(57)【要約】本発明の開示は、少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを合成するための方法、および本方法において使用される中間体を提供する。２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドのβアノマーを生成するための方法であって、ａ）核酸塩基をグリコシル化する工程であって、グリコシル供与体が、保護されたアルキルヒドロキシまたはアルキルアミンをその２’位に含有する、工程と、ｂ）該グリコシル基の２’位および４’位で環化する工程とを含む、方法。
2017512774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドのβアノマーを生成するための方法であって、
ａ）核酸塩基をグリコシル化する工程であって、グリコシル供与体が、保護されたアルキルヒドロキシまたはアルキルアミンをその２’位に含有する、工程と、
ｂ）該グリコシル基の２’位および４’位で環化する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドの前記βアノマーを精製または回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、式Ｉ：
【化４】
2017512774.tif 000009
（式中、
ＸはＮ、Ｓ、またはＯから選択され、
Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、Ｈ、アルコール保護基、示されているＯを含むリン酸エステル、示されているＯを含むホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェート、またはホスホルアミダイトから独立して選択され、
Ｗ３は、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホルアミダイト、ＸがＮの場合にＮを含むホスホルアミデートエステル、ＸがＮの場合にＮを含むホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１（Ｏ）Ｒ、もしくは−ＣＯＯＲから独立して選択され、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸、または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートであり、
Ｂは核酸塩基である）
の構造を有するかまたはそのホスホルアミダイトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＸがＮである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＸがＳである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＸがＯである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸塩基がプリンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸塩基が、アデニン、グアニン、またはその誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸塩基がピリミジンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸塩基が、チミン、シトシン、もしくはウラシル、またはその誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸塩基が過シリル化されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルコール保護基が、４，４’−ジメトキシトリチル、エステル、シリル、または酸不安定エーテルから選択される、請求項３から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミン保護基が、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、またはトリフルオロアセチル（ｔｆａ）から選択される、請求項３から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリコシル供与体が、アセチル保護されたメチルヒドロキシをその２’位に含有し、前記環化する工程が、アミン、マスクされたアミンまたは保護されたアミンで該ヒドロキシを置換し、該２’位および４’位を環化することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記グリコシル供与体が、保護されたメチルアミンまたはマスクされたメチルアミンをその２’位に含有し、前記環化する工程が、該２’位の保護されたメチルアミンまたはマスクされたメチルアミンおよびその４’位を直接環化することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコシル供与体が、保護されたメチルヒドロキシまたはマスクされたメチルヒドロキシをその２’位に含有し、前記環化する工程が、該ヒドロキシをチオール、マスクされたチオールまたは保護されたチオールで置換し、該２’位および４’位を環化することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコシル供与体が、アセチル保護されたメチルヒドロキシをその２’位に含有し、前記環化する工程が、該ヒドロキシを脱アセチル化し、該２’位および４’位を環化することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリコシル供与体が、アルコール保護基をその３’位に含有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルコール保護基がエーテルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルコール保護基が熱および酸安定性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルコール保護基が、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリル、ベンジル、置換ベンジルまたは不安定エーテルから選択される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記グリコシル供与体が、置換されていてもよいペントースである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコシル供与体が、リボース、アラビノースまたはグルコース由来のものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記グリコシル化する工程が、５０％を超えるβアノマー収率をもたらす、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記グリコシル化する工程が、７：３を超える、８：２を超える、または９：１を超えるβ：αアノマー比をもたらす、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２０１４年３月１６日に出願された米国仮出願第６１／９５３，８８９号に対する優先権の利益を主張する。この出願の内容全体は、すべての目的でその全体が参照によって本明細書により援用される。
【０００２】
開示の分野
本発明の開示は、少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを合成するための方法、ならびに本方法において使用される中間体に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドは、効力、送達効率、標的特異性、安定性、および／または毒性における利点を提供する可能性がある。したがって、このようなオリゴヌクレオチドに取り込むための２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを効率的に合成するための方法が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
開示の概要
本発明の開示は、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド（ＣＢＢＮ）、またはそのホスホルアミダイト、および少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、ならびに本方法において使用される合成中間体を生成するための方法に関する。様々な実施形態では、合成されたオリゴヌクレオチドは、効力、送達効率、標的特異性、安定性および／または毒性において利点を提供するアンチセンス阻害剤である。
【０００５】
一態様では、本開示は、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド（ＣＢＢＮ）のβアノマーを生成するための方法を提供する。本方法は、核酸塩基（例えば、過シリル化核酸塩基）をグリコシル化する工程であって、グリコシル供与体が、保護されたアルキルヒドロキシを２’位に含有する、工程を含む。グリコシル化する工程の後には環化する工程が続き、この工程で、グリコシル基の２’位および４’位が環化される。一実施形態では，本方法は、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド（ＣＢＢＮ）のβアノマーを精製または回収する工程をさらに含み得る。
【０００６】
一実施形態では、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式Ｉ：
【化１】
2017512774.tif 000003
（式中、ＸはＮ、Ｓ、またはＯである）の構造を有する。一実施形態では、ＸはＮであり、Ｗ３と共にアミノ基を形成する。別の実施形態では、ＸはＳである。さらなる実施形態では、ＸはＯである。Ｗ１およびＷ２は、独立して、Ｈ、アルコール保護基、示されているＯを含むリン酸エステル、示されているＯを含むホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェート、またはホスホルアミダイトである。Ｗ３は、独立して、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホルアミダイト、ＸがＯの場合にＯを含むホスホルアミデートエステル、ＸがＯの場合にＯを含むホスホルジアミデートエステル（phosphordiamidate ester）、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、または本明細書に記載される他のコンジュゲート分子、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、もしくは−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル直鎖状アルケニル、分岐状アルケニル、環状アルケニル、糖、脂肪酸、または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートである。Ｂは核酸塩基である。いくつかの実施形態では、核酸塩基はピリミジン塩基である。他の実施形態では、核酸塩基はプリン塩基である。
【０００７】
一実施形態では、Ｗ３は、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホルアミダイト、ＸがＮの場合にＮを含むホスホルアミデートエステル、ＸがＮの場合にＮを含むホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１（Ｏ）Ｒ、もしくは−ＣＯＯＲから独立して選択され、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸、または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートである。
【０００８】
さらに、いくつかの態様では、ＸがＳの場合、Ｗ３は、＝Ｏまたは（＝Ｏ）２のいずれかであり得る。
【化２】
2017512774.tif 000004
【０００９】
様々な実施形態では、グリコシル化する工程は、式ＩＩの構造のグリコシル供与体（式中、ＸはＮ、Ｓ、またはＯである）を含む。一実施形態では、ＸはＮである。別の実施形態では、ＸはＳである。さらなる実施形態では、ＸはＯである。Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６は、独立して、アルコール保護基、アルキルスルホネートエステル（示されているＯを含む）またはアリールスルホネートエステル（示されているＯを含む）である。Ｙ１およびＹ２は、独立して、Ｈ、アミン保護基、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、または本明細書に記載される他のコンジュゲート分子、−Ｃ１（Ｏ）Ｒ、もしくは−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル、直鎖状アルケニル、分岐状アルケニル、環状アルケニル、糖、脂肪酸、または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートである。
【００１０】
様々な実施形態では、グリコシル化する工程は、保護されたアルキルヒドロキシ基を２’位に有するグリコシル供与体を含む。一実施形態では、グリコシル供与体は、アセチル保護されたメチルヒドロキシを２’位に含有し、環化する工程は、ヒドロキシをアミン、マスクされたアミンまたは保護されたアミンで置換し、２’位および４’位を環化することを含む。一実施形態では、グリコシル供与体は、アセチル保護された（acetyl protectected）メチルアミノ置換基を２’位に含有し、環化する工程は、２’位および４’位を直接環化することを含む。一実施形態では、グリコシル供与体は、アセチル保護されたメチルヒドロキシを２’位に含有し、環化する工程は、ヒドロキシをチオール、マスクされたチオールまたは保護されたチオールで置換し、２’位および４’位を環化することを含む。別の実施形態では、グリコシル供与体は、アセチル保護されたメチルヒドロキシを２’位に含有し、環化する工程は、ヒドロキシルを脱アセチル化し、２’位および４’位を環化することによって、エーテル結合を有する２’Ｃ−４’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドを得ることを含む。一実施形態では、グリコシル供与体は、アルコール保護基を３’位に含有する。一実施形態では、アルコール保護基は、場合により置換されているベンジルエーテルである。別の実施形態では、アルコール保護基は熱安定性である。様々な実施形態では、アルコール保護基は、アセチル、シリル、または不安定エーテルであり得る。様々な実施形態では、グリコシル供与体は、置換されていてもよいペントースである。一実施形態では、グリコシル供与体は、出発材料としてリボース、アラビノース、またはグルコース由来のものである。
【００１１】
別の態様では、本開示の方法は、効率よくおよび高収率で２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドを生成する。一実施形態では、グリコシル化する工程は、５０％を超えるβアノマーの収率をもたらす。別の実施形態では、グリコシル化する工程は、７：３を超える、８：２を超える、または９：１を超えるβ：αアノマー比をもたらす。
【００１２】
一態様では、本開示は、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドのβアノマーを生成するための方法であって、ａ）グリコシル供与体が、保護されたアルキルヒドロキシまたはアルキルアミンを２’位に含有する、核酸塩基をグリコシル化する工程と、ｂ）グリコシル基の２’位および４’位を環化することによって、グリコシル化ビシクロ［３．２．１］オクタン環系を得る工程とを含む方法を提供する。
【００１３】
ある態様では、グリコシル化は、炭水化物、（グリコシル供与体）が、別の分子（グリコシル受容体）のヒドロキシル基または他の官能基に結合する反応を含む。
【００１４】
本開示の他の態様および実施形態は、以下の詳細な記載および実施例から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１は、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的合成経路を提供する。
【図１−２】図１は、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的合成経路を提供する。
【図１−３】図１は、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的合成経路を提供する。
【００１６】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる核酸塩基を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的生成を提供する。図２Ａは、チミン核酸塩基の取り込みを示す。
【００１７】
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる核酸塩基を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的生成を提供する。図２Ｂは、完全に保護されたアデノシンオキソＣＢＢＮの合成を示す。アデニン核酸塩基の取り込みの後に環化する工程が続き、この環化する工程は、ヒドロキシルを脱アセチル化し、２’位および４’位を環化することによって、エーテル結合を有する２’Ｃ−４’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドを得ること、および５’位を最終的にベンゾイル化することによって、完全に保護された２’Ｃ−４’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（ここで、式Ｉの「Ｘ」はＯである）を得ることで構成される。
【００１８】
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる核酸塩基を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的生成を提供する。図２Ｃは、グアニン核酸塩基の取り込みを示し、ここで、式Ｉの「Ｘ」はＯである。
【００１９】
【図３Ａ】図３Ａは、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）、そのアミノＬＮＡカウンターパートならびに２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオシド（オキソＥＮＡ）およびそのアミノＥＮＡカウンターパートに関する親和性増加（ΔＴｍ、Ｃ／修飾）の比較チャートを提供する。図３Ｂは、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（アミノＣＢＢＮ）とそのオキソＣＢＢＮカウンターパートに関する親和性増加（ΔＴｍ、Ｃ／修飾）の比較チャートを提供する。示されているように、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、そのオキソＣＢＢＮカウンターパートよりも大きな親和性／修飾を付与する。加えて、オリゴヌクレオチド内の単一および複数のアミノＣＢＢＮ修飾は、ＬＮＡヌクレオシドのものと同等かまたはそれを超える親和性を付与する。
【００２０】
【図３Ｂ】図３Ａは、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）、そのアミノＬＮＡカウンターパートならびに２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオシド（オキソＥＮＡ）およびそのアミノＥＮＡカウンターパートに関する親和性増加（ΔＴｍ、Ｃ／修飾）の比較チャートを提供する。図３Ｂは、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（アミノＣＢＢＮ）とそのオキソＣＢＢＮカウンターパートに関する親和性増加（ΔＴｍ、Ｃ／修飾）の比較チャートを提供する。示されているように、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、そのオキソＣＢＢＮカウンターパートよりも大きな親和性／修飾を付与する。加えて、オリゴヌクレオチド内の単一および複数のアミノＣＢＢＮ修飾は、ＬＮＡヌクレオシドのものと同等かまたはそれを超える親和性を付与する。
【００２１】
【図４】図４は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイで測定した場合の、ｍｉＲ−２０８ａ発現に対する様々なｍｉＲ−２０８ａ阻害剤の有効性を示す。化合物Ｍ−１０５９１、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１１９１９およびＭ−１１９２０の活性を測定する。化合物Ｍ−１０５９１は、非ターゲティングコントロールである。化合物Ｍ−１０１０１（混合９ＬＮＡ／７ＤＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）は、最適化ｍｉＲ２０８ａ阻害剤である。Ｍ１０１０１化合物は、米国特許第８，６４２，７５１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。化合物Ｍ−１０９１９およびＭ−１１９２０は、親化合物（Ｍ−１０１０１）のＬＮＡチミジンがそれぞれ１つまたは２つのアミノＣＢＢＮ残基で置換されている混合ＬＮＡ／ＤＮＡ／アミノＣＢＢＮホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。示されているように、複数のＬＮＡ残基がアミノＣＢＢＮ残基で置換されている化合物Ｍ−１１９２０は、最適化Ｍ−１０１０１化合物のすべての活性を保持する。
【００２２】
【図５】図５は、アデニン塩基を用いた２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的生成を提供し、ここで、式Ｉの「Ｘ」はＮである。
【００２３】
【図６】図６は、グアニン塩基を用いた２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的生成を提供し、ここで、式Ｉの「Ｘ」はＮである。
【００２４】
【図７】図７は、チミン塩基を用いた２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的生成を提供し、ここで、式Ｉの「Ｘ」はＮである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明の開示は、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（ＣＢＢＮ）を含む修飾ヌクレオシドを合成するための方法、および本方法において使用される中間体に関する。様々な態様では、本合成法は、安価な、容易に入手できる出発材料および試薬を使用することによって、コストおよび利便性における利点を提供する。本開示の方法はまた、有意により高い収率を可能にする。
【００２６】
一態様では、本開示は、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド（ＣＢＢＮ）のβアノマーを生成するための方法を提供する。本方法は、核酸塩基（例えば、過シリル化核酸塩基）をグリコシル化する工程であって、グリコシル供与体が、保護されたアルキルヒドロキシを２’位に含有する、工程を含む。グリコシル化する工程の後には環化する工程が続き、この工程で、グリコシル基の２’位および４’位が環化されて閉環をもたらす。一実施形態では，本方法は、βアノマーを精製または回収する工程をさらに含み得る。
【００２７】
一実施形態では、本開示は、式Ｉの構造：
【化３】
2017512774.tif 000005
（式中、ＸはＮ、Ｓ、またはＯである）を有するＣＢＢＮのβアノマーの合成に関する。一実施形態では、ＸはＮである。別の実施形態では、ＸはＳである。さらなる実施形態では、ＸはＯである。
【００２８】
種々の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、独立して、Ｈ、アルコール保護基、示されているＯを含むリン酸エステル、示されているＯを含むホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェート、またはホスホルアミダイトである。一実施形態では、Ｗ３は、独立して、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホルアミダイト、ＸがＯの場合にＯを含むホスホルアミデートエステル、ＸがＯの場合にＯを含むホスホルジアミデートエステル（phosphordiamidate ester）、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、または本明細書に記載される他のコンジュゲート分子、−Ｃ１−４（Ｏ）Ｒ、もしくは−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル直鎖状アルケニル、分岐状アルケニル、環状アルケニル、糖、脂肪酸、または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートである。
【００２９】
一実施形態では、Ｗ３は、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホルアミダイト、ＸがＮの場合にＮを含むホスホルアミデートエステル、ＸがＮの場合にＮを含むホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１（Ｏ）Ｒ、もしくは−ＣＯＯＲから独立して選択され、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸、または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートである。
【００３０】
さらに、いくつかの態様では、ＸがＳの場合、Ｗ３は、＝Ｏまたは（＝Ｏ）２のいずれかであり得る。
【００３１】
様々な実施形態では、アルコール保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリルまたは酸不安定エーテルから選択される。一実施形態では、Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリルまたは酸不安定エーテルから独立して選択されるアルコール保護基である。様々な実施形態では、アミン保護基は、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）またはトリフルオロアセチル（ｔｆａ）である。一実施形態では、Ｗ３は、カルボキシベンジル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはトリフルオロアセトアミジルから選択されるアミン保護基である。一実施形態では、Ｗ３は、第３級アミンが生じる、不安定ではないアルキル置換基である。
【００３２】
様々な実施形態では、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（２’−ＣＢＢＮ）である。
【００３３】
様々な実施形態では、オキソ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、２’Ｃおよび４’Ｃが酸素を介して接続されて３原子結合（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−）が生じた２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（オキソＣＢＢＮ）である。
【００３４】
様々な実施形態では、アミノ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはアザ−２’−架橋二環式ヌクレオシドは、２’Ｃおよび４’Ｃが窒素を介して接続されて３原子結合（−Ｃ−Ｎ−Ｃ−）が生じた２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（アミノＣＢＢＮ）である。
【００３５】
様々な実施形態では、チオ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、２’Ｃおよび４’Ｃが硫黄を介して接続されて３原子結合（−Ｃ−Ｓ−Ｃ−）が生じた２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（チオＣＢＢＮ）である。
【００３６】
様々な実施形態では、アミノ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドおよびチオ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドは、それぞれアミノ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドおよびチオ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００３７】
様々な実施形態では、ロックドヌクレオシドは、ヌクレオシドのリボース環の２’位と４’位との間に２原子結合を有する２’−オキソ−４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（ＬＮＡ）である。コア糖は、２．５ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン構造を形成する。
【００３８】
様々な実施形態では、ＥＮＡおよびオキソＥＮＡは、ヌクレオシドのリボース環の２’
位と４’位との間に３原子結合を有する２’−オキソ−４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドである。コア糖は、２．６ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン構造を形成する。
【００３９】
様々な実施形態では、アミノＥＮＡおよびアザＥＮＡは、ヌクレオシドのリボース環の２’位と４’位との間に３原子結合を有する２’−アザ−４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドである。コア糖は、６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．１］オクタン構造を形成する。
【００４０】
様々な実施形態では、Ｂは、核酸塩基である。核酸塩基または塩基は、修飾され得るプリンまたはピリミジン塩基であり得る。一実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基である。別の実施形態では、核酸塩基は、ピリミジン塩基である。様々な実施形態では、核酸塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシンまたはそれらの誘導体およびまたはそれらの置換体などの天然ヌクレオシド塩基から選択され得る。加えて、本開示はまた、天然に存在しない核酸塩基の使用を企図する。ある実施形態では、天然に存在しない核酸塩基は、核酸塩基の環原子のいずれかが別の原子で置換されている塩基であり得る。例えば、ＣＨがＮで置換されていてもよいし、またはその逆も同様である。このような修飾は、複数の位置で起こり得る。天然に存在しない塩基の別の例は、天然に存在する塩基の２−置換基および４−置換基が逆転している塩基である。さらなるプリンおよび／またはピリミジン塩基修飾は、国際公開第２０１２／０６１８１０号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、カルボキシアミノ、カルバモイルまたはカルバミド基などのアミノカルボニルである。様々な実施形態では、修飾は、１つもしくはそれを超えるピリミジン塩基のＣ−５位に、および／または１つもしくはそれを超えるプリン塩基のＣ−８位にある。例示的な核酸塩基としては、限定されないが、９−Ｎ−アデニン、９−Ｎ−グアニン、チミジン、シチジン、ウリジン、５−メチルシトシン、イノシン、５−置換ウリジン、５−置換シトシン、２−アミノアデノシンまたは５−メチルシトシンが挙げられる。
【００４１】
様々な実施形態では、グリコシル化する工程は、保護されたアルキルヒドロキシ基を２’位に有するグリコシル供与体を含み、ここで、アルキルヒドロキシ基はＣ１〜Ｃ４アルキルヒドロキシであり得る。一実施形態では、グリコシル供与体は、アセチル保護されたメチルヒドロキシを２’位に含有する。
【００４２】
ある実施形態では、グリコシル供与体は、アルコール保護基を３’位に含有する。一実施形態では、アルコール保護基は、場合により置換されているベンジルエーテルを含む。別の実施形態では、アルコール保護基は熱安定性である。例示的アルコール保護基として、限定されないが、アセチル、シリル、または塩基不安定エーテルが挙げられる。一実施形態では、アルコール保護基は、４−ハロベンジルである。図１（化合物１７および１８）に示されているように、このスキームは、高い比のβアノマーを提供する。
【００４３】
様々な実施形態では、グリコシル供与体は、置換されていてもよいペントース糖であり得る。ある実施形態では、グリコシル供与体は、例えば、便利な出発材料である、リボース、アラビノース、またはグルコース由来のものである。
【００４４】
次いで、２’位および４’位を環化してもよい。２’−ヒドロキシメチルは、脱保護し、直接環化して、２’−Ｃ、４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドを得ることができる。あるいは、環化前に、脱保護２’−ヒドロキシメチル基を、アミン、マスクされたアミンまたは保護されたアミンに変換し、次いでＮ−中心で環化することによって、アミノ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドを得ることができる。あるいは、環化前に、脱保護２’−ヒドロキシメチル基は、チオール、マスクされたチオールまたは保護されたチオールに変換し、次いでＳ−中心で環化して、チオ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドを得ることができる。
【００４５】
一態様では、本開示の合成法は、あまり高価でない、より容易に入手できる、およびより安全な化学試薬を使用することによって、コスト、利便性、および安全性における利点を提供する。様々な実施形態では、本開示の方法は、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドを効率よくおよび高収率で生成する。一実施形態では、グリコシル化する工程は、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、または９０％を超えるβアノマー収率をもたらす。一実施形態では、グリコシル化する工程は、７：３を超える、８：２を超える、または９：１を超えるβ：αアノマー比をもたらす。
【００４６】
一部の実施形態では、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに固相合成により取り込まれる、対応するホスホルアミダイトへ変換される。様々な実施形態では、２’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド合成は、限定されないが、メチル−Ｄ−リボース、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル４−Ｃ−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド、メチル５−Ｏ−メシル−４−Ｃ−（メシルオキシメチル）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（ヒドロキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド、（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート、（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート、（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート、（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（チミジン−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イ��）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート、１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−チミジン、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（チミジン−イル）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６，８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト、（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート、（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−イソブチリルグアノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート、および｛（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−［（９Ｒ）−９ａ−ベンゾイル−９−アデニンイル］−８−（４−クロロベンジルオキシ）−３．６−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタ−５−イル｝メチルベンゾエートを含めた、例えば図１および２に示されているような、１つまたはそれを超える中間体を含み得る。これらの中間体の中に記載されている保護基は、当技術分野で公知である、または本明細書に記載される他の保護基、例えば４，４’−ジメトキシトリチルオキシ保護基の代わりに４−モノメトキシトリチルオキシで、あるいは置換されていてもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５ａもしくはｂ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９のヌクレオチド配列と実質的に相補的な配列を含む。例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と実質的に相補的な配列を含み得る。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と実質的に同一な配列を含み得る。本明細書で使用される「実質的に相補的」または「実質的に同一」は、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的または同一な配列を指す。
【００４８】
固相合成によるオリゴヌクレオチド（修飾ポリヌクレオチドを含む）の合成は周知であり、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、“Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，（７）：２１５−２３（１９８０）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって概説されている。オリゴヌクレオチドの合成は、利用されるヌクレオチドモノマー（複数可）の選択に応じて変化する。例示的な実施形態では、合成に使用されるヌクレオチドモノマーとしては、限定されないが、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）で保護されたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト、ＤＭＴｒで保護されたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホルアミダイト誘導体、ＤＭＴｒ−およびトリフルオロ酢酸で保護されたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト、ＤＭＴｒで保護され脂肪酸をコンジュゲートしたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト、ならびにＤＭＴｒで保護され糖をコンジュゲートしたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイトが挙げられる。ある実施形態では、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）で保護されたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト、ＤＭＴｒ−およびトリフルオロ酢酸で保護されたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト、ＤＭＴｒで保護され脂肪酸をコンジュゲートしたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト、ならびにＤＭＴｒで保護され糖をコンジュゲートしたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイトを利用するオリゴヌクレオチド合成の場合、長期のカップリング時間が必要であり得る。ある実施形態では、ＤＭＴｒで保護されたアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホルアミダイト誘導体を含むオリゴヌクレオチド合成の場合、Ａｃ２Ｏ／塩基を利用する通常のキャッピング試薬を非標準的なキャッピング試薬に交換することによって、標準的なオリゴヌクレオチド合成サイクルを改変し得る。あるいは、ホスホルアミダイトカップリングサイクルの直後、しかし標準的なキャッピング工程の前に、新たにカップリングされたオリゴヌクレオチドを、合成サイクルに対して安定な（しかし、所望により後で除去可能な）アミン反応性コンジュゲートまたは保護基で処理することによって、合成を改変し得る。
【００４９】
参照による組み込み  
本明細書で引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、その全体において、すべての目的のために参照により組み込まれる。しかし、本明細書で引用されるいずれの参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の記載も、これらが有効な従来の技術を構成するという承認または任意の形態の示唆とみなされることはないし、みなされるべきではない。
【実施例】
【００５０】
実施例１：アミノ２’−Ｃ−４’Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの生成
本実施例では、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを生成するための重要な中間体の合成を記載する（図１を参照のこと）。
【００５１】
メチル−Ｄ−リボース（２）  
３つの５００ｍＬショットボトルにおいて、Ｄ−リボース（１）（９０ｇ、５９９ｍｍｏｌ）、アンバーリスト１５（Ｈ＋）（９０ｇ、５９９ｍｍｏｌ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｒａｐ  Ｐａｃｋ（９０ｇ、５９９ｍｍｏｌ）を等分した（すなわち、各ショットボトルにおいて各３０ｇ）。等量のメタノール（容量：１３５０ｍｌ、すなわち４５０ｍＬ／ボトル）を各ボトルに充填して、無色の溶液を得た。すべてのボトルをオービタルシェーカー上に２５０ｒｐｍ／２５℃で１７時間置いた。展開溶媒として非保護リボースの１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ溶液を用いた、同時スポットと比較した反応混合物のＴＬＣによって、反応の進行をモニタリングした。木炭を用いるＨａｎｎｅｓｓｉａｎ染色によって、糖を可視化した。
【００５２】
この溶液をガラス焼結漏斗に通してろ過した。過剰なＭｅＯＨ（各３０ｇのアンバーリストおよびＴｒａｐ  Ｐａｃｋｓを含有するボトル当たり約５００ｍＬ）で触媒およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｒａｐ  Ｐａｃｋｓを洗浄した。１５ｍＬのＴＥＡ（５ｍＬ／反応ボトル）を添加することによって、メタノール溶液を塩基性にした。混合物を濃縮乾固した。残留物をジクロロメタン（３×２００ｍＬ）と共に共蒸発させて、残留ＭｅＯＨを共沸除去した。残留物を高真空下で一晩乾燥して、９７．５５ｇ（９９％）のメチル−Ｄ−リボース（２）を得、これをさらに精製せずに使用した。
【００５３】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（３）  
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル−Ｄ−リボース（２、６０．１２ｇ、３６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１２８ｍｌ、７３２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（容量：４００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。アルゴンでフラスコをフラッシュし、氷浴中で０℃に冷却した。ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（９９ｍｌ、３８５ｍｍｏｌ）を１０分間滴下添加し、混合物を一晩かけて室温にした。
【００５４】
反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１Ｌ）溶液に注いだ。ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で水相を抽出した。有機相を合わせ、水（１×４００ｍＬ）およびブライン（１×４００ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮して暗褐色の油状物質を得、これを４等分し、１００ｍＬ／分で７５分間かけて標準的な０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配でランし、続いて１００％ＥｔＯＡｃで７分間保持するシリカクロマトグラフィーによって精製することによって精製した。純粋な画分を合わせて、無色の油状物質として１２１．５９ｇ（８２％）のメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（３）を得た。
【００５５】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（４）  
２Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（３、５５．０ｇ、１３７ｍｍｏｌ）を計量した。４０℃および高真空下において、この物質をトルエン（２×１００ｍＬ）と共に共蒸発させた。還流冷却器をフラスコに取り付け、アルゴン下で出発材料をトルエン（容量：５００ｍｌ）に溶解した。水素化ナトリウム（２１．８６ｇ、５４７ｍｍｏｌ）を約５ｇずつ添加して、灰色の懸濁液を得た。混合物を３０分間かけて６０℃に加熱し、次いで氷浴で室温に冷却した。１−クロロ−４−（クロロメチル）ベンゼン（６６．０ｇ、４１０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら約１５ｇずつ添加した。混合物を加熱し、還流して一晩撹拌した。
【００５６】
反応混合物を０℃に冷却し、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈した。ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）を徐々に添加することによって混合物をクエンチして、泡立ちを最小限にした。ＥｔＯＡｃで混合物を１．５Ｌにさらに希釈し、１０％Ｎａ２ＣＯ３（２×５００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１×５００ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機物を乾燥させ、ろ過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、粗製の生成物（crude product）を精製した。０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出した。回収した純粋な画分を合わせて、琥珀色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（４、６２．１５ｇ、７０％）を得た。
【００５７】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（５）  
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（４、６５ｇ、１００ｍｍｏｌ）を６００ｍＬのＤＣＭに溶解して、黄色の溶液を得た。アルゴン下で混合物を０℃に冷却した。溶液が透明な暗褐色の溶液に変化する間に、塩化スズ（ＩＶ）（１５０ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を１０分間かけて徐々に添加した。反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら４℃で一晩保存した。
【００５８】
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で反応混合物を希釈し、４Ｌ分液漏斗中の５００ｍＬの脱イオン水に添加した。混合物を激しく振盪し、分離した。すべての有機物およびエマルジョン／沈殿物を保持し、第２のアリコートの水５００ｍＬで洗浄した。すべての有機物およびエマルジョン／沈殿物を保持し、５００ｍＬの１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。ＭｅＯＨの添加および機械的撹拌によって、エマルジョンを減少させた。すべての有機物およびエマルジョン／沈殿物を保持し、最後に５００ｍＬのブラインで洗浄した。再度、ＭｅＯＨの添加および機械的撹拌によって、エマルジョンを減少させた。有機相を取り出し、ＭｇＳＯ４懸濁液で乾燥した。さらなるＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で残りのエマルジョンおよび水相を抽出し、これをＭｇＳＯ４懸濁液と合わせた。有機相をろ過し、褐色の油状物質に濃縮した。０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗製の生成物を精製した。回収した純粋な画分を合わせて、琥珀色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（５、４１．２０ｇ、７８％）を得た。
【００５９】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド（６）  
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（５、４１．００ｇ、７８ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＰＯ（１．２１５ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（容量：２５０ｍｌ）に溶解して、オレンジ色の溶液を得た。ヨードベンゼンジアセテート（３７．６ｇ、１１７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。
【００６０】
ＤＣＭで反応混合物を５００ｍＬに希釈し、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（２×３００ｍＬ）およびブライン（１×３００ｍＬ）で洗浄した。ＭｇＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮した。オレンジ色の残留物を５０℃の高真空下で３時間乾燥した。琥珀色の油状物質である粗製のメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド（６、４０．５０、「９９％」）をそのまま次の反応に使用した。
【００６１】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド（７）  
２０００ｍＬ丸底フラスコにおいて、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（６、２６．６ｇ、７５ｍｍｏｌ）をエーテル（比：２０．００、容量：１５００ｍｌ）に懸濁して、白色の懸濁液を得た。アルゴンでフラスコをフラッシュし、氷浴中で０℃に冷却した。ナトリウムｔ−ペンタオキシド（７．３９ｇ、６７ｍｍｏｌ）をベンゼン（比：１．０００、容量：７５ｍｌ）に溶解し、懸濁液に一度に添加した。アルゴンでフラスコを再度フラッシュし、２時間かけて室温にした。懸濁液をさらに４時間撹拌した。次いで、アセトン／ドライアイス浴中で懸濁液を−７２℃に冷却した。メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド（１９．５６ｇ、３７．２５ｍｍｏｌ）をさらなるエーテル（比：１．０６７，容量：４０ｍｌ）に溶解した。シリンジを介して炭水化物溶液を添加し、反応混合物を４℃で１７時間撹拌した。
【００６２】
ＴＬＣにより、反応が完了したことが明らかになった（１５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）。飽和ＮＨ４Ｃｌ（２×５００ｍＬ）およびブライン（１×２５０ｍＬ）で反応混合物を洗浄した。エーテル（１５０ｍＬ）で水相を逆抽出した。有機相を合わせ、ブラインの洗浄（１×２５０ｍＬ）およびＮａ２ＳＯ４の添加によって乾燥した。有機相をろ過し、濃縮した。ヘキサン中０〜２０％ＥｔＯＡｃ勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、精製を行った。純粋な画分を合わせ、濃縮乾固して、無色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド（７、１４．７９ｇ、２８．３ｍｍｏｌ、収率７６％）を得た。
【００６３】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８）  
アルゴン下で、９−ＢＢＮ（８．９７ｇ、７３．５ｍｍｏｌ）をメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド（７、２８．５０ｇ、５４．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３００ｍｌ）溶液に室温で添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した後、ＴＬＣにより、すべての出発
物質が消費されたことが明らかになった。
【００６４】
過ホウ酸ナトリウム四水和物（３３．９ｇ、２２１ｍｍｏｌ）および水（８０ｍＬ）を添加し、混合物を室温でさらに２時間撹拌した。有機層を分離し、水性部分を４００ｍＬに希釈し、次いで、酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、０〜６０％の酢酸エチル／ヘキサン勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。精製した画分を合わせ、濃縮乾固して、無色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８、２６．３９ｇ、４８．８ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。
【００６５】
メチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０）  
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８、２６．３０ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）をアルゴン下でピリジン（２００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。ＤＭＴｒ−Ｃｌ（２０．５８ｇ、６０．８ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に一度に添加した。反応混合物を一晩撹拌した。５０ｍＬのＭｅＯＨを添加して２０分間撹拌することによって、トリチル化反応をクエンチし、続いてＥｔＯＡｃで混合物を７５０ｍＬに希釈した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×３５０ｍＬ）およびブライン（１×１５０ｍＬ）で有機相を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。
【００６６】
粗製の生成物（９ａ）をＴＨＦ（容量：７０ｍｌ）に溶解した。１．０Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（７２．９ｍｌ、７２．９ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、それを室温で１．５時間撹拌した。ＴＢＡＦを添加することにより、くすんだ暗色の溶液を得た。混合物を濃縮乾固し、３％ＴＥＡのヘキサン溶液で前処理した３３０ｇ  ＩＳＣＯシリカカラムにアプライした。１００ｍＬ／分で５０分間かけてヘキサン中０〜６０％ＥｔＯＡｃ勾配で生成物を溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、無色の油状物質としてメチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０、２７．１７ｇ、４４．９ｍｍｏｌ、収率９２％）を得た。
【００６７】
メチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４モノメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０ｂ）  
２５０ｍＬ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８、１．８２ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）をピリジン（２５ｍｌ）にアルゴン下で溶解して、無色の溶液を得た。ＭＭＴｒ−Ｃｌ（１．３０ｇ、４．２０ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に一度に添加した。反応混合物を一晩撹拌した。５０ｍＬのＭｅＯＨを２０分間撹拌しながら添加することによって、トリチル化反応をクエンチし、これに続いて、ＥｔＯＡｃで混合物を１５０ｍＬに希釈した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×７５ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で有機相を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。
【００６８】
粗製の生成物（９ｂ）をＴＨＦ（容量：１０ｍｌ）に溶解した。１．０Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（５．０ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、それを室温で１．５時間撹拌した。ＴＢＡＦを添加することにより、くすんだ暗色の溶液を得た。混合物を濃縮乾固し、３％ＴＥＡヘキサン溶液で前処理した１００ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰシリカカラムにアプライした。５０ｍＬ／分で３０分間かけてヘキサン中０〜６０％ＥｔＯＡｃ勾配で生成物を溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、無色の油状物質としてメチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４−モノメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０ｂ、１．７４ｇ、３．０２ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。
【００６９】
メチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１１）  
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０ａ、２７．１５ｇ、４４．９ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（２７．８ｇ、１３５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１６６ｍｌ、２３３３ｍｍｏｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。４０ｍＬのＤＭＳＯ中でピリジン（５．４４ｍｌ、６７．３ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（１．７２８ｍｌ、２２．４３ｍｍｏｌ）を合わせ、得られた溶液を反応混合物に添加した。フラスコに蓋をし、室温で一晩撹拌した。
【００７０】
水（２５ｍＬ）を添加し、反応物を室温で３時間撹拌した。５００ｍＬのＥｔＯＡｃで反応物を希釈し、ろ過した。さらに２００ｍＬのＥｔＯＡｃで沈殿物を洗浄した。合わせた有機物をブライン（５×４００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてメチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１１ａ、２５．２２ｇ、４１．８ｍｍｏｌ、収率９３％）を得た。
【００７１】
メチル４−Ｃ−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１２）  
２Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１１ａ、２５．２０ｇ、４１．８ｍｍｏｌ）をジオキサン（１０００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。ホルムアルデヒド（２４９ｍｌ、３３４３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。氷浴中で反応混合物を０℃に冷却した。７５０ｍＬ圧力均等化滴下漏斗をフラスコに取り付け、２．０Ｍ水酸化ナトリウム（６０６ｍｌ、１２１２ｍｍｏｌ）を３０分間かけて添加して、濁った白色の溶液を得た。混合物を４２時間かけて室温になるまで撹拌した。溶液は透明に変化した。第一リン酸ナトリウム一水和物（８６ｇ、６２７ｍｍｏｌ）を添加することによって、この溶液を中和した。この溶液をその体積の約１／３に濃縮し、５００ｍＬの水で希釈し、ＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブライン（１×３００ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、０〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。精製した画分を合わせ、濃縮乾固して、無色の油状物質としてメチル４−Ｃ−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１２ａ、２２．５０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
【００７２】
メチル５−Ｏ−メシル−４−Ｃ−（メシルオキシメチル）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（ヒドロキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１４）  
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル４−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１２ａ、２２．５０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）をＡｒ下でピリジン（２００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。氷浴中で混合物を０℃に冷却した。メシル−Ｃｌ（８．２８ｍｌ、１０６ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に１０分間かけて滴下添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、２０分間撹拌しながら水１５ｍＬを添加することによって、メシル化反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃで混合物を７５０ｍＬに希釈し、ブライン（３×４００ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。
【００７３】
粗製の生成物（１３ａ）を８００ｍＬのＡｃＯＨに溶解した。水（２００ｍＬ）を撹拌溶液に添加した。この溶液を室温で２．５時間撹拌し、次いで、５００ｍＬの水で希釈した。混合物を約４００ｍＬに濃縮し、さらに２５０ｍＬの水で希釈した。次いで、この溶液を高真空下で濃縮乾固した。残留物を２２０ｇ  ＩＳＣＯシリカカラムにアプライし、０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、無色の油状物質としてメチル５−Ｏ−メシル−４−Ｃ−（メシルオキシメチル）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（ヒドロキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１４、１０．０１ｇ、２０．４７ｍｍｏｌ、収率５７．８％）を得た。
【００７４】
あるいは、粗製の生成物（１３ｂ）（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−メトキシ−４−（（４−モノメトキシトリチルオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１．６０ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにアセトニトリルを充填し、炭水化物が完全に溶解するまで撹拌する。水、これに続いて硝酸セリウムアンモニウム（０．１１５ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に添加した。混合物に蓋をし、１時間６０℃に加熱した。溶液を室温に冷却し、ブライン溶液（５００ｍＬ）に注ぐ。水相を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮する。得られた材料を５０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰシリカゲルカラムにアプライし、０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出する。純粋な画分を合わせ、濃縮して、無色の油状物質として、メチル５−Ｏ−メシル−４−Ｃ−（メシルオキシメチル）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（ヒドロキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１４、０．９４ｇ、９１．５％）を得た。
【００７５】
（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１６）  
撹拌棒を有する１００ｍＬ丸底フラスコに、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−メトキシテトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（３．４１ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）をに計量して入れ、セプタムで密封した。フラスコを０℃に冷却し、ピリジン（容量：２５ｍｌ）および無水酢酸（１．３１６ｍｌ、１３．９５ｍｍｏｌ）を充填した。混合物を６時間かけて室温にした。混合物を０℃に冷却し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、１５分間撹拌した。混合物を濃縮乾固し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解した。１％ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で有機相を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮した。
【００７６】
１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、得られた油状物質を酢酸（９．９８ｍｌ、１７４ｍｍｏｌ）および無水酢酸（２．６３ｍｌ、２７．９ｍｍｏｌ）で再溶解した。Ｈ２ＳＯ４（０．０３７ｍｌ、０．６９７ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをセプタムで密封し、混合物を一晩撹拌した。水（１００ｍＬ）で混合物を希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×７５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で慎重に洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮して、淡黄色の油状物質として３．１５ｇの粗製の（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（３．１５ｇ、５．６４ｍｍｏｌ、収率８１％）を得、これをさらに精製せずに使用した。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ６１７  （Ｍ  ＋  アセテート）−
【００７７】
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１７）  
Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（４．０７ｍｌ、１６．６４ｍｍｏｌ）を（（３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（３．１０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）およびチミン（０．８７４ｇ、６．９３ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２０ｍｌ）中の混合物に添加した。反応混合物を１時間還流して、透明な溶液を得た。この溶液を４０℃に冷却し、ＴＭＳ−ＯＴｆ（１．３０３ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を６０℃で４時間加熱した。この溶液を室温に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮し、標準的なＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ勾配（０〜１０％ｖ／ｖ  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、白色の固体物質として（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（２．８４ｇ、４．５４ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：  ６２４  （Ｍ）−
【００７８】
（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１９）  
撹拌棒を取り付けた１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（２．８４ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）をメタノール（容量：２０ｍｌ）に溶解した。ナトリウムメトキシド（０．１２３ｇ、２．２７２ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコに蓋をし、室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）により、反応が完了したことが明らかになった。反応混合物を真空下で蒸発乾固し、３ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓａｍｐｌｅｔに直接アプライし、これを２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに取り付けた。４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配で生成物を溶出して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２．３２ｇ、３．９８ｍｍｏｌ、収率８８％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５８２  （Ｍ）−
【００７９】
（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（チミジン−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２０）  
（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１．０ｇ、１．７１５ｍｍｏｌ）およびピリジン（１０ｍｌ）の混合物に、ＴＭＳ−Ｃｌ（０．２１９ｍｌ、１．７１５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。１時間撹拌した後、反応混合物を０℃に冷却し、シリンジによって塩化ベンゾイル（０．１９９ｍｌ、１．７１５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。次いで、氷浴を取り除き、反応混合物を室温で４８時間撹拌した。水（２ｍＬ）を添加することによって、反応をクエンチした、室温で１５分間撹拌した後、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で混合物を希釈し、５％ＨＣｌ水溶液（２×２５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１×２５ｍＬ）およびブライン（１×２５ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮乾固した。最小限のＤＣＭを含む３ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓａｍｐｌｅｔに残留物をアプライし、次いでこれを２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに取り付けた。４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配で所望の生成物を溶出して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（０．８７ｇ、１．２６６ｍｍｏｌ、収率７３．８％）を得た。
【００８０】
チミジンのＮ−ベンゾイル保護はジアステレオマー混合物をもたらし、３：２の比で２つのＣ−５メチルシングレットおよび２つのＣ−６プロトンシングレットを生じさせる。αアノマーの場合：
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ７．８９  （ｓ，  １Ｈ，  ジアステレオマー  １），  ７．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ，  ジアステレオマー  ２），  ７．６７  −  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６０  −  ７．３９  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．３９  −  ７．１７  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６７  −  ４．４６  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．４２  −  ４．２６  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．８７  −  ３．７３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．９８  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．８２  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．０３  （ｓ，  ３Ｈ，  ジアステレオマー  １），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ，  ジアステレオマー（ｄｉａｓｔｅｒｏｍｅｒ）  ２）．
【００８１】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２１）  
撹拌棒を取り付けた２０ｍＬシンチレーションバイアルにおいて、（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（３−ベンゾイル−チミジン−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（０．２５ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）、（２，２，２−トリフルオロエチル）−ｔｅｒｔ−ブチル−イミノジカーボネート（０．０８８ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．０９５ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）を計量した。ＴＨＦ（容量：４ｍｌ）をバイアルに充填し、ＴＨＦ中の１．０Ｍ  ＤＩＡＤ溶液（０．３６４ｍｌ、０．３６４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。一晩撹拌した後、反応混合物を真空下で濃縮乾固し、２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライした。４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（０．２２８ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、収率６８．７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ７．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１５  （ｓ，  １Ｈ），  ５．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４９  （ｑｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  ３．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４１  −  ４．２４  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．２０  −  ３．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９８  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９７  （ｓ，  ４Ｈ），  １．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４６  （ｓ，  ９Ｈ）．    ＥＳＩ−ＭＳ：  ９７１  （Ｍ  ＋  アセテート）−
【００８２】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２２）  
２０ｍＬスクリューキャップシンチレーションバイアルにおいて、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１２５ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を磁気撹拌棒と共に計量した。ＴＨＦ（容量：１．５ｍｌ）および２．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（１．５０７ｍｌ、３．０１ｍｍｏｌ）をバイアルに充填し、蓋をし、室温で一晩撹拌した。ＥｔＯＡｃ（７ｍＬ）で反応混合物を希釈し、飽和重炭酸ナトリウム（１×５ｍＬ）およびブライン（１×５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し真空下で濃縮して、灰白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（８０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、収率８６％）（これは十分に純粋であり、精製せずに次の反応に使用した）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ８．６１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．０４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７４  −  ４．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４０  −  ４．２３  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．００  −  ３．８９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．６，  ６．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．１７  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  １４．３，  ８．４，  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．０９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．３２  （ｓ，  ９Ｈ）．    ＥＳＩ−ＭＳ：  ６８１  （Ｍ）−
【００８３】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２３）  
１０ｍＬコニカル反応バイアルにおいて、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（６０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７ｍｌ）に溶解した。水素化ナトリウムの６０％油懸濁液（１２．２１ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）を一度にバイアルに添加し、撹拌棒およびテフロン（登録商標）ライニングセプタムスクリューキャップをバイアルに取り付け、混合物を５５℃で一晩撹拌した。反応物を室温に冷却し、撹拌しながら数滴のＭｅＯＨを添加してクエンチした。ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で混合物を希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮して、黄褐色の泡状物質を得、これを最小量のＤＣＭに溶解し、１０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに取り付けた１ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓａｍｐｌｅｔにアプライした。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出して、白色の泡状物質として（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（３５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ、収率７８％）を得た。
【００８４】
環化は３：２のＮ−ジアステレオマー混合物をもたらし、これは、ＴＬＣ／カラムクロマトグラフィーによって分離不可能であった。このマイナージアステレオマーの存在は、（＊）によって示されるいくつかの別個のシグナルを生じさせた。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ８．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５９＊  （ｓ），  ７．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５８＊  （ｓ），  ７．４０  −  ７．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ５．８０＊  （ｓ），  ５．７９  （ｓ，  １Ｈ），  ４．６６  −  ４．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．４４  −  ４．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０９  −  ３．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６１＊  （ｄ，  Ｊ＝１２．６  Ｈｚ），  ３．３６  −  ３．１０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．８１＊  （ｓ），  ２．７０  （ｓ，  １Ｈ），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４６  （ｓ，  ９Ｈ），  １．４４＊  （ｓ）．    ＥＳＩ−ＭＳ：  ５８５  （Ｍ）−
【００８５】
１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−チミジン（２４）  
１０ｍＬガラス反応バイアルにおいて、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（３５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）および安息香酸ナトリウム（１７．２１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。撹拌棒をバイアルに取り付け、テフロン（登録商標）ライニングスクリューキャップセプタムで密封した。油浴中で混合物を一晩かけて１０５℃に加熱した。すべての要素が溶液を生じさせた。油浴からバイアルを取り出し、ＴＬＣによって反応の完了を評価する（asses）ために１０μＬを取り出した。冷却すると直ぐに白色の結晶が形成し始めた。ＴＬＣにより、反応が５０％しか完了していないことが明らかになったため、さらなる安息香酸ナトリウム（１７．２１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦと共に添加し、撹拌した。混合物をさらに４８時間かけて１０５℃に加熱し、ＴＬＣ分析のためにアリコートを定期的に取り出した。２日間かけて１０５℃に加熱した後であっても、厚い沈殿物は溶液を十分に生じさせなかったが、反応は、検出可能な分解を伴わずに完了した。
【００８６】
反応混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、水（２×１０ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（１×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。残留物をＭｅＯＨ（２ｍｌ）に再溶解し、ナトリウムメトキシド（６．４５ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を一度に添加した。混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応が完了したことが明らかになり、混合物を濃縮乾固した。得られた残留物を１ｍＬの１：１  ＤＣＭ／ＴＦＡに再溶解し、室温で３０分間撹拌した。混合物を濃縮乾固し、最小量のＤＣＭを使用して４ｇ  ＲｅｄｉＳｅｐ  Ｒｆシリカカラムにアプライした。３％ＴＥＡを含有する０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配で生成物を溶出した。生成物画分を合わせ、濃縮乾固した。得られた白色の粉末をＤＣＭ（３ｍＬ）に再溶解し、飽和重炭酸塩溶液（１×５ｍＬ）で洗浄した。７０／３０クロロホルム／イソプロパノール（２×５ｍＬ）で水性画分を逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、白色の粉末として１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−チミジン（１７ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、収率６９．８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  アセトニトリル−ｄ３）  δ  ８．０５  （ｑ，  Ｊ  ＝  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３６  （ｓ，  ４Ｈ），  ５．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ４．５２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３８．６，  １１．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３３．９，  １２．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．７５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．０，  ３．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．５７  −  ２．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．９８  −  １．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．１  Ｈｚ，  ３Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （１０１  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  １６５．０１，  １５１．２２，  １３８．０７，  １３６．９８，  １３３．７２，  １３０．０５，  １２９．２３，  １０９．１９，  ８７．４２，  ８５．０４，  ７３．０６，  ７１．３８，  ６１．０４，  ４５．８５，  ４３．６０，  ４１．５８，  １２．７１．
【００８７】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２５）  
撹拌棒を備える１００ｍＬ丸底フラスコに、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（１．０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）および安息香酸ナトリウム（０．６３ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を計量して入れた。ＤＭＦ（１０ｍＬ）をフラスコに充填し、セプタムで密封し、４０時間かけて１００℃に加熱した。ＴＬＣ（６５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）により、反応が完了したことが示された。飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）で混合物を希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して黄褐色の固体を得、これをジオキサン（２０ｍＬ）および２Ｍ  ＮａＯＨ（３ｍＬ）の混合物に溶解した。混合物を一晩かけて５０℃に加温した。反応混合物を真空下で固体に濃縮し、５０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰシリカカラムにアプライし、７カラム容量のヘキサン中５０〜１００％ＥｔＯＡｃ勾配を使用して溶出し、７カラム容量の１００％ＥｔＯＡｃで保持した。生成物を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮して、白色の泡状物質として（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（ヒドロキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．６３ｇ、１．２４ｍｍｏｌ、８４．６％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５０６  （Ｍ）−
【００８８】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（２６）  
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（ヒドロキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．６ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をエタノール（２５ｍＬ）に溶解し、５００ｍＬ  Ｐａｒｒ水素化容器に移した。パールマン触媒（０．３５ｇ）および１滴の氷酢酸を一度に添加し、水素雰囲気（４０ｐｓｉ）下、Ｐａｒｒ水添器上で混合物を４時間振盪した。ＴＬＣにより、反応がスポットごとに完了したことが示された（５％メタノールのＤＣＭ溶液）。数容量のメタノールで予め洗浄したセライトベッドに混合物を通して慎重にろ過した。酢酸エチル（１００ｍＬ）およびエタノール（１００ｍＬ）でセライトベッドを洗浄した。ろ液を真空下で約５ｍＬに濃縮し、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアルに移した。この物質を真空下で乾固して、灰白色の粉末としてｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−７−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（５４）を得、これをさらに精製せずに使用した。
【００８９】
マイクロ撹拌棒をガラスシンチレーションバイアルに取り付け、ジクロロメタン（２ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を充填した。バイアルを密封し、３０分間撹拌した。マイクロ撹拌棒を取り除き、揮発物を真空下で除去した。得られた油状物質をトルエン（２×４ｍＬ）、メタノール（１×４ｍＬ）およびＤＣＭ（２×４ｍＬ）と共に共蒸発させて、バイアル中に灰白色の粉末／残留物を得た。残留物をメタノール（５ｍＬ）に再溶解し、マイクロ撹拌棒をシンチレーションバイアルに入れた。トリフルオロ酢酸エチル（２．００ｍＬ、１６．９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．４１０ｍＬ、３．５４ｍｍｏｌ）を添加し、バイアルを密封し、混合物を一晩撹拌した。２０時間後、混合物のＴＬＣにより、出発材料が完全に消費され、新たな生成物が形成されたことが示された。揮発物を真空下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（２×５ｍＬ）およびトルエン（２×５ｍＬ）と共に共蒸発させて、次のトリチル化工程に直接使用するための（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（０．３０ｇ、７９．８％）を得た。粗物質の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、約５５：４５の比のジアステレオマー混合物が形成されたことが示された（アノマーシグナルの積分による）。
【００９０】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（２７）  
５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）  
５０ｍＬ丸底フラスコにおいて、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（０．２８ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×１０ｍＬ）と共に共蒸発させた。無水ピリジン（７ｍＬ）をフラスコに充填し、ＤＭＴｒ−Ｃｌをこの溶液に一度に添加した。フラスコを密封し、混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣにより、すべての出発材料が消費されたことが明らかになった（９５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘまたは５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。メタノール（０．５ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌し続け、続いて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）を添加することによって、反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で水相を抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して、黄褐色の泡状物質を得た。この固体を最小量のＤＣＭに溶解し、６０ｍＬの２５％ＴＥＡのヘキサン溶液で前処理し、２００ｍＬの３０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘで平衡化した５０ｇ  ＢｉｏｔａｇｅシリカＳＮＡＰカラムにアプライした。１０カラム容量のヘキサン中３０〜１００％ＥｔＯＡｃ勾配と、それに続く４カラム容量の１００％ＥｔＯＡｃで生成物をカラムから溶出した。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−（Ｎ−ｔｆａ）−アミノＣＢＢＮを得た。１Ｈおよび１９Ｆ  ＮＭＲは両方とも、２つの異なるジアステレオマーを示している。１Ｈ  ＮＭＲ表のアスタリスクは、ジアステレオマープロトンが約５５：４５の比で分離されるピークを示す。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ７．７２＊  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６８＊  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４９  −  ７．３８  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３５  −  ７．２０  （ｍ，  １４Ｈ），  ６．９３  −  ６．７８  （ｍ，  ８Ｈ），  ５．７３＊  （ｓ，  １Ｈ），  ５．６８＊  （ｓ，  １Ｈ），  ４．５５  −  ４．３６  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．０５＊  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０１＊  （ｓ，２Ｈ），  ３．９４  −  ３．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７９  （ｑ，  Ｊ  ＝  ０．７  Ｈｚ，  １３Ｈ），  ３．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  １２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５７  −  ３．３８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３８  −  ３．１５  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７０＊  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．６５＊  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．４７＊  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４１＊  （ｓ，  ３Ｈ），  １．２８  （ｂｓ，  ２Ｈ）．    １９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ｃｄｃｌ３）  δ  −６８．６１，  −６８．９０．
ＥＳＩ  ＭＳ：  ６８０  （Ｍ）−
【００９１】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（チミジン−イル）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６，８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２８）  
５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）アミダイト  
撹拌棒を取り付けた１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）（０．３２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を計量した。ジクロロメタン（７ｍＬ）をフラスコに充填し、撹拌した。２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２８３ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）をシリンジに計量し、この溶液に一度に添加し、続いて４，５−ジシアノイミダゾール（５５．４４ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをセプタムで直ぐに密封し、一晩撹拌した。プロセスでは、２０時間の時点のＴＬＣにより、わずかに微量の出発材料と、生じた２つの新たなスポット（これらはトリチルポジティブであり、５％メタノール／ＤＣＭ  ｗ／ＵＶ可視化による展開後にＨａｎｅｓｓｉａｎ染色で処理すると、開始ヌクレオシドと同様に炭化が生じた）が存在していることが明らかになった。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を添加することによって、反応をクエンチした。酢酸エチル（４×２０ｍＬ）で水相を抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×２０ｍＬ）で抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、ろ過し、濃縮して、無色の油状物質を得た。粗製の生成物を最小量のＤＣＭに溶解し、６０ｍＬの２５％ＴＥＡのヘキサン溶液で前処理し、１５０ｍＬの３０％酢酸エチル／ヘキサンで平衡化した５０ｇ  ＢｉｏｔａｇｅシリカＳＮＡＰカラムにアプライした。１０カラム容量のヘキサン中３０〜１００％ＥｔＯＡｃ勾配と、それに続く４カラム容量の１００％ＥｔＯＡｃで生成物をカラムから溶出した。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−（Ｎ−ｔｆａ）−アミノＣＢＢＮを得た。３１Ｐおよび１Ｈ  ＮＭＲは、予想通り、４つの異なる生成物の存在を示しており、これらはそれぞれ、環状アミンのｔｆａ保護およびホスフィチル化反応から生じる別個の立体異性体に対応する。
３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  １５０．０３，  １４９．９７，  １４７．４６．１：１：２の相対強度。  １９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  −６９．３０，  −６９．３１，  −６９．４７，  −６９．４７．
ＥＳＩ  ＭＳ：  ９０４．８  （Ｍ  ＋  Ｎａ＋）＋
【００９２】
実施例２：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの生成
本実施例は、異なる核酸塩基を用いた２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの生成のための主要中間体の合成について記載する（図２Ａ〜２Ｃを参照のこと）。
【００９３】
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（図２Ａ）  
Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（４．０７ｍｌ、１６．６４ｍｍｏｌ）を、（（３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（３．１０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）およびチミン（０．８７４ｇ、６．９３ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２０ｍｌ）中の混合物に添加した。反応混合物を１時間還流して、透明な溶液を得た。この溶液を４０℃に冷却し、ＴＭＳ−ＯＴｆ（１．３０３ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を６０℃で４時間加熱した。この溶液を室温に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、標準的なＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ勾配（０〜１０％ｖ／ｖ  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、白色の固体物質として（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（２．８４ｇ、４．５４ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：６２４（Ｍ）−
【００９４】
粗物質のＮＭＲにより、相対積分値が０．１０：１．００である、メジャーアノマーシグナルおよびマイナーアノマーシグナルが明らかになった。
アノマーピークの１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ６．５４（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、マイナー）、６．０４（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、メジャー）
【００９５】
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（２９）  
Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１．０９ｇ、１．３１ｍｌ、５．３７ｍｍｏｌ）を、（（３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１．００ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）およびＮ６−ベンゾイルアデニン（０．６４０ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１５ｍｌ）中の混合物に添加した。反応混合物を１時間還流した。溶液を４０℃に冷却し、ＴＭＳ−ＯＴｆ（０．６０ｇ、０．４９ｍｌ、２．６８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４時間還流した。溶液を室温に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、標準的なＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ勾配（０〜１０％ｖ／ｖ  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、白色の固体物質として、（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（０．９５ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、収率７２％）を得た。任意の感知できるほどの量の分離可能なヌクレオシド副生成物は存在しなかった。
【００９６】
｛（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−［（９Ｒ）−９ａ−ベンゾイル−９−アデニンイル］−８−（４−クロロベンジルオキシ）−３．６−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタ−５−イル｝メチルベンゾエート（３０）  
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（０．７０ｇ、ｍｍｏｌ）を計量して、マイクロ撹拌棒を有する２０ｍＬガラスシンチレーションバイアルに入れた。バイアルにＴＨＦ（５ｍＬ）およびＬｉＯＨ水溶液（０．４７ｍＬ、１．０Ｍ）を充填した。次いで混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣは、Ｎ−ベンゾイル基が元のまま残り、脱アセチル化が生じたことを示した。反応物を水（７ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×５ｍＬ）。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し（１×５ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して、白色の泡状物質を得、これを粗製のまま使用した。
【００９７】
撹拌棒を取り付けた１０ｍＬコニカル反応バイアルに固体を移し、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。水素化ナトリウムを一度にバイアルに添加した。バイアルをセプタムで密閉し、５５℃で４時間撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを示した。炭酸水素ナトリウム溶液を冷却反応混合物（３ｍＬ）に慎重に添加することによって、反応をクエンチした。混合物を水で１０ｍＬにさらに希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×５ｍＬ）。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し（１×５ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して、灰白色／黄褐色泡状物質を得、これを粗製のまま使用した。
【００９８】
粗製の固体を、撹拌棒を取り付けた２０ｍＬシンチレーションバイアルに移した。安息香酸ナトリウムをこのバイアルに添加し、次いでＤＭＦ（５ｍＬ）を充填した。バイアルを密閉し、連続的に撹拌しながら、油浴中で１１０℃に加熱した。３０分後、混合物は高粘度のスラリーになった。この混合物を一晩撹拌し続けた。ＴＬＣは、反応が完了したことを示している。冷却すると、混合物は高粘度のゲルとなり、これを、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３０ｍＬ）および酢酸エチル（１０ｍＬ）に分配した。水相を酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して、灰白色／黄褐色泡状物質を得、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配３０％〜１００％）を介してこれをさらに精製して、｛（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−［（９Ｒ）−９ａ−ベンゾイル−９−アデニンイル］−８−（４−クロロベンジルオキシ）−３．６−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタ−５−イル｝メチルベンゾエート（０．４８ｇ、０．７７ｍｍｏｌ、８０．５％）を得た。
【００９９】
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−イソブチリルグアノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（３１）  
Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１．０９ｇ、１．３１ｍｌ、５．３７ｍｍｏｌ）を、（（３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１．００ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）およびＮ２−イソブチリルグアニン（０．５９ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１５ｍｌ）中の混合物に添加した。反応混合物を１時間還流した。溶液を４０℃に冷却し、ＴＭＳ−ＯＴｆ（０．６０ｇ、０．４９ｍｌ、２．６８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４時間還流した。溶液を室温に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、残留物を標準的なＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ勾配（０〜１０％ｖ／ｖ  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の固体物質としてβ−９−Ｎ−グアノシニルアノマー（０．６７ｇ、０．９３ｍｍｏｌ、収率５２％）およびβ−７−Ｎグアノシニルアノマー（０．１７ｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１３．２％）を得た。
【０１００】
粗製のグリコシル化のＮＭＲ分析により、７５：１７：８比の１つのメジャーアノマーピークおよび２つのマイナーアノマーピークが明らかになった。β−Ｎ９、β−Ｎ７およびα−Ｎ９アノマーにそれぞれ関連するアノマーピークの１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ６．３０（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）マイナー８％、６．１４（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ）マイナー１７％、５．９８（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）メジャー７５％。
【０１０１】
１−［（９Ｓ）−９−｛（１Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−（４−クロロベンジルオキシ）−５−［（メチルスルホニルオキシ）メチル］−３．６−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタ−７−イル｝−６−オキソ−１，９−ジヒドロプリン−２−イルアミノ］−２−メチル−１−プロパノン（３４）（３４）  
化合物３１：３２を８２：１８比で有する２５ｍｇの粗製のグリコシル化生成物を計量して、撹拌棒を有する４ｍＬガラスバイアルに入れた。バイアルにＴＨＦ（１ｍＬ）を充填し、６０％  ＮａＨ分散液（４．５ｍｇｓ）を添加した。バイアルを密閉し、４時間撹拌しながら油浴で５５℃に加熱した。反応が完了するまで、ＴＬＣを介してＲｘｎをモニターした。粗製の反応混合物に数滴の水を添加することによって、混合物をクエンチした。水（約７ｍＬ）および酢酸エチル（約７ｍＬ）を有する２０ｍＬシンチレーションバイアルに混合物を移した。水相をさらに酢酸エチル（２×５ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、ブライン（１×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して、黄褐色の泡状物質として粗製の環化混合物（１２ｍｇ）を得た。混合物をＣＤＣｌ３に溶解し、１Ｈ  ＮＭＲを施し、これによって、メジャーアノマーピークとマイナーアノマーピークの両方が８２：１８比で一重線に変化したことから、主要不純物がＮ７−アノマーであることを確認した。ｉｂｕ−メチルピークも残留し、これによって、環化反応が（ｉｂｕ）Ｇ−グリコシル化分子と適合性のあることが確認された。
【０１０２】
実施例３：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの合成
一般的な合成方法
修飾ヌクレオシドを合成し、適切な反応性基で遊離５’および３’−ヒドロキシル基をマスクしてヌクレオチドモノマーにしたら、糖および塩基修飾を有するオリゴヌクレオチドの短鎖を調製し得る。例えば、ホスホルアミダイト化学を使用する自動固相合成を使用し得る（ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４：２４５〜２４８（１９８３）およびＳｉｎｈａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４：５８４３〜５８４６（１９８３）を参照のこと）。ホスホルアミダイト化学は、オリゴヌクレオチド化学におけるそれらの使用に関して、ホスホン酸水素化学などの関連方法と共に広く概説されている（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３〜２３１１（１９９２）を参照のこと）。固相オリゴヌクレオチド合成では、一連のヌクレオチドモノマーを、それらのホスホルアミダイト誘導体を介して、所定の順序で、鎖伸長の方向に応じて、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の５’官能基または３’−官能基のいずれかに逐次に結合させる。
【０１０３】
オリゴヌクレオチド鎖を、孔制御ガラスまたはポリスチレン樹脂ビーズなどの不溶性部分にアンカリングする。各モノマーの結合方法は、一般に、以下の工程１〜５から構成される。工程１は、反応性官能基の保護を含む。一般的な反応性官能基は、末端ヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基である。通常、酸処理によって除去され得る４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）部分でこの官能基を保護する。ＤＭＴ部分の特徴の１つは、酸脱保護中に、それが明るいオレンジ色のＤＭＴカチオンを形成することである。このカチオンはレポーター基として有効に機能し、先のカップリング工程の完全性を判断するために、４８０〜５００ｎｍの波長でモニタリングすることができる。ほとんどの市販の自動合成機は、放出されたＤＭＴカチオンをモニタリングする能力を有する。このデータは、合成が任意の所与の工程で失敗したか否かについての指標を操作者に瞬時に与える。工程２は、ホスホルアミダイト誘導体および活性化剤の添加によるカップリングを含む。ホスホルアミダイト誘導体は、通常、ヌクレオシドホスホルアミダイトである。しかしながら、それはまた、異なる有機部分で誘導体化されたホスホルアミダイトであり得る。工程３は、未反応の末端官能基のキャッピングを含む。この工程は、さらなるカップリングを防止する不活性保護基を失敗配列に導入する。工程４は、新たに形成された亜リン酸ヌクレオチド（phosphorous nucleotide）骨格結合の、三価のホスファイトから安定性の五価状態への酸化を含む。この酸化工程は、リン酸ヌクレオチド（phosphate nucleotide）をもたらす酸素系酸化剤、またはホスホロチオエートヌクレオチドをもたらす加硫酸化剤（sulfurizing oxidant）のいずれかを用いて実施され得る。工程５は、洗浄工程後にこのプロセスを繰り返すことを含む。
【０１０４】
ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システム（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）において、ヒトｍｉＲ−２０８ａのヌクレオチド配列に相補的な短縮型１６ヌクレオチド配列を１μｍｏｌスケールで合成した。当業者に公知の標準的な脱トリチル化、活性化剤およびキャッピング溶液を使用して、合成機を操作した。各デオキシヌクレオチドアミダイトについては４２０秒間のシングルカップリング、ＬＮＡアミダイトについては合計９００秒間継続するダブルカップリング、および新規ヌクレオシドアミダイト（例えば、ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）アミダイト）については合計１８００秒間継続するトリプルカップリングを使用して、オリゴヌクレオチド鎖の伸長に影響を与えた。各カップリングサイクル後、０．０２５Ｍヨウ素溶液または０．２Ｍ  ＰＡＤＳ酸化溶液のいずれかを用いて酸化を実施して、それぞれホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホロチオエートヌクレオチド間結合のいずれかを生成した。非修飾抗２０８ａ  ＤＮＡ配列は、チミジンＬＮＡ（ｌＴ）、チミジンオキソＣＢＢＮ（ｂＴ）、シチジンオキソＣＢＢＮ（ｂＣ）またはチミジンアミノＣＢＢＮ（ａｂＴ）ヌクレオチドで選択的に置換した９つの２’−デオキシチミジン残基を取り込んでいる。チミジンＬＮＡアミダイトは商業的供給源から購入したものであり、報告されている分光データに一致している（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．、Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，４５５−６を参照のこと）。チミジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（チミジンオキソＣＢＢＮ、ｂＴ）およびシチジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（シチジンオキソＣＢＢＮ、ｂＣ）は、文献の手順にしたがって合成したものであり、すべての分光データは、報告値に一致していた（米国特許第６，４０３，５６６号、Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ｇｉｒａｒｄｅｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｉｃ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５，１９９９，７７０７〜７７２４を参照のこと）。ヌクレオチドのバランスは、天然抗２０８ａ  ＲＮＡ配列に対応する塩基を有する２’−デオキシヌクレオチドまたはＬＮＡヌクレオチドから構成されていた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、塩基の後ろに「ｓ」を付けて示されており（例えば、ａｂＴｓまたはｄＧｓ）、塩基の後ろに文字がないのは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を示す（例えば、ａｂＴまたはｄＧ）。
【０１０５】
化合物Ｍ−１１９１５：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＧ．ｄＣ．ａｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製  
単一修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホルアミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８４５．２、実測値４８４４．０（Ｍ）−。
【０１０６】
化合物Ｍ−１１９１６：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ａｂＴ．ｄＧ．ｄＣ．ａｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製  
二重修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホルアミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８８６．２、実測値４８８５．２（Ｍ）−。
【０１０７】
化合物Ｍ−１１９１７：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ａｂＴ．ａｂＴ．ｄＧ．ｄＣ．ａｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製  
三重修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホルアミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４９２７．３、実測値４９２６．１（Ｍ）−。
【０１０８】
化合物Ｍ−１１９１８：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ａｂＴ．ａｂＴ．ｄＧ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製  
二重修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホルアミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８８６．２、実測値４８８５．０（Ｍ）−。
【０１０９】
化合物Ｍ−１１９１９：ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ａｂＴｓ．ａｂＴｓ．ｄＧｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｌＧｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｌＴｓ．ｌＡの調製  
キメラＤＮＡ／ＬＮＡ／アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホルアミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、０．２Ｍ  ＰＡＤＳの１：１ピリジン／ＡＣＮ溶液を酸化溶液に交換して、市販の合成試薬を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値５３７９．３、実測値５３７８．３（Ｍ）−。
【０１１０】
化合物Ｍ−１１９２０：ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｌＴｓ．ｌＴｓ．ｄＧｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｌＧｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ａｂＴｓ．ｌＡの調製  
キメラＤＮＡ／ＬＮＡ／アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホルアミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、０．２Ｍ  ＰＡＤＳの１：１ピリジン／ＡＣＮ溶液を酸化溶液に交換して、市販の合成試薬を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。上記「短縮型ヌクレオチドの一般的な合成方法」に記載されているように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値５３６６．３、実測値５３６５．３（Ｍ）−。
【０１１１】
化合物Ｍ−１０９３０  ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＧ．ｄＣ．ｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製  
単一修飾オキソＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、チミジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト（例えば、米国特許第６，４０３，５６６号、Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ｇｉｒａｒｄｅｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｉｃ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５，１９９９，７７０７〜７７２４を参照のこと）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてすべてのホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８４６．１、実測値４８４５．８（Ｍ）−。
【０１１２】
化合物Ｍ−１０９２４  ｂＣ．ｂＴ．ｂＴ．ｂＴ．ｂＴ．ｂＴ．ｄＧ．ｂＣ．ｂＴ．ｂＣ．ｄＧ．ｂＴ．ｂＣ．ｂＴ．ｂＴ．ｄＡの調製  
単一修飾オキソＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、チミジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびＮ−Ｂｚ−シチジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホルアミダイト（例えば、米国特許第６，４０３，５６６号、Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ｇｉｒａｒｄｅｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｉｃ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５，１９９９，７７０７〜７７２４を参照のこと）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてすべてのホスホルアミダイト試薬を添加した。濃水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。粗製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに取り付けたＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値５３５０．６、実測値５３５０．２（Ｍ）−。
【０１１３】
実施例４：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの機能的特性決定  
融解温度（Ｔｍ）の決定  
アンチセンスおよびマイクロＲＮＡ標的に対する薬物として合成オリゴヌクレオチド配列を設計する際、融解温度（Ｔｍ）は重要なパラメータである。一般に、活性を決定する閾値を上回るまたは下回る特定のＴｍはない。しかしながら、アンチセンスおよびマイクロＲＮＡ阻害剤オリゴヌクレオチド薬物の場合、Ｔｍは極めて高くなければならないと認識されている。さらに、合成オリゴヌクレオチド薬物のヌクレオチド骨格（例えば、ホスホロチオエート）の化学修飾は、インビボにおける生分解に対する安定性を付与するために使用されることが多い。それにもかかわらず、ほとんどのヌクレオチドリン酸骨格の修飾は、その標的と二重鎖形成したオリゴヌクレオチド薬物のＴｍの低下を引き起こすことが多い。したがって、合成オリゴヌクレオチド薬物が十分な特異性を有するために、標的結合のために、および最終的には標的によって制御される細胞プロセスの下流の調節（downstream regulation）のためには、その標的配列に対する合成オリゴヌクレオチド薬物のＴｍが、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡおよび他の類似ヌクレオチド単位に固有のＴｍよりも十分に大きいことが必要である。
【０１１４】
修飾１６ヌクレオチドホスホジエステル鎖の融解温度（Ｔｍ）を決定し、天然ホスホジエステルＤＮＡヌクレオチドを有する同一の１６ヌクレオチド配列のＴｍと比較した。具体的には、１６ヌクレオチドの長さのアミノ修飾ホスホジエステル鎖の融解温度と、２’−デオキシヌクレオシドまたはオキソＣＢＢＮホスホジエステルＤＮＡヌクレオチドのいずれかを利用する同一の１６ヌクレオチド配列の融解温度との間の差異を組み込みベースで決定することによって、同じ核酸塩基を有する２’−デオキシヌクレオシドまたはオキソＣＢＢＮヌクレオシドと比較した相対的なアミノＣＢＢＮ融解温度（Ｔｍ）を決定した。それらを配列の同じ位置に配置した場合にのみ、置換のＴｍ差異を比較した。アミノ−ＬＮＡおよびそのオキソＬＮＡカウンターパートに関する比較可能な値は、文献の基準を介して得た（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｗｅｎｇｅｌ  Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．２６，１９９８を参照のこと）。
【０１１５】
例えば、修飾抗２０８ａオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡヌクレオシドおよびリン酸骨格
から構成される２２ヌクレオチドの長さの相補配列とアニーリングした。相補配列は、内因性成熟ｍｉＲＮＡと同一であった。融解曲線の一次導関数プロットの最大値として、熱変性温度（Ｔｍ）を測定した（Ａ２６０対Ｔｅｍｐ）。０．９％ＮａＣｌ緩衝液中、１μＭで二重鎖が構成された。１℃／分で２５℃から９５℃に温度を上昇させ、２６０ｎｍのＯＤを３０秒ごとに１回読んだ。Ｔｍ値は、少なくとも２回の測定の平均である。
【０１１６】
成熟ヒトｍｉＲ−２０８ａのヌクレオチド配列に相補的な１６ヌクレオチド配列の様々な修飾の二重鎖融解温度を、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  １Ｅ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して測定した。試験した抗ｍｉＲＮＡ  ２０８ａオリゴヌクレオチド配列には、完全ＤＮＡホスホジエステル（化合物Ｍ−１０９３１）、ｄＴ残基に代えて１つ、２つまたは３つのアミノＣＢＢＮチミジン残基を有する４つのＤＮＡホスホジエステルオリゴヌクレオチド（化合物Ｍ−１１９１５、Ｍ−１１９１６、Ｍ−１１９１７およびＭ−１１９１８）、混合９ＬＮＡ／７ＤＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（化合物Ｍ−１０１０１）、および親化合物（化合物Ｍ−１０１０１）のＬＮＡチミジンを１つまたは２つのアミノＣＢＢＮ残基のいずれかで置換した２つの混合ＬＮＡ／ＤＮＡ／アミノＣＢＢＮホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（化合物Ｍ−１１９１９およびＭ−１１９２０）が含まれていた。０．９％ＮａＣｌ中、１μＭで二重鎖が構成された。１℃／分で２５℃から９５℃に温度を上昇させ、２６０ｎｍのＯＤを３０秒ごとに１回読んだ。
【０１１７】
アミノＣＢＢＮ修飾を有するホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、一様に、それらの完全ＤＮＡカウンターパートよりも高い融解温度を有しており、したがって相補配列に対してより高い親和性を有していた（表３を参照のこと）。親和性増強は、ＤＮＡに対して約５〜９℃／修飾であった。これらの親和性増加は、ＬＮＡおよびアミノＬＮＡに関する文献値と同程度であるか、またはそれよりも優れている。
【表１】
2017512774.tif 000006
【表２】
2017512774.tif 000007
【０１１８】
アミノＬＮＡ−Ｔとそのオキソ類似体ＬＮＡ−Ｔとの比較は、アミノＬＮＡ−Ｔが、その相補体に対する安定性がＬＮＡ−Ｔよりも低いことを示している。同様に、アミノＥＮＡ−Ｔは、そのオキソ類似体のものよりも非常に低い二重鎖安定化効果を有するとようである。驚くべきことに、アミノＣＢＢＮ−ＴとそのオキソＣＢＢＮ−Ｔ類似体との比較は、アミノＣＢＢＮ修飾がオキソＣＢＢＮ−Ｔよりも２〜４℃／修飾だけ有意に安定にすることを示している（表３および図３Ｂを参照のこと）。理論に縛られるものではないが、ＬＮＡの２’−Ｏ（プロトン受容体）は、アミノＬＮＡの場合のように、それを２’位でプロトン供与体により置換する場合よりも、二重鎖水和および安定性に対する安定化効果が高いと仮定する。反対に、アミノＣＢＢＮは、そのオキソＣＢＢＮ類似体よりも、二重鎖水和および安定性に対するプラス効果がかなり高いようであり、いかなる他の２’４’−炭素−架橋二環式ヌクレオチドにおいても見られないＴｍの増強を提供する（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。
【表３】
2017512774.tif 000008
【０１１９】
抗２０８ａオリゴヌクレオチドの細胞培養活性
ｍｉＲ−２０８ａを安定発現するＨｅＬａ細胞株を作製した。具体的には、ｍｉＲ−２０８ａを発現するｍｉＲＮＡ発現ベクター（Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。次いで、ピューロマイシン選択スクリーニングを使用して細胞を選択し、ｑＰＣＲによって測定した場合に検出可能なｍｉＲ−２０８ａ発現を有しているクローンを単離した（Ｃｔ値＝約３０）。
【０１２０】
細胞を１ウェル当たり細胞１０，０００個でブラックウェル９６ウェルプレートにまいた。まいてから２４時間後、ウミシイタケ遺伝子の３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−２０８ａ結合部位および様々なｍｉＲ−２０８ａ阻害剤（化合物Ｍ−１１９１９、Ｍ−１１９２０およびＭ−１０１０１）を含有するデュアルルシフェラーゼプラスミドで細胞をトランスフェクトした。化合物Ｍ−１０５９１は、非ターゲティングコントロールであった。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光によって、ホタルレベル（トランスフェクション正規化として）およびウミシイタケレベルの両方を測定した。ｍｉＲ−２０８ａデュアルルシフェラーゼプラスミド（ｐｓｉ  ｃｈｅｃｋ２０８ａ）のみで処理した細胞に対して、データを正規化した。ｍｉＲ−２０８ａ結合部位を含まないデュアルルシフェラーゼプラスミドでｐｓｉ  ｃｈｅｃｋ２細胞を処理した。
【０１２１】
結果は、化合物Ｍ−１１９２０が化合物Ｍ−１０１０１（これは、ＬＮＡ／ＤＮＡ塩基のみを含む最適化ｍｉＲ２０８ａ阻害剤である）と同程度の活性を有することを実証している（図４を参照のこと）。したがって、アミノＣＢＢＮ残基でＬＮＡ残基を複数置換することにより、ｍｉＲ２０８ａ阻害活性が完全に保持される。化合物Ｍ−１１９１９は、他の２つの阻害剤と比較してわずかに低い活性を有する（図４を参照のこと）。化合物Ｍ−１１９１９の活性はＴｍデータと相関しているが、これは、化合物Ｍ−１１９１９が、Ｍ−１１９２０化合物よりも低いｍｉＲ−２０８ａ  ＲＮＡ親和性を有することを示している。
【０１２２】
実施例５：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの生成
本実施例は、異なる核酸塩基を用いた２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの生成におけるさらなる合成反応物および主要中間体（ここで、式１の「Ｘ」はＮである）について記載する（図５〜７を参照のこと）。
【０１２３】
実施例５Ａ：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（アデノシン）  
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（２９）  
Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（２７．６ｍｌ、１１３ｍｍｏｌ）を（（３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（２０．０ｇ、３７．７ｍｍｏｌ）およびＮ６−ベンゾイルアデニン（１１．２ｇ、４７．１ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（１００ｍｌ）中の混合物に添加した。反応混合物を１時間還流した。溶液を６０℃に冷却し、ＴＭＳ−ＯＴｆ（１３．６ｍｌ、７５．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４時間還流した。溶液を室温に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×２００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、酢酸エチルを介して溶出する、３４０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰシリカゲルカラムで２つのバッチで残留物を精製した。１Ｌ丸底フラスコに純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の固体物質として（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１８．９０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。任意の感知できるほどの量の分離可能なヌクレオシド副生成物は存在しなかった。
【０１２４】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−（Ｎ−ベンゾイルベンズアミド）−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（３６）  
精製された（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１８．９０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）を含有するフラスコにＴＨＦ（４００ｍＬ）および１．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（１１３ｍＬ、１．０Ｍ）を充填した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣは、Ｎ−ベンゾイル基が元のまま残り、脱アセチル化が生じたことを示した。反応物を水（２００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１×２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、１０００ｍＬ丸底フラスコへとろ過し、真空下で濃縮して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１７．６０ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）を得、これをさらに精製せずに使用した。フラスコに撹拌棒およびセプタムシールを取り付けた。フラスコにピリジン（２００ｍＬ）を充填し、水浴内で撹拌しながら約５℃に冷却した。撹拌しながらクロロトリメチルシラン（７．０ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を冷却浴槽から取り出し、室温にした。３０分後、塩化ベンゾイル（４．４ｍＬ、３８ｍｍｏｌ）を室温で滴下添加し、混合物を一晩撹拌した。水を反応混合物（２０ｍＬ）に添加し、混合物を３０分間撹拌した。混合物をＤＣＭ（６００ｍＬ）で希釈し、ブライン（３×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。残留物の半分を３４０ｇ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、ヘキサン中４０〜１００％ＥｔＯＡｃ勾配を有するＢｉｏｔａｇｅを介して生成物を溶出した。このプロセスを粗物質の残りの半分に対して繰り返した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質として純粋な（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−（Ｎ−ベンゾイルベンズアミド）−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１６．２１ｇ、８０．１％）を得た。
【０１２５】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（３７）  
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−（Ｎ−ベンゾイルベンズアミド）−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１６．２ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）、（２，２，２−トリフルオロエチル）−ｔ−ブチル−イミノジカルボキシレート（６．１６ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（６．６４ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコに、撹拌しながら２００ｍＬのＴＨＦを充填した。シリンジを介してＤＩＡＤ（５．０ｍＬ、２５．３ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下添加し、混合物を４５分間撹拌した。粗製混合物（６０／４０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）のＴＬＣ分析により、反応が完了まで進み、新規のヌクレオシド陽性スポット（Ｈａｎｎｅｓｓｉａｎｓ  Ｓｔａｉｎを介して）を生成したことが明らかとなった。混合物を濃縮乾固し、３４０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、９カラム容量のヘキサン中４０〜１００％ＥｔＯＡｃ勾配で溶出した。生成物を含有する画分を合わせることによって、白色の泡状物質を得、これを直ちにＴＨＦ（５００ｍＬ）に再溶解し、２．０Ｍ  ＬｉＯＨ（５０．６ｍＬ、５当量）で４時間処理した。ＴＬＣ分析は、生成物が主要な生成物となったことを明らかにした。完全に脱ベンゾイル化した物質についての明らかなスポットは存在しなかった。生成物、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１５．８ｇ、９８．２％）を、さらに精製せずに使用した。
【０１２６】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（３８）  
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（５．０ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する１０００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにＴＨＦ（４３０ｍＬ）を充填し、溶液を撹拌した。水素化ナトリウムの油中６０％分散液（１．０ｇ、２５ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、乾燥管にベントした還流冷却器をフラスコに取り付け、反応物を１．５時間６０℃に加熱した。反応混合物を氷浴中で冷却し、蓋を開け、１０ｍＬの水を１５分間かけて滴下添加することによってクエンチした。混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチル（３００ｍＬ）中に再懸濁した。有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、黄褐色の泡状物質に濃縮した。３４０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、６カラム容量のヘキサン中３５〜１００％酢酸エチル勾配で溶出することによるカラムクロマトグラフィーによって、泡状物質をさらに精製した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２．３１ｇ、５２．５％）を得た。
【０１２７】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（ベンゾイルオキシ）メチル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（３９）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（１．７０ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）および安息香酸ナトリウム（１．７５ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコに、ＤＭＦ（１５０ｍＬ）を充填し、１００℃で４８時間撹拌した。反応混合物を真空下で１／３の体積に濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、白色の泡状物質としてｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（ベンゾイルオキシ）メチル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（１．７５ｇ、９９．２５％）を得、これをさらに精製せずに使用する。
【０１２８】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４０）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（ベンゾイルオキシ）メチル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（６．８５ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにメタノール（５０ｍＬ）を充填し、５０℃で撹拌した。ナトリウムメトキシド（０．５１ｇ、９．４ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、これを２時間撹拌した。反応混合物を冷却し、濃縮乾固し、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中に再懸濁した。有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固して、白色の泡状物質としてｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４．２５ｇ、８７．０％）を得た。
【０１２９】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４２）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４．２５ｇ、８．２２ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）に溶解し、撹拌棒を有する１００ｍＬボロシリケートボトルに移した。パールマン触媒（３ｇ）をこの溶液に一度に添加した。蓋をしていないボトルを３００ｍＬ  Ｐａｒｒボンベの内側に配置し、密閉し、水素ガス（６０ｐｓｉ）を充填した。油浴中で、この器具を１７時間７０℃に加熱した。この器具を氷浴中で冷却し、圧力をゆっくりと開放した。反応混合物をＰａｒｒボンベから取り出し、セライトのパッドを介してろ過した。セライトおよび触媒を温かいエタノール（２００ｍＬ）で洗浄した。５００ｍＬ丸底フラスコ内、真空下でエタノール濾液を濃縮して、暗色の泡状物質を得、これをＤＣＭ（３×２０ｍＬ）と共蒸発させて、粗製のｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４１）を得て、わずかな量の触媒と混合した。撹拌棒をフラスコに直ちに加え、これにピリジン（５０ｍＬ）を充填し、セプタムで密閉した。氷浴中で０℃に冷却しながら、混合物を撹拌した。ＴＭＳ−Ｃｌ（２．６ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に滴下添加した。反応混合物を氷浴から取り出し、３０分間かけて室温に温めた。塩化ベンゾイル（）を反応混合物に滴下添加した。反応物を室温で３時間撹拌した。５分間撹拌しながら水（１０ｍＬ）を添加することによって反応混合物をクエンチし、これに続いて、さらに室温で１５分間撹拌しながら、濃水酸化アンモニウム（２０ｍＬ）を添加した。混合物を真空下で濃縮乾固した。油状物質を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。残留物をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ中１．０Ｍ  ＴＢＡＦ（８．５ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。反応物を３０分間撹拌してから、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。有機相を１０％クエン酸ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をクエン酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。残留物を１００ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、９カラム容量のＤＣＭ中０〜１０％メタノール勾配で溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２．００ｇ、４９．０％）を得た。
【０１３０】
Ｎ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル）ベンズアミド  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２．００ｇ、４．０３ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。ジクロロメタン（１０ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、蓋を開け、次いで３０分間濃縮乾固した。残留物をメタノール（２×１０ｍＬ）と共蒸発させた。残留物をメタノール（２０ｍＬ）およびエチルトリフルオロアセテート（９．６ｍＬ、２０当量）に再溶解した。トリエチルアミン（４．５０ｍＬ、８当量）をこの溶液に添加し、混合物を一晩撹拌し、室温で蓋をした。混合物を濃縮乾固し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、白色の泡状物質としてＮ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル）ベンズアミド（１．８０ｇ、９０．８％）を得て、これをさらに精製せずに使用した。
【０１３１】
Ｎ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−８−ヒドロキシ−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル）ベンズアミド［ＤＭＴｒ−ａＡ（Ｂｚ）（ｔｆａ）］（４３）  
Ｎ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル）ベンズアミド（１．８０ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにピリジン（３０ｍＬ）を充填し、撹拌した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．４９ｇ、４．３９ｍｍｏｌ）をこの溶液に一度に添加した。フラスコをセプタムで密閉し、混合物を１７時間撹拌した。メタノール（２ｍＬ）を反応混合物に添加し、これをさらに３０分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム溶液（４ｍＬ）を反応混合物に添加し、次いで蒸発乾固した。残留物をＤＣＭに懸濁し、ろ過し、ＴＥＡ前処理した１００ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライした。生成物を６カラム容量のヘキサン中３０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。生成物を含有する画分を合わせて、白色の泡状物質としてＮ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−８−ヒドロキシ−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル）ベンズアミド（１．５０ｇ、５１．６％）を得た。
【０１３２】
ＤＭＴｒ−ａＡ（Ｂｚ）（ｔｆａ）アミダイト（４４）
ＤＭＴｒ−ａＡ（Ｂｚ）（ｔｆａ）（１．５０ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにＤＣＭ（３０ｍＬ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（2-Cyanoethyl  N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphordiamidite）（１．１４ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を充填した。４，５−ジシアノイミダゾール（０．２２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物を、ＴＥＡ処理した１００ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、６カラム容量のヘキサン中３０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。生成物を含有する画分を合わせて、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−ａＡ（Ｂｚ）（ｔｆａ）アミダイト（１．６４ｇ、８７．３％）を得た。
【０１３３】
実施例５Ｂ：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（グアノシン）  
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−２−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（４５）  
（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−メトキシ−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（１５．００ｇ、２８．２５ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコに無水酢酸（１０．６８ｍｌ、１１３ｍｍｏｌ）および酢酸（６０ｍＬ）を充填した。すべての固体が溶液を生じるまで混合物を６０℃で撹拌した。濃硫酸（７５μＬ、０．０５当量）を滴下添加し、混合物を６０℃でさらに５分間撹拌した。反応混合物を熱から外し、一晩撹拌しながら室温にした。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、分液ロートに移し、ブライン（３×２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を飽和炭酸水素塩洗浄液（２×２００ｍＬ）および最終ブライン洗浄液（１００ｍＬ）で慎重に中和した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、５００ｍＬ丸底フラスコにろ過し、濃縮して、透明な、淡黄色−茶色油状物質を得、これを粗製のまま直接使用した。
【０１３４】
２−アミノ−６−クロロプリン（６．２３ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）および撹拌棒を得られた油状物質に加え、乾燥管にベントした還流冷却器をフラスコに取り付けた。フラスコにＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（１９．３４ｍＬ、７９．１ｍｍｏｌ）およびアセトニトリルを充填した。混合物を油浴中で４５分間還流させながら撹拌し、この時点で混合物が均質の溶液になった。反応混合物を油浴から素早く取り出し、わずかに冷却させておいてから、トリメチルシリルトリフレート（１０．２３ｍＬ、５６．５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した後、反応混合物を１．５時間還流に戻した。ＴＬＣ（６０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、ＵＶ＆Ｈａｎｎｅｓｓｉａｎ’ｓ  染色可視化（Hannessian's Stain visualiztion）、Ｒｆ０．５）を介したプロセスモニタリングにより、主要なＵＶ生成物の出現および出発糖の完全な消費が明らかとなった。
【０１３５】
反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム（２×２００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗製の生成物を半分に分割し、各部分をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ、３４０ｇ  ＳＮＡＰカラム）に供した。すべての純粋な画分を合わせて、白色の泡状物質としてＮ９、ベータグリコシド、（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−２−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（９．８０ｇ、５１％）を得た。
【０１３６】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（４６）  
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−２−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）メチルアセテート（９．８０ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコに、ＴＨＦ（１００ｍＬ）および１．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（４４ｍＬ、３当量）を充填した。混合物を６時間撹拌した。混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈し、ブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（９．１８４ｇ、９９％）を得、これをさらに精製せずに使用した。
【０１３７】
（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２，２，２−トリフルオロエチルカルバモイル）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２，２，２−トリフルオロエチル）−ｔｅｒｔ−ブチル−イミノジカルボネート（図６）  
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（９．０９ｇ、１４．５１ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（５．７０９ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）および（２，２，２−トリフルオロエチル）−ｔ−ブチル−イミノジカルボキシレート（５．２９ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を有する５００ｍＬ丸底フラスコに添加した。フラスコにＴＨＦを充填し、セプタムで密閉し、２０℃の水浴中で撹拌した。ジイソプロピルアゾジイミド（４．２９ｍＬ、２１．８ｍｍｏｌ）を撹拌反応混合物に３分間かけて滴下添加した。反応混合物を１．５時間撹拌した。反応混合物を固体に濃縮した。その物質を３４０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに直ちにアプライし、９カラム容量のヘキサン中２０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質として生成物（１１．７５ｇ、９５．１％）を得た。
【０１３８】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（図６）  
（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２，２，２−トリフルオロエチルカルバモイル）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２，２，２−トリフルオロエチル）−ｔｅｒｔ−ブチル−イミノジカルボネート（１１．７ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を計量し、撹拌棒を有する５００ｍＬ丸底フラスコに入れる。フラスコに、ＴＨＦ（１００ｍＬ）および１．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（４２ｍＬ、３当量）を充填する。混合物に蓋をし、室温で１．５時間撹拌する。反応物を酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈し、ブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固する。得られた泡状物質をＡＣＮ（２×１００ｍＬ）と共蒸発させて、高真空下で恒量（constant mass）にし、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（９．７５ｇ、９７％）を得た。
【０１３９】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（４７）  
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（９．７５ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコに、ＡＣＮ（１５０ｍＬ）およびベンジルアルコールを充填し、セプタムで密閉し、次いで撹拌しながら塩−氷浴中で冷却した。カリウムｔ−ブトキシド（２．３８ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）を４００ｍｇの画分で２０分間かけて添加した。最後の画分を添加した後、塩−氷浴の温度を維持しながら反応物を２時間撹拌し続けた。
【０１４０】
反応混合物のＴＬＣ（９５：５ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、ＵＶ／Ｈａｎｅｓｓｉａｎｓ染色可視化）は、反応が完了したことを明らかにしている（revel）。反応混合物を水（４００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせ、ブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固する。得られた油状物質をＴＥＡ前処理したＢｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラム（３４０ｇ）にアプライし、６カラム容量の２０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出する。純粋な画分を合わせ、特別な注意を払いながらベンジルアルコールを排除し、濃縮して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（８．５０ｇ、７９．３％）を得た。
【０１４１】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４８）  
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（８．５０ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２Ｌ丸底フラスコに入れた。乾燥管ベントを有する還流冷却器を取り付けたフラスコにＴＨＦ（８５０ｍＬ）および水素化ナトリウム（４．２６ｇ、１０７ｍｍｏｌ）を充填し、６０℃で４時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、１０ｍＬの水の滴下添加によりクエンチした。反応混合物を真空下で濃縮乾固し、酢酸エチル（３００ｍＬ）に再溶解した。有機相を水（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。残留物を３４０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、９カラム容量の３０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。生成物のｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４．７０ｇ、６２．９％）、および出発材料の（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２．３２ｇ、２７．３％）を含有する画分を別々に合わせ、白色の泡状物質に濃縮した。
【０１４２】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（ベンゾイルオキシ）メチル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４９）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４．７０ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）および安息香酸ナトリウム（７．８０ｇ、５４．１ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する２Ｌ丸底フラスコに入れた。フラスコにＤＭＦ（５００ｍＬ）を充填し、セプタムで密閉した。一晩激しく撹拌しながら、混合物を１００℃に加熱した。反応混合物を真空下、５０℃で、約１００ｍＬに濃縮する。混合物を飽和炭酸水素ナトリウムで５００ｍＬに希釈する。水相を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせ、ブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、白色の泡状物質として粗製のｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（ベンゾイルオキシ）メチル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（４．５６ｇ、９３．６％）を得た。これをさらに精製せずに使用する。
【０１４３】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（５０）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−（ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（ベンゾイルオキシ）メチル）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２．４０ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を計量し、撹拌棒を有する２５０ｍＬ丸底フラスコに入れる。フラスコにエタノール（１５ｍＬ）を充填する。ナトリウムメトキシド（０．１９ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、フラスコをセプタムで密閉し、２時間５０℃に温める。酢酸（０．１９ｍＬ、３．３０ｍｍｏｌ）の添加により溶液を中和する。３００ｍＬ  Ｐａｒｒボンベ内に配置されている１００ｍＬボロシリケートボトルに混合物および撹拌棒を移す。パールマン触媒（１．５０ｇ）を混合物に添加し、器具を密閉し、水素ガス（６０ｐｓｉ）を充填した。磁気撹拌プレート上でボンベ器具を７０℃に加熱し、５００ｒｐｍで１７時間撹拌した。
【０１４４】
器具を０℃に冷却し、圧力を開放してから、ボンベ器具を取り外した。溶液をセライトのパッドを介してろ過して、大部分の触媒を除去した。さらなる２００ｍＬの温かいエタノールでセライトを洗浄した。濾液を濃縮乾固し、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）と共蒸発させて、白色の泡状物質としてｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（１．１２ｇ、８３．１％）を得た。これをさらに精製せずに使用する。
【０１４５】
Ｎ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）イソブチルアミド（５１）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（２−アミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．４５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を計量して、磁気撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにピリジン（１０ｍＬ）を充填し、氷浴中で０℃に冷却する。ＴＭＳ−Ｃｌ（０．４２ｍＬ、３．３ｍｍｏｌ）を混合物に滴下添加し、反応物を３０分間撹拌する。塩化イソブチリル（０．１３ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を撹拌混合物に滴下添加し、これを３時間かけて室温にする。反応混合物の密封を解いて、水（２ｍＬ）でクエンチし、３０分間撹拌する。クエンチした反応物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で抽出する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗製の泡状物質を得、３０分間撹拌しながら、これを直ちにＴＨＦ中０．５Ｍ  ＴＢＡＦ（２．４ｍＬ、１．１当量）での処理に供した。混合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸ナトリウム水溶液（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、黄色がかった茶色の粉末に濃縮し、４５分間撹拌しながら、これを直ちに１０ｍＬの１：１  ＴＦＡ：ＤＣＭに供した。混合物を蒸発乾固し、エタノール（２×１０ｍＬ）と共蒸発させた。得られた固体をエタノール（１０ｍＬ）およびエチルトリフルオロアセテート（２．５ｍＬ、２１．５５ｍｍｏｌ）に再溶解した。トリエチルアミンを撹拌混合物（２．２ｍＬ、１５．６７ｍｍｏｌ）に添加し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、ジクロロメタン（３０ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ）に分配した。炭酸水素塩溶液をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）でさらに抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、黄褐色の泡状物質として、Ｎ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）イソブチルアミド（０．３８ｇ、７３％）を得た。これをさらに精製せずに使用する。
【０１４６】
ＤＭＴｒ−ａＧ（ｉｂｕ）（ｔｆａ）（５２）
Ｎ−（９−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）イソブチルアミド（０．３８ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにピリジン（１０ｍＬ）を充填し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．３２６ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を一度に添加した。フラスコに蓋をし、室温で一晩撹拌した。メタノール（０．５ｍＬ）の添加により、反応をクエンチした。飽和炭酸水素ナトリウム溶液（４ｍＬ）を反応混合物に添加し、次いで蒸発乾固した。残留物をＤＣＭ中に懸濁させ、ろ過し、ＴＥＡ前処理した５０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライした。６カラム容量のヘキサン中３０〜１００％酢酸エチル勾配で、生成物を溶出した。生成物を含有する画分を合わせて、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−ａＧ（ｉｂｕ）（ｔｆａ）（０．４１ｇ、６５．９％）を得た。
【０１４７】
ＤＭＴｒ−ａＧ（ｉｂｕ）（ｔｆａ）アミダイト（５３）
ＤＭＴｒ−ａＧ（ｉｂｕ）（ｔｆａ）（０．４０ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにＤＣＭ（１０ｍＬ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．３２ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を充填した。４，５−ジシアノイミダゾール（６２．４ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物をＴＥＡ処理した１００ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、９カラム容量のヘキサン中３０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。生成物を含有する画分を合わせて、白色の泡状物質として、ＤＭＴｒ−ａＧ（ｉｂｕ）（ｔｆａ）アミダイト（０．３９ｇ、７６％）を得た。
【０１４８】
実施例５Ｃ：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（シトシン）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（４−アミノ−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−８−（（トリメチルシリル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（５５）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−７−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート、５４、（０．８０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにＡＣＮ（１０ｍＬ）およびＴＥＡ（１．１６ｍＬ、８．３５ｍｍｏｌ）を充填し、次いで０℃に冷却した。ＴＭＳ−Ｃｌ（０．５８３ｍＬ、４．６０ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら５分間かけて滴下添加した。室温にしながら３０分間混合物を撹拌した。
【０１４９】
撹拌棒およびセプタムシールを有する、別々の２５０ｍＬ丸底フラスコに、１，２，４−１Ｈ−トリアゾール（１．４４１ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをアルゴンでフラッシュし、氷浴中で０℃に冷却した。フラスコにＡＣＮ（２０ｍＬ）およびＴＥＡ（２．９０ｍＬ、２０．９ｍｍｏｌ）を充填し、次いで撹拌した。激しく撹拌しながら、５分間かけてＰＯＣｌ３を滴下添加した。シリル化ヌクレオシド溶液をシリンジ中で溶解し、冷却したＰＯＣｌ３／トリアゾール溶液に数分間かけて滴下添加した。反応物を氷浴から取り出し、１時間かけて室温にした。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で慎重に洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、撹拌棒を有する１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、黄色の泡状物質に濃縮する。フラスコを密閉し、ＡＣＮ（１５ｍＬ）および飽和アンモニア溶液（１５ｍＬ）を充填する。混合物を室温で１７時間撹拌してから密封を解く。混合物を濃縮乾固し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）に再溶解し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム（２×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固して、黄色−黄褐色の泡状物質として、粗製のｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（４−アミノ−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−８−（（トリメチルシリル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．６３ｇ、６６．４％）を得た。
【０１５０】
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（４−ベンズアミド−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（５６）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（４−アミノ−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−８−（（トリメチルシリル）オキシ）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．６０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにピリジン（２５ｍＬ）を充填し、氷浴中で０℃に冷却しながら混合物を撹拌した。ＴＭＳ−Ｃｌ（０．２５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に、滴下添加した。反応混合物を氷浴から取り出し、３０分間かけて室温に温めた。塩化ベンゾイル（０．１７ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下添加した。反応物を室温で３時間撹拌した。５分間撹拌しながら水（６ｍＬ）の添加により反応混合物をクエンチし、これに続いて、室温でさらに１５分間撹拌しながら濃水酸化アンモニウム（１０ｍＬ）を添加した。混合物を真空下で濃縮乾固した。油状物質を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。残留物をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。撹拌しながらＴＨＦ中の１．０Ｍ  ＴＢＡＦ（２．５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を３０分間撹拌してから、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈した。有機相を１０％クエン酸ナトリウム溶液（２×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。残留物を２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、９カラム容量のＤＣＭ中０〜１０％メタノール勾配で溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質として、ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（４−ベンズアミド−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．４９ｇ、７６．３％）を得た。
【０１５１】
Ｎ−（１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド（図７）  
ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（４−ベンズアミド−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．４９ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒を有する５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。ＤＣＭ（５ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸を撹拌しながらフラスコに充填する。３０分後、溶液を真空下で濃縮乾固する。残留物をエタノール（２×１０ｍＬ）と共蒸発させる。得られた物質をエタノール（１０ｍＬ）、エチルトリフルオロアセテート（２．４ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）およびトリメチルアミン（１．４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）に再溶解する。混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を蒸発乾固し、２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに直接アプライし、９カラム容量のＤＣＭ中０〜１０％メタノール勾配で溶出する。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてＮ−（１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド（０．３５ｇ、７２％）を得た。
【０１５２】
Ｎ−（１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−８−ヒドロキシ−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド（５７）  
先の工程からのＮ−（１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド（０．３５ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにピリジン（１０ｍＬ）を充填し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．２９５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を一度に添加した。フラスコに蓋をし、室温で一晩撹拌した。メタノール（０．５ｍＬ）の添加により反応をクエンチした。飽和炭酸水素ナトリウム溶液（４ｍＬ）を反応混合物に添加し、次いで蒸発乾固した。残留物をＤＣＭに懸濁し、ろ過し、ＴＥＡ前処理した５０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライした。生成物を６カラム容量のヘキサン中３０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。生成物を含有する画分を合わせて、白色の泡状物質としてＮ−（１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−８−ヒドロキシ−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド［ＤＭＴｒ−ａＣ（Ｂｚ）（ｔｆａ）］（０．３５ｇ、６１．５％）を得た。
【０１５３】
ＤＭＴｒ−ａＣ（Ｂｚ）（ｔｆａ）アミダイト（５８）
ＤＭＴｒ−ａＣ（Ｂｚ）（ｔｆａ）（０．３５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を計量して、撹拌棒およびセプタムシールを有する１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにＤＣＭ（７ｍＬ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２７ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を充填した。４，５−ジシアノイミダゾール（５３ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×２０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物をＴＥＡ処理した２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライし、９カラム容量のヘキサン中３０〜１００％酢酸エチル勾配で溶出した。生成物を含有する画分を合わせて、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−ａＣ（Ｂｚ）（ｔｆａ）アミダイト（０．３８ｇ、８６％）を得た。
【図１−１】
2017512774.tif 000010
【図１−２】
2017512774.tif 000011
【図１−３】
2017512774.tif 000012
【図２Ａ】
2017512774.tif 000013
【図２Ｂ】
2017512774.tif 000014
【図２Ｃ】
2017512774.tif 000015
【図３Ａ】
2017512774.tif 000016
【図３Ｂ】
2017512774.tif 000017
【図４】
2017512774.tif 000018
【図５】
2017512774.tif 000019
【図６】
2017512774.tif 000020
【図７】
2017512774.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月1日(2017.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017512774000001.app
【国際調査報告】
2017512774.tif 000022
2017512774.tif 000023