(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物に、配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡ、前記ゲノムＤＮＡのオオムギ由来のアレル変異体であって、かつニコチアナミンアミノ基転移酵素活性を有する蛋白質を発現し得るゲノムＤＮＡ、又はそれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡを導入して、鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方法。
【請求項２】
導入される遺伝子がオオムギ由来のゲノム遺伝子であり、当該遺伝子がＲｉプラスミド複製起点を有するベクターに保持されている遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法で製造され得る鉄欠乏耐性を有するイネ科植物。
【請求項４】
請求項３に記載のイネ科植物の種子。
【請求項５】
請求項３に記載のイネ科植物の細胞。
【請求項６】
請求項３に記載のイネ科植物を鉄欠乏耕地で育成する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により得られたイネ科植物の作物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を製造する方法、その方法により得られたイネ科植物並びに当該イネ科植物を育成する方法及びその方法で得られた作物に関する。
より詳細には、本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、好ましくは当該酵素がニコチアナミン・アミノ基転移酵素である遺伝子を導入して鉄欠乏耐性を有するイネ科植物の創製に関する。
【０００２】
【従来の技術】
地球上の９０％近くの土壌は、何らかの問題を抱える不良土壌であると言われている。不良土壌では一般的に、植物の生育に必須な元素を質的または量的に欠いているために植物の生育が阻害されたり、あるいは重金属等を多く含む土壌による生育障害などが起こる。不良土壌の代表として、乾燥地塩類集積土壌がある。これは、人為的な過剰潅漑や、長年にわたる乾燥気候により、土壌上層にＮａＣｌやＮａ２ＣＯ３が集積したものと、ＣａＣＯ３やＣａＳＯ４が集積したものとがある。ナトリウムの集積した土壌では、塩類濃度障害を引き起こし、石灰質の土壌では、鉄欠乏障害を引き起こす。
【０００３】
地球上の耕地土壌の約３０％は、潜在的な鉄欠乏地帯と言われている(Wallence et al. 1960)。半乾燥地域の石灰質土壌では、毛管現象により母材から溶出した石灰質成分が地表に集積する。このような土壌では、ｐＨが上昇しアルカリ性を示すため土壌中の鉄がＦｅ（ＯＨ）３の形で存在し、溶解度が極めて低くなる。  このような土壌に生育した植物は、可溶性の鉄が少ないことにより、鉄欠乏クロロシスとなり、生育が阻害されるか、または枯死する。
【０００４】
高等植物の鉄獲得機構は、ストラテージ−Ｉ（Strategy-I）とストラテージ−II（Strategy-II）という２つに区分される。ストラテージ−Ｉは、イネ科を除く高等植物の鉄獲得機構である。土壌中の三価の不溶態鉄を根の細胞表面に存在する三価鉄還元酵素により還元し、二価鉄のトランスポーターで吸収する機構である。この機構を有する植物の中には、根圏にプロトンを放出し、根圏のｐＨを下げることで三価鉄還元酵素の活性を増加させる機構を有しているものや、フェノール系化合物を根圏に放出し、形成されたＦｅ(III)-フェノール系化合物キレートが細胞膜表面に存在する三価鉄還元酵素にＦｅ(III)を供給する機構を持っているものが存在する。最近の研究で、シロイヌナズナの根に特異的に発現する二価鉄のトランスポーターＩＲＴ１(Eide et al. 1996)や、シロイヌナズナの三価鉄還元酵素の遺伝子が単離された(Robinson et al. 1997)。
【０００５】
ストラテージ−IIは、単子葉植物の中のイネ科植物にのみ見られる鉄獲得機構である。イネ科植物は鉄欠乏条件下で、三価鉄キレート活性を有するムギネ酸類を根圏に放出し、「Ｆｅ(III)-ムギネ酸」錯体として根から鉄を吸収する(Takagi et al. 1984 )。ムギネ酸類（ＭＡｓ）は、ムギネ酸（ＭＡ）、２’−デオキシムギネ酸（ＤＭＡ）、３−ヒドロキシムギネ酸（ＨＭＡ）、３−エピヒドロキシムギネ酸（ｅｐｉＨＭＡ）、アベニン酸（ＡＶＡ）、ディスティコン酸，エピヒドロキシデオキシムギネ酸（ｅｐｉＨＤＭＡ）の７つが知られており、ムギネ酸類（ＭＡｓ）は全て図１に示すようにメチオニンを前駆体として合成される(Shojima et al. 1990，Ma et al.1998)。
ムギネ酸の分泌には概日リズムが存在し(Takagi et al. 1984)、日の出後にその分泌量が最大となり、夜には分泌されなくなる。また、鉄欠乏のオオムギ根で分泌前に膨らんでいた顆粒が、分泌後にしぼむ現象が観察され(Nishizawa et al. 1987)、この顆粒内でムギネ酸が合成されていると考えられている。これらのことから、イネ科植物の鉄欠乏応答は、ムギネ酸合成のみならず、鉄欠乏シグナルの伝達、根の形態変化など複雑な制御系により成立していることが示唆される。
【０００６】
ムギネ酸合成経路に関わる酵素として、ニコチアナミン合成酵素の遺伝子が単離され、鉄欠乏により誘導されていることが報告された(Higuchi et al. 1999)。また、ニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）の遺伝子が単離され、鉄欠乏により誘導されていた(Takahashi et al. 1997)。
また、鉄欠乏オオムギ根、コントロールのオオムギ根から抽出したｍＲＮＡを用いたディファレンシャルスクリーニングにより、鉄欠乏条件下で特異的に誘導される遺伝子Ｉｄｓ１、Ｉｄｓ２、Ｉｄｓ３が単離された。Ｉｄｓ１は、メタロチオネイン様タンパク質をコードする遺伝子である(Okumura et al. 1991)。Ｉｄｓ２は、その遺伝子配列から予測されるアミノ酸配列が、水酸化酵素に相同性をもつ遺伝子であり(Okumura et al. 1994)、Ｉｄｓ３もまた、その遺伝子配列から予測されるアミノ酸配列が、水酸化酵素に相同性をもつ遺伝子であった(Nakanishi et al. 1993)。エピヒドロキシムギネ酸合成経路には、水酸化反応が２カ所存在し、この遺伝子がこの反応を触媒する酵素をコードしているものと考えられている。
【０００７】
また、オオムギ根において鉄欠乏により誘導されるタンパク質として、ＩＤＳ３タンパク質、アデニンリボースリン酸転移酵素(板井, 1999)、ギ酸脱水素酵素(Suzuki et al. 1998)、そして３６ｋＤａタンパク質(入船, 1991)などが挙げられる。イネ科植物は、鉄欠乏条件で、ムギネ酸を生合成するが、このとき根に含まれるメチオニンが減少するためにメチオニンサイクルでメチオニンを合成すると共に、生じたアデニンをＡＭＰに変換するためにアデニンリボースリン酸転移酵素が誘導されていると考えられている(板井, 1999)。
ギ酸脱水素酵素は、メチオニンサイクルで生じたギ酸を分解する。また鉄欠乏のイネの根では、ミトコンドリアの形態変化と電子伝達系のエネルギーチャージの減少(Mori et al. 1991)が報告されており、ギ酸脱水素酵素は、鉄欠乏により生じた嫌気条件により誘導され、エネルギー源としてのＮＡＤＨの供給をしているものと考えられている。
【０００８】
一方、人工の増加に伴って食糧の増産が今後の人類の生存の条件として大きな問題となってきている。イネは人類の古来からの重要な食糧のひとつであるが、鉄欠乏地帯でのイネの生育は難しいのが現状である。鉄欠乏地帯でイネの生育が可能となれば食糧の増産も可能となり、食糧増産の問題の解決策のひとつとして注目されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、鉄欠乏地帯での生育が可能な鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を提供することを目的としている。
より詳細には、本発明は、イネ科植物のムギネ酸類の生合成経路上の酵素の遺伝子をイネ科植物に導入することにより、石灰質アルカリ土壌などでも旺盛に生育する鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入して、鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方法、より詳細には、当該酵素がニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）であり、それをコードする遺伝子naatを導入する鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方法に関する。
【００１１】
また、本発明は前記した方法により製造され得るイネ科植物に関する。より詳細には本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入してなる鉄吸収性が改善されたイネ科植物、さらに詳細には、当該酵素がニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）であり、それをコードする遺伝子naatが導入されてなる鉄吸収性が改善されたイネ科植物に関する。
さらに、本発明は、前記鉄吸収性が改善されたイネ科植物を育成する方法及び当該育成により得られる作物に関する。
【００１２】
単子葉植物の中のイネ科植物にのみ見られる鉄獲得機構である前記したストラテージ−IIは、ムギネ酸類を生合成し、これを放出することにより鉄を獲得する方法であることから、ムギネ酸類の生合成経路（図１参照）における酵素の強化方法について検討した。
本発明者らは、ムギネ酸合成経路上の酵素としてニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）にまず着目し、その遺伝子naatを導入してみたところ、驚くべきことに、遺伝子が導入されたイネは石灰質アルカリ土壌でも旺盛に生育することを見出した。
【００１３】
ニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）の遺伝子ｎａａｔ−ＡのｃＤＮＡを、ｐＩＧ１２１ＨｍにＸｂａＩ及びＳａｃＩ部位を使って組み込んで、図２に示すバイナリーベクターを作成した。得られたベクターをアグロバクテリウムに導入し形質転換に用いた。
イネの形質転換はヒエイら（Hieiら（1994））の方法に従い、材料に「つきのひかり」を用い、胚盤から誘導したカルスを前記した形質転換したアグロバクテリウム懸濁液に浸し感染させて、再生体（Ｔ１植物）を得、この種子から最終的に３４系統の形質転換イネを得た。
【００１４】
導入された遺伝子の検出をサザンハイブリダイゼーション法により行った。結果を図３に示す。図３のＷＴは野生種のイネの場合を示し、ｃｏｎｔｒｏｌはベクターのみを導入した対照のイネの場合を示し、１−５、１−６、１−７、８−１及び１５−２は３５Ｓプロモーターを有する形質転換体を示す。図３に示されるように形質転換体はいずれもｎａａｔ−Ａを過剰発現していることがわかる。また、３５Ｓ形質転換イネのうち、８−１、１５−２には少なくともそれぞれ５コピー、２コピーのｎａａｔが導入されたことが分かった。
遺伝子ｎａａｔを導入することにより、野生種やベクターのみを導入したものに比べてニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）が過剰に発現され、その結果としてムギネ酸合成経路が活性化され、鉄の取り込みに必要とされるムギネ酸類が多量に産生されていることが推察される。
【００１５】
そこで、まずこれらの種のＮＡＡＴ活性を検討した。発芽後３週間の幼植物（Ｔ２）を鉄存在（＋Ｆｅ）及び鉄欠乏（−Ｆｅ）の水耕液でそれぞれ２週間栽培し、それぞれの根におけるＮＡＡＴの活性を測定した結果を図４に示す。図４の白抜き部分は＋Ｆｅの場合を示し、斜線部分は−Ｆｅの場合を示す。ＷＴは野生種のものを示し、１−５、１−６及び１−７は形質転換体のものを示す。
この結果、＋Ｆｅ、−Ｆｅのいずれにおいても形質転換していない野生種（ＷＴ）よりも形質転換したもののほうが比活性が高く、−Ｆｅの時さらに比活性が高くなることがわかった。このことは遺伝子の導入により、ＮＡＡＴの活性が高くなることを示しているのみならず、形質転換体は鉄欠乏状態又は鉄の不溶態化した状態においてＮＡＡＴ活性が非常に亢進されることを示している。即ち、鉄欠乏状態又は鉄の不溶態化した状態において強い耐性を有する種となっていることが推察された。
【００１６】
以上のことにより、遺伝子ｎａａｔを導入することによりＮＡＡＴ活性が亢進されることがわかったが、これらの形質転換体が実際の鉄欠乏土壌で生育できるかどうかを検討した。３５Ｓ−ｎａａｔ−Ａ形質転換イネを鉄の不溶態化したアルカリ土壌に移植すると、移植後２週間目までは葉が黄化してくるが、その後の４〜５週間目に新葉が濃い緑になり回復し始めた。図５のアルカリ土壌に移植後８週目の生育状況の写真を挙げる。図５のコントロール（control）は、ベクターのみを移植した対照のイネを示し、その右側のイネは形質転換したものである。コントロールのものに比べて形質転換体のものの発育が格段に優れていることがわかる。また、アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図６に示す。図６のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。黒丸印は形質転換体１５−２を示し、黒四角印は形質転換体８−１を示し、白丸印はｃｏｎｔｒｏｌとして用いたベクターのみを移植した対照のイネを示す。
【００１７】
前述したように、３５Ｓ形質転換イネ８−１には少なくとも５コピーのｎａａｔ遺伝子が、また、３５Ｓ形質転換イネ１５−２には少なくとも２コピーのｎａａｔ遺伝子が導入されており、図６の草丈からみれば遺伝子のコピー数には余り関係無く、遺伝子が導入されていればイネに鉄欠乏耐性が付与できることが示されたことになる。
このように、イネのムギネ酸合成経路のなかの酵素の活性を、その遺伝子の導入により高めることができ、さらにそれにより鉄欠乏耐性が与えられることがわかった。
【００１８】
本発明のイネのムギネ酸合成経路のなかの酵素としては、図１に示すムギネ酸類の生合成経路の中の酵素であって、当該酵素をコードする遺伝子を導入することによりその活性が高められるものであればよいが、前記したようにその中のニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）やニコチアナミン合成酵素が好ましい。本発明のイネのムギネ酸合成経路のなかの酵素をコードする遺伝子としては、ｃＤＮＡであってもゲノム由来のものであってもよい。後述するようにゲノムの使用も本発明の好ましい例である。
したがって、本発明のイネ科植物としては、ストラテージIIの機構により鉄を吸収することが可能な植物であればよく、学術上のイネ科植物に限定されるものではない。本発明の好ましいイネ科植物の例としては、イネ、トウモロコシ、ソルガム、小麦，大麦、エンバクなどが挙げられる。これらのイネ科植物はその品種に関係なく、広く本発明の方法を適用することができ、目的とする遺伝子が導入されたイネ科植物を製造することができる。
【００１９】
本発明のプロモーターとしては、目的の酵素を発現させることができるものであれば特に制限はなく、３５Ｓプロモーター、より具体的にはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどを用いることができる。
本発明のベクターとしては、形質転換において好適に使用することができるものであれば、特に制限はない。本発明の形質転換法としては、前記したアグロバクテリウムを用いる方法に限定されるものではなく、ファージなどを用いた各種の形質転換法を採用することもできる。また、形質転換されるイネ科植物の細胞としては、前記したカルスからの細胞に限定されるものではなく、各種の細胞を使用することもできるが、通常はカルス由来のものが好ましい。
本発明の鉄欠乏とは、鉄分が欠乏している状態であってもよいが、好ましくは植物が吸収することができる状態の鉄分が欠乏している状態であり、植物の種類に応じて鉄欠乏状態であるか否かを決めることもできる。したがって、本発明における鉄欠乏耐性とは、目的とする植物がその土壌においては鉄分を吸収するのが困難な状態に対する耐性であるということもできる。
【００２０】
次に本発明者らは、ｎａａｔのｃＤＮＡに代えてオオムギのゲノムｎａａｔの導入を試みた。
ゲノムｎａａｔは、オオムギ(Horudeum vulgare L. var. Igri)より抽出したゲノムＤＮＡを用いて作成されたライブラリー（SRTRATAGENE社製）を用いた。このライブラリーは、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に切断され、λＦＩＸＩＩベクターのＸｈｏＩサイトに導入されたものである。プローブとしては、先に単離したｎａａｔ−Ａ  ｃＤＮＡの全長を用いた。ホストとしては、大腸菌XL1-Blue MRA（E. coli XL1-Blue MRA (P2)）を使用した。
【００２１】
スクリーニングの結果、５つのファージが得られ、これらについてそれぞれファージＤＮＡの単離を行い、それぞれについて制限酵素地図を作製したところ、すべて同じ断片を含むことが解った。すなわち、得られた５つのファージは同じゲノムの部分から由来するものであることが解った。また、これらはプローブに使用したｎａａｔを含むことが予想された。そこで、図７に示すこのうちの１つについて塩基配列の決定を行った。
【００２２】
図７に示したファージＤＮＡを、１０ｋｂ以上の断片を挿入でき、かつアグロバクテリウムを用いたイネの形質転換を行うことのできるプラスミドベクターｐＢＩＧＲＺ１のＮｏｔＩサイトに挿入した（図８参照）。
さらに、図７に示した断片について１１．０ｋｂまでを、Ａ〜Ｄまでの４つに分け、これらをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩサイト（Ｂ、Ｃ）、またはＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩサイト（Ａ、Ｄ）に導入した。
Ａ〜Ｄの各断片についてプラスミド上の配列を元にしたプライマー（Ｍ１３フォワードプライマー，Ｍ１３リバースプライマー）にて断片の両端から塩基配列を決定した。塩基配列の決定には島津製作所社製ＤＮＡシーケンサＤＳＱ−２０００Ｌを使用した。
配列決定の詳細は後述する実施例に記載されている。
【００２３】
決定した１０，９６６ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号１示す。また、全配列を図９〜図１２（塩基番号なし）に示した。
得られた塩基配列から、この１０，９６６ｂｐの遺伝子は、これまで得られていたｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂをコードするオオムギゲノムの断片であることがわかった。順序はｎａａｔ−Ｂ、ｎａａｔ−Ａの順であった。
図１３〜図１９にｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した。図１３〜図１９において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。エキソン部分の塩基番号はそれぞれ以下のようになる。
【００２４】
この模式図を、図２０に示した。エキソン部分を斜線で塗った部分で示してある。両遺伝子ともに６つのイントロン、７つのエキソンで形成されている。また、イントロンの挿入位置は、各遺伝子ともに相同の位置であった。ｃＤＮＡのどの位置にどの大きさのイントロンが挿入されているかを図２１に示した。
このゲノムから予想されるｎａａｔ−Ａ及びｎａａｔ−Ｂのアミノ酸配列を図２２及び図２３にそれぞれ示した。
【００２５】
得られたオオムギのゲノムｎａａｔを導入したイネの形質転換法は、前述した３５Ｓの形質転換イネの形質転換法に準じて行った。
次に得られたゲノムｎａａｔを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定を行った。得られた再生体（Ｔ１）のうち３９個体とベクターのみを導入したコントロール（control）１５個体を用いて３５Ｓの形質転換植物と同様に検定を行った。移植後５週目から、１週間または２週間ごとに草丈の測定を行った。４−５週間ごとに２回土壌サイズを増やしたポットに移し変えた。
【００２６】
ゲノムｎａａｔで形質転換されたイネは、アルカリ土壌に移植後２週間目までに葉が黄化し４〜５週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、俄然旺盛な生育を示すようになった。これに対してベクターのみを入れた対照区は永く黄化葉が続き、８週目あたりから新葉の緑化が始まった。
図２４は、アルカリ土壌に移植後１０週間目の生育の状況を移した写真である。
図２４のｃｏｎｔｒｏｌは、ベクターのみを移植した対照のイネを示す。右側のイネはゲノムｎａａｔで形質転換したものである。
アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図２５に示す。図２５のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。図２５の左側はゲノムｎａａｔで形質転換したイネであり、右側はベクターのみを移植した対照のイネである。
これにより、ゲノムｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった。
【００２７】
【実施例】
次に、具体例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターでｎａａｔを過剰発現するイネの形質転換法）
図２に示すバイナリーベクターを、遺伝子ｎａａｔのｃＤＮＡをｐＩＧ１２１ＨｍにＸｂａＩ及びＳａｃＩ部位を使って組み込んで作成した。これをアグロバクテリウムに導入し形質転換に用いた。
イネの形質転換はヒエイら（Hiei, et al.,  （1994））の方法に従い、材料には「つきのひかり」を用いた。まず、籾を取り除いた種子を滅菌して、Ｎ６無機塩  Ｎ６ビタミン  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ２ｇ／Ｌゲルライト（gelrite）からなるカルス誘導培地（ｐＨ  ５．８）に播種し、６０μｍｏｌ／ｍ２ｓで、１６時間明期／８時間暗期の条件で２５℃、３週間培養して胚盤からカルスを誘導した。
新しい培地に移し、２５℃明所で３日間培養した後、アグロバクテリウム懸濁培地（ｐＨ５．８）（ＡＡ無機塩  アミノ酸  Ｂ５ビタミン  ２０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ０．２ｍｇ／Ｌ、キネチン（kinetin）  １０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン（acetosyringone））でアグロバクテリウム懸濁液に浸し、ペーパータオルで水を切った後、共存培養培地（ｐＨ５．２）（Ｎ６無機塩  Ｎ６ビタミン  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  １０ｇ／Ｌ、グルコース（glucose）  ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  １０ｍｇ／Ｌ  アセトシリンゴン（acetosyringone）  ２ｇ／Ｌゲルライト（gelrite））で２８℃暗黒下で３日間感染させた。
【００２９】
その後、５００ｍｇ／Ｌでクラフォランを入れた滅菌水洗浄液でカルスを洗ってアグロバクテリウムを除去し、５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む選抜培地（ｐＨ５．８）（Ｎ６無機塩  Ｎ６ビタミン  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ２ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite）  ５００ｍｇ／Ｌ、クラフォラン  ５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン（hygromycin））上に置床して２５℃明所で３週間培養した。
培養後、再分化培地（ｐＨ５．８）（ＭＳ無機塩  ＭＳビタミン  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  ３０ｇ／Ｌ、ソルビトール（sorbitol）  ２ｇ／Ｌ、カサミノ酸類（casamino acids）  １ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ  ２ｍｇ／Ｌ、ＢＡＰ５００ｍｇ／Ｌ、クラフォラン  ５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン（hygromycin）  ４ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite））に移し３〜５週間で再分化してきた再生体（Ｔ１植物）を検定培地に移した。検定培地（ｐＨ５．８）は、ＭＳ無機塩  ＭＳビタミン  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  ５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン（hygromycin）  ８ｇ／Ｌ、寒天（agar）からなっている。
【００３０】
シャーレ一杯に大きくなった植物体を４〜５日間馴化させた後、合成培土（ボンソル１号、住友化学）とバーミキュライトを１：１にまぜた土に移植して種子をとった。最終的に３４系統の形質転換イネを得た。
【００３１】
実施例２（導入された遺伝子のサザンハイブリダイゼーション法による検出）
実施例１で得られたＴ１植物の葉を磨砕し、Ｃ−ＴＡＢ法の改変によりゲノムを抽出した。抽出したゲノムをＨｉｎ  ｄＩＩＩで処理し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離した。これをナイロンメンブレンにブロッティングした。プローブにｎａａｔの内部配列で作成したプライマーを用いてＰＣＲによって３２Ｐでラベルしたものを用いてハイブリダイゼーションを行った後、ＢＡＳ２０００（フジフィルム）によってバンドを検出した。
このサザンハイブリダイゼーションの結果を図３に示す。図３のＷＴは野生型のイネの場合を示し、ｃｏｎｔｒｏｌはべくたーのみを導入した対照のイネの場合を示し、１−５、１−６、１−７、８−１及び１５−２は３５Ｓプロモーターでｎａａｔ−Ａを過剰発現するイネの場合を示す。
図３に示す結果より、３５Ｓ形質転換イネのうち、８−１、１５−２には少なくともそれぞれ５コピー、２コピーのｎａａｔが導入されたことが分かった。
【００３２】
実施例３（アルカリ土壌を用いた鉄欠乏耐性の検定）
供試土壌として、次の構成成分からなる貝化石土壌を用いた。
0004084502.tif 000002
この土壌の可溶性の鉄濃度は２２ｐｐｍであり、ｐＨは８．７８であり、電気抵抗は０．０３ｍΩであった。
【００３３】
３５Ｓの形質転換植物の検定には、最初に得られた形質転換植物の再生体（Ｔ１）の種子を５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含むＭＳ固形培地上に播種して選抜、馴化後、２０〜２５ｃｍになった幼植物（Ｔ２）を用いた。
３４系統のうちの１６系統２７種について耐性の検定を行った。検定法はプラスチックの黒ポット（０．５Ｌ）の底にペーパータオルとろ紙を円形に切ってしき、アルカリ土壌を入れたものに植物を移植し、水耕液（春日井氏液；７×１０−４Ｍ  Ｋ２ＰＯ４，１×１０−４Ｍ  ＫＣｌ，１×１０−４Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４，２×１０−３Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２，５×１０−４Ｍ  ＭｇＳＯ４，１×１０−５Ｍ  Ｈ３ＢＯ３，５×１０−７Ｍ  ＭｎＳＯ４，５×１０−７Ｍ  ＺｎＳＯ４，２×１０−４Ｍ  ＣｕＳＯ４，１×１０−８Ｍ  （ＮＨ４）３ＭｏＯ２４，１．５×１０−４Ｍ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ）をポットの底から２〜３ｃｍ浸し、昼３０℃、夜２５℃の温室で栽培した。アルカリ土壌は３〜４週間後にポットのサイズを１Ｌにし、８〜９週間後に２Ｌと一回りづつ大きくして植え替えた。移植後２週目から、１週間または２週間ごとに草丈の測定を行った。
【００３４】
＋Ｆｅ（鉄存在）又は−Ｆｅ（鉄欠乏）の水耕液で育てた形質転換イネ（３５Ｓｎａａｔ  イネ）のＮＡＡＴ比活性の測定を次のようにして行った。発芽後３週間の幼植物（Ｔ２）を＋Ｆｅ、−Ｆｅの水耕液で２週間栽培しそれぞれの根におけるＮＡＡＴ活性を測定した。その結果を図４に示す。図４の白抜き部分は＋Ｆｅの場合を示し、斜線部分は−Ｆｅの場合を示す。ＷＴは野生種のものを示し、１−５、１−６及び１−７は形質転換体のものを示す。
＋Ｆｅ、−Ｆｅのいずれにおいても形質転換していない野生種（ＷＴ）よりも形質転換したもののほうが比活性が高く、−Ｆｅの時さらに比活性が上乗せされた（図４参照）。
【００３５】
実施例４（アルカリ土壌による鉄欠乏耐性の検定）
３５Ｓ−ｎａａｔ−Ａ形質転換イネをアルカリ土壌に移植して、その生育を観察した。
３５Ｓ−ｎａａｔ−Ａ形質転換イネは、移植後２週間目までに葉が黄化し４〜５週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、ｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった。
移植後８週目の生育状況の写真を図５に示す。図５のｃｏｎｔｒｏｌは、ベクターのみを移植した対照のイネを示す。右側のイネは形質転換したものである。
アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図６に示す。図６のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。黒丸印は形質転換体１５−２を示し、黒四角印は形質転換体８−１を示し、白丸印はｃｏｎｔｒｏｌとして用いたベクターのみを移植した対照のイネを示す。
遺伝子ｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった（図５、図６）。
【００３６】
実施例５（ｎａａｔ−Ａ及びＢゲノミッククローンの単離）
スクリーニングの手順は主に「クローニングとシーケンス」（農村文化社）によった。
ライブラリーとして、ストラタジーン（SRTRATAGENE）社より購入したλＦＩＸＩＩライブラリーを用いた。これはオオムギ（Horudeum vulgare L. var. Igri）より抽出したゲノムＤＮＡを用いて作成されたものである。ゲノムＤＮＡは、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に切断され、λＦＩＸＩＩベクターのＸｈｏＩサイトに導入されたものである。ライブラリーのインサートサイズは９〜２３ｋｂである。
【００３７】
（１）  ＮＺＣＹＭ液体培地（ＮＺアミン  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、カサミノ酸  １ｇ、バクトイースト抽出物（Bacto-yeast extract）  ５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、及び、１Ｎ  ＮａＯＨ  約６ｍＬを蒸留水で１Ｌにし（ｐＨ７．５）オートクレーブで殺菌したもの。）で一晩培養した大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ  （Ｐ２））を遠心した後、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４溶液２０ｍＬに懸濁した。
（２）  この大腸菌懸濁液１００ｍＬとファージ希釈液（スクリーニング用プレート（９ｃｍｘ１３ｃｍ）に２５，０００プラークを形成する量）１００ｍＬとを混ぜ、３７℃２０分静置後、８ｍＬの５０℃  ０．７％トップアガー（１００ｍＬあたり０．７ｇのアガロースを加えたもの）と混ぜ、スクリーニング用プレート（９ｃｍｘ１３ｃｍ）にまいた。プレートは３７℃に静置し、プラークのサイズが０．５ｍｍになるまで培養した。
【００３８】
（３）  ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）をプレートのサイズに切り取り、トップアガロースの上に３０秒間おいた。これを変性液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）を含ませた濾紙の上にプラークと接触した面を上にして置いた。２枚目のメンブレンをトップアガロース上に置き、１分間放置した。同様に変性液をしみこませた濾紙上においた。５分間放置した後、２枚のメンブレンを中和液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）をしみこませた濾紙上に移した。５分間放置後、２ｘＳＳＰＥ（０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）液で２回よく洗い、乾燥させた。
【００３９】
（４）  先に単離したｎａａｔ−ＡのｃＤＮＡ全長をプローブとして使用するために、プラスミドベクターｐＹＨ２３のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩサイトに入っているものを同サイトで切り出し、精製した。これをランダムプライマーＤＮＡラベリングキット第２版（Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2（宝酒造））を用いて［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰでラベル化した。
一方、メンブレンを予め６５℃に加温しておいた３０ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー（６ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルト溶液、０．１％  ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精巣ＤＮＡ）でプレハイブリダイゼーションを６５℃で１時間行い、ハイブリダイゼーションバッファーを交換した（２５ｍＬ）。
【００４０】
これに、前記で調製したプローブを加え、６５℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンの洗浄は予め６５℃に加温しておいた洗浄液（５ｘＳＳＰＥ）で６５℃で１０分間を２回、ハイストリージェント（high stringent）洗浄液（２ｘＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ）６５℃で１回を行った。メンブレンをサランラップで包み、イメージングプレート（フジフィルム）に一晩感光させ、イメージングアナライザー（フジフィルム）で結果を得た。
試薬は、２０ｘＳＳＰＥ（０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４、３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、５０ｘデンハルト溶液、５ｇ  フィコール４００、５ｇ  ポリビニルピロリドン（ＭＷ  ３６０，０００）、５ｇ  仔ウシ血清アルブミンを５００ｍＬの蒸留水に溶解し、０．４５ｍｍのフィルターで濾過したものを使用した。
【００４１】
（５）  二枚のメンブレンに共通して現れたものをポジティブとして、この場所に対応するプラークを元のシャーレから打ち抜いた。打ち抜いたものはＳＭ液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１％  ゼラチン）にとり、４℃で保存した。その後、このファージ液を使って同様に２次、３次スクリーニングを行った。最終的に５つのファージが得られた。
【００４２】
上記で得られた５つのファージについてそれぞれファージＤＮＡの単離を行った。それぞれについて制限酵素地図を作製したところ、すべて同じ断片を含むことが解った。すなわち、得られた５つのファージは同じゲノムの部分から由来するものであることが解った。また、これらはプローブに使用したｎａａｔを含むことが予想された。そこで、このうちの１つ（図７参照）について塩基配列の決定を行うこととした。図７中のＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄIIIを、ＢはＢａｍＨＩを、ＮはＮｏｔＩをそれぞれ示す。両端のＮｏｔＩサイトはλＦＩＸＩＩのアームにあるＮｏｔＩである。
【００４３】
実施例６（サブクローニングと塩基配列の決定）
（１）  図７に示したファージＤＮＡを、１０ｋｂ以上の断片を挿入でき、かつアグロバクテリウムを用いたイネの形質転換を行うことのできるプラスミドベクターｐＢＩＧＲＺ１に挿入した。図７で示したファージＤＮＡのはじめのＮｏｔＩサイトから１１．０  ｋｂにあるＮｏｔＩサイトまでの断片１１．０ｋｂｐを切り出し、ｐＢＩＧＲＺ１のＮｏｔＩサイトに挿入した（図８参照）。図８のＮＰＴIIはカナマイシン耐性遺伝子を、ＨＰＴはハイグロマイシン耐性遺伝子を、ＧＵＳはイントロン入りβグルクロニダーゼ遺伝子を、ＬａｃＺはβガラクトシダーゼ遺伝子を、３５Ｐは３５Ｓプロモーターを、ＮＰはＮＯＳプロモーターを、ＮＴはＮＯＳターミネーターを、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、ＲｉｏｒｉはＲｉプラスミド複製起点をそれぞれ示している。
すなわち、塩基配列の決定を行ったのは、この１１．０ｋｂについてである。後のイネの形質転換にはこの作成したコンストラクトを使用した。
【００４４】
（２）  ｐＢＩＧＲＺ１は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ｂｌｕｅ）内で安定に保持される。このコンストラクトを持った大腸菌を培養し、ここからプラスミドをプラスミド調整器ＰＩ−５０α（倉敷紡績株式会社）により抽出した。
（３）  図７に示した断片について１１．０ｋｂまでを、Ａ〜Ｄまでの４つに分け、これらをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩサイト（Ｂ、Ｃ）、またはＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩサイト（Ａ、Ｄ）に導入した。
（４）  Ａ〜Ｄの各断片についてプラスミド上の配列を元にしたプライマー（Ｍ１３フォワードプライマー，Ｍ１３リバースプライマー）にて断片の両端から塩基配列を決定した。塩基配列の決定には島津製作所社製ＤＮＡシーケンサＤＳＱ−２０００Ｌを使用した。
【００４５】
（５）  各断片について塩基配列の決定された部分からさらに先を読むためのプライマーとそこまで読めた配列を逆方向から確認するためのプライマーを作成し、順次塩基配列を決定した。最終的には全ての断片について、５’方向からと３’方向から両方向について配列決定を行った。各断片の塩基配列を決定するのに使用したプライマーの配列を以下に示す。
これらのプライマーは、ＤＳＱ−２０００Ｌでの使用のため５’末端にフルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate, ＦＩＴＣ）でラベルした。
【００４６】
断片Ａ用のプライマー
名称:配列  F-A1F: FITC-5'-gct act agt agt att cct ggt gta g
名称:配列  F-A1R: FITC-5'-gga gta cta cta gac tac acc agg a
名称:配列  F-A2F: FITC-5'-aca tgc gca tgc atg aat tgc cg
名称:配列  F-A2R: FITC-5'-caa ttc atg cat gcg cat gtg cc
【００４７】
断片Ｂ用のプライマー
名称:配列  F-B1F: FITC-5'-ggt caa gta tgc agt atg ttg gaa c
名称:配列  F-B1R: FITC-5'-gtt cca aca tac tgc ata ctt gac c
名称:配列  F-B2F: FITC-5'-cta gaa gcc tat gga tgt ttc ttt tgg
名称:配列  F-B2R: FITC-5'-cca aaa gaa aca tcc ata ggc ttc tag
名称:配列  F-B3F: FITC-5'-agt tct tat caa ttt ccg aga tga c
名称:配列  F-B3R: FITC-5'-ata gtc atc tcg gaa att gat aag a
名称:配列  F-B4F: FITC-5'-agt ggt cac cat gcg gac caa cac c
名称:配列  F-B4R: FITC-5'-ggt gtt ggt ccg cat ggt gac cac t
【００４８】
断片Ｃ用のプライマー
名称:配列  F-C1F: FITC-5'-cac cgg cca gtt caa ctg cta cgc
名称:配列  F-C1R: FITC-5'-gcg tag cag ttg aac tgg ccg gtg
名称:配列  F-C2F: FITC-5'-ttt gga gga gat cca tga cga cat a
名称:配列  F-C2R: FITC-5'-tat gtc gtc atg gat ctc ctc caa a
名称:配列  F-C3F: FITC-5'-tct tct cat atg cta ctg tgg gga t
名称:配列  F-C3R: FITC-5'-tga cat gca aca cag gga cat gag c
【００４９】
断片Ｄ用のプライマー
名称:配列  F-D1F: FITC-5'-cat gct gac gaa gag cga ggt cat a
名称:配列  F-D1R: FITC-5'-ccc agg ata tga cct tag tgg ttg g
【００５０】
（６）  上で完全に配列決定ができなかった部分について新たに下に示すプライマーを合成し、パーキンエルマージャパン社製自動ＤＮＡシーケンサABI PRISMTM 310 genetic Analyzerを使用して、完全に塩基配列を決定した。
断片Ｂ用のプライマー
名称:配列  B5F: 5'-gaa tgg caa act ggg tcc gca tta c
名称:配列  B5R: 5'-gta atg cgg acc cag ttt gcc att c
名称:配列  B6F: 5'-ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa c
名称:配列  B6R: 5'-gtt tcg tcc agg cca caa caa cca g
名称:配列  B7F: 5'-agc aca aac cct acc tat gtt agg c
名称:配列  B7R: 5'-gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc t
【００５１】
断片Ｃ用のプライマー
名称:配列  C4F: 5'-tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac
名称:配列  C4R: 5'-ccc tgt gac aag tgc tct gct acg
名称:配列  C5F: 5'-tct ggg atc tca gtg cat cca aca
名称:配列  C5R: 5'-gaa gca tat atc agt caa aca taa cc
【００５２】
また、断片Ａと断片Ｂ、断片Ｂと断片Ｃのつなぎ目部分を確定するために以下のプライマーを作成して、（１）で作成したコンストラクトをパーキンエルマージャパン社製自動ＤＮＡシーケンサABI PRISMTM 310 genetic Analyzerを使用して、塩基配列を決定した。
断片Ａと断片Ｂの境目
名称：配列  A-eF: 5'-cac atc ctt tgc ctt gct gaa tat gg
名称：配列  B-tR: 5'-cag tag tac taa tta atc acc tta gta gc
断片Ｂと断片Ｃの境目
名称：配列  B-eF: 5'-cac gat caa cca aag aat gtc ctc c
名称：配列  C-tR: 5'-tac ttg tat atg cag ctc cag cac
（７）  決定した１０，９６６ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号１示す。また、全配列を図９〜図１２（塩基番号なし）に示した。
【００５３】
得られた塩基配列から、この１０，９６６ｂｐの遺伝子は、これまで得られていたｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂをコードするオオムギゲノムの断片であることがわかった。順序はｎａａｔ−Ｂ、ｎａａｔ−Ａの順であった。
図１３〜図１９にｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した。図１３〜図１９において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。エキソン部分の塩基番号はそれぞれ以下のようになる。
【００５４】
0004084502.tif 000003
【００５５】
0004084502.tif 000004
【００５６】
この模式図を、図２０に示した。エキソン部分を斜線で塗った部分で示してある。両遺伝子ともに６つのイントロン、７つのエキソンで形成されている。また、イントロンの挿入位置は、各遺伝子ともに相同の位置であった。ｃＤＮＡのどの位置にどの大きさのイントロンが挿入されているかを図２１に示した。
このゲノムから予想されるｎａａｔ−Ａ及びｎａａｔ−Ｂのアミノ酸配列を図２２及び図２３にそれぞれ示した。
【００５７】
実施例７（オオムギのゲノムnaatを導入したイネの形質転換法）
前記した実施例６で得られたオオムギのゲノムｎａａｔを導入したイネの形質転換法は、以下に示す（１）〜（３）の点を除いては３５Ｓの形質転換イネのときと同様に形質転換を行った。
（１）カルス誘導を２８℃暗所で行い、カルス誘導培地を、
Ｎ６無機塩  Ｎ６ビタミン  ０．３ｇ／Ｌ、カサミノ酸（casamino acid）  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ２．８ｇ／Ｌ、プロリン  ４ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite）（ｐＨ５．８）とした。
（２）アグロバクテリウムによる感染を２５℃で行い、共存培養培地を、
Ｎ６無機塩  Ｎ６ビタミン  ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose）  １０ｇ／Ｌ、グルコース（glucose）  １ｇ／Ｌ、カサミノ酸（casamino acid）  ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ２０ｍｇ／Ｌ、アセトシリンゴン（acetosyringone）  ２ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite）（ｐＨ５．２）とし、ろ紙を敷いて行った。
【００５８】
（３）選抜は、はじめの１週間を１０ｍｇ／Ｌ、次の１週間を３０μｇ／Ｌ、最後の２週間を５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む選抜培地を使い、暗所２８℃で培養した。
選抜培地として、Ｎ６無機塩  Ｎ６ビタミン  １ｇ／Ｌ、カサミノ酸（casamino acid）、３０ｇ／Ｌ  スクロース（sucrose）、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／Ｌ  クラフォラン、１０−５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン（hygromycin）、２ｇ／Ｌ  ゲルライト（gelrite）（ｐＨ５．８）を用い、
再分化培地として、ＭＳ無機塩  ＭＳビタミン  ３０ｇ／Ｌ  スクロース（sucrose）、３０ｇ／Ｌ  ソルビトール（sorbitol）、２ｇ／Ｌ  カサミノ酸（casamino acid）、１．１ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、２ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  キネチン（kinetin）、２５０ｍｇ／Ｌ  クラフォラン、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン（hygromycin）、４ｇ／Ｌ  ゲルライト（gelrite）（ｐＨ５．８）を用い、２８℃で培養を行った。
【００５９】
実施例８（ゲノムｎａａｔを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定）
ゲノムｎａａｔを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定は、得られた再生体（Ｔ１）のうち３９個体とベクターのみを導入したコントロール（control）１５個体を用いて３５Ｓの形質転換植物と同様に検定を行った。移植後５週目から、１週間または２週間ごとに草丈の測定を行った。４−５週間ごとに２回土壌サイズを増やしたポットに移し変えた。
【００６０】
ゲノムｎａａｔで形質転換されたイネは、アルカリ土壌に移植後２週間目までに葉が黄化し４〜５週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、俄然旺盛な生育を示すようになった。これに対してベクターのみを入れた対照区は永く黄化葉が続き、８週目あたりから新葉の緑化が始まった。これによりｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった（図２４及び図２５参照）。
図２４は、アルカリ土壌に移植後１０週間目の生育の状況を移した写真である。
図２４のｃｏｎｔｒｏｌは、ベクターのみを移植した対照のイネを示す。右側のイネはゲノムｎａａｔで形質転換したものである。
アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図２５に示す。図２５のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。図２５の左側はゲノムｎａａｔで形質転換したイネであり、右側はベクターのみを移植した対照のイネである。
これにより、ゲノムｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、鉄欠乏耐性を有する新規なイネ科植物を提供するものであり、鉄欠乏耕地においても生育可能な新規なイネ科植物を提供するものである。
また、本発明は、イネ科植物に、ムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入することにより、鉄吸収性が改善されたイネ科植物をえることができるという新規な知見を提供するものである。
【配列表】
0004084502.tif 000005
0004084502.tif 000006
0004084502.tif 000007
0004084502.tif 000008
0004084502.tif 000009
0004084502.tif 000010
0004084502.tif 000011
0004084502.tif 000012
0004084502.tif 000013
0004084502.tif 000014
0004084502.tif 000015
0004084502.tif 000016
0004084502.tif 000017
0004084502.tif 000018
0004084502.tif 000019
0004084502.tif 000020
0004084502.tif 000021
0004084502.tif 000022
0004084502.tif 000023
0004084502.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、鉄欠乏オオムギ根のムギネ酸類生合成経路と根圏環境を図示したものである。
【図２】図２は、ｎａａｔ−ＡのｃＤＮＡを挿入したイネ科形質転換用のバイナリーベクターｐＩＧ１２１Ｈｍの遺伝子の配列を示したものである。
【図３】図３は、導入された遺伝子の検出をサザンハイブリダイゼーション法により行った結果を示す図面に代わる写真である。図３のＷＴは野生種のイネの場合を示し、コントロールはベクターのみを導入した対照のイネの場合を示し、１−５、１−６、１−７、８−１及び１５−２は３５Ｓプロモーターを有する形質転換体を示す。
【図４】図４は、鉄存在（＋Ｆｅ）及び鉄欠乏（−Ｆｅ）の水耕液で栽培した根におけるＮＡＡＴの活性を測定した結果を示すものである。図４の白抜き部分は＋Ｆｅの場合を示し、斜線部分は−Ｆｅの場合を示す。ＷＴは野生種のものを示し、１−５、１−６及び１−７は形質転換体のものを示す。
【図５】図５は、アルカリ土壌に移植後８週目の各イネの生育状況を示す図面に代わる写真である。図５のコントロール（control）は、ベクターのみを移植した対照のイネを示し、その右側のイネは形質転換したものである。
【図６】図６は、アルカリ土壌移植後の各イネの草丈の変化をグラフにして示したものである。黒丸印は形質転換体１５−２を示し、黒四角印は形質転換体８−１を示し、白丸印はコントロールとして用いたベクターのみを移植した対照のイネを示す。
【図７】図７は、単離されたゲノムｎａａｔを含むファージＤＮＡのひとつの制限酵素地図を示すものである。図７中のＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄIIIを、ＢはＢａｍＨＩを、ＮはＮｏｔＩをそれぞれ示す。両端のＮｏｔＩサイトはλＦＩＸＩＩのアームにあるＮｏｔＩである。
【図８】図８は、ＮＡＡＴゲノム断片を挿入したイネ科形質転換用のバイナリーベクターｐＢＩＧＲＺ１の遺伝子の配列を示したものである。図８のＮＰＴIIはカナマイシン耐性遺伝子を、ＨＰＴはハイグロマイシン耐性遺伝子を、ＧＵＳはイントロン入りβグルクロニダーゼ遺伝子を、ＬａｃＺはβガラクトシダーゼ遺伝子を、３５Ｐは３５Ｓプロモーターを、ＮＰはＮＯＳプロモーターを、ＮＴはＮＯＳターミネーターを、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、ＲｉｏｒｉはＲｉプラスミド複製起点をそれぞれ示している。
【図９】図９は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列を示した４枚のうちの１枚目の図である。
【図１０】図１０は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列を示した４枚のうちの２枚目の図である。
【図１１】図１１は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列を示した４枚のうちの３枚目の図である。
【図１２】図１２は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列を示した４枚のうちの４枚目の図である。
【図１３】図１３は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの１枚目の図である。図１３において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。
【図１４】図１４は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの２枚目の図である。図１４において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。
【図１５】図１５は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの３枚目の図である。図１５において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。
【図１６】図１６は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの４枚目の図である。図１６において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。
【図１７】図１７は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの５枚目の図である。図１７において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。
【図１８】図１８は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの６枚目の図である。図１８において大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。
【図１９】図１９は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した７枚のうちの７枚目の図である。
【図２０】図２０は、得られたゲノム断片のもし葛を示す。図２０中のＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄIIIを、ＢはＢａｍＨＩを示す。
【図２１】図２１は、ｎａａｔ−Ａ及びｎａａｔ−ＢのｃＤＮＡにおけるイントロンの挿入位置とイントロンのサイズをしめしたものである。
【図２２】図２２は、ゲノムから予想されるｎａａｔ−Ａのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示したものである。
【図２３】図２３は、ゲノムから予想されるｎａａｔ−Ｂのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示したものである。
【図２４】図２４は、ゲノムｎａａｔを導入したイネのアルカリ土壌に移植後１０週間目の生育の状況を示した図面に代わる写真である。図２４のコントロールは、ベクターのみを移植した対照のイネを示す。右側のイネはゲノムｎａａｔで形質転換したものである。
【図２５】図２５は、ゲノムｎａａｔを導入したイネのアルカリ土壌移植後の草丈の変化をグラフにして示したものである。図２５の左側はゲノムｎａａｔで形質転換したイネであり、右側はベクターのみを移植した対照のイネである。
【図１】
0004084502.tif 000025
【図２】
0004084502.tif 000026
【図３】
0004084502.tif 000027
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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