(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターにより大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を油脂関連物質により脂肪酸資化能を誘導し、その脂肪酸資化能誘導株を油脂関連物質を炭素源とする培地で培養し、得られる培養物からポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法であって、前記ポリエステル重合酵素遺伝子が、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡであって、ポリエステル重合酵素をコードするＤＮＡであり、前記油脂関連物質が、カプロン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、並びにこれらの塩及びエステルからなる群より選ばれる物質である、製造方法。
【請求項２】
ポリエステルが、一般式（１）：
【化１】
0004177912.tif 000010
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示す）で表される３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体である請求項１記載のポリエステルの製造方法。
【請求項３】
ポリエステル重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来の遺伝子である請求項１又は２記載のポリエステルの製造方法。
【請求項４】
脂肪酸資化能誘導株の培養を油脂関連物質を唯一の炭素源とする培地で行う請求項１〜３いずれか記載のポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された大腸菌を用いたポリエステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、自然環境（土中、河川、海中）の下で、微生物の作用を受けて分解するポリエステルの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例として、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産した、３−ハイドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと略す）と３−ハイドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）等の３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体が知られている（特開平５−９３０４９号公報及び特開平７−２６５０６５号公報）。３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体は、３ＨＨ分率の増加と共に結晶化度が低下するために、柔軟な高分子材料となり、熱安定性や成形性に優れるため、糸やフィルムを加工するのに好ましいことが知られている（Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe, Macromolecules 28, 4822-4823 (1995)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体をより効率よく製造するため、前記アエロモナス・キャビエより、ポリエステル重合酵素の遺伝子のクローニングを行い、該遺伝子を含むプラスミドベクターによりアルカリゲネス・ユートロファスを形質転換した形質転換体を得、この形質転換体の培養によりポリエステルの製造を行い、特許出願を行った（特願平８−２１４５０９号）。さらに、本発明者らは、より増殖が早く、工業的に有利な大腸菌を形質転換体として用いて、３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体等のポリエステルを生産したという例がない点に着目し、鋭意検討した。即ち、本発明は、ポリエステル重合酵素遺伝子を含むプラスミドベクターにより形質転換した大腸菌を用いて、熱安定性や成形性に優れた生分解性ポリエステルを安価に生産する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターにより大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を油脂関連物質により脂肪酸資化能を誘導し、その脂肪酸資化能誘導株を油脂関連物質を炭素源とする培地で培養し、得られる培養物からポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法であって、前記ポリエステル重合酵素遺伝子が、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡであって、ポリエステル重合酵素をコードするＤＮＡであり、前記油脂関連物質が、カプロン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、並びにこれらの塩及びエステルからなる群より選ばれる物質である、製造方法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の詳細を説明する。
【０００６】
１．形質転換体の取得方法
本発明のポリエステルとしては、例えば、一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
0004177912.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示す）
で表される３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体が挙げられ、その中では、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が好ましい。
【０００９】
前記ポリエステルを生合成するポリエステル重合酵素の遺伝子は、その由来については、特に限定されないが、特願平８−２１４５０９号に記載の方法により、アエロモナス属に属する微生物から分離して得ることができる。本発明で用いるポリエステル重合酵素遺伝子には、具体的にはアエロモナス・キャビエから分離したＤＮＡが挙げられ、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡであって、ポリエステル重合酵素をコードするＤＮＡが使用される。
【００１０】
前記（Ａ）に規定される、配列番号：１に示される塩基配列は、前記のようにアエロモナス属に属する微生物中のＤＮＡに見出される。また、（Ｂ）に規定されるような、配列番号：１に示される塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡも本発明の遺伝子に包含される。本明細書における「１個以上」とは、１個又は数個若しくはそれ以上の個数をいう。
【００１１】
塩基配列において、１個以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を行う手段としては、部位特異的変異技術のような自体常套の手段（Nucleic Acid Research Vol 10, pp6487-6500, 1982)等の種々の遺伝子工学的手法が挙げられる。
【００１２】
さらに、（Ｃ）で規定されるＤＮＡも本発明の遺伝子に包含される。本発明において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ」とは、プローブとともに０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す。）中、６８℃にて１２〜２０時間インキュベートした後に、プローブとハイブリダイズしているＤＮＡをいう。
【００１３】
また、本発明において、ベクターの構築に際しては、特願平８−２１４５０９号に記載されている遺伝子発現カセットを用いてもよい。該遺伝子発現カセットとして、例えば、発現制御領域、ポリエステル重合酵素遺伝子（配列番号：１）、ポリエステル重合酵素遺伝子の上流に位置するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）及び下流に位置するＯＲＦ（ＯＲＦ３）を含むＤＮＡ断片（ＥＥ３２）、あるいは該ＤＮＡ断片（ＥＥ３２）からＯＲＦ１又はＯＲＦ３のいずれか一方又は両方を欠失させたＤＮＡ断片等が使用される。なお、ＯＲＦ１の塩基配列を配列番号：２、ＯＲＦ３の塩基配列を配列番号：３に示す。
【００１４】
このように、遺伝子発現カセットのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ断片を切断した制限酵素と同じ制限酵素で切断したベクターと連結させることにより組換えベクターを作製することができる。
【００１５】
ベクターには、大腸菌の中で自律的に増殖し得るプラスミドベクターが用いられる。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。
【００１６】
前記ＤＮＡ断片とベクターを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いることができる。ＤＮＡリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等が挙げられ、具体的には、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが用いられている市販のライゲーションキット（宝酒造（株）製）等を使用することができる。
【００１７】
前記のようにして得られた組換えベクターを大腸菌に導入するには、例えば、カルシウム法（Lederberg, E. M. et al., J. Bacteriol. 119.1072 (1974)）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, １巻，1.8.4 頁, 1994年) 等の公知の方法を用いることができる。
【００１８】
本発明に使用する大腸菌には、特に制限がなく、ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の一般に市販されている菌株を用いることができる。
【００１９】
かくして、本発明に使用する形質転換体である大腸菌を得ることができる。
【００２０】
２．ポリエステルの製造方法
ポリエステルの製造は、本発明の形質転換体を油脂関連物質により脂肪酸資化能を誘導した後に、油脂関連物質を炭素源とする培地で培養することにより、ポリエステルを菌体内に蓄積させて、該培養菌体及び培養物からポリエステルを回収することにより行うことができる。
【００２１】
本発明においては、前記油脂関連物質により、まず脂肪酸資化能を誘導することに、一つの大きな特徴がある。かかる脂肪酸資化能を誘導することにより、培養時間に対する培養菌体の量が増加し、さらに、菌体内に蓄積されるポリエステルの量が増加するという効果が発現される。
【００２２】
脂肪酸資化能の誘導は、油脂関連物質を本発明の形質転換体を含む培地に添加することにより行うことができる。ここで用いられる培地としては、特に限定がなく、後述する本培養に用いられる培地であればよい。
【００２３】
油脂関連物質としては、例えば、カプロン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸等の脂肪酸、これら脂肪酸の塩及びこれら脂肪酸のエステル等が挙げられる。これらの中では、炭素数が４以上の脂肪酸が好ましい。
【００２４】
油脂関連物質の使用量としては、特に制限はなく、例えば、培地中において終濃度１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上であることが望ましく、培地中において終濃度５０ｍＭ以下、好ましくは２０ｍＭ以下であることが望ましい。また、脂肪酸資化能を誘導する際の温度としては、特に制限はなく、例えば２０〜４０℃程度であればよく、誘導する時間としては、特に制限はなく、例えば、１〜３日間程度であればよい。
【００２５】
かかる方法で、脂肪酸資化能を誘導した形質転換体は、グリセロールストックにして保存することができる。
【００２６】
次に、脂肪酸資化能を誘導した形質転換体を、油脂関連物質を炭素源とする培地で培養する。
【００２７】
本発明においては、油脂関連物質を炭素源とする培地を用いることに一つの大きな特徴がある。かかる油脂関連物質を炭素源とすることにより、グルコースとプロピオン酸を炭素源とする、大腸菌を用いて共重合体を発酵合成する方法（Slater. S.C. et al., Appl. Environ. Microbiol. 58. 1089 (1992)) に比べて、設備等の面から、ポリエステルを安価に製造することができるという効果が発現される。
【００２８】
前記油脂関連物質としては、脂肪酸資化能を誘導した形質転換体を調製した際に用いたものと同様のものであればよい。本発明では、炭素源として、前記のように油脂関連物質を用いることを特徴とし、炭素源中、好ましくは油脂関連物質を１０〜１００％使用するのがよく、特に好ましくは、油脂関連物質を唯一の炭素源とする場合である。
【００２９】
また、培養に用いられる培地には、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地であればよく、特に限定はないが、例えば、Ｍ９最小培地（０．６％リン酸水素二ナトリウム・１２水、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．００１％サイアミン）に増殖に最小限必要なビタミンとミネラルを添加したものを基本培地とし、炭素源をグルコースから油脂関連物質に置き換えた培地等が好ましく用いられる。
【００３０】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００３１】
その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ1 、ビタミンＢ12、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００３２】
かかる成分を含有する培地のｐＨは、中性又は微アルカリ性であればよい。
【００３３】
前記培地を用いた形質転換体の培養方法としては、通常の大腸菌の培養方法であればよく、例えば、培養温度は２５〜３７℃の範囲であればよく、好気的に１〜５日培養する方法が挙げられる。また、培養中はカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を適宜添加してもよい。
【００３４】
また、難溶性の油脂関連物質を可溶化するために界面活性剤を培地に添加してもよい。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ８０等が挙げられる。
【００３５】
かかる方法で培養した菌体からのポリエステルの回収は、常法により行うことができる。例えば、培養終了後、菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体をクロロホルム等の有機溶媒を用いて該有機溶媒中にポリエステルを抽出し、有機溶媒から濾過等によって菌体成分を除去した後、その濾液にメタノール等を加えてポリエステルを沈澱させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、ポリエステルを乾燥して回収する。得られたポリエステルの組成の確認は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行う。
【００３６】
かくして形質転換した大腸菌を用いて、ポリエステルを製造することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
【００３８】
製造例１〔形質転換体の取得〕
アエロモナス・キャビエ由来のポリエステル重合酵素遺伝子は特願平８−２１４５０９号に記載の方法により分離し、配列番号：１のＤＮＡを含む遺伝子発現カセットＥＥ３２（３．２ｋｂのEcoRI-EcoRI 断片；この配列を配列番号：４に示す) を用いた。この遺伝子断片を制限酵素EcoRI 処理、アルカリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１８とライゲーションキット（宝酒造（株）より購入）を用いてライゲーションし、組換えプラスミドを構築した。これを用いて塩化カルシウム法により、コンピテントセル化した大腸菌ＤＨ５α（東洋紡より購入）を形質転換した。以下、得られた形質転換体をＤＨ５α−ＥＥ３２株と呼ぶ。
【００３９】
実施例１〔Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造〕
１．脂肪酸資化能の誘導
ＤＨ５α−ＥＥ３２株をＭ９液体培地（０．６％リン酸水素二ナトリウム・１２水、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．００１％サイアミン）に炭素源としてラウリン酸ナトリウムを１％添加した培地に接種し、３７℃で１日間培養し、脂肪酸資化能を誘導した。この脂肪酸資化能を誘導した株をグリセロールストックにして保存し、以下の実験に用いた。
【００４０】
２．大腸菌形質転換体によるポリエステル合成
ＤＨ５α−ＥＥ３２株のグリセロールストックより前培養培地（炭素源としてラウリン酸を最終濃度が１０ｍＭになるように添加したＭ９液体培地）に接種し一晩３０℃で培養した。これを本培養培地（前培養と同じ培地）に植菌し、坂口フラスコ中で、３７℃で２４時間及び７２時間、連続培養した。培地には５０ｍｇ／ｌの濃度でアンピシリンを含有させた。遠心分離によって菌体を回収し、メタノール、蒸留水で洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体の重量を測定した。
【００４１】
得られた乾燥菌体３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（硫酸：メタノール＝１５：８５（混合比））と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することで菌体内のポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに蒸留水１ｍｌを添加し、激しく攪拌した。静置して混合液を二層に分離させた後、下層の有機層を取り出し、その組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１４Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。その結果を表１に示す。なお、表中の３ＨＢは、ヒドロキシ酪酸、３ＨＨｘは３−ヒドロキシヘキサン酸を示す。
【００４２】
比較例１
脂肪酸資化能を誘導したＤＨ５α−ＥＥ３２株のかわりに、脂肪酸資化能を誘導していないＤＨ５α−ＥＥ３２株を用いた以外は、実施例１と同様にして、菌体重量、ポリエステル含量及びポリエステル組成を調べた。その結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
0004177912.tif 000003
【００４４】
表１の結果から、脂肪酸資化能を誘導したＤＨ５α−ＥＥ３２株を用いた場合には、脂肪酸資化能を誘導していないＤＨ５α−ＥＥ３２株を用いた場合より、２４時間及び７２時間の本培養ではいずれも、菌体重量、ポリエステル含量がともに大きく、効率的にポリエステルを得ることができることがわかる。
【００４５】
特に、２４時間の本培養において、その差が顕著であった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性や成形性に優れた生分解性プラスチックであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を安価な脂肪酸を原料にして大腸菌で生産することが可能になった。
【００４７】
【配列表】
0004177912.tif 000004
0004177912.tif 000005
【００４８】
0004177912.tif 000006
【００４９】
0004177912.tif 000007
【００５０】
0004177912.tif 000008
0004177912.tif 000009