(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の外膜に誘導される可溶性化合物であって、
（Ａ）補体を阻害する可溶性ポリペプチド；および
（Ｂ）膜局在化試薬（ここで、膜局在化試薬は可溶性であり、以下の成分：
（１）８ないし１８個のメチレン単位を有する脂肪族アシル基を含む少なくとも一つの親油性結合エレメント；
（２）塩基性アミノ酸を含む親水性ペプチド結合エレメントであって、
（ａ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧ              （配列番号３７）；
（ｂ）ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤ              （配列番号３８）；
（ｃ）ＳＰＳＮＥＴＰＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＧ      （配列番号３９）；
（ｄ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ              （配列番号４０）；
（ｅ）ＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫ                  （配列番号４１）；
（ｆ）ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤＣ            （配列番号５）；
（ｇ）ＣＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ              （配列番号１８）；
および
（ｈ）ＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣ                  （配列番号１９）
からなる群より選択される配列を含み、かつ該親油性エレメントに結合する親水性ペプチド結合エレメント；
（３）該可溶性ポリペプチドを膜局在化試薬の親水性ペプチド結合エレメントと共有結合させ、可溶性化合物を形成させるリンカーを含む）
を含む、可溶性化合物。
【請求項２】
親水性ペプチド結合エレメントがＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤ（配列番号３８）を含む、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項３】
親水性ペプチド結合エレメントがＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤＣ（配列番号５）を含む、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項４】
親油性結合エレメントがミリストイルを含む、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項５】
膜局在化試薬が配列番号２７の配列からなるミリストイル／静電気的スイッチペプチド試薬１（ＭＳＷＰ−１）である、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項６】
補体を阻害する可溶性ポリペプチドが補体受容体１（ＣＲ１）のロング・ホモロガス・リピートＡ（ＬＨＲ−Ａ）のショート・コンセンサス・リピート１−３（ＳＣＲ１−３）である、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項７】
リンカーが、システイン残基；Ｎ−ハロアセチル基（ここでハロは塩素、臭素またはヨウ素を意味する）；リジン残基のε−アミノ基にあるハロアセチル基（ここでハロは塩素、臭素またはヨウ素を意味する）；結合手；Ｃ−末端にあるアミド基；Ｎ−末端ブロック基；およびＮ−末端またはリジン残基のε−アミノ基にある脂肪酸Ｎ−アシル基からなる群より選択される、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項８】
配列番号８の配列によって示される化合物である、請求項１記載の可溶性化合物。
【請求項９】
可溶性ポリペプチドの可溶性誘導体であって、ポリペプチドと、さらに２種またはそれ以上の共有結合した異種膜結合エレメントからなる単位とのコンジュゲートまたは融合体からなり、該エレメントは、そのすべてがすべて同じではなく、細胞外流体に曝される細胞または人工膜の成分と独立して相互作用する能力を有し、かつ、
（１）８ないし１８個のメチレン単位を有する脂肪族アシル基から選択される膜挿入性疎水性基；
（２）（ａ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧ              （配列番号３７）；
（ｂ）ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤ              （配列番号３８）；
（ｃ）ＳＰＳＮＥＴＰＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＧ      （配列番号３９）；
（ｄ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ              （配列番号４０）；
（ｅ）ＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫ                  （配列番号４１）；
（ｆ）ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤＣ            （配列番号５）；
（ｇ）ＣＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ              （配列番号１８）；
および
（ｈ）ＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣ                  （配列番号１９）
からなる群より選択される配列を含む膜結合電荷ペプチド；および
（３）膜貫通タンパク質などの膜成分についての既知のリガンドから誘導され、化合物、バクテリオファージまたは他の提示ライブラリを特異的膜誘導分子標的に対してスクリーニングすることにより同定される、３ないし１３個のアミノ酸を含有するペプチドをさらに含む膜成分リガンド
を含む、可溶性タンパク質の可溶性誘導体。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ポリペプチド誘導体、治療におけるそれらの使用、それらの製造方法およびその中間体に関する。
本質的に、すべてのタンパク質薬剤は、溶液として投与され、インビボで溶液相にて機能する。しなしながら、生化学および薬理学において、多くのコントロールおよびメディエータータンパク質は、細胞の原形質膜に結合するか、または該膜中もしくは該膜上で機能する。これらの分子の１つのクラスの可溶性の、末端切断されたものを除いては、治療剤として開発された膜結合タンパク質はない。この状況には２つの主な理由がある。第一に、産生細胞の膜中に保持されるタンパク質の過剰発現は、タンパク質に対する膜の低許容性により、およびしばしば、発現が本質的に効率的である場合に保持の毒性作用により、限定される。第二に、膜からのこれらのタンパク質の抽出は、界面活性剤または有機溶媒を必要とし、その結果タンパク質が不活性となり、薬剤使用に必要な高い純度を得ることが困難となり、通常、静脈投与用に処方することが困難な生成物が得られる。加えて、きわめて疎水性の膜固定エレメントの保持は、静脈投与された場合、タンパク質を血液中で脂質結合タンパク質と強固に結合させ、その結果細胞膜への接近を妨げる可能性がある。
膜結合タンパク質の可溶性の、末端切断されたものは、全長タンパク質に伴なう製造の困難を克服する。しかしながら、かかる末端切断分子は、その特性が所望の治療活性に有利であるかまたは必須であるかもしれない、全長タンパク質の、膜結合能力および特異性を欠く。
タンパク質の膜との相互作用の主なクラスは、以下のようにまとめることができる：
１．  複合体脂質のリン脂質ヘッド基または他の親水性領域との直接的で特異的な相互作用、または、すでに膜中に挿入されているタンパク質との非直接的相互作用。後者は、以下に示す内因性膜タンパク質のすべてのタイプを包含し、かかる相互作用は、通常、細胞外ドメインまたは膜タンパク質の配列ループとによる；
２．  タンパク質の末端付近の単一疎水性膜貫通ヘリカルによる固定による。一般にこれらの領域は、ヘリックスシリンダーの周囲全体の周りの疎水性面に位置し、この構造の大量の水の親水性環境への移動は、エネルギー的に好ましくない；
３．  さらなる固定は、しばしば細胞の細胞質側、膜貫通ヘリックスに対してＣ末端にて、カチオン性アミノ酸の短い配列によりしばしば提供される；
４．  通常、ヘリカルまたはヘリカル近位と予想される多重（通常、２〜１２および一般に４、７および１０）膜貫通領域の使用による。一般にこれらの領域は、全体に疎水性であるが、しばしばいくらか両親媒性性質−外側の疎水性面および脂質二重膜中に位置するヘリックス束内で同定可能な内側のより親水性面を示す；
５．  翻訳後に結合したホスファチジルイノシトール基（ＧＰＩ−アンカー）による。これらは、Ｃ−末端アミノ酸の特異的な伸長を認識して除去し、伸水性炭水化物スペーサーを介してポリペプチドに結合する膜結合ジアシルグリセロール単位を形成する、特異的生合成経路により生成される；
６．  関連する工程において、ミリストイル、パルミトイルまたはプレニルなどの単一脂肪酸基が、翻訳後に、タンパク質内の１またはそれ以上の部位（通常、Ｎ−またはＣ−末端にて）に結合する可能性がある。再度、アミノ酸（Ｒａｓタンパク質内のＣ−末端ＣＡＡＸボックスなど）が除去されてもよい。
人工膜は、細胞膜の基本的特性を模倣した脂質複合体、すなわち、水性内部および細胞膜に似た表面化学を有する脂質小腔であると考えられる。典型的には、人工膜は、リン脂質またはその模倣物を含み、単一レメラー（unilemellar）またはバイレメラー（bilemellar）であってもよく、外側表面は、もっとも豊富なリン脂質のコリン基と同様な荷電した基を含む。プロトタイプの人工膜は、リポソームとして知られており、リポソーム中への治療的に有用な薬剤の組み込みを含め、リポソームの構築のための技術は当該分野で周知である。リポソームは多数の病態において評価されており、抗真菌剤アンホテリシンを含むリポソームは、市販されている。加えて、プロテオリポソームが記載されている。例えば、アンホテリシンＢを封入する免疫リポソームの使用が、動物モデルにおける実験的真菌感染の治療において有用であることが報告されている（例えば、Hospenthal, D. et al（1989）, J. Med. Microbiol. 30. 193-197;Dromer, F. et al（1990）, Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2055-2060）。
天然のまたは人工の膜の模倣物は、しばしば構造において関連しており、膜の１つまたはそれ以上の特性を模倣する。１つのかかる例は、細胞表面の外側上に見られるリン脂質両性イオン基を模倣するペンダント基を有する人工表面の供給である。例えば、ＷＯ９２／０６７１９（Biocompatibles Limited）には、人工表面、例えば、デバイス上に被覆され、使用において、タンパク質含有または生物学的液体と接触し、改良された生物適合性および血液適合性を提供する天然および合成のリン脂質が開示され、ＷＯ９４／１６７４９には、同様な方法で生物適合性を改良するのに用いられるさらなる両性イオン基が開示される。
本発明は、可溶性ポリペプチドの可溶性誘導体であって、該誘導体は、ポリペプチドに共有的に結合した低い膜親和性を有する２またはそれ以上の異種性膜結合エレメントを含み、該エレメントは、独立して、熱力学的付加物と共に、細胞外流体に暴露される細胞または人工膜の成分と相互作用できる、誘導体を提供する。
「異種性」は、可溶性タンパク質が由来する、天然の全長タンパク質中に見られないエレメントを意味する。
「可溶性ポリペプチド」は、天然の膜結合能力を欠く全長タンパク質の末端切断誘導体、および／または水性媒体中にて＞１００μｇ／ｍｌの可溶性レベルを有するポリペプチドである。
「低い膜親和性を有する膜結合エレメント」は、エレメントが膜に対して弱い親和性のみを有し、解離定数が０．１μＭよりも大きく、好ましくは１μＭ〜１ｍＭであるものを意味する。好ましくは、エレメントは＜５ｋＤａの大きさを有する。
誘導体は、誘導体が特異的膜に対する高い親和性（好ましくは、０．０１〜１０ｎＭ解離定数）を有するのに十分な、膜成分に対して低い親和性を有するエレメントを組み込むべきである。エレメントは、全体として特定の標的膜に対して高い親和性を生じるが、単一エレメントが（低い親和性）リガンドとなるような他のタンパク質に対するかかる高い親和性を欠くように、組み合わせる。
エレメントは、医薬処方媒体中にて有用な可溶性、好ましくは、＞１００μｇ／ｍｌを保持するように選択されるべきである。好ましくは少なくとも１つのエレメントは親水性である。
それゆえ、本発明は、細胞膜にて治療的タンパク質の局在化を促進し、それにより、以下の治療的有利性を含む、有効な治療的有利性を有する、いくつかの生物学的に重要な効果の１つまたはそれ以上を提供する：
有効性：タンパク質がレセプターであり、アゴニストまたはアンタゴニスト活性がレセプターそれ自身として同じ表面上に局在する場合、効果的な濃度における増加が自由の拡散程度における減少により得られる。
薬物動態学および投薬頻度：誘導体タンパク質の長期生存細胞型または血清タンパク質との相互作用は、タンパク質の血漿保持時間を長くし、細胞表面上の沈着を介してデポット（depot）効果を産生することが期待される。
特異性：多くの臨床的に重要な病理学プロセスは、特異的細胞型および組織に関連する（例えば、血管内皮細胞およびＥＬＡＭ−１に対するシアリルルイス抗原を有する好中球のそれに対する新参者、以下参照）。それゆえ、修飾タンパク質を、病理学関連膜マーカーを含む膜の領域に対して標的することは、標的タンパク質の治療的割合を改良できる。
本発明の誘導体を人工膜またはその模倣物と結合して用い、治療利益を提供する部位への治療タンパク質の伝達を可能にできる。例えば、リポソームを本発明の誘導体と接触させることにより形成されるリポソームと結合したポリペプチドは、遊離のタンパク質よりもより安定である。リポソームは、例えば、抗炎症剤または細胞毒製剤などの治療剤を組み込むことができる。本発明のポリペプチド誘導体を用いて、治療剤を標的できる。ポリペプチドそれ自体が治療剤である場合、治療剤を組み込んだリポソームを用いて、治療の効率または許容性をさらに増強できる。
本発明の誘導体の細胞膜の模倣物への結合を用い、誘導体ではないタンパク質の治療的に有用な濃度を達成することが困難な部位にて、治療タンパク質を濃縮することができる。例えば、ＷＯ９２／０６７１９およびＷＯ９４／１６７４９において開示されるような、細胞表面の外側に見られるリン脂質両性イオン基の模倣物で被覆された埋め込み医薬デバイスは、さらに、本発明の誘導体で処理できる。例えば、本発明にしたがって誘導された補体阻害剤を、埋め込みカテーテルまたは臀部置換体または心臓弁の外側表面中に組み込み、これらの手術に伴なう炎症の発生を最小限とすることができる。
ヒトタンパク質の可溶性誘導体であるポリペプチドと異種性アミノ酸配列のすべての結合体は、特にアミノ酸配列がヒトタンパク質由来でない場合、潜在的な免疫原性について評価する必要があることは明らかである。可能な限り公知のヒトタンパク質に近い配列を用いることにより、および、２次構造および抗原性索引の算定により、問題を最小限とすることができる。
本発明にしたがって修飾できるタンパク質治療剤の例には、以下のものが包含されるがこれに限定されるものではない：
0004177457.tif 000002
好ましくは、誘導体は、２ないし８個、より好ましくは２ないし４個の膜結合エレメントを含む。
好ましくは、膜結合エレメントは：脂肪性アシル基などの脂肪酸誘導体；塩基性アミノ酸配列；公知の完全な膜タンパク質のリガンド；膜タンパク質のエピトープに対して生成されるモノクローナル抗体の相補性決定領域由来の配列；ランダムな化学またはペプチドライブラリーのスクリーニングにより同定された膜結合配列から選択される。
膜結合エレメントの適当な組み合わせの選択は、標的細胞膜またはその成分の性質により導かれる。
適当な脂肪酸誘導体には、膜への高親和性結合を可能とするのに不充分に大きくまたは親水性であるミリストイル（１２個のメチレン単位）が包含される。ミリストイル化ペプチドを用いた研究（例えば、R. M. Peitzsch & S. McLaughlin, Biochemistry, 32, 10436-10443, 1993）は、これらがモデル脂質系で１０-4Ｍの効果的な解離定数を有し、１２メチレン基の約１０個が脂質二重膜に埋め込まれていることを示している。それゆえ、約８ないし１８個のメチレン単位、好ましくは１０ないし１４個のメチレン単位を有する脂肪族アシル基は、適当な膜結合エレメントである。適当な脂肪酸誘導体の他の例には、長鎖（８〜１８、好ましくは、１０〜１４メチレン）脂肪族アミンおよびチオール、ステロイドおよびファルネシル誘導体が包含される。
酸性リン脂質ヘッド基と相互作用し、膜結合を標的とするさらなるエネルギーを提供するタンパク質配列中で塩基性アミノ酸のクラスターと組み合わせた場合、膜結合が、脂肪性アシル基による限定（単一部位）修飾と関連して見られる。ごの効果の組み合わせは、「ミリストイル−静電気的スイッチ（myristoyl-electrostatic switch）」と称されている（S. McLaughlin and A. Aderem. TIBS, 20, 272-276, 1994; J. F. Hancock et al, Cell, 63, 133-139, 1990）。それゆえ、適当な膜結合エレメントのさらなる例は、ＲａｓおよびＭＡＲＣＫ（ミリストイル化アラニン−リッチ Ｃ−キナーゼ基質、P. J. Blackshear, J. Bol. Chem,, 268, 1501-1504, 1993）などの、配列内のセリン残基の可逆的リン酸化およびネットの正の電荷の付随する中和化を介して静電気的「スイッチ」を媒介するタンパク質内に見られるような、塩基性アミノ酸配列である。かかる配列には、限定するものではないが、（Ｌｙｓ）ｎ（ここでｎは３〜１０、好ましくは４〜７である）などのリジンおよびアルギニンの連続的配列が包含される。
塩基性アミノ酸を含むアミノ酸配列の適当な例には：
ｉ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧ
ii）ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤ
iii）ＳＰＳＮＥＴＰＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＧ
iv）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ
ｖ）ＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫ
（左側にＮ−末端）
配列ｉ）ないしｖ）は、静電気的スイッチ配列の例である。
公知の完全な膜タンパク質のリガンド由来のアミノ酸配列の例には、ヒト血小板膜のαβインテグリンに対するリガンドであるＧＲＧＤＳＰなどのＲＧＤ−含有ペプチドが包含される。他の例は、血小板中のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ膜タンパク質に結合する、ヒトフィブリノゲンアルファ鎖由来のＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳである。
かかる配列のさらなる例には、レセプターなどの膜タンパク質と主要組織適合遺伝子複合体間の相互作用に関与することが知られるものが包含される。かかる膜タンパク質リガンドの例は、穏やかな親和性で主要組織適合遺伝子複合体クラス１タンパク質（ＭＨＣ−１）に結合することが示されている（L. Olsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9086-909, 1994）、配列ＧＮＥＱＳＦＲＶＤＬＲＴＬＬＲＹＡである。
かかる配列のよりさらなる例には、Ｔ細胞に特異的な膜挿入アドレスが使用される。かかる配列は、Ｔ細胞抗原レセプターの膜貫通ヘリックスとＣＤ３と公知の相互作用から由来する（Nature Medicine 3, 84-88, 1997）。例は：
ＳＡＡＰＳＳＧＦＲＩＬＬＬＫＶ
ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧ
などの配列ＧＦＲＩＬＬＬＫＶを含むペプチドである。
完全な膜タンパク質に対するリガンドの一例は、完全な膜タンパク質ＥＬＡＭ−１に対するリガンドとして同定されている炭水化物リガンド、シアリルルイス（Sialyl Lewis）である（M. L. Phillips et al, Science, 250, 1130-1132, 1990 & G. Walz et al, Ibid, 250, 1132-1135, 1990）。
膜タンパク質内のエピトープに対して生成されるモノクローナル抗体の相補性決定領域由来の配列（例えば、J. W. Smith et al, J. Biol. Chem. 270, 30486-30490, 1995参照）もまた、適当な膜結合エレメントであり、配列は、ファージディスプレイフォーマット中で生成され、インビトロ（G. F. Smirh and J. K. Scott, Methods in Enzymology, 217H, 228-257, 1993）またはインビボ（R. Pasqualini & E. Ruoslahti, Nature, 380, 364-366, 1996）でバイオパンニング（biopanning）操作により選択されるようなランダムな化学的ライブラリーからである。
所望により、膜からの条件付解離を、ｐＨ感受性（静電気的スイッチ）、金属イオン結合による調節（内因性Ｃａ2+、Ｚｎ2+および膜結合エレメント中のイオン結合部位の組み込みを用いる）およびプロテアーゼ開裂（例えば、プロウロキナーゼを放出し活性化する、リジン−リッチ膜結合配列のプラスミノ溶解など）などの機構を用いて、本発明の誘導体中に組み込むことができる。
本発明の好ましい誘導体は以下の構造を有する：
［Ｐ］−｛Ｌ−［Ｗ］｝n−Ｘ
（式中：
Ｐは、可溶性ポリペプチドであり、
各Ｌは、独立して、可撓性連結基であり、
各Ｗは、独立して、ペプチド性膜結合エレメントであり、
ｎは、１またはそれ以上の整数であり、
Ｘは、いずれかのＷに共有結合していてもよいペプチド性または非ペプチド性膜結合基である。）
ペプチド性膜結合エレメントは、好ましくは８〜２０個のアミノ酸長であり、エレメントＷは、好ましくは、可溶性ポリペプチドのＮまたはＣ末端に連続して位置する。アミノ酸配列は、互いにおよび可溶性ペプチドに、好ましくは４〜２０個のアミノ酸の親水性および／または可撓性アミノ酸配列；線状親水性合成ポリマー；化学的架橋基から選択される連結基により結合する。
ペプチド結合は、化学的にまたは適当なコーディングＤＮＡ配列の発現により生合成的に作成できる。非ペプチド結合は、翻訳後修飾により化学的にまたは酵素的に作成できる。
本発明の誘導体のポリペプチド部分を、適当な宿主にて、１またはそれ以上のペプチド性膜結合エレメント、および、さらなる膜結合エレメントによる翻訳後誘導を促進するための結合基を導入するためのシステインなどの所望の残基を足した、目的の可溶性ポリペプチドをコードする修飾遺伝子の発現により調製できる。
さらなる態様において、それゆえ、本発明は、本発明の誘導体を製造する方法であって、組換え宿主細胞において該誘導体のポリペプチド部分をコードするＤＮＡを発現させ、産物を回収し、その後、翻訳後的にポリペプチドを修飾し、化学的に膜結合エレメントを導入することを含む方法を提供する。
特に、方法の組換えの態様には：
ｉ）宿主中で、該ポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを発現可能な、複製可能な発現ベクターの調製；
ii）該ベクターでの宿主細胞の形質転換；
iii）該形質転換宿主細胞の、該ＤＮＡポリマーが発現され、該ポリペプチドを産性できる条件下での培養；
iv）該ポリペプチドの回収
の工程を含んでいてもよい。
ポリペプチド部分が新規である場合、該ポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマー、ならびにポリペプチド部分それ自体およびそのＳ−誘導体もまた、本発明の一部を形成する。特に、本発明は、ペプチド結合により１つのペプチド性膜結エレメントに結合する可溶性ペプチドを含み、および／または、Ｃ−末端システインおよびポリペプチド部分をコードするＤＮＡポリマーを包含する、本発明の誘導体のポリペプチド部分を提供する。
本発明の組換え法を、Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）およびDNA Cloning vols I, II and III（D. M. Glover ed., IRL Press Ltd）に記載されるような慣用の組換え技術により行ってもよい。
調製を、インビトロまたはインビボにて、適当に、化学的に、酵素的に、または２つの方法を組み合わせて、行うことができる。それゆえ、ＤＮＡポリマーを、D. M. Roberts et al., Biochemistry 1985, 24, 5090-5098に記載されるような慣用の方法により、適当なＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションにより調製できる。
ＤＮＡフラグメントを、適当な制限酵素で必要なヌクレオチドの配列を含むＤＮＡを消化することにより、化学的合成により、酵素的ポリマー化により、またはこれらの方法の組み合わせにより、得ることができる。
制限酵素での消化を、適当な緩衝液中、２０〜７０℃の温度にて、一般に５０μｌまたはそれ以下の容量中、０．１〜１０μｇのＤＮＡで、行ってもよい。
ＤＮＡの酵素的ポリマー化を、インビトロで、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）などのＤＮＡポリメラーゼを用い、必要とされるように、ヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む適当な緩衝液中、１０〜３７℃の温度にて、一般に５０μｌまたはそれ以下の容積で、行ってもよい。
ＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションをＴ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを用い、適当な緩衝液中、４℃〜３７℃の範囲にて、一般に５０μｌまたはそれ以下の容積で、行ってもよい。
ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学的合成を、慣用のリン酸トリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミド化学により、‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual’（ed. H. G. Gassen and A. Lang）, Verlag Chemie, Weinheim（1982）または他の科学的刊行物、例えば、M. J. Gait. H. W. D. Matthes M. Singh, B. S. Sproat and R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci and M. H. Caruther, Journal of the American Chemical Society 1981, 103, 3185; S. P. Admas et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus and H. Koester, Nucleic Acids Rearch, 1984, 12, 4539; およびH. W. D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801などに記載されるような固相技術を用い、行ってもよい。好ましくは、自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Applied Biosystems 381A Synthesiser）を用いる。
好ましくは、ＤＮＡポリマーをポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を共に含む２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子をライゲートして調製する。
ＤＮＡ分子を、必要なコーディング配列を有するベクターの適当な制限酵素による消化により得ることができる。
ＤＮＡ分子の正確な構造およびそれらを得る方法は、所望の生成物の構造による。ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の構築の適当な手法の設計は、当業者の慣用の方法である。
特に、特定の宿主細胞のコドン使用を考慮する。コドンを、Devereux et al.,（1984）Nucl. Acid Res., 12, 387に示される原則を用いて、イー．コリ（E. coli）における高いレベルの発現に対し最適化できる。
組換え宿主細胞においてポリペプチドをコードするＤＮＡポリマーの発現を、宿主中にて、ＤＮＡポリマーを発現可能な、複製可能な発現ベクター手段により、行ってもよい。新規な発現ベクターはまた、本発明の部分を形成する。
複製可能な発現ベクターを、本発明にしたがって、宿主細胞に適するベクターを開裂して、完全なレプリコンを有する線状ＤＮＡフラグメントを得て、該線状フラグメントを、該線状セグメントとともに、ポリペプチドをコードする一つまたはそれ以上のＤＮＡ分子と、ライゲート条件下に組み合わせることにより、調製してもよい。
線状セグメントおよび１以上のＤＮＡ分子とのライゲーションを、所望により、同時にまたは連続的に行ってもよい。
それゆえ、所望により、ＤＮＡポリマーを事前に形成するかまたはベクターの構築中に形成してもよい。ベクターの選択は、イー．コリなどの原核細胞、または、マウスＣ１２７、マウスミエローマ、チャイニーズハムスター卵巣、真菌、例えば繊維状真菌、または単核「酵母」などの真核細胞、またはドロソフィアなどの昆虫細胞であってもよい宿主細胞により部分的に決定される。宿主細胞は、トランスジェニック動物中にあってもよい。適当なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、および例えばバキュロウイルスもしくはワクシニア由来の組換えウイルスが包含される。
ＤＮＡポリマーをフラグメントを発現する安定に形質転換された哺乳動物細胞系の単離用に設計されたベクター、例えば、マウスＣ１２７細胞におけるウシ乳頭腫ウイルス、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞における増幅ベクター中に組み込むませてもよい（DNA Cloning Vol. II D. M. Glover ed. IRL Press 1985; Kaufman, R. J. et al., Molecular and Cellular Biology, 5, 1750-1759, 1985; Pavlakis G. N. and Hamer, D. H. Proceedings of the National Academy of Sciences（USA）80, 397-401, 1983; Goeddel, D. V. et al., European Patent Application No. 0093619, 1983）。
復元可能な発現ベクターの調製を、例えばSambrook et al.（前掲）に記載される手法により、ＤＮＡの制限、ポリマー化およびライゲーション用の適当な酵素で、慣用的に行ってもよい。ポリマー化およびライゲーションをＤＮＡポリマーの調製について上記したように行ってもよい。制限酵素での消化を、適当な緩衝液中、２０〜７０℃の温度にて、一般に５０μｌ位下の容量で、０．１〜１０μｇのＤＮＡで行ってもよい。
組換え宿主細胞を、本発明にしたがって、形質転換条件下に、本発明の複製可能な発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより調製する。適当な形質転換条件は、慣用であり、例えば、Sambrook et al.（前掲）、または″DNA Cloning″Vol. II. D. M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。それゆえ、イー．コリなどの細菌宿主を、ＣａＣｌ2の溶液（Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ2、酢酸カリウムおよびグリセロールの混合物を含む溶液で、ついで、３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパン硫酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理するか、または、例えば、Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA, manufacturers of and electroporatorに記載されるエレクトロポレーションにより処理してもよい。培養中の哺乳動物細胞を、細胞中にベクターＤＮＡのカルシウム共沈により、またはカチオン性リポソームを用いることにより、形質転換させてもよい。
本発明はまた、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換した宿主細胞にもわたる。
ＤＮＡポリマーの発現が可能な条件下での形質転換宿主細胞の培養を、例えば、Sambrook et al.および″DNA Cloning″（前掲）に記載されるように慣用的に行う。それゆえ、好ましくは、細胞に栄養分を供給し、４５℃以下の温度にて培養する。
タンパク質産物を、宿主細胞に応じて慣用の方法により回収する。それゆえ、宿主細胞がイー．コリなどの細菌細胞であり、タンパク質が細胞内に発現される場合、物理的、化学的または酵素的に細胞を溶解させ、タンパク質産物を得られる溶解物から単離してもよい。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、産物を通常栄養培地から単離する。
宿主細胞がイー．コリなどの細菌細胞である場合、培養から得られる産物は最適機能活性のために折りたたむことが必要であり得る。タンパク質が封入体として発現されるとき、もっともこの可能性がある。重要であると考えられる単離および折りたたみ方法の多数の態様がある。特に、混入タンパク質との凝集形成を最小とし、ポリペプチドの間違った折りたたみを最小とするために、好ましくはポリペプチドを、折りたたみの前に部分的に精製する。それゆえ、特異的に封入体を単離することにより混入しているイー．コリのタンパク質を除去し、続けて折りたたみの前にさらに精製することは、方法の重要な態様である。
折りたたみ操作をポリペプチドの中間−折りたたみ状態の凝集を最小とするように行う。それゆえ、なかでも、塩型および濃度、温度、タンパク質濃度、レドックス緩衝液濃度および折りたたみ時間を注意深く考慮する必要がある。所定のポリペプチドについての正確な条件は、一般に予測不可能であり、実験により決定しなければならない。
封入体からのタンパク質の折りたたみに利用可能な多数の方法があり、この分野における当業者に知られている。一般に、該方法は、例えば、５０ｍＭ ２−メルカプトエタノールで、８Ｍ尿素または６Ｍ塩酸グアニジンなどの高濃度の変性剤の存在下で、封入体中のすべてのジスルフィド結合を壊すことを包含する。次の工程では、これらの薬剤を除去し、タンパク質の折りたたみが起こるようにする。ジスルフィド架橋の形成は酸化環境を必要とし、これを、例えば空気により、または適当なレドックスシステム、例えば還元および酸化グルタチオンの混合物などの組み込みにより、提供してもよい。
好ましくは、封入体をメルカプトエタノールの存在下、８Ｍ尿素を用いて可溶化し、冷緩衝液の添加により混入タンパク質をはじめに除去した後にタンパク質を折りたたむ。適当な緩衝液は、I. Dodd et al.,’Perspectives in Protein Engineering and Complementary Technologies’, Mayflower Publications, 66-69, 1995に記載されるような技術を用いて同定してもよい。本明細書に記載するＳＣＲ構築物の多くに適した緩衝液は、１ｍＭ還元グルタチオンおよび０．５ｍＭ酸化グルタチオンを含む２０ｍＭエタノールアミンである。折りたたみを、好ましくは、１〜５℃の範囲の温度にて、１〜５日間にわたって行う。
何らかの沈澱または凝集が観察される場合、例えば、遠心分離によりまたは硫酸アンモニウムなどの沈澱剤での処理により、凝集タンパク質を除去できる。これらの手法のいずれかを適用する場合、モノマーポリペプチドが主要な可溶産物である。
細菌細胞がタンパク質を分泌する場合、折りたたみは通常必要でない。
本発明の誘導体のポリペプチド部分にＣ−末端システインを含有させ、翻訳後修飾を容易にしてもよい。Ｃ−末端システインを含む可溶性ポリペプチドもまた、本発明の一部を形成する。中程度の大きさ（〜７０ｋＤａまで）で＜−８ジスルフィド架橋を有するタンパク質には細菌系における発現が好ましい。遊離の末端Ｃｙｓが折りたたみまたは安定性の問題を引き起こす、より複雑なタンパク質には、哺乳細胞系（特にＣＨＯ）における安定な発現が必要であり得る。炭水化物膜結合エレメントを翻訳後に導入する場合にも、このことが必要とされる。ポリペプチド部分をコードする組換えバキュロウイルスで感染した昆虫細胞の使用もまた、より複雑なタンパク質の調製に有用な一般法であり、生合成的に特定の翻訳後操作（パルミトイル化など）を行うことが所望される場合、好ましい（例えば、M. J. Page et al., J. Biol. Chem. 264, 19147-19154, 1989参照）。
Ｃ−末端でシステインで誘導されるタンパク質の取り扱いの好ましい方法は、一般的に以下の方法にて記載されるようなメルカプトエタノールまたはグルタチオンで混合されるジスルフィド、または、２−ニトロ、５−カルボキシフェニルチオー誘導体のようなものである。
ペプチド膜結合エレメントを、Merrifield法などの標準的な固相合成を用いて調製してもよく、この方法をペプチドのＮ−末端にてミリスチン酸またはパルミチン酸由来のＮ−アシル基などの必要とされる非ペプチド膜結合エレメントを組み込むのに適用できる。加えて、続くタンパク質への結合のためにアミノ酸残基を活性化することも、かかる膜結合エレメントの化学合成間に達成できる。かかる活性化の例には、システインチオールでの混合２−ピリジルジスルフィドの形成またはＮ−ハロアセチル基の組み込みが包含される。両方のこれらの基は、それぞれジスルフィド相互交換およびアルキル化により、遊離のチオールと反応できる。所望により、ペプチドをＣ−末端アミドとしておよび／またはアセチルなどの慣用のＮ−末端ブロック基で、調製できる。
本発明はまた：
・チオール基にて所望により活性化された末端システイン残基；
・ペプチドのＮ−末端にまたはリジン残基のε−アミノ基に位置するＮ−ハロアセチル基（ハロは、塩素、臭素またはヨウ素を意味する）；
・Ｎ−末端ブロック基；および
・Ｎ−末端またはリジン残基のε−アミノ基の脂肪酸Ｎ−アシル基
から選択される１またはそれ以上の誘導体を含むペプチド性膜結合エレメントを提供する。
これらの形成に適当な化学架橋基および試薬には、ＥＰ０１０９６５３、ＥＰ０１５２７３６、ＥＰ０１５５３８８およびＥＰ０２８４４１３（出典明示により本明細書に含める）に記載されるものが包含される。架橋基は、一般に式：
−Ａ−Ｒ−Ｂ−    （Ｉ）
（式中、ＡおよびＢはそれぞれ、同一でも異なっていてもよく、−ＣＯ−、−Ｃ（＝ＮＨ2+）−、マレイミド、−Ｓ−または結合であり、
Ｒは、結合、あるいは、所望により親水性部分とともに、１またはそれ以上の−（ＣＨ2）−またはメタ−、オルト−もしくはパラ−ジ置換フェニル単位（好ましくはオルトまたはパラ）を含む連結基である）
で示される。
本発明の誘導体のポリペプチド部分およびペプチド性膜結合エレメントの両方がＣ−末端システインを包含する場合、化学架橋基は、−Ｓ−Ｓ−の形態をとる。架橋は、慣用のジスルフィド交換化学により、１つのポリペプチド上のチオールを活性化し、活性化チオールを他のポリペプチド上の遊離のチオールと反応させて、生成する。かかる活性化方法は、Ｓ−Ｓ架橋の開裂時に安定なチオレートアニオンを形成するジスルフィドを使用し、チオールとさらに反応できる中間体混合ジスルフィドを形成し、安定なジスルフィド架橋を得る、２，２’−ジチオピリジンおよび５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸、ＤＴＮＢ）などの試薬を包含する。
Ｒには、水と相互作用し架橋基の水可溶性を維持する基、および、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＭｅ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＳＯ2−、−ＣＯ2−、−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）m−および−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ここで、ｍは２以上の整数である）を含む適当な基、または、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリシン、ポリアラニンもしくはポリサルコシンなどの線状親水性ポリマーが包含される。
Ｒの他の例には、−（ＣＨ2）r−、−（ＣＨ2）p−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）q−および−（ＣＨ2）p−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ2）q−（ここで、ｒは少なくとも２、好ましくは少なくとも４の整数であり、ｐおよびｑは独立して少なくとも２の整数である）が包含される。
さらなる態様において、Ｒは、−Ｕ−Ｖ−Ｗ−を形成してもよく、ここで、Ｕは（ＣＨ2）ＣＯＮＨ（ＣＨ2）n（ここで、ｎは３〜８の整数である）であり、Ｖは、Ｏ、Ｓ、ＮＲaまたはＮＲa−ＮＲa（ここで、各Ｒaは、ＨまたはＣ1-6アルキル、ＮＨ−ＯもしくはＯ−ＮＨである）であり、Ｗは２−または４−位にて基Ｂにより置換されたベンジルである。好ましい具体例において、Ｒは、
（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−（４−フェニル）（ここで、ｎは、３〜８の整数である）である。式（Ｉ）の架橋基は、式（II）：
Ｘ−Ｒ1−Ｙ    （II）
（ここで、Ｒ1は、結合または連結基であり、ＸおよびＹは、表面アミノ酸、好ましくは、リジンまたはシステイン基、Ｎ−末端アミノ基、触媒セリンヒドロキシルまたはタンパク質結合基と反応可能な官能基であり、Ｘ、Ｒ1およびＹは、必要な架橋基−Ａ−Ｒ−Ｂ−を生成するように選択される。）
の連結基に由来させてもよい。
好ましい基は、ＸおよびＹが異なり、ヘテロ二機能基として知られるものである。基分子の各末端は、順番に、各ポリペプチドと反応し、別々の反応で結合する。式（II）のヘテロ二機能基の例には：
Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）ピロピオネート
スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミド）カプロエート
３−（２−ピリジル）メチルプロピオンイミダート  塩酸
４’−アミジノフェニル  ４−Ｎ−［２−Ｎ−（３−［２−ピリジルジチオ］エチルカルボニル）アミノエチル］アミノベンゾエート  塩酸
が包含される。
他の適当な基は、ＥＰ０１０９６５３、ＥＰ０１５２７３６、ＥＰ０１５５３８８およびＥＰ０２８４４１３に開示され、特に、ＥＰ０１５５３８８における式（II）およびＥＰ０２８４４１３における式（III）のものである（出典明示により本明細書中に含める）。
各場合に、Ｙは、本来のチオールまたはタンパク質結合基として導入されたものであってもよい、ポリペプチド上のチオール基と反応可能である。
タンパク質結合基は、ポリペプチドまたはタンパク質を１またはそれ以上のアミノ酸側鎖に特異的な試薬で修飾することにより機能的に導かれ、他のポリペプチド上の開裂セクションと反応可能な基を含む。タンパク質結合基の一例は、チオール基である。開裂セクションの一例は、ジスルフィド結合である。別に、開裂セクションは、α、βジヒドロキシ官能基を含む。
一例として、ポリペプチドを２−イミノチオラン、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（続けて還元）またはＮ−アセチルホモシステインチオラクトンと反応させることにより遊離のチオール官能基を導入することで、タンパク質結合基をチオール反応性Ｙ構造と結合できる。別法として、タンパク質結合基は、６−マレイミドヘキシル基または２−ピリジル−ジチオ基などの、Ｘにて遊離のチオールと反応できるチオール反応性基を含むことができる。
Ｘがタンパク質のアミノ酸側鎖と直接反応可能な基である場合、好ましくはＮ−スクシンイミジル基である。Ｘがタンパク質結合基と反応可能な基である場合、好ましくは、ピリジルチオ基である。Ｘが触媒セリンヒドロキシル基と反応可能な基である場合、好ましくは、ＥＰ０１５５３８８における式（II）およびＥＰ０２８４４１３における式（III）の化合物に含まれる種類の、エステルの反応性を高める、１またはそれ以上の電子求引性基で所望により置換された４−アミジノフェニルエステル基である。
上記の方法において、タンパク質連結基を導入するポリペプチドの修飾は、好ましくは、水性緩衝媒体中、用いる試薬に応じて３．０および９．０の間のｐＨにて行う。好ましい試薬、２−イミノチオランでは、好ましくはｐＨは６．５〜８．５である。ポリペプチドの濃度は、好ましくは高く（＞１０ｍｇ／ｍｌ）および修飾試薬を試薬の反応性に応じて、中程度（１．１〜５倍）モル過剰にて用いる。温度および反応時間は、好ましくは、０〜４０℃の範囲で、１０分から７日間である。ポリペプチドの修飾の程度を導入される結合基についてアッセイすることで調べてもよい。
かかるアッセイは、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）での滴定などの標準的なタンパク質化学技術であり得る。好ましくは、タンパク質結合基の０．５〜３．０モルが、ポリペプチド平均１モル当たりに導入される。修飾ポリペプチドを、透析、限外濾過、ゲル濾過および溶剤または塩析沈澱などの標準的な技術により過剰の修飾剤から分離させてもよい。中間体物質を凍結溶液中または凍結乾燥して保存させてもい。
式（II）の連結基がアミジノフェニルエステル基Ｘを含む場合、好ましくは、第一に該基を基Ｘを介してポリペプチド酵素と反応させ、好ましくは反応を欧州公開特許出願第０００９８９７中のブロック基の導入について記載される条件下に行う。高処理サイズ排除クロマトグラフィーまたはジアフィルレーション（diafiluration）などの適当な技術により過剰の試薬を含まないようにし、ついで、アシル化酵素を他のポリペプチドと、約１：１の比で、非−求核緩衝液中、ｐＨ７．０〜８．０、０〜３０℃にて、６時間まで反応させてもよい。しかしながら、結合を１０℃以下（好ましくは、０℃〜４℃）で行い、アシル化酵素の加水分解を最小とすることが好ましい。
タンパク質結合基をこのように導入した場合、架橋基（Ｉ）は、連結基（II）およびタンパク質結合基の反応から形成される。
連結するポリペプチドを、連結基またはタンパク質結合基を導入するための試薬と別々に、典型的にはポリペプチドに過量の試薬を加え、通常、中性または穏やかなアルカリ性緩衝液中、反応させ、反応後、ゲル濾過または透析により低分子量物質を除去する。ポリペプチド連結反応は、好ましくは、中性緩衝液中等モル比にて修飾ポリペプチドを混合することにより行う。他の反応条件、例えば、時間および温度は、所望程度の連結が得られるように選択されなければならない。チオール交換反応が含まれる場合、好ましくは反応を窒素雰囲気下に行わなければならない。好ましくは、連結をモニターできるようにＵＶ−活性産物を製造する（例えば、２−ピリジルジチオ誘導体からのピリジン  ２−チオンの放出）。
連結反応後、ポリペプチド結合体を、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグアフィーなどの種々のクロマトグラフィー法により単離できる。これらの方法は、低庄力または高処理変形法であってもよい。
結合体を低圧力または高処理ゲル濾過、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点電気泳動を含む種々の技術により解析してもよい。
脂肪酸誘導体である膜結合エレメントを翻訳後的にペプチド性膜結合エレメントに、好ましくはポリペプチド鎖の末端にて、結合させる。好ましくは、本発明の誘導体の組換えポリペプチド部分がペプチド性膜結合エレメントを含む場合、これは、脂肪酸誘導体に結合するための独特のシステインを有する。組換えポリペプチドがシステイン残基を有する場合、脂肪酸のチオール誘導体が精製の後期段階（しかしながら最終段階である必要はない）で、好ましくは臨界ミセル濃度以下の試薬濃度で、再生組換えタンパク質に加えられる。脂肪酸誘導体および組換えペプチドの１つはチオール相互交換反応について上記したように活性化されたチオール基を有する。脂肪酸誘導体は、好ましくは、Ｎ−（２−ミリストイル）アミノエタンチオールまたはＮ−ミリストイル Ｌ−システインなどのアミノＣ2-6アルカンチオール（所望によりＣ−置換される）のＣ10-20脂肪酸アシル誘導体であり、本発明の一部を形成する。
親水性合成ポリマーの適当な例には、例えば固相合成法（アミノ基誘導化）またはチオール相互交換化学によりポリペプチドに連結される４００および５０００ダルトン間の分子量の、リエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくは、α，ω−官能基化誘導体、より好ましくは、α−アミノ，ω−カルボキシＰＥＧが包含される。
アミノ酸配列または炭水化物のいずれかの、公知の内在性膜タンパク質のリガンド由来の膜結合エレメントは、ペプチド配列のＮ−連結グリコシル化部位を標的とした真核細胞のグリコシル化経路を用いて翻訳後修飾により生成されてもよい。
慣用の一般的な最終段階精製法は、疎水性静電気的スイッチ組み合わせが挿入されている誘導されたおよび誘導されていないタンパク質を分離するための、Ｃ２−Ｃ８媒体上、疎水性クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびカチオン交換クロマトグラフィーである。
本発明の誘導体を、好ましくは医薬組成物として投与する。
したがって、本発明はまた、本発明の医薬組成物を医薬上許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
本発明の組成物を、経口、局所、非経口、舌下もしくは経皮または吸入などの経路による投与用の常套方法にしたがって処方してもよい。組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、クリームまたは経口もしくは滅菌非経口溶液もしくは懸濁剤などの液体調製物の形態、スプレー、エアロゾルもしくは吸入用の他の慣用法の形態であってもよい。
本発明の局所処方は、例えば、軟膏、クリームまたはローション、眼軟膏および眼もしくは耳滴剤、含浸包帯およびエアロゾルとして存在してもよく、保存剤、薬物浸透を助ける溶剤ならびに軟膏およびクリームにおいて皮膚軟化薬などの適当な慣用の助剤を含んでいてもよい。
処方は、クリームまたは軟膏基剤およびローション用にエタノールまたはオレイルアルコールなどの適合可能な慣用の担体も含んでいてもよい。かかる担体は、処方の約１％から約９８％まで存在してもよい。より通常は、これらは処方の約８０％まで存在する。
経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位投与調製物形態であってもよく、結合剤、例えばシロップ、アラビアガム、ゼラチン、ソルビトール、トラガントガムまたはポリビニルピロリドンなど；充填剤、例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ポテトデンプン；または許容可能な湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの、慣用の賦形剤を含んでいてもよい。錠剤は、通常の医薬手法で周知の方法にしたがって被覆されていてもよい。
座剤は、例えばココア油脂、または他のグリセリドなどの慣用の座剤基剤を含む。
非経口投与用には、液体単位投与形態を化合物および滅菌ビヒクル、好ましい場合水を用いて調製する。用いるビヒクルおよび濃度に応じて、化合物はビヒクル中に溶解される。溶液を調製する場合、化合物を注射用に水に溶解し、滅菌バイアルまたはアンプルに充填し、封印する前に濾過滅菌できる。
非経口投与処方は、ポリ乳酸共グリコール酸などの生分解性ポリマーのミクロスフェア内の封入などの遅延放出系を包含してもよい。
有利は、局所麻酔剤、保存剤および緩衝剤などの薬剤をビヒクル中に溶解できる。安定性を高めるため、組成物をバイアル中に充填後に凍結し、真空下に水を除去できる。乾燥凍結乾燥粉末を、ついでバイアル中に封印し、注射用の水の付随するバイアルを使用前に液体を復元するために供してもよい。有利には、界面活性剤または湿潤剤を組成物中に包含させ、化合物の均一な分布を促進する。
適当には、本発明の組成物を、呼吸器管への投与用に、噴霧器用に嗅剤またはエアロゾルまたは溶液として、または吸入用にミクロファイン粉末として、単独でまたはラクトースなどの不活性担体と組み合わせて、存在させてもよい。かかる場合、適当には、活性化合物の粒子は５０ミクロンより小さい直径、好ましくは１０ミクロンよりも小さい直径、例えば１〜５０ミクロン、１〜１０ミクロンまたは１〜５ミクロンの範囲の直径を有する。適当な場合、少量の抗喘息および気管支拡張薬、例えば、イソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリンおよびエフェドリンなどの交換神経作用アミン；テオフイリンおよびアミノフィリンなどのキサンチン誘導体ならびにプレドニゾロンなどのコルチコステロイドならびにＡＣＴＨなどの副腎刺激剤を包含させてもよい。
ミクロファイン粉末処方を、適当には計量器付エアロゾルまたは適当な呼吸活性化装置により投与してもよい。
適当な計量器付エアロゾル処方は、慣用の推進剤、エタノールなどの共溶剤、オレイルアルコールなどの界面活性剤、オレイルアルコールなどの滑沢剤、硫酸カルシウムなどの乾燥剤、塩酸ナトリウムなどの密度修飾剤を含む。
噴霧器用に適当な溶液は、標準的な噴霧装置での使用のための、例えばｐＨ４〜７の間に所望により緩衝された、２０ｍｇ／ｍｌまでの化合物を含むが、より一般には０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ含む等張滅菌溶液である。
投与される物質の量は、誘導体の効力、病気の性質により、治療を管理する医師により決定される。しかしながら、一般的には、疾患または障害の処置用に効果的なポリペプチドの量は、１日当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの容量範囲、好ましくは、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、５回まで投薬によるかまたは点滴により投与される。
許容されない毒物学的作用は、上記した投薬範囲内で本発明の化合物では何ら示されない。
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の誘導体を提供する。
本発明はさらに、可溶性ペプチドによる治療に影響を受ける障害の治療方法であって、本発明の該可溶性ペプチドの可溶性誘導体を投与することを含む方法、および、かかる障害の治療用の医薬の製造のための本発明の誘導体の使用を提供する。
好ましい態様の１つにおいて、本発明は補体活性を含む障害ならびに種々の炎症および免疫障害の治療における使用のための誘導体に関する。
この好ましい態様において、本発明により誘導される可溶性ポリペプチドは可溶性ＣＲ１ポリペプチドフラグメントなどの可溶性補体阻害剤である。
正常血清において約１０％のグロブリンを構成する、補体系は、免疫系の外来抗原に対する応答において重要である多くの異なるタンパク質からなる。補体系は、その１次成分が開裂される場合に活性化され、産物が単独でまたは他のタンパク質と共にさらなる補体タンパク質を活性化し、蛋白質分解カスケードとなる。補体系の活性化は、高い血管透過性、食細胞の走化性、炎症細胞の活性化、外来粒子のオプソニン化、細胞の直接殺害および組織損傷を含め、種々の応答を導く。補体系の活性化は抗原−抗体複合体により（古典的経路）、または、例えば病原細菌の細胞壁に存在するリポポリサッカライドにより（別の経路）、誘発される。
補体レセプタータイプ１（ＣＲ１）は、赤血球、単球／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、いくつかのＴ細胞、脾臓小胞樹状突起および糸球有足突起の膜上に存在することが示されている。ＣＲ１は、補体成分Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプターともまた呼ばれる。ＣＲ１の１つのアロタイプの構造構成および１次配列は知られている（Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095-1112, Klickstein et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1699-1717; Hourcade et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1255-1270, WO89/09220, WO91/05047）。これは各々約６０〜７０個のアミノ酸を含む３０個のショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）からなる。各ＳＣＲにおいて、平均６５個のアミノ酸の約２９個が保存される。各ＳＣＲは、ジスルフィド結合における、第３および第１ならびに第４および第２のハーフ−システインでのジスルフィド結合により、３次元トリプルループ構造を形成するものと推定されている。さらに、ＣＲ１は、それぞれ７個のＳＣＲの４個のロング・ホモロガス・リピート（ＬＨＲ）として整列する。リーダー配列に続き、ＣＲ１分子はＮ−末端ＬＨＲ−Ａ、次の二つの繰り返し、ＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−Ｃ、および２つのさらなるＳＣＲが続くほとんどのＣ末端ＬＨＲ−Ｄ、２５残基の推定膜貫通領域および４３残基の細胞質部からなる。
本明細書において後に残基１として示す推定Ｎ−末端グルタミン残基を有する成熟ＣＲ１分子に基づき、ＬＨＲ−Ａのはじめの４個のＳＣＲドメインは、本明細書において、それぞれ成熟ＣＲ１の残基２〜５８、６３〜１２０、１２５〜１９１および１９７〜２５２から構成されると明らかにされる。
ＣＲ１のいくつかの可溶性フラグメントが、組換えＤＮＡ法により、発現されるＤＮＡから膜貫通領域を除去することにより生成されている（ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７）。可溶性ＣＲ１フラグメントは、機能的に活性であり、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂに結合し、それらが含む領域に応じてファクターＩコファクター活性を示した。かかる構築物は、好中球酸化バースト、補体媒介溶血、およびＣ３ａおよびＣ５ｂ産生などのインビトロ補体−関連機能を阻害した。特定の可溶性構築物、ｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃもまた、反受身アルツス現象においてインビボ活性を示し（ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７；Yeh et al., 1991, J. Immunol. 146: 250）、虚血後心筋炎症および壊死を抑制し（ＷＯ８９／０９９２０、ＷＯ９１／０５０４７;Weisman et al., Science, 1990, 249: 146-1511; Dupe, R. et al., Thrombosis & Haemostasis（1991）65（6）695）、移植後の生存率を伸長した（Pruitt & Bollinger, 1991, J. Surg, Res 50:350: Pruitt et al, 1991 Transplantation 52: 868）。さらに、ｐ−アニソイル化ヒトプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−アクチベーター複合体（ＡＳＰＡＣ）とのｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃの共形成により、ｓＣＲ１単独と同様に類似の抗溶血活性が生じ、これは血栓溶解剤と補体阻害剤ｓＣＲ１の組み合わせが適していることを示唆した（ＷＯ９１／０５０４７）。
ｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃによりコードされる可溶性ＣＲ１ポリペプチドフラグメント、ＣＲ１の１〜１９２９残基は、本発明にしたがって誘導させてもよい。
ＣＲ１の部分に対応する可溶性ポリペプチドは、抗溶血活性を含む機能的な補体阻害活性を有することが知られている。ＷＯ９４／００５７１には、順番に、ＣＲ１の唯一の構造的および機能的に完全なＳＣＲドメインとしてロング・ホモロガス・リポートＡ（ＬＨＲ−Ａ）のＳＣＲ１、２、３および４から選択されるショート・コンセンサセス・リピート（ＳＣＲ）を含み、少なくともＳＣＲ３を包含する、可溶性ポリペプチドが開示される。
好ましい態様において、ポリペプチドは、順番に、ＣＲ１の唯一の構造的および機能的に完全なＳＣＲドメインとして、ＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１、２、３および４またはＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１、２および３を含む。
一態様において、ポリペプチドは：
ＮＨ2-Ｖ1-ＳＣＲ１-Ｗ1-ＳＣＲ２-Ｘ1-ＳＣＲ３-Ｙ1-ＯＨ  （Ａ）
（式中、
ＳＣＲ１は成熟ＣＲ１の残基２〜５８を示し、
ＳＣＲ２は成熟ＣＲ１の残基６３〜１２０を示し、
ＳＣＲ３は成熟ＣＲ１の残基１２５〜１９１を示し、
Ｖ1、Ｗ1、Ｘ1およびＹ1は結合、または、好ましくは１〜５残基の長さであり、好ましくはＣＲ１の天然のドメイン間配列由来のものである、アミノ酸の短い連結配列を示す。）
で記号的に示されてもよい。
式（Ｉ）の好ましい具体例において、Ｗ1、Ｘ1およびＹ1は、それぞれ成熟ＣＲ１の残基５９〜６２、１２１〜１２４および１９２〜１９６を示し、Ｖ1は所望によりそのＮ−末端を介してメチオニンに連結する成熟ＣＲ１の残基１を示す。
別の態様において、ポリペプチドは：
ＮＨ2-Ｖ2-ＳＣＲ１-Ｗ2-ＳＣＲ２-Ｘ2-ＳＣＲ３-Ｙ2-ＳＣＲ４-Ｚ2-ＯＨ（Ｂ）
（式中、
ＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３は前記の定義と同意義であり、
ＳＣＲ４は成熟ＣＲ１の残基１９７〜２５２を示し、
Ｖ2、Ｗ2、Ｘ2、Ｙ2およびＺ2は結合、または、好ましくは１〜５残基の長さであり、好ましくはＣＲ１の天然のドメイン間配列由来のものである、アミノ酸の短い連結配列を示す。）
で記号的に示されてもよい。
式（II）の好ましい具体例において、Ｗ2、Ｘ2、Ｙ2およびＺ2は、それぞれ成熟ＣＲ１の残基５９〜６２、１２１〜１２４、１９２〜１９６および残基２５３を示し、Ｖ2は所望によりそのＮ−末端を介してメチオニンに連結する成熟ＣＲ１の残基１を示す。
式（Ｂ）の一具体例において、アルギニン２３５はヒスチジンで置換される。
式（Ｂ）の好ましい具体例において、残基２３５はアルギニンである。
さらなる態様において、ポリペプチドは：
ＮＨ2-Ｘ3-ＳＣＲ３-Ｙ3-ＯＨ    （Ｃ）
（式中、
ＳＣＲ３は、前記の定義と同意義であり、
Ｘ3およびＹ3は結合、または、好ましくは１〜５残基の長さであり、好ましくはＣＲ１の天然のドメイン間配列由来のものである、アミノ酸の短い連結配列を示す。）
で記号的に示されてもよい。
式（Ｃ）の好ましい具体例において、Ｘ3は所望によりそのＮ−末端にてメチオニンに連結する成熟ＣＲ１のアミノ酸１２２〜１２４を示し、Ｙ4は成熟ＣＲ１のアミノ酸１９２〜１９６を示す。
さらに別の態様において、ポリペプチドは：
ＮＨ2-Ｘ4-ＳＣＲ３-Ｙ4-ＳＣＲ４-Ｚ4-ＯＨ    （Ｄ）
（式中、
ＳＣＲ３およびＳＣＲ４は、前記の定義と同意義であり、
Ｘ4、Ｙ4およびＺ4は結合、または、好ましくは１〜５残基の長さであり、好ましくはＣＲ１の天然のドメイン間配列由来のものである、アミノ酸の短い連結配列を示す。）
で記号的に示されてもよい。
式（Ｄ）の好ましい具体例において、Ｘ4は所望によりそのＮ−末端にてメチオニンに連結する成熟ＣＲ１のアミノ酸１２２〜１２４を示し、Ｙ4およびＺ4はそれぞれ成熟ＣＲ１のアミノ酸１９２〜１９６および２５３を示す。
可溶性ＣＲ１ポリペプチドを、上記に概略を示した慣用の方法により本発明にしたがって誘導させる。好ましい具体例において、可溶性ＣＲ１ポリペプチドはＣＲ１の残基１〜１９６からなり、Ｎ−末端メチオニンを有し、誘導体はミリストイル基および
ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧＣ
ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤＣ
ＣＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ
ＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣ
ＣＳＡＡＰＳＳＧＦＲＩＬＬＬＫＶ
ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣ
および
ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣ
（左側にＮ−末端）
から選択される１またはそれ以上のポリペプチドを含む。
本発明の誘導体である、可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤は、限定するものではないが以下に列挙する、多くの補体媒介または補体関連疾患および障害の治療において有用である。
補体が関与する疾患および障害
神経学的障害
多発性硬化症
発作
ギャン−バレー症候群
外傷性脳損傷
パーキンソン病
アレルギー性脳炎
アルツハイマー病
不適当なまたは望ましくない補体活性化の障害
血液透析合併症
過剰急性同種移植片拒絶反応
異種移植片拒絶反応
角膜移植片拒絶反応
ＩＬ−２治療中のインターロイキン−２誘発毒性
発作性夜行性ヘモグロビン尿症
炎症性障害
自己免疫疾患の炎症
クローン病
成人呼吸促迫症候群
火傷または凍傷を含む熱損傷
ブドウ膜炎
乾癬
喘息
急性膵炎
虚血後再灌流状態
心筋梗塞
バルーン血管形成
アテローム性硬化症（コレステロール−誘発）＆再狭窄
高血圧
心肺バイパスまたは腎血液透析におけるポスト−ポンプ症候群
腎虚血
腸虚血
感染症疾患または敗血症
多重臓器不全
敗血症ショック
免疫複合疾患および自己免疫疾患
慢性関節リウマチ
全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）
ＳＬＥ腎炎
増殖性腎炎
糸球体腎炎
溶血性貧血
重症筋無力症
生殖性障害
抗体−または補体媒介不妊症
創傷治癒
本発明はまた、炎症または不適当な補体活性化に付随する疾患または障害を治療するための医薬組成物であって、本発明の誘導体である、可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の治療的に有効量、および、医薬上許容される担体または賦形剤を含む組成物に関する。
本発明はまた、炎症または不適当な補体活性化に付随する疾患または障害を治療する方法であって、かかる治療を必要とする対象に、本発明の誘導体である、可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の治療的に有効量を投与することを含む方法を提供する。
上記の方法において、対象は好ましくはヒトである。
さらに、本発明の誘導体である、可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の、炎症または不適当な補体活性化に付随する疾患または障害の治療のための医薬の製造における使用を提供する。
補体活性化を阻害し、同時に、血栓溶解治療を提供するために、本発明はさらに血栓溶解剤を治療的有効量含む医薬組成物を提供する。血栓溶解剤の有効量は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量である。好ましい血栓溶解剤には、限定するものではないが、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーターおよびウロキナーゼ分子およびそれらの誘導体、フラグメントまたは結合体が包含される。血栓溶解剤には、他の薬剤と融合しまたは可逆的に連結して、例えば、プラスミンに連結したウロキナーゼ（ＥＰ−Ａ−０１５２７３６）、水可溶性ポリマーに連結したフィブリン溶解酵素（ＥＰ−Ａ−０１８３５０３）などのハイブリッド分子を形成できる１またはそれ以上の鎖を含ませてもよい（ＥＰ−Ａ−０２９７８８２およびＥＰ１５５３８７）。血栓溶解剤にはまた、プラスミノーゲンアクチベーターのムテインを含ませてもよい（ＥＰ−Ａ−０２０７５８９）。好ましい具体例において、血栓溶解剤には、米国特許第４２８５９３２号に記載されるような可逆的に遮断されたインビトロフィブリン溶解酵素を含ませてもよい。最も好ましい酵素は、米国特許第４８０８４０５に記載されるようなｐ−アニソイルプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベーター複合体、アニストレプターゼ（anistreplase）である（Monk et al., 1987, Drugs 34: 25-49）。
本発明の個々のまたは組み合わせ治療組成物の投与経路には、例えば静脈注入またはボーラス注入などの標準的な経路が包含される。活性な補体阻害剤および血栓溶解剤を、ともにまたは連続して、いかなる順序で投与してもよい。
本発明はまた、ヒトまたはヒト以外の動物における、血栓症状態、特に急性心筋梗塞を治療する療方法を提供する。この方法は、この治療を必要とするヒトまたはヒト以外の動物に、本発明の誘導体である可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の有効量、および、血栓溶解剤の有効量を投与することを含む。
また、ヒトまたは動物における血栓症状態の治療のための医薬の製造における、本発明の誘導体である可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤および血栓溶解剤の使用を提供する。かかる方法および使用は、ＷＯ９１／０５０４７に記載されるように行ってもよい。
本発明または、ヒトまたはヒト以外の動物における、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療する方法を提供する。この方法は、患者に、本発明の誘導体である可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の有効量を投与することを含む。
本発明はまた、本発明の誘導体である可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の有効量を投与することによる、移植を受けたヒトまたはヒト以外の動物における、過剰急性同種移植片または過剰急性異種移植片拒絶反応を遅延する方法を提供する。かかる投与は、患者にされてもよくまたは埋め込み前に移植片に適用されることによってもよい。
本発明はさらに、本発明の誘導体である可溶性ＣＲ１ポリペプチドなどの可溶性補体阻害剤の有効量を、局所または静脈内などの非経口経路により投与することによる、ヒトまたはヒト以外の動物における、損傷を治療する方法を提供する。
他の好ましい態様において、可溶性ポリペプチドは、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲンアクチベーターまたはレトプラーゼなどの血栓溶解剤であり、本発明の誘導体は、急性心筋梗塞などの血栓症障害の治療において有用である。それゆえ、本発明は血栓症障害を治療するための医薬組成物であって、本発明の血栓溶解剤の誘導体の有効量、および、医薬上許容される担体または賦形剤を含む組成物を提供する。本発明はさらに、本発明の血栓溶解剤の誘導体の有効量を投与することによる血栓症障害の治療方法、および、かかる誘導体の血栓症障害の治療のための医薬の製造における使用を提供する。
以下の方法および実施例は、本発明を説明する。
実施例で用いる一般法
（ｉ）ＤＮＡ切断
製造者の指示書に従って規定の緩衝液を用いて制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ切断を行った。緩衝液の条件が二つの酵素に適している場合、同時に二重消化を行った。そうでなければ二重消化を連続的に行い、その場合低塩条件を要する酵素を最初に消化物に加えた。一度消化が完了すると塩濃度を変化させ、次の酵素を加えた。
（ｉｉ）ＤＮＡライゲーション
Promegaから購入したＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Sambrookら［Molecular Cloning : A Laboratory Manual第２編（1989）、Cold Spring Harbour Laboratory Press］に記載されるようにライゲーションを実施した。
（ｉｉｉ）プラスミドの単離
Sambrookら［Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2編（1989）、Cold Spring Harbour Laboratory Press］に記載されるようにアルカリ性溶解法によるか、または２種の市販のキット:Promega WizardTM plus MiniprepsまたはQiagen Plasmid Maxiキットの一つにより製造者の指示書に従ってプラスミド単離を行った。
（ｉｖ）ＤＮＡフラグメント単離
アガロースゲルからＤＮＡフラグメントを切り取り、３種の市販のキット：ＱＩＡＥＸゲル抽出キットもしくはQiaquickゲル抽出キット（QIAGEN Inc.、USA）またはGeneClean（Bio 101 Inc.、USA）の一つを用いて製造者の指示書に従ってＤＮＡを抽出した。
（ｖ）ＤＮＡのイー・コリ（E.coli）への導入
Sambrookら（1989）に記載されるように塩化カルシウムを用いてコンピテント化したイー・コリ（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）［StudierおよびMoffat、J.Mol.Biol.189:113（1986）］、イー・コリＸＬＩ−blue、ＢＬ２１（ＤＥ３）pLys−ＳまたはＢＬＲ（ＤＥ３）pLys−Ｓにプラスミドを形質転換した。セルラインはStratageneから凍結コンピテント培養物として購入した。イー・コリＪＭ１０９はPromegaから凍結コンピテント培養物として購入した。
（ｖｉ）ＤＮＡシークエンシング
VistraＤＮＡLabstation６２５でプラスミドＤＮＡの配列決定を行った。Amersham International’s「Thermo Sequenase蛍光染料−ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット」（ＲＰＮ２４３５）を「ＦＭＰ蛍光染料−ターミネーター・沈殿キット」（ＲＰＮ２４３３）と組み合わせて用い、製造者の指示書に従ってシークエンシングを行った。
前記の方法で得られた配列をPerkin ElmerＡＢＩPrism３７７ＤＮＡシークエンサーにより分析した。これは３６cmｘ０．２mm・４％アクリルアミドゲルを用いる電気泳動技術であり、チャージ結合装置カメラ（charge coupled device camera）により製造者の指示書に従って蛍光標識したＤＮＡフラグメントを検出した。
（ｖｉｉ）オリゴヌクレオチドの製造
Cruachemよりオリゴヌクレオチドを購入した。
（ｖｉｉｉ）ｐＢＲＯＣ４１３
プラスミドｐＴ７−７［Tabor,S.、Current Protocols in Molecular Biology、F.A.Ausubel,Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith，およびK.Struhl,編、16.2.1-16.2.11頁（1990）、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York］はｐＢＲ３２２のヌクレオチド２０６５−４３６２に対応するＤＮＡを含有し、ｐＢＲ３２２の様に別のプラスミドＣｏＩＫの存在下接合性プラスミドにより移動させることができる。ＣｏＩＫによりコードされる運動性タンパク質はｐＢＲ３２２のヌクレオチド２２５４のnic部位に作用し、この点から運動が開始される。ｐＴ７−７をＬｓｐＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、張り出した５’末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントで平滑化した。プラスミドＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製し、平滑末端を一緒にライゲートし、Bio-Rad Gene Pulserを用いるエレクトロポレーションにより製造者の指示する条件に従ってイー・コリＤＨ１に形質転換した。得られたプラスミドｐＢＲＯＣ４１３をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により同定した。
ｐＢＲＯＣ４１３におけるｆ１０プロモーターのすぐ上流のＬｓｐＩ部位からｐＴ７−７のヌクレオチド４３４のＢｇｌＩＩ部位までの欠失はｐＢＲ３２２のヌクレオチド２０６５−２２９７に対応するＤＮＡを欠失する。従ってnic部位および隣接する配列を欠失すると非運動性ｐＢＲＯＣ４１３になる。
（ｉｘ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）
Novexシステム（British Biotechnology）を用いて製造者の指示書に従ってＳＤＳ ＰＡＧＥを実施した。予め充填した４−２０％アクリルアミドのゲルを用いた。電気泳動するためにサンプルおよびタンパク質分子量標準（例えばＬＭＷキット、PharmaciaまたはNovex Mark１２）を通常緩衝液（５容量／容量％２−メルカプトエタノールを含むかまたは含まない）を含む１重量／容量％ＳＤＳで希釈し、ゲルに適用するまで室温で約１０から３０分間放置した。
（ｘ）タンパク質のジスルフィドの還元およびチオールの修飾
標題の目的を達成するために多くの方法が用いられる。ジスルフィドを選択的に還元しなければならない理由は、チオールを多く含むタンパク質の単離および精製中、とりわけ十分に変性したチオールを多く含むタンパク質のリフォールディング中に不適当なジスルフィドペアを生じ得るということである。加えて、たとえ適切なジスルフィドペアを生じても、タンパク質中の遊離のシステインが例えばグルタチオンで遮断され得る。これらの誘導体は一般に非常に安定である。これらの反応性を高めるために、例えば続いて別の官能基に結合させるためにこれらを例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはTris（２−カルボキシエチル）ホスフィン・ＨＣｌ（ＴＣＥＰ）で選択的に還元し、次いで要すればあまり安定でない官能基で修飾する必要がある。後者の例としてはEllmants試薬（ＤＴＮＢ）が挙げられ、これにより混合ジスルフィドが得られる。ＤＴＮＢとの反応を省略する場合、実験計画に注意を払い、遊離のチオールを含有するタンパク質の二量体形成が最少化されていることを確認する必要がある。前記の「選択的な還元」なる用語は、反応条件例えば希釈、温度、反応物の分子量比を注意深く調節してタンパク質の天然構造中のジスルフィド架橋の還元を最少化することを意味する。全ての試薬は例えばSigmaまたはPierceから市販されている。
以下の一般的な実施例では、利用可能で、遊離のチオールを生じ、要すれば修飾するのに有用な条件について説明する。最適なチオール還元および／または修飾を達成するための具体的な条件は各タンパク質バッチに関して理想的な条件に決定する。
ＴＣＥＰは５０ｍＭHepes（ｐＨ約４．５）中２０ｍＭ溶液として調製して、−４０℃で保存できる。ＤＴＴはリン酸ナトリウム中１０ｍＭ、ｐＨ７．０に調製して、−４０℃で保存できる。前記の試薬は全て通常タンパク質濃度と等価かまたは過剰のモル濃度であり、正確な理想的な濃度は実験的に決定する。反応の時間および温度も同様に実験的に決定する。一般に時間は１から２４時間の範囲であり、温度は２から３０℃の範囲である。過剰の試薬を例えばSephadexＧ２５またはSephadexＧ５０を用いて緩衝液交換により除去するのが都合よい。適当な緩衝液は０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であり、または溶液は未処理のままでもよい。
実施例
実施例１  Ｎ−（ミリストイル）２−アミノエタン・チオール（ＭＡＥＴ）の製造
塩化ミリストイル（１．０ｍｍｏｌ）を氷冷した乾燥ピリジン（１．０ｍｌ）に激しく攪拌しながら加え、次いで即座にＮ−ヒドロキシサクシンイミド（１．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４時間環境温度（〜２３℃）で攪拌した。固体の２−アミノエタンチオール遊離塩基（１．１ｍｍｏｌ）を混合物に加え、環境温度で６時間反応させて、次いで４℃で３日間反応させた。生成物を水（５ｍｌ）と反応させ、環境温度で１時間攪拌し、濾過し、氷水で洗浄した。白色固体をジメチルスルフォキシドに溶解し、水で再沈殿させ、次いで酸化リン（Ｖ）で真空乾燥した。最終的な収量は０．２１ｇ（〜７０％）であった。Elman試薬を用いたチオール滴定により生成物が〜４５％の遊離のチオールを含有することが示された。
実施例２  ミリストイル／静電気的スイッチペプチド試薬１（ＭＳＷＰ−１）（配列番号：２７）の合成
0004177457.tif 000003
ペプチド：
0004177457.tif 000004
（配列番号：５）
をSheppardおよびAthertonが開発した［E.AthertonおよびR.C.Sheppard、Solid Phase Synthesis、IRL Press、Oxford（1989）］一般的なFmoc/tBu法による固相合成を用いて製造した。キーゼルグールを支持体とするポリジメチルアクリルアミド樹脂（Macrosorb 100）を固体支持体として用いてエチレンジアミンで誘導した。
予めＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４倍過剰のモル濃度で）で活性化したＮ−α-Fmoc保護試薬を用いて、ブロモフェノール・ブルーでモニター観察しながらカップリング反応を実施した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いてFmoc切断を行った。最後の切断でＣ−末端アミドを生じるように設計した修飾Rink連結試薬（Ｐ−［（Ｒ,Ｓ）−α−［１−（９Ｈ−フルオレニル−９−イル−メトキシホルムアミド］2，４ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）の結合等のカップリングおよび脱保護のサイクルを繰り返してペプチド鎖を集めるための反応を行った。個々のアミノ酸の側鎖の官能基を以下のように保護した：
Ser（tButyl）、Lys（Boc）、Asp（O-tButyl）、Cys（Trityl）
ペプチド集合体をまだ樹脂に結合しているペプチドと比較した場合、同一の活性化法により、ミリスチン酸の直接的なカップリングによりミリストイル基はＮ末端グリシンのアミノ基に結合した。次いでこの修飾ペプチドを樹脂から切断し、２．５％水および２．５％トリイソプロピルシランを含有するトリフルオロ酢酸と反応させて側鎖保護基を同時に除去した。
粗製物を０．０１Ｍ酢酸アンモニウム溶液中２，２’ジチオピリジンとｐＨ８−９で約２時間反応させ、次いで酢酸で酸性にし、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で勾配成分として０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水および０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを用いて精製した。凍結乾燥の後、ペプチドは白色無定形粉末であり、ジメチルスルフォキシドに少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまで溶解した。高速原子衝撃質量分析法によりｍ／ｅ２１０７．８、２１２９．７および２１４５．８で主要なピークが得られ、これらはペプチドのモノプロトン化、モノナトリウム化およびモノカリウム化分子イオンに対応する。ペプチドの２−チオピリジル含量を０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０中約０．０３ｍＭから０．２ｍＭまで溶解し、ジチオスレイトールを５ｍＭまで添加し還元して測定した。３４３ｎｍにおける光学密度の変化を用いて８０８０ｃｍ-1Ｍ-1のこの波長での消失係数を用いてピリジン２−チオンの放出量を算出した。これによりペプチド含量は乾燥重量の約６０％であることが示された。
実施例３  ミリストイル／静電気的スイッチペプチド試薬２（ＭＳＷＰ−２）（配列番号：２８）の合成
0004177457.tif 000005
ペプチド：
0004177457.tif 000006
（配列番号：１８）を実施例２で記載した一般法および以下の変法を用いる固相合成により製造した：
ａ．  Ｃ末端リジンを４−メチルトリチル（ＭＴＴ）基を用いるアルキル化により保護した；その他の全てのリジンはｔ−Boc基によりＮ−ε保護した。
ｂ.ジクロロメタン中１容量／容量％トリフルオロ酢酸を用いてＭＴＴを除去し、その他のリジンを脱保護する前に得られた独特の遊離アミノ基をミリスチン酸で誘導した（実施例２に記載するとおり）。
ペプチド鎖の集合体の完成時にＮ末端を無水酢酸でアセチル化した。前記のように脱保護したペプチドを２，２’−ジチオピリジンと反応させて２−ピリジルジチオシステイン基を生成した。生成物を実施例２に記載するように精製した。高速原子衝撃質量分析法により２２２１．３で分子イオンのピークが得られた（参考：モノプロトン化したものの理論質量は２２２０．３）。
0004177457.tif 000007
アミノ酸分析により正味のペプチド含量が６８．７重量％であることが示された。実施例２の方法を用いると、２−ピリジルジスルフィド含量は約６０重量％であった。
実施例４  ミリストイル／静電気的スイッチペプチド試薬３（ＭＳＷＰ−３）（配列番号：２９）の合成
0004177457.tif 000008
ペプチド：
0004177457.tif 000009
（配列番号：１９）を実施例２の一般的な固相合成プロトコルを用いて製造した。ミリストイル化、Ｃ−末端アミド化およびCys残基の誘導を実施例２に記載するように実施した。精製した後、質量分析法により２０４０．５で主要なピークが得られ、これはモノプロトン化形態に対応する（理論値：２０３９．５）。
0004177457.tif 000010
ペプチド含量は約５６重量％であった。
実施例５  Ｔセル標的ペプチド試薬１（ＴＣＴＰ−１）（配列番号：３０）の合成
0004177457.tif 000011
ペプチド：
0004177457.tif 000012
（配列番号：２０）を実施例２の一般的な固相法および実施例３に記載したＮ−アセチル化を用いて製造した。Rink試薬の代わりにｎ−デシルアミンを用いてＣ−末端を誘導した。精製したペプチドの質量分析法により１９５２．３で主要なピークが得られ、これはモノプロトン化分子イオンに対応する（理論値：１９５１．１）。１８４３．３でもイオンが観察されたが、これは分光光度計中でのチオピリジル基の損失に相当すると考えられる。
0004177457.tif 000013
ペプチド含量は５３重量％であった。
実施例６  ［ＳＣＲ１−３］−Cys（配列番号：６）の発現および単離
（ａ）  ［ＳＣＲ１−３］−CysをコードするプラスミドｐＤＢ１０３０の構築
ＣＲ１のＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１−３をコードするプラスミドｐＤＢ１０１３−５（特許出願ＷＯ９４／００５７１）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Qiagen QiaexＤＮＡ抽出キットを用いて製造者の指示書に従ってアガロースゲルから２．２キロベースのプラスミドのバンドを単離した。これがフラグメント１である。ｐＤＢ１０１３−５の別のバッチをＢａｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、１９６塩基対のバンドを前記のアガロースから抽出した。これがフラグメント２である。二つのオリゴヌクレオチド、配列番号：１および配列番号：２をアニーリングしてＤＮＡの最終濃度が１００ピコモル／μｌになった。アニーリングしたオリゴにはＢａｎＩ／ＥｃｏＲＩの張り出しがあり、ｐＤＢ１０１３−５の３’末端で配列が重複するが、加えて停止コドンの直前でシステインをコードするコドンを含有する。これがフラグメント３である。
フラグメント１、２および３をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１回の反応でライゲートし、ｐＤＢ１０３０を得た。ライゲートしたプラスミドをPromegaから購入したコンピテントイー・コリＪＭ１０９に形質転換した。得られたコロニーを制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、ＤＮＡシークエンシングによりＳＣＲ（１−３）（ＷＯ９４／００５７１の配列番号：２７）のコード化アミノ酸配列が１個のＣ−末端タンパク質システイン残基により変化して配列番号：６が得られることを確認した。
（ｂ）  ｐＤＢ１０３０からの［ＳＣＲ１−３］-Cysの発現
ｐＤＢ１０３０を塩化カルシウムでコンピテント化したイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、得られたコロニーを単離してプラスミド含量を検査した。イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中でｐＤＢ１０３０からタンパク質を発現するために、１個のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢリン酸塩培地（２０ｇ／ｌトリプトン、１５ｇ／ｌ酵母抽出物、０．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4）１０ｍｌに接種した。培養物を３７℃、２３０r.p.m.で６時間成長させた後、これを用いて５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する同一の培地１００ｍｌに接種した。同一条件下で一晩成長させた。次いで各培養物２５ｍｌを３ｌエルレンマイヤーフラスコ中５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する同一の培地６００ｍｌに接種した。Ａ600nmでのＯＤが０．８−１．０になるまで細胞を成長させた。ＩＰＴＧ（イソプロピルＢ−Ｄガラクトピラノシド）を最終濃度が１ｍＭになるまで加えて、細胞をさらに３−４時間成長を続けさせた後、８０００ｇ／１０分間遠心して収穫した。培養物２１から得たペレットを−８０℃で保存した。
（ｃ）  ［ＳＣＲ１−３］−Cysの単離、リフォールディング、精製および処方
記載する方法は本質的にDodd I.ら、Protein Expression and Purification 6:727-736（1995）に詳述されるものである。
ｉ）  可溶性封入体の単離
イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ｃＰＢ１０３０）の凍結細胞ペレットを５０ｍＭTris／５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０に、培養物ペレット１ｌあたり３３ｍｌの比率で再懸濁した。懸濁液を氷で囲んだガラスビーカーに移し、通常３−６分間ソニケート（Heat systems−UltrasonicsＷ３８０；５０ｘ５０％パルス、パルス時間＝５秒）した。次いで粉砕したペレットを凍結し、−８０℃で保存した。約２週間後ソニケートしたものを溶激し、約８０００ｇで２０分間遠心した。ペレットを室温で２０ｍＭTris／８Ｍ尿素／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ８．５（２００ｍｌ）に激しく攪拌して再懸濁し、次いで室温で１時間、続いて４℃で一晩放置した。
ｉｉ）  ＳＰ−セファロースを用いる最初の精製
粘性の溶液に水で洗浄し減圧乾燥したＳＰ−セファロースＦＦ（含水重量約３０ｇ）を加えた。混合物を激しく攪拌し、室温で１−２時間静置した。上澄をデカンテートし、サンプリングし、捨てた。残ったスラリーを一様な懸濁液に再懸濁し、ガラスジャケットに注ぎ、落ち着かせて充填されたベッドにした。カラムを４℃で０．０２Ｍ Tris／８Ｍ尿素／０．０５Ｍ ２−メルカプトエタノール／０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５で平衡にした。溶出液のＡ280が基底線で安定すると、緩衝液をさらに１Ｍ ＮａＣｌを含有する平衡用緩衝液に交換した。１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液でＡ280の１本ピークを溶出した；容量は約５０ｍｌであった。５０ｍＭギ酸に緩衝液交換（SephadexＧ２５）したサンプルのモル濃度消失係数２５０００ｃｍ-1を用いてＡ280の値より溶液のタンパク質濃度を推定した。これにより生成物のタンパク質濃度は１．６ｍｇ／ｍｌであることが示された。溶液を−４０℃で保存した。
ｉｉｉ）  折りたたみおよびさらなるプロセッシング
ＳＰ−セファロースで精製した生成物２５ｍｌを用時調製した冷０．０２Ｍエタノールアミン／１ｍＭ ＥＤＴＡ７８０ｍｌに絶えず攪拌しながら１分間以上にわたって徐々に加え、１時間／４℃で静置した。還元グルタチオン（ＧＳＨ）を１ｍＭまで加え、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を０．５ｍＭまで加えた。溶液は透明で約２−３℃で３日間静置した。次いで溶液をＹＭ１０メンブランを用いて限外濾過し、最後まで保持した容量は約３５ｍｌであった；保持物質はわずかに濁っており、半透明溶液の外観を呈した。これを４℃で１２日間保存した。次いでこれを３００００ｇで１５分間遠心し、上澄を室温で０．１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4／１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）９容量と混合し、すぐに３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上澄を約４ｍｌまで限外濾過（ＹＭ１０）し、次いで０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０（５．０ｍｌ）に緩衝液交換した；Ａ２８０分析によると、この溶液のタンパク質濃度は１．７ｍｇ／ｍｌであった。これをジチオ・ビス・ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）（８倍過剰のモル濃度）と室温で３０分間反応させた。Ａ４１２測定および消失係数１３６００（遊離のチオニトロ安息香酸イオンに関して）に基づくと遊離のチオール含量は６μＭであり、これは生成物Ａを得るための誘導の約１０％に過ぎない。主要な生成物は［ＳＣＲ１−３］−Cysであると考えられ、ここで遊離のＣ末端チオールはリフォールディング工程でグルタチオンまたは２−メルカプトエタノールとの反応により遮断されている。
（ｄ）  ［ＳＣＲ１−３］−Cysの単離、リフォールディング、精製および処方に関する別法
この方法は、Doddら（前記で引用）に記載された方法により近いという以外は前記の方法に類似している。注目すべきはリフォールディング後の限外濾過の保持物質をすぐに硫酸アンモニウムと反応させ、次いで遠心およびButyl Toyopearlクロマトグラフィーにより透明化したことである。約０．２から０．４Ｍ硫酸アンモニウムで溶出して得られたＡ２８０吸収フラクションをプールし、これを生成物Ｂと称する。十分に還元したＳＣＲ１−３／cysのわずか１００ｍｇで出発して、生成物Ｂは１７ｍｇ含有した。生成物は非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより主要な１種を含有し、推定純度がほぼ＞９０％であり、見かけの分子量は２１０００であった。同様に製造した生成物での研究に基づき、これは親タンパク質のＳ−グルタチオンおよび／またはＳ−メルカプトエタノール誘導された形態であると考えられるが、類似の方法で製造したかまたはある期間保存した少なくともいくつかのバッチは遊離のシステイン変種として存在するかもしれない。生成物はまた見かけの分子量が約４００００のポリペプチドをも含有した。この種に富むタンパク質の類似のバッチでの研究に基づき、これは［ＳＣＲ１−３］−Cysの２量体であると同定された。
実施例７  ＳＣＲ１−３／スイッチ融合（配列番号：７）の発現および単離
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（ａ）  ＳＣＲ１−３／スイッチをコード化するプラスミドｐＤＢ１０３１の構築
ｐＤＢ１０１３−５のフラグメント１およびフラグメント２は前記の実施例６と同一である。Cruachemが製造した二つのオリゴヌクレオチド、配列番号：３および配列番号：４をアニーリングしてＤＮＡの最終濃度を１００ピコモル／μｌにした。アニーリングしたオリゴにはＢａｎＩ／ＥｃｏＲＩの張り出しがあり、ｐＤＢ１０１３−５の３’末端で配列を重複するが、加えて停止コドンの直前にＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧＣをコードする１７個のさらなるコドンを含有する。これがフラグメント４である。
フラグメント１、２および４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１回の反応でライゲートし、ｐＤＢ１０３１を得た。ライゲートしたプラスミドをコンピテントイー・コリＪＭ１０９に形質転換した。得られたコロニーを制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、ＤＮＡシークエンシングによりＳＣＲ１−３（ＷＯ９４／００５７１の配列番号：２７）のコード化アミノ酸配列がアミノ酸ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧＣのＣ−末端付加により変化して配列番号：７が得られることを確認した。
（ｂ）  ｐＤＢ１０３１からのＳＣＲ１−３／スイッチの発現
ｐＤＢ１０３１を塩化カルシウムでコンピテント化したイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、得られたコロニーを単離してプラスミド含量を検査した。イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中でｐＤＢ１０３１からタンパク質を発現するために、１個のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢリン酸塩培地（２０ｇ／ｌトリプトン、１５ｇ／ｌ酵母抽出物、０．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4）１０ｍｌに接種した。培養物を３７℃、２３０r.p.m.で６時間成長させた後、これを用いて５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する同一の培地１００ｍｌに接種した。同一条件下で一晩成長させた。次いで各培養物２５ｍｌを３ｌエルレンマイヤーフラスコ中５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する同一の培地６００ｍｌに接種した。Ａ600ｎｍでのＯＤが０．８−１．０になるまで細胞を成長させた。ＩＰＴＧ（イソプロピルＢ−Ｄガラクトピラノシド）を最終濃度が１ｍＭになるまで加えて、細胞をさらに３−４時間成長を続けさせた後、８０００ｇ／１０分遠心して収穫した。細胞ペレットを−４０℃で凍結した。
（ｃ）  ＳＣＲ１−３／スイッチの単離、リフォールディング、精製および処方
記載する方法は本質的にDodd I.ら、Protein Expression and Purification 6:727-736（1995）に詳述されるものであり、いくつかの修飾を加えている。
ｉ）  可溶性封入体の単離
イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の凍結細胞ペレット（ｐＤＢ１０３１）を溶融し、５０ｍＭTris／５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０に、培養物ペレット１ｌあたり３３ｍｌの比率で再懸濁した。懸濁液を氷で囲んだガラスビーカーに移し、通常３−６分間ソニケート（Heat systems−UltrasonicsＷ３８０；５０ｘ５０％パルス、パルス時間＝５秒）した。次いで粉砕したペレットを凍結し、−８０℃で保存した。約１日後ソニケートしたものを溶融し、約８０００ｇで２０分間遠心した。ペレットを室温で２０ｍＭTris／８Ｍ尿素／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ８．５（２４０ｍｌ）に激しく攪拌して再懸濁し、次いで室温で１時間、続いて４℃で５日間放置した。
ｉｉ）  ＳＰ−セファロースを用いる予備的な精製
粘性の溶液に水で洗浄し減圧乾燥したＳＰ−セファロースＦＦ（含水重量約３０ｇ）を加えた。混合物を激しく攪拌し、室温で約２時間静置した。上澄をデカンテートし、サンプリングし、捨てた。残ったスラリーを一様な懸濁液に再懸濁し、ガラスジャケットに注ぎ、落ち着かせて充填されたベッドにした。カラムを４℃で０．０２ＭTris／８Ｍ尿素／０．０５Ｍ ２−メルカプトエタノール／０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５で平衡にした。溶出液のＡ280が基底線で安定すると、緩衝液をさらに１Ｍ ＮａＣｌを含有する平衡用緩衝液に交換した。１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液でＡ280の１本ピークを溶出した；容量は約５０ｍｌであった。５０ｍＭギ酸に緩衝液交換（SephadexＧ２５）したサンプルのモル濃度消失係数２５０００ｃｍ-1を用いてＡ280の測定値より溶液のタンパク質濃度を推定した。これにより生成物のタンパク質濃度は２．８ｍｇ／ｍｌであることが示された。ＳＤＳ ＰＡＧＥ／染色での分析により約２３０００ダルトンで主要なバンド（約８０％）が示された。溶液を−４０℃で保存した。
ｉｉｉ）  折りたたみおよびさらなるプロセッシング
ＳＰ−セファロースで精製した生成物１４ｍｌを用時調製した冷０．０５ＭHepes／２Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、４３０ｍｌに絶えず攪拌しながら１分間以上にわたって徐々に加え、１時間／４℃で静置した。還元グルタチオン（ＧＳＨ）を１ｍＭまで加え、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を０．５ｍＭまで加えた。溶液は透明で約２−３℃で３日間静置した。次いで溶液をＹＭ１０メンブランを用いて限外濾過し、最終的に保持した容量は約３４ｍｌであった；保持物質はわずかに濁っていた。次いでこれを２５０００ｇで１５分間遠心し、上澄を０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０（４６ｍｌ）に緩衝液交換した。このフラクションはＡ２８０の測定に基づくと２ｍｇのタンパク質を含有する。溶液を４℃で２０分間ＤＴＮＢ（２０ｍＭ；０．６５ｍｌ）と混合し、次いで限外濾過して２．４ｍｌになった。この保持物質を０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０（３．０ｍｌ）に緩衝液交換し、−４０℃で保存した。限外濾過前の溶液に関する４１２ｎｍにおける吸収の測定によりＤＴＮＢで２５％誘導されたことが示唆された。
（ｄ）  ＳＣＲ１−３／スイッチの単離、リフォールディング、精製および処方に関する別法
この方法は、リフォールディング後の限外濾過工程がDoddら（前記で引用）に記載される方法により近いという以外は前記の（ｃ）に記載した方法に類似している。注目すべきはリフォールディング後の限外濾過の保持物質をすぐに硫酸アンモニウムと反応させ、次いで遠心およびButyl Sepharoseクロマトグラフィーにより透明化したことである。約０．２から０．４Ｍ硫酸アンモニウムで溶出して得られたＡ２８０吸収フラクションをプールし、最初の生成物と称する。本質的に前記のとおりさらにＴＣＥＰと反応させ、続いてＤＴＮＢと反応させて最終タンパク質濃度が１０μＭの最終生成物を生成した。最終生成物は非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより主要な１種を含有し、純度はほぼ＞９０％であり、見かけの分子量は２３０００であり、タンパク質のモルあたり約２モルのＴＮＢを含有する。
実施倒８  ［ＳＣＲ１−３］Cys−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］（配列番号：８）の製造
0004177457.tif 000015
（ａ）  実施例６（ｃ）の生成物Ａ（１．５ｍｌ）を４℃で６０分間ジチオスレイトール（水中０．５Ｍを３０μｌ、最終濃度１０ｍＭ）と反応させ、遊離のペプチド配列番号：６を得た。黄色の溶液をSephadexＧ−２５の小型カラム（ＰＤ−１０、Pharmacia）で０．０５ＭHepesＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５（３．０ｍｌ）中に、４℃でゲル濾過した。わずかに濁った溶液をＭＳＷＰ−１（実施例２）の溶液（３．８ｍＭジチオピリジル当量、１５０μｌ）と混合して最終濃度を０．１８ｍＭにした（〜８モル濃度当量）。混合物を氷上で２時間放置し、次いで前記のとおりゲル濾過したが、２ＰＤ１０カラムを用いた（１．６ｍｌ供し、３．２ｍｌ溶出した）。最終溶出物は濁りがなく、０．４ｍｌアリコートで−７０℃で凍結保存した。
（ｂ）  実施例６（ｄ）で記載した［ＳＣＲ１−３］-Cysタンパク質生成物Ｂ（１．５ｍｌ；３１μＭタンパク質）をＴＣＥＰ（２０ｍＭ；０．００７ｍｌ）と混合し、室温で２３時間インキュベートし、遊離のタンパク質配列番号：６を得た。ＭＳＷＰ−１（実施例２）（１０ｍＭ；０．００９３ｍｌ）を加え、溶液をさらに４時間インキュベートした。最終溶液０．７５ｍｌを５０ｍＭギ酸と緩衝液交換し、アリコートを溶液で放置するかまたは凍結乾燥した。ＳＤＳ ＰＡＧＥにより生成物の純度は＞８０％であり、見かけの分子量は２３０００であり、元の親物質の分子量２１０００からシフトしたことは明らかである。凍結乾燥物は推定タンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌで５０ｍＭギ酸に容易に溶解した。
（ｃ）  実施例６（ｄ）で記載した［ＳＣＲ１−３］-Cysタンパク質生成物Ｂ（２１．６ｍｌ；３１μＭタンパク質）をＴＣＥＰ（２０ｍＭ；０．１ｍｌ）と混合し、室温で２２時間インキュベートし、遊離のタンパク質配列番号：６を得た。ＭＳＷＰ−１（０．１Ｍリン酸ナトリウム中２０ｍＭ、ｐＨ７．０；０．６７ｍｌ）を加え、溶液をさらに４時間インキュベートした。SephadexＧ５０（Ｖｔ １６０ｍｌ）を用いて２２ｍｌ全てを５０ｍＭギ酸と緩衝液交換した。Ａ２８０の３個のピークを得た。最初のピークを容量５６−１０６ｍｌで溶出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析により標題化合物が得られた。フラクションをアリコートに分け、アリコートを−４０℃で保存するかまたは凍結乾燥した。凍結乾燥前の溶液のアミノ酸分析によりタンパク質濃度が０．４２ｍｇ／ｍｌであることが示された。Ａ２８０（通過距離１ｃｍ）は０．４４であった。Ｃ８逆相ＨＰＬＣおよびＳＤＳ ＰＡＧＥにより共に純度が約８０％であることが示された。後者の技術により主要なバンドが見かけの分子量が２３０００であることが示され；元の親物質の分子量２１０００からシフトしたことは明らかであり；還元時に２３０００のバンドが分子量約２１０００および約５０００の二つのバンドにシフトした。凍結乾燥物はタンパク質濃度６ｍｇ／ｍｌで５０ｍＭギ酸またはＰＢＳ「Ａ」（Dulbecco）に容易に溶解した。
（ｄ）  （ｃ）から［ＳＣＲ１−３］−Cys−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］を０．３ｍｌアリコートに分け、凍結乾燥した。個々のアリコートを５０ｍＭギ酸（０．３ｍｌまたは０．０３９ｍｌ）に再度溶解した。
実施例９  ［ＭＡＥＴ］にジスルフィド結合した［ＳＣＲ１−３／スイッチ融合］（配列番号：３１）の製造
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実施例７（ｄ）のとおり製造したＴＮＢ−活性化ＳＣＲ１−３／スイッチ（配列番号：７）を用いて標題化合物を合成できる。ＴＮＢ−活性化ＳＣＲ１−３／スイッチを通常ＤＭＳＯ中２．０ｍｇ／ｍｌにした（約３ｍＭの遊離チオールと等価である）１モル濃度過剰のＭＡＥＴ（実施例１）と混合した。通常の反応条件は室温で１−４時間かまたは４℃で一晩であり、用いるタンパク質濃度は１から１００μＭである。遊離のＴＮＢイオンの放出により引き起こされる黄色の発色を検査して反応をモニター観察した。一度が反応が完了すると溶液は適当な緩衝液、例えば０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に緩衝液交換し、−４０℃で必要なときまで保存した。
実施例１０  ［ＭＳＷＰ−１］にジスルフィド結合した［ＳＣＲ１−３／スイッチ融合］（配列番号：９）の製造
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方法（ａ）
ＭＳＷＰ−１（実施例２，０．１Ｍリン酸ナトリウム中１０ｍＭ、ｐＨ７．０）０．０２ｍｌをＴＣＥＰ（５０ｍＭHepes中２０ｍＭ）０．００５ｍｌと混合し、室温で１０分間放置した。得られた溶液は配列番号：５のミリストイル化ペプチドを含有する溶液Ａである。実施例７（ｃ）に１記載する方法と類似の方法で製造したＴＮＢ活性化ＳＣＲ１−３／スイッチ（配列番号：７）（０．３ｍｌ；０．１Ｍリン酸ナトリウム中１５μＭ、ｐＨ７．０）を溶液Ａ０．００５６ｍｌと混合し、理論的にタンパク質より５倍過剰のモル濃度のＭＳＷＰ−ＳＨを得た。混合物を室温で４時間、次いで４℃で１８時間放置した。ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、次いでタンパク質染色すると見かけのＭr２３Ｋで１個の主要なバンドが認められ、これは標題タンパク質に相当する。
方法（ｂ）
実施例７（ｄ）に記載する方法と類似の方法で製造したＴＮＢ活性化ＳＣＲ１−３／スイッチ生成物（配列番号：７）（１０μＭ；０．４３ｍｌ）をＴＣＥＰ（５ｍＭ；０．００２６ｍｌ）と混合し、室温で１７時間インキュベートし遊離の融合タンパク質、配列番号：７を生成した。ＭＳＷＰ−１（１０ｍＭ；０．００８６ｍｌ）を加え、さらに４時間インキュベーションを続けた。小型粒子または結晶が溶液中に存在したが、それがなければ透明であった。粒子を含む溶液を５０ｍＭギ酸（１．０ｍｌ）に緩衝液交換し、アリコートに分け、凍結した。非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによる分析を行い、多くのバンドが認められたが、これらは目的の物質である見かけの分子量２５０００の物質を含んでいることを示している。
実施例１１  ［ＣＲ１：１−１９２９］−Cys−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］（配列番号：１０）の製造
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ヒト補体レセプター１（ＣＲ１、ＣＤ３５）は主要な天然型アロタイプの細胞外ＳＣＲドメインの全てを含有する組み換え可溶性形態で産生される補体活性化のレギュレーターとして知られている（Feraronら、ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７）。この形態（ｓＣＲ１）はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に活性なタンパク質として発現された。Cys−１９２４のコドンのすぐ下流でＤＮＡ配列の変異誘発を行い新規のＣ−末端システイン残基を作った。
ｓＣＲ１のｃＤＮＡ配列の修飾末端の適当な例としては以下のようなものが挙げられる：
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修飾オリゴヌクレオチドを５９１４（ナンバリングはFearonら、1989、1991による）の位置で独特のＢａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にライゲートすることにより、ＣＲ１のコドンAsp−１９３０をシステインのコドンと置換する。
ＣＨＯ細胞でこの修飾ｃＤＮＡを発現し、標準的なクロマトグラフィー法により生成物を単離することにより、実施例８（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で用いることができる修飾ｓＣＲ１タンパク質を作り、ＭＳＷＰ−１（実施例２）に結合させて標題化合物を得た。
実施例１２  ［ＳＣＲ１−３］−Cys−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−２］（配列番号：１１）の製造
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実施例６（ｄ）に記載した方法に類似の方法で製造した［ＳＣＲ１−３］−Cysタンパク質（配列番号：６）（４６μＭタンパク質；０．２０ｍｌ）をＴＣＥＰ（５ｍＭ；０．００５４ｍｌ）と混合し、室温で約２０時間インキュベートした。この溶液０．０５ｍｌを０．１Ｍエタノールアミン０．０２５ｍｌおよびＭＳＷＰ−２（実施例３を参照のこと；ＤＭＳＯ中５ｍＭ）０．００３ｍｌと混合した；溶液を室温でさらに３時間インキュベートした。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析により生成物の主要なバンドが見かけの分子量２３０００であることが示され、元の親物質の分子量２１０００からシフトしたことは明らかである。目的のタンパク質の純度はＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから推定され、約８０％である。
実施例１３  ［ＳＣＲ１−３−Cys−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−３］（配列番号：１２）の製造
0004177457.tif 000021
実施例６（ｄ）に記載した方法に類似の方法で製造した［ＳＣＲ１−３］−Cysタンパク質（配列番号：６）（４６μＭタンパク質；０．１０ｍｌ）をＴＣＥＰ（５ｍＭ；０．００３７ｍｌ）と混合し、室温で約１８時間インキュベートした。０．５Ｍエタノールアミン０．０１ｍｌを加えた。この溶液０．１１ｍｌのうち０．０３ｍｌをＭＳＷＰ−３（実施例４を参照のこと；０．１Ｍリン酸ナトリウム中２ｍＭ、ｐＨ７．０）０．００３２ｍｌと混合した；溶液を室温でさらに３時間インキュベートした。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析により生成物の主要なバンドが見かけの分子量２３０００であることが示され、元の親物質の分子量２１０００からシフトしたことは明らかである。目的のタンパク質の純度はＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから推定され、約８０％である。
実施例１４  ［ＳＣＲ１−３］−Cys−Ｓ−Ｓ−［ＴＣＰＴ−１］（配列番号：１３）の製造
0004177457.tif 000022
実施例６（ｄ）に記載した方法に類似の方法で製造した［ＳＣＲ１−３］−Cysタンパク質（４６μＭタンパク質；０．０８ｍｌ）をＴＣＥＰ（５ｍＭ；０．００２９ｍｌ）と混合し、室温で約１８時間インキュベートした。０．５Ｍエタノールアミン０．００８ｍｌを加えた。この溶液０．０８８ｍｌのうち０．０４ｍｌをＴＣＰＴ−１（実施例５を参照のこと；ＤＭＳＯ中２．９ｍＭ）０．００２９ｍｌと混合した。凝集を最少にするために２時間以上にわたってＴＣＰＴ−１を６アリコートに加えた。溶液をさらに２時間室温でインキュベートした。混合物の最終的な外観は一種のコロイド懸濁液であり、これを２０００ｇで１分間遠心して目的のタンパク質が沈殿物中で分かれているのが認められた。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析により生成物の主要バンドが見かけの分子量２３０００であることが示され、元の親物質の分子量２１０００からシフトしたことは明らかである。目的のタンパク質の純度はＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから推定され、約８０％である。
実施例１５  ウサギ抗（ヒト赤血球膜）抗体−［ＭＳＷＰ−１］結合体（ＲＡＥＭ−ＭＳＷＰ−１）（配列番号：３２）の製造
0004177457.tif 000023
ウサギポリクローナル抗（ヒト赤血球膜）（ＲＡＥＭ）抗血清（Dako、Denmark、１３ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｌ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム ０．１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．４（ＰＢＳ）で１．０ｍｌまで希釈しＰＢＳ（用時溶解）中１００ｍＭ ２−イミノチオラン３０μｌと２５℃で３０分間反応させた。示したこれらの条件は免疫グロブリンＧ分子あたり平均２−３個の遊離のチオール基を導入するためのものである［R.A.G.Smith & R.Cassels、Fibrinolysis 2:189-195（1988）］。
SephadexＧ−２５ｍ（ＰＤ−１０、Pharmacia、Stockholm、Sweden）の小型ディスポーザブル・カラムで、ゲル透過クロマトグラフィーにより４℃で生成物を精製した。生成物２．５ｍｌ（全量３．０ｍｌ、タンパク質濃度の理論値は〜６．１μＭ）をＭＳＷＰ−１（実施例２、ジメチルスルフォキシド中５ｍＭの溶液０．１２５ｍｌ、最終濃度〜２４０μＭ）と反応させ２５℃で３０分間インキュベートした。生成物を前記のとおりＰＤ１０カラムでゲル濾過し、タンパク質中〜５μＭの溶液３．０ｍｌを得た。これを−７０℃で保存した。
実施例１６  ストレプトキナーゼおよびＭＳＷＰ−１の結合体（配列番号：２１）の製造
0004177457.tif 000024
ＰＤ１０カラムを用いてストレプトキナーゼ（ＳＫ）の保存溶液（Behringwerke、Marburg、Germany、１２．８ｍｇ／ｍｌ、２７１μＭ、２．５ｍｌ）を０．０１重量／容量％Tween８０を含有するＰＢＳ緩衝液（実施例１５を参照のこと）［ＰＳＴ緩衝液］３．２ｍｌ中にゲル濾過した。用時調製した２−イミノチオラン（１００ｍＭを６４μｌ）を加え、混合物を２５℃で１時間インキュベートした。生成物を２個のＰＤ１０カラムで、４℃で２ｘ１．６ｍｌのバッチで２ｘ３．０ｍｌ ＰＳＴ中にゲル濾過した。溶液を−７５℃で１．５ｍｌのアリコートで保存した。
Elman試薬（０．１ＭトリエタノールアミンＨＣｌｐＨ８．０の０．５ｍｌ中０．１ｍＭ）で生成物を滴定し、これが約０．３ｍＭの遊離のチオール基を含有することが示された。これはＳＫ分子あたり平均３−３．５個のチオール基に対応する。チオール化ＳＫの保存溶液（２ｘ０．５ｍｌ）をＭＳＷＰ−１（ＤＭＳＯ中５ｍＭの保存溶液３２μｌ）で１個のアリコートを修飾することによりプロセッシングし、２５℃で１時間インキュベートし４℃で３．０ｍｌ ＰＳＴ中にゲル濾過（ＰＤ１０カラム）した。対照アリコートをＭＳＷＰ−１に曝露せずに平行してプロセッシングした。ＳＫに関する２８０ｎｍにおける消失係数０．７６（ｍｇ／ｍｌ）-1に基づくと、生成物は共に〜０．８ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有し、これを−７５℃で保存した
実施例１７  ＭＳＷＰ−１のヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーターの活性中心への可逆的結合（配列番号：２２）
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SmithおよびCassels［Fibrinolysis 2:189-195（1988）］の方法でチオール反応性アシル酵素４−Ｎ−［２−Ｎ−（３−［２−ピリジルジチオ］エチルカルボニル）アミノエチル］アミノベンゾイル−［Ser−４７８］ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター［ＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡ］を製造した。組織プラスミノーゲンアクチベーター（Actilyse、Boehringer Ingelheim、Germany、約２ｍｇ）を実施例１６のＰＳＴ緩衝液（１．０ｍｌ）に溶解し、ジメチルスルフォキシド中塩酸４’−アミノフェニル・４−Ｎ−［２−Ｎ−（３−［２−ピリジルジチオ］−エチルカルボニル）アミノエチル］アミノベンゾエート［S.B.Kalindjian & R.A.G.Smith、Biochem.J.248:409-413（1987）］２０ｍＭ溶液２５μｌと反応させた。混合物を２５℃で１時間インキュベートし−８０℃で凍結保存した。ジチオスレイトール（水中０．５Ｍを５μｌ）を添加して０℃で３０分間還元し、次いで実施例１６に記載するようにＰＳＴ緩衝液（３．０ｍｌ）に緩衝液交換した。すぐに生成物を保持用サンプル（０．６ｍｌ）および反応用サンプル（２．４ｍｌ）に分け、これをＭＳＷＰ−１（実施例２、ジメチルスルフォキシド中５ｍＭの溶液を１００μｌ）と混合し、氷上９０分間インキュベートした。前記のように生成物をＰＳＴ３．２ｍｌに緩衝液交換し、アリコートに分けて−１９６℃で保存した。
実施例１８  醗酵中の［ＳＣＲ１−３］−Cys（配列番号：６）の発現および精製
（ａ）  プラスミドｐＤＢ１０３０を宿すイー・コリの醗酵
最初にプラスミドｐＤＢ１０３０を宿すイー・コリの凍結保存物をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌで添加したＬＢ寒天で平板培養して調製した。１ｍｌアリコートを１０％グリセロール／ＰＢＳ低温保存液中に保存して、液体窒素下で貯蔵した。１ｍｌのバイアルを融解し、これを用いて５００ｍｌフラスコ中ＬＢAmp100１次播種用培地（Difco Bactotryptone、１０ｇｌ-1；Difco酵母抽出物、５ｇｌ-1；塩化ナトリウム、５ｇｌ-1；滅菌前のｐＨ７．４）１００ｍｌに接種した。１次播種段階を３７℃で３時間インキュベートし、次いでまた１％の接種材料を用いて５００ｍｌフラスコあたりＬＢAmp100１００ｍｌに接種する２次播種段階に移した。次いで前記のようにさらに４時間インキュベートし、１％の接種材料を１５１のBiolafitte醗酵器中ＬＢAmp100１０１の３次播種段階に移した。４次播種用培地１０１を接種前に１２１℃で４５分間インサイチュー滅菌した。１４．５時間インキュベートした後４次播種物を６％接種材料として最終段階の醗酵器に移した。播種段階のインキュベーション条件は以下のとおりである：空気流１０ｌ／分（１．０ｖｖｍ）、温度３７℃、４０００ｒｐｍで振とう（１．９ｍ／秒）および加圧０．２バール。リン酸トリプトン培地Amp100（Difco Bactotryptone、２０ｇ／ｌ；Difco酵母抽出物、１．５ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、８ｇ／ｌ；オルトリン酸水素二ナトリウム、２ｇ／ｌ；オルトリン酸水素二カリウム、１ｇ／ｌ；Dow Corning１５２０消泡剤、０．１ｇ／ｌ；滅菌前のｐＨ７．４）３００ｌを４５０ｌのBioengineerin醗酵器中１２１℃で３０分間インサイチュー滅菌した。４次播種段階からの接種材料２０ｌを醗酵器に接種し、以下の条件でインキュベートした：空気流４５０ｌ／分（１．５ｖｖｍ）、温度３７℃、２３０ｒｐｍで振とう（１．５ｍ／秒）および加圧０．５バール。ＯＤ550nm３．５を得た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えた。２時間インキュベーションを続けた後収穫した。WestfaliaＣＳＡ１９（２回放電（two discharges））による１次遠心の後細胞スラリーを回収した。SorvallＲＣ３Ｂ遠心で細胞をさらに４７００ｒｐｍ（７０００ｇ）で３０分間回転させた。全細胞収量（含水重量）は２．９８ｋｇであり、これを約６００ｇロットで−８０℃で保存した。
（ｂ）封入体の単離および［ＳＣＲ１−３］-Cysの精製
細胞ペレット１００ｇ（含水重量）から封入体を単離し、本質的に実施例６に記載のとおり可溶化した。再度可溶化した封入体からの目的のタンパク質の精製もまた実施例６に記載の方法にいくらか修飾を加えた方法で行った。主要な修飾は以下のとおりである：
１．Ｓ−Sepharoseの代わりにMacroprep High S（Biorad）を用いた。ソニケートした細胞ペレット１００ｇにマトリックス２００ｇを用いた。可溶化し部分的に精製したフラクション・ボディー（fractionon bodies）中に純度約６０％の目的のタンパク質１．４ｇを生成した。
２．６０ｍＭ冷エタノールアミン／１ｍＭＥＤＴＡ中十分に変性したタンパク質（２ｍｇ／ｍｌ）を１００倍希釈し、次いでグルタチオン酸化還元対を添加することにより、部分的に精製したタンパク質のサンプル１００ｍｇをリフォールディングした。
上記の方法の生成物を実施例８に1記載する方法に類似の方法でＭＳＷＰ−１（実施例２）を用いて修飾できる。
実施例１９  ［ＳＣＲ１−３（delＮ１９５−Ｋ１９６）］ＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣＱＴ（配列番号：１４）の発現および単離
（ａ）［ＳＣＲ１−３（delＮ１９５−Ｋ１９６）］ＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣＱＴをコード化するプラスミドｐＢＣ０４−２９の構築
QuickChange位置指定変異誘発（Stratagene）により製造者のプロトコルに従ってＣＲ１のＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１−３をコード化するプラスミドｐＤＢ１０１３−５（特許出願ＷＯ９４／００５７１）からプラスミドｐＢＣ０４−２９を構築した。二つの相補的オリゴヌクレオチド（配列番号：１５および配列番号：１６）を用いてＧ１８６／Ｐ１８７およびＣ末端システインで新規制限部位（サイレント）を作った。結局反応によりＮ１９５の位置でフレームシフト変異を生じた。得られた配列ではＣ末端アミノ酸Ｎ１９５およびＫ１９６が１４個のアミノ酸ペプチドＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣＱＴと置換された。幸運にもこの配列はＣ末端近くで１１個のアミノ酸のスペイサー配列が先行する内在性システインを含有する。
（ｂ）イー・コリにおける［ＳＣＲ１−３（delＮ１９５−Ｋ１９６）］ＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣＱＴをコード化するプラスミドｐＢＣ０４−２９の発現
ｐＢＣ０４−２９をコンピテント化したイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）pLys−Ｓに形質転換し、得られたコロニーを単離してプラスミド含量を検査した。１個のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ）１０ｍｌに接種した。培養物を３７℃、２３０r.p.m.で６−１８時間成長させた後、これを用いて４ｌのエルレンマイヤーフラスコ中５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する同一の培地１ｌに１：１００希釈になるように接種した。Ａ600ｎｍでのＯＤが０．８−１．０になるまで細胞を成長させた。ＩＰＴＧ（イソプロピルＢ−Ｄガラクトピラノシド）を最終濃度が１ｍＭになるまで加えて、細胞をさらに３−４時間または一晩成長を続けさせた後、８０００ｇ／１０分遠心して収穫した。培養物１ｌのペレットを−８０℃で保存した。
（ｃ）［ＳＣＲ１−３（delＮ１９５−Ｋ１９６）］ＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣＱＴの単離および精製
この方法は本質的にDodd I.ら、Protein Expression and Purification 6:727-736（1995）に詳述されるものであり、次いで実施例１８に記載のとおりいくつかの修飾を加えている。簡単には（ｂ）の細胞培養物１ｌからの細胞ペレットを緩衝液に再懸濁し、ソニケートし、遠心により封入体を単離した。封入体を十分な還元用緩衝液１００ｍｌ中再可溶化し、目的のタンパク質をMacroprep HighＳで精製した（含水重量３０ｇ）。カラムから１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液に溶出した生成物（わずか１．５ｍｇ／ｍｌで２７ｍｌ）を冷６０ｍＭエタノールアミン／１ｍＭ ＥＤＴＡ ２．５ｌ中に希釈し、１時間後にグルタチオン酸化還元対試薬を添加してリフォールディングを行った。４℃で３日間の後ＹＭ１０メンブランを用いて溶液を限外濾過し、保持物質を硫酸アンモニウムと反応させ、遠心し、上澄をButyl Toyopearl６５０Ｍ（ベッド容量５３ｍｌ）で精製した。Ａ２８０の１本のピークを硫酸アンモニウムグラジエントを減少させることにより溶出した。非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥを行った後、タンパク質染色し、見かけの分子量２２０００の主要なポリペプチドが示され、これが目的のタンパク質であると考えられる。ポリペプチドを含有するものの一つは見かけの分子量が約４００００であり、これは隣接する［ＳＣＲ１−３］-Cysのマーカーと比較して目的の単量体の二量体であると同定された。生成物のタンパク質濃度は３０μＭであると推定された。
実施例２０  ［ＳＣＲ１−３（delＮ１９５−Ｋ１９６）］ＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣ−（−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］）ＱＴ（配列番号：１７）の製造
0004177457.tif 000026
実施例１９に記載するように製造した［ＳＣＲ１−３（delＮ１９５−Ｋ１９６）］ＴＮＡＮＫＳＬＳＳＩＳＣＱＴ（約３０μＭタンパク質；０．１ｍｌ）をＴＣＥＰ（５０ｍＭHepes、ｐＨ４．５中５ｍＭ；０．００７２ｍｌ）と混合し、室温（２２℃）で１５時間インキュベートした。この溶液０．０５ｍｌを０．５Ｍエタノールアミン０．００５ｍｌおよび７ｍＭ ＭＳＷＰ−１、０．００３ｍｌ（実施例２を参照のこと）と混合した；溶液を室温でさらに４時間インキュベートした。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析により生成物の主要なバンドの見かけの分子量が２５０００であることが示され、元の親物質の分子量２３０００からシフトしたことは明らかである。
実施例２１  ［ＳＣＲ１−３］ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣ（配列番号：２３）の製造
（ａ）  ［ＳＣＲ１−３］ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣをコード化するプラスミドｐＢＣ０４−３１の構築
プラスミドｐＢＣ０４−２９（実施例１９に記載）および合成オリゴヌクレオチド対（配列番号：２５および配列番号：２６）を用いてプラスミドｐＢＣ０４−３１を構築した。ｐＢＣ０４−２９を制限酵素HindＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、大きなフラグメント（２１７０塩基対）を単離した。二つのオリゴヌクレオチドを＞９０℃に加温し、徐々に室温にまで冷却することによりアニーリングし、ＤＮＡフラグメントとライゲートした。ライゲートしたＤＮＡをコンピテントイー・コリＸＬＩ−Blueに形質転換した。２７３３の位置で新規ＡｖａＩ部位の存在を探すことによりオリゴヌクレオチドが挿入されたプラスミドに関してコロニーを分析した。ＡｖａＩ ｐＢＣ０４−３１で消化することにより２３１１および４９５塩基対のフラグメントを生じた。陽性クローンからのＤＮＡを用いて発現株を形質転換した。挿入されたオリゴヌクレオチドはペプチド配列ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣをＳＣＲ１−３のＣ末端に付加し、またｐＢＣ０４−２９に認められるフレームシフトのエラーをも修復した。
（ｂ）  ［ＳＣＲ１−３］ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣの発現、単離および精製実施例６に概して記載した方法によりｐＢＣ０４−３１を用いて［ＳＣＲ１−３］ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣの発現、単離および精製を行った。
実施例２２  ［ＳＣＲ１−３］ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣ−（−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］）（配列番号：２４）の製造
0004177457.tif 000027
実施例２１に記載した方法と類似の方法で製造した［ＳＣＲ１−３］ＤＧＰＳＥＩＬＲＧＤＦＳＳＣタンパク質を実施例：８に1記載するようにＭＳＷＰ−１と反応させて標題化合物を得た。
実施例２３  ［ＳＣＲ１−３］ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣ（配列番号：３３）の製造
（ａ）  ［ＳＣＲ１−３］ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣをコード化するｐＢＣ０４−３４の構築
プラスミドｐＢＣ０４−２９（実施例１９に記載）および合成オリゴヌクレオチド対（配列番号：３４および配列番号：３５）を用いてプラスミドｐＢＣ０４−３４を構築した。ｐＢＣ０４−２９を制限酵素HindＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、大きなフラグメント（２１７０塩基対）を単離した。二つのオリゴヌクレオチドを＞９０℃に加温し、徐々に室温まで冷却することによりアニーリングし、ＤＮＡフラグメントとライゲートした。ライゲートしたＤＮＡをコンピテントイー・コリＸＬＩ−Blueに形質転換した。Ｎｄｅｌ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの大きさが５９塩基対大きくなっているものを探すことによりオリゴヌクレオチドが挿入されたプラスミドに関してコロニーを分析した。２７８１の位置にＤｄｅＩ部位が存在することによりシステインコドンが存在することを決定した。ｐＢＣ０４−３４をＤｄｅＩで消化することにより診断用のバンド４８１および１０９塩基対を生じた。陽性クローンからのＤＮＡを用いて発現株を形質転換した（次のセクションを参照のこと）。挿入されたオリゴヌクレオチドはペプチド配列ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣをＳＣＲ１−３のＣ末端に付加し、またｐＢＣ０４−２９に認められるフレームシフトのエラーをも修復した。
（ｂ）  ［ＳＣＲ１−３］ＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣの発現、単離および精製
実施例６に概して記載した方法によりｐＢＣ０４−３４を用いて［ＳＣＲ１−３］ＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣの発現、単離および精製を行った。
実施例２４  ［ＳＣＲ１−３］ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣ−（−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］）（配列番号：３６）の製造
0004177457.tif 000028
実施例２３に記載した方法と類似の方法で製造した［ＳＣＲ１−３］ＡＡＰＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＣタンパク質を実施例：８に記載するようにＭＳＷＰ−１と反応させた。
生物学的活性
（Ｉ）ヒツジ赤血球の古典的経路で媒介された溶血によって測定した抗−補体活性
（ｉ）補体阻害剤の機能的活性を、ウサギ抗体（Diamedix Corporation,Miami,USA）で感作させたヒツジ赤血球の補体−媒介性溶解の阻害を測定することによって評価した。アッセイは、補体活性化の古典的経路に特異的であるように設計される。０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．１％ゼラチンｐＨ７．４中で１：５００または１：４００（アッセイ混合物中の最終濃度）に希釈したヒト血清を補体源として用いた。Dacie & Lewis,1975に記載のようにボランティアのプールから血清を調製した。簡単に言うと、血液を３７℃まで５分間加温し、血餅を除去し、残りの血清は遠心分離によって不純物を除去した。血清画分を少量のアリコートに分け、−１９６℃または−８０℃で貯蔵した。アリコートを必要に応じて解凍し、使用直前にＨｅｐｅｓ緩衝液中で希釈した。
感作されたヒツジ赤血球の補体−媒介性溶解の阻害を、ｖ−底ミクロタイタープレートフォーマットを用いる標準的な溶血アッセイを用いて、以下のように測定した。
Ｈｅｐｅｓ緩衝液中で希釈された一連の濃度範囲の阻害剤５０μｌを５０μｌの希釈血清および１００μｌの感作されたヒツジ赤血球と混合し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。試料を周囲の温度で３分間１６００ｒｐｍで回転させた後、１５０μｌの上清を平底ミクロタイタープレート上に移し、４０５または４１０ｎｍで吸光度を測定した。いかなる阻害剤も存在させずに血清を赤血球とインキュベートすることによって、最大溶解度（Ａｍａｘ）を決定した。いかなる血清または阻害剤も存在させずに赤血球をインキュベートすることによって、バックグラウンド溶解度（Ａｏ）を決定した。ＩＨ５０が溶解の５０％阻害に要する阻害剤濃度を示すように、阻害を全細胞溶解の画分として表した。
％阻害＝１−［（Ａ−Ａｏ）／（Ａｍａｘ−Ａｏ）］
0004177457.tif 000029
同様のバッチに関して生じた他のＩＨ50値は：
（１）１５ｎＭ
（２）８ｎＭ、５ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ
（３）０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ
を包含する。
前記のデータは以下のことを示す：
１．  「ベース」タンパク質（ＷＯ９４／００５７１のヒト補体レセプター１のＳＣＲ１−３）および付加的Ｃ−末端システイン（ＳＣＲ１−３／ｃｙｓ、実施例６）または単一のカチオン性「スイッチ」配列（ＳＣＲ１−３／スイッチ、実施例７）のいずれかを有するその誘導体の補体阻害活性は類似する。
２．  しかしながら、ＭＳＷＰｓ−１、２または３（２つの膜結合エレメント（静電気スイッチおよびミリストイル）の両エレメントを含有する）の付加によるＳＣＲ１−３／ｃｙｓへの２つの膜結合エレメントの組み込み、またはＭＳＷＰ−１の付加によるＳＣＲ１−３／スイッチ構築物へ３つの膜結合エレメントの組み込みにより、ベースまたは単一の膜結合エレメントタンパク質より有意に影響力のある（−２０−２００ｘ）産物を生じる。ＣＤ３−陽性細胞にみられる膜エレメントへの標的とされ、赤血球膜への標的とされないＴＣＴＰ−１の使用は、膜アドレスを有さないかまたは単一の膜アドレスを有するＳＣＲ１−３誘導体と同様に有効な結合体を与える。したがって、赤血球膜事象（補体の膜攻撃複合体による細胞溶解）に依存するアッセイにおける能力の増加は、２つの膜結合エレメントの組み合わせによる細胞溶解阻害剤タンパク質の膜標的の結果である。
（ｉｉ）古典的経路溶血アッセイにおける抗−補体活性のアッセイ：飼いならされたブタ、モルモット、ラットおよびマーモセットの血清における活性
［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］の活性を、ブタ、モルモット、ラットまたはマーモセットの血清を用いる古典的経路溶血アッセイにおいて試験した。方法は、少しの修飾、例えば、使用する血清の濃度を少し変化させることを用いて本質的に（Ｉ）に記載のとおりであった。本質的に実施例８ｃに記載のように［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］を調製した。各血清に対するＩＨ５０値は：ブタ、０．２ｎＭ；モルモット、０．３ｎＭ；ラット、０．４ｎＭ；マーモセット、０．２ｎＭであった。これらの結果は、［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］が様々な動物種の血清において古典的経路補体阻害を阻害できることを示す。
（ＩＩ）モルモット赤血球の別の経路で媒介された溶血によって測定した抗−補体活性
補体阻害剤の機能的活性をScesney, S.M.ら（１９９６）J. Immunol. 26. 1729-1735によって記載されたように、モルモット赤血球の補体媒介溶解の阻害を測定することによって評価した。アッセイは、補体活性化の別の経路に特異的であるように設計される。Dacie ＆ Lewis,1975に記載のようにボランティアのプールから調製したヒト血清を補体源として用いた。簡単には、血液を３７℃まで５分間加温し、血餅を除去し、残りの血清は遠心分離によって不純物を除去した。血清画分を少量のアリコートに分け、−１９６℃または−８０℃で貯蔵した。アリコートを必要に応じて解凍し、使用直前に０．１ＭＨｅｐｅｓ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．１％ゼラチン／８ｍＭ ＥＧＴＡ／５ｍＭ ＭｇＣｌ2ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）中で希釈した。モルモット赤血球をＥＤＴＡ−コートした試験管中に収集したモルモットの全血液から、以下のように調製した。血液を１６００ｒｐｍで５分間回転させ、回転後の上清が無色になるまで赤血球ペレットを０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．１％ゼラチンｐＨ７．４で３回洗浄した。最終的に、赤血球を使用した血液の元の容量まで再懸濁し、＋４℃で貯蔵した。それらを２週間以内に使用した。
ｖ−底ミクロタイタープレート中の緩衝液Ａで希釈された一連の濃度範囲の阻害剤５０μｌを、第１に、１：３に希釈した血清１００μｌ、および第２に、モルモット赤血球（緩衝液Ａで１：４９に希釈した）５０μｌと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを３分間１６００ｒｐｍで回転させた後、１５０μｌの各上清を平底ミクロタイタープレート上に移し、各試験溶液中の溶解量を反映する４０５ｎｍで吸光度を測定した。いかなる阻害剤も存在させずに血清を赤血球とインキュベートすることによって、最大溶解度（Ａｍａｘ）を決定した。いかなる血清または阻害剤も存在させずに赤血球をインキュベートすることによって、バックグラウンド溶解度（Ａｏ）を決定した。アッセイにおいて使用した血清の最終希釈液は、４０５ｎｍで吸収するが、その吸光度レベル（Ａｍａｘの約１０％）は、全アッセイの結果に無視して良いほどの影響しか有さないと考えられ、計算では無視した。ＩＨ５０が溶解の５０％阻害に要する阻害剤濃度を示すように、阻害を全細胞溶解の画分として表した。
％阻害＝１−［（Ａ−Ａｏ）／（Ａｍａｘ−Ａｏ）］
結果
実施例８（ｃ）の記載と同様の方法で調製された［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］の単一のバッチの２つのアリコート（１つは凍結乾燥し、中性緩衝液中に再可溶化したもの、他方は凍結乾燥しないもの）を溶血アッセイで試験した。化合物に関するＩＨ５０値は：
［ＳＣＲ１-３］-Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-［ＭＳＷＰ-１］（凍結乾燥しない）  ３１０ｎＭ
［ＳＣＲ１-３］-Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-［ＭＳＷＰ-１］（凍結乾燥する）    ４８０ｎＭ
詰果は、［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］が補体系の別の経路に対して活性を示したこと、ならびにタンパク質の凍結乾燥および再可溶化がタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさなかった（実験的誤差の範囲内）ことを示す。
（ＩＩＩ）プラスミノーゲンアクチベーターアッセイ
（ｉ）実施例１６由来のＳＫ−関連分子を、プラスミノーゲン活性化アッセイを用いてアッセイした。精製したヒトＬｙｓ77−プラスミノーゲン（２５％v/vグリセロールを含有するＰＳＴ緩衝液［ＰＳＴＧ緩衝液］中１μＭ、０．５ｍｌ）の溶液をチオール化（thiolated）ＳＫ（最終濃度０．１ないし１．０７ｎＭ）と共に２５℃で１時間インキュベートした。該混合物のアリコート（１０μｌ）を１．０ｍＭのプラスミン基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−p-ニトロアニリド、KabiVitrum，ストックホルム、スウェーデン）と共に、２５℃にて０．１ＭトリエタノールアミンＨＣＩ ｐＨ８．０（０．５ｍｌ）中でインキュベートした。４０５ｎｍで連続的にｐ−ニトロアニリンの放出をモニターした。これらの条件下、プラスミン活性の１基質単位（ＳＵ）を４０５ｎｍでの光学濃度において０．００１分あたりの増加を引き起こす酵素量として定義する。これらの条件下、チオール化ＳＫ（１ｎＭ）は、ほとんど直線的に４２２５ＳＵ／ｍｌのプラスンミンを生じた。
ＳＫ−ＭＳＷＰ−１結合体をＰＳＴＧ緩衝液中で１：１００に希釈し、５−５０μｌアリコートをプラスミノーゲン活性化アッセイにおいて試験した。貯蔵調製物は、およそ２．９μＭの機能的ＳＫを含有することがわかった。
（ｉｉ）実施例１７のアシル−酵素調製物の潜在的活性をＰＳＴ緩衝液中での２０−５０倍希釈および３７℃で２時間のインキュベーションによって、次いで、１２ｍＭ Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ-ニトロアニリド２ＨＣｌ）を用いて前記（ｉ）に用いたのと同じ条件下でアッセイすることによって測定した。これらの条件下、還元したＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡ調製物の潜在的活性は２７６０ＳＵ／ｍｌであり、ＭＳＷＰ−１／ＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡ結合体では５３５ＳＵ／ｍｌであった。
（ＩＶ）赤血球結合アッセイ
（ｉ）修飾および非修飾ウサギ抗−（ヒト赤血球膜）抗体に関する赤血球凝集試験
ヒトプールされた赤血球（Ortho A2,Raritan,New Jersey,3%v/v, 50ul）をミクロタイタープレートウェルに加え、非修飾のウサギ抗−（ヒト赤血球膜）抗体［ＲＡＥＭ］または実施例１５由来のＲＡＥＭ−ＭＳＷＰ１結合体のいずれかを非希釈貯蔵ＲＡＥＭに関して示した濃度で加えた。細胞を２５℃にて〜１００ｒｐｍで４０分間、激しく振盪した。５μｌを各ウェルから採取し、光学顕微鏡によってｘ２０拡大で調べた。視覚的なスコアリングスケールを以下のように用いた。
-凝集しない、細胞は相互に自由に移動している
＋小さい凝集塊（＜１０細胞＞）
＋＋より大きい凝集塊（１００プラス細胞）
＋＋＋非常に大きい可視凝集塊
結果
対照（ｎ＝６）        -      ＲＡＥＭ−ＭＳＷＰ１  １／３９００  ＋／-
ＲＡＥＭ１／１１００  -      ＲＡＥＭ−ＭＳＷＰ１  １／１０００  ＋／-
ＲＡＥＭ１／６００    -
ＲＡＥＭ１／３５０    ＋／-  ＲＡＥＭ−ＭＳＷＰ１  １／３５７    ＋＋＋
ＲＡＥＭ１／５０      ＋＋   ＲＡＥＭ−ＭＳＷＰ１  １／６２      ＋＋＋
結論
膜−結合単位を含有するように修飾された抗体調製物は、膜表面における架橋抗体のより高い有効濃度を可能にするＭＳＷＰ１によって細胞膜に結合するので、細胞の凝集の誘発においてより有効であった。
（ｉｉ）１２５−ヨード−［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］のヒト赤血球への結合
ヨードゲン法および試薬（Pierce and Warriner（UK）Ltd.）にしたがって、［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ；０．２５ｍｌ）を９ナノモルのヨウ化カリウムの存在下で０．５ｍＣｉの１２５−ヨード（Amersham）と混合した。標識化を室温で２０分間行い、反応を０．１ｍｌの１Ｍヨウ化カリウムでクエンチし、溶液をＰＢＳ／０．１％アルブミンに緩衝液交換した。健康なボランティアから採血したクエン酸塩加血液をヒト赤血球源として用いた。血液（０．２ｍｌ）を１０マイクロリットルの適当に希釈した１２５−ヨード−［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］と混合し（最終濃度７００ｐＭ）、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、赤血球をＰＢＳ／遠心分離段階において３回繰り返して洗浄することによって単離し、試料をＷａｌｌａｃ １４７０ Ｗｉｚａｒｄガンマカウンターでカウントした。結果は以下のとおりであった。
0004177457.tif 000030
血液１ｍｌあたり５Ｘ１０9赤血球および［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］に関する比放射能２．７Ｘ１０7ｃｐｍ／ナノモルを用いて、［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］の約６００分子が細胞につき結合したことを算出した（「最終ペレット」の値）。
（ｉｉｉ）フルオレセイン標識−［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］のヒト赤血球への結合
［ＳＣＲ１−３］−ｃｙｓ（実施例１８に記載と同様な方法で調製した）（０．１Ｍリン酸ナトリウム、約０．２Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．０中において４５μＭ，１．０ｍｇ／ｍｌ）を４モル濃度過剰のＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；Pierce ＆ Warriner（UK）Ltd.）の添加によって２５℃で１８時間インキュベートすることにより部分的に還元した。溶液を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０に緩衝液交換し；緩衝液交換後、タンパク質濃度は２２μＭであった。部分的に還元した［ＳＣＲ１−３］−ｃｙｓを４倍モル濃度過剰の６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサン酸，スクシンイミジルエステル（Molecular Probes Inc.,USA）と共にインキュベートし、４℃で１時間インキュベートした。過剰の蛍光標識をタンパク質溶液の５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０での緩衝液交換により除去した。ＭＳＷＰ−１（実施例２）を加えることによってフルオレセイン−［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］を合成して、５倍モル濃度過剰のブルオレセイン標識タンパク質を得、２５℃で４時間インキュベートした。溶液をＰＢＳで緩衝液交換し、該溶液を顕微鏡研究に用いた。
５０ｍＭギ酸中において１０ｍｇ／ｍｌの［ＳＣＲ１−３］を１：１０の割合で５０ｍＭ ＮａＨＣＯ3ｐＨ８．５と混合し；溶液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ９．５に調整した。フルオレセインをセライト−フルオレセインイソチオシアネート（セライト：フルオレセイン；１：１０、Sigma）から１：４（ｗ／ｖ）の割合でＤＭＳＯによって抽出した。フルオレセイン−ＤＭＳＯ溶液をタンパク質溶液に１：１４の割合で加え、室温で１時間インキュベートした。過剰の標識を０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有するＰＢＳ中でのゲルろ過によって除去し、該溶液を顕微鏡研究に用いた。
クエン酸塩加血液を健康なボランティアから採血し、赤血球を単離し、ＰＢＳ中で洗浄し、元の血液容量に対して２５０倍に希釈した。０．０５ｍｌの赤血球を２μＭフルオレセイン−［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］または２μＭフルオレセイン−［ＳＣＲ１−３］と共にインキュベートし、３７℃で３０分間インキュベートした。８マイクロリットルの各インキュベーション試料をスライド上に封入し、倒立共焦顕微鏡（Biorad）上で調べた。フルオレセイン−［ＳＣＲ１−３］でインキュベートした細胞は、特異的な染色を示さなかったが、フルオレセイン−［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］でインキュベートした細胞の染色は細胞表面にわたり広汎に現れ、また、強く染色された部分が細胞膜に見られた。標識は、細胞内に見られなかった。
（ｉｖ）ＭＳＷＰ−１／ＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡのヒト赤血球への結合
ヒトトリプシン処理およびグルタルアルデヒド処理した赤血球（４％懸濁液の１．０ｍｌ）を低速遠心分離によってペレット化し、添加物を含有しないか、あるいは還元したＰＤＥＡＢ−＞ｔＰＡまたは実施例１７のＭＳＷＰ−１／ＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡ結合体のいずれかの約２７０ＳＵを含有する０．５ｍｌ ＰＳＴの全容量中に再懸濁した。混合物を２３℃で５分間穏やかに回転させることによってインキュベートし、次いで、細胞を遠心分離によってペレット化した後、１．０ｍｌ ＰＳＴ緩衝液で２回洗浄した。最後に、細胞を０．５ｍｌ ＰＳＴ中に懸濁し、３７℃でインキュベートした。上清（１００μｌ）の試料をペレット化後に採取した。Ｓ−２２８８（前記のとおり）を用いるアッセイは、２時間後、約７％の適用したｔ−ＰＡ活性がＭＳＷＰ−１／ＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡに曝露した細胞の上清に存在するが、還元したＰＤＡＥＢ−＞ｔＰＡに曝露した細胞の上清には〜２．８％のみが存在することを示した。ｔ−ＰＡアミド分解活性は、対照において検出されなかった。
該実験は、ｔ−ＰＡの活性部位のＭＳＷＰ−１への可逆的結合が、該酵素の赤血球細胞へ結合する傾向を増加させることを示唆した。
（ｖ）ヒト赤血球表面におけるＳＫ−ＭＳＷＰ−１結合体の局在性
ヒト赤血球の安定化調製物（トリプシン処理した、グルタルアルデヒド処理したもの、Sigma, Gillingham, UK, ４％ｖ／ｖ，０．４ｍｌ）を遠心分離（〜２０００ｇ／２分）によってペレット化し、０．１μＭチオール化ＳＫまたは実施例１６由来の０．１μＭ ＳＫ−ＭＳＷＰ−１のいずれかを含む０．４ｍｌ ＰＳＴ緩衝液中に再懸濁した。
懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離およびＰＳＴ緩衝液中での再懸濁の２サイクルによって洗浄した。最後に、それらを１μＭプラスミノーゲンを含有するＰＳＴＧ緩衝液（０．４ｍｌ）中に再懸濁し、インキュベートし、前記のようにプラスミンについてアッセイした。
対照チオール化−ＳＫは５２２ＳＵ／ｍｌの割合でプラスミンを生じたが、ＳＫ−ＭＳＷＰ−１結合体は６１８４ＳＵ／ｍｌを生成した。後者の活性は、およそ２１００チオール化ＳＫ分子／細胞に相当した。
（ｖｉ）［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］のヒト赤血球膜への結合
４Ｘ２．０ｍｌのトリプシン処理した、グルタルアルデヒド処理したヒト赤血球（Sigma,R0127）を約３０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を捨て、細胞をホスフェート／セーライン／Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）（ＰＳＴ）（試験管あたり１ｍｌ）中に再懸濁し、実施例８の［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］を最終濃度２０μｇ／ｍｌまで３本の試験管に加えた。次いで、混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離およびＰＳＴ中での洗浄の繰り返しによって５回洗浄した。最後に、細胞を１ｍｌ ＰＳＴ中に懸濁し、４℃に保持した。
これらの細胞の、ヒツジ赤血球の補体−媒介性溶解を阻害する能力を（Ｉ）に前記した標準的な古典的経路補体阻害アッセイを用いて測定した。ヒト赤血球を４つの異なる希釈度でアッセイに加えた後、ヒト血清、次いでヒツジ赤血球細胞を加え、通常通り３７℃でインキュベートした。％阻害データを以下に示す。
0004177457.tif 000031
よって、最大希釈度の［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］処理した細胞に対するパーセンテージ阻害は、１／４希釈で処理しなかった細胞より有意に大きい。したがって、［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］処理した細胞は、たとえ、細胞を広範囲に洗浄していずれの非結合［ＳＣＲ１−３］−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−［ＭＳＷＰ−１］も除去したとしても、処理しない細胞よりも少なくとも６００倍大きい補体阻害活性を含んだ。
表
配列表
（｛  ｝中のペプチド配列の側の＜−は、ＣからＮ末端への配列方向を意味する）
配列番号１：
0004177457.tif 000032
配列番号２：
0004177457.tif 000033
配列番号３：
0004177457.tif 000034
配列番号４：
0004177457.tif 000035
配列番号５：
0004177457.tif 000036
配列番号６：
0004177457.tif 000037
配列番号７：
0004177457.tif 000038
配列番号８：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000039
配列番号９：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000040
配列番号１０：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000041
0004177457.tif 000042
配列番号１０、ペプチド配列は１文字アミノ酸コードにおける角型括弧において与えられる。
配列番号１１：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000043
配列番号１２：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000044
配列番号１３：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000045
配列番号１４：
0004177457.tif 000046
配列番号１５：
0004177457.tif 000047
配列番号１６：
0004177457.tif 000048
配列番号１７：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000049
配列番号１８：
0004177457.tif 000050
配列番号１９：
0004177457.tif 000051
配列番号２０：
0004177457.tif 000052
配列番号２１：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000053
配列番号２２：
５２７アミノ酸残基無傷ｔ−ＰＡ分子の１本鎖型。
残基４７８（セリン）は下記のように修飾されている。
0004177457.tif 000054
配列番号２３：
0004177457.tif 000055
配列番号２４：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000056
配列番号２５：
0004177457.tif 000057
配列番号２６：
0004177457.tif 000058
配列番号２７：
0004177457.tif 000059
配列番号２８：
0004177457.tif 000060
配列番号２９：
0004177457.tif 000061
配列番号３０：
0004177457.tif 000062
配列番号３１：
0004177457.tif 000063
配列番号３２：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000064
配列番号３３：
0004177457.tif 000065
配列番号３４：
0004177457.tif 000066
配列番号３５：
0004177457.tif 000067
配列番号３６：
直鎖状、ジスルフィド結合した２ポリペプチド鎖
0004177457.tif 000068