(57)【要約】  本開示は、ヒト胎盤抽出物と生分解性微小粒子とを含む組成物、持続放出性血管新生調節組成物、ならびに標的に対してある期間にわたって胎盤抽出物を放出する組成物および方法、ならびに血管新生を誘導および／または調節する方法、ならびに血管新生の調節物質を同定する方法を提供する。本開示は、血管新生を誘導および／または調節できる胎盤抽出物を含む組成物を作製する方法も提供する。
2017520517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胎盤試料から得られたヒト胎盤抽出物であって、血液および固形物が、前記抽出物から実質的に取り除かれており、前記抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含み、前記胎盤タンパク質が、前記胎盤試料中に存在していたものである、ヒト胎盤抽出物と、
生分解性微小粒子と
を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に曝露された後にある期間にわたって前記微小粒子から前記ヒト胎盤抽出物が放出されるように、前記ヒト胎盤抽出物が、前記微小粒子と結合している、組成物。
【請求項２】
前記胎盤抽出物が、
前記ヒト胎盤試料から得られた試料から血液を取り除いて粗胎盤抽出物を生成し、
前記粗胎盤抽出物をタンパク質可溶化剤と混合して前記粗抽出物中のタンパク質を可溶化し、
可溶化タンパク質−胎盤抽出物混合物から固形物質を分離し、
可溶化タンパク質−胎盤抽出物混合物に対して透析を行って、前記混合物から前記タンパク質可溶化剤を取り除いてヒト胎盤抽出物を生成する
ことにより作製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記胎盤抽出物が、少なくとも２０の異なるサイトカインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質可溶化剤が、尿素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記胎盤抽出物が、血管新生を調節する能力を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記生分解性微小粒子が、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）微小粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＬＧＡ微小粒子は、前記ヒト胎盤抽出物（ｈＰＥ）が添加されたものであり、ｈＰＥ添加ＰＬＧＡ微小粒子は、二重の均質化が関わる水中油型プロセスを用いて作製されたものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項８】
前記生分解性微小粒子が、ゼラチン微小粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記生分解性微小粒子が、異なるサイズの微小粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞を持続放出性血管新生調節組成物と接触させることを含む、血管新生を誘導する方法であって、前記持続放出性血管新生調節組成物が、
生分解性微小粒子と
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に前記微小粒子を曝露した後にある期間にわたって前記微小粒子からヒト胎盤抽出物が放出されるように前記微小粒子と結合している前記ヒト胎盤抽出物であって、前記胎盤抽出物が、ヒト胎盤試料から得られた抽出物を含み、血液および固形物は前記抽出物から実質的に取り除かれており、前記抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含み、前記胎盤タンパク質は、前記胎盤試料中に存在していたものである、ヒト胎盤抽出物と
を含む、方法。
【請求項１１】
前記細胞が、内皮細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記胎盤抽出物が、
前記ヒト胎盤試料から得られた試料から血液を取り除いて粗胎盤抽出物を生成し、
前記粗胎盤抽出物をタンパク質可溶化剤と混合して粗抽出物中のタンパク質を可溶化し、
可溶化タンパク質−胎盤抽出物混合物から固形物質を分離し、
可溶化タンパク質−胎盤抽出物混合物に対して透析を行って、前記混合物から前記タンパク質可溶化剤を取り除いてヒト胎盤抽出物を生成する
ことにより作製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質可溶化剤が、尿素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記持続放出性血管新生調節組成物を生体材料と結合させること
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体材料を対象に移植することによりｉｎ  ｖｉｖｏで前記生体材料への血管形成を誘導することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体材料が、ヒト由来基質物質を含む工学的に操作された生体スキャフォールドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体スキャフォールドが、ヒト内皮細胞を播種した、脱細胞化ヒト臍帯静脈スキャフォールドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒト内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト胎盤試料から得られたヒト胎盤抽出物を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症を低減する方法であって、血液および固形物が、前記抽出物から実質的に取り除かれており、前記抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含み、前記胎盤タンパク質は、前記胎盤試料中に存在していたものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、出願番号６１／９９０，２５６で２０１４年５月８日に出願された「血管新生を誘導および調節する組成物および方法、ならびに血管新生調節物質を同定する方法およびアッセイ」との表題の米国仮出願の優先権を主張し、該仮出願は本明細書に参照により全体が組み込まれている。
【０００２】
政府支援研究または開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により与えられた認可番号ＨＬ０８８２０７の下での政府支援により発明された。政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
血管新生は、創傷治癒からがんまでの範囲の生理的および病理学的状態において血管の形成を可能にする。血管新生調節は、場所および刺激の両方に依存し、それぞれの状況は独特の組み合わせの調節分子が関与し得る。
【背景技術】
【０００４】
工学的に操作された器官に血管形成できず、梗塞の領域に再血管形成できないことは、再生医療による治療をうまく臨床まで持って行くための大きな難題になっている。決定的な様式で血管新生を調節する能力は、正常および病理学的な血管生理を規定することから組織／器官の再生、創傷治癒、梗塞組織修復ならびにがんの阻害に至るまでの広い範囲の臨床的用途において、著しい影響を有すると考えられる。血管新生を開始させ、より大型の血管形成を駆動するために、直接細胞播種（単独および共培養）、幹細胞の使用およびヒト由来調節物質／増殖因子の組み合わせを含む様々な異なるアプローチがとられている。現在までに、非ヒト動物化合物を典型的に用いるこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチは、それらのばらばらのタンパク質の構成、非ヒトの由来、腫瘍由来、または遺伝子発現を制御する方法の場合においては遺伝子調節の欠如のために、臨床まで持って行くことがほとんどできていない。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生を誘導するための現在の方法は、ヒト由来調節物質の単純な組み合わせによるものであるか、動物由来刺激因子を用いるか、または評価のために生存動物の使用に完全に頼っている。有効な血管新生阻害薬を試験するためにヒト由来および／または動物由来調節物質の単純な組み合わせからなるこれらの現在のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いる場合、スクリーニングプロセスは限定されてしまう。なぜなら、これらは、一連の広範なヒトｉｎ  ｖｉｖｏ分子相互作用に相当するものではないからである。選択された分子経路だけを調節することは、工学的に操作された器官に予め血管形成する試みも制限する。なぜなら、血管新生を調節することは、多くの代謝経路の誘導を必要とするからである。また、現在では、最も人気があり成功しているアプローチは、エンジェルブレス−ホーム−スワーンマウス肉腫細胞に由来する物質であるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を用いており、これは、ヒト治療のために不適切であると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、血管新生を誘導および調節するための改良されたヒトベースの方法は、医薬開発および再生医療の両方に拍車をかけることができると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡単に記載すると、本開示の実施形態は、ヒト胎盤抽出物を含むヒト胎盤抽出物組成物、持続放出性血管新生調節組成物、血管新生の誘導方法ならびに抗炎症性組成物および方法を提供する。
【０００８】
本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に曝露された後にヒト胎盤抽出物が生分解性微小粒子から放出されるように該微小粒子と結合しているヒト胎盤抽出物を含む組成物を提供する。ヒト胎盤抽出物は、ヒト胎盤試料から得られ、血液および固形物が、抽出物から実質的に取り除かれており、抽出物は、胎盤試料に存在していたサイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含む。
【０００９】
本開示の血管新生を誘導する方法の実施形態は、持続放出性血管新生調節組成物を細胞と接触させることを含み、持続放出性血管新生調節組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に生分解性微小粒子を曝露した後のある期間にわたってヒト胎盤抽出物が該微小粒子から放出されるように本開示のヒト胎盤抽出物と結合している生分解性微小粒子を含む。実施形態では、該方法は、持続放出性血管新生調節組成物を生体材料と結合させて、生体材料への血管形成を誘導することをさらに含む。
【００１０】
本開示は、本開示のヒト胎盤抽出物または本開示の持続放出性／ヒト胎盤抽出物組成物を炎症の処置を必要とする対象に投与することにより、対象における炎症を低減する方法も提供する。
【００１１】
本開示の他の方法、組成物、特徴および利点は、以下の図面および詳細な記載を吟味することにより当業者に明らかになる。全てのこのような追加の組成物、方法、特徴および利点は本記載に含まれ、本開示の範囲内であることを意図する。
【００１２】
本開示のさらなる態様は、添付の図面と一緒に考慮した場合、以下に記載する本開示の様々な実施形態の詳細な記載を調査することにより、より容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｋは、ヒト胎盤抽出物（ｈＰＥ：human placental extract）（本明細書において、ヒト胎盤マトリクスまたはｈＰＭともいう）の形成、ｈＰＥ薄膜の特徴付け、およびｈＰＥ薄膜上に形成した血管新生ネットワークの特徴付けを示す図である。図１Ａは、胎盤ＥＣＭの均質化と、その後の尿素可溶化および透析によりｈＰＭを得るステップの実施形態を示す。図１Ｂ〜１Ｃは、ｈＰＥの表面形態を示すＳＥＭ画像であり、図１Ｄ〜１Ｅは、ＨＵＶＥＣを４×１０４細胞／ｃｍ２でｈＰｍ薄膜に播種し、３日間培養した場合の血管原性ネットワーク形成のＳＥＭ画像である。図１Ｆは、胎盤抽出物上で１日後の血管新生出芽中の分岐細胞糸状仮足を示す、ローダミンファロイジン（「赤」−灰色の分岐した経路として示す）およびＤＡＰＩ（「青」−分岐した経路内の薄い灰色の点として示す）を示す。図１Ｇは、３日後の広範な細胞索条形成をしている成熟血管新生ネットワークを示す、ローダミンファロイジン（「赤」−灰色の分岐した経路として示す）およびＤＡＰＩ（「青」−分岐した経路内の薄い灰色の点として示す）を示す。図１Ｈは、胎盤抽出物上で１日後の初期段階細胞索条形成および血管新生ネットワーク形成中の、カルセイン（「緑」−灰色の分岐として示す）およびＤＡＰＩ（「青」−分岐内の薄い灰色の点として示す）で染色したＨＵＶＥＣを示す。図１Ｉは、胎盤抽出物上で３日後のＨＵＶＥＣの細胞索条形成を示す、ＤＡＰＩ（「青」−灰色の点線経路で示す）染色を示す。図１Ｊは、４×１０４細胞／ｃｍ２で組織培養プレートに播種し、内皮細胞培地で３日間培養したＨＵＶＥＣを示す。図１Ｋは、１００μＬ  ＰＥ／ｃｍ２で組織培養プレートの表面に接着し、次いで内皮細胞培地で３日間培養した胎盤抽出物上で４×１０４細胞／ｃｍ２にて播種したＨＵＶＥＣによる血管新生ネットワークの形成を示す。
【００１４】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ｈＰＥの生化学的分析およびｈＰＥ上に播種したＨＵＶＥＣの遺伝子分析を示す図である。図２Ａは、サンドイッチベースのヒト血管新生抗体アレイを用いて行ったサイトカイン分析を示す棒グラフである。データは、陰性対照の値（０％）から陽性対照の値（１００％）までの範囲の尺度で標準化した（データは、３つの生物学的反復を表す）。図２Ｂおよび２Ｃは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて決定した、免疫関連（２Ｂ）および血管新生関連（２Ｃ）ＢＭ関連タンパク質の標準化したスペクトル存在量係数（％）を示す棒グラフである。フィブリノゲンの標準化したスペクトル存在量係数の値は、ＦＧＡ値とＦＧＧ値との合計として示し、ラミニンは、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３およびＬＡＭＣ１の値の合計として示す。図２Ｄは、１００μＬ  ＰＥ／ｃｍ２上に８０，０００細胞／ｃｍ２の密度で３日間播種したＨＵＶＥＣに対して行った遺伝子分析を示す。ＶＥＧＦＡを含む、溶解液中に存在しないいくらかの血管新生関連タンパク質は、ｈＰＥ上に播種した場合にＨＵＶＥＣにより上方制御された。データは、４つの生物学的反復を表す。Ｐ値は、対照群および処置群の各遺伝子について反復２＾（−デルタＣｔ）値のスチューデントのｔ検定を用いて算出する。
【００１５】
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ｈＰＥおよびＭａｔｒｉｇｅｌをコーティングした組織培養フラスコ上に形成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生ネットワークを示す図である。図３Ａは、１ｄ（日）、３ｄおよび５ｄ後の様々な細胞播種密度でのｈＰＥおよびＭａｔｒｉｇｅｌ上のカルセイン染色ＨＵＶＥＣを示す。最大の細管数／ｍｍ２までの時間として定義される血管新生ネットワーク成熟速度は、細胞播種密度を変動させることにより、ｈＰＥ試料において調節された。定量的分析により、４０，０００細胞／ｃｍ２血管新生ネットワークはその最大細管密度（細管／ｍｍ２）に達するまで第３日までかかったが、８０，０００細胞／ｃｍ２ネットワークは、その最大細管密度に１日で達することが明らかになった（データは示さず）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ試料では、血管新生ネットワークは、第１日の後にあまり明確でなかった。尺度バー、２００ミクロン。図３Ｂは、ＷＰＭＹ−１筋線維芽細胞が胎盤抽出物（図３Ｂ．ｉ）上に播種された場合に血管新生を形成しないが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（図３Ｂ．ｉｉ）上に播種した場合に形成したことを示す。図３Ｃは、平均細管長（ｍｍ）、細管密度、分岐点の数、メッシュの数および細管幅を含む血管新生ネットワークパラメータを決定するための定量的画像分析（マスキング）を示す。図３Ｃは、ｈＰＥおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）により誘導された血管原性ネットワークパラメータの比較を示す一連の棒グラフであり、第１日までに、８０，０００細胞／ｃｍ２で播種した試料では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ試料はその最大の平均細管長、細管密度、分岐点およびメッシュの数に達し、第３日までにアポトーシスボールが形成されたが、ｈＰＭネットワークパラメータは培養５日間にわたってより安定していたことを示す。
【００１６】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ｈＰＥベースの血管新生スクリーニングアッセイを用いる抗血管新生阻害腫瘍抑制タンパク質トロンボスポンジン−１のスクリーニングを示す図である。図４Ａは、ＴＳＰ−１を培養培地に加えてｈＰＥ、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび対照培養フラスコ（コーティングせず）上に１日間播種し、次いでカルセインＡＭを用いて染色したＨＵＶＥＣを示す。尺度バー、２００μｍ。図４Ｂのグラフは、ｈＰＥをコーティングしたフラスコにおいて、ＴＳＰ−１濃度の増加とともに直線的にどちらも減少する平均全細管長［ｍｍ］および分岐点の平均数を示す。図４Ｃのグラフは、血管新生ネットワークカバー面積の標準化パーセント減少の比較を示す。ｈＰＥをコーティングした培養プレートは、ＴＳＰ−１濃度に対して、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングした培養プレートよりも著しく高い感度を有し、Ｒ２値はそれぞれ０．９７および０．３６であった。
【００１７】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、３Ｄ組織構築物上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生を示す図である。図５Ａは、３日間の播種および培養後にｈＰＥに浸漬した（ヒト臍帯静脈）生体スキャフォールドにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生を誘導するための、胎盤由来細胞、スキャフォールドおよびサイトカインを示す模式図である。図５Ｂは、ｈＰＥ浸漬なしでのＨＵＶＥＣ播種組織スキャフォールドが血管新生ネットワークを形成しなかったことを示す。図５Ｃは、培養３日後の血管新生の出芽および陥入の両方の機序の出現を示す、ｈＰＥに浸漬した生体スキャフォールドの一連の代表的画像を示す。２０，０００細胞／ｃｍ２のＨＵＶＥＣ細胞播種密度では、出芽血管新生が最も優勢であった（図５Ｃ．ｉ．〜５Ｃ．ｉｉ．）。４０，０００細胞／ｃｍ２の播種密度では、出芽および陥入の両方の血管新生の出現が観察された（図５Ｃ．ｉｉｉ．〜５Ｃ．ｉｖ．）が、６０，０００細胞／ｃｍ２の密度では（図５Ｃ．ｖ．〜５Ｃ．ｖｉ．）、血管新生細管は陥入により形成された。
【００１８】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ｈＰＥとインキュベートした生体スキャフォールドにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生の図を示す図である。図６Ａは、ＰＥ、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはリン酸緩衝生理食塩水（対照）中で２時間インキュベートした後に筋膜と筋層との間でラットモデルに移植した、脱細胞化ＨＵＶスキャフォールドを示す模式図である。図６Ｂは、移植５ｄ後に分析のために取り除いたスキャフォールドを示す、一連の画像を示す。ｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールドと比較して、対照およびＭａｔｒｉｇｅｌとインキュベートした生体スキャフォールドにおいて、著しくより多くの線維化莢膜形成が生じた（図６Ｂ．ｉ．〜６Ｂ．ｉｉｉ．）。半透明生体スキャフォールドシートの前面を通して撮影した明視野画像は、対照と比較して、ＭａｔｒｉｇｅｌおよびｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールド（図６Ｂ．ｉｖ．〜６Ｂ．ｖｉ．）で毛細血管ネットワーク形成が著しく改善され、ｈＰＥスキャフォールドにおいて最も成熟した毛細血管床があることを示し、このことは、細動脈から毛細血管から細静脈への連結された血液流を有する血管構造の形成を示す（図６Ｂ．ｖｉ．（点線で丸く囲む））。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、ｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールド（図６Ｂ．ｖｉｉ．〜６Ｂ．ｖｉ．）は、対照およびＭａｔｒｉｇｅｌスキャフォールドと比較して、最も多くのスキャフォールドリモデリングを有していたことが明らかになった。対照スキャフォールド（図６Ｂ．ｖｉ．）は、元の線維配向のリモデリングがほとんどなく、ＨＵＶ生体スキャフォールドの反管腔側（ablumenal）表面（斜体の「ｌ」で示す）からスキャフォールドへの細胞遊走（移動）も最も少なかった。Ｍａｔｒｉｇｅｌとインキュベートしたスキャフォールドは、ＨＵＶの反管腔側（ablumen）表面からの細胞遊走が、ｈＰＥスキャフォールドと比較してわずかにより少なかった（図６Ｂ．ｖｉｉ．〜６Ｂ．ｉｘ．）。対照と比較した場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌとインキュベートしたスキャフォールドはまた、ｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールドよりも細胞分布が不均一で、スキャフォールドリモデリングが少なく、ｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールドは、新しいコラーゲン線維配向を有し、細胞分布がより均一であった。
【００１９】
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、動的細胞培養条件を用いて培養したヒト臍帯静脈スキャフォールド（ＨＵＶ）上での血管新生ネットワークの形成についての実施形態を示す図である。図７Ａおよび７Ｂの模式図により示すように、管状ＨＵＶスキャフォールドを胎盤抽出物中で２時間インキュベートした後に細胞を播種し、標準的細胞培養条件下で、二重灌流バイオリアクタ中で５日間構築物を培養した。細胞はスキャフォールドの管腔に残り、遊走しなかった（図７Ｃ）。細管形成の最初の段階である細胞索条形成は、散発的であった（図７Ｄおよび７Ｅ）。
【００２０】
【図８】図８は、ＰＥ上で成長する管および細胞ネットワークの元の画像（左）およびその領域のズーム（右）を示す図である。ズームした画像は、各細管（点線）をどのようにして同定および測定したかを示す。右の画像の小さい円は、矢印で指し示す画像上の数字を付けた小点により同定される分岐点を示す。細管のそれぞれの六角形の配置は、メッシュ（点線の円）を同定する。
【００２１】
【図９】図９Ａ〜Ｂは、ＰＥの血管新生能力を示す一連の画像（図９Ａ）および棒グラフ（図９Ｂ）である。図９Ａ中のパネルは、組織培養プレート上に播種したＨＵＶＥＣと比較した、ＰＥ上に播種し、１、３および５日間培養したＨＵＶＥＣにより形成される微小血管の細管の細胞形態を示す。毛細血管ネットワークは第１日から形成し始め、第３日にはより成熟した構成に達した（右下の拡大図を参照）。第５日には、ネットワークは退行した。メッシュの数は減少し、いくつかの孤立細胞（白い小点）が存在した。図９Ｂのグラフは、培養１、３および５日後にＰＥ上に形成された細管様ネットワークの形態学的および組織分布的特徴を示す。細管長、ＢＰの数およびメッシュの数を１、３および５日の間で比較した。３つ全てのパラメータにおける統計学的な差（アステリスクで示す）が、第１日の細胞と第５日の細胞との間で見出された。統計分析は、ｐ＜０．０５での不等分散の両側ｔ検定を用いて行った。
【００２２】
【図１０】図１０Ａ〜９Ｂは、組織培養プレート上に播種したＨＵＶＥＣ（対照）と比較した、ＰＥ上に播種し、５日間培養したＨＵＶＥＣにより形成される微小血管ネットワークの細胞形態を示す図である。対照は、図１０Ａの画像の右上の隅の挿入図に示す。左上から、第１日に１回のみのＰＥの接種、第１日および第３日に２回の接種、ならびに第１、３および４日に３回の接種。接種の回数を（１回から３回に）増やすことにより、毛細血管ネットワークは、より成熟した長持ちする構成に進化したことに気付くことが可能である。図１０Ｂ中のヒストグラムにおいて、細管長、ＢＰおよびメッシュの数を第１日と第５日との間で比較する。３つ全てのパラメータにおける統計学的な差（アステリスクで示す）が、１回の接種を受けた細胞（１  ＩＮＯＣ）と３回の接種を受けた細胞（３  ＩＮＯＣ）との間で見出された。統計分析は、ｐ＜０．０５での不等分散の両側ｔ検定を用いて行った。
【００２３】
【図１１】図１１は、１日から２０日まで３７℃にて湿潤６％ＣＯ２インキュベータで保存した、ＰＥと３日間培養したＨＵＶＥＣを示す一連の画像を示す図である。各画像上の数字は、インキュベーション時間（日数）を示す。ＰＥは、１５日間のインキュベーションの後でさえ、血管新生を誘導する能力を維持した。
【００２４】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ゼラチン微小粒子の特徴を示す図である。図１２Ａでは、上の列は、およそ４０μｍのサイズの空の粒子のＳＥＭ画像を示す。粒子は、規則的な形状および平滑な表面を有する。図１２Ａの下の列は、ＰＥ添加粒子のＳＥＭ画像を示す。表面形態の変化およびサイズの増加は、おそらくＰＥ収着のためである。図１２Ｂのグラフは、光学顕微鏡検査によるゼラチン微小粒子のサイズ分布分析を示す。
【００２５】
【図１３】図１３は、非架橋微小粒子の分解プロファイルを示す図である。非架橋微小粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ累積パーセント分解を、それらの乾燥重量の関数として示す。パーセント累積分解の合計は、２０日後に１８．６５％±０．０９であった。挿入グラフは、６時間のインキュベーションの後の分解を示す（６．４５％±０．１２）。誤差バーは、ｎ＝３での平均±標準偏差を表す。
【００２６】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、空のおよび添加済みの微小粒子のタンパク質放出動態を示す図である。図１４Ａは、空（ＰＥなし）および添加済み（ＰＥ）微小粒子からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ累積パーセント放出を、それぞれそれらの乾燥および添加済み重量の関数として示す。パーセント累積放出の合計は、２２日後にそれぞれ４．６５％±０．１１および４．６５％±０．０７であった。誤差バーは、ｎ＝３での平均±標準偏差を表す。図１４Ｂは、添加済み微小粒子と空の微小粒子との間の放出のパーセントでのｉｎ  ｖｉｔｒｏの差を示す。最初のピークは、粒子の表面からのＰＥの放出を示し、２つ目のピークは、おそらく大量浸食によるものである。
【００２７】
【図１５】図１５は、ゼラチン微小粒子を用いるＰＥの送達を示す図である。画像は、空の微小粒子を播種したＨＵＶＥＣ（対照）と比較した、培養５日後（Ｄ５）のＰＥ添加微小粒子に対する２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種したＨＵＶＥＣの応答を示す。矢印は、異なる条件の細胞を指し示し、形状の差を示す。ＰＥ添加粒子との５日間の培養後に、いくつかの出芽が存在するが、ネットワーク形成は観察されなかった。より大きい球体は微小粒子である。
【００２８】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｇは、ＨＵＶＥＣへのｈＰＥの連続送達の影響を示す図である。図１６Ａは、血管新生培地中で２０，０００細胞／ｃｍ２にて培養したＨＵＶＥＣでの対照を示す。図１６Ｂ〜１６Ｄは、それぞれ、第１日にｈＰＭの単回接種（図１６Ｂ）、第１および３日の２回の接種（図１６Ｃ）および第１、３および５日の３回の接種（図１６Ｄ）でのＨＵＶＥＣを示す。図１６Ｅ〜１６Ｇは、染色後に図１６Ｂ〜１６Ｄの画像に対して行った血管新生の定量を示す棒グラフである。結果は、各条件について１点につき３つの試料に対する測定間の平均プラスまたはマイナス平均標準誤差として示す。
【００２９】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｆは、微小粒子の評価を示す図である。図１７Ａ〜１７Ｃは、評価した３つのプロトコール、単一（２分間）均質化（図１７Ａ）、二重（２分間／１分間）均質化（図１７Ｂ）および二重（２分間／２０秒間）均質化（図１７Ｃ）についての光学顕微鏡画像を示す。図１７Ｄ〜１７Ｆのヒストグラムは、３つのプロトコールそれぞれにおいて形成される粒子についてのミクロンでのサイズの分布を示す（各バッチは１点につき３つの試料で調製した）。
【００３０】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｆは、３つのプロトコール、単一（図１８Ａ、１８Ｄ）、２／１二重（図１８Ｂ、１８Ｅ）および２／２０二重（図１８Ｃ、１８Ｆ）のそれぞれについて、ｈＰＭを添加したＰＬＧＡ微小粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。図１８Ａ〜１８Ｃは、微小粒子形状を示し、図１８Ｄ〜１８Ｆは、表面多孔性を示す。
【００３１】
【図１９】図１９Ａと図１９Ｆは、各プロトコール（Ｐ２：単一、Ｐ３：２／１二重およびＰ４  ２／２０二重）について、添加効率の表（図１９Ａ）および粒子からの放出速度の評価のグラフ（図１９Ｂ）を示す図である。曲線は、各プロトコールについて２１日までの累積放出速度を表す。
【００３２】
【図２０】図２０は、微小粒子の上清のＳＤＳｐａｇｅ分析を示す図である。画像は、ＢＳＡ添加およびｈＰＭ添加微小粒子の上清における定性的タンパク質含量を示す染色後のゲルのもの、ならびに微小粒子調製中に添加された相対的初期含量のものである。
【００３３】
【図２１】図２１は、純粋ｈＰＭをアルギン酸塩マトリクスに加えた場合（最上列）と、マトリクスに包埋したＰＬＧＡ微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からのｈＰＭの持続放出（第２列）との間の血管新生ネットワーク安定性の差を評価するための、培養７、１４、２１および２８日後のカルセインＡＭで染色した内皮細胞を示す一連の画像である。最下列は、２つの対照、１つはアルギン酸塩マトリクス中に包埋した空のＰＬＧＡ微小粒子、２つ目は微小粒子なしを示す。ＨＵＶＥＣは、両方の対照について全ての時点を通して全般的に円形を維持した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示をより詳細に記載する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、よって、もちろん変動し得ることが理解されよう。本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定することを意図しないことも理解されよう。
【００３５】
値の範囲を示す場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在する値、およびその言及された範囲の他のあらゆる値または介在する値が、本開示に包含されることが理解されよう。これらのより小さい範囲の上限および下限は、言及された範囲において具体的に除外された限界は別として、そのより小さい範囲に独立して含まれ得、本開示に包含もされる。言及された範囲が一方または両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本開示に含まれる。
【００３６】
そうでないと規定しない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する当該技術分野における当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価な任意の方法および材料は本開示の実施または試験においても用いることができるが、好ましい方法および材料は、ここで記載する。
【００３７】
参照により組み込まれる、本明細書で引用する任意の刊行物および特許は、引用される刊行物が関連する方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれている。任意の刊行物の引用は、出願日前の開示のためであり、本開示が、事前開示によるこのような刊行物に先立たないことを認めると解釈されるべきでない。さらに、記載する出版の日は、独立して確認する必要がある実際の出版日と異なることがある。
【００３８】
本開示を読むことにより当業者に明らかになるように、本明細書に記載し示す個別の実施形態のそれぞれは、別個の成分および特徴を有し、これらは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれの特徴からも容易に分けることができるか、またはそのような特徴と組み合わせることができる。任意の記載する方法は、言及された事象の順序または論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
【００３９】
本開示の実施形態は、そうでないと示さない限り、当該技術分野における技量の範囲内である医療、生化学、分子生物学、生物学、薬理学などの技術を採用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。
【００４０】
明細書および添付の実施形態において用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含むことに注意されたい。よって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」についての言及は、複数の細胞を包含する。本明細書およびそれに続く実施形態では、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語に言及する。
【００４１】
様々な実施形態を記載する前に、以下の定義が提供され、そうでないと示さない限り以下の定義が使用される。
【００４２】
（定義）
開示する主題を記載する際に、以下の用語を以下に示す定義に従って用いる。
【００４３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で用いる場合、ペプチド結合で連結された連続する３つ以上のアミノ酸のアミノ酸重合体のことをいう。用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどを含む。用語「ポリペプチド」は、核酸によりコードされるか、組換え技術により生成されるか（鳥類のような適当な供給源から単離される）、または合成される、上記で定義するようなポリペプチドを企図する。用語「ポリペプチド」は、化学修飾アミノ酸または標識リガンドと共有結合もしくは非共有結合で連結したアミノ酸を含む上記で定義するようなポリペプチドをさらに企図する。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸配列」は、本明細書において交換可能に用いられ、コード配列（適当な調節または制御配列の制御下に置かれた場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写および翻訳されるポリヌクレオチドまたは核酸配列）、制御配列（例えば翻訳開始および終結コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流の調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサーなど）、および調節配列（転写因子が結合して、遺伝子のプロモーターの活性を正（誘導）または負（抑制）に変えるＤＮＡ配列）を含むが、それらに限定されない。本明細書に記載する用語により、長さまたは合成起源の限定は示唆されない。
【００４５】
用語「遺伝子」は、本明細書で用いる場合、ＲＮＡ全体、タンパク質全体またはそのようなＲＮＡ全体もしくはタンパク質全体の任意の部分の合成のための遺伝情報をコードする核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの両方を含む）のことをいう。「遺伝子」は、典型的に、染色体上の特定の場所を占めるＤＮＡの配列に相当する遺伝性単位のことをいい、生物における特徴または形質についての遺伝的指示を含む。用語「遺伝子産物」は、遺伝子によりコードされるＲＮＡまたはタンパク質のことをいう。
【００４６】
用語「処置する」、「処置し」および「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。具体的に、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能な、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患の広がりの実質的な防止、疾患状況の改善または一時的緩和および軽減（部分的または完全）を含むが、それらに限定されない。さらに、「処置する」、「処置し」および「処置」は、疾患および／または疾患に起因する有害な影響についての部分的または完全な治癒の点で治療的でもあり得る。本明細書で用いる場合、用語「予防的に処置する」または「予防的に処置し」は、ホストにおける疾患／状態または１もしくは複数のその症状を完全、実質的または部分的に防止することをいう。同様に、「状態の開始を遅延し」も「予防的に処置し」に含まれることがあり、状態にかかりやすくなっている患者における状態の実際の開始までの時間を増加する作用のことをいう。
【００４７】
「投与」は、本開示の化合物を対象に導入することを意味する。「投与」は、本開示の組成物を対象に（例えば処方することにより）提供する行為のこともいうことがある。
【００４８】
用語「生物」、「対象」または「ホスト」は、処置を必要とするヒト、哺乳動物（例えばネコ、イヌ、ウマ、マウス、ラット、ブタ（pigs）、ブタ（hogs）、ウシおよびその他の畜牛、鳥類（例えばニワトリ）およびその他の生存種を含む、処置を必要とする任意の生体のことをいう。特に、用語「ホスト」は、ヒトを含む。本明細書で用いる場合、用語「ヒトホスト」または「ヒト対象」は、ヒトホストのことをいうために全般的に用いられる。本開示では、用語「ホスト」は、ヒトホストのことを典型的にいうので、本開示において単独で用いる場合、「ホスト」という語は、非ヒトホストを示すことを意図することを文脈が明らかに示さない限り、ヒトホストのことをいう。状態に「かかりやすくなっている」ホストは、これらの状態の１または複数の顕性の症状を示さないが、これらの状態の１または複数を発生する危険性を遺伝的に、生理的に、またはその他のかたちで有しているホストと定義できる。
【００４９】
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、ポリペプチドを生成するために構成遺伝子が経るプロセスを表す。これは、転写と翻訳の組み合わせである。発現は、ポリペプチドを生成するための核酸の「発現」のことを一般的にいうが、対応する核酸の発現を介してポリペプチドが生成されることを示す、ポリペプチドの「発現」を表すことも一般的に許容される。
【００５０】
「血管新生」は、新しい血管の成長が関わる生理的プロセスである。血管新生は、成長および発達、創傷治癒、胚形成などのような生物学的プロセスの重要な一部である。過剰の血管新生は、疾患細胞が異常な量の血管新生増殖因子を生成して、自然の血管新生阻害物質の効果を圧倒する場合に生じることがある。血管新生増殖因子と血管新生阻害物質の生成の間の不均衡は、血管の不適当に調節された成長または抑制を引き起こすことがある。新しい血管が過剰または不十分に成長する場合に、血管新生依存性疾患または血管新生関連疾患になる。血管新生関連疾患は、例えば、それらに限定されないが、がん、前がん組織、腫瘍、心梗塞および脳卒中を含み得る。過剰の血管新生は、がん、糖尿病性失明、加齢黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、および７０を超えるその他の状態を含み得る。不十分な血管新生は、冠動脈疾患、脳卒中および創傷治癒の遅延を含み得、本開示においてより詳細に論じるように組織工学におけるファクターにもなる。
【００５１】
本明細書で用いる場合、用語「調節する」および／または「調節物質」は、細胞／生物における特定の機能および／または形質を直接的または間接的に促進／活性化／誘導／増加するかあるいは干渉／阻害／減少する作用のことを全般的にいう。いくつかの例では、調節物質は、その自然の状況と比べて、または通常期待される平均的なレベルの活性と比べて、ある活性または機能を増加または減少することがある。調節は、ペプチドの過剰発現または過少発現を（例えばペプチドの発現を上方制御または下方制御するように作用することにより）引き起こすことを含み得、あるいは、対象ペプチドと直接的に相互作用して、活性を増加および／または減少し得る。調節は、血管新生または血管新生に関連する生物学的事象のような特定の生物学的活性または生物学的事象の増加または減少を引き起こすことも含む。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「上方制御する」は、タンパク質またはその他の遺伝子産物の発現および／または活性を増加する作用のことをいう。「下方制御」は、タンパク質またはその他の遺伝子産物の発現および／または活性を減少することをいう。
【００５３】
用語「単離細胞または細胞の集団」は、本明細書で用いる場合、組織から切り出したかまたは組織培養技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した単離細胞または複数の細胞のことをいう。用語「細胞または細胞の集団」は、上記の単離細胞のことをいうか、または動物もしくはヒトの組織中のｉｎ  ｖｉｖｏの細胞のことをいうこともある。
【００５４】
用語「組織」は、生物において器官の全体または一部を形成するような（例えば結合組織、内皮組織）、生物学的機能を協同的に行い、かつ／または生物学的目的を行うように組織化された細胞の群のことを全般的にいう。「組織」は、同様の細胞の群、または全て同じ種類の細胞を一般的に含むが、組織は、細胞の群が全体として共通の目的を行う場合、１種より多い細胞も含むこともある。
【００５５】
本明細書で用いる場合、用語「生体適合性」は、過度のストレス、毒性または有害な影響を生物学的物質または系に与えることなく、生きた生物学的物質および／または生物学的系（例えば細胞、細胞成分、生存組織、器官など）と共存する能力のことをいう。
【００５６】
用語「生体スキャフォールド」は、生きた生物学的物質（例えば生存細胞）の成長を支持するために十分な構造的安定性を有する、任意の生体適合性基質（自然由来または合成）のことをいう。本開示の実施形態では、生体適合性スキャフォールド物質は、それらに限定されないが、脱細胞化したヒト臍帯静脈スキャフォールドのような、自然由来基質（例えば生存生物から調達されるが、さらなる加工および処理を受け得るもの、または自然の供給源に由来する物質から生成される）である。実施形態では、本開示の生体スキャフォールドは、生存細胞の３次元成長を支持するために（平面、２次元構造ではなく）３次元構造を有する。
【００５７】
本明細書で用いる場合、用語「生分解性」は、自然環境中で（例えば生存生物または生存培養物内で）経時的に溶解、変質、またはその他の態様で分解し、その構造完全性を失い、その元の構造形で存在しなくなる物質のことをいう。本開示の実施形態では、生分解性物質は、ホスト生物中である期間にわたって溶解／分解する。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「工学的に操作された」は、その工学的に操作された物体が人間により創出および／または変更されることを示す。工学的に操作された物体は、自然に由来する物質を含むことがあるが、物体自体はヒトの介入および設計によりいくらか変更されている。
【００５９】
本明細書で用いる場合、用語「試験化合物」は、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、核酸配列、または生存細胞もしくは生物に影響を与え得るその他の化合物を含み得る。一部の実施形態では、「試験化合物」は、生物学的活性、機能、または別の化合物に対する応答に対して調節効果を有すると疑われる、化学物質またはペプチドのような化合物であり得る。例えば、本開示では、「試験化合物」は、血管新生活性の増加、血管新生活性の減少および／または異なる血管新生調節物質の効果の調節のような、血管新生に対する調節効果を有することが疑われる化合物であり得る。
【００６０】
本明細書で用いる場合、用語「取り除かれ」または「実質的に取り除かれ」は、ある量の物質または化合物が別の組成物から分けられたことを示すが、取り除かれた物質が完全に検出不能となるようにその取り除かれた物質の全ての痕跡が残りの組成物に絶対的に存在しないことは、必要としない。例えば、血液が組成物から「取り除かれた」かまたは「実質的に取り除かれた」ならば、このことは、組成物中の血液の実質的な部分が取り除かれたことを示すが、いくらかの血液または血液成分は精密なスクリーニングにより痕跡量でまだ検出される可能性がある（例えば「実質的に取り除かれた」は、組成物がその「取り除かれた」成分を１００％含まないことは必要とせず、代わりに、組成物または物質は、その「取り除かれた」成分が約９９％除去されているか、約９５％除去されているか、もしくは約９０％除去されているか、または上記の例示したパーセンテージの範囲内の任意のパーセンテージもしくは範囲で除去されていてもよい）。
【００６１】
（考察）
本開示の実施形態は、血管新生を誘導する方法および組成物、ならびに血管新生を調節する方法および組成物、ならびに血管新生を調節するための組成物を作製する方法を包含する。本開示は、血管新生の調節物質を同定する方法、および血管新生の調節物質を同定するアッセイも含む。本開示の実施形態は、血管新生を調節するための組成物を送達する方法および組成物をさらに含む。実施形態では、本開示は、組織構築物および／または自然の組織においてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導および／または調節することができる胎盤抽出物、ならびに組織構築物および／または自然の組織中の細胞に胎盤抽出物を送達する方法および組成物を含む。本開示は、血管新生を調節する化合物を同定するためのアッセイにおいて用いることができる胎盤抽出物も含む。さらに、本開示は、血管新生を誘導するためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞集団に対して抽出物を制御放出するための、胎盤抽出物を添加した送達媒介物の組成物を含む。
【００６２】
血管新生は、場所および刺激の両方に依存する複雑なプロセスであり、それぞれの場合において、これらのプロセスを調節する能力には、制御分子の複雑な組み合わせが関与し得る。血管形成の制御は、異なる形成機序によりさらに複雑にされ、これらの機序のうち最も理解されている２つは、陥入（intussusception）および出芽（sprouting）である。陥入は、現存する血管の管腔内への間質細胞柱の挿入を特徴とし、出芽は、以前は微小血管がなかった組織での血管新生刺激に向かう内皮細胞出芽を特徴とする。多くの分子が血管新生を調節すると見出されており、より多くのものがこれから発見される可能性がある。血管新生誘導物質のこの多様性が、血管発達、薬物スクリーニング、および再生医療による治療の研究に用いるための血管新生調節物質の継続した探索および開発を駆動してきた。
【００６３】
血管新生を研究するための従来のモデルは、動物由来刺激物質を用いるか、または評価のために生存動物の使用に完全に依存している。ｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究は、ヒト血管形成中に生じる生体分子経路および機序の複雑さを比較するためのより正確なモデルを提供する。標準的なｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生モデルは、ウサギ角膜新血管形成アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒヨコ絨毛尿膜アッセイおよびラット腸間膜開窓アッセイを含む。可能であれば、複雑な生物学的現象をよりよくコントロールするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生モデルが選択される。しかし、このことにより、研究は限定された数の分子種、例えばＶＥＧＦに制限される。この複雑なカスケードでは、より複雑なまたは多因子の「ミックス」が、十分な血管形成を促進するために必要であり得、単一分子（またはいくつか）を用いても得られるものはそれ自体限定的であることがある。
【００６４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生モデルについて、マウス由来基底膜マトリクス（ＢＭＭ）または「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」アッセイが好ましいモデルであるが、これは、このアッセイがｉｎ  ｖｉｖｏ複雑さの程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに持ち込み、結果がｉｎ  ｖｉｖｏの結果により匹敵するように見受けられるからである。しかし、このアッセイは、エンジェルブレス−ホーム−スワーン（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来し、多数の動物を犠牲にする必要があるので１１、臨床使用には適切でない。いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト由来調節物質が、血管新生をモデル化するために用いられている。歴史的に、これらは、単一調節物質（ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ）に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏで本来的に見られるサイトカインおよび化学的勾配の多様性を欠く１２。動物由来モデルに伴う種間の差１３、１４、およびヒト組換えタンパク質から複数タンパク質配合を得ることの複雑さに鑑みて、堅固なヒト由来アプローチ（ほぼ生理的な比率での複数タンパク質のより複雑なミックスを含む）は、機械論的な研究、血管新生薬物のスクリーニング、および再生医学療法の臨床的転換を増強する能力に対して著しい影響を有するであろう。さらに、血管新生プロセスを調節して、形成の異なる機序および段階に相当するもの得ることができることから、血管形成中の鍵となる分子および分子経路を特徴付ける改良されたプラットフォームが提供されるであろう。
【００６５】
本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導および調節するための方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生を誘導することに加えて、このモデルは、微小血管ネットワーク成熟の速度の調節ならびに出芽および陥入血管新生を選択的にモデル化することを可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、成分添加したコラーゲンベースの生体スキャフォールドを用いて、ヒト胎盤抽出物（ＰＥ）が毛細血管形成を著しく増強し、線維化を排除することが示された。
【００６６】
本開示は、ヒト胎盤に由来する調整可能な完全ヒト生体分子の複雑なセットを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導および調節するためのこのような方法について記載する。このアプローチは、ヒト胎盤から単離された活性ヒト生体分子の複合体を得るための、制御された分画および分離の技術を用いる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生およびｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生を誘導および調節することに加えて、本開示の方法および組成物は、微小血管ネットワーク成熟の速度の調節し、ならびに出芽および陥入血管新生を選択的にモデル化することを可能にする。実施形態では、本開示の方法および化合物は、重合体のおよびｅｘ  ｖｉｖｏ由来の組織スキャフォールドの両方においても血管新生を誘導および調節する。これらの方法は、微小血管ネットワーク成熟の速度を調節することを可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、成分添加したコラーゲンベースの生体スキャフォールドを用いて、本開示のヒト胎盤抽出物が毛細血管の形成を著しく増強し、線維化を排除することが示された。
【００６７】
血管新生をもたらす増殖因子の持続的送達も、組織工学的アプローチに関して血管形成を促進するための血管新生の調節の成功が直面する課題である。本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で血管新生を調節するための、本開示の組成物の制御放出のための方法および組成物も提供する。
【００６８】
（ヒト胎盤抽出物）
本開示は、ヒト胎盤抽出物（ＰＥまたはｈＰＥ）を含む、血管新生を誘導および／または調節する組成物および方法を提供する。本開示の実施形態では、ＰＥは、ヒト胎盤から試料を得て、胎盤試料から血液を取り除いて粗胎盤抽出物（粗ＰＥ）を生成し、粗ＰＥを尿素またはその他のタンパク質可溶化剤と混合して抽出物中に存在するタンパク質を可溶化し、粗抽出物から残存固形物を取り除き、尿素−胎盤抽出物混合物を透析して混合物から実質的な量の尿素を取り除いてヒトＰＥを生成することにより作製される。ヒトＰＥは、マトリクス様化合物であり、本明細書において時としてヒト胎盤マトリクス（ｈＰＭ）ということがある。
【００６９】
実施形態では、ヒトＰＥを作製するためのプロセスは、約−８６℃から約５℃の間の温度で行われる。実施形態では、ヒト胎盤抽出物は、約４℃以下の温度で作製される。
【００７０】
実施形態では、胎盤試料から血液を取り除いて粗胎盤抽出物を作製するプロセスは、ヒト胎盤試料を緩衝液で均質化（ホモジェナイズ）することと、均質化された試料を遠心分離することと、血液を含む上清を捨てることとを含む。このプロセスは、実質的に全ての血液が試料から取り除かれて（例えば試料は、血液が約９９％除去されている、血液が約９５％除去されている、血液が約９０パーセント除去されている、など）粗ＰＥが生成されるまで、複数回（例えば２、３回以上）反復できる。ある実施形態では、緩衝液は、塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ）である。
【００７１】
実施形態では、粗胎盤抽出物中のタンパク質は、粗胎盤抽出物をタンパク質可溶化剤と混合することにより可溶化される。実施形態では、タンパク質可溶化剤は、タンパク質を恒久的に破壊することなく、またはタンパク質を恒久的に不活性化することなく（例えば可溶化は、タンパク質を可逆的に変性させて、タンパク質可溶化剤を取り除いたときなどにタンパク質がリフォールディングできるようにするべきである）、タンパク質を可溶化（例えば変性）することができる任意の化合物または化合物の混合物であり得る。実施形態では、タンパク質可溶化剤は、それらに限定されないが、尿素、グアニジン−ＨＣｌまたはその他の類似の化合物であり得る。実施形態では、タンパク質可溶化剤は尿素であり、粗抽出物は、粗抽出物を尿素を用いて均質化することにより尿素組成物と混合される。実施形態では、尿素は、約１２から約３６時間の間の期間、粗抽出物と混合される。実施形態では、尿素は、約２４時間粗抽出物と混合される。実施形態では、尿素溶液は、約０．５Ｍ以上の尿素濃度を有する尿素緩衝液である。実施形態では、尿素は、約２Ｍ以上、約４Ｍ尿素以上で、約１５Ｍまでである。実施形態では、尿素溶液は、約０．５Ｍ〜約１５Ｍの濃度を有することができる。他の実施形態では、タンパク質可溶化剤は、約０．５Ｍ〜約１５Ｍの濃度を有するグアニジン−ＨＣｌである。実施形態では、グアニジン−ＨＣＬは、約６Ｍの濃度を有する。以下に記載する方法および組成物は尿素を可溶化剤として用いて記載されるが、その他の適切な可溶化剤、例えば、それらに限定されないが、上で論じたもので尿素を置き換えることができると理解される。
【００７２】
実施形態では、尿素またはその他のタンパク質可溶化剤と混合した後に、可溶化タンパク質−粗抽出物混合物（例えば尿素−粗抽出物混合物）から固形物を取り除く。実施形態では、固形物は、ＰＥ混合物を遠心分離し、ペレット（固形物を含む）を捨てることにより取り除かれる。このステップは、複数回反復できる。固形物を取り除いた後に、ＰＥ混合物（例えば上清）を透析して、尿素またはその他のタンパク質可溶化剤を胎盤抽出物から取り除く。実施形態では、透析溶液は、ＴＢＳである。実施形態では、透析溶液は、ある期間（例えば１時間、２時間、３時間など）の後に替え、透析を数回（例えば２、３、４回など）反復して、実質的に全ての尿素をＰＥから取り除く（例えば胎盤抽出物は、尿素が約９９％除去されている、尿素が約９５％除去されている、など）。実施形態では、ＰＥを再び遠心分離して、残った固形物（例えば重合したタンパク質など）を取り除いてよい。実施形態では、残存ＰＥは、透明からピンクがかった粘性の物質である。本開示の胎盤抽出物を作製する本開示のプロセスの実施形態に関するさらなる詳細は、下記の実施例で見出すことができる。
【００７３】
よって、本開示の実施形態は、本開示の方法により作製されたＰＥも含む。実施形態では、本開示は、ヒト胎盤試料から得られた試料から血液を取り除いて粗ＰＥを生成し、粗胎盤抽出物をタンパク質可溶化剤（例えば、それらに限定されないが、尿素、グアニジン−ＨＣｌなど）と混合して粗抽出物中のタンパク質を可溶化し、可溶化タンパク質−ＰＥ混合物から固形物質を分離し、ＰＥ混合物に対して透析を行って、混合物からタンパク質可溶化剤（例えば尿素）を取り除いてヒトＰＥを生成することにより作製されたＰＥを含む。
【００７４】
本開示は、よって、血液および固形物が実質的に取り除かれ、胎盤試料中に存在していた胎盤タンパク質を（いくらかまたは全て）保持する、ヒト胎盤から（例えばヒト胎盤試料から）得られた抽出物を含むヒト胎盤抽出物を含む。実施形態では、胎盤タンパク質は、サイトカインおよび増殖因子を含む。
【００７５】
本開示のＰＥの分析により、ＰＥが、多くのサイトカインおよび増殖因子を含む多くのタンパク質を含むことが明らかになる。本開示の胎盤抽出物の実施形態では、抽出物は、少なくとも２０の異なるサイトカインを含む。一部の実施形態では、抽出物は、４０までの異なるサイトカインを含む。その他の実施形態は、少なくとも５０のサイトカインを含む。本開示のＰＥ中に存在し得るいくつかのサイトカインは、下記の実施例に列挙するものを含む。例えば、本開示のＰＥ中に存在し得るサイトカインのいくつかは、それらに限定されないが、アンジオゲニン、Ａｃｒｐ３０Ａｇ、ＩＧＦＢＰ−１、ＮＡＰ−２およびＦａｓ／ＴＮＦＧＳＦ６、ならびにＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＦを含む。
【００７６】
本開示の胎盤抽出物中に存在するサイトカインおよび増殖因子ならびにその他の胎盤化合物は、内皮細胞の培養物、組織、組織構築物、工学的に操作された生体スキャフォールドなどにおいて血管新生を誘導できる。本開示の胎盤抽出物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導できる。本開示の胎盤抽出物は、内皮細胞の成長を刺激できる。実施形態では、本開示のヒトＰＥは、血管新生を調節できる。血管新生を誘導するために用いられるその他の従来の化合物、例えばＢＭＭ（単一精製血管新生調節物質（例えば精製ＶＥＧＦ−アルファまたはＳＤＦ−１）および精製フィブリンを含む化合物）と比較して、本開示のＰＥは、ＢＭＭと比較して、内皮細胞の血管新生成長の増加（例えば細管およびネットワーク形成）および筋線維芽細胞の血管新生型成長の減少（例えば細管形成）を刺激する。本開示のＰＥは、ＢＭＭと比較して、様々な株化細胞（例えば幹細胞、平滑筋細胞など）の異なる成長および／または分化パターンも刺激するので、そのような細胞の成長／分化パターンが、ＢＭＭを用いる成長とは区別できる。
【００７７】
本開示のＰＥは、ＰＥの非存在下で成長した内皮細胞と比較して、内皮細胞における様々な遺伝子を上方制御することもできる。このような遺伝子のいくつかは、血管新生関連遺伝子、細胞外マトリクスリモデリング遺伝子および血管発達遺伝子を含む。いくつかの血管新生関連遺伝子は、それらに限定されないが、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＸＣＬ３、ヒト増殖因子（ＨＧＦ）、ＡＮＧＰＴ２、ＰＧＦ、ＴＹＭＰ、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１ＡおよびＦＧＦ１を含む。本開示の胎盤抽出物により誘導できるいくつかの細胞外マトリクスリモデリング遺伝子は、それらに限定されないが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＯＬ４Ａ３およびＬＡＭＡ５を含む。血管発達遺伝子は、それらに限定されないが、ＣＤＨ２、ＨＡＮＤ２、ＬＥＣＴ１およびＭＤＫを含む。
【００７８】
（血管新生を調節する方法）
本開示は、細胞培養物において血管新生を誘導する方法であって、本開示のヒト胎盤抽出物の存在下で内皮細胞を成長させることを含む方法も含む。実施形態では、血液および固形物を取り除き、尿素と混合し、透析して尿素を取り除くように処理されたヒト胎盤試料から得られた本開示の胎盤抽出物であって、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含む胎盤抽出物の存在下で、細胞培養物を成長させる。実施形態では、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：human umbilical vein endothelial cell）である。細胞培養物において血管新生を誘導する方法の実施形態では、細胞は、少なくとも約４０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。実施形態では、細胞は、少なくとも約８０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。実施形態では、細胞培養物は、増殖培地および本開示の胎盤抽出物を含むプレート上で成長できる。
【００７９】
本開示は、本開示のヒト胎盤抽出物を含む組成物中で生体材料をインキュベートすることと、生体材料をホストに移植することとを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで生体材料への血管形成を誘導する方法も含む。実施形態では、生体材料は、自然由来材料および／または細胞を含む。実施形態では、生体材料は、ヒト由来基質物質を含む工学的に操作された生体スキャフォールドを含む。実施形態では、工学的に操作された生体スキャフォールドは、ヒト臍帯静脈スキャフォールドを含む。実施形態では、ヒト臍帯静脈スキャフォールドは、脱細胞化されている。一部の実施形態では、生体材料には、それらに限定されないが、ヒト内皮細胞（例えばＨＵＶＥＣ）のような内皮細胞が播種される。本開示の実施形態では、生体材料は、ＨＵＶＥＣが播種されたヒト臍帯静脈スキャフォールドを含む、工学的に操作されたスキャフォールド材料を含む。一部の実施形態では、ＨＵＶＥＣは、少なくとも約４０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で生体スキャフォールド上に播種される。実施形態では、ＨＵＶＥＣは、少なくとも約８０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。実施形態では、生体材料は、胎盤抽出物中で少なくとも約２時間インキュベートされる。
【００８０】
（生体材料および工学的に操作された生体スキャフォールドへの血管形成）
本開示は、それらに限定されないが、工学的に操作された生体材料、自然由来生体材料およびホストに移植されるその他の生体材料を含む生体材料に血管形成する方法も含む。生体材料を本開示の胎盤抽出物で処理することは、生体材料に血管形成することに加えて、生体許容性を助成し、炎症を低減し、拒絶および瘢痕形成を低減することなどのためのｉｎ−ｖｉｖｏ用途のために生体材料を前処理することにも用いられ得る。よって、本開示の胎盤抽出物および本開示の胎盤抽出物を含む組成物は、そのような移植の結果を改善させるために、任意の数の生体材料に「成分添加」することに用いられ得る。
【００８１】
本開示は、本開示のヒト胎盤抽出物を含む組成物中でインキュベートしたヒト由来基質物質を含む移植可能な工学的に操作された生体スキャフォールドのような、具体的に工学的に操作された生体材料も含む。本開示の生体スキャフォールドは、ヒトのような哺乳動物に移植できる。本開示の生体スキャフォールドは、ホストへの移植のために適切な任意の生体材料を含むことができる。本開示において用いるための生体スキャフォールドの例は、それらに限定されないが、組織を含む工学的に操作された生体スキャフォールド、マトリクス材料、任意の数の自然由来生体材料などを含む。実施形態では、生体スキャフォールドは、２Ｄまたは３Ｄ生体スキャフォールドである。実施形態では、生体スキャフォールドは、ヒト由来基質物質を含む。実施形態では、生体スキャフォールドは、脱細胞化したヒト臍帯静脈スキャフォールドを含む。実施形態では、それらに限定されないが、ヒト細胞、ヒト内皮細胞（例えばヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、幹細胞、その他の多能性細胞などのような細胞を生体スキャフォールドに播種する。
【００８２】
下記の実施例に記載するように、本開示の胎盤抽出物中でインキュベートした本開示の生体スキャフォールドは、血管新生誘導化合物ＢＭＭまたは対照化合物中でインキュベートした生体スキャフォールドよりも多くの血管形成（例えば血管新生）および少ない線維化を誘導する。本開示の胎盤抽出物中でインキュベートした生体スキャフォールドはまた、ＢＭＭまたは対照中でインキュベートした生体スキャフォールドとは対照的に、炎症誘発性陽性マクロファージ（例えばＣＤ８６（Ｍ１））に対する免疫抑制性かつ血管新生促進性陽性マクロファージ（例えばＣＤ２０５（Ｍ２））の比率がより高かった。
【００８３】
（血管新生スクリーニングアッセイ）
本開示の胎盤抽出物は、細胞培養物において血管新生を誘導するので、血管新生調節物質を同定およびスクリーニングするための良好なアッセイを提供する。よって、本開示は、血管新生調節物質を同定する方法およびアッセイも含む。
【００８４】
実施形態では、方法は、本開示のヒト胎盤抽出物を含む化合物の存在下でヒト内皮細胞の培養物を成長させることと、ヒト内皮細胞培養物を試験化合物と接触させることとを含む。胎盤抽出物は細胞培養物において血管新生を誘導するので、血管新生が予測されるよりも少なくなるかまたは多くなるならば、その試験化合物は、血管新生調節物質として同定できる。よって、この方法はまた、培養物における血管新生の量を決定することと、細胞培養物における血管新生の量が、試験化合物の非存在下での培養物の成長における血管新生の量より大きいかまたは小さい場合に、その試験化合物を血管新生調節物質と同定することとを含む。実施形態では、試験化合物の非存在下で成長した培養物と比べた血管新生の量の増加が、試験化合物が血管新生を誘導することを示す。試験化合物の非存在下で成長した培養物と比べた血管新生の量の減少は、試験化合物が血管新生を阻害することを示す。下記の実施例に記載するように、本開示の方法に従う化合物トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）のスクリーニングは、この化合物を血管新生の阻害物質と同定した。本開示は、本開示のヒト胎盤抽出物の存在下で成長した内皮細胞の培養物を含む、試験化合物をスクリーニングして血管新生の調節物質を同定するためのアッセイも提供する。本開示のアッセイは、本開示の方法とともに用いて、血管新生の調節物質を同定できる。
【００８５】
（持続送達法および組成物）
胎盤抽出物の血管新生効果はｉｎ  ｖｉｖｏまたは生体材料（例えば組織、細胞培養物、生体スキャフォールドなど）において長期間持続しないことがあるので、本開示のＰＥの持続放出のための組成物および方法も本開示において提供する。
【００８６】
本開示の実施形態は、持続放出性／ヒトＰＥ組成物を提供するように生分解性微小粒子と結合している本開示のヒトＰＥ（ｈＰＥ）を含む組成物を含む。ＰＥ添加生分解性微小粒子は、持続放出性血管新生調節組成物をもたらす。よって、実施形態では、持続放出性血管新生調節組成物は、本開示のヒトＰＥと生分解性微小粒子とを含み、ここで、ヒトＰＥは、ヒトＰＥが微小粒子から放出されるように微小粒子と結合している。実施形態では、ヒトＰＥは、ヒト胎盤試料から得られ、血液および固形物が抽出物から実質的に取り除かれており、抽出物は、胎盤試料に存在していた胎盤タンパク質（サイトカインおよび増殖因子を含む）を含む。持続放出性血管新生調節組成物において用いられるヒトＰＥは、上記のヒトＰＥの任意の実施形態であり得る。
【００８７】
実施形態では、ヒトＰＥは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に曝露された後に微小粒子から放出される。実施形態では、生分解性微小粒子をｉｎ  ｖｉｖｏでホスト内に置くかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞培養物もしくは細胞を播種した生体スキャフォールドと接触させる場合、生分解性微小粒子は、分解し始めてＰＥを周囲の細胞、組織などに経時的に放出する。実施形態では、生分解性微小粒子は、ＰＥの最初の「バースト」を放出し、次いで、持続する期間（例えば数日、数週間など）にわたってゆっくりとＰＥを放出する。微小粒子の放出プロフィールは、微小粒子のサイズおよび架橋の程度を変化させることにより制御できる。実施形態では、微小粒子は、架橋され、架橋の程度は、粒子の放出パラメータを改変するために制御できる。
【００８８】
実施形態では、生分解性微小粒子は、ゼラチンでできている。ゼラチン生分解性微小粒子の実施形態に関するさらなる詳細は、下記の実施例２に記載する。実施形態では、生分解性微小粒子は、異なるサイズの微小粒子の混合物を含む。様々なサイズの微小粒子を含むことによりＰＥの持続放出性が得られると考えられる。なぜなら、異なるサイズの粒子はＰＥを異なる速度で放出するからである。
【００８９】
実施形態では、生分解性微小粒子は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）微小粒子である。実施形態では、ｈＰＥは、ＰＬＧＡ微小粒子中に添加される（例えばカプセル化される）。実施形態では、本開示のｈＰＥを添加したＰＬＧＡ微小粒子は、約１０〜約１０００μｍの平均粒子サイズを有する。実施形態では、ＰＬＧＡ微小粒子は、二重均質化ステップを含む水中油型エマルジョンプロセスにより作製される。実施形態では、ＰＬＧＡ微小粒子は、本開示のｈＰＥを含む第１水溶液（Ｗ１）とＰＬＧＡ油状溶液を混合し、第１均質化ステップにおいてＰＬＧＡおよびＷ１を均質化することにより第１エマルジョンを調製し、溶媒（例えばアルコール、例えば、それに限定されないが、ポリビニルアルコール）を水中に含む第２水溶液（Ｗ２）に第１エマルジョンを加えて、第２エマルジョン（水中油中水型エマルジョン）を形成し、次いで溶媒を蒸発させることにより作製される。実施形態では、第２均質化ステップを用いて、第２エマルジョンを均質化する。実施形態では、第１均質化は、約１〜約２分間である。一部の実施形態では、他の均質化ステップを用いない。他の実施形態では、第２均質化ステップを加える。実施形態では、第２均質化は、約２０秒間〜約１分間である。ｈＰＥ添加ＰＬＧＡ微小粒子の調製方法の実施形態に関するさらなる詳細は、下記の実施例３に示す。実施形態では、単一均質化ステップを用いて作製したｈＰＥ添加ＰＬＧＡ微小粒子は、直径約１００〜約１０００μｍのサイズを有する。単一均質化ステップが約２分間である実施形態では、得られる微小粒子は、直径約５０〜約５００μｍの範囲のサイズを有し、平均直径約２６０〜約２９０μｍである。実施形態では、約１分間の第２均質化ステップを用いて作製したｈＰＥ添加ＰＬＧＡ微小粒子は、サイズが直径約２０未満から約１００μｍの範囲であり、平均直径約３６〜約４０μｍである。実施形態では、約２０秒間の第２均質化ステップを用いて作製したｈＰＥ添加ＰＬＧＡ微小粒子は、サイズが２０未満から約２００μｍの範囲であり、平均直径約８５〜約９５μｍである。
【００９０】
本開示は、上記の持続放出性血管新生調節組成物をＰＥの持続放出のために使用する方法も含む。実施形態では、方法は、持続放出性組成物を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＰＥの持続放出、例えば、それらに限定されないが、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生体材料（例えば細胞培養物、組織、組織構築物、生体スキャフォールドなど）へのヒトＰＥの経時的な持続放出を得ることを含む。実施形態では、本開示の方法は、細胞（例えば培養物中の細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞、生体材料中の細胞または工学的に操作された生体材料と接触している細胞など）を、細胞に微小粒子を曝露した後にある期間にわたってヒト胎盤抽出物が微小粒子から生体材料中に放出されるように本開示の胎盤抽出物と結合している生分解性微小粒子を含む上記の持続放出性血管新生調節組成物と接触させることを含む。実施形態では、細胞は、それに限定されないが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のような内皮細胞である。
【００９１】
実施形態では、持続放出性血管新生調節組成物は、生体材料と結合している。実施形態では、生体材料は、細胞培養物である。実施形態では、生体材料は、細胞培養物を含む組織構築物および／または組織マトリクスである。実施形態では、生体材料は、アルギン酸塩マトリクスに包埋された細胞（例えばヒト細胞、例えばＨＵＶＥＣ）を含む、アルギン酸塩マトリクスであり、持続放出性血管新生調節組成物（例えばｈＰＥ添加生分解性微小粒子）もアルギン酸塩マトリクスに包埋されているかまたはアルギン酸塩マトリクスと接触している。実施形態では、持続放出性血管新生調節組成物と結合している生体材料は、対象に移植され、生体材料への血管形成を誘導する。実施形態では、生体材料は、それらに限定されないが、ヒト内皮細胞が播種された、脱細胞化ヒト臍帯静脈スキャフォールドのようなヒト由来基質物質を含む、工学的に操作された生体スキャフォールドである。実施形態では、対象は、哺乳動物である。実施形態では、対象は、ヒトである。本開示の持続放出性血管新生調節組成物を用いて血管新生を誘導する方法のその他の変形が可能であり、その方法の例示的な実施形態は、下記の実施例においてより詳細に記載する。
【００９２】
（抗炎症性組成物および使用方法）
下記の実施例に記載するように、本開示のヒトＰＥおよび本開示の持続放出性／ヒトＰＥ組成物は、周囲の細胞および組織に対する抗炎症効果を有することも見出された。よって、本開示の組成物は、本開示のヒトＰＥまたは持続放出性／ヒトＰＥ組成物を含む抗炎症性組成物も含む。本開示の方法は、本開示のヒトＰＥまたは持続放出性ヒト／ＰＥ組成物に対象または組織を曝露することにより、対象または対象の組織の炎症を処置する方法（例えば低減する、緩和する、相殺する、防止するなど）も含む。
【００９３】
本開示の試験および方法に関するさらなる詳細は、下記の実施例に示す。下記の具体的な例は、説明のみとして解釈され、残りの開示を決して限定しない。さらなる詳細を述べなくとも、本明細書の記載に基づいて、当業者は本開示をその最大限の範囲で利用できると考えられる。本明細書において引用する全ての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００９４】
本開示の実施形態、特に任意の「好ましい」実施形態は、本開示の原理を明確に理解するためにのみ述べられた、実施についての単に可能な例である。本開示の趣旨および原理から実質的に逸脱することなく、多くの改変および修飾を本開示の上記の実施形態に対して施すことができる。そのような修飾および改変は全て、本明細書において本開示の範囲内に含まれ、下記の実施形態により保護されることを意図する。
【００９５】
以下の例は、本明細書に開示する方法をどのようにして行い、組成物および化合物をどのようにして使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提供される。数値（例えば量、温度など）に関して正確性を確実にするように努力したが、いくらかの誤差および偏差が考えられる。そうでないと示さない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧付近である。標準温度および圧力は、２０℃および１気圧と定義される。
【００９６】
比率、濃度、量およびその他の数値データは、本明細書において範囲のフォーマットで表現することがあることに注意されたい。このような範囲のフォーマットは、簡便さおよび簡潔さのために用いられるので、範囲の限界として明示的に記載する数値だけでなく、それぞれの数値および副次範囲が明示的に記載されているかの如く、その範囲内に含まれる全ての個別の数値または副次範囲も含まれるような様式で柔軟に解釈されるべきであると理解されたい。例えば、「約０．１％〜約５％」の濃度範囲は、約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％の明示的に記載する濃度だけでなく、示した範囲内の個別の濃度（例えば１％、２％、３％および４％）および副次範囲（例えば０．５％、１．１％、２．２％、３．３％および４．４％）も含むように解釈されるべきである。ある実施形態では、用語「約」は、数値の有効数字による伝統的な四捨五入を含み得る。
【実施例】
【００９７】
本開示の実施形態を全般的にここまで記載してきたが、以下の実施例は、本開示のいくつかのさらなる実施形態を示す。本開示の実施形態を以下の例ならびに対応する文章および図との関連で記載するが、この記載に本開示の実施形態を限定する意図はない。それどころか、本開示の実施形態の趣旨および範囲に含まれる全ての代替物、修飾および均等物をカバーすることを意図する。
【００９８】
（実施例１）
胎盤由来抽出物を用いるｅｘ  ｖｉｖｏ由来生体スキャフォールドにおける血管新生の誘導および調節
序説
本実施例は、複雑なヒト胎盤抽出物（ＰＥ）を用いて血管形成を誘導する方法について記載する。ＰＥは、ヒト胎盤に由来し、２Ｄおよび３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ならびに生物工学的に操作された組織インプラント内でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、血管新生を誘導できる。本実施例は、胎盤抽出物を用いて、現在のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルと比べて増加した感度で、トロンボスポンジン−１を血管新生阻害タンパク質として陽性スクリーニングすることについても記載する。特に、このモデルは、血管新生の速度および種類（陥入対出芽）について調節することを可能にし、従来のアプローチに優る多くの利点ならびに再生医療および医薬の分野における広い応用を示す。
【００９９】
組織内での物質移動の制限は、効果的な生体材料を生成する上での難題となっている。この難題を一時的に克服してヒト生体スキャフォールド内で細胞遊走が改善できたとしても、効果的な脈管構造の創出は、厚く細胞が密に詰まった材料に長期にわたって栄養素を送達するための根本的な目標として残っている。成体では、新しい血管は、血管新生の生理的プロセスにより主に生成され４７、該プロセスは、最終的に、栄養素豊富な血管ネットワークの形成を導く。本実施例は、ヒト臍帯静脈（ＨＵＶ）血管グラフトにおいて血管新生を誘導でき、血管新生が長期の栄養素送達系をもたらすことを証明する。
【０１００】
工学的に操作された器官への血管形成の成功、および血管新生調節物質による梗塞組織のｉｎ  ｖｉｖｏ修復は、再生医療による治療を臨床にうまく持って行く上での主な難題である。血管新生を開始させ、より大型の血管形成を駆動するために、直接細胞播種（単独および共培養）、幹細胞およびヒト由来調節物質／増殖因子の組み合わせを含む、様々な異なるアプローチがとられている。現在までに、非ヒト動物化合物を典型的に用いるこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチは、臨床まで持って行くことがほとんどできていない。
【０１０１】
この分野における重要な問題は、最も人気があり成功しているアプローチ（Ｍａｔｒｉｇｅｌまたは基底膜マトリクス）がエンジェルブレス−ホーム−スワーンマウス肉腫細胞に由来し、よって、ヒト治療のためには不適切であることである。よって、ヒトベースの材料（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ系の両方で血管形成を能動的に促進するもの）を用いるアプローチまたは機序は、著しい影響力を有すると考えられる。本実施例は、２Ｄおよび３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ならびに生物工学的に操作された組織インプラント内でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管新生を誘導できる、ヒト胎盤抽出物（ｈＰＥ）を提供する。ＰＥは、活性ヒト生体分子の複合体であり、本実施例は、ｅｘ  ｖｉｖｏ由来ヒト臍帯静脈血管グラフトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生を誘導することに加えて、このモデルが血管新生の速度および段階を調節できることを証明する。本実施例はまた、成分添加したコラーゲンベースの生体スキャフォールドを用いて、ＰＥが毛細血管形成を増強するとともに、線維化も低減することを証明する。
【０１０２】
方法
胎盤抽出物の導出。満期胎盤を、ＵＦ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｈａｎｄｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬ）から出産の１２時間以内に収集した。臍帯および胎膜を取り除き、胎盤を２ｃｍの立方体に切開して凍結した。−１℃／分の速度にて−８６℃までの累進凍結の１２時間後に、胎盤の立方体を４℃に維持された低温室に運んで、ここで残りの手順を完了した。一旦４℃にすると、１００グラムの組織を１５０ｍＬの３．４Ｍ冷ＮａＣｌ緩衝液（１Ｌの蒸留水中に１９８．５ｇ  ＮａＣｌ、１２．５ｍｌ  ２Ｍトリス、１．５ｇ  ＥＤＴＡおよび０．２５ｇ  ＮＥＭ）と混合した。ＮａＣｌ緩衝液／組織ミックスを、Ｔｉｓｓｕｅｔｅｋホモジナイザーを３２００ＲＰＭにて用いてペーストに均質化し、次いで７０００ＲＰＭで１５分間遠心分離し、上清から分けた。このＮａＣｌ洗浄プロセスをさらに２回反復し、そのたびに上清を捨てて血液を取り除いた。
【０１０３】
次に、１００ｍＬの４Ｍ尿素緩衝液（１Ｌの蒸留水中に２４０ｇ尿素、６ｇトリスベースおよび９ｇ  ＮａＣｌ）中でペレットを均質化し、磁気撹拌プレート上で２４時間撹拌し、次いで１４０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ６＋遠心分離機、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＣ、ＵＳＡ）。上清を取り除き、１ＬのＴＢＳ（１Ｌの蒸留水中に６ｇトリスベースおよび９ｇ  ＮａＣｌ）および滅菌のための２．５ｍｌのクロロホルムの中に入れた８０００ＭＷ透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて透析した。緩衝液を、それぞれ２時間の間隔で新しいＴＢＳにさらに４回交換した。最後に、透析チューブの内容物を３０００ＲＰＭで１５分間（Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１２Ｒ遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）遠心分離して、重合したタンパク質を取り除き、上清（ピンク色の粘性溶解液）を回収して、使用時まで−８６℃にて貯蔵した。
【０１０４】
生体分子組成分析。相対的なサイトカインレベルを、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．からのサンドイッチイムノアッセイアレイ（ヒトサイトカイン抗体アレイＣシリーズ１０００、Ｉｎｃ、ＧＡ、ＵＳＡ）を用いて決定した。Ｆｏｔｏ／Ａｎａｌｙｓｔ  Ｌｕｍｉｎａｒｙｆｘワークステーション（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて化学発光を検出し、ＴｏｔａｌＬａｂ  １００ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｌｔｄ、ＵＫ）を用いてシグナル強度を測定した。基底膜生体分子の相対的存在量は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＥＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）システムを用いるナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、ＭＳＢｉｏｗｏｒｋｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）により行った。タンパク質は、Ｍａｓｃｏｔデータベース検索エンジン（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて一次配列データベースから同定した。
【０１０５】
ｈＰＬ誘導血管新生ネットワークからの細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。相対的血管新生遺伝子発現を、３８４ウェルＲＴ２ヒト血管新生ＲＴ２Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイ（ＰＡＨＳ−０２４Ａ、Ｑｕｉａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて決定した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて培養プレートからＥＣを剥離し、１００μｌのＲＮＡｌａｔｅｒ中で直ちに貯蔵した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてゲノムＤＮＡを消化した。４２℃にて１５分のインキュベーションでＲＴ２第一鎖キット（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて、精製ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後の９５℃にて５分のインキュベーションにより反応を停止した。次いで、ｃＤＮＡをＲＴ２  ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）と混合し、３８４ウェルヒト血管新生ＰＣＲアレイにロードした。Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４リアルタイムシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ロードしたアレイプレートは、９５℃にて１０分の変性サイクル、４０サイクルの６０℃にて３０秒のアニーリング／伸長サイクルを経て、最後に、６０℃から９５℃まで１秒あたり℃の速度の温度上昇で融解曲線を得た。データは、ΔΔＣｔ法およびＲＴ２Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイデータ分析テンプレートｖ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｑｕｉａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０１０６】
ヒト臍帯静脈内皮細胞単離および筋線維芽細胞培養。内皮細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）中のウシＩ型コラゲナーゼの１ｍｇ／ｍｌ溶液を用いて血管壁から剥離することにより、ヒト臍帯静脈（ＵＦ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｈａｎｄｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬから収集）から導出した。全ての実験において、最初に導出したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を１〜３回の間の継代で用いた。増殖のためには、コンプリートＶａｓｃｕＬｉｆｅ基礎培地（ＶａｓｃｕＬｉｆｅ  ＶＥＧＦ培地コンプリートキット、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて細胞を培養した。血管新生実験のためには、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ基礎培地を、２５ｍｌのグルタミン、０．５ｍｌのヒドロコルチゾン、０．５ｍｌのアスコルビン酸、１０ｍｌのＦＢＳおよび１．２５μｌのｂＦＧＦとともに５００ｍＬの（ＶａｓｃｕＬｉｆｅ  ＶＥＧＦ培地コンプリートキット、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）として、内皮細胞培地を調製した。ヒト筋線維芽細胞（ＣＲＬ２８５４）は５〜１０回の間の継代で用い（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓｅｓ、ＶＡ）、１０％ＦＢＳ補充低グルコースＤＭＥＭを用いて培養した。
【０１０７】
胎盤抽出物由来血管新生アッセイの調製。そうでないと記載しない限り、３２μｌの胎盤抽出物を融解し、９６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。軌道振とう器を３０ＲＰＭにて１分間用いて各ウェルの底を抽出物で均一にコーティングした。コーティングしたプレートを、次いで、３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、２０，０００細胞／ｃｍ２、４０，０００細胞／ｃｍ２または８０，０００細胞／ｃｍ２にて直接ピペットで入れることによりＨＵＶＥＣを植えた。各濃度にて、第１日、第３日および第５日を含む複数の時点で調査した。内皮細胞培地で希釈した０、５、１０、２０および３５μｇ／μＬの最終濃度を用いて、トロンボスポンジン−１を血管新生阻害薬として試験した。
【０１０８】
血管新生ネットワークの形態学的特徴付け。内皮細胞培養培地と共に２μｇ／ｍＬの濃度としたカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）で染色した後に、ネットワーク形成を分析した。暗室にて、染色した細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベートし、次いで、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて画像を撮影した。画像を分析し、ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて、細管長、細管幅、分岐点およびその他の網目特徴を決定した。分岐点は、分岐が合流するか細管が出芽する全ての節の位置として手動で割り当て、細管長は、分岐点から接続分岐点までの曲線長を決定することにより評価した。細管幅測定は、細管あたり３つの異なる地帯、すなわち始点および終点からそれぞれ１０μｍの２つの地帯ならびに曲線長の中央の１つの地帯において行った。パーセントカバー面積は、ｉｍａｇｅＪ機能の「ｂｉｎａｒｙ＞＞ｃｏｎｖｅｒｔ  ｔｏ  ｍａｓｋ」を用いた後に「ｍｅａｎ」の測定を行って画像を処理することにより決定した。ＴＳＰ−１実験では、最終の値を、成分添加なし試料に対して標準化し、ピクセル値の合計カウントに対する「１」値のパーセンテージとして算出し、「％カバー面積」として得た。
【０１０９】
形態の走査型電子顕微鏡検査分析のために、ガラススライド上で成長した微小血管ネットワークを２．５％グルタルアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで洗浄し、１％四酸化オスミウム溶液で固定し、２５％、５０％、７５％、８５％、９５％および３×１００％エタノール溶液で累進的に脱水した。次いで試料を臨界点乾燥し、金／パラジウムでコーティングし、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４０００  ＦＥ−ＳＥＭを用いて画像化した。
【０１１０】
ヒト臍帯静脈スキャフォールドの導出および胎盤抽出物インキュベーション。胎盤をＵＦ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｈａｎｄｓ  ＨｏｓｐｉｔａｌＦｌｏｒｉｄａ（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬ）から収集し、以前に記載された３２自動化法を用いてＨＵＶを切開した。溶媒／組織塊２０：１（ｗ：ｖ）にて１％ＳＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）溶液中で、切開したＨＵＶ試料を脱細胞化した。軌道振とう器プレート上で１００ｒｐｍにて２４時間試料を脱細胞化し、次いでＰＢＳですすいだ後に、ＰＢＳ中の７０Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で３７℃にて一晩インキュベートした。試料は、０．２％過酢酸／４％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液を用いて２時間、最終滅菌し、最後にＰＢＳを用いてｐＨを均衡化した（７．４）。脱細胞化の後に、スキャフォールドを１．５ｃｍ×１．５ｃｍ×０．０７５ｃｍのシートに切断し、−８５℃に予備凍結し、次いで、−８５℃にて１０ｍＴ真空下で２４時間、Ｍｉｌｌｒｏｃｋ卓上マニホルド凍結乾燥機（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）を用いて凍結乾燥した。細胞播種の直前に、スキャフォールドをｈＰＥ、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＰＢＳ（対照）に２時間浸し、そして播種した。
【０１１１】
動物インプラント再血管形成研究。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（６ヶ月齢、２００ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入し、全ての手順はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ  ＩＡＣＵＣ（ＵＦ＃２０１２０７７２８）により承認された。最終滅菌したＨＵＶスキャフォールドを、生物学的フード内で、それぞれ５ｍＬのｈＰＥ、ＭＡＴＲＩＧＥＬまたはＰＢＳ（対照）中で、２時間インキュベートした。動物にイソフラン吸入を用いて麻酔をかけ、はさみを用いて鈍麻調製（ｂｌｕｎｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）により皮下ポケットを背中の左および右側に創出した。各皮下ポケットに１つのスキャフォールドを挿入し、４−０縫合糸（Ｃｏｖｉｄｅｎ、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）を用いて皮膚を縫合した。移植５日後に、動物を安楽死させ、分析のために試料を取り出した。
【０１１２】
毛細血管ネットワーク形成を分析するために、動物から取り出した直後に、メスを用いて線維化莢膜を切開し、ＨＵＶ試料をガラススライド上に置いた。半透明スキャフォールドシートの全体の画像を、Ａｘｉｏｃａｍ  ＨＲｍデジタルカメラ（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えるＩｍａｇｅｒ  Ｍ２光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて撮影した。細胞移動およびスキャフォールドリモデリングを定量するために、組織試料をＮｅｇ−５０凍結切片媒体に包埋し、７μｍの切片に切断し（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５５０低温保持装置、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を用いて染色した。
【０１１３】
統計。結果は、平均±標準偏差として報告する。ＳＰＳＳ（ＩＢＭ、Ｓｏｍｅｒｓ、ＮＹ）を用いて線形回帰を行った。Ｒｔ−ＰＣＲデータは、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイデータ分析ソフトウェアｖ３．２（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて分析した。
【０１１４】
灌流バイオリアクタ培養およびＨＵＶ生体スキャフォールドにおける血管新生誘導。細胞播種済み管状構築物を、６０パルス／分にて４ｍＬ／分の管腔流速を用いて二重灌流バイオリアクタ（図７）で５日間培養した。培地の流れが一様かつ層流であり、血管が非弾性で円筒形であり、直線状であるとの仮定の下でＨａａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｓｅｕｉｌｌｅ等式を用いて血管壁上のせん断応力を算出した：１３４
【数１】
2017520517.tif 000003
（式中、Ｑは、平均体積流量であり、μは、３７℃での水の動粘度（０．０００６９２ｋｇ／（ｍ＊ｓ）と等しい）１３４。各パルス中にせん断応力は０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２から０．０４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２まで回帰した。環境は、３７℃および５％ＣＯ２の標準的細胞培養条件の下に維持した。系内圧力は、反管腔側および管腔側の両方の流れ回路において無視できるレベル（＜２ｍｍＨｇ）に維持し、スキャフォールドに渡って圧力勾配が存在しないようにした。バイオリアクタ中の培養培地は２日ごとに補給した。灌流培養５日後に、組織学的分析のために１０ｃｍ長の管状スキャフォールドを小環に切開した。
【０１１５】
結果
ヒト胎盤抽出物の導出および特徴付け
最初の機械的ホモジェナイゼーション（均質化）および遠心分離の後に、本ｈＰＥ導出法は、尿素ステップを利用して分子を直線化して可溶化した。この後に透析分離を行って尿素を取り除き、生体分子をその元の立体構造にリフォールディングさせた（図１Ａ）。この導出の全てのステップは、４℃の低温室で行った。ＰＥの最終溶液は透明、高粘性であり、８ｋＤから８６８ｋＤの間の生体分子で構成された。
【０１１６】
ｈＰＥは、生体材料を浸すために用いるか、または組織培養アッセイのための薄膜にすることができた。ｈＰＥの再現性は、ｎ  １／４  ３バッチのｈＰＥ（各バッチは、３名の別々のドナーからの等質量の組織を用いて創出した）中の全タンパク質含量の標準偏差の分析により評価し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と類似の再現性およびタンパク質含量を有することが示された。走査型電子顕微鏡検査の画像は、ｈＰＥの表面形態（図１Ｂ〜１Ｃ）およびＨＵＶＥＣを４×１０４細胞／ｃｍ２にてｈＰＥ薄膜上に播種し３日間培養した場合の血管新生ネットワーク形成（図１Ｄ〜１Ｅ）を示す。
【０１１７】
ヒト胎盤抽出物（ｈＰＥ）の血管新生能力は、ｈＰＥでコーティングした組織培養プレート（ＴＣＰ）上に初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種することにより最初に特徴付けた。早期段階の細胞索条形成および出芽は、細胞播種から１時間以内に目視可能であり（データは示さず）、血管新生ネットワークは、３ｄの実験終了まで成熟し続けた（図１Ｆ〜１Ｇ）。個別の細胞索条（多細胞）の長さは、播種第１日（図１Ｈ）から第３日（図１Ｉ）まで著しく増加した。培養３日後に、細胞は、対照試料と比べて広範な血管新生ネットワークを形成した（図１Ｊ、１Ｋ）。
【０１１８】
胎盤抽出物の生体分子の特徴付け
評価した１２０のサイトカインのうち、５４の血管新生関連サイトカインが胎盤溶解液中で検出された（図２Ａ）。最も多く見られる血管新生関連ケモカインはアンジオゲニンであったが、これは、新血管形成の強力な刺激物質である１６。それらに限定されないが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ４）、レプチン（ＬＥＰ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＴＩＭＰ−２を含む著しい血管新生促進性ケモカインも検出された。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、アネキシン（ＡＮＸＡ１、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ４およびＡＮＸＡ５）、好中球デフェンシン（ＤＥＦＡ１）、インターロイキンエンハンサー結合因子（ＩＬＦ２およびＩＬＦ３）、ＩＬ２７、ＩＴＢＧ１およびＭＲＣ１を含む免疫関連タンパク質の存在を示した（図２Ｂ）。ラミニン（ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３およびＬＡＭＣ１）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、ヘパリン硫酸（ＨＳＰＧ２）および４型コラーゲン（ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２およびＣＯＬ４Ａ３）を含む血管新生関連基底膜（ＢＭ）タンパク質もＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて検出され（図２Ｃ）、これらはそれぞれ血管新生において鍵となる役割を演じることが示されている１７〜２０。
【０１１９】
ｈＰＥにより誘導された血管新生ネットワーク内の内皮細胞遺伝子発現
ケモカイン分析とともに、ＨＵＶＥＣ遺伝子分析は、胎盤抽出物の血管新生性の性質をさらに支持した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｈＰＥ上に３ｄ播種した内皮細胞が、肝細胞増殖因子、上皮増殖因子および胎盤増殖因子を含む広範な必須の血管新生促進性遺伝子を発現したことを示した（図２Ｄ）。さらなる上方制御された遺伝子は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９を含んだが、これらは、内皮細胞およびＥＣＭリモデリングに関連するその他の細胞の移動を促進させるために周囲の細胞外マトリクスの分解を助けるタンパク質分解酵素である２１。ＩＶ型コラーゲンも上方制御されたが、これは、成熟中の微小血管系における基底膜の形成と関連する２２。
【０１２０】
毛細血管発達の調節およびＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの形態
歴史的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、血管新生の速度および段階をほとんどまたは全く制御できない９。今回のデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈＰＥベースの血管新生アッセイが、初期細胞播種密度を変動させることにより血管新生ネットワーク形成の成熟および形態を制御するように調節できることを示す。１日後に、４０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種したＨＵＶＥＣは、８０，０００細胞／ｃｍ２の密度での播種と比較してより明確な細管を形成したが、第５日までに、両方の密度で播種した細胞は、良好に明確な細管を有していた（図３Ａ）。これらの結果は、細胞播種密度を変動させることによって、培養物をｈＰＥに曝露した場合にネットワーク形成の成熟段階を制御できることを示す。例えば、毛細血管ネットワークの定量画像分析（平均細管長［ｍｍ］、細管密度［＃／ｍｍ２］、分岐点［＃／ｍｍ２］、メッシュ［＃／ｍｍ２］および平均細管幅［ｍｍ］）（図３Ｃ）は、より高い播種密度がより遅いネットワーク成熟をもたらし（最高の平均細管長およびメッシュの数／ｍｍ２に達するまでの時間枠が延長される）、ネットワーク形成の時間枠が延長できるので、より詳細な分析を可能にすることを示した。比較上、より低い細胞密度は、より早い成熟速度をもたらし、このことは、（例えば）がん治療のための血管新生阻止物質の有効性を試験するための迅速スクリーニングアプローチに対してより伝導力があると考えられる。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイの歴史的な代表として、Ｍａｔｒｉｇｅｌにより誘導された血管新生ネットワークを、ｈＰＥにより誘導されたネットワークと比較した（図３Ｄ）。カルセインＡＭを用いて細胞培養物をＭａｔｒｉｇｅｌまたはｈＰＥのいずれかに曝露して、生存性およびネットワーク構造を決定することにより、内皮細胞毛細血管ネットワークの形態をまず分析した。播種後第１日に、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたプレートは、ＨＵＶＥＣが明確な血管新生細管ネットワークを形成することを示したが、３ｄ後に、ネットワーク構造は、アポトーシス細胞の球状ボールに崩壊した（図３Ａ、３Ｄ）。いくらかの細胞死はｈＰＥにより誘導されたネットワークにおいて確認されたが、延長された５ｄ期間の後にアポトーシスボールの形成は観察されなかった。
【０１２２】
血管新生の後期段階中に、ＥＣは平滑筋細胞（ＳＭＣ）を動員して、毛細血管ネットワークが成熟するにつれて血管を安定化する。よって、平滑筋細胞形態に対するｈＰＥおよびＭａｔｒｉｇｅｌの影響を評価した。興味深いことに、ＨＵＶＥＣの非存在下では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に播種したＳＭＣは、１ｄ後に細管を形成した（図３Ｂ．ｉ）が、ｈＰＥでコーティングしたプレート上では、典型的な「丘と谷」が依然として形成され（図３Ｂ．ｉｉ）、このことは、細胞種間での分子シグナル伝達経路に著しい差があることを示した。ＳＭＣは、微小血管形成の初期段階で細管を形成することは知られていないので、これらの結果は、ｈＰＥベースの血管新生がより正確に、正常な生理に相当ことを示し得る。
【０１２３】
薬物スクリーニング用途のためのｈＰＥにより誘導された血管新生の分析
再生医療におけるその役割に加えて、ヒト胎盤抽出物（ｈＰＥ）により駆動される血管新生を、血管新生関連薬物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングするその能力について試験した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを対照として用いた。ＭａｔｒｉｇｅｌおよびｈＰＥベースの血管新生アッセイを、新血管形成に対する有効な阻害活性を有する糖タンパク質であるトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）に対してスクリーニングした。ＴＳＰ−１は、固形腫瘍の抗血管新生処置のためのモデル薬物である２３。培養１ｄ後に、組織培養プレート上に直接播種した対照ＨＵＶＥＣは、ＴＳＰ−１により影響されず、細胞は典型的な丸石の形態を形成した。これとは対照的に、ｈＰＥ処理培養プレート上で培養したＨＵＶＥＣは、血管新生ネットワーク形成が著しく低減した（図４Ａ）。結果は、ＴＳＰ−１濃度の関数として全細管長および分岐点が直線的に減少することを示す（図４Ｂ）。重要なことには、これらの研究は、ｈＰＥベースのアッセイが、Ｍａｔｒｉｇｅｌベースのアッセイと比較して、薬物濃度に対してより感度が高いことを示す。このことは、ＴＳＰ−１濃度と血管新生ネットワークカバー面積のパーセント低減との間のより高い相関により示され、Ｒ２値はそれぞれ０．９７および０．３６である（図４Ｃ）。ネットワーク形成のこの阻害は、未知のストレス応答ではなく実際の血管形成が起きていることをさらに確証する。さらに、ｈＰＥはヒト由来であるので、これは、非ヒト系を用いてスクリーニングすることによりもたらされ得る種差に基づく不正確さを回避する１３、１４。
【０１２４】
３Ｄ生体スキャフォールド内でのｉｎ  Ｖｉｔｒｏ血管新生ネットワーク形成
工学的に操作された器官への血管形成を成功させることは、再生医療による治療をうまく開発する上での主な難題であり２４、ｅｘ  ｖｉｖｏ由来生体スキャフォールドにおいて血管新生を誘導するｈＰＥの能力を分析した。これらの研究は、ｈＰＥが、工学的に操作された（脱細胞化された）ヒト臍帯静脈（ＨＵＶ）生体スキャフォールドにおける血管新生ネットワークの形成を誘導したことを示す（図５Ａ）。２Ｄ培養プレートにおけるアッセイと一貫して、生体スキャフォールド上に播種された内皮細胞（ＥＣ）は、複雑な相互連結ネットワークを形成する多細胞索条に連結された長く伸びた形態に発展した。
【０１２５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生は、様々な機序により生じ、最も一般的には出芽または陥入である。これらのデータは、ｈＰＥとインキュベートする場合に細胞密度を変動させることにより、血管新生の出芽対陥入をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節できることを示す。より低い細胞密度（２×１０４細胞／ｃｍ２）では、ｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールド上のネットワーク形態は、出芽血管新生を示し（図５Ｃ．ｉ、５Ｃ．ｉｉ）、中間の密度（４×１０４細胞／ｃｍ２）では、ネットワーク形態は出芽と陥入との組み合わせの血管新生を示し（図５Ｃ．ｉｉｉ、５Ｃ．ｉｖ）、より高い密度（６×１０４細胞／ｃｍ２）では、ネットワーク形態は陥入血管新生により近似していた（図５Ｃ．ｖ、５Ｃ．ｖｉ）。出芽は一般的に、毛細血管がない低い細胞密度領域において血管新生の早期段階に生じるので、細胞密度と血管新生の特定の機序との間の相関は、ｉｎ  ｖｉｖｏ毛細血管およびネットワーク形成の現在の理解を支持する。これとは対照的に、陥入は、毛細血管および内皮細胞が既に存在するより高い細胞密度の領域に生じる２５、２６。
【０１２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生の誘導
皮下ラットモデル（図６Ａ）を用いて、成分添加したスキャフォールド（ＭａｔｒｉｇｅｌおよびｈＰＥ）に対する血管新生応答を、移植５日後に評価した。対照およびＭａｔｒｉｇｅｌとインキュベートしたスキャフォールドはともに、スキャフォールドの周囲に著しい線維化を示したが、ｈＰＥを成分添加したスキャフォールドは、インプラントの周りに識別可能な線維化を示さなかった（図６Ｂ．ｉ〜６Ｂ．ｉｉｉ．）。ｈＰＥ試料における線維化の防止は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出されるように、それらに限定されないが、抗炎症性アネキシン（ＡＮＸＡ１、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ４およびＡＮＸＡ５）２７、抗微生物デフェンシンペプチド、例えばＤＥＦＡ１２８、ならびにウイルスおよび細菌を含む可能性のある病原体と結合することが知られているＭＲＣ１を含む免疫関連分子に起因すると考えられる。
【０１２７】
明視野顕微鏡検査により示されるように、ＭａｔｒｉｇｅｌおよびｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールドはともに、対照と比較して、新血管形成の著しい増加を示した（図６Ｂ．ｉｖ〜６Ｂ．ｖｉ．）。全血管形成は同程度であると見受けられるが、ｈＰＥ処理は、成熟毛細血管床の形成を示す一方、Ｍａｔｒｉｇｅｌ試料は、成熟毛細血管床形成の証拠はなく、組織化がより低いと見受けられた。Ｈ＆Ｅ染色切片は、細胞がｈＰＥ中でインキュベートしたスキャフォールドの中および全体に遊走したが、Ｍａｔｒｉｇｅｌとインキュベートした試料では、細胞浸潤が低減し、対照試料中の細胞は、スキャフォールド周縁に限定されたことを示す（図６Ｂ．ｖｉｉ．〜６Ｂ．ｉｘ．）。ＭａｔｒｉｇｅｌおよびｈＰＥとインキュベートした試料の両方における細胞遊走の改善は、スキャフォールド構造に吸着した化学走性および増殖因子シグナルの結果であった。ｈＰＥおよびＭａｔｒｉｇｅｌを成分添加したスキャフォールドはいずれも細胞遊走が対照に対して改善されるにもかかわらず、これら試料群間の細胞リモデリングは変動を示した。Ｍａｔｒｉｇｅｌとインキュベートした試料における細胞が密な領域は、元のＨＵＶ線維の残りを示し、その全般的な構造は、ｈＰＥとインキュベートしたスキャフォールドがほぼ完全にリモデリングされたように見受けられより組織化された線維および細胞構造を示したのと比較して、定性的により無定形であった（図６Ｂ．ｖｉｉ．〜６Ｂ．ｉｘ．）。
【０１２８】
考察
組織再生、梗塞組織および虚血創傷修復は、創傷回復または器官置換のための方策の改善が著しい臨床的影響を有する、３つの臨床領域である。様々な用途における羊膜および絨毛膜の使用は、過去５年間で著しく成長し、周産期組織がかなりの臨床的見込みを有することを示す証拠が増えてきている２９〜３２。
【０１２９】
本明細書における結果は、血管新生および組織リモデリングの、強力なヒト由来刺激物質の生理的比率を濃縮して送達するための新規なアプローチを詳細に説明する。これらのデータは、毛細血管形成の開始（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）、成長または成熟の動力学を調節する能力を伴った血管新生中のＥＣ表現型の制御、およびｉｎ  ｖｉｖｏ組織線維化における著しい低減へと向かう、増強された細胞活性を示す。
【０１３０】
毛細血管ネットワーク形成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟速度を調節し、出芽および陥入血管新生ネットワーク形態の出現を制御する能力は、創傷治癒および器官再生中の調節経路のさらなる理解のために有用なプラットフォームを提供すると考えられる。Ｍａｔｒｉｇｅｌとの比較に基づいて、ｈＰＥが細胞を刺激する機序は、基本的に異なるように見受けられる。ＭａｔｒｉｇｅｌとインキュベートしたＳＭＣは、毛細血管様形成を開始したが、ｈＰＥに曝露されたＳＭＣは、それらの典型的な丘および谷の形態を保持し、よって、ヒト由来ｈＰＥは、より複雑なモデルにおける生理的血管新生のより代表的なモデルを与え得る。
【０１３１】
いくつかの現在のモデルは、単一または分離した組み合わせの血管新生調節物質に依拠するヒト由来（組換え）調節物質に基づく３３。分離した組み合わせは、変動を制御し、雑多的アプローチの固有の複雑さを低減するために有用であるが、これらは、スクリーニングプロセスを限定し、抗血管形成性、腫瘍抑制性の薬物の能力を試験する場合に重要になると思われる、一連の広範なヒトｉｎ  ｖｉｖｏ分子相互作用に相当するものではない。
【０１３２】
ｈＰＥベースのモデルの固有の複雑さは、腫瘍抑制薬物についてのより効果的なスクリーニングアプローチを提供することにより、製薬産業における進歩を導き得る。現在の技術と比べて、ヒトＥＣをｈＰＥに曝露することは、血管新生阻害薬物濃度（ＴＳＰ−１）に対する感度の増加と、より低い検出限界を有することが示された。
【０１３３】
ｈＰＥベースのモデルは、ほぼ生理的比率にあるヒト由来分子の広範なセットを用いて血管新生を誘導する。選択された分子経路のみを調節することは、新規な抗血管新生薬物を発見する試みを制限すると考えられる。なぜなら、ｉｎ  ｖｉｖｏの血管形成は、多重の代謝経路の誘導を必要とするからである３４、３５。よって、ある薬物はこれらの多数の経路のいずれかとの相互作用により血管新生を調節し得るとしても、局所的環境の複雑さが欠如している場合に十分な血管新生を誘導する効果はほとんど有さないと考えられる。本実施例におけるｉｎ  ｖｉｖｏ分析からの結果は、複雑なＰＥが多数の生化学的経路に影響し、広い範囲の効果をもたらすことのさらなる証拠を提供する。データは、ｈＰＥが、血管新生特性の増強を示すだけでなく、ｈＰＥを成分添加した生体スキャフォールド内での線維化の低減により示されるように、免疫低減特性を有することも示すことを示した。血管新生と免疫学的分子経路との間の複雑な相互の関連性に鑑みて３６、ｈＰＥの分子組成物は、著しい免疫学的および炎症反応なしで毛細血管形成を誘導するための、臨床的に利用可能な技術の開発のための適切な基礎を提供する。
【０１３４】
上記の研究の肯定的な結果は、鍵となる増殖因子（ＧＦ：growth factors）および遺伝子調節因子がＰＥに存在するということだけでなく、それらが生理的比率において存在するということにも関連すると見られる。例えば、ＶＥＧＦはｈＰＥにより誘導されたＥＣにおいて上方制御されたが、ｈＰＥ溶液は検出可能なレベルを含んでいなかった。このことは、標準およびＧＦＲ（増殖因子低減）バージョンの両方において活性濃度のＶＥＧＦを含むＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＭＭ）と対照的である。より成熟した毛細血管床形成を示す本明細書における結果から、ＶＥＧＦの存在は、多くの寄与因子のうちの１つだけであり、その他の制御因子の存在が、血管発達において鍵となる役割を演じる可能性が高い。同様に、血管新生を開始するために用いられるヒト組換えタンパク質と比較すると、これらは、高度に濃縮された（典型的には）単一のＧＦに依存する３７〜３９。単一で高度に反応性なＧＦを臨床的に用いたことが望ましくない影響をもたらした問題が報告されている４０〜４２。
【０１３５】
ｈＰＥ血管新生モデルは、２Ｄおよび３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルならびに生物工学的に操作された組織インプラント内でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて検証されており、様々な臨床または製薬用途に直ちに適応できる。その血管新生および免疫低減性特性と共に、それが生理的に健常なヒト血管床から導出されるということは、現在の血管新生モデルのうちでそれをユニークなものにする。ここで示すデータは、より成功する代替的アプローチに対する要求が臨床的優先事項となっているいくつかの鍵となる臨床的問題において、ｈＰＥが決定的な役割を演じることを示した。
【０１３６】
実施例１についての参考文献
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【０１３７】
（実施例２）
血管新生の刺激のための胎盤抽出物の制御送達
序説
組織工学は、病気の患者に移植するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでゼロから組織および器官を構築することをねらいとする。しかし、移植に代わるこの革命的な代替は、移植グラフトに播種した細胞へ酸素および栄養素を供給するための適切な脈管構造の形成の欠如を伴う。よって、組織工学構築物において血管新生を誘導するための効果的な方法が差し迫って必要である。
【０１３８】
現在までに、工学的に操作された生成物において血管形成を促進することを試みる全ての方法は、結果として成功していない。本開示は、上記の実施例に記載するように、血管新生の初期段階を誘導および調節することが示されたヒト胎盤から血管新生促進性抽出物を導出するプロトコールを提供する。
【０１３９】
本実施例は、毛細血管ネットワークの形成を促進し、それを経時的に持続する３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイについて記載する。この目的のために、胎盤抽出物の血管新生能力および経時的なその生物活性を分析した。これらの調査は、抽出物の頻繁な投与が成熟した長持ちする毛細血管ネットワークの形成を促進することを示した。よって、抽出物の組み込みおよび制御放出のための生分解性ゼラチン微小粒子を調製し、それらの分解動態を研究した。最後に、３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを開発した。胎盤抽出物添加微小粒子を、ＨＵＶＥＣを播種したＩ型コラーゲンヒドロゲルスキャフォールドに包埋し、マトリクス内の微小血管形成の初期段階の証拠を証明した。
【０１４０】
器官または組織の喪失または不全は、現代社会における最も重篤で高価なヒトの健康問題の１つである。外科的再構築、薬物療法、合成装具、機械的装置および移植を含むこの問題を解決するための多くのアプローチが試みられている。長期間では、これらのアプローチは、通常、失敗する。なぜなら、これらは、喪失器官または組織の機能を完全には置き換えないからであり２、または移植の場合は、器官に対する需要が大きく、ドナーの数が不十分である。
【０１４１】
一解決法は、工学的に操作された器官または組織を開発することであると考えられる。しかし、現在の組織工学アプローチは、厚い生体スキャフォールドを横切って生じる栄養素障壁を部分的な原因として、成功が限定されている。厚い（＞２００μｍ）組織構築物を工学的に得るための大きな難題は、酸素拡散が組織工学スキャフォールドにおいて１５０〜２００μｍの距離に典型的に制限されるので、３Ｄ組織構築物内の細胞成長および生存性が損なわれることである６、７。酸素は、細胞生存のために重大な栄養素であり、酸素なしでは、スキャフォールド内の細胞は死滅する。さらに、乏しい輸送条件は、細胞により分泌される線維化莢膜の形成を頻繁にもたらす。この莢膜の形成は、スキャフォールド内の栄養素物質移動の欠如をもたらし、最終的に低い細胞密度をもたらす。よって、長期間持続できる組織を工学的に得る上で、３Ｄ組織構築物中に播種した細胞への酸素および栄養素の送達を容易にする方法は有益であると考えられる。本開示の胎盤抽出物および方法は、スキャフォールド内で栄養素に富む毛細血管系の迅速な発達を誘導することを含む、酸素および栄養素欠乏を克服するためのアプローチを提供する。構築物の縁へだけでなく、中央にもこれらの必須の栄養素を供給するために方法を実行することは、線維化莢膜の形成を防止する助けとなると考えられる。
【０１４２】
血管新生は、組織発達および維持の中心であり、その調節がうまく行くことは、移植されたグラフトにおける確立された血管ネットワークの制御された形成を促進する。いくつかの生物学的因子および分子経路が、まだ部分的に未知のこの複雑なプロセスの調節に関与する。血管成長を開始および制御する分子機序をよりよく理解するために、研究は、単純、明確かつ制御された条件下で血管新生の決定的な要素をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
【０１４３】
ｖｉｖｏで再現する細胞培養系である血管新生アッセイの開発に焦点を当てている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生を促進するために様々な異なるアプローチが用いられているが、現在までに、それらを臨床的な実施に移すことはほとんど成功していない。ほとんどの血管新生モデルの制限は、それらが動物由来（例えばＭａｔｒｉｇｅｌベース）であるか、または生存動物の使用に完全に依存している（例えばヒヨコ絨毛尿膜およびウサギ角膜微小ポケット）ことである。さらに、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏで自然な様々なサイトカインおよび化学勾配を欠く。その結果、これらのアッセイの結果は、長持ちする血管形成の欠如のために、しばしばがっかりするものである。よって、ヒト起源の堅固なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、機械論的研究およびヒトのための血管新生薬物のスクリーニングのために有用であると考えられる。
【０１４４】
胎盤は容易に入手可能な組織であり、血管組織および血管新生関連増殖因子の豊富な供給源であることに鑑みて、これらの研究において、上記および実施例１に記載したように、血管新生を促進するサイトカインおよび血管新生関連増殖因子が豊富な粘性タンパク質化合物である多重タンパク質ヒト胎盤抽出物またはマトリクス（ｈＰＥまたはｈＰＭ）を導出するために胎盤を用いた。ｈＰＥが、限定された期間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生の初期段階を誘導および調節できることが示された。さらに、ｈＰＥは、線維化を著しく低減することも示された。
【０１４５】
本実施例は、成熟毛細血管ネットワークの形成を可能にするのに十分長くｈＰＥ内の増殖因子が機能的であり続けるような、ｈＰＥの持続送達のための方法を提供する。この目的のために、微小粒子の多用性、およびポリペプチドを効率的にカプセル化してそれらを長期間連続的な速度で放出するそれらの能力２２のために微小粒子を送達系として開発した。
【０１４６】
微小粒子は、１〜１０００μｍの範囲のサイズで大きい表面対体積比を有する２３固形で、ほぼ球形の粒子である。これらは、自然（例えばデンプン、ゴム）および合成（例えばポリ乳酸およびポリグリコール酸）の両方のいくつかの異なる物質から、熱溶融押出、噴霧乾燥または溶媒除去２４のような異なる方法を用いて調製できる。微小粒子の放出速度は、それらのサイズを変化させることにより調節でき、より小さい粒子は、表面対体積比が増加するので、大きいものよりも早く溶解する。この理由から、異なるサイズの粒子を組み合わせることにより送達速度を調節することが可能である２５。微小粒子からの薬物またはタンパク質の放出は、通常、単純なマトリクス生物浸食により生じる。このプロセスは、粒子表面の浸食を含み、次いで、バルク浸食および粒子の孔への放出媒体の侵入が続く２６、２７。
【０１４７】
本実施例では、３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを行うために、生分解性ゼラチン微小粒子を調製して使用した。血管新生アッセイは、単純、明確かつ制御された条件下で血管新生の決定的要素をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで再現する細胞培養系である２８。これらは、２次元または３次元であり得る。３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、ＥＣは、基質の表面上、および通常バイオゲルで構築される１３周囲のマトリクスに侵入するものの両方で管状構造を発展させる。
【０１４８】
本実施例は、移植したグラフト内で長持ちする血管ネットワークの形成を促進するための３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイの実施形態を提供する。この実施形態では、アッセイは、ＰＥ添加微小粒子とともにヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＩ型コラーゲンマトリクスに包埋することにより調製する。異なるインキュベーション時間でのＨＵＶＥＣの血管新生応答を、次いで、分析した。
【０１４９】
実験方法
内皮細胞単離および培養。ヒト臍帯静脈から予め単離し、Ｊａｆｆｅら（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎｓ．５２、２７４５〜２７５６；１９７３、ＨＵＶＥＣの単離および培養に関して本明細書に参照により組み込まれている）により記載されるようにして予め培養したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ａｃｕｔａｓｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてフラスコから剥離し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを培地（５００ｍｌのＶａｓｃｕＬｉｆｅ基礎培地に加えた２５ｍｌのグルタミン、０．５ｍｌのヒドロコルチゾン、０．５ｍｌのアスコルビン酸、１０ｍｌのＦＢＳ、１．２５μＬのＶＥＧＦおよび１．２５μＬのｂＦＧＦ）に再懸濁し、血球計数器を用いてＨＵＶＥＣを計数した。
【０１５０】
時間の関数としてのｈＰＭ血管新生性の分析。ｈＰＥインキュベーション時間がＨＵＶＥＣ血管新生応答にどのように影響するかを評価するために、細胞を、ｈＰＥでコーティングした組織培養プレートに植え、１日、３日または５日間ｈＰＥとインキュベートした。手短に述べると、上記の実施例に記載する単離方法を用いて胎盤マトリクスを調製した。抽出物を含むバイアルを融解し、９６ウェルプレートのウェルにピペットで入れた（１ｃｍ２あたり１００μＬ）。２０，０００細胞／ｃｍ２にて細胞溶液を直接ピペットで入れることにより、植えるためにＨＵＶＥＣを調製した。プレートの調製した各試料（１ｃｍ２あたり２００μＬ）に血管新生培地を加え、プレートを３７℃にて湿潤５％ＣＯ２インキュベータに入れた。
【０１５１】
ｈＰＥが経時的に生物活性をどのように保持するかを決定するために、２０日、１５日、９日、７日、５日、３日および１日を含む様々な時間、ｈＰＥを貯蔵した（５％ＣＯ２および３７℃のインキュベータ中）。次いで、各時点からのｈＰＥ膜で組織培養９６ウェルプレートをコーティングし、上記のようにしてＨＵＶＥＣを播種した。細胞を３日間培養し、血管新生ネットワークを定性的に特徴付けた。
【０１５２】
接種回数の関数としてのｈＰＥ血管新生性の分析。ｈＰＥ接種回数に対するＨＵＶＥＣの応答も分析した。最初に、ｈＰＥ膜上に第１日に細胞を播種し、第１日の後にｈＰＥ成分添加のためにｈＰＥを培養培地と混合した。細胞を５日間培養し、いくつかの試料群は、第１日（播種の日）に１回のみのｈＰＥの接種を受け、他の群は第１日および第３日に２回の接種、他の群は第１日、第３日および第４日に３回の接種を受けた。
【０１５３】
ゼラチン微小粒子の調製。Ｔａｂａｔａら（ゼラチン微小粒子の調製に関して本明細書に参照により組み込まれている）により記載される方法３３を用いてゼラチン微小粒子を調製した。用いた全ての試薬は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。手短に述べると、１ｇのゼラチンを９ｍＬの脱イオン水に加えることにより、Ｂ型ゼラチンの１０％ｗｔ水溶液を調製した。温度を４５℃に上げ、４００ｒｐｍの不断の撹拌の下でシリンジおよび２１−Ｇ針を通して溶液を３７５ｍｌの温（４５℃）オリーブ油に滴下した。１０分後に、エマルジョン温度を１５℃に下げ、撹拌を３０分間維持してゲル化を誘導した。１００ｍＬの冷アセトンを加え、エマルジョンを１時間撹拌した。微小粒子を真空ろ過により取り除き、アセトンで洗浄して乾燥させた。一旦乾燥すると、これらを０．１％ｗｔのＴｗｅｅｎ８０および０．５％ｗｔのグルタルアルデヒドを含む水溶液に入れた。溶液を１２５ｒｐｍ、４℃にて１５時間絶えず撹拌して、微小粒子の架橋を容易にした。架橋微小粒子を真空ろ過により回収し、脱イオン水で洗浄し、１００ｍＬの１０ｍＭグリシン水溶液中で撹拌して、いずれの未反応のグルタルアルデヒドもブロックした。１時間後に、ろ過により微小粒子を再び回収し、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥した。微小粒子ｍｇあたり１００μＬの純粋ｈＰＭをインキュベートすることにより、架橋凍結乾燥ゼラチン微小粒子に添加した。最大速度で混合物をボルテックスし、４℃にて一晩インキュベートして、吸着が起こさせた。
【０１５４】
ｈＰＥ添加微小粒子からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出動態。ゼラチン微小粒子の分解動態を評価するために、１０ｍｇ（乾燥重量）の空の未架橋微小粒子を、ｐＨ７．４、３７℃にて１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートし、タンパク質アッセイキットを用いてタンパク質放出動態をｈＰＥ添加架橋および未添加架橋微小粒子からの放出と比較した。手短に述べると、各検体の上清を定期的（１、２、３および６時間後、次いで毎日）に回収し、新しいＰＢＳで置き換えた。プレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｋ  Ｓｉｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダー、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、Ｖｅｒｍｏｎｔ；ＵＳＡ）を用いて５６２ｎｍで吸光度を測定しながら、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いて上清中のタンパク質を定量した。タンパク質濃度は、２００〜０．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度のウシ血清アルブミンの新しく調製した標準物質と比較した。最終の値は、実験の開始からの全放出タンパク質として得て、空の未架橋微小粒子乾燥重量または実験の開始前の推定湿潤重量の関数として標準化する。吸光度の値は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）の値に対して標準化する。アッセイの直線範囲は２〜４０μｇ／ｍＬであり、検出限界は０．１μｇ／ｍＬであった。各実験は、１点につき３つの試料で行った。
【０１５５】
３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイの調製。ＨＵＶＥＣおよびＰＥ添加微小粒子を包埋したＩ型コラーゲンマトリクスを用いて非平面３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを調製した。８ｍＬの冷Ｖｉｔｒｏｇｅｎコラーゲン、１ｍＬの滅菌ＰＢＳおよび１．１６６ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を混合することにより、コラーゲンヒドロゲルマトリクスを調製した。赤から紫への溶液の色の推移は、ｐＨの変化を示した。溶液のｐＨは、ｐＨ試験紙で確認し、数滴の０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは０．１ＭのＨＣｌ溶液を加えることにより７．４に調整した。ゲル化の前に、溶液中の３ｍＬのＨＵＶＥＣを４０，０００細胞／ｍＬの濃度で加え、以前に記載された１７ようにして調製した２ｍｇの添加微小粒子を加えた。その後、コラーゲン／細胞／微小粒子溶液を均質になるまでピペット操作により混合し、４８ウェルプレートの各ウェルに５００μＬをピペットで入れた。コラーゲンゲル化を誘導するために、培養プレートを３７℃のオーブンに３０分間入れた。コラーゲンヒドロゲルの最終の厚さは６．６ｍｍであった。最後に、１ｃｍ２あたり１００μＬの血管新生培地を各ウェル（細胞を播種し、ゲル化し、微小粒子を包埋したヒドロゲルを含む）に加え、プレートを３７℃の湿潤５％ＣＯ２インキュベータに入れた。
分析方法
【０１５６】
カルセインＡＭでの蛍光染色。生存死滅アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いてカルセインＡＭ染色を行った。手短に述べると、２μｇ／ｍｌの最終濃度で培養ウェルに存在する培地にカルセインＡＭを直接ピペットで入れた。染色された細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、これらを次いで倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００倒立蛍光顕微鏡）を用いて観察した。
【０１５７】
定性的および定量的ネットワーク形成分析。血管新生のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける実験条件に対する細胞応答の分析は、いくつかの半定性的および定量的方法において以前の研究（それぞれは本明細書に参照により組み込まれている）３４〜３７で行われている。形態学的（平均細管長）および位相幾何学的（分岐点の数およびメッシュの数）パラメータの両方を考慮した。なぜなら、これらは、毛細血管様ネットワークにおけるＥＣの空間的構成の特徴付けを可能にするからである。
【０１５８】
細胞染色の後に、各試料について選択した視野を撮影した。ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓ（Ｗａｙｎｅ、Ｒａｓｂａｎｄ−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を用いて、得た画像を分析した。
【０１５９】
分岐が合流するかまたはそこから細管が出芽する節である分岐点（ＢＰ）を同定して計数した。六角形に配置された血管に囲まれる無血管領域により同定される３８細胞ネットワークのメッシュも手動で計数した。最後に、各細管に沿って直線（ズーム画像の図８における白い点線）を描くことにより細管長を評価し、その直線の測定をソフトウェアにより自動的に算出した。
【０１６０】
走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）。走査型電子顕微鏡検査（Ｓ−４０００  ＦＥ−ＳＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）により微小粒子表面構造を調査した。凍結乾燥試料を、両面グラファイトテープを用いてアルミニウムの試料台の上に載せ、スキャッタ（scatter）（ｄｅｓｋＶ、Ｄｅｎｔｏｎ  Ｖａｃｕｕｍ）を用いて金およびパラジウムでコーティングした。試料の画像を、次いで、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４０００  ＦＥ−ＳＥＭ（ＴＸ、ＵＳＡ）で撮影した。
【０１６１】
統計分析。実験は、１点につき３つの試料を用いて行った。全ての図表にしたデータは、平均±標準偏差として示した。データ分析は、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ、Ｓｏｍｅｒｓ、ＮＹ）を用いて行った。有意性検定は、不等分散で対応のない両側スチューデントのｔ検定を用いて算出した。有意性レベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
結果
【０１６２】
ＰＥの血管新生能力。収集したデータは、ＰＥに対するＨＵＶＥＣの血管新生応答の程度が、インキュベーション時間およびＰＥを与えた接種回数により強く影響されることを示す。
【０１６３】
インキュベーション時間について、ＰＥとインキュベートしたＨＵＶＥＣは、血管新生様ネットワークを形成し、その形態は、インキュベーション時間の関数として変動した（図９Ａ〜Ｂ）。播種後第１日にて、ＨＵＶＥＣは、明確なネットワークをまだ形成しなかった（図９Ａ、第１日）。メッシュは多数（１０２．６７±３．５２）で小さく、短い細管が観察された（平均細管長：７８．８５±３．２４μｍ）。また、分岐点の数（ＢＰ）は多かったが（１０５±９．８５）、いくつかの細胞クラスタの存在下では同定するのが困難であった。培養第３日（図９Ａにおける第３日）にて、よく形成されたネットワークが出現した。これは、より少数のＢＰ（７１±６．２５）、より長い細管（平均長：１３６．４３±１５．２３μｍ）およびより広くかつより少ない多数のメッシュ（６１．３３±８．０２）の存在によっても確認される。培養第５日（図９Ａ、第５日）にて、ネットワークはまだ目視可能であったが、分解し始めた。細管はより長かったが（１７０．５６±１６．５１μｍ）、より少なくかつより薄かった。メッシュは同定するのが困難であり、その数は減少した（３６．３３±６．０２）。ＢＰについて、その数はわずかに減少した（６３±４）。ネットワークの分解は、細胞がＰＥ内に含まれる血管新生分子を既に使い尽くしたことに起因し得る。対照プレート（各画像の右上の隅）において細管形成は観察されず、よって、細胞形態の変化がストレスまたはその他の外因によるものでないことが示された。
【０１６４】
ＨＵＶＥＣの空間構成の半定量的分析を図９Ｂのヒストグラムに示す。バーは、平均細管長、ＢＰの数およびメッシュの数を示す。３つ全てのパラメータを考慮して第１日と第５日との間で統計的な差が見出されたことに気付くことができる。
【０１６５】
本研究では、毛細血管様ネットワーク形成は、ＰＥの接種回数に影響された（図１０Ａ〜Ｂ）。平均細管長は、１回の接種を受けた細胞から３回受けたものまで増加したが、ＢＰおよびメッシュの数はともに減少した（図１０Ａおよび１０ＢＢ）。ＰＥの１回の接種の後に、明確なネットワーク形成はなかった。メッシュは多数であったが（７６．６７±１９．７４）、平均細管長（１２９．７１±１２．８８μｍ）によっても確認されるように、広がっていなかった（図１０Ａ、最初のパネル）。さらに、いくつかのＢＰ（１１０．７８±１５．４０）および細胞クラスタがあり、よって、細胞がうまく接続されてないことを示した。２回の接種を受けた細胞はネットワークを形成したが、いくつかのクラスタがまだ存在した（図１０Ａ、２つ目のパネル）。このことは、ネットワークが完全に成熟していないことを示唆し得る。しかし、平均細管長は増加したが（１３９．９１±８．９３μｍ）、メッシュの数および分岐点は減少し（それぞれ５２．６７±１９．７４および８４．３３±１１．８６）、よって、ネットワークがより明確な構造に向かっておそらく変化していることを示した。３回の接種を受けた細胞は、より広いがより少ないメッシュ（４３．８９±６．５２）を有し、ＢＰの数が低減した（８０．６７±１１．９２）（図１０Ａ、３つ目のパネル）。細管長は増加し（１５３．８９±８．５４μｍ）、細管が一緒に接合して、ネットワーク構造を改善したことを示唆した。また、この場合、対照プレート（各パネルにおける右上の隅）において細管形成は観察されなかった。
【０１６６】
図１０Ｂにおける棒グラフは、ＨＵＶＥＣの空間的構成の半定量的分析を示す。平均細管長、ＢＰの数およびメッシュの数を示すバーは、受けたＰＥの接種回数（１、２または３回）に従って３つの群に分かれている。データは、１回の接種を受けた細胞（１２９．７１±１２．８８μｍ）から３回受けた細胞（１５３．８９±８．５４μｍ）まで平均細管長の増加を示し、細胞がより成熟したネットワークに組織化していることを示唆した。この知見は、メッシュの数（７６．６７±１９．７４から４３．８９±６．５２まで）およびＢＰの数（１１０．７８±１５．４０から８０．６７±１１．９２まで）の両方の減少が観察されたことによっても支持される。行った統計分析から、１回の接種を受けた細胞と３回受けた細胞との間に３つ全てのパラメータにおいて差が見出された。
【０１６７】
抽出物の保持された生物活性について、抽出物は、３７℃で湿潤５％ＣＯ２インキュベータ中の１５日間の貯蔵までその血管新生能力を維持する（図１１）。貯蔵１日と７日との間で有意差は観察されなかった。ＰＥのこれら全ての特徴に鑑みて、ＰＥは、経時的に一定で持続性の放出のために適切であると考えられた。
【０１６８】
ゼラチン微小粒子の特徴付け。いくつかの調製物のゼラチン微小粒子のサイズ分布分析は、これらのサイズ範囲が２０．８８６±３．５３から１２４．０８３±１３．０１μｍの間であったことを示した。これらの８０％近くが、２０〜８０μｍの範囲の直径を有していた（図１２Ｂ）。図１２Ａに示す微小粒子のＳＥＭ検査は、空の微小粒子と添加微小粒子との間に表面形態の差を示した。空の微小粒子（上の列）は、平滑な表面および規則的な形状を示した。添加後（下の列）、粒子はより大きく、不規則的な表面を有していた。これらの２つの外観は、（ｉ）表面へのＰＥの付着（吸着）および（ｉｉ）粒子内部へのＰＥの浸透（吸収）２７を意味する。
【０１６９】
図１３は、非架橋微小粒子の分解プロファイルを示す。この実験は、空の微小粒子を用いてのみ行って、ＰＢＳ中のゼラチンの分解動態を評価した。初期バーストが観察された。６時間後に、累積パーセント放出は、６．４５％±０．１２であった（図１３、挿入図）。バーストの後に、よりゆっくりした放出が続いた。２０日後に、全累積放出は１８．６５％±０．０９であった（図１３、主図）。
【０１７０】
図１４Ａは、空の微小粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解（黒、ＰＥなし）およびＰＥを添加した微小粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（灰色、ＰＥ）を示す。両方の場合では、小さい初期バーストが観察された。４８時間後に、添加微小粒子からの累積パーセント放出は１．０３％±０．０８であったが、空の微小粒子については０．７６％±０．０５であり、両方の場合においてほぼ一定の放出が続いた。２２日後に添加および空の微小粒子からの累積パーセント放出はほぼ同じであり、グラフにおいても強調するように、それぞれ４．６５％±０．０７および４．６５％±０．１１であった。２３日目に、空の微小粒子からの放出は、添加粒子からのものよりもわずかに大きかった（それぞれ５．１８±０．０５および４．９２±０．０９）。ほとんどのＰＥが放出されたという証拠に基づいて、実験を終えた。
【０１７１】
図１４Ｂは、添加微小粒子と空の微小粒子との間の放出パーセントの差を示す。２つのピークが観察できる。最初のピークは１時間目から第５日までであり、２つ目は第５日から第２２日までである。第１のピークは、粒子表面と結合しているＰＥが最初に、より短い期間で放出されたことを示す。おそらく大量の粒子の浸食による第２のピークは、より長く続き、全累積放出はより大きい。このことは、放出媒体により微小粒子に形成された孔またはチャネルからＰＥが徐々に放出されることを示す。
【０１７２】
初期「バースト」の存在にもかかわらず、ろ過により得られた微小粒子から示された放出動態は、ゼロ次プロファイルに近く、このことは、放出がほぼ一定であることを意味する。本発明者らは、このことは、同じ試料中に異なるサイズの粒子が共存することに起因し得ると論じる。放出速度は、粒子サイズにより影響され、より正確には、より小さい微小粒子は、表面積対体積比の増加の結果として、より大きい放出を有する。この現象は、制御されたほぼゼロ次の放出プロファイルを達成するために薬物またはタンパク質放出を調節するために既に用いられている２５。
【０１７３】
空の微小粒子および添加微小粒子の両方からの全累積放出は、通常２０％を超える３９、４０文献に報告された値より幾分低い。このことは、高度の架橋に起因し得る。
【０１７４】
３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ。最適細胞密度およびＰＥ体積を決定した後に、上記の方法に記載したようにして血管新生アッセイを調製した。培養３日後に、細管形成の兆候はなく、ＰＥ添加微小粒子を播種したＨＵＶＥＣと対照との間に差はみられなかった（結果は示さず）。培養５日後に、細胞の形態は変化し、出芽が観察されたが、毛細血管様ネットワークはまだ形成されなかった（図１５）。出芽は、血管新生の初期段階であり、よって、培養５日後の出芽の存在は、ＨＵＶＥＣからの血管新生応答を証明する４１。播種後３日でネットワークは形成されなかったので、粒子により放出されるＰＥの量は、観察した時間枠内で血管新生を促進するためには不十分であった可能性がある。しかし、出芽の形成は、ＰＥが放出され、血管新生応答が開始したことを示す。微小粒子の放出速度は、より短時間の枠内で細管形成を促進するように最適化できる。
【０１７５】
考察および結論
本実施例の知見は、ＨＵＶＥＣの血管新生応答が、インキュベーション時間だけでなく、受けたＰＥの接種回数によっても影響されることを明らかにする。特に、初期の実験では、毛細血管ネットワークは播種１日後から形成され始め、３日後によく明確になり、５日後に分解し始めた。ＨＵＶＥＣが、１回より多いＰＥの接種を受けた場合に、より成熟した毛細血管ネットワークを形成することも示された。さらに、本実施例では、ネットワークは、上で論じた実験におけるように、５日後に分解しなかった。最後に、抽出物は、貯蔵１５日目までその血管新生能力を維持する。ＰＥのこれら全ての特徴に鑑みて、ＰＥは、経時的に一定で持続性の放出のために適切であると考えることができる。よって、血管新生を誘導および調節するその能力を改善することを目標として、多重タンパク質混合物のための薬物送達の方法を、生分解性ゼラチン微小粒子を用いて開発して、生物活性をさらに保存し、ｈＰＥの送達を制御および延長した。
【０１７６】
この目的のために、生分解性ゼラチン微小粒子を、ＰＥの送達系として調製した。ゼラチン粒子へのｈＰＥの吸収および吸着を、ＳＥＭ検査およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出動態の分析により評価した。ＳＥＭ分析は、添加粒子と空の粒子との間でサイズの増加および形態の変化を示し、このことは、表面へのｈＰＥの付着（吸着）および／または粒子への浸透（吸収）の結果である。放出動態は２つのピークを示し、第１のピークは、微小粒子の表面上に結合したタンパク質の放出の結果であると考えられ、このピークは、第２ピークよりも小さく、より短い期間で生じた。第２のピークは、大量浸食に起因すると考えられた。なぜなら、これは、より高い全累積放出をより長い期間、有していたからである。初期「バースト」の存在にもかかわらず、放出動態は、第１日後にゼロ次プロファイルに近かった。分析により、粒子が３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイにおける抽出物の持続放出のための媒介物として用いるために適切であることが明らかになった。
【０１７７】
これらの研究は、３Ｄ  Ｉ型コラーゲンマトリクスに組み込まれた場合に、ｈＰＥ添加ゼラチン微小粒子が、培養５日後にいくらかの細胞出芽とともに細胞を長い形態および細管形成の初期段階に誘導したことも示す（図１５、右）。出芽は血管新生の初期段階であるので、出芽の存在は、ＨＵＶＥＣからの血管新生応答を意味する。空の微小粒子および添加微小粒子の両方からの観察された全累積放出は、２３日後にほぼ５％であったが、これは、単一タンパク質がゼラチン微小粒子から放出される場合の文献に報告される２０〜３０％の値より著しく低い。低い累積放出にもかかわらず、粒子により放出されるｈＰＥの濃度は、コラーゲンヒドロゲル内で血管新生応答を生じるためにまだ十分高かった。よって、ｈＰＥ添加ゼラチン微小粒子を包埋したコラーゲンヒドロゲルは、抗血管新生がん薬物をスクリーニングすることから、細管および血管新生ネットワーク形成の機械論的研究までの範囲で用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイにおける応用の可能性がある。
【０１７８】
全体として、本実施例は、生分解性ゼラチン微小粒子を、３Ｄ血管新生アッセイにおける多重タンパク質ｈＰＥの持続放出のための媒介物として用いることができることを証明した。ｈＰＥ添加ゼラチン微小粒子を用いて細胞出芽が培養５日後に観察されたが、相互連結毛細血管ネットワークは形成されなかった。粒子により放出されるｈＰＭの量の増加または培養時間の延長は、より相互連結された毛細血管ネットワークの形成を促進し得る。
【０１７９】
実施例２についての参考文献
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【０１８０】
（実施例３）
血管新生を調節するためのＰＬＧＡ微小粒子からの胎盤抽出物放出
導入
本開示のヒト胎盤抽出物の単独投与は、実施例１で上記に記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生の初期段階を誘導および調節することが示された。経時的なｈＰＭの複数回投与は、さらなる毛細血管ネットワーク発達を促進することが示されたので、制御送達は、上記の実施例２に記載するように、延長された期間ネットワーク形成をさらに安定化すると仮説を立てた。本実施例では、ｈＰＥをポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）微小粒子にカプセル化して、放出期間を延長した。微小粒子調製物をｈＰＥ添加のために最適化し、形態学的特徴（サイズ、カプセル化効率、多孔性）を特徴付けて、タンパク質放出をプロファイリングした。
【０１８１】
移植組織または組織構築物のために血管新生を誘導するために上記で同定された問題を克服するために、本開示の方法では、ヒト胎盤を用いて、毛細血管ネットワーク形成を誘導でき、上記の実施例に記載するように血管新生および免疫調節タンパク質を含む本実施例においてヒト胎盤マトリクス（ｈＰＭ）というヒト胎盤抽出物を導出した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｈＰＭ上に播種した内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、上記で、血管新生遺伝子の上方制御とともに血管新生ネットワークを形成することが示され、ｉｎ  ｖｉｖｏで、マトリクスは、成分添加した生体スキャフォールド内で血管形成を誘導しつつ組織線維化を阻害することが示された。さらに、規則的な時点（培養の第１日、第３日および第５日）にて複数回のｈＰＭ接種を受けた内皮細胞は、そのネットワークが５日後に分解し始めた単独接種だけを受けた細胞と比較して、より安定で長持ちする血管新生ネットワークを形成した。よって、経時的なマトリクスの制御送達のためのアプローチについて調査して、より長持ちし、より安定な毛細血管ネットワーク形成を可能にした。
【０１８２】
ｈＰＭの複雑で不均質な性質は、制御放出機序を複雑にし得る。例えば、タンパク質の異なる電荷および鎖特性は、お互いの相互作用および制御放出のために用いる材料との相互作用のために、添加効率に対して影響を有し得る。自然のおよび合成の両方の微小粒子材料が、タンパク質をカプセル化するその能力について調査されている。自然の材料、例えばコラーゲン、キトサンおよびアルギン酸塩は、生体適合性および侵襲的でないカプセル化技術を提供し、これらは、約７から１０日の間の分解速度を有し、これは、ある程度の持続放出を可能にするが、より長い期間の持続タンパク質放出のための使用を制限し得る１１、１２、１３。化学または光化学架橋は、これらの微小粒子の分解を遅くし得る９、１４。
【０１８３】
ＰＬＡ共重合体は、生物医学用途においてタンパク質カプセル化のために用いられており、ＦＤＡ承認済み生体適合性合成材料である１５、１６、１７。これらの重合体は、タンパク質の長持ちする制御放出を与えることができ、複合物および多層微小粒子を創出するために用いることができる１５、１８。これらの材料のうち、ＰＬＧＡまたはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）は、特定の増殖因子（例えばＢＭＰ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の制御放出のために用いられている１９、２０、２１。
【０１８４】
研究は、単一タンパク質のＰＬＧＡカプセル化について評価しており、いくつかは多重タンパク質の同時カプセル化について調査しているが２２、２３、タンパク質の複雑な不均質混合物のカプセル化について評価した研究はない。本実施例は、ＰＬＧＡ微小粒子を用いるｈＰＭについての組成物およびカプセル化技術について記載し、内皮細胞の３Ｄ培養物におけるこの混合物の制御放出の効果について評価する。
【０１８５】
ｈＰＭの不均質な組成に鑑みて、本実施例に記載する本実施形態では、細胞培養物における用途のための多重タンパク質ｈＰＭ放出に適するようにＰＬＧＡ合成プロトコールを最適化した。微小粒子サイズの最適化（再生医療のために適するように）、高い添加量およびカプセル化効率、低い初期バーストならびに制御放出プロファイルを含めて考慮した。さらに、内皮細胞を用いて血管新生を誘導するのに適当な濃度においてｈＰＭが微小粒子から放出されることを確認した。微小粒子合成および添加の後に、分析を行って、カプセル化プロセスがｈＰＭタンパク質について選択的であるかを評価した。血管新生の誘導に対する制御ｈＰＭ放出の効果を、ＨＵＶＥＣを播種したアルギン酸塩ベースのヒドロゲルに包埋したｈＰＭ添加微小粒子を用いる３Ｄ培養系を用いて評価した。２８日間の間の特定の時点にて細胞挙動を評価して、培養の全期間にわたってＰＬＧＡ微小粒子からのｈＰＭの制御された成分添加を受けた細胞と比較して、第１日にｈＰＭの単回の直接接種を受けた細胞の応答を評価した。
【０１８６】
方法
複数回の急速投与ｈＰＭ接種の効果。軌道振とう器を３０ｒｐｍにて１分間用い、９６ウェル組織培養プレートのウェルをピペットを用いて均一にコーティングすることにより、ＨＵＶＥＣを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、血管新生ネットワーク形成中のｈＰＭ成分添加プロファイルの効果の分析を決定した。プレートを次いで３７℃にて３０分間インキュベートして、ｈＰＭを温めた。ＨＵＶＥＣを血管新生培地に懸濁し、ｈＰＭの上にピペットで入れ、次いで、３７℃にて湿潤６％ＣＯ２インキュベータに入れた。対照のために、ＨＵＶＥＣを２０，０００細胞／ｃｍ２にて血管新生（Angiogenci）培地で培養した。ｈＰＭ接種の３つの異なるプロファイルを比較した。１）ｈＰＭを第１日（播種の日）にのみ接種して加えた、２）ｈＰＭを第１および３日に接種した、および３）ｈＰＭを第１、３および５日に接種した。細胞を７日間培養し、培地を第３および５日に置き換えた。対照として、細胞を同じ密度にてプレートの底に直接播種し、培地を２日ごとに置き換えた。細胞を第７日に染色し、蛍光顕微鏡を用いて画像化し、「血管新生定量」の項に記載するようにして画像を分析することにより、血管新生を定量した。
【０１８７】
ＰＬＧＡ微小粒子調製。水中油中水エマルジョン（プロトコール１）（Ｄｕｒｅｃｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）を用いてＰＬＧＡ（ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド））微小粒子を調製した。実施例１に記載したようにｈＰＭタンパク質混合物を用いて一方の水溶液（Ｗ１）を調製し、２ｇのポリビニルアルコール（ｗｔ３０，０００〜７０，０００、８７〜９０％加水分解、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１００ｍＬのＤＩ水に溶解することにより他方の水溶液（Ｗ２）を調製した。油溶液（Ｏ）は、溶液が透明に見えるまで９０ｍｇのＰＬＧＡを３ｍＬのクロロホルムに溶解することにより得た。Ｗ１をＯに加え、２０，０００ｒｐｍにて１分間均質化した。マイクロピペットを用いて、得られた一次エマルジョンを３００ｒｐｍにて撹拌しながらＷ２に滴下した。全ての一次エマルジョンを加えたときに、得られた二次エマルジョンをアルミホイルで軽く覆い、換気フード内で一晩撹拌したまま（３００ｒｐｍ）にして、溶媒を蒸発させた。次に、二次エマルジョンを１０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、上清を取り除き、微小粒子をさらに２回ＤＩ水で洗浄した。固くなった微小粒子をＤＩ水に懸濁し、４８時間凍結乾燥し、次いで、必要になるまで４℃にて貯蔵した。対照のために、ｈＰＭの代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で置換することによりＷ１を作製して（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、単一タンパク質添加ＰＬＧＡ微小粒子を創出した。
【０１８８】
ｈＰＭ混合物の不均質な性質のために、カプセル化は、ＰＬＧＡ微小粒子からの制御放出の難しい要素である。よって、サイズおよび放出に対するプロトコールの改変の影響を分析した。まず、一次段階のより長い均質化の影響を評価した（プロトコール２：１分の代わりに２分）。次いで、二次水中油中水エマルジョンの形成の後かつ溶媒除去の前に導入したさらなる均質化ステップの影響を調査した（プロトコール３：１分のさらなる均質化；プロトコール４：２０秒のさらなる均質化）。各改変の後に、最適化プロセスに移る前に、微小粒子の形態学的特徴および関連する放出速度を評価および比較した。
【０１８９】
ＰＬＧＡ微小粒子形態学的特徴付け。ＰＬＧＡ微小粒子の形態学的特徴を、顕微鏡検査を用いて評価した。カラーデジタルカメラ（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＬＥＤ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ＩＬ、ＵＳＡ）が装着された倒立光学Ｌｅｉｃａ顕微鏡を用いて微小粒子の平均サイズを評価した。フリーソフトウェアＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓ（Ｗａｙｎｅ、Ｒａｓｂａｎｄ−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ−ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて、撮影した画像を分析した。粒子を手動でトレースした後にＬｅｉｃａ  ＬＡＳソフトウェア（Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて自動測定することにより、各粒子の直径を決定した。
【０１９０】
走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）（Ｓ−４０００  ＦＥ−ＳＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて微小粒子の表面形態および多孔性を特徴付けた。形状および表面分析のために、凍結乾燥試料を、両面グラファイトテープを用いてアルミニウムの試料台の上に載せ、スキャッタ（scatter）（ｄｅｓｋＶ、Ｄｅｎｔｏｎ  Ｖａｃｕｕｍ）を用いて金およびパラジウムでコーティングした。コーティングした試料を、次いで、２ｋＶの加速電圧にて調べ、低倍率で撮影して平均寸法および形状を評価し、高倍率で多孔性および形態学的特徴の変化を評価した。
【０１９１】
添加効率。微小粒子溶解後のカプセル化されたタンパク質の直接測定を用いて、ＰＬＧＡ微小粒子中のｈＰＭ添加効率を決定した。これは、Ｒａｖｉ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．７０、（２００８）およびＩｇａｒｔｕａ，Ｍ．ら、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＢＳＡ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＰＡＧＥ  ａｎｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １６９、４５〜５４（１９９８）（これらはともに加水分解技術について本明細書に参照により組み込まれている）に記載される加水分解技術の適応により行った。手短に述べると、１５ｍｇの凍結乾燥マイクロスフェアを、５％ｗ／ｖのＳＤＳを含む５ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いて消化し、振とう器上で１５ｈ、室温にて、透明な溶液が得られるまで加水分解した。得られた透明溶液を、次いで、１Ｍ  ＨＣｌを加えることによりｐＨ７まで中和し、５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。ＵＶ−可視分光光度計を５６２ｎｍにて用い、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ標準タンパク質アッセイを用いて、１点につき３つの試料を用いて上清中のタンパク質濃度を分析した。カプセル化効率は、理論的タンパク質含量に対する実際のタンパク質含量の比率として表した。
【０１９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈＰＭ放出の特徴付け。ＰＬＧＡ微小粒子からのｈＰＭの放出を特徴付けるために、１０ｍｇの添加微小粒子を１ｍＬのリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。チューブを振とうインキュベータ中でインキュベートし、３つの試料を各プロトコールについて評価した。２日ごとにチューブを５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を回収し、等量の新しいＰＢＳをチューブに加えた。タンパク質濃度は、５６２ｎｍでの吸光度を分光光度計で測定することにより定量した。標準Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＳＡアッセイとマイクロ−タンパク質ＢＳＡアッセイからの結果の比較を行って、試験した各時点での放出されたタンパク質のより信頼できる評価を得た。測定は、１点につき３つの試料を用いて収集した。タンパク質濃度は、２００から０．５μｇ／ｍＬまでの範囲の新しく調製した標準物質と比較した。標準ＰＢＳの平均吸光度を全ての測定値から減じた。各試料中のタンパク質の量は、それぞれの以前の時点での量と合計して、累積放出曲線を構築した。
【０１９３】
ｈＰＭは、様々な電荷および特性を特徴とする増殖因子、細胞外マトリクスタンパク質および生体分子を含む複雑なタンパク質混合物であるので、これらの研究は、選択的にカプセル化が生じるかを決定するために、ｈＰＭ添加微小粒子からのタンパク質放出を分析した。一晩の撹拌の後に回収した上清に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。ｈＰＭ添加およびＢＳＡ添加微小粒子からの上清、ならびに微小粒子に添加するときと同じ濃度で用いたＰＶＡ中のｈＰＭおよびＢＳＡ（５０ｍＬ  ＤＩ水中の１０ｍｇ  ＢＳＡおよび５ｍＬ  ＤＩ水で希釈した５０μＬ  ｈＰＭ）を含む４つの溶液を分析した。タンパク質標準物質を用いて、検出したタンパク質の分子量を評価した。ＢＩＯ−ＲＡＤ電気泳動システム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ｐａｇｅを行った。電気泳動の後に、ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで１時間、連続的な振とう下で染色した。次いで、ゲルを４：１：５のメタノール：酢酸：ＤＩ水溶液中で脱染色することによりタンパク質のバンドを増強した。最終のゲルをＤＩ水で洗浄し、画像化した。
【０１９４】
アルギン酸塩−ヒドロゲルベースの３Ｄ培養。添加微小粒子を用いる血管新生アッセイを創出して、制御ｈＰＭ放出のための応用を評価した。ｈＰＭ添加微小粒子を包埋した３Ｄアルギン酸塩ゲル（１．５％アルギン酸塩）中にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種して培養した。試料群は、純粋ｈＰＭを含むアルギン酸塩に懸濁した細胞、包埋したｈＰＭ添加微小粒子を含むアルギン酸塩に懸濁した細胞、微小粒子なしのアルギン酸塩に懸濁した細胞、および空の微小粒子を含むアルギン酸塩に懸濁した細胞を含んだ。全ての試料群について、ＨＵＶＥＣを培地に懸濁し、アルギン酸塩マトリクスに穏やかに懸濁した後に、０．０５４Ｍ塩化カルシウム溶液をピペットで入れることにより重合した。アルギン酸塩−細胞懸濁物を静置して１５分間重合を可能にし、次いで、ゲルをＰＢＳで洗浄し、培養培地を加え、プレートを３７℃にて湿潤６％ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０１９５】
ｈＰＭをマトリクスに直接加えた条件と、ｈＰＭを微小粒子から放出した条件との間の比較結果を得るために、それぞれのゲルに混合したｈＰＭの濃度は、包埋した微小粒子から２１日後に放出されたタンパク質の濃度（１ｃｍ２あたり７８μｇのタンパク質）と等しかった。微小粒子からの持続制御ｈＰＭ放出の影響を、カルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて染色したゲル内の細胞ネットワークの形態学的特徴付けにより、ｈＰＭの急速投与接種と７、１４、２１および２８日に比較した。
【０１９６】
血管新生定量。血管新生の出力の定量は、ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて行った。倒立蛍光顕微鏡を用いて得た５倍の倍率での画像を、以下のパラメータ、すなわち実施例１に記載するように時間中にＨＵＶＥＣにより形成されたメッシュの数、分岐点の数および細管様構造の長さを評価および定量するために処理した。
【０１９７】
統計分析。微小粒子および３Ｄ培養物の両方についての実験は、１点につき３つの試料を用いて行った。全てのグラフおよび表にしたデータは、平均±平均標準誤差として示した。分析は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）およびＭｉｎｉｔａｂ  １５（Ｍｉｎｉｔａｂ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）を用いて行った。有意性は、ＡＮＯＶＡ検定を用いて算出し、ここでは、２より多い条件を評価し、具体的な差は、事後検定を用いて評価した。２つだけの条件を比較した場合、不等分散の、対応のない両側スチューデントのｔ検定を用いた。有意性レベルは＊ｐ＜０．０５に設定した。
【０１９８】
結果
複数回急速投与ｈＰＭ接種の影響。血管新生ネットワークへのＨＵＶＥＣの形成は、経時的に受けたｈＰＭの成分添加の回数に影響された（図１６Ａ〜１６Ｄ）。図１６Ｅに示すように、細管長は接種の数の関数として増加した。メッシュの数および分岐点の数について有意な差は生じなかったが（図１６Ｆ〜１６Ｇ）、増加しかつより成熟したメッシュの傾向が、接種の回数の関数として観察された。成熟血管新生は、長い細管ならびに分岐点およびメッシュの数の低減を特徴とするので、結果から、ｈＰＬの連続投与が安定したネットワークを組織化するために内皮細胞を助けることが確認される。
【０１９９】
初期ＰＬＧＡ微小粒子調製：プロトコール１。プロトコール１から得られたＰＬＧＡ微小粒子は、４４７±３２μｍの平均サイズおよび１００から１０００μｍまでの範囲のサイズの正規分布を有していた。３つのバッチの微小粒子を同じ条件下で調製し、反復可能な分布を証明できた。ＰＬＧＡ微小粒子中のｈＰＭの添加効率は、６４±４％であった（データは示さず）。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出分析は、カプセル化したタンパク質の合計量の１０％に対応する低い初期バーストを示したが（２１．３８±０．８３μｇ／ｍＬ）、最初にカプセル化されたタンパク質の５１．２３±０．１９％（１３４．５６±０．５０μｇ／ｍＬ）は、２１日後にＰＬＧＡ微小粒子から放出された（データは示さず）。放出速度プロファイルは、評価した２１日の期間を通して線形かつ一定であるように見受けられたが、評価期間の最後に微小粒子から放出されたｈＰＭの量は、（上記のようにして）血管新生応答を誘導するためのｈＰＭ（５００μｇ／ｍＬ）の急速投与注入の使用と比較して、濃度が著しくより低かった。
【０２０１】
対照ＢＳＡ添加ＰＬＧＡ微小粒子は、２３９．６０±９．４５μｍの平均サイズおよび５０から４００μｍまでのサイズの正規分布を有し、７０％の微小粒子は１５０から３５０μｍの間の範囲であった。ＢＳＡ添加ＰＬＧＡ微小粒子の添加効率は、初期に添加したタンパク質の全量の７６±３％であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出分析は、カプセル化されたＢＳＡの全量の２０％（５１．５２±１．７６μｇ／ｍＬ）にてｈＰＭ添加微小粒子と比較してより高い初期バーストを示したが、最初にカプセル化されたタンパク質の６６．７±９．５５％（１６６．７４±２３．８μｇ／ｍＬ）が２１日後にＰＬＧＡ微小粒子から放出された（データは示さず）。放出速度プロファイルは、評価した期間を通して線形かつ一定であるように見受けられた。ｈＰＭ添加ＰＬＧＡ微小粒子とＢＳＡ添加ＰＬＧＡ微小粒子との間で観察された結果の差は、調製および添加プロトコールの最適化を通して放出動態を改善できることを示唆した。
【０２０２】
ＰＬＧＡ微小粒子サイズの最適化および形態の特徴付け。一次エマルジョンを２分間均質化した（プロトコール１よりも１分追加）プロトコール２を用いて創出した微小粒子からのサイズ分析は、２７６．７８±１３．４１μｍの平均直径を示した（図１７Ａ、１７Ｄ）。二次（secondard）エマルジョン調製ステップに１分の均質化ステップを加えたプロトコール３を用いて創出した微小粒子は、３７．７９±１．３０μｍの平均サイズを有していた（図１７Ｂ、１７Ｅ）が、二次（secondard）エマルジョンに２０秒均質化ステップが加えられたプロトコール４を用いて創出した微小粒子は、９１．８５±２．９２μｍの平均サイズを有していた（図１７Ｃ、１７Ｆ）。
【０２０３】
ＳＥＭ分析からの結果は、異なるプロトコール間で表面多孔性に著しい差を示さなかった。記載する異なる改変を用いて得られた微小粒子の表面は、全て均質な表面を有する丸い形状であるように見受けられた（図１８Ａ〜１８Ｆ）。図１８Ａ〜１８Ｃは、微小粒子形状を示し、図１８Ｄ〜Ｆは、それぞれプロトコール２、３および４により調製された粒子の微小粒子表面多孔性を示す。
【０２０４】
添加効率。カプセル化効率は、微小粒子のサイズと線形的に相関しているように見受けられなかった（図１９Ａ）。カプセル化効率は、プロトコール２について７３±４％まで増加し、プロトコール３においてサイズが著しく低減した場合に６３±３％まで減少した。最高のカプセル化効率は、プロトコール４を用いて得られ、初期の全タンパク質添加のカプセル化されたタンパク質の７９±９％であった。
【０２０５】
最適化されたｈＰＭ添加微小粒子からのｈＰＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出。最適化されたプロトコールを用いて創出した微小粒子からのｈＰＭの放出速度は、サイズおよび添加効率の差の直接的な結果であり、均質化ステップを改変することにより得られる放出プロファイル傾向は、類似するように見受けられた。初期バーストは、一次エマルジョン均質化ステップの期間の改変で著しく変化せず、プロトコール１における８．１４±０．３１％（２１．３８±０．８３μｇタンパク質／ｍＬ）（データは示さず）からプロトコール２の６．４２±２．０７％（１８．８８±６．１１μｇタンパク質／ｍＬ）まで行った。バースト放出における著しい増加が、二次エマルジョンの均質化を導入した場合に観察された。プロトコール４についての２７．７２±３．７３％（１０６．３３±１４．３３μｇ／ｍＬ）と比較して、プロトコール３について、カプセル化された全タンパク質の２３．７５±０．４０％（６０．８２±１．０３μｇ／ｍＬ）が第１日中に放出された（図１９Ｂ）。
【０２０６】
２１日後の累積放出は、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）サイズと相関し、より小さい微小粒子は、アッセイした期間においてより多くのｈＰＭの放出を可能にした。２１日の放出の後、プロトコール２からの微小粒子はカプセル化された全タンパク質の６４．０９±１．７０％（１８８．４３±５μｇ／ｍＬ）を放出したが、プロトコール３からのＭＰは、９８．６２±１．４０％（２５２．４８±３．６μｇ／ｍＬ）を放出し、プロトコール４からのＭＰは、８７．６０±１．１２％（３３５．９８±４．７２μｇ／ｍＬ）を放出した（図１９Ｂ）。Ｐ３およびＰ４放出プロファイルを延長された期間にわたって比較するためのさらなる分析は、３０日後にプロトコール３からの微小粒子が完全に分解されてｈＰＭをもはや放出しなかったが、プロトコール４からの微小粒子は、カプセル化された全タンパク質の９３．１２±０．２％（３５７±４．０９μｇ／ｍＬ）までを放出したことを示した。
【０２０７】
ＳＤＳ  ｐａｇｅからの結果は、回収して分析した上清に含まれるタンパク質の濃度が低いことにより制限された。しかし、分析は、特定のタンパク質についての選択的カプセル化のいずれの証拠もなく、ＰＬＧＡ微小粒子におけるｈＰＭの均一なカプセル化を示した。ＢＳＡ添加およびｈＰＭ添加の両方の微小粒子について、微小粒子が固くなった後に回収した上清の分析は、より低い濃度とともに同様のタンパク質含量を示した（図２０）。
【０２０８】
アルギン酸塩−ヒドロゲルベースの３Ｄ培養。血管新生アッセイからの結果は、ｈＰＭの制御放出が、内皮細胞播種マトリクスにおける毛細血管様構造の安定性を改善できることを示した。図２１は、培養７日後に、ｈＰＭ添加微小粒子が包埋されたアルギン酸塩ヒドロゲルにおいて培養したＨＵＶＥＣにおいてほんの少しの出芽および細管構造が観察された（かつ成熟ネットワークが観察されなかった）が、純粋ｈＰＭを含むマトリクスにおける血管新生形成は、同じ時間枠において比較的より成熟しており、２０７．９０±１５．３１μｍの平均細管長、１．２７±０．８４メッシュ／ｍｍ２、および９．６０±０．７０分岐点／ｍｍ２であった。しかし、培養１４日後に、ｈＰＭ添加ＭＰを包埋したアルギン酸塩ゲルは、１３７．４１±９．７７μｍの平均長および６．６６±０．４７分岐点／ｍｍ２の一次細管を組織化し始め、純粋ｈＰＭを含有するマトリクスは、血管新生ネットワークの分解を示し、メッシュは観察されず、２２６．５８±２５．６４μｍの平均長の孤立した細管だけが観察された。２１日にて、ＭＰ包埋ゲルは、未成熟のメッシュ形成、２０４．０７±１２．７５μｍの平均細管長および平均１１±１．２５分岐点／ｍｍ２を示した。全体として、培養２１日後に、形成された血管新生ネットワークは、分岐点の数／ｍｍ２におけるわずかな変化だけで安定したままであった（図２１）。培養２８日後に、平均細管長は１６８．８８±１０．３１μｍであり、分岐点の数の平均数／ｍｍ２は１２．９３±１．６１であり、平均メッシュ数は１ｍｍ２あたり３．１７±０．９３であった。
【０２０９】
考察
ＰＬＧＡ微小粒子を用いてカプセル化したタンパク質は、増殖因子の制御放出のための薬物送達系であり、一般的に用いられる製作技術は、水中油中水型法である１９、２０、２１。本研究では、２６００を超える血管新生および抗線維化タンパク質を含む複雑なヒト由来多重タンパク質混合物（胎盤マトリクスまたはｈＰＭ）をＰＬＧＡ微小粒子にカプセル化した。結果は、ｈＰＭ添加ＰＬＧＡ微小粒子を用いて、血管新生促進性および線維性タンパク質を含む多重タンパク質融合体の放出を経時的に持続および制御できることを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中に内皮細胞とともに用いると、ｈＰＭ添加ＰＬＧＡ微小粒子は、安定な血管新生ネットワークの形成を可能にする。
【０２１０】
これらの研究は、ｈＰＭが、複雑な多重タンパク質組成物に起因して、ＰＬＧＡ添加および微小粒子形態に影響を有していたことを明らかにした。単一タンパク質（ＢＳＡ）カプセル化と比較して、ｈＰＭ添加微小粒子は、ＢＳＡを添加したものよりも著しく大きい平均サイズを示した。これは、ｈＰＭ中のタンパク質と、ＢＳＡ添加微小粒子と比較して広く様々な異なる分子電荷、ｐＨおよびサイズを有するＰＬＧＡ重合体との間の複雑な相互作用の結果であり得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ｈＰＭ添加ＰＬＧＡ微小粒子から放出されたタンパク質の低い濃度に関わらず、希釈ｈＰＭと同様の組成で上清において広い分布が観察できたことを明らかにした。これらの結果は、タンパク質混合物のカプセル化が均質であり、特定のタンパク質について選択的でないことと、ｈＰＭのタンパク質組成が微小粒子調製中に影響を受けないこととを示唆した。
【０２１１】
均質化ステップの速度および期間はともに、微小粒子サイズに影響することが以前に示されている１７  ２７。本実施例は、ｈＰＭ添加ＰＬＧＡ微小粒子のサイズとｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出速度との間の相関を明らかにした。一次エマルジョン段階の均質化の最適化は所望の制御放出特徴を有する微小粒子を創出したが、これらの粒子におけるｈＰＭの添加効率は、評価した他の製作プロトコールと比較していくらか低かった。二次エマルジョン段階の均質化の最適化は、所望のサイズ範囲でタンパク質溶液のカプセル化が（７８％まで）増加した微小粒子を生成した。興味深いことに、カプセル化効率は微小粒子のサイズと相関しなかったが、代わりに、二次エマルジョンの均質化の長さに影響され、これは、不均質タンパク質混合物と重合体との間の相互作用を原因とする断片化された不完全粒子の形成の結果であり得る。
【０２１２】
上記の最適化ＰＬＧＡ微小粒子合成プロトコール（これは、非最適化プロトコールと比較して、より高いｈＰＭカプセル化効率、最適化微小粒子サイズおよび線形放出を３０日にわたって可能にする）を用いて、ｈＰＭ添加微小粒子をアルギン酸塩ベースの血管新生アッセイに組み込んで、経時的な制御ｈＰＭ放出に対する内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）応答を評価した。３Ｄ血管新生アッセイは、費用対効果のよい加工性と全体的に良好な細胞外材料としての特性とのためにアッセイの基礎として選択した３０、３１アルギン酸塩ゲルにｈＰＭ添加微小粒子を包埋することにより創出した。培養２１日後に、微小粒子から送達されたタンパク質の全量（７８μｇ／ｃｍ２）は急速投与注入を用いる以前の２Ｄ血管新生研究において送達された濃度（２６３μｇ／ｃｍ２）よりも低いにもかかわらず、ＨＵＶＥＣは、包埋されたｈＰＭ添加ＰＬＧＡ微小粒子に近い領域中のゲル内に血管新生細管を形成した。アルギン酸塩マトリクスと直接混合したｈＰＭの急速投与成分添加と比較して、ｈＰＭ添加微小粒子の使用は、２８日にわたって延長され持続する血管新生ネットワーク形成を可能にした。細胞は、ｈＰＭと直接混合したアルギン酸塩ゲルにおいて血管新生ネットワークをより早く形成したが、これらのネットワークは、ｈＰＭ添加微小粒子を用いるゲルと比較してより早く分解した。２８日後に、微小粒子からのｈＰＭ放出は、ほぼゼロ次であったが、新しい血管新生メッシュの形成はまだ確認でき、このことは、ＰＬＧＡ微小粒子からのｈＰＭの制御放出が、血管新生ネットワーク形成の安定性を改善したことを示唆した。
【０２１３】
全体として、本実施例は、複雑な多重タンパク質混合物を低い初期バーストと高いカプセル化効率で送達するために用いるためのＰＬＧＡ微小粒子合成プロトコールの最適化について記載する。ここで開発した方法を、次いで、新規な血管新生アッセイを開発するために用い、該アッセイは、アルギン酸塩マトリクス内での持続性の血管新生ネットワーク形成を可能にした。重要なことに、開発した技術は、広い範囲の組織工学および再生医療システムにおける用途とともに、任意の複雑な血清およびタンパク質混合物の送達における用途を有する。これらの技術は、血清添加ＰＬＧＡ微小粒子を包埋することで異なる材料（例えば、コラーゲン、フィブリン、ラミニン）に適用して、改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを開発し、細胞播種マトリクス内の持続性の血清送達が演じる役割のよりよい理解を得ることができる。
【０２１４】
結論
本実施例は、ｈＰＭカプセル化の方法の実施形態について記載し、血管新生構造形成が、アルギン酸塩ベースの血管新生アッセイを用いて観察された。２１日間の延長された期間にわたる持続性の血管新生応答が３Ｄヒドロゲル培養系内で観察された。このことから、毛細血管ネットワークの形成および維持を導くための制御ｈＰＭ放出アプローチの有効性が確認された。
【０２１５】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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