【手続補正書】
【提出日】平成20年9月17日(2008.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定極と対極を有する電極系、および少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応試薬系を具備し、
前記反応試薬系が、前記電子メディエータを含む反応層と前記酸化還元酵素を含む反応層とからなり、かつ前記電極系上またはその近傍に形成されているバイオセンサの製造方法であって、
前記電子メディエータを含む反応層を、前記電子メディエータの水溶液を温風乾燥することによって形成し、
前記酸化還元酵素を含む反応層を、
昇華性を有する物質からなる溶媒に溶解した前記酸化還元酵素を含む溶液を前記所定の形成位置に配置する工程、
前記酸化還元酵素を含む溶液を凍結する工程、および
前記減圧下において前記凍結された溶液の固形物中の溶媒を昇華させて除去する工程、
を経て形成する、バイオセンサの製造方法。
【請求項２】
前記基板と対向するカバーがさらに設けられ、
前記電子メディエータを含む反応層が前記基板側に固定され、
前記酸化還元酵素を含む反応層が前記カバー側に形成されている、
請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項３】
前記電子メディエータを含む反応層および前記酸化還元酵素を含む反応層が積層体を構成している、請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項４】
前記酸化還元酵素を含む反応層が、カルボキシメチルセルロースを含有している、請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項５】
前記酸化還元酵素がコレステロールオキシターゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、またはコレステロールエステラーゼとの組み合わせである、請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項６】
前記電子メディエータがフェリシアン化カリウムである、請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定成分について、迅速、高精度、かつ簡便に定量することができるバイオセンサの製造方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明に係るバイオセンサの製造方法は、
絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定極と対極を有する電極系、および少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応試薬系を具備し、
前記反応試薬系が、前記電子メディエータを含む反応層８ａと前記酸化還元酵素を含む反応層８ｂとからなり、かつ前記電極系上またはその近傍に形成されているバイオセンサの製造方法であって、
前記電子メディエータを含む反応層８ａを、前記電子メディエータの水溶液を温風乾燥することによって形成し、
前記酸化還元酵素を含む反応層８ｂを、
昇華性を有する物質からなる溶媒に溶解した前記酸化還元酵素を含む溶液を前記所定の形成位置に配置する工程、
前記酸化還元酵素を含む溶液を凍結する工程、および
前記減圧下において前記凍結された溶液の固形物中の溶媒を昇華させて除去する工程、
を経て形成する。
前記基板と対向するカバーがさらに設けられ、前記電子メディエータを含む反応層が前記基板側に固定され、前記酸化還元酵素を含む反応層が前記カバー側に形成されていることが好ましい。
前記電子メディエータを含む反応層および前記酸化還元酵素を含む反応層が積層体を構成していることが好ましい。
前記酸化還元酵素を含む反応層が、カルボキシメチルセルロースを含有していることが好ましい。
前記酸化還元酵素がコレステロールオキシターゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、またはコレステロールエステラーゼとの組み合わせであることが好ましい。
前記電子メディエータがフェリシアン化カリウムであることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【発明の実施の形態】
電子メディエータとしては、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールオキシダーゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス化合物から選択して用いることができる。電子メディエータは単独でセンサに担持される。
本発明に用いる昇華性を有する物質からなる溶媒としては、電気化学的に不活性であるか、自身が酸化体であり、電子メディエータや酵素を還元することがなく、かつこれらを変質させないものが好ましい。水が最も使いやすいが、電子メディエータの溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、あるいはパラベンゾキノンなどのキノン類などを用いることもできる。酵素の溶媒としては、水またはバッファーが好ましい。ジメチルホルムアミドの４０％程度の水溶液あるいはエタノールの２０％程度の水溶液などを用いることもできる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
図２は、実施の形態におけるセンサの縦断面図である。絶縁性基板１上の電極系上に、前記と同様にして親水性高分子層７が形成されている。この親水性高分子層７上、およびカバー１２の試料液供給路に露出する面に、それぞれ反応層８ａおよび８ｂが形成されている。
他の実施の形態においては、上記の反応層８ａ、８ｂを複数の層の積層体として構成する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【実施例】
《実施例１》
図２の構成を有するコレステロールセンサで、反応層８ａが電子メディエータを含み、反応層８ｂがコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、および界面活性剤を含む。このセンサの作製手順を以下に示す。
まず、基板１の電極系上に、カルボキシルメチルセルロースのナトリウム塩（以下、ＣＭＣと略す）の０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させることによりＣＭＣ層７を形成した。次に、フェリシアン化カリウムの１Ｍ水溶液１μｌをＣＭＣ層７上に滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層８ａを形成した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
こうして作製したコレステロールセンサに、試料液として、コレステロールおよびコレステロールエステルの一種であるリノール酸コレステロールを含むコレステロール標準液１μｌを試料液供給路の開口部１３より供給し、３分後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ＋０．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。その結果を図３に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
《実施例２》
図２の構成を有するコレステロールセンサで、反応層８ａが電子メディエータを含み、反応層８ｂがコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、界面活性剤および０．１２５ｗｔ％のＣＭＣを含む。このセンサの作製手順を以下に示す。
実施例１と同様にして、絶縁性基板１上の電極系上にＣＭＣ層７を形成した。次に、フェリシアン化カリウムを水に溶解させた水溶液を、ＣＭＣ層７上に１μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させることによりフェリシアン化カリウムを含む層８ａを形成した。一方、ＣｈＯＤ、ＣｈＥ、界面活性剤およびＣＭＣを水に溶解させて混合水溶液を調製した。カバーとスペーサを組み合わせたカバー部材のスリット１５により形成される凹部に前記混合水溶液を２．５μｌ滴下し、−１９６℃の液体窒素にて凍結後、梨型フラスコ内に収納して凍結乾燥器中で３時間乾燥させることにより、ＣｈＯＤ、ＣｈＥ、界面活性剤およびＣＭＣを含む反応層８ｂを形成した。なお、ここに用いたフェリシアン化カリウム、界面活性剤、ＣｈＯＤおよびＣｈＥの量は、実施例１と同じであり、以下の実施例３、４および比較例においても同じである。
こうして、実施例１と同様にして、コレステロールセンサを作製し、試料液を供給してから電圧を印加するまでの時間を変化させて、各試料濃度に対する応答電流値を測定した。その結果を図３に示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
《参考例１》
図２の構成を有するコレステロールセンサで、反応層８ｂが電子メディエータを含み、反応層８ａがコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよび界面活性剤を含む。このセンサの作製手順を以下に示す。
実施例１と同様にして、絶縁性基板１上の電極系上にＣＭＣ層７を形成した。次に、ＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび、界面活性剤を水に溶解させて混合水溶液を調製し、この混合水溶液２.５μｌをＣＭＣ層７上に滴下し、−１３５℃の液体窒素
にて凍結後、梨型フラスコ内に収容して凍結乾燥器中で３時間乾燥させることによりＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび、界面活性剤を含む層８ａを形成した。一方、フェリシアン化カリウムを水に溶解させた水溶液を、カバーとスペーサを組み合わせたカバー部材のスリット１５により形成される凹部に１μｌ滴下し、−１９６℃の液体窒素にて凍結後、梨型フラスコ内に収納して凍結乾燥器中で３時間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層８ｂを形成した。
こうして、実施例１と同様にして、コレステロールセンサを作製し、試料液を供給してから電圧を印加するまでの時間を変化させて、各試料濃度に対する応答電流値を測定した。その結果を図３に示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
《参考例２》
図２の構成を有するコレステロールセンサで、反応層８ａが電子メディエータを含み、反応層８ｂがコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよび界面活性剤を含む。このセンサの作製手順を以下に示す。
実施例１と同様にして、絶縁性基板１上の電極系上にＣＭＣ層７を形成した。次に、フェリシアン化カリウムを水に溶解させた水溶液１μｌをＣＭＣ層７上に滴下し、−１９６℃の液体窒素にて凍結後、梨型フラスコ内に収容して凍結乾燥器中で３時間乾燥させることにより層８ａを形成した。一方、ＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび、界面活性剤を水に溶解させて混合水溶液を調製した。この混合水溶液２．５μｌを、カバーとスペーサを組み合わせたカバー部材のスリット１５により形成される凹部に滴下し、−１３５℃の液体窒素にて凍結後、梨型フラスコ内に収納して凍結乾燥器中で３時間乾燥させることにより、ＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび、界面活性剤を含む層８ｂを形成した。
こうして、実施例１と同様にして、コレステロールセンサを作製し、試料液を供給してから電圧を印加するまでの時間を変化させて、各試料濃度に対する応答電流値を測定した。その結果を図３に示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
《比較例》
実施例１と同様にして、絶縁性基板１上の電極系上にＣＭＣ層を形成した。次に、フェリシアン化カリウム、界面活性剤、ＣｈＯＤ、およびＣｈＥを水に溶解させて混合水溶液を調製した。この混合水溶液４．５μｌをＣＭＣ層上に滴下し、５０℃で１５分間温風乾燥することにより、フェリシアン化カリウム、界面活性剤、ＣｈＯＤ、およびＣｈＥを含む反応層を形成した。
こうして、実施例１と同様にして、コレステロールセンサを作製し、試料液を供給してから電圧を印加するまでの時間を変化させて、各試料濃度に対する応答電流値を測定した。その結果を図３に示す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、基質濃度が高濃度域でも応答特性の優れたバイオセンサを得ることができる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の実施例におけるバイオセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
【図２】
本発明の実施例におけるバイオセンサの要部の縦断面図である。
【図３】
実施例、参考例、および比較例におけるコレステロールセンサの応答特性を示す図である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2001281202.tif 000001
【図２】
2001281202.tif 000002
【図３】
2001281202.tif 000003