(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチンシンセターゼ活性を有する蛋白質
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
下記の（I）の制限酵素切断地図で示される、ビオチンシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードする、シュードモナス  エスピーＤ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）由来のＤＮＡ。
【化１】
0004104729.tif 000017
【請求項４】
以下の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a) 配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ
(b) (a)のＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつビオチンシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
ＤＮＡがシュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡである、請求項２または４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
ＤＮＡがシュードモナス  エスピーＤ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）由来のＤＮＡである、請求項４の(a)記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項９】
形質転換体がエシェリヒア属に属する微生物またはシュードモナス属に属する微生物である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
形質転換体が宿主微生物としてエシェリヒア・コリまたはシュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）を用いて得られた形質転換体である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項８、９または１０記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項２〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡがコードするビオチンシンセターゼ活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、ビオチンシンセターゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項１２】
蛋白質がビオチンシンセターゼである、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項８、９または１０記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にｄ−ビオチンを生成蓄積させ、該培養物からｄ−ビオチンを採取することを特徴とする、ｄ−ビオチンの製造方法。
【請求項１４】
シュードモナス属に属し、請求項２〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを保有し、かつｄ−ビオチンの生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にｄ−ビオチンを生成蓄積させ、該培養物からｄ−ビオチンを採取することを特徴とする、ｄ−ビオチンの製造方法。
【請求項１５】
微生物がシュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）またはＤ−０１１０株から誘導され、かつビオチンシンセターゼ活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物であることを特徴とする、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１６】
培養時、培地中にエタノールを０．２〜２０容量％の範囲で添加することを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質の製造法、および該形質転換体を用いたビオチン活性物質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビオチン活性物質とは、サッカロミセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 7754 のビオチン要求性を相補する活性を有するビオチン関連物質の総称であり、具体的には、ビオチンおよびビオチン生合成経路上の中間体であるｄ−デチオビオチン、７，８−ジアミノペラルゴン酸、および７−ケト−８−アミノペラルゴン酸のことをいう〔緒方浩一ら、日本生化学会（編）「生化学実験講座（１３、上）ビタミンと補酵素」、p. 345-361、東京化学同人(1975)〕。
【０００３】
ｄ−ビオチンは水溶性ビタミンの一種であり、飼料添加物、化粧品の原料、あるいは医薬品として用いられる有用な化合物である。ｄ−デチオビオチンは生体においてｄ−ビオチン生合成経路の最終中間体でありｄ−ビオチン生成の前駆物質として、また、７，８−ジアミノペラルゴン酸および７−ケト−８−アミノペラルゴン酸はｄ−ビオチン生合成の中間体として重要である。
【０００４】
ｄ−ビオチンは現在、化学合成法によって工業的に生産されている。その製造方法として、Ｌ−システイン、クロロ酢酸、グルタル酸からｄｌ−ビオチンを生産する方法、ピメリン酸からｄｌ−ビオチンを生産する方法、フマル酸からｍｅｓｏ−ジアミノコハク酸を経由して光学分割によりｄ−ビオチンを生産する方法、Ｄ−マンノースからｄ−ビオチンを生産する方法、Ｄ−グルコースからｄ−ビオチンを生産する方法、Ｌ−システインからｄ−ビオチンを生産する方法などが知られている〔和泉好計ら、日本ビタミン学会編「ビタミン学実験法（ＩＩ）」、ｐ．４７５−５２１、東京化学同人（１９８３）〕。
【０００５】
一方、微生物を用いたビオチンの生産も古くから研究されている。これまでに、細菌（特開平６−３３９３７１、特開昭６０−１３３８８２、特公昭４４−１４７９５）、放線菌（特公昭４１−２１７５６、特公昭４２−３０７４）、酵母〔Lett. Appl. Microbiol., 2, 25 (1986)〕、およびカビ（特公昭４２−８９１８）を用いた生産が報告されている。さらに近年では、組換えＤＮＡ技術を適用したビオチン生産菌の改良も進められている。たとえば、セラチア（Serratia）属細菌（特開平５−１９９８６７）、エシェリヒア（Escherichia）属細菌（特開平８−７０８５７、特開平８−２１４８７４、特開平８−５０１６９４）、バシルス（Bacillus）属細菌（特開平７−２３１７８９、特開平３−１５１８７０、特開平４−１１８９４）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌（特開平７−８７９６３）でビオチン生合成遺伝子を増幅した組換え微生物を用いることによりｄ−ビオチンの比較的高い生産性が得られている。
【０００６】
ｄ−ビオチンの前駆体であるｄ−デチオビオチンについては、クルチア（Kurthia）属細菌を利用した生産方法（特開平８−２５６７８５）が知られているが、生産性は低い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
化学合成法によるビオチン活性物質の合成は工程が複雑なことから、かなり高価となるため、微生物を利用した発酵法によるビオチン活性物質の生産技術の開発が望まれている。ビオチン活性物質、例えば、ｄ−ビオチン、ｄ−デチオビオチン等は、発酵法による従来の技術において生産される量は必ずしも満足のいくレベルには至っていない。従って、さらに効率の良い、工業的に有利な、ビオチン活性物質の製造法が強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の状況に鑑み、ビオチン活性物質の高生産能を有する微生物を自然界より新たに検索し、シュードモナス属に属する微生物が野生株としては極めて多量のｄ−ビオチンを培地中に生成することを見いだし、該微生物よりｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を取得することにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本願の第１の発明は、シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物由来の、ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質である。
ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質としては、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡへの生合成に関与する活性を有する蛋白質、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸への生合成に関与する活性を有する蛋白質、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸への生合成に関与する活性を有する蛋白質、７，８−ジアミノペラルゴン酸からデチオビオチンへの生合成に関与する活性を有する蛋白質、デチオビオチンからビオチンへの生合成に関与する活性を有する蛋白質をあげることができ、具体的には、ピメリル−ＣｏＡシンセターゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンセターゼ、７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、デチオビオチンシンセターゼ、ビオチンシンセターゼ等をあげることができる。
【００１０】
シュードモナス属に属する微生物としては、例えば、シュードモナス  エスピー等をあげることができる。具体的には、シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）またはＤ−０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物をあげることができる。
【００１１】
本願の第２の発明は、以下の(a)または(b)の蛋白質：
(a)  配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)  (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質、
である。
【００１２】
上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。
かかる１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、Molecular Cloning, Second Editionと略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法に準じて調製す ることができる。
【００１３】
本願の第３の発明は、上記蛋白質をコードするＤＮＡである。
本願の第４の発明は、以下の(a)または(b)のＤＮＡ：
(a)  図１または２で示される、ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
(b)  (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
である。
【００１４】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、図１または２で示されるＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００１５】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, Second Edition、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、図１または２で表される塩基配列と少なくとも80％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００１６】
本願の第５の発明は、以下の(a)または(b)のＤＮＡ：
(a)  配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(b)  (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
である。
【００１７】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、第４の発明に記載された方法により、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００１８】
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも80％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本願の第６の発明は、上記ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡである。
【００１９】
本願の第７の発明は、上記組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体である。
本願の第８の発明は、上記形質転換体を培地に培養し、培養物中に本願の第１の発明で記載した蛋白質から選ばれる蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
【００２０】
本願の第９の発明は、上記形質転換体を培地に培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取することを特徴とする、ビオチン活性物質の製造方法である。
本願の第１０の発明は、シュードモナス(Pseudomonas)属に属し、ビオチン活性物質の生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取することを特徴とする、ビオチン活性物質の製造方法である。
【００２１】
シュードモナス属に属する微生物としては、例えば、シュードモナス  エスピー等をあげることができる。具体的には、シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）またはＤ−０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物をあげることができる。
【００２２】
第９および１０の発明において、ビオチン活性物質として、例えば、d−ビオチン、ｄ−デチオビオチン等をあげることができる。
第９および１０の発明において、培養時、培地中にエタノールを０．２〜２０容量％の範囲で添加することによりｄ−ビオチンの生産量を一層高めることができる。
【００２３】
本願の第１１の発明は、シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）である。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
（１）ビオチンの生合成に関与する遺伝子の単離
ビオチンの生合成に関与する遺伝子を単離するための微生物としては、シュードモナス属に属する微生物であればいずれも用いることができ、好ましくは、シュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８）をあげることができる。
【００２５】
該Ｄ−０１１０株は、本発明者らが土壌試料から新たに分離した菌株である。
Ｄ−０１１０株の菌学的性質を以下第１〜５表に示す。
【００２６】
【表１】
0004104729.tif 000002
【００２７】
【表２】
0004104729.tif 000003
【００２８】
【表３】
0004104729.tif 000004
【００２９】
【表４】
0004104729.tif 000005
【００３０】
【表５】
0004104729.tif 000006
【００３１】
【表６】
0004104729.tif 000007
以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイのマニュアル〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2 (1986)〕の記載と照合することにより、本菌株をシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌と同定し、該菌株をシュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０(Pseudomonas sp. D-0110)と命名した。
【００３２】
該菌株は、ブダペスト条約に基づいて、平成１０年３月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５-００４６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８８として寄託されている。
シュードモナス属に属する微生物より、公知の方法〔例えば、Biochim.Biophys.Acta, 72, 619 (1963)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
【００３３】
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば、ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲI等で切断し、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法によりＤＮＡ断片を分画し、2〜１５ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。
該回収ＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、Molecular Cloning, Second Edition、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（ライフ・テクノロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔ストラタジーン（Staratagene)社製〕を用いクローニングベクターを作製し、作製した該クローニングベクターを用い、各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸菌を形質転換する。
【００３４】
該大腸菌を形質転換するためのクローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテック 社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファルマシア社製）、pcD2〔H.Okayama and P.Berg；Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)〕、pMW218（和光純薬社製）等を挙げることができる。
【００３５】
各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸菌は以下の方法により取得することができる。
大腸菌、例えばＭＭ２９４株を、ＬＢ培地〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl １０ｇを水１Lに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕等の培地を用い、通常の方法により培養する。
【００３６】
培養後、得られた菌体を、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤を用い、常法に従い、変異処理する。
該変異処理菌体を０．８５％食塩水等を用い、適当に希釈し、ＬＢ寒天平板培地〔ＬＢ培地に寒天１．５％を添加した培地〕等の天然寒天平板培地あるいは合成寒天平板培地上に塗布し、培養する。
【００３７】
培養後、出現したコロニーを、Ｍ９寒天平板培地〔グルコース ２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．０１ｇ、チアミン塩酸塩 ０．１ｍｇ、寒天１５ｇを水1Lに含み、ｐＨ7.2に調整した培地〕等の最少寒天平板培地および該最少寒天平板培地にビオチンを添加した寒天平板培地にレプリカし、培養する。
【００３８】
最少寒天平板培地では生育できず最少寒天平板培地にビオチンを添加した寒天平板培地でコロニーを形成した菌株がビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸菌変異株（ビオチン要求性変異株）である。
該ビオチン要求性変異株のビオチン生合成経路の欠損箇所は、大腸菌由来のビオチン生合成遺伝子群を持つプラスミド、例えば、ｐＬＣ２５−２３〔J. Mol. Biol., 148, 63 (1981)〕を利用した生育の相補試験により同定することができる。
【００３９】
即ち、プラスミドｐＬＣ２５−２３より、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏＢ遺伝子から選ばれる遺伝子を一つ以上含有するプラスミドを調製し、これらプラスミドを用い、取得した該ビオチン要求性変異株を形質転換し、いずれのプラスミドを導入したときに、該ビオチン要求性変異株が最少培地で生育可能となるかによりビオチン生合成経路の欠損箇所を同定することができる。
【００４０】
以上の方法により、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＣ欠損株）、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸への生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＦ欠損株）、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸への生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＡ欠損株）、７，８−ジアミノペラルゴン酸からデチオビオチンへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＤ欠損株）、デチオビオチンからビオチンへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＢ欠損株）およびこれら生合成経路を複数欠損した株等を取得することができる。
【００４１】
該各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸菌を、上記で作製したクローニングベクターで形質転換した後、該形質転換体をＭ９培地等の最少寒天平板培地で培養する。
培養後、該培地上にコロニーを形成した菌株を取得する。
該菌株は、シュードモナス属由来のビオチン生合成に関与する遺伝子を含有したプラスミドを有している。
【００４２】
該菌株より、シュードモナス属由来のビオチン生合成に関与する遺伝子を含有したプラスミドを常法、例えば、Molecular Cloning, Second Edition、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により取得することができる。
【００４３】
このようにして取得されたプラスミドとして、例えば７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸への生合成に関与する遺伝子を含有するプラスミドｐＭＢ−００１、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡ、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸、７，８−ジアミノペラルゴン酸からデチオビオチンおよびデチオビオチンからビオチンへの生合成に関与する遺伝子を含有するプラスミドｐＭＢ−００２等をあげることができる。
（２）ビオチンの生合成に関与する蛋白質の製造
上記のようにして得られるビオチンの生合成に関与する遺伝子を宿主細胞中で発現させるためには、まず、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００４４】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等をあげることができる。
【００４５】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、ビオチンの生合成に関与する遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等を宿主細胞として用いる場合は、ビオチンの生合成に関与する遺伝子発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ビオチンの生合成に関与する遺伝子および転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４６】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕等を例示することができる。
【００４７】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４８】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
本発明のビオチンの生合成に関与する遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００４９】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【００５０】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００５１】
また、接合伝達法により異属微生物に組換えベクターを導入することもできる。
具体的な接合伝達法としては、例えば、以下のように大腸菌の含有する組換えベクターをシュードモナスに属する微生物に導入する方法をあげることができる。
【００５２】
組換えベクターを含有する大腸菌、シュードモナスに属する微生物およびｔｒａおよびｍｏｂを含むヘルパープラスミドを含有する大腸菌を各々培養し、得られた培養液を等量混合する。
該混合液をフィルター（例えば、Millipore、TypeHA、0.45μｍ）上で濃縮した後、フィルターを菌体を含む面を上にして、ＬＢ寒天平板培地等の天然培地あるいは合成寒天平板培地上に乗せる。
【００５３】
数時間静置培養後、適度に希釈し、大腸菌は生育できず、大腸菌の含有する組換えベクターの導入されたシュードモナスに属する微生物のみ生育可能な寒天平板培地、例えば、５００ｍｇ／ｌのアンピシリンと５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを同時に含むＬＢ培地等の上に塗布し、培養する。
生育してきたコロニーを分離することにより、目的の組換えベクターの導入されたシュードモナスに属する微生物を取得することができる。
【００５４】
ヘルパープラスミドとしては、例えばｐＲＫ２０１３〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1648 (1979)〕等を利用することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
【００５５】
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００５６】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等をあげることができる。
【００５７】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929  (1978)記載の方法等をあげることができる。
【００５８】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329, 840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００５９】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００６０】
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３―２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２―２２７０７５）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 84, 7413(1987)〕、virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００６１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント1-３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【００６２】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００６３】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman and Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００６４】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
【００６５】
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
ビオチンの生合成に関与する遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にビオチンの生合成に関与する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、ビオチンの生合成に関与する蛋白質を製造することができる。
【００６６】
本発明のビオチンの生合成に関与する蛋白質製造用の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６７】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００６８】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００６９】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００７０】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００７１】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Pharmingen社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
【００７２】
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の形質転換体の培養物から、本発明のビオチンの生合成に関与する蛋白質を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００７３】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００７４】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００７５】
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００７６】
また、上記方法により発現させた蛋白質を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced chemTech社製)、パーキンエルマージャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオテク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
（３）ビオチン活性物質の製造
上記（２）で取得された形質転換体を、上記（２）の方法に準じて培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取することによりビオチン活性物質を製造することができる。
【００７７】
また、形質転換させていない、シュードモナス属に属し、ビオチン活性物質の生産能を有する微生物を上記（２）の方法に準じて培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取することによりビオチン活性物質を製造することもできる。
培養時にエタノールを０．２〜２０容量％の範囲で培地に添加して培養することにより、ｄ−ビオチン生産効率を高めることができる。
【００７８】
また、培養中に、培養に用いる培地成分およびエタノールを適宜途中添加あるいは連続添加することにより、ｄ−ビオチンの生産効率を高めることができる。
培養液からのビオチン活性物質の単離・精製は、ビオチン活性物質の諸性質を利用して、一般の天然物から抽出精製する通常の方法により行うことができる。
即ち、培養液から遠心分離等の方法により不溶物を除いた後、活性炭やマクロポーラス非イオン系樹脂等に吸着させ、その後溶出させ、さらにイオン交換樹脂に通して精製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹脂で処理して精製し、水またはアルコールより再結晶することによりビオチン活性物質を単離・精製することができる〔遠藤  勲ら、化学工学会（編）「バイオセパレーションプロセス便覧」、共立出版(1996)〕。
【００７９】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
【実施例】
実施例１  ビオチン活性物質高生産微生物の検索
土壌試料中よりビオチン活性物質高生産能を有する微生物を以下のように検索した。
土壌試料を滅菌済の０．８５％食塩水に懸濁し適当に希釈した後に、ＢＹ寒天平板培地〔普通ブイヨン ２０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ポリペプトン ５ｇ、寒天 １５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に塗布し、３０℃で１〜３日間培養した。
【００８１】
形成されたコロニーを新たなＢＹ寒天平板培地に塗布して３０℃で１〜２日間培養した後、評価培地ＰＭ１〔グリセロール ２０ｇ、ペプトン ２０ｇ、カザミノ酸 １０ｇ、酵母エキス ２ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩 ５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３０℃で３日間振とう培養した。
【００８２】
培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質を定量した。ｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の定量は、それぞれ、ラクトバシルス  プランタルム（Lactobacillus plantarum ATCC8014）、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ATCC7754 ）を用いる微生物定量法〔和泉好計ら、日本ビタミン学会（編）「ビタミン学実験法  ＩＩ」、ｐ．４７５−５２１、東京化学同人（１９８３）〕により行った。
【００８３】
ｄ−ビオチン含量に関しては、高速液体クロマトグラフィー（YMC A-313カラム、５０ｍＭ ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4：アセトニトリル＝８５：１５、２１０ｎｍ）でも確認した。
検索の結果、多数のｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の高い生産能を有する菌株を取得したが、特にシュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株（以下、Ｄ−０１１０株ともいう）が野生株としては極めて高いｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の生産性を示し、培地中に各々約１ｍｇ／ｌおよび約３0ｍｇ／ｌ生産・蓄積した。
【００８４】
シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株と既知のビオチン高生産株を評価培地ＰＭ１または評価培地ＰＭ２〔評価培地ＰＭ１にピメリン酸 ０．１％を添加した培地〕８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３０℃で３日間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質を上記と同様な方法により定量した。
【００８５】
結果を第６表に示す。
【００８６】
【表７】
0004104729.tif 000008
Ｄ−０１１０株は、既知のビオチン高生産微生物と比べて、極めて高いｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の生産能を有していた。
【００８７】
実施例２  Ｄ−０１１０株のビオチン生合成遺伝子のクローニング
エシェリヒア  コリ  ＭＭ２９４株を３０ｍｌのＬＢ培地を含む三角フラスコに接種し、３０℃で対数増殖期の中期まで振とう培養した。
該培養液を遠心分離して得た菌体を、常法に従い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いて変異処理後、０．８５％食塩水で適当に希釈してＬＢ寒天平板培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。
【００８８】
形成されたコロニーをＭ９寒天平板培地〔グルコース ２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．０１ｇ、チアミン塩酸塩 ０．１ｍｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕およびｄ−ビオチン１０ｍｇ／ｌを含むＭ９寒天平板培地にそれぞれ塗布し、３０℃で2日間培養した。
該培養において、ｄ−ビオチンを含むＭ９寒天平板培地でのみ生育可能なｄ−ビオチン要求性変異株を４株取得した。以後、これら変異株をそれぞれＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株と呼ぶ。
【００８９】
ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株における欠損遺伝子の同定は、エシェリシア  コリ由来のビオチン生合成遺伝子群を持つプラスミドpLC25-23〔J. Mol. Biol., 148, 63 (1981)〕を利用した生育の相補試験により行った。
即ち、pLC25-23からビオチン生合成遺伝子群の中に部分的に欠損を持った欠失プラスミド、あるいは同遺伝子群の中の一部をサブクローニングして得た誘導体プラスミドを常法によって種々作製し、これらの一連のプラスミドで各ビオチン要求株を形質転換して、ビオチン要求性の相補の有無を調べた。
【００９０】
その結果、変異株ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株は、それぞれｂｉｏＡ欠損株、ｂｉｏＢ欠損株、ｂｉｏＤ欠損株、およびｂｉｏＦ欠損株と同定された。
シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株を２５０ｍｌの評価培地ＰＭ１を含む２Ｌ三角フラスコに接種し、３０℃で対数増殖期の後期まで振とう培養した。
【００９１】
該培養液を遠心分離して得られた菌体から、Saitoらの方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)〕に従って染色体ＤＮＡを調製した。
該染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩで完全に消化した後に、プラスミドベクターｐＭＷ２１８（和光純薬）の、それぞれ対応する制限酵素切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【００９２】
該ＤＮＡ連結物を用いて、上記の各種ビオチン生合成遺伝子欠損株を塩化カルシウム法〔Molecular Cloning, Second Edition〕により形質転換した。
該形質転換体をカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＭ９寒天平板培地で培養し、該培地で生育可能な形質転換体を取得した。
これら形質転換体を、ＬＢ培地８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３０℃で１日間振とう培養した。
【００９３】
培養後、得られた培養液を遠心分離により菌体を取得した。
該菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法〔Molecular Cloning, Second Edition〕によりプラスミドを取得した。
取得したプラスミドの内、２種類の組換え体プラスミドｐＭＢ−００１およびｐＭＢ−００２について、各種制限酵素による切断解析を行った。
【００９４】
該解析の結果、ｐＭＢ−００１はｐＭＷ２１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位に約７．５ｋｂの、またｐＭＢ−００１はｐＭＷ２１８のＥｃｏＲＩ部位に約１２ｋｂの、シュードモナス由来のＤＮＡ断片を有していた。
両ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を図１および２に示す。
上記２種のＤＮＡ断片に含まれるビオチン生合成遺伝子を同定するために、組換え体プラスミドｐＭＢ−００１およびｐＭＢ−００２をそれぞれ、上記で取得した、ビオチン要求性変異株ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株に導入して、ビオチン非存在下での生育相補能を調べた。
【００９５】
ｐＭＢ−００１に挿入されている約７．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片には７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸の生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＡに対応）が、ｐＭＢ−００２に挿入されている約１２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には、デチオビオチンからビオチンの生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＢに対応）、７，８−ジアミノペラルゴン酸からデチオビオチンの生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＤに対応）、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸の生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＦに対応）の各遺伝子が存在することが判明した。
【００９６】
さらに、両断片のサブクローニングとその相補試験により、ｂｉｏＡはＨｉｎｄＩＩＩ断片中の、内部にＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩＩ部位を有する約２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位内に、ｂｉｏＢはＥｃｏＲＩ断片中の約３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位内に存在することがわかった。ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位内にはＳａｌＩ部位が数カ所存在し、これらＳａｌＩ部位内の約１．９ｋｂ断片内にｂｉｏＢは存在することがわかった。
【００９７】
ｂｉｏＢを含む約１．９ｋｂのＳａｌＩ断片の塩基配列を常法に従って決定した。ｂｉｏＢは１０５３ｂｐ長で、３５１アミノ酸をコードしていた。
ｂｉｏＢのＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、該ＤＮＡにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００９８】
実施例３  組換え体プラスミドｐＥＢ−００２の作製
組換え体プラスミドｐＭＢ−００１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで切断し、ｂｉｏＡを含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＥＧ４００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【００９９】
該連結プラスミドを用い、エシェリヒア  コリ  ＤＨ５α株を塩化カルシウム法により形質転換した。
得られた形質転換体をスペクチノマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天平板培地で培養し、該培地で生育する形質転換株を目的をする形質転換体として取得した。
【０１００】
これら形質転換株の１株からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドｐＥＢ−００１を取得した。
該ｐＥＢ−００１は、各種制限酵素による切断解析の結果、ベクターｐＥＧ４００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に、ｂｉｏＡを含む約２．９ｋｂＤＮＡ断片を有していることがわかった（図３）。
【０１０１】
組換え体プラスミドｐＭＢ−００２については、ＥｃｏＲＩで切断し、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏＦを含む約１２ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該断片を、上記で得た組換え体プラスミドｐＥＢ−００１のＥｃｏＲＩ切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
該連結プラスミドを用い、エシェリヒア  コリ  ＤＨ５α株を塩化カルシウム法により形質転換した。
【０１０２】
得られた形質転換体をスペクチノマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天平板培地で培養し、該培地で生育する形質転換株を目的をする形質転換体として取得した。
これら形質転換株の１株からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドｐＥＢ−００２を取得した。
【０１０３】
該ｐＥＢ−００２は、各種制限酵素による切断解析の結果、ｐＥＢ−００１のＥｃｏＲＩ部位に、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏＦを含む約１２ｋｂのＤＮＡ断片を有していることがわかった（図３）。
ｐＥＢ−００２を保有するエシェリヒア  コリ  ＤＨ５α株は、ブダペスト条約に基づいて、平成１０年３月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８９号として寄託されている。
【０１０４】
実施例４  組換え体プラスミドｐＥＢ−００２によるＤ−０１１０株の形質転換組換え体プラスミドｐＥＢ−００２を保有するエシェリヒア  コリ  ＤＨ５α株およびヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を保有するエシェリヒア  コリ  ＨＢ１０１株を、各々スペクチノマイシン(５０ｍｇ／ｌ)、カナマイシン(５０ｍｇ／ｌ)を添加したＬＢ培地４０ｍｌを含む三角フラスコに接種し、３０℃で１２時間振とう培養した。
【０１０５】
シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株をＬＢ培地４０ｍｌを含む三角フラスコに接種し、３０℃で１２時間振とう培養した。
これら３菌株の培養液からそれぞれ遠心分離により菌体を調製し、４０ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．３で２回遠心洗浄後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。
【０１０６】
これら菌体懸濁液をそれぞれ１ｍｌずつ抜き取り混合した後、１０ｍｌの注射筒とフィルターホルダー（Millipore, Swinnex ４７ｍｍ）を用いてフィルター（Millipore, Type HA、４７ｍｍ、０．４５μｍ）上に濃縮した。
該フィルターを菌体が濃縮された面を上にしてＬＢ寒天平板培地上に乗せ、３０℃で４〜６時間培養した。フィルター上の混合菌体を上記リン酸カリウム緩衝液に懸濁し、適当に希釈後、５００ｍｇ／ｌのアンピシリンと５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを同時に含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３０℃で１日間培養した。
【０１０７】
該培地で生育可能なアンピシリンおよびスペクチノマイシン耐性の形質転換株は、シュードモナス  エスピー  Ｄ−０１１０株と同一の菌学的性質を示した。
該形質転換株の中の１株よりプラスミドを調製した。
該プラスミドを各種の制限酵素により切断し、解析を行うことにより、該形質転換株がｐＥＢ−００２を保有していることを確認した。
【０１０８】
実施例５  ビオチン活性物質の生産
Ｄ−０１１０株およびｐＥＢ−００２を保有するＤ−０１１０株についてｄ−ビオチンおよびｄ−デチオビオチンの生産を以下のように行った。
ＬＢ培地８ｍｌを用い、３０℃で２４時間振とう培養し、得られた種培養液０．８ｍｌを８ｍｌの生産培地ＢＭ１〔グリセロール ２０ｇ、酵母エキス ２ｇ、ペプトン ２０ｇ、カザミノ酸 １０ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩 ５ｇ、Ｌ−アラニン １ｇ、Ｌ−メチオニン １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ ４２ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １０ｍ ｇ、ビタミンＢ1 ０．２ｍｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕の入った太型試験管に上記２菌株をそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。なお、プラスミド保有株の種培養および生産培地での培養はスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。
【０１０９】
培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマトグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量した。
結果を第７表に示す。
【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
実施例６ エタノール添加効果
ＬＢ培地にｐＥＢ−００２を保有するＤ−０１１０株を接種し、実施例５と同様な方法により振とう培養した。
該種培養液０．８ｍｌを、生産培地ＢＭ１を８ｍｌ含み、フィルター滅菌したエタノールを５０〜１５０μｌの範囲で種々添加した太型試験管に接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。なお、種培養および生産培地での培養はスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。
【０１１２】
培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマトグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量した。
結果を第８表に示す。
【０１１３】
【表９】
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エタノールを培地に添加して培養することにより、ｄ―デチオビオチンの生成量は増加しなかったが、ｄ−ビオチンの生成量は２倍以上高まった。
【０１１４】
実施例7  ビオチン活性物質の製造
ｐＥＢ−００２を保有するＤ−０１１０株を用いて、２Ｌジャーファーメンターによる製造を以下のように行った。
ＢＹ寒天平板培地上に菌体を塗布し、３０℃、２４時間培養後、４５mlの種培地Ｄ１〔グルコース ２g、酵母エキス ０．５g、ポリペプトン １．５g、ＮａＣｌ １．５g、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １g、ＣａＣＯ3 ２gを水１Ｌに含み、ｐＨ６．５に調整した培地〕の入った３００ml容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２４時間振とう培養した。
【０１１５】
該種培養液１０ｍｌを、８００ｍｌの種培地Ｅ１〔コーン・スチープ・リカー５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4０．５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ６．８に調整した培地〕の入った２Ｌジャーファーメンターに接種し、３０℃、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、８００ｒｐｍの条件下で、培地中のｐＨを硫酸で７．５に調整しながら培養した。
【０１１６】
約１２時間後、該種培養液６０mlを４４０mlの生産培地Ｆ１〔グルコース ４ｇ、コーン・スチープ・リカー ３ｇ、グルタミン酸ナトリウム ０．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ６．８に調整した培地〕の入った２Ｌジャーファーメンターに接種し、３２℃、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、９００ｒｐｍの条件下で、培地中のｐＨをアンモニア水で６．７に調整しながら培養した。
【０１１７】
培養開始時点からフィルター滅菌したエタノールを流加速度約１．０ｍｌ／ｈで連続的に添加した。
更に、培地中のグルコースが消費された時点でグルコース・フィード液〔グルコース５００ｇを水１Ｌに含む培地〕を連続的に添加した。
該フィード液の流加速度は最初５．０ｍｌ／ｈで行い、溶存酸素濃度が約１ｐｐｍまで低下後、溶存酸素濃度１〜２ｐｐｍの範囲に維持されるように、流加速度を調整しながらフィード液を添加した。
【０１１８】
培養開始後、約１２０時間で培養を終了した。なお、種培養および生産培地での培養はすべてスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。
培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマトグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量した。
【０１１９】
結果を第９表に示す。
【０１２０】
【表１０】
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【０１２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ビオチン活性物質の生産能を有するシュードモナス属に属する微生物、あるいは該微生物由来のｄ−ビオチン生合成に関与するDNAを導入した微生物を用いることにより、工業的に有利なビオチン活性物質の製造方法を提供することができる。
【０１２２】
【配列表】
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【０１２３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｄ−０１１０株よりクローン化した、ｂｉｏＡを含むビオチンの生合成に関与する遺伝子を含有する約７．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を示す。ｂｉｏＡは内部にＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩＩ切断部位を有する約２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｓｔＩ部位に存在する。
【図２】図２は、Ｄ−０１１０株よりクローン化した、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦを含むビオチンの生合成に関与する遺伝子を含有する、約１２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の制限酵素地図を示す。ｂｉｏＢは約３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位に存在する。
【図３】図３は、ｐＥＢ−００１およびｐＥＢ−００２の作製工程を示す。図中、黒塗りの太線で示した部分が、Ｄ−０１１０株からクローン化したｂｉｏＡを含むＤＮＡ断片を示す。灰色の太線で示した部分は、Ｄ−０１１０株からクローン化したｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦを含むＤＮＡ断片を示す。Ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を、Ｓｍ／Ｓｐｃはストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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