(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離されたヒト羊膜上皮細胞を含む痴呆症治療剤。
【請求項２】
前記痴呆症は、アルツハイマー病である請求項１記載の痴呆症治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、痴呆症治療剤に関する。
背景技術
神経前駆細胞（neural progenitor cells）を中枢神経系に移植して治療的な遺伝子産物を直接供給することにより、神経機能不全を治癒することが提案されている（Snyder, E.Y. et al., Cell 68, 33-51（1992）; Groves, A.K. et al., Nature 362, 453-455（1993）; Renfranz, P.J. et al., Cell 66, 713-729(1991））。最近、Snyderらは、神経前駆細胞を移植することにより、MPS VIIマウスの脳中のリソゾーム蓄積が治癒されることを報告した。
一方、アルツハイマー病は、神経原繊維変化（neurofibriallary tangle:NFT）、老人斑（plaque）として知られる神経突起の変性した領域、顆粒空胞変性（granulovaculoar degeneration:GVD）と呼ばれる神経細胞体内の単一な電子密度の高い顆粒、Hirano小胞体として知られる好酸性の封入体等を示す痴呆症である（C.U.M. Smith著、「スミス分子神経生物学」、オーム社、p.419）。アルツハイマー病の他の重要な徴候として、特に海馬におけるコリンアセチルトランスフェラーゼの著しい減少があり、アセチルコリンを脳の損傷部分（海馬中の老人斑等）に投与することにより、遮断された神経伝達が回復することが知られている（SuhrST, Gage FH, Gene therapy for neurologic disease, Arch Neurol 1993;50:1252-1268）。また、ショウジョウバエのコリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する一次線維芽細胞を健康なラットの海馬に移植するとアセチルコリンが該細胞により生産されることが知られている（Fisher LJ et al., In vivo production and release of acetylcholine from primary fibroblasts genetically modifide to express choline acetyltransferase, J. Neurochem. 1993;61:1323-1332）。
発明の開示
従って、脳内に移植された際にコリンアセチルトランスフェラーゼ生産能を有し、かつ、生体の拒絶反応を受けずに生着することができる細胞を痴呆症患者の脳に移植することにより、脳にコリンアセチルトランスフェラーゼ、ひいてはアセチルコリンが供給され、痴呆症が治癒又は少なくともその症状が軽減されると考えられる。脳に細胞を移植する場合、拒絶反応を防止する観点から、該細胞がヒト由来であることが望ましいことは言うまでもない。しかしながら、ヒト由来の神経前駆細胞は、胎児の脳細胞を除き報告されていない。しかし、胎児の脳細胞は安定的に確保することはできない。
本発明の目的は、安定的に確保でき、脳内に移植された際にコリンアセチルトランスフェラーゼ生産能を有し、かつ、生体の拒絶反応を受けずに脳に生着することができる、痴呆症治療用細胞を提供することである。
本発明者は、鋭意研究の結果、ヒト羊膜上皮細胞が神経前駆細胞であり、脳内に移植された際にコリンアセチルトランスフェラーゼを産生し、かつ、ヒト羊膜上皮細胞の抗原性がわずかで脳内に生着可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、生体から分離されたヒト羊膜上皮細胞を含む痴呆症治療剤を提供する。また、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞を含む、脳内におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ産生用細胞を提供する。また、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞を脳に移植することを含む痴呆症の治療方法を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞を脳に移植することを含む脳内においてコリンアセチルトランスフェラーゼを産生する方法を提供する。さらに、本発明は、痴呆症治療用細胞としてのヒト羊膜上皮細胞の用途を提供する。さらにまた、本発明は、コリンアセチルトランスフェラーゼ産生用細胞としてのヒト羊膜上皮細胞の用途を提供する。
本発明で用いられる痴呆症治療用細胞を脳に移植することにより、脳内でコリンアセチルトランスフェラーゼ、ひいてはアセチルコリンが生産され、アルツハイマー病のような痴呆症の症状が軽減される。本発明において用いられるヒト羊膜上皮細胞は、ヒト胎盤から得ることができるので、安定的に確保することができ、また、倫理上の問題もない。さらに、ヒト羊膜上皮細胞はClass II表面抗原を発現せず、class I表面抗原の発現もわずかであるから拒絶反応を受けずに脳に生着することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の細胞又はγ−インターフェロン処理した本発明の細胞を抗class I抗体又は抗class II抗体で染色したもののフローサイトメトリーの結果を示す図である。
発明を実施する最良の形態
ヒト羊膜上皮（以下、「ＨＡＥ」と言うことがある）細胞は、受精後約８日で原外胚葉（epiblast）から分離する羊膜芽細胞（amnioblast）から形成される。ＨＡＥ細胞が多機能性神経前駆細胞であるか否かを調べるために、免疫組織化学的研究を行ない、いくつかの特異的マーカーを検出した。ＨＡＥ細胞はニューロフィラメント蛋白質、微小管付属蛋白質２、微小管付属蛋白質２キナーゼ、Ａ２Ｂ５、ビメンチン及び神経膠線維酸性蛋白質に対して免疫反応性を示す。またＨＡＥ細胞は乏突起神経膠細胞（oligodendrocyte）マーカーの2',3'-サイクリックヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ、ガラクトセレブロシド及びミエリン塩基性蛋白質に対して免疫性を示した。これらのデータから、ＨＡＥ細胞はニューロン、タイプ２神経膠星状細胞及び乏突起神経膠細胞の抗原を発現していると考えられる。なお、上記のマーカーに対する免疫反応性の実験方法及び結果は下記参考例１に詳述されている。
本願発明者は、ヒト羊膜細胞がclass II表面抗原を発現せず、class I表面抗原の発現も僅かであることを見出した（下記参考例２参照、Sakuragawa et al., Cell Transplantation, Vol.4, No.3, pp.343-346, 1995）。従って、ヒト羊膜細胞は移植しても拒絶反応がほとんど起きない。下記参考例１で明らかになるように、本願発明者はＨＡＥ細胞が神経系細胞のマーカーを保有していることを見出した。さらに、下記実施例１に具体的に示すように、ＨＡＥ細胞を脳に移植すると、ＨＡＥ細胞はコリンアセチルトランスフェラーゼを産生する。従って、ＨＡＥ細胞を脳に移植することにより、ＨＡＥ細胞が産生するコリンアセチルトランスフェラーゼが脳細胞に供給されて痴呆症が改善され、また、移植による拒絶反応が起きない。従って、ＨＡＥ細胞は、痴呆症治療用細胞として有用である。また、ＨＡＥ細胞は、胎盤から調製できるので、安定的に調製可能である。
本発明で用いられる痴呆症治療用細胞は、ＨＡＥ細胞を含むものであり、ＨＡＥ細胞のみからなっていてもよいし、本発明の効果に悪影響を与えない他の細胞又は薬理的に許容できる他の成分との混合物であってもよい。該痴呆症治療用細胞を用いる場合には、ＨＡＥ細胞を脳に移植する。移植するＨＡＥ細胞の数は症状に応じて適宜選択することができるが、通常、１０4個ないし１０6個程度である。また、移植する脳の部位は、特に限定されないが、痴呆症において損傷を受けている部分が好ましく、例えばアルツハイマー病では海馬、脳基底核、脳線条体等が好ましい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、下記実施例は例示のためにのみ示すものであって、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
参考例１  ＨＡＥ細胞上の神経細胞マーカーの検出
ＨＡＥ細胞が多機能性神経前駆細胞であるか否かを調べるために、種々の発達特異的マーカーを検出する免疫組織化学的方法を用いた。神経細胞マーカーとして、ニューロフィラメント蛋白質（ＮＦ）、微小管付属蛋白質２（ＭＡＰ２）、及び微小管付属蛋白質２キナーゼ（ＭＫ）を用いた。神経膠細胞を同定するために、神経膠線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、ガラクトセレブロシド（ＧＣ）及び2':3'-サイクリックヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ（CNPase）に対する抗体を用いた。ビメンチンは未分化ニューログリア、ニューロン前駆細胞、Ｏ−２Ａ前駆細胞及びタイプ２神経膠星状細胞のマーカーとして用いた。Ａ２Ｂ５モノクローナル抗体は、Ａ２Ｂ５（＋）ニューロン、Ｏ−２Ａ前駆細胞及びタイプ２神経膠星状細胞を検出するために用いた。
材料及び方法
（1）帝王切開により得られた胎盤から、ＨＡＥ細胞を公知の方法（Akle et al., Lancet II:1003-1005, 1981）により調製し、１０％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地中で、５％ＣＯ2を含む湿潤空気中で３７℃で培養した。２４穴ディッシュにカバーグラスを置き、以下のように免疫組織化学染色を行なった。細胞をＰＢＳ（-）４．０％パラホルムアルデヒド溶液で室温１５分間固定した。５％正常ヤギ血清及び３％ＢＳＡでブロッキング後、細胞を一次抗体と共に１時間インキュベートした。用いた一次抗体は、NF（1:20 Serotec）, MAP2（1:20, Chemicon）及びMK（1:500, Pharmingen）, GFAP（1:5, Serotec）に対するマウスモノクローナル抗体並びにマウスＩｇＧ（３μｇ／ｍｌ、Vector）であった。次いでカバーグラスをPBS（-）で洗い、さらに二次抗体である、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（1:200, Vector）で１時間処理した。次いで、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ニチレイ）で１時間処理した。カバーグラスを再び洗い、0.05M Tris-HCl, pH7.2中に0.5mg/mlのジアミノベンチジン（同仁）を含む溶液を加えた。なお、この溶液をスライドに加える直前にこの溶液に過酸化水素（0.006%）を加えた。スライドはハリスヘマトキシリンで３０秒間染色した。
（2）上記（1）と同様にして免疫組織化学染色を行なった。用いた一次抗体はビメンチン（1:50, DAKO）とCNPase（1:50, Sigma)に対するマウスモノクローナル抗体であった。マウスモノクローナル抗体Ａ２Ｂ５ハイブリドーマ上清は希釈率１：５で用いた。
（3）また間接蛍光抗体法を用いて免疫組織化学的検討を行った。ガラクトセレブロシド（1:50, SIGMA）に対する兎ポリクローナル抗体及びMBP（1:200, DAKO）に対する兎ポリクローナル抗体を用いた。
（3）公知の方法［Mizuguchi et al., Brain Res. 649, 197-202（1994）］により免疫ブロットを行なった。すなわち、イモビロンポリビニリデンジフロリド膜（Millipore）を一次抗体と共にインキュベートした。用いた一次抗体は（1）と同様、MAP2（1:30）, MK（1:500）及びGFAP（1:5）であった。次いで膜をビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector, 1:500）及びペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Zymed, 1:500）で処理した。免疫産物は、50mM Tris-HCl, pH7.4中に0.03％の3,3'−ジアミノベンチジン及び0.006%の過酸化水素を含む溶液で５分間処理することにより可視化した。
結果
ＨＡＥ細胞は、ＮＦ，ＭＡＰ２及びＭＫに対して強い免疫反応性を示した。ＭＡＰ２及びＭＫの抗原性は免疫ブロットでも検出され、３００ｋＤ及び４２ｋＤのバンドの存在がそれぞれ示された。ビメンチンに対する免疫反応性が細胞中に見出された。ビメンチンは、生体内ではまずほとんど全ての神経前駆細胞中で発現し、次いで、未熟ニューロンが後分裂性（postmitotic）になる少し前に徐々にニューロフィラメントサブユニットに置換される。微小管はニューロン発達の初期、通常、ニューロフィラメントよりもはるか以前に生じる。ＨＡＥ細胞はＮＦ，ＭＡＰ２及びビメンチンの抗原性を示したので、ＨＡＥ細胞は異なる分化によりニューロンの発現を獲得したものであることが示唆される。
ＧＦＡＰはＨＡＥ細胞中で陽性に染色され、ＨＡＥ細胞からの抽出物のブロット上に単一の免疫反応性バンドが検出された。このことにより、タイプ１及び２神経膠星状細胞と同様に、ＧＦＡＰが細胞中に存在することが示された。また、ＨＡＥ細胞は表面マーカーＡ２Ｂ５の抗体に対して強い免疫反応性を示した。Ａ２Ｂ５陽性細胞はニューロン、タイプ２神経膠星状細胞、Ｏ−２Ａ系列細胞（lineage cell）及び未熟乏突起神経膠細胞である。ＨＡＥ細胞は、タイプ２神経膠星状細胞と同様、Ａ２Ｂ５及びＧＦＡＰの両者との免疫反応性を示した。
発達性乏突起神経膠細胞を同定するために用いたマーカーではCNPase、Gal C及びＭＢＰ抗体に対して陽性に染色された。さらに、ＨＡＥ細胞は、中間フィラメント蛋白質であるビメンチンを発現した。Ｏ−２Ａ系列の分化についてのフローチャート［Dubois-Daloq, M.EMBO J. 6:2587-2595,（1987）］から判断すると、Ａ２Ｂ５、ビメンチン、CNPase, GFAP, Gal C, MBPの抗体に陽性反応を示しているＨＡＥ細胞は、乏突起神経膠細胞及びタイプ２神経膠星状細胞の性質を示している。
以上のように、ＨＡＥ細胞はニューロン性及びグリア性細胞の両形質を発現していることが明らかになった。
参考例２  ＨＡＥ細胞の抗原性
帝王切開により得られた胎盤から、羊膜上皮層を公知の方法（Akle et al., Lancet II:1003-1005, 1981）により調製した。分離した羊膜を数個の断片に切り、トリプシン−ＥＤＴＡ（トリプシン濃度：０．１２５％）で１５分間処理して細胞を分離した。細胞を遠心分離により集め、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％Ｃ０２を含む空気雰囲気下、３７℃で培養した。８０ｃｍ２の組織培養フラスコを用い、コンフルエントに近くなった細胞を実験に用いた。
得られたヒト羊膜細胞の抗原性を調べるためのマウスモノクローナル抗体として、抗ヒトＨＬＡ class I抗原モノクローナル抗体（デンマーク、ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ社製、クローンＷ６／３２）及び抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ class II抗原α鎖モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製、クローンTAL.1B5）を用いた。さらに、酵素標識抗体法を行うために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識ヤギF（ab'）２抗マウスIg's（G+L）抗体（米国カリフォルニア州TAGO社製）を用いた。フローサイトメトリーにおいてclass I抗原及びclass II抗原を検出するために、抗ヒトＨＬＡ class I抗原モノクローナル抗体（上述）及び抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製、クローンＣＲ３／４３）並びにフルオレッセイン結合抗マウス免疫グロブリンＦ（ａｂ）２分画（オーストラリア国、ホーソーンビクトリア、Silenus Lab.社製）を用いた。
フローサイトメトリーは次のように行った。すなわち、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により、８０ｃｍ２の組織培養フラスコから、コンフルーエントに近くなったヒト羊膜細胞を採取し、冷ＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を一次抗体と３０分間４℃でインキュベートし、次いでＦＩＴＣ−結合二次抗体と共に４℃で３０分間再懸濁した。次いで細胞を直ちにフローサイトメーター（ＦＣＭ−１Ｄ、東京、ジャスコ社製）にかけた。
また、class I及びclass II抗原の誘起についてのγ−インターフェロンの効果を調べるために、上記のように調製したヒト羊膜細胞をγ−インターフェロン（ＡＢ型のヒト血清１０％を含む１００Ｕ／ｍｌ、米国シグマ社製）と３７℃で３日間処理し、上記と同様にフローサイトメトリーにかけた。
フローサイトメトリーの結果を図１に示す。図１中、横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。なお、図１Ｂは１０％ヒト血清と３日間培養したものについての結果を示す。図１Ａに示されるように、非特異的マウスＩｇＧ１抗体で染色した細胞との比較から、ヒト羊膜細胞はclass II抗原を全く発現していないことがわかる。また、対照として用いたリンパ球（図示せず）よりも蛍光強度が低いことからclass I抗原は僅かに発現されていることがわかる。また、γ−インターフェロン処理により、class I抗原及びclass II抗原とも、その発現が誘起されないことがわかった（図１Ｃ）。
一方、プレパラート上の羊膜上皮細胞標本を抗class I又は抗class II一次抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いでこれらをＨＲＰＯ結合抗体と３７℃で１時間インキュベートし、ジアミノベンジジンと室温で５分間反応させることにより発色させた。その結果、抗class IIモノクローナル抗体を用いた場合には全く染色されず、抗class Iモノクローナル抗体を用いた場合には極めて僅かに染色された。
実施例１  ＨＡＥ細胞のコリンアセチルトランスフェラーゼの発現と移植したラット脳内におけるコリンアセチルトランスフェラーゼの産生
前述（参考例１）した方法により、ヒト胎盤から羊膜細胞を分離、培養した。カバーグラス上の培養細胞を市販のコリンアセチルトランスフェラーゼ抗体（ベーリンガーマンハイム社、１：５希釈）で参考例１と同様な方法により免疫組織化学染色を行なった。その結果、細胞は染色された。また培養細胞をトリプシン処理して、細胞浮遊液（約５ｘ１０5／５μｌ、ＰＢＳ液）を作成した。ウィスターラット（２００〜３００ｇ）をネンブタールで麻酔し、定位脳手術法によりこの細胞浮遊液５μｌを脳線条体に移植した。移植後２週間日にラットを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドで還流固定を行なった。脳を取出して超薄切片を作成した。この標本を用いて、市販のコリンアセチルトランスフェラーゼ抗体（ベーリンガーマンハイム社、１：５希釈）で参考例１と同様な方法により免疫組織化学染色を行なった。その結果、細胞は染色された。この結果から、ＨＡＥ細胞が脳に生着すること及び該細胞によりコリンアセチルトランスフェラーゼが産生されることが明らかになった。
【図１】
0004072203.tif 000002