(57)【要約】  アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から低減するための製剤、組成物及び生産物が開示される。その製剤は、Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用し、Ｆｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含む。アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去するための製剤を用いる方法も開示される。【選択図】  図１
2017512213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用して前記Ｆｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含む、アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去するための製剤。
【請求項２】
少なくとも１つのタンパク質分解酵素が、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ及び亜鉛金属プロテアーゼから選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記セリンプロテアーゼが、スブチリシン、プロテイナーゼＫ、トリプシン、α−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃから選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記スブチリシンが、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・クラウシィ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｕｄｕｒａｎｓ）、バチルス・レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）又はバチルス・サブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種由来である、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記チオールプロテアーゼが、ブロメライン、パパイン及びフィシンから選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項６】
前記アスパルチルプロテアーゼが、キモシン、エンドチアペプシン、ムコールペプシン／レンニン、ペプシン及びアスペルギロペプシンから選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項７】
前記亜鉛金属プロテアーゼが、サーモリシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎから選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項８】
前記サーモリシンがバチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｒｏｋｋｏ）又はゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．由来であり、前記エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎがフラボバクテリウム・メニゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来である、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
表２に示されたタンパク質分解酵素に適切な分析条件下で、ＥＬＩＳＡにより測定された場合に、前記タンパク質分解酵素が抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも９０％低減する、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
前記タンパク質分解酵素が、スブチリシン、トリプシン、α−キモトリプシン、ブロメライン、パパイン、フィシン、キモシン、エンドチアペプシン、ムコールペプシン／レンニン、ペプシン、アスペルギロペプシン、サーモリシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのうち１つ以上から選択される、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記タンパク質分解酵素が、パパイン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来スブチリシン、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来アスペルギロペプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、ブロメライン、フィシン、α−キモトリプシン、クリフォネクトリア・パラシチカ（Ｃｈｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）由来エンドチアペプシン、ペプシン及びゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．由来サーモリシンのうち１つ以上から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
前記タンパク質分解酵素が、パパイン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来スブチリシン、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来アスペルギロペプシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのうち１つ以上から選択される、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
表２に示されたタンパク質分解酵素に適切でありかつ７．５％イソプロパノールを含有する分析条件下で、ＥＬＩＳＡにより測定された場合に、前記タンパク質分解酵素が抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも５０％低減する、又は表２に示された前記タンパク質分解酵素に適切でありかつ１０％ポリソルベート２０を含有する分析条件下で、ＥＬＩＳＡにより測定された場合に、前記タンパク質分解酵素が抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも５０％低減する、請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
前記タンパク質分解酵素が、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来アスペルギロペプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来スブチリシン、パパイン、ブロメライン及びフィシンのうち１つ以上から選択される、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
Ｆｅｌ  ｄ  １の分解において前記タンパク質分解酵素の効率を増強する添加剤を更に含み、前記添加剤がシステイン若しくはカルシウム塩／イオン（Ｃａ２＋）、又はシステイン及びカルシウム塩／イオン（Ｃａ２＋）の組み合わせである、請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
液体、固体若しくは粉体の洗浄剤、スプレー、湿った布、拭取り布、スポンジ、水分散性錠剤、フィルタ、食品、油若しくは水補助剤、電気掃除機のフィルタ若しくは添加剤、粒剤、洗剤、絨毯及び室内用の消臭剤、ネコ砂、ネコ砂用添加剤、手袋、不織布製品用の添加剤、洗濯機用ポッド（タブレット）及びマルチチャンバー液体タブレットから選択される組成物中に配合される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
前記タンパク質分解酵素が食品及び化粧品における使用において安全であると認識される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１８】
皮膚、毛髪又は毛皮への適用に適した、石鹸、シャンプー、リンス、パウダー、スプレー、ジェル、ムース、泡沫、コンディショナ、ローション、首輪、分散剤又はモイスト手袋若しくは拭取り布から選択される組成物中に配合される、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
食用組成物中に配合される、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２０】
前記タンパク質分解酵素が、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、他のタンパク質及び繊維若しくは布地から選択される物質と実質的に相互作用しない、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２１】
Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用して前記Ｆｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素と、前記タンパク質分解酵素が活性を有する又は使用に先立ち活性化し得る媒体とを組み合わせることを含む、Ｆｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性を減少又は除去するための製剤を作製する方法。
【請求項２２】
Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用して前記Ｆｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解することによりアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含む製剤に、Ｆｅｌ  ｄ  １が存在する環境の要素を接触させることを含む、アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去する方法。
【請求項２３】
前記Ｆｅｌ  ｄ  １が無生物の表面上に存在し、前記製剤が前記表面に適用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｆｅｌ  ｄ  １が空中浮遊しており、前記製剤を空気に接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆｅｌ  ｄ  １を産生する動物の内部又は該動物上に前記Ｆｅｌ  ｄ  １が存在しており、前記Ｆｅｌ  ｄ  １が存在する前記動物の部分に前記製剤を適用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｆｅｌ  ｄ  １が、前記動物の毛髪、毛皮若しくは外皮に存在する又は前記動物の口腔内に存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用して前記Ｆｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を有する製剤、及びアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １の環境からの減少又は除去における使用のための使用説明を含む製品。
【請求項２８】
無生物の表面への適用のために製剤化された、請求項２７に記載の製品。
【請求項２９】
液体、固体又は粉体の洗浄剤、スプレー、湿った布、拭取り布、スポンジ、水分散性錠剤、洗剤、絨毯又は布地用消臭剤、ネコ砂、ネコ砂用添加剤、手袋、不織布製品用の添加剤、洗濯機用タブレットから選択される、請求項２８に記載の製品。
【請求項３０】
空中浮遊Ｆｅｌ  ｄ  １に接触させるために製剤化されたフィルタを含む、請求項２８に記載の製品。
【請求項３１】
前記動物の毛髪、毛皮又は外皮への適用のための、シャンプー、コンディショナ、リンス、ジェル、ムース、スプレー、ローション又はパウダーとして製剤化される、請求項２７に記載の製品。
【請求項３２】
前記動物の口腔への適用のための、歯磨き、フィルム、食品、おやつ、又は前記動物用食品若しくは水の添加剤として製剤化される、請求項２７に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
[0001]本出願は、２０１３年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／９１８，４２０号の優先権を主張するものであり、この開示の全体は本参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002]本発明は、概ね、ネコアレルギー又はその症状を減少又は防止すること、並びに特に主要なネコアレルゲンであるＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]イエネコは、世界中の人々に影響を与えるアレルギー反応誘導因子の中でも、特に強力な作用を持つものをいくつか産生する。症状の重症度は、軽度の鼻炎及び結膜炎から生命を脅かす喘息性反応までにわたる。ネコ鱗屑中の最も顕著でありかつ強力なアレルゲンはＦｅｌ  ｄ  １である。Ｆｅｌ  ｄ  １は、ネコアレルギー患者の９０〜９５％においてＩｇＥ応答を誘導し（ｖａｎ  Ｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０４：１２２３〜１２３０）、ネコ鱗屑中のアレルゲン活性全体の６０〜９０％を占める（Ｋｌｅｉｎｅ−Ｔｅｂｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００：２５６〜２６２）。
【０００４】
[0004]ごく少数のアレルゲンのみで３次元構造が報告されている（参照Ｖａｌｅｎｔａ＆Ｋｒａｆｔ，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７９：１１９〜１２７）。これらのアレルゲンの生物学的機能は多様又は未知であり、アレルゲンとして作用するタンパク質としてみなされる傾向のある生物学的又は構造上特有の特徴を何ら有していない（参照Ａａｌｂｅｒｓｅ，２０００，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：２２８〜２３８）。アレルゲン性に関連すると考えられているタンパク質の構造上の特徴としては、タンパク質の溶解性、安定性、大きさ、及びコンパクトさが挙げられる。これらの特徴は、アレルゲン性が、経粘膜バリア的な輸送及びタンパク質分解酵素への感受性に依拠していることを反映している（Ａａｌｂｅｒｓｅ，２０００，上記）。翻訳後修飾も、新規の抗原決定基の導入により、あるいは可溶性、安定性、大きさ、タンパク質分解酵素に対する感受性の変更、及び／又は抗原提示細胞による抗原取り込みと処理の変更などにより、アレルゲン性に影響を与え得る（Ａａｌｂｅｒｓｅ，２０００，上記）。糖鎖形成はこれらの過程の多くに影響するが、糖鎖形成そのものはアレルゲン性の決定要因ではない。多くのアレルゲンは糖鎖が付加されていないが、いくつかのものには著しい糖鎖付加が見られる（Ａａｌｂｅｒｓｅ，２０００，上記）。その結果、アレルゲン性についての判定基準として、アレルゲンの構造についての詳細な研究が必要とされる場合があり、その場合でも確定的な結果が得られないこともある。
【０００５】
[0005]Ｆｅｌ  ｄ  １は、２つのヘテロ２量体から形成される３５ｋＤａの４量体糖タンパク質である。１８ｋＤａの２量体のそれぞれは、７０残基から形成される鎖１、及び９０又は９２残基から形成される鎖２（２つのアイソフォームがある）の、２つの独立した遺伝子に由来する共有結合した２つの鎖により構成される。Ｆｅｌ  ｄ  １の３次元構造は決定されている（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７７３０〜３７７３５，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：８９９〜９０８）。このタンパク質の折り畳み構造は、抗炎症特性及び免疫調節特性を持つサイトカイン様分子でありステロイド誘導性のウテログロビンの構造と顕著な類似性を有することが明らかとなっている。３つのＩｇＥ抗原決定基の相対的な位置が、Ｆｅｌ  ｄ  １分子表面のそれぞれ１５〜２８（鎖２）、１１７〜１３０及び１３８〜１５１（鎖１）残基であると確定された（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，上記）。
【０００６】
[0006]Ｆｅｌ  ｄ  １は、脂腺及び扁平上皮細胞により産生され、舐めたり毛づくろいすることによって毛皮に移動する（Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７６：５０３〜５０６；Ｃｈａｒｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８：７７〜８２；Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：４６２〜４６５）。Ｆｅｌ  ｄ  １は、唾液、肛門周囲、及び涙腺にも存在する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７６：５６３〜５６９；ｖａｎ  Ｍｉｌｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２：３７５〜３７８）このように、そのアレルゲンは動物の内部及び動物上に存在し、ネコが居住する環境内にある物の表面へ空中浮遊小粒子によって運ばれもする。
【０００７】
[0007]そのようなアレルゲンに対する反応を制御するために開発された戦略としては、個体にアレルゲンに対する寛容性を付与すること、及び単に回避することが挙げられる。免疫寛容戦略では、外因性アレルゲンに対する害のより少ない又は利益のより大きい応答の確立又は再確立が必要となる。免疫寛容を誘導する戦略は、従来、感作された個体を、例えば一連の注射又は経口若しくは経鼻吸収など制御された方法で意図的にアレルゲンに暴露するという、アレルゲン免疫療法を含んでいる。免疫療法は１００年以上にわたり用いられており成功を収めているものの、十分な寛容度合いとなるまでに何年もかかる場合がある。免疫寛容戦略は、処置を受ける特定の個体にとって有効である可能性があるが、高価で、侵襲性の、長期にわたるものであり、投与に際して医師、免疫学者、及びその他同様の者など専門家を必要とする。免疫寛容のための処置は、副作用及び有害反応に関連するある程度の危険性も伴う。
【０００８】
[0008]Ｆｅｌ  ｄ  １を回避することは原理的には魅力的だが、達成するのは困難である。ネコがいる世帯についての研究は、Ｆｅｌ  ｄ  １が、例えば９６．６％のベッド、９６．９％の寝室の床、９６．１％の居間の床、及び９７．９％のソファで広く存在することを示した。（Ｇｅａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１１６（２）：Ａｕｇｕｓｔ  ２００５）。ネコがいる家庭の学童の服を家庭外（学校）で検査したところ、Ｆｅｌ  ｄ  １抗原を含んでいることが明らかとなった。
【０００９】
[0009]このように、この環境抗原は、ネコのいる家庭に居住する感作された個体のみならず、アレルギーを持つヒト集団全体に対して重大な危険を提示する。（Ｇｅｒｇｅ＆Ｄｒｅｂｏｒｇ，Ｐｅｄ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎ．，９（１）：２５〜３０，１９９８）その結果、アメリカ合衆国ではネコの所有者が増加傾向にある一方、ネコアレルギーが、ネコを動物保護施設に引き渡す主な理由になり、その状況は変わっていない（Ｓｃａｒｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｓｃｉ．２：４１〜５７）。
【００１０】
[0010]Ｆｅｌ  ｄ  １を完全に回避するのは実際的ではないだろうが、Ｆｅｌ  ｄ  １の量の減少は、わずかな減少でさえも、感作された個体の健康に大きな効果がある場合がある。Ｆｅｌ  ｄ  １の量の減少により、ヒトが家庭で感作されることによる放棄を最少限に抑えることもできるのではないだろうか。
【００１１】
[0011]環境からネコアレルゲンを減らす試みがなされてきている。例えば米国特許第７，７０４，５３２号は、衣服、表面、室内装飾品、家具、花壇、植物及びその他同様のものにおいて、アルミニウム塩、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩を含む酸性の塩溶液を含有する組成物と、ネコアレルゲンを含むアレルゲンを直接接触させることにより、ヒト及び他の感受性動物におけるアレルギー反応を緩和することを趣旨とする方法を開示している。米国特許第５，８２６，５４６号は、組成物を泡沫として分注することが可能なディスペンサと組み合わせて発泡性のシャンプー組成物を用いることを含む、水を必要とせずにペットをシャンプーするための方法を開示している。この組成物には、ペットに特有の必要性に応じ、陰イオン性洗剤、非イオン性洗剤、両イオン性洗剤、防腐剤、抗菌物質、抗酸化剤、低刺激性石鹸、界面活性剤、アロエ抽出物のようなスキンコンデイショナ、香料、ティーツリー油などノミの寄生を処置する剤、クエン酸などのｐＨ調整剤のうち１つ以上を含ませることができる。米国特許出願公開第２０１１／０１３５７５０号は、ネコＦｅｌ  ｄ  １などのアレルゲンを変性することを趣旨とする方法及び組成物を開示しており、組成物はカルシウム塩及びランタン塩の組み合わせを含有する。米国特許出願公開第２００４／０００７２５１号は、ネコＦｅｌ  ｄ  １のなどのアレルゲンに結合し又はこれを切断し、表面からのかかるアレルゲンの除去を可能とすることを意図した、レクチン、タンパク質分解酵素、及び／又は酵素阻害剤などの添加剤を含む、湿性及び乾性の拭取りクリーナを開示している。米国特許出願公開第２００６／０１４２３９４号は、ヒトに対しアレルゲン性の作用を誘起不能になるようポリペプチド類を分解することのできる酵素を含む組成物を使用して、チリダニの排泄物を抑制し、並びに動物の毛髪ケラチン及び／又は植物の花粉若しくは胞子を変性させるための方法を開示している。米国特許第８，４５４，９５３号は、アレルギー応答を起こしやすい動物におけるアレルゲンの肥満細胞への結合能を阻害することのできる分子を含む組成物と、アレルゲンを接触させることを含む、アレルギー又はアレルゲンに対するアレルギー応答の症状を低減又は防止する方法を開示している。その分子は、ネコＦｅｌ  ｄ  １アレルゲン特異的抗体などの、アレルゲン特異的な抗体であり得る。
【００１２】
[0012]様々な商業的に入手可能な製品及び方法も、環境からアレルゲンを減じると称している。ネコＦｅｌ  ｄ  １により生じるものなどのヒトにおけるアレルギー反応の防止又は緩和に有益であるとされているかかる方法の１つは、まず環境中の表面を清潔にし、その後スプレー塗布器を使い、マットレス、絨毯、布張り家具、敷物及び窓周りのものなどの表面に、果実及び植物種子の抽出液に由来する成分を含有する水性溶液を適用することにより実行される（参照ＭＡＳＴＥＲＢＬＥＮＤ（登録商標）Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＲＥＳＰＯＮＳＩＢＬＥＣＡＲＥ  ＳＹＳＴＥＭ（商標）ＡＬＬＥＲＧＹ  ＲＥＬＩＥＦ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ（商標）、ｕｒｌ  ｍａｓｔｅｒｂｌｅｎｄ．ｎｅｔ）。ＡＰＤＣ，Ｉｎｃ．（ｕｒｌ  ａｐｄｃ−ｉｎｃ．ｃｏｍ）は、二酸化塩素を含有する植物及び天然の有機化合物に由来するとされる液体組成物であるＡＬＬＥＲ−ＲＸ（登録商標）Ａｎｔｉ−Ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｓｐｒａｙを製造している。他の方法は、ネコＦｅｌ  ｄ  １を含む、動物の毛皮及び皮膚上のアレルゲンを取り除くために、シャンプー及びスキンコンディションの成分を含む組成物を直接動物に適用することを含む（参照Ａｌｌｅｒｐｅｔ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにより製造されるＡＬＬＥＲＰＥＴ（登録商標））。その組成物をネコに直接適用することにより、ネコの毛皮及びネコにさらされた絨毯上のＦｅｌ  ｄ  １量が減少することが示された（ＬＧＨ  Ｋｏｒｅｎ，Ｅ  Ｊａｎｓｓｅｎ，Ａ  Ｗｉｌｌｅｍｓｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｒｃｈ  １９９５  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ＆Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
【００１３】
[0013]上記に要約されたように、ある種の方法及び組成物が当該技術分野において利用可能ではあるが、環境中のＦｅｌ  ｄ  １を低減する又はそのアレルゲン性を低減する若しくは非アレルゲン性とするための追加の方法及び改良された方法が依然として必要とされている。アレルギー応答を起こしやすい個体の応答を減じ、最小限に抑え、又は防止するための、Ｆｅｌ  ｄ  １の量及び／又は効力の十分な制御を可能とする組成物も必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
[0014]したがって、アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去することが、本発明の目的である。
【００１５】
[0015]アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を、ネコアレルギーに罹患し得る個体の局所環境を含む環境から減少又は除去することが、本発明の更なる目的である。
【００１６】
[0016]アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を、例えばネコの毛髪、皮膚若しくは毛皮、又はネコの唾液などのアレルゲン源から減少又は除去することが、本発明のその上更なる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
[0017]これらの目的のうち１つ以上は、Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用してＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解することによりアレルゲン性を減少又は除去するタンパク質分解酵素を含む、製剤、生産物、キット及び方法を使用することにより達成することができる。
【００１８】
[0018]本発明のその他の及び更なる課題、特徴、及び利点は、当業者には容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｆｅｌ  ｄ  １がバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシンにより完全に分解されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ。天然Ｆｅｌ  ｄ  １（１．９μｇ）を、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．８）又は酢酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．０）中で、０．１、１又は１０ｒｆｕ／ｓの活性のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と共に３７℃で一晩保温した。Ｆｅｌ  ｄ  １を非添加のスブチリシン（１０ｒｆｕ  ｓ−１）及びスブチリシンを非添加のＦｅｌ  ｄ  １を、対照として供試した。
【図２】ＥＬＩＳＡにより測定された、タンパク質分解酵素に触媒させた分解後の残存Ｆｅｌ  ｄ  １濃度を示すヒストグラム。天然Ｆｅｌ  ｄ  １（２．５μｇ）を、Ｆｅｌ  ｄ  １の完全分解が可能な最少必要活性（表２参照）の試験したすべての商用タンパク質分解酵素（ＢＬＡＰを除く）と共に、２０μＬの最適な緩衝液中で一晩保温した。試料は希釈し、２０分及び３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。希釈の結果、Ｆｅｌ  ｄ  １の初発の濃度は１２ｎｇ  ｍＬ−１と期待された（すなわち分解なし）。陰性対照（Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ）はＦｅｌ  ｄ  １を含まず、陽性対照は異なる緩衝液で保温したＦｅｌ  ｄ  １を含んだ。陽性対照１：Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．８）、陽性対照２：リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）、陽性対照３：リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）、陽性対照４：酢酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．０）。タンパク質分解酵素に触媒させる分解は２連で実施した。
【図３】ＴＮＢＳ分析により測定された、タンパク質分解酵素のケラチン加水分解活性を示すヒストグラム。Ｆｅｌ  ｄ  １分解に最適であることが明らかとなった濃度及び反応条件下（表２参照）で、ケラチン粉末を、適合するタンパク質分解酵素と共に一晩保温した。ケラチン分解産物は、ピクリルスルホン酸（ＴＮＢＳ）とのカップリング反応の後、１０倍希釈試料を用い４０５ｎｍで分光光度計により測定された。データは、試料で測定された吸光度と、同一の緩衝液だがタンパク質分解酵素非添加の対照との相違を表している。３回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図４】スルホローダミンＢ及びＷＳＴ−１分析により測定された、ヒトケラチノサイトに対するタンパク質分解酵素の細胞毒性を示すヒストグラム。集密増殖した初代ヒトケラチノサイトを、１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １を分解するのに必要と同定された最少濃度の適合するタンパク質分解酵素（表２参照）と共に、一晩培養した（細胞培養培地中で）。培養の後、ウェルごとにすべての細胞（接着及び剥離細胞）の残存細胞活性を、ＷＳＴ−１を用いた染色（代謝活性のある細胞の染色）により測定した。その後、接着細胞のみの残存細胞活性をスルホローダミンＢを用いた染色（生細胞のタンパク質の染色）により測定した。タンパク質分解酵素と共には培養しなかった細胞（残存細胞活性１００％に相当）を対照として供試した。３回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図５】タンパク質分解酵素に触媒されるＦｅｌ  ｄ  １の分解におけるイソプロパノールの影響を示すヒストグラム。Ｆｅｌ  ｄ  １分解に最適であることが明らかとなった反応条件下（表２参照）で、適合するタンパク質分解酵素を、０、２．５％、５．０％、７．５％、１０．０％及び１２．５％濃度のイソプロパノールと共に一晩保温した。試料は希釈し、２０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、最大のイソプロパノール濃度を含むがタンパク質分解酵素を含まないそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。３回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図６】タンパク質分解酵素に触媒されるＦｅｌ  ｄ  １の分解におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の影響を示すグラフ。Ｆｅｌ  ｄ  １分解に最適であることが明らかとなった反応条件下（表２参照）で、適合するタンパク質分解酵素を、０、１０％、２０％及び３０％濃度のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０と共に一晩保温した。試料は希釈し、２０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を含まないがそれぞれのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０濃度である緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。３回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図７】３７℃で一晩保温の間に、人工ネコ唾液中で、異なる濃度のＦｅｌ  ｄ  １がパパインにより触媒される分解を受ける際の、システイン及び異なる濃度の脱脂乳の影響を示すヒストグラム。０、７１、７１４及び７１４０μｇ  ｍＬ−１の脱脂乳を含み、４０ｍＭシステイン添加及び非添加の人工ネコ唾液中で、１．２５、１２．５及び１２５μｇ  ｍＬ−１の天然Ｆｅｌ  ｄ  １を、４．６５μｇ  ｍＬ−１のパパイン（２０μＬの反応混合液中６０ｒｆｕ  ｓ−１に相当、表２参照）と共に３７℃で一晩保温した。保温後、試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。希釈の結果、Ｆｅｌ  ｄ  １の最大濃度は１２ｎｇ  ｍＬ−１と期待された（すなわち分解なし）。２回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図８】人工ネコ唾液（極端条件）中で、異なる濃度のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン（Ｐｒｏｔｅｘ（登録商標）６Ｌ）と共に、３７℃で１時間及び一晩保温した後のＥＬＩＳＡによるＦｅｌ  ｄ  １の測定を示すヒストグラム。１２５μｇ  ｍＬ−１の天然Ｆｅｌ  ｄ  １が、０、９．５、９５、９５０及び９５００μｇ  ｍＬ−１のスブチリシンと共に、人工ネコ唾液中（極端条件）３７℃で、０分、１時間又は２０時間（一晩）保温した。反応は１ｍＭのＰＭＳＦ添加で停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。希釈の結果、Ｆｅｌ  ｄ  １の最大濃度は１２ｎｇ  ｍＬ−１と期待された（すなわち分解なし）。２回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図９】人工ネコ唾液中の１０００倍に増加した濃度のパパイン及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン（Ｐｒｏｔｅｘ（登録商標）６Ｌ）のＦｅｌ  ｄ  １分解について、５〜６０分保温後の試験結果を示すヒストグラム。Ｆｅｌ  ｄ  １と共に通常及び極端条件下で人工ネコ唾液中、４．５ｍｇ  ｍＬ−１のパパイン及び９．５ｍｇ  ｍＬ−１のスブチリシンが、３７℃で０、５、１０、１５及び６０分間保温された。反応は、１００μＭのＥ６４（パパイン用）及び１ｍＭのＰＭＳＦ（スブチリシン用）の添加により停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を非添加のそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。３回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。略語：ｎ．ｄ．、未決定
【図１０】人工ネコ唾液中のＦｅｌ  ｄ  １分解について、パパイン及びバチルス・リケニフォルミス（ａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン（Ｐｒｏｔｅｘ（登録商標）６Ｌ）濃度の異なる組み合わせ（比は一定）の０〜６０分保温後の試験結果を示すヒストグラム。パパイン及びスブチリシン濃度の異なる組み合わせ（４．５及び９．５μｇ  ｍＬ−１；４５及び９５μｇ  ｍＬ−１；４５０及び９５０μｇ  ｍＬ−１；４５００及び９５００μｇ  ｍＬ−１のそれぞれパパイン及びスブチリシン）を、０、５、１０、１５及び６０分間、Ｆｅｌ  ｄ  １と共に、通常及び極端条件下、人工ネコ唾液中、３７℃で保温した。反応は、１００μＭのＥ６４及び１ｍＭのＰＭＳＦの添加により停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を非添加のそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。２回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図１１】人工ネコ唾液中のＦｅｌ  ｄ  １分解について、パパイン及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン（Ｐｒｏｔｅｘ（登録商標）６Ｌ）濃度の異なる組み合わせ（パパイン濃度一定）の０〜１０分保温後の試験結果を示すヒストグラム。パパイン及びスブチリシン濃度の異なる組み合わせ（４５００及び１１８８μｇ  ｍＬ−１；４５００及び２３７５μｇ  ｍＬ−１；４５００及び４７５０μｇ  ｍＬ−１；４５００及び９５００μｇ  ｍＬ−１のそれぞれパパイン及びスブチリシン）を、０、５及び１０分間、Ｆｅｌ  ｄ  １と共に、通常及び極端条件下、人工ネコ唾液中、３７℃で保温した。反応は、１００μＭのＥ６４及び１ｍＭのＰＭＳＦの添加により停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を非添加のそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。２回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。
【図１２】人工ネコ唾液中のＦｅｌ  ｄ  １分解について、パパイン及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン（Ｐｒｏｔｅｘ（登録商標）６Ｌ）濃度の異なる組み合わせ（スブチリシン濃度一定）の０〜１０分保温後の試験結果を示すヒストグラム。パパイン及びスブチリシン濃度の異なる組み合わせ（５６５及び１１８８μｇ  ｍＬ−１；１１２５及び１１８８μｇ  ｍＬ−１；２２５０及び１１８８μｇ  ｍＬ−１；４５００及び１１８８μｇ  ｍＬ−１のそれぞれパパイン及びスブチリシン）を、０、５及び１０分間、Ｆｅｌ  ｄ  １と共に、通常及び極端条件下、人工ネコ唾液中、３７℃で保温した。反応は、１００μＭのＥ６４及び１ｍＭのＰＭＳＦの添加により停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を非添加のそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。２回の独立した反復実験から平均及び標準偏差を算定した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
[0031]本明細書で用いられる「アレルギー」という用語は、「アレルギー応答」又は「アレルギー反応」と同義である。その用語の各々は、ある動物において他の場合にはその動物にとって有害ではない外因性抗原（又は「アレルゲン」）に対する、特異的な免疫応答性状態を表す。アレルギー応答の「症状」とは、前述の免疫応答性の、例えば分子レベル（タンパク質、又は転写産物若しくは遺伝子の活性又は発現の測定を含む）、細胞レベル、器官レベル、全身レベル、又は生体レベルでのいかなる測定量をも表す。そのような症状は１つ以上のそのようなレベルを含み得る。症状は、炎症、呼吸器の愁訴、腫脹などの全身性の現象、あるいはアレルギー、鼻炎、浮腫、並びに限定されるものではないがアトピー性皮膚炎（例えば湿疹）、じんま疹及び血管性浮腫、並びにアレルギー性の接触性皮膚炎を含むアレルギー性の皮膚障害、に一般に関連する苦痛、を含み得る。アレルギー応答の「症状」としてより特徴的な現象は、例えば細胞レベルでは、限定されるものではないが細胞数、好酸球増加、例えば肥満細胞及び／又は好塩基球を含む免疫細胞の動員及び／又は活性化における局所的又は全身性の変化、抗原提示細胞（限定されるものではないがＦｃεＲＩを有する樹状細胞）の変化、免疫学的カスケードにおける１つ以上のステップの測定値又は観察結果、すべてのアレルギー応答を媒介する細胞内化合物（例メディエータ）の放出を含む細胞内又は分子の変化、並びに１つ以上のサイトカイン（例えばＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−４、又はＩＬ−１３）若しくは関連化合物又はそれらのアンタゴニストの変化を含む、いかなる測定可能な又は観察可能な変化をも含む。他より容易に測定されるものとして本明細書で定義された特定の症状、及びいくつかのものが、その症状の主観的評価又は自己評価であることを当業者は理解するであろう。他の症状については、変化を客観的に評価するための簡便又は迅速な分析又は測定方法が存在する。
【００２１】
[0032]本明細書で用いられる「環境」という用語は、ネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １に関連するものとして３つの構成成分を有する。これらは、ときに「ネコ周辺」、「ネコ上」及び「ネコ内」と表される。「ネコ周辺」の環境とは、ネコアレルギーに罹患し得る個体の周辺環境、及び／又はネコが居住する周辺環境を表す。例えば、家、部屋、車、事務所、ホテル、庭、ガレージ、及びその他同様のものそれぞれが、本明細書で用いられる「環境」であり得る。アレルゲンが付着し得るいかなる無生物表面も、環境の一部と考えられる。アレルゲンを含有する空中浮遊粒子も、環境の一部と考えられる。ネコ周辺の環境は屋内であることが多いが、本明細書では部分的若しくは完全に開放された限定空間又は野外を環境であることから除外しないこととし、例えばパティオ、デッキ、踊り場、ラナイ、東屋、玄関、又はその他同様のものは、本明細書の目的のための環境を構成し得る。環境は、アレルゲン源である動物の一部又は全体をも含み得る。例、ネコの皮膚、毛皮又はネコの皮膚若しくは毛皮についた（「ネコ上」の）唾液又はネコ口腔若しくはその中の（「ネコ内」の）唾液。
【００２２】
[0033]本明細書で用いられる「個体」は、ヒトを含むいかなる種又は種類の動物個体をも意味する。
【００２３】
[0034]キットに関して、「単一パッケージ」という用語は、キットの構成要素が１つ以上の容器内に物理的に随伴する又は容器に随伴するものであり、製造、流通、販売、又は使用のための１つの単位と考えられることを意味する。容器には、限定されるものではないが、袋、箱若しくはボール箱、ビン、任意の種類、設計、若しくは材料のパッケージ、上包み、シュリンク包装、貼付された（例えば、ホチキス留め、接着、又は同様の）構成部分、又は前述したものの任意の組み合わせが含まれる。例えば単一パッケージのキットにより、製造、流通、販売、又は使用のための１つの単位として考えられるような物理的に随伴する個々の構成要素及び／又は食品構成要素の容器を供給することが可能である。
【００２４】
[0035]「実質上のパッケージ（virtual package）」という用語は、他の構成要素の入手方法を使用者に指示する、１つ以上の有形又は実質上のキット構成要素についての説明が、キットの構成要素に添付されていることを意味する［例えば、袋又はその他の容器の中に、１つの構成要素と、使用者に、ウェブサイト若しくはパーソナル機器のアプリケーション（「アプリ」）にアクセスするよう、録音メッセージ若しくはファックス返送サービスに連絡するよう、視覚的メッセージを見るよう、又は例えばキットの使用説明若しくは１つ以上のキット構成要素についての安全性情報若しくは技術情報を得るためにサポート提供者若しくは指導者に連絡するよう支持する指示書と、を含む］。実質上のキットの一部として提供され得る情報の例としては、使用説明、化学物質等安全データシートなどの安全上の情報、毒物規制情報、可能性のある副作用に関する情報、臨床試験結果、食品組成又はカロリー組成などの食に関する情報、身体活動性、運動、代謝、安定性及びその他同様のものに関する一般情報が挙げられる。
【００２５】
[0036]本明細書で表されているすべての百分率は、別段の記述がない限り組成物の乾物重による。当業者は、「乾物重」という用語が、組成物中のすべての自由水分が除去された後に成分の濃度又は組成物中の百分率が計測又は測定されることを意味すると理解するであろう。
【００２６】
[0037]本明細書では範囲内の個々の値及びすべての値を長々と提示したり記述したりすることを避けるために、範囲は省略して用いられる。範囲内の任意の適切な値が、範囲の上限値、下限値、又は末端値として適切に選択可能である。
【００２７】
[0038]本明細書で用いられる用語「約（about）」は、与えられた値±２０％又は±１５％又は±１０％又は±５％又は±１％が意図されることを示している。したがって「約（About）」は、記載された値からの小さな変動も本発明の範囲内にあるという認識により、省略が用いられている。
【００２８】
[0039]本明細書及び添付の請求項で用いられる単語の単数形は、文脈により明確に指示されない限り、複数形が包含され逆に複数形には単数形が包含される。したがって、「ａ」、「ａｎ］及び「ｔｈｅ」の言及には、通常はそれぞれの用語の複数形が包含される。例えば、「ａ  ｃａｔ」、「ａ  ｍｅｔｈｏｄ」、又は「ａ  ｐｒｏｄｕｃｔ」への言及には、それらの複数形の「ｃａｔｓ」、「ｍｅｔｈｏｄｓ」、又は「ｐｒｏｄｕｃｔｓ」が包含される。同様に、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含んでいる（comprising）」という単語は、排他的にではなく、包含的に解釈されるべきである。同様にして、用語「含有する（include）」、「含有している（including）」及び「又は（or）」は、そのような解釈が文脈から明確に妨げられない限りは包含的なものであると解釈される。本明細書で用いられる用語「例（examples）」、又は「例えば（for example）」は、特にその後に言葉の項目が続く場合には、単なる例示的かつ例証的なものであり、排他的又は包括的なものであるとみなされるべきではない。
【００２９】
[0040]用語「含む（comprising）」は、「基本的に〜で構成されている（consistingessentially of）」及び「〜で構成されている（consisting of）」といった用語により網羅される実施形態を含有することが意図されている。同様に、「基本的に〜で構成されている（consisting essentially of）」という用語は、「〜で構成されている（consisting of）」という用語により網羅されている実施形態を含有することが意図されている。
【００３０】
[0041]本明細書で開示される方法及び組成物及び他の改良は、当業者により理解されるように変更可能であるので、本明細書に記載されている特定の方法、手順、及び試薬に限定されるものではない。更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、開示又は請求の範囲を制限することを意図するものではなく制限するものでもない。
【００３１】
[0042]別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語、専門用語、及び頭字語は、本発明分野の当業者により又はその用語が用いられる分野において、一般に理解されている意味を有している。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の組成物、方法、製品、又はその他の手法若しくは材料が本発明の実施に使用され得るが、好ましい組成物、方法、製品、又はその他の手法若しくは材料が本明細書中に記載されている。
【００３２】
[0043]本明細書において引用又は参照されるすべての特許、特許出願、出版物、及びその他の参考文献は、参照することにより法律により認可される範囲で本明細書に組み込まれる。それらの参照についての論考は、その中でなされた主張を要約することを意図するにすぎない。そのような特許、特許出願、出版物若しくは参考文献、又はそれらの任意部分などのすべてについて、関連性がある、材料となる、又は先行技術であるということを認めてはいない。そのような特許、特許出願、出版物、及び他の参考文献が、関連性がある、材料となる、又は先行技術であるという、いかなる主張に対しても、正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利を明確に留保する。
【００３３】
[0044]ネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去するための組成物、方法、製品、キット及びパッケージが提供される。本発明の一部は、ある種の酵素、特にタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）がＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を分解可能であり、それによりアレルゲン性の作用を減少又は除去できるという本発明者の発見に由来する。
発明を実施するための形態
【００３４】
[0045]本発明の１つの態様は、アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を減少又は除去するための、Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用しＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含む製剤を特徴とする。有効なタンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、亜鉛金属プロテアーゼ、又はこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３５】
[0046]ある種の実施形態において、セリンプロテアーゼはスブチリシン、プロテイナーゼＫ、トリプシン、α−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含む。スブチリシンが用いられる場合は、バチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）、バチルス・クラウシィ（B.clausii）、バチルス・ハロデュランス（B.haloudurans）、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）、バチルス・サブチルス（B.subtilis）又はこれらの任意の組み合わせから選択されるバチルス（Bacillus）属の種に由来する場合がある。チオールプロテアーゼは、植物資源、例えば、パイナップル、パパイヤ及びイチジクに由来する、ブロメライン、パパイン及びフィシンを含み得る。アスパルチルプロテアーゼは、ウシキモシン、エンドチアペプシン［例、クライフォネクトリア・パラシチカ（Chryphonectria parasitica）由来］、ムコールペプシン／レンニン［例、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）由来］、ペプシン（例ブタ由来）及びアスペルギロペプシン［例、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillusniger）、又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来］を含み得る。亜鉛金属プロテアーゼは、サーモリシン（例、バチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ（Bacillus thermoproteolyticus rokko）又はゲオバチルス（Geobacillus）ｓｐ．由来）及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（例、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）由来）を含み得る。
【００３６】
[0047]下記の表１は、本発明における使用に適したタンパク質分解酵素を示している。そのタンパク質分解酵素は生物源から精製することが可能であり、又は商業的に入手することもできる。いくつかの商業的供給源の例を表に示す。その他の多くの供給源からも入手可能である。
【表１】
2017512213.tif 000003
【００３７】
[0048]ある種の実施形態において、製剤中のタンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素の組み合わせは、実施例に記載のものなどのタンパク質分解酵素又はこれらのタンパク質分解酵素の組み合わせを適用可能な条件下で、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抗原及び／若しくは抗原決定基の存在又は抗原のＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体への結合を検出するための既知である他の任意の方法の１つ以上により測定されるとおり、抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも５０％低減する。例えば、タンパク質分解酵素はスブチリシン、プロテイナーゼＫ、α−キモトリプシン、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ブロメライン、パパイン、フィシン、キモシン、エンドチアペプシン、ムコールペプシン／レンニン、ペプシン、アスペルギロペプシン、サーモリシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのうち１つ以上を含み得る。
【００３８】
[0049]より詳細には、製剤中のタンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素の組み合わせは、実施例に記載のものなどの、タンパク質分解酵素又はこれらのタンパク質分解酵素の組み合わせを適用可能な条件下で、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抗原及び／若しくはアンチゲン性の抗原決定基の存在又は抗原のＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体への結合を検出するための既知である他の任意の方法の１つ以上により測定されるとおり、抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも９０％低減する。例えばタンパク質分解酵素は、スブチリシン（例、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis,）、バチルス・クラウシィ（B.clausii）、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B.amyloliquefacien）及び／又はバチルス・サブチルス（B.subtilis）由来）、トリプシン（例  ブタ由来）、α−キモトリプシン（例  ウシ由来）、ブロメライン、パパイン、フィシン、キモシン（例  ウシ由来）、エンドチアペプシン、ムコールペプシン／レンニン、ペプシン、アスペルギロペプシン（例、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillusniger）、又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来）、サーモリシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのうち１つ以上を含み得る。
【００３９】
[0050]ある種の実施形態において、タンパク質分解酵素は、パパイン、バチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）由来スブチリシン、アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）由来アスペルギロペプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、ブロメライン、フィシン、α−キモトリプシン、クリフォネクトリア・パラシチカ（Cryphonectriaparasitica）由来エンドチアペプシン、ペプシン及びゲオバチルス（Geobacillus）ｓｐ由来サーモリシンのうち１つ以上を含む。特別な実施形態において、タンパク質分解酵素は、パパイン、バチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）由来スブチリシン、アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）由来アスペルギロペプシン、及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのうち１つ以上を含む。
【００４０】
[0051]本発明者は、ある種のタンパク質分解酵素が、アルコール又は特定の洗剤を含有する組成物の使用に特に好適であり得ることを把握した。例えば、ある種の実施形態において、タンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素の組み合わせは、７．５％までのイソプロパノール存在下、表２でそれぞれの酵素分類について示した反応条件下で抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも５０％低減する。これらのタンパク質分解酵素は、フィシン、ブロメライン、パパイン、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来アスペルギロペプシン、又はエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのうち１つ以上を含み得る。他の実施形態において、タンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素の組み合わせは、例えば１０％までのポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）などの非イオン性洗剤の存在下、表２で示した反応条件下で抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合を少なくとも５０％低減する。これらのタンパク質分解酵素は、アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）由来アスペルギロペプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、バチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）由来スブチリシン、パパイン、ブロメライン及びフィシンのうち１つ以上を含み得る。その範囲はもっと広くあるべきではないかと考えていた。
【００４１】
[0052]製剤は、Ｆｅｌ  ｄ  １分解における酵素の効率を増強する添加剤を更に含み得る。ある種の実施形態において、添加剤はシステイン若しくはカルシウム塩／イオン（Ｃａ２＋）、又はシステイン及びカルシウム塩／イオンの組み合わせ、又はシステイン又はカルシウム塩／イオンを生体内（in situ）で生成する化合物である。
【００４２】
[0053]様々な実施形態において、製剤は例えば液体、固体又は粉体の洗浄剤、スプレー、湿った布、拭取り布、スポンジ、水分散性錠剤、フィルタ、食品、油又は水補助剤、電気掃除機のフィルタ又は添加剤、粒剤、洗剤、絨毯及び室内用の消臭剤、ネコ砂、ネコ砂用添加剤、手袋、不織布製品用の添加剤、洗濯機用ポッド（タブレット）、マルチチャンバー液体タブレットから選択される組成物中に配合される。更に、製剤は経口製剤中に配合することができる。ひとつの態様においては、製剤は玩具、例えばネコ用の玩具などの、食用及び非食用の玩具を含む玩具に配合することができる。
【００４３】
[0054]ある種の実施形態において、製剤は使用に先立ち液体（例、水、緩衝液又は他の液体）でもどされる顆粒、粉体又は錠剤を含み得る。他の実施形態において、製剤は表面又は動物に適用可能な液体又はスプレーを含み得る。好ましくは、スプレーはエアロゾル化されない。エアロゾル化されない適切なスプレーは、当業者に知られている方法に従って作製することができる。
【００４４】
[0055]ある種の実施形態において、製剤は一般に食品及び化粧品での使用において安全と認識されている酵素を含有する。そのような製剤は、石鹸、シャンプー、泡沫／ムース、パウダー、スプレー、コンディショナ、リンス、ジェル、ローション、首輪、分散剤、モイスト手袋、拭取り布、歯磨き及び／若しくは洗口液、又は皮膚、毛髪、毛皮若しくは口腔への使用に適した、又は食用組成物中に配合される、又はそのような任意の組成物に添加するために配合される他のすべての組成物、における使用に特に適している。
【００４５】
[0056]ある種の実施形態において、タンパク質分解酵素は、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、他のタンパク質及び繊維若しくは布地（衣服、絨毯、室内装飾、カーテン及び寝具）を含む物質と実質的に相互作用しない。そのようなタンパク質に対して不活性である適切なタンパク質分解酵素としては、限定されるものではないが、パパイン及びペプシンが挙げられる。
【００４６】
[0057]他の実施形態において、タンパク質分解酵素はケラチンに対して活性がある場合があり、ペットをシャンプーしたときに起こり得るケラチンの蓄積を低減するのに有益である可能性がある。例えば、ブロメライン、フィシン、アスペルギロペプシン、エンドチアペプシン、特定のスブチリシン、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ及びα−キモトリプシンはケラチンを分解することが見出された（実施例２）。
【００４７】
[0058]本発明の他の態様は、アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を減少又は除去するための製剤を作製する方法を特徴とする。通常その方法は、Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用しＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素と、タンパク質分解酵素が活性を有する又は使用に先立ち活性化し得る媒体とを組み合わせることを含む。媒体は、限定されるものではないが少数の例を挙げると、液体、固体、顆粒、粉体、湿った布、拭取り布、手袋、スポンジ、水分散性錠剤、フィルタ、食品、栄養補助食品、飲料、食品及び飲料に添加する濃縮液、電気掃除機のフィルタ又は添加剤、洗剤、絨毯、室内装飾及び室内消臭剤、ネコ砂、ネコ砂用添加剤、手袋、洗濯機用ポッド（タブレット）などを含む、前述の必要条件を満たすいかなる媒体であってもよい。
【００４８】
[0059]タンパク質分解酵素は、製剤が環境中（ネコ周辺、ネコ上又はネコ内）のＦｅｌ  ｄ  １にさらされる間に、抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体への結合を抑制するために十分にＦｅｌ  ｄ  １を分解するのに適した量の、本明細書内上記で検討されたいかなるタンパク質分解酵素又はそれらのいかなる組み合わせをも含み得る。例えば、洗浄剤、ペット用シャンプー又は口腔用製品などの、環境に適用されその直後（例えば数分又は数時間後）に取り除かれることが意図される製剤は、その時間内にＦｅｌ  ｄ  １を分解するのに十分な濃度のタンパク質分解酵素を含有する必要がある。実施例において検討される反応速度論的解析は、そのような結果を達成するためのタンパク質分解酵素の濃度範囲を提供する。例えば、人工ネコ唾液中のパパイン及びバチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）由来スブチリシンの反応速度論的解析は、通常のネコ唾液条件下で４．５ｍｇ／ｍＬのパパイン及び９．５ｍｇ／ｍＬのスブチリシンにより、５分以内に８０％を超えるＦｅｌ  ｄ  １が分解されることを明らかにした。室内装飾若しくは布地用のスプレー又は洗い流さないムース、ジェル、シャンプー若しくはスプレーなどの、長時間（例えば数時間又は一晩）にわたりその場所に留めることが意図される製剤に必要とされるタンパク質分解酵素（複数可）の濃度は低くなるだろう。
【００４９】
[0060]当業者は、当該技術分野において既知の任意の方法によりＦｅｌ  ｄ  １の分解を測定することができる。例えば、Ｆｅｌ  ｄ  １の分解はＥＬＩＳＡ及び／又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又はこれらの組み合わせにより測定可能である。特別な実施形態において、ＥＬＩＳＡ分析は、タンパク質分解酵素への暴露の後にＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体へのＦｅｌ  ｄ  １の結合量を測定するために用いられる。
【００５０】
[0061]１つの実施形態において、タンパク質分解酵素の活性は標準的なタンパク質分解酵素分析法を用いて測定及び規格化される。そのような分析法の使用により、タンパク質分解酵素の活性はタンパク質分解酵素及び分析条件から規格化され得る。典型的なタンパク質分解酵素活性の分析系は、タンパク質分解酵素の基質及びタンパク質分解酵素活性を支える適切な緩衝液を含み、希釈剤又は溶剤及びタンパク質分解酵素活性に有効な他の薬剤（例、システイン）も含み得る。一般にその基質は、タンパク質分解酵素による基質の切断が、検出可能な産物を生成するように設計される。例えばタンパク質分解酵素分析法の一例では、発蛍光団を含有するように誘導体化されたタンパク質、例カゼイン、を利用し、かかる発蛍光団は、タンパク質分解酵素が前述のタンパク質を切断するまでは消光している。タンパク質分解酵素による切断により、発蛍光団は消光物質から分離され、定量検出可能な蛍光信号が生成する。
【００５１】
[0062]他の種類のタンパク質分解酵素活性の分析法も使用に適している。例えばスクシニル化された、カゼインなどのタンパク質を基質として分析に利用することが可能である。タンパク質分解酵素の存在下でこの基質を加水分解すると、遊離の末端アミノ基を有するペプチド断片が生じる。これらのペプチドをトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応させ、その後、黄色のＴＮＢ付加ペプチドの形成により結果として生じる吸光度の増加を測定する。
【００５２】
[0063]タンパク質分解酵素の分析により測定された酵素活性は、一般的には１秒当たりの相対的な産物ユニットとして表すことができ、酵素剤の量に対して標準化され得る（ｒｐｕ  ｓ−１  ｇ−１）。上述のとおりの蛍光に基づく分析の場合では、酵素活性は１秒当たりの相対的な蛍光ユニットとして表すことができ、酵素剤の量に対して標準化され得る（ｒｆｕ  ｓ−１  ｇ−１）。
【００５３】
[0064]その方法はタンパク質分解酵素の必要量を媒体と組み合わせることを含む。製剤中に含まれるタンパク質分解酵素の量は、「すぐに使える」形で調製されるのか、又はその後希釈する濃縮物として調製されるのかにより異なるであろう。
【００５４】
[0065]本発明の他の態様は、アレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去する方法を特徴とする。その方法は、Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用しＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含む製剤に、Ｆｅｌ  ｄ  １が存在する環境の要素を接触させ、それによりアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去することを含む。
【００５５】
[0066]ある種の実施形態において、環境は「ネコ周辺」である。１つの実施形態において、Ｆｅｌ  ｄ  １は無生物の表面上に存在し、製剤はその表面に適用される。数例を挙げると、典型的な表面は、カウンタ、床、壁、家具、室内装飾及び衣服を含み得る。他の実施形態において、Ｆｅｌ  ｄ  １は空中浮遊しており、製剤を空気に接触させる。例えば製剤は、送風機、暖房器具若しくはエアコンディショナ用エアフィルタ、又は電気掃除機用フィルタなどの空気が通過するフィルタ中に配合され得る。
【００５６】
[0067]その他の実施態様においては、環境は「ネコ上」であり、製剤はＦｅｌ  ｄ  １がその上に存在する動物の部分上に適用される。例えばＦｅｌ  ｄ  １は、動物の毛髪、毛皮若しくは外皮上、又は動物の毛髪、毛若しくは皮膚についた唾液に存在し得る。他の実施形態において、環境は「ネコ内」であり、代表的にはＦｅｌ  ｄ  １を含有する唾液が生産される動物の口腔内であり、製剤は歯磨き、リンス、食品、おやつ、フィルム若しくは紐、泡沫若しくはスプレー又は飲料として適用される。
【００５７】
[0068]本発明の他の態様においては、Ｆｅｌ  ｄ  １と相互作用してＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性の抗原決定基を実質的に分解する少なくとも１つのタンパク質分解酵素を有する製剤を含む製品（本明細書では「生産物」とも表す）、及びアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去するための使用説明を特徴とする。１つの実施形態において、生産物は無生物表面への適用のための、液体、固体又は粉体の洗浄剤、スプレー、湿った布、拭取り布、スポンジ、水分散性錠剤、洗剤、絨毯又は布地用消臭剤、ネコ砂、ネコ砂用添加剤、手袋、不織布若しくは織物製品の添加剤、洗濯機用ポッド（タブレット）、マルチチャンバー液体タブレットとして製剤化され得る。他の実施形態において、生産物は空中浮遊Ｆｅｌ  ｄ  １に接触させるためのエアフィルタ添加剤として製剤化され得る。
【００５８】
[0069]その他の実施形態において、生産物はＦｅｌ  ｄ  １を産生する動物に適用又は投与するために製剤化される。例えば生産物は、動物の毛髪、毛皮又は外皮への適用のためのシャンプー、コンディショナ、リンス、ムース、ジェル、スプレー、ローション又はパウダーとして製剤化され得る。あるいは、生産物は動物の口腔への適用のための歯磨き、食品、おやつ、又は動物用食品若しくは水の添加剤として製剤化され得る。
【００５９】
[0070]本明細書で開示されるそのような生産物及び製品は、環境中のＦｅｌ  ｄ  １の不活化に有効であり得る。１つの実施形態では、生産物及び／又は製品は各環境において少なくとも１０％のＦｅｌ  ｄ  １を減少又は不活化することができる。いくつかの態様においては、Ｆｅｌ  ｄ  １は生産物及び／又は製品により少なくとも５０％不活化され得る。他の態様においては、Ｆｅｌ  ｄ  １は少なくとも１％、５％、１５％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は更には少なくとも９５％不活化され得る。
【００６０】
[0071]ある種の実施形態において、生産物はネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性を減少又は除去するための、食品又は他の食用組成物を含む。１つの実施形態において、食品生産物はタンパク質分解酵素含有製剤を含むドライペットフード又はペット用おやつである。例えば製剤は、包装又は出荷前に乾燥食品組成物に製剤を散粉又は塗りつけることにより適用され得る。食品生産物は乾燥しているので、タンパク質分解酵素の活性は出荷及び貯蔵の間維持され得る。製剤は、与える直前に溶解させる濃縮物、又は食品組成物に散布又は水若しくは他の液体飲料に混合され得る粉末状若しくは顆粒状のタンパク質分解酵素剤を含有する袋若しくは小袋としても供給することができる。製剤は、例えば食品組成物（乾性、湿性又は中間型）、又は水若しくは他の液体飲料に、直接適用され得る液体製剤として供給することができる。
【００６１】
[0072]更なる態様においては、本発明はネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性を減少又は除去するためのキットを提供する。一般に、これらのキットは前述のタンパク質分解酵素含有製剤のうち１種、及びアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から取り除くための使用説明を含む。
【００６２】
[0073]１つの実施形態において、キットは無生物の物体表面などのネコ周辺の環境からＦｅｌ  ｄ  １を洗浄する又はそうでなければ取り除くための組成物を含む。キットは例えば、液体、固体又は粉体の洗浄剤、スプレー、湿った布、拭取り布、スポンジ、絨毯及び室内用の消臭剤、顆粒又は洗剤などの、Ｆｅｌ  ｄ  １分解製剤を含むかかる組成物を、使用説明と共に含む。ある種の実施形態において、タンパク質分解酵素製剤は濃縮された形状で供給され得、指示は希釈についての説明を含むであろう。他の実施形態において、複数の構成要素からなるキットが供給される。例えば洗浄キットに、１つの容器に入った洗浄剤及び他の容器に入ったタンパク質分解酵素製剤を含めることが可能であり、かつ使用説明により使用前の構成要素の組み合わせ方法を使用者に教えることができる。長期の暴露により洗浄剤によって不活化され得るなど、製剤中のタンパク質分解酵素が洗浄剤中の成分に感受性である場合に、そのような実施形態は特に有益なものになり得る。
【００６３】
[0074]更に、キットには、液体、固体又は粉体、水分散性錠剤又は洗濯機用ポッド（タブレット）などの布地を洗浄するための、Ｆｅｌ  ｄ  １分解製剤を含む組成物を、使用説明と共に含ませることも可能である。他の実施形態において、キットは、Ｆｅｌ  ｄ  １分解製剤を含む、電気掃除機用フィルタ又は添加剤のようなエアフィルタを、使用説明と共に含む。これらの実施形態においても、タンパク質分解酵素製剤は濃縮された形状で供給され得、指示は希釈についての説明を含み得る。他の実施形態において、複数の構成要素からなるキットが供給される。例えば洗濯用キットに、１つの容器に入った洗濯用洗剤及び他の容器に入ったタンパク質分解酵素製剤を含めることが可能であり、かつ使用説明により使用前の構成要素の組み合わせ方法を使用者に教えることができる。エアフィルタキットは、エアフィルタ及びタンパク質分解酵素製剤、並びに空中浮遊Ｆｅｌ  ｄ  １を減少又は除去するために２つを組み合わせることについての使用説明を含み得る。
【００６４】
[0075]他の実施形態において、キットは、例えば毛皮、毛髪又は皮膚など「ネコ上」の処置剤を含む。そのようなキットは、皮膚、毛髪若しくは毛皮への適用に適した石鹸、シャンプー、パウダー、スプレー、コンディショナ、リンス、ムース、ジェル、ローション、首輪、分散剤若しくはモイスト手袋又は拭取り布、あるいは任意のこのような組成物に添加するために配合されたものを、使用説明と共に含み得る。タンパク質分解酵素含有製剤は、毛皮／毛髪処置組成物に含まれる場合、又は濃縮物若しくはその他のものとして別々に供給され使用に先立ち毛皮／毛髪の処置剤と混合される場合がある。キットは毛皮／毛髪処置剤の組み合わせも含み得る。例えばキットは、毛皮の拭取りのための手袋又は布及び液体のタンパク質分解酵素製剤を含み得る。使用説明は、液体を手袋又は布に浸み込ませ、ネコに適用する方法についての説明を提供し得る。他の例として、キットは、シャンプーがタンパク質分解酵素製剤を含有しない標準的なペット用シャンプーであり、リンス、スプレー、ジェル又はムースがタンパク質分解酵素製剤を含有する、シャンプー及びリンス、スプレー、ジェル又はムースを含み得る。
【００６５】
[0076]他の実施形態において、キットは、口腔への適用に適した又はそのような任意の組成物に添加するために配合される液体、固体又は粉体、湿った布、拭取り布、歯磨き又は洗口液などの、Ｆｅｌ  ｄ  １分解製剤を含む口腔用組成物を、使用説明と共に含む。他の実施形態において、キットは、飲料水に分散するなどにより動物に投与し得る水分散性錠剤を含む歯科用キットを含む。
【００６６】
[0077]他の実施形態において、キットは、食品に食用組成物を混合すること、その組成物を食品に添加すること、又は食品を摂取する動物に与えられる飲料水などの流体にその組成物を溶解、混合、若しくは添加することについての指示と共に、食品組成物に付属する又は食品組成物と併せて使用することが推奨される袋又は小袋（ペットフードパッケージなど）に入った、本明細書に記載の食用形態の組成物を含む。他の実施形態において、キットは、少なくとも、Ｆｅｌ  ｄ  １分解製剤を含む本明細書に記載された食品組成物を、使用説明と共に含む。他のキットでは、濃縮形状の組成物が供給され、動物に与えるために食品又は流体に混合、添加、希釈、又は溶解する濃縮物の適量を簡便に計測するための道具又は器具も供給される。１つのキットでは、組成物の１包装が計量の必要なくペットフードの１包装（例えば１缶）に添加されるというように、同じ包装シリーズに便利な用量で、食用形態の組成物が供給される。そのようなキットは、店頭パッケージ中のペットフードの個々の包装ごとにＦｅｌ  ｄ  １分解製剤の包装１つが供給されるように提供され得る。例えば、食品１２缶及び組成物１２包装が単一のキットに一緒に包装される。
【００６７】
[0078]いかなる前述の実施形態においても、キットは濃縮された又は他の形状の組成物、必要な場合には適切な希釈調製の指示を含む使用についての指示、選択として１つ以上の希釈剤若しくは増量剤、適切な希釈調製のための道具若しくは計測器具、及びスプレー、ふきん、拭取り布、又はその他同様のもののような塗布器を含み得る。そのようなキットは、表面を処置する、環境中の空気を処置する、又は動物を組成物で外用処置するために製剤化された組成物において有用な場合がある。
【００６８】
[0079]そのようなすべてのキットについて、キットは、適切な使用のための自動の又は組成物の調合、希釈、混合、添加、若しくは適用を自動化する器具、塗布器、希釈器、及びその他同様のものを含み得る。本明細書に記載されたいかなるキットについても、使用及び購入の利便性、順法性、及び効率を最大にするために、袋として供給され又は他の製品とひとまとめにされ得る。したがって、キットは任意の又はすべてのペット用食品、ペット用寝具、ペット用シャンプー又は化粧品、ペット用薬品を含み得る、又は前述とひとまとめにされ得る。
【００６９】
[0080]他のものに加えて前述のいかなるキットも、実質上のキットとして供給され得る。キットが実質上のパッケージを含む場合、キットは前述したとおり、１つ以上の有形のキット構成要素と組み合わせて仮想環境で使用説明を提供する。キットは本明細書に記載された少なくとも１つの組成物、及び選択構成要素を含む他の構成要素を含有する。キットは、任意の様々な組み合わせ及び／又は混合物でキット構成要素を含むことも可能である。１つの実施形態において、キットは１つ以上の組成物を含有する小箱及び動物に食される食品の容器を含む。キットは、例えば餌入れなどの、組成物と成分を混合するための器具又は混合物を入れるための器具などの追加の物品を含む場合もある。他の実施形態において、組成物はビタミン及びミネラルなどの動物の健康を増進する追加の栄養補助食品と混合される。更なる情報及び指示は購入者に提供される仮想環境、すなわちウェブサイト、ファックスバックサービス提供者、又はＣＤ−ＲＯＭなどのコンピュータで読むことのできる同梱された媒体及び／又は機器のためのアプリケーション（「アプリ」）の使用説明などで供給される。
【００７０】
[0081]他の態様においては、本発明は通信手段を提供し、あるいは環境からＦｅｌ  ｄ  １のアレルゲン性を減少する、又はアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １の量を減少するための、本明細書に記載の製剤、方法、組成物、製品、生産物及び／又はキットのうち１つ以上についての情報若しくは使用説明を伝達する手段を提供する。様々な実施形態において、情報は本発明の製剤、組成物、製品又は生産物に関連するものである。他の実施形態において、情報は本明細書に記載された本発明の実施に有益である方法又はキットに関連するものである。他の実施形態において、情報は前述の任意のものの組み合わせに関連するものである。
【００７１】
[0082]通信手段は、文書情報、音声情報、静止画又はアニメーション若しくはビデオを含む動画のうち１つ以上を含む。様々な実施形態において通信手段は、印刷文書、静的又は動的な電子文書、例えばハイパーテキスト文書、電子的、光学的、若しくは磁気的媒体の任意の型、音声情報、音声、視聴覚若しくは視覚的な表示若しくは提示、又は任意に暗号化されたビデオ情報などが挙げられるがこれらに限定されないコンピュータ読み取り可能な媒体又は電子記憶媒体、のうちの１つ以上を含み、通信手段は、前述の任意のものを構成する情報又は使用説明を表示する又は含む。ある種の実施形態において通信手段は、ウェブサイト、ＦＡＱ（よくある質問）のページ又はファイル、電子ファイル又は２つ以上の同種若しくは異種の電子ファイルの収集物、電子メール又は電子メールファイル、視覚的表示、情報キオスク、小冊子、広告、パッケージ又は生産物のラベル、パッケージ又は生産物の挿入物、ハンドアウト、告示、音声テープ又は任意の機器若しくはコンピュータ読み取り可能な媒体に収録された電子音声ファイル、ビデオテープ、ビデオディスク、又は任意の機器若しくはコンピュータ読み取り可能な媒体に収録された電子ビデオファイル、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、アプリ、又はその他同様のもの、又はそのような情報若しくは使用説明を有する任意の前述のものの組み合わせを含む。有用な情報には、（１）アレルゲン特異的分子及び／又は他の構成成分を組み合わせ、投与する方法及び技術、（２）アレルギーを引き起こす動物又はその管理者若しくは飼い主のための、キット、組成物、又はその使用について疑問が生じた場合に利用する連絡先情報、（３）任意のキットで供給される食品組成物、及び他の組成物についての栄養情報、（４）例えば緊急時の情報などを含む安全情報、及び副作用が生じた場合の更なる連絡先、毒物規制、化学物質等安全データシート、（５）例えば自動注文履行システムによる再注文の際に有用な情報、（６）アレルギー、環境中のアレルゲン、及び特定の環境中のアレルゲンを最少化又は除去する方法に関する一般情報、のうち１つ以上を含む。有用な指示は、混合量並びに投与量及び頻度を含み得る。通信手段は、本発明を用いる利点について知らせるのに、及び本発明を動物に投与するのに承認された方法を伝達するのに有用である。
【００７２】
[0083]本発明の他の態様は、本明細書に記載された製剤、組成物、生産物及び／又はキットのうち１つ以上を含むパッケージを提供する。パッケージには、単語、絵、記号、デザイン、頭字語、標語、語句を含むラベル、若しくは他の方策、又はこれらの組み合わせ（ラベル「方策」）が添付され、そこにはパッケージの内容物がアレルゲン性のＦｅｌ  ｄ  １を環境から減少又は除去するためのタンパク質分解酵素製剤を含有することが表示されている。
【実施例】
【００７３】
[0084]本発明の様々な態様が、以下の実施例により更に説明され得る。これらの実施例は単に例示を目的として提供されるものであり、特段の指示がない限り、本明細書で開示される本発明の範囲を限定するものではないと理解されるであろう。
【００７４】
実施例１
[0085]Ｆｅｌ  ｄ  １を分解する能力について、３２のタンパク質分解酵素群を、システインなどの化学物質と組み合わせて試験した。特有の機構について限定する意図はないが、Ｆｅｌ  ｄ  １を分解してＩｇＥ抗体によるＦｅｌ  ｄ  １の認識及び結合を不能にし、結果として免疫応答及びアレルギー反応を生じさせなくするタンパク質分解酵素の評価の際には、酵素触媒作用によるＦｅｌ  ｄ  １の不活化を論理的根拠とした。タンパク質分解酵素の候補は、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及び亜鉛金属プロテアーゼを含む異なる数群のタンパク質分解酵素から選択された。
【００７５】
[0086]個々の候補タンパク質分解酵素の活性を標準化し最適な反応条件を確定するために、タンパク質分解酵素により切断されるまで消光している発蛍光団を有するよう誘導体化されたカゼインを基質とする、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）のＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（緑色蛍光）を用いた。タンパク質分解酵素の分析により測定された酵素活性は、１秒当たりの相対的な蛍光ユニットとして表し、酵素剤の量に対して標準化した（ｒｆｕ  ｓ−１  ｇ−１）。異なる群の酵素に対する適切な反応条件を確定するために、異なる緩衝液及びｐＨ条件を３７℃で試験した。表２に、最良の結果を示した緩衝液のｐＨ、及びタンパク質分解酵素剤の量当たり（ｇ−１）の、ＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙにより測定された活性（１秒当たりの蛍光の増加、ｒｆｕ  ｓ−１）を示す。
【００７６】
[0087]試験されたほとんどのタンパク質分解酵素（セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ及び亜鉛金属プロテアーゼ）は、ｐＨ７．８の反応緩衝液で最良の活性を示した。アスパラギン酸プロテアーゼはｐＨ４．０又はｐＨ６．０で最良の活性があった。いくつかのセリン及びアスパラギン酸プロテアーゼは、カルシウム塩／イオン（Ｃａ２＋）の添加により活性化された。チオールプロテアーゼは、反応緩衝液にシステインを添加した場合に顕著に活性が高くなった。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃは、今回の試験条件下、ＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙで活性がない唯一のタンパク質分解酵素であった。
【００７７】
[0088]Ｆｅｌ  ｄ  １の分解特性を明らかにするために、異なる濃度の候補タンパク質分解酵素を、Ｆｅｌ  ｄ  １と共に３７℃で一晩（約１８時間）保温し、その後ゲル電気泳動（非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりタンパク質を分離しＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）で染色した。Ｆｅｌ  ｄ  １の分解試験には、２．５μｇの天然Ｆｅｌ  ｄ  １（ｎＦｅｌ  ｄ  １，ＬＯＴＯＸ（登録商標）Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｅｌｄ  ｄ  １をＩｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手（ＬＴＮ−ＦＤ１−１））及び種々の濃度の候補タンパク質分解酵素を、総反応液量２０μＬ（Ｆｅｌ  ｄ  １終濃度１２５μｇ  ｍＬ−１）中に含む反応混合物を代表的なものとして用いた。Ｆｅｌ  ｄ  １は、２つの１８ｋＤａのヘテロ２量体から形成される３５ｋＤａの４量体糖タンパク質であると報告されている。したがってＦｅｌ  ｄ  １の分解は、およそ１８ｋＤａのＦｅｌ  ｄ  １タンパク質バンドの消失程度により評価した。ほとんどのタンパク質分解酵素について、最少のタンパク質分解酵素活性でＦｅｌ  ｄ  １の完全分解が進むよう条件を最適化した。試験したすべてのタンパク質分解酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＦｅｌ  ｄ  １バンドの消失に基づき、最少活性（ｒｆｕ  ｓ−１）並びに２０μＬ緩衝液中（各タンパク質分解酵素の至適ｐＨ）で２．５μｇＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するために必要であった対応する酵素量（μｇ）を評価した。結果を表２に示す。
【表２−１】
2017512213.tif 000004
【表２−２】
2017512213.tif 000005
【００７８】
[0089]Ｆｅｌ  ｄ  １を分解する能力についてセリンプロテアーゼの種々の候補を試験した。例えばバチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）（ｂｌ）由来スブチリシン（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）２．４Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のＦｅｌ  ｄ  １タンパク質分解活性を測定した。２０μＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．８）又は酢酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．０）のいずれかを用い、天然Ｆｅｌ  ｄ  １（１．９μｇ）を０．１、１又は１０ｒｆｕ  ｓ−１のｂｌ  スブチリシンと共に３７℃で一晩保温した。Ｆｅｌ  ｄ  １を非添加のスブチリシン（１０ｒｆｕ  ｓ−１）及びスブチリシンを非添加のＦｅｌ  ｄ  １を対照として供試した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）染色により測定したところ、Ｆｅｌ  ｄ  １はＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中で１０ｒｆｕ  ｓ−１のｂｌ  スブチリシンにより完全に分解されたが、酢酸アンモニウム緩衝液の条件では分解されなかった（図１）。これらの実験は、２０μＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中で１．９μｇのＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するために必要となるｂｌスブチリシンの最少量が、１−１０ｒｆｕ  ｓ−１（０．０４−０．４２μｇ）であることを明らかにした。
【００７９】
[0090]バチルス・クラウシィ（B.clausii）（ｂｃ）由来スブチリシン（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）１６．０Ｌ、ＥＶＥＲＬＡＳＥ（登録商標）１６．０Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）及びバチルス・ハロデュランス（B.halodurans）（ｂｈ）由来スブチリシン（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）８．０Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）も、Ｆｅｌ  ｄ  １を分解するために必要となる最少量を求めるため評価した。これらの実験では、２０μＬリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中で１００又は１０００ｒｆｕ  ｓ−１のそれぞれのスブチリシンと共に天然Ｆｅｌ  ｄ  １（２．５μｇ）を３７℃で一晩保温した。Ｆｅｌ  ｄ  １を非添加のタンパク質分解酵素（１０００ｒｆｕ  ｓ−１）及びタンパク質分解酵素を非添加のＦｅｌ  ｄ  １を対照として供試した。２０μＬ中２．５μｇのＦｅｌ  ｄ  １を分解するために必要なそれぞれのタンパク質分解酵素の最少量は、表２に示されている。
【００８０】
[0091]植物性のチオールプロテアーゼである、それぞれパイナップル、パパイヤ及びイチジクといった食用植物由来のブロメライン、パパイン及びフィシンを、Ｆｅｌ  ｄ  １分解について分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実験では、４０ｍＭシステインを含むリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中で、天然Ｆｅｌ  ｄ  １（２．５μｇ）を、異なる量のパパイン、ブロメライン及びフィシンと共に３７℃で一晩保温した。システインだけを添加した緩衝液、Ｆｅｌ  ｄ  １を非添加の無システイン緩衝液中の酵素及び酵素を非添加のＦｅｌ  ｄ  １（システイン有及び無）を、対照として供試した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）染色により測定したところ、チオールプロテアーゼであるブロメライン、パパイン及びフィシンは、すべてＦｅｌ  ｄ  １を完全に分解することができた。表２に示されているように、ＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙにより測定されたブロメライン、パパイン及びフィシンに最適な条件は、システイン存在下でｐＨ７．８を含んでいる。ＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙにより測定したところ、特に、４０ｍＭシステインの添加は、ブロメライン、パパイン及びフィシン各々の活性をそれぞれ２７０、６０及び４６０倍に増加させた。表２に、２０μＬシステイン含有緩衝液中で２．５μｇＦｅｌ  ｄ  １を分解するために必要となるこれらタンパク質分解酵素の最少量を示す。
【００８１】
[0092]加えて、アスパラギン酸プロテアーゼであるクリフォネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria parasitica）由来エンドチアペプシン（ＴＨＥＲＭＯＬＡＳＥ（登録商標）、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｈoｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びウシ由来キモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ（登録商標）、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｈoｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、両者ともカルシウム塩／イオン（Ｃａ２＋）の存在下ｐＨ４．０で最適な活性があった（表２）。１０ｍＭ塩化カルシウムを含む２０μＬの酢酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．０）中で、天然Ｆｅｌ  ｄ  １（２．５μｇ）を、０．１、１又は１０ｒｆｕ  ｓ−１のタンパク質分解酵素と共に３７℃で一晩保温した。この実験では、Ｆｅｌ  ｄ  １を非添加の緩衝液及び酵素を非添加のＦｅｌ  ｄ  １を対照として供試した。表２に、２つのアスパラギン酸プロテアーゼについて、２０μＬ緩衝液中で２．５μｇのＦｅｌ  ｄ  １を分解するために必要となるタンパク質分解酵素の最少量を示す。
【００８２】
[0093]いくつかの候補タンパク質分解酵素を、２０μＬの最適な反応緩衝液中、３７℃で、１又は２時間後に反応を止めるためにタンパク質分解酵素阻害剤を添加するまでの短時間に、２．５μｇの天然Ｆｅｌ  ｄ  １を分解する能力について試験した。反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）染色により可視化された。１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を阻害剤として用いた場合、１時間以内の保温でＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するためには、５０ｒｆｕ  ｓ−１（２．１μｇ）のｂｌ  スブチリシン（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）２．４Ｌ）で十分であることが明らかとなった。更に、６００ｒｆｕ  ｓ−１（０．９３μｇ）のパパインは、１０μＭのＥ６４を阻害剤として用いた場合、１時間の保温後に大部分のＦｅｌ  ｄ  １を分解した。５００ｒｆｕ  ｓ−１（１７１μｇ）のゲオバチルス（Geobacillus）ｓｐ．由来サーモリシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）１４Ｌ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を阻害剤として用いた場合、一晩の保温では２．５μｇのＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するために十分であったが、２時間の保温では部分的な分解が生じるだけであった。タンパク質分解酵素阻害剤を用いた反応速度論的研究は、一般にタンパク質分解酵素の濃度を上げることにより、Ｆｅｌ  ｄ  １の完全分解がより短時間で達成され得ることを明らかにした。更に、タンパク質分解酵素の濃度を増加することにより、より多量のＦｅｌ  ｄ  １を分解することができた。
【００８３】
[0094]要約すると、３２のタンパク質分解酵素候補集団を用いたＦｅｌ  ｄ  １のタンパク質分解実験の結果、すべての群のタンパク質分解酵素がＦｅｌ  ｄ  １を完全に分解可能であることが明らかになった。表２に見られるように、タンパク質分解酵素候補は、様々な程度でＦｅｌ  ｄ  １分解活性を示した。ほとんどのタンパク質分解酵素候補は、１００ｒｆｕ  ｓ−１未満の活性で、２０μＬ中の２．５μｇ  Ｆｅｌ  ｄ  １を分解可能であった。
【００８４】
[0095]次に、タンパク質分解後のＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体のＦｅｌ  ｄ  １認識能及び結合能をＥＬＩＳＡにより測定した。天然のＦｅｌ  ｄ  １及びＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体は、Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ（Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ（Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｗａｌｅｓ））から入手した。ＥＬＩＳＡの条件は、０．３から１２ｎｇ  ｍＬ−１までの濃度範囲で天然Ｆｅｌ  ｄ  １を信頼性高く定量できるように決定された。Ｆｅｌ  ｄ  １の完全分解を達成するために必要とされる最少の活性で、表２に示すとおりの種々のタンパク質分解酵素候補を用い、２０μＬの最適な緩衝液中でＦｅｌ  ｄ  １（２．５μｇ）と共に一晩保温した（表２に示す最適化された条件を参照）。試料は、Ｆｅｌ  ｄ  １の理論的な終濃度が１２ｎｇ  ｍＬ−１（初発の基質濃度）となるよう希釈し、ＥＬＩＳＡにより異なる２通りの反応時間（２０及び３０分）で分析した。Ｆｅｌ  ｄ  １をタンパク質分解酵素候補と保温した後、抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体で固相化したプレートをＦｅｌ  ｄ  １の捕捉に用いた。そしてＦｅｌ  ｄ  １に結合する酵素結合検出抗体を加えた後、酵素的に検出シグナルに変換される基質を添加した。タンパク質分解酵素がＦｅｌ  ｄ  １を分解した場合には、抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体による結合に必要となるＦｅｌ  ｄ  １抗原決定基がもはや存在せず及び／又は抗体はこの抗原決定基に到達できないので、抗Ｆｅｌ  ｄ  １抗体はＦｅｌ  ｄ  １に結合せずＥＬＩＳＡによりシグナルは検出されない。タンパク質分解酵素の活性がＥＬＩＳＡ分析により干渉を受けていなかったことを確かめるための対照として、規定量のＦｅｌ  ｄ  １を添加してＥＬＩＳＡを繰り返した。上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験は、試験したすべてのタンパク質分解酵素について、Ｆｅｌ  ｄ  １分解及びＥＬＩＳＡの結果を確認するために実施した。
【００８５】
[0096]結果を図２に示す。見られるように、トリプシン及びα−キモトリプシン、チオールプロテアーゼであるパパイン、ブロメライン及びフィシン、アスパラギン酸プロテアーゼであるムコールペプシン／レンニン、ペプシン、アスペルギロペプシン、エンドチアペプシン及びキモシン、並びに亜鉛金属プロテアーゼであるサーモリシン（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ由来）及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎに加えて、いくつかのセリンプロテアーゼであるスブチリシンで、Ｆｅｌ  ｄ  １特異的抗体によるＦｅｌ  ｄ  １の結合が完全に抑制された。他の数種のタンパク質分解酵素では、濃度を上げることによって、Ｆｅｌ  ｄ  １の完全な分解を達成することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、これらのタンパク質分解酵素がＦｅｌ  ｄ  １を分解することが更に確認された。まとめると、ＥＬＩＳＡ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験は、抗体の結合がＦｅｌ  ｄ  １の分解に関連することを実証する。試験したすべてのタンパク質分解酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したＦｅｌ  ｄ  １分解の程度がＥＬＩＳＡにより測定した残存するＦｅｌ  ｄ  １濃度に対応していた。特定の機構に限定する意図はないが、これらの結果は、Ｆｅｌ  ｄ  １分解産物がもはやＦｅｌ  ｄ  １特異的抗体に結合される抗原決定基を有さず、タンパク質分解酵素により触媒されるＦｅｌ  ｄ  １の分解が、結果として抗原決定基特異的なＦｅｌ  ｄ  １抗体によるＦｅｌ  ｄ  １の結合を抑制することを示唆した。したがって、タンパク質分解酵素によるＦｅｌ  ｄ  １分解により、ＩｇＥによるアレルギー反応を抑制できると期待される。試験されたほとんどのタンパク質分解酵素はＦｅｌ  ｄ  １を完全に分解可能であり、生じた分解産物の抗原決定基特異的抗体による結合を抑制可能であった。これらの実験によりＦｅｌ  ｄ  １の完全分解が可能であった代表的タンパク質分解酵素（以下「適合」するタンパク質分解酵素と表す）としては、パパイン、バチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）由来スブチリシン（ｂｌ  スブチリシン、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ）、アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）由来アスペルギロペプシン（ａｏ  アスペルギロペプシン、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、ブロメライン、フィシン、α−キモトリプシン、クリフォネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria parasitica）由来エンドチアペプシン（ｃｐ  エンドチアペプシン、ＴＨＥＲＭＯＬＡＳＥ（登録商標））、ペプシン及びゲオバチルス（Geobacillus）ｓｐ．由来サーモリシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）１４Ｌ）が挙げられる。以下の実施例で記述される詳細と共に、表３はこれら「適合」するタンパク質分解酵素の特性を要約している。
【表３】
2017512213.tif 000006
【００８６】
実施例２
[0097]タンパク質分解酵素によるＦｅｌ  ｄ  １の分解を使用したすべての適用例において、ネコ及び使用者はタンパク質分解酵素活性にさらされるであろう。タンパク質ケラチンの線維は、ヒト及びネコいずれにおいても表皮（皮膚）の角化層中のケラチノサイトに加え、毛髪及び爪に豊富に存在する。したがって、ケラチンに対してタンパク質分解活性が低いＦｅｌ  ｄ  １タンパク質分解酵素の候補を同定することは、ヒト及び動物への適用が意図される生産物の開発における安全性の懸念に取り組む上で有用であろう。
【００８７】
[0098]有力なタンパク質分解酵素候補の、生理学的に関連するタンパク質に対する基質特異性を把握するために、Ｆｅｌ  ｄ  １に適合するタンパク質分解酵素候補のケラチン加水分解能を測定した。ケラチンアズール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｋ８５００）はアズール色素が浸透した羊毛ケラチンから構成され、タンパク質分解酵素活性を定量するためのケラチン基質として用いられる。ケラチンアズールを、１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １を完全分解することが明らかとなったタンパク質分解酵素濃度を用いて、最適条件下（ＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｓｓａｙで決定された）（表２）で、適合するタンパク質分解酵素と共に一晩保温した。その後ケラチンアズールの分解を測定した。３反復の実験で、有意な分解活性はチオールプロテアーゼであるブロメライン及びフィシンの分析のみで再現性良く測定可能であり、それらは用いたケラチンアズールのそれぞれ４３．２％±２３．３％及び３３．１％±８．５％を分解した（表３）。アスパルチルプロテアーゼであるアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来アスペルギロペプシン（ａｏ  アスペルギロペプシン、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）、クリフォネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria parasitica）由来エンドチアペプシン（ｃｐ  エンドチアペプシン、ＴＨＥＲＭＯＬＡＳＥ（登録商標））及びペプシンは、平均して１％未満のケラチンアズールしか分解せず活性がなかった（表３）。
【００８８】
[0099]適合するタンパク質分解酵素のケラチン分解活性を更に評価するために、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）試薬とのカップリング反応を用いたケラチン分解産物の比色検出による分析を行った。この分析は、試験したすべての酵素について羊毛由来のケラチン粉末を基質として用いた加水分解活性の測定を可能とした。パパイン及びペプシンはケラチン分解活性を示さなかった。他のすべての適合するタンパク質分解酵素はケラチン基質に対し活性を有していた。ゲオバチルス（Geobacillus）サーモリシンのケラチン分解活性は、他のすべての試験したタンパク質分解酵素に比べ少なくとも２倍高かった（図３）。上述のアズールケラチン分析の結果は、２つのアスパラギン酸プロテアーゼ、ａｏ  アスペルギロペプシン及びｃｐ  エンドチアペプシンを除き、ＴＮＢＳに基づくケラチン分析の結果と相互に関連した（表３）。この２つのアスパラギン酸プロテアーゼ及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎについては、緩衝液の条件がＴＮＢＳ分析による測定におけるケラチン分解活性測定に影響を及ぼした可能性がある。これは、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ緩衝液（製造者により添付された緩衝液）と同様に酢酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ４．０）が、タンパク質分解酵素なしの分析においても基底レベルのケラチン分解活性を示したことによる。加えて、ケラチンアズール分析は誘導体化されたケラチン基質を用いるのに対し、ＴＮＢＳに基づく分析はケラチンのタンパク質分解を直接測定するものであり、このことがいくつかの試験された適合するタンパク質分解酵素における２種の分析結果の不一致を更に説明する可能性がある。
【００８９】
[0100]皮膚生細胞のモデルとしてケラチノサイトを用い、適合するタンパク質分解酵素の細胞毒性を試験した。ヒトケラチノサイトの初代細胞系をマイクロプレート中で集密するまで培養し、１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １を完全分解することが明らかとなった最少濃度（表２）の適合するタンパク質分解酵素と共に一晩培養した後に、細胞の生存能を試験した。培養した哺乳動物細胞は、細胞培養培地の組成及びｐＨに非常に影響を受けやすいので、タンパク質分解酵素は細胞培養培地で直接希釈した。タンパク質分解酵素を添加し一晩培養した後、水溶性テトラゾリウムＷＳＴ−１を培養細胞（集密層及び培地）に添加した（細胞増殖試薬ＷＳＴ−１、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。無色のＷＳＴ−１は、生細胞ミトコンドリアの脱水素酵素により触媒される電子伝達により、黄色素（ホルマザン）に還元される。したがって、黄色素の生成は接着及び剥離細胞両方の細胞の活性を表す。接着細胞のみの細胞活性は、タンパク質分解酵素を添加し一晩培養した後、スルホローダミンＢで染色することにより測定した。赤色の形成はタンパク質濃度の測定量であり、接着細胞の濃度に相関する。タンパク質分解酵素を添加せずに培養した細胞を対照として用いた。試験したすべてのタンパク質分解酵素において、両方の分析で同様の結果が得られた（図４、表３）。見てとれるように、比較的高い細胞毒性（低い残存細胞活性）が、ブロメライン、フィシン、ゲオバチルス（Geobacillus）サーモリシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで測定された。他のすべての適合するタンパク質分解酵素（パパイン、ａｏ  アスペルギロペプシン、ペプシン、ｃｐ  エンドチアペプシン、ｂｌ  スブチリシン及びα−キモトリプシン）は、無処理細胞（細胞活性１００％に相当）と比較して細胞活性に特段の影響を及ぼさなかった。
【００９０】
[0101]ケラチノサイトに細胞毒性を示したタンパク質分解酵素に関して、皮膚のケラチノサイトはケラチンからなる数層により保護されているので、皮膚刺激性の影響を確実に予想することはできない。しかし、細胞毒性を示さなかったタンパク質分解酵素については、皮膚刺激生影響はないと考えられる。
【００９１】
[0102]細胞毒性の分析結果（図４）は、ＴＮＢＳケラチン分解分析の結果（図３）に比較して、段階性がより小さかった。タンパク質分解酵素は、顕著な細胞毒性を有するか、あるいは細胞毒性を示さないかのいずれかであった。にもかかわらず、２つの分析結果には互いに関連が見られた。例えば、パパイン及びペプシンは、どちらの分析でも影響は認められなかった。一方、ブロメライン、フィシン、ゲオバチルス（Geobacillus）サーモリシン及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのケラチノサイトへの細胞毒性は、ＴＮＢＳ分析により確認された。
【００９２】
[0103]パパインの活性を更に評価するために、表２に示した最少必要タンパク質分解酵素濃度の１０００倍濃度のパパインを添加し、ケラチノサイトを細胞培養培地中で一晩培養した。この結果、ＷＳＴ−１及びスルホローダミンＢ分析によりそれぞれ細胞生存率３１％及び８％という顕著な細胞毒性が見られた。ほとんどの化粧品適用では一晩培養は必要とならない。顕微鏡観察により、１０００倍に濃度を増加させたパパインの存在下でさえも、培養開始後最初の１時間に顕著な細胞剥離は起こらないことが明らかとなり、このような初期の時点では細胞毒性がないものと示唆される。
【００９３】
[0104]ケラチンアズールの類似基質であるセルロースアズール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用い、セルロース繊維へのタンパク質分解酵素剤の影響を試験した。この実験は適合するタンパク質分解酵素剤の綿製品に対する効果を評価するために実施した。セルロースのタンパク質加水分解は、代用基質としてセルロースアズールを用いて測定した。分析は、２連で製造者による指示に従って実施した。セルロース加水分解活性はアズール色素の遊離に対応しており、分光光度計により５７５ｎｍで測定した。陽性対照として、２．５ユニットのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来セルラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃ１１８４）を測定したところ、０．２８±０．０１の吸収が見られた。１０種の適合するタンパク質分解酵素のうち、ａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）のみが、最適なＦｅｌ  ｄ  １分解緩衝液（表２）中での一晩培養の間に、陽性対照の活性の２８％±２％に相当する顕著な活性を示した（表３）。タンパク質分解酵素は通常多糖を基質としないので、この（又はすべての）タンパク質分解酵素のセルラーゼ活性は予想されないものであった。おそらく、このタンパク質分解酵素剤はタンパク質分解酵素過剰生産アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の粗抽出物であり、それゆえセルラーゼのような発現宿主に由来する他の酵素を含有している。
【００９４】
[0105]ほとんどの適合するタンパク質分解酵素は、ケラチン分解活性又は細胞毒性を示さず、又はごくわずかしか示さなかった（図３及び４並びに表３）。ａｏ  アスペルギロペプシン剤（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）を除き、いずれの適合するタンパク質分解酵素もセルロースアズールに対し活性がなく、綿製品を分解する能力はないことが示唆された。加えて、化粧品における高濃度のパパインなどのタンパク質分解酵素の使用が、Ｆｅｌ  ｄ  １の分解用途へのそれらの使用が使用者及びネコの両者にとって安全である可能性が高いことも示唆している。
【００９５】
実施例３
[0106]可能性のある用途は、Ｆｅｌ  ｄ  １で汚染された家具又は他の表面を洗浄するために用いられるような洗浄剤又は拭取り布を含む。代表的な洗浄剤は、殺菌剤として並びに油及びグリースを溶解するための、変性エタノール又はイソプロパノールのような溶剤を含む。典型的な浴槽洗剤のイソプロパノール濃度は１０〜１５％である。しかし、イソプロパノールなどの溶剤はタンパク質分解酵素などの酵素を不活化し得る。それゆえ、イソプロパノール含有媒体での活性について適合するタンパク質分解酵素を試験した。洗浄剤は通常水で希釈されるので、適合するタンパク質分解酵素のＦｅｌ  ｄ  １分解活性は、０〜１２．５％までの濃度のイソプロパノール存在下で試験した。
【００９６】
[0107]適合するタンパク質分解酵素は、Ｆｅｌ  ｄ  １分解に最適の反応条件下（表２）で、０、２．５％、５．０％、７．５％、１０．０％及び１２．５％濃度のイソプロパノールを添加し一晩保温した。試料は希釈し、２０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。図５に示されるように、残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、最大量のイソプロパノール濃度だがタンパク質分解酵素を含まないそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。図５は３回の独立した反復の平均及び標準偏差を示す。
【００９７】
[0108]ブロメライン及びフィシンを除いて、すべてのタンパク質分解酵素の活性は１２．５％のイソプロパノール存在下で少なくとも５０％減少した。チオールプロテアーゼは最もイソプロパノールに影響されなかった。１２．５％のイソプロパノール存在下でも、パパイン、ブロメライン及びフィシンは、添加されたＦｅｌ  ｄ  １の約４０％〜７０％を分解した（図５）。２５％イソプロパノールを用いた付加的な実験では、ブロメライン及びフィシンは５０％より多くのＦｅｌ  ｄ  １を分解した。対照的にアスパラギン酸プロテアーゼは、イソプロパノールに最も影響を受けやすかった。ａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）、ペプシン及びｃｐ  エンドチアペプシンは、１２．５％のイソプロパノール存在下で９０％より多く不活化された。対照としてのＥＬＩＳＡ実験により、イソプロパノール単独ではＦｅｌ  ｄ  １濃度の顕著な減少は見られないことが明らかとなった。このことからブロメライン又はフィシンは、イソプロパノール含有洗浄剤を用いてほこり中又は表面上に存在するＦｅｌ  ｄ  １を分解するために、とりわけ適したタンパク質分解酵素であると考えられる。これらのタンパク質分解酵素は、通常の洗浄用途における濃度を越えたイソプロパノール濃度下でも、活性高くＦｅｌ  ｄ  １を分解した。
【００９８】
[0109]皮膚、毛髪及び毛皮との接触は最小限でありかつ一過的なので、ブロメライン及びフィシンの、試験した他のタンパク質分解酵素と比較して高いケラチン分解活性は、不利益とは思われない。更に、ブロメライン及びフィシンは一般に化粧品（上述参照）又は栄養加工（例えば肉軟化剤として）で用いられる場合、安全とみなされている。
【００９９】
実施例４
[0110]ネコの毛皮のＦｅｌ  ｄ  １濃度を減少するための可能性のある用途は、タンパク質分解酵素を含有する、シャンプー、又は他の組成物の中でも乾燥粉末、泡沫／ムースを含む。ネコ当たりのＦｅｌ  ｄ  １総量は６７ｍｇと見積もられている。アレルゲンのほんの少量は空中浮遊となるが、ネコの上にある多量のＦｅｌ  ｄ  １は、ネコの毛皮及び／又は皮膚の中又は上のＦｅｌ  ｄ  １量の減少によりもたらされる顕著な有益性を示唆する。従来のペット用シャンプーをネコへ使用することにより、ネコのいる家の空中浮遊Ｆｅｌ  ｄ  １濃度に加えて毛皮のＦｅｌ  ｄ  １濃度が減少することが報告されている。本明細書に記載されたタンパク質分解酵素の添加により、従来のシャンプーの有効性を向上させることが可能である。
【０１００】
[0111]ほとんどのシャンプーの製剤は異なる界面活性剤の混合物を含有し、そのうち陰イオン性界面活性剤が最も多い。非イオン性界面活性剤は２番目に多い界面活性剤種であり、水溶性を上げるための極性基としてポリエーテル又はポリヒドロキシル基いずれかを有する。非イオン性界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤に比し刺激性が少ないので、外用に広く用いられる。この特性から、非イオン性界面活性剤はタンパク質分解酵素含有ペット用シャンプーにとって魅力的である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）は、栄養剤及び化粧品において非イオン性界面活性剤として頻繁に用いられており、欧州連合では認可された食品添加物（Ｅ−４３２）として登録されており、ＩＮＣＩの目録（化粧品原料の国際命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients））にも登録されている。認可された食品添加物なので、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０はシャンプーの成分として用いることができ、洗っている最中に偶然一部をネコが摂取してしまった場合でも安全上の問題が生じることはないと考えられる。
【０１０１】
[0112]表２に示されるＦｅｌ  ｄ  １分解に最適なタンパク質分解酵素の濃度及び反応条件下で、０、１０％、２０％、及び３０％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を添加し一晩保温した後、適合するタンパク質分解酵素のＦｅｌ  ｄ  １分解活性に及ぼすＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の影響について試験を行った。試料は希釈し、２０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。示された残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を含まないがそれぞれのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０濃度である緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。３回の独立した反復から平均及び標準偏差が算定された。試験されたすべての適合するタンパク質分解酵素が、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に対し寛容を示した。試験されたうち最も高濃度の３０％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でも、完全に不活化されたものはなかった。１０％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０では、すべてのタンパク質分解酵素で、１２５μｇ  ｍＬ−１Ｆｅｌ  ｄ  １の５０％より多くが分解された（図６、表３）。典型的なシャンプー製剤は約４０％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有すること及び適用の間におよそ２０倍希釈されることから、タンパク質分解酵素はおよそ２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の濃度でＦｅｌ  ｄ  １分解活性を保持できる程度の活性を有する必要があると考えられる。したがって、すべての適合するタンパク質分解酵素がシャンプー用途に適していると考えられる。
【０１０２】
[0113]ｐＨ中立の皮膚製品は、皮膚のｐＨに一致するおよそｐＨ５．５である。アスパラギン酸プロテアーゼであるａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）のＦｅｌ  ｄ  １分解活性は、試験した最高濃度である３０％でもＴＷＥＥＮ（登録商標）２０による影響は見られなかった（図６）。このタンパク質分解酵素はｐＨ４．０で活性が最も高いことが明らかとなったが（参照表２）、ｐＨ６．０でもＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｓｓａｙにおいて４６％の活性を保持していた。加えて、ケラチンアズールが基質として用いられた場合に分解活性を示さなかったａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）は（表３）、ケラチンに対して最少の活性しか示さず（図３）、ケラチノサイトに対して顕著な細胞毒性を有さなかった（図４）。これらの特性は、ａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）が、Ｆｅｌ  ｄ  １減少のためのタンパク質分解酵素含有シャンプーでの使用に適していることを示唆する。
【０１０３】
[0114]パパインも、シャンプー適用におけるａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）の適切な代替となり得る。パパインはａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）よりＴＷＥＥＮ（登録商標）２０への耐性が低いが、適用の間に予想される２％濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０において活性を保持している（図６）。パパインはｐＨ７．４及びｐＨ６．０で同程度のＦｅｌ  ｄ  １分解活性を示し、このことからｐＨ中立シャンプーでの使用に適切であると考えられる。パパインはＴＮＢＳ分析でケラチンに対し活性がなく（図３）、ケラチノサイトに対し顕著な細胞毒性を引き起こさなかった（図４）。パパインはセルロースアズール基質に対し活性がなく、したがって綿製品に対し分解活性を持たないと考えられる（表３）。パパインは高濃度で、使用前の熱による不活化を必要とせずに栄養剤（肉軟化剤、ＢＢＱソース）及び化粧品（酵素による角質除去）としても用いられる。パパインは、洗っている最中に偶然シャンプーをネコが摂取してしまったとしても、シャンプーの成分として適用可能であると考えられる。
【０１０４】
実施例５
[0115]他の用途は、歯磨き、リンス、飲料、食品又はおやつ、紐又はフィルムを含む、ネコの口腔内で使用するタンパク質分解酵素含有生産物である。そのような生産物は、アレルゲンの主要な供給源であるネコの口腔内Ｆｅｌ  ｄ  １の濃度を減少することができる。用途に類似の条件下でタンパク質分解酵素の活性を試験するために、ネコ唾液モデルを確立した。人工ネコ唾液の調製は、公表されている人工ヒト唾液調製物に基づいた（ＭｃＫｎｉｇｈｔ−Ｈａｎｅｓ＆Ｗｈｉｔｆｏｒｄ，１９９２，Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．２６：３４５〜３５０）（表４）。
【表４】
2017512213.tif 000007
【０１０５】
[0116]ｐＨはネコ唾液のｐＨである７．５に調整した。ネコ唾液中のＦｅｌ  ｄ  １濃度は、０．３から４５μｇ／ｍＬまでの間（ネコ集団全体）、集団全体の３分の１である中間群では２．２から１２．４μｇ／ｍＬまでの間と測定された。予想されるネコ唾液中の最大Ｆｅｌ  ｄ  １濃度の２から３倍と過剰であるが、すべての先行実験で以下の濃度を用いたので、人工ネコ唾液の最大Ｆｅｌ  ｄ  １濃度を１２５μｇ  ｍＬ−１に設定した。
【０１０６】
[0117]およそ３５％のタンパク質を含有する脱脂乳を、唾液中に含まれるタンパク質の模擬として用いた。脱脂乳は炭水化物などの他の構成成分も含有し、そのことは実際の唾液の複雑な組成に関連し、したがってモデルをより現実的にすると予想される。異なる個体に由来するヒト唾液は、０．６７〜２．３７ｍｇ  ｍＬ−１までの間のタンパク質を含むと報告されている（ウシ血清アルブミンを標準として異なる技術により測定された）。この評価を、ネコ唾液中のタンパク質含量の近似として用いた。人工ネコ唾液の最大タンパク質含量を、脱脂乳７．１４ｍｇ  ｍＬ−１に相当する、２．５ｍｇ  ｍＬ−１と設定した。上記で検討したとおり、システインはＦｅｌ  ｄ  １分解において特定のタンパク質分解酵素を活性化することが明らかとなっている。その効果は、パパイン、ブロメライン及びフィシンのようなチオールプロテアーゼで最も顕著であった（上記参照）。
【０１０７】
[0118]適合するタンパク質分解酵素であるパパインを用い、人工唾液中でのＦｅｌ  ｄ  １分解におけるシステインの要求性に加えて、異なる濃度のＦｅｌ  ｄ  １及び脱脂乳の影響を、３７℃、一晩の保温で試験した（図７）。パパインは、最適条件下、すなわちｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液中（表２）、１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するために必要となる最少濃度で用いた。緩衝液中で実施された先行実験と同様に、４０ｍＭのＬ−システインは人工ネコ唾液中でも、パパインによる効率的なＦｅｌ  ｄ  １分解に必須であることが示された（図６）。しかし、この要求性は、特に食品、飲料又はおやつのような食用の組成物では、製剤の他の構成成分によって満たすことが可能であろう。
【０１０８】
[0119]人工ネコ唾液での反応条件は、表２に記載された最適反応条件から大きく異なっていたが、脱脂乳濃度７１４μｇ  ｍＬ−１までは、添加された１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １の大部分が一晩の保温の間に（システイン存在下で）分解された（図７）。にもかかわらず、脱脂乳濃度が増加するにつれ、おそらくタンパク質濃度の増加によってＦｅｌ  ｄ  １分解活性は減少した。脱脂乳タンパク質は主としてカゼインから構成され、カゼインはパパインにより加水分解されることが、標識されたカゼインを基質として用いたＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｓｓａｙにより示された（表２）。カゼイン及びＦｅｌ  ｄ  １は、このようにパパインによる分解における競合する基質である。したがって脱脂乳濃度が最大の場合、Ｆｅｌ  ｄ  １を完全分解するためには、パパインの濃度を増加する必要があると考えられる（システインの存在下で）。更にパパイン濃度の増加によって、Ｆｅｌ  ｄ  １分解はより速く起こると考えられ、それはネコがタンパク質分解酵素含有ペットフード又は飲料を消費する時間内、あるいはタンパク質分解酵素含有製剤に口腔がさらされている時間内に、唾液中のＦｅｌ  ｄ  １を分解するのに好ましいであろう。
【０１０９】
[0120]２つの型の人工ネコ唾液を更なる試験のために開発した（表４）。第一の型は、「極端条件」として１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １（ネコの唾液で測定される最大濃度より２から３倍高い濃度）及び７１４０μｇ  ｍＬ−１の脱脂乳（ヒト唾液中で測定される最大タンパク質含量に相当する）を含有するものとした。これらのアレルゲン及びタンパク質の濃度は予想される水準を越えるものであり、ペットフード用途におけるタンパク質分解酵素の余剰の活性を評価するためのものである。第二の型は、「通常条件」として１２．５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １（ネコ中間群で測定されたＦｅｌ  ｄ  １濃度の上限に相当）及び４．５μｇ  ｍＬ−１の脱脂乳（ヒト唾液中で測定される平均タンパク質含量１．６μｇ  ｍＬ−１に相当する）を含有するものとした。これらのアレルゲン及びタンパク質の濃度は、ほとんどのネコの唾液で予想される平均的水準を表している。
【０１１０】
[0121]比較的短時間で人工ネコ唾液中のＦｅｌ  ｄ  １を分解するために必要なタンパク質分解酵素の活性を（通常及び極端条件下で）同定するために、適合するタンパク質分解酵素であるパパイン、ｂｌ  スブチリシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ）、ａｏ  アスペルギロペプシン（ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）５０ＦＰ）及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを、より高い酵素活性における反応速度論的解析により更に評価した。予備実験により、４．５μｇ  ｍＬ−１（最適条件下で一晩保温する間にＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するために必要となる最少濃度に相当、表２）〜４５００μｇ  ｍＬ−１まで、パパインを１０００倍まで増加することが、人工ネコ唾液中のＦｅｌ  ｄ  １を極端条件下、１時間以内の保温で完全分解するために必要であることが明らかとなった。
【０１１１】
[0122]それゆえ、１２５μｇ  ｍＬ−１のＦｅｌ  ｄ  １を最適条件下、一晩保温の間に分解するために必要となるタンパク質分解酵素の最少濃度であった９．５μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシン（表２）より１０倍、１００倍、及び１０００倍多いｂｌ  スブチリシン量を、人工ネコ唾液中、Ｆｅｌ  ｄ  １分解の極端条件下、３７℃で１時間及び２０時間保温の後、試験した（図８）。したがって１２５μｇ  ｍＬ−１の天然Ｆｅｌ  ｄ  １を、０、９．５、９５、９５０及び９５００μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシンと共に、人工ネコ唾液中３７℃で、０分、１時間又は２０時間（一晩）保温した（極端条件、表４参照）。反応は１ｍＭのＰＭＳＦ添加で停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。希釈を考慮に入れると、Ｆｅｌ  ｄ  １の最大濃度は１２ｎｇ  ｍＬ−１と期待された（すなわち分解の可能性を考えない場合）。２回の独立した反復実験から平均及び標準偏差が算定された。パパインでの予備実験と同様に、極端条件下、人工ネコ唾液中で１時間以内にＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するためには、１０００倍高いｂｌ  スブチリシン濃度が必要とされた（図８）。
【０１１２】
[0123]１０００倍過剰のタンパク質分解酵素の有効性を更に把握するために、パパイン及びｂｌ  スブチリシンによるＦｅｌ  ｄ  １分解を、通常及び極端条件下、人工ネコ唾液中、比較的短時間の保温において反応速度論的に解析した（図９）。Ｆｅｌ  ｄ  １を添加し、パパイン及び９．５ｍｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシンを、０、５、１０、１５及び６０分間、通常及び極端条件下、人工ネコ唾液中、３７℃で保温した（表４）。反応は、１００μＭのＥ６４（パパイン用）及び１ｍＭのＰＭＳＦ（ｂｌ  スブチリシン用）の添加により停止した。試料は希釈し、３０分の反応時間でＥＬＩＳＡにより分析した。残存するＦｅｌ  ｄ  １の濃度は、タンパク質分解酵素を非添加のそれぞれの緩衝液対照のＦｅｌ  ｄ  １に対する、試料で測定されたＦｅｌ  ｄ  １の百分率を表す。３回の独立した反復から平均及び標準偏差が算定された。大部分のＦｅｌ  ｄ  １は、人工ネコ唾液中、通常及び極端条件下いずれにおいても、ｂｌ  スブチリシン（９．５ｍｇ  ｍＬ−１）により５分後には既に分解されていた。この実験はｂｌ  スブチリシンがパパインよりいくらか効果的であることを明らかにした。しかし、ネコ唾液の平均的な組成に対応する通常条件下で、パパイン（４．５ｍｇ  ｍＬ−１）により、５分以内に８０％を越えるＦｅｌ  ｄ  １が分解された（図９）。これらの条件下での０分における明瞭なＦｅｌ  ｄ  １分解活性は、反応を停止するため直後にＥ６４阻害剤を添加したにもかかわらず残存した活性によると説明できる可能性がある。続く実験ではパパイン及びｂｌ  スブチリシンの組み合わせた活性を停止するために、Ｅ６４及びＰＭＳＦ両阻害剤を添加することにより、この影響を回避した（図１０〜１２）。
【０１１３】
[0124]唾液中に平均的なＦｅｌ  ｄ  １及びタンパク質の濃度を有するネコが、食物を食べるのに約５分〜１０分を要するようなペットフードとしての用途において、試験濃度のパパイン及びｂｌ  スブチリシンは両者とも８０％より多くのアレルゲンを５分以内に分解すると予想することができる。試験した両方の濃度、それぞれ４．５ｍｇ  ｍＬ−１のパパイン及び９．５ｍｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシンは、用いたＦｅｌ  ｄ  １（１２５μｇ  ｍＬ−１）に対して大過剰の濃度である。しかしこの過剰の酵素は、Ｆｅｌ  ｄ  １分解の加速を、その大部分を数分内に分解するほどに促進する。
【０１１４】
[0125]最終的なキャットフードへの適用において、単独タンパク質分解酵素と同等のアレルゲン分解効率を維持しているが、タンパク質分解酵素の総濃度を低減する可能性があると考えられるパパイン及びｂｌ  スブチリシンの異なる組み合わせについて、Ｆｅｌ  ｄ  １分解における相乗効果を確認するために試験を行った。チオールプロテアーゼであるパパイン及びｂｌ  スブチリシンは、異なる機構を有するタンパク質分解酵素群に属し、したがって異なる基質特異性を有する。特定の機構に限定する意図はないが、Ｆｅｌ  ｄ  １ポリペプチド鎖において相互に現れる新しい切断点により２つのタンパク質分解酵素は相乗的に働く可能性があり、その結果単独のタンパク質分解酵素のみを用いて達成される分解に比べてより速くより効果的な分解が達成されると考えられる。
【０１１５】
[0126]人工ネコ唾液中での相乗的なＦｅｌ  ｄ  １分解能について、各々のタンパク質分解酵素単独での先行試験の濃度（パパイン４５００μｇ  ｍＬ−１及びｂｌ  スブチリシン９５００μｇ  ｍＬ−１、図９）で、２つのタンパク質分解酵素を組み合わせて試験した。加えて、タンパク質分解酵素の濃度を１０分の１、１００分の１及び１０００分の１に減じて、Ｆｅｌ  ｄ  １分解を試験した。４５０μｇ  ｍＬ−１のパパイン及び９５０μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシンが、１時間以内にＦｅｌ  ｄ  １を完全分解するための最少必要量であった（図１０）。試験した最大のタンパク質分解酵素濃度組み合わせ（４５００μｇ  ｍＬ−１のパパイン及び９５００μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシン）では、Ｆｅｌ  ｄ  １の完全分解は１０分後に達成された（図１０）。この効果は、９５００μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシン単独と同等であった（図９）。
【０１１６】
[0127]パパイン濃度を一定（４５００μｇ  ｍＬ−１）として、ｂｌ  スブチリシンの貢献を評価するためにその濃度を１１８８から９５００μｇ  ｍＬ−１まで変化させた（図１１）。４５００μｇ  ｍＬ−１のパパインと９５００又は４７５０μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシンと組み合わせた場合、Ｆｅｌ  ｄ  １分解には小さな相違しか観察されなかった。したがって４５００μｇ  ｍＬ−１のパパイン及び４７５０μｇ  ｍＬ−１のｂｌ  スブチリシンは、極端条件下でさえもネコ唾液中に存在する大部分のＦｅｌ  ｄ  １を１０分以内に分解するのに十分であると考えられる。ほとんどのネコの場合としての通常条件下で、最少のｂｌ  スブチリシン濃度（１１８８μｇ  ｍＬ−１）の組み合わせは、約９０％のＦｅｌ  ｄ  １を１０分以内に分解するのに十分である。
【０１１７】
[0128]ｂｌ  スブチリシン濃度を先行試験の最低濃度で一定（１１８８μｇ  ｍＬ−１）として、パパインの貢献を評価するためにその濃度を５６５から４５００μｇ  ｍＬ−１まで変化させた（図１２）。極端条件下では、４５００μｇ  ｍＬ−１のパパインと組み合わせた場合のみで、１０分での８０％のＦｅｌ  ｄ  １減少が達成された（図１２）。対照的に通常条件下では、試験されたパパイン濃度は、保温１０分後のＦｅｌ  ｄ  １分解に特段の影響を及ぼさなかった。したがって最少のタンパク質分解酵素組み合わせである５６５μｇ  ｍＬ−１パパイン及び１１８８μｇ  ｍＬ−１ｂｌ  スブチリシンは、平均的なネコの唾液中のＦｅｌ  ｄ  １含量を１０分以内の保温で、例えばネコが、タンパク質分解酵素を含有する、ペットフード若しくはおやつを食べている間又は飲料を飲んでいる間、又はタンパク質分解酵素含有製剤に口腔がさらされているその他の間に、およそ８０％減少するのに十分であると考えられる。
【０１１８】
実施例６
[0129]機能を持つタンパク質分解酵素を含有する拭取り布の原型が開発され、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。活性のあるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する１群の綿の拭取り布（２０ｃｍ×２０ｃｍ）を製造し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。拭取り布はＦｅｌ  ｄ  １の分解に好結果を示した。以下に特性を詳細に検討する。
【０１１９】
[0130]まず、拭取り布として必要なＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの濃度を確定した。必要となる酵素濃度は、原型により不活化されるべきＦｅｌ  ｄ  １量に依存する。Ｎｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａにより提供されたデータに基づくと、原型拭取り布により消化されるべき環境中のＦｅｌ  ｄ  １量は、およそ２５ｎｇ／ｃｍ２（＝０．２５ｍｇ／ｍ２）である。
【０１２０】
[0131]酵素の結合量は、固体材料の有効な結合／架橋結合部位によって限定されると考えられるので、原型拭取り布について望ましい酵素濃度を単純に設定することはできない。それゆえ目標を、固定化ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの量を最大にすることとした。
【０１２１】
[0132]表５は、表３のデータに基づきここで分析された適合するタンパク質分解酵素の、適用及び安全に関連する特性を要約している。タンパク質分解酵素ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌは、実施例６〜１０の特性を含む適用のための原型の開発に必要な特性を、すべて兼ね備えていることが明らかとなった。それは、ケラチン加水分解にごく弱い影響しか示さず、ケラチノサイトの生存能に影響がなく、セルロースに活性がないが、非イオン性界面活性剤に対し高度の耐性を示す。したがってＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌが、ここでの原型（拭取り布、ネコ砂、シャンプー、洗浄液）の開発に用いられた。
【表５】
2017512213.tif 000008
【０１２２】
綿拭取り布へのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの固定化
綿拭取り布の製造
[0133]数多くの綿布地のタイプから、モルトンを拭取り布の製造用に選択した。モルトン布地は、１００％綿繊維からなる。粗い表面及び高い吸水性から、多様な清掃用薄織物に利用される。最終的な拭取り布の１つの大きさは、およそ２０ｃｍ×２０ｃｍである。
【０１２３】
固定化ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌのための架橋方法
[0134]理論的には、酵素の固体材料への固定化は、化学反応による酵素の共有結合カップリングによって実施することができる。しかし、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを綿繊維にカップリングすることを記述した確立された方法はない。
【０１２４】
[0135]ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの固定化について最初の条件選別では、担体の材料（綿）は共有結合を容易に形成する官能基を有していないので、酵素及び担体（綿拭取り布）だけではなく２種の架橋剤も用いた。用いられた架橋剤は２成分系、ジアミン（ペンタエチレンヘキサミン、ＰＥＨＡ）及びジアルデヒド（グルタルアルデヒド、ＧＡ）、である。それらは一定の比率で組み合わされ、酵素に対応して用いられる量の表示は主にグルタルアルデヒド濃度で表した。
【０１２５】
[0136]２成分架橋系は、タンパク質の量に適合させる必要がある。少なすぎる量ではすべての酵素を架橋することはできないか、不安定な製剤となってしまうなど、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌに対応して用いられる量が重要であることが明らかとなった。多すぎる量では、架橋過剰となることで立体構造上の自由度が減少し、その結果酵素活性が減少してしまう。
【０１２６】
固定化効率把握のための酵素分析
[0137]異なる架橋条件及び方法の成否を知るために、架橋及び洗浄の後の酵素活性を測定した。この段階で、架橋されたＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６ＬのＦｅｌ  ｄ  １分解活性をＥＬＩＳＡで直接測定するのは、不便で時間がかかる。より迅速に架橋条件を選別するために、２つの他の酵素分析法、基質である酢酸４−ニトロフェニルのタンパク質分解酵素による加水分解に基づくＮＰＡ分析又は乳酸エチルの加水分解に基づくＥＬＵ試験を選択した。ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを小さな綿拭取り布に架橋するための最終的な方法を確立した後に、拭取り布全体への大規模固定化が実施されるであろう。その後、Ｆｅｌ  ｄ  １分解の能力及び酵素の安定性が、標的基質であるＦｅｌ  ｄ  １についてＥＬＩＳＡにより直接試験されるであろう。
【０１２７】
綿拭取り布に固定化されたＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの最終的な生産
[0138]酵素添加量及び条件に加えて、架橋剤の量及び条件を実験により決定した。その後、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを拭取り布全体（２０ｃｍ×２０ｃｍ）に架橋するための大規模反応を実施した。詳細には、液体のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ（９．２４ｍＬの４６００  ＥＬＵ／ｍＬ  ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ）を、８３．２ｍＬのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．５）と混合し、グルタルアルデヒドを加えた（終濃度１３３ｍＭ）。酵素の架橋は、室温で一晩、反応混合液中で拭取り布を保温することにより生成した。拭取り布は水で洗浄し、この水を搾り出し、水及び３％ＰＥＧで再度洗浄した。最終的に、拭取り布は空気流（２１℃）で５時間乾燥する。
【０１２８】
[0139]要約すると、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを１０枚の綿拭取り布に固定化し、他の１０枚の対照拭取り布は、反応混合液に酵素が加えられなかったことを除き、同じ方法で生産した。その後拭取り布を用途について試験した。Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化能を測定し、実施例１０に示す（表６）。
【０１２９】
実施例７
[0140]機能を持つタンパク質分解酵素を含有するネコ砂の原型を開発し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。具体的には、活性のあるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する２６０ｇのネコ砂（パーライト）を製造し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。ネコ砂はＦｅｌ  ｄ  １の分解に好結果を示した。以下に特性を詳細に検討する。
【０１３０】
[0141]まず、原型として必要なＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの濃度を確定した。必要となる酵素濃度は、原型により不活化されるべきＦｅｌ  ｄ  １量に依存する。Ｎｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａにより提供されたデータに基づくと、ネコ砂により不活化されるべきＦｅｌ  ｄ  １の量は、およそ２５０ｍｇである。
【０１３１】
[0142]酵素の結合量は、固体材料の有効な結合／架橋結合部位によって限定されると考えられるので、ネコ砂の場合、望ましい酵素濃度を単純に設定することはできない。それゆえ目標を、固定化ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの量を最大にすることとした。
【０１３２】
ネコ砂へのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの固定化
ベントナイトへの固定化
[0143]「Ｐｕｒｉｎａ  Ｔｉｄｙ  Ｃａｔｓ  ｎｏｎ  ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ｃａｔ  ｌｉｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ａｃｔｉｏｎ」を、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの固定化について試験した。このネコ砂は粘土鉱物であるベントナイトを基材としている。ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを水で希釈し、可能性のある固定化条件及び酵素の吸着を調査するために、ベントナイトに加えた。しかし、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌへの水の添加はこの酵素混合物に存在する５０％グリセロールを希釈し、ベントナイトを崩壊させた。
【０１３３】
[0144]他のベントナイトへの固定化試験を、液体の使用を最少化して実施した。これを目的として容易に吸着され得る少量のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌをベントナイトに直接加えた。担体材料は共有結合を容易に形成する官能基を有していないので、酵素及び担体に加えて２種の架橋剤を添加した。用いた架橋剤は２成分系、ジアミン（ペンタエチレンヘキサミン、ＰＥＨＡ）及びジアルデヒド（グルタルアルデヒド、ＧＡ）であり、一定の比率で組み合わせた。最大添加量がベントナイト１ｇ当たり液体１５０〜２００μＬであることが明らかとなった。液体は各々の粒子に個別に与えられなけらばならない。粒子が崩壊するという事実により、固定化後の詳細な検討はできない。このことは即座の障害とはならないが、ベントナイトが湿り再度乾燥した後に、酵素を有する塵が空中に浮遊することになる。しかし、この担体上のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌは、乾燥していても数日後にはすべての活性を失った。結論として、試験したネコ砂はＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの固定化には適していなかった。
【０１３４】
砂への固定化
[0145]１．２ｍｍの粒子径をもつ砂が、ベントナイトに第一に混合され得る他の担体として試験した。酵素の他に２種の架橋剤を再度用いた。砂は酵素を２番目の担体（砂）に固定化するという取り組みの能力を示すために用い、その後他のネコ砂粒子に混合され得る。砂１ｇ当たり最大添加量として２００μＬのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを用いた。しかし、おそらく砂には細孔がなく表面積が小さいことにより、活性及び回収は比較的低かった。酵素の浸出が少なく、したがって砂は基本的に共有結合に適切な材料である。
【０１３５】
パーライトへの固定化
[0146]パーライトを３番目の担体として選択した。粒子径が２．８〜６ｍｍであることにより、これもベントナイトに第一に混合され得る。酵素の他に２種の架橋剤（ＧＡ及びＰＥＨＡ）を、共有結合を誘導するために再度用いた。最初の固定化実験は、酵素ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの浸出に加えて回収も、酵素添加量が低い領域で比較的良好であることを示した。５００μＬを越える酵素添加量ではパーライト粒子は顕著に着色するが、低添加量では明るい白色を維持する。
【０１３６】
パーライトに固定化されたＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの最終的な生産
[0147]ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌのネコ砂材料への架橋にとってパーライトは、砂及びベントナイトより優れていることが明瞭に明らかとなった。パーライトは多量の酵素添加が可能であり、酵素の浸出は低いままである。更に、その粒子径は他のネコ砂材料との均一な混合を可能とする。それゆえパーライトが（登録商標）ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの架橋にとって優れた材料であることが見出され、最終的に２６０ｇのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ含有パーライトが生産された。
【０１３７】
[0148]詳細には、液体のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ（６０ｍＬの４６００ＥＬＵ／ｍＬ  ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ）を、４７２．８ｍＬの冷水と混合し、ＰＥＨＡ（ｐＨ７．０に調整、終濃度２０ｍＭ、４℃）及びグルタルアルデヒド（終濃度１３３ｍＭ）を添加し、よく混合し、３００ｇパーライトに加えた。酵素の架橋は、室温で一晩、反応混合液中でパーライト粒子を保温することにより生成した。パーライトは、水、５ｍＭリン酸緩衝液、そして３％ＰＥＧを含む水で洗浄した。最終的にパーライト粒子は、室温で一晩、乾燥した。
【０１３８】
[0149]要約すると、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌが２６０ｇのパーライトに固定化され、他の少量の対照試料（１ｇパーライト）は、反応混合液に酵素が加えられなかったことを除き、同じ方法で生産された。その後パーライトを適用について試験した。Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化能を測定し、実施例１０に示す（表６）。
【０１３９】
実施例８
[0150]機能を持つタンパク質分解酵素を含有する洗浄液の原型を開発し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。具体的には、１リットルの洗浄液及び５０ｍＬの活性のあるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する酵素濃縮液を製造し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。原型はＦｅｌ  ｄ  １の分解に好結果を示した。以下に特性を詳細に検討する。
【０１４０】
[0151]まず、それぞれの原型に必要なＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの濃度を確定した。必要となる酵素濃度は、それぞれの原型により不活化されるべきＦｅｌ  ｄ  １量に依存する。Ｎｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａにより提供されたデータに基づくと、原型により消化されるべき環境中のＦｅｌ  ｄ  １量は、およそ２５ｎｇ／ｃｍ２（＝０．２５ｍｇ／ｍ２）である。
【０１４１】
[0152]総Ｆｅｌ  ｄ  １の消化に必要となるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの濃度の決定のために、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ希釈系列の活性をＥＬＩＳＡにより分析した。３．８Ｕ／ｍＬのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ（単位は、Ｌ−（−）−乳酸エチル分析（ＥＬＵ）に基づいており、製造者Ｇｅｎｅｎｃｏｒｅにより測定された）は、最適な反応条件下（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８）で２．５μｇのＦｅｌ  ｄ  １を完全消化可能である。実施例９のシャンプーでの最初の計算を含んだこれらの計算に基づき、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの濃度を、洗浄液に適するように調整した。
【０１４２】
ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する表面洗浄剤の開発
[0153]硬質表面のＦｅｌ  ｄ  １濃度に基づき、必要となるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの量を決定し、洗浄液基盤の製剤（ＫＡＲ−００１）に混合した。詳細には、ガラスビーカーに水（９６０ｇ）を加え、１０ｇのフェノキシエタノール（防腐剤）、続いて３０ｇのＺｕｓｏｌａｔ  １００８／８５（Ｚｓｃｈｉｍｍｅｒ＆Ｓｃｈｗａｒｚ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧから入手可能な脂肪族アルコール）及び１０ｇのＥＵＸＹＬ（登録商標）ＰＥ９０１０を添加し、かき混ぜた。ｐＨは、必要な場合にはＮａＯＨを用いて８．０に合わせなければならない。この基盤製剤（ＫＡＲ−００１）に、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ（９ｍＬの４６００ＥＬＵ／ｍＬ  ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ）を加えた（ＫＡＲ−００１＋Ｅ）。最終的に、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含まない１リットルの表面洗浄剤（ＫＡＲ−００１−Ｅ）２本に加えて、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する１リットルの表面洗浄剤ＫＡＲ−００１（ＫＡＲ−００１＋Ｅ）を製造し、適用について試験した。Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化能を測定し、実施例１０に示す（表６）。
【０１４３】
ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する酵素濃縮液の開発
[0154]ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを既に含んでいる、すぐに使える形の表面洗浄剤に加えて、酵素及び液体表面洗浄剤を使用直前に混合することを基本とした他の用途に思い至るかもしれない。
【０１４４】
[0155]その利点は、顧客により供給される可能性もあるいかなる他の表面洗浄剤とも酵素を混合することが可能なことにある。加えて、酵素を表面洗浄剤製剤ではない最適な液体製剤中で保存することで、酵素を安定化し増強された酵素安定性を誘導することが可能となる。それゆえ、２０倍に濃縮された（すぐに使える形の表面洗浄剤ＫＡＲ−００１＋Ｅに比較して）ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ及び酵素安定剤プロピレングリコールからなる酵素濃縮液が開発された。Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化能（２０倍ＫＡＫ−００１＋Ｅを１倍表面洗浄剤で希釈後）を測定し、実施例１０に示す（表６）。
【０１４５】
実施例９
[0156]機能を持つタンパク質分解酵素を含有するシャンプーの原型を開発し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。具体的には、活性のあるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する２種のネコ用シャンプー（つけたままの製剤、それぞれ１リットル）を製造し、Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化について試験した。すべての原型はＦｅｌ  ｄ  １の分解に好結果を示した。以下に、それぞれの原型の特性を詳細に検討する。
【０１４６】
[0157]まず、原型として必要なＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの濃度を確定した。必要となる酵素濃度は、原型により不活化されるべきＦｅｌ  ｄ  １量に依存する。ネコ上のＦｅｌ  ｄ  １量は、およそ２μｇ／ｍｇネコの毛（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｐｕｒｉｎａより提供されたデータ）である。ネコ当たりの毛の重量は平均１２１ｇ（Ａｖｎｅｒ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７）であるから、シャンプーにより不活化されるべきネコ上のＦｅｌ  ｄ  １の総量はおよそ２５０ｍｇである。
【０１４７】
[0158]総Ｆｅｌ  ｄ  １の消化に必要となるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ濃度の決定のために、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ希釈系列の活性をＥＬＩＳＡにより分析した。３．８Ｕ／ｍＬのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ（単位は、Ｌ−（−）−乳酸エチル分析（ＥＬＵ）に基づいており、製造者Ｇｅｎｅｎｃｏｒｅにより測定された）は、最適な反応条件下（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８）で２．５μｇのＦｅｌ  ｄ  １を完全消化可能である。次に、シャンプー製剤中のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの活性を測定するために、ネコ用シャンプーＫＦＳ−００２（以下参照）中のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの活性を分析した。液体製剤中のＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ活性の最初の算出用モデルとして、ＫＦＳ−００２を選択した。ＫＦＳ−００２中でＦｅｌ  ｄ  １を完全に不活化するために３８．４Ｕ／ｍＬのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌが必要であることが、ＥＬＩＳＡにより確定された（最適な反応緩衝液よりおよそ１０倍多い）。
【０１４８】
ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有するシャンプーの開発
[0159]両性コカミドプロピルベタイン（ベタイン）、陰イオン性ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥ）、陰イオン性ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＬＳ）、陰イオン性ココイルグルタミン酸ナトリウム／ジナトリウム及び非イオン性デシルグルコシドに基づくいくつかの泡沫製剤が試験されたが、すべての製剤で満足な結果が得られたわけではない。
【０１４９】
[0160]ネコ上のＦｅｌ  ｄ  １濃度に基づき、必要となるＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌの量を決定し、２種の基盤シャンプー製剤（ＫＦＳ−００２及びＫＦＳ−００４ａ）に混合した。
【０１５０】
[0161]詳細には、ガラスビーカーに水（９８０ｇ）を加え、１０ｇのフェノキシエタノール（防腐剤）、続いて１０ｇのベタイン（ＫＦＳ−００２）又は１０ｇのＳＬＳ（ＫＦＳ−００４ａ）並びに１０ｇのＰＥＲＬＡＳＴＡＮ（登録商標）Ｌ３０を添加し、かき混ぜた。ｐＨは、必要な場合にはＮａＯＨを用いて５．５（ＫＦＳ−００２）又は７．５（ＫＦＳ−００４ａ）に合わせなければならない。
この基盤製剤（ＫＦＳ−００２／００４ａ）に、９ｍＬのＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ（４６００ＥＬＵ／ｍＬ  ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌ）を加えた（ＫＦＳ−００２／００４ａ＋Ｅ）。最終的に、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含まない１リットルのシャンプー２本（ＫＦＳ−００２／００４ａ−Ｅ）に加えて、ＰＲＯＴＥＸ（登録商標）６Ｌを含有する、１リットルのシャンプーＫＦＳ−００２及び１リットルのシャンプーＫＦＳ−００４ａ（ＫＦＳ−００２／００４ａ＋Ｅ）を製造し、適用について試験した。Ｆｅｌ  ｄ  １の不活化能を測定し、実施例１０に示す（表６）。
【０１５１】
実施例１０
[0162]実施例６〜９の原型のＦｅｌ  ｄ  １の不活化について研究を行った。データを表６に示す。すべての開発された原型が、適用に連関するＦｅｌ  ｄ  １量を不活化することが可能ということは明瞭である。
【表６】
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【０１５２】
[0163]本明細書中には本発明の代表的な好ましい実施形態が開示されており、特定の用語が用いられているが、それらは一般的かつ記述上の意味のみで限定を目的とせずに使用されており、本発明の範囲は請求項に述べられている。上記教示に照らして、本発明の数多くの改変及び変形が可能である。したがって、本明細書に記載のもの以外であっても、添付の特許請求の範囲内で本発明を実施することが可能であると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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