(57)【要約】  本発明は、架橋剤およびポリペプチド分子を架橋反応が起こるために適切である条件下、溶液中で結合させる工程を含むポリペプチド分子を架橋するための方法、ならびに、該方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物に関する。本発明はさらに、架橋されたポリペプチド分子であって、少なくとも４０個の連続する原子を含む本質的に枝分かれしていない架橋基によって架橋されているポリペプチド分子に関する。さらに、本発明は、酸化還元補酵素と、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤と、指示試薬と、を含む試験化学マトリックスであって、本発明による方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子のおよび／または本発明による架橋されたポリペプチド分子の調製物をさらに含む試験化学マトリックス、ならびに、該試験化学マトリックスを含む診断用試験エレメントに関する。本発明はさらに、疾患の診断における使用のための、および糖尿病の診断における使用のための本発明による方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子のおよび／または本発明による架橋されたポリペプチド分子の調製物、ならびに、試験化学マトリックスを製造するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋剤およびポリペプチド分子を、架橋反応が起こるために適切である条件下、溶液中で結合させる工程を含むポリペプチド分子を架橋するための方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが酵素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、両末端で化学的に活性化されている枝分かれ構造のない分子である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤が、ビス活性化ポリエチレングリコールである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤が、０．６ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子質量、より好ましくは、０．９ｋＤａ〜１０ｋＤａの分子質量、さらにより好ましくは、１ｋＤａ〜５ｋＤａの分子質量、最も好ましくは３ｋＤａの分子質量を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤／前記ポリペプチド分子のモル比が、０．２〜５、好ましくは０．５〜４、より好ましくは０．８〜３、最も好ましくは１〜２である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチド分子の少なくとも一部分が、グルコース脱水素酵素分子であり、好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも８０％が、グルコース脱水素酵素分子であり、より好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも９０％が、グルコース脱水素酵素分子である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物。
【請求項９】
架橋されたポリペプチド分子であって、前記ポリペプチド分子が、少なくとも４０個の連続する原子を含む本質的に枝分かれしていない架橋基によって架橋されている架橋されたポリペプチド分子。
【請求項１０】
前記ポリペプチド分子が酵素、好ましくは脱水素酵素である請求項９記載の架橋されたポリペプチド分子。
【請求項１１】
酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤および指示試薬を含む試験化学マトリックスであって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物および／または請求項９または１０記載の架橋されたポリペプチド分子をさらに含む試験化学マトリックス。
【請求項１２】
請求項１１記載の試験化学マトリックスを担体上に含む、体液サンプルからの分析物の測定のための診断用テストエレメント。
【請求項１３】
疾患の診断における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または請求項９または１０記載の架橋されたポリペプチド分子の調製物。
【請求項１４】
糖尿病の診断における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または請求項９または１０記載の架橋されたポリペプチド分子の調製物。
【請求項１５】
（ａ）請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法による架橋された酵素分子および／または請求項１０記載の架橋された酵素分子の調製物を取得する工程、ならびに
（ｂ）酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤、指示試薬、および工程（ａ）で取得される架橋された酵素分子の調製物を混合する工程、ならびにそれによって
（ｃ）試験化学マトリックスを製造する工程
を含む試験化学マトリックスを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋剤およびポリペプチド分子を架橋反応が起こるために適切である条件下、溶液中で結合させる工程を含むポリペプチド分子を架橋するための方法、ならびに、該方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物に関する。本発明はさらに、架橋されたポリペプチド分子であって、少なくとも４０個の連続する原子を含む本質的に枝分かれしていない架橋基によって架橋されているポリペプチド分子に関する。さらに、本発明は、酸化還元補酵素と、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤と、指示試薬と、を含む試験化学マトリックスであって、本発明による方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子のおよび／または本発明による架橋されたポリペプチド分子の調製物をさらに含む試験化学マトリックス、ならびに、該試験化学マトリックスを含む診断用試験エレメントに関する。本発明はさらに、疾患の診断における使用のための、および糖尿病の診断における使用のための本発明による方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子のおよび／または本発明による架橋されたポリペプチド分子の調製物、ならびに、試験化学マトリックスを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素の固定化は、化学合成に使用される酵素のリサイクルを可能にする、ハンドリングの利便性（例えば、生成物からの分離など）、および固定化された酵素調製物の向上された安定性という観点において当該技術分野において研究されてきた（非特許文献１にレビューされている）。したがって、酵素を固定化するためのいくつかの方法が従来技術において記載されてきており、例えば、酵素が固体粒子にカップリングされること、酵素をクロスリンクすること、酵素のキャプシド化、または固体マトリックス中への酵素の固定化などが挙げられる（非特許文献２）。クロスリンクのためには、酵素は結晶化されてそしてその後架橋されて架橋された酵素結晶（ＣＬＥＣｓ）が産生されるか、または、酵素は沈殿され、そして沈殿物がクロスリンクされた酵素凝集物（ＣＬＥＡｓ（登録商標））を産生するように処理される（非特許文献１）。架橋剤としては、グルタルアルデヒドが選択される一般的な薬剤である。しかしながら、グルタルアルデヒドは、多くの酵素がクロスリンクのあいだに不活性化されてしまうという不利益点を有しており、これは、グルタルアルデヒド分子の小さなサイズに起因し、タンパク質分子中へと浸透し、そして酵素の活性にとって極めて重要であるアミノ酸を不活性化させてしまうためであると考えられている（非特許文献１）。したがって、デキストランポリアルデヒドが、例えばニトリラーゼおよびペニシリンＧアシラーゼのためなどにおいて示されている、グルタルアルデヒドと比較した改良点を有する代替的な架橋剤として提案された（非特許文献３）。
【０００３】
診断用試験エレメントは、通常、患者の近くでの適用（near-patient application）における使用のために製造される。したがって、エレメントは、ハンドリングおよび保管に関して頑丈でなければならない。これは特に、試験エレメントの試験化学に適用される（非特許文献４を参照のこと）。しかしながら、多くの診断用試験エレメントは、試験エレメント上に存在する比較的複雑な酵素の試験化学に基づいている。具体的には、試験エレメントは、担体と、酵素を通常含んでいる検出層と、を含む。試験エレメントの適切な性能のために、これらの酵素が保管のあいだおよび処置の際に生物学的に活性な状態であることは非常に重要である。個々の測定における較正は通常可能でないため、試験エレメントは通常バッチ法で較正される。１バッチの試験エレメントに関する較正情報が保管され、そして処置および保管における個々の違いに関係なくそのバッチのそれぞれのエレメントに対して使用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Scheldon, Adv Synth Catal (2007) 349:1289
【非特許文献２】J.M.Guisan (ed), Meth Biotechnol Nr. 22: Immobilization of Enzymes and Cells, 2nd ed., Human press
【非特許文献３】Mateo et al, Biotech Bioeng (2004) 86(3):273
【非特許文献４】Hoenes, Diabetes Technology & Therapeutics (2008) 10: S10
【０００５】
しかしながら、試験エレメントの前処理および保管条件は、酵素の活性に重篤な影響をもたらし得る。例えば、試験エレメントの製造または保管のあいだのどちらかの熱処理は、試験エレメント上に存在する酵素の全体的な活性が顕著に低下するように酵素を変性させ得、これは、次いで、このような試験エレメントが使用された際に誤った試験結果をもたらすであろう。同様に、検出層における水分量の増加によって、検出層の酵素および他の成分は、拡散する傾向にあり、これは、二以上の試験化学の層を含む試験エレメントにおいて特に問題である。この問題は、試験ストリップが延長された時間のあいだ環境条件に暴露されている適用、例えば「オープンバイアル（open vial）」適用などにおいて、または、試験ストリップがカートリッジ中に提供されているような適用において、特に明らかである。したがって、そのような試験ストリップ中に含有される酵素は、荷電粒子に、例えばＴｒａｎｓｐａｆｉｌなどに吸収されている。しかしながら、この固定方法は、質量当たりベースで算出されるため、固定化された酵素の比活性を著しく薄めてしまい、これは、次いで、領域当たり必要とされる酵素活性を提供するために層厚の増加を必要とするという不利な点を有する。層厚におけるこの増大は、次に、分析物の層中への遅延された拡散に起因する反応時間の増大を通常もたらし、これは増大された試験時間が必要とされることを意味する。
【０００６】
したがって、当該技術分野において、ポリペプチドの固定化を改良するための手段および方法に対する必要性が存在する。とりわけ、質量当たりの比活性の著しい希薄化を避けて酵素を固定化する方法、および／または、細かく分散可能な凝集物の形状で酵素を固定化するための方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
前述の課題は、独立クレームの特徴を有する手段および方法によって解決される。単独の様式でまたは任意の組み合わせで実行され得る好ましい実施態様は、従属クレームに挙げられている。
【０００８】
したがって、本発明はポリペプチド分子を架橋させるための方法であって、架橋剤およびポリペプチド分子を、架橋反応が起こるために適切である条件下、溶液中で結合させる工程を含む方法に関する。
【０００９】
以下に使用されるように、用語「有する（have）」、「含む（comprise）」もしくは「包含する（include）」、またはそれらの任意の文法上の変形が非排他的に使用される。したがって、これらの用語は、そこに、これらの用語によって導入される特徴以外に、さらなる特徴が、本文脈において記載されている実体において存在していない状況および一またはそれ以上のさらなる特徴が存在している状況の両方を指し得る。例として、「ＡはＢを有する（A has B）」、「ＡはＢを含む（A comprises B）」および「ＡはＢを包含する（A includes B）」という表現は、Ｂ以外他の要素がＡ中に存在しない状況（すなわち、Ａが単独でかつ排他的にＢを構成しているという状況）、および、Ｂ以外に一またはそれ以上のさらなる要素、例えば要素Ｃ、要素ＣおよびＤ、またはさらなる他の要素さえもが実体Ａ中に存在している状況の両方を指し得る。
【００１０】
さらに、以下に使用されるように、用語「好ましくは（preferably）」、「より好ましくは（more preferably）」、「より好ましくは（more preferably）」、「特には（particularly）」、「より特には（more particularly）」、「具体的には（specifically）」、「より具体的には（more specifically）」または同様の用語は、代替的な可能性を制限することなく、任意の特徴と併せて使用される。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、任意の特徴であり、およびどのような形であれクレームの範囲を制限することを意図していない。本発明は、当業者であれば把握するであろうように、代替的な特徴を使用することによって行われてもよい。同様に、「本発明の態様において（in an embodiment of the invention）」または同様の表現によって導入される特徴は、本発明の代替的な実施態様に関するいかなる制限もなしに、本発明の範囲に関するいかなる制限もなしに、およびそのような方法において導入される特徴を本発明の他の任意のまたは任意ではない特徴と組み合わせる可能性に関するいかなる制限もなしに、任意の特徴であることが意図されている。
【００１１】
本発明のポリペプチド分子を架橋するための方法は、インビトロ方法である、さらには、上記で明示的に示したものに追加で工程を含んでいてもよい。さらなる工程は、例えば、架橋反応の前にポリペプチドを精製すること、および／または、架橋反応工程の後の過剰の試薬および／または不要な副生成物の除去などに関していてもよい。さらには、一またはそれ以上の工程が、自動化された装置によって行われてもよい。
【００１２】
用語「ポリペプチド（polypeptide）」は、当業者にとって公知であり、および、複数のペプチド結合を含む化学分子に関する。好ましくは、ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成される。アミノ酸は、好ましくは、α−アミノ酸であり、より好ましくは、Ｌ−α−アミノ酸である。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して互いに結合している少なくとも５個のアミノ酸を含み、より好ましくは、ペプチド結合を介して互いに結合している少なくとも２５個のアミノ酸を含み、最も好ましくは、ペプチド結合を介して互いに結合している少なくとも１００個のアミノ酸を含む。好ましくは、ポリペプチドは、インビトロでのペプチド合成、すなわち、当業者にとって公知である方法のうちの一つに従った化学合成によって合成されたポリペプチドである。より好ましくは、ポリペプチドは、インビトロでのタンパク質生合成によって合成されたポリペプチドである。最も好ましくは、ポリペプチドは、インビボでのタンパク質生合成によって、すなわち、生細胞中で、合成されたポリペプチドである。
【００１３】
好ましくは、ポリペプチドは、それ自身の触媒活性、例えば細胞レセプター、イムノグロブリン、またはそれらの一部分などをもたないポリペプチドである。より好ましくは、ポリペプチドは、触媒活性を有するポリペプチドであり、すなわち、ポリペプチドは、酵素である。当業者であれば、ポリペプチド調製物の純度は、一般的に１００％に満たないことを理解するであろう。したがって、ポリペプチド分子の少なくとも一部分が対応する酵素活性を有している分子であることが好ましく、より好ましくは、ポリペプチド分子の少なくとも８０％が対応する酵素活性を有している分子であることが好ましく、および、最も好ましくは、ポリペプチド分子の少なくとも９０％が対応する酵素活性を有している分子であることが好ましい。
【００１４】
好ましくは、酵素は、脱水素酵素であるか、または、脱水素酵素もしくは酸化還元酵素を含んでいる。用語「脱水素酵素（dehydrogenase）」は、本明細書において使用されるように、一段階機構において水素化物（Ｈ-）を、または、二段階機構においてＨ+／ｅ-を酸化還元等価物として、本明細書中において示される酸化還元補酵素へとまたは酸化還元補酵素から移動させることによって基質の酸化または還元を触媒することのできる酵素を意味している。好ましくは、脱水素酵素は、アクセプター分子に、好ましくは本明細書中において示される酸化還元補酵素に酸化還元等価物として水素化物（Ｈ-）を移動させることによって基質の酸化を触媒することのできるポリペプチドである。本発明によって想定される脱水素酵素は、好ましくは、例えばピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはその誘導体などの酸化還元補酵素（redox cofactor）（またはしばしば補酵素（co-enzyme）と称される）、または、例えばフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）もしくはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などのフラビン補酵素に依存性であるものである。好ましい脱水素酵素は、特には、乳酸脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．２７または１．１．１．２８）、グルコース脱水素酵素（以下を参照のこと）、アルコール脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．１または１．１．１．２）、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素（ＥＣ番号  １．４．１．５）、グリセリン脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．６）、リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．３７）、３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．３０）、ソルビトール脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．１４）、またはコレステロール脱水素酵素である。
【００１５】
より好ましくは、脱水素酵素は、グルコース脱水素酵素である。最も好ましくは、該グルコース脱水素酵素は、グルコース脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．４７）、キノプロテイングルコース脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．５．２）、より特には、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グルコース脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．５．２）、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．４９）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性グルコース脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．１１９）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存性グルコース脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．９９．１０）または酵素的に活性なそれらの変異体からなる群より選択される。
【００１６】
前述の酵素の酵素的に活性な変異体は、上で列挙した従来技術において前述の野生型酵素について報告されたアミノ酸配列から一またはそれ以上のアミノ酸を置換、付加または欠失することによって取得され得る。好ましい変異体は、米国特許第７，１３２，２７０または米国特許第７，５４７，５３５に開示されるようなそれらの野生型対応物と比較して向上した基質特異性を有するＰＱＱ−依存性グルコース脱水素酵素の変異体である。さらなる変異体は、Ｂａｉｋら（Baik 2005, Appl Enviorn Microbiol 71: 3285）、Ｖａｓｑｕｅｚ−Ｆｉｇｕｅｒａら（Vasquez-Figuera 2007, Chem BioChem 8: 2295）および国際公開第２００５／０４５０１６号明細書中に開示されているものである。本発明にしたがった好ましいものは、国際公開第２００９／１０３５４０号明細書（２１頁）また欧州特許第１６６０６４８号明細書に開示されている、少なくとも、アミノ酸の９６位、１７０位および／または２５２位に変異を有するグルコース脱水素酵素（ＥＣ番号  １．１．１．４７）変異体であり、これは参照によって本明細書中に組み込まれる。これらのアミノ酸位置において想定される好ましい変異は、Ｇｌｕ９６Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１７０ＡｒｇまたはＬｙｓ、および／またはＬｙｓ２５２Ｌｅｕであり、Ｇｌｕ１７０Ｌｙｓ／Ｌｙｓ２５２Ｌｅｕの組み合わせはさらに好ましい。最も好ましくは、前記変異は、バチルス  サブティリス（Bacillus subtilis）由来のグルコース脱水素酵素における変異Ｇｌｕ１７０ＡｒｇおよびＧｌｎ２５２Ｌｅｕ（「ＧｌｕｃＤＨ  Ｅ１７０Ｋ／Ｑ２５２Ｌ」であり、また、実施例において「ＧｌｕｃＤＨ２」として関連付けられている）である。
【００１７】
本明細書中で使用される用語「架橋（cross-linking）」は、介在している架橋基を介して２個のポリペプチド分子を共有結合的に相互に連結することに関連する。原則的に、本発明のポリペプチド分子を架橋するための方法を用いて同一でない種類のポリペプチド分子の架橋させること（混合型の架橋）、例えば、化学反応シークエンスの種々のステップを触媒する酵素分子を架橋させることなど、が可能である。非限定的な例として、グルコース脱水素酵素およびジアホラーゼが本明細書で記載されるような架橋反応において結合され得る。当業者であれば、混合型の架橋が、原則的に２個の同一でない種類のポリペプチド分子に限られるものではなく、２種類より多いポリペプチド分子を含んでいてもよいことが理解されるであろう。しかしながら、好ましくは、同じ分子種であるポリペプチド分子が架橋される。
【００１８】
用語「架橋剤（cross-linking agent）」は、適切な条件下で、架橋されるポリペプチド分子と共有結合を形成する反応性の化学基を含む化学分子に関する。好ましくは、架橋剤は、少なくとも４０個の原子、より好ましくは少なくとも５０個の原子、最も好ましくは、少なくとも６５個の原子である連続鎖を含む。好ましくは、架橋剤は、少なくとも２個の反応性化学基を含み、より好ましくは、架橋剤は正確に２個の反応性の化学基を含む。当業者であれば、少なくとも２個の反応性化学基は、前記２個の反応性化学基が架橋される２個の異なるポリペプチド分子と接触することができるような方法で空間的に配置されていることが理解されるであろう。好ましくは、架橋剤および／または架橋基は、本質的に枝分かれしていない分子であり、すなわち、架橋剤および／または架橋基は、１０％未満の、枝分かれ点を構成する原子しか含まない。より好ましくは、架橋剤は、枝分かれ構造のない分子である。さらにより好ましくは、架橋剤は、本明細書中以下で規定される少なくとも１つの反応性化学基を各末端に含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ビス活性化ＰＥＧ（bis-activated PEG））である。最も好ましくは、架橋剤は、ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ポリエチレングリコール（Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−スクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール）である。前記より、架橋基は、少なくとも２つの反応性化学基が架橋反応を経た後に残存する架橋剤の骨格であることが明らかである。
【００１９】
好ましくは、架橋剤は、０．６ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子質量、より好ましくは、０．９ｋＤａ〜１０ｋＤａの分子質量、さらにより好ましくは、１ｋＤａ〜５ｋＤａの分子質量、最も好ましくは３ｋＤａの分子質量を有する。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「反応性化学基（reactive chemical group）」は、ポリペプチド中に存在する原子群、好ましくはアミノ酸側鎖と反応し、およびそれによって適切な条件下共有結合を形成する化学基を意味する。好ましくは、反応性化学基は、前記ポリペプチドの変性を引き起こさない条件下でポリペプチド中に存在する原子団と反応する化学基である。好ましくは、変性を引き起こさないそのような条件とは、生理学的条件であり、好ましくは、適切な溶媒中２５℃、１００ｋＰａである。適切な反応性化学基は当該技術分野において公知であり、例としては例えば、好ましくは、シアン酸エステル、エポキシド、イソシアネート、イミダート、チオイミダート、および、より好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基などが挙げられる。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「溶液中（in solution）」は、均一な混合物中の溶液中に存在している化学物質の状況を意味し、化学化合物（溶質）は溶媒中に溶解している。したがって、好ましい溶媒は、本発明のポリペプチドを変性させるおよび／または沈殿させることのない溶媒である。当業者にとっては、所定のポリペプチドに対して適切な溶媒を選択する方法は既知である。例えば、短いポリペプチドは極性の有機溶媒、例えばＤＭＳＯなど中に溶解され得る。より長いペプチド、より好ましくは５０個より多い数のアミノ酸を含むペプチドは、典型的には水溶液中に最も良好に溶解される。したがって、好ましくは、溶液は水溶液である。好ましくは、溶液は、ｐＨ７〜９である、好ましくはｐＨ７．５〜８．８である、より好ましくはｐＨ８．３±１である、最も好ましくはｐＨ８．３である緩衝溶液である。好ましいバッファーは、架橋剤の反応性化学基と反応しないバッファーである。より好ましくは、バッファーは、Ｎａ−および／またはＫ−リン酸塩バッファー、最も好ましくは、０．１Ｍ  Ｋ−リン酸塩バッファーである。当業者であれば、特定のペプチドは、溶液中にとどまるために、溶媒中に追加の成分、例えば、一価および／または二価カチオン、補酵素、基質または複数の基質、および／または界面活性剤など、を必要とするかもしれないということが理解されるであろう。
【００２２】
当業者であれば、「架橋反応が起こるために適切な状況（conditions suitable for a cross-linking reaction to occur）」の選択は、架橋剤に、および、特には、そこに含まれている化学的に反応性の基に、そして、ポリペプチドの特定の型に、依存するということを理解し、かつ、条件を適宜選択することを熟知している。好ましい条件は、本明細書中の他の箇所で記載されている。好ましくは、ポリペプチド分子は、０．１ｍＭ〜５ｍＭの初期濃度で、好ましくは、０．３ｍＭ〜４ｍＭの初期濃度で、より好ましくは、２．５±１ｍＭの初期濃度で溶液中に存在する。また好ましくは、架橋剤／ポリペプチド分子のモル比は、０．２〜５、好ましくは０．５〜４、より好ましくは０．８〜３、最も好ましくは１〜２である。好ましくは、溶液中での架橋剤およびポリペプチド分子の混合は、架橋剤の、ポリペプチド分子を含む溶液への滴下による添加を含む。より好ましくは、前述の混合は、さらに、ポリペプチド分子を含む前述の溶液の攪拌を含む。好ましくは、架橋剤は、ポリペプチド溶液へと添加されるまでに、有機溶媒中に、より好ましくは相溶性有機溶媒中に、溶解される。当業者であれば、相溶性有機溶媒は、好ましくは、架橋剤と反応しないように、反応混合物中に存在する最終濃度のポリペプチドを不活性化または変性させないように、かつ、架橋剤を溶解するように選択されることを理解する。好ましくは、有機溶媒は水を含まない。より好ましくは、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。最も好ましくは、有機溶媒は、無水ＤＭＳＯである。
【００２３】
有利なことに、そして予想外なことに、本発明の根底となる研究において、ポリペプチド分子は、溶液中で、すなわちポリペプチドを沈殿させる必要性なしで、効果的に架橋され得ることが発見された。この方法は、とりわけ沈殿によって不活性化される酵素にとって、および沈殿の後に再溶解させることが困難であるポリペプチドにとって有利である。さらに、架橋されたポリペプチドは、一方でマトリックス層または複数のマトリックス層を通る拡散を大幅に減少させるのに充分に大きく、そして他方では、化学マトリックス上でのポリペプチドの微細分散のためには充分に小さいため、本発明の方法にしたがって得られる架橋されたポリペプチドは試験化学マトリックスを製造するために特によく適していることが判明した。さらに、本発明にしたがって酵素を架橋させることによって、高分子量ポリマーとの架橋の結果である比活性の希薄化は、大幅に減少され得ることが発見された。
【００２４】
上記で規定された定義は、以下に適宜必要な変更を加えて適用される。以下でさらに規定される追加の定義および説明はまた、本明細書において記載される全ての実施態様に必要な変更を加えて適用される。
【００２５】
本発明はまた、本発明のポリペプチド分子を架橋させるための方法によって得られ得る、架橋されたポリペプチド分子を含む調製物にも関する。
【００２６】
好ましくは、本発明のポリペプチド分子を架橋させるための方法によって得られ得る調製物中に含まれる架橋されたポリペプチド分子は、平均して５〜５０個のポリペプチド分子、より好ましくは１０〜４０個のポリペプチド分子、および最も好ましくは１５〜２５個のポリペプチド分子を含む共有結合性凝集体に含有されている。したがって、例えば１×１０2ｋＤａである分子質量を有するポリペプチドの場合、好ましくは、架橋されたポリペプチド分子は、５×１０2ｋＤａ〜５×１０3ｋＤａの、より好ましくは、１×１０3ｋＤａ〜４×１０3ｋＤａの、最も好ましくは、１．５×１０3ｋＤａ〜２．５×１０3ｋＤａの、見かけの分子質量を有する共有結合性凝集体中に含まれている。
【００２７】
好ましくは、架橋されたポリペプチド分子を含む調製物の質量あたりの比活性は、架橋前のポリペプチドの比活性の少なくとも５０％である。より好ましくは、架橋されたポリペプチド分子を含む調製物の質量あたりの比活性は、架橋前のポリペプチドの比活性の少なくとも６０％である。最も好ましくは、架橋されたポリペプチド分子を含む調製物の質量あたりの比活性は、架橋前のポリペプチドの比活性の少なくとも７０％である。
【００２８】
さらに、本発明は、架橋されたポリペプチド分子であって、少なくとも４０個の連続した原子を含む本質的に枝分かれしていない架橋基によって架橋されているポリペプチド分子に関する。
【００２９】
好ましくは、架橋されたポリペプチド分子は、本明細書中上記で特定されるような架橋基によって架橋されている。また、好ましくは、架橋されたポリペプチド分子は、同様に本明細書中上記で特定されるような凝集物中に含まれる。
【００３０】
さらに、本発明は、酸化還元補酵素と、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤と、指示試薬と、を含む試験化学マトリックスに関し、ここで、前記化学マトリックスは、本発明のポリペプチド分子を架橋するための方法によって得られ得る架橋された酵素および／または本発明の架橋されたポリペプチド分子をさらに含む。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「マトリックス（matrix）」は、本明細書中で特定される化合物を含む混合物に関する。当業者であれば、組成物は、追加の成分、例えば、好ましくはバッファー成分（例えばリン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファー、クエン酸緩衝液、グリセリンリン酸緩衝液、もしくはグッドバッファーなど）または他の塩、界面活性剤、または本明細書中の以下で特定される成分などを含むその他のものなど、を含んでいてもよいことを理解するであろう。また、当業者であれば、本発明のマトリックスが、例えば分散物または混合物などの不均質な混合物であってもよいことを理解するであろう。
【００３２】
好ましくは、本発明のマトリックスは、乾燥組成物である。本明細書中で使用される用語「乾燥組成物（dry composition）」は、本質的に溶媒または溶媒の混合物を含まない組成物を意味する。本明細書中で使用される本質的に含まないとは、組成物の溶液または分散液中に当初から存在していた溶媒または溶媒混合物の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が組成物から取り除かれていることを意味する。したがって、好ましくは、溶媒または溶媒混合物は本発明の乾燥組成物中に５％まで、好ましくは２％まで、より好ましくは１％まで、または最も好ましくは１％未満の量で存在していることが把握される。より好ましくは、乾燥組成物は、５％まで、好ましくは２％まで、より好ましくは１％まで、または、最も好ましくは１％未満の量で水を含む組成物である。残渣の水を測定するための方法は当業者に公知であり、そして、好ましくは、本発明の組成物中の残渣の水分は、国際公開第１９９３／０１２４１８号に記載の方法にしたがって五酸化リンセンサーを使用して測定される。前述の割合の値および本明細書中で参照される量を規定するために使用される他の割合の値は、他に特記されていない限り、重量パーセント（ｗ／ｗ）を意味する。本明細書のこのような組成物は、好ましくは、通常の条件下、すなわち室温および通常の圧力下で固体組成物である。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「試験化学マトリックス（test chemistry matrix）」は、少なくとも酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤を含む化合物と、指示試薬と、本発明のポリペプチド分子を架橋するための方法によって得られ得る少なくとも一つの架橋された酵素および／または本発明の架橋されたポリペプチド分子を含む調製物とのマトリックスを意味する。試験化学マトリックスをデザインするための様々な可能性が当該技術分野において既知である。この意味において、前述された先行技術文献が参照され得る。とりわけ、Ｊ．Ｈｏｅｎｅｓら（The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips, Diabetes Technology & Therapeutics, Volume 10, Supplement 1, 2008, S-10 to S-26）が参照され得る。しかしながら、他の種類の試験化学マトリックスもまた可能である。試験化学マトリックスの好ましい組成は、本明細書に記載されており、そして本明細書中の例にも示されている。好ましくは、試験化学マトリックスは、本発明のポリペプチド分子を架橋させるための方法によって得られ得る２以上の種類の架橋された酵素、および／または、本発明の架橋されたポリペプチド分子を含む２以上の調製物を含む。例えば、好ましくは、試験化学マトリックスは、本発明によって架橋されたグルコース脱水素酵素と本発明によって架橋されたジアホラーゼとを含み、ここで２つの酵素は別個の架橋反応で架橋されたものであることが、本発明によって把握される。
【００３４】
好ましくは、本発明の試験化学マトリックスは、分析物の存在によって少なくとも１つの計測可能な特性を変化させるように適用される。本明細書中で使用される用語「計測可能な特性（measurable property）」は、分析物の存在下で変化する、かつ、任意の種類の物理的シグナルへと移され得る試験化学の任意の特性を意味する。好ましくは、計測可能な特性の変化および／またはそこから生成され得るシグナルは、サンプル中の分析物の濃度に比例する。好ましくは、計測可能な特性は、試験化学マトリックスの構成成分の少なくとも一つの、好ましくは本明細書中で前述の酸化還元補酵素および／または酸化還元指示薬の、酸化還元状態である。したがって、好ましくは、検出反応は酸化還元反応である。より好ましくは、検出反応は、中間体および／または反応生成物として酸化還元等価物および／または電子を生成する。より好ましくは、計測可能な特性は、本明細書中に記載されるような、還元されたまたは酸化された酸化還元メディエーターの濃度であり、すなわち、好ましくは、計測可能な特性は、試験化学中に含まれる前述のメディエーターの酸化還元状態である。前記で規定された計測可能な特性を、計測値として読み取られ得る物理的シグナルへと変換する方法は、当該技術分野において既知であり、ならびに、例えば欧州特許第０８２１２３４号明細書、欧州特許第０９７４３０３号明細書および米国特許出願公開第２００５／００２３１５２号明細書などに記載されている。
【００３５】
好ましくは、測定される試験化学マトリックスの計測可能な特性は、メディエーターおよび／または指示薬とは異なる試験化学マトリックスの化合物の特性であり、したがって、好ましくは、このような場合には、メディエーターおよび／または指示薬は試験化学マトリックスから省かれ得る。例えば、非限定的な例として、ＮＡＤまたはその誘導体の酵素的な還元はＵＶ照射によって検出されてもよい。したがって、酸化還元補酵素、メディエーターおよび指示薬は、好ましくは、同じ化合物であってもよい。
【００３６】
好ましくは、計測可能な特性は、電気化学的特性である。したがって、試験化学マトリックスは、好ましくは、少なくとも２個の電極と接触する電気化学的試験化学マトリックスである。適切な電極、電極構成、電気化学的試験化学マトリックスの適切なさらなる化合物およびその操作モードは、当業者にとって既知であり、ならびに、例えば、国際公開第２００７／０７１５６２号、米国特許出願公開第２００９／０１９８１１７号明細書、国際公開第２００７／０７１５６２号、国際公開第２０１４／００１３８２号などおよびそれらで参照されている文献に記載されている。好ましい電極構成は、例えば、国際公開第２００４／１１３９１０号および国際公開第２００６／０２７２２２号などに開示されている。本発明によって、電気化学的試験化学マトリックスは、分析物と反応するための、サンプル流体中での分析物の存在を表す電気化学的シグナルを生成する一またはそれ以上の化学試薬を含むことが把握される。好ましくは、電気化学的特性は、分析物の濃度を示すアンペロメトリック応答またはクーロメトリック応答を含む。例えば、米国特許第５，１０８，５６４、米国特許第４，９１９，７０７、および米国特許第６，０５４，０３９などが参照される。
【００３７】
より好ましくは、計測可能な特性は、光学的特性である。したがって、好ましくは、試験化学マトリックスは、分析物の存在下、少なくとも一つの光学的に検出可能な検出反応を行う。さらにより好ましくは、検出反応によって生成される光学的に検出可能なシグナルは、サンプル中の分析物の量におよび／または濃度に比例する。好ましくは、計測可能な特性は、試験化学の色におけるおよび／または色彩強度における変化、すなわち、好ましくは試験化学の吸収スペクトルおよび／または発光スペクトルにおける変化である。したがって、計測可能な特性の変化において、光学的特性は好ましくは、反射特性、好ましくは反射率および／または緩和；透過特性、好ましくは吸収；色；発光、好ましくは蛍光からなる群より選択される。
【００３８】
用語「検出（detecting）」は、体液のサンプル中に存在する分析物の量の定量化、すなわち、前記分析物の量または濃度を、好ましくは半定量的にまたは定量的に、測定すること、を意味する。分析物の量の検出は、当業者にとって公知である様々な方法で、または本明細書中、以下に詳細に記載される方法で行われ得る。本発明にしたがって、分析物の量を検出することは、それらが本発明の分析物を特異的に検出するように適用されており、かつ本発明の要件と合致している限り、サンプル中の前記分析物の量を検出するための全ての公知の手段によって達成され得る。本明細書中で使用される用語「量（amount）」は、本明細書中で言及される分析物の絶対量、本明細書中で言及される分析物の相対的な量または濃度、および、それらに関連付けられる任意の値またはパラメータを包含する。このような値またはパラメータは、本明細書中で言及される分析物から測定によって取得される全ての特異的な物理的または化学的特性からのシグナル値強度を含む。前述の量またはパラメータに関連付けられる値はまた、全ての標準的な数学的処理によっても取得され得ることが理解されるべきである。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「酸化還元補酵素（redox cofactor）」は、酵素的に移動された酸化還元等価物、および、特には、水素化物（Ｈ-）のアクセプターとして作用し得る分子を意味する。好ましくは、酸化還元補酵素は、ＰＱＱ、ＮＡＤまたはＦＡＤである。本発明の試験化学マトリックス中に含まれるであろう酸化還元補酵素は、想定される脱水素酵素の特性に依存することが理解されるであろう。例えば、ＰＱＱは、本発明の組成物中でＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素と組み合わせられ、ＮＡＤは、本発明の組成物中でＮＡＤ依存性グルコース脱水素酵素と組み合わせられ、および、ＦＡＤは、本発明の組成物中でＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素と組み合わせられる。本発明の酸化還元補酵素はまた、好ましくは、ＰＱＱ、ＮＡＤまたはＦＡＤの誘導体であってもよい。ＮＡＤの好ましい誘導体は、国際公開第２００７／０１２４９４号に開示されているものであり、開示されているＮＡＤ／ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ誘導体に関してこれは参照によって本明細書中に組み込まれる。より好ましくは、本発明の酸化還元補酵素は、国際公開第２００７／０１２４９４号に開示されているようなｃａｒｂａＮＡＤである。
【００４０】
したがって、用語「酸化還元等価物の存在下、指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤（agent capable of eliciting a change in at least one measurable property of an indicator reagent in the presence of redox equivalents）」は、酸化還元等価物の存在下で、指示試薬中で少なくとも１つの計測可能な特性における変化を誘導することのできる分子を意味する。本発明において、薬剤はまた、その後続いて検出され得る、指示試薬の２以上の計測可能な特性における変化を引き出してもよいことが理解されるべきである。さらに、薬剤は、好ましくは、また、その後続いて検出され得る２以上の指示試薬の計測可能な特性における変化を引き出してもよい。
【００４１】
前記で参照されるような薬剤は、好ましくは、酸化還元補酵素から指示試薬へと酸化還元等価物を、直接的に、または、間接的に、すなわちさらなるメディエーターを介して、移動することができる。酸化還元等価物の前記移動の結果として、指示試薬は、少なくとも１つの計測可能な特性における変化が起こるように修飾されるであろう。計測可能な特性が光学的特定である場合、好ましくは、例えば、酸化状態において無色または蛍光発光性でない指示試薬は、薬剤によって媒介される酸化還元等価物の移動によって還元状態において有色または蛍光発光性指示試薬へと変換されてもよい。酸化還元等価物の移動は、酸化還元等価物が薬剤によって指示試薬へと移動されるような直接的な移動であってもよく、また、間接的であってもよい。後者の場合、酸化還元等価物は、薬剤から中間体メディエーターへと移動され、中間体メディエーターがその後、酸化還元等価物を指示試薬へと移動させる。好ましくは、２以上のメディエーターが使用され得ることが理解されるであろう。例えば、薬剤は酸化還元等価物を第１のメディエーターへと移動させ、第１のメディエーターが続いて酸化還元等価物を第２のメディエーターへと移動させ、そして、第２のメディエーターが酸化還元等価物を指示試薬へと移動させる。このようなメディエーターカスケードにおいては３以上のメディエーターが使用され得るであろうことが理解されるであろう。一またはそれ以上のメディエーターを酸化還元等価物の指示試薬への移動のために使用することの利点は、計測可能な特性の検出のタイミングが向上され得ることである。
【００４２】
本発明の文脈において適用され得るメディエーターは、当該技術分野において広く公知であり、および、例えば、フェリシアン化カリウム、キノン誘導体、ナイルブルー（ＣＡＳ番号：３６２５−５７−８）、Ｍｅｌｄｏｌａ’ｓ  ｂｌｕｅ（ＣＡＳ番号：７０５７−５７−０）、欧州特許第１４５７５７２号明細書に開示されるようなオスミウム錯体、ルテニウムヘキサミンクロライドなどの遷移金属錯体、またはニトロソアニリン誘導体などが挙げられる。
【００４３】
本発明の薬剤として好ましく想定されるものは、フェナジンである。より好ましくは、前述のフェナジンは、フェナジンエトスルファート、フェナジンメトスルファート、１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナジニウムトリフルオロメタンスルホネート、または１−メトキシフェナジンメトスルファートである。このようなフェナジンは、指示試薬の少なくとも１つの光学的特性における変化を引き出すために適用され得る。検出に関する詳細およびどのようにそれらフェナジンが適用されるのかに関する詳細は、欧州特許出願公開第０６５４０７９号明細書中で見いだされ得るであろう。また、本文脈中で想定される薬剤は、好ましくは、キノンである。より好ましくは、前述のキノンは、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノンまたはベンゾ［ｈ］キノリンキノンである。本文脈において想定される別の薬剤は、ニトロソアニリンである。より好ましくは、前述のニトロソアニリンは、［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノールヒドロクロライドである。最も好ましくは、前述のニトロソアニリンは、４−ビス（ヒドロキシエチル）−１−ニトロソアニリンまたは４−ビス（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−１−ニトロソアニリンである。または、本発明によって好ましく想定されるものは、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤であり、酸化還元補酵素から指示試薬への酸化還元等価物の移動を触媒することのできる酵素である薬剤である。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「指示試薬（indicator reagent）」は、好ましくは、本発明の酵素の活性に依存性である、好ましくは比例している少なくとも１つの計測可能な、好ましくは光学的な特性において変化する化合物に関する。好ましくは、指示試薬は、少なくとも１つの酵素または試験化学マトリックス中に含まれる酵素が分析物と反応した場合に、少なくとも１つの光学的に検出可能な特性の変化を起こす、光学的指示物質である。したがって、少なくとも１つの指示試薬は、好ましくは、少なくとも１つの酵素と分析物との酵素的反応を示す光学的特性における変化を起こす一またはそれ以上の色素を含む。本発明における、指示試薬の光学的特性は、本発明の酵素の活性に依存して変化する。したがって、好ましくは、光学的特性の変化は、酵素が検出反応を触媒した場合のみに生じる。より好ましくは、光学的特性の変化は、試験化学マトリックス中に存在する酵素によって起こされた触媒サイクルの回数に比例する。したがって、最も好ましくは、光学的特性の変化は、酵素によって変換された分析物分子の数に比例する。
【００４５】
好ましくは、指示試薬における光学的特性の変化は、前述の指示試薬を含む試験化学マトリックス中で計測され得る。したがって、少なくとも１つの光学的特性は、分析物の存在下で変化する、および、任意の種類の光学的シグナルへと転換され得る、試験化学マトリックスの任意の特性であり得る。好ましくは、光学的特性の変化および／またはそれから生成され得るシグナルは、サンプル中の分析物の濃度に比例する。追加でまたは代替的に、シグナルから濃度を導き出すために使用され得るような、光学的特性、光学的特性の変化および／またはそれから生成され得るシグナルとサンプル中の分析物の濃度との間の所定のまたは決定され得る関係が存在し得る。
【００４６】
当業者であれば、測定される試験化学マトリックスの計測可能な特性はまた、メディエーターおよび／または指示試薬とは異なる試験化学マトリックスの化合物の特性であってもよいこと、および、そのような場合、メディエーターおよび／または指示試薬は試験化学マトリックスから省かれ得ること、例えば、好ましくは、ＮＡＤまたはその誘導体の酵素的還元はＵＶ照射によって検出されてもよいことが理解される。したがって、酸化還元等価物、メディエーターおよび指示試薬は、好ましくは、同じ化合物であってもよい。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「分析物（analyte）」は、体液中に存在する化学化合物に関する。好ましくは、分析物は、低分子であり、すなわち好ましくは、分析物は、生物学的な高分子ではない。より好ましくは、分析物は有機分子であり、最も好ましくは、本発明の試験化学の存在下で酸化還元反応を受け得る有機分子である。好ましくは、分析物は、被験者の代謝に関わる分子である。また、好ましくは、分析物は低分子量の化学化合物であり、より好ましくは、１０００ｕ（１０００Ｄａ；１．６６×１０-24ｋｇ）未満の分子質量を有する化学化合物である。より好ましくは、分析物は、リンゴ酸塩、エタノール、アスコルビン酸、コレステロール、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシブチレート、乳酸塩、ピルビン酸塩、トリグリセリド、ケトン、肝臓パラメータ（liver parameters）、クレアチニン、ＨＤＬなどからなるリストより選択され、より好ましくは、分析物は血糖である。好ましくは、分析物は、血糖であり、および測定される実際の濃度は、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも７０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも９０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１３０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４０ｍｇ／ｄＬ、また少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬである。好ましくは、分析物はグルコースであり、および測定される濃度は、０ｍｇ／ｄＬから８００ｍｇ／ｄＬの範囲であり、または、より好ましくは、１０ｍｇ／ｄＬから６００ｍｇ／ｄＬの範囲、または、最も好ましくは、５０ｍｇ／ｄＬから３００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「体液（body fluid）」は、血液、血漿、血清、涙液、尿、リンパ液、脳脊髄液、胆汁、糞便、汗および唾液などを含む、本発明の分析物を含むまたは含むと疑われることが知られている、被験者の体液の全てを含む。好ましくは、体液は血液である。用語「サンプル（sample）」は、当業者であれば理解できる用語であり、および、体液の任意のサブポーション（subportion）、好ましくはテストエレメントへと前記サンプルを適用するに先立って被験者から取り出された任意のサブポーションに関する。
【００４９】
さらに、本発明は、試験化学マトリックスを製造するための方法であって、以下の工程
（ａ）本発明のポリペプチド分子を架橋するための方法にしたがって架橋された酵素分子および／または本発明の架橋されたポリペプチド分子の調製物を取得する工程、ならびに
（ｂ）酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤、指示試薬、および工程（ａ）で取得された架橋された酵素分子の調製物を混合する工程、ならびにそれによって
（ｃ）試験化学マトリックスを作製する工程
を含む方法に関する。さらに、本発明は、本発明の試験化学マトリックスを担体上に含む、体液サンプルからの分析物の測定のための診断用テストエレメントに関する。
本発明の文脈中で使用される用語「担体（carrier）」は、その上に本発明の試験化学マトリックスが適用される固体支持体を意味する。好ましくは、試験化学マトリックスは、担体上に固定され得る。さらに、試験化学マトリックスは、担体上に空間的に配置され得ることもまた想定される。担体は、指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性の変化の検出を可能にするような様式で配置されなければならず、すなわち、好ましくは、少なくとも１つの計測可能な特性の検出を妨げるであろう成分または空間的配置を含まない。適切な担体は、本発明の組成物を含むバイアル、例えばウェルプレートの形式に配置されたバイアルなどを含んでいてもよい。他のアッセイは、光導波路または半導体プレートを適用してもよい。しかしながら、好ましい担体は、テストストリップのために使用されるものである。前記テストストリップは通常、固体の担体を形成している一またはそれ以上の層を含む。
【００５０】
好ましくは、本発明の診断用テストエレメントは、前記試験化学マトリックスを含む試験フィールドを含み、ここで、試験フィールドは、その上に体液サンプルが適用されるサンプル適用面と、分析物が試験化学マトリックスの成分と反応した際に計測可能な特性における変化の検出を可能にする検出面と、を有する。サンプルは、サンプル適用面に適用されるものであり、および、好ましくは、例えば血液サンプル中に存在する赤血球などの細胞は検出面に到達しないことが想定される。このような診断用テストエレメントおよびその製造に関する詳細は、欧州特許第０８２１２３４号明細書中に見出され得る。本発明によって想定されるさらなるテストエレメントは、欧州特許第１０３５９１９号明細書または欧州特許第１０３５９２０号明細書中に開示されているものである。
【００５１】
本発明の診断用テストエレメントの試験フィールドは、好ましくは、その上に、一つ、より好ましくは２つ以上のフィルム層が適用されている透明な箔（foil）を含む。診断用テストエレメントのフィルム層は、高分子塗膜形成要素の分散体またはエマルションから作製される。塗膜形成要素の分散体は、キャリア液（通常、水）に不溶であり、およびキャリア液中に微細に分散している微視的なポリマー粒子を含む。液体がフィルム形成のあいだに蒸発乾固によって除去されると、粒子が接近し合い、および互いに微細に接触し合う。このプロセス中に起こる大きな力およびフィルム形成と同時の表面エネルギーの増大が、実質的に閉じたフィルム層となる粒子を結果として生じる。代替的に、塗膜形成要素のエマルションであってその中でこれが溶媒中に溶解されているエマルションを使用することもまた可能である。ポリビニルエステル、ポリビニルアセテート、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリアミドおよびポリスチレンが、このような塗膜形成要素のためのポリマーとして特に適切である。ホモポリマーに加えて、例えばブタジエン、スチレンまたはマレイン酸エステルなどの混合重合物もまた適切である。
【００５２】
ウェルを膨潤させる膨潤剤（すなわち、水を取り入れた場合にその体積を増大させる物質）を添加することによって、サンプル流体によって比較的迅速に浸透され得るだけでなく、膨潤剤のこの開口効果にも関わらず良好な細胞（例えば赤血球などおよび追加でまた血色素）分離特性をも有する層が得られる。膨張特性は、少なくとも１つの計測可能な特性の変化が主に層を通り抜けるサンプル流体の浸透に依存する試験において、計測可能な特性の変化が最長でも１分後には計測可能であるほどに良好でなければならない。特に適切な膨張剤は、メチルビニルエーテルマレイン酸無水物コポリマー、キサンタンガムおよびメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマーであることが実証された。
【００５３】
診断用テストエレメントの単一層レイアウトが従来技術（例えば欧州特許出願第１５６６６３７号明細書および欧州特許出願第１７８０２８８号明細書などを参照のこと）から公知である。より好ましい２層レイアウトは、好ましくは、第１の層および第２の層を含み、第１の層および第２の層はこの順序で重なり合っている。透明の箔上に配置されている第１の層が、重ねられている第２の層と比較してより顕著に少なくしか光を散乱しないことが重要である。透明な箔のコートされていない面は検出面と称され、および、第２の層の、第１の層に接触している面と反対側の面は、サンプル適用面と称される。２つのいわゆるフィルム層は、本発明の診断用試験担体の試験フィールド中の透明な箔上に配置されている。このため、液体に対して不浸透性であるこれらのプラスティック箔が考慮される。ポリカーボネート箔がとりわけ適切であることが実証された。２つのフィルム層は、同一の高分子塗膜形成剤を含むコーティング化合物から製造されてもよく、またはそれらは、異なる高分子塗膜形成剤を含むコーティング化合物から製造されてもよい。第１の層は膨張剤および任意には弱い光散乱フィラーを含むが、第２の層は、膨張剤およびどの場合にも光を強力に散乱する少なくとも１つの色素を必要とする。
【００５４】
好ましくは、電気化学的検出において使用され得る単一層フィルムの場合、本発明の架橋されたポリペプチドは、前記単一層に含まれている。複数層（すなわち、２以上の層）の場合、本発明の架橋されたポリペプチドは１つのフィルム層に、より好ましくは、第１のフィルム層に含まれることが好ましい。
【００５５】
本発明の診断用テストエレメント中の試験フィールドを最適化するために、全てのフィルム層、好ましくは２層レイアウトの場合両方の層が、溶血することのない湿潤剤を含んでいる場合に特に有利であることが実証された。中性、すなわち非荷電性の湿潤剤がこのためには特に好ましい。Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルアミドが最も特に好ましい。
【００５６】
本発明の診断用テストエレメントの２層の試験フィールドを製造するために、それぞれのフィルム層は、前記成分の均一な分散体から連続的に製造される。このためには、透明な箔が、第１のフィルム層のためのコーティング化合物を形成するためのベースとして使用される。第１のフィルム層のためのコーティング化合物が特定の層厚で適用された後、層は乾燥される。その後、第２の層のためのコーティング化合物がこの層に、同様に薄い層厚で適用され、そして乾燥される。この様式で製造される試験フィールドは、より良好なハンドリングのために支持層上に配置されてもよく、試験される流体を取り込まないような層のために、それらの材料は考慮される。これらは、いわゆる非吸水性材料であり、例えば、特に好ましくは、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、ポリエステル、ポリカーボネートまたはポリアミドなどから作製されるプラスティック箔である。金属箔またはガラスがさらなる支持材料として適切である。
【００５７】
本発明のテストエレメントの好ましい実施態様において、指示試薬の少なくとも１つの光学的特性における変化が観察されるおよび計測されるための試験フィールドの検出面は、身体サンプル中で検出されるべき分析物を測定するために、支持層を通して可視的であるべきである。これは、透明な支持層によって達成され得る。しかしながら、支持層が、試験フィールドの検出面によって被覆される穿孔を有していることもまた可能である。それにより検出面は、穿孔を通じて見ることができる。好ましくは、本発明の診断用テストエレメントには、それを通じて試験フィールドの検出面が観察され得る孔が、試験フィールドの検出面の下方の支持層中に存在する。孔は、試験フィールドの最も小さい長さ寸法よりも多少小さい直径を有しており、このため、孔の外側の試験フィールドは支持層上に重なり、そしてそこに取り付けられ得る。
【００５８】
本発明のテストエレメントの別の好ましい実施態様において、テストエレメントは、キャピラリー管を備える。このようなレイアウトは、従来技術より、例えば欧州特許第１０３５９２１号明細書などから公知である。さらなる好ましい実施態様において、本発明のテストエレメントは、テストエレメントバンド（例えば欧州特許第１５９３４３４号明細書などを参照のこと）から製造され、または、テストストリップである。さらには、さらなる好ましい実施態様において、診断用テストエレメントは、カートリッジ中に備えられ、前記カートリッジは好ましくは、複数の診断用テストエレメントを備えている。
【００５９】
本発明はさらに、本発明の架橋されたポリペプチド分子および／または疾患の診断における使用のための本発明の架橋されたポリペプチド分子を含む調製物に関する。したがって、本発明は、疾患の診断における使用のためのポリペプチド分子を架橋させるための方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子の調製物に、および、架橋されたポリペプチド分子に関し、ここで、前記ポリペプチド分子は、疾患の診断における使用のために、本発明の少なくとも４０個の連続した原子を含む枝分かれ構造のない側鎖によって架橋されている。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「診断（diagnosis）」は、それによって被験者が本明細書中において参照される疾患または症状を患っているまたは患うであろう蓋然性を評価することを意味する。当該技術分野における当業者によって理解されるであろうように、このような評価は、通常、診断される被験者の１００％について正確であることは意図されていない。しかしながら、該用語は、統計学的に有意な割合の被験者が、疾患または症状を患うことを正確に診断され得ることを要件とする。割合が統計学的に有意であるかどうかは、様々な良く知られている統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、ステューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定などを使用して当該技術分野における当業者によって造作なく決定され得る。詳細は、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎによるStatistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見いだされる。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．０００１である。好ましくは、本発明によって想定される蓋然性は、診断が、所定のコホートまたは母集団の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の被験者に対して正確であろうことを可能にする。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「疾患（disease）」は、正常な代謝からの、任意の臨床的に関連のある逸脱を意味する。したがって、「疾患の診断（diagnosis of disease）」は、少なくとも１つの臨床的に関連のあるパラメータおよび／または緊急事態のパラメータ、これらに限定される訳ではないが例えば、マレイン酸塩、エタノール、リンゴ酸塩、エタノール、アスコルビン酸、コレステロール、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシブチレート、乳酸塩、ピルビン酸塩、トリグリセリド、ケトン、肝臓パラメータ、クレアチニン、ＨＤＬなどを測定すること、および、好ましくは、正常な代謝からの臨床的に関連のある逸脱が存在するかどうかを評価することを意味する。当業者であれば、診断が好ましくは、前述の臨床的に関連のある逸脱の不在を決定すること、すなわち除外による診断、を含むことが理解されるであろう。
【００６２】
さらに、本発明は、糖尿病の診断における使用のための、本発明の架橋されたポリペプチド分子および／または本発明の架橋されたポリペプチド分子を含む調製物に関する。したがって、本発明は、糖尿病の診断における使用のためにポリペプチド分子を架橋させるための方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子の調製物に、および、架橋されたポリペプチド分子に関し、ここで、前記ポリペプチド分子は、糖尿病の診断における使用のために、本発明の少なくとも４０個の連続した原子を含む枝分かれ構造のない側鎖によって架橋されている。
【００６３】
本発明はまた、本発明の試験化学マトリックスの製造のための、本発明の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または本発明の架橋されたポリペプチド分子、および／または本発明の診断用テストエレメントの使用に関する。
【００６４】
さらに、本発明は、診断用組成物の製造のための、本発明の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または本発明の架橋されたポリペプチド分子の使用に関する。
【００６５】
さらに、本発明は、本発明の試験化学マトリックスを担体上に作製する工程を含む診断用テストエレメントの製造のための方法に関する。
【００６６】
本明細書中で引用された全ての文献は、それらの全ての開示内容および本明細書中において具体的に言及された開示内容に関し参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００６７】
本発明の発見を要約すると、以下の実施態様が好ましい。
【００６８】
実施態様１：架橋剤およびポリペプチド分子を、架橋反応が起こるために適切である条件下、溶液中で結合させる工程を含むポリペプチド分子を架橋するための方法。
実施態様２：前記ポリペプチドが酵素である実施態様１記載の方法。
実施態様３：前記架橋剤が、少なくとも４０個の原子である連続鎖を含む実施態様１または２記載の方法。
実施態様４：前記架橋剤が、両末端で化学的に活性化されている枝分かれ構造のない分子である実施態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
実施態様５：前記架橋剤が、ビス活性化ポリエチレングリコールである実施態様１〜４のいずれか１項に記載の方法。
実施態様６：前記架橋剤が、ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ポリエチレングリコール（Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−スクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール）である実施態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
実施態様７：前記架橋剤が、０．６ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子質量、より好ましくは、０．９ｋＤａ〜１０ｋＤａの分子質量、さらにより好ましくは、１ｋＤａ〜５ｋＤａの質量、最も好ましくは３ｋＤａの分子質量を有する実施態様１〜６のいずれか１項に記載の方法。
実施態様８：前記ポリペプチド分子が、０．１ｍＭ〜５ｍＭの初期濃度で、好ましくは、０．３ｍＭ〜４ｍＭの初期濃度で、より好ましくは、２．５±１ｍＭの初期濃度で前記溶液中に存在する実施態様１〜７のいずれか１項に記載の方法。
実施態様９：架橋剤／ポリペプチド分子のモル比が、０．２〜５、好ましくは０．５〜４、より好ましくは０．８〜３、最も好ましくは１〜２である実施態様１〜８のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１０：前記溶液が、ｐＨ７〜９である、好ましくはｐＨ７．５〜８．８である、より好ましくはｐＨ８．３±１である、最も好ましくはｐＨ８．３である実施態様１〜９のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１１：前記ポリペプチド分子の少なくとも一部分が、脱水素酵素分子であり、好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも８０％が、脱水素酵素分子であり、より好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも９０％が、脱水素酵素分子である実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１２：前記ポリペプチド分子の少なくとも一部分が、グルコース脱水素酵素分子であり、好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも８０％が、グルコース脱水素酵素分子であり、より好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも９０％が、グルコース脱水素酵素分子である実施態様１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１３：前記ポリペプチド分子の少なくとも一部分が、ＧｌｕｃＤＨ  Ｅ１７０Ｋ／Ｑ２５２Ｌ分子であり、好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも８０％が、ＧｌｕｃＤＨ  Ｅ１７０Ｋ／Ｑ２５２Ｌ分子であり、より好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも９０％が、ＧｌｕｃＤＨ  Ｅ１７０Ｋ／Ｑ２５２Ｌ分子である実施態様１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１４：前記架橋剤およびポリペプチド分子を溶液中で結合させる工程が、前記架橋剤の、前記ポリペプチド分子を含む溶液への滴下による添加、好ましくは攪拌下での添加を含む実施態様１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１５：前記架橋剤およびポリペプチド分子を溶液中で結合させる工程が、相溶性有機溶媒中に溶解されている前記架橋剤の、前記ポリペプチド分子を含む溶液への滴下による添加を含む実施態様１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
実施態様１６：前記相溶性有機溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である実施態様１５記載の方法。
実施態様１７：実施態様１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物。
実施態様１８：ポリペプチド分子が、少なくとも４０個の連続する原子を含む本質的に枝分かれしていない架橋基によって架橋されている架橋されたポリペプチド分子。
実施態様１９：前記ポリペプチド分子が酵素、好ましくは脱水素酵素である実施態様１８記載の架橋されたポリペプチド分子。
実施態様２０：前記ポリペプチド分子がグルコース脱水素酵素、好ましくはＧｌｕｃＤＨ  Ｅ１７０Ｋ／Ｑ２５２Ｌである実施態様１８または１９記載の架橋されたポリペプチド分子。
実施態様２１：前記架橋基がポリエチレングリコール鎖である実施態様１８〜２０のいずれか１項に記載の架橋されたポリペプチド分子。
実施態様２２：酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤および指示試薬を含む試験化学マトリックスであって、実施態様１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋された酵素および／または実施態様１９〜２１のいずれか１項に記載の架橋されたポリペプチド分子をさらに含む試験化学マトリックス。
実施態様２３：前記酸化還元補酵素、前記指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤および／または前記指示試薬が同一の化合物である実施態様２２に記載の試験化学マトリックス。
実施態様２４：（ａ）実施態様２〜１６のいずれか１項に記載の方法による架橋された酵素分子および／または実施態様１９〜２１のいずれか１項に記載の架橋された酵素分子の調製物を取得する工程、ならびに
（ｂ）酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤、指示試薬、および工程（ａ）で取得された架橋された酵素分子の調製物を混合する工程、ならびにそれによって
（ｃ）試験化学マトリックスを製造する工程
を含む試験化学マトリックスを製造するための方法。
実施態様２５：前記酸化還元補酵素、前記指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤および／または前記指示試薬が同一の化合物である実施態様２４に記載の方法。
実施態様２６：実施態様２２または２３記載の試験化学マトリックスを担体上に含む、体液サンプルからの分析物の測定のための診断用テストエレメント。
実施態様２７：前記試験化学マトリックスの少なくとも一部分が試験フィールド中に含まれている実施態様２６記載の診断用テストエレメント。
実施態様２８：前記診断用テストエレメントがテストストリップまたはテストバンドである実施態様２６または２７記載の診断用テストエレメント。
実施態様２９：カートリッジ中に備えられている実施態様２６〜２８のいずれか１項に記載の診断用テストエレメント。
実施態様３０：疾患の診断における使用のための、実施形態１７記載の架橋されたポリペプチド分子および／または実施態様１８〜２１のいずれか１項に記載の架橋されたポリペプチド分子を含む調製物。
実施態様３１：糖尿病の診断における使用のための、実施形態１７記載の架橋されたポリペプチド分子および／または実施態様１８〜２１のいずれか１項に記載の架橋されたポリペプチド分子を含む調製物。
実施態様３２：実施態様２２または２３記載の試験化学マトリックスの製造のための、実施態様１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または実施態様１８〜２１のいずれか１項に記載の調製物、および／または実施態様２６〜２９のいずれか１項に記載の診断用テストエレメントの使用。
実施態様３３：診断用組成物の製造のための、実施態様１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチドおよび／または実施態様１８〜２１のいずれか１項に記載の調製物の使用。
実施態様３４：実施態様２２または２３記載の試験化学マトリックスを担体上に作製する工程を含む診断用テストエレメントの製造のための方法。
【００６９】
本発明のさらなる任意の特徴および実施態様は、以下の好ましい実施態様の記載中に、好ましくは従属クレームと共により詳細に開示されるであろう。その場合、それぞれの任意の特徴は、当業者であれば認識するように、個別の様式で、および任意の可能な組み合わせで実行されてもよい。本発明の範囲は、好ましい実施態様によって制限されない。実施態様は、図中に概略的に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】表１で特定されている架橋された反応生成物のＳＤＳゲルクロマトグラフィー分析を示す図であり（ゲル中のアクリルアミド濃度は４〜１２％）、ＧｌｕｃＤＨ２がａｍｐｈｉｂｌｕｅ染色されている。実験Ｖ１に対応するレーンＶ１では、遊離ＧｌｕｃＤＨ２は見られない。Ｍ：マーカー、Ｃ：対照、Ｖ１〜Ｖ６：表１の実験Ｖ１〜Ｖ６に対応するレーン。矢印は、ＧｌｕｃＤＨ２モノマーの位置を示す。Ｖ１およびＶ２はＮＨＳ  ＰＥＧを用いて架橋された。Ｖ３、Ｖ５およびＶ６は、エポキシ−ＰＥＧを用いて架橋された。マーカー化合物の分子量は、ｋＤａ単位で示されている。
【図２】実施例２の反応生成物のゲル浸透クロマトグラフィーを示す。反応生成物は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００カラム上で、１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０の移動相を用いて、流速０．５ｍＬ／分でクロマトグラフ分析され、そして、２８０ｎｍでフローセル中で検出された。サンプル量はそれぞれの場合において１．２５ｍｇのタンパク質であった。Ｘ軸：溶出量（ｍＬ）；Ｙ軸：２８０ｎｍにおける吸収（任意単位）。
【図３】拡散試験ステップの概略図を示す。２０μＬのバッファー１２２がピペット１２４によってグルコーステストストリップ１２０上へピペッティングされる。１分後、１０μＬのバッファー１２２がピペット１２４中に回収され、そしてさらなる分析に使用される。
【図４】層が作製された直後の蛍光標識された酵素を含む乾燥テストストリップの蛍光顕微鏡写真を示す。Ａ：遊離のＧｌｕｃＤＨ２。Ｂ：架橋されたＧｌｕｃＤＨ２。図４Ａにおいて、その中に標識された酵素が当初含まれていた第１の層１２８およびその中に標識された酵素が拡散した第２の層の両方の層が観察されている。図４Ｂにおいて、その中に標識された酵素が当初含まれていた第１の層１２８のみが観察されている。
【図５】様々な条件下で保管されているあいだの、テストストリップの第１の層および第２の層のあいだの蛍光シグナルの拡散の蛍光顕微鏡評価の定量的評価を示す。Ｘ軸：インキュベーション時間（日）；Ｙ軸：第１の層中で見出された酵素の量に対する第２の層中で見出された酵素の量。Ａ：遊離のＧｌｕｃＤＨ２。Ｂ：架橋されたＧｌｕｃＤＨ２。
【図６】様々な保管条件下におけるＧｌｕｃＤＨ２の安定性を示す。Ｆ：遊離の酵素；Ｘ：架橋された酵素；Ａ：乾燥および暖かい条件；Ｂ：湿潤したおよび暖かい条件。Ｘ軸：インキュベーション時間（日）；Ｙ軸：時間＝０日と比較した残存活性（Ａrel）（％）。
【図７】乾燥および暖かい条件または湿潤したおよび暖かい条件下での保管後のＧｌｕｃＤＨ２の移動度を示す。Ｆ：遊離の酵素；Ｘ：架橋された酵素；Ａ：乾燥および暖かい条件下での保管；Ｂ：湿潤したおよび暖かい条件下での保管。Ｘ軸：インキュベーション時間（日）；Ｙ軸：パーセント移動度（％）。
【図８】様々なグルコース濃度でのＧｌｕｃＤＨ２の性能。それぞれの場合において、グルコーステストストリップのグルコース濃度の依存性における相対的レミッションが示されている。Ｘ軸：グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）；Ｙ軸：相対的レミッション（％）。Ｆ：遊離のＧｌｕｃＤＨ２；Ｘ／Ｕ：架橋されたＧｌｕｃＤＨ２、未精製（遊離の酵素の画分を含む）、Ｘ／Ｐ：架橋されたＧｌｕｃＤＨ２、精製（遊離の酵素を含まない）。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
実施例
実施例１
ＧｌｕｃＤＨ２を架橋させるための第１の試みにおいて、短鎖のビスエポキシ−およびビスＮＨＳ−活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）が、以下の比率を使用して用いられた：０．３ｍＭ  ＧｌｕｃＤＨ２（１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液中）が１０倍過剰のビスＮＨＳ−活性化ＰＥＧｓまたは５０倍過剰のビスエポキシ−活性化ＰＥＧと反応される。反応は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨ７．５で、活性化されたＰＥＧｓを攪拌下室温にて滴下により添加して行われた。ビスエポキシ−活性化ＰＥＧとの反応は、低い分子質量（３８０および５２０ｇ／ｍｏｌ）においてＧｌｕｃＤＨ２の活性の完全な喪失を導き、一方、中程度の分子質量（９８０ｇ／ｍｏｌ）では、活性の８５％が保持され得た。この実験は、酵素の完全な不活性化を導くであろうＧｌｕｃＤＨ２中の必須のリジン残基が反応することを妨げるために活性化されたリンカーとしてどの最も低い分子質量が必要とされるかを示すものである。しかしながら、高い分子量のタンパク質凝集物はエポキシ−活性化ＰＥＧを用いた架橋によっては得られなかった（図１）。対照的に、分子質量が３０００および１００００ｇ／ｍｏｌであるＮＨＳ−活性化ＰＥＧｓは、活性の保持と同様に架橋性を示した（表１、図１および２）。３０００ｇ／ｍｏｌのビスＮＨＳ−活性化ＰＥＧｓとの架橋反応の生成物は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーによって分析された。上に示された条件が架橋のかわりにＰＥＧ化を主に導くことが発見された。
【００７２】
【表１】
2017512478.tif 000002
【００７３】
【表２】
2017512478.tif 000003
【００７４】
実施例２
架橋反応を最適化するために、分子間反応を増加させるためにタンパク質の量が大幅に増大された。ｐＨ値もまた、酵素中に含まれるアミノ基のＮＨＳ基への反応性を向上させるために増大された。さらに、ＮＨＳ−活性化ＰＥＧｓはＮＨＳ基の尚早な加水分解を避けるためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解された。したがって、以下の改良された反応条件が使用された：２．８５ｍＭのＧｌｕｃＤＨ２（８０ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液）の、０．５〜２倍過剰のビスＮＨＳ−活性化ＰＥＧ（３０００ｇ／ｍｏｌ）との反応。架橋は、ｐＨ８．３の０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム中で、反応混合物を攪拌しながら、ＤＭＳＯ中に溶解されたＮＨＳ−活性化ＰＥＧを室温にてゆっくりと滴下して添加することにより行われた。結果として得られる、粘性の溶液は、０．０５ＭのｐＨ７．０のリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液に対して透析された。活性が、活性度アッセイによって測定され、そして、生成物のサイズがゲルろ過クロマトグラフィーによって測定された。図２に示されるように、酵素：ＰＥＧの開始のモル比である１：１では、遊離のＧｌｕｃＤＨ２は観察されず、モル比が１：１．５へと増大すると、大きな架橋生成物の産生が増大した。
【００７５】
実施例２において産生された架橋された酵素は、グルコーステストストリップの２つの層のうちの第１の層中に包含され、そして酵素の安定性および移動度に関して評価された。表２に示されるように、酵素：ＰＥＧのモル比の増大は、より大きい架橋生成物の産生を導いている。したがって産生されたＧｌｕｃＤＨ２の、ゲルろ過クロマトグラフィーによって測定された分子量は、１：１．５のモル比が使用された場合、１１２ｋＤａ（遊離の酵素）から２０００ｋＤａまで増加した。これに対応して、テストストリップ中の酵素の移動度は架橋生成物のサイズが増大するにしたがって顕著に減少する。テストストリップ中での安定性は、３５℃および８５％の相対湿度で試験され、そして、遊離のＧｌｕｃＤＨ２と比較して顕著には異ならなかった。
【００７６】
実施例３
さらなる実験において、分子質量が３０００ｇ／ｍｏｌより大きいＮＨＳ−活性化ＰＥＧｓが試験された。しかしながら、架橋反応は、実施例２と比較して効率的ではないことが判明した。さらに、分子質量１００００および２００００ｇ／ｍｏｌであるＮＨＳ−活性化ＰＥＧを用いて得られた架橋生成物は、非常に粘性の高い生成物を生じ、これは、その後の処理を困難なものとした。したがって、３０００ｇ／ｍｏｌよりも大きな分子質量を有するＰＥＧｓは、ＧｌｕｃＤＨ２を架橋するためには好ましくないことが発見された。
【００７７】
実施例４
以下の実験のために、以下の標準反応条件がＧｌｕｃＤＨ２を架橋するために使用された。ｐＨ８．３の０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム中の２．８５ｍＭのＧｌｕｃＤＨ２（８０ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液）の溶液に、ＮＨＳ−ＰＥＧのＤＭＳＯ溶液が攪拌下、室温で滴下によりゆっくりと４．２ｍＭの濃度まで添加された。得られた粘性溶液は、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウム／カリウムに対して３回、ｐＨ７．０の０．０５Ｍリン酸カリウム／ナトリウムに対して１回透析された。このように産生された架橋生成物の特性がさらに明らかにされた。
【００７８】
ａ）固定化試験（上澄み試験）
酵素の固定化に関する第１の試験として、２０μＬのバッファーがそれぞれのＧｌｕｃＤＨ２調製物を含む試験化学上にピペッティングされ、そして１分間インキュベートされた。この時間の後、１０μＬのバッファーが回収されて、そして、ＧｌｕｃＤＨ２活性が分析された。バッファー中へ拡散した活性は、適用された合計の活性度に対するパーセンテージとして表２に示されている。表２から理解され得るように、拡散性の酵素の量は、架橋生成物の分子量が増大するにつれて大幅に低下している。
【００７９】
ｂ）拡散性試験（蛍光顕微鏡）
このアッセイのために、ＧｌｕｃＤＨ２は、６５０ｎｍの波長で励起され得、６６８ｎｍでの蛍光発光を導く蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７と化学的に結合された。蛍光標識された酵素が、前述の架橋反応において使用され、そして、２層式のグルコーステストストリップの第１層へと適用された。ストリップは、様々な条件下、様々な時間のあいだ保管され、その後、酵素の位置が蛍光顕微鏡によって試験された（図４および５）。酵素の第２の層への拡散が本質的に防がれ得たことが発見された。
【００８０】
実施例５  架橋したＧｌｕｃＤＨ２の安定性
実施例４に示された方法によって製造され、および、実施例４に示された条件下で保管されたテストストリップはまた、数日後、残存活性に関して試験された（図６）。乾燥および暖かい条件（３５℃／０％相対湿度）下では、遊離の酵素と架橋された酵素とのあいだで顕著な違いは見いだされなかった。これに対し、架橋された酵素は、湿潤したおよび暖かい条件（３５℃／８５％相対湿度）下では、５５日後、２０％高い残存活性を示した。
【００８１】
前述のテストストリップに関して、移動度のための上澄み試験（実施例４ａ））がまた行われた。遊離のＧｌｕｃＤＨ２は３〜６％の平均の移動度を有していた一方、架橋されたＧｌｕｃＤＨ２は、全ての条件下で１％に満たない移動度を有していたことが発見され、これは、テストストリップの第１の層中での酵素の固定化を示している。
【００８２】
実施例６
遊離のＧｌｕｃＤＨ２および架橋されたＧｌｕｃＤＨ２の速度論およびシグナルダイナミクスを比較するために、前述の酵素調製物のどちらかを含むテストストリップが、速度論的パラメータおよびシグナルダイナミックパラメータに関して試験された。酵素を架橋することは顕著な違いをもたらさないことが判明した。驚くべきことに、ｃＮＡＤ化学を使用する測色テストストリップにおいて、ｃＮＡＤＨの拡散は、明らかに非常に速いため、測光法で試験される層である第１の層中での増大した色産生は観察され得ない。これに対し、最終的な着色反応生成物としてヘテロポリブルーを産生する異なる化学は、異なる挙動を示している。特に２００ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度においては、得られるシグナルのグルコース依存性は、遊離の酵素と比較して架橋された酵素が使用された場合、はるかに強く、システムの顕著に向上された性能をもたらしている。
【符号の説明】
【００８３】
１２０    グルコーステストストリップ
１２２    バッファー
１２４    ピペット
１２８    グルコーステストストリップの第１の層
１３０    グルコーステストストリップの第２の層
【図１】
2017512478.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2017512478.tif 000014
【図８】
2017512478.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月27日(2016.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋剤およびポリペプチド分子を、架橋反応が起こるために適切である条件下、溶液中で結合させる工程を含むポリペプチド分子を架橋するための方法であって、
前記架橋剤が、少なくとも４０個の原子である連続鎖を含み、および、前記ポリペプチド分子の少なくとも一部分が、グルコース脱水素酵素分子であり、好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも８０％が、グルコース脱水素酵素分子であり、より好ましくは、前記ポリペプチド分子の少なくとも９０％が、グルコース脱水素酵素分子である方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが酵素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、両末端で化学的に活性化されている枝分かれ構造のない分子である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤が、ビス活性化ポリエチレングリコールである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤が、０．６ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子質量、より好ましくは、０．９ｋＤａ〜１０ｋＤａの分子質量、さらにより好ましくは、１ｋＤａ〜５ｋＤａの分子質量、最も好ましくは３ｋＤａの分子質量を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤／前記ポリペプチド分子のモル比が、０．２〜５、好ましくは０．５〜４、より好ましくは０．８〜３、最も好ましくは１〜２である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物。
【請求項８】
架橋されたポリペプチド分子であって、前記ポリペプチド分子が、少なくとも４０個の連続する原子を含む本質的に枝分かれしていない架橋基によって架橋されており、および、前記ポリペプチド分子が、グルコース脱水素酵素分子である架橋されたポリペプチド分子。
【請求項９】
酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも一つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤および指示試薬を含む試験化学マトリックスであって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子を含む調製物および／または請求項８記載の架橋されたポリペプチド分子をさらに含む試験化学マトリックス。
【請求項１０】
請求項９記載の試験化学マトリックスを担体上に含む、体液サンプルからの分析物の測定のための診断用テストエレメント。
【請求項１１】
疾患の診断における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または請求項８記載の架橋されたポリペプチド分子の調製物。
【請求項１２】
糖尿病の診断における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る架橋されたポリペプチド分子および／または請求項８記載の架橋されたポリペプチド分子の調製物。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法による架橋された酵素分子および／または請求項８記載の架橋された酵素分子の調製物を取得する工程、ならびに
（ｂ）酸化還元補酵素、酸化還元等価物の存在下で指示試薬の少なくとも１つの計測可能な特性における変化を引き出すことのできる薬剤、指示試薬、および工程（ａ）で取得される架橋された酵素分子の調製物を混合する工程、ならびにそれによって
（ｃ）試験化学マトリックスを製造する工程
を含む試験化学マトリックスを製造するための方法。
【国際調査報告】
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