式会社製造）を固形物１グラム当り１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製造）を固形物１グラム当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し２時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイアイオンＰＫ２１８』と『ダイアイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイアイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレータで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．６ｇの糖質粉末を得た。
【００６７】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、ＨＰＬＣと略称する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間１０．８４分に単一ピークのみが検出され、純度は９９．９％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用いカラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００６８】
また、還元力をソモギ−・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断される。
【００６９】
【実験２】
〈環状四糖の構造解析〉
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法による質量分析（通称「ＦＡＢ−ＭＳ」）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であることが判明した。
【００７０】
また、常法にしたがって、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本糖質の構成糖はＤ−グルコースであることも判明し、質量数をも考慮すると、本糖質はグルコース４分子からなる環状糖質であることが推測された。
【００７１】
さらに、本糖質を用いて核磁気共鳴法（通称ＮＭＲ）を行ったところ、図２に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図３に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを既知糖質のものと異同を比較したところ、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている非還元性環状糖質サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝のスペクトルと一致し、本糖質の構造が図４に示す環状四糖、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることが判明した。
【００７２】
【実験３】
〈バチルス  グロビスポルス  Ｃ９からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産〉
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』（アサヒビール株式会社製造）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム１２含水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７含水塩０．０５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００７３】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気撹拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．４５単位／ｍｌの活性（総活性約８，１１０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．５単位／ｍｌの活性（総活性約２６，９００単位）で、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌ（総活性約１７，１００単位）であった。
【００７４】
なお、酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルトースのうち、このマルトース量を、実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量とした。
【００７５】
また、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することによって行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量とした。
【００７６】
環状四糖生成活性の測定は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を濃度２ｗ／ｖ％となるよう５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１００℃で１０分間熱処理して反応を停止させた後、更に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬製造）７０単位／ｍｌとグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）２７単位／ｍｌとを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加えて、５０℃で６０分間処理し、その液を１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。環状四糖生成活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状四糖を生成する酵素量とした。
【００７７】
【実験４】
〈バチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来酵素の調製〉
【実験４−１】
〈バチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来酵素の精製〉
実験３で得られた培養上清約１８ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，１１０単位と、α−イソマルトシル転移酵素活性を２４，７００単位と、環状四糖生成活性を約１５，６００単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１，０００ｍｌ）に供した。この際、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、α−イソマルトシル転移酵素及び環状四糖のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲＳ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。また、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【００７８】
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
【００７９】
【実験４−２】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製〉
実験４−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００８０】
【表１】
0004147109.tif 000002
【００８１】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００８２】
【実験４−３】
〈α−イソマルトシル転移酵素の精製〉
実験４−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【００８３】
【表２】
0004147109.tif 000003
【００８４】
【実験５】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の性質〉
【実験５−１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質〉
実験４−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１４０，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００８５】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００８６】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図５（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４０℃（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０乃至６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下又は１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約３５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００８７】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
【００８８】
【表３】
0004147109.tif 000004
【００８９】
表３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００９０】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００９１】
【実験５−２】
〈α−イソマルトシル転移酵素の性質〉
実験４−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００９２】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．５±０．５であった。
【００９３】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．０乃至９．０であった。
【００９４】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
0004147109.tif 000005
【００９６】
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００９７】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−アスパラギン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００９８】
【実験６】
〈バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム１２含水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００９９】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気撹拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．５１単位／ｍｌの活性（総活性約９，１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．７単位／ｍｌの活性（総活性約３０，４００単位）で、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，４００単位）であった。
【０１００】
【実験７】
〈バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来酵素の調製〉
【実験７−１】
〈バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来酵素の精製〉
実験６で得られた培養上清約１８ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、環状四糖生成活性を約１７，７００単位を有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成いずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α‐イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【０１０１】
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
【０１０２】
【実験７−２】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチルートヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【０１０３】
【表５】
0004147109.tif 000006
【０１０４】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１０５】
【実験７−３】
〈α−イソマルトシル転移酵素の精製〉
実験７−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
【０１０６】
【表６】
0004147109.tif 000007
【０１０７】
【実験８】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製〉
【実験８−１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質〉
実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１０８】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【０１０９】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図１３（温度の影響）、図１４（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４５℃（Ｃａ２＋非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下又は１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１５（温度安定性）、図１６（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。
【０１１０】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表７に示す。
【０１１１】
【表７】
0004147109.tif 000008
【０１１２】
表７の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【０１１３】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列Ｎ末端チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【０１１４】
このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス・グロビシポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のＮ末端配列と比較すると同一であることが判明し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。
【０１１５】
【実験８−２】
〈α−イソマルトシル転移酵素の性質〉
実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１１６】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．６±０．５であった。
【０１１７】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図１７（温度の影響）、図１８（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１９（温度安定性）、図２０（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【０１１８】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【０１１９】
【表８】
0004147109.tif 000009
【０１２０】
表８の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【０１２１】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。
【０１２２】
【実験９】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のアミノ酸配列〉
【実験９−１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列〉
実験７−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号５乃至７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表９に示す。
【０１２３】
【表９】
0004147109.tif 000010
【０１２４】
【実験９−２】
〈α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列〉
実験７−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ２２（保持時間約２２分）、Ｐ６３（保持時間約６３分）、Ｐ７１（保持時間約７１分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号８乃至１０に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１０に示す。
【０１２５】
【表１０】
0004147109.tif 000011
【０１２６】
【実験１０】
〈各種糖質への作用〉
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、α，α−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。
【０１２７】
これらの溶液に、実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、又は実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表１１に示す。
【０１２８】
【表１１】
0004147109.tif 000012
【０１２９】
表１１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。また、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
【０１３０】
【実験１１】
〈マルトオリゴ糖からの生成物〉
【実験１１−１】
〈生成物の調製〉
濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースのそれぞれ水溶液に実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、それぞれ固形物１グラム当たり２単位（マルトース及びマルトトリオース）、０．２単位（マルトテトラオース）、０．１単位（マルトペンタオース）加え、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用いカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。その結果を表１２に示す。
【０１３１】
【表１２】
0004147109.tif 000013
【０１３２】
表１２の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）とが生成し、基質マルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）、生成物Ｘが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、生成物Ｙが生成することが判明した。基質マルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、生成物Ｚが生成することが判明した。
【０１３３】
基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘ、並びに基質マルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの単離・精製を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ｒ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マルトペンタオースからの反応物それぞれから、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物収率約８．３％で、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
【０１３４】
【実験１１−２】
〈生成物の構造解析〉
実験１１−１の方法で得た生成物Ｘ標品及び生成物Ｙ標品を用いて、常法にしたがってメチル化分析とＮＭＲ分析を行なった。メチル化分析の結果は表１３にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２１（生成物Ｘ）、図２２（生成物Ｙ）に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び帰属を図２３（生成物Ｘ）、図２４（生成物Ｙ）、表１４にまとめた。
【０１３５】
【表１３】
0004147109.tif 000014
【０１３６】
これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【０１３７】
構造式１：
α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１３８】
また、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
【０１３９】
構造式２：
α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１４０】
【表１４】
0004147109.tif 000015
【０１４１】
以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のマルトオリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。
【０１４２】
（１）  本酵素は、基質として、α−１，４結合からなるグルコース重合度が２以上のマルトオリゴ糖に作用し、その非還元性末端のグルコシル残基を他の分子の非還元性末端のグルコシル残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
（２）  本酵素は、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【０１４３】
【実験１２】
〈還元力生成試験〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が還元力生成能を有するかどうかを調べるため、以下の試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及び実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギ−・ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。
【０１４４】
計算式：
【数１】
0004147109.tif 000016
【０１４５】
結果を表１５に示す。
【０１４６】
【表１５】
0004147109.tif 000017
【０１４７】
表１５の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力を実質的に増加しないこと、即ち、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は加水分解作用を示さないか若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。
【０１４８】
【実験１３】
〈デキストラン生成試験〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素がデキストラン生成作用を有するかどうかを調べるため、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、１６９乃至１７３（１９９２年）に記載の方法に準じて試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たＣ９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及び実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で４時間及び８時間作用させた後、１００℃で１５分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の５０μｌを遠心管に入れ、それに３倍量のエタノールを加え十分に撹拌した後、４℃で３０分間静置した。次いで、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し、その上清を除去した後、１ｍｌの７５％のエタノールを加え撹拌して洗浄した。再度、遠心分離してその上清を除き、真空乾燥した後、１ｍｌの脱イオン水を加え十分に撹拌した。その液中の全糖量（グルコース換算）をフェノール硫酸法で測定し、試験の全糖量とした。反応のブランクとして、１００℃で１０分間熱処理し失活させたバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来又はバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて同様に行い、ブランクの全糖量とした。デキストラン生成量は以下の計算式で計算した。
【０１４９】
計算式：
デキストラン生成量（ｍｇ／ｍｌ）＝［（試験の全糖量）−（ブランクの全糖量）］×２０
【０１５０】
結果を表１６に示す。
【０１５１】
【表１６】
0004147109.tif 000018
【０１５２】
表１６の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトテトラオースに作用させてもデキストランを生成しないこと、つまり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、デキストラン生成作用を実質的に有さないか、その生成量は検出限界以下であることが判明した。
【０１５３】
【実験１４】
〈転移受容体特異性〉
各種糖質を用いて、本酵素の転移受容体になりうるかどうかの試験をした。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ソルビトール、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトース、スクロース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリンの溶液を調製した。
【０１５４】
これらの受容体溶液（濃度１．６％）に、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（濃度４％）を加え、実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品又は実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖供与体固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応後の反応液を、受容体が単糖又は二糖の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ法」と略する。）で、受容体が三糖以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、それぞれの糖質が本酵素の転移受容体になるかを確認した。なお、ＧＬＣにおいて、ＧＬＣ装置は『ＧＣ−１６Ａ』（株式会社島津製作所製）、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス製カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン化検出器で分析した。ＨＰＬＣでは、ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製）、溶離液は水を流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折計で分析した。結果を表１７に示す。
【０１５５】
【表１７】
0004147109.tif 000019
【０１５６】
表１７の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、転移受容体として種々の糖質が利用でき、特に、Ｄ−／Ｌ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトース及びスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボ−ス及びＮ−アセチルグルコサミンに転移し、更には、Ｄ−アラビノースにも転移することが判明した。
【０１５７】
以上に述べたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質について、先に報告されている６−グルコシル転移作用を有する酵素、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、第１６９乃至１７３頁（１９９２年）に記載のデキストリン・デキストラナ−ゼ及び『日本農芸化学会誌』、第３７巻、第６６８乃至６７２頁（１９６３年）に記載のトランスグルコシダーゼと比較した。その結果を表１８にまとめた。
【０１５８】
【表１８】
0004147109.tif 000020
【０１５９】
表１８から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、既知のデキストリン・デキストラナーゼやトランスグルコシダーゼとは全く異なる新規な理化学的性質を有することが判明した。
【０１６０】
【実験１５】
〈環状四糖の生成〉
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）又はグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）の溶液を調製した。
【０１６１】
これらの水溶液（濃度０．５％）に、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位とを加え、これらを３０℃、ｐＨ６．０で作用させた。作用条件は、以下の４つの系で行った。
【０１６２】
（１）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、α−イソマルトシル転移酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（３）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（４）  α−イソマルトシル転移酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
【０１６３】
これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験１と同様のα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１９に示す。
【０１６４】
【表１９】
0004147109.tif 000021
【０１６５】
表１９の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみの作用及びα−イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を同時併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にα−イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約１１％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に作用させると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンでは約８７％に増加し、澱粉部分分解物では約６４％に増加することが判明した。
【０１６６】
このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との同時併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
【０１６７】
（１）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（２）  α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（３）  続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。
（４）  切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）から（３）の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との同時併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用し、環状四糖の生成量が増加すると推察された。
【０１６８】
【実験１６】
〈澱粉液化程度の影響〉
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉１グラム当り０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブし、約３５℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり２単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り２０単位とを加え、３５℃で２４時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２０に示す。
【０１６９】
【表２０】
0004147109.tif 000022
【０１７０】
表２０の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０１７１】
【実験１７】
〈澱粉部分分解物濃度の影響〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至５）の最終濃度０．５乃至４０％の水溶液を調製し、それぞれに、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、両酵素を同時併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２１に示す。
【０１７２】
【表２１】
0004147109.tif 000023
【０１７３】
表２１の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が０．５％の低濃度では、環状四糖の生成量は約６４％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、環状四糖の生成量は約４０％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物が低濃度であるほど高まる傾向にあることが判明した。
【０１７４】
【実験１８】
〈シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（濃度１５％）を調製し、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たＣ１１株由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位と、バチルス・ステアロサーモフィルス由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を固形物１グラム当り０乃至０．５単位加え、両酵素を同時併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２２に示す。
【０１７５】
【表２２】
0004147109.tif 000024
【０１７６】
表２２の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。
【０１７７】
【実験１９】
〈環状四糖の調製〉
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、ＨＰＬＣで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約８４％であった。この反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、さらに、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し温度９０℃で１時間保持して、酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約３，７００ｇを含む糖液約６．２ｋｇを得た。
【０１７８】
得られた糖液を、オルガノ製イオン交換樹脂『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』を充填したカラム（ゲル量約２２５ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行なった。溶出液の糖組成を実験１に記載のＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、常法にしたがって脱塩、脱色、濾過、濃縮したところ、固形分約２，５００ｇを含む糖液約７．５ｋｇを得た。得られた糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．５％であった。
【０１７９】
【実験２０】
〈環状四糖の水溶液からの結晶化〉
実験１９の方法で得られた純度約９８％以上の環状四糖画分をエバポレーターで固形物濃度約５０％に濃縮した後、この濃縮糖液約５ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させることにより晶析させたところ、白色の結晶状粉末が得られた。その顕微鏡写真の１例を図２５に示す。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し結晶状物を湿重量として１，３６０ｇを回収した。さらに、６０℃で３時間乾燥して環状四糖結晶状粉末を１，１７０ｇ得た。得られた結晶粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は９９．９％以上と極めて高純度であった。
【０１８０】
この環状四糖の結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、図２６に示すように、主な回折角（２θ）として１０．１°、１５．２°、２０．３°及び２５．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分は１３．０％であることがわかり、環状四糖１分子当たり５乃至６分子の水を含む結晶であることが判明した。
【０１８１】
さらに、この環状四糖の結晶粉末を熱重量測定したところ、図２７に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度１５０℃までの上昇で４乃至５分子の水に相当する重量減少が認められ、続いて、温度２５０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２８０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、５乃至６含水結晶環状四糖は、常圧において、温度を１５０℃まで上昇させることにより結晶分子当たり４乃至５分子の水が離脱して１分子の水を含む結晶になり、さらに温度２５０℃までに１分子の水が結晶から離脱して無水結晶になることが判明した。
【０１８２】
【実験２１】
〈１含水結晶環状四糖への変換〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖粉末をガラス容器に入れ、予め温度１４０℃に保温したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持した。得られた環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、熱処理前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折とは全く異なり、図２８に示すように、主な回折角（２θ）として、８．３°、１６．６°、１７．０°及び１８．２°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分が約２．７％であることがわかり、環状四糖１分子当たり１分子の水を含むことが判明した。さらに、この結晶粉末を熱重量測定したところ、図２９に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度２７０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２９０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、この環状四糖結晶状物は１含水結晶であることが判明した。
【０１８３】
【実験２２】
〈無水結晶への変換〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖粉末を温度４０℃乃至１２０℃でそれぞれ１６時間真空乾燥した。得られた環状四糖粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、真空乾燥温度４０℃の場合は水分が約４．２％であり、真空乾燥温度１２０℃の場合は水分が約０．２％で、実質的に無水であることが判明した。これら真空乾燥した環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、真空乾燥前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折及び１含水結晶のものとは全く異なり、図３０（真空乾燥温度４０℃）、図３１（真空乾燥温度１２０℃）に示すように、主な回折角（２θ）として、１０．８°、１４．７°、１５．０°、１５．７°及び２１．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。両回折スペクトル間でのピ−ク強度の強弱は認められるものの、基本的にピ−クの回折角度は同一で、結晶学的に同一無水結晶と推察された。また、回折スペクトルのベースラインは山状を呈し、真空乾燥前の５乃至６含水結晶環状四糖のもの及び１含水結晶のものと比べ結晶化度が低下しており、非結晶状態の環状四糖が存在していることが判明した。このことから、真空乾燥４０℃の場合の水分を約４．２％含む環状四糖粉末は、その水分を含む無水非晶質環状四糖と、無水結晶環状四糖とが混在する粉末と推察された。以上のことから、５乃至６含水結晶環状四糖粉末を真空乾燥することにより、５乃至６含水結晶は水分子を失い、無水非晶質と無水結晶に変換することがわかった。なお、水分０．２％の無水結晶環状四糖粉末について、実験２０と同様に熱重量分析したところ、図３２に示すように、温度２７０℃付近から環状四糖の熱分解と考えられる重量減少のみが観察された。
【０１８４】
【実験２３】
〈環状四糖の水に対する飽和濃度〉
温度１０乃至９０℃での水に対する環状四糖の飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を、各温度で完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度１０乃至９０℃で保温しながら２日間撹拌した。それぞれの温度の環状四糖飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状四糖を除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ、各温度での飽和濃度を求めた。結果を表２３に示す。
【０１８５】
【表２３】
0004147109.tif 000025
【０１８６】
【実験２４】
〈熱安定性〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を水に溶解し濃度１０ｗ／ｖ％の環状四糖水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表２４に示す。
【０１８７】
【表２４】
0004147109.tif 000026
【０１８８】
表２４の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、糖組成の純度の低下もなく、環状四糖は熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１８９】
【実験２５】
〈ｐＨ安定性〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を各種の緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状四糖を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至１０に調整した環状四糖溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表２５に示す。
【０１９０】
【表２５】
0004147109.tif 000027
【０１９１】
表２５の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至１０の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において糖組成の純度は僅かに低下するものの、ｐＨ３乃至１０の範囲では全く糖組成の純度は低下せず、環状四糖は広いｐＨ範囲、換言すれば、ｐＨ３乃至５の酸性側、ｐＨ６乃至８の中性側、ｐＨ９乃至１０のアルカリ側で煮沸しても極めて安定な糖質であることが判明した。
【０１９２】
【実験２６】
〈アミノカルボニル反応〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を水に溶解し、さらに、それに市販試薬特級のグリシンとリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐH７．０に調整した１ｗ／ｖ％グリシンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果を表２６に示す。
【０１９３】
【表２６】
0004147109.tif 000028
【０１９４】
表２６の結果から明らかなように、環状四糖は、グリシン共存下で加熱しても着色はなく、グリシンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応（メイラード反応とも言う）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１９５】
【実験２７】
〈アミノカルボニル反応〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値に基づいて評価した。結果を表２７に示す。
【０１９６】
【表２７】
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【０１９７】
表２７の結果から明らかなように、環状四糖は、ポリペプトン共存下で加熱して、ポリペプトンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１９８】
【実験２８】
〈包接作用〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を脱イオン水に溶かし、２０％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たり、メタノールは２ｇ、エタノールは３ｇ、酢酸は４．６ｇを加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分枝シクロデキストリン（商品名『イソエリートＰ』、マルハ株式会社販売）を用いて同様に行なった。
【０１９９】
凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエ−テルを加えて抽出を行ない、再度、抽出を繰り返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表２８に示す。
【０２００】
【表２８】
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【０２０１】
表２８の結果から明らかなように、環状四糖は包接能を有しており、その包接能は、分枝サイクロデキストリンと比べ、重量当たり約２倍も高いことが判明した。
【０２０２】
【実験２９】
〈甘味度〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を脱イオン水に溶かし、固形物濃度１０％水溶液を調製し、この環状四糖１０％水溶液を基準とし、蔗糖（市販グラニュ−糖）の濃度を変え、パネラ−５名で官能試験を行なった。その結果、環状四糖の甘味度は、蔗糖の約２０％であった。
【０２０３】
【実験３０】
〈消化性試験〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を用いて、『日本栄養食糧学会誌』、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０年）に記載の岡田等の方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状四糖の消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行なった。結果を表２９に示す。
【０２０４】
【表２９】
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【０２０５】
表２９の結果から明らかなように、環状四糖は、唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼで全く消化されず、小腸粘膜酵素によって僅かに消化されたが、その程度は０．７４％と低値であり、対照の難消化性糖質マルチトールの値と比較すると１／５以下であり、環状四糖が極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０２０６】
【実験３１】
〈醗酵性試験〉
実験２０の方法で得られる５乃至含水結晶環状四糖を用いて、『ジャ−ナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、第５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載のＯｋｕ等の方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状四糖の発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状四糖は盲腸内容物重量当たり約７％を添加し、添加直後及び１２時間後に残存する環状四糖量はガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６８．０ｍｇ、１２時間後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６３．０ｍｇであり、９３％が醗酵されず残存していることがわかり、環状四糖は極めて醗酵されにくい糖質であることが判明した。
【０２０７】
【実験３２】
〈資化性試験〉
実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を用いて、『腸内フローラと食物因子』、光岡知足編、学会出版センター（１９８４年）に記載の方法に準じて、各種腸内細菌の資化性を調べた。即ち、予め培養しておいた新鮮な菌を、環状四糖を０．５％添加したＰＹＦ培地５ｍｌに約１０７ＣＦＵ接種し、嫌気条件下で３７℃、４日間培養した。対照として、資化されやすい糖質グルコースを用いて行なった。資化性の判定は、培養後の培養液のｐＨが、６．０以上の場合、資化されない（−）とし、６．０未満の場合、資化される（＋）とした。さらに、培養液中に残存する糖質をアンスロン法で測定し糖質の減少量を調べ、資化性の判定を確認した。結果を表３０に示す。
【０２０８】
【表３０】
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【０２０９】
表３０の結果から明らかなように、環状四糖は、試験した腸内細菌株のいずれにも資化されなく、対照のグルコースはいずれにも資化されることがわかり、環状四糖が腸内細菌に極めて資化されにくい糖質であることが判明した。
【０２１０】
【実験３３】
〈急性毒性試験〉
マウスを使用して、実験２０の方法で得られる５乃至６含水結晶環状四糖を経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状四糖は低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。したがって、正確な値とはいえないが、そのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇマウス体重以上であった。
【０２１１】
以上の実験３０乃至３３の結果から、環状四糖は、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとしての利用が期待できる。
【０２１２】
【実験３４】
〈非還元性糖質による脱水量の大きさと脱水物品の粉末化の比較実験〉
実験に用いた非還元性糖質は、無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖、無水非晶質環状四糖、５乃至６含水結晶環状四糖、無水結晶α，α−トレハロース、無水非晶質α，α−トレハロース及び２含水結晶α，α−トレハロースである。５乃至６含水結晶環状四糖は実験２０の方法で調製した。無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、それぞれ実施例Ａ−１、実施例Ａ−２及び実施例Ａ−３の方法で調製した。２含水結晶α，α−トレハロースは市販のもの（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）を用いた。無水結晶α，α−トレハロース及び無水非晶質α，α−トレハロースは市販の２含水結晶α，α−トレハロースから特開平６−１７０２２１号公報参考例１及び参考例３に開示される方法で調製した。
【０２１３】
水分含量約７７％のプレーンヨーグルト４重量部に、上記の糖質をそれぞれ１１乃至１６重量部を混合し得られる混合物をバットにとり、２５℃で室内に２４時間静置後、その混合物の状態変化を観察した。その判定は、充分に脱水して固化し、これを切削機にかけて粉末化が容易である場合を○、脱水がやや不充分で固化したけれども切削機による粉末化が困難である場合を△、脱水が不充分で固化しなかったことにより切削機にかけて粉末化することができなかった場合を×とした。結果は、表３１に示す。
【０２１４】
【表３１】
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【０２１５】
表３１の結果から、無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、無水結晶α，α−トレハロース、無水非晶質α，α−トレハロースよりも少ない重量部で固化することができ、切削機による粉末化が容易であることが判明した。また、得られる粉末の性状も優れていた。この結果から、無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は脱水能を有する環状四糖で脱水剤として好適であり、とりわけ、無水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖が脱水能に優れていることが判明した。
【０２１６】
【実験３５】
〈脱水能を有する環状四糖による脱水作用〉
無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖、無水非晶質環状四糖及び５乃至６含水結晶環状四糖の脱水作用、具体的には、糖質に対する吸水量とその経時変化について詳細に実験した。比較実験には糖質として無水結晶α，α−トレハロース、無水非晶質α，α−トレハロース及び２含水結晶トレハロースを用いた。実験は、実験３４で述べた方法で調製したそれぞれの環状四糖及びα，α−トレハロースをふるい分けして粒径約１００乃至１５０μｍの粉末品とし、直径５ｃｍのプラスチックシャーレにそれぞれ１ｇずつ採り、相対湿度６０％又は７５％に調整されたデシケーター内に入れ、２５℃の雰囲気に１週間放置し、経時的に糖質中に含まれる水分（％）をカール・フィッシャー法で測定した。結果は表３２に示す。
【０２１７】
【表３２】
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【０２１８】
表３２の結果から、相対湿度６０％で放置した場合、１含水結晶環状四糖及び５乃至６含水結晶環状四糖は１週間放置したのちもほとんど吸水は見られなかったが、無水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は１日目でほぼ吸水量が飽和に達した。吸水量は、無水結晶環状四糖ではその重量の約１０％であるのに対して、無水非晶質環状四糖ではその重量の約１４％の値を示した。１週間放置した後の各試料を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、主な回折角はそれぞれ放置前の試料と同一の回折パターンを示し、結晶型に変化は見られなかった。相対湿度が６０％以下では、水分は取りこむが，結晶水として取り込まれるのではないことが明らかとなった。
【０２１９】
一方、相対湿度７５％で放置した場合、無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、無水結晶α，α−トレハロース及び無水非晶質α，α−トレハロースを同様に、放置後１日でほぼ吸水量が飽和に達した。この際の吸水量は、いずれの環状四糖も、その重量の約１４％であるのに対し、α，α−トレハロースはその重量の１０％弱であることから、環状四糖の方が脱水能としては優れていることが判明した。また、いずれの試料も粉末状態を維持し、吸湿によってべとついたり、流れたりする現象は見られなかった。更に、１週間放置後の無水結晶環状四糖、１含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、粉末Ｘ線回折法で解析したところ、主な回折角はそれぞれ放置前の試料と異なった回折パターンを示し、いずれも５乃至６含水結晶環状四糖の回折パターンに一致した。このことから、相対湿度が７５％以上では、水分は結晶水として取り込まれて、５乃至６含水結晶に変換していることが明らかとなった。
【０２２０】
上記のように優れた脱水能を有する本発明の環状四糖は、食品、医薬品、化粧品、これら原材料又は加工中間物などの含水物の強力な脱水剤として有利に利用できることが判明した。
【０２２１】
【実験３６】
〈糊化澱粉の微生物汚染に対する無水結晶環状四糖と５乃至６含水結晶環状四糖の効果の比較〉
もち粉４重量部を水６重量部に溶いて、木枠に濡れ布きんを敷いたものに流し込み、これを１０５℃で１０分間蒸して糊化澱粉とする。これに実験２０の方法で調製した５乃至６含水結晶環状四糖又は実施例Ａ−１の方法で調製した無水結晶環状四糖６重量部をミキサーで混和し、均一になったら、更に水飴２重量部を加え十分に捏ねて成形し、更に４０℃の温風で２時間軽く乾燥して求肥を得た。
【０２２２】
本品を２５℃の室温に開放して放置したところ５乃至６含水結晶環状四糖を使用したものは、１５日後に黒カビのコロニーの発生を見たが、無水結晶環状四糖を使用したものは、３０日後においても微生物の汚染が見られなかった。
【０２２３】
また３０日後のものを切断して、その断面を観察したところ、無水結晶環状四糖を使用したものは、表層部がやや硬化して結晶が析出しているものの、内部は、製造直後と同様に半透明で適度な艶、粘度を有していた。なお表層部の結晶は、Ｘ線回折図形より、無水結晶環状四糖が５乃至６含水結晶環状四糖に変換しているものであることが判明した。
【０２２４】
この結果、脱水能を有する環状四糖は、糊化澱粉の脱水剤として作用し、微生物汚染を防止し、更に糊化澱粉の老化を防止することが判明した。この性質は、求肥、フラワーペーストなどの糊化澱粉を用いる各種製品に対して有利に利用できる。
【０２２５】
以下、本発明の脱水能を有する環状四糖を実施例Ａでその用途を実施例Ｂで具体的に述べる。
【０２２６】
【実施例Ａ−１】
〈無水結晶環状四糖の製造方法〉
バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を実験６の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を９．０単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を３０．２単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１ｌを回収した。タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ−ゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法にしたがって、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。この環状四糖含有シラップを実験１９に記載の方法にしたがって、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバ−ライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』、オルガノ株式会社製）を充填したカラム（ゲル量２２５ｌ）に供し、カラム温度を６０℃に維持しつつ、流速約４５ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行った。溶出液の糖組成を実験１に記載のＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、環状四糖高含有液を原料澱粉固形物当たり収率約２１％で得た。本高含有液は、固形物当たり約９８％の環状四糖を含有していた。本溶液を濃度約９０％に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として無水結晶環状四糖約２％を加えて、１２０℃で１６時間維持しつつ真空乾燥し、水分約０．２％の無水結晶環状四糖粉末を得た。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。
【０２２７】
【実施例Ａ−２】
〈１含水結晶環状四糖の製造方法〉
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３重量％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」、天野製薬株式会社製造』を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法にしたがって、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。実施例Ａ−１に記載の方法にしたがってクロマト分離し、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収した。これを実験２０の方法にしたがって、エバポレーターで固形物濃度約５０％に濃縮した後、この濃縮糖液約５ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、穏やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させることにより晶析させたところ、５乃至６含水結晶環状四糖粉末が得られた。これをガラス容器に入れ、予め温度１４０℃に保温したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持した。得られた乾燥物を粉砕機にて粉砕し、水分約２．７％の１含水結晶環状四糖粉末を得た。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。
【０２２８】
【実施例Ａ−３】
〈無水非晶質環状四糖の製造方法〉
実施例Ａ−１に記載の方法にしたがって得られた環状四糖の純度が９８％以上の画分を、常法にしたがって脱塩、脱色、濾過した後、その濃度を５０％にした。これを−８０℃で急速に凍結した後、その凍結物を凍結真空乾燥を行い、さらに８０℃で３時間真空乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機にて粉砕し、水分約０．３％の無水非晶質環状四糖粉末を得た。このＸ線回折図形を図３３に示す。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。
【０２２９】
【実施例Ａ−４】
〈パノースから無水結晶環状四糖の製造方法〉
澱粉から製造されたパノース（株式会社林原生物化学研究所製造）の水溶液（約１００ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をパノース１グラム当たり２単位加え、４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、ＨＰＬＣで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約４４％であった。この反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物１グラム当たり１５００単位を添加し、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり７５単位を添加して、２４時間反応させ、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、更に、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調整し９０℃で１時間保持して酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約３，６５０ｇを含む糖液約６．１ｋｇを得た。得られた糖液を、実施例Ａ−１に記載の方法にしたがってクロマト分離し、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約１，０００ｇを含む糖液約３ｋｇを得た。得られた糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．２％であった。得られた環状四糖水溶液をエバポレーターで濃度約５０％に濃縮した後、得られた濃縮糖液約２ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで下げて晶析させ、乾燥して、５乃至６含水結晶環状四糖を得た。得られた５乃至６含水結晶環状四糖をさらに温度１２０℃で１６時間真空乾燥し、水分約０．２％の無水結晶環状四糖を得た。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。
【０２３０】
【実施例Ｂ−１】
〈脱水剤〉
実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末を用いて、紙製の透湿性小袋に１５ｇずつ充填し、脱水剤を製造した。本品は、味付け海苔、クッキーなどの乾燥食品を封入した防湿容器内雰囲気の脱水剤として有利に利用できる。また、各種乾燥食品、油性食品などに対し、本脱水剤とともに脱酸素剤などを併用して、これら食品などを安定保存することも有利に実施できる。
【０２３１】
【実施例Ｂ−２】
〈脱水剤入り砂糖〉
砂糖５０重量部に実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶環状四糖粉末１重量部を添加し、高速回転ミキサーで混合して得た混合物をそれぞれ１ｋｇずつポリエチレン袋に入れ、脱気後ポリエチレン袋の口を熱シールして閉封して、脱水剤入り砂糖を製造した。本品は、本発明の脱水剤が砂糖の微細結晶表面の水分を吸収し、砂糖の固着及び固結を防止するので安定に保存される。また、本品は調味料として各種調理、加工食品の製造などに有利に利用できる。
【０２３２】
【実施例Ｂ−３】
〈脱水剤入り食塩〉
食塩１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末１重量部を添加し、高速回転ミキサーで混合して得た混合物をそれぞれ１ｋｇずつポリエチレン袋に入れ、脱気後ポリエチレン袋の口を熱シールして閉封して、脱水剤入り食塩を製造した。本品は、本発明の脱水剤が食塩の微細結晶表面の水分を吸収し、食塩の固着及び固結を防止するので安定に保存される。また、本品は調味料として各種調理、加工食品の製造などに有利に利用できる。
【０２３２】
【実施例Ｂ−４】
〈そぼろ求肥〉
餅粉４重量部を水６重量部で溶いて、木枠に濡れ布きんを敷いたものに流し込み、これを１００℃で２０分間蒸した後、実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末６重量部及び砂糖１重量部を捏り込み、次いで水飴２重量部を加えて、充分に捏ねた後に成形し、更に、室内に１６時間放置して、本品の表層において無水結晶環状四糖を５乃至６含水結晶環状四糖に変換させ、これを軽くロール掛けして表面をひび割れさせ、そぼろ風の求肥を得た。本品は、風味良好で、微生物汚染を受けにくく、高品質を長期間に亙って維持した。
【０２３３】
【実施例Ｂ−５】
〈いも菓子〉
さつまいもを厚さ約１ｃｍにスライスし、これを蒸した後放冷し、これに実施例Ａ−３の方法で得た無水非晶質環状四糖粉末をまぶし５乃至６含水結晶環状四糖に変換させて脱水し、表面に５乃至６含水結晶環状四糖の付着したいも菓子を製造した。本品は風味良好で安定ないも菓子である。
【０２３４】
【実施例Ｂ−６】
〈粉末クリーム〉
生クリーム１重量部に実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末３重量部を混合した後バットに移し、２日間放置して５乃至６含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して風味良好な粉末クリームを得た。本品は、風味良好な粉末クリームで、コーヒー、紅茶の味付けに、また、プレミックス、冷菓、ケーキ、キャンディー類などの製菓材料、経管流動食などの治療用栄養剤などとして有利に利用できる。
【０２３５】
【実施例Ｂ−７】
〈粉末ブランディー〉
ブランディー２重量部にプルラン１０重量部を混合し、これに実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末７重量部を混合した後バットに移し、２日間放置して５乃至６含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して風味良好な粉末ブランディーを得た。本品を口に含めば、適度の甘味を有し、ブランディー香の充分な粉末香料である。本品は紅茶用香り付けとして、また、プレミックス、キャンディー類などの製菓材料などとして有利に利用できる。また、本粉末を顆粒成形機、打錠機にかけて成型し、顆粒、錠剤として利用することも有利に実施できる。
【０２３６】
【実施例Ｂ−８】
〈粉末味噌〉
赤味噌２重量部に実施例Ａ−２の方法で得た１含水結晶環状四糖粉末４重量部を混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込み、これを室温下で一夜静置して固化し、離型して１個当り約４ｇの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末味噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固形調味料としてだけでなく味噌菓子などとしても利用できる。
【０２３７】
【実施例Ｂ−９】
〈粉末醤油〉
実施例Ａ−３の方法で得た無水非晶質環状四糖粉末３．５重量部及び実験２０の方法で得た５乃至６含水結晶環状四糖０．０２重量部をコンベア上で流動させつつ、これに対して薄口醤油を１重量部の割合になるように噴霧し、次いで熟成塔に移し、３０℃で一夜放置して無水非晶質環状四糖を５乃至６含水結晶環状四糖に変換させて粉末醤油を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味料として有利に利用できる。
【０２３８】
【実施例Ｂ−１０】
〈粉末卵黄〉
生卵から調製した卵黄を、プレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得られる液状卵黄１重量部に対して、実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末３．５重量部の割合で混合した後、実施例Ｂ−７と同様にブロック化し粉末化して粉末卵黄を得た。本品は、プレミックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。また美肌剤、育毛剤などとしても有効に利用できる。
【０２３９】
【実施例Ｂ−１１】
〈粉末ヨーグルト〉
プレーンヨーグルト１重量部に実施例Ａ−３の方法で得た無水非晶質環状四糖粉末３．６重量部を混合した後、実施例Ｂ−７と同様にブロック化し、粉末化して粉末ヨーグルトを得た。本品は、風味良好であるだけでなく、乳酸菌を生きたまま長期に安定化し得る。また、プレミックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとして、更には、例えば、マーガリン、ホィップクリーム、スプレッド、チーズケーキ、ゼリーなどに含有させヨーグルト風味の製品にするなどに有利に利用できる。さらに本粉末を顆粒成型機、打錠機などで成型して乳酸菌製剤とし、整腸剤などとして利用することも有利に実施できる。
【０２４０】
【実施例Ｂ−１２】
〈ホットケーキミックス〉
小麦粉２００重量部に実施例Ｂ−１０の方法で得られた粉末卵黄６０重量部、バター２５重量部、砂糖１０重量部、ベーキングパウダー１２重量部及び食塩０．５重量部を配合してホットケーキミックスを得た。本品は、水、牛乳などで溶いて焼くことにより、簡単に風味良好なホットケーキを調製することができる。
【０２４１】
【実施例Ｂ−１３】
〈粉末薬用人参エキス〉
薬用人参エキス０．５重量部に実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末１．２重量部を混捏した後、実施例Ｂ−７と同様にブロック化し、粉末化して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量のビタミンＢ１及びビタミンＢ２粉末とともに顆粒成型機にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用できる。また、育毛剤などとしても利用できる。
【０２４２】
【実施例Ｂ−１４】
〈粉末プロポリスエキス〉
プロポリスを９５ｖ／ｖ％エタノール水溶液で、常法にしたがって抽出し、次いで残渣を少量の水で洗浄し、洗液を合わせて得られたプロポリス粗抽出物含有８０ｖ／ｖ％エタノール（固形物約２０ｗ／ｗ％含有）水溶液に、水を加えてエタノール濃度５０ｖ／ｖ％に低減して、５０℃に１時間保ち、プロポリス有効成分を含有する上層と粘着性沈澱物の下層を形成させ、室温で一夜放置し、この上層を分離し採取して、色調、香味、抗菌作用に優れた液状の精製プロポリス抽出液を、粗抽出粗抽出物含有溶液に対して、固形物当り約４８％の収率で得た。この精製プロポリス抽出液１重量部を、実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末１０重量部に噴霧混合し、さらに乾燥させて風味良好な粉末プロポリスエキスを得た。本品は、抗菌剤、抗酸化剤、抗炎症剤、免疫調節剤、マクロファージ活性化剤などとして直接利用されるだけでなく、他の適宜な材料と配合して、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【０２４３】
【実施例Ｂ−１５】
〈粉末アイエキス〉
タデ科の一年生草本であるアイ（学名「ポリゴナム・ティンクトリウム」）の地上部３０ｋｇを破砕した後、９０ｖ／ｖ％エタノール水溶液で、常法にしたがって抽出し、次いで残渣を少量の水で洗浄し、洗液を合わせて得られたアイ粗抽出物含有水溶液に、水を加えてエタノール濃度５０ｖ／ｖ％に低減した。この粗抽出液１重量部に対し、実施例Ａ−２の方法で得た１含水結晶環状四糖１２重量部の割合で混合した後バットに移し、２日間放置して５乃至６含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して粉末アイ抽出液を得た。本品は抗菌作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、ラジカル捕捉作用、アポトーシス調整作用、サイトカイン調整作用などの多彩な生理作用を具備しており、食品、化粧品及び医薬品に配合する生薬として有利に利用できる。
【０２４４】
【実施例Ｂ−１６】
〈粉末中国パセリエキス〉
セリ科の植物である中国パセリ（英名：コリアンダー、分類：コエンドロ属）の地上部を水洗し、水切りした後、ブレンダーを用いて細断した。細断した中国パセリを遠心濾過分離器を用いて１５０メッシュパスした抽出液を回収し、１２１℃で１０分間処理して、固形物含量６０ｍｇ／ｍｌの中国パセリ抽出液を得た。この抽出液１重量部に対し、実施例Ａ−４で得た無水結晶環状四糖９重量部の割合で混合した後バットに移し、２日間放置して５乃至６含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して粉末中国パセリ抽出液を得た。本品は鉛などの金属の沈着を抑制する作用を具備しており、直接若しくは食品又は医薬品に配合して有利に利用できる。
【０２４５】
【実施例Ｂ−１７】
〈粉末ローヤルゼリー〉
未加工のブラジル産ローヤルゼリー（水分６５重量％）１重量部に実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖７重量部の割合で混合した後バットに移し、２日間放置して５乃至６含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、粉末ローヤルゼリーを得た。さらにこれを１００メッシュパスにより分級した後、打錠機を用いて１錠当り３００ｍｇの錠剤を製造した。本品は強壮作用、細胞賦活作用を具備しており、さらに、劣化しやすいローヤルゼリーを常温下で長期間保存できる。また、風味が改善されており、まろやかな甘味と適度な酸味を示すので、日常的に利用する健康食品として有利に利用できる。
【０２４６】
【実施例Ｂ−１８】
〈流動食用固形製剤〉
実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖粉末４００重量部、実施例Ｂ−７の方法で得られた粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８５重量部、チアミン０．０１重量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５ｇずつを防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして流動食用固形製剤を製造した。
【０２４７】
本固形製剤は、小袋内雰囲気の水分を低減し、低温貯蔵の必要もなく室温下で長期間安定である。また、水に対する分散、溶解は良好である。本固形製剤は、一袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへの経管的投与により利用される。
【０２４８】
【実施例Ｂ−１９】
〈医薬用錠剤状製剤〉
新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた後、その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘤を摘出して細断し、生理食塩水中で分散させてほぐした。得られた細胞を血清無添加のＰＲＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）で洗浄し、同培地に約２×１０６個／ｍｌになるように懸濁し、３５℃に保った。
【０２４９】
これに部分精製したヒトインターフェロン−αを２００ＩＵ／ｍｌの割合で加えて約２時間保った後、更に、センダイウイルスを約３００赤血球凝集価／ｍｌの割合で添加し、２０時間保ってヒトインターフェロン−αを誘導させた。これを、約４℃、約１，０００ｇで遠心分離して沈殿物を除去し、得られた上清を更に精密濾過し、その濾液を、公知の方法にしたがって、抗インターフェロン−α抗体を固定化しているカラムにかけ、非吸着画分を除去した後、その吸着画分を溶出し、膜濃縮して濃度約０．００１ｗ／ｖ％、比活性約２×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白質の濃縮液をハムスター一匹当たり約４ｍｌの収量で得た。
【０２５０】
実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖１ｋｇを粉末化し、１５０メッシュパスさせ、先に得られたインターフェロン−α濃縮液０．２５ｍｌ（約１×１０６ＩＵ）を蒸留水１００ｍｌに希釈した後、噴霧しながら均一に混ぜ合わせ、常法にしたがい打錠機を用いて１錠が３００ｍｇ（１５０ＩＵ／錠）の錠剤を製造した。本製造方法は、インターフェロン−α含有液を無水結晶環状四糖粉末に噴霧するだけで脱水され、さらに均一に混合され、インターフェロン−αの安定化にも効果的である。
【０２５１】
本品は、水に対して易溶である事から、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗リューマチ剤、抗免疫疾患剤などの抗感受性疾患剤として内服用剤、口腔用剤として利用することができる。また、検査用の試験薬に用いることも有利に実施できる。
【０２５２】
【実施例Ｂ−２０】
〈医薬用顆粒状製剤〉
ヒト由来のリンパ芽球細胞ＢＡＬＬ−１細胞を牛胎児血清を２０％補足したＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＨ７．４）に接種し、３７℃で常法に従い生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で浮遊培養した。得られた細胞を血清無添加のＥａｇｌｅ最少基本培地で（ｐＨ７．４）で洗浄し、同培地に約１×１０７個／ｍｌになるように懸濁した。この懸濁液にセンダイウイルスをｍｌ当り約１，０００赤血球凝集価添加し、３８℃で１日保ってツモア・ネクロシス・ファクター−αを誘導生成させた。これを４℃、約１，０００ｇで遠心分離し、得られた上清をｐＨ７．２、０．０１Ｍリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で１５時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を常法にしたがって、抗インターフェロン抗体のカラムに流し、その非吸着画分を、抗ツモア・ネクロシス・ファクター−α  モノクローナル抗体のゲルカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、濃縮して、濃度約０．０１ｗ／ｖ％比活性約２×１０６ＪＲＵ／ｍｇ蛋白質の濃縮液を得た。活性収量は、誘導生成時の懸濁液１ｌ当り約５×１０４ＪＲＵであった。
【０２５３】
実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖１ｋｇを粉末化し、１５０メッシュパスさせ、先に得られたツモア・ネクロシス・ファクター−α濃縮液０．５ｍｌ（約１×１０５ＪＲＵ）蒸留水１００ｍｌに希釈した後、噴霧しながら均一に混ぜ合わせ、常法にしたがい顆粒形成機によって顆粒状のツモア・ネクロシス・ファクター−α製剤（約１００ＪＲＵ／ｇ）を製造した。本製造方法は、ツモア・ネクロシス・ファクター−α含有液を無水結晶環状四糖粉末に噴霧するだけで脱水され、さらに均一に混合され、ツモア・ネクロシス・ファクター−αの安定化にも効果的である。
【０２５４】
本品は、水に対して易溶であることから、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗リューマチ剤、抗免疫疾患剤などの抗感受性疾患剤として内服用剤、口腔用剤として利用することができる。また、検査用の試験薬に用いることも有利に実施できる。
【０２５５】
【実施例Ｂ−２１】
〈外傷治療用膏薬〉
実施例Ａ−１の方法で得た無水結晶環状四糖４００重量部にヨウ素３重量部を溶解しメタノール５０重量部加えて混合し、更に１０％プルラン水溶液２００重量部及びマルトース含水結晶５０重量部を加えて混合し、室温下で一夜放置して５乃至６含水結晶環状四糖に変換させ、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。
【０２５６】
本品は、創面に塗るか、又は、ガーゼ、油紙などに塗るなどして使用することにより、切傷、擦り傷、火傷、水虫による漬傷などの外傷を治療することができる。
【０２５７】
【発明の効果】
上記したことから明らかなように、本発明は、非還元性の環状四糖を有効成分とする脱水剤に関するものであって、脱水能を有する環状四糖を、例えば乾燥食品などを封入した防湿容器内の雰囲気に含まれる水分を低減させる場合、更には、例えば、食品、医薬品、化粧品、工業化学品、これらの原材料、又は加工中間物などの各種含水物の水分を低減させる場合などに有利に利用できる。脱水能を有する環状四糖を５乃至６含水結晶環状四糖に変換させて脱水し、実質的に水分を低減させる本発明の方法は、加熱乾燥などの苛酷な条件を必要としないで、各種含水物、例えば、風味、香気を劣化しやすい食品、有効成分の分解、活性低下の伴いやすい医薬品などの品質を低下させること無く、高品質の脱水物品を容易に製造することができる。また、得られた脱水物品は、微生物汚染が防止され、加水分解、酸敗、褐変などの変質、劣化が防止され、その商品の寿命を長期にわたって安定に維持することができる。
【０２５８】
本発明は斯くも顕著な作用効果を有する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【０２５９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> Desiccant, Dehydration Therewith, And Dehydrated Product Obtainable Thereby
<130> WO880
<150> JP 010,991/01
<151> 2001-1-19
<160> 10
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 1
Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile
1               5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 2
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly
1               5                  10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 3
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly
1               5                  10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 4
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro
1               5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 5
Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr
1               5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 6
Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe
1               5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 7
Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe
1               5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 8
Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr
1               5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 9
Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser
1               5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 10
Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser
1               5
【図面の簡単な説明】
【図１】  α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パタ−ンを示す図である。
【図２】  α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図３】  α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図４】  環状四糖の構造が、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることを示す図である。
【図５】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１２】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１３】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１４】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１５】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１６】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１７】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１８】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１９】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図２０】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図２１】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２３】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２４】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２５】  ５乃至６含水結晶環状四糖の顕微鏡写真をディスプレ−上に表示した中間調画像である。
【図２６】  ５乃至６含水結晶環状四糖状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図２７】  ５乃至６含水結晶環状四糖状粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図２８】  本発明の１含水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図２９】  本発明の１含水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図３０】  ５乃至６含水結晶環状四糖粉末を４０℃で真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図３１】  ５乃至６含水結晶環状四糖粉末を１２０℃で真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図３２】  本発明の無水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図３３】  環状四糖水溶液を凍結乾燥及び真空乾燥して得られる無水非晶質環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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